(57)【要約】【課題】  インターカレーターを用いるハイブリダイゼーション検出技術において、Ｓ／Ｎ比の向上を達成できる新規かつ有用な技術を提供すること。【解決手段】  二本鎖核酸の相補結合部位に結合すると蛍光を発するインターカレーターを用いてハイブリダイゼーションを検出する際のノイズ蛍光を低減する方法であって、前記ハイブリダイゼーションを進行させる反応場に、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（single-stranded DNA binding protein、ＳＳＢ）を加えることによって、前記反応場に存在する遊離一本鎖核酸、二本鎖核酸の余剰一本鎖部、自己ループ構造部位などに対するインターカレーターの非特異的吸着を防止する。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖核酸の相補結合部位に結合すると蛍光を発するインターカレーターを用いてハイブリダイゼーションを検出する際のノイズ蛍光を低減する方法であって、
前記ハイブリダイゼーションを進行させる反応場に、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（single-stranded DNA binding protein）を加えることによって、前記反応場に存在する次の（１）〜（３）の少なくとも一つに対するインターカレーターの非特異的吸着を防止するノイズ蛍光低減方法。
（１）遊離一本鎖核酸。
（２）二本鎖核酸の余剰一本鎖部位。
（３）自己ループ構造部位。
【請求項２】
前記反応場に臨む所定表面には、ハイブリダイゼーション検出用のプローブ核酸鎖が固定されていることを特徴とする請求項１記載のノイズ蛍光低減方法。
【請求項３】
前記反応場は、マイクロアレイチップを構成する基板に設けられていることを特徴とする請求項１記載のノイズ低減方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイブリダイゼーションを蛍光強度により検出の際のノイズ蛍光低減技術に関する。より詳しくは、二本鎖核酸の相補結合部位に特異的に結合して蛍光を発するインターカレーターを用いてハイブリダイゼーションを検出の際のノイズ蛍光低減技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、二本鎖核酸の相補結合部位に特異的に結合して蛍光を発する「インターカレーター」が開発され、このインターカレーターを用いるハイブリダイゼーション検出技術が提案されている。この検出技術では、蛍光標識された標的核酸鎖を調製する必要がないなどの利点があるので、今後さらに普及していくと考えられる。
【０００３】
しかしながら、現実には、ハイブリダイゼーションの場に存在する一本鎖核酸や自己ループ構造部位などにもインターカレーターが非特異的に結合して蛍光を発する。この蛍光は、ハイブリダイゼーション検出の際のバックグラウンドノイズ蛍光となり、ハイブリダイゼーションの検出精度に無視できない程度に影響を及ぼす。特に、ハイブリダイゼーションによって生じた二本鎖核酸の量が少ない場合は、ノイズ蛍光の存在によってハイブリダイゼーションの定量が困難となる。
【０００４】
従って、検出される蛍光シグナルから、ハイブリダイゼーションとは本質的に無関係であるノイズ蛍光を排除して、いわゆるＳ／Ｎ比をどの程度向上できるかが、ハイブリダイゼーション検出の精度向上に直結する。
【０００５】
ここで、一本鎖ＤＮＡに結合する一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（single-stranded DNA binding protein）が知られている。ＳＳＢとも略称されるこのタンパク質は、ＲＮＡや二本鎖ＤＮＡに対してよりも一本鎖ＤＮＡに対してはるかに強い結合活性を有している。このＳＳＢは、ＤＮＡ複製の際に生じる開裂単鎖領域（ラギング鎖）に結合してこれを安定化し、遺伝子構造の維持や変化に係る機能を有し、ＤＮＡの組み換えや修復の過程にも必須とされている。
【０００６】
このＳＳＢを用いて、ハイブリダイゼーションのバックグラウンドノイズを低下させる技術が、特許文献１に開示されている。より詳しくは、蛍光などで標識された一本鎖核酸の蛍光を、該一本鎖核酸に特異的に相互作用するＳＳＢを用いて低下又はクエンチする技術が開示されている。なお、本先行技術は、インターカレーターの使用とは無関係である。
【特許文献１】特表２００４−５３２６１５号公報（特に、段落０１６８参照）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記したように、インターカレーターを用いるハイブリダイゼーション検出技術では、インターカレーターの非特異的に結合により発生する蛍光が、バックグラウンドノイズ蛍光となるので、このノイズ蛍光を低減する技術が求められていた。
【０００８】
そこで、本発明は、インターカレーターを用いるハイブリダイゼーション検出技術において、ノイズ蛍光を低減し、Ｓ／Ｎ比の向上を達成できる新規かつ有用な技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、まず、二本鎖核酸の相補結合部位に結合すると蛍光を発するインターカレーターを用いてハイブリダイゼーションを検出する際のノイズ蛍光を低減する方法であって、前記ハイブリダイゼーションを進行させる反応場に、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（single-stranded DNA binding protein）を加えることによって、前記反応場に存在する、（１）遊離一本鎖核酸、（２）二本鎖核酸の余剰一本鎖部位、（３）自己ループ構造部位の少なくとも一つに対するインターカレーターの非特異的吸着を防止するノイズ蛍光低減方法を提供する。
【００１０】
本発明において、反応場に対して一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を加える方法やその量は、目的に応じて適宜決定できるのであり、狭く解釈されない。一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の種類も目的や効果に応じて選定できる。また、反応場の概念については、ハイブリダイゼーションを進行させることが可能な条件を提供し得る領域又は空間を広く意味している。
【００１１】
また、本発明は、この反応場にハイブリダイゼーション検出用のプローブ核酸が遊離して存在している反応系、反応場に臨む所定表面（例えば、基板、ビーズ、繊維状物などの表面など）に、ハイブリダイゼーション検出用のプローブ核酸鎖が固定されている反応系、マイクロアレイチップを構成する基板に反応場が設けられている構成などを広く包含する。
【００１２】
ここで、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が、ノイズ蛍光を低減する効果は、次の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかの作用機序によるものと推定できる。（Ａ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が一本鎖ＤＮＡに結合することによって、該一本鎖ＤＮＡの自己ループ構造を抑制する。（Ｂ）同タンパク質が、既に形成されている自己ループ構造部分を解くことによって、該自己ループ構造部分に非特異的に吸着していたインターカレーターを反応場へ放出させ、蛍光を消失させる。（Ｃ）同タンパク質が、一本鎖ＤＮＡに結合し、そのマスク効果によって、該一本鎖ＤＮＡに対するインターカレーターの非特異的吸着を不可能にする。（Ｄ）同タンパク質が、蛍光クエンチャーとして機能し、一本鎖ＤＮＡに非特異的に吸着したインターカレーターの蛍光を低減又は消失させる。
【００１３】
ここで、本発明に関連する主たる技術用語について説明する。
【００１４】
まず、「一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（single-stranded DNA binding protein）」は、しばしばＳＳＢとも略称され、ＲＮＡや二本鎖ＤＮＡに対してよりも一本鎖ＤＮＡに対してはるかに強い結合活性を有し、ＤＮＡ複製時に一本鎖となった核酸鎖に結合して安定化させたり、遺伝子構造を維持したりすることが主な役割とされている。ファージ、大腸菌、真核生物に至る多くの生物種で単離されている。例えば、Ｔ４ファージの遺伝子３２タンパク質（gene 32 protein）は、一本鎖ＤＮＡに対する高い親和性と協同性を有し、一本鎖ＤＮＡに結合することによりＤＮＡの巻戻しあるいはリアニーリングを促進し、結合ドメインも同定されている。大腸菌の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質はホモ四量体として存在するが、一本鎖ＤＮＡ結合ドメインはいまだ同定されていない。真核生物では、ＤＮＡ複製時にヘリカーゼで一本鎖になったＤＮＡにヒト一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＲＦ-Ａ）が結合することが知られている。
【００１５】
「プローブ核酸鎖」とは、反応場に存在し、当該核酸鎖とハイブリダイゼーションする標的核酸を検出するための探り針（検出子）として機能する核酸鎖であって、反応場に遊離状態で存在したり、あるいは基板、ビーズ、繊維体などの表面にその一端が固定されて存在したりする。例えば、ＤＮＡプローブなどのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが代表的である。
【００１６】
「標的核酸鎖」とは、前記プローブ核酸との間で相補的な塩基対を形成するか否かを調べることを目的に、サンプルとして準備された核酸分子である。なお、一般にこの標的核酸鎖のヌクレオチド鎖長は、プローブ核酸のヌクレオチド鎖長に比べて長いため、該プローブ核酸との間で相補鎖を形成すると、標的核酸鎖側には余剰の一本鎖核酸部分が発生する。
【００１７】
「核酸鎖」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖がグリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステルの重合体（ヌクレオチド鎖）を意味し、プローブＤＮＡを含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチオドが重合したＤＮＡ（全長あるいはその断片）、逆転写により得られるｃＤＮＡ（ｃプローブＤＮＡ）等を広く含む。
【００１８】
「ハイブリダイゼーション」は、相補的な塩基配列構造を備える間の相補鎖（二本鎖）形成反応を意味する。
【００１９】
「自己ループ構造」は、一本鎖又は二本鎖を構成する核酸鎖の一部において、ループ形状を形成して突出する構造部分であって、相補塩基対部分を持つものと持たないものの両方を含む。
【００２０】
「ノイズ蛍光」は、ハイブリダイゼーションの蛍光検出において、バックグラウンドノイズとなる蛍光を意味する。本発明では、特に、ハイブリダイゼーションの結果得られた相補鎖部分に対して特異的に結合したインターカレーターが発する正規蛍光に対して、前記相補鎖部分以外の核酸部位に対して非特異的に結合したインターカレーターが発する蛍光をノイズ蛍光と呼ぶ。
【００２１】
「インターカレーター」は、二本鎖核酸の相補結合部位に特異的に結合して蛍光を発する物質であって、ハイブリダイゼーション検出に用いることが可能な物質である。例えば、ＰＯＰＯ−１やＴＯＴＯ−３、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩなどを挙げることができる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、プローブ核酸と標的核酸鎖の相補鎖部位に結合するインターカレーターからの蛍光強度を測定することによってハイブリダイゼーションを検出する方法において、ノイズ蛍光を低減又は消失させることができるため、ハイブリダイゼーションを良好なＳ／Ｎに基づいて定量検出することができる。また、ハイブリダイゼーションを進行させた後に、ノイズ蛍光の発生原因となる物質を除去するための水溶液洗浄作業を省略することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明を実施するための好適な形態について、添付図面を参照しながら説明する。なお、添付図面に示された各実施形態は、本発明に係わる方法の代表的な実施形態を例示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００２４】
まず、図１は、本発明に係るハイブリダイゼーション検出方法の基本的な原理及び構成を模式的に示す図である。
【００２５】
この図１には、符号Ｓで示す表面（例えば、基板、ビーズ、繊維状体など）に対して、その一方の末端が固定された状態のプローブ核酸鎖Ｐと、このプローブ核酸鎖Ｐが存在する反応場Ｒへ導入された標的核酸鎖Ｔと、の間でハイブリダイゼーションが進行し、相補鎖Ｃが形成されている状態が示されている。
【００２６】
なお、本発明では、プローブ核酸鎖Ｐを固定する末端は、３′末端、５′末端のいずれであってもよく（図示せず）、また、プローブ核酸鎖Ｐは、固定された状態で使用される形態に限定されず、プローブ核酸鎖Ｐを反応場Ｒ内に遊離させた状態で行うアッセイ系であってもよい。
【００２７】
次に、図１中の符号Ｉは、ハイブリダイゼーションによって得られた前記相補鎖Ｃ部分に特異的に結合して蛍光を発するインターカレーターを示している。本発明に係わるハイブリダイゼーション検出方法では、図示しない外部光源（例えば、所定波長のレーザ光源）から反応場Ｒ内へ蛍光励起光Ｑを絞り込んで照射することにより、インターカレーターＩからの励起蛍光Ｆの強度（蛍光量）を公知のフォトディテクターなどの光検出手段Ｄで測定することによって、ハイブリダイゼーションを検出する。
【００２８】
ここで、このインターカレーターＩは、反応場Ｒ中に遊離している一本鎖核酸、相補鎖を形成している片側の核酸（例えば、プローブ核酸鎖Ｐよりも長鎖の標的核酸鎖Ｔ）の余剰一本鎖部分や自己ループ構造を形成する核酸鎖部分などにも非特異的に結合し、蛍光（即ち、ノイズ蛍光）を発する。
【００２９】
本発明は、相補鎖へのインターカレーターＩの結合をそのまま保持して正規蛍光量を低減させないようにしながら、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（以下「ＳＳＢ」と略称。）の特性を有効に利用して、ノイズ蛍光の発生を未然に防止したり、発生したノイズ蛍光を反応場Ｒから低減又は消失させたりする。以下、図面を参照しながら、具体的に説明する。
【００３０】
図２は、表面Ｓの近傍の反応場Ｒであり、ハイブリダイゼーションアッセイに伴う反応場Ｒの典型的な状態の一例が模式的に示されている図である。
【００３１】
まず、固相表面Ｓに３′末端が固定されたプローブ核酸鎖Ｐに対して標的核酸鎖Ｔがハイブリダイゼーションして相補鎖Ｃが形成されている（図２参照）。そして、プローブ核酸鎖Ｐのヌクレオチド鎖長に比べて前記標的核酸鎖Ｔのヌクレオチド鎖長が長いために(図２参照)、該標的核酸鎖Ｔの３′末端側に余剰鎖長の一本鎖核酸部分Ｔ１１、５′末端側に余剰鎖長の一本鎖核酸部分Ｔ１２が形成されている状態が示されている（図２参照）。また、この図２には、反応場Ｒ中に遊離状態で存在している、ハイブリダイゼーションに関与しなかった（関与できなかった）一本鎖標的核酸鎖Ｔｓ、さらに、ハイブリダイゼーションに関与しなかった一本鎖プローブ核酸鎖Ｐｓも示されている。
【００３２】
この一本鎖標的核酸鎖Ｔｓや一本鎖プローブ核酸Ｐｓがハイブリダイゼーションに関与しない原因としては、これらのヌクレオチド鎖内に相補鎖を形成し得る塩基配列部分が存在しない場合に加え、相補的な塩基配列部分はあっても、立体障害などの影響によってハイブリダイズできなかった場合などが考えられる。
【００３３】
このような状態にある反応場ＲへインターカレーターＩが添加されると、相補鎖Ｃ部分に対してインターカレーターＩが特異的に結合すると同時に、その結合量に差はあっても、上記した一本鎖核酸部分Ｔ１１，Ｔ１２、遊離一本鎖標的核酸鎖Ｔｓ、一本鎖プローブ核酸ＰｓなどにもインターカレーターＩが非特異的に結合してしまう。
【００３４】
このような場合では、相補鎖Ｃ部分に結合したインターカレーターＩ由来の蛍光は、ハイブリダイゼーション検出に有用である正規蛍光シグナルを提供するが、一本鎖核酸部分Ｔ１１，Ｔ１２、遊離一本鎖標的核酸鎖Ｔｓ、一本鎖プローブ核酸Ｐｓに対して非特異的に結合したインターカレーターＩ由来の蛍光は、バックグラウンドノイズとなるため、Ｓ／Ｎ比悪化の原因となる。
【００３５】
続いて、図３は、反応場Ｒにおける別のハイブリダイゼーションアッセイ状態を模式的に示す図である。
【００３６】
この図３には、表面Ｓに固定されているプローブ核酸鎖Ｐが示され、さらに、このプローブ核酸鎖Ｐと相補鎖Ｃを形成しているとともに、その一部に自己ループ構造Ｌ１を形成している標的核酸鎖Ｔが示されている。また、この図３には、ハイブリダイゼーションに関与することなく、反応場Ｒ中に遊離して存在し、その一部に自己ループ構造Ｌ２を形成している一本鎖状態の標的核酸鎖Ｔｓが示されている。
【００３７】
このような状態にある反応場ＲへインターカレーターＩが添加されると、相補鎖Ｃ部分に対してインターカレーターＩが特異的に結合すると同時に、その結合量に差はあっても、二本鎖状態にある標的核酸鎖Ｔの一本鎖核酸部分Ｔ１１，遊離一本鎖標的核酸鎖Ｔｓの一本鎖部分、自己ループ構造部位Ｌ１，Ｌ２にもインターカレーターＩが非特異的に結合し、相補鎖Ｃ由来の正規蛍光に混じってノイズ蛍光を発生してしまう。
【００３８】
図２や図３、あるいはこれらが複合したような反応場Ｒの状態において、ノイズ蛍光の発生を未然に防止したり、発生したノイズ蛍光を低減又は消去したりするために、本発明では、ＳＳＢを目的達成に必要な量を反応場へ添加する。なお、このＳＳＢの添加タイミングは、反応場ＲへインターカレーターＩを導入する前、インターカレーターＩと同時導入、インターカレーターＩを導入後のいずれでもあってもよい。
【００３９】
ここで、ＳＳＢのノイズ蛍光の発生防止やノイズ蛍光の低減又は消去に係る効果は、次の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかの作用機序によるものと推定することができる。
【００４０】
（Ａ）ＳＳＢが一本鎖ＤＮＡに結合することによって、該一本鎖ＤＮＡの自己ループ構造を抑制する。図４は、このときの様子を模式的に示す図であり、四量体状態でＳＳＢが一本鎖ＤＮＡ（図４中、ｓｓＤＮＡで示す。）に結合し、一本鎖ＤＮＡを直鎖状に保持している様子が模式的に示されている。即ち、ＳＳＢが一本鎖状態のＤＮＡに結合することによって、その一本鎖の直鎖状構造が保持され、自己ループ構造（Ｌ１，Ｌ２）の形成が阻止されている。自己ループ構造（Ｌ１，Ｌ２）には、上記したように、インターカレーターＩが非特異的に吸着するので、ＳＳＢの自己ループ構造（Ｌ１，Ｌ２）の形成阻止作用は、ノイズ蛍光発生防止に寄与する。
【００４１】
（Ｂ）ＳＳＢが、一本鎖ＤＮＡ中に既に形成されている自己ループ構造（Ｌ１，Ｌ２）部分を解くことによって、該自己ループ構造（Ｌ１，Ｌ２）部分に非特異的に吸着していたインターカレーターを反応場へ放出させ、蛍光を消失させる。図５は、このときの様子を模式的に示す図であり、四量体状態でＳＳＢが一本鎖ＤＮＡ（図４中、ｓｓＤＮＡで示す。）に結合して自己ループ構造Ｌ２を解き、直鎖状の一本鎖ＤＮＡを直鎖状の構造に変化させている様子が模式的に示されている。なお、図５中のＩａ，Ｉｂは、放出され蛍光を失ったインターカレーターを示している。
【００４２】
その他、（Ｃ）ＳＳＢが、一本鎖ＤＮＡに結合し、そのマスク効果によって、該一本鎖ＤＮＡに対するインターカレーターの非特異的吸着を不可能にしたり、（Ｄ）ＳＳＢが、蛍光クエンチャーとして機能し、一本鎖ＤＮＡに非特異的に吸着したインターカレーターＩの蛍光を低減又は消失させたりする作用も想定できる。
【実施例１】
【００４３】
次に、ＳＳＢのノイズ蛍光低減作用又は消去作用を検証する実験を行った。実験方法は次の通りである。適切な塩を加えた緩衝液(reaction buffer)中に、二本鎖特異的インターカレーターとしてSYBR GreenＩ、一本鎖核酸として様々な塩基配列を有した３０ｍｅｒあるいは６０ｍｅｒの合成一本鎖オリゴＤＮＡ(ＤＮＡプローブ)を加え、適切な温度における前記SYBR GreenＩの蛍光強度を測定する系を構築し、この測定系にＳＳＢを添加した区と、ＢＳＡ（bovine serum alubmin）を添加した対照区において、SYBR GreenＩの蛍光強度を解析する実験を行った。本実験で使用した試料を図６にまとめて示し、図７（図面代用グラフ）に実験結果を示す。
【００４４】
この図７に示した結果は、各ＤＮＡプローブに対して、ＳＳＢあるいはＢＳＡを加えた場合と全く加えない場合（図７中「none」）におけるSYBR GreenＩの蛍光強度を、ＤＮＡプローブＡにおいてＳＳＢあるいはＢＳＡを加えない場合の蛍光強度を１００とする相対値で示した。また、本実験で使用したＤＮＡプローブの量は、それぞれ５０ｎＭ、添加したＳＳＢ、ＢＳＡの量はそれぞれ２μｇ／μＬとした。また、図７で示した結果は、反応系に全ての構成要素を加えた後、９４℃にて５分間の熱変性処理を加え、その後４０℃にて蛍光強度を検出したときの結果である。
【００４５】
その結果、試した何れのＤＮＡプローブにおいても、何も添加しなかった場合、あるいはＢＳＡを加えた場合と比較して、ＳＳＢを加えた場合のSYBR GreenＩの蛍光強度が明らかに低下していることを検証することができた。即ち、ＳＳＢには、ノイズ蛍光を低減又は消去する作用があることを確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明は、プローブ核酸と標的核酸鎖の相補鎖部位に結合するインターカレーターからの蛍光強度を測定することによってハイブリダイゼーションを検出する技術に利用できる。特に、前記技術において、ノイズ蛍光を低減又は消失させ、Ｓ／Ｎを向上させる技術として利用できる。また、従来採用されているノイズ蛍光原因分子を水溶液洗浄する工程を行わなくてもよいハイブリダイゼーション検出技術、即ち、洗浄フリーのハイブリダイゼーション検出技術として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明に係るハイブリダイゼーション検出方法の基本的な原理及び構成を模式的に示す図である。
【図２】基板などの表面（Ｓ）の近傍の反応場（Ｒ）における典型的なハイブリダイゼーションアッセイ状態の一例が模式的に示されている図である。
【図３】同反応場（Ｒ）における別のハイブリダイゼーションアッセイ状態を模式的に示す図である。
【図４】ＳＳＢのノイズ蛍光の発生防止やノイズ蛍光の低減又は消去に係る作用機序の一例を模式的に説明する図である。
【図５】ＳＳＢのノイズ蛍光の発生防止やノイズ蛍光の低減又は消去に係る作用機序の他の例を模式的に説明する図である。
【図６】実施例１に係る実験で使用した試料をまとめた図面代用表である。
【図７】同実験の結果を示す図面代用グラフである。
【符号の説明】
【００４８】
Ｃ  相補鎖
Ｉ  インターカレーター
Ｌ（Ｌ１，Ｌ２）  自己ループ構造
Ｐ  プローブ核酸
Ｐｓ  相補鎖を形成していないプローブ核酸
Ｒ  反応場
Ｓ  （固相）表面
ＳＳＢ  一本鎖ＤＮＡ結合タンパク
Ｔ  標的核酸鎖
Ｔ１１  標的核酸鎖の余剰一本鎖核酸部分（３´末端側）
Ｔ１２  標的核酸鎖の余剰一本鎖核酸部分（５´末端側）
Ｔｓ  遊離して存在する一本鎖標的核酸鎖
【図１】
2007028991.tif 000003
【図２】
2007028991.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2007028991.tif 000009
【配列表】
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