(57)【要約】【課題】測定妨害物質の影響を軽減し、血液等の生体試料中のカテコールアミン濃度を連続的にモニターすることを可能にするカテコールアミンセンサを提供すること。【解決手段】本発明の一実施形態に係る、カテコールアミンセンサは、流路１２中に上流側から下流側へと測定試料１６を流してカテコールアミン濃度を検出する。上記カテコールアミンセンサは、流路１２に形成された、測定試料１６に含まれる、カテコールアミンおよび測定妨害物質を酸化するための酸化用電極１３と、流路１２において酸化用電極１３よりも下流側に形成された、カテコールアミンを還元するための還元用電極１４と、流路１２において還元用電極１４よりも下流側に形成された、カテコールアミンを検出するための検出用電極１５とを備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
流路中に上流側から下流側へと測定試料を流してカテコールアミン濃度を検出するカテコールアミンセンサであって、
前記流路に形成された、前記測定試料に含まれる、カテコールアミンおよび測定妨害物質を酸化するための第１の電極と、
前記流路において前記第１の電極よりも下流側に形成された、前記第１の電極にて酸化されたカテコールアミンを還元するための第２の電極と、
前記流路において前記第２の電極よりも下流側に形成された、前記カテコールアミンを検出するための第３の電極と
を備えることを特徴とするカテコールアミンセンサ。
【請求項２】
前記第１の表面は、正電荷を有する官能基を有する物質により修飾されていることを特徴とする請求項１記載のカテコールアミンセンサ。
【請求項３】
前記物質は、チオール類であることを特徴とする請求項２記載のカテコールアミンセンサ。
【請求項４】
前記第１、第２、および第３の電極のうち、少なくとも１つはアレイ型電極であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載のカテコールアミンセンサ。
【請求項５】
前記アレイ型電極は、くし型電極であることを特徴とする請求項４記載のカテコールアミンセンサ。
【請求項６】
前記流路内において前記第１の電極の上流側に形成された、酵素反応手段をさらに備えることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載のカテコールアミンセンサ。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれかに記載のカテコールアミンセンサと、
前記カテコールアミンセンサに接続された、試料採取用のキャピラリ、前記カテコールアミンセンサに接続された、チューブ、または前記カテコールアミンセンサに接続された、微小透析膜付プローブのいずれか１つ
を備えることを特徴とするフローセル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カテコールアミンセンサに関し、より詳細には、生体試料中のカテコールアミン濃度を電気化学的に測定するためのカテコールアミンセンサに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
カテコールアミンは、神経伝達物質の一種で、脳内において神経細胞から放出されたり、副腎から放出されたりする。このカテコールアミンは電気化学活性が高いため、カテコールアミンの検出には電気化学測定法がよく用いられる。
【０００３】
カテコールアミンの検出について臨床では、液体クロマトグラフィーと電気化学検出器とを組み合わせたシステムが主に用いられている。一方、脳内等の生体内のカテコールアミンの検出では、カーボンファイバーを加工して作製した微小な電極が用いられている。脳内でも、Ｌ−アスコルビンや尿酸等のアニオン性分子による測定妨害を受けやすいため、電極表面をナフィオン（登録商標）や過酸化ポリピロールなどの陽イオン交換材料によって被覆されている（非特許文献１参照）。また、連続測定の実現を目的とした、測定妨害物質除去用の酵素反応器と電気化学検出器とが集積されたセンサーチップも報告されている（非特許文献２）。
【０００４】
【非特許文献１】1. K.Puhel, Q.D.Walker, R.M.Wightman. “Overoxidized Polypyrrole-Coated Carbon Fiber Microelectrodes for Dopamine Measurements with Fast-Scan Cyclic Voltammetry” Anal,Chem.,68,2084-2089, 1996
【非特許文献２】K.Hayashi, Y.Iwasaki, R.Kurita, K.Sunagawa, O.Niwa, A.Tate. “The Highly sensitive detection of catecholamines using a microfluidic device integrated with an enzyme-modified pre-reactor for interferent elimination and interdigitated array electrode” J.Electroanal.Chem.,579, 215-222, 2005
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
血液中のカテコールアミン濃度は、心疾患指標として期待されている。しかしながら、血液中のカテコールアミン濃度を連続的に測定することは困難であるため、臨床では、心疾患指標としてカテコールアミン以外のバイオマーカー（血液ガス、ｐＨ、電解質など）が用いられている。このように心疾患指標としてカテコールアミン濃度を用いないのは、血液や尿中ではカテコールアミンの濃度は低い上に、Ｌ−アスコルビン酸など電気化学活性の高い物質が多く存在しているために、カテコールアミン濃度の連続測定が困難なためである。
【０００６】
カテコールアミン濃度の連続測定を実現するためには、Ｌ−アスコルビン酸などの測定妨害物質が検出電極に到達する前に除去しておく必要がある。酵素反応器では、酵素の基質特異性から測定妨害物質を選択的に除去することが可能であるが、酵素反応によって除去できる測定妨害物質の量には限りがある。また、酵素分解が不可能な電気化学活性のある物質も存在することから、酵素反応器のみでは、上記酵素分解が不可能な電気化学活性のある物質を除去できず、連続測定において、さらなる精度向上、望ましくは、測定妨害物質の完全除去を実現することは困難であった。
【０００７】
このように、従来のカテコールアミンセンサでは、例えば酵素反応器を用いるなどして、当時としては望まれる精度で連続的に測定を行うことができたが、近年求められる要望を満たすためには、更なる精度で連続測定を行えることが求められていた。すなわち、酵素分解が可能か否かに関らず、測定妨害物質の除去効率を向上することが望まれている。
【０００８】
本発明は、このような問題を鑑みてなされたもので、その目的とするところは、測定妨害物質の影響を軽減し、血液等の生体試料中のカテコールアミン濃度を連続的にモニターすることを可能にするカテコールアミンセンサを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、このような目的を達成するために、請求項１記載の発明は、流路中に上流側から下流側へと測定試料を流してカテコールアミン濃度を検出するカテコールアミンセンサであって、前記流路に形成された、前記測定試料に含まれる、カテコールアミンおよび測定妨害物質を酸化するための第１の電極と、前記流路において前記第１の電極よりも下流側に形成された、前記第１の電極にて酸化されたカテコールアミンを還元するための第２の電極と、前記流路において前記第２の電極よりも下流側に形成された、前記カテコールアミンを検出するための第３の電極とを備えることを特徴とする。
【００１０】
請求項２記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記第１の表面は、正電荷を有する官能基を有する物質により修飾されていることを特徴とする。
【００１１】
請求項３記載の発明は、請求項２記載の発明において、前記物質は、チオール類であることを特徴とする。
【００１２】
請求項４記載の発明は、請求項１乃至３のいずれかに記載の発明において、前記第１、第２、および第３の電極のうち、少なくとも１つはアレイ型電極であることを特徴とする。
【００１３】
請求項５記載の発明は、請求項４記載の発明において、前記アレイ型電極は、くし型電極であることを特徴とする。
【００１４】
請求項６記載の発明は、請求項１乃至５のいずれかに記載の発明において、前記流路内において前記第１の電極の上流側に形成された、酵素反応手段をさらに備えることを特徴とする。
【００１５】
請求項７記載の発明は、請求項１乃至６のいずれかに記載のカテコールアミンセンサと、前記カテコールアミンセンサに接続された、試料採取用のキャピラリ、前記カテコールアミンセンサに接続された、チューブ、または前記カテコールアミンセンサに接続された、微小透析膜付プローブのいずれか１つを備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、カテコールアミンを検出するための電極の上流側に、測定妨害物質を酸化するための電極、およびカテコールアミンを還元するための電極を設けているので、測定妨害物質の影響を軽減し、血液等の生体試料中のカテコールアミン濃度を連続的にモニターすることを可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、図面を参照して本発明の実施形態を詳細に説明する。  
本発明の一実施形態では、例えば生体試料などの測定試料が流れる流路が形成されており、該流路内には、上流側から下流側に向かって順に、測定妨害物質を酸化するための電極（本明細書では、「酸化用電極」とも呼ぶ）、酸化したカテコールアミンを還元するための電極（本明細書では、「還元用電極」とも呼ぶ）、カテコールアミンを検出するための電極（本明細書では、「検出用電極」とも呼ぶ）が配置されている。このような構成にすることで、生体試料等の測定試料からカテコールアミンを検出したい場合、上記測定試料に測定妨害物質が含まれていても、該測定妨害物質を除去することができる。
【００１８】
本明細書において、「カテコールアミン」には、ドーパミン、ノルアドレナリン、アドレナリン等のｏ−ジヒドロキシベンゼン骨格を有する生体アミン等が含まれる。  
また、本明細書において、「測定妨害物質」には、Ｌ−アスコルビン酸、尿酸、ＤＯＰＡＣ（３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸）等の電気化学特性が似たカテコールアミンの代謝物等が含まれる。
【００１９】
図１は、本発明の一実施形態に係る、カテコールアミンセンサの上面図である。  
図１において、基板１には、絶縁層１７により流路１２が形成されており、該流路１２には、矢印方向Ｐ（上流から下流に向かう方向）に向かって測定試料１６が流れる。本明細書において、「上流」とは、カテコールセンサの流路中を流れる測定試料の流れの上流であり、図１の左側である。また、「下流」とは、カテコールセンサの流路中を流れる測定試料の流れの下流であり、図１の右側である。
【００２０】
流路１２中には、酸化用電極１３が形成されており、酸化用電極１３の下流側には、還元用電極１４が形成されており、還元用電極１４の下流側には検出用電極１５が形成されている。このように、上流側から下流側に向かって順に、酸化用電極１３、還元用電極１４および検出用電極１５が形成された流路１２中を測定試料１６が流れる。
【００２１】
図１では、まず、基板１１上に酸化用電極１３、還元用電極１４、および検出用電極１５を形成し、その後、流路１２を確保するように、絶縁層１７を形成する。このようにすることで、流路１２の底部に各電極が形成されることになる。
【００２２】
このような流路１２中に測定試料１６が流れると、測定試料１６に測定妨害物質が含まれている場合は、酸化用電極１３に酸化電位が印加されると、上記測定妨害物質は酸化用電極１３により酸化される。これと同時に、測定試料１６中のカテコールアミンも酸化される。次いで、酸化用電極１３にて酸化された、測定妨害物質およびカテコールアミンを含む測定試料１６は、還元用電極１４へと流れ、還元用電極１４に還元電位が印加されると、上記流れてきた測定試料１６に含まれる酸化されたカテコールアミンは、還元される。これは、カテコールアミンが、電極上で可逆的に酸化・還元する性質を有しているからである。このとき測定試料１６に含まれる酸化された測定妨害物質は、還元用電極１４ではほとんど還元されない。
【００２３】
次いで、還元用電極１４にて還元されたカテコールアミンおよび還元用電極１４ではほとんど還元されていない、酸化した測定妨害物質は、検出用電極１５へと流れる。このとき、検出用電極１５に電位を印加することによって、測定試料１６中のカテコールアミンのみが検出され、酸化した測定妨害物質はそのまま下流側へと流れていく。このようにして、検出用電極１５にて、測定試料１６からカテコールアミンが選択的に検出される。
【００２４】
測定対象であるカテコールアミンは、上述のように、電極上で可逆的に酸化・還元する性質を有しているが、測定妨害物質は、基本的には、酸化・還元が可逆的ではない。ただし、条件が揃えば、測定妨害物質も可逆的に酸化・還元する性質を発現するが、その割合はカテコールアミンに比べて非常に小さい。よって、例え条件が揃って、還元用電極１４上にて測定妨害物質の一部が還元しても、その量は非常に小さいので、検出用電極１５にて検出されるカテコールアミンにはほとんど影響しない。よって、測定妨害物質の影響を軽減することができる。
【００２５】
すなわち、本発明の一実施形態では、検出用電極１３にてカテコールアミンを検出する際に検出される測定妨害物質の量を低減するために、検出用電極１３の上流側に、測定妨害物質を酸化するための酸化用電極１３を設けている。ただし、このとき、検出対象のカテコールアミンも酸化してしまうが、この酸化してしまったカテコールアミンは、酸化用電極１３の下流に配置された還元用電極１４にて還元される。このとき、酸化された測定妨害物質は上述の性質により還元されない、または還元されたとしてもほんの少しなので、測定妨害物質の、検出用電極１５におけるカテコールアミンの検出への影響は実質的に除去されることになる。すなわち、従来よりも、測定妨害物質の除去効率を向上することができる。よって、連続的にカテコールアミン濃度の検出を行うことができる。
【００２６】
上述のように、検出用電極１５にて検出される測定妨害物質の量を軽減する、ないしは無くすために、本発明の一実施形態では、検出用電極の上流側に、上流側から下流側に向かって順に、酸化用電極および還元用電極を配置している。すなわち、酸化用電極１３は、測定妨害物質を検出用電極１５の検出に影響を与えない物質に変換する機能を有し、還元用電極１４は、測定対象のカテコールアミンのみを検出用電極１５にて検出できる状態に戻す機能、すなわち、検出用電極１５にて検出できる物質とできない物質とを選別する機能を有し、酸化用電極１３と還元用電極１４とが機能することによって、測定試料１６から、測定妨害物質のみを選択的に除去するのである。
【００２７】
上述のように、本発明の一実施形態において、酸化用電極では、カテコールアミンおよび測定妨害物質の双方を酸化させるが、後の検出効率を上げるためにも、カテコールアミンの酸化は極力抑えることが望ましい。すなわち、酸化用電極では、測定妨害物質の酸化量を多くし、カテコールアミンの酸化量は少なくすることが望ましい。
【００２８】
そこで、本発明の一実施形態では、カテコールアミンの酸化を抑えるために、酸化用電極の表面を正電荷で修飾しても良い。具体的には、酸化用電極の表面に、正電荷を有する高分子等の正電荷を有する官能基を有する物質、例えばチオール類を修飾すれば良い。チオール類には、単一のチオール、および複数のチオールが含まれる。このチオール類の修飾は、自己組織化法により行うことができる。
【００２９】
このように、酸化用電極の表面に正の電荷を有する高分子を修飾することにより、カテコールアミンの酸化用電極上での酸化が抑制されるので、検出用電極１５にて検出されるカテコールアミンの量の減少を抑制することができる。
【００３０】
なお、図１では、酸化用電極、還元用電極、および検出用電極は、平面状の電極であるが、本発明の一実施形態ではこれに限定されず、くし型電極などのアレイ型電極や、他の形状の電極であっても良い。  
本発明の一実施形態では、カテコールアミンの検出感度を向上させるために、各電極はくし型電極であることが望ましい。くし型電極とは、幹部と、幹部から突出する複数の枝状部とで構成され、該複数の枝状部は平行して配列されている電極を意味する。
【００３１】
酸化用電極および還元用電極がともにくし型電極である場合、それらを一対のくし型アレイ電極とすることが望ましい。一対のくし型アレイ電極とは、２つのくし型電極の幹部を並行させ、枝状部が交互に配置されるように配列された電極対を意味する。この構成においては、枝状部の交互配置領域の端部を除いて、酸化用電極の枝状部は、還元用電極の２つの隣接する枝状部の間に配置され、還元用電極の枝状部は、酸化用電極の２つの隣接する枝状部の間に配置される。なお、還元用電極は、酸化用電極にて酸化されたカテコールアミンを還元することが目的であるので、１対のくし型アレイ電極の最下流は、還元用電極であることが好ましい。
【００３２】
本発明の一実施形態では、酸化用電極、還元用電極、および検出用電極の全てをアレイ型電極にしても良いし、上記各電極のうち少なくとも１つをアレイ電極にしても良い。
【００３３】
また、本発明の一実施形態において、酸化用電極、還元用電極、および検出用電極は、電位を印加してもほとんど溶けない材料を含むことが望ましい。酸化用電極用および還元用電極の材料の一例として、炭素、金、白金、イリジウム等が挙げられる。また、検出用電極用の材料の一例として、炭素、金、白金、イリジウム等が挙げられる。上記では、各電極の一例を挙げたが、本発明では、電極の材質は本質ではないので、電極として機能するものであれば、いずれの電極を用いても良い。  
また、本発明の一実施形態では、基板は絶縁性基板であることは好ましい。
【００３４】
さらに、本発明の一実施形態では、さらなる測定妨害物質の除去効率の向上のために、酸化用電極の上流側に、酵素反応手段を設けても良い。
【００３５】
本明細書において、「酵素反応手段」とは、酵素反応により、測定試料から測定妨害物質を除去する手段である。上記酵素反応手段には、測定妨害物質と酵素反応する膜、および酵素反応により測定試料から測定妨害物質を除去する機構を有する酵素反応器などを含む。
【００３６】
さらに、本発明の一実施形態では、上述したカテコールセンサを有するフローセルにおいて、カテコールセンサに接続された試料採取用として、チューブ、ガラスキャピラリなどのキャピラリ、微小透析膜付プローブのいずれかを用いても良い。
【００３７】
以下、本発明の一実施形態に係るカテコールセンサを実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明は、下記実施例に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において、種々変更可能であることは言うまでもない。
【００３８】
（実施例）  
図１（ａ）および（ｂ）に、本実施例に係る、カテコールアミンセンサの模式図を示す。本実施例に係る、カテコールセンサは、２枚のガラス基板を、それぞれのガラス基板の電極が形成されている面を張り合わせるようにして形成されている。  
図１（ａ）および（ｂ）において、絶縁性基板としてのガラス基板８ａには、絶縁層１０により流路４が形成されている。流路４内には、上流側から順に、酸化用電極１および還元用電極２からなる第１の１対のくし型アレイ電極、および２つの検出用電極３からなる第２の１対のくし型アレイ電極が形成されている。この酸化用電極１、還元用電極２、および検出用電極３はそれぞれ、くし型電極である。また、酸化用電極１および還元用電極２は金膜、検出用電極３は炭素薄膜である。
【００３９】
本実施例では、まずガラス基板８ａ上に、酸化用電極１、還元用電極２、および検出用電極３を形成する。次いで、各電極が形成されたガラス基板８ａ上に、流路４が形成されるように絶縁層１０を形成する。すなわち、流路４内では、ガラス基板８ａ、各電極の表面が露出するように、絶縁層１０を形成するのである。
【００４０】
第１の１対のくし型アレイ電極において、酸化用電極１の幹部と還元用電極２の幹部とは略平行に配置されており、かつ酸化用電極１の枝状部と還元用電極２の枝状部とは互いに略平行になるように交互に配置されている。さらに、第１の１対のくし型アレイ電極の最上流は、酸化用電極１の枝状部であり、最下流は、還元用電極２の枝状部である。
【００４１】
第２の１対のくし型アレイ電極において、２つの検出用電極３のそれぞれの幹部が略平行に配置され、かつ２つの検出用電極３の枝状部が互いに平行になるように交互に配置されている。
【００４２】
このような酸化用電極１、還元用電極２、および検出用電極３は、同一基板、すなわちガラス基板８ａに形成されている。また、流路４内の、酸化用電極１の上流側には、酵素反応手段としてのアスコルビン酸酸化酵素膜７が形成されている。
【００４３】
また、絶縁性基板としてのガラス基板８ｂには、ガラス基板８ａとガラス基板８ｂとを張り合わせた際に、第１の１対のくし型アレイ電極を含む領域と対向する位置に、対向電極５が形成され、第２の１対のくし型アレイ電極を含む領域と対向する位置に、参照電極６が形成されている。この対向電極５は白金電極であり、参照電極は銀電極である。
【００４４】
本実施例では、このような構成のガラス基板８ａおよびガラス基板８ｂを張り合わせることによって、カテコールアミンセンサは完成する。このような構成のカテコールアミンセンサにおいて、流路４に測定試料９を流すことによって、カテコールアミン濃度のモニターを連続的に行う。
【００４５】
なお、本実施例では、対向電極５および参照電極６を、酸化用電極１、還元用電極２、および検出用電極３と別個の基板に形成しているが、同一の基板に形成するようにしても良い。
【００４６】
酸化用電極１は、金をパターニングして作製しており、金表面には、アミノエタンチオールの単分子膜を自己組織化法により修飾している。ここで用いるチオールの単分子膜は、単一種でもよいし、複数のチオール類を同時に用いて形成したものでも構わない。
【００４７】
以上の電極を、ＡＬＳ１０００（ＣＨｌ，ＵＳＡ）に接続し、測定を行った。参照電極６に対して、酸化用電極１には６００ｍＶ、還元用電極２には−２００ｍＶ、検出用電極３を構成する２つの電極にはそれぞれ６００ｍＶ、−２００ｍＶの電位を印加した。測定試料９を導入する際にはシリンジポンプを用い、流速を２μｌ／ｍｉｎに設定した。
【００４８】
はじめに、検出用電極３のみに電位を印加した。測定試料９として１００ｎＭのドーパミン溶液を流路４に導入すると、１０ｎＡの電流値が得られた。次に、酸化用電極１および還元用電極２にそれぞれ６００ｍＶ、−２００ｍＶの電位を印加し、同様な測定を行ったところ、同じく１０ｎＡの電流値が得られた。これは、ドーパミンが、酸化用電極１および還元用電極２を通過した際に消費されず、検出用電極３に到達していることを示している。続いて、測定試料９として、測定妨害物質としてのＬ−アスコルビン酸５０μＭとドーパミン１００ｎＭとの混合溶液を流路４に導入したところ、同じく１０ｎＡの電流値が得られた。これは、Ｌ−アスコルビン酸がアスコルビン酸酸化酵素膜７と酸化用電極１上で完全に除去されていることを示している。
【００４９】
比較として、酸化用電極１を用いずに測定を行ったところ、１１ｎＡの電流値が得られた。これは、Ｌ−アスコルビン酸酸化酵素で完全にＬ−アスコルビン酸を除去できていないことを示している。また、酸化用電極１に自己組織化膜を形成しない場合には、電流値が８ｎＡに低下した。これは酸化用電極１の電極でドーパミンが酸化されたものを、還元用電極２にて還元しきれていないことを示す。よって、酸化用電極１の表面をチオール類にて修飾することは好ましい。
【００５０】
なお、本実施例では、酵素反応手段の酵素にアスコルビン酸酸化酵素を用いたが、その限りではなく、ウリカーゼ、カタラーゼを固定することによって尿酸を分解することが可能となる。また、検出用電極としてくし形電極を用いたが、マイクロメートルオーダーの微小な電極を多数配列させたアレイ電極を用いてもよい。生体試料を採取しながら測定を行う場合には、マイクロダイアリシスプローブやガラスキャピラリを接続するとよい。
【００５１】
以上のように、測定妨害物質の電解酸化用電極として正の電荷を有するチオール類を修飾した電極を用いることにより、酵素反応で除去しきれなかった測定妨害物質を選択的に除去し、カテコールアミンを選択的に検出することのできるデバイスを構築することができた。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】本発明の一実施形態に係る、カテコールアミンセンサの上面図である。
【図２】（ａ）は、本発明の実施例に係る、カテコールアミンセンサの上面図であり、（ｂ）は、（ａ）のＡ−Ａ線断面図である。
【符号の説明】
【００５３】
１１    基板
１２    流路
１３    酸化用電極
１４    還元用電極
１５    検出用電極
１６    測定試料
１７    絶縁層
【図１】
2007163440.tif 000003
【図２】
2007163440.tif 000004