(57)【要約】【課題】検体液中において十分な分散性を有し、且つ、標的物質の高感度な検出を可能とする磁性マーカー及びその製造方法を提供する。【解決手段】検出部の表面近傍に位置する磁性マーカーの有無、数を検知することにより、検体液中の標的物質の有無、濃度を検出する標的物質検出素子に用いる磁性マーカーにおいて、該磁性マーカーは、磁性微粒子と、該磁性微粒子の表面に存在するリビング重合開始基に結合した高分子鎖と、該高分子鎖の少なくとも一部に結合した生体分子と、を有することを特徴とする磁性マーカー。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出部の表面近傍に位置する磁性マーカーの有無、数を検知することにより、検体液中の標的物質の有無、濃度を検出する標的物質検出素子に用いる磁性マーカーにおいて、該磁性マーカーは、磁性微粒子と、該磁性微粒子の表面に存在するリビング重合開始基に結合した高分子鎖と、該高分子鎖の少なくとも一部に結合した生体分子と、を有することを特徴とする磁性マーカー。
【請求項２】
前記生体分子が、前記高分子鎖の少なくとも一部の末端に存在する活性基に結合していることを特徴とする請求項１に記載の磁性マーカー。
【請求項３】
前記高分子鎖が水に対して高い親和性を有することを特徴とする請求項１または２に記載の磁性マーカー。
【請求項４】
前記高分子鎖の分子量分布（重量平均分子量／数平均分子量）が１．８以下であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の磁性マーカー。
【請求項５】
前記高分子鎖の数平均分子量が５００以上１００００００以下であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の磁性マーカー。
【請求項６】
前記磁性微粒子がフェライトであることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の磁性マーカー。
【請求項７】
前記標的物質検出の検出方式が、磁気抵抗効果素子、ホール効果素子、超電導量子干渉計素子を用いる検出方式のいずれかであることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の磁性マーカー。
【請求項８】
検出部の表面近傍に位置する磁性マーカーの有無、数を検知することにより、検体液中の標的物質の有無、濃度を検出する標的物質検出素子に用いる磁性マーカーの製造方法であって、
磁性微粒子の表面にリビング重合開始基を導入する工程と、
該リビング重合開始基が導入された磁性微粒子の存在下、モノマーをリビング重合して、該リビング重合開始基に結合した高分子鎖を形成する工程と、
該高分子鎖の少なくとも一部の末端に活性基を導入する工程と、
該活性基に生体分子を結合させる工程と
を含むことを特徴とする磁性マーカーの製造方法。
【請求項９】
前記リビング重合がリビングラジカル重合であることを特徴とする請求項８に記載の磁性マーカーの製造方法。
【請求項１０】
前記リビングラジカル重合が原子移動ラジカル重合であることを特徴とする請求項９に記載の磁性マーカーの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体液中の標的物質の有無、濃度を検出する標的物質検出素子用の磁性マーカー及びその製造方法に関するものである。本発明は、特に、生体由来の物質又はその類似物質の特異的な分子認識能を利用した、いわゆるバイオセンサーに好適に応用できる。
【背景技術】
【０００２】
バイオセンサーは、生体や生体分子の持つ、優れた分子認識能を活用した計測デバイスである。生体内には、互いに親和性のある物質の組み合わせとして、例えば、酵素−基質、抗原−抗体、ＤＮＡ−ＤＮＡ等がある。バイオセンサーは、これらの組み合わせの一方を基材に固定もしくは担持して用いることによって、もう一方の物質を選択的に計測できるという原理を利用している。
【０００３】
近年では、バイオセンサーは医療分野のみならず、環境や食料品等への幅広い応用が期待され、その使用領域を広げるためにも、あらゆる場所に設置あるいは持ち運び可能な小型、軽量、高感度なバイオセンサーが望まれている。
【０００４】
そして、現在、高感度センシング方式のひとつとして、磁気センサーを用い、検出部の表面近傍に位置する磁性マーカーの有無、数を検知することにより、検体液中の標的物質の有無、濃度を検出する標的物質検出素子の研究が盛んに進められている。
【０００５】
この標的物質検出素子による検出は、以下のように行うことができる。まず、検出部の表面に、標的物質の一方の領域（抗原抗体反応の場合はエピトープと呼ばれる）と特異的に結合することができる第一の標的物質捕捉分子（抗原抗体反応の場合は一次抗体と呼ばれる）を固定し、標的物質を含む検体液と接触せしめる。その後、第一の標的物質捕捉分子により特異的に捕捉された標的物質の他方の領域と特異的に結合することができる第二の標的物質捕捉分子（抗原抗体反応の場合は二次抗体と呼ばれる）を固定化した磁性マーカーを接触せしめる。このようにして、結果的に第二の標的物質捕捉分子を介して磁性マーカーを検出部の表面に固定化する。その結果、検出部の表面に固定化された磁性マーカーの数を何らかの手法で測定することで、目的とする標的物質の数、濃度を計算することが可能となる。
【０００６】
また、他の検出方法として、以下のように磁性マーカーを検出部の表面に固定化する方法をとることもできる。予め標的物質を含む検体液中に第二の標的物質捕捉分子を固定化した磁性マーカーを加えて標的物質と第二の標的物質捕捉分子を接触せしめ、「標的物質−第二の標的物質捕捉分子」複合体を形成させる。そして、その複合体を検出部の表面に固定化された第一の標的物質捕捉分子と接触させることによって、結果的に磁性マーカーを検出部の表面に固定化する。
【０００７】
このような磁気検出の手法を用いた標的物質検出素子として、以下の手法が提案されている。センサー素子上の第一の捕捉分子と標的分子を介した第二の捕捉分子に標識された磁性微粒子の磁気信号を、磁気抵抗効果素子を用いて検出する方法が開示されている（特許文献１）。また、結合した磁性分子により形成される磁場を検知するための検知素子が半導体ホール素子を含むものであり、特定された磁性分子の量に基づいて測定対象物の分析を行うことを特徴とするバイオセンサーが開示されている（特許文献２）。また、ＳＱＵＩＤ（超電導量子干渉計）磁気センサーによる免疫反応の測定に用いられるのに好適な高感度の磁性マーカーとその作製方法が開示されている（特許文献３）。
【０００８】
ここで、特許文献３に記載されている磁性マーカーは、磁性微粒子とその周りを被覆するポリマーから構成される。このポリマーは、磁性微粒子の表面に吸着させた親水性マクロモノマーとカルボキシル基含有親水性ビニルモノマー及び架橋剤とのラジカル重合によって形成されている。そして、ポリマー上のカルボキシル基に抗体を結合させることによって磁性マーカーが得られている。
【特許文献１】米国特許５９８１２９７号明細書
【特許文献２】ＷＯ０３−０６７２５８号公報
【特許文献３】特許２００４−１５７０７２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、特許文献３に記載されているような従来の磁性マーカーは、検体液中において十分な分散性を有していないことから、磁性マーカー同士が凝集し、その結果、標的物質を高感度に検出することができないという課題があった。
【００１０】
本発明の目的は、検体液中において十分な分散性を有し、且つ、標的物質の高感度な検出を可能とする磁性マーカー及びその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、検出部の表面近傍に位置する磁性マーカーの有無、数を検知することにより、検体液中の標的物質の有無、濃度を検出する標的物質検出素子に用いる磁性マーカーであって、磁性微粒子と、該磁性微粒子の表面に存在するリビング重合開始基に結合した高分子鎖と、該高分子鎖の少なくとも一部に結合した生体分子と、を有することを特徴とする磁性マーカーである。
【００１２】
ここで、前記生体分子が、前記高分子鎖の少なくとも一部の末端に存在する活性基に結合していることが好ましい。
【００１３】
前記高分子鎖は水に対して高い親和性を有することが好ましい。
【００１４】
また、前記高分子鎖の分子量分布（重量平均分子量／数平均分子量）が１．８以下であることが好ましい。
【００１５】
また、前記高分子鎖の数平均分子量が５００以上１００００００以下であることが好ましい。
【００１６】
また、前記標的物質検出の検出方式が、磁気抵抗効果素子、ホール効果素子、超電導量子干渉計素子を用いる検出方式のいずれかであることが好ましい。
【００１７】
また別の本発明は、検出部の表面近傍に位置する磁性マーカーの有無、数を検知することにより、検体液中の標的物質の有無、濃度を検出する標的物質検出素子に用いる磁性マーカーの製造方法であって、
磁性微粒子の表面にリビング重合開始基を導入する工程と、
該リビング重合開始基が導入された磁性微粒子の存在下、モノマーをリビング重合して、該リビング重合開始基に結合した高分子鎖を形成する工程と、
該高分子鎖の少なくとも一部の末端に活性基を導入する工程と、
該活性基に生体分子を結合させる工程と
を含むことを特徴とする磁性マーカーの製造方法である。
【００１８】
前記リビング重合がリビングラジカル重合であることが好ましい。
【００１９】
また、前記リビングラジカル重合が原子移動ラジカル重合であることが好ましい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、検体液中において十分な分散性を有し、且つ、標的物質の高感度な検出を可能とする磁性マーカー及びその製造方法を提供できる。より詳しくは、本発明の磁性マーカーは、磁性微粒子の表面に精密制御された、生体分子を含む高分子鎖を結合していることから、検体液中において十分な分散性機能を有し、且つ、生体分子が磁性微粒子の最表面に局在化している。このことから、標的物質の高感度な検出を可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、検出部の表面近傍に位置する磁性マーカーの有無、数を検知することにより検体液中の標的物質の有無、濃度を検出する標的物質検出に用いる磁性マーカーである。
【００２２】
本発明の磁性マーカーの一例の模式図を図１に示す。図１の磁性マーカー１は、磁性微粒子２の表面のリビング重合開始基４に高分子鎖３を結合した構造を有している。
【００２３】
高分子鎖３は、検体液、即ち、水に対して高い親和性を有し、検体液中における磁性マーカー同士の凝集を防止する機能を有している。したがって、本発明の磁性マーカー１は、水中で優れた分散性を有する。
【００２４】
更に、高分子鎖３の一部には生体分子６が結合している。図１の磁性マーカー１は、高分子鎖３の一部の末端に活性基５が存在しており、その活性基５を介して生体分子６を有している。そして、生体分子６が磁性マーカー１の表面に局在化していることから、免疫反応によって検体液中に存在する標的物質を検出することができる。生体分子（例えば二次抗体）が高分子鎖の中に閉じ込められていると、抗原との反応が生じにくくなる場合がある。これに対し、生体分子が表面に局在化すると、抗原抗体反応の反応効率が良くなり、好ましい。
【００２５】
本発明の磁性マーカー１をイムノアッセイ（抗原抗体検査）に用いた場合における、検出部の表面近傍の模式図を図２に示す。図２において、磁性マーカー１は二次抗体７を有し、検出部１０に固定化された一次抗体８、標的物質である抗原９とサンドイッチ型の抗原抗体反応によって、検出部１０の表面に固定化される。なお、二次抗体７となる部分は生体分子６に存在する。その結果、検出部１０に固定化された磁性マーカー１からの磁界信号を検出することによって、検体液中の標的物質である抗原９の有無、濃度を検出することができる。
【００２６】
本発明の磁性マーカーは、次の工程を含む方法により好適に製造できる。
・磁性微粒子の表面にリビング重合開始基を導入する工程。
・該リビング重合開始基が導入された磁性微粒子の存在下、モノマーをリビング重合して、該リビング重合開始基に結合した高分子鎖を形成する工程。
・該高分子鎖の少なくとも一部の末端に活性基を導入する工程。
・該活性基に生体分子を結合させる工程。
このような方法により、磁性微粒子の表面に、分子量、分子量分布（重量平均分子量／数平均分子量）、及びグラフト密度が精密制御された高分子鎖がグラフト化され、表面に生体分子が固定化された磁性マーカーが得られる。
【００２７】
リビング重合としては、リビングラジカル重合、リビングカチオン重合、及びリビングアニオン重合を挙げることができる。これらの中でも、重合の簡便さからリビングラジカル重合が好ましい。また、リビングラジカル重合には、原子移動ラジカル重合、ニトロキシド媒介重合、ＲＡＦＴ（付加開裂移動型）重合、光イニシエーター重合等を使用することができる。ここでは、特に、原子移動ラジカル重合を用いた方法について詳細に説明する。
【００２８】
リビングラジカル重合は、一般的にモノマーの種類、重合度、共重合体の形成を自由に設計することができ、磁性微粒子表面の高分子鎖の分子量、分子量分布、及びグラフト密度を精密に制御することによって、磁性微粒子に分散性を付与することができる。
【００２９】
（磁性微粒子）
本発明の磁性マーカーを構成する磁性微粒子としては、例えばフェライトを使用することができる。フェライトは、生理活性条件下で十分な磁性を有し、溶媒中で酸化等の劣化が起こりにくいことから好ましい。フェライトは、マグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）、マグヘマイト（γ−Ｆｅ2Ｏ3）、及びこれらのＦｅの一部を他の原子で置換した複合体から選択される。他の原子としては、Ｌｉ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｃａ、Ｓｃ、Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｇａ、Ｇｅ、Ｚｒ、Ｎｂ、Ｍｏ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｓｎ、Ｔａ、Ｗの少なくともいずれかが挙げられる。
【００３０】
磁性微粒子の平均粒径は、１０から５００ｎｍが好ましく、更に２０から２００ｎｍが好ましい。なお、磁性微粒子の平均粒径は、動的光散乱法で測定できる。
【００３１】
また、磁性微粒子は、原子移動ラジカル重合開始基の前駆体と反応する官能基を有していることが好ましい。官能基を有していない磁性微粒子を用いる場合には、適宜前処理して、原子移動ラジカル重合開始基の前駆体と反応する官能基を導入しておくことが好ましい。このような官能基としては、水酸基を挙げることができる。
【００３２】
（リビング重合開始基の導入）
磁性微粒子への原子移動ラジカル重合開始基の導入方法について説明する。
【００３３】
磁性微粒子の表面に存在する官能基と、原子移動ラジカル重合開始基の前駆体の官能基とを反応させて、磁性微粒子の表面に原子移動ラジカル重合開始基を導入することができる。例えば、下記の反応式（Ｉ）に従って行うことができる。
【００３４】
【化１】
2007263935.tif 000002
【００３５】
即ち、反応溶媒中に磁性微粒子を十分に分散させる。その後、不活性ガスの雰囲気下で原子移動ラジカル重合開始基の前駆体１を前記磁性微粒子含有溶液に加え、磁性微粒子の水酸基と原子移動ラジカル重合開始基の前駆体１のトリクロロシリル基を反応させる。このような方法により、磁性微粒子の表面に原子移動ラジカル重合開始基を導入することができる。原子移動ラジカル重合開始基の前駆体１の官能基は、トリクロロシリル基以外にトリメトキシシリル基、あるいはトリエトキシシリル基であっても構わない。
【００３６】
不活性ガスとしては、窒素ガスやアルゴンガスを使用することができる。
【００３７】
反応溶媒は特に限定されないが、例えば、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ベンゼン、トルエン、キシレン等を使用することができる。
【００３８】
原子移動ラジカル重合開始基の前駆体１の代わりに、以下に記載の原子移動ラジカル重合開始基の前駆体２から４を使用しても良い。また、原子移動ラジカル重合開始基の前駆体２から４のトリクロロシリル基は、トリメトキシシリル基、あるいはトリエトキシシリル基であっても構わない。
【００３９】
反応温度に関しては、上記の反応が進行するのであれば特に限定されないが、０℃以上１００℃以下の範囲内であることが好ましい。
【００４０】
原子移動ラジカル重合開始基の前駆体の濃度は、磁性微粒子の表面官能基の濃度に対して１当量以上５当量以下の範囲内が好ましい。
【００４１】
【化２】
2007263935.tif 000003
【００４２】
【化３】
2007263935.tif 000004
【００４３】
【化４】
2007263935.tif 000005
【００４４】
導入されるリビング重合開始基の数は、目的とするグラフト密度となるように適宜調整する。例えば、０．０１分子／ｎｍ2以上１．０分子／ｎｍ2以下のグラフト密度でリビング重合開始基を導入することができる。
【００４５】
（リビング重合）
ここでは、原子移動ラジカル重合について説明する。
【００４６】
原子移動ラジカル重合は、例えば、ハロゲン化銅−ビピリジル錯体を用いると、ポリマー鎖末端の速やかな移動反応により分子量分布の狭いポリマーを得ることができる。この原子移動ラジカル重合は、銅錯体が成長末端から可逆的にハロゲン原子を引き抜くことにより反応が進行する。原子移動ラジカル重合における反応制御の要因としては、リガンド、開始基の種類、触媒濃度、反応温度、反応時間、濃度などが挙げられる。これらの条件を最適化し、反応を制御することによって、分子量分布の狭いポリマーを形成することができる。
【００４７】
そこで、原子移動ラジカル重合開始基が導入された磁性微粒子をコア粒子として用い、原始移動ラジカル重合を行うことで、容易にコア粒子表面に鎖長の揃った高分子鎖を形成することができる。具体的には、上記したコア粒子を反応溶媒に分散させた後、高分子鎖となる重合性モノマー、遷移金属錯体を添加し、反応系を不活性ガスで置換して原子移動ラジカル重合を行うことで、高分子鎖を形成することができる。
【００４８】
反応溶媒としては、コア粒子が分散するものであれば特に限定されない。例えば、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ピリジン、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、シクロヘキサノール、メチルセロソルブ、エチルセロソルブ、イソプロピルセロソルブ、ブチルセロソルブ、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸エチル、トリオキサン、テトラヒドロフラン、水等を使用することができる。これらは単独で使用しても良いし、又は２種以上を併用しても良い。
【００４９】
不活性ガスとしては、窒素ガスやアルゴンガスを使用することができる。
【００５０】
遷移金属錯体としては、ハロゲン化金属とリガンドからなる錯体を使用することができる。ハロゲン化金属の金属種としては、原子番号２２番のＴｉから３０番のＺｎまでの遷移金属が好ましく、更に、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕが好ましい。その中でも、塩化第一銅、臭化第一銅が好ましい。
【００５１】
リガンドとしては、ハロゲン化金属に配位可能であれば特に限定されない。例えば、２，２’−ビピリジル、４，４’−ジ−（ｎ−ヘプチル）−２，２’−ビピリジル、２−（Ｎ−ペンチルイミノメチル）ピリジン、（−）−スパルテイン、トリス（２−ジメチルアミノエチル）アミン、エチレンジアミン、ジメチルグリオキシム、１，４，８，１１−テトラメチル−１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン、１，１０−フェナントロリン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ペンタメチルジエチレントリアミン、ヘキサメチル（２−アミノエチル）アミン等を使用することができる。
【００５２】
遷移金属錯体は、高分子鎖となるモノマーに対して、０．００１質量％以上１０質量％以下の割合で添加することが好ましく、より好ましくは０．０５質量％以上５質量％以下である。
【００５３】
重合温度は、４０℃以上１００℃以下の範囲が好ましく、より好ましくは５０℃以上８０℃以下の範囲である。
【００５４】
また、重合を行う際、磁性微粒子に固定化されていないフリーな重合開始種を添加することが好ましい。フリーな重合開始種から生成するフリーポリマーは、磁性微粒子にグラフト化された高分子鎖の分子量及び分子量分布の指標とすることができる。
【００５５】
フリーな重合開始種としては、磁性微粒子に固定化している原子移動ラジカル重合基と同種のものを選択することが好ましい。つまり、原子移動ラジカル重合開始基の前駆体１により重合開始基を導入した粒子に対しては、２−ブロモイソ酪酸エチルがフリーな重合開始種として好ましい。原子移動ラジカル重合開始基の前駆体２により重合開始基を導入した粒子に対しては、２−ブロモプロピオン酸エチルが好ましい。原子移動ラジカル重合開始基の前駆体３により重合開始基を導入した粒子に対しては、ベンジルクロライドが好ましい。原子移動ラジカル重合開始基の前駆体４により重合開始基を導入した粒子に対しては、ベンゼンスルホニルクロライドが好ましい。
【００５６】
（高分子鎖）
本発明の磁性マーカーが有する高分子鎖について説明する。
【００５７】
本発明の磁性マーカーが有する高分子鎖は、リビング重合開始基が導入された磁性微粒子の存在下、モノマーをリビング重合することで形成することができる。このときの高分子鎖は、リビング重合開始基に結合しており、直鎖状に成長した非架橋型の高分子鎖となる。
【００５８】
本発明の磁性マーカーが有する高分子鎖は、水に対して高い親和性を有することが好ましい。ここでいう「高い親和性」とは、高分子鎖と水が相分離することなく、相溶性に優れている性質を意味する。高分子鎖が水に対して高い親和性を有することにより、水溶性の検体液中で高分子鎖が広がりを有する。これにより、磁性マーカー間の凝集を防止することが可能となる。
【００５９】
このような分散機能を有する高分子鎖形成するためのモノマーとしては、上記したように、その重合体が水に対して高い親和性を有するポリマー、即ち、親水性ポリマーとなることが好ましい。また、前記親水性ポリマーとしては、例えば、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、ポリエチレングリコールアクリレート、メトキシポリエチレングリコールアクリレート、ポリエチレングリコールメタクリレート、メトキシポリエチレングリコールメタクリレート等の親水性モノマーを重合してなる重合体が挙げられる。これらは、単独で重合してもよく、２種以上を混合して共重合体を形成してもよい。
【００６０】
モノマーの使用量は、目的とする数平均分子量の高分子鎖を形成するのに必要な量とする。例えば、リビング重合開始基１個に対して５分子以上１００００分子以下のモノマーを使用することができる。
【００６１】
また、高分子鎖の数平均分子量は、５００以上１００００００以下の範囲が好ましく、更に１０００以上５０００００以下が好ましい。高分子鎖の数平均分子量が５００未満であると、分散機能を発現することが難しくなる場合があり、高分子鎖の数平均分子量が１００００００を超えると、水に対する溶解性が低下する場合がある。
【００６２】
各磁性マーカーの分散性のバラツキを抑制するには、磁性微粒子にグラフト化される高分子鎖の分子量分布が狭いことが望ましい。即ち、磁性微粒子にグラフト化される高分子鎖の分子量分布（重量平均分子量／数平均分子量）は１．８以下が好ましく、分子量分布は１．５以下が好ましい。
【００６３】
なお、磁性微粒子にグラフト化された高分子鎖の数平均分子量及び分子量分布は、前記のようにフリーな重合開始種から生成するフリーポリマーの数平均分子量及び分子量分布と同じとして見積もることができる。また、ポリマーの数平均分子量及び分子量分布は、ＧＰＣ（東ソー社製、商品名：ＡＳ−８０２０、溶離液：水、標準ポリマー：ポリエチレンオキシド）により測定できる。
【００６４】
なお、高分子鎖のグラフト密度はリビングラジカル重合開始基の導入率によって制御することができる。また、高分子鎖の鎖長（数平均分子量）及び分子量分布は、重合性モノマーの添加量や重合時間等によって制御することができる。
【００６５】
（高分子鎖の末端への活性基の導入）
重合過程で連鎖移動剤を添加することで、高分子鎖の末端に活性基を導入することができる。ここで、本発明および本明細書において、「活性基」とは、生体分子が有する官能基と反応し得る官能基のことを意味する。連鎖移動剤とは、一般にラジカル重合反応において、連鎖移動反応により、反応の活性点を移動させる物質であり、重合の末端を所望の官能基に変換したいときに用いられる。本発明においては、生体分子の固定化用の活性基を導入するために、連鎖移動剤が原子移動ラジカル重合の過程で使用される。
【００６６】
本発明においては、連鎖移動剤がチオール化合物であることが好ましい。連鎖移動剤として有効なチオール化合物は、炭素鎖が２以上のアルキル鎖の一端にチオール基を有し、他端に所望の官能基を有するものを用いる。所望の官能基とは、生体分子を固定化する為の官能基、即ち、活性基のことであり、活性基としては、例えば、カルボキシル基、活性エステル基、及びアミノ基などを挙げることができる。活性基を有する連鎖移動剤としては、例えば、メルカプト酢酸を挙げることができる。
【００６７】
また、高分子鎖の末端に導入する活性基の量を制御するには、活性基を有する連鎖移動剤と不活性基を有する連鎖移動剤の２種を所望の割合で添加すれば良い。不活性基を有する連鎖移動剤としては、炭素鎖が２以上のアルキル鎖の一端にチオール基を有し、他端に水酸基を有するものが好ましい。活性基を有する連鎖移動剤と不活性基を有する連鎖移動剤の割合は、例えば、モル比での、活性基を有する連鎖移動剤／不活性基を有する連鎖移動剤が１／１０００００以上１００／１以下の範囲とすることができる。
【００６８】
重合終了後、生成した磁性微粒子を洗浄、ろ過、デカンテーション、沈殿分別、遠心分離等の適当な方法によって分離精製して、末端に活性基を含む高分子鎖が結合した磁性微粒子を得ることができる。
【００６９】
（生体分子による検出）
本発明の磁性マーカーに固定化される生体分子としては、タンパク質、ＤＮＡ、糖鎖、及びアレルゲン、バクテリア、ウイルス等の抗体を挙げることができる。
【００７０】
生体分子内には、磁性微粒子にグラフトされた高分子鎖の末端の活性基と反応する他の活性基を有していることが好ましい。高分子鎖の末端の活性基がカルボキシル基である場合は、生体分子内にアミノ基を有していることが好ましく、高分子鎖の末端の活性基がアミノ基である場合は、生体分子内にカルボキシル基を有していることが好ましい。これらの活性基間の結合様式は特に限定されないが、例えば、上記の組み合わせによるアミド結合などを挙げることができる。アミド結合を形成する為の反応条件、即ち、ｐＨや反応温度などは、上記の組合せに応じて適宜決めれば良い。
【００７１】
例えば、検出部に一本鎖の状態のＤＮＡプローブを固定化しておく。その後、標的物質である検体ＤＮＡを固定化した磁性マーカーを含む検体液を検出部に滴下し、ＤＮＡプローブと検体ＤＮＡが交配した場合に磁性マーカーが検出部の表面に固定される。検出部の表面に固定されない磁性マーカーを洗浄などによって検出部から除去した後、磁性マーカーの測定を行う。このとき磁性マーカーの存在が確認されれば、検体ＤＮＡは所望のＤＮＡ配列を持つものであると確認される。以上はＤＮＡの検出方法について述べたが、その他にも例えば抗原の検出を行うことも可能である。
【００７２】
例えば、検出部に一次抗体を固定化しておく。その後、検体液を検出部に滴下する。このとき検体液中に所望の抗原が存在するならば、一次抗体と抗原が特異的に結合する。検出部表面の検体液を洗浄し、不要な物質を除去しておく。検出に用いる磁性マーカーには抗原に特異的に結合する二次抗体を固定しておき、この磁性マーカーを含む溶液を検出部の表面に滴下する。次に検出部の表面を洗浄し、抗原と結合しなかった磁性マーカーを除去する。測定で磁性マーカーを検出することによって、間接的に抗原を検出することができる。
【００７３】
（検出方式）
本発明の磁性マーカーを用いて標的物質を検出する検出方式は、磁界効果を利用する方式であれば如何なる方式でも用いることが可能である。その中でも特に、磁気抵抗効果素子、ホール効果素子、超電導量子干渉計素子を好適に用いることができる。
【実施例】
【００７４】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明する。なお、本発明に係る磁性マーカー、及びその製造方法は、以下に示す実施例のみに限定されるものではない。
【００７５】
（実施例１）
本実施例では、本発明の磁性マーカー及びその製造方法、並びにそれを用いて前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を検出するバイオセンサーについて説明する。バイオセンサーの検出方式としては、磁気抵抗効果素子を使用する。
【００７６】
無水トルエンに磁性微粒子（マグネタイト、平均粒径５０ｎｍ、粒子表面に水酸基を含有）を十分に分散させる。その後、窒素雰囲気下で原子移動ラジカル重合開始基の前駆体１（ｎ＝６）を前記磁性微粒子含有溶液に加え、磁性微粒子の水酸基と前駆体１のトリクロロシリル基とを反応させて、磁性微粒子の表面に原子移動ラジカル重合開始基を導入する。
【００７７】
次に、原子移動ラジカル重合開始基を導入した磁性微粒子をメタノールに分散させた後、フリーな重合開始剤として２−ブロモイソ酪酸エチルを加え、ＣｕＢｒ、２，２’−ビピリジルを加える。凍結真空脱気により反応系内の酸素を除去した後、窒素で置換し、ＨＥＭＡ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）モノマーを原子移動ラジカル重合により所定時間反応させる。反応系内にメルカプト酢酸：メルカプトエタノール＝１：１００（モル比）の割合で大量に加えることにより、磁性微粒子上にグラフト化された高分子鎖（ＰＨＥＭＡ）末端にカルボキシル基とヒドロキシル基が混在した状態とする。
【００７８】
Ｘ線光電子分光法を用いてＳ原子を検出することで連鎖移動剤が導入されていることを確認できる。飛行時間型二次イオン質量分析計を用いて、ポリマー末端に結合したメルカプト酢酸とメルカプトエタノールに由来するイオンを検出することで２種類のポリマー末端が形成されていることが確認できる。
【００７９】
また、フリーな重合開始種として加えておいた２−ブロモイソ酪酸エチルから生成した高分子の分子量と分子量分布を測定すると、数平均分子量が５０００で、分子量分布が１．０７である。このことから、磁性微粒子にグラフト化された高分子鎖は鎖長の揃った高分子鎖であることを確認できる。
【００８０】
このようにして得られた磁性微粒子は、水中において優れた分散性を有していることが確認できる。
【００８１】
前記磁性微粒子の表面に水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）、Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）を反応させ、ＰＨＥＭＡ層の末端のカルボキシル基を活性エステル基に変換する。抗ＰＳＡ抗体（二次抗体）を溶解したリン酸緩衝溶液中に前記磁性微粒子を加え、抗ＰＳＡ抗体のアミノ基と前記磁性微粒子の活性エステル基とを反応させて、抗ＰＳＡ抗体を固定する。このようにして得られた磁性マーカーは、水中において優れた分散性を有していることが確認できる。
【００８２】
バイオセンサーの検出部上に形成されるＡｕ膜の表面にＰＳＡを捕捉する一次抗体を固定化する。まず、１０−カルボキシ−１−デカンチオールのエタノール溶液をＡｕ膜表面に塗布する。この操作により、Ａｕ膜表面にカルボキシル基が露出される。次に、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド水溶液と１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩水溶液を同様に塗布する。これらの操作により、Ａｕ膜表面にスクシンイミド基が露出することになる。前記スクシンイミド基と抗体のアミノ基を反応させ、ＰＳＡを捕捉する一次抗体を固定化することができる。尚、Ａｕ膜表面上の未反応のスクシンイミド基は、塩酸ヒドロキシルアミンを添加して脱離させてもよい。
【００８３】
以上の操作により、Ａｕ膜の表面にＰＳＡを捕捉する一次抗体を有するバイオセンサーを作製することができる。
【００８４】
このバイオセンサーを用い、以下のプロトコールに従って、前立腺癌のマーカーとして知られているＰＳＡの検出を試みることができる。
（１）抗原（標識物質）であるＰＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（検体液）に上記バイオセンサーの検出部を浸し、５分間インキュベートする。
（２）未反応のＰＳＡをリン酸緩衝生理食塩水で洗浄する。
（３）磁性マーカーに固定化された抗ＰＳＡ抗体（二次抗体）を含むリン酸緩衝生理食塩水に工程（１）及び（２）が終了した上記バイオセンサーの検出部を浸し、５分間インキュベートする。
（４）未反応の該磁性マーカーをリン酸緩衝生理食塩水で洗浄する。
【００８５】
上記プロトコールによって、抗ＰＳＡ抗体（二次抗体）、抗原、一次抗体がそれぞれ結合し、磁性マーカーが図２に示すようにバイオセンサーの検出部上に固定されている。つまり、検体液中に抗原が存在しない場合には、磁性マーカーはバイオセンサーの検出部上に固定されないので、磁性マーカーの有無を検出することによって、抗原の検出が可能である。また、固定された磁性マーカーの数を検出することによって、検体液中に含まれる抗原の量を間接的に知ることが可能である。本実施例の磁性マーカーは、検体液中において分散性に優れ、且つ、二次抗体が磁性微粒子の最表面に局在化していることから、抗原抗体反応が効率良く進行し、標的物質を高感度に検出することができる。
【００８６】
（実施例２）
検出方式を実施例１の磁気抵抗効果素子からホール効果素子に替え、実施例１の磁性マーカーを使用して、実施例１と同様にして評価する。本実施例の磁性マーカーは、検体液中において優れた分散性を有し、且つ、二次抗体が磁性微粒子の最表面に局在化していることから、抗原抗体反応が効率良く進行し、標的物質を高感度に検出することができる。
【００８７】
（実施例３）
検出方式を実施例１の磁気抵抗効果素子から超電導量子干渉計素子に替え、実施例１の磁性マーカーを使用して、実施例１と同様にして評価する。本実施例の磁性マーカーは、検体液中において優れた分散性を有し、且つ、二次抗体が磁性微粒子の最表面に局在化していることから、抗原抗体反応が効率良く進行し、標的物質を高感度に検出することができる。
【００８８】
（実施例４）
実施例１の高分子鎖を形成するモノマーをＨＥＭＡからポリエチレングリコールメタクリレート（商品名：ＮＫエステルＭ−９０Ｇ、新中村化学製）に替えて、実施例１と同様にして磁性マーカーを合成する。また、フリーな重合開始種として加えておいた２−ブロモイソ酪酸エチルから生成した高分子の分子量と分子量分布を測定すると、数平均分子量が９０００で、分子量分布が１．０８である。このことから、磁性微粒子にグラフト化された高分子鎖は鎖長の揃った高分子鎖であることを確認できる。
【００８９】
実施例１と同様の操作を行って磁性マーカーを合成すると、水中において優れた分散性を有していることが確認できる。
【００９０】
この磁性マーカーを使用して、実施例１と同様にして評価する。そして、本実施例の磁性マーカーは、検体液中において優れた分散性を有し、且つ、二次抗体が磁性微粒子の最表面に局在化していることから、抗原抗体反応が効率良く進行し、標的物質を高感度に検出することができる。
【００９１】
（実施例５）
検出方式を実施例４の磁気抵抗効果素子からホール効果素子に替え、実施例４の磁性マーカーを使用して、実施例４と同様にして評価する。本実施例の磁性マーカーは、検体液中において優れた分散性を有し、且つ、二次抗体が磁性微粒子の最表面に局在化していることから、抗原抗体反応が効率良く進行し、標的物質を高感度に検出することができる。
【００９２】
（実施例６）
検出方式を実施例４の磁気抵抗効果素子から超電導量子干渉計素子に替え、実施例４の磁性マーカーを使用して、実施例４と同様にして評価する。本実施例の磁性マーカーは、検体液中において優れた分散性を有し、且つ、二次抗体が磁性微粒子の最表面に局在化していることから、抗原抗体反応が効率良く進行し、標的物質を高感度に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】本発明の磁性マーカーの一例の模式図である。
【図２】本発明の磁性マーカーをイムノアッセイ（抗原抗体検査）に用いた場合における、検出部の表面近傍の模式図である。
【符号の説明】
【００９４】
１  磁性マーカー
２  磁性微粒子
３  高分子鎖
４  リビング重合開始基
５  活性基
６  生体分子
７  二次抗体
８  一次抗体
９  抗原
１０  検出部
【図１】
2007263935.tif 000006
【図２】
2007263935.tif 000007