(57)【要約】      （修正有）【課題】リパーゼ活性及び安定性が向上したリパーゼ粉末製剤及びその製造方法を提供する。【解決手段】リパーゼと豆類蛋白とを含有する造粒物であるリパーゼ粉末製剤、更に油脂を含有するリパーゼ粉末製剤、及びリパーゼ及び豆類蛋白を溶解・分散させた水溶液を乾燥させることを特徴とするリパーゼ粉末製剤の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リパーゼと豆類蛋白とを含有する造粒物であることを特徴とするリパーゼ粉末製剤。
【請求項２】
豆類蛋白が、エンドウ、ソラマメ及びダイズからなる群より選択される１又は２以上の豆の蛋白である、請求項１記載のリパーゼ粉末製剤。
【請求項３】
豆類蛋白が、豆類破砕物から水又はアルカリ性水溶液で可溶化して抽出し、その抽出液から酸により蛋白を沈殿させて得られる、請求項１又は２記載のリパーゼ粉末製剤。
【請求項４】
更に脂肪酸エステル及び／又は脂肪酸を含有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のリパーゼ粉末製剤。
【請求項５】
前記脂肪酸エステルが油脂である、請求項４記載のリパーゼ粉末製剤。
【請求項６】
リパーゼ及び豆類蛋白を溶解・分散させた水溶液を乾燥させることを特徴とする、リパーゼ粉末製剤の製造方法。
【請求項７】
リパーゼ及び豆類蛋白を溶解・分散させた水溶液に、脂肪酸エステル及び／又は脂肪酸を接触させる工程を更に含む、請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
前記脂肪酸エステル及び／又は脂肪酸を接触させる工程において、脂肪酸エステルを加水分解させる、請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
前記乾燥が、スプレードライ、フリーズドライ、及び溶剤沈殿・乾燥の中から選ばれるいずれか１種である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記乾燥が、エステル化反応を伴う脱水である、請求項７又は８に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記エステル化反応させた後、更に、濾過する工程を含む、請求項１０記載の製造方法。
【請求項１２】
更に、濾過助剤を添加する工程を含む、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１３】
得られたリパーゼ粉末製剤を、更に、脂肪酸エステル及び／又は脂肪酸で洗浄する工程を含む、請求項６〜１２のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１４】
請求項６〜１３のいずれか１項に記載の製造方法により得られたリパーゼ粉末製剤を用いて、脂肪酸エステル、脂肪酸、及びアルコールから選ばれる１種以上にエステル交換反応又はエステル化反応を行うことを特徴とする、エステル交換物又はエステル化物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、各種エステル化反応、エステル交換反応などに好適に使用することができるリパーゼ粉末製剤、更に脂肪酸エステル及び／又は脂肪酸を含有するリパーゼ粉末製剤、これらの製造方法、これらのリパーゼ粉末製剤を用いるエステル交換方法などに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
リパーゼは、脂肪酸などの各種カルボン酸とモノアルコールや多価アルコールなどのアルコール類とのエステル化反応、複数のカルボン酸エステル間のエステル交換反応などに幅広く使用されている。このうち、エステル交換反応は動植物油脂類の改質をはじめ、各種脂肪酸のエステル、糖エステルやステロールエステルの製造法として重要な技術である。これらの反応の触媒として、油脂加水分解酵素であるリパーゼを用いると、室温ないし約７０℃程度の温和な条件下でエステル交換反応を行うことができ、従来の化学反応に比べ、副反応の抑制やエネルギーコストが低減化されるだけでなく、触媒としてのリパーゼが天然物であることから安全性も高い。また、その基質特異性や位置特異性により目的物を効率良く生産することができる。ところが、粉末リパーゼをそのままエステル交換反応に用いても活性が十分に発現しないばかりか、元来が水溶性のリパーゼを油性原料中に均一に分散させることは困難であり、その回収も困難である。
このため、従来はリパーゼを何らかの担体、たとえば陰イオン交換樹脂（特許文献１）、フェノール吸着樹脂（特許文献２）、疎水性担体（特許文献３）、陽イオン交換樹脂（特許文献４）、キレート樹脂（特許文献５）等に固定化してエステル化やエステル交換反応などに用いることが一般的である。さらに、リパーゼとリパーゼの担体として作用する物質とを溶解している水相が疎水相に分散しているエマルジョンを製造し、そのエマルジョンから水を除去することにより、水相をリパーゼで被覆した固体粒子へ変化させる固定化リパーゼ粒子の製造方法が提案されている（特許文献６）。
【０００３】
このように、従来はリパーゼを固定化してエステル交換反応に用いていたが、かかる固定化リパーゼは固定化処理による本来のリパーゼ活性の損失を伴うだけでなく、多孔性担体を用いた場合は細孔に原料や生成物が詰まり、結果としてエステル交換率の低下を招いていた。さらに、従来の固定化リパーゼを用いたエステル交換反応においては、担体が保持する水分が反応系に持ち込まれるため、副反応、たとえば油脂類のエステル交換反応におけるジグリセリドやモノグリセリドの生成等を避けることは困難であった。
このような状況に鑑み、粉末リパーゼを用いる各種技術が開発されている。例えば、不活性有機溶媒の存在下または非存在下、エステル交換反応時に分散リパーゼ粉末粒子の９０％以上を１〜１００μｍの範囲の粒径に保つように、エステルを含有する原料に粉末リパーゼを分散させてエステル交換反応を行う方法が提案されている（特許文献７）。又、リン脂質および脂溶性ビタミンを含む酵素溶液を乾燥して得た酵素粉末を用いることが提案されている（特許文献８）。
しかしながら、さらにリパーゼ活性及び安定性が向上した粉末リパーゼが求められている。
【０００４】
【特許文献１】特開昭６０−９８９８４号公報
【特許文献２】特開昭６１−２０２６８８号公報
【特許文献３】特開平２−１３８９８６号公報
【特許文献４】特開平３−６１４８５号公報
【特許文献５】特開平１−２６２７９５号公報
【特許文献６】特許第３４０３２０２号公報
【特許文献７】特許第２６６８１８７号公報
【特許文献８】特開２０００−１０６８７３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、リパーゼ活性及び安定性が向上したリパーゼ粉末製剤を提供することを目的とする。
本発明は、又、更に脂肪酸エステル及び／又は脂肪酸を含有するリパーゼ粉末製剤を提供することを目的とする。
本発明は、又、これらのリパーゼ粉末製剤の製造方法を提供することを目的とする。
本発明は、又、これらのリパーゼ粉末製剤を用いるエステル交換方法及びエステル化方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、リパーゼ及び豆類蛋白を含有する造粒物をリパーゼ粉末製剤としてエステル化反応及び／又はエステル交換反応に使用すると、リパーゼ活性及び安定性が格段に向上するという知見に基づいてなされたのである。
すなわち、本発明は、リパーゼと豆類蛋白とを含有する造粒物であることを特徴とするリパーゼ粉末製剤を提供する。
本発明は、更に脂肪酸エステル及び／又は脂肪酸を含有するリパーゼ粉末製剤を提供する。
本発明は、又、リパーゼ及び豆類蛋白を溶解・分散させた水溶液を乾燥することを特徴とするリパーゼ粉末製剤の製造方法を提供する。
本発明は、又、リパーゼ及び豆類蛋白を溶解・分散させた水溶液に、脂肪酸エステル及び／又は脂肪酸を接触させる工程を更に含むリパーゼ粉末製剤の製造方法を提供する。
本発明は、又、エステル交換用又はエステル化用に使用できるリパーゼ粉末製剤を提供する。
本発明は、又、エステル交換用及び／又はエステル化用リパーゼを用いて得られるエステル交換物及び／又はエステル化物を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、エステル交換反応又はエステル化反応を効率的に行い且つ反応後に回収して再度の利用が可能である、酵素活性及び安定性が格段に向上したリパーゼ粉末製剤を得ることができる。
また、本発明によれば、宗教上の理由や健康上の理由などにより動物由来の蛋白や油脂を摂取できない人々のための食品又は食品添加剤を製造するのに安全に且つ廉価で使用できるリパーゼ粉末製剤を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明で用いるリパーゼとしては、リポプロテインリパーゼ、モノアシルグリセロリパーゼ、ジアシルグリセロリパーゼ、トリアシルグリセロリパーゼ、ガラクトリパーゼ、フォスフォリパーゼ等が挙げられる。これらのうち、トリアシルグリセロリパーゼが好ましい。
これらのリパーゼを産生する微生物としては、細菌、酵母、糸状菌、放線菌等特に限定されるものではないが、シュードモナス属（Psudomonas sp.）、アルカリゲネス属（Alcaligenes sp.）、アスロバクター属（Arthrobacter sp.）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus sp.）、トルロプシス属（Torulopsis sp.）、エスチエリシア属（Escherichia sp.）、マイコトルラ属（Micotorula sp.）、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterum sp.）、クロモバクテリウム属（Chromobacterum sp.）、キサントモナス属（Xanthomonas sp.）、ラクトバチルス属（Lactobacillus sp.）、クロストリデイウム属（Clostridium sp.）、キャンデイダ属（Candida sp.）、ジオトリカム属（Geotrichum sp.）、サッカロマイコプシス属（Sacchromycopsis sp.）、ノカルデイア属（Nocardia sp.）、フザリウム属（Fusarium sp.）、アスペルギルス属（Aspergillus sp.）、ペニシリウム属（Penicillum sp.）、ムコール属（Mucor sp.）、リゾプス属（Rhizopus sp.）、フィコマイセス属（Phycomyces sp.）、プチニア属（Puccinia sp.）、バチルス属（Bacillus sp.）、ストレプトマイセス属（Streptmycese sp.）、サーモマイセス属(Thermomyces sp.)などが挙げられる。
本発明では、これらのうち、１，３-特異性リパーゼが好ましく、特に、リゾムコール属、アルカリゲネス属、リゾプス属及びサーモマイセス属に由来する１，３-特異性リパーゼが好ましく、中でもリゾムコール属のリゾムコール  ミーへイ（Rhizomucor miehei）、アルカリゲネス属のAlcaligenes sp.、リゾプス属のリゾプス  デレマー（Rhizopus delemar）及びリゾプス  オリザエ（Rhizopus oryzae）並びにサーモマイセス属のサーモマイセス  ラヌゲノウス(Thermomyces lanuginosus)由来の１，３-特異性リパーゼが好ましい。尚、従来、リゾムコール  ミーヘイ（Rhizomucor miehei）は、ムコール属（Mucor sp.）として扱われていた場合もある。
なお、本発明に使用するリパーゼは、リパーゼの培地成分等を含有したリパーゼ含有水溶液を乾燥して得られたものも含む。
【０００９】
本発明で使用できるRhizopus oryzae由来のリパーゼとしては、天野エンザイム社の商品：リパーゼＦ−ＡＰ１５等が挙げられる。このものは粉末リパーゼである。
Rhizopus delemar由来のリパーゼとしては、天野エンザイム社の商品：リパーゼＤ等が挙げられる。このものは粉末リパーゼである。なお、このリパーゼＤについては現在、Rhizopus oryzae由来に変更されているが、従来はRhizopus delemar由来の表記であった。
Alcaligenes sp.由来のリパーゼとしては、名糖産業の商品：リパーゼＱＬＭ等が挙げられる。このものは粉末リパーゼである。
Rhizomucor miehei由来のリパーゼとしては、ノボザイムズ社の商品：Ｐａｌａｔａｓｅ  ２００００Ｌ等が挙げられる。パタラーゼ（Palatase）は、水溶液にリパーゼが溶解・分散した形態で市販されているが、限外濾過膜を使用して該水溶液を濾過することにより低分子成分を除去してリパーゼ含有水溶液とし、例えば、スプレードライやフリーズドライを用いて噴霧することにより得ることができる。
Thermomyces lanuginosus由来のリパーゼとしては、ノボザイムズ社の商品：Ｌｉｐｏｚｙｍｅ  ＴＬ  １００Ｌ等が挙げられる。粉末リパーゼは、上述した方法と同様にして得ることができる。
【００１０】
本発明で用いる豆類蛋白としては、エンドウ、ソラマメ、ダイズ、アズキ、インゲン及びササゲなどの豆類の蛋白があげられる。これらのうち、エンドウ蛋白、ソラマメ蛋白及びダイズ蛋白が好ましく、特にエンドウ蛋白、ソラマメ蛋白が好ましい。
本発明で用いる豆類蛋白は、常法により抽出して製造したものや、市販されているものを使用することができる。市販されているものとして、例えば、ダイズ蛋白やエンドウ蛋白があり、特にダイズ蛋白は蛋白含量によって分類されている。酵素の活性化及び安定性をより向上させるためには、豆類蛋白中の蛋白含量は、好ましくは６０〜９５質量％であり、より好ましくは７０〜９０質量％である。
蛋白含量の測定方法は、ケルダール法、ＵＶ法、ローリー法、ＢＣＡ法などの他、少量で容易に測定できるデュマ（燃焼）法が挙げられ、窒素含量を測定することにより求めることができる。
リパーゼに対する豆類蛋白の質量は、０．１〜２００倍の量であるのが好ましく、１．０〜１００倍の量であるのがより好ましく、３．０〜５０倍の量が最も好ましい。
【００１１】
豆類から蛋白質を抽出する方法として、例えば、豆類を破砕した後、水又はアルカリ性水溶液で抽出し、その抽出液から酸により蛋白を沈殿させることによって得る方法が挙げられる。
より具体的には、原料の豆類を水に浸し、吸水した豆を破砕して、水酸化ナトリウム水溶液を添加して０．１Ｎのアルカリ性水溶液とし、豆破砕物から水中に蛋白を可溶化して抽出する。その後、この溶液に、例えば希塩酸水溶液を添加してｐＨ３〜６程度の弱酸性水溶液とし、可溶化していた蛋白を析出・沈殿させることができる。使用する酸は、無機酸、有機酸のどちらでもよいが、強酸である塩酸等を使用する場合には希釈して使用するか、抽出液に少量ずつ使用することが好ましい。有機酸としては、クエン酸、酢酸等が挙げられる。
また、ダイズから蛋白質を得る方法として、脱脂ダイズを酸性水溶液やアルコールで洗浄して蛋白を得る方法もある。ダイズは他の豆類よりも脂肪含量が多いため、脱脂ダイズを用いて、先に説明した方法により、蛋白質を抽出・分離することが好ましい。
このようにして沈殿した豆類蛋白は、例えば１，０００〜３，０００×ｇの遠心分離によって分離することができ、分離した豆類蛋白は、例えばフリーズドライなどの減圧乾燥、スプレードライによる乾燥等によって乾燥させ粉末とすることができる。
なお、得られる蛋白質の劣化を防ぐために、蛋白の抽出及び乾燥等の処理を行う際には、蛋白質を高濃度の強酸・強アルカリ水溶液に長時間接触させたり、高温に長時間放置しないようにすることが重要である。
プロテアーゼインヒビター等は、添加しても添加しなくてもよい。
【００１２】
本発明のリパーゼ粉末製剤は、水分含量が１０質量％以下であるのが好ましく、特に、１〜８質量％であるのが好ましい。
本発明のリパーゼ粉末製剤の粒径は任意とすることができるが、リパーゼ粉末製剤の９０質量％以上が粒径１〜１００μｍであるのが好ましい。平均粒径は１０〜８０μｍが好ましい。又、リパーゼ粉末製剤の形状は球状であるのが好ましい。
リパーゼ粉末製剤の粒径は、例えば、ＨＯＲＩＢＡ社の粒度分布測定装置（ＬＡ−５００）を用いて測定することができる。
本発明のリパーゼ粉末製剤は、リパーゼ及び豆類蛋白を溶解・分散させた水溶液を、スプレードライ、フリーズドライ、及び溶剤沈澱・乾燥の中から選ばれるいずれか１種の乾燥方法で乾燥し、製造することができる。
ここで、リパーゼ及び豆類蛋白を溶解・分散させた水溶液は、粉末リパーゼと豆類蛋白を水に溶解・分散させたり、豆類蛋白が溶解・分散した水溶液に粉末リパーゼを混合したり、又は、後に説明するリパーゼ含有水溶液に豆類蛋白を混合することにより得ることができる。
【００１３】
リパーゼ及び豆類蛋白を溶解・分散させた水溶液を乾燥させる過程では、リパーゼ及び／又は豆類蛋白の粒子が凝集して、リパーゼ及び豆類蛋白を含有する造粒物が形成される。この造粒物は、リパーゼの培地成分を含んでいてもよい。
このようにして調製したリパーゼ粉末製剤は、そのままエステル交換又はエステル化に使用することができる。
リパーゼ及び豆類蛋白を溶解・分散させた水溶液中の水の量は、リパーゼ及び豆類蛋白との合計質量に対して水の質量を調整する。具体的には、リパーゼ及び豆類蛋白との合計質量に対する水の質量が、０．５〜１，０００倍であるのが好ましく、１．０〜５００倍であるのがより好ましく、３．０〜１００倍が最も好ましい。
特に、スプレードライによりリパーゼ粉末製剤を製造する場合は、装置の特性からリパーゼ及び豆類蛋白との合計質量に対する水の質量が、２．０〜１，０００倍であるのが好ましく、２．０〜５００倍であるのがより好ましく、３．０〜１００倍が最も好ましい。なお、リパーゼ含有水溶液を原料として使用する場合で、リパーゼ含有水溶液中のリパーゼ含量が不明な時は、フリーズドライ、その他の減圧乾燥によりリパーゼ含有水溶液を粉末化してリパーゼ含量を求め、リパーゼ質量を算出することができる。
【００１４】
ここで、リパーゼ含有水溶液としては、菌体を除去したリパーゼ培養液、精製培養液、これらから得たリパーゼを再度水に溶解・分散させたもの、市販の粉末リパーゼを再度水に溶解・分散させたもの、市販の液状リパーゼ等が挙げられる。さらに、リパーゼ活性をより高めるために塩類等の低分子成分を除去したものがより好ましく、また、粉末性状をより高めるために糖等の低分子成分を除去したものがより好ましい。
リパーゼ培養液としては、例えば、大豆粉、ペプトン、コーン・ステープ・リカー、Ｋ2ＨＰＯ4、（ＮＨ4）2ＳＯ4、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ等含有する水溶液があげられる。これらの濃度としては、大豆粉０．１〜２０質量％、好ましくは１．０〜１０質量％、ペプトン０．１〜３０質量％、好ましくは０．５〜１０質量％、コーン・ステープ・リカー０．１〜３０質量％、好ましくは０．５〜１０質量％、Ｋ2ＨＰＯ4  ０．０１〜２０質量％、好ましくは０．１〜５質量％である。又、（ＮＨ4）2ＳＯ4は０．０１〜２０質量％、好ましくは０．０５〜５質量％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏは０．０１〜２０質量％、好ましくは０．０５〜５質量％である。培養条件は、培養温度は１０〜４０℃、好ましくは２０〜３５℃、通気量は０．１〜２．０ＶＶＭ、好ましくは０．１〜１．５ＶＶＭ、攪拌回転数は１００〜８００ｒｐｍ、好ましくは２００〜４００ｒｐｍ、ｐＨは３．０〜１０．０、好ましくは４．０〜９．５に制御するのがよい。
【００１５】
菌体の分離は、遠心分離、膜濾過などで行うのが好ましい。また、塩類や糖等の低分子成分の除去は、ＵＦ膜処理により行うことができる。具体的には、ＵＦ膜処理を行い、リパーゼを含有する水溶液を１／２量の体積に濃縮後、濃縮液と同量のリン酸バッファーを添加するという操作を１〜５回繰り返すことにより、低分子成分を除去したリパーゼ含有水溶液を得ることができる。
遠心分離は２００〜２０，０００×ｇ、膜濾過はＭＦ膜、フィルタープレスなどで圧力を３．０ｋｇ/ｍ2以下にコントロールするのが好ましい。菌体内酵素の場合は、ホモジナイザー、ワーリングブレンダー、超音波破砕、フレンチプレス、ボールミル等で細胞破砕し、遠心分離、膜濾過などで細胞残さを除去することが好ましい。ホモジナイザーの攪拌回転数は５００〜３０，０００ｒｐｍ、好ましくは１，０００〜１５，０００ｒｐｍ、ワーリングブレンダーの回転数は５００〜１０，０００ｒｐｍ、好ましくは１，０００〜５，０００ｒｐｍである。攪拌時間は０．５〜１０分、好ましくは１〜５分がよい。超音波破砕は１〜５０ｋＨｚ、好ましくは１０〜２０ｋＨｚの条件で行うのが良い。ボールミルは直径０．１〜０．５ｍｍ程度のガラス製小球を用いるのがよい。
乾燥工程前の途中の工程において、リパーゼ含有水溶液を濃縮してもよい。濃縮方法は、特に限定されるものではないが、エバポレーター、フラッシュエバポレーター、ＵＦ膜濃縮、ＭＦ膜濃縮、無機塩類による塩析、溶剤による沈殿法、イオン交換セルロース等による吸着法、吸水性ゲルによる吸水法等があげられる。好ましくはＵＦ膜濃縮、エバポレーターがよい。ＵＦ膜濃縮用モジュールとしては、分画分子量３，０００〜１００，０００、好ましくは６，０００〜５０，０００の平膜または中空糸膜、材質はポリアクリルニトリル系、ポリスルフォン系などが好ましい。
【００１６】
次に、リパーゼ及び豆類蛋白を溶解・分散させた水溶液を乾燥する方法であるスプレードライ、フリーズドライ、又は溶剤沈澱・乾燥について説明する。
スプレードライは、例えば、ノズル向流式、デイスク向流式、ノズル並流式、デイスク並流式等の噴霧乾燥機を用いて行うのがよい。好ましくはデイスク並流式が良く、アトマイザー回転数は４，０００〜２０，０００ｒｐｍ、加熱は入口温度１００〜２００℃、出口温度４０〜１００℃で制御してスプレードライするのが好ましい。
フリーズドライ（凍結乾燥）は、例えば、ラボサイズの少量用凍結乾燥機、棚段式凍結乾燥により行うのが好ましい。さらに、減圧乾燥により調製することもできる。
溶剤沈殿・乾燥は、リパーゼ及び豆類蛋白を溶解・分散させた水溶液を、使用する溶剤に徐々に添加して沈殿物を生成させ、得られた沈殿物を遠心分離機を用いて遠心分離を行って沈殿を回収した後、減圧乾燥する。一連の操作は、リパーゼ粉末製剤の変性・劣化を防止するために、室温以下の低温条件下で行うのが好ましい。
溶剤沈澱で用いる溶剤として、例えば、エタノール、アセトン、メタノール、イソプロピルアルコール、及びヘキサン等の水溶性溶剤又は親水性溶剤が挙げられ、これらの混合溶剤も使用することができる。その中でもリパーゼ粉末製剤の活性をより高めるために、エタノール又はアセトンを用いることが好ましい。
使用する溶剤の量は特に限定されないが、リパーゼ及び豆類蛋白を溶解・分散させた水溶液の体積に対し、１〜１００倍の体積の溶剤を使用するのが好ましく、２〜１０倍の体積の溶剤を使用するのがより好ましい。
また、溶剤沈澱した後、沈殿物は静置後に濾過により得ることができるが、１，０００〜３，０００×ｇ程度の軽度な遠心分離により得ることもできる。得られた沈殿物の乾燥は、例えば、減圧乾燥により行うことができる。
【００１７】
次に、脂肪酸エステル及び／又は脂肪酸を含有するリパーゼ粉末製剤について説明する。本発明の脂肪酸エステル及び／又は脂肪酸を含有するリパーゼ粉末製剤は、粉末であっても、油状のものであっても良い。
本発明の脂肪酸エステル及び／又は脂肪酸を含有するリパーゼ粉末製剤は、リパーゼ及び豆類蛋白を溶解・分散させた水溶液に、脂肪酸エステル及び／又は脂肪酸を接触させる工程の後、乾燥することにより得ることができる。このような脂肪酸エステル及び／又は脂肪酸の接触を行うことにより、リパーゼ活性及び安定性をより向上させることができる。
使用する脂肪酸エステルとしては、モノアルコール又は多価アルコールと脂肪酸との脂肪酸エステルが挙げられる。多価アルコールの脂肪酸エステルは、部分エステルでも良く、フルエステルでも良い。
ここで、モノアルコールとしてはアルキルモノアルコール、フィトステロール等のステロール類が挙げられる。アルキルモノアルコールを構成するアルキル部分は、炭素数が６〜１２の中鎖アルキル又は炭素数が１３〜２２の長鎖アルキルであるのが好ましく、飽和でも不飽和でもよく、直鎖でも分岐鎖でもよい。フィトステロールとしては、例えばシトステロール、スチグマステロール、カンペステロール、フコステロール、スピナステロール、ブラシカステロール等が好ましい。また、多価アルコールとしては、グリセリン、ジグリセリンやデカグリセリン等のグリセリン縮合物、プロピレングリコール等のグリコール類、ソルビトール等が挙げられる。
使用する脂肪酸エステルの構成脂肪酸、及び使用する脂肪酸は、特に限定されないが、油脂由来の脂肪酸であることが好ましい。例えば、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ウンデカン酸等の炭素数が６〜１２の中鎖脂肪酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、リシノール酸、エルシン酸等の炭素数が１３〜２２の長鎖不飽和脂肪酸が挙げられる。その他、テトラデカン酸、ヘキサデカン酸、オクタデカン酸、エイコサン酸、ドコサン酸等の長鎖飽和脂肪酸も挙げられる。
【００１８】
本発明に使用する脂肪酸エステルとしては、油脂、油脂由来の脂肪酸を構成成分とするジグリセリド、モノグリセリドから選ばれる１種又は２種以上が好ましい。また、脂肪酸エステルの一部を加水分解することにより得られる、部分エステルと脂肪酸の混合物を使用することもできる。
なお、リパーゼ粉末製剤に使用する脂肪酸エステル及び脂肪酸は、リパーゼ粉末製剤を用いて行うエステル交換やエステル化に使用する原料と同じものを選択するのが好ましい。
ここで、本発明に脂肪酸エステルとして使用する油脂は、特に限定されないが、加水分解反応及びエステル化反応を行うことでリパーゼ粉末製剤を製造する場合は、反応温度において液体の油脂を使用することが好ましい。
油脂として、例えば、菜種油、ひまわり油、オリーブ油、コーン油、ヤシ油、ゴマ油、紅花油、大豆油、それらのハイオレイン品種の油脂、綿実油、米油、アマニ油、パーム油、パーム油の分別油、パーム核油、つばき油、カカオ脂、シア脂、サル脂、及びイリッペ脂等などの植物性油脂、トリオレイン（トリオレイン酸グリセリド）、トリカプリリン（トリオクタン酸グリセリド）、トリアセチン（トリ酢酸グリセリド）、トリブチリン（トリブタン酸グリセリド）などのトリグリセリド（合成油脂）、魚油、牛脂、ラード等の動物性油脂といった油脂の１種又は２種以上の混合物があげられる。これらの中でも植物性油脂が好ましい。
【００１９】
次に、脂肪酸エステル及び／又は脂肪酸を含有するリパーゼ粉末製剤の製造方法について説明する。
脂肪酸エステル、又は脂肪酸エステルと脂肪酸を原料として使用する場合、リパーゼ及び豆類蛋白を溶解・分散させた水溶液に、脂肪酸エステル、又は脂肪酸エステルと脂肪酸を添加して接触させ、スターラーやスリーワンモーター等で均一に攪拌して加水分解及び／又は乳化・分散させた後に、スプレードライ、フリーズドライ又は溶剤沈殿・乾燥から選ばれる１種の乾燥方法で乾燥することで、リパーゼ粉末製剤を製造することができる。  ここで、乾燥を、エステル化反応を伴う脱水により行うこともできる。すなわち、加水分解及び／又は乳化・分散させた後、続いて脱水しながらエステル化反応を行い、必要に応じて未反応物等の油分を濾過することにより、リパーゼ粉末製剤を製造することができる。
ここで、加水分解について説明をしておく。
リパーゼ及び豆類蛋白を溶解・分散させた水溶液に、脂肪酸エステル、又は脂肪酸エステルと脂肪酸を添加して行う加水分解反応は、特に限定されないが、常圧下で行うことができる。
加水分解反応の温度は、２０〜５０℃が好ましく、３０〜４５℃が特に好ましい。加水分解を終了させる時機は、原料として油脂を用いた場合、加水分解の進行の度合いをＧ度によって決定することができ、その程度は反応時間、水の量、撹拌条件等により異なる。  加水分解反応は、目的とするＧ度に達したときに終了させれば良く、Ｇ度が２．９〜０となるまで行うのが好ましく、２．５〜０の範囲内となることがより好ましい。ここで、Ｇ度が０とは、脂肪酸とグリセリンに完全に加水分解された状態を示す。
【００２０】
ここで、Ｇ度とは、加水分解反応途中に反応液を採取してトリメチルシリル化（ＴＭＳ化）したものをＧＣ（ガスクロマトグラフィー）分析し、各グリセリド（グリセリン(ＧＬＹ)、モノグリセリド(ＭＧ)、ジグリセリド(ＤＧ)、トリグリセリド(ＴＧ)）のピークエリア％を求めた。得られた数値を使ってＴＭＳ化された各グリセリドからのモル換算を行い、再度グリセリドの百分率として各成分（ＧＬＹ、ＭＧ、ＤＧ、ＴＧ）の存在比を求め、その値を次式にあてはめて算出することができる。
Ｇ度＝（ＭＧ＋２×ＤＧ＋３×ＴＧ）／１００  
また、脂肪酸エステルとして、脂肪酸の部分エステルを使用する場合は、加水分解処理を行わない方法、すなわち、リパーゼ及び豆類蛋白を溶解・分散させた水溶液に、脂肪酸エステル、又は脂肪酸エステルと脂肪酸を添加後、攪拌してただちにスプレードライ、フリーズドライ又は溶剤沈殿・乾燥から選ばれる１種の乾燥方法で乾燥することで、リパーゼ粉末製剤を製造することもできる。
脂肪酸のみを使用する場合は、リパーゼ及び豆類蛋白を溶解・分散させた水溶液に、脂肪酸を添加し、スターラーやスリーワンモーター等で均一に攪拌して乳化・分散させた後に、スプレードライ、フリーズドライ又は溶剤沈殿・乾燥から選ばれる１種の乾燥方法で乾燥することで、リパーゼ粉末製剤を製造することもできる。
【００２１】
リパーゼ粉末製剤の製造に使用する脂肪酸エステル及び／又は脂肪酸の添加量は、リパーゼ及び豆類蛋白の合計質量に対して０．１〜５００倍の質量であるのが好ましく、０．２〜１００倍の質量であるのがより好ましく、０．３〜５０倍の質量が最も好ましい。
ただし、スプレードライを使ってリパーゼ粉末製剤を製造する場合、使用する脂肪酸エステル及び／又は脂肪酸の添加量は、リパーゼ及び豆類蛋白の合計質量に対して０．１〜１０倍の質量であるのが好ましく、０．２〜１０倍の質量であるのがより好ましく、０．３〜１０倍の質量が最も好ましい。
スプレードライを使用する場合、脂肪酸エステル及び／又は脂肪酸の添加量が多くなると、水分の蒸発が不完全になったり、得られるリパーゼ粉末製剤が過剰な脂肪酸エステル及び／又は脂肪酸により回収しにくくなる等の問題が発生するからである。
スプレードライの装置の改良や回収形態の変更により、使用する脂肪酸エステル及び／又は脂肪酸の添加量の上限値を高くすることもできるが、必要以上に脂肪酸エステル及び／又は脂肪酸を含有すると濾過等の工程が必要となる。
脂肪酸エステル及び／又は脂肪酸を含有するリパーゼ粉末製剤を、溶剤沈殿を用いて製造する場合、使用する溶剤の量は、脂肪酸エステル及び／又は脂肪酸と、リパーゼ及び豆類蛋白を溶解・分散させた水溶液とを合計した全質量の値に対し、１〜１００倍の値の体積の溶剤を使用するのが好ましく、２〜１０倍の体積の溶剤を使用するのがより好ましい。
溶剤沈殿を行う前に、後に説明する濾過助剤を添加した場合には、更に濾過助剤を加えた質量を全質量として、溶剤を使用する。
【００２２】
次に、エステル化反応を伴う脱水による乾燥について説明する。すなわち、加水分解及び／又は乳化・分散させた後、続いて脱水しながらエステル化反応を行い、必要に応じて未反応物等の油分を濾過することにより、リパーゼ粉末製剤を製造することができる。
加水分解後に行うエステル化反応は、脱水しながら、常圧から１０ｈＰａ程度までの減圧度に達する環境下で行うことが好ましい。
エステル化反応の反応温度は特に限定されないが、２０〜８０℃が好ましく、３０〜６０℃がより好ましい。この温度範囲であると、エステル化反応がより早く進行し、さらに、リパーゼの失活を生じることが少ないからである。
エステル化反応を終了させる時機もエステル化の進行の度合いをＧ度によって決定することができ、その程度は反応温度、リパーゼ濃度により異なる。エステル化反応液のＧ度は、前述の方法で算出することができる。そして、目的とするＧ度に達したときに、エステル化反応を終了させる。
ここで、エステル化反応後、各グリセリドの合計を基準としてトリグリセリド含量が１００％となっていれば、エステル化反応液のＧ度は３．０となる。
本発明で行うエステル化反応は、反応後のＧ度の値が、加水分解後のＧ度の値から０．２以上増加した値となるよう行うことが好ましい。
そして、エステル化反応後のＧ度は、１．０〜２．９９であることが好ましい。
【００２３】
ここで、前述の加水分解の好ましい範囲と重なる部分が存在するが、これは、例えば加水分解後のＧ度が０．５のとき、エステル化反応により１．０程度までエステル化を行う場合や加水分解後のＧ度が１．５のとき、エステル化反応により２．０程度までエステル化を行う場合があるからである。
エステル化反応を終了させた後は、必要に応じて濾過により未反応物等の過剰な油分を除去して、本発明の脂肪酸エステル及び／又は脂肪酸を含有するリパーゼ粉末製剤を得ることができる。
上記乾燥により得られた後のリパーゼ粉末製剤が含有する脂肪酸エステル及び／又は脂肪酸（以下、含油分ともいう）の質量は、リパーゼ及び豆類蛋白の合計質量に対し０．０１〜５０倍であるのが好ましく、０．１〜１０倍であるのがより好ましい。
また、後に説明する濾過助剤を含む場合は、リパーゼ、豆類蛋白及び濾過助剤の合計質量に対し０．０１〜５０倍であるのが好ましく、０．１〜１０倍であるのがより好ましい。
また、後述するが、エステル交換又はエステル化に使用する原料を用いて、エステル化反応を伴う脱水により製造したリパーゼ粉末製剤を洗浄した場合であっても、リパーゼ粉末製剤が含有する脂肪酸エステル及び／又は脂肪酸の好ましい質量は、これと同じである。
【００２４】
本発明では、更に、濾過助剤を添加する工程を含むことができる。
乾燥を、エステル化反応を伴う脱水により行う場合は、エステル化反応前、エステル化反応中又はエステル化反応後に、濾過助剤を添加することができる。濾過助剤を添加することにより、エステル化反応をした後に濾過処理をスムーズに行うことができるので好ましい。
エステル化反応前又はエステル化反応中に濾過助剤を添加する場合は、その際に、更に油脂を添加してもよい。添加することにより粘度が増加し、撹拌が悪くなった場合は、このように油脂を追加することによって、反応溶液の流動性が良くなるからである。
使用できる濾過助剤としては、シリカゲル、セライト、セルロース、でんぷん、デキストリン、活性炭、活性白土、カオリン、ベントナイト、タルク、砂等があげられる。このうち、シリカゲル、セライト、セルロースが好ましい。濾過助剤の粒径は任意でよいが、１〜１００μｍが好ましく、５〜５０μｍが特に好ましい。
エステル化反応前後又は反応中に使用できる濾過助剤は、リパーゼ及び豆類蛋白の合計質量に対し１〜５００質量％の量を添加することが好ましく、１０〜２００質量％の量を添加することがさらに好ましい。この範囲の量を使用すると、濾過時の負担がより小さくなり、大規模な濾過設備や高度な遠心分離等の濾過前処理を必要としないからである。
【００２５】
また、本発明のエステル化反応を伴う脱水以外の乾燥方法により得られるリパーゼ粉末製剤中に濾過助剤を含有させることもできる。スプレードライ又はフリーズドライにより乾燥を行ってリパーゼ粉末製剤を得る場合には、乾燥の前又は後のどちらで濾過助剤を添加してもよい。
溶剤沈殿後に乾燥させる方法によって乾燥を行う場合には、乾燥して得られたリパーゼ粉末製剤へ濾過助剤を添加するのが好ましい。
得られたリパーゼ粉末製剤に含有させる濾過助剤の量は、リパーゼと豆類蛋白の合計質量を基準として１〜５００質量％とすることができ、１０〜２００質量％であることがさらに好ましい。
また、先に説明した製造方法で得られたリパーゼ粉末製剤を、脂肪酸エステル及び／又は脂肪酸で洗浄する工程を含む方法により精製することもできる。
洗浄は、先に説明した製造方法で得られたリパーゼ粉末製剤に、脂肪酸エステル及び／又は脂肪酸を加え、必要に応じて加熱をし、液体状態で攪拌後、濾過することにより行うことができる。
濾過は、自然濾過、吸引濾過、加圧濾過等の方法が挙げられる。
ここで、洗浄に使用する脂肪酸エステル及び／又は脂肪酸は、本発明のリパーゼ粉末製剤を用いてエステル交換反応を行う際に、原料として使用する脂肪酸エステル及び／又は脂肪酸と同じものを用いるのが好ましい。なぜなら、得られるエステル交換反応物への不純物の混入を避けることができるためである。
なお、エステル化反応を伴う脱水により乾燥してリパーゼ粉末製剤を得る場合は、かかる洗浄は、エステル化未反応物及び脂肪酸の濾過工程前、又は濾過工程後に行うことができるが、濾過工程後に行うのが好ましい。
【００２６】
次に、本発明のリパーゼ粉末製剤を用いてエステル交換反応又はエステル化反応することにより得られるエステル交換物又はエステル化物の製造方法について説明する。
本発明のリパーゼ粉末製剤を使用して行うエステル交換反応は、脂肪酸エステル、脂肪酸、及びアルコールから選ばれる１種以上と、脂肪酸エステルとのエステル交換反応であり、例えば、常法による油脂と油脂のエステル交換反応、油脂と脂肪酸エステルとのエステル交換反応、アルコリシスやアシドリシスのエステル交換反応が挙げられる。
また、本発明のリパーゼ粉末製剤を使用して行うエステル化反応は、脂肪酸の部分エステルと脂肪酸とのエステル化反応、又は一価又は多価アルコールと脂肪酸とのエステル化反応であり、例えば、グリセリンと脂肪酸とのエステル化反応等が挙げられる。
さらに詳細には、油脂と油脂とのエステル交換反応として、例えば、長鎖脂肪酸のトリグリセリドである菜種油と植物由来の中鎖脂肪酸のトリグリセリドであるトリオクタン酸グリセリドをエステル交換させる反応を行うことができ、長鎖と中鎖の混合したトリグリセリドを製造することができる。
また、油脂と脂肪酸によるアシドリシスを使ったエステル交換反応としては、リパーゼの持つ１，３-特異性リパーゼを大いに利用した構造油脂の製造をすることができる。グリセリン骨格の２位に特定の脂肪酸を残して１，３位の脂肪酸を目的の脂肪酸に置き換えるものである。得られたものはチョコレート等に使用する油脂へ利用でき、また特定の栄養効果を持つ油脂へ利用できる。
【００２７】
本発明のリパーゼ粉末製剤を用いたエステル交換反応やエステル化反応の条件については、特に限定するものではなく、常法により行うことができる。
一般的には、加水分解の原因となる水分の混入を避けながら、常圧又は減圧下にて行なわれる。反応温度としては、使用する原料及び原料を混合した混合物の凝固点にもよるが、２０〜８０℃程度で行うことが好ましく、凝固点により限定されなければ、４０〜６０℃で行うことがより好ましい。
また、リパーゼ粉末製剤の反応原料への添加量としては、０．０５〜１０質量％が好ましく、０.０５〜５質量％がより好ましい。最適な量は、反応温度、設定する反応時間、得られたリパーゼ粉末製剤の活性等により決定される。反応終了後、リパーゼ粉末製剤は濾過・遠心分離等により除かれ、製造が不可能な活性に低下するまで繰り返し使用（安定性の評価）できる。
したがって、通常、高価であるリパーゼは、できるだけ少量で高い活性と高い安定性とを同時にリパーゼ粉末製剤に付与できることが望ましい。
このようにして得られたエステル交換物又はエステル化物は、特に限定されないが、食品分野に使用されるエステル交換油脂又はエステル化油脂であることが好ましく、さらに宗教上の理由や健康上の理由などにより動物由来の蛋白や油脂を摂取できない人々のための食品又は食品添加剤を製造するのに使用できる植物油由来のエステル交換油脂又はエステル化油脂であることがより好ましい。
次に本発明を製造例及び実施例により詳細に説明する。
【実施例】
【００２８】
＜製造例１：青色エンドウ蛋白の抽出＞
乾燥状態の青色エンドウ１００グラムを水２００ｇに一晩浸漬して、水を含んだ状態の豆２１０ｇを得た（水分含量１１０ｇ）。ここに水１９０ｇを添加し、ミキサーで粉砕した。得られた豆粉砕液を１５℃の冷水浴下で、スターラーで撹拌しながら、２ｇのＮａＯＨを加えた水溶液２００ｇを少しずつ加えて約０．１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液となるように調整した。そのまま約３０分間放置して蛋白を可溶化した後、これを遠心分離機（ベックマン社製：ＧＳ−６ＫＲ）により、３０００ｒｐｍ、１５℃、１５分の条件下で遠心分離を行い、不溶性成分を分離した。得られた水相にクエン酸水溶液を滴下してｐＨを５〜６とし、蛋白を析出させた。遠心分離機により、３０００ｒｐｍ、１５℃、１５分の条件下で遠心分離を行い、沈殿物を回収した。この沈殿物をフリーズドライにより乾燥させて、乳鉢で粉砕し、粉末状の青色エンドウ抽出蛋白を得た。その収率は、使用した乾燥状態の青色エンドウ豆の質量を基準として、約１３質量％であった。また、この抽出物の蛋白含量をデュマ法により測定を行ったところ、窒素含量が約１２％となり、蛋白含量としては約７８％に相当する。
【００２９】
＜製造例２：赤色エンドウ蛋白の抽出＞
製造例１と同様に操作を行い、粉末状の赤色エンドウ抽出蛋白を得た。その収率は、約１６質量％であった。また、この抽出物の蛋白含量をデュマ法により測定を行ったところ、窒素含量が１２％となり、蛋白含量としては約７６％に相当する。
＜製造例３：青色ソラマメ蛋白の抽出＞
製造例１と同様に操作を行い、粉末状の青色ソラマメ抽出蛋白を得た。その収率は、約２０質量％であった。また、この抽出物の蛋白含量をデュマ法により測定を行ったところ、窒素含量が１３％となり、蛋白含量としては約８３％に相当する。
＜製造例４：オタフクソラマメ蛋白の抽出＞
製造例１と同様に操作を行い、粉末状のオタフクソラマメ抽出蛋白を得た。その収率は、約１７質量％であった。また、この抽出物の蛋白含量をデュマ法により測定を行ったところ、窒素含量が１３％となり、蛋白含量としては約８３％に相当する。
＜製造例５：ＰＰ−ＣＳ＞
市販されている黄色エンドウ蛋白（商品名：ＰＰ−ＣＳ、オルガノ ダニスコ フードテクノ（株））の蛋白含量をデュマ法により測定を行ったところ、窒素含量が１３％となり、蛋白含量としては約８３％に相当する。
＜製造例６：ダイズ蛋白＞
市販されているダイズ蛋白（商品名：ソルピー５０００、日清オイリオグループ（株））の蛋白含量をデュマ法により測定を行ったところ、窒素含量が１４％となり、蛋白含量としては約９０％に相当する。
【００３０】
＜実施例１＞
撹拌機付き反応容器に粉末リパーゼ（商品名：リパーゼＤ：加水分解活性１９００万Ｕ／ｇ、天野エンザイム（株）、以下同じ）０．１ｇと水１２ｍｌ（粉末リパーゼ及び豆類蛋白の合計質量に対し５．７倍、以下同様に示す）を添加し、撹拌しながら溶解・分散させてリパーゼ含有水溶液とした。
このリパーゼ含有水溶液に対して、製造例５記載の黄色エンドウ蛋白（ＰＰ−ＣＳ）２．０ｇ（粉末リパーゼ質量に対し２０倍、以下同様に示す）を添加し、撹拌して、溶解・分散させた。
ここに油脂としてハイオレイックひまわり油（商品名：オレインリッチ、昭和産業(株)）５０ｇ（粉末リパーゼ及び豆類蛋白の合計質量に対し２３．８倍、以下同様に示す）を添加した。水浴を用いて反応容器内の温度を４０℃に維持しながら２時間撹拌して、油脂を加水分解させた。このときのＧ度は１．８であった。
この溶液を４０℃に維持したまま、粉末セルロース（商品名：ＫＣフロック（平均粒子径約１０μｍ）、日本製紙ケミカル（株））２ｇ（粉末リパーゼ及び豆類蛋白の合計質量に対し９５質量％、以下同様に示す）を添加して２０時間、減圧ポンプを用いて減圧しながら撹拌することにより、過剰な水を除去し、続いて脱水エステル化反応を行った。最終の減圧度は約２５ｈＰａであった。得られた溶液のＧ度は２．４であった。
得られた溶液の全量を定量濾紙（アドバンテック東洋（株））を用いて濾過することで、過剰な油脂やエステル化未反応物及び脂肪酸を除去した。さらに、目的のエステル交換反応の原料油脂（トリオクタン酸グリセリド：ハイオレイックひまわり油を１：１の質量比で混合し、モレキュラーシーブスで乾燥処理した油脂）約１０ｇで洗浄・濾過し、精製したリパーゼ粉末製剤(１)７．３ｇを得た。濾過助剤を含めた固形分の合計質量の１００％が回収されたと仮定した時、含油分は０．８倍であった。
【００３１】
＜実施例２＞
実施例１で使用した黄色エンドウ蛋白を製造例１で得られた青色エンドウ抽出蛋白に置き換えた以外の原料及び操作は同様に行った。加水分解後のＧ度は１．９であった。得られた溶液のＧ度は２．５であった。洗浄・濾過により得られたリパーゼ粉末製剤(２)６．５ｇを得た。含油分は０．６倍であった。
＜実施例３＞
実施例１で使用した黄色エンドウ蛋白を製造例２で得られた赤色エンドウ抽出蛋白に置き換えた以外の原料及び操作は同様に行った。加水分解後のＧ度は２．０であった。得られた溶液のＧ度は２．５であった。洗浄・濾過により得られたリパーゼ粉末製剤(３)６．４ｇを得た。含油分は０．６倍であった。
＜実施例４＞
実施例１で使用した黄色エンドウ蛋白を製造例３で得られた青色ソラマメ抽出蛋白に置き換えた以外の原料及び操作は同様に行った。加水分解後のＧ度は１．８であった。得られた溶液のＧ度は２．５であった。洗浄・濾過により得られたリパーゼ粉末製剤(４)７．１ｇを得た。含油分は０．７倍であった。
＜実施例５＞
実施例１で使用した黄色エンドウ蛋白を製造例４で得られたオタフクソラマメ抽出蛋白に置き換えた以外の原料及び操作は同様に行った。加水分解後のＧ度は１．９であった。得られた溶液のＧ度は２．５であった。洗浄・濾過により得られたリパーゼ粉末製剤(５)６．９ｇを得た。含油分は０．７倍であった。
【００３２】
＜実施例６＞
実施例１で使用した黄色エンドウ蛋白を製造例６記載のダイズ蛋白に置き換え、水を２０ｍｌ（９．５倍）、ハイオレイックひまわり油を１８ｇ（８．６倍）とした以外の原料及び操作は同様に行った。加水分解後のＧ度は１．６であった。得られた溶液のＧ度は１．９であった。洗浄・濾過により得られたリパーゼ粉末製剤(６)１０．２ｇを得た。含油分は１．５倍であった。
＜実施例７＞
実施例１で使用したハイオレイックひまわり油をナタネ油（商品名：キャノーラ油、日清オイリオグループ（株））、粉末セルロースの平均粒子径約を２８μｍの製品に置き換えた以外の原料及び操作は同様に行った。加水分解後のＧ度は１．９であった。得られた溶液のＧ度は２．７であった。洗浄・濾過により得られたリパーゼ粉末製剤(７)５．８ｇを得た。含油分は０．４倍であった。
＜実施例８＞
実施例１で使用した粉末セルロースをセライト（商品名：ロカヘルプ、三井金属鉱業（株））に置き換え、ハイオレイックひまわり油を１２ｇ（５．７倍）として、また濾過助剤としてエステル化反応前に添加するのを反応終了の１時間前に一旦常圧に戻して添加した以外の原料及び操作は同様に行った。加水分解後のＧ度は１．０であった。得られた溶液のＧ度は２．１であった。洗浄・濾過により得られたリパーゼ粉末製剤(１４)８．９ｇを得た。含油分は１．２倍であった。
【００３３】
＜実施例９＞
実施例１で使用した黄色エンドウ蛋白を４ｇ（４０倍）、水を２４ｇ（５．９倍）として、また濾過助剤を加えなかった以外の原料及び操作は同様に行った。加水分解後のＧ度は１．９であった。得られた溶液のＧ度は２．１であった。洗浄・濾過により得られたリパーゼ粉末製剤(９)７．８ｇを得た。含油分は０．９倍であった。
＜実施例１０＞
実施例１で使用した黄色エンドウ蛋白を１ｇ（１０倍）、水を８ｇ（７．３倍）とした以外の原料及び操作は同様に行った。加水分解後のＧ度は１．８であった。得られた溶液のＧ度は２．４であった。洗浄・濾過により得られたリパーゼ粉末製剤(１０)４．７ｇを得た。含油分は０．５倍であった。
＜比較例１＞
実施例１で使用した黄色エンドウ蛋白を使用せず、水を４ｇ（４０倍）とした以外の原料及び操作は同様に行った。加水分解後のＧ度は２．４であった。得られた溶液のＧ度は２．６であった。洗浄・濾過により得られた蛋白未使用リパーゼ粉末製剤(１)２．８ｇを得た。含油分は０．３倍であった。
【００３４】
＜実施例１１＞
撹拌機付き反応容器にリパーゼＤ０．１ｇと水９ｍｌ（５．６倍）を添加し、撹拌しながら溶解・分散させてリパーゼ含有水溶液とした。
このリパーゼ含有水溶液に対して、製造例５記載の黄色エンドウ蛋白（ＰＰ−ＣＳ）１．５ｇ（１５倍）を添加し、撹拌して、溶解・分散させた。
ここに油脂としてハイオレイックひまわり油１．０ｇ（０．６倍）を添加した。水浴を用いて反応容器内の温度を４０℃に維持しながら１時間撹拌して、油脂を加水分解させた。このときのＧ度は０．８であった。
この溶液を４０℃に維持したまま粉末セルロース１ｇ（６０質量％）を添加し撹拌した後、スプレードライヤー（ＳＤ−１０００型：東京理化器械（株）社製）を用い、入口温度１３０℃、乾燥空気量０．７〜１．１ｍ3/ｍｉｎ、噴霧圧力１１〜１２ｋＰａの条件下噴霧して、リパーゼ粉末製剤(１１)１．７ｇを得た。なお、本条件では添加油分が少ないため、含油分は仕込み時の換算とすると０．４倍となる。
＜実施例１２＞
実施例１１で使用した黄色エンドウ蛋白を２ｇ（２０倍）、水を１１ｇ（５．２倍）、ハイオレイックひまわり油を１．６ｇ（０．８倍）、粉末セルロースを１．２ｇ（６０質量％）とした以外の原料及び操作は同様に行った。加水分解後のＧ度は１．０であった。リパーゼ粉末製剤(１２)２．６ｇを得た。含油分は仕込み時の換算とすると０．５倍となる。
【００３５】
＜実施例１３＞
実施例１２で油脂として使用したハイオレイックひまわり油を部分グリセリドと脂肪酸の混合物に置き換えた。部分グリセリドとしては、サフラワー油由来の脂肪酸のモノグリセリド（商品名：サンソフト８０９０、太陽化学（株））０．６ｇを、脂肪酸としてはオレイン酸（試薬名：オレイン酸、東京化成工業（株））１．０ｇを混合して使用した。また、この際、約２５℃の室温下で作業を行い、リパーゼ含有水溶液に撹拌しながら黄色エンドウ蛋白と粉末セルロースを同時に加え、最後に部分グリセリドと脂肪酸の混合物を加えることで、特に加水分解の操作は除いて素早くスプレードライを行った。それによりリパーゼ粉末製剤(１３)２．４ｇを得た。含油分は仕込み時の換算とすると０．５倍となる。
＜実施例１４＞
実施例１３で使用した部分グリセリドと脂肪酸の混合物をオレイン酸のみに置き換えた以外の原料及び操作は同様に行った。それによりリパーゼ粉末製剤(１４)２．８ｇを得た。含油分は仕込み時の換算とすると０．５倍となる。
＜実施例１５＞
実施例１２で使用した黄色エンドウ蛋白を赤色エンドウ抽出蛋白に置き換えた以外の原料及び操作は同様に行った。加水分解後のＧ度は１．６であった。それによりリパーゼ粉末製剤(１５)２．３ｇを得た。含油分は仕込み時の換算とすると０．５倍となる。
【００３６】
＜実施例１６＞
実施例１２で使用したハイオレイックひまわり油を０．８ｇ（０．４倍）とした以外の原料及び操作は同様に行った。加水分解後のＧ度は０．７であった。それによりリパーゼ粉末製剤(１６)２．１ｇを得た。含油分は仕込み時の換算とすると０．２倍となる。
＜実施例１７＞
実施例１２で使用した黄色エンドウ蛋白を４ｇ（４０倍）、水を２２ｇ（５．４倍）、ハイオレイックひまわり油を３．０ｇ（０．７倍）とした以外の原料及び操作は同様に行った。加水分解後のＧ度は１．９であった。それによりリパーゼ粉末製剤(１７)５．２ｇを得た。含油分は仕込み時の換算とすると０．６倍となる。
＜比較例２＞
実施例１２で使用した黄色エンドウ蛋白を使用せず、粉末セルロースを３．２ｇ（３２０質量％）とした以外の原料及び操作は同様に行った。加水分解後のＧ度は１．４であった。それにより蛋白未使用リパーゼ粉末製剤(２)２．２ｇを得た。含油分は仕込み時の換算とすると０．５倍となる。
【００３７】
＜実施例１８＞
撹拌機付き反応容器にリパーゼＤ０．１ｇと水１０ｍｌ（５．６倍）を添加し、撹拌しながら溶解・分散させてリパーゼ含有水溶液とした。
このリパーゼ含有水溶液に対して、製造例５記載の黄色エンドウ蛋白（ＰＰ−ＣＳ）１．７ｇ（１７倍）を添加し、撹拌して、溶解・分散させた。
ここに油脂としてハイオレイックひまわり油１０ｇ（５．６倍）を添加した。水浴を用いて反応容器内の温度を４０℃に維持しながら１時間撹拌して、油脂を加水分解させた。このときのＧ度は１．４であった。
この溶液を、予め０℃以下に冷却したエタノール約１８０ｍｌ（８．３倍）に徐々に添加し沈殿物を得た。得られた沈殿物を遠心分離機（ベックマン社製：ＧＳ−６ＫＲ）により、３０００ｒｐｍ、１５℃、１５分の条件下で遠心分離を行って沈殿を回収した後、フリーズドライヤー（東京理科器械（株）社製：ＦＤＵ−８３０）で１６〜２０時間、室温にて減圧乾燥してリパーゼ粉末製剤(１８)２．０ｇを得た。なお、溶剤沈殿では回収率が低いのに加え、溶剤に油分が大部分溶解してしまうため、含油分は不明である。
＜実施例１９＞
実施例１８で油脂として使用したハイオレイックひまわり油を部分グリセリドに置き換えた。部分グリセリドとしては、サフラワー油由来の脂肪酸のモノグリセリド（商品名：サンソフト８０９０、太陽化学（株））１０ｇを使用した。また、この際、約２５℃の室温下で作業を行い、リパーゼ含有水溶液に撹拌しながら黄色エンドウ蛋白を加え、最後に部分グリセリドを加えることで、特に加水分解の操作は除いて素早く溶剤沈殿を行った。この際のエタノールの量は１００ｍｌ（４．６倍）とした。それによりリパーゼ粉末製剤(１９)１．９ｇを得た。
【００３８】
＜実施例２０＞
実施例１８で使用した黄色エンドウ蛋白を赤色エンドウ抽出蛋白に置き換えた以外の原料及び操作は同様に行った。この際のエタノールの量は１００ｍｌ（４．６倍）とした。加水分解後のＧ度は２．１であった。それによりリパーゼ粉末製剤(２０)３．５ｇを得た。
＜実施例２１＞
実施例１８で油脂として使用したハイオレイックひまわり油を油脂から加水分解を行ってＧ度が約１程度になる時の加水分解物の組成に調整した配合油（Ｇ＝約１）に置き換えた。配合油（Ｇ＝約１）の調整は、ＧＣ分析値から分子量換算を行って各配合成分の組成質量を求め、各成分を混合した。さらに具体的には、グリセリン（試薬名：グリセリン、東京化成工業（株））２．４ｇ、サフラワー油由来の脂肪酸のモノグリセリド１０．０ｇ、ジグリセリド油９．９ｇ、ハイオレイックひまわり油１１．４ｇ、オレイン酸６６．３ｇを混合して１００ｇの配合油（Ｇ＝約１）を作成した。また、黄色エンドウ蛋白を３．０ｇ（３０倍）、水を２５ｍｌ（８．１倍）、配合油（Ｇ＝約１）を２５ｇ（８．１倍）として行った。この際、約２５℃の室温下で作業を行い、リパーゼ含有水溶液に撹拌しながら黄色エンドウ蛋白を加え、最後に配合油（Ｇ＝約１）を加えることで、特に加水分解の操作は除いて素早く溶剤沈殿を行った。この際のエタノールの量は２５０ｍｌ（４．７倍）とした。それによりリパーゼ粉末製剤(２１)３．５ｇを得た。
【００３９】
＜実施例２２＞
実施例２１で使用した配合油（Ｇ＝約１）をＧ度が約２となるように同様な計算を行って調整した配合油（Ｇ＝約２）に置き換えた。具体的には、グリセリン０．５ｇ、サフラワー油由来の脂肪酸のモノグリセリド５．６ｇ、ジグリセリド油３３．７ｇ、ハイオレイックひまわり油２５．９ｇ、オレイン酸３４．４ｇを混合して１００ｇの配合油（Ｇ＝約２）を作成した。また、黄色エンドウ蛋白を０．５ｇ（５倍）、水を１ｍｌ（１．７倍）、配合油（Ｇ＝約２）を１０ｇ（１６．７倍）として行った。この際、約２５℃の室温下で作業を行い、リパーゼ含有水溶液に撹拌しながら黄色エンドウ蛋白を加え、最後に配合油（Ｇ＝約２）を加えることで、特に加水分解の操作は除いて素早く溶剤沈殿を行った。この際のエタノールの量は５５ｍｌ（４．７倍）とした。それによりリパーゼ粉末製剤(２２)０．９ｇを得た。
＜比較例３＞
実施例１８で使用した黄色エンドウ蛋白を使用せず、粉末セルロースを１．７ｇ（１７０質量％）とした以外の原料及び操作は同様に行った。加水分解後のＧ度は１．５であった。それにより蛋白未使用リパーゼ粉末製剤(３)２．１ｇを得た。
【００４０】
＜実施例２３：エステル交換活性能の評価＞
実施例１〜２２及び比較例１〜３で得られたリパーゼ粉末製剤を使用してエステル交換反応を行い、エステル交換活性能を調べた。
エステル交換反応の原料として、トリオクタン酸グリセリド：ハイオレイックひまわり油を１：１の質量比で混合し、モレキュラーシーブスで乾燥処理した油脂（以下、エステル交換原料油脂という）を使用した。
油脂のエステル交換反応は、まず、反応容器にエステル交換原料油脂、及び各種リパーゼ粉末製剤を仕込み、６０℃で反応させることにより行った。なお、リパーゼ粉末製剤は、エステル交換原料油脂に対して、各処理法毎に以下のように添加量を定義して添加した。エステル化反応を伴う脱水により得られた実施例１〜１０及び、比較例１のリパーゼ粉末製剤の場合、リパーゼＤ（１９００万Ｕ／ｇ）に換算して０．０５質量％使用した。リパーゼＤの換算方法は、次のようになる。使用したリパーゼＤが得られたリパーゼ粉末製剤中に１００％含まれると仮定し、例えば、リパーゼＤ（１９００万Ｕ／ｇ）０．１ｇを使用して、リパーゼ粉末製剤の収量が１０ｇの時は、リパーゼ粉末製剤中のリパーゼＤの含量は１質量％となる。エステル交換原料油脂を１０ｇ使用した場合、このリパーゼ粉末製剤を０．５ｇ添加する。添加量の設定は測定を短時間で行うために調整しており、製造に使用する場合はより少量の添加でよいことになる。
【００４１】
また、スプレードライにより得られた実施例１１〜１７及び、比較例２のリパーゼ粉末製剤の場合、エステル交換原料油脂に対してこのリパーゼ粉末製剤を２質量％添加した。その際のリパーゼＤ含量は、水を除く全ての原料中のリパーゼＤの含量から計算により求めた。例えば、リパーゼＤを０．１ｇ、黄色エンドウ蛋白を２ｇ、粉末セルロースを１．２ｇ、ハイオレイックひまわり油を１．６ｇ使用した時、そのリパーゼ粉末製剤中のリパーゼＤ含量は２．１質量％となる。この場合、リパーゼＤを０．０４２質量％添加したこととなる。フリーズドライにより得られたリパーゼ粉末製剤の場合も同様に測定する。
溶剤沈澱法により得られた実施例１８〜２２及び、比較例３のリパーゼ粉末製剤の場合、エステル交換原料油脂に対してこのリパーゼ粉末製剤を２質量％添加した。その際のリパーゼＤ含量は、エステル化反応を伴う脱水の場合と同様に算出した。例えば、リパーゼＤ（１９００万Ｕ／ｇ）０．１ｇを使用して、収量が２ｇの時のリパーゼＤ含量は５.０質量％となり、リパーゼＤを０．１質量％添加したこととなる。
【００４２】
次に、エステル交換反応により生成したモノオレイン酸置換体の生成率を次に示す式より求め、エステル交換活性の指標となる反応速度定数Ｋを計算した。
モノオレイン酸置換体の生成率（％）＝
{モノオレイン酸置換体／(トリオクタン酸グリセリド＋モノオレイン酸置換体)}×１００
具体的には、ＧＣ分析により得られたトリオクタン酸グリセリドからトリオレイン酸グリセリドまでのピークのエリア％の数値の内、トリオクタン酸グリセリド及びジオクタン酸モノオレイン酸グリセリド（モノオレイン酸置換体）のエリア％の数値を用い、上記式からモノオレイン酸置換体の生成率を計算した。
なお、ＧＣ分析は、カラム温度：初期５０℃、昇温１５℃/ｍｉｎ.、最終３７０℃の条件で行った。
反応開始から反応終了までの間の数点の反応時間におけるモノオレイン酸置換体の生成率（％）の値を解析ソフト（Ｏｒｉｇｉｎ  Ver.6.1）に入力することにより、各種リパーゼ粉末製剤中に含まれるリパーゼを基準とした反応速度定数Ｋ（リパーゼ当たりの反応速度定数）をＫ１として算出した。この活性測定の反応時間は約１時間である。
上記測定方法により得られた反応速度定数Ｋをそれぞれ、各種乾燥方法毎に分けて表１〜３に示した。
【００４３】
＜活性持続性能の測定法＞
実施例１〜２２及び比較例１〜３で得られたリパーゼ粉末製剤を使用してエステル交換反応を行い、安定性の評価の指標としてエステル交換活性持続性能を調べた。
エステル交換反応の原料、反応条件及び、各種リパーゼ粉末製剤中に含まれるリパーゼを基準とした反応速度定数Ｋ（リパーゼ当たりの反応速度定数）の算出はエステル交換活性の測定と同様に行った。
また、活性持続性能を調べる時の反応方法はバッチ式で行い、２３時間を１バッチとして４バッチ行った。バッチ間のリパーゼ粉末製剤の濾過・回収の時間は加えず、４バッチ後に行った活性測定の１時間を足して９３時間とした。なお、バッチ間の濾過によるリパーゼ粉末製剤の減量はないものとして反応速度定数Ｋを求めた。
エステル交換活性持続性能の指標として、反応スタート時のエステル交換活性（Ｋ１）、及び反応９３時間のエステル交換活性（Ｋ２）から次式（Ｉ）を用いて半減期（ｈ）を求めた。さらに、反応スタート時のエステル交換活性の高さとエステル交換活性持続性能の両方を考慮した指標として、反応スタート時のエステル交換活性（Ｋ１）、及び半減期（ｈ）から次式（II）を求めた。具体的には、Ｋ１から半減期に達するまでの時間により求めた面積を半値面積として定義し、計算により求めた。これにより、高活性で半減期の短いものと低活性でも半減期が長いものを比較することができる。
【００４４】
各処理法の比較例１〜３（蛋白不使用）の半値面積を各々１００とした場合の各種リパーゼ粉末製剤のエステル交換活性持続性能も半値面積相対値で表した。
（Ｉ）    ＝９３×（Ｋ１）／２／｛（Ｋ１）−（Ｋ２）｝
（II）    ＝１．５×（Ｋ１）×（Ｉ）／２
上記測定及び計算方法により得られたＫ２、（Ｉ）及び半値面積相対値をそれぞれ、各種乾燥方法毎に分けて表１〜３に示した。
【００４５】
【表１】
2007068426.tif 000002
【００４６】
表１の結果から明らかなように、豆類蛋白を含有させずにエステル化反応を伴う脱水にて製剤化を行った比較例１の場合、ある程度エステル交換能は向上するが、半減期が５０時間と短く製造には適さない。一方、本発明の豆類蛋白を含有させたリパーゼ粉末製剤は、リパーゼ当りの反応速度定数Ｋが、比較例１と比較し、約２〜３倍の値となり、また、半減期も長かった。さらに、活性の高さと活性持続性能の両方を考慮した半値面積相対値は約４〜５０倍の値となり、得られたリパーゼ粉末製剤が非常に優れていることが分かった。
【００４７】
【表２】
2007068426.tif 000003
【００４８】
表２の結果から明らかなように、豆類蛋白を含有させずスプレードライにて製剤化を行った比較例２の場合、ある程度エステル交換能は向上するが、半減期が４９時間と短く製造には適さない。一方、本発明の豆類蛋白を含有させたリパーゼ粉末製剤は、リパーゼ当りの反応速度定数Ｋが、比較例２と比較し、約１〜３倍の値となり、また、半減期も長かった。さらに、活性の高さと活性持続性能の両方を考慮した半値面積相対値は約４〜５０倍の値となり、得られたリパーゼ粉末製剤が非常に優れていることが分かった。
【００４９】
【表３】
2007068426.tif 000004
【００５０】
表３の結果から明らかなように、豆類蛋白を含有させず溶剤沈殿・乾燥にて製剤化を行った比較例３の場合、ある程度エステル交換能は向上するが、半減期が６０時間と短く製造には適さない。一方、本発明の豆類蛋白を含有させたリパーゼ粉末製剤は、リパーゼ当りの反応速度定数Ｋが、比較例３と比較し、約１〜２倍の値となった。また、半減期はいずれも長かった。さらに、活性の高さと活性持続性能の両方を考慮した半値面積相対値は約２〜１３０倍の値となり、得られたリパーゼ粉末製剤が非常に優れていることが分かった。リパーゼ当りの反応速度定数Ｋが比較例３と同等又は低いものであっても、活性持続性能が高いことにより実際の製造では優位であることが明らかである。
また、表１〜３の結果から分かるように、乾燥方法により、得られるリパーゼ粉末製剤のリパーゼ当たりの初期活性値が異なっていた。リパーゼ当たりの初期活性値が最も高かったのは、エステル化反応を伴う脱水による乾燥で製造したものであり、次に高かったのは、スプレードライによる乾燥で製造したものであった。