(57)【要約】【課題】生体の神経組織から放出される神経伝達物質の濃度分布を光学的にイメージングする方法において、神経組織から放出される神経伝達物質を捕捉するのに十分な量の酵素を反応場に保持する光学的に透明なアルギン酸ゲルの提供。【解決手段】アルギン酸ゲル作製の過程で、ある種のｐＨ緩衝材の添加によってアルギン酸のカルボン酸基の解離度を調整し、過度の重合反応が起こらないようにすれば、アルギン酸ゲルに期待される酵素保持能力を維持したまま、光散乱度の少ない透明なアルギン酸ゲルが得られることを発見した。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素を用いて生体組織から放出される神経伝達物質を捕捉し、その濃度分布を光学的にイメージングする方法において、該酵素を十分な濃度で反応場に保持するための光学的に透明なアルギン酸ゲル。
【請求項２】
請求項1における十分な濃度の酵素量が、 ５units/ｍＬ乃至２０units/ｍＬである請求項1に記載の光学的に透明なアルギン酸ゲル。
【請求項３】
請求項１、２に記載の光学的に透明なアルギン酸ゲルの透明性が、水の光散乱度を1.0とした場合にその光散乱度が1.25以下である請求項１もしくは２に記載のアルギン酸ゲル。
【請求項４】
請求項３に記載のアルギン酸ゲルがアルギン酸カルシウムゲルである請求項３に記載の酵素保持用ゲル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体の神経組織から放出される神経伝達物質、例えばガンマアミノ酪酸を、特定の酵素を用いて捕捉し、当該神経伝達物質の濃度分布を光学的にイメージングする方法に関する。具体的には、神経組織から放出される神経伝達物質を捕捉するために十分な量の酵素を反応場に保持するためのゲル、すなわち酵素保持用ゲルに関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
生体組織から放出される神経伝達物質量を短時間に、かつ該神経伝達物質の放出細胞を特定しながら測定する方法は、再生組織における組織の状態の判定や、病理検査などに有用である。前願の特願2004-237541、特願2003-116525は、神経組織から放出される神経伝達物質であるガンマアミノ酪酸を溶液中に懸濁させた酵素を用いて捕捉し、その濃度分布を二次元画像としてイメージングする方法に関するものである。原理的にはこの方法で神経組織から放出される神経伝達物質の量を測定することができる。
【０００３】
しかし、特願2004-237541、特願2003-116525においては、測定用サンプルを入れた300μＬの測定用チャンバーに神経伝達物質捕捉用の酵素、グルタミン酸デヒドロゲナーセもしくはGABA分解酵素を添加・攪拌し、その後CCDカメラを用いて光学的にガンマアミノ酪酸量を測定していたが、この方法では時間分解能は1秒から4秒、空間分解能は10μｍ程度にとどまるという不都合があった。またチャンバーの深さが10ｍｍ程度と大きいため横方向への伝達物質の拡散が生じ、本来伝達物質を放出していない部位に酵素反応が現れるという不都合も観察された。さらに酵素が溶液中にあるため、攪拌や取り扱いに技術的習熟を要し、個人差が生じるという難点も生じた。
【０００４】
アルギン酸は海藻から抽出される多糖の一種で、分子中のカルボン酸基がカルシウムイオン等のカチオンとキレートを作ることにより網目状の高分子体を構成する。この分子内にはカルボン酸基を多く含むため、酵素や生体構成物質とのなじみがよく、また多糖の類縁分子で副反応を起こしにくいため、以前から生体反応の反応場を構成する酵素の保持体として利用されてきた。しかし、アルギン酸ゲルは白色不透明のゲルであり、励起光・吸光・発光などの光を測定する系での酵素保持に用いることはできなかった。
【０００５】
また生体組織から放出される神経伝達物質の濃度分布を測定するためには、該神経伝達物質を捕捉するために十分な量の酵素を反応場に保持する必要がある。従来から行なわれている酵素保持法では、高分子含水ゲルが使用されることもあったが、高分子含水ゲルの中に酵素を埋め込むものでは十分な量の酵素を保持することができないなどの不都合があった。このような状況下、十分な量の酵素を保持でき、かつ光学的に透明な酵素保持用ゲルが望まれていた。
【０００６】
【特許文献１】特願2004-237541
【特許文献２】特願2003-116525
【非特許文献１】Cell Physiology 3rd Edition, 2001年、Academic Press, USA,p.209-214
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、生体の神経組織から放出される神経伝達物質を捕捉するのに十分な量の酵素を反応場に保持し、かつ光学的測定に支障をきたさない透明な酵素保持用ゲルを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力し、アルギン酸ゲル作製の過程でアルギン酸ナトリウムとカルシウムとのキレート反応を行う際に、ある種のｐＨ緩衝材の添加によってアルギン酸のカルボン酸基の解離度を調整し、過度の重合反応が起こらないようにすれば、アルギン酸ゲルに期待される酵素保持能力を維持したまま、光散乱度の少ない透明なアルギン酸ゲルが得られることを発見した。本発明はこれらの知見を基に完成されたものである。
【０００９】
すなわち、本発明によれば、生体組織から放出される神経伝達物質を特定の酵素を用いて捕捉し、該神経伝達物質の濃度分布を光学的方法でイメージングする方法において、該酵素を十分な濃度で反応場に保持することができ、かつ光学的測定に支障をきたさない透明なアルギン酸ゲルが提供される。
【００１０】
また本発明の好ましい態様によれば、反応場において、神経伝達物質を捕捉するための酵素を５〜２０units/ｍＬまで保持する光学的に透明なアルギン酸ゲルが提供される。ここでunitは酵素の活性単位を表す。
【００１１】
さらにゲルの光学的透明性に関し、水の光散乱度を1.0とした場合にゲル自身の光散乱度が1.25以下であるような酵素保持用アルギン酸ゲルが本発明により提供される。
【００１２】
また本発明のとくに好ましい態様によれば、アルギン酸ゲルを構成する多価金属がカルシウムである光学的に透明な酵素保持用ゲルが提供される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、神経組織から放出される神経伝達物質を捕捉するに十分な量の酵素が反応場に保持され、かつ光学的測定に支障をきたさない程度に透明な酵素保持用ゲルが提供される。このゲルを用いることにより、生体の神経組織が放出する神経伝達物質の濃度分布を光学的にイメージングする方法における空間分解能ならびに時間分解能が改善される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
「アルギン酸ゲル」とは、アルギン酸の分子中のカルボン酸基と多価金属イオンとがキレート構造を形成してゲル化したものを意味する。アルギン酸は、グロクロン酸（Ｇ）とマンヌロン酸（Ｍ）よりなるブロック共重合体であり、Ｍブロックが有するポケット構造に多価金属カチオンが侵入してエッグボックスを形成し、ゲル化すると考えられている。アルギン酸のゲル化を引き起こしうる多価金属カチオンの具体例としては、バリウム、鉛、銅、ストロンチウム、カドミニウム、カルシウム、亜鉛、ニッケル、コバルト、マンガン、鉄、マグネシウム等の金属イオンを例示でき、これらのうちとくに好ましいものは、カルシウムイオンである。
【００１５】
アルギン酸のゲル化は常法、例えばイオン交換を利用して行なうことができる。具体的には、アルギン酸ナトリウム水溶液にカルシウムイオンを添加すると速やかにイオン交換が生じてアルギン酸ゲルが得られるが、通常、得られるゲルは白色不透明なゲルである。
【００１６】
本発明でいうゲルの透明性とは以下のことをいう。すなわち、落射顕微鏡を用いて特定波長をもつ入射光を試料ゲルに照射する。ゲルの光散乱によって戻ってくる反射光をCCDデジタルカメラに集光し、測定した光強度をa1とする。一方、同様な操作を、水を試料として行い、得られた光強度をa0とした場合のa1/a0の値をもって透明度評価の指標とする。この定義によれば、a1/a0の値が1.0に近ければ透明性がある、1.0より大きくなればその分不透明の度合いが大きいと判断される。また別の観点からは、該透明度評価の指標は、水の光散乱度で正規化したゲルの光散乱度ということができる。透明度評価では試料水としてMilliQ水（生理的超純水）を使用した。
【００１７】
このため、本発明では次のような工夫をする。以下、ゲルの作製手順を記す。
１）アルギン酸ナトリウムを熱浴上で溶解した後、ｐＨ緩衝材、好ましくはHEPESナトリウム（2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonate）を加え、アルギン酸ナトリウムのｐＨを6〜8、好ましくは6.5〜7.5に調整する。アルギン酸ナトリウムの濃度が濃いとゲルは白濁してしまい、薄すぎると酵素が保持できない。ここでのアルギン酸ナトリウムの濃度は、５〜６０ｍｇ/ｍＬ、好ましくは１０〜３０ｍｇ/ｍＬ とする。
２）ｐＨ緩衝材でｐＨを6〜8、好ましくは6.5〜7.5に調整したアルギン酸ナトリウムに0.05〜0.3モル、好ましくは0.1〜0.2モルの塩化カルシウム溶液を加えゲル化する。この際ゲル化に要する時間を5〜30秒とし、生成したアルギン酸ゲルをすくって純水中で洗う。
【００１８】
このような操作をすることにより、アルギン酸ゲルの不透明化が抑制される。具体的には、水の光散乱度を1.0とした場合に、光散乱度が1.25以下であるような光学的透明性のある酵素保持用アルギン酸ゲルが得られる。またｐＨ緩衝材、好ましくはHEPESナトリウムで調整したアルギン酸ゲル中には、神経伝達物質の反応場を提供する酵素であるところのグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、あるいはGABA分解酵素を光学的測定に十分な量保持できる。具体的には、本発明の方法で生成したアルギン酸ゲルは5〜100ｍｇ/ｍＬの該酵素を保持できる。
【００１９】
本発明は、生体の神経組織から放出される神経伝達物質、例えばガンマアミノ酪酸を、特定の酵素を用いて捕捉し、当該神経伝達物質の濃度分布を光学的にイメージングする方法に関する。本発明により光学的に透明なゲルで酵素を保持できるようになったことで以下の１）〜３）の改善がなされた。
１）特願2004-237541、特願2003-116525で例示されている溶液中に酵素を添加して行なう測定系と比較し、反応場として使われる空間が10ｍｍ（反応チャンバーの深さ）から1ｍｍ（ゲルの厚み）に圧縮された。
２）反応空間の圧縮に伴い、時間分解能が4秒から50ミリ秒に向上した。
３）さらに空間分解能が10μｍから1μｍに向上した。
【００２０】
生体内で神経伝達物質の測定に必要と考えられる最低限の空間分解能及び時間分解能は、それぞれ5μｍ及び100ミリ秒であるといわれる（非特許文献１）。本発明で得られる光学的に透明なゲルに酵素を保持することで、放出細胞を特定しながら神経伝達物質の放出量を測定するのに必要な条件を満たしたものと考えられる。
【００２１】
神経伝達物質の濃度分布を光学的にイメージングする方法において、酵素のゲルによる保持は欠かせない簡素化技術であるが、ゲル自身が励起光または発蛍光を吸収したり、別種の発光を行ったりしては光学的イメージングは困難になる。本発明に基づく保持体ゲルの透明化により、神経伝達物質の濃度分布を光学的にイメージングする方法が簡素化され、再生組織における組織の状態の判定や、病理検査などにおける医用工学デバイスとして実用化されることが期待できる。
【実施例１】
【００２２】
以下の手順でアルギン酸ゲルを作成した。
１）    50mＬビーカーに0.1Ｍ-ＣａＣｌ２を30mＬ入れ、氷水中に静置する。更にｐH緩衝材であるHEPESナトリウムを60mｇとり、これを10mＬのMilliQ水に溶解し、分注しておく。
２）    10mＬビーカーにMilliQ水を４ｍＬ入れ、沸騰直前まで加熱する。この液にアルギン酸ナトリウム25mｇを液面に均一に添加し、アルギン酸ナトリウムが透明になるまで、およそ5分間静置する。マイクロスパチュラのへら部を使って泡立たないように丁寧に撹拌し、氷水上で冷却する。氷で冷やしたアルギン酸溶液に酵素、グルタミン酸デヒドロゲナーセもしくはGABA分解酵素（200unit/mＬ）と補酵素、NADもしくはNADHを300μＬ(濃度は2ミリモル)、HEPESナトリウム溶液を1mＬ加え、再度マイクロスパチュラのへら部にてゆっくり撹拌する。
３）    ２）で作った混合液1000μＬを、１）で作った0.1Ｍ-ＣａＣｌ２溶液に滴下する。生成したゲルビーズを金網ですくい、MilliQ水にて素早く洗う。
【００２３】
以上の操作で得られた透明性のあるアルギン酸ゲルを図1に示す。引き続き生体組織から放出された神経伝達物質の分析に該ゲルを使用する際には以下の手順に従う。
４）    得られたゲルをガラス板に乗せ、もう1枚のガラス板にて徐々に押しつぶし、シート状にする（図4参照）。
５）    生体組織サンプルを専用チャンバーに乗せ、これに上記ゲルシートを乗せて測定を行う（図5参照）。
【実施例２】
【００２４】
以下の手順でアルギン酸ゲルを作成した。
１）      50mＬビーカーに0.1Ｍ-ＣａＣｌ２を30mＬ入れ、氷水中に静置する。
２）      10mＬビーカーにMilliQ水を４ ｍＬを入れ、沸騰直前まで加熱する。この液にアルギン酸ナトリウム25mgを液面に均一に添加し、アルギン酸ナトリウムが透明になるまで、およそ5分間静置する。マイクロスパチュラのへら部を使って泡立たないように丁寧に撹拌し、氷水上で冷却する。氷で冷やしたアルギン酸溶液に酵素、グルタミン酸デヒドロゲナーセもしくはGABA分解酵素（200unit/mＬ）と補酵素、NADもしくはNADHを300μＬ(濃度は2ミリモル)加え、再度マイクロスパチュラのへら部にてゆっくり撹拌する。
３）      ２）で作った混合液を1000μＬ、１）で作った0.1Ｍ-ＣａＣｌ２溶液に滴下する。生成したゲルビーズを金網ですくい、MilliQ水にて素早く洗う。
【００２５】
以上の操作で得られたアルギン酸ゲルを図2に示す。HEPESナトリウム溶液によるｐＨ調整を行なわないこの操作で得られたゲルは白濁しており、光学的測定に使うことはできない。
【実施例３】
【００２６】
アルギン酸ナトリウムを過剰に添加してゲルを作製した手順を以下に示す。
１） 50mＬビーカーに0.1Ｍ-CａCｌ２を30mＬ入れ、氷水中に静置する。更にｐH緩衝材であるHEPESナトリウムを60ｍｇとり、これを10mＬのMilliQ水に溶解し、分注しておく。
２） 10mＬビーカーにMilliQ水4mＬを入れ、沸騰直前まで加熱する。この液にアルギン酸ナトリウム100mgを液面に均一に添加し、アルギン酸ナトリウムが透明になるまで、およそ5分間静置する。マイクロスパチュラのへら部を使って泡立たないように丁寧に撹拌し、氷水上で冷却する。
３） よく冷えたアルギン酸溶液に酵素(GDHもしくはGABAse)をstock-solution260μＬ（200unit/mＬ）と補酵素(NADもしくはNADH)を300μＬ(終濃度2mM)、HEPES-Na溶液を1mＬ加え、再度マイクロスパチュラのへら部にてゆっくり撹拌する。
４）３）で作った混合液1000μＬを、１）で作った0.1Ｍ-ＣａＣｌ２溶液に滴下する。生成したゲルビーズを金網ですくい、MilliQ水にて素早く洗う。
【００２７】
実施例１、実施例２、実施例３で作製したゲル及び水の光散乱度を測定した結果を図３に示す。図３の結果は、本発明のアルギン酸ゲルと水とがほぼ同等な光学的透明度を有することを示す。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】透明なゲルの写真
【図２】白濁した状態のゲルの写真
【図３】作製したゲルの透明度の違いを示す図
【図４】実施例１  手順４）説明図
【図５】実施例１  手順５）説明図
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１】
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【図２】
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