(57)【要約】【課題】  細菌を十分に短時間で簡単に検出できる細菌検出装置及び細菌検出方法を提供すること。【解決手段】  本発明は、チャネル幅ｄが１ｍｍ以下であるチャネル１１を有するマイクロチャネルチップ１０のチャネル１１内で、細菌を含む検体液と、細菌から細菌内ＡＴＰを抽出させる抽出液と、細菌内ＡＴＰの存在下に発光する発光液とを混合し、抽出液により細菌から細菌内ＡＴＰを抽出し、細菌内ＡＴＰの存在下、発光液を発光させ、該発光を検出する細菌検出方法である。【選択図】  図１
2007236202.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌を含む検体液を収容するための第１ウェル、
前記細菌から細菌内ＡＴＰを抽出させる抽出液を収容するための第２ウェル、
前記細菌内ＡＴＰの存在下で発光する発光液を収容するための第３ウェル、
前記細菌内ＡＴＰと前記発光液とを接触させる発光部、
前記第１ウェルと前記発光部とを接続する第１チャネル、
前記第１チャネルの抽出液導入部と前記第２ウェルとを接続する第２チャネル、及び、
前記第１チャネルの発光液導入部と前記第３ウェルとを接続する第３チャネル
を有するマイクロチャネルチップと、
前記細菌内ＡＴＰと前記発光液との接触により生じる光を検出する光検出手段と、
前記第１ウェルに収容される液体を前記発光部に移送させ、前記第２、及び第３ウェルに収容される液体を前記第１チャネル移送させるための移送手段と、
を備えており、且つ、
前記第１チャネルのチャネル幅が１ｍｍ以下であることを特徴とする細菌検出装置。
【請求項２】
前記マイクロチャネルチップが、
ＡＴＰ除去剤を含む除去液を収容するための第４ウェルと、
前記ＡＴＰ除去剤を不活性化させる不活性化剤を含む不活性化液を収容するための第５ウェルと、
前記第１チャネルの除去液導入部と前記第４ウェルとを接続する第４チャネルと、
前記第１チャネルの不活性化液導入部と前記第５ウェルとを接続する第５チャネルと、
を更に備えており、
前記第１チャネルにおいて、前記除去液導入部が前記抽出液導入部よりも上流側に設けられており、
前記不活性化液導入部が前記除去液導入部の下流側であって前記抽出液導入部の上流側に設けられており、且つ、
前記移送手段が前記第４及び第５ウェルに収容される液体を前記第１チャネルに移送することが可能となっていることを特徴とする請求項１に記載の細菌検出装置。
【請求項３】
前記マイクロチャネルチップが、
ＡＴＰ除去剤を含む除去液を収容するための第４ウェルと、
前記第１チャネルの除去液導入部と前記第４ウェルとを接続する第４チャネルと、
前記除去液を温度５０℃以上に制御してＡＴＰ除去剤を不活性化させる温度制御手段と、
を更に備えており、
前記第１チャネルにおいて、前記除去液導入部が前記抽出液導入部よりも上流側に設けられており、
前記温度制御手段によって温度が制御される温度制御部が前記除去液導入部の下流側であって前記抽出液導入部の上流側の部分の温度を制御することが可能であり、且つ、
前記移送手段が前記第４ウェルに収容される液体を前記第１チャネルに移送することが可能となっていることを特徴とする請求項１に記載の細菌検出装置。
【請求項４】
前記マイクロチャネルチップが、
細菌内ＡＴＰを増幅させる増幅液を収容するための第６ウェルと、
前記第１チャネルの増幅液導入部と前記第６ウェルとを接続する第６チャネルと、
を更に備えており、
前記第１チャネルにおいて、前記増幅液導入部が前記不活性化液導入部の下流側に設けられおり、且つ、
前記移送手段が前記第６ウェルに収容される液体を前記第１チャネルに移送することが可能となっていることを特徴とする請求項１又は２に記載の細菌検出装置。
【請求項５】
前記マイクロチャネルチップが、
前記細菌のフロックを分解させる分解液を収容する第７ウェルと、
前記第１チャネルの分解液導入部と前記第７ウェルとを接続する第７チャネルと、
を更に備えており、
前記第１チャネルにおいて、前記分解液導入部が前記抽出液導入部よりも上流側に設けられており、且つ、
前記移送手段が前記第７ウェルに収容される液体を前記第１チャネルに移送することが可能となっていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌検出装置。
【請求項６】
前記マイクロチャネルチップにおいて、前記第２ウェル、前記第３ウェル、及び前記第６ウェルのうちのいずれか一つのウェルが他のウェルを兼ねていることを特徴とする請求項４に記載の細菌検出装置。
【請求項７】
前記マイクロチャネルチップが、
細菌内ＡＴＰを増幅させる増幅液を収容するための第６ウェルと、
前記細菌のフロックを分解させる分解液を収容する第７ウェルと、
前記第１チャネルの増幅液導入部と前記第６ウェルとを接続する第６チャネルと、
前記第１チャネルの分解液導入部と前記第７ウェルとを接続する第７チャネルと、
を更に備えており、
前記第１チャネルにおいて、前記分解液導入部が前記抽出液導入部よりも上流側に設けられており、
前記第１チャネルにおいて、前記増幅液導入部が前記不活性化液導入部の下流側に設けられおり、且つ、
前記第２ウェル、前記第３ウェル、前記第４ウェル、前記第５ウェル、前記第６ウェル、及び前記第７ウェルからなる群より選ばれる少なくとも１つのウェルに、そのウェルに対応する前記抽出液、前記発光液、前記除去液、前記不活性化液、前記増幅液、及び前記分解液が収容されていることを特徴とする請求項２に記載の細菌検出装置。
【請求項８】
更にマイクロチャネルチップ内の液体の温度を制御する制御手段を備えることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の細菌検出装置。
【請求項９】
細菌を含む検体液を収容するための第１ウェル、
前記細菌内ＡＴＰの存在下で発光する発光液を収容するための第３ウェル、
前記細菌内ＡＴＰと前記発光液とを接触させる発光部、
前記第１ウェルと前記発光部とを接続する第１チャネル、及び、
前記第１チャネルの発光液導入部と前記第３ウェルとを接続する第３チャネル
を有するマイクロチャネルチップと、
前記細菌内ＡＴＰと前記発光液との接触により生じる光を検出する光検出手段と、
前記第１ウェルに収容される液体を前記発光部に移送させ、前記第３ウェルに収容される液体を前記第１チャネルに移送させるための移送手段と、
を備えており、且つ、
前記第１チャネルのチャネル幅が１ｍｍ以下であり、
前記第１チャネルを加熱する加熱手段、前記第１チャネルに電界を印加する電界印加手段、及び前記第１チャネルに超音波を印加する超音波印加手段のうちの少なくとも１種以上の手段を更に備えることを特徴とする細菌検出装置。
【請求項１０】
前記マイクロチャネルチップが、
ＡＴＰ除去剤を含む除去液を収容するための第４ウェルと、
前記ＡＴＰ除去剤を不活性化させる不活性化剤を含む不活性化液を収容するための第５ウェルと、
前記第１チャネルの除去液導入部と前記第４ウェルとを接続する第４チャネルと、
前記第１チャネルの不活性化液導入部と前記第５ウェルとを接続する第５チャネルと、
を更に備えており、
前記第１チャネルにおいて、前記除去液導入部が前記加熱手段、前記電界印加手段又は前記超音波印加手段によって細菌から細菌内ＡＴＰを抽出する抽出部よりも上流側に設けられており、
前記不活性化液導入部が前記除去液導入部の下流側であって前記抽出部の上流側に設けられており、且つ、
前記移送手段が前記第４及び第５ウェルに収容される液体を前記第１チャネルに移送することが可能となっていることを特徴とする請求項９に記載の細菌検出装置。
【請求項１１】
前記マイクロチャネルチップが、
ＡＴＰ除去剤を含む除去液を収容するための第４ウェルと、
前記第１チャネルの除去液導入部と前記第４ウェルとを接続する第４チャネルと、
前記除去液を温度を５０℃以上に制御してＡＴＰ除去剤を不活性化させる温度制御手段と、
を更に備えており、
前記第１チャネルにおいて、前記除去液導入部が前記加熱手段、前記電界印加手段又は前記超音波印加手段によって細菌から細菌内ＡＴＰを抽出する抽出部よりも上流側に設けられており、
前記温度制御手段によって温度が制御される温度制御部が前記除去液導入部の下流側であって前記抽出部の上流側の部分の温度を制御することが可能であり、且つ、
前記移送手段が前記第４ウェルに収容される液体を前記第１チャネルに移送することが可能となっていることを特徴とする請求項９に記載の細菌検出装置。
【請求項１２】
前記マイクロチャネルチップが、
細菌内ＡＴＰを増幅させる増幅液を収容するための第６ウェルと、
前記第１チャネルの増幅液導入部と前記第６ウェルとを接続する第６チャネルと、
を更に備えており、
前記第１チャネルにおいて、前記増幅液導入部が前記不活性化液導入部の下流側に設けられおり、且つ、
前記移送手段が前記第６ウェルに収容される液体を前記第１チャネルに移送することが可能となっていることを特徴とする請求項９又は１０に記載の細菌検出装置。
【請求項１３】
前記マイクロチャネルチップが、
前記細菌のフロックを分解させる分解液を収容する第７ウェルと、
前記第１チャネルの分解液導入部と前記第７ウェルとを接続する第７チャネルと、
を更に備えており、
前記第１チャネルにおいて、前記分解液導入部が前記加熱手段、前記電界印加手段又は前記超音波印加手段によって細菌から細菌内ＡＴＰを抽出する抽出部よりも上流側に設けられており、且つ、
前記移送手段が前記第７ウェルに収容される液体を前記第１チャネルに移送することが可能となっていることを特徴とする請求項９〜１２のいずれか一項に記載の細菌検出装置。
【請求項１４】
前記マイクロチャネルチップが、
細菌内ＡＴＰを増幅させる増幅液を収容するための第６ウェルと、
前記細菌のフロックを分解させる分解液を収容する第７ウェルと、
前記第１チャネルの増幅液導入部と前記第６ウェルとを接続する第６チャネルと、
前記第１チャネルの分解液導入部と前記第７ウェルとを接続する第７チャネルと、
を更に備えており、
前記第１チャネルにおいて、前記分解液導入部が前記加熱手段、前記電界印加手段又は前記超音波印加手段によって細菌から細菌内ＡＴＰを抽出する抽出部よりも上流側に設けられており、
前記第１チャネルにおいて、前記増幅液導入部が前記不活性化液導入部の下流側に設けられおり、且つ、
前記第３ウェル、前記第４ウェル、前記第５ウェル、前記第６ウェル、及び前記第７ウェルからなる群より選ばれる少なくとも１つのウェルに、そのウェルに対応する前記発光液、前記除去液、前記不活性化液、前記増幅液、及び前記分解液が収容されていることを特徴とする請求項１０に記載の細菌検出装置。
【請求項１５】
更にマイクロチャネルチップ内の液体の温度を制御する制御手段を更に備えることを特徴とする請求項９〜１４のいずれか一項に記載の細菌検出装置。
【請求項１６】
チャネル幅が１ｍｍ以下であるチャネルを有するマイクロチャネルチップの前記チャネル内で、細菌を含む検体液と、前記細菌から細菌内ＡＴＰを抽出させる抽出液と、前記細菌内ＡＴＰの存在下に発光する発光液とを混合し、前記抽出液により前記細菌から前記細菌内ＡＴＰを抽出し、前記細菌内ＡＴＰの存在下、前記発光液を発光させ、該発光を検出することを特徴とする細菌検出方法。
【請求項１７】
前記抽出液が特定の細菌のみから選択的にＡＴＰを抽出する特定抽出液であることを特徴とする請求項１６に記載の細菌検出方法。
【請求項１８】
前記特定抽出液がファージ又は抗生物質であることを特徴とする請求項１７に記載の細菌検出方法。
【請求項１９】
前記検体液を、前記抽出液と前記発光液に混合させる前に、ＡＴＰ除去剤を含む除去液と混合して、前記除去液により前記検体液から遊離ＡＴＰを除去し、更に不活性化剤を含む不活性化液と混合して、前記除去液を不活性化させることを特徴とする請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の細菌検出方法。
【請求項２０】
前記検体液を、前記抽出液と前記発光液に混合させる前に、ＡＴＰ除去剤を含む除去液と混合して、前記除去液により前記検体液から遊離ＡＴＰを除去し、更に前記除去液との混合液の温度を５０℃以上に制御して前記ＡＴＰ除去剤を不活性化させることを特徴とする請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の細菌検出方法。
【請求項２１】
前記検体液を、前記除去液を不活性化させた後に細菌内ＡＴＰを増幅させる増幅液と混合して、前記検体液に含まれる細菌の細菌内ＡＴＰを増幅させることを特徴とする請求項１９に記載の細菌検出方法。
【請求項２２】
前記検体液を、前記抽出液と前記発光液に混合させる前に、細菌のフロックを分解させる分解液と混合して、前記分解液により前記検体液から細菌のフロックを分解させることを特徴とする請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の細菌検出方法。
【請求項２３】
チャネル幅が１ｍｍ以下であるチャネルを有するマイクロチャネルチップの前記チャネル内で、細菌を含む検体液に加熱、電界印加および超音波印加のいずれか１つ以上を行うことにより前記細菌から前記細菌内ＡＴＰを抽出し、前記細菌内ＡＴＰの存在下、前記発光液を発光させ、該発光を検出させる細菌検出方法。
【請求項２４】
前記検体液に前記加熱、前記電界印加又は前記超音波印加を行う前に、ＡＴＰ除去剤を含む除去液と混合して、前記除去液により前記検体液から遊離ＡＴＰを除去し、更に不活性化剤を含む不活性化液と混合して、前記除去液を不活性化させることを特徴とする請求項２３に記載の細菌検出方法。
【請求項２５】
前記検体液に前記加熱、前記電界印加又は前記超音波印加を行う前に、ＡＴＰ除去剤を含む除去液と混合して、前記除去液により前記検体液から遊離ＡＴＰを除去し、更に前記除去液との混合液の温度を５０℃以上に制御して前記ＡＴＰ除去剤を不活性化させることを特徴とする請求項２３に記載の細菌検出方法。
【請求項２６】
前記検体液を、前記除去液を不活性化させた後に細菌内ＡＴＰを増幅させる増幅液と混合して、前記検体液に含まれる細菌の細菌内ＡＴＰを増幅させることを特徴とする請求項２４に記載の細菌検出方法。
【請求項２７】
前記検体液に前記加熱、前記電界印加又は前記超音波印加を行う前に、細菌のフロックを分解させる分解液と混合して、前記分解液により前記検体液から細菌のフロックを分解させることを特徴とする請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の細菌検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌検出装置及び細菌検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌の検出方法として、細菌内のＡＴＰを界面活性剤やエレクトロポレーション法などを用いて抽出（Lysis工程）し、これにルシフェラーゼ等の酵素を加えることにより発生する蛍光を、ＣＣＤやフォトダイオードなどで受光して計測することにより細菌の有無を検出する方法が知られている（例えば下記特許文献１参照）。
【０００３】
従来は、この一連の反応を、試験管などの中で進行させていた。この方法は細菌の検出方法としては、一般的な細菌検出法である培養法に比べ、培地を作成する必要が無く手軽で、且つ迅速に検出結果を得られるという利点を有する。
【特許文献１】特開２０００−１８９１９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、前述した特許文献１に記載の細菌検出方法は、以下に示す課題を有していた。
【０００５】
即ち上記細菌検出方法では、反応時間が長く、検出に数時間を必要とするという問題がある。このような問題は特に食品業界等、多くの商品に対し細菌検出試験を要する場合においては深刻な問題であり、例えば新鮮な商品を迅速に出荷することができないという不具合があった。
【０００６】
また、上記細菌検出方法では、遊離ＡＴＰを除去するアピラーゼなどの成分、アピラーゼを不活性化する成分、ＡＴＰと反応して発光するルシフェラーゼなどの成分、細菌のフロックを分散する成分、細菌の細胞壁を壊す成分、その他必要な成分などを別に試薬瓶などに用意する必要があり、それぞれの試薬瓶から、マイクロシリンジなどを用いて規定量を分取し、サンプル管内に別々に滴下する必要があり、作業が極めて煩雑である。
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、細菌を十分に短時間で簡単に検出できる細菌検出装置及び細菌検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、上記のように細菌の検出に長時間がかかるのが、フラスコ等の反応容器で行われることに起因するのではないかと考えた。即ち本発明者らは、上記のような反応容器では、細菌内ＡＴＰとルシフェラーゼとの接触確率が不十分であることにより発光反応のスピードが遅くなり、細菌の検出に長時間がかかるのではないかと考えた。そして、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、以下の発明により上記課題を解決し得ることを見出した。
【０００９】
即ち本発明は、細菌を含む検体液を収容するための第１ウェル、前記細菌から細菌内ＡＴＰを抽出させる抽出液を収容するための第２ウェル、前記細菌内ＡＴＰの存在下で発光する発光液を収容するための第３ウェル、前記細菌内ＡＴＰと前記発光液とを接触させる発光部、前記第１ウェルと前記発光部とを接続する第１チャネル、前記第１チャネルの抽出液導入部と前記第２ウェルとを接続する第２チャネル、及び、前記第１チャネルの前記抽出液導入部よりも下流側の発光液導入部と前記第３ウェルとを接続する第３チャネルを有するマイクロチャネルチップと、前記細菌内ＡＴＰと前記発光液との接触により生じる光を検出する光検出手段と、前記第１ウェルに収容される液体を前記発光部に移送させ、前記第２、第３ウェルに収容される液体を前記第１チャネルに移送させるための移送手段とを備えており、且つ、前記第１チャネルのチャネル幅が１ｍｍ以下であることを特徴とする細菌検出装置である。
【００１０】
このような構造を有する細菌検出装置は、従来技術のような分取作業が不要となり、利便性が増すという効果を有する。すなわち、マイクロチャネルチップ内において、検体液を収容する第１ウェルと発光部とが第１チャネルで接続されているため、検体液を数秒で発光部に送流することができ、第２チャネル及び第３チャネルが第１チャネルに接続されているため、検体液が第１ウェルから発光部に送流される際に、第２ウェルに収容される抽出液と第３ウェルに収容される発光液とを順次第１チャネルに送流することができ、それぞれが第１チャネル内で混合されることにより、検体液との反応を効率よく行うことができる。
【００１１】
また、上記細菌検出装置は、前記ウェル中の液体を前記発光部に移送させる移送手段を備える。この場合、移送手段により、各ウェルからの液体を確実に第１チャネルに導入することができる。
【００１２】
更に、第１〜第３チャネルのチャネル幅が１ｍｍ以下であるため、検体液と抽出液及び発光液が混合すると、拡散が極めて短時間で行われることになり、この結果、反応を瞬時に行うことができる。その結果、従来は最速でも１〜２時間要していた細菌の検出を数秒で行うことができるようになる。
【００１３】
また、上記細菌検査装置においては、前記マイクロチャネルチップが、ＡＴＰ除去剤を含む除去液を収容するための第４ウェルと、前記ＡＴＰ除去剤を不活性化させる不活性化剤を含む不活性化液を収容するための第５ウェルと、前記第１チャネルの除去液導入部と前記第４ウェルとを接続する第４チャネルと、前記第１チャネルの不活性化液導入部と前記第５ウェルとを接続する第５チャネルとを更に備えており、前記第１チャネルにおいて、前記除去液導入部が前記抽出液導入部よりも上流側に設けられており、且つ前記不活性化液導入部が、前記除去液導入部の下流側であって前記抽出液導入部の上流側に設けられていることが好ましい。
【００１４】
この場合、遊離ＡＴＰを除去させる除去液が、第１チャネルに導入されることにより、遊離ＡＴＰが除去される。このため、遊離ＡＴＰによるノイズ光を除去して細菌内ＡＴＰによる光のみを検出することができ、細菌内ＡＴＰの測定精度を高めることができる。
【００１５】
更に、除去液が第１チャネルに導入されていつまでも残存していると、細菌内ＡＴＰが除去剤により破壊されるおそれがある。しかし、この発明によれば、不活性化剤が第１チャネルに導入されるため、細菌内ＡＴＰのみを検出することができ、細菌内ＡＴＰの測定精度を高めることができる。
【００１６】
また、除去液導入部が抽出液導入部よりも上流側に設けられ、不活性化液導入部が抽出液導入部よりも上流側であって、除去液導入部よりも下流側に設けられているため、検出液内の細菌の量が微量であっても、上記のように測定精度が高い場合にも、誤差を十分に小さく抑えることができる。
【００１７】
更に、この場合において、前記移送手段が第４及び第５ウェルに収容される液体も第１チャネル移送することが可能となっている。したがって、第１〜第５ウェルに収容される液体は、この移送手段により、各ウェルからの液体を確実に第１チャネルに導入することができる。
【００１８】
更にまた、前記第１チャネルにおいて、前記除去液導入部より下流側の少なくとも１部の温度を５０℃以上に制御してＡＴＰ除去剤を不活性化させる温度制御手段を更に備えることが好ましい。この場合、不活性化液を第１チャネルに導入せず温度を制御するだけで余分な除去液を不活性化することができる。従って、不活性化液が不要となるため、不活性化液を収容するためのウェルや不活性化液を送流するためのチャネルを省くことができ、マイクロチャネルチップの構造を簡素にすることができる。
【００１９】
また、この温度制御手段は除去液導入部の下流側であって抽出液導入部の上流側の部分（以下「温度制御部」という。）の温度制御を行うことが好ましい。このように温度制御することによって上述した不活性化液を第１チャネルに導入した場合と同様の効果を得ることができる。
【００２０】
更に、前記移送手段により第４ウェルに収容される液体も第１チャネルに移送することが可能となっている。したがって、第１〜第４ウェルに収容される液体は、この移送手段により、各ウェルからの液体を確実に第１チャネルに導入することができる。
【００２１】
ここで、マイクロチャネルチップが、細菌内ＡＴＰを増幅させる増幅液を収容するための第６ウェルと、前記第１チャネルの増幅液導入部と前記第６ウェルとを接続する第６チャネルとを更に備えており、前記増幅液導入部が前記不活性化液導入部よりも下流側に設けられていることが好ましい。
【００２２】
この場合、遊離ＡＴＰを増幅させることなく、測定精度を更に高めることができる。更に、第６チャネルから増幅液が第１チャネルに導入されるため、発光し難い細菌（更に微量の細菌や栄養状態が優れない細菌）であっても、増幅液により増幅されるため、検出することが可能となる。ＡＴＰ増幅試薬としては例えば特開２００１−２９９３９０号公報で開示されているものが有る。
【００２３】
また、前記移送手段により第６ウェルに収容される液体も第１チャネルに移送することが可能となっている。したがって、第１〜第３、第６ウェルに収容される液体は、この移送手段により、各ウェルからの液体を確実に第１チャネルに導入することができる。
【００２４】
前記マイクロチャネルチップが、前記細菌のフロックを分解させる分解液を収容する第７ウェルと、前記第１チャネルの分解液導入部と前記第７ウェルとを接続する第７チャネルとを更に備えており、前記分解液導入部が、前記抽出液導入部よりも上流側に設けられていることが好ましい。
【００２５】
この場合、分解液を第７チャネルから第１チャネルに導入することができ、分解液により細菌のフロックを分散させることができる。これにより、細菌と抽出液の接触効率が上がり、抽出反応を促進することができる。
【００２６】
また、前記移送手段により第７ウェルに収容される液体も第１チャネルに移送することが可能となっている。したがって、第１〜第３、第７ウェルに収容される液体は、この移送手段により、各ウェルからの液体を確実に第１チャネルに導入することができる。
【００２７】
なお、上記細菌検出装置においては、前記抽出液導入部が前記発光液導入部よりも前記第１ウェルの下流側に設けられていてもよく、発光液導入部が前記抽出液導入部よりも前記第１ウェルの下流側に設けられていてもよい。
【００２８】
また、第２ウェル、第３ウェル、及び第６ウェルのうちのいずれか一つのウェルが他のウェルを兼ねていてもよい。この場合、装置構成を極めて簡単なものとすることができる。従って、安価で提供することも可能となる。
【００２９】
また、前記第２〜第７ウェルがそのウェルに対応する抽出液、発光液、除去液、不活性化液、増幅液、及び分解液を収容していることが好ましい。予めこれらの液を収容していれば、検体液を導入するのみで細菌検出を行うことができ、環境を選ばず、簡便に検出精度の高い測定ができる。
【００３０】
なお、これらのウェルは、検出する細菌の特性や検出値の精度に応じて必要とする液のみを収容することができ、不必要なウェルであれば当然そのウェルを省くことも可能である。
【００３１】
ここで、マイクロチャネルチップ内の液体の温度を制御する制御手段を備えることが好ましい。温度を制御することによって、本発明の装置内で行われる反応に最適な環境を提供することができる。例えば、温度を抽出液や発光液にとって最適な値とすることによって、反応速度を更に高めることができ、更には、温度をその値で維持することによって、反応を安定化することができる。
【００３２】
また、本発明は細菌を含む検体液を収容するための第１ウェル、前記細菌内ＡＴＰの存在下で発光する発光液を収容するための第３ウェル、前記細菌内ＡＴＰと前記発光液とを接触させる発光部、前記第１ウェルと前記発光部とを接続する第１チャネル、及び、前記第１チャネルの発光液導入部と前記第３ウェルとを接続する第３チャネルを有するマイクロチャネルチップと、前記細菌内ＡＴＰと前記発光液との接触により生じる光を検出する光検出手段と、前記第１ウェルに収容される液体を前記発光部に移送させ、前記第３ウェルに収容される液体を前記第１チャネルに移送させるための移送手段とを備えており、且つ、前記第１チャネルのチャネル幅が１ｍｍ以下であり、前記第１チャネルを加熱する加熱手段、前記第１チャネルに電界を印加する電界印加手段、及び前記第１チャネルに超音波を印加する超音波印加手段のうちの少なくとも１種以上の手段を更に備えることを特徴とする細菌検出装置である。
【００３３】
このような構造を有する細菌検出装置は、第２チャネル及び第２ウエルを持つ代わりに、第１チャネルの少なくとも一部に対して加熱、電界印加又は超音波印加を行う手段を備えている。すなわち、マイクロチャネルチップ内において、検体液を収容する第１ウェルと発光部とが第１チャネルで接続されているため、検体液を数秒で発光部に送流することができる。また、加熱、電界印加又は超音波印加を行う手段が第１チャネルに備えられているため、検体液が第１ウェルから発光部に送流される際に、検体液中の細菌から細菌内ＡＴＰを抽出することができる。更に、第３チャネルが第１チャネルに接続されているため、第３ウェルに収容される発光液を順次第１チャネルに送流することができ、第１チャネル内で該検体液と混合されることにより、細菌内ＡＴＰと発光液との反応を効率よく行うことができる。
【００３４】
したがって、これらの手段を備えることによって、抽出液を用いなくても細菌から細菌内ＡＴＰを抽出させることができる。なお、加熱、電界印加又は超音波印加の手段は複数あってもよい。
【００３５】
また、上記細菌検査装置においては、前記マイクロチャネルチップが、ＡＴＰ除去剤を含む除去液を収容するための第４ウェルと、前記ＡＴＰ除去剤を不活性化させる不活性化剤を含む不活性化液を収容するための第５ウェルと、前記第１チャネルの除去液導入部と前記第４ウェルとを接続する第４チャネルと、前記第１チャネルの不活性化液導入部と前記第５ウェルとを接続する第５チャネルとを更に備えており、前記第１チャネルにおいて、前記除去液導入部が前記加熱手段、電界印加手段又は超音波印加手段によって細菌から細菌内ＡＴＰを抽出する抽出部よりも上流側に設けられており、且つ前記不活性化液導入部が、前記除去液導入部の下流側であって前記抽出部の上流側に設けられていることが好ましい。
【００３６】
この場合、遊離ＡＴＰを除去させる除去液が、第１チャネルに導入されることにより、遊離ＡＴＰが除去される。このため、遊離ＡＴＰによるノイズ光を除去して細菌内ＡＴＰによる光のみを検出することができ、細菌内ＡＴＰの測定精度を高めることができる。
【００３７】
更に、除去液が第１チャネルに導入されていつまでも残存していると、細菌内ＡＴＰが除去剤により破壊されるおそれがある。しかし、この発明によれば、不活性化剤が第１チャネルに導入されるため、細菌内ＡＴＰのみを検出することができ、細菌内ＡＴＰの測定精度を高めることができる。
【００３８】
また、除去液導入部が抽出部よりも上流側に設けられ、不活性化液導入部が抽出部よりも上流側であって除去液導入部よりも下流側に設けられているため、検出液内の細菌の量が微量であっても、上記のように測定精度が高い場合にも、誤差を十分に小さく抑えることができる。
【００３９】
更に、前記移送手段により第４及び第５ウェルに収容される液体も第１チャネルに移送することが可能となっている。したがって、第１、第３〜第５ウェルに収容される液体は、この移送手段により、各ウェルからの液体を確実に第１チャネルに導入することができる。
【００４０】
更にまた、前記第１チャネルにおいて、前記除去液導入部より下流側の少なくとも１部の温度を５０℃以上に制御してＡＴＰ除去剤を不活性化させる温度制御手段を更に備えることが好ましい。この場合、不活性化液を第１チャネルに導入せず温度を制御するだけで余分な除去液を不活性化することができる。従って、不活性化液が不要となるため、不活性化液を収容するためのウェルや不活性化液を送流するためのチャネルを省くことができ、マイクロチャネルチップの構造を簡素にすることができる。
【００４１】
また、この温度制御手段を温度制御部に設けると、温度制御することによって上述した不活性化液を第１チャネルに導入した場合と同様の効果を得ることができる。
【００４２】
更に、前記移送手段により第４ウェルに収容される液体も第１チャネルに移送することが可能となっている。したがって、第１、第３、第４ウェルに収容される液体は、この移送手段により、各ウェルからの液体を確実に第１チャネルに導入することができる。
【００４３】
ここで、マイクロチャネルチップが、細菌内ＡＴＰを増幅させる増幅液を収容するための第６ウェルと、前記第１チャネルの増幅液導入部と前記第６ウェルとを接続する第６チャネルとを更に備えており、前記増幅液導入部が前記不活性化液導入部よりも下流側に設けられていることが好ましい。  
【００４４】
この場合、遊離ＡＴＰを増幅させることなく、測定精度を更に高めることができる。更に、第６チャネルから増幅液が第１チャネルに導入されるため、発光し難い細菌（更に微量の細菌や栄養状態が優れない細菌）であっても、増幅液により増幅されるため、検出することが可能となる。
【００４５】
また、前記移送手段により第６ウェルに収容される液体も第１チャネルに移送することが可能となっている。したがって、第１、第３、第６ウェルに収容される液体は、この移送手段により、各ウェルからの液体を確実に第１チャネルに導入することができる。
【００４６】
前記マイクロチャネルチップが、前記細菌のフロックを分解させる分解液を収容する第７ウェルと、前記第１チャネルの分解液導入部と前記第７ウェルとを接続する第７チャネルとを更に備えており、前記分解液導入部が、前記発光液導入部よりも上流側に設けられていることが好ましい。
【００４７】
この場合、分解液を第７チャネルから第１チャネルに導入することができ、分解液により細菌のフロックを分散させることができる。これにより、細菌と抽出液の接触効率が上がり、抽出反応を促進することができる。
【００４８】
また、前記移送手段により第７ウェルに収容される液体も第１チャネルに移送することが可能となっている。したがって、第１、第３、第７ウェルに収容される液体は、この移送手段により、各ウェルからの液体を確実に第１チャネルに導入することができる。
【００４９】
また、前記第３〜第７ウェルがそのウェルに対応する発光液、除去液、不活性化液、増幅液、及び分解液を収容していることが好ましい。予めこれらの液を収容していれば、検体液を導入するのみで細菌検出を行うことができ、環境を選ばず、簡便に検出精度の高い測定ができる。
【００５０】
なお、これらのウェルは、検出する細菌の特性や検出値の精度に応じて必要とする液を収容することが好ましく、不必要なウェルであれば当然そのウェルを省くことも可能である。
【００５１】
ここで、マイクロチャネルチップ内の液体の温度を制御する制御手段を備えることが好ましい。温度を制御することによって、本発明の装置内で行われる反応に最適な環境を提供することができる。例えば、温度を発光液にとって最適な値とすることによって、反応速度を更に高めることができ、更には、温度をその値で維持することによって、反応を安定化することができる。
【００５２】
また本発明は、チャネル幅が１ｍｍ以下であるチャネルを有するマイクロチャネルチップの前記チャネル内で、細菌を含む検体液と、前記細菌から細菌内ＡＴＰを抽出させる抽出液と、前記細菌内ＡＴＰの存在下に発光する発光液とを混合し、前記抽出液により前記細菌から前記細菌内ＡＴＰを抽出し、前記細菌内ＡＴＰの存在下、前記発光液を発光させ、該発光を検出することを特徴とする細菌検出方法である。
【００５３】
この細菌検出方法は、上記細菌検出装置で有効に実施することができる。
【００５４】
なお、チャネル内では、検体液と抽出液とを混合させた後に発光液と混合させる方法、マイクロチャネルチップ内で検体液と発光液とを混合させた後に抽出液と混合させる方法、及び抽出液と発光液とを混合させた後にマイクロチャネルチップ内で検体液と混合させる方法のいずれであってもよい。なお、発光液は細菌内ＡＴＰと反応するため、細菌内ＡＴＰを抽出する前の細菌と発光液とを混合させた場合には、その後に細菌と発光液に抽出液を混合すると、細菌内ＡＴＰが抽出されると同時に発光液が細菌内ＡＴＰと反応するため問題なく本発明の目的を達成することができる。
【００５５】
前記抽出液は、特定の細菌のみから選択的にＡＴＰを抽出する特定抽出液であることが好ましい。
【００５６】
細菌には多くの種類があり、特定の細菌のみを選択的に検出することが望まれる場合がある。したがって、抽出液が上記特定抽出液であれば、例えば、食品の検査において、食中毒を引き起こすおそれのある細菌（例えば腸炎ビブリオ、サルモネラ菌、黄色ブドウ球菌、セレウス菌又はカンピロバクター菌）のみを選択的に検出することができる。
【００５７】
前記特定抽出液はファージ又は抗生物質であることが好ましい。特定抽出液がファージや抗生物質であると、ファージや抗生物質に感受性のある細菌のみ破壊されるので、ファージや抗生物質を選択することで、所望の細菌からのみ細菌内ＡＴＰを抽出することができる。
【００５８】
また、前記検体液を、前記抽出液と前記発光液に混合させる前に、ＡＴＰ除去剤を含む除去液と混合して、前記除去液により前記検体液から遊離ＡＴＰを除去し、更に不活性化剤を含む不活性化液と混合して、前記除去液を不活性化させることが好ましい。
【００５９】
このように遊離ＡＴＰを除去させる除去液を導入することにより、上述したように遊離ＡＴＰによるノイズ光を除去することができ、更に、不活性化液を導入することで、除去液が細菌内ＡＴＰを破壊することを防止することができる。したがって、細菌内ＡＴＰの測定精度を高めることができる。
【００６０】
また、除去液及び不活性化液は検体液と抽出液を混合する前に導入する。そうすると不要な遊離ＡＴＰのみを除去することができ、細菌内ＡＴＰに悪影響を及ぼすことも防止することができる。
【００６１】
ここで、前記不活性化液の代わりに温度を５０℃以上に制御してＡＴＰ除去剤を不活性化させることも可能である。この場合、予め不活性化液を準備する必要が無く、温度管理のみで余分なＡＴＰ除去剤を不活性化させることができるため、容易に細菌内ＡＴＰの測定精度を高めることできる。
【００６２】
またチャネル内で前記細菌内ＡＴＰを増幅させる増幅液を混合させてもよい。このとき、増幅液は除去液を不活性化させた後に導入する。そうすると、増幅液により細菌内ＡＴＰのみを増幅することができ、測定精度を更に高めることができる。また、前記チャネル内で前記細菌のフロックを分解させる分解液を更に混合させてもよい。このとき、分解液は細菌から細菌内ＡＴＰを抽出する前に行う。そうすると、分解液により細菌のフロックを分散させることができ、更に細菌と抽出液の接触効率が上がることとなるため抽出反応を促進することができる。
【００６３】
また、本発明は、チャネル幅が１ｍｍ以下であるチャネルを有するマイクロチャネルチップの前記チャネル内で、細菌を含む検体液に、加熱、電界印加および超音波印加のいずれか１つ以上を行うことにより前記細菌から前記細菌内ＡＴＰを抽出し、前記細菌内ＡＴＰの存在下、前記発光液を発光させ、該発光を検出させる細菌検出方法である。
【００６４】
この細菌検出方法は、上記細菌検出装置で有効に実施することができる。
【００６５】
すなわち、上記発明においては、抽出液に代えて前記検体液を加熱、電界印加および超音波印加のいずれか１つを行うことによって細菌から細菌内ＡＴＰを抽出させることができる。
【００６６】
また、前記検体液を、前記加熱、電界印加又は超音波印加を行う前に、ＡＴＰ除去剤を含む除去液と混合して、前記除去液により前記検体液から遊離ＡＴＰを除去し、更に不活性化剤を含む不活性化液と混合して、前記除去液を不活性化させることが好ましい。
【００６７】
このように遊離ＡＴＰを除去させる除去液を導入することにより、上述したように遊離ＡＴＰによるノイズ光を除去することができ、更に、不活性化液を導入することで、除去液が細菌内ＡＴＰを破壊することを防止することができる。したがって、細菌内ＡＴＰの測定精度を高めることができる。
【００６８】
ここで、前記不活性化液の代わりに温度を５０℃以上に制御してＡＴＰ除去剤を不活性化させることも可能である。この場合、予め不活性化液を準備する必要が無く、温度管理のみで余分なＡＴＰ除去剤を不活性化させることができるため、容易に細菌内ＡＴＰの測定精度を高めることできる。
【００６９】
またチャネル内で前記細菌内ＡＴＰを増幅させる増幅液を混合させてもよい。このとき、増幅液は除去液を不活性化させた後に導入する。そうすると、増幅液により細菌内ＡＴＰのみを増幅することができ、測定精度を更に高めることができる。また、前記チャネル内で前記細菌のフロックを分解させる分解液を更に混合させてもよい。このとき、分解液は細菌から細菌内ＡＴＰを抽出する前に行う。そうすると、分解液により細菌のフロックを分散させることができ、更に細菌と抽出液の接触効率が上がることとなるため抽出反応を促進することができる。
【発明の効果】
【００７０】
本発明によれば、細菌を十分に短時間で簡単に検出できる細菌検出装置及び細菌検出方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７１】
以下、図面を参照して本発明に係る細菌検出装置の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００７２】
図１は、本発明の細菌検出装置の第１実施形態の主要部であるマイクロチャネルチップを示す斜視図である。図１に示すように、本実施形態の細菌検出装置は、マイクロチャネルチップ１０を有しており、マイクロチャネルチップ１０は矩形平板状の本体部１０ａと、本体部１０ａの表面を覆うカバー１０ｂとを有している。本体部１０ａの一面には、両端部にそれぞれ第１ウェル１と、反応場（発光部）８とが形成されており、第１ウェル１には細菌を含む検体液が収容されるようになっている。また、第１ウェル１と反応場８とは、本体部１０ａの一面に形成される第１チャネル１１で接続されており、第１ウェル１に検体液を導入することによって、検体液が第１ウェル１から第１チャネル１１を経て反応場８に送流されるようになっている。
【００７３】
更に本体部１０ａには、第２ウェル２と、第３ウェル３とが第１チャネル１１に沿って形成されており、第２ウェル２には細菌から細菌内ＡＴＰを抽出させる抽出液が、第３ウェル３には、細菌内ＡＴＰの存在下に発光する発光液が収容されるようになっている。
【００７４】
また、第２ウェル２は第１チャネル１１の抽出液導入部３１ａと第２チャネル１２によって接続され、第３ウェル３は、反応場８と第３チャネルによって接続されている。第２チャネル１２及び第３チャネル１３は、いずれも本体部１０ａの一面上に形成されている。そして、反応場８は、抽出液導入部３１ａよりも下流側に配置されている。従って、検体液が第１チャネル１１を通じて反応場８に送流される際に、第２ウェル２から第２チャネル１２を通じて抽出液が送流され、更に第３ウェル３から第３チャネル１３を通じて発光液が送流される。送流された抽出液及び発光液は第１チャネル１１内で検出液と混合されて所望の反応が行われる。なお、本実施形態の細菌検出装置において、反応場８は発光液導入部３１ｂを兼ねている。
【００７５】
図２は、本体部１０ａの厚さ方向に沿った部分断面図である。図２において、第１チャネル１１の断面形状は四角形であり、第１チャネル１１のチャネル幅ｄは、１ｍｍ以下である。なお、「チャネル幅」とは、本体部の厚さ方向に対して垂直の方向の長さをいう。第１チャネル１１の断面形状が四角形の場合は横の長さをいい、台形や三角形の場合は前記方向に対して最も長い長さをいう。また、円形や半円形の場合は直径の長さ、楕円形の場合は前記方向に対して最も長い径の長さをいう。なお、図示しないが、第２チャネル１２及び第３チャネル１３の断面形状も第１チャネル１１と同様であり、チャネル幅も第１チャネル１１と同様である。
【００７６】
これらの第１ウェル１、第２ウェル２及び第３ウェル３は検体液、抽出液及び発光液を収容できるように表面から垂直方向に沿って形成された孔である。
【００７７】
更に、本体部１０ａには、反応場８に対して第１ウェル１と反対側に配置される空洞部３５が形成されている。そして、空洞部３５には、本体部１０ａの縁部まで延びる空気抜き孔３６が形成されている。
【００７８】
また上記マイクロチャネルチップ１０においては、反応場８に隣接して光検出手段（図示しない）が配置されている。
【００７９】
更に、上述したカバー１０ｂは、第２ウェル２、第３ウェル３、第１チャネル１１、第２チャネル１２及び第３チャネル１３を密閉するように設けられている。またカバー１０ｂは、透光性であることが好ましい。この場合、各ウェル１，２，３内の液体が第１チャネル１１に導入されかどうかを目視で確認することができ、便利である。
【００８０】
このように構成された細菌検出装置においては、第２ウェル２に抽出液を、第３ウェル３に発光液を収容して本体部１０ａをカバー１０ｂで覆う。カバー１０ｂにおいて空洞部３５の部分を指で押圧し、空洞部３５の空間から空気抜き孔３６を通して空気を逃がし、何らかの方法で空気抜き穴３６を塞ぐ。第１ウェル１に検体液を垂らした後に指を離すと、空洞部３５の空間が負圧となるため、第１ウェル１の検体液、第２ウェル２の抽出液、第３ウェル３の発光液が空洞部３５に引き込まれる。その結果、まず検体液と抽出液が抽出液導入部３１ａで混合されて、検体液中の細菌から細菌内ＡＴＰが抽出され、次にその混合液と発光液が発光液導入部３１ｂで混合されて、細菌内ＡＴＰが発光液と反応し発光する。この発光が、図示しない光検出手段で検出される。
【００８１】
このような構造を有する細菌検出装置によれば、従来技術のような分取作業が不要となり、利便性が増すという効果を有する。すなわち、マイクロチャネルチップ１０内において、検体液を収容する第１ウェル１と反応場８とが第１チャネル１１で接続されているため、検体液を数秒で反応場８に送流することができ、第２チャネル１２及び第３チャネル１３が第１チャネル１１に接続されているため、検体液が第１ウェル１から反応場８に送流される際に、第２ウェル２に収容される抽出液と第３ウェル３に収容される発光液とを順次第１チャネル１１に送流することができ、それぞれが第１チャネル１１内で混合されることにより、検体液との反応を効率よく行うことができる。
【００８２】
更に、第１〜第３チャネル１１〜１３のチャネル幅ｄが１ｍｍ以下であるため、検体液と抽出液及び発光液が混合すると、拡散が極めて短時間で行われることになり、この結果、反応を瞬時に行うことができる。その結果、従来は最速でも１〜２時間要していた細菌の検出を数秒で行うことができるようになる。また、チャネル幅ｄが０．１〜５００μｍであると更に好ましい。
【００８３】
また上記マイクロチャネルチップ１０では、本体部１０ａがカバー１０ｂで密閉されているため、外部からの細菌の進入が十分に抑制される。従って、従来のようにクリーン環境中での検査や厳密な消毒等が不要であるため、極めて利便性に優れる。
【００８４】
上記光検出手段は、公知のものを用いることができ、例えばＣＣＤ、フォトダイオードや光電子増倍管を使用することができる。光検出手段は、反応場８にて細菌内ＡＴＰが発光液と反応することによって生じる光を検出する。したがって、光検出手段の設置位置は特に限定はしないが、反応場８の近くに設置することが好ましい。なお、マイクロチャネルチップ１０の本体部１０ａ内に設置することも可能である。
【００８５】
検体液に含まれる細菌としては、特に限定されないが食中毒を引き起こすおそれのある細菌（例えば腸炎ビブリオ、サルモネラ菌、黄色ブドウ球菌、セレウス菌又はカンピロバクター菌）等が挙げられる。
【００８６】
また、抽出液に含まれる成分としては、細菌内ＡＴＰを抽出できるものであれば良く、リゾチーム、エタノールとアンモニアの混合液、メタノール、エタノール、界面活性剤（塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム、トリトンＸ−１００等）、トリクロル酢酸、過塩素酸、ファージ、抗生物質等が挙げられる。
【００８７】
更に、発光液に含まれる成分としては、ＡＴＰの存在下に発光するものであればよく、例えばルシフェラーゼ及びルシフェリンが挙げられる。
【００８８】
なお、これらの検体液、抽出液及び発光液は液状であればよく、サスペンションやエマルジョンであってもよい。
【００８９】
図３（ａ）及び（ｂ）は、第１チャネル１１、第２チャネル１２及び第３チャネル１３の第２〜第３の態様を示す断面図である。
【００９０】
図３（ａ）に示す、第２の態様のチャネル２１ａは、二つの基材を積層して形成される流路である。すなわち、一方の基材２３ａの下部と、他方の基材２３ｂの上部とにそれぞれ溝を設け、貼り合わせることによってチャネル２１ａが形成される。図３（ｂ）に示す、第３の態様のチャネル２１ｂは、三つの基材を積層して形成されたものである。すなわち、中間層である基材２４ｂに貫通溝を設け、その上部と下部に、基材２４ｂを挟持するように基材２４ａ及び２４ｃを積層してチャネル２１ｂが形成される。なお、チャネル２１ａ及びチャネル２１ｂはそれぞれ第１チャネル１１、第２チャネル１２、第３チャネル１３に相当するものである。
【００９１】
これらの基材２３ａ，２３ｂ，２４ａ〜２４ｃは任意に定めることができ、石英ガラス又はパイレックス（登録商標）ガラス等のガラス、ＰＤＭＳ、ポリカーボネート又はポリイミド等のポリマー、鉄、ステンレス、アルミニウム、ニッケル又は銅等のメタル、又はシリコン等を使用することができ、積層する場合のそれぞれの基材は、同一の種類であっても異なった種類であってもよい。
【００９２】
また、第１チャネル１１、第２チャネル１２及び第３チャネル１３のチャネル幅は１ｍｍ以下である。
【００９３】
チャネル幅が上記の範囲であるため、このチャネル内で検体液、抽出液及び発光液が混合した場合には、単位体積あたりの接触表面積が増加するため、反応を促進することができる。すなわち拡散が極めて短時間で行われることになり、この結果、反応を瞬時に行うことができる。一方チャネル幅が１ｍｍを超えると十分に拡散律速を低減することができないので、本発明の目的を達成することができない。更に好ましくはチャネル幅が０．１〜５００μｍのときである。
【００９４】
また、第１実施形態に係るマイクロチャネルチップ１０は、第２ウェル２に抽出液を、第３ウェル３に発光液を収容させているが、これらは逆にすることもでき、混合して使用することもできる。
【００９５】
すなわち、第１ウェル１の検体液が第１チャネル１１を通じて反応場８に送流される際に、第２ウェル２から第２チャネル１２を通じて発光液が送流され、更に第３ウェル３から第３チャネル１３を通じて抽出液が送流されてもよく、同様に第１ウェル１の検体液が第１チャネル１１を通じて反応場８に送流される際に、第２ウェル２から第２チャネル１２を通じて抽出液及び発光液の混合液が送流されてもよい。
【００９６】
これは抽出液が細菌内ＡＴＰを抽出するための液であるため、細菌を含まない発光液と混合しても反応することは無く、一方で発光液はＡＴＰの存在下に発光するための液であるため、ＡＴＰを含まない抽出液と混合しても反応することはないからである。また、検体液と発光液とを混合させた後、抽出液と混合させると、検体液から細菌内ＡＴＰが抽出されると同時に発光させることができる。また、抽出液と発光液とを混合してから検体液と混合させるとウェルの数やチャネルの数を減らすことができ、細菌検出装置を簡略化できる。
【００９７】
図４（ａ）は、上記第１実施形態に係る細菌検出装置を示す概略図、図４（ｂ）〜（ｇ）及び図５は本発明の細菌検出装置に係る第２〜第８実施形態を示す概略図である。
【００９８】
図４（ｂ）は本発明に係る細菌検出装置の第２実施形態を示す概略図である。図４（ｂ）は、第１実施形態に係るマイクロチャネルチップ１０の第１チャネル１１が第１チャネル１１とチャネル１１ｂに枝分かれした態様であり、一方は第１実施形態と同様であるが、他方はウェル２ｂとウェル３ｂと反応場８とを備え、ウェル２ｂとチャネル１１ｂとはチャネル１２ｂで接続され、ウェル３ｂとチャネル１１ｂとはチャネル１３ｂで接続されている。ウェル２ｂには特定の細菌から細菌内ＡＴＰを抽出させる特定抽出液が、ウェル３ｂには細菌内ＡＴＰを発光させる発光液が収容されている。したがって、一方では検体液に含まれる細菌を検出することができ、他方では検体液に含まれる特定の細菌を検出することができる。
【００９９】
図４（ｃ）は本発明に係る細菌検出装置の第３実施形態を示す概略図である。図４（ｃ）は、第１実施形態に係るマイクロチャネルチップの第１チャネル１１が第１チャネル１１とチャネル１１ｃに枝分かれした態様で、一方は第１実施形態と同様であるが、他方はウェル３ｃと反応場８とを備え、ウェル３ｃとチャネル１１ｃとはチャネル１３ｃで接続されている。ウェル３ｃには細菌内ＡＴＰを発光させる発光液が収容されている。したがって、一方では検体液に含まれる細菌を検出することができ、他方では検体液に含まれる遊離ＡＴＰを検出することができ、測定精度を高めることができる。
【０１００】
図４（ｄ）は本発明に係る細菌検出装置の第４実施形態を示す概略図である。図４（ｄ）は、第１実施形態に係るマイクロチャネルチップに加え、第４ウェル４と、第５ウェル５とを備え、第４ウェル４には遊離ＡＴＰを除去させる除去液が、第５ウェル５には除去液を不活性化させる不活性化液が収容されている。また、第４ウェル４は最上流で第１チャネル１１と第４チャネル１４で接続され、第５ウェル５は第４ウェル４よりも下流側で且つ第２ウェル２よりも上流側で第１チャネル１１と第５チャネル１５で接続されている。したがって、検体液が第１チャネル１１を通じて反応場８に送流される際に、第４ウェル４から第４チャネル１４を通じて除去液が送流されると、測定精度を低下させる遊離ＡＴＰを除去することができ、更に第５ウェル５から第５チャネル１５を通じて不活性化液が送流されると、余分な除去液を不活性化させることができる。すなわち、遊離ＡＴＰを除去し正確な細菌内ＡＴＰを検出することができるため、測定精度を高めることができる。
【０１０１】
除去液に含まれる成分としては、アデノシンリン酸デアミナーゼ、アピラーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ヘキソキナーゼ及びアデノシントリホスファターゼ等が挙げられる。
【０１０２】
また、不活性化液に含まれる成分としては、例えばコホルマイシン、ＥＤＴＡ、ジチオスレイトール、硫酸アンモニウム、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ等が挙げられる。
【０１０３】
図４（ｅ）は本発明に係る細菌検出装置の第５実施形態を示す概略図である。図４（ｅ）は、第１実施形態に係るマイクロチャネルチップに加え、第６ウェル６を備え、第６ウェル６には細菌内ＡＴＰを増幅させる増幅液が収容されている。また、第６ウェル６は第２ウェル２よりも上流側で第１チャネル１１と第６チャネル１６で接続されている。したがって、検体液が第１チャネル１１を通じて反応場８に送流される際に、第６ウェル６から第６チャネル１６を通じて増幅液が送流されると、細菌内ＡＴＰを増量することができる。すなわち、微量の細菌や栄養状態に優れない細菌であっても顕著に発光させることができ、これらの細菌を検出することができるため、測定精度を高めることができる。
【０１０４】
なお、第５実施形態に係る第６ウェル６の増幅液については、第２ウェル２の抽出液や第３ウェル３の発光液との送流順序が異なってもよい。
【０１０５】
また、増幅液に含まれる成分としては、特に限定されないがアデニル酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ポリリン酸、アデノシンモノリン酸、ピルべートオルトホスフェートジキナーゼ、ホスホエノールピルビン酸、ピロリン酸、マグネシウムイオン等が挙げられる。
【０１０６】
図４（ｆ）は本発明に係る細菌検出装置の第６実施形態を示す概略図である。図４（ｆ）は、第４実施形態に係る第４ウェル４及び第５ウェル５と第５実施形態に係る第６ウェル６を備えたマイクロチャネルチップである。したがって、遊離ＡＴＰを除去することができると同時に細菌内ＡＴＰを増幅させることができるため、測定精度を高めることができる。なお、送流順序には留意を要する。すなわち、遊離ＡＴＰを増幅させないためにも、遊離ＡＴＰを除去し、除去液を不活性化させた後に増幅液、抽出液及び発光液を送流する必要がある。
【０１０７】
図４（ｇ）は本発明に係る細菌検出装置の第７実施形態を示す概略図である。図４（ｇ）は、第１実施形態に係るマイクロチャネルチップに加え、第７ウェル７を備え、第７ウェル７には細菌のフロックを分解させる分解液が収容されている。また、第７ウェル７は第２ウェル２よりも上流側で第１チャネル１１と第７チャネル１７で接続されている。したがって、検体液が第１チャネル１１を通じて反応場８に送流される際に、第７ウェル７から第７チャネル１７を通じて分解液が送流されると、細菌のフロックを分解することができ、細菌のフロックを分散することができるため、細菌と抽出液の接触効率が上がり、抽出反応を促進させることができる。
【０１０８】
また、分解液に含まれる成分としては、特に限定されないがＴｒｉｓ−Ｈｃｌ、ＨＥＰＥＳ、ＰＢＳ、ＭＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ等が挙げられる。
【０１０９】
図５は本発明に係る細菌検出装置の第８実施形態を示す概略図である。図５は、検体液を収容する第１ウェル１に検体液を導入すると、第一〜第五の経路Ａ〜Ｅに送流され、それぞれで個別の検出を行うことができる装置である。まず、導入された検体液は、フィルタ３０を通して不溶成分を排除し、次いで除去液と混合して遊離ＡＴＰを除去し、更に不活性化液と混合して、余分な除去液を不活性化させる。更に分解液で細菌のフロックを分散させる。こうして得られた混合液を第一〜第五経路Ａ〜Ｅに分岐させる。そして、第一経路Ａにおいては、増幅液と抽出液により細菌内ＡＴＰを抽出、増幅させ、発光液により発光させ、光検出手段８ａにより、細菌を検出することができる。また、第二経路Ｂにおいては、増幅液と特定抽出液Ａにより特定の細菌Ａの細菌内ＡＴＰを抽出、増幅させ、発光液により発光させ、光検出手段８ａにより、細菌Ａを検出することができる。更に、第三経路Ｃにおいては、増幅液と特定抽出液Ｂにより特定の細菌Ｂの細菌内ＡＴＰを抽出、増幅させ、発光液により発光させ、光検出手段８ａにより、細菌Ｂを検出することができる。また、第四経路Ｄにおいては、増幅液と発光液により遊離ＡＴＰを検出することができる。そして、第五経路Ｅにおいては、ＡＴＰを導入し増幅液と発光液により試薬の活性度を確認することができる。
【０１１０】
したがって、経路Ａによってすべての細菌を検出することができ、経路Ｂ及びＣによって特定の細菌Ａ及びＢを検出することができ、経路Ｄ及びＥによって遊離ＡＴＰの検出及び試薬の活性度の確認を行うことができる。また、この経路は拡散が極めて短時間で行われることになり、この結果、反応を瞬時に行うことができ、迅速且つ正確に細菌を検出することができる。
【０１１１】
本発明の細菌検出装置は、上記実施形態に限定されるものではない。例えば上記第１実施形態では、カバー１０ｂを指で押圧することにより空洞部３５に負圧部を作り、それによって各ウェルからの液体を第１チャネル１１に導入している。すなわち、カバー１０ｂ、空洞部３５及び空気抜き孔３６が移送手段を構成しているが、本発明の細菌検出装置は、移送手段としてバルブやポンプ等が用いられてもよい。このような場合でも、各ウェルからの液体を確実且つ容易に第１チャネルに導入することができる。また、逆止弁を設けることも有用である。なお、これらはマイクロチャネルチップ内に設置することも可能である。
【０１１２】
このように移送手段を設けることによって、各ウェルに収容される液体を発光部に移送させることが容易となる。なお、これらの移送手段はウェル数やチャネル数に影響することなく、各ウェルからの液体を確実に第１チャネルに導入することができる。
【０１１３】
また本発明の細菌検出装置は、第１チャネル１１を加熱する加熱手段、第１チャネル１１に電界を印加する電界印加手段、及び第１チャネル１１に超音波を印加する超音波印加手段のうちの少なくとも１種以上を備えることが好ましい。
【０１１４】
細菌検出装置がこれらの手段を備えることにより、抽出液に代えて、これらの手段で細菌から細菌内ＡＴＰを抽出することができる。したがって、第２ウェルが不要となるため、更に装置構造を簡単にすることができる。なお、これらは抽出反応のみならず、発光させる反応等にも応用させることができる。また、これらの手段は複数並列して設置することもでき、マイクロチャネルチップ内に設置することも可能である。
【０１１５】
更にまた、前記第１チャネルにおいて、前記除去液導入部より下流側の少なくとも１部の温度を５０℃以上に制御してＡＴＰ除去剤を不活性化させる温度制御手段を更に備えることが好ましい。この場合、温度を制御するだけで余分な除去液を不活性化させることができる。従って、不活性化液が不要となるため、不活性化液を収容するためのウェルや不活性化液を送流するためのチャネルを省くことができ、マイクロチャネルチップの構造を簡素にすることができる。
【０１１６】
また上記実施形態では、細菌の検出の際に第２ウェル、第３ウェルに抽出液、発光液をそれぞれ収容しているが、第２ウェル及び第３ウェルには、予め抽出液と発光液を収容させておくのが好ましい。予め抽出液と発光液を収容していれば、検体液を第１ウェルに導入するのみで細菌検出を行うことができ、環境を選ばず、簡便に検出精度の高い測定ができる。更に、除去液、不活性化、増幅液、分解液も必要に応じて予め収容させておくことも可能である。
【０１１７】
更にこの場合、抽出液と発光液の温度を制御する制御手段を備えることが好ましい。温度制御手段はマイクロチャネルチップをヒーターブロックで上下から挟むように設置することができ、ヒーターブロックには温度センサが電気的に接続される。そして、温度センサで得られた温度に基づいてヒーターブロックの温度が制御される。
【０１１８】
このように温度を制御することによって、本発明の装置内で行われる反応に最適な環境を提供することができる。例えば、温度を抽出液や発光液等にとって最適な値とすることによって、反応速度を更に高めることができ、更には、温度をその値で維持することによって、反応を安定化することができる。
【０１１９】
また、マイクロチャネルチップは冷凍装置（温度制御手段）等によって冷凍して保存することが好ましい。冷凍保存を行えば、細菌が増殖したり不活性化することなく長期間保存することができる。また、冷凍したマイクロチャネルチップは解凍することにより用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】本発明の細菌検出装置の第１実施形態の主要部であるマイクロチャネルチップを示す斜視図である。
【図２】図１のマイクロチャネルチップを構成する本体部の厚さ方向に沿った部分断面図である。
【図３】図３（ａ）及び（ｂ）は、第１チャネル、第２チャネル及び第３チャネルの第１及び第２の態様を示す断面図である。
【図４】図４（ａ）は、本発明の細菌検出装置の第１実施形態を示す概略図、図４（ｂ）〜（ｇ）は本発明の細菌検出装置に係る第２〜第７実施形態を示す概略図である。
【図５】図５は、本発明の細菌検出装置に係る第８実施形態を示す概略図である。
【符号の説明】
【０１２１】
１…第１ウェル、２…第２ウェル、３…第３ウェル、４…第４ウェル、５…第５ウェル、６…第６ウェル、７…第７ウェル、８…反応場（発光部）、８ａ…光検出手段、１０…マイクロチャネルチップ、１０ａ・・・本体部、１０ｂ・・・カバー、１１…第１チャネル、１２…第２チャネル、１３…第３チャネル、１４…第４チャネル、１６…第６チャネル、１７…第７チャネル、２１ａ，２１ｂ・・・チャネル、３１ａ…抽出液導入部、３１ｂ…発光液導入部、３１ｃ…除去液導入部、３１ｄ…不活性化液導入部、３１ｅ…増幅液導入部、３１ｆ…分解液導入部、３５・・・空洞部、３６・・・空気抜き孔、ｄ…チャネル幅。
【図１】
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【図２】
2007236202.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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