(57)【要約】【課題】培養液中に含まれる細胞を、無駄なくかつ確実に細胞培養支持体に付着させることができる補助具を提供すること。【解決手段】本発明の補助具６０ａは、中心部に孔６３を有する筒状の本体６１を備え、この本体６１の一端側に孔６３の孔径が本体６１の一端に向かって漸増するテーパ部を有するものである。そして、穴（ウェル）内に、細胞培養ペレット（細胞培養支持体）１を収納するとともに、この補助具６０ａを、テーパ部を上側にして収納した状態で、穴２０内に細胞４０を含む培養液３０を供給し、細胞４０を沈降させて細胞培養ペレット１に付着させる際、前記テーパ部は、培養液３０中において沈降する細胞４０を細胞培養ペレット１の孔６３内に露出する部分に誘導する細胞誘導手段として機能することを特徴とする。また、テーパ部は傾斜面６４で構成されるのが好ましい。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
中心部に孔を有する筒状の本体を備え、該本体の一端側に前記孔の孔径が前記本体の一端に向かって漸増するテーパ部を有する補助具であって、
ウェル内に、細胞培養支持体を収納するとともに、前記補助具を、前記テーパ部を上側にして収納した状態で、前記ウェル内に細胞を含む培養液を供給し、前記細胞を沈降させて前記細胞培養支持体に付着させる際、前記テーパ部は、前記培養液中において沈降する前記細胞を前記細胞培養支持体の前記孔内に露出する部分に誘導する細胞誘導手段として機能することを特徴とする補助具。
【請求項２】
前記補助具の外径は、前記ウェルの内径とほぼ等しいかまたは前記ウェルの内径よりも若干小さい請求項１に記載の補助具。
【請求項３】
前記孔の平面視形状は、前記細胞培養支持体の外形とほぼ等しい請求項１または２に記載の補助具。
【請求項４】
前記テーパ部は、前記本体の外周面側から内周面側に向かって傾斜する傾斜面で構成されている請求項１ないし３のいずれかに記載の補助具。
【請求項５】
前記傾斜面は、前記孔の中心軸に対して１５〜６５°の角度で傾斜している請求項４に記載の補助具。
【請求項６】
前記テーパ部の表面には、前記細胞が付着するのを防止または低減する付着防止処理が施されている請求項１ないし５のいずれかに記載の補助具。
【請求項７】
前記付着防止処理は、前記テーパ部の表面に撥液性を付与する撥液処理である請求項６に記載の補助具。
【請求項８】
前記付着防止処理は、前記テーパ部の表面の凹凸を低減する平滑化処理である請求項６または７に記載の補助具。
【請求項９】
前記平滑化処理が施された前記テーパ部の表面の表面粗さＲａ（ＪＩＳ  Ｂ  ０６０１に規定）は、１０μｍ以下である請求項８に記載の補助具。
【請求項１０】
前記本体は、前記ウェル内に前記細胞培養支持体および前記補助具を収納した状態で、前記本体の前記孔の内壁が、前記細胞培養支持体の外縁より中心側に位置しており、前記本体の前記テーパ部と反対側の端部の前記孔に臨む部位に、前記細胞培養支持体の前記外縁部と係合する係合部を有している請求項１ないし９のいずれかに記載の補助具。
【請求項１１】
前記ウェルの内側面と前記細胞培養支持体の外縁部との間に形成された間隙内に位置し、前記細胞培養支持体の前記ウェルに対する位置決めを行う位置決め手段を有する請求項１０に記載の補助具。
【請求項１２】
前記位置決め手段は、前記本体の前記テーパ部と反対側の端部に一体的に形成された脚部である請求項１１に記載の補助具。
【請求項１３】
前記脚部は、前記本体の周方向に沿って設けられている請求項１２に記載の補助具。
【請求項１４】
前記培養液に対する前記補助具の全体の比重は、１．０１以上である請求項１ないし１３のいずれかに記載の補助具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、細胞を細胞培養担体に誘導する際に用いることができる補助具に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、例えば、リン酸カルシウム系材料等で構成される移植片を生体内へ移植した際の生体適合性を評価する方法として、この移植片（細胞培養ペレット）に各種細胞を培養し、これらの細胞の増殖能、分化能および致死率等から、その生体適合性を評価することが行われている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
逆に、例えば、骨の主たる構成成分がリン酸カルシウム系材料であることから、この材料で構成される細胞培養ペレット上での各種細胞の増殖能、分化能および致死率等の評価することにより、各種細胞の骨への親和性等の評価を行うこともできる（例えば、特許文献２参照）。
【０００４】
さらに、人為的に機能を付与した細胞培養ペレット上で細胞培養を行うことにより、培養される細胞の増殖能および分化能等の生物学的性質を改変させる試みも行われている。
【０００５】
このような細胞培養ペレット上での細胞の培養は、上述したような種々の目的により広く行われているが、一般に、次のようにして行うことができる。
【０００６】
まず、細胞を培地に懸濁させることにより細胞を含む培養液を調製する。
次に、培養容器が備えるウェル内の底面に細胞培養ペレットを配置させた後、このウェル内に培養液を供給する。
【０００７】
これにより、培養液中に含まれる細胞がその自重により沈降して、ウェル内の底面に配置された細胞培養ペレット上に到達し、付着することとなる。
【０００８】
その後、所定の条件下で放置することにより、細胞培養ペレット上において細胞を培養する。
【０００９】
ところが、通常、細胞培養ペレットとウェルの側面との間には、間隙が形成されるため、この間隙内に多くの細胞が落込むこととなる。このため、細胞の無駄が生じたり、ウェル毎で細胞培養ペレットに付着する細胞の数にバラツキが生じるという問題がある。
【００１０】
【特許文献１】特開２００４−２３６９４０号公報
【特許文献２】特開２００４−１７３５０２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、培養液中に含まれる細胞を、無駄なくかつ確実に細胞培養支持体に付着させることができる補助具を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
このような目的は、下記の（１）〜（１４）の本発明により達成される。
（１）  中心部に孔を有する筒状の本体を備え、該本体の一端側に前記孔の孔径が前記本体の一端に向かって漸増するテーパ部を有する補助具であって、
ウェル内に、細胞培養支持体を収納するとともに、前記補助具を、前記テーパ部を上側にして収納した状態で、前記ウェル内に細胞を含む培養液を供給し、前記細胞を沈降させて前記細胞培養支持体に付着させる際、前記テーパ部は、前記培養液中において沈降する前記細胞を前記細胞培養支持体の前記孔内に露出する部分に誘導する細胞誘導手段として機能することを特徴とする補助具。
【００１３】
これにより、培養液中において沈降する細胞を、細胞培養支持体に誘導して、無駄なくかつ確実に、細胞培養支持体に付着させることができる。
【００１４】
（２）  前記補助具の外径は、前記ウェルの内径とほぼ等しいかまたは前記ウェルの内径よりも若干小さい上記（１）に記載の補助具。
【００１５】
これにより、ウェル内への補助具の出し入れを容易かつ確実に行うことができる。また、ウェルの内側面により補助具の水平方向に対する位置が規制されるため、ウェル内に補助具を配置した際に、傾きが生じることを確実に防止することができる。さらに、補助具の外周面とウェルの内側面とが近接して、補助具をウェル内に隙間なく収納することができるため、補助具とウェルの内側面との間に細胞が入り込むのを防止することができる。
【００１６】
（３）  前記孔の平面視形状は、前記細胞培養支持体の外形とほぼ等しい上記（１）または（２）に記載の補助具。
【００１７】
これにより、ウェルの内側面と細胞培養支持体の外縁部との間に形成された間隙の幅と、本体の幅とがほぼ等しい場合には、補助具で間隙のほぼ全面を確実に塞ぐことができる。また、細胞培養支持体および補助具をウェル内に収納する際に、この工程を、細胞培養支持体と補助具とを一体化させた状態で行うことができる。また、本体の幅が間隙の幅よりも小さい場合であっても、間隙が孔内で露出する大きさを比較的小さくすることができる。その結果、間隙内に落込む細胞の量を少なくすることができる。
【００１８】
（４）  前記テーパ部は、前記本体の外周面側から内周面側に向かって傾斜する傾斜面で構成されている上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の補助具。
【００１９】
これにより、テーパ部は、培養液中において沈降する細胞を細胞培養支持体の孔内に露出する部分に誘導する細胞誘導手段としての機能を発揮することとなる。
【００２０】
（５）  前記傾斜面は、前記孔の中心軸に対して１５〜６５°の角度で傾斜している上記（４）に記載の補助具。
【００２１】
これにより、細胞を傾斜面に付着させることなく、より確実に細胞培養支持体の孔内に露出する部分に誘導することができ、傾斜面に細胞誘導手段としての機能をより確実に発揮させることができる。
【００２２】
（６）  前記テーパ部の表面には、前記細胞が付着するのを防止または低減する付着防止処理が施されている上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の補助具。
【００２３】
これにより、細胞をテーパ部に沿ってより確実に下方に向かって移動させることができるようになり、細胞培養支持体の孔内に露出する部分により無駄なく細胞を誘導して付着させることができる。
【００２４】
（７）  前記付着防止処理は、前記テーパ部の表面に撥液性を付与する撥液処理である上記（６）に記載の補助具。
【００２５】
撥液処理によれば、電気的な反発により細胞がテーパ部に付着するのをより確実に防止することができる。
【００２６】
（８）  前記付着防止処理は、前記テーパ部の表面の凹凸を低減する平滑化処理である上記（６）または（７）に記載の補助具。
【００２７】
平滑化処理によれば、細胞の足場となる部分をより減少させ、テーパ部に付着するのをより確実に防止することができる。
【００２８】
（９）  前記平滑化処理が施された前記テーパ部の表面の表面粗さＲａ（ＪＩＳ  Ｂ  ０６０１に規定）は、１０μｍ以下である上記（８）に記載の補助具。
【００２９】
これにより、細胞の足場がより少なくなり、より確実にテーパ部に細胞が付着し難くなる。
【００３０】
（１０）  前記本体は、前記ウェル内に前記細胞培養支持体および前記補助具を収納した状態で、前記本体の前記孔の内壁が、前記細胞培養支持体の外縁より中心側に位置しており、前記本体の前記テーパ部と反対側の端部の前記孔に臨む部位に、前記細胞培養支持体の前記外縁部と係合する係合部を有している上記（１）ないし（９）のいずれかに記載の補助具。
【００３１】
これにより、本体により、細胞培養支持体の外縁部をその全体に亘って覆うことができる。その結果、間隙は、本体の底面により覆われるようにして、孔から露出するのが防止される。これにより、細胞培養支持体の孔内に露出する部分に誘導された細胞が、培養液の対流や振動等により、間隙内に落込むようになるのをより確実に防止することができる。
【００３２】
（１１）  前記ウェルの内側面と前記細胞培養支持体の外縁部との間に形成された間隙内に位置し、前記細胞培養支持体の前記ウェルに対する位置決めを行う位置決め手段を有する上記（１０）に記載の補助具。
【００３３】
これにより、たとえ、ウェルの振動等により細胞培養支持体の位置がウェルの中央部からずれたとしても、係合部が細胞培養支持体の外縁部と係合した状態を維持して、間隙を確実に塞ぐとともに、細胞を付着させる領域を孔から確実に露出させることができる。
【００３４】
（１２）  前記位置決め手段は、前記本体の前記テーパ部と反対側の端部に一体的に形成された脚部である上記（１１）に記載の補助具。
【００３５】
位置決め手段を前記脚部で構成することにより、位置決め手段は、間隙内に位置し、ウェルに対して細胞培養支持体の位置決めを行う位置決め手段としての機能を発揮することとなる。
【００３６】
（１３）  前記脚部は、前記本体の周方向に沿って設けられている上記（１２）に記載の補助具。
これにより、脚部に位置決め手段としての機能を発揮させることができる。
【００３７】
（１４）  前記培養液に対する前記補助具の全体の比重は、１．０１以上である上記（１）ないし（１３）のいずれかに記載の補助具。
【００３８】
これにより、培養液を穴内に供給した際に、補助具が培養液中で浮き上がるのを防止して、係合部により、細胞培養支持体の外縁部を上側から確実に押さえることができる。
【発明の効果】
【００３９】
本発明によれば、培養液中に含まれる細胞を確実に細胞培養支持体に誘導できることから、ウェルの内側面と細胞培養支持体の外縁部との間に形成された間隙に細胞が落込んで細胞の無駄が生じるのを確実に防止することができる。また、このように細胞の無駄が生じないことから、培養液中に含まれる細胞の量を調整することにより、細胞培養支持体に付着している細胞の量を調整することができる。そのため、この細胞を用いた実験の実験精度の向上を図ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
以下、本発明の補助具について、好適実施形態に基づいて詳細に説明する。
なお、以下では、本発明の補助具の説明を行うのに先立って、細胞培養ペレット（細胞培養支持体）に細胞を付着させる方法（細胞培養）の一例について説明する。
【００４１】
＜細胞培養＞
図１０は、細胞培養の一例を説明するための拡大縦断面図である。なお、以下の説明では、図１０中の上側を「上」、下側を「下」という。
【００４２】
［１］まず、試験管やフラスコのような容器内で一次培養した細胞４０に、例えば、トリプシンのようなタンパク質分解酵素等による処理を施す。これにより、この細胞４０を容器の内面から剥離（遊離）させる。
【００４３】
［２］次に、この遊離した細胞４０を培地に懸濁するとともに、この懸濁液中に含まれる細胞数を調整して、細胞４０を含む培養液３０を調製する。
【００４４】
培養液３０に含まれる培地としては、懸濁させる細胞４０の種類等により適宜選択され、特に限定されないが、例えば、ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ダルベッコＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＭＣＤＢ−１０４培地等が挙げられる。
【００４５】
また、培養液３０中には、必要に応じて、例えば、血清、アルブミン等の血清タンパク質、各種ビタミン類、各種アミノ酸、塩類等の添加剤を添加するようにしてもよい。
【００４６】
［３］次に、図１０に示すプレート（培養容器）１０に複数設けられた各穴（ウェル）２０の底面に、細胞４０を付着させ増殖させる細胞付着面２が上側となるように細胞培養ペレット（細胞培養支持体）１を収納（配置）する。
【００４７】
ここで、各穴２０の内径は、細胞培養ペレット１の直径より大きく設定されている。これにより、細胞培養ペレット１の穴２０内への収納、および、穴２０内からの取り出しを容易に行うことができる。
【００４８】
なお、細胞培養ペレット１の構成材料としては、培養する細胞４０の種類や、生体適合性を評価する材料等に応じて適宜選択され、特に限定されないが、例えば、ハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、リン酸二カルシウム、フッ酸アパタイトのようなリン酸カルシウム系材料、チタン、マグネシウム、ニッケルのような金属材料、ポリ乳酸のような生分解性樹脂材料等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００４９】
［４］次に、前記工程［２］で調製した細胞４０を含む培養液３０を、各穴２０内に供給する。
【００５０】
このとき、培養液３０中に含まれる細胞４０は、その自重により培養液３０中において鉛直下方に向かって沈降して、細胞付着面２上に到達・付着することとなる。
【００５１】
そして、細胞付着面２上に細胞４０が付着した細胞培養ペレット１を所定の条件下で放置することにより、細胞４０を二次培養（培養）することができる。
【００５２】
培養液の温度（培養温度）は、培養する細胞４０の種類等に応じて適宜設定され、特に限定されないが、通常、２０〜４０℃程度、好ましくは２５〜３７℃程度とされる。
【００５３】
なお、本実施形態では、穴２０内に細胞４０を供給する方法として、細胞４０を含む培養液３０を穴２０内に注入（供給）する方法を用いたが、このような場合に限定されず、例えば、穴２０内に、先に培地の供給を行い、次いで細胞４０の供給を行うようにしてもよい。
【００５４】
さて、このような培養方法においては、前述したように、各穴２０の内径が細胞培養ペレット１の直径より大きく設定される。このため、穴２０の底面に細胞培養ペレット１を配置すると、穴２０の内側面と細胞培養ペレット１の外縁部との間に、穴２０の底面が露出する間隙５０が形成されることとなる。
【００５５】
この状態で、前記工程［４］を行うと、すなわち、穴２０内に培養液３０を供給すると、図１０においてＡで示すように、細胞培養ペレット１の中央部に向かって沈降する細胞は、細胞培養ペレット１上に到達し、付着する。
【００５６】
ところが、図１０においてＢで示すように、細胞培養ペレット１の縁部に向かって沈降する細胞は、培養液３０の対流や振動等により、容易に間隙５０内に落込む。また。Ｃで示すように、穴２０の内側面近傍を間隙５０に向かって沈降する細胞は、確実に間隙５０内に落込む。一旦、細胞が間隙５０内に落込むと、細胞培養ペレット１上に移動することはなく、無駄となる。
【００５７】
本発明の補助具は、かかる問題を解消するために用いられるものである。
る。
【００５８】
＜補助具＞
以下、本発明の補助具について詳述する。
【００５９】
＜＜第１実施形態＞＞
まず、本発明の補助具の第１実施形態について説明する。
【００６０】
図１および図２は、本発明の補助具の第１実施形態を細胞培養ペレットが配置された穴内に装着した状態を示す図であり、図１は部分断面図であり、図２は拡大縦断面図であり、図３は、本発明の補助具の第１実施形態を示す斜視図である。なお、以下の説明では、図１〜図３中の上側を「上」、下側を「下」という。
【００６１】
図１〜図３に示す補助具６０ａは、その中心部に上下方向（鉛直方向）に貫通する孔６３を有し、その全体形状がほぼ筒状をなす本体６１を備えている。
【００６２】
この補助具６０ａ（本体６１）は、その外径が高さ方向に沿ってほぼ一定である。一方、補助具６０ａの内径は、下端から上端に向かって厚さ方向の途中までほぼ一定であるが、途中から上端に向かって漸増し、補助具６０ａの上端では、その幅が実質的に「０」となっている。
【００６３】
すなわち、孔６３（本体６１の内周面）がロート状をなしており、補助具６０ａの上部内周面が、補助具６０ａの外周面側から内周面側に向かって傾斜する傾斜面６４となっている。換言すれば、この傾斜面６４が、本体６１の一端（上）側に孔６３の孔径がこの本体６１の一端（上）に向かって漸増するテーパ部を構成する。
【００６４】
本体６１をかかる構成とすることにより、穴２０内に、細胞培養ペレット１を収納するとともに、補助具６０ａ（本体６１）を、傾斜面６４を上側にして収納した状態で、前述した培養方法のように、穴２０内に細胞４０を含む培養液３０を供給し、細胞４０を沈降させて細胞培養ペレット１に付着させる際に、傾斜面６４は、培養液３０中において沈降する細胞４０を細胞培養ペレット１の孔６３内に露出する部分（細胞付着面２）に誘導する細胞誘導手段としての機能を発揮することとなる。
【００６５】
そのため、図２に示すように、間隙５０の鉛直上方に存在している細胞４０は、傾斜面６４上に到達すると、傾斜面６４を転がって（を沿うように）孔６３内を下方に向かって移動して、細胞付着面２上に誘導され付着する。
【００６６】
このようなことから、補助具６０ａを用いることにより、細胞４０を無駄なく、かつ確実に細胞培養ペレット１（細胞付着面２）に付着させることができる。また、このように、細胞４０の無駄が生じないことから、培養液３０中に含まれる細胞４０の数を調整することにより、細胞付着面２上に付着する細胞４０の数を確実に調整することができる。その結果、この細胞４０を用いた実験の実験精度の向上を図ることができる。
【００６７】
補助具６０ａの外径は、穴２０の内径とほぼ等しいかまたは穴２０の内径より若干小さく設定されている。これにより、穴２０内への補助具６０ａの出し入れを容易かつ確実に行うことができる。また、穴２０の内側面により補助具６０ａの水平方向に対する位置が規制されるため、穴２０内に補助具６０ａを配置した際に、傾きが生じることを確実に防止することができる。さらに、補助具６０ａの外周面と穴２０の内側面とが近接して、補助具６０ａを穴２０内に隙間なく収納することができるため、補助具６０ａと穴２０の内側面との間に細胞４０が入り込むのを防止することができる。
【００６８】
また、孔６３の平面視形状は、細胞培養ペレット１の外形と異なっていてもよいが、図１および図３に示すように、好ましくはほぼ等しいものとされる。これにより、間隙５０の幅と本体６１の幅とがほぼ等しい場合には、補助具６０ａで間隙５０のほぼ全面を確実に塞ぐことができる。また、細胞培養ペレット１および補助具６０ａを穴２０内に収納する際に、この工程を、細胞培養ペレット１と補助具６０ａとを一体化させた状態、すなわち、細胞培養ペレット１を孔６３内に装着した状態で行うことができる。また、本体６１の幅が間隙５０の幅よりも小さい場合であっても、間隙５０が孔６３内で露出する大きさを比較的小さくすることができる。その結果、間隙５０内に落込む細胞４０の量を少なくすることができる。
【００６９】
傾斜面６４は、特に限定されないが、孔６３の中心軸に対して、１５〜６５°程度の角度で傾斜しているのが好ましく、２５〜５５°程度の角度で傾斜しているのがより好ましい。これにより、細胞４０を傾斜面６４に付着させることなく、より確実に細胞付着面２上に誘導することができ、傾斜面６４に細胞誘導手段としての機能をより確実に発揮させることができる。
【００７０】
また、傾斜面６４には、細胞４０が付着するのを防止または低減する付着防止処理が施されているのが好ましい。これにより、細胞４０を傾斜面６４に沿ってより確実に下方に向かって移動させることができるようになり、細胞培養ペレット１の孔６３内に露出する部分（細胞付着面２）により無駄なく細胞４０を誘導して付着させることができる。
【００７１】
この付着防止処理としては、例えば、傾斜面（平面）６４に撥液性を付与する撥液処理（化学的処理）、傾斜面６４の凹凸を低減する平滑化処理（物理的処理）等が挙げられる。撥液処理によれば、電気的な反発により細胞４０が傾斜面６４に付着するのをより確実に防止することができる。また、平滑化処理によれば、細胞４０の足場となる部分をより減少させ、傾斜面６４に付着するのをより確実に防止することができる。
【００７２】
撥液処理の方法としては、例えば、傾斜面６４の上面に撥液膜を形成する方法、フッ素イオン等の撥液性を付与し得るイオンを注入（打ち込む）方法等のうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００７３】
撥液膜の構成材料としては、例えば、トリデカフルオロ−１，１，２，２テトラヒドロオクチルトリエトキシシラン、トリデカフルオロ−１，１，２，２テトラヒドロオクチルトリメトキシシランのような撥液性を示す官能基を有するカップリング剤や、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、テトラフルオロエチレン−パーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体（ＰＦＡ）、エチレン−テトラフルオロエチレン共重合体（ＥＴＦＥ）のような撥液性の樹脂材料等が挙げられる。
【００７４】
平滑化処理の方法としては、例えば、化学的研磨、電解研磨等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００７５】
平滑化処理が施された傾斜面６４は、その表面粗さＲａ（ＪＩＳ  Ｂ  ０６０１に規定）が１０μｍ以下であるのが好ましく、０．１〜１０μｍ程度であれば良い。これにより、細胞４０の足場がより少なくなり、より確実に傾斜面６４に細胞４０が付着し難くなる。
【００７６】
さらに、付着防止処理は補助具６０ａ（本体６１）の内周面に施すこともできる。この場合、細胞４０が補助具６０ａに付着するのを防止することが確実となる。
【００７７】
なお、テーパ部は、図１〜図３に示すような本体６１の外周面側から内周面側に向かって傾斜する傾斜面６４で構成されている場合に限らず、例えば、湾曲凹面、湾曲凸面、または傾斜面６４を含み、これらのうちの任意の２以上を組み合わせて構成することができる。
【００７８】
このような補助具６０ａ（本体６１）の構成材料としては、例えば、石英ガラス、ソーダガラスのようなガラス材料、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリテトラフルオロエチレンのような樹脂材料、セラミックス材料、金属材料および炭素繊維等のような炭素系材料等が挙げられるが、これらの中でも、ポリテトラフルオロエチレンを用いるのが好ましい。ポリテトラフルオロエチレンは、特に細胞４０に対する親和性が低い材料であることから、本体６１をポリテトラフルオロエチレンで構成することにより、本体６１に細胞４０に付着させることなく、細胞付着面２上に誘導することができる。
【００７９】
本体６１の外径は、前述したように、穴２０の内径と等しいかまたは穴２０の内径より若干小さく設定される。
【００８０】
そこで、プレート１０として２４穴のものを用いる場合、穴２０の内径は、通常、１５．０ｍｍ程度と設定されることから、本体６１の外径は、１４．８〜１５．０ｍｍ程度であるのが好ましい。この場合、本体６１の最小内径は、特に限定されないが、１０．０〜１３．５ｍｍ程度であるのが好ましい。また、本体６１の最大高さは、特に限定されないが、４．３〜５．０ｍｍ程度であるのが好ましい。
【００８１】
＜＜第２実施形態＞＞
次に、本発明の補助具の第２実施形態について説明する。
【００８２】
図４は、本発明の補助具の第２実施形態を細胞培養ペレットが配置された穴内に装着した状態を示す拡大縦断面図である。なお、以下の説明では、図４中の上側を「上」、下側を「下」という。
【００８３】
以下、第２実施形態について、前記第１実施形態との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
【００８４】
図４に示すように、第２実施形態の補助具６０ｂ（本体６１）は、穴２０内に細胞培養ペレット１および補助具６０ｂを収納した状態で、本体６１の孔６３の内壁が、細胞培養ペレット１の外縁より中心側に位置しており、本体６１の下端部の孔６３に臨む部位に、細胞培養ペレット１の外縁部と係合する係合部６２を有している以外は、前記第１実施形態の補助具６０ａ（本体６１）と同様である。
【００８５】
本体６１をかかる構成、すなわち、係合部６２を有する構成とすることにより、本体６１により、細胞培養ペレット１の外縁部をその全体に亘って覆うことができる。その結果、間隙５０は、本体６１の底面により覆われるようにして、孔６３から露出するのが防止される。これにより、細胞付着面２上に誘導された細胞４０が、培養液３０の対流や振動等により、間隙５０内に落込むようになるのをより確実に防止することができる。また、係合部６２により、細胞培養ペレット１の外縁部を上側から押さえることができるため、穴２０の振動等による細胞培養ペレット１の浮き上がりを好適に防止または抑制することができる。さらに、孔６３の大きさを適宜設定することにより、孔６３から露出する細胞付着面２の領域、すなわち、細胞４０を誘導して付着させる細胞付着面２の領域を比較的容易に規定することができ、補助具６０ｂは、この領域内に細胞４０を集積する機能を発揮することとなる。
【００８６】
なお、本実施形態において、孔６３の内径は、本体６１の下端から上端まで、高さ方向に沿って連続的に漸増する構成、すなわち、内周面全体が傾斜面６４を構成してもよい。このような構成によっても、前記と同様の効果が得られる。
【００８７】
＜＜第３実施形態＞＞
次に、本発明の補助具の第３実施形態について説明する。
【００８８】
図５は、本発明の補助具の第３実施形態を細胞培養ペレットが配置された穴内に装着した状態を示す拡大縦断面図である。なお、以下の説明では、図５中の上側を「上」、下側を「下」という。
【００８９】
以下、第３実施形態について、前記第２実施形態との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
【００９０】
図５に示すように、第３実施形態の補助具６０ｃは、本体６１の下側の端部に、本体６１と一体的に形成された脚部６６を備える以外は、前記第２実施形態の補助具６０ｂと同様である。
【００９１】
この脚部６６は、下方に向かって突出するように、本体６１の周方向に沿って設けられた円環状をなしており、補助具６０ｃを穴２０内に配置した状態で、脚部６６が穴２０の内側面と細胞培養ペレット１の外縁部との間に形成された間隙５０内に位置することとなる。これにより、細胞培養ペレット１を穴２０の中央部に正確に移動（センタリング）することができる。すなわち、脚部６６は、間隙５０内に位置し、穴２０に対して細胞培養ペレット１の位置決めを行う位置決め手段として機能する。これにより、たとえ、穴２０の振動等により細胞培養ペレット１の位置が穴２０の中央部からずれたとしても、係合部６２が細胞培養ペレット１の外縁部と係合した状態を維持して、間隙５０を確実に塞ぐとともに、孔６３から細胞付着面２（細胞を付着させる領域）を確実に露出させることができる。
【００９２】
脚部６６は、本体６１と別体となったものであってもよいが、本実施形態のように、一体的に形成されるものであるのが好ましい。これにより、補助具６０ｃの製造工程の削減を図ることができるとともに、寸法精度に優れた補助具６０ｃを比較的容易に形成することができる。
【００９３】
なお、脚部６６は、本体６１の周方向に沿って連続的に形成されているものに限定されず、間歇的に形成されているものであってもよく、例えば、本体６１の下面から突出し、本体６１に周方向に沿って配設された複数の棒状体で構成することもできる。この場合、棒状体の数は、特に限定されないが、その形成されている位置は、それぞれがほぼ等間隔となっているのが好ましい。これにより、穴２０に対する細胞培養ペレット１の位置決めを確実に行うことができる。
【００９４】
また、位置決め手段は、図５に示すような脚部６６で構成されている場合に限らず、本体６１と別体とする場合には、例えば、穴２０の内周面および／または底面に接合されたもの、細胞培養ペレット１の外周面に接合されたもの、間隙５０内に挿入されたもの等であってもよい。
【００９５】
＜＜第４実施形態＞＞
次に、本発明の補助具の第４実施形態について説明する。
【００９６】
図６は、本発明の補助具の第４実施形態を細胞培養ペレットが配置された穴内に装着した状態を示す拡大縦断面図である。なお、以下の説明では、図６中の上側を「上」、下側を「下」という。
【００９７】
以下、第４実施形態について、前記第３実施形態との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
【００９８】
図６に示すように、第４実施形態の補助具６０ｄは、本体６１の下側の端部に設けられた脚部６６内に錘６７を備える以外は、前記第３実施形態の補助具６０ｃと同様である。
【００９９】
ここで、補助具６０ｄは、培養液３０に対するその全体の比重が好ましくは１．０１以上、より好ましくは１．２〜１．５程度となっているのが好適である。前記比重をかかる範囲内に設定することにより、培養液３０を穴２０内に供給した際に、補助具６０ｄが培養液３０中で浮き上がるのを防止して、係合部６２により、細胞培養ペレット１の外縁部を上側から確実に押さえることができる。
【０１００】
そこで、本実施形態のような脚部６６内に錘６７を備える構成とすることにより、補助具６０ｄ全体としての比重を前記範囲内に比較的容易に設定することができる。また、本体６１（脚部６６）に用いる材料の選択の幅が広がるという利点も得られる。
【０１０１】
錘６７の構成材料としては、特に限定されないが、例えば、Ｃｕ、Ｐｂ、Ｆｅのような金属材料が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【０１０２】
また、本実施形態では、錘６７は、脚部６６内に設けられるものとしたが、本体６１内に設けられていてもよく、脚部６６内および本体６１内の双方に亘って設けられるものであってもよい。
【０１０３】
＜＜第５実施形態＞＞
次に、本発明の補助具の第５実施形態について説明する。
【０１０４】
図７は、本発明の補助具の第５実施形態を細胞培養ペレットが配置された穴内に装着した状態を示す拡大縦断面図である。なお、以下の説明では、図７中の上側を「上」、下側を「下」という。
【０１０５】
以下、第５実施形態について、前記第３実施形態との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
【０１０６】
第５実施形態の補助具６０ｅは、光透過性を有し、図７に示すように、反射面６８を備えること以外は、前記第３実施形態の補助具６０ｃと同様である。
【０１０７】
反射面６８は、本体６１の高さ方向の途中に、鉛直方向に対して所定角度で傾斜して設けられており、補助具６０ｅでは、穴２０の下面（底部）側から入射した光を、反射面６８において細胞付着面（細胞４０が付着する領域）２に向かって反射することができる。
【０１０８】
ここで、実質的に光を透過しない細胞培養ペレット１において、細胞付着面２に付着した細胞４０の状態を顕微鏡を用いて観察する場合、対物レンズ近傍に光源（照明手段）を配置する必要があり、光源が邪魔になり細胞４０の観察操作が困難となる。
【０１０９】
これに対して、補助具６０ｅを本実施形態のような構成とすることにより、穴２０の底部側から入射した光を、補助具６０ｅの下面（底面）から取り込んで、反射面６８で反射させることにより、細胞付着面２側に導入することができ、顕微鏡を用いた観察の際に、対物レンズの近傍に光源を配置することを要さないため、その観察操作を容易に行うことができる。
【０１１０】
反射面６８の傾斜角度は、細胞培養ペレット１のサイズ等によっても若干異なり、特に限定されないが、鉛直方向に対して４５〜８５°程度であるのが好ましく、５０〜６０°程度であるのがより好ましい。
【０１１１】
このような反射面６８は、好ましくは光反射性を有する金属材料で構成される。これにより、前述したような構成の反射面６８を本体６１内に比較的容易に設けることができる。また、かかる反射面６８は、例えば、蒸着法、ＣＶＤ法、スパッタリング法等の気相成膜法等により形成することができる。
【０１１２】
金属材料としては、特に限定されないが、Ａｌ、Ｎｉ、ＣｏおよびＡｇこれらを含む合金のうちの少なくとも１種を主材料として構成されるものを用いるのが好ましい。これらの金属材料は、特に光反射性に優れるものである。
【０１１３】
また、反射面６８の表面粗さＲａ（ＪＩＳ  Ｂ  ０６０１に規定）は、好ましくは２０ｎｍ以下、より好ましくは２〜７ｎｍ程度に設定されているのが好適である。これにより、光の反射率が向上して、補助具６０ｅの底面から導入された光を細胞付着面２側により確実に反射（導入）することができる。
【０１１４】
また、透光性を有する本体６１の構成材料としては、前述した本体６１の構成材料のうち透明な各種ガラス材料および各種樹脂材料が選択され、例えば、石英ガラス、ソーダガラスのようなガラス材料や、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリスチレン、ポリエーテルサルフォン、ポリアクリル酸メチル、ポリカーボネートのような樹脂材料等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【０１１５】
また、本実施形態では、脚部６６は、本体６１に光を導く導光部として機能させることができる。
【０１１６】
なお、反射面６８に光を導く光ファイバー等の導光路（光導波路）を、補助具６０ｅ内に配設してもよい。さらに、反射面６８を省略して、この導光路を用いて、光を直接、細胞付着面２に誘導するように構成してもよい。
【０１１７】
以上、本発明の補助具を図示の実施形態に基づいて説明したが、本発明はこれらに限定されるものではない。例えば、本発明の補助具は、各前記実施形態のうち任意の２以上の構成（特徴）を組み合わせたものであってもよい。
【０１１８】
また、本発明の補助具の各部の構成は、同様の機能を発揮し得る任意のものと置換することができ、あるいは、任意の構成のものを付加することもできる。
【実施例】
【０１１９】
次に、本発明の具体的実施例について説明する。
（実施例１）
＜１＞まず、フラスコ内でヒト骨肉腫由来細胞（ＨＯＳ、ＡＴＣＣ＃１５４３）を一次培養し、培養されたヒト骨肉腫由来細胞を０．２５ｗｔ％トリプシン−０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を用いて処理した後、剥離したヒト骨肉腫由来細胞が１×１０５個／ｍＬとなるように、培養液を用いて細胞浮遊液を調製した。
【０１２０】
なお、培養液には、ＭＥＭ培地に、ＦＢＳ：１０ｖｏｌ％、ＮＥＡＡ：１ｖｏｌ％となるように混合した。
【０１２１】
＜２＞次に、細胞培養ペレットとして外径１３ｍｍ×厚さ２．０ｍｍのハイドロキシアパタイト緻密体（ペンタックス社製、「CELLYARD pellet」）を用意し、このハイドロキシアパタイト緻密体を１２１℃×２０分の条件下でオートクレーブ処理した。
【０１２２】
＜３＞次に、図１に示すような培養容器（プレート）（Falcon社製、「２４穴マルチウェルプレート」）が備える内径１５．３ｍｍ×深さ１７ｍｍのウェルの底面にハイドロキシアパタイト緻密体を配置した。
【０１２３】
＜４＞次に、図１〜図３に示す補助具をハイドロキシアパタイト緻密体が配置されたウェル内に図１に示すように配置した。そして、この状態で、前記工程＜１＞で調製した細胞浮遊液１ｍＬをウェル内に供給した。
【０１２４】
＜５＞その後、９５ｖｏｌ％Ｏ２＋５ｖｏｌ％ＣＯ２の混合ガス気流下、３７℃の条件下で４時間静置して、ヒト骨肉腫由来細胞を培養（二次培養）した。
【０１２５】
（実施例２）
前記工程＜４＞において、ウェル内に図１〜３に示す補助具に代えて、図４に示す補助具を配置した以外は、前記実施例１と同様にしてヒト骨髄腫由来細胞を培養した。
【０１２６】
（実施例３）
前記工程＜４＞において、ウェル内に図１〜３に示す補助具に代えて、図５に示す補助具を配置した以外は、前記実施例１と同様にしてヒト骨髄腫由来細胞を培養した。
【０１２７】
（実施例４）
前記工程＜４＞において、ウェル内に図１〜３に示す補助具に代えて、図６に示す補助具を配置した以外は、前記実施例１と同様にしてヒト骨髄腫由来細胞を培養した。
【０１２８】
（実施例５）
前記工程＜４＞において、ウェル内に図１〜３に示す補助具に代えて、図７に示す補助具を配置した以外は、前記実施例１と同様にしてヒト骨髄腫由来細胞を培養した。
【０１２９】
（比較例１）
前記工程＜４＞において、ウェル内への補助具の配置を省略した以外は、前記実施例１と同様にしてヒト骨髄腫由来細胞を培養した。
【０１３０】
（比較例２）
前記工程＜３＞において、ウェル内へのハイドロキシアパタイト緻密体の配置を省略し、前記工程＜４＞において、ウェル内への補助具の配置を省略した以外は、前記実施例１と同様にしてヒト骨髄腫由来細胞を培養した。
【０１３１】
［評価］
（評価１）
まず、実施例１〜５および比較例１、２において、それぞれ、ヒト骨髄腫由来細胞（以下、単に「細胞」という。）が培養された５個のウェル内から培養液を吸引除去した後、ＰＢＳ（−）で洗浄した後、１０ｖｏｌ％ホルマリンによりウェル内の細胞を固定化し、０．０５ｖｏｌ％トルイジンブルー水溶液を用いて細胞を染色して可視化させた。
そして、ウェル内に付着している細胞の場所を目視により観察した。
【０１３２】
その結果、実施例１の補助具が配置されたウェルの底面に、細胞の付着が若干認められたものの、実施例２〜５の補助具が配置されたウェル内では、細胞は、補助具の表面およびウェルの内面には付着しておらず、補助具の孔から露出するハイドロキシアパタイト緻密体の表面だけに付着していた。
【０１３３】
これに対して、比較例１では、細胞は、ウェルの内側面とハイドロキシアパタイト緻密体の外縁部との間に形成された間隙で露出するウェルの底面と、ハイドロキシアパタイト緻密体の表面とに付着していた。また、比較例２では、細胞は、ウェルの底面全体に付着していた。
【０１３４】
（評価２）
まず、実施例１〜５および比較例１、２において、それぞれ、細胞が培養された５個のウェル内から培養液を吸引して取り除いた。
【０１３５】
次に、各実施例のウェル内から、補助具およびハイドロキアパタイト緻密体を取り出した後、ウェル内、補助具およびハイドロキシアパタイト緻密体に付着する細胞を、０．２５ｗｔ％トリプシン−０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を用いて剥離・回収し、それぞれに付着していた細胞数と、培養液中に残存していた細胞数とを粒子数測定装置（ベックマンコルター社製、「Multisizer3」）を用いて計測した。
【０１３６】
また、比較例１のウェル内からハイドロキシアパタイト緻密体を取り出し、ウェル内およびハイドロキシアパタイト緻密体に付着していた細胞数と、培養液中に残存していた細胞数とを前記と同様にして計測した。
【０１３７】
さらに、比較例２のウェル内に付着していた細胞数と、培養液中に残存していた細胞数とを前記と同様にして計測した。
【０１３８】
なお、各細胞数は、いずれも、５個のウェルの平均値を求めた。
その結果を、表１に示す。
【０１３９】
【表１】
2007202479.tif 000003
【０１４０】
表１に示すように、実施例１の補助具を配置したウェルでは、ウェル内に細胞の付着が認められたものの、その他の実施例２〜５の補助具を配置したウェルでは、沈降した細胞のほぼ全てがハイドロキシアパタイト緻密体に付着していた。これに対して、比較例１では、ハイドロキシアパタイト緻密体の他、ウェル内にも細胞が付着しており、各実施例と比較して、ハイドロキシアパタイト緻密体への細胞の付着率が低下する傾向が見られた。なお、比較例１において、ハイドロキシアパタイト緻密体に付着していた細胞数とウェル内に付着していた細胞数との比が、ハイドロキシアパタイト緻密体の上面の表面積と、ハイドロキシアパタイト緻密体から露出するウェルの底面の表面積との比がほぼ等しかったことから、ウェル内に付着していた細胞のほぼ全てが、ウェルの底面に付着していたものと推測された。
【０１４１】
（評価３）
まず、実施例５おいて、補助具をウェル内に配置した状態で、細胞が培養されたウェル内の培養液に対して、ニュートラルレッド溶液を添加することにより細胞にニュートラルレッド染色を施した。
【０１４２】
そして、ウェルの底面側から光を照射しつつ、ウェルの上面（観察面）側から、ヒト骨ハイドロキシアパタイト緻密体上の細胞の状態を、正立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社製、「ＤＭＲ」）により観察した。
【０１４３】
その結果、図８に示すように、補助具をウェル内に配置した状態では、補助具を介してハイドロキシアパタイト緻密体の上面に細胞を観察するのに十分な光量を導入することができ、鮮明な観察像を得ることができた。これに対して、補助具をウェル内から取り出して、前記と同様にウェルの底面側から光を照射しつつ、ウェルの上面側から観察すると、図９に示すように、細胞を観察するのに十分な光量を、ハイドロキシアパタイト緻密体を透過させることができず、細胞の状態を観察することができなかった。
【０１４４】
なお、補助具をウェル内から取り出した状態で、光ファイバーを用いてウェルの斜め上方から光を供給して細胞の状態を観察することを試みた。この場合、正立顕微鏡の対物レンズによる立体障害等により、光ファイバーの位置決め等が困難であり、鮮明な観察像を得るのに時間を要した。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】本発明の補助具の第１実施形態を細胞培養ペレットが配置された穴内に装着した状態を示す部分断面図である。
【図２】本発明の補助具の第１実施形態を細胞培養ペレットが配置された穴内に装着した状態を示す拡大縦断面図である。
【図３】本発明の補助具の第１実施形態を示す斜視図である。
【図４】本発明の補助具の第２実施形態を細胞培養ペレットが配置された穴内に装着した状態を示す拡大縦断面図である
【図５】本発明の補助具の第３実施形態を細胞培養ペレットが配置された穴内に装着した状態を示す拡大縦断面図である。
【図６】本発明の補助具の第４実施形態を細胞培養ペレットが配置された穴内に装着した状態を示す拡大縦断面図である。
【図７】本発明の補助具の第５実施形態を細胞培養ペレットが配置された穴内に装着した状態を示す拡大縦断面図である。
【図８】実施例５のウェル内に補助具を配置した状態で、ヒト骨髄腫由来細胞を正立顕微鏡で観察した観察像である。
【図９】実施例５のウェル内から補助具を取り出した状態で、ヒト骨髄腫由来細胞を正立顕微鏡で観察した観察像である。
【図１０】細胞培養の一例を説明するための拡大縦断面図である。
【符号の説明】
【０１４６】
１      細胞培養ペレット
２      細胞付着面
１０    プレート
２０    穴
３０    培養液
４０    細胞
５０    間隙
６０ａ、６０ｂ、６０ｃ、６０ｄ、６０ｅ    補助具
６１    本体
６２    係合部
６３    孔
６４    傾斜面
６６    脚部
６７    錘
６８    反射面
【図１】
2007202479.tif 000004
【図２】
2007202479.tif 000005
【図３】
2007202479.tif 000006
【図４】
2007202479.tif 000007
【図５】
2007202479.tif 000008
【図６】
2007202479.tif 000009
【図７】
2007202479.tif 000010
【図８】
2007202479.tif 000011
【図９】
2007202479.tif 000012
【図１０】
2007202479.tif 000013