(57)【要約】      （修正有）【課題】ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）を検出することができ、従来用いられているプライマとは異なるプライマを提供する。【解決手段】ＰＣＲ法によりＨＣＶのＲＮＡを検出するための第一プライマ及び第二プライマを含む核酸増幅用プライマセットを提供する。上記ＰＣＲ法プライマーセットの一方を使用してＨＣＶの本体であるテンプレート（＋）鎖から逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成する。そのｃＤＮＡをテンプレートとしてて上記プライマーセットを使用してＬＡＭＰ法ＰＣＲ増幅を行ない、ＨＣＶ検出を行なう。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣＲ法によりＨＣＶのＲＮＡを検出するための第一プライマ及び第二プライマを含むプライマセットであって、
前記第一プライマが、以下の（ａ）及び（ｂ）の何れかであり：
（ａ）配列番号６記載のポリヌクレオチド；
（ｂ）前記（ａ）記載のポリヌクレオチドにおいて少なくとも一つのヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、ＰＣＲ反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド；
前記第二プライマが、以下の（ｃ）及び（ｄ）の何れかである核酸増幅用プライマセット：
（ｃ）配列番号２０記載のポリヌクレオチド；
（ｄ）前記（ｃ）記載のポリヌクレオチドにおいて１個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド。
【請求項２】
ＨＣＶのＲＮＡを検出するための核酸増幅用プライマであって、
前記ＲＮＡの一部の配列Ｙにハイブリダイズ可能な第一配列を３’末端側に有し、
前記ＲＮＡの一部の配列であり、前記配列Ｙよりも下流に位置する配列Ｚにハイブリダイズ可能な第二配列を５’末端側に有するプライマ。
【請求項３】
前記プライマが、以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される、請求項２記載のプライマ：
（ａ）配列番号２４〜２７の何れかに記載のポリヌクレオチド；
（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドにおいて一個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド。
【請求項４】
ＨＣＶのＲＮＡを検出するための核酸増幅用プライマセットであって、
前記ＲＮＡの一部の配列Ｃの相補鎖にハイブリダイズ可能な第一プライマと、
前記ＲＮＡの一部の配列であり、前記配列Ｃよりも下流に位置する配列Ｂの相補鎖にハイブリダイズ可能な第一配列を３’末端側に有し、
前記ＲＮＡの一部の配列であり、前記配列Ｂよりも下流に位置する配列Ａにハイブリダイズ可能な第二配列を５’末端側に有する第二プライマと、
前記ＲＮＡの一部の配列であり、前記配列Ａよりも下流に位置する配列Ｙにハイブリダイズ可能な第三配列を３’末端側に有し、
前記ＲＮＡの一部の配列であり、前記配列Ａと前記配列Ｙとの間に位置する配列Ｘの相補鎖にハイブリダイズ可能な第四配列を５’末端側に有する第三プライマと、
前記ＲＮＡの一部の配列であり、前記配列Ｙよりも下流に位置する配列Ｚにハイブリダイズ可能な第四プライマと、
を有するプライマセット。
【請求項５】
前記配列Ａと前記配列Ｂとの間に位置する配列Ｓにハイブリダイズ可能な第五プライマと、
前記配列Ｘと前記配列Ｙとの間に位置する配列Ｔの相補鎖にハイブリダイズ可能な第六プライマと、
をさらに含む、請求項４記載のプライマセット。
【請求項６】
前記第一プライマ〜第四プライマがＨＣＶのＲＮＡの５’ＵＴＲ領域又はコアタンパク質をコードする領域にハイブリダイズ可能な請求項４又は５記載のプライマセット。
【請求項７】
前記第一プライマが、以下の（ａ）及び（ｂ）の何れかであり：
（ａ）配列番号６記載のポリヌクレオチド；
（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドにおいて一個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド；
前記第二プライマが、以下の（ｃ）及び（ｄ）の何れかであり：
（ｃ）配列番号２４記載のポリヌクレオチド；
（ｄ）前記（ｃ）のポリヌクレオチドにおいて一個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド；
前記第三プライマが、以下の（ｅ）及び（ｆ）の何れかであり：
（ｅ）配列番号２５記載のポリヌクレオチド；
（ｆ）前記（ｅ）のポリヌクレオチドにおいて一個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド；
前記第四プライマが、以下の（ｇ）及び（ｈ）の何れかである請求項４〜６の何れかに記載のプライマセット：
（ｇ）配列番号２０〜２２の何れかに記載のポリヌクレオチド；
（ｈ）前記（ｇ）のポリヌクレオチドにおいて一個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記第五プライマが、以下の（ｉ）及び（ｊ）の何れかであり：
（ｉ）配列番号１４記載のポリヌクレオチド；
（ｊ）前記（ｉ）のポリヌクレオチドにおいて一個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド；
前記第六プライマが、以下の（ｋ）及び（ｌ）の何れかである請求項５記載のプライマセット：
（ｋ）配列番号１２記載のポリヌクレオチド；
（ｌ）前記（ｋ）のポリヌクレオチドにおいて一個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記第一プライマが、以下の（ａ）及び（ｂ）の何れかであり：
（ａ）配列番号７記載のポリヌクレオチド；
（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドにおいて一個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド；
前記第二プライマが、以下の（ｃ）及び（ｄ）の何れかであり：
（ｃ）配列番号２６記載のポリヌクレオチド；
（ｄ）前記（ｃ）のポリヌクレオチドにおいて一個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド；
前記第三プライマが、以下の（ｅ）及び（ｆ）の何れかであり：
（ｅ）配列番号２７記載のポリヌクレオチド；
（ｆ）前記（ｅ）のポリヌクレオチドにおいて一個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド；
前記第四プライマが、以下の（ｇ）及び（ｈ）の何れかである請求項４〜６の何れかに記載のプライマセット：
（ｇ）配列番号２３に記載のポリヌクレオチド；
（ｈ）前記（ｇ）のポリヌクレオチドにおいて一個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記第五プライマが、以下の（ｉ）及び（ｊ）の何れかであり：
（ｉ）配列番号１５記載のポリヌクレオチド；
（ｊ）前記（ｉ）のポリヌクレオチドにおいて一個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド；
前記第六プライマが、以下の（ｋ）及び（ｌ）の何れかである請求項５記載のプライマセット：
（ｋ）配列番号１３記載のポリヌクレオチド；
（ｌ）前記（ｋ）のポリヌクレオチドにおいて一個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項４〜１０の何れかに記載のプライマセットと、逆転写活性を有する酵素と、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼと、ｄＮＴＰｓと、を含む試薬キット。
【請求項１２】
生体から採取された試料中のＨＣＶを検出する方法であって、
前記試料に請求項４〜１０の何れかに記載のプライマセットと、逆転写活性を有する酵素と、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼと、ｄＮＴＰｓとを添加し、試料に含まれるＨＣＶのＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを増幅する工程と、
前記増幅されたｃＤＮＡを検出する工程と、
を含むＨＣＶ検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＲＮＡを検出するための核酸増幅用プライマ（以下、単にプライマともいう）及びプライマセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＣＶは、ゲノムとして約９５００ｂの一本鎖（＋鎖）ＲＮＡを有するフラビウイルス科の粒子状ウイルスである。ＨＣＶゲノムはコアタンパク質に包含され、このコアタンパク質はエンベロープタンパク質に包含される。ＨＣＶに感染すると、８０〜９０％の高率で持続感染化し、慢性肝炎から肝硬変、さらには肝癌へ進行することがある。
【０００３】
近年、生体から採取した試料中のＨＣＶを検出するため、ＨＣＶゲノムの特定の領域を増幅することが可能なＰＣＲ用プライマが開発された（例えば、特許文献１）。このプライマを用いると、ＰＣＲ法によってＨＣＶゲノムの特定の領域を増幅し、ＨＣＶを検出することができる。
【０００４】
【特許文献１】特開平６−１４８００号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、ＨＣＶを検出することができ、従来用いられているプライマとは異なるプライマを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ＰＣＲ法によりＨＣＶのＲＮＡを検出するための第一プライマ及び第二プライマを含む核酸増幅用プライマセットを提供する。第一プライマは、配列番号６記載のポリヌクレオチドと、配列番号６記載のポリヌクレオチドにおいて少なくとも一つのヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、ＰＣＲ反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチドとからなる群より選択される。第二プライマは、配列番号２０記載のポリヌクレオチドと、配列番号２０記載のポリヌクレオチドにおいて１個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチドとからなる群より選択される。
【０００７】
また、本発明は、ＨＣＶのＲＮＡを検出するための核酸増幅用プライマを提供する。このプライマは、ＲＮＡの一部の配列Ｙにハイブリダイズ可能な第一配列を３’末端側に有し、前記ＲＮＡの一部の配列であり、前記配列Ｙよりも下流に位置する配列Ｚにハイブリダイズ可能な第二配列を５’末端側に有する。
【０００８】
また、本発明は、ＨＣＶのＲＮＡを検出するための第一プライマ〜第四プライマを含む核酸増幅用プライマセットを提供する。このプライマセットにおける第一プライマは、ＨＣＶのＲＮＡの一部の配列Ｃの相補鎖にハイブリダイズ可能である。第二プライマはＨＣＶのＲＮＡの一部の配列であり、配列Ｃよりも下流に位置する配列Ｂの相補鎖にハイブリダイズ可能な第一配列を３’末端側に有し、このＲＮＡの一部の配列であり、配列Ｂよりも下流に位置する配列Ａにハイブリダイズ可能な第二配列を５’末端側に有する。第三プライマは、ＨＣＶのＲＮＡの一部の配列であり、配列Ａよりも下流に位置する配列Ｙにハイブリダイズ可能な第三配列を３’末端側に有し、このＲＮＡの一部の配列であり、配列Ａと配列Ｙとの間に位置する配列Ｘの相補鎖にハイブリダイズ可能な第四配列を５’末端側に有する。第四プライマは、ＲＮＡの一部の配列であり、配列Ｙよりも下流に位置する配列Ｚにハイブリダイズ可能である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ＨＣＶを検出することができ、従来用いられているプライマとは異なるプライマを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
ＨＣＶのゲノムは約９５００ｂのＲＮＡからなり、このＲＮＡゲノムの約９０００ｂが約３０００アミノ酸残基からなる巨大なポリプロテインをコードする一つのＯＲＦ(Open Reading frame)となっている。ＯＲＦには、上流から順に、コアタンパク質をコードする領域、エンベロープタンパク質をコードする領域及び非構造タンパク質をコードする領域が存在する。５’末端には約３４０ｂからなる５’ＵＴＲが位置し、３’末端には約１７０〜２５０ｂからなる３’ＵＴＲが位置している。
【００１１】
ＨＣＶはゲノムのヌクレオチド配列の違いから複数の遺伝子型（genotype1, genotype2など）に分類される。それぞれのgenotype内をさらに詳細に検討すると各グループはそれぞれ二つ以上のサブタイプに分類される。サブタイプ名はタイプ名の後に小文字のアルファベットを付して表記される（genotype1a, genotype1b, genotype2a, genotype2bなど）。本邦においては、ＨＣＶ感染者全体のうち約６〜７割がgenotype1の感染者であり、約３〜４割がgenotype2の感染者であると考えられている。配列番号１〜５はＨＣＶゲノムの５’ＵＴＲ及びコアタンパク質をコードする領域の一部を示している。配列番号１はgenotype1aの配列、配列番号２はgenotype1bの配列、配列番号３はgenotype2aの配列、配列番号４はgenotype2bの配列、配列番号５にはgenotype3aの配列を示す。
【００１２】
ＨＣＶのＲＮＡを検出するためには、以下に説明するプライマが用いられる。ここで、「プライマ」とは、ＰＣＲ法（Saiki et al, 1988, Science, 239: 487-491）やＬＡＭＰ法（国際公開ＷＯ  ００／２８０８２号）などの核酸増幅法において、ＨＣＶのＲＮＡの特定の領域にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる増幅反応の起点となることのできる機能（以下、プライマ機能とする）を有するポリヌクレオチドのことである。「ハイブリダイズ」とは、ストリンジェントな条件下で塩基の相補性に基づいて二種類の一本鎖ポリヌクレオチドが水素結合によって二本鎖ポリヌクレオチドを形成することをいう。「ストリンジェントな条件」とは、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行う際に当業者が一般的に用いる条件であって、本実施形態のプライマがＨＣＶのＲＮＡ又はそのｃＤＮＡにハイブリダイズすることができる条件であれば特に限定されない。ハイブリダイゼーション時のストリンジェンシーは、温度、塩濃度、プライマの鎖長、プライマのヌクレオチド配列のＧＣ含量及びハイブリダイゼーション緩衝液中のカオトロピック剤の濃度の関数であることが知られている。ストリンジェントな条件としては、例えば、Sambrook, J. et al. (1998) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載された条件などを用いることができる。具体的には、「５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．６、５×デンハーツ溶液、１０％デキストラン硫酸、及び２０μｇ／ｍｌのＤＮＡを含む溶液中、ハイブリダイゼーション温度４２℃」を例示することができるが、これに限定されない。
【００１３】
本実施形態のプライマと、このプライマがハイブリダイズする領域のヌクレオチド配列とは、完全に相補的である必要はなく、ハイブリダイズできる程度の相補性を有していればよい。即ち、プライマ機能を有するポリヌクレオチドであれば、このプライマは、ハイブリダイズする領域と完全な相補性を有するヌクレオチド配列に置換、欠失、挿入、付加などのような変異を導入したヌクレオチド配列であってもよい。
【００１４】
このプライマは、複数のgenotypeのＨＣＶゲノムにハイブリダイズすることが好ましい。このようなプライマを用いた場合、複数のgenotypeのＨＣＶゲノムを１種類のプライマで検出することが可能である。特に、genotype1及びgenotype2のＨＣＶゲノムにハイブリダイズできることが好ましく、genotype1, genotype2及びgenotype3のＨＣＶゲノムにハイブリダイズできることがより好ましい。
【００１５】
本実施形態ではテンプレートがＲＮＡであるため、核酸増幅の方法としてはＲＴ−ＰＣＲ法やＲＴ−ＬＡＭＰ法などが用いられる。
【００１６】
「検出」とは、試料中の標的とする物質の存否を判定することだけでなく、定量することをも含む。
【００１７】
＜ＲＴ−ＰＣＲを用いる場合＞
ＲＴ−ＰＣＲ法とは、テンプレートであるＲＮＡを鋳型として逆転写反応（ＲＴ反応）を行い、ＲＴ反応によって生成したｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅する方法である。
【００１８】
ＨＣＶを検出するためにＲＴ−ＰＣＲ法を用いる場合、好ましくはヌクレオチドを５個以上有するポリヌクレオチド、より好ましくはヌクレオチドを１０個以上有するポリヌクレオチドをプライマとして用いることができる。このプライマはＨＣＶのＲＮＡにハイブリダイズ可能であり、逆転写反応の基点となることができ、さらにＰＣＲ反応による増幅の基点となることもできる。このプライマ（プライマＲ）に加えて、ＨＣＶゲノムのｃＤＮＡにハイブリダイズ可能なもう一種のプライマ（プライマＦ）をさらに用いることが好ましい。プライマＦ及びプライマＲは、ＨＣＶゲノムの５’ＵＴＲ領域又はコアタンパク質をコードする領域にハイブリダイズすることが好ましい。
【００１９】
本明細書では、上記のように核酸増幅において用いられるプライマが複数である場合はこの複数のプライマの組み合わせを「プライマセット」と呼ぶ。
【００２０】
なお、ｃＤＮＡのヌクレオチド配列において、プライマＦがハイブリダイズするｃＤＮＡの領域は、プライマＲがハイブリダイズするゲノム領域に対応するｃＤＮＡの領域よりも上流に位置することが好ましい。これにより、ＰＣＲ反応において、領域Ｆと領域Ｒとに挟まれたｃＤＮＡの領域が増幅される。
【００２１】
プライマＦ及びプライマＲとしては、例えば、以下のような配列を有するプライマを用いることができる。
（プライマＦ）
5'atcactcccctgtgagg3' （配列番号６）
5'accgctagccgagtag3' （配列番号７）
5'ctactgtcttcacgcagaaag3' （配列番号８）
5'gttgggttgcgaaaggcc3' （配列番号９）
5'ctcccgggagagccatag3' （配列番号１０）
5'gtagaccgtgcaacatgagcac3'（配列番号１１）
5'tggtctgcggaaccgg3' （配列番号１２）
5'cctaaacctcaaagaaaaaccaaa3' （配列番号１３）
（プライマＲ）
5'atactaacgccatggctag3' （配列番号１４）
5'cctatcaggcagtaccac3' （配列番号１５）
5'ggggtcctggaggctg3' （配列番号１６）
5'ccggggcactcgcaag3' （配列番号１７）
5'ggcaattccggtgtactc3' （配列番号１８）
5'ctattgggcgacggtttgtgtt3' （配列番号１９）
5'tccaagaaaggacccggtc3' （配列番号２０）
5'gggtttatccaagaaaggac3'（配列番号２１）
5'gtttatccaagaaaggaccc3' （配列番号２２）
5'cgcccgggaacttgacg3' （配列番号２３）
【００２２】
上記の配列からプライマＦ及び／又はプライマＲを選択し、ＲＴ−ＰＣＲ法によるｃＤＮＡの増幅に用いることができる。なお、上記の配列で示される配列は、ＰＣＲ法の増幅反応においてプライマ機能を有していれば、配列中に一個又は複数個の変異を有していてもよい。変異の割合は、元のプライマの配列に対して好ましくは５０％以下であり、より好ましくは４０％以下である。なお、変異とは、配列を構成するヌクレオチドの置換、欠失、挿入、付加などを指す。
【００２３】
上記のプライマは配列番号１〜５（genotype1a, 1b, 2a, 2b及び3aのＨＣＶゲノム配列）に記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズし、核酸増幅のプライマとして機能することができる。
【００２４】
＜ＲＴ−ＬＡＭＰ法を用いる場合＞
ＲＴ−ＬＡＭＰ法とは、テンプレートであるＲＮＡを鋳型としてＲＴ反応を行い、ＲＴ反応によって生成したｃＤＮＡをＬＡＭＰ法によって増幅する方法である。
【００２５】
ＨＣＶゲノムを検出するためにＲＴ−ＬＡＭＰ法を用いる場合、ＨＣＶゲノムの一部の配列Ｆ２の相補配列Ｆ２ｃにハイブリダイズ可能な第一配列を３’末端側に有し、配列Ｆ２よりも下流に位置する配列Ｆ１にハイブリダイズ可能な第二配列を５’末端側に有するポリヌクレオチドをプライマとして用いることができる。また、ＨＣＶゲノムの一部の配列Ｒ２ｃにハイブリダイズ可能な第三配列を３’末端側に有し、配列Ｒ２ｃよりも上流に位置する配列Ｒ１ｃの相補配列Ｒ１にハイブリダイズ可能な第四配列を５’末端側に有するポリヌクレオチドをプライマとして用いてもよい。
【００２６】
第一配列と第二配列とは直接連結されていてもよいし、介在配列を介して連結されていてもよい。第三配列と第四配列とは直接連結されていてもよいし、介在配列を介して連結されていてもよい。介在配列としては、ＨＣＶゲノムに由来しない配列であることが好ましい。例えば、5'tttt3'などを挙げることができる。介在配列が存在する場合、その長さは１〜５０ヌクレオチドであることが好ましく、１〜４０ヌクレオチドであることがより好ましい。このプライマはＬＡＭＰ法による増幅反応においてインナープライマとして機能することができる。
【００２７】
ＬＡＭＰ法によってＨＣＶゲノムのｃＤＮＡを増幅するためには、二種類のインナープライマとＦ３プライマとを含むプライマセットが用いられる。以下、図１に基づいてこのプライマセットについて説明する。図１は、プライマがハイブリダイズする核酸領域を示した模式図である。なお、図１中、Ｆ１とＦ１ｃ、Ｆ２とＦ２ｃ、Ｆ３とＦ３ｃ、Ｒ１とＲ１ｃ、Ｒ２とＲ２ｃ、Ｒ３とＲ３ｃ、ＬとＬｃ、及びＭとＭｃはそれぞれ相補的である。
【００２８】
Ｆ３プライマは、ＨＣＶゲノムから逆転写反応によって合成されたｃＤＮＡの一部の配列Ｆ３ｃにハイブリダイズ可能である。
フォワードインナープライマ（以下、ＦＩＰとする）は、配列Ｆ３ｃよりも下流に位置する配列Ｆ２ｃにハイブリダイズ可能な第一配列を３’末端側に有し、配列Ｆ２よりも下流に位置する配列Ｆ１にハイブリダイズ可能な第二配列を５’末端側に有する。
リバースインナープライマ（以下、ＲＩＰとする）は、ＨＣＶゲノムの一部の配列Ｒ２ｃにハイブリダイズ可能な第三配列を３’末端側に有し、配列Ｒ２ｃよりも上流に位置する配列Ｒ１ｃの相補鎖Ｒ１にハイブリダイズ可能な第四配列を５’末端側に有する。
【００２９】
前記したように、ＦＩＰは第一配列と第二配列との間に介在配列を有していてもよく、ＲＩＰは第三配列と第四配列との間に介在配列を有していてもよい。
【００３０】
上記プライマに加えて配列Ｒ２ｃよりも下流に位置する配列Ｒ３ｃにハイブリダイズ可能なＲ３プライマをさらに用いることもできる。
【００３１】
上述のプライマセットは、複数のgenotypeのＨＣＶゲノムにハイブリダイズすることが好ましい。このようなプライマセットを用いた場合、複数のgenotypeのＨＣＶゲノムを１種類のプライマセットで検出することが可能である。特に、genotype1及びgenotype2のＨＣＶゲノムにハイブリダイズできることが好ましく、genotype1, genotype2及びgenotype3のＨＣＶゲノムにハイブリダイズできることがより好ましい。
【００３２】
上記プライマに加えてループプライマをさらに用いることにより核酸増幅を迅速に行うことができる。ループプライマにはループプライマＦとループプライマＲがあり、ループプライマＦは配列Ｆ１と配列Ｆ２との間に位置する配列Ｌにハイブリダイズ可能であり、ループプライマＲは配列Ｒ１と配列Ｒ２との間に位置する配列Ｍの相補鎖にハイブリダイズ可能である。ＬＡＭＰ法による増幅反応において、これらのうち片方のループプライマを用いてもよいし、両方を用いてもよい。
【００３３】
これらのプライマの鎖長としては、プライマ機能を有する長さであれば特に限定されない。核酸合成反応を触媒する公知のポリメラーゼが認識するプライマの鎖長は５ヌクレオチド前後であることから、プライマの鎖長は、好ましくは５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは１０〜５０ヌクレオチドである。
【００３４】
ＨＣＶゲノムにおけるＦ１，Ｆ２，Ｆ３，Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｌ及びＭの各領域は、５’ＵＴＲ又はコアタンパク質をコードする領域の配列から連続する５つ以上のヌクレオチドを選択して設定される。これらの領域の例として、配列番号１に示される配列の下記の領域が挙げられる。
【００３５】
（Ｆ１の領域）
配列番号１の１０８〜１２３番目の領域
（Ｆ２の領域）
配列番号１の５５〜７５番目の領域
（Ｆ３の領域）
配列番号１の３６〜５２番目の領域
（Ｒ１の領域）
配列番号１の１２６〜１４３番目の領域
（Ｒ２の領域）
配列番号１の１６１〜１７８番目の領域
（Ｒ３の領域）
配列番号１の１８４〜２０４番目の領域
配列番号１の１８８〜２０９番目の領域
配列番号１の１９９〜２１１番目の領域
（Ｌの領域）
配列番号１の７９〜９７番目の領域
（Ｍの領域）
配列番号１の１４４〜１５９番目の領域
【００３６】
上記のＦ１，Ｆ２，Ｆ３，Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｌ及びＭの各領域に基づき、プライマを設計することができる。Ｆ３プライマ、ＦＩＰ、Ｒ３プライマ、ＲＩＰ、ループプライマＦ及びループプライマＲとして、以下のような配列を有するプライマが例示される。
【００３７】
（Ｆ３プライマ）
5'atcactcccctgtgagg3'  （配列番号６）
5'accgctagccgagtag3'  （配列番号７）
（ＦＩＰ）
5'ggggtcctggaggctgttttctactgtcttcacgcagaaag3'  （配列番号２４）
5'ccggggcactcgcaagttttgttgggttgcgaaaggcc3'  （配列番号２６）
（ＲＩＰ）
5'ctcccgggagagccatagttttcggcaattccggtgtactc3'  （配列番号２５）
5'gtagaccgtgcaacatgagcacttttctattggcgacggtttgtgtt3'  （配列番号２７）
（Ｒ３プライマ）
5'tccaagaaaggacccggtc3'  （配列番号２０）
5'gggtttatccaagaaaggac3'  （配列番号２１）
5'gtttatccaagaaaggaccc3'  （配列番号２２）
5'cgcccgggaacttgacg3'  （配列番号２３）
（ループプライマＦ）
5'atactaacgccatggctag3'  （配列番号１４）
5'cctatcaggcagtaccac3'  （配列番号１５）
（ループプライマＲ）
5'tggtctgcggaaccgg3'  （配列番号１２）
5'cctaaacctcaaagaaaaaccaaa3'  （配列番号１３）
【００３８】
上記の配列からプライマを選択し、ＲＴ−ＬＡＭＰ法によるｃＤＮＡの増幅に用いることができる。なお、上記の配列で示される配列は、ＰＣＲ法の増幅反応においてプライマ機能を有していれば、配列中に一個又は複数個の変異を有していてもよい。変異の割合は、元のプライマの配列に対して好ましくは５０％以下であり、より好ましくは４０％以下である。なお、変異とは、配列を構成するヌクレオチドの置換、欠失、挿入、付加などを指す。
【００３９】
下記表１に示すように各プライマを選択し、プライマセットとして用いることにより、ＨＣＶゲノムのｃＤＮＡを増幅することができる。なお、表中各プライマの列の数字は配列番号を示す。
【００４０】
なお、上記の各領域は配列番号１（genotype1aのＨＣＶゲノム配列）における領域であるが、配列番号２〜５（他のgenotypeのＨＣＶゲノム配列）においても対応する領域が存在するため、上記各プライマは配列番号１だけでなく、配列番号２〜５のヌクレオチド配列にもハイブリダイズし、核酸増幅のプライマとして機能することができる。
【００４１】
【表１】
2007117049.tif 000002
【００４２】
ＲＴ−ＬＡＭＰ法を用いる場合、上記のプライマセットに加えて、逆転写活性を有する酵素、ｄＮＴＰｓ及び鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを含む試薬キットを用いてＨＣＶを検出することができる。この試薬キットは、さらに酵素反応に好適な条件を与える緩衝剤が含まれていることが好ましい。ｄＮＴＰｓとは、四種類のデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）を指す。これらの物質はそれぞれ別の容器に収容することができるが、逆転写活性を有する酵素及びＤＮＡポリメラーゼを同一の容器に収容してもよい。また、ｄＮＴＰｓ、緩衝剤、及び各種プライマのうち少なくとも二種を同一の容器に収容してもよい。
【００４３】
＜ＨＣＶの検出＞
ＲＴ−ＬＡＭＰ法を用いたＨＣＶの検出は、増幅工程及び検出工程を経て行われる。先ず、生体から採取した試料に、上述のプライマセット、逆転写活性を有する酵素、ｄＮＴＰｓ及び鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを添加する。これらの混合液を加温してＲＴ反応を行い、ＨＣＶゲノムからｃＤＮＡを生成する。次にＬＡＭＰ反応を行い、ｃＤＮＡを増幅する。
【００４４】
このようにして増幅された核酸はｄｓＤＮＡ(double strand DNA)であるため、この増幅産物をエチジウムブロマイド、SYBR GREEN I、Pico Greenなどのような蛍光インターカレーターで蛍光染色し、紫外線を照射することによって蛍光を検出することができる。蛍光染色は、増幅反応後の反応液に蛍光色素を添加することによって行ってもよいが、予め反応液に蛍光色素を添加し、蛍光色素の存在下で核酸増幅を行ってもよい。蛍光色素の存在下で核酸増幅を行うことにより増幅産物の増加に伴って蛍光強度の増大を観察することができる。これをリアルタイムでモニターすれば、閉鎖系でＤＮＡの増幅と蛍光の増加が同時に追跡可能である。増幅産物の蛍光が検出されるか否かで試料中にＨＣＶが存在しているか否かを判定することができる。また、増幅産物の蛍光強度を測定することによって増幅産物の定量を行うことができ、増幅産物の定量結果に基づいて試料に含まれるＨＣＶを定量することも可能である。蛍光強度の増大をリアルタイムに測定している場合は、一定の蛍光強度に達するまでの時間を測定し、この時間を試料中のＨＣＶの量に換算することもできる。
【００４５】
また、ＬＡＭＰ法では、増幅反応において副産物として不溶性のピロリン酸マグネシウムが生成する。ピロリン酸マグネシウムは核酸増幅が進むにつれて増加し、この増加に伴って反応液が白濁する。そこで、反応液の濁りを目視により確認する、或いは反応液の吸光度や散乱光強度を測定して濁度を測定する、又は反応液を有色のフィルターで濾過し、フィルター上の残渣を確認することにより標的核酸を検出することができる（国際公開ＷＯ  ０１／８３８１７号）。反応液の吸光度や散乱光強度を測定して濁度測定を行う場合、前記蛍光色素を用いた場合と同様に、濁度変化をリアルタイムでモニターすることによって閉鎖系でＤＮＡの増幅と濁度の増加が追跡可能である。反応液が白濁するか否かで、試料中にＨＣＶが存在しているか否かを判定することができる。また、増幅産物の濁度を測定することによって増幅産物の定量を行うことができ、増幅産物の定量結果に基づいて試料に含まれるＨＣＶを定量することも可能である。濁度の増大をリアルタイムに測定している場合は、一定の濁度に達するまでの時間（以下、増幅立ち上がり時間とする）を測定し、この時間を試料中のＨＣＶの量に換算することもできる。
【００４６】
ＨＣＶ検出に用いられる試料は生体から採取される。試料としては、血液、精液、骨髄液、唾液、喀痰などを用いることができる。
【００４７】
（実施例１）
ＲＴ−ＰＣＲ用のプライマセットがＨＣＶゲノムを検出できるか否かを確認した。
【００４８】
（i）テンプレートＲＮＡの調製
テンプレートＲＮＡとして、genotype 1a, 1b, 2a/2c, 2b及び3aのArmored RNA-Hepatitis C Virus (Ambion社)をそれぞれ７５℃で３分間熱処理したものを用意した。また、ネガティブコントロール（ＮＣ）用のテンプレートＲＮＡとして、Yeast RNA(Ambion社, Catalog#:7120G)を用意した。
【００４９】
（ii）プライマセット
配列番号６に示すプライマ(ＨＣ−Ｆ３)と、配列番号２０に示すプライマ（ＨＣ−Ｂ３−１）とをプライマセットとして用いた。
【００５０】
（iii）ＲＴ反応
以下に示す物質とNuclease-free waterとを混合し、ＲＴ反応液を調製した。
5 x AMV Buffer  5.0μＬ
10mM dNTPs (Invitrogen)  2.5μＬ
40U/uL RNasin Ribonuclease Inhibitor   1.0μＬ
10uM HC-B3-1プライマ 1.0μＬ
10U/uL AMV Reverse Transcriptase (Promega)    0.5μＬ
Heat-treated Armored RNA (Ambion)  2.0μＬ
さらに、ＲＴ反応液が２５μＬとなるようにNuclease-free waterでメスアップした。
【００５１】
このＲＴ反応液を４２℃３０分、９５℃３分加温し、ＲＴ反応を行ってｃＤＮＡを生成させた。
【００５２】
（iii）ＰＣＲ反応
以下に示す物質とＲＴ反応後のＰＣＲ反応液２μＬとNuclease-free waterとを混合し、ＰＣＲ反応液を調製した。
10 x Ex Taq Buffer (Takara Bio)  5.0μＬ
2.5mM dNTPs (Takara Bio)  4.0μＬ
10μM HC-F3プライマ 2.5μＬ
10μM HC-B3-1プライマ  2.5μＬ
Ex Taq polymerase (Takara Bio)  0.25μＬ
さらに、このＰＣＲ反応液が５０μＬとなるようにNuclease-free waterでメスアップした。
【００５３】
このＰＣＲ反応液を９４℃１分、９４℃３０秒−５５℃３０秒−７２℃３０秒を３０サイクル、７２℃５分でＰＣＲ反応を行った。
【００５４】
(iv)増幅産物の検出
ＰＣＲ反応後、５μＬの反応液を用いて、１００Ｖ、３０分間で２％アガロースゲル電気泳動を行なった。図２は、電気泳動の結果を示す写真である。図２に示されるレーンＭでは、ラダーとして０．１μｇ／μＬのφ×174/HaeIII（タカラバイオ）２μＬを用いて電気泳動を行なった。また、レーン１はネガティブコントロール、レーン２はgenotype1aのテンプレートを含む反応液、レーン３はgenotype1bのテンプレートを含む反応液、レーン４はgenotype2a/2cのテンプレートを含む反応液、レーン５は、genotype2bのテンプレートを含む反応液、レーン６はgenotype3aのテンプレートを含む反応液の電気泳動結果である。以上より、ＰＣＲ用のプライマセットを用いることにって様々なgenotypeのｃＤＮＡを増幅することができ、ＨＣＶを検出できることが確認された。
【００５５】
（実施例２）
ＲＴ−ＬＡＭＰ用のプライマセットがＨＣＶを検出できるか否かを確認した。
【００５６】
（i）テンプレートＲＮＡの調製
テンプレートＲＮＡとして、genotype 1aのArmored RNA-Hepatitis C Virus (Ambion社)を７５℃で３分間熱処理したものを用意した。また、ネガティブコントロール（ＮＣ）用のテンプレートＲＮＡとして、Yeast RNA(Ambion社, Catalog#:7120G)を用意した。
【００５７】
（ii）ＲＴ−ＬＡＭＰ反応
ＲＴ−ＬＡＭＰ反応液１〜４及びＮＣ用の反応液５を調整した。反応液１及び５には上記表１に示されるプライマセット１，反応液２にはプライマセット２，反応液３にはプライマセット３，反応液４にはプライマセット４を含有させた。反応液１〜４にはテンプレートとして(i)で調整したＨＣＶのＲＮＡを含有させ、反応液５にはテンプレートとしてYeast RNAを含有させた。各反応液のその他の組成は下記の通りである。
【００５８】
Nuclease-free water 2.73μＬ
1M Tris-HCl (pH8.0) (ニッポンジーン）0.5μＬ
10x ThermoPol Buffer（New England BioLabs）2.5μＬ
10mM dNTPs (Invitrogen) 2μＬ
100mM MgSO4 (ナカライ）0.75μＬ
100mM  ジチオトレイトール（和光純薬）1.25μＬ
2% Tergitol (ＳＩＧＭＡ）2.5μＬ
10U/μＬ  AMV逆転写酵素（Promega）0.14μＬ
40U/μＬ  RNase inhibitor（Promega）0.63μＬ
テンプレートＲＮＡ  2μＬ
プライマセット
40μＭ  ＦＩＰ  2μＬ
40μＭ  ＲＩＰ  2μＬ
5μＭ  Ｆ３プライマ  1μＬ
5μＭ  Ｒ３プライマ  1μＬ
60μＭ  ループプライマＦ  1μＬ
60μＭ  ループプライマＲ  1μＬ
【００５９】
反応液１〜５を先ず４２℃３０分、９５℃５分加温してＲＴ反応を行った。次に、各反応液にBst polymerase (8U/μＬ) を2μＬずつ添加し、６５℃で６０分間さらに加温してＬＡＭＰ反応を行った。
【００６０】
(iii)リアルタイム濁度測定
６０分間のＬＡＭＰ反応中、濁度の変化をリアルタイムに測定した。図３〜７は、各反応液の濁度変化を表すグラフである。反応液１〜４では増幅が観察されたが、ネガティブコントロールである反応液５は増幅が観察されなかった。以上より、プライマセット１〜４の何れを用いてもＨＣＶゲノムのｃＤＮＡを増幅することができ、ＨＣＶを検出できることが確認された。
【００６１】
（実施例３）
ＲＴ−ＬＡＭＰ用のプライマセットがＨＣＶを検出できるか否かを確認した。
【００６２】
（i）テンプレートＲＮＡの調製
テンプレートＲＮＡとして、genotype 1a, 1b, 2a/2c, 2b及び3aのArmored RNA-Hepatitis C Virus (Ambion社)をそれぞれ７５℃で３分間熱処理したものを用意した。また、ネガティブコントロール用のテンプレートＲＮＡとして、Yeast RNA(Ambion社, Catalog#:7120G)を用意した。
【００６３】
（ii）ＲＴ−ＬＡＭＰ反応
ＲＴ−ＬＡＭＰ反応液１〜６を調整した。反応液１〜６には上記表１に示されるプライマセット１を含有させた。反応液１はネガティブコントロールであり、テンプレートとして実施例１(i)で調整されたYeast RNAを含有させた。反応液２にはテンプレートとしてgenotype1aのＲＮＡ、反応液３にはテンプレートとしてgenotype1bのＲＮＡ、反応液４にはテンプレートとしてgenotype2a/2cのＲＮＡ、反応液５にはテンプレートとしてgenotype2bのＲＮＡ、反応液６にはテンプレートとしてgenotype3aのＲＮＡをそれぞれ含有させた。各反応液のその他の組成は下記の通りである。
【００６４】
Nuclease-free water 4.73μＬ
1M Tris-HCl (pH8.0) (ニッポンジーン）0.5μＬ
10x ThermoPol Buffer（New England BioLabs）2.5μＬ
10mM dNTPs (Invitrogen) 2μＬ
100mM MgSO4 (ナカライ）0.75μＬ
100mM  ジチオトレイトール（和光純薬）1.25μＬ
2% Tergitol (ＳＩＧＭＡ）2.5μＬ
10U/μＬ  AMV逆転写酵素（Promega）0.14μＬ
40U/μＬ  RNase inhibitor（Promega）0.63μＬ
テンプレートＲＮＡ  2μＬ
プライマセット
40μＭ  ＦＩＰ  1μＬ
40μＭ  ＲＩＰ  1μＬ
5μＭ  Ｆ３プライマ  1μＬ
5μＭ  Ｒ３プライマ  1μＬ
60μＭ  ループプライマＦ  1μＬ
60μＭ  ループプライマＲ  1μＬ
【００６５】
反応液１〜６を先ず４２℃３０分、９５℃５分加温してＲＴ反応を行った。次に、各反応液にBst polymerase (8U/μＬ) を2μＬずつ添加し、６５℃で６０分間さらに加温してＲＴ−ＬＡＭＰ反応を行った。
【００６６】
(iii)増幅産物の検出
ＬＡＭＰ反応後、５μＬの反応液を用いて、１００Ｖ、３０分間で２％アガロースゲル電気泳動を行なった。図８は、電気泳動の結果を示す写真である。図８に示されるレーンＭでは、ラダーとして０．１μｇ／μＬのλ/HindIII（タカラバイオ）１μＬと０．１μｇ／μＬのφ×174/HaeIII（タカラバイオ）１μＬとの混合液２μＬを用いて電気泳動を行なった。また、レーン１はネガティブコントロール、レーン２はgenotype1aのテンプレートを含む反応液、レーン３はgenotype1bのテンプレートを含む反応液、レーン４はgenotype2a/2cのテンプレートを含む反応液、レーン５は、genotype2bのテンプレートを含む反応液、レーン６はgenotype3aのテンプレートを含む反応液の電気泳動結果である。以上より、プライマセット１を用いることによって様々なgenotypeのＨＣＶゲノムのｃＤＮＡを増幅することができ、ＨＣＶを検出できることが確認された。
【００６７】
（実施例４）
ＲＴ−ＬＡＭＰ用のプライマセットがＨＣＶを検出できるか否かを確認した。ここでは、プライマセット１ではなくプライマセット４を用いること以外は実施例３と同様にしてＨＣＶゲノムのｃＤＮＡを増幅し、アガロースゲル電気泳動により増幅産物の検出を行った。
【００６８】
図９は、電気泳動の結果を示す写真である。図９に示されるレーンＭでは、ラダーとして０．１μｇ／μＬのλ/HindIII（タカラバイオ）１μＬと０．１μｇ／μＬのφ×174/HaeIII（タカラバイオ）１μＬとの混合液２μＬを用いて電気泳動を行なった。また、レーン１はネガティブコントロール、レーン２はgenotype1aのテンプレートを含む反応液、レーン３はgenotype1bのテンプレートを含む反応液、レーン４はgenotype2a/2cのテンプレートを含む反応液、レーン５は、genotype2bのテンプレートを含む反応液、レーン６はgenotype3aのテンプレートを含む反応液の電気泳動結果である。以上より、プライマセット４を用いることによって様々なgenotypeのＨＣＶゲノムのｃＤＮＡを増幅することができ、ＨＣＶを検出できることが確認された。
【００６９】
（実施例５）
ＲＴ−ＬＡＭＰ用のプライマセットがＨＣＶを検出できるか否かを確認した。ここでは、プライマセット１ではなくプライマセット２を用いること及びgenotype 1a,1b,2a/2c,2b及び3aのArmored RNAではなくgenotype 1a,1b,及び2a/2cのArmored RNAを用いること以外は実施例３と同様にしてＨＣＶゲノムのｃＤＮＡを増幅し、アガロースゲル電気泳動により増幅産物の検出を行った。
【００７０】
図１０は、電気泳動の結果を示す写真である。図１０に示されるレーンＭでは、ラダーとしてλ/HindIII（タカラバイオ）とφ×174/HaeIII（タカラバイオ）との混合液５μＬを用いて電気泳動を行なった。また、レーン１はネガティブコントロール、レーン２はgenotype1aのテンプレートを含む反応液、レーン３はgenotype1bのテンプレートを含む反応液、レーン４はgenotype2a/2cのテンプレートを含む反応液の電気泳動結果である。以上より、プライマセット２を用いることによって様々なgenotypeのＨＣＶゲノムのｃＤＮＡを増幅することができ、ＨＣＶを検出できることが確認された。
【００７１】
（実施例６）
ＲＴ−ＬＡＭＰ用のプライマセットがＨＣＶを検出できるか否かを確認した。ここでは、プライマセット１ではなくプライマセット３を用いること及びgenotype 1a,1b,2a/2c,2b及び3aのArmored RNAではなくgenotype3aのArmored RNAを用いること以外は実施例３と同様にしてＨＣＶゲノムのｃＤＮＡを増幅し、アガロースゲル電気泳動により増幅産物の検出を行った。
【００７２】
図１１は、電気泳動の結果を示す写真である。図１１に示されるレーンＭでは、ラダーとしてλ/HindIII（タカラバイオ）とφ×174/HaeIII（タカラバイオ）との混合液５μＬを用いて電気泳動を行なった。また、レーン１はネガティブコントロール、レーン２はgenotype3aのテンプレートを含む反応液の電気泳動結果である。以上より、プライマセット３を用いることによってgenotype 3aのＨＣＶゲノムのｃＤＮＡを増幅することができ、ＨＣＶを検出できることが確認された。本実施例及び実施例２より、プライマセット３は様々なgenotypeのＨＣＶゲノムのｃＤＮＡを増幅することができ、ＨＣＶを検出できることが判った。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】プライマがハイブリダイズする核酸領域を示した模式図である。
【図２】実施例１の電気泳動の結果を示す写真である。
【図３】反応液１の濁度変化を表すグラフである。
【図４】反応液２の濁度変化を表すグラフである。
【図５】反応液３の濁度変化を表すグラフである。
【図６】反応液４の濁度変化を表すグラフである。
【図７】反応液５の濁度変化を表すグラフである。
【図８】実施例３の電気泳動の結果を示す写真である。
【図９】実施例４の電気泳動の結果を示す写真である。
【図１０】実施例５の電気泳動の結果を示す写真である。
【図１１】実施例６の電気泳動の結果を示す写真である。
【図１】
2007117049.tif 000003
【図３】
2007117049.tif 000004
【図４】
2007117049.tif 000005
【図５】
2007117049.tif 000006
【図６】
2007117049.tif 000007
【図７】
2007117049.tif 000008
【図２】
2007117049.tif 000009
【図８】
2007117049.tif 000010
【図９】
2007117049.tif 000011
【図１０】
2007117049.tif 000012
【図１１】
2007117049.tif 000013
【配列表】
2007117049000001.app