(57)【要約】【課題】本発明の課題は、哺乳動物において二本鎖ＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉を可能とさせるダブルノックアウト非ヒト動物やその使用方法を提供することにある。【解決手段】ＲＮＡ干渉用として、ＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ５をコードする遺伝子を欠損或いは変異させることにより、野生型において発現されるＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ５の機能が失われているダブルノックアウト非ヒト動物を使用する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ５をコードする遺伝子の一部又は全部を欠損或いは変異させることにより、野生型において発現されるＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ５の機能が共に失われていることを特徴とするＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）産生のシグナル伝達機能が失われているＲＮＡ干渉用ダブルノックアウト非ヒトモデル動物。
【請求項２】
少なくとも３０塩基よりも長い長鎖二本鎖ＲＮＡによって誘導されるＲＮＡ干渉作用を引き起こすことを特徴とする請求項１記載の非ヒトモデル動物。
【請求項３】
非ヒトモデル動物が、モデルマウスであることを特徴とする請求項１又は２記載の非ヒトモデル動物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか記載の非ヒトモデル動物又は該非ヒトモデル動物由来の組織、器官又は細胞をＲＮＡ干渉に使用する方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか記載の非ヒトモデル動物又は該非ヒトモデル動物由来の組織、器官若しくは細胞に、二本鎖ＲＮＡ又は二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを導入してＲＮＡ干渉を誘導することを特徴とするＲＮＡ干渉作用により標的遺伝子の発現を抑制する方法。
【請求項６】
二本鎖ＲＮＡが、少なくとも３０塩基よりも長い長鎖二本鎖ＲＮＡであることを特徴とする請求項５記載のＲＮＡ干渉作用により遺伝子の発現を抑制する方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか記載の非ヒトモデル動物又は該非ヒトモデル動物由来の組織、器官若しくは細胞に、所定の二本鎖ＲＮＡ又は二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを導入してＲＮＡ干渉を誘導し、ＲＮＡ干渉作用による遺伝子の発現抑制の結果、動物個体、組織、器官若しくは細胞に現れる表現型の変化を解析することを特徴とする標的遺伝子の機能を同定する方法。
【請求項８】
二本鎖ＲＮＡが、少なくとも３０塩基よりも長い長鎖二本鎖ＲＮＡであることを特徴とする請求項７記載の標的遺伝子の機能を同定する方法。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか記載の非ヒトモデル動物又は該非ヒトモデル動物由来の組織、器官若しくは細胞に、被験物質として長鎖二本鎖ＲＮＡ又は該長鎖二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを導入してＲＮＡ干渉を誘導し、ＲＮＡ干渉作用による遺伝子の発現抑制の結果、動物個体、組織、器官若しくは細胞に現れる表現型の変化を解析することを特徴とするＲＮＡ干渉作用を利用した標的遺伝子のスクリーニング方法。
【請求項１０】
長鎖二本鎖ＲＮＡが、少なくとも３０塩基よりも長い長鎖二本鎖ＲＮＡであることを特徴とする請求項９記載のＲＮＡ干渉を利用した標的遺伝子のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ５をコードする遺伝子の一部又は全部を欠損或いは変異させることにより、野生型において発現されるＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ５の機能が失われているダブルノックアウト非ヒトモデル動物やその使用方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ；RNA interference）は、二本鎖ＲＮＡと相補的な塩基配列を持ったｍＲＮＡが分解される現象をいい、ＲＮＡｉ法は、この現象を利用して人工的に二本鎖ＲＮＡを導入することにより、任意の遺伝子の発現を抑制する手法とされている。詳しくは、ＲＮＡｉは、長鎖二本鎖ＲＮＡがＤｉｃｅｒ分子により２０ｍｅｒ程度の短鎖二本鎖ＲＮＡに切断され、その配列に相同する遺伝子メッセンジャーＲＮＡの発現を抑制する現象であり、この現象は１９９８年Fireらにより、線虫で発見されてから（例えば、非特許文献１参照）、植物やショウジョウバエなど、他の様々な生物種で観察されている。これらの生物では、外来の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を導入することにより、標的遺伝子の発現が抑制されることが確認されており、ノックアウト個体を創生する方法としても利用されつつある。
【０００３】
しかし、哺乳動物においては、長鎖のｄｓＲＮＡとして３０塩基以上のｄｓＲＮＡを用いた場合にはＲＮＡｉが起こりにくいとされている。この原因の一つとして、哺乳動物はウィルス感染を防ぐ様々な防御機構が発達しており、実際に、極めて低い濃度の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が存在するだけでインターフェロンの応答が起こるためと考えられている。インターフェロン応答とは、インターフェロン分子が産生され、インターフェロン受容体に結合、細胞内シグナル伝達経路を活性化し様々な応答を引き起こす現象を表す。その結果強力な抗ウイルス応答が誘導される。その反応のうちよく知られたものとして、ｄｓＲＮＡ依存的タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）をコードする遺伝子の転写が高まり、ＰＫＲの自己リン酸化とキナーゼ活性が促進され、活性化されたＰＫＲは、ｅＩＦ−２αをリン酸化し、これにより遺伝子全体の翻訳が阻害される現象があげられる。このようなインターフェロン応答により、長鎖ｄｓＲＮＡを導入した哺乳動物においては、ＲＮＡｉ効果の特異性が下がり、またアポトーシスも誘導されるため、細胞毒性が上がるという問題があった。
【０００４】
そこで、哺乳動物においては、２０ｍｅｒ程度の短鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によるＲＮＡｉ法を用い、哺乳動物細胞での二本鎖ＲＮＡによるインターフェロン応答を回避し、遺伝子発現の抑制を行ってきた（例えば、非特許文献２参照）。また、ｓｉＲＮＡに代わるものとして、ヘアピン構造に折り畳んだ小さなＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が、ｓｉＲＮＡと同程度に遺伝子の発現を抑制することが報告されている（例えば、非特許文献３参照）。
【０００５】
しかしながら、その遺伝子発現抑制効果は不安定であり、また、短鎖ＲＮＡを用いてもインターフェロンを活性化させてしまう等の問題点が指摘されている。
【０００６】
一方、ウィルスやバクテリア等の微生物病原体に対する自然免疫応答は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）及びヘリカーゼファミリーメンバーのような宿主パターン認識受容体（ＰＲＲ）が、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と呼ばれる侵入病原体の特異構造を認識することによって惹起される（例えば、非特許文献４及び非特許文献５参照）。宿主パターン認識受容体（ＰＲＲ）は、ＤＮＡ、一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡ、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ及び糖タンパク質を含むウィルスに特異的な分子パターンの認識に不可欠の役割を果たしている。エンドソーム膜に局在するＴＬＲ３は、合成ｄｓＲＮＡアナログであるポリイノシン−ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）に加えてウィルスのｄｓＲＮＡも認識することが知られている。また、細胞質タンパク質であるＲＩＧ−Ｉ（Retinoic acid-inducible protein-I）及びヘリカードとしても知られるＭＤＡ−５（Melanoma differentiation associated gene-5）は、ｄｓＲＮＡディテクターとして同定されている。ＲＩＧ−Ｉは、カスパーゼをリクルートするドメイン（ＣＡＲＤ）様モジュールを２個有するＤＥｘＤ／Ｈｂｏｘ型ＲＮＡヘリカーゼである。へリカーゼドメインは、ｄｓＲＮＡの認識に関与していると考えられ、ＲＩＧ−ＩにおけるＣＡＲＤは、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７及びＮＦ−κＢの活性化を導くダウンストリームシグナル伝達の開始に必須であることが報告されている（例えば、非特許文献６参照）。また、ＲＩＧ−Ｉ欠損マウスは、水疱性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）、ニューカッスル病ウィルス（ＮＤＶ）及びセンダイウイルス（ＳｅＶ）の感染に対して、一貫してＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）を産生しないことが報告されている（例えば、非特許文献７参照）。さらに、ウィルス感染に応答したＩＲＦ３及びＮＦ−κＢの活性化は、ＲＩＧ−Ｉ欠損細胞で障害されていた。また、ＭＤＡ−５は、ＲＩＧ−Ｉに類似した構造を有し、抗ウィルス応答の媒介に関与していることが報告されている（例えば、非特許文献８及び非特許文献９参照）。
【０００７】
ＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ５は、ウィルスｄｓＲＮＡの認識に関与することが示唆されるものの、インビボでのこれらｄｓＲＮＡディテクター間の機能的関係に加え、ＭＤＡ５の機能的役割については知られていない。このようにｄｓＲＮＡディテクターの明確な機能が解明されていないため、哺乳動物において、これらの作用に基づくインターフェロン応答を抑えることはできなかった。
【０００８】
【非特許文献１】Nature 391 p806-811 1998
【非特許文献２】Nature 411 p494-498 2001
【非特許文献３】Genes & Dev. 16 p948-958 2002
【非特許文献４】Annu Rev Immunol.20, 197-216, 2002
【非特許文献５】Annu Rev Immunol. 21,335-376, 2003
【非特許文献６】Nat Immunol. 5, 730-737, 2004参照
【非特許文献７】Immunity Vol.23 19-28 July 2005
【非特許文献８】Curr Biol. 12, 838-843, 2002
【非特許文献９】Proc Natl Acad Sci USA. 101, 17264-17269, 2004
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、哺乳動物においてｄｓＲＮＡを用いたＲＮＡｉを可能とさせるダブルノックアウト非ヒトモデル動物やその使用方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、まず、インビボでのＭＤＡ５の機能的役割を調べるため、ＭＤＡ５−／−マウスを確立し、ウィルス認識に対するＭＤＡ５の寄与を分析した（図１ａ及び１ｂ参照）。ＭＤＡ５のｍＲＮＡの発現は、ＭＤＡ５タンパク質の場合と同様に、ＭＤＡ５−／−細胞では検出されなかった（図１ｃ及び１ｄ参照）。その多くが胚期に死亡するＲＩＧ−Ｉ−／−マウスとは対照的に、ＭＤＡ５−／−マウスはメンデル比にしたがって誕生して健康に成長し、２４週齢まで巨視的な発達異常は認められなかった。脾臓及びリンパ節におけるＣＤ３、Ｂ２２０、ＣＤ１１ｃのフローサイトメトリー分析により、野生型とＭＤＡ５−／−マウスとの間には、リンパ球及び樹状細胞の数において変化がないことを確認した。
【００１１】
ＴＬＲ３、ＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ５は、ポリＩ：Ｃの認識及びその後の抗ウィルス応答の誘導に関与しているとされている。しかし、ｄｓＲＮＡ刺激に対する応答におけるこれらの分子のインビボでの寄与については、まだ明らかにされていない。したがって、本発明者らは次に、ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ−５、ＴＲＩＦ、又はＭＤＡ−５とＴＲＩＦの両方を欠損したマウスにおけるポリＩ：Ｃへのインビボでの応答について調べた。意外にも、ポリＩ：Ｃを投与すると野生型及びＲＩＧ−Ｉ−／−マウスのいずれの血清中でも、ＩＦＮ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１２が急速に誘導され、ＲＩＧ−ＩがインビボにおけるポリＩ：Ｃを介した応答に不可欠ではないことが示された（図２ａ参照）。これとは際立って対照的に、ＭＤＡ５−／−マウスがポリＩ：Ｃに応答してＩＦＮ−αを生成することはなく、ＩＬ−６及びＩＬ−１２ｐ４０の生成も、かなり減少していた。また、ＴＲＩＦ−／−マウスは通常量のＩＦＮ−αを生成していたが、ＩＬ−１２ｐ４０の生成は著しく減少しており、ＩＬ−６の生成もかなり減少していた。さらに、ＭＤＡ５−／−ＴＲＩＦ−／−マウスがポリＩ：Ｃに応答してＩＦＮ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１２ｐ４０を誘導することはなかった（図２ｂ参照）。これらの結果は、ＭＤＡ５はポリＩ：Ｃ誘導性のＩＦＮ−α生成に不可欠であり、ＴＬＲ３シグナリングはＩＬ−１２の生成に重要である一方で、ＭＤＡ５及びＴＬＲ３の両方がＩＬ−６の生成を調節することを示している。サイトカインの誘導に加え、野生型マウスのポリＩ：Ｃ処理によっても、従来の脾臓ＤＣにおけるＣＤ８６などの共刺激分子の表面発現が増加した（図２ｃ参照）。ＭＤＡ５又はＴＲＩＦの一方が欠損していてもＣＤ８６発現に影響はなかったが、二重欠損では結果的にＣＤ８６のアップレギュレーションが阻害された。このことは、ＭＤＡ５シグナリング及びＴＬＲ３シグナリングの両方が、インビボにおけるポリＩ：Ｃ応答性のｃＤＣ活性化に関与していることを示している。ＧＭ−ＣＳＦを用いて作製した骨髄由来ＤＣ（ＧＭＣＳＦ−ＤＣ）をポリＩ：Ｃで刺激すると、野生型又はＲＩＧ−Ｉ−／−マウスのいずれかの細胞は、ポリＩ：Ｃに応答して投与量依存的にＩＦＮ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１２ｐ４０を生成する。これとは対照的に、ＭＤＡ５−／−ＧＭＣＳＦ−ＤＣでは、これらのサイトカインの生成がひどく減少していた（図２ｄ参照）。したがって、細胞質中では、ＲＩＧ−ＩではなくＭＤＡ５がポリＩ：Ｃを主に認識していることを確認した。
【００１２】
しかし、イノシン酸は自然状態でのウィルス複製過程では利用されないため、本発明者らはインビトロ転写により長鎖ｄｓＲＮＡを合成し、ＭＤＡ５又はＲＩＧ−Ｉを欠損しているマウスの胚線維芽細胞（ＭＥＦ）におけるＩＦＮ応答を調べてみた。リポフェクション試薬との錯体を形成するマウスラミン（Lamin）Ａ／Ｃの配列に対応する、長さの異なる２つのｄｓＲＮＡ（２００ｂｐ及び４００ｂｐ）で、ＭＥＦを刺激した。ポリＩ：Ｃの場合とは異なり、野生型及びＭＤＡ５−／−ＭＥＦは同等量のＩＦＮ−βを生成した（図２ｅ参照）。ＲＩＧ−Ｉ−／−ＭＥＦは、検出可能量のＩＦＮ−βをまったく生成しなかった。これは、ＲＩＧ−Ｉがインビトロ転写ｄｓＲＮＡの検出に不可欠であることを示している。また、他のいくつかの配列に対応するインビトロ転写ｄｓＲＮＡは、ＭＤＡ５ではなくＲＩＧ−Ｉを介してＩ型ＩＦＮを誘導していた。総合的に考えて、これはＭＤＡ５とＲＩＧ−ＩがポリＩ：Ｃ及びインビトロ転写ｄｓＲＮＡの検出にそれぞれ差別的に関与している証拠となる。
【００１３】
これらの知見から、本発明者らは、ＲＩＧ−Ｉの機能を喪失させることでｄｓＲＮＡによるインターフェロン応答を有意に抑制し、哺乳動物におけるＲＮＡｉを誘導させることができるのではないかとの仮説を立てた。
【００１４】
しかしながら、ＲＩＧ−Ｉの機能のみを喪失させたＲＩＧ−Ｉ単独ノックアウトマウスでは、ラミンＡに対するＲＮＡｉを誘導させることはできなかった。そこで、ｄｓＲＮＡの発現によるＩＦＮα産生誘導をＥＬＩＳＡ法で観察するような場合には、ＲＩＧ−ＩのみがｄｓＲＮＡの認識に関与しているように見えるものの完全ではなく、ＭＤＡ５もｄｓＲＮＡの認識に関与しているのではないかという仮説を立て、ＲＩＧ−ＩとＭＤＡ５を共に欠損する細胞（ＲＩＧ−Ｉ−／−ＭＤＡ５−／−）に、ラミンＡ遺伝子に相同的な２００、４００、６００ｂｐの長鎖ｄｓＲＮＡを導入し、その後のラミンＡ分子の発現をウェスタンブロット法にて確認したところ、野生型細胞ではラミンＡ分子の低下を認めなかったのに対し、意外にもＲＩＧ−ＩとＭＤＡ５を共に欠損する細胞（ＲＩＧ−Ｉ−／−ＭＤＡ５−／−）においては、これらすべての長鎖ｄｓＲＮＡの導入に対しラミンＡ分子の発現が低下することを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち本発明は、（１）ＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ５をコードする遺伝子の一部又は全部を欠損或いは変異させることにより、野生型において発現されるＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ５の機能が共に失われていることを特徴とするＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）産生のシグナル伝達機能が失われているＲＮＡ干渉用ダブルノックアウト非ヒトモデル動物や、（２）少なくとも３０塩基よりも長い長鎖二本鎖ＲＮＡによって誘導されるＲＮＡ干渉作用を引き起こすことを特徴とする上記（１）記載の非ヒトモデル動物や、（３）非ヒトモデル動物が、モデルマウスであることを特徴とする上記（１）又は（２）記載の非ヒトモデル動物に関する。
【００１６】
また本発明は、（４）上記（１）〜（３）のいずれか記載の非ヒトモデル動物又は該非ヒトモデル動物由来の組織、器官又は細胞をＲＮＡ干渉に使用する方法や、（５）上記（１）〜（３）のいずれか記載の非ヒトモデル動物又は該非ヒトモデル動物由来の組織、器官若しくは細胞に、二本鎖ＲＮＡ又は二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを導入してＲＮＡ干渉を誘導することを特徴とするＲＮＡ干渉作用により標的遺伝子の発現を抑制する方法や、（６）二本鎖ＲＮＡが、少なくとも３０塩基よりも長い長鎖二本鎖ＲＮＡであることを特徴とする上記（５）記載のＲＮＡ干渉作用により遺伝子の発現を抑制する方法や、（７）上記（１）〜（３）のいずれか記載の非ヒトモデル動物又は該非ヒトモデル動物由来の組織、器官若しくは細胞に、所定の二本鎖ＲＮＡ又は二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを導入してＲＮＡ干渉を誘導し、ＲＮＡ干渉作用による遺伝子の発現抑制の結果、動物個体、組織、器官若しくは細胞に現れる表現型の変化を解析することを特徴とする標的遺伝子の機能を同定する方法や、（８）二本鎖ＲＮＡが、少なくとも３０塩基よりも長い長鎖二本鎖ＲＮＡであることを特徴とする上記（７）記載の標的遺伝子の機能を同定する方法に関する。
【００１７】
さらに本発明は、（９）上記（１）〜（３）のいずれか記載の非ヒトモデル動物又は該非ヒトモデル動物由来の組織、器官若しくは細胞に、被験物質として長鎖二本鎖ＲＮＡ又は該長鎖二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを導入してＲＮＡ干渉を誘導し、ＲＮＡ干渉作用による遺伝子の発現抑制の結果、動物個体、組織、器官若しくは細胞に現れる表現型の変化を解析することを特徴とするＲＮＡ干渉作用を利用した標的遺伝子のスクリーニング方法や、（１０）長鎖二本鎖ＲＮＡが、少なくとも３０塩基よりも長い長鎖二本鎖ＲＮＡであることを特徴とする上記（９）記載のＲＮＡ干渉を利用した標的遺伝子のスクリーニング方法に関する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のＲＮＡｉ用ダブルノックアウト非ヒトモデル動物や、該ダブルノックアウト非ヒトモデル動物由来の組織、器官又は細胞においては、ｄｓＲＮＡによるインターフェロン応答が有意に抑制されるため、哺乳動物において長鎖ｄｓＲＮＡを使用したＲＮＡｉを誘導させることが可能となり、本発明のＲＮＡｉ用ダブルノックアウト非ヒトモデル動物や、該ダブルノックアウト非ヒトモデル動物由来の組織、器官又は細胞は、標的遺伝子の機能解析や、ウィルスの発現抑制、疾患原因遺伝子の発現抑制などによる遺伝子治療の開発材料として、またＲＮＡ医薬品の開発等のためのスクリーニング方法にも使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明のＲＮＡｉ用ダブルノックアウト非ヒトモデル動物（以下、単に「ダブルノックアウトモデル動物」ということがある。）としては、ＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ５をコードする遺伝子の一部又は全部を欠損或いは変異させることにより、野生型において発現されるＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ５の機能が共に失われて、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）産生のシグナル伝達機能が失われている非ヒトモデル動物であれば特に制限されず、本発明のダブルノックアウトモデル動物は、ＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ５によるＩ型インターフェロン（ＩＦＮαやＩＦＮβ）産生のシグナル伝達機能が失われているため、インターフェロン応答が有意に抑制され、ｄｓＲＮＡによって誘導されるＲＮＡｉ用に使用することができる。特に通常３０塩基よりも長いｄｓＲＮＡではインターフェロン応答が生じると考えられているが、本発明のダブルノックアウトモデル動物によれば、これよりも長いｄｓＲＮＡによるＲＮＡｉ作用を生じさせることが可能であり、ＲＮＡｉ法に３０〜８００塩基のｄｓＲＮＡを使用することも可能である。また、短鎖のｄｓＲＮＡにおいてもインターフェロン応答が完全に生じないわけではないため、本発明のダブルノックアウトモデル動物又は該モデル動物由来の組織、器官又は細胞を用いたＲＮＡｉに短鎖ｄｓＲＮＡを使用することもできる。また、非ヒトモデル動物としては、ヒト以外の適宜の哺乳動物を対象とすることができ、具体的には、マウス、ラット、モルモット等の齧歯目動物を挙げることができる。なお、これらのうちマウスを好適な例示として挙げることができる。
【００２０】
本発明のダブルノックアウトモデル動物を作製するためには、ＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ５遺伝子の遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒトモデル動物、すなわちＲＩＧ−Ｉ分子及びＭＤＡ５分子のタンパク質のノックアウト動物を作製する。例えば、本発明のダブルノックアウトモデルマウスは、以下のようにして作製することができる。マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用い、ＲＩＧ−Ｉ遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされたＲＩＧ−Ｉ遺伝子を、ウイルスベクターやプラスミドベクター等を用いてサブクローンし、制限酵素マッピング及びＤＮＡシーケンシングにより特定する。次に、このＲＩＧ−Ｉをコードする遺伝子の全部又は一部をｐＭＣ１ネオ遺伝子カセット等に置換し、３’末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入することによって、ターゲットベクターを作製する。この作製されたターゲティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質により相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を選択する。この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。その確認されたＥＳ細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型マウスと交雑させると、ＲＩＧ−Ｉヘテロ接合体マウス（ＲＩＧ−Ｉ＋／−）を得ることができる。また、同様にしてＭＤＡ５ヘテロ接合体マウス（ＭＤＡ５；＋／−）を得て、ＲＩＧ−Ｉヘテロ接合体（ＲＩＧ−Ｉ＋／−）マウスとＭＤＡ５ヘテロ接合体（ＭＤＡ５＋／−）マウスとを掛け合わせ、ＲＩＧ−Ｉ＋／−ＭＤＡ５＋／−マウスを作製する。次に、この遺伝子型（ＲＩＧ−Ｉ＋／−ＭＤＡ５＋／−）のマウス間同士で交配させることにより、本発明のダブルノックアウトモデルマウス作製することができる
【００２１】
本発明のダブルノックアウトモデル動物又は該非ヒトモデル動物由来の組織、器官若しくは細胞のＲＮＡｉに使用する方法としては、前記ダブルノックアウトモデル動物又は非ヒトモデル動物由来の組織、器官又は細胞を使用して、ＲＮＡｉを誘導するものであれば、その使用の形態については特に制限されず、具体的には、後述するＲＮＡ干渉作用により標的遺伝子の発現を抑制する方法、標的遺伝子の機能を同定する方法、ＲＮＡ干渉作用を利用した標的遺伝子のスクリーニング方法の他、本発明のダブルノックアウトモデル動物又は該非ヒトモデル動物由来の組織、器官若しくは細胞に、所定遺伝子の異なる部位を認識するｄｓＲＮＡ又は該ｄｓＲＮＡを発現しうるベクター（ｄｓＲＮＡ発現ベクター）、あるいは、所定遺伝子の異なる大きさのｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ発現ベクターを導入して、所定遺伝子の発現の程度を解析する等のＲＮＡｉのメカニズムを解明する方法や、本発明のダブルノックアウトモデル動物又は該非ヒトモデル動物由来の組織、器官若しくは細胞に、被験物質の存在下、ｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ発現ベクターを導入して、ＲＮＡｉの誘導の程度を評価するＲＮＡｉ促進又は抑制剤のスクリーニング方法や、本発明のダブルノックアウトモデル動物に、被験物質を投与して、その欠損により疾患（例えば、早老症候群）を引き起こす所定遺伝子（例えば、ラミンＡ）を認識するｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ発現ベクターを導入して、ＲＮＡｉ作用による遺伝子の発現抑制の結果、モデル動物に現れる疾患改善の程度を、被験物質の非存在下の場合と比較・評価する前記疾患の治療薬のスクリーニング方法など、前記ダブルノックアウトモデル動物又はダブルノックアウトモデル動物由来の組織、器官又は細胞にｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ発現ベクターを導入してＲＮＡｉを引き起こし、遺伝子の発現を抑制させることで、遺伝子の機能解析や、ウィルスの発現抑制、疾患原因遺伝子の発現抑制などの方法や、ＲＮＡ医薬品の開発等のためのスクリーニング方法を挙げることができる。そして、本発明のダブルノックアウトモデル動物又は該非ヒトモデル動物由来の組織、器官若しくは細胞を使用してＲＮＡｉを誘導した場合、インターフェロン応答が有意に抑制されているので、たとえ３０塩基よりも長いｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ発現ベクターを用いた場合であっても、インターフェロン応答によるＲＮＡｉ効果の特異性の低下や、アポトーシス誘導による細胞毒性の上昇等の問題のないＲＮＡｉを誘導することが可能となる。
【００２２】
本発明のＲＮＡｉ作用により標的遺伝子の発現を抑制する方法としては、上記本発明のダブルノックアウトモデル動物又は該ダブルノックアウトモデル動物由来の組織、器官又は細胞に、ｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ発現ベクターを導入してＲＮＡｉを誘導する方法であれば特に制限されず、ＲＮＡｉ作用により標的遺伝子の発現が抑制される。ＲＮＡｉに使用するｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ発現ベクターとしては、ノックダウンさせたい標的遺伝子、例えば、配列は判明しているがどのような機能を有するかを解明したい遺伝子や、その発現が疾患の原因と考えられる遺伝子などを認識することができるｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ発現ベクターを挙げることができる。通常３０塩基よりも長いｄｓＲＮＡではインターフェロン応答が生じると考えられているが、本発明のＲＮＡｉ作用による標的遺伝子の発現を抑制する方法によれば、これよりも長いｄｓＲＮＡによるＲＮＡｉを生じさせることが可能であり、３０〜８００塩基のｄｓＲＮＡを使用することも可能である。また、短鎖のｄｓＲＮＡにおいても、インターフェロン応答が完全に生じないわけではないため、本発明のＲＮＡｉ作用による遺伝子の発現を抑制する方法に短鎖ｄｓＲＮＡを使用することもできる。
【００２３】
本発明のＲＮＡｉ作用による遺伝子の発現を抑制する方法によれば、生物組織中におけるＤＮＡの増幅作用やタンパク質合成作用を抑止するＲＮＡｉにより、病原体の増殖やガン細胞の活性を下げるための有力な知見を得ることができる。また、未知の標的遺伝子の機能が解明されれば、その機能に基づく生理作用が解明され、標的遺伝子に起因する病理作用の解明が可能となる。なお、本発明のＲＮＡｉ作用による遺伝子の発現を抑制する方法において、遺伝子の発現が抑制されたことを確認する方法としては、例えば、標的遺伝子のｍＲＮＡの発現量の減少や、そのｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質の発現量の減少の程度をウェスタンブロット法等の公知の方法により、確認することにより行うことができる。
【００２４】
本発明の標的遺伝子の機能を同定する方法としては、上記本発明のダブルノックアウトモデル動物又は該ダブルノックアウトモデル動物由来の組織、器官又は細胞に、所定のｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ発現ベクターを導入してＲＮＡｉを誘導し、ＲＮＡｉ作用による遺伝子の発現抑制の結果、動物個体、組織、器官若しくは細胞に現れる表現型の変化を解析する方法であれば特に制限されず、上記所定のｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ発現ベクターとしては、例えば、配列は判明しているが機能が明らかでなく、どのような機能を有するかを解明したい標的遺伝子を認識することができるｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ発現ベクターを挙げることができる。通常３０塩基よりも長いｄｓＲＮＡではインターフェロン応答が生じると考えられているが、本発明の標的遺伝子の機能を同定する方法によれば、これよりも長いｄｓＲＮＡによるＲＮＡｉを生じさせることが可能であり、３０〜８００塩基のｄｓＲＮＡを使用することも可能である。また、短鎖のｄｓＲＮＡにおいても、インターフェロン応答が完全に生じないわけではないため、本発明の標的遺伝子の機能を同定する方法に短鎖ｄｓＲＮＡを使用することもできる。
【００２５】
本発明のＲＮＡｉ作用を利用した標的遺伝子のスクリーニング方法としては、前記本発明のダブルノックアウトモデル動物又は該ダブルノックアウトモデル動物の組織、器官又は細胞に、被験物質としてｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ発現ベクターを導入してＲＮＡｉを誘導し、ＲＮＡｉ作用による遺伝子の発現抑制の結果、動物個体、組織、器官若しくは細胞に現れる表現型の変化を解析する方法であれば特に制限されず、上記被験物質としてのｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ発現ベクターとしては、例えば、遺伝子ライブラリーから作製したｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ発現ベクターライブラリーを挙げることができる。通常３０塩基よりも長いｄｓＲＮＡではインターフェロン応答が生じると考えられているが、本発明のＲＮＡｉ作用を利用した標的遺伝子のスクリーニング方法によれば、これよりも長いｄｓＲＮＡによるＲＮＡｉを生じさせることが可能であり、３０〜８００塩基のｄｓＲＮＡを使用することも可能である。また、短鎖のｄｓＲＮＡにおいても、インターフェロン応答が完全に生じないわけではないため、本発明のＲＮＡｉ作用を利用した標的遺伝子のスクリーニング方法に短鎖ｄｓＲＮＡを使用することもできる。ＲＮＡｉ作用による遺伝子の発現抑制の結果、動物個体、組織、器官若しくは細胞に現れる表現型に、所望の変化（例えば、所望の疾患の症状を呈する変化）を与えたｄｓＲＮＡをｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ発現ベクターライブラリーの中からスクリーニングし、スクリーニングしたｄｓＲＮＡからの標的遺伝子の同定は、前記遺伝子ライブラリーを対象に、当該ｓｓＲＮＡをプローブとして、ハイブリダイゼーションやＰＣＲやパニング操作等を行う常法により行うことができる。例えば、アポトーシスを誘導する遺伝子を標的遺伝子とする場合、前記のダブルノックアウトモデル動物又は該ダブルノックアウトモデル動物の組織、器官又は細胞に、被験物質としてのｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ発現ベクターを導入してＲＮＡｉを誘導し、前記ダブルノックアウトモデル動物にアポトーシスを引き起こす薬剤を投与するか又は前記ダブルノックアウトモデル動物の組織、器官又は細胞にアポトーシスを引き起こす薬剤を接触させて刺激し、刺激後も生存する細胞を回収して、使用したｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ発現ベクターから標的遺伝子を同定することで、アポトーシスを誘導する遺伝子をスクリーニングすることができる。
【００２６】
また、動物個体、組織、器官若しくは細胞でその変化を解析すべき表現型としては特に制限はされないが、例えば動物個体、組織、器官若しくは細胞の疾患症状、動物個体、組織、器官若しくは細胞の形態、動物個体、組織、器官若しくは細胞内の物質量、動物個体、組織、器官若しくは細胞が分泌する物質量、動物個体、組織、器官若しくは細胞内物質の動態、細胞間接着、動物個体、組織、器官若しくは細胞の運動、動物個体、組織、器官若しくは細胞の寿命等の生命体行動等を挙げることができる。本発明の標的遺伝子の機能を同定する方法においては、上記表現型の変化を解析することにより標的遺伝子の機能を同定することができ、他方、本発明のＲＮＡｉ作用を利用した標的遺伝子のスクリーニング方法においては、上記表現型の変化を解析することにより所望の機能を有する標的遺伝子をスクリーニングすることができる。また、表現型の変化を解析する手段としては、動物個体、組織、器官若しくは細胞の形態の変化を解析する場合には、顕微鏡、あるいは肉眼的に検出する方法を挙げることができ、動物個体、組織、器官若しくは細胞内の物質がｍＲＮＡの場合には、ノーザンハイブリダイゼーション、定量的リバーストランスフェレースＰＣＲ、あるいは In situ hybridization等を定量的解析手段として挙げることができ、タンパク質の場合には、標的遺伝子がコードするタンパク質を抗原とする抗体によるウェスタンブロッティング法や、標的遺伝子がコードするタンパク質が有する酵素活性を測定する方法等を定量的解析手段として挙げることができる。このようにして解析した、ＲＮＡｉが誘導された動物個体、組織、器官若しくは細胞にのみ現れる表現型の変化は、標的遺伝子の発現阻害の結果生じているものであるので、これを標的遺伝子の機能として同定することができる。
【００２７】
ｄｓＲＮＡを構成するｓｓＲＮＡの合成は、例えば自動核酸合成装置を用いた標準的なホスホアミダイト法による固相合成で行うことができる。こうしてｄｓＲＮＡを構成するオリゴＲＮＡの各々を合成し、二重鎖形成部が相補的な２本のｓｓＲＮＡを等モルで混合することでｄｓＲＮＡとして用いることができる。ｄｓＲＮＡは、リポフェクション法等により直接細胞内に導入することができる。通常陰電荷を有するホスファチジルセリン（ＰＳ）からなるリポソームを用いることができるが、より安定したリポソームを形成する陽イオン性脂質であるＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ、商品名：トランスフェクタム、リポフェクトアミン）を用いることもできる。これら陽イオン脂質と陰電荷をもつｄｓＲＮＡとの複合体を形成させると、正に荷電しているリポソームが、負に荷電している細胞の表面に吸着し、細胞膜と融合することでｄｓＲＮＡを細胞内に導入することができる。また、動物個体、組織若しくは器官への導入に際しては、局部又はその周辺組織にｄｓＲＮＡとリポソームの複合体を直接注入することができる。
【００２８】
上記ｄｓＲＮＡ発現ベクターは、ｄｓＲＮＡを直接細胞内に導入した場合より、ｄｓＲＮＡが細胞内に存在できる期間が長くなり、遺伝子発現抑制の効率が高くなるという利点を有する。かかるｄｓＲＮＡ発現ベクターとしては、標的遺伝子の発現産物を標的とした遺伝子の特定配列のセンス鎖ＤＮＡ−リンカー−アンチセンス鎖ＤＮＡからなるｄｓＲＮＡ発現カセットをプロモーターの下流に挿入することにより有利に作製することができる。また、ｄｓＲＮＡ発現用のベクターは市販品を含め公知のものを用いることができるが、哺乳動物に導入する場合にはウイルスベクターであることが好ましい。ウイルスベクターとしては、例えば、マウス白血病レトロウイルスベクター（Microbiology and Immunology, 158, 1-23, 1992）や、アデノ随伴ウイルスベクター（Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 97-129, 1992）や、アデノウイルスベクター（Science, 252, 431-434, 1991）や、リポソーム等を具体的に挙げることができるが、ＨＩＶレンチウイルスベクターは、非分裂細胞にも効率よく長期発現が可能であるという特徴を有する点で好ましい。また、これら発現系は、発現を起こさせるだけでなく、発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。これらの発現ベクターへのｄｓＲＮＡ発現カセットの導入は常法によって行うことができ、例えばこれら発現ベクター中の適当なプロモーターの下流にｄｓＲＮＡ発現カセットを挿入することによりｄｓＲＮＡ発現ベクターを構築することができる。
【００２９】
また、組織、器官又は細胞内にｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ発現ベクターを導入する方法としては特に制限されないが、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染、直接注入等を例示することができる。
【００３０】
上記ダブルノックアウトモデル動物由来の組織、器官又は細胞としては、ダブルノックアウトモデル動物から採取される組織、器官又は細胞であれば特に制限されるものではなく、組織、器官としては、心臓、肺臓、膵臓、肝臓、脾臓、胃、腸等を挙げることができる。また、細胞としては、これら組織、器官由来の細胞の他、胎児線維芽細胞、樹状細胞等を挙げることができ、これら組織、器官又は細胞のうち、ＲＩＧ−Ｉ−／−ＭＤＡ５−／−のものを選び出すことが好ましい。
【００３１】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３２】
（ＭＤＡ５−／−マウスの作製）
ＰＣＲにより、ＥＳ細胞（ＧＳＩ−Ｉ）から抽出したゲノムＤＮＡからＭＤＡ５遺伝子を単離した。ＭＤＡ５ＯＲＦ（ＤＥｘＨ  ｂｏｘを含む）をコードする４．３−ｋｂの断片をネオマイシン耐性遺伝子カセット（neo）で置換することによりターゲティングベクターを構築し、ＰＧＫプロモーターにより動かされた単純ペルペスウィルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）を、ネガティブ選択のため、ゲノム断片に挿入した。ターゲティングベクターをＥＳ細胞にトランスフェクトした後、Ｇ４１８とガンシクロビアの二重耐性コロニーを選択し、ＰＣＲによりスクリーニングし、さらにサザンブロットによって確認した。相同組換体を雌のＣ５７ＢＬ／６マウスにマイクロインジェクションし、ＭＤＡ５−／−マウスを得るために、ヘテロ接合体のＦ１子孫をインタークロスした。
【００３３】
（ＭｙＤ８８−／−マウス、ＴＲＩＦ−／−マウス、ＴＬＲ３−／−、ＴＲＩＦ−／−マウス及びＲＩＧ−Ｉ−／−マウスの作製）
ＭｙＤ８８−／−マウス、ＴＬＲ３−／−マウス、ＴＲＩＦ−／−マウスについては、文献Sceience 301, 640-3 （2003）に記載の方法により作製した。また、ＩＦＮα／βＲ−／−マウスは、Int Immunol 14 1225-31（2002）に記載の方法により作製した。さらに、ＩＣＲマウスとの交配により、ＲＩＧ−Ｉ−／−成体マウスを作製した。
【００３４】
（ＲＩＧ−Ｉ−／−ＭＤＡ５−／−マウスの作製）
ＲＩＧ−Ｉヘテロ接合体（ＲＩＧ−Ｉ＋／−）マウスとＭＤＡ５ヘテロ接合体（ＭＤＡ５＋／−）マウスとを交配すると、その子はＲＩＧ−Ｉ＋／＋ＭＤＡ５＋／＋，ＲＩＧ−Ｉ＋／−ＭＤＡ５＋／＋，ＲＩＧ−Ｉ＋／＋ＭＤＡ５＋／−ＲＩＧ−Ｉ＋／−ＭＤＡ５＋／−のどれかとなる。この遺伝子型はマウス尾より抽出したゲノムＤＮＡを用い、ＰＣＲ法もしくはサザンブロット法を用いることにより同定することが出来る。このうち、ＲＩＧ−Ｉ＋／−ＭＤＡ５＋／−の遺伝子型のマウス間同士で交配させることにより、ＲＩＧ−Ｉ＋／＋ＭＤＡ５＋／＋，ＲＩＧ−Ｉ＋／−ＭＤＡ５＋／＋，ＲＩＧ−Ｉ＋／＋ＭＤＡ５＋／−，ＲＩＧ−Ｉ＋／−ＭＤＡ５＋／−、ＲＩＧ−Ｉ−／−ＭＤＡ５＋／＋、ＲＩＧ−Ｉ−／−ＭＤＡ５＋／−、ＲＩＧ−Ｉ＋／＋ＭＤＡ５−／−、ＲＩＧ−Ｉ＋／−ＭＤＡ５−／−、ＲＩＧ−Ｉ−／−ＭＤＡ５−／−、のどれかとなる。このうち、ＲＩＧ−Ｉ−／−ＭＤＡ５−／−マウスをＰＣＲ法もしくはサザンブロット法により同定した。
【００３５】
（細胞、試薬及びウィルス）
ＲＩＧ−Ｉ−／−ＭＥＦ及び骨髄由来ＧＭＣＳＦ又はＦｌｔ３Ｌ−ＤＣの作製については、文献Immunity 23, 19-28 （2005）記載のとおり作製した。Miltenyi Biotech社製の抗Ｂ２２０及びＣＤ１１ｃマイクロビーズを用いたＭＡＣＳにより、Ｆｌｔ３Ｌ−ＤＣからｐＤＣ及びｃＤＣを前述のとおり単離した。ポリ（Ｉ：Ｃ）は、Amersham Biosciences社から購入した。
【実施例２】
【００３６】
（ＭＤＡ５−／−マウスの性状）
ＭＤＡ５−／−マウスを確立し、ウィルス認識に対するＭＤＡ５の寄与を分析した（図１ａ及び１ｂ参照）。ＭＤＡ５のｍＲＮＡの発現は、タンパク質の場合と同様に、ＭＤＡ５−／−細胞では検出されなかった（図１ｃ及び１ｄ）。その多くが胚期に死亡するＲＩＧ−Ｉ−／−マウスとは対照的に、ＭＤＡ５−／−マウスはメンデル比にしたがって誕生して健康に成長し、２４週齢まで巨視的な発達異常は認められなかった。脾臓及びリンパ節におけるＣＤ３、Ｂ２２０、ＣＤ１１ｃのフローサイトメトリー分析により、野生型とＭＤＡ５−／−マウスとの間には、リンパ球及びＤＣの組成に変化がないことが明らかになった。
【００３７】
（ノーザンブロット）
１０００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−βを用いて又は用いずに、ＰＥＣを８時間処理し、TRIzol試薬（Invitrogen社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを電気泳動にかけ、ナイロン膜に転写した後、表示のｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。ＭＤＡ５ｍＲＮＡの発現を検出するため、３０８ｂｐの断片（７７７−１０８４）をプローブとして使用した。同じ膜をβアクチンプローブと再度ハイブリダイズさせた。結果は図１のｃのとおりである。
【００３８】
（ウェスタンブロット）
１０００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−βでＭＥＦを８時間処理した。その後、１．０％のNonidet-P40、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche社製）を含む溶解緩衝液中で細胞を溶解した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで細胞溶解物を溶解し、ＰＶＤＦ膜に転写した。かかる膜をＭＤＡ５タンパク質の特異抗体でブロットし、増強した化学発光システム（Perkinermer社製）により視覚化した。結果は図１のｄのとおりである。
【００３９】
（フローサイトメトリー）
マウスの静脈内に２００μｇのポリＩ：Ｃを注入し、注入から２４時間後にマウスを処分した。コラゲナーゼ及びＤＮａｓｅＩを用いてマウスから脾細胞を調製した。ＣＤ８６−ＦＩＴＣ（BD Biosciences Pharmingen社製）、Ｂ２２０−ＰＥ、及びＣＤ１１ｃ−ＡＰＣで脾細胞を染色し、FACS Calibur（BD Bioscience社製）で分析した。結果は図２のｃのとおりであり、ＩＬ−６の生成は、ＭＤＡ５及びＴＬＲ３の両方によって調節され、サイトカインの誘導に加え、野生型マウスのポリＩ：Ｃ処理によっても、脾臓ＤＣにおけるＣＤ８６などの共刺激分子の表面発現が増加することがわかった。
【実施例３】
【００４０】
（インビトロ転写ｄｓＲＮＡの調製）
マウスラミンＡ／ＣのｃＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅し、ｐＴ７ブルーＴベクター（Novagen社製）にてクローン化し、配列決定した。以下のＴ７配列でタグしたプライマーを用いた別のＰＣＲ反応により、マウスラミンＡ／Ｃに対応する２００及び４００ｂｐのＤＮＡ配列の末端に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターをタグした；
７Ｔ Lamin. フォワード（配列番号１）：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧａｃｔｔｇｔｔｇｇｃｔｇｃｇｃａｇｇｃ
７Ｔ Lamin. ２００リバース（配列番号２）：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧｃｃａｃｔｃｇｃｃｔｃａｇｃａｔｃｔｃａｔ
７Ｔ Lamin. ４００リバース（配列番号３）：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧｃｔｇｔｔｃｃａｃｃｔｇｇｔｃｃｔｃａｔｇ
Ｔ７  Lamin.６００  リバース（配列場号４）：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧｔｃｃｔｃｃａｇｇｔｃａｃｇｃａｇｃｔｔｔ
ＰＣＴ産物をゲル精製し、T7 RiboMAXTMExpress RNAi System（Promega社製）を製造者の説明書どおりに用いてのｄｓＲＮＡのインビトロ転写及び作製に使用した。
【００４１】
（ＲＩＧ−Ｉ−／−ＭＤＡ５−／−によるＲＮＡｉ）
上記実施例１で作製したＲＩＧ−ＩとＭＤＡ５を共に欠損する、ＲＩＧ−Ｉ−／−ＭＤＡ５−／−マウスの胎児（胎生１１．５日）から採取した胎児線維芽細胞から、その一部よりゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法によりＲＩＧ−Ｉ−／−ＭＤＡ５−／−の細胞を選び出した。野生型、及びＲＩＧ−Ｉ−／−ＭＤＡ５−／−の細胞を培養した。ラミンＡ遺伝子に相同的な２００、４００、６００ｂｐの長鎖ｄｓＲＮＡを最終１マイクログラム/ｍｌとなるように調整し、リポフェクション試薬であるリポフェクタミン２０００（Invitrogen社）と混合した。その方法はInvitrogen社の推薦する方法に準じた。その後、このｄｓＮＲＡ／リポフェクタミン２０００混合物で野生型、及びＲＩＧ−Ｉ−／−ＭＤＡ５−／−細胞を処理した。処理後更に４８時間細胞培養を継続し、その後、細胞を１．０％のNonidet-P40、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche社製）を含む溶解緩衝液中で細胞を溶解した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで細胞溶解物を溶解し、ＰＶＤＦ膜に転写した。かかる膜をラミンＡ／Ｃタンパク質の特異抗体でブロットし、増強した化学発光システム（Perkinermer社製）により視覚化した。その結果、野生型細胞ではラミンＡ分子の低下を認めなかったのに対し、ＲＩＧ−ＩとＭＤＡ５を共に欠損する細胞（ＲＩＧ−Ｉ−／−ＭＤＡ５−／−）においては、これらすべての長鎖ｄｓＲＮＡを導入に対しラミンＡ分子の発現が低下すること確認した（図３参照）。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１のａは、マウスＭＤＡ５遺伝子、ターゲティングベクター及び予測された破壊遺伝子の構造を示す図である。■はコーディングエクソンを示す。Ｂ；ＢａｍＨＩを示す。図１のｂは、ヘテロ接合体のインタークロスによる子孫のサザンブロット分析結果を示す図である。ゲノムＤＮＡをマウスの尾から抽出し、ＢａｍＨＩで分解し、電気泳動で分離して、ａに示した放射性標識プローブとハイブリダイズした。サザンブロットにより、野生型（＋／＋）マウスには９．４ｋｂのシングルバンド、ホモ接合体（−／−）マウスには４．６ｋｂのバンド、ヘテロ接合体（＋／−）マウスには両方のバンドが得られた。図１のｃは、腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）のノーザンブロット分析結果を示す図ある。１０００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−βで８時間処理した野生型（ＷＴ）及びＭＤＡ５−／−ＰＥＣの全ＲＮＡを抽出し、ＭＤＡ５のｍＲＮＡの発現について、ノーザンブロット分析を行った。同じ膜をβアクチンプローブと再度ハイブリダイズした。図１のｄは、ＭＤＡ５発現のウェスタンブロット分析結果を示す図ある。ＷＴ及びＭＤＡ５−／−ＭＥＦを１０００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−βで８時間処理し、全細胞溶解液をＭＤＡ５の抗体でイムノブロットした。
【図２】図２のａ及びｂは、表示のマウスの静脈内に、２００μｇのポリＩ：Ｃを表示した時間注入しておき、血清中のＩＦＮ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１２ｐ４０の生成をＥＬＩＳＡで測定した結果を示す図である。データは、血清試料の平均値±Ｓ．Ｄ．である。図２のｃは、ＰＢＳ又はポリＩ：Ｃを注入されたマウスの脾臓ＣＤ１１ｃ+Ｂ２２０−ｃＤＣについて、ＣＤ８６の表面発現をフローサイトメトリーで分析した結果を示す図である。図２のｄは、ＷＴ、ＲＩＧ−Ｉ−／−、及びＭＤＡ５−／−ＧＭＣＳＦ−ＤＣを、濃度を次第に増大させたポリＩ：Ｃで２４時間刺激した結果を示す図である。培養上清中のＩＦＮ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１２ｐ４０の生成をＥＬＩＳＡで測定した。図２のｅは、ＷＴ、ＲＩＧ−Ｉ−／−、及びＭＤＡ５−／−ＭＥＦを、リポフェクトアミン２０００と錯体を形成する、表示した長さのインビトロ転写ｄｓＲＮＡで２４時間処理した結果を示す図である。培養上清中のＩＦＮ−βの生成をＥＬＩＳＡで測定した。ｄ及びｅのエラーバーは、３回の±Ｓ．Ｄ．を示す。
【図３】図３はＲＩＧ−ＩとＭＤＡ５を共に欠損する細胞（ＲＩＧ−Ｉ−／−ＭＤＡ５−／−）に、LaminA遺伝子に相同的な２００、４００、６００ｂｐの長鎖ｄｓＲＮＡを導入し、その後のLaminA分子の発現をウェスタンブロット法に供した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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