(57)【要約】【課題】物質が有する薬物代謝酵素阻害能力を簡易に且つ精度良く検定する方法の開発【解決手段】１）哺乳動物由来の薬物代謝酵素（本酵素）と、指標基質（本基質）と本基質とを溶解するのに適する溶媒を含む反応液における本基質の濃度が、本基質の代謝体を生成させるのに適する濃度となる候補反応液を選択する工程、２）前工程の候補反応液から、本基質と本物質とを溶解するのに適する溶媒を含む反応液を選択する工程、３）前工程の反応液の中で、本基質と本物質とこれらに応じた濃度である本酵素とを接触させながら、本酵素による本基質の代謝体を生成させる工程、４）前工程の代謝体の生成量を、ＨＰＬＣタンデム型質量分析計を用いて測定する工程、５）前工程の測定された生成量又は指標値に基づき、阻害能力の有無等を評価する工程、を有する薬物代謝酵素阻害能力の検定方法等。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質が有する、薬物代謝能力を有する酵素を阻害する能力を検定する方法において、
（１）哺乳動物由来の薬物代謝酵素と前記酵素の基質のうち指標と成り得る指標基質とを溶解するのに適する溶媒を含む反応液における前記指標基質の濃度が、前記酵素による前記指標基質の代謝体を所定時間内に生成させるのに適する濃度となるような環境を与えることができる候補反応液を選択する第一工程、
（２）第一工程により選択された候補反応液の中から、前記指標基質と前記被験物質とを溶解するのに適する溶媒を含む反応液を選択する第二工程、
（３）第二工程により選択された反応液の中で、前記指標基質と、前記被験物質と、これら２者に応じた濃度である前記酵素とを接触させながら、前記酵素による前記指標基質の代謝体を生成させる第三工程、
（４）第三工程により生成された代謝体の生成量を、高速液体クロマトグラフィータンデム型質量分析計を用いて測定する第四工程、
（５）第四工程により測定された生成量、又は、当該生成量に基づき算出された前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力に係る指標値に基づき、前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力の有無、そのタイプ若しくはその程度を評価する第五工程
を有することを特徴とする検定方法。
【請求項２】
前記酵素がヒト由来チトクロムＰ４５０であることを特徴とする請求項１記載の検定方法。
【請求項３】
前記酵素がヒト肝ミクロソームであることを特徴とする請求項１記載の検定方法。
【請求項４】
前記第五程において、前記第四程の生成量又はその指標値と、対照における生成量又はその指標値とを比較し、その差異に基づいて前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力の有無、そのタイプ若しくはその程度を評価することを特徴とする請求項１、２又は３記載の検定方法。
【請求項５】
物質が有する、薬物代謝能力を有する酵素を阻害する能力を検定する方法において、請求項１〜４のいずれかの請求項記載の検定方法を用いて、複数の薬物代謝酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力の有無、そのタイプ若しくはその程度を評価するに際して、第四工程を除く全ての工程は薬物代謝酵素毎に独立して実施し、且つ、第四工程は薬物代謝酵素毎に独立することなく実施することを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかの請求項記載の検定方法によって、前記酵素に対する被験物質の阻害能力の有無、そのタイプ若しくはその程度を評価し、当該評価結果に基づき、所望の薬物代謝能力を有する酵素を阻害する能力を有する物質を選抜することを特徴とする、薬物代謝能力を有する酵素を阻害する能力を有する物質の探索方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質が有する、薬物代謝能力を有する酵素を阻害する能力を検定する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物は、生体内に取り込まれた薬物を異物として認識し、極性を高めて体外に排泄するシステムを持っており、当該システムを薬物代謝と呼ぶことがある。薬物代謝において中心的な役割を担っているのが、例えば、チトクロームＰ４５０と呼ばれる一群の酸化還元酵素であり、薬物（特に医薬化合物）の薬理効果や毒性を決定する重要な因子の一つとして位置づけられている。
このようなチトクロームＰ４５０等の薬物代謝能力を有する酵素は、多くの組織中に含まれるが、特に肝臓中に高い水準で含まれている。例えば、ヒト等の哺乳動物由来の肝臓では１５〜２０種類の異なるチトクロームＰ４５０分子種の存在が推測されている。この中で、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４と呼ばれるチトクロームＰ４５０分子種は、薬物代謝及び薬物−薬物相互作用を最も一般的に担うと考えられている。そして、特定のチトクロームＰ４５０分子種による薬物代謝における競合は、臨床的に重要な薬物−薬物相互作用のメカニズムであるとされている（例えば、非特許文献１、２参照）。
【０００３】
【非特許文献１】P450の分子生物学、大村 恒雄、藤井 義明、石村 巽、出版社:講談社;ISBN 406153677X、発行日：2003/10
【０００４】
【非特許文献２】薬物代謝学−医療薬学・毒性学の基礎として、出版社: 東京化学同人;ISBN 4807905279、第2版、発行日：2000/10
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで最近、薬物の併用により発現する薬物−薬物相互作用が臨床的に重要視されてきており、各製薬企業においては、薬物の開発段階において薬物−薬物相互作用の有無及びその程度を検討しておくことが求められている。このために、薬物が有する、薬物代謝能力を有する酵素を阻害する能力を簡易に且つ精度良く検定する方法の開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、かかる状況のもと反応液に係る実験を積み重ねながら鋭意検討した結果、基質である薬物の種類に応じて特定の環境を与えることができる反応液を選択して用いることにより、薬物代謝能力を有する酵素が薬物代謝体を常に安定して製造可能であることを見出し、本発明に至った。
本発明者らは、かかる状況のもと薬物−薬物相互作用に係る実験を積み重ねながら鋭意検討した結果、（１）薬物代謝能力を有する酵素に対しての、指標と成り得る指標基質と被験薬物（即ち、被験物質）との薬物代謝における競合性を利用するために適した反応液の選択、並びに、（２）指標基質から生成した代謝体の生成量の、高速液体クロマトグラフィータンデム型質量分析計を利用した測定及びその測定結果の解析、等により、上記所望の検定方法が構築できることを見出し、本発明に至った。
【０００７】
本発明は、
１．物質が有する、薬物代謝能力を有する酵素を阻害する能力を検定する方法において、
（１）哺乳動物由来の薬物代謝酵素と前記酵素の基質のうち指標と成り得る指標基質とを溶解するのに適する溶媒を含む反応液における前記指標基質の濃度が、前記酵素による前記指標基質の代謝体を所定時間内に生成させるのに適する濃度となるような環境を与えることができる候補反応液を選択する第一工程、
（２）第一工程により選択された候補反応液の中から、前記指標基質と前記被験物質とを溶解するのに適する溶媒を含む反応液を選択する第二工程、
（３）第二工程により選択された反応液の中で、前記指標基質と、前記被験物質と、これら２者に応じた濃度である前記酵素とを接触させながら、前記酵素による前記指標基質の代謝体を生成させる第三工程、
（４）第三工程により生成された代謝体の生成量を、高速液体クロマトグラフィータンデム型質量分析計を用いて測定する第四工程、
（５）第四工程により測定された生成量、又は、当該生成量に基づき算出された前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力に係る指標値に基づき、前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力の有無、そのタイプ若しくはその程度を評価する第五工程
を有することを特徴とする検定方法（以下、本発明検定方法と記すこともある。）；
２．前記酵素がヒト由来チトクロムＰ４５０であることを特徴とする前項１記載の検定方法；
３．前記酵素がヒト肝ミクロソームであることを特徴とする前項１記載の検定方法；
４．前記第五程において、前記第四程の生成量又はその指標値と、対照における生成量又はその指標値とを比較し、その差異に基づいて前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力の有無、そのタイプ若しくはその程度を評価することを特徴とする前項１、２又は３記載の検定方法；
５．物質が有する、薬物代謝能力を有する酵素を阻害する能力を検定する方法において、前項１〜４のいずれかの前項記載の検定方法を用いて、複数の薬物代謝酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力の有無、そのタイプ若しくはその程度を評価するに際して、第四工程を除く全ての工程は薬物代謝酵素毎に独立して実施し、且つ、第四工程は薬物代謝酵素毎に独立することなく実施することを特徴とする方法；
６．前項１〜５のいずれかの請求項記載の検定方法によって、前記酵素に対する被験物質の阻害能力の有無、そのタイプ若しくはその程度を評価し、当該評価結果に基づき、所望の薬物代謝能力を有する酵素を阻害する能力を有する物質を選抜することを特徴とする、薬物代謝能力を有する酵素を阻害する能力を有する物質の探索方法（以下、本発明探索方法と記すこともある。）；
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、薬物が有する、薬物代謝能力を有する酵素を阻害する能力を簡易に且つ精度良く検定する方法が提供可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００１０】
本発明における「薬物代謝能力を有する酵素」（以下、本酵素と記すこともある。）とは、例えば、哺乳動物由来の薬物代謝酵素を意味している。具体的には例えば、ヒト由来チトクロムＰ４５０や、ヒト肝ミクロソーム等を挙げることができる。ヒト由来チトクロムＰ４５０やヒト肝ミクロソーム等は市販の製品を用いてもよいし、公知の方法（例えば、「実験生物学講座６  細胞分画法」、編集：毛利秀雄、香川靖雄、発行所：丸善株式会社、ISBN：4-621-02950-9 C3345、発行日：1984/12/25、「Method in Enzymolozy, Volume 206, Cytochrome P450」、EDITED BY Michael R.Waterman、Eric F. Johnson、ACADEMIC PRESS, INC.、1991等の文献参照）に従って調製してもよい。具体的には、ヒト肝ミクロソームの場合には、由来の明らかなヒトの肝臓をホモジナイズして得られる組織破砕物を遠心分離（例えば、４℃、１０,０００×ｇ、３０ min）した後、その上清をさらに遠心分離（４℃、１００,０００×ｇ、９０ min）し、得られた沈殿を １００ mM ピロリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.4） に再度懸濁し遠心分離（４℃、１００,０００×ｇ、６０ min）して得られる沈殿を、適切な緩衝液に懸濁して得られる画分をヒト由来チトクロムＰ４５０等の薬物代謝能力を有する酵素を含む膜画分として、これを試料とすれば用いればよい。
【００１１】
尚、本酵素において、２種以上の薬物代謝酵素（例えば、ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種）を組み合せて使用するには、例えば、ヒト肝臓における各々の薬物代謝酵素への存在量に相当する割合で、当該薬物代謝酵素を混合した状態で組み合せて使用すればよい。尚、この組み合せ割合を適宜変えることにより、ヒトにおける人種差、個人差に対応することもできる。ここで「混合した状態」とは、上記の２種以上の分子種を混合し、１つの反応系で同時に存在させる状態を意味する。
【００１２】
人為的に作製される、哺乳動物由来の薬物代謝酵素は、突然変異処理により作製される酵素であってもよいし、遺伝子工学的な手法を用いて作製させる酵素（以下、改変型酵素と記すこともある。）であってもよい。尚、改変型酵素形質を作製する際に用いられる哺乳動物由来の薬物代謝酵素（即ち、本酵素）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子（以下、本遺伝子と記すこともある。）は、（１）天然に存在する遺伝子の中からクローニングされたものであってもよいし、（２）天然に存在する遺伝子であっても、このクローニングされた遺伝子の塩基配列において、その一部の塩基の欠失、置換又は付加が人為的に導入されてなる遺伝子（即ち、天然に存在する遺伝子を変異処理（部分変異導入法、突然変異処理等）を行ったものであってもよいし、（３）人為的に合成されたものであってもよい。
【００１３】
本発明における「指標と成り得る指標基質」とは、薬物代謝能力を有する酵素（即ち、本酵素）によって作用を受ける典型的な化合物であり、当該酵素がその構造を特異的に認識しながら作用するような酵素反応を特徴付けるに足り得る代表的な物質を意味する。具体的には、例えば、本酵素がヒト由来のチトクロムＰ４５０の場合には、ヒト由来のチトクロムＰ４５０の基質となる各種の脂溶性化合物を、当該チトクロムＰ４５０に基づく酸素添加等の異化作用（即ち、モノオキシゲナーゼ反応）により分解して得られる典型的な化合物とし、これを当該指標基質として挙げることができる。
【００１４】
より具体的には、本酵素がヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種の場合には、例えば、
【００１５】
【表１】
2007236327.tif 000002
【００１６】
等を挙げることができる。勿論、この他にも、ＦＤＡ（米国食品医薬品局）や厚生労働省等が推奨する指標と成り得る酵素反応の中から適切なものを選択し、当該反応を特徴付けるに足り得る代表的な物質であってもよい。
尚、本酵素が２箇所以上の基質結合部位を有する場合には、２種以上の指標と成り得る酵素反応の各々に対応した、指標と成り得る指標基質を利用することが好ましい。このような酵素としては、例えば、ＣＹＰ３Ａ４等を挙げることができる。
【００１７】
本発明における「指標基質の代謝体」とは、薬物代謝能力を有する酵素（即ち、本酵素）の指標と成り得る指標基質を当該酵素に基づく異化作用により分解して得られる化合物を意味し、具体的には、例えば、本酵素がヒト由来のチトクロムＰ４５０の場合には、ヒト由来のチトクロムＰ４５０の基質となる各種の脂溶性化合物を当該チトクロムＰ４５０に基づく酸素添加等の異化作用（即ち、モノオキシゲナーゼ反応）により分解して得られる化合物を挙げることができる。
【００１８】
より具体的には、本酵素がヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種の場合には、例えば、
【００１９】
【表２】
2007236327.tif 000003
【００２０】
等を挙げることができる。
【００２１】
本発明検定方法における第一工程について説明する。
第一工程では、哺乳動物由来の薬物代謝酵素と前記酵素の基質のうち指標と成り得る指標基質とを溶解するのに適する溶媒を含む反応液における前記指標基質の濃度が、前記酵素による前記指標基質の代謝体を所定時間内に生成させるのに適する濃度となるような環境を与えることができる候補反応液を選択する。従って、第一工程では、哺乳動物由来の薬物代謝酵素と前記酵素の基質のうち指標と成り得る指標基質との２者の組み合わせによる反応において適する反応液が、後述する第三工程において用いられる反応液の候補としてまず選択されることになる。
まず、前記酵素と前記指標基質とを溶解するのに適する溶媒を選択する。前記酵素と前記指標基質とを溶解する溶媒は、前記酵素（特に、当該酵素がヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種の場合）の活性を上昇させたり、又は、阻害させたりすることがあるため、このような変化を回避することが重要である。
例えば、前記酵素がＣＹＰ２Ｅ１であり且つ前記指標基質がChlorozoxazone（クロルゾキサゾン）である場合には、０．２％のアセトニトリルは影響を与えないが、０．２％のジメチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ）は阻害作用（＞８０％）を示す。このことから、万一、溶媒として不適切なものを選択した場合には、阻害作用を誤って評価することに繋がり、精度良い検定が困難になろう。
従って、溶媒は、前記酵素と前記指標基質とを溶解するのに適する溶媒でありながら、当該溶媒を含む反応液における前記指標基質から、前記酵素による前記指標基質の代謝体を所定時間内に生成させるのに適するような環境を与えることができる溶媒であることが重要であり、このことは、前記酵素と前記指標基質とを溶解するのに適する溶媒を含む反応液における前記指標基質の濃度が、前記酵素による前記指標基質の代謝体を所定時間内に生成させるのに適する濃度となるような環境を与えることができる候補反応液を選択しなければならないことも意味するものである。
下表に、溶媒の適正を予め確認した代表的な例を記載する。勿論その他についても事前に、候補溶媒が、哺乳動物由来の薬物代謝酵素と前記酵素の基質のうち指標と成り得る指標基質との２者の組み合わせによる反応系に影響を与えないことを通常の酵素工学的な方法等を用いて調べておけばよい。尚、下表中の略記（MeOH、MeCN、EtOH、DMSO、DMF）は、メタノール、アセトニトリル、エタノール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドを意味する。
【００２２】
【表３】
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【００２３】
次いで、選択された溶媒を含む反応液における前記指標基質の濃度を、前記酵素による前記指標基質の代謝体を所定時間内に生成させるのに適した濃度に決定し、決定された濃度になるような環境を与えることができる候補反応液を選択すればよい。ここで「前記酵素による前記指標基質の代謝体を所定時間内に生成させるのに適した濃度」とは、例えば、前記酵素による前記指標基質の代謝体を生成させる反応における酵素反応速度論に基づいた濃度であり、具体的には例えば、
（１）後述する「第四工程により測定された生成量に基づき算出された前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力に係る指標値」がＩＣ５０である場合：
Michaelis 定数（Ｋｍ：酵素反応における初速度が最大速度Ｖmaxの１／２になる時の基質濃度）、又は、
（２）後述する「第四工程により測定された生成量に基づき算出された前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力に係る指標値」がＫｉ値である場合：
Ｋｍ×１／２、Ｋｍ、Ｋｍ×２の３点の濃度
等を基本的に選択すればよい。
より具体的には本酵素がヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種の場合には、
前者のMichaelis 定数（Ｋｍ）を含む濃度範囲の例としては、例えば、
【００２４】
【表４】
2007236327.tif 000005
【００２５】
等を挙げることができる。
【００２６】
また第一工程における候補反応液は、緩衝液（例えば、ｐＨ７．４）であることがよい。
【００２７】
次いで、本発明検定方法における第二工程について説明する。
第二工程では、第一工程により選択された候補反応液の中から、前記指標基質と前記被験物質とを溶解するのに適する溶媒を含む反応液を選択する。従って、第二工程では、前記酵素と前記指標基質と被験物質との３者の組み合わせによる反応系において適する反応液が第一工程により選択された候補反応液の中からさらに選択されることになる。
まず、第一工程により選択された候補反応液の中から、前記指標基質と前記被験物質とを溶解するのに適する溶媒を決定し、次いで、決定された溶媒を含む反応液を選択すればよい。
前記指標基質と前記指標基質とを溶解する溶媒は、前述の如く、前記酵素（特に、当該酵素がヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種の場合）の活性を上昇させたり、又は、阻害させたりすることがあるため、このような変化を回避することが重要である。従って、溶媒は、第一工程により選択された候補反応液でありながら、前記指標基質と前記指標基質とを溶解するのに適する溶媒であることが重要である。このような溶媒は、事前に、第一工程により選択された候補反応液に含まれる溶媒が、哺乳動物由来の薬物代謝酵素と前記指標基質と被験物質との３者の組み合わせによる反応系に影響を与えないことを通常の酵素工学的な方法等を用いて調べておけばよい。
【００２８】
次いで、本発明検定方法における第三工程について説明する。
第三工程では、第二工程により選択された反応液の中で、前記指標基質と、前記被験物質と、これら２者に応じた濃度である前記酵素とを接触させながら、前記酵素による前記指標基質の代謝体を生成させる。
前記代謝体の生成は、例えば、本酵素を含む反応液に前記指標基質と前記被験物質とを添加する操作、又は前記指標基質と前記被験物質とを含む反応液に本酵素を添加する操作等により開始される。
【００２９】
上記反応は、前記指標基質と、前記被験物質と、これら２者に応じた濃度である前記酵素とを含む反応液の中で行われ、具体的には例えば、ヒト由来チトクロムＰ４５０等の薬物代謝能力を有する酵素（即ち、本酵素）を含む反応液に前記指標基質と前記被験物質とを添加した後、又は、前記指標基質と前記被験物質とを含む反応液にヒト由来チトクロムＰ４５０等の薬物代謝能力を有する酵素（即ち、本酵素）を添加した後、当該混合物を、例えば、約１０℃〜約４０℃で、約２分間〜約２時間インキュベートすることにより行うことができる。
【００３０】
当該反応液中の本酵素の存在量は、当該反応液中の前記指標基質若しくは前記被験物質等の存在量に応じて決定すればよい。本酵素の存在量は、本酵素、前記指標基質若しくは前記被験物質等の種類、反応温度又は反応時間等の各種条件によっても異なってもよいが、本酵素の存在量としては、例えば、本酵素がヒト由来チトクロムＰ４５０の場合において、前記指標基質の存在量が、例えば、溶液１ｍｌあたり約０．０１μｍｏｌ  〜約１０μｍｏｌ  程度の範囲であり、且つ、前記被験物質の存在量が、例えば、溶液１ｍｌあたり約０．０１μｍｏｌ  〜約１０μｍｏｌ  程度の範囲である場合には、溶液１ｍｌあたり約１０１０〜約１０１５程度のチトクロムＰ４５０分子数、好ましくは溶液１ｍｌあたり約１０１２〜約１０１３のチトクロムＰ４５０分子数を望ましいものとして挙げることができる。尚、上記の範囲にかかることなく適宜増加させたり、減少させることができることは言うまでもない。
【００３１】
当該反応に際しては、前記指標基質と前記被験物質とを同時に又は各々独立して反応系内に連続又は逐次加えてもよい。
尚、当該反応中（特に反応開始時）は、本酵素と前記指標基質と前記被験物質とがよく混合するように、攪拌又は振とう等の操作を用いることがよい。
【００３２】
反応の終点は、例えば、反応液中の前記指標基質の存在量を高速液体クロマトグラフィータンデム型質量分析計を用いた測定等により追跡することにより決定することができる。
具体的には例えば、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ 7.4）及びヒト肝ミクロソームを含む溶液に、被験物質を５μＬ（終濃度が検討すべき濃度となるように原液の濃度を調整する。）添加した後、これに５μＬ添加することにより、プレウォーミングを開始する。プレウォーミングを３７℃で１０分間行った後、１０ｍｍｏｌ／Ｌのニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（以下、ＮＡＤＰＨと記すこともある。）溶液を１００μＬ（終濃度１ｍｍｏｌ／Ｌ）添加することにより代謝反応（反応温度：３７℃）を開始する。反応停止には、前記の反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加すればよい。
因みに、被験物質によっては、ＮＡＤＰＨの存在下で、ヒト肝ミクロソームとインキュベーションすることにより、各ヒト由来チトクロームＰ４５０分子種を不可逆的に失活させるものが存在する。これは、Mechanism based inhibition（以下、ＭＢＩと記すこともある。）と呼ばれる。ＭＢＩの事前検討は、例えば、以下のように実施すればよい。
１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及びヒト肝ミクロソームを含む溶液に、被験物質を５μＬ（終濃度が検討すべき濃度となるように原液の濃度を調整する。）添加することにより、プレウォーミングを３７℃で１０分間実施する。１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌ）添加することにより、プレインキュベーションを開始する。プレインキュベーションを０分間、１５分間又は３０分間実施した後、これに前記指標基質を５μＬを添加することにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始する。反応停止には、前記の反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加すればよい。
【００３３】
前記指標基質と、前記被験物質と、これら２者に応じた濃度である前記酵素とを接触させながら、前記酵素による前記指標基質の代謝体を生成させるには、前記代謝体の生成量が接触経過時間に対して実質的に直線的に増加する範囲で実施することが好ましい。本酵素の濃度としては、反応液に対して、例えば、０．０５ｍｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬを挙げることができる。
より具体的には、本酵素がヒト肝ミクロソームの場合には、例えば、
【００３４】
【表５】
2007236327.tif 000006
【００３５】
等を挙げることができる。
接触時間としては、例えば、５ｍｉｎ〜６０ｍｉｎを挙げることができる。
より具体的には、本酵素がヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種の場合には、例えば、
【００３６】
【表６】
2007236327.tif 000007
【００３７】
等を挙げることができる。
【００３８】
本発明における第四工程について説明する。
第四工程では、第三工程により生成された代謝体の生成量を、高速液体クロマトグラフィータンデム型質量分析計（以下、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳと記すこともある。）を用いて測定する。
例えば、まず第三工程により生成された代謝体を含む反応液に内標準物質を添加した後、当該反応液を遠心分離（室温、３０００ｒｐｍ、１０分間）する。得られた上清を５０倍に希釈しフィルターろ過した後、これをＬＣ−ＭＳ／ＭＳに注入することにより前記代謝体の生成量を測定すればよい。前記上清の希釈倍率は、前記代謝体の生成量の測定感度に応じて適宜変更すればよいが、例えば、１０倍〜１００倍希釈が好ましい。
【００３９】
以下に、より具体的なＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる前記代謝体の生成量の測定方法に係る代表的な分析例を詳細に述べる。
（１）分析条件
（ａ）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにおける高速液体クロマトグラフィー法
分析カラム：Ｌｕｎａ  ５μ  Ｃ１８（２）、１５０ｍｍ  Ｌ．×２．０ｍｍ  Ｉ．Ｄ．，５μｍ（Phenomenex社）
カラム温度：２５℃
移動相：移動相Ａ；０．１％ギ酸水溶液、移動相Ｂ；  メタノール
グラジエント条件：
【００４０】
【表７】
2007236327.tif 000008
【００４１】
流量：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：１０μＬ
【００４２】
尚、勿論、移動相の組成をグラジエント条件に代えて定比率条件にしてもよい。その場合には、所望の代謝体の保持時間に応じた０．１％ギ酸水溶液／メタノールの比率を選択すればよい。
（ｂ）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにおける質量分析法
装置：Tandem Mass Spectrometer：API 4000  Applied Biosystems /MDS SCIEX社
API interface：TurboV (ESIプローブ)
測定条件：
【００４３】
【表８】
2007236327.tif 000009
【００４４】
尚、内部標準物質を利用する場合には、第三工程における代謝反応の停止後、直ちに、前記代謝体の物性に適した内部標準物質をスパイクすればよい。
より具体的には、本酵素がヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種の場合には、例えば、
【００４５】
【表９】
2007236327.tif 000010
【００４６】
等を挙げることができる。
また、場合によっては、上記の異なる分子種の代謝反応を独立して実施した後の反応液を混合して、当該反応液中に存在する全ての前記代謝体の生成量を、一度にＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて測定してもよい。その場合に用いられる好ましい内部標準物質としては、デキストロファン酒石酸塩、フロセミド等を挙げることができる。即ち、本発明は、物質が有する、薬物代謝能力を有する酵素を阻害する能力を検定する方法において、本発明検定方法を用いて、複数の薬物代謝酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力の有無、そのタイプ若しくはその程度を評価するに際して、第四工程を除く全ての工程は薬物代謝酵素毎に独立して実施し、且つ、第四工程は薬物代謝酵素毎に独立することなく実施することを特徴とする方法を含む。
【００４７】
（２）前記代謝体の定量方法（測定された前記代謝体の生成量、又は、当該生成量に基づき算出された前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力に係る指標値）
まず１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、ヒト肝ミクロソーム及びメタノール（反応停止液）を含む溶液に、既知濃度の前記代謝体及び内部標準物質が添加された試料（以下、添加検量線試料と記すこともある。）を調製する。次いで、当該試料と、第三工程における代謝反応を停止した後の反応液とを供試試料として、これら供試試料に含まれる前記代謝体の生成量をＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて測定する。
添加検量線試料の測定で得られたピーク面積比（前記代謝体のピーク面積／内部標準物質のピーク面積）をＹとし、代謝体の濃度をＸとする。前記Ｘ及び前記Ｙから、最小二乗法により一次回帰式（Ｙ＝ａＸ＋ｂ、重み付けは得られた回帰式の直線性を考慮して選択する。）を算出する。上記の代謝反応を停止した後の反応液についても同様にピーク面積比を求め、上記の一次回帰式に代入することにより、前記代謝体の生成量（即ち、定量値）を算出する。
このようにして算出された前記代謝体の生成量から、単位時間（分）、ミクロソーム１ｍｇ当たりの前記代謝体の生成量を算出する。また同時に、当該代謝反応の代謝速度（ｖ）を算出してもよい。
【００４８】
代謝速度（ｖ、ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）
＝（代謝物生成量（μｍｏｌ／Ｌ））／（反応時間（分））／（反応液中ヒト肝ミクロソーム濃度（ｍｇ蛋白／ｍＬ））
【００４９】
前記代謝体の生成量に基づき算出された前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力に係る指標値である「ＩＣ５０」は、例えば、以下の手順で算出すればよい。
残存活性は、被験物質の濃度がゼロである場合の値（コントロール）に対する百分率であり、下記で示すことができる。
残存活性（％）=（平均代謝速度／コントロールの平均代謝速度）×100
残存活性をＹとし、被験物質の濃度の対数をＸとする。前記Ｘ及び前記Ｙから、残存活性が５０％のときの前記被験物質の濃度をＩＣ５０として算出する。尚、ＩＣ５０は、５０％阻害となる被験物質の濃度を挟む被験物質の他の濃度２点を用い、最小二乗法により一次回帰式（Ｙ＝ａＸ＋ｂ、重みなし）を算出する。算出された一次回帰式においてＹ＝５０を与えるＸの値をＩＣ５０とする。
因みに、前記被験物質が一連の類似阻害物質（競合阻害物質）である場合には、「ＩＣ５０」はどれが最も効果的な阻害物質であるかを表し、低濃度領域においては、最小の「ＩＣ５０」を持つ阻害物質が多くの場合において最大の阻害効果を表している。
【００５０】
また前記代謝体の生成量に基づき算出された前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力に係る指標値である「Ｋｉ値」は、例えば、以下の手順で算出すればよい。
まず前記指標基質の濃度（３濃度）毎に、代謝速度（ｖ）の逆数（１/ｖ）をＹとし、被験物質の濃度をＸとする。前記Ｘ及び前記Ｙから、最小二乗法により一次回帰式（Ｙ＝ａＸ＋ｂ、重みなし）を算出する（当該プロットをDixon plotと呼ぶこともある。）。ここで直線の交点のＸ軸座標の絶対値を平均してこれをＫｉとする。Dixon plotから前記被験物質が有する阻害タイプを評価する。
因みに、前記被験物質が一連の類似阻害物質（競合阻害物質）である場合には、「Ｋｉ値」はどれが最も効果的な阻害物質であるかを表し、低濃度領域においては、最小の「Ｋｉ値」を持つ阻害物質が多くの場合において最大の阻害効果を表している。
【００５１】
本発明における第五工程について説明する。
第五工程では、第四工程により測定された生成量、又は、当該生成量に基づき算出された前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力に係る指標値に基づき、前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力の有無、そのタイプ若しくはその程度を評価する。
当該工程における好ましい態様としては、例えば、前記第四工程の生成量又はその指標値と、対照における生成量又はその指標値とを比較し、その差異に基づいて前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力の有無、そのタイプ若しくはその程度を評価することを挙げることができる。
【００５２】
対照における生成量又はその指標値（以下、総じて対照値と記すことがある。）としては、例えば、被験物質の濃度がゼロである場合の前記代謝体の生成量又はその指標値をあげることができる。ここで、被験物質の濃度がゼロである場合とは、例えば、被験物質を添加しない反応系である場合や被験物質が溶媒である場合等を意味する。かかる対照値は、前記の第三工程〜第四工程と併行して測定して求めてもよいし、別途測定して求めてもよい。
例えば、被験物質が溶媒である場合の値を対照値として、各種の被験物質における前記の生成量又は前記の指標値が当該対照値に対して統計学上有意に減じていれば（例えば、２分の１以下であれば、）、前記被験物質は薬物代謝能力を有する酵素を阻害する能力を有すると評価することができる。また当該減少量の大きさに応じてその程度を評価してもよい。
また例えば、被験物質が、前記酵素に対する阻害能力を有することが既に知られている物質（陽性対照物質）である場合の値を対照値として、各種の被験物質における前記の生成量又は前記の指標値が当該対照値に対して実施的に同等であれば、前記被験物質は薬物代謝能力を有する酵素を阻害する能力を有すると評価することができる。また前記の同等性において、当該阻害能力のタイプにおける差異が実質的に認められなければ、前記被験物質は、前記の陽性対照物質と同タイプの阻害能力を有すると評価することもできる。
また例えば、被験物質が有する前記酵素に対する阻害能力が、前記酵素による前記指標基質の濃度増加により解除される（競合阻害）か否（非競合阻害）かによって、競合阻害物質と非競合阻害物質とに区別することもできる。さらにまた、縦軸に1/Vi、横軸に1/[S]とする二重逆数プロットを作成し反応速度論的解析を行えば、典型的な競合阻害の場合には、２本の直線（阻害剤存在下のものと非存在下のもの）はＹ軸上で交わり（Ｖmaxは不変）、Ｘ軸との交点（-1/Km）は、阻害剤が存在するときには、より原点に近いところで交わることになる（見かけＫｍが大となる）。非競合阻害の場合には、阻害剤が存在するとＹ軸との交点（1/Ｖmax）が大となるが（Ｖmaxは減少）、Ｘ軸との交点は不変である。
【００５３】
本発明は、薬物代謝能力を有する酵素を阻害する能力を有する物質の探索方法（即ち、本発明探索方法）を含む。本発明探索方法では、本発明検定方法によって、前記酵素に対する被験物質の阻害能力の有無、そのタイプ若しくはその程度を評価し、当該評価結果に基づき、所望の薬物代謝能力を有する酵素を阻害する能力を有する物質を選抜すればよい。
選抜された物質が医薬品候補化合物である場合には、一般に併用薬との薬物相互作用を起こす可能性があるため、得られた知見（即ち、選抜された物質に係る情報等）をもって医薬品開発の意思決定に利用することができる。
【実施例】
【００５４】
以下に、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５５】
実施例Ａ１  （薬物代謝酵素がＣＹＰ１Ａ２である場合における本発明検定方法（第一工程））
薬物代謝酵素がＣＹＰ１Ａ２であることから、表１記載の如く、前記指標基質としてフェナセチン（Phenacetin）を選択した。因みに、当該選択により、表２記載の如く、酵素反応はフェナセチンＯ-デエチレーション（Phenacetin O-deethylation）に決定され、また前記指標基質の代謝体はアセトアミノフェン（acetaminophen）に決定された。
【００５６】
次いで、前記酵素と前記指標基質とを溶解するのに適する溶媒を含む反応液における前記指標基質の濃度が、前記酵素による前記指標基質の代謝体を所定時間内に生成させるのに適する濃度となるような環境を与えることができる候補反応液が下記の手順に従い選択された。
【００５７】
（ａ）まず当該前記酵素と前記指標基質とを溶解するのに適する溶媒として、表３記載の如く、MeCN若しくはMeOHのいずれかを選択できるが、ここではMeCNを仮に選択する。
（ｂ）次いで、選択されたMeCNを含む反応液における前記指標基質の濃度を、前記酵素による前記指標基質の代謝体を所定時間内に生成させるのに適するように決定するために、代謝反応に係る時間の検討及びＫｍ値の測定（具体的には、Ｋｍ値×１／８を最低濃度とし、Ｋｍ×２を最高濃度とした、合計で６点の前記指標基質の濃度での検討）を下記のように実施した。そして「第四工程により測定された生成量に基づき算出された前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力に係る指標値」がＩＣ５０である場合には、表４記載の如く、前記濃度をＫｍ値付近の一点（反応液中の終濃度：５０μｍｏｌ／Ｌ）を前記指標基質の濃度として決定した。一方、「第四工程により測定された生成量に基づき算出された前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力に係る指標値」がＫｉ値である場合には、前記濃度をＫｍ×１／２、Ｋｍ、Ｋｍ×２の３点に決定した（表４参照）。
【００５８】
＜代謝反応に係る時間の検討＞
０．５ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のアセトニトリルを含む反応液に、１０ｍｍｏｌ／Ｌのフェナセチン（指標基質）を５μＬ添加した（終濃度：５０μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から１０分間、１５分間、２０分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析した。
このようにして、表７の如く、所定の反応時間（即ち、表６記載の薬物代謝酵素の濃度における接触時間）は１５分間に決定した（図１参照）。
【００５９】
＜Ｋｍ値の測定＞
０．５ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のアセトニトリルを含む反応液に、各種濃度のフェナセチン（指標基質）を５μＬ添加した（終濃度：６．２５、１２．５、２５、５０、１００μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から１５分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析した。
このようにして、表１４記載の如く、Ｋｍ値は５２．９であることが明らかにされた（図２及び図３参照）。
【００６０】
そして、このようにして前記指標基質の濃度を決定することが可能であることを確認することにより、所望の環境を与えることができる候補反応液として、前記溶媒（即ち、MeCN）を含む反応液を選択した。
【００６１】
実施例Ａ２  （薬物代謝酵素がＣＹＰ１Ａ２である場合における本発明検定方法（第二工程））
被験物質としてフラフィリン（furafylline）を用いた。
実施例１で選択された溶媒（即ち、MeCN）が、当該被験物質（即ち、フラフィリン）と前記指標基質（即ち、フェナセチン）とを溶解するのに適する溶媒であることを確認することにより、実施例１で選択された候補反応液が、記指標基質と前記被験物質とを溶解するのに適する溶媒を含む反応液であるとして選択した。
【００６２】
実施例Ａ３  （薬物代謝酵素がＣＹＰ１Ａ２である場合における本発明検定方法（第三工程その１：ＩＣ５０測定））
薬物代謝酵素の濃度及び所定の反応時間として表６及び表７記載のものを用いた。
０．５ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のアセトニトリルを含む反応液に、各種濃度のフラフィリン（被験物質）を５μＬ添加した後（終濃度：０、０．０３、０．１、０．３、１、３、１０μｍｏｌ／Ｌに相当する）、さらに当該混合物に１０ｍｍｏｌ／Ｌのフェナセチン（指標基質）を５μＬ添加した（終濃度：５０μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から１５分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析することにより、ＩＣ５０を算出した（図４参照）。
【００６３】
実施例Ａ４  （薬物代謝酵素がＣＹＰ１Ａ２である場合における本発明検定方法（第三工程その２：Ｋｉ値測定））
薬物代謝酵素の濃度及び所定の反応時間として表６及び表７記載のものを用いた。
０．５ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のアセトニトリルを含む反応液に、各種濃度のフラフィリン（被験物質）を５μＬ添加した後（終濃度：０、１、３、５、１０μｍｏｌ／Ｌに相当する）、さらに当該混合物に各種濃度のフェナセチン（指標基質）を５μＬ添加した（終濃度：２５、５０、１００μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から１５分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析することにより、Ｋｉ値を算出した（図５参照）。
【００６４】
実施例Ａ５  （薬物代謝酵素がＣＹＰ１Ａ２である場合における本発明検定方法（第四工程））
後述の「実施例８」に記載する。
【００６５】
実施例Ａ６  （薬物代謝酵素がＣＹＰ１Ａ２である場合における本発明検定方法（第五工程））
後述の「実施例９」に記載する。
【００６６】
実施例Ａ７  （薬物代謝酵素がＣＹＰ１Ａ２である場合における本発明検定方法（その他）：ＭＢＩの確認）
０．５ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のアセトニトリルを含む反応液に、各種濃度のフラフィリン（被験物質）を５μＬ添加した（終濃度：０、１、３、５、１０μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で５分間プレウォーミングした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、プレインキュベーションを開始した。反応開始から０分間、１０分間、３０分間経過した後、フェナセチン（指標基質）を５μＬ（終濃度：５０μｍｏｌ／Ｌ）添加することにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から１５分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させた。
その結果、プレインキュベーション時間に依存した代謝反応阻害の増強が認められることから、Mechanism-based-inhibition（即ち、ＭＢＩ）が起こっていることが確認された（図６及び図７参照）。
【００６７】
実施例Ｂ１  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ａ６である場合における本発明検定方法（第一工程））
薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ａ６であることから、表１記載の如く、前記指標基質としてクマリン（Coumarin）を選択した。因みに、当該選択により、表２記載の如く、酵素反応はクマリン ７−ヒドロキシレーション（Coumarin 7-hydroxylation）に決定され、また前記指標基質の代謝体は７−ヒドロキシクマリン（7-hydroxycoumarin）に決定された。
【００６８】
次いで、前記酵素と前記指標基質とを溶解するのに適する溶媒を含む反応液における前記指標基質の濃度が、前記酵素による前記指標基質の代謝体を所定時間内に生成させるのに適する濃度となるような環境を与えることができる候補反応液が下記の手順に従い選択された。
【００６９】
（ａ）まず当該前記酵素と前記指標基質とを溶解するのに適する溶媒として、表３記載の如く、DMSO若しくはMeOHのいずれかを選択できるが、ここではMeOHを仮に選択する。
（ｂ）次いで、選択されたMeOHを含む反応液における前記指標基質の濃度を、前記酵素による前記指標基質の代謝体を所定時間内に生成させるのに適するように決定するために、代謝反応に係る時間の検討及びＫｍ値の測定（具体的には、Ｋｍ値×１／８を最低濃度とし、Ｋｍ×２を最高濃度とした、合計で６点の前記指標基質の濃度での検討）を下記のように実施した。そして「第四工程により測定された生成量に基づき算出された前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力に係る指標値」がＩＣ５０である場合には、表４記載の如く、前記濃度をＫｍ値付近の一点（反応液中の終濃度：２μｍｏｌ／Ｌ）を前記指標基質の濃度として決定した。一方、「第四工程により測定された生成量に基づき算出された前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力に係る指標値」がＫｉ値である場合には、前記濃度をＫｍ×１／２、Ｋｍ、Ｋｍ×２の３点に決定した（表４参照）。
【００７０】
＜代謝反応に係る時間の検討＞
０．０５ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のメタノールを含む反応液に、４００μｍｏｌ／Ｌのクマリン（指標基質）を５μＬ添加した（終濃度：２μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から５分間、１０分間、１５分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノール／エタノール＝９／１を添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析した。
このようにして、表７記載の如く、所定の反応時間（即ち、表６記載の薬物代謝酵素の濃度における接触時間）は５分間に決定した。
【００７１】
＜Ｋｍ値の測定＞
０．０５ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のメタノールを含む反応液に、各種濃度のクマリン（指標基質）を５μＬ添加した（終濃度：０．５、１、２、４、６μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から５分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノール／エタノール＝９／１を添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析した。
このようにして、表１４記載の如く、Ｋｍ値は０．８５８であることが明らかにされた。
【００７２】
そして、このようにして前記指標基質の濃度を決定することが可能であることを確認することにより、所望の環境を与えることができる候補反応液として、前記溶媒（即ち、MeOH）を含む反応液を選択した。
【００７３】
実施例Ｂ２  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ａ６である場合における本発明検定方法（第二工程））
被験物質としてトラニルシプロミン（tranylcypromine）を用いた。
実施例１で選択された溶媒（即ち、MeOH）が、当該被験物質（即ち、トラニルシプロミン）と前記指標基質（即ち、クマリン）とを溶解するのに適する溶媒であることを確認することにより、実施例１で選択された候補反応液が、記指標基質と前記被験物質とを溶解するのに適する溶媒を含む反応液であるとして選択した。
【００７４】
実施例Ｂ３  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ａ６である場合における本発明検定方法（第三工程その１：ＩＣ５０測定））
薬物代謝酵素の濃度及び所定の反応時間として表６及び表７記載のものを用いた。
０．０５ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のメタノールを含む反応液に、各種濃度のトラニルシプロミン（被験物質）を５μＬ添加した後（終濃度：０、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３μｍｏｌ／Ｌに相当する）、さらに当該混合物に１０ｍｍｏｌ／Ｌのクマリン（指標基質）を５μＬ添加した（終濃度：２μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から５分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノール／エタノール＝９／１を添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析することにより、ＩＣ５０を算出した。
【００７５】
実施例Ｂ４  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ａ６である場合における本発明検定方法（第三工程その２：Ｋｉ値測定））
薬物代謝酵素の濃度及び所定の反応時間として表６及び表７記載のものを用いた。
０．０５ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のメタノールを含む反応液に、各種濃度のトラニルシプロミン（被験物質）を５μＬ添加した後（終濃度：０、０．０５、０．１、０．２、０．４μｍｏｌ／Ｌに相当する）、さらに当該混合物にクマリン（指標基質）を５μＬ添加した（終濃度：２μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から５分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノール／エタノール＝９／１を添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析することにより、Ｋｉ値を算出した。
【００７６】
実施例Ｂ５  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ａ６である場合における本発明検定方法（第四工程））
後述の「実施例８」に記載する。
【００７７】
実施例Ｂ６  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ａ６である場合における本発明検定方法（第五工程））
後述の「実施例９」に記載する。
【００７８】
実施例Ｂ７  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ａ６である場合における本発明検定方法（その他）：ＭＢＩの確認）
０．０５ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のメタノールを含む反応液に、各種濃度のトラニルシプロミン（被験物質）を５μＬ添加する（終濃度：０、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で５分間プレウォーミングした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、プレインキュベーションを開始する。反応開始から０分間、１０分間、３０分間経過した後、クマリン（指標物質）を５μＬ（終濃度：２μｍｏｌ／Ｌに相当する）添加することにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始する。反応開始から５分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノール／エタノール＝９／１を添加することにより当該代謝反応を停止させる。
その結果、プレインキュベーション時間に依存した代謝反応阻害の増強が認められれば、Mechanism-based-inhibition（即ち、ＭＢＩ）が起こっていることを確認することができる。
【００７９】
実施例Ｃ１  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｂ６である場合における本発明検定方法（第一工程））
薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｂ６であることから、表１記載の如く、前記指標基質としてブプロピオン（bupropion）を選択した。因みに、当該選択により、表２記載の如く、酵素反応はブプロピオン  ヒドロキシレーション（Bupropion hydroxylation）に決定され、また前記指標基質の代謝体はヒドロキシブプロピオン（hydroxybupropion）に決定された。
【００８０】
次いで、前記酵素と前記指標基質とを溶解するのに適する溶媒を含む反応液における前記指標基質の濃度が、前記酵素による前記指標基質の代謝体を所定時間内に生成させるのに適する濃度となるような環境を与えることができる候補反応液が下記の手順に従い選択された。
【００８１】
（ａ）まず当該前記酵素と前記指標基質とを溶解するのに適する溶媒として、表３記載の如く、MeOH、acetone若しくはDMSOのいずれかを選択できるが、ここではMeOHを仮に選択する。
（ｂ）次いで、選択されたMeOHを含む反応液における前記指標基質の濃度を、前記酵素による前記指標基質の代謝体を所定時間内に生成させるのに適するように決定するために、代謝反応に係る時間の検討及びＫｍ値の測定（具体的には、Ｋｍ値×１／８を最低濃度とし、Ｋｍ×２を最高濃度とした、合計で６点の前記指標基質の濃度での検討）を下記のように実施した。そして「第四工程により測定された生成量に基づき算出された前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力に係る指標値」がＩＣ５０である場合には、表４記載の如く、前記濃度をＫｍ値付近の一点（反応液中の終濃度：８０μｍｏｌ／Ｌ）を前記指標基質の濃度として決定した。一方、「第四工程により測定された生成量に基づき算出された前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力に係る指標値」がＫｉ値である場合には、前記濃度をＫｍ×１／２、Ｋｍ、Ｋｍ×２の３点に決定した（表４参照）。
【００８２】
＜代謝反応に係る時間の検討＞
０．５ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のメタノールを含む反応液に、１６０００μｍｏｌ／Ｌのブプロピオン（指標基質）を５μＬ添加した（終濃度：８０μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から１０分間、２０分間、３０分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析した。
このようにして、表７記載の如く、所定の反応時間（即ち、表６記載の薬物代謝酵素の濃度における接触時間）は２０分間に決定した。
【００８３】
＜Ｋｍ値の測定＞
０．５ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のメタノールを含む反応液に、各種濃度のブプロピオン（指標基質）を５μＬ添加した（終濃度：２０、４０、８０、１６０、２４０μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から２０分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析した。
このようにして、表１４記載の如く、Ｋｍ値は１１２であることが明らかにされた。
【００８４】
そして、このようにして前記指標基質の濃度を決定することが可能であることを確認することにより、所望の環境を与えることができる候補反応液として、前記溶媒（即ち、MeOH）を含む反応液を選択した。
【００８５】
実施例Ｃ２  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｂ６である場合における本発明検定方法（第二工程））
被験物質としてチオ−ＴＥＰＡ（thio-TEPA）を用いた。
実施例１で選択された溶媒（即ち、MeOH）が、当該被験物質（即ち、チオ−ＴＥＰＡ）と前記指標基質（即ち、ブプロピオン）とを溶解するのに適する溶媒であることを確認することにより、実施例１で選択された候補反応液が、記指標基質と前記被験物質とを溶解するのに適する溶媒を含む反応液であるとして選択した。
【００８６】
実施例Ｃ３  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｂ６である場合における本発明検定方法（第三工程その１：ＩＣ５０測定））
薬物代謝酵素の濃度及び所定の反応時間として表６及び表７記載のものを用いた。
０．５ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のメタノールを含む反応液に、各種濃度のチオ−ＴＥＰＡ（被験物質）を５μＬ添加した後（終濃度：０、０．１、０．３、１、３、１０、１００μｍｏｌ／Ｌに相当する）、さらに当該混合物に５μＬのブプロピオン（指標基質）を５μＬ添加した（終濃度：８０μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から２０分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析することにより、ＩＣ５０を算出した。
【００８７】
実施例Ｃ４  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｂ６である場合における本発明検定方法（第三工程その２：Ｋｉ値測定））
薬物代謝酵素の濃度及び所定の反応時間として表６及び表７記載のものを用いた。
０．５ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のメタノールを含む反応液に、各種濃度のチオ−ＴＥＰＡ（被験物質）を５μＬ添加した後（終濃度：０、０．１、０．３、１、３、１０、１００μｍｏｌ／Ｌに相当する）、さらに当該混合物にブプロピオン（指標基質）を５μＬ添加した（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から２０分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析することにより、Ｋｉ値を算出した。
【００８８】
実施例Ｃ５  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｂ６である場合における本発明検定方法（第四工程））
後述の「実施例８」に記載する。
【００８９】
実施例Ｃ６  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｂ６である場合における本発明検定方法（第五工程））
後述の「実施例９」に記載する。
【００９０】
実施例Ｃ７  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｂ６である場合における本発明検定方法（その他）：ＭＢＩの確認）
０．５ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のメタノールを含む反応液に、各種濃度のチオ−ＴＥＰＡ（被験物質）を５μＬ添加する（終濃度：０、２、５、１０、２０μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で５分間プレウォーミングした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、プレインキュベーションを開始する。反応開始から０分間、１０分間、３０分間経過した後、ブプロピオン（指標物質）を５μＬ（終濃度：８０μｍｏｌ／Ｌに相当する）添加することにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始する。反応開始から２０分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させる。
その結果、プレインキュベーション時間に依存した代謝反応阻害の増強が認められれば、Mechanism-based-inhibition（即ち、ＭＢＩ）が起こっていることを確認することができる。
【００９１】
実施例Ｄ１  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｃ８である場合における本発明検定方法（第一工程））
薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｃ８であることから、表１記載の如く、前記指標基質としてパクリタキセル（paclitaxel）を選択した。因みに、当該選択により、表２記載の如く、酵素反応はパクリタキセル  ヒドロキシレーション（Paclitaxel hydroxylation）に決定され、また前記指標基質の代謝体は６α−ヒドロキシパクリタキセル（6α-hydroxypaclitaxel）に決定された。
【００９２】
次いで、前記酵素と前記指標基質とを溶解するのに適する溶媒を含む反応液における前記指標基質の濃度が、前記酵素による前記指標基質の代謝体を所定時間内に生成させるのに適する濃度となるような環境を与えることができる候補反応液が下記の手順に従い選択された。
【００９３】
（ａ）まず当該前記酵素と前記指標基質とを溶解するのに適する溶媒として、表３記載の如く、MeCN、MeOH、EtOH若しくはacetoneのいずれかを選択できるが、ここではEtOHを仮に選択する。
（ｂ）次いで、選択されたEtOHを含む反応液における前記指標基質の濃度を、前記酵素による前記指標基質の代謝体を所定時間内に生成させるのに適するように決定するために、代謝反応に係る時間の検討及びＫｍ値の測定（具体的には、Ｋｍ値×１／８を最低濃度とし、Ｋｍ×２を最高濃度とした、合計で６点の前記指標基質の濃度での検討）を下記のように実施した。そして「第四工程により測定された生成量に基づき算出された前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力に係る指標値」がＩＣ５０である場合には、表４記載の如く、前記濃度をＫｍ値付近の一点（反応液中の終濃度：１０μｍｏｌ／Ｌ）を前記指標基質の濃度として決定した。一方、「第四工程により測定された生成量に基づき算出された前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力に係る指標値」がＫｉ値である場合には、前記濃度をＫｍ×１／２、Ｋｍ、Ｋｍ×２の３点に決定した（表４参照）。
【００９４】
＜代謝反応に係る時間の検討＞
０．５ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のエタノールを含む反応液に、３０００μｍｏｌ／Ｌのパクリタキセル（指標基質）を５μＬ添加した（終濃度：１０μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から１０分間、１５分間、２０分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析した。
このようにして、表７記載の如く、所定の反応時間（即ち、表６記載の薬物代謝酵素の濃度における接触時間）は１５分間に決定した。
【００９５】
＜Ｋｍ値の測定＞
０．５ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のエタノールを含む反応液に、各種濃度のパクリタキセル（指標基質）を５μＬ添加した（終濃度：１．２５、２．５、５、１０、２０μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から１５分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析した。
このようにして、表１４記載の如く、Ｋｍ値は３７であることが明らかにされた。
【００９６】
そして、このようにして前記指標基質の濃度を決定することが可能であることを確認することにより、所望の環境を与えることができる候補反応液として、前記溶媒（即ち、EtOH）を含む反応液を選択した。
【００９７】
実施例Ｄ２  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｃ８である場合における本発明検定方法（第二工程））
被験物質としてケルセチン（quercetin）を用いた。
実施例１で選択された溶媒（MeOH）が、当該被験物質（即ち、ケルセチン）と前記指標基質（即ち、パクリタキセル）とを溶解するのに適する溶媒であることを確認することにより、実施例１で選択された候補反応液が、記指標基質と前記被験物質とを溶解するのに適する溶媒を含む反応液であるとして選択した。
【００９８】
実施例Ｄ３  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｃ８である場合における本発明検定方法（第三工程その１：ＩＣ５０測定））
薬物代謝酵素の濃度及び所定の反応時間として表６及び表７記載のものを用いた。
０．５ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のエタノールを含む反応液に、各種濃度のケルセチン（被験物質）を５μＬ添加した後（終濃度：１．２５、２．５、５、１０、２０μｍｏｌ／Ｌに相当する）、さらに当該混合物に５μＬのパクリタキセル（指標基質）を５μＬ添加した（終濃度：１０μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から１５分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析することにより、ＩＣ５０を算出した。
【００９９】
実施例Ｄ４  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｃ８である場合における本発明検定方法（第三工程その２：Ｋｉ値測定））
薬物代謝酵素の濃度及び所定の反応時間として表６及び表７記載のものを用いた。
０．５ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のエタノールを含む反応液に、各種濃度のケルセチン（被験物質）を５μＬ添加した後（終濃度：１．２５、２．５、５、１０、２０μｍｏｌ／Ｌに相当する）、さらに当該混合物にパクリタキセル（指標基質）を５μＬ添加した（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から１５分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析することにより、Ｋｉ値を算出した。
【０１００】
実施例Ｄ５  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｃ８である場合における本発明検定方法（第四工程））
後述の「実施例８」に記載する。
【０１０１】
実施例Ｄ６  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｃ８である場合における本発明検定方法（第五工程））
後述の「実施例９」に記載する。
【０１０２】
実施例Ｄ７  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｃ８である場合における本発明検定方法（その他）：ＭＢＩの確認）
０．５ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のエタノールを含む反応液に、各種濃度のケルセチン（被験物質）を５μＬ添加する（終濃度：１．２５、２．５、５、１０、２０μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で５分間プレウォーミングした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、プレインキュベーションを開始する。反応開始から０分間、１０分間、３０分間経過した後、パクリタキセル（指標物質）を５μＬ（終濃度：１０μｍｏｌ／Ｌに相当する）添加することにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始する。反応開始から１５分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させる。
その結果、プレインキュベーション時間に依存した代謝反応阻害の増強が認められれば、Mechanism-based-inhibition（即ち、ＭＢＩ）が起こっていることを確認することができる。
【０１０３】
実施例Ｅ１  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｃ９である場合における本発明検定方法（第一工程））
薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｃ９であることから、表１記載の如く、前記指標基質としてジクロフェナク（Diclofenac）を選択した。因みに、当該選択により、表２記載の如く、酵素反応はジクロフェナク  ヒドロキシレーション（Diclofenac hydroxylation）に決定され、また前記指標基質の代謝体は４’−ヒドロキシジクロフェナク（4'-hydroxydiclofenac）に決定された。
【０１０４】
次いで、前記酵素と前記指標基質とを溶解するのに適する溶媒を含む反応液における前記指標基質の濃度が、前記酵素による前記指標基質の代謝体を所定時間内に生成させるのに適する濃度となるような環境を与えることができる候補反応液が下記の手順に従い選択された。
【０１０５】
（ａ）まず当該前記酵素と前記指標基質とを溶解するのに適する溶媒として、表３記載の如く、MeOH、EtOH、acetone若しくはDMSOのいずれかを選択できるが、ここではDMSOを仮に選択する。
（ｂ）次いで、選択されたDMSOを含む反応液における前記指標基質の濃度を、前記酵素による前記指標基質の代謝体を所定時間内に生成させるのに適するように決定するために、代謝反応に係る時間の検討及びＫｍ値の測定（具体的には、Ｋｍ値×１／８を最低濃度とし、Ｋｍ×２を最高濃度とした、合計で６点の前記指標基質の濃度での検討）等に基づき下記のように実施した。そして「第四工程により測定された生成量に基づき算出された前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力に係る指標値」がＩＣ５０である場合には、表４記載の如く、前記濃度をＫｍ値付近の一点（反応液中の終濃度：４μｍｏｌ／Ｌ）を前記指標基質の濃度として決定した。一方、「第四工程により測定された生成量に基づき算出された前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力に係る指標値」がＫｉ値である場合には、前記濃度をＫｍ×１／２、Ｋｍ、Ｋｍ×２の３点に決定した（表４参照）。
【０１０６】
＜代謝反応に係る時間の検討＞
０．１ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び１（ｖ／ｖ）％のＤＭＳＯを含む反応液に、４００μｍｏｌ／Ｌのジクロフェナク（指標基質）を５μＬ添加した（終濃度：４μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から５分間、１０分間、１５分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析した。
このようにして、表７記載の如く、所定の反応時間（即ち、表６記載の薬物代謝酵素の濃度における接触時間）は１０分間に決定した。
【０１０７】
＜Ｋｍ値の測定＞
０．１ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び１（ｖ／ｖ）％のＤＭＳＯを含む反応液に、各種濃度のジクロフェナク（指標基質）を５μＬ添加した（終濃度：１、２、４、８、１２μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から１０分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析した。
このようにして、表１４記載の如く、Ｋｍ値は１６．４であることが明らかにされた。
【０１０８】
そして、このようにして前記指標基質の濃度を決定することが可能であることを確認することにより、所望の環境を与えることができる候補反応液として、前記溶媒を含む反応液を選択した。
【０１０９】
実施例Ｅ２  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｃ９である場合における本発明検定方法（第二工程））
被験物質としてスルファフェナゾール（sulfaphenazole）を用いた。
実施例１で選択された溶媒（DMSO）が、当該被験物質（即ち、スルファフェナゾール）と前記指標基質（即ち、ジクロフェナク）とを溶解するのに適する溶媒であることを確認することにより、実施例１で選択された候補反応液が、記指標基質と前記被験物質とを溶解するのに適する溶媒を含む反応液であるとして選択した。
【０１１０】
実施例Ｅ３  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｃ９である場合における本発明検定方法（第三工程その１：ＩＣ５０測定））
薬物代謝酵素の濃度及び所定の反応時間として表６及び表７記載のものを用いた。
０．１ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び１（ｖ／ｖ）％のＤＭＳＯを含む反応液に、各種濃度のスルファフェナゾール（被験物質）を５μＬ添加した後（終濃度：１．２５、２．５、５、１０、２０μｍｏｌ／Ｌに相当する）、さらに当該混合物に５μＬのジクロフェナク（指標基質）を５μＬ添加した（終濃度：４μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から１０分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析することにより、ＩＣ５０を算出した。
【０１１１】
実施例Ｅ４  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｃ９である場合における本発明検定方法（第三工程その２：Ｋｉ値測定））
薬物代謝酵素の濃度及び所定の反応時間として表６及び表７記載のものを用いた。
０．１ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び１（ｖ／ｖ）％のＤＭＳＯを含む反応液に、各種濃度のスルファフェナゾール（被験物質）を５μＬ添加した後（終濃度：１．２５、２．５、５、１０、２０μｍｏｌ／Ｌに相当する）、さらに当該混合物にジクロフェナク（指標基質）を５μＬ添加した（終濃度：４μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から１０分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析することにより、Ｋｉ値を算出した。
【０１１２】
実施例Ｅ５  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｃ９である場合における本発明検定方法（第四工程））
後述の「実施例８」に記載する。
【０１１３】
実施例Ｅ６  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｃ９である場合における本発明検定方法（第五工程））
後述の「実施例９」に記載する。
【０１１４】
実施例Ｅ７  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｃ９である場合における本発明検定方法（その他）：ＭＢＩの確認）
０．１ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び１（ｖ／ｖ）％のＤＭＳＯを含む反応液に、各種濃度のスルファフェナゾール（被験物質）を５μＬ添加する（終濃度：１．２５、２．５、５、１０、２０μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で５分間プレウォーミングした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、プレインキュベーションを開始する。反応開始から０分間、１０分間、３０分間経過した後、ジクロフェナク（指標物質）を５μＬ（終濃度：４μｍｏｌ／Ｌに相当する）添加することにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始する。反応開始から１０分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させる。
その結果、プレインキュベーション時間に依存した代謝反応阻害の増強が認められれば、Mechanism-based-inhibition（即ち、ＭＢＩ）が起こっていることを確認することができる。
【０１１５】
実施例Ｆ１  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｃ１９である場合における本発明検定方法（第一工程））
薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｃ１９であることから、表１記載の如く、前記指標基質として(S)-メフェニトイン（(S)-mephenytoin）を選択した。因みに、当該選択により、表２記載の如く、酵素反応は４’−ヒロドキシメフェニトイン（4'-hydroxymephenytoin）に決定され、また前記指標基質の代謝体は（Ｓ）−（＋）−Ｎ−３−ベンジルニルバノール（(S)-(+)-N-3-benzyl-nirvanol）に決定された。
【０１１６】
次いで、前記酵素と前記指標基質とを溶解するのに適する溶媒を含む反応液における前記指標基質の濃度が、前記酵素による前記指標基質の代謝体を所定時間内に生成させるのに適する濃度となるような環境を与えることができる候補反応液が下記の手順に従い選択された。
【０１１７】
（ａ）まず当該前記酵素と前記指標基質とを溶解するのに適する溶媒を、表３記載の如く、MeCN若しくはMeOHのいずれかを選択できるが、ここではMeOHを仮に選択する。
（ｂ）次いで、選択されたMeOHを含む反応液における前記指標基質の濃度を、前記酵素による前記指標基質の代謝体を所定時間内に生成させるのに適するように決定するために、代謝反応に係る時間の検討及びＫｍ値の測定（具体的には、Ｋｍ値×１／８を最低濃度とし、Ｋｍ×２を最高濃度とした、合計で６点の前記指標基質の濃度での検討）を下記のように実施した。そして「第四工程により測定された生成量に基づき算出された前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力に係る指標値」がＩＣ５０である場合には、表４記載の如く、前記濃度をＫｍ値付近の一点（反応液中の終濃度：１００μｍｏｌ／Ｌ）を前記指標基質の濃度として決定した。一方、「第四工程により測定された生成量に基づき算出された前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力に係る指標値」がＫｉ値である場合には、前記濃度をＫｍ×１／２、Ｋｍ、Ｋｍ×２の３点に決定した（表４参照）。
【０１１８】
＜代謝反応に係る時間の検討＞
１ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のメタノールを含む反応液に、２００００μｍｏｌ／Ｌの(S)-メフェニトイン（指標基質）を５μＬ添加した（終濃度：１００μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から５０分間、６０分間、７０分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析した。
このようにして、表７記載の如く、所定の反応時間（即ち、表６記載の薬物代謝酵素の濃度における接触時間）は６０分間に決定された。
【０１１９】
＜Ｋｍ値の測定＞
１ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のメタノールを含む反応液に、各種濃度の(S)-メフェニトイン（指標基質）を５μＬ添加した（終濃度：１２．５、２５、５０、１００、２００μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から６０分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析した。
このようにして、表１４記載の如く、Ｋｍ値は５１．８であることが明らかにされた。
【０１２０】
そして、このようにして前記指標基質の濃度を決定することが可能であることを確認することにより、所望の環境を与えることができる候補反応液として、前記溶媒（即ち、MeCN）を含む反応液を選択した。
【０１２１】
実施例Ｆ２  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｃ１９である場合における本発明検定方法（第二工程））
被験物質として（Ｓ）−（＋）−Ｎ−３−ベンジルニルバノール（(S)-(+)-N-3-benzyl-nirvanol）を用いた。
実施例１で選択された溶媒（即ち、MeOH）が、当該被験物質（即ち、（Ｓ）−（＋）−Ｎ−３−ベンジルニルバノール）と前記指標基質（即ち、(S)-メフェニトイン）とを溶解するのに適する溶媒であることを確認することにより、実施例１で選択された候補反応液が、記指標基質と前記被験物質とを溶解するのに適する溶媒を含む反応液であるとして選択した。
【０１２２】
実施例Ｆ３  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｃ１９である場合における本発明検定方法（第三工程その１：ＩＣ５０測定））
薬物代謝酵素の濃度及び所定の反応時間として表６及び表７記載のものを用いた。
１ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のメタノールを含む反応液に、各種濃度の（Ｓ）−（＋）−Ｎ−３−ベンジルニルバノール（被験物質）を５μＬ添加した後（終濃度：１２．５、２５、５０、１００、２００μｍｏｌ／Ｌに相当する）、さらに当該混合物に５μＬの(S)-メフェニトイン（指標基質）を５μＬ添加した（終濃度：１００μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から６０分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析することにより、ＩＣ５０を算出した。
【０１２３】
実施例Ｆ４  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｃ１９である場合における本発明検定方法（第三工程その２：Ｋｉ値測定））
薬物代謝酵素の濃度及び所定の反応時間として表６及び表７記載のものを用いた。
１ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のメタノールを含む反応液に、各種濃度の（Ｓ）−（＋）−Ｎ−３−ベンジルニルバノール（被験物質）を５μＬ添加した後（終濃度：１２．５、２５、５０、１００、２００μｍｏｌ／Ｌに相当する）、さらに当該混合物に(S)-メフェニトイン（指標基質）を５μＬ添加した（終濃度：１００μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から６０分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析することにより、Ｋｉ値を算出した。
【０１２４】
実施例Ｆ５  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｃ１９である場合における本発明検定方法（第四工程））
後述の「実施例８」に記載する。
【０１２５】
実施例Ｆ６  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｃ１９である場合における本発明検定方法（第五工程））
後述の「実施例９」に記載する。
【０１２６】
実施例Ｆ７  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｃ１９である場合における本発明検定方法（その他）：ＭＢＩの確認）
１ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のメタノールを含む反応液に、各種濃度の（Ｓ）−（＋）−Ｎ−３−ベンジルニルバノール（被験物質）を５μＬ添加する（終濃度：０、０．４、０．８、１、２μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で５分間プレウォーミングした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、プレインキュベーションを開始する。反応開始から０分間、１０分間、３０分間経過した後、(S)-メフェニトイン（指標基質）を５μＬ（終濃度：１００μｍｏｌ／Ｌに相当する）添加することにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始する。反応開始から６０分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させる。
その結果、プレインキュベーション時間に依存した代謝反応阻害の増強が認められれば、Mechanism-based-inhibition（即ち、ＭＢＩ）が起こっていることを確認することができる。
【０１２７】
実施例Ｇ１  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｄ６である場合における本発明検定方法（第一工程））
薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｄ６であることから、表１記載の如く、前記指標基質としてブフラロール（bufuralol）を選択した。因みに、当該選択により、表２記載の如く、酵素反応はブフラロール  ヒドロキシレーション（Bufuralol hydroxylation）に決定され、また前記指標基質の代謝体は１’−ヒドロキシブフラロール（1'-hydroxybufuralol）に決定された。
【０１２８】
次いで、前記酵素と前記指標基質とを溶解するのに適する溶媒を含む反応液における前記指標基質の濃度が、前記酵素による前記指標基質の代謝体を所定時間内に生成させるのに適する濃度となるような環境を与えることができる候補反応液が下記の手順に従い選択された。
【０１２９】
（ａ）まず当該前記酵素と前記指標基質とを溶解するのに適する溶媒として、表３記載の如く、MeCNを選択でき、ここではMeCNを仮に選択する。
（ｂ）次いで、選択されたMeCNを含む反応液における前記指標基質の濃度を、前記酵素による前記指標基質の代謝体を所定時間内に生成させるのに適するように決定するために、代謝反応に係る時間の検討及びＫｍ値の測定（具体的には、Ｋｍ値×１／８を最低濃度とし、Ｋｍ×２を最高濃度とした、合計で６点の前記指標基質の濃度での検討）を下記のように実施した。そして「第四工程により測定された生成量に基づき算出された前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力に係る指標値」がＩＣ５０である場合には、表４記載の如く、前記濃度をＫｍ値付近の一点（反応液中の終濃度：２０μｍｏｌ／Ｌ）を前記指標基質の濃度として決定した。一方、「第四工程により測定された生成量に基づき算出された前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力に係る指標値」がＫｉ値である場合には、前記濃度をＫｍ×１／２、Ｋｍ、Ｋｍ×２の３点に決定した（表４参照）。
【０１３０】
＜代謝反応に係る時間の検討＞
０．４ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のアセトニトリルを含む反応液に、２０００μｍｏｌ／Ｌのブフラロール（指標基質）を１０μＬ添加した（終濃度：２０μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から２０分間、３０分間、４０分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析した。
このようにして、表７記載の如く、所定の反応時間（即ち、表６記載の薬物代謝酵素の濃度における接触時間）は３０分間に決定した。
【０１３１】
＜Ｋｍ値の測定＞
０．４ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のアセトニトリルを含む反応液に、各種濃度のブフラロール（指標基質）を１０μＬ添加した（終濃度：５、１０、２０、４０、６０μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から３０分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析した。
このようにして、表１４記載の如く、Ｋｍ値は１５．５であることが明らかにされた。
【０１３２】
そして、このようにして前記指標基質の濃度を決定することが可能であることを確認することにより、所望の環境を与えることができる候補反応液として、前記溶媒を含む反応液を選択した。
【０１３３】
実施例Ｇ２  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｄ６である場合における本発明検定方法（第二工程））
被験物質としてキニジン（quinidine）を用いた。
実施例１で選択された溶媒（即ち、MeCN）が、当該被験物質（即ち、キニジン）と前記指標基質（即ち、ブフラロール）とを溶解するのに適する溶媒であることを確認することにより、実施例１で選択された候補反応液が、記指標基質と前記被験物質とを溶解するのに適する溶媒を含む反応液であるとして選択した。
【０１３４】
実施例Ｇ３  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｄ６である場合における本発明検定方法（第三工程その１：ＩＣ５０測定））
薬物代謝酵素の濃度及び所定の反応時間として表６及び表７記載のものを用いた。
０．４ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のアセトニトリルを含む反応液に、各種濃度のキニジン（被験物質）を５μＬ添加した後（終濃度：０、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１μｍｏｌ／Ｌに相当する）、さらに当該混合物に２０００μｍｏｌ／Ｌのブフラロール（指標基質）を１０μＬ添加した（終濃度：２０μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から３０分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析することにより、ＩＣ５０を算出した。
【０１３５】
実施例Ｇ４  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｄ６である場合における本発明検定方法（第三工程その２：Ｋｉ値測定））
薬物代謝酵素の濃度及び所定の反応時間として表６及び表７記載のものを用いた。
０．４ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のアセトニトリルを含む反応液に、各種濃度のキニジン（被験物質）を５μＬ添加した後（終濃度：０、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１μｍｏｌ／Ｌに相当する）、さらに当該混合物に２０００μｍｏｌ／Ｌのブフラロール（指標基質）を１０μＬ添加した（終濃度：２０μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から３０分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析することにより、Ｋｉ値を算出した。
【０１３６】
実施例Ｇ５  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｄ６である場合における本発明検定方法（第四工程））
後述の「実施例８」に記載する。
【０１３７】
実施例Ｇ６  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｄ６である場合における本発明検定方法（第五工程））
後述の「実施例９」に記載する。
【０１３８】
実施例Ｇ７  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｄ６である場合における本発明検定方法（その他）：ＭＢＩの確認）
０．４ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のアセトニトリルを含む反応液に、各種濃度のキニジン（被験物質）を５μＬ添加する（終濃度：０、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で５分間プレウォーミングした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、プレインキュベーションを開始する。反応開始から０分間、１０分間、３０分間経過した後、２０００μｍｏｌ／Ｌのブフラロール（指標基質）を１０μＬ（終濃度：２０μｍｏｌ／Ｌ）添加することにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始する。反応開始から３０分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させる。
その結果、プレインキュベーション時間に依存した代謝反応阻害の増強が認められれば、Mechanism-based-inhibition（即ち、ＭＢＩ）が起こっていることを確認することができる。
【０１３９】
実施例Ｈ１  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｅ１である場合における本発明検定方法（第一工程））
薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｅ１であることから、表１記載の如く、前記指標基質としてクロロゾキサゾン（chlorozoxazone）を選択した。因みに、当該選択により、表２記載の如く、酵素反応はクロロゾキサゾン  ヒドロキシレーション（Chlorozoxazone hydroxylation）に決定され、また前記指標基質の代謝体は６−ヒロドキシクロロゾキサゾン（6-hydroxychlorzoxazone）に決定された。
【０１４０】
次いで、前記酵素と前記指標基質とを溶解するのに適する溶媒を含む反応液における前記指標基質の濃度が、前記酵素による前記指標基質の代謝体を所定時間内に生成させるのに適する濃度となるような環境を与えることができる候補反応液が下記の手順に従い選択された。
【０１４１】
（ａ）まず当該前記酵素と前記指標基質とを溶解するのに適する溶媒として、表３記載の如く、MeCNを選択できるが、ここではMeCNを仮に選択する。
（ｂ）次いで、選択されたMeCNを含む反応液における前記指標基質の濃度を、前記酵素による前記指標基質の代謝体を所定時間内に生成させるのに適するように決定するために、代謝反応に係る時間の検討及びＫｍ値の測定（具体的には、Ｋｍ値×１／８を最低濃度とし、Ｋｍ×２を最高濃度とした、合計で６点の前記指標基質の濃度での検討）を下記のように実施した。そして「第四工程により測定された生成量に基づき算出された前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力に係る指標値」がＩＣ５０である場合には、表４記載の如く、前記濃度をＫｍ値付近の一点（反応液中の終濃度：１００μｍｏｌ／Ｌ）を前記指標基質の濃度として決定した。一方、「第四工程により測定された生成量に基づき算出された前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力に係る指標値」がＫｉ値である場合には、前記濃度をＫｍ×１／２、Ｋｍ、Ｋｍ×２の３点に決定した（表４参照）。
【０１４２】
＜代謝反応に係る時間の検討＞
０．５ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のアセトニトリルを含む反応液に、２００００μｍｏｌ／Ｌのクロロゾキサゾン（指標基質）を５μＬ添加した（終濃度：１００μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から１０分間、１５分間、２０分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷アセトニトリルを添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析した。
このようにして、表７記載の如く、所定の反応時間（即ち、表６記載の薬物代謝酵素の濃度における接触時間）は１５分間に決定した。
【０１４３】
＜Ｋｍ値の測定＞
０．５ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のアセトニトリルを含む反応液に、各種濃度のクロロゾキサゾン（指標基質）を５μＬ添加した（終濃度：１２．５、２５、５０、１００、２００μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から１５分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷アセトニトリルを添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析した。
このようにして、表１４記載の如く、Ｋｍ値は１９２であることが明らかにされた。
【０１４４】
そして、このようにして前記指標基質の濃度を決定することが可能であることを確認することにより、所望の環境を与えることができる候補反応液として、前記溶媒（即ち、MeCN）を含む反応液を選択した。
【０１４５】
実施例Ｈ２  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｅ１である場合における本発明検定方法（第二工程））
被験物質としてジエチルジチオカルバメート（diethyldithiocarbamate）を用いた。
実施例１で選択された溶媒（即ち、MeCN）が、当該被験物質（即ち、ジエチルジチオカルバメート）と前記指標基質（即ち、クロロゾキサゾン）とを溶解するのに適する溶媒であることを確認することにより、実施例１で選択された候補反応液が、記指標基質と前記被験物質とを溶解するのに適する溶媒を含む反応液であるとして選択した。
【０１４６】
実施例Ｈ３  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｅ１である場合における本発明検定方法（第三工程その１：ＩＣ５０測定））
薬物代謝酵素の濃度及び所定の反応時間として表６及び表７記載のものを用いた。
０．５ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のアセトニトリルを含む反応液に、各種濃度のジエチルジチオカルバメート（被験物質）を５μＬ添加した後（終濃度：０、０．３、１、３、１０、３０、１００μｍｏｌ／Ｌに相当する）、さらに当該混合物に２００００μｍｏｌ／Ｌのクロロゾキサゾン（指標基質）を５μＬ添加した（終濃度：１００μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から１５分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷アセトニトリルを添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析することにより、ＩＣ５０を算出した。
【０１４７】
実施例Ｈ４  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｅ１である場合における本発明検定方法（第三工程その２：Ｋｉ値測定））
薬物代謝酵素の濃度及び所定の反応時間として表６及び表７記載のものを用いた。
０．５ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のアセトニトリルを含む反応液に、各種濃度のジエチルジチオカルバメート（被験物質）を５μＬ添加した後（終濃度：０、０．３、１、３、１０、３０、１００μｍｏｌ／Ｌに相当する）、さらに当該混合物に２００００μｍｏｌ／Ｌのクロロゾキサゾン（指標基質）を５μＬ添加した（終濃度：１００μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から１５分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷アセトニトリルを添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析することにより、Ｋｉ値を算出した。
【０１４８】
実施例Ｈ５  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｅ１である場合における本発明検定方法（第四工程））
後述の「実施例８」に記載する。
【０１４９】
実施例Ｈ６  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｅ１である場合における本発明検定方法（第五工程））
後述の「実施例９」に記載する。
【０１５０】
実施例Ｈ７  （薬物代謝酵素がＣＹＰ２Ｅ１である場合における本発明検定方法（その他）：ＭＢＩの確認）
０．５ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のアセトニトリルを含む反応液に、各種濃度のジエチルジチオカルバメート（被験物質）を５μＬ添加する（終濃度：０、０．３、１、３、１０、３０、１００μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で５分間プレウォーミングした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、プレインキュベーションを開始する。反応開始から０分間、１０分間、３０分間経過した後、２００００μｍｏｌ／Ｌのクロロゾキサゾン（指標基質）を５μＬ（終濃度：１００μｍｏｌ／Ｌに相当する）添加することにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始する。反応開始から１５分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷アセトニトリルを添加することにより当該代謝反応を停止させる。
その結果、プレインキュベーション時間に依存した代謝反応阻害の増強が認められれば、Mechanism-based-inhibition（即ち、ＭＢＩ）が起こっていることを確認することができる。
【０１５１】
実施例Ｉ１  （薬物代謝酵素がＣＹＰ３Ａ４（ＴＳ）である場合における本発明検定方法（第一工程））
薬物代謝酵素がＣＹＰ３Ａ４（ＴＳ）であることから、表１記載の如く、前記指標基質としてテストステロン（testosterone）を選択した。因みに、当該選択により、表２記載の如く、酵素反応はテストステロン  ヒドロキシレーション（testosterone hydroxylation）に決定され、また前記指標基質の代謝体は６β−ヒドロキシテストステロン（6β-hydroxytestosterone）に決定された。
【０１５２】
次いで、前記酵素と前記指標基質とを溶解するのに適する溶媒を含む反応液における前記指標基質の濃度が、前記酵素による前記指標基質の代謝体を所定時間内に生成させるのに適する濃度となるような環境を与えることができる候補反応液が下記の手順に従い選択された。
【０１５３】
（ａ）まず当該前記酵素と前記指標基質とを溶解するのに適する溶媒として、表３記載の如く、MeCN、MeOH若しくはEtOHのいずれかを選択できるが、ここではMeCNを仮に選択する。
（ｂ）次いで、選択されたMeCNを含む反応液における前記指標基質の濃度を、前記酵素による前記指標基質の代謝体を所定時間内に生成させるのに適するように決定するために、代謝反応に係る時間の検討及びＫｍ値の測定（具体的には、Ｋｍ値×１／８を最低濃度とし、Ｋｍ×２を最高濃度とした、合計で６点の前記指標基質の濃度での検討）を下記のように実施した。そして「第四工程により測定された生成量に基づき算出された前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力に係る指標値」がＩＣ５０である場合には、表４記載の如く、前記濃度をＫｍ値付近の一点（反応液中の終濃度：１５０μｍｏｌ／Ｌ）を前記指標基質の濃度として決定した。一方、「第四工程により測定された生成量に基づき算出された前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力に係る指標値」がＫｉ値である場合には、前記濃度をＫｍ×１／２、Ｋｍ、Ｋｍ×２の３点に決定した（表４参照）。
【０１５４】
＜代謝反応に係る時間の検討＞
０．１ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のアセトニトリルを含む反応液に、３００００μｍｏｌ／Ｌのテストステロン（指標基質）を５μＬ添加した（終濃度：１５０μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から１０分間、２０分間、３０分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析した。
このようにして、表７記載の如く、所定の反応時間（即ち、表６記載の薬物代謝酵素の濃度における接触時間）は２０分間に決定した。
【０１５５】
＜Ｋｍ値の測定＞
０．１ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のアセトニトリルを含む反応液に、各種濃度のテストステロン（指標基質）を５μＬ添加した（終濃度：２５、５０、１００、１５０、２００μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から２０分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析した。
このようにして、表１４記載の如く、Ｋｍ値は８９．９であることが明らかにされた。
【０１５６】
そして、このようにして前記指標基質の濃度を決定することが可能であることを確認することにより、所望の環境を与えることができる候補反応液として、前記溶媒（即ち、MeCN）を含む反応液を選択した。
【０１５７】
実施例Ｉ２  （薬物代謝酵素がＣＹＰ３Ａ４（ＴＳ）である場合における本発明検定方法（第二工程））
被験物質としてケトコナゾール（ketoconazole）を用いた。
実施例１で選択された溶媒（MeCN）が、当該被験物質（即ち、ケトコナゾール）と前記指標基質（即ち、テストステロン）とを溶解するのに適する溶媒であることを確認することにより、実施例１で選択された候補反応液が、記指標基質と前記被験物質とを溶解するのに適する溶媒を含む反応液であるとして選択した。
【０１５８】
実施例Ｉ３  （薬物代謝酵素がＣＹＰ３Ａ４（ＴＳ）である場合における本発明検定方法（第三工程その１：ＩＣ５０測定））
薬物代謝酵素の濃度及び所定の反応時間として表６及び表７記載のものを用いた。
０．１ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のアセトニトリルを含む反応液に、各種濃度のケトコナゾール（被験物質）を５μＬ添加した後（終濃度０、０．０２、０．０５、０．１、０．２μｍｏｌ／Ｌに相当する）、さらに当該混合物に３００００μｍｏｌ／Ｌのテストステロン（指標基質）を５μＬ添加した（終濃度：１５０μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から２０分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析することにより、ＩＣ５０を算出した。
【０１５９】
実施例Ｉ４  （薬物代謝酵素がＣＹＰ３Ａ４（ＴＳ）である場合における本発明検定方法（第三工程その２：Ｋｉ値測定））
薬物代謝酵素の濃度及び所定の反応時間として表６及び表７記載のものを用いた。
０．１ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のアセトニトリルを含む反応液に、各種濃度のケトコナゾール（被験物質）を５μＬ添加した後（終濃度０、０．０２、０．０５、０．１、０．２μｍｏｌ／Ｌに相当する）、さらに当該混合物に３００００μｍｏｌ／Ｌのテストステロン（指標基質）を５μＬ添加した（終濃度：１５０μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から２０分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析することにより、Ｋｉ値を算出した。
【０１６０】
実施例Ｉ５  （薬物代謝酵素がＣＹＰ３Ａ４（ＴＳ）である場合における本発明検定方法（第四工程））
後述の「実施例８」に記載する。
【０１６１】
実施例Ｉ６  （薬物代謝酵素がＣＹＰ３Ａ４（ＴＳ）である場合における本発明検定方法（第五工程））
後述の「実施例９」に記載する。
【０１６２】
実施例Ｉ７  （薬物代謝酵素がＣＹＰ３Ａ４（ＴＳ）である場合における本発明検定方法（その他）：ＭＢＩの確認）
０．１ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のアセトニトリルを含む反応液に、各種濃度のケトコナゾール（被験物質）を５μＬ添加する（終濃度０、０．０２、０．０５、０．１、０．２μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で５分間プレウォーミングした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、プレインキュベーションを開始する。反応開始から０分間、１０分間、３０分間経過した後、３００００μｍｏｌ／Ｌのテストステロン（指標基質）を５μＬ（終濃度：１５０μｍｏｌ／Ｌに相当する）添加することにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始する。反応開始から２０分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させる。
その結果、プレインキュベーション時間に依存した代謝反応阻害の増強が認められれば、Mechanism-based-inhibition（即ち、ＭＢＩ）が起こっていることを確認することができる。
【０１６３】
実施例Ｊ１  （薬物代謝酵素がＣＹＰ３Ａ４（ＭＤＺ）である場合における本発明検定方法（第一工程））
薬物代謝酵素がＣＹＰ３Ａ４（ＭＤＺ）であることから、表１記載の如く、前記指標基質としてミダゾラム（midazolam）を選択した。因みに、当該選択により、表２記載の如く、酵素反応はミダゾラム  ヒドロキシレーション（Midazolam hydroxylation）に決定され、また前記指標基質の代謝体は１’−ヒドロキシミダゾラム（1'-hydroxymidazolam）に決定された。
【０１６４】
次いで、前記酵素と前記指標基質とを溶解するのに適する溶媒を含む反応液における前記指標基質の濃度が、前記酵素による前記指標基質の代謝体を所定時間内に生成させるのに適する濃度となるような環境を与えることができる候補反応液が下記の手順に従い選択された。
【０１６５】
（ａ）まず当該前記酵素と前記指標基質とを溶解するのに適する溶媒として、表３記載の如く、MeCN、MeOH若しくはEtOHのいずれかを選択できるが、ここではMeCNを仮に選択する。
（ｂ）次いで、選択されたMeCNを含む反応液における前記指標基質の濃度を、前記酵素による前記指標基質の代謝体を所定時間内に生成させるのに適するように決定するために、代謝反応に係る時間の検討及びＫｍ値の測定（具体的には、Ｋｍ値×１／８を最低濃度とし、Ｋｍ×２を最高濃度とした、合計で６点の前記指標基質の濃度での検討）を下記のように実施した。そして「第四工程により測定された生成量に基づき算出された前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力に係る指標値」がＩＣ５０である場合には、表４記載の如く、前記濃度をＫｍ値付近の一点（反応液中の終濃度：４μｍｏｌ／Ｌ）を前記指標基質の濃度として決定した。一方、「第四工程により測定された生成量に基づき算出された前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力に係る指標値」がＫｉ値である場合には、前記濃度をＫｍ×１／２、Ｋｍ、Ｋｍ×２の３点に決定した（表４参照）。
【０１６６】
＜代謝反応に係る時間の検討＞
０．１ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のアセトニトリルを含む反応液に、８００μｍｏｌ／Ｌのミダゾラム（指標基質）を５μＬ添加した（終濃度：４μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から５分間、１０分間、１５分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析した。
このようにして、表７記載の如く、所定の反応時間（即ち、表６記載の薬物代謝酵素の濃度における接触時間）は５分間に決定した。
【０１６７】
＜Ｋｍ値の測定＞
０．１ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のアセトニトリルを含む反応液に、各種濃度のミダゾラム（指標基質）を５μＬ添加した（終濃度：１、２、４、８、１２μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から５分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析した。
このようにして、表１４記載の如く、Ｋｍ値は２．９９であることが明らかにされた。
【０１６８】
そして、このようにして前記指標基質の濃度を決定することが可能であることを確認することにより、所望の環境を与えることができる候補反応液として、前記溶媒（即ち、MeCN）を含む反応液を選択した。
【０１６９】
実施例Ｊ２  （薬物代謝酵素がＣＹＰ３Ａ４（ＭＤＺ）である場合における本発明検定方法（第二工程））
被験物質としてケトコナゾール（ketoconazole）を用いた。
実施例１で選択された溶媒（MeCN）が、当該被験物質（即ち、ケトコナゾール）と前記指標基質（即ち、ミダゾラム）とを溶解するのに適する溶媒であることを確認することにより、実施例１で選択された候補反応液が、記指標基質と前記被験物質とを溶解するのに適する溶媒を含む反応液であるとして選択した。
【０１７０】
実施例Ｊ３  （薬物代謝酵素がＣＹＰ３Ａ４（ＴＳ）である場合における本発明検定方法（第三工程その１：ＩＣ５０測定））
薬物代謝酵素の濃度及び所定の反応時間として表６及び表７記載のものを用いた。
０．１ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のアセトニトリルを含む反応液に、各種濃度のケトコナゾール（被験物質）を５μＬ添加した後（終濃度０、０．０２、０．０５、０．１、０．２μｍｏｌ／Ｌに相当する）、さらに当該混合物に８００μｍｏｌ／Ｌのミダゾラム（指標基質）を５μＬ添加した（終濃度：４μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から２０分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析することにより、ＩＣ５０を算出した。
【０１７１】
実施例Ｊ４  （薬物代謝酵素がＣＹＰ３Ａ４（ＭＤＺ）である場合における本発明検定方法（第三工程その２：Ｋｉ値測定））
薬物代謝酵素の濃度及び所定の反応時間として表６及び表７記載のものを用いた。
０．１ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のアセトニトリルを含む反応液に、各種濃度のケトコナゾール（被験物質）を５μＬ添加した後（終濃度０、０．０２、０．０５、０．１、０．２μｍｏｌ／Ｌに相当する）、さらに当該混合物に８００μｍｏｌ／Ｌのミダゾラム（指標基質）を５μＬ添加した（終濃度：４μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で１０分間プレインキュベーションした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始した。反応開始から５分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させた。
代謝反応停止後、当該代謝反応を酵素反応速度論に基づきながら、後述と同様な方法に従い解析することにより、Ｋｉ値を算出した。
【０１７２】
実施例Ｊ５  （薬物代謝酵素がＣＹＰ３Ａ４（ＭＤＺ）である場合における本発明検定方法（第四工程））
後述の「実施例８」に記載する。
【０１７３】
実施例Ｊ６  （薬物代謝酵素がＣＹＰ３Ａ４（ＭＤＺ）である場合における本発明検定方法（第五工程））
後述の「実施例９」に記載する。
【０１７４】
実施例Ｊ７  （薬物代謝酵素がＣＹＰ３Ａ４（ＭＤＺ）である場合における本発明検定方法（その他）：ＭＢＩの確認）
０．１ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．５（ｖ／ｖ）％のアセトニトリルを含む反応液に、各種濃度のケトコナゾール（被験物質）を５μＬ添加する（終濃度０、０．０２、０．０５、０．１、０．２μｍｏｌ／Ｌに相当する）。
当該混合物を３７℃で５分間プレウォーミングした後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＰＨ溶液を１００μＬ添加する（終濃度：１ｍｍｏｌ／Ｌに相当する）ことにより、プレインキュベーションを開始する。反応開始から０分間、１０分間、３０分間経過した後、８００μｍｏｌ／Ｌのミダゾラム（指標基質）を５μＬ添加した（終濃度：４μｍｏｌ／Ｌに相当する）添加することにより、代謝反応（反応温度：３７℃）を開始する。反応開始から５分間経過した後、当該反応液に反応液容量と等量の冷メタノールを添加することにより当該代謝反応を停止させる。
その結果、プレインキュベーション時間に依存した代謝反応阻害の増強が認められれば、Mechanism-based-inhibition（即ち、ＭＢＩ）が起こっていることを確認することができる。
【０１７５】
実施例８  （代謝反応後の代謝体の生成量の測定：本発明検定方法（第四工程））
実施例Ａ７〜Ｊ７で得られた反応停止後の反応液を全て混合した後、当該混合物に５０μｍｏｌ／Ｌのデキストロファン及びフロセミドを内標準物質（Ｉ．Ｓ）として添加した。次いで、これを遠心分離（室温、３０００ｒｐｍ、１０分間）した後、その上清を回収した。回収された上清を５０倍に希釈した後、当該希釈液をフィルターろ過した。得られたろ液の一部を採取し、これをＬＣ−ＭＳ／ＭＳに供することにより、代謝体の生成量を下記のようにして測定した。
（１）分析条件
（ａ）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにおける高速液体クロマトグラフィー法 
分析カラム： Ｌｕｎａ  ５μ  Ｃ１８（２）、１５０ｍｍ  Ｌ．×２．０ｍｍ  Ｉ．Ｄ．，５μｍ（Phenomenex社）
カラム温度：２５℃
移動相：移動相Ａ；０．１％ギ酸水溶液、移動相Ｂ；メタノール
グラジエント条件：
【０１７６】
【表１０】
2007236327.tif 000011
【０１７７】
流量：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：１０μＬ
オートサンプラー洗浄液：水／メタノール（１／１）
オートサンプラー温度：４℃
Ｒｕｎ  Ｔｉｍｅ：１５分間
（２）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにおける質量分析法
装置：Tandem Mass Spectrometer：API 4000  Applied Biosystems /MDS SCIEX社
API interface：TurboV (ESIプローブ)
Ionization mode：Positive/Negative
測定条件：
【０１７８】
【表１１】
2007236327.tif 000012
【０１７９】
実施例９  （本発明検定方法（第五工程））
（１）測定された前記代謝体の生成量、及び、当該生成量に基づき算出された前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力に係る指標値（本発明検定方法（第五工程その１））
まず１００ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、０．５ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬのヒト肝ミクロソーム及び０．５（ｖ／ｖ）％のメタノールを含む溶液に、既知濃度の代謝体が添加された試料を調製した。当該試料に含まれる前記代謝体の生成量と、実施例Ａ４〜Ｊ４に従い代謝反応が停止された後の反応液に含まれる前記代謝体の生成量とをＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて測定した。
添加検量線試料の測定で得られたピーク面積比（前記の試料中に添加された代謝体のピーク面積／内部標準物質のピーク面積）をＹとし、前記の試料中に添加された代謝体の濃度をＸとする。前記Ｘ及び前記Ｙから、パーソナルコンピューター「臨床試験データ分析システム  ＷＤＰ３２  ｖｅｒ．２．０」、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）、またはＡＰＩ４０００付属のデータ解析ソフト「Ａｎａｌｙｓｔ」等を用いて最小二乗法により一次回帰式（Ｙ＝ａＸ＋ｂ、重み付け；１／Ｙまたは１／Ｙ２）を算出した（表１３参照）。上記の実施例Ａ４〜Ｊ４に従い代謝反応が停止された後の反応液についても同様にピーク面積比を求め、算出された一次回帰式に代入することにより、前記代謝体の生成量（即ち、定量値）を算出した。
このようにして算出された前記代謝体の生成量から、単位時間（分）、ミクロソーム１ｍｇ当たりの前記代謝体の生成量を算出し、さらにまた当該代謝反応の代謝速度（ｖ）を算出した。
【０１８０】
代謝速度（ｖ、ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）
＝（代謝物生成量（μｍｏｌ／Ｌ））／（反応時間（分））／（反応液中ヒト肝ミクロソーム濃度（ｍｇ蛋白／ｍＬ））
【０１８１】
【表１２】
2007236327.tif 000013
【０１８２】
前記代謝体の生成量に基づき算出された前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力に係る指標値である「ＩＣ５０」は、以下の手順で算出した。
まず残存活性は、被験物質の濃度がゼロである場合の値（コントロール）に対する百分率であり、下記の式により算出した。
【０１８３】
残存活性（％）=（平均代謝速度／コントロールの平均代謝速度）×100
【０１８４】
次いで、残存活性をＹとし、被験物質の濃度の対数をＸとする。前記Ｘ及び前記Ｙから、残存活性が５０％のときのトリメトプリムの濃度をＩＣ５０として算出した。具体的には、ＩＣ５０は、５０％阻害となる被験物質の濃度を挟む被験物質の他の濃度２点を用い、最小二乗法により一次回帰式（Ｙ＝ａＸ＋ｂ、重みなし）を算出した。そして算出された一次回帰式においてＹ＝５０を与えるＸの値をＩＣ５０とした。
【０１８５】
また前記代謝体の生成量に基づき算出された前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力に係る指標値である「Ｋｉ値」は、以下の手順で算出した。
まず前記指標基質の濃度（３濃度）毎に、代謝速度（ｖ）の逆数（１/ｖ）をＹとし、被験物質の濃度をＸとした。次いで、前記Ｘ及び前記Ｙから、最小二乗法により一次回帰式（Ｙ＝ａＸ＋ｂ、重みなし）を算出した（当該プロットをDixon plotと呼ぶこともある。）。ここで直線の交点のＸ軸座標の絶対値を平均してこれをＫｉとした。上記のDixon plotから前記被験物質が有する阻害タイプを評価した。
【０１８６】
このようにしてなされた代謝反応に関する酵素速度論に基づく解析結果を表１４に示した。
【０１８７】
【表１３】
2007236327.tif 000014
【０１８８】
（２）代謝反応に関する酵素速度論に基づく解析結果に基づく、前記酵素に対する前記被験物質が有する阻害能力の有無、そのタイプ若しくはその程度の評価（本発明検定方法（第五工程その２））
前記（１）において得られた代謝反応に関する酵素速度論に基づく解析結果（即ち、表１４）から、各種の被験物質が前記酵素に対し阻害能力を有することが確認できた。また、「ＩＣ５０」及び「Ｋｉ値」並びにDixon plotから、前記酵素に対する当該被験物質が有する阻害能力のタイプ及びその程度を評価することが可能となることも確認できた。さらに、当該被験物質に代えて他の被験物質（例えば、医薬品候補化合物）を用いて同様な検定を行ない、当該被験物質における上記の解析結果等と比較することにより、他の被験物質が有する前記酵素に対する阻害能力を評価できる。
【産業上の利用可能性】
【０１８９】
本発明により、薬物が有する、薬物代謝能力を有する酵素を阻害する能力を簡易に且つ精度良く検定する方法が提供可能になった。
【図面の簡単な説明】
【０１９０】
【図１】図１は、実施例Ａ１に係る、薬物代謝酵素がＣＹＰ１Ａ２である場合における本発明検定方法での代謝反応に係る時間の検討結果を示す図である。当該図から、反応時間２０分間までは、前記代謝体であるアセトアミノフェンの生成量は反応時間に対して線形性を保っていることが確認できた。
【図２】図２は、実施例Ａ１に係る、薬物代謝酵素がＣＹＰ１Ａ２である場合における本発明検定方法でのＫｍ値の測定結果を示す図である。当該図の横軸を（1／前記指標基質の濃度）とし、且つ、縦軸を（1／代謝速度）として、各測定値に基づいたデータをプロットしたもので、一般的には「Lineweaver-Burk plot」とも呼ばれるものである。当該結果から、Ｋｍ値は５２．９μｍｏｌ／Ｌ、Ｖｍａｘ値は０．９７９ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎと算出された。
【図３】図３は、実施例Ａ１に係る、薬物代謝酵素がＣＹＰ１Ａ２である場合における本発明検定方法でのＫｍ値の測定結果を示す図である。当該図の横軸を（代謝速度／前記指標基質の濃度）とし、且つ、縦軸を（代謝速度）として、各測定値に基づいたデータをプロットしたもので、一般的には「Eadie-Hofstee plot」とも呼ばれるものである。当該結果から、Ｋｍ値は５２．９μｍｏｌ／Ｌ、Ｖｍａｘ値は０．９７８ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎと算出された。
【図４】図４は、実施例Ａ３に係る、薬物代謝酵素がＣＹＰ１Ａ２である場合における本発明検定方法でのＩＣ５０の測定結果を示す図である。当該図の横軸を（阻害剤（被験物質）濃度の対数表示）とし、且つ、縦軸を（残存酵素活性）として、各測定値に基づいたデータをプロットしたものである。当該結果から、ＩＣ５０は２．６８μｍｏｌ／Ｌと算出された。
【図５】図５は、実施例Ａ４に係る、薬物代謝酵素がＣＹＰ１Ａ２である場合における本発明検定方法でのＫｉ値の測定結果を示す図である。当該図の横軸を（阻害剤（被験物質）濃度の対数表示）とし、且つ、縦軸を（1／代謝速度）として、各測定値に基づいたデータをプロットしたもので、一般的には「Dixon plot」とも呼ばれるものである。図中のシンボル●は、前記指標基質の濃度２５μｍｏｌ／Ｌ、■は、前記指標基質の濃度５０μｍｏｌ／Ｌ、▲は、前記指標基質の濃度１００μｍｏｌ／Ｌのときのプロットを示している。交点の横軸の値を平均することにより、Ｋｉ値は１．６５μｍｏｌ／Ｌと算出された。
【図６】図６は、実施例Ａ７に係る、薬物代謝酵素がＣＹＰ１Ａ２である場合における本発明検定方法でのＭＢＩの確認結果を示す図である。当該図の横軸を（阻害剤（被験物質）濃度の対数表示）とし、且つ、縦軸を（残存酵素活性）として、各測定値に基づいたデータをプロットしたものである。図中のシンボル●は、プレインキュベーション時間０分間、■は、プレインキュベーション時間１５分間、▲は、プレインキュベーション時間３０分間のときのプロットを示している。その結果、プレインキュベーション時間に依存した代謝反応阻害の増強が認められることから、Mechanism-based-inhibition（即ち、ＭＢＩ）が起こっていることが確認された。
【図７】図７は、実施例Ａ７に係る、薬物代謝酵素がＣＹＰ１Ａ２である場合における本発明検定方法でのＭＢＩの確認結果を示す図である。当該図の横軸を（プレインキュベーション時間）とし、且つ、縦軸を（残存酵素活性）として、各測定値に基づいたデータをプロットしたものである。図中のシンボル●は、阻害剤濃度０μｍｏｌ／Ｌ、■は、阻害剤濃度１μｍｏｌ／Ｌ、▲は、阻害剤濃度３μｍｏｌ／Ｌ、◆は、阻害剤濃度１０μｍｏｌ／Ｌのときのプロットを示している。その結果、プレインキュベーション時間に依存した代謝反応阻害の増強が認められることから、Mechanism-based-inhibition（即ち、ＭＢＩ）が起こっていることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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