(57)【要約】【課題】ヒト肺癌に高頻度に認められる上皮成長因子受容体（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＥＧＦＲ）遺伝子のチロシンキナーゼ部分の突然変異を特異的かつ迅速に検出することができる遺伝子診断法を提供すること。【解決手段】ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ部位に高頻度に見られる遺伝子異常をもつＤＮＡのみを特異的に増幅することのできるＰＣＲ用プライマー【選択図】図１
2007202546.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮成長因子受容体（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＥＧＦＲ）遺伝子のチロシンキナーゼ部分の突然変異のひとつであるエクソン１９内の１５塩基対（塩基対番号２４８１番から２４９５番）の欠失を特異的に検出することの出来るＰＣＲ用プライマー。
【請求項２】
ＥＧＦＲ遺伝子のチロシンキナーゼ部分の突然変異のひとつであるエクソン１９内の１５塩基対（塩基対番号２４８２番から２４９６番）の欠失を特異的に検出することの出来るＰＣＲ用プライマー。
【請求項３】
ＥＧＦＲ遺伝子のチロシンキナーゼ部分の突然変異のひとつであるエクソン２１内の塩基対番号２８１９番のチロシンからグアニンへの点突然変異を特異的に検出することの出来るＰＣＲ用プライマー。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のプライマーから選択された１組のプライマーをＰＣＲに用いることを特徴とする、ＥＧＦＲ遺伝子のチロシンキナーゼ部分の突然変異を検出する方法。
【請求項５】
請求項１、２のいずれか一項に記載の１組のプライマー、及び請求項３に記載の１組のプライマーを同時にＰＣＲに用いることを特徴とする、ＥＧＦＲ遺伝子のチロシンキナーゼ部分の２種類の突然変異を同時に検出・識別する方法。
【請求項６】
請求項４又は５の記載の検出方法を用いて、ヒト組織におけるＥＧＦＲ遺伝子のチロシンキナーゼ部分の突然変異を検出する方法。
【請求項７】
ヒト組織がパラフィン包埋保存組織である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ヒト組織が肺癌である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ヒト組織が肺である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
ヒト組織がリンパ節である、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
ヒト組織が血液である、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１または２に記載されたような、一部を欠失した遺伝子に相補的なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、遺伝子の欠失を検出する方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明は、ヒト悪性腫瘍におけるＥＧＦＲ遺伝子のチロシンキナーゼ部位の異常を検出するＰＣＲ用プライマー、ＰＣＲ増幅産物であるＤＮＡ、及び該プライマーを用いる各種の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】ＥＧＦＲの阻害剤であるゲフィチニブは肺癌の治療に有効であるため、わが国でもすでに臨床現場で使用されている。この際、標的であるＥＧＦＲ遺伝子のチロシンキナーゼ部位に変異を持つ症例の方が、変異のない例に比べゲフィチニブの有効性が高いと報告されている（例えば、非特許文献１参照）。一方、ゲフィチニブについては副作用として致死的な肺線維症を生ずる例も多く報告され、社会問題にもなっている。そのため、ＥＧＦＲの変異の有無を検出し、有効であると予測される症例にのみ投与を行うことが、治療効果／副作用の比を最大限にする上で重要であるとされる。現在までの報告では、特にわが国を含む東アジア諸国でＥＧＦＲ遺伝子変異の頻度が高く、ゲフィチニブの有効性を高める上で、肺癌症例においてＥＧＦＲ遺伝子の変異の有無を調べることが必要であると思われる。【０００３】従来ＥＧＦＲ遺伝子変異を検出するには主にダイレクトシークエンス法が用いられてきたが、臨床検体では正常細胞の混入のため異常を見逃す場合があること、手技が煩雑なこと、特別な機器が必要であること、コストが高いことなどの欠点があった。他にも単鎖立体構造異型（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法やリアルタイムＰＣＲ法が応用できるとする報告もあるが、これらも検出力ではダイレクトシークエンス法にまさるものの、機器の普遍性や技術の簡便性の点で問題があった（例えば、非特許文献２参照）。
【非特許文献１】Ｍａｒｃｈｅｔｔｉ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｌｏｇｙ，２３：８５７−６５（２００５）
【非特許文献２】Ｓａｓａｋｉ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１：２９２４−９（２００５）
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】われわれは、ＥＧＦＲ遺伝子の変異が特定の部分に集中しており、大部分が３種類の遺伝子異常のうちのいずれかであることに注目し、この３種類の異常についてはＰＣＲ法を応用した簡便な変異検出法が可能であると考えた。この３種類とは、１）エクソン１９内の１５塩基対（塩基対番号２４８１番から２４９５番）の欠失（ＥＧＦＲ１９ｄｅｌｔｙｐｅ１）、２）エクソン１９内の１５塩基対（塩基対番号２４８２番から２４９６番）の欠失（ＥＧＦＲ１９ｄｅｌｔｙｐｅ２）、３）エクソン２１内の塩基対番号２８１９番のチロシンからグアニンへの点突然変異（ＥＧＦＲ２１Ｌ８５８Ｒ）、である。本法を応用し実用化するには、チロシンキナーゼ部位にこれら３種類の変異のいずれかをもつＥＧＦＲ遺伝子を特異的に増幅することのできるプライマーを作製することが必要であった。
【課題を解決するための手段】
【０００５】そこで本発明者は、上記の３種類のＥＧＦＲのチロシンキナーゼ部位の変異に特異的なプライマーを作製して、迅速かつ特異的にこれら３種類のＥＧＦＲのチロシンキナーゼ部位の特定の変異を検出できるような遺伝子診断法が可能であるかを精査、検証した。
【０００６】即ち、本発明者は、これら３種類の特定のチロシンキナーゼ部位の変異をもつＥＧＦＲ遺伝子の一部（遺伝子断片）を特異的に増幅することが出来るプライマーを作成し、本発明を完成した。更に、これらのプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、上記の特異的な遺伝子断片を増幅することが出来た。
【０００７】即ち、本発明は、上記３種類のＥＧＦＲ遺伝子の異常のいずれかを検出することの出来るＰＣＲ用プライマーに係る。
かかるプライマーの好適な例として、塩基配列として、「ｔｇｃａｔｃｇｃｔｇｇｔａａｃａｔ（ＥＧＦＲ１９Ｓ４）（配列番号１）及び「ｃｇｇａｇａｔｇｔｔｔｔｇａｔａｇｃｇ（ＥＧＦＲ１９ＡＳＤ１）」（配列番号２）を有するプライマーがある。後者はＥＧＦＲ遺伝子の塩基対番号２４７２番から２５０５番までの配列から、塩基対番号２４８１番から２４９５番の塩基を除いたものと相補的な配列である。
【０００８】かかるプライマーのもうひとつの例としては、塩基配列として、「ａｔｇｔｃａａｇａｔｃａｃａｇａｔｔｔｔｇｇｇｃｇ（ＥＧＦＲ２１ＳＭ１）」（配列番号３）および「ｃｔｇｇｃｔｇａｃｃｔａａａｇｃ（ＥＧＦＲ２１ＡＳ４）」（配列番号４）を有するプライマーがある。
【０００９】本明細書の実施例に示されるように、本発明のプライマーを用いることによって、上記３種類のＥＧＦＲ遺伝子の異常をもつＤＮＡにおいてのみ、ＰＣＲにおいて異常ＥＧＦＲ遺伝子の一部の塩基配列を増幅することが出来る。従って、上記３種類のＥＧＦＲ遺伝子の異常のいずれももたないＤＮＡにおいては、かかる塩基配列を有するＰＣＲ産物は増幅されない。ＰＣＲ自体は、当業者には周知の反応であり、当業者であれば、適宜、反応条件を設定し実施することが出来る。このようなＰＣＲの好適条件は、本明細書の実施例に記載されたものである。
【００１０】本発明は更に、本発明のプライマーから選択された１組または２組のプライマーをＰＣＲに用いることを特徴とする、上記３種類のＥＧＦＲ遺伝子の異常を検出する方法に係る。特に、ＥＧＦＲｄｅｌ１９ｔｙｐｅ１およびＥＧＦＲｄｅｌｔｙｐｅ２を検出できるプライマー１組と、ＥＧＦＲ２１Ｌ８５８Ｒを検出できるプライマー１組を同時に使用することによって、ＥＧＦＲｄｅｌ１９Ｔｙｐｅ１またはＥＧＦＲｄｅｌ１９ｔｙｐｅ２と、ＥＧＦＲ２１Ｌ８５８Ｒとを同時に検出し、識別することが可能となる。
【００１１】又、本発明は、上記の検出方法を用いて、ヒト組織におけるＥＧＦＲ遺伝子の上記３種類の異常を検出する方法にも係る。ヒト組織としては、例えば肺癌組織、その他の癌組織、肺、リンパ節、血液、およびこれらをパラフィンで包埋した組織などが挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】より具体的には、本発明者は、非特許文献１により報告されたＥＧＦＲ１９ｄｅｌｔｙｐｅ１，ＥＧＦＲ１９ｄｅｌｔｙｐｅ２，ＥＧＦＲ２１Ｌ８５８Ｒの３種類のＥＧＦＲ遺伝子の異常についての遺伝子情報を基に特異的なプライマーを作製して、迅速かつ特異的に上記３種類の遺伝子異常を検出できるような遺伝子診断法が可能であるかを精査、検証した。【００１３】ＥＧＦＲ１９ｄｅｌｔｙｐｅ１の異常をもつ塩基配列のＰＣＲ産物を特異的に増幅させるための１組の特異プライマー（ＥＧＦＲ１９Ｓ４とＥＧＦＲ１９ＡＳＤ１）を設計した。後者はＥＧＦＲ遺伝子の塩基対番号２４７２番から２５０５番までの配列から、塩基対番号２４８１番から２４９５番の塩基を除いたものと相補的な配列である。このプライマーを用いてＰＣＲを行ったところ、塩基対番号２４８１番から２４９５番の１５塩基の欠失であるＥＧＦＲ１９ｄｅｌｔｙｐｅ１の異常をもつＤＮＡにおいて１３３ｂｐの遺伝子が増幅された。一方、塩基対番号２４８２番から２４９６番のＥＧＦＲ１９ｄｅｌｔｙｐｅ２はＥＧＦＲ１９ｄｅｌｔｙｐｅ１と１塩基対のみが異なる異常であるが、上記のプライマーを用いたＰＣＲではやはり１９ｄｅｌｔｙｐｅ２の異常をもつＤＮＡにおいても１３３ｂｐの遺伝子が増幅された。このＰＣＲ産物は確かに当該異常を持つＥＧＦＲ遺伝子の一部であることがＰＣＲ産物を用いたダイレクトシークエンス法で確認された。以降、ＥＧＦＲ１９ｄｅｌｔｙｐｅ１ならびにＥＧＦＲ１９ｄｅｌｔｙｐｅ２をまとめてＥＧＦＲ１９ｄｅｌと記す。【００１４】また、配列番号３に示されたＥＧＦＲ２１Ｌ８５８Ｒの異常をもつ塩基配列のＰＣＲ産物を特異的に増幅させるための１組の特異プライマー（ＥＧＦＲ２１ＳＭ１とＥＧＦＲ２１ＡＳ４）を設計した。このプライマーを用いてＰＣＲを行ったところ、ＥＧＦＲ２１Ｌ８５８Ｒの異常をもつＤＮＡにおいて予測された１０４ｂｐの遺伝子が増幅された。このＰＣＲ産物は確かに当該異常を持つＥＧＦＲ遺伝子の一部であることがＰＣＲ産物を用いたダイレクトシークエンス法で確認された。【００１５】更に、これらのＰＣＲ産物は、正常ヒト血液や上記３種類以外のＥＧＦＲ遺伝子の異常をもつ肺癌などから両検査法では増幅されなかった。また、２組のプライマーを混合してＰＣＲを行うと、１回の反応でＥＧＦＲ１９ｄｅｌとＥＧＦＲ２１Ｌ８５８Ｒを同時に検出、鑑別することができた（図１参照）。
【実施例】
【００１６】以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００１７】ＥＧＦＲ１９ｄｅｌｔｙｐｅ１の異常をもつＥＧＦＲ遺伝子の塩基配列に基づいて、新しいプライマーＥＧＦＲ１９ＡＳＤ１及びＥＧＦＲ１９Ｓ４（１３３ｂｐ増幅）を設計した。また、Ｌ８５８Ｒの異常をもつＥＧＦＲ遺伝子の塩基配列に基づいて、新しいプライマー、ＥＧＦＲ２１ＳＭ１及びＥＧＦＲ２１ＡＳ４（１０４ｂｐ増幅）を設計した。
【実施例２】
【００１８】次に、このプライマーの組合せ、ＥＧＦＲ１９Ｓ４−ＥＧＦＲ１９ＡＳＤ１ならびにＥＧＦＲ２１ＳＭ１−ＥＧＦＲ２１ＡＳ４により、ＥＧＦＲ１９ｄｅｌならびにＥＧＦＲ２１Ｌ８５８Ｒの異常をもつＤＮＡが特異的に増幅できることを確認するため、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡ  １μｌ、１０ＸＰＣＲバッファー（Ｑｉａｇｅｎ）２．５μｌ、６６７ｎＭの各プライマー、０．２ＵのＴａｑポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）、２５０μＭの各デオキシヌクレオチド３リン酸（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含んだ３０μｌの反応で行った。ＰＣＲ反応は、９４℃５分の一本鎖化反応の後、９４℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃３０秒を３２サイクル、その後７２℃１０分の伸長反応を行った。ＰＣＲ増幅産物は、アガロースゲルの電気泳動で解析した。【００１９】その結果、ＥＧＦＲ１９ｄｅｌに特異的なＥＧＦＲ１９Ｓ４−ＥＧＦＲ１９ＡＳＤ１のプライマーでは、予測された１３３ｂｐの一本のバンドが、供試したＥＧＦＲ１９ｄｅｌｔｙｐｅ１をもつことが判明している肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ１６５０（例えば、非特許文献３を参照）およびダイレクトシークエンスによりＥＧＦＲ１９ｄｅｌｔｙｐｅ２をもつことが判明している肺癌患者検体Ｌ４８の両者で増幅されたが、対照の正常人血液細胞およびダイレクトシークエンスによりＥＧＦＲ１９ｄｅｌｔｙｐｅ１，ＥＧＦＲ１９ｄｅｌｔｙｐｅ２以外の異常をもつことが判明している肺癌細胞では増幅されなかった。それに対し、ＥＧＦＲ２１Ｌ８５８Ｒに特異的なＥＧＦＲ２１ＳＭ１−ＥＧＦＲ２１ＡＳ４を用いると、供試したＥＧＦＲ２１Ｌ８５８Ｒをもつことが判明している肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ１９７５（非特許文献３）では、予測された１０４ｂｐのバンドが増幅されたが、対照の正常人血液細胞およびダイレクトシークエンスによりＥＧＦＲ２１Ｌ８５８Ｒ以外の異常をもつことが判明している肺癌細胞では増幅されなかった。なお、このＰＣＲ反応はパラフィン包埋組識から抽出したＤＮＡにおいても増幅可能であった。【００２０】
【非特許文献３】Ｌｙｎｃｈ  ＴＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３５０：２１２９−３９（２００４）．
【実施例３】
【００２１】従って、上記の１３３ｂｐ及び１０４ｂｐのＰＣＲ増幅産物は、ＥＧＦＲ１９ｄｅｌならびにＥＧＦＲ２１Ｌ８５８Ｒ固有の塩基配列であり、これらの特異的な検出に利用することが出来ることが判明した。
【実施例４】
【００２２】一回のＰＣＲ反応でＥＧＦＲ１９ｄｅｌ、ならびにＥＧＦＲ２１Ｌ８５８Ｒの同時の検出と同定を可能にするため、ＥＧＦＲ１９Ｓ４−ＥＧＦＲ１９ＡＳＤ１ならびにＥＧＦＲ２１ＳＭ１−ＥＧＦＲ２１ＡＳ４のプライマーを混合してワンステップデュプレックスＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件およびプログラムは、上述の特異的ＰＣＲ増幅反応と同じ条件で行った。
デュプレックスＰＣＲの結果を図１に示す。２種類の特異的プライマーセットを用いることで、肺癌細胞株Ｈ１６５０および肺癌検体Ｌ４８からは１３３ｂｐの１本のバンドが得られたのに対し、肺癌細胞株Ｈ１９７では１０４ｂｐの１本のバンドが観察できた。正常血液や、他の種類のＥＧＦＲ遺伝子異常をもつ肺癌検体からは増幅産物は得られなかった。
【発明の効果】
【００２３】本発明の２組の特異プライマーを用いたＰＣＲによる遺伝子診断法は、ＥＧＦＲ１９ｄｅｌｔｙｐｅ１、ＥＧＦＲ１９ｄｅｌｔｙｐｅ２ならびにＥＧＦＲ２１Ｌ８５８Ｒの３種のＥＧＦＲ遺伝子異常を検出することができることに加え、ＥＧＦＲ１９ｄｅｌおよびＥＧＦＲ２１Ｌ８５８Ｒの２種の異常を同時に鑑別することが可能となった。さらに従来のダイレクトシークエンス法に比べ診断に要する時間を飛躍的に短縮することができる。よって今回作成された新たなプライマーの塩基配列は、今後ダイレクトシークエンス法が不可能であるパラフィン包埋臨床検体やダイレクトシークエンスを行うための設備のない場所におけるＥＧＦＲ遺伝子の主要な異常の検出法、およびダイレクトシークエンス法の前のスクリーニング検査法として応用されることが期待される。
即ち、肺癌などの悪性腫瘍の治療のターゲットであるＥＧＦＲ遺伝子の異常を特異的かつ迅速に検出、鑑別するための遺伝子診断法を提供することにより、肺癌などＥＧＦＲ遺伝子の異常をもつヒト悪性腫瘍の治療に大きく貢献する。
また、一部を欠失した遺伝子に相補的なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、遺伝子の欠失を検出する方法は、他の遺伝子の欠失による異常についても応用可能であり、遺伝子欠失の簡便な検出法として役立つことが期待される。
【００２４】
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、２組のプライマーを混合したワンステップデュプレックスＰＣＲによるＥＧＦＲ１９ｄｅｌｔｙｐｅ１、ＥＧＦＲ１９ｄｅｌｔｙｐｅ２ならびにＥＧＦＲ２１Ｌ８５８Ｒの特異的検出の結果を示す電気泳動の写真である。レーンＭ：１００ｂｐマーカー（最下段のバンドが１００ｂｐの大きさに相当する）  レーン１：ＮＣＩ−Ｈ１６５０（ＥＧＦＲ１９ｄｅｌｔｙｐｅ１の異常をもつ）  レーン２：肺癌検体Ｌ４８（ＥＧＦＲ１９ｄｅｌｔｙｐｅ２の異常をもつ）  レーン３：ＮＣＩ−Ｈ１９７５（ＥＧＦＲ２１Ｌ８５８Ｒの異常をもつ）  レーン４：肺癌検体Ｌ５４（ＥＧＦＲ２１Ｌ８５８Ｒの異常をもつ）  レーン５：肺癌検体Ｌ１２（上記３種類以外のＥＧＦＲ遺伝子異常をもつ）  レーン６，７：正常人血液（ＥＧＦＲ遺伝子の異常をもたない）
【図１】
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【配列表】
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