(57)【要約】【課題】  夾雑成分が混在するＩｇＭ型抗体含有液から簡便に高純度かつ高活性なＩｇＭ型抗体を分離精製する方法を提供する。【解決手段】  ＩｇＭ型抗体含有液に前処理を施し尿酸ナトリウム結晶に高親和性を有する夾雑成分を除去した後、尿酸ナトリウム結晶と接触させると、ＩｇＭ型抗体が尿酸ナトリウム結晶に選択的に結合するため、簡便に高純度かつ高活性なＩｇＭ型抗体を精製することができる。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩｇＭ型抗体含有液を尿酸ナトリウム結晶と接触させることによりＩｇＭ型抗体を尿酸ナトリウム結晶に選択的に結合させ、その後にＩｇＭ型抗体を尿酸ナトリウム結晶から解離、回収することを特徴とするＩｇＭ型抗体の分離精製方法。
【請求項２】
カチオン交換能を有する吸着材と接触させることを含む請求項１記載のＩｇＭ型抗体の分離精製方法。
【請求項３】
カチオン交換能を有する吸着材としてアニオン性化合物を固定してなる吸着材を用いる請求項１または２記載のＩｇＭ型抗体の分離精製方法。
【請求項４】
アニオン性化合物としてデキストラン硫酸を固定してなる吸着材を用いることを特徴とする請求項３記載のＩｇＭ型抗体の分離精製方法。
【請求項５】
アニオン交換能を有する吸着材と接触させることを含む請求項１乃至４記載のＩｇＭ型抗体の分離精製方法。
【請求項６】
請求項１乃至５記載の方法により、分離精製されたＩｇＭ型抗体。
【請求項７】
ＩｇＭ型抗体含有液を尿酸ナトリウム結晶と接触させることにより、尿酸ナトリウム結晶にＩｇＭ型抗体を結合させた、ＩｇＭ型抗体が認識する抗原の吸着材。
【請求項８】
ＩｇＭ型抗体含有液を尿酸ナトリウム結晶と接触させることによりＩｇＭ型抗体を尿酸ナトリウム結晶に選択的に結合させ、その後にＩｇＭ型抗体を尿酸ナトリウム結晶から解離、回収したＩｇＭ型抗体を結合させた、ＩｇＭ型抗体が認識する抗原の吸着材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は試料中より高純度かつ高活性なＩｇＭ型抗体を簡便で安価に精製する新規な方法、またはＩｇＭ型抗体認識抗原の吸着材に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体、即ち免疫グロブリンはＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ及びＩｇＤというクラスに分類される。そのうちＩｇＭ型抗体は最も大きな分子量を有し、一般に１０個の重鎖と１０個の軽鎖からなるペンタマーとして存在する。ＩｇＭ型抗体は免疫応答において最も早期に産出される抗体であり、細菌の感染を防御する際に主要な役割を担っていると考えられている。ＩｇＭ型抗体は血液中の主要免疫グロブリンであるＩｇＧ型抗体に比べると抗原に対する親和性は低いものの、抗原と多点結合でき効率良く動物の補体系を刺激できることから、ＩｇＧ型抗体に替わる抗体医薬としての能力も期待されている。また多糖類に対して高特異性を有することから、癌関連糖鎖に特異的な免疫グロブリンとして癌診断への応用も試みられている。以上のことからＩｇＭ型抗体の医療分野における利用価値は今日、極めて高まっている。
【０００３】
モノクローナルＩｇＭ型抗体を作成する最も一般的な方法としてはハイブリドーマ細胞を用いる細胞融合法が考えられる（Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒ、Ｃ．Ｍｉｌｓｔａｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６巻、４９５項、１９７５年）。ハイブリドーマ細胞とは抗体生産能を有するＢ細胞と増殖能を有するミエローマ細胞とを細胞融合し、モノクローナルなＩｇＭ型抗体を合成するように調製した細胞である。ハイブリドーマ細胞からＩｇＭ型抗体溶液を得る方法としては、ハイブリドーマ細胞を血清培地および無血清培地などで細胞培養することによってモノクローナルＩｇＭ型抗体を含む溶液を得る方法、マウスやラットの腹腔に移植・増殖させ、その腹水からモノクローナルＩｇＭ型抗体を含む溶液を得る方法などが考えられる。他にＩｇＭ型抗体を作成する方法としてはミエローマ患者由来のＢ細胞からモノクローナルＩｇＭ型抗体を得る方法やマクログロブリン血症患者の血中から得る方法などが挙げられる。
【０００４】
しかしながら、それらのＩｇＭ型抗体を含む血液や培養液には目的とするＩｇＭ型抗体以外の蛋白質、脂質や細胞培養液に由来する成分が混在しているため、その不純物が精製ＩｇＭ型抗体の純度と回収率に与える影響は極めて大きいと考えられる。特に血清・血漿成分には低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）などの夾雑蛋白質の占める割合が高く、高純度のＩｇＭ型抗体を得ることはさらに困難を極める。
【０００５】
ＩｇＧ型抗体の精製においてはプロテインＡやプロテインＧ固定化材料の使用が一般的な手法となっているが、これはＩｇＭ型抗体に対しては親和性が低くＩｇＭ型抗体の精製には適当でない。また抗体とプロテインＡまたはプロテインＧとの結合が非常に強固なために、結合した抗体を分離回収するのに約ｐＨ３という強酸性溶液を用いる必要がある。そのため、元来の抗体活性を保持したままの状態で回収してくることが難しいという問題がある。さらにプロテインＡやプロテインＧは抗体の動物種によっては使用できない、そしてプロテインＡやプロテインＧは菌類から産生されるものであるので大量生産が困難であり、抗体を精製する材料としては非常に高価であるという問題もある。加えて材料が菌類由来であるために毒性物質の混入が懸念され安全性の問題も完全に払拭することはできない。
【０００６】
ＩｇＭ型抗体の精製に関しても抗ＩｇＭ抗体を固定化した材料などのアフィニティクロマトグラフィが開発されているが、上記と同様の問題が考えられる。他にも様々な精製方法があるが、それら単独での精製では不十分で複数の精製方法を組み合わせる必要があり、精製には煩雑で長時間の操作が必要とされるという問題もある。そこで簡便で高純度かつ高活性なＩｇＭ型抗体精製方法の開発が望まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は試料中から簡便に高純度かつ高活性のＩｇＭ型抗体を精製する新規な方法、またはＩｇＭ型抗体が認識する抗原の吸着材を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、夾雑成分を含むＩｇＭ型抗体試料中から簡便に高純度かつ高活性なＩｇＭ型抗体を精製する方法について鋭意検討を行った。その結果、ＩｇＭ型抗体含有液に前処理を施し尿酸ナトリウム結晶に高親和性を有するＩｇＭ型抗体以外の物質を除去した後、尿酸ナトリウム結晶と接触させＩｇＭ型抗体を尿酸ナトリウム結晶に選択的に結合させることにより、簡便に高純度かつ高活性なＩｇＭ型抗体を精製しうることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明は効率良く高純度かつ高活性なＩｇＭ型抗体を精製する方法に関する。
【００１０】
本発明における前処理とはＩｇＭ型抗体含有液をカチオン交換能を有する吸着材と接触させることであり、具体的に言えばカチオン交換能を有する吸着材とはデキストラン硫酸などのアニオン性化合物を固定化してなる吸着材である。
【００１１】
また、前処理としてＩｇＭ型抗体含有液をアニオン交換能を有する吸着材と接触させても良く、カチオン交換能を有する吸着材とアニオン交換能を有する吸着材を併用しても良い。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のＩｇＭ型抗体の精製方法は治療薬、診断薬に応用が期待されるＩｇＭ型抗体を効率良く簡便に、回収・精製を行うことを可能にするものであり、さらには回収されたＩｇＭ型抗体は高い活性を保持させることができる。尚且つ、抗体に対して高親和性を有するプロテインＡやプロテインＧというアフィニティクロマトグラフィを用いる必要がなく、安価に分離精製することも可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明における前処理とは、ＩｇＭ型抗体含有液をカチオン交換能を有する吸着材と接触させることによって、尿酸ナトリウム結晶に高親和性を有するＩｇＭ型抗体以外の物質を吸着除去することである。
【００１４】
またカチオン交換能を有する吸着材とはデキストラン硫酸などのアニオン性化合物を固定化してなる吸着材である。
【００１５】
吸着材としては常温常圧で固体の水不溶性担体が好ましい。水不溶性担体には粒状、板状、繊維状、中空糸状等があるが形状は問わず、その大きさもとくに限定されない。例えば、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストリンなどの多糖類からなる有機担体、さらにはこれらの組み合わせによってえられる有機−有機、有機−無機などの複合担体などが代表例としてあげられる。
【００１６】
本発明におけるＩｇＭ型抗体含有液には血液、血漿、血清、腹水、リンパ液、関節内液およびこれらから得たれた分画成分、ならびにその他の生体由来の液体成分、あるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養液の上清などが考えられるが、特にこれらに限定されるものではない。
【００１７】
ＩｇＭ型抗体含有液、例えば、血液を始めとする生体由来の液体成分や細胞培養液にはＬＤＬなどの脂質・蛋白質成分、細胞培養液に由来する成分他、多くの夾雑成分が混在している。その為、高純度のＩｇＭ型抗体を精製分離するのは非常に困難である。本発明による前処理を施すことにより尿酸ナトリウム結晶に高親和性を有するＩｇＭ型抗体以外の物質を吸着除去できるため、ＩｇＭ型抗体を尿酸ナトリウム結晶に選択的に結合させ高純度のＩｇＭ型抗体を得ることが可能である。
【００１８】
具体的な使用法として、例えば以下の操作により夾雑成分を含むＩｇＭ型抗体含有液から高純度そして高活性なＩｇＭ型抗体が精製できるが、本発明は以下の具体例に限定されるものではない。即ち、前処理として、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、Ｌｐ（ａ）に対して高い吸着能を有する吸着型血漿浄化器リポソーバー（株式会社カネカ）をカラムに充填し、ＩｇＭ型抗体含有液をカラムに通液することにより夾雑成分を吸着除去する。その後、ＭｃＣａｒｔｙ（マックカーティー）とＦａｉｒｅｓ（フェアーズ）の方法（Ｃｕｒｒ  Ｔｈｅｒ  Ｒｅｓ  ５巻、２８４頁、１９６３年）に準じて作成した尿酸ナトリウム結晶をカラムに充填し、尿酸ナトリウム結晶に高親和性を有する夾雑成分を除いたＩｇＭ型抗体含有液を通液し、ＩｇＭ型抗体を尿酸ナトリウム結晶に選択的に結合させる。続いて適当な溶液で残存する夾雑成分を洗浄した後に、尿酸ナトリウム結晶に結合したＩｇＭ型抗体を溶出させ、高純度かつ高活性なＩｇＭ型抗体を回収する。
【００１９】
本発明により得られるＩｇＭ型抗体が結合した尿酸ナトリウム結晶は、ＩｇＭ型抗体が認識する抗原を吸着させるアフィニティーカラムに適用することが可能である。
【００２０】
また、本発明の方法により得られるＩｇＭ型抗体は高活性であるため、他の担体に固定化させ、ＩｇＭ型抗体が認識する抗原を吸着させるアフィニティーカラムに適用することが可能である。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例において本発明についてさらに詳細に述べるが、本発明は以下の実施例
のみに限定されるものではない。
【００２２】
（実施例１）
全血清をリポソーバー（株式会社カネカ製）を充填したＬＤＬ除去カラムに通し、ＬＤＬ除去画分と１Ｍ塩化ナトリウム溶液で溶出したＬＤＬ画分を得た。ＬＤＬ除去画分をさらに微顆粒性セルロースの陰イオン交換カラムＤＥ５２（Ｗｈａｔｍａｎ）に通しＩｇＧ画分とＩｇＧ除去画分を得た。またＬＤＬ除去画分にＺｙｍｏｓａｎを加え３７℃で３０分インキュベートして補体消費画分を得た。
【００２３】
全血清または各血清画分をＭｃＣａｒｔｙ  ＆  Ｆａｉｒｅｓの方法で作成した尿酸ナトリウム結晶に加え３７℃で３０分インキュベートし、尿酸ナトリウム飽和生理食塩水で数回洗浄した後、分画分子量６−８０００の限外濾過膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  １）に入れて尿酸ナトリウムが完全に溶解するまで純水透析することで尿酸ナトリウム吸着蛋白質を得た。これらの操作工程を図１に示した。
【００２４】
上述の方法で得た血清および血清画分とそれぞれの尿酸ナトリウム吸着蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＣＢＢ染色したところ図２のような結果となった。全血清およびＬＤＬ除去画分の尿酸ナトリウム吸着蛋白質についてはＣＢＢ染色で濃染したバンドを切り出し、トリプシンでゲル内消化後、ＬＣ−ＭＳで分析を行い、得られたペプチドマップより蛋白質の同定を行い図３の結果を得た。
【００２５】
図２の通り、全血清にはアルブミンが濃く染色されているが（レーン１）、リポソーバーを通すと、分子量５０万のアポ蛋白質Ｂ−１００とそのフラグメントが除かれ（レーン２）、ＬＤＬ除去画分が得られる（レーン３）。その後、陰イオン交換カラムで処理すると、ＩｇＧ画分はＩｇＧのγ鎖と軽鎖が染色され（レーン６）、得られたＩｇＧ除去画分はＩｇＧγ鎖がほぼ消失し、ＩｇＧ軽鎖も薄まっている（レーン５）。補体消費画分もＬＤＬ除去画分と同様の傾向を示す（レーン４）。
【００２６】
ＬＤＬ除去画分、補体消費画分、ＩｇＧ除去画分の尿酸ナトリウム結晶吸着蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果はそれぞれレーン９、レーン１０、レーン１１となり、７０ｋＤａ付近と２５ｋＤａ付近に濃染するバンドが見られた。
【００２７】
図３より全血清の尿酸ナトリウム結晶吸着蛋白質の３つの濃染するバンドはすべてアポリポ蛋白質Ｂ−１００「のフラグメント」であり、ＬＤＬ除去画分の尿酸ナトリウム吸着蛋白質については６８ｋＤａのバンドはイムノグロブリンμ鎖、２５ｋＤａのバンドはイムノグロブリン軽鎖であった。
【００２８】
以上の結果よりヒト血清からリポソーバーゲルでＬＤＬを除去する前処理を行った後に尿酸ナトリウム結晶を使用することで、ＩｇＭ型抗体を選択的に回収することが可能である。
【００２９】
（実施例２）
マウスモノクローナル抗体を以下のようにして作成した。ヒト尿細管分泌尿蛋白質に対するＩｇＭ型（ＵＰ５０９、ＵＰ５９９）およびＩｇＧ１型マウスモノクローナル抗体（ＵＰ７２０）を産生するハイブリドーマ（日本泌尿器科学会雑誌．８７巻、１１２０頁、１９９６年）を、牛胎児血清を１０％含む培養液（ＲＰＭＩ１６４０）で培養し上清を採取した。
【００３０】
リポソーバーゲルをカラムに充填し、Ｍｇ濃度１ｍＭになるように硫酸マグネシウム注射液（日本薬局方）を添加した生理食塩水でプライミングを行った。上述のハイブリドーマ培養上清に塩酸を加えてｐＨ７に調製した後、リポソーバーゲルカラムに通し前処理を行った。
【００３１】
実施例１と同様の方法で作成した尿酸ナトリウム結晶を尿酸ナトリウム飽和生理食塩水で数回洗浄した後、繊維セルロースＣＦ１（Ｗｈａｔｍａｎ）と混和してカラムに充填し、尿酸ナトリウム飽和生理食塩水でプライミングを行った。
【００３２】
リポソーバーゲルカラムを通した培養上清を尿酸ナトリウム結晶カラムに通した後、１Ｍ  ＮａＣｌで洗浄した。０．５Ｍ  ＫＨ2ＰＯ4溶液（ｐＨ４．４）でＩｇＭ型抗体を溶出させ、ＮａＯＨ溶液でｐＨ７に調整し、ＩｇＭ型抗体を得た。
【００３３】
上述の方法で得たＩｇＭ型抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。結果を図４、図５に示す。
【００３４】
図４、つまり、マウスモノクローナルＩｇＭ型抗体（ＵＰ５０９）の培養上清ならびに培養上清を通したリポソーバーゲルカラムおよび尿酸ナトリウム結晶カラムから溶出した蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果より、尿酸ナトリウムに吸着した蛋白質はＩｇＭのμ鎖と軽鎖であった。図５より、マウスの抗体においてもＩｇＭ型抗体であるＵＰ５０９とＵＰ５９９は尿酸ナトリウム結晶に結合したが、ＩｇＧ型抗体であるＵＰ７２０は吸着しなかった。
【００３５】
（実施例３）
ＩｇＭ型抗体を産生する３種類のハイブリドーマ（ＵＰ７０、ＵＰ５０９、ＵＰ５９９）をＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に注射して貯留した腹水を採取した。
【００３６】
リポソーバーゲルをカラムに充填し、Ｍｇ濃度１ｍＭになるように硫酸マグネシウム注射液（日本薬局方）を添加した生理食塩水でプライミングを行った。上述の腹水をリポソーバーゲルカラムに通し前処理を行った。
【００３７】
実施例１と同様の方法で作成した尿酸ナトリウム結晶を尿酸ナトリウム飽和生理食塩水で数回洗浄した後、繊維セルロース（ＣＦ１：Ｗｈａｔｍａｎ）と混和してカラムに充填し、尿酸ナトリウム飽和生理食塩水でプライミングを行った。
【００３８】
リポソーバーゲルカラムを通した腹水を尿酸ナトリウム結晶カラムに通した後、１Ｍ  ＮａＣｌで洗浄した。
【００３９】
腐食剤としてアジ化ナトリウム存在下に蓄尿し、Ｎｏ．１濾紙、次いで５μｍ、さらに０．２２μｍのフィルターで濾過した。濾過尿を分画分子量３万の限外濾過膜を用いて濃縮した。ＩｇＭ型抗体を吸着させた尿酸ナトリウム結晶に尿蛋白濃縮液を通し、１Ｍ  ＮａＣｌ溶液で十分洗浄した後、０．５Ｍ  ＫＨ2ＰＯ4溶液（ｐＨ４．４）でＩｇＭ型抗体と抗原を溶出し、ＩｇＭ型抗体と抗原の混合試料を得た。
【００４０】
上述の方法で得たＩｇＭ型抗体と抗原の混合試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。結果を図６に示す。さらにイムノブロット法により抗原の吸着を確認した結果も図６に示す。
【００４１】
図６の左図は尿蛋白と尿酸ナトリウム結晶カラムから溶出したＩｇＭ型抗体および抗原のＣＢＢ染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。図６の右図はそのイムノブロットで、ＵＰ７０、ＵＰ５０９は分子量３万以下の同じ抗原を認識するＩｇＭ型抗体であり、ＵＰ５９９は分子量１００万以上の抗原を認識するＩｇＭ型抗体であり、精製したＩｇＭ型抗体は高い抗原吸着活性を有していることが明らかになった。
【００４２】
また、リポソーバーで前処理したＩｇＭ型抗体含有液を通した尿酸ナトリウム結晶カラムは、アフィニティーカラムとして、ＩｇＭ型抗体が認識する抗原を吸着できることが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】操作工程の概念図
【図２】実施例１におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図３】実施例１における尿酸ナトリウム吸着蛋白質のＬＣ−ＭＳの結果を示す図である。
【図４】実施例２におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図５】実施例２におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図６】実施例３におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びそのイムノブロットの結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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