(57)【要約】【課題】酵素による蛋白質の架橋高分子化方法の欠点である、蛋白質の基質依存性から生ずる限界を解消すること及びその架橋効率を向上させた蛋白質の架橋方法を提供する。【解決手段】非芳香族レダクトン化合物と酸化酵素を用いることを特徴とする蛋白質の架橋方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非芳香族レダクトン化合物と酸化酵素を用いることを特徴とする蛋白質の架橋方法。
【請求項２】
非芳香族レダクトン化合物が一般式（Ｉ）で表される請求項１記載の蛋白質の架橋方法。
【化１】
2007028955.tif 000006
一般式（Ｉ）において、Ｒ11、Ｒ12は各々ヒドロキシル基、置換基を有していても良いアミノ基、アシルアミノ基、アルキルスルホニルアミノ基、アリールスルホニルアミノ基、アルコキシカルボニルアミノ基またはメルカプト基を表し、Ｘ1はＲ11、Ｒ12が置換している二つのビニル炭素原子とカルボニル炭素原子と共に５〜６員環を形成するのに必要な原子群であって、−Ｏ−、−Ｃ（Ｒ13）（Ｒ14）−、−Ｃ（Ｒ15）＝、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ16）−、−Ｎ＝を組合せて構成される。Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15、Ｒ16は各々、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、ヒドロキシル基、カルボキシル基を表し、またＸ1で形成される５〜６員環は飽和または不飽和の縮合環を形成してもよく、更に一般式（Ｉ）で表される化合物は、リチウム、ナトリウム、カリウム、アンモニウム等と塩を形成していてもよい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化酵素及び非芳香族レダクトン化合物を用いた蛋白質の新規な架橋方法に関するものである。
【０００２】
本架橋方法により製造される架橋（高分子化、或いはゲル化）された蛋白質素材は、魚肉すり身、蒲鉾、魚肉・畜肉ソーセージ、豆腐、麺類、製菓・製パン、食品接着剤、肉シート状食品、ヨーグルト、ゼリー、チーズなどの食品加工分野に用いることができる。更に、ハロゲン化銀写真感光材料及び銀塩拡散転写型平版印刷版等の材料のゼラチン膜の架橋硬膜にも用いることができ、更にまた、新規な蛋白質由来素材としての化粧品、マイクロカプセルの素材、固定化酵素等の坦体などを含む広範な産業に用いることができる。
【背景技術】
【０００３】
蛋白質を架橋反応により高分子化せしめる可能性を有する酵素としては、従来よりトランスグルタミナーゼ、リジルオキシダーゼ、プロテインジスルフィドイソメラーゼ、プロテインジスルフィドレダクターゼ、スルフヒドリルオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ（チロシナーゼ）、ペルオキシダーゼなどが知られていた（Matheis and Whitaker，J．Food Biochemistry11，３０９−３２７  １９８７）。
【０００４】
上述の、蛋白質を架橋反応により高分子化せしめる可能性を有する酵素の中でトランスグルタミナーゼによる蛋白質の架橋法はよく知られており、微生物由来の安価な、そして反応にカルシウムの存在を必要としないトランスグルタミナーゼが発見されたことにより、食品加工分野を中心に広く利用されていることは周知の通りである（特公平６−６５２８０号、特開２００１−６９９５６号、同２００１−１３１０６０号、同２００４−２７５０２４号、日本農芸化学会誌６９巻１０号１３０１−１３０８頁など）。
【０００５】
しかしながら、上記した酵素による蛋白質の架橋高分子化方法では、使用する酵素の基質特異性の影響を受け、蛋白質原料（基質）の差異によってその反応性が異なってくる。例えば、特開平１１−７５８８７号明細書に開示されている、ペルオキシダーゼを酵素とする蛋白質の架橋方法に於いては、当該酵素であるペルオキシダーゼの触媒反応の基質であるチロシン残基に乏しい蛋白質（ゼラチンなど）ではその効果が発現し難いという欠点を有している。
【０００６】
更に、上記のトランスグルタミナーゼは、蛋白質中のグルタミン残基の γ−カルボキシル基と、リジン残基のε−アミノ基の間で生ずるアシル転移反応の結果、蛋白質分子内或いは分子間に橋かけ構造を形成する酵素であるため、グルタミン残基或いはリジン残基の少ない蛋白質では、トランスグルタミナーゼの基質となり難いという欠点がある。（例えば、アルブミン類の蛋白質などには適用し難い）
【０００７】
これらの問題点を克服し対象となる基質蛋白質の範囲を拡大する為に、特開平１１−２７６１６２号公報（特許文献１）では、マルチ銅オキシダーゼが提案されており、酵素としてマルチ銅オキシダーゼを用いた蛋白質の架橋方法およびその架橋高分子化反応の機構に関する記載がある。それによれば、基質としての蛋白質自体の側鎖官能基に酵素が作用して架橋高分子化する旨の機構を提示しているが、未だ架橋効率が十分とは言えないものであった。
【特許文献１】特開平１１−２７６１６２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明の目的は、従来から提案されてきている酵素による蛋白質の架橋高分子化方法の欠点である、蛋白質の基質依存性から生ずる限界を解消すること及びその架橋効率を向上させることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題の克服について鋭意検討した結果、酸化酵素による蛋白質の架橋高分子化を促進させる化合物に着目し、本発明に至った。即ち、前記（化１）の一般式（Ｉ）で表される非芳香族レダクトン化合物と酸化酵素を用いることを特徴とする蛋白質の新規な架橋高分子化方法により、上記課題が解決されることを見出したものである。
【００１０】
非芳香族レダクトン化合物とは、ハロゲン化銀写真感光材料を画像露光した後、得られた潜像を更に増幅し銀画像とする際に常用される非芳香族の還元剤（現像主薬）の一種であり、写真感光材料の分野に於いて繁用されている用語である。例えば、特開２００３−１７３００６号公報、特開平９−２６９５７１号公報、特開平７−１１０５５６号公報等に記載がなされている。
【発明の効果】
【００１１】
本発明においては、基質としての蛋白質自体の側鎖官能基に酵素が作用して架橋高分子化するのではないので、基質としての蛋白質自体の側鎖官能基の存在（量）に全く左右されることはない。従って、使用する蛋白質原料（基質）の差異による影響を受けることはない。また、架橋を為す主体が基質としての蛋白質中には存在していない非芳香族のレダクトン化合物であるので、その化合物の添加量に応じた架橋密度（架橋の程度）のコントロールは容易に行うことができ、その結果、架橋効率の向上が図れるものと考えている。
【００１２】
本発明による蛋白質の新規架橋方法は、蛋白質の架橋（高分子化、或いはゲル化）が求められる諸分野に適用することができる。例えば、本架橋方法により製造される架橋された蛋白質素材は、魚肉すり身、蒲鉾、魚肉・畜肉ソーセージ、豆腐、麺類、製菓・製パン、食品接着剤、肉シート状食品、ヨーグルト、ゼリー、チーズなどの食品加工分野に用いることができる。更に、ハロゲン化銀写真感光材料及び銀塩拡散転写型をも含む平版印刷版等のゼラチン膜の架橋硬膜にも用いることができ、更にまた、新規な蛋白質由来素材としての化粧品、マイクロカプセルの素材、固定化酵素等の坦体などを含む広範な分野に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
酸化酵素について詳細に説明する。「酵素」とは、触媒として働く複合蛋白質性物質を意味し、主としてペプチド結合によってリンクされたアミノ酸の鎖からなる高分子量化合物である。「酸化酵素」とは、基質から電子を受容し、水素イオン（プロトン）を吸い上げて、酸素を水に還元することができる酵素の総称である。当該酸化酵素の内、マルチ銅オキシダーゼとは、分子中に複数の銅原子を含有し、多価フェノール、メトキシフェノール、アミン、ビリルビン、アスコルビン酸などを分子状酸素により酸化せしめる一群の酵素である。含まれる銅原子の数は、これまで知られているものは通常２ないし８個であるが、この数は分析時の酵素標品の状態、分析法によりばらつきが見られるため、特に限定されるものではない。マルチ銅オキシダーゼに分類される酵素としては、例えばラッカーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼなどが挙げられる。
【００１４】
ラッカーゼとは、マルチ銅蛋白質の一種で、カテコール類、ハイドロキノン類、アミノフェノール類やフェニレンジアミン類にも作用する、低い基質特異性を有する酸化酵素である。このようなラッカーゼの例としては、漆などの植物や、バクテリアや真菌（Fungi）などの微生物由来のものがあり、微生物由来のラッカーゼとしては例えば、Aspergillus, Neurospora, Podospora, Botrytis, Collybia, Fomes, Lentinus, Pleurotus, Pycnoporus, Pyricularia, Trametes, Rhizoctonia, Rigidoporus, Coprinus, Psatyrella, Myceliophtera, Schtalidium, Polyporus, Phlebia, Coriolus属由来の酵素が挙げられる。
【００１５】
ビリルビンオキシダーゼとは、マルチ銅蛋白質の一種で、主としてビリルビンに作用する酵素であり、このようなビリルビンオキシダーゼの例としては、例えば Penicillium, Myrothecium, Trachyderma属由来の酵素が挙げられる。
【００１６】
アスコルビン酸オキシダーゼ（EC 1.10.3.3）とは、マルチ銅蛋白質の一種で、主としてＬ−アスコルビン酸に作用する酵素であり、キュウリ、カボチャ、ズッキーニなどの植物や、バクテリアや真菌（Fungi）などの微生物由来のものがある。
【００１７】
本発明に係わる酸化酵素を、基質蛋白質溶液の架橋（高分子化、増粘、ゲル化など）を行う為に添加する場合、その添加量は目的とする蛋白質の種類、物理的性質等により異なるが、概して基質蛋白質の乾燥状態質量の０．０１〜１００質量％、好ましくは０．１〜１０質量％が良い。また、その添加時期は、任意の段階で良い。基質蛋白質からなる膜を形成するための塗布液を調製する場合には、当該塗布液を調製する任意の段階で良いが、より好ましくは塗布直前に添加するのが良い。非芳香族レダクトン化合物を含む塗布液と酸化酵素を含む塗布液とは、その塗布直前に混合添加するのが特に良い。
【００１８】
次に、本発明の架橋促進剤として作用する一般式（Ｉ）で表される非芳香族レダクトン化合物について詳細に説明する。
【００１９】
一般式（Ｉ）において、Ｒ11、Ｒ12は各々ヒドロキシル基、置換基を有していても良いアミノ基、アシルアミノ基、アルキルスルホニルアミノ基、アリールスルホニルアミノ基、アルコキシカルボニルアミノ基またはメルカプト基を表すが、Ｒ11、Ｒ12で表されるアミノ基は、例えば、エチル、ブチル、ヒドロキシエチル、炭素数１〜１０のアルキル基等の置換基を有していてもよい。アシルアミノ基としては、例えば、アセチルアミノ、ベンゾイルアミノ等が挙げられ、アルキルスルホニルアミノ基としては、例えば、メタンスルホニルアミノ等が挙げられ、アリールスルホニルアミノ基としては、例えば、ベンゼンスルホニルアミノ、ｐ−トルエンスルホニルアミノ等が挙げられ、アルコキシカルボニルアミノ基としては、例えば、メトキシカルボニルアミノ等が挙げられる。
【００２０】
Ｒ11、Ｒ12の好ましい例としては、ヒドロキシル基、アミノ基、アルキルスルホニルアミノ基、アリールスルホニルアミノ基を挙げることができる。
【００２１】
Ｘ1はＲ11、Ｒ12が置換している二つのビニル炭素原子とカルボニル炭素原子と共に５〜６員環を形成するのに必要な原子群であり、好ましくは、炭素原子、酸素原子あるいは窒素原子から構成される。
【００２２】
Ｘ1で表される原子群は、具体的には、−Ｏ−、−Ｃ（Ｒ13）（Ｒ14）−、−Ｃ（Ｒ15）＝、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ16）−、−Ｎ＝を組合せて構成される。ただし、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15、Ｒ16は各々、水素原子、炭素数１〜１０の置換基を有していてもよいアルキル基（置換基としては、例えば、ヒドロキシル基、カルボキシル基、スルホ基等を挙げることができる。）、ヒドロキシル基、カルボキシル基を表す。
【００２３】
更に、Ｘ1で形成される５〜６員環は飽和または不飽和の縮合環を形成してもよい。
【００２４】
Ｘ1で形成される５〜６員環の例としては、ジヒドロフラノン、ジヒドロピロン、ピラノン、シクロペンテノン、シクロヘキセノン、ピロリノン、ピラゾリノン、ピリドン、アザシクロヘキセノン、ウラシル環等が挙げられる。Ｘ1で形成される好ましい環としては、ジヒドロフラノン、シクロペンテノン、シクロヘキセノン、ピラゾリノン、アザシクロヘキセノン、ウラシル環を挙げることができる。なお、一般式（Ｉ）で表される化合物は、リチウム、ナトリウム、カリウム、アンモウム等と塩を形成していてもよい。
【００２５】
以下に、一般式（Ｉ）で表される化合物の具体例を示すが、本発明ではこれらの化合物に限定されるものではない。
【００２６】
【化１】
2007028955.tif 000002
【００２７】
本発明に係わる非芳香族レダクトン化合物を、基質蛋白質溶液の架橋（高分子化、増粘、ゲル化など）を行う為に使用する場合、その添加量は目的とする蛋白質の種類、物理的性質等により異なるが、概して基質蛋白質の乾燥状態質量の０．０１〜１００質量％、好ましくは０．１〜１０質量％が良い。また、その添加時期は、任意の段階で良い。基質蛋白質からなる膜を形成するための塗布液を調製する場合には、当該塗布液を調製する任意の段階で良いが、より好ましくは塗布直前に添加するのが良い。非芳香族レダクトン化合物を含む塗布液と酸化酵素を含む塗布液とは、その塗布直前に混合添加するのが特に良い。
【００２８】
本発明に用いられる基質蛋白質は、上記酸化酵素の作用を受けるものであればいかなるものであっても良く、その起源、性状に制約されるものではない。例えば、植物性蛋白質であれば、豆類、穀物由来の蛋白質、動物性蛋白質であれば、カゼイン、β−ラクトグロブリン等の乳蛋白、オボアルブミンなどの卵蛋白、ミオシン、アクチンなどの肉蛋白、血清アルブミンなどの血液蛋白、ゼラチン、コラーゲンなどの腱蛋白質などがあげられる。また、酸、アルカリなどによる化学的、或いはプロテアーゼなどによる酵素的部分分解蛋白質や、各種試薬による化学修飾蛋白質や、合成ペプチドであっても良い。
【００２９】
これら基質蛋白質は、溶液またはスラリー或いはペースト状態で反応に供されるが、その濃度は特に限定されるものではなく、目的の蛋白質架橋物の望まれる性状、状態によって適宜選択される。一般に低濃度であれば粘性の増加した溶液あるいは沈殿物、高濃度であればゲル状物が得られるが、１質量％以上であれば十分にゲル化物を得ることができる。またこの基質蛋白質の溶液またはスラリーあるいはペーストは、水溶液に限らず油脂とのエマルジョンであってもよく、さらに必要に応じて塩類、糖類、蛋白質、香料、保湿剤、着色料などが添加されたものであってもよい。
【００３０】
本発明による架橋を行う為の反応の時間、温度、反応溶液のｐＨ等も特に限定されるものではないが、通常、反応温度は５〜80℃、好ましくは20〜60℃、反応溶液のｐＨは２〜１０、好ましくは４〜８で行うことができるが、これらの反応の条件は、目的とする蛋白質架橋物ないしゲル状物の物性、水分含量に応じて適宜選択される。
【００３１】
以下に本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明がこれに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３２】
（酸化酵素及び非芳香族レダクトン化合物を用いるゼラチンの架橋）
蛋白質の一種であるゼラチンを用いて、架橋の進行度合いを以下の様に調べた。即ち、１０％ゼラチン溶液２５ｇに、架橋硬膜度判定を容易にする為に１０％カーボンブラック溶液１ｇ、ビリルビンオキシダーゼ（天野エンザイム社製）０．０５ｇ、更に純水４．５ｍｌを加え、１回分の塗布液を調製した後、塗布直前に表１で示される非芳香族レダクトン化合物の１０％水溶液１ｍｌを添加混合し、ウエット塗布量が５６ｇ／ｍ2の塗布バーを用い、ポリエチレンをラミネートした紙（ＲＣ紙）に塗布、乾燥し、評価サンプルとした。
【００３３】
【表１】
2007028955.tif 000003
【００３４】
塗布乾燥後の各サンプルを２種に分け、一方のサンプルはそのまま室温下に１週間放置した。他のサンプルは、５０℃で１週間加温した。１週間の加温または室温放置したそれぞれのサンプルを、５ｃｍ×２０ｃｍの小片となし、これに１Ｎ−ＮａＯＨ水溶液１滴ずつ垂らし、５分間経過後、温水にて洗浄し、膜の剥がれ状況を観察し、その時間変化によるゼラチン膜のアルカリ耐性を測定した。本測定法では、ゼラチン膜の架橋硬膜度合いが進行するほどゼラチン膜マトリックスが密となり、アルカリの小滴が浸透し難くなる為、アルカリ耐性が増大するが、架橋硬膜度合いが少ないと容易にアルカリ液の浸透を許す為、耐性が減少してくると考えられる。
【００３５】
その他、表１に示すように、酸化酵素の有無を比較例とし、前記と同様な評価を行った。得られた結果を表２に示す。
【００３６】
【表２】
2007028955.tif 000004
【００３７】
表２から明らかな様に、ビリルビンオキシダーゼを酸化酵素とし、非芳香族レダクトン化合物を添加した系は、明らかなアルカリ耐性を示し、かつ、サンプルの加温条件に拘らずほぼ一定のアルカリ耐性を示したが、比較例に於いてはその耐性が全く認められなかった。
【実施例２】
【００３８】
酸化酵素をビリルビンオキシダーゼからラッカーゼＹ−１２０（天野エンザイム製）に替えた以外は、実施例１と同様な試験を行った。ビリルビンオキシダーゼとラッカーゼＹ−１２０との差は殆ど認められず、また、アルカリ耐性も同様の傾向を示した。
【実施例３】
【００３９】
蛋白質としてゼラチン、酸化酵素としてラッカーゼＹ−１２０を用い、非芳香族レダクトン化合物としてのアスコルビン酸の添加量を変化させて、実施例１に記載した試験条件で架橋度（アルカリ耐性）を調べた。即ち、１０％ゼラチン溶液２５ｇに、架橋硬膜度判定を容易にする為に１０％カーボンブラック溶液１ｇ、ビリルビンオキシダーゼ（天野エンザイム社製）０．０５ｇ、更に純水４．５ｍｌを加え、１回分の塗布液を調製した後、塗布直前に１０％アスコルビン酸水溶液を塗布直前に添加混合し、ウエット塗布量が５６ｇ／ｍ2の塗布バーを用い、ポリエチレンをラミネートした紙（ＲＣ紙）に塗布、乾燥し、それぞれ評価サンプルとした。
【００４０】
塗布乾燥後のサンプルは加温することなく、それぞれのサンプルを、５ｃｍ×２０ｃｍの小片となし、これに１Ｎ−ＮａＯＨ水溶液１滴ずつ垂らし、５分間経過後、温水にて洗浄し、実施例１と同様に、膜の剥がれ状況を観察した。得られた結果を表３に示す。
【００４１】
【表３】
2007028955.tif 000005
【００４２】
表３の結果が示すように、架橋の度合いは非芳香族レダクトン化合物の添加量にほぼ比例している事が判る。
【実施例４】
【００４３】
基質蛋白質として、１．ミルクカゼイン（ハマーステン、メルク社製）、２．牛血清アルブミン（Armour Pharma社製）、３．ゼラチン（新田ゼラチン社製）をそれぞれ５質量％濃度の水溶液を作り、これら各水溶液に、非芳香族レダクトン化合物として、エリソルビン酸０．５質量％を加えて良く撹拌した後、酸化酵素として、ラッカーゼ（天野エンザイム社製  Ｙ−１２０）を０．１質量％加えて良く撹拌した。このようにして得た蛋白質の水溶液を、約４０℃に加温して１時間放置した。一方で、比較として、上記酵素を添加せずに、同温度で放置した水溶液サンプルも調製した。    
【００４４】
１時間後、室温に戻したところ、本発明による酸化酵素及び非芳香族レダクトン化合物であるエリソルビン酸を添加したサンプルは、いずれも硬化しゼリー状となっていた。しかし、上記酵素を添加していないサンプルは、いずれも水溶液の状態のままであった。
【実施例５】
【００４５】
乾燥昆布１００ｇに対して、清水１．２Ｌを加えて２時間放置して昆布を膨潤させた。これを擂潰機に入れて５分間擂潰すると、昆布から多量の粘質物が滲出してゼリー状となった。この中にゼラチンを７５ｇ加えて２０分間吸水膨潤させた。この全量を加熱用容器に入れ４５℃に加温してゼラチンを溶解させた。それに食塩５ｇ、砂糖３０ｇ、アスコルビン酸１ｇ、ビリルビンオキシダーゼ（天野エンザイム社製）０．３ｇを加えて、素早く攪拌混合して、これを所定の型に流し込んだ。なお、素早く混合させるために、食塩や砂糖は予め乳鉢等で微粉末にしておいた。次いでこれを４０℃の保温庫に入れ３時間放置してゼラチンを凝固させた。凝固した段階で型から昆布ゲルを取り出して所定の大きさに裁断し、ポリセロ袋に入れて真空包装し、９０℃・３３分の加熱殺菌を行い、冷却して成形品を得た。
【実施例６】
【００４６】
ゼラチン８０ｇに清水１Ｌを加えて、約３０分間吸水膨潤させた。これを４５℃まで加温してゼラチン溶液を加熱溶解させた。次に、食塩５ｇ、砂糖２０ｇ、粉末状のアスコルビン酸１０ｇ、ラッカーゼＹ−１２０（天野エンザイム社製）０．５ｇを混合したものを加え、素早く攪拌混合して溶液中に溶解させた。このようにして得られたゼラチン溶液を予め、底に野菜・フルーツ・蒲焼・魚卵等を敷きつめた型内に流し込み、４０℃の保温庫に入れて３時間放置して凝固させた。凝固完了後ゲルを型から取り出し、所望の大きさに裁断したものをポリセロ袋に入れて真空包装し、９０℃にて３３分間の加熱殺菌を行い、冷却してアスビッツゼリーを得た。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明の方法は、実施例等で説明した如く、広範な蛋白質の架橋高分子化に適用できる為、様々な食品加工分野に用いることができ、更に、ハロゲン化銀写真感光材料等のゼラチン膜の架橋硬膜にも用いることができる。更にまた、新規な蛋白質由来素材としての化粧品、マイクロカプセル等の素材、固定化酵素等の坦体などを含む広範な分野に活用することができる。