(57)【要約】【課題】血漿に含まれるクロルフェニラミン及びフェニレフリン又はそれらの塩を同時に定量する方法の提供。【解決手段】非イオン性ポリマーからなる固相抽出剤を用いることを特徴とする血漿中に含まれるクロルフェニラミン及びフェニレフリン又はそれらの塩の同時抽出方法、並びにこの抽出方法により得られた試料を弱酸性溶媒に溶解させた後、液体クロマトグラフィーにより測定することを特徴とする血漿中に含まれるクロルフェニラミン及びフェニレフリン又はそれらの塩の同時定量方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非イオン性ポリマーからなる固相抽出剤を用いることを特徴とする血漿中に含まれるクロルフェニラミン及びフェニレフリン又はそれらの塩の同時抽出方法。
【請求項２】
非イオン性ポリマーが、Ｎ−ビニルピロリドン・ジビニルベンゼン共重合体又はスチレンジビニルベンゼン・ポリメタクリレートである請求項１記載の同時抽出方法。
【請求項３】
クロルフェニラミンの塩がマレイン酸クロルフェニラミンであり、フェニレフリンの塩が塩酸フェニレフリンである請求項１又２記載の同時抽出方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の抽出方法により得られた固相抽出剤に吸着した試料を、酸を含む有機溶媒で溶出することを特徴とする血漿中に含まれるクロルフェニラミン及びフェニレフリン又はそれらの塩の同時抽出方法。
【請求項５】
酸を含む有機溶媒がギ酸を含む有機溶媒である請求項４記載の同時抽出方法。
【請求項６】
請求項４又は５記載の抽出方法により得られたクロルフェニラミン及びフェニレフリン又はそれらの塩の混合物を、乾固後、弱酸性溶媒に溶解させ、液体クロマトグラフィーにより測定することを特徴とする血漿中に含まれるクロルフェニラミン及びフェニレフリン又はそれらの塩の同時定量方法。
【請求項７】
弱酸性溶媒が、酢酸アンモニウムとアセトニトリルの混合溶媒である請求項６記載の同時定量方法。
【請求項８】
弱酸性溶媒が、ｐＨ４〜７である請求項６又は７記載の同時定量方法。
【請求項９】
液体クロマトグラフィーが、質量分析計を備えた高速液体クロマトグラフィーである請求項６〜８のいずれか１項記載の同時定量方法。
【請求項１０】
クロルフェニラミンの塩がマレイン酸クロルフェニラミンであり、フェニレフリンの塩が塩酸フェニレフリンである請求項６〜９のいずれか１項記載の同時定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロルフェニラミン及びフェニレフリン又はそれらの塩の血漿中濃度を同時に定量する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまで、風邪あるいは花粉症等による鼻水、鼻づまり等の症状の緩和を目的として、マレイン酸クロルフェニラミン及び塩酸フェニルプロパノールアミンを含有する一般用医薬品が数多く販売されている。マレイン酸クロルフェニラミンは、じん麻疹、血管運動性浮腫、枯草熱、皮膚疾患に伴うそう痒（湿疹、皮膚炎、皮膚そう、薬疹）、アレルギー性鼻炎、血管運動性鼻炎、感冒等上気道炎に伴うくしゃみ・鼻水・咳嗽の治療薬であり、塩酸フェニルプロパノールアミンは、鼻炎薬、鎮咳去痰剤、感冒薬、上気道炎の治療薬である。しかし、塩酸フェニルプロパノールアミンは米国における出血性脳卒中に係る安全性の問題から、代替品へと切り替えるよう指示されており、近年、その代替品として同様の作用効果を示す塩酸フェニレフリンが用いられるようになっている。
【０００３】
マレイン酸クロルフェニラミン及び塩酸フェニレフリンを配合した製剤の効果を確認するために、投与後の血漿中濃度を測定する必要がある。クロルフェニラミンとフェニレフリンをそれぞれ単独で測定する方法については既に報告されている。例えばクロルフェニラミンは、０．５ｍＬの血漿を用い、０．２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液及びジエチルエーテルにて抽出を行い、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにて測定することで０．５２〜２０．８ｎｇ／ｍＬの濃度範囲で定量可能であることが知られている（非特許文献１参照）。一方、フェニレフリンは、０．２ｍＬの血漿を用い、アセトニトリルにて除タンパク後、酸性条件下、７０℃にて１時間インキュベートし、ＨＰＬＣにて測定することで５〜５００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲で定量可能であることが知られている（非特許文献２参照）。
これらの方法により各化合物の定量は可能であったが、定量に必要な血漿量は１測定ポイントあたり０．７ｍＬと多く、採血時に動物あるいはヒトに負担となっていた。また、各化合物を別々に定量する必要があるため、操作が煩雑となる等の問題を有していた。
【非特許文献１】Journal of Chromatography B, 776(2002), 169-176
【非特許文献２】Journal of Chromatography B, 661(1994), 93-99
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記問題は、両化合物を同時に測定することにより解決可能と考えられた。しかしながら、クロルフェニラミンは脂溶性の薬物で、フェニレフリンは水溶性の薬物であるため、その物理化学的特性は大きく異なる。従って、非特許文献１の方法ではフェニレフリンの抽出が困難であり、非特許文献２の方法では抽出操作におけるクロルフェニラミンの安定性に影響を及ぼすため、いずれも同時定量することはできなかった。
【０００５】
本発明は、血漿に含まれるクロルフェニラミン及びフェニレフリン又はそれらの塩を同時に定量する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、先ず両化合物を血漿から良好に抽出する方法について種々検討を行った。両化合物共に塩基性の官能基を持つことから、強カチオン交換樹脂を用いた固相抽出を試みたが、化合物と固相との相互作用が強くうまく溶出できないことを見出した。そこで、さらに検討したところ、非イオン性ポリマーからなる固相抽出剤を用いた固相抽出法によれば、適度な相互作用を持ち、両化合物を効率よく抽出できることを見出した。次に、抽出により得られた試料を溶解させる溶媒について検討したところ、強酸性溶媒では両化合物とも回収率が悪く、また強塩基性溶媒では良好な回収率を示すものの、フェニレフリンの濃度のバラツキが大きくなることを見出した。そこで、弱酸性溶媒に溶解させれば、回収率も良く、かつフェニレフリンの濃度のバラツキも小さいことを見出した。
このように、本発明者らは、血漿を非イオン性ポリマーからなる固相抽出剤に保持させて固相抽出し、得られた試料を弱酸性溶媒に溶解させた後液体クロマトグラフィーで測定すれば、良好な回収率で両化合物が回収され、且つ精度よく両化合物を同時定量できることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、非イオン性ポリマーからなる固相抽出剤を用いることを特徴とする血漿中に含まれるクロルフェニラミン及びフェニレフリン又はそれらの塩の同時抽出方法を提供するものである。
また、本発明は、上記抽出方法により得られた固相抽出剤に吸着した試料を、酸を含む有機溶媒で溶出することを特徴とする血漿中に含まれるクロルフェニラミン及びフェニレフリン又はそれらの塩の同時抽出方法を提供するものである。
さらにまた、本発明は、上記抽出方法により得られたクロルフェニラミン及びフェニレフリン又はそれらの塩の混合物を、乾固後、弱酸性溶媒に溶解させ、液体クロマトグラフィーにより測定することを特徴とする血漿中に含まれるクロルフェニラミン及びフェニレフリン又はそれらの塩の同時定量方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明方法によれば、クロルフェニラミン及びフェニレフリン又はそれらの塩の血漿中濃度を同時に定量できるため、これらを含む製剤をヒトを含む動物に投与した場合の薬理効果を簡便かつ効率良く評価できる。また、両化合物の血漿中の濃度を測定するために従来は合わせて０．７ｍＬと多くの血漿量を必要としていたが、この方法を利用することにより僅か０．１ｍＬ程度と微量でよく、採血時の負荷を軽減できる。さらに、固相抽出剤に吸着された両化合物は弱酸性溶媒中で安定且つ良好な回収率で溶出できるため、精度よく測定することができ、操作性も向上する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明方法の対象は、血漿中のクロルフェニラミン、フェニレフリン又はそれらの塩である。クロルフェニラミン又はフェニレフリンの塩としては、薬学的に許容される塩であれば特に制限されず、例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩等の有機酸塩等が挙げられる。クロルフェニラミン又はその塩としては、マレイン酸塩が好ましい。また、フェニレフリン又はその塩としては、塩酸塩が好ましい。
【００１０】
本発明方法において用いられる血漿は、ヒトを含む動物由来の血漿であればよく、常法に従い、例えばヘパリン等の抗凝固剤を含む注射器で採血するか、あるいは採血後抗凝固剤と混和し、次いで遠心分離することで得ることができる。当該ヒトを含む動物には、採血前にクロルフェニラミン及びフェニレフリン又はそれらの塩を含有する医薬製剤が投与されている。ここで用いられる医薬製剤には、クロルフェニラミン又はその塩とフェニレフリン又はその塩の両方を含む医薬製剤、及びクロルフェニラミン又はその塩、あるいはとフェニレフリン又はその塩のいずれか一方をそれぞれ含む２種の医薬製剤のいずれも含まれる。さらにこれらの医薬製剤は、錠剤、顆粒剤、その他の経口投与製剤でもよいし、注射用製剤、座薬であってもよい。
採取する血漿の量は、従来はクロルフェニラミンとフェニレフリンとを別々に定量していたため１測定ポイントあたり０．７ｍＬ程度と多く必要であったが、本発明においてはこれらを同時定量することにより、０．０５〜  ０．３ｍＬ、好ましくは  ０．１〜０．２ｍＬ程度と微量でよい。
【００１１】
血漿中のクロルフェニラミン及びフェニレフリン又はそれらの塩は、非イオン性ポリマーからなる固相抽出剤を用いた固相抽出法により抽出される。すなわち、非イオン性ポリマーからなる固相抽出剤に血漿を吸着させた後、適当な洗浄液で洗浄し、次いで酸を含む有機溶媒で溶出させることで両化合物を良好に溶出できる。固相抽出の使用形態は、特に限定されず、シリンジ、カートリッジ、プレート、カラム等いずれも用いることができる。
【００１２】
本発明の固相抽出に用いられる非イオン性ポリマーとしては、例えばＮ−ビニルピロリドン・ジビニルベンゼン共重合体、スチレンジビニルベンゼン・ポリメタクリレート等の非イオン性有機ポリマー等が挙げられる。市販品としては、例えばOasis HLB、Oasis HLB μExtraction（日本ウォーターズ（株）製）を用いることができ、特にOasis HLBを用いるのが好ましい。
【００１３】
血漿を吸着させた固相抽出カラム等の洗浄には、純水、メタノール等を用いることができ、特に純水が好ましい。
【００１４】
上記両化合物の溶出に用いられる酸を含む有機溶媒としては、特に限定されず、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸等の酸を含む有機溶媒が挙げられる。ここで、有機溶媒としては、クロロホルム、塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素系；ヘキサン、トルエン等の炭化水素系；ジエチルエーテル、ｔ−メチルブチルエーテル等のエーテル系；メタノール等のアルコール系；アセトニトリル等のニトリル系、酢酸エチル等のエステル系、アセトン等が挙げられ、特にアセトニトリルが好ましい。このうち、ギ酸とアセトニトリルの混合溶媒を用いるのが好ましい。溶媒中の酸の濃度は２〜８ｖｏｌ％、特に４〜６ｖｏｌ％が好ましい。
酸を含む有機溶媒の使用量は、固相抽出剤容量の１〜５倍でよく、１〜２倍が好ましい。
【００１５】
得られた溶出液は、例えばエバポレータによる減圧乾固、あるいは窒素ガスを吹込み蒸発させ乾固する方法等により濃縮するのが好ましい。乾固後の試料は弱酸性溶媒に溶解し、測定機器への注入試料を調製する。
本発明において試料の溶解用に用いられる弱酸性溶媒とは、ｐＨが４〜７、好ましくはｐＨ４〜６であり、より好ましくはｐＨ５付近の範囲の水溶液である。弱酸性溶媒としては、例えば水、アセトニトリル、メタノール等の溶媒に、ギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の弱酸水溶液を配合した混合溶媒が挙げられる。このうち、酢酸アンモニウム水溶液とアセトニトリルの混合溶媒を用いるのが好ましい。酢酸アンモニウムとアセトニトリルの混合比は、５：５〜８：２が好ましく、特に６：４〜７：３が好ましい。これらは１種又は２種以上を混合して用いることができる。
【００１６】
弱酸性溶媒に溶解させた試料は、液体クロマトグラフィーを用いて測定できる。液体クロマトグラフィーとしては、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が挙げられ、常法に従い定量できる。固定相は、特に限定されず、例えば多孔性シリカゲル表面のシラノール基に無極性のアルキル基、特にオクタデシル基を化学結合させたもの（ＯＤＳ）等を用いることができる。また、移動相には、水、メタノール、エタノール、アセトニトリル等を用いることができ、特に上記試料の溶解用に用いられる弱酸性溶媒を用いた勾配による方法が好ましい。検出器としては、特に限定されず、例えば質量分析計、紫外・可視吸光検出器、示差屈折計、蛍光分光検出器、電気化学検出器等を用いることができる。本発明においては、特に高速液体クロマトグラフィー装置と質量分析計とを結合させた液体クロマトグラフ/タンデム質量分析装置(ＬＣ/ＭＳ/ＭＳ)を用いるのが好ましい。
また、定量に際し用いられる内部標準物質としては、リドカイン等が挙げられる。
【００１７】
本発明によれば、血漿中のクロルフェニラミン及びフェニレフリン、又はそれらの塩の濃度が、０．１〜１００ｎｇ／ｍＬの範囲で正確に定量可能である。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明について実施例をあげて具体的に説明するが、本発明はこれらによって何等限定されるものではない。
【００１９】
参考例１〜６、比較参考例１〜４
マレイン酸クロルフェニラミン１４．２２ｍｇ、塩酸フェニレフリン１２．１８ｍｇを、それぞれ純水２５ｍＬ中に溶解させた後、各溶液を用いて純水にて希釈し、８０ｎｇ/ｍＬのクロルフェニラミン及びフェニレフリンを含む標準溶液を調製した。次に血漿０．１ｍＬに、８０ｎｇ/ｍＬの標準溶液０．１ｍＬ、精製水０．５ｍＬ及び、内標準溶液０．１ｍＬを添加した溶液を、予めメタノール及び純水各１ｍＬで平衡化した固相抽出カートリッジ（１ｃｃ／３０ｍｇ）にそれぞれ保持させた。固相抽出カートリッジを純水１ｍＬで洗浄後、溶離液各１ｍＬで溶出させ、溶出液を窒素気流下約４０℃で乾固した。残渣に再溶解溶媒各０．２ｍＬを加えて再溶解し、メンブランフィルター（０．２μｍ）で濾過後、濾液をＬＣ/ＭＳ/ＭＳ（ＬＣ部：Agilent1100：Agilent Technologies、ＭＳ/ＭＳ部：API4000:Applied Biosystems）にて測定を行った。その結果を表１に示す。なお、使用した固相抽出カートリッジ、溶離液及び再溶解溶媒は表１の通りである。
【００２０】
＜測定条件＞
質量分析器  モニタリングイオン：クロルフェニラミン；m/z275.1(Q1)
フェニレフリン；m/z168.1(Q1)
リドカイン（IS）；m/z235.9(Q1)
カラム：内径４．６mm、長さ１５cmのステンレス管に平均粒子径５μmの液体クロマトグラフ用オクタデシルシリル化シリカゲルを充填したもの
カラム温度：４０℃
移動相Ａ：１０mmol/L酢酸アンモニウム（pH５．０）
移動相Ｂ：アセトニトリル                        のグラジェントを行った
流量：０．３mL/分
【００２１】
実施例１、比較例２及び３
マレイン酸クロルフェニラミンと塩酸フェニレフリンを含む血漿０．１ｍＬに、精製水０．６ｍＬ及び、内標準溶液０．１ｍＬを添加した溶液を、予めメタノール及び純水各１ｍＬで平衡化したポリマー系の固相抽出カートリッジ（日本ウォーターズ（株）製：「Oasis HLB」、１ｃｃ／３０ｍｇ）に保持させた。固相抽出カートリッジを純水１ｍＬで洗浄後、１ｍＬの５vol％ギ酸含有アセトニトリルで溶出させ、溶出液を窒素気流下約４０℃で乾固した。残渣にそれぞれ表２に示す再溶解溶媒各０．２ｍＬを加えて再溶解し、メンブランフィルター（０．２μｍ）で濾過後、濾液を参考例１と同様の条件でＬＣ/ＭＳ/ＭＳにて測定を行った。その結果を表２に示す。なお、回収率の括弧内の数値はバラツキを示す。
【００２２】
【表１】
2007147541.tif 000002
【００２３】
【表２】
2007147541.tif 000003
【００２４】
表１から明らかなように、固相抽出剤として強カチオン交換樹脂を用いた抽出法では（比較参考例１〜４）、マレイン酸クロルフェニラミン及び塩酸フェニレフリンの抽出率が低かった。これは、両化合物と固相との相互作用が強く、保持が強すぎたため、溶出しないことが原因と考えられた。一方、固相抽出剤として非イオン性ポリマーを用いた抽出法では（参考例１〜６）、適度な相互作用を持ち、良好な抽出率を示した。
また、表２から明らかなように、抽出試料の再溶解用溶媒として強酸性溶媒を用いた場合では（比較例１）、マレイン酸クロルフェニラミン及び塩酸フェニレフリンの回収率は悪かった。これは、強酸性では両化合物がイオン化し、溶媒への溶解性が低下するためと考えられた。また、強塩基溶媒を用いた場合では（比較例２）、良好な回収率を示したが塩酸フェニレフリンのバラツキは大きかった。これは、強塩基性溶媒中ではフェニレフリンが持つフェノール部分の安定性が悪くなるためと考えられた。一方、弱酸性溶媒を用いた場合では（実施例１）、良好な回収率を示し、なおかつ塩酸フェニレフリンのバラツキも小さかった。
以上より、固相抽出剤として非イオン性ポリマーを用いて血漿からの抽出を行い、弱酸性溶媒にて抽出試料を溶解させることで、マレイン酸クロルフェニラミン及び塩酸フェニレフリンを同時に定量でき、且つ精度の高い測定ができることが確認できた。定量は、０．１〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲で可能であった。