(57)【要約】【課題】従来捨てられていたエゾリンドウ根や葉を有効に利用する。【解決手段】リンドウ属（Gentiana spp）植物の粗抽出物又はこれから得た精製物を有効成分とし、経口剤又は外用剤とする制癌剤である。リンドウ属植物としてはエゾリンドウ（Gentiana triflora）が好ましく用いられる。植物の部位としては、根又は葉が好ましく用いられ、特に根が好ましい。粗抽出物又は精製物は健康補助食品（サプリメント）や薬用化粧品としても使える。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンドウ属（Gentiana spp）植物の粗抽出物又はこれから得た精製物を有効成分とし、製剤形態は経口剤又は外用剤であることを特徴とする制癌剤。
【請求項２】
リンドウ属（Gentiana spp）植物はエゾリンドウ（Gentiana triflora）である、請求項１の制癌剤。
【請求項３】
リンドウ属（Gentiana spp）植物の部位は根又は葉である、請求項１又は２の制癌剤。
【請求項４】
抽出媒体は水である、請求項１〜３いずれかの制癌剤。
【請求項５】
リンドウ属（Gentiana spp）植物の粗抽出物又はこれから得た精製物を含む健康補助食品（サプリメント）。
【請求項６】
リンドウ属（Gentiana spp）植物の粗抽出物又はこれから得た精製物を含む薬用化粧品。
【請求項７】
制癌活性を有するリンドウ粗抽出物の製造方法であって、次の（ａ）〜（ｅ）の工程を含むことを特徴とするリンドウ粗抽出物の製造方法：
（ａ）リンドウ属（Gentiana spp）植物を細断する工程；
（ｂ）細断物を沸騰水で処理する工程；
（ｃ）不溶物を除去（濾過）する工程；
（ｄ）（オートクレーブ）加圧下に加熱処理する工程；及び
（ｅ）必要に応じて乾燥する工程。
【請求項８】
リンドウ属（Gentiana spp）植物としてエゾリンドウ（Gentiana triflora）を用い、部位として根又は葉を用いる、請求項７の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リンドウ属（Gentiana spp）植物の抽出物を有効成分として含む制癌剤、健康補助食品（サプリメント）及び薬用化粧品、並びに、リンドウ属（Gentiana spp）植物から（制癌活性を有する）リンドウ抽出物を製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
リンドウは比較的寒冷な高地に生息する多年生植物で、その根は中国名で「ロンダン」（和名：竜胆、リュウタン）と呼ばれる漢方薬である。健胃、食欲増進、肝機能亢進その他の効能があると言われ、湯剤、散剤、丸剤、粉末塗布剤として用いられてきた（神農本草経などに記述）。これら効能のすべてについて科学的根拠が示されているわけではないが、リンドウ根については、次の表１に示すように、興味ある薬効・薬理作用が幾つか報告されている。
【０００３】
【表１】
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【０００４】
注１）ＰＡＦ：血小板活性化因子(platelet activating factor)。アナフィラクティックショックに関連。(Huh, H. et al. (1998) Arch. Pharm. Res., 21, 436-439)
注２）アルドース還元酵素は糖尿病合併症の角膜障害を亢進。糖尿病患者の一部では、角膜上皮（特に基底細胞）、角膜内皮細胞、神経シュワン細胞にアルドース還元酵素の活性が認められる。この酵素の阻害剤（リンドウではない）で臨床的改善が認められる。(Zhang, J.Q. and Zhou, Y.P. (1989) Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 14, 557-559, 576)  （中国語）
注３）四塩化炭素（ＣＣｌ4）による肝臓障害に関係する血中および肝臓中のマロンジアルデヒドの形成（脂質過酸化の指標）を阻害する。同時に、その血中での上昇が肝臓障害の指標となるＡＳＴ（アスパラギン酸トランスアミナーゼ）やＡＬＴ（グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ）などの酵素活性の上昇を抑制する。 (Aktay, G. et al. (2000) J. Ethnopharmacol., 73, 121-129; Kondo, Y. and Hojo, H. (1994) Planta Med., 60, 414-416 )
注４）カンジダアルビカンスの増殖を阻害する。（Tan, RX et al. (1996) Phytochemistry 4, 111-116）
【０００５】
表１に記載したリンドウの中で、G. scabla (Gentiana scabla var. buergeri) は、ササリンドウ（あるいはトウリンドウ）と呼ばれる種類のものであり、中国漢方薬に用いられてきた主たるものである。このリンドウは中国、東ロシア、韓国、日本に自生する。
G. luteaは黄色い花をつけるヨーロッパ種のリンドウで、この根の抽出物や散剤は、胃、腸管に対して弱い刺激作用があり、消化不良や食欲不振および消化液欠乏患者に用いられる。また、G. luteaの根を浸したリキュールがフランスその他の外国で生産、販売されており、日本にも輸入されている。
G. olivieriはトルコの民間伝承薬として用いられているリンドウである。
このように、リンドウ科植物の根は中国に限らず、ヨーロッパでも伝承薬として用いられてきた歴史があり、何らかの薬効・薬理作用があると信じられている。
【０００６】
日本にはエゾリンドウ（Gentiana triflora  var. japonica）と呼ばれるGentiana triflora の変種が生息している。このリンドウは日本、韓国、東ロシアに自生するが、ササリンドウ（G. scabla）とは草本の形態、花の形態および越冬芽（次年度萌芽する栄養繁殖の芽）の形態などが異なる。切り花用品種として日本で育種が進み、かなりの量が生産されている。しかし、このエゾリンドウの抽出物についての薬効・薬理の研究例は少なく、現在、漢方薬の素材としては使われていない。植物病原菌に対する新規抗菌性タンパク質とその遺伝子が知られている程度である（特許文献１参照）。
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−８８３８６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述したように、日本在来種のエゾリンドウ（Gentiana triflora）は、日本では切り花用品種として育種が進み、かなりの量が生産されているが、その根は不要物（農業廃棄物）として捨てられている。本発明は、従来捨てられていたこれらエゾリンドウ根を有効に利用しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、これらエゾリンドウ根を有効に利用する研究を種々試みた結果、このエゾリンドウ根の水溶性抽出物中に、培養ガン細胞の増殖又はマウスに移植した固形ガンの増殖を阻害する物質が存在することを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、リンドウ属（Gentiana spp）植物の粗抽出物又はこれから得た精製物を有効成分とし、製剤形態は経口剤又は外用剤であることを特徴とする制癌剤である。
【００１１】
ここで、リンドウ属（Gentiana spp）植物としてはエゾリンドウ（Gentiana triflora）が好ましく用いられる。
また、リンドウ属（Gentiana spp）植物の部位としては、根又は葉が好ましく用いられ、特に根が好ましく用いられる。
また、リンドウ属（Gentiana spp）植物からの抽出に用いる媒体は水を主とする水性媒体が好ましく、水に加えてアルコール等の水に可溶な有機溶媒との混合液であってもよい。
【００１２】
また、本発明は、リンドウ属（Gentiana spp）植物の粗抽出物又はこれから得た精製物を含む健康補助食品（サプリメント）も提供する。
【００１３】
また、本発明は、リンドウ属（Gentiana spp）植物の粗抽出物又はこれから得た精製物を含む薬用化粧品も提供する。
【００１４】
更には、本発明は、次の工程（ａ）〜（ｅ）、すなわち、
（ａ）リンドウ属（Gentiana spp）植物を細断する工程；
（ｂ）細断物を沸騰水で処理する工程；
（ｃ）不溶物を除去（濾過）する工程；
（ｄ）（オートクレーブ）加圧下に加熱処理する工程；及び
（ｅ）必要に応じて乾燥する工程；
を含んでなる（制癌活性を有する）リンドウ粗抽出物の製造方法も提供する。
なお、上記工程（ａ）〜（ｅ）は、必ずしもこの順序で行う必要はなく、（ａ）−（ｂ）−（ｄ）−（ｃ）−（ｅ）等の順でもよい。また、工程（ｅ）を行なったあと、あるいは行うことなく、更に別の精製工程を加えてもよい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の制癌剤は、特定の癌細胞・癌組織を標的とする癌治療用医薬品あるいは癌予防医薬品として有用である。
また、本発明の健康補助食品は予防医学的なサプリメントとしての有用性が期待される。
また、本発明の薬用化粧品は皮膚癌などの予防に有用性が期待される。
本発明の製造方法により、リンドウ属（Gentiana spp）植物から制癌活性を有するリンドウ抽出物を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
更に本発明を詳述する。本発明におけるリンドウ属（Gentiana spp）植物の粗抽出物又はこれから得た精製物は、培養ガン細胞の増殖又はマウスに移植した固形ガンの増殖を阻害するので、制癌剤に用いることができる。また、健康補助食品（サプリメント）としても用いることができ、また、化粧品に混ぜて薬用化粧品とすることもできる。
本発明の制癌剤の製剤形態は、先に述べたように、経口剤又は外用剤とする。これら経口剤又は外用剤は、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤などの固形製剤、液剤、シロップ剤などの液体製剤、あるいは軟膏剤、クリーム剤、坐剤などの半固形製剤などとすることができる。また、顆粒剤及び散剤は、カプセル剤として単位量を投与する形態とすることもでき、液体製剤の場合は乾燥物を投与前に再溶解させる形態でもよい。
また、これら剤形のうち、経口剤又は外用剤は、リンドウ属（Gentiana spp）植物から抽出した有効成分のほかに、一般に製剤に使用される結合剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、安定剤、緩衝剤、矯味剤、保存剤、芳香剤、着色剤などの添加剤を含有させることができる。
また、その投与量は、投与対象の年齢、投与経路、投与回数等により異なるので、場合に応じて適宜最適な量を決めればよい。
【００１７】
本発明の健康補助食品（サプリメント）あるいは薬用化粧品は、公知の製剤技術又は化粧品製造技術によって、リンドウ属（Gentiana spp）植物の粗抽出物又はこれから得た精製物を含む製剤（錠剤、ソフトカプセル、等）又は化粧品（クリーム、化粧水、等）を製造することにより得られる。
【００１８】
以下、添付図面を参照しながら、本発明における実施例を具体的に説明する。
なお、本明細書におけるＰＢＳやトリパンブルーは次の意味もしくは意義がある。
・ＰＢＳ：  Phosphate-buffered Saline（食塩リン酸緩衝液）の略語。
・トリパンブルー：細胞の染色に用いる色素で、死細胞が染色される。
【００１９】
実施例１  エゾリンドウ根からの粗抽出液の調製
乾燥したエゾリンドウ根を細かく切断し、所定量の沸騰水（例えば、根の乾燥重量の１０倍量の沸騰水）で、所定時間（例えば、３０分間）加熱処理し、抽出した。抽出液を別の容器に移し、残った根を同様にして沸騰水で処理し、再度抽出した。２度の抽出で得た抽出液を合わせ、ガーゼ等を用いて粗く濾過した後、滅菌フィルター（例えば、孔の大きさ２２μｍの滅菌フィルター）を用いて精密濾過した。得られた清澄濾液を凍結乾燥し、適当量の水またはＰＢＳに溶解し、更にオートクレーブで加圧・加熱（例えば、１２０℃で２０分間）処理し、これを披検用粗抽出液とした。なお、上記オートクレーブで加圧・加熱処理することなく、凍結乾燥物を適当量の水またはＰＢＳに溶解してそのまま用いることもできるが、オートクレーブで加圧・加熱処理することで、抽出液中の細胞増殖阻害活性を約２倍に高めることができる。図１にエゾリンドウ根からの抽出手順の一例をスキームにまとめた。
【００２０】
実施例２  評価試験Ｉ（各種培養癌細胞に対する粗抽出液の阻害活性）
次に、各種培養癌細胞を用いて、本発明のエゾリンドウ抽出物の増殖阻害活性を評価した。方法は、エゾリンドウ抽出物の一定量（終濃度：抽出物乾燥重量２ｍｇ／ｍｌ培地）を培養細胞の培地に加え、２４時間後の生存細胞数を計測して行なった。その結果が図２で、縦軸は抽出物無添加で培養した場合の生存細胞数に対する添加培地での生存細胞数の相対値（％）を表す。
この結果からリンドウ抽出物の細胞増殖阻害効果は細胞の種類によって異なることが分かる。また、本発明のエゾリンドウ抽出物は、ヒトＤａｕｄｉ（バーキットリンパ腫由来）、ＫＴＣ−２（未分化型甲状腺癌由来）及びＹ３−Ａｇ（ラット骨髄腫）に特に強い増殖阻害を示し、ＳＫ−Ｍｅｌ２８（ヒト悪性黒色腫）やｄＲＬｈ８４（ラット肝癌）についても増殖阻害を示した。ただし、ＴＴＡ−１（ＫＴＣ−２とは異なる未分化型甲状腺癌由来の細胞株）のようにまったく影響を受けない培養癌細胞もあった。なお、図２中、*で示した甲状腺癌由来の細胞はそれぞれ別の患者から確立した細胞株である。
【００２１】
実施例３  評価試験II（固形癌に対する粗抽出液の増殖抑制効果）
次に、マウスに移植した癌細胞を用いて、本発明のエゾリンドウ抽出物の増殖抑制効果を評価した。方法は、マウス固形癌（腎細胞癌Ｒｅｎｃａ）を背皮下に移植したＢＡＬＢ／ｃマウスに体重Ｋｇ当たり３３０ｍｇのリンドウ抽出物（ＰＢＳ溶液）を経口投与（一日一回、一定時刻）した場合の固形癌の増殖を約１ヶ月に渡って追跡することで行なった。その結果が図３で、図３左側の図は、リンドウ抽出物投与は固形癌移植と同日に行なったものであり、図３右側の図は、リンドウ抽出物投与は固形癌移植の７日前に行なったものである。なお、固形癌増殖の指標は固形癌体積とし、その固形癌体積は通常用いられている以下の計算式を用いた。
＜計算式＞  固形癌体積  （ｍｍ3）  ＝（短径）2  ×（長径）×０．５      
コントロール実験はリンドウ抽出物を含まないＰＢＳを同容量経口投与して行った。図３の結果から、リンドウ抽出物を経口投与することによって固形癌の増殖が３０〜４０％抑制されたことが分かる。
【００２２】
実施例４  エゾリンドウ植物体の部位の検討
エゾリンドウの根、茎および葉について、各々の細胞増殖阻害物質の存在量を検討し、実施例１で得られた乾燥根抽出物と比較した。方法は、各組織から得た抽出物の同量を癌細胞（ヒトバーキットリンパ腫、Ｄａｕｄｉ）培地に加え、培養２４時間後の細胞群をトリパンブルーで染色し、死細胞数および生細胞数を計測することで行なった。その結果が図４で、縦軸は抽出物処理後の生細胞数を表す。細胞増殖阻害物質は根＞葉＞茎の順に多く、葉における細胞増殖阻害活性は根の１／２程度であることが分かる。
【００２３】
実施例５  粗抽出物からの細胞増殖阻害物質の精製
実施例１で得られたエゾリンドウ根粗抽出物を原料とし、これを液体クロマトグラフィーで種々の画分に分け、各分画における細胞増殖阻害活性を調べた。図５に液体クロマトグラフィーの溶出パターンと、細胞増殖阻害活性が強く存在する画分（ピークＡ画分：溶出時間２０分前後に溶出される画分）を示す。液体クロマトグラフィーの条件は以下のとおりである。
・カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ  ＨＧ−５
・移動相Ａ：０．１％  トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液
・移動相Ｂ：０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液
・流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
・カラム温度：４０℃
・ＵＶ検出条件：２３０  ｎｍ
・グラジエント条件：表２
【００２４】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】エゾリンドウ根からの抽出手順の一例のスキームである。
【図２】各種培養癌細胞に対する、本発明のエゾリンドウ抽出物の増殖阻害活性を示すグラフである。
【図３】マウスに移植した癌細胞に対する、本発明のエゾリンドウ抽出物の増殖抑制効果を示すグラフである。
【図４】培養癌細胞に対する、エゾリンドウ抽出物の植物体部位の比較を示すグラフである。
【図５】エゾリンドウ根粗抽出物を試料液とした液体クロマトグラフィーによる分離・溶出パターンである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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