(57)【要約】【課題】筋肉の分化および生存を促進する有用な治療法を提供すること。このような治療法は色々な神経性および筋肉の疾患および障害の治療に有用である。【解決手段】平滑筋の筋細胞上の受容体と結合するかまたは平滑筋の筋細胞の第２のメッセンジーシステムを活性化するポリペプチドまたは化合物を含有してなる、平滑筋の筋細胞の分裂促進、成長、分化または生存を誘導することによって平滑筋障害を治療または予防するための医薬品。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
平滑筋の筋細胞上の受容体と結合するかまたは平滑筋の筋細胞の第２のメッセンジーシステムを活性化するポリペプチドまたは化合物を含有してなる、平滑筋の筋細胞の分裂促進、成長、分化または生存を誘導することによって平滑筋障害を治療または予防するための医薬品であって、該ポリペプチドまたは化合物が、
ａ）配列番号１３３または１５９に記載される核酸配列によってコードされるＥ配列からなるポリペプチド；
ｂ）配列番号１３２に記載される核酸配列によってコードされるＦ配列からなるポリペプチド；
ｃ）式
ＹＢＡＺＣＸ
（式中、ＹＢＡＺＣＸは図３０に示されるポリペプチドセグメント（配列番号１３３〜１３５、１３７〜１４３、１４６、１５６および１５９）から構成され、式中、ＹはポリペプチドセグメントＥ（配列番号１３３および１５９）からなるかまたは存在せず、式中、ＺはポリペプチドセグメントＧ（配列番号１３７）からなるかまたは存在せず、そして式中、ＸはポリペプチドセグメントＣ／Ｄ  ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ  Ｈ、Ｃ／Ｄ  ＨＬ、Ｃ／Ｄ  Ｄ、Ｃ／Ｄ′  ＨＬ、Ｃ／Ｄ′  ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ′  Ｈ、Ｃ／Ｄ′  Ｄ、Ｃ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  Ｈ、Ｃ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  ＨＬ、Ｃ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  Ｄ、Ｃ／Ｄ  Ｄ′  Ｈ、Ｃ／Ｄ  Ｄ′  ＨＬ、Ｃ／Ｄ  Ｄ′  ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ′  Ｄ′  Ｈ、Ｃ／Ｄ′  Ｄ′  ＨＬ、Ｃ／Ｄ′  Ｄ′  ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  Ｄ′  Ｈ、Ｃ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  Ｄ′  ＨＬ、またはＣ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  Ｄ′  ＨＫＬからなる；ここで、前記ポリペプチドセグメントは、Ａが配列番号１３５、Ｂが配列番号１３４、Ｃが配列番号１５６、Ｃ／Ｄが配列番号１３８、Ｃ／Ｄ′が配列番号１３９、Ｄが配列番号１４０、Ｄ′が配列番号１４１、Ｈが配列番号１４６、Ｋが配列番号１４２、Ｌが配列番号１４３で示される）によって定義されるポリペプチド；
ｄ）式
ＷＢＡＺＣＸ
（式中、ＷＢＡＺＣＸは図３０に示されるポリペプチドセグメント（配列番号１３２、１３４、１３５、１３７〜１４３、１４６および１５６）から構成され、式中、ＷはポリペプチドセグメントＦ（配列番号１３２）からなるかまたは存在せず、式中、ＺはポリペプチドセグメントＧ（配列番号１３７）からなるかまたは存在せず、そして式中、ＸはポリペプチドセグメントＣ／Ｄ  ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ  Ｈ、Ｃ／Ｄ  ＨＬ、Ｃ／Ｄ  Ｄ、Ｃ／Ｄ′  ＨＬ、Ｃ／Ｄ′  ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ′  Ｈ、Ｃ／Ｄ′  Ｄ、Ｃ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  Ｈ、Ｃ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  ＨＬ、Ｃ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  Ｄ、Ｃ／Ｄ  Ｄ′  Ｈ、Ｃ／Ｄ  Ｄ′  ＨＬ、Ｃ／Ｄ  Ｄ′  ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ′  Ｄ′  Ｈ、Ｃ／Ｄ′  Ｄ′  ＨＬ、Ｃ／Ｄ′  Ｄ′  ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  Ｄ′  Ｈ、Ｃ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  Ｄ′  ＨＬ、またはＣ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  Ｄ′  ＨＫＬからなる；ここで、前記ポリペプチドセグメントは、Ａが配列番号１３５、Ｂが配列番号１３４、Ｃが配列番号１５６、Ｃ／Ｄが配列番号１３８、Ｃ／Ｄ′が配列番号１３９、Ｄが配列番号１４０、Ｄ′が配列番号１４１、Ｈが配列番号１４６、Ｋが配列番号１４２、Ｌが配列番号１４３で示される）によって定義されるポリペプチド；
ｅ）筋細胞のｐ１８５erbB2受容体と特異的に結合する化合物;
ｆ）上皮成長因子様（ＥＧＦ−様）ドメインからなるポリペプチドであって、該上皮成長因子様ドメインが
ｉ）配列番号１５０（ＥＧＦＬ１）；
ii）配列番号１５１（ＥＧＦＬ２）；
iii）配列番号１５２（ＥＧＦＬ３）；
iv）配列番号１５３（ＥＧＦＬ４）；
ｖ）配列番号１５４（ＥＧＦＬ５）；および
vi）配列番号１５５（ＥＧＦＬ６）；
からなる群から選択される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｇ）
ｉ）ラットＩ−ＥＪ形質転換された線維芽細胞系から単離された３５ｋＤポリペプチド因子;
ii）ＳＫＢＲ−３  ヒト胸部細胞系から単離された７５ｋＤポリペプチド因子;
iii）ラットＩ−ＥＪ形質転換された線維芽細胞系から単離された４４ｋＤポリペプチド因子;
iv）ＭＤＡ−ＭＢ２３１  ヒト胸部細胞系から単離された４５ｋＤポリペプチド因子;
ｖ）ＡＴＬ−２ヒトＴ細胞系から単離された７〜１４ｋＤポリペプチド因子;
vi）活性化されたマウス腹腔マクロファージから単離された２５ｋＤポリペプチド因子;
vii）ウシ腎臓から単離された２５ｋＤポリペプチド因子;
viii）ＡＲＩＡポリペプチド; および
ix）０〜２Ａ前グリア細胞を刺激する４６〜４７ｋＤポリペプチド因子
からなる群から選択されるポリペプチド；および
ｈ）ＧＧＦ−IIIからなるポリペプチド；
からなる群から選択される医薬品。
【請求項２】
前記ポリペプチドが配列番号１３３または１５９に記載される核酸配列によってコードされるＥ配列からなる請求項１記載の医薬品。
【請求項３】
前記ポリペプチドが配列番号１３２に記載される核酸配列によってコードされるＦ配列からなる請求項１記載の医薬品。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、式
ＹＢＡＺＣＸ
（式中、ＹＢＡＺＣＸは図３０に示されるポリペプチドセグメント（配列番号１３２〜１４３、１５６、１５７、１５９）から構成され、式中、ＹはポリペプチドセグメントＥからなるかまたは存在せず、式中、ＺはポリペプチドセグメントＧからなるかまたは存在せず、そして式中、ＸはポリペプチドセグメントＣ／Ｄ  ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ  Ｈ、Ｃ／Ｄ  ＨＬ、Ｃ／Ｄ  Ｄ、Ｃ／Ｄ′  ＨＬ、Ｃ／Ｄ′  ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ′  Ｈ、Ｃ／Ｄ′  Ｄ、Ｃ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  Ｈ、Ｃ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  ＨＬ、Ｃ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  Ｄ、Ｃ／Ｄ  Ｄ′  Ｈ、Ｃ／Ｄ  Ｄ′  ＨＬ、Ｃ／Ｄ  Ｄ′  ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ′  Ｄ′  Ｈ、Ｃ／Ｄ′  Ｄ′  ＨＬ、Ｃ／Ｄ′  Ｄ′  ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  Ｄ′  Ｈ、Ｃ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  Ｄ′  ＨＬ、またはＣ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  Ｄ′  ＨＫＬからなる）によって定義されるポリペプチドからなる請求項１記載の医薬品。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、式
ＷＢＡＺＣＸ
（式中、ＷＢＡＺＣＸは図３０に示されるポリペプチドセグメント（配列番号１３２〜１４３、１５６、１５７、１５９）から構成され、式中、ＷはポリペプチドセグメントＦからなるかまたは存在せず、式中、ＺはポリペプチドセグメントＧからなるかまたは存在せず、そして式中、ＸはポリペプチドセグメントＣ／Ｄ  ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ  Ｈ、Ｃ／Ｄ  ＨＬ、Ｃ／Ｄ  Ｄ、Ｃ／Ｄ′  ＨＬ、Ｃ／Ｄ′  ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ′  Ｈ、Ｃ／Ｄ′  Ｄ、Ｃ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  Ｈ、Ｃ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  ＨＬ、Ｃ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  Ｄ、Ｃ／Ｄ  Ｄ′  Ｈ、Ｃ／Ｄ  Ｄ′  ＨＬ、Ｃ／Ｄ  Ｄ′  ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ′  Ｄ′  Ｈ、Ｃ／Ｄ′  Ｄ′  ＨＬ、Ｃ／Ｄ′  Ｄ′  ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  Ｄ′  Ｈ、Ｃ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  Ｄ′  ＨＬ、またはＣ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  Ｄ′  ＨＫＬからなる）によって定義されるポリペプチドからなる請求項１記載の医薬品。
【請求項６】
前記化合物が平滑筋の筋細胞のｐ１８５erbB2受容体と特異的に結合する化合物からなる請求項１記載の医薬品。
【請求項７】
前記ポリペプチドが上皮成長因子様（ＥＧＦ−様）ドメインからなる医薬品であって、該上皮成長因子様ドメインが
ｉ）配列番号１５０（ＥＧＦＬ１）；
ii）配列番号１５１（ＥＧＦＬ２）；
iii）配列番号１５２（ＥＧＦＬ３）；
iv）配列番号１５３（ＥＧＦＬ４）；
ｖ）配列番号１５４（ＥＧＦＬ５）；および
vi）配列番号１５５（ＥＧＦＬ６）；
からなる群から選択される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列からなる請求項１記載の医薬品。
【請求項８】
前記ポリペプチドが
ｉ）ラットＩ−ＥＪ形質転換された線維芽細胞系から単離された３５ｋＤポリペプチド因子;
ii）ＳＫＢＲ−３  ヒト胸部細胞系から単離された７５ｋＤポリペプチド因子;
iii）ラットＩ−ＥＪ形質転換された線維芽細胞系から単離された４４ｋＤポリペプチド因子;
iv）ＭＤＡ−ＭＢ２３１  ヒト胸部細胞系から単離された４５ｋＤポリペプチド因子;
ｖ）ＡＴＬ−２ヒトＴ細胞系から単離された７〜１４ｋＤポリペプチド因子;
vi）活性化されたマウス腹腔マクロファージから単離された２５ｋＤポリペプチド因子;
vii）ウシ腎臓から単離された２５ｋＤポリペプチド因子;
viii）ＡＲＩＡポリペプチド; および
ix）０〜２Ａ前グリア細胞を刺激する４６〜４７ｋＤポリペプチド因子
からなる群から選択されるポリペプチドからなる請求項１記載の医薬品。
【請求項９】
前記ポリペプチドがＧＧＦ−IIIからなる請求項１記載の医薬品。
【請求項１０】
前記Ｅ配列からなるポリペプチドが配列番号１８５からなる請求項１記載の医薬品。
【請求項１１】
５０  Ｎ−末端アミノ酸が、前記Ｅ配列からなる前記ペプチドから開裂される請求項１または２記載の医薬品。
【請求項１２】
前記Ｆ配列からなるポリペプチドが、図３０に示されるアミノ酸配列(配列番号１３２、１３４、１３５)を有するＦＢＡポリペプチドセグメント、図３０に示されるアミノ酸配列(配列番号１３２、１３４、１３６)を有するＦＢＡ′ポリペプチドセグメント、図３０に示されるアミノ酸配列(配列番号１３２、１３５、１５９)を有するＦＥＢＡポリペプチドセグメント、または図３０に示されるポリペプチドセグメントに対応するアミノ酸配列(配列番号１３２〜１３４、１３６、１５９)を有するＦＥＢＡ′ポリペプチドセグメントからなる請求項１記載の医薬品。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが組換えヒトＧＧＦ２である請求項２記載の医薬品。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが発現可能な遺伝子構造にあるＤＮＡ配列によってコードされる請求項１〜１３のいずれか１項記載の医薬品。
【請求項１５】
前記平滑筋障害が動脈硬化、血管障害、または先天性血管疾患もしくは障害である請求項１〜１４のいずれか１項記載の医薬品。
【請求項１６】
平滑筋の筋細胞増殖の疾患または障害の治療または予防のための医薬品であって、請求項１〜１４のいずれか１項に定義されたポリペプチドまたは化合物と結合する抗体を含有してなる医薬品。
【請求項１７】
前記治療または予防がヒトの治療または予防である請求項１〜１６のいずれか１項記載の医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脊椎動物種において見出された、筋細胞のための成長、分化および生存因子であるポリペプチドを投与することによる、筋組織の疾患および障害の予防的または肯定的（affirmative）治療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
成長した（adult）脊椎動物における筋組織は付随細胞（satellite cells）と呼ばれる予備の筋芽細胞から再生するであろう。付随細胞は筋組織全体に分布しており、損傷または疾患がなければ有糸分裂的に静止している。筋肉損傷ののち、または疾患からの回復の間に、付随細胞は細胞周期に再び入り、増殖して１）既存の筋線維に入るか、２）新しい筋線維を形成する多角性筋管に分化するであろう。筋芽細胞は最終的に既存の筋線維に置きかわる筋線維を生じるか既存の筋線維と融合し、これによって収縮装置成分の合成による線維帯径（girth）が増す。この過程は、たとえば誘導された筋線維変性（degradation）に続くホ乳動物において起こるほぼ完全な再生によって例証される；前筋細胞（muscle progenitor cells）は増殖し再生する筋線維とともに融合する。
【０００３】
成長した（および未成長の（embryonic））筋芽細胞のインビトロの増殖および分化を制御するいくつかの成長因子が同定されている。線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は筋細胞に対して分裂促進性（mitogenic）であり、筋肉分化の阻害剤である。トランフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）は筋芽細胞の増殖には効果がないが、筋肉分化の阻害材である。インスリン様成長因子類（ＩＧＦｓ）は齧歯動物における筋芽細胞の増殖および分化の両方を刺激することが示されている。血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）もまた筋芽細胞に対して分裂促進性であり、筋細胞の分化の有力な阻害剤である（参照：FloriniおよびMagri, 1989:256:C701〜C711）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
脊椎動物種において筋組織およびニューロンのいずれもが筋芽細胞の増殖および分化を刺激する因子の有力なソースである。起源が神経系（すなわち、神経原性）である神経筋システムを冒す疾患において、冒された神経が分布する（innervate）筋組織は麻痺し進行性で衰える。末梢神経の再生と神経学的およびミオパシャー性（myopathic）の疾患からの回復の間に、ニューロンは前記の筋肉の再生を誘い出す成長因子のソースを提供するかもしれず、衰弱と萎縮からの筋肉の修復のメカニズムを提供しうる。
【０００５】
最近記載された成長因子のファミリー、ニューレグリン（neuregulin）類は駆動ニューロン（motor neurons）（Marchioniら、Nature 362:313, 1993）および炎症性細胞（Tarakhovskyら、Oncogene 6:2187-2196(1991))によって合成される。ニューレグリン類および関連のｐ１８５erbB2結合因子は精製され、クローン化され、発現されている（Benvenisteら、PNAS 82:3930-3934、1985；Kimuraら、Nature 348:257-260、1990；DavisおよびStroobant、J. Cell. Biol. 110：1353-1360、1990；Wenら、Cell 69:559、1992；YardenおよびUllrich、Ann. Rev. Biochem. 57:443、1988；Holmesら、Science 256:1205、1992；Dobashiら、Proc. Natl. Acad. Sci. 88:8582、1991；Lupuら、Proc. Natl. Acad. Sci. 89:2287、1992）。組換えニューレグリン類は末梢グリアに対して分裂促進性であることが示され（Marchionniら、Nature 362:313、1993）、神経筋接合（junction）の形成に影響を与えることが示されている（Fallsら、Cell 72:801、1993）。したがって再生するニューロンと神経原性疾患および神経損傷からの修復に関係する炎症性細胞により駆動ニューロン（motor neurons）の再ミエリン化（remyelination）およびそれらのターゲットとの適当な連結（connection）を形成する能力を調整する因子のソースを提供する。筋肉が再度分布した（reinnervated）のち、駆動ニューロンは筋肉の成長および生存を刺激する、筋肉に対する因子を提供するかもしれない。
【０００６】
現在、筋肉の分化および生存を促進する有用な治療法はない。このような治療法は色々な神経性および筋肉の疾患および障害の治療に有用であろう。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
我々は筋細胞の増大された分裂促進分化および生存が、グリア成長因子、活性を誘導するアセチルコリン受容体（ＡＲＩＡ）、ヘレグリン（heregulin）類、ニュー分化因子（neu differentiation factor）およびより一般的なニューレグリン類などの前記したタンパク質を用いて達成されうることを発見した。我々はこれらの化合物が筋細胞の増殖および筋管の分化と生存の両方を誘導しうることを発見した。これらの現象は骨格筋組織に加えて心臓組織および平滑筋組織において起こりうる。したがって、先の化合物、これらの化合物の合成を誘導する制御化合物および筋肉上の受容体に結合することによってまたはリガンド−受容体複合体によって活性化される第２のメッセンジャーシステムをほかの手段によって刺激することによりこれらの化合物をまねる小さな分子は、すべて筋肉疾患のための予防的または肯定的治療法として極めて有用である。
【０００８】
本発明の新規な観点は筋細胞の分裂促進、生存、成長および分化を誘導する成長因子として先に挙げたタンパク質の使用を包含する。これらの効果を達成するための筋細胞の治療はここに記載されたポリペプチドに筋細胞を接触させることによって達成されうる。治療は正味の筋肉の損失を遅らせるまたは停止する、ないしは脊椎動物中にプレウエント（prewent）な筋肉の量または質を増大するために提供されうる。
【０００９】
これらの因子は、脊椎動物に有効量のポリペプチドまたは関連化合物を投与することにより脊椎動物（好ましくはホ乳動物、より好ましくはヒト）において筋細胞の分裂促進、分化、および生存を生じるために用いうる。筋肉に対するニューレグリンの効果は、たとえばミオシンの重鎖の緩徐なおよび早いアイソフォームなどの収縮装置の特別のアイソフォームの合成を誘導することによって筋肉のパフォーマンスにおける増加を引き起こすことにより、これに限定されないがジストロフィン（dystrophin）などの保護分子の合成を誘導することによって筋線維の生存を促進することにより；および／またはたとえば神経筋接合でアセチルコリン受容体分子を増加することによって筋肉への神経の分布（innervation）を増大することにより発生しうる。
【００１０】
ここで用いられる筋細胞という用語は筋組織に寄与するいかなる細胞をも意味する。菌筋細胞、付随細胞、筋管、および筋原線維組織はすべて「筋細胞」という用語に包含され、すべて本発明の方法を用いて治療されうる。筋細胞効果は骨格筋、心筋および平滑筋に誘導されうる。
【００１１】
分裂促進は骨格筋、平滑筋または心筋の、筋芽細胞または付随細胞を包含する筋細胞に誘導されうる。ここで用いられる分裂促進とは患者の新しい筋細胞の産生が結果としておこるいかなる細胞分裂をも意味する。さらに詳しくは、インビトロの分裂促進は２つの倍加時間と等しい時間、標識試薬に細胞がさらされるとき、処理されていない細胞の５０％、より好ましくは１００％、もっとも好ましくは３００％と比較した分裂指数における増加として定義される。分裂指数はＳ期（すなわち、ＢｒｄＵ）の間にのみ取込まれるトレーサーの存在において成長するとき、標識された核をもつ培養物中の細胞の分数（fraction）であり倍加時間は培養物中の細胞数が２倍に増加するのに必要な平均時間として定義される。
【００１２】
インビボの分裂促進に対する効果は、Ｓ期（すなわち、ＢｒｄＵ）の間にのみ取込まれるトレーサーにさらされたホ乳動物の筋組織における標識された付随細胞の外観により測定されるような付随細胞活性化における増加として定義される。有用な治療薬において、ホ乳動物が１５分間よりも長い期間標識試薬にさらされ、治療用量の分裂促進剤を投与したのち１０時間から２４時間の間に組織をアッセイするばあい、コントロールのホ乳動物と比較して少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも５０％およびもっとも好ましくは２００％よりも多く付随細胞の活性化を増大する化合物としてインビボで定義される。または、インビボの付随細胞活性化は免疫学的またはＲＮＡ分析方法によって中間体のフィラメント  ビメンチン（filament vimentin）の外観をモニターすることによって検出しうる。ビメンチンがアッセイされるとき、有用な分裂促進剤は治療上有用な投薬用量が与えられたばあい筋組織におけるビメンチンの検出可能なレベルの発現を引き起こすものとして定義される。
【００１３】
ここで用いる筋発生は筋管を生じる筋芽細胞のいかなる融合をも意味する。もっとも好ましくは筋発生に対する効果は筋芽細胞の融合および筋肉の分化プログラムの実施可能性における増大として定義される。有用な筋原性治療薬はインビトロの融合指数におけるいずれかの増加を授与する化合物として定義される。さらに好ましくは、化合物はコントロールと比較して融合指数における少なくとも２．０倍の増加を授与し、もっとも好ましくは、化合物は３倍またはそれより大きい増加を授与する。融合指数は培養物中に存在する核の総数と比較した培養物中の多核化された細胞（multinucleated cells）に存在する核の分数として定義される。先によって与えられた割合は筋原性化合物に６日間さらされたのちにアッセイした細胞についてであり処理されていないコントロールと比較する。筋発生はまた筋管における面積あたりの核数をアッセイすることによりまたはウエスタン分析による筋肉に特異的なタンパク質のレベルを測定することによっても決定しうる。好ましくは、化合物はたとえばここで与えられたアッセイを用いて筋管の密度において少なくとも２．０倍の増加を授与し、もっとも好ましくは化合物は３倍またはそれより多くの増加を授与する。
【００１４】
筋肉の成長は線維サイズにおける増大および／または線維の数の増加によって生じうる。ここで用いる筋肉の成長とはＡ）湿重量における増加、Ｂ）タンパク質含有量の増加、Ｃ）筋線維数の増加、またはＤ）筋線維の直径における増加によって測定しうる。筋線維の成長における増加は断面のエリプシス（elipsis）のマイナーな軸として定義されるとき直径における増加として定義することができる。有用な治療薬として同様に処理されたコントロール動物（すなわち、筋肉成長化合物で処理されていない変性した筋組織を持つ動物）と比較して、筋肉がすでに少なくとも１０％変性している動物の１０％またはそれより多く、より好ましくは５０％よりも多く、もっとも好ましくは１００％より多く、湿重量、タンパク質含有量および／または直径を増大するものである。筋線維の数を増加することにより成長を増大する化合物は、少なくとも１％、より好ましくは少なくとも２０％、およびもっとも好ましくは少なくとも５０％病んだ組織における線維の数を増加するばあい治療薬として有用である。これらの百分率は化合物が投与され局所的に作用するときの比較しうる処理されておらず病んでいないホ乳動物におけるまたは対側性（contralateral）の病んでいない筋肉におけるベーサルレベルと比較して決定される。
【００１５】
ここで用いられる筋線維の生存とは壊疽またはアポプトーシス（apoptosis）によって証明されるような筋線維の損失の防止（prevention）または筋線維の損失のほかのメカニズムの防止を意味する。ここで用いられる生存とは処理されていないコントロールと比較して少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも５０％、およびもっとも好ましくは少なくとも３００％の細胞死の割合（rate）における減少を示す。生存の割合は、細胞が分化８日後（すなわち培地を２０％から０．５％血清のものに変えて８日後）に培養物中の死んだ細胞に特異的な染料（たとえばプロピジウムイオダイドなど）で染色されうる細胞をカウントすることにより測定しうる。
【００１６】
ここで用いられる筋肉の再生とはそれにより前筋細胞から新しい筋線維を形成する過程を意味する。再生に有用な治療薬は前記のように、少なくとも１％、より好ましくは少なくとも２０％、およびもっとも好ましくは少なくとも５０％の新しい線維の数における増加を意味する。
【００１７】
ここで用いられる筋細胞の分化とはたとえば収縮装置などの筋線維の成分（筋原線維）を特定する筋の発達プログラムの誘導を意味する。分化に有用な治療薬は同様に処理されたコントロール動物における等価な組織と比較して少なくとも１０％またはそれより多く、より好ましくは５０％またはそれより多く、およびもっとも好ましくは１００％よりも多く病んだ組織における筋線維のいずれかの成分の量を増加する。
【００１８】
ここで用いられる筋肉の萎縮とは筋線維帯径における重大な損失を意味する。重大な萎縮によって病んでいない、損傷されていないまたは正常に利用される組織と比較して少なくとも１０％の病んだ損傷されているまたは用いられていない筋組織における筋線維の直径の減少が意味される。
【００１９】
ここに記載されたポリペプチドまたはほかの化合物を用いる疾患または障害の治療方法もまた本発明の一部である。治療されうる筋障害の例にはたとえばミオパシー、ジストロフィー、神経筋の伝導性疾患（myoneural conductive diseases）、外傷性筋損傷、および神経損傷などの骨格筋疾患および障害が含まれる。たとえば心筋症、虚血性のダメージ、先天性疾患、および外傷性損傷などの心筋病理も、たとえば動脈硬化、血管病変、および先天性血管疾患などの平滑筋疾患および障害が治療されうるように、本発明の方法を用いて治療されうる。たとえば、デュシェーヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型ジストロフィー、および重症筋無力症はしかし本発明の方法を用いて治療されうる３種の疾患である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
また本発明はたとえば横紋筋肉種などの筋細胞起源の腫瘍の予防または治療のための方法を包含する。これらの方法はここに記載された１つまたはそれより多くのポリペプチドの結合を阻害し、腫瘍に寄与する細胞の増殖を阻害する物質を有効量で投与することを包含する。
【００２１】
本発明の方法はまた神経親和性因子の欠除によって引き起こされる疾患にかかった患者を治療するためにも用いうる。神経親和性因子の欠除によって意味されることは神経筋接合および／または筋肉強度における検出しうる減少を生じるに足る影響を受けない個体と比較して神経親和性因子の減少した量である。神経親和因子は影響を受けない個体に認められるものよりも１０％より低いレベルで存在しうる。より好ましくは、前記因子は影響を受けない個体にみとめられるものよりも２０％低いレベルで存在し、もっとも好ましくは同様の状況下で影響を受けない個体と比較して８０％レベルが下げられる。
【００２２】
本発明の方法はニューレグリンタンパク質が同じ遺伝子によってコードされるという事実を利用する。メッセンジャーＲＮＡスプライシング変異体（およびそれらの結果として生じるタンパク質の変種）はこの遺伝子に由来しこれらの産物の多くはｐ１８５ergB2への結合およびその活性化を示す。この遺伝子の産物は筋細胞分裂促進活性（以下の実施例１および２参照）、分化（実施例３および６）、および生存（実施例４および５）を示すために用いられている。本発明は筋細胞分裂促進剤、分化因子、および生存因子のような記載された活性をもつニューレグリン遺伝子の既知の産物（ここおよび先に挙げた文献に記載された）のすべてに対する使用を提供する。もっとも好ましくは組換えヒトＧＧＦ２（ｒｈＧＧＦ２）はこれらの方法に用いられる。
【００２３】
本発明はまたほかのまだ天然には単離されていない、ニューレグリン遺伝子のスプライシング変異体の使用に関する。図２９はスプライシングの既知のパターンを示す。これらのパターンはポリメラーゼチェーン反応実験（polymerase chain reaction experiments）（逆転写されたＲＮＡについて）、ｃＤＮＡクローン（その中で表わされたような）の分析、およびニューレグリン類をコードする公開された配列の分析（Pelesら、Cell 69:205(1992)およびWenら、Cell 69:559(1992)）に由来する。ここに開示された追加のパターンと同様に、これらのパターンは存在する考えられるスプライシング変異体を表わす。スプライシング変異体は、ここにリファレンスにより組込まれる１９９３年３月２４日に出願された、ＵＳＳＮ  ０８／０３６，５５５、Goodearlらに充分に記載される。
【００２４】
さらに詳しくは、筋細胞の細胞分裂、生存、分化および増殖は、式
ＷＢＡＺＣＸ
（式中、ＷＢＡＺＣＸは図３０で示されるポリペプチドセグメント（配列番号１３２、１３４、１３５、１３７〜１３９、１５６）から構成され、式中、ＷはポリペプチドセグメントＦからなるかまたは存在せず、式中、ＺはポリペプチドセグメントＧからなるかまたは存在せず、そして式中、ＸはポリペプチドセグメントＣ／Ｄ  ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ  Ｈ、Ｃ／Ｄ  ＨＬ、Ｃ／Ｄ  Ｄ、Ｃ／Ｄ′  ＨＬ、Ｃ／Ｄ′  ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ′  Ｈ、Ｃ／Ｄ′  Ｄ、Ｃ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  Ｈ、Ｃ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  ＨＬ、Ｃ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  Ｄ、Ｃ／Ｄ  Ｄ′  Ｈ、Ｃ／Ｄ  Ｄ′  ＨＬ、Ｃ／Ｄ  Ｄ′  ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ′  Ｄ′  Ｈ、Ｃ／Ｄ′  Ｄ′  ＨＬ、Ｃ／Ｄ′  Ｄ′  ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  Ｄ′  Ｈ、Ｃ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  Ｄ′  ＨＬ、またはＣ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  Ｄ′  ＨＫＬからなる）によって定義されるポリペプチドと筋細胞とを接触させること、および（または）式
ＹＢＡＺＣＸ
（式中、ＹＢＡＺＣＸは図３０で示されるポリペプチドセグメント（配列番号１３３〜１３５、１５６、１５９）から構成され、式中、ＹはポリペプチドセグメントＥからなるかまたは存在せず、式中、ＺはポリペプチドセグメントＧからなるかまたは存在せず、そして式中、ＸはポリペプチドセグメントＣ／Ｄ  ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ  Ｈ、Ｃ／Ｄ  ＨＬ、Ｃ／Ｄ  Ｄ、Ｃ／Ｄ′  ＨＬ、Ｃ／Ｄ′  ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ′  Ｈ、Ｃ／Ｄ′  Ｄ、Ｃ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  Ｈ、Ｃ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  ＨＬ、Ｃ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  Ｄ、Ｃ／Ｄ  Ｄ′  Ｈ、Ｃ／Ｄ  Ｄ′  ＨＬ、Ｃ／Ｄ  Ｄ′  ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ′  Ｄ′  Ｈ、Ｃ／Ｄ′  Ｄ′  ＨＬ、Ｃ／Ｄ′  Ｄ′  ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  Ｄ′  Ｈ、Ｃ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  Ｄ′  ＨＬ、またはＣ／Ｄ  Ｃ／Ｄ′  Ｄ′  ＨＫＬからなる）によって定義されるポリペプチドと筋細胞とを接触させることによって達成される。
【００２５】
一般に、前記ポリペプチドのＮ−末端はＦまたはＥポリペプチドセグメントメントではじまる。Ｆポリペプチドが存在するときタンパク質の成熟（maturation）により開裂し成熟したポリペプチドを生じうる。Ｅ配列が存在するときＮ末端のシグナル配列を表わすはじめの５０アミノ酸がポリペプチドからなくなりうる。
【００２６】
さらに、本発明は、リファレンスによりここに組込まれる、１９９２年８月１７日に出願された米国特許出願ＳＮ０７／９３１，０４１の
−ＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト胸部細胞系（human breast cell line）から単離された３０ｋＤのポリペプチド因子、または
−グリア細胞に対する形質転換されたラット、Ｉ−ＥＪ線維芽細胞系から単離された３５ｋＤのポリペプチド因子、または
−ＳＫＢＲ−３ヒト胸部細胞系から単離された７５ｋＤのポリペプチド因子、または
−ラットＩ−ＥＪ形質転換された線維芽細胞系から単離された４４ｋＤのポリペプチド因子、または
−活性化されたマウス腹膜マクロファージから単離された２５ｋＤのポリペプチド因子、または
−ＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト胸部細胞から単離された４５ｋＤのポリペプチド因子、または
−グリア細胞に対するＡＴＬ−２ヒトＴ細胞系から単離された７〜１４ｋＤのポリペプチド因子、または
−ウシ腎臓細胞から単離された２５ｋＤのポリペプチド因子、または
−脳から単離された４２ｋＤ  ＡＲＩＡポリペプチド因子；０〜２Ａの前グリア細胞（glial progenitor cells）を刺激する４６〜４７ｋＤのポリペプチド因子；または
−４３〜４５ｋＤのポリペプチド因子、ＧＧＦＩＩＩ、１７５の筋細胞への適用により筋細胞を治療する方法を包含する。
【００２７】
本発明はさらに、インビボおよびインビトロの筋細胞の治療に、ＥＧＦＬ１、ＥＧＦＬ２、ＥＧＦＬ３、ＥＧＦＬ４、ＥＧＦＬ５、およびＥＧＦＬ６ポリペプチド、図３７から４２および配列含号１５０から１５５をそれぞれ用いる方法を包含する。
【００２８】
また本発明には筋細胞の治療のための図４４に示される配列のＧＧＦ２ポリペプチドの投与が包含される。
【００２９】
本発明の追加の重要な観点は、
（ａ）約３０ｋＤから約３６ｋＤの分子量で、および１つまたはそれより多くの以下のペプチド配列をそのアミノ酸配列中に含む、胎児子ウシ血漿の存在下、グリア細胞分裂促進活性をもつことも知られているベーシックなポリペプチド因子：
ＦＫＧＤＡＨＴＥ          （配列番号：１）
ＡＳＬＡＤＥＹＥＹＭＸＫ  （配列番号：２）
ＴＥＴＳＳＳＧＬＸＬＫ    （配列番号：３）
ＡＳＬＡＤＥＹＥＹＭＲＫ  （配列番号：７）
ＡＧＹＦＡＥＸＡＲ        （配列番号：１１）
ＴＴＥＭＡＳＥＱＧＡ      （配列番号：１３）
ＡＫＥＡＬＡＡＬＫ        （配列番号：１４）
ＦＶＬＱＡＫＫ            （配列番号：１５）
ＥＴＱＰＤＰＧＱＩＬＫＫＶＰＭＶＩＧＡＹＴ
（配列番号：１６５）
ＥＹＫＣＬＫＦＫＷＦＫＫＡＴＶＭ
（配列番号：１７）
ＥＸＫＦＹＶＰ            （配列番号：１９）
ＫＬＥＦＬＸＡＫ          （配列番号：３２）；および
（ｂ）約５５ｋＤから約６３ｋＤの分子量をもち、１つまたはそれより多くの以下のペプチド配列をそのアミノ酸配列中に含む、胎児子ウシ血漿の存在下グリア細胞分裂促進を刺激することも知られている筋細胞を治療するのに用いられるベーシックなポリペプチド因子：
ＶＨＱＶＷＡＡＫ          （配列番号：３３）
ＹＩＦＦＭＥＰＥＡＸＳＳＧ（配列番号：３４）
ＬＧＡＷＧＰＰＡＦＰＶＸＹ（配列番号：３５）
ＷＦＶＶＩＥＧＫ          （配列番号：３６）
ＡＳＰＶＳＶＧＳＶＱＥＬＱＲ
（配列番号：３７）
ＶＣＬＬＴＶＡＡＬＰＰＴ  （配列番号：３８）
ＫＶＨＱＶＷＡＡＫ        （配列番号：４８）
ＫＡＳＬＡＤＳＧＥＹＭＸＫ（配列番号：４９）
ＤＬＬＬＸＶ              （配列番号：３９）
を用いる筋細胞の治療方法である。
【００３０】
より小さな分子量のポリペプチド因子に、およびより大きな分子量のポリペプチド因子に由来する、前記したペプチド配列の使用のための方法はまた本発明の観点である。前記ペプチドに対するモノクローナル抗体はそれ自体有用な研究道具および治療薬である。
【００３１】
したがって、本発明はさらに筋細胞を治療するのに有用な活性をもち、
（ａ）それぞれ図２７Ａ、２７Ｂまたは２７Ｃ、配列番号１２９〜１３１のいずれか１つに示されるＤＮＡ配列；
（ｂ）図２１、配列番号８５に示されるＤＮＡ配列；
（ｃ）図２７Ａ、配列番号１２９に示される配列のヌクレオチド２８１〜５５７によって示されるＤＮＡ配列；または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）によるＤＮＡ配列のいずれか１つとハイブリダイズしうるＤＮＡ配列
によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド因子を用いる方法を含む。
【００３２】
筋細胞分裂促進剤としての以下の因子：
（ａ）ウシ脳下垂体材料からえられたばあい、還元コンディションであってもなくても、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動上で約３０ｋＤから約３６ｋＤのみかけ上の（observed）分子量をもち、筋細胞の分裂を刺激することを含む筋細胞分裂促進活性をもち、逆相ＨＰＬＣを用いて単離されたばあい４℃で０．１％トリフルオロ酢酸における１０週間のインキュベーションののち該活性の少なくとも５０％を保つベーシックなポリペプチド因子；および
（ｂ）ウシ脳下垂体材料からえられたばあい、非還元コンディション下、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動上約５５ｋＤから約６３ｋＤのみかけ上の分子量をもち、そのヒトの等価物がＤＮＡクローンＧＧＦ２ＨＢＳ５によってコードされ筋細胞分裂促進活性をもち逆相ＨＰＬＣを用いて単離されたときに４℃  ０．１％トリフルオロ酢酸において４日間インキュベーションしたのち活性の少なくとも５０％を保つベーシックなポリペプチド因子。
【００３３】
したがって本発明のほかの重要な観点は以下の使用である：
（ａ）筋細胞の分裂を刺激することを含む細胞分裂促進活性をもつ一連のヒトおよびウシポリペプチド因子。これらのペプチド配列はそれぞれ図３０、３１、３２および３３、配列番号１３２〜１３３に示される。
（ｂ）筋細胞の分裂を刺激することを含む細胞分裂促進活性をもち、Lupuら、Science 249:1552(1990)；Lupuら、Proc.Natl.Acad.Sci USA 89:2287(1992)；Holmesら、Science 256:1205(1992)；Pelesら、69:205(1992)；YardenおよびPeles Biochemistry 30:3543(1991)；Dobashiら、Proc.Natl.Acad.Sci.88:8582(1991)；Davisら、Biochem.Biophys.Res.Commun.179:1536(1991)；Beaumontら、特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０３４４３（１９９０）；Bottenstein、１／４／９４に発行された、米国特許第５，２７６，１４５号；およびGreeneら、特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０２３３１（１９９０）に概説された手順にしたがい精製および特徴づけられた一連のポリペプチド因子。
（ｃ）筋細胞の分裂を刺激することを含むグリア細胞分裂促進活性をもつポリペプチド因子（ＧＧＦＢＰＰ５）。アミノ酸配列は図３１、配列番号１４４に示される。
【００３４】
筋芽細胞をインビボまたはインビトロの筋細胞分裂促進剤として前記のポリペプチドに接触させることにより筋芽細胞の分裂促進を刺激する方法は本発明の特徴として包含される。
【００３５】
また筋細胞治療は、発現しうる遺伝子構築物における前記のポリペプチド化合物をコードするＤＮＡを投与することによっても達成しうる。ポリペプチドをコードするＤＮＡは細胞へＤＮＡを送達するための当該技術分野において知られている技術を用いて患者に投与されうる。たとえばレトロウイルスベクター、電気内孔法またはリポソームはＤＮＡを送達するために用いうる。
【００３６】
本発明は天然のソース（組織または細胞系）から抽出されたようなまたは組換え手段により調製されたようなタンパク質の先に挙げたファミリーの使用を包含する。
【００３７】
特異的にｐ１８５erbB2受容体に結合する、ほかの化合物、とくにペプチドもまた筋細胞分裂促進剤として本発明にしたがって用いることができる。候補の化合物をルーチンにｐ１８５erbB2結合についてスクリーニングすることができ、もしそれが結合すれば、つぎにここに記載された方法を用いてグリア細胞分裂促進活性についてスクリーニングすることができる。
【００３８】
本発明は重大な活性の低下を示さない先のポリペプチド因子のいかなる改変物または等価物の使用を包含する。たとえば、アミノ酸含有量（content）または配列が活性に実質的な悪影響なしに変更される改変は含まれる。よってここに含まれる効果および使用は、したがって本発明の一部である。改変されたまたは等価の因子を用いてこのような使用および効果をともなって組立てられるために記載される。
【００３９】
先に記載されそれぞれ図３０、３１、３２および３３、配列番号１３２〜１４６に示されたヒトペプチド配列は、天然のソース（適当な組織から調製されたｃＤＮＡライブラリー）から全長の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡＳ）として単離することができる、または当業者によって個々のエクソン（たとえば、別個のエクソンとして誘導された）をともなうＤＮＡ構築物として組立てることができる一連のスプライシング変異体を示す。
【００４０】
本発明はまた先に定義されたようなポリペプチドを有効量投与することによる、筋細胞を治療するための、すなわち筋肉の分裂促進、筋発生、分化、または生存を誘導するための、医薬品を製造する方法を包含する。このような医薬品はポリペプチドを薬学上有効な担体とともに投与することによって製造される。
【００４１】
本発明の別の観点は、それぞれ薬学的または獣医学的（veterinary）使用のために製剤化された先に定義された因子のいずれかからなる、適宜許容しうる希釈剤、担体または賦形剤（excipient）および／または単位投薬用量形態をともなう薬学上または獣医学上の製剤の使用である。本発明の因子を用いるばあい、通常の薬学的または獣医学上のプラクティスが適切な製剤または組成物を提供するために用いられうる。
【００４２】
したがって、本発明の一部として用いるべき製剤は、非経口投与、たとえば静脈内、皮下、筋肉、眼窩内、眼科用、脳室内（intraventricular）、頭蓋内、嚢内、脊椎内（intraspinal）、槽内（intracisternal）、腹腔内、局所、鼻内、エアロゾル、乱切（scarification）投与、およびまた経口、頬側、直腸または腟投与に適用できる。
【００４３】
また本発明の製剤は、本発明の方法に効果のあるポリペプチドをコードするＤＮＡを発現する宿主細胞の患者への移植により、または本発明の製剤を放出する外科的インプラントの使用により投与されうる。
【００４４】
非経口製剤は液体溶液（liquid solution）または懸濁液の形態であってもよく；経口投与のために、製剤は錠剤またはカプセル剤の形態であってもよく；鼻内製剤として粉末、点鼻液、またはエアロゾルの形態であってもよい。
【００４５】
製剤を製造するために当該技術分野において公知の方法は、たとえば「Remington's Pharmaceutical Sciences」において知られている。非経口投与用の製剤は、たとえば賦形剤として滅菌水または滅菌生理食塩水、たとえばポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、野菜起源の油、または水素化されたナフタレンを含有してもよく、生体適合性、生体分解性の（biodegradable）のラクチドポリマー、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーを本因子の放出をコントロールするために用いてもよい。因子のためのほかの可能性のある非経口の送達システムはエチレン−ビニルアセテートコポリマー粒子、浸透ポンプ、インプラントできる注入システム、およびリポソームを含む。吸入用製剤は賦形剤として、たとえばラクトースを含んでもよく、またたとえばポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリコール酸塩およびデオキシコール酸塩を含有する水性溶液であってもよく、また点鼻液の形態、または鼻内に適用されるゲルとして投与するための油状溶液であってもよい。また非経口投与製剤も頬側投与のためにグリコール酸、直腸投与用にメトキシサリチル酸、または腟投与用にクエン酸を含有してもよい。
【００４６】
本因子は単独の活性試薬として用いてもよく、またほかの活性成分、たとえば、神経学上の疾患においてニューロンの生存を容易にしうるであろうほかの成長因子、またはペプチダーゼまたはプロテアーゼ阻害剤と組合せて用いることができる。
【００４７】
本発明の製剤における本因子の濃度は、投与される投薬量、および投与経路を含む、多数の問題に依存して変わるであろう。
【００４８】
一般的な用語として、本発明の因子は、非経口投与のために約０．１から１０％ｗ／ｖの化合物を含有する水性生理学的緩衝液に提供されてもよい。一般的な用量範囲は１日あたり約１ｍｇ／ｋｇ体重から約１ｇ／ｋｇ体重であり；好ましい用量範囲は１日あたり０．０１ｍｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇ体重である。投与されるべき好ましい投薬量（dosage）は、取りくまれる（addressed）病理学的コンディションの進行のタイプと程度、患者の全身の健康、製剤の調合および投与経路に依存するであろう。
【００４９】
本発明の方法に利用されるポリペプチド因子はまた標準的な技術につづく、たとえばモノクローナル抗体などの抗体を作製するために免疫原として用いることもできる。これらの抗体は、代って治療または診断目的で用いることができる。したがって、因子の正常でないレベルに起因する筋疾患に関係するであろうコンディションがこのような抗体を用いることにより追跡されうる。
【００５０】
標準的な方法を用いる単離されたサンプルについてのアッセイを用いるときにインビトロの技術を用いることができる。抗体に、たとえば腫瘍のイメージングの当該技術分野のための技術を用いる体外にイメージされうる放射性アイソトープがつけられるイメージング方法も用いうる。
【００５１】
本発明のさらなる一般的な観点は、好ましくは筋肉の疾患または障害の治療のための、医薬品の製造における本発明の因子の使用である。「ＧＧＦ２」という名称はＧＧＦ−IIタンパク質に由来するペプチド配列データを用いてすでに単離されたすべてのクローン（すなわち、ＧＧＦ２ＨＢＳ５、ＧＧＦ２ＢＰＰ３）のために用いられ、単独で存在するとき（すなわちＧＧＦ２またはｒｈＧＧＦ２）、ＧＧＦ−IIタンパク質に由来するペプチド配列データを用いて単離されるプラスミドによりコードされる組換えヒトタンパク質（すなわち、プラスミドＨＢＳ５からの昆虫細胞において生産されるような）を示すために用いられる。ＧＧＦＨＢＳ５クローンからの組換えヒトＧＧＦをＧＧＦ２、ｒｈＧＧＦ２およびＧＧＦ２ＨＢＳ５ポリペプチドとよぶ。
【００５２】
ここで用いられる治療（treating）とは筋細胞の分裂促進、生存および／または分化を増大する、および／または筋肉の委縮および変性を減らす目的でここに記載された化合物のいかなる投与も意味する。もっとも好ましくは治療は筋細胞の疾患または障害の徴症または進行を減少または衰えさせるためである。またここで用いられる治療は健康な個体における筋細胞を増加するまたは変えるために化合物を投与することを意味する。治療は前記のように、ここに記載された化合物に感受性のあるまたは反応する筋細胞の有効量の化合物との接触により成し遂げられうる。ここに記載された化合物の阻害剤も筋細胞増殖の疾患を停止するまたは遅らせるためにも用いうる。
【００５３】
詳細な説明
本発明は、単離され精製されたニューレグリン因子およびこれらの因子をコードするＤＮＡ配列、これらの因子の筋肉外濃度を増加する制御化合物、およびインビボおよびインビトロの筋細胞の生存、分化および筋細胞分裂促進を誘導するこれらの因子の擬態（mimetics）である化合物の使用に適している。ＧＧＦ／ｐ１８５erbB2と結合するニューレグリンタンパク質をコードする遺伝子は多数の可変的にサイズ化され（variably-sized）、特異的にスプライスされる（differentially-spliced）ＲＮＡ転写物を産生し、これらにより一連のタンパク質の増加（rise）が与えられるということは明らかである。これらのタンパク質は異なる長さのものであり、いくつかの共通のペプチド配列といくつかの独自のペプチド配列を含む。これらの因子が単一の遺伝子によってコードされるという結論は、ウシ下垂体後葉およびヒト胸部癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１））から回収可能な特異的にスプライシングされたＲＮＡ配列によって支持される。この結論のさらなる支持は筋組織のための両分裂促進剤（ここに開示されたような）としておよびｐ１８５erbB2受容体のリガンド（以下参照）として作用するタンパク質のサイズ範囲から導き出される。
【００５４】
ＧＧＦ／ｐ１８５erbB2結合タンパク質をコードする遺伝子は相同であるという事実を支持するさらなる証拠はヌクレオチド配列の比較からくる。Holmesら、（Science 256:1205-1210,1992）は受容体タンパク質ｐ１８５erbB2と特異的に相互に作用する４５キロダルトンのヒトタンパク質（ヘレグリン−α）の精製を論証する。Pelesら（Cell 69:205(1992)）およびWenら（Cell 69:559(1992)）は「ニュー分化因子（neu differentiation factor）」（ＮＤＦ）と呼ばれるタンパク質をコードするラット細胞から単離された相補的ＤＮＡを記載する。ＮＤＦ  ｃＤＮＡの翻訳産物はｐ１８５erbB2結合活性をもつ。いくつかのほかのグループがｐ１８５erbB2結合活性をもつ種々の分子量のタンパク質の精製を報告している。これらのグループはLupuら（(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2287)；YardenおよびPeles（(1991) Biochemistry 30:3543）；Lupuら（(1990) Science 249:1552)）；Dobashiら（(1991) Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:1536）；およびHuangら（(1992) J. Biol. Chem. 257:11508-11512）を含む。
【００５５】
我々はｐ１８５erbB2受容体結合タンパク質は筋細胞分裂促進を刺激し、したがって筋管形成（筋発生）を刺激することを見出した。この刺激により結果として筋芽細胞の形成の増大および筋管（筋発生）の形成の増大が起こる。ここに記載された化合物も筋肉の成長、分化、および筋細胞の生存の増大を刺激する。しかしながら、これらのリガンドは限定されないが、ＧＧＦの（GGF's）ニューレグリン、ヘレグリン、ＮＤＦ、およびＡＲＩＡを含む。この分裂促進活性の結果として、これらのタンパク質、これらのタンパク質をコードするＤＮＡ、および関連化合物は筋組織の外傷性のダメージまたは疾患にかかっている患者に投与されうる。分裂促進の目的で提供されるすべての方法は筋発生のために有用であると理解される。これらのリガンド（たとえば抗体またはペプチドフラグメントなど）の阻害剤は筋肉に由来する腫瘍の治療のために投与されうる。
【００５６】
これらの化合物はここ（実施例９〜１７）におよびHolmesら、Science 256:1205(1992)；Pelesら、Cell 69:205(1992)；Wenら、Cell 69:559(1992);Lupuら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2287(1992);YardenおよびPeles、Biochemistry 30:3543(1991);Lupuら、Science 249:1552(1990);Dobashiら、Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:1536(1991)；Huangら、J. Biol. Chem. 257:11508-11512(1992);Marchionniら、Nature 362:313,(1993)に；およびここにリファレンスにより組込まれるすべてのＧＧＦ−III特許に記載されたプロトコルを用いてえることができる。これらの化合物の多くについて配列が提供され特徴が記載される。配列については図８〜１１、２０〜２７Ｃ、２９〜３４、３６〜４４、および４６を参照。タンパク質の特徴については図１２〜１９、２８  ３５、４５Ａおよび４５Ｂを参照。
【００５７】
化合物は以下の実施例に提供された方法を用いてインビトロのそれらの有用性についてアッセイしうる。インビボの試験は実施例１およびSklarら、In Vitro Cellular and Developmental Biology 27A:433-434,1991に記載されたように行ないうる。
【００５８】
ほかの実施の形態
本発明は、筋肉の分裂促進を誘導するためのほかの天然に生じるＧＧＦポリペプチドに加えて図３０（配列番号１３２〜１４３、１５６、１５７６〜１４７、１６０、および１６１）のコーディングセグメントと実質的に相同なタンパク質のいずれかの使用のための方法をも包含する。また対立遺伝子のアレル変異体（allelic variations）；天然の突然変異体（mutants）；誘導された突然変異体；天然に生じる核酸と高いまたは低いストリンジェンシーコンディション（stringency conditions）の下、ハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるタンパク質（高いおよび低いストリンジェンシーの定義については、リファレンスによりここに組込まれる、Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons、New York、1989、6.3.1-6.3.6を参照）の使用；およびＧＧＦポリペプチドに対する抗血清により特異的に結合されるポリぺプチドまたはタンパク質の使用が包含される。用語はまた筋肉の分裂促進の誘導のために図２８からの配列からなるＧＧＦポリペプチドを含むキメラポリペプチドの使用も含む。
【００５９】
以下の、実施例８からわかるであろうように、本因子は細胞のタイプのある範囲に分裂促進活性を示す。製剤および／または医薬品またはそれらの製造に関連する先の本発明の一般的な記述は明確に適当な生産物および使用を包含するために組立てられるべきである。
【００６０】
ここに記載される請求の範囲の追加の根拠を提供する一連の実験が続く。本発明に関連する以下の実施例は本発明を特定的に限定されるように組立てられるべきではなく、また本発明のこのような変異は現在知られておりのちに開発される。
【実施例】
【００６１】
実施例は組換えヒトＧＧＦ２（ｒｈＧＧＦ２）が第１代ヒト筋肉培養物に数種の効果を授与するという我々の発見を例証する。ｒｈＧＧＦ２は筋肉培養物に対する３つの独立した生物学的活性アッセイにおける重大な効果をもつ。ポリペプチドはサブコンフルエントの静止した筋芽細胞の増殖により測定されるような分裂促進を増大し、成長因子の存在下コンフルエントの筋芽細胞により分化を増大し、染色除外の損失により測定されるような分化された筋管の生存を増大し、アセチルコリン受容体合成を増大した。これらの活性は、筋肉修復、再生、および筋肉変性に対する予防的効果を誘導する際のＧＧＦ２およびほかのニューレグリン類の有効性（efficacy）を示す。
【００６２】
実施例１
筋芽細胞に対するｒｈＧＧＦの分裂促進活性
クローンＧＧＦ２ＨＢＳ５を、実施例１４に記載したごとくに、組換えバクロウイルス感染昆虫細胞で発現させ、得られた組換えヒトＧＧＦ２を培養（４０μｌ／ｍｌで添加したならし培地）中の筋芽細胞に添加した。筋芽細胞（０５７Ａ細胞）を２４ウェル・ディッシュ中で前密集まで増殖させた。培地を除去し、４０μｌ／ｍｌの濃度にて、ＧＧＦ２ならし培地と共にあるいはそれ無くして、０.５％胎児子ウシ血清を含有するＤＭＥＭで置き換えた。培地を２日後に交換し、細胞を固定し、５日後に染色した。合計核を、筋芽細胞における核数として計数した（表１）。
【００６３】
【表１】
2007332153.tif 000002
【００６４】
ＧＧＦ処理した筋芽細胞は、分裂促進活性を示す未処理対照（３９５核）よりも増加した数の合計核（６３６核）を示した。ｒｈＧＧＦ２処理した筋芽細胞は、未処理対照（２０４核）よりもかなり大きい数の核（３８１核）を有していた。かくして、ｒｈＧＧＦ２は、増殖および細胞生存の増大を通じて、合計核数を増大させる。また、ｒｈＧＧＦ２は筋管の形成も増強するようである。
【００６５】
ｒｈＧＧＦ２の分裂促進活性は、浸透圧ミニポンプを介してＧＧＦ２および［3Ｈ］チミジンをラット筋肉に継続的に供給することによってin vivoで測定することができる。筋肉のバルクは、処理の１および２週間後の湿重量によって決定される。ＤＮＡ複製は、ShamおよびｒｈＧＧＦ２−処理筋肉におけるオートラジオグラフィー（Sklar et al., In Vitro Cellular and Developmental Biology 27A:433-434, 1991）のためにコーティングした後にセクション中の標識核を計数することによって測定される。また、脱神経筋をこれらの方法を介してこのラット動物モデルで調べたが、この方法は、筋肉の萎縮および修復におけるｒｈＧＧＦ２の役割の評価を可能とする。また、平均線維径を、萎縮の防止に対するＦＧＦの効果を評価するのに使用することができる。
【００６６】
実施例２
筋細胞分裂促進に対するｒｈＧＧＦ２の効果
休止初代クローン・ヒト筋芽細胞は前記したごとくに調製した（Sklar, R., Hudson, A., Brown, R., In vitro Cellular and Developmental Biology 1991; 27A:433-434)。休止細胞を、ＤＭＥＭ中の１０μＭ  ＢｒｄＵ、０.５％ＦＣＳの存在下で、示した試薬（ｒｈＧＧＦ２ならし培地、メチルプレドニソロンを含むあるいは含まないＰＤＧＦ、および対照培地）で処理した。２日後、細胞をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定し、７０％エタノールで洗浄した。次いで、細胞を抗−ＢｒｄＵ抗体と共にインキュベートし、洗浄し、抗体結合をペルオキシダーゼ反応で可視化した。次いで、染色核の数を領域当たりにつき定量した。結果は、ＧＧＦ２は対照よりも大きい、領域当たりの標識核の数の増大を誘導することを示す（表２参照）。
【００６７】
【表２】
2007332153.tif 000003
【００６８】
血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を陽性対照として用いた。また、ｒｈＧＧＦ２の他に、メチルプレドニソロン（コルチコステロイド）を用いたが、ＤＮＡの標識に有意な増加は示さなかった。
【００６９】
また、均質（＞９５％純度）まで精製したｒｈＧＧＦ２は、ヒト筋芽細胞に対して分裂促進を示す（図１）。
【００７０】
また、組換えヒトＧＧＦ２は、初代ヒト筋芽細胞の分裂促進を引き起こす（表２および図１参照）。分裂促進アッセイは前記したごとくに行う。次いで、ＢｒｄＵ陽性細胞の数を細胞の合計数で割ることによって有糸分裂指標が計算される。
【００７１】
実施例３
筋細胞分化に対するｒｈＧＧＦ２の効果
筋肉培養分化に対する精製ｒｈＧＧＦ２（９５％純度）の効果を調査した（図２）。培地の血清含量を２０％から０.５％まで低下させることによって、密集筋芽細胞培養を誘導して分化させた。テスト培養を、６日間、示した濃度のｒｈＧＧＦ２で処理し、培地を２日毎に新鮮なものとした。次いで、培養を固定し、染色し、核の数を１ミリリットル当たりで計数した。図２におけるデータは、対照に対する、ｒｈＧＧＦ２が存在した場合における、筋管中の核数の大きな増加を示す。
【００７２】
実施例４
分化した筋管の生存に対するｒｈＧＧＦ２の効果
分化した筋管の生存は、ｒｈＧＧＦ２処理によって有意に増加した。筋肉培養をｒｈＧＧＦ２の存在下で分化させ、種々の時間において、死んだ筋管の数をヨウ化プロピジウム染色法によって計数した。図３から分かるように、死んだ筋管の数は、分化４、５、６および８日において、ｒｈＧＧＦ２処理培養ではより低かった。筋管における核の数は、分化８日後、非処理培養と比較して、ＧＧＦ２処理によって有意に増加した。特に、ギムザ染色の後に同一プレートで計数した場合、対照は８.６筋核／ｍｍ2を示したのに対し、ｒｈＧＧＦ２処理培養は５７.２筋核／ｍｍ2（Ｐ＝０．０３５）を示した。
【００７３】
また、筋肉培養に対して公知の効果を有する他の成長因子で生存アッセイを行った。ｒｈＧＧＦ２効果は、テストした成長因子の中でユニークであった（図４）。この実験において、種々の成長因子の示した濃度にて、培養を、ｒｈＧＧＦ２処理プレートと平行して処理した。筋管の生存は、０５７Ａ筋芽細胞の分化８日後において前記したごとくに測定した。因子の濃度は以下の通りであった：
ｒｈＧＧＦ２：１００ｎｇ／ｍｌ；ヒト血小板由来成長因子；２０ｎｇ／ｍｌ；ヒト塩基性線維芽細胞成長因子：２５ｎｇ／ｍｌ；ヒト上皮成長因子：３０ｎｇ／ｍｌ；ヒト白血球阻害因子：１０ｎｇ／ｍｌ；ヒト・インスリン様成長因子Ｉ：３０ｎｇ／ｍｌ；ヒト・インスリン様成長因子II：２５ｎｇ／ｍｌ。
【００７４】
分化した筋管の死滅からの観察された保護は、多数の筋疾患によって特徴付けられる筋肉の変性の関与に対する治療として希望が持てるものである。かくして、ニューレグリンの筋肉外濃度を増大させる薬剤は予防効果を有し得るか、あるいは筋肉消耗性障害の進行を遅延させ、および筋肉の分化、修復、コンディショニング、および再生の速度を増大させる。
【００７５】
実施例５
ｒｈＧＧＦ２は、Duchenne型筋ジストロフィー遺伝子座における遺伝欠陥を持つ分化筋管の生存を促進する
筋管生存に対するｒｈＧＧＦ２の陽性効果は、変性障害における可能な効力を反映し得た。筋管生存に対するこれらの効果を、クローン化に由来する初代デュシェーヌ（Duchenne）型筋芽細胞についてテストして、正常な筋肉培養で観察される応答が疾患に対する個体に由来する培養でも示され得るか否かを判断した。図５に示すデータは、正常個体で用いる同一筋肉培養条件（前記実施例４）を用いて得られた。ｒｈＧＧＦ２は、対照と比較して、分化したDuchenne型筋肉培養において、死滅した筋管の数を有意に低下させた（ｐ＝０.０３２）。濃度は以下の通りであった：ＧＧＦ２：１００ｎｇ／ｍｌ；ヒト血小板由来成長因子：２０ｎｇ／ｍｌ；ヒト・インスリン様成長因子Ｉ：３０ｎｇ／ｍｌ。
【００７６】
本実施例は、ｒｈＧＧＦ２は分化したDuchenne型筋管の生存も促進し、ｒｈＧＧＦ２はホ乳動物における筋肉の変性および消耗の進行を遅延しもしくは防止し得るという強力な証拠を提供する。
【００７７】
実施例６
分化プログラムに対するｒｈＧＧＦ２効果：ＭＨＣ slowおよびジストロフィンタンパク質の誘導
培養溶解物のウェスタン分析によって、筋肉培養分化に対する精製ｒｈＧＧＦ２の効果も調べた。筋特異的タンパク質のレベルを、三連処理および未処理培養で測定した。これらの培養を調製し、プレートのサイズを１５０ｍｍまで増大し、筋肉培養層をSklar, R., およびBrown, R.（J. Neurol. Sci. 101:73-81, 1991)に記載されているごとくにウェスタン分析用に掻き落とした以外は前記したごとくに処理し、テストした。表Ａに提示する結果は、ｒｈＧＧＦ２処理が、ジストロフィン、ミオシン重鎖（ＭＨＣ、成人スロー（slow）およびファスト（fast）アイソフォーム）を含めたいくつかの筋肉特異的タンパク質のレベルを増大させるが、ＨＳＰ７２またはＭＨＣネオネイト（neonate）アイソフォームのレベルを、ウェスタンに負荷したタンパク質の量当たり同様のレベルまでは増大させないことを示す。ｒｈＧＧＦ２によって誘導された筋肉特異的タンパク質のレベルは、筋核／ｍｍ2の数の定量的増加と同様であった（表３）。
【００７８】
【表３】
2007332153.tif 000004
【００７９】
成人ミオシン重鎖アイソフォーム（スローはタイプＩヒト筋線維で見出され；ファストはタイプ２Ａおよび２Ｂヒト筋線維で見出される）におけるｒｈＧＧＦ２依存性増加は、ネオネイタル（neonatal）アイソフォームがｒｈＧＧＦ２処理によって有意に増加されなかったので、筋管の成熟を表すであろう。ラット筋の発生の間に、ＭＨＣアイソフォームはフェイタル（fatal）形態からネオネイタルアイソフォームにスイッチし、続いて、成熟成人スローおよびファストＭＨＣアイソフォームにスイッチする（Periasamy et al. J. Biol. Chem. 259:13573-13578, 1984; Periasamy et al.， J. Biol. Chem. 260:15856-15862, 1985;Wieczorek et al. J. Cell Biol. 101:618-629, 1985）。筋肉は、神経細胞もしくは組織の不存在下で、これらのアイソフォームの変換のうちのいくつかを自律的に受け得るが、マウス筋外植体はマウス脊髄の存在下で培養した場合のみ成人ファストＭＨＣアイソフォームを発現する（Ecob-Prince et al. J. Cell Biol. 103:995-1005, 1986）。ＭＨＣアイソフォーム変換が神経によって影響されるというさらなる証拠がWhalen et al.（Deve. Biol. 141:24-40, 1990)によって確立され；ノテキシン処理ラットヒウメ筋の再生の後、成人ファストＭＨＣアイソフォームの変換が新しい脱神経筋で産生されたが、神経支配再生筋はファストおよびスロー成人ＭＨＣアイソフォームを共に産生した。かくして、ｒｈＧＧＦ２は成人ＭＨＣアイソフォームの合成を増加させるという表３における証拠は、ｒｈＧＧＦ２が、ニューロン神経支配を模擬し得る筋肉の発生的成熟を誘導し得ることを示す。
【００８０】
実施例７
ｒｈＧＧＦ２を含めたニューレグリンは筋肉におけるアセチルコリン受容体の合成を誘導する
アセチルコリン受容体（ＡｃｈＲ）サブユニットタンパク質の発現は筋細胞をニューレグリンに暴露することによって誘導できる。より詳しくは、本発明者らは、筋細胞をｒｈＧＧＦ２と接触させることはＡｃｈＲサブユニットタンパク質の合成を誘導できることを示した。ｒｈＧＧＦ２暴露に続くこの誘導は、２つの方法で観察された：まず、本発明者らは、レポーター遺伝子構築物の産物を介してヒト成長ホルモンの発現の増加を検出し、第２に、本発明者らは、アルファ−ブンガロトキシンの細胞への結合の増加を検出した。
【００８１】
以下の例では、マウス筋芽細胞系Ｃ２を用いた。Ｃ２細胞は、ヒト成長ホルモン全長ｃＤＮＡに連結したマウスのＡＣｈＲデルタサブユニット遺伝子の５’調節配列を含有するトランスジーンでトランスフェクトした（Baldwin and Burden, 1988. J. Cell Biol. 107:2271-2279）。このレポーター構築物は、培地に分泌された成長ホルモンの量をアッセイすることによってＡＣｈＲデルタ遺伝子の発現の誘導の測定を可能とする。該系は、培地中の血清濃度を２０％から０.５％に低下させることによって誘導して筋管を形成することができる。
【００８２】
特に、ＡＣｈＲ−ヒト成長ホルモンレポーター構築物でトランスフェクトしたマウスＣ２筋芽細胞を、ｒｈＧＧＦ２での処理に続くｈＧＨの発現につきアッセイした。２つの別々の実験の結果を表４ならびに図６（ｈＧＨ発現）および７（ｈＧＨ発現およびアルファ−ブンガロトキシン結合）にまとめる。示したのは、分泌されたヒト成長ホルモンについての、およびｒｈＧＧＦ２で処理した筋肉培養からのブンガロトキシン結合についての、用量応答曲線である。
【００８３】
【表４】
2007332153.tif 000005
【００８４】
Ｃ２筋管を３７℃にて１時間、冷したα−ＢＴＸ（２０ｎＭ）で処理し、培地で２回洗浄し、次いで、ＧＧＦ２で処理した。培地を１ｍｇ／ｍｌの濃度のウシ血清アルブミンで調整した。２４時間後、培地を取り出し、ｈＧＨアッセイのために保存した。３７℃にて、筋肉培養を125Ｉ−α−ＢＴＸ（２０ｎＭ）で１時間処理し、洗浄し、１％ＳＤＳを含有するＰＢＳ中に掻き入れた。非特異的結合は冷したα−ＢＴＸ（４０ｎＭ）の存在下で測定した。細胞ホモジネートを放射能につき計数し、合計タンパク質量についてアッセイした。
【００８５】
ｒｈＧＧＦ２の存在は、ｈＧＨ遺伝子発現の増加を２倍以上に導き、それにより、ｒｈＧＧＦ２はアセチルコリン受容体のデルタサブユニットの合成を誘導したことが示される。さらに、増大したブンガロトキシン結合は、これらのサブユニットタンパク質の機能的アセチルコリン受容体への取込みと一致する。これらのデータの解釈を補強するために、ｒｈＧＧＦ２に応答するはずのない、メタロチエン・プロモーターに連結されたｈＧＨレポーターを有する培養で、分析を繰り返した。その対照実験の結果は、ｈＧＨ応答はＡｃｈＲデルタサブユニット遺伝子対照エレメントの転写活性化を通じて媒介されることを示した。
【００８６】
これらの結果は、ｒｈＧＧＦ２が、自己免疫疾患重症筋無力症のための治療の一部としてＡｃｈＲｓを補給するのに有用であり得ることを示す。また、この活性は、筋肉の再神経支配の鍵となる工程を刺激することによって末梢神経再生およびニューロパシーの治療に有用であり得る。
【００８７】
実施例８
精製されたＧＧＦ−ＩおよびＧＧＦ−IIのさらなる分裂促進活性
単一のミクロ培養をＤＮＡ合成、細胞形態学、細胞数および細胞抗原の発現について調査されるのを可能とする定量的方法を用いて、ＧＧＦＩおよびIIを共に含有する高度に精製された試料の分裂促進活性を実験した。この技術はMuir et al.,（Analytical Biochemistry 185, 377-382, 1990)によって従前に報告されている方法を改変した。主な改変は、１）未被覆マイクロタイタープレートの使用、２）ウェル当たりの細胞数、３）１０％子ウシ血清（ＦＣＳ）の代わりの５％子ウシ血漿（ＦＢＰ）の使用、および４）同時に培養に添加した、分裂促進剤およびブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の存在下におけるインキュベーション時間である。加えて、固定前に細胞単層を洗浄しないで、細胞の喪失を回避し、マウス抗−ＢｒｄＵモノクローナル抗体およびペルオキシダーゼ結合ヤギ抗−マウス免疫グロブリン（ＩｇＧ）抗体のインキュベーション時間を２倍にしてアッセイの感度を増大させた。細胞培養条件に対して適当な改変を加えた後、ラット坐骨神経シュワン細胞について最適化したアッセイもいくつかの細胞系で用いた。
【００８８】
Ｉ．分裂促進テストの方法
第１日目に、精製したシュワン細胞を、５％ＦＢＰ／ダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）（５,０００細胞／ウェル）中の未被覆９６ウェルプレートに平板培養した。第２日目に、ＧＧＦまたは他のテスト因子、ならびに最終濃度１０μｍのＢｒｄＵを培養に添加した。４８時間後（第４日）に、培地にアスピレーターをかけることによってＢｒｄＵの取込みを停止させ、室温にて７０％エタノールの２００μｌ／ウェルで２０分間細胞を固定した。次に、細胞を水で洗浄し、３７℃にて２Ｎ ＨＣｌ １００μｌで１０分間インキュベートすることによってＤＮＡを変性させた。アスピレーションに続き、ウェルに０.１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９.０）を満たすことによって残存する酸を中和し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。次いで、細胞を５０μｌのブロッキング緩衝液（０.１％トリトンＸ １００および２％正常ヤギ血清を含有するＰＢＳ）で３７℃にて１５分間処理した。アスピレーションの後、マウス抗−ＢｒｄＵモノクローナル抗体（Dako Corp., Santa Barbara, CA)（５０μｌ／ウェル、ブロッキング緩衝液に希釈した１.４μｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で２時間インキュベートした。０.１％トリトンＸ−１００を含有するＰＢＳ中で３回洗浄することによって未結合抗体を除去し、ペルオキシダーゼ−結合ヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体（Dako Corp., Santa Barbara, CA)（５０μｌ／ウェル、ブロッキング緩衝液に希釈した２μｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ／トリトン中で３回洗浄し、ＰＢＳ中で最後に濯いだ後、０.０５％可溶性クロモゲンｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）および０.０２％Ｈ2Ｏ2を含有する５０ｍＭリン酸／クエン酸緩衝液（ｐＨ５.０）の１００μｌ／ウェルをウェルに与えた。各ウェルからの８０μｌを、２Ｎ硫酸の４０μｌ／ウェルを含有する清浄なプレートにピペットで加えることによって、室温にて５〜２０分後に反応を停止させた。プレートリーダー（Dynatech Labs)を用い、４９０ｎｍで吸光度を記録した。細胞単層を含有するアッセイプレートをＰＢＳで２回洗浄し、基質ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）の１００μｌ／ウェルおよび０.０２％Ｈ2Ｏ2を添加して不溶性生成物を生じさせることによってＢｒｄＵ−ＤＮＡについて免疫細胞化学的に染色した。１０〜２０分後、水で洗浄することによって染色反応を停止させ、倒立顕微鏡を用いてＢｒｄＵ−陽性核を観察し、計数した。場合によっては、陰性核が０.００１％トルイジンブルーでカウンター染色され、前記したごとくに計数した。
【００８９】
II．分裂促進アッセイで用いた細胞系
スウィス（Swiss） ３Ｔ３ 線維芽細胞：空気中１０％ＣＯ2の湿潤雰囲気中、３７℃にて、フロー・ラブズ（Flow Labs）からの細胞を、１０％ＦＣＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補足したＤＭＥＭ中で維持した。細胞に栄養を与え、２日毎に継代培養した。分裂促進アッセイのために、完全培地中５,０００細胞／ウェルの密度にて細胞を平板培養し、細胞が密集し休止するまで１週間インキュベートした。血清含有培地を取り出し、細胞単層を無血清培地で２回洗浄した。分裂促進剤および１０μＭのＢｒｄＵを含有する無血清培地１００μｌを各ウェルに添加し、４８時間インキュベートした。ＧＧＦおよび血清またはＰＤＧＦ（陽性対照として）に対する用量応答を行った。
【００９０】
ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）２１ Ｃ１３線維芽細胞：空気中５％ＣＯ2の湿潤雰囲気中、３７℃にて、５％トリプトーゼホスフェートブロス、５％ＦＣＳ、ペンシリンおよびストレプトマイシンを補足したグラスゴウ改良イーグル培地（ＧＭＥＭ）中で、ユーロピーアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズ（European Collection of Animal Cell Cultures)（ＥＣＡＣＣ）からの細胞を維持した。細胞に栄養を与えるか、あるいは２日ないし３日毎に継代培養した。分裂促進アッセイのために、完全培地中２,０００細胞／ウェルの密度で細胞を２４時間平板培養した。次いで、血清含有培地を取り出し、無血清培地で洗浄した後、０.１％ＦＣＳ含有ＧＭＥＭまたはＧＭＥＭ単独１００μｌで置き換えた。ＧＧＦおよびＦＣＳまたはｂＦＧＦ（陽性対照として）を添加し、１０μＭ ＢｒｄＵと一致させ、４８時間インキュベートした。次いで、細胞培養をシュワン細胞について前記したごとく加工した。
【００９１】
Ｃ６ラット膠腫細胞系：空気中１０％ＣＯ2の湿潤雰囲気中、３７℃にて、５％ＦＣＳ、５％ウマ血清（ＨＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中で、３９継代で得られた細胞を維持した。細胞に栄養を与えるか、あるいは３日毎に継代培養した。分裂促進アッセイのために、完全培地中２,０００細胞／ウェルの密度で細胞を平板培養し、２４時間インキュベートした。次いで、無血清培地中で洗浄した後、１：１のＤＭＥＭおよび０.１％ＦＣＳ含有Ｆ１２培地の混合物で置き換えた。次いで、ＧＧＦ、ＦＣＳおよびαＦＣＦに対する用量応答を行い、他の細胞型について前記したごとくに細胞をＥＬＩＳＡ法により加工した。
【００９２】
ＰＣ１２（ラット副腎クロム親和性細胞腫細胞）：空気中５％ＣＯ2の湿潤雰囲気中、３７℃にて、コラーゲン被覆フラスコ中、１０％ＨＳ、５％ＦＣＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ １６４０中で、ＥＣＡＣＣからの細胞を維持した。培地の８０％を置き換えることによって、３日毎に細胞を栄養を与えた。コラーゲン被覆プレート（５０μｌ／ウェルコラーゲン、Vitrogen Collagen Corp.、１：５０希釈、３７℃で３０分間）上、完全培地中３,０００細胞／ウェルの密度にて細胞を平板培養し、２４時間インキュベートした。次いで、新鮮なＲＰＭＩ単独または１ｍＭインスリンもしくは１％ＦＣＳを含有する新鮮なＲＰＭＩで培地を置き換えた。陽性対照としてのＦＣＳ／ＨＳ（１：２）に対するおよびＧＧＦに対する用量応答を前記したごとくに行った。４８時間後、細胞を固定し、前記したごとくＥＬＩＳＡ法を行った。
【００９３】
III．分裂促進アッセイの結果
本実施例に示したすべての実験は、ＧＧＦ−ＩおよびＧＧＦ−II（ＧＧＦｓ）の混合物を含有するセファロース１２クロマトグラフィー精製工程からの高度に精製した試料を用いて行った。
【００９４】
まず、ＢｒｄＵ取込みアッセイで得られた結果を、J. P. Brockes（Methods Enzymol. 147:217, 1987)によって記載されている、分裂細胞のＤＮＡへの［１２５］Ｉ−ＵｄＲ取込みに基づいてシュワン細胞についての古典的分裂促進アッセイと比較した。
【００９５】
図１２は、同一細胞培養条件（５,０００細胞／ウェル、５％ＦＢＰ／ＤＭＥＭ中、ＧＧＦの存在下で４８時間インキュベート）で行った、２つのアッセイで得られたデータの比較を示す。明らかに示されるごとく、結果は同等であるが、グラフの左側、すなわちＧＧＦの低濃度への曲線のシフトによって示されるごとく、ＢｒｄＵ取込みアッセイは、わずかにより感度が良好のようである。
【００９６】
「分裂促進テスト方法」のセクションで述べたごとく、ＯＰＤペルオキシダーゼ反応の可溶性生成物の強度を読むことによって免疫反応性ＢｒｄＵ−ＤＮＡを定量した後、細胞単層を含有するオリジナルのアッセイプレートは第２の反応を受けて不溶性ＤＡＢ生成物が生じ、これはＢｒｄＵ陽性核を染色する。次いで、ミクロ培養を倒立顕微鏡で調査でき、細胞の形態学およびＢｒｄＵ−陽性および陰性核の数を観察できる。
【００９７】
図１３Ａおよび図１３Ｂにおいて、４９０ｎｍにおける吸光度を読むことによって評価したＢｒｄＵ−ＤＮＡ免疫反応性を、同一培養で計数した、ＢｒｄＵ−陽性核の数に対して、ウェル当たりの細胞の合計数に対するＢｒｄＵ−陽性核のパーセンテージに対して比較する。標準偏差は１０％未満であった。２つの評価方法は非常に良好な相関を示し、最高用量のＧＧＦにおける値間の矛盾は、ＢｒｄＵ−陽性として検出された細胞におけるＤＮＡ合成の異なる程度によって説明できる。
【００９８】
従って、ＢｒｄＵ取込みアッセイは、（１２５）Ｉ−ＵｄＲ取込みアッセイと比較した場合、シュワン細胞上のポリペプチドの生物学的活性についてのさらなる有用な情報を提供できる。例えば、図１５に報告するデータは、ＧＧＦはシュワン細胞に作用してＤＮＡ合成を誘導できるが、より低用量では、４８時間後にミクロ培養中に存在する陰性細胞の数を増加させることができることを示す。
【００９９】
該アッセイを異なる起源のいくつかの細胞系に用いた。図１５において、ＧＧＦに対するシュワン細胞およびSwiss ３Ｔ３線維芽細胞の分裂促進応答を比較した;３Ｔ３線維芽細胞で得られた弱い応答にも拘わらず、いくつかの明瞭にＢｒｄＵ−陽性の核がこれらの培養で検出された。ＦＣＳまたはヒト組換えＰＤＧＦのいくつかの用量の存在下で、対照培養を平行して行い、細胞は適当な刺激に対して応答し得ることが示された（図示せず）。
【０１００】
ＢＨＫ２１ Ｃ１３細胞系を用いて、ＧＧＦに応答する線維芽細胞の能力をさらに調べた。腎臓由来のこれらの線維芽細胞は接触阻止を示さないか、あるいは密集した場合には休止状態に達する。従って、細胞活性を危うくすることなく非常に低いバックグラウンド増殖を有するように実験条件を設計した。図１６および図１７によって示されるごとく、ＧＧＦは、ＢＨＫ２１ Ｃ１３細胞に対する有意な分裂促進活性を有する。図１６は、０.１％ＦＣＳの存在下でＧＧＦによって刺激されたＢＨＫ ２１ Ｃ１３細胞によるＢｒｄＵのＤＮＡへの取込みを示す。ＦＣＳに対する良好な分裂促進応答は、細胞培養条件が限定的でないことを示す。図１７において、ＧＧＦの分裂促進効果は、ウェル当たりの、ＢｒｄＵ−陽性およびＢｒｄＵ−陰性の数として、および計数した細胞の合計数として表す。データは、二連で行った２つの実験の代表であり；ウェル当たり少なくとも３つのフィールドを計数した。低用量における増殖効果に加えてシュワン細胞で観察されたごとく、ＧＧＦはまた非応答性細胞の生存数を増加させる。ＢｒｄＵ陽性細胞のパーセンテージは培地に添加したＧＧＦの増加する量に比例する。高濃度のＧＧＦの存在下における４８時間後における細胞の合計数は少なくとも２倍となり、ＧＧＦはＢＨＫ２１ Ｃ１３細胞でＤＮＡ合成および増殖を誘導することが確認される。同一条件下、２％ＦＣＳの存在下で４８時間維持した細胞は約６倍の増加を示した（図示せず）。
【０１０１】
Ｃ６膠腫細胞は、グリア細胞特性を研究する有用なモデルを提供した。発現された表現型は、細胞の継代に依存するらしく、細胞は初期段階における星状膠細胞の表現型、および後の段階における（継代７０を超える）稀突起膠細胞の表現型によく似ている。これらの実験で用いたＣ６細胞は継代３９ないし継代５２のものであった。Ｃ６細胞は高度に増殖性の集団であり、従って、ＢｒｄＵ取込みの非常に低いバックグラウンドを有するように実験条件を最適化した。ＦＣＳに対する用量応答によって示されるごとく（図１８）、分裂促進応答に有意に影響することなく、細胞活性を維持するのに０.１％の血清の存在が必要であった。
【０１０２】
図１９において、ａＦＧＦ（酸性線維芽細胞成長因子）およびＧＧＦに対する分裂促進応答は、ＦＣＳ（８％）の存在下で得られた最大ＢｒｄＵ取込みのパーセンテージとして表す。値は、二連で行った２つの実験の平均である。ＧＧＦの効果はａＦＧＦの純粋な調製物のそれに匹敵するものであった。ａＦＧＦはＣ６細胞に特異的な成長因子として記載され（Lim R. et al., Cell Regulation 1:741-746,1990)、その理由で、それは陽性対照として用いられた。ＢｒｄＵ陽性および陰性細胞の直接計数は、ミクロ培養における高細胞密度のため可能ではなかった。これまで報告した細胞系とは対照的に、ＰＣ１２細胞は、ＰＣ１２が血清（細胞の維持にルーチン的に使用されるＦＣＳまたはＨＳの混合物）に応答できる培養条件下で処理する場合、ＧＧＦＳに対するいずれの明らかな応答性も示さなかった。それにも拘わらず、ウェル当たりの平板培養した細胞の数はＰＣ１２細胞の挙動に影響を与えるらしく、従って、さらなる実験が必要である。
【０１０３】
実施例９
精製したＧＧＦ−ＩおよびＧＧＦ−IIのアミノ酸配列
アミノ酸配列分析実験は、高度に精製したウシ下垂体ＧＧＦ−ＩおよびＧＧＦ−IIを用いて行った。配列を記載するのに通常の一文字コードを用いた。ペプチドは、１１％ＳＤＳ−ＰＡＧＥの５５−６５ＲＤ領域から流出（前記したマーカーに対するＭＷ）した物質について行ったＧＧＦ−IIのリシルエンドペプチダーゼ消化を用い、還元しカルボキシメチル化した試料につき行った、リシルエンドペプチダーゼおよびプロテアーゼＶ８消化によって得られた。
【０１０４】
合計２１のペプチド配列（図８、配列番号１〜２０、１６５参照）がＧＧＦ−Ｉにつき得られ、そのうち１２のペプチド（図９、配列番号１、２２〜２９、１７、１９および３２参照）が現在のタンパク質データベースには存在せず、従って、ユニークな配列を表す。合計１２のペプチド配列（図１０、配列番号４２〜５０および１６１−１６３）がＧＧＦ−IIについて得られ、そのうち１０のペプチド（図１１、配列番号４２〜５０）が現在のタンパク質データベースに存在せず、従って、ユニークな配列を表す（例外は、少数の残基であれば恐らくは重要でない多くのタンパク質において同一の配列を示すペプチドＧＧＦ−II ０６である）。これらの新規な配列は、ＧＧＦＩおよびIIの真実のアミノ酸配列の一部に極めて対応しているようである。
【０１０５】
明らかに高度に関連する、ＧＧＦ−Ｉ ０７およびＧＧＦ−II １２の配列に特別の注意を払うことができる。類似性は、これらのペプチドの配列は、ほとんど確かに割り当てられたＧＧＦ種のものであり、汚染タンパク質に由来するものではほとんどないようであることを示す。
【０１０６】
加えて、ペプチドＧＧＦ−II ０２において、配列Ｘ Ｓ Ｓは、Ｘで示される位置のアスパラギン上のＮ結合カルボヒドレート残基の存在と合致する。
【０１０７】
一般に、図８および１０において、Ｘは未知の残基を表し、これは、配列決定サイクルには同等のサイズの１を超えるシグナルがあるか、あるいはシグナルが存在しないので、単一の位置が確実性を持って呼ばれない配列決定サイクルを示す。星印は、最後であると考えられるアミノ酸がそのペプチドに存在する最後のアミノ酸であるペプチド示す。残りのペプチドにおいて、最後であると考えられるアミノ酸の後のシグナル強度は、配列の命名をそのペプチド末端まで継続するのに不十分であった。右側のカラムは、ＮＢＲＦおよびＥＭＢＬ配列データベースを分析するためのＧＣＧパッケージＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡプログラムを用いたコンピューターデータベースサーチの結果を示す。このカラムにおけるタンパク質の名称は、その配列の一部の、最大２つのミスマッチを可能とすると考えられるペプチドアミノ酸配列との同一性を示す。疑問符は３つの可能なミスマッチを示す。用いた略字は以下の通りである。
ＨＭＧ−１        高移動性群タンパク質−１
ＨＭＧ−２        高移動性群タンパク質−２
ＬＨ−アルファ    黄体形成ホルモンアルファサブユニット
ＬＨ−ベータ      黄体形成ホルモンベータサブユニット
【０１０８】
実施例１０
ＧＧＦ−ＩおよびＧＧＦ−IIペプチドを含有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の単離およびクローニング
ＧＧＦ−IIヌクレオチド配列の単離およびクローニングは、ペプチド配列情報およびライブラリースクリーニングを用い、ここに概略を述べるごとく行い、また、後記するごとくに行った。図１０および１１のペプチドは、ＧＧＦ−Ｉ配列の単離およびクローニング、続いてのここに記載する技術についての出発点として用いることができるのが認識されよう。事実、図２０、配列番号５１〜８４は、この目的のための可能な変性オリゴヌクレオチドプローブを示し、図２２、配列番号８６〜１１５は、可能なＰＣＲプライマーをリストする。ＤＮＡ配列およびポリペプチド配列はＧＧＦ−IIに関しこの手段によって得られるはずであり、また、ＤＮＡ構築物およびかかるＤＮＡ配列を一体化させる発現ベクター、かかる構築物／ベクターを一体化させることによって遺伝的に改変された宿主細胞、およびかかる宿主細胞を培養することによって得られるタンパク質も同様である。本発明はかかる主題にも関する。
【０１０９】
Ｉ．オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーの設計および合成
変性ＤＮＡオリゴマープローブは、（精製ＧＧＦタンパク質から生成したペプチドに由来する）アミノ酸配列をヌクレオチド配列に逆翻訳することによって設計した。オリゴマーは、ＤＮＡ配列のコーディング鎖または非コーディング鎖いずれかを表す。セリン、アルギニンまたはロイシンがオリゴマー設計に含まれる場合、２つの別々の合成物を調製して不明確さを回避した。例えば、セリンは５３７および５３８または６０９および６１０におけるごとくＴＣＮまたはＡＧＹによってコードされた。同様のコドン分裂がアルギニンまたはロイシンでなされている（例えば、５４４、５４５）。ＤＮＡオリゴマーは、０.２マクイロモル規模の合成で働くβ−シアノエチル化学を用い、バイオサーチ（Biosearch）８７５０  ４−カラムで合成した。オリゴマーをカラム（５００オングストロームＣｐＧ樹脂）から切断し、５５〜６０℃で６〜２４時間濃水酸化アンモニウム中で脱保護した。脱保護オリゴマーを真空下（Speedvac）で乾燥し、１５％アクリルアミド（２０モノ：１ビス）のゲル、７Ｍ尿素を含有する５０ｍＭトリス−ＥＤＴＡ緩衝液にての電気泳動によって精製した。ＵＶシャドウイングによって、ゲル中にて全長オリゴマーを検出し、次いで、バンドを切り出し、振とうしつつ４〜１６時間、ＤＮＡオリゴマーを１.５ｍｌずつの水に溶出させた。溶出物を乾燥し、０.１ｍｌの水に再溶解させ、吸光度測定を２６０ｎｍで行った。
【０１１０】
濃度は以下の式に従って求めた。
（Ａ２６０ｘユニット／ｍｌ）（６０.６／長さ＝ｘμＭ）
すべてのオリゴマーを水の添加によって５０μＭ濃度に調整した。
【０１１１】
前記のごとく設計した変性プローブを図２０、配列番号５４〜８８に示す。
【０１１２】
ＰＣＲプライマーは、以下の改変を施した、プローブで用いたものと実質的に同一の方法によって調製した。制限部位を含有する１３のヌクレオチドのリンカーを、ベクターにクローニングするのに用いるため縮重オリゴマーの５’末端に含ませた。ＤＮＡ合成は、１,０００オングストロームＣｐＧ樹脂を用いて１マイクロモルの規模で行い、すべての４種のヌクレオチドが通常は縮重プローブに一体化される位置でイノシンを用いた。ＰＣＲプライマーの精製は、ゲル電気泳動精製に続いてのエタノール沈殿を含むものであった。
【０１１３】
II．ライブラリー構築およびスクリーニング
ウシゲノムＤＮＡライブラリーはStratagene(カタログ番号:945701)から購入した。該ライブラリーはベクターラムダＤａｓｈIIにクローン化した２×１０6  １５〜２０ｋｂ Ｓａｕ３Ａｌ部分ウシＤＮＡ断片を含有するものであった。ウシ全脳ｃＤＮＡライブラリーはClonetech (カタログ番号:BL10139)から購入した。相補ＤＮＡラブラリーは、ウシ全脳、ウシ下垂体およびウシ下垂体後葉から調製したｍＲＮＡから構築した（ヴァイトロジェン（Vitrogen）中：ストラタジーン（Stratagene））。Vitrogen調製した２つのｃＤＮＡライブラリーにおいて；１のライブラリーはベクターラムダｇ１０におけるものであり、他のライブラリーはベクターｐｃＤＮＡＩにおけるものであった（プラスミドライブラリー）。ストラタジーン（Stratagene）ライブラリーはベクターラムダ  ユニザップ（unizap）にて調製した。集合的に、ｃＤＮＡライブラリーは１４００万の一次組換えファージを含有するものであった。
【０１１４】
プレート当たり１５０,０００ないし２００,０００ファージプラークにて、ウシゲノムライブラリーを２３×２３ｃｍのプレート（Ｎｕｎｃ）上の大腸菌Ｋ１２宿主株ＬＥ３９２に平板培養した。各プレートは、約１のウシゲノム当量を示した。３７℃における一晩のインキュベーションの後、該プレートを冷却し、Maniatis et al．（2:60-81）の手法に従って複製フィルターを調製した。４つのプラークリフトを各プレートから非荷電ナイロン膜（Pall Biodyne A またはMSI Nitropure）に調製した。ＵＶ光の下で５分間架橋させるか、あるいは８０℃、真空下で２時間加熱することによってＤＮＡを該膜に固定化した。供給業者の仕様に従い、ガンマ３２Ｐ ＡＴＰ（New England Nuclear:６５００Ｃｉ／ミリモル）と共にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs)を用いてＤＮＡプローブを標識した。略言すれば、３７℃にて、６００μＣｉガンマ32Ｐ−ＡＴＰおよび５ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼの存在下で、５０ピコモルの縮重ＤＮＡオリゴマーを３０分間インキュベートした。反応を終結させ、ゲル電気泳動負荷緩衝液を添加し、次いで、電気泳動によって放射性同位体標識プローブを精製した。３２Ｐ標識プローブをゲルスライスから切り出し、水中に溶出させた。別法として、SchowalterおよびSommer, Anal. Biochem 177:90-94 (1989)のプロトコルに従ってα−３２Ｐ−ｄＡＴＰまたはα−３２Ｐ ｄＣＴＰを一体化することによって、ＤＮＡプローブをＰＣＲ増幅を介して標識した。ＰＣＲ反応で標識したプローブを、セファデックスＧ−１５０カラムで脱塩することによって精製した。
【０１１５】
ＧＭＣ緩衝液（０.５２Ｍ ＮａＰｉ、７％ＳＤＳ、１％ＢＳＡ、１.５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０.１Ｍ ＮａＣｌ  １０ｍｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ）中でプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを行った。洗浄は、オリゴウォッシュ（oligowash）（１６０ｍｌ １Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4、２００ｍｌ ２０％ＳＤＳ、８.０ｍｌ ０.５Ｍ ＥＤＴＡ、１００ｍｌ ５Ｍ ＮａＣｌ、３６３２ｍｌ Ｈ2Ｏ）中で行った。典型的には、１０のウシゲノム当量の複製コピーを表す２０のフィルター（各々４００ｓｑ．センチメーター）を、１００ピコモルの縮重オリゴヌクレオチドプローブ（１２８〜５１２倍縮重）を含む２００ｍｌのハイブリダイゼーション溶液中でインキュベートした。ハイブリダイゼーションは、縮重プローブについて計算した最小融解温度の５℃以下で一晩起こさせた。最小融解温度の計算は、ＡＴ対につき２℃を、ＧＣ対につき４℃を見積もっている。
【０１１６】
フィルターは、ハイブリダイゼーション温度で反復して交換したオリゴウォッシュ中で４ないし５時間、および最後には、ＤＮＡプローブ長に応じた温度にて１％ＳＤＳ中、３.２Ｍ塩化テトラメチルアンモニウムで３０分間２回洗浄した。２０量体については、最終洗浄温度は６０℃であった。フィルターを取り付け、次いで、増感スクリーン（Dupont Cronex Lightening Plus)を用いてＸ−線フィルム（Kodak XAR5）に暴露した。通常、−８０℃における３日ないし５日間のフィルム暴露が、これらのライブラリースクリーンにおける二連シグナルを検出するのに十分であった。結果の分析に続き、フィルムをストリップし、再プローブできる。フィルターは、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）を含有する１％ＳＤＳの溶液中、フルパワーのマイクロ波オーブン中での１５分間の２回の連続的サイクルを通じてインキュベートすることによってストリップした。少なくとも３ないし４サイクルのストリッピングおよび種々のプローブでの再プロービングによりフィルターを採取した。
【０１１７】
III．組換えファージの単離、増殖およびＤＮＡ調製
これらの手法は組換えＤＮＡ法で記載されている標準的なプロトコルに従うものであった（Maniatis et al 2:60-2:81)。
【０１１８】
IV．ＤＮＡ消化およびサザーンブロットを用いる単離したクローンの分析
制限エンドヌクレアーゼ供給業者（New England Biolabs)によって推奨される条件に従い、組換えファージＤＮＡ試料（２マイクログラム）を消化した。３７℃における４時間のインキュベーションに続き、０.１Ｍ酢酸ナトリウムおよび３容量のエタノールの存在下で、反応生成物を沈殿させた。沈殿させたＤＮＡを遠心によって収集し、７５％エタノール中で濯ぎ、乾燥した。すべての懸濁した試料をアガロースゲルに負荷した（典型的には、ＴＡＥ緩衝液；０.０４Ｍトリスアセテート、０.００２Ｍ ＥＤＴＡ中１％）。１センチメーター当たり１ボルトにて４ないし２０時間、ゲルを泳動させた。マーカーはラムダＨｉｎｄ  III  ＤＮＡ断片および／またはφＸ１７４ＨａｅIII ＤＮＡ（New England Biolabs)を含むものであった。ゲルを０.５マイクログラム／ｍｌの臭化エチジウムで染色し、写真を撮った。サザーンブロッティングについては、０.１２５Ｎ ＨＣｌでの処理によってＤＮＡをまずゲル中で脱プリン化し、０.５Ｎ ＮａＯＨで変性し、２０×ＳＳＣ（３Ｍ塩化ナトリウム、０.０３Ｍクエン酸ナトリウム）中にて非荷電ナイロン膜に移した。ブロッティングは６時間から２４時間まで行い、次いで、０.５トリスＨＣｌ ｐＨ７.５、０.１５Ｍ塩化ナトリウム中で中和し、次いで、５０ｍＭトリス−ホウ酸ＥＤＴＡ中で簡単に濯いだ。
【０１１９】
架橋については、フィルターをまず透明プラスチックラップに包み、次いで、ＤＮＡ側を紫外光に５分間暴露した。ハイブリダイゼーションおよび洗浄はライブラリーのスクリーニングについて記載したごとくに行った（本実施例のセクション２参照）。同様の遺伝子が他の種に存在するか否かを判断するためのハイブリダイゼーションのためにわずかに修飾を施した。ＤＮＡフィルターはコロネテック（Clonetech）（カタログ番号７７５３−１）から購入し、それは、レーン当たり種々の種からのＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡを５マイクログラムを含有するものであった。前記したセクション２に記載したごとくＰＣＲ増幅反応によってプローブを標識し、ハイブリダイゼーションは、１０％硫酸デキストランを含有する８０％緩衝液Ｂ（２ｇのポリビニルピロリドン、２ｇのＦｉｃｏｌｌ−４００、２ｇのウシ血清アルブミン、５０ｍｌの１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、５８ｇのＮａＣｌ、１ｇのピロリン酸ナトリウム、１０ｇのドデシル硫酸ナトリウム、９５０ｍｌのＨ2Ｏ）中で行った。プローブは、１０分間煮沸し、次いで、氷水中で迅速に冷却することによって変性した。プローブを、１ｍｌ当たり１０6ｄｐｍ32Ｐのハイブリダイゼーション緩衝液に添加し、６０℃で一晩インキュベートした。フィルターを、６０℃でまず緩衝液Ｂ中で、続いて２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ、次いで１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中で洗浄した。高ストリンジェンシーについては、実験、最終洗浄を０.１×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ中で温度を６５℃まで上昇させて行った。
【０１２０】
サザーンブロットデータを用いて、ゲノムクローンの制限地図を作成し、いずれのサブ断片がＧＧＦプローブにハイブリダイズしたかを示した（サブクローニングのための候補）。
【０１２１】
Ｖ．ハイブリダイゼーションプローブに相同なＤＮＡのセグメントのサブクローニング
ＤＮＡ消化物（例えば、５マイクログラム）を１％アガロースゲルに負荷し、次いで、適当な断片を染色後のゲルから切り出した。ガラスビーズへの吸着および供給業者（Bio 101)によって記載されているプロトコルを用いる溶出によってＤＮＡを精製した。回収したＤＮＡ断片（１００〜２００ｎｇ）を、Ｔ４リガーゼ（New England Biolabs)を用い、ｐＣＵ１８の誘導体である線状化脱リン酸化ベクター、例えばｐＴ３Ｔ７（Ambion）に連結した。このベクターは大腸菌βラクタマーゼを担持し、よって、形質転換体はアンピシリンを含有するプレートで選択できる。また、該ベクターは、β−ガラクトシダーゼ相補性を宿主細胞に供給し、従って、非組換体（ブルー）はイソプロピルチオガラクトシダーゼおよびBluogal（Bethesda Research Labs)を用いて検出できる。連結反応の一部を用いて、大腸菌Ｋ１２ ＸＬｌ blueコンピテント細胞（ストラタジーン（Stratagene）カタログ番号：２００２３６）を形質転換し、次いで、アンピシリン１ｍｌ当たり５０マイクログラムを含有するＬＢプレートで形質転換体を選択した。白色コロニーを選択し、プラスミドミニプレプ（preps）をＤＮＡ消化およびＤＮＡ配列分析のために調製した。選択したクローンを再テストして、そのインサートＤＮＡがＧＧＦプローブにハイブリダイズするか否かを判断した。
【０１２２】
VI．ＤＮＡ配列決定
標準的なプロトコルに従い、５ｍｌ培養から二本鎖プラスミドＤＮＡ鋳型を調製した。配列決定は、製造業者のプロトコル［Sanger et al. PNAS;USA 74:5463 (1977)］に従い、セクエナーゼ（Sequenase）２.０およびジデオキシヌクレオチド配列決定キット（ＵＳ Biochemical）を用いてジデオキシ鎖停止法によって行った。別法として、配列決定は、サイクル配列決定キット（New England Biolabs; Bethesda Research Laboratories)を用いてＤＮＡサーマルサイクラー（Perkin Elmer, モデル４８００）で行い、５’末端標識プライマーを用い、製造業者の指示に従って行った。配列プライマーは配列キットで供給されたものか、あるいはクローンから決定された配列に従って合成したものであった。６％ポリアクリルアミドの０.４ｍｍ厚配列決定用ゲルに配列決定反応物を負荷し、解像した。ゲルを乾燥し、Ｘ−線フイルムに暴露した。典型的には、標準的な配列決定キットを用いる場合、３５Ｓを取り込み、サイクル配列決定反応のために３２Ｐ末端標識プライマーを用いた。ゲルの底部から頂部まで（５’方向から３’）の配列をＤＮＡ配列エディターに読み込み、ジェネティクス・コンピュータ・グループ（Genetics Computer Group）（ＧＣＧ、ウィスコンシン大学）によって供給されているプログラムを用いてデータを解析した。
【０１２３】
VII．ＲＮＡ調製およびＰＣＲ増幅
ゲノムＤＮＡ中に検出され、かつＧＧＦペプチドをコードする配列を含有するオープンリーディングフレームを下垂体ＲＮＡのＰＣＲ増幅を介して延長した。ＲＮＡは、グアニジン中性−ＣｓＣｌ手法（Chirgwin et al. Biochemistry 18:5294 (1979)）に従い凍結ウシ組織（Pelfreeze）から調製した。ポリアデニル化ＲＮＡはオリゴ−ｄＴセルロースカラムクロマトグラフィー（Aviv and Leder PNAS (USA) 69:1408 (1972)）によって選択した。
【０１２４】
パーキン・エルマー社製ＰＣＲ／ＲＮＡキット番号：Ｎ８０８−００１７を用いてｃＤＮＡに変換された全ＲＮＡまたはポリアデニル化ＲＮＡ試料いずれかで開始して、特異的ＤＮＡ標的配列を増幅した。第１鎖逆転写反応は１μｇの鋳型ＲＮＡと、制限酵素認識部位リンカーを付加したオリゴｄＴのプライマーまたは制限部位が付加したクローン化配列から決定した特異的アンチセンスプライマーいずれかとを用いた。第２鎖を生成するには、プライマーは、３’ＲＡＣＥ反応で用いたプラス鎖ユニーク配列（Frohman et. al. PNAS (USA) 85:8998 (1988)）であるか、あるいは第１鎖反応生成物をｄＡＴＰでターミナルトランスフェラーゼテーリングすることによって第２の標識部位が付加されている場合には制限部位が付加されたオリゴｄＴプライマーであった（例えば、５’race反応、Frohman et al.、前掲）。別法として、アンカードＰＣＲ反応においては、第２鎖プライマーは縮重し、従って、個々のペプチド配列を表す。
【０１２５】
増幅プロフィールは以下の一般的スキームの通りである：１）９５℃における５分間の浸漬ファイル；２）９５℃、１分間の加熱サイクルファイル；１分間、４５℃、５０℃または５５℃のアニーリング温度に下げる；１分間アニーリング温度に維持する；１分間にわたって７２℃まで上げる；７２℃で１分間または１分間プラス１０秒間の自己延長にて延長させる；３）７２℃、５分間の延長サイクル、および４）有限時間での４℃における浸漬ファイル。加熱サイクルファイル（＃２）は、通常、３０サイクル行った。１センチメーター当たり４ボルトにて、３時間の、ＴＡＥ緩衝液中における、２％Ｎｕｓｉｅｖｅ１％アガロースゲルでの電気泳動によって、各１００μｌの増幅反応の１６μｌの試料を分析した。ゲルを染色し、次いで、非荷電ナイロン膜にブロットし、これを、プライマーに対して内部にある標識ＤＮＡプローブでプローブした。
【０１２６】
ＤＮＡ増幅産物の特異的セットはブロッティング実験で同一であり得、その位置を精製および再増幅のガイドとして用いた。適当には、選択した試料の残存部分を分取用ゲルに負荷し、続いて、電気泳動の後に、０.５ｍｍ厚の４ないし５のスライス（特異的産物の予測される位置を括弧に入れる）をゲルから採取した。アガロースを潰し、次いで、４０℃にて、０.５ｍｌの電気泳動緩衝液に２〜１６時間浸漬した。潰したアガロースを２分間遠心し、水性相を新しい試験管に移した。
【０１２７】
元の反応と同一セットのプライマーおよび反応プロフィールを用い、溶出した物質５マイクロリットル（生成物の概略１％）について再増幅を行った。再増幅反応が完了すると、クロロホルムで試料を抽出し、新しい試験管に移した。濃縮した制限酵素緩衝液および酵素を反応に添加して、リンカー中に存在する制限部位にて切断した。消化したＰＣＲ産物を電気泳動によって精製し、次いで、サブクローニングのセクションで前記したごとくにベクターにサブクローニングした。ＤＮＡ配列決定は前記したごとくに行った。
【０１２８】
VIII．ＤＮＡ配列分析
断片組立てプログラムを用いてＤＮＡ配列を組み立て、ＧＣＧプログラム  ゲルアセンブル（GelAssemble）、地図およびトランスレート（Translate）によってアミノ酸配列を推定した。推定したタンパク質配列を疑問配列として用いて、ワードサーチ（WordSearch）を使用してタンパク質配列データベースをサーチした。分析は、ＶＭＳ５.１下で操作するＶＡＸ Station  ３１００  ワークステーションで行った。データベースサーチは、ＧＣＧバージョン７.０を用いてスウィスプロット（SwissProt）リリース番号２１で行った。
【０１２９】
IX．ＧＧＦ−ＩおよびＧＧＦ−IIをコードする遺伝子のクローニングおよび配列決定の結果
示したごとく、ウシＧＧＦ−IIをコードするＤＮＡ配列を同定するために、縮重オリゴヌクレオチドプローブをＧＧＦ−IIペプチド配列から設計した。ＧＧＦ−II １２（配列番号４４）、すなわち、精製したＧＧＦ−II調製のリシルエンドペプチダーゼ消化を介して生成したペプチドは（図１６および１２参照）、ＧＧＦ−Ｉ ０７（配列番号３９）、すなわち、精製したＧＧＦ−Ｉ調製から生成したトリプシンペプチドと強いアミノ酸配列相同性を示した。かくして、ＧＧＦ−II １２を用いて１０の縮重オリゴヌクレオチドプローブを得た（各々、図２０中のオリゴ６０９、６１０および６４９ないし６５６、配列番号６６、６７、６８および７５参照）。フィルターの二連セットを、ＧＧＦ−II １２の２つの重複部分をコードするプローブの２つのセット（セット１＝６０９、６１０；セット２＝６４９〜５６５６）でプローブした。ハイブリダイゼーションシグナルは観察されたが、１つのクローンのみが両プローブセットにハイブリダイズした。クローン（ＧＧＦ２ＢＧ１と命名）を精製した。
【０１３０】
ファージクローンＧＧＦ２ＢＧ１からのＤＮＡのサザーンブロット分析により、両プローブセットはそのウシＤＮＡ配列にハイブリダイズすることが確認され、さらに、両プローブはクローン内の同一セットのＤＮＡ断片と反応することが示された。これらの実験に基づき、元のクローンの４ｋｂ ＥｃｏＲＩサブ断片を同定し、サブクローンし、部分的に配列決定した。図２１は、ヌクレオチド配列（配列番号８９）、ならびにプローブ６０９および６５０のハイブリダイゼーション部位を包む最初のＤＮＡ配列のリーディングの推定アミノ酸配列を示し、このウシゲノムＤＮＡの一部がペプチド１２（ＫＡＳＬＡＤＳＧＥＹＭ）をコードすることが確認された。
【０１３１】
さらなる配列分析は、ＧＧＦ−II １２は、推定ウシＧＧＦ−ＩＩ遺伝子およびｃＤＮＡを表す重複配列の単離の出発点となった６６アミノ酸オープンリーディングフレーム（後記参照）に存在することを示した。
【０１３２】
いくつかのＰＣＲ方法を用いて、推定ウシＧＧＦ−II遺伝子についてのさらなるコーディング配列を得た。全ＲＮＡおよびオリゴｄＴ−選択（ポリＡ含有）ＲＮＡ試料は、ウシ全下垂体、下垂体前葉、下垂体後葉、および視床下部から調製した。図２２、配列番号１０９−１１９に示したリストからのプライマーを用い、片側ＰＣＲ反応（ＲＡＣＥ）を用いて、３’および５’両方向でｃＤＮＡ末端を増幅し、アンカードＰＣＲ反応はさらなるＧＧＦ−IIペプチドを表す縮重オリゴヌクレオチドプライマーで行った。図２９は、それらの実験で得られた隣接ＤＮＡ構造および配列をまとめる。３’ＲＡＣＥ反応から、３つの別のスプライスしたｃＤＮＡ配列が得られ、これをクローン化し、配列決定した。５’ＲＡＣＥ反応は、少なくとも５２アミノ酸のコーディング配列を含有するさらなるエクソンの発見に導いた。その推定アミノ酸配列の分析により、ペプチドＧＧＦ−II−６、およびＧＧＦ−Ｉ−１８（後記参照）に類似の配列が明らかにされた。アンカードＰＣＲ反応は、３００ｂｐのさらなるｃＤＮＡセグメント内に含まれるペプチドＧＧＦ−II−１、２、３および１０の（ｃＤＮＡ）コーディング配列の同定に導いた。このセグメント（すなわち、セグメントＥ、図３０参照）の５’リミットは、ペプチドＧＧＦ−II−１をコードし、かつＰＣＲ反応で用いられたオリゴヌクレオチドによって定義される（さらなる５’配列データは、実施例１１におけるヒト・クローンについて記載したごとく存在する）。かくして、このクローンは存在する合計して９つの新規なＧＧＦ−IIペプチド配列のうちの６つをコードするヌクレオチド配列を含有する。
【０１３３】
クローン化遺伝子は、見い出されたコーディング配列（後記、図３０参照）の本発明者による位置決めを可能としたＧＧＦ２ＢＧ１の物理的地図を構築することによってまず特徴付けられた。前記したコーディング配列からのＤＮＡプローブは、このファージクローン上のエクソンを含有するさらなるＤＮＡ断片を同定するのに、また、両方向で重複するクローンを同定するのに用いられた。推定ウシＧＧＦ−II遺伝子は少なくとも５つのコーディングセグメントに分割される。コーディングセグメントは、普遍的な遺伝暗号を用いてポリペプチド配列に翻訳できる不連続長さのＤＮＡ配列と定義される。図３６に記載し、本出願で言及したコーディングセグメントは、１）ＧＧＦ遺伝子内に存在する特定のエクソン（例えば、コーディングセグメントａ）、または２）ｍＲＮＡの特異的サブグループに出現する２以上のエクソンのセットに由来するものであり、ここに、各セットは、示した遺伝子産物におけるごとく特異的ポリペプチドセグメントに翻訳できる。請求の範囲で言及するポリペプチドセグメントは同種ＤＮＡコーディングセグメントの翻訳産物である。コーディングセグメントＡおよびＢのみが、これまでにエクソンとして定義されており、配列決定され、マッピングされている。同定された隣接コーディング配列の要約は図３１に示す。エクソンはその発見の順に（アルファベット順にて）リストする。イントロン／エクソン境界より、エクソンＢは、コーディングセグメントＥおよびコーディングセグメントＡを結合するｃＤＮＡ中に包含され得ることが明らかである。すなわち、エクソンＢは、リーディングフレームを損なうことなくスプライシングできない。従って、本発明者らは、３つの別のスプライシングパターンが推定ウシＧＧＦ−II ｃＤＮＡ配列１、２および３を生じ得ることを示す。各々ＧＧＦ２ＢＰＰ１.ＣＤＳ、ＧＧＦ２ＢＰＰ２.ＣＤＳおよびＧＧＦ２ＢＰＰ３.ＣＤＳと命名されたこれらのコーディング配列を、各々、図２７Ａ（配列番号１２９）、２７Ｂ（配列番号１３０）、および２７Ｃ（配列番号１３１）に示す。３つのｃＤＮＡの推定されるアミノ酸配列も図２７Ａ（配列番号１２９）、２７Ｂ(配列番号１３０）、および２７Ｃ（配列番号１３１）に示す。
【０１３４】
３つの推定構造は長さ２０６、２８１および２５７アミノ酸のタンパク質をコードする。推定タンパク質配列の第１の１８３残基はすべての３つの遺伝子産物で同一である。１８４位において、クローンはかなり異なる。また、ＧＧＦ２ＢＰＰ１におけるグリシンについてのコドンＧＧＴは、ＧＧＦ２ＢＰＰ２およびＧＧＦ２ＢＰＰ３のためのスプライスドナーとして働き、これは別々に、各々、エクソンＣ、Ｃ／Ｄ、Ｃ／Ｄ’およびＤまたはＣ、Ｃ／ＤおよびＤに付加され、図３２（配列番号１４５）に示す。ＧＧＦIIＢＰＰ１は、コーディングセグメントＡスプライス連結部を次の介在配列（イントロン）まで読み過ごすことによって生じる切形（truncated）遺伝子産物である。これは、図３０（配列番号１３６）におけるコーディングセグメントＡ’を表す。転写体はカノニカルＡＡＴＡＡＡポリアデニル化配列に隣接して終わり、本発明者らは、この切形遺伝子産物がボナ・ファイド（bona fide）成熟転写体を表すことを示す。他の２つのより長い遺伝子産物は同一の３’非翻訳配列およびポリアデニル化部位を共に有する。
【０１３５】
すべての３つのこれらの分子は、９つの新規なＧＦＦ−IIペプチド配列（図１１参照）のうちの６つを含有し、他のペプチドはＧＧＦ−Ｉ−１８（図２６参照）に対し高度に相同である。この知見は、この組換え分子がウシＧＧＦ−IIの少なくとも一部をコードする高い確率を与える。さらに、３つのペプチドについての計算された等電点はＧＧＦ−ＩおよびIIの物理的特性に合致する。ＧＧＦ−IIの分子サイズは大まか６０ｋＤであるので、３つのＤＮＡのうち最大のものは、予測されるアミノ酸数のほとんど半分を持つタンパク質をコードする。
【０１３６】
ＢおよびＡエクソンを含むプローブをＰＣＲ増幅を介して標識し、ウシ下垂体後葉から単離されたＲＮＡから作製されたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに用いた。１のクローン（ＧＧＦ２ＢＢＰ５）は図２９に示したパターンを示し、コーディングセグメントＡおよびＣの間にさらなるＤＮＡコーディングセグメント（Ｇ）を含有する。全核酸配列を図３１に示す（配列番号１４４）。最長オープンリーディングフレームからの予測される翻訳産物は２４１アミノ酸である。また、前記したプローブを用い、ウシ下垂体後葉ライブラリーから第２ｃＤＮＡの一部（ＧＧＦ２ＢＰＰ４）を単離した。このクローンは、図２９に示すパターンを示した。このクローンは５’末端が不完全であるが、コーディングセグメントＧおよびＤを欠くという意味でスプライシング変異体である。また、ＢＰＰ４は領域Ｃ／Ｄを超えて領域Ｈ、ＫおよびＬを持つ新規な３’末端を示す。ＢＰＰ４の配列は図３３に示す（配列番号１４６）。
【０１３７】
実施例１１
種々の種におけるＧＧＦ配列
ＧＧＦタンパク質はタンパク質の新しいスーパーファミリーのメンバーである。他のホ乳動物ＤＮＡに関しての高ストリンジェンシイ・クロスハイブリダイゼーション実験（ＤＮＡブロッティング実験）において、本発明者らは、このウシ組換え分子からのＤＮＡプローブはテストした種々の試料において特異的配列を容易に検出できることを明らかに示した。また、高度に相同性の配列がヒトゲノムＤＮＡで検出される。オートラジオグラフィーは図２８に示す。ラットおよびヒトＤＮＡを含有するレーンにおけるシグナルは、ＧＧＦ遺伝子のラットおよびヒト同等物を表し、この遺伝子によってコードされるいくつかのｃＤＮＡの配列は最近Holems et al.（Science 256: 1205 (1992)）およびWen et al.（Cell 69:559 (1992)）によって報告されている。
【０１３８】
実施例１２
ヒトＧＧＦ２をコードするヒト配列の単離
脳幹から調製したヒトｃＤＮＡライブラリー（ストラタジーンカタログ番号９３５２０６）をスクリーニングすることによって、ウシＧＧＦIIコーディングセグメントＥからの配列を含有するいくつかのヒト・クローンを単離した。この戦略は、ＧＧＦ２ペプチド（ＧＧＦ２に対してユニーク）のほとんどおよびウシＥセグメントを含有するクローンからの予測されるペプチド配列の間の強力なリンクに基づいて追求されたものであった。このライブラリーは、以下にリストするオリゴヌクレオチド９１４〜９１９を用いて、実施例８、セクションIIに記載されたごとくにスクリーニングした。
【０１３９】
［外１］
2007332153.tif 000006
【０１４０】
これらのプローブで検出されたクローンをハイブリダイゼーションによってさらに分析した。また、セグメントＡからのポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）産物を標識することによって産生された、コーディングセグメントＡ（図３０参照）に由来するプローブを用いて初代ライブラリーをスクリーニングした。ＡおよびＥ由来プローブの双方にハイブリダイズするいくつかのクローンを選択し、特定クローンＧＧＦ２ＨＢＳ５をさらなる分析のために選択した。このクローンはコーディングセグメントのパターン（図３０に示すごとくＥＢＡＣＣ／Ｄ’Ｄ）によって表される。このクローンにおけるＥセグメントは図３０で示したＥの切形ウシバージョンのヒト同等物である。ＧＧＦ２ＨＢＳ５が、記載したすべての「推定」ＧＧＦ−II候補のうちＧＧＦ−IIをコードする最もそうであろう候補である。コーディング配列セグメントＥの長さは７８６ヌクレオチドプラス非翻訳配列の２６４塩基対である。ＧＧＦ２ＨＢＳ５によってコードされたタンパク質の予測されるサイズはほぼ４２３アミノ酸（ほぼ４５キロダルトン、図４４参照、配列番号：２１）であり、これは、ＧＧＦ−IIからの脱グリコシル化された形態のサイズと同様である（実施例２０参照）。加えて、図２６にリストしたＧＧＦ−IIペプチドの７つは、領域Ｅから予測されるタンパク質配列の範囲内にある同等配列を有する。ペプチドII−６およびII−１２は例外であり、各々、コーディングセグメントＢおよびコーディングセグメントＡの範囲内である。ＧＧＦ２ＨＢＳ５タンパク質をコードするＲＮＡは、ＧＧＦ２ＨＢＳ５インサートを含有するベクター（Bluescript SK [Stratagene Inc.] 図４７参照）に存在するバクテリオファージＴ７プロモーターによって駆動されるin vitro転写系で産生された。このＲＮＡは無細胞（ウサギ網状赤血球）転写系で転写され、タンパク質産物のサイズは４５ｋｄであった。加えて、無細胞タンパク質をシュワン細胞分裂促進アッセイで検定して、生物学的活性を確認した。ならし培地で処理したシュワン細胞は、125Ｉ−ウリジンの取込みで測定して増加した増殖、および１８５キロダルトン範囲におけるタンパク質のチロシン上のリン酸化の双方を示した。
【０１４１】
かくして、ＧＧＦ２ＨＢＳ５によってコードされる産物のサイズおよび図１１に示したウシペプチドに対して高度に相同性のヒトペプチドをコードするＤＮＡ配列の存在により、ＧＧＦ２ＨＢＳ５がウシＧＧＦ２のヒト同等物をコードすることが確認された。このクローンで形質転換された細胞から調製したならし培地はシュワン細胞分裂促進活性を誘導するという事実により、（ＢＰＰ５遺伝子産物とは異なり）ＧＧＦIIＨＢＳ５遺伝子産物が分泌されることが確認された。加えて、ＧＧＦＢIIＢＰＰ５遺伝子産物は、ｐ１８５erbB2のごとき受容体チロシンキナーゼまたは密接に関連する受容体を介するシュワン細胞増殖応答を媒介するらしい(実施例１９参照)。
【０１４２】
実施例１３
ホ乳動物および昆虫細胞におけるヒト組換えＧＧＦ２の発現
（実施例１２に記載し、またＨＢＳ５として言及した）ヒトＧＧＦ２をコードするＧＧＦ２ＨＢＳ５ ｃＤＮＡクローンをベクター ｐｃＤＬ−ＳＲα２９６にクローン化し、ＣＯＳ−７細胞をＤＥＡＥ−デキストラン法によって１００ｍｍディッシュにトランスフェクトした。細胞溶解物および一時的に発現するＣＯＳ細胞からのならし培地をトランスフェクション後３および４日に収穫した。溶解物を調製するには、細胞単層をＰＢＳで洗浄し、３回の凍結／解凍のサイクルによって溶解したディッシュから０.２５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８の１５０μｍ中に掻き取った。細胞夾雑物をペレット化し、上清を回収した。ならし培地試料（７ｍｌｓ．）を収集し、次いで、濃縮し、製造業者（Amicon, Beverly, MA)によって記載されているごとくセントリプレップ（Centriprep）-10およびセントリコン（Centricon）-10ユニットを用い、緩衝液を１０ｍＭトリス、ｐＨ７.４と取り替えた。ラット神経シュワン細胞を、前記したごとくに、ＤＮＡ合成前駆体の取込みについてアッセイした。ならし培地および細胞溶解物試料をMarchionni et al., Nature 362:313 (1993）に記載されているごとくシュワン細胞増殖アッセイでテストした。ＧＧＦ２をコードするｃＤＮＡであるＧＧＦ２ＨＢＳ５は、タンパク質産物の分泌を培地に向けた。細胞溶解物を用いるアッセイによって測定して、最小活性が細胞内部で検出可能であった。ＧＧＦ２ＨＦＢ１およびＧＧＦＢＰＰ５ ｃＤＮＡは、産物の分泌を細胞外培地に向けなかった。これらのクローンからのＧＧＦ活性は細胞溶解物でのみ検出可能できた。
【０１４３】
また、組換えＧＧＦ２をＣＨＯ細胞で発現させた。ＧＧＦ２をコードするＧＧＦ２ＨＢＳ５ ｃＤＮＡをベクターｐｃｄｈｆｒｐｏｌｙＡのＥｃｏＲＩ部位にクローン化し、リン酸カルシウム共沈法によって、ＤＨＦＲ陰性ＣＨＯ細胞系（ＧＧ４４）にトランスフェクトした。９６−ウェルプレートにおいてヌクレオチドおよびヌクレオシドのないα培地（Gibco）でクローンを選択した。３週間後、個々のクローンからのならし培地試料を、Marchionni et al., Nature 362:313 (1993)に記載されているごとくシュワン細胞増殖アッセイによってＧＧＦの発現についてスクリーニングした。有意なレベルのＧＧＦ活性を培地に分泌した安定クローンを同定した。ＣＨＯ細胞ならし培地の異なる容量アリコートからのシュワン細胞増殖活性を用いて、図４６に示す用量応答曲線を得た（GrahamおよびVan Der Eb, Virology 52:456、1973)。この物質を、ＧＧＦ２特異的ペプチドに対して生起されたポリクローナル抗血清でプローブしたウェスタンブロットで分析した。ほぼ６５Ｋｄ（下垂体から抽出したＧＦＧ２の予測サイズ）のバンドが特異的に標識された（図４８、レーン１２）。
【０１４４】
また、バクロウイルス発現を用いて、組換えＧＧＦ２をインサート細胞中で発現させた。３〜５の多重度（１０6細胞／ｍｌ）にて、Ｓｆ９インサート細胞を、ＧＧＦ２ＨＢＳ５ ｃＤＮＡクローンを含有するバクロウイルスで感染させ、Ｓｆ９００−ＩＩ培地で培養した。シュワン細胞分裂促進活性が細胞外培地に分泌された。フォルスコリンの不存在下、異なる容量の昆虫細胞ならし培地をシュワン細胞増殖アッセイでテストして、用量応答曲線を得た。
【０１４５】
また、この物質を、前記したＧＧＦＩＩ特異的抗体でプローブしたウェスタンブロット（図４５Ｂ）で分析した。
【０１４６】
本実施例で用いた方法は以下の通りである。
【０１４７】
組換えヒトおよびウシ・グリア成長因子のシュワン細胞分裂促進活性は以下のように測定した：一時的ホ乳動物発現実験から得られた粗組換えＧＧＦ調製を用い、培養したシュワン細胞の分裂促進応答を５μＭフォルスコリンの存在下で測定した。［125Ｉ］−Ｕｒｄの取込みは、「方法（Methods）」に記載したごとくトランスフェクトしたまたはモックトランスフェクトしたＣＯＳ細胞から得られた物質に１８〜２４時間暴露した後に測定した。４セットの平均値および標準偏差のデータを示す。部分的に精製された天然ウシ下垂体ＧＧＦ（カルボキシメチルセルロース画分；Goodearl et al., 提出）に対する分裂促進応答は、１００パーセント活性の標準として示す（ＧＧＦ）。
【０１４８】
ｃＤＮＡ（図４６、配列番号１６６〜１６８）をｐｃＤＬ−ＳＲα２９６（Takebe et al., Mol. Cell Biol. 8:466-472 (1988)）にクローン化し、ＣＯＳ−７細胞をＤＥＡＥ−デキストラン法（Sambrook et al., In Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 第2版（Cold Spring Harbor Laboratoey Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)）によって１００ｍｍディッシュにトランスフェクトした。トランスフェクション後３または４日に、細胞溶解物またはならし培地を収穫した。溶解物を調製するには、細胞単層をＰＢＳで洗浄し、ディッシュから掻き取り、０.２５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８の１５０μｌ中、３回の凍結／解凍サイクルによって溶解させた。細胞夾雑物をペレット化し、上清を回収した。ならし培地試料（７ｍｌｓ）を収集し、次いで、濃縮し、製造業者（Amicon, Beverly, MA)によって記載されているごとくセントリプレップ-10およびセントリコン-10ユニットを用い、緩衝液を１０ｍＭトリス、ｐＨ７.４と取り替えた。ラット坐骨神経シュワン細胞を、記載されているごとく（Davis and Stroobant, J. Cell Biol. 110:1353-1360 (1990)); Brockes et al., Brain Res. 165:105-118 (1979))、ＤＮＡ合成前駆体の取込みについてアッセイした。
【０１４９】
組換えＣＨＯ細胞ならし培地のウェスタンブロットは以下のごとくに行った：組換えＣＨＯクローンをＭＣＤＢ３０２無タンパク質中で３日間培養した。ならし培地２ｍｌを収穫し、濃縮し、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.４に関して緩衝液を交換し、凍結乾燥した。ペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液に再懸濁し、還元性ＳＤＳゲル電気泳動に付し、ＧＧＦペプチド抗体でのウェスタンブロッティングによって分析した。ＣＨＯ対照は、未トランスフェクトＣＨＯ−ＤＧ４４宿主からのならし培地を用いてなし、ＣＨＯ  ＨＢＳ５レベルは、組換えクローンからのならし培地を用いてアッセイした。
【０１５０】
実施例１４
ＧＧＦの機能的エレメントの同定
ＧＧＦ配列のファミリーの推定構造は、（ＧＧＦ２ＢＰＰ４によって表される）最長形態が、細胞外部分が上皮成長因子に似たドメインを含有する膜貫通タンパク質をコードすることを示す（CarpenterおよびWahl, in Peptide Growth FactorsおよびTheir Receptors I, pp. 69-133, Springer-Verlag, NY 1991参照）。コーディングセグメントＣおよびＣ／ＤまたはＣ／Ｄ’ペプチド配列に存在するシステインの位置は上皮成長因子（ＥＧＦ）ペプチド配列中の相同残基に関して保存されている（図３２、配列番号１４７〜１４９参照）。これは、細胞外ドメインが受容体認識部位および生物学的活性化部位として働くことを示す。変異体形態のうちいくつかはＨ、Ｋ、およびＬコーディングセグメントを欠き、かくして、分泌される拡散可能な生物学的活性タンパク質として発現され得る。ＥＧＦ−様ドメイン（ＥＧＦＬ）を含むポリペプチドをコードするＧＧＦ ＤＮＡ配列は、グリア細胞分裂促進活性を刺激する十分な生物学的活性を有し得る。
【０１５１】
このタンパク質の膜結合バージョンは、胚形成の間にまたは神経再生の間にニューロンの表面で発現されれば（ここに、ニューロンの表面は増殖するシュワン細胞の表面に親和性である）、シュワン細胞の増殖を誘導し得る。
【０１５２】
分泌された（非膜結合）ＧＧＦは分泌地点からいくらかの距離にてシュワン細胞と相互反応できる古典的に拡散可能な因子として働き得る。他の形態は、組織の損傷および細胞の破壊を介して源により細胞内から放出され得る。分泌されるＧＧＦの例はＧＧＦ２ＨＢＳ５によってコードされるタンパク質であり；これは、細胞の外部に向けられることが判明している唯一の公知ＧＧＦである。分泌は、恐らくは、ＧＧＦ２ＨＢＳ５によってコードされた組換えＧＧＦ２内に含有されるＮ−末端ドメインである、領域Ｅにのみ見出されるＮ−末端疎水性配列を介して媒介される。
【０１５３】
他のＧＧＦ類はスクリーニングされないようである。これらＧＧＦ類は、筋肉の損傷の結果として放出される損傷性反応体（injury response forms）でありうる。
【０１５４】
（ＧＧＦ２ＨＢＳ５によってコードされる）ＧＧＦ２の予測されるタンパク質構造ならびに領域ＢおよびＡを含有する他のタンパク質の他の領域はヒト基底膜硫酸ヘパリンプロテオグリカンコアタンパク質に対する類似性を示す。これらのＧＧＦ中に畳み込まれたＣ２免疫グロブリンの第２システインの隣に位置するペプチドＡＤＳＧＥＹは、その基底膜ラミナタンパク質で見い出される２２のＣ−２リピートのうち９つで生じる。この証拠は、これらのタンパク質は、ニューロンおよびグリアに関連するもののごときマトリックスタンパク質と関連し得ることを強く示し、標的部位におけるグリア成長因子の隔離方法を示唆し得る。
【０１５５】
実施例１５
組換え細胞からのＧＧＦの精製
生物学的活性をアッセイするためにＧＧＦの全長または部分を得るには、クローン化ＤＮＡを用いてタンパク質を過剰生産させることができる。いくつかのアプローチを用いることができる。前記配列を含有する組換え大腸菌を構築することができる。ｐＮＨ８ａまたはｐＨＨ１６ａ（Stratagene, Inc.)のごとき発現系を以下の製造方法によってこの目的で用いることができる。別法として、これらの配列をホ乳動物発現ベクターに挿入し、過剰生産細胞系を構築することができる。例として、この目的では、ＧＧＦをコードするＤＮＡ、クローンＧＧＦ２ＢＰＰ５がＣＯＳ細胞で発現されており、ｐＭＳＸＮＤ発現ベクター（Lee and Nathans, J. Biol. Chem. 263, 3521-3527, (1981)）を用いチャイニーズハムスター卵巣細胞で発現させることができる。ＧＧＦ ＤＮＡ配列を含有するこのベクターは確立された手法を用いて宿主細胞にトランスフェクトすることができる。
【０１５６】
一時的発現を調べることができるか、あるいはメトトレキセートの存在下でＧ４１８−耐性クローンを増殖させて、（ｐＭＳＸＮＤベクターに含有される）ｄｈｆｒ遺伝子を増幅させ、該過程において、隣接するＧＧＦタンパク質コーディング配列を同時増幅させる細胞について選択することができる。ＣＨＯ細胞は全くタンパク質の無い培地（Hamilton and Ham, In Vitro 13, 537-547 (1977)）で維持することができるので、所望のタンパク質は培地から精製することができる。実施例１７で産生された抗血清を用いるウェスタン分析を用いて、過剰生産細胞のならし培地中で所望のタンパク質の存在を検出することができる。
【０１５７】
所望のタンパク質（ｒＧＧＦ２）は、以下のごとくＣＯＳ細胞を一時的に発現させることによってならし培地から精製することができる。ｒＧＧＦＩＩをならし培地から収穫し、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＰＯＲＯＳ−ＨＳ）を用いて部分的に精製した。カラムは３３.３ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６.０で平衡化した。ならし培地は１０ｍｌ／分の流速で負荷した。シユワン細胞増殖活性および（前記したＧＧＦペプチドに対するポリクローナル抗血清を用いる）免疫反応性を含有するピークを５０ｍＭトリス、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８.０で溶出させた。
【０１５８】
また、安定したチャィニーズハムスター卵巣細胞系を用いてｒｈＧＧＦ２を発現させる。ならし培地から収穫したｒＧＧＦ２を、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＰＯＲＯＳ−ＨＳ）を用いて部分的に精製した。カラムはＰＢＳ、ｐＨ７.４で平衡化させた。ならし培地は１０ｍｌ／分で負荷した。シュワン細胞増殖活性および（ＧＧＦ２ポリクローナル抗血清を用いる）免疫反応性を含有するピークを５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８.０で溶出させた。増殖ならびに免疫反応性双方に関し、さらなるピークが５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８.０で観察された（図４５）。
【０１５９】
ｒｈＧＧＦ２は、高分解工程としての疎水性相互作用クロマトグラフィー；陽イオン交換／逆相クロマトグラフィー（第２の高分解工程として必要であれば）；ウイルス不活化工程および陰イオン交換クロマトグラフィーのごときＤＮＡ除去工程を用いてさらに精製することができる。
【０１６０】
陽イオン交換カラムから溶出させた組換えＧＧＦ２ピークのシュワン細胞増殖活性は以下のように測定した：培養したシュワン細胞の分裂促進応答を、５０ｍＭトリス  １Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８.０によって溶出させたピークを用い、５Ｍフォルスコリンの存在下で測定した。ピークは２０ １、１０ １（１：１０）および（１：１００）１０ １で添加した。125Ｉ−ウリジンの取込みを測定し、１８〜２４時間の暴露の後に（ＣＰＭ）として測定し、表した。
【０１６１】
ＧＧＦ２のペプチドに対して生起したポリクローナル抗体を用いるイムノブロットは以下のごとくに行った：１０ １の異なる画分を４〜１２％のグラジエントゲルで泳動させた。該ゲルをニトロセルロースペーパーに移し、ニトロセルロースブロットを５％ＢＳＡでブロックし、ＧＧＦ２−特異的抗体（１：２５０希釈）でプローブした。125ＩプロテインＡ（１：５００希釈、比活性＝９.０／Ｃｉ／ｇ）を第２抗体として用いた。イムノブロットをコダック社製Ｘ−線フィルムに６時間暴露した。１Ｍ ＮａＣｌで溶出させたピーク画分は６９Ｋで免疫反応性バンドを示した。
【０１６２】
陽イオン交換カラムでのＧＧＦ２精製は以下のごとくに行った：ｒＧＧＦＩＩを発現するＣＨＯ細胞ならし培地を１０ｍｌ／分で陽イオン交換カラムに負荷した。該カラムをＰＢＳ、ｐＨ７.４で平衡化した。溶出は各々５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，  ５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８.０および５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，１Ｍ ＮＡＣｌ、ｐＨ８.０で達成した。前記したシュワン細胞増殖アッセイ（ＣＰＭ）を用いてすべての画分を分析した。タンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）は、標準としてＢＳＡを用いるブラッドフォード（Bradford）アッセイによって測定した。
【０１６３】
各画分１０ ｌを用いるウェスタンブロットを行い、免疫反応性およびシュワン細胞活性は共移動するのが観察された。
【０１６４】
ウェスタンブロットアッセイを用い、タンパク質を手法の種々の時点でアッセイすることができる。別法として、前記したシュワン細胞分裂促進アッセイを用いて、全長クローンまたはそのいずれかの生物学的活性タンパク質の発現産物をアッセイすることができる。全長クローンＧＧＦ２ＨＢＳ５はＣＯＳ細胞で一時的に発現される。トランスフェクトされたＣＯＳ細胞の細胞内抽出物は、実施例８に記載したシュワン細胞増殖アッセイ法でアッセイした場合、生物学的活性を示す。加えて、ＧＧＦ２ＢＰＰ５をコードする全長クローンをＣＯＳ細胞で一時的に発現させた。この場合、細胞抽出物およびならし培地は共に、実施例８に記載したシュワン細胞増殖アッセイで生物学的活性を示す。（ヘレグリンを包含する）ＧＧＦ遺伝子に由来するスプライシング変異体相補的ＤＮＡのファミリーのいずれのメンバーもこのようにして発現させることができ、当業者がシュワン細胞増殖アッセイでアッセイすることができる。
【０１６５】
別法として、スプライシング変異体Ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）をＣＯＳ−７細胞で発現させたWen et al.（Cell 69:559 (1992））に従い、他の変異体から組換え物質を単離することができる。ｐＪＴ−２真核生物プラスミドベクターに挿入されたｃＤＮＡクローンはＳＶ４０初期プロモーターの制御下にあり、ＳＶ４０終結およびポリアデニル化シグナルで３’がフランクされている。ＣＯＳ−７細胞を、エレクトロポレーションによって以下のごとくにｐＪＴ−２プラスミドＤＮＡでトランスフェクトした：６×１０6細胞（ＤＭＥＭおよび１０％ＦＥＢＳの０.８ｍｌ中）を０.４ｃｍのキュベットに移し、ＴＥ溶液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.０））、１ｍＭ ＥＤＴＡ）１０μｌ中、プラスミドＤＮＡ２０μｇと混合した。２００ｏｈｍに設定したパルスコントローラーユニットを装備したBio-Rad Gene パルサー装置を用い、１６００Ｖおよび２５μＦにてエレクトロポレーションを室温で行った。次いで、細胞をＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳの２０ｍｌに希釈し、Ｔ７５フラスコ（Falcon)に移した。３７℃におけるインキュベーションの１４時間後、培地をＤＭＥＭ、１％ＦＢＳで置き換え、インキュベーションをさらに４８時間継続した。細胞から収穫した組換えタンパク質を含有するならし培地は、このタンパク質についての受容体を発現する細胞系において生物学的活性を示した。この細胞系（培養したヒト胸カルシノーマ細胞系ＡＵ５６５）を組換え物質で処理した。処理した細胞は、ｅｒｂＢ２受容体の活性化に特徴的な形態学的変化を示した。また、このタイプのならし培地をシュワン細胞増殖アッセイでテストすることもできる。
【０１６６】
実施例１６
Ｎ−末端配列分析
ｈＧＧＦ２をコードするｃＤＮＡを増幅可能なベクーｐｃｄｈｆｒｐｏｌｙＡにクローン化し、安定な発現のためにＣＨＯ−ＤＧ４４細胞にトランスフェクトした。ｒｈＧＧＦ２がならし培地に分泌された。組換えＧＧＦ２の分泌される能力は、恐らくは、Ｎ−末端疎水性ストレッチ（シグナル配列）により媒介される。一旦粗小胞体を横切って成長するタンパク質の輸送を開始したならば、シグナル配列は特異的部位において成熟タンパク質から切断される。発現され精製されたｒｈＧＧＦ２のＮ−末端配列分析は後記にて示す切断部位を示す。タンパク質のＮ−末端における最初の５０のアミノ酸残基の配列は、後記するＮ−末端配列分析によって確認された（表５）。
【０１６７】
【表５】
2007332153.tif 000007
【０１６８】
以下の配列（配列番号：１８５）は、ｈＧＧＦ２のアミノ酸配列を表す。影を付けた領域は切断されたシグナル配列を示す。
【０１６９】
［外２］
2007332153.tif 000008
【０１７０】
影を付けた領域は、ｒｈＧＧＦ２のＮ−末端における実験的に決定した１５のアミノ酸残基を表し、Ａ50−Ｇ51結合がシグナル配列の切断部位であることを示す。
【０１７１】
実施例１７
さらなるスプライシング変異体の単離
ここに引用して本明細書の一部とみなす、１９９２年１０月２３日付け出願の米国特許出願０７／９６５,１７３号に記載されている他のニューレグリンを更新する（updating)方法により、スプライシング変異の結果として生じる４つの密接に関連する配列（ヘレグリンα、β１、β２、β３）が産生されている。Peles et al.(Cell 69:205 (1992)）、およびWen et al. (Cell 69:559 (1992)）は、ｐ１８５erbB2に結合するタンパク質に関与する実施例１〜９および１１に記載されたものと同様の精製およびクローニングアプローチを用いてもう１つのスプライシング変異体を（ラットから）単離している。ｃＤＮＡクローンは、（形質転換ラット線維芽細胞系からｐ１８５erbB2結合タンパク質を精製し配列決定することにより）以下のようにして得られた。ｐ１８５erbB2結合タンパク質はならし培地から以下のごとくに精製された。５００ローラーボトル（合計１２０リットル）の３つの収穫物からのプールされたならし培地を０.２μフィルターを通す濾過によって清澄化し、２０ｋｄ分子量カットオフの膜を用い、ペリコン（Pelicon）限外濾過系にて３１倍濃縮した。すべての精製工程は、ファルマシア社製のファストタンパク質液体クロマトグラフィーシステムを用いることによって行った。濃縮した物質をヘパリン−セファロースのカラム（１５０ｍｌ、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で予め平衡化）に直接負荷した。２８０ｎｍ波長での吸光度が検出されなくなるまで、０.２Ｍ  ＮａＣｌを含有するＰＢＳでカラムを洗浄した。次いで、結合タンパク質をＮａＣｌの連続的グラジエント（０.２Ｍから１.０Ｍ）（２５０ｍｌ）で溶出し、５ｍｌずつの画分を収集した。試料（収集した画分からの０.０１ｍｌ）をキナーゼ刺激活性の定量アッセイで用いた。３回カラムを流して（合計容量＝３６０ｍｌ）活性画分をプールし、ＹＭ１０限外濾過膜（Amicon, Danvers, MA）を用いることによって濃縮し、硫酸アンモニウムを濃度１.７Ｍに到達するまで添加した。遠心（１０,０００×ｇ、１５分）によって清澄化した後、プールした物質をフェニル−セファロースカラム（ＨＲ１０／１０、ファルマシア社製）に負荷した。該カラムを０.１Ｍ Ｎａ2ＰＯ4（ｐＨ７.４）中の（ＮＨ4）2ＳＯ4のグラジエント（１.７Ｍないし無塩）４５ｍｌで展開し、２ｍｌずつの画分を収集し、（実施例１９に記載した）キナーゼ刺激につきアッセイした（試料当たり０.００２ｍｌ）。活性の主要ピークをプールし、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.３）に対して透析した。モノ−Ｓ陽イオン交換カラム（ＨＲ５／５、ファルマシア社製）を５０ｍＭリン酸ナトリウムで予め平衡化した。活性物質（タンパク質０.８８４ｍｇ；３５ｍｌ）を負荷した後、カラムを出発緩衝液で洗浄し、次いで、ＮａＣｌのグラジエントにて、１ｍｌ／分の液速で展開した。キナーゼ刺激活性物を０.４５〜０.５５Ｍ塩にて回収し、各２ｍｌずつの４つの画分にわたって展開した。これらをプールし、Ｃｕ2+キレート化カラムに直接負荷した（１.６ｍｌ、ＨＲ２／５キレート化セファロース、ファルマシア社製）。タンパク質のほとんどは樹脂に吸着したが、それらは、塩化アンモニウムの３０ｍｌ直線グラジエント（０〜１Ｍ）で徐々に溶出した。活性は０.０５ないし０.２Ｍ ＮＨ4Ｃｌの��囲で、タンパク質の単一ピークにて溶出した。精製の種々の工程からの試料を、ゲル電気泳動、続いてのＩＣＮからのキット（Costa Mesa, CA）を用いる銀染色によって分析し、そのタンパク質含量をバイオ−ラド（Bio-Rad）(Richmond, CA)からのキットを用いるクーマシーブルー染料結合アッセイで測定した。
【０１７２】
ｐ４４タンパク質（１０μｇ）を０.１Ｍ炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐＨ７.８）２００μｌ中で復元した。１：１０の酵素−対−基質の比にて、３７℃で、Ｌ−１−トシル−アミド  ２−フェニルエチルクロロメチルケトン−処理トリプシン（Serva)で１８時間消化を行った。得られたペプチド混合物を逆相ＨＰＬＣによって分離し、ヴィダック（Vydac）C4ミクロカラム（２.１ｍｍ  ｉ．ｄ．×１５ｃｍ、３００Å）およびダイオード−アレイ検出器およびワークステーションを装備したＨＰ １０９０液体クロマトグラフィーシステムを用いて２１５ｎｍでモニターした。カラムを０.１％トリフルオロ酢酸（移動相Ａ）で平衡化し、溶出は７０分間にわたる０％〜５５％移動相Ｂ（０.１％トリフルオロ酢酸中の９０％アセトニトリル）からの直線グラジエントで行った。液速は０.２ｍｌ／分であり、カラム温度は２５℃で制御した。ＨＰＬＣ系から手動で収集したペプチドピークの１／３アリコートを、エドマン分解によるＮ−末端配列分析によって特徴付けた。２７.７分（Ｔ２７.７）後に溶出した画分は混合されたアミノ酸配列を含有し、還元の後に以下のごとくさらに再クロマトグラフィーに付した：ペプチド画分の７０％アリコートを真空中で乾燥し、０.２Ｍ炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐＨ７.８）１００μｌ中で復元した。ＤＴＴ（終濃度２ｍＭ）を溶液に添加し、これを、次いで、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、ヴィダックカラム(２.１ｍｍ  ｉ．ｄ．×１５ｃｍ）を用い、還元したペプチド混合物を逆相ＨＰＬＣによって分離した。溶出条件および液速は前記と同じである。ペプチドのアミノ酸配列分析は、オン−ラインのフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸アナライザーおよびモデル９００データ解析システム（Hunkapiller et al. (1985) Methods of Protein Microcharacterization, J.E. Shively編（Clifton, New Jersey: Humana Press, p. 223-247)）を備えたモデル４７７タンパク質シーケンサー（Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA）で行った。予めポリブレンおよびＮａＣｌでサイクルを行ったトリフルオロ酢酸処理したガラス繊維ディスクにタンパク質を負荷した。ＰＨＴ−アミノ酸分析は、デュアルシリンジポンプおよび逆相（Ｃ−１８）の狭い孔のカラム（Applied Biosystems, ２.１ｍｍ×２５０ｍｍ）を用いてミクロ液体クロマトグラフィーシステム（Model 120)で行った。標準的な手法（Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manial (Cold Spring Harbor, New York (1982)))によってＲＮＡをラット１−ＥＪ細胞から単離し、ｍＲＮＡセパレータキット（Clontech Lab, Inc., Palo Alto, CA)を用いてポリ（Ａ）+を選択した。(ＢＲＬ Life Technologies, Inc., Bethesda, MDからの)スーパースクリプト（Superscript）キットでｃＤＮＡを合成した。カラム分画した二本鎖ｃＤＮＡをＳａｌ１−およびＮｏｔ１−消化のｐＪＴ−２プラスミドベクター、すなわちｐＣＤ−Ｘベクター（Okayama およびBerg, Mol. Cell Biol. 3:280 (1983））の誘導体に連結し、エレクトロポレーション(Dower et al., Nucl. Acids. Res., 16:6127 (1988))によってＤＨ１０Ｂ大腸菌細胞に形質転換した。ＮＤＦのＮ−末端のタンパク質配列（残基５〜２４）およびＴ４０.０トリプテック（tryptic）ペプチド（残基７〜１２）に由来する２つのオリゴヌクレオチドプローブで、ほぼ５×１０5初代形質転換体をスクリーニング��た。その各配列は以下の通りである（Ｎはすべての４つのｎｔを示す）：
【０１７３】
［外３］
2007332153.tif 000009
【０１７４】
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼと共に［γ−32Ｐ］ＡＴＰで、合成オリゴヌクレオチドを末端標識し、ニトロセルロースフィルターの複製セットをスクリーニングするのに用いた。ハイブリダイゼーション溶液は、６×ＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６.８）、０.１％ピロリン酸ナトリウム、２×デンハート溶液、５０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、および２０％ホルムアミド（プローブ１につき）またはホルムアミド無し（プローブ２につき）を含有するものであった。５０℃で、０.５×ＳＳＣ、０.２％ＳＤＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ（プローブ１につき）でフィルターを洗浄するか、あるいは３７℃で、２×ＳＳＣ、０.２％ＳＤＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ（プローブ２につき）でフィルターを洗浄した。フィルターのオートラジオグラフィーは両プローブにハイブリダイズする１０のクローンを与えた。これらのクローンを、前記したごとき再平板培養およびプローブハイブリダイゼーションによって精製した。製造業者の指示に従い、アプライド・バイオシステムズ（Appied Biosystems）３７３Ａ自動ＤＮＡシーケンサーおよびアプライド・バイオシステムズ・タック・ダイデオキシ（Taq DyeDeoxy）（商品名）ターミネーターサイクル配列決定キットを用いて、ｃＤＮＡクローンを配列決定した。いくつかの場合、製造業者の指示に従い、米国バイオケミカルズ社（Biochemicals）からの［35Ｓ］ｄＡＴＰ（Amersham)およびセクエナーゼ（Sequenase）（商品名）キットを用いて配列を得た。ｃＤＮＡクローン４４の両鎖は、プライマーとして合成オリゴヌクレオチドを用いることによって配列決定した。最も５’の３５０ｎｔの配列は、７つの独立したｃＤＮＡクローンで決定された。得られたクローンは、図２７（ＮＤＦ）に示したパターンを示した。
【０１７５】
実施例１９
ｐ１８５erbB2受容体に結合する他のタンパク質の精製およびアッセイ
Ｉ．ｇｐ３０およびｐ７０の精製
Lupe et al. (Science 249, 1552 (1990))およびここに引用して本明細書の一部とみなすLippmanおよびLupe（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０３４４３(１９９０)）は、ヒト胸癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１のならし培地からタンパク質を精製している。
【０１７６】
Lupe et al.（Proc. Natl. Acad. Sci. 89, 2287 (1992)）は、ｐ１８５erbB2受容体に結合するもう１つのタンパク質を精製している。この特定のタンパク質ｐ７５は、１０％子ウシ血清（GIBCO)を補足した改良イーグル培地（ＩＭＥＭ：GIBCO)中で増殖したＳＫＢｒ−３（ヒト胸癌細胞系）の増殖で用いたならし培地から精製された。
【０１７７】
II．他のｐ１８５erbB2リガンド
また、Pelesら(Cell 69，205(1992))は、ラット細胞から１８５erbB2刺激リガンドを精製している。Holmesら(Science 256, 1205 (1992))は、ｐ１８５erbB2に結合しそれを刺激するヒト細胞からヘレグリンαを精製している。Tarakovsky et al., Oncogene 6:218 (1991)は、活性化マクロファージから単離された２５ｋＤのポリペプチドのＮｅｕ受容体への結合、ｐ１８５erbB2相同性を示しており、ここに引用して本明細書の一部とみなす。
【０１７８】
III．ＮＤＦ単離
YardenおよびPeles (Biochemistry 30, 3543 (1991))は１８５erbB2受容体を刺激する３５キロダルトンの糖タンパク質を同定している。
【０１７９】
他の文献において、Davisら(Biochem. Biophys. Res. Commun. 179, 1536 (1991))，Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 8582 (1991)) およびGreeneら(国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０２３３１（１９９０)）は、ヒトＴ−細胞（ＡＴＬ−２）細胞系のならし培地からのタンパク質の精製を記載している。
【０１８０】
ここに引用して本明細書の一部とみなす、Huangら(1992, J. Biol. Chem. 257:11508-11512)は、ウシ腎臓からさらなるneu／erb B2リガンド成長因子を単離している。２５ｋＤポリペプチド因子は、カラム分画、続いてのＤＥＡＥ／セルロース（ＤＥ５２）、スルファデックス（Sulfadex）(硫酸化セファデックスG-50)、ヘパリン-セファロース4B、およびスーパーデックス(Superdex) 75（ファストタンパク質液体クロマトグラフィー)の連続的カラムクロマトグラフィーによって単離された。因子ＮＥＬ−ＧＦはneu/erb B2遺伝子産物のチロシン特異的自己リン酸化を刺激する。
【０１８１】
IV．アセチルコリン受容体誘導活性（ＡＲＩＡ）の精製
ＡＲＩＡ、アセチルコリン受容体合成を刺激する４２ｋＤタンパク質は、ジェラルド・フィッシュバッハ（Gerald Fischbach）（Falls et al., (1993) Cell 72:801-815)の研究所で単離されている。ＡＲＩＡは１８５erbB2に類似する１８５Ｋｄａ筋肉膜貫通タンパク質のチロシンリン酸化を誘導し、培養した胚性筋管でアセチルコリン受容体合成を刺激する。ＡＲＩＡはまずはＧＧＦ／ｅｒｂＢ２リガンド群タンパク質のメンバーであるらしく、これは、グリア細胞分裂促進刺激および本明細書に記載した例えばＧＧＦ２の適用で潜在的に有用である。
【０１８２】
実施例１９
ＧＧＦによって媒介されるタンパク質チロシンリン酸化
増殖を誘導する十分なレベルのグリア成長因子での処理に続き、ラット・シュワン細胞は、タンパク質チロシンリン酸化の刺激を示す。実施例９に概略を示した手法に従い、種々の量の部分的に精製したＧＧＦをラット・シュワン細胞の初代培養に適用した。シュワン細胞は、ポリＤ−リシン被覆した２４ウェルプレート中、ＤＭＥＭ／１０％子ウシ血清／５μＭフォルスコリン／ＧＧＦ−ＣＭ１ｍＬ当たり０.５μｇ（ウェル当たり０.５ｍＬ）で増殖させた。密集したら、ＤＭＥＭ／ウェル当たり０.５ｍＬの１０％子ウシ血清を細胞に与え、休止するまでインキュベーター中に一晩放置した。翌日、細胞にＤＭＥＭ／１０％子ウシ血清の０.２ｍＬを与え、インキュベーター中に１時間放置した。次いで、テスト試料を、要求される異なる濃度および異なる時間にて直接培地に添加した。次いで、細胞を、沸騰する溶解緩衝液（リン酸ナトリウム、５ｍＭ、ｐＨ６.８；ＳＤＳ，２％，β−メルカプトエタノール，５％；ジチオスレイトール，０.１Ｍ；グリセロール，１０％；ブロモフェノールブルー，０.４％；バナジン酸ナトリウム，１０ｍＭ）中で溶解し、沸騰する水浴中で１０分間インキュベートし、次いで、直接分析するか、あるいは−７０℃で凍結した。７.５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動させ、次いで、Towbin et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350-4354によって記載されている標準的な手法を用いてニトロセルロースに電気ブロッティングすることによって、試料を分析した。ブロットしたニトロセルロースを、KampsおよびSelton (1988) Oncogene 2:305-315に記載されている標準的な方法を用いて抗ホスホチロシン抗体でプローブした。プローブしたブロットをオートラジオグラフィーフィルムに一晩暴露し、標準的な実験方法を用いて展開した。デンシトメトリー測定は、ウルトラスキャン（Ultrascan）ＸＬ増強レーザーデンシトメーター（ＬＫＢ）を用いて行った。分子量の測定は、予め染色した高分子量のスタンダード（Sigma)に対して行った。タンパク質リン酸化およびシュワン細胞増殖の用量応答は非常に似ている（図３３）。リン酸化バンドの分子量はｐ１８５erbB2の分子量に非常に近い。ＧＧＦ２ＨＢＳ５クローンでＣＯＳ細胞翻訳体から調製したならし培地でシュワン細胞を処理した場合、同様の結果が得られた。これらの結果は、ＧＧＦと、１８５erbB2の活性化との予測される相互作用とよく相関する。
【０１８３】
この実験を組換えＧＧＦ２で反復した。ＧＧＦ２クローン（ＧＧＦ２ＨＢＳ５）で安定に形質転換したＣＨＯ細胞系に由来するならし培地は、前記したアッセイを用いると、タンパク質チロシンリン酸化を刺激する。モックトランスフェクトしたＣＨＯ細胞はこの活性を刺激しない。
【０１８４】
実施例２０
ＧＧＦのＮ−グリコシル化
ＧＧＦ−II候補クローンＧＧＦ２ＢＰＰ１、２および３のｃＤＮＡ配列から予測されるタンパク質配列は、多数のコンセンサスＮ−グリコシル化モチーフを含有する。ＧＧＦＩＩ０２ペプチド配列におけるギャップは、これらのモチーフのうちの１つにおけるアスパラギン残基に合致し、これは、炭水化物は恐らくはこの部位にて結合していることを示す。
【０１８５】
ＧＧＦのＮ−グリコシル化は、Ｎ−グルカナーゼ、すなわち、炭水化物とタンパク質におけるアスパラギン残基との間の共有結合を切断する酵素と共にインキュベーションした後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける移動度変化を観察することによって調べた。
【０１８６】
ＧＧＦ−IIのＮ−グルカナーゼ処理により、ＭＷ４０〜４２ｋＤの主たるバンドおよび４５〜４８ｋＤａの従たるバンドが生じた。
【０１８７】
活性  約４５〜５０ｋＤａにおける単一の脱グリコシル化種
また、ＧＧＦ−Ｉでの活性溶出実験は、Ｎ−グルカナーゼで処理した場合に電気泳動移動度の増大を示し、これは、ＭＷ２６〜２８ｋＤａの活性種を与える。用いた試料におけるバックグラウンド染色のためＮ−脱グリコシル化バンドは割り当てできないにも拘わらず、銀染色により、移動度のシフトがあることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】筋芽細胞の分裂促進アッセイにおけるｒｈＧＧＦ２の結果を示すグラフである。
【図２】筋管中の核数に対するｒｈＧＧＦ２の効果を示すグラフである。
【図３】分化された筋管の生存に対するｒｈＧＧＦ２の効果を示す生存アッセイのグラフである。
【図４】ヒト血小板由来成長因子、ヒト線維芽細胞成長因子、ヒト上皮成長因子、ヒト白血球阻害因子、およびヒトインシュリン様成長因子ＩおよびIIと比較した分化された筋管に対するｒｈＧＧＦ２の効果を示す生存アッセイのグラフである。
【図５】ｒｈＧＧＦ２の存在下デュシェーヌ型ジストロフィー細胞の増加した生存を示すグラフである。
【図６】ＡｃｈＲデルタサブユニット転写コントロール要素のコントロール下ｈＧＨ受容体遺伝子からのＣ２細胞におけるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）発現の増加のグラフである。この増加は培地へのＧＧＦ２の添加に結びつく。
【図７】Ｃ２細胞にＧＧＦ２の量を増加して添加したのちのｈＧＨ受容体合成およびＡｃｈＲｓへのバンガロトキシン（bungarotoxin）（ＢＴＸ）の結合の増加のグラフである。
【図８】ＧＧＦ−Ｉ、配列番号１〜２０および１６５に由来するペプチド配列である（以下の実施例１１〜１３参照）。
【図９】パネルＡは変性オリゴヌクレオチドプローブを設計するために用いたＧＧＦ−Ｉペプチドの配列であり、変性ＰＣＲプライマーを示す（配列番号１、１７および２２〜２９）。パネルＡの配列のうちのいくつかは合成ペプチドを設計するためにも用いられた。パネルＢは変性プローブまたは変性ＰＣＲプライマーの設計のためには短すぎた（６アミノ酸より少ない）新規なペプチド（配列番号１７および３２）の表である。
【図１０】ＧＧＦ−II、配列番号４２〜５０および１６５に由来するペプチド配列である（以下の実施例１１〜１３参照）。
【図１１】パネルＡに、変性オリゴヌクレオチドプローブおよび変性ＰＣＲプライマーを設計するために用いられたＧＧＦ−IIペプチドの配列を列挙する（配列番号４２〜４９）。パネルＡの配列のうちのいくつかは合成ペプチドを設計するために用いられた。パネルＢは変性プローブまたは変性ＰＣＲプライマーの設計のためには短すぎた（６アミノ酸より少ない）新規なペプチド（配列番号５０）を示す。
【図１２】実施例８に関連し、本発明の因子の分裂促進活性を示す。
【図１３】図１３Ａ、１３Ｂは実施例８に関連し、本発明の因子の分裂促進活性を示す。
【図１４】実施例８に関連し、本発明の因子の分裂促進活性を示す。
【図１５】実施例８に関連し、本発明の因子の分裂促進活性を示す。
【図１６】実施例８に関連し、本発明の因子の分裂促進活性を示す。
【図１７】実施例８に関連し、本発明の因子の分裂促進活性を示す。
【図１８】実施例８に関連し、本発明の因子の分裂促進活性を示す。
【図１９】実施例８に関連し、本発明の因子の分裂促進活性を示す。
【図２０】実施例１０に関連し、以下に簡単に説明する。  図２０は図７、パネルＡおよび図９、パネルＡの新規なペプチド配列から設計された変性オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号５１〜８４）を列挙する。
【図２１】実施例１０に関連し、以下に簡単に説明する。  図２１（配列番号８５）は組換えウシゲノムファージＧＧＦ２ＢＧ１からの推定される(putative)一続きのウシＧＧＦ−II遺伝子配列を示し、これは変性オリゴヌクレオチドプローブ６０９および６５０（図１８、それぞれ配列番号６６および６９）の結合部位を含む。図は第３リーディングフレーム内のＤＮＡ配列のコーディングストランドおよび推定された(deduced)アミノ酸配列である。因子２からのペプチド１２の配列（ボールド(bold)）は、６６アミノ酸のオープンリーディングフレーム（ヌクレオチド７５２７２）の一部である。
【図２２】実施例１０に関連し、以下に簡単に説明する。  図２２は変性ＰＣＲプライマー（パネルＡ、配列番号８６〜１０４）および下垂体前葉からのＲＮＡ中に存在するウシＧＧＦ−IIをコードする配列のセグメントを単離するための実験において用いられた独自なＰＣＲプライマー（パネルＢ、配列番号１０５〜１１５）を列挙する。
【図２３】実施例１０に関連し、以下に簡単に説明する。  図２３に、ＰＣＲ増幅実験でえられた９個の別個の隣接する(contiguous)ウシＧＧＦ−II  ｃＤＮＡ構造および配列を示す。図の上に付した線は特徴付けがなされたｃＤＮＡ構造に寄与するコーディング配列の図解を示す。
【図２４】実施例１０に関連し、以下に簡単に説明する。  図２４はＧＧＦ２ＢＧ１のウシ組換えファージの物理的地図(physical map)である。ウシフラグメントはおおよそ２０ｋｂの長さでウシＧＧＦ−II遺伝子の２つのエクソン（ボールド）を含む。酵素Ｘｂａｌ、Ｓｐｅｌ、Ｎｄｅｌ、ＥｃｏＲＩ、Ｋｐｎｌ、およびＳｓｔＩに対する制限部位をこの物理的地図に記している。影を付した部分は配列決定のためにサブクローン化されたフラグメントに対応する。
【図２５】実施例１０に関連し、以下に簡単に説明する。  図２５は推定されるウシＧＧＦ−II遺伝子の３つの副遺伝子産物(alternative gene products)の構造を図式的に示す。エクソンはＡからＥまでそれらの発見の順に列挙する。選択的スプライシングパターン１、２および３は、３つのオーバーラップする推定されたタンパク質構造（ＧＧＦ２ＢＰＰ１、２、および３）をつくり、それらを種々の図２７Ａ、２７Ｂ、２７Ｃ（後記）に表わす。
【図２６】実施例１０に関連し、以下に簡単に説明する。  図２６（配列番号１１６〜１２８）では、図９および図１１に列挙された新規なペプチド配列をもつ、図２７Ａ、図２７Ｂおよび図２７Ｃに示す推定されたタンパク質の配列（後記）において同定されるＧＧＦ−ＩおよびＧＧＦ−II配列を比較する。図によって９つの新規なＧＧＦ−IIペプチド配列のうち６つがこれら推定されたタンパク質の配列に対することが示される。ＧＧＦ−Ｉ配列と類似の２つのペプチド配列もまた見出された。
【図２７】実施例１０に関連し、以下に簡単に説明する。  図２７（配列番号１２９）は図２５のスプライシングパターン番号１からえられるｃＤＮＡのコーディングストランドＤＮＡ配列および推定されたアミノ酸配列を示す。この推定されるウシＧＧＦ−II遺伝子の部分的なｃＤＮＡは、２０６アミノ酸長のタンパク質をコードする。ボールドで示すペプチドは図９および図１１に示すリストから同定されたものである。潜在的なグリコシル化部位に下線を付す（ポリアデニル化シグナルＡＡＴＡＡＡに加えて）；  図２７（配列番号１３０）は図２５におけるスプライシングパターン番号３からえられるｃＤＮＡのコーディングストランドＤＮＡ配列および推定されたアミノ酸配列を示す。この推定されるウシＧＧＦ−II遺伝子の部分的なｃＤＮＡは、２５７アミノ酸長のタンパク質をコードする。ボールドで示すペプチドは図９および図１１におけるリストから同定されたものである。潜在的なグリコシル化部位に下線を付す（ポリアデニル化シグナルＡＡＴＡＡＡに加えて）。
【図２８】実施例１６に関連し、サザンブロット上での種々のホ乳動物ＤＮＡへの推定されるウシＧＧＦ−II遺伝子配列の交差ハイブリダイゼーション分析のオートラジオグラムを示す。フィルターは図に列挙する種からのＥｃｏＲＩで消化されたＤＮＡ（レーンあたり５μｇ）のレーンを含む。図２４中の物理的地図により予想されるようにウシＤＮＡ中の４ｋｂフラグメントを含めて、プローブは各ＤＮＡサンプル中に強い単一バンドを検出する。比較的小さい強度のバンドもまた観察され、これらは関連するＤＮＡ配列を示しうる。他のホ乳動物ＤＮＡサンプルのそれぞれからの強くハイブリダイズするバンドは、おそらくはこれらの種のＧＧＦ−II相同物を示す。
【図２９】代表的なスプライシング変異体のダイアグラムである。コーディングセグメントはＦ、Ｅ、Ｂ、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｃ／Ｄ、Ｃ／Ｄ′、Ｄ、Ｄ′、Ｈ、ＫおよびＬで示される。精製されたタンパク質に由来したペプチド配列の位置を「○」によって示す。
【図３０Ａ】図３０（配列番号１３６〜１４３、１５６、１５７、１６９〜１７８）は、ＧＧＦのコーディングセグメントのＤＮＡ配列および予測されるペプチド配列を示す。列１はウシＧＧＦの予測されるアミノ酸配列を表わし、列２はウシＧＧＦのヌクレオチド配列を表わし、列３はヒトＧＧＦ（ヘレグリン）のヌクレオチド配列を表わし（ヌクレオチドの塩基のマッチ(matches)を垂直線で示す）また列４はヒトＧＧＦ／ヘレグリンの予測されるアミノ酸配列を表わし、この配列は予測されるウシの配列とは異なる。コーディングセグメントＥ、Ａ′およびＫはウシの配列のみを示す。コーディングセグメントＤ′はヒト（ヘレグリン）の配列のみを示す。
【図３０Ｂ】図３０（配列番号１３６〜１４３、１５６、１５７、１６９〜１７８）は、ＧＧＦのコーディングセグメントのＤＮＡ配列および予測されるペプチド配列を示す。列１はウシＧＧＦの予測されるアミノ酸配列を表わし、列２はウシＧＧＦのヌクレオチド配列を表わし、列３はヒトＧＧＦ（ヘレグリン）のヌクレオチド配列を表わし（ヌクレオチドの塩基のマッチ(matches)を垂直線で示す）また列４はヒトＧＧＦ／ヘレグリンの予測されるアミノ酸配列を表わし、この配列は予測されるウシの配列とは異なる。コーディングセグメントＥ、Ａ′およびＫはウシの配列のみを示す。コーディングセグメントＤ′はヒト（ヘレグリン）の配列のみを示す。
【図３０Ｃ】図３０（配列番号１３６〜１４３、１５６、１５７、１６９〜１７８）は、ＧＧＦのコーディングセグメントのＤＮＡ配列および予測されるペプチド配列を示す。列１はウシＧＧＦの予測されるアミノ酸配列を表わし、列２はウシＧＧＦのヌクレオチド配列を表わし、列３はヒトＧＧＦ（ヘレグリン）のヌクレオチド配列を表わし（ヌクレオチドの塩基のマッチ(matches)を垂直線で示す）また列４はヒトＧＧＦ／ヘレグリンの予測されるアミノ酸配列を表わし、この配列は予測されるウシの配列とは異なる。コーディングセグメントＥ、Ａ′およびＫはウシの配列のみを示す。コーディングセグメントＤ′はヒト（ヘレグリン）の配列のみを示す。
【図３０Ｄ】図３０（配列番号１３６〜１４３、１５６、１５７、１６９〜１７８）は、ＧＧＦのコーディングセグメントのＤＮＡ配列および予測されるペプチド配列を示す。列１はウシＧＧＦの予測されるアミノ酸配列を表わし、列２はウシＧＧＦのヌクレオチド配列を表わし、列３はヒトＧＧＦ（ヘレグリン）のヌクレオチド配列を表わし（ヌクレオチドの塩基のマッチ(matches)を垂直線で示す）また列４はヒトＧＧＦ／ヘレグリンの予測されるアミノ酸配列を表わし、この配列は予測されるウシの配列とは異なる。コーディングセグメントＥ、Ａ′およびＫはウシの配列のみを示す。コーディングセグメントＤ′はヒト（ヘレグリン）の配列のみを示す。
【図３０Ｅ】図３０（配列番号１３６〜１４３、１５６、１５７、１６９〜１７８）は、ＧＧＦのコーディングセグメントのＤＮＡ配列および予測されるペプチド配列を示す。列１はウシＧＧＦの予測されるアミノ酸配列を表わし、列２はウシＧＧＦのヌクレオチド配列を表わし、列３はヒトＧＧＦ（ヘレグリン）のヌクレオチド配列を表わし（ヌクレオチドの塩基のマッチ(matches)を垂直線で示す）また列４はヒトＧＧＦ／ヘレグリンの予測されるアミノ酸配列を表わし、この配列は予測されるウシの配列とは異なる。コーディングセグメントＥ、Ａ′およびＫはウシの配列のみを示す。コーディングセグメントＤ′はヒト（ヘレグリン）の配列のみを示す。
【図３０Ｆ】図３０（配列番号１３６〜１４３、１５６、１５７、１６９〜１７８）は、ＧＧＦのコーディングセグメントのＤＮＡ配列および予測されるペプチド配列を示す。列１はウシＧＧＦの予測されるアミノ酸配列を表わし、列２はウシＧＧＦのヌクレオチド配列を表わし、列３はヒトＧＧＦ（ヘレグリン）のヌクレオチド配列を表わし（ヌクレオチドの塩基のマッチ(matches)を垂直線で示す）また列４はヒトＧＧＦ／ヘレグリンの予測されるアミノ酸配列を表わし、この配列は予測されるウシの配列とは異なる。コーディングセグメントＥ、Ａ′およびＫはウシの配列のみを示す。コーディングセグメントＤ′はヒト（ヘレグリン）の配列のみを示す。
【図３０Ｇ】図３０（配列番号１３６〜１４３、１５６、１５７、１６９〜１７８）は、ＧＧＦのコーディングセグメントのＤＮＡ配列および予測されるペプチド配列を示す。列１はウシＧＧＦの予測されるアミノ酸配列を表わし、列２はウシＧＧＦのヌクレオチド配列を表わし、列３はヒトＧＧＦ（ヘレグリン）のヌクレオチド配列を表わし（ヌクレオチドの塩基のマッチ(matches)を垂直線で示す）また列４はヒトＧＧＦ／ヘレグリンの予測されるアミノ酸配列を表わし、この配列は予測されるウシの配列とは異なる。コーディングセグメントＥ、Ａ′およびＫはウシの配列のみを示す。コーディングセグメントＤ′はヒト（ヘレグリン）の配列のみを示す。
【図３０Ｈ】図３０（配列番号１３６〜１４３、１５６、１５７、１６９〜１７８）は、ＧＧＦのコーディングセグメントのＤＮＡ配列および予測されるペプチド配列を示す。列１はウシＧＧＦの予測されるアミノ酸配列を表わし、列２はウシＧＧＦのヌクレオチド配列を表わし、列３はヒトＧＧＦ（ヘレグリン）のヌクレオチド配列を表わし（ヌクレオチドの塩基のマッチ(matches)を垂直線で示す）また列４はヒトＧＧＦ／ヘレグリンの予測されるアミノ酸配列を表わし、この配列は予測されるウシの配列とは異なる。コーディングセグメントＥ、Ａ′およびＫはウシの配列のみを示す。コーディングセグメントＤ′はヒト（ヘレグリン）の配列のみを示す。
【図３０Ｉ】図３０（配列番号１３６〜１４３、１５６、１５７、１６９〜１７８）は、ＧＧＦのコーディングセグメントのＤＮＡ配列および予測されるペプチド配列を示す。列１はウシＧＧＦの予測されるアミノ酸配列を表わし、列２はウシＧＧＦのヌクレオチド配列を表わし、列３はヒトＧＧＦ（ヘレグリン）のヌクレオチド配列を表わし（ヌクレオチドの塩基のマッチ(matches)を垂直線で示す）また列４はヒトＧＧＦ／ヘレグリンの予測されるアミノ酸配列を表わし、この配列は予測されるウシの配列とは異なる。コーディングセグメントＥ、Ａ′およびＫはウシの配列のみを示す。コーディングセグメントＤ′はヒト（ヘレグリン）の配列のみを示す。
【図３０Ｊ】図３０（配列番号１３６〜１４３、１５６、１５７、１６９〜１７８）は、ＧＧＦのコーディングセグメントのＤＮＡ配列および予測されるペプチド配列を示す。列１はウシＧＧＦの予測されるアミノ酸配列を表わし、列２はウシＧＧＦのヌクレオチド配列を表わし、列３はヒトＧＧＦ（ヘレグリン）のヌクレオチド配列を表わし（ヌクレオチドの塩基のマッチ(matches)を垂直線で示す）また列４はヒトＧＧＦ／ヘレグリンの予測されるアミノ酸配列を表わし、この配列は予測されるウシの配列とは異なる。コーディングセグメントＥ、Ａ′およびＫはウシの配列のみを示す。コーディングセグメントＤ′はヒト（ヘレグリン）の配列のみを示す。
【図３０Ｋ】図３０（配列番号１３６〜１４３、１５６、１５７、１６９〜１７８）は、ＧＧＦのコーディングセグメントのＤＮＡ配列および予測されるペプチド配列を示す。列１はウシＧＧＦの予測されるアミノ酸配列を表わし、列２はウシＧＧＦのヌクレオチド配列を表わし、列３はヒトＧＧＦ（ヘレグリン）のヌクレオチド配列を表わし（ヌクレオチドの塩基のマッチ(matches)を垂直線で示す）また列４はヒトＧＧＦ／ヘレグリンの予測されるアミノ酸配列を表わし、この配列は予測されるウシの配列とは異なる。コーディングセグメントＥ、Ａ′およびＫはウシの配列のみを示す。コーディングセグメントＤ′はヒト（ヘレグリン）の配列のみを示す。
【図３０Ｌ】図３０（配列番号１３６〜１４３、１５６、１５７、１６９〜１７８）は、ＧＧＦのコーディングセグメントのＤＮＡ配列および予測されるペプチド配列を示す。列１はウシＧＧＦの予測されるアミノ酸配列を表わし、列２はウシＧＧＦのヌクレオチド配列を表わし、列３はヒトＧＧＦ（ヘレグリン）のヌクレオチド配列を表わし（ヌクレオチドの塩基のマッチ(matches)を垂直線で示す）また列４はヒトＧＧＦ／ヘレグリンの予測されるアミノ酸配列を表わし、この配列は予測されるウシの配列とは異なる。コーディングセグメントＥ、Ａ′およびＫはウシの配列のみを示す。コーディングセグメントＤ′はヒト（ヘレグリン）の配列のみを示す。
【図３０Ｍ】図３０（配列番号１３６〜１４３、１５６、１５７、１６９〜１７８）は、ＧＧＦのコーディングセグメントのＤＮＡ配列および予測されるペプチド配列を示す。列１はウシＧＧＦの予測されるアミノ酸配列を表わし、列２はウシＧＧＦのヌクレオチド配列を表わし、列３はヒトＧＧＦ（ヘレグリン）のヌクレオチド配列を表わし（ヌクレオチドの塩基のマッチ(matches)を垂直線で示す）また列４はヒトＧＧＦ／ヘレグリンの予測されるアミノ酸配列を表わし、この配列は予測されるウシの配列とは異なる。コーディングセグメントＥ、Ａ′およびＫはウシの配列のみを示す。コーディングセグメントＤ′はヒト（ヘレグリン）の配列のみを示す。
【図３０Ｎ】図３０（配列番号１３６〜１４３、１５６、１５７、１６９〜１７８）は、ＧＧＦのコーディングセグメントのＤＮＡ配列および予測されるペプチド配列を示す。列１はウシＧＧＦの予測されるアミノ酸配列を表わし、列２はウシＧＧＦのヌクレオチド配列を表わし、列３はヒトＧＧＦ（ヘレグリン）のヌクレオチド配列を表わし（ヌクレオチドの塩基のマッチ(matches)を垂直線で示す）また列４はヒトＧＧＦ／ヘレグリンの予測されるアミノ酸配列を表わし、この配列は予測されるウシの配列とは異なる。コーディングセグメントＥ、Ａ′およびＫはウシの配列のみを示す。コーディングセグメントＤ′はヒト（ヘレグリン）の配列のみを示す。
【図３０Ｏ】図３０（配列番号１３６〜１４３、１５６、１５７、１６９〜１７８）は、ＧＧＦのコーディングセグメントのＤＮＡ配列および予測されるペプチド配列を示す。列１はウシＧＧＦの予測されるアミノ酸配列を表わし、列２はウシＧＧＦのヌクレオチド配列を表わし、列３はヒトＧＧＦ（ヘレグリン）のヌクレオチド配列を表わし（ヌクレオチドの塩基のマッチ(matches)を垂直線で示す）また列４はヒトＧＧＦ／ヘレグリンの予測されるアミノ酸配列を表わし、この配列は予測されるウシの配列とは異なる。コーディングセグメントＥ、Ａ′およびＫはウシの配列のみを示す。コーディングセグメントＤ′はヒト（ヘレグリン）の配列のみを示す。
【図３１】図３１（配列番号１４４）は、ＢＰＰ５の予測されるＧＧＦ２アミノ酸配列およびヌクレオチド配列である。上側の列はヌクレオチド配列を表わし、下側の列は予測されるアミノ酸配列を表わす。
【図３２】図３２（配列番号１４５）は、ＧＧＦ２ＢＰＰ２の予測されるアミノ酸配列およびヌクレオチド配列である。上側の列はヌクレオチド配列を表わし、下側の列は予測されるアミノ酸配列を表わす。
【図３３】図３３（配列番号１４６）は、ＧＧＦ２ＢＰＰ４の予測されるアミノ酸配列およびヌクレオチド配列である。上側の列はヌクレオチド配列を表わし、下側の列は予測されるアミノ酸配列を表わす。
【図３４】図３４（配列番号１４７〜１４９）は、２つのＧＧＦペプチド配列（ＧＧＦ２ＢＰＰ４およびＧＧＦ２ＢＰＰ５）のヒトＥＧＦ（ｈＥＧＦ）とのアラインメントを記す。星印は保存されたシステインの位置を示す。
【図３５】ＧＧＦの量の増加に応じたＧＧＦ活性（シュワン細胞分裂促進能アッセイ）および約２００ｋＤタンパク質のチロシンリン酸化（抗ホスホチロシンポリクローナル抗体とともに展開されたウェスタンブロットのオートラジオグラム上での２００ｋＤのバンドの強度）のレベルを記す。
【図３６】図３０に示す配列に由来するスプライシング変異体のリストである。
【図３７】ＥＧＦＬ１の予測されるアミノ酸配列、下部、およびヌクレオチド配列、上部である（配列番号１５０）。
【図３８】ＥＧＦＬ２の予測されるアミノ酸配列、下部、およびヌクレオチド配列、上部である（配列番号１５１）。
【図３９】ＥＧＦＬ３の予測されるアミノ酸配列、下部、およびヌクレオチド配列、上部である（配列番号１５２）。
【図４０】ＥＧＦＬ４の予測されるアミノ酸配列、下部、およびヌクレオチド配列、上部である（配列番号１５３）。
【図４１】ＥＧＦＬ５の予測されるアミノ酸配列、下部、およびヌクレオチド配列、上部である（配列番号１５４）。
【図４２】ＥＧＦＬ６の予測されるアミノ酸配列、下部、およびヌクレオチド配列、上部である（配列番号１５９）。
【図４３】クローンのスケールコーディングセグメント地図である。Ｔ３はクローンからｍＲＮＡをつくるために用いられたバクテリオファージプロモーターのことである。Ｒ＝フランキングするＥｃｏＲＩ制限酵素部位。５′ＵＴは５′非翻訳領域のことである。Ｅ、Ｂ、Ａ、Ｃ、Ｃ／Ｄ′およびＤはコーディングセグメントのことである。Ｏ＝翻訳開始部位。Λ＝ウシＥセグメントと相同な領域の５′限界（実施例１７参照）また３′ＵＴは３′非翻訳領域のことである。
【図４４】ＧＧＦ２ＨＢＳ５の予測されるアミノ酸配列（中部）およびヌクレオチド配列（上部）である（配列番号２１）。下部（間欠(intermittent)配列）は、ＧＧＦ−II調製物に由来したペプチド配列を表わす（図８、９参照）。
【図４５Ａ】分画による陽イオン交換カラム上のｒＧＧＦの精製を示すグラフである。
【図４５Ｂ】図４５Ａに示された画分とＧＧＦIIに特異的な抗体を用いたウェスタンブロットの写真である。
【図４６】ＧＧＦＨＢＳ５、ＧＧＦＨＦＢ１およびＧＧＦＢＰＰ５ポリペプチドの配列を示す（配列番号：１６６、１６７、および１６８）。
【図４７】プラスミドｐｃＤＨＲＦｐｏｌｙＡの地図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３０Ｄ】
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【図３０Ｅ】
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【図３０Ｆ】
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【図３０Ｇ】
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【図３０Ｈ】
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【図３０Ｉ】
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【図３０Ｊ】
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【図３０Ｋ】
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【図３０Ｌ】
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【図３０Ｍ】
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【図３０Ｎ】
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【図３０Ｏ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４６】
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【図４７】
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【配列表】
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