(57)【要約】【課題】本発明は、特に喘息患者の病態を、的確かつ客観的に把握することができ、最適時に吸引入ステロイド剤などによる介入を行い、最適時に介入を中止することができ、気管支喘息の治療効率を格段にあげることを目的とする。【解決手段】上記目的を達成するために、本発明は、被検試料中のサイトカイン（ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＦＮ−γ等）、またはケモカイン、もしくはその両方の存在量を計ることによって、被検試料由来の疾患の病態を検査する方法、および、その方法に基づき、被検試料中のサイトカインの存在を計る確認手段と、被検試料の設置手段と、被検試料からかかる確認手段にアクセスする手段と、を含む疾患の病態を検査するための検査キットを提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル設置部と、サンプルのサイトカインを検出する検出部とを有する疾患の病態を検査するための検査キットにおいて、
前記サンプル設置部には、被検試料として喀痰が配置され、
前記検出部には、サイトカイン濃度の上昇あるいは下降を検出し、
検出したこれらのサイトカイン濃度を判別することにより、
喘息発作の開始あるいは収束時の判定を行うことが可能な検査キット。
【請求項２】
前記検出部で検出するサイトカインには、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＦＮ−γのいずれか、あるいは全てを含むことを特徴とする請求項１に記載の検査キット。
【請求項３】
前記喘息発作の開始を判定する検査キットにおいて、前記検出部で検出するサイトカインには、ＩＬ−５、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γであることを特徴とする請求項２に記載の検査キット。
【請求項４】
前記喘息発作の収束を判定する検査キットにおいて、前記検出部で検出するサイトカインには、ＩＬ−５、ＩＬ−８およびＩＬ−１０であることを特徴とする請求項２に記載の検査キット。
【請求項５】
前記喘息発作の開始を判定する検査キットにおいて、前記検出部で検出するサイトカインには、ＩＬ−５、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γであり、前記喘息発作の収束を判定する検査キットにおいて、前記検出部で検出するサイトカインには、ＩＬ−５、ＩＬ−８およびＩＬ−１０であって、当該喘息発作の開始を判定する検査キットと喘息発作の収束を判定する検査キットは、物理的に一つの形状として構成されていることを特徴とする請求項２に記載の検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、喀痰、鼻汁、血清、脳脊髄液等の被検試料中のサイトカインまたはケモカインもしくはその両方の存在量を測定することにより、疾患を検査する検査キットおよび検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
気管支喘息は、気管支の慢性的な炎症が原因となって、発作的に呼吸困難を繰り返す疾患であり、好酸球が重要な役割を果たしていることが知られている。現代病の一つとされている気管支喘息患者は、幼児から成人まで幅広く分布しており、近年増加傾向にある。日本では約１５０万人の患者がおり、毎年６千人が喘息発作で死亡している。
【０００３】
現在、気管支喘息の治療に関しては、根本的な治療はなく、対症療法的な薬物療法によって病状がコントロールされている。特に噴霧式の吸入ステロイド剤は、病状の改善に非常に効果的であり多用されている。しかし、ステロイド剤は、多彩な副作用を引き起こすことが知られており、その使用は最小限にとどめるべきである。その使用にあたっては、喘息発作を的確に予知できれば発作発症前から使用する（介入）ことにより、発作を未然に防ぐことできる。
【０００４】
また、一度吸入ステロイド剤を使用した場合でも、患者の病態を的確に見極め、できるだけ早期に使用を中止することが、喘息の的確なコントロールとなる。しかし、現状では、気管支喘息の発作を的確に予知することはもちろん、発作を起こしている患者の病態がどの段階にあるかを、的確に見極めることも困難である。これらの背景技術を説明するものとして、非特許文献等１乃至５及び特許文献１がある。
【０００５】
すなわち、上述の背景から、気管支喘息の治療にあたって、もし病態を的確にかつ客観的に把握することができれば、最適時に吸入ステロイド剤による介入を行い、最適時に介入を中止することができ、気管支喘息の治療を格段にあげることができる。
【非特許文献１】Ｔｏｃｋｍａｎ，Ｍ．Ｓ，Ｑiａｏ，Ｙ．，Ｌi，Ｌ．，Ｚｈａｏ，Ｇ．Ｚ．Ｓｈａｒｍａ，Ｒ．，Ｃａｖｅｎａｕｇｈ，Ｌ．Ｌ．，Ｅｒｏｚａｎ，Ｙ．Ｓ．Ｓａｆｅ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｕｔｕｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｕｃｏiｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅiｎ．Ａｃｔａ  Ｃｙｔｏｌ．３９：１１２８−１１３６，１９９５．
【非特許文献２】Ｓiｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｇiｂｓｏｎ，Ｐ．Ｇ．Ｗａｒｋ，Ｐ．Ａ．Ｏｐｔiｍiｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｕｔｕｍ−ｐｒｏｃｅｓｓiｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  iｎｔｅｒｌｅｕｋiｎ−５：ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  iｎｈiｂiｔiｏｎ．  Ｒｅｓｐiｒｏｌｏｇｙ  ７−１１１−１１６，２００２
【非特許文献３】Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ  Ｏｒｔｅｇａ，Ｄ．Ｊ．，Ｌｅｏｎ，Ｆ．，ＭａｒｔｉｎｅｚＡｌｏｎｓｏ，Ｊ．Ｃ．，Ａｌｏｎｏｓ  Ｌｌａｍａｚａｒｅｓ，Ａ. Ｒｏｌｄａｎ，Ｅ., Ｒｏｂｌｅｄｏ，Ｔ., Ｍｅｓａ，Ｍ., Ｂｏｏｔｅｌｌｏ，Ａ，Ｍａｒｔiｎｅｚ−Ｃｏｃｅｒａ，Ｃ  Ｆｌｕｏｒｃｙｔｏｍｅｔｒiｃ  ａｎａｌｙｓiｓ  ｏｆ  iｎｄｕｃｅｄ  ｓｐｕｔｕｍ  ｃｅｌｌｓ  iｎ  ａｎ  ａｓｔｈｍａｔiｃ  ｐｏｐｕｌａｔiｏｎ．Ｊ．Iｎｖｅｓｔ．Ａｌｌｅｒｇｏｌ．  Ｃｌiｎ．  Iｍｍｕｎｏｌ．１４：１０８−１１３，２００４．
【非特許文献４】Ｂｅiｅｒ，Ｊ，Ｂｅｅｈ，Ｋ，Ｍ，Ｋｏｒｍａｎｎ，Ｏ．Ｂｕｈｌ，Ｒ．Iｎｄｕｃｅｄ  ｓｐｕｔｕｍ  ｍｅｔｔｈｏｄｏｌｏｇｙ：Ｖａｌiｄiｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｐｒｏｄｕｃiｂiｌiｔｙ  ｏｆ  ｔｏｔａｌ  ｇｌｕｔａｔｈiｏｎｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  iｎ  ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ  ｏｆ  ｈｅａｌｔｈｙ  ａｎｄ  ａｓｔｈｍａｔiｃ  iｎｄiｖiｄｕａｌｓ．Ｊ．Ｌａｂ  Ｃｌiｎ．Ｍｅｄ．１４４：３８−４４，２００４．
【非特許文献５】Ｇｅｒｓｈｍａｎ，Ｎ．Ｈ．Ｗｏｎｇ，Ｈ．Ｈ．Ｌiｕ，Ｊ．Ｔ．Ｍａｈｌｍｅｓｔｅｒ，Ｍ．Ｊ．Ｆａｈｙ，Ｊ．Ｖ．Ｃｏｍｐａｒiｓｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｃｏｌｌｅｃｔiｎｇ  iｎｄｕｃｅｄ  ｓｐｕｔｕｍ  iｎ  ａｓｔｈｍａｔiｃ  ｐａｔiｅｎｔｓ．Ｅｕｒ．Ｒｅsｐiｒ．Ｊ．９：２４３５−２４３６，１９９６
【特許文献１】国際公開第０１／０５３８３２号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、実際の診療上、その病態は、臨床病状、ピークフロー値（換気能）等から推測されている。これだけでは、気管支喘息の病態病状を的確に判断することは困難であり、より客観的に簡便に病態病状を判断できる方法の開発が望まれている。すなわち、気管支喘息の治療において、治療の早期介入のために指標となる、また介入を終了するための指標となる診断法の確立が重要である。
【０００７】
実際に、成人気管支喘息患者では、気管支肺胞洗浄を行い、洗浄液中の細胞分画などを検討することによって、喘息の病態病状を推定して、治療方法を立てることも試みられてきている。しかし、気管支肺胞洗浄は、患者に多大の侵襲を与える。気管支喘息患者から誘発痰を採取することは比較的簡単であり、侵襲も少ない。
【０００８】
また、近年、小児気管支喘息患児の喀痰中の好酸球を指標に、喘息発作をコントロールする試みが報告されており、重症化する患者や入院を必要とする患者を減少させられたとの結果が出されている。上述の特許文献１では、被検試料（喀痰でない）中のＥ−カドへリン分解物の存在量に基づく、気管支喘息発作の検査方法が開示されている。
【０００９】
本発明は、以上の問題を鑑み、喘息において、ある特定のサイトカインまたはケモカインもしくはその両方の変化が、喘息の発作予測あるいは発作収束に関与していることを見出し、それらのサイトカイン等の変化から、喘息の病態を把握する方法と、その方法に基づいたこれらのサイトカイン等に対する抗体を組み込んだ喘息の発症と、病態を診断するキットに関する。
【００１０】
具体的には、本発明は、喘息患者からの被検試料中のサイトカイン、またはケモカイン、もしくはその両方の存在量を計ることによって、被検試料由来の疾患の病態を検査する方法、および、その方法に基づき、被検試料中のサイトカインの存在を計る確認手段と、被検試料の設置手段と、被検試料からかかる確認手段にアクセスする手段と、を含む疾患の病態を検査するための検査キットを提案するものである。
【００１１】
これにより、本発明は、特に喘息患者の病態を、的確かつ客観的に把握することができ、最適時に吸入ステロイド剤などによる介入を行い、最適時に介入を中止することができ、気管支喘息の治療効率を格段にあげるための方法およびキットの提供を行うことができる。
【００１２】
そして、この目的を達成するために、本発明は、被検試料中のサイトカイン（ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＦＮ−γ等）、またはケモカイン、もしくはその両方の存在量を計ることによって、被検試料由来の疾患の病態を検査する方法、および、その方法に基づき、被検試料中のサイトカインの存在を計る確認手段と、被検試料の設置手段と、被検試料からかかる確認手段にアクセスする手段と、を含む疾患の病態を検査するための検査キットを提供するものである。
【００１３】
すなわち、本発明は、喘息発作の予知の良い指標として、ＩＬ−５およびＴＮＦ−αの上昇と、それに加え、ＩＦＮ−γの上昇があれば、喘息発作を予知する。
【００１４】
その一方で、喘息発作の収束の良い指標として、ＩＬ−５、ＩＬ−８およびＩＬ−１０の下降があれば、喘息発作の収束を予知する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本願における検査キットの解決手段として代表的な発明は、サンプル設置部と、サンプルのサイトカインを検出する検出部とを有する疾患の病態を検査するための検査キットにおいて、サンプル設置部には、被検試料として喀痰が配置され、検出部には、サイトカイン濃度の上昇あるいは下降を検出し、検出したこれらのサイトカイン濃度を判別することにより、喘息発作の開始あるいは収束時の判定を行うことが可能な検査キットである。
【００１６】
検出部で検出するサイトカインには、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＦＮ−γのいずれか、あるいは全てを含むことを特徴としてもよい。
【００１７】
喘息発作の開始を判定する検査キットにおいて、検出部で検出するサイトカインには、ＩＬ−５、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γであることを特徴としてもよい。
【００１８】
喘息発作の収束を判定する検査キットにおいて、検出部で検出するサイトカインには、ＩＬ−５、ＩＬ−８およびＩＬ−１０であることを特徴としてもよい。
【００１９】
喘息発作の開始を判定する検査キットにおいて、検出部で検出するサイトカインには、ＩＬ−５、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γであり、喘息発作の収束を判定する検査キットにおいて、検出部で検出するサイトカインには、ＩＬ−５、ＩＬ−８およびＩＬ−１０であって、当該喘息発作の開始を判定する検査キットと喘息発作の収束を判定する検査キットは、物理的に一つの形状として構成されていることを特徴としてもよい。
【発明の効果】
【００２０】
気管支喘息の治療効率を格段にあげることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下に、本発明の内容を説明する。本発明者らは、喀痰中ＩＬ−β、ＩＦＮ−γは、喘息非発作時とともに喘息発作時にも上昇していたことと、特に喘息非発作時には上昇せず、喘息発作時に特異的に上昇する喀痰中のサイトカインは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、ＩＬ−６であったことと、非発作時で後に発作症状を起こした症例では、喀痰中ではＩＬ−５、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γが上昇していたことと、この内喀痰中ＴＮＦ−γ濃度は、発作をすぐに生じない非発作時、疾患コントロールでも上昇しているが、発作を起こす直前でより上昇することを確認した。
【００２２】
すなわち、本発明者らは、気管支喘息発作に伴って、喀痰中ＴＮＦ−α、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０濃度が上昇することから、これらの喀痰中サイトカイン濃度の上昇および下降は、喘息発作発症の予測、発作収束の予測の指標にできる可能性を有していることを見出した。具体的に、以下に各分布グラフを用いて説明する。
【００２３】
なお、本実施の形態では、小児喘息患者の誘発痰中の細胞を分離する方法を検討し、この誘発痰中の細胞分画を精査することにより、喘息の症状・病態に関与する細胞について解析を進めた。その背景の下で、簡便かつ迅速に誘発痰中のサイトカイン等を測定し、喘息の病態を決定する方法を開発すると共に、その有用性を本実施の形態では検証した。
【００２４】
本実施の形態では、小児気管支喘息患者の誘発痰を分画し、細胞成分と細胞成分以外の分画に分け、細胞分画の解析とともに細胞除去分画のサイトカイン、ケモカイン濃度を測定し、喘息の病態病状との関連性についても検討した。種々病態病状にある気管支喘息患者から誘発喀痰を採取し、その喀痰中のＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１β、ＩＦＮ−γの濃度を測定した。
【００２５】
まず、対象は、気管支喘息で通院中または入院中の患者で、気道過敏性検査を行った患者である。気道過敏性検査は、アセチルコリン、ヒスタミン吸入闘値ＰＣ２０、運動誘発試験の３種を行った。気管支喘息患者３５例の内、喘息非発作時３５検体と発作時１９検体、１０例の発作直前の１０検体を対象とした。コントロールとして、アレルギー疾患の既往のない健康児７名、症例コントロールとして、健康児でウイルスあるいは細菌による上気道感染症例９名を対象とした。
【００２６】
次に、喀痰は、鼻かみ、うがいの後、４．５％生理食塩水を加えた後に、超音波ネブライザーで噴霧吸入した後に採取され、その喀痰量と同量の０．１％Ｄiｔｈｏｔｈｒｅiｔｏｌを加え、１５分処理後、濾過遠心した。
【００２７】
さらに、サイトカイン、ケモカインの測定は、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄickinson社製のＣＢＡキット（Ｃｙｔｏｍｅｔｒic  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ）を用いて、喀痰中のＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１β、ＩＦＮ−γの濃度を測定した。
【００２８】
結果は、図１乃至図１０の通りになった。図１は、気管支喘息発作、非発作時における喀痰中検出されたＴＮＦ−αの量の分布グラフである。これによれば、ＴＮＦ−αは、喘息発作時に上昇する例が多いが、上気道感染症でも一部ＴＮＦ−αが上昇する。そして、気管支喘息発作、非発作時における喀痰中ＴＮＦ−αについては、図１に示すように、健康な人では喀痰中に、ＴＮＦ−αは検出されないが、症例コントロール（上気道感染症）では、９例中３例で上昇していた。一方、喘息非発作群（３５例）では、すべての例でＴＮＦ−αは検出されなかった。これに対して、喘息発作群では、１９例中１３例でＴＮＦ−αが上昇していた。すなわち、ＴＮＦ−αは、喘息発作時に上昇する例が多いが、上気道感染症でも一部ＴＮＦ−αが上昇する。
【００２９】
図２は、気管支喘息発作、非発作時における喀痰中検出されたＩＬ−５の量の分布グラフである。これによれば、ＩＬ−５は、喘息発作時に特徴的に上昇すると言える。
【００３０】
すなわち、気管支喘息発作、非発作時における喀痰中ＩＬ−５については、図２のごとく、ＩＬ−５は健常者、症例コントロールではまったく上昇せず、喘息非発作群では、３５例中２例で上昇していた。発作群では、１９例中１５例で上昇していた。すなわちＩＬ−５は、喘息発作時に特徴的に上昇すると言える。しかしながら、非発作群でも、ごく一部の症例でＩＬ−５が上昇している例が見られる。
【００３１】
図３は、気管支喘息発作、非発作時における喀痰中検出されたＩＬ−６の量の分布グラフである。これによれば、ＩＬ−６は、喘息発作時に特徴的に上昇すると言える。
【００３２】
すなわち、気管支喘息発作、非発作時における喀痰中ＩＬ−６については、図３のごとく、ＩＬ−６は健常者ではまったく上昇せず、症例コントロールでは１例のみ上昇していた。喘息非発作群では、３５例中５例で極わずか上昇していた。発作群では１９例中１７例で上昇していた。すなわちＩＬ−６は喘息発作時に特徴的に上昇すると言える。しかしながら、非発作群でも極一部の症例でＩＬ−６がわずかに上昇している例が見られる。
【００３３】
図４は、気管支喘息発作、非発作時における喀痰中検出されたＩＬ−８の量の分布グラフである。これによれば、ＩＬ−８は、喘息発作時に特徴的に上昇すると言える。
【００３４】
すなわち、気管支喘息発作、非発作時における喀痰中ＩＬ−８については、図４のごとく、ＩＬ−８は健常者では、まったく上昇せず、症例コントロールでは２例が上昇していた。喘息非発作群では、３５例中６例で上昇していた。発作群では、１９例中１５例で上昇していた。すなわち、ＩＬ−８は、喘息発作時に特徴的に上昇すると言える。しかしながら、非発作群でも極一部の症例で、ＩＬ−８が上昇している例が見られる。
【００３５】
図５は、気管支喘息発作、非発作時における喀痰中検出されたＩＬ−１０の量の分布グラフである。ＩＬ−１０は、喘息発作時に上昇すると言え、ＩＬ−１０上昇の認められない非発作群と対比をなすと考えられる。
【００３６】
すなわち、気管支喘息発作、非発作時における喀痰中ＩＬ−１０については、図５のごとく、ＩＬ−１０は、健常者ではまったく上昇せず、症例コントロールでは、１例でわずかに上昇していた。喘息非発作群では上昇せず、発作群では、１９例中８例で上昇していた。すなわち、ＩＬ−１０は、喘息発作時に上昇すると言え、ＩＬ−１０上昇の認められない非発作群と対比をなすと考えられる。
【００３７】
図６は、気管支喘息発作、非発作時における喀痰中検出されたＩＬ−１２の量の分布グラフである。これによれば、発作群では１９例中２例でわずかに上昇していた。
【００３８】
すなわち、気管支喘息発作、非発作時における喀痰中ＩＬ−２については、図６のごとく、ＩＬ−２は、健常者及び症例コントロールでは、まったく上昇せず、喘息非発作では、３５例中３例で上昇していた。発作群では１９例中２例で、わずかに上昇していた。
【００３９】
図７は、気管支喘息発作、非発作時における喀痰中検出されたＩＬ−１βの量の分布グラフである。これによれば、ＩＬ−１βは、喘息発作時に上昇するが、非発作時でも極わずかに上昇すると考えられる。
【００４０】
すなわち、気管支喘息発作、非発作時における喀痰中ＩＬ−１βについては、図７のごとく、ＩＬ−８は、健常者ではまったく上昇せず、症例コントロールでは、１例のみ上昇していた。喘息非発作群では、３５例中５例でわずかに上昇しており、発作群では、１９例中９例で上昇していた。すなわち、ＩＬ−１βは喘息発作時に上昇するが、非発作群でも極わずかに上昇すると考えられる。
【００４１】
図８は、気管支喘息発作、非発作時における喀痰中検出されたＩＦＮ−γの量の分布グラフである。これによれば、ＩＦＮ−γは、喘息発作時も含め、炎症時に上昇すると見られる。
【００４２】
すなわち、気管支喘息発作、非発作時における喀痰中ＩＦＮ−γについては、図８のごとく、ＩＦＮ−γは、健常者でも７例中３例で上昇、症例コントロールでは、９例中５例が上昇していた。喘息発作群では、３５例中１２例で上昇していた。発作群では、１９例中１２例で上昇していた。また、喘息発作直前では、一部症例で著しく上昇している。すなわち、ＩＦＮ−γは喘息発作時も含め、炎症時に上昇すると見られる。
【００４３】
図９は、症例１における発作後の喀痰中IL-5、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０の濃度の経時的変化を示したグラフである。そして、図１０は、症例２における発作後の喀痰中ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０の濃度の経時的変化を示したグラフである。
【００４４】
すなわち、症例１における、発作後の喀痰中ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０の濃度の経時的変化については、気管支喘息患児症例で、発作後経時的に観察できた２症例（図９および図１０）において、経時的に喀痰中にサイトカインを測定し、喘息発作との関連について検討した。図９に見られるごとく、症例１では、発作時上昇していたＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０の４つのサイトカインの内、まずＩＬ−１０が下降し遅れてＩＬ−５、ＩＬ−６、ついでＩＬ−８が下降した。
【００４５】
すなわち、症例２における発作後の喀痰中ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０の濃度の経時的変化については、図１０に示すがごとく、症例２においては、発作時上昇していたＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０の内、まずＩＬ−１０が下降し、遅れてＩＬ−５、ついでＩＬ−６、ＩＬ−８がほぼ同時に下降した。
【００４６】
以上の結果から、発作前にまず喀痰中ＩＦＮ−γが高値を示し、ついでＩＬ−５が高値を示すことが分かった。発作時には、喀痰中にＩＬ−５とともにＩＬ−８、ＩＬ−１０の上昇が認められ、発作の終息につれて、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０が低値を示すようになることが分かった。これらの喀痰中のサイトカインの増減が、予後の改善を目指した早期介入および治療終了の優れた指標となりうるものと考えられる。これにより、喀痰中の好酸球に加え、同時にサイトカインを簡便に調べる検査診断法の開発により、患者の病態を医療現場で迅速により的確に判断できる。
【００４７】
なお、本実施の形態は、被検試料中のサイトカイン、またはケモカイン、もしくはその両方の存在量を検出するステップを含む疾患の病態を検査する方法である。また、別の態様では、被検試料の喀痰、鼻汁、血清、脳脊髄液のサイトカイン、またはケモカイン、もしくはその両方の存在量を検出するステップを含む疾患の病態を検査する方法をとることが可能である。
【００４８】
さらに、別の態様では、気管支喘息（小児喘息を含む）の発作時と非発作時における患者の喀痰にある、サイトカインの存在量を検出するステップを含む、疾患の病態を検査する方法がある。また、さらに別の態様では、気管支喘息の発作時と非発作時における患者の喀痰にあるＴＮＦ−α、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１βのいずれかを、それぞれのモノクロナール抗体である抗ＴＮＦ−α、抗ＩＬ−５、抗ＩＬ−６、抗ＩＬ−８、抗ＩＬ−１０、抗ＩＬ−１２、抗ＩＦＮ−γ、抗ＩＬ−１βモノクロナール抗体によって、検出するステップを含む疾患の病態を検査する方法がある。
【００４９】
図１１は、被検試料サンプル、コントロール、サイトカインのモノクロナール抗体（３種類：抗ＩＬ−５モノクロナール抗体、抗ＴＮＦ−αモノクロナール抗体、抗ＩＮＦ−γモノクロナール抗体）から構成する喘息発作予測用、および、被検試料サンプル、コントロール、サイトカインのモノクロナール抗体（３種類：抗ＩＬ−５モノクロナール抗体、抗ＩＬ−８モノクロナール抗体、抗ＩＬ−１０モノクロナール抗体）から構成する喘息発作収束判定用、検査キットの簡略図である。
【００５０】
なお、本発明の検査キットの具体例として、上述の図１１に示した喘息発作予測用キットのように、抗ＩＬ−５モノクロナール抗体、抗ＴＮＦ−αモノクロナール抗体と、抗ＩＦＮ−γモノクロナール抗体、そしてコントロールおよび被検試料を備えてなるキットがある。一方、喘息発作の収束に関しては、ＩＬ−１０の低下によって予測し、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−８の低下によって、完全収束したと判断する。
【００５１】
キットの具体例として、図１１に示した喘息発作収束判定用キットのように、抗ＩＬ−５モノクロナール抗体、抗ＩＬ−８モノクロナール抗体と、抗ＩＬ−１０モノクロナール抗体、そしてコントロールおよび被検試料を備えている。
【００５２】
喘息発作前で介入の是非の判断には、喀痰中ＩＬ−５、ＴＮＦ−α（ＩＦＮ−γ）の上昇を確認できれば介入を開始し、一方で、一旦開始した介入の中止の判断については、喀痰中ＩＬ−１０の低下で収束をまず予知し、ＩＬ−５、（ＩＬ−６）、ＩＬ−８の低下を確認して介入を中止できる。
【００５３】
これにより、早期に病態を簡単かつ迅速に把握し、喘息発作の予防、及び長期的展望に基づいた治療決定を可能とするものである。特に、非浸襲的な試料採集法である血清、喀痰、鼻汁を用いて、好酸球性炎症の指標であるＥｏｓiｎｏｐｈiｌ  Ｃａｔiｏｎiｃ  Ｐｒｏｔｅiｎ（ＥＣＰ）と、各種サイトカインの動向を測定することにより、気管支喘息病態の効果的・有効的診断を可能とするものである。
【００５４】
なお、本発明では、発作予測用と発作収束用に検査キットを分離しているが、これに限定される必要はなく、１つのプレートで発作予測用と発作収束用双方の検査キットの試料を備える検査キットであってもよい。
【００５５】
そして、本発明による検査方法およびキットは、気管支喘息の治療にあたって、患者から採取した喀痰に含まれるサイトカイン、またはケモカイン、もしくはその両方の量を適宜に検出することによって、患者の病態を的確にかつ客観的に把握することができ、最適時に吸入ステロイド剤等による介入を行い、最適時に介入を中止することができ、気管支喘息の治療効率を格段にあげることができる効果がある。
【００５６】
別の態様では、被検試料中のサイトカインの存在を測る確認手段と、被検試料の設置手段と、被検試料からかかる確認手段にアクセスする手段と、を含む疾患の病態を検査するための検査キットがある。さらに別の態様では、喀痰にあるサイトカインをそのモノクロナール抗体によって検出する確認手段を有する、疾患の病態を検査するための検査キットがある。
【００５７】
また、別の態様として、サイトカインＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０に対するモノクロナール抗体である抗ＴＮＦ−α、抗ＩＦＮ−γ、抗ＩＬ−５、抗ＩＬ−８、抗ＩＬ−１０の中少なくとも２つ、好ましくは３つのモノクロナール抗体をあらかじめ一列に並べた確認手段を有する、疾患の病態を検査するための検査キットがある。
【００５８】
別の態様として、抗ＴＮＦ−α、抗ＩＬ−５、抗ＩＦＮ−γモノクロナール抗体をあらかじめ一列に並べた確認手段を有する、気管支喘息発作予測判定用検査キットとしてもよい。さらに別の態様では、モノクロナール抗ＴＮＦ−α、抗ＩＬ−５を、あらかじめ一列に並べた確認手段を有する気管支喘息発作予測判定用検査キットでもよい。なお、上記キットにおいて、被検試料中の検出すべきサイトカイン濃度について、ＴＨＦ−αに関しては、３０ｐｇ／ｍｌ以上、ＩＬ−５に関しては、２０ｐｇ／ｍｌ以上、ＩＦＮ−γに関しては、２０ｐｇ／ｍｌ以上であることが好ましい。
【００５９】
さらに、別の態様では、抗ＩＬ−５、抗ＩＬ−８、抗ＩＬ−１０モノクロナール抗体をあらかじめ一列に並べた確認手段を有する、気管支喘息発作収束判定用検査キットでもよい。別の態様として、抗ＩＬ−５、抗ＩＬ−８モノクロナール抗体を、あらかじめ一列に並べた確認手段を有する気管支喘息発作収束判定用検査キットでもよい。なお、上記キットにおいて、被検試料中の検出すべきサイトカイン濃度について、ＩＬ−１０に関しては、３０ｐｇ／ｍｌ以上、ＩＬ−５に関しては、２０ｐｇ／ｍｌ以上、ＩＬ−６に関しては、１０００ｐｇ／ｍｌ以上、ＩＬ−８に関しては、６０００ｐｇ／ｍｌ以上であることが好ましい。
【００６０】
また、別の態様として、クロマトグラフィ原理による、被検試料をサイトカインのモノクロナール抗体にアクセスさせる気管支喘息発作予測判定用、もしくは気管支喘息発作収束判定用検査キットとしてもよい。また、上記濃度以上のサイトカインの存在を視覚的に表現するためには、イムノクロマト法使用に際し、一般的に使用される発色剤を用いることができるが、本発明では、特に金コロイドが好ましい。
【００６１】
なお、本発明の検査方法および検査キットは、上述の実施態様のみに限定されるものではなく、これに類似する検査方法および検査キットも、その目的および効果を有する限り、本発明の技術的範囲に含まれるものである。
たとえば、図１１では、発作予測用と発作収束用に検査キットを物理的に分離しているが、これに限定される必要はなく、検査キットで発作予測用と発作収束用双方の検査を行えるようにしてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明は、気管支喘息の治療効率を格段にあげるための方法およびキットに使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】気管支喘息発作、非発作時における喀痰中検出されたＴＮＦ−αの量の分布グラフである。
【図２】気管支喘息発作、非発作時における喀痰中検出されたＩＬ−５の量の分布グラフである。
【図３】気管支喘息発作、非発作時における喀痰中検出されたＩＬ−６の量の分布グラフである。
【図４】気管支喘息発作、非発作時における喀痰中検出されたＩＬ−８の量の分布グラフである。
【図５】気管支喘息発作、非発作時における喀痰中検出されたＩＬ−１０の量の分布グラフである。
【図６】気管支喘息発作、非発作時における喀痰中検出されたＩＬ−１２の量の分布グラフである。
【図７】気管支喘息発作、非発作時における喀痰中検出されたＩＬ−１βの量の分布グラフである。
【図８】気管支喘息発作、非発作時における喀痰中検出されたＩＦＮ−γの量の分布グラフである。
【図９】症例１における発作後の喀痰中ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０の濃度の経時的変化を示したグラフである。
【図１０】症例２における発作後の喀痰中ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０の濃度の経時的変化を示したグラフである。
【図１１】被検試料サンプル、コントロール、サイトカインのモノクロナール抗体から構成する喘息発作予測用、および、被検試料サンプル、コントロール、サイトカインのモノクロナール抗体から構成する喘息発作収束判定用、検査キットの簡略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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