(57)【要約】【課題】            発現ベクターを用いた核酸医薬における導入遺伝子の発現量を増大させ、更に、核酸医薬の中でも遺伝子ワクチンにおける導入遺伝子の発現量の増大と導入遺伝子から合成された蛋白質に対する抗原特異的な免疫反応を増強する。【解決手段】        脊椎動物の細胞内で主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）エンハンセオソームとの結合能を有する転写因子結合配列を含む改変プロモータを含有することを特徴とする発現ベクターを提供する。【選択図】            図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊椎動物の細胞内で主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）エンハンセオソームとの結合能を有する転写因子結合配列を含む改変プロモータを含有することを特徴とする発現ベクター。
【請求項２】
前記改変プロモータと機能的に連結した目的遺伝子を含み、前記転写因子結合配列が該目的遺伝子の転写を促進することを特徴とする請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
前記改変プロモータが、ＣＭＶプロモータ又はＣＡＧプロモータに前記転写因子結合配列を付加して構築されることを特徴とする請求項１又は２に記載の発現ベクター。
【請求項４】
前記転写因子結合配列が、ＣＭＶプロモータ又はＣＡＧプロモータのＴＡＴＡボックスの凡そ３０〜１０００塩基対上流に位置することを特徴とする請求項３に記載の発現ベクター。
【請求項５】
ＭＨＣクラスＩＩトランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）をコードする核酸配列をさらに含み、該ＣＩＩＴＡが目的遺伝子とは別個に発現されることを特徴とする請求項１〜４の何れか一項に記載の発現ベクター。
【請求項６】
前記ＣＩＩＴＡをコードする核酸配列が、内部リボソーム結合サイト（ＩＲＥＳ）と機能的に連結されるか、又は前記改変プロモータとは別個のプロモータと機能的に連結されることを特徴とする請求５に記載の発現ベクター。
【請求項７】
前記別個のプロモータが、ＣＭＶプロモータ又はＣＡＧプロモータであることを特徴とする請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項８】
請求項１〜４の何れか一項に記載の発現ベクターと、ＣＩＩＴＡ発現ベクターとを含むことを特徴とする発現ベクター混合物。
【請求項９】
前記ＣＩＩＴＡ発現ベクターのプロモータが、ＣＭＶプロモータ又はＣＡＧプロモータであることを特徴とする請求項８に記載の発現ベクター混合物。
【請求項１０】
前記転写因子結合配列が、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ及び／又はβ２マイクログロブリン遺伝子の転写因子結合配列であることを特徴とする請求項１〜９の何れか一項に記載の発現ベクター又は発現ベクター混合物。
【請求項１１】
前記転写因子結合配列が、配列番号１〜５の何れか一つに記載された塩基配列からなるＤＮＡ、又は該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし且つＭＨＣエンハンセオソームとの結合能を有するＤＮＡであることを特徴とする請求項１０に記載の発現ベクター又は発現ベクター混合物。
【請求項１２】
前記転写因子結合配列が、ＳＸＹモジュールを含むことを特徴とする請求項１〜９の何れか一項に記載の発現ベクター又は発現ベクター混合物。
【請求項１３】
請求項１〜１２の何れか一項に記載の発現ベクター又は発現ベクター混合物を含むことを特徴とする遺伝子発現用組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１２の何れか一項に記載の発現ベクター又は発現ベクター混合物を用いることを特徴とする遺伝子発現方法。
【請求項１５】
請求項１〜１２の何れか一項に記載の発現ベクター又は発現ベクター混合物を含むことを特徴とする脊椎動物を対象とした核酸医薬。
【請求項１６】
前記脊椎動物が、感染症の予防又は治療のためのワクチン接種を受ける必要があることを特徴とする請求項１５に記載の核酸医薬。
【請求項１７】
前記脊椎動物が、悪性腫瘍、多発性硬化症、アルツハイマー病、又は、その他疾患の予防又は治療のためのワクチン接種を受ける必要があることを特徴とする請求項１５に記載の核酸医薬。
【請求項１８】
前記脊椎動物が、遺伝子治療を受ける必要があることを特徴とする請求項１５に記載の核酸医薬。
【請求項１９】
請求項１６に記載の核酸医薬を用いることを特徴とするＭＨＣを有する非ヒト脊椎動物を対象とした感染症の予防又は治療方法。
【請求項２０】
請求項１７又は１８に記載の核酸医薬を用いることを特徴とするＭＨＣを有する非ヒト脊椎動物を対象とした悪性腫瘍、多発性硬化症、アルツハイマー病、又は、その他疾患の予防又は治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的遺伝子を発現させるための発現ベクター、及び当該ベクターを利用した遺伝子発現方法に関する。また、当該ベクターを含む遺伝子ワクチン等の核酸医薬、さらに、当該核酸医薬を利用した疾患の予防若しくは治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、核酸を主成分として用いた医薬品である核酸医薬の技術開発が活発に展開されている。なかでもベクターを用いて、生体内に目的遺伝子を導入することによりヒト又は動物の疾患の治療又は予防を行う遺伝子治療や遺伝子ワクチンのカテゴリーに属する研究は、実用化を視野に入れた段階に入っており、幾つかのものは既に臨床研究にまで進んでいる。
【０００３】
一般的には、遺伝子治療は、動物における特定の遺伝子の機能異常に起因する疾患に対して、発現ベクター等を用いて遺伝子導入することにより当該遺伝子の働きについて人為的に強めたり弱めたりする事により治療を行うものである。この遺伝子治療全般にわたる問題としては、導入した遺伝子について十分な発現効率が得られず、そのため十分な治療効果が得られないということが共通した主要問題となっている。一方、これに対して、遺伝子ワクチンは、発現ベクターを用いて生体内に外来遺伝子を導入し、導入された遺伝子より発現された蛋白質に対する特異的免疫反応を人為的に誘導することにより、感染症や悪性腫瘍の予防又は治療を行おうとするものである。したがって、遺伝子ワクチンにおいては、その目的に特化したベクターの開発が必要とされている。すなわち、より効果的に特異的免疫反応を誘導できるベクターの開発である。
【０００４】
このため発現ベクターによる遺伝子の発現効率を高めるために、発現ベクターのプロモータを開発・改良する試みが数多くなされてきたが、遺伝子治療や遺伝子ワクチンなどに実際に使用可能なプロモータのうち発現効率が良好なものは少なく、現状ではＣＭＶプロモータやＣＡＧプロモータ等が広く使用されている。また、組織特異的プロモータの使用も試みられてはいるが、その転写活性はＣＭＶやＣＡＧプロモータに比べて非常に弱い。
【０００５】
こうした中で、従来の目的遺伝子とプロモータとの組み合わせに加えて、エンハンサーなどの促進性の転写因子結合配列と、この転写因子結合配列と結合して転写活性を増強させる転写因子をコードする遺伝子とを、発現ベクターに併せて組み込むことにより、該ベクターにより発現させた該転写因子とそれに対する該転写因子結合配列との促進的相互作用によって構成される、自己促進的な発現系のアイデアが提唱された（特許文献１参照）。しかしながら、上記特許文献１は、実施例について、実験方法の記載はあるものの、実験結果の記載の無い、所謂ペーパーイグザンプルであった。
【０００６】
本出願の発明者らは、自己促進的な発現系について、これまで上記特許文献１とは独立に、その研究を行い、実際の実験を以って自己促進的な発現系が実施可能である事について実証・報告してきた（例えば、非特許文献１参照）。すなわち、本出願の発明者らは、自己促進的な発現系を実際に実現するためには、改変のベースとなるプロモータ及び転写因子の種類、組み込む転写因子結合配列の範囲、ベースとなるプロモータと転写因子結合配列との位置関係などの要素が非常に重要であり、これら要素の組み合わせにより、発現効率の程度が大きく変わる事を明らかにしてきた。
【０００７】
一方、先に述べたように、発現ベクターを遺伝子ワクチンとして使用する場合には、導入遺伝子の単なる発現量の増大に加えて、該導入遺伝子からの遺伝子発現が最終的には生体内での抗原特異的な免疫反応の増強に結び付かなければならない。生体内で異物として認識された蛋白質・ペプチド等の抗原は、主要組織適合遺伝子複合体（major histocompatibility complex；ＭＨＣ）分子により、抗原として細胞外に提示される。したがって、このＭＨＣによる抗原提示機能を活性化させる事が抗原特異的免疫反応を誘導するために必須とされている。ＭＨＣにはＩ型とＩＩ型があるが、ＭＨＣＩ型及びＩＩ型の両者の遺伝子の転写は、転写因子であるクラスＩＩトランスアクチベーター（class II transactivator；ＣＩＩＴＡ）によって活性化される（非特許文献２〜６を参照）。詳しくは、ＣＩＩＴＡは、他の幾つかの蛋白質とＭＨＣエンハンセオソーム（enhanceosome）と呼ばれる蛋白質複合体を形成することにより、ＭＨＣＩ型及びＭＨＣＩＩ型遺伝子の転写因子結合配列に該複合体を介して結合し、各々のＭＨＣ遺伝子の転写を活性化する。そのため、ＣＩＩＴＡを標的として、免疫反応を活性化する試みが報告されている（例えば、非特許文献７参照）。
【０００８】
【特許文献１】特開平１１−１７６号公報
【非特許文献１】第１６回日本生体防御学会学術総会発表抄録
【非特許文献２】Elsen, PJ. Et al., Current Opinion in Immunology, 16, 67-75, 2004
【非特許文献３】Masternak, K. et al., Genes Dev, 14, 1156-1166, 2000
【非特許文献４】Zhu, XS. Et al., Mol Cell Biol, 20, 6051-6061, 2000
【非特許文献５】Jabrane-Ferrat, N., et al., Int immunol, 15, 467-475, 2003
【非特許文献６】Rousseau, P. et al., Immunology, 111, 53-65, 2004
【非特許文献７】Martin, BK. Et al., J Immunol, 162, 6663-70, 1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以上に述べたように、発現ベクターを用いた従来の核酸医薬においては、導入遺伝子の高レベルの発現、また、核酸医薬の中でも遺伝子ワクチンにおいては導入遺伝子の高レベルの発現に加えて導入遺伝子から発現された蛋白質に対する抗原特異的な免疫反応の高レベルの誘導を行わせる事が、困難な状況にあった。
【００１０】
そこで、本発明は、こうした従来技術の問題点を改善しようとするものであり、発現ベクターを用いた核酸医薬における導入遺伝子の更なる発現量の増大を目的とし、更に、核酸医薬の中でも遺伝子ワクチンにおける導入遺伝子の更なる発現量の増大と導入遺伝子から合成された蛋白質に対する抗原特異的な免疫反応の更なる増強を目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
そして、本出願の発明者らは、上記目的を達成するために、前記の自己促進的な発現系と、前記のＣＩＩＴＡによる抗原提示活性化作用とを組み合わせる事に想到した。すなわち、前記の自己促進的な発現系において、転写因子結合配列として抗原提示に必須の役割を果たすＭＨＣ遺伝子の転写因子結合配列（ＭＨＣエンハンセオソームと結合する領域）を使用し、転写因子としてＭＨＣ遺伝子の転写因子であるＣＩＩＴＡを使用した発現ベクター系を構築した。但し、転写因子結合配列の標的を、単なる転写因子ではなく、ＭＨＣエンハンセオソームというタンパク質複合体（この複合体中の少なくとも３つの転写因子が直接に転写因子結合配列に結合する）にしている点で、本発明の基本的構成は従来技術と一線を画するものである。そして、このように構築した発現ベクター系について、目的（抗原）遺伝子の発現及び発現された蛋白質に対する抗原特異的免疫反応を調べた結果、該発現ベクター系は、従来の発現ベクターと比較して、高レベルの遺伝子発現効率を得られるだけでなく、尚且つ、発現された蛋白質に対する高レベルの抗原特異的免疫反応を誘導できることを見出した。
【００１２】
すなわち、第一の側面において、本発明の発現ベクターは、脊椎動物の細胞内で主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）エンハンセオソームとの結合能を有する転写因子結合配列を含む改変プロモータを有することを特徴とする。好ましい実施形態において、当該発現ベクターは、前記改変プロモータと機能的に連結した目的遺伝子を含み、前記転写因子結合配列が該目的遺伝子の転写を促進することを特徴とする。本発明はまた、前記発現ベクターとＣＩＩＴＡ発現ベクターとを含むことを特徴とする発現ベクター混合物を提供する。これらの発現ベクター及び／又は発現ベクター混合物において、前記転写因子結合配列が、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ及び／又はβ２マイクログロブリン遺伝子の転写因子結合配列であることが好ましい。
【００１３】
本発明の異なる側面において、前記発現ベクター又は発現ベクター混合物を含むことを特徴とする遺伝子発現用組成物、又は脊椎動物を対象とした核酸医薬が提供される。これらの核酸医薬は、悪性腫瘍、多発性硬化症、アルツハイマー病、又は、その他疾患の予防又は治療のためのワクチンとして使用することができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の発現ベクターは、目的遺伝子を効率的に発現することができる。また、当該発現ベクターを含む遺伝子ワクチンは、導入遺伝子の高レベルの発現に加え、導入遺伝子から発現される蛋白質に対する高レベルの抗原特異的免疫反応を誘導できる。さらに、本発明の核酸医薬は、感染症の予防又は治療のみならず、悪性腫瘍、多発性硬化症、アルツハイマー病、及びその他疾患の予防又は治療に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（ＭＨＣエンハンセオソームとその転写因子結合配列）
ＭＨＣＩ型及びＩＩ型遺伝子は細胞表面の糖タンパク質をコードしており、異物として認識された抗原ペプチドはＭＨＣにより細胞表面に提示され、ＭＨＣ抗原ペプチド複合体がＴリンパ球表面のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）と結合することにより、Ｔ細胞の活性化が惹起される。ＭＨＣＩ型蛋白質は、内因性ペプチドをＣＤ８陽性Ｔ細胞に提示し、一方、ＭＨＣＩＩ型蛋白質は外因性ペプチドをＣＤ４陽性Ｔ細胞に提示する。これらのＭＨＣ−ペプチド−ＴＣＲ間の相互作用が抗原特異的な免疫応答に重要な役割を果たしている。ＭＨＣＩ型のサブタイプ遺伝子（ＨＬＡ-Ａ、ＨＬＡ-Ｂ、ＨＬＡ−ＢＥ、及びＨＬＡ−Ｃ等）、ＭＨＣＩＩ型のサブタイプ遺伝子（ＨＬＡ-ＤＲＡなど）、並びにβ２マイクログロブリン遺伝子は、そのプロモータ配列上にＳＸＹモジュールという特有の転写因子結合配列を有しており、ＭＨＣエンハンセオソームと呼ばれる転写因子複合体（ＣＩＩＴＡをコアとするＲＦＸ（regulatory factor X）、ＣＲＥＢ（cAMP response element binding protein）、ＮＦＹ（nuclear factor Y）、ＣＢＰ（CREB-binding protein）、ＢＲＧ１などから構成される転写因子複合体）と相互作用して各々の遺伝子の転写が活性化される。ここで、実際に、ＳＸＹモジュールと結合するのは、ＲＦＸ、ＣＲＥＢ、ＮＦＹであるが、これらを統合しているのがＣＩＩＴＡである。尚、ＳＸＹモジュールは、Ｓ若しくはＷボックス、Ｘ１ボックス、Ｘ２ボックス、及びＹボックスの４つの転写因子結合配列を構成要素とする転写因子結合配列のモジュールである。Ｓ若しくはＷボックスに結合する転写因子は不明であるが、Ｘ１ボックスにはＲＦＸが、Ｘ２ボックスにはＣＲＥＢが、及びＹボックスにはＮＦＹが、それぞれ結合する。
【００１６】
（本発明の発現ベクター又は発現ベクター混合物の基本的構成）
本発明の一つの実施態様における基本要素は、プロモータと前記転写因子結合配列（ＭＨＣエンハンセオソームと相互作用し転写を活性化する配列）とを含み、さらに該プロモータと機能的に連結された目的遺伝子とを含む発現ベクターである。別の態様における基本要素は、前記基本要素にＣＩＩＴＡをコードする遺伝子をさらに含み、該ＣＩＩＴＡ遺伝子が目的遺伝子とは別のプロモータにより発現される発現ベクターである。さらに別の態様における基本要素は、前記基本要素を含む発現ベクターとは別個に、ＣＩＩＴＡをコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターとから成る発現ベクター混合物である。前記後２者の態様において重要なことは、細胞中で発現されたＣＩＩＴＡが該転写因子結合配列と相互作用して転写活性を増強し目的遺伝子の発現を増大させることであって、一つのベクター中に全ての要素を含んでいても、ＣＩＩＴＡが異なる発現ベクターによって発現させていても、どちらでもよいが、ＣＩＩＴＡの発現をコントロールするプロモータには前記転写因子結合配列を含まないことが好ましい。ＣＩＩＴＡが自己促進的に発現されるとかえって目的遺伝子の発現量が低下するからである。本発明において、用語「プロモータ」とは、転写の際にＲＮＡポリメラーゼ複合体が結合するＴＡＴＡボックスなどのコアプロモータエレメントを必須要素として含み、その他に、その上流に種々の転写因子結合配列を含む遺伝子の転写に必要なＤＮＡ領域のことをいう。本発明に係る、促進性の「転写因子結合配列」は、一般に「エンハンサー」とも称する場合があるが、対応する転写因子の結合により転写を促進する塩基配列であって、遺伝子の５’上流又は３’下流に存在するものをいう。
【００１７】
（本発明の発現ベクターのベースとなるプロモータ）
前記転写因子結合配列を組み込んだ改変プロモータを作成するためのベースとなるプロモータは、脊椎動物の細胞で機能するプロモータであるならば、どのようなプロモータであっても構わない。但し、本発明の課題が遺伝子の発現効率を高める事を一つの目的としていることから、概ねプロモータ活性の強いプロモータをベースとなるプロモータとして用いることが望ましい。従って、例えば、ＣＭＶプロモータ又はＣＡＧプロモータなどがベースとなるプロモータとして好ましい。
【００１８】
（本発明の発現ベクターの転写因子結合配列）
本発明に係る転写因子結合配列は、脊椎動物の細胞内においてＭＨＣエンハンセオソームと結合し、且つ、該転写因子結合配列がプロモータとの位置関係において適切な位置に存在する場合に、プロモータ活性を増強する配列である。少なくとも一つのＳＸＹモジュールを含んでいなければならないが、全体として転写活性を高める作用を有するものであれば、その他の転写因子結合配列、例えば、ＮＦ−κＢ結合配列（エンハンサーＡ）及びインターフェロン刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）等を含んでいてもよい。ＳＸＹモジュールは正方向に組み込まれていても負方向に組み込まれていても構わない。また、正方向のＳＸＹモジュールと負方向のＳＸＹモジュールとを連結して組み込んでもよい。ＳＸＹモジュールの具体的配列は配列番号１〜５に示す。配列番号１は、ＭＨＣＩ型ＨＬＡ-ＡのＳＸＹモジュールであり、配列番号２はＭＨＣＩ型ＨＬＡ-ＢのＳＸＹモジュールであり、配列番号３はＭＨＣＩＩ型ＨＬＡ−ＤＬＡの転写開始点の近位にあるＳＸＹモジュールであり、配列番号４はＭＨＣＩＩ型ＨＬＡ−ＤＬＡの転写開始点の遠位にあってＳＸＹモジュールとは配列の方向が逆向きのＳＸＹモジュール（以下Ｓ’Ｘ’Ｙ’モジュールと略記）であり、配列番号５はβ２マイクログロブリンのＳＸＹモジュールである。ＳＸＹモジュールとしては、これらの配列に限定されず、ＭＨＣエンハンセオソームと結合し転写活性を高める能力を保持しているのであれば、これら配列と相補的なＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列をも含む。ここで、ＳＸＹモジュールは図４、５、及び６に示すようにＳボックスとＸ１Ｘ２ボックス間、またＸ１Ｘ２ボックスとＹボックス間にはリンカーがあり、各ボックス内の変異は許容度が低いが、リンカーについては比較的変異の自由度が高いと思われる。
【００１９】
前記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは当業者において周知のハイブリダイゼーションの実験条件である。具体的には、２つの核酸断片が、サムブルックら(Sambrook,J.)のMolecular Cloning：A Laboratory Manual 第３版に記載されたハイブリダイゼーション条件下で、相互にハイブリダイズすることを意味する。より具体的には、「ストリンジェントな条件」とは約４５℃にて６．０×ＳＳＣでハイブリダイゼーションを行った後に、５０℃で２．０×ＳＳＣで洗浄することを指す。ストリンジェンシーの選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば低ストリンジェンシーとしての約２．０×ＳＳＣ、５０℃から、高ストリンジェンシーとしての約０．２×ＳＳＣ、５０℃まで選択すること、ができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジェンシー条件の室温、約２２℃から、高ストリンジェンシー条件の約６５℃まで増大させることができる。なお、当業者であれば、ＳＳＣの希釈率、ホルムアミド濃度、温度などの諸条件を適宜選択することで、上記の条件と同様のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を実現することができる。
【００２０】
（本発明の発現ベクターにおける転写因子結合配列の位置）
ＭＨＣエンハンセオソームと相互作用する転写因子結合配列の存在する位置は、ベースとなるプロモータ配列の内部であっても、ベースとなるプロモータ配列の外側の上流域であっても構わない。一般的には、転写因子結合配列が通常存在している位置に挿入されるのが好ましい。そのため、ベースとなるプロモータ配列との関係で見ると、該転写因子結合配列はベースとなるプロモータ配列上流域よりも、ベースとなるプロモータ配列内部に存在している方が好ましい。数値で表すと、ＴＡＴＡボックス等のコアプロモータエレメントの、凡そ３０〜１０００塩基対上流に存在することが好ましい。また、コアプロモータエレメントの上流凡そ６００塩基対以内が更に好ましい。また、コアプロモータエレメントの上流凡そ３００塩基対以内が最も好ましい。また、組み込む個数としては、１個であっても、複数個であっても問題ない。また、ＳＸＹモジュールを正方向に含む配列とＳＸＹモジュールを負方向に含む配列とを各々組み込んでもよい。
【００２１】
（本発明の発現ベクターにおけるＣＩＩＴＡ遺伝子）
発現ベクターに組み込むＣＩＩＴＡ遺伝子は、脊椎動物由来のＣＩＩＴＡ遺伝子であれば利用可能であるが、特にヒト由来のＣＩＩＴＡ遺伝子が好ましい。その配列は天然型（例えば、配列番号６）のものに限らず、ＣＩＩＴＡとしてＭＨＣエンハンセオソームを形成し転写活性を刺激する特性を維持できる範囲であれば、変異が導入されていても構わない。すなわち、例えば、配列番号６に記載の塩基配列において、１若しくは複数の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入された塩基配列であっても構わない。
【００２２】
（本発明の発現ベクターの目的遺伝子）
「目的遺伝子」とは宿主細胞内で発現させたい任意の外来遺伝子である。遺伝子ワクチンでは、病原微生物や悪性新生物などに由来するすべての抗原遺伝子、ならびに免疫応答を至適化する目的で抗原遺伝子とともに導入される一切の遺伝子を指す。遺伝子治療の目的で導入される遺伝子も全て含まれる。具体的には先天性・後天性欠乏症の遺伝子治療では責任遺伝子の全部または一部、悪性新生物の遺伝子治療では殺戮遺伝子のほか、薬剤・放射線感受性を高めるために導入される遺伝子が、冠疾患・下肢動脈閉塞症などの循環障害の遺伝子治療では血管再生の目的で導入される遺伝子が、移植医療では拒絶反応の抑制や移植片対宿主病の制御のために導入される遺伝子が対象となる。インビトロでは、培養細胞を用いたタンパク質生産のために導入される遺伝子が対象となる。具体的には、サイトカイン、インターフェロン、共刺激因子などの各種免疫調節性分子、転写因子、抗体またはその断片、各種成長因子、ホルモン、造血因子、血液凝固因子、神経伝達物質、神経ペプチド、ワクチンの抗原として用いられる分子、アジュバントとして用いられる分子、各種酵素および糖タンパク質などの遺伝子が挙げられる。
【００２３】
また、本発明の好ましい実施形態において、上記発現ベクターはＣＩＩＴＡ以外の転写因子をコードする核酸配列をさらに含む。すなわち、上記各改変プロモータ内に存在する促進性の転写因子結合配列に結合して転写活性を増強する転写因子をコード化する核酸配列である。これらの転写因子は、上記所望の遺伝子と別々のプロモータによって転写されてもよく、また同一のプロモータでもよい。或いは、上記所望の遺伝子と転写因子とが内部リボソーム結合サイト（ＩＲＥＳ）と機能的に連結され、単一のプロモータの転写制御下に置かれた２個以上のシストロンを形成してもよい。この場合「所望の遺伝子」をプロモータの３’近傍に、転写因子をコードするＤＮＡをＩＲＥＳの３’近傍に置くことが重要である。逆の順序で２つの遺伝子を配すると、遺伝子発現増強効果は期待できない。
【００２４】
本発明の他の実施形態において、１種又は２種以上のプロモータと機能的に連結された１種又は２種以上の所望の遺伝子を複数個含む発現ベクターであって、前記複数の遺伝子がそれぞれプロモータを有する多重プロモータ発現ベクター、及び前記複数の遺伝子のうち少なくとも１つが内部リボソーム結合サイトを介して他の遺伝子と連結された多重シストロンを形成する多重シストロン発現ベクターが提供される。本実施形態の多重プロモータ発現系、又は多重シストロン発現系は、例えば、肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、及びヘルペスウイルスのそれぞれの抗原遺伝子を同時に発現することができ、肝炎、インフルエンザ及びヘルペスの３種の感染症に対する多価ワクチンとして用いることができる。遺伝子治療においても同様の方法で複数の欠乏遺伝子を一度に補充することができる。更に、抗原とアジュバントを同時に発現させたり、多量体タンパク質のそれぞれのサブユニットを同時に発現させる等の多様な応用方法に使用することができる。
【００２５】
（本発明の発現ベクター内に付加できる配列）
本発明の発現ベクターには、その基本要素の他にも、発現効率を高める作用のある任意の配列や免疫原性を高める作用のある任意の配列を付加することが出来る。例えばＷＰＲＥ（woodchuck hepatitis virus post-transcriptional response element）のようなｍＲＮＡ安定化配列（Garg, S et al. Journal of Immunology 173:550-558, 2004）やＣｐＧモチーフのような抗原の免疫原性を高める配列（Klinman DM. et al. Journal of Immunology. 158:3635-3639, 1997）の付加などが挙げられる。
【００２６】
（本発明の発現ベクターに使用できるベクターの種類）
本発明の発現ベクターは、遺伝子治療の分野で数多く用いられているアデノウイルスベクターのようなウイルスベクターであっても、或いは、プラスミドやＰＣＲ増幅産物のような裸のＤＮＡ(naked DNA)の何れであってもよい。近年、電気穿孔法や遺伝子銃等の物理的方法、及びリポソームやペプチド媒介法などの化学的方法が改善され、非ウイルスベクターによる簡便且つ安全な生体内への遺伝子導入が行われている(Niidome, T. and Huang, L. Gene Therapy (2002) vol.9, pp.1647-1652)が、具体的な方法については後述する。
【００２７】
（宿主細胞への遺伝子導入）
本発明の遺伝子導入は、上記発現ベクターを宿主細胞に導入することによって行う。発現させたい所望の遺伝子と転写因子をコードする核酸配列は同一のＤＮＡ上に構築されていても、或いは別々のＤＮＡとして構築し同一の宿主細胞内にコトランスフェクション（共形質転換）してもよい。コトランスフェクションする場合は、それぞれのベクターＤＮＡの量比を変えることにより所望の遺伝子発現量を最適化することができる。このベクターＤＮＡの量比は、用いる宿主細胞の種類によって最適となるように適宜調整される。
【００２８】
一つのベクターに１種又は２種以上のプロモータと機能的に連結された１種又は２種以上の所望の遺伝子を複数個組み込んで、多重プロモータ発現系(multiple promoter expression system)、又は多重シストロン発現系(multiple cistoronic expression system)を構築する際、特に以下の点に留意しなければならない。転写因子結合モチーフを導入した改変プロモータの転写制御下にある遺伝子は、対応する転写因子の存在下で発現量を増すが、一つのベクターに２つ以上の改変プロモータを組み込むと、改変プロモータによる遺伝子発現増強効果は低下してしまう。多重プロモータ発現系を用いて所望の遺伝子と転写因子を共発現させるベクターを作製する際には、改変プロモータの下流に所望の遺伝子を、通常のプロモータの下流に転写因子をコードする遺伝子を配置することが重要である。これは、ＩＲＥＳを用いた二重シストロン発現系を２つ組み合わせて、４重シストロン発現系を構築する際も同様で、改変プロモータの使用は１つのみにとどめるべきである。
【００２９】
（培養細胞の形質転換）
本発明の発現ベクターは、宿主細胞を形質転換することができ、得られた形質転換細胞を培養することによって本発明の発現ベクター自体及びそれによって発現される所望の遺伝子産物を製造することができる。ここで、宿主としては、本発明の発現ベクターを複製及び維持できるものであれば特に限定されるものではないが、例えば、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）等の細菌や、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等の酵母、さらにＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞、或いはＳｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞を用いることができる。
【００３０】
大腸菌は本発明の発現ベクターを調製するための宿主細胞として好ましく、形質転換細胞を培養して本発明の発現ベクターの複数のコピーを自律複製させた後に、当該形質転換細胞を破砕して本発明の発現ベクターを回収、精製することができる。細菌や酵母に本発明の発現ベクターを導入する方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、及び酢酸リチウム法等が挙げられる。
【００３１】
本発明の遺伝子発現を行うための宿主細胞としては、脊椎動物の細胞が好ましく、特に哺乳動物細胞が好ましく、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウス３Ｔ３細胞やＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒト２９３、及びＨｅＬａ細胞等が用いられるがこれらに限定されない。また、動物細胞への本発明の発現ベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等がある。
【００３２】
動物細胞を宿主として得られた形質転換細胞を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地が用いられる。培養は、通常５％ＣＯ２存在下、３７℃で１〜３０日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。また、血清の共存が望ましくない場合には目的に応じた無血清培地を使用してもよい。
【００３３】
培養後、所望の遺伝子産物が細胞内に生産される場合には細胞を破砕することにより当該遺伝子産物を抽出する。また、所望の遺伝子産物が細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により細胞を除去する。その後、当該遺伝子産物の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で、又は適宜組み合わせて用いることにより、上記培養物中から当該遺伝子産物を単離精製することができる。
【００３４】
（本発明の核酸医薬としての遺伝子ワクチン・遺伝子治療への使用）
本発明の方法を用いて、遺伝子産物に対する免疫応答を誘導することを意図して抗原となる遺伝子を生体内に導入することができる。また、遺伝子産物そのものが何らかの治療的効果を生むことを期待して治療用の遺伝子を生体内に導入することもできる。遺伝子導入の方法として、導入遺伝子がプラスミドＤＮＡ(naked plasmid DNA)であるか、組み換えウィルスベクター(recombinant viral vector)であるかは問わない。プラスミドＤＮＡを用いる場合の投与方法も特に限定する必要はない。ＤＮＡを生理食塩水に溶解してそのまま注射する方法、ＤＮＡを微細金粒子に塗布したものを高圧で噴射して皮内に到達させる遺伝子銃、リポソームや種々のポリマーなどの担体を用いた方法、パウダージェクトおよび類似の高圧注入式遺伝子導入装置、電気穿孔法(electroporation)、超音波穿孔法(sonoporation)など種々の導入法を適用することができる。投与部位は、筋肉、皮下、皮内、血管内、呼吸器および泌尿生殖器の粘膜、脳、肝臓、腎臓、肺などの実質、消化管など管腔臓器の壁面、腹腔、胸腔、関節腔、脳脊髄腔内などの体腔、視器、聴器など考え得る全ての部位が対象となる。投与に用いるベクターや遺伝子導入装置の詳細については下記のような文献を参照することができる（Methods, Nucleic Acid Vaccines (ed.,JW. Morrow and NA. Sheikh ), 31 (3), pp181-262, 2003. Elseviers Science; The Journal of Gene Medicine, Supplement: Gene Therapy Vectors Vol. 6, Issue S1, 2004. John Wiley & Sons, Ltd; Somiari S et al. Theory and in vivo application of electroporative gene delivery; Molecular Therapy: the Journal of the American Society of Gene Therapy. 2(3):178-87, 2000）。
【００３５】
（個体への投与の際の用量等）
本発明の医薬組成物の投与量は、投与対象の年齢、投与経路、投与回数により異なり、一概に規定することはできないが、本発明の発現ベクターによって生産される生理活性物質の有効量と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得る担体との組合せとして投与される有効量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲の投与量を選ぶことができ、好ましくは１日１回から数回に分けて１日以上投与される。
【００３６】
（本発明の医薬組成物の対象動物）
ＭＨＣを有する全ての脊椎動物が、本発明の医薬組成物の対象となる。すなわち、基本的には、ＭＨＣ分子を持たないとされる無顎類（魚類の進化的に下等な類型）を除く全ての脊椎動物が対象となる。従って、本発明の医薬組成物は、一般的な遺伝子ワクチン又は遺伝子治療の対象となる種々の疾患の治療又は予防の必要のある、ヒト、ヒト以外の哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類及び魚類の予防又は治療に対して適用可能である。並びに、本発明の医薬組成物を用いた非ヒト脊椎動物に対する治療又は予防法も、本発明の対象である。
【００３７】
（分子生物学等の基本的手技）
本発明の実施において、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組換えＤＮＡ技術等の一般的方法及び従来技術について、実施者は、特に示されなければ、当該分野の標準的な参考書籍を参照し得る。これらには、例えば、Molecular Cloning：A Laboratory Manual 第３版（Sambrook & Russell、Cold Spring Harbor Laboratory Press、2001）；DNA vaccines Methods and Protocols (Lowrie & Whalen編、Humana Press, 1999)；実験医学別冊  必ず上手くいく遺伝子導入と発現解析プロトコール（仲嶋と北村編、羊土社、2003）；Methods, Nucleic Acid Vaccines (ed.,JW. Morrow and NA. Sheikh)31 (3), pp181-262, 2003. Elseviers Science.；The Journal of Gene Medicine, Supplement: Gene Therapy Vectors Vol. 6, Issue S1, 2004. John Wiley & Sons, Ltd.；Somiari S et al. Theory and in vivo application of electroporative gene delivery.；Molecular Therapy: the Journal of the American Society of Gene Therapy. 2(3):178-87, 2000を参照のこと。また、本明細書において参照される細胞培養、細胞生物学実験のための試薬及びキット類はSigma社やAldrich社、Invitrogen/GIBCO社、Clontech社、Stratagene社、Qiagen社、Promega社、Roche Diagnostics社、Becton-Dickinson社、TaKaRa（タカラバイオ株式会社）等の市販業者から入手可能である。
【００３８】
以下に、本発明に関する具体的な実施例を示すが、これらは本発明を限定するためのものではなく、本発明の説明のために例示するものである。
【実施例１】
【００３９】
（改変ＣＭＶプロモータを含む発現ベクターの構築）
本発明の発現ベクターは、ヒトサイトメガロウイルスＩＥプロモータ／エンハンサー（ＣＭＶプロモータ）を含むｐＧＡベクター（Ross, TM et al. Nature Immunology vol.1 p127-131, 2000参照）を元にして構築した。ｐＧＡベクターは、米国エモリー大学医学部ワクチン研究センターのH.L.Robinson教授より供与を受けたものである。ｐＧＡベクターは、真核細胞における転写のための、サイトメガロウイルス最初期プロモータ（ＣＭＶ−ＩＥ）、イントロンＡ、及び、ウシ成長ホルモンポリアデニレーションシグナル（ＢＧＨ poly Ａ）、更に、原核生物における増殖のためのCol E1 Originを、また、抗生物質による選別のためのカナマイシン抵抗性遺伝子、また、目的遺伝子の安定性を増強するためのλＴ０ terminatorから構成されている。まず、発現ベクターの遺伝子発現効率を全般的に上昇させるため、ｐＧＡベクターのＸｈｏＩ−ＡＶＲＩＩ制限酵素サイトに、ｍＲＮＡ安定化配列であるＷＰＲＥ（woodchuck hepatitis virus post-transcriptional response element）モチーフを組み込んだ。このｐＧＡベクターにＷＰＲＥを付加したコンストラクトを「ｐＧＡ−ＩＡ（ｄｏｎｏｒ）／ＭＣＳ−ＷＰＲＥベクター」と名づけ、改変ＣＭＶプロモータを含む発現ベクターの基礎とした（図２参照）。尚、ＷＰＲＥモチーフは米国疾病管理センターのS. Garg博士より供与を受けた。そしてイントロンＡとＷＰＲＥとの間にルシフェラーゼ遺伝子を機能的に組み込んだ。次に、ルシフェラーゼを組み込んだｐＧＡ−ＩＡ（ｄｏｎｏｒ）／ＭＣＳ−ＷＰＲＥのＣＭＶプロモータ内のＴＡＴＡボックス（図３の塩基配列において５７１〜５７７位に存在する）の上流領域に部位特異的変異導入法により複数個の制限酵素部位を設置した（図３）。すなわち、上流から順にＸｍａＩ、ＭｌｕＩ、ＭｆｅＩ、ＸｂａＩ、ＡｇｅＩ及びＡｓｃＩサイトの６箇所の制限酵素部位を設置した。このようにして設置されたＸｍａＩ-ＭｌｕＩ、ＭｆｅＩ-ＸｂａＩ及びＡｇｅＩ-ＡｓｃＩの３組を単位として、各組の制限酵素部位に挟まれる領域の配列と置換する形で本発明の転写因子結合配列を組み込めるようにした。図４はＭＨＣＩ型及びＩＩ型並びにβ２マイクログロブリン遺伝子のプロモータ領域を模式的に示した図であるが、転写開始点の近位にＳＸＹモジュールが共通して存在する。ＩＩ型では、ＳＸＹモジュールの約２ｋｂ上流に、当該ＳＸＹモジュールとは逆向きでＳＸＹモジュールと類似した配列が存在する（図５及び図６）。ここでは、このＩＩ型ＳＸＹモジュールの上流域に存在するモジュールをＳ’Ｘ’Ｙ’モジュールと表す。また、ＭＨＣＩＩ型プロモータ領域（ＩＩ型のうちＨＬＡ−ＤＲＡを使用）に存在するＳＸＹモジュール（配列番号３）をＰと略して表記する、また、その上流域にあるＳ’Ｘ’Ｙ’モジュール（配列番号４）をＤと略記する。このＰ、Ｄ及びＰ＋Ｄ（以下ＰＤと略記する）を、上記の３組の制限酵素部位に様々な組み合わせで組み込んだ。また転写因子結合配列を当該制限酵素部位に組み込まない場合をＸと略記した。実際に転写因子結合配列を、どのような組み合わせで組み込んだかを、図７に模式的に示した。なお、ＭＨＣＩＩ型ではなくＩ型プロモーター（Ｉ型のうちＨＬＡ−Ｂを使用）のＳＸＹモジュールとその上流に位置する二つのκＢ��とＩＳＲＥを含む領域（配列番号２）を３箇所に各々１つずつ組み込んだ場合は、「１１１」と略記した。上記で使用したＭＨＣＩ型（ＨＬＡ−Ｂ）及びＩＩ型（ＨＬＡ−ＤＲＡ）の転写因子結合配列の核酸は、いずれも米国エモリー大学医学部ワクチン研究センターのH.L.Lobinson教授より供与を受けた。
【００４０】
（ヒトＣＩＩＴＡ発現ベクターの構築）
前記のＳＸＹモジュールを含む改変ＣＭＶプロモータ含有発現ベクターと共発現させるために用いる、ヒトＣＩＩＴＡ発現ベクターは以下のように構築した。国立感染症研究所の鈴木幸一博士より供与されたヒトＣＩＩＴＡ発現ベクター（該ベクターの作成法と構造は、Montani, V et al. Endocrinology, 139:280-289, 1998を参照）を元に、ヒトＣＩＩＴＡのｃＤＮＡに該当するフラグメント（配列番号６）を切り出し、そのフラグメントをｐＧＡベクターのイントロンＡとＢＧＨポリＡの間に機能的に挿入して、本発明におけるヒトＣＩＩＴＡ発現ベクターを構築した。
【００４１】
（発現ベクターの大量調製）
動物培養細胞へのトランスフェクションのための、前記各発現ベクターの大量調製は、まず、前記各発現ベクターにより形質転換された大腸菌を抗生物質入りのＬＢ培地で大量培養した後、Qiagen Maxiprep kit (Qiagen, Hilden, Germany)を用い、製造業者のプロトコールに記載の方法に従って、プラスミドを抽出・精製して行った。尚、後述する実施例４及び５の動物免疫用のワクチン用ベクターについても同様の方法にて、ベクターの大量調製を行った。
【００４２】
（培養細胞における導入遺伝子の発現効率の検討―ルシフェラーゼアッセイ）
本発明ベクターにおける導入遺伝子の発現効率の検討は、ルシフェラーゼレポーターアッセイによって行った。すなわち、導入遺伝子の細胞レベルでの発現効率の検討は、レポーター遺伝子として発現ベクターに組み込んだホタルルシフェラーゼ遺伝子の翻訳産物の活性に起因する発光反応を指標とした。ルシフェラーゼアッセイに用いるＮＩＨ−３Ｔ３、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ、及びＬ９２９細胞は、ＲＰＭＩ１６４０培地若しくはＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地において、５％ＣＯ２存在下、３７℃にて培養した。ルシフェラーゼ発現ベクターのトランスフェクションにはFuGene6(Roche Applied Science, Mannheim, Germany又はPolyFect (Qiagen, Hilden, Germany)を用いた。また、ルシフェラーゼアッセイは、トランスフェクションから４８時間後に、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏキット(Promega)を用いて細胞を溶解させ発光反応を生じさせ、Fluostar Galaxy (BMG Labtechnologies, Duren, Germany)を用いた蛍光強度の測定により、ルシフェラーゼ活性を算出し、ルシフェラーゼ遺伝子の発現レベルを求めた。
【００４３】
（ＳＸＹモジュールの組み合わせ、及びＣＩＩＴＡ共発現による発現効率への影響）
本実施例１において作成した、図７に模式的に図示した様々な改変ＣＭＶプロモータを含有する発現ベクターの遺伝子発現レベルを検討した。任意の３箇所の制限酵素部位にＳＸＹモジュール及びＳ’Ｘ’Ｙ’モジュールを様々な組み合わせで組み込んだ改変型ＣＭＶプロモータ又は非改変型ＣＭＶプロモータ（ネガティブコントロール）を含むルシフェラーゼ遺伝子発現ベクター１０ｎｇを、５０ｎｇのＣＩＩＴＡ発現ベクター若しくはモックプラスミド（ＣＩＩＴＡ遺伝子を含まないカラのベクター）と共に、９６ウエル中のＮＩＨ−３Ｔ３細胞にトランスフェクションした。４８時間後に細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【００４４】
その結果を図８に示す。各々の棒グラフは３サンプルのルシフェラーゼ活性の平均値を表したものである。モックプラスミド（無関係なプラスミド）を同時にトランスフェクションした場合、非改変型プロモータ（ｎａｉｖｅ）と比較して、ほとんどの改変型プロモータにおいて遺伝子発現量が増大している。一方、ＣＩＩＴＡ発現ベクターを同時に投与した場合には全ての改変型プロモータにおいて非改変型プロモータよりも遺伝子発現量が顕著に増大している。更に、同一のプロモータ間の比較においては、全ての改変プロモータにおいてＣＩＩＴＡ発現ベクターによりＣＩＩＴＡを共発現させることにより、改変プロモータ発現ベクター単独の場合と比較して目的遺伝子の発現量の増加が見られた。またＩＩ型のＳＸＹモジュールを３つ組み込んだ場合（ＰＰＰ；実施例２では２２２と略記）だけでなくＩ型のＳＸＹモジュールなどを３つ組み込んだ場合（１１１）にも遺伝子発現量の顕著な増加が見られた。以上の実験より、ＣＩＩＴＡを共発現させなくともＳＸＹモジュールをプロモータに組み込むだけで幾らかの遺伝子発現量の増大が得られ、更に、ＣＩＩＴＡを共発現させることにより、増加の程度が更に増すことが証明された。そして、これらの発現量の増加において、ＳＸＹモジュールとＳ’Ｘ’Ｙ’モジュールとの違い、組み合わせや組み込む個数による違い、また、組み込む場所による違いは明確ではないが、いずれにおいても程度の差はあるものの、非改変型プロモータと比較して十分な発現量の増加が得られることが証明された。
【実施例２】
【００４５】
（複数種の細胞株における遺伝子発現効率の検討）
次に、実施例１で見られた本発明のベクターによる遺伝子発現量の増加作用が、実施例１で用いたＮＩＨ−３Ｔ３細胞以外の細胞株でも見られるか否かを、その他の細胞株を用いて調べた。本実施例では、実施例１で顕著な効果が認められたＩＩ型（ＨＬＡ−ＤＲＡ）のＳＸＹモジュールを３つ組み込んだ改変プロモータ（２２２；実施例１ではＰＰＰと略記）を含有するルシフェラーゼ発現ベクターを用いて４種類の細胞株を対象に実験を行った。すなわち、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ、Ｌ９２９、ＮＩＨ−３Ｔ３の４種類の細胞株を用い、実施例１と同様の条件で、コントロールの非改変型プロモータ又は転写因子結合配列を組み込んだ改変型プロモータ（２２２）に対して、各々、ＣＩＩＴＡ発現ベクター又はモックプラスミドを共トランスフェクションして、遺伝子発現量をリポーター遺伝子のルシフェラーゼ活性をもとに検討した。
【００４６】
その結果を図９に示す。各々の細胞株について、非改変型プロモータを用いてモックプラスミドと共トランスフェクションした場合（ナイーブ＋モック）のルシフェラーゼ活性の値を１とした相対値でルシフェラーゼ活性を示している。各処置群は３サンプルであり、棒グラフは相対ルシフェラーゼ活性の平均値と標準誤差を表している。ＣＩＩＴＡを共発現させていない場合、調べた全ての細胞株において、ＳＸＹモジュールを組み込んだ改変型プロモータ（２２２＋モック）の遺伝子発現量が非改変型プロモータ（ナイーブ＋モック）と比較して顕著に増加していた。更に、ＣＩＩＴＡ発現ベクターの同時トランスフェクションによりＣＩＩＴＡを共発現させた場合（２２２＋ＣＩＩＴＡ）には、調べた全ての細胞において、改変型プロモータベクターのみをトランスフェクションした場合（２２２＋モック）よりも、更に、遺伝子発現量が増していた。以上の結果より、ヒトの培養細胞においては、ＳＸＹモジュールを組み込んだ改変型プロモータを用いて遺伝子導入することにより遺伝子発現量を増加させることが可能となり、それに加えて更にＣＩＩＴＡを発現ベクターにより共発現させることにより、更に導入遺伝子の発現量を増加させることが可能であることが明らかになった。
【実施例３】
【００４７】
（インターフェロン存在下での遺伝子発現効率の検討）
通常、動物の生体内には内在性の各種インターフェロンが存在し、これらインターフェロンによって、生体に導入された発現ベクターの発現効率が減弱することが報告されている。そこで、細胞株を用いたベクターの発現効率を調べる実験系において、インターフェロンが存在する条件下でも、本発明の発現ベクターが効果を有するか否かを検討した。前記実施例１で構築した発現ベクターのうち、ＣＭＶプロモータの３組の制限酵素サイト全てにＭＨＣＩ型又はＩＩ型のＳＸＹモジュールを各々組み込んだルシフェラーゼ発現ベクターである「１１１」又は「２２２」を、非改変型ＣＭＶプロモータのルシフェラーゼベクター「naive」との間で、インターフェロンβ若しくはγの存在下又は非存在下で、ルシフェラーゼアッセイにより転写活性を比較した。アッセイに用いた細胞株はＨｅＬａ及びＮＩＨ‐３Ｔ３である。またインターフェロン濃度は、５００ｍＵ／ｍｌにて行った。
【００４８】
この結果を示したのが、図１０である。各処置群は３サンプルであり、棒グラフはルシフェラーゼ活性の平均値と標準誤差を表している。ＨｅＬａ細胞においてはインターフェロン非存在下ではＳＸＹモジュールを組み込まれた１１１及び２２２改変型ＣＭＶプロモータ含有発現ベクターは非改変型naive ＣＭＶプロモータ発現ベクターに比較して顕著な転写活性の増加を見せた。一方、インターフェロンβ存在下では、非改変型naiveプロモータの転写活性はインターフェロンβ非存在下における３割弱ほどまで低下しているものの、１１１または２２２改変型プロモータではインターフェロンβ存在下においても非改変型naiveプロモータの２−３倍の活性増加が認められる。こうした改変型プロモータによる顕著な増加は、インターフェロンγ存在下でも同様であった。また、ＮＩＨ‐３Ｔ３細胞における実験でも、増加の程度に差はあるものの、ＨｅＬａ細胞同様にインターフェロン存在下での改変型プロモータによる顕著な増加作用が認められた。すなわち、以上の実験からインターフェロンβ又はγ存在下でも、本発明のＭＨＣ遺伝子転写因子結合配列のＳＸＹモジュールによる転写活性の増強作用が証明された。したがって、これらの改変プロモータは、インターフェロン存在下での転写活性の低下が、非改変型ＣＭＶプロモータに比して軽度であるため、インターフェロンの誘導を惹起するウイルスベクターを用いた遺伝子導入において転写活性を維持するのに効果を発揮することが期待される。
【実施例４】
【００４９】
（遺伝子ワクチン用ベクターの構築）
ＭＨＣ遺伝子転写因子結合配列を含有するプロモータの制御下にある抗原遺伝子（ＬａｃＺ）と、それとは別個のプロモータの制御下にあるＣＩＩＴＡ遺伝子とを、単独のベクター内に含む、遺伝子ワクチン用の発現ベクターを以下のように構築した。まず、ｐＧＡベクターのプロモータの下流に抗原遺伝子のＬａｃＺを連結した。そして、ＬａｃＺの下流に、ＸｈｏＩ−ＡｖｒＩＩサイトを利用して、発現効率を高めるために、ｍＲＮＡ安定化作用のあるＷＰＲＥ（woodchuck hepatitis virus post-transcriptional response element）を組み込んだ。そして、このＬａｃＺ発現ｐＧＡベクターのＣＭＶプロモータ内に、実施例１における発現ベクターの構築法と同様の手順により、ＭＨＣＩ型又はＩＩ型のＳＸＹモジュールを含む領域（配列番号２又は３）を各々３つずつ組み込んだ。そして、部位特異的変異導入法で予め導入していたＰｏｌｙＡサイトの３’側近傍に位置するＮｏｔＩサイトを、当該制限酵素により消化する。これと平行して、ｐＧＡベクターをベースにしたＣＩＩＴＡ発現ベクターを構築し、このＣＩＩＴＡ発現ベクターから、非改変型ＣＭＶプロモータとＣＩＩＴＡ遺伝子とＰｏｌｙＡの領域のみをＮｏｔＩで切り出す。その上で、切り出したフラグメントを、ＮｏｔＩで切断されたＬａｃＺ発現プラスミドと連結し、本発明の遺伝子ワクチン用ベクターを構築した。このようにして完成したワクチン用ベクター（Ｉ型ＳＸＹモジュールを３つ含む）を模式的に示したのが、図１である。これをｐＤＸ ＣＭＶ−１１１−ＬａｃＺ−ＷＰＲＥ／ＣＩＩＴＡベクターと名付け、「１１１−ＬａｃＺ−ＷＰＲＥ／ＣＩＩＴＡ」と略記する。
【実施例５】
【００５０】
（抗原特異的免疫反応の動物個体での検討）
前記で作成した遺伝子ワクチン用発現ベクター「１１１−ＬａｃＺ−ＷＰＲＥ／ＣＩＩＴＡ」（図１）の効果を調べるため、図１１に記載したような、以下の６種類のコンストラクトを用いて、マウスを用いた免疫実験を行った。前段落中で記載のＩ型の代わりにＩＩ型のＳＸＹを用いたものは、「２２２−ＬａｃＺ−ＷＰＲＥ／ＣＩＩＴＡ」と略記し、また、コントロールとしては、ＣＩＩＴＡ発現カセット及びＷＰＲＥモチーフを含まず、プロモータが各々、非改変型ＣＭＶ、１１１改変型ＣＭＶ又は２２２改変型ＣＭＶであるコンストラクトを用意し、各々、「ｎａｉｖｅ‐ＬａｃＺ」、「１１１‐ＬａｃＺ」、「２２２−ＬａｃＺ」と略記した。また非改変型ＣＭＶプロモータにおいてＷＰＲＥモチーフのみを組み込んだＬａｃＺ発現ベクター（「ｎａｉｖｅ‐ＬａｃＺ‐ＷＰＲＥ」と略記）も用意した。
【００５１】
６〜８週齢のＢＡＬＢ／Ｃ雌性マウスを被検動物として、上記において構築した各ＬａｃＺ発現ベクターによって誘導される抗原特異的な細胞性免疫反応を検討した。各々の群は、５〜８匹ずつで実験をおこなった。まず、マウスへの初回免疫は、生理食塩水に溶解した５０マイクログラムのＬａｃＺ発現ベクターを露出した大腿四頭筋に注射し、次いでピンセット型白金電極（直径 10mm, 極間距離 約5mm、CUY650-10, NepaGene Chiba, Japan）を直視下に四頭筋にあてて矩形波エレクトロポレーター（CUY21EDIT, NepaGene Chiba, Japan）で６回の通電（電圧30 V, 通電時間50 msec、通電間隔 100 msec）により行った。その４週間後に、同一の条件で追加免疫を行った。最後の免疫から２週間経過後に、マウスから脾臓を摘出し、リンパ球を分離し、ＬａｃＺ特異的細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）活性を測定した。ＣＴＬ活性を測定するためのＣＴＬアッセイは、Deckerらによる文献（Decker, T. et al. J. Immunol Meth. Vol115, p61-69, 1988）に記載の方法を利用したアッセイキットCytoTox 96 Non-radioactive cytotoxicity assay(Promega)を用いて行った。
【００５２】
上記のＣＴＬアッセイの実験結果を示したのが、図１２である。ＣＴＬアッセイは、ワクチン接種された動物から分離された活性化リンパ球（効果細胞）が、抗原を持つ細胞（標的細胞）に、どの程度障害を与えられるかを調べる実験である。抗原ペプチドでパルスした黒丸のグラフに対し、白丸のグラフは抗原ペプチドでパルスしていないネガティブコントロールを示している。縦軸（％Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｌｙｓｉｓ）は、標的細胞の何％が障害を受けて溶解されたかを示しており、横軸（Ｅ／Ｔ Ｒａｔｉｏ）は、効果細胞／標的細胞の比を示している。効果細胞／標的細胞の比が小さいにもかかわらず高効率の細胞溶解が認められる場合、細胞障害性が非常に強い事を示している。まず、ＣＩＩＴＡ発現カセットを含まない「ｎａｉｖｅ‐ＬａｃＺ」、「１１１‐ＬａｃＺ」及び「２２２−ＬａｃＺ」の比較においては、細胞溶解率の大きな差は認められなかった。ｍＲＮＡ安定化配列であるＷＰＲＥを含む「ｎａｉｖｅ‐ＬａｃＺ‐ＷＰＲＥ」は、ＷＰＲＥを含まない「ｎａｉｖｅ‐ＬａｃＺ」に対して細胞溶解率が増加している。このＷＰＲＥ含有の非改変型プロモータ「ｎａｉｖｅ‐ＬａｃＺ‐ＷＰＲＥ」を、ＣＩＩＴＡ発現カセットと改変型１１１若しくは２２２ＣＭＶプロモータとを含む「１１１−ＬａｃＺ−ＷＰＲＥ／ＣＩＩＴＡ」若しくは「２２２−ＬａｃＺ−ＷＰＲＥ／ＣＩＩＴＡ」とを比較すると、「１１１−ＬａｃＺ−ＷＰＲＥ／ＣＩＩＴＡ」において顕著な細胞溶解率の上昇が見られ、「２２２−ＬａｃＺ−ＷＰＲＥ／ＣＩＩＴＡ」でも程度は少ないが上昇がみられる。従って、これらの実験から、ＳＸＹモジュールを含むプロモータに連結された抗原遺伝子が、これと別個のプロモータ下にあるＣＩＩＴＡ遺伝子と共発現されることにより、高レベルの抗原特異的な細胞性免疫を誘導できることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】ＭＨＣＩ型遺伝子の転写因子結合配列を含有するＣＭＶプロモータの制御下にある抗原遺伝子（ＬａｃＺ）と、それとは別個のＣＭＶプロモータの制御下にあるクラスＩＩトランスアクチベータ（ＣＩＩＴＡ）遺伝子とを、単独のベクター内に含む、遺伝子ワクチン用発現ベクターのプラスミドコンストラクトの開裂地図である。
【図２】サイトメガロウイルス最初期プロモータ（ＣＭＶ−ＩＥ）とイントロンＡなどを基本要素とするｐＧＡベクターのＸｈｏＩ−ＡＶＲＩＩ制限酵素サイトに、ｍＲＮＡ安定化配列であるＷＰＲＥ（woodchuck hepatitis virus post-transcriptional response element）モチーフを組み込んだプラスミドコンストラクト（ｐＧＡ−ＩＡ（ｄｏｎｏｒ）／ＭＣＳ−ＷＰＲＥベクター）の開裂地図である。
【図３】ＣＭＶ−ＩＥプロモータ内に部位特異的変異導入法により、６箇所の制限酵素サイトを導入した改変プロモータの基礎となるプロモータ（ｎａｉｖｅ ＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の配列を示した図であり、その他に、該プロモータ配列内に存在するコアプロモータエレメントであるＴＡＴＡ ｂｏｘやＣＲＥＢ等の転写因子結合部位などを示している。
【図４】ＭＨＣＩ型及びＩＩ型並びにβ２マイクログロブリン遺伝子のプロモータ領域を模式的に示した図であり、各々の遺伝子におけるＳＸＹモジュールの保存性を表している。
【図５】ＭＨＣＩＩ型（ＨＬＡ−ＤＲＡ）のプロモータ領域について、ＳＸＹモジュール（Distal promoter）と、その上流に逆向きで存在するＳ’Ｘ’Ｙ’モジュール（Proximal promoter）との位置関係を示した図である。
【図６】ＭＨＣＩＩ型（ＨＬＡ−ＤＲＡ）のプロモータ領域について、ＳＸＹモジュール（Distal promoter）とＳ’Ｘ’Ｙ’モジュール（Proximal promoter）との配列の類似性を示した図である。
【図７】図３で示したＣＭＶ−ＩＥプロモータ配列内の３組の制限酵素サイト内に、ＭＨＣＩＩ型ＨＬＡ−ＤＲＡプロモータ領域のＳＸＹモジュール（Ｐと略記）、Ｓ’Ｘ’Ｙ’モジュール（Ｄと略記）、及びＰ＋Ｄ（ＰＤと略記）を、どのような組み合わせで組み込み、改変型プロモータを作成したかを模式的に示した図である（但し、何も組み込まない場合はＸと略記した）。
【図８】図７に示した、ＭＨＣ遺伝子プロモータ領域のＳＸＹモジュールを様々な組み合わせで組み込んだ改変型ＣＭＶプロモータ含有ルシフェラーゼ発現ベクターを、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対して、モックプラスミド又はＣＩＩＴＡ発現ベクターと共投与した際の、転写活性を示したグラフである。
【図９】図７に示した、ＭＨＣＩＩ型遺伝子のプロモータ領域のＳＸＹモジュールを３つ組み込んだ改変型ＣＭＶプロモータ含有ルシフェラーゼ発現ベクター（２２２）又は非改変型ＣＭＶプロモータ含有ルシフェラーゼ発現ベクター（naive）を、４種類の細胞に対して、モックプラスミド又はＣＩＩＴＡ発現ベクターと共投与した際の、転写活性を示したグラフである。
【図１０】図７で示したＭＨＣＩＩ型遺伝子のプロモータ領域のＳＸＹモジュールを３つ組み込んだ改変型ＣＭＶプロモータ含有ルシフェラーゼ発現ベクター（２２２）、及び、ＭＨＣＩ型遺伝子のプロモータ領域のＳＸＹモジュールを３つ組み込んだ改変型ＣＭＶプロモータ含有ルシフェラーゼ発現ベクター（１１１）を、インターフェロン存在下で２種類の細胞へのトランスフェクションした際の転写活性を、非改変型ＣＭＶプロモータ含有ルシフェラーゼ発現ベクター（naive）の転写活性と比較したグラフである。
【図１１】マウスにおいて、ＭＨＣＩ型遺伝子の転写因子結合配列を含有する遺伝子ワクチン用ベクター（図１に開裂地図を図示）、及び、ＭＨＣＩＩ型遺伝子の転写因子結合配列を含有する遺伝子ワクチン用ベクターの効果を検討するための免疫実験に用いた各プラスミドコンストラクトの模式図である。
【図１２】図１１に示した各遺伝子ワクチン用ベクターによる、マウスにおける抗原特異的ＣＴＬ活性を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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