(57)【要約】【課題】血管新生作用を有するニコチン等のピリジン誘導体を皮下組織又は筋組織へ直接注入することができる血管新生材と、その製造方法を提供する。【解決手段】少なくともピリジン誘導体と感光基とを導入したゼラチン修飾体に光照射して架橋することにより形成されたゲルからなる血管新生材及びその製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともピリジン誘導体と感光基を有する分子団を導入したゼラチン修飾体を含む溶液に光照射して架橋することにより形成されたゲルからなる血管新生材。
【請求項２】
請求項１において、該ピリジン誘導体はニコチン、ニコチン酸、ニコチン酸エステル、、ニコチン酸アミド、ニセリトルオール、ニコクロネイト、ニコフィブレイト、ニコフラノース、ニコモール、ニコモルフィン、ニコランジル、ニコテリン、ニコチニルアルコール、ニフェジピン、ニフェナゾン、ニフルム酸、ニフロキン、ニケサミド、ニフルピリノール及びニルバジピン並びにこれらの置換体からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする血管新生材。
【請求項３】
請求項１又は２において、ゼラチン１分子中に１個〜１０個のピリジン誘導体が導入されていることを特徴とする血管新生材。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、前記感光基を有する分子団が、キサンテン系色素、アジン系色素、チアジン系色素、オキサジン系色素、キノリン系色素、ピラゾロン系色素、スチルゼン色素、アゾ系色素、ジアゾ系色素、アントラキノン系色素、インジゴ系色素、チアゾール系色素、フェニルメタン系色素、アクリジン系色素、シアニン系色素、インドフェノール系色素、ナフタルアミド系色素及びペリレン系色素からなる郡から選択される少なくとも１種であることを特徴とする血管新生材。
【請求項５】
請求項４項において、前記感光基を有する分子団が、エオシン、フルオロセイン、ローズベンガル、ベンゾフェノン、カンファーキノン、オレフィン、ベンザルアセトフェノン、シンナミリデンアセチル、シンナモイル、スチリルピリジン、α−フェニルマレイミド、フェニルアジド、スルホニルアジド、カルボニルアジド、ｏ−キノンジアジド、フリルアクリロイル、クマリン、ピロン、アントラセン、ベンゾイル、スチルベン、ジチオカルバメート、ザンタート、シクロプロペン、１、２、３−チアジアゾール、アザ−ジオキサビシクロ、ハロゲン化アルキル、ケトン及びジアゾ並びにこれらで修飾された物質からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする血管新生材。
【請求項６】
請求項５において、前記感光基を有する分子団はエオシンであることを特徴とする血管新生材。
【請求項７】
請求項４ないし６のいずれか１項において、ゼラチン１分子中に１個〜１０個のキサンテン系色素が導入されていることを特徴とする血管新生材。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項において、光照射は可視光であることを特徴とする血管新生材。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれかにおいて、光照射する際にハイドロゲンドナーを共存させておくことを特徴とする血管新生材。
【請求項１０】
請求項９において、ハイドロゲンドナーは、チオール、アルコール、還元糖、ポリフェノール又は１分子内に少なくとも１個のＮ−アルキル及び／又はＮ，Ｎ−ジアルキルアミノ基を有する化合物であることを特徴とする血管新生材。
【請求項１１】
少なくともピリジン誘導体と感光基を導入したゼラチン修飾体に光照射して架橋することによりゲルからなる血管新生材を製造することを特徴とする血管新生材の製造方法。
【請求項１２】
請求項１１において、該ピリジン誘導体はニコチン、ニコチン酸、ニコチン酸エステル、ニコランジル、ニフェナゾン、及びニコチン酸アミドからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする血管新生材の製造方法。
【請求項１３】
請求項１１又は１２において、前記感光基はキサンテン系色素であることを特徴とする血管新生材の製造方法。
【請求項１４】
請求項１３において、キサンテン系色素はエオシンであることを特徴とする血管新生材の製造方法。
【請求項１５】
請求項１１ないし１４のいずれか１項において、光照射は可視光であることを特徴とする血管新生材の製造方法。
【請求項１６】
請求項１１ないし１５のいずれかにおいて、光照射する際にハイドロゲンドナーを共存させておくことを特徴とする血管新生材の製造方法。
【請求項１７】
請求項１６において、ハイドロゲンドナーは、チオール、アルコール、還元糖、ポリフェノール又は１分子内に少なくとも１個のＮ−アルキル及び／又はＮ，Ｎ−ジアルキルアミノ基を有する化合物であることを特徴とする血管新生材の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮下組織又は筋組織へ直接注入されるゲル状の血管新生材と、その製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病による四肢欠損症など血流不全による組織のネクローシスを防止、改善するための血管新生材の提供が期待されている。血管閉塞による血行不良を要因とする組織のネクローシスは重篤な疾病であり、現在までに有効な治療方法は見出されていない。
【０００３】
ステントにより血流不全の要因部位、つまり、狭窄部位を拡張する方法は、患者自身の既存の血管の狭窄部位を拡張するものであり、血管を新生させるものではない。狭窄部位が存在する場合、血管自体が病変している可能性が高く、一部を拡張してもステント留置部位の上流側、下流側で同様に狭窄がおこる。他に内科的な方法として血管拡張作用のある薬剤による血流改善術があるが、これも血管を新生させるものではなく、また、長期間薬剤投与を行うと、全身に効果が波及し、多臓器出血などの重篤な副作用を惹起してしまう。
【０００４】
血管新生を原理とする技術には、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）をコードするプラスミドＤＮＡを筋肉注射する遺伝子治療があり、血管新生による血流改善効果が確認されている。しかしながら、プラスミドベクターの遺伝子導入効率は低く、高価なプラスミドを大量に消費し、治療費用は高騰する。また、血管新生作用を有するＨＧＦは、筋組織の細胞内に導入されたプラスミドにより発現されるもので、遺伝子導入効率、遺伝子発現効率に大きく依存するため、ＨＧＦとしての投与量調整が困難である。
【０００５】
ＨＧＦをコードするプラスミドベクターは無菌的に製造する必要があるが、高圧蒸気滅菌や放射線では失活してしまう。従って、製造のほぼ全工程を無菌的に行う必要があり、製造設備、施設などが大掛かりになってしまう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、血管新生作用を有するニコチン等のピリジン誘導体を皮下組織又は筋組織へ直接注入することができる血管新生材と、その製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明（請求項１）の血管新生材は、少なくとも感光基を有する分子団を導入したゼラチン修飾体を含む溶液に光照射して架橋することにより形成されたゲルからなるものである。
【０００８】
請求項２の血管新生材は、請求項１において、該ピリジン誘導体はニコチン、ニコチン酸、ニコチン酸エステル、、ニコチン酸アミド、ニセリトルオール、ニコクロネイト、ニコフィブレイト、ニコフラノース、ニコモール、ニコモルフィン、ニコランジル、ニコテリン、ニコチニルアルコール、ニフェジピン、ニフェナゾン、ニフルム酸、ニフロキン、ニケサミド、ニフルピリノール及びニルバジピン並びにこれらの置換体からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とするものである。
【０００９】
請求項３の血管新生材は、請求項１又は２において、ゼラチン１分子中に１個〜１０個のピリジン誘導体が導入されていることを特徴とするものである。
【００１０】
請求項４の血管新生材は、請求項１ないし３のいずれか１項において、前記感光基を有する分子団が、キサンテン系色素、アジン系色素、チアジン系色素、オキサジン系色素、キノリン系色素、ピラゾロン系色素、スチルゼン色素、アゾ系色素、ジアゾ系色素、アントラキノン系色素、インジゴ系色素、チアゾール系色素、フェニルメタン系色素、アクリジン系色素、シアニン系色素、インドフェノール系色素、ナフタルアミド系色素及びペリレン系色素からなる郡から選択される少なくとも１種であることを特徴とするものである。
【００１１】
請求項５の血管新生材は、請求項４項において、前記感光基を有する分子団が、エオシン、フルオロセイン、ローズベンガル、ベンゾフェノン、カンファーキノン、オレフィン、ベンザルアセトフェノン、シンナミリデンアセチル、シンナモイル、スチリルピリジン、α−フェニルマレイミド、フェニルアジド、スルホニルアジド、カルボニルアジド、ｏ−キノンジアジド、フリルアクリロイル、クマリン、ピロン、アントラセン、ベンゾイル、スチルベン、ジチオカルバメート、ザンタート、シクロプロペン、１、２、３−チアジアゾール、アザ−ジオキサビシクロ、ハロゲン化アルキル、ケトン及びジアゾ並びにこれらで修飾された物質からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とするものである。
【００１２】
請求項６の血管新生材は、請求項５において、前記感光基を有する分子団はエオシンであることを特徴とするものである。
【００１３】
請求項７の血管新生材は、請求項４ないし６のいずれか１項において、ゼラチン１分子中に１個〜１０個のキサンテン系色素が導入されていることを特徴とするものである。
【００１４】
請求項８の血管新生材は、請求項１ないし７のいずれか１項において、光照射は可視光であることを特徴とするものである。
【００１５】
請求項９の血管新生材は、請求項１ないし８のいずれかにおいて、光照射する際にハイドロゲンドナーを共存させておくことを特徴とするものである。
【００１６】
請求項１０の血管新生材は、請求項９において、ハイドロゲンドナーは、チオール、アルコール、還元糖、ポリフェノール又は１分子内に少なくとも１個のＮ−アルキル及び／又はＮ，Ｎ−ジアルキルアミノ基を有する化合物であることを特徴とするものである。
【００１７】
請求項１１の血管新生材の製造方法は、少なくともピリジン誘導体と感光基を導入したゼラチン修飾体に光照射して架橋することによりゲルからなる血管新生材を製造することを特徴とするものである。
【００１８】
請求項１２の血管新生材の製造方法は、請求項１１において、該ピリジン誘導体はニコチン、ニコチン酸、ニコチン酸エステル、ニコランジル、ニフェナゾン、及びニコチン酸アミドからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とするものである。
【００１９】
請求項１３の血管新生材の製造方法は、請求項１１又は１２において、前記感光基はキサンテン系色素であることを特徴とするものである。
【００２０】
請求項１４の血管新生材の製造方法は、請求項１３において、キサンテン系色素はエオシンであることを特徴とするものである。
【００２１】
請求項１５の血管新生材の製造方法は、請求項１１ないし１４のいずれか１項において、光照射は可視光であることを特徴とするものである。
【００２２】
請求項１６の血管新生材の製造方法は、請求項１１ないし１５のいずれかにおいて、光照射する際にハイドロゲンドナーを共存させておくことを特徴とするものである。
【００２３】
請求項１７の血管新生材の製造方法は、請求項１６において、ハイドロゲンドナーは、チオール、アルコール、還元糖、ポリフェノール又は１分子内に少なくとも１個のＮ−アルキル及び／又はＮ，Ｎ−ジアルキルアミノ基を有する化合物であることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００２４】
ニコチンに血管新生作用があることは公知である。本発明によって提供される血管新生材は、ピリジン誘導体を水徐溶性のゼラチン系ゲルに修飾し、生体内においてピリジン誘導体を放出させて血管を新生させるようにしたものである。
【００２５】
このゲルよりなる血管新生材は、皮下組織又は筋組織へ直接に注入される。
【００２６】
架橋したゼラチンゲルは水に不溶であるが、骨格のゼラチン自体が生体内で生分解すること及びゼラチン側鎖の結合が切断されることによりゼラチン側鎖を修飾しているピリジン誘導体が放出される。ピリジン誘導体を長期間、好ましくは２週間以上にわたって徐々に放出させることにより、優れた血管新生効果が得られる。
【００２７】
なお、ピリジン誘導体は水に極めて溶けやすく、そのまま生体内に投与すると注入部位から速やかに拡散してしまい、局部的な血管新生効果は得られない。継続的にピリジン誘導体を投与したのでは、全身にピリジン誘導体が蓄積的に高濃度で負荷されることになり副作用を惹起する可能性が高い。
【００２８】
本発明では、上記の通り、ゼラチンが生体内で生分解されることにより、長期にわたりピリジン誘導体が放出される。
【００２９】
本発明では、光架橋に関わるキサンテン色素の導入量、ハイドロゲンドナーの混合量、光照射量により架橋密度を制御調整することができる。投与部位の面積（腕なのか大腿部なのか、小児なのか体躯の大きな成人なのかなど）、病状（血流不全の程度）などを考慮して、適宜調整することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明の血管新生材は、少なくともピリジン誘導体と感光基とを導入したゼラチン修飾体に光照射して架橋することで形成されるゲルからなる。
【００３１】
このピリジン誘導体としては、ニコチン、ニコチン酸、ニコチン酸エステル、、ニコチン酸アミド、ニセリトルオール、ニコクロネイト、ニコフィブレイト、ニコフラノース、ニコモール、ニコモルフィン、ニコランジル、ニコテリン、ニコチニルアルコール、ニフェジピン、ニフェナゾン、ニフルム酸、ニフロキン、ニケサミド、ニフルピリノール及びニルバジピン並びにこれらの置換体からなる群から選択される少なくとも１種のニコチン系化合物が好適である。
【００３２】
この感光基を有する分子団としては、キサンテン系色素、アジン系色素、チアジン系色素、オキサジン系色素、キノリン系色素、ピラゾロン系色素、スチルゼン色素、アゾ系色素、ジアゾ系色素、アントラキノン系色素、インジゴ系色素、チアゾール系色素、フェニルメタン系色素、アクリジン系色素、シアニン系色素、インドフェノール系色素、ナフタルアミド系色素及びペリレン系色素からなる郡から選択される少なくとも１種が好適であり、より具体的には、エオシン、フルオロセイン、ローズベンガル、ベンゾフェノン、カンファーキノン、オレフィン、ベンザルアセトフェノン、シンナミリデンアセチル、シンナモイル、スチリルピリジン、α−フェニルマレイミド、フェニルアジド、スルホニルアジド、カルボニルアジド、ｏ−キノンジアジド、フリルアクリロイル、クマリン、ピロン、アントラセン、ベンゾイル、スチルベン、ジチオカルバメート、ザンタート、シクロプロペン、１、２、３−チアジアゾール、アザ−ジオキサビシクロ、ハロゲン化アルキル、ケトン及びジアゾ並びにこれらで修飾された物質からなる群から選択される少なくとも１種が好適であり、中でもエオシンが好適である。
【００３３】
従って、ピリジン誘導体及び感光基で修飾されたゼラチンとしてはニコチン系化合物で修飾されたエオシン化ゼラチンが好適である。このエオシン化ニコチン系ゼラチンについては後に詳述する。
【００３４】
エオシン及びピリジン誘導体のゼラチン分子への導入はゼラチン分子のアミノ基を利用することができる。例えば、ピリジン誘導体がニコチン酸の場合であれば、カルボキシル基をカルボジイミドの作用でゼラチンアミノ基と縮合させてアミド結合を介して固定することができる。また、グルタアルデヒドやエチレンジアミンなど２塩基性の架橋剤を使用して行っても良い。
【００３５】
ニコチンにアミノ基を導入した後にゼラチンへ固定する場合には、
(1)ニコチンへＮaＮＨ２／ＮＨ３を作用させ、ニコチンのピリジン環にアミノ基を導入する。
(2)アジピン酸、セバシン酸などの２塩基酸のモノアルキルエステルを塩化オキザリルなどで酸塩化物化とする。
(3)これをニコチンのピリジン環に導入したアミノ基へ反応させてアミド結合を介して末端アルキルエステル化する。
(4)導入したエステル部分を加水分解すると、カルボキシル基を導入したニコチン誘導体ができる。
(5)これをカルボジイミドの存在下でゼラチンと作用させてアミド結合を介してニコチン誘導体を導入する。
【００３６】
なお、ピリジン環のＮ原子と多価金属イオンによりゼラチンのアミノ基とキレーションさせて導入する方法も考えられる。
【００３７】
ゼラチン１分子中に１個〜１０個のキサンテン系色素が導入されることが好ましい。また、ゼラチン１分子中に１個〜１０個のピリジン誘導体が導入されることが好ましい。
【００３８】
光照射する際には、ラジカルのカウンターであるプロトン供与体としてハイドロゲンドナーを共存させておくことが好ましい。ハイドロゲンドナーとしてはチオール、アルコール、還元糖、ポリフェノール又は１分子内に少なくとも１個のＮ−アルキル及び／又はＮ，Ｎ−ジアルキルアミノ基を有する化合物が好適である。
【００３９】
光照射時には、ピリジン誘導体及び感光基で修飾したゼラチンを０．１〜５０重量％、ハイドロゲンドナーを０．１〜２０重量％の各割合で含む水溶液に対し光を照射するのが好ましい。光照射は有害な分解物を生成させないために可視光が好ましい。
【００４０】
光架橋することにより、水不溶性のゲルが生じる。ピリジン誘導体はゲルを構成するゼラチンに化学的に結合されているためゲルから拡散流出することはない。
【００４１】
この血管新生材が生体に注入されると、ゼラチンの分解にともなって、血管新生作用を有するピリジン誘導体が放出される。放出期間は、ゼラチンへの導入量、架橋密度、投与するゲルの容量に依存するが、例えば１００μＬのゲルを皮下組織に注入した場合の放出期間は数週間におよぶ。
【００４２】
ゲルは皮下組織又は筋組織へ直接注入して使用するのが好ましい。部位が四肢の場合やバイパス手術など開胸術時の心筋の場合は注射器でそのまま投与が可能である。投与の要領としては、例えば、１００μＬずつ略均等な間隔で数箇所〜数百箇所へ注入すれば良い。
【００４３】
次に、本発明において用いるのに好適なニコチン系化合物で修飾されたエオシン化ゼラチンについて説明する。
【００４４】
ここでゼラチンは、分子量５千〜１０万、アミノ基約１０〜１００個／１分子程度の通常のゼラチンで良い。
【００４５】
ニコチン系化合物で修飾されたエオシン化ゼラチンは、下記反応に従ってゼラチンの側鎖にエオシンを導入し、その後ニコチン系化合物を導入することにより調製される。
【００４６】
【化１】
2007070309.tif 000002
【００４７】
【化２】
2007070309.tif 000003
【００４８】
ゼラチン分子へのエオシンの導入数は、例えば、エオシン化ゼラチンの水溶液の吸光度をエオシンの最大吸収波長５２２ｎｍにおいて測定し、エオシンのモル吸光係数（Ｌｏｇε＝４．９  ｍｏｌ-1ｄｍ3ｃｍ-1）を基に算出可能であり、ゼラチン１分子に対して１〜１０個、特に２〜５個程度が好ましい。このエオシン等の感光基を有する化合物の導入数が少ないとゲル化率が低下し、また必要以上に多くてもゼラチン固有の柔軟性が損なわれる可能性があると共に、水へ難溶性となってしまう。
【００４９】
ゼラチン分子へのニコチン系化合物の導入数は、例えば、ニコチン化ゼラチンの水溶液の吸光度をニコチンの最大吸収波長２６０ｎｍにおいて測定し、ニコチンのモル吸光係数（Ｌｏｇε＝３．４８  ｍｏｌ-1ｄｍ3ｃｍ-1）を基に算出可能であり、ゼラチン１分子当り１〜１０個のニコチン系化合物を導入するのが好ましい。
【００５０】
このニコチン系化合物で修飾されたエオシン化ゼラチンは、粘稠性の液体状である。これを例えば濃度１〜１０重量％の水溶液とした場合には、３００〜３０，０００ｌｘ程度、特に３００〜１５，０００ｌｘ程度の比較的低照度で、可視光を０．１〜３０分程度照射してゲル状に硬化させることができる。なお、光照射するにあたっては、粘稠性の液体状のものに光照射して硬化するだけでなく、あらかじめ液体を乾燥させてから光照射することで、より高密度なゲルを形成させることも可能である。
【００５１】
本発明では、上記ゼラチンゲル形成用の水溶液がさらに、ラジカルのカウンターであるプロトン供与体として、アミノ基、Ｎ−アルキルアミノ基及びＮ、Ｎ−ジアルキルアミノ基からなる群から選択される少なくとも１種の基を有したアミノ化合物特にアミノアクリルアミド、具体的にはポリジメチルアミノプロピルアクリルアミドを５重量％程度含有することが好ましい。このアミノ化合物を含有させることにより、分子間結合を切断して分解物を生成させる可能性が高い紫外線を使用せずに、エネルギーが低く量産においても作業者への安全性が確保される可視光で、本発明の範囲内にある条件によっては蛍光灯などの日常生活で使用されているレベルの光で、不溶化することが可能となる。
【実施例】
【００５２】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。
【００５３】
実施例１
［エオシン化ゼラチンの合成］
ゼラチン（分子量９５，０００、アミノ基量約３７個／分子）に、水溶性カルボジイミドであるＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣ）の存在下、下記反応でゼラチンの側鎖のアミノ基にエオシンを結合させることにより、ゼラチン１分子当たりエオシン約５個を導入してエオシン化ゼラチンを合成した。
【００５４】
【化３】
2007070309.tif 000004
【００５５】
［ニコチン酸の導入］
次いで、下記反応式に従ってゼラチンにさらにニコチン酸を導入した。
【化４】
2007070309.tif 000005
【００５６】
［血管新生材の作成］
合成したエオシン化ニコチン酸ゼラチンを終濃度１０重量％となるように水に溶解した。
【００５７】
石英製ガラス管（内径２ｍｍ、外径３ｍｍ）中へ上記溶液を充填し、トクソーパワーライト（トクヤマ製、ハロゲンランプ、波長４００ｎｍ〜５２０ｎｍ）にて照射強度２００ｍＷ／ｃｍ２となるように可視光を２０分間照射してゲル化させた。
【００５８】
［放出性の確認試験］
このゲル５００μＬを、３００ｍＬの生食中へ浸漬し、２５℃で放置した。ここから経時的にアリコットを採取し、放出されたニコチン系化合物の濃度を測定した。測定は高速液体クロマトグラフィーで行い、測定条件は、
カラム：ＯＤＳカラム（島津製作所ＳＴＲ−II）
カラム温度：４０℃
移動相：３０％ｎ-ブタノール水溶液
検出器：紫外可視分光光度計（波長２５４ｎｍ）
である。
【００５９】
測定の結果、浸漬から１時間後には約５〜２０ｍｇ／ｍＬの量で放出され、放出は約４週間継続することが確認された。
【００６０】
［生体への注入及び血管新生作用の確認］
ＰＴＦＥ製のシースを１８Ｇのシリンジの入口へあて、上記石英管中をシース内へ挿入してから０．２μｍフィルターを介した清浄空気で石英管の反対側から加圧し、前記石英管中で不溶化したゲルをシリンジ内へ押し込んだ。
【００６１】
通常手技によってウサギ背部の表皮を剃毛してイソジン消毒を行った。ウサギ背部の皮下組織内へ、略１０ｍｍ間隔で、それぞれ約１００μＬのゲルを１８Ｇシリンジから注入し、合計で１０箇所へ注射投与し、そのままウサギを飼育した。水は自由給水とし、飼料としてヘイキューブを体重に応じて適量給仕した。
【００６２】
ゲルを投与した部位において、炎症や感染の所見は認められず、抗生物質は一切使用する必要がなかった。投与から２週間後にウサギを犠牲死させ、ゲルを注入した周辺の皮下組織を摘出した。通常手技で病理標本を作成すると、周辺部に多くの毛細血管、血管が新生して成熟しており、かつ、炎症や感染の所見は認められなかった。