(57)【要約】      （修正有）【課題】同一の標的核酸における異なる領域を検出できるプローブセットにおいても、異なるプローブの固定領域に形成される各ハイブリッド体の安定性が均一で、各ハイブリッド体で同じレベルの検出感度が得られるプローブ担体を提供する。【解決手段】一の標的核酸の第一の領域を検出するための第一のプローブと、該第一の領域とは異なる第二の領域を検出するための第二のプローブとが、固相上の互いに離間した閉じた第一の領域および第二の領域に各々配置されているプローブ担体であって、前記第一の領域に配置されている第一のプローブの量と、該第二の領域に配置されている第二のプローブの量とが互いに異なっていることを特徴とするプローブ担体を提供する。【選択図】図２
2007029032.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一の標的核酸の第一の領域を検出するための第一のプローブと、該第一の領域と異なる第二の領域を検出するための第二のプローブとが、固相上の互いに離間した閉じた第一の領域および第二の領域に各々配置されているプローブ担体であって、
前記第一の領域に配置されている第一のプローブの量と、該第二の領域に配置されている該第二のプローブの量とが互いに異なっていることを特徴とするプローブ担体。
【請求項２】
前記第一のプローブの量および第二のプローブの量は、前記第一の領域の第一のプローブおよび前記第二の領域の第二のプローブを各々蛍光標識した前記標的核酸とハイブリダイズさせた時に、前記第一および第二の領域において観察される蛍光の輝度が同等もしくは実質的に同等となるように異なっている、請求項１記載のプローブ担体。
【請求項３】
ハイブリダイゼーション強度が相対的に該第一のプローブよりも低い該第二のプローブの量が、該第一のプローブの量よりも多い請求項1記載のプローブ担体。
【請求項４】
プローブとしてＤＮＡを用いる請求項１〜３のいずれかに記載のプローブ担体。
【請求項５】
プローブとしてＲＮＡを用いる請求項１〜３のいずれかに記載のプローブ担体。
【請求項６】
プローブとしてＰＮＡを用いる請求項１〜３のいずれかに記載のプローブ担体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のプローブ担体の製造方法であって、
該第一のプローブを含む第一の液体及び該第二のプローブを含む第二の液体を該固相上に吐出して該第一および第二の領域を形成する工程を含み、
該第一の液体と該第二の液体のプローブ濃度が互いに異なっていることを特徴とするプローブ担体の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜６の何れかに記載のプローブ担体の製造方法であって、
該第一のプローブを含む第一の液体および該第二のプローブを含む第二の液体を該固相上に吐出して該第一および第二の領域を形成する工程を含み、
該第一の液体の吐出量と、該第二の液体の吐出量とを変化させることを特徴とするプローブ担体の製造方法。
【請求項９】
（ｉ）請求項１〜６の何れかに記載のプローブ担体を標的核酸を含んでいる可能性のある検体とハイブリダイゼーションさせる工程；
（ｉｉ）前記工程（ｉ）により得られるプローブ担体の各領域におけるハイブリッドの存在を示すシグナルの有無並びに該シグナルの強度を測定する工程；
を有することを特徴とする標的核酸の検出方法。
【請求項１０】
（ｉ）請求項１〜６の何れかに記載のプローブ担体を標的核酸を含んでいる可能性のある検体とハイブリダイゼーション反応させる工程；
（ｉｉ）前記工程（ｉ）により得られるプローブ担体の各領域におけるハイブリッドの存在を示すシグナルの有無並びに該シグナルの強度を測定する工程；および
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）によって各領域におけるハイブリッドの存在を示すシグナルが認められた場合に、各領域における当該シグナルの強度を比較し、その強度の一致度に基づき該ハイブリッドの塩基配列の相補性を評価する工程；
を含む検体中の標的核酸の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検出対象となる核酸に対して複数のプローブを設けたプローブセットを固定したプローブ担体とその製造方法並びにそれを用いた標的核酸の検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年のヒトゲノム計画の完了や、他の生物種のゲノム解読計画の進展に伴い、特定の遺伝子の有無や発現量を検出することで、生命現象の解明や、医療行為への応用がなされるようになってきた。
【０００３】
検体に含まれる遺伝子の検出を行う方法として、様々な方法が考案されているが、その中で特に有用な方法としてしばしば用いられるのが、ハイブリダイゼーション反応を応用した方法である。具体的には検体の核酸配列(ターゲット)の部分配列に相補的な塩基配列を持つ核酸配列(プローブ)を用意し、ターゲットとプローブとがハイブリダイゼーションをするかどうかを標識等何らかの手段により検知することで、検体中の特定の核酸配列の有無を調べる方法である。
【０００４】
このプローブを固相上に固定または吸着させておき、その固相上に何らかの検出可能な標識を導入したターゲットを作用させ、固相上からその標識物質のシグナルを測定することにより検出する方法が代表的な固相上でのハイブリダイゼーションによる検出方法である。特に、プローブを固定する基板として、ガラスや樹脂や金属などの平板基板に固定したチップや、微少粒子表面に固定したビーズなどは、代表的な固相ハイブリダイゼーションの形態である。また標識物質として、蛍光物質や放射性同位元素等が用いられる場合が多い。
【０００５】
このような固相上にプローブを固定する際には、様々な遺伝子の塩基配列と特異的にハイブリッドを形成しうるプローブを多種大量に固定する事が可能である。そのため、このような固相上にプローブを固定したＤＮＡチップ法による実験を行うことで、同時に多項目の検出が可能となる。
【０００６】
同時に多項目の検出が可能であるという特徴から、様々な遺伝子解析研究にＤＮＡチップ法による実験が利用されている。例えば、ｃＤＮＡをプローブとして固定したＤＮＡチップを用いることで、ある細胞において現在発現している全てのｍＲＮＡの解析を網羅的に行うことが可能となる。このようなＤＮＡチップを用いることで、複数の検体間でのｍＲＮＡの発現量の比較を行ったり、時系列でのｍＲＮＡの発現の変化を正確に解析することが可能となる。
【０００７】
あるいは、部分的に同じ塩基配列を共有しているファミリー遺伝子を検出する際には、ファミリー遺伝子間で共通となる部分の塩基配列に相補的な配列を持つプローブと、ファミリー遺伝子間でもそれぞれの遺伝子に特異的となる部分の塩基配列に相補的な配列を持つプローブとを設定することにより、複数の検体間においてどのタイプのファミリー遺伝子が発現しているのかを正確に判断したりすることが可能となる。
【０００８】
また、感染症の起炎菌の判別を行う場合には、菌種、株、属など様々な生物学上の分類のレベルに合わせて共通な配列、あるいは特異的な配列を選択することにより、目的とする菌の判別を正確に行うことが可能になる。
【０００９】
以上のように、ｃＤＮＡをプローブとして用いたｍＲＮＡ検出を目的とするような一種類の標的核酸に対して一種類のプローブを用いることで網羅性を追及するＤＮＡチップがある一方で、ファミリー遺伝子の検出や感染症起炎菌の検出の例で説明したような、対象となる一種の配列の、複数の箇所を選択してプローブとして設定することにより、詳細に対象遺伝子の判別を行うことを目的とするＤＮＡチップの使い方もある。
【００１０】
同一の検出対象核酸に対して、複数のプローブを設定している実例としては、例えば米国アフィメトリックス社製のＤＮＡチップ(商品名：GeneChip)がある。当該ＤＮＡチップを用いた検出方法では、平面基板上に合成されたオリゴＤＮＡに対し、標識された核酸を作用させ、そのハイブリッド形成(ハイブリダイゼーション)を蛍光により検出することで、検体中に含まれる特定の核酸や量を検出している(特許文献１参照)。そして、同一の検出対象核酸に対して、約10から20種のプローブを設定し、それらのプローブから得られる信号を総合的に判定し、遺伝子の発現量を測定することが可能になっている。
【００１１】
このように、ＤＮＡチップにて使用するために設計されるプローブは、同時に多項目の検出を行うことを目的としていることから、全てのプローブの性能は均一であることが求められている。ハイブリッド形成(ハイブリダイゼーション)反応の条件を、プローブごとに均一にするために、プローブのＴｍをそれぞれ均一にすることが一般的である。
【００１２】
プローブのＴｍとは、二本鎖を形成している核酸が、熱変性して一本鎖になる際の融解温度のことであり、このＴｍは、ＤＮＡ配列における塩基の構成・長さに強く依存することが知られている。よって、プローブの核酸配列から、Ｔｍを最近接塩基対法・ＧＣ％法などにより、計算により予想することができる。ＤＮＡチップに固定する複数のプローブは、それぞれのＴｍが近似している方が検出操作の高い再現性を得られることが期待される。
【００１３】
実験の結果、ＤＮＡチップ上のハイブリダイゼーションを検出するためには、蛍光色素を用いることが一般的である。このような蛍光色素を用いた検出系の場合、ハイブリダイゼーション強度の強弱は、蛍光輝度の強弱によって得られる。
【特許文献１】米国特許第６４１０２２９号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
ハイブリダイゼーション反応においては、プローブの核酸配列と検体中の遺伝子ＤＮＡの核酸配列とが完全に一致している場合はいうまでもないが、一部がミスマッチとなっているような配列同士であっても、完全一致している配列と比較して比較的弱い強度で二本鎖を形成することがあり、その場合、低い蛍光輝度として検出される。
【００１５】
先述したような部分的に共通な配列を持つ複数の遺伝子群に対する実験や菌種の判別に関する実験などの場合、標的となる一の核酸の異なる複数の領域を検出できるような、該複数の領域に対して特異的に結合可能な複数の異なるプローブの設定が有効である。この場合において、複数の異なるプローブ間での、Ｔｍ値やプローブの全塩基に対するグアニン(Ｇ)あるいはシトシン(Ｃ)の含量(以下、ＧＣ％)に着目して設定した複数の異なるプローブの各々を固相上の互いに離間した閉じた領域に配置したプローブ担体を用いて該標的核酸と該固相上に配置した複数のプローブとのハイブリダイゼーション反応を行うと、各プローブを配置した領域に形成されるハイブリッド体の安定性にバラツキが生じることがあった。そのような場合、完全一致している塩基配列同士のハイブリッド体の形成であっても、比較的低い蛍光輝度として検出される可能性があり、完全一致であるがハイブリッド強度の低いプローブであるのか、または、ミスマッチを含んでいることによりハイブリッド強度が低くなっているプローブであるのか、区別が付き難い。
【００１６】
ＤＮＡチップにおける蛍光輝度の測定(すなわちハイブリッドの検出)においては、蛍光輝度を精細に測定できるスキャナを利用するが、一般にこのようなスキャナではＤＮＡチップの全面を一括してスキャンする方式を取っており、プローブごとに検出感度を変えて検出操作を行うことは不可能であり、完全一致であってもハイブリッド強度の低くなる傾向のあるプローブのみ検出感度を上げてスキャンを行うということはできない。
【００１７】
従って、同一の検出対象核酸における異なる領域を検出できるプローブセットにおいても、異なるプローブの固定領域に形成される各ハイブリッド体の安定性が均一で、各ハイブリッド体で同じレベルの検出感度が得られるプローブセットを備えたＤＮＡチップの提供が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
そこで本発明に係る目的の一つは、標的核酸をより高精度に検出することのできるプローブ担体及びその製造方法を提供する点にある。
【００１９】
また本発明の別の目的は、上記のプローブ担体を用いたより高精度な標識核酸の検出方法を提供する点にある。
【００２０】
本発明者は、上記の目的に対して、Ｔｍ値・ＧＣ％等を揃えたプローブセットにおいては、ターゲットの塩基配列とプローブの塩基配列が完全に一致している状態でも、ターゲットに対するプローブの位置によって検出されるハイブリダイゼーション強度には傾きがあるというこれまでの実験結果と、ＤＮＡチップ上に固定するプローブの量と検出される蛍光輝度に相関があるというこれまでの実験結果を踏まえて、標的核酸における各プローブの特異的結合領域の位置の情報、具体的には標的核酸の５'末端からの各特異的結合領域までの塩基数を元にして、固相上の互いに離間した閉じた領域内に配するプローブの量を調整することで、ハイブリダイゼーション検出時の蛍光輝度を均一化できることを見出した。本発明は、このような本発明者の知見に基づきなされたものである。
【００２１】
即ち、本発明の一態様によれば、一の標的核酸の第一の領域を検出するための第一のプローブと、該第一の領域とは異なる第二の領域を検出するための第二のプローブとが、固相上の互いに離間した閉じた第一の領域および第二の領域に各々配置されているプローブ担体であって、前記第一の領域に配置されている第一のプローブの量と、該第二の領域に配置されている第二のプローブの量とが互いに異なっていることを特徴とするプローブ担体が提供される。
【００２２】
本発明の他の態様によれば、上記のプローブ担体の製造方法であって、
該第一のプローブを含む第一の液体及び該第二のプローブを含む第二の液体を該固相上に吐出して該第一及び第二の領域を形成する工程を含み、該第一の液体と該第二の液体のプローブ濃度が互いに異なっていることを特徴とするプローブ担体の製造方法が提供される。
【００２３】
本発明の他の態様によれば、上記のプローブ担体の製造方法であって、
該第一のプローブを含む第一の液体及び該第二のプローブを含む第二の液体を該固相上に吐出して該第一及び第二の領域を形成する工程を含み、該第一の液体の吐出量と、該第二の液体の吐出量とを変化させることを特徴とするプローブ担体の製造方法が提供される。
【００２４】
また、本発明の他の態様によれば、
（ｉ）上記のプローブ担体を標的核酸を含んでいる可能性のある検体とハイブリダイゼーション反応させる工程；
（ｉｉ）前記工程（ｉ）により得られるプローブ担体の各領域におけるハイブリッドの存在を示すシグナルの有無並びに該シグナルの強度を測定する工程；
を有する標的核酸の検出方法が提供される。
【００２５】
更に本発明の他の態様によれば、
（ｉ）上記のプローブ担体を標的核酸を含んでいる可能性のある検体とハイブリダイゼーション反応させる工程；
（ｉｉ）前記工程（ｉ）により得られるプローブ担体の各領域におけるハイブリッドの存在を示すシグナルの有無並びに該シグナルの強度を測定する工程；及び
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）によって各領域におけるハイブリッドの存在を示すシグナルが認められた場合に、各領域における当該シグナルの強度を比較し、その強度の一致度に基づき該ハイブリッドの塩基配列の相補性を評価する工程、を含む検体中の標的核酸の検出方法が提供される。
【発明の効果】
【００２６】
本発明により、一の検出対象核酸(標的核酸)における特異的結合領域が異なる複数のプローブが搭載されているプローブ担体を用いてハイブリダイゼーション反応を行う場合において、より高い精度で該標的核酸の検出を行うことが出来る。また、このプローブ担体に固定されたプローブは、同一の検体に対して見かけ上、同レベルのハイブリッド体安定性を有するものとなる。これにより、ハイブリダイゼーションの検出結果から、検体中の遺伝子の配列とプローブの核酸配列とが完全に一致しているのか、ミスマッチがあるのかが分かりやすくなり、標的核酸の検出精度のより一層の向上に寄与する。すなわち、プローブに対してフルマッチのターゲットがハイブリダイゼーションした場合には、均一な蛍光輝度のデータが得られるようになり、また、ミスマッチのあるターゲットがハイブリダイゼーションした場合には、蛍光輝度が均一化されないことになる。よってハイブリダイゼーション反応の後にプローブ担体表面にハイブリッドが形成されたことを示す蛍光が観察されたときに、その蛍光がプローブと標的核酸とのフルマッチのハイブリッド由来のものであるのか、或いはミスマッチのハイブリッドであるのかの判定が容易になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明の実施形態について、図を用いて詳細に説明する。
【００２８】
図１は、ＤＮＡチップにおけるハイブリダイゼーション反応の模式図である。101はＤＮＡチップを示す。ＤＮＡチップ101上には複数のプローブ核酸102が固定されている。プローブ核酸102を構成する塩基はＤＮＡの場合はアデニン(＝Ａ)、シトシン(＝Ｃ)、グアニン(＝Ｇ)、チミン(＝Ｔ)の４種類であり、それぞれが水素結合できる(相補的である)塩基は「Ａ−Ｔ」「Ｃ−Ｇ」のペアとなっている。プローブ核酸102の塩基配列に対して、相補的な塩基配列を持つ一本鎖核酸103が試薬中にある場合、図１に示すように相補的な核酸配列を持つ部分で二本鎖を形成する。生体内においては、ＤＮＡは二本の核酸鎖が水素結合をすることで二重螺旋構造を取っているが、熱変化により二重螺旋をほどいて一本鎖核酸にしたり、一本鎖核酸を再び結合させたりすることが可能である。
【００２９】
ＤＮＡチップ上のハイブリダイゼーションについては、ターゲットとする一本鎖核酸103に化学的に蛍光色素104を標識することで、プローブ102の位置ごとにターゲット103の標識が検出されるかどうかを評価することで、検出を行うのが一般的である。図１では、標識104をターゲットの末端に導入しているが、標識の導入位置は末端に限定されるわけではない。また、図１ではＤＮＡチップ101基板上にはプローブが102の一本だけ設定されているが、固定されるプローブの数は一本に限定されるわけではない。
【００３０】
図２は、図１に示すようなＤＮＡチップにおけるハイブリダイゼーションを利用した、細菌を同定する方法を説明する模式図である。201は、未知の細菌の核酸202を含む試料である。203は細菌の同定を目的として作成されたＤＮＡチップであり、菌Ａの核酸に特有の塩基配列に相補的な塩基配列を持つプローブ204と、菌Ｂの核酸に特有の塩基配列に相補的な塩基配列を持つプローブ205とを有する。試料201にＤＮＡチップ202を適用しハイブリダイゼーション反応を起こさせた後に、どちらのプローブとハイブリダイゼーションをしたかを評価することで、未知の細菌の同定が可能である。図２の例では未知の細菌の核酸202はプローブ205と結合している(206に示す破線は、核酸の水素結合を意味するものとする)ため、この細菌は菌Ｂであると判断できる。
【００３１】
図２の例ではプローブは２つしか設定されていないが、実際のＤＮＡチップにおいては、プローブの数は数百から数千に渡って設定することが可能である。また、図２の例では、一つの菌について一つのプローブを設定しているが、一つの菌について複数のプローブを設定することも可能である。
【００３２】
図３は、本発明に係るプローブ担体に用いる、一つの標的核酸の複数の互いに異なる領域に特異的に結合する複数のプローブの例の模式図である。301は標的核酸を示す。302〜304はプローブを示し、それぞれ301の全長に対して、図３で示すような位置関係で、プローブ位置を決定したものとする。
【００３３】
プローブセットを構成するプローブ302〜304については、プローブセットとしてハイブリダイゼーション実施時にターゲット301を特異的に他の塩基配列から区別できるような組み合わせとなるように設計する。その際には、プローブ302、303、304は、それぞれの長さとＴｍ値とＧＣ％とがなるべく均一になるように設計するものとする。
【００３４】
プローブのＴｍ値は、プローブとその相補鎖を用意した上で、定法に従い吸収測定をすることにより直接測定することができる。また、直接測定しなくても、塩基配列から近似値を計算することができることが知られており、最近接塩基対法、Wallance法、ＧＣ％法などが特によく用いられる。プローブの設計時には、これらの計算方法を用いてＴｍ値を決定するのが一般的である。
【００３５】
なお、最近接塩基対法に関しては、Breslauer K.J., Frank R., Blocker H., Markey L.A. (1986) Predicting DNA duplex stability from the base sequence - Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83, 3746-3750、Freier S.M., Kierzek R., Jaeger J.A., Sugimoto N., Caruthers M.H., Nielson T., Turner D.H. (1986) Improved free-energy parameters for predictions of RNA duplex stabilit. - Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83, 9373-9377、Schildkraut C., Lifson S. (1965) Dependence of the melting temperature of DNA on salt concentration - Biopolymers 3, 195-208などを参照し、Wallace法に関しては、Wallace, R.B.; Shaffer, J.; Murphy R.F.; Bonner, J.; Hirose, T.; Itakura, K.; (1979) Nucelic Acid Res. 6, 3543などを参照し、ＧＣ％法に関しては、Dependence of the Melting Temperature of DNA on Salt Concentration、Schildkraut C., Lifson S. (1965) BIOPOLYMERS 3.195-208、Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro、W.Rychlik、Nucl.Acids Res.(1990) 18(21)6409-6412などを参照する。
【００３６】
プローブ302〜304の間で、Ｔｍを均一にするために、プローブセットとしてのターゲット301に対する特異性を損なわない範囲で、長さを変更したりＧＣ％を変更するなどすることで、調整を行うのが一般的である。
【００３７】
検出対象となる遺伝子の塩基配列の部分配列に相補的な塩基配列を持つプローブは、そのプローブ位置によって、ハイブリダイゼーションを蛍光輝度で検出した場合に、蛍光輝度に傾きが生じることがこれまでの実験により分かっている。具体的に言うと、図３に示すような位置に、Ｔｍが均一になるように設計した３個のプローブを固定したＤＮＡチップを設計して、ターゲット塩基配列301に蛍光標識を導入した検体を使用してハイブリダイゼーション反応を検出すると、蛍光輝度は
プローブ302 ≧ プローブ303 ≧ プローブ304
となる。また蛍光輝度の強弱は、プローブとハイブリッドを形成するターゲットの量と相関があることも分かっている。
【００３８】
従って、図３に示すような一の標的核酸（検出対象核酸）の複数の互いに異なる領域に対して特異的に結合可能な複数のプローブを設定する場合において、各プローブが結合する標的核酸の領域の位置、具体的には該標的核酸の５'末端からの塩基数に応じて固相上に互いに離間した閉じた領域（スポット）に配置するプローブの量を調整したＤＮＡチップを供給することで、それぞれのプローブにハイブリッドするターゲットによって得られる蛍光輝度を均一化することができるＤＮＡチップを提供できることになる。具体的には、例えば標的核酸が蛍光標識されている場合において、標的核酸３０１の５'末端からの距離が最も遠い領域に特異的に結合するプローブ３０４は、上記したようにフルマッチの標的核酸がハイブリダイズした場合においても、プローブ３０２がフルマッチの標的核酸がハイブリダイズした場合と比較してハイブリッドの安定性が低く、そのため蛍光輝度も相対的に低いものとなる。そこで、プローブ担体の固相上のプローブ固定領域（図５の５０２〜５１０）に配置するプローブの相対的な量を、３０３で最も多く、３０２を最も少なくすることで各プローブがフルマッチの標的核酸と結合したときの蛍光輝度を同等もしくは実質的に同等にすることができる。尚、本発明において、蛍光の輝度が同等もしくは実質的に同等とは、各蛍光輝度の平均に対して誤差が１０％以下であることを意味する。
【００３９】
このようなプローブ担体を標的核酸を含んでいる可能性のある検体とのハイブリダイゼーション反応に供した場合、標的核酸が各領域のプローブとハイブリダイズしたことを示すシグナル、例えば検体中の核酸が蛍光標識を施された場合には蛍光輝度がほぼ等しいものとなる。一方、各領域においてハイブリッド体の存在を示すシグナルが観察された場合であっても、各領域におけるシグナルの強度（蛍光輝度など）が大きく異なっている場合には、プローブ担体上に標的核酸とプローブとのフルマッチのハイブリッド以外のハイブリッドが形成されている蓋然性が高いことが推定できる。即ち、検体中に標的核酸以外の核酸が存在している可能性があることが分かるものである。
【００４０】
ＤＮＡチップの作製に際しては、基板上にフォトリソグラフィーを用いてＤＮＡプローブを逐次合成する方法(米国特許第5405783号等)や、あらかじめ合成したＤＮＡ、または、ｃＤＮＡを基板上に供給し固定する方法(米国特許第5601980号、特開平11-187900号、Science Vol.270, 467, 1995、Nature Biotechnology Vol. 18, 438, 2000等)が代表的な方法である。従って、例えば予め合成したプローブを固相にインクジェット法を用いて供給する方法によりプローブ担体を製造する場合においては、例えば下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの方法を用いることにより本発明に係るプローブ担体を得ることができる：
（ｉ）プローブ３０２〜３０４の各々を含む、インクジェット法により吐出される３種の液体のプローブの濃度を異ならせる。
（ｉｉ）プローブ３０２〜３０４の各々を含む３種の液体の、インクジェット法による吐出量を異ならせる。
（ｉｉｉ）上記（ｉ）と（ｉｉ）との組み合わせ。
【００４１】
図４にはガラス基板401上に合成したオリゴヌクレオチド402をプローブとして、共有結合により固定するＤＮＡチップの模式図を示す。図４では、一例としてガラス基板401を、一級アミノ基を有するシランカップリング剤(例:ＫＢＭ−６０３：信越化学工業製)403で処理し、次にＥＭＣＳ(N-(6-Maleimidocaproyloxy) succinimide:同仁化学研究所製)404のスクシイミドエステル基と上記シランカップリング剤403のアミノ基とを反応させ、最後に一方の末端にチオール基を導入したオリゴヌクレオチド402を該チオール基と上記ＥＭＣＳ404のマレイミド基と反応結合させて、ガラス基板にオリゴヌクレオチド402をプローブとして共有結合させている。
【００４２】
図５はＤＮＡチップの一例を示す図であり、ガラス基板501上に複数のスポット502〜510が設定されている。このスポット502〜510のそれぞれの箇所で、オリゴヌクレオチドがプローブとして固定されている。各スポットにプローブとして固定するオリゴヌクレオチドの量や種類は目的に応じて実験者が決める。なお、本発明において、プローブは必ずしもＤＮＡである必要はなく、例えばＲＮＡやＰＮＡであってもよい。
【００４３】
図５は、プローブを固定する基板として平面状のガラス基板を例にしているが、樹脂、金属、プラスチック、金属薄膜、繊維等のプローブを固定できるものであれば、特に制限なく使用することができる。また、形態についても平面状、ビーズ等を特に制限なく使用することができる。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。
【００４５】
（実施例１）
以下の実施例では、プローブ含有インク中のプローブの濃度を変動させることによって蛍光輝度を補正できることを示す。
【００４６】
１.プライマーの設計
検査対象の検体のモデルとして、大腸菌Ｋ１２株の１６Ｓ ｒＲＮＡを選択し、その塩基配列中より、下記の配列を有するフォワードプライマーＦ１とリバースプライマーＲ１を設計した。
【００４７】
【表１】
2007029032.tif 000003
【００４８】
なお、Ｔｍ値については、Ｎａ+が50ｍＭ、プライマー濃度が0.5μＭとして、最近接塩基対法により計算して求めたものである。
【００４９】
このプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行うと、１５０４ｂｐの増幅産物を得ることができる。
【００５０】
２.プローブの設計
上述の大腸菌Ｋ１２株の１６Ｓ ｒＲＮＡ由来ＰＣＲ産物に対して、プローブを設計した。各プローブの設計については、大腸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡを特異的に認識できるよう十分に配慮して行った。設計したプローブＥＣ−１〜ＥＣ−３(配列番号：３〜５）を以下の表２に示す。
【００５１】
【表２】
2007029032.tif 000004
【００５２】
なお、Ｔｍ値については、Ｎａ+が50ｍＭ、プライマー濃度が0.5μＭとして、最近接塩基対法により計算して求めたものである。
【００５３】
位置については、実施例１の１の表１に示されるＲ１のプライマーで増幅されるＰＣＲ産物におけるＲ１末端からの塩基数を示している。
【００５４】
３.プライマーの合成
実施例１の１で設計した２種類のプライマーを合成した。各プライマーの合成は、それぞれの塩基配列を有するＤＮＡ鎖を定法に従ってＤＮＡ合成機で合成した。精製はカートリッジ精製にて行い２種類のプライマーを得た。得られたプライマーはＴＥバッファにて10μＭの濃度に希釈した。
【００５５】
４.プローブの合成
実施例１の２で設計した３種類のプローブを合成した。各プローブの合成は、それぞれの塩基配列を有するＤＮＡ鎖を定法に従ってＤＮＡ合成機で合成した後、５'末端にチオール基を導入した。チオール基の導入後、精製し、凍結乾燥した。凍結乾燥したプローブは−30℃の冷凍庫に保存した。
【００５６】
５.ＤＮＡチップの作製
合成石英のガラス基板(サイズ:２５ｍｍ×７５ｍｍ×１ｍｍ、飯山特殊ガラス社製)を耐熱、耐アルカリのラックに入れ、所定の濃度に調整した超音波洗浄用の洗浄液に浸した。一晩洗浄液中で浸した後、20分間超音波洗浄を行った。続いて基板を取り出し、軽く純水ですすいだ後、超純水で20分間超音波洗浄を行った。次に80℃に加熱した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中に10分間基板を浸した。再び純水洗浄と超純水洗浄を行い、ＤＮＡチップ用の石英ガラス基板を用意した。
【００５７】
シランカップリング剤(商品名：ＫＢＭ−６０３；信越シリコーン社製）を、１％の濃度となるように純水中に溶解させ、２時間室温で攪拌した。続いて、先に洗浄したガラス基板をシランカップリング剤水溶液に浸し、20分間室温で放置した。ガラス基板を引き上げ、軽く純水で表面を洗浄した後、窒素ガスを基板の表面に吹き付けて乾燥させた。次に乾燥した基板を120℃に加熱したオーブン中で1時間ベークし、カップリング剤処理を完結させ、基板表面にアミノ基を導入した。次いで同仁化学研究所社製のＮ-マレイミドカプロイロキシスクシイミド(N-(6-Maleimidocaproyloxy) succinimido)(以下、ＥＭＣＳと略す)を、ジメチルスルホキシドとエタノールの１：１混合溶媒中に最終濃度が0.3ｍｇ/ｍｌとなるように溶解したＥＭＣＳ溶液を用意した。
【００５８】
ベークの終了したガラス基板を放冷し、調整したＥＭＣＳ溶液中に室温で２時間浸した。この処理により、シランカップリング剤によってガラス基板表面に導入されたアミノ基とＥＭＣＳのスクシイミド基が反応し、ガラス基板表面にマレイミド基が導入された。ＥＭＣＳ溶液から引き上げたガラス基板を、先述のＥＭＣＳを溶解した混合溶媒を用いて洗浄し、さらにエタノールにより洗浄した後、窒素ガス雰囲気下で乾燥させた。
【００５９】
実施例１の４で作成したプローブを純水に溶解し、それぞれ、最終濃度(インク溶解時)10μＭとなるように分注した後、凍結乾燥を行い、水分を除いた。
【００６０】
グリセリン7.5ｗｔ％、チオジグリコール7.5ｗｔ％、尿素7.5ｗｔ％、アセチレノールＥＨ(川研ファインケミカル社製)1.0ｗｔ％を含む水溶液を用意した。続いて、先に用意した３種類のプローブ(表２)の各々を上記の混合溶媒に規定濃度になるように溶解した。得られたＤＮＡ溶液をバブルジェットプリンタ(商品名:ＢＪＦ−８５０；キヤノン(株)社製)用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。
【００６１】
なお、ここで用いたバブルジェットプリンタは平板への印刷が可能なように改造を施したものである。またこのバブルジェットプリンタは、所定のファイル作製方法に従って印字パタンを入力することにより、約５ピコリットルのＤＮＡ溶液を約120μｍピッチでスポッティングすることが可能となっている。
【００６２】
続いて、この改造バブルジェットプリンタを用いて、一枚のガラス基板に対して、印字操作を行い、アレイを作製した。印字が確実に行われていることを確認した後、30分間加湿チャンバー内に静置し、ガラス基板表面のマレイミド基と核酸プローブ末端のチオール基とを反応させた。
【００６３】
30分間の反応後、100ｍＭのＮａＣｌを含む10ｍＭのリン酸緩衝液(ｐＨ7.0)により表面に残ったＤＮＡ溶液を洗い流し、ガラス基板表面にプローブ核酸が一本鎖ＤＮＡとして固定されたＤＮＡチップを得た。
【００６４】
６.ＰＣＲ増幅反応(標識化)
実施例１の３で合成した２種のプライマー、テンプレートとする大腸菌Ｋ１２株のＤＮＡ、およびＰＣＲ増幅キット(タカラバイオ社製；商品名：ＥｘＴａｑ)を用いてＰＣＲ増幅反応を行った。尚、ＰＣＲ増幅は、標識化したヌクレオチド(商品名：Ｃｙ３-ｄＵＴＰ；アマシャムファルマシア社製）を加えて行うことにより、ＰＣＲ増幅産物にＣｙ３（商品名）を蛍光標識として導入した。
【００６５】
検体となる大腸菌Ｋ１２株のＤＮＡの増幅、および標識化反応を以下の表３、表４に示す。
【００６６】
【表３】
2007029032.tif 000005
【００６７】
上記表３組成の反応液を、市販のサーマルサイクラを用いて、下記表４の温度サイクルプロトコルによって、ＰＣＲ増幅反応を行った。すなわち、９５℃/１０分の保持(酵素の活性化のため)の後、「９２℃(変性)/４５秒、５５℃(アニーリング)/４５秒、および７２℃(伸長)/４５秒」を１サイクルとして３５サイクル、最後に７２℃/１０分保持した。
【００６８】
【表４】
2007029032.tif 000006
【００６９】
反応終了後、精製用カラム(商品名：QIAGEN QIAquick PCR Purification Kit)を用いてプライマーを除去した後、増幅産物の定量を行い、標識化検体とした。
【００７０】
７.ブロッキング
ＢＳＡ(牛血清アルブミンFraction V：Sigma社製)を１ｗｔ％となるように100ｍＭ ＮａＣｌ/10ｍＭ Phosphate Bufferに溶解し、この溶液に実施例１の５で作製したＤＮＡチップを室温で２時間浸し、ブロッキングを行った。ブロッキング終了後、0.1ｗｔ％ＳＤＳ(ドデシル硫酸ナトリウム)を含む２×ＳＳＣ溶液(ＮａＣｌ 300ｍＭ、Sodium Citrate(trisodium citrate dihydrate, C6H5Na3・2H2O) 30ｍＭ、pH 7.0)で洗浄を行った後、純水でリンスしてからスピンドライ装置で水切りを行った。
【００７１】
８.ハイブリダイゼーション
実施例１の７で水切りしたＤＮＡチップをハイブリダイゼーション装置(Genomic Solutions Inc.社製；商品名：Hybridization Station)にセットし、以下に示すハイブリダイゼーション溶液、条件でハイブリダイゼーション反応を行った；
65℃ 3min → 92℃ 2min → 45℃ 3hr → Wash 2x SSC / 0.1% SDS at 25℃ → Wash 2x SSC at 20℃ → (Rinse with H2O : Manual) → Spin dry。
【００７２】
すなわち、65℃に加温し３分間保持した後、さらに92℃で２分間、続いて45℃で３時間保持した。そのあと、２×ＳＳＣおよび0.1％ ＳＤＳを用いて25℃で洗浄をした。さらに２×ＳＳＣを用いて20℃で洗浄を行い、必要に応じてマニュアル操作により純水でリンスして、最後にスピンドライ装置を用いて水切りを行い乾燥させた。
【００７３】
【表５】
2007029032.tif 000007
【００７４】
９.蛍光測定
上記ハイブリダイゼーション反応終了後のＤＮＡチップを遺伝子チップ用蛍光検出装置(Axon社製、商品名：GenePix 4000B)を用いて蛍光測定を行った。測定の結果得られた蛍光輝度を以下の表６に示す。なお実験は再現性を保証するために３回行い、平均値と標準化係数を示す。
【００７５】
【表６】
2007029032.tif 000008
【００７６】
表６に示す「位置」とは表２同様に、プライマーＲ１の５'末端よりの塩基数を意味する。この表６に示されるように、５'末端から離れると得られる蛍光輝度は弱くなる傾向があることが分かる。
【００７７】
また、各実験結果の欄には、輝度とその輝度に対する標準化係数を表している。標準化係数は、平均輝度をプローブの輝度で割った値である。
【００７８】
１０．濃度を補正したＤＮＡチップの作製
実施例１の９の実験結果を受けて、プローブとして固定するＤＮＡの量を調整した。ＤＮＡ量の調整には、１０μＭの濃度を実施例１の９で求めた標準化係数で割った値を用いた。プローブの最終濃度をそれぞれ以下の表７となるように調整した上で、実施例１の５の作製方法に従い、ＤＮＡチップを作製した。
【００７９】
【表７】
2007029032.tif 000009
【００８０】
１１．ハイブリダイゼーション
実施例１の１０にて作成したＤＮＡチップを用いて、実施例１の８同様にハイブリダイゼーションを行った。
【００８１】
１２．蛍光測定
実施例１の９同様に蛍光測定を行った。以下の表８に検出された蛍光輝度を示す。
【００８２】
【表８】
2007029032.tif 000010
【００８３】
以上、本実施例においては、検出される蛍光輝度の強弱に、プローブ位置による傾きが発生することを示し、それをプローブの濃度を変更することで補正して、安定した輝度を得られることを示した。
【００８４】
(実施例２)
以下の実施例では、インクの吐出量を変更させることでスポット毎のプローブの量を調整し、蛍光輝度を補正できることを示す。
【００８５】
１.プライマーの設計
実施例１の１で設計した、大腸菌Ｋ１２株の１６Ｓ rＲＮＡを増幅できるフォワードプライマーＦ１とリバースプライマーＲ１とを使用するものとする。
【００８６】
２.プローブの設計
実施例１の２で設計した、大腸菌Ｋ１２株から作製したプローブＥＣ−１、ＥＣ−２およびＥＣ−３を使用するものとする。
【００８７】
３.プライマーの合成
実施例１の３同様に、プライマーを合成する。
【００８８】
４.プローブの合成
実施例１の４同様に、プローブを合成し、保存する。
【００８９】
５.ＤＮＡチップの作製
実施例１の５と同様に、ＤＮＡチップを作製する。ただし、印字操作を行う際にインク濃度は実施例１の５同様にプローブ毎に一定にした状態で、各プローブの吐出量を下記の表９に示すように変更する。表６に示す実験結果より、ＥＣ−３の蛍光輝度はＥＣ−１、ＥＣ−２と比較して高くなる傾向があることから、基板上に固定されるプローブの量が少なくなることを期待して、ＥＣ−３の吐出量を減らした。
【００９０】
【表９】
2007029032.tif 000011
【００９１】
以上のように、吐出量を変更することで基板上に固定されているスポットごとのプローブの量を調整したＤＮＡチップを作製した。
【００９２】
６.ＰＣＲ増幅反応(標識化)
実施例１の６同様に、実施例２の３で合成した２種のプライマーと、テンプレートとする大腸菌Ｋ１２株のＤＮＡと、タカラバイオ社のＰＣＲ増幅キットＥｘＴａｑとを用いてＰＣＲ増幅反応を行い、Ｃｙ３標識を導入した。
【００９３】
７.ブロッキング
実施例１の７同様にブロッキングを行う。
【００９４】
８.ハイブリダイゼーション
実施例１の８同様に、実施例２の５で作成したＤＮＡチップを用いて、実施例２の６で得たＰＣＲ増幅産物に対して、ハイブリダイゼーションを行った。
【００９５】
９.蛍光測定
上記ハイブリダイゼーション反応終了後のＤＮＡチップを遺伝子チップ用蛍光検出装置(Axon社製、商品名：GenePix 4000B)を用いて蛍光測定を行った。その結果得られた蛍光輝度を以下の表１０に示す。
【００９６】
【表１０】
2007029032.tif 000012
【００９７】
以上、本実施例においては、検出される蛍光輝度の強弱に発生するプローブ位置に起因する傾きを、プローブインクの吐出量を変えることで基板に固定されるプローブ量を変動させることで補正を行うと、安定した輝度が得られるということを示した。
【００９８】
(実施例３)
以下の実施例では、実施例１の１０で作製したＤＮＡチップに対して、ＥＣ−１とＥＣ−３とに対してそれぞれ一塩基ミスマッチとなるターゲットをハイブリダイゼーションさせた時の輝度と実施例１の１２で得られた蛍光輝度とを比較する。
【００９９】
１.ターゲットの用意
ＥＣ−１のプローブに一塩基ミスマッチの１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を持つ生物として、Serratia marcescensがある。Serratia marcescensとＥＣ−１、ＥＣ−３との配列を比較して、表11に示す。
【０１００】
【表１１】
2007029032.tif 000013
【０１０１】
２.蛍光輝度比較
実施例１および２で示したのと同様にハイブリダイゼーションを行い、以下の蛍光輝度を得た。
【０１０２】
【表１２】
2007029032.tif 000014
【０１０３】
この時、ＥＣ−１とＥＣ−３とで値が大きく異なっており、実施例１に示される結果から鑑みるに、検体が大腸菌でないと判断できる。
【０１０４】
以上、本実施例においては、想定している検体に対して蛍光輝度が均一になるように濃度調整されたＤＮＡチップによって、通常は検出されにくい１塩基ミスマッチの検体を判別できることを示した。
【０１０５】
（実施例４）プローブの位置による蛍光輝度の均一化
前述の表２に示すプローブセットは、それぞれターゲットとなるＰＣＲ産物の５'末端からの位置が確定している。実施例１に開示する実験により、プローブ濃度が均一である場合、これらのプローブの位置に応じて得られる蛍光輝度に傾きがあることが分かる。
【０１０６】
実施例１においては、均一な濃度のプローブによって得られた実験結果から得られる蛍光輝度を元に濃度の補正を行ったが、実験を行うことなく、ＰＣＲターゲットの全長に対するプローブの位置により濃度の補正を行うことも可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】ＤＮＡチップ状でのハイブリダイゼーションの模式図である。
【図２】ＤＮＡチップを用いた菌判定を説明する模式図である。
【図３】一つのターゲットに対して複数箇所のプローブを設定する例を説明する模式図である。
【図４】固相上にプローブを固定する方法を説明する模式図である。
【図５】一般的なＤＮＡチップの形態を説明する模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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