(57)【要約】      （修正有）【課題】改変型ＰＱＱＧＤＨを反応させる工程を含むグルコース測定において高濃度のグルコースに対する反応阻害を抑制する方法を提供する。【解決手段】改変型ＰＱＱＧＤＨを反応させる工程を含むグルコース測定において、改変型ＰＱＱＧＤＨを、コハク酸、グルタル酸、マロン酸、リンゴ酸、フタル酸、２−ケトグルタル酸、３，３−ジメチルグルタル酸、ピメリン酸、スベリン酸、アジピン酸、及びクエン酸アジピン酸からなる群より選ばれるいずれか１つ以上、アミノ酸、および／または、塩類の存在下で反応させる工程を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定方法において、該改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを、コハク酸、マロン酸、グルタル酸、リンゴ酸、３，３−ジメチルグルタル酸、ピメリン酸、及びアジピン酸からなる群より選ばれるいずれか１つ以上、アミノ酸、および／または、塩類の存在下で反応させる工程を含む、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定において高濃度のグルコースに対する反応阻害を抑制する方法。
【請求項２】
１００ｍＭ以上のグルコースを含有する改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ反応系において、反応阻害の抑制効果が見られる、請求項１に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定において高濃度のグルコースに対する反応阻害を抑制する方法。
【請求項３】
アミノ酸がリジンであり、および／または、塩類が塩化カリウムであって、これらの群より選ばれる少なくとも１種類の化合物が含有する、請求項１、２のいずれかに記載の改
変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定において高濃度のグルコースに対する反応阻害を抑制する方法。
【請求項４】
アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼが、対応する野生型酵素と比較してマルトース作用性の低下したピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼである、請求項１に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定において高濃度のグルコースに対する反応阻害を抑制する方法。
【請求項５】
改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程が、アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコース測定用試薬組成物においてなされることを含む、請求項１に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定において高濃度のグルコースに対する反応阻害を抑制する方法。
【請求項６】
グルコース測定用組成物がグルコースアッセイキットに含まれる形態をとることを含む、請求項５に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定において高濃度のグルコースに対する反応阻害を抑制する方法。
【請求項７】
改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程が、アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含み、かつ、少なくとも作用極と対極からなる電極を含むグルコースセンサーにおいてなされることを含む、請求項１に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定において高濃度のグルコースに対する反応阻害を抑制する方法。
【請求項８】
グルコースセンサーにおける反応が、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含む反応溶液に電圧を印加し、メディエーターの酸化電流を測定してなる、請求項７に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定において高濃度のグルコースに対する反応阻害を抑制する方法。
【請求項９】
アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ、および、コハク酸、マロン酸、グルタル酸、リンゴ酸、３，３−ジメチルグルタル酸、ピメリン酸、及びアジピン酸からなる群より選ばれるいずれか１つ以上、アミノ酸、および／または、塩類を含む、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコース測定用組成物において高濃度のグルコースに対する反応阻害を抑制したグルコース測定用組成物。
【請求項１０】
アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ、および、コハク酸、マロン酸、グルタル酸、リンゴ酸、３，３−ジメチルグルタル酸、ピメリン酸、及びアジピン酸からなる群より選ばれるいずれか１つ以上、アミノ酸、および／または、塩類を含む、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースセンサーにおいて高濃度のグルコースに対する反応阻害を抑制したグルコースセンサー。
【請求項１１】
コハク酸、マロン酸、グルタル酸、リンゴ酸、３，３−ジメチルグルタル酸、ピメリン酸、及びアジピン酸からなる群より選ばれるいずれか１つ以上、アミノ酸、および／または、塩類を含有させる工程を含む、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコース測定用組成物において高濃度のグルコースに対する反応阻害を抑制したグルコース測定用組成物の製造方法。
【請求項１２】
コハク酸、マロン酸、グルタル酸、リンゴ酸、３，３−ジメチルグルタル酸、ピメリン酸、及びアジピン酸からなる群より選ばれるいずれか１つ以上、アミノ酸、および／または、塩類をを含有させる工程を含む、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースセンサーにおいて高濃度のグルコースに対する反応阻害を抑制したグルコースセンサーの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ピロロキノリンキノンをＰＱＱ、グルコースデヒドロゲナーゼをＧＤＨ、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼをＰＱＱＧＤＨともそれぞれ記載する。）を反応させる工程を含むグルコース測定において高濃度のグルコースに対する反応阻害を抑制させる方法、該高濃度のグルコースに対する反応阻害が抑制したグルコース測定用組成物、グルコースセンサー、ならびに、それらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素（本願では、ＰＱＱＧＤＨとも記載する。）は、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）である。グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒するから、血糖の測定に用いることができる。血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマーカーとして臨床診断上きわめて重要な指標である。現在、血中グルコース濃度の測定はバイオセンサーを用いる方法が主流となっているが、血中グルコース濃度の測定に使用される酵素としてピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素が注目されている。このようなＰＱＱＧＤＨとして例えば、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ
ｂａｕｍａｎｎｉｉ）  ＮＣＩＭＢ１１５１７株が、ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素を産生することを見出し，遺伝子のクローニングならびに高発現系を構築した事例（たとえば、特許文献１を参照。）などが開示されている。
【特許文献１】特開平１１−２４３９４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素は、Ｄ−グルコースを酸化してＤ−グルコノ−１，５−ラクトンを生成する反応を触媒する点、及び反応系の溶存酸素の影響を受けず、補酵素添加を必要としない酵素特性を有する点より、血糖の生化学診断薬はもちろん血糖センサー等幅広い用途が期待される反面、センサーへの適用検討にあたっては感度低下の問題の指摘があった。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは上記課題を解決するため、その原因について鋭意研究したところ、一般的に血糖センサーで電子のメディエーターとして使用されるフェリシアン化物イオンに対する反応性が低いことがわかった。
我々はこの点についてさらに検討を加え、フェリシアン化物イオンに対して反応性が低い原因は、バッファー条件が中性付近で反応阻害の影響を受けているためであることを明らかにした。
これまでＰＱＱＧＤＨの反応阻害を回避する方策に関する報告としては特許文献１があり、その中では遺伝子レベルでのＰＱＱＧＤＨ改変手段を用いた検討が報告されている（例えば特許文献２を参照。）が、その反応阻害のメカニズムについては開示も示唆もされておらず、測定反応条件の観点から反応阻害を解決する手段については、その可能性にすら触れられていなかった。
【特許文献２】ＷＯ０３／１０６６６８
【０００５】
本発明者らは、過去の方策とは異なる視点から、より簡便な反応阻害の回避策を探ることとし、さらなる鋭意研究を実施した結果、グルコース測定反応系の組成物を改良するこ
とによりＰＱＱＧＤＨの反応阻害を回避することができることを明らかにし、遂に本発明を完成するに到った。即ち本発明は、
［項１］
アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定方法において、該改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを、コハク酸、マロン酸、グルタル酸、リンゴ酸、３，３−ジメチルグルタル酸、ピメリン酸、及びアジピン酸からなる群より選ばれるいずれか１つ以上、アミノ酸、および／または、塩類の存在下で反応させる工程を含む、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定において高濃度のグルコースに対する反応阻害を抑制する方法。
［項２］
１００ｍＭ以上のグルコースを含有する改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ反応系において、反応阻害の抑制効果が見られる、項１に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定において高濃度のグルコースに対する反応阻害を抑制する方法。
［項３］
アミノ酸がリジンであり、および／または、塩類が塩化カリウムであって、これらの群より選ばれる少なくとも１種類の化合物が含有する、項１、２のいずれかに記載の改変型
ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定において高濃度のグルコースに対する反応阻害を抑制する方法。
［項４］
アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼが、対応する野生型酵素と比較してマルトース作用性の低下したピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼである、項１に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定において高濃度のグルコースに対する反応阻害を抑制する方法。
［項５］
改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程が、アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコース測定用試薬組成物においてなされることを含む、項１に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定において高濃度のグルコースに対する反応阻害を抑制する方法。
［項６］
グルコース測定用組成物がグルコースアッセイキットに含まれる形態をとることを含む、項５に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定において高濃度のグルコースに対する反応阻害を抑制する方法。
［項７］
改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程が、アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含み、かつ、少なくとも作用極と対極からなる電極を含むグルコースセンサーにおいてなされることを含む、項１に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定において高濃度のグルコースに対する反応阻害を抑制する方法。
［項８］
グルコースセンサーにおける反応が、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含む反応溶液に電圧を印加し、メディエーターの酸化電流を測定してなる、項７に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定において高濃度のグルコースに対する反応阻害を抑制する方法。
［項９］
アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ、および、コハク酸、マロン酸、グルタル酸、リンゴ酸、３，３−ジメチルグルタル酸、ピメリン酸、及びアジピン酸からなる群より選ばれるいずれか１つ以上、アミノ酸、および／または、塩類を含む、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコース測定用組成物において高濃度のグルコースに対する反応阻害を抑制したグルコース測定用組成物。
［項１０］
アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ、および、コハク酸、マロン酸、グルタル酸、リンゴ酸、３，３−ジメチルグルタル酸、ピメリン酸、及びアジピン酸からなる群より選ばれるいずれか１つ以上、アミノ酸、および／または、塩類を含む、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースセンサーにおいて高濃度のグルコースに対する反応阻害を抑制したグルコースセンサー。
［項１１］
コハク酸、マロン酸、グルタル酸、リンゴ酸、３，３−ジメチルグルタル酸、ピメリン酸、及びアジピン酸からなる群より選ばれるいずれか１つ以上、アミノ酸、および／または、塩類を含有させる工程を含む、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコース測定用組成物において高濃度のグルコースに対する反応阻害を抑制したグルコース測定用組成物の製造方法。
［項１２］
コハク酸、マロン酸、グルタル酸、リンゴ酸、３，３−ジメチルグルタル酸、ピメリン酸、及びアジピン酸からなる群より選ばれるいずれか１つ以上、アミノ酸、および／または、塩類をを含有させる工程を含む、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースセンサーにおいて高濃度のグルコースに対する反応阻害を抑制したグルコースセンサーの製造方法。
である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明による反応阻害を抑制する組成物は、グルコース測定試薬、グルコースアッセイキット及びグルコースセンサーでの高濃度グルコース測定を可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
本発明でいう反応阻害とは、測定対象であるサンプルのグルコース（基質）濃度を上げていった際に、一定濃度を境に反応速度が低下する現象をさす。種々のグルコース濃度のサンプルを測定した場合、反応速度が低下する直前のグルコース濃度を「反応阻害が起こらない最高濃度」とみなす。
【０００９】
また、「反応阻害を抑制する」とは、「反応阻害が起こらない最高濃度」を上げることであるが、実際的には、正常血糖値（グルコース濃度）が５ｍＭ（９０ｍｇ／ｄｌ）程度、高血糖値が１０ｍＭ（１８０ｍｇ／ｄｌ）程度であることから判断して、それらより有意に高値である３０ｍＭ（５４０ｍｇ／ｄｌ）まで反応阻害が認められなければ（すなわち「反応阻害が起こらない最高濃度」が３０ｍＭ以上であれば）実用上十分である。１００ｍＭまで反応阻害が認められなければさらに好ましい。
本発明でいう、「高濃度のグルコースに対する反応阻害の抑制」とは、グルコース濃度５ｍＭ以下までの濃度範囲において、上記反応阻害がおこらないことを指す。好ましくはグルコース濃度１０ｍＭ以下、さらに好ましくはグルコース濃度３０ｍＭ以下、最も好ましくは１００ｍＭ以下までの濃度範囲において、上記反応阻害がおこらないことを指す。
【００１０】
本発明の方法に適用することができるＰＱＱＧＤＨは、ピロロキノリンキノンを補酵素として配位し、Ｄ−グルコースを酸化してＤ−グルコノ−１，５−ラクトンを生成するという反応を触媒する酵素（ＥＣ１．１．５．２（旧ＥＣ１．１．９９．１７））であり、由来や構造に関しては特に限定するものではない。
好ましくは、野生型ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼに適用される。ここでアミノ酸配列の改変とは、遺伝子工学的手法により元来のアミノ酸配列に少なくとも１以上のアミノ酸残基の置換・挿入・欠失を実施することをいう。中でも、かかるアミノ酸配列の改変を施すことによって、対応する野生型酵素と比較してマルトースへの作用性が低下した改変型ＰＱＱＧＤＨを用いるのが好ましい。
【００１１】
本発明に用いる改変型ＰＱＱＧＤＨは、例えば、野生型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を取得し、次いでそれを改変して改変型ＰＱＱＧＤＨをコードするポリヌクレオチドを構築し、次いで当該ポリペプチドを適当な発現系において発現させることによって作製されうる。
【００１２】
本発明に用いる改変型ＰＱＱＧＤＨの改変の基になる野生型のＰＱＱＧＤＨとしては、由来は特に限定されない。例えば微生物では、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）（例えば、特許文献１を参照。）、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）（例えば、非特許文献１および２を参照。）、シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）（例えば、非特許文献３を参照。）等の酸化細菌やアグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（例えば、非特許文献４を参照。）、クレブシーラ・エーロジーンズ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）等の腸内細菌、ブルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｒｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）などを挙げることができる。
【非特許文献１】Ａ．Ｍ．Ｃｌｅｔｏｎ−Ｊａｎｓｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０，２１２１（１９８８）
【非特許文献２】Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１７，４３０（１９８９）
【非特許文献３】Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２９，２０６（１９９１）
【非特許文献４】Ａ．Ｍ．Ｃｌｅｔｏｎ−Ｊａｎｓｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，６３０８（１９９０）
【００１３】
上記のうち好ましいのは、アシネトバクター属由来のＰＱＱＧＤＨである。これらは可溶型酵素であり水系において易溶である。さらに好ましいのは、アシネトバクター・カルコアセティカスもしくはアシネトバクター・バウマンニのいずれかに由来するＰＱＱＧＤＨである。さらにより好ましいのは、アシネトバクター・バウマンニ  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来（例えば、特許文献１を参照。）、アシネトバクター・カルコアセティカス
ＬＭＤ７９．４１株由来（例えば、非特許文献１および２を参照。）、もしくは、アシネトバクター・カルコアセティカス  ＩＦＯ  １２５５２株（例えば、特許文献３を参照。）のＰＱＱＧＤＨである。もっとも好ましいのは、アシネトバクター・バウマンニ  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来のＰＱＱＧＤＨである。なお、アシネトバクター・バウマンニＮＣＩＭＢ１１５１７株は、分類当初はＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓとされていた。
【特許文献３】特開２００４−１７３５３８
【００１４】
これらはいずれも、アミノ酸配列、遺伝子配列が公知であるか、酵素の精製法が確立されていてその理化学的性質も明らかになっているものであり、このような知見を基に、当業者であれば改変型ＰＱＱＧＤＨを容易に作製することができる。
このような改変は当該技術分野における公知技術を用いて当業者であれば容易に実施することが出来る。例えば、蛋白質に部位特異的変異を導入するために当該蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列を置換または挿入するための種々の方法が、Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。
【００１５】
本発明の方法に適用することができるＰＱＱＧＤＨは、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、上記に例示されたものにさらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていてもよい。
【００１６】
例えば、上記のＰＱＱＧＤＨを生産する天然の微生物、あるいは、天然のＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子をそのまま、あるいは、変異させてから、発現用ベクター（多くのものが当該技術分野において知られている。例えばプラスミド。）に挿入し、適当な宿主（多くのものが当該技術分野において知られている。例えば大腸菌。）に形質転換させた形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じてＥＤＴＡなどのキレート剤や界面活性剤等を添加して可溶化し、ＰＱＱＧＤＨを含む水溶性画分を得ることができる。または適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現したＰＱＱＧＤＨを直接培養液中に分泌させることが出来る。
【００１７】
上記のようにして得られたＰＱＱＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。また、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＰＱＱＧＤＨを得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００１８】
上記工程と前後して、全ＧＤＨ酵素タンパク質に対するホロ型ＰＱＱＧＤＨの割合を向上させるために、好ましくは２５〜５０℃、より好ましくは３０〜４５℃の加熱処理を行っても良い。
【００１９】
本発明におけるＰＱＱＧＤＨの濃度は特に制約がない。
【００２０】
ＰＱＱＧＤＨの酵素活性は以下の方法により測定できる。
ＰＱＱＧＤＨ酵素活性の測定方法
（１）測定原理
Ｄ−グルコース＋ＰＭＳ＋ＰＱＱＧＤＨ  →  Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン  ＋  ＰＭＳ（ｒｅｄ）
２ＰＭＳ（ｒｅｄ）  ＋  ＮＴＢ  →  ２ＰＭＳ  ＋  ジホルマザン
フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）（ｒｅｄ）によるニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）の還元により形成されたジホルマザンの存在は、５７０ｎｍで分光光度法により測定した。
（２）単位の定義
１単位は、以下に記載の条件下で１分当たりジホルマザンを０．５ミリモル形成させるＰＱＱＧＤＨの酵素量をいう。
（３）方法
試薬
Ａ．Ｄ−グルコース溶液：０．５Ｍ（０．９ｇ  Ｄ−グルコース（分子量１８０．１６）／１０ｍｌ  Ｈ２Ｏ）
Ｂ．ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液，  ｐＨ６．５：５０ｍＭ（６０ｍＬの水中に懸濁した１．５１ｇのＰＩＰＥＳ（分子量３０２．３６）を、５Ｎ  ＮａＯＨに溶解し、２．２ｍｌの１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加える。５Ｎ  ＮａＯＨを用いて２５℃でｐＨを６．５±０．０５に調整し、水を加えて１００ｍｌとした。）
Ｃ．ＰＭＳ溶液：３．０ｍＭ（９．１９ｍｇのフェナジンメトサルフェート（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｄ．ＮＴＢ溶液：６．６ｍＭ（５３．９６ｍｇのニトロテトラゾリウムブルー（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｅ．酵素希釈液：１ｍＭ  ＣａＣｌ２，  ０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，  ０．１％  ＢＳＡを含む５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）
手順
遮光ビンに以下の反応混合物を調製し、氷上で貯蔵した（用時調製）
１．８ｍｌ  Ｄ−グルコース溶液          （Ａ）
２４．６ｍｌ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）    （Ｂ）
２．０ｍｌ  ＰＭＳ溶液                              （Ｃ）
１．０ｍｌ  ＮＴＢ溶液                              （Ｄ）
上記アッセイ混合物中の濃度は次のとおり。
ＰＩＰＥＳ緩衝液  ４２ｍＭ
Ｄ−グルコース  ３０ｍＭ
ＰＭＳ  ０．２０ｍＭ
ＮＴＢ  ０．２２ｍＭ
３．０ｍｌの反応混合液を試験管（プラスチック製）に入れ、３７℃で５分間予備加温した。
０．１ｍｌの酵素溶液を加え、穏やかに反転して混合した。
５７０ｎｍでの水に対する吸光度の増加を３７℃に維持しながら分光光度計で４〜５分間記録し、曲線の初期直線部分からの１分当たりのΔＯＤを計算した（ＯＤテスト）。
同時に、酵素溶液に代えて酵素希釈液（Ｅ）加えることを除いては同一の方法を繰り返し、ブランク（ΔＯＤブランク）を測定した。
アッセイの直前に氷冷した酵素希釈液（Ｅ）で酵素粉末を溶解し、同一の緩衝液で０．１−０．８Ｕ／ｍｌに希釈した（該酵素の接着性のためにプラスチックチューブの使用が好ましい）。
計算
活性を以下の式を用いて計算する：
Ｕ／ｍｌ＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤテスト−  ΔＯＤブランク）×Ｖｔ×ｄｆ｝／（２０．１×１．０×Ｖｓ）
Ｕ／ｍｇ＝（Ｕ／ｍｌ）×１／Ｃ
Ｖｔ：総体積（３．１ｍｌ）
Ｖｓ：サンプル体積（１．０ｍｌ）
２０．１：ジホルマザンの１／２ミリモル分子吸光係数
１．０：光路長（ｃｍ）
ｄｆ：希釈係数
Ｃ：溶液中の酵素濃度（ｃ  ｍｇ／ｍｌ）
【００２１】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを反応させる工程を含むグルコース測定において高濃度のグルコースに対する反応阻害を抑制する方法において、ＰＱＱＧＤＨと共存させる物質としては、コハク酸、グルタル酸、マロン酸、リンゴ酸、フタル酸、２−ケトグルタル酸、３，３−ジメチルグルタル酸、ピメリン酸、スベリン酸、アジピン酸、及びクエン酸からなる群より選ばれる物質のうち少なくとも１種類である。これらの共通する特徴は、ジカ
ルボン酸ということである。
【００２２】
本発明の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定において高濃度のグルコースに対する反応阻害を抑制する方法にはさらにバッファー成分、界面活性剤、ＰＱＱＧＤＨの活性および安定性を最大限発揮させるための金属塩、親水性ポリマー及び各種安定化剤等を含んでいてもよい。バッファー成分としては特に限定しないが、例えば、リン酸カリウム塩、リン酸ナトリウム塩、ＰＩＰＥＳやＭＥＳなどのＧＯＯＤの緩衝剤、酢酸、グリシン、ホウ酸等を挙げることができる。また界面活性剤は特に限定しないが、各種Ｔｒｉｔｏｎ、Ｔｗｅｅｎ、胆汁酸、ＳＤＳ等を挙げることができる。また、金属塩としては活性中心に結合することが知られているカルシウムを含む化合物がより好適である。安定化剤としては例えば牛血清アルブミン・卵白アルブミン等のタンパク質、グルタミン・リジン及びグルタミン酸に代表されるアミノ酸等を挙げることができる。
【００２３】
本発明の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定において高濃度のグルコースに対する反応阻害を抑制する方法に含まれる、ジカルボン酸あるいはアミノ酸あるいは塩類の含有量は、基質特異性の向上に効果がある範囲であればよく、特に限定しないが、０．００１％以上であり、より好ましくは０．００２％以上である。
【００２４】
本発明の方法においては測定時のｐＨは中性である。ｐＨが中性とは７．０±１．０を指し特に限定されないが、本発明において好ましい範囲はｐＨ６．５〜７．５である。
【００２５】
また、本発明は、上記グルコース定量用組成物にさらに各種メディエーターを添加し測定を行うグルコース定量方法を包含する。使用可能なメディエーターの例は上述のとおりである。
【００２６】
本発明の定量方法においてはグルコースの定量はメディエーターあるいは発色試薬の発色・減色に起因する特定波長の吸光度の増減を指標とする、いわゆる比色法を採用することもでき、あるいは反応溶液に電圧を印加しメディエーターの酸化電流値を元に定量することもできる。
【００２７】
本発明におけるグルコース定量方法においては、検体中のグルコースすべてをＰＱＱＧＤＨと反応させた後に蓄積された還元型メディエーターを定量する、いわゆるエンドポイント測定を行ってもよく、また基質であるグルコース濃度依存的なＰＱＱＧＤＨ酵素活性を測定する、いわゆるレート測定を行ってもよい。
【００２８】
本発明のグルコース定量用組成物およびグルコース定量方法は、より具体的には以下の形態をとることができる。
【００２９】
本発明の方法において測定時には、種々のバッファーを用いることが出来る。そのようなバッファーとしては、ｐＨを中性に保つことができる緩衝能を持つものであれば特に限定されない。一般に使用することができるバッファー種としては、トリス塩酸、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、コハク酸、フタル酸、マレイン酸、グリシン及びそれらの塩な
どやＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ等のグット緩衝液などがあげられる。
カルシウムと不溶性の塩を形成しない緩衝液が好ましい。
これらのうち１種のみを適用してもよいし、２種以上を用いてもよい。さらには上記以外を含む１種以上の複合組成であってもよい。
また、これらの添加濃度としては、緩衝能を持つ範囲であれば特に限定されないが、好ましい上限は１００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下である。好ましい下限は５ｍＭ以上である。
凍結乾燥物中においては緩衝剤の含有量は、特に限定されるものではないが、好ましくは０．１％（重量比）以上、特に好ましくは０．１〜３０％（重量比）の範囲で使用される。
これらは、種々の市販の試薬を用いることが出来る。
【００３０】
これらのバッファーは測定時に添加してもよいし、後記するグルコース測定用試薬、グルコースアッセイキットあるいはグルコースセンサーを作製するときに予め含有させておくこともできる。なお、その際には、液体状態、乾燥状態などの形態は問われず、測定時に機能するようにしておけばよい。
【００３１】
本発明の効果は、メディエーターを含む系においてより顕著なものとなる。本発明の方法に適用できるメディエーターは特に限定されないが、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）と２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）との組み合わせ、ＰＭＳとニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）との組み合わせ、ＤＣＰＩＰ単独、フェリシアン化物イオン（化合物としてはフェリシアン化カリウムなど）単独、フェロセン単独などが挙げられる。中でもフェリシアン化物イオン（化合物としてはフェリシアン化カリウムなど）が好ましい。
これらの各メディエーターは感度に様々な違いが存在するするために、添加濃度を一律に規定する必要性はないが、一般的には１ｍＭ以上の添加が望ましい。
【００３２】
これらのメディエーターは測定時に添加してもよいし、後記するグルコース測定用試薬、グルコースアッセイキットあるいはグルコースセンサーを作製するときに予め含有させておくこともできる。なお、その際には、液体状態、乾燥状態などの形態は問われず、測定時に反応時に解離してイオンの状態になるようにしておけばよい。
【００３３】
本発明においてはさらに必要に応じて種々の成分を共存させることが出来る。例えば、界面活性剤、安定化剤、賦形剤などを添加しても良い。
【００３４】
例えば、カルシウムイオンまたはカルシウム塩を含有させることにより、ＰＱＱＧＤＨを安定化させることができる。カルシウム塩としては、塩化カルシウムまたは酢酸カルシウムもしくはクエン酸カルシウム等の無機酸または有機酸のカルシウム塩などが例示される。また、水性組成物において、カルシウムイオンの含有量は、１×１０−４〜１×１０−２Ｍであることが好ましい。
【００３５】
カルシウムイオンまたはカルシウム塩を含有させることによる安定化効果は、グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されたアミノ酸を含有させることにより、さらに向上する。グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されるアミノ酸は、１種または２種以上であってもよい。ここにさらに牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）を含有させてもよい。
【００３６】
あるいは、（１）アスパラギン酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、リンゴ酸、α−ケトグルコン酸、α−サイクロデキストリンおよびそれらの塩からなる群から選ばれた
１種または２種以上の化合物および（２）アルブミンを共存せしめることにより、ＰＱＱＧＤＨを安定化することができる。
【００３７】
本発明においては以下の種々の方法によりグルコースを測定することができる。
本発明のグルコース測定用試薬、グルコースアッセイキット、グルコースセンサーは、液状（水溶液、懸濁液等）、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化したもの、凍結乾燥など種々の形態をとることができる。凍結乾燥法としては、特に制限されるものではなく常法に従って行えばよい。本発明の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られず、凍結乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
【００３９】
実施例１
グルコース測定系を用いた基質特異性の確認
測定原理
ＰＱＱＧＤＨ
Ｄ−グルコース＋フェリシアン化物イオン→
Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン  ＋  フェロシアン化物イオンＤ−グルコースの部分を他の糖類に変更して、それぞれの基質に対する特異性を測定する。フェリシアン化物イオンの還元により生じたフェロシアン化物イオンの存在は、分光光度法により波長４２０ｎｍでの吸光度の減少を測定することで確認した。
（２）方法
試薬
Ａ．各種緩衝液，  フタル酸−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ７．０：５０ｍＭ（６０ｍＬの水に１．０２ｇのフタル酸水素カリウム（分子量２０４．２２）を溶解し、２．２ｍｌの１０％
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加える。更に、５Ｎ  ＮａＯＨを用いて２５℃でｐＨを７．０±０．０５に調整し、水を加えて１００ｍｌとした。グルタル酸−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ７．０もフタル酸−ＮａＯＨ緩衝液の時と同様の方法で作製した。リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０においても、同濃度のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００となるように添加した。）Ｂ．フェリシアン化カリウム溶液：５０ｍＭ（０．１６５ｇ  フェリシアン化カリウム（分子量３２９．２５）を  １０ｍｌ  蒸留水にて溶解した）
Ｃ．ＰＱＱＧＤＨ溶液：１０００Ｕ／ｍｌ（約１０ｍｇ  ＰＱＱＧＤＨ（東洋紡績社製：ＧＬＤ−３３１）を蒸留水１０ｍｌに溶解した）
サンプル
Ｄ−グルコース溶液：各々１５０，３００，６００，９００，１２００及び１５００ｍＭの各濃度（２７０ｇ  Ｄ−グルコース（分子量１８０．１６）／１０００ｍｌＨ２Ｏにて
調製した１５００ｍＭグルコース溶液を基準にして、１／１０，２／１０，４／１０，６／１０，８／１０水希釈して作成した。）
手順
１．遮光ビンに以下の反応混合物を調製し、氷上で貯蔵した（用時調製）
４９．６ｍｌ  各種緩衝液（ｐＨ７．０）        （Ａ）
４．０ｍｌ  フェリシアン化カリウム溶液      （Ｂ）
５．６ｍｌ        （Ｃ）
２．  ３．０ｍｌの反応混合液を試験管（プラスチック製）に入れ、３７℃で５分間予備加温した。
３．  ０．１ｍｌのグルコース溶液を加え、穏やかに混合した。
４．  ４２０ｎｍでの水に対する吸光度の減少を３７℃に維持しながら分光光度計で１〜３分間記録し、曲線の初期直線部分からの１分間当たりのΔＯＤを計算した（ΔＯＤテスト）。同時に、グルコース溶液に代えて蒸留水を加えることを除いては同一の方法を実施し、ブランク（ΔＯＤブランク）を測定した。
上記操作を、各１５０ｍＭ〜１５００ｍＭの各濃度のグルコース溶液を用いて実施した。
【００４０】
計算
ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤテスト  −  ΔＯＤブランク）を算出することにより、単位時間当たりの吸光度変化を求めた。
グラフの横軸に反応液中のグルコース濃度、縦軸に各グルコース濃度に対応するΔＯＤ／ｍｉｎをプロットする。
フタル酸−ＮａＯＨ緩衝液で測定した結果を図１に、グルタル酸−ＮａＯＨ緩衝液で測
定した結果を図７に、リン酸カリウム緩衝液で測定した結果を図１３に示す。
【００４１】
実施例２
各種化合物によるＰＱＱＧＤＨ反応阻害の抑制効果の検討
実施例１のＰＱＱＧＤＨ反応系において、最終濃度が各種グラフの凡例の数字（％）となるように各種グラフのタイトルに記載の化合物を添加して、同様にグルコース濃度と活性値（ΔＯＤ／ｍｉｎ）の関係を調べた。フタル酸−ＮａＯＨ緩衝液をベースとした測定結果を図２〜６、グルタル酸−ＮａＯＨ緩衝液をベースとした測定結果を図８〜１２、リン酸カリウム緩衝液をベースとした測定結果を図１４〜１６に示す。
【００４２】
実施例３
グルコース電極での測定
乳鉢上においてカーボングラファイト０．５ｇと流動パラフィン０．３ｍＬを乳棒でよく練り、カーボンペーストとした。このカーボンペーストを白金電極上に塗りこみ、その上にＰＱＱＧＤＨ溶液（東洋紡製ＧＬＤ−３３１、２，０００Ｕ／ｍＬ）１０μＬをのせ、室温で３０分風乾した。この電極に分子量８，０００カットのセルロース製半透膜を被せてＯリングで半透膜を固定し、グルコース電極とした。このグルコース電極は、測定に使用するバッファーに３０分以上浸したのち使用した。使用バッファーとして、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０であり０．１％トリトンＸ−１００と１ｍＭＣａＣｌ２を含む。バッファーＡ）と、このバッファーＡにさらに１％のピメリン酸を溶解したもの（バッファーＢ）、そして５０ｍＭのグルタル酸（ｐＨ７．０であり、０．１％トリトンＸ−１００と１ｍＭＣａＣｌ２を含む。バッファーＣ）と、このバッファーＣに
さらに１％のコハク酸を溶解したもの（バッファーＤ）の計４種類を調製した。これら４種の溶液にメディエーターとしてそれぞれ終濃度０．１Ｍとなるようフェリシアン化カリウムを溶解し、反応液とした。まず、反応液２０ｍＬを２５℃でインキュベートし、ここに上記グルコース電極と、対極・参照極を浸し、＋０．３５Ｖの電圧を印加した。約５分後に応答電流値が安定したのを確認し、ここにＤ−グルコース溶液を添加して応答電流値の上昇をモニタリングした。Ｄ−グルコースを添加後に電流値が上昇し定常値に落ち着くまでの上昇度を応答値とした。各使用バッファーごとにＤ−グルコース濃度が４０ｍＭ、３０ｍＭ、２０ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭにおける測定値をプロットした結果を図１７に示す。ここで、理論値とは５ｍＭにおける測定値を元にＤ−グルコース量と測定値が比例しているとして算出される各濃度での応答値を指し、図中では直線で示している。それぞれリン酸、グルタル酸単独の溶媒に比してピメリン酸、コハク酸を添加した場合の方が応答値の直線性に優れ、特に３０ｍＭ以上のグルコース濃度における実測応答値が比較的理論値に近くなっている。これは、本発明により基質阻害を回避した結果としてグルコース高濃度領域での直線性がより良好になったものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定において高濃度のグルコースに対する反応阻害を抑制する方法を用いることにより、グルコース測定試薬、グルコースアッセイキット及びグルコースセンサでの測定精度を向上することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ＰＱＱＧＤＨのフタル酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）における基質濃度と反応速度の関係
【図２】所定濃度のコハク酸を添加した場合におけるＰＱＱＧＤＨのフタル酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）における基質濃度と反応速度の関係
【図３】所定濃度のピメリン酸を添加した場合におけるＰＱＱＧＤＨのフタル酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）における基質濃度と反応速度の関係
【図４】所定濃度の塩化カリウムを添加した場合におけるＰＱＱＧＤＨのフタル酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）における基質濃度と反応速度の関係
【図５】所定濃度のマロン酸を添加した場合におけるＰＱＱＧＤＨのフタル酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）における基質濃度と反応速度の関係
【図６】所定濃度のＬ−リジン塩酸塩を添加した場合におけるＰＱＱＧＤＨのフタル酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）における基質濃度と反応速度の関係
【図７】ＰＱＱＧＤＨのグルタル酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）における基質濃度と反応速度の関係
【図８】所定濃度のコハク酸を添加した場合におけるＰＱＱＧＤＨのグルタル酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）における基質濃度と反応速度の関係
【図９】所定濃度のピメリン酸を添加した場合におけるＰＱＱＧＤＨのグルタル酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）における基質濃度と反応速度の関係
【図１０】所定濃度のグルタル酸を添加した場合におけるＰＱＱＧＤＨのグルタル酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）における基質濃度と反応速度の関係
【図１１】所定濃度のＤＬ−リンゴ酸を添加した場合におけるＰＱＱＧＤＨのグルタル酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）における基質濃度と反応速度の関係
【図１２】所定濃度のアジピン酸を添加した場合におけるＰＱＱＧＤＨのグルタル酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）における基質濃度と反応速度の関係
【図１３】ＰＱＱＧＤＨのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）における基質濃度と反応速度の関係
【図１４】所定濃度のコハク酸を添加した場合におけるＰＱＱＧＤＨのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）における基質濃度と反応速度の関係
【図１５】所定濃度のピメリン酸を添加した場合におけるＰＱＱＧＤＨのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）における基質濃度と反応速度の関係
【図１６】所定濃度の３，３−ジメチルグルタル酸を添加した場合におけるＰＱＱＧＤＨのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）における基質濃度と反応速度の関係
【図１７】バッファーＡ〜Ｄを反応液として用いた場合のグルコース電極におけるグルコース濃度と応答値の関係
【図１】
2007068525.tif 000002
【図２】
2007068525.tif 000003
【図３】
2007068525.tif 000004
【図４】
2007068525.tif 000005
【図５】
2007068525.tif 000006
【図６】
2007068525.tif 000007
【図７】
2007068525.tif 000008
【図８】
2007068525.tif 000009
【図９】
2007068525.tif 000010
【図１０】
2007068525.tif 000011
【図１１】
2007068525.tif 000012
【図１２】
2007068525.tif 000013
【図１３】
2007068525.tif 000014
【図１４】
2007068525.tif 000015
【図１５】
2007068525.tif 000016
【図１６】
2007068525.tif 000017
【図１７】
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