(57)【要約】【課題】ヒト被検試料における疾患又は疾患マーカーの検出のための定常発現遺伝子の使用を提供する。【解決手段】ヒト被検試料における疾患又は疾患マーカーの検出方法であって、特定の種類の定常発現遺伝子から選択される少なくとも１種の定常発現遺伝子の発現量に対する、少なくとも１種の診断用遺伝子又は診断用候補遺伝子の発現量の変動量を測定することを含む方法、ならびに、このような方法に使用するためのＤＮＡマイクロアレイ。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト被検試料における疾患又は疾患マーカーの検出方法であって、下記のステップ：
（１）被検試料において少なくとも１種の診断用遺伝子又は診断用候補遺伝子の発現量および、下記の遺伝子群から選択された少なくとも１種の定常発現遺伝子の発現量を測定するステップ、
（２）該診断用遺伝子又は診断用候補遺伝子の発現量と該定常発現遺伝子の発現量とを比較し、それにより該定常発現遺伝子の発現量に対する該診断用遺伝子又は診断用候補遺伝子の発現量の変動量を決定するステップ、及び
（３）前記ステップ（２）で決定された該診断用遺伝子又は診断用候補遺伝子の発現量の変動量を指標として、該疾患を検出する、或いは該被検試料中の該診断用候補遺伝子を疾患マーカーとして検出する、ステップ、
を含み、
ここで、該定常発現遺伝子は、以下の遺伝子名で表されるZNF37A（配列番号１、２）、HTR2C（配列番号３）、HTR1A（配列番号４）、HUMMLC2B（配列番号５）、FY（配列番号６）、PRKCG（配列番号７）、BRD3（配列番号８）、AQP7（配列番号９）、TUB（配列番号１０、１１）、MPP2（配列番号１２）、MADD（配列番号１３〜２０）、ADRB3（配列番号２１）、DHX38（配列番号２２）、IKBKE（配列番号２３）、CCR9（配列番号２４、２５）、LTK（配列番号２６、２７）、HP（配列番号２８）、PPP1R8（配列番号２９〜３１）、MAP1A（配列番号３２）、RFC1（配列番号３３）、SMARCD1（配列番号３４、３５）、HSD17B3（配列番号３６）、DBT（配列番号３７）、COX10（配列番号３８）、DSIPI（配列番号３９、４０）、HD（配列番号４１）、POP1（配列番号４２）、UBTF（配列番号４３）、HLA-DOA（配列番号４４）、AANAT（配列番号４５）、RAF1（配列番号４６）、THAP11（配列番号４７）、PSCD2（配列番号４８、４９）、NUP62（配列番号５０〜５３）、ARHGEF1（配列番号５４〜５６）、UNC119（配列番号５７、５８）、NUP188（配列番号５９）、GCGR（配列番号６０）、PTPRN（配列番号６１）、DPF2（配列番号６２）、PSD（配列番号６３）、CCNA2（配列番号６４）、TPR（配列番号６５）、RING1（配列番号６６）、RABGGTA（配列番号６７、６８）、CD36（配列番号６９〜７１）、BAD（配列番号７２、７３）、AQP2（配列番号７４）、DRG2（配列番号７５）、CCL22（配列番号７６）、KIAA0056（配列番号７７）、KIAA0063（配列番号７８）、CREB3（配列番号７９）、TIAL1（配列番号８０、８１）、GRM4（配列番号８２）、IRF3（配列番号８３）、R3HDM（配列番号８４）、PMS2L11（配列番号８５）、GSK3A（配列番号８６）、MARS（配列番号８７）、ATM（配列番号８８〜９０）、CASC3（配列番号９１）、KIAA0195（配列番号９２）、MRPL49（配列番号９３）、DDB1（配列番号９４）、TSFM（配列番号９５）、TRAF4（配列番号９６、９７）、GRB2（配列番号９８、９９）、HYAL2（配列番号１００、１０１）、RNF10（配列番号１０２）、PPP4C（配列番号１０３）、DNMT1（配列番号１０４）、POFUT1（配列番号１０５、１０６）、SUMO1（配列番号１０７〜１０９）、DCTN2（配列番号１１０）、PSMD7（配列番号１１１）、CLPP（配列番号１１２）、MCM6（配列番号１１３）、AAMP（配列番号１１４）、EBP（配列番号１１５）、CCT7（配列番号１１６、１１７）、DCTD（配列番号１１８）、ADRM1（配列番号１１９、１２０）、PLK1（配列番号１２１）、RNPS1（配列番号１２２、１２３）、CCT2（配列番号１２４）、HNRPC（配列番号１２５、１２６）、OPRS1（配列番号１２７〜１３１）、CKAP1（配列番号１３２）、USP11（配列番号１３３）、TTC1（配列番号１３４）、KPNB1（配列番号１３５）、KHDRBS1（配列番号１３６）、LMNB2（配列番号１３７）、POLR2K（配列番号１３８）、ZNF91（配列番号１３９）、PSMA2（配列番号１４０）、SEC61B（配列番号１４１）、PSMC5（配列番号１４２）、SFRS3（配列番号１４３）、SSBP1（配列番号１４４）、CSE1L（配列番号１４５、１４６）、CCT5（配列番号１４７）、PSMA1（配列番号１４８、１４９）、ATP5F1（配列番号１５０〜１５２）、PSMC1（配列番号１５３）、NEFL（配列番号１５４）、MLF2（配列番号１５５）、AP2S1（配列番号１５６、１５７）、CSNK2B（配列番号１５８）、HRMT1L2（配列番号１５９〜１６１）、ILF2（配列番号１６２）、BAT1（配列番号１６３、１６４）、G10（配列番号１６５）、CANX（配列番号１６６）、CAPNS1（配列番号１６７、１６８）、EIF3S8（配列番号１６９）、TRIM28（配列番号１７０）、CCT3（配列番号１７１〜１７３）、PCBP2（配列番号１７４、１７５）、CCT4（配列番号１７６）、TUFM（配列番号１７７）、PFDN5（配列番号１７８〜１８０）、WBSCR1（配列番号１８１、１８２）、FUS（配列番号１８３、１８４）、IMPDH2（配列番号１８５）、PSMB3（配列番号１８６）、DNCL1（配列番号１８７）、PSMD8（配列番号１８８）、PSMB6（配列番号１８９）、PSMB1（配列番号１９０）、TCEB1（配列番号１９１）、EEF1B2（配列番号１９２、１９３）、NME1（配列番号１９４、１９５）、ATP5C1（配列番号１９６、１９７）、H2AFZ（配列番号１９８）、HMGB1（配列番号１９９）、CLIC1（配列番号２００）、NONO（配列番号２０１）、HINT1（配列番号２０２）、ATP5B（配列番号２０３）、NACA（配列番号２０４）、EIF4A1（配列番号２０５）、HSPCB（配列番号２０６）、EEF1G（配列番号２０７）、HSPCA（配列番号２０８）、COX6A1（配列番号２０９）、ENO1（配列番号２１０）、UBA52（配列番号２１１）、PFN1（配列番号２１２）、TPT1（配列番号２１３）、CFL1（配列番号２１４）、NSEP1（配列番号２１５）、NPM1（配列番号２１６、２１７）、EEF1A1（配列番号２１８）、OAZ1（配列番号２１９）、及びWNT2B（配列番号２２０、２２１）からなる群から選択される遺伝子であることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記診断用遺伝子若しくは診断用候補遺伝子又は定常発現遺伝子の発現量が、該遺伝子、その変異体、そのＲＮＡ、そのｃＤＮＡ、その相補的ポリヌクレオチド、それとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及びそれらの少なくとも１５塩基の断片からなる群から選択される核酸を使用して測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記診断用遺伝子若しくは診断用候補遺伝子又は定常発現遺伝子の発現量が、ハイブリダイゼーションによって測定される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ハイブリダイゼーションが、ＤＮＡマイクロアレイを使用したハイブリダイゼーションである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ステップ（１）において、少なくとも３種の定常発現遺伝子の発現量を測定する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載の定常発現遺伝子群から選択された少なくとも３種の定常発現遺伝子、それらの変異体、それらのＲＮＡ、それらのｃＤＮＡ、それらの相補的ポリヌクレオチド、それらの各々とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及びそれらの少なくとも１５塩基の断片からなる群から選択される核酸が、アレイの支持体上のそれぞれ定められた位置に固定化された状態で含むことを特徴とするＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項７】
請求項１に記載の定常発現遺伝子群、それらの変異体、それらのＲＮＡ、それらのｃＤＮＡ、それらの相補的ポリヌクレオチド、それらの各々とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド及びそれらの少なくとも１５塩基の断片からなる群から選択される核酸プローブが、アレイ上に含まれる全プローブ数の５０％以上を占有することを特徴とするＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項８】
疾患の診断用として既知の又は未知の少なくとも１種の遺伝子、その変異体、そのＲＮＡ、そのｃＤＮＡ、その相補的ポリヌクレオチド、それとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド及びそれらの少なくとも１５塩基の断片からなる群から選択される核酸を、アレイの支持体上の定められた別個の位置に固定化された状態でさらに含む、請求項６又は７に記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項９】
疾患マーカーの検出用である、請求項６又は７に記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項１０】
疾患の検出用である、請求項６又は７に記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項１１】
ヒト被検試料における疾患又は疾患マーカーの検出方法であって、請求項１に記載の少なくとも１種の定常発現遺伝子の発現量に対する、少なくとも１種の診断用遺伝子又は診断用候補遺伝子の発現量の変動量を測定することを含む方法。
【請求項１２】
ヒト被検試料中の細胞内遺伝子発現変動の測定における、請求項１に記載の少なくとも１種の定常発現遺伝子、その変異体、そのＲＮＡ、そのｃＤＮＡ、その相補的ポリヌクレオチド、それとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドおよびそれらの少なくとも１５塩基の断片からなる群から選択される核酸の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト被検試料における疾患又は疾患マーカーの検出に関する。より具体的には、本発明は、疾患マーカーとなりうる診断用候補遺伝子の発現変動を、定常発現遺伝子の発現量を基準にして測定及び評価する方法に関するものであり、そのような方法は、例えばハイブリダイゼーション法、特にＤＮＡマイクロアレイを用いた方法によって実施可能である。したがって、本発明はまた、上記の方法に使用するための、定常発現遺伝子を固定化して含むＤＮＡマイクロアレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
個別化医療の発展に伴い、個々の患者の病態を把握するための臨床診断手法が重要なものとして認識されるようになってきている。特に患者の病態把握、治療への反応、また投薬に先立っての薬効予測など行うために、患者検体中のｍＲＮＡ発現量の変化を把握する発現遺伝子解析については多くの研究が行われており、発現量変化が診断の基準となる診断用遺伝子が多くの疾患において同定されている。
【０００３】
このような発現遺伝子解析では、特に多種類のｍＲＮＡの発現量を一度に効率よく検出する方法として、ＤＮＡマイクロアレイ（マイクロアレイ、ＤＮＡチップ）が多用されている。ＤＮＡマイクロアレイは大きく、ｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて逆転写したｃＤＮＡ断片を基板上に高密度に固定化したｃＤＮＡマイクロアレイ、多種類のオリゴヌクレオチドを人工的に合成して、同じく基板上に高密度に固定化したオリゴヌクレオチドマイクロアレイ、及び微細加工技術を用いて多種類のオリゴヌクレオチドを直接基板上に合成したチップ（例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標））の３種類に分けられる。これらのＤＮＡマイクロアレイやＤＮＡチップ（以下ＤＮＡマイクロアレイと呼ぶ）は製造方法こそ違うものの、使用に際してはそれぞれのＤＮＡアレイ上のプローブに患者由来の遺伝子をハイブリダイズさせ、プローブへの遺伝子の結合量を何らかの方法によって測定することで共通している。
【０００４】
結合量の測定には電気化学的にチップ上のプローブへの遺伝子の結合量を直接測定する方法も用いられるが、現在一般に汎用されているものには蛍光色素標識法である。この方法は、測定対象となるサンプル中の遺伝子に何らかの方法で蛍光色素を標識し、これらの遺伝子をＤＮＡマイクロアレイ上のプローブに結合させ、アレイを洗浄した後にそれぞれのプローブに対応した位置の蛍光強度をスキャンして、サンプル中の遺伝子量を求めるものである。
【０００５】
また蛍光色素法には、１種類のサンプル由来の遺伝子を１種類の蛍光色素で標識した上でＤＮＡマイクロアレイに反応させて、蛍光の絶対値を測定・解析する１色法と、２種類のサンプル由来の遺伝子をそれぞれ別の蛍光色素で標識した上でＤＮＡマイクロアレイに反応させて競合ハイブリダイズさせ、２色の蛍光強度を測定することによって、遺伝子結合量の比を測定・解析する２色法がある。
【０００６】
ＤＮＡアレイを用いた発現遺伝子解析法は、特に数百から数万遺伝子に対して一度に網羅的に発現量が変動した遺伝子を同定するのに有効である。一方で、実験によって得られた測定データは必ずしも真の値を反映しておらず、チップそのものの特性や、実験操作、何らかのバイアスを含んでいるチップ作製時の機械的な要因、また実験実施上の操作についての人為的な要因であったり、蛍光色素の性質によるものであったりすると考えられる。したがって正確な遺伝子発現量を計測するためには、個々の測定値についてこれらのバイアスを補正する必要がある。
【０００７】
ＤＮＡマイクロアレイデータのバイアス補正に関する測定値の一般的補正方法には、バックグラウンド補正および正規化（ノーマライズ）とよばれる大きく二つの工程が含まれる。
【０００８】
バックグラウンド補正では、単純に個々の測定値からブランクのスポットの平均バックグラウンド値、あるいは、各スポットの周囲の領域のバックグラウンド値を、スポットの蛍光強度測定値から引くことによってバックグラウンドの補正を行なう方法が主に用いられている。
【０００９】
さらに複数のＤＮＡアレイ由来のデータを比較する場合や、２色法での測定データの解析には、正規化と呼ばれる工程を欠かすことはできない。正規化には主に総強度正規化（グローバル・ノーマライゼーション）、Ｌｏｗｅｓｓ正規化などの手法が用いられる。説明のために、アレイ上に搭載されているプローブに対応したｉ番目の遺伝子の、２種の色素による蛍光強度をそれぞれＧｉ、Ｒｉとする。
【００１０】
グローバル・ノーマライゼーションは、２種の蛍光強度測定値の平均値（それぞれΣＲｉ、ΣＧｉとする。なおこの値は中央値、トリム平均値などでもよい）の比（Ｎ＝ΣＲｉ／ΣＧｉ）をとり、Ｇi'＝ＮＧi、Ｒｉ’＝Ｒｉとする。すなわち、一方の種類の蛍光強度測定値を基準として、もう一方の種類の蛍光強度測定値を上記の比にあたる数によって定数倍するものである。この操作によって、２種の蛍光強度値を平均化することができる。
【００１１】
一方、２種の蛍光色素を利用した２色法での検出では、色素の性質の違いによるバイアスが生じることがある。一般に２色法に用いられる蛍光色素である、Ｃｙ３、Ｃｙ５は、遺伝子発現量に対する強度比が、強度自身に対してバイアスを持っていることが知られている。このバイアスを補正するスタンダードな手法がＬｏｗｅｓｓまたはＬｏｅｓｓ正規化である（非特許文献１、２）。Ｌｏｗｅｓｓ（Ｌｏｃａｌｌｙ  Ｗｅｉｇｈｔｅｄ  Ｓｃａｔｔｅｒ  Ｐｌｏｔ  Ｓｍｏｏｔｈｅｒ）とはノンパラメトリック回帰の手法の一つで、データ群に沿うような滑らかな曲線を引くための手法であり、多項式近似を行う際に、データをオーバーラップする狭い区間に分け、次数を制限して行う。アレイデータ解析ではＬｏｗｅｓｓはＣｙ３とＣｙ５の強度比が１であるとみなせる線を推定するために用いられる。
【００１２】
以上の補正法はアレイデータ解析に汎用されているが、その使用の前提条件として、「測定間で変動が見られない遺伝子が大半を占めること」「測定間で発現が増大、減少する遺伝子が同程度含まれていること」が前提とされる（非特許文献３）。もし、測定間での遺伝子変動量が極端にまちまちであった場合、平均化や回帰といった手法による上述の方法は、各測定データに特異的な数値を導くだけで、なんら比較のための補正にはならないからである。全ゲノムを搭載したＤＮＡマイクロアレイを利用する場合、発現変動する遺伝子はゲノム中の数％〜数十％に過ぎないことがほとんどであるため、この前提条件は満たされていると考えてよい。
【００１３】
しかしながら、検査・診断用ＤＮＡマイクロアレイなど、目的が明確なＤＮＡマイクロアレイにおいて、発現変動を指標としての検出すべき遺伝子のみを搭載した場合には、当然のことながらこれらの遺伝子発現は測定間で激しく変動することが予想される。このようなＤＮＡマイクロアレイを作製する場合には、同一種の生物由来のサンプルであれば発現変動が極めて小さいと予想される一連の遺伝子をプローブとして搭載しておくことにより、アレイデータ解析の精度が向上すると予想される。この場合、検査又は診断用のＤＮＡマイクロアレイは、診断用遺伝子の発現変動によって、疾患の有無や程度を判定するものであるから、診断用遺伝子の発現が変動したか否かを、なんらかの基準に基づいて判断する必要がある。
【００１４】
かかる用途に利用されうる遺伝子として、従来ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、β−アクチン、β２−マイクログロブリン、ＨＰＲＴ１（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  １）、マウス由来遺伝子（βアクチン、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、ユビキチンBおよびリボソームタンパク質；特許文献１）、などが知られている。これらの遺伝子は細胞の維持、増殖に不可欠なハウスキーピング遺伝子であるためよい定常発現遺伝子となりうるが、常用されているハウスキーピング遺伝子は上述の数種しかなく、ＤＮＡマイクロアレイ解析の補正に用いるには遺伝子の数が十分でない。複数のリボゾーマルＲＮＡ遺伝子をハウスキーピング遺伝子として利用する場合もあるが、これらのリボゾーマルＲＮＡ遺伝子はお互いの配列に相同な部分が多く、ハイブリダイゼーション量を検出することを測定原理としているＤＮＡマイクロアレイ法における検出プローブとしては適当ではないと考えられる。
【００１５】
【特許文献１】特開２００５−１０２５１５
【非特許文献１】Ｃｌｅａｖｅｌａｎｄ，Ｗ．Ｓ．ら、１９７９、Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、第７４巻、第８２９〜８３６頁
【非特許文献２】Ｃｌｅａｖｅｌａｎｄ，Ｗ．Ｓ．ら、１９８８、Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、第８３巻、第５９６〜６１０頁
【非特許文献３】佐々木博己、青柳一彦編、「ＤＮＡチップ実験まるわかり」羊土社、２００４年１２月１日発行、第８０〜９０頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
検査又は診断用のハイブリダイゼーション、例えばＤＮＡマイクロアレイにおいて、診断用遺伝子又は診断用候補遺伝子のみならず、定常発現遺伝子を搭載することにより、かかる定常発現遺伝子の発現量と診断用遺伝子又は診断用候補遺伝子の発現量とを比較解析することによって、明確に診断用遺伝子又は診断用候補遺伝子の発現変動を検知することが可能になるし、また、ＤＮＡマイクロアレイに搭載する定常発現遺伝子数を診断用遺伝子又は診断用候補遺伝子の数以上に設定することにより、バイアスのないデータ解析を可能にすることができるだろうと推定し、かかる定常発現遺伝子を探索するための研究を行った。
【００１７】
したがって、本発明は、上記の課題を解決するための定常発現遺伝子群を提供することを目的とする。
【００１８】
本発明はまた、検査・診断用のＤＮＡマイクロアレイ上に含まれる該定常発現遺伝子を利用することにより、被検試料中の疾患又は疾患マーカーを検出する方法、あるいはかかる検出に使用するためのＤＮＡマイクロアレイ、を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
検査又は診断用のＤＮＡマイクロアレイに使用しうる定常発現遺伝子群は、ヒト由来組織において、その発現がほとんど変動しない性質を有する必要がある。このような要件を満たし、疾患又は疾患マーカーの検出に使用可能な定常発現遺伝子を見出すために、本発明者らは、標準化されたヒトガン由来株化細胞の発現遺伝子をマイクロアレイによって解析することを試みた。その結果、細胞間の発現変動を表す変動係数（ＣＶ）が４０％以内に抑制されている１５７種の遺伝子群（表１、配列番号１〜２２１）を見出した。さらに、本発明者らは、これらの遺伝子が、少なくとも1種で、好ましくは組み合わせて参照遺伝子として使用されるとき、意外にも、検査若しくは診断用の遺伝子又は候補遺伝子の発現変動を精確に判定することができることを見出した。
【００２０】
特にＤＮＡマイクロアレイによるデータの解析においては、多数の遺伝子の発現変動を解析する必要があり、例えば横軸に遺伝子発現強度を、縦軸に試料/対照の発現比を取り実験データをプロットするときには、通常、プロットされた多数の点にゆがみが生じる、測定ごとに異なったバイアス（偏り）が生じる、などの理由のため、これを正規化し補正する必要がある。データの補正には、発現量が実質的に変化しない遺伝子である定常発現遺伝子が必要となるはずであるが、従来のＤＮＡマイクロアレイでは、このような定常発現遺伝子が使用されていなかった。これは、疾患マーカーの検出に際して、疾患等の事象の前後における同一マーカーの発現変動差を測定することが一般的に行われていたからである。
【００２１】
本発明者らが今回見出した定常発現遺伝子群は、それを参照遺伝子とすることによって、ある対象遺伝子の発現変動を精確に捕らえることを可能にする画期的なものである。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
１．発明の概要
本発明は、要約すると、以下の特徴を有する。
本発明は、第１の態様において、ヒト被検試料における疾患又は疾患マーカーの検出方法であって、下記のステップ：
（１）被検試料において少なくとも１種の診断用遺伝子又は診断用候補遺伝子の発現量および、下記の遺伝子群から選択された少なくとも１種の定常発現遺伝子の発現量を測定するステップ、
（２）該診断用遺伝子又は診断用候補遺伝子の発現量と該定常発現遺伝子の発現量とを比較し、それにより該定常発現遺伝子の発現量に対する該診断用遺伝子又は診断用候補遺伝子の発現量の変動量を決定するステップ、及び
（３）前記ステップ（２）で決定された該診断用遺伝子又は診断用候補遺伝子の発現量の変動量を指標として、該疾患を検出する、或いは該被検試料中の該診断用候補遺伝子を疾患マーカーとして検出する、ステップ、
を含み、
ここで、該定常発現遺伝子は、以下の遺伝子名で表されるZNF37A（配列番号１、２）、HTR2C（配列番号３）、HTR1A（配列番号４）、HUMMLC2B（配列番号５）、FY（配列番号６）、PRKCG（配列番号７）、BRD3（配列番号８）、AQP7（配列番号９）、TUB（配列番号１０、１１）、MPP2（配列番号１２）、MADD（配列番号１３〜２０）、ADRB3（配列番号２１）、DHX38（配列番号２２）、IKBKE（配列番号２３）、CCR9（配列番号２４、２５）、LTK（配列番号２６、２７）、HP（配列番号２８）、PPP1R8（配列番号２９〜３１）、MAP1A（配列番号３２）、RFC1（配列番号３３）、SMARCD1（配列番号３４、３５）、HSD17B3（配列番号３６）、DBT（配列番号３７）、COX10（配列番号３８）、DSIPI（配列番号３９、４０）、HD（配列番号４１）、POP1（配列番号４２）、UBTF（配列番号４３）、HLA-DOA（配列番号４４）、AANAT（配列番号４５）、RAF1（配列番号４６）、THAP11（配列番号４７）、PSCD2（配列番号４８、４９）、NUP62（配列番号５０〜５３）、ARHGEF1（配列番号５４〜５６）、UNC119（配列番号５７、５８）、NUP188（配列番号５９）、GCGR（配列番号６０）、PTPRN（配列番号６１）、DPF2（配列番号６２）、PSD（配列番号６３）、CCNA2（配列番号６４）、TPR（配列番号６５）、RING1（配列番号６６）、RABGGTA（配列番号６７、６８）、CD36（配列番号６９〜７１）、BAD（配列番号７２、７３）、AQP2（配列番号７４）、DRG2（配列番号７５）、CCL22（配列番号７６）、KIAA0056（配列番号７７）、KIAA0063（配列番号７８）、CREB3（配列番号７９）、TIAL1（配列番号８０、８１）、GRM4（配列番号８２）、IRF3（配列番号８３）、R3HDM（配列番号８４）、PMS2L11（配列番号８５）、GSK3A（配列番号８６）、MARS（配列番号８７）、ATM（配列番号８８〜９０）、CASC3（配列番号９１）、KIAA0195（配列番号９２）、MRPL49（配列番号９３）、DDB1（配列番号９４）、TSFM（配列番号９５）、TRAF4（配列番号９６、９７）、GRB2（配列番号９８、９９）、HYAL2（配列番号１００、１０１）、RNF10（配列番号１０２）、PPP4C（配列番号１０３）、DNMT1（配列番号１０４）、POFUT1（配列番号１０５、１０６）、SUMO1（配列番号１０７〜１０９）、DCTN2（配列番号１１０）、PSMD7（配列番号１１１）、CLPP（配列番号１１２）、MCM6（配列番号１１３）、AAMP（配列番号１１４）、EBP（配列番号１１５）、CCT7（配列番号１１６、１１７）、DCTD（配列番号１１８）、ADRM1（配列番号１１９、１２０）、PLK1（配列番号１２１）、RNPS1（配列番号１２２、１２３）、CCT2（配列番号１２４）、HNRPC（配列番号１２５、１２６）、OPRS1（配列番号１２７〜１３１）、CKAP1（配列番号１３２）、USP11（配列番号１３３）、TTC1（配列番号１３４）、KPNB1（配列番号１３５）、KHDRBS1（配列番号１３６）、LMNB2（配列番号１３７）、POLR2K（配列番号１３８）、ZNF91（配列番号１３９）、PSMA2（配列番号１４０）、SEC61B（配列番号１４１）、PSMC5（配列番号１４２）、SFRS3（配列番号１４３）、SSBP1（配列番号１４４）、CSE1L（配列番号１４５、１４６）、CCT5（配列番号１４７）、PSMA1（配列番号１４８、１４９）、ATP5F1（配列番号１５０〜１５２）、PSMC1（配列番号１５３）、NEFL（配列番号１５４）、MLF2（配列番号１５５）、AP2S1（配列番号１５６、１５７）、CSNK2B（配列番号１５８）、HRMT1L2（配列番号１５９〜１６１）、ILF2（配列番号１６２）、BAT1（配列番号１６３、１６４）、G10（配列番号１６５）、CANX（配列番号１６６）、CAPNS1（配列番号１６７、１６８）、EIF3S8（配列番号１６９）、TRIM28（配列番号１７０）、CCT3（配列番号１７１〜１７３）、PCBP2（配列番号１７４、１７５）、CCT4（配列番号１７６）、TUFM（配列番号１７７）、PFDN5（配列番号１７８〜１８０）、WBSCR1（配列番号１８１、１８２）、FUS（配列番号１８３、１８４）、IMPDH2（配列番号１８５）、PSMB3（配列番号１８６）、DNCL1（配列番号１８７）、PSMD8（配列番号１８８）、PSMB6（配列番号１８９）、PSMB1（配列番号１９０）、TCEB1（配列番号１９１）、EEF1B2（配列番号１９２、１９３）、NME1（配列番号１９４、１９５）、ATP5C1（配列番号１９６、１９７）、H2AFZ（配列番号１９８）、HMGB1（配列番号１９９）、CLIC1（配列番号２００）、NONO（配列番号２０１）、HINT1（配列番号２０２）、ATP5B（配列番号２０３）、NACA（配列番号２０４）、EIF4A1（配列番号２０５）、HSPCB（配列番号２０６）、EEF1G（配列番号２０７）、HSPCA（配列番号２０８）、COX6A1（配列番号２０９）、ENO1（配列番号２１０）、UBA52（配列番号２１１）、PFN1（配列番号２１２）、TPT1（配列番号２１３）、CFL1（配列番号２１４）、NSEP1（配列番号２１５）、NPM1（配列番号２１６、２１７）、EEF1A1（配列番号２１８）、OAZ1（配列番号２１９）、及びWNT2B（配列番号２２０、２２１）からなる群から選択される遺伝子であることを特徴とする方法を提供する。
【００２４】
上記発明の一の実施形態において、上記診断用遺伝子若しくは診断用候補遺伝子又は定常発現遺伝子の発現量が、該遺伝子、その変異体、そのＲＮＡ、そのｃＤＮＡ、その相補的ポリヌクレオチド、それとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及びそれらの少なくとも１５塩基の断片からなる群から選択される核酸を使用して測定されることを特徴とする。
【００２５】
上記発明の別の実施形態において、上記診断用遺伝子若しくは診断用候補遺伝子又は定常発現遺伝子の発現量が、ハイブリダイゼーションによって測定されることを特徴とする。
【００２６】
上記発明の別の実施形態において、上記ハイブリダイゼーションが、ＤＮＡマイクロアレイを使用したハイブリダイゼーションであることを特徴とする。
【００２７】
上記発明の別の実施形態において、上記ステップ（１）において、少なくとも３種の定常発現遺伝子の発現量を測定することを特徴とする。
【００２８】
本発明はまた、第２の態様において、上記の定常発現遺伝子群（表１）から選択された少なくとも３種の定常発現遺伝子、それらの変異体、それらのＲＮＡ、それらのｃＤＮＡ、それらの相補的ポリヌクレオチド、それらの各々とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及びそれらの少なくとも１５塩基の断片からなる群から選択される核酸が、アレイの支持体上のそれぞれ定められた位置に固定化された状態で含むことを特徴とするＤＮＡマイクロアレイを提供する。
【００２９】
本発明はまた、第３の態様において、上記の定常発現遺伝子群（表１）、それらの変異体、それらのＲＮＡ、それらのｃＤＮＡ、それらの相補的ポリヌクレオチド、それらの各々とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド及びそれらの少なくとも１５塩基の断片からなる群から選択される核酸プローブが、アレイ上に含まれる全プローブ数の５０％以上を占有することを特徴とするＤＮＡマイクロアレイを提供する。
【００３０】
上記発明の一の実施形態において、上記ＤＮＡマイクロアレイに、疾患の診断用として既知の又は未知の少なくとも１種の遺伝子、その変異体、そのＲＮＡ、そのｃＤＮＡ、その相補的ポリヌクレオチド、それとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド及びそれらの少なくとも１５塩基の断片からなる群から選択される核酸を、アレイの支持体上の定められた別個の位置に固定化された状態でさらに含まれることを特徴とする。
【００３１】
上記発明の別の実施形態において、上記ＤＮＡマイクロアレイが疾患マーカーの検出用であることを特徴とする。
【００３２】
上記発明の別の実施形態において、上記ＤＮＡマイクロアレイが疾患の検出用であることを特徴とする。
【００３３】
本発明はさらに、第４の態様において、ヒト被検試料における疾患又は疾患マーカーの検出方法であって、上記の少なくとも１種の定常発現遺伝子（表１）の発現量に対する、少なくとも１種の診断用遺伝子又は診断用候補遺伝子の発現量の変動量を測定することを含む方法を提供する。
【００３４】
本発明はさらに、第５の態様において、ヒト被検試料中の細胞内遺伝子発現変動の測定における、上記の少なくとも１種の定常発現遺伝子（表１）、その変異体、そのＲＮＡ、そのｃＤＮＡ、その相補的ポリヌクレオチド、それとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドおよびそれらの少なくとも１５塩基の断片からなる群から選択される核酸の使用方法を提供する。
【００３５】
２．定義
本明細書中で使用する用語は、以下の定義を有する。
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡ及びＤＮＡのいずれも包含する核酸として用いられる。なお、上記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また上記ＲＮＡには、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ａＲＮＡ（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ＲＮＡ）、及び合成ＲＮＡのいずれもが含まれる。また、本明細書では、ポリヌクレオチドは核酸と互換的に使用される。
【００３６】
本明細書において「ｃＤＮＡ」とは、遺伝子の発現によって生じたＲＮＡに相補的な配列のＤＮＡ鎖全長、及びその部分配列からなるＤＮＡ断片、を包含する。ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡを鋳型にして、ポリＴプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲ(逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応)によって合成されうる。
【００３７】
本明細書において「遺伝子」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成する正鎖（又はセンス鎖）又は相補鎖（又はアンチセンス鎖）などの各１本鎖ＤＮＡを包含することを意図して用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。
【００３８】
従って、本明細書において「遺伝子」は、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）、該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、及びこれらの断片のいずれも含む。また該「遺伝子」は特定の塩基配列（又は配列番号）で示される「遺伝子」だけではなく、これらによってコードされるタンパク質と生物学的機能が同等であるタンパク質、例えば同族体（すなわち、ホモログ）、スプライスバリアントなどの変異体、及び誘導体をコードする「遺伝子」が包含される。これらの「遺伝子」はＨＵＧＯ（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｏｒｇａｎａｉｚａｔｉｏｎ）によって遺伝子名（Ｇｅｎｅ  Ｓｙｍｂｏｌ）が決定されており、Ｇｅｎｅ  Ｓｙｍｂｏｌから配列および配列番号（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号、Ｅｎｓａｍｂｌｅ登録番号など）を決定することが可能である。また、決定された配列からその同族体を得ることも、配列検索によって可能である。
【００３９】
例えばヒト由来のタンパク質の同族体（すなわち、ホモログ）又はそれをコードする遺伝子としては、当該タンパク質又はそれをコードするヒト遺伝子に対応する他生物種のタンパク質又は遺伝子が例示でき、これらのタンパク質又は遺伝子ホモログは、ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/ｈｏｍｏｌｏＧｅｎｅ/）により同定することができる。具体的には特定のヒトアミノ酸又は塩基配列をＢＬＡＳＴプログラム（Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ.Ｓ.Ａ.、 １９９３年、第９０巻、ｐ.５８７３-５８７７、 ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/ＢＬＡＳＴ/）にかけて一致する（Ｓｃｏｒｅが最も高く、Ｅ-ｖａｌｕｅが０でかつＩｄｅｎｔｉｆｙが１００％を示す）配列の登録番号（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ）を取得することができる。ＢＬＡＳＴプログラムとしては、ＢＬＡＳＴＮ（遺伝子）、ＢＬＡＳＴＸ(タンパク質)などが知られている。例えば、遺伝子検索の場合、上記ＢＬＡＳＴ検索からの登録番号をＵｎｉＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/ＵｎｉＧｅｎｅ/）に入力して得られたＵｎｉＧｅｎｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＤ（Ｈｓ．で示す番号）をＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅに入力する。結果として得られた他生物種遺伝子とヒト遺伝子との遺伝子ホモログの相関を示したリストから、特定の塩基配列で示されるヒト遺伝子に対応する遺伝子ホモログとして、他生物種の遺伝子を選抜することができる。またこの方法において、ＢＬＡＳＴプログラムの代わりにＦＡＳＴＡプログラム（ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈ／ｆａｓｔａ−ｅ．ｈｔｍｌ）を用いてもよい。
【００４０】
なお、「遺伝子」は、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン又はイントロンを含むことができる。
【００４１】
本明細書において「定常発現遺伝子」とは、ヒト生体由来組織、ヒト由来株化細胞、ヒト由来初代培養細胞など、ヒトから採取された生体組織に由来する複数の細胞において、そのｍＲＮＡの発現量が、絶対量の変動値にしてＣＶ４０％以内である遺伝子であり、具体的には、表１（上記）に示される遺伝子である。本発明においては、定常発現遺伝子は、診断用遺伝子又は診断用候補遺伝子の発現量の変化を検出又は測定するための参照遺伝子であるということができる。
【００４２】
本明細書において「診断用遺伝子」とは、ヒト生体由来組織、ヒト由来株化細胞、ヒト由来初代培養細胞など、ヒトから採取された生体組織に由来する複数の細胞において、疾患の罹患の有無、罹患の程度、疾患の性質を反映して、そのｍＲＮＡの発現量が変動（すなわち、増加又は減少）する遺伝子である。また、診断用候補遺伝子は、疾患のマーカーとなりうる可能性のある遺伝子を指す。
【００４３】
本明細書において「変動」とは、特に指定がない限り、参照遺伝子（又は比較対照）としての定常発現遺伝子の発現量と比べて、±１．３〜±５倍又はそれ以上、例えば±１．３、±１．５、±１．７、±２、±３、±４、±５倍、の数値変化を示すことを意味する。
【００４４】
本明細書において「転写産物」とは、遺伝子のＤＮＡ配列を鋳型にして合成されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のことをいう。ＲＮＡポリメラーゼが遺伝子の上流にあるプロモーターと呼ばれる部位に結合し、ＤＮＡの塩基配列に相補的になるように３'末端にリボヌクレオチドを結合させていく形でｍＲＮＡが合成される。このｍＲＮＡには遺伝子そのもののみならず、発現制御領域、コード領域、エキソン又はイントロンをはじめとする転写開始点からポリＡ配列の末端にいたるまでの全配列が含まれる。
【００４５】
本明細書において「プローブ」とは、遺伝子の発現によって生じたＲＮＡ又はそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に検出するために使用されるポリヌクレオチド及び／又はそれに相補的なポリヌクレオチドを包含する。
【００４６】
ここで相補的なポリヌクレオチド（相補鎖又は逆鎖）とは、配列番号１〜２２１によって定義される塩基配列からなるポリヌクレオチドの全長配列、又はその部分配列、（ここでは便宜上、これを正鎖と呼ぶ）に対してＡ：Ｔ（Ｕ）、Ｇ：Ｃといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味する。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズできる程度の相補関係を有するものであってもよい。
【００４７】
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、プローブが他の配列に対するよりも、検出可能により大きな程度（例えばバックグラウンドよりも少なくとも２倍）で、その標的配列に対してハイブリダイズする条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、ハイブリダイゼーションが行われる環境によって異なる。ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブに対して１００％相補的である標的配列が同定され得る。
【００４８】
本明細書において「変異体」とは、核酸の場合、多型性、突然変異、転写時の選択的スプライシングなどに起因した天然の変異体、あるいは遺伝暗号の縮重に基づく変異体、あるいはＧｅｎｅ  Ｓｙｍｂｏｌまたは配列番号１〜２２１から同定される塩基配列又はその部分配列において１以上、好ましくは１もしくは数個、の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含む変異体、あるいは該塩基配列又はその部分配列と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上の％同一性を示す変異体、あるいは該塩基配列又はその部分配列を含むポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドと上記定義のストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸を意味する。
【００４９】
本明細書において「数個」とは、約１０、９、８、７、６、５、４、３又は２個以下の整数を意味する。
【００５０】
本明細書において「％同一性」は、上記のＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡによる遺伝子の検索システムを用いて、ギャップを導入して又はギャップを導入しないで、決定することができる（Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら、１９９３年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、第９０巻、ｐ.５８７３-５８７７；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９０年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２１５巻、ｐ．４０３−４１０；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．ら、１９８８年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８５巻、ｐ.２４４４-２４４８）。
【００５１】
本明細書において「誘導体」とは、核酸の場合、蛍光団などによるラベル化誘導体、修飾ヌクレオチド(例えばハロゲン、メチルなどのアルキル、メトキシなどのアルコキシ、チオ、カルボキシメチルなどの基を含むヌクレオチドおよび塩基の再構成、二重結合の飽和、脱アミノ化、酸素分子の硫黄分子への置換などを受けたヌクレオチドなど)を含む誘導体などを意味する。
【００５２】
本明細書において「診断用遺伝子検出用核酸」又は「診断用候補遺伝子検出用核酸」とは、ヒト疾患の罹患の有無、罹患の程度もしくは改善の有無や改善の程度を診断するために、又は疾患の予防、改善又は治療に有用な候補物質をスクリーニングするために、直接又は間接的に利用しうる核酸をいう。これには疾患の罹患に関連して生体内、特に疾患が発生した組織において発現が変動する遺伝子を特異的に認識し、また結合することのできるヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドが包含される。これらのヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、上記性質に基づいて生体内、組織や細胞内などで発現した上記遺伝子を検出するためのプローブとして、また生体内で発現した上記遺伝子を増幅するためのプライマーとして有効に利用することができる。
【００５３】
本明細書において「被検試料」とは、生体より分離採取された生体材料、例えば生体組織、生体細胞、体液などを指し、好ましい被検試料は生体組織、特にヒト生体組織である。
【００５４】
本明細書において検出又は診断の対象となる「生体組織」とは、疾患の発生にともない疾患関連遺伝子の発現が変化する組織を指す。
【発明の効果】
【００５５】
本発明は、検査又は診断用のＤＮＡマイクロアレイにおいて、診断用遺伝子又は診断用候補遺伝子のみならず、定常発現遺伝子を搭載することにより、かかる定常発現遺伝子の発現量と診断用遺伝子又は診断用候補遺伝子の発現量を比較することによって、明確に、定常発現遺伝子の発現量に対する診断用遺伝子又は診断用候補遺伝子の発現変動を検知することを可能とし、さらにまた、ＤＮＡマイクロアレイに搭載する定常発現遺伝子数を診断用遺伝子又は診断用候補遺伝子の数よりも多く搭載することにより、バイアス（ゆがみ又は偏り）のないデータ解析を可能にし、その結果、診断効率を顕著に向上させることができるという格別の効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５６】
以下に本発明をさらに具体的に説明する
１．定常発現遺伝子検出用核酸
本発明の上記定義の定常発現遺伝子を検出するための核酸には、表１にＧｅｎＢａｎｋ登録番号とともに遺伝子名で表される、ZNF37A（配列番号１、２）、HTR2C（配列番号３）、HTR1A（配列番号４）、HUMMLC2B（配列番号５）、FY（配列番号６）、PRKCG（配列番号７）、BRD3（配列番号８）、AQP7（配列番号９）、TUB（配列番号１０、１１）、MPP2（配列番号１２）、MADD（配列番号１３〜２０）、ADRB3（配列番号２１）、DHX38（配列番号２２）、IKBKE（配列番号２３）、CCR9（配列番号２４、２５）、LTK（配列番号２６、２７）、HP（配列番号２８）、PPP1R8（配列番号２９〜３１）、MAP1A（配列番号３２）、RFC1（配列番号３３）、SMARCD1（配列番号３４、３５）、HSD17B3（配列番号３６）、DBT（配列番号３７）、COX10（配列番号３８）、DSIPI（配列番号３９、４０）、HD（配列番号４１）、POP1（配列番号４２）、UBTF（配列番号４３）、HLA-DOA（配列番号４４）、AANAT（配列番号４５）、RAF1（配列番号４６）、THAP11（配列番号４７）、PSCD2（配列番号４８、４９）、NUP62（配列番号５０〜５３）、ARHGEF1（配列番号５４〜５６）、UNC119（配列番号５７、５８）、NUP188（配列番号５９）、GCGR（配列番号６０）、PTPRN（配列番号６１）、DPF2（配列番号６２）、PSD（配列番号６３）、CCNA2（配列番号６４）、TPR（配列番号６５）、RING1（配列番号６６）、RABGGTA（配列番号６７、６８）、CD36（配列番号６９〜７１）、BAD（配列番号７２、７３）、AQP2（配列番号７４）、DRG2（配列番号７５）、CCL22（配列番号７６）、KIAA0056（配列番号７７）、KIAA0063（配列番号７８）、CREB3（配列番号７９）、TIAL1（配列番号８０、８１）、GRM4（配列番号８２）、IRF3（配列番号８３）、R3HDM（配列番号８４）、PMS2L11（配列番号８５）、GSK3A（配列番号８６）、MARS（配列番号８７）、ATM（配列番号８８〜９０）、CASC3（配列番号９１）、KIAA0195（配列番号９２）、MRPL49（配列番号９３）、DDB1（配列番号９４）、TSFM（配列番号９５）、TRAF4（配列番号９６、９７）、GRB2（配列番号９８、９９）、HYAL2（配列番号１００、１０１）、RNF10（配列番号１０２）、PPP4C（配列番号１０３）、DNMT1（配列番号１０４）、POFUT1（配列番号１０５、１０６）、SUMO1（配列番号１０７〜１０９）、DCTN2（配列番号１１０）、PSMD7（配列番号１１１）、CLPP（配列番号１１２）、MCM6（配列番号１１３）、AAMP（配列番号１１４）、EBP（配列番号１１５）、CCT7（配列番号１１６、１１７）、DCTD（配列番号１１８）、ADRM1（配列番号１１９、１２０）、PLK1（配列番号１２１）、RNPS1（配列番号１２２、１２３）、CCT2（配列番号１２４）、HNRPC（配列番号１２５、１２６）、OPRS1（配列番号１２７〜１３１）、CKAP1（配列番号１３２）、USP11（配列番号１３３）、TTC1（配列番号１３４）、KPNB1（配列番号１３５）、KHDRBS1（配列番号１３６）、LMNB2（配列番号１３７）、POLR2K（配列番号１３８）、ZNF91（配列番号１３９）、PSMA2（配列番号１４０）、SEC61B（配列番号１４１）、PSMC5（配列番号１４２）、SFRS3（配列番号１４３）、SSBP1（配列番号１４４）、CSE1L（配列番号１４５、１４６）、CCT5（配列番号１４７）、PSMA1（配列番号１４８、１４９）、ATP5F1（配列番号１５０〜１５２）、PSMC1（配列番号１５３）、NEFL（配列番号１５４）、MLF2（配列番号１５５）、AP2S1（配列番号１５６、１５７）、CSNK2B（配列番号１５８）、HRMT1L2��配列番号１５９〜１６１）、ILF2（配列番号１６２）、BAT1（配列番号１６３、１６４）、G10（配列番号１６５）、CANX（配列番号１６６）、CAPNS1（配列番号１６７、１６８）、EIF3S8（配列番号１６９）、TRIM28（配列番号１７０）、CCT3（配列番号１７１〜１７３）、PCBP2（配列番号１７４、１７５）、CCT4（配列番号１７６）、TUFM（配列番号１７７）、PFDN5（配列番号１７８〜１８０）、WBSCR1（配列番号１８１、１８２）、FUS（配列番号１８３、１８４）、IMPDH2（配列番号１８５）、PSMB3（配列番号１８６）、DNCL1（配列番号１８７）、PSMD8（配列番号１８８）、PSMB6（配列番号１８９）、PSMB1（配列番号１９０）、TCEB1（配列番号１９１）、EEF1B2（配列番号１９２、１９３）、NME1（配列番号１９４、１９５）、ATP5C1（配列番号１９６、１９７）、H2AFZ（配列番号１９８）、HMGB1（配列番号１９９）、CLIC1（配列番号２００）、NONO（配列番号２０１）、HINT1（配列番号２０２）、ATP5B（配列番号２０３）、NACA（配列番号２０４）、EIF4A1（配列番号２０５）、HSPCB（配列番号２０６）、EEF1G（配列番号２０７）、HSPCA（配列番号２０８）、COX6A1（配列番号２０９）、ENO1（配列番号２１０）、UBA52（配列番号２１１）、PFN1（配列番号２１２）、TPT1（配列番号２１３）、CFL1（配列番号２１４）、NSEP1（配列番号２１５）、NPM1（配列番号２１６、２１７）、EEF1A1（配列番号２１８）、OAZ1（配列番号２１９）、及びWNT2B（配列番号２２０、２２１）、あるいはそれらの同族体、それらのＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ａＲＮＡ）又はｃＤＮＡ、あるいはそれらの変異体又は誘導体、あるいはそれらの相補的ポリヌクレオチド、あるいはそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、あるいはそれらの少なくとも１５塩基の断片、が含まれる。ここで、遺伝子、同族体、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、変異体及び誘導体は、上記定義のとおりである。好ましい核酸は、上記遺伝子名で表されるヒト遺伝子、それらの転写産物（ｍＲＮＡ）又はｃＤＮＡ、より好ましくは該転写産物又はｃＤＮＡである。
【００５７】
本発明において定常発現遺伝子となる上記遺伝子はいずれも、ヒト由来株化ガン細胞での発現レベルが変動係数４０％以内に抑制されているものである。それゆえ、本発明の定常発現遺伝子は、限定された数の診断用遺伝子又は診断用候補遺伝子のみが搭載されている検査又は診断用のＤＮＡマイクロアレイ上に、さらに加えて搭載することにより、測定データの解析において有効に使用することができる。
【００５８】
本発明において定常発現遺伝子を検出するために使用可能なプローブはさらに,表１に示す遺伝子名で定義される遺伝子群及びその塩基配列に相補的ポリヌクレオチド群、該塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でそれぞれハイブリダイズするポリヌクレオチド群及びその相補的ポリヌクレオチド群、ならびにそれらのポリヌクレオチド群の塩基配列において例えば１５以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上、１２０以上、１５０以上、２００以上、２５０以上又は３００以上の連続した塩基からなるポリヌクレオチド断片群から選ばれた１又は複数のポリヌクレオチドの組み合わせを含むことができる。
【００５９】
本発明において使用可能な定常発現遺伝子検出用核酸は、例えば以下の（１）から（３）の１又は複数のポリヌクレオチド又はその断片を含むことができる。
（１）表１に示す遺伝子名で定義されるポリヌクレオチド群、それらの変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
（２）表１に示す遺伝子名で定義されるポリヌクレオチド群に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド群、それらの変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
（３）表１に示す遺伝子名で定義されるポリヌクレオチド群の各々と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド群、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
【００６０】
あるいは、本発明で使用可能な定常発現遺伝子検出用核酸の好ましい例は、以下の（１）及び（２）のポリヌクレオチドである。
(１)表１に示す遺伝子名で定義されるポリヌクレオチド群の塩基配列又はその相補的配列の各々において、１５以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
(２)表１に示す遺伝子名で定義されるポリヌクレオチド群の塩基配列又はその相補的配列の各々において、６０以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
【００６１】
本発明で使用される上記ポリヌクレオチド類又はその断片類はいずれもＤＮＡでもよいしＲＮＡでもよい。
【００６２】
本発明における定常発現遺伝子又はその検出用核酸は、ＤＮＡ組換え技術、ＰＣＲ法、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機による方法などの一般的な技術を用いて作製することができる。
【００６３】
ＤＮＡ組換え技術及びＰＣＲ法は、例えばＡｕｓｕｂｅｌら，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ＵＳ  （１９９３）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ    Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ＵＳ  （１９８９）などに記載される技術を使用することができる。
【００６４】
表１に列挙される遺伝子は、本発明におけるような用途については知られていないものの、配列自体は公知であり、またその取得方法も知られている。このため、これらの遺伝子をクローニングすることによって、本発明の方法及びＤＮＡマイクロアレイで使用するための核酸を作製することができる。
【００６５】
具体的には、本発明における定常発現遺伝子検出用核酸は、ＤＮＡ自動合成装置を用いて化学的に合成することができる。この合成には一般にホスホアミダイト法が使用され、この方法によって約１００塩基までの一本鎖ＤＮＡを自動合成することができる。ＤＮＡ自動合成装置は、例えばＰｏｌｙｇｅｎ社、ＡＢＩ社、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社などから市販されている。
【００６６】
あるいは、本発明の定常発現遺伝子検出用核酸は、ｃＤＮＡクローニング法によって作製することもできる。本発明において標的である上記遺伝子が発現される食道組織などの生体組織から抽出した全ＲＮＡをオリゴｄＴセルロースカラムで処理して得られるポリＡ（＋）ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法によってｃＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーからハイブリダイゼーションスクリーニング、発現スクリーニング、抗体スクリーニングなどのスクリーニングによって目的のｃＤＮＡクローンを得ることができる。必要に応じて、ｃＤＮＡクローンをＰＣＲ法によって増幅することもできる。プローブ又はプライマーは、配列番号１〜２２１に示される塩基配列に基づいて１５〜１００塩基の連続する配列の中から選択し、合成しうる。ｃＤＮＡクローニング技術は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．& Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ． 著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１年１月１５日発行、の 第１巻７．４２〜７．４５、第２巻８．９〜８．１７に記載されている。
【００６７】
２．診断用遺伝子又は診断用候補遺伝子及びその検出用核酸
ある種の疾患又はその診断に有用なマーカー（若しくは指標）を見出すために、本発明を使用することができる。かかる候補マーカーが診断用候補遺伝子であり、及び、診断に有用であることが証明されたマーカーが診断用遺伝子である。
【００６８】
本発明において、診断用遺伝子又は診断用候補遺伝子は、任意の疾患を検出又は診断することができるあらゆる遺伝子を包含する。疾患は、以下のものに限定されないが、例えば、悪性又は良性腫瘍、血液疾患、各種臓器（脳、心臓、胃、腸、肝臓、腎臓、肺、膵臓、脾臓など）の疾患、生殖器疾患、婦人病、遺伝病、皮膚疾患、呼吸器疾患、循環器疾患、炎症性疾患、感染症、神経変性症、などを含むことができる。本発明で使用される診断用遺伝子又は診断用候補遺伝子は、例示されるような任意の疾患の検出又は診断を可能にする遺伝子又は候補遺伝子である。そのような遺伝子の例として、既知の腫瘍マーカー、例えばＣＥＡ、ケラチン１９などが挙げられる。
【００６９】
診断用遺伝子又は診断用候補遺伝子を検出するための核酸は、該遺伝子又はその変異体、それらのＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ａＲＮＡを含む）、それらのｃＤＮＡ、及びそれらの塩基配列に相補的ポリヌクレオチド、該塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でそれぞれハイブリダイズするポリヌクレオチド及びその相補的ポリヌクレオチド、ならびにそれらのポリヌクレオチドの塩基配列において例えば１５以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上、１２０以上、１５０以上、２００以上、２５０以上又は３００以上の連続した塩基からなるポリヌクレオチド断片からなる群から選ばれた１又は複数のポリヌクレオチドの組み合わせを含むことができる。
【００７０】
これらの核酸は、「１．定常発現遺伝子検出用核酸」の項に記載したのと同様の手法で作製することができる。
【００７１】
３．ＤＮＡマイクロアレイ
本発明はさらに、疾患又は疾患の指標若しくはマーカーの検出に使用されるＤＮＡマイクロアレイであって、表１において記載された遺伝子群から選択された少なくとも１種又は２種、好ましくは少なくとも３種、４種、５種、６種、７種、８種又は９種、より好ましくは少なくとも１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種又は１９種、さらに好ましくは少なくとも２０種から全数、の定常発現遺伝子、それらの変異体、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ａＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、相補的ポリヌクレオチド、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及びそれらの少なくとも１５塩基の断片からなる群から選択される核酸が、該アレイの支持体上のそれぞれ定められた位置に固定化された状態で含まれるＤＮＡマイクロアレイを提供する。
【００７２】
本発明の実施形態によれば、上記ＤＮＡマイクロアレイにおいて、好ましくは、疾患の検出又は診断用として既知の又は未知の少なくとも１種の遺伝子、その変異体、そのＲＮＡ、そのｃＤＮＡ、その相補的ポリヌクレオチド、それとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド及びそれらの少なくとも１５塩基の断片からなる群から選択される核酸を、アレイの支持体上の定められた別個の位置に固定化された状態でさらに含むことができる。
【００７３】
本発明の別の実施形態によれば、上記ＤＮＡマイクロアレイにおいて、好ましくは、上記の定常発現遺伝子群、それらの変異体、それらのＲＮＡ、それらのｃＤＮＡ、それらの相補的ポリヌクレオチド、それらの各々とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド及びそれらの少なくとも１５塩基の断片からなる群から選択される核酸プローブが、アレイ上に含まれる全プローブ数の５０％以上、例えば５０％から６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％までを占有することができる。ここで、残りの核酸プローブは、診断用遺伝子又は診断用候補遺伝子の検出用プローブであってもよいし、又は他の任意のプローブ、又はそれらの組み合わせとしうる。本発明においては、通常、定常発現遺伝子検出用プローブの数が、診断用遺伝子又は診断用候補遺伝子の検出用プローブの数よりも多いことが好ましい。
【００７４】
ＤＮＡマイクロアレイ上で、疾患の検査又は診断用の上記核酸を、ヒト被検試料中の測定すべき診断用遺伝子又は診断用候補遺伝子（好ましくは、標識された転写産物又はｃＤＮＡ調製物）とハイブリダイズさせて該遺伝子の発現量の変動を測定するとき、本発明の特徴である上記定常発現遺伝子の発現量に対する変動量として、該診断用遺伝子又は診断用候補遺伝子の発現の変化を精確に測定することが可能になる。
【００７５】
本発明のＤＮＡマイクロアレイを使用することによって、既知の診断用遺伝子を対象とするときには、疾患の検出が可能になるし、一方、未知の診断用候補遺伝子を対象とするときには、疾患マーカーの検出が可能になる。
【００７６】
ここで、固定化された状態とは、共有結合又は非共有結合を介してポリヌクレオチドが支持体上に結合している状態をいう。好ましい結合は、共有結合である。
【００７７】
ＤＮＡマイクロアレイの基板としては、ＤＮＡを固相化できるものであれば特に制限はなく、スライドガラス、シリコン製チップ、ポリマー製チップ及びナイロンメンブレンなどを例示することができる。またこれらの基盤には、前もって、ポリＬリジンコートやアミノ基、カルボキシル基などの官能基導入などの表面処理が施されていてもよい。
【００７８】
また固相化法については一般に用いられる方法であれば特に制限はなく、スポッター又はアレイヤーと呼ばれる高密度分注機を用いてＤＮＡをスポットする方法や、ノズルより微少な液滴を圧電素子などにより噴射する装置（インクジェット）を用いてＤＮＡを基板に吹き付ける方法、又は基板上で順次ヌクレオチド合成を行う方法を例示することができる。高密度分注機を用いる場合には、例えば多数のウエルを持つプレートのおのおののウエルに異なった遺伝子溶液を入れておき、この溶液をピン（針）で取り上げて基板上に順番にスポットすることによる。インクジェット法では、ノズルより遺伝子を噴射し，基板上に高速度で遺伝子を整列配置することによる。基板上でのＤＮＡ合成は、基板上に結合した塩基を光によって脱離する官能基で保護し、マスクを用いることにより特定部位の塩基だけに光を当て、官能基を脱離させ、その後、塩基を反応液に加えて、基板上の塩基とカップリングさせる工程を繰り返すことによって行うことができる。
【００７９】
固相化される核酸は、上で説明した本発明の全てのポリヌクレオチドである。例えば、そのようなポリヌクレオチドは、以下の１又は複数のポリヌクレオチド又はその断片を含むことができる。
【００８０】
本発明において、固相化される核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ａＲＮＡ）、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡのいずれでもよいし、あるいは１本鎖でもよいし又は２本鎖でもよい。
【００８１】
測定すべき遺伝子、ＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現レベルを検出、測定することができるＤＮＡチップの例としては、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｅ Ｃｈｉｐ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ Ａｒｒａｙ、Ａｇｉｌｅｎｔ社のＷｈｏｌｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｏｌｉｇｏ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ、タカラバイオ社のＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅ（登録商標） ＨＳ Ｈｕｍａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＣＨＩＰなどを挙げることができるが、これらに制限されないものとする。
【００８２】
ＤＮＡマイクロアレイの作製について、例えば予め調製したプローブを固相表面に固定化する方法を使用することができる。予め調製したポリヌクレオチドプローブを固相表面に固定化する方法では、官能基を導入したポリヌクレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面にオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを点着し、共有結合させる（例えば、Ｊ．Ｂ．Ｌａｍｔｕｒｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４年、第２２巻、第２１２１〜２１２５頁、Ｚ．Ｇｕｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４年、第２２巻、第５４５６〜５４６５頁）。ポリヌクレオチドは、一般的には、表面処理した固相担体にスペーサーやクロスリンカーを介して共有結合される。ガラス表面にポリアクリルアミドゲルの微小片を整列させ、そこに合成ポリヌクレオチドを共有結合させる方法も知られている（Ｇ．Ｙｅｒｓｈｏｖら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９６年、第９４巻、第４９１３頁）。また、シリカマイクロアレイ上に微小電極のアレイを作製し、電極上にはストレプトアビジンを含むアガロースの浸透層を設けて反応部位とし、この部位をプラスに荷電させることでビオチン化ポリヌクレオチドを固定し、部位の荷電を制御することで、高速で厳密なハイブリダイゼーションを可能にする方法も知られている（Ｒ．Ｇ．Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９７年、第９４巻、第１１１９〜１１２３頁）。
【００８３】
４．疾患又は疾患マーカーの検出
本発明はまた、本発明の特徴である表１に記載の定常発現遺伝子を利用した疾患又は疾患マーカーの検出方法、細胞内遺伝子発現変動の測定などに使用できる。
【００８４】
具体的には、本発明は、
（１）ヒト被検試料における疾患マーカーの検出方法であって、上記の少なくとも１種の定常発現遺伝子の発現量に対する、少なくとも１種の診断用遺伝子又は診断用候補遺伝子の発現量の変動量を測定することを含む方法、あるいは、
（２）ヒト被検試料中の細胞内遺伝子発現変動の測定における、上記の少なくとも１種の定常発現遺伝子、その変異体、そのＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ａＲＮＡ）、そのｃＤＮＡ、その相補的ポリヌクレオチド、それとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドおよびそれらの少なくとも１５塩基の断片からなる群から選択される核酸の使用方法、
を提供する。
【００８５】
本発明において、ヒト被検試料における疾患又は疾患マーカーの検出方法は、下記のステップ：
（１）被検試料において少なくとも１種の診断用遺伝子又は診断用候補遺伝子の発現量および、下記の遺伝子群から選択された少なくとも１種の定常発現遺伝子の発現量を測定するステップ、
（２）該診断用遺伝子又は診断用候補遺伝子の発現量と該定常発現遺伝子の発現量とを比較し、それにより定常発現遺伝子の発現量に対する該診断用遺伝子又は診断用候補遺伝子の発現量の変動量を決定するステップ、及び
（３）前記ステップ（２）で決定された該診断用遺伝子又は診断用候補遺伝子の発現量の変動量を指標として、疾患を検出する、或いは該被検試料中の該診断用候補遺伝子を疾患マーカーとして検出する、ステップ、
を含み、
ここで、該定常発現遺伝子は、表１に記載の遺伝子からなる群から選択される遺伝子であることを特徴とする。
【００８６】
本発明の上記方法は、上記定常発現遺伝子を検出可能にするための核酸を参照遺伝子として使用して、ハイブリダイゼーション法、例えばＤＮＡマイクロアレイ、ノーザンブロット、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなど、あるいは定量ＲＴ-ＰＣＲ法を用いて実施されうる。好ましいハイブリダイゼーションは、ＤＮＡマイクロアレイを使用するハイブリダイゼーションである。本発明で使用可能なＤＮＡマイクロアレイは、上記「３．ＤＮＡマイクロアレイ」の項に記載したように作製することができる。
【００８７】
本発明のＤＮＡマイクロアレイに含まれるポリヌクレオチドプローブのサイズは、１５塩基〜全配列の塩基数、好ましくは２５〜１０００塩基、より好ましくは２５〜１００塩基の塩基長を有するものが例示できるが、この範囲に限定されない。
【００８８】
定量ＲＴ-ＰＣＲ法を使用する場合、プライマーのサイズは、通常１５〜５０塩基、好ましくは１５〜３０塩基、より好ましくは１８〜２５塩基の塩基長を有するものが例示できる。
【００８９】
測定のための被検試料としては、使用する検出方法の種類に応じて、被験者の生体組織の一部又は全部をバイオプシーなどで採取するか、もしくは手術によって摘出した生体組織から回収する。さらにそこから常法に従って調製した全ＲＮＡを用いてもよいし、さらに全ＲＮＡから調製される、ｃＤＮＡ、ポリＡ（＋）ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ａＲＮＡを含む各種のポリヌクレオチドを用いてもよい。
【００９０】
本発明の方法においては、生体組織における本発明の定常発現遺伝子又は診断用遺伝子若しくは診断用候補遺伝子、ＲＮＡ、ｃＤＮＡなどの核酸の発現量は、ＤＮＡマクロアレイを用いて検出あるいは定量することができる。この場合、本発明に関わる上記定常発現遺伝子（表１）又はそれらを検出するための上記核酸類は、ＤＮＡマイクロアレイの参照プローブとして使用することができる（例えば、アフィメトリックス社のＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ａｒｒａｙでは２５塩基の長さのポリヌクレオチドプローブが用いられる）。かかるＤＮＡマイクロアレイを生体組織から採取したＲＮＡをもとに調製される標識ＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズさせ、該ハイブリダイズによって形成された上記プローブと標識ＤＮＡ又はＲＮＡとの複合体を、該標識ＤＮＡ又はＲＮＡの標識を指標として検出することにより、生体組織中での本発明定常発現遺伝子の発現の有無又は発現レベル（発現量）を評価することができる。本発明の方法では、ＤＮＡチップを好ましく使用できるが、これは、ひとつの生体試料について同時に複数遺伝子の発現の有無又は発現レベルの評価が可能である。
【００９１】
本発明方法で用いられる被検試料としては、被験者の生体組織から調製される試料を挙げることができる。具体的には該組織から調製されるＲＮＡ含有試料、或いはそれからさらに調製されるポリヌクレオチドを含む試料は、被験者の生体組織の一部又は全部をバイオプシーなどで採取するか、もしくは手術によって摘出した生体組織から回収し、そこから常法に従って調製することができる。
【００９２】
本発明の方法は、測定対象として用いる生体試料の種類に応じて工程を変更することができる。
【００９３】
測定対象物としてＲＮＡを利用する場合、発現遺伝子の検出は、例えば下記のステップ：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡ又はそれから転写された相補的ポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ）を、本発明のＤＮＡマイクロアレイ上のポリヌクレオチドと結合させるステップ、
（ｂ）該ポリヌクレオチドに結合した生体試料由来のＲＮＡ又は該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを、上記ポリヌクレオチドをプローブとして用いて測定するステップ、
（ｃ）上記（ｂ）の測定により得られた、定常発現遺伝子の発現量データを用いて、マイクロアレイ上の遺伝子発現量を補正するステップ、
（ｄ）上記（ｃ）の補正によって整理された遺伝子発現量データについて、定常発現遺伝子の発現量と、診断用遺伝子又は診断用候補遺伝子の発現量を比較するステップ、
を含むことができる。
【００９４】
本発明において、ＤＮＡマイクロアレイ解析を利用する場合は、上記定義の定常発現遺伝子および診断用遺伝子を検出するためのＤＮＡプローブ（一本鎖又は二本鎖）を基板に貼り付けたＤＮＡマイクロアレイを用いる。遺伝子群を基板に固相化したものには、一般にＤＮＡチップ及びＤＮＡマイクロアレイという名称があるが、本明細書ではＤＮＡマイクロアレイといった場合、ＤＮＡチップを含むものとする。
【００９５】
ハイブリダイゼーション条件は、限定されないが、例えば３０℃〜５０℃で、３〜４×ＳＳＣ、０．１〜０．５％ ＳＤＳ中で１〜２４時間のハイブリダイゼーション、より好ましくは４０℃〜４５℃で、３．４×ＳＳＣ、０．３％ＳＤＳ中で１〜２４時間のハイブリダイゼーション、そしてその後の洗浄を含む。洗浄条件としては、例えば、２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳを含む溶液、及び１×ＳＳＣ溶液、０．２×ＳＳＣ溶液による室温での連続した洗浄などの条件を挙げることができる。ここで、１×ＳＳＣは、１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む水溶液（ｐＨ７．２）である。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが望ましい。具体的にはこのような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の同一性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
【００９６】
また、本発明に関わる遺伝子、そのＲＮＡ又はそのｃＤＮＡを定量するための定量ＲＴ-ＰＣＲを実施する際のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、例えば１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭＫＣｌ、１〜２ｍＭ  ＭｇＣｌ２などの組成のＰＣＲバッファーを用い、プライマーの配列から計算されたＴｍ＋５〜１０℃において１５秒から１分程度処理することなどが挙げられる。かかるＴｍの計算方法としてＴｍ＝２×(アデニン残基数＋チミン残基数)＋４×(グアニン残基数＋シトシン残基数)などが挙げられる。
【００９７】
これらのハイブリダイゼーションにおける「ストリンジェントな条件」の他の例については、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． & Ｒｕｓｓｅｌ， Ｄ． 著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１年１月１５日発行、の 第１巻７．４２〜７．４５、第２巻８．９〜８．１７などに記載されており、本発明において利用できる。
【００９８】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、それらの実施例によって制限されないものとする。
【実施例】
【００９９】
ＤＮＡマイクロアレイ解析データの抽出
６０種のヒト由来株化細胞（表２）の発現遺伝子７１２９種について、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）を用い、発現量の解析を行った（ｈｔｔｐ：／／ｄｉｓｃｏｖｅｒ.ｎｃｉ.ｎｉｈ.ｇｏｖ／ｄａｔａｓｅｔｓＰｎａｓ２００１.ｊｓｐ）。公表されたデータはそれぞれの遺伝子発現量についてグローバル・ノーマライゼーションを行い、発現量の絶対値を補正した後のデータである。このデータを利用して（発現量がマイナスのデータについては発現量０と見なした）、各遺伝子の６０細胞株間での発現量平均値、およびＣＶ値を算定した。ＣＶ値４０以下の遺伝子１５９種について、平均発現量とＣＶ値を表３に示す。これら１５９種の遺伝子には、今回新規に見出した１５７種（配列番号１〜２２１）の定常発現遺伝子に加えて、定常発現遺伝子として既知であるＡＣＴＢ（配列番号２２２）およびＧＡＰＤ（配列番号２２３）が含まれる。
【０１００】
【表２】
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【０１０１】
【表３】
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【０１０２】
定常発現遺伝子群を搭載したＤＮＡマイクロアレイの作製
上記の処理によって得たＣＶ値４０以下定常発現遺伝子１５９種（表１）、および診断用遺伝子４０種によるＤＮＡマイクロアレイを作製し、各種ヒト由来株化細胞においてそれぞれの遺伝子発現を検討した。抽出した１５９種の遺伝子について、配列の重複をおこさないように配列特異性が高い部位の配列６０〜７０残基をそれぞれ選択して合成した。これらの合成オリゴＤＮＡを、凹凸構造を持つポリメチルメタクリレート製ＤＮＡチップ基板（東レ株式会社、特開２００４−２６４２８９）の凸部にスポッターを用いてスポットした。
【０１０３】
ターゲットａＲＮＡの調製
胃ガン由来株化細胞株（ＨＳＣ４３）および食道ガン由来株化細胞株（ＴＥ２）から、Ｔｒｉｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、同社推奨のプロトコールにより全ＲＮＡを調製した。
【０１０４】
上述の方法で得られた全ＲＮＡ０．５μgについて、Ａｍｂｉｏｎ Ａｍｉｎｏ Ａｌｌｙｌ ａＲＮＡ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いてメーカー推奨のプロトコールで１ラウンドＩＶＴ反応によるａＲＮＡ合成を行った。また、株化細胞由来の全ＲＮＡにはＣｙ３−ｄＵＴＰ（ＧＥヘルスケア社）を、リファレンス全ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）にはＣｙ５−ｄＵＴＰ（ＧＥヘルスケア社）を添加して、メーカー推奨のプロトコールでａＲＮＡの標識を行った。標識されたａＲＮＡはマイクロコンＹＭ３０（ミリポア社）で精製してからハイブリダイゼーションに用いた。
【０１０５】
ハイブリダイゼーション
標識したａＲＮＡ０．１μgと上記ＤＮＡチップを用い、４２℃で１６時間ハイブリダイズを行った。ハイブリダイズ終了後、ＤＮＡチップを２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、１×ＳＳＣ、０．２×ＳＳＣで順次洗浄した。
【０１０６】
遺伝子発現量の測定
上述の方法によりハイブリダイゼーションを行ったＤＮＡチップをＡｇｉｌｅｎｔマイクロアレイスキャナー（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いてスキャンし、画像を取得して蛍光強度を数値化した。統計学的処理はＳｐｅｅｄ Ｔ．著「Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｄａｔａ」Ｃｈａｐｍａｎ & Ｈａｌｌ/ＣＲＣ、及びＣａｕｓｔｏｎ Ｈ．Ｃ．ら著「Ａ ｂｅｇｉｎｎｅｒ’ｓ ｇｕｉｄｅ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ」Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇを参考にして行った。すなわちハイブリダイズ後の画像解析から得られたデータについて、それぞれの対数値をとり、グローバルノーマライゼーションとＬｏｗｅｓｓ補正法による平滑化を行い、ＭＡＤによるスケーリング処理によってノーマライゼーション補正を行った。
【０１０７】
その結果、胃ガン細胞株（図１）、大腸ガン細胞株（図２）に示すようなＭ−Ａプロットを得ることができた。この際、定常発現遺伝子として想定した遺伝子群はＭ値において−２〜２の範囲内でのみ変動し、診断用遺伝子として想定した遺伝子群は、−２以下、または２以上の変動値を示した。したがって、定常発現遺伝子の変動量と比較することにより、確実なガン細胞の存在を検出可能であった。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明により、定常的に発現している遺伝子を提供することができ、診断用遺伝子又は診断用候補遺伝の発現変動を解析するための方法を提供することができるため、診断用遺伝子又は診断用候補遺伝子の発現変動を指標としたヒト疾患の検査・診断、あるいは疾患マーカーの検出、などに非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】胃ガン細胞株ＨＳＣ４３についての発現量−発現強度連関図（Ｍ−Ａプロット、黒印：診断用遺伝子、白印：定常発現遺伝子）。縦軸に示したＭ（すなわち、Ｍｉｎｕｓ）は各遺伝子の対照と検体における測定値のログ値の差を示し、横軸に示したＡ（すなわち、Ａｄｄ）はそれぞれの測定値のログ値の和を示す。
【図２】食道ガン細胞株ＴＥ２についての発現量−発現強度連関図（Ｍ−Ａプロット、黒印：診断用遺伝子、白印：定常発現遺伝子）。縦軸に示したＭ（すなわち、Ｍｉｎｕｓ）は各遺伝子の対照と検体における測定値のログ値の差を示し、横軸に示したＡ（すなわち、Ａｄｄ）はそれぞれの測定値のログ値の和を示す。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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