(57)【要約】【課題】柑橘類果実を有効利用した優れた抗アレルギー剤およびアレルギー性疾患の予防・改善用食品を提供すること。【解決手段】柑橘類果実を破砕する工程、該破砕物を水処理する工程、その水層を除去する工程を含む方法により得られる水不溶物を含有する、抗アレルギー剤およびアレルギー性疾患の予防・改善用食品。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
柑橘類果実の水不溶物を含有する抗アレルギー剤。
【請求項２】
柑橘類果実のアルコール可溶性の水不溶物を含有する抗アレルギー剤。
【請求項３】
水不溶物が、柑橘類果実を破砕する工程、該破砕物を水処理する工程、水層を除去する工程を含む方法により得られるものである、請求項１または２に記載の抗アレルギー剤。
【請求項４】
該破砕物１重量部に対して１〜１０重量部の水で水処理する、請求項３に記載の抗アレルギー剤。
【請求項５】
水処理の温度が０〜８５℃、時間が５分〜４８時間である請求項３または４記載の抗アレルギー剤。
【請求項６】
アルコールで抽出する工程を含む請求項３〜５のいずれか１項に記載の抗アレルギー剤。
【請求項７】
アルコールがメタノールまたはエタノールである請求項６記載の抗アレルギー剤。
【請求項８】
柑橘類が、温州ミカン（Citrus unshiu）またはシークワサー（Citrus depressa）である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗アレルギー剤。
【請求項９】
柑橘類果実が、直径１〜４ｃｍの柑橘類果実である、請求項８に記載の抗アレルギー剤。
【請求項１０】
柑橘類果実の水不溶物を含有する抗アレルギー剤の製造方法であって、柑橘類果実を破砕する工程、該破砕物を水処理する工程、水層を除去し水不溶物を得る工程を含む製造方法。
【請求項１１】
破砕物１重量部に対して１〜１０重量部の水で水処理する、請求項１０記載の製造方法。
【請求項１２】
水処理の温度が０〜８５℃、時間が５分〜４８時間である請求項１０または１１記載の製造方法。
【請求項１３】
さらにアルコールで抽出する工程を含む請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１４】
アルコールがメタノールまたはエタノールである請求項１３記載の製造方法。
【請求項１５】
柑橘類果実の水不溶物を含有する、アレルギー性疾患の予防・改善作用を有するものであることを特徴とし、アレルギー性疾患の予防・改善のために用いられる旨の表示を付した食品。
【請求項１６】
柑橘類果実のアルコール可溶性の水不溶物を含有する、アレルギー性疾患の予防・改善作用を有するものであることを特徴とし、アレルギー性疾患の予防・改善のために用いられる旨の表示を付した食品。
【請求項１７】
水不溶物が、柑橘類果実を破砕する工程、該破砕物を水処理する工程、水層を除去する工程を含む方法により得られるものである、請求項１５または１６に記載の食品。
【請求項１８】
破砕物１重量部に対して１〜１０重量部の水で水処理する、請求項１７に記載の食品。
【請求項１９】
水処理の温度が０〜８５℃、時間が５分〜４８時間である請求項１７または１８に記載の食品。
【請求項２０】
アルコールで抽出する工程を含む請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の食品。
【請求項２１】
アルコールがメタノールまたはエタノールである請求項２０に記載の食品。
【請求項２２】
柑橘類が、温州ミカン（Citrus unshiu）またはシークワサー（Citrus depressa）である、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の食品。
【請求項２３】
柑橘類果実が、直径１〜４ｃｍの柑橘類果実である、請求項２２に記載の食品。
【請求項２４】
柑橘類果実の水不溶物を含有するアレルギー性疾患の予防・改善用食品の製造方法であって、柑橘類果実を破砕する工程、該破砕物を水処理する工程、水層を除去し水不溶物を得る工程を含む製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、柑橘類果実より得られる抗アレルギー剤およびその製造方法に関する。より詳細には、本発明は柑橘類果実を水処理して得られる水不溶物を含有する抗アレルギー剤およびアレルギー疾患の予防・改善用食品、ならびにそれらの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
日本におけるアレルギー患者の数は年々増加の一途を辿っている。なかでも、ＩｇＥを介するＩ型アレルギー（即時型アレルギー）反応に分類されるアトピー性皮膚炎や気管支喘息、花粉症などは今や深刻な社会問題となっている。
そこで、アレルギー患者を治療するために様々な化学療法が用いられているが、従来の化学療法では副作用を伴う場合が多く、また化学物質の関与がアレルギーの一因として考えられているため、アレルギー治療の一助として、天然物由来のアレルギー抑制物質の検索が行われている。
【０００３】
柑橘類は古来より生薬の原料として多岐にわたり用いられてきた。例えば、未熟な柑橘類果実に多く含有されるヘスペリジン、ネオヘスペリジン、ナリンギンなどは抗アレルギー効果を有することが知られており、柑橘類果実からヘスペリジンを抽出する方法、およびヘスペリジン、ネオヘスペリジン、ナリンギンなどを含有する抗アレルギー剤などがすでに報告されている（特許文献１〜３）。しかしながら、これらはいずれもエタノールなどのアルコールを用いて柑橘類果実から有効成分を抽出したものであり、水処理によって得られる柑橘類果実の水不溶物については何ら記載されていない。
【０００４】
また、柑橘類の搾汁残渣を水で洗浄し、急速冷凍し、その後解凍して乾燥させ粉末にする、未熟柑橘類の粉末の製造方法も報告されているが（特許文献４）、水処理によって得られる柑橘類の水不溶性の成分がアレルギーの治療に有効であることについては、今まで知られていなかった。
【０００５】
【特許文献１】特開平８−１８８５９３号公報
【特許文献２】特開２００５−１３２７９１号公報
【特許文献３】特開２００５−１７０８０４号公報
【特許文献４】特開２００５−２２９８３６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、古来より生薬の原料として用いられてきた柑橘類果実を、有効利用した優れた抗アレルギー剤およびアレルギー性疾患の予防・改善用食品を提供することである。また、本発明のさらなる課題は、前記抗アレルギー剤または該食品を製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題に鑑み、柑橘類果実、特に温州ミカン（Citrus unshiu）およびシークワサー（Citrus depressa）等の果実から得た水不溶物の生理活性に注目し、該水不溶物が、脱顆粒抑制、浮腫抑制およびアナフィラキシー抑制効果を有するという知見を得て、抗アレルギー剤として有用であることを見出し本発明を完成した。
【０００８】
即ち、本発明は下記の通りである。
（１）柑橘類果実の水不溶物を含有する抗アレルギー剤。
（２）柑橘類果実のアルコール可溶性の水不溶物を含有する抗アレルギー剤。
（３）水不溶物が、柑橘類果実を破砕する工程、該破砕物を水処理する工程、水層を除去する工程を含む方法により得られるものである、（１）または（２）記載の抗アレルギー剤。
（４）該破砕物１重量部に対して１〜１０重量部の水で水処理する、（３）に記載の抗アレルギー剤。
（５）水処理の温度が０〜８５℃、時間が５分〜４８時間である（３）または（４）記載の抗アレルギー剤。
（６）アルコールで抽出する工程を含む（３）〜（５）のいずれか１項に記載の抗アレルギー剤。
（７）アルコールがメタノールまたはエタノールである（６）記載の抗アレルギー剤。
（８）柑橘類が、温州ミカン（Citrus unshiu）またはシークワサー（Citrus depressa）である、（１）〜（７）のいずれか１項に記載の抗アレルギー剤。
（９）柑橘類果実が、直径１〜４ｃｍの柑橘類果実である、（８）に記載の抗アレルギー剤。
（１０）柑橘類果実の水不溶物を含有する抗アレルギー剤の製造方法であって、柑橘類果実を破砕する工程、該破砕物を水処理する工程、水層を除去し水不溶物を得る工程を含む製造方法。
（１１）破砕物１重量部に対して１〜１０重量部の水で水処理する、（１０）記載の製造方法。
（１２）水処理の温度が０〜８５℃、時間が５分〜４８時間である（１０）または（１１）記載の製造方法。
（１３）さらにアルコールで抽出する工程を含む（１０）〜（１２）のいずれか１項に記載の製造方法。
（１４）アルコールがメタノールまたはエタノールである（１３）記載の製造方法。
（１５）柑橘類果実の水不溶物を含有する、アレルギー性疾患の予防・改善作用を有するものであることを特徴とし、アレルギー性疾患の予防・改善のために用いられる旨の表示を付した食品。
（１６）柑橘類果実のアルコール可溶性の水不溶物を含有する、アレルギー性疾患の予防・改善作用を有するものであることを特徴とし、アレルギー性疾患の予防・改善のために用いられる旨の表示を付した食品。
（１７）水不溶物が、柑橘類果実を破砕する工程、該破砕物を水処理する工程、水層を除去する工程を含む方法により得られるものである、（１５）または（１６）に記載の食品。
（１８）破砕物１重量部に対して１〜１０重量部の水で水処理する、（１７）に記載の食品。
（１９）水処理の温度が０〜８５℃、時間が５分〜４８時間である（１７）または（１８）に記載の食品。
（２０）アルコールで抽出する工程を含む（１７）〜（１９）のいずれか１項に記載の食品。
（２１）アルコールがメタノールまたはエタノールである（２０）に記載の食品。
（２２）柑橘類が、温州ミカン（Citrus unshiu）またはシークワサー（Citrus depressa）である、（１５）〜（２１）のいずれか１項に記載の食品。
（２３）柑橘類果実が、直径１〜４ｃｍの柑橘類果実である、（２２）に記載の食品。
（２４）柑橘類果実の水不溶物を含有するアレルギー性疾患の予防・改善用食品の製造方法であって、柑橘類果実を破砕する工程、該破砕物を水処理する工程、水層を除去し水不溶物を得る工程を含む製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の、柑橘類果実の水不溶物を含む抗アレルギー剤は、柑橘類果実のアルコール抽出物を含むものよりはるかに優れた抗アレルギー効果を有する。さらに、本発明の抗アレルギー剤は、柑橘類という天然物由来であるため副作用もなく、従来の薬物療法などは適用できなかった患者にも安全に使用することができる。また、その製造方法も水を用いた水処理によるものであるため、煩雑な工程も経る必要がなく、環境的にもコスト的にも有意である。したがって、本発明の抗アレルギー剤、アレルギー性疾患の予防・改善用食品およびそれらの製造方法は、社会問題であるアレルギー治療を向上・改善させる上で極めて有益である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
本発明の抗アレルギー剤は、柑橘類果実の水不溶物を有効成分とする。本発明における水不溶物とは、柑橘類果実の破砕物を水抽出した際の残渣で、乾燥重量の約７５%を占めるものである。通常は、少なくとも破砕物の重量の３倍量の、４℃以上の水で、１０分以上水に浸漬または振とうした場合に水に溶けないものをいう。
【００１２】
本発明の抗アレルギー剤は、柑橘類果実のアルコール可溶性の水不溶物を有効成分とする。アルコール可溶性とは、室温で、１０倍量アルコールで最低１時間の振とうによる抽出を５回行った際抽出されるもので、乾燥重量の約５０％を占めるものであり、アルコール可溶性の水不溶物とは、アルコール可溶性物をさらに水抽出した際の残渣または上記水不溶物をアルコール抽出したもので、アルコール可溶性物乾燥重量の約５０％を占めるものである。
【００１３】
本発明の水不溶物は、柑橘類果実を水処理して、その水を除去した残渣を意味する。具体的には、柑橘類果実を破砕する工程、該破砕物を水処理する工程、水層を除去する工程を含む方法により得られるものである。
【００１４】
本発明において、柑橘類果実を破砕する工程とは、柑橘類果実を採取後、外力を加えて、原料よりも小さな固体を大量に作り出す工程である。柑橘類果実は、０．１ｍｍ３〜３０ｍｍ３に砕くのが抽出の効率が良くなる観点から好ましく、さらに好ましくは１ｍｍ３〜１０ｍｍ３である。破砕する方法としては、特に限定されないが、例えば、フードプロセッサー、ミキサーなどの機器を用いて行う。
【００１５】
本発明において、該破砕物を水処理する工程とは、該破砕物から水可溶性成分を除去するために水を加えて水可溶性成分を水層に抽出する工程である。通常、上記破砕物を水に浸漬させ、好ましくは振とう下に放置することによって行われる。
【００１６】
水処理する工程において加える水の量は、高い抗アレルギー活性が得られ、作業効率が優れている点で、通常該破砕物１重量部に対して水１〜１０重量部であり、好ましくは２〜５重量部であり、さらに好ましくは３〜５重量部である。
【００１７】
水処理の温度は、高い抗アレルギー活性が得られ、作業効率が優れている点で通常は０〜８５℃であり、好ましくは０〜６５℃であり、より好ましくは０〜３０℃である。
【００１８】
水処理の時間は、高い抗アレルギー活性が得られ、作業効率が優れている点で通常５分〜４８時間であり、好ましくは１０分〜１２時間であり、さらに好ましくは１〜３時間である。
【００１９】
本発明において水層を除去する工程とは、上記水処理した破砕物を含む混合物から、水層を分離して水可溶物を除去する工程である。水層は、水および水可溶性成分を含む。除去の方法としては、ろ過、遠心分離などが挙げられるが、これに限定されない。
除去は、数回行うのが好ましい。すなわち完全に水溶性成分を除去するためには、水処理の工程および除去の工程を２〜５回繰り返すことが好ましい。
【００２０】
本発明においては、上記の工程にアルコールで抽出する工程をさらに含んでいてもよい。アルコールで抽出する工程は、上述した柑橘類果実の破砕工程の後であればいずれで行ってもよい。
具体的には、柑橘類果実の破砕物１重量部に対して１〜２０重量部のアルコールで抽出して濃縮乾固したものを水処理および水層を除去して水不溶物を得る、または上述の３工程で得られた水不溶物１重量部に対して１〜２０重量部のアルコールで抽出して濃縮乾固させて水不溶物を得ることができる。
このようにアルコールで抽出する工程を加えることで有効成分の濃縮効果が得られる。
【００２１】
アルコールは、抽出効率、価格および安全性の点でメタノール、エタノールが好ましい。より好ましくは、メタノールが挙げられる。
【００２２】
本発明で用いる柑橘類は特に限定されないが、高い抗アレルギー効果が得られるという点で、温州ミカン（Citrus unshiu）、シークワサー（Citrus depressa）、じゃばら（Citrus jabara）、ゆず（Citrus junos）、はっさく（Citrus hassaku）、いよかん（Citrus iyo）、すだち（Citrus sudachi）、れもん（Citrus limon）が好ましく、温州ミカンおよびシークワサーがより好ましい。
【００２３】
本発明において、柑橘類は、未熟な柑橘類果実が好ましい。未熟な柑橘類果実とは、果実の生長過程において、果皮が黄変する前の段階の十分に熟していない果実のことであり、温州ミカンの場合は、直径１ｃｍ〜４ｃｍのものが高い抗アレルギー活性が得られるという点で好ましい。より好ましくは２ｃｍ〜３ｃｍである。柑橘類は、生のものでも冷凍したものでもよくこれに限定されない。
【００２４】
本発明における抗アレルギー剤は、抗原抗体反応に基づく生体の過剰な免疫反応やそれによって惹起される組織または細胞傷害に対して有効である。好ましくは、I型アレルギーに対して有効である。I型アレルギーとは即時型またはアナフィラキシー型ともいわれ、細胞膜表面にIgE抗体受容体をもつ肥満細胞や好塩基球に結合したIgE抗体に抗原が結合するとIgE抗体受容体が架橋されてその刺激によって種々のchemical mediatorsが遊離して、毛細血管透過性亢進、粘膜浮腫、粘膜分泌亢進、平滑筋れん縮、局所への好酸球、好中球の集積をおこす。本発明の抗アレルギー剤は、脱顆粒抑制、浮腫抑制およびアナフィラキシー抑制作用を有することから、I型アレルギー反応の抑制に有効であり、気管支喘息、鼻アレルギー、アトピー性皮膚炎、花粉症、アレルギー性結膜炎、じんま疹等に有効である。
【００２５】
本発明における抗アレルギー剤の投与対象としてはアレルギー性疾患を罹患した個体（例えば、ヒトをはじめウシ、ウマ、イヌ、マウス、ラット等の哺乳動物）、アレルギー性疾患を罹患する可能性のある個体などが挙げられる。
【００２６】
本発明における抗アレルギー剤は、上記のようにして得られた水不溶物またはアルコール可溶性水不溶物を、そのままで、もしくは乾燥させた粉末状で含有する。本発明の抗アレルギー剤の投与方法は、経口投与、または経直腸投与（坐薬）、注射投与（経静脈投与）、点眼等の非経口投与でも良く、特に限定しないが、有効成分が柑橘類果実由来であることから経口投与であることが好ましい。
【００２７】
本発明における抗アレルギー剤を経口投与する場合の有効成分である水不溶物の投与量は、投与する患者の性別、症状、年齢、投与方法によって異なるが、通常、成人（体重６０ｋｇ）１日あたりの投与量が全量で、０．２ｇ〜３０ｇである。好ましくは成人１日あたりの投与量が全量で、１〜３ｇである。上記１日あたりの量を一度にもしくは数回に分けて投与することができる。食前、食後、食間を問わない。また投与期間は特に限定されない。なおアルコール抽出工程を含む方法で調製された水不溶物の場合、上記の投与量の２〜３分の１程度を投与することができる。
【００２８】
一方、注射投与（経静脈投与）、経直腸投与（坐薬）または点眼等、非経口投与することも可能であり、その場合の投与量については、前記経口投与についての好ましい投与量範囲の１０〜２０分の１程度を投与することができる。
【００２９】
本発明における抗アレルギー剤の経口投与剤としては、顆粒剤、細粒剤、錠剤、散剤、カプセル剤、チュアブル剤、液剤、懸濁剤など、また注射剤としては静脈直接注入用、点滴投与用などの医薬製剤一般の剤型を採用することができる。これらは、常法により製剤化することができ、製剤上の必要に応じて、例えば、乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンニトール、でんぷん、結晶セルロース、炭酸カルシウム、カオリン、ゼラチン等の担体や、溶剤、溶解補助剤、等張化剤等の通常の添加剤を適宜配合することができる。
【００３０】
本発明における抗アレルギー剤中の水不溶物の含有量は、通常１〜９５重量％であり、好ましくは５〜９０重量％である。なおアルコール抽出工程を含む方法で調製された水不溶物の場合、通常１〜９５重量％であり、好ましくは５〜９０重量％である。
【００３１】
本発明においては、抗アレルギー剤の製造方法を提供する。該製造方法は、柑橘類果実を破砕する工程、該破砕物を水処理する工程、その水層を除去し水不溶物を得る工程を含む。詳細は上述した通りであり、同様にアルコールで抽出する工程を含んでもよい。
【００３２】
本発明においては、柑橘類果実の水不溶物を含有する、アレルギー性疾患の予防・改善作用を有するものであることを特徴とし、アレルギー性疾患の予防・改善のために用いられる旨の表示を付した食品を提供する。
【００３３】
本発明における食品は、本発明の水不溶物を含む一般的な食品形態であれば如何なるものでも良い。例えば、適当な風味を加えてドリンク剤、例えば清涼飲料、粉末飲料とすることもできる。具体的には、ジュース、牛乳、菓子、ゼリー等に混ぜて飲食することができる。また、このような食品を保健機能食品として提供することも可能であり、この保健機能食品には、アレルギーの予防および改善などの本発明の用途に用いるものであるという表示を付した飲食品、特に保健機能食品、特定保健用食品、栄養機能食品なども含まれる。
【００３４】
さらに、本発明における食品を濃厚流動食や、食品補助剤として利用することも可能である。食品補助剤として使用する場合、例えば錠剤、カプセル、散剤、顆粒、懸濁剤、チュアブル剤、シロップ剤等の形態に調製することができる。本発明における食品補助剤とは、食品として摂取されるもの以外に栄養を補助する目的で摂取されるものをいい、栄養補助剤、サプリメントなどもこれに含まれる。
【００３５】
本発明における水不溶物を食品として摂取する場合、成人（体重６０ｋｇ）１日当たりの水不溶物の摂取量は、通常０．２ｇ〜３０ｇ程度、好ましくは１ｇ〜３ｇ程度、より好ましくは２ｇ〜３ｇ程度である。なおアルコール抽出工程を含む方法で調製された水不溶物の場合、上記の投与量の２〜３分の１程度を摂取することができる。
【００３６】
本発明における食品中の水不溶物の含有量は、通常１〜９５重量％であり、好ましくは５〜９０重量％である。なおアルコール抽出工程を含む方法で調製された水不溶物の場合、通常１〜９５重量％であり、好ましくは５〜９０重量％である。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、実施例は本発明の説明のために記載するものであり、本発明を限定するものではない。
【００３８】
以下に説明するアレルギー反応の指標となる脱顆粒反応測定に用いるサンプルを次のとおり調製した。
【００３９】
みかんメタノール抽出サンプルの調製（比較例１）
凍結保存していた未熟温州ミカン（本実験では、平均２６ｍｍのものを使用）の表面を水で洗浄し、フードプロセッサーで破砕した。破砕物を５０ｍｌ遠心チューブに１ｇ取り、メタノール２０ｍｌを加えて懸濁した。室温で１２時間振とうした後、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を別チューブに移した。上清を採取した残渣に再びメタノール２０ｍｌを加え懸濁し、室温で１時間振とう後、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を採取するという操作を４回繰り返し行った。
計５回の抽出により得られた上清を合わせ、減圧濃縮乾固した。得られた乾固物を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に終濃度５０ｍｇ／ｍｌになるよう溶解し、メタノール抽出サンプル（比較例１）を得た。
【００４０】
水抽出上清、水抽出残渣のメタノール再抽出サンプルの調製(実施例１および２、比較例２および３)
凍結保存していた未熟温州みかん(本実験では、平均２６ｍｍのものを使用) の表面を水で洗浄し、フードプロセッサーで破砕した。破砕物を５０ｍｌ遠心チューブに各１０ｇずつ取り分け、次の条件で水を加え懸濁し、４０℃の温浴で１時間振とうすることにより抽出を行った。
[１]水１０ｍｌを加え抽出[２]水３０ｍｌを加え抽出
抽出後、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。別チューブに移した上清は減圧濃縮乾固後、ＤＭＳＯで５０ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、水抽出上清サンプル（比較例３および４）を得た。
残渣にメタノール１００ｍｌを加え懸濁し、室温で一晩振とうすることにより抽出を行った。翌日、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を別チューブに移した。
上清を採取した各残渣に再びメタノール１００ｍｌを加え懸濁し、室温で２時間振とう後、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を採取するという操作を４回繰り返し行った。
計５回の抽出により得られた上清を合わせ、減圧濃縮乾固した。得られた乾固物をＤＭＳＯで５０ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、水抽出残渣メタノール再抽出サンプルを得た（実施例１および２）。比較例として、上記の水を加える代わりに、水を加えずに他は実施例１と同様にしてサンプルを得た（比較例２）。
実施例および比較例は表１の通りである。
【００４１】
【表１】
2007332117.tif 000003
【００４２】
メタノール抽出物の水再抽出サンプルの調製
１．時間による違い（実施例３〜７）
凍結保存していた未熟温州みかん（本実験では、平均２６ｍｍのものを使用）を水で表面を洗浄し、フードプロセッサーで破砕後、凍結乾燥を行った。
５０ｍｌ遠心チューブ６本に凍結乾燥物各１ｇずつ取り分け、メタノール２０ｍｌを加え懸濁し、室温で一晩振とうすることにより抽出を行った。翌日、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を別チューブに移した。上清を採取した残渣に再びメタノール２０ｍｌを加え懸濁し、室温で１時間振とう後、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を採取するという操作を４回繰り返し行った。計５回の抽出により得られた上清を合わせ、減圧濃縮乾固した。
上記メタノール抽出により得られた乾固物を５０ｍｌ遠心チューブに各０．４ｇずつ取り分け、８ｍｌの水を加え懸濁し、４５℃の温浴で次の時間振とうすることにより抽出を行った。
[１]３時間[２]６時間[３]１２時間[４]２４時間[５]４８時間
抽出後、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を除去し、沈殿は減圧濃縮乾固後、ＤＭＳＯで５０ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、メタノール抽出物水再抽出沈殿サンプルを得た。実施例３〜７は表２の通りである。
【００４３】
【表２】
2007332117.tif 000004
【００４４】
２．温度による違い（実施例８〜１２）
上記メタノール抽出により得られた乾固物を５０ｍｌ遠心チューブに各０．４ｇずつ取り分け、８ｍｌの水を加え懸濁し、次の温度で３時間振とうすることにより抽出を行った。
[１]４℃[２]２５℃[３]４５℃[４]６５℃[５]８５℃
抽出後、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を除去し、沈殿は減圧濃縮乾固後、ＤＭＳＯで５０ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、メタノール抽出物水再抽出沈殿サンプルを得た。実施例８〜１２は表３の通りである。
【００４５】
【表３】
2007332117.tif 000005
【００４６】
３．水量による違い（実施例１３〜１７）
上記メタノール抽出により得られた乾固物を５０ｍｌ遠心チューブに各０．４ｇずつ取り分け、次の水量の水を加え懸濁し、４℃で３時間振とうすることにより抽出を行った。
[１]２ｍｌ[２]４ｍｌ[３]８ｍｌ[４]１２ｍｌ[５]２４ｍｌ
抽出後、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を除去し、沈殿は減圧濃縮乾固後、ＤＭＳＯで５０ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、メタノール抽出物水再抽出沈殿サンプルを得た。実施例１３〜１７は表４の通りである。
【００４７】
【表４】
2007332117.tif 000006
【００４８】
シークワサーメタノール抽出サンプルの調製（実施例１８、比較例５）
シークワサー（本実験では、平均３８．６ｍｍのものを使用）を水で表面を洗浄し、フードプロセッサーで破砕後、凍結乾燥を行った。５０ｍｌ遠心チューブに凍結乾燥物１ｇ取り、メタノール２０ｍｌを加え懸濁し、室温で一晩振とうすることにより抽出を行った。翌日、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を別チューブに移した。上清を採取した残渣に再びメタノール２０ｍｌを加え懸濁し、室温で１時間振とう後、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を採取するという操作を４回繰り返し行った。計５回の抽出により得られた上清を合わせ、減圧濃縮乾固した。得られた乾固物を、ＤＭＳＯに終濃度５０ｍｇ／ｍＬになるよう溶解し、シークワサーメタノール抽出物を得た（比較例５）。
濃縮した上記シークワサーメタノール抽出物０．４ｇに８ｍｌの水を加えて懸濁した。４℃で３時間振とうした後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清、沈殿をそれぞれ別チューブに取った。沈殿を減圧濃縮乾固し、得られた乾固物を、ＤＭＳＯに終濃度５０ｍｇ／ｍｌになるよう溶解し、シークワサーメタノール抽出物の水再抽出サンプルを得た（実施例１８）。
【００４９】
（試験例１）ラット好塩基性白血病細胞株（ＲＢＬ−２Ｈ３細胞）を用いた脱顆粒反応
実施例１〜１７および比較例１〜５の抗アレルギー作用を評価するにあたり、ラット好塩基性白血病細胞株（ＲＢＬ−２Ｈ３細胞）を用いて、抗原刺激に伴うβ−ヘキソサミニダーゼ酵素活性を指標とする脱顆粒反応を行った。
【００５０】
ＲＢＬ−２Ｈ３細胞をＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含む）中に、１×１０6細胞／ｍｌの濃度で懸濁した。
抗ジニトロフェニル特異的モノクローナル免疫グロブリンＥ（ＳＩＧＭＡ社製）を終濃度０．６μｇ／ｍｌになるように加え再懸濁後、２４穴培養プレートに０．５ｍｌずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ2下で一晩培養した。
培地に別に示す終濃度になるように同培地で希釈したサンプルを１０μｌ加え、３７℃、５％ＣＯ2下で３０分間培養し、前処理を行った。なお、コントロールには培地内濃度が１％になるようにＤＭＳＯを１０μｌ加えた。
３０分後、培地を取り除き、０．１％ウシ血清アルブミンを含むＰＩＰＥＳ生理食塩水（２５ｍＭＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ、１５９ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＫＣｌ、０．４ｍＭＭｇＣｌ2、１ｍＭＣａＣｌ2、５．６ｍＭグルコース、ｐＨ７．２）０．５ｍｌで２回洗浄した後、更に同生理食塩水を０．５ｍｌ／穴に加えた。
抗原として、ジニトロフェニル結合ウシ血清アルブミンを５μｌ／穴（終濃度１００ｎｇ／ｍｌ）加え、３７℃、５％ＣＯ2下で３０分間培養し、脱顆粒反応を誘発した。なお、脱顆粒反応陰性コントロールには上記生理食塩水を５μｌ／穴加えた。
３０分後、氷上で冷却した９６穴培養プレートにサンプル別培養上清を各５０μｌずつ移し、ここに等量の酵素基質液（５ｍＭ４−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、０．２Ｍクエン酸−ＮａＯＨ、ｐＨ４．５）を加え、３７℃、５％ＣＯ2下で酵素反応を行った。
１時間後、反応停止液として１Ｍ炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．５）を１００μｌ／穴加えた。酵素反応により生成したｐ−ニトロフェノールの発色（４０５ｎｍ）を比色法により測定し、β−ヘキソサミニダーゼ酵素活性とした。
コントロール（ＤＭＳＯで前処理、抗原刺激あり）測定値から陰性コントロール（ＤＭＳＯで前処理、抗原刺激なし）の測定値を引いた値を１００％とし、各サンプルで処理した細胞の活性を調べた。
【００５１】
結果を図１〜７に示す。
図１は、比較例２（水抽出をしていないメタノール抽出サンプル）、比較例３、４（水抽出上清サンプル）並びに、実施例１〜２（水抽出残渣メタノール再抽出サンプル）の脱顆粒反応に対する抑制効果を示した（終濃度５００μｇ／ｍｌ）。比較例３および４では脱顆粒抑制効果が認められなかった。一方、比較例２、実施例１〜２では有意な脱顆粒抑制効果が認められた。このことより、水に溶解する成分には脱顆粒抑制効果は認められず、これらを除いた水不溶物に脱顆粒抑制効果があることが明らかになった。また、その抑制効果は水処理工程を加えたもの程強く、加えた水量と相関があることが示された。
【００５２】
図２は、脱顆粒反応に及ぼす温州みかんメタノール抽出物の水再抽出時間の検討結果を示した（終濃度５００μｇ／ｍｌ）。水再抽出沈殿においては、いずれの抽出時間においても有意な脱顆粒抑制効果が認められた。
【００５３】
図３は、脱顆粒反応に及ぼす温州みかんメタノール抽出物の水再抽出温度の検討結果を示した（終濃度５００μｇ／ｍｌ）。いずれの抽出温度においても有意な脱顆粒抑制効果が認められた。特に、４℃で抽出を行った沈殿には顕著な脱顆粒抑制効果が認められ、８５℃では他の温度と比較し効果が弱かった。
【００５４】
図４は、脱顆粒反応に及ぼす温州みかんメタノール抽出物の水再抽出水量の検討結果を示した（終濃度５００μｇ／ｍｌ）。水再抽出沈殿においては、いずれの抽出水量においても有意な脱顆粒抑制効果が認められた。水抽出量は８ｍｌで顕著な脱顆粒抑制効果が認められた。
【００５５】
図５は、図２〜図４で検討を行った好ましい条件における温州みかんメタノール抽出物の水再抽出サンプル（メタノール抽出物０．４ｇに対し、水８ｍｌを加え、４℃で３時間抽出を行ったサンプル（実施例１５））とメタノール抽出サンプル（比較例１）の脱顆粒反応に対する抑制効果を示した（終濃度５００μｇ／ｍｌ）。いずれも、有意な脱顆粒抑制効果が認められたが、メタノール抽出物の水再抽出を行った場合の沈殿には、より強い活性が認められた。
【００５６】
図６は、比較例１および実施例１５の濃度と脱顆粒反応に対する影響の関係を示した（終濃度３１．２５μｇ／ｍｌ、６２．５μｇ／ｍｌ、１２５μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ）。実施例１５は、用量依存的に脱顆粒抑制効果を示し、比較例１よりもいずれの濃度においても優れた脱顆粒抑制効果を認めた。
これらの結果より、水処理して得られた温州みかん水不溶物が脱顆粒抑制効果に優れていることが明らかになった。
【００５７】
図７は、シークワサーメタノール抽出物の水再抽出沈殿サンプル（実施例１８）とメタノール抽出サンプル（比較例５）の脱顆粒反応に対する抑制効果を示した（終濃度５００μｇ／ｍｌ）。メタノール抽出サンプル（実施例５）では、有意な脱顆粒抑制効果が認めらなかったが、メタノール抽出物の水再抽出沈殿サンプル（実施例１８）には、抑制効果が認められた。
【００５８】
以下に説明する実験動物を使ったアレルギーモデル実験に用いるサンプルを次のとおり調製した。
【００５９】
生体での試験用サンプルの調製
凍結保存していた直径２５ mm未満の未熟温州みかん２ kgを水で表面を洗浄し、フードプロセッサーで破砕後、凍結乾燥を行った。凍結乾燥物をフードプロセッサーで粉砕し、粉末サンプル（比較例６）を得た。
同量のみかんの表面を水で洗浄し、フードプロセッサーで破砕後、水を溜めた大型ビーカー内で懸濁した。その後、布巾で絞り、脱水後、凍結乾燥を行った。凍結乾燥物をフードプロセッサーで粉砕し、粉末サンプル（実施例１９）を得た。
【００６０】
（試験例２）ラットを用いた受身皮膚アナフィラキシー反応
上記調製サンプル（比較例６、実施例１９）の生体における経口摂取による抗アレルギー作用を評価するにあたり、SDラットを用いて、抗原刺激に伴うアナフィラキシー反応に対する影響を調べた。
【００６１】
紀和実験動物研究所より購入した雄のSDラット１２匹（４週齢）を溶媒対照群、比較例６投与群、実施例１９投与群の３群に各４匹ずつ分けた。
５日間、コンベンショナル動物室（気温２３-２５℃、湿度５０-６０ %、明暗周期１４時間/１０時間）で予備飼育を行い、飼育環境に慣れさせた。
予備飼育開始６日目より、４週間、経口胃ゾンデを用い、下記のとおりラット体重１０ gあたり０．１ ml を１日１回強制経口投与した（５００ ｍｇ/ｋｇ投与）。
【００６２】
溶媒対照群には０．５%カルボキシメチルセルロースナトリウム水溶液を投与した。
比較例６投与群（Ｎ＝３）には、比較例６を上記水溶液に懸濁し投与した。
実施例１９投与群（Ｎ＝３）には、実施例１９を上記水溶液に懸濁し投与した。
【００６３】
４週間後、背面の毛を剃った。２４時間後、抗ジニトロフェニル特異的モノクローナル免疫グロブリンEを０．１ %ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝液で希釈した溶液を背面の皮内４-５箇所に各１００ μl（１５ μg/kg）投与した。皮内投与を行った位置に油性赤マジックで目印を付けた。
２４時間後、０．１%ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝液で１%エバンスブルー溶液を調製し、同溶液でジニトロフェニル結合ウシ血清アルブミンを溶解後、０．５ml（３０μg/kg）尾静脈内投与した。
【００６４】
３０分後、安楽死を行い、目印を付けた部分の皮膚を切り取った。切り取った皮膚片を遠心チューブに入れ、１N ＫＯＨ 1 mlを加え、４０ ℃の温浴で一晩静置した。翌日、同チューブに0.6 Nリン酸2.5 mlを加え懸濁、中和後、タンパク質を除くためアセトン7 mlを加えた。よく懸濁し、２０００×gで２０分間遠心分離を行い、分光光度計で６２０ ｎｍの上清の吸光度を測定した。
浸出したエバンスブルー色素濃度を指標に未熟温州みかん投与による受身皮膚アナフィラキシー反応抑制効果を評価した。
【００６５】
結果は図８に示した。受身皮膚アナフィラキシー反応に対して、比較例６および実施例１９投与群のいずれも抑制効果が認められたが、実施例１９投与群の方が、比較例６投与群に比べてより強い抑制効果を認めた。以上の結果より、生体において水処理して得られた水不溶物を経口より摂取してもアレルギー抑制効果を示し、水処理して得られた水不溶物の方が、未処理のものに比して、抗アレルギー作用が優れていることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は、温州みかんの水抽出上清サンプル及び水抽出残渣メタノール再抽出サンプルの脱顆粒反応に対する抑制効果を示す（終濃度５００μｇ／ｍｌ）。縦軸は（％コントロール）を表わしている。
【図２】図２は、温州みかんのメタノール抽出物の水再抽出沈殿サンプル（水再抽出時間による違い）の脱顆粒反応に対する抑制効果を示す（終濃度５００μｇ／ｍｌ）。縦軸は（％コントロール）を表わしている。
【図３】図３は、温州みかんのメタノール抽出物の水再抽出沈殿サンプル（水再抽出温度による違い）の脱顆粒反応に対する抑制効果を示す（終濃度５００μｇ／ｍｌ）。縦軸は（％コントロール）を表わしている。
【図４】図４は、温州みかんのメタノール抽出物の水再抽出沈殿サンプル（水再抽出水量による違い）の脱顆粒反応に対する抑制効果を示す（終濃度５００μｇ／ｍｌ）。縦軸は（％コントロール）を表わしている。
【図５】図５は、図２〜図４で検討を行った好ましい条件における温州みかんメタノール抽出物の水再抽出沈殿サンプル（抽出時間：３時間、抽出温度：４℃、抽出水量：８ｍｌ）とメタノール抽出サンプルの脱顆粒反応に対する抑制効果を示す（終濃度５００μｇ／ｍｌ）。縦軸は（％コントロール）を表わしている。
【図６】図６は、図５で示した結果をより詳細に温州みかんメタノール抽出物の水再抽出サンプルの異なる濃度で検討を行った脱顆粒反応に対する抑制効果を示す（終濃度３１．２５μｇ／ｍｌ、６２．５μｇ／ｍｌ、１２５μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ）。
【図７】図７は、シークワサーのメタノール抽出物の水再抽出沈殿サンプルとメタノール抽出サンプルの脱顆粒反応に対する抑制効果を示す（終濃度５００μｇ／ｍｌ）。縦軸は（％コントロール）を表わしている。
【図８】図８は、ラット受身皮膚アナフィラキシー反応に対する抑制効果を示す。縦軸は（％コントロール）を表わしている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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