(57)【要約】【課題】高い遺伝子材料導入効率と再現性、並びに副作用の少ないトランスフェクションを実現し得る新規なトランスフェクションデバイスを提供すること。【解決手段】遺伝子試料、遺伝子デリバリー材料に加え、アルブミンまたはその複合体群から選択される少なくとも一種の化合物を含む混合物１を固相基材３に固着してあるトランスフェクションデバイス。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子試料、遺伝子デリバリー材料に加え、アルブミンまたはその複合体群から選択される少なくとも一種の化合物を含む混合物を固相基材に固着してあるトランスフェクションデバイス。
【請求項２】
前記遺伝子試料が、一本鎖又は二本鎖のデオキシリボ核酸、リボ核酸、アプタマー、あるいはこれらの化学修飾誘導体からなる群から少なくとも一種が選択される請求項１記載のトランスフェクションデバイス。
【請求項３】
前記遺伝子デリバリー材料が、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質、ミネラルからなる群から少なくとも一種を含有する請求項１または２のいずれかに記載のトランスフェクションデバイス。
【請求項４】
前記混合物が、グルコース、スクロース、グリコーゲン、グルタミン、アルギニン、ヒスチジン、リシン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、グリシン、プロリン、セリンからなる群から選択される少なくとも一種の化合物又は、細胞培養用培地成分を含む請求項１〜３のいずれかに記載のトランスフェクションデバイス。
【請求項５】
前記固相基材を構成する材料が、ガラス、合成高分子、金属類、天然高分子からなる群から選択される請求項１〜４のいずれか１項に記載のトランスフェクションデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物細胞に外部から遺伝子試料（例えば、一本鎖又は、二本鎖のデオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）、アプタマーあるいはこれらの化学修飾誘導体など）を導入するトランスフェクションデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
トランスフェクション（遺伝子導入）を目的として遺伝子試料を固相基材に固着させたデバイスは遺伝子治療用途や遺伝子解析用途に用いられることが可能である。これまで報告されてきたトランスフェクションデバイス技術としては、遺伝子試料をゼラチンやフィブロネクチン等の細胞間マトリックスタンパク質と一緒に固着したものや（特許文献１、特許文献２又は非特許文献１参照）、遺伝子試料をリン酸カルシウム塩と一緒に固相表面に析出させたものなどがある（非特許文献２〜６参照）
【０００３】
【特許文献１】米国特許第664297号公報
【特許文献２】米国特許第324780号公報
【非特許文献１】J. Ziauddin and D. M. Sabatini. Microarrays of cells expressed defined cDNAs. Nature 411, 107-110 (2001).
【非特許文献２】R. Z. Wu et al. Cell-biological applications of transfected-cell microarrays. Trends in Cell Biology 12, 485-488 (2002).
【非特許文献３】T. Ochiya et al. New delivery system for plasmid DNA in vivo using atelocollagen as a carrier material: the Minipellet. Nature Med. 5, 707-710 (1999)
【非特許文献４】K. Honma et al. Atelocollagen-based gene transfer in cells allows high-throughput screening of gene functions. Biochem. Biophys. Res. Commu. 289, 1075-1081 (2001)
【非特許文献５】T. Yoshikawa et al. Transfection microarray of human mesenchymal stem cells and on-chip siRNA gene knockdown. J. Controlled Release 96, 227-232 (2004).
【非特許文献６】E. Uchimura et al. On-chip transfection of PC12 cells based on the rational understanding of the role of ECM molecules: efficient, non-viral transfection of PC12 cells using collagenIV. Neuroscience Lett. 378,  40-43 (2005).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上記文献に記載される従来のトランスフェクションデバイス技術においては、遺伝子試料、遺伝子デリバリー材料に加え、細胞接着因子及びその誘導体を必要とした。フィブロネクチンやコラーゲンなどの細胞接着因子は、細胞表面のインテグリンレセプターなどと結合し細胞に外的刺激を入力する分子であり細胞機能に直接影響を与える分子である。そのため細胞接着因子をトランスフェクションデバイスに用いると、遺伝子導入以外に副作用として細胞機能影響（分化誘導、増殖亢進・抑制など）を及ぼすことが予想される。遺伝子試料の導入による細胞機能への影響を調べることを目的としたトランスフェクションデバイスにおいては、副作用を生じさせない物質を用いることが望まれる。
本発明は、高い遺伝子材料導入効率と再現性、並びに副作用の少ないトランスフェクションを実現し得る新規なトランスフェクションデバイスを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の第一特徴構成は、遺伝子試料、遺伝子デリバリー材料に加え、アルブミンまたはその複合体群から選択される少なくとも一種の化合物を含む混合物を固相基材に固着してあるトランスフェクションデバイスである点にある。
〔作用及び効果〕
本発明のトランスフェクションデバイスは、遺伝子試料、遺伝子デリバリー材料、細胞接着因子を含むものを固相基材に固着してある従来のトランスフェクションデバイスと比較して、同等又はそれ以上の遺伝子導入効率及び再現性を有している。さらに、従来のトランスフェクションデバイスでは、細胞接着因子を含有する固相基材上にて細胞分化や増殖（以下、副作用と称する）への影響が懸念されているのに対し、本発明では、そのような細胞接着因子を一切用いていないため、それらの副作用を生じさせる虞の少ない固相表面を提供できる。これにより、トランスフェクションデバイスの実用性、汎用性の向上が期待できる。
副次的効果として、細胞接着因子はその精製工程が複雑で、非常に高価であるが、本発明では、比較的容易に血清より分離精製可能なアルブミンまたは、その複合体を用いることで、安価かつ同等以上の、トランスフェクションデバイスを提供できる点にある。
尚、遺伝子試料、遺伝子デリバリー材料に加え、アルブミンまたは、その複合体群から選択される少なくとも一種の化合物を固相基材に固着することで、例えば、細胞接着因子の存在に基づく分化誘導、増殖亢進・抑制による影響を受けずに遺伝子試料の導入による細胞機能への影響をみることができ、トランスフェクションデバイスとしての実用性、汎用性が向上できるという知見は、本発明者らの鋭意研究によって初めて見出されたものである。
【０００６】
本発明の第２特徴構成は、前記遺伝子試料が、一本鎖又は二本鎖のデオキシリボ核酸、リボ核酸、アプタマー、あるいはこれらの化学修飾誘導体からなる群から少なくとも一種が選択される点にある。
〔作用及び効果〕
遺伝子試料が核酸である場合、遺伝子の過剰発現、アンチセンス効果及び、ＲＮＡ干渉などが期待される。これによって、遺伝子の機能解析が可能となる。これら核酸の化学修飾は、核酸の安定化や非特異的反応を導くことが期待できる。アプタマーの場合、標的とするタンパク質に強固に結合することによって、機能阻害を生じさせることが可能である。化学修飾されたアプタマーでは、安定化及び非特異的反応を抑制する働きのほかに、ターゲットタンパク質の特異的ラベル化等の用途がある。
【０００７】
本発明の第３特徴構成は、前記遺伝子デリバリー材料が、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質、ミネラルからなる群から選択される少なくとも一種を含有する点にある。
〔作用及び効果〕
遺伝子デリバリー試料は、遺伝子試料を細胞に導入する際、エンドサイトーシス、ピノサイトーシス、ファゴサイトーシス、細胞膜との融合などを誘導する試料である。これにより、効率的に遺伝子試料を細胞内に送り込むことが可能となる。
【０００８】
本発明の第４特徴構成は、前記混合物が、グルコース、スクロース、グリコーゲン、グルタミン、アルギニン、ヒスチジン、リシン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、グリシン、プロリン、セリンからなる群から選択される少なくとも一種の化合物又は、細胞培養用培地成分を含む点にある。
〔作用及び効果〕
本発明のトランスフェクションデバイスは、遺伝子試料、遺伝子デリバリー材料、細胞接着因子を含むものを固相基材に固着してある従来のトランスフェクションデバイスに比べて、細胞によって差はあるが、およそ２倍から１０倍程度、遺伝子導入効率を向上させることが可能であり、その結果、高い再現性を確保することができる。これにより、トランスフェクションデバイスの実用性の向上が期待できる。
尚、遺伝子試料、遺伝子デリバリー材料、アルブミンまたはその複合体群から選択される少なくとも一種の物質を含むものに加え、グルコース、スクロース、グリコーゲン、グルタミン、アルギニン、ヒスチジン、リシン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、グリシン、プロリン、セリンからなる群から選択される少なくとも一種の化合物または、細胞培養用培地成分を含むものを固相基材に固着すると、遺伝子導入効率を向上させることができる。
【０００９】
本発明の第５特徴構成は、前記固相基材を構成する材料が、ガラス、合成高分子、金属類、天然高分子からなる群から選択される点にある。
〔作用及び効果〕
固相基材を構成する材料が、硬質板（ガラス、プラスチック、金属類）の場合は、細胞アレイなどの基材として適した環境を提供する。また、その中でも特に透過性の高い基材では、顕微鏡観察などが容易に可能となり、金属などの導電基材では、電位変化の測定などが可能となる。軟質板（高分子フィルムなど）では、シート状トランスフェクションデバイスの提供や、パッチ基材などへ適用可能である。基材が、粒子及び高分子マトリクスの場合には、ｉｎ  ｖｉｖｏデリバリーや、徐放化基材への利用用途が考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に本発明の実施の形態を図面に基づいて説明する。
（実施形態）
図１は、本発明のガラスアレイ（トランスフェクションデバイスの一例）の製造法(一例)を示したものである。
図１（イ）に示すように、適当な容器（例えば、エッペンドルフチューブなど）において、各種糖類やアミノ酸類等を含有し得る溶媒に、所望の遺伝子試料を溶解させた後、適当な遺伝子デリバリー材料を加えて混合し、所定条件下にて反応させる。所定の反応時間が経過した後、その反応液にアルブミン又はその複合体群を加えて混合する。
次いで、図１（ロ）に示されるように、その混合液１を、適当なプリント装置２により、ガラススライド３（固相基材）上へプリント（スポット形成）し、自然乾燥で完全に乾燥させる。
また、トランスフェクション（遺伝子導入）を実施する際は、図１（ロ）に示されるように、スポット形成された前記ガラススライド３をシャーレ５内に収容し、適当な細胞を含有する細胞懸濁液４を注ぎ込んで播種し、細胞培養を行うことで遺伝子導入が完了する。尚、遺伝子導入された細胞は、混合液１のプリント領域（スポット領域）のみで観察される。
【００１１】
（アルブミン又はその複合体群）
本発明に適応可能なアルブミンまたはその複合体群としては、各動物由来アルブミンまたは、アルブミン／リノール酸複合体などの分子のうち少なくとも1種の化合物を含有する水溶液などが挙げられる。
【００１２】
（遺伝子試料）
本発明に適用可能な遺伝子試料としては、一本鎖又は二本鎖のデオキシリボ核酸（例えば、プラスミドＤＮＡ等）、リボ核酸、アプタマー、あるいはこれらの化学修飾誘導体等が挙げられる。
【００１３】
（遺伝子デリバリー材料）
本発明に適用可能な遺伝子デリバリー材料としては、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質、ミネラル等が挙げられ、これらを単独で、あるいは任意に組み合わせて使用することができる。
【００１４】
（溶媒）
本発明に適用可能な溶媒としては、グルコース、スクロース、グリコーゲン、グルタミン、アルギニン、ヒスチジン、リシン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、グリシン、プロリン、セリンからなる群から選択される少なくとも一種の化合物を含む水溶液、細胞培養用培地成分を含む水溶液、又は水のみ等が挙げられる。
【００１５】
（プリント装置）
本発明に適用可能なプリント装置としては、例えば、インクジェットプリンター等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００１６】
（固相基材）
本発明に適用可能な固相基材を構成する材料としては、例えば、ガラス、合成樹脂や合成繊維等の合成高分子、金属類、天然樹脂や天然繊維等の天然高分子等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。また、本発明に適用可能な固相基材の形状としては、例えば、板状体、織布、ニードル、多孔性繊維、ビーズ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１７】
（細胞）
本発明のトランスフェクションデバイスを使用して遺伝子試料を導入し得る細胞としては、培養可能な真核細胞であれば任意の細胞に適用可能であり、例えば、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸がん細胞）等が挙げられるがこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００１８】
（実施例１）
従来のトランスフェクションデバイスでは、フィブロネクチンなどの細胞接着因子を用いたデバイス製造を行っていたが、本実施例では、フィブロネクチン以外の接着因子（アグリカン、ビグリカン、デコリン）のほか、細胞接着因子ではない生体由来成分（コレステロール、ヒアルロン酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸、リノール酸/アルブミン複合体、アルブミン）を用いることで、遺伝子導入される細胞への生化学的影響が少なく、高効率かつ再現性良く遺伝子導入可能な分子探索を行った。本実施例で用いた分子一覧を表１に示した。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
前述の各種溶液を、図２〜９の溶液組成にてデバイス上に配し、フィブロネクチンを使用した場合と比較した。これらを比較した結果を、図２〜９に示した。この結果をまとめると、表２のようになった。
尚、遺伝子試料（ＤＮＡ）として、１μｇ/μＬのｐＥＧＦＰ-Ｎ１（緑色蛍光タンパク質EGFPを発現するプラスミドＤＮＡ）溶液を滅菌蒸留水で調製した。実験に使用したプラスミドＤＮＡ（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１）は、エンドトキシン除去工程を経て生成されたものを使用し、ＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅ）及びＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ）を含まない滅菌蒸留水を用いて溶解したものを使用した。
また、溶媒として、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地成分（細胞培養用培地成分）を含む水溶液）を使用し、遺伝子デリバリー材料として、ＬＦ２０００（市販のＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００（インビトロジェン社製））を使用した。
【００２１】
【表２】
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【００２２】
コレステロール、ヒアルロン酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸では、遺伝子導入が殆ど認められなかったが、アグリカン、ビグリカン、デコリン、リノール酸/アルブミン複合体では、遺伝子導入が確認できた。さらに、リノール酸/アルブミン複合体では、フィブロネクチンと同等の遺伝子導入効率、局在性、均一性が確認された。
【００２３】
また、図１０〜１３では前述の実施例の再評価もかねて、溶媒として、グルコース（２．２５ｇ/Ｌ）とアラニン（４．４５ｍｇ/Ｌ）とを含む水溶液（以下、グルコース/アラニン溶液と称する）を用いて、遺伝子導入実験を行った。その結果を表３に示すが、先に示した図２〜９の結果同様に、リノール酸/アルブミン複合体で、フィブロネクチンと同等のリバーストランスフェクションアレイデバイス製造が可能であることが確認できた。
【００２４】
【表３】
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【００２５】
（実施例２）
実施例１で行った実験において、リノール酸/アルブミン複合体の有効性が示されたが、複合体の効果なのか、リノール酸またはアルブミンの効果かを明らかにするために、各種アルブミン（ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン）を用いて、遺伝子導入実験を行った。図１４〜１８に、その混合溶液組成及び、遺伝子導入結果を示した。
尚、使用した遺伝子試料（ＤＮＡ）、遺伝子デリバリー材料、及び溶媒については、上述の実施例１と同様であるが、溶媒については、グルコース/アラニン溶液を使用した。
この結果、各種アルブミンで高い遺伝子導入効率、局在性、均一性が確認され、フィブロネクチンと同等もしくは、それよりも優位なトランスフェクションデバイス製造が可能であることが確認された。また、アルブミン中に通常多く含まれている、イムノグロブリンの影響は、イムノグロブリン不含アルブミンを用いた場合でも、高い効果を確認したことから否定される。これらの結果をまとめたものを表４に示し、細胞接着因子以外の分子であるアルブミンでも、リバーストランスフェクションデバイス製造に有効であることが確認された。
【００２６】
【表４】
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【００２７】
（実施例３）
細胞接着因子の代わりにアルブミンを用いてリバーストランスフェクションデバイスを製造する際に、溶媒として、滅菌蒸留水、ＤＭＥＭ、グルコース／アラニン溶液を使用した際の、緑色蛍光タンパク質発現プラスミドベクター（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１）の導入効率を比較検討した。評価検討に用いた、試薬混合条件を、図１９に示した。
図１９の結果をまとめたものを表５に示した。その結果、上記３種の溶媒を用いても、アルブミンを細胞接着因子（フィブロネクチン）の代わりに用いた場合、同等かそれ以上の、遺伝子導入効率、局在性、再現性を実現できるリバーストランスフェクションデバイスを製造可能であることが確認できた。
【００２８】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明のガラスアレイ（トランスフェクションデバイスの一例）の製造方法（一例）を示した図
【図２】リバーストランスフェクションへのコレステロールの影響を評価した図
【図３】リバーストランスフェクションへのヒアルロン酸ナトリウムの影響を評価した図
【図４】リバーストランスフェクションへのコンドイチン硫酸Ａの影響を評価した図
【図５】リバーストランスフェクションへのコンドイチン硫酸Ｃの影響を評価した図
【図６】リバーストランスフェクションへのアグリカンの影響を評価した図
【図７】リバーストランスフェクションへのビグリカンの影響を評価した図
【図８】リバーストランスフェクションへのデコリンの影響を評価した図
【図９】リバーストランスフェクションへのリノール酸/アルブミン複合体の影響を評価した図
【図１０】リバーストランスフェクションへのアグリカンの影響を再評価した図
【図１１】リバーストランスフェクションへのビグリカンの影響を再評価した図
【図１２】リバーストランスフェクションへのデコリンの影響を再評価した図
【図１３】リバーストランスフェクションへのリノール酸/アルブミン複合体の影響を再評価した図
【図１４】リバーストランスフェクションへのリノール酸/アルブミン複合体の影響を評価した図
【図１５】リバーストランスフェクションへのウシ血清アルブミンの影響を評価した図
【図１６】リバーストランスフェクションへのヒト血清アルブミン１の影響を評価した図
【図１７】リバーストランスフェクションへのヒト血清アルブミン２の影響を評価した図
【図１８】リバーストランスフェクションへのヒト血清アルブミン３の影響を評価した図
【図１９】リバーストランスフェクションへの各種溶媒の影響を評価した図
【符号の説明】
【００３０】
１  混合液
２  プリント装置
３  固相基板
４  細胞懸濁液
５  シャーレ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2007236224.tif 000023
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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