(57)【要約】      （修正有）【課題】水溶性タンパク質を化学修飾することにより、水溶性タンパク質の利用範囲を非水系にまで広げ、低極性溶媒に可溶な疎水化修飾タンパク質を製造する方法の提供。【解決手段】水溶性タンパク質のアミノ基にポリアルキレンオキシド基を結合させ、次いで、極性有機溶媒中で、該タンパク質のカルボキシル基に疎水性基を結合させる、水溶性タンパク質の低極性溶媒への可溶化方法、及び疎水化修飾タンパク質の提供。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性タンパク質のアミノ基にポリアルキレンオキシド基を結合させ、次いで、極性有機溶媒中で、該タンパク質のカルボキシル基に疎水性基を結合させることを特徴とする水溶性タンパク質の低極性溶媒への可溶化法。
【請求項２】
アミノ基とポリアルキレンオキシド基との結合が、ホウ酸緩衝液中で、タンパク質のアミノ基に活性化ポリアルキレンオキシドを反応させることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タンパク質のアミノ基に対して、活性化ポリアルキレンオキシド１０〜２００倍モル量を用いることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ポリアルキレンオキシド基がトリエチレンオキシド以上の分子量を有するポリエチレンオキシドから選ばれるものである請求項１〜３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
タンパク質のカルボキシル基と疎水性基との結合が、極性有機溶媒中で、カルボキシル基と反応性を有する官能基と疎水性鎖とを有する化合物を反応させるものである請求項１〜４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
タンパク質のカルボキシル基に対して、カルボキシル基と反応性を有する官能基と疎水性鎖とを有する化合物１〜１０倍モル量を反応させることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
カルボキシル基と反応性を有する官能基と疎水性鎖とを有する化合物がアルキルアミンである請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７の方法で得られる水に不溶で低極性溶媒に可溶な疎水化修飾水溶性タンパク質。
【請求項９】
低極性溶媒が水と２相系になる溶媒である請求項８に記載の疎水化修飾水溶性タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水溶性タンパク質の低極性溶媒への可溶化法に関する。より具体的には、水溶性タンパク質を化学修飾することにより、低極性溶媒に可溶な修飾タンパク質を製造する方法に関する。かかる方法により、水溶性タンパク質の利用範囲を、非水系にまで広げることが期待される。
【背景技術】
【０００２】
酵素などのタンパク質は、それぞれ固有のアミノ酸配列、分子量およびアミノ酸配列で規定される立体構造をもち、多くのものは固有の生理機能をもっており、酵素蛋白質であれば生体触媒としての反応特異性を示すものが多い。従来から、斯かる蛋白質の固有の立体構造や生理機能などを損なうことなく、穏和な条件下で蛋白質に各種の化合物を結合させて修飾する、各種の方法が提案されている。
【０００３】
例えば、ペプチドの活性を殆ど低下させることなく、耐ｐＨ性、耐熱性を高めた修飾ペプチドを簡易に得る方法として、ｐＨ８．５のホウ酸水溶液に、ペプチド、２価のグリシジルエーテル型の低分子およびポリエチレングリコール誘導体を同時に混在させて、室温で反応させることにより、ペプチドのアミノ基及び／または水酸基を、架橋剤を介してポリエチレングリコール誘導体で部分的に置換して修飾することが提案されている（特許文献１参照）。
【０００４】
また、蛋白質に合成高分子を結合させて修飾し、油溶性化、固定化あるいは電荷付与などの機能を蛋白質に付与する方法として、蛋白質と活性水素を有する水溶性アゾ系重合開始剤とをジアルデヒドなどの連結剤により結合させ、次いでこの結合物を重合開始剤として、疎水性あるいは水溶性のビニルモノマーの重合を行う方法が提案されている（特許文献２参照）。
【０００５】
最近では、脂質性の汚れを除くために洗剤用酵素として用いられているリパーゼ等の脂質分解酵素に、炭素数１２〜２２の脂肪族アシル基などの疎水基を平均して１〜３個結合させることにより、脂質分解酵素の性能を向上させることが報告されている（特許文献３参照）。
【０００６】
一方、本発明者らは、ポリオキシエチレン(ポリエチレングリコール)で化学修飾したタンパク質（ＰＥＧ修飾タンパク質）が有機溶媒などの非水系溶媒に可溶化することを見出し、ベンゼンのような低極性溶媒に中でもタンパク質を用いた反応が行なえること、タンパク質を用いたデバイス用の溶媒として、蒸気圧が殆どない安全な溶媒として様々な研究が行なわれてきている、イオン液体を用いることで、バイオ電池の実現の可能性を示唆した（非特許文献１参照）。
【０００７】
【特許文献１】特開平６−３１９５３７号公報
【特許文献２】特開平６−１８４１９０号公報
【特許文献３】特表２００３−５２９３２２号公報
【非特許文献１】ECO INDUSTRI Vol.10 No.4 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記実情に鑑みなされたものであり、その目的は、水溶性タンパク質を化学修飾することにより、水溶性タンパク質の利用範囲を、非水系にまで広げることが期待される、低極性溶媒に可溶な修飾タンパク質を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち、本発明の要旨は、水溶性タンパク質のアミノ基にポリアルキレンオキシド基を結合させ、次いで、極性有機溶媒中で、該タンパク質のカルボキシル基に疎水性基を結合させることを特徴とする水溶性タンパク質の低極性溶媒への可溶化法を提供することにある。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、タンパク質表面の疎水性を大きく向上させ、水に溶けず有機溶媒のみに溶解するタンパク質を簡易に作成することが出来るため、様々な種類の疎水性分子をタンパク質表面に導入することが可能となり、修飾剤の選択によってタンパク質表面の性質をデザインすることが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。タンパク質は、アミノ酸が多数つながった高分子物質であり、生物体を構成する最も基本的な物質として、さまざまな重要な働きをしている。タンパク質は、一般に、水溶性タンパク質と膜タンパク質に分けられるが、本発明においては、取り扱いの容易な水溶性タンパク質を用いる。
【００１２】
水溶性タンパク質としては、特に制限はないが、酸化還元酵素、加水分解酵素、電子伝達タンパク質などが挙げられる。具体例としては、シトクロムＰ４５０、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミン酸化酵素、アスコルビン酸酸化酵素、ビリルビンオキシダーゼ、ラッカーゼ等の酸化還元酵素、リパーゼ、リゾチーム、パパイン、セルラーゼ、アミラーゼ、キチナーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素、シトクロムｂ、シトクロムｃなどのヘムタンパク質、アズリン、シュードアズリン、プラストシアニン、アミシアニンなどのブルー銅タンパク質、ルブレドキシン、フェレドキシン等の鉄−硫黄タンパク質などの電子伝達タンパク質が挙げられる。
【００１３】
本発明の方法においては、先ず、水溶性タンパク質のアミノ基にポリアルキレンオキシド基を導入する。その方法としては、従来公知の方法を採用することができ、例えば、架橋剤とポリエチレングリコール誘導体を反応させた、アミノ基と反応性を有する活性化ポリエチレンオキシド（活性化ＰＥＯ）を用いる方法などが挙げられる。
【００１４】
活性化ＰＥＯとしては、アミノ基と反応性を有するＰＥＯであればよく、例えば、モノメトキシポリエチレングリコールの末端の水酸基に無水コハク酸などを反応させて末端にカルボキシル基を導入し、このカルボキシル基とＮ―ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の水酸基を、カルボジイミド等の脱水試薬を用いて、脱水縮合させて得られる末端イミド基を有する活性化ＰＥＯ（M.Leonardら、Biochim. Biophys. Acta, 1984）が好適に用いられる。また、架橋剤としてジグリシジルエーテル等を用いたものを使用することも出来る。
【００１５】
水溶性タンパク質と活性化ＰＥＯとの反応は、通常、ホウ酸緩衝液に水溶性タンパク質を溶解し、そこにタンパク質のアミノ基に対して、１０〜２００倍モル量、好適には１０倍モル量の活性化ＰＥＯを溶解させたホウ酸緩衝液を加えて反応させることにより行なわれる。ホウ酸緩衝液は、通常、ｐＨ８〜１０であり、常温で、１〜２４時間程度反応させる。
【００１６】
水溶液中のタンパク質の濃度は、タンパク質の分子量によるが、通常、分子量１０，０００のもので１ｍｇ／ｍｌ、分子量４０，０００であれば３ｍｇ／ｍｌ程度である。ポリアルキレンオキシド基の導入に用いられるポリエチレングリコールの分子量としては、トリエチレングリコール等の低分子のものから平均分子量５０００、一般的には平均分子量２０００迄のものが用いられる。対象とする水溶性タンパク質の性質に応じて適宜選択され、高分子量のタンパク質には高分子量の、また、修飾サイトとなるリジン残基が少ないものについても高分子量のポリエチレングリコールを用いる。
【００１７】
反応終了後、限外ろ過により溶媒を水に置換し、凍結乾燥を行なうことで、ＰＥＯ鎖を有するタンパク質（ＰＥＧ修飾タンパク質）を得ることができる。なお、ホウ酸水溶液に代えて、水／極性有機溶媒の混合系で反応を行なうこともできる。
【００１８】
本発明の方法においては、上記の様にして得られたＰＥＧ修飾タンパク質のカルボキシル基に、極性有機溶媒中で、疎水性基を結合させる。疎水性基の導入は、ＤＭＦ等の極性有機溶媒に上記のＰＥＧ修飾タンパク質を溶解し、そこにカルボキシル基と反応する官能基と疎水性鎖を有する化合物、縮合試薬、及び必要に応じて活性化剤を加えて、室温で１２〜４８時間、反応させる。
【００１９】
カルボキシル基と反応性を有する官能基と疎水性鎖とを有する化合物としては、例えば、アルキルアミン、アリールアミン、アルキルアルコール等が挙げられる。縮合試薬としては、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）等が挙げられる。活性化剤としては、例えば、Ｎ―ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアゾール（ＨＯＯＢｔ）等が挙げられる。
【００２０】
使用される極性有機溶媒としては、脱水縮合反応に通常使用される溶媒、例えば、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、ジクロルメタン、クロロホルム等が用いられる。極性有機溶媒中のタンパク質の濃度は、タンパク質の分子量により適宜選定され、分子量１０，０００のもので１ｍｇ／ｍｌ、分子量４０，０００であれば３ｍｇ／ｍｌ程度である。
【００２１】
導入する疎水性基がアルキル基の場合、アルキル基の炭素数は１〜２０、好ましくは２〜１２の範囲で適宜選定され、反応性を考慮して、ＰＥＧ修飾タンパク質中のグルタミン酸やアスパラギン酸などのカルボキシル基に対して、１０倍モル程度を用いるのが好ましい。アリール基としては、フェニル基、トリル基などが挙げられる。疎水性基が大きいほど、得られる疎水化修飾タンパク質の低極性溶媒への溶解性が増大する。
【００２２】
反応終了後、ゲルろ過クロマトグラフィー用担体などに生成液を通すことで、未反応試薬類を取り除いた後、真空乾燥を行うことで、目的とする低極性溶媒に可溶な修飾タンパク質（疎水化修飾タンパク質）を得ることができる。
【００２３】
本発明の方法で作製された疎水化修飾タンパク質は、水に不溶であり、低極性溶媒に可溶である。低極性溶媒としては、溶媒抽出に用いられる水と２相系になる溶媒、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、ジエチルエーテル等が挙げられる。また、ベンゼン、トルエン等の芳香族系溶媒、エチルメチルイミダゾリウム（トリフルオロメチル）スルフォニルイミド塩などのイオン液体も挙げられる。疎水化修飾タンパク質は、斯かる低極性溶媒に可溶であることから、この性質を利用した各種の応用が期待される。
【００２４】
低極性溶媒への溶解性の確認は、例えば、水／低極性溶媒の２相系に得られた修飾タンパク質を添加し、実質的に低極性溶媒層へのみ分配されることを、紫外・可視吸収スペクトル等により確認することで行なうことができる。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
【００２６】
比較例１
モノメトキシトリエチレングリコールの末端の水酸基に無水コハク酸を反応させて末端にカルボキシル基を導入した。導入したカルボキシル基とＮ―ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の水酸基を、脱水試薬としてカルボジイミドを用いて、脱水縮合させて、アミノ基と反応性を有する活性化トリエチレンオキシド（活性化ＴＥＧ）を得た。
【００２７】
シトクロムｃ（cytc）を０．０５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．２）に溶解し、そこにcytcに対して２００倍モル量の活性化ＴＥＧを溶解させた０．０５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．２）をゆっくり滴下した。１時間反応させた後、限外ろ過により溶媒を水に置換し、凍結乾燥を行なって、ＴＥＧ鎖を有するタンパク質（ＴＥＧ修飾cytc）を得た。
【００２８】
実施例１
比較例１において得られたＰＥＧ修飾cytcを０．１ｍＭになるようにジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、そこに、ヘキシルアミン、ＮＨＳ、及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を夫々２００ｍＭに成るように加えた。室温で２４時間反応させた後、ゲルろ過クロマトグラフィー用担体（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０；アマシャムバイオサイエンス社商品名）を用いて未反応試薬類を取り除いた。真空乾燥を行い、ＰＥＯ／アルキル修飾タンパク質（ＴＥＧ／Ｃ６修飾cytc）を得た。
【００２９】
比較例１（ＴＥＧ修飾cytc）及び実施例１（ＴＥＧ／Ｃ６修飾cytc）で得たサンプルについて溶解性の評価を行なった。ジクロロメタン１ｍＬ中にサンプル１ｍｇを加えて室温で５分間ゆっくり攪拌した後、目視により評価を行なった結果、アルキル鎖を修飾していないＴＥＧ修飾cytcはジクロロメタンに溶解しなかったが、アルキルアミンを修飾したＴＥＧ／Ｃ６修飾cytcは、ジクロロメタンに溶解した。
【００３０】
次いで、ジクロロメタンに溶解したＴＥＧ／Ｃ６修飾cytcのジクロロメタン溶液に水１ｍＬを加え、数回転倒して混合した後、静置して２層分離して、紫外・可視吸収スペクトルにより、ＴＥＧ／Ｃ６修飾cytcは上の水層には溶解しないことを確認した。
この結果から、疎水性分子であるアルキルアミンを表面に化学修飾することにより、疎水性cytcを作製できていることが分かる。
【００３１】
ジクロロメタン１ｍＬ中にＴＥＧ／Ｃ６修飾cytc１ｍｇを溶解し、波長４１３．１−ｎｍのレーザーを用い、室温で共鳴ラマンスペクトル測定をおこなった。得られたＴＥＧ／Ｃ６修飾cytcの共鳴ラマンスペクトルを、化学修飾していないcytcの水溶液中で測定した共鳴ラマンスペクトルと比較した。それぞれのラマンバンドの大きなシフトが見られなかったことから、ジクロロメタンなどの低極性溶媒中でも、活性中心の構造に変化がないことが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明によれば、タンパク質表面の疎水性を大きく向上させ、水に溶けず有機溶媒のみに溶解するタンパク質を作成することが出来るので、修飾剤の選択によってタンパク質表面の性質をデザインすることが出来、水・有機溶媒の２相系を用いて抽出や洗浄が行なえる。また、水に難溶な物質（スチレン、アルキル等）を基質とする酵素反応を有機溶媒中で行なう場合への応用として、生産物が水溶性である場合、生産物のみを水で抽出することが可能となる。