(57)【要約】【課題】統合失調症を発症する危険度を判定する方法を提供する。【解決手段】本発明は、被験者のゲノムDNAにおけるfyn遺伝子の多型を検出することを含む、統合失調症を発症する危険度を判定する方法、前記方法において使用されるプライマーおよびプローブ、および前記方法を実施するためのキットを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者のゲノムDNAにおけるfyn遺伝子の多型を検出することを含む、統合失調症を発症する危険度を判定する方法。
【請求項２】
多型が以下から選択される少なくとも１つである、請求項１記載の方法。
（ａ）配列番号１に記載の配列の５１７７位の一塩基多型；
（ｂ）配列番号１に記載の配列の５１２３〜５１３０位の欠失。
【請求項３】
fyn遺伝子の以下のいずれかの位置の少なくとも一方を含む領域を増幅するためのプライマー：
（ａ）配列番号１に記載の配列の５１７７位；
（ｂ）配列番号１に記載の配列の５１２３〜５１３０位。
【請求項４】
配列番号２または３に記載の配列を有する、請求項３記載のプライマー。
【請求項５】
fyn遺伝子の以下のいずれかの位置の少なくとも一方を含む領域にハイブリダイズするプローブ：
（ａ）配列番号１に記載の配列の５１７７位；
（ｂ）配列番号１に記載の配列の５１２３〜５１３０位。
【請求項６】
請求項３または４に記載のプライマーおよび／または請求項５記載のプローブを含む、被験者のゲノムDNAにおけるfyn遺伝子の多型を検出するためのキット。
【請求項７】
多型が以下から選択される少なくとも１つである、請求項６記載のキット。
（ａ）配列番号１に記載の配列の５１７７位の一塩基多型；
（ｂ）配列番号１に記載の配列の５１２３〜５１３０位の欠失。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、fyn遺伝子の多型を調べることを含む、統合失調症を発症する危険度を判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
統合失調症は、人口の約１％が罹患する一般的な精神疾患である。家族、双生児、および養子研究により、遺伝が統合失調症の病因に重要な役割を果たすことが示された(非特許文献１)。連鎖解析により、染色体1q、4q、5p、5q、6p、6q、8p、9q、10p、13q、15q、22q、およびXp上のいくつかの遺伝子座が統合失調症と連鎖することが報告された(非特許文献２)。6qでは、Cao et al. が、6q21-22.3における連鎖を示唆する証拠を示した(非特許文献３)。この知見は、米国国立精神保健研究所（NIMH）のGenetics Initiativeのデータセット(非特許文献４)、多施設解析(非特許文献５)、およびゲノムスキャンメタ解析(非特許文献６)のデータにより支持されている。しかしながら、統合失調症の感受性遺伝子はいまだ特定されていない。
【０００３】
SrcファミリーチロシンキナーゼのメンバーであるFynは脳に強く発現しており、その遺伝子は6q21に位置する。マウスの脳において、Fynは、軸索ガイダンス、シナプス形成、および神経伝達のような神経機能に関与する(非特許文献７)。シナプスでは、Fynはシナプス後膜肥厚に局在し、NMDA受容体サブユニットをリン酸化することによってその活性を調節する(非特許文献８)。マウスにおいてfyn遺伝子を破壊すると、海馬錐体神経細胞の配列異常(非特許文献９)、皮質層 II/IIIの形成異常(非特許文献１０)、および前脳におけるミエリン形成障害(非特許文献１１)を含む各種の脳の異常が起こる。興味深いことに、海馬の配列異常(非特許文献１２−１４)、皮質上層の形成異常(非特許文献１５−１７)、およびミエリン形成障害(非特許文献１８、１９)は、統合失調症患者の脳でも報告されている。行動の面では、fyn欠損マウスは、過剰恐怖や母性行動の障害などの情動欠陥を示す(非特許文献７)。最近、本発明者らは、定型抗精神病薬であるドーパミン受容体遮断薬ハロペリドールがマウス線条体においてFynの活性化およびNMDA受容体サブユニットのリン酸化を誘導することを見いだした(非特許文献２０)。このように、Fynは、ドーパミン受容体機能にも関与する。NMDA受容体遮断薬やドーパミン受容体刺激薬が統合失調症に類似した精神症状を誘起し、またドーパミン受容体遮断薬が統合失調症治療薬として使用されることから、統合失調症ではこれらの受容体の機能異常が想定されている。さらに、統合失調症患者の死後脳において、fyn遺伝子の発現が増加していることが報告された(非特許文献２１)。これらの理由により、fyn遺伝子は、6q21-22上の統合失調症感受性遺伝子の候補といえる。しかしながら、これまで統合失調症と相関のあるfyn遺伝子上のSNPは知られていなかった(非特許文献２２、２３)。
【特許文献１】特開２００５−  ５５２２７号公報
【非特許文献１】T. A. Ban, Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 28, 753-62 (Aug, 2004).
【非特許文献２】M. Baron, Am J Hum Genet 68, 299-312 (Feb, 2001).
【非特許文献３】Q. Cao et al., Genomics 43, 1-8 (Jul 1, 1997).
【非特許文献４】M. Martinez et al., Am J Med Genet 88, 337-43 (Aug 20, 1999).
【非特許文献５】D. F. Levinson et al., Am J Hum Genet 67, 652-63 (Sep, 2000).
【非特許文献６】C. M. Lewis et al., Am J Hum Genet 73, 34-48 (Jul, 2003).
【非特許文献７】T. Yagi, Biochem Pharmacol 57, 845-50 (Apr 15, 1999).
【非特許文献８】M. W. Salter, L. V. Kalia, Nat Rev Neurosci 5, 317-28 (Apr, 2004).
【非特許文献９】S. G. Grant et al., Science 258, 1903-10 (Dec 18, 1992).
【非特許文献１０】S. Yuasa, K. Hattori, T. Yagi, Neuroreport 15, 819-22 (Apr 9, 2004).
【非特許文献１１】B. R. Sperber et al., J Neurosci 21, 2039-47 (Mar 15, 2001).
【非特許文献１２】A. J. Conrad, T. Abebe, R. Austin, S. Forsythe, A. B. Scheibel, Arch Gen Psychiatry 48, 413-7 (May, 1991).
【非特許文献１３】J. A. Kovelman, A. B. Scheibel, Acta Neurol Scand 73, 1-32 (Jan, 1986).
【非特許文献１４】M. F. Casanova, B. Rothberg, Schizophr Res 55, 19-24 (May 1, 2002).
【非特許文献１５】S. E. Arnold, B. T. Hyman, G. W. Van Hoesen, A. R. Damasio, Arch Gen Psychiatry 48, 625-32 (Jul, 1991).
【非特許文献１６】F. M. Benes, S. L. Vincent, M. Todtenkopf, Biol Psychiatry 50, 395-406 (Sep 15, 2001).
【非特許文献１７】L. D. Selemon, G. Rajkowska, P. S. Goldman-Rakic, J Comp Neurol 392, 402-12 (Mar 16, 1998).
【非特許文献１８】K. L. Davis et al., Arch Gen Psychiatry 60, 443-56 (May, 2003).
【非特許文献１９】D. Tkachev et al., Lancet 362, 798-805 (Sep 6, 2003).
【非特許文献２０】K. Hattori, S. Uchino, T. Isosaka, M. Maekawa, M. Iyo, T. Sato, S. Kohsaka, T. Yagi, S. Yuasa, J Biol Chem, Epu ahead of print (Jan 2006).
【非特許文献２１】T. Ohnuma, H. Kato, H. Arai, P. J. McKenna, P. C. Emson, Brain Res Mol Brain Res 112, 90-4 (Apr 10, 2003).
【非特許文献２２】H. Ishiguro, T. Saito, H. Shibuya, M. Toru, T. Arinami, Am J Med Genet 96, 716-20 (Dec 4, 2000).
【非特許文献２３】T. Ohnuma et al., Neurosci Lett 343, 70-2 (May 29, 2003).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、fyn遺伝子に基づき統合失調症を発症する危険度を判定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、被験者のゲノムDNAにおけるfyn遺伝子の多型を検出することを含む、統合失調症を発症する危険度を判定する方法、前記方法において使用されるプライマーおよびプローブ、および前記方法を実施するためのキットを提供する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、統合失調症発症の危険度を遺伝子レベルで簡便に判定することが可能になった。本発明の方法は、統合失調症の予防および治療の選択に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は、被験者のゲノムDNAにおけるfyn遺伝子の多型を検出することを含む、統合失調症を発症する危険度を判定する方法を提供する。fyn遺伝子の塩基配列はGenBank HS66H14に開示されており、配列番号１に示す。
【０００８】
被験者のゲノムDNAは、被験者から採取された生体試料から公知の方法によって調製することができる。生体試料は、ゲノムDNAを含むものであれば特に限定されず、例えば被験者の各種細胞、組織、臓器、血液、体液等である。
【０００９】
好ましい態様において、多型は、fyn遺伝子のゲノムDNA上の５１７７位（配列番号１に記載の配列の５１７７位）の一塩基多型（SNP)である。被験者のゲノムDNAにおける前記多型部位の遺伝子型がＡＡの場合、その被験者は統合失調症を発症する危険度が高いと判定することができる。
【００１０】
別の態様において、多型は、fyn遺伝子のゲノムDNA上の５１２３〜５１３０位（配列番号１に記載の配列の５１２３〜５１３０位）の欠失である。被験者のゲノムDNAに前記欠失が存在する場合、その被験者は統合失調症を発症する危険度が高いと判定することができる。
【００１１】
ゲノムDNAにおける多型は、公知の各種方法によって検出することができる。検出方法の例には以下が含まれるが、これらに限定されない：
TaqMan PCR法（Genet. Anal., 14, 143-149 (1999), J. Clin. Microbiol., 34, 2933-2936 (1996)）；
インベーター（Invader）法（Science, 5109, 778-783(1993), J. Biol. Chem., 30, 21387-21394 (1999), Nat. Biotechnol., 17, 292-296 (1999)）；
モレキュラー・ビーコン（Molecular Beacons）法（Nat. Biotechnol.，1, p49-53 (1998)、遺伝子医学、4, p46-48(2000)）；
DNAマイクロアレイまたはDNAチップ法；
ダイレクトシークエンス法（Biotechniques, 11, 246-249 (1991)）；
RFLP（制限酵素切断断片長多型）法；
PCR-SSCP法（Biotechniques, 16,296-297 (1994), Biotechniques, 21, 510-514 (1996)）；
ASO（Allele Specific Oligonucleotide）ハイブリダイゼーション法（Clin. Chim. Acta, 189, 153-157 (1990)）；
変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis、DGGE）法（（Biotechniqus, 27, 1016-1018 (1999)）；
RNaseA切断法（DNA Cell. Biol., 14, 87-94 (1995)）；
MALDI-TOF/MS（Matrix Assisted Laser Desorption-Time of Flight/Mass Spectrometry）法（Genome Res., 7, 378-388 (1997), Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 35, 545-548 (1997)）；
RCA法（Nat. Genet., 19, 225-232(1998)）。
【００１２】
本発明の方法は、前記のfyn遺伝子の多型の両方を検出するものであってもよい。また本発明の方法は、統合失調症発症の危険度を予測しうる他の方法と組み合わせて用いてもよい。例えば、前記多型を他の遺伝子多型と組み合わせると、より確実な判定が可能となる。
【００１３】
本発明はまた、fyn遺伝子の以下のいずれかの位置の少なくとも一方を含む領域を増幅するためのプライマーを提供する：
（ａ）配列番号１に記載の配列の５１７７位；
（ｂ）配列番号１に記載の配列の５１２３〜５１３０位。
本発明のプライマーは、被験者のゲノムDNAの前記位置における多型の検出に使用される。本発明のプライマーは、通常１５〜１００塩基、好ましくは１５〜３０塩基、より好ましくは１８〜２４塩基のオリゴヌクレオチドである。プライマーを構成するヌクレオチドは、天然または非天然のヌクレオチドでありうる。本発明のプライマーにより増幅される領域の長さ、およびプライマーがハイブリダイズする部位と前記位置との距離は、使用する検出方法によって適宜変更される。本発明のプライマーにより増幅される領域には、前記位置の両方が含まれていても良い。プライマーの配列はfyn遺伝子の配列に基づき選択することができるが、前記配列と完全に相補的でなくてもよく、検出方法に応じて塩基配列が改変または付加されていてもよい。また、本発明のプライマーは、検出のため、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、酵素、ビオチン等によって修飾されていてもよい。当業者は、使用する検出方法に応じて、プライマーの配列および設計を適宜決定することができる。
【００１４】
本発明のプライマーの例として、5’-GCT ACG TGT GGG TAT AGA TC-3’（配列番号２）および5’-CCC AAT TCT GAT GGG CAT GT-3’（配列番号３）が挙げられる。これらプライマーは、PCRとシークエンスとを行うダイレクトシークエンス法に使用することができる。
【００１５】
本発明はまた、fyn遺伝子の以下のいずれかの位置の少なくとも一方を含む領域にハイブリダイズするプローブを提供する：
（ａ）配列番号１に記載の配列の５１７７位；
（ｂ）配列番号１に記載の配列の５１２３〜５１３０位。
本発明のプローブもまた、被験者のゲノムDNAの前記塩基における多型の検出に使用される。本発明のプローブは、検出方法に応じて適宜変更されるが、通常１０〜１００塩基、好ましくは１０〜５０塩基、より好ましくは１５〜２５塩基であるオリゴヌクレオチドである。プローブを構成するヌクレオチドは、天然または非天然のヌクレオチドでありうる。本発明のプローブは、DNAアレイ法で一般的に用いられるような固相、例えばガラス板、ナイロンメンブラン、マイクロビーズ、キャピラリー等に固定されていてもよい。プローブの配列は、前記プライマーと同様に、fyn遺伝子の配列の一部と完全に相補的でなくてもよく、検出方法に応じて塩基配列が改変または付加されていてよい。また、プローブは、前述のような検出のための適当な物質で修飾されていてもよい。当業者は、使用する検出方法に応じて、プローブの配列および設計を適宜決定することができる。
【００１６】
本発明はさらに、本発明のプライマーおよび／またはプローブを含む、被験者のゲノムDNAにおけるfyn遺伝子の多型を検出するためのキットを提供する。本発明のキットは、（ａ）配列番号１に記載の配列の５１７７位の一塩基多型および／または（ｂ）配列番号１に記載の配列の５１２３〜５１３０位の欠失を検出するものであり、統合失調症の遺伝子診断に使用される。本発明のキットは、必要に応じて、さらに適当な緩衝液、標準試料、酵素、プレート等を含んでも良い。
【００１７】
本発明はまた、被験者より採取された血液試料においてFynの発現レベルを調べることを含む、統合失調症を発症する危険度を判定する方法を提供する。Fynとは、fyn遺伝子にコードされるタンパク質を意味する。Fynには、そのスプライスバリアントであるFynΔ7（配列番号４）、FynT（配列番号５）、およびFynB（配列番号６）が含まれ、また天然に存在する個人差および人種差等に基づくアミノ酸の変異を含むそれらの変異体も含まれる。本明細書および特許請求の範囲において「Fynの発現レベル」とは、各スプライスバリアントを含むfyn遺伝子にコードされるタンパク質全体の発現レベルを意味する。
【００１８】
本方法において、被験者におけるFynの発現レベルが低い場合、統合失調症発症の危険度が高いと判定することができる。発現レベルは、例えば多数（例えば５０人以上）の健常人における発現レベルの平均値と比較すればよい。
【００１９】
タンパク質の発現レベルは、公知のいずれの方法で調べてもよいが、抗Fyn抗体を使用して調べることが好ましい。そのような方法として、例えばウェスタンブロッティング、ELISA法、ドットブロット法などが挙げられる。本方法に使用する抗Fyn抗体は、各スプライスバリアントに共通するエピトープを認識することが好ましい。本方法に使用可能な抗体は、各種市販されている：ポリクローナル抗Fyn抗体： GTX13955、GTX74453およびGTX74252（GeneTex）、EB05153（Everest Biotech）、SP1361P、SP1185およびFA1075 （Acris Antibodies）、IMG-3040（IMGENEX）、FA1075（Fusion Antibodies）、AP7709a（ABGENT）、H00002534-A01（Abnova）、RB-10325-P（Lab Vision）、01-091-311C（AmProxs）、AB1378（CHEMICON）、ab13955（Novus Biologicals）、OBT1252（OXFORD BIOTECHNOLOGY）、SC16、SC30680およびSC28791（SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY）、AHP651、MCA2379（SEROTEC）、06133（UPSTATE）、AB13955、AB1881およびAB802（ABCAM）、604102（BIOLEGEND）、AHO065（BIOSOURCE）、E11004（SPRING BIOSCINCE）、並びにAP7709A（ABGENT）；モノクローナル抗Fyn抗体： 1S（GeneTex、Novus Biologicals、Lab Vision、CHEMICON、Acris Antibodies、Exalpha Biologicals、UPSTATE、ABCAM、BIOSOURCEおよびZYMED LABORATORIES）、FYN-01（GeneTex、Bio Vendor Laboratory Medicine、Novus Biologicals、Acris Antibodies、Exbio PrahaおよびALEXIS）、15（SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY）、SPM247（SPRING BIOSCINCE）、Y303（EPITOMICS）、並びにFYN-59（BIOLEGEND）。また、以下の文献に記載の抗Fyn抗体γC3は、本発明の方法に好適に使用される：Yasunaga M et al., Involvement of Fyn tyrosine kinase in progression of cytokinesis of B lymphocyte progenitor. J Cell Biol. 1996 Jan;132(1-2):91-9; Maekawa M et al., Fyn tyrosine kinase in Sertoli cells is involved in mouse spermatogenesis. Biol Reprod. 2002 Jan;66(1):211-21; Hattori K et al., Fyn is required for haloperidol-induced catalepsy in mice. J Biol Chem. 2006 Jan 10。
【００２０】
本発明はまた、被験者より採取された血液試料においてfyn mRNAの発現レベルを調べることを含む、統合失調症を発症する危険度を判定する方法を提供する。本明細書および特許請求の範囲において「fyn mRNAの発現レベル」とは、fynΔ7、fynT、およびfynB mRNAのような各スプライスバリアントのmRNAを含む、fyn遺伝子に由来するmRNA全体の発現レベルを意味する。被験者におけるfyn mRNAの発現レベルが低い場合、統合失調症発症の危険度が高いと判定することができる。
【００２１】
mRNAの発現レベルは、公知のいずれの方法で調べてもよい。そのような方法として、例えば、RT-PCR法、競合的PCR法、リアルタイムPCR法、ノーザンブロット法、ドットハイブリダイゼーション法、マイクロアレイ法、RNaseプロテクションアッセイ法などが挙げられる。
【００２２】
本発明はまた、被験者より採取された血液試料において、fynΔ7またはfynT mRNAの発現レベルを調べることを含む、統合失調症を発症する危険度を判定する方法を提供する。fynΔ7およびfynT mRNAに相補的なcDNA配列をそれぞれ配列番号７および８に示すが、被験者のmRNA配列には個人差および人種差等に基づく変異が含まれる場合もある。
【００２３】
健常人と比較して被験者におけるfynΔ7 mRNAの発現レベルが高い場合、またはfynT mRNAの発現レベルが低い場合に、統合失調症を発症する危険度が高いと判定することができる。判定は、例えば、被験者におけるfyn遺伝子の転写産物（mRNA）全体の発現レベルに対する各スプライスバリアントのmRNAの相対的発現レベルが、多数（例えば５０人以上）の健常人の平均レベルと比較して有意に高いまたは低いかを調べることにより行う。
【００２４】
mRNAの発現レベルは、前述のような公知のいずれの方法により調べても良い。本方法においては、個々のスプライスバリアントを区別するため、各バリアント間で相違する領域に基づいてプライマーを設計することが好ましい。
【００２５】
本発明はさらに、被験者より採取された血液試料において、FynΔ7またはFynTの発現レベルを調べることを含む、統合失調症を発症する危険度を判定する方法を提供する。健常人と比較して被験者におけるFynΔ7の発現レベルが高い場合、またはFynTの発現レベルが低い場合に、その被験者は統合失調症を発症する危険度が高いと判定することができる。タンパク質の発現レベルは、前述のような方法により調べることができる。本方法においては、各バリアントを特異的に認識する抗体を使用することが好ましい。
【００２６】
有意差検定は、一元分散分析 (One-way ANOVA)、スチューデント t-検定、F-検定などにより行うことができる。
【００２７】
血液試料は、血液中のタンパク質またはmRNAレベルを調べることができる試料であれば、いずれの方法により調製したものも使用可能である。本発明の方法においては、被験者の末梢血より公知の方法（O. Lingjaerde, O. Kildemo, Agents Actions 11, 410-6 (Jul, 1981)）により調製することができる多血小板血漿が好適に用いられる。
【００２８】
本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、本発明はこれら実施例によっていかなる意味においても限定されるものではない。
【実施例】
【００２９】
１．材料と方法
１−１．被験者
以下の被験者より末梢血試料を採取した：DSM-IVの診断による統合失調症患者109人（男性65人、女性44人、年齢36.1 ± 12.6）、前記患者の一親等以内の家族75人（男性40人、女性35人、年齢54.7 ± 11.4)、および健常人162人（男性111人、女性51人、年齢27.0 ± 6.4）。いずれの被験者も、急性感染、炎症、または神経疾患の証拠は現れていなかった。
【００３０】
１−２．試料調製
分画遠心法により、血小板と単核球を主に含む多血小板血漿を調製した(O. Lingjaerde, O. Kildemo, Agents Actions 11, 410-6 (Jul, 1981))。説明すると、末梢血 30mlを含む試料を50 x gで15分間遠心し、その上清を1,000 x gで15分間遠心した。沈殿を1 mLのPBSに溶解し、3本のチューブに分け、1,000 x gで15分間遠心した。沈殿物を凍結し、使用まで液体窒素中で保存した。基本的に、これらチューブの1本はタンパク質アッセイに、1本はRNA解析に、そして1本はゲノム解析に使用した。しかしながら、被験者から採取した血液試料の量が限られたこと、および場合によっては同じ試料で同じアッセイを繰り返し行う必要があったことから、全ての被験者で３種類のアッセイ全てを行うことはできなかった。各解析の正確な試料数は、表１に示す。
【表１】
2007236300.tif 000002
【００３１】
１−３．ウェスタンブロッティング
試料をSDSサンプルバッファー（50 mM Tris HCl（pH 6.8）、5% SDS、10% グリセロール、1 mM オルトバナジウム酸ナトリウム）で可溶化し、超音波分解した後、20,000 x gで15分間遠心した。上清を回収し、タンパク質濃度をBCAタンパク質アッセイ(Pierce)にて測定した。それらをβ-メルカプトエタノール（全量の5％）あり、またはなしで煮沸した後、SDS-ポリアクリルアミド(10%)ゲル電気泳動にかけた。その後、タンパク質をPVDFメンブランに転写した。メンブランにラットモノクローナル抗Fyn抗体（γC3、Dr. Masahiro Yasudaが作成（M. Yasunaga et al., J Cell Biol 132, 91-9 (Jan, 1996)）を反応させ、さらにペルオキシダーゼ結合二次抗体を反応させた。免疫反応性タンパク質は、ECL-plus (Amersham)およびATTO Cool Saver (ATTO)で可視化した。その後、剥離バッファー(100 mM β-メルカプトエタノール、2% SDS、62.5 mM Tris-HCl（pH 6.7）)を50℃で30分間処理してメンブラン上の抗体を剥離した。洗浄およびブロッキングの後、メンブランに抗β-チューブリン抗体(H-235, Santa Cruz)を反応させ、続いてペルオキシダーゼ結合二次抗体を反応させた。
【００３２】
１−４．RNA抽出、RT-PCR、およびクローニング
TRIzol 試薬 (Invitrogen)により試料から全RNAを単離し、SuperScript II (Invitrogen)およびオリゴ-dTプライマーを用いて逆転写した。fynB、fynT、またはfynΔ7のcDNA領域（開始コドンの38ヌクレオチド上流から停止コドンの64ヌクレオチド下流まで）を、LA-Taqポリメラーゼ(Takara)とプライマー hfyn-30F (5’-AGT TTG TGA TCG TTG GCG-3’（配列番号９））およびhfyn+50R (5’-TGA AAG CTA ATG GGG AGG-3’（配列番号１０））とを用いて増幅した。fynBとfynTのヌクレオチド配列は、それぞれGenBank NM_002037およびS74774に基づいた。このPCR産物を、pBluescript SK- ベクター (Stratagene)にライゲートした。
【００３３】
１−５．競合的RT-PCR
Weil et al. が記載の方法（R. Weil et al., J Virol 73, 3709-17 (May, 1999)）を改変して用いた。説明すると、Ex-Taqポリメラーゼ (Takara)とプライマー hfyn390FおよびFAM-hfyn850R (5’-FAM-GTG TTT CCA TAC CAG GTA CC-3’（配列番号１１））とを用いてcDNAを増幅した。このPCR断片をSuprec-PCR (Takara)で精製し、ABI Prism 3100 Genetic Analyzerで解析した。
【００３４】
１−６．リアルタイムRT-PCR 
１−４．に記載のcDNA産物に対して、SYBR Green MixおよびABI PRISM 7900 HT (Applied Biosystems)を用いてリアルタイムPCRを行った。各PCR反応には、全量20μl中に2x SYBER Green Mix 10μl、各プライマー 5 pmol、およびcDNA調製物 1μlが含まれた。プライマーは、GAPDHについてはhGAPDH20F (5’-GTC AAC GGA TTT GGT CGT ATT GG-3’（配列番号１２））およびhGAPDHex3RV (5’-GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG-3’（配列番号１３））、fynTについてはhfyn610F (5’-AAA ATT CGC AAA CTT GAC AAT GGT-3’（配列番号１４））およびhfynT719R (5’-AAA CAC AAA CCG TCA GCT TTC TCT-3’（配列番号１５））を用いた。fynTまたはGAPDHを含有するプラスミドを調製し、このプラスミドを段階希釈したものをスタンダードとして使用した。所定の検量線における遺伝子含有プラスミドの数とそれに対応するCT値との間の直線関係を用いて、各反応のCT（cycle threshold）値から、プラスミドと同じ遺伝子の分子数を求めた。所定の試料における各cDNA分子の数は、同じ試料のGAPDHのcDNA分子の数で標準化した。
【００３５】
１−７．ゲノムDNAのシークエンス
エクソン6からエクソン8のゲノム領域をカバーするため、各試料のエクソン6からエクソン7B、およびエクソン7Aからエクソン8に由来する2つの4 kbの領域（0.2 kbが重複する）をLA-Taqポリメラーゼにより増幅した。PCRにはそれぞれ以下のプライマーを使用した：5’-ACA TGT GTG TGT GCA TCC-3’（配列番号１６）および5’-AGT GTC TTT GTC CCA ACG-3’（配列番号１７）、5’-TTT TAA CTT AAC TGT GAT TGC ATC GA-3’（配列番号１８）および5’-TGG GAA TAC TTG ACC CAG-3’（配列番号１９）。PCR産物をPEG沈殿により精製し、Applied Biosystems 3730 シークエンサーで直接シークエンスした。シークエンストレースは、SeqScape software (ABI)により解析した。ゲノムヌクレオチド配列は、GenBank HS66H14に基づいた。
多型の遺伝子型決定はダイレクトシークエンス法により行い、2組のプライマーペアで増幅した2種類の0.7kbのPCR断片を、それぞれPCRに使用したフォワードおよびリバースプライマーでシークエンスした。使用したプライマーは以下である：5’-GCT ACG TGT GGG TAT AGA TC-3’（配列番号２）および5’-CCC AAT TCT GAT GGG CAT GT-3’（配列番号３）、または5’-GCA GAA CAG GAA ACC AGT A-3’（配列番号２０）および5’-GCA GCC AGC CTT ATC AAT GA-3’（配列番号２１）。反復配列は、RepeatMasker (http://www.repeatmasker.org)により解析した。
【００３６】
１−８．インビトロ発現
pBlueScript SK- ベクター中のfynB、fynT、およびfynΔ7の完全長cDNAを、pcDNA 3.1またはpcDNA 3.1/myc-His (Invitrogen) 発現ベクターに移した。これらコンストラクトを、LipofectAmine 2000 試薬 (Invitrogen)を用いてHEK293T細胞にトランスフェクトした。24時間後、細胞試料を前記SDSサンプルバッファーで回収した。溶解物を直接、またはモノクローナル抗Fyn抗体 (γC3)で免疫沈降した後、ウェスタンブロッティングに使用した。チロシンリン酸化を評価するため、このブロットに抗ホスホチロシン抗体 PY100 (Cell Signaling Technology)を反応させた。
【００３７】
１−９．キナーゼアッセイ
免疫沈降のため、fynB、fynT、またはfynΔ7をトランスフェクトしたHEK293T細胞をTNEバッファー(10 mM Tris-HCl、pH 7.5, 1 mM EDTA、150 mM NaCl、1 mM Na3VO4、50μM Na2cO4、1% Nonidet P-40)で溶出した。モノクローナル抗Fyn抗体(γC3) 2μgを各タンパク質試料（TNEバッファー 300μl）に添加した。Protein G-Sepharose (Amersham)で吸収したのち、この免疫沈降物をTNEバッファーで３回、およびキナーゼアッセイバッファー(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 3 mM MnCl2, and 0.1 mM Na3VO4)で２回洗浄した。キナーゼアッセイでは、25μlのキナーゼアッセイバッファーが、前記免疫沈降物、酸処理エノラーゼ 2.5 μg、および32P-ATP 10μCuを含有した。30℃で10分間リン酸化を行い、リン酸化されたタンパク質をSDS-ポリアクリルアミド (10%)ゲル電気泳動で分離し、続いてオートラジオグラフィーを行った。
【００３８】
１−１０．統計解析
ウェスタンブロッティングおよび相対的mRNA発現の結果は、一元分散分析 (One-way ANOVA)、またはスチューデント t-検定およびF-検定 (StatView-J 5.0)により解析した。ゲノム多型の有意性は、χ2 検定(StatView-J 5.0)により解析した。0.05未満のPレベルを有意と判断した。
【００３９】
２．結果
２−１．統合失調症患者血清におけるFyn発現レベル
統合失調症患者のfyn遺伝子の異常について調べるため、統合失調症患者、その一親等以内の家族、および健常人の末梢血中のFyn（fyn遺伝子の最終産物）をウェスタンブロッティングにより調べた。Fynが特に血小板に豊富であること、簡単な方法で収集可能であることから、多血小板血漿を使用した。
健常人の試料では、Fynの強い免疫反応バンドが観察された。一方、統合失調症患者の試料の多くは、Fynの免疫反応が弱かった（図１Ａ）。Fynに対する免疫反応性と統合失調症との関係を明らかにするため、各バンドの濃さを測定し、その濃さを4μLのスタンダード試料の濃さと比較して標準化した。Fynバンドの濃さに、有意な性差または年齢依存性は見られなかった（図２ＡおよびＢ）。患者群のFynバンドの平均強度は対照（健常人）群と比較して有意に低く、家族群も程度は小さいものの対照群より有意に低かった（図１Ｂ）。
【００４０】
２−２．統合失調症患者試料におけるfyn遺伝子転写産物の選択的スプライスバリアント
Fynの減少がfyn遺伝子の転写産物の変化に起因するのかを調べるため、各試料のmRNAについてRT-PCRを行った。その結果、完全長のfyn cDNAに加えて、正常なfyn遺伝子転写産物（fynTおよびfynB）より約150 bp短い断片が増幅された（図３Ａ）。このバンドの強度は、健常人の試料と比較して統合失調症患者の試料の方が強かった。このバンドをクローニングしシークエンスした結果、これはfynΔ7として報告されているfyn遺伝子のスプライスバリアント(J. F. Goldsmith, C. G. Hall, T. P. Atkinson, Biochem Biophys Res Commun 298, 501-4 (Nov 8, 2002))であることがわかった（図３Ｂ）。
【００４１】
２−３．統合失調症患者試料におけるfynΔ7mRNA発現レベル
統合失調症患者の試料においてfynΔ7の発現レベルが高いことが示唆されたため、半定量的RT-PCR（競合的RT-PCR）を行って各fynアイソフォームの相対量を調べた (R. Weil et al., J Virol 73, 3709-17 (May, 1999))。
エクソン7の上流および下流にハイブリダイズするプライマーを用いて、各試料由来のmRNAを増幅した（図３Ｂ）。自動化シークエンサーで得られたPCR産物の電気泳動図より、これらPCR産物はfynB、fynT、およびfynΔ7であることがわかった。fynBはfynTと9 bp異なり、fynΔ7はfynTより156 bp短かった（図３Ｃ）。
次いで、各バンドの長さと蛍光強度を測定し比較した。図３Ｄに示すように、３つのアイソフォームの強度の合計で割ったfynBの強度の比の平均は、いずれの群も同程度であった。一方、one-way ANOVAによると、fynTの平均強度は対照群と比較して患者群および家族群で有意に低く、fynΔ7の平均強度は対照群と比較して患者群および家族群で有意に高かった（図３Ｄ）。fynTの減少およびfynΔ7の上昇は、患者群よりも家族群で大きい傾向があった。fynΔ7比は男性群よりも女性群のほうが高かったため、男性と女性の試料を別々に調べた。患者群および家族群におけるfynΔ7比の上昇は、いずれの性別でも観察された（図４Ａ）。一方、fynΔ7比に有意な年齢依存性は見られなかった（図４Ｂ）。相関解析により、Fynバンドの濃さとfynΔ7の発現レベルの間に、弱いものの有意な相関があることがわかった（n = 243）（図５）。
次に、fynTについて定量的RT-PCR（リアルタイムRT-PCR）を行い、一部の試料で解析に成功した。各試験チューブ（cDNA 1μL）に含まれるGAPDHが1000分子未満またはfynTが10分子未満の試料を排除した場合、平均発現レベル (fynT/GAPDH)は患者群で2.41 (n = 26)、家族群で2.36 (n = 28)、そして対照群で3.23 (n=60)であった。One-way ANOVAでは、この差は有意な差ではなかった。
【００４２】
２−４．FynΔ7のキナーゼ活性
fynΔ7遺伝子の転写産物の機能的役割を調べるため、HEK293T細胞における発現解析を行った。ウェスタンブロッティングにより、HEK293T細胞において、fynB、fynT、およびfynΔ7の各発現ベクターから、対応するタンパク質アイソフォームが産生されたことが示された。しかしながら、同じメンブランを抗ホスホチロシン抗体でリプローブしたところ、fynΔ7のレーンではシグナルが検出されなかった（図６Ａ）。
さらにこのタンパク質のキナーゼ活性について調べるため、インビトロキナーゼアッセイを行った。Goldsmith et al. が報告するように (J. F. Goldsmith, C. G. Hall, T. P. Atkinson, Biochem Biophys Res Commun 298, 501-4 (Nov 8, 2002))、FynΔ7が自己リン酸化活性を有さず、また反応系に添加したエノラーゼをリン酸化する能力も有さないことが確認された（図６Ｂ）。fynΔ7ベクターから産生されるFynΔ7タンパク質は、fynBベクターおよびfynTベクターから産生される対応のタンパク質より少なかった（図６ＣおよびＤ）。この現象は、等量のfynBベクターとfynΔ7ベクターを混合して同じ培養プレート中で細胞にトランスフェクトした場合にも観察された（データ非提示）。
【００４３】
２−５．fyn遺伝子のエクソン6およびエクソン8の間のシークエンス解析
選択的スプライシングに影響するゲノム多型を探索するため、fyn遺伝子のエクソン6と8の間のゲノム配列を調べた。はじめに、48人の試料（患者42人、家族6人）を用いて多型を探索し、11個のSNPと２つの8 bpリピート配列の１つの欠失を発見した（図７）。RepeatMaskerプログラムにより、これら多型はエクソン7Bとエクソン8の間の2つのAlu配列付近に集中していることがわかった。
次に、これら試料の10%以上に観察された多型に注目し、より多くの試料（患者109人、家族45人、および健常人140人）を用いて、これら多型の遺伝子型を決定した。Hardy-Weinberg平衡の偏差は、各SNP分布において統計学的に有意ではなかった。患者および健常人の結果についてχ2検定を行ったところ、統合失調症とSNP(rs9481183)（fyn遺伝子のゲノムDNA上（配列番号１）の５１７７位）および8 bp欠失（fyn遺伝子のゲノムDNA上（配列番号１）の５１２３〜５１３０位）との間に有意な相関があることがわかった（表２）。数人の被験者では、このSNPと8bp欠失とは連鎖していなかった。このことは、異なるプライマーペアによる増幅によっても確認された。また、これら2つの多型の家族群における遺伝子型分布は、患者群と対照群の中間の分布を示した。他の多型では群間で明らかな分布の差は認められなかった。SNP(rs9481183)について、野生型（AA）の頻度は、対照群より統合失調症患者群のほうが高かった。fynΔ7の発現比は、試料が野生型アリルを有する場合のほうが高かったが(+17.5%)、この差は有意ではなかった（p = 0.08、スチューデント t-検定、優性遺伝モデル）。
【表２】
2007236300.tif 000003
【００４４】
３．まとめ
被験者血液におけるFynの発現レベル、およびfynΔTまたはfynT mRNAの発現レベルは、統合失調症と関係することが示された。また、統合失調症と相関するfyn遺伝子におけるSNPおよび8bpの欠失が同定された。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、統合失調症におけるFyn発現レベルの低下を示す。（Ａ）ウェスタンブロッティングの結果。（Ｂ）各被験者のFynバンドの平均強度。＊：p ＜ 0.05, ＊＊：p ＜ 0.0015, One-way ANOVA。
【図２】図２は、Fyn発現レベルに対する性別および年齢の影響を示す。（Ａ）Fyn発現レベルと性別の関係。男性(n=175)、女性(n=116)。（Ｂ）Fyn発現レベルと年齢の関係。
【図３】図３は、統合失調症患者におけるfyn遺伝子スプライシングパターンを示す。（Ａ）fyn遺伝子PCR産物の電気泳動。矢印は、正常なfyn遺伝子転写産物（約1700 bp）より小さいバンド（約1550 bp）を示す。（Ｂ）選択的スプライシングによる３種類のfynアイソフォーム：fynB（エクソン7Aを使用）、fynT（エクソン7Bを使用）、およびfynΔ7（エクソン7が欠失）。（Ｃ）半定量的RT-PCRによるPCR産物の電気泳動図。（Ｄ）各アイソフォームの平均強度。One-way ANOVA, ＊：p ＜ 0.05, ＊＊：p ＜ 0.01。C:健常人、F:家族、S:患者。
【図４】図４は、fynΔ7mRNA発現に対する性別および年齢の影響を示す。（Ａ）fynΔ7mRNA発現と性別の関係。＊＜0.05；＊＊＜0.01；＃＜0.001, One-way ANOVA。C:健常人、F:家族、S:患者。（Ｂ）fynΔ7mRNA発現と年齢の関係。
【図５】図５は、Fynバンドの濃さとfynΔ7mRNAの発現比との間の相関解析を示す。
【図６】図６は、HEK293T 細胞におけるFynB、FynT、およびFynΔ7の発現を示す。（Ａ）FynB、FynT、およびFynΔ7の自己リン酸化活性。（Ｂ）FynB、FynT、およびFynΔ7の自己およびエノラーゼリン酸化活性。（Ｃ）fynT、fynB、およびfynΔ7ベクターから産生されるタンパク質。（Ｄ）FynB、FynT、およびFynΔ7の発現レベルの比較。One-way ANOVA, ＊P＜0.01。P-Tyr：ホスホチロシン；WB：ウェスタンブロット；IP：免疫沈降；C：対照ベクター (pcDNA 3.1)。
【図７】図７は、fyn遺伝子のエクソン6からエクソン8のゲノム領域を示す略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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