(57)【要約】【課題】できるだけ早期にかつ簡便に、種子が有する発芽能力を定量的に評価する方法等を提供すること。【解決手段】種子が有する発芽能力の定量的評価方法であって、（１）種子由来の細胞を含む検体における、以下の遺伝子群の中から選ばれる一つ以上の遺伝子の発現レベルを測定する第一工程、及び（２）第一工程で得られた前記検体における遺伝子の発現レベルの測定値と対照との量的な数値比較による差異に基づいて前記検体に含まれる細胞からなる種子が有する発芽能力の存在程度を定量的に評価する第二工程を有することを特徴とする方法。＜遺伝子群＞(a)LsGA3ox1(b)LsGA2ox2(c)LsNCED4(d)LsABA8ox3【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
種子が有する発芽能力の定量的評価方法であって、
（１）種子由来の細胞を含む検体における、以下の遺伝子群の中から選ばれる一つ以上の遺伝子の発現レベルを測定する第一工程、及び
（２）第一工程で得られた前記検体における遺伝子の発現レベルの測定値と対照との量的な数値比較による差異に基づいて前記検体に含まれる細胞からなる種子が有する発芽能力の存在程度を定量的に評価する第二工程
を有することを特徴とする方法。
＜遺伝子群＞
(a)LsGA3ox1
(b)LsGA2ox2
(c)LsNCED4
(d)LsABA8ox3
【請求項２】
種子由来の細胞が、高温に制御された環境条件下に存在してなる細胞であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
遺伝子の発現レベルの測定が、当該遺伝子の転写物量又は翻訳産物量の測定によりなされることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
遺伝子の発現レベルの測定が、当該遺伝子の転写物量の測定によりなされることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
遺伝子の転写物量の測定が、遺伝子の転写物であるmRNA量を、当該遺伝子の塩基配列の中の連続する１５〜２５個の塩基からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー若しくは当該オリゴヌクレオチドプライマーが有する機能を失わない範囲で、当該オリゴヌクレオチドプライマーが有する塩基配列の中の１乃至数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されてなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセットを用いた定量的逆転写ポリメラ−ゼチェイン反応による測定であることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
遺伝子の転写物量の測定が、遺伝子の転写物であるmRNA量を、下記のプライマーセット群の中から選ばれる一つ以上のプライマーセットを用いた定量的逆転写ポリメラ−ゼチェイン反応による測定であることを特徴とする請求項４記載の方法。
＜プライマーセット群＞
（ａ）配列番号５で示されるオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号６で示されるオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセット
（ｂ）配列番号７で示されるオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号８で示されるオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセット
（ｃ）配列番号９で示されるオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号１０で示されるオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセット
（ｄ）配列番号１１で示されるオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号１２で示されるオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセット
【請求項７】
遺伝子の発現レベルの対照が、予め発芽能力の程度が知られる種子由来の細胞を含む検体における当該遺伝子の発現レベルの値であることを特徴とする請求項１又は３記載の方法。
【請求項８】
遺伝子の発現レベルの対照が、休眠中の種子若しくは予め休眠処理してなる種子由来の細胞を含む検体における当該遺伝子の発現レベルの値であることを特徴とする請求項１又は３記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載される方法の第一工程の前工程として、
（Ａ）種子に対して、種子発芽促進剤の候補活性物質又は種子発芽抑制剤の候補活性物質を予め接触させる工程を有し、且つ、第二工程の後工程として、
（Ｂ）第二工程により評価された発芽能力の存在程度に基づき、種子発芽促進剤又は種子発芽抑制剤の活性物質を選択する工程、
を追加的に有することを特徴とする種子発芽促進剤又は種子発芽抑制剤の活性物質を探索する方法。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれかに記載される方法により定量的に評価された、種子が有する発芽能力の存在程度に基づき、発芽能力を有する種子を選抜する工程を有することを特徴とする発芽能力を有する種子の探索方法。
【請求項１１】
発芽能力を定量的に評価するための指標を提供する試薬としての、以下の遺伝子群の中から選ばれる一つ以上の遺伝子又はその一部の使用。
＜遺伝子群＞
(a)LsGA3ox1
(b)LsGA2ox2
(c)LsNCED4
(d)LsABA8ox3
【請求項１２】
下記のプライマーセット群の中から選ばれる一つ以上のプライマーセット。
＜プライマーセット群＞
（ａ）配列番号５で示されるオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号６で示されるオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセット
（ｂ）配列番号７で示されるオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号８で示されるオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセット
（ｃ）配列番号９で示されるオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号１０で示されるオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセット
（ｄ）配列番号１１で示されるオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号１２で示されるオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセット；
【請求項１３】
請求項１２記載のプライマーセットを含有することを特徴とする種子発芽能力の定量的評価用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種子が有する発芽能力の定量的評価方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
LsGA3ox1、LsGA2ox2、LsNCED4及びABA8ox3の各遺伝子は、ジベレリン若しくはアブシジン酸の生合成及び代謝に関わる遺伝子ファミリーに属することが知られている（例えば、非特許文献１、２、３、４参照）。
また、種子が有する発芽能力を検出する方法としては、従来、温度や光という条件を制御した環境条件下で種子を吸水・生育させた後、当該種子の発芽率を測定する検査を実施するという方法が用いられてきた（例えば、非特許文献５、６参照）。そして当該方法により、均一な発芽や苗立ちをする種子を選択していた。
【０００３】
【非特許文献１】Toyomasu, T. et al.,  Plant Physiol., 118: 1517-1523 (1998)
【非特許文献２】Nakaminami， K， et al．， Biosci． Biotechnol． Biochem． 67： 1551−1558 (2003)
【非特許文献３】青木美紀ら、植物の生長調節 38（Supplement）、p.38 (2003)
【非特許文献４】青木美紀ら、植物の生長調節 39（Supplement）、p.46 (2004)
【非特許文献５】International Seed Testing Association, Seed Sci. and Technol. 27, Supplement (1999)
【非特許文献６】中村俊一郎、農林種子学総論、pp19−22
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上記の従来方法では、通常、約１〜２週間程度の期間を要し、迅速な判別ができないという問題点があった。このため、温度や光という条件を制御した種々の環境条件下において種子の発芽率を可能な限り短時間で予測可能とする方法の開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
かかる状況の下、本発明者らは鋭意検討した結果、ある種の遺伝子のｍRNAの発現レベルが、発芽能力を有する種子由来の細胞を含む検体における当該遺伝子の発現レベルの測定値と、休眠中の種子由来の細胞を含む検体における当該遺伝子の発現レベルの測定値とを比較した結果、明らかな数量的差異を生じることを突き止め、当該数量的差異を利用することにより種子が有する発芽能力を定量的に評価することが可能となることを見出し、本発明に至った。
【０００６】
即ち、本発明は、
１．種子が有する発芽能力の定量的評価方法であって、
（１）種子由来の細胞を含む検体における、以下の遺伝子群の中から選ばれる一つ以上の遺伝子の発現レベルを測定する第一工程、及び
（２）第一工程で得られた前記検体における遺伝子の発現レベルの測定値と対照との量的な数値比較による差異に基づいて前記検体に含まれる細胞からなる種子が有する発芽能力の存在程度を定量的に評価する第二工程
を有することを特徴とする方法（以下、本発明評価方法と記すこともある。）；
＜遺伝子群＞
(a)LsGA3ox1
(b)LsGA2ox2
(c)LsNCED4
(d)LsABA8ox3
２．種子由来の細胞が、高温に制御された環境条件下に存在してなる細胞であることを特徴とする前項１記載の方法；
３．遺伝子の発現レベルの測定が、当該遺伝子の転写物量又は翻訳産物量の測定によりなされることを特徴とする前項１記載の方法；
４．遺伝子の発現レベルの測定が、当該遺伝子の転写物量の測定によりなされることを特徴とする前項１記載の方法；
５．遺伝子の転写物量の測定が、遺伝子の転写物であるmRNA量を、当該遺伝子の塩基配列の中の連続する１５〜２５個の塩基からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー若しくは当該オリゴヌクレオチドプライマーが有する機能を失わない範囲で、当該オリゴヌクレオチドプライマーが有する塩基配列の中の１乃至数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されてなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセットを用いた定量的逆転写ポリメラ−ゼチェイン反応による測定であることを特徴とする前項４記載の方法；
６．遺伝子の転写物量の測定が、遺伝子の転写物であるmRNA量を、下記のプライマーセット群の中から選ばれる一つ以上のプライマーセットを用いた定量的逆転写ポリメラ−ゼチェイン反応による測定であることを特徴とする前項４記載の方法；
＜プライマーセット群＞
（ａ）配列番号５（5'-aagctgctagagcaccagac-3'）で示されるオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号６（5'-gataagcgactgacaagcgg-3'）で示されるオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセット
（ｂ）配列番号７（5'-tcaacatgagacagtacgag-3'）で示されるオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号８（5'-aagctttcttcaccaggctc-3'）で示されるオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセット
（ｃ）配列番号９（5'-cggaggatgatctaccgtacag-3'）で示されるオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号１０（5'-cggttcacctccaaaccgtccatt-3'）で示されるオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセット
（ｄ）配列番号１１（5'-ttgttctccgagcattcacc-3'）で示されるオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号１２（5'-caggatctgtgctaattccc-3'）で示されるオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセット
７．遺伝子の発現レベルの対照が、予め発芽能力の程度が知られる種子由来の細胞を含む検体における当該遺伝子の発現レベルの値であることを特徴とする前項１又は３記載の方法；
８．前項１〜８のいずれかに記載される方法の第一工程の前工程として、
（Ａ）種子に対して、種子発芽促進剤の候補活性物質又は種子発芽抑制剤の候補活性物質を予め接触させる工程を有し、且つ、第二工程の後工程として、
（Ｂ）第二工程により評価された発芽能力の存在程度に基づき、種子発芽促進剤又は種子発芽抑制剤の活性物質を選択する工程、
を追加的に有することを特徴とする種子発芽促進剤又は種子発芽抑制剤の活性物質を探索する方法（以下、本発明物質探索方法と記すこともある。）；
９．遺伝子の発現レベルの対照が、休眠中の種子若しくは予め休眠処理してなる種子由来の細胞を含む検体における当該遺伝子の発現レベルの値であることを特徴とする前項１又は３記載の方法；
１０．前項１〜８のいずれかに記載される方法により定量的に評価された、種子が有する発芽能力の存在程度に基づき、発芽能力を有する種子を選抜する工程を有することを特徴とする発芽能力を有する種子の探索方法（以下、本発明種子探索方法と記すこともある。）；
１１．発芽能力を定量的に評価するための指標を提供する試薬としての、以下の遺伝子群の中から選ばれる一つ以上の遺伝子又はその一部の使用（以下、本発明使用と記すこともある。）；
＜遺伝子群＞
(a)LsGA3ox1
(b)LsGA2ox2
(c)LsNCED4
(d)LsABA8ox3
１２．下記のプライマーセット群の中から選ばれる一つ以上のプライマーセット（以下、本発明プライマーセットと記すこともある。）；
＜プライマーセット群＞
（ａ）配列番号５（5'-aagctgctagagcaccagac-3'）で示されるオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号６（5'-gataagcgactgacaagcgg-3'）で示されるオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセット
（ｂ）配列番号７（5'-tcaacatgagacagtacgag-3'）で示されるオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号８（5'-aagctttcttcaccaggctc-3'）で示されるオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセット
（ｃ）配列番号９（5'-cggaggatgatctaccgtacag-3'）で示されるオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号１０（5'-cggttcacctccaaaccgtccatt-3'）で示されるオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセット
（ｄ）配列番号１１（5'-ttgttctccgagcattcacc-3'）で示されるオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号１２（5'-caggatctgtgctaattccc-3'）で示されるオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセット；
１３．前項１２記載のプライマーセットを含有することを特徴とする種子発芽能力の定量的評価用試薬（以下、本発明試薬と記すこともある。）；
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によって、特定の遺伝子の発現レベルを指標とした、種子が有する発芽能力の正確且つ簡便な定量的評価方法等が提供可能となる。当該定量的評価方法を用いれば、種子が有する発芽能力をより短期間で定量的に評価することもでき、例えば、温度や光という条件を制御した種々の環境条件下における種子の発芽能力を可能な限り短時間で予測することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明における種子由来の細胞を含む検体とは、例えば、種子を構成する細胞又はその内容物が含まれる可能性のある生体試料をあげることができる。具体的には例えば、種子から採取された植物組織或いは当該組織から分離された細胞又はその培養細胞等を挙げることができる。これらの試料はそのまま検体として用いてもよく、また、かかる試料から分離、分画、固定化等の種々の操作により調製された試料を検体として用いてもよい。検体を提供する植物としては、例えば、レタス、ゴボウ等のキク科作物、ナス、トマト、台木ナス、トウガラシ等のナス科作物、ネギ、タマネギ、ニラ等のユリ科作物、カンラン、ハクサイ、ダイコン等のアブラナ科作物、ニンジン、セロリ、パセリ等のセリ科作物、ホウレンソウ等のアカザ科作物、キュウリ、メロン等のウリ科作物、スイートコーン等のイネ科作物等の野菜種子、ユーストマ、パンジー、ベゴニア等の花種子、ギニアグラス、ローズグラス等の牧草種子、イネ、オオムギ、トウモロコシ等の穀物種子、ユーカリ等の樹木種子、ダイズ、エンドウ等の豆科作物、ヒマワリ等のキク科作物、ソバ等のタデ科作物、食用ヒエ等のイネ科作物の食用および工芸作物等の植物を挙げることができる。好ましくは野菜種子等が挙げられ、より好ましくはLactuca属の種子等を挙げることができる。
尚、本発明における検体に含まれる種子由来の細胞は、如何なる種子由来の細胞であってもよいが、好ましく適するものとしては、温度や光という条件を制御した種々の環境条件下存在してなる種子由来の細胞、より好ましく適するものとしては、温度条件が制御された環境条件下に存在してなる種子由来の細胞、特に好ましく適するものとしては、高温（例えば、３０℃以上）に制御された環境条件下に存在してなる細胞等を挙げることができる。
【０００９】
本発明において発現レベルが測定される遺伝子は、以下の遺伝子群の中から選ばれる一つ以上の遺伝子（以下、本遺伝子と記すこともある。）である。
【００１０】
＜遺伝子群＞
(a)LsGA3ox1（Genbankに登録されている塩基配列の登録番号AB012205／尚、本願では当該遺伝子の塩基配列を配列番号１に示した。）
(b)LsGA2ox2（Genbankに登録されている塩基配列の登録番号AB031207／尚、本願では当該遺伝子の塩基配列を配列番号２に示した。）
(c)LsNCED4（Genbankに登録されている塩基配列の登録番号AB120110／尚、本願では当該遺伝子の塩基配列を配列番号３に示した。）
(d)LsABA8ox3（Genbankに登録されている塩基配列の登録番号AB235919／尚、本願では当該遺伝子の塩基配列を配列番号４に示した。）
【００１１】
本遺伝子の塩基配列に関する情報は、例えば、National Center for Biotechnology Information のWEBペ−ジ（URL；http://www.ncbi.nlm.nih.gov）から、Genbankによって各遺伝子に付与されている上記の登録番号 (Accession No.)をもとに検索を行うことによって入手することができる。因みに、GenBnak、DDBL及びEMBLの各デ−タバンクが公開しているデ−タ全てを誰でも制限なしで利用でき、INSDに登録されたデ−タは科学資料として永久に保存され公開されることは、上記３デ−タバンクで構成される国際塩基配列デ−タベ−ス（international Nucleotide Sequence Databases, INSD）の諮問機関である国際諮問委員会により作成された「DDBL/EMBL/GenBnakの登録デ−タの取り扱い」（2002年5月23−24日）で明文化されており、如何なる当業者であっても登録番号 (Accession No.)に基づきデ−タの照合、検索、入手等は可能である。
本発明において利用される本遺伝子には、上記の公知の塩基配列と全く同一の塩基配列を有する遺伝子のほか、前記の遺伝子の塩基配列に、生物の種差、個体差等により天然に生じる変異による塩基の欠失、置換若しくは付加が生じた塩基配列を有する遺伝子も含まれる。
【００１２】
本遺伝子の発現レベルの測定は、例えば、単位量の検体当たりの本遺伝子の転写物量を測定する方法、単位量の検体当たりの本遺伝子の翻訳産物量を測定する方法等により行うことができる。
本遺伝子の転写物量を測定するには、例えば、当該遺伝子の転写物であるmRNA量を測定する。特定の遺伝子のmRNA量の測定は、具体的には、例えば、定量的逆転写ポリメラ−ゼチェイン反応（以下、定量的RT−PCRと記す。）、ノ−ザンハイブリダイゼ−ション法［J.Sambrook, E.F.Frisch,T.Maniatis著；モレキュラ−・クロ−ニング第２版（Molecular Cloning 2nd edition）、コ−ルドスプリング・ハ−バ−・ラボラトリ−（Cold Spring Harbor Laboratory）発行、1989年］、DNAアレイ法等により実施することができる。
また、本遺伝子の翻訳産物量を測定するには、例えば、本遺伝子の塩基配列にコ−ドされるアミノ酸配列を有する蛋白質の量を測定する。特定の蛋白質の量の測定は、具体的には、例えば、当該蛋白質に対する特異抗体を用いた免疫学的測定法（例えば、ELISA、ウェスタンブロット、RIA、免疫組織化学的検査等）、二次元電気泳動法、高速液体クロマトグラフィ−等により実施することができる。本遺伝子の塩基配列にコ−ドされるアミノ酸配列を有する蛋白質に対する特異抗体は、常法に準じて、本遺伝子の塩基配列にコ−ドされるアミノ酸配列を有する蛋白質を免疫抗原として調製することができる。
【００１３】
本遺伝子の転写物量の測定方法についてさらに説明する。
本遺伝子の転写物であるmRNA量は、例えば、本遺伝子の塩基配列に基づいて設計、調製されたプロ−ブ又はプライマ−を使用して、通常の遺伝子工学的方法、例えば、ノ−ザンハイブリダイゼ−ション法、定量的RT−PCR、DNAアレイ法等を用いることによって測定することができる。具体的には、例えば、J.Sambrook, E.F.Frisch,T.Maniatis著；モレキュラ−・クロ−ニング第２版（Molecular Cloning 2nd edition）、コ−ルドスプリング・ハ−バ−・ラボラトリ−（Cold Spring Harbor Laboratory）発行、1989年等に記載された方法に準じて行うことができる。この際、組織における発現レベルが恒常的に一定であることが知られている遺伝子（以下、対照遺伝子と記す。）、例えば、β−actin遺伝子（Nucl.Acids.Res., vol.12,No.3, p.1687,1984）や36B4（Acidic Ribosomal Phosphoprotein）（Nucl.Acids.Res., vol.19,No.14, p.3998,1991）遺伝子等のmRNA量を同時に測定しても良い。そして、対照遺伝子のmRNA量若しくはその指標値当たりの本遺伝子のmRNA量又はその指標値を算出することにより、本遺伝子の発現レベルを求めてもよい。
【００１４】
本遺伝子の転写物量の測定方法において、遺伝子の転写物量の測定としては、遺伝子の転写物であるmRNA量を、当該遺伝子の塩基配列の中の連続する１５〜２５個の塩基からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー若しくは当該オリゴヌクレオチドプライマーが有する機能を失わない範囲で、当該オリゴヌクレオチドプライマーが有する塩基配列の中の１乃至数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されてなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセットを用いた定量的逆転写ポリメラ−ゼチェイン反応による測定等を挙げることができる。
【００１５】
本遺伝子の一つの遺伝子である「LsGA3ox1」は、ジベレリンの生合成に関わる遺伝子ファミリーに属する遺伝子である。上記の本発明評価方法において、当該遺伝子の発現レベルの測定に用いられるプライマーセットとしては、具体的には例えば、配列番号１で示される塩基配列の中の連続する１５〜２５個の塩基からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー若しくは当該オリゴヌクレオチドプライマーが有する機能を失わない範囲で、当該オリゴヌクレオチドプライマーが有する塩基配列の中の１乃至数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されてなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー等を挙げることができる。より具体的には例えば、当該プライマーセットとしては、配列番号５（5'-aagctgctagagcaccagac-3'）で示されるオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号６（5'-gataagcgactgacaagcgg-3'）で示されるオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセット等が挙げられる。
【００１６】
本遺伝子の一つの遺伝子である「LsGA2ox2」は、ジベレリンの代謝に関わる遺伝子ファミリーに属する遺伝子である。上記の本発明評価方法において、当該遺伝子の発現レベルの測定に用いられるプライマーセットとしては、具体的には例えば、配列番号２で示される塩基配列の中の連続する１５〜２５個の塩基からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー若しくは当該オリゴヌクレオチドプライマーが有する機能を失わない範囲で、当該オリゴヌクレオチドプライマーが有する塩基配列の中の１乃至数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されてなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー等を挙げることができる。より具体的には例えば、当該プライマーセットとしては、配列番号７（5'-tcaacatgagacagtacgag-3'）で示されるオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号８（5'-aagctttcttcaccaggctc-3'）で示されるオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセット等が挙げられる。
【００１７】
本遺伝子の一つの遺伝子である「LsNCED4」は、アブシジン酸の生合成に関わる遺伝子ファミリーに属する遺伝子である。上記の本発明評価方法において、当該遺伝子の発現レベルの測定に用いられるプライマーセットとしては、具体的には例えば、配列番号３で示される塩基配列の中の連続する１５〜２５個の塩基からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー若しくは当該オリゴヌクレオチドプライマーが有する機能を失わない範囲で、当該オリゴヌクレオチドプライマーが有する塩基配列の中の１乃至数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されてなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー等を挙げることができる。より具体的には例えば、当該プライマーセットとしては、配列番号９（5'-cggaggatgatctaccgtacag-3'）で示されるオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号１０（5'-cggttcacctccaaaccgtccatt-3'）で示されるオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセット等が挙げられる。
【００１８】
本遺伝子の一つの遺伝子である「LsABA8ox3」は、アブシジン酸の代謝に関わる遺伝子ファミリーに属する遺伝子である。上記の本発明評価方法において、当該遺伝子の発現レベルの測定に用いられるプライマーセットとしては、具体的には例えば、配列番号４で示される塩基配列の中の連続する１５〜２５個の塩基からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー若しくは当該オリゴヌクレオチドプライマーが有する機能を失わない範囲で、当該オリゴヌクレオチドプライマーが有する塩基配列の中の１乃至数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されてなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー等を挙げることができる。より具体的には例えば、当該プライマーセットとしては、
（ｄ）配列番号１１（5'-ttgttctccgagcattcacc-3'）で示されるオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号１２（5'-caggatctgtgctaattccc-3'）で示されるオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセット等が挙げられる。
【００１９】
次に、本遺伝子の転写物であるmRNA量を測定するための前記の各種方法について説明する。
（１．ノ−ザンハイブリダイゼ−ション法）
まず、mRNA量を測定しようとする遺伝子のDNAを調製し、次いで、その全部又は一部からなるDNAを標識してプロ−ブを調製する。
上記遺伝子は、以下に示した方法により調製したｃDNAを鋳型にしてPCR等によって調製することができる。例えば、まず当該遺伝子を発現する種子又は種子由来の細胞から、塩酸グアニジン／フェノ−ル法、SDS−フェノ−ル法、グアニジンチオシアネ−ト／CsCl法等の通常の方法によって全RNAを抽出する。例えばISOGEN（ニッポンジ−ン製）等の市販のキットを利用して全RNAを抽出してもよい。
抽出された全RNAから、例えば、以下のようにしてmRNAを調製する。まず、オリゴdTをリガンドとして有するポリAカラムを5倍カラム容量以上のLoading buffer［20mMトリス塩酸緩衝液（pH7.6）、0.5M NaCl、1mM EDTA、0.1％(w/v)SDS］を用いて、平衡化し、続いて前述の方法で調製された全RNAをカラムにかけ、10倍カラム容量のloading bufferで洗浄する。さらに5倍カラム容量のWashing buffer［20mMトリス塩酸緩衝液（pH7.6）、0.1M NaCl、1mM EDTA、0.1％(w/v)SDS］で洗浄する。続いて、3倍カラム容量のelution buffer［10mMトリス塩酸緩衝液（pH7.6）、1mM EDTA、0.05％(w/v)SDS）でmRNAを溶出させることによってmRNAを得る。
次いで、オリゴdTプライマ−を前記全RNA又はmRNAのポリＡ鎖にアニ−ルさせ、例えばcDNA合成キット（宝酒造）のプロトコ−ルに従って、一本鎖cDNAを合成する。この時、鋳型とするRNAは、全RNA又はmRNAのどちらでも良いが、mRNAを用いる方がより好ましい。
前記一本鎖cDNAを鋳型にして、TaKaRa taq（宝酒造）等のDNA polymeraseを用いてPCRすることにより、DNAを増幅する。PCRの条件は、測定対象とする動物の種類、使用するプライマ−の配列等により異なるが、例えば、反応緩衝液［10mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、50mM KCl，1.5mM MgCl2］中、2.5mM NTP存在下で、94℃，30秒間次いで40℃〜60℃，2分間さらに72℃，2分間の保温を1サイクルとしてこれを30〜55サイクル行う条件等を挙げることができる。
【００２０】
このようにして増幅された本遺伝子のDNAはpUC118等のベクタ−に挿入してクロ−ニングしておいてもよい。当該DNAの塩基配列は、Maxam Gilbert法 (例えば、Maxam,A.M&W.Gilbert, Proc.Natl.Acad.Sci.,74,560,1977 等に記載される)やSanger法（例えばSanger,F.&A.R.Coulson,J.Mol.Biol.,94,441,1975 、Sanger,F,& Nicklen and A.R.Coulson., Proc.Natl.Acad.Sci.,74,5463,1977等に記載される）等により確認することができる。
【００２１】
このようにして調製された本遺伝子のDNAの全部又はその一部を、次のようにして放射性同位元素や蛍光色素等で標識することによりプロ−ブを調製することができる。例えば、上記のようにして調製されたDNAを鋳型とし、当該DNAの塩基配列の部分配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマ−に用いて、[α−32P]dCTP又は[α−32P]dATPを含むdNTPを反応液に添加してPCRを行うことにより32Pで標識されたプロ−ブが得られる。また、上記のようにして調製されたDNAを、例えば、Random prime labeling Kit（ベ−リンガ−マンハイム社）、MEGALABEL（宝酒造）等の市販の標識キットを用いて標識してもよい。
【００２２】
次に、上記プロ−ブを使用して、ノ−ザンハイブリダイゼ−ション分析を行う。具体的には、本遺伝子の発現レベルを測定しようとする種子又は種子由来の細胞から全RNA又はmRNAを調製する。調製された全RNA 20μg又はｍRNA 2μgをアガロ−スゲルで分離し、10×SSC（1.5Ｍ NaCl、0.35Ｍクエン酸ナトリウム）で洗浄した後、ナイロンメンブラン［例えば、Hybond−N（アマシャム製）等］に移す。ポリエチレン袋にメンブランを入れ、ハイブリダイゼ−ションバッファ−〔6×SSC（0.9Ｍ NaCl、0.21Mクエン酸ナトリウム）、5×デンハルト溶液［0.1％(w/v)フィコ−ル400、0.1％(w/v)ポリビニルピロリドン、0.1％BSA］、0.1％(w/v)SDS，100μg/ml変性サケ精子DNA、50％ホルムアミド〕25mlを加えて、50℃、2時間インキュベ−トした後、ハイブリダイゼ−ションバッファ−を捨て、新たに2ml〜6mlのハイブリダイゼ−ションバッファ−を加える。更に上記方法で得られたプロ−ブを加え、50℃、一晩インキュベ−トする。ハイブリダイゼ−ションバッファ−としては、上記のほかに、市販のDIG EASY Hyb(ベ−リンガ−マンハイム社)等を用いることができる。メンブランを取り出して、50〜100mlの2×SSC、0.1％ SDS中で室温、15分間インキュベ−トし、さらに同じ操作を１回繰り返し行い、最後に50〜100mlの0.1×SSC、0.1％ SDS中で68℃、30分間インキュベ−トする。メンブラン上の標識量を測定することにより、本遺伝子の転写産物であるmRNAの量を測定することができる。
【００２３】
（２．定量的RT−PCR）
本遺伝子の発現レベルを測定しようとする種子又は種子由来の細胞から上記（１  ノ−ザンハイブリダイゼ−ション法）に記載された方法と同様の方法でmRNAを調製する。調製されたmRNAに例えばMMLV（東洋紡）等の逆転写酵素を添加し、反応緩衝液［50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、3mM MgCl2、75mM KCl、10mM DTT］中、0.5mM dNTP及び25μg/mlオリゴdT存在下で42℃、15分間〜1時間反応させ、対応するcDNAを調製する。cDNA合成キット（宝酒造）を用いて対応するcDNAを調製しても良い。調製されたcDNAを鋳型にして、本遺伝子の塩基配列の一部分を有するDNAをプライマ−としてPCRを行う。プライマ−としては、例えば、登録番号M33648でGenbankに登録されている塩基配列を有する本遺伝子の部分塩基配列を有するプライマ−を挙げることができる。PCRの条件としては、例えば、例えば、TAKARA taq（宝酒造）を使用し、反応緩衝液［10mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、50mM KCl，1.5mM MgCl2］中、2.5mM dNTP及び［α32P］−dCTP存在下で、例えば、94℃，30秒間次いで40℃〜60℃，2分間さらに72℃，2分間の保温を1サイクルとしてこれを30〜55サイクル行う条件を挙げることができる。増幅されたDNAをポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離されたDNAの放射活性量を測定することにより、本遺伝子のmRNAの量を測定することができる。或いはまた、例えば、TAKARA taq（宝酒造）を使用し、反応緩衝液［10mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、50mM KCl，1.5mM MgCl2］中、SYBR Green PCR ReagentsPCR(ABI社) 25μlを含む50μlの反応液を調製し、ABI7700(ABI社)を用いて、50℃，2分間次いで95℃，10分間の保温の後、95℃，15秒間次いで60℃，１分間の保温を１サイクルとしてこれを40サイクル実施する条件でPCRを行う。増幅されたDNAの蛍光を測定することにより、本遺伝子のmRNAの量を測定することができる。
【００２４】
（３．DNAアレイ解析）
本発明の転写物量の測定には、ナイロンメンブラン等のメンブランフィルタ−等に本遺伝子のcDNAをスポットして作製されるマクロアレイ、スライドガラス等に本遺伝子のcDNAをスポットして作製されるマイクロアレイ、スライドガラス上に本遺伝子の塩基配列の部分配列を有するオリゴヌクレオチド（通常18〜25merの鎖長）を光化学反応を利用して固定して作製されるプロ−ブアレイ等、公知の技術に基づいたDNAアレイを利用することができる。これらのアレイの作製は、例えばゲノム機能研究プロトコ−ル  実験医学別冊（羊土社刊）等に記載された方法に準じて行うことができる。またAffymetrix社等から市販されているGenechip等を利用することもできる。
【００２５】
以下、DNAアレイを用いて本遺伝子の転写物量を測定する方法の一例を示す。
（３−１．マクロアレイによる定量）
本遺伝子の発現レベルを測定しようとする種子又は種子由来の細胞から上記（１  ノ−ザンハイブリダイゼ−ション法）に記載された方法と同様の方法でmRNAを調製する。調製されたmRNAに、例えばMMLV（東洋紡社）等の逆転写酵素を添加し、反応緩衝液［例えば50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、3mM MgCl2、75mM KCl、及び10mM DTTを含む液］中、0.5mMdNTP、［α32P］−dCTP、及び25μg/mlオリゴdT存在下で42℃、15分間〜１時間反応させて、標識DNAを調製し、これをプロ−ブとする。このとき、cDNA合成キット（宝酒造）等を用いても良い。メンブランフィルタ−に本遺伝子のcDNAをスポットして作製されたマクロアレイをポリエチレン袋に入れ、ハイブリダイゼ−ションバッファ−〔6×SSC（0.9Ｍ NaCl、0.21Mクエン酸ナトリウム）、5×デンハルト溶液［0.1％(w/v)フィコ−ル400、0.1％(w/v)ポリビニルピロリドン、0.1％ BSA］、0.1％(w/v) SDS，100μg/ml変性サケ精子DNA、50％ホルムアミド〕25mlを加えて、50℃、2時間インキュベ−トした後、ハイブリダイゼ−ションバッファ−を除去し、新たに2ml〜6mlのハイブリダイゼ−ションバッファ−を添加する。更に上記プロ−ブを加え、50℃、一晩インキュベ−トする。ハイブリダイゼ−ションバッファ−としては、上記のほかに、市販のDIG EASY Hyb(ベ−リンガ−マンハイム社)等を用いることもできる。マクロアレイを取り出して、50ml〜100mlの2×SSC、0.1％ SDSに浸し室温にて15分間程度インキュベ−トした後、さらに同じ操作を1回繰り返し行い、最後に50ml〜100mlの0.1×SSC、0.1％ SDS中で68℃、30分間インキュベ−トする。マクロアレイ上の標識量を測定することにより、本遺伝子の転写物であるmRNAの量、即ち、本遺伝子の発現量を測定することができる。
【００２６】
（３−２．マイクロアレイによる定量）
本遺伝子の発現レベルを測定しようとする種子又は種子由来の細胞から上記（１  ノ−ザンハイブリダイゼ−ション法）に記載された方法と同様の方法でmRNAを調製する。調製されたmRNAに、例えばMMLV（東洋紡社）等の逆転写酵素を添加し、反応緩衝液［例えば、50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、3mM MgCl2、75mM KCl、及び10mM DTTを含む液］中、0.5mM dNTP、Cy3−dUTP、（又はCy5−dUTP）及び25μg/mlオリゴdT存在下で42℃、15分間〜１時間反応させる。アルカリバッファ−（例えば、１N NaOH、20mM EDTAを含む液）を加え、65℃10分間保温した後、MicroconYM−30等を用いて遊離のCy3又はCy5を除くことにより蛍光標識DNAを調製し、これをプロ−ブとする。得られたプロ−ブを用いてマイクロアレイに対して（３−１  DNAマクロアレイによる定量）に記載された方法と同様にしてハイブリダイゼ−ションを行う。アレイ上のシグナル量をスキャナ−により測定することによって、本遺伝子の転写物であるmRNAの量、即ち、本遺伝子の発現量を測定することができる。
【００２７】
（３−３．プロ−ブアレイによる定量）
本遺伝子の発現レベルを測定しようとする種子又は種子由来の細胞から上記（１  ノ−ザンハイブリダイゼ−ション法）に記載された方法と同様の方法でmRNAを調製する。調製されたmRNAに、例えば、cDNA合成キット（GENSET社）等を用いてcDNAを調製する。調製されたcDNAを、例えば、ビオチンラベル化cRNA合成キット（In Vitro Transcription社）（Enzo社）等によりビオチン標識し、cRNA cleanup and quantitation キット（In Vitro Transcription社）により精製する。生成されたビオチン標識DNAをFragmentation バッファ−（200mMトリス酢酸（pH8.1）、500mM KOAc、150mM MgOAc）により断片化する。これに内部標準物質Contol Oligo B2 （Amersham社製）、100×Control cRNA Cocktail、Herring sperm DNA （Promega社製）、Acetylated BSA（Gibco−BRL社製）、2×MES Hybridization Buffer〔200mM MES、2M [Na＋], 40mM EDTA、0.02% Tween20 (Pierce社製)、pH6.5〜6.7〕及びDEPC処理滅菌蒸留水を加え、ハイブリカクテルを作製する。
1×MESハイブリダイゼ−ションバッファ−で満たしたプロ−ブアレイ［例えば、Genechip（Affymetrix社製）等］を、ハイブリオ−ブン内で、45℃、60rpm、10分間回転させた後、1×MESハイブリダイゼ−ションバッファ−を除去する。その後、該プロ−ブアレイに上記のハイブリカクテル200μlを添加し、ハイブリオ−ブン内で45℃、60rpm、16時間回転させる（ハイブリダイゼ−ション）。続いてハイブリカクテルを除去し、Non−Stringent Wash Buffer〔6×SSPE［20×SSPE(ナカライテスク社製)を希釈］、0.01％ Tween20、及び0.005％ Antifoam0−30(Sigma社)を含む〕で満たした後、GeneChip Fluidics Station 400(Affymetrix社製)の所定の位置に上記プロ−ブアレイを装着し、プロトコ−ルに従って洗浄する。次いで、MicroArray Suite(Affymetrix社)の染色プロトコ−ルEuKGE−WS2に従って該プロ−ブアレイを染色する。HP GeneArray Scanner(Affymetrix社製)により570nmの蛍光輝度を測定することにより、本遺伝子の転写物であるmRNAの量、即ち、本遺伝子の発現量を測定することができる。
【００２８】
本発明評価方法においては、本遺伝子の検体における発現レベルを、上述のようにして測定する。
【００２９】
本遺伝子の発現レベルの測定は、上述のようにして、単位量の検体当たりの本遺伝子の転写物量を測定する方法、単位量の検体当たりの本遺伝子の翻訳産物量を測定する方法等により行うことができ、本遺伝子の転写物量又は翻訳産物量を測定する方法を好ましく挙げることができる。
【００３０】
上記のようにして得られた前記検体における本遺伝子の発現レベルの測定値と対照（即ち、当該遺伝子の発現レベルの対照値）との量的な数値比較による差異に基づいて前記検体における種子が有する発芽能力の存在程度を定量的に評価する。
ここで「対照」とは、上記の測定された値の技術的意味を理解するに際して基準となり得るような値であって、実測値であってもよく、文献記載の値であってもよい。さらにまた、陽性対照であっても陰性対照であってもよい。陽性対照の代表的な例としては、予め発芽能力の程度が知られる種子由来の細胞を含む検体における当該遺伝子の発現レベルの値等を挙げることができる。一方、陰性対照としては、休眠中の種子若しくは予め休眠処理してなる種子由来の細胞を含む検体における当該遺伝子の発現レベルの値等を挙げることができる。
これらの対照と前記の測定値とを量的に数値比較して、当該対照が陰性対照である場合において差異が存在する場合には発芽能力の存在程度が前記差異の大きさに基づいたものであるとその量的関係を明らかにできる（本発明では、発芽率を定量的に評価する場合も含む。）。一方、当該差異が存在しない場合には発芽能力の存在程度が同等なものであると順位・段階付けを明らかにできる（本発明では、発芽率を定量的に評価する場合も含む。）。また、当該対照が陽性対照である場合において差異が存在しない場合には発芽能力の存在程度が同等なものであると順位・段階付けを明らかにできる。
このようにして、本発明評価方法では、種子が有する発芽能力の定量的評価を行なえばよい。
【００３１】
より具体的には例えば、対照種子が発芽能力を有する場合において、当該対照種子由来の細胞を含む検体における本遺伝子の発現レベルの値を対照値として、被験種子由来の細胞を含む検体における、発芽率とその遺伝子の発現レベルとが正の相関関係を有するような遺伝子の発現レベルの測定値が当該対照値よりも量的な数値比較において増加すれば若しくは量的な数値比較による差異が存在すれば、被験種子は当該対照種子よりも当該増量若しくは差異の大きさに基づいた高い発芽能力があると定量的評価ができる。
また、対照種子が発芽能力を有する場合において、当該対照種子由来の細胞を含む検体における本遺伝子の発現レベルの値を対照値として、被験種子由来の細胞を含む検体における、発芽率とその遺伝子の発現レベルとが負の相関関係を有するような遺伝子の発現レベルの測定値が当該対照値よりも量的な数値比較において減少すれば若しくは差異の大きさに基づいた低い発芽能力があると定量的評価することができる。
【００３２】
本発明は、本発明評価方法の第一工程の前工程として、
（Ａ）種子に対して、種子発芽促進剤の候補活性物質又は種子発芽抑制剤の候補活性物質を予め接触させる工程を有し、且つ、第二工程の後工程として、
（Ｂ）第二工程により評価された発芽能力の存在程度に基づき、種子発芽促進剤又は種子発芽抑制剤の活性物質を選択する工程、
を追加的に有することを特徴とする種子発芽促進剤又は種子発芽抑制剤の活性物質を探索する方法（即ち、本発明物質探索方法）を含む。
【００３３】
本発明探索方法の前工程（Ａ）に関して、種子に対して、種子発芽促進剤の候補活性物質又は種子発芽抑制剤の候補活性物質を予め接触させる方法としては、例えば、当該候補活性物質を含む液状薬物を用いた散布処理、浸漬処理等の薬剤施用により行うことができる。また、当該候補活性物質を含む紛状薬物を用いた散布処理、紛衣処理等の薬剤施用により行うことができる。薬剤施用における施用量、施用回数及び施用期間は、例えば、通常の種子処理分野における薬剤施用に準じて適宜決定すればよい。
【００３４】
より具体的には例えば、前工程（Ａ）により、種子に対して種子発芽促進剤の候補活性物質又は種子発芽抑制剤の候補活性物質を予め接触させるには、以下のように行えばよい。
まず、種子発芽促進剤の候補活性物質又は種子発芽抑制剤の候補活性物質を含有する水溶液を調製する。通常、水溶液に前記候補活性物質を、水溶液の量に対して、例えば、０．００１〜４重量％の割合で含有させることがよい。粉末状のものを用いる場合には、通常、水溶液に前記候補活性物質を、例えば、０．００２〜２重量％、好ましくは０．００５〜１重量％の割合で含有させることがよい。ペースト状のものを用いる場合には、通常、水溶液に前記候補活性物質を、水溶液の量に対して、例えば、０．００４〜４重量％、好ましくは０．００５〜１重量％の割合で含有させることがよい。
このように調製された液剤に種子を浸漬する際の当該液剤の量は、種子が浸漬できる量であればよく、通常、種子の重量に対して約１〜３倍量である。当該液剤に種子を浸漬する際の浸漬時間は、種子を浸漬する際の温度にもよるが、通常、５分間〜４８時間の範囲である。
【００３５】
本発明は、上記説明の如く、発芽能力を定量的に評価するための指標を提供する試薬としての、以下の遺伝子群の中から選ばれる一つ以上の遺伝子又はその一部の使用（即ち、本発明使用）を含むものである。
＜遺伝子群＞
(a)LsGA3ox1
(b)LsGA2ox2
(c)LsNCED4
(d)LsABA8ox3
【００３６】
本発明は、本発明プライマーセットを含有することを特徴とする種子発芽能力の定量的評価用試薬（即ち、本発明試薬）を含むものである。
本発明試薬は、種子が有する発芽能力を定量的に評価するための核酸増幅用試薬であり、本発明評価方法、本発明物質探索方法、本発明種子探索方法等において極めて有用である。
【００３７】
本発明は、本発明評価方法により定量的に評価された、種子が有する発芽能力の存在程度に基づき、発芽能力を有する種子を選抜する工程を有することを特徴とする発芽能力を有する種子の探索方法（即ち、本発明種子探索方法）を含むものである。
本発明種子探索方法によれば、短時間で発芽能力を有する種子を正確且つ簡便に選抜することが可能となる。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例を挙げてさらに詳細に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３９】
実施例１  （従来方法によるレタス種子の発芽性能の検定例）
レタス種子の発芽性能を従来方法に従い評価した。
第一の試験系では、レタス種子において発芽不適とされる高温（30℃）で明条件に制御された環境条件下で、国際種子検査規定に準じたシャーレ上での発芽試験を用いて、当該種子を吸水・生育させた後（２日間後）、当該種子の発芽率を測定した。第二の試験系では、レタス種子において発芽不適とされる高温（30℃）で暗条件に制御された環境条件下で、当該種子を吸水・生育させた後（２日間後）、国際種子検査規定に準じたシャーレ上での発芽試験を用いて、当該種子の発芽率を測定した
【００４０】
実施例２  （種子の準備）
実施例１における環境条件と同一の環境条件下で、国際種子検査規定に準じたシャーレ上での発芽試験を用いて、レタス種子を吸水・生育させた後（６時間後）、当該種子を回収した。
【００４１】
実施例３  （total RNAの調製）
実施例２で回収されたレタス種子０．２ｇを液体窒素中で凍結した後、当該凍結物からWan and Wilkinsの方法（Analytical Biochemistry, 223巻, 7-12ページ, 1994年）に準じてtotal RNAを抽出した。抽出されたtotal RNAのうちの100μgを分取し、これをDynabeads mRNA精製キット（ベリタス社製）を用いて精製することにより、mRNAを得た。
尚、ＲＮＡ濃度は、分光光度計により測定した260nmの吸光度をもとに算出した。
【００４２】
実施例４  （ｃDNAの調製）
実施例３で得られたｍRNAのうちの０．５μｇを分取し、これを逆転写酵素Superscript II（Invitrogen社製）を用いて逆転写反応に供することにより、cDNAを合成した。
【００４３】
実施例５（定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いた本遺伝子の発現レベルの測定）
実施例４に準じて、５ｎｇのｍRNAから合成されたcDNAを鋳型として、本発明プライマーセットをプライマーとして、並びに、Taq DNA polymerase（ロッシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いてＰＣＲ（polymerase chain reaction）を行った。ＰＣＲは、94℃・2分間の初期変性反応後、94℃・30秒間の熱変性反応と50〜58℃・30秒間のアニーリング反応と72℃・1分間の伸長反応とからなるサイクルを２５〜３０回繰り返し、最後に72℃・7分間の伸長反応を行うという条件で行った。ＰＣＲ産物は1.0％TAEアガロースゲルで電気泳動した後、当該ゲルを臭化エチジウムで染色したのちＵＶを照射して蛍光発色させた。そしてこの蛍光発色状態にあるゲルを写真撮影した。このようにして得られたゲルの写真からパソコンツールJtrimを用いて電子化画像を得、次いでパソコンツールScion Imageによりバンド強度の数値化を行った。数値化は、一度の比較試験で最も強い蛍光を示したサンプルの蛍光強度を１として相対値で示した。
以下、上記の実施例２〜５に準じて実施された下記の各試験系での結果を表１〜８に示した。
【００４４】
（第一の試験系）
第一の試験系では、本発明プライマーセットとして、配列番号５で示されるオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号６で示されるオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセットを用いた。また被験種子であるレタス種子としては、高温（30℃）又は暗条件の下でも比較的発芽しやすい品種Ａと、高温(30℃)又は暗所条件の下で発芽しにくい品種Ｂとの２種の品種を用いた。
上記の実施例２〜５に準じて実施された当該第一の試験系での結果を表１に示した。
表１から明らかなように、従来方法により測定された発芽率と、配列番号５で示されるオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号６で示されるオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセットを用いて増幅されたＰＣＲ産物の量との間には、正の相関関係が存在することが判明した。
以上、高温（30℃）且つ明条件の下で発芽しやすい品種Ａは、高温(30℃)且つ明暗両条件の下で発芽しにくい品種Ｂと比べて有意に高いＰＣＲ産物の量の値を示しており、本発明評価方法が発芽能力を定量的に評価する方法として有効であることが確認された。
【００４５】
【表１】
2007117033.tif 000002
【００４６】
（第二の試験系）
第二の試験系では、本発明プライマーセットとして、配列番号５で示されるオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号６で示されるオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセットを用いた。また被験種子であるレタス種子としては、高温（30℃）且つ明条件の下で発芽能力が異なる５種類の種子ロットを用いた。
上記の実施例２〜５に準じて実施された当該第二の試験系での結果を表２に示した。
表２から明らかなように、従来方法により測定された発芽率と、配列番号５で示されるオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号６で示されるオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセットを用いて増幅されたＰＣＲ産物の量との間には、正の相関関係が存在することが判明した。
以上、発芽しやすい種子ロット３〜５は、発芽しにくい種子ロット１と比べて有意に高いＰＣＲ産物の量の値を示しており、本発明評価方法が発芽能力を定量的に評価する方法として有効であることが確認された。
【００４７】
【表２】
2007117033.tif 000003
【００４８】
（第三の試験系）
第三の試験系では、本発明プライマーセットとして、配列番号７で示されるオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号８で示されるオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセットを用いた。また被験種子であるレタス種子としては、高温（30℃）又は暗条件の下でも比較的発芽しやすい品種Ａと、高温(30℃)又は暗所条件の下で発芽しにくい品種Ｂとの２種の品種を用いた。
上記の実施例２〜５に準じて実施された当該第二の試験系での結果を表３に示した。
表３から明らかなように、従来方法により測定された発芽率と、配列番号７で示されるオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号８で示されるオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセットを用いて増幅されたＰＣＲ産物の量との間には、負の相関関係が存在することが判明した。
以上、高温（30℃）且つ明条件の下で発芽しやすい品種Ａは、高温(30℃)且つ暗条件の下で発芽しにくい品種Ｂと比べて有意に低いＰＣＲ産物の量の値を示しており、本発明評価方法が発芽能力を定量的に評価する方法として有効であることが確認された。
【００４９】
【表３】
2007117033.tif 000004
【００５０】
（第四の試験系）
第四の試験系では、本発明プライマーセットとして、配列番号７で示されるオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号８で示されるオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセットを用いた。また被験種子であるレタス種子としては、高温（30℃）且つ明条件の下で発芽能力が異なる３種類の種子ロットを用いた。
上記の実施例２〜５に準じて実施された当該第四の試験系での結果を表４に示した。
表４から明らかなように、従来方法により測定された発芽率と、配列番号７で示されるオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号８で示されるオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセットを用いて増幅されたＰＣＲ産物の量との間には、負の相関関係が存在することが判明した。
以上、発芽しやすい種子ロット３及び５は、発芽しにくい種子ロット１と比べて有意に低いＰＣＲ産物の量の値を示しており、本発明評価方法が発芽能力を定量的に評価する方法として有効であることが確認された。
【００５１】
【表４】
2007117033.tif 000005
【００５２】
（第五の試験系）
第五の試験系では、本発明プライマーセットとして、配列番号９で示されるオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号１０で示されるオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセットを用いた。また被験種子であるレタス種子としては、高温（30℃）又は暗条件の下でも比較的発芽しやすい品種Ａと、高温(30℃)又は暗所条件の下で発芽しにくい品種Ｂとの２種の品種を用いた。
上記の実施例２〜５に準じて実施された当該第五の試験系での結果を表５に示した。
表５から明らかなように、従来方法により測定された発芽率と、配列番号９で示されるオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号１０で示されるオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセットを用いて増幅されたＰＣＲ産物の量との間には、負の相関関係が存在することが判明した。
以上、高温（30℃）且つ明条件の下で発芽しやすい品種Ａは、高温(30℃)且つ明暗条件の下で発芽しにくい品種Ｂと比べて有意に低いＰＣＲ産物の量の値を示しており、本発明評価方法が発芽能力を定量的に評価する方法として有効であることが確認された。
【００５３】
【表５】
2007117033.tif 000006
【００５４】
（第六の試験系）
第六の試験系では、本発明プライマーセットとして、配列番号９で示されるオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号１０で示されるオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセットを用いた。また被験種子であるレタス種子としては、高温（30℃）且つ明条件の下で発芽能力が異なる５種類の種子ロットを用いた。
上記の実施例２〜５に準じて実施された当該第六の試験系での結果を表６に示した。
表６から明らかなように、従来方法によ測定された発芽率と、配列番号９で示されるオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号１０で示されるオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセットを用いて増幅されたＰＣＲ産物の量との間には、負の相関関係が存在することが判明した。
以上、発芽しやすい種子ロット３〜５は、発芽しにくい種子ロット１と比べて有意に低いＰＣＲ産物の量の値を示しており、本発明評価方法が発芽能力を定量的に評価する方法として有効であることが確認された。
【００５５】
【表６】
2007117033.tif 000007
【００５６】
（第七の試験系）
第七の試験系では、本発明プライマーセットとして、配列番号１１で示されるオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号１２で示されるオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセットを用いた。また被験種子であるレタス種子としては、高温（30℃）又は暗条件の下でも比較的発芽しやすい品種Ａと、高温(30℃)又は暗所条件の下で発芽しにくい品種Ｂとの２種の品種を用いた。
上記の実施例２〜５に準じて実施された当該第一の試験系での結果を表７に示した。
表７から明らかなように、従来方法により測定された発芽率と、配列番号１１で示されるオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号１２で示されるオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセットを用いて増幅されたＰＣＲ産物の量との間には、正の相関関係が存在することが判明した。
以上、高温（30℃）且つ明条件の下で発芽しやすい品種Ａは、高温(30℃)且つ明暗両条件の下で発芽しにくい品種Ｂと比べて有意に高いＰＣＲ産物の量の値を示しており、本発明評価方法が発芽能力を定量的に評価する方法として有効であることが確認された。
確認された。
【００５７】
【表７】
2007117033.tif 000008
【００５８】
（第八の試験系）
第八の試験系では、本発明プライマーセットとして、配列番号１１で示されるオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号１２で示されるオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセットを用いた。また被験種子であるレタス種子としては、高温（30℃）且つ明条件の下で発芽能力が異なる２種類の種子ロットを用いた。
上記の実施例２〜５に準じて実施された当該第八の試験系での結果を表８に示した。
表８から明らかなように、従来方法により測定された発芽率と、配列番号１１で示されるオリゴヌクレオチドプライマー及び配列番号１２で示されるオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセットを用いて増幅されたＰＣＲ産物の量との間には、正の相関関係が存在することが判明した。
以上、発芽しやすい種子ロット５は、発芽しにくい種子ロット１と比べて有意に高いＰＣＲ産物の量の値を示しており、本発明評価方法が発芽能力を定量的に評価する方法として有効であることが確認された。
【００５９】
【表８】
2007117033.tif 000009
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明によって、特定の遺伝子の発現レベルを指標とした、種子が有する発芽能力の正確且つ簡便な定量的評価方法等が提供可能となる。当該定量的評価方法を用いれば、種子が有する発芽能力をより短期間で定量的に評価することもでき、例えば、温度や光という条件を制御した種々の環境条件下における種子の発芽能力を可能な限り短時間で予測することが可能となる。
【配列表フリーテキスト】
【００６１】
配列番号５
ＲＴ−ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６
ＲＴ−ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７
ＲＴ−ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８
ＲＴ−ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号９
ＲＴ−ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１０
ＲＴ−ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１１
ＲＴ−ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２
ＲＴ−ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
【配列表】
2007117033000001.app