(57)【要約】【課題】感作性物質の新規な評価方法の提供。【解決手段】本発明は、ヒト単核球細胞と、ヒト肝Ｓ９ミックスと、感作性を有すると予想される被験物質とを一緒にインキュベートし、該ヒト単核球細胞の表面に発現されたＣＤ８６分子を検出することを特徴とする感作性物質のインビトロ評価方法又はスクリーニング方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト単核球細胞と、ヒト肝Ｓ９ミックス（薬物代謝酵素系）と、感作性を有すると予想される被験物質とを一緒にインキュベートし、該ヒト単核球細胞の表面に発現されたＣＤ８６分子を検出することを特徴とする感作性物質のインビトロ評価方法又はスクリーニング方法。
【請求項２】
前記ヒト単核球細胞がＴＨＰ−１細胞である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感作性物質のインビトロ評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体においてアレルギー等を誘発する物質（感作性物質）を評価する方法としては、実験動物に被験物質を適用し、そして該実験動物の皮膚などに生ずる反応を視察する方法が行われている。しかしながら、この方法は動物愛護等の見地から見直しがせまられている。
【０００３】
外来物質によりアレルギー反応が惹起される最初の段階では、感作性物質が抗原提示細胞を刺激し、活性化して、該細胞表面に、プロセシングされた抗原を担持したＭＨＣクラスIIタンパク質や、ＣＤ８６分子が発現される。このような抗原提示細胞としては樹状細胞やヒト単核球細胞が知られている。しかしながら、樹状細胞の性質には個人差があり、また再現性に問題があり、一定の特性を有する樹状細胞を安定的に入手することが困難である。また樹状細胞はその調製に困難さが伴う。
【０００４】
ヒト単核球細胞、特にＴＨＰ−１細胞の取扱いは比較的容易であり、感作性物質を作用させた場合、該細胞表面に感作性物質の量や特性を反映してＣＤ８６分子が発現されることが明らかとなっている。特開特開２００１−２２１７９６号公報はＣＤ８６の発現を指標とする感作性物質のインビトロ評価方法を開示する。しかしながら、感作性物質によってはヒト単核球細胞に作用させてもその細胞の代謝系に起因してＣＤ８６の発現の亢進が判定できない場合、即ち偽陰性結果が示される場合もあり、ＣＤ８６の発現を指標とするインビトロ評価方法による判定結果は、インビボ評価法の結果と必ずしも一致しない場合がある。
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−２２１７９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ヒト単核球細胞、特にＴＨＰ−１細胞を用いて感作性物質をインビトロで評価する方法であって、インビトロにおける感作性物質評価方法の精度をさらに向上させる手段を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の目的を達成するため、種々検討した結果、ヒト単核球細胞にヒト肝Ｓ９ミックス（薬物代謝酵素系）を添加し、感作性物質を作用させた場合、ヒト肝Ｓ９ミックス不在下の場合に比べてさらに向上した精度をもって、該細胞の表面に感作性物質の量や特性を反映してＣＤ８６分子が発現されることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明に従い、本来感作性物質であるにもかかわらず、ヒト単核球細胞上でのＣＤ８６発現を指標とする方法ではその感作性が同定されなかった物質も、ヒト肝Ｓ９ミックスをその反応系に添加することで、その感作性が同定され、これにより感作性物質の偽陰性結果を回避することが可能となる。
【０００８】
従って、本発明は、ヒト単核球細胞と、ヒト肝Ｓ９ミックスと、感作性を有すると予想される被験物質とを一緒にインキュベートし、該ヒト単核球細胞の表面に発現されたＣＤ８６物質を検出することを特徴とする、感作性物質のインビトロ評価方法、又はスクリーニング方法を提供する。好ましくは、ヒト単核球細胞はＴＨＰ−１細胞である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、インビトロによる感作性物質評価方法の精度を一層向上させることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明において用いるヒト単核球細胞としては、感作性物質の特性を反映してその表面にＣＤ８６物質を発現するものであれば特に限定されないが、具体例としてＴＨＰ−１細胞やＵ−９３７細胞などが挙げられる。特に好ましくはＴＨＰ−１細胞である。これらの細胞は樹立された培養細胞であって、当業界の研究者により広く用いられており、容易に入手することができる。具体的には、ＴＨＰ−１細胞やＵ−９３７細胞は、公的な細胞バンク又は民間企業より入手することができる。
【００１１】
ヒト肝Ｓ９ミックスはヒトの肝臓ホモジネートの９，０００×ｇ遠心後の上清液であるヒト肝組織画分（ヒト肝Ｓ９）に補酵素ＮＡＤＰ（β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸ナトリウム、酸化型）を添加することで調製できる。ヒト肝Ｓ９は市販されており、例えばＧｅｎｔｅｓｔ社よりプールドヒト肝Ｓ９として入手できる。
【００１２】
ヒト肝Ｓ９ミックスの使用量は特に制限されるものではないが、好ましくは本発明の評価方法又はスクリーニング方法における反応系1000μｌ当たり、ヒト肝Ｓ９（タンパク質濃度20mg/mlとして）は約10〜100μｌ、より好ましくは約25〜75μｌ、ＮＡＤＰは100〜1000μｇ、より好ましくは50〜750μｇの量で使用する。
【００１３】
本発明のヒト単核球細胞を培養するための培地としては、これらの細胞を培養することができる常用の任意の培地を使用することができるが、例えば具体例としてＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地、ダルベッコ改変イーグル培地等が挙げられる。
【００１４】
感作性物質の評価又はスクリーニングにおいては、培地中の上記ヒト単核球細胞に被験物質を加え、さらにヒト肝Ｓ９ミックスを加えてから、例えば炭酸ガスインキュベーター中で、約３７℃にて２４〜４８時間培養（インキュベーション）を行う。ヒト単核球細胞の初期濃度は１×１０5 〜５×１０5 細胞／mlが好ましい。この場合、被験物質を加えないで、上記の同様の培養を行い、対照とする。
【００１５】
培養（インキュベーション）が終了した後、培養したヒト単核球細胞の表面に発現されたＣＤ８６分子を検出又は測定する。ＣＤ８６の検出又は測定方法は特に限定されないが、抗ヒトＣＤ８６抗体を用いた免疫測定が好ましく、フローサイトメトリー法が特に好ましい。抗ヒトＣＤ８６抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよく、ＣＤ８６を表面に発現している細胞を免疫原として用いて常法に従って調製することができる。フローサイトメトリー法も常法に従って行うことができる。
【実施例】
【００１６】
次に実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
【００１７】
材料
・細胞：ＴＨＰ−１（大日本製薬（株）より購入）
・ヒト肝Ｓ９ミックス：下記の組成で使用した（1000μｌ当たり）
グルコース６リン酸（180 mg/ml）                              40 μｌ
ＮＡＤＰ（55.3 mg/ml）                                       40 μｌ
ヒト肝Ｓ９（Gentest社）（タンパク質濃度20mg/ml)             250 μｌ
10％ＦＢＳ（JRH biosciences社）含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Invitrogen社）
670 μｌ
・ラット肝Ｓ９ミックス：下記の組成で使用した（1000μｌ当たり）
グルコース６リン酸（180mg/ml）                               40 μl
ＮＡＤＰ（55.3mg/ml）                                        40 μl
ラット肝Ｓ９（キッコーマン社）（タンパク質濃度25mg/ml)      200 μｌ
10％ＦＢＳ（JRH biosciences社）含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Invitrogen社）
720 μｌ
【００１８】
・被験物質：感作性物質として一般に周知されている下記の化合物を使用した
イソオイゲノール（和光純薬工業（株））
シンナミルアルコール（和光純薬工業（株））
オイゲノール（東京化成工業（株））
キニザリン（関東化学（株））
４−アミノ安息香酸エチル（東京化成工業（株））
ハイドロキノンモノベンジルエーテル（東京化成工業（株））
スチレン（関東化学（株））
エチレンジアミン（和光純薬工業（株））
ｐ−ジメチルアミノアゾベンゼン（和光純薬工業（株））
アントラセン（和光純薬工業（株））
ファルネソール（和光純薬工業（株））
ｍ−アミノフェノール（和光純薬工業（株））
アクリル酸２−ヒドロキシエチル（和光純薬工業（株））
ε−カプロラクタム（和光純薬工業（株））
４−メチルカテコール（東京化成工業（株））
ベンジルペニシリンカリウム（和光純薬工業（株））
サリチル酸ベンジル（東京化成工業（株））
没食子酸プロピル（和光純薬工業（株））
ヒドロコルチゾン（和光純薬工業（株））
アネトール（和光純薬工業（株））
キノリン（和光純薬工業（株））
バニリン（和光純薬工業（株））
【００１９】
方法
ＣＤ８６発現法のための濃度設定試験
96穴プレートを用い、96穴プレート上で被験物質溶液の公比２希釈系列（各50μｌ/ウェル、反応系における被験物質の最終濃度は3.91から1000μg/ml）を50μｌ調製した。代謝活性化系では肝Ｓ９ミックスを25μｌ、非代謝活性化系では培地含有30mM塩化カリウム溶液を25μｌ添加後、４×106個/mlに調製した細胞浮遊液を25μｌ加えた。反応系の容量は100μｌとし、５％炭酸ガスインキュベーターで21時間培養後、1.67mg/ml MTT（3-(4,5-ジメチル-2-チアゾリル)-2,5-ジフェニル-2H-テトラゾリウムブロミド）溶液を25μｌ加え、再び５％炭酸ガスインキュベーターで３時間培養した。色素抽出液（0.04N塩酸を含むイソプロパノール溶液）175μｌを加え、660nmにおける波長での吸光度を対照として570nmにおける波長での吸光度を測定し、生存率を求め、被験物質を含まない陰性対照ウェルの生存率を100%として50%生育阻害濃度（IC50）値を算出した。
【００２０】
ＣＤ８６発現の検討法
24穴プレートを用いた。目的の濃度に調製した被験物質を１濃度につき0.5 mlずつ２ウェル（ＣＤ８６抗体処理用とＩｇＧ処理用）に分注した。各ウェルに代謝活性化系では肝Ｓ９ミックス250μｌ、非代謝活性化系では緩衝液を250μｌ添加後、４×106個/mlに調製した細胞浮遊液を250μｌ加えた。反応系における被験物質の最終濃度はIC50値の２倍，１倍、0.5倍、0.1倍の濃度とした。５％炭酸ガスインキュベーターで24時間培養後、細胞をＦＩＴＣ標識ＣＤ８６抗体処理またはＦＩＴＣ標識ＩｇＧ処理し、プロピジウムヨージドを添加してフローサイトメーターにて、細胞生存率、生存細胞10000個における平均ＦＩＴＣ強度を測定した。
被験物質処理群の細胞生存率およびＣＤ８６発現量は、被験物質無処理群を100％としたときの相対比で算出した。
【数１】
2007163356.tif 000002
【００２１】
評価
細胞生存率が50％以上で、ＣＤ８６発現が150％以上の場合を陽性とし、被験物質が感作性を有するものとみなした。
【００２２】
結果
図１は各種感作性物質についての、肝Ｓ９ミックス不在下におけるＴＨＰ−１細胞によるＣＤ８６発現の検討結果を示す。試験した22種の感作性物質のうち、シンナミアルコール、キニザリン、ハイドロキノンモノベンジルエーテル、エチレンジアミン、ファルネソール、ｍ−アミノフェノール、アクリル酸２−ヒドロキシエチル、ε−カプロラクタム、４−メチルカテコール、ベンジルペニシリンカリウムの10種のみ陽性の結果が示され、その他の感作性物質については偽陰性の結果が示された。
【００２３】
図２は各種感作性物質についての、ラット肝Ｓ９ミックス存在下におけるＴＨＰ−１細胞によるＣＤ８６発現の検討結果を示す。Ｓ９ミックス不在下におけるＴＨＰ−１細胞によるＣＤ８６発現で偽陰性結果を示した感作性物質は、この試験でも同様に偽陰性の結果を示した。
【００２４】
図３は各種感作性物質についての、ヒト肝Ｓ９ミックス存在下におけるＴＨＰ−１細胞によるＣＤ８６発現の検討結果を示す。この試験により、Ｓ９ミックス不在下又はラット肝Ｓ９存在下で偽陰性結果を示した感作性物質のうち、イソオイゲノール、オイゲノール、キノリン、バニリン、ヒドロコルチゾール、アネトールについて、陽性の結果が示された。
従って、ヒト肝Ｓ９ミックスを反応系に添加することで、ヒト単核球細胞上でのＣＤ８６の発現を指標とするインビトロ評価方法の精度をさらに高めることができることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】各種感作性物質の、肝Ｓ９ミックス不在下でのＴＨＰ−１細胞上でのＣＤ８６発現に対する影響を示す。
【図２】各種感作性物質の、ラット肝Ｓ９ミックス存在下でのＴＨＰ−１細胞上でのＣＤ８６発現に対する影響を示す。
【図３】各種感作性物質の、ヒト肝Ｓ９ミックス存在下でのＴＨＰ−１細胞上でのＣＤ８６発現に対する影響を示す。
【図１】
2007163356.tif 000003
【図２】
2007163356.tif 000004
【図３】
2007163356.tif 000005