(57)【要約】【課題】DSCAM遺伝子の欠損と中枢性呼吸障害の発症との関連性を新規に証明し、中枢性呼吸障害の発症メカニズムや中枢性呼吸障害に関する創薬を可能とする有用な非ヒト動物、非ヒト動物の作製方法、呼吸中枢障害に起因する疾患の治療薬のスクリーニング方法、呼吸中枢障害に起因する疾患の検査方法及び呼吸中枢障害に起因する疾患の検査キットを提供する。【解決手段】ダウン症細胞接着分子（Down syndrome cell adhesion molecule: DSCAM）遺伝子が欠損した遺伝子型を有する中枢性呼吸障害を示す非ヒト動物である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダウン症細胞接着分子（Down syndrome cell adhesion molecule: DSCAM）遺伝子が欠損した遺伝子型を有し、中枢性呼吸障害を示す非ヒト動物。
【請求項２】
上記DSCAM遺伝子がホモ欠損である請求項１記載の非ヒト動物。
【請求項３】
上記DSCAM遺伝子がヘテロ欠損である請求項１記載の非ヒト動物。
【請求項４】
ダウン症細胞接着分子（Down syndrome cell adhesion molecule: DSCAM）遺伝子が欠損した遺伝子型を有し、中枢性呼吸障害を示す非ヒト動物の作製方法であって、
非ヒト動物胚幹細胞おける前記遺伝子が欠失されているか又は非機能性とされた胚幹細胞を選別し、
当該胚幹細胞からキメラ胚を作製し、
当該キメラ胚を仮親非ヒト動物の子宮に移植し、出産により非ヒト仔動物を得て、前記遺伝子が破壊されたキメラ非ヒト動物を選別し、
前記キメラ非ヒト動物の雌と雄の交配によって、DSCAM遺伝子が欠損した遺伝子型を有する非ヒト動物を得る、
工程を含む方法。
【請求項５】
上記交配によって上記DSCAM遺伝子がホモ欠損である非ヒト動物を得ることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
上記交配によって上記DSCAM遺伝子がヘテロ欠損である非ヒト動物を得ることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項７】
請求項１乃至３いずれか一項記載の非ヒト動物に対して、候補物質を投与する工程と、
上記（１）〜（４）の少なくとも１つのデータを測定する工程と、
（１）非ヒト動物の呼吸リズムを示すデータ
（２）C4前根活性を示すデータ
（３）前呼吸性ニューロン活性を示すデータ
（４）後根神経節ニューロン培養物の神経突起伸長を示すデータ
下記（１）〜（４）いずれか１以上のデータが、候補物質未投与の上記非ヒト動物を用いて測定したデータと比較して有意に改善している場合に当該候補物質を呼吸中枢障害に起因する疾患の治療薬として同定する工程と
を含む呼吸中枢障害に起因する疾患の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項８】
上記疾患が先天性中枢性低換気症候群であることを特徴とする請求項７記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
上記疾患がヒルシュスプリング病を併発することを特徴とする請求項７記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
被検者から生体サンプルを採取する工程、
採取した生体サンプルにおける、ダウン症細胞接着分子（Down syndrome cell adhesion molecule: DSCAM）遺伝子の変異を検出する工程を含む、呼吸中枢障害に起因する疾患の検査方法。
【請求項１１】
被検者から採取した生体サンプルにおける、ダウン症細胞接着分子（Down syndrome cell adhesion molecule: DSCAM）遺伝子の変異を検出する試薬を含む、呼吸中枢障害に起因する疾患診断キット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
中枢性呼吸障害とは、脳幹及び/又は延髄にある呼吸運動をつかさどる中枢神経系が正常に作動せず、呼吸運動が異常となる状態と定義される。より具体的に中枢性呼吸障害としては、先天性中枢性低換気症候群（Ondine curse病）や、難病である原発性肺胞低換気症候群（primary alveolar hypoventilaon syndrome；PAHS）等を挙げることができる。また、乳幼児突然死症候群や睡眠時無呼吸症候群なども原因の一つとして中枢性呼吸障害が疑われている。
【０００２】
しかしながら、中枢性呼吸障害の原因遺伝子が未だ特定されておらず、中枢性呼吸障害の発症メカニズムを解明するには至っていない。中枢性呼吸障害の発症メカニズムが明らかになれば、上述した各種の症候群の有効な治療や薬剤の創出を期待することができる。
【０００３】
ところで、神経系免疫グロブリンスーパーファミリーの細胞接着分子（CAM）は、神経系の発生および機能（移動、神経突起の認識、軸索伸長および軸索反発を含む）に重要な種々の細胞間相互作用を仲介するものとして知られている。なかでも、ダウン症細胞接着分子（DSCAM）は、ヒト第21q22染色体から単離される神経系Igスーパーファミリーの最大のメンバーである（非特許文献１）。非特許文献１及び非特許文献２では、マウスDscamを同定し、これが胎児期から成人期にかけて神経系で広範に発現していることが示されている。
【０００４】
しかしながら、DSCAMと中枢性呼吸障害との関連性を示す知見はなく、またDSCAM遺伝子は中枢性呼吸障害の原因遺伝子の候補としてさえ挙がっていないのが現状である。
【０００５】
【非特許文献１】Yamakawaら“DSCAM: a novel member of the immunoglobulin superfamily maps in a Down syndrome region and is involved in the development of the nervous system.”Hum. Mol. Genet. 7, 227-237 (1998)
【非特許文献２】Agarwalaら“Dscam is associated with axonal and dendritic features of neuronal cells.”J. Neurosci. Res. 66, 337-346 (2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、上述したような実情に鑑み、DSCAM遺伝子の欠損と中枢性呼吸障害の発症との関連性を新規に証明することで、中枢性呼吸障害の発症メカニズムや中枢性呼吸障害に関する創薬を可能とする有用な非ヒト動物、非ヒト動物の作製方法、呼吸中枢障害に起因する疾患の治療薬のスクリーニング方法、呼吸中枢障害に起因する疾患の検査方法及び呼吸中枢障害に起因する疾患の検査キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述した目的を達成した本発明は以下を包含する。
（１）ダウン症細胞接着分子（Down syndrome cell adhesion molecule: DSCAM）遺伝子が欠損した遺伝子型を有し、中枢性呼吸障害を示す非ヒト動物。
（２）上記DSCAM遺伝子がホモ欠損である（１）記載の非ヒト動物。
（３）上記DSCAM遺伝子がヘテロ欠損である（１）記載の非ヒト動物。
（４）ダウン症細胞接着分子（Down syndrome cell adhesion molecule: DSCAM）遺伝子が欠損した遺伝子型を有し、中枢性呼吸障害を示す非ヒト動物の作製方法であって、非ヒト動物胚幹細胞おける前記遺伝子が欠失されているか又は非機能性とされた胚幹細胞を選別し、当該胚幹細胞からキメラ胚を作製し、当該キメラ胚を仮親非ヒト動物の子宮に移植し、出産により非ヒト仔動物を得て、前記遺伝子が破壊されたキメラ非ヒト動物を選別し、前記キメラ非ヒト動物の雌と雄の交配によって、DSCAM遺伝子が欠損した遺伝子型を有する非ヒト動物を得る工程を含む方法。
（５）上記交配によって上記DSCAM遺伝子がホモ欠損である非ヒト動物を得ることを特徴とする（４）記載の方法。
（６）上記交配によって上記DSCAM遺伝子がヘテロ欠損である非ヒト動物を得ることを特徴とする（４）記載の方法。
（７）（１）乃至（３）いずれか一項記載の非ヒト動物に対して、候補物質を投与する工程と、上記（１）〜（４）の少なくとも１つのデータを測定する工程と、
（１）非ヒト動物の呼吸リズムを示すデータ
（２）C4前根活性を示すデータ
（３）前呼吸性ニューロン活性を示すデータ
（４）後根神経節ニューロン培養物の神経突起伸長を示すデータ
下記（１）〜（４）いずれか１以上のデータが、候補物質未投与の上記非ヒト動物を用いて測定したデータと比較して有意に改善している場合に当該候補物質を呼吸中枢障害に起因する疾患の治療薬として同定する工程とを含む呼吸中枢障害に起因する疾患の治療薬のスクリーニング方法。
（８）上記疾患が先天性中枢性低換気症候群であることを特徴とする（７）記載のスクリーニング方法。
（９）上記疾患がヒルシュスプリング病を併発することを特徴とする（７）記載のスクリーニング方法。
（１０）  被検者から生体サンプルを採取する工程、採取した生体サンプルにおける、ダウン症細胞接着分子（Down syndrome cell adhesion molecule: DSCAM）遺伝子の変異を検出する工程を含む、呼吸中枢障害に起因する疾患の検査方法。
（１１）  被検者から採取した生体サンプルにおける、ダウン症細胞接着分子（Down syndrome cell adhesion molecule: DSCAM）遺伝子の変異を検出する試薬を含む、呼吸中枢障害に起因する疾患診断キット。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、図面を参照して本発明をより詳細に説明する。
【０００９】
１．DSCAM遺伝子
本発明においてダウン症細胞接着分子（Down syndrome cell adhesion molecule: DSCAM）遺伝子とは、神経系の発生・分化に深く関与する神経系免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーの一つであり、中脳・神経管・後根神経節など早い時期に発生する神経組織で発現している。DSCAM遺伝子は、ヒト、マウス、ラット、等の哺乳動物、ショウジョウバエ、コクヌストモドキ、カイコ等の昆虫、ゼブラフィッシュ等の魚類等において同定されている。DSCAM遺伝子は、上述のように種々の生物において発現していることが確認されており、未確認の生物においても定法に従って単離同定することは容易に可能である。ただし、DSCAM遺伝子は、種々のスプライシングバリアントが知られており、コードしているタンパク質は一種類ではない。
【００１０】
例えば、ヒト由来のDSCAM遺伝子としては、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDSCAM遺伝子を挙げることができる。また、マウス由来のDSCAM遺伝子としては、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。
【００１１】
２．DSCAM遺伝子ノックアウト・非ヒト動物
本発明においては、上記「１」で説明したDSCAM遺伝子を欠損させることで、中枢性呼吸障害を示す非ヒト動物を作製することができる。ここで、非ヒト動物とは、ヒトを除く動物を意味し、例えばヒトを除く哺乳動物（マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ等）、鳥類（例えば、ニワトリ等）、両生類（例えば、カエル等）、爬虫類又は昆虫が挙げられる。
【００１２】
非ヒト動物を作製する手法は、特に限定されず、従来公知の手法を適宜使用することができる。従来公知の手法としては、例えば「ジーンターゲティングの最新技術」（八木健編集 羊土社）、「ジーンターゲティング」（野田哲生監訳 メディカル・サイエンス・インターナショナル社）又はScience 244:1288-1292, 1989等に開示されている。
【００１３】
例えば、相同組換えによって少なくとも一方の対立遺伝子であるDSCAM遺伝子を破壊した胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞とも表記する）を、受精卵の胚盤胞に注入してキメラ非ヒト動物を得る。得られたキメラ動物を、相当する野生型非ヒト動物と交配させて、対立遺伝子の一方のみが破壊されたヘテロ接合体非ヒト動物（以下、DSCAM+/-とも表記する）を作出することができる。さらにこれら得られたヘテロ接合体非ヒト動物を交配させて、両方の対立遺伝子が破壊されたホモ接合体非ヒト動物（以下、DSCAM-/-とも表記する）を作出することができる。野生型はDSCAM+/+で表現される。
【００１４】
ＥＳ細胞としては、マウスの場合には、Ｅ１４、ＣＣＥ、Ｊ１又はＴ２等を用いることができる。ＥＳ細胞の相同組換えは、例えばDSCAM遺伝子の発現を妨害し得る任意のＤＮＡ配列を挿入した組換えＤＮＡを、ＥＳ細胞に導入することにより行うことができる。DSCAM遺伝子の発現を妨害し得る任意のＤＮＡ配列は、組換えＤＮＡのＥＳ細胞への導入を確認できるような薬剤耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ））等を用いるのが好ましく、またレポーター遺伝子（β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ））等を用いるのが好ましいが、特に限定されない。
【００１５】
上述のＤＮＡ導入法としては、例えば電気穿孔法又はマイクロインジェクション法が挙げられる。ＥＳ細胞におけるDSCAM遺伝子の破壊は、常法に従って、例えばＰＣＲとサザンブロットハイブリダイゼーションで確認することができる。
【００１６】
相同組換えによりDSCAM遺伝子を破壊したＥＳ細胞を有するキメラ非ヒト動物の作出方法は、例えば胚盤胞マイクロインジェクション法等が挙げられる。胚盤胞インジェクション法は、非ヒト動物の胚盤胞にDSCAM遺伝子を破壊したＥＳ細胞をマイクロインジェクションし、処理した胚盤胞を擬妊娠非ヒト動物に移植することにより所望のキメラ非ヒト動物を作出することができる。
【００１７】
上述のように得られたキメラ非ヒト動物を、相当する野生型非ヒト動物に交配させることで得られるヘテロ接合体非ヒト動物、あるいは該へテロ接合体非ヒト動物を更に交配させることで得られるホモ接合体非ヒト動物は、例えば、尾部から採取したＤＮＡを用いたサザンブロット法によりその遺伝子型を確認することができる。またＲＮＡブロット分析によりDSCAM遺伝子の発現の有無を確認することができる。
【００１８】
作製されたノックアウト・非ヒト動物は、驚くべくことに中枢性呼吸障害を発症していることが判明し、中枢性呼吸障害モデル動物としての利用が可能となる。特にDSCAM-/-には、正常に出生するが24時間以内にほぼ全個体が呼吸障害によって死亡するといった特徴を有している。また、特にDSCAM+/-には、正常に出生してDSCAM+/+と同様に生育するが僅かに呼吸障害を発症しているといった特徴を有している。上記「１」で説明したように、DSCAM遺伝子が種々の神経組織で発現していることが知られているが、上述したノックアウト・非ヒト動物（DSCAM-/-及びDSCAM+/-）の特徴は全く予測できるものではない。
【００１９】
また、DSCAM-/-においては、延髄及び脊髄のサイズが野生型DSCAM+/+と比較して有意に肥大しているといった特徴を有している。また、先天性中枢性低換気症候群（CCHS）に罹っている患者の50％はヒルシュスプルング病（HSCR）を併発している。HSCRは可変長の腸に沿った腸神経節の欠失によって特徴付けられる先天性の疾患である（Croakerら(1998)“Congenital central hypoventilation syndrome and Hirschsprung’s disease”Arch. Dis. Child 78, 316-322.）。HSCRの病理は、神経堤細胞が移動し損なうことに起因していると考えられる。DSCAM遺伝子は神経堤から誘導される腸の腸筋神経叢で発現されることが知られている（Yamakawaら(1998)“DSCAM: a novel member of the immunoglobulin superfamily maps in a Down syndrome region and is involved in the development of the nervous system”Hum. Mol. Genet. 7, 227-237.）。さらに、HSCRの変更因子領域の一つが第21q22染色体上で報告されている（Puffenbergerら(1994)“Identity-by-descent and association mapping of a recessive gene for Hirschsprung disease on human chromosome 13q22”Hum. Mol. Genet. 3, 1217-1225）。そして、このDSCAM遺伝子は当該論文に報告された領域内に位置する。したがって、DSCAM遺伝子は、HSCRの発症にも関与していることが示唆される。
【００２０】
３．DSCAM遺伝子ノックアウト・非ヒト動物の利用
上記「２」で説明したDSCAM遺伝子ノックアウト・非ヒト動物は、中枢性呼吸障害を発症するといった特徴を利用することで、中枢性呼吸障害モデル動物として利用することができる。具体的には、呼吸中枢障害に起因する疾患に対する治療薬を同定するスクリーニン方法にDSCAM遺伝子ノックアウト・非ヒト動物を利用することができる。
【００２１】
具体的には、先ず、DSCAM遺伝子ノックアウト・非ヒト動物に対して候補物質を投与する。ここで候補物質とは、中枢性呼吸障害に対する治療薬の候補となりうる物質を意味する。候補物質は既知物質でも未知物質でもよい。また候補物質としては、タンパク質、ペプチド、核酸分子、疑似核酸分子、低分子化合物、高分子化合物、有機化合物及び無機化合物といった如何なる物質であってもよい。特に、DSCAM-/-においては、出生後24時間で死亡するため、死亡前に投与することとなる。これに対して、DSCAM+/-においては、野生型と同様に生育するため、様々な生育段階で投与することができる。
【００２２】
次に、本スクリーニング方法では、候補物質の投与によるDSCAM遺伝子ノックアウト・非ヒト動物における中枢性呼吸障害の改善効果を確認する。例えば、投与後のDSCAM遺伝子ノックアウト・非ヒト動物における呼吸リズムをモニターするか、呼吸中枢の機能をモニターする。より具体的には、下記（１）〜（４）の少なくとも１つのデータを測定する。
【００２３】
（１）DSCAM遺伝子ノックアウト・非ヒト動物の呼吸リズムを示すデータ
（２）C4前根活性を示すデータ
（３）前呼吸性（Pre-I）ニューロン活性を示すデータ
（４）後根神経節ニューロン培養物の神経突起伸長を示すデータ
【００２４】
上記（１）に示す呼吸リズムを測定する方法は、特に限定されないが、例えば全身プレチスモグラフィーを用いる方法を挙げることができる（Kuwakiら(1996)“Impaired ventilatory responses to hypoxia and hypercapnea in mutant mice deficient in endothelin-1”Am. J. Physiol. 270, 1279-1286参照）。また、上記（２）に示すC4前根活性を測定する方法は、特に限定されないが、in vitro調製物用の延髄及び脊髄を用い、吸息リズムに対応する呼吸様活性をガラスキャピラリー吸引電極及び時定数0.3秒の高域フィルターを介して測定する方法を挙げることができる（Shirasawaら(2000)“Rnx deficiency results in congenital central hypoventilation”Nat. Genet. 24, 287-290、Suzueら(1984)“Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat”J. Physiol. 354, 173-183及びOnimaruら(1988)“Primary respiratory rhythm generator in the medulla of brainstem-spinal cord preparation from newborn rat”Brain Res. 445, 314-324参照）。上記（３）に示すPre-Iニューロン活性を測定する方法としては、特に限定されないが、電圧感受性色素で染色した脳幹-脊髄調製物を用いた光記録システムを適用して平均膜電位軌道を測定する方法を挙げることができる（Onimaruら(2003)“A novel functional neuron group for respiratory rhythm generation in the ventral medulla”J. Neurosci. 23, 1478-1486参照）。また、Pre-Iニューロン活性は、例えば腹側外側延髄の吸息性ニューロンの膜電位を全細胞パッチクランプ法（Onimaruら(1992)“Whole cell recordings from respiratory neurons in the medulla of brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats”Pflugers. Arch. 420, 399-406及びArataら(1990)“Respiration-related neurons in the ventral medulla of newborn rats in vitro”Brain Res. Bull. 24, 599-604参照）を用いて測定することができる。上記（４）に示す後根神経節ニューロン培養物の神経突起伸長を測定する方法としては、特に限定されないが、Dscam-Fc又はL1cam-Fcをコートしたシャーレに後根神経節（DRG）をプレーティングし、培養物を撮像することで測定することができる（Kamiguchiら(2001)“The role of endocytic l1 trafficking in polarized adhesion and migration of nerve growth cones”J. Neurosci. 21, 9194-9203）。
【００２５】
次に、本スクリーニング方法では、上記（１）〜（４）いずれか１以上のデータが、候補物質未投与の上記非ヒト動物を用いて測定したデータと比較する。比較の結果、候補物質を投与した場合に、いずれかのデータが有意に改善している場合に当該候補物質を呼吸中枢障害に起因する疾患の治療薬として同定する。
【００２６】
４．DSCAM遺伝子の利用
以上で説明してきたように、DSCAM遺伝子の欠損によって中枢性呼吸障害を発症することが実証された。この知見に基づけば、DSCAM遺伝子が中枢性呼吸障害の発症メカニズムに深く関与していることとなる。したがって、中枢性呼吸障害が疑われる患者におけるDSCAM遺伝子を検査することによって、中枢性呼吸障害の診断を支援することができる。すなわち、上述してきた知見に基づいて、被検者から採取した生体サンプルにおける、DSCAM遺伝子の変異を検出する工程を含む呼吸中枢障害の検査方法及びDSCAM遺伝子の変異を検出する試薬を含む呼吸中枢障害診断キットを提供することができる。
【００２７】
ここで、DSCAM遺伝子の変異とは、DSCAM遺伝子の欠失及びミスセンス変異といった変異のみならず、DSCAM遺伝子の発現量の変化も意味する。すなわち、DSCAM遺伝子の発現を制御するプロモーター領域や、DSCAM遺伝子の転写制御因子における変異も、DSCAM遺伝子の変異として定義する。このような意味でDSCAM遺伝子の変異を検出することによって、被験者における中枢性呼吸障害を診断することが可能となる。
【００２８】
また、DSCAM遺伝子の変異を検出する試薬としては、配列番号１に示すヒト由来のDSCAM遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブや、DSCAM遺伝子を特異的に増幅するプライマーセットを挙げることができる。DSCAM遺伝子がコードするDSCAMタンパク質に対する抗体をDSCAM遺伝子の変異を検出する試薬として使用することもできる。これらのプローブ、プライマーセット及び抗体は、DSCAM遺伝子の欠失や、その発現量の変化を検出する際に使用することができる。
【００２９】
一方、DSCAM遺伝子におけるミスセンス変異は、当該変異を有する変異DSCAM遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブや、当該変異DSCAM遺伝子を特異的に増幅するプライマーセット、変異DSCAM遺伝子がコードする変異DSCAMタンパク質に対する特異的抗体を使用して検出することができる。
【００３０】
さらに一例として、DSCAM遺伝子の変異は、DHPLC（denaturing HPLC）法と組み合わせたヘテロデュプレックス法を行うための装置（WAVETM DNA Fragment Analysis System (Transgenomic, Inc., San Jose, CA)利用することができる。当該装置には、オートサンプラー、高分離能のマイクロペリキュラーマトリックスを充填したキャピラリーカラム、分離条件の予測・入力および分離結果の出力のためのソフトウェア、ならびにディスプレイが含まれる。
【００３１】
本手法では、DSCAM遺伝子における33個のエキソンのうち少なくとも１以上のエキソンについて、当該エキソンを特異的に増幅する一対のプライマーを設計する。このとき、一対のプライマーとしては、33個のエキソンすべてについて設計してもよいし、一部のエキソンについてのみ設計してもよい。特に、中枢性呼吸障害を発症する患者において、DSCAM遺伝子の特定の領域に変異を有することが明らかになっていれば、当該変異を含むエキソンについてプライマーを設計すればよい。
【００３２】
本手法では、このように設計した一対のプライマーを使用してDSCAM遺伝子におけるエキソンを増幅し、増幅したDNA断片を含む溶液を熱処理することによってヘテロ二本鎖を形成する。その後、ヘテロ二本鎖を含む溶液をクロマトグラディーの原理で溶出することによって、変異を含まない野生型ホモ二本鎖の溶出ピークと比較して、異なる位置に出現する溶出ピークをヘテロ二本鎖として同定する。本手法によれば、患者由来のゲノムDNAを用いてDSCAM遺伝子の特定のエキソンにおける変異の有無を検出することができる。そして、当該変異の有無を検出することによって、患者に対する中枢性呼吸障害の診断を支援するための有用な情報を取得することができる。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定して解釈されるものではない。
【００３４】
〔実施例１〕Dscam遺伝子ノックアウトマウスの作製
本実施例では、図１aに示すように、Dscam遺伝子の第1エキソン（図１aにおける黒塗り四角で示す。）を欠失させたDscam遺伝子ノックアウトマウスを作製した。第1エキソンを変換するゲノムクローンを得るべく、プローブでマウスPACライブラリー（RPCI-21：マウス129s6/SvEvTAC；Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA, USA）をスクリーニングしており、2種類の独立のクローン（639K11及び671I13）を同定した。第1エキソンを含む30kb付近の領域のゲノム構造は、この2種類のクローンにおいて数種の制限酵素とプローブとを用いたサザンブロット分析によって確認した。
【００３５】
Cre-loxP系を用いたターゲティング構築物は以下のように調製した。先ず、639K11クローンの2.8kb EcoRI-SpeI断片をプラスミドベクターpBluescript II SK(-)（Stratagene Inc., La Jolla, CA, USA）のEcoRI-SpeI部位にサブクローニングした。続いて、EcoRI及びSpeI消化によって切除された平滑末端化2.8kb EcoRI-SpeI断片をターゲティング構築物の平滑末端化SalI部位にクローニングし、構築物の3’アームを作製した。5’アームは639K11クローンの8.8kb平滑末端化BamHI-EcoRI断片を平滑末端化HbaI部位に挿入し、その後loxP断片をMluI部位に挿入することによって作製し、こうしてネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（neo）を有するターゲティング構築物を作製した。
【００３６】
なお、図１aにおいて、AcはAccIであり、BはBamHIであり、EIはEcoRIであり、EVはEcoRVであり、HcはHincIIであり、HdはHindIIIであり、MはMluIであり、SpはSpeIである。
【００３７】
次に、NotIでターゲティング構築物を線状化し、Gene-Pulser（BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA）を用いて、3μF及び800Vで約7x107個のE14ES細胞にエレクトロポレートした。トランスフェクト細胞を、10cmシャーレ中で、ネオマイシン耐性、マイトマイシン処理済マウス胚繊維芽細胞（MEF）にプレーティングした。プレーティングから1日後に、ゲネチシンの存在下で（G418；125μg/ml）ポジティブ選択を行った。耐性クローンを9日目に選択し、その後予めMEFが蒔かれた24ウェル平板で増殖させた。個々のクローンに由来するEcoRV消化ゲノムDNAを、ターゲティング構築物のすぐ上流のゲノム配列に由来する356bpプローブ（図１aにおいてP2として示す）を用いたサザンブロットによって分析した（図１b）。プローブはPCRによって作製した。ポジティブクローンをさらに、SpeI消化ゲノムDNAを5末端プローブ（図１aにおいてP1として示す。385bpPCR増幅断片）にハイブリダイズさせることによって確認した。
【００３８】
2種類の各標的クローン（A38及びA151）に由来する約15個のES細胞をC57BL/6胚盤胞に注射した。注射した平均15個の胚盤胞を偽妊娠メス受容ICRマウスに転移した。いずれのESクローンも50％以上がアグーチの毛色のマウスをわずかに生じた。二種類（各クローンにつき1個体）のオスキメラをC57BL/6メスと交配させて、アグーチの毛色マーカーによる生殖細胞伝達の検出を可能にした。サザンブロット分析により測定したところ、アグーチの子孫の52％（17/33）は挿入について陽性であった。ヘテロ接合型flox-neoメスマウスをCAG-creオスと交配させてヘテロ接合型ノックアウトマウスを作製した。
【００３９】
実験手順及び動物の飼育条件は、RIKEN Institute’s Animal Experiments Committeeに認可され、かつ全ての動物は動物実験用の制度指針に従って世話がなされ人道的に扱われた。
【００４０】
得られたヘテロ接合型ノックアウトマウス（Dscam＋/−マウス）は稔性であり、ほぼ正常に発育した。また、ヘテロ接合体間の交配によりホモ接合体を産出したところ、出生直後の全ての出生仔の遺伝子型はメンデルの分離比に合致し（野生型、220/835、26.3％；Dscam＋/−、420/835、50.3％；Dscam−/−、195/835、23.4％）、これはDscam−/−マウスが胚性致死でないことを示した。しかし、ほとんどのDscam−/−マウスは出生後24時間以内に死亡し、48時間以上生存したマウスは稀であった。
【００４１】
〔実施例２〕Dscam遺伝子ノックアウトマウスの分析
ノーザンブロット分析
得られたノックアウトマウスにおけるDSCAM遺伝子の発現を確認するためにノーザンブロット分析を行った。脳組織はP0マウスから切り取った。トータルRNAをTrizol試薬（Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA）を用いて抽出し、mRNAをμMACS mRNA Isolation Kit（Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany）により単離した。3μgのポリ(A)RNAを1％アガロースホルムアルデヒドゲルの各レーンに充填し、サイズにより分離したRNAをナイロンメンブレン（Biodyne;Pall Bio Support, East Hills, NY, USA）に転写した。ハイブリダイゼーションのために、DNAプローブを[α-32P]dCTPで標識し、ExpressHybハイブリダイゼーション溶液（Clontech, Palo Alto、CA, USA）中で製品に推奨されるように一晩ハイブリダイズさせた。最後にブロットを0.1xSSC/0.1% SDS中、55℃で洗浄し、-80℃でX線フィルムに曝露した。
【００４２】
結果を図１cに示す。なお、図１cにおいて、Ex.1はエキソン1部分（1-496bp）を意味し、ECは細胞外部分（2299-2626bp）を意味し、TMは膜内外部分（5210-5410bp）を意味し、CPは細胞部分（5385-5637bp）を意味する。また、本例では、野生型（図１cにおいて+/+と表記）、Dscam+/-（図１cにおいて+/-と表記）及びDscam-/-マウス（図１cにおいて-/-と表記）について分析を行った。
【００４３】
図１cに示したように、ノーザンブロット分析により、Dscam−/−出生仔の脳ではDscam転写産物が全く確認されず、Dscam＋/−出生仔の脳ではDscam遺伝子の発現量が減少していることが確認された。
【００４４】
RNA in situハイブリダイゼーション
参考のため、野生型マウス（Dscam＋／＋マウス）の出生直後（すなわちDscam−/−マウスの急死時）におけるDscam mRNAの発現をRNA in situハイブリダイゼーションによって確認した。RNA in situハイブリダイゼーションは、ジゴキシゲニンで標識したcRNAプローブを用い、低温切片で実施した。先ず、切片を0.1M PB（リン酸緩衝液）で洗浄し、4％ PFAを用いて30分間で固定した。次に切片を0.1M PBで洗浄し、その後、0.1M PB中で5分間0.3％ Triton X-100で透過処理した。これらを0.1M PBで5分間洗浄し、その後、1xSSC中0.1N HClで10分間洗浄した。次いで、それらを0.1M トリエタノールアミン中で10分間、0.25％無水酢酸でアセチル化し、0.1M PBで洗浄した。次いで、切片をハイブリダイゼーションバッファー中、55℃、cRNAプローブ不在下で16時間プレハイブリダイゼーションし、10μg/mlのcRNAプローブを含むハイブリダイゼーションバッファー（50％ホルムアミド、5xSSC、0.1％ N-ラウロイルザルコシン、0.02％遮断剤）を用いて、55℃で一晩ハイブリダイズさせた。切片を50％ホルムアミドを含む2xSSC中55℃で3回、それぞれにつき1時間洗浄した。ハイブリダイゼーションをアルカリホスファターゼと結合した抗DIG Fab（Roche Diagnostics）を用いて、NBT/BCIP（Roche Diagnostics）を用いて検出した。
【００４５】
結果を図２a〜dに示した。図２aはDscam抗センスプローブとハイブリダイズしたP0マウス脳の矢状断切片の写真である。図２bは図２aにおいて実線で囲った領域（延髄に相当）を拡大して示す写真である。図２cは、図２b中、実線の位置を切断レベルとする冠状切片の写真である。図２dは延髄における呼吸ニューロン分布の模式図である。図２c及び図２dにおいて実線で囲った領域は呼吸中枢の位置を示している。図２dにおいて白丸又は黒丸は、それぞれ前吸息性（Pre-I）又は吸息性（I）ニューロンの記録部位を示している。
【００４６】
図２aに示すように、Dscam mRNAは、大脳皮質、海馬、視床、脳橋、嗅球で広範に発現し、そして延髄の呼吸中枢で優性的に発現していた。図２b中の矢印で示すように、Dscamは腹側延髄の呼吸リズム形成ニューロンで発現していた。図２c及びdに示すようにDscam mRNAはPre-I及びIニューロンが活性化する部位で発現していた。
【００４７】
脳の形態学的分析及び免疫組織化学
得られたノックアウトマウスにおける組織学的異常を評価すべく、P0 Dscam−/−マウス及びその野生型同腹仔から単離した脳の形態を調査した。麻酔したDscam−/−マウス又は野生型マウスに0.1M PB中4％パラホルムアルデヒドを経心臓的に灌流させた。20μmの低温切片を0.9％トルイジンブルーで染色（ニッスル染色）した。また、34種類のマーカー（SMI311、SMI52、SMI35、NF150、NFL、NF-MH、2H3、3A10、CD57、5HT、ネスチン、RAT401、OLIG2、NeuN、v-glut2、NK1R、GLAST、Brn3a、ペリフェリン、CR50、GAD65、グルタメート、GABA、カルレチニン、AChE、ChAT、Pax2、Pax6、GluR2、Phox2b、TH、μ-オピオイドR1、ソマトスタチン及びspot）を用いて実施した。免疫組織化学分析においては、抗体をPBS/0.01% Triton X-100及び5％ウシ血清アルブミンで希釈した。
【００４８】
図３aには、出生後０日目のDscam-/-及び野生型マウスの脳の腹側図を示す。Dscam-/-マウスの延髄及び脊髄は野生型マウスのものよりも大きいことが分かる。図３bには大脳（図３aにおいて＊を付した実線）を及び延髄（図３aにおいて＊＊を付した実線）の幅を測定した結果を示す。測定の結果はt検定で比較した。図３bにおいてエラーバーはSEMを示す。図３bに示すように、大脳及び延髄の幅は、野生型（n=7）でそれぞれ6.05±0.07mm及び3.11±0.04であった。これに対して、Dscam−/−マウス（n=7）でそれぞれ6.20±0.07及び3.35±0.03mmであった。大脳についてはp=0.188、延髄についてはp=0.0004であった。Dscam−/−マウスの延髄及び脊髄は野生型同腹仔のものよりも7.8％大きかった。
【００４９】
図３c〜jは、延髄（図３c、d、g及びh）及び脊髄（図３e、f、i及びj）の冠状切片をニッスル染色した結果を示している。Dscam−/−マウスの延髄（図３d及びh）は、野生型マウスのもの（図３c及びg）より、背腹軸（図３c及びd）及び内外軸（図３g及びh）のいずれにおいてもサイズが大きいことがわかる。また、Dscam−/−マウスの脊髄（図３f及びj）は、野生型マウスのもの（図３e及びi）より、背腹軸（図３e及びf）及び内外軸（図３i及び,j）のいずれにおいてもサイズが大きいことがわかる。これらの結果は、Dscam−/−マウスのこれらの組織で明らかな構造的欠損は見られず、延髄及び脊髄の細胞の大きさはDscam−/−と野生型とで類似しているが、細胞数がDscam−/−で増加したことを示唆している。
【００５０】
呼吸分析
実施例１で作製したDscam-/-マウスの外見は、出生直後は正常に見え、その体重は統計的に野生型及びDscam+/-同腹仔の体重と異ならなかった（データは示されない）。しかし、Dscam-/-出生仔が発作又は呼吸様動作の困難さを示すのを観察した。また、胃にミルクを有するDscam-/-出生仔はほとんどおらず、これはほとんどのDscam-/-出生仔が授乳していないことを示している。Dscam-/-出生仔におけるこれらの表現型及び延髄呼吸中枢においてDscam mRNAが優性的に発現していることから、全身プレチスモグラフィーを用いてDscam−/−及びDscam＋/−出生仔並びに野生型同腹仔における自発呼吸活性を調査した。
【００５１】
詳細には、全身プレチスモグラフィーを一日齢未満のP0マウスで実施した（上掲Kuwakiら（1996）参照）。呼吸頻度、一回呼吸量、及び分時拍出量を、安静呼吸の間に50〜70回の呼吸サイクルから算出した。結果を図４aに示した。図４aに示すように、Dscam−/−出生仔の呼吸リズムは不規則かつ頻繁な無呼吸を示し、他方、野生型同腹仔の呼吸リズムは規則正しく一定であり、Dscam＋/−もわずかな異常を示すことが明かとなった。
【００５２】
また、in vitro調製物用の延髄および脊髄を、既に記載されるように十分にエーテル麻酔が施されたP0マウスから単離した（上掲Shirasawaら（2000）、Suzueら（1984）及びOnimaruら（1988）参照）。吸息リズムに対応する呼吸様活性を、ガラスキャピラリー吸引電極及び時定数0.3秒の高域フィルターを介してC4/C5前根でモニターした。値は平均±SDとして示される。3種全ての遺伝子型について、統計的有意性を分散分析（分散分析）によって決定した。グループ間での有意な差異は事後的ボンフェローニ検定を用いて同定した。腹側外側延髄の吸息性ニューロンの膜電位（上掲Arataら（1990））を従来の全細胞パッチクランプ法（上掲Onimaruら（1992））を用いて記録した。膜電位を、連続抵抗（25〜50mol/LΩ）及び静電容量の補償後に、単電極膜電位固定用増幅器（CEZ-3100, Nihon Kohden, Tokyo, Japan）で記録した。結果を図４bに示した。図４bに示すように、Dscam-/-マウスにおいては、無呼吸を示す低振幅のC4活性が観察された（図４bにおける矢印）。図４bに示す結果から、Dscam-/-マウスの呼吸パターンの異常（図４a）が腹側延髄に位置する呼吸リズム形成中枢に起因していることが示された。
【００５３】
光記録法
腹側延髄の呼吸性ニューロン活性の空間-時間パターンを可視化するために、電圧感受性色素で染色した脳幹-脊髄調製物を用いた光記録システムを適用した（上掲Onimaruら（2003））。先ず、延髄-脊髄調製物を、電圧感受性蛍光色素、Di-2-ANEPEQ（33μg/ml, Molecular Probe, Eugene, OR）を含む改変したクレブス溶液中、95％O2及び5％CO2の割合で、室温で30分間インキュベートした。染色後、この調製物を、蛍光顕微鏡（THT-75顕微鏡セットアップ, Scimedia Ltd., Tokyo, Japan）が取り付けられた2-mL灌流チェンバー中で腹側表面にして置いた。ニューロン活性を、電圧感受性色素を用いて光学式記録装置（MiCAM02；Brain Vision Inc., Saitama, Japan）により、510-550nm励起フィルター、ダイクロイックミラー、及び光源とするタングステン-ハロゲンランプ（150W）を備えた590nm吸収フィルターを介して検出した。CCDベースカメラは192x128ピクセル（33.3x37.5μm/ピクセル）から構成される。光学像は20ミリ秒毎に得た。吸息活性の取得時間はC4吸息群発の開始前3.84秒及び開始後1.28秒からなる5.12秒であった。取得した像は50回の呼吸サイクルの平均であった。各タイプのニューロンの光学活性を、78ピクセルを含む平均ΔF/F値として測定した。蛍光の変化は比率（％、部分的変化）（すなわち参照像の蛍光強度に対する蛍光強度）として表現した。2x2ピクセルのソフトウェア-空間フィルターで処理された差異的な像は、赤が蛍光の減少（これは膜脱分極を示している）に対応する擬色ディスプレイによって表した。BV_分析（BrainVision Inc., Saitama, Japan）をデータの取得及び分析に用いた。
【００５４】
結果を図５a〜fに示す。-1500ms（図５a及びb）または0ms（図５c及びd）におけるC4吸息群発からのΔF/F擬色像を延髄の腹側表面に重ねた。光学像の結果は、C4吸息活性によって誘発された50回の呼吸サイクルの平均である。図５中、赤丸はPre-I（前吸息性）ニューロン活性の最も顕著な領域を示し、青丸はI（吸息性）ニューロン活性の最も顕著な領域を示している。図５e及びfには、赤丸及び青丸（78ピクセル）内の光学的反応を定量し、それぞれ赤色（図５e及びfにおいて上段のプロファイル）及び青色トレース（図５e及びfにおいて中段のプロファイル）として示した。図５e及びfにおいて下段のトレース（黒）はC4前根吸息活性を示す。この像の各時点は、グラフ中の垂直の点線で示される。
【００５５】
図５a及びeに示すように、野生型マウスでは、前吸息性（Pre-I）ニューロン活性の平均膜電位軌道は、吻側延髄腹外側部（RVLM）の限定された領域で、吸息性（Pre-I）神経活性の開始前には顔面神経核レベルで数百ミリ秒を現した。続いて、図５c及びeに示すように、呼吸性ニューロン活性は腹側延髄で中央及び尾部に伝播するように観察された。対照的に図５b及びfに示すように、Dscam-/-マウスでは、前吸息段階の間RVLMにおけるPre-Iニューロン活性の平均膜電位軌道は消失していることがわかった。これらの結果から、Dscam-/-マウスにおける呼吸機能不全はPre-Iニューロンの異常から生じていることが判明した。
【００５６】
さらにまた、Pre-Iニューロンの長期継続活性の基本性質を調査するために（図５eにおける上段プロファイル）、従来の全細胞パッチクランプ法を用いて、野生型マウス由来のRVLMの対応領域における数個のニューロンの膜電位を記録した。その結果、図６に示すように、Pre-Iニューロン活性の膜電位の複数のサブタイプがI-ニューロン活性の開始前に連続して出現するのを観察した。これらの結果は、Pre-Iニューロンが複数のサブタイプからなり、これらが順次活性化することを示唆している。これらは互いに結合して、その活性を中継し、その後活性をI-ニューロンへ転移する。
【００５７】
神経突起伸長アッセイ
神経突起の伸長におけるDscamの同種親和性結合依存性促進活性も調査した。
P0マウスから切り取った後根神経節（DRG）を、37℃で30分間トリプシン-EGTA（Life Technologies）で処理し、p20マイクロピペットマンを用いて粉砕することによって解離させた。解離した細胞を、10％ウシ胎児血清（Life Technologies）、1％PSF（Life Technologies）及び20ng/ml NGF（Promega）を添加したRPMI1640培地（Life Technologies）で再懸濁し、Dscam-Fc又はL1cam（細胞接着分子L1）-Fcをコートしたガラス製シャーレ上にプレーティングした。CAM-Fcをコートしたシャーレを、0.1mg/ml ポリ-D-リシン（70-150kD；Sigma Aldrich）、40μg/ml 抗Fc抗体（Sigma Aldrich）及びDscam-Fc又はL1cam-Fcを順にコートすることによって準備した。Dscam-Fc又はL1cam-Fcの製造は、既に記載されるように行った（上掲Kamiguchi及びYoshihara（2001））。4％ホルムアルデヒドで固定する前に、細胞を加湿したインキュベーター中、5％CO2、37℃で7時間培養した。
【００５８】
冷却デジタルCCDカメラ（CoolSNAP HQ；Photometrics）で撮影したDRGニューロンの像をMetaMorphバージョン4.6（Universal Imaging）を用いて分析した。神経突起の長さは、最長の神経突起の先端と神経突起が現れる細胞体の外面との距離として測定した。
【００５９】
結果を図７a及びbに示す。なお、図７aにおいて、Dscam-Fcのサンプル数はn=465又はn=348であり、L1cam-Fcのサンプル数はn=327又はn=335である。また、ネガティブコントロールは、タンパク質でコートしていないシャーレを用いた場合の結果を示している（n=151又はn=142）。また、図７aにおいて『****』はp＜0.0001を意味しており、同一の培養条件下で野生型ニューロンとt検定で比較した結果である。図７ｂにおいて各サンプル数はn=600である。図７a及びbにおいてエラーバーはSEMを表す。
【００６０】
図７a及びbに示すように、Dscam-Fcでコートしたシャーレ上のDscam-/-由来DRGニューロンの神経突起長は、野生型由来DRGニューロンのものと比較してかなり短いが（図７a）、神経突起を保有するDRGニューロンの比率がDscam-/-対野生型DRGニューロン間で異ならなかったことを観察した（図７b）。これらの結果は、Dscamの同種親和性結合が神経突起の伸長を刺激し、Dscamの欠損が異常な神経ネットワークの形成を導き得ることを示している。
【００６１】
これらは、RVLMにおけるDscamの発現が、その内部ネットワークの形成に重要な役割（例えば、軸索誘導受容体等）を果たし得ること、並びに、Dscam-/-マウスにおけるその欠損がPre-Iニューロンサブタイプの異常な内部結合を導き、その結果、全体としてPre-Iニューロン活性の欠損を生じ得ることを示している。
【００６２】
〔実施例３〕DSCAM遺伝子の解析
実施例１及び２からDSCAM遺伝子が中枢性呼吸障害に関与していることが明かとなったが、DSCAM遺伝子の変異を検出することで中枢性呼吸障害の診断を支援することができる。本実施例ではDSCAM遺伝子の変異を検出する一手法として、DHPLC法と組み合わせたヘテロデュプレックス法を説明する。
【００６３】
本手法では、先ず、DSCAM遺伝子のエキソンをPCRによって増幅した。PCRは、QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden社製)を用いてヘパリン処理血からゲノムDNAを抽出した。PCRは、抽出したゲノムDNAを鋳型として、DSCAM遺伝子の３３個のエキソンを増幅すべく設計した３３対のプライマーセット及びPyrobestTMDNA polymerase (Takara 社製)又はPwo DNA polymerase (Roche社製)を使用した。本実施例で使用した３３対のプライマーセットの塩基配列を表１及び表２に示す。なお、DSCAM遺伝子における３３個のエキソンについては『Yamakawaら“DSCAM: a novel member of the immunoglobulin superfamily maps in a Down syndrome region and is involved in the development of the nervous system.”Hum. Mol. Genet. 7, 227-237 (1998)』を参照する。
【００６４】
【表１】
2007236347.tif 000002
【００６５】
【表２】
2007236347.tif 000003
【００６６】
エキソン２〜３３を増幅するPCRに際しては、鋳型となるゲノムDNAを50〜100ng使用し、各プライマーを0.5μMと1xPyrobestTMbufferとdNTP混合液を0.2 mMとPyrobestTM DNA polymeraseを2.5 U含む全量２５μlの反応液で行った。エキソン１を増幅するPCRに際しては、Epicentre MasterAmp KN bufferとPwo DNA polymeraseを2.5 U使用した。エキソン２〜３３を増幅する際のPCR条件としては、95℃で3分間の初期変成の後、94℃で20秒間及び68℃で1分間を1サイクルとして3サイクル（ただし1サイクル毎に後半ステップの温度を1℃ずつ低下するように設定する）行い、その後、94℃で20秒間、64.5℃で20秒間及び72℃で40秒間を1サイクルとして13サイクル（ただし1サイクル毎に“64.5℃で20秒間”ステップの温度を0.8℃ずつ低下するように設定する）行い、その後、94℃で20秒間、55℃で20秒間及び72℃で40秒間を1サイクルとして19サイクル行い、その後、72℃で5分間の最終伸長を行う条件とした。エキソン１を増幅する際のPCR条件としては、94℃で2分間の初期変成の後、94℃で15秒間、62℃で30秒間及び72℃で1分間を1サイクルとして10サイクル（ただし1サイクル毎に“62℃で30秒間”ステップの温度を1℃ずつ低下するように設定する）行い、その後、94℃で15秒間、52℃で30秒間及び72℃で1分間を1サイクルとして23サイクル行い、その後、72℃で5分間の最終伸長を行う条件とした。PCRによって増幅産物を2％アガロースゲルで確認したところ、エキソン１〜３３全てについて予期していたサイズで増幅できていたことが示された（データは示さない）。なお、得られたPCR産物は、ArrayItTMPCR purification kit(TeleChem International社製)を使用して精製し、配列決定に供した。そして、BigDyeTMterminator cycle sequencing kit及びABI PRISMTM 3700 DNA sequencing system (PE Applied Biosystems社製)を使用して配列決定を行った。
【００６７】
次に、本手法では、上述したPCRによる産物を95℃で5分間処理して熱変成させ、その後、80〜55℃で50分間処理して段階的な再アニーリングさせた。これにより、エキソン１〜３３について、ヘテロ二本鎖を形成することができる。
【００６８】
次に、反応液を用いてDHPLC法によってヘテロ二本鎖を検出した。DHPLC法は、WAVE DNA-fragment analysis system(Transgenomic社製)を用いて行った。このときカラム温度は、WAVEMAKER software (Transgenomic社製)に基づいて決定した。また、DHPLC法に供する反応液には、多型が存在せず、ホモ二本鎖を形成して単一ピークを示すコントロールを等量添加した。また、コントロールを加えた反応液は、直線的なアセトニトリル濃度勾配で速度0.9ml/minの条件で溶出した。
【００６９】
具体的な温度条件としては、エキソン2、21及び22については59℃及び60℃とし、エキソン3、6、8、15、16、19及び27については60℃及び61℃とし、エキソン4、7、10、11、12、14、17、18、24、25及び29については58℃及び59℃とし、エキソン5、20及び26については62℃及び63℃とし、エキソン9、30及び32については61℃及び62℃とし、エキソン13については56℃及び57℃とし、エキソン23及び28については54℃及び55℃とし、エキソン31については63℃及び64℃とし、エキソン33については55℃及び56とした。
【００７０】
また、DHPLC法におけるデータ分析は、得られたクロマトグラムに対する目視検査によって行った。また、各サンプルにおいてはコントロールとの比較も行った。ヘテロ接合体及びホモ接合体の変異プロファイルは、野生型ホモ接合体のピークから区別可能なピークとして検出した。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】DSCAM遺伝子ノックアウトマウスを作製する手順を説明するための模式図、作製したノックアウトマウスにおけるDSCAM遺伝子を検出するためのサザンブロット分析の結果を示す写真及び野生型、Dscam+/-及びDscam-/-マウスの脳から抽出したRNAのウエスタンブロット分析の結果を示す写真である。
【図２】Dscam抗センスプローブとハイブリダイズしたP0野生型マウス脳の矢状断切片の写真である。
【図３】出生後０日目のDscam-/-及び野生型マウスの脳の腹側の写真、大脳を及び延髄の幅を測定した結果を示す特性図、延髄及び脊髄の状切片をニッスル染色した後の写真、及び野生型及びDscam−/−マウス由来のsagital方向連続切片をニッスル染色した後の写真である。
【図４】Dscam−/−、Dscam＋/−出生仔及び野生型同腹仔に対して全身プレチスモグラフィーを用いて呼吸リズムを測定した結果を示す特性図、及び吸息性ニューロンの膜電位を全細胞パッチクランプ法を用いて測定した結果を示す特性図である。
【図５】電圧感受性色素で染色した脳幹-脊髄調製物を用いた光記録システムにより測定した結果を示す写真及び特性図である。
【図６】野生型マウス由来のRVLMの対応領域における数個のニューロンの膜電位を全細胞パッチクランプ法を用いて測定した結果を示す特性図である。
【図７】神経突起伸長アッセイの結果を示す特性図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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