(57)【要約】【課題】非特異的に結合する候補分子を除外して、簡便に且つ効率よく候補分子をスクリーニングする。【解決手段】生理活性を低下させる活性低下処理を行っていない前記標的分子が固定されている測定領域に、前記候補分子を供給して得られた活性時結合量データと、生理活性を低下させる活性低下処理を行った前記標的分子が固定されている測定領域に、前記候補分子を供給して得られた低活性時結合量データとの間に、所定の差がある候補分子を抽出する。【選択図】図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分子が固定された固定化膜で構成された測定領域に検討対象である候補分子を供給し得られる標的分子と候補分子との結合量データを用いて、特定の候補分子を選別するスクリーニング方法であって、
生理活性を低下させる活性低下処理を行っていない前記標的分子が固定されている測定領域に、前記候補分子を供給して、活性時結合量データを得る工程と、
生理活性を低下させる活性低下処理を行った前記標的分子が固定されている測定領域に、前記候補分子を供給して、低活性時結合量データを得る工程と、
前記活性時結合量データと前記低活性時結合量データとの間に所定の差がある候補分子を抽出する工程と、
を含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２】
前記候補分子を抽出する工程が、予め設定されたしきい値以下又はこれ未満の低活性時結合量データを示す候補分子を抽出するものであることを特徴とする請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記候補分子を抽出する工程が、予め設定されたしきい値以上又はこれを超える活性時結合量データを示す候補分子を抽出するものであることを特徴とする請求項２記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記活性低下処理を、活性時結合量データを取得した後の標的分子に対して行うことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記活性低下処理を、固定化膜に固定化した後の前記標的分子に対して行うことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記固定化膜が金属膜上に形成され、活性時結合量データと低活性時結合量データが、片面に前記固定化膜が形成された金属膜の前記固定化膜が形成されていない側へ光ビームを入射させることにより発生する全反射減衰を利用して得られたものであることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記標的分子が固定されていない固定化膜が形成された金属膜に前記候補分子を供給し、前記光ビームを前記標的分子が固定されていない金属膜の前記固定化膜が形成されていない側へ光ビームを入射させることにより発生する全反射減衰量を参照データとして、前記活性時結合量データと低活性時結合量データとを得ることを特徴とする請求項６記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
標的分子が固定された固定化膜で構成された測定領域に検討対象である候補分子を供給し得られる標的分子と候補分子との結合量データを用いて、特定の候補分子を選別するスクリーニングプログラムであって、
生理活性を低下させる活性低下処理を行っていない前記標的分子が固定化されている測定領域に供給された前記候補分子と、前記標的分子と、の結合量に基づいて活性時結合量データを算出するステップと、
前記標的分子の生理活性を低下させる活性低下処理を行った前記標的分子が固定化されている測定領域に供給された前記候補分子と、前記標的分子と、の結合量に基づいて低活性時結合量データを算出するステップと、
前記活性時結合量データと低活性測定データとの間に所定の差を示す候補分子を抽出するステップと、
をコンピュータに実行させるスクリーニングプログラム。
【請求項９】
前記活性時結合量データを算出するステップの後に、当該標的分子の生理活性を低下させるための活性低下処理用溶液を当該標的分子に対して供給する活性低下処理を実行させるステップと、
前記活性低下処理が完了した後に、前記低活性時結合量データを算出するステップへの移行を指示するステップと、
を更に含むことを特徴とする請求項８記載のスクリーニングプログラム。
【請求項１０】
前記抽出するステップが、前記低活性時結合量データを用いて候補分子を選別するために入力されたしきい値と低活性結合量データとを対比させて、しきい値以下又はこれ未満の低活性時結合量データを示す候補分子を抽出するものであることを特徴とする請求項８又は９記載のスクリーニングプログラム。
【請求項１１】
前記抽出するステップが、前記活性時結合量データを用いて候補分子を選別するために入力されたしきい値と活性結合量データとを対比させて、しきい値以上又はこれを超える活性結合量データを示す候補分子を抽出するものであることを特徴とする請求項１０記載のスクリーニングプログラム。
【請求項１２】
前記活性時結合量データと低活性時結合量データが、片面に前記固定化膜が形成された金属膜の前記固定化膜が形成されていない側へ光ビームを入射させることにより発生する全反射減衰を利用して得られたものであることを特徴とする請求項８乃至１１のいずれか１項記載のスクリーニングプログラム。
【請求項１３】
前記標的分子が固定されていない固定化膜が形成された金属膜に前記候補分子を供給し、前記光ビームを前記標的分子が固定されていない金属膜の前記固定化膜が形成されていない側へ光ビームを入射させることにより発生する全反射減衰量から取得された参照データに基づいて、前記活性時結合量データと低活性時結合量データとを得ることを特徴とする請求項１２記載のスクリーニングプログラム。
【請求項１４】
標的分子が固定された固定化膜で構成された測定領域に検討対象である候補分子を供給し得られる標的分子と候補分子との結合量データを用いて、特定の候補分子を選別するスクリーニング装置であって、
前記測定領域に候補分子を供給して、前記結合量データを取得する測定手段と、
活性低下処理液を前記測定領域に供給して、前記標的分子の生理活性を低下させるための活性低下処理手段と、
前記測定手段から取得された前記活性低下処理を行っていない標的分子に対する候補分子の活性結合量データと、前記活性低下処理後の低活性標的分子に対する候補分子の低活性時結合量データを、候補分子毎に記憶する記憶手段と、
前記記憶手段に記憶された前記活性時結合量データと低活性測定データとを間に所定の差がある候補分子を抽出する抽出手段と、
を備えたスクリーニング装置。
【請求項１５】
前記抽出手段が、入力されたしきい値以下又はこれ未満の低活性時結合量データを示す候補分子を抽出するものであることを特徴とする請求項１４記載のスクリーニング装置。
【請求項１６】
前記抽出手段が、入力されたしきい値以上又はこれを超える活性時結合量データを示す候補分子を抽出するものであることを特徴とする請求項１５記載のスクリーニング装置。
【請求項１７】
前記固定化膜が金属膜上に形成され、活性時結合量データと低活性時結合量データが、片面に前記固定化膜が形成された金属膜の前記固定化膜が形成されていない側へ光ビームを入射させることにより発生する全反射減衰を利用して得られたものであることを特徴とする請求項１４乃至１６のいずれか１項記載のスクリーニング装置。
【請求項１８】
前記標的分子が固定されていない固定化膜が形成された金属膜に前記候補分子を供給し、前記光ビームを前記標的分子が固定されていない金属膜の前記固定化膜が形成されていない側へ光ビームを入射させることにより発生する全反射減衰量から取得された参照データに基づいて、前記活性時結合量データと低活性時結合量データとを得ることを特徴とする請求項１７記載のスクリーニング装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スクリーニング方法、スクリーニングプログラム及びスクリーニング装置に関し、詳しくは、標的分子と候補分子との結合を用いて所定の候補分子を抽出するスクリーニング方法、スクリーニングプログラム及びスクリーニング装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質などの生理活性物質と所定の化合物との相互作用を測定する装置として、様々なバイオセンサーが提案されている。そのうち、エバネッセント波を利用した測定装置の１つとして、表面プラズモンセンサーが知られている（特許文献１参照）。一般的に、表面プラズモンセンサーは、プリズムと、このプリズムの一面に配置され生理活性物質が固定される金属膜と、光ビームを発生させる光源と、光ビームをプリズムに対して、プリズムと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、界面で全反射した光ビームの強度を検出する光検出手段と、を備え、光検出手段の検出結果に基づいて、生理活性物質に関する測定を行うものである。そして、この表面プラズモンセンサーによる測定では、金属膜の上に固定化された生理活性物質に対して化合物溶液を供給すると共に、金属膜の化合物溶液が供給されている側と逆側の面へ光ビームを入射し、その反射光から得られる屈折率の情報に基づいて、生理活性物質と化合物溶液中の化合物との相互作用が測定される。
【０００３】
ところで、表面プラズモンセンサーは、金属膜上での化合物間の微細な結合状態を精度よく検出することができるため、特定の生理活性物質を標的分子として金属膜に固定し、この標的分子に対して特異的に結合可能か否かを指標として大量の候補分子を選別する大規模なスクリーニングに好適である。
【０００４】
しかしながら、候補分子の中には標的分子に対して非特異的に結合するものがある。表面プラズモンセンサーは上述のように化合物間の結合状態の変化を検出するものであるため、このような結合状態の変化だけでは、候補分子と標的分子との間での特異的結合と非特異的結合とを区別することができない。このため、大量のスクリーニングを行う際に、候補分子の絞り込みに時間がかかるという問題がある。
このような非特異的な結合を少なくするために、測定に使用するバッファー等に、Ｔｗｅｅｎ２０やポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルなどの高濃度の界面活性剤を添加することが行われている（例えば、特許文献２〜４）。
【特許文献１】特許第３２９４６０５公報
【特許文献２】特開昭５８−１８７８６２号公報
【特許文献３】特開昭６１−２６０１６３号公報
【特許文献４】特開平６−３００７５９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、高濃度の界面活性剤を含有するバッファーを用いる方法では、高濃度の界面活性剤が常に測定系に存在することになり、センサ表面に吸着、脱離することによって、測定の安定性が損なわれることがある。また、界面活性剤を含むバッファー等を大量に調製する必要がある。
【０００６】
従って、本発明は、標的分子に対して非特異的に結合し得る候補分子を効率よく除外して、標的分子に対して特異的に結合し得る候補分子を簡便に且つ効率よく抽出可能なスクリーニング方法、スクリーニングプログラム及びスクリーニング装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のスクリーニング方法は、標的分子が固定された固定化膜で構成された測定領域に、検討対象である候補分子を供給し得られる標的分子と候補分子との結合量データを用いて、特定の候補分子を選別するスクリーニング方法であって、生理活性を低下させる活性低下処理を行っていない前記標的分子が固定されている測定領域に、前記候補分子を供給して、活性時結合量データを得る工程と、生理活性を低下させる活性低下処理を行った前記標的分子が固定されている測定領域に、前記候補分子を供給して、低活性時結合量データを得る工程と、前記活性時結合量データと前記低活性時結合量データとの間に所定の差がある候補分子を抽出する工程と、を含むことを特徴とするものである。
【０００８】
本発明のスクリーニングプログラムは、標的分子が固定された固定化膜で構成された測定領域に検討対象である候補分子を供給し得られる標的分子と候補分子との結合量データを用いて、特定の候補分子を選別するスクリーニングプログラムであって、生理活性を低下させる活性低下処理を行っていない前記標的分子が固定化されている測定領域に供給された前記候補分子と、前記標的分子と、の結合量に基づいて活性時結合量データを算出するステップと、前記標的分子の生理活性を低下させる活性低下処理を行った前記標的分子が固定化されている測定領域に供給された前記候補分子と、前記標的分子と、の結合量に基づいて低活性時結合量データを算出するステップと、前記活性時結合量データと低活性測定データとの間に所定の差を示す候補分子を抽出するステップと、をコンピュータに実行させるものである。
【０００９】
また、本発明のスクリーニング装置は、標的分子が固定された固定化膜で構成された測定領域に検討対象である候補分子を供給し得られる標的分子と候補分子との結合量データを用いて、特定の候補分子を選別するスクリーニング装置であって、前記測定領域に候補分子を供給して、前記結合量データを取得する測定手段と、活性低下処理液を前記測定領域に供給して、前記標的分子の生理活性を低下させるための活性低下処理手段と、前記測定手段から取得された前記活性低下処理を行っていない標的分子に対する候補分子の活性結合量データと、前記活性低下処理後の低活性標的分子に対する候補分子の低活性時結合量データを、候補分子毎に記憶する記憶手段と、前記記憶手段に記憶された前記活性時結合量データと低活性測定データとを間に所定の差がある候補分子を抽出する抽出手段と、を備えたものである。
【００１０】
本発明では、検討対象となる候補分子をスクリーニングするための標的となる標的分子に対して、生理活性を低下させる活性低下処理を行う。候補分子は標的分子に対して特異的に結合可能であったとしても、このような活性低下処理を行った後の標的分子に対しては本来の結合量を維持できない。このために、活性低下処理後の標的分子に対して得られた結合量データ（低活性時結合量データ）は、本来、活性低下処理を行っていない標的分子に対して得られた結合量データ（活性時結合量データ）よりも低い値を示し、これらのデータの間には所定の差が示される。一方、標的分子に対して非特異的に結合する候補分子であれば、標的分子の活性の高さとは無関係に結合するため、これらのデータ間には、所定の差が示されない。従って、このような所定の差に基づいて、標的分子に対して非特異的に結合する候補分子を確実に排除し、標的分子に対して特異的に結合する候補分子を効率よくスクリーニングすることができる。
【００１１】
このとき、候補分子を選別するためのしきい値を予め設定することができる。これによって更に効率よくスクリーニングを行うことができる。
しきい値としては、低活性時結合量データと対比するしきい値であってもよく、活性時結合量データと対比するしきい値であってもよい。低活性時結合量データと対するしきい値を用いた場合には、しきい値以下又はこれ未満の低活性時結合量データを示す候補分子を抽出する。一方、活性時結合量データと対比するしきい値を用いた場合には、しきい値以上又はこれを超える活性時結合量データを示す候補分子を抽出する。更に、活性時結合量データ及び低活性時結合量データの差と対比するしきい値であってもよい。この場合には、活性時結合量データと低活性時結合量データとの差がしきい値以上又はこれを超える候補分子を抽出する。
しきい値は、複数組み合わせて使用することもできる。これにより、より精度よく目的とする候補分子をスクリーニングすることができる。
【００１２】
また、抽出工程が、複数設定されたしきい値をそれぞれ用いて候補分子を抽出する独立した複数の抽出工程で構成されているものであってもよい。この場合、１のしきい値に基づく第１の抽出工程によって抽出された候補分子に対して、他のしきい値に基づく第２の抽出を行うことができる。これにより、第２の抽出の対象となる候補分子の数を減らすことができ、より短時間でスクリーニングすることができる。
【００１３】
また、活性低下処理は、活性時結合量データを取得した後の標的分子に対して行ってもよい。この場合には、固定化膜に固定された同一の標的分子に対して得られた活性時結合量データと低活性時結合量データとに基づいてスクリーニングを行うので、より精度よく標的分子に対して特異的に結合する候補分子を抽出することができる。
更に、活性低下処理は、標的分子の種類によって固定化処理の前の標的分子に対して行うこともできるが、固定化膜に固定化された標的分子に対して行うことが好ましい。これにより、活性低下処理によって固定化膜に固定化しにくくなる性質の標的分子であっても、固定化膜に確実に固定化された活性低下処理後の標的分子から低活性時結合量データを得ることができる。
【００１４】
なお、前記固定化膜が金属膜上に形成され、活性時結合量データ及び低活性時結合量データが、片面に前記固定化膜の形成された金属膜の前記固定化膜の形成されていない側へ光ビームを入射させることにより発生する全反射減衰を利用して得られたものであってもよい。
上記のような形態としては、表面プラズモンセンサー、漏洩モードセンサーによる測定を挙げることができる。
【００１５】
また、このような前記標的分子が固定されていない固定化膜が形成された金属膜に前記候補分子を供給し、前記光ビームを前記標的分子が固定されていない金属膜の前記固定化膜が形成されていない側へ光ビームを入射させることにより発生する全反射減衰量を参照データとして、前記活性時結合量データと低活性時結合量データとを得てもよい。
このように参照データを得ることによって、活性時結合量データ及び低活性時結合量データを正確に得て、適切なスクリーニングを行うことができる。
【００１６】
なお、本発明における標的分子及び候補分子としては、日本工業規格（ＪＩＳ）Ｋ３６１１中に「天然高分子」（記号１１００１〜１１０２５）として記載されている各物質、生物学データ大百科事典（朝倉書店）中の「１．生体物質概論」に記載されている糖、アミノ酸、ヌクレオチド、脂質、ヘム、キノン、蛋白質、ＲＮＡ，ＤＮＡ、リン脂質、多糖、バイオサイエンス辞典（朝倉書店）中の「ＩＩ．生物物質と代謝」に記載されている蛋白質、アミノ酸、核酸、脂質、糖質、酵素のうちのいずれか１つ以上で構成された、所謂、生理活性物質及びこの生理活性物質と結合可能な有機又は無機分子を挙げることができる。
また、本発明における標的分子と候補分子との結合とは、物理的、化学的、もしくは生化学的な結合反応をいう。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、標的分子に対して非特異的に結合し得る候補分子を効率よく除外して、標的分子に対して特異的に結合し得る候補分子を簡便に且つ効率よく抽出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
［第１の実施形態］
以下、図面を参照しながら本発明の第１の実施形態について説明する。
本実施形態のスクリーニング装置としてのバイオセンサー１０は、金属膜の表面に発生する表面プラズモンを利用して、標的分子としての生理活性物質Ｄと候補分子との相互作用を測定する、いわゆる表面プラズモンセンサーである。本実施形態では、このバイオセンサー１０を、生理活性物質Ｄに特異的に結合する物質を大量の候補分子からスクリーニングするために使用する。
【００１９】
図１に示すように、バイオセンサー１０は、トレイ保持部１２、搬送部１４、容器載置台１６、液体吸排部２０、光学測定部５４及び制御部６０を備えている。
トレイ保持部１２は、載置台１２Ａ及びベルト１２Ｂを含んで構成されている。載置台１２Ａは、矢印Ｙ方向に架け渡されたベルト１２Ｂに取り付けられており、ベルト１２Ｂの回転により矢印Ｙ方向に移動可能とされている。載置台１２Ａ上には、２枚のトレイＴが位置決めして載置される。トレイＴには、センサースティック４０が８本収納されている。センサースティック４０は、生理活性物質Ｄが固定されるチップであり、詳細については後述する。載置台１２Ａの下には、センサースティック４０を後述するスティック保持部材１４Ｃの位置まで押し上げるための図示しない押上機構が配置されている。
【００２０】
センサースティック４０は、図２及び図３に示すように、誘電体ブロック４２、流路部材４４、保持部材４６、接着部材４８及び蒸発防止部材４９で構成されている。
【００２１】
誘電体ブロック４２は、光ビームに対して透明な透明樹脂等で構成されており、断面が台形の棒状とされたプリズム部４２Ａと、プリズム部４２Ａの両端部にプリズム部４２Ａに対して一体的に形成された被保持部４２Ｂとを備えている。プリズム部４２Ａの互いに平行な２面の内の広い側の上面には、図４にも示すように金属膜５０が形成されている。誘電体ブロック４２は、いわゆるプリズムとして機能し、バイオセンサー１０での測定の際には、プリズム部４２Ａの対向する互いに平行でない２つの側面の内の一方から光ビームが入射され、他方から金属膜５０との界面で全反射された光ビームが出射される。
【００２２】
金属膜５０の表面には、図４に示すように、固定化膜５０Ａが形成されている。固定化膜５０Ａは、生理活性物質Ｄを金属膜５０上に固定化するためのものである。固定化膜５０Ａは、固定する生理活性物質Ｄの種類に応じて選択される。
【００２３】
固定化膜５０Ａとしては、例えばアガロース、デキストラン、カラゲナン、アルギン酸、デンプン、セルロースなどのヒドロゲル、又はこれらの誘導体、例えばカルボキシメチル誘導体、又は水膨潤性有機ポリマー、例えばポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコールなどを使用することができる。特に、ポリエチレングリコール誘導体、デキストラン誘導体は、生理活性維持の観点から好ましく用いられる。
【００２４】
固定化膜５０Ａ上には、生理活性物質Ｄが固定された測定領域Ｅ１と、生理活性物質Ｄが固定されず、測定領域Ｅ１の信号測定に際しての参照信号を得るための参照領域Ｅ２とが形成される。即ち、参照領域Ｅ２は、生理活性物質Ｄの固定された測定領域Ｅ１から得られるデータを補正するために設けられた領域である。この参照領域Ｅ２は、上述した固定化膜５０Ａを製膜する際に形成される。形成方法としては、例えば、固定化膜５０Ａに対して表面処理を施して、生理活性物質Ｄと結合する結合基を失活させる。これにより、固定化膜５０Ａの半分が測定領域Ｅ１となり、残りの半分が参照領域Ｅ２となる。
図５にも示すように、参照領域Ｅ２と、参照領域Ｅ２よりも上流側に位置する測定領域Ｅ１とには、各々光ビームＬ２、Ｌ１が入射される。
【００２５】
プリズム部４２Ａの両側面には、上側の端辺に沿って保持部材４６と係合される係合凸部４２Ｃが、下側の端辺に沿ってプリズム部４２Ａの上面と垂直な仮想面の延長上に構成される垂直凸部４２Ｄが、各々７箇所に形成されている。また、誘電体ブロック４２の下面の長手方向に沿った中央部には、係合溝４２Ｅが形成されている。
【００２６】
流路部材４４は、誘電体ブロック４２よりもわずかに狭幅の直方体状とされ、図３に示すように、誘電体ブロック４２の金属膜５０上に６個並べて配置されている。各々の流路部材４４の下面には流路溝４４Ａが形成されており、上面に形成された供給口４５Ａ及び排出口４５Ｂと連通されて、金属膜５０との間に、液体流路４５が構成される。したがって、１本のセンサースティック４０には、独立した６個の液体流路４５が構成される。流路部材４４の側壁には、保持部材４６の内側の図示しない凹部に圧入されて保持部材４６との密着性を確保するための凸部４４Ｂが形成されている。
なお、液体流路４５には蛋白質を含有する液体が供給されることが想定されるので、流路部材４４の材料としては、蛋白質に対する非特異吸着性を有しないものであることが好ましい。
【００２７】
保持部材４６は、長尺とされ、上面板４６Ａ及び２枚の側面板４６Ｂで構成されている。側面板４６Ｂには、誘電体ブロック４２の係合凸部４２Ｃと係合される係合孔４６Ｃが形成されている。保持部材４６は、６個の流路部材４４を間に挟んで係合孔４６Ｃと係合凸部４２Ｃとが係合されて、誘電体ブロック４２に取り付けられる。これにより、流路部材４４は、誘電体ブロック４２に取り付けられる。上面板４６Ａには、流路部材４４の供給口４５Ａ及び排出口４５Ｂと対向する位置に、流路部材４４に向けて狭くなるテーパー状のピペット挿入孔４６Ｄが形成されている。また、隣り合うピペット挿入孔４６Ｄとピペット挿入孔４６Ｄとの間には、位置決め用のボス４６Ｅが形成されている。
【００２８】
保持部材４６の上面には、蒸発防止部材４９が接着部材４８を介して接着されている。接着部材４８のピペット挿入孔４６Ｄと対向する位置にはピペット挿入用の孔４８Ｄが形成され、ボス４６Ｅと対向する位置には位置決め用の孔４８Ｅが形成されている。また、蒸発防止部材４９のピペット挿入孔４６Ｄと対向する位置には十字状の切り込みであるスリット４９Ｄが形成され、ボス４６Ｅと対向する位置には位置決め用の孔４９Ｅが形成されている。ボス４６Ｅを孔４８Ｅ及び４９Ｅに挿通させて、蒸発防止部材４９を保持部材５２の上面に接着することにより、蒸発防止部材４９のスリット４９Ｄと流路部材４４の供給口４５Ａ及び排出口４５Ｂとが対向するように構成される。ピペットチップＣＰの非挿入時には、スリット４９Ｄ部分が供給口４５Ｂを覆い、液体流路４５に供給されている液体の蒸発が防止される。
【００２９】
図１に示すように、バイオセンサー１０の搬送部１４は、上部ガイドレール１４Ａ、下部ガイドレール１４Ｂ及びスティック保持部材１４Ｃ、を含んで構成されている。上部ガイドレール１４Ａ及び下部ガイドレール１４Ｂは、トレイ保持部１２及び光学測定部５４の上部で、矢印Ｙ方向と直交する矢印Ｘ方向に水平に配置されている。上部ガイドレール１４Ａには、スティック保持部材１４Ｃが取り付けられている。スティック保持部材１４Ｃは、センサースティック４０の両端部の被保持部４２Ｂを保持可能とされていると共に、上部ガイドレール１４Ａに沿って移動可能とされている。スティック保持部材１４Ｃに保持されたセンサースティック４０の係合溝４２Ｅと下部ガイドレール１４Ｂとが係合され、スティック保持部材１４Ｃが矢印Ｘ方向に移動することにより、センサースティック４０が光学測定部５４上の測定部５６に搬送される。
【００３０】
容器載置台１６には、化合物溶液プレート１７、バッファー液ストック容器１８、廃棄液容器１９が載置されている。化合物溶液プレート１７は、９６に区画されており、各種の化合物溶液をストック可能とされている。バッファー液ストック容器１８は、容器１８Ａ〜１８Ｅで構成されており、容器１８Ａ〜１８Ｅには、後述するピペットチップＣＰを挿入可能な開口Ｋが形成されている。
【００３１】
バッファー液としては、例えば公知の緩衝溶液（化学便覧応用編改訂２版、１３１２頁〜１３２０頁）を基本に、食塩、金属イオン（マグネシウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオンなど）、安定化剤（ＤＴＴなど）などを添加したものを用いることができる。特に、ＰＢＳバッファー（リン酸バッファー生理食塩水）、Ｔｒｉｓバッファー、ＨＥＰＥＳバッファーなどが好ましく用いられる。
【００３２】
廃棄液容器１９は、複数の容器１９Ａ〜１９Ｅで構成されており、容器１８Ａ〜１８Ｅと同様にピペットチップＣＰを挿入可能な開口Ｋが形成されている。
液体吸排部２０は、上部ガイドレール１４Ａと、ガイドレール１６Ｂよりも上方で、矢印Ｙ方向に架け渡された横断レール２２と、ヘッド２４とを含んで構成されている。横断レール２２は、図示しない駆動機構により、矢印Ｘ方向へ移動可能とされている。また、ヘッド２４は、横断レール２２に取り付けられ、矢印Ｙ方向に移動可能とされている。また、ヘッド２４は、図示しない駆動機構により、鉛直方向（矢印Ｚ方向）にも移動可能とされている。ヘッド２４は、図６に示すように、２本のピペット部２４Ａ、２４Ｂを備えている。ピペット部２４Ａ、２４Ｂには、先端部にピペットチップＣＰが取り付けられ、個々にＺ方向の長さを調整可能とされている（図６（Ａ）〜（Ｂ）参照）。ピペットチップＣＰは、図示しないピペットチップストッカーに多数ストックされており、必要に応じて交換可能とされている。
【００３３】
なお、本実施形態においてはセンサースティック４０への液体供給はピペットチップＣＰにより行われるが、ピペットチップの代わりに、一端が上記各溶液プレートに接続され、他端がセンサースティック４０に接続可能とされたインジェクションチューブを設け、送液ポンプにより液体の供給を行ってもよい。
【００３４】
光学測定部５４は、図７に示すように、光源５４Ａ、第１光学系５４Ｂ、第２光学系５４Ｃ、受光部５４Ｄ、信号処理部５４Ｅを含んで構成されている。光源５４Ａからは、発散状態の光ビームＬが出射される。光ビームＬは、第１光学系５４Ｂを介して、２本の光ビームＬ１、Ｌ２となり、測定部５６に配置された誘電体ブロック４２の測定領域Ｅ１と参照領域Ｅ２に入射される。測定領域Ｅ１及び参照領域Ｅ２において、光ビームＬ１、Ｌ２は、金属膜５０と誘電体ブロック４２との界面に対して種々の入射角成分を含み、かつ全反射角以上の角度で入射される。光ビームＬ１、Ｌ２は、誘電体ブロック４２と金属膜５０との界面で全反射される。全反射された光ビームＬ１、Ｌ２も、種々の反射角成分をもって反射される。この全反射された光ビームＬ１、Ｌ２は、第２光学系５４Ｃを経て受光部５４Ｄで受光されて、各々光電変換され、光検出信号が信号処理部５４Ｅへ出力される。信号処理部５４Ｅでは、入力された光検出信号に基づいて所定の処理が行なわれ、測定領域Ｅ１の測定データＧ１及び参照領域Ｅ２の参照データＧ２が求められる。この測定データＧ１、参照データＧ２が制御部６０へ出力される。
【００３５】
制御部６０は、バイオセンサー１０の全体を制御する機能を有し、図７に示すように、光源５４Ａ、信号処理部５４Ｅ及びバイオセンサー１０の図示しない駆動系と接続されている。制御部６０は、図８に示すように、バスＢを介して互いに接続される、ＣＰＵ６０Ａ、ＲＯＭ６０Ｂ、ＲＡＭ６０Ｃ、メモリ６０Ｄ及びインターフェースＩ／Ｆ６０Ｅを有し、各種の情報を表示する表示部６２及び、各種の指示、情報を入力するための入力部６４と接続されている。
【００３６】
メモリ６０Ｄには、バイオセンサー１０を制御するための各種プログラムや、各種データ及び、スクリーニングプログラムが記憶されている。
メモリ６０Ｄに記憶される参照データＧ２は、生理活性物質Ｄが固定化されていない固定化膜５０Ａ上にランニングバッファーを供給した際に求められる基準点と、候補分子Ａを供給した際に求められる信号との変化量ＲＵ（Resonance Unit、１ＲＵ＝１ｐｇ／ｍｍ２に相当）で示されている。
【００３７】
このように、本実施の形態にかかるバイオセンサー１０では、センサースティック４０が測定部５６へ搬送され、入力部６４から測定開始の指示が入力されると、制御部６０では、結合量測定処理が実行される。この結合量測定処理では、検討対象となっている最初の候補分子の溶液を液体流路４５へ供給し、光源５４Ａ、信号処理部５４Ｅ及び図示しない駆動系を駆動して、測定領域Ｅ１から測定データＧ１を取得し、参照領域Ｅ２から参照データＧ２を取得する。次いで、測定データＧ１を参照データＧ２で補正して、結合量データＧ３を算出し、候補分子毎に結合量データが記憶される。
【００３８】
次に、本実施形態にかかるスクリーニング方法について説明する。
本実施形態では、生理活性物質Ｄの生理活性を低下させるための活性低下処理を行い、生理活性物質Ｄの生理活性を維持した状態での結合量データ（活性時結合量データ）と、生理活性を低下させた状態での結合量データ（低活性時結合量データ）と、の間で活性低下処理の前後で生じた所定の差に基づいて、候補分子をスクリーニングする。
【００３９】
生理活性物質Ｄの活性低下処理としては、生理活性物質Ｄの候補分子に対する結合活性を低下させることができればよいが、低活性時結合量データと活性時結合量データとの差を明確にするために、好ましくは低活性処理前の結合活性の少なくとも５０％、より好ましくは２０％以下、最も好ましくは１０％以下まで、結合活性を低下させることができる。低活性処理前の活性と低活性処理後の活性の差が小さいと、結合量の差異の検出が困難になり、好ましいスクリーニング結果が得られない。
【００４０】
活性低下処理としては、（１）ｐＨ、塩濃度などのバッファー組成、（２）界面活性剤の濃度、（３）酸、アルカリ、有機溶剤による処理、（４）光の照射、（５）温度変化、（６）蛋白変性剤の添加などを挙げることができる。このうち、（１）〜（３）は、通常の測定と同様の作業で活性低下処理を実施することができ、（４）及び（５）は、処理液を調製する必要がない。このため、生理活性物質Ｄの種類によって上記（１）〜（５）から適切な活性低下処理を適宜選択すればよい。
【００４１】
バッファー組成を変更する場合には、生理活性物質Ｄの活性が維持されているｐＨから０．０１以上７．０以下変化させることが好ましく、０．５以上４．０以下変化させることがさらに好ましい。また、０．２〜１０ｍＭの塩濃度とすることが好ましく、０．３ｍＭ〜５ｍＭの塩濃度とすることが更に好ましい。このような結合活性低下処理溶液としては、塩濃度及びｐＨを調整した上記バッファーとして記載されたものの他、酢酸バッファー、ホウ酸バッファー等を挙げることができる。
【００４２】
界面活性剤としては、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、ＳＤＳなどの公知の界面活性剤を、０．１容量％以上、好ましくは０．５容量％以上の比較的高濃度で用いるとよい。
有機溶剤としては、エタノール、ＤＭＳＯなどの公知の溶剤を、１０容量％以上、好ましくは２０容量％以上の濃度で用いるとよい。蛋白変性剤としては、フェノール、尿素、塩酸グアニジンのような公知の化合物を用いることができる。
【００４３】
光を照射する場合は、紫外光を少なくとも１０分以上照射させるとよい。温度を変化させる場合は、生理活性物質Ｄの至適温度から、５℃以上、好ましくは１０℃以上異なる温度で処理するとよい。
【００４４】
活性低下処理溶液として処理用バッファーを使用する場合、バッファー液ストック容器１８に代えて活性低下処理溶液ストック容器を載置し、活性低下処理開始の指示と共に、液を供給する。これにより、バッファー液の供給と同様に活性低下処理を行うことができる。
【００４５】
このような活性低下処理は、生理活性物質Ｄを固定化する前、後のいずれで行ってもよい。生理活性物質Ｄを固定化膜５０Ａに固定化した後で行うことが、生理活性物質Ｄの固定可能を損なわないため好ましい。その一方で、生理活性物質Ｄの固定化時に、生理活性物質Ｄと候補分子との結合部位に結合することがわかっている物質、例えば阻害剤を共存させることによって、特異結合部位を保護することができるため、このような物質を共存させる場合には、固定前又は固定化工程中に活性低下処理を行うこともできる。
【００４６】
生理活性の低下は、候補分子の結合量又は生理活性物質Ｄの機能を測定することによって確認することができる。
【００４７】
生理活性物質Ｄと候補分子との結合量は、バイオセンサー１０を使用し、固定化膜５０Ａに固定化された生理活性物質Ｄに対する候補分子の結合量データＧ３を得ることによって容易に確認することができる。
その際、生理活性物質Ｄと候補分子それぞれの分子量から、以下の式にて理論最大結合量を算出する。
理論最大結合量＝蛋白質固定量×（特異的に結合する化合物の分子量）／蛋白質分子量×（蛋白質１分子に対する該化合物の結合部位の数）
【００４８】
次に、その化合物の蛋白質に対する結合量を測定し、以下の式より結合比率を算出する。この比率が１００に近いほど、蛋白質の機能・活性が維持されていると考えることができる。
結合比率＝（結合量測定値／理論最大結合量）×１００
【００４９】
生理活性物質Ｄの機能を測定する方法としては、酵素活性を測定する方法及びレセプター活性を測定する方法を挙げることができる。
【００５０】
酵素活性の測定原理については蛋白質、酵素の基礎実験法（堀尾武一、山下仁平）第IV章に記載されている。また、検出方法としては（１）分光学的測定法、（２）蛍光法（３）電極法、（４）発光法等があり、例えば新生化学実験講座  蛋白質  Ｖ、酵素免疫測定法  第３版、エンザイムイムノアッセイ  生化学実験法等に記載されている方法等も使用することができる。
例えば、蛍光法により酵素活性を測定する場合には、酵素に特異的な基質（酵素による分解物のみが蛍光を発する基質）を反応させ、分解物の蛍光測定を行うころにより酵素活性を測定することができる。
【００５１】
分光学的測定法により酵素活性を測定する場合には、基質と生成物との間に分光学的性質の差があることを利用して、その時間的変化を測定し、酵素反応の初速度を求めることで酵素活性を測定することができる。
電極法により酵素活性を測定する場合には、自動滴定装置を利用した方法で、酵素反応を含めて化学反応に伴って生成される酸あるいは塩基による試料溶液のｐＨ変化を電気的に検出することで酵素活性を測定することができる。
【００５２】
発光法により酵素活性を測定する場合には、抗体ないし抗原に酵素標識しておき、抗原抗体反応後、酵素に特異的な化学発光基質（酵素による分解物のみが化学発光する基質）を反応させ、分解物の化学発光測定することで酵素活性を測定することができる。
レセプター活性を測定する場合には、支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドと抗原標識されたリガンドまたはレセプターを含む検体とを接触させた後に、支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドに結合した抗原標識されたリガンドまたはレセプターと、該抗原に対する抗体（例えば、検出のための酵素で標識した抗体など）とを接触させて抗原抗体反応を行い、これにより結合した抗体の存在を検出することにより、検体中のリガンドまたはレセプターを検出することができる。
【００５３】
本実施形態においては、生理活性物質Ｄを固定化し、その固定化量を測定すると共に、上記の方法を利用して蛋白質の機能、活性を数値化する。蛋白質の固定化量は、常に一定とは限らないので、下記の式により、一定の蛋白質量あたりの活性値を算出することが好ましい。
活性値＝蛋白質活性値／蛋白質固定量
【００５４】
候補分子の抽出には、予め設定されたしきい値を用いて行うことが好ましい。
このようなしきい値として、低活性時結合量データを用いた選別のときの上限値となる第１のしきい値を設定してもよい。この場合、このしきい値以下の低活性時結合量データを示す候補分子を抽出する。第１のしきい値よりも大きい候補分子は、生理活性物質Ｄに対して特異的な結合以上に結合する物質と考えられる。これにより、生理活性物質Ｄに対して非特異的に結合する候補分子を効率よく除外することができる。
【００５５】
更に、第１のしきい値に加えて、活性時結合量データを用いた選別のときの下限値となる第２のしきい値を設定してもよい。この場合、このしきい値以上の活性時結合量データを示す候補分子を抽出する。第２のしきい値よりも小さい候補分子は、生理活性物質Ｄに対する結合量が不十分な物質と考えらえる。これにより、生理活性物質Ｄに対して特異的に充分に結合する候補分子を効率よく抽出することができる。
このように２つの２つのしきい値を設定することによって、生理活性物質Ｄに対して非特異的に結合する候補分子を除外すると共に、充分な結合量で特異的に結合する候補分子を効率よく抽出することができる。
【００５６】
しきい値としては、結合量データとして得られた値をそのまま適用してもよく、結合量データの値を候補分子の分子量で除した値としてもよい。結合量は分子量に比例するため、結合量データを候補分子の分子量で除した値を用いたほうが、物質としての相対的な比較、選別において、より好ましい。
【００５７】
次に、図９を参照して、活性時結合量データに対応した第１のしきい値と、低活性時結合量データに対応した第２のしきい値とをそれぞれ「５ＲＵ」及び「３ＲＵ」として設定した場合のバイオセンサー１０でのスクリーニング処理について説明する。
【００５８】
センサースティック３０が測定部５６へ搬送され、入力部６４からスクリーニング開始の指示が入力されると制御部６０では図９に示すスクリーニング処理が実行される。
ステップＳ１００で、第１のしきい値「５ＲＵ」及び第２のしきい値「３ＲＵ」が入力されたか否かが判断される。ユーザによってそれぞれのしきい値が入力部６４から入力されると、判断は肯定されてステップＳ１０２において、第１の結合量測定が実行され、ステップＳ１０４において測定結果が取得されるまで判断が否定される。結合量の測定は、候補分子ライブラリーから検討対象となっている最初の候補分子溶液を液体流路４５へ供給させ、測定領域Ｅ１からの測定データＧ１と、参照領域Ｅ２からの参照データＧ２とを測定結果として取得することにより行われる。
【００５９】
ステップＳ１０４において、測定結果としての測定データＧ１及び参照データＧ２が取得されると判断は肯定されて、ステップＳ１０６において、測定データＧ１を参照データＧ２で補正して結合量データＧ３としての活性時結合量データＨｎを算出し、候補分子に対応づけてメモリ６０Ｄに記憶する。この活性時結合量データには、生理活性物質Ｄに対する候補分子の特異的結合に応じた特異的結合成分が含まれている。活性時結合量データＨｎの算出及び記憶が完了すると、ステップＳ１０８に移行し、次の候補分子があるか否かが判断される。
ステップＳ１０８では、図示しないセンサによって次の候補分子が感知されると、判断が肯定されてステップＳ１０２に移行し、次の候補分子に対して第１の結合量測定処理を実施させる。
【００６０】
ステップＳ１０８において、次の候補分子が感知されない場合には判断は否定されてステップ１１０に移行し、活性低下処理を実行させる。
活性低下処理は、ランニングバッファーに代えて、調製された活性低下処理液を液体流路４５へ供給させ、固定化膜５０Ａ上の生理活性物質Ｄと反応させることによって行われる。この処理によって、生理活性物質Ｄの候補分子に対する特異的な結合を低下させる。所定時間後に活性低下処理液の供給を停止させると共に所定時間ランニングバッファーを供給させて活性低下処理を終了させ、ステップＳ１１２に移行する。
【００６１】
ステップＳ１１２では、活性時結合量データを取得した後の候補分子に対して第２の結合量測定処理を実行させる。
第２の結合量測定処理では、活性低下処理を行った生理活性物質Ｄを用いている以外は第１の結合量測定と同様に結合量測定を行い、ステップＳ１１４において、測定結果として測定データＧ１及び参照データＧ２が取得されるまで判断は否定される。測定結果が取得されると判断は肯定されてステップＳ１１６に移行し、結合量データＧ３としての低活性時結合量データＬｎを前記同様に算出する。低活性時結合量データＬｎでは、活性低下処理によって生理活性物質Ｄの結合活性が低下しているため、データに含まれる特異的結合成分は、活性時結合量データの値に含まれていたものよりも理論的に少なくなる。
【００６２】
低活性時結合量データＬｎを算出すると、ステップＳ１１８において、同一候補分子の対応する活性時結合量データＨｎをメモリ６０Ｄから読み取り、ステップＳ１２０において、活性時結合量データＨｎが第１のしきい値５ＲＵ以上か否かが判断される。
活性時結合量データＨｎが５ＲＵよりも小さい場合には、判断は否定されてステップＳ１２２に移行する。一方、活性時結合量データＨｎが５ＲＵ以上の場合には、判断は肯定されてステップＳ１２４に移行する。
【００６３】
ステップＳ１２４では、低活性時結合量データＬｎが第２のしきい値３ＲＵ以下か否かが判断され、３ＲＵよりも大きい場合には判断は否定されてステップＳ１２２に移行する。ステップＳ１２２では、対象となっている候補分子を、生理活性物質Ｄに対して非特異的に結合し得る候補分子と判定して、抽出対象から除外し、ステップＳ１２８に移行する。
【００６４】
一方、低活性時結合量データＬｎが３ＲＵ以下である場合には判断は肯定されてステップＳ１２６に移行する。ステップＳ１２６では、対象となっている候補分子を抽出すべき候補分子として判定し、ステップＳ１２８に移行する。
【００６５】
ステップＳ１２８では、次の候補分子があるか否かを判断し、図示しないセンサが次の候補分子を感知すると判断は肯定されてステップＳ１１２に移行し、次の候補分子に対して第２の結合量測定の処理を実行させる。
一方、センサが次の候補分子を感知しないと判定は否定され、抽出工程において抽出された候補分子を表示部６２に表示すると共にメモリ６０Ｄをクリアして、処理を終了する。
【００６６】
本実施形態のスクリーニング処理を実行することによって、３ＲＵを超える低活性時結合量データを示す非特異的結合の高い候補分子を抽出対象から除外し、非特異的結合が低く、５ＲＵ以上の高い結合活性を示す候補分子を抽出することができる。この結果、生理活性物質Ｄに対して特異的に結合する物質についてのスクリーニングを、大量の候補分子に対して簡便に且つ効率よく行うことができる。
【００６７】
図１０には、候補分子毎に記憶された結合量測定の結果（活性時結合量データＨｎ及び低活性時結合量データＬｎ）を示すリストの一例が示されている。
このような候補分子に対して第１のしきい値３ＲＵ及び第２のしきい値５ＲＵを用いてスクリーニングを行うと、候補分子Ｎｏ．０００００３及びＮｏ．０００００５の２つが抽出される。特に、候補分子Ｎｏ．０００００２のような低活性時結合量データと活性時結合量データとの差が小さく、非特異的結合しやすいと考えられる候補分子を抽出対象から除外することができる。
【００６８】
本実施形態では、第１及び第２のしきい値を用いて候補分子の抽出を行ったが、これに限定されない。
例えば、活性時結合量データＨｎと低活性時結合量データＬｎの差に相当する１のしきい値や、この差に相当するしきい値と、本実施形態で使用した第１のしきい値又は第２のしきい値とを組み合わせて使用し、候補分子の抽出を行ってもよい。しきい値の選択や、しきい値の組み合わせの選択は、スクリーニング対象となる候補分子や標的分子、或いはスクリーニングの絞り込み具合によって、ユーザによって適宜選択可能である。
【００６９】
［第２の実施形態］
次に、本発明の第２の実施形態について説明する。
なお、第２の実施形態を適用可能なスクリーニング装置としては、第１の実施形態で使用したバイオセンサー１０をそのまま適用可能であるため、バイオセンサー１０の構成についての説明を省略する。
本発明の第２の実施形態では、活性時結合量データを第１のしきい値と対比して候補分子を抽出し、抽出された候補分子に対してのみ第２の結合量測定処理を行い、第２のしきい値を用いて、生理活性物質Ｄに対して特異的に結合する候補分子を抽出する。
ここで第１のしきい値は、生理活性物質Ｄに対して結合量の高い候補分子を抽出すると共に、低活性時結合量データを得るための結合量測定の対象となる候補分子を抽出するものである。この結果、第２の結合量測定の測定対象の数を減らすことができるので、より短時間で候補分子のスクリーニングを行うことができる。
【００７０】
以下に、図１１を参照して、低活性時結合量データに対応した第１のしきい値と、活性時結合量データに対応した第２のしきい値とをそれぞれ「５ＲＵ」及び「３ＲＵ」として設定した場合のバイオセンサー１０でのスクリーニング処理について説明する。
【００７１】
センサースティック３０が測定部５６へ搬送され、入力部６４からスクリーニング開始の指示が入力されると制御部６０では図１１に示すスクリーニング処理が実行される。
ステップＳ２００で、第１のしきい値「３ＲＵ」及び第２のしきい値「５ＲＵ」が入力されたか否かが判断される。ユーザによってそれぞれのしきい値が入力部６４から入力されると、判断は肯定されてステップＳ２０２に移行し、第１の結合量測定を実行させ、ステップＳ２０４において、測定結果としての測定データＧ１及び参照データＧ２が取得されるまで判断は否定される。
ステップＳ２０４において、測定結果としての測定データＧ１及び参照データＧ２が取得されると判断は肯定されて、ステップＳ２０６に移行し、測定データＧ１を参照データＧ２で補正して結合量データＧ３としての活性時結合量データＨｎを算出し、ステップＳ２０８に移行する。
【００７２】
ステップＳ２０８では、第１の抽出工程として、活性時結合量データＨｎが第１のしきい値５ＲＵ以上か否かが判断される。５ＲＵよりも小さい場合には判断は否定されてステップＳ２１０に移行し、対象となっている候補分子を抽出対象から除外し、ステップＳ２１６に移行する。
活性時結合量データＨｎが５ＲＵ以上の場合には判断は肯定されてステップＳ２１２に移行する。ステップＳ２１２では、対象となっている候補分子を抽出し、ステップＳ２１４では、活性時結合量データＨｎを、抽出された候補分子に対応づけてメモリ６０Ｄに記憶する。活性時結合量データＨｎを記憶するとステップＳ２１６に移行する。
ステップＳ２１６では、次の候補分子があるか否かが判断され、次の候補分子が感知されると、判断が肯定されてステップＳ２０２に移行し、次の候補分子に対して第１の結合量測定を実行させる。
【００７３】
ステップＳ２１６において、次の候補分子が感知されない場合には、判断は否定されてステップＳ２１８に移行し、所定の活性低下処理を実行させ、活性低下処理が終了すると、ステップＳ２２０において、第２の結合量測定処理を実行させる。この第２の結合量測定処理は、第１の抽出工程で抽出された候補分子のみを選択して実行される。
ステップＳ２２０で第２の結合量測定処理を実行させると、ステップＳ２２２において測定結果が取得されたか否かが判断され、測定結果が取得されると判断は肯定されてステップＳ２２４において、結合量データＧ３としての低活性時結合量データＬｎを算出する。
【００７４】
低活性時結合量データＬｎを算出すると、ステップＳ２２６において、第２の抽出工程として、低活性時結合量データＬｎが第２のしきい値３ＲＵ以下か否かが判断される。
低活性時結合量データＬｎが３ＲＵよりも大きい場合には、判断は否定されてステップＳ２２８に移行し、生理活性物質Ｄに対して非特異的に結合し得る候補分子と判定して抽出対象から除外し、ステップＳ２３２に移行する。
一方、ステップＳ２２６において、低活性時結合量データＬｎが３ＲＵ以下の場合には、判断は肯定されてステップＳ２３０に移行し、対象となっている候補分子を、生理活性物質Ｄに対して特異的に結合する抽出すべき候補分子として判定し、ステップＳ２３２に移行する。
【００７５】
ステップＳ２３２では、次の候補分子があるか否かを判断し、次の候補分子を感知すると判断は肯定されてステップＳ２２０に移行し、次の抽出候補分子に対して第２の結合量測定処理を実行する。
一方、センサが次の候補分子を感知しないと判定は否定され、第２の抽出工程で抽出された候補分子を表示部６２に表示すると共にメモリ６０Ｄをクリアして、処理を終了する。
【００７６】
本実施形態のスクリーニング処理を実行することによって、３ＲＵを超える低活性時結合量データを示す非特異的結合の高い候補分子が除外され、非特異的結合が低く、５ＲＵ以上の高い結合活性を示す候補分子が抽出できる。この結果、生理活性物質Ｄに対して特異的に結合する物質についてのスクリーニングを、大量の候補分子に対して簡便に且つ効率よく行うことができる。
また、第２の結合量測定処理の対象となる候補分子は、抽出工程によって絞り込みによって抽出された少ない数の候補分子であるために、第２の結合量測定処理の数を減らすことができ、より短時間で効率よく生理活性物質Ｄに対して特異的結合する候補分子をスクリーニングすることができる。
【００７７】
本発明の実施形態では、低活性時結合量データに対する第１のしきい値を３ＲＵとし、活性時結合量データに対する第２のしきい値を５ＲＵとしたが、これに限定されない。しきい値は、同一の値であっても異なる値であってもよく、候補分子又は生理活性物質Ｄの特性、或いは、要求される特異的結合の程度に応じてユーザが適宜設定することができる。
また本発明の実施の形態では、生理活性物質Ｄに特異的に結合する物質として抽出された候補分子を表示部６２に表示してメモリ６２Ｄをクリアしたが、これに限定されない。結合量測定処理を実行させたすべての候補分子の結合量データを候補分子と対応づけて記憶し、データとして蓄積させてもよい。
【００７８】
更に、本発明の実施形態では、結合量測定処理を含めてスクリーニング処理としたが、抽出工程のみをスクリーニング処理としてもよい。この場合、結合量測定処理によって活性低下処理の前後で取得された結合量データをすべての候補分子に対応づけて結合量データリストを作成し、この結合量データリストを読み取ることによってスクリーニング処理を開始することができる。
【００７９】
また、本発明の本実施形態では、生理活性物質Ｄを固定化膜５０Ａに対して固定化してから活性低下処理を行ったが、これに限定されない。用いられる生理活性物質Ｄ及び活性低下処理の種類によって、生理活性物質Ｄを固定化膜５０Ａに固定化する前に活性低下処理を行ってもよい。活性低下処理しない場合と、活性低下処理する場合の結合量データを比較する上で、生理活性物質Ｄの固定量は両者でほぼ同一であることが好ましいので、固定化した後に活性低下処理を行う方が好ましい。
【００８０】
本実施の形態では、結合能に基づく活性低下処理前の結合量データを活性時結合量データとし、処理後の結合量データを低活性時結合量データとしたが、これに限定されない。活性時結合量データは、活性低下処理が未処理のものであってもよく、ある程度の処理を行ったものであってもよい。この場合には、少なくとも４０％以上、好ましくは６０％以上、更に好ましくは８０％以上の活性を維持しているものについて活性時結合量データを得る。
【００８１】
本発明の実施形態では、固定化膜５０Ａに固定化される標的分子として生理活性物質Ｄを使用し、液体流路４５へ供給する候補分子として、生理活性物質Ｄに結合可能な有機又は無機の分子としたが、これに限定されず、生理活性物質Ｄを候補分子として、これに結合可能な有機又は無機の分子を標的分子としてもよい。
【００８２】
なお、本発明の実施形態では、バイオセンサーとして、表面プラズモンセンサーを一例として説明したが、バイオセンサーとしては、表面プラズモンセンサーに限定されるものではない。その他の例えば、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した光学的測定技術など、あらゆるバイオセンサーを用いた場合における、参照領域で得られる参照データを予めデータベース化して記憶しておき、記憶された参照データにより、測定された測定データを補正するようにすることもできる。
【００８３】
また、全反射減衰を利用する他のバイオセンサーとしては、漏洩モード検出器をあげることができる。漏洩モードセンサは、誘電体と、この上に順に層設されたクラッド層と光導波層とによって構成された薄膜とからなり、この薄膜の一方の面がセンサ面となり、他方の面が光入射面となる。光入射面に全反射条件を満たすように光を入射させると、その一部が前記クラッド層を透過して前記光導波層に取り込まれる。そして、この光導波層において、導波モードが励起されると、前記光入射面における反射光が大きく減衰する。導波モードが励起される入射角は、表面プラズモン共鳴角と同様に、センサ面上の媒質の屈折率に応じて変化する。この反射光の減衰を検出することにより、前記センサ面上の反応を測定することができる。
【実施例】
【００８４】
次に、上記実施形態で説明した誘電体ブロック４２上への固定化膜５０Ａの作製及び作製された固定化膜５０Ａに対する生理活性物質Ｄの固定化と、固定化された生理活性物質Ｄに対する候補分子の結合について説明する。
【００８５】
［実施例１］
（１）測定チップの作成
金属膜として５０ｎｍの金が蒸着された誘電体ブロックをＭｏｄｅｌ−２０８ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION INC.）で３０分間処理した後、エタノール／水（８０／２０：容量比）で溶解した１６−ヒドロキシ−１−ヘキサデカンチオールの１．０ｍＭ溶液を金属膜に接触するように添加し、２５℃で１時間表面処理を行った。その後、エタノールで５回、エタノール／水混合溶媒で１回、水で５回洗浄を行った。
【００８６】
次に、１６−ヒドロキシ−１−ヘキサデカンチオールで被覆した表面に１０重量（質量）％のエピクロロヒドリン溶液（溶媒：０．４Ｍ水酸化ナトリウム及びジエチレングリコールジメチルエーテルの１：１混合溶液）を接触させ、２５℃の振盪インキュベーター中で４時間反応を進行させた。その後、表面をエタノールで２回、水で５回洗浄した。次に、２５重量％のデキストラン（Ｔ５００，Pharmacia）水溶液４０．５ｍｌに４．５ｍｌの１Ｍ水酸化ナトリウムを添加し、その溶液をエピクロロヒドリン処理表面上に接触させた。次に振盪インキュベーター中で、２５℃で２０時間インキュベートした。表面を５０℃の水で１０回洗浄した。続いて、ブロモ酢酸３．５ｇを２７ｇの２Ｍ水酸化ナトリウム溶液に溶解した混合物を上記デキストラン処理表面に接触させて、２５℃の振盪インキュベーターで１６時間インキュベートした。表面を水で洗浄し、その後同様のブロモ酢酸処理をさらに１回繰り返した。
【００８７】
（２）蛋白質の固定化
以下に示す手順で、（１）で作成したヒドロゲル被覆測定チップにｐ３８ＭＡＰキナーゼ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製、＃５５９３２４）を固定化した。
まず、表１に記載の固定化バッファーを用いて、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ２００μｇ／ｍｌ、および表１に記載の阻害剤１０μＭを含む蛋白質溶液を調製する。ランニングバッファーは、以下の組成とした：５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．２）／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／３．４ｍＭ ＥＤＴＡ。
【００８８】
まず、ヒドロゲル被覆チップに、ランニングバッファーを添加し、ベースラインをとる。次に、１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との混合液を添加し、１５分間静置後、ランニングバッファーで洗浄する。次に、作成した蛋白質溶液を添加し２０分間静置後、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄する。更に、エタノールアミン・ＨＣｌ溶液（１Ｍ，ｐＨ８．５）を添加し、１５分静置後、ランニングバッファーで３回洗浄する。最初のベースラインからの信号変化分をｐ３８キナーゼの固定量（ＲＵ）とする。
結果を表１に示す。固定化バッファーのｐＨが上がると、固定化量が低下し、ｐＨ６．０では固定できないことがわかる。
【００８９】
【表１】
2007163284.tif 000003
【００９０】
（３）化合物の結合測定
蛋白質を固定化した測定チップ（試料Ｅ以外）を、市販の表面プラズモン共鳴測定装置にセットし、化合物１、２、３の結合測定を以下のようにして行った。ここで、化合物１は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性を阻害することが知られている化合物である。一方、化合物２、３は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性を阻害しない化合物である。
【００９１】
以下の組成のランニングバッファーを作成する：５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．２）／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／３．４ｍＭ ＥＤＴＡ／ＤＭＳＯ ５容量％。
【００９２】
次に、ランニングバッファーに表２に記載の化合物１、２、３が１０μＭになるように溶解する。次に、ヒドロゲル被覆チップにランニングバッファーを添加し、ベースラインをとる。次に、調製した化合物溶液を添加して３分間静置後の信号変化分を、各化合物の結合量（ＲＵ）とする。最後にランニングバッファーで洗浄する。
【００９３】
結果を表２に示す。ここで、理論最大結合量とは、蛋白質と化合物が１：１で結合したときの結合量を示す。ｐ３８ＭＡＰキナーゼの分子量は４１，０００、化合物１の分子量は３７７である。
理論最大結合量＝蛋白質固定量×化合物分子量／蛋白質分子量
【００９４】
化合物１の結合比率は、以下の式から算出している。化合物１は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性部位特異的に結合することがわかっているため、この比率が１００に近いほど、蛋白質の活性が維持されていると考えられる
結合比率＝（結合量測定値／理論最大結合量）×１００
【００９５】
【化１】
2007163284.tif 000004
【００９６】
【表２】
2007163284.tif 000005
【００９７】
表２から、固定化ｐＨが高いほど活性の低下が小さく、また、固定化時に阻害剤を存在させると活性低下が小さくなることがわかる。
【００９８】
ｐ３８ＭＡＰキナーゼに特異的に結合する化合物１は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性が低下するほど、その結合量は小さくなっている。一方、化合物２は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性が低下しても結合量は低下しない。化合物２は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼに非特異的に結合しているものと推測される。化合物３は、いずれの試料でも、ほとんど結合はみられない。
ここで、スクリーニングを考える場合、試料Ｄのような状態だけで判断すると、化合物１と化合物２は、それぞれ２４．０ＲＵ及び２１．５ＲＵとなって両者に差がほとんどなく、共に抽出対象（ヒット化合物）と判断してしまう。試料Ａのように、蛋白の活性を低下させた状態でデータを取得することにより、化合物２は非特異的に吸着するものと判断することができる。
【００９９】
［実施例２］
蛋白質を固定化した後に、蛋白質の活性を低下させる方法の具体例を以下に示す。
実施例１の試料Ｄと同様に化合物１を共存させてｐ３８ＭＡＰキナーゼを固定化した後に、表３に示す活性低下処理を行った。さらに、実施例１と同様の方法で、化合物１の結合測定を行い、結合比率を算出した。結果を表３に示す。表３に示されるように、このような簡便な処理で、ｐ３８ＭＡＰキナーゼの結合活性を低下させることができる。
【０１００】
【表３】
2007163284.tif 000006
【０１０１】
その後、第１のしきい値として例えば２０ＲＵ、第２のしきい値として５ＲＵを設定することにより、２０ＲＵ以上で且つ５ＲＵ以下の結合量データを示す化合物１を抽出することができる。一方、化合物２については、同一のスクリーニング処理により、第１のしきい値に基づいて抽出されたとしても、第２のしきい値に基づいて除外される。
【０１０２】
従って、ｐ３８ＭＡＰキナーゼに対して特異的に結合する候補分子をスクリーニングする場合に、酢酸バッファーによる活性低下処理を行って低活性時結合量データを取得することによって、ｐ３８ＭＡＰキナーゼに対して非特異的に結合する候補分子と特異的に結合する候補分子とを簡便に選別することができる。
このように、活性低下処理の前の結合量データと活性低下処理後の結合量データとの差が大きい候補分子を、ｐ３８ＭＡＰキナーゼに対して特異的に結合する物質として効率よく且つ簡便に抽出することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】本発明の実施形態にかかるバイオセンサーの全体斜視図である。
【図２】本発明の実施形態にかかるセンサースティックの斜視図である。
【図３】本実施形態のセンサースティックの分解斜視図である。
【図４】本実施形態のセンサースティックの１の液体流路部分の断面図である。
【図５】本実施形態のセンサースティックの測定領域、参照領域へ光ビームが入射している状態を示す図である。
【図６】（Ａ）〜（Ｃ）は本発明の実施形態にかかる液体供給部を構成するピペット部の側面図である。
【図７】本発明の実施形態にかかるバイオセンサーの光学測定部付近の概略図である。
【図８】本発明の実施形態にかかる制御部とその周辺の概略ブロック図である。
【図９】本発明の第１の実施形態にかかるスクリーニング処理のフローチャートである。
【図１０】本発明の実施形態にかかる候補分子リストの一例である。
【図１１】本発明の第２の実施形態にかかるスクリーニング処理のフローチャートである。
【符号の説明】
【０１０４】
１０  バイオセンサー
４０  センサースティック
５０  金属膜
５０Ａ  固定化膜
５４  光学測定部
６０Ｄ  メモリ
６０  制御部
６２  表示部
６４  入力部
Ｄ  生理活性物質
Ｅ１  測定領域
Ｅ２  参照領域
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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