(57)【要約】【課題】細胞培養支持体の細胞付着面に付着している細胞に光を照射して、細胞の状態を観察することができる補助具を提供すること。【解決手段】本発明の補助具６０ａは、細胞４０が付着した細胞付着面２を上側として穴（ウェル）２０内に配置された細胞培養ペレット（支持体）１に対して、穴２０の底部側から光を照射しつつ、細胞培養ペレット１の上側から細胞４０の状態を観察する際に用いられるものであり、光を導く導光手段を備え、穴２０内に、細胞培養ペレット１と、この細胞培養ペレット１の周囲に補助具６０ａとを配置した状態で、穴２０の底部側から光を照射したとき、前記導光手段により、前記光の一部を細胞付着面２に誘導して照射するよう構成したことを特徴とする。この導光手段は、細胞培養ペレット１の外周部で、かつ、細胞付着面２よりも上方に位置する反射面６８で構成されるのが好ましい。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞が付着した細胞付着面を上側としてウェル内に配置された細胞培養支持体に対して、前記ウェルの底部側から光を照射しつつ、前記細胞培養支持体の上側から前記細胞の状態を観察する際に用いられる補助具であって、
当該補助具は、光を導く導光手段を備え、
前記ウェル内に、前記細胞培養支持体と、該細胞培養支持体の周囲に当該補助具とを配置した状態で、前記ウェルの底部側から光を照射したとき、前記導光手段により、前記光の一部を前記細胞付着面に誘導して照射するよう構成したことを特徴とする補助具。
【請求項２】
中央部に孔を有する筒状をなし、前記孔内で前記細胞付着面が露出するように配置される請求項１に記載の補助具。
【請求項３】
前記補助具の外径は、前記ウェルの内径とほぼ等しいかまたは前記ウェルの内径よりも若干小さい請求項２に記載の補助具。
【請求項４】
前記ウェル内に前記細胞培養支持体および前記補助具を配置した状態で、前記補助具の前記孔の内壁が、前記細胞培養支持体の外縁より外壁側に位置する請求項２または３に記載の補助具。
【請求項５】
前記ウェル内に前記細胞培養支持体および前記補助具を配置した状態で、前記補助具の前記孔の内壁が、前記細胞培養支持体の外縁より中心側に位置しており、前記補助具の下側の端部の前記孔に臨む部位に、前記細胞培養支持体の前記外縁部と係合する係合部を備えている請求項２または３に記載の補助具。
【請求項６】
前記孔の平面視形状は、前記細胞培養支持体の外形とほぼ等しい請求項２ないし５のいずれかに記載の補助具。
【請求項７】
前記ウェルの内側面と前記細胞培養支持体の外縁部との間に形成された間隙内に位置し、前記細胞培養支持体の前記ウェルに対する位置決めを行う位置決め手段を備える請求項２ないし６のいずれかに記載の補助具。
【請求項８】
下端部に前記位置決め手段として機能する脚部を備える請求項７に記載の補助具。
【請求項９】
前記脚部は、前記補助具の下端部に、その周方向に沿って設けられている請求項８に記載の補助具。
【請求項１０】
前記細胞培養支持体は、実質的に光を透過しない光不透過性の部材で構成されている請求項５ないし９のいずれかに記載の補助具。
【請求項１１】
前記導光手段は、前記細胞培養支持体の外周部で、かつ、前記細胞付着面よりも上方に位置する反射面を備える請求項２ないし１０のいずれかに記載の補助具。
【請求項１２】
前記反射面は、光反射性を有する金属材料で構成される請求項１１に記載の補助具。
【請求項１３】
前記反射面は、鏡面または乱反射面で構成されている請求項１１または１２に記載の補助具。
【請求項１４】
前記反射面と、該反射面で反射された光を拡散する光拡散手段とを備える請求項１１ないし１３のいずれかに記載の補助具。
【請求項１５】
前記光拡散手段は、前記補助具の前記孔の内壁に形成された乱反射面で構成されている請求項１４に記載の補助具。
【請求項１６】
第１の反射面と、第２の反射面とを備え、
前記第１の反射面で反射した光を前記第２の反射面で反射して、前記孔内で露出する細胞付着面に導くよう構成されている請求項１１ないし１５のいずれかに記載の補助具。
【請求項１７】
前記孔の上側に当該孔の孔径が上端に向かって漸増するテーパ部を備え、
前記ウェル内に、前記細胞培養支持体と、前記テーパ部を上側にした前記補助具とを配置した状態で、前記細胞を含む培養液を供給し、前記細胞を沈降させて前記細胞付着面に付着させる際、前記テーパ部は、前記培養液中において沈降する前記細胞を前記孔内で露出する前記細胞付着面に誘導する細胞誘導手段として機能する請求項２ないし１６のいずれかに記載の補助具。
【請求項１８】
前記テーパ部は、前記補助具の外周面側から内周面側に向かって傾斜する傾斜面で構成されている請求項１７に記載の補助具。
【請求項１９】
前記傾斜面は、前記孔の中心軸に対して１５〜６５°の角度で傾斜している請求項１８に記載の補助具。
【請求項２０】
前記テーパ部の表面には、前記細胞が付着するのを防止または低減する付着防止処理が施されている請求項１７ないし１９のいずれかに記載の補助具。
【請求項２１】
前記付着防止処理は、前記テーパ部の表面に撥液性を付与する撥液処理である請求項２０に記載の補助具。
【請求項２２】
前記付着防止処理は、前記テーパ部の表面の凹凸を低減する平滑化処理である請求項２０または２１に記載の補助具。
【請求項２３】
前記平滑化処理が施された前記テーパ部の表面の表面粗さＲａ（ＪＩＳ  Ｂ  ０６０１に規定）は、１０μｍ以下である請求項２２に記載の補助具。
【請求項２４】
前記テーパ部に形成された第１の反射面と、前記補助具の外壁に形成された第２の反射面とを備え、
前記第１の反射面で反射した光を前記第２の反射面で反射して、前記孔内で露出する細胞付着面に導くよう構成されている請求項１７ないし２３のいずれかに記載の補助具。
【請求項２５】
前記培養液に対する前記補助具の全体の比重は、１．０１以上である請求項１ないし２４のいずれかに記載の補助具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、細胞付着担体に付着させた細胞の状態を観察する際に用いることができる補助具に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、例えば、リン酸カルシウム系材料等で構成される移植片を生体内へ移植した際の生体適合性を評価する方法として、この移植片（細胞培養ペレット）に各種細胞を培養し、これらの細胞の増殖能、分化能および致死率等から、その生体適合性を評価することが行われている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
逆に、例えば、骨の主たる構成成分がリン酸カルシウム系材料であることから、この材料で構成される細胞培養ペレット上での各種細胞の増殖能、分化能および致死率等の評価することにより、各種細胞の骨への親和性等の評価を行うこともできる（例えば、特許文献２参照）。
【０００４】
さらに、人為的に機能を付与した細胞培養ペレット上で細胞培養を行うことにより、培養される細胞の増殖能および分化能等の生物学的性質を改変させる試みも行われている。
【０００５】
このような細胞培養ペレット上での細胞の培養、および、その細胞の観察は、上述したような種々の目的により広く行われているが、一般に、次のようにして行うことができる。
【０００６】
まず、細胞を培地に懸濁させることにより細胞を含む培養液を調製する。
次に、培養容器が備えるウェル内の底面に細胞培養ペレットを配置させた後、このウェル内に培養液を供給する。
【０００７】
これにより、培養液中に含まれる細胞がその自重により沈降して、ウェル内の底面に配置された細胞培養ペレット上に到達し、付着することとなる。
【０００８】
その後、所定の条件下で放置することにより、細胞培養ペレット上において細胞を培養する。
【０００９】
そして、ウェルの底部側すなわち細胞培養ペレットの下側から光を照射して、この光を、細胞培養ペレット中を透過させることにより、この細胞が細胞培養ペレット上に付着したり、分化したりする等の様子を、細胞培養ペレットの上面側から肉眼や顕微鏡等により観察することができる。
【００１０】
ところが、細胞培養ペレットの材質によっては、細胞培養ペレットの下側から上側への光透過率が低くなり、細胞の状態が観察し辛くなるという問題がある。
【００１１】
また、細胞培養ペレットの上側から光源により光を供給して、細胞を照射する方法も行われているが、この場合、顕微鏡の対物レンズが邪魔になることから、光源の位置決め等が困難であり、鮮明な観察像を得るのに時間と手間を要する。
【００１２】
【特許文献１】特開２００４−２３６９４０号公報
【特許文献２】特開２００４−１７３５０２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、細胞培養支持体の細胞付着面に付着している細胞に光を照射して、細胞の状態を観察することができる補助具を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
このような目的は、下記の（１）〜（２５）の本発明により達成される。
（１）  細胞が付着した細胞付着面を上側としてウェル内に配置された細胞培養支持体に対して、前記ウェルの底部側から光を照射しつつ、前記細胞培養支持体の上側から前記細胞の状態を観察する際に用いられる補助具であって、
当該補助具は、光を導く導光手段を備え、
前記ウェル内に、前記細胞培養支持体と、該細胞培養支持体の周囲に当該補助具とを配置した状態で、前記ウェルの底部側から光を照射したとき、前記導光手段により、前記光の一部を前記細胞付着面に誘導して照射するよう構成したことを特徴とする補助具。
これにより、細胞付着面に付着している細胞の状態を観察することができる。
【００１５】
（２）  中央部に孔を有する筒状をなし、前記孔内で前記細胞付着面が露出するように配置される上記（１）に記載の補助具。
【００１６】
これにより、孔内で露出する細胞付着面に付着している細胞の状態を観察することができる。
【００１７】
（３）  前記補助具の外径は、前記ウェルの内径とほぼ等しいかまたは前記ウェルの内径よりも若干小さい上記（２）に記載の補助具。
【００１８】
これにより、ウェル内への補助具の出し入れを容易かつ確実に行うことができる。また、ウェルの内側面により補助具の水平方向に対する位置が規制されるため、ウェル内に補助具を配置した際に、傾きが生じることを確実に防止することができる。
【００１９】
（４）  前記ウェル内に前記細胞培養支持体および前記補助具を配置した状態で、前記補助具の前記孔の内壁が、前記細胞培養支持体の外縁より外壁側に位置する上記（２）または（３）に記載の補助具。
【００２０】
これにより、補助具の反射面よりも下側の部分の少なくとも一部を間隙内に挿入することができ、ウェル内で露出するウェルの底面の面積を小さくすることができる。その結果、ウェルの振動等により細胞培養支持体の位置がウェルの中央部からずれるのが確実に防止されることとなる。これにより、反射面により反射された光を、より確実に孔内で露出する細胞付着面に誘導することができる。
【００２１】
（５）  前記ウェル内に前記細胞培養支持体および前記補助具を配置した状態で、前記補助具の前記孔の内壁が、前記細胞培養支持体の外縁より中心側に位置しており、前記補助具の下側の端部の前記孔に臨む部位に、前記細胞培養支持体の前記外縁部と係合する係合部を備えている上記（２）または（３）に記載の補助具。
【００２２】
かかる構成とすることにより、補助具により、細胞培養支持体の外縁部をその全体に亘って覆うことができる。そのため、係合部により、細胞培養支持体の外縁部を上側から押さえることができ、ウェルの振動等による細胞培養支持体の浮き上がりを好適に防止または抑制することができる。その結果、補助具により孔内に導入された光を、より確実に孔内で露出する細胞付着面に照射することができる。
【００２３】
（６）  前記孔の平面視形状は、前記細胞培養支持体の外形とほぼ等しい上記（２）ないし（５）のいずれかに記載の補助具。
【００２４】
これにより、孔内で露出する細胞付着面の形状に対応して、この細胞付着面に光をより確実に誘導・照射することができる。
【００２５】
（７）  前記ウェルの内側面と前記細胞培養支持体の外縁部との間に形成された間隙内に位置し、前記細胞培養支持体の前記ウェルに対する位置決めを行う位置決め手段を備える上記（２）ないし（６）のいずれかに記載の補助具。
【００２６】
これにより、ウェルの振動等により細胞培養支持体の位置がウェルの中央部からずれるのを確実に防止することができ、反射面により反射された光を、より確実に孔内で露出する細胞付着面に誘導することができる。
【００２７】
（８）  下端部に前記位置決め手段として機能する脚部を備える上記（７）に記載の補助具。
【００２８】
位置決め手段を前記脚部で構成することにより、位置決め手段は、間隙内に位置し、ウェルに対して細胞培養支持体の位置決めを行う位置決め手段としての機能を発揮することとなる。
【００２９】
（９）  前記脚部は、前記補助具の下端部に、その周方向に沿って設けられている上記（８）に記載の補助具。
これにより、脚部に位置決め手段としての機能を発揮させることができる。
【００３０】
（１０）  前記細胞培養支持体は、実質的に光を透過しない光不透過性の部材で構成されている上記（５）ないし（９）のいずれかに記載の補助具。
【００３１】
細胞培養支持体がかかる部材で構成されている場合、細胞付着面に付着した細胞の状態を観察するのに、本発明の補助具を用いるのは好適である。
【００３２】
（１１）  前記導光手段は、前記細胞培養支持体の外周部で、かつ、前記細胞付着面よりも上方に位置する反射面を備える上記（２）ないし（１０）のいずれかに記載の補助具。
【００３３】
これにより、反射面で前記光の一部を反射して、孔内で露出する細胞付着面に付着している細胞の状態を観察することができる。
【００３４】
（１２）  前記反射面は、光反射性を有する金属材料で構成される上記（１１）に記載の補助具。
これにより、反射面を補助具内に比較的容易に設けることができる。
【００３５】
（１３）  前記反射面は、鏡面または乱反射面で構成されている上記（１１）または（１２）に記載の補助具。
【００３６】
反射面を鏡面で構成することにより、光の反射率が向上することから、ウェルの底部側からの光をより確実に細胞付着面に誘導することができる。また、光乱射面で構成することにより、ウェルの底部側からの光を特定の領域に集中させることなく細胞付着面側に反射することができ、細胞付着面を均一に照射することができる。
【００３７】
（１４）  前記反射面と、該反射面で反射された光を拡散する光拡散手段とを備える上記（１１）ないし（１３）のいずれかに記載の補助具。
【００３８】
これにより、反射面で反射された光が細胞付着面に誘導される際に、特定の領域に誘導されるのを防止でき、細胞付着面をより均一に照射することができる。
【００３９】
（１５）  前記光拡散手段は、前記補助具の前記孔の内壁に形成された乱反射面で構成されている上記（１４）に記載の補助具。
これにより、乱反射面に光拡散手段としての機能を発揮させることができる。
【００４０】
（１６）  第１の反射面と、第２の反射面とを備え、
前記第１の反射面で反射した光を前記第２の反射面で反射して、前記孔内で露出する細胞付着面に導くよう構成されている上記（１１）ないし（１５）のいずれかに記載の補助具。
【００４１】
かかる構成とすることにより、補助具を一体的に形成することができることから、補助具の製造工程を削減することができ、さらには製造コストの削減を図ることができる。
【００４２】
（１７）  前記孔の上側に当該孔の孔径が上端に向かって漸増するテーパ部を備え、
前記ウェル内に、前記細胞培養支持体と、前記テーパ部を上側にした前記補助具とを配置した状態で、前記細胞を含む培養液を供給し、前記細胞を沈降させて前記細胞付着面に付着させる際、前記テーパ部は、前記培養液中において沈降する前記細胞を前記孔内で露出する前記細胞付着面に誘導する細胞誘導手段として機能する上記（２）ないし（１６）のいずれかに記載の補助具。
【００４３】
これにより、培養液中において沈降する細胞を細胞付着面に誘導して、無駄なくかつ確実に、細胞付着面に付着させることができる。
【００４４】
（１８）  前記テーパ部は、前記補助具の外周面側から内周面側に向かって傾斜する傾斜面で構成されている上記（１７）に記載の補助具。
【００４５】
これにより、テーパ部は、培養液中において沈降する細胞を孔内に露出する細胞付着面に誘導する細胞誘導手段としての機能を発揮することとなる。
【００４６】
（１９）  前記傾斜面は、前記孔の中心軸に対して１５〜６５°の角度で傾斜している上記（１８）に記載の補助具。
【００４７】
これにより、細胞を傾斜面に付着させることなく、より確実に細胞培養支持体の孔内に露出する部分に誘導することができ、傾斜面に細胞誘導手段としての機能をより確実に発揮させることができる。
【００４８】
（２０）  前記テーパ部の表面には、前記細胞が付着するのを防止または低減する付着防止処理が施されている上記（１７）ないし（１９）のいずれかに記載の補助具。
【００４９】
これにより、細胞をテーパ部に沿ってより確実に下方に向かって移動させることができるようになり、細胞培養支持体の孔内に露出する部分により無駄なく細胞を誘導して付着させることができる。
【００５０】
（２１）  前記付着防止処理は、前記テーパ部の表面に撥液性を付与する撥液処理である上記（２０）に記載の補助具。
【００５１】
撥液処理によれば、電気的な反発により細胞がテーパ部に付着するのをより確実に防止することができる。
【００５２】
（２２）  前記付着防止処理は、前記テーパ部の表面の凹凸を低減する平滑化処理である上記（２０）または（２１）に記載の補助具。
【００５３】
平滑化処理によれば、細胞の足場となる部分をより減少させ、テーパ部に付着するのをより確実に防止することができる。
【００５４】
（２３）  前記平滑化処理が施された前記テーパ部の表面の表面粗さＲａ（ＪＩＳ  Ｂ  ０６０１に規定）は、１０μｍ以下である上記（２２）に記載の補助具。
【００５５】
これにより、細胞の足場がより少なくなり、より確実にテーパ部に細胞が付着し難くなる。
【００５６】
（２４）  前記テーパ部に形成された第１の反射面と、前記補助具の外壁に形成された第２の反射面とを備え、
前記第１の反射面で反射した光を前記第２の反射面で反射して、前記孔内で露出する細胞付着面に導くよう構成されている上記（１７）ないし（２３）のいずれかに記載の補助具。
【００５７】
かかる構成とすることにより、補助具を一体的に形成することができることから、補助具の製造工程を削減することができ、さらには製造コストの削減を図ることができる。
【００５８】
（２５）  前記培養液に対する前記補助具の全体の比重は、１．０１以上である上記（１）ないし（２４）のいずれかに記載の補助具。
【００５９】
これにより、培養液を穴内に供給した際に、補助具が培養液中で浮き上がるのを確実に防止することができる。
【発明の効果】
【００６０】
本発明によれば、細胞が付着した細胞付着面を上側にしてウェル内に配置された細胞培養支持体の下側から照射された光の少なくとも一部を、本発明の補助具が備える導光手段により細胞付着面上に誘導して照射することができる。これにより、細胞培養支持体の上側に光源（照明手段）を配置することなく、細胞培養支持体の上側からこの細胞付着面上に付着する細胞の状態を鮮明に観察することができる。
【００６１】
また、補助具の上側に傾斜面のようなテーパ部を設けることにより、培養液中に含まれる細胞を確実に前記細胞付着面に誘導できることから、ウェルの内側面と細胞培養支持体の外縁部との間に形成された間隙に細胞が落込んで細胞の無駄が生じるのを確実に防止することができる。また、このように細胞の無駄が生じないことから、培養液中に含まれる細胞の量を調整することにより、細胞付着面に付着している細胞の量を調整することができる。そのため、この細胞を用いた実験の実験精度の向上を図ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６２】
以下、本発明の補助具について、好適実施形態に基づいて詳細に説明する。
なお、以下では、本発明の補助具の説明を行うのに先立って、細胞培養ペレット（細胞培養支持体）に細胞を付着させ、そして、この細胞培養ペレットに付着した細胞の状態を観察する方法の一例について説明する。
【００６３】
＜細胞を付着させ、観察する方法＞
図１２は、細胞培養ペレットに細胞を付着させ、そして、この細胞の状態を観察する方法の一例を説明するための拡大縦断面図である。なお、以下の説明では、図１２中の上側を「上」、下側を「下」という。
【００６４】
［１］まず、試験管やフラスコのような容器内で一次培養した細胞４０に、例えば、トリプシンのようなタンパク質分解酵素等による処理を施すことにより、この細胞４０を容器の内面から剥離（遊離）させる。
【００６５】
［２］次に、この遊離した細胞４０を培地に懸濁させるとともに、この懸濁液中に含まれる細胞数を調整して、細胞４０を含む培養液３０を調製する。
【００６６】
培養液３０に含まれる培地としては、懸濁させる細胞４０の種類等により適宜選択され、特に限定されないが、例えば、ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ダルベッコＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＭＣＤＢ−１０４培地等が挙げられる。
【００６７】
また、培養液３０中には、必要に応じて、例えば、血清、アルブミン等の血清タンパク質、各種ビタミン類、各種アミノ酸、塩類等の添加剤を添加するようにしてもよい。
【００６８】
［３］次に、プレート（培養容器）１０に複数設けられた各穴（ウェル）２０の底面に、付着した細胞４０の状態を観察する細胞付着面２が上側となるように細胞培養ペレット（細胞培養支持体）１を収納（配置）する。
【００６９】
ここで、各穴２０の内径は、細胞培養ペレット１の直径より大きく設定されている。これにより、細胞培養ペレット１の穴２０内への収納、および、穴２０内からの取り出しを容易に行うことができる。
【００７０】
なお、細胞培養ペレット１の構成材料としては、培養する細胞４０の種類や、生体適合性を評価する材料等に応じて適宜選択され、特に限定されないが、例えば、ハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、リン酸二カルシウム、フッ酸アパタイトのようなリン酸カルシウム系材料、チタン、マグネシウム、ニッケルのような金属材料、ポリ乳酸のような生分解性樹脂材料等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００７１】
［４］次に、前記工程［２］で調製した細胞４０を含む培養液３０を、各穴２０内に供給する。
【００７２】
このとき、培養液３０中に含まれる細胞４０は、図１２（ａ）に示すように、その自重により培養液３０中において、鉛直下方に向かって沈降して細胞付着面２上に到達・付着することとなる。
【００７３】
そして、細胞付着面２上に細胞４０が付着した細胞培養ペレット１を所定の条件下で放置することにより、細胞４０を二次培養（培養）することができる。
【００７４】
培養液の温度（培養温度）は、培養する細胞４０の種類等に応じて適宜設定され、特に限定されないが、通常、２０〜４０℃程度、好ましくは２５〜３７℃程度とされる。
【００７５】
なお、本実施形態では、穴２０内に細胞４０を供給する方法として、細胞４０を含む培養液３０を穴２０内に注入（供給）する方法を用いたが、このような場合に限定されず、例えば、穴２０内に、先に培地の供給を行い、次いで細胞４０の供給を行うようにしてもよい。
【００７６】
［５］次に、培養液３０を除去した後、図１２（ｂ）に示すように、穴２０の底部側すなわち細胞培養ペレット１の下側から光を照射することにより、細胞培養ペレット１内に光を透過させて、細胞培養ペレット１の上面側（上側）から肉眼や顕微鏡等により細胞４０の状態を観察する。
【００７７】
なお、培養液３０を除去するのに先立って、細胞４０を染色するようにしてもよい。これにより、細胞４０の状態をより鮮明に観察することができる。
【００７８】
細胞４０を染色する方法としては、特に限定されないが、例えば、ニュートラルレッド溶液、クリスタルバイオレット溶液およびメチレンブルー溶液等の染色液を培養液３０に添加して、細胞４０内に取り込ませる方法等が挙げられる。
【００７９】
以上のような工程により、細胞培養ペレット１が備える細胞付着面２上に細胞４０を付着させるとともに、細胞４０の状態が観察される。
【００８０】
ここで、細胞４０の状態の観察は、上述したように、細胞培養ペレット１の上面側から肉眼や顕微鏡等により行われる。
【００８１】
このとき、細胞培養ペレット１の構成材料（材質）によっては、細胞培養ペレット１の光の透過率が低下する。
【００８２】
そのため、細胞培養ペレット１の底面（下面）側から照射された光を、細胞付着面２上の細胞４０の状態を観察するのに十分な光量で細胞付着面２側に供給することができず、細胞４０の鮮明な観察像を得ることができないという問題がある。
本発明の補助具は、かかる問題を解消するために用いられるものである。
【００８３】
＜補助具＞
以下、本発明の補助具について詳述する。
【００８４】
なお、以下では、補助具が、細胞付着面２上の細胞４０の状態を観察することができる構成となっている他、前記工程［４］において、培養液３０中に含まれる細胞４０を無駄なくかつ確実に細胞付着面２上に誘導して付着させることができる構成となっている場合について説明する。
【００８５】
＜＜第１実施形態＞＞
まず、本発明の補助具の第１実施形態について説明する。
【００８６】
図１は、本発明の補助具の第１実施形態を示す斜視図であり、図２は、図１に示す補助具を細胞培養ペレットが配置された穴内に装着した状態を示す部分断面図であり、図３は、穴内に装着された図１に示す補助具により、補助具の孔内で露出する細胞付着面に細胞が誘導される様子を示す拡大縦断面図であり、図４は、穴内に装着された図１に示す補助具により、補助具の孔内で露出する細胞付着面に光が誘導される様子を示す拡大縦断面図である。なお、図１および図２では、説明の都合上、反射面６８の記載を省略している。また、以下の説明では、図１〜図４中の上側を「上」、下側を「下」という。
【００８７】
図１〜図４に示す補助具６０ａは、その中心部に上下方向（鉛直方向）に貫通する孔６３を有し、その全体形状がほぼ筒状をなす本体６１を備えている。
【００８８】
この補助具６０ａ（本体６１）は、その外径が高さ方向に沿ってほぼ一定である。一方、補助具６０ａの内径は、下端から上端に向かって厚さ方向の途中までほぼ一定であるが、途中から上端に向かって漸増し、補助具６０ａの上端では、その幅が実質的に「０」となっている。
【００８９】
すなわち、孔６３（本体６１の内周面）がロート状をなしており、補助具６０ａの上部内周面が、補助具６０ａの外周面側から内周面側に向かって傾斜する傾斜面６４となっている。換言すれば、この傾斜面６４が、本体６１の上（他端）側に孔６３の孔径がこの本体６１の上（他端）に向かって漸増するテーパ部を構成する。
【００９０】
ここで、本実施形態のように本体６１を傾斜面６４すなわちテーパ部を備える構成とすることにより、穴２０内に、細胞培養ペレット１を収納するとともに、補助具６０ａ（本体６１）を、傾斜面６４を上側にして収納した状態で、前記工程［４］で説明したように、穴２０内に細胞４０を含む培養液３０を供給し、細胞４０を沈降させて細胞培養ペレット１に付着させる際に、傾斜面６４は、培養液３０中において沈降する細胞４０を細胞培養ペレット１（細胞付着面２）の孔６３内で露出する部分に誘導する細胞誘導手段としての機能を発揮することとなる。
【００９１】
そのため、図３に示すように、細胞４０を含む培養液３０を穴２０内に供給すると、細胞４０は、培養液３０中において鉛直下方に沈降することとなるが、穴２０の内側面と細胞培養ペレット１の外縁部との間に形成された間隙５０の鉛直上方に存在している細胞４０は、傾斜面６４上に到達すると、傾斜面６４を転がって（を沿うように）孔６３内を下方に向かって移動して、細胞付着面２上に誘導され付着する。
【００９２】
このようなことから、補助具６０ａを用いることにより、細胞４０を無駄なく、かつ確実に細胞培養ペレット１（細胞付着面２）に付着させることができる。また、このように、細胞４０の無駄が生じないことから、培養液３０中に含まれる細胞４０の数を調整することにより、細胞付着面２上に付着する細胞４０の数を確実に調整することができる。その結果、この細胞４０を用いた実験の実験精度の向上を図ることができる。
【００９３】
傾斜面６４は、特に限定されないが、孔６３の中心軸に対して、１５〜６５°程度の角度で傾斜しているのが好ましく、２５〜５５°程度の角度で傾斜しているのがより好ましい。これにより、細胞４０を傾斜面６４に付着させることなく、より確実に細胞付着面２上に誘導することができ、傾斜面６４に細胞誘導手段としての機能をより確実に発揮させることができる。
【００９４】
また、傾斜面６４には、細胞４０が付着するのを防止または低減する付着防止処理が施されているのが好ましい。これにより、細胞４０を傾斜面６４に沿ってより確実に下方に向かって移動させることができるようになり、細胞培養ペレット１の孔６３内に露出する部分（細胞付着面２）により無駄なく細胞４０を誘導して付着させることができる。
【００９５】
この付着防止処理としては、例えば、傾斜面（平面）６４に撥液性を付与する撥液処理（化学的処理）、傾斜面６４の凹凸を低減する平滑化処理（物理的処理）等が挙げられる。撥液処理によれば、電気的な反発により細胞４０が傾斜面６４に付着するのをより確実に防止することができる。また、平滑化処理によれば、細胞４０の足場となる部分をより減少させ、傾斜面６４に付着するのをより確実に防止することができる。
【００９６】
撥液処理の方法としては、例えば、傾斜面６４の上面に撥液膜を形成する方法、フッ素イオン等の撥液性を付与し得るイオンを注入（打ち込む）方法等のうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００９７】
撥液膜の構成材料としては、例えば、トリデカフルオロ−１，１，２，２テトラヒドロオクチルトリエトキシシラン、トリデカフルオロ−１，１，２，２テトラヒドロオクチルトリメトキシシランのような撥液性を示す官能基を有するカップリング剤や、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、テトラフルオロエチレン−パーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体（ＰＦＡ）、エチレン−テトラフルオロエチレン共重合体（ＥＴＦＥ）のような撥液性の樹脂材料等が挙げられる。
【００９８】
平滑化処理の方法としては、例えば、化学的研磨、電解研磨等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００９９】
平滑化処理が施された傾斜面６４は、その表面粗さＲａ（ＪＩＳ  Ｂ  ０６０１に規定）が１０μｍ以下であるのが好ましいが、０．１〜１０μｍ程度であればよい。これにより、細胞４０の足場がより少なくなり、より確実に傾斜面６４に細胞４０が付着し難くなる。
【０１００】
さらに付着防止処理は、補助具６０ａ（本体６１）の内周面に施すこともできる。この場合、より効果的に細胞４０が補助具６０ａに付着するのを防止することが確実となる。
【０１０１】
なお、テーパ部は、図１〜図４に示すような本体６１の外周面側から内周面側に向かって傾斜する傾斜面６４で構成されている場合に限らず、例えば、湾曲凹面、湾曲凸面、または傾斜面６４を含み、これらのうちの任意の２以上を組み合わせて構成することができる。
【０１０２】
さて、本実施形態では、図３および図４に示すように、補助具６０ａ（本体６１）は、光を反射する反射面６８と、この反射面６８よりも下側の部分６１１と、上側の部分６１２とで構成されている。そして、穴（ウェル）２０内に細胞培養ペレット（細胞培養支持体）１と、この細胞培養ペレット１の周囲に補助具６０ａとを配置した状態で、反射面６８が、細胞培養ペレット１の外周部で、かつ、細胞付着面２よりも上方に位置して、細胞培養ペレット１の下側すなわち穴２０の底部側から光を照射したとき、この光の一部を細胞付着面（細胞４０付着した面）２に誘導して照射する機能を発揮する点に特徴を有する。
【０１０３】
ここで、実質的に光を透過しない光不透過性の部材で構成されている細胞培養ペレット１において、細胞付着面２に付着した細胞４０の状態を細胞培養ペレット１の上側から顕微鏡を用いて観察する場合、細胞培養ペレット１の光の透過率が低下することに起因して、対物レンズ近傍に光源（照明手段）を配置する必要があるが、この光源が邪魔になり細胞４０の観察操作が困難となる。
【０１０４】
これに対して、補助具６０ａを上述したような構成とすることにより、細胞培養ペレット１の下側すなわち穴２０の底部側から照射された光を、反射面６８で反射させることができる。その結果、前記光の少なくとも一部が、補助具６０ａ（本体６１）の中央部に設けられた孔６３に向かうこととなり、この孔６３内で露出する細胞付着面２に誘導され照射される。
【０１０５】
換言すれば、反射面６８に、穴２０の底部側から光を照射したとき、その光の少なくとも一部を、細胞付着面２に誘導して照射する導光手段としての機能を発揮させることができる。その結果、顕微鏡を用いた観察の際に、対物レンズの近傍に光源を配置することを要さないため、その観察操作を容易に行うことができる。
【０１０６】
反射面６８の傾斜角度は、細胞培養ペレット１のサイズ等によっても若干異なり、特に限定されないが、孔６３の中心軸に対して４５〜８５°程度であるのが好ましく、５０〜６０°程度であるのがより好ましい。
【０１０７】
このような反射面６８は、好ましくは光反射性を有する金属材料で構成される。これにより、前述したような構成の反射面６８を本体６１内、すなわち、下側の部分６１１と上側の部分６１２との間に比較的容易に設けることができる。なお、かかる反射面６８を備える補助具６０ａ（本体６１）は、例えば、蒸着法、ＣＶＤ法、スパッタリング法等の気相成膜法等により下側の部分６１１に反射面６８を形成した後、この反射面６８が設けられた下側の部分６１１と上側の部分６１２とを接合することにより得ることができる。
【０１０８】
金属材料としては、特に限定されないが、Ａｌ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ａｇおよびこれらを含む合金のうちの少なくとも１種を主材料として構成されるものを用いるのが好ましい。これらの金属材料は、特に光反射性に優れるものである。
【０１０９】
また、反射面６８は、光を反射し得るもので構成されていればよく、特に限定されるものではないが、鏡面または光乱射面で構成されているのが好ましい。反射面６８を鏡面で構成することにより、光の反射率が向上することから、穴２０の底部側からの光をより確実に細胞付着面２に誘導することができる。また、光乱射面で構成することにより、穴２０の底部側からの光を特定の領域に集中させることなく細胞付着面２側に反射することができ、細胞付着面２を均一に照射することができる。
【０１１０】
なお、反射面６８に光を導く光ファイバー等の導光路（光導波路）を、反射面６８よりも下側の部分６１１内に配設するようにしてもよい。かかる構成とすることによっても、穴２０の底部側から照射された光を反射面６８で反射させて、孔６３内で露出する細胞付着面２に誘導することができる。なお、かかる構成とする場合、導光路の周辺は、黒色または暗色の材料で構成されているのが好ましい。これにより、導光路のから漏洩する光量を少なくして、反射面６８に効率よく光を供給（誘導）することができる。
【０１１１】
さらに、反射面６８を省略して、この導光路を用いて、光を直接、孔６３内で露出する細胞付着面２上に誘導する構成としてもよい。この場合、この導光路が導光手段としての機能を発揮することとなる。
【０１１２】
また、光ファイバーのような光導波路等の光源を、穴２０の底面を介して本体６１の底面に対応するように配置して、この光源から光を照射するような構成としてもよい。かかる構成とすることにより、穴２０の底部側からの光を、より効率よく下側の部分６１１内に供給することができる。その結果、細胞付着面２上に導入される光量が増大して、細胞４０の状態をより鮮明に観察することができる。
【０１１３】
さて、本実施形態では、補助具６０ａの外径は、穴２０の内径とほぼ等しいかまたは穴２０の内径より若干小さく設定されている。これにより、穴２０内への補助具６０ａの出し入れを容易かつ確実に行うことができる。また、穴２０の内側面により補助具６０ａの水平方向に対する位置が規制されるため、穴２０内に補助具６０ａを配置した際に、傾きが生じることを確実に防止することができる。さらに、補助具６０ａの外周面と穴２０の内側面とが近接して、補助具６０ａを穴２０内に隙間なく収納することができるため、補助具６０ａと穴２０の内側面との間に細胞４０が入り込むのを防止することができる。
【０１１４】
また、補助具６０ａは、図２〜図４に示すように、穴２０内に細胞培養ペレット１およびこの補助具６０ａを配置した状態で、孔６３の内壁が、細胞培養ペレット１の外縁より補助具６０ａの外壁側に位置するように設定されている。これにより、反射面６８よりも下側の部分６１１の少なくとも一部を間隙５０内に挿入することができ、穴２０内で露出する穴２０の底面の面積を小さくすることができる。その結果、穴２０の振動等により細胞培養ペレット１の位置が穴２０の中央部からずれるのが確実に防止されることとなる。すなわち、下側の部分６１１（補助具６０ａ）に、間隙５０内に位置し、穴２０に対して細胞培養ペレット１の位置決めを行う位置決め手段としての機能を発揮させることができる。これにより、反射面６８により反射された光を、より確実に孔６３内で露出する細胞付着面２に誘導することができる。
【０１１５】
さらに、孔６３の平面視形状は、細胞培養ペレット１の外形と異なっていてもよいが、図２〜図４に示すように、好ましくはほぼ等しいものとされる。これにより、孔６３内で露出する細胞付着面２の形状に対応して、この細胞付着面２上に光をより確実に誘導・照射することができる。さらに、間隙５０の幅と本体６１の幅とがほぼ等しい場合には、補助具６０ａで間隙５０のほぼ全面を確実に塞ぐことができる。また、細胞培養ペレット１および補助具６０ａを穴２０内に収納する際に、この工程を、細胞培養ペレット１と補助具６０ａとを一体化させた状態、すなわち、細胞培養ペレット１を孔６３内に装着した状態で行うことができる。また、本体６１の幅が間隙５０の幅よりも小さい場合であっても、間隙５０が孔６３内で露出する大きさを比較的小さくすることができる。その結果、間隙５０内に落込む細胞４０の量を少なくすることができる。
【０１１６】
反射面６８よりも下側の部分６１１の構成材料としては、光透過性を有するものであればよく、特に限定されるものではないが、各種ガラス材料および各種樹脂材料のうち透明なものが好適に選択され、例えば、石英ガラス、ソーダガラスのようなガラス材料や、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリスチレン、ポリエーテルサルフォン、ポリアクリル酸メチル、ポリカーボネートのような樹脂材料等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【０１１７】
また、反射面６８よりも上側の部分６１２の構成材料としては、特に光透過性は要求されず、例えば、石英ガラス、ソーダガラスのようなガラス材料、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレートのような樹脂材料、セラミックス材料、金属材料および炭素繊維等のような炭素系材料等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【０１１８】
本体６１の外径は、前述したように、穴２０の内径と等しいかまたは穴２０の内径より若干小さく設定される。
【０１１９】
そこで、プレート１０として２４穴のものを用いる場合、穴２０の内径は、通常、１５．０ｍｍ程度と設定されることから、本体６１の外径は、１４．８〜１５．０ｍｍ程度であるのが好ましい。この場合、本体６１の最小内径は、特に限定されないが、１０〜１３．５ｍｍ程度であるのが好ましい。また、本体６１の最大高さは、特に限定されないが、４．３〜５．０ｍｍ程度であるのが好ましい。
【０１２０】
なお、本実施形態では、細胞培養ペレット１が、実質的に光を透過しない光不透過性の部材で構成される場合について説明したが、このような場合に限定されず、例えば、細胞培養ペレット１が透光性の高い部材で構成される場合であってもよい。かかる構成の細胞培養ペレット１と補助具６０ａとを穴２０内に配置した状態で、穴２０の底部側から光を照射した場合には、補助具６０ａを介した光ばかりでなく、細胞培養ペレット１を介した光をも孔６３で露出する細胞付着面２上に導入することができる。その結果、穴２０の底部側で照射する光の強度を比較的低く設定することができるため、この光を発光する光源により消費される消費エネルギーの削減を図ることができる。
【０１２１】
また、本実施形態では、培養液３０中に含まれる細胞４０を無駄なくかつ確実に細胞付着面２上に誘導して付着させるために、本体６１がその上側にテーパ部として機能する傾斜面６４を備える場合について説明したが、穴２０の底部側から照射された光の少なくとも一部を、孔６３内で露出する細胞付着面２に誘導し照射するという観点からは、この傾斜面６４の形成を省略してもよい。
【０１２２】
さらに、孔６３内で露出する細胞付着面２に誘導し照射するという観点、すなわち、細胞付着面２に付着する細胞の鮮明な観察像を得るという観点からは、補助具６０ａの穴２０内への配置（収納）は、穴２０内に培養液３０を供給する前記工程［４］に先立って行うものであってもよいし、前記工程［４］の後に行うものであってもよい。
【０１２３】
＜＜第２実施形態＞＞
次に、本発明の補助具の第２実施形態について説明する。
【０１２４】
図５は、本発明の補助具の第２実施形態を細胞培養ペレットが配置された穴内に装着した状態を示す拡大縦断面図である。なお、以下の説明では、図５中の上側を「上」、下側を「下」という。
【０１２５】
以下、第２実施形態について、前記第１実施形態との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
【０１２６】
図５に示すように、第２実施形態の補助具６０ｂ（本体６１）は、穴２０内に細胞培養ペレット１および補助具６０ｂを収納した状態で、補助具６０ｂの孔６３の内壁が、細胞培養ペレット１の外縁より中心側に位置しており、補助具６０ｂの下端部の孔６３に臨む部位に、細胞培養ペレット１の外縁部と係合する係合部６２を有している以外は、前記第１実施形態の補助具６０ａ（本体６１）と同様である。
【０１２７】
本体６１をかかる構成、すなわち、係合部６２を有する構成とすることにより、本体６１により、細胞培養ペレット１の外縁部をその全体に亘って覆うことができる。そのため、係合部６２により、細胞培養ペレット１の外縁部を上側から押さえることができ、穴２０の振動等による細胞培養ペレット１の浮き上がりを好適に防止または抑制することができる。その結果、補助具６０ｂにより孔６３内に導入された光を、より確実に孔６３内で露出する細胞付着面２に照射することができる。また、孔６３の大きさを適宜設定することにより、孔６３から露出する細胞付着面２の領域、すなわち、補助具６０ｂにより光を照射する細胞付着面２の領域を比較的容易に設定することができる。さらに、間隙５０の全面を、本体６１の底面により覆うことができることから、間隙５０が孔６３から露出するようになるのを防止することができる。これにより、細胞付着面２上に誘導された細胞４０が、培養液３０の対流や振動等により、間隙５０内に落込むようになるのを確実に防止することができる。
【０１２８】
なお、本実施形態において、孔６３の内径は、本体６１の下端から上端まで、高さ方向に沿って連続的に漸増する構成、すなわち、内周面全体が傾斜面６４を構成してもよい。このような構成によっても、前記と同様の効果が得られる。
【０１２９】
＜＜第３実施形態＞＞
次に、本発明の補助具の第３実施形態について説明する。
【０１３０】
図６は、本発明の補助具の第３実施形態を細胞培養ペレットが配置された穴内に装着した状態を示す拡大縦断面図である。なお、以下の説明では、図６中の上側を「上」、下側を「下」という。
【０１３１】
以下、第３実施形態について、前記第１実施形態および前記第２実施形態との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
【０１３２】
図６に示すように、第３実施形態の補助具６０ｃは、本体６１の下側の端部に、本体６１と一体的に形成された脚部６６を備える以外、すなわち、補助具６０ｃの下端部に脚部６６を有している以外は、前記第２実施形態の補助具６０ｂと同様である。
【０１３３】
この脚部６６は、下方に向かって突出するように、本体６１の周方向に沿って設けられた円環状をなしており、補助具６０ｃを穴２０内に配置した状態で、脚部６６が穴２０の内側面と細胞培養ペレット１の外縁部との間に形成された間隙５０内に位置することとなる。これにより、細胞培養ペレット１を穴２０の中央部に正確に移動（センタリング）することができる。すなわち、脚部６６は、間隙５０内に位置し、穴２０に対して細胞培養ペレット１の位置決めを行う位置決め手段として機能する。これにより、たとえ、穴２０の振動等により細胞培養ペレット１の位置が穴２０の中央部からずれたとしても、係合部６２が細胞培養ペレット１の外縁部と係合した状態を維持することができる。その結果、細胞付着面２（細胞を観察する領域）が孔６３から露出することとなり、穴２０の底部側からの光の一部を、補助具６０ｃを介してこの細胞付着面２に確実に誘導・照射することができる。また、かかる構成とすることにより、間隙５０をより確実に塞ぐことができることから、細胞付着面２上に誘導された細胞４０が、間隙５０内に落込むようになるのをより確実に防止することができる。
【０１３４】
また、脚部６６は、下側の部分６１１と別体となったものであってもよいが、本実施形態のように、一体的に形成されるものであるのが好ましい。これにより、補助具６０ｃの製造工程の削減を図ることができるとともに、寸法精度に優れた補助具６０ｃを比較的容易に形成することができる。
【０１３５】
なお、脚部６６は、補助具６０ｃ（本体６１）の下端部に、その周方向に沿って連続的に設けられているものに限定されず、間歇的に設けられているものであってもよく、例えば、本体６１の下面から突出し、本体６１に周方向に沿って配設された複数の棒状体で構成することもできる。この場合、棒状体の数は、特に限定されないが、その形成されている位置は、それぞれがほぼ等間隔となっているのが好ましい。これにより、穴２０に対する細胞培養ペレット１の位置決めを確実に行うことができる。
【０１３６】
また、位置決め手段は、図６に示すような脚部６６で構成されている場合に限らず、本体６１と別体とする場合には、例えば、穴２０の内周面および／または底面に接合されたもの、細胞培養ペレット１の外周面に接合されたもの、間隙５０内に挿入されたもの等であってもよい。
【０１３７】
＜＜第４実施形態＞＞
次に、本発明の補助具の第４実施形態について説明する。
【０１３８】
図７は、本発明の補助具の第４実施形態を細胞培養ペレットが配置された穴内に装着した状態を示す拡大縦断面図である。なお、以下の説明では、図７中の上側を「上」、下側を「下」という。
【０１３９】
以下、第４実施形態について、前記第３実施形態との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
【０１４０】
図７に示すように、第４実施形態の補助具６０ｄは、その孔の内壁、すなわち下側の部分６１１の内壁が、乱反射面６９で構成されている以外は、前記第３実施形態の補助具６０ｃと同様である。
【０１４１】
本実施形態のように、補助具６０ｄの内壁を乱反射面６９で構成することにより、反射面６８で反射された光がこの乱反射面６９を透過する際に、光を拡散させることができる。すなわち、この乱反射面６９に、反射面６８で反射された光を拡散する光拡散手段としての機能を発揮させることができる。その結果、反射面６８で反射された光が細胞付着面２に誘導される際に、特定の領域に誘導されることなく、細胞付着面２をより均一に照射することができる。
【０１４２】
このような乱反射面６９を形成する方法としては、例えば、ショットブラスト法、サンドブラスト法等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【０１４３】
＜＜第５実施形態＞＞
次に、本発明の補助具の第５実施形態について説明する。
【０１４４】
図８は、本発明の補助具の第５実施形態を細胞培養ペレットが配置された穴内に装着した状態を示す拡大縦断面図である。なお、以下の説明では、図８中の上側を「上」、下側を「下」という。
【０１４５】
以下、第５実施形態について、前記第３実施形態との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
【０１４６】
図８に示すように、第５実施形態の補助具６０ｅは、本体６１内に反射面６８が設けられているのに代えて、傾斜面６４に第１の反射面６８１が形成され、本体６１の外壁の一部に第２の反射面６８２が形成されている以外は、前記第３実施形態の補助具６０ｃと同様である。
【０１４７】
ここで、補助具６０ｅが備える第１の反射面６８１と第２の反射面６８２とは、穴２０の底部側から入射された光を第１の反射面６８１で反射した後、さらに第２の反射面で反射することにより、孔６３内で露出する細胞付着面２に導く（誘導する）よう設定されている。かかる構成とすることにより、本体６１を一体的に形成することができることから、前記第３実施形態の補助具６０ｃのように下側の部分６１１と上側の部分６１２とを個別に設ける必要がないことから、補助具６０ｅの製造工程を削減することができ、さらには製造コストの削減を図ることができる。
【０１４８】
なお、第１の反射面６８１および第２の反射面６８２は、前記第１実施形態で説明したような、反射面６８を形成する際に下側の部分６１１に施す処理を、それぞれ、傾斜面６４および本体６１の外壁の一部に行うことにより形成することができる。
【０１４９】
＜＜第６実施形態＞＞
次に、本発明の補助具の第６実施形態について説明する。
【０１５０】
図９は、本発明の補助具の第６実施形態を細胞培養ペレットが配置された穴内に装着した状態を示す拡大縦断面図である。なお、以下の説明では、図９中の上側を「上」、下側を「下」という。
【０１５１】
以下、第６実施形態について、前記第３実施形態との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
【０１５２】
図９に示すように、第６実施形態の補助具６０ｆは、反射面６８よりも上側の部分６１２内に錘６７を備える以外は、前記第３実施形態の補助具６０ｃと同様である。
【０１５３】
ここで、補助具６０ｆは、培養液３０に対するその全体の比重が好ましくは１．０１以上、より好ましくは１．２〜１．５程度となっているのが好適である。前記比重をかかる範囲内に設定することにより、培養液３０を穴２０内に供給した際に、補助具６０ｆが培養液３０中で浮き上がるのを防止して、係合部６２により、細胞培養ペレット１の外縁部を上側から確実に押さえることができ、孔６３内で露出する細胞付着面２の位置にずれが生じるのを確実に防止することができる。
【０１５４】
そこで、本実施形態のような上側の部分６１２に錘６７を備える構成とすることにより、補助具６０ｆ全体としての比重を前記範囲内に比較的容易に設定することができる。また、本体６１に用いる材料の選択の幅が広がるという利点も得られる。
【０１５５】
錘６７の構成材料としては、特に限定されないが、例えば、Ｃｕ、Ｐｂ、Ｆｅのような金属材料が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【０１５６】
以上、本発明の補助具を図示の実施形態に基づいて説明したが、本発明はこれらに限定されるものではない。例えば、本発明の補助具は、各前記実施形態のうち任意の２以上の構成（特徴）を組み合わせたものであってもよい。
【０１５７】
また、本発明の補助具の各部の構成は、同様の機能を発揮し得る任意のものと置換することができ、あるいは、任意の構成のものを付加することもできる。
【実施例】
【０１５８】
次に、本発明の具体的実施例について説明する。
（実施例１）
＜１＞まず、フラスコ内でヒト骨肉腫由来細胞（ＨＯＳ、ＡＴＣＣ＃１５４３）を一次培養し、培養されたヒト骨肉腫由来細胞を０．２５ｗｔ％トリプシン−０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を用いて処理した後、剥離したヒト骨肉腫由来細胞が１×１０５個／ｍＬとなるように、培養液を用いて細胞浮遊液を調製した。
【０１５９】
なお、培養液には、ＭＥＭ培地に、ＦＢＳ：１０ｖｏｌ％、ＮＥＡＡ：１ｖｏｌ％となるように混合した。
【０１６０】
＜２＞次に、細胞培養ペレットとして外径１３ｍｍ×厚さ２．０ｍｍのハイドロキシアパタイト緻密体（ペンタックス社製、「CELLYARD pellet」）を用意し、このハイドロキシアパタイト緻密体を１２１℃×２０分の条件下でオートクレーブ処理した。
【０１６１】
＜３＞次に、図１に示すような培養容器（プレート）（Falcon社製、「２４穴マルチウェルプレート」）が備える内径１５．３ｍｍ×深さ１７ｍｍのウェルの底面にハイドロキシアパタイト緻密体を配置した。
【０１６２】
＜４＞次に、図１〜図４に示す補助具をハイドロキシアパタイト緻密体が配置されたウェル内に図２に示すように配置した。そして、この状態で、前記工程＜１＞で調製した細胞浮遊液１ｍＬをウェル内に供給した。
【０１６３】
＜５＞その後、９５ｖｏｌ％Ｏ２＋５ｖｏｌ％ＣＯ２の混合ガス気流下、３７℃の条件下で４時間静置して、ヒト骨肉腫由来細胞を培養（二次培養）した。
【０１６４】
（実施例２）
前記工程＜４＞において、ウェル内に図１〜図４に示す補助具に代えて、図５に示す補助具を配置した以外は、前記実施例１と同様にしてヒト骨髄腫由来細胞を培養した。
【０１６５】
（実施例３）
前記工程＜４＞において、ウェル内に図１〜図４に示す補助具に代えて、図６に示す補助具を配置した以外は、前記実施例１と同様にしてヒト骨髄腫由来細胞を培養した。
【０１６６】
（実施例４）
前記工程＜４＞において、ウェル内に図１〜図４に示す補助具に代えて、図７に示す補助具を配置した以外は、前記実施例１と同様にしてヒト骨髄腫由来細胞を培養した。
【０１６７】
（実施例５）
前記工程＜４＞において、ウェル内に図１〜図４に示す補助具に代えて、図８に示す補助具を配置した以外は、前記実施例１と同様にしてヒト骨髄腫由来細胞を培養した。
【０１６８】
（実施例６）
前記工程＜４＞において、ウェル内に図１〜図４に示す補助具に代えて、図９に示す補助具を配置した以外は、前記実施例１と同様にしてヒト骨髄腫由来細胞を培養した。
【０１６９】
（比較例１）
前記工程＜４＞において、ウェル内への補助具の配置を省略した以外は、前記実施例１と同様にしてヒト骨髄腫由来細胞を培養した。
【０１７０】
（比較例２）
前記工程＜３＞において、ウェル内へのハイドロキシアパタイト緻密体の配置を省略し、前記工程＜４＞において、ウェル内への補助具の配置を省略した以外は、前記実施例１と同様にしてヒト骨髄腫由来細胞を培養した。
【０１７１】
［評価］
（評価１）
まず、実施例１において、補助具をウェル内に配置した状態で、ヒト骨髄腫由来細胞（以下、単に「細胞」という。）が培養されたウェル内の培養液に対して、ニュートラルレッド溶液を添加することにより細胞にニュートラルレッド染色を施した。
【０１７２】
そして、ウェルの底面側から光を照射しつつ、ウェルの上面（観察面）側から、ヒト骨ハイドロキシアパタイト緻密体上の細胞の状態を、正立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社製、「ＤＭＲ」）により観察した。
【０１７３】
その結果、図１０に示すように、補助具をウェル内に配置した状態では、補助具を介してハイドロキシアパタイト緻密体の上面に細胞を観察するのに十分な光量を導入することができ、鮮明な細胞の観察像を得ることができた。これに対して、補助具をウェル内から取り出して、前記と同様にウェルの底面側から光を照射しつつ、ウェルの上面側から観察すると、図１１に示すように、細胞を観察するのに十分な光量を、ハイドロキシアパタイト緻密体を透過させることができず、細胞の状態を観察することができなかった。
【０１７４】
なお、補助具をウェル内から取り出した状態で、光ファイバーを用いてウェルの斜め上方から光を供給して細胞の状態を観察することを試みた。この場合、正立顕微鏡の対物レンズによる立体障害等により、光ファイバーの位置決め等が困難であり、鮮明な観察像を得るのに時間を要した。
【０１７５】
また、実施例１と同様にして、実施例２〜６のハイドロキシアパタイト緻密体の上面に付着した細胞を観察したが、前記実施例１と同様の結果が得られた。
【０１７６】
（評価２）
まず、実施例１〜６および比較例１、２において、それぞれ、細胞が培養された５個のウェル内から培養液を吸引除去した後、ＰＢＳ（−）で洗浄した後、１０ｖｏｌ％ホルマリンによりウェル内の細胞を固定化し、０．０５ｖｏｌ％トルイジンブルー水溶液を用いて細胞を染色して可視化させた。
そして、ウェル内に付着している細胞の場所を目視により観察した。
【０１７７】
その結果、実施例１の補助具が配置されたウェルの底面に、細胞の付着が若干認められたものの、実施例２〜６の補助具が配置されたウェル内では、細胞は、補助具の表面およびウェルの内面には付着しておらず、補助具の孔から露出するハイドロキシアパタイト緻密体の表面だけに付着していた。
【０１７８】
これに対して、比較例１では、細胞は、ウェルの内側面とハイドロキシアパタイト緻密体との間に形成された間隙で露出するウェルの底面と、ハイドロキシアパタイト緻密体の表面とに付着していた。また、比較例２では、細胞は、ウェルの底面全体に付着していた。
【０１７９】
（評価３）
まず、実施例１〜６および比較例１、２において、それぞれ、細胞が培養された５個のウェル内から培養液を吸引して取り除いた。
【０１８０】
次に、各実施例のウェル内から、補助具およびハイドロキアパタイト緻密体を取り出した後、ウェル内、補助具およびハイドロキシアパタイト緻密体に付着する細胞を、０．２５ｗｔ％トリプシン−０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を用いて剥離・回収し、それぞれに付着していた細胞数と、培養液中に残存していた細胞数とを粒子数測定装置（ベックマンコルター社製、「Multisizer3」）を用いて計測した。
【０１８１】
また、比較例１のウェル内からハイドロキシアパタイト緻密体を取り出し、ウェル内およびハイドロキシアパタイト緻密体に付着していた細胞数と、培養液中に残存していた細胞数とを前記と同様にして計測した。
【０１８２】
さらに、比較例２のウェル内に付着していた細胞数と、培養液中に残存していた細胞数とを前記と同様にして計測した。
【０１８３】
なお、各細胞数は、いずれも、５個のウェルの平均値を求めた。
その結果を、表１に示す。
【０１８４】
【表１】
2007202480.tif 000003
【０１８５】
表１に示すように、実施例１の補助具を配置したウェルでは、ウェル内に細胞の付着が認められたものの、その他の実施例２〜６の補助具を配置したウェルでは、沈降した細胞のほぼ全てがハイドロキシアパタイト緻密体に付着していた。これに対して、比較例１では、ハイドロキシアパタイト緻密体の他、ウェル内にも細胞が付着しており、各実施例と比較して、ハイドロキシアパタイト緻密体への細胞の付着率が低下する傾向が見られた。なお、比較例１において、ハイドロキシアパタイト緻密体に付着していた細胞数とウェル内に付着していた細胞数との比が、ハイドロキシアパタイト緻密体の上面の表面積と、ハイドロキシアパタイト緻密体から露出するウェルの底面の表面積との比がほぼ等しかったことから、ウェル内に付着していた細胞のほぼ全てが、ウェルの底面に付着していたものと推測された。
【図面の簡単な説明】
【０１８６】
【図１】本発明の補助具の第１実施形態を示す斜視図である。
【図２】図１に示す補助具を細胞培養ペレットが配置された穴内に装着した状態を示す部分断面図である。
【図３】穴内に装着された図１に示す補助具により、補助具の孔内で露出する細胞付着面に細胞が誘導される様子を示す拡大縦断面図である。
【図４】穴内に装着された図１に示す補助具により、補助具の孔内で露出する細胞付着面に光が誘導される様子を示す拡大縦断面図である。
【図５】本発明の補助具の第２実施形態を細胞培養ペレットが配置された穴内に装着した状態を示す拡大縦断面図である。
【図６】本発明の補助具の第３実施形態を細胞培養ペレットが配置された穴内に装着した状態を示す拡大縦断面図である。
【図７】本発明の補助具の第４実施形態を細胞培養ペレットが配置された穴内に装着した状態を示す拡大縦断面図である。
【図８】本発明の補助具の第５実施形態を細胞培養ペレットが配置された穴内に装着した状態を示す拡大縦断面図である。
【図９】本発明の補助具の第６実施形態を細胞培養ペレットが配置された穴内に装着した状態を示す拡大縦断面図である。
【図１０】実施例１のウェル内に補助具を配置した状態で、ヒト骨髄腫由来細胞を正立顕微鏡で観察した観察像である。
【図１１】実施例１のウェル内から補助具を取り出した状態で、ヒト骨髄腫由来細胞を正立顕微鏡で観察した観察像である。
【図１２】細胞培養ペレットに細胞を付着させ、そして、この細胞の状態を観察する方法を説明するための縦断面図である。
【符号の説明】
【０１８７】
１      細胞培養ペレット
２      細胞付着面
１０    プレート
２０    穴
３０    培養液
４０    細胞
５０    間隙
６０ａ、６０ｂ、６０ｃ、６０ｄ、６０ｅ、６０ｆ    補助具
６１    本体
６１１  下側の部分
６１２  上側の部分
６２    係合部
６３    孔
６４    傾斜面
６６    脚部
６７    錘
６８    反射面
６８１  第１の反射面
６８２  第２の反射面
６９    乱反射面
【図１】
2007202480.tif 000004
【図２】
2007202480.tif 000005
【図３】
2007202480.tif 000006
【図４】
2007202480.tif 000007
【図５】
2007202480.tif 000008
【図６】
2007202480.tif 000009
【図７】
2007202480.tif 000010
【図８】
2007202480.tif 000011
【図９】
2007202480.tif 000012
【図１０】
2007202480.tif 000013
【図１１】
2007202480.tif 000014
【図１２】
2007202480.tif 000015