(57)【要約】【課題】  生体の画像を処理する方法を提供する。【解決手段】  本発明は、生体サンプルの画像を処理する方法である。当該生体サンプルは、核、細胞質、および小核を含む。個々の核は、細胞質に囲まれる。本方法は、サンプル内の小核発生率を求める。細胞質には、最大距離がある。この最大距離とは、画像に現われた、細胞質の、その核からの最も大きい長さである。本方法は、当該最大距離未満の値に捜索距離を設定するステップと、核から捜索距離の範囲で小核を捜索するステップと、捜索で発見された小核に注釈付けするステップを有する。【選択図】図４
2007147563.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体サンプル画像処理方法であって、
前記生体サンプルは、核、細胞質、および、小核を含み、
前記核は前記細胞質に囲まれ、
画像における、前記細胞質の前記核からの最も大きな隔たりを最大距離とし、
前記最大距離未満の値に捜索距離を設定するステップと、
前記核から前記最大距離以下の範囲で小核を捜索するステップと、
前記捜索ステップで発見した小核に注釈付けを行うステップを有することを特徴とする方法。
【請求項２】
さらに、前記核の少なくとも１つの周りに第１領域を定めるステップを有し、
前記第１領域は、内側境界と外側境界とに囲まれ、
第１要素の縁部と前記外側境界との距離は、前記捜索距離と実質的に等しく、
前記小核の捜索は、前記第１領域により制限された捜索領域の内部で行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記内側境界は、前記核の縁部であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１領域の前記内側境界は、前記核の外側であって前記外側境界の内側に定められることを特徴とする請求項２または３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
さらに、前記核の周りに第２領域を定めるステップを有し、
前記第２領域は、前記第１領域と、前記核を取り囲む前記細胞質の領域との重複する領域であり、前記捜索領域は、前記第２領域によって限定されることを特徴とする請求項２ないし４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
前記捜索領域は、近隣の核と重複する領域を除外した前記第１領域に限定されることを特徴とする請求項２ないし４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
前記捜索領域は、近隣の核と重複する領域を除外した前記第２領域に限定されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記小核の少なくとも１つと、その最近傍の核との間の距離を第３距離と定めるステップと、
前記第３距離が、前記捜索距離未満である場合、前記小核を注釈付けするステップを有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記小核を注釈付けするステップは、前記小核が前記最近傍の核の周りの細胞質と重複している場合に限り、前記小核を注釈付けすることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
さらに、核の密集部を前記捜索から除外するステップを有する請求項１ないし９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
前記捜索は、生細胞内の核に限定されていることを特徴とする請求項１ないし１０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれか１つに記載の方法を実行するように構成されたコンピュータ・プログラム。
【請求項１３】
請求項１２に記載のコンピュータ・プログラムを備えるデータ記憶媒体。
【請求項１４】
請求項１２に記載のコンピュータ・プログラムを実行させることができる処理装置を備えるシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体サンプル画像処理方法に関する。生体サンプルには、核、細胞質、および小核が含まれる。本発明は、また、本発明に係る方法を実行するコンピュータプログラム、当該コンピュータプログラムを含むデータ記憶媒体、および当該コンピュータプログラムを実行可能なシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
画像処理は、生物学分野に格別の関与がある。この分野では、生体サンプルの画像を分析することで特定の特徴的形態の存在について分析する。特徴的形態には、細胞内構成要素、線維、および顆粒が含まれることがある。蛍光顕微鏡観察法を用いればフルオロフォアで標識されたサンプル内の要素の分布を画像化し、デジタル画像の画素の強度値として記憶可能である。異なる要素は、異なるフルオロフォアで標識可能である。よって、サンプルに照射する波長と、サンプルからの放射を収集するフィルタとを適切に選択することにより、特定の要素を造影できる。波長とフィルタの具体的な組み合わせをチャネルと称する。例えば、第１チャネルを、細胞核の造影に、第２チャネルを、核を囲む細胞質の造影に設定することができる。
【０００３】
創薬領域では数多くの生体サンプルを画像処理する必要がある。妥当な時間で完全なアッセイを処理可能とするために、処理法はコンピュータ上での高速な実行を実現しなければならない。ある種の創薬アッセイでは、遺伝毒性化合物を見つけるために、小核の誘導を観察する。小核形成の分析は、新薬候補の、並びに、人間が消費若しくは使用する目的を有するか、または、間接的に若しくは図らずに消費若しくは経口摂取する可能性を有する食用色素や化粧品といった化学物質および材料の、毒性評価の重要な要素である。このような分析によって細胞の細胞質内での小核の発生率、および、好ましくは、小核の単核性細胞および二核性細胞の帰属を決定する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
小核の発生率を分析するための、周知の自動化された手法は比較的遅い。このような周知の手法の１つにおいては、第１チャネルによる画像を用いてサンプル内の核の位置を決定し、第２チャネルによる画像から細胞質を識別し、ウォーターシェッド法(watershed method)を用いて細胞質をバックグラウンドから分け、さらに、第１チャネルによる画像における細胞質の領域内に小核が存在することを割り出している。細胞質の区分けおよび第２チャネルの使用にかなりの時間を要する。本発明の目的は、より高速な手法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の目的は生体サンプル画像処理方法により達成される。生体サンプルは、核、細胞質、および小核を含み、各核は細胞質に囲まれており、細胞質においては最大距離が規定される。この最大距離とは、画像における、細胞質の核と細胞質との最大の隔たり（範囲の最大）である。本方法は、捜索距離を最大距離未満の値に設定するステップと、核から捜索距離以内において小核を捜索するステップと、捜索で発見した小核に注釈付けするステップとを有する。
【０００６】
本発明による方法では、ウォーターシェッド・セグメンテーション法を用いる必要がなく、また、単一のチャネルによる画像で処理可能である。最大距離は、核から核を囲む細胞質の広がりの、画像における、最大値である。核の縁部から第２距離未満の隔たりにある小核の捜索が実行される。一般的に、これらの小核は核を囲む細胞質内に存在する。この要件を満たす小核を、捜索の発見物として注釈付けする。本方法によれば、単核性細胞や二核性細胞といった、具体的な細胞への小核の帰属を考察可能である。
【０００７】
一般に、小核は、核の縁部に比較的近い場所に存在する。本発明による方法は、細胞質内において第２距離よりも大きく隔たって存在する小核を切り捨てることが可能である。このことは、相対発生率に基づく分析、例えば遺伝毒性化合物の濃度の関数としての小核発生率の増加に焦点を当てた分析、に影響を及ぼすものではない。実際の事例を得れば、発生率が既知のリファレンス・サンプルを用いることで、本発明による方法で得た発生率をスケーリングすることができる。
【０００８】
本方法の第１の好適な実施形態では、本方法は、少なくとも１つの核の周りを第１領域と定めるステップを有する。第１領域は、内側境界と外側境界とに囲まれた領域である。そして、第１要素と外側境界との間隔は、捜索距離と実質的に等しく、小核の捜索はこの第１領域によって限定される捜索領域で実行される。捜索領域の形状は、核の縁部に従うものである。一般に、小核の捜索は、画像全体にわたって全ての核について適用される。捜索領域の計算法は、従来の、ウォーターシェッド法を用いた細胞質の範囲を決定する方法よりも、かなり高速である。画像における核周囲の捜索領域内での小核の捜索は、核の識別に用いたチャネルと同一のチャネルで実行可能であり、この処理も相対的に高速に実行可能である。
【０００９】
また、代替的方法では、捜索距離は、捜索領域に含まれる核の径の半値と実質的に等しい値に設定される。語「実質的に」は、この値が、径の０．３倍から０．７倍の間にあることが好ましい、ことを意味する。核の形状が円形でない場合、径の値は、核の最も長い径と最も短い径の平均とすることができる。また、調査対象の核全体にわたり径の平均をとってもよい。
【００１０】
別の実施形態では、捜索領域の内側境界は、核の縁部である。核を識別することで既に核の縁部は定められている。そのため、内側境界を定めるうえでさらなる計算は不要である。別の好適な実施形態では、第１領域の内側境界は、核の外側かつ外側境界の内側に構成される。内側境界を核の縁部からは拡張し、染色による縁部の輝度を、小核と誤識別することを回避する。外側境界を、内側境界から特定の間隔に定める場合、捜索距離は、その間隔と、内側境界と核の縁部との間の間隔の和に等しい。
【００１１】
核の周囲に第２領域を定めるステップにより、本方法はさらに精緻化される。この第２領域は、第１領域と、核を取り囲む細胞質の領域とが重複する領域である。捜索領域は、この第２領域により制限される。こうすることにより、捜索領域が細胞の領域から外れること、および、細胞の外側にあるものを小核として注釈付けすることを防止する。第２チャネルによって細胞質の大きさを定めることが可能である。第２チャネルは、核および小核の識別に用いるチャネルとは別のものであって、第２チャネルでは高速実行スレッショルディングを用いて細胞質を識別する。
【００１２】
核同士が割合近接する場合、一の核を囲む捜索領域と、近接する核の一部とが重複することがある。この重複している領域を小核と識別することを防止するため、捜索領域は、第１領域または第二領域に制限し、近接する核との重複した領域を除外することが望まれる。
【００１３】
米国特許第５，９８９，８３５号は、細胞内にレポーター分子を配置する方法を開示する。この方法は、第１チャネルの画像において、細胞の核の領域内部に核マスクを定め、核の周囲にサンプリング領域を定める。別のチャネルの画像において、核マスクおよびサンプリング領域の平均蛍光を測定することで、レポーター分子の存在を判定する。この特許発明は、小核のような分離した物体の存在を判定するために捜索領域を用いる点を開示していない。また、この特許発明は、領域を定めることに用いたチャネルと同一のチャネルによる画像内の物体を捜索するという点について開示しない。このことは、処理速度においてかなり有利な点である。さらには、この特許発明は、核に近接した捜索領域についても開示しない。この捜索領域とは、小核が発見される可能性が最も高い領域である。
【００１４】
本方法の第２の好適な実施形態では、本方法は、小核の少なくとも１つとそれに最近接する核との間を第３距離と定めるステップと、第３距離が捜索距離未満である場合に小核に注釈付けを行うステップとを有する。この方法では、小核の大きさおよび輝度を有する物体を画像から捜索し、最近の核との距離を求め、その距離が捜索距離未満の場合に限って発見物として小核に注釈付けを行う。この、第２の好適な実施形態による方法は、非常に高速であり、かつ、実行容易である。
【００１５】
代替的方法では、捜索距離は、核の径の半値と実質的に等しい値に設定される。語「実質的に」は、径の０．３ないし０．７倍の値であることが好ましい。核の形状が円形でない場合、径は、核の最長径および最短径の平均として求めることができる。好ましくは径は、調査対象である核の全体にわたる平均である。
【００１６】
小核を細胞の外部で見つけることがないように、本方法は、小核が、最近の核を囲む細胞質と重複している場合に限り小核に注釈付けを行うステップを備えることが好ましい。細胞質の範囲は、上述した手法より求めることができる。
【００１７】
本発明の第２の態様は、本発明にかかる方法を実行可能に構成されたコンピュータ・プログラムに関する。
【００１８】
本発明の第３の態様は、前段のコンピュータ・プログラムを記録したデータ記憶媒体に関する。
【００１９】
本発明の第４の態様は、システム、好ましくは分析システムに関する。この分析システムは、先のコンピュータ・プログラムを実行する処理装置（プロセシング・ユニット）を有する。本システムは、先のコンピュータ・プログラムを記録したデータ記憶媒体を有することが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の別の特徴および有利点は、以下の本発明の好適な実施形態に関する説明より明らかとなる。以下の説明は、添付の図面を参照しており、例示のみを目的としている。
【００２１】
小核の誘導は、遺伝毒性化合物の重要な特徴である。それ故、小核形成の分析は重要な研究調査対象である。小核形成は、遺伝毒性化合物に曝された細胞の細胞分裂の際に生じる。これは、染色体異常誘発性化合物によるＤＮＡ鎖の切断、または、異数性誘発性化合物によってチューブリンのような細胞の染色体分離機構を構成する要素が干渉することによる誤った染色体分離のいずれかに起因する場合がある。
【００２２】
図１は、細胞分裂における小核形成を示す図である。これは、有形分裂とも称される。細胞１は、細胞質３に囲まれた核２を含む。分裂中の細胞を参照数字４で示す。分裂した染色体５は、微小管６によって分離される。本図は、ＤＮＡ鎖の切断７および微小管の切断８を示している。染色体の分離におけるこれらの欠陥により、染色体の断片または染色体全体が生じる。細胞質分裂後、つまり、細胞が２つの、それぞれ分離された染色体のセットを含む娘細胞に分裂した後は、２つの、それぞれが核１１、１２を含む細胞９、１０が存在する。欠陥によって生じた染色体の断片または全染色体は、細胞１０の細胞質内に小核１３として存在する。図１に示す細胞９および１０のように単一の核を含む細胞は、単核性細胞と呼ばれる。有形分裂後に細胞質分裂が行われず、細胞質内に２つの核を含む細胞は、二核性細胞と呼ばれる。
【００２３】
インビトロ小核アッセイは、被験化合物と一緒に細胞を、細胞分裂が一巡以上行われるのに十分な期間の間培養し、被験化合物が染色体異常誘発性もしくは異数性誘発性について活性を有する場合には小核が形成され得るように、行われる。細胞分裂は小核形成の要件である。そのため、細胞は、アッセイの間、活発に分裂していることを確かめることが必要である。細胞分裂の確認には、幾つかの手法を利用可能である。それらには、サイトカラシンＢを用いた細胞質分裂の阻害を利用することも含まれる。サイトカラシンＢによる細胞質分裂の阻害を利用するプロトコルでは、阻害剤の添加により、細胞は娘細胞の分裂の前で直ちに停止し、その結果、二核性細胞が形成される。結果、被験化合物と一緒に処理された細胞群を、単核性細胞と二核性細胞の相対頻度について分析することで、培養の増殖についての活性に関する測度が得られる。この増殖指標を用いて細胞周期の遅延または停止を引き起こす化合物の識別が可能である。また、化合物の細胞毒性に起因し偽陰性のアッセイ結果が出る危険性のある場合に、化合物を再試験する必要性を示唆することができる。増殖制御および細胞質分裂阻害剤についてのガイダンスについては、キルシュ−フォルダース  エム．ら(Kirsch-Volders M. et al.)の「Ｒｅｐｏｒｔ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｉｃｒｏｎｕｃｌｅｕｓ  ａｓｓａｙ  ｗｏｒｋｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ．」  Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ．  ２００３  ５４０（２）：頁１５３−１６３を参照されたい。
【００２４】
小核の存在は、標準的なＤＮＡ染色法および蛍光造影法を用いて容易に検出可能である。一般的なＤＮＡの染色は、ヘキスト（トレードマーク）３３３４２およびＤＲＡＱ５（トレードマーク）である。細胞質は、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）またはカルセインブルーＡＭ（Ｃａｌｃｅｉｎ  ｂｌｕｅ  ＡＭ）で染色可能である。生育不能な細胞を検出するには、染色用のプロピジウム・イオダイド(stein Propidium iodide)を用いることができる。アッセイのサンプルは、従来の方法で準備する。異なる量の被験化合物を含むサンプルをウェルまたはマイクロタイター・プレートに沈着させればよい。
【００２５】
図２は、蛍光顕微鏡の概略図である。この蛍光顕微鏡は、上述のサンプルを、米国特許第６，４００，４８７号および６，３８８，７８８号明細書において開示するＧＥヘルスケア社のＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ３０００システムといった分析システムで造影することに用いることができる。本顕微鏡は、電磁放射線源を有する。この電磁放射線源は、例えば、可視領域である３５０ないし７５０ナノメートルの放射線を放つ電球２１および／またはレーザ２２である。放射された放射線は、レンズ２３および２４によりそれぞれ平行化される。本顕微鏡は、さらにシリンドリカル・レンズ２５、第１スリット・マスク２６、第１リレー・レンズ２７、二色性ミラーの形態を備えたビーム・スプリッタ２８、対物レンズ２９、サンプル・ウェル３１の２次元的アレイを備えたマイクロタイター・プレート３０、結像レンズ３２、フィルタ３３、第２スリット・マスク３４、および、検出器３５を有する。これらの要素は、マスク２６、３４のスリット開口部３６、３７のそれぞれが定める光軸ＯＡに沿って配置され、図２の面に垂直な方向に延在する。レンズ２７、２９、および３２の焦点距離、これらレンズ間の間隔、マスク２６とレンズ２７の間隔、対物レンズ２９とマイクロタイター・プレート３０の間隔、レンズ３２とマスク３４の間隔は、共焦点顕微鏡を構成するものである。
【００２６】
本実施形態では、線源からの電磁放射線は、シリンドリカル・レンズ２５を用いて一線に集中される。この線の形状は、第１スリット・マスク２６によって最適化される。スリット・マスク２６は、マイクロタイター・プレート３０と共役の関係にある、本光学系の、ある平面内にある。スリット・マスク２６の開口部３６により形成される照射縞は、レンズ２７、二色性ミラー２８、および対物レンズ２９によって中継され、マイクロタイター・プレート３０に達する。図示の簡単化のため、光学要素は断面図であり、ウェル・プレートは斜視図としている。照射される線のウェル・プレート３０上への投射は、線３８として示す。矢印ＡおよびＢとして示すとおり、ウェル・プレート３０は、アレイの方向と平行な２方向（ｘ，ｙ）へ図示しない手段により移動することができる。
【００２７】
或いは、スリット・マスク２６を、本光学系のフーリエ面に配してもよい。これは、対物レンズ２９の後焦点面（ＢＦＰ）３９と共役な平面に含まれる。この場合、スリットの開口部３６は本図の面内に含まれ、レンズ２７は、開口部２６によって形成された照射縞を、対物レンズ２９の後焦点面３９へ向けて中継する。レンズ２７により、照射縞は図１の面に垂直な、マイクロタイター・プレート３０の面内の線に変換される。
【００２８】
線源からの放射線を、スリット・マスク２６を用いずに、対物レンズ２９の後焦点面３９に集中させてもよい。これは、図２に示すシリンドリカル・レンズ２５と球面レンズ２７とを組み合わせることで可能である。或いは、シリンドリカル・レンズ２５によって照射を直接的に面３９に集中させることもできる。
【００２９】
サンプル領域の画像、例えば、サンプル・ウェル３１内にあるサンプルの画像は、照射の線がサンプルを横断するようにマイクロタイター２０を位置合わせし、サンプルの放射する蛍光を検出器３５に結像させ、そして、検出器３５の読み出しと同期してプレート３０を照射の線と垂直な方向へ平行移動させることで得ることができる。蛍光の放射は、対物レンズ２９によって集光され、ビーム・スプリッタ２８に投射され、そして、フィルタ３３および第２スリット・マスク３４を通してレンズ３２により結像される。これは、無限遠補正対物レンズ２９を備える共焦点結像系に適切なものである。ビーム・スプリッタ２８およびフィルタ３３は、照射する波長の光を選択的に遮断する。検出器３５は、ＣＣＤアレイを用いることができる。この検出器は、一次元的であっても二次元的であってもよい。一次元的検出器を用いるならば、スリット・マスク３４は不要である。これら、照射、検出、および平行移動は、規定された領域を撮像するまで継続される。間断のない速さで平行移動を行うならば、マイクロタイターの機械的な動作は、単純化される。カメラの読み出し時間が、露光時間に較べて短い場合、途切れることのない運動はとても有用である。好適な実施形態では、カメラは、連続的に読み出される。露光時間と読み出し時間とをすべて含めた時間の間のサンプルの変位ｄは、照射線の幅Ｗよりも大きくとも小さくともよい。例えば、Ｗは、０．５Ｗ≦ｄ≦５Ｗである。マルチ・ウェル・プレートのウェルは全て、同様にして撮像可能である。しかし、非共焦点顕微鏡も使用可能であることを付け加えておく。これは、例えば、ＧＥヘルスケア社のＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００システムにも組み込まれている。また、このシステムは、米国特許第６，５６３，６５３号および第６，３４５，１１５号明細書に開示されている。画像を取得するために利用可能な蛍光顕微鏡に関するその他の実施形態は、国際特許出願ＷＯ００２３５４７４号に開示されている。
【００３０】
図３は、分析システムの、データ処理に関わる構成要素を示す略図である。本システムは、細胞分析システム４０を有する。システム４０は、ＧＥヘルスケアのＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒシステムを基とするものである。細胞分析システム４０は、検出器Ｄ１を備える。この検出器Ｄ１は、図２に示した顕微鏡の検出器３５でよい。また、細胞分析システム４０は、制御部４１、画像データ記憶部４２、および入出力（Ｉ／Ｏ）デバイス３３を備える。
【００３１】
接続されたコンピュータ端末４４は、中央処理装置（ＣＰＵ）４５、メモリ４６、ハード・ディスク・ドライブ４７のようなデータ記憶デバイス、ならびに、コンピュータと細胞分析システム４０との相互接続性、および、スクリーンＩ／Ｏデバイス５１を介したスクリーン５０の表示部４９とコンピュータとの相互接続性をそれぞれ実現するためのＩ／Ｏデバイス４８を備える。マイクロソフト・ウィンドウズ２０００（トレードマーク）またはウィンドウズＸＰ（トレードマーク）といったオペレーティング・システム・プログラム６０は、ハード・ディスク・ドライブ４７に記憶され、周知の方法でコンピュータ端末４４の下位レベルの演算処理を制御する。また、プログラム・ファイルおよびデータ６１もハード・ディスク・ドライブ４７に記憶され、それらファイルおよびデータは、周知の方法で関連するデバイスを介した操作者への出力を制御し、かつ、ハード・ディスク・ドライブに記憶されているデータを出力する。この、関連するデバイスには、スクリーン５０の要素である表示部４９、（図示しない）ポインティング・デバイス、および（図示しない）キーボードが含まれる。これらは、（図示しない）別のＩ／Ｏデバイスを介し、操作者からの入力を受け取ったり、操作者へ情報を出力したりする。ハード・ディスク・ドライブ４７に記憶されるプログラム・ファイル６１には、画像処理分析アプリケーション６２、アッセイ制御アプリケーション６３、および、細胞分析システム４０から受け取った画像データを記憶するためのデータベース６４、ならびに、データ処理で生成される出力ファイルが含まれる。画像処理分析アプリケーション５２は、画像を処理したり分析したりするためのソフトウェア・パッケージを含む。本発明の実施形態による方法は、画像処理分析アプリケーション６２の内部ソフトウェアとして実装することができる。
【００３２】
細胞分析システム４０を用いたスキャン工程は、制御アプリケーション６３によって制御され、画像データが生成される。本発明の実施形態では、制御アプリケーションは、図２に示した顕微鏡のオート・フォーカス・システムと協働的に動作する。検出器Ｄ１が、マイクロタイター・プレートの少なくとも１つのウェルに関し画像のデータを取得した後、画像データはコンピュータ４４に送られ、コンピュータ端末のハード・ディスク・ドライブ４７のデータベース６４に記憶される。この時点において、画像データを、画像処理分析アプリケーション６２で処理可能となる。
【００３３】
図４は、第１の好適な実施形態による、生物標本に関する入力画像を処理する方法の流れ図である。先ず、核の標識に用いたフルオロフォアと関係しているチャネルで得た画像を処理する。本方法の第１のステップ７０において、核を分ける（セグメンテーションする）。セグメンテーションは、スレッショルディングによることができる。画像内における対象物の強度（輝度）は、対象物のＤＮＡ含有量の指標である。輝度の閾は、分析システムの操作者によって、核が明瞭に現われる値に設定される。対象物の輝度が閾輝度より強く、かつ、サイズが操作者の設定した最小閾サイズよりも大きくかつ最大閾サイズよりも小さい場合、その対象物は、核であると標識される。最小閾サイズは通常、核の平均的サイズの３分の１に設定される。そうすることで小核を核と誤識別することを防止する。図５は、２物体８０および８１が核と識別された生体サンプルの略図である。
【００３４】
本処理にかかる第２のステップ７２において、画像に現われた細胞を分類する。小核アッセイでは通常、単核性細胞と二核性細胞とを区別する。単核性の対象物は、二核性の対象物より高い形状因子を有する。閾形状因子は、分析システムの操作者によって設定される。操作者は、形状因子対輝度に関するプロットを用いて閾を最適値に設定することもできる。この形状因子は、対象物の最短径の最長径に対する比である。閾値よりも大きな形状因子を示す核は、単核性と標識され、閾値よりも小さな形状因子を示す核は、二核性と標識される。細胞は生きていなければならない、といった特定の要件を満たさない核は、単核性または二核性の物体であると標識しなくてもよく、また、以降の処理では除外しても構わない。図５の核８０は、単核性に分類され、核８１は二核性に分類される。
【００３５】
本処理の第３のステップ７３は、任意的なステップである。本ステップでは、核を囲んでいる細胞質の広がる範囲を明らかにする。細胞質の広がる範囲は、細胞質のマーカと関係のあるチャネルの画像より決定される。細胞質の領域は、操作者が設定した閾値を用いて画像をスレッショルディングして決定すればよい。この閾値は、目視による検定で定める。この目視検定で、付与される細胞質の縁部を、目視による細胞質に近似させる。
【００３６】
第４のステップでは、標識された核８０、８１の各々の周りに捜索領域を定める。捜索領域は、内側境界および外側境界を備えた第１領域と等しい。内側境界は、核の縁部８４、８５とすることができる。または、内側境界を、数ピクセル分だけ縁部を拡大させることによって、核の縁部から周囲の細胞質へ広げてもよい。この、拡大は、核のサイズに較べれば小さなものである。拡大が１ないし３ピクセルであるのに対し、核は、最大径で１０ないし３０ピクセル有する。ピクセル数で測る核の大きさは、細胞のタイプおよび分析システムに依存するものである。例えば、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  ３０００システムでのチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ  ｃｅｌｌｓ）では、核は、最大径でおよそ１０ないし１５ピクセルであり、二核性細胞で見られるような二倍の核は、２０ないし３０ピクセルである。前もって浸食を用い、核の領域を定めるのであれば、先述の拡大は、もっと大きな値にとって、確実に捜索領域が細胞質内にあるようにする必要がある。この、広げられた内側境界は、図５では要素８６、８７として図示されている。
【００３７】
外側境界と核の縁部との距離が操作者設定捜索距離ｄｓと等しくなるように、外側境界を定める必要がある。この捜索距離は、画像における細胞質の最大距離によって制限される。図５に示す核８０、８１は、それぞれ、細胞質８８、８９に囲まれている。細胞質８９の最大の広がりは、線ｄ１で示している。画像の関心領域内に存在する標識された核の線ｄ１の最大の長さを、最大距離と称する。捜索距離は、最大距離の値よりも小さくなければならない。捜索距離は、細胞質内にある多くの小核を見落としかねないような小さなものであってはならず、また、細胞質外の物体に注釈付けするような大きなものであってはならない。多くのサンプルにとっては、捜索距離は、核の平均径の半分の値とすることが標準的な設定である。換言すれば、外側境界の径は、核の径の２倍に等しい。実際面では、外側境界を、内側境界または核の縁部を拡大することにより設定する。多くの実際の事例においては、捜索距離は、１１ピクセルに等しい。この設定は、第１設定として用いられ、もって、捜索距離を最適化することができる。捜索距離の値は、様々な方法で定めることができる。例えば、データベースを参照して引用してもよいし、または、捜索領域と細胞質とオーバーレイさせて定めてもよい。
【００３８】
捜索領域を、任意的に、細胞質とオーバーレイしている第２領域に制限してもよい。細胞質のビット・マップを、捜索領域を含む画像とオーバーレイすればよい。細胞質の領域から外れた捜索領域の領域９０、９１は、捜索領域から除外される。ビット・マップは、捜索領域の外側境界と、細胞質の広がる範囲との関係の視覚化に用いてもよい。捜索領域を制限する別の方法としては、細胞質に関する強度画像（輝度画像）と、捜索領域を含んだ画像とを、オーバーレイする方法がある。操作者設定マーキング・スレッショルドよりも低い細胞質輝度を示す、第１領域８２、８３の領域を捜索領域から除外し、第２領域を求めてよい。捜索領域は、この第２領域に限られる。
【００３９】
細胞の密度が高く、一の核に対する捜索領域が一以上の近隣の核の領域と重複する場合、捜索領域をさらに限定してもよい。このような重複している領域は、小核と誤識別するおそれがある。核の画像と、捜索領域とをオーバーレイし、重複している領域の全てを捜索領域から除外することができる。
【００４０】
細胞が高密度である画像内領域にある細胞は、小核の捜索から除外してもよい。なぜなら、物体を単核性細胞または二核性細胞と誤識別する危険性が増加するからである。
【００４１】
処理する細胞を任意的に制限する方法には、生育不能細胞または死細胞の除外が含まれる。細胞の生存度は、プロピジウム・イオダイド・マーカと関係した第３チャネルによる画像で定める。操作者設定最小値と、操作者設定最大値との間に含まれる平均強度（平均輝度）を有する細胞は、死んでいると識別し、この範囲に含まれない平均強度（平均輝度）を有する細胞は、生きていると識別する。死細胞は、以後の処理から除外され、生細胞に捜索を限定する。
【００４２】
本処理の第５のステップ７４は、小核を識別する。捜索領域内部にあって、操作者設定閾輝度よりも輝度が高く、操作者設定最小サイズ値と操作者設定最大サイズ値との間に含まれる物体について、小核として注釈付けする。
【００４３】
捜索領域はそれぞれ、特定の一の核に属するので、捜索で発見した小核を核に帰属させることも可能である。これにより、小核の単核性細胞および二核生細胞への属性を与えることが可能である。このことは、被験化合物の毒性分析にとって有利である。
【００４４】
捜索領域が重複する場合、重複した領域内で発見した小核は、細胞質が見つかっている第１核に帰属させることが可能である。この帰属のさせ方は、核の捜索領域をスキャンする方法に依存する。あるスキャン法では、画像を直線的に左から右へ走査し、そして上端から下端へと走査する。
【００４５】
捜索領域の重複に関する問題を解決するための別の方法としては、隣接した核の両縁部から等しい距離にある分界線を両核の間に引くことがある。両核についての捜索領域は、分界線を越えた領域を除外した第１領域または第２領域に制限される。このように捜索領域を定義することで、小核を誤った核に帰属させる危険性が減少する。
【００４６】
図６は、第２の好適な実施形態による生体標本に関する入力画像の処理方法の流れ図である。処理する画像は、ＤＮＡの標識に用いたフルオロフォアに関係したチャネルより得た画像である。第１のステップ１００において、核性の物体を分ける（セグメンテーション）。このセグメンテーションは、スレッショルディングにより行えばよい。分析システムの操作者が、強度（輝度）に対する閾を、核および小核が明瞭に現われる値に設定する。物体が、閾輝度よりも高い輝度を示し、設定された閾サイズよりも大きいサイズを有する場合、その物体を、核性物体と標識する。図７は、４つの核性物体８０、８１、１１０、および１１１を示す。
【００４７】
第２ステップ１０１は、サイズおよび形状因子を用いて物体を分類する。操作者設定閾より大きいサイズの物体を核に分類する。先述の閾よりも小さいサイズの物体は、見込み小核(potential micronucleus)に分類する。先述の閾は、核の平均サイズの３分の１の値にすることができる。核を、その形状に基づいてさらに分類することもできる。操作者は、輝度に対する形状因子のプロットを用いて先述の閾を最適な値に設定してもよい。図７は、２つの核８０、８１を含む。第１の核は単核性であり、第２の核は二核性である。また、図７は、２つの見込み小核１１０、１１１を含む。
【００４８】
図４の第３ステップ７２で説明した方法で、任意的な第３のステップ１０２において、細胞質を分ける（セグメンテーション）。
【００４９】
第４のステップ１０３では、小核と核との間の距離を決定する。距離の決定は、見込み小核の縁部を拡大していって、核と分類される物体と拡大された小核の縁部とが重なるまで拡大させる。距離は、重なったピクセルと、小核の縁部または中心までとする。図７には、見込み小核１１０とその最近の核８１との間の距離ｄ３、および、見込み小核１１１とその最近の核８０との間の距離ｄ４が示される。或いは、見込み小核に対し境界矩形、円、または多角形を適用し、ピクセル単位で拡大し、その境界形状が核と分類された物体と重なるまで境界形状を拡大させて距離を定めてもよい。また、さらに別の変形例では、見込み小核の周りの領域の拡大、およびこの小核に関する最近の核の捜索は、見込み小核の縁部と拡大された領域の縁部との間の距離が捜索距離と等しくなった時に、終了する。
【００５０】
細胞質の広がる範囲を決定した場合、捜索を精緻化することが可能である。細胞質と小核とのオーバーレイにより、図７における見込み小核１１１のような細胞質の外側に位置する見込み小核を除外することができる。この場合、図７における見込み小核１１０のみを、以後の画像処理で扱う。
【００５１】
同様、細胞の密度が高い領域における見込み小核を除外してもよい。なぜなら、誤識別の危険性が高いためである。図４に記載の方法で、死細胞も除外してよい。
【００５２】
第４のステップ１０４において、小核を識別する。見込み小核とそれに最近の核との間の距離が、捜索距離よりも小さい場合、その見込み小核を小核として注釈付けする。距離が捜索距離よりも大きい場合、その見込み小核を小核として注釈付けしない。捜索距離は、図４に示した方法の第４のステップ７３で説明したようにして決定する。小核は、それに最近の核に帰属させることができる。核同士が互いに比較的接近している場合であっても、本方法は、小核を自動的にそれに最近の核に帰属させる。
【００５３】
前記の帰属化は、以下のようにして精緻化してもよい。最近の核と、その次に近い核を見つける。そして、核の細胞質の積分輝度に基づいて核を重み付けし、重み付けした最近の核に帰属させる。細胞質の広がる範囲が大きければ大きい程、小核を含む可能性が高まる。
【００５４】
上述の方法は、セグメンテーション法としてスレッショルディングを行っているが、別のセグメンテーションを、例えばトップ・ハット(top-hat)変換を用いてもよい。同様、第２の実施形態も、小核と核との間の距離を求める方法は、開示した方法に限定されない。
【００５５】
上記実施形態は、本発明の例示と解すべきである。本発明にかかる別の実施形態も構想している。一の実施形態に関する特徴は、それ単独で実施することができ、また、開示した別の特徴と併せて実施することもできる。あるいは、別の実施形態の一以上の特徴と組み合わせて実施してもよいし、別の実施形態と組み合わせて実施してもよい。さらには、本願に記載しない等価なもの、および、変形例も、本発明の範囲から逸脱することなく使用することができる。本発明の範囲は、添付のクレームにより定める。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】細胞分裂で形成される小核を示す図
【図２】サンプルを画像化する蛍光顕微鏡の概略図
【図３】データ処理のための、システムの構成要素の略図
【図４】本発明の第１の好適な実施形態による画像処理方法のフローチャート
【図５】核および捜索領域の略図
【図６】本発明の第２の好適な実施形態による画像処理方法のフローチャート
【図７】細胞核の対象物の略図
【符号の説明】
【００５７】
１  細胞
２  核
３  細胞質
４  分裂中の細胞
５  染色体
６  微小管
７  ＤＮＡ鎖の切断
８  微小管の切断
９  細胞
１０  細胞
１１  核
１２  核
１３  小核
２１  電球
２２  レーザ
２３  レンズ
２４  レンズ
２５  シリンドリカル・レンズ
２６  第１スリット・マスク
２７  第１リレー・レンズ
２８  ビーム・スプリッタ
２９  対物レンズ
３０  マイクロタイター・プレート
３１  サンプル・ウェル
３２  結像レンズ
３３  フィルタ
３４  第２スリット・マスク
３５  検出器
３６  開口部
３７  開口部
３８  照射線
３９  後焦点面
４０  細胞分析システム
４１  制御部
４２  画像データ記憶部
４３  Ｉ／Ｏデバイス
４４  コンピュータ端末
４５  中央処理装置
４６  メモリ
４７  ハード・ディスク・ドライブ
４８  Ｉ／Ｏデバイス
４９  表示部
５０  スクリーン
５１  スクリーンＩ／Ｏデバイス
６０  オペレーティング・システム・プログラム
６１  プログラム・ファイルおよびデータ
６２  画像処理分析アプリケーション
６３  アッセイ制御アプリケーション
６４  データベース
８０  対象物体
８１  対象物体
８２  第１領域
８３  第１領域
８４  縁部
８５  縁部
８６  拡大した内側境界
８７  拡大した内側境界
８８  細胞質
８９  細胞質
９０  細胞質外の捜索領域
９１  細胞質外の捜索領域
１１０  見込み小核
１１１  見込み小核
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【外国語明細書】
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