(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞接着・伸展タンパク質と、それを用いた細胞の接着・伸展方法の提供。【解決手段】副腎皮質帯状因子−１（ＡＺ−１）等と呼ばれる、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を含む、細胞接着及び/又は伸展用組成物。（ａ）特定のアミノ酸配列を含むタンパク質（ｂ）上記アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ細胞接着及び/又は伸展活性を有するタンパク質及び、これとフィブロネクチンを用いて、平滑筋細胞または血管内皮細胞を培養する、細胞の接着・伸展方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を含む、細胞接着及び/又は伸展用組成物。
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ細胞接着及び/又は伸展活性を有するタンパク質
【請求項２】
細胞が平滑筋細胞又は血管内皮細胞である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
フィブロネクチン又はその断片の存在下で平滑筋細胞を接着及び/又は伸展させることができる、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の組成物の存在下で平滑筋細胞又は血管内皮細胞を培養することを特徴とする、当該細胞の接着及び/又は伸展方法。
【請求項５】
平滑筋細胞は、フィブロネクチン又はその断片の存在下で接着及び/又は伸展することができるものである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載の組成物の存在下で平滑筋細胞又は血管内皮細胞を培養し、得られる培養物から平滑筋細胞又は血管内皮細胞を採取することを特徴とする、当該細胞の製造方法。
【請求項７】
平滑筋細胞は、フィブロネクチン又はその断片の存在下で接着及び/又は伸展することができるものである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を含む、細胞接着及び/又は伸展用キット。
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ細胞接着及び/又は伸展活性を有するタンパク質
【請求項９】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を含む、炎症、腫瘍、創傷及び免疫疾患からなる群から選ばれる少なくとも１つの疾患の治療用医薬組成物。
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ細胞接着及び/又は伸展活性を有するタンパク質
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規細胞接着・伸展タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞接着・伸展タンパク質は、組織を構成する細胞の接着、移動、増殖、分化、形態、代謝などに重要な役割を果たしている。その役割は、生体の生殖、発生、成熟、加齢、炎症、創傷治癒、免疫、腫瘍など多くの生体現象に関与する。
【０００３】
細胞接着・伸展タンパク質は、上記の生体現象を研究する上で、また、これらのタンパク質が関与する疾病又は創傷の診断及び検査、あるいは治療に有用である。さらに、再生医学における組織再生や、生体外における人工組織形成に応用可能である。従って、組織を構成する細胞の外環境因子を生産して、細胞接着や伸展活性などの生物活性を見いだし、利用する方法の開発が望まれている。
【０００４】
ところで、副腎皮質帯状因子-１（Adrenocortical zonation factor-1、以下「AZ-1」という）は、466個のアミノ酸配列を有する分泌タンパク質であり、分泌シグナル、システインリッチ配列（EGF様ドメイン）及びプロカテプシンB-関連領域からなる52kDのマウスタンパク質である。その発現は、副腎皮質細胞の帯状分化(zonal differentiation)と緊密にリンクしている。このタンパク質のオルソログは、ヒトまたはラット等では間質性尿細管腎炎抗原(TIN-ag)様蛋白質(TIN-ag RP) (Wex, T. et al. (2001) Biochemistry 40:1350-1357)、または、リポカリン7(lcn7)と呼ばれており、これらのホモログは、哺乳動物においてTIN-agとして知られている（Nelson, T. R. at al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 16265-16270）。システインリッチ配列は、ソマトメジンB（ビトロネクチンのN末端フラグメント）、並びにフォンビルブランド因子(von Willebrand factor)及びラミニン鎖に類似したドメインを有している。プロカテプシンB-関連配列は、カテプシンBにおいて保存された触媒性システイン残基が置換されてタンパク質分解が不活性となっている。以前報告したように、抗AZ-1抗体を用いた免疫組織化学分析では、AZ-1が副腎皮質類洞に沿って基底膜に局在し、また種々の器官の血管平滑筋細胞を取り囲んでいる基底膜に局在することを示した（Mukai, K. et al. (2005) 生化学 77, 970-970）。
【０００５】
AZ-1は、本タンパク質をコードする遺伝子(cDNA)のクローニングによって同定され、細胞間情報伝達を調節する作用、細胞接着・結合を調節する作用、プロテアーゼ活性又はそれを調節する作用、細胞移動又はガンの転移を調節する作用を有するタンパク質であることが予測された（特許文献１、非特許文献１）。
しかしながら、AZ-1の作用に関する詳細については明らかではない。
【特許文献１】特開2001-211887号公報
【非特許文献１】Mukai, K. et al. (2003) J. Biol. Chem. 278(19), 17084-17092
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、新規細胞接着及び/又は伸展タンパク質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記の課題に鑑み鋭意検討した結果、発明者がすでにクローニングしたマウス由来の分泌タンパク質（Mukai, K. et al. (2003) J Biol Chem 278(19), 17084-17092）について、そのcDNAを用いて組み換えタンパク質を発現させ、その機能を解析したところ、このタンパク質が新規の細胞接着・伸展活性を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１） 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を含む、細胞接着及び/又は伸展用組成物。
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ細胞接着及び/又は伸展活性を有するタンパク質
（２）上記（１）に記載の組成物の存在下で平滑筋細胞又は血管内皮細胞を培養することを特徴とする、当該細胞の接着及び/又は伸展方法。
（３）上記（１）に記載の組成物の存在下で平滑筋細胞又は血管内皮細胞を培養し、得られる培養物から平滑筋細胞又は血管内皮細胞を採取することを特徴とする、当該細胞の製造方法。
（４） 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を含む、細胞接着及び/又は伸展用キット。
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ細胞接着及び/又は伸展活性を有するタンパク質
（５）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を含む、炎症、腫瘍、創傷及び免疫疾患からなる群から選ばれる少なくとも１つの疾患の治療用医薬組成物。
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ細胞接着及び/又は伸展活性を有するタンパク質
本発明において、 細胞接着及び/又は伸展の対象となる細胞としては、例えば平滑筋細胞又は血管内皮細胞が挙げられる。平滑筋細胞は、血管平滑筋細胞であることが好ましい。
【０００９】
また本発明の一態様において、平滑筋細胞は、フィブロネクチン又はその断片の存在下で接着及び/又は伸展させることができる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、細胞接着及び/又は伸展活性を有するタンパク質が提供される。AZ-1は、血管平滑筋細胞及び血管内皮細胞に対する接着及び/又は伸展活性を有することが示されたことから、AZ-1は、上記これらの細胞の増殖、分化、形態、移動、代謝などを制御するといえる。したがって、生体の生殖、発生、成熟、加齢、炎症、創傷治癒、免疫、腫瘍形成・転移など多くの生体現象においてAZ-1を利用した技術の開発が可能である。さらに、再生医学における組織再生や、生体外における人工組織形成に応用することが可能である。従って、本発明において使用されるAZ-1タンパク質は、人工臓器の開発、臓器移植を含む組織損傷・回復時の治療薬、また、これらの開発のための基礎研究に利用可能である。
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、AZ-1（「アンギオネクチン」又は「Angionectin」ともいう）を含む細胞接着及び/又は伸展用組成物に関するものである。以下「AZ-1/angionectin」又は「本タンパク質」と表記する。
【００１３】
組換えAZ-1/angionectinは、その発現ベクターで安定トランスフェクトされたHEK293細胞のコンディションド培地から単離されたものである。AZ-1/angionectinを用いた固相タンパク質-タンパク質相互作用及び細胞接着アッセイにより、本タンパク質は、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン-１などの主要な細胞外基質（ECM）タンパク質と相互作用し、細胞接着を促進することが明らかとなった。組織におけるAZ-1/angionectinの局在を分析すると、副腎皮質洞様血管基底膜、血管平滑筋基底膜、腎糸球体等では検出されるのに対し、細尿管、骨格筋細胞及び心筋細胞の基底膜では検出できないことが分かった。したがって、AZ-1/angionectinは、基底膜タンパク質の新規メンバーであり、血管壁に優先的に局在するタンパク質であるといえる。
本発明は、新規な細胞接着・伸展タンパク質を生産・精製し、その機能を解析し、これらの利用方法を提案するものである。
１．AZ-1/angionectin及び遺伝子
本発明において使用されるAZ-1/angionectinは、以下の(a)又は(b)のタンパク質である。
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ細胞接着及び/又は伸展活性を有するタンパク質
また、本発明において使用されるAZ-1/angionectinは、全長AZ-1/angionectin遺伝子（配列番号１）の塩基配列のうち、少なくとも一部、例えば少なくとも118〜1464番の塩基配列（配列番号３）の領域によりコードされるアミノ酸配列（配列番号２に示すアミノ酸配列の18〜466番のアミノ酸配列（配列番号４））を含むものである。また、配列番号１に示す塩基配列のうち67〜1467番によりコードされるアミノ酸配列（配列番号２：全長コード領域）も含む。本発明においては、全長AZ-1/angionectin遺伝子配列（配列番号１）及び全長AZ-1/angionectinのアミノ酸配列（配列番号２）のほか、上記部分断片（配列番号３及び４）を使用することもできるが、全長AZ-1/angionectinを使用することが好ましい。
さらに、本発明において、AZ-1/angionectinをコードする「遺伝子」には、RNA及びDNAが含まれるものとする。RNAにはmRNAが含まれ、DNAには、例えばクローニングや化学合成技術又はそれらの組み合わせで得られるようなcDNAやゲノムDNAなども含まれる。また、DNAは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖DNAは、センス鎖となるコードDNAでもよく、アンチセンス鎖となるアンチコード鎖でもよい（アンチセンス鎖は、プローブとして又はアンチセンス薬物として利用できる）。さらに、本発明の「遺伝子」は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。また必要に応じて、AZ-1/angionectinにヒスチジンタグ（Hisタグ）などを付与して融合タンパク質とすることもできる。Hisタグを付与すると、ニッケルカラムによる精製、抗Hisタグ抗体を用いた検出が可能である点で好ましい。
【００１４】
ここで、本発明において、上記AZ-1/angionectin又はその部分断片が細胞の接着及び/又は伸展活性を有する限り、本タンパク質のアミノ酸配列において少なくとも１個、好ましくは１個又は数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。
例えば、配列番号２又は４に示すアミノ酸配列の1個又は数個、例えば１〜10個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２又は４に示すアミノ酸配列に、1個又は数個、例えば１〜10個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２又は４に示すアミノ酸配列の1個又は数個、例えば１〜10個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されてもよい。従って、上記変異が導入されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子も、当該タンパク質が細胞接着及び/又は伸展活性を有する限り本発明において使用し得る遺伝子に含まれる。
【００１５】
「細胞接着及び/又は伸展活性」は、細胞接着活性及び細胞伸展活性の両者又はいずれか一方の活性を意味しており、また、「細胞接着活性」とは培養器表面にコーティングされた物質が概ね球状の形態で細胞を付着させる活性を意味し、「細胞伸展活性」とは、培養器表面にコーティングされた物質が仮足を伸ばした形態で細胞を付着させる活性を意味する。これらの活性は、付着した細胞を蛍光色素Hoechst33342等で染色することにより測定することができ、活性を有することの判断基準は、ネガティブコントロールとして接着・伸展活性を持たないウシ血清アルブミン(BSA)等のコーティングとの蛍光強度の差が有意であることである。そして、接着活性、または、伸展活性であるのかの判断は、顕微鏡観察により、それぞれ付着した細胞の形態が概ね球状で仮足を持たない形態、あるいは、仮足を伸ばした形態であるのかによる。
【００１６】
上記欠失、置換、付加等の変異の導入は、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばGeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等（タカラバイオ））等を用いて行うことができる。
【００１７】
さらに、本発明においては、上記AZ-1/angionectinをコードするDNA（配列番号１）に対し相補的な塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるDNAであって細胞接着及び/又は伸展活性を有するタンパク質をコードするDNAも本発明において使用することができる。「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄時の条件であって塩濃度が15〜900mM、温度が40〜75℃、好ましくは塩濃度が15〜300mM、温度が65℃の条件を意味する。例えば、2×SSCで65℃等の条件を挙げることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、反応時間等の諸条件を加味してハイブリダイゼーションの条件を設定することができる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、Sambrook J and Russel D. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001等を参照することができる。
【００１８】
本発明において使用されるAZ-1/angionectinは、後述の実施例に示すように、機能解析の結果、他の細胞外マトリックス因子との結合性を有すること、特に、フィブロネクチン及びフィブロネクチンの一部分であるIII1-C（アナステリン）、タイプ4及びタイプ１コラーゲンとの結合能を有すること等が実験的に確認されている。
【００１９】
本発明においてAZ-1/angionectinを発現するために使用される組換え発現ベクターは、上記（ａ）若しくは（ｂ）のタンパク質、全長タンパク質又はこれらの部分断片をコードする遺伝子を含むものである。例えば、配列番号１若しくは３に示される塩基配列、又は配列番号１に示す塩基配列のうち67〜1467番の塩基配列を含む遺伝子が挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、コスミド、又はウイルスベクターなどを用いることができるが特に限定されるものではなく、公知手法を採用することができる（例えば、Sambrook J and Russel D. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001を参照）。
【００２０】
本発明においてAZ-1/angionectinを発現するために使用される形質転換体は、上記（ａ）若しくは（ｂ）のタンパク質、全長タンパク質又はこれらの部分断片をコードする遺伝子が導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。また、上記「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、動物個体（マウスやラット、ウサギ、ブタ、サルなどの形質転換動物）を含む意味である。特に、マウスやラットは、実験動物・病態モデル動物として広く用いられており、ノックアウトマウス等は、細胞外マトリックス因子の機能解析、同因子が関係する病気の病態解析やその病気の診断法、診断薬、治療法、治療薬の開発などに有用である。
【００２１】
タンパク質発現用組換えベクターは、上記ポリヌクレオチドを適当なベクターに連結することにより得ることができ、形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる（Sambrook J and Russel D. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition, CSHL Press, 2001)。
【００２２】
ベクターには、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドが使用される。プラスミドDNAとしては、大腸菌、枯草菌又は酵母由来のプラスミドなどが挙げられ、ファージDNAとしてはλファージが挙げられる。さらに、動物ウイルス、昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
組換えベクターの作製は、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター DNAの制限酵素部位等に挿入してベクターに連結すればよい。
形質転換に使用する宿主としては、目的の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞（COS細胞、CHO細胞等）、昆虫細胞が挙げられる。
宿主への組換えベクターの導入方法は公知であり、任意の方法（例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等）が挙げられる。
【００２３】
本発明において、本発明のペプチドは、前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることもできる。「培養物」は、培養上清であっても、培養細胞若しくは培養菌体又はその破砕物のいずれかであってもよい。培養法は、当分野において周知である（前記Sambrookら、Molecular Cloningを参照）。
【００２４】
培養後、AZ-1/angionectinが菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりタンパク質を抽出する。また、本タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、目的のタンパク質を単離精製することができる。
【００２５】
また、本発明においては、AZ-1/angionectinを得るためにin vitro翻訳によるタンパク質合成を採用することができる。in vitro翻訳システムは、市販のシステム、例えばExpresswayTMシステム（Invitrogen社）、PURESYSTEM（登録商標；ポストゲノム研究所）、TNTシステム(登録商標；Promega社)などを用いることができる。
２．細胞接着及び/又は伸展用組成物並びにその方法
上記のようにして得られたAZ-1/angionectinは、細胞接着及び/又は伸展用組成物として使用することができる。
【００２６】
本発明の組成物の適用対象となる細胞の種類としては、特に限定されるものではないが、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、副腎皮質細胞、繊維芽細胞、腫瘍由来細胞等が挙げられるが、血管内皮細胞及び血管平滑筋細胞であることが好ましい。
【００２７】
本発明の組成物の存在下で上記細胞を培養することにより、目的とする細胞を接着及び/又は伸展させることができる。「本発明の組成物の存在下で」とは、培養の際に細胞が本発明の組成物に接触し得る状態で、という意味であり、培養液中に本発明の組成物を含有させること、あるいは培養プレートに本発明の組成物をコーティングすることのいずれをも意味する。例えば本発明の組成物を培養器表面へコーティングして、または、適当な細胞培養用培地（RPMI-1640、DMEM等）に本発明の組成物を混合して、目的とする細胞を所定の条件で培養すればよい。培養の際の細胞濃度は、1 x 103〜5 x 105 cells/cm2、好ましくは1 x 104〜3 x 105 cells/cm2、さらに好ましくは3 x 104〜1.5 x 105 cells/cm2である。培養温度及び時間は、25〜37℃、好ましくは37℃で、0.2〜48時間、好ましくは0.5〜18時間である。培養の際、CO2濃度を５%とすることが好ましい。培養は無血清培地で行なうことができるが、培養液中にFCS、FBS等の血清を含有させるときは、その含有割合は1〜20％である。
【００２８】
上記条件下で培養すると、細胞は接着・伸展しながら増殖する。細胞がコンフルエントとなったところでトリプシン及び/又はEDTA処理して細胞を採取することにより、目的とする細胞を得ることができる。したがって、本発明は、本発明の組成物の存在下で平滑筋細胞又は血管内皮細胞を培養することにより、これらの細胞を接着及び/又は伸展させる方法を提供し、さらには、上記培養物から平滑筋細胞又は血管内皮細胞を採取することを特徴とする、当該細胞の製造方法を提供する。
【００２９】
本発明の方法において、平滑筋細胞を、フィブロネクチン又はその断片の存在下で培養すると、平滑筋細胞を効率よく接着及び/又は伸展させることができる。
「フィブロネクチン又はその断片の存在下で」とは、培養の際に細胞がフィブロネクチン又はその断片に接触し得る状態で、という意味であり、培養液中にフィブロネクチン又はその断片を含有させること、あるいは培養プレートにフィブロネクチン又はその断片をコーティングすることのいずれをも意味する。
【００３０】
例えば、血管平滑筋細胞を培養する場合において、予め培養プレートにフィブロネクチン又はその断片をコートし（第一のコーティング）、次にAZ-1/angionectinをコーティング（第二のコーティング）してから、血管平滑筋細胞を培養すると、AZ-1/angionectinの濃度依存的に細胞の接着及び/又は伸展が認められる。
【００３１】
ここで使用されるフィブロネクチンは公知であり、市販のもの（例えばIII1-C（シグマ社））を使用することができる。III1-Cの使用量又は使用濃度は、0〜100 μMである。
【００３２】
細胞が接着したことの確認は、細胞の形態に関わらず培養プレートに付着したことで判断すればよい。また、細胞が伸展したことの確認は、培養プレートに付着した細胞の形態が球状でなく、仮足を伸ばしていることで判断すればよい。
【００３３】
３．キット
本発明において使用されるAZ-1/angionectinは、予めパッケージングして細胞接着及び/又は伸展用キットとして供給することができる。具体的には、本発明のキットは、前記AZ-1/angionectin若しくは変異型タンパク質又はこれらの断片を含むが、その他に、細胞培養用培地、培地に添加する抗生物質、血清（ウシ胎児血清等）、炭酸水素ナトリウムなど、さらに必要に応じて、細胞接着及び/又は伸展のポジティブコントロール及びネガティブコントロールの実施、または培養器のブロッキング、細胞の蛍光染色のために必要な試薬類を含めることができる。  
【００３４】
４．医薬組成物
本発明において、AZ-1/angionectinは、炎症、腫瘍、創傷又は免疫疾患を治療するための医薬組成物（治療薬）として使用することができる。これらの疾患は単独でも、２つ以上の疾患でも適用の対象となり、上記疾患以外の疾患が併発しても適用の対象となる。
炎症は、生体組織に何らかの器質的変化をもたらす侵襲が加わったときに、生体が自己の恒常性を維持するための防衛的反応である。炎症には、組織が細菌感染することによって生じる化膿性炎症、液体成分主体の滲出物が組織に浸出する漿液性炎症、あるいは繊維素性炎症、壊死性炎症などが挙げられるが、これらの炎症に限定されるものではない。
【００３５】
腫瘍としては、以下のものが挙げられる。
(a) 口腔又は咽頭：舌癌、歯肉癌、上顎癌、鼻癌、鼻腔癌、喉頭癌、上咽頭癌、中咽頭癌、下咽頭癌
(b) 脳腫瘍：神経膠腫、髄膜腫、星状細胞腫
(c) 呼吸器：肺癌(扁平上皮癌、腺癌、肺胞上皮癌、大細胞性未分化癌、小細胞性未分化癌) 、細気管支癌
(d) 乳房：乳癌、乳房肉腫、乳房肉腫
(e) 消化器：食道癌、胃癌、膵臓癌、胆道癌、胆嚢癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌
(f) 女性性器：子宮体癌、卵巣癌、子宮頚癌
(g) 泌尿器：前立腺癌、腎癌、膀胱癌、精巣腫瘍、尿道癌、腎盂尿管癌
(h) 運動器：横紋筋肉腫、線維肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、脂肪肉腫、ユーイング肉
腫、平滑筋肉腫
(i) 皮膚：皮膚癌、皮膚ページェット病、悪性黒色腫
(j) 血液：急性骨髄性白血病、急性前骨髄性白血病、急性骨髄性単球白血病、急性単球性白血病、急性リンパ性白血病、急性未分化性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、成人型T細胞白血病、悪性リンパ腫(リンパ肉腫、細網肉腫、ホジキン病)、多発性骨髄腫、原発性マクログロブリン血症
創傷とは、体組織の損傷で、特に物理的外力によっておこるものを意味し、切創、裂創、刺創、咬創、銃創、挫創などが挙げられる。
【００３６】
免疫疾患とは、体構成成分に対して，液性または細胞性免疫の作用の結果生じた組織の機能喪失や破壊による疾患を意味し、自己免疫疾患を含む。これらの疾患としては、例えば関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、橋本病、全身性強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、混合性結合組織病、バセドウ病などが挙げられる。
【００３７】
AZ-1/angionectinは、細胞接着及び/又は伸展を必要とする哺乳動物に投与することができる。投与の対象となる哺乳動物としては、例えばヒトのほか、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の家畜、イヌ、ネコ等の愛玩動物、マウス、ラット、モルモット、ウサギ等の実験動物が挙げられるが、これらの動物に限定されるものではない。
本発明の医薬組成物の投与形態は、経口、非経口投与のいずれでも可能である。
【００３８】
経口投与の場合は、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤又はシロップ剤等による投与が可能である。非経口投与の場合は、注射剤、座剤又は点眼剤等、経肺剤型(例えばネフライザーなどを用いたもの)、経鼻投与剤型、経皮投与剤型(例えば軟膏、クリーム剤)等が挙げられる。注射剤型の場合は、例えば点滴等の静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等により全身又は局部的に投与することができる。これらの製剤は、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤などの医薬上許容される添加剤を用いて周知の方法で製造される。
【００３９】
賦形剤としては、例えば、バレイショデンプン、トウモロコシデンプン等のデンプン、乳糖、結晶セルロース、リン酸水素カルシウム等を挙げることができる。滑沢剤（コーティング剤）としては、例えば、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、セラック、タルク、カルナウバロウ、パラフィン等を挙げることができる。結合剤としては、例えばポリビニルピロリドン、マクロゴール及び前記賦形剤と同様の化合物を挙げることができる。崩壊剤としては、例えば前記賦形剤と同様の化合物及びクロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン等の化学修飾されたデンプン・セルロース類を挙げることができる。安定剤としては、例えばメチルパラベン、プロピルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾール等のフェエノール類が挙げられ、さらに、チメロサール；デヒドロ酢酸；及びソルビン酸を挙げることができる。  矯味矯臭剤としては、例えば通常使用される、甘味料、酸味料、香料等を挙げることができる。また、液剤を製造するための溶媒としては、エタノール、フェノール、クロロクレゾール、精製水、蒸留水等を使用することができる。界面活性剤又は乳化剤としては、例えば、ポリソルベート80、ステアリン酸ポリオキシル40、ラウロマクロゴール等を挙げることができる。
【００４０】
上記添加物等は、本発明の医薬組成物の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれる。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製されたAZ-1/angionectinを溶剤(例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等)に溶解し、これにTween 80、Tween 20、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、本発明の医薬組成物は、使用前に溶解する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥用賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
【００４１】
本発明の医薬組成物の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なる。投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択する。有効投与量は、例えば、一回につき体重1kgあたり1μg〜200mg、好ましくは200μg〜60mgである。但し、上記医薬組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。
【００４２】
本発明の医薬組成物は、公知の細胞接着及び/又は伸展剤を併用することもできる。併用で用い得る細胞接着及び/又は伸展剤は、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ビトロネクチンなどがあるが、これらに限定されるものではない。
【００４３】
さらに、本発明においては、AZ-1/angionectinを細胞接着及び/又は伸展が必要な哺乳動物において発現（例えば遺伝子発現）させることにより、当該哺乳動物において細胞を接着及び/又は伸展させることができる。「発現」とは、哺乳動物内においてAZ-1/angionectinを産生させることをいう。遺伝子治療を行う場合は、AZ-1/angionectin遺伝子を単独で、又は適当な担体に担持させて哺乳動物に投与することを特徴とする。
【００４４】
遺伝子治療の場合は、それぞれの遺伝子を注射により直接投与する方法のほか、核酸が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。
【００４５】
また、上記遺伝子をリポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能である。例えば、上記遺伝子を保持させた小胞体をリポフェクション法により所定の細胞に導入する。そして、得られる細胞を例えば静脈内、動脈内等に全身投与する。細胞は、脳等に局所投与することもできる。
【００４６】
遺伝子治療を行なう場合の本発明の医薬組成物の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、遺伝子治療の場合、例えばアデノウイルスの場合の投与量は1日1回あたり106〜1011個程度である。
遺伝子治療に使用されるAZ-1/angionectin遺伝子を目的の組織又は器官に導入するために、市販の遺伝子導入キット（例えばアデノエクスプレス：クローンテック社）を用いることもできる。
【００４７】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。以下の実施例では、AZ-1/angionectinを生産し、培養液から精製する方法、及びAZ-1/angionectinの性質を調べた結果を説明するものである。
【実施例１】
【００４８】
組み換えAZ-1/angionectinの発現、精製
（１）AZ-1/angionectinの発現
本発明において発現させたAZ-1/angionectinはC端にヘキサヒスチジンタグを有する。この融合タンパク質の発現ベクターpR/C11.13Hisは、本発明者が既に構築した発現ベクターpR/C11.13FD1（文献名：Mukai, K. et al. (2003) J. Biol. Chem. 278(19), 17084-17092）を改変して得られた。改変は、以下の（i）及び（ii）のプライマーを使用した。
（i）5'-TGGGGCCCATGGTGGGGTGA-3'（配列番号５）
（ii）5'- AAGGGCCCTC TAGATTAATC ACTTAGTGAT GGTGATGGTG GTGCTCGAGG TGGTGCCCCA TGTCCTCC-3' （配列番号６）
上記オリゴヌクレオチドプライマーを用いてpR/C11.13FD1を鋳型としてPCR法により、タンパク質のC端部分を含み、その両端に制限酵素ApaI部位（下線部）を持つ断片を増幅し、pR/C11.13FD1の中の対応する断片と入れ替える手順によった。
PCRは、以下の反応組成液を用い、以下の反応サイクルで行なった。
【００４９】
組成液：
鋳型DNA（0.1μg/μl）：           1μL
Pyrobest DNA polymerase：   2.5 units
(i)プライマー( 5μM)：           20μL
(ii)プライマー(5μM)：           20μL
dNTP(各2.5mM)：                   8μL
10×Buffer：                            10μL
滅菌水：                                    適量
合計：                                100μL
サイクル数：94℃×0.5分、56℃× 0.5分及び 72℃×1分を24サイクル、72℃×7分を1サイクル。
【００５０】
得られたpR/C11.13HisをヒトHEK293細胞に安定導入して、培地にAZ-1/angionectinを分泌する細胞クローンを選択した。クローンの選択には、抗AZ-1/angionectin抗体によるウエスタンブロット法によった。
【００５１】
（２）AZ-1/angionectinの精製
AZ-1/angionectinを発現するHEK293細胞を、無血清培養液を用いて培養し、１日または２日間ごとに培養液を集め、新しい培養液と交換した。集めた培養液を150 x g にて10分間室温で遠心し、その上清を引き続き、 48,400 x gにて 20分間、 4℃で遠心し上清を得た。
【００５２】
精製には、AZ-1/angionectinの溶解度が低いことを利用した。すなわち、遠心操作により得られた上清に1L当たり29.2gのNaClを溶かし、遠心力を利用する限外濾過器(Amicon Ultra PL-30, Millipore)により200倍濃縮した。大部分のAZ-1/angionectinは不溶性となり限外濾過膜に蓄積したが、濃縮液中に残る可溶性のAZ-1/angionectinの回収率を上げるため、0.5 M NaClを余分に含むphosphate-buffered saline (PBS)を用いて濃縮液を25倍に希釈し、同じ限外濾過膜で濃縮した。この希釈・濃縮をさらに２回行った。濃縮液を捨て、濾過膜を同一の緩衝液を用いて3回洗った。AZ-1/angionectinを2 M Urea、0.5 M NaClを含むPBSを用いて室温、15分間インキュベートして可溶化し回収した。SDS-PAGE法と銀染色法により、純度は約90%と判明した。
【実施例２】
【００５３】
細胞の調製、接着・伸展アッセイ
（１）細胞の調製
ヒト冠動脈由来血管平滑筋細胞(VSMC)、及び、同血管内皮細胞(VEC)(Cambrex Bio Science社)をそれぞれSmGM-2 and EGM-2-MV（同社製）を用いて培養した。これらの細胞をトリプシンにより分散させ、無血清のDMEM/F-12に懸濁した。
（２）接着・伸展アッセイ
マイクロプレートウェルを0から30 μg/mlの濃度にPBSで希釈した50 μLのAZ-1/angionectin、III1-C（シグマ社）、または、ポジティブコントロールとしてフィブロネクチン(シグマ社)で37℃にて18時間インキュベートした。1 % BSAを含むPBSでウェルをブロッキング後、無血清培地に懸濁したVSMC (1 x104)またはVEC(2 x 104)を添加し、37℃で1時間インキュベートした。マイクロプレートを一定の強さで振とう後、接着していない細胞を吸引により除去し、5%グルタルアルデヒドで20分間固定した。Hoechst 33342で染色し蛍光強度を測定した。VSMCのアッセイでは、上記の方法に加えて以下の実験を行った。マイクロプレートウェルを最初に50 μLのIII1-C (30 μg/ml、シグマ社)で37℃にて18時間インキュベートした。1% BSAを含むPBSで1時間ブロッキング後、III1-CへAZ-1/angionectin (0から0.4 μM、50 μL)を室温で18時間インキュベートして結合させた。これらの処理を行ったウェルへのVSMCの接着を上述の方法で測定した。接着した細胞の形態は、固定後クマシーブルーR250により染色し、透過光により撮影した。
【００５４】
その結果を図１及び２に示す。図１において、(A), (B)は、それぞれAZ-1/angionectin、 III1-Cを単独でコートしたときに、血管平滑筋細胞の接着が弱く、伸展しないことを示す顕微鏡写真である。(C)は、最初にIII1-Cを単独でコートし、次にIII1-CへAZ-1/angionectinを結合させた場合、血管平滑筋細胞が接着・伸展することを示す顕微鏡写真である。(D)は、(C)に示した接着・伸展が、AZ-1/angionectinについて容量依存的であることを示すヒストグラムである。
【００５５】
図１A及びBにそれぞれ示したように、VSMCはウェルへ直接コートされたAZ-1/angionectin及びIII1-C断片に弱く接着し、伸展しなかった。しかし、ウェルをIII1-Cで最初にコートし、そこへAZ-1/angionectinを結合させた場合に、VSMCは接着・伸展した（図１C）。この接着・伸展は、AZ-1/angionectinの濃度に依存した（図１D）。
【００５６】
また、図２において、(A)は、血管内皮細胞の接着が、AZ-1/angionectinまたはフィブロネクチンを単独でコートしたとき、それぞれ容量依存的であることを示すグラフである。(B)、(C)は、血管内皮細胞が、それぞれAZ-1/angionectin、フィブロネクチンへ接着・伸展することを示す顕微鏡写真である。
【００５７】
図２Aに示したように、AZ-1/angionectinまたはフィブロネクチンを直接コートしたとき、VECはそれぞれ容量依存的に接着した。AZ-1/angionectinへの接着は、フィブロネクチンへの接着に比較して60%程度であった。しかし、図2Bに示したようにAZ-1/angionectinへの接着は、フィブロネクチンへの接着・伸展（図2C）で見られたように、伸展を伴っていた。
【００５８】
これらの結果から、AZ-1/angionectinは、VSMCに対しては単独では接着・伸展活性はほとんど示さないが、フィブロネクチン断片のIII1-Cと複合体を形成すると接着・伸展活性を示すタンパク質であることが判明した。一方、VECに対しては、AZ-1/angionectinは単独のコートで接着・伸展活性を示すことがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】血管平滑筋細胞の接着及び/又は伸展を示す図である。
【図２】血管内皮細胞の接着及び/又は伸展を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００６０】
配列番号５：合成DNA
配列番号６：合成DNA
【図１】
2007332082.tif 000002
【図２】
2007332082.tif 000003
【配列表】
2007332082000001.app