(57)【要約】【課題】  ヒトにおける薬剤動態を正確に評価できる実験動物を提供する。【解決手段】    ヒトのシトクロームP450遺伝子が導入され、該遺伝子が発現していることを特徴とするクローンブタ及びブタクローン胚、並びに（１）除核した卵を調製する工程、（２）CYP遺伝子を導入した核ドナー細胞を調製する工程、（３）除核した卵と核ドナー細胞を融合させる工程、（４）融合卵を培養し、クローン胚を得る工程、及び（５）クローン胚を仮親ブタの卵管又は子宮に移植し、クローンブタを得る工程をことを特徴とするヒトのシトクロームP450遺伝子を発現するクローンブタの作製方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトのシトクロームP450遺伝子が導入され、該遺伝子が発現していることを特徴とするクローンブタ。
【請求項２】
シトクロームP450遺伝子が、シトクロームP450 3A4遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載のクローンブタ。
【請求項３】
ブタが、ミニブタであることを特徴とする請求項１又は２に記載のクローンブタ。
【請求項４】
以下の（１）〜（５）の工程を含むことを特徴とするヒトのシトクロームP450遺伝子を発現するクローンブタの作製方法、
（１）除核した卵を調製する工程、
（２）CYP遺伝子を導入した核ドナー細胞を調製する工程、
（３）除核した卵と核ドナー細胞を融合させる工程、
（４）融合卵を培養し、クローン胚を得る工程、
（５）クローン胚を仮親ブタの卵管又は子宮に移植し、クローンブタを得る工程。
【請求項５】
シトクロームP450遺伝子が、シトクロームP450 3A4遺伝子であることを特徴とする請求項４に記載のヒトのシトクロームP450遺伝子を発現するクローンブタの作製方法。
【請求項６】
核ドナー細胞が、ミニブタ由来の細胞であることを特徴とする請求項４又は５に記載のヒトのシトクロームP450遺伝子を発現するクローンブタの作製方法。
【請求項７】
ヒトのシトクロームP450遺伝子が導入され、該遺伝子が発現していることを特徴とするブタクローン胚。
【請求項８】
シトクロームP450遺伝子が、シトクロームP450 3A4遺伝子であることを特徴とする請求項７に記載のブタクローン胚。
【請求項９】
ブタが、ミニブタであることを特徴とする請求項７又は８に記載のブタクローン胚。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトのシトクロームP450（以下、「CYP」という）遺伝子が導入され、発現しているクローンブタ及びその作製方法、並びに前記遺伝子導入され、発現しているブタクローン胚に関する。本発明のクローンブタは、新薬開発、又は既存薬剤の生体への影響を調べるための試験に利用できる。
【背景技術】
【０００２】
従来、投与された薬剤の動態は、ヒト肝臓から単離されたミクロソーム画分あるいはラット等の実験動物を用いて研究が行われてきた（非特許文献１、非特許文献２）。しかし、ミクロソーム画分を用いた試験は試験管内で行われるため、全身における作用を反映しないこともある。また、実験動物から得られた知見は、動物の種類によって薬剤に対する生体反応が異なることから、必ずしもヒトに当てはまるわけではない。
【０００３】
【非特許文献１】In Vivo. 2005 Nov-Dec;19(6):1061-9, Effects of 5-methoxypsoralen (5-MOP) on arylamine N-acetyltransferase activity in the stomach and colon of rats and human stomach and colon tumor cell lines. Lee YM, Wu TH.
【非特許文献２】Clinical pharmacology and therapeutics., Interaction of flurbiprofen with cranberry juice, grape juice, tea, and fluconazole: in vitro and clinical studies., Greenblatt DJ, von Moltke LL, Perloff ES, Luo Y, Harmatz JS, Zinny MA.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ヒトにおける薬剤動態を実験動物に反映させるためには、投与薬物に対する代謝反応系で働く酵素をヒト由来の酵素に置き換えることが必要である。また、薬剤動態の試験では、薬剤の投与量は一般に体重あたりの量として設定されるので、実験動物としては、ヒトと個体重量及び肝臓等の臓器の大きさが近似した動物を使用することが望ましい。
本発明は、以上のような技術的背景の下になされたものであり、ヒトにおける薬剤動態を正確に評価できる実験動物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、CYP3A4遺伝子が生体内の薬剤代謝において中心的な役割を果たしていること、及びブタの個体重量及び臓器の大きさがヒトと比較的近似していることに着目し、ヒトCYP3A4遺伝子を導入したブタが、ヒトの薬剤動態を評価するための実験動物として好適であるという発想を得て、本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明は、以下の〔１〕〜〔９〕を提供するものである。
〔１〕ヒトのシトクロームP450遺伝子が導入され、該遺伝子が発現していることを特徴とするクローンブタ。
〔２〕シトクロームP450遺伝子が、シトクロームP450 3A4遺伝子であることを特徴とする〔１〕に記載のクローンブタ。
〔３〕ブタが、ミニブタであることを特徴とする〔１〕又は〔２〕に記載のクローンブタ。
〔４〕以下の（１）〜（５）の工程を含むことを特徴とするヒトのシトクロームP450遺伝子を発現するクローンブタの作製方法、
（１）除核した卵を調製する工程、
（２）CYP遺伝子を導入した核ドナー細胞を調製する工程、
（３）除核した卵と核ドナー細胞を融合させる工程、
（４）融合卵を培養し、クローン胚を得る工程、
（５）クローン胚を仮親ブタの卵管又は子宮に移植し、クローンブタを得る工程。
〔５〕シトクロームP450遺伝子が、シトクロームP450 3A4遺伝子であることを特徴とする〔４〕に記載のヒトのシトクロームP450遺伝子を発現するクローンブタの作製方法。
〔６〕核ドナー細胞が、ミニブタ由来の細胞であることを特徴とする〔４〕又は〔５〕に記載のヒトのシトクロームP450遺伝子を発現するクローンブタの作製方法。
〔７〕ヒトのシトクロームP450遺伝子が導入され、該遺伝子が発現していることを特徴とするブタクローン胚。
〔８〕シトクロームP450遺伝子が、シトクロームP450 3A4遺伝子であることを特徴とする〔７〕に記載のブタクローン胚。
〔９〕ブタが、ミニブタであることを特徴とする〔７〕又は〔８〕に記載のブタクローン胚。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のクローンブタは、投与薬剤に対し、ヒトと近似した代謝反応を示すので、新規薬剤又は既存薬剤のヒトへの影響を調べるための実験動物として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のクローンブタは、ヒトのCYP遺伝子が導入され、該遺伝子が発現していることを特徴とするものである。
【０００９】
導入するCYP遺伝子は特に限定されず、例えば、CYP3A4遺伝子（accession No.E10636）、CYP1A2遺伝子（accession No.M31664-31667）、CYP2A3遺伝子（accession No.X13929）、CYP2A4遺伝子（accession No.X13930）、CYP2A6遺伝子（accession No.U22027）、CYP2A7遺伝子（accession No.U22029）、CYP1B1遺伝子（accession No.U03688）、CYP2B6遺伝子（accession No.X16864）、CYP2C18遺伝子（accession No.M61853）、CYP2B1遺伝子（accession No.M29874）、CYP2B3遺伝子（accession No.M29873）、CYP2C8遺伝子（accession No.X56452）、CYP2C9遺伝子（accession No.M61855）、CYP2C17遺伝子（accession No.M61858）、CYP2C18遺伝子（accession No.M61856）、CYP2C19遺伝子（accession No.M61854）、CYP2D6遺伝子（accession No.M33388）、CYP2F遺伝子（accession No.J02906）、CYP4A遺伝子（accession No.L04751）などを導入することができる。
【００１０】
ブタの種類は特に限定されないが、小型のブタが好ましく、特にミニブタが好ましい。ここで「ミニブタ」とは、1950年頃から開発された小型のブタで成熟ブタの最大体形が60kg程度のブタを指す。幾種類かの系統が存在し、詳細については実験動物の基礎と技術  II各論  日本実験動物協会編(ISBN4-621-03419-7 C3047)p153-、新編  畜産大事典  田先威和夫  監修(ISBN4-8425-9601-5 C3061)p1428-1435、または日生研たより第50巻4号(ISBN0029-0750)p8-12等に示される特徴を有するものを指す。
【００１１】
本発明のクローンブタは、例えば、（１）除核した卵を調製する工程、（２）CYP遺伝子を導入した核ドナー細胞を調製する工程、（３）除核した卵と核ドナー細胞を融合させる工程、（４）融合卵を培養し、クローン胚を得る工程、（５）クローン胚を仮親ブタの卵管又は子宮に移植し、クローンブタを得る工程を含む方法によって作製することができる。以下各工程を説明する。
【００１２】
工程（１）：卵の除核は、クローン動物の作製に一般的に採用されている手法に従って行うことができる。このような方法としては、例えば、Polejaeva IAらの文献（Polejaeva IA, Chen S-H, Vaught TD, Page RL, Mullins J, Ball S, Dai Y, Boone J, Walker S, Ayares D, Colman A, Campbell KH. Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nature 2000; 407: 86-90.）に記載されている方法などを挙げることができる。また、除核は未受精卵に対して行うことが好ましく、特に第一極体の放出後の成熟卵に対して行うのが好ましい。
【００１３】
工程（２）：核ドナー細胞としては、クローン動物の作製に一般的に使用されているものでよく、例えば、胎児繊維芽細胞を使用することができる。また、核ドナー細胞は、ブタ由来のもであればどのようなものでもよいが、ミニブタ由来の細胞を用いることが好ましい。CYP遺伝子導入核ドナー細胞の調製は、CYP遺伝子を含むベクターを作製し、これを核ドナー細胞へ導入することにより行う。CYP遺伝子を含むベクターは、哺乳類遺伝子発現ベクターに、CYP遺伝子断片を挿入することにより作製できる。哺乳類遺伝子発現ベクターは、市販のものでよく、例えば、pEGFP-C1（Clonetech）、pRL-SV40(Promega)、pEF6/V5-His-TOPO(Invitrogen)などを用いることができる。CYP遺伝子を含むベクターの核ドナー細胞への導入は、通常のトランスフェクション試薬または電気穿孔法を用いて導入し、プラスミド上の薬剤耐性遺伝子で遺伝子が導入された細胞を選択する。調製した核ドナー細胞は、血清飢餓培養法（Campbell KHS, McWhir J, Ritchie WA, Wilmut I. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line. Nature 1996; 380: 64-66.）、接触阻止法（Onishi A, Iwamoto M, Akira T, Mikawa S, Takeda K, Awata T, Hanada H, Perry ACF. Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei. Science 2000; 289: 1188-1190.）などにより、細胞周期を休止期に誘導する。
【００１４】
工程（３）：卵と核ドナー細胞の融合は、クローン動物の作製に一般的に採用されている手法、例えば、電気融合法、注入法などによって行うことができる。電気融合法は、例えば、Polejaeva IAらの文献（Polejaeva IA, Chen S-H, Vaught TD, Page RL, Mullins J, Ball S, Dai Y, Boone J, Walker S, Ayares D, Colman A, Campbell KH. Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nature 2000; 407: 86-90.）の記載に従って行うことができ、注入法はOnishi Aらの文献（Onishi A, Iwamoto M, Akira T, Mikawa S, Takeda K, Awata T, Hanada H, Perry ACF. Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei. Science 2000; 289: 1188-1190.）の記載に従って行うことができる。電気融合法による電気刺激は、核ドナー細胞の核が卵に移植され、正常な胚が形成され得る範囲内であれば特に限定されないが、例えば、直流パルスであれば電圧は100〜300V/mm、時間は10〜30 micro-sec、回数は1〜3回とするのが好ましく、交流であれば周波数は1〜5MHz、電圧は1〜10V、時間は1〜30secとするのが好ましい。
【００１５】
融合処理後の卵には、活性化処理を行うのが好ましい。活性化処理は、クローン動物の作製に一般的に採用されている手法、例えば、電気刺激や塩化ストロンチウム処理などにより行うことができる。電気刺激による活性化処理としては、電圧30〜200 V/mm、時間10〜200 micro-sec、1〜5 回の直流パルスを印加する方法などを例示できる。また、活性化処理は、融合処理から0〜6時間後に行うのが好ましい。
また、活性化処理後の卵には、極体放出抑制処理を行うのが好ましい。極体放出抑制処理は、サイトカラシンなどを用いて行うことができる。
【００１６】
工程（４）：融合卵の培養は、クローン動物の作製に一般的に採用されている手法、例えば、Betthauser Jらの文献（Betthauser J, Forsberg E, Augenstein M, Childs L, Eilertsen K, Enos J, Forsythe T, Golueke P, Jurgella G, Koppang R, Lesmeister T, Mallon K, Mell G, Misica P, Pace M, Pfister-Genskow M, Strelchenko N, Voelker G, Watt S, Thompson S, Bishop M. Production of cloned pigs from in vitro systems. Nature Biotechnology 2000; 18: 1055-1059.）の記載に従って行うことができる。培地としては、NCNU23培地、TCM199、BECM、PZM培地などを使用することができる。
【００１７】
工程（５）：クローン胚の卵管あるいは子宮への移植は、クローン動物の作製に一般的に採用されている手法、例えば、Onishi Aらの文献（Onishi A, Iwamoto M, Akira T, Mikawa S, Takeda K, Awata T, Hanada H, Perry ACF. Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei. Science 2000; 289: 1188-1190）やBetthauser Jらの文献（Betthauser J, Forsberg E, Augenstein M, Childs L, Eilertsen K, Enos J, Forsythe T, Golueke P, Jurgella G, Koppang R, Lesmeister T, Mallon K, Mell G, Misica P, Pace M, Pfister-Genskow M, Strelchenko N, Voelker G, Watt S, Thompson S, Bishop M. Production of cloned pigs from in vitro systems. Nature Biotechnology 2000;18: 1055-1059.）の記載に従って行うことができる。クローン胚は、正常なクローンブタに生育できるものであれば特に限定されないが、１細胞期から胚盤胞期の胚を使用するのが好ましい。
【００１８】
本発明には、個体にまで成長したクローンブタだけでなく、その前段階であるブタクローン胚も含まれる。
【実施例】
【００１９】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
〔実施例１〕  ヒトCYP3A4遺伝子導入用プラスミドの作製
市販のヒト肝臓cDNA（製造元：Biosciences Clonetech:BD）を鋳型とし、下記のプライマーを用いて、ヒトCYP3A4遺伝子を増幅した。
hcyp5'-1: ATGGATCTCA TTCCAAACTT（配列番号１）
hcyp3'-2: TCAGGGTCCACTTGTAATCC（配列番号２）
hcyp5'-1及びhcyp3'-2は、それぞれGenBankデータベース上のヒトCYP3A4遺伝子（accession No. E10636）の1-20番目の塩基及び1512-1493番目の塩基と対応する。
PCRの条件は、トータルボリューム50μlの系で鋳型cDNA 0.1μgを用い,94℃で3分処理後、94℃ 1分、58℃1分、72℃ ２分の３ステップ、30サイクル、で行い、増幅終了後72℃ 5分の処理を行った。PCR後、増幅した断片をクローニングし、塩基配列を決定した。
この増幅断片を市販のプラスミドベクターpEGFP-C1(GenBank accession No. U55763図１)のEco47III, SalI 切断フラグメントへクローニングし、ヒトCYP3A4遺伝子導入用プラスミドpHCYP3A4を作製した（図１）。
【００２０】
〔実施例２〕  ヒトCYP3A4遺伝子導入ブタ胎児繊維芽細胞の調製
胎児繊維芽細胞の採取
妊娠２５日齢のデュロック種の胎児をハサミにより細断し、PBS(-)で洗浄した。これを1200rpmで５分間遠心処理し、沈殿を採取した。この沈殿に0.25%トリプシン（0.01% EDTA添加）を加え５分間静置した。続いて400rpmで５分間の遠心処理し、上清側に集まった細胞を採取した後に15%ウシ胎児血清（FCS）を添加したDulbecco’s Modified Eagle’s Medium（DMEM）に懸濁した。上記のトリプシン処理からの過程をもう一度繰り返し、最後に1200rpmで５分間遠心処理して得られた沈殿を5%CO2、37.5℃でインキュベーターにより培養した。
【００２１】
ヒトCYP3A4遺伝子の導入
1日目、上記ミニブタ胎児由来繊維芽細胞を直径６cmのプラスチックシャーレに4x105  cells/dish の濃度でまき、一晩5%CO2、37.5℃でインキュベーターにより培養した。
【００２２】
2日目、血清、抗生物質等を混合していないDulbecco’s Modified Eagle’s Medium（DMEM）197μlとFugene6 transufection reagent 6μlを混合後、これにキアゲン社製プラスミド精製キットで採取したプラスミドpHCYP3A4２μg(1μg/10μl)を混ぜ、30分室温放置した。
これを、上記細胞に滴下し、24時間5%CO2、37.5℃でインキュベーターにより一晩培養した。
【００２３】
3日目、細胞を0.25%トリプシン（0.01% EDTA添加）で消化した後、15%ウシ胎児血清（FCS）を添加したDulbecco’s Modified Eagle’s Medium（DMEM）で希釈し、2000 cells/wellになるように48穴プレートへまいた。この時、培地にG418を終濃度400 μ/mlになるように加え、1週間選択培養した。（培地交換は3日に一度行った）
1週間後、コロニーを作っているwellから細胞を上記と同じトリプシンで消化し、各コロニーを24 well プレートへまいた。G418の濃度は終濃度100 μg/mlになるように培地に加え、さらに1週間選択培養を行った。
得られた細胞コロニーを48 well、および  24wellへまき直し、24 well でconfluent になった細胞を液体窒素中に保存した。48 wellで培養した細胞は、RT-PCRに用いるRNA回収に用いた。
【００２４】
〔実施例３〕  レシピエント卵の調製
レシピエント卵は、ブタ（LW種、ＬＷＤ種、６ヶ月令）の卵巣から採取した卵を体外で培養して成熟させ、その後、核を取り除くことにより調製した。体外培養、除核は以下の通り行った。
【００２５】
体外培養
食肉工場から得た卵巣を0.2% 臭化セチルトリメチル  アンモニウム（CETAB）、続いてPBS(-)-PVAで３回洗った後、38.5℃の恒温槽で待機させた。卵巣は、75μg/mlペニシリンG、50μg/ml硫酸ストレプトマイシン、0.1%ポリビニールアルコールを添加したダルベッコPBS（PBS(-)-PVA）内に入れ、24〜30℃に加温した状態で食肉工場から輸送してきた。
【００２６】
ホットプレートにより38.5℃に加温した状態で、20ゲージの注射針と５mlシリンジを使い、直径３〜６mmの卵胞から卵胞液ごと卵を吸引した。得られた卵胞液を800rpmで２分間遠心処理することにより、卵を沈殿させた。この沈殿をTL-Hepes-PVPに懸濁させ、顕微鏡下で卵丘細胞が多量付着しており、かつ卵の細胞質が正常な卵丘卵子複合体を選別した。選別した卵丘卵子複合体を、NCSU23に0.6mMシステイン、10μg/ml上皮増殖因子（EGF）、10%ブタ卵胞液、75μg/mlペニシリンG、50μg/ml硫酸ストレプトマイシン、10IU/mlウマ絨毛性ゴナドトロピン（eCG）、10IU/mlヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）を添加したNCSU23培養液で5%CO2、38.5℃でインキュベーターにより培養した。培養開始から22時間後にホルモンを除いたNCSU23に移し変え、さらに22時間培養した。
【００２７】
培養を終了した卵を0.01%ヒアルロニダーゼで処理した後、TL-Hepes-PVPのドロップ内においてピペッティングにより卵丘細胞、顆粒層細胞を除去した。これにより卵の透明帯が露出し、顕微鏡下での観察や操作が容易となる。次に、成熟卵の特徴である第一極体の放出を起こした卵のみを選別した。また、この際に死んだ卵および細胞質の形状がいびつな卵などは排除した。
【００２８】
除核
除核は、7.5μg/mlサイトカラシンB、10%ウシ胎児血清（FCS）を添加したTL-Hepes-PVP内の卵の第一極体周辺の細胞質を吸引することにより行った。細胞質の吸引には、先端が鋭角の口径30μmのピペットを用いた。
除核が正常に行われたかどうかは、ヘキスト染色により確認した。即ち、除核処理後の卵を、5μg/mlヘキスト33342を添加したTL-Hepes-PVPドロップ内に５分間入れて染色し、その後、蛍光顕微鏡で卵内を観察した。ヘキスト33342はDNAに結合する蛍光色素なので、除核されていなければ卵内に染色体が観察される。
【００２９】
〔実施例４〕  核移植
レシピエント卵の囲卵腔にドナー細胞を挿入し、卵とドナー細胞を融合させた後、活性化処理と倍数体化処理を行った。細胞融合、活性化処理は、以下のように行った。
【００３０】
細胞融合
レシピエント卵は10%ウシ胎児血清（FCS）添加のTL-Hepes-PVPのドロップ内、ドナー細胞は0.1%トリプシン（0.01% EDTA添加）により剥がした後10%ウシ胎児血清（FCS）添加のNCSU23-Hepes（NCSU23に21mM Hepesを添加）のドロップ内に入れて待機させた。先端が鋭角の口径30μmのピペットを用いて、除核の際にできた透明帯の穴からマイクロマニュピレーションによりレシピエント卵の囲卵腔にドナー細胞を挿入した。
細胞挿入された卵を細胞融合用マンニトール液（0.3Mマンニトールに50μM塩化カルシウム、100μM塩化マグネシウム、0.01%ポリビニールアルコールを添加）のドロップに入れ、卵と囲卵腔に挿入された細胞の接触面が電流に対して垂直になるように電極で挟んだ。
続いて、細胞融合装置（島津製作所製 SSH-1）により細胞融合を行った（交流1MHz、5V、5sec、直流200V/mm、10μsec、１回）。また、融合20分後に顕微鏡下で観察し、細胞融合が起きなかった卵については再度細胞挿入を行った。
【００３１】
活性化処理
細胞融合から1〜1.5時間後に、スライドグラス上に平行に置かれた電極間（幅１mm）に活性化用マンニトール液（0.3Mマンニトールに50μM塩化カルシウム、100μM塩化マグネシウム、0.01%ポリビニールアルコールを添加）のドロップを作り、このドロップ内に融合卵を顕微鏡下で一列に並べた。この際、卵が他の卵や電極に触れないように注意した。続いて、細胞融合装置（島津製作所製 SSH-1）により電気刺激を与えて融合卵の活性化を行った（直流100V/mm、100μsec、１回）。活性化された卵は第二極体の放出をするので、その前に5μg/mlサイトカラシンB、4mg/mlウシ血清アルブミン（BSA）を添加したNCSU23に移し、３時間培養することで極体放出抑制処理を行った。
【００３２】
〔実施例５〕  胚の培養
活性化および倍数体化処理を行った融合卵は、4mg/mlウシ血清アルブミン（BSA）を添加したNCSU23内で5%CO2、38.5℃でインキュベーターにより体外培養した。培養した核移植胚78個中７個が胚盤胞まで分化した。
【００３３】
〔実施例６〕  ヒトCYP3A4遺伝子の発現確認
胚盤胞まで分化した上記クローン胚から、全RNAを調製し、これを鋳型としてRT-PCRを行った。
ミニブタが元々持つCYPと区別するため、プライマーは、上記hcyp5'-1とプラスミドpEGFP-C1内で、クローニングしたCYP遺伝子の3'下流領域に対応するプライマーSV40pA35(1646-1627: acgcgttaagatacattgat（配列番号３）)を用いた。RT-PCRの結果を図２に示す。この図に示すように、クローン胚中では、ヒトCYP3A4遺伝子のmRNAが存在していた。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】CYP3A4遺伝子導入用プラスミドの構造を示す図（Nh:制限酵素Nhe1認識配列、Eco:制限酵素Eco47III認識配列、Ag:制限酵素Age1認識配列、MCS:マルチクローニングsite、EGFP:EGFP蛋白質コード配列、CMV P/E:サイトメガロウイルスプロモーターおよびエンハンサー、ＳＶ４０pA:SV40ウイルス由来polyA付加シグナル）。
【図２】実施例６で行ったRT-PCRの結果を示す図（左から１番目のレーン：マーカー、左から２〜８番目のレーン：クローン胚から得たRNAを鋳型としたRT-PCRの産物、左から９番目のレーン：pHCYP3A4を鋳型としたPCRの産物）。
【図１】
2007236351.tif 000002
【図２】
2007236351.tif 000003
【配列表】
2007236351000001.app