(57)【要約】【課題】より効率的、且つ低コストに、ランダムミュータジェネシス等により作製された生物個体群の中から、標的遺伝子において変異が導入された個体を選択する方法を提供すること【解決手段】以下を含む、標的遺伝子中にミスマッチを有する生物を選択するための方法：（Ａ）被検生物からの標的遺伝子を含む核酸（被検核酸）を、ｉ）Ｍｕ終末核酸、及びｉｉ）ファージＭｕトランスポゼースと、標的遺伝子がミスマッチを含む場合に、Ｍｕ終末核酸が標的遺伝子中のミスマッチの部位付近に転位し得る条件下で接触させ、被検Ｍｕ転位産物を得ること、（Ｂ）該被検Ｍｕ転位産物における、Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子への転位を検出すること、及び、（Ｃ）Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子中の特定部位への顕著な転位が検出された被検核酸の由来する被検生物を、標的遺伝子中の該部位付近においてミスマッチを有する生物として選択すること。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、標的遺伝子中にミスマッチを有する生物を選択するための方法：
（Ａ）被検生物からの標的遺伝子を含む核酸（被検核酸）を、
ｉ）Ｍｕ終末核酸、及び
ｉｉ）ファージＭｕトランスポゼース
と、標的遺伝子がミスマッチを含む場合に、Ｍｕ終末核酸が標的遺伝子中のミスマッチの部位付近に転位し得る条件下で接触させ、被検Ｍｕ転位産物を得ること、
（Ｂ）該被検Ｍｕ転位産物における、Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子への転位を検出すること、及び、
（Ｃ）Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子中の特定部位への顕著な転位が検出された被検核酸の由来する被検生物を、標的遺伝子中の該部位付近においてミスマッチを有する生物として選択すること。
【請求項２】
Ｍｕ終末核酸が検出可能に標識されている、請求項１の方法。
【請求項３】
Ｍｕ終末核酸が蛍光標識されている、請求項２の方法。
【請求項４】
Ｍｕ終末核酸及び／又は被検核酸がＤＮＡである、請求項１の方法。
【請求項５】
被検核酸がＰＣＲにより増幅されたものである、請求項１の方法。
【請求項６】
被検生物がミュータジェネシスにより創生されたものである、請求項１の方法。
【請求項７】
更に以下を含む、請求項１の方法：
（Ａ’）標的遺伝子中にミスマッチを有さないコントロール生物からの標的遺伝子を含む核酸（コントロール核酸）を、
ｉ）Ｍｕ終末核酸、及び
ｉｉ）ファージＭｕトランスポゼース
と、標的遺伝子がミスマッチを含む場合に、Ｍｕ終末核酸が標的遺伝子中のミスマッチの部位付近に転位し得る条件下で接触させ、コントロールＭｕ転位産物を得ること、
（Ｂ’）該コントロールＭｕ転位産物中における、Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子への転位を検出すること、及び、
（Ｃ’）Ｍｕ終末核酸の、被検核酸中の標的遺伝子の特定部位への転位の効率を、コントロール核酸中の対応部位への転位の効率と比較すること。
【請求項８】
更に、ミスマッチの位置を決定することを含む、請求項１の方法。
【請求項９】
被検核酸が複数被検生物からの標的遺伝子を含む核酸の混合物である、請求項１の方法。
【請求項１０】
被検核酸が２〜１６の被検生物からの標的遺伝子を含む核酸の混合物である、請求項９の方法。
【請求項１１】
（Ａ）において得られる被検Ｍｕ転位産物の複数を混合し、得られる混合物におけるＭｕ終末核酸の標的遺伝子への転位を（Ｂ）において検出する、請求項１の方法。
【請求項１２】
被検Ｍｕ転位産物の複数のそれぞれにおいて、Ｍｕ終末核酸が、互いに異なる種類の蛍光により標識されている、請求項１１の方法。
【請求項１３】
蛍光が、同一波長の励起光により、異なる波長の発光を生じる蛍光の組み合わせから選択される、請求項１２の方法。
【請求項１４】
以下を含む、標的遺伝子中にミスマッチを有する生物を選択するための方法：
（Ａ）複数被検生物からの標的遺伝子を含む核酸の混合物（被検核酸混合物）を、
ｉ）Ｍｕ終末核酸、及び
ｉｉ）ファージＭｕトランスポゼース
と、標的遺伝子がミスマッチを含む場合に、Ｍｕ終末核酸が標的遺伝子中のミスマッチの部位付近に転位し得る条件下で接触させ、被検Ｍｕ転位産物を得ること、
（Ｂ）被検Ｍｕ転位産物の複数を混合し、被検Ｍｕ転位産物混合物を得ること、
（Ｃ）被検Ｍｕ転位産物混合物における、Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子への転位を検出すること、及び、
（Ｄ）Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子中の特定部位への顕著な転位が検出された被検Ｍｕ転位産物混合物が由来する被検生物群から、標的遺伝子中の該部位付近においてミスマッチを有する生物を選択すること。
【請求項１５】
以下を含む、標的遺伝子中にミスマッチを有する非ヒト生物を製造するための方法：
（Ａ）ミュータジェネシスにより、標的遺伝子中にミスマッチを有し得る生物群を提供すること、
（Ｂ）該生物群中の生物からの標的遺伝子を含む核酸（被検核酸）を、
ｉ）Ｍｕ終末核酸、及び
ｉｉ）ファージＭｕトランスポゼース
と、標的遺伝子がミスマッチを含む場合に、Ｍｕ終末核酸が標的遺伝子中のミスマッチの部位付近に転位し得る条件下で接触させ、被検Ｍｕ転位産物を得ること、
（Ｃ）該被検Ｍｕ転位産物における、Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子への転位を検出すること、及び、
（Ｄ）Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子中の特定部位への顕著な転位が検出された被検核酸が由来する生物を、標的遺伝子中の該部位付近においてミスマッチを有する生物として獲得すること。
【請求項１６】
被検核酸が該生物群中の複数生物からの標的遺伝子を含む核酸の混合物である、請求項１５の方法。
【請求項１７】
（Ｂ）において得られる被検Ｍｕ転位産物の複数を混合し、得られる混合物におけるＭｕ終末核酸の標的遺伝子への転位を（Ｃ）において検出する、請求項１５の方法。
【請求項１８】
以下を含む、標的遺伝子中にミスマッチを有する生物を選択するためのキット：
ａ）Ｍｕ終末核酸、
ｂ）ファージＭｕトランスポゼース、
ｃ）Ｍｕ終末核酸が標的遺伝子へ転位したか否かを決定するための手段、及び／又は
ｄ）被検生物が標的遺伝子中にミスマッチを含有しているか否かを決定するための指示書、及び、随意的に、更に以下を含んでもよい：
ｅ）ミスマッチを含む疑いのある部位を含む核酸断片の増幅に適したオリゴヌクレオチドプライマー、及び／又は
ｆ）Ｍｕ終末核酸を標識するための手段、及び／又は
ｇ）前もって形成されたゲル。
【請求項１９】
以下を含む、標的遺伝子中に変異又は多型を有する生物を選択するための方法：
（Ａ）被検生物からの標的遺伝子を含む第１の核酸鎖、及び標的遺伝子中に変異又は多型を有さず、且つ第１の核酸鎖に相補的な第２の核酸鎖を含む、被検二重鎖核酸を得ること、
（Ｂ）該被検二重鎖核酸を
ｉ）Ｍｕ終末核酸、及び
ｉｉ）ファージＭｕトランスポゼース
と、該被検二重鎖核酸中の標的遺伝子がミスマッチを含む場合に、Ｍｕ終末核酸が標的遺伝子中のミスマッチの部位付近に転位し得る条件下で接触させ、被検Ｍｕ転位産物を得ること、
（Ｃ）該被検Ｍｕ転位産物における、Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子への転位を検出すること、及び、
（Ｄ）Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子中の特定部位への顕著な転位が検出された被検二重鎖核酸中の第１の核酸鎖が由来する被検生物を、標的遺伝子中の該部位付近において変異又は多型を有する生物として選択すること。
【請求項２０】
複数被検生物からの標的遺伝子を含む核酸の混合物を含む鋳型、及び標的遺伝子中の変異又は多型を含む可能性のある部位を増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマーセットを用いたＰＣＲ増幅により被検二重鎖核酸を得る、請求項１９の方法。
【請求項２１】
（Ｂ）において得られる被検Ｍｕ転位産物の複数を混合し、得られる混合物におけるＭｕ終末核酸の標的遺伝子への転位を（Ｃ）において検出する、請求項２０の方法。
【請求項２２】
以下を含む、標的遺伝子中に変異又は多型を有する生物を選択するためのキット：
ａ）Ｍｕ終末核酸
ｂ）ファージＭｕトランスポゼース、
ｃ）Ｍｕ終末核酸が標的遺伝子へ転位したか否かを決定するための手段、及び／又は
ｄ）被検生物が標的遺伝子中に変異又は多型を含有しているか否かを決定するための指示書、及び、随意的に、更に以下を含んでもよい：
ｅ）変異又は多型を含む疑いのある部位を含む核酸断片の増幅に適したオリゴヌクレオチドプライマー、及び／又は
ｆ）Ｍｕ終末核酸を標識するための手段、及び／又は
ｇ）前もって形成されたゲル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的遺伝子中にミスマッチを有する生物を選択するための方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ある特定の遺伝子を破壊したり、人為的にＤＮＡ変異を起こした生物は、遺伝子の機能を個体レベルで解析するために、あるいはヒト疾患のモデルとして病態解析や薬理薬効試験などにおいて非常に有用である。マウスにおいては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の利用により特定の遺伝子を破壊／改変した動物を作製する技術（ノックアウトマウス）が確立されている。しかしながらマウス以外の生物に目を向けてみると、実験動物として有用なラットやウサギなど多くの哺乳動物、ゼブラフィッシュやメダカなどの魚類、イネや大豆などの植物においては、このような優れた遺伝子改変技術が開発されていない。
従来より、エチルニトロソウレア（ＥＮＵ）などの化学変異原物質を用いてＤＮＡに遺伝子変異を起こし、突然変異体（ミュータント）を作製するランダムミュータジェネシスという方法が利用されてきた。さらに、多数のミュータント群の中から標的の遺伝子に突然変異を有する個体をＤＮＡスクリーニングにより選抜することで、目的の遺伝子の突然変異動物を抽出する『遺伝子主体ミュータジェネシス』という手法が報告された（非特許文献１）。この遺伝子主体ミュータジェネシスを用いれば、遺伝子破壊動物だけでなく、点突然変異を起こすことで遺伝子機能変異動物あるいは遺伝子機能亢進動物などを作ることも可能であり、該方法はＥＳ細胞などの遺伝子改変技術がない生物において極めて有用である。
遺伝子主体ミュータジェネシスにおいては、多数のミュータントの中から目的の遺伝子に変異を有する動物を選び出す必要があり、効率的なＤＮＡスクリーニング方法が求められる。これまでＤＮＡスクリーニング方法として、１）シークエンス解析、２）Single-Strand Conformation Polymorphism(SSCP)、３）Temperature Gradient Gel Electrophoresis(TGGE)、４）Targeting Induced Local Lesions IN Genomes(TILLING)などが報告されている。これら従来の方法は、以下のように評価することができる：
１）シークエンス解析は確実に遺伝子変異を検出できる反面、費用と時間がかかる。
２）ＳＳＣＰや３）ＴＧＧＥは条件設定などが必要であり、時間と労力が必要である。
４）セロリから抽出したＣｅｌ１酵素（ミスマッチ特異的ヌクレアーゼ）を利用するＴＩＬＬＩＮＧは、上記３手法に比べて大幅に費用、時間、労力を削減する方法として紹介された（非特許文献２）。しかしながらＴＩＬＬＩＮＧも、小規模で行うには、やはり費用と時間がかかる。
本発明者らは以前に、転位酵素の働きによって、すべてのミスマッチＤＮＡに部位特異的に挿入されるというトランスポゾンＭｕの性質を利用して、ＳＮＰｓ（疾患遺伝子の変異などの一塩基置換）を検出する方法を報告している（特許文献１、非特許文献３）。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００４１９１８２１号明細書
【非特許文献１】Coghill EL et al., A gene-driven approach to the identification of ENU mutants in the mouse., Nat. Genet., 30(3), 255-256, 2002
【非特許文献２】Stemple DL, TILLING…a high-throughput harvest for functional genomics., Nat. Rev. Genet., 5(2), 145-150, 2004
【非特許文献３】Yanagihara K,Mizuuchi K., Mismatch-targeted transposition of Mu: a new strategy to map genetic polymorphism., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(17), 11317-1132l, 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記事情に鑑み、本発明は、従来法と比較してより効率的、且つ低コストに、ランダムミュータジェネシス等により作製された生物個体群の中から、標的遺伝子において変異が導入された個体を選択する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記トランスポゾンＭｕの性質を用いることにより、遺伝子主体ミュータジェネシスにおけるＤＮＡスクリーニングを効率的且つ簡便に行うことが出来ることを見い出した。更に、この方法とプール法を組み合わせたり、また複数種類の蛍光標識Ｍｕ終末核酸を用いたりすることにより、遺伝子主体ミュータジェネシスにおけるＤＮＡスクリーニングの効率を、時間、費用、感度等の面において飛躍的に向上させることに成功し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下に関する。
［１］以下を含む、標的遺伝子中にミスマッチを有する生物を選択するための方法：
（Ａ）被検生物からの標的遺伝子を含む核酸（被検核酸）を、
ｉ）Ｍｕ終末核酸、及び
ｉｉ）ファージＭｕトランスポゼース
と、標的遺伝子がミスマッチを含む場合に、Ｍｕ終末核酸が標的遺伝子中のミスマッチの部位付近に転位し得る条件下で接触させ、被検Ｍｕ転位産物を得ること、
（Ｂ）該被検Ｍｕ転位産物における、Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子への転位を検出すること、及び、
（Ｃ）Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子中の特定部位への顕著な転位が検出された被検核酸の由来する被検生物を、標的遺伝子中の該部位付近においてミスマッチを有する生物として選択すること。
［２］Ｍｕ終末核酸が検出可能に標識されている、［１］の方法。
［３］Ｍｕ終末核酸が蛍光標識されている、［２］の方法。
［４］Ｍｕ終末核酸及び／又は被検核酸がＤＮＡである、［１］の方法。
［５］被検核酸がＰＣＲにより増幅されたものである、［１］の方法。
［６］被検生物がミュータジェネシスにより創生されたものである、［１］の方法。
［７］更に以下を含む、［１］の方法：
（Ａ’）標的遺伝子中にミスマッチを有さないコントロール生物からの標的遺伝子を含む核酸（コントロール核酸）を、
ｉ）Ｍｕ終末核酸、及び
ｉｉ）ファージＭｕトランスポゼース
と、標的遺伝子がミスマッチを含む場合に、Ｍｕ終末核酸が標的遺伝子中のミスマッチの部位付近に転位し得る条件下で接触させ、コントロールＭｕ転位産物を得ること、
（Ｂ’）該コントロールＭｕ転位産物中における、Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子への転位を検出すること、及び、
（Ｃ’）Ｍｕ終末核酸の、被検核酸中の標的遺伝子の特定部位への転位の効率を、コントロール核酸中の対応部位への転位の効率と比較すること。
［８］更に、ミスマッチの位置を決定することを含む、［１］の方法。
［９］被検核酸が複数被検生物からの標的遺伝子を含む核酸の混合物である、［１］の方法。
［１０］被検核酸が２〜１６の被検生物からの標的遺伝子を含む核酸の混合物である、［９］の方法。
［１１］（Ａ）において得られる被検Ｍｕ転位産物の複数を混合し、得られる混合物におけるＭｕ終末核酸の標的遺伝子への転位を（Ｂ）において検出する、［１］の方法。
［１２］被検Ｍｕ転位産物の複数のそれぞれにおいて、Ｍｕ終末核酸が、互いに異なる種類の蛍光により標識されている、［１１］の方法。
［１３］蛍光が、同一波長の励起光により、異なる波長の発光を生じる蛍光の組み合わせから選択される、［１２］の方法。
［１４］以下を含む、標的遺伝子中にミスマッチを有する生物を選択するための方法：
（Ａ）複数被検生物からの標的遺伝子を含む核酸の混合物（被検核酸混合物）を、
ｉ）Ｍｕ終末核酸、及び
ｉｉ）ファージＭｕトランスポゼース
と、標的遺伝子がミスマッチを含む場合に、Ｍｕ終末核酸が標的遺伝子中のミスマッチの部位付近に転位し得る条件下で接触させ、被検Ｍｕ転位産物を得ること、
（Ｂ）被検Ｍｕ転位産物の複数を混合し、被検Ｍｕ転位産物混合物を得ること、
（Ｃ）被検Ｍｕ転位産物混合物における、Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子への転位を検出すること、及び、
（Ｄ）Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子中の特定部位への顕著な転位が検出された被検Ｍｕ転位産物混合物が由来する被検生物群から、標的遺伝子中の該部位付近においてミスマッチを有する生物を選択すること。
［１５］以下を含む、標的遺伝子中にミスマッチを有する非ヒト生物を製造するための方法：
（Ａ）ミュータジェネシスにより、標的遺伝子中にミスマッチを有し得る生物群を提供すること、
（Ｂ）該生物群中の生物からの標的遺伝子を含む核酸（被検核酸）を、
ｉ）Ｍｕ終末核酸、及び
ｉｉ）ファージＭｕトランスポゼース
と、標的遺伝子がミスマッチを含む場合に、Ｍｕ終末核酸が標的遺伝子中のミスマッチの部位付近に転位し得る条件下で接触させ、被検Ｍｕ転位産物を得ること、
（Ｃ）該被検Ｍｕ転位産物における、Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子への転位を検出すること、及び、
（Ｄ）Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子中の特定部位への顕著な転位が検出された被検核酸が由来する生物を、標的遺伝子中の該部位付近においてミスマッチを有する生物として獲得すること。
［１６］被検核酸が該生物群中の複数生物からの標的遺伝子を含む核酸の混合物である、［１５］の方法。
［１７］（Ｂ）において得られる被検Ｍｕ転位産物の複数を混合し、得られる混合物におけるＭｕ終末核酸の標的遺伝子への転位を（Ｃ）において検出する、［１５］の方法。
［１８］以下を含む、標的遺伝子中にミスマッチを有する生物を選択するためのキット：
ａ）Ｍｕ終末核酸、
ｂ）ファージＭｕトランスポゼース、
ｃ）Ｍｕ終末核酸が標的遺伝子へ転位したか否かを決定するための手段、及び／又は
ｄ）被検生物が標的遺伝子中にミスマッチを含有しているか否かを決定するための指示書、及び、随意的に、更に以下を含んでもよい：
ｅ）ミスマッチを含む疑いのある部位を含む核酸断片の増幅に適したオリゴヌクレオチドプライマー、及び／又は
ｆ）Ｍｕ終末核酸を標識するための手段、及び／又は
ｇ）前もって形成されたゲル。
［１９］以下を含む、標的遺伝子中に変異又は多型を有する生物を選択するための方法：
（Ａ）被検生物からの標的遺伝子を含む第１の核酸鎖、及び標的遺伝子中に変異又は多型を有さず、且つ第１の核酸鎖に相補的な第２の核酸鎖を含む、被検二重鎖核酸を得ること、
（Ｂ）該被検二重鎖核酸を
ｉ）Ｍｕ終末核酸、及び
ｉｉ）ファージＭｕトランスポゼース
と、該被検二重鎖核酸中の標的遺伝子がミスマッチを含む場合に、Ｍｕ終末核酸が標的遺伝子中のミスマッチの部位付近に転位し得る条件下で接触させ、被検Ｍｕ転位産物を得ること、
（Ｃ）該被検Ｍｕ転位産物における、Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子への転位を検出すること、及び、
（Ｄ）Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子中の特定部位への顕著な転位が検出された被検二重鎖核酸中の第１の核酸鎖が由来する被検生物を、標的遺伝子中の該部位付近において変異又は多型を有する生物として選択すること。
［２０］複数被検生物からの標的遺伝子を含む核酸の混合物を含む鋳型、及び標的遺伝子中の変異又は多型を含む可能性のある部位を増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマーセットを用いたＰＣＲ増幅により被検二重鎖核酸を得る、［１９］の方法。
［２１］（Ｂ）において得られる被検Ｍｕ転位産物の複数を混合し、得られる混合物におけるＭｕ終末核酸の標的遺伝子への転位を（Ｃ）において検出する、［２０］の方法。
［２２］以下を含む、標的遺伝子中に変異又は多型を有する生物を選択するためのキット：
ａ）Ｍｕ終末核酸
ｂ）ファージＭｕトランスポゼース、
ｃ）Ｍｕ終末核酸が標的遺伝子へ転位したか否かを決定するための手段、及び／又は
ｄ）被検生物が標的遺伝子中に変異又は多型を含有しているか否かを決定するための指示書、及び、随意的に、更に以下を含んでもよい：
ｅ）変異又は多型を含む疑いのある部位を含む核酸断片の増幅に適したオリゴヌクレオチドプライマー、及び／又は
ｆ）Ｍｕ終末核酸を標識するための手段、及び／又は
ｇ）前もって形成されたゲル。
【発明の効果】
【０００５】
本発明の方法を用いれば、ランダムミュータジェネシスにより作製された生物個体群の中から、標的遺伝子において点突然変異が導入された個体を効率的且つ簡便に検出することが可能となる。本発明の方法を用いれば、短期間、且つ低コストで、動植物さまざまな生物種における任意の標的遺伝子の突然変異体の作製が可能となり、特にラット等、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を利用した遺伝子改変技術の適用が困難な生物種の突然変異体の作製に有用である。本発明の方法を利用して製造された遺伝子変異体は、医学、薬学、生物学等さまざまな分野における貴重な研究材料となり得る。また、例えばラット等の遺伝子変異動物は薬理薬効試験などの疾患モデル動物として、製薬業界においては非常に利用価値のあるものと考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
（１．標的遺伝子中にミスマッチを有する生物を選択するための方法）
本発明は、以下を含む、標的遺伝子中にミスマッチを有する生物を選択するための方法（本発明の方法Ｉ）を提供するものである：
（Ａ）被検生物からの標的遺伝子を含む核酸（被検核酸）を、
ｉ）Ｍｕ終末核酸、及び
ｉｉ）ファージＭｕトランスポゼース
と、標的遺伝子がミスマッチを含む場合に、Ｍｕ終末核酸が標的遺伝子中のミスマッチの部位付近に転位し得る条件下で接触させ、被検Ｍｕ転位産物を得ること、
（Ｂ）該被検Ｍｕ転位産物における、Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子への転位を検出すること、及び、
（Ｃ）Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子中の特定部位への顕著な転位が検出された被検核酸の由来する被検生物を、標的遺伝子中の該部位付近においてミスマッチを有する生物として選択すること。
【０００７】
Ｍｕ転位反応により、二重鎖核酸標的中のミスマッチを検出するための方法は、公知であり、例えばUS2004191821や、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(17), 11317-1132l, 2002等に記載されている。本発明の方法Ｉは、これら公知の方法を、標的遺伝子中にミスマッチを有する生物の選択、例えばミュータジェネシスにより創生された変異生物群からの、注目する遺伝子（標的遺伝子）に所望のミスマッチ（又は変異、多型等）を有する生物の選択に適用したことを一つの特徴とする。
【０００８】
本明細書中、「標的遺伝子」とは、ミスマッチ（又は変異、多型等）が含まれていることが期待される、又はミスマッチ（又は変異、多型等）が含まれる可能性のある、関心のある遺伝子をいう。標的遺伝子は、構造遺伝子であることが好ましいが、生物内の高分子核酸（例えば、染色体ＤＮＡ、染色体ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ等）中の一定の領域の塩基配列により規定される作用単位であれば足りる。
【０００９】
ミスマッチは、例えばＤＮＡ複製エラー、ミュータジェネシス、５−メチルシトシンの脱アミノ化、ＤＮＡ組換え等により生じた変異の存在を反映し得る。本明細書において「変異」とは、核酸配列中のヌクレオチド配列変化（例えば、１つ（点変異）又は多数のヌクレオチド置換、欠失、挿入又は付加）をいう。変異を含む核酸は、対応する野生型集団とは異なったヌクレオチド配列を有する。
【００１０】
本明細書中、「ミスマッチ」は二重鎖核酸の一方の鎖中にあるヌクレオチドが、ワトソン−クリック塩基ペアリング及び対面する相補的な核酸鎖中のヌクレオチドとの［pi］スタッキング相互作用を通じて対にならない又は対になれないことを意味する。例えば、以下の１又は２以上が核酸中に存在し得る：（１）A-T又はG-C以外のＤＮＡヌクレオチド対、例えば、A-C, A-G, A-A, T-C, T-G, T-T, G-G, 又は C-Cのようなヌクレオチド対。（２）バブルともいわれる複数（通常２から５ヌクレオチド）の連続的なミスマッチ。
【００１１】
本発明において使用される「生物」としては、特に限定がなく、ヒト及びあらゆる種類の非ヒト生物（例えば、真核生物（動物、植物等）、原核生物、真正細菌細胞等）を使用することが出来る。また、本明細書中、「生物」は広義に理解され、非感染状態では通常自己複製できない、ウイルス、レトロウイルス、ファージ等も「生物」に含まれる。好ましくは、本発明において使用される生物はヒト又は非ヒト脊椎動物、より好ましくは、ヒト又は非ヒト哺乳動物（例えば、農場動物、家畜、研究動物等）である。
【００１２】
１つの好ましい態様において、本発明において使用される生物は、ミュータジェネシスにより創生されたものであり得る。ミュータジェネシスとは、人為的に遺伝子中に変異を導入することをいう。ミュータジェネシスは、自体公知の方法により行うことが出来る。例えば、脊椎動物であれば、ＥＮＵ（エチルニトロソウレア）等の変異原性物質が投与された雄性動物と野生型の雌性動物とを掛け合わせることにより、その子孫動物中に、ある確率で標的遺伝子中に変異が導入された変異体を得ることが出来る。
【００１３】
本発明において用いられる「被検生物からの標的遺伝子を含む核酸（被検核酸）」は、本発明の方法ＩにおいてファージＭｕトランスポゼースの基質として機能することのできる限り、如何なる形体をとってもよい。該核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよいが、好ましくはＤＮＡである。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよいが、通常二本鎖である。二本鎖の場合は、該核酸は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよいが、通常、二本鎖ＤＮＡである。被検核酸としては、具体的には、例えば、染色体ＤＮＡ、染色体ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ等を挙げることが出来る。被検核酸は、好ましくは染色体ＤＮＡである。被検核酸は、自体公知の方法により調製される。
【００１４】
被検核酸は、１つ又はそれ以上の、多様な公知の結合部分（例えば、エステル、スルファメート、スルファミド、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、カルバメート等）を介して結合されたヌクレオチドを含んでいてもよい（U.S. Pat. No. 5,378,825）。また、ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログは、６−メルカプトグアニン、８−オキソグアニン等と結合していてもよい。多様な他の改変、例えば検出可能なマーカー（アビヂン、ビオチン、放射活性エレメント、蛍光タグ、色素、エネルギー転位ラベル、エネルギー放射ラベル、結合パートナー等）や、ハイブリダイゼーション、検出及び／又は安定性を改善する部分の結合等が被検核酸に施されていてもよい。ここにおける議論は、通常二重鎖ＤＮＡに向けられたものである。しかしながら、当業者は、該議論を、他の形態の核酸へも適用し得ることを理解することができる。
【００１５】
被検核酸は、標的遺伝子の全長を含んでいなくてもよく、少なくとも、標的遺伝子の一部であって、ミスマッチ（又は変異、多型等）が含まれていることが期待される、又はミスマッチ（又は変異、多型等）が含まれる可能性のある部位を含む一部を含んでいればよい。
【００１６】
本発明において用いられる被検核酸の大きさは、本発明の目的を達成できる限り、特に限定されない。Ｍｕトランスポゼースの基質として機能可能な被検核酸の最小限の全長は約３０塩基対であり、理論上の上限はない。通常、被検核酸の大きさは、Ｍｕ転位反応の産物の大きさが、ゲル電気泳動等により容易に分離できるように選択される。被験核酸の大きさは、通常は約３０〜１００００ｂｐ、例えば約３０〜２０００ｂｐである。
【００１７】
１つの好ましい態様において、本発明において使用される被検核酸はＰＣＲ増幅産物であり得る。該ＰＣＲ増幅産物の調製には、被検生物からの標的遺伝子を含む核酸が鋳型として用いられる。該鋳型は、少なくとも１つのミスマッチ（又は変異、多型等）を含む可能性がある部位、及びそれに隣接するオリゴヌクレオチドプライマーハイブリダイゼーション及びＰＣＲ増幅のための鋳型として役割を果たすのに十分な長さを有するヌクレオチドを含む。ＰＣＲ増幅は、まず、２つのオリゴヌクレオチドプライマーを上記鋳型へハイブリダイズし、そしてＰＣＲ増幅の多重回数を行う。該オリゴヌクレオチドプライマーセットは、標的遺伝子中のミスマッチ（又は変異、多型等）を含む可能性のある部位を増幅可能なようにデザインされる。オリゴヌクレオチドプライマーセットは、ミスマッチ（又は変異、多型等）を含む可能性のある部位に隣接するヌクレオチド配列及び少なくとも２つの重要なパラメーター（オリゴヌクレオチドプライマーのサイズ及び鋳型へハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプライマーの３’終末間に挟まれた領域の大きさ）を考慮しデザインされる。好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーは長さが、少なくとも約１２ヌクレオチドであり、より好ましくは長さが１５〜５０ヌクレオチドであり、最も好ましくは長さが１５〜２５ヌクレオチドである。
【００１８】
鋳型にハイブリダイズした２つのオリゴヌクレオチドプライマーの３’終末の間に介在している領域の大きさは、ＰＣＲにより増幅された鋳型の周知の大きさ制限及び（ゲルで転位産物を分析するために用いる場合には）転位産物を検出するために用いられる特定のゲルの分解能により決定され得る。鋳型へハイブリダイズした２つのオリゴヌクレオチド間の３’終末の間に介在している領域の大きさはアッセイの必要性に応じて多様であり得る。Ｍｕトランスポゼースの基質として機能可能な被検核酸の最小限の全長は約３０塩基対であり、理論上の上限はない。従って、プライマー間の最小限の大きさは、もし既知の部位における特定の変異に焦点を当てたいのであれば、数塩基のみであってもよい。大きな領域の測定のためには、ＰＣＲ反応の効率により現実的な制限が課される。非常に長い分子の増幅効率が低いこと、及び増幅の正確性が制限されていることの両方により、プライマー間の大きさの上限を決定することが出来る。なぜなら、増幅の間の誤りはランダムな変異を生じるからである。通常、被検核酸の大きさは、転位反応の産物の大きさが、ゲル電気泳動等により容易に分離できるように選択される。ＰＣＲ増幅産物の大きさは、通常は約３０〜１００００ｂｐ、例えば約３０〜２０００ｂｐである。
【００１９】
ＰＣＲ増幅のための適当なプライマー及び条件は、当業者により容易に決定され得る。例えば、Innis et al., eds. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press, San Diego, Califを参照のこと。ＰＣＲ増幅条件は、それぞれのプライマーセットについて標準的技術により経験的に、マグネシウム濃度、アニーリング温度、プライマー／鋳型組み合わせ等について最適化することができる。
【００２０】
尚、本発明に用いられる「被検生物からの標的遺伝子を含む核酸」は、ミスマッチを含んでいてもいなくてもよい。通常の意味において、本発明は、被検核酸中にミスマッチが検出されるか否かに関わらず、生物が標的遺伝子中にミスマッチを有するか否かを決定する方法に関する。
【００２１】
図１ａ、ｂ及びｃは、本発明で用いられる被検核酸の典型的な例を示す。図１ａの核酸は、該核酸の中央にある１ヌクレオチドが、完全なワトソン−クリック塩基対マッチを形成する様に整列している（ホモ二重鎖という場合がある）。図１ｂの核酸は、塩基Ｘ及びＹがワトソン−クリック塩基対を形成せず、１ｂｐミスマッチを形成している（ヘテロ二重鎖という場合がある）。図１ｃの核酸においては、ヌクレオチドＺが対ではなく、「バルジ」またはループを形成した、ミスマッチを示す。
【００２２】
本発明において用いられるＭｕ終末核酸は、通常ＤＮＡである。本明細書中、「Ｍｕ終末核酸」とは、本発明において用いられるインビトロＭｕ媒介転位反応において機能を果たすことが出来る、二重鎖Ｍｕ核酸の右（Ｒ）終末からの断片をいう。本発明において用いられる反応条件で有効に機能するＭｕ終末核酸の最小サイズは、非移入鎖の５’終末の複数のヌクレオチド伸長（オーバーハング）を除き、約５０塩基対である。Ｍｕ終末核酸の長さは短い程、連結された転位産物の直接的なサイズ測定が容易になるが、所望により、種々の配列又は長さの付加的核酸、及び／又は選択可能な原料が、Ｍｕ終末核酸の遠位終末へ付加されてもよい。図２に例示されるような、本発明において用いられる好ましいＭｕ終末核酸断片は、「前開裂（ｐｒｅ−ｃｌｅａｖｅｄ）」３’終末及び短い５’オーバーハングを有する。図２に例示されるＭｕ終末核酸断片は、第１の５１ｂｐのＭｕ−Ｒ終末配列を含む。本明細書において、図２に示されるＭｕ終末核酸の上側の鎖を「非移入」鎖、下側の鎖を「移入」鎖と呼ぶことがある。また、本明細書中、標的核酸中へ転位するＭｕ終末核酸の終末を「近位」終末、もう一方の終末を「遠位」終末ということがある。
【００２３】
本発明に用いられるＭｕ終末核酸の具体例としては、例えば、配列番号１で示されるヌクレオチド配列を含む非移入ＤＮＡ鎖及び配列番号２で示されるヌクレオチド配列を含む移入ＤＮＡ鎖からなる二重鎖ＤＮＡ、配列番号３で示されるヌクレオチド配列を含む非移入ＤＮＡ鎖及び配列番号４で示されるヌクレオチド配列を含む移入ＤＮＡ鎖からなる二重鎖ＤＮＡ、配列番号１０２で示されるヌクレオチド配列を含む非移入ＤＮＡ鎖及び配列番号１０３で示されるヌクレオチド配列を含む移入ＤＮＡ鎖からなる二重鎖ＤＮＡ等を挙げることが出来る。
【００２４】
また、上記ヌクレオチド配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含有し、且つ、本発明において用いられるインビトロＭｕ媒介転位反応において機能を果たすことが出来る二重鎖ＤＮＡも、Ｍｕ終末核酸に含まれる。
【００２５】
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）第２版（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なわれる。ハイストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム塩濃度が約１９〜約４０ｍＭ、好ましくは約１９〜約２０ｍＭで、温度が約５０〜約７０℃、好ましくは約６０〜約６５℃の条件等が挙げられる。特に、ナトリウム塩濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が好ましい。
【００２６】
また、上記ヌクレオチド配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含有し、且つ本発明において用いられるインビトロＭｕ媒介転位反応において機能を果たすことが出来る二重鎖ＤＮＡも、Ｍｕ終末核酸に含まれる。本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（NationalCenter for Biotechnology Information Basic LocalAlignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；フィルタリング=ON；マッチスコア=1；ミスマッチスコア=-3）にて計算することができる。
【００２７】
本発明において使用されるＭｕ終末核酸は、検出可能なマーカー（アビヂン、ビオチン、放射活性エレメント、蛍光タグ、色素、エネルギー転位ラベル、エネルギー放射ラベル、結合パートナー等）により標識されていてもよい。Ｍｕ終末核酸は好ましくは蛍光標識されている。上述したように、Ｍｕ終末核酸は移入鎖及び非移入鎖からなるが、好ましくはＭｕ終末核酸の移入鎖が標識され、より好ましくは移入鎖の５’終末が標識される。これによりＭｕ転位反応産物を電気泳動等で分離した後に、標識された移入鎖が連結された核酸断片を容易に検出し、可視化することが出来る。
【００２８】
本発明において用いられるファージＭｕトランスポゼースは、本発明の目的を達成し得る限り、多様な態様のものを用いることが出来る。例えば、ファージＭｕトランスポゼースの全長を使用することが出来る。この酵素は、市販材料から獲得され得る。例えば、ファージＭｕトランスポゼースは、（特殊化されたトランスポゼース構築物との組み合わせで）Invitrogen Life Technologies (1600 Faraday Ave. Carlsbad, Calif. 92008) から市販されている“Gene Jumper Kit” 及び“Gene Jumper oriV Transposon Kit”という名のキット中に存在している。あるいは、該酵素は、標準的なタンパク質精製カラムクロマトグラフィーを含む既報の方法(Baker et al. (1993), Cell 74, 723-33)等の常法に従って調製されてもよい。
【００２９】
あるいは、該トランスポゼースは、全長酵素の機能的断片であってもよい。インビトロ転位現象を行う能力に実質的に影響しないように欠失することの出来る該タンパク質の部分には、例えば、Ｎ末端におけるエンハンサー結合ドメイン及びＣ末端における他のアクセサリー蛋白質と相互作用するドメイン等が含まれる。野生型Ｍｕトランスポゼースの全長サイズは、６６３アミノ酸である（配列番号５）（Genbankアクセッション番号：AAA32369）。本発明の目的のために必要な最小限の触媒活性は、アミノ酸配列の７７位に始まり、６０４位に終わる不完全なタンパク質において維持されている。該蛋白質は、通常ＭｕＡ７７−６０４という。本発明において使用することの出来る他のトランスポゼース分子としては、例えば、ＭｕＡ７７−６６３（全長タンパク質の最初の７６アミノ酸を欠失している）、Ｍｕ７７−６１５（Ｎ末端の７６アミノ酸及びＣ末端の４８アミノ酸を欠失している）が含まれる。
【００３０】
トランスポゼースには、野生型タンパク質と異なるバリアントをも含まれ得る。インビトロ転位現象を行う実質的能力を保持している活性なバリアントが容認される。適当なバリアントとしては、例えば、１又は２以上の天然又は非天然に生じた、及び保存的又は非保存的な改変（例えば、挿入、欠失、付加、及び／又は置換）が含まれる。「保存的置換」とは、例えば、Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; and Phe, Tyrのような組み合わせを意味する。バリアントには、例えばホモログ、ムテイン及びミメティックを含むことが出来る。翻訳後改変を含む多くのタンパク質改変体が含まれる。翻訳後改変には、天然に生じた、又は合成の、例えば、糖基、脂質、リン酸、アセチル基等の他の化学的部分との共有又は凝集のコンジュゲート、そして末端アミノ酸の裂開などが含まれる。改変は例えばU.S. Pat. No. 5935835に開示されている。他の活性バリアントは、最小限の活性Ｍｕトランスポゼースを含むＭｕトランスポゼースのＮ又はＣ末端のいずれかに付加された、適切に折りたたまれたペプチド配列（例えば、タンパク質ドメイン）を含み得る。付加配列は、天然に生じたものであってもヘテロなものであっても良く、リーダー、シグナル、分泌、標的、酵素的等の配列が含まれる。そのような融合タンパク質の更なる例には、エピトープタグ及びＧＦＰ（又はそのバリアント）タグが含まれる。
【００３１】
当業者は、ファージＭｕトランスポゼースの断片又はバリアント型を容易に試験し、本発明において活性であるか否かを決定する事が出来る。
【００３２】
本発明の方法Ｉは、被検核酸を、
ｉ）Ｍｕ終末核酸、及び
ｉｉ）ファージＭｕトランスポゼース
と、標的遺伝子がミスマッチを含む場合に、Ｍｕ終末核酸が標的遺伝子中のミスマッチの部位付近に転位し得る条件下で接触させ、被検Ｍｕ転位産物を得る工程（工程Ａ）を含む。
【００３３】
工程Ａの一例を、図３に模式的に示す。被検核酸として、図１ｂ中に示す、１塩基対ミスマッチを有するヘテロ二重鎖ＤＮＡが用いられ、Ｍｕ終末核酸として、図２に示されるＭｕ終末ＤＮＡが用いられている。該被検核酸を、適切な条件でＭｕ終末核酸及びファージＭｕトランスポゼースと接触すると、第一に被検核酸の上側の鎖については、該被検核酸がミスマッチの部位から２塩基５’側で切断され、Ｍｕ終末核酸の移入鎖が、この部位で該被検核酸に連結する。その結果、図３の例では、この連結されたＤＮＡ鎖は、５１ｎｔ（Ｍｕ終末核酸の移入鎖）＋４１ｎｔ（被検核酸の上側の鎖）、即ち全体で９２ｎｔの長さを有する。被検核酸の上側の鎖の残りの長さは、３５ｎｔである。同様の鎖移入が、被検核酸の下側の鎖にも起こり、４０ｎｔ＋５１ｎｔ、即ち９１ｎｔの連結されたＤＮＡを生じ、残りの鎖は３６ｎｔの長さとなる。即ち、Ｍｕ転位反応の結果、ミスマッチを有する１つの被検核酸から、４つの「転位産物」が形成される。
【００３４】
図３から理解されるように、被検核酸の２つの鎖における切断及びＭｕ終末ＤＮＡへの連結の位置は５ヌクレオチドずれて（５’伸長）生じ、ミスマッチ部位における好ましい転位は、該５ヌクレオチドの中央にミスマッチヌクレオチドを配するように生じる。従って、好ましい切断・移入の位置は、それぞれの鎖上のミスマッチから２塩基５’側となる。従って、Ｍｕ転位反応により生じる「連結産物鎖」は、移入されたＭｕ終末核酸の鎖の長さ及びミスマッチの部位からそれぞれの鎖の３’末端までの被検核酸の長さの合計よりも２塩基長い。一方、Ｍｕ終末核酸へ連結せずに残存している切断された被検核酸鎖は、ミスマッチの部位からそれぞれの鎖の５’末端までの長さより２塩基短い。複数の連続的なヌクレオチドミスマッチがある場合は、転位産物のサイズ分布はそれに伴って広がる。本明細書において、標的遺伝子中の「ミスマッチの部位付近における」転位という場合、該転位が、上記の距離の範囲内、例えばミスマッチの部位から２塩基５’側で起こることを意味する。本明細書において、「転位」とは、被検核酸のミスマッチの部位付近での切断、及びＭｕ終末核酸の「移入鎖」の３’末端の切断された被検核酸の５’末端への連結を含む、Ｍｕ終末核酸の核酸鎖転位反応をいう。
【００３５】
本発明において、インビトロでのファージＭｕトランスポゼース媒介Ｍｕ終末核酸転位のために有効な条件は、経験的に最適化することが出来る。幾つかの反応条件がSavilahti et al (1995), EMBO Journal 14, 4893-4903において改変され、議論されている。またUS2004191821や、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(17), 11317-1132l, 2002等に記載された反応条件を最適化してもよい。好ましい態様において、反応が、後述の実施例１において記載されたものと実質的に同様な条件において行われる。反応条件は、幅広く変更可能である。好ましい態様において、Ｍｕ終末核酸は、標的ＤＮＡについては、制限されている。Ｍｕ終末核酸転移反応の反応液には、通常、マグネシウムイオン、ＤＭＳＯ及びＮａＣｌが含まれる。本発明において、ミスマッチを検出する際にＭｕ終末核酸のランダムな転位により生じるバックグラウンドを低下させるため、反応液中のマグネシウムイオン濃度は２〜１０ｍＭの範囲、ＤＭＳＯ濃度は５〜１２．５％（v/v）（例えば１０％（v/v））の範囲、ＮａＣｌ濃度は２７５〜３２５ｍＭ（例えば３００ｍＭ）の範囲であることが好ましい。Ｍｕ終末核酸転位反応の際の反応温度は、Ｍｕトランスポゼースが機能し、Ｍｕ終末核酸転位反応が生じ得る範囲で適宜設定される。本発明において、該反応温度は、通常、１０〜３５℃の範囲であるが、Ｍｕ終末核酸のランダムな転位により生じるバックグラウンドを低下させるため、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(17), 11317-1132l, 2002等に記載された反応温度よりも低く設定されることが好ましく、該反応温度は好ましくは１０〜２５℃、より好ましくは１５〜２０℃である。特に後述のプール法においては、１つの被検核酸に由来するミスマッチのシグナルが低下するため、上記反応条件を用いてバックグラウンドを低下させることが望ましい。
【００３６】
本発明の方法Ｉにおいて、上記工程（Ａ）の後で、被検Ｍｕ転位産物における、Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子への転位が検出される（工程（Ｂ））。
【００３７】
多様な常法を、Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子への転位を検出するために使用することが出来る。好ましい態様において、Ｍｕ転位反応の産物が、大きさにより分離され、そして可視化される。例えば、一本鎖ＤＮＡが、通常の変性ゲル上等で、電気泳動により分離される。該ゲルには、分離される断片の大きさに応じて、４−８Ｍ尿素やホルムアミドのような変性剤の存在中で形成されたポリアクリルアミド又はアガロースゲルが含まれる。該ゲルは、スラブゲルのようなキャスト（鋳造物）であってもよく、或いはキャピラリーチューブ中であってもよい。
【００３８】
本明細書中に記載されたような検出可能な標識を含む核酸断片は、常法により可視化することが出来る。被検核酸又はＭｕ終末核酸を、前出の検出可能な標識によりラベルすることにより、可視化を容易にすることが出来る。好ましい実施態様において、Ｍｕ終末核酸の移入鎖の５’終末がラベルされる。転位反応の産物の大きさは、通常、標準サイズマーカーとの比較により決定される。
【００３９】
蛍光標識されたＭｕ終末核酸を用いた場合には、Ｍｕ転位反応の産物を市販の自動シークエンサーに付すことにより、該産物が大きさにより分離され、蛍光検出器により、転位反応産物の有無及び／又は大きさが測定される。
【００４０】
工程（Ｂ）で、被検Ｍｕ転位産物において、Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子中の特定部位への顕著な転位が検出された場合、被検核酸は該特定部位付近においてミスマッチを有する、即ち、被検核酸が由来する被検生物は、標的遺伝子中の該部位付近においてミスマッチを有する生物であると判断することが出来る。一方、被検Ｍｕ転位産物において、Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子中の特定部位への顕著な転位が検出されなかった場合、被検核酸は該特定部位付近においてミスマッチを有さない、即ち、被検核酸が由来する被検生物は、標的遺伝子中の該部位付近においてミスマッチを有さない生物であると判断することが出来る。
【００４１】
「特定部位」とは、Ｍｕ終末核酸が特異的に転位する部位を意味する。Ｍｕ終末核酸の転位が特異的であるか否かは、標的遺伝子中にミスマッチを有さないコントロール生物（例えば、野生型生物等）からの標的遺伝子を含む核酸（コントロール核酸）が、被検核酸と平行して処理され、Ｍｕ転位産物の２つのセットを比較し、被検核酸において顕著な（有意な）転位効率の増加が認められるか否かを評価することにより決定することが出来る。
【００４２】
即ち、本発明の方法Ｉは、更に以下を含むことが出来る：
（Ａ’）標的遺伝子中にミスマッチを有さないコントロール生物からの標的遺伝子を含む核酸（コントロール核酸）を、
ｉ）Ｍｕ終末核酸、及び
ｉｉ）ファージＭｕトランスポゼース
と、標的遺伝子がミスマッチを含む場合に、Ｍｕ終末核酸が標的遺伝子中のミスマッチの部位付近に転位し得る条件下で接触させ、コントロールＭｕ転位産物を得ること、
（Ｂ’）該コントロールＭｕ転位産物中における、Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子への転位を検出すること、及び、
（Ｃ’）Ｍｕ終末核酸の、被検核酸中の標的遺伝子の特定部位への転位の効率を、コントロール核酸中の対応部位への転位の効率と比較すること。
【００４３】
しかしながら、コントロール核酸との比較は必ずしも必要ではなく、例えば、被検核酸を用いたＭｕ転位反応からのＭｕ転位産物を、標準化された値と比較してもよい。あるいは、多数の被検核酸からのＭｕ転移産物を、お互いに比較してもよい。
【００４４】
そして、工程（Ｂ）の結果に基づき、Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子中の特定部位への顕著な転位が検出された被検核酸の由来する被検生物を、標的遺伝子中の該部位付近においてミスマッチを有する生物として選択する（工程（Ｃ））。
【００４５】
本発明の方法Ｉにおいて、ミスマッチを有する生物が選択された場合、更に該ミスマッチの位置を決定してもよい。ミスマッチの位置の決定は多様な方法により行うことが可能である。
【００４６】
例えば、検出されたミスマッチを含む被検核酸のヌクレオチド配列を解析することにより、標的遺伝子中のミスマッチの位置を決定することが出来る。
【００４７】
また、上述したように、４つの転位産物がＭｕ転位反応の結果生じるので、これらの４つの転位産物の長さを決定することにより、ミスマッチの位置を決定することが出来る。Ｍｕ終末核酸が検出可能に標識されている場合、検出される転位産物の長さは、移入鎖が連結された被検核酸の長さとなり、より具体的には、被検核酸の３’終末からミスマッチまで＋２ヌクレオチド（上述の様に）＋Ｍｕ終末核酸の移入鎖の長さである。被検核酸は通常２つの核酸鎖を有するので、それぞれの鎖から１つずつ（合計２つ）の転位産物が検出される可能性があり、そのそれぞれが「被検核酸の３’終末からミスマッチまで＋２ヌクレオチド＋Ｍｕ終末核酸の移入鎖」の長さを反映している。しかしながら、更なる解析がなければ、２つの被検核酸終末のどちらが、ミスマッチの位置に近いのかに関して２倍の不確実性が残る。原理的には、もしＭｕ終末核酸の代わりに被検核酸の３’終末が標識されていれば、Ｍｕ終末核酸を標識した際に得られる転位産物と同一の転位産物が検出され得る。しかしながら、この場合、検出されたミスマッチの位置の２倍の不確実性を解消するため、被検核酸中の注目する鎖の３’終末のみをラベルすることが出来る。あるいは、被検核酸の５’終末が標識されていれば、検出される転位産物は、５’末端からミスマッチ−（マイナス）２ヌクレオチドの部位までの、切断された被検核酸の鎖となる。この核酸断片は、Ｍｕ終末核酸に連結されていないが、その長さは、被検核酸中のＭｕ転位反応の位置を反映するので、ミスマッチの存在やその位置を特定するために有用である。上述したように、被検核酸中のそれぞれの鎖について、２つの長さの転位産物、即ちＭｕ終末核酸の移入鎖へ連結した鎖の半分と、Ｍｕ終末核酸へ連結していない鎖のもう半分が存在する。従って、ミスマッチの位置を決定するために、標識の仕方によって、４つの転位産物のいずれの長さをも決定することが出来る。
【００４８】
1つの好ましい態様において、本発明の方法Ｉにおいて用いられる被検核酸は、複数被検生物からの標的遺伝子を含む核酸の混合物であり得る（プール法）。複数の被検生物からの標的遺伝子を含む核酸を１つにプールすることにより、それらの複数の生物中に、目的とするミスマッチを有する生物が存在するか否かを一度に評価することが出来、時間的及び費用的なコストを大幅に削減することが可能である。従って、この「プール法」を用いれば、例えばミュータジェネシスにより創生された多数の生物群の中から、極めて効率的に、標的遺伝子中にミスマッチを有する生物を選択することが出来る。
【００４９】
プールされるそれぞれの被検核酸について、ミスマッチの検出感度が同等となるように、被検核酸は、それぞれ約等重量ずつプールされることが好ましい。「約等重量」とは、重量が約０．５〜２倍の範囲内であることを意味する。
【００５０】
プールされる被検核酸の数は、本発明の目的を達成し得る限り、特に限定されない。プールされる被検核酸の数が多くなると、上述のコスト削減効果が増加する一方で、１つの被検核酸からのＭｕ転位産物の相対量が低下し、ミスマッチの検出感度が低下する。従って、プールされる被検核酸の数は、コスト削減効果及びミスマッチの検出感度を考慮し、適宜設定することが出来る。良好なミスマッチの検出感度を維持しつつ、コスト削減効果を達成するため、本発明において用いられる被検核酸は、通常２〜１６、好ましくは４〜１２の被検生物からの標的遺伝子を含む核酸の混合物であり得る。
【００５１】
1つの好ましい態様において、本発明の方法Ｉの上記工程（Ａ）において得られる被検Ｍｕ転位産物の複数を混合し、得られる混合物におけるＭｕ終末核酸の標的遺伝子への転位を工程（Ｂ）において検出してもよい（Ｍｕ転位産物混合法）。このように複数の被検Ｍｕ転位産物を混合した後で、Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子への転位を検出することにより、複数の被検核酸について、目的とするミスマッチが存在するか否かを一度に評価することが出来、時間的及び費用的なコストを大幅に削減することが可能である。
【００５２】
この場合、混合される被検Ｍｕ転位産物の複数のそれぞれについて、Ｍｕ終末核酸が、互いに、異なる種類の標識（例えば、蛍光等）により標識されていることが好ましい。これにより、被検Ｍｕ転位産物の混合物中に、Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子中の特定部位への顕著な転位が検出された場合、その検出された標識の種類に基づき、該転位が混合物中のどの被検Ｍｕ転位産物において生じたものであるかを容易に見分けることが可能となる。
【００５３】
異なる種類の標識の組み合わせは、本発明の目的が達成される限り特に限定されないが、１回の測定で多種類の標識を見分け得るように、該標識は同一波長の励起光により、異なる波長の発光を生じる蛍光の組み合わせから選択されることが好ましい。このような蛍光の組み合わせとしては、市販の自動シークエンサーで検出可能な蛍光の組み合わせ（例えば、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＮＥＤ及びＲＯＸからなる組み合わせ）等を挙げることが出来る。
【００５４】
本発明の方法Ｉの最も好ましい態様の１つとして、上述の「プール法」及び「Ｍｕ転位産物混合法」を組み合わせた方法（以下、該方法をMuT-POWER法という場合がある）を挙げることが出来る。即ち、本発明は、以下を含む、標的遺伝子中にミスマッチを有する生物を選択するための方法を提供する：
（Ａ）複数被検生物からの標的遺伝子を含む核酸の混合物（被検核酸混合物）を、
ｉ）Ｍｕ終末核酸、及び
ｉｉ）ファージＭｕトランスポゼース
と、標的遺伝子がミスマッチを含む場合に、Ｍｕ終末核酸が標的遺伝子中のミスマッチの部位付近に転位し得る条件下で接触させ、被検Ｍｕ転位産物を得ること、
（Ｂ）被検Ｍｕ転位産物の複数を混合し、被検Ｍｕ転位産物混合物を得ること、
（Ｃ）被検Ｍｕ転位産物混合物における、Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子への転位を検出すること、及び、
（Ｄ）Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子中の特定部位への顕著な転位が検出された被検Ｍｕ転位産物混合物が由来する被検生物群から、標的遺伝子中の該部位付近においてミスマッチを有する生物を選択すること。
【００５５】
MuT-POWER法の一例を模式的に図４に示す。図４の例では、まず被検生物群（７６８個体）から抽出された染色体ＤＮＡが８サンプルごとにプールされている（９６ウェル）（１）。このプールされた染色体ＤＮＡを鋳型として、標的遺伝子がＰＣＲ増幅される。ＰＣＲ産物（９６サンプル）を４つのグループに分けて、それぞれ４色の蛍光（ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＮＥＤ又はＲＯＸ）により移入鎖の５’末端が標識されたＭｕ終末ＤＮＡを用いてＭｕ転位反応を行う（２）。反応後、４つの転位反応産物グループを１つにまとめ（２４サンプル）（３）、自動キャピラリーシークエンサーに付し、蛍光標識Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子中への転位の有無を確認する（４）。特異的転位の存在が確認されたウェル／蛍光の種類に対応する８個体からのそれぞれの染色体ＤＮＡ中の標的遺伝子のヌクレオチド配列を確認し、最終的に標的遺伝子中にミスマッチを有する個体、及びミスマッチの位置を確認する。
【００５６】
MuT-POWER法を用いることにより、多大な数のサンプルを１つに縮重した上で、その縮重されたサンプル中に目的とするミスマッチが存在するか否かを評価することが可能となり、時間的及び費用的なコストを著しく削減することが可能である。
【００５７】
（２．標的遺伝子中にミスマッチを有する生物の製造方法）
また本発明は、以下を含む、標的遺伝子中にミスマッチを有する生物を製造するための方法（以下、本発明の製造方法という場合がある）を提供するものである：
（Ａ）ミュータジェネシスにより、標的遺伝子中にミスマッチを有し得る生物群を提供すること、
（Ｂ）該生物群中の生物からの標的遺伝子を含む核酸（被検核酸）を、
ｉ）Ｍｕ終末核酸、及び
ｉｉ）ファージＭｕトランスポゼース
と、標的遺伝子がミスマッチを含む場合に、Ｍｕ終末核酸が標的遺伝子中のミスマッチの部位付近に転位し得る条件下で接触させ、被検Ｍｕ転位産物を得ること、
（Ｃ）該被検Ｍｕ転位産物における、Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子への転位を検出すること、及び、
（Ｄ）Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子中の特定部位への顕著な転位が検出された被検核酸が由来する生物を、標的遺伝子中の該部位付近においてミスマッチを有する生物として獲得すること。
【００５８】
本発明の製造方法は、上記本発明の方法Ｉと同様にして行うことが出来る。本発明の製造方法においても、上記プール法を組み合わせることができ、本発明の製造方法において用いられる被検核酸は、工程（Ａ）で提供された生物群中の複数生物からの標的遺伝子を含む核酸の混合物であり得る。
【００５９】
また、本発明の製造方法においても、上記Ｍｕ転位産物混合法を組み合わせることができ、上記工程（Ｂ）において得られる被検Ｍｕ転位産物の複数を混合し、得られる混合物におけるＭｕ終末核酸の標的遺伝子への転位を（Ｃ）において検出してもよい。
【００６０】
本発明の製造方法の最も好ましい態様としては、上述の本発明の方法Ｉと同様に、上述の「プール法」及び「Ｍｕ転位産物混合法」が組み合わされる。
【００６１】
（３．変異または多型を有する生物を選択する方法）
また、本発明は以下を含む、標的遺伝子中に変異又は多型を有する生物を選択するための方法（本発明の方法ＩＩ）を提供するものである：
（Ａ）被検生物からの標的遺伝子を含む第１の核酸鎖、及び標的遺伝子中に変異又は多型を有さず、且つ第１の核酸鎖に相補的な第２の核酸鎖を含む、被検二重鎖核酸を得ること、
（Ｂ）該被検二重鎖核酸を
ｉ）Ｍｕ終末核酸、及び
ｉｉ）ファージＭｕトランスポゼース
と、該被検二重鎖核酸中の標的遺伝子がミスマッチを含む場合に、Ｍｕ終末核酸が標的遺伝子中のミスマッチの部位付近に転位し得る条件下で接触させ、被検Ｍｕ転位産物を得ること、
（Ｃ）該被検Ｍｕ転位産物における、Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子への転位を検出すること、及び、
（Ｄ）Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子中の特定部位への顕著な転位が検出された被検二重鎖核酸中の第１の核酸鎖が由来する被検生物を、標的遺伝子中の該部位付近において変異又は多型を有する生物として選択すること。
【００６２】
本明細書中、「変異又は多型」にはホモザイガスな変異又は多型と、ヘテロザイガスな変異又は多型が含まれる。ホモザイガスな変異又は多型とは、標的遺伝子中の変異部位のヌクレオチド配列が野生型のヌクレオチド配列とは異なっており、且つ該部位においてミスマッチを有さない変異又は多型をいう。ヘテロザイガスな変異又は多型とは、標的遺伝子中の変異部位のヌクレオチド配列が野生型のヌクレオチド配列とは異なっており、且つ該部位においてミスマッチを有する変異又は多型をいう。
【００６３】
本発明の方法ＩＩにおいて、被検生物が標的遺伝子中にヘテロザイガスな変異又は多型を有する場合、被検二重鎖核酸は、該生物からの標的遺伝子を含む二重鎖核酸（染色体ＤＮＡ等）であり得る。被検生物が標的遺伝子中にホモザイガスな変異又は多型を有する場合、他の出所（同等の出所）からの核酸鎖を用いて、被検二重鎖核酸が形成され得る。好ましくは、第１の核酸鎖は、標的遺伝子中の変異又は多型を有する可能性のある部位を含み、第２の核酸鎖は、変異又は多型について野生型のヌクレオチド配列を有している。第１の核酸鎖は、標的遺伝子中に変異又は多型を有する可能性のある被検生物に由来する変異又は多型アレルのセンス又はアンチセンス鎖をコードし、第２の核酸鎖は該変異にとっての野生型アレルのセンス又はアンチセンス鎖をコードし得る。第２の核酸鎖は、第１の核酸鎖と相補的である。本明細書において「相補的」とは、２つの核酸、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ、又はＤＮＡの二本鎖が、マッチしたワトソン−クリック塩基対を形成して二重鎖の領域を構成できる一続きのヌクレオチドの連続を含むことを意味する。例えば、一方のＤＮＡの鎖中のアデニンが対面の相補的なＤＮＡ鎖中のチミジン又は対面の相補的なＲＮＡ鎖中のウラシルと対をなす。或いは、ＤＮＡ又はＲＮＡの一方の鎖中のグアニンが、対面の相補的な核酸鎖中のシトシンと対をなす。対をなした領域は二重鎖と呼ばれる。該二重鎖はホモ二重鎖又はヘテロ二重鎖のいずれかであり得る。「ヘテロ二重鎖」とは、１又は２以上のミスマッチのために、第１の鎖中の１又は２以上のヌクレオチドが、第２の対面の相補的な鎖におけるそれと適切に塩基対となることが出来ない、２つのアニールした、相補的な核酸鎖（例えば、試験及び参照核酸がアニールした鎖）の間で形成される構造を意味する。
【００６４】
被検二重鎖核酸は、常法により調製することができる。例えば、被検生物から変異又は多型を有する可能性のある標的遺伝子中の目的とする領域（部分、断片）を含む核酸（ＤＮＡ等）を単離し、随意的にそれを増幅する。被検生物から単離された核酸断片の一方の鎖を、コントロール（参照、野生型）生物からの同等の核酸断片の相補鎖とアニールさせる。被検生物が標的遺伝子中に変異又は多型を有する場合、結果として得られる被検二重鎖核酸は、ヘテロ二重鎖を形成し、該核酸は変異又は多型の部位においてミスマッチを有する。被検生物が標的遺伝子中に変異又は多型を有さない場合、結果として得られる被検二重鎖核酸は、ホモ二重鎖を形成し、該核酸はミスマッチを有さない。
【００６５】
被検二重鎖核酸はＰＣＲ増幅により調製してもよい。
被検生物が標的遺伝子中にヘテロザイガスな変異又は多型を有する場合、該変異又は多型を含む疑いのある部位を増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマーにより、該部位をＰＣＲ増幅することにより、ヘテロ二重鎖が生じるので、該ＰＣＲ産物を被検二重鎖核酸としてもよい。上記ＰＣＲ増幅の後で生じる二重鎖核酸の約５０％はヘテロ二重鎖である。所望により、変性及び再アニーリングの追加的な最終工程を行うことにより、ヘテロ二重鎖の最大回収率を確保することが出来る。
【００６６】
一方、被検生物が標的遺伝子中にホモザイガスな変異又は多型を有する場合、該変異又は多型を含む可能性のある部位を増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマーにより、該部位をＰＣＲ増幅しても、ホモ二重鎖を生じ、ヘテロ二重鎖を生じない。従って、通常は、増幅される領域中に変異又は多型を含まないコントロール生物（野生型生物等）からの核酸と共に、被検生物からの標的遺伝子を含む核酸を共増幅することが望ましい。この態様では、被検生物がホモザイガス変異を有している場合、一方の核酸鎖が被検生物からの変異を有しており、もう一方の核酸鎖が変異を有していないヘテロ二重鎖が、ＰＣＲ共増幅の間に形成される。
【００６７】
本発明の方法ＩＩにおける工程（Ｂ）〜（Ｄ）は、上記本発明の方法Ｉに準じて行うことが出来る。
【００６８】
1つの好ましい態様において、被検二重鎖核酸は、複数被検生物からの標的遺伝子を含む核酸の混合物を含む鋳型、及び標的遺伝子中の変異又は多型を含む可能性のある部位を増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマーセットを用いたＰＣＲ増幅により獲得される（プール法）。複数の被検生物からの標的遺伝子を含む核酸がプールされた混合物を鋳型として用いることにより、それらの複数の生物中に目的とする変異又は多型を有する生物が存在するか否かを一度に評価することができ、時間的及び費用的なコストを大幅に削減することが可能である。また、複数被検生物のうちのいずれかがホモザイガスな変異又は多型を有している場合に、該被験生物からの標的遺伝子を含む核酸を、該変異又は多型に関して野生型である他の被検生物からの標的遺伝子を含む核酸と混合し、共増幅することで、ヘテロ二重鎖が形成される。
【００６９】
鋳型とされる核酸混合物において、プールされるそれぞれの被検生物からの標的遺伝子を含む核酸は、ミスマッチの検出感度が同等となるように、それぞれ約等重量ずつプールされることが好ましい。「約等重量」とは、重量が約０．５〜２倍の範囲内であることを意味する。
【００７０】
プールされる被検核酸の数は、本発明の目的を達成し得る限り、特に限定されない。プールされる被検核酸の数が多くなると、上述のコスト削減効果が増加する一方で、１つの被検核酸からのＭｕ転位産物の相対量が低下し、ミスマッチの検出感度が低下する。従って、プールされる被検核酸の数は、コスト削減効果及びミスマッチの検出感度を考慮し、適宜設定することが出来る。良好なミスマッチの検出感度を維持しつつ、コスト削減効果を達成するため、本発明において用いられる被検核酸は、通常２〜１６、好ましくは４〜１２の被検生物からの標的遺伝子を含む核酸の混合物であり得る。
【００７１】
１つの好ましい態様において、本発明の方法ＩＩの上記（Ｂ）において得られる被検Ｍｕ転位の複数を混合し、得られる混合物におけるＭｕ終末核酸の標的遺伝子への転位を（Ｃ）において検出してもよい（Ｍｕ転位産物混合法）。このように複数の被検Ｍｕ転位産物を混合した後で、Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子への転位を検出することにより、複数の被検核酸において、目的とするミスマッチが存在するか否かを一度に評価することが出来、時間的及び費用的なコストを大幅に削減することが可能である。
【００７２】
この場合、本発明の方法Ｉと同様に、混合される被検Ｍｕ転位産物の複数のそれぞれについて、Ｍｕ終末核酸が、互いに、異なる種類の標識（例えば、蛍光等）により標識されていることが好ましい。これにより、被検Ｍｕ転位産物の混合物中に、Ｍｕ終末核酸の標的遺伝子中の特定部位への顕著な転位が検出された場合、その検出された標識の種類に基づき、該転位が混合物中のどの被検Ｍｕ転位産物において生じたものであるかを見分けることが可能となる。
【００７３】
異なる種類の標識の組み合わせは、本発明の目的が達成される限り特に限定されないが、１回の測定で多種類の標識を見分け得るように、該標識は同一波長の励起光により、異なる波長の発光を生じる蛍光の組み合わせから選択されることが好ましい。このような蛍光の組み合わせとしては、市販の自動シークエンサーで検出可能な蛍光の組み合わせ（例えば、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＮＥＤ及びＲＯＸからなる組み合わせ）等を挙げることが出来る。
【００７４】
本発明の方法ＩＩの最も好ましい態様は、本発明の方法Ｉと同様に、上述の「プール法」と「Ｍｕ転位産物混合法」とを組み合わせた方法である。
【００７５】
（４．キット）
当業者であれば、本発明の方法Ｉ又はＩＩ、あるいは本発明の製造方法において使用される構成要素を、標的遺伝子中にミスマッチを有する生物を選択するため、標的遺伝子中にミスマッチを有する生物を製造するため、或いは標的遺伝子中に変異又は多型を有する生物を選択するためのキットとして１つに容易にまとめることが出来る。即ち、本発明は、以下を含む、標的遺伝子中にミスマッチを有する生物を選択するため（標的遺伝子中にミスマッチを有する生物を製造するため、又は或いは標的遺伝子中に変異又は多型を有する生物を選択するため）のキットを提供するものである：
ａ）Ｍｕ終末核酸、
ｂ）ファージＭｕトランスポゼース、
ｃ）Ｍｕ終末核酸が標的遺伝子へ転位したか否かを決定するための手段（例えば自動シークエンサー等）、及び／又は
ｄ）被検生物が標的遺伝子中にミスマッチを含有しているか否か（又は、被検生物が標的遺伝子中に変異又は多型を含有しているか否か）を決定するための指示書。
【００７６】
ｄ）の指示書には、本発明のキットの構成要素を用いて、上記本発明の方法Ｉ又はＩＩ、あるいは本発明の製造方法を行い得ることが記載されていてもよい。
【００７７】
好ましい態様において、本発明のキットは、あらかじめ集められたＭｕ終末核酸（ＤＮＡ等）とファージＭｕトランスポゼースとの混合物を含む。好ましくは、該キットは、凍結乾燥された又は適切な緩衝液中の精製ファージＭｕトランスポゼース、及び／又は凍結乾燥された又は適切な緩衝液中の精製Ｍｕ終末核酸を含む。
【００７８】
本発明のキットは、随意的に、更に以下の１又は２以上を含んでいてもよい；
ｅ）ミスマッチ（又は、変異又は多型等）を含む疑いのある部位を含む核酸断片の増幅に適したオリゴヌクレオチドプライマー、
ｆ）Ｍｕ終末核酸を標識するための手段、
ｇ）前もって形成されたゲル、
【００７９】
本発明のキットを、上述のＭｕ転位産物混合法に用いる場合、本発明のキットは、異なる種類の複数のＭｕ終末核酸を標識するための手段（試薬）を含み得る。該手段は、好ましくは核酸を蛍光標識するための試薬であり、より好ましくは、同一波長の励起光により、異なる波長の発光を生じる蛍光により核酸を標識するための手段の組み合わせである。
【００８０】
或いは、本発明のキットは、予めファージＭｕトランスポゼースと適切な緩衝液中に集められ、個々の反応チューブに分注され、凍結された、標識された又は非標識のＭｕ終末核酸を含んでいてもよい。これにより、使用者はＭｕ転位反応を行うために、単に被検核酸を反応チューブへ加えるだけでよい。
【００８１】
また、随意的に、本発明のキットが特定のミスマッチ（変異、又は多型等）を検出するためにデザインされる場合、該キットは、標識されていてもよい参照（コントロール、野生型）核酸、及び標識されていてもよい、ミスマッチ（又は、変異又は多型等）を含む可能性のある部位を含む核酸断片の増幅に適したオリゴヌクレオチドプライマーを含んでいてもよい。好ましい態様において、該キットは、第１のプライマー及び第２のプライマーを含み、第１及び第２のプライマーは標的遺伝子中のミスマッチの疑いのある部位を含む領域を規定し、コントロール核酸は、該ミスマッチの領域のヌクレオチドについて野生型である。本発明のキットは、反応条件を標準化するために、予め形成されたヘテロ二重鎖、及び／又は適切な緩衝液（例えば、酵素希釈緩衝液又は酵素反応緩衝液）を含んでいてもよい。
【００８２】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００８３】
＜参考例１＞
ファージＭｕトランスポゼース（ＭｕＡ）の調製
ファージＭｕトランスポゼースはBaker et al. (1993), Cell 74, 723-33に記載された方法に従って調製された。即ち、ファージＭｕトランスポゼース遺伝子を組み込んだ発現ベクターpET3c(novagen）でトランスフォームされたBL21(DE3)を培養し、OD600=0.6でIPTGを400nMになるように加え、37℃で更に2時間培養した。集菌後、大腸菌をリゾチーム(200mg/l)で溶菌し、40,000gで遠心して上清を回収した。上清に30%飽和となるように硫酸アンモニウムを加えて、10,000gで遠心し、沈殿を回収した。沈殿をHEDG緩衝液（25mM Hepes(pH7.6), 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 10%(v/v)Glycerol, 300mM KCl)に溶解し、HEDG緩衝液に対して透析した。これをP11(whatman) を詰めたカラムに添加し、300-1000mM KClのグラジエントで溶出した。およそ500-800mMにファージＭｕトランスポゼースが溶出された。３０μＭ  ファージＭｕトランスポゼースの溶液をファージＭｕトランスポゼース希釈緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．５Ｍ  ＫＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）  グリセロール含有）で３倍に希釈し、１０μＭ  ファージＭｕトランスポゼースの溶液を得た。該溶液は、使用時まで−８０℃にて保存された。
【００８４】
＜参考例２＞
Ｍｕ終末ＤＮＡの調製
以下の２つのヌクレオチド配列のオリゴＤＮＡを合成した。
オリゴ１：5’-GTTTTCGCATTTATCGTGAAACGCTTTCGCGTTTTTCGTGCGCCGCTTCA-3’（配列番号１）
オリゴ２：5’-GGATGAAGCGGCGCACGAAAAACGCGAAAGCGTTTCACGATAAATGCGAAAAC-3’（配列番号２）
オリゴ１の５’末端を、蛍光（ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＮＥＤ又はＲＯＸ）により標識した。オリゴ２及び蛍光標識したオリゴ１を、それぞれ１００μＭに調製した。以下のように溶液を混合した。
【００８５】
【表１】
2007185116.tif 000002
【００８６】
混合液をヒートブロック中で８５℃にて３分間静置した。混合液をヒートブロックごとキムワイプ及びアルミホイルで包み、発泡スチロールの箱へ入れ、３７℃インキュベーター中で一晩静置した。翌日、混合液をインキュベーターから出し、徐々に室温に冷却した。混合液の１〜２μｌを、４％アガロースゲルを用いた電気泳動に付し、５０〜７０ｂｐ付近のバンドを確認した。混合液は使用時まで−２０℃にて保存した。
【００８７】
＜参考例３＞
トランスポソソームの調製
以下のように、各溶液を混合し、Ｍｕ溶液を得た。
【００８８】
【表２】
2007185116.tif 000003
【００８９】
【表３】
2007185116.tif 000004
【００９０】
Ｍｕ溶液を３０℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、氷上で、６０μｌのＭｕ溶液に、希釈緩衝液（下表参照）５４０μｌを加えた。
【００９１】
【表４】
2007185116.tif 000005
【００９２】
混合液の５μｌを、４％ＴＢＥアガロースゲル（ヘパリン含）を用いた電気泳動に付した。２本のバンド（約５０〜７０ｂｐ（未反応Ｍｕ終末ＤＮＡ）及び約３１０〜４００ｂｐ（トランスポソソーム））の存在を確認後、混合液を使用時まで−８０℃にて保存した。
【００９３】
＜実施例１＞
ＳＮＰ解析によるＭｕＴ−ＰＯＷＥＲ法の確立
（方法）
（１）８系統のラット（ＡＣＩ／ＮＫｙｏ、ＢＮ／ＳｓＮＳＩｃ、ＤＯＮ、ＤＲＨ／Ｓｅａｃ、Ｆ３４４／ＮＳＩｃ、ｌＳ／Ｋｙｏ、ＮＥＲ及びＷＴＣ）から染色体ＤＮＡを抽出した。８系統のラットからの染色体ＤＮＡを等重量ずつ混合し、１つのサンプルとしてプールした。該染色体ＤＮＡ混合物を鋳型とし、下表に示される４８プライマーセット（１４遺伝子）を用いてＰＣＲを行った。
【００９４】
【表５】
2007185116.tif 000006
【００９５】
ＰＣＲ産物、活性化緩衝液（下表参照）及び参考例３で調製されたＦＡＭ標識トランスポソソームのそれぞれ５μｌを混合し、混合液を２０℃で５分間インキュベートした。混合液中のＤＭＳＯ濃度は１０％（Ｖ／Ｖ）、ＮａＣｌ濃度は３００ｍＭであった。反応を氷上にて停止させ、反応混合液へＰｒｏＫ溶液（下表参照）５μｌを加え、５０℃で１０分間インキュベートした。混合液をＣｌｅａｎＳＥＱ（PerkinElmer社製）又はエタノール沈殿にて精製し、Ｍｕ反応産物を回収した。Ｍｕ反応産物を自動キャピラリーシークエンサー（ＡＢＩ３１００）に付すことによりＳＮＰ解析を行った。
【００９６】
【表６】
2007185116.tif 000007
【００９７】
【表７】
2007185116.tif 000008
【００９８】
（２）ＡＣＩ及びＢＮからの染色体ＤＮＡを、ＡＣＩ：ＢＮ（重量比）として、１：１、１：７及び１：１５の比でプールした。下表に示す１３種類のプライマーセットにより検出可能なＳＮＰについて、４種類（ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＮＥＤ及びＲＯＸ）の蛍光標識Ｍｕトランスポソソームを用いて上記（１）と同様に解析を行った。
【００９９】
（結果）
（１）蛍光標識Ｍｕトランスポソソームにより検出されたＳＮＰの具体例を図５に示す。Gabra1(gamma-aminobutyric acid A receptor,alpha 1)遺伝子の第４エクソン中のＳＮＰが、２本のピークとして検出された。シークエンス法により、増幅領域中にＳＮＰが確認された１９プライマーセットのうち、１４プライマーセット（７４％）による増幅領域中のＳＮＰを蛍光標識Ｍｕトランスポソソームにより検出することができた。以上より、８つの染色体ＤＮＡサンプルを１つにプールした染色体ＤＮＡ混合物を用いて、Ｍｕ転位反応によりＳＮＰを検出することが可能であることが示された。
【０１００】
（２）ＡＣＩ：ＢＮ＝１：１で８５％（１１／１３）、１：７で６９％（９／１３）、１：１５でも５４％（７／１３）のＳＮＰｓが検出された（表８）。例えば、Scn1a(sodium channel, voltage-gated, type I,alpha)遺伝子第７イントロン中のＳＮＰは、１：１、１：７及び１：１５の比率でプールされた染色体ＤＮＡサンプルを用いて、４種類の蛍光標識のうちのＦＡＭ標識により検出された（図６）。以上より、Ｍｕ転位反応を用いたＳＮＰ解析において、プール法及び複数種類蛍光標識法を組み合わせることによって、効率よくＳＮＰを検出することが可能であることが示された。
【０１０１】
【表８】
2007185116.tif 000009
【０１０２】
＜実施例２＞
遺伝子主体ミュータジェネシスにおけるＭｕＴ−ＰＯＷＥＲ法の利用
（方法）
２０−４５ｍｇ／ｋｇのエチルニトロソウレア（ＥＮＵ）を雄ラット３０匹に２回（１０、１１適齢時）腹腔内投与して、２０適齢時に雌ラット６０匹と交配した。得られた仔（Ｇ１ラット）２４２匹の尾から染色体ＤＮＡを抽出した。
抽出された染色体ＤＮＡを８サンプルごとにプールし、９６穴プレートに並べた。３０種類の遺伝子のエクソン又はイントロン領域を増幅するようにデザインされた２９７種類のプライマーセットを用いて、９６穴プレートによるＰＣＲによって、それぞれの遺伝子の目的とするゲノム領域を増幅した。
ＰＣＲ産物を４つのグループに分け、実施例１と同様に、それぞれ異なる４種類（ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＮＥＤ及びＲＯＸ）の蛍光標識Ｍｕトランスポソソームを用いて、Ｍｕ転位反応を行った。
エタノール沈殿によりＭｕ転位反応産物を精製する際に、４種類の蛍光標識Ｍｕ転位産物を混合し、１つのサンプルとした。
この混合サンプルを自動キャピラリーシークエンサー（ＡＢＩ３１００）により電気泳動することにより、変異の存在の有無を解析した。
また、変異の存在が確認されたウェルについては、変異の存在を示すピークの蛍光色に対応する８匹の個体について、シークエンス法により、変異が含まれる領域のヌクレオチド配列を決定することにより、変異を有する個体を決定した。
【０１０３】
（結果）
（１）２４２匹のＧ１ラット個体の中に、ＥＮＵにより誘導されたと考えられる小型で毛色異常を示す突然変異個体が存在した（図７）。従って、ＥＮＵによりミュータジェネシスが確かに誘導されたことが示唆された。
【０１０４】
（２）Ｍｕ転位反応により、Amyloid beta A4 protein precursor(APP)遺伝子の第１１イントロン領域に点突然変異を有する個体の存在が確認された（図８左）。図８の例では、変異の存在は、ＦＡＭのピークにより示される。ＦＡＭ標識ＭｕトランスポゼースによりＭｕ転位反応を行ったサンプルに対応する８匹の個体について、シークエンス法により、該第１１イントロン領域のヌクレオチド配列を解析し、そのうちの１匹においてＧ→Ａの点突然変異が確認された（図８右）。同様にして、２４２匹のＧ１ラット個体の中に、ＡＰＰ遺伝子の第１１イントロン領域に点突然変異を有する個体が６匹検出された。
【０１０５】
（３）本ケースにおいて、２９７プライマーセットで２４２匹Ｇ１ラットのＤＮＡスクリーニングを行う場合、シークエンス法を用いると７１，８７４サンプルのＰＣＲと電気泳動が必要だが、本発明の方法を用いれば９，５０４のＰＣＲと２，３７６の電気泳動のみで変異を解析することができ、費用と解析時間を大幅に削減することができた。
【０１０６】
＜参考例４＞
５０００匹のＧ１生物を用いて、１遺伝子について１０の領域の変異を検出する遺伝子主導ミュータジェネシスを行う場合において、シークエンス法、ＴＩＬＬＩＮＧ法及びＭｕＴ−ＰＯＷＥＲ法の間でそれぞれのパフォーマンスを比較した一例を示す（表９）。シークエンス法と比較して、ＭｕＴ−ＰＯＷＥＲ法では時間的及び経済的コストが大幅に低減されることが分かる。
【０１０７】
【表９】
2007185116.tif 000010
【０１０８】
＜参考例５＞
（方法）
MM1200：5’-TCGGATGAAGCGGCGCACGAAAAACGCGAAAGCGTTTCACGATAAATGCGAAAACAATGTATGTAT-3’（配列番号１０２）とMM1202：5’-ANACATACATGTTTTCGCATTTATCGTGAAACGCTTTCGCGTTTTTCGTGCGCCGCTTCA-3’（N=フルオレセインdT)（配列番号１０６）を常法によりアニールさせ、Mu終末DNAを作成した。
ACIおよびBN系統のラットのゲノムDNA各20 ng を混合したものをテンプレートとし、agouti遺伝子の一部をPCR法により増幅した産物を標的DNAとして用いた。PCRに用いたプライマーは、Primer K ：CTTCTCCCACTTCACCACAG（配列番号１０４）及びPrimer L：AGGCCGAGGAAGTATCTTTC（配列番号１０５）である。これらの試薬をPyrobest(タカラバイオ)の説明書に従い混合した (精製水 41.2 μl、10×反応バッファー 5.0 μl、25 mM dNTP 0.4 μl、10 μM Primer K 1.0 μl、10 μM Primer L 1.0 μl、Pyrobest 0.25 μl)。混合物を95℃で2分保持した後、（95℃30秒、60℃20秒、68℃45秒）を35サイクル行なうことにより、ＰＣＲ増幅を行った。
終濃度で25 mM Hepes-HCl (pH 7.6), 300 mM NaCl, 10 mM CHAPS, 10 %(v/v)DMSO, 15 %(w/v)Glycerol, 5 mM MgCl2, 100 nM Mu-end DNA, 100ng標的DNA, 300 nM MuA になるように反応混合液を調製し、混合液を１０℃、１５℃、２０℃又は３０℃で30分間インキュベーションすることによりMu転移反応を行った。
反応産物を尿素入り6％変性アクリルアミドゲル電気泳動で解析した。
【０１０９】
（結果）
反応温度が高いほど、Ｍｕ転位反応産物の量は増大したが、Ｍｕ終末核酸のランダムな転位により生じるバックグラウンドも上昇した（図９）。該バックグラウンドは３０℃において顕著に認められたが、１０、１５及び２０℃においてはほとんど認められなかった。これらの結果から、バックグラウンドを低レベルに抑制したまま、Ｍｕ転位反応を高い効率で行うため、Ｍｕ転位反応の反応温度は約２０℃が好ましいことが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
本発明の方法を用いれば、ランダムミュータジェネシスにより作製された生物個体群の中から、標的遺伝子において点突然変異が導入された個体を効率的且つ簡便に検出することが可能となる。本発明の方法を用いれば、短期間、且つ低コストで、動植物さまざまな生物種における任意の標的遺伝子の突然変異体の作製が可能となり、特にラット等、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を利用した遺伝子改変技術の適用が困難な生物の突然変異体の作製に有用である。本発明の方法を利用して作製された遺伝子変異体は、医学、薬学、生物学等さまざまな分野における貴重な研究材料となり得る。また、例えばラット等の遺伝子変異動物は薬理薬効試験などの疾患モデル動物として、製薬業界においては非常に利用価値のあるものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】本発明で用いられる被検核酸の典型例を模式的に示す。
【図２】本発明で用いられるＭｕ終末核酸断片の典型例を模式的に示す。
【図３】Ｍｕ転位産物の典型例を模式的に示す。
【図４】MuT-POWER法の一例を模式的に示す。
【図５】Gabra1遺伝子の第４エクソン中のＳＮＰを示す。ＭｕトランスポゼースおよびＦＡＭ蛍光標識されたＭｕ終末ＤＮＡを用いることにより、該ＳＮＰが２本の青色のピークとして検出された。
【図６】Scn1a遺伝子の第７イントロン中のＳＮＰを示す。該ＳＮＰは、本発明の方法を用いて、１／２、１／８及び１／１６のプールサンプル中で検出された。
【図７】ＥＮＵミュータジェネシスのＧ１ラット群中に発見された小型で毛色異常を示す突然変異ラットを示す。
【図８】ＭｕＴ−ＰＯＷＥＲ法により検出されたAmyloid beta A4 protein precursor (App)逮伝子の第１１イントロン領域の点突然変異を示す。シークエンス解析により、Ｇ（グアニン）からＡ（アデニン）への変異が確認された。
【図９】それぞれの反応温度におけるＭｕ転位反応産物を6％変性アクリルアミドゲル電気泳動にて解析した結果を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１１２】
配列番号１：Mu終末ＤＮＡ移入鎖
配列番号２：Mu終末ＤＮＡ非移入鎖
配列番号３：Mu終末ＤＮＡ移入鎖
配列番号４：Mu終末ＤＮＡ非移入鎖
配列番号６：CHRNA4ex5-3 F プライマー
配列番号７：CHRNA4ex5-3 R プライマー
配列番号８：CHRNA4ex3,4 F プライマー
配列番号９：CHRNA4ex3,4 R プライマー
配列番号１０：CHRNA4ex5-1 F プライマー
配列番号１１：CHRNA4ex5-1 R プライマー
配列番号１２：CHRNA4ex5-2 F プライマー
配列番号１３：CHRNA4ex5-2 R プライマー
配列番号１４：CHRNB2ex2,3 F プライマー
配列番号１５：CHRNB2ex2,3 R プライマー
配列番号１６：CHRNB2ex4 F プライマー
配列番号１７：CHRNB2ex4 R プライマー
配列番号１８：CHRNB2ex5-1 F プライマー
配列番号１９：CHRNB2ex5-1 R プライマー
配列番号２０：CHRNB2ex5-2 F プライマー
配列番号２１：CHRNB2ex5-2 R プライマー
配列番号２２：GABRA1ex4 F プライマー
配列番号２３：GABRA1ex4 R プライマー
配列番号２４：GABRA1ex8 F プライマー
配列番号２５：GABRA1ex8 R プライマー
配列番号２６：GABRA1ex9 F プライマー
配列番号２７：GABRA1ex9 プライマー
配列番号２８：GABRG2ex4 F プライマー
配列番号２９：GABRG2ex4 R プライマー
配列番号３０：GABRG2ex8 F プライマー
配列番号３１：GABRG2ex8 R プライマー
配列番号３２：GABRG2ex10 F プライマー
配列番号３３：GABRG2ex10 R プライマー
配列番号３４：CLCN2ex2 F プライマー
配列番号３５：CLCN2ex2 R プライマー
配列番号３６：CLCN2ex5 F プライマー
配列番号３７：CLCN2ex5 R プライマー
配列番号３８：CLCN2ex12 F プライマー
配列番号３９：CLCN2ex12 R プライマー
配列番号４０：CLCN2ex15 F プライマー
配列番号４１：CLCN2ex15 R プライマー
配列番号４２：CLCN2ex16 F プライマー
配列番号４３：CLCN2ex16 R プライマー
配列番号４４：SCNIAex7 F プライマー
配列番号４５：SCNIAex7 R プライマー
配列番号４６：SCNIAex11 F プライマー
配列番号４７：SCNIAex11 R プライマー
配列番号４８：SCNIAex16 F プライマー
配列番号４９：SCNIAex16 R プライマー
配列番号５０：SCNIAex17 F プライマー
配列番号５１：SCNIAex17 R プライマー
配列番号５２：SCNIAex22 F プライマー
配列番号５３：SCNIAex22 R プライマー
配列番号５４：CACNB4ex2 F プライマー
配列番号５５：CACNB4ex2 R プライマー
配列番号５６：CACNB4ex8 F プライマー
配列番号５７：CACNB4ex8 R プライマー
配列番号５８：CACNB4ex10 F プライマー
配列番号５９：CACNB4ex10 R プライマー
配列番号６０：Kcnq2EX5 F プライマー
配列番号６１：Kcnq2EX5 R プライマー
配列番号６２：Kcnq2EX3 F プライマー
配列番号６３：Kcnq2EX3 R プライマー
配列番号６４：Kcnq2EX4 F プライマー
配列番号６５：Kcnq2EX4 R プライマー
配列番号６６：Kcnq3EX4 F プライマー
配列番号６７：Kcnq3EX4 R プライマー
配列番号６８：Kcnq3EX5 F プライマー
配列番号６９：Kcnq3EX5 R プライマー
配列番号７０：Kcnq3EX7 F プライマー
配列番号７１：Kcnq3EX7 R プライマー
配列番号７２：LGI1EX6 F プライマー
配列番号７３：LGI1EX6 R プライマー
配列番号７４：LGI1EX7 F プライマー
配列番号７５：LGI1EX7 R プライマー
配列番号７６：LGI1EX8-1 F プライマー
配列番号７７：LGI1EX8-1 R プライマー
配列番号７８：EPM1EX1 F プライマー
配列番号７９：EPM1EX1 R プライマー
配列番号８０：EPM1EX2 F プライマー
配列番号８１：EPM1EX2 R プライマー
配列番号８２：EPM2EX2 F プライマー
配列番号８３：EPM2EX2 R プライマー
配列番号８４：EPM2EX3 F プライマー
配列番号８５：EPM2EX3 R プライマー
配列番号８６：EPM2EX4 F プライマー
配列番号８７：EPM2EX4 R プライマー
配列番号８８：rApc-ex1 F プライマー
配列番号８９：rApc-ex1 R プライマー
配列番号９０：rApc-ex9 F プライマー
配列番号９１：rApc-ex9 R プライマー
配列番号９２：rApc-ex11 F プライマー
配列番号９３：rApc-ex11 R プライマー
配列番号９４：rApc-ex12 F プライマー
配列番号９５：rApc-ex12 R プライマー
配列番号９６：rApc-ex14 F プライマー
配列番号９７：rApc-ex14 R プライマー
配列番号９８：rP53-ex5 F プライマー
配列番号９９：rP53-ex5 R プライマー
配列番号１００：rP53-ex7 F プライマー
配列番号１０１：rP53-ex7 R プライマー
配列番号１０２：Mu終末ＤＮＡ非移入鎖
配列番号１０３：Mu終末ＤＮＡ移入鎖
配列番号１０４：プライマーＫ
配列番号１０５：プライマーＬ
配列番号１０６：Mu終末ＤＮＡ移入鎖
【図１】
2007185116.tif 000011
【図３】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2007185116.tif 000019
【配列表】
2007185116000001.app