(57)【要約】【課題】より正確にアレルの判定を行うことが可能なプログラム、当該プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体、及び多型アレル判定方法を提供する。【解決手段】多型のアレルの判定処理をコンピュータに行わせるための、多型アレル判定プログラムであって、蛍光検出を用いた多型検出法を行って得られる、アレル判定すべき多型について測定された蛍光強度の経時変化を表す反応曲線のデータと、反応曲線がポジティブであると想定した場合の、プラトー時間の基準量とプラトー後の蛍光強度の基準量とのデータが少なくとも与えられることにより、アレル判定すべき反応曲線のデータが、多型が検出されたことを示すデータであるかどうかを、時間の基準量と、蛍光強度の基準量とに基づいて判定することを実行することを含む判定工程を行う、多型アレル判定プログラム。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多型のアレルの判定処理をコンピュータに行わせるための、多型アレル判定プログラムであって、
アレル判定すべき多型を含む標的核酸に対し、蛍光検出を用いた多型検出法を行うことによって得られる、前記アレル判定すべき多型について測定された蛍光強度の経時変化を表す反応曲線C_measのデータを含む、反応曲線のデータと、
前記アレル判定すべき多型の塩基が認識されることに起因する蛍光強度の有意な上昇が起こると想定した場合の、蛍光強度上昇開始から終了までの時間の基準量と、蛍光強度上昇終了後の蛍光強度の基準量とのデータと、が少なくとも与えられることにより、
前記アレル判定すべき反応曲線C_measのデータが、多型の塩基が認識されたことに起因して蛍光強度が有意に上昇したことを示すデータであるかどうかを、前記時間の基準量と、前記蛍光強度の基準量とに基づいて判定することを実行することを含む判定工程を行うことによって、前記アレル判定すべき反応曲線C_measのデータから多型のアレルを判定する処理をコンピュータに行わせるための、多型アレル判定プログラム。
【請求項２】
前記反応曲線は、補正処理が行われたものである、請求項１に記載の多型アレル判定プログラム。
【請求項３】
前記アレル判定すべき多型を含む標的核酸として、核酸増幅法を行うことにより得られる増幅産物が用いられる場合に、
・前記反応曲線のデータは、
核酸増幅反応及び多型検出反応の両方に関するポジティブコントロール部位について、或いは、多型検出反応に関するポジティブコントロール部位について、前記多型検出法を行うことによって得られる反応曲線C_contのデータをさらに含み、
・前記時間の基準量のデータは、
前記ポジティブコントロールの反応曲線C_contにおける、蛍光強度上昇開始から終了までの時間T_cont、及び、
前記アレル判定すべき反応曲線C_measにおける、蛍光強度上昇開始から終了までの時間T_measに対して定められる閾値であって、前記時間T_contから導かれる時間の閾値T_th_cont、を含み、且つ、
・前記蛍光強度の基準量のデータは、
前記ポジティブコントロールの反応曲線C_contにおける、蛍光強度上昇終了後の蛍光強度I_cont、及び、
前記アレル判定すべき反応曲線C_measにおける、蛍光強度上昇終了後の蛍光強度I_measに対して定められる閾値であって、前記時間I_contから導かれる蛍光強度の閾値I_th_contを含む、請求項１又は２に記載の多型アレル判定プログラム。
【請求項４】
・前記時間の基準量のデータは、
一方のアレル１の反応曲線C1_measにおける蛍光強度上昇開始から終了までの時間T 1_measに対して定められる閾値であって、他方のアレル２の蛍光強度上昇開始から終了までの時間T2_measを考慮して定められる時間の閾値T1_th_alle、及び、
他方のアレル２の反応曲線C2_measにおける蛍光強度上昇開始から終了までの時間T 2_measに対して定められる閾値であって、一方のアレル１の蛍光強度上昇開始から終了までの時間T1_measを考慮して定められる時間の閾値T2_th_alle、を含み、且つ、
・前記蛍光強度の基準量のデータは、
一方のアレル１の反応曲線C1_measにおける蛍光強度上昇終了後の蛍光強度I1_measに対して定められる閾値であって、他方のアレル２の蛍光強度上昇終了後の蛍光強度I2_measを考慮して定められる蛍光強度の閾値I1_th_alle、及び、
他方のアレル２の反応曲線C2_measにおける蛍光強度上昇終了後の蛍光強度I2_measに対して定められる閾値であって、一方のアレル１の蛍光強度上昇終了後の蛍光強度I1_measを考慮して定められる蛍光強度の閾値I2_th_alle、を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の多型アレル判定プログラム。
【請求項５】
前記アレル判定すべき多型を含む標的核酸として、３以上の複数のアレル判定すべき部位を同時に核酸増幅することにより得られる増幅産物が用いられる場合に、
前記判定工程によって、前記アレル判定すべき反応曲線C_measのデータのうちの、多型の塩基が認識されたことに起因して蛍光強度が有意に上昇したことを示すデータであることが判定されたデータにおける、蛍光強度上昇終了後の蛍光強度の偏差I_dev、蛍光強度上昇終了後の蛍光強度の標準偏差I_sd、及び、前記偏差I_devに対して定められる閾値であって、前記蛍光強度の標準偏差I_sdから導かれる偏差の閾値I_th_dev、がさらに与えられることにより、
判定結果の信頼性について調べることを実行することを含むチェック工程をさらに行う、請求項１〜４のいずれか１項に記載の多型アレル判定プログラム。
【請求項６】
前記多型は、一塩基多型である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の多型アレル判定プログラム。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の多型アレル判定プログラムを記録した、コンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【請求項８】
多型のアレルの判定を、コンピュータを用いて行う方法であって、
アレル判定すべき多型を含む標的核酸に対し、蛍光検出を用いた多型検出法を行うことによって得られる、前記アレル判定すべき多型について測定された蛍光強度の経時変化を表す反応曲線C_measのデータと、
前記アレル判定すべき多型の塩基が認識されることに起因する蛍光強度の有意な上昇が起こると想定した場合の、蛍光強度上昇開始から終了までの時間の基準量と、蛍光強度上昇終了後の蛍光強度の基準量とのデータと、が少なくとも与えられることにより、
前記アレル判定すべき反応曲線C_measのデータが、多型の塩基が認識されたことに起因して蛍光強度が有意に上昇したことを示すデータであるかどうかを、前記時間の基準量と、前記蛍光強度の基準量とに基づいて判定することを実行することを含む判定工程を行うことによって、前記アレル判定すべき反応曲線C_measのデータから多型のアレルを判定する、多型アレル判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多型のアレルを判定するためのプログラム（以下、単に多型アレル判定プログラムと記載する場合がある）、当該プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体、及び、多型アレル判定方法に関する。特に、本発明は、一塩基多型（SNP）を検出する反応からSNPのアレルを判定するためのプログラム、当該プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体、及び、SNPを検出反応からSNPのアレルを判定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子多型を利用して病気の罹りやすさなどを予測する方法又は装置として、下記のようなものが提案されている。
【０００３】
例えば、特表２００２−５３３０９６号公報には、患者が敗血症に罹りやすいか否か及び／又は敗血症に急速に進行しやすいか否かを決定するために、患者から核酸サンプルを採取し、該サンプル中におけるパターン２対立遺伝子、又はパターン２対立遺伝子と連鎖不平衡であるマーカー遺伝子を検出し、パターン２対立遺伝子又はパターン２対立遺伝子と連鎖不平衡であるマーカー遺伝子が検出されれば該患者が敗血症に罹りやすいと判定することが記載されている。
【０００４】
また例えば、特開２００１−２９９３６６号公報には、ヒトのｆｌｔ−１遺伝子中の１又はそれ以上の単一ヌクレオチド多型性の診断のために、ヒトの核酸の１又はそれ以上の位置の配列を決定し、ｆｌｔ−１遺伝子中の多型性を参照することにより、そのヒトの体質を決定することが記載されている。
【０００５】
ＳＮＰ部位の塩基を判別する、いわゆるタイピングについては多くの手法が報告されている。そのうちの代表的なものは次の方法である。
【０００６】
特開２００２−３００８９４号公報によると、比較的に少量のゲノムＤＮＡを用いて数十万箇所に及ぶＳＮＰ部位についてタイピングを行なうために、少なくとも一つの一塩基多型部位を含む複数の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ及び複数対のプライマーを用いて同時に増幅し、増幅した複数の塩基配列を用いて、当該塩基配列に含まれる一塩基多型部位の塩基をタイピング工程により判別することが記載されている。そのタイピング工程としては、インベーダ法又はタックマンＰＣＲ法が用いられる。
【特許文献１】特表２００２−５３３０９６号公報
【特許文献２】特開２００１−２９９３６６号公報
【特許文献３】特開２００２−３００８９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来からの方法では、以下の問題がある。
遺伝子多型を診断する際、タイピング反応には時間がかかることが通常である。従来、蛍光を用いたタイピング反応は蛍光検出値の絶対値に基づいて行なわれてきた。具体的には、例えば、縦軸に一方のアレルに対する検出反応による蛍光強度、横軸に他方のアレルに対する検出反応の蛍光強度をドットプロットし、それぞれの軸においてポジティブ及びネガティブを分ける値を設定することにより、タイピングを行う。
【０００８】
この場合、蛍光のベース値との有意差がでるまで測定を続けると３０分から２時間を要することがある。また蛍光検出値の絶対値を求めるには蛍光のベース値を求める必要があるが、ベース値は光源の強度変動などの要因で経時変化をする。そのため、標識蛍光からの蛍光強度検出とともにベース値となる蛍光強度を検出するために、標識蛍光とは別のベース値検出用の蛍光色素が必要となる。そのベース値検出用の蛍光色素も標識蛍光と同様に高価であるため、コスト高を招くおそれがある。
【０００９】
そこで、例えば蛍光強度の上昇速度（反応曲線の傾き）に基づいてアレルを判定することも考えることができる。しかしながら、その場合にも、以下のいくつかの問題が考えられる。ここでは、タイピング反応としてインベーダ反応を用いたとして述べる。インベーダ反応では、ＳＮＰなどの検出部位の配列とプローブ配列とがマッチしていればポジティブ、ミスマッチであればネガティブと判定される。
【００１０】
PCRの増幅産物をインベーダ反応の試料として用いる場合、インベーダ反応の蛍光強度の上昇速度は、PCR増幅産物量に依存する。つまり、増幅産物が多いと蛍光強度の傾きは大きく、逆にPCR増幅産物が少ないと蛍光強度の傾きが小さくなる。しかし、同じ傾きであっても上昇時間が長ければポジティブと判断される可能性は高く、逆に蛍光強度が低ければ、ネガティブと判断される可能性が高くなる。このように、判定を間違える可能性があるため、たとえば臨床検査装置においてこのような基準で判定が行われると、誤診断のもととなる。
【００１１】
また、とくにマルチプレックスPCRでは複数の部位を同時に増幅するため、通常、それぞれの部位で増幅量が異なる。これに伴い、増幅部位によってインベーダ反応の蛍光強度の上昇速度も異なる。また、試料の遺伝子配列がインベーダプローブの配列とマッチしていない場合でも、インベーダ反応を進める条件下におくと、徐々に蛍光強度が上昇してくる場合もある。従って、蛍光強度の上昇速度が遅い場合に、プローブの配列はマッチしているがPCR増幅産物量自体が少ない場合と、プローブの配列がミスマッチである場合との両方の可能性がある。このため、正しい判定を行うことは難しい。
【００１２】
さらに、測光時のバラつきが判定結果に影響を与える場合も考えられる。試料の遺伝子配列がインベーダプローブの配列とマッチしていない場合でも、インベーダ反応を進める条件下におくと、徐々に蛍光強度が上昇してくる。そして十分な時間が経過した後では、ポジティブでもネガティブでも、蛍光強度はある一定の値におさまることになる。これはPCR反応での増幅量には依存せず、インベーダ反応で使用するフレット試薬の濃度に依存する。しかし、現実には蛍光強度にバラつきがある。これは、装置の測定誤差と考えられる。この測定誤差の範囲を超えて蛍光強度にバラつきがある場合は、測光時に装置で何らかの不具合が起きていることが分からなければならない。蛍光強度の傾きのみを考慮して判定を行う場合は、このような不具合があるのかどうかは判断できない。
【００１３】
そこで本発明の目的は、より正確にアレルの判定を行うことが可能な多型アレル判定プログラム、当該プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体、及び、多型アレル判定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、以下の（１）〜（６）の発明を含む。
下記（１）は、蛍光検出を用いた多型検出法において得られた、蛍光強度の経時変化の反応曲線から、コンピュータを用いて多型アレルを判定する場合に用いられるプログラムである。本発明のプログラムにおいては、蛍光強度上昇開始から終了までの時間と、蛍光強度上昇終了後の蛍光強度とを、アレルを判定する際の基準として用いることを特徴とする。
【００１５】
（１）
多型のアレルの判定処理をコンピュータに行わせるための、多型アレル判定プログラムであって、
アレル判定すべき多型を含む標的核酸に対し、蛍光検出を用いた多型検出法を行うことによって得られる、前記アレル判定すべき多型について測定された蛍光強度の経時変化を表す反応曲線C_measのデータを含む、反応曲線のデータと、
前記アレル判定すべき多型の塩基が認識されることに起因する蛍光強度の有意な上昇が起こると想定した場合の、蛍光強度上昇開始から終了までの時間の基準量と、蛍光強度上昇終了後の蛍光強度の基準量とのデータと、が少なくとも与えられることにより、
前記アレル判定すべき反応曲線C_measのデータが、多型の塩基が認識されたことに起因して蛍光強度が有意に上昇したことを示すデータであるかどうかを、前記時間の基準量と、前記蛍光強度の基準量とに基づいて判定することを実行することを含む判定工程を行うことによって、前記アレル判定すべき反応曲線C_measのデータから多型のアレルを判定する処理をコンピュータに行わせるための、多型アレル判定プログラム。
【００１６】
本発明においては、蛍光強度の上昇が終了した状態を、しばしばプラトーと表現する。プラトーの状態においては、蛍光強度がほぼ頭打ちになる。そして、蛍光強度上昇開始から終了までの時間、すなわち蛍光強度上昇開始からプラトーに達するまでの時間を、しばしばプラトー時間と記載する。
【００１７】
さらに、アレル判定すべき多型について測定された反応曲線C_measのデータが、実際に多型の塩基が認識されたことに起因して蛍光強度が有意に上昇したことを示すデータであると判定することができる場合を、ポジティブと記載する。ポジティブであると想定した場合の、プラトー時間及びプラトー後の蛍光強度の基準量の条件を満たせば、反応曲線C_measのデータがポジティブであると判定することができ、当該基準量の条件を満たさなければ、反応曲線C_measのデータがポジティブでないと判定することができる。
【００１８】
ポジティブでないとは、実際に多型の塩基が認識されなかったことが原因で、ポジティブの場合のような有意な蛍光強度の上昇が起こらなかった場合（ネガティブと記載する）、と、ポジティブかネガティブか不明である場合（判定不能と記載する）とが含まれる。
【００１９】
アレル判定すべき多型部位における全てのアレル（通常２つのアレル）についてポジティブの結果であれば、当該アレルはヘテロ型で判定され、ポジティブとネガティブとの両方の結果であれば、当該アレルはホモ型で判定される。
【００２０】
（２）
前記反応曲線のデータは、補正処理が行われたものである、（１）に記載の多型アレル判定プログラム。
【００２１】
下記（３）においては、本発明のプログラムが、核酸増幅反応によって得られる増幅産物を試料とした多型検出方法に用いられる場合に、ポジティブコントロールのデータを判断材料に用いる形態に向けられる。ポジティブコントロールのデータとは、ポジティブコントロール部位における反応曲線C_contから得られるプラトー時間及びプラトー後の蛍光強度である。ポジティブコントロールのデータを用いることによって、ポジティブコントロール部位とアレル判定すべき部位との間で増幅産物量を相対的に見積もることができ、増幅産物量が反応曲線に与える影響を考慮することができる。このように、増幅産物量の観点から判定を行うことによって、判定をより正しく行うことができる。
【００２２】
（３）
前記アレル判定すべき多型を含む標的核酸として、核酸増幅法を行うことにより得られる増幅産物が用いられる場合に、
・前記反応曲線のデータは、
核酸増幅反応及び多型検出反応の両方に関するポジティブコントロール部位について、或いは、多型検出反応に関するポジティブコントロール部位について、前記多型検出法を行うことによって得られる反応曲線C_contのデータをさらに含み、
・前記時間の基準量のデータは、
前記ポジティブコントロールの反応曲線C_contにおける、蛍光強度上昇開始から終了までの時間T_cont、及び、
前記アレル判定すべき反応曲線C_measにおける、蛍光強度上昇開始から終了までの時間T_measに対して定められる閾値であって、前記時間T_contから導かれる時間の閾値T_th_cont、を含み、且つ、
・前記蛍光強度の基準量のデータは、
前記ポジティブコントロールの反応曲線C_contにおける、蛍光強度上昇終了後の蛍光強度I_cont、及び、
前記アレル判定すべき反応曲線C_measにおける、蛍光強度上昇終了後の蛍光強度I_measに対して定められる閾値であって、前記時間I_contから導かれる蛍光強度の閾値I_th_contを含む、（１）又は（２）に記載の多型アレル判定プログラム。
【００２３】
核酸増幅反応及び多型検出反応の両方に関するポジティブコントロール部位について、多型検出法を行うことによって得られる場合の反応曲線C_contは、蛍光を用いた多型検出反応で有意に蛍光強度が上昇することが分かっている部位（すなわちコントロール部位）と、アレル判定すべき多型部位とを同時に核酸増幅し、且つ、それにより得られる、コントロール部位を含むDNA断片と、アレル判定すべき多型部位を含むDNA断片とを、同時に多型検出する反応によって得られる。
【００２４】
多型検出反応に関するポジティブコントロール部位について、多型検出法を行うことによって得られる場合の反応曲線C_contは、コントロール部位を含むDNA断片を、別途核酸増幅して得られた、アレル判定すべき多型部位を含むDNA断片と同時に多型検出する反応によって得られる。
【００２５】
上記時間の閾値T_th_contは、プラトー時間T_measについて、ポジティブとポジティブでないとを分けるために定められる閾値である。一方、蛍光強度の閾値I_th_contは、プラトー後の蛍光強度I_measについて、ポジティブとポジティブでないとを分けるために定められる閾値である。両方の閾値を判定要素とすることによって、測定で得られたアレル判定すべき反応曲線C_measのデータが、ポジティブであるか、ポジティブでないかを判定する。
【００２６】
本発明においては、上記（３）が後述の（４）の形態と組み合わされる場合、ポジティブコントロールを用いた判定を、しばしば予備判定と記載する。
【００２７】
下記（４）は、対立アレルの反応曲線（アレル１の反応曲線C1_meas及びアレル２の反応曲線C2_meas）のデータを判断材料に用いる形態に向けられる。すなわちこの形態においては、アレル１の反応曲線C1_measについてはアレル２の反応曲線C2_measの反応曲線におけるプラトー時間及びプラトー後の蛍光強度を考慮し、アレル２の反応曲線C2_measについては、アレル１の反応曲線C1_measにおけるプラトー時間及びプラトー後の蛍光強度を考慮することによって、判定をより正しく行うことができる。
【００２８】
（４）
・前記時間の基準量のデータは、
一方のアレル１の反応曲線C1_measにおける蛍光強度上昇開始から終了までの時間T 1_measに対して定められる閾値であって、他方のアレル２の蛍光強度上昇開始から終了までの時間T2_measを考慮して定められる時間の閾値T1_th_alle、及び、
他方のアレル２の反応曲線C2_measにおける蛍光強度上昇開始から終了までの時間T 2_measに対して定められる閾値であって、一方のアレル１の蛍光強度上昇開始から終了までの時間T1_measを考慮して定められる時間の閾値T2_th_alle、を含み、且つ、
・前記蛍光強度の基準量のデータは、
一方のアレル１の反応曲線C1_measにおける蛍光強度上昇終了後の蛍光強度I1_measに対して定められる閾値であって、他方のアレル２の蛍光強度上昇終了後の蛍光強度I2_measを考慮して定められる蛍光強度の閾値I1_th_alle、及び、
他方のアレル２の反応曲線C2_measにおける蛍光強度上昇終了後の蛍光強度I2_measに対して定められる閾値であって、一方のアレル１の蛍光強度上昇終了後の蛍光強度I1_measを考慮して定められる蛍光強度の閾値I2_th_alle、を含む、（１）〜（３）のいずれかに記載の多型アレル判定プログラム。
【００２９】
本発明においては、上記時間の閾値T1_th_alle及びT2_th_alleを、まとめて対立アレルプラトー時間閾値と記載する場合がある。対立アレルプラトー時間閾値T1_th_alle及びT2_th_alleは、プラトー時間T1_meas及びT2_measについて、ポジティブとネガティブとを分ける閾値である。  
【００３０】
同様に、上記蛍光強度の閾値I1_th_alle及びI2_th_alleを、まとめて対立アレル蛍光強度閾値と記載する場合がある。対立アレル蛍光強度閾値は、対立アレルポジティブ蛍光強度閾値I1_th+_alle及びI2_th+_alleと、対立アレルネガティブ蛍光強度閾値I1_th-_alle及びI2_th-_alleとを含む。
対立アレルポジティブ蛍光強度閾値I1_th+_alle及びI2_th+_alleは、プラトー後の蛍光強度I1_meas及びI2_measについて、ポジティブと不明（すなわちポジティブでもネガティブでもない）とを分けるために定められる閾値である。一方、対立アレルネガティブ蛍光強度閾値I1_th-_alle及びI2_th-_alleは、プラトー後の蛍光強度I1_meas及びI2_measについて、ネガティブと不明とを分けるために定められる閾値である。
【００３１】
これらの閾値を判定要素とすることによって、アレル判定すべき反応曲線C1_meas及びC2_measのデータが、ポジティブであるか、ネガティブであるか、或いはさらに不明であるかを判定する。
【００３２】
本発明においては、上記（４）が既述の（３）の形態と組み合わされる場合、対立アレルのデータを用いた判定を、しばしば本判定と記載する。
【００３３】
さらに本発明のプログラムが、複数の部位についてのマルチプレックス増幅反応による増幅産物を試料とした多型検出方法に用いられる場合、それぞれの部位の増幅効率をあらかじめ求めて、パラメータ化しておくことが好ましい。アレル判定の際には、このパラメータを考慮することができる。
【００３４】
下記（５）は、本発明のプログラムが、３以上の複数のアレル判定すべき部位について同時に増幅反応を行うことによって得られた増幅産物を試料とした多型検出方法に用いられる場合に、ポジティブと判定された結果のみについて、測定装置の測定誤差の範囲を超えて蛍光強度にばらつきがあるかどうかをさらに判断することによって、ポジティブ判定結果の信頼性を調べる形態に向けられる。
【００３５】
（５）
前記アレル判定すべき多型を含む標的核酸として、３以上の複数のアレル判定すべき部位を同時に核酸増幅することにより得られる増幅産物が用いられる場合に、
前記判定工程によって、前記アレル判定すべき反応曲線C_measのデータのうちの、多型の塩基が認識されたことに起因して蛍光強度が有意に上昇したことを示すデータであることが判定されたデータにおける、蛍光強度上昇終了後の蛍光強度の偏差I_dev、蛍光強度上昇終了後の蛍光強度の標準偏差I_sd、及び、前記偏差I_devに対して定められる閾値であって、前記蛍光強度の標準偏差I_sdから導かれる偏差の閾値I_th_dev、がさらに与えられることにより、
判定結果の信頼性について調べることを実行することを含むチェック工程をさらに行う、（１）〜（４）のいずれかに記載の多型アレル判定プログラム。
【００３６】
偏差の閾値I_th_devは、偏差I_devに対して、ばらつきが大きいか否かを分けるために定められる閾値である。
【００３７】
本発明の多型アレル判定プログラムを好ましく適用することができる好ましい多型検出方法としては、インベーダ法が挙げられる。
【００３８】
（６）
前記多型は、一塩基多型である、（１）〜（５）のいずれかに記載の多型アレル判定プログラム。
【００３９】
下記（７）は、上記多型アレル判定プログラムを記録した記録媒体に関する。
（７）
（１）〜（６）のいずれかに記載の多型アレル判定プログラムを記録した、コンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【００４０】
下記（８）は、多型アレル判定方法である。当該方法は、上記（１）〜（６）に記載の多型アレル判定プログラムによって実行することができる。
（８）
多型のアレルの判定を、コンピュータを用いて行う方法であって、
アレル判定すべき多型を含む標的核酸に対し、蛍光検出を用いた多型検出法を行うことによって得られる、前記アレル判定すべき多型について測定された蛍光強度の経時変化を表す反応曲線C_measのデータと、
前記アレル判定すべき多型の塩基が認識されることに起因する蛍光強度の有意な上昇が起こると想定した場合の、蛍光強度上昇開始から終了までの時間の基準量と、蛍光強度上昇終了後の蛍光強度の基準量とのデータと、が少なくとも与えられることにより、
前記アレル判定すべき反応曲線C_measのデータが、多型の塩基が認識されたことに起因して蛍光強度が有意に上昇したことを示すデータであるかどうかを、前記時間の基準量と、前記蛍光強度の基準量とに基づいて判定することを実行することを含む判定工程を行うことによって、前記アレル判定すべき反応曲線C_measのデータから多型のアレルを判定する、多型アレル判定方法。
【発明の効果】
【００４１】
本発明により、より正確にアレルの判定を行うことが可能な多型アレル判定プログラム、当該プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体、及び、多型アレル判定方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
＜１．システムの全体構成と動作概要＞
以下、本発明の実施形態について説明する本発明のプログラムは、コンピュータにインストールされて実行される。図１は、当該コンピュータの全体構成の一例を示すブロック図である。当該コンピュータは、入力部（I）、処理部（II）、記憶部（III）、及び出力部（IV）の機能を有し、スタンドアローンのコンピュータ、あるいはクライアント／サーバ形式のコンピュータによって実現される。図１に示される各要素の機能は周知のものである。  
【００４３】
入力部（I）には、測定データ（蛍光強度の経時変化を示す反応曲線のデータ）が入力され、記憶部（III）の所定の領域に格納される。測定データからは、処理部（II）において、蛍光強度上昇開始から終了までの時間（プラトー時間）と、蛍光強度上昇終了後（プラトー後）の蛍光強度のデータとが抽出され、記憶部（III）の所定の領域に格納される。
【００４４】
測定データとして入力される反応曲線が、ポジティブであるか否かを判断するための、基準量が用意される。具体的には、アレル判定すべき多型の塩基が認識されることに起因する蛍光強度の有意な上昇が起こると想定した場合の、プラトー時間に関する基準量と、プラトー後の蛍光強度に関する基準量を用意する。これら基準量は、経験的或いは統計的にあらかじめ定められた量や、そのような量を勘案することによって、記憶部（III）に記憶された上記プラトー時間及びプラトー後の蛍光強度の量から処理部（II）において算出された量などが含まれる。これらの基準量は、記憶部（III）の所定の領域に格納される。
【００４５】
反応曲線のデータ及び基準量が処理部（II）に呼び出されることによって、反応曲線のプラトー時間とプラトー後の蛍光強度とを、それぞれプラトー時間の基準値及びプラトー後の蛍光強度の基準値に照らし合わせ、反応曲線が、ポジティブであるか否かを判断する処理が行われる。その結果は、記憶部（III）の所定の領域に格納される。記憶部（III）に格納された結果は、出力部（IV）に出力される。
【００４６】
＜２．ハードウェア構成＞
図１の処理部は、中央演算処理装置ＣＰＵを用いて実現されうる。他の構成要素としては、キーボードが入力部として、ディスプレイが出力部として、ＲＡＭなどの主記憶装置及びハードディスクなどの補助記憶装置が記憶部として実現されうる。この場合の、本発明がインストールされたコンピュータのハードウェア構成を図２に示す。図２において、ＣＰＵ１には、ＲＡＭ２、キーボード３、ディスプレイ４、及びハードディスク５が接続されている。ハードディスクには、多型アレル判定プログラム記憶部６、データ記憶部７、及びオペレーティングシステム（ＯＳ）記憶部８などの領域があり、それぞれ、多型アレル判定プログラム、データ、ＯＳが記憶されている。多型アレル判定プログラムが起動されると、当該プログラムがハードディスク５からＲＡＭ２にロードされた後、ＣＰＵ１に送られて判定のための処理が行われ、その結果がＲＡＭ２に書き戻される。この一連の動作により、本発明の機能が奏されるようになっている。
【００４７】
＜３．多型アレル判定処理実施形態＞
＜３−１．メイン処理＞
本発明においては、プラトー時間とプラトー後の蛍光強度を考慮することによりアレル判定を行うことを必須とする。本発明においては、まず、測定データ（蛍光強度の経時変化を示す反応曲線）を用意する。反応曲線は、アレルごとに波長の異なる蛍光が検出されるような条件下で、蛍光検出を用いた多型検出法を行うことによって得られるものである。従って、反応曲線は、時間の経過により蛍光強度が上昇していく形状や、一定時間経過後に蛍光強度が頭打ち（プラトー）となる形状を有するものが観察される。測定データにおいては、１つの多型部位に対してアレルの数だけの反応曲線が含まれる。アレルを判定すべき多型部位についての測定により得られた反応曲線をC_measと記載する。通常、１つの多型部位に対してアレル１に対応する反応曲線とアレル２に対応する反応曲線とが含まれる。アレルを判定すべき多型部位についての反応曲線C_measにおいて、アレル１についてのものをC1_meas、アレル２についてのものをC2_meas、と記載する。
【００４８】
反応曲線のデータは、記憶部（III）の所定の領域に格納される。反応曲線のデータとしては、反応曲線C_measと、反応曲線C_measから得られる、蛍光強度上昇開始から終了までの時間（プラトー時間）T_meas、及び蛍光強度上昇終了後（プラトー後）の蛍光強度I_measに関する量のデータとが少なくとも含まれてよい。時間T_measは、アレル１についてはT1_meas、アレル２についてはT2_measと記載する。蛍光強度I_measは、アレル１についてはI1_measアレル２についてはI2_measと記載する。
【００４９】
さらに本発明においては、反応曲線C_measがポジティブであるか否かを判断するための基準量を用意する。具体的には、アレル判定すべき多型の塩基が認識されることに起因する蛍光強度の有意な上昇が起こる（すなわちポジティブである）と想定した場合の、プラトー時間に関する基準量と、プラトー後の蛍光強度に関する基準量とを用意する。
これら基準量のデータは、記憶部（III）の所定の領域に格納される。基準量には、経験的或いは統計的にあらかじめ定められた量や、そのような量を勘案することによって、上記プラトー時間T_meas及びプラトー後の蛍光強度I_measの量からそれぞれ算出された量などが含まれてよい。
【００５０】
格納された反応曲線のデータ及び基準量のデータは、処理部（II）によって呼び出される。処理部（II）においては、測定データのプラトー時間T_measとプラトー後の蛍光強度I_measとを、それぞれ、プラトー時間の基準値とプラトー後の蛍光強度の基準値とに照らし合わせ、反応曲線が、ポジティブであるか否かを判断する処理が行われる。なお、ポジティブでない場合は、ネガティブである場合と、ポジティブでもネガティブでもない（すなわち判定不能である）場合とが含まれる。得られたアレル判定結果は、記憶部（III）の所定の領域に格納され、出力部（IV）に表示される。
【００５１】
＜３−２．チップ情報ファイルを用いる形態＞
測定データが、複数の多型についての反応曲線のデータを含む場合、蛍光を用いた多型検出法は、複数のウェルを有するチップを用い、ウェル中に測定すべきサンプルを収容して行われると良い。この場合、チップにおいて、各々のウェルが、アレルを判定すべきサンプルすなわち検体のウェル（後述のフローチャートの説明などにおいては、データのウェルと記載する場合がある）か、何も収容されていないウェル（後述のフローチャートの説明などにおいては、ブランクのウェルと記載する場合がある）か、或いは、ポジティブコントロール部位のデータが含まれている場合はコントロールのウェルか、をデータ化したファイルが、記憶部（III）の所定の領域に格納されてよい。このファイルを、チップ情報ファイルと記載する。処理部（II）は、アレル判定処理の際に、このファイルを呼び出し、書き込まれたチップ情報に基づいて、複数のデータの処理を行うことができる。この処理は、例えば、後述の図４〜図１２のフローチャートに記載されるような処理を実行することによって実現される。
【００５２】
＜３−３．補正処理を行う形態＞
反応曲線は、補正処理が行われたものであることが好ましい。補正処理は、反応曲線から、反応曲線の傾き、プラトー時間、プラトー後の蛍光強度、などの量を抽出しやすいようにノイズ除去などの目的で行われるものであれば、どのような処理でもよい。具体的には、平均化処理や中間値フィルタ処理などが挙げられる。この場合、補正前の反応曲線が処理部（II）によって呼び出され、当業者に公知の補正アルゴリズムが実行される。この処理は、例えば、後述の図４のフローチャートに記載されるような処理の中に組み込まれて実現される。処理された反応曲線は記憶部（III）の所定の領域に格納される。
【００５３】
＜３−４．傾きを考慮する形態＞
基準量としては、反応曲線の傾きに関するものがさらに用意されることが好ましい。この場合、好ましくは前記３−３．に記載の補正処理が行われた反応曲線を呼び出し、処理部（II）によって傾きが求められる。この処理は、例えば、後述の図４のフローチャートに記載されるような処理の中に組み込まれて実現される。求められた傾きのデータは記憶部（III）の所定の領域に格納される。傾きのデータを用いることによって、反応曲線がプラトーになっているかどうかを判断することが容易になる。このようなプラトーの判断を行うための処理は、例えば、後述の５−５．[1][2]に記載されるようなアルゴリズムによって実現される。
【００５４】
＜３−５．ポジティブコントロールを用いる形態＞
前記３−１．に述べた、入力部（I）に入力される反応曲線のデータには、アレルを判定すべき多型部位についての反応曲線C_measに加え、ポジティブコントロール部位についての反応曲線C_contが含まれていてよい。すなわち、反応曲線のデータには、ポジティブコントロール部位についての反応曲線C_contと、反応曲線C_contから得られる、プラトー時間T_cont及びプラトー後の蛍光強度I_contに関する量のデータとがさらに含まれてよい。この形態は、アレル判定すべき多型を含む標的核酸として、核酸増幅法を行うことにより得られる増幅産物が用いられた場合に有用である。
【００５５】
ポジティブコントロール部位についての反応には、核酸増幅反応と多型検出反応との両方に関するポジティブコントロール部位を検出する反応と、多型検出反応に関するポジティブコントロール部位を検出する反応とが含まれる。
【００５６】
具体的には、核酸増幅反応と多型検出反応との両方に関するポジティブコントロール部位を検出する反応とは、蛍光を用いた多型検出反応で有意に蛍光強度が上昇することが分かっている部位（すなわちコントロール部位）と、アレル判定すべき多型部位とを同時に核酸増幅し、且つ、それにより得られる、コントロール部位を含むDNA断片と、アレル判定すべき多型部位を含むDNA断片とを、同時に多型検出する反応、を指す。
【００５７】
一方、多型検出反応に関するポジティブコントロール部位を検出する反応とは、コントロール部位を含むDNA断片を、別途核酸増幅して得られた、アレル判定すべき多型部位を含むDNA断片と同時に、多型検出する反応、を指す。
【００５８】
＜３−５−１．ポジティブコントロールのポジティブ判定＞
ポジティブコントロールのデータを判定すべきデータに適用することに先立って、処理部（II）は、記憶部（III）からポジティブコントロールの反応曲線C_contに関するデータを呼び出し、ポジティブコントロールの反応曲線C_contが、確かにポジティブであるかどうかを検証する処理をあらかじめ行っておくことが好ましい。この処理は、例えば、後述の図６のフローチャートに記載されるような処理を実行することによって実現される。ポジティブコントロールの反応曲線C_contが、確かにポジティブであるかどうかの判断基準は、後述の３−７．で述べる、ポジティブのプラトー時間の正常範囲T_rang+、及びポジティブのプラトー後の蛍光強度の正常範囲I_rang+を考慮して設定された閾値を用いることができる。判定結果は、記憶部（III）の所定の領域に格納される。
【００５９】
＜３−５−２．ポジティブコントロールのデータを考慮することによる判定すべきデータの判定＞
本発明においては、ポジティブコントロールのデータを考慮することによる判定すべきデータの判定は、後述の３−６．対立アレルのデータを考慮することによる判定すべきデータの判定と組み合わせて行われる場合、しばしば予備判定と記載される。
【００６０】
ポジティブコントロールのデータを判定すべき反応曲線C_measのデータに適用するために、判定すべきデータがポジティブかポジティブでないかを分けるための閾値を、判定のための基準量として用意する。当該閾値は、プラトー時間についての閾値T_th_contと、プラトー後の蛍光強度についての閾値I_th_contとを少なくとも含む。さらに、傾きについての同様の閾値を含んでいても良い。これら閾値は、記憶部（III）の所定の領域に格納される。
【００６１】
上記時間の閾値T_th_contは、ポジティブコントロールのデータT_contの考慮のうえ、判定すべき反応曲線C_measのプラトー時間T_measに対して、ポジティブとポジティブでないとを分けるために定められる閾値である。
一方、蛍光強度の閾値I_th_contは、ポジティブコントロールのデータI_contを考慮のうえ、判定すべき反応曲線C_measのプラトー後の蛍光強度I_measに対して、ポジティブとポジティブでないとを分けるために定められる閾値である。
【００６２】
閾値を定める処理を本発明において行う場合、当該処理は、例えば、後述の図８のフローチャートに記載されるような処理を実行することによって実現される。
【００６３】
記憶部（III）に格納された反応曲線C_measのデータ及び基準量のデータ（閾値T_th_cont及びI_th_cont）は、処理部（II）によって呼び出される。
処理部（II）においては、反応曲線C_measのプラトー時間T_measを、プラトー時間の閾値T_th_contに照らし合わせ、両者の量的関係が、T_measがT_th_contよりも小さい、或いはT_measがT_th_cont以下、であれば、ポジティブであると判断することができる。両者の量的関係がそれ以外であれば、ポジティブでないと判断することができる。
同様に、処理部（II）においては、反応曲線C_measのプラトー後の蛍光強度I_measを、プラトー後の蛍光強度の閾値I_th_contに照らし合わせ、両者の量的関係が、I_measがI_th_contよりも大きい、或いは、I_measがI_th_cont以上、であれば、ポジティブであると判断することができる。両者の量的関係がそれ以外であれば、ポジティブでないと判断することができる。
【００６４】
これらの処理は、アレル１及びアレル２の両方について行われる。すなわち、これらの処理は、アレル１の反応曲線C1_measについては、閾値T1_th_cont及びI1_th_contを用いて、アレル２の反応曲線C2_measについては、閾値T2_th_cont及びI2_th_contを用いて行われる。
【００６５】
プラトー時間T_meas及びプラトー後の蛍光強度I_measの両方がポジティブであるとの判定であれば、判定対象となったアレルについてはポジティブであると判定してよい。判定結果は、記憶部（III）の所定の領域に格納される。
【００６６】
このような、ポジティブコントロールのデータを考慮することによる判定すべきデータの判定処理は、例えば、後述の図９のフローチャート（Ｓ８０１〜Ｓ８０４）に示すような処理を実行することによって実現される。
【００６７】
上述のように、反応曲線C_measが、プラトー時間及びプラトー後の蛍光強度に関する基準量の条件を満たしているかどうかを確かめることによって、アレル判定すべき部位において、増幅反応自体が十分に起こったか否かを知ることができる。すなわち、ポジティブコントロール部位とアレル判定すべき部位との間で増幅産物量を相対的に見積もることができ、増幅産物量が反応曲線に与える影響を考慮することができる。このように、増幅産物量の観点から判定を行うことによって、判定をより正しく行うことができる。
【００６８】
＜３−６．対立アレルのデータを考慮することによる判定すべきデータの判定を行う形態＞
本発明においては、対立アレルのデータを考慮することによる判定すべきデータの判定は、前述の３−５．ポジティブコントロールのデータを考慮することによる判定すべきデータの判定と組み合わせて行われる場合、しばしば本判定と記載される。
【００６９】
一方のアレルの反応曲線のデータを、他方のアレルの反応曲線の判定に用いるために、一方のアレルの反応曲線のデータを考慮し、且つ、他方のアレルの反応曲線がポジティブか、ネガティブか、或いはどちらでもないかを分けるための閾値を、判定のための基準量として用意する。
当該閾値は、プラトー時間についての閾値（対立アレルプラトー時間閾値）T1_th_alle及びT2_th_alleと、プラトー後の蛍光強度についての閾値（対立アレル蛍光強度閾値）I1_th_alle及びI2_th_alleとを少なくとも含む。さらに、対立アレル蛍光強度閾値は、対立アレルポジティブ蛍光強度閾値I1_th+_alle及びI2_th+_alleと、対立アレルネガティブ蛍光強度閾値I1_th-_alle及びI2_th-_alleとを含む。さらに、傾きについての同様の閾値を含んでいても良い。これら閾値は、記憶部（III）の所定の領域に格納される。
【００７０】
対立アレルプラトー時間閾値T1_th_alleは、アレル２のデータT2_measを考慮のうえ、アレル１の反応曲線C1_measのプラトー時間T1_measに対して、ポジティブと不明とを分けるために定められる閾値である。
同様に、対立アレルプラトー時間閾値T2_th_alleは、アレル１のデータT1_measを考慮のうえ、アレル２の反応曲線C2_measのプラトー時間T2_measに対して、ポジティブと不明とを分けるために定められる閾値である。
【００７１】
対立アレルポジティブ蛍光強度閾値I1_th+_alleは、アレル２のデータI2_measを考慮のうえ、アレル１の反応曲線C1_measのプラトー後の蛍光強度I1_measに対して、ポジティブと不明（すなわちポジティブでもネガティブでもない）とを分けるために定められる閾値である。
同様に、対立アレルポジティブ蛍光強度閾値I2_th+_alleは、アレル１のデータI1_measを考慮のうえ、アレル２の反応曲線C2_measのプラトー後の蛍光強度I2_measに対して、ポジティブと不明とを分けるために定められる閾値である。
【００７２】
対立アレルネガティブ蛍光強度閾値I1_th-_alleは、アレル２のデータI2_measを考慮のうえ、アレル１の反応曲線C1_measのプラトー後の蛍光強度I1_measに対して、ネガティブと不明とを分けるために定められる閾値である。
同様に、対立アレルネガティブ蛍光強度閾値I2_th-_alleは、アレル１のデータI1_measを考慮のうえ、アレル２の反応曲線C2_measのプラトー後の蛍光強度I2_measに対して、ネガティブと不明とを分けるために定められる閾値である。
【００７３】
閾値を定める処理を本発明において行う場合、当該処理は、例えば、後述の図９のフローチャート（Ｓ８０６〜Ｓ８１１）に記載されるような処理を実行することによって実現される。
【００７４】
記憶部（III）に格納された反応曲線C_measのデータ及び基準量のデータ（閾値T1_th_alle、T2_th_alle；I1_th+_alle、I2_th+_alle；I1_th-_alle、I2_th-_alle）は、処理部（II）によって呼び出される。
処理部（II）においては、反応曲線C_measのデータを、閾値に照らし合わせ、上記３−５−２．ポジティブコントロールのデータを考慮することによる判定すべきデータの判定における説明と同様に、両者の量的関係が一定の条件を満たすかどうかを判定する。
【００７５】
これらの閾値を判定要素とすることによって、アレル判定すべき反応曲線C1_meas及びC2_measのデータが、ポジティブであるか、ネガティブであるか、或いはさらに不明であるかを判定することができる。
【００７６】
具体的には、プラトー時間T_meas及びプラトー後の蛍光強度I_measの両方がポジティブであるとの判定であれば、判定対象となったアレルについてはポジティブであると判定してよい。また、プラトー後の蛍光強度I_measがネガティブであるとの判定であれば、判定対象となったアレルについてはネガティブであると判定してよい。さらに、上記に当てはまらない場合は、判定対象となったアレルについては判定不能であると判定してよい。判定結果は、記憶部（III）の所定の領域に格納される。
【００７７】
このような、対立アレルのデータを考慮することによる判定すべきデータの判定を行う処理は、例えば、後述の図１０のフローチャートに記載されるような処理を実行することによって実現される。
【００７８】
このように、アレル１の反応曲線C1_measについてはアレル２の反応曲線C2_measの反応曲線におけるプラトー時間及びプラトー後の蛍光強度を考慮し、アレル２の反応曲線C2_measについては、アレル１の反応曲線C1_measにおけるプラトー時間及びプラトー後の蛍光強度を考慮することによって、判定をより正しく行うことができる。
【００７９】
＜３−７．複数の多型部位それぞれの増幅効率を考慮する形態＞
この形態は、アレル判定すべき多型を含む標的核酸として、複数の部位を同時に核酸増幅する方法を行うことにより得られる増幅産物が用いられた場合に有用である。この場合、前記３−１．に述べた、入力部（I）に入力される反応曲線のデータが、複数の部位についての複数の反応曲線のデータを含む。複数の部位を同時に増幅する場合、それぞれの部位で増幅量が異なるため、これらの複数の反応曲線においては、増幅部位によって蛍光強度の上昇速度が異なる。また、ネガティブの場合でも、多型検出法を進める条件下におくと、徐々に蛍光強度が上昇してくる現象が起こる。
【００８０】
そこで、正常に動作したときの多型検出反応の、蛍光強度上昇時間と蛍光強度をあらかじめ求めておくことが好ましい。すなわち、この場合、事前に多くのサンプルで核酸増幅反応と核酸検出反応とをおこない、それらの反応曲線データから、プラトー時間及びプラトー後の蛍光強度の正常範囲を求めておく。具体的には、まずポジティブの場合のプラトー時間の正常範囲T_rang+を数値化して求める。さらに、ポジティブの場合のプラトー後の蛍光強度の正常範囲I_rang+も同様に数値化して求めておく。同じように、ネガティブの場合のプラトー後の蛍光強度の正常範囲I_rang-も数値化して求めておく。
【００８１】
これら範囲T_rang+、I_rang+及びI_rang-は、記憶部（III）の所定の領域に格納されており、後述の３−５−１．ポジティブコントロールのポジティブ判定、３−５−２．ポジティブコントロールのデータを考慮することによる判定すべきデータの判定（予備判定と記載することがある）、及び/又は３−６．対立アレルのデータを考慮することによる判定すべきデータの判定（本判定と記載することがある）の処理工程を行う処理部（II）によって呼び出され、閾値設定の処理が行われ、各判定に用いられる。
【００８２】
具体的には、前述の３−５−１．ポジティブコントロールのポジティブ判定、及び、３−５−２．ポジティブコントロールのデータを考慮することによる判定すべきデータの判定においては、ポジティブか否か、の判定を行うため、ポジティブのプラトー時間の正常範囲T_rang+、及びポジティブのプラトー後の蛍光強度の正常範囲I_rang+を考慮して閾値を設定し、設定された閾値を判定の基準として用いることができる。
【００８３】
また、前述の３−６．対立アレルのデータを考慮することによる判定すべきデータの判定においては、ポジティブかネガティブか、或いは、いずれでもないか、の判定を行うため、ポジティブのプラトー時間の正常範囲T_rang+、ポジティブのプラトー後の蛍光強度の正常範囲I_rang+、及びネガティブのプラトー後の蛍光強度の正常範囲I_rang-を考慮して閾値を設定し、設定された閾値を判定の基準として用いることができる。
【００８４】
＜３−８．ポジティブシグナルのばらつきを検証する形態＞
この形態は、アレル判定すべき多型を含む標的核酸として、３以上の複数の部位を同時に核酸増幅する方法を行うことにより得られる増幅産物が用いられた場合に有用である。この場合、上述の判定工程の後、ポジティブと判定された結果のみについて、以下のチェック工程を行う。
【００８５】
処理部（II）は、判定工程により得られた結果が格納された記憶部（III）から当該結果を呼び出し、ポジティブであると判定された結果のみを抽出する処理を行う。
処理部（II）は、次の処理を行うことができる。まず、ポジティブであると判定された反応曲線C_meas全てのデータから、プラトー後の蛍光強度I_measの平均値I_meas_mean、及び当該蛍光強度I_measの標準偏差I_sdを求める処理を行うことができる。そして、チェックすべき各々の反応曲線C_measにおける、当該蛍光強度I_measの偏差I_devを求める処理を行うことができる。さらに、偏差の閾値I_th_devを、標準偏差I_sdと定められた値との積として定めることができる。偏差の閾値I_th_devは、偏差I_devに対して、ばらつきが大きいか否かを分けるために定められる閾値である。処理部（II）は、両者の量関係が、偏差I_devが偏差の閾値I_th_devを超える関係であるかどうかを判断することができる。超えていれば、当該チェックすべき反応曲線C_measのデータはばらつきが大きいため判定不能と判定することができる。
【００８６】
言い換えれば、処理部（II）は、ポジティブであると判定された反応曲線C_measの蛍光強度I_meas、当該蛍光強度の平均値I_meas_mean、及び当該蛍光強度の標準偏差I_sdの各量が、以下の式：
|(蛍光強度I_meas)-(平均値I_meas_mean)|＜(標準偏差I_sd)×(定められた値)
を満たすかどうかを判断していることとなる。当該式を満たす場合、上記判定工程でポジティブと判定された、チェックすべき蛍光強度I_measは、このチェック工程ではばらつきが大きいため信頼性が低いデータであるとして、判定不能と判定される。
【００８７】
このようなチェック工程の処理は、例えば後述の図１１のフローチャートに示すような処理を実行することによって実現される。
【００８８】
このように、本発明では、ポジティブと判定された結果のみについて、測定装置の測定誤差の範囲を超えて蛍光強度にばらつきがあるかどうかをさらに判断することが好ましい。蛍光強度のデータにばらつきが大きければ、測光時に何らかの異常があったと推測することができる。このように、チェック工程によって、ポジティブ判定結果の信頼性を高めることができる。
【００８９】
＜４．蛍光検出を用いた多型検出法の形態＞
本発明で判定される多型としては特に限定されないが、特にＳＮＰのアレルを判定する場合に好ましく適用される。
蛍光検出を用いた多型検出法としては特に限定されない。特に好ましい方法においては、特定の核酸、第１オリゴヌクレオチド及び第２オリゴヌクレオチドがダブルフラップ構造を形成し、フラップエンドヌクレアーゼが当該構造を認識するとともに核酸断片（フラップ断片と記載することがある）を遊離させ、遊離した核酸断片をプローブとしての第３のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることによって生じる蛍光を測定することによって検出する。
【００９０】
より具体的には、（i）特定の配列として、第１領域、第２領域及び第３領域からなる配列であって、前記第１領域は前記第２領域に隣接した下流に位置し、前記第２領域は多型の塩基から構成され且つ前記第３領域に隣接した下流に位置する特定の配列を有する、試料中の特定の核酸に、
第１オリゴヌクレオチドとして、前記第３領域に相補的な配列、前記第２領域に相補的な配列、及び前記特定の配列と相補性のないフラップ配列を有するオリゴヌクレオチドであって、前記第３領域に相補的な配列は前記第２領域に相補的な配列に隣接した下流に位置し、前記第２領域に相補的な配列は前記フラップ配列に隣接した下流に位置するオリゴヌクレオチドと、
第２オリゴヌクレオチドとして、前記第１領域に相補的な配列、及び任意の配列を有するオリゴヌクレオチドであって、前記任意の配列は前記第１領域に相補的な配列に隣接した下流に位置するオリゴヌクレオチドとを、ハイブリダイズさせることによって、３本鎖構造体を形成させ、
（ii）前記３本鎖構造体の３重鎖部分をフラップエンドヌクレアーゼに認識させることにより前記フラップ配列を含む核酸断片を遊離させ、
（iii）前記遊離した核酸断片を、第３のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることによって生じる蛍光強度の経時変化を測定することによって検出する。
【００９１】
このような方法としては、インベーダ法が挙げられる。インベーダ法は、２段階の酵素反応により、フラップ（FLAP）プローブから遊離した蛍光物質を測定する手法である。
具体的には、インベーダ法は、フラッププローブ（第１オリゴヌクレオチド）とインベーダプローブ（第２オリゴヌクレオチド）とが鋳型ＤＮＡ（特定の核酸）にハイブリダイズしたダブルフラップ構造を形成し、酵素クリベース（Cleavase）がこの構造を認識しフラッププローブを切断することによってフラップ部分を遊離する工程を第１段階として；遊離したフラップ（核酸断片）をフレット（第３オリゴヌクレオチド）と結合させ、再度クリベースで切断することで、フレット（第３オリゴヌクレオチド）における消光物質と蛍光物質とを遊離させる工程を第２段階として含む。その結果、発生した蛍光を検出することで、多型の検出を行うことができる。この技術については、例えば、特表２００２−５１５７３７号公報などに記載されている。
【００９２】
＜５．処理フローチャート＞
＜５−１．アレル判定処理フローチャート＞
図３に、本発明の一形態を示すプログラムのフローチャートを示す。このプログラムの実行に際しては、あらかじめ、アレル１及びアレル２に対応する２蛍光を用いてインベーダ反応を行っておき、時間に対する蛍光強度の変化の測定結果（反応曲線のデータ）を取得しておく。得られた測定結果を、プログラムに入力する。図３の例では、２蛍光として、FAM及びRED(Redmond Red)を採用している。また、図３の例では、ポジティブコントロールを判定のために用いている。さらに、図３の例では、判定すべきサンプル（検体）が複数存在し、それらはそれぞれ、ウェルチップの各ウェル内に収容されている。
【００９３】
プログラムは、変数宣言を行った後、Ｓ１において、中間値・傾き計算を行う。Ｓ１においては、中間値フィルタをかけ、測定データ（反応曲線）を滑らかにしておく。そして、入力された測定データの各点における傾き（すなわち単位時間当たりの蛍光強度変化）を求める。
【００９４】
Ｓ２においては、測定結果のデータ数及びデータの有無のチェックを行うことによって、適切なデータが入力されていることを調べる。
Ｓ３においては、有効なコントロールがあるかどうかを判断することによって、ポジティブコントロールの存在を調べる。ポジティブコントロールがデータの中に存在していれば（YES）、Ｓ４に進む。
【００９５】
Ｓ４においては、ポジティブコントロールが有効なポジティブシグナルを示しているかどうかの判定を行う。さらにＳ５において、FAM及びREDの２蛍光ともにポジティブコントロールが有効なポジティブシグナルを示しているかどうかの判定を行う。２蛍光ともにポジティブコントロールの存在を確認できれば、Ｓ６において、各ポジティブコントロールのプラトー時間T_contの平均及びプラトー後の蛍光強度I_contの平均を求める。
【００９６】
Ｓ７においては、各ウェルについて、測定データ（プラトー時間T_meas及びプラトー後の蛍光強度I_meas）がポジティブか否かを分ける閾値（スレショルド）（T_measに対する閾値T_th_cont及びI_measに対する閾値I_th_cont）を定める。
【００９７】
Ｓ８においては、これらの閾値T_th_cont及びI_th_contを用いて、各ウェルについて、測定データ（プラトー時間T_meas及びプラトー後の蛍光強度I_meas）の予備判定を行う。予備判定では、ポジティブコントロールからみて、ウェルの測定データがポジティブか、或いはポジティブではないか、を決めることができる。少なくとも一方の蛍光でポジティブと判定されれば、後のＳ９の本判定に進むことができる。両方の蛍光でポジティブでないと判定された場合は、判定不能と判定される。
【００９８】
この後、後のＳ９の本判定に用いる新たな閾値として、アレル１の測定データ（プラトー時間T1_meas及びプラトー後の蛍光強度I1_meas）が、ポジティブか、ネガティブか、いずれでもないかを分けるための対立アレルプラトー時間閾値（T1_th_alle）及び対立アレル蛍光強度閾値（I1_th+_alle及びI1_th-_alle）と、アレル２の測定データ（プラトー時間T2_meas及びプラトー後の蛍光強度I2_meas）が、ポジティブか、ネガティブか、いずれでもないかを分けるための対立アレルプラトー時間閾値（T2_th_alle）及び対立アレル蛍光強度閾値（I2_th+_alle及びI2_th-_alle）とを求めることができる。
【００９９】
Ｓ９においては、これらの閾値T1_th_alle、T2_th_alle、I1_th+_alle、I2_th+_alle、I1_th-_alle及びI2_th-_alleを用いて、各ウェルについて測定データの本判定を行う。本判定では、対立アレルのデータを考慮して、測定データがポジティブか、或いはネガティブか、を決めることができる。ポジティブでもネガティブでもない場合は、判定不能と判定される。
【０１００】
Ｓ１０においては、ポジティブデータのみを抽出して、データのばらつきが大きすぎないかを検証し、Ｓ１１において終了処理を行い、判定を終了する。
【０１０１】
以下、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ４、及びＳ６〜Ｓ１１の各工程を含む、本発明の処理工程について、さらに詳細に説明する。前提として、測定された複数のサンプル（検体）をそれぞれ収容したウェルを含む０番〜３１番のウェルについて、本発明の処理工程に従って判定を行うとする。そして、０番〜３１番のウェルが、「コントロール」のウェルか「データ」（アレルを判定すべきサンプルすなわち検体）のウェルか、「ブランク」のウェルかが示された「チップ情報ファイル」がすでに準備されているとする。ここでは、チップ情報ファイルと測定結果のファイルとを読み込んで、判定のための処理をおこなう。
【０１０２】
＜５−２．中間値・傾き計算の処理フローチャート＞
図４に、前記Ｓ１における中間値・傾き計算の一形態を示す処理フローチャートを示す。
【０１０３】
全てのウェルを順に調べるために、全ウェルの数だけ以下のＳ１０２〜Ｓ１１５の処理を繰り返す（Ｓ１０１）。
Ｓ１０２においては、サブルーチン内だけで使用する変数を初期化する。
Ｓ１０３においては、ウェルが「コントロール」もしくは「データ」（検体）であるかどうかを判断する。「コントロール」もしくは「データ」（検体）のウェルであれば（YES）、Ｓ１０４に進む。「ブランク」のウェルなど、「コントロール」及び「データ」（検体）以外のウェルであれば（NO）、Ｓ１１３に進む。
Ｓ１０４においては、そのウェルのデータが存在するかどうかを判断する。データが存在すれば（YES）、Ｓ１０５へ進む。データが存在しなければ（NO）、Ｓ１１０へ進む。
【０１０４】
FAMとREDの両方について調べるため、以下のＳ１０６〜１０９を２回繰り返す（Ｓ１０５）。
Ｓ１０６においては、後述のＳ１０８で行う中間値フィルタ処理を行った後のデータを保存しておくための領域を確保する。
Ｓ１０７においては、測定データを取り出してくる。
Ｓ１０８においては、中間値フィルタをかけ、傾きを計算する。
Ｓ１０９においては、フィルタをかけたあとのデータを前記Ｓ１０６において確保された領域に保存する。
【０１０５】
Ｓ１１０においては、データが存在しないウェルがコントロールのウェルであるかどうかを判断する。「コントロール」のウェルであれば（YES）、Ｓ１１１へ進む。「データ」（検体）のウェルであれば（NO）、Ｓ１１２へ進む。
Ｓ１１１においては、表示が"Negative"となるようにする。
Ｓ１１２においては、表示が「判定不能」となるようにする。
【０１０６】
Ｓ１１３においては、「チップ情報ファイル」に書込まれている情報（すなわちParameter）が不足しているかどうかを判断する。不足していれば（YES）、Ｓ１１４に進む。不足していなければ（NO）、すなわち、「ブランク」ウェルであると示されていれば、Ｓ１１５に進む。
Ｓ１１４においては、表示が「判定不能」となるようにする。
Ｓ１１５においては、表示が「ブランク」ウェル（すなわちウェルなし）となるようにする。
【０１０７】
＜５−３．データ数・データ有無チェックの処理フローチャート＞
図５に、前記Ｓ２におけるデータ数・データ有無チェックの一形態を示す処理フローチャートを示す。
【０１０８】
全てのウェルを順に調べるために、ウェルの数だけ以下のＳ２０２〜Ｓ２０６の処理を繰り返す（Ｓ２０１）。
Ｓ２０２においては、ウェルが「コントロール」もしくは「データ」（検体）のウェルであるかどうかを判断する。「コントロール」もしくは「データ」（検体）のウェルであれば（YES）、Ｓ２０３に進む。「ブランク」のウェルなど、「コントロール」及び「データ」（検体）以外のウェルであれば（NO）、次のウェルの処理にうつる。
Ｓ２０３においては、そのウェルのデータが存在するかどうかを判断する。データが存在すれば（YES）、Ｓ２０４に進む。データがなければ（NO）、次のウェルの処理にうつる。
【０１０９】
Ｓ２０４においては、そのウェルがコントロールのウェルであるかどうかを調べる。そのウェルがコントロールのウェルであれば（YES）、Ｓ２０５に進む。そのウェルがコントロールのウェルでなければ（NO）、つまり「データ」（検体）のウェルであれば、Ｓ２０６に進む。
Ｓ２０５においては、「コントロールあり」のフラグをTRUE（真）にする。
Ｓ２０６においては、「データあり」のフラグをTRUE（真）にする。
【０１１０】
＜５−４．コントロールのポジティブ判定の処理フローチャート＞
図６に、前記Ｓ４におけるコントロールのポジティブ判定の一形態を示す処理フローチャートを示す。
【０１１１】
全てのウェルを順に調べるために、ウェルの数だけ以下のＳ４０２〜Ｓ４０７の処理を繰り返す（Ｓ４０１）。
さらに、FAMとREDの両方を調べるため、以下のＳ４０３〜４０７の処理を2回繰り返す（Ｓ４０２）。
Ｓ４０３においては、そのウェルがコントロールのウェルであって、データが存在するかどうかを調べる。そのウェルがコントロールのウェルであって、データが存在する場合は（YES）、Ｓ４０４へ進む。そのウェルがコントロールでなければ（NO）、次のウェルに移る。
【０１１２】
Ｓ４０４においては、ポジティブ判定が行われる。このステップにおけるさらなるアルゴリズムについては、後述の５−５．ポジティブ判定において別途述べる。
Ｓ４０５においては、ポジティブであれば（YES）、Ｓ４０６に進む。ポジティブでなければ（NO）、Ｓ４０７へ進む。
Ｓ４０６においては、プラトー後の蛍光強度I_cont、その合計、及びプラトー時間T_contを保存する。
Ｓ４０７においては、ポジティブでないため「ネガティブ」であると記録する。
【０１１３】
＜５−５．ポジティブ判定＞（フローチャート示さず）
以下、前述の図６のＳ４０４のステップ、及び後述の図９のＳ８０４のステップとして記載したポジティブ判定のステップについて述べる。
あらかじめ、閾値として、「傾きの閾値」、「プラトー後の蛍光強度の閾値」、及び「プラトー時間の閾値」を定めておく。これら閾値は、複数の多型部位それぞれの増幅効率尾を考慮して定められたものである。
【０１１４】
測定開始時間をt=0[秒]とし、最初のデータが時間t1で計測されたとき、そのときの蛍光強度のデータをI1とする。同様に2番目，3番目，……，n番目のデータが時間t2，t3，……，tnで計測されたとき、そのときのそれぞれのデータをI2，I3，……，Inとする。
さらに、計算によってデータの微分を求めておく。これは、前述の図３のＳ１のステップで行われる。I1，I2から求められる微分をI1'とし、以降同様にI2'，I3'，……，In-1'とする。
【０１１５】
[1]  I1'，I2'，I3'，……と順番に微分の値を調べていき、「傾きの閾値」よりも大きい微分の値が、はじめて「傾きの閾値」以下になる場所があるかどうかを調べる。そのような場所があれば下記[2]に進む。なければ、そのデータは「ポジティブでない」と判定され、この判定を終了する。
[2]  「傾きの閾値」よりも大きい微分の値が、はじめて「傾きの閾値」以下になる場所が、Ik-1とIkから求められた微分Ik-1'であったとする。このとき、時間tkで反応が終了しプラトーに達したといえる。
[3]  時間tkが「プラトー時間の閾値」以下であるかどうかを調べる。閾値以下であれば下記[4]に進む。閾値よりも大きければ、そのデータは「ポジティブでない」と判定され、この判定を終了する。
[4]  プラトー時間以降のデータIk，Ik+1，……，Inがすべて「プラトー後の蛍光強度の閾値」以上であるかどうかを調べる。すべて閾値以上であれば、このデータは「ポジティブ」と判定され、閾値より小さいものがあれば「ポジティブでない」と判定される。
[5]  判定終了する。
【０１１６】
＜５−６．コントロールのプラトー時間平均及びプラトー後蛍光強度平均の計算の処理フローチャート＞
図７に、前記Ｓ６におけるコントロールのプラトー時間平均及びプラトー後蛍光強度平均の計算の一形態を示す処理フローチャートを示す。
【０１１７】
FAMとREDの両方について調べるため、以下のＳ６０２及びＳ６０３の処理を2回繰り返す（Ｓ６０１）。
Ｓ６０２においては、ポジティブコントロールのデータのうち「ポジティブである」と判定されたデータに関して、プラトー後の蛍光強度I_contの平均値I_cont_meanを求める。
Ｓ６０３においては、上記Ｓ６０２と同様に、プラトー時間T_contの平均値T_cont_meanを求める。
【０１１８】
＜５−７．各ウェルのスレショルド計算（Ｓ７）の処理フローチャート＞
図８に、前記Ｓ７における各ウェルのスレショルド計算の一形態を示す処理フローチャートを示す。
【０１１９】
全てのウェルを順に調べるために、ウェルの数だけ以下のＳ７０２〜Ｓ７０６の処理を繰り返す（Ｓ７０１）。
FAMとREDの両方を調べるため、以下のＳ７０３〜Ｓ７０６の処理を2回繰り返す（Ｓ７０２）。
Ｓ７０３においては、そのウェルが検体のウェルであるかどうか、さらにデータが存在しているかどうかを調べる。ウェルが検体でデータがある場合は（YES）、Ｓ７０４へ進む。そうでなければ（NO）、次のウェルに移る。
【０１２０】
Ｓ７０４においては、あらかじめ定めてある「傾き係数」と、コントロールの「傾きの閾値」とから、各ウェルの「傾きの閾値」を求める。なお、このプログラムではこのように求めているが、はじめから「傾きの閾値」をウェル毎に定めておいても構わない。
Ｓ７０５においては、あらかじめ定めてある「プラトー時間係数」と、コントロールの「プラトー時間平均」T_cont_meanとの積を求めて、ウェルの「プラトー時間の閾値」T_th_contとする。
Ｓ７０６においては、あらかじめ定めてある「プラトー後の蛍光強度係数」と、コントロールの「プラトー後の蛍光強度の平均値」I_cont_meanとの積を求めて、ウェルの「プラトー後の蛍光強度の閾値」I_th_contとする。
【０１２１】
＜５−８．各ウェルの予備判定の処理フローチャート＞
図９に、前記Ｓ８における各ウェルの予備判定の一形態を示す処理フローチャートを示す。
【０１２２】
全てのウェルを順に調べるために、ウェルの数だけ以下のＳ８０２〜Ｓ８１１の処理を繰り返す（Ｓ８０１）。
FAMとREDの両方を調べるため、以下のＳ８０３〜Ｓ８１１の処理を2回繰り返す（Ｓ８０２）。
Ｓ８０３においては、そのウェルが検体のウェルであるかどうか、さらにデータが存在しているかを調べる。ウェルが検体でデータが存在していれば（YES）、Ｓ８０４へ進む。そうでなければ（NO）、次のウェルに移る。
【０１２３】
Ｓ８０４においては、ポジティブ判定が行われる。ここでは、「プラトー時間の閾値」T_th_cont及び「プラトー後の蛍光強度の閾値」I_th_contが判定基準に用いられる。このステップにおけるさらなるアルゴリズムについては、前述の５−５．ポジティブ判定において別途述べたとおりである。
Ｓ８０５においては、判定の結果、ポジティブであれば（YES）、Ｓ８０６に進む。ポジティブでなければ（NO）、次の色について処理を行うか、或いは、2色両方について処理が行われた場合は、次のウェルへ移る。
【０１２４】
Ｓ８０６においては、ポジティブデータのプラトー後の蛍光強度I_meas（すなわちI1_meas及びI2_meas）の平均値I_meas_mean（すなわちI1_meas_mean及びI2_meas_mean）およびプラトー時間T_meas（すなわちT1_meas及びT2_meas）を保存する。
【０１２５】
Ｓ８０７においては、あらかじめ定めた「対立アレル上昇時間係数」とプラトー時間T1_meas及びT2_measとの積を計算することによって、それぞれ「対立アレル上昇時間の閾値」T1_th_alle及びT2_th_alleを一旦求める。
Ｓ８０８においては、上記Ｓ８０７で求めた閾値T1_th_alle及びT2_th_alleが、それぞれ測定時間T1_meas及びT2_meas以上であるかどうかを判定する。当該時間以上であれば（YES）、Ｓ８０９に進む。当該時間未満であれば（NO）、Ｓ８１０へ進む。
Ｓ８０９においては、「対立アレル上昇時間の閾値」T1_th_alle及び/又はT2_th_alleを、当該測定時間T1_meas及び/又はT2_measと同じ値に変更する。
【０１２６】
Ｓ８１０においては、あらかじめ定めた「対立アレルポジティブ強度係数」と蛍光強度の平均値I1_meas_mean及びI2_meas_meanとの積を計算することによって、それぞれ「対立アレルポジティブ強度の閾値」I1_th+_alle及びI2_th+_alleを求める。
Ｓ８１１においては、あらかじめ定めた「対立アレルネガティブ強度係数」と蛍光強度の平均値I1_meas_mean及びI2_meas_meanとの積を計算することによって、それぞれ「対立アレルネガティブ強度の閾値」I1_th-_alle及びI2_th-_alleを求める。
【０１２７】
＜５−９．各ウェルの本判定の処理フローチャート＞
図１０に、前記Ｓ９における各ウェルの本判定の一形態を示す処理フローチャートを示す。
【０１２８】
全てのウェルを順に調べるために、ウェルの数だけ以下のＳ９０２〜Ｓ９１６の処理を繰り返す（Ｓ９０１）。
Ｓ９０２においては、そのウェルが検体のウェルであるかどうか、さらにデータが存在しているかを調べる。ウェルが検体でデータが存在していれば（YES）、Ｓ９０３へ進む。創でなければ（NO）、次のウェルに移る。
FAMとREDの両方を調べるため、以下のＳ９０４〜Ｓ９０９及びＳ９１２〜Ｓ９１４の処理を2回繰り返す（Ｓ９０３）。
Ｓ９０４においては、対立アレルの予備判定結果がポジティブであるか、ポジティブでないかを判断する。ポジティブあれば（YES）、Ｓ９０５へ進む。ポジティブでなければ（NO）、Ｓ９１２へ進む。
【０１２９】
Ｓ９０５においては、現在のアレルの本判定（ポジティブ判定）をおこなう。判定には前記「各ウェルの予備判定」工程で求めた「対立アレル上昇時間の閾値」T1_th_alle及びT2_th_alleと「対立アレルポジティブ強度の閾値」I1_th+_alle及びI2_th+_alleとを使用する。
Ｓ９０６においては、上記の本判定の結果、ポジティブでないかどうかを判断する。ポジティブでなければ（YES）、Ｓ９０７へ進む。ポジティブであれば（NO）、Ｓ９１２へ進む。
【０１３０】
Ｓ９０７においては、現在のアレルの本判定（ネガティブ判定）をおこなう。判定には前記「各ウェルの予備判定」工程で求めた「対立アレルネガティブ強度の閾値」I1_th-_alle及びI2_th-_alleを使用する。
Ｓ９０８においては、上記の本判定の結果、ネガティブでないかどうかを判断する。ネガティブでなければ（YES）、Ｓ９０９へ進む。ネガティブであれば（NO）、次の色について処理を行うか、或いは、2色両方について処理が行われた場合は、Ｓ９１０へ進む。
Ｓ９０９においては、ネガティブでもポジティブでもないので「判定不能」と記憶する。
【０１３１】
Ｓ９１２においては、対立アレルの予備判定結果が「ポジティブではない」である。この場合に、現在のアレルの予備判定結果がポジティブであるかどうかを判断する。ポジティブであれば（YES）、Ｓ９１３へ進む。そうでなければ（NO）、Ｓ９１４へ進む。
Ｓ９１３においては、ひとまず判定結果は「ポジティブである」としておき、次の色について処理を行うか、或いは、2色両方について処理が行われた場合は、Ｓ９１０へ進む。
Ｓ９１４においては、予備判定の段階でFAM、REDともに「ポジティブでない」と判定されている場合は「判定不能」と記憶し、次の色について処理を行うか、或いは、2色両方について処理が行われた場合は、Ｓ９１０へ進む。
【０１３２】
Ｓ９１０においては、FAMおよびREDの本判定の両方の結果がネガティブであるかどうかを判断する。両方の結果においてネガティブであれば（YES）、Ｓ９１１へ進む。そうでなければ（NO）、Ｓ９１５へ進む。
Ｓ９１１においては、FAMもREDもネガティブと判定されているので「判定不能」と記憶する。
Ｓ９１５においては、本判定の結果でFAMまたはREDのいずれか一方が判定不能の場合も、ともに「判定不能」と記憶する。
【０１３３】
＜５−１０．ポジティブデータチェックの処理フローチャート＞
図１１に、前記Ｓ１０におけるポジティブデータチェックの一形態を示す処理フローチャートを示す。
【０１３４】
FAMとREDの両方を調べるため、以下のＳ１００２〜Ｓ１０１４の処理を2回繰り返す（Ｓ１００１）。
さらに、全てのウェルを順に調べるために、ウェルの数だけ以下のＳ１００３〜Ｓ１００５の処理を繰り返す（Ｓ１００２）。
Ｓ１００３においては、ポジティブであるかどうかを判断する。ポジティブであれば（YES）、Ｓ１００４へ進む。ポジティブでなければ（NO）、次のウェルに移る。
【０１３５】
Ｓ１００４においては、プラトー後の蛍光強度の値I_measを保存する。
Ｓ１００５においては、ポジティブシグナルのウェルの数に1を加える。
Ｓ１００６においては、ポジティブシグナルのウェルの数が3以上であるかどうかを判断する。3以上であれば（YES）、Ｓ１００７へ進む。そうでなければ（NO）、データチェックを終了する。
【０１３６】
Ｓ１００７においては、プラトー後の蛍光強度の平均値I_meas_meanを計算する。
Ｓ１００８においては、プラトー後の蛍光強度の標準偏差I_sdを計算する。
Ｓ１００９においては、上記Ｓ１００８で計算した標準偏差I_sdが0でないかどうかを判断する。0でなければ（YES）、Ｓ１０１０へ進む。0であれば（NO）、データチェックを終了する。
【０１３７】
全てのウェルを順に調べるために、ウェルの数だけ以下のＳ１０１１〜Ｓ１０１４の処理を繰り返す（Ｓ１０１０）。
Ｓ１０１１においては、ウェルが検体であり、かつポジティブであるかどうかを判断する。ウェルが検体でポジティブであれば（YES）、Ｓ１０１２へ進む。そうでなければ（NO）、次のウェルへ移る。
【０１３８】
Ｓ１０１２においては、平均値との差（偏差）I_devを計算する。
Ｓ１０１３においては、あらかじめ、定められた値と標準偏差I_sdとの積を計算することによって得られた偏差の閾値I_th_devを用いる。上記Ｓ１０１２で求めた偏差I_devが、当該偏差の閾値I_th_devを超えているかどうかを判断する。超えていれば（YES）、Ｓ１０１４へ進む。閾値I_th_dev以下であれば（NO）、次のウェルへ移る。
Ｓ１０１４においては、偏差I_devが閾値I_th_devを超えていたので「判定不能」と記憶する。
【０１３９】
＜５−１１．終了処理の処理フローチャート＞
図１２に、前記Ｓ１１における終了処理の一形態を示す処理フローチャートを示す。
【０１４０】
FAMとREDの両方を調べるため、以下のＳ１１０２〜Ｓ１１０４の処理を2回繰り返す（Ｓ１１０１）。
さらに、全てのウェルを順に調べるために、ウェルの数だけ以下のＳ１１０３〜Ｓ１１０５の処理を繰り返す（Ｓ１１０２）。
Ｓ１１０３においては、データがまだ残っているかどうかを判断する。データがまだ残っていれば（YES）、Ｓ１１０４へ進む。そうでなければ（NO）、次の色について処理を行うか、或いは、2色両方について処理が行われた場合は、次のウェルへ移る。
Ｓ１１０４においては、データを削除する。
【０１４１】
＜６．プログラムによる表示＞
上記項目５−１．〜５−１１に示される処理を行うプログラムを用い、ＰＣを用いて実際にアレル判定処理を行った。図１３及び図１４に、本プログラムによる、出力部（IV）における表示例を示す。より詳しくは、測定データとして用いられた反応曲線を表示したブラウザ画面を図１３に示し、それに対する判定結果を表示したブラウザ画面を図１４に示す。なお、０番〜３１番のウェルは、図１３及び図１４においては、１番〜３２番の番号が付されている。
この画面は、以下の２通りの形態において表示されうる。
【０１４２】
＜６−１．多型検出方法による測定とアレル判定処理とを自動で行う形態＞
この形態においては、蛍光測定を行い、測定結果が保存される。
[1]多型検出をおこなうための検査キットを用意する。このキットには、たとえば、インベーダ法による多型検出に必要な、フラッププローブ、インベーダプローブ、フレット、及び酵素クリベースを含む反応液が各ウェルに配置された分析チップが含まれる。キットには、たとえば外袋に、検査キットの認識番号（検査キットＩＤ）がたとえばバーコードの形で付されている。
[2]図１３の画面の「検査キットＩＤ」に、検査キットＩＤを入力する。たとえば、画面の「検査キットＩＤ」にカーソルを合わせ、検査キットＩＤのバーコードを、ＰＣに接続されたバーコードリーダで読み取る。このことにより、自動的に検査キットのＩＤが入力される。
[3]検査キットにサンプルを分注し、測定装置にセットする。
[4] メニューの「測定(M)」から「測定開始」を選ぶ。このことにより、多型検出方法による蛍光測定が自動的に始まる。
[5]測定が終了すると、ファイル保存のダイアログボックスが開く。ユーザは適当なフォルダ及びファイル名を指定して保存することができる。
[6]ハードディスクに保存されている測定結果ファイルを開く。
[7]自動的に図１３の画面が表示される。
[8]「結果」タブをクリックすると、図１４の画面が表示される。
【０１４３】
この形態においては、測定が終了すると、ＰＣは自動的に検査キットＩＤから適切なチップ情報ファイルを探し出し、情報を取り込むことができる。そして、自動的にアレル判定処理を行い、その結果を図１４として表示する。なお、アレル判定処理の終了に、図１３が表示されるようにして良い。
【０１４４】
＜６−２．保存された測定結果についてアレル処理を行う形態＞
この形態においては、多型検出方法による蛍光測定がすでに完了して保存されており、保存されている測定済みの結果を閲覧するときにアレル判定処理を行い、その結果が表示される。
[1]ハードディスクに保存されている測定結果ファイルを開く。
[2]自動的に図１３の画面が表示される。
[3]「結果」タブをクリックすると、図１４の画面が表示される。
【０１４５】
この形態においては、保存されている測定結果ファイルに検査キットＩＤも保存されていて良い。ユーザによって読み出す測定ファイルが指定されると、自動的に検査キットＩＤから適切なチップ情報ファイルを探し出し、情報を取り込む。そして、自動的にアレル判定処理が行われ、その結果が図１４として表示される。測定結果ファイルにアレル判定結果は保存されず、ファイルを開くごとにアレル判定処理を行うことができる。
【０１４６】
＜多型アレル判定プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体＞
本発明は、コンピュータを、多型アレル判定処理を行うシステムとして機能させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であってよい。
多型アレル判定プログラムは記録媒体から記憶部（III）に読み込まれ、処理部（II）において、入力部（I）から入力された測定データに対して前述の処理と同一の処理が実行される。
【０１４７】
この記録媒体は可搬形あるいは固定型のいずれであってもよく、磁気ディスク、半導体メモリ、ＣＤ−ＲＯＭその他の記録媒体であってもよい。また、本発明の多型アレル判定プログラムを、ネットワークに接続されたコンピュータの記録装置に格納しておき、ネットワークを介して他のコンピュータに転送することもできる。本発明の多型アレル判定プログラムを提供する提供媒体としては、様々な形式のコンピュータに読み出し可能な媒体として頒布可能であって、特定のタイプの媒体に限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】本発明のプログラムをインストールしたコンピュータの全体構成の一例を示す図である。
【図２】図１のコンピュータを、ＣＰＵを用いて実現した場合のハードウェア構成の一例を示す図である。
【図３】本発明の一形態を示す処理フローチャートである。
【図４】中間値・傾き計算の一形態を示す処理フローチャートである。
【図５】データ数・データ有無チェックの一形態を示す処理フローチャートである。
【図６】コントロールのポジティブ判定の一形態を示す処理フローチャートである。
【図７】コントロールのプラトー時間平均及びプラトー後蛍光強度平均の計算の一形態を示す処理フローチャートである。
【図８】各ウェルのスレショルド計算の一形態を示す処理フローチャートである。
【図９】各ウェルの予備判定の一形態を示す処理フローチャートである。
【図１０】各ウェルの本判定の一形態を示す処理フローチャートである。
【図１１】ポジティブデータチェックの一形態を示す処理フローチャートである。
【図１２】終了処理の一形態を示す処理フローチャートである。
【図１３】本発明のプログラムを用いて実際にアレル判定処理を行った場合の、測定データとして用いられた反応曲線を表示したブラウザ画面の一例である。
【図１４】図１３の測定データに対する判定結果を表示したブラウザ画面の一例である。
【符号の説明】
【０１４９】
I：入力部
II：処理部
III：記憶部
IV：出力部
1：CPU
2：RAM
3：キーボード
4：ディスプレイ
5：ハードディスク
6：プログラム記憶部
7：データ記憶部
8：OS記憶部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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