(57)【要約】【課題】検体中に遊離体及び結合体で存在する物質を高精度かつ簡便に定量できる方法並びに試薬キットを適用すること。【解決手段】測定対象物質が遊離体及び結合体で存在する検体と、測定対象物質に対するモノクローナル抗体１を固定化したラテックス１とを反応させて反応体１を得る工程（１）、並びに抗体１と測定対象物質に対する認識部位の異なるモノクローナル抗体２を固定化したラテックス２と、反応体１とを反応させて反応体２を得る工程（２）を含むことを特徴とする免疫測定法、また検体中の遊離体及び結合体で存在する測定対象物質を定量するための試薬キットであって、測定対象物質に対するモノクローナル抗体１を固定化したラテックス１を含む試薬（１）と、抗体１と測定対象物質に対する認識部位の異なるモノクローナル抗体２を固定化したラテックス２を含む試薬（２）とを必須構成試薬として含有すことを特徴とする免疫測定用試薬キットを用いる。    【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象物質が遊離体及び結合体で存在する検体と、測定対象物質に対するモノクローナル抗体１を固定化したラテックス１とを反応させて反応体１を得る工程（１）、
並びに抗体１と測定対象物質に対する認識部位の異なるモノクローナル抗体２を固定化したラテックス２と、反応体１とを反応させて反応体２を得る工程（２）を含むことを特徴とする免疫測定法。
【請求項２】
工程（１）及び工程（２）の反応時間の合計が２〜６０分であり、かつ工程（１）の反応時間（１）が工程（２）の反応時間（２）の０．２〜５倍である請求項１に記載の免疫測定法。
【請求項３】
ラテックス１の体積平均粒子径（ａ）とラテックス２の体積平均粒子径（ｂ）との比（ａ／ｂ）が０．９〜１．１である請求項１又は２に記載の免疫測定法。
【請求項４】
測定対象物質が前立腺特異抗原である請求項１〜３のいずれかに記載の免疫測定法。
【請求項５】
検体中の遊離体及び結合体で存在する測定対象物質を定量するための試薬キットであって、
測定対象物質に対するモノクローナル抗体１を固定化したラテックス１を含む試薬（１）と、
抗体１と測定対象物質に対する認識部位の異なるモノクローナル抗体２を固定化したラテックス２を含む試薬（２）とを必須構成試薬として含有することを特徴とする免疫測定用試薬キット。
【請求項６】
試薬（１）及び／又は試薬（２）に凝集促進剤を含んでなる請求項４に記載の免疫測定用試薬キット。
【請求項７】
ラテックス１の体積平均粒子径（ａ）とラテックス２の体積平均粒子径（ｂ）との比（ａ／ｂ）が０．９〜１．１である請求項５又は６に記載の免疫測定用試薬キット。
【請求項８】
測定対象物質が前立腺特異抗原である請求項５〜７のいずれかに記載の免疫測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫測定法及び免疫測定用試薬キットに関する。詳しくは測定対象物が検体中の遊離体及び結合体で存在する測定対象物質を定量するために好適な免疫測定法、並びにこれに好適に用いられる測定用試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体中の物質には、遊離体及び結合体で存在するものがあることは従来から知られている（たとえば、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）は、遊離体であるＰＳＡ自体以外に、ＰＳＡとα１−アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）等との結合体で血中に存在する）。そしてこのような物質を定量する方法として、（１）遊離体と結合体と等モル反応させるＥＬＩＳＡ（Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay)法用測定試薬及びこれを用いた測定方法が提案されている（特許文献１）。
また、（２）２種類のモノクローナル抗体を平均粒子径が異なる２種の不溶性担体（ラテックス等）にそれぞれ担持させたものを用いて定量する方法が知られている（特許文献２）。
【特許文献１】特開平９−２３４０６８号公報
【特許文献２】特開２００５−１０６６０９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、前者の方法（１）は、特殊な装置を必要とし、汎用の自動分析装置には適用できないという問題がある。
また、後者の方法（２）では、高感度で定量できないという問題がある。
本発明の目的は、このような現状に鑑み、検体中に遊離体及び結合体で存在する物質を高精度でかつ簡便に定量する方法、並びにこの方法に適した試薬キットを適用することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の免疫測定法の特徴は、測定対象物質が遊離体及び結合体で存在する検体と、測定対象物質に対するモノクローナル抗体１を固定化したラテックス１とを反応させて反応体１を得る工程（１）、
並びに抗体１と測定対象物質に対する認識部位の異なるモノクローナル抗体２を固定化したラテックス２と、反応体１とを反応させて反応体２を得る工程（２）を含む点を要旨とする。
また、本発明の免疫測定用試薬キットの特徴は、検体中の遊離体及び結合体で存在する測定対象物質を定量するための試薬キットであって、
測定対象物質に対するモノクローナル抗体１を固定化したラテックス１を含む試薬（１）と、
抗体１と測定対象物質に対する認識部位の異なるモノクローナル抗体２を固定化したラテックス２を含む試薬（２）とを必須構成試薬として含有する点を要旨とする。
【発明の効果】
【０００５】
本発明の免疫測定法は、検体中に遊離体及び結合体で存在する物質を高精度でかつ簡便に定量することができる。
また、本発明の試薬キットは、検体中に遊離体及び結合体で存在する物質を高精度でかつ簡便に定量することができる。
したがって、本発明によると、特殊な装置を必要とせず、汎用の自動分析装置を用いて、高感度で定量できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
測定対象物質としては、遊離体と結合体とで存在し得るものであれば特に限定されないが、本発明は検体中に遊離体及び結合体で存在するものに好適である（これらのいずれかの状態で存在する場合は従来の方法でも、簡便に定量できるが、高精度ではない。）。なお、遊離体とは、測定対象物質が遊離状態であること（測定対象物質が親和性物質と結合していないこと）を意味する。また、結合体とは、測定対象物質と、親和性物質（結合物）とが結合しているものを意味する。
測定対象物質としては、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、プロテインＣ、エラスターゼ、カテプシンＧ、トロンビン、Ｃ１−エステラーゼ、プラスミン及び組織型プロスミノゲン・アクチベータ等が挙げられる。これらのうち、ＰＳＡが好ましい。
親和性物質としては、測定対象物質に対して親和性を有し結合（水素結合やファンデルワールス力による結合等）し得る物質であれば特に限定はされないが、たとえば、以下の物質が挙げられる。
測定対象物質がＰＳＡの場合、α１−アンチキモトリプシン又はプロテインＣインヒビター等；同様にプロテインＣの場合、プロテインＣインヒビター等；エラスターゼの場合、α１−プロテアーゼインヒビター等；カテプシンＧの場合、α１−アンチキモトリプシン等；トロンビンの場合、抗トロンビンIII等；Ｃ１−エステラーゼの場合、Ｃ１−インヒビター等；プラスミンの場合、α２−抗プラスミン等；組織型プロスミノゲン・アクチベータの場合、プロスミノゲン・アクチベータ・インヒビター１等が挙げられる。
【０００７】
測定対象物質に対するモノクローナル抗体１としては、測定対象物質（遊離体と結合体の両者を含む）との反応性を有するものであれば特に限定されない。
測定対象物質に対するモノクロナール抗体２としては、測定対象物質（遊離体と結合体の両者を含む）との反応性を有し、かつ抗体１と測定対象物質に対する認識部位（エピトープ）の異なるモノクローナル抗体であれば特に制限されない。
なお、２種の抗体の認識部位が異なることは、抗体及び抗原のエピトープマッピング等により確認できるが、より簡便には、抗原及び２種の抗体を用いて、通常の２部位サンドイッチ免疫測定できるかどうをによっても確認できる。
これらのモノクロナール抗体の由来も特に限定されず、市販品（例えば、メディックスバイオメミカ；Anti-hPSA Clone code 8301, 8311、日本臨床検査研究所；anti-PSA Clone No.68, 4D10 等）、或いは細胞融合技術や遺伝子組換え技術等を利用した自体公知の方法〔Eur.J immunol, 6, 511 (1976)〕等によって産生されたもの等が使用できる。
【０００８】
モノクローナル抗体１及びモノクローナル抗体２は、パパイン等で部分分解して得られるＦａｂフラグメント、ペプシン等で部分分解して得られるＦ（ａｂ'）2フラグメント及び／又はＦ（ａｂ'）2フラグメントを還元処理して得られるＦａｂ'フラグメント等を含んでいてもよい。
【０００９】
モノクローナル抗体１又はモノクローナル抗体２は、単独のモノクローナル抗体であってもよく、複数のモノクローナル抗体の混合物であってもよい。
【００１０】
ラテックス１及びラテックス２に使用されるラテックスとしては、免疫測定分野で用いられているものであれば特に限定はされないが、スチレンラテックス（ポリスチレンラテックス等）、アクリルラテックス（メタクリル酸エステルラテックス等）、変性ラテックス（ポリスチレンラテックスにカルボキシル基を導入したカルボキシ変性ラテックス等）、磁性ラテックス（磁性粒子を内包させたラテックス等）等が挙げられる。これらのラテックスのうち、スチレンラテックス及び変性ラテックスが好ましく、さらに好ましくはソープフリー乳化重合によって得られるポリスチレンラテックス及びカルボキシ変性ラテックス、特に好ましくはカルボキシ変性ラテックスである。
【００１１】
ラテックスの粒子径は測定対象物及び必要とする測定感度等により適宜選択することができ、ラテックスの体積平均粒子径（μｍ）は、０．０５〜２．４が好ましく、さらに好ましくは０．０５〜１、特に好ましくは０．０５〜０．３である。これらの範囲であると、測定感度がさらに良好となる。
ラテックス粒子の粒子径は、測定感度の観点等から、バラツキが小さい方が好ましく、粒子径の変動係数が１０％以下が好ましく、さらに好ましくは５％以下、特に好ましくは３％以下である。
【００１２】
ラテックス１又はラテックス２は、ラテックスにモノクローナル抗体１又はモノクローナル抗体２を固定化して調製される。
ラテックスにモノクローナル抗体を固定化する方法としては、従来公知の方法（物理吸着法及び化学結合法）に準じて行うことができる。
物理吸着法としては、モノクローナル抗体とラテックスとを適当な緩衝液（リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液及びホウ酸緩衝液等）中で懸濁させ、たとえば、２０〜３０℃で２〜３時間反応させた後、遠心分離し、上清を除き、適当なブロッキング剤を含む緩衝液（１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液等）に再分散すること（ブロッキング処理）により固定化する方法等が適用できる。
化学結合法としては、カルボキシ変性ラテックスに可溶性カルボジイミド［例えば、1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride等］等を反応させて、表面のカルボキシル基を活性化した後、モノクローナル抗体を反応させることにより固定化する方法等が適用できる（モノクロナール抗体のアミノ基が活性化されたカルボキシル基と結合する）。なお、結合後のブロッキング処理等は物理吸着法と同様に行うことができる。
【００１３】
ラテックスにモノクローナル抗体を固定化する時の抗体量は、抗体の力価、測定対象物、測定感度等により適宜設定できるが、ラテックス固形分（約１００℃における揮発分を含まない）１ｍｇ当たり、２〜１００μｇ程度である。
【００１４】
ラックス１及びラテックス２は、同一の平均粒子径をもつラテックスから作成されることが好ましく、ラックス１の体積平均粒子径（ａ）とラテックス２の体積平均粒子径（ｂ）との比（ａ／ｂ）は、０．９〜１．１が好ましく、さらに好ましくは０．９３〜１．０７、特に好ましくは０．９５〜１．０５、最も好ましくは０．９７〜１．０２である。この範囲であると、測定感度がさらに良好となる。
【００１５】
測定感度、測定レンジ等の改善のため、ラテックス１は、平均粒子径の異なる２種以上のラテックスにそれぞれモノクローナル抗体１を結合した後、混合して使用することもできる。なお、平均粒子径の異なる２種以上のラテックスを用いる場合、ラテックスの粒子径の変動係数は、それぞれ１０％以下が好ましく、さらに好ましくは５％以下、特に好ましくは３％以下である。
また、同様の理由から、ラテックス２についても同様である。
これらの場合でも、ラックス１の体積平均粒子径（ａ）とラテックス２の体積平均粒子径（ｂ）との比（ａ／ｂ）は上記の範囲であることが好ましい。
【００１６】
ラテックス１及びラテックス２は、それぞれ、適当な緩衝液に分散して試薬１及び試薬２として調製され、保存及び測定に使用される。
試薬１及び試薬２を調製するために用いられる緩衝液としては、上記モノクローナル抗体と測定対象物質とが反応することを妨げるものでなければよく、ｐＨ５．０〜１０．０（好ましくは６．５〜８．５）に緩衝作用を有する緩衝液｛リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液及びホウ酸緩衝液等｝等が使用できる。なお、これらの緩衝液中の緩衝剤の濃度（ｍＭ）としては、１〜５００が好ましく、さらに好ましくは５〜３００、特に好ましくは１０〜２００である。この範囲であると、測定感度がさらに良好となる。
【００１７】
試薬１中のラテックス１の含有量は、測定対象物、ラテックスの平均粒子径、要求される測定感度等により適宜設定できるが、試薬１００ｍｌ当たり、０．０１〜１ｇが好ましく、さらに好ましくは０．０２〜０．５ｇ、特に好ましくは０．０５〜０．３ｇである。また、試薬２についても同様である。これらの範囲であると、測定感度がさらに良好となる。
なお、ラテックスの含有量を試薬１と試薬２とで異なる設定としてもよく、異なる場合、試薬１中のラテックス１の含有量（ｇ／１００ｍｌ）と試薬２中のラテックス２の含有量（ｇ／１００ｍｌ）との比（ラテックス１／ラテックス２）は、１０／１〜１／１０が好ましく、さらに好ましくは５／１〜１／５、特に好ましくは３／１〜１／３である。この範囲であると、測定感度がさらに良好となる。
【００１８】
この試薬１及び／又は試薬２には、測定感度や測定操作の簡便性の観点等から、凝集促進剤を含有させることが好ましく、さらに好ましくは試薬１に凝集促進剤を含有させることである。なお、凝集促進剤は、試薬１及び試薬２とは別の試薬として構成することもできる。
【００１９】
凝集促進剤としては、抗原抗体反応によるラテックスの凝集を促進させる作用を有するものであればよく、従来公知のものが使用でき、ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリビニルピロリドン及びポリ塩化ビニル等が挙げられる。これらのうち、ポリエチレングリコール及びポリビニルピロリドン、さらに好ましくはポリエチレングリコールである。なお、複数の凝集促進剤を組み合わせて使用することもできる。
【００２０】
凝集促進剤の数平均平均分子量は、３，０００〜１，０００，０００が好ましく、さらに好ましくは５，０００〜１００，０００、特に好ましくは５，０００〜５０，０００である。この範囲であると、測定感度がさらに良好となる。
【００２１】
試薬１及び／又は２に凝集促進剤を含有させる場合、凝集促進剤の含有量（重量％）は、試薬１又は試薬２の重量に基づいて、０．１〜１０が好ましく、さらに好ましくは０．２〜８、特に好ましくは０．５〜５である。この範囲であると、測定感度がさらに良好となる。
【００２２】
この試薬１及び／又は試薬２には、上記モノクローナル抗体と測定対象物質とが反応することを妨げない範囲で、糖類（グルコース、シュークロース等）、無機塩（塩化ナトリウム等）、界面活性剤（モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン等）、防腐剤（アジ化ナトリウム等）及び／又は非特異反応防止剤等（正常動物由来のＩｇＧ抗体等）を含有させてもよい。
糖類、無機塩、界面活性剤、防腐剤及び／又は非特異反応防止剤を含む場合、試薬１又は試薬２の重量に基づいて、糖類の含有量は０．１〜１０重量％程度、無機塩の含有量は０．０１〜５重量％程度、界面活性剤の含有量は０．０２〜５重量％程度、防腐剤の含有量は０．００１〜０．１重量％程度、非特異反応防止剤の含有量は０．００１〜５重量％程度である。
【００２３】
本発明のキットは、さらに構成試薬として、標準試薬（濃度既知の測定対象物溶液等）、希釈用試薬（高濃度検体の希釈用試薬等）、洗浄試薬（反応容器の洗浄用試薬等）等を含み、さらに取り扱い説明書、測定に必要な治具等（例えば検体容器等）を含んでもよい。
【００２４】
本発明のキットは例えば、以下のようにして免疫測定に適用できる。
１）検体の準備工程；たとえば、血液からの血漿、血清等の分離処理等を行う。必要により希釈等を実施する。
２）工程（１）；反応容器に、試薬（１）及び検体を分注し、一定時間反応（免疫反応）させる。
３）工程（２）；工程（１）の反応体に試薬（２）を分注し、濁度ｘを計測し、一定時間反応（免疫反応）させる。そして、反応後の濁度ｙを計測し、濁度変化（ｙ−ｘ）を求める。
４）測定対象物質の濃度算出；あらかじめ濃度既知の検体を測定し、それぞれの濁度を計測し、この濁度から検量線を作成しておく。そして、この検量線から、濁度変化（ｙ−ｘ）を濃度に換算する。
【００２５】
工程（１）及び工程（２）の反応時間は、測定対象物、反応性及び要求される測定感度の観点等から適宜設定可能であるが、測定感度及び測定時間の短縮の観点等から、工程（１）及び工程（２）の合計反応時間は２〜６０分が好ましく、さらに好ましくは３〜３０分、特に好ましくは４〜２０分である。また、同様の観点等から、工程（１）の反応時間（１）は、工程（２）の反応時間（２）の０．２〜５倍であることが好ましく、さらに好ましくは０．５〜２．５倍、特に好ましくは１〜２倍である。
【００２６】
工程（１）及び工程（２）によって、ラテックス１及びラテックス２が凝集するので、この凝集を従来公知の方法（濁度の変化、凝集粒子の計測等）で計測することにより、測定対象物質を定量できる。
濁度変化の計測は、例えば、分光光度計｛測定波長：３４０〜１０００ｎｍ（好ましくは５００〜９００ｎｍ）｝で、工程（２）の始めと終わりの時間ポイント（例えば、１ポイント目は試薬２の分注・混合の３０秒後等、２ポイント目は工程（２）の終了直前等）で濁度をそれぞれ計測し、その濁度の差を濁度変化として求めることができる。
【００２７】
検体、試薬１及び試薬２の分注量、反応温度等の条件は自由に設定できる。例えば、検体量としては、通常１〜１００μＬであり、好ましくは２〜２０μＬ、さらに好ましくは５〜１０μＬである。試薬１及び試薬２の分注量は、通常２０〜５００μＬであり、好ましくは５０〜２００μＬ、さらに好ましくは５０〜１００μＬである。反応温度は、通常２５〜４５℃であり、好ましくは３５〜３９℃、さらに好ましくは３６〜３８℃である。なお、市販されている臨床検査用の生化学自動分析機｛たとえば、日立ハイテクノロジーズ製、自動分析機７１８０等｝を用いると、検体、試薬１及び試薬２の分注量、工程（１）及び工程（２）の反応時間、濁度の計測の条件等を設定することができ、自動分析が可能である。
【００２８】
以上のように、本発明の免疫測定キットを用いれば、遊離体及び結合体を等モル反応させることができるため（等モル反応性に優れている）、高精度に測定対象物質を定量できる。
なお、遊離体及び結合体の等モル反応とは、モノクローナル抗体への遊離体の結合量（モル数）とモノクロナール抗体への結合体の結合量（モル数）との比が、ほぼ１：１である反応を意味する。
等モル反応性とは、遊離体との反応性及び結合体との反応性が同程度であることを意味し、遊離体及び結合体のいずれの免疫測定においても、質量分析で測定された濃度とほぼ同じ値が得られるという性質を意味する。
具体的には、例えばＰＳＡでの等モル反応とは以下の様に定義できる。即ち、スタンフォード大学より入手した精製ＰＳＡ｛遊離体ＰＳＡ（以下ｆＰＳＡ）及びＡＣＴ−ＰＳＡ結合体（ＰＳＡとα１−アンチキモトリプシンとの結合体、以下ｃＰＳＡ）｝をそれぞれ段階希釈して測定し、Ｘ軸に理論濃度値｛精製ＰＳＡの表示濃度値と希釈倍率とから算出した値｝、Ｙ軸に実際の測定値をプロットしたとき、その希釈直線の傾きを回帰式から求め、両者｛ｆＰＳＡ及びｃＰＳＡについて｝の傾きの比（ｆＰＳＡ傾き／ｃＰＳＡの傾き）を偏り度γと表す。そのγの範囲が０．９≦γ＜１．１のときに等モル反応しているとみなされ、０．８≦γ＜０．９、１．１≦γ＜１．２のときにほぼ等モル反応しているとみなされる［第６５回日本泌尿器科学会東部総会シンポジウム］。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
＜作成例１＞抗ＰＳＡモノクロナール抗体の作成
１．免疫用抗原の調製とマウスへの免疫
コンプリートフロイントアジュバント（ディフコ社製）１ｇと１００μｇの精製遊離ＰＳＡ（カルビオケム社製）を含む０．８５重量％塩化ナトリウム水溶液１ｇをホモジナイザーで混合・乳化し、免疫抗原エマルションとした。免疫抗原エマルションの０．２ｇをマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）１頭の腹腔内に投与した。そして１ヶ月間隔で３回同様に投与した（合計４回投与）。
【００３０】
２．ハイブリドーマの作成
免疫したマウスから脾臓を摘出し、以下の通り常法に従い抗ＰＳＡモノクローナル抗体を作成した。
すなわち、脾臓から脾臓細胞２×１０8個を採取し、ＲＰＭＩ１６４０培地１５ｍＬで４回洗浄した後、この洗浄後の脾臓細胞と、２×１０7個のミエローマ細胞（Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４．１）とを、３７℃の４２．５重量％（培地の重量に対する濃度）のポリエチレングリコール４０００［数平均分子量４０００、（株）ナカライテスク］及び７．５重量％（培地の重量に対する濃度）のジメチルスルフォキシドを含むＲＰＭＩ１６４０培地１ｍＬ中で、１分間混合（細胞融合）させ、融合細胞懸濁液を得た。この融合細胞懸濁液をＲＰＭＩ１６４０培地５ｍＬで徐々に希釈し、融合細胞を遠心分離し、洗浄した後、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、１０重量％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地）２０ｍＬを加えて融合細胞液を得た。次いで、この融合細胞液を９６ウエルマイクロプレートに０．２ｍＬずつ分注して２週間培養した後、融合細胞（ハイブリドーマ）が増殖したウエル中の培養上清の抗体価を下記の方法で測定した。
【００３１】
３．抗体価の測定法
１）抗ＰＳＡポリクローナル抗体結合ビーズの調製
抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体（ダコ社製）を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）に２０μｇ／ｍＬの濃度に溶解し、この溶液５００ｍＬに直径６．３５ｍｍポリスチレンビーズ（商品名：イムノビーズ、イムノケミカル社製）５００個を浸漬し、２〜１０℃で１０時間放置した。その後、溶液をアスピレーターで吸引除去し、ポリスチレンビーズを０．１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に浸漬して、抗ＰＳＡポリクローナル抗体結合ビーズとした。作成した抗ＰＳＡポリクローナル抗体結合ビーズは使用時まで４〜１０℃で保存した。
【００３２】
２）標識抗マウスＩｇＧ抗体液の調製
ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧウサギ抗体（ダコ社製）を０．１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で２０００倍に希釈し、標識抗体液とした。使用時まで−２０℃で凍結保存した。
【００３３】
３）発色液の調製
０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）１００ｍＬにｏ−フェニレンジアミン３００ｍｇ及び３０重量％過酸化水素水７０μＬを加え溶解し、発色液を調製した。使用時まで遮光冷蔵保存した（作成当日のみ使用可能）。
【００３４】
４）測定操作
試験管（内径１．２ｃｍ、長さ１０ｃｍ）に抗ＰＳＡポリクローナル抗体結合ビーズ１個、１重量％ウシ血清アルブミン含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３００μＬ及び精製遊離ＰＳＡ抗原液（免疫に使用した精製遊離ＰＳＡ抗原の濃度を０．１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で５０ｎｇ／ｍＬとしたもの）５０μＬを加え、３７℃、１時間静置下で反応させた。反応液をアスピレーターで吸引除去し、０．８５重量％塩化ナトリウム水溶液１ｍＬを加えた後、塩化ナトリウム水溶液をアスピレーターで吸引除去することによりビーズを洗浄した。この洗浄操作をさらに２回行った後、１重量％ウシ血清アルブミン含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２５０μＬ及び上記で培養したウエルの上清５０μＬを加え、３７℃、１時間静置下で反応させた。上述と同様にビーズの洗浄を３回行った後、標識抗体液３００μＬを加え、３７℃、１時間静置下で反応させた。上述と同様にビーズの洗浄を３回行った後、発色液５００μＬを加え、３７℃、３０分間静置下で反応させた。１．５Ｎ硫酸１ｍＬを加えて反応を停止させ、測定波長４９２ｎｍで吸光度（光路長１０ｍｍ）を測定した。なお、上記で培養した９６ウエルについて、それぞれ測定した。
【００３５】
４．抗ＰＳＡモノクローナル抗体の選択
上記、抗体価の測定でブランク吸光度（培養上清を加えない場合の測定吸光度）の１０倍以上の吸光度を示したハイブリド−マを限界希釈法によりクローン化し、１２クローンを得た。１２クローンの培養上清について、上記の抗体価の測定法に準じて遊離体ＰＳＡ及び結合体ＰＳＡとの反応性を確認した。ただし、精製遊離ＰＳＡ抗原液に換えて、スタンフォード大学メディカルセンターの泌尿器学科から入手したＰＳＡ抗原液｛遊離体ＰＳＡ（ｆＰＳＡ）からなる抗原液及び結合体ＰＳＡ（ｃＰＳＡ）からなる抗原液｝を０．１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で５０ｎｇ／ｍＬの濃度に希釈したものを使用した。
以上の結果、１２クローンの全てが抗体価を示し、その内７クローンが遊離体及び結合体の両方に反応性を示した。これらの内、結合体との反応性の高い３クローンを抗ＰＳＡモノクローナル抗体（Ｎｏ．１〜３）として選択した。
【００３６】
５．抗ＰＳＡモノクローナル抗体の精製
抗ＰＳＡモノクローナル抗体（Ｎｏ．１）を産生するハイブリドーマを無血清培地（ＡＳＦ培地１０４，味の素株式会社）１Ｌで１週間培養（３７℃）し、培養上清を限外ろ過膜（ウルトラフィルターＵＫ−５０，東洋濾紙製）で１００分の１容量にそれぞれ濃縮した。これらの濃縮液を０．８５重量％塩化ナトリウム含有０．０２Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．０を移動相としてゲル濾過カラム（スーパーデックス２００プレップカラム，ファルマシア製）にかけ、各フラクションにそれぞれ分画した。各フラクションの抗体価を測定し、抗体価を示したフラクションをプールした。プールしたフラクションを限外ろ過膜（ウルトラフィルターＵＫ−５０，東洋濾紙製）でタンパク濃度１ｍｇ／ｍＬとなるよう濃縮し、抗ＰＳＡモノクローナル抗体の緩衝溶液（１）を得た。なお、抗ＰＳＡモノクローナル抗体（Ｎｏ．２及び３）について同様に精製をおこない、抗ＰＳＡモノクローナル抗体の緩衝溶液｛（２）（３）｝を得た。
【００３７】
６．抗ＰＳＡモノクローナル抗体の認識部位の確認
「３．抗体価の測定法  １）抗ＰＳＡポリクローナル抗体結合ビーズの調製」の記載に準じて、抗ＰＳＡモノクローナル抗体（Ｎｏ．１）結合ビーズ、抗ＰＳＡモノクローナル抗体（Ｎｏ．２）結合ビーズ、及び抗ＰＳＡモノクローナル抗体（Ｎｏ．３）結合ビーズをそれぞれ作成した。
ジャーナルオブモレキュラアンドセルイムノロジー（J.Mol.Cell.Immunol）2,191(1986)に記載の方法で、Ｎ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート｛N-Succinimidyl3-(2-pyridyldithio)propionate｝［商品名：ＳＰＤＰ、同仁化学（株）製］と、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（東洋紡製）とを反応させ、ペルオキシターゼにメルカプト基を導入した。
次いで、メルカプト基導入ペルオキシダーゼと抗ＰＳＡモノクローナル抗体（Ｎｏ．１）とをジャーナルオブバイオケミストリー（J.Biochem）,92，1413(1982)に記載の方法で、二架橋性試薬Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）サクシニイミド｛N-(4-Maleimidobutyryloxy)succinimide｝［ＧＭＢＳ、同仁化学製］で結合し、ペルオキシダーゼ標識抗ＰＳＡモノクローナル抗体（Ｎｏ．１）を調製し、冷凍（−３０℃）保存した。同様にして、ペルオキシダーゼ標識抗ＰＳＡモノクローナル抗体（Ｎｏ．２）、ペルオキシダーゼ標識抗ＰＳＡモノクローナル抗体（Ｎｏ．３）を調製した。
そして、３種の結合ビーズと３種のペルオキシターゼ標識抗ＰＳＡモノクロナール抗体とを用いて、表１に記載した組み合わせで次の通り測定した。
すなわち、試験管（内径１．２ｃｍ、長さ１０ｃｍ）に抗ＰＳＡモノクローナル抗体結合ビーズ１個、１重量％ウシ血清アルブミン含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３００μＬ及び検体５０μＬを加え、３７℃、１時間静置下で反応させた。反応液をアスピレーターで吸引除去し、０．８５重量％塩化ナトリウム水溶液１ｍＬを加えた後、塩化ナトリウム水溶液をアスピレーターで吸引除去することによりビーズを洗浄した。この洗浄操作をさらに２回行った後、標識抗体液３００μＬを加え、３７℃、１時間静置下で反応させた。引き続き、上述と同様にビーズの洗浄を３回行った後、発色液５００μＬを加え、３７℃、３０分間静置下で反応させた。１．５Ｎ硫酸１ｍＬを加えて反応を停止させ、測定波長４９２ｎｍで吸光度（光路長１０ｍｍ）を測定した。ただし、検体は、「４．抗ＰＳＡモノクローナル抗体の選択」記載のｃＰＳＡの５０ｎｇ／ｍＬ溶液及びｃＰＳＡの０ｎｇ／ｍＬ｛０．１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）｝を測定した。
吸光度の測定結果を表１に示した。異種のモノクロナール抗体間の組み合わせの吸光度は高かったが、同種のモノクロナール抗体間の組合せの吸光度は著しく低かった。すなわち、３種のモノクロナール抗体は各々認識部位が異なることが証明された。なお、表中数値はｃＰＳＡの測定吸光度で、上段はｃＰＳＡ０ｎｇ／ｍＬ、下段はｃＰＳＡ５０ｎｇ／ｍＬの場合である。
【００３８】
【表１】
2007163319.tif 000003
【００３９】
＜実施例１＞免疫測定用試薬キット（１）の作成
１．抗ＰＳＡモノクローナル抗体結合ラテックス［（試薬（１）］の作成
カルボキシ変性ラテックス分散液（ＪＳＲ社製、体積平均粒子径０．２μｍ、ラテックス含有量１０重量％）１００μＬ、ＨＥＰＰＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）９００μＬ、ＷＳＣ溶液（可溶性カルボジイミド、1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide,hydrochlorideの１Ｍ水溶液）５００μＬを、遠心管に加え、室温（２０〜３０℃）で１時間、撹拌させた（カルボキシ変性ラテックスと可溶性カルボジイミドとを反応させた）。次いで、この遠心管を１５０００ｒｐｍ、１５分間遠心した後、上清をアスピレーターで吸引除去し、沈殿に純水１５００μＬを加え、ボルテックスミキサーを用いて再分散し、再度１５０００ｒｐｍ、１５分間遠心し、上清をアスピレーターで吸引除去し、この沈殿にＨＥＰＰＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）９００μＬを加え、超音波破砕機（トミー社製、品番ＵＤ−２０１）で２分間処理し再分散した。この分散液に、抗ＰＳＡモノクローナル抗体（Ｎｏ．１）を蛋白量として０．３ｍｇ加え、室温（２０〜３０℃）で２時間、撹拌しながら反応させた。反応後、８０００ｒｐｍ、１０分遠心した後、上清をアスピレーターで吸引除去し、沈殿に１％牛血清アルブミン含有ＨＥＰＰＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）２０００μＬを加え、超音波破砕機（トミー社製、品番ＵＤ−２０１）で２分間処理し再分散することにより、抗ＰＳＡモノクローナル抗体（Ｎｏ．１）結合ラテックス分散液を調製した。
この抗ＰＳＡモノクローナル抗体結合ラテックス分散液を、１％牛血清アルブミン含有ＨＥＰＰＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）で、ラテックスの含有量が０．１重量％となるように希釈して、試薬（１Ａ）（モノクローナル抗体Ｎｏ．１結合）を得た。
【００４０】
２．抗ＰＳＡモノクローナル抗体結合ラテックス［（試薬（２）］の作成
抗ＰＳＡモノクローナル抗体（Ｎｏ．１）に換えて、抗ＰＳＡモノクローナル抗体（Ｎｏ．２）を使用すること以外、「１．抗ＰＳＡモノクローナル抗体結合ラテックス［（試薬（１）］の作成」と同様にして、抗ＰＳＡモノクローナル抗体（Ｎｏ．２）結合ラテックス分散液を調製した。この抗ＰＳＡモノクローナル抗体結合ラテックス分散液を、１％牛血清アルブミン含有ＨＥＰＰＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）で、ラテックスの含有量が０．１重量％となるように希釈して、試薬（２Ａ）（モノクローナル抗体Ｎｏ．２結合）を得た。
【００４１】
３．凝集促進剤含有試薬の作成
ポリエチレングリコール（商品名：ＰＥＧ−６０００Ｓ、三洋化成工業社製）１ｇを１％牛血清アルブミン含有ＨＥＰＰＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）１００ｍＬに溶解し、凝集促進剤含有試薬を得た。
【００４２】
４．試薬キットの調製
試薬（１Ａ）、試薬（２Ａ）及び凝集促進剤含有試薬を試薬キット（１）とし、使用時まで冷蔵（２〜１０℃）で保存した。
【００４３】
＜実施例２＞免疫測定用試薬キット（２）の作成
１．抗ＰＳＡモノクローナル抗体結合ラテックス［（試薬（２）］の作成
実施例１の抗ＰＳＡモノクローナル抗体（Ｎｏ．１）を、抗ＰＳＡモノクローナル抗体（Ｎｏ．３）に変更すること以外、実施例１と同様にして、試薬（２Ｂ）（モノクローナル抗体Ｎｏ．３結合）を得た。
２．試薬キットの調製
実施例１で調製した試薬（１Ａ）及び凝集促進剤含有試薬と、試薬（２Ｂ）とを試薬キット（２）とし、使用時まで冷蔵（２〜１０℃）で保存した。
【００４４】
＜実施例３＞免疫測定用試薬キット（３）の作成
１．抗ＰＳＡモノクローナル抗体結合ラテックス［（試薬（２）］の作成
実施例１で調製した試薬（２Ａ）と、実施例２で調製した試薬（２Ｂ）とを等容量で混合し、試薬（２Ｃ）を調製した。
２．試薬キットの調製
実施例１で調製した試薬（１Ａ）及び凝集促進剤含有試薬と、試薬（２Ｃ）とを試薬キット（３）とし、使用時まで冷蔵（２〜１０℃）で保存した。
【００４５】
＜実施例４＞免疫測定用試薬キット（４）の作成
１．抗ＰＳＡモノクローナル抗体結合ラテックス［（試薬（１）］の作成
実施例１で調製した試薬（１Ａ）と凝集促進剤含有試薬とを１：２の容量で混合し、試薬（１Ｂ）とした。
２．試薬キットの調製
試薬（１Ｂ）と、実施例１で調製した試薬（２Ａ）とを試薬キット（４）とし、使用時まで冷蔵（２〜１０℃）で保存した。
【００４６】
＜比較例１＞免疫測定用試薬キット（５）の作成
１．抗ＰＳＡモノクローナル抗体結合ラテックスの作成
実施例１で調製した試薬（１Ａ）と試薬（２Ａ）を等容量で混合し、試薬（Ｈ１）とした。
２．試薬キットの調製
実施例１で調製した凝集促進剤含有試薬と試薬（Ｈ１）を試薬キット（５）とし、使用時まで冷蔵（２〜１０℃）で保存した。
【００４７】
＜実施例５＞
本実施例５は、試薬キット（１）を用いた場合の感度及びＰＳＡ等モル反応性を評価するものである。
分光光度計測定セル（島津製作所製、ミクロブラックセルＬ、光路長１０ｍｍ）に、凝集促進剤含有試薬１００μＬ、試薬（１Ａ）５０μＬを加えて均一撹拌した後、検体１０μＬを加えて均一撹拌した後、２、３．３、５、６又は８分間反応させた（工程１）。
引き続き、試薬（２Ａ）５０μＬを加えて均一撹拌し、８、６．７、５、４又は２分間｛（工程１）の反応時間と併せて１０分間となる時間｝反応させた（工程２）。
（工程２）の試薬（２Ａ）５０μＬを加えて均一撹拌した直後と、（工程２）の終了時に、濁度を計測して（島津製作所製、ＵＶｍｉｎ−１２４０、測定波長：５７０ｎｍ）、濁度の差を求め、この差を濁度変化量とした。
なお、検体として、スタンフォード大学から入手したＰＳＡ抗原液をそれぞれ５０ｎｇ／ｍＬに希釈したもの（上記のものと同じ）を使用した。また、全ての操作は、３７℃に管理された恒温室で実施した（以下、同じ。）。
【００４８】
得られた濁度変化量から、ブランク値（ＰＳＡ抗原の希釈に使用した、０．１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて同様にして測定した濁度変化量）を減算し、さらに１００００を乗じた計算値を表２に示した。
また、偏り度γ｛ｆＰＳＡの濁度変化量から算出した計算値（ｆ）と、ｃＰＳＡの濁度変化量から算出した計算値（ｃ）との比を表２に示した。この偏り度γは１に近いほど等モル反応性が良好であることを表す。
【００４９】
＜実施例６＞
本実施例は、試薬キット（２）を用いた場合の感度及びＰＳＡ等モル反応性を評価するものである。
分光光度計測定セル（島津製作所製、ミクロブラックセルＬ、光路長１０ｍｍ）に、凝集促進剤含有試薬１００μＬ、試薬（１Ａ）５０μＬを加えて均一撹拌した後、検体１０μＬを加えて均一撹拌した後、５分間反応させた（工程１）。
引き続き試薬（２Ｂ）５０μＬを加えて均一撹拌し、５分間反応させた（工程２）。
（工程２）の試薬（２Ｂ）５０μＬを加えて均一撹拌した直後と、（工程２）の終了時、濁度を計測して（島津製作所製、ＵＶｍｉｎ−１２４０、測定波長：５７０ｎｍ）、濁度の差を求め、この差を濁度変化量とした。
そして、実施例５と同様に、計算値及び偏り度γを表２に示した。
なお、検体として、実施例５と同じものを使用した。
【００５０】
＜実施例７＞
本実施例は、試薬キット（３）を用いた場合の感度及びＰＳＡ等モル反応性を評価するものである。
試薬（２Ｂ）５０μＬを試薬（２Ｃ）５０μＬに変更した以外、実施例６と同様にして濁度の差を求め、計算値及び偏り度γを算出し、これらを表２に示した。
【００５１】
＜比較例２＞
本比較例は、試薬キット（５）を用いた場合の感度、等モル反応性を評価するものである。
分光光度計測定セル（島津製作所製、ミクロブラックセルＬ、光路長１０ｍｍ）に、凝集促進剤含有試薬１００μＬ及び検体１０μＬを加えて均一撹拌した後、試薬（Ｈ１）１００μＬを加えて均一撹拌し、５分間反応させた。試薬（Ｈ１）１００μＬを加えて均一撹拌した直後と、５分間反応終了時に濁度を計測した（島津製作所製、ＵＶｍｉｎ−１２４０、測定波長：５７０ｎｍ）。そして、実施例５と同様にして濁度の差を求め、計算値及び偏り度γを算出し、これらを表２に示した。
【００５２】
【表２】
2007163319.tif 000004
【００５３】
試薬キット（１）（実施例５）は、どの反応時間においても、偏り度が、０．８〜１．２となり、等モル反応性が優れていた。また、計算値も大きく、高感度であった。
特に工程１と工程２との反応時間の比が０．５〜１．５の範囲では、偏り度γが０．９〜１．１であり、等モル反応性が極めて優れていた。さらに、計算値も大きく、極めて高感度であった。
試薬キット（２）（実施例６）は、試薬キット（１）よりも、計算値が小さく、やや感度が低かったが、偏り度γは１．０９であり、等モル反応性が優れていた。
試薬キット（３）（実施例７）についての偏り度γは１．０２であり、等モル反応が優れていた。また、計算値が極めて大きく、試薬キット（１）〜（３）及び（５）の中で最も高感度であった。
試薬キット（５）（比較例２）の１．６２と大きな値であり、等モル反応性を示さなかった（すなわち、実施例１と同じ抗体を使用しても従来の方法では精度良く測定できなかった）。また、計算値が著しく小さく、低感度であった。
【００５４】
＜実施例８＞
本実施例は、試薬キット（４）を用いて、ｆＰＳＡ及びｃＰＳＡの反応性を詳細に確認した例である。
分光光度計測定セル（島津製作所製、ミクロブラックセルＬ、光路長１０ｍｍ）に、試薬（１Ｂ）１５０μＬ及び検体１０μＬを加えて均一撹拌した後５分間反応させた（工程１）。
引き続き、試薬（２Ａ）５０μＬを加えて均一撹拌した後５分間反応させた（工程２）。
そして、実施例５と同様にして濁度の差を求め、これを濁度変化量とした。
なお、検体は、ｆＰＳＡ及びｃＰＳＡの各５０ｎｇ／ｍＬ溶液（実施例５と同じ）と、さらにこれらを１重量％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ７．０）で希釈して調製した希釈液｛各２５、１０又は５ｎｇ／ｍＬのｆＰＳＡ及びｃＰＳＡ溶液｝を用いた。尚、全ての操作は、３７℃に管理された恒温室で実施した（以下、同じ）。
ｆＰＳＡの理論濃度値と測定した濁度変化量とから検量線を作成し、この検量線と、ｆＰＳＡ及びｃＰＳＡの各濃度の濁度変化量とから、それぞれの濃度測定値を算出した。
そして、ｃＰＳＡの各濃度測定値をＸ、ｆＰＳＡの各濃度測定値をＹとして、回帰分析し、その相関式｛ｙ＝γＸ＋α｝の傾きγを偏り度とし、表３に示した。
【００５５】
＜比較例３＞
本比較例は、試薬キット（５）を用いて、ｆＰＳＡ及びｃＰＳＡの反応性を詳細に確認した例である。
分光光度計測定セル（島津製作所製、ミクロブラックセルＬ、光路長１０ｍｍ）に、凝集促進剤含有試薬１００μＬ及び検体１０μＬを加えて均一撹拌した後試薬（Ｈ１）１００μＬを加えて均一撹拌した後５分間反応させた。
そして、実施例５と同様にして濁度の差を求め、これを濁度変化量とし、実施例８と同様にして偏り度γを求め、表３に示した。
【００５６】
【表３】
2007163319.tif 000005
【００５７】
試薬キット（４）（実施例８）の偏り度γは０．９４であり、等モル反応性が優れていた。一方、試薬キット（５）（比較例３）の偏り度γは１．４９と大きく、等モル反応性を示さなかった。
【００５８】
＜実施例９〜１５＞
本実施例は、試薬キット（１）を用いて、試薬（１Ａ）と試薬（２Ａ）の使用量を変化させた場合の性能を確認したものである。
分光光度計測定セル（島津製作所製、ミクロブラックセルＬ、光路長１０ｍｍ）に、凝集促進剤含有試薬１００μＬ及び試薬（１Ａ）｛表４に記載した使用量｝を加えて均一撹拌した後、検体１０μＬを加えて均一撹拌した後５分間反応させた（工程１）。
引き続き、試薬（２Ａ）｛表４に記載した使用量｝を加えて均一撹拌した後５分間反応させた（工程２）。実施例６と同様にして濁度の差を求め、計算値及び偏り度γを算出し、これらを表４に示した。
【００５９】
＜比較例４〜１０＞免疫測定用試薬キット（６〜１２）の作成
実施例１で調製した試薬（１Ａ）と試薬（２Ａ）を表４に記載した容量で均一混合して、試薬（Ｈ２）〜（Ｈ７）を調製した。
実施例１で調製した凝集促進剤含有試薬と、試薬（Ｈ２）を試薬キット（６）とした。
同様に、実施例１で調製した凝集促進剤含有試薬と、試薬（Ｈ３）〜（Ｈ７）を用いて、試薬キット（７）〜（１２）とし、これらの試薬キットを使用時まで冷蔵（２〜１０℃）で保存した。
【００６０】
＜比較例１１〜１７＞
本比較例は、試薬キット（６）〜（１２）の感度、等モル反応性を確認したものである。
試薬（Ｈ１）を、試薬（Ｈ２）〜（Ｈ７）のいずれかを使用した以外、比較例１と同様にして、計算値及び偏り度γを求め、表４に示した。
【００６１】
【表４】
2007163319.tif 000006
【００６２】
試薬キット（１）を用いた実施例９〜１５において、偏り度γは、すべて０．８〜１．２であり、等モル反応性が優れていた。また、計算値が高く、感度が優れていた。特に、実施例１１〜１３について、偏り度γ及び計算値が最も優れていた。
一方、比較例１１〜１７について、偏り度γは大きく、等モル反応性を示さなかった。また、計算値も著しく小さく、感度が悪かった。
【００６３】
＜実施例１６＞免疫測定用試薬キット（１３）の作成
１．抗ＰＳＡモノクローナル抗体結合ラテックスの作成
カルボキシ変性ラテックス分散液（ＪＳＲ社製、体積平均粒子径０．２μｍ、ラテックス含有量１０重量％）を、カルボキシ変性ラテックス分散液（ＪＳＲ社製、体積平均粒子径０．１５μｍ、ラテックス含有量１０重量％）に変更したこと、及び抗ＰＳＡモノクロナール抗体（Ｎｏ．１）を、抗ＰＳＡモノクロナール抗体（Ｎｏ．２）に変更したこと以外実施例１と同様にして、抗ＰＳＡモノクローナル抗体（Ｎｏ．２）結合ラテックス（粒子径０．１５ｎｍ）分散液を調製した。
この抗ＰＳＡモノクローナル抗体（Ｎｏ．２）結合ラテックス（粒子径０．１５ｎｍ）分散液を、実施例１と同様に希釈し、試薬（２Ｄ）（モノクローナル抗体Ｎｏ．２結合）を得た。
２．試薬キットの調製
実施例１で調製した試薬（１Ａ）、凝集促進剤含有試薬及び試薬（２Ｄ）を試薬キット（１３）とし、使用時まで冷蔵（２〜１０℃）で保存した。
【００６４】
＜実施例１７＞免疫測定用試薬キット（１４）の作成
１．抗ＰＳＡモノクローナル抗体結合ラテックスの作成
カルボキシ変性ラテックス分散液（ＪＳＲ社製、体積平均粒子径０．２μｍ、ラテックス含有量１０重量％）を、カルボキシ変性ラテックス分散液（ＪＳＲ社製、体積平均粒子径０．１５μｍ、ラテックス含有量１０重量％）に変更したこと以外実施例１と同様にして、抗ＰＳＡモノクローナル抗体（Ｎｏ．１）結合ラテックス（粒子径０．１５ｎｍ）分散液を調製した。
この抗ＰＳＡモノクローナル抗体（Ｎｏ．１）結合ラテックス（粒子径０．１５ｎｍ）分散液を、実施例１と同様に希釈し、試薬（１Ｃ）（モノクローナル抗体Ｎｏ．１結合）を得た。
２．試薬キットの調製
実施例１で調製した凝集促進剤含有試薬、試薬（２Ａ）及び試薬（１Ｃ）を試薬キット（１４）とし、使用時まで冷蔵（２〜１０℃）で保存した。
【００６５】
＜実施例１８＞免疫測定用試薬キット（１５）の作成
１．抗ＰＳＡモノクローナル抗体結合ラテックスの作成
実施例１で作成した試薬（２Ａ）と実施例１６で作成した試薬（２Ｄ）とを、体積平均粒子径が０．１８μｍになるように混合して、試薬（２Ｅ）を調製した。尚、本発明において、体積平均粒子径は、レーザー回折散乱式粒径分布測定装置（堀場製作所製、Partica LA-950、試薬（２Ｅ）を希釈なしにそのまま２５℃で測定した）で計測した。
２．試薬キットの調製
実施例１で調製した試薬（１Ａ）、凝集促進剤含有試薬及び試薬（２Ｅ）を試薬キット（１５）とし、使用時まで冷蔵（２〜１０℃）で保存した。
【００６６】
＜実施例１９＞免疫測定用試薬キット（１６）の作成
１．抗ＰＳＡモノクローナル抗体結合ラテックスの作成
実施例１で作成した試薬（１Ａ）と実施例１７で作成した試薬（１Ｃ）とを、体積平均粒子径が０．１８μｍになるように混合して、試薬（１Ｄ）を調製した。
２．試薬キットの調製
実施例１で調製した凝集促進剤含有試薬、試薬（２Ａ）及び試薬（１Ｄ）を試薬キット（１６）とし、使用時まで冷蔵（２〜１０℃）で保存した。
【００６７】
＜比較例１８＞免疫測定用試薬キット（１７）の作成
１．抗ＰＳＡモノクローナル抗体結合ラテックスの作成
実施例１で作成した試薬（１Ａ）と実施例１６で作成した試薬（２Ｄ）とを等容量で混合し、試薬（Ｈ８）を調製した。
２．試薬キットの調製
実施例１で調製した凝集促進剤含有試薬及び試薬（Ｈ８）を試薬キット（１７）とし、使用時まで冷蔵（２〜１０℃）で保存した。
【００６８】
＜比較例１９＞免疫測定用試薬キット（１８）の作成
１．抗ＰＳＡモノクローナル抗体結合ラテックスの作成
実施例４で作成した試薬（１Ｂ）と実施例１で作成した試薬（２Ａ）とを等容量で混合し、試薬（Ｈ９）を調製した。
２．試薬キットの調製
実施例１で調製した凝集促進剤含有試薬及び試薬（Ｈ９）を試薬キット（１８）とし、使用時まで冷蔵（２〜１０℃）で保存した。
【００６９】
＜実施例２０〜２３＞
本測定例は、本発明による試薬キット（１３〜１６）を用いた場合の性能を確認したものである。
試薬キット（１）を試薬キット（１３〜１６）に変更した以外、実施例５と同様にして濁度の差を求め、計算値及び偏り度γを算出し、これらを表５に示した。参考のため実施例５の結果も表５に記載した。
【００７０】
＜比較例２０、２１＞
本測定例は、従来の技術で調製した試薬キット（１７、１８）を用いた場合の性能を確認したものである。
試薬キット（５）を試薬キット（１７、１８）に変更した以外、比較例２と同様に実施し、濁度の差を求め、計算値及び偏り度γを算出し、これらを表５に示した。参考のため比較例２の結果も表５に記載した。
【００７１】
【表５】
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【００７２】
試薬キット（１３〜１６）を用いた実施例２０〜２３において、偏り度γはすべて０．８〜１．２であり等モル反応性に優れていた。また、計算値が高く、感度が優れていた。特に、比（ａ／ｂ）が０．９〜１．１の範囲である実施例６、２２及び２３において等モル反応性及び感度がいづれも著しく優れていた。
一方、試薬キット（１７、１８）を用いた比較例２５〜２６において、比較例２５では偏り度γは０．９１で等モル反応性を示したが、計算値は著しく低く、感度は劣っていた。また、比較例２６は等モル反応性、感度とも著しく劣っていた。
【００７３】
＜実施例２４＞
本実施例は、本発明による試薬キット（４）で血清検体を測定した例を示すものである。
健康診断において、前立腺癌、前立腺肥大等の前立腺疾患の疑いのあった患者１０名を含む２０名の肘正中静脈から採血用注射器を用いて、全血約２ｍＬをそれぞれ採取した。肘正中静脈より採取した全血のそれぞれを、室温（約２５℃）で１〜３時間静置した後、冷却遠心機にて（１５００Ｇ、１０分間、１０℃）遠心分離し、上清部分（血清）を分取した。この血清を検体とすべく、測定時まで凍結（−２０〜−３０℃）保存した。
測定は、検体を上記の血清に変更する以外、実施例８と同様に行った。
なお、ｆＰＳＡ及びｃＰＳＡの各５０ｎｇ／ｍＬ溶液（実施例５と同じ）と、さらにこれらを１重量％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ７．０）で希釈して調製した希釈液｛各５０、２５、１０又は５ｎｇ／ｍＬのｆＰＳＡ及びｃＰＳＡ溶液｝及び０ｎｇ／ｍＬ溶液｛１重量％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ７．０）｝を用いて、実施例８と同様にして検量線を作成した。
この検量線と、血清検体の濁度変化量とから、それぞれの濃度測定値を算出し、この結果を表６に示した。
一方、試薬キット（１９）｛商品名：Ｅテスト「ＴＯＳＨ」II（ＰＡ）、東ソー株式会社製｝、及び専用装置｛ＡＩＡ１２００、東ソー株式会社製｝を用い、試薬キット（１９）及び専用装置の取扱説明書に従って、上記血清を自動分析（定量）し、この結果を表６に示した。
また、試薬キット（４）による測定結果をｙ軸に、試薬キット（１９）による測定結果をｘ軸に、それぞれの血清についてプロットした（図１）。
なお、本試薬（１９）は体外診断薬として認可を受けており、等モル反応性が確認されている［Stamey, Urology : 45, 173-184(1995)］。また、専用装置は、この試薬キット（１９）専用の測定装置である。
【００７４】
【表６】
2007163319.tif 000008
【００７５】
試薬キット（４）による測定結果と、試薬キット（１９）による測定結果とは、相関係数Ｒ＝０．９９７｛相関式ｙ＝１．０２０５ｘ＋０．００９３｝で良好な相関を示した。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】血清中のＰＳＡ濃度の相関を表すグラフである（実施例２４）。
【図１】
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