(57)【要約】【目的】本発明は、抗ＮＣ１モノクローナル抗体と免疫反応性を有するペプチド及び又はその抗体を用いる事を特徴とする慢性腎炎検出試薬と腎疾患治療剤に関する。【構成】以下の通り、構成する。イ、抗ＮＣ１モノクローナル抗体と免疫反応性を有するペプチド及び又はその抗体を用いる事で、腎炎の血清や尿などの生体試料からペプチド及び又はその抗体に免疫反応性を持つ物質を見出だす事で腎炎の早期を検出する試薬。ロ、抗ＮＣ１モノクローナル抗体と免疫反応性を有するペプチド及び又はその抗体よりなる薬剤。ハ、抗ＮＣ１モノクローナル抗体と免疫反応性を有するペプチド及び又はその抗体を用いて、同ペプチド及び又はその抗体と免疫反応をする抗体及び又はペプチドをスクリーニングする方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗タイプ４コラーゲンＮＣ１（以下ＮＣ１）モノクローナル抗体と免疫反応性を有するペプチド及び又はその抗体
【請求項２】
免疫組織染色に用いる時、障害腎を染色し、健常腎臓を染色しないことを特徴とする抗ＮＣ１モノクローナル抗体と免疫反応性を有するペプチド及び又はその抗体
【請求項３】
免疫組織染色に用いる時、障害腎を染色し、健常腎臓を染色しないことを特徴とする抗ＮＣ１モノクローナル抗体を用いたＮＣ１様物質の検出方法
【請求項４】
下記のアミノ酸配列を含むペプチド及び又はその抗体（各ペプチドは連続するアミノ酸配列をＮ端から５個単位に見やすい様に示した）
１）ＧＲＧＴＣ  ＮＹＹＡＮ  ＳＹＳＦＷ  ＬＡＴＶＤ      ５−１３
２）ＳＣＬＥＥ  ＦＲＳＡＰ  ＦＩＥＣＨ  ＧＲＧＴＣ      ５−１２
３）ＧＷＤＳＬ  ＷＩＧＹＳ  ＦＭＭＨＴ  ＳＡＧＡＥ      ５−１０
４）ＰＦＩＳＲ  ＣＡＶＣＥ  ＡＰＡＶＶ  ＩＡＶＨＳ      ５−８
５）ＳＴＭＰＦ  ＭＦＣＮＩ  ＮＮＶＣＮ  ＦＡＳＲＮ      ５−５
【請求項５】
前記の請求項４のアミノ酸配列を含むペプチドのいずれか１つと、４個以上のアミノ酸配列と相同性を持ち、タイプ４コラーゲンＮＣ１様免疫活性を持つペプチドと及び又はその抗体
【請求項６】
請求項２のペプチド及び又はその抗体を用いたワクチン及び又は免疫調整剤
【請求項７】
請求項２のペプチド及び又はその抗体を用いた腎炎検出方法
【請求項８】
請求項２の抗ＮＣ１モノクローナル抗体を用いたワクチン及び又は腎疾患治療剤及び又は免疫調整剤
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【産業上の利用分野】
【０００１】本発明は、抗ＮＣ１モノクロ−ナル抗体の利用に関するもので、特には免疫組織染色に用いる時、障害腎を染色し、健常腎臓を染色しないことを特徴とする抗ＮＣ１モノクローナル抗体に関するものである。抗ＮＣ１モノクローナル抗体は、それ自身が免疫反応性を持つＮＣ１様物質の検出に有用であるし、尿から検出する事で、腎疾患診断薬に利用できる。
又、免疫組織染色に用いる時、障害腎を染色し健常腎臓を染色しないことを特徴とする抗ＮＣ１モノクローナル抗体は、ジン疾患治療剤の標的物質として利用できる。更に、免疫組織染色に用いる時、障害腎を染色し健常腎臓を染色しないことを特徴とする抗ＮＣ１モノクローナル抗体を用いれば、公知のＮＣ１のアミノ酸配列から、特に免疫反応性の強い領域（ペプチド）を見出だす事で抗原決定基を確定できる。この確定された領域（ペプチド）は、以降、抗ＮＣ１モノクローナル抗体と免疫反応性を有するペプチド及び又はその抗体と共に、腎疾患モデルの惹起物質として、ワクチン、免疫寛容剤（免疫調整剤と同義に使用）あるいは腎疾患治療剤などの薬剤（以下薬剤）として、又、薬剤開発の標的物質として薬剤候補のスクリーニングに、あるいは早期の腎炎検出のリガンドとして用いられる。
【背景技術】
【０００２】腎炎の抗原の存在あるいは示唆は古今東西、多数の論文があるし、提唱された抗原例も多数あるが、唯一の例を除き、今だ確定されたものはない。それにも関わらず、抗原の探索が続くのは、腎炎が免疫反応に基づいて起こる、もしくは進行原因と考えられているからである。
実際、専門誌「腎と透析」では「注目される腎関連蛋白」として巻頭に抗原例を毎号連載をしているほどである（腎と透析２００５  Ｊｕｌｙ  Ｖｏｌ５９  Ｎｏ．１東京医学社）。抗原が決定されている唯一の例は、稀な腎炎である「抗糸球体基底膜（ＧＢＭ）抗体腎炎」である。抗ＧＢＭ抗体腎炎は急速に悪化する「急性腎炎」である。
しかし、通常、腎炎と呼ばれるものの大多数は、１０年以上の単位でゆっくり進行する。その中には、糖尿病や高血圧を原因疾患とした二次性腎炎もあるが、いずれも、腎炎の悪化を促進する抗原は確定していない。
ここで、本発明のご理解を頂くためにタイプ４コラーゲンの概要を述べる。
タイプ４コラーゲンは全て解明されているわけではない。タイプ４コラーゲンは多数の分子が結合し、そこに多種類の成分が係わる事で組織基底膜は形成する。又、タイプ４コラーゲンは組織基底膜の中心成分であることから基底膜コラーゲンとも呼ばれる。
タイプ４コラーゲンはアルファ鎖６種が知られ、１分子は３種のアルファ鎖から構成される。又、基底膜を構成するタイプ４コラーゲンは組織により３種のアルファ鎖の構成が異なる。胎盤由来の基底膜ではアルファ１、アルファ２に富み、全身の各組織基底膜に共通に見られる。腎由来の基底膜は特異で、アルファ３からアルファ６鎖に富むとされ、腎臓の糸球体、ボウマン嚢、尿細管の基底膜には共通したアルファ鎖が示唆されている。
タイプ４コラーゲン１分子は三領域に分けられ、Ｎ末端から三本鎖らせん構造を持つ７Ｓと中央螺旋部（ＴＨ）、Ｃ末端領域で非らせん構造のＮＣ１である。
生体組織から取り出す時、処理方法により得られる領域は異なり、ペプシン処理で三本鎖らせん領域が、細菌由来コラゲナーゼ処理でＮＣ１が得るのが一般的手法である（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕａｒ  Ｍａｔｒｉｘ  ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ／  ＯＸＦＯＲＤ  ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＰＲＥＳＳ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
一方、腎炎は、毎年３万人が新規透析導入例となり、本人の生活の質（ＱＬ）にとっても、国民医療費（透析１例に付き、６００万円／年）の上でも多大な負担である。透析の技術は進歩しているが、それ以前のごく初期に腎障害を特定したり、直接腎炎を治療する薬剤はない。その理由は、腎炎の発症メカニズムが解明されていないことが大きい。又、腎炎には、腎炎特有の抗原が存在する可能性があるとして、世界中で様々な抗原物質が研究されているが、抗糸球体基底膜（ＧＢＭ）抗体腎炎を除き、抗原は特定されていない。抗原が特定されれば、そこを標的物質として診断薬や腎炎治療剤の開発が期待できる。【０００３】抗ＧＢＭ抗体腎炎の抗原は、腎臓のＧＢＭに存在するタイプ４コラーゲンアルファ３鎖のＮＣ１のＣ末端３６アミノ酸残基に存在する。
稀な腎炎である抗ＧＢＭ抗体腎炎は急性腎炎に属し、典型的には２週間ほどで重篤な状態になるので、速やかに確定診断する事が必要とされる。確定診断には腎生検の免疫組織染色を用い、ＧＢＭに自己抗体である免疫グロブリンＩｇＧの沈着の有無で判定する。しかし、この検査は、検体採取で患者さんへの苦痛と危険性があり、免疫組織染色には専門病理医の高度な診断能力が求められる。
そこで簡便法として、血中に出現する自己抗体を検出するＥＬＩＳＡキットが利用されている。現在、日本で唯一診断薬として認可され、保険適用されているのは高価な輸入品である。キット添付の説明書及びそこで引用している文献では、抗ＧＢＭ抗体腎炎のみが高濃度で自己抗体が検出され、他の腎炎は健常者と同じ程度に低くしか検出されないとしている。同説明書によれば、用いている抗原はウシＧＢＭ抗原との記載である。ＧＢＭはタイプ４コラーゲンを主成分として多種の成分からなる。大きさから行けばＧＢＭ＞タイプ４コラーゲン＞ＮＣ１＞アルファ３鎖のＮＣ１＞３６アミノ酸残基（抗原）である。ウシＧＢＭ抗原を用いる事は、この巨大領域には３６アミノ酸残基（抗原）以外には他腎炎の抗原が無いと言う暗黙の了解のもとに診断の場で用いられている事になる。なお、ＧＢＭ抗原部位は、アルファ３鎖のＮＣ１でＮ末端からのアミノ酸配列が１７−３１、及び１２７−１４１にあるとの報告もある（Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９３）２６８，２６０３３−２６０３６）。いずれの抗原部位も、アルファ３鎖である。
【発明が解決しょうとする課題】
【０００４】これまで、世界中で見出だされていない腎炎の抗原部位を見出だす事で、慢性腎炎の早期診断試薬、ジン疾患治療薬、ジン疾患治療薬候補のスクリーニング方法を提示しょうとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】本発明者は、長い間腎疾患や他疾患に伴う二次性腎疾患の治療薬開発と早期検出方法に努めてきた。
【０００６】先ずウシ腎糸球体よりＮＣ１を精製した。ウシ腎臓よりの収率は僅か０．００２５％であり、新鮮なウシ腎臓１ｋｇを原料として約２５ｍｇであった。ＮＣ１を惹起原として、ラットと前例の無いサルに腎炎を発症させることで、取り出したＮＣ１の抗原性を確認した。
しかし、ＮＣ１の採取には多大の時間もいるし、生物体特有の変質を防ぐ必要もあるし、常に均一なものを精製するには多大な費用も掛かる。加えて収率が低い。
【０００７】続いて約２年、このＮＣ１を抗原とした抗ＮＣ１モノクローナル抗体の複数作製に努めた。そして、障害腎を染色し、健常腎臓を染色しないことを特徴とする特異な抗ＮＣ１モノクローナル抗体（１２Ｄ）を見出だした（医学と薬学  ５３（３）：３３５−３４１，２００５）。同様の抗ＮＣ１モノクローナル抗体を作製するには、上記の公開されている文献で可能である。
【０００８】そこで、この、障害腎を染色し健常腎臓を染色しないことを特徴とする抗ＮＣ１モノクローナル抗体を用いて、ＮＣ１より抗原部位を特定する事とした。
ヒトＮＣ１のアミノ酸配列は、公開されている。抗ＮＣ１モノクローナル抗体に免疫反応性を持つペプチドは、ＮＣ１に限定して示すが、本願はこれに限定されない。本検索方法はあらゆるペプチドからの本願の抗ＮＣ１モノクローナル抗体よる免疫反応性を持つペプチドの検索にあてはまる。
【０００９】コラーゲン１分子のＮＣ１のアルファ鎖１本当りはアミノ酸残基数は約２３０である。公表されているアミノ酸配列は複数あり、Ｎ端の１個から３個が異なるが、本願発明者はニノミヤの提示配列に従った。
アルファ鎖は６本であるから、総計１３８０アミノ酸残基を調べれば良いが手法の確立と膨大な手間が求められる。
そこで、活性部位を予測するパソコンソフトを使用する事とした。抗ＧＢＭ抗体腎炎の抗原で知られるＮＣ１アルファ３鎖では、Ｎ端５位置から１８位置のアミノ酸鎖（ＴＴＲＧＦＶＦＴＲＨＳＱＴＴ）をパソコンソフト専門家より指定された。そこで同位置を含むＮ端から連続した２０アミノ酸残基（以下３−１）と、対象にＮＣ１アルファ４鎖、ＮＣ１アルファ５鎖（以下５−１）、ＮＣ１アルファ６鎖の同位置のペプチドを検討した。更に、パソコンソフトの指定した部位（ＳＤＭＦＳＫＰＱＳＥＴ）も含む５−１５（後述）も検討した。しかし、いずれも、期待した結果は得られなかった。
【００１０】又、別途試験の結果は、抗原５−１がパソコンソフトで指定されなかったにもかかわらず、抗原３−１と免疫反応性に差がなかった。そこで、抗原部位を見出だせるか否か不明ながら、より網羅的に検索する事とした。
その時、パソコンソフト指定の３−１と同程度の免疫反応性を示した抗原５−１の連続を、即ち、アルファ５鎖ＮＣ１の全域を調べることとした。
【００１１】候補ペプチドの合成。
ＮＣ１アルファ５鎖をＮ端から２０アミノ酸単位で、５アミノ酸単位を重ねながらＮＣ１アルファ５鎖の全てを２０アミノ酸単位で１５個の合成ペプチドとした（５−１〜５−１５）。ペプチド５−１５は、２０個のアミノ酸を超えたものを入れた。
ペプチドの作製は合成のみで無く、他の分野で利用されている方法ならいずれでも当業者に可能である。
【００１２】候補ペプチドの検索に用いる免疫反応方法（ＥＬＩＳＡ）とその試薬。
１）候補ペプチド１００ｕｌ／ｗｅｌｌ（１０ｕｇ／ｍｌ）をコートしたプレートに、
２）ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１００倍希釈した抗ＮＣ１モノクローナル抗体（未希釈時１ｍｇ／ｍｌ）１００ｕｌを加えて、２３Ｃで２時間反応後ＰＢＳで洗浄し、
３）酵素標識抗マウスＩｇＧ抗体１００ｕｌを加えて、１時間反応後ＰＢＳで洗浄し、
４）発色基質（ＴＭＢ，過酸化水素）を加えて１０分後に、
５）反応停止液（希硫酸）を加えて、直ちに４５０ｎｍでＯＤ値を測定する。
免疫反応としては、酵素免疫反応に限定されず、ＡＢ法、ＲＩＡ，免疫発光法、沈降反応、凝集反応、ウエスタンブロット法他を含み、酵素標識抗体としてはポリクローナル又はモノクローナル抗体を問わず、又それを放射性物質、発光物質で標識した物、無標識物でも良い。
反応形式は、サンドイッチ法に囚われず、競合法等でも良い。
プレートに替え、ガラス、磁性物質、ラテックスにしても良く、無しにして固相法を用いないことでも良い。
プレートにペプチドをコートする時、コート物質をアビジン、ビオチン、又はこれらの結合した成分を介しても良い。
プレートにコートするペプチドは、複数種を混合しても良く、後から選ばれた混合体を構成ペプチドに別けて再度選んでも良い。
ペプチドは合成のみで無く、他の分野で利用されている方法ならいずれでも当業者に可能である。
【００１３】測定結果は、抗ＮＣ１モノクローナル抗体（１２Ｄ）は、５−１２＞５−１３＞５−８＞５−１０＞５−５の順の５か所でＯＤ高値であった。また、対象とした腎炎発症前の尿試料（５１歳女性、約１年半後に、高血圧で受診中の大学病院にて慢性腎炎と診断されるＴＤｃ  Ｎｏ．２）もＯＤ値の順位は異なるが、抗ＮＣ１モノクローナル抗体（１２Ｄ）の示した５か所で高値を示した。
【００１４】抗ＮＣ１モノクローナル抗体（１２Ｄ）が認識した５か所は、単に腎臓の障害により表出した部位であるばかりで無く、ヒト尿も同じ部位で免疫反応を示した事から、これらのペプチドは腎炎の共通した抗原部位である。
【００１５】障害腎を染色し健常腎臓を染色しないことを特徴とする抗ＮＣ１モノクローナル抗体（１２Ｄ）用いれば、腎障害の時に特有に出現するＮＣ１様物質を検出でき、腎障害と無関係のＮＣ１を測定しない事が可能となる。
【００１６】腎障害の時に特有に出現するＮＣ１様物質の検出方法（ＥＬＩＳＡ）とその試薬。
１）ウサギ由来抗ＮＣ１抗体（ＮＣ１に反応するなら、いずれの動物由来のポリクローナル抗体でも、免疫組織染色で健常腎臓組織に反応する抗ＮＣ１モノクローナル抗体でも良い）をコートした９６穴マイクロプレートに、
２）ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２倍希釈した尿検体もしくは血清検体１００ｕｌ／ｗｅｌｌを加えて、室温で２時間反応後ＰＢＳで３回洗浄し、
３）抗ＮＣ１モノクローナル抗体（１２Ｄ）を加えて、室温で２時間反応後ＰＢＳで３回洗浄し、
４）酵素（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体１００ｕｌを加えて、室温で１時間反応後ＰＢＳで３回洗浄し、
５）発色基質（ＴＭＢ，過酸化水素）を加えて１０分後に、
６）反応停止液（希硫酸）を加えて、直ちに波長４５０ｎｍでＯＤ値を測定する。
標準物質には、動物の腎臓由来を用いるか、本願のペプチドの１個もしくは複数個を組み合わせて用いる。
更に、本測定の抗体は、本願のペプチドにより作製した抗体（モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体）を単独又は組み合わせて用いる事ができる。
免疫反応としては、酵素免疫反応に限定されず、ＡＢ法、ＲＩＡ，免疫発光法、沈降反応、凝集反応、他を含み、酵素標識抗体としてはポリクローナル又はモノクローナル抗体を問わず、又それを放射性物質、発光物質で標識した物、無標識物でも良い。
反応形式は、サンドイッチ法に囚われず、競合法等でも良い。
プレートに替え、ガラス、磁性物質、ラテックスにしても良く、無しにして固相法を用いないことでも良い。
プレートに抗体をコートする時、コート物質をアビジン、ビオチン、又はこれらの結合した成分を介しても良い。
【００１７】本願の抗ＮＣ１モノクローナル抗体以外の抗ＮＣ１抗体能を有する血清、尿又はその精製物でもペプチドの検索に使用できる。例えば、動物由来の抗ＮＣ１抗体である。ＮＣ１で惹起した腎炎モデルは急性腎炎の一種なので、その抗ＮＣ１抗体は、ヒト抗ＧＢＭ抗体の自己抗体に近いので、本願の抗ＮＣ１モノクローナル抗体と比較しながら使用を進める事が良い。動物の糖尿病モデルや高血圧モデル由来の生体試料を用いる場合も可能であるが、やはり、本願の抗ＮＣ１モノクローナル抗体もしくはヒト慢性腎炎の単離した生体試料（血清や尿他）と比較しながら進める事が良い。
【００１８】本発明に従って、ペプチドを診断、治療、薬剤のスクリーニング用途に用いる事ができる。追加のアミノ酸や種々のアミノ酸配列の置換で修飾された配列も使用できる。
【００１９】本発明の範疇のペプチドはＮＣ１様免疫反応性を持つ事である。用いるペプチドは、提示ペプチドと同等のＮＣ１様免疫反応性ペプチドで有る限り、短くしても、改変しても、修飾しても、合体させたアミノ酸配列でも良い。例えば５−１２と５−１３の合体である。提示ペプチドの一部を変更するには、簡単には動物由来の配列を用いても良い。例えばウシ由来は、アルファ５鎖全てのアルファ鎖が公開されている。更には、全く別配列のアミノ酸配列でも良い。
本願は、アルファ５鎖のＮＣ１のアミノ酸配列を全て含むもので、一部を用いたものでも良く、５−１の様に、尿や血清他のヒト腎炎試料とＮＣ１様免疫反応性を持つものならいずれのペプチド域も利用できる。より望ましくは、全域アルファ５鎖よりもＮＣ１様免疫反応性の優れたペプチドで、一層望ましく、より短いペプチドでよりＮＣ１様免疫反応性を示すペプチドである。
【発明の効果】
【００２０】作製したペプチド及びその抗体は、ＮＣ１及びその抗体の代用として利用できる。特にペプチドは、ＮＣ１を腎臓から精製するのに比べ格段に廉価で、合成機で均一に短時間に作製できるので、扱い易い。
本願発明で用いたアルファ５鎖ＮＣ１の網羅的ペプチドマップは（もちろん、ペプチド鎖は更に長くしても短くしても良い）、腎炎患者個々の免疫反応性の違いや、病気進行に従って変化する免疫反応性が捕らえるにも有用で、テーラーメード医療に役立つものである。
抗ＮＣ１モノクローナル抗体、特には免疫組織染色に用いる時、障害腎を染色し、健常腎臓を染色しないことを特徴とする抗ＮＣ１モノクローナル抗体は、直接的間接的に、慢性腎炎の検出と治療とに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【図１】マウス由来抗ＮＣ１モノクローナル抗体（１２Ｄ）とヒトＴＤＣ  Ｎｏ２（尿）とによる  アルファ５鎖ＮＣ１由来ペプチドの免疫反応性比較  ＊明細書の３−１は図のＨ４ＮＡ３−１に、５−１は図のＨ４ＮＡ５−１に相当する。以下同じ。
【図２】ヒトタイプ４コラーゲンＮＣ１の  アルファ３鎖、アルファ４鎖  アルファ５鎖、アルファ６鎖
【図１】
2007332122.tif 000002
【図２】
2007332122.tif 000003