(57)【要約】【課題】  組換えグルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）ポリペプチド、及びＧＡＤ６５ポリペプチドを、自己免疫疾患において診断的及び治療的に使用する方法を提供する。【解決手段】  以下の（ａ）−（ｃ）から選択される組換えＧＡＤ６５ポリペプチド：（ａ）図２−図４に示すアミノ酸配列をもつタンパク質；（ｂ）図５−図８に示すアミノ酸配列をもつタンパク質；（ｃ）図２−図４又は図５−図８に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる（ａ）もしくは（ｂ）由来のタンパク質であって、かつグルタミン酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）−（ｃ）から選択される組換えＧＡＤ６５ポリペプチド：
（ａ）図２−図４に示すアミノ酸配列をもつタンパク質；
（ｂ）図５−図８に示すアミノ酸配列をもつタンパク質；
（ｃ）図２−図４又は図５−図８に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる（ａ）もしくは（ｂ）由来のタンパク質であって、かつグルタミン酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
（ａ）サンプルをＧＡＤポリペプチドと接触させ、ここで該ポリペプチドは非−ＧＡＤ真核生物性ポリペプチドを実質的に含まないものであり；
（ｂ）工程（ａ）の成分を、自己抗体がポリペプチドと結合するのに十分な条件下で、一定時間インキュベーションし；
（ｃ）ポリペプチドと結合した自己抗体をサンプルから分離し；そして
（ｄ）ポリペプチドと結合した自己抗体の存在を検出する、
ことからなる、ＧＡＤに対する自己抗体の検出方法。
【請求項３】
ＧＡＤがＧＡＤ６５である、請求の範囲第２項に記載の方法。
【請求項４】
ＧＡＤ６５が以下の（ａ）−（ｃ）から選択されるタンパク質をコードするｃＤＮＡでコードされるものである請求項３記載の方法：
（ａ）図２−図４に示すアミノ酸配列をもつタンパク質；
（ｂ）図５−図８に示すアミノ酸配列をもつタンパク質；
（ｃ）図２−図４又は図５−図８に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる（ａ）もしくは（ｂ）由来のタンパク質であって、かつグルタミン酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項５】
ＧＡＤ６５がヒトＧＡＤ６５である、請求項３記載の方法。
【請求項６】
ＧＡＤがＧＡＤ６７である、請求項２記載の方法。
【請求項７】
ＧＡＤ６７がヒトＧＡＤ６７である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ＧＡＤがＧＡＤ６５とＧＡＤ６７との混合物である、請求項２記載の方法。
【請求項９】
サンプルがヒト由来のものである、請求項２記載の方法。
【請求項１０】
自己抗体と結合することのできる検出可能な標識タンパク質を用いて検出を行う、請求項２記載の方法。
【請求項１１】
結合タンパク質が検出可能な標識された第２抗体である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
検出可能な標識が、放射性同位体、蛍光化合物、コロイド金属、化学発光化合物、生物発光化合物、及び酵素からなる群から選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
治療的に有効量のＧＡＤポリペプチドを含み、ここで該ＧＡＤポリペプチドはリセプターと結合するものである、自己免疫応答を改善するための医薬組成物。
【請求項１４】
ＧＡＤがＧＡＤ６５である、請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ＧＡＤがＧＡＤ６７である、請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１６】
ＧＡＤがＧＡＤ６５とＧＡＤ６７との混合物である、請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１７】
ＧＡＤがヒトＧＡＤである、請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１８】
リセプターが、抗体及びＴ−ヘルパー細胞からなる群から選択される、請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１９】
自己免疫疾患が、ＩＤＤＭ及びスティッフマン病からなる群から選択される、請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項２０】
非経口的に投与される、請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項２１】
非経口的投与を、皮下、筋肉内、腹腔内、空洞内、経皮、又は静脈内注射によって行う、請求項２０記載の医薬組成物。
【請求項２２】
投与を、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／回から約２０００ｍｇ／ｋｇ／回までの投与量で行う、請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項２３】
組換えＧＡＤ６５ポリペプチドを治療的に標識する、請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項２４】
治療的標識が、放射性同位体、医薬、レクチン、及び毒素からなる群から選択される、請求項２３記載の医薬組成物。
【請求項２５】
１又はそれ以上の容器を密に封じ込めるために仕切られた担体からなり、ここで、
（ａ）第１の容器はＧＡＤ６５を含み；そして
（ｂ）第２の容器は検出可能な標識された第２抗体を含み、ここで該第２抗体は自己抗体上に存在するエピトープ性決定基と結合する、
ＧＡＤ６５に対する自己抗体の検出に使用するキット。
【請求項２６】
ＧＡＤ６５が担体と結合する、請求項２５記載のキット。
【請求項２７】
担体が不溶性である、請求項２６記載のキット。
【請求項２８】
第１の容器が更にＧＡＤ６７を含む、請求項２５記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はグルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）ポリペプチドの発現のために、ＧＡＤ６５で宿主生物を形質転換する組換えＤＮＡ手法の使用に関する。また、ＧＡＤ６５ポリペプチドを、自己免疫疾患において診断的及び治療的に使用する方法をも包含する。
【背景技術】
【０００２】
インシュリン−依存性真性糖尿病（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ：ＩＤＤＭ；Ｉ型糖尿病）は、最も普遍的な代謝性疾患の一つである。アメリカ合衆国では、ＩＤＤＭはおよそ３００から４００人に１人の割合で見られ、免疫的研究によると、この疾患は増加していることを示唆している。この疾患は膵臓のインシュリン生産性β−細胞の自己免疫破壊の結果生じる。更に特定すれば、この疾患の始まる前段階は、リンパ球が膵臓の（ランゲルハンス）島細胞に浸潤し、β−細胞を選択的に破壊する、“インスリティス”という状態を特徴とする。典型的なＩＤＤＭの過血糖症は、インシュリン−生産性β−細胞の少なくとも８０％が失われた後に、初めて現れる。残りのβ−細胞は引きつづく数年間に破壊される。
【０００３】
インシュリン治療によって大半のＩＤＤＭ患者は普通の生活を送ることができるが、この補充は不完全なものであって、代謝恒常性を完全に元に戻すものではない。従って、目、腎臓、心臓、及びその他の器官の機能低下に至る深刻な合併症が、インシュリン治療を受けているＩＤＤＭ患者には多い。このために、β−細胞破壊の開始時と、実際にインシュリン補充が必要となる時（即ち、β−細胞の８０％が破壊されたとき）との間の潜伏期間を伸ばすこと（例えば、免疫抑制剤の投与によって）が極めて望ましい。従って、β−細胞破壊の開始を決定する診断テストがあれば、医者が潜伏期間を伸ばすための免疫抑制剤を投与することができ（非特許文献１参照）、それによってインシュリン補充による副作用の開始を遅らせることができる。
【０００４】
ＩＤＤＭ患者の多くは、６４ｋＤ分子（非特許文献２参照）、島細胞細胞質（ＩＣＡ）分子又は島細胞表面（ＩＣＳＡ）分子（非特許文献３参照）、或いはインシュリン（非特許文献４参照）に対する抗体を含む血清を有している。Ａｔｋｉｎｓｏｎとその共同研究者ら（非特許文献５参照）は、ヒト血清中における６４ｋＤ分子に対する抗体の存在が、ＩＤＤＭ症状が実際に起きる始まりについての、最も初期でかつ最も信頼できる指標であることを示した。
【非特許文献１】Silverstein et al., New England Journal of Medicine, 319:599-604, 1988
【非特許文献２】Baekkeskov et al., J. Clin. Invest. 79:926-934, 1987; Atkinson et al., Lancet, 335:1357-1360, 1990
【非特許文献３】Bottazzo et al., Lancet, 1:668-672, 1980
【非特許文献４】Palmer et al., Science, 222:1137-1139, 1983; Atkinson et al., Diabetes, 35:894-898, 1986
【非特許文献５】Atkinson et al., Lancet, 335:1357-1360, 1990
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
最近になって、Ｂａｅｋｋｅｓｋｏｖとその共同研究者らは、６４ｋＤ分子と、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）とは幾つかの共通の抗原エピトープを有しており、従ってこれらは同じものであるか、或いは非常によく似た分子である、ということを確立した。この同定は重要な発見ではあるが、ＧＡＤの分子生物学に関する知識が未知である限りは、この情報をＩＤＤＭ予知の診断法として用いることは極めて厄介であり、かつ限定されている。結果として、大量の６４ｋＤ分子、又は６４ｋＤ分子と抗原的に実質的に同一なＧＡＤ分子をクローニングし、次いで量産することができれば、ＩＤＤＭ予知のための診断キットの開発が可能となろう。本発明は、かかる結果を達成するための手段を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、組換えＤＮＡ手法を用いて真核性ＧＡＤ６５ポリペプチドの生産が可能であり、かつＧＡＤ６５ポリペプチドを自己免疫疾患の患者の診断及び治療に用い得るという知見に基づいてなされた。特定すれば、クローン化真核性ＧＡＤ６５ポリペプチドを、インシュリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）を有する患者、或いは有する危険性のある患者の診断に用いることに関する。
【０００７】
本発明の主な利点は、天然の真核性ＧＡＤ６５ポリペプチドをその他の真核性非−ＧＡＤ６５ポリペプチドから分離する際に、その単離に関して生じる問題を回避しつつ、天然源から精製したものに対応する真核性ＧＡＤ６５ポリペプチドの容易な生産源を当業界に提供することである。その他の真核性非−ＧＡＤ６５ポリペプチドが存在しないことは、ＧＡＤ６５ポリペプチドと特異的に反応する抗体のみを検出する試験システムの開発が可能となるので、重要である。
【０００８】
宿主細胞中にある真核性ＧＡＤ６５ポリペプチドを提供する他の利点は、そうすることによって天然源から現在実際に得られているよりも、はるかに大量のポリペプチドを得ることが可能となることである。その結果、本発明のポリペプチドを用いてＩＤＤＭのような自己免疫疾患を有する患者をより正確に分類することが可能となるばかりでなく、診断システムに使用するための商業的に使用可能な量のＧＡＤ６５ポリペプチドを提供することも可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）に対する自己抗体と結合するための、１又はそれ以上のエピトープ（抗原決定基）の１次構造コンホメーションの一部又は全てを有するポリペプチドの生産を可能にする組換え手法によって、遺伝的物質を操作することに関する。これらのポリペプチドは、これと反応する自己抗体を免疫学的に検出するのに極めて有用である。なぜなら、このような自己抗体は、インシュリン依存性真性糖尿病や“スティッフマン（ｓｔｉｆｆ  ｍａｎ）”症候群のような自己免疫疾患の指標となるからである。これらのポリペプチドは、ＧＡＤ機能を変えるようなスクリーニング医薬として、また、ＧＡＤ６５を診断的に検出するために用いるポリクローナル及びモノクローナル抗体の製造用としても使用できる。
【００１０】
ＤＮＡベクター中にスプライシングするための真核性ＧＡＤ６５ポリペプチドをコードする特異的ＤＮＡ配列の作製は各種の方法を用いて実施できる。例えば、（１）真核生物のゲノムＤＮＡから二本鎖ＤＮＡ配列を単離する；（２）興味のあるポリペプチドにとって必要なコドンを提供するためのＤＮＡ配列を化学的に製造する；及び（３）真核生物ドナー細胞から単離したｍＲＮＡの逆転写によってｉｎ  ｖｉｖｏで二本鎖ＤＮＡ配列を合成する、といった方法を含む各種の方法を用いることができる。後者の場合、実際には、ｃＤＮＡと一般に呼ばれる、ｍＲＮＡと相補的な二本鎖ＤＮＡが形成される。
【００１１】
所望のポリペプチド産物のアミノ酸残基の全配列が公知の場合には、ＤＮＡ配列の製造方法はしばしば選択の問題である。所望のポリペプチドのアミノ酸残基の全配列が公知でない場合には、ＤＮＡ配列の直接製造は不可能で、選択しうる方法はｃＤＮＡ配列の形成である。興味のあるｃＤＮＡ配列を単離するための標準的方法には、高レベルでの遺伝子発現を有するドナー細胞中に豊富にあるｍＲＮＡの逆転写に由来する、プラスミド運搬性のｃＤＮＡライブラリーを形成することがある。ポリメラーゼ鎖反応法と組み合わせて用いると、まれな発現産物でもクローニングすることができる。ポリメラーゼのアミノ酸配列の重要な部分が公知の場合には、ターゲットのｃＤＮＡ中に存在すると推定される配列と二重になるような、ラベルした一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡプローブ配列を作成して、あらかじめ一本鎖形に変性しておいたｃＤＮＡのクローン化コピー上で行うＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション法に用いることができる（Jay et al., Nucleic Acid Research, 11:2325, 1983）。
【００１２】
ラベルした混合合成オリゴヌクレオチドプローブを用いることによって（ここで各プローブは、変性化二本鎖ＤＮＡの異種混合物を含むハイブリダイゼーションサンプル中において、特定のＤＮＡ配列の完全な相補体である可能性がある）、ハイブリタイゼーション法は組換え体クローンをスクリーニングするのに有用である。このようなスクリーニングのためには、ハイブリダイゼーションは、一本鎖ＤＮＡか、或いは変性化二本鎖ＤＮＡのいずれかで実施するのが好ましい。このような方法は、興味のあるポリペプチドと関連するｍＲＮＡ配列の量が極めて少ししか存在しない材料に由来するｃＤＮＡクローンを検出する際には特に有用である。言い換えると、非特異的な結合を避けるためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を用いることによって、例えば、ターゲットＤＮＡがその完全な相補体である、混合物中の１個のプローブとハイブリダイゼーションすることによって、特定のｃＤＮＡクローンをオートラジオグラフで可視化することができるようになる（Wallace et al., Nucleic Acid Research, 9:879, 1981）。
【００１３】
更に、各種ｃＤＮＡをオーサイト（ｏｏｃｙｔｅｓ）に注入して、ｃＤＮＡ遺伝子産物の発現が起きるのに十分な時間をおき、そして所望のｃＤＮＡ発現産物の存在を、例えばＧＡＤ６５ポリペプチドに特異的な抗体を用いるか、或いはＧＡＤ６５酵素活性の機能アッセイを用いることによって試験することにより、ＧＡＤ  ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。
【００１４】
若しくは、ＧＡＤ６５に対する抗体を用いて、少なくとも１個のエピトープを有するＧＡＤ６５ペプチドに対して、ｃＤＮＡライブラリーを間接的にスクリーニングすることができる（Chang and Gottlieb, J.Neurosci., 8:2123, 1988）。このような抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル由来であり、ＧＡＤ６５ｃＤＮＡの存在を示す発現産物を検出するのに使用することができる。ＧＡＤ６５のＮ−末端部分の最初の１００アミノ酸にみられるエピトープに対する抗体が好ましい。
【００１５】
遺伝子組換えにおいて使用できる、特定のＤＮＡ配列作製のための上記３つの方法のうちでは、ゲノムＤＮＡ単離を用いる方法が最も一般的でない。これは、哺乳動物ポリペプチドを微生物の発現で得たいという場合には、イントロンの存在のために、特にそうである。
【００１６】
本発明は、ＧＡＤ６５に対する抗体への少なくとも１個のスピトープを有する１次構造コンホメーション、即ち、アミノ酸残基の連続的配列の一部又は全てを有する、ＧＡＤ６５の新規ポリペプチドを提供する。
【００１７】
ＧＡＤ６５に対する自己抗体を検出するためには、完全なＧＡＤ６５よりもむしろ本発明のポリペプチド断片を用いることができる。ＧＡＤ６５ポリペプチドに用いる場合の“ポリペプチド”の語は、ＧＡＤ６５に対する自己抗体へのエピトープを有するいかなるアミノ酸配列をも示すが、ここで該アミノ酸配列は、本発明のｃＤＮＡ配列の一部又は全てによってコードされる。
【００１８】
本発明のＤＮＡ配列の微生物発現から得られるポリペプチドは、他の真核性ポリペプチド、或いは天然の細胞環境中で、又は血漿（Ｐｌａｓｍａ）や尿のような細胞外液体中で、ＧＡＤ６５と関連している他の汚染物を含まない、という特徴を更に有している。
【００１９】
本発明者による研究により、ＧＡＤ６５がＧＡＤ６７とは別々の遺伝子でコードされ、例えば、共通のゲノム性配列が転写後、又は翻訳後に修飾されることによって生産されるのではないことが明白に確立された。ＧＡＤ６５とＧＡＤ６７とが別々の遺伝子によってコードされることを示す証拠には以下のものが含まれる：（ａ）ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７ｃＤＮＡの間の正確に一致する部分の最大の連続した配列は、たった１７ヌクレオチドの長さである、（ｂ）ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７からのｃＤＮＡは、低ストリンジェントな条件下で（２．０×ＳＳＣ，０．０１％ＳＤＳ，２３℃）お互いにクロスハイブリダイゼーションしないし、またお互いのｍＲＮＡともクロスハイブリダイゼーションしない、そして（ｃ）ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７ｃＤＮＡは、それぞれＧＡＤ６７及びＧＡＤ６５をコードする単離したゲノム性クローンとクロスハイブリダイゼーションしない。
【００２０】
“宿主”の語は、原核生物のみでなく、酵母菌、糸状菌のような真核生物、また植物及び動物細胞のように、複製可能で、かつ真核性ＧＡＤ６５のイントロンを含まないＤＮＡ配列を発現することのできるものを意味する。しかしながら、宿主生物としては原核生物が好ましい。
【００２１】
“原核生物”の語は、ＧＡＤ６５の発現のための遺伝子で形質転換又はトランスフェクションされる全てのバクテリアを含む。原形生物宿主は、グラム陰性菌や、例えばＥ．ｃｏｌｌｉ，Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓなどのグラム陽性菌を含む。
【００２２】
ＧＡＤ６５ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子によって、当業者に公知の方法を用いて、宿主を形質転換又はトランスフェクションすることができる。特に好ましいのは、ＧＡＤ６５コーディング配列を含むプラスミド又はウィルスを、それぞれ原形生物の形質転換又はトランスフェクションのために用いることである。
【００２３】
融合し、作動するように連結した遺伝子を調製し、またそれらをバクテリア中で発現させる方法は当業者に公知である（Maniatis et. al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Habor,  NY, 1989）。ここで記載する遺伝的構築物及び方法は、原核生物宿主中でのＧＡＤ６５の発現に用いることができる。
【００２４】
一般に、挿入された真核生物性遺伝子配列の効率よい転写を容易にするプロモーター配列を含む発現ベクターを、宿主との関連で使用する。発現ベクターは典型的には複製起点、プロモーター、及びターミネーター、並びに形質転換細胞の表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ）選択を与えることのできる特定遺伝子を含む。形質転換された原核生物宿主は、発酵槽中で成長させて、当業者に公知の方法によって最適成長条件で培養することができる。次いで本発明のポリペプチドを成育培地、細胞分解物、又は細胞膜分画から単離することができる。
【００２５】
微生物で発現された本発明のポリペプチドの単離及び精製は、例えば、プレパラティブクロマトグラフ分離や、モノクローナル又はポリクローナル抗体の使用を含む免疫学的分離のようないかなる慣用的方法によってもよい。
【００２６】
ＧＡＤ６５のアミノ酸残基の配列を提供したことによって、本発明は、１又はそれ以上のアミノ酸残基の種類又は位置において天然型と異なっており、かつ天然型ポリペプチドの幾つかの又は全てのエピトープを共有する、ＧＡＤ６５のポリペプチド類似体又は誘導体の宿主発現をコードするＤＮＡ配列の製造を提供する。
【００２７】
本発明の新規なＤＮＡ配列は、ＧＡＤ６５に対する自己抗体と反応することができる１又はそれ以上のエピトープのための１次構造コンホメーションの少なくとも一部を有するポリペプチドを、原核生物又は真核生物宿主細胞中で発現させるのに有用な全ての配列を含み、該ＧＡＤ６５は以下のものと理解される：（ａ）図２−図４又は図５−図８に示されるＤＮＡ配列、又はその相補的鎖；（ｂ）（ａ）で定義したＤＮＡ配列又はこの断片とハイブリダイズするＤＮＡ配列；及び（ｃ）遺伝暗号の縮重のために、（ａ）及び（ｂ）で定義したＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列。特に（ｂ）で定義したものは、ＧＡＤ６５の対立遺伝子変異型をコードするゲノムＤＮＡ配列と理解される。（ｃ）では特に、そのＤＮＡ配列が、無脊椎動物宿主中でのｍＲＮＡの翻訳を容易にするコドンを導入するような、ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６５断片、及びＧＡＤ６５類似体をコードするＤＮＡ配列を製造するものと理解される。
【００２８】
本発明のｃＤＮＡ配列は本質的にヒト又はラットＧＡＤ６５分子をコードするものであるので、これからｃＤＮＡの小さいポリペプチド断片、又はヒト又はラットＧＡＤ６５に対する自己抗体のための少なくとも１個のエピトープをコードする対応するｃＤＮＡ配列を調製し、サブクローニングし、そして発現させることは今や日常的なことである。次いでクローン化ポリペプチド上にこのようなエピトープが存在することを、例えばＧＡＤ６５に対する自己抗体を有する患者からの血清を用いて確認できる。このような小さいペプチドの例としては、ＧＡＤ６５のＮ−末端からの最初の約１００アミノ酸がある（図１１に示す）。このアミノ酸配列には本質的にＧＡＤ６７が欠けている。
【００２９】
本発明のＧＡＤ６５はイムノアッセイに用いるのに特に適しており、液相又は固相担体に結合して使用できる。更に、これらのアッセイに用いるＧＡＤ６５は各種の方法で検出できるように標識することができる。
【００３０】
本発明のＧＡＤ６５を用いるイムノアッセイの例としては、直接又は間接法における、競合的又は比競合的イムノアッセイがある。このようなイムノアッセイの例としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチイムノアッセイ及びウェスタンブロットアッセイがある。本発明のＧＡＤ６５と結合する抗体の検出は、生理学的サンプルでの免疫組織化学的アッセイを含む、順相、逆相、又は同時モードのいずれかで行うイムノアッセイを用いて実施することができる。用いるＧＡＤ６５の濃度は、イムノアッセイのタイプ及び使用する検出可能な標識の性質に依って変化する。しかしながら、どのようなタイプのイムノアッセイを用いるにせよ、使用するＧＡＤ６５の濃度は定法を用いて、当業者には容易に決定できる。
【００３１】
本発明のＧＡＤ６５は多くの種類の担体と結合させて、このポリペプチドと特異的に反応する抗体の存在を検出することができる。よく知られた担体の例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然及び修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、及びマグネタイトがある。担体の性質は本発明の目的のためには可溶性又は不溶性のいずれであってもよい。当業者はＧＡＤ６５と結合するためのその他の適当な担体を知ることができるし、また定法によってこれを確認することができる。
【００３２】
多くの異なる標識及び標識法が当業者には公知である。本発明に使用できる標識のタイプの例としては、酵素、放射性同位体、コロイド金属、蛍光化合物、化学発光化合物、及び生物的発光化合物がある。
【００３３】
更に、本発明のポリペプチドはＧＡＤ酵素活性を測定することによって、ＧＡＤ６５に対する抗体を検出することができる。例えば、ＧＡＤ６５と、ＧＡＤ６５に対する抗体を有している疑いのある標本とを、一定期間、ＧＡＤ６５と抗体との間に結合を起こさせるに十分な条件下にインキュベーションする。反応生成物を沈殿化して、このＧＡＤ酵素活性を試験する。
【００３４】
本発明の目的のためには、本発明のＧＡＤ６５と結合する抗体は、各種の生物的液体及び組織中に存在する。検出可能な量のＧＡＤ６５に対する抗体を含むいかなるサンプルも用いることができる。普通、サンプルは尿、唾液、脳脊髄液、血液、血清などの液体であるか、或いは組織、糞などの固体又は半固体である。
【００３５】
本発明のアッセイに用いる物質は、そのままキットの製造にも適している。このようなキットは、バイアル、チューブなどの１又はそれ以上の容器手段を密に閉じ込めるために仕切られた担体手段を含み、該容器手段の各々はこの方法で使用する別々の要素のうちの１つを含む。例えば、容器手段のうちの１つは担体と結合したＧＡＤ６５を含む。第２の容器は可溶性の検出可能な第２の抗体を凍結乾燥又は溶液の形で含む。
【００３６】
更に、担体手段はまた複数の容器を含み、各容器は異なる、あらかじめ定められた量のＧＡＤ６５を含む。次いでこの後者の容器を用いて標準曲線を描き、これに未知の量のＧＡＤ６５に対する自己抗体を含むサンプルから得られた結果を挿入する。
【００３７】
キットを使用するに当たって使用者がしなければならないことは、測定可能であるが、未知の量の検出されるべきＧＡＤ６５に対する自己抗体を含む、あらかじめ測定した量の検出用サンプルと、第１の容器中に存在するあらかじめ測定した量の担体結合したＧＡＤ６５と、第２の容器中に存在するあらかじめ測定した量の検出可能な標識化第２抗体とを容器に加えることである。若しくは、検出不能な標識化ＧＡＤ６５を容器に付けて提供し、これにサンプルと、検出可能な標識化第２抗体とを加えることもできる。適当な時間インキュベーションした後、免疫複合体が形成され、これを上澄み液から分離し、免疫複合体又は上澄み液を、放射能カウントするか、又は酵素基質を加えて発色させるなどによって検出する。
【００３８】
“改善する（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）”の語は、患者が受け取る治療において自己免疫応答の有害な効果を減少することを意味する。“治療的に有効な”の語は、使用するＧＡＤ６５ポリペプチドの量が自己免疫応答による疾患誘発を改善するのに十分な量であることを意味する。
【００３９】
本発明の組換えＧＡＤ６５ポリペプチドは、ＧＡＤ６５に対する自己免疫応答を有する患者の治療に用いることもできる。このような治療は、例えば、組換えＧＡＤ６５ポリペプチドを投与することによって実施できる。このような投与には非標識化又は標識化ＧＡＤ６５ポリペプチドを用いることができる。非標識化ＧＡＤ６５ポリペプチドを用いるのが有利な場合には、例えば、免疫応答を刺激するには小さすぎるが、自己免疫応答の継続を束縛したりブロックしたりするには十分大きい断片の形でＧＡＤ６５ポリペプチドを投与する。例えば、ＧＡＤ６５をエピトープーサイズのペプチド（典型的には５−１２アミノ酸の長さ）に酵素的に消化して、自己免疫疾患を有する患者の体液中、又は免疫細胞の表面上に存在するＦａｂ結合部分に結合させる。
【００４０】
或いは、本発明の組換えＧＡＤ６５ポリペプチドは、治療剤で標識して投与することができる。これらの治療剤は本発明のＧＡＤ６５ポリペプチドと直接又は間接にカップリングさせることができる。間接的カップリングの一例はスペーサー部分を用いることである。このスペーサー部分は可溶性又は不溶性であることができ（Diener et al., Science, 231:148, 1986）、ターゲット部分でＧＡＤ６５ポリペプチドから医薬の放出をできるように選択される。免疫治療用に本発明のＧＡＤ６５ポリペプチドとカップリングすることができる治療剤の例としては、医薬、放射性同位体、レクチン、及び毒素がある。
【００４１】
本発明のＧＡＤ６５ポリペプチドと結合することができる医薬には、マイトマイシンＣ、ダウノルビシン、及びビンブラスチンのような古典的に医薬と呼ばれていたものを含む。
【００４２】
免疫治療用に放射性同位体と結合した本発明のＧＡＤ６５ポリペプチドを使用する際には、白血球の分布、安定性及び放射のような要因に依って、一定の同位体が他の同位体よりも好ましいことがある。自己免疫応答に依って、一定の放射体が他のものよりも好ましいことがある。一般に、免疫治療ではα及びβ粒子放射性の放射性同位体が好ましい。２１２Ｂｉのような近距離、高エネルギーのα放射体が好ましい。治療の目的のために本発明のＧＡＤ６５ポリペプチドと結合することができる放射性同位体の例としては、１２５Ｉ，１３１Ｉ，９０Ｙ，６７Ｃｕ，２１２Ｂｉ，２１１Ａｔ，２１２Ｐｂ，４７Ｓｃ，１０９Ｐｄ及び１８８Ｒｅがある。
【００４３】
レクチンは通常植物から単離されるタンパク質であって、特定の糖部分と結合する。多くのレクチンが細胞を凝集させ、リンパ球を刺激することができる。しかし、リシン（ｒｉｃｉｎ）は免疫治療に用いられてきた毒性レクチンである。これは、毒性の原因であるリシンのα−ペプチド鎖を、抗体分子と結合させて、毒性効果を特異的に配給することによって達成できる。
【００４４】
毒素は植物、動物、又は微生物によって産出される毒性物質であって、十分な投与量でしばしば死に至る。ジフテリア毒素は治療的に用い得るＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａによって産出される物質である。この毒素はα及びβサブユニットからなっており、一定条件下に分離できる。
【００４５】
毒素Ａ部分は、ＧＡＤ６５ポリペプチドと結合させて、ＧＡＤ６５ポリペプチドに対するリセプターを発現する白血球への部分特異的な配給に用いられる。
【００４６】
本発明のＧＡＤ６５ポリペプチドとカップリングすることができるその他の治療剤は、ｅｘ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの治療法共に、公知であり、又は当業者によって容易に確認できる。
【００４７】
本発明のＧＡＤ６５ポリペプチドの投与量は、自己免疫応答の症状又は細胞破壊が改善されるような所望の効果を生じるのに十分な量である。投与量は、好ましくない交差反応や、アナフィラキシー反応（過敏症）などの副作用を引き起こす程大きいものであってはならない。一般に、投与量は年齢、症状、性別、及び患者の病気の重症度によって変化し、当業者によって決定される。万一何か好ましくない症状があった場合には、投与量は個々の医師によって調節される。投与量は、一回の投与当たり、約０．１ｍｇ／ｍ２から約２０００ｍｇ／ｍ２まで、好ましくは約０．１ｍｇ／ｍ２から約５００ｍｇ／ｍ２までで、１日に１回又は数回、１日又は数日間投与する。
【００４８】
本発明のＧＡＤ６５ポリペプチドは、注射又は時間をかけた勾配還流によって非経口的に投与される。本発明のＧＡＤ６５ポリペプチドは、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、空洞内、又は経皮的に投与される。
【００４９】
非経口的投与のための製剤は、滅菌水性、又は非水性溶液、懸濁液、及びエマルジョンを含む。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、及びエチルオレエートのような注射可能な有機エステルがある。水性担体は、食塩水及び緩衝液を含む、水、アルコール／水性溶液、エマルジョン、又は懸濁液を含む。非経口的担体は、塩化ナトリウム溶液、リンガーのデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸化リンガー液、又は不揮発性油を含む。
【００５０】
静脈内担体は、液体及び栄養補充物、電解補充物（リンガーのデキストロースに基づくようなもの）などを含む。保存料、及びその他の添加物、例えば抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスなども存在する。
【００５１】
本発明はまた、本発明のＧＡＤ６５ポリペプチドを含む医薬、又は医薬組成物の製造法にも関し、該医薬はＧＡＤ６５に対する自己免疫応答の治療に使用する。
【００５２】
上記の記載は本発明を一般的に述べたものである。以下の特定の実施例を参照することによって、より完全な理解が得られるが、ここで述べる実施例は説明のためのみになされるものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００５３】
実施例１：ＧＡＤ６５のクローニング及び発現
Ａ．組換えＤＮＡ手法
ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７に特異的なｃＤＮＡプローブを得るために、Chirgwin et al., Biochemistry, 18:5294, 1979の方法を用いて、成熟ラットの脳から、グアニジンイソチオシアネート−セシウムグラジエントによって、全ＲＮＡを抽出した。Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＢＲＬ）による実験書を用いて、ポリ（Ａ）ＲＮＡをオリゴｄＴセルロース上で精製した。ポリｄ（Ｎ６）−ｍｅｒｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）プライマーとして用いた以外は、指示された条件を用いて、ＭＭＬＶ−逆転写酵素（ＢＲＬ）を用いて一本鎖合成を行った。このｃＤＮＡ−ＲＮＡ混合物を６５℃で１５分間加熱して不活性化して、−２０℃に貯蔵した。ＰＣＲのためには、サンプルの１／５０を反応物１００μｌに加えた。ネコ（ｃＤＮＡから）（Kobayashi et al., J.
Neurosci., 7:2768, 1987）及びラット（ペプチドから）（Chang and Gottlieb, J. Neurosci. 8:2123, 1988）ＧＡＤ（図１）の下線を施した共通のアミノ酸配列をコードするために変性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）オリゴヌクレオチドを合成した（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。各変性オリゴヌクレオチドの５′末端配列は、ＳｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ（５′末端オリゴ）又はＳｓｔＩ及びＳｓｔＩＩ（３′末端オリゴ）のいずれかによって認識されるＤＮＡ配列の１本鎖を含む。これらのプライマーを用いて、Gould et al, Proc. Natl. Acad. Sci.,  USA, 86:1934, 1989に記載されたように、生じたｃＤＮＡ鋳型のポリメラーゼ鎖反応によって選択的増幅を行った。ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｓｔＩで二重消化されたＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングし、ＤＨ５（ＢＲＬ）に形質転換して、標準法（Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Habor, NY, 1989）によってプレートした。
【００５４】
ネコＧＡＤ６７に特異的な５′−３２Ｐ末端標識化オリゴヌクレオチドでコロニーハイブリダイゼーションを行った（Kobayashi et al., J. Neurosci., 7:2768, 1987）。ニトロセルロースフィルターを５０℃で１５分間洗浄した以外は、文献（Wallace et al., in Guide to Molecular Cloning Techniques; Berger et al., Eds. in Methods of Enzymology; Abelson et al., Eds. Academic Press, Inc. San   Diego, 432-442, 1987）記載のようにして、オリゴヌクレオチドの末端標識、ハイブリダイゼーション条件、及び洗浄条件を実施した。ハイブリダイゼーションで陽性及び陰性であったコロニーを個々に取り上げて、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ液体培地中で一夜成長させた（Tartof et al., Focus, 9:12, 1987）。煮沸法（Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Habor, NY, 1989）を用いてＤＮＡを単離し、０．２Ｎ  ＮａＯＨで鋳型を変性し、Ｓｅｐｈａｃｒｙ１  Ｓ４００スパンカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で精製した。変性された二本鎖鋳型の配列決定は、Ｔ７−シークエンスキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、鎖−末端法（Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463, 1977）によって行った。
【００５５】
図１に示すように、ＰＣＲで生じたラットＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７ｃＤＮＡをプローブとして用いて、標準的手法（Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Habor, NY, 1989）によって、Ｓ．Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ（Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から供与されたラムダＺＡＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ラット海馬ライブラリーをスクリーニングした。２４００ヌクレオチドのＧＡＤ６５ｃＤＮＡ（最大クローン）を単離して、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅに記載するように“ザッピング（ｚａｐｐｉｎｇ）”によってサブクローニングした。手元に既にあった３．２ｋｂのラットＧＡＤ６７ｃＤＮＡクローンよりも小さいラットＧＡＤ６７ｃＤＮＡを得たら、より大きなｃＤＮＡの配列決定を行った。ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７について両方の方向にＥｘｏ  ＩＩＩ削除（Henikoff, Gene, 28:351, 1984）を行って、鋳型を調製し、上記のようにして配列決定を行った。ライブラリースクリーニングにおいて単離された元のｃＤＮＡクローン中には現れていなかったＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７ｍＲＮＡの残りの５′末端をクローニングするために、アンカーＰＣＲを行った（Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8998,
1988）。これらのクローンの配列決定を行ったところ、ＧＡＤ６５又はＧＡＤ６７ｍＲＮＡのいずれも、フレーム中に元のｃＤＮＡクローンの開始コドンであると以前に同定されたものと共に、更に別の開始コドン（ＡＵＧ）をなんら含んでいないことが明らかとなった。
【００５６】
実施例２：クローン化ＧＡＤ６５の特徴
Ａ．ノーザンブロットハイブリダイゼーション
ＧＡＤ６７及びＧＡＤ６５ｃＤＮＡは２個の異なるｍＲＮＡに由来するのかどうかを決定するために、２個のＰＣＲ−由来のｃＤＮＡプローブを、ラットの脳ＲＮＡを含むノーザンブロットにハイブリダイゼーションした。ＲＮＡは実施例１に記載したように抽出した。ホルムアルデヒド中の電気泳動によってポリ（Ａ）ＲＮＡを分離し、Ｂｉｏｔｒａｎｓ（ＩＣＮ）膜上に移して、１００μｍ／ｍｌのポリ（Ａ）を加えた以外は、Well et al., J.Neurosci., 16:311, 1986に記載の方法によってハイブリダイゼーションを行った。Feinberg and Vogelstein,
Anal. Biochem., 132:6, 1983に記載のオリゴラベリング法によって、プローブを約１０９ｄｐｍ／μｇまで標識した。次いでＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７ｃＤＮＡの全長クローンで同じ結果が得られた。
【００５７】
図１１に示すように、レーン１及び２は、ラット小脳から抽出したポリ（Ａ）選択ＲＮＡ１μｇを含む。レーン１はネコＧＡＤ６７（Kobayashi et al., J. Neurosci., 7:2768, 1987）のラット起源のｃＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションさせたものであり、レーン２はラットペプチド配列（ＧＡＤ６５と対応する）のｃＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションさせたものである。
【００５８】
ラットペプチド配列のｃＤＮＡプローブは５．７ｋｂのＲＮＡとハイブリダイゼーションし、一方ネコｃＤＮＡのラット起源のｃＤＮＡプローブは３．７ｋｂのＲＮＡとハイブリダイゼーションした。これは、ＧＡＤ６５とＧＡＤ６７が同じｍＲＮＡに由来するものではないことを示している。
Ｂ．ＧＡＤ６７及びＧＡＤ６５のゲノム性ハイブリダイゼーション
ＧＡＤ６７及びＧＡＤ６５が別々の遺伝子に由来する可能性を調べるために、ＧＡＤ６７及びＧＡＤ６５の両方のｃＤＮＡを、ゲノム性ＤＮＡを含むＤＮＡブロットとハイブリダイゼーションした。
【００５９】
サザンブロットのために、ゲノム性ＤＮＡはKaiser et al., in DNA Cloning,
vol.1, A Practical Approach, D.M.Glover ed., IRL Press, Oxford, 38-40, 1985 に記載に従って、ラット肝臓から抽出した。製造者（ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）の指示する条件を用いて、ＤＮＡ（１０μｇ／サンプル）をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化した。０．８％アガロース中、１．５ｖ／ｃｍで１６時間、電気泳動を行ったＤＮＡ断片を分離した。次いで、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液の代わりに５μｇ／ｍｌのＣａｒｎａｔｉｏｎドライミルクを用いた以外は、Gatti et al., Biotechniques, 2:148, 1984の記載に従って、ＤＮＡをＺｅｔａ−Ｐｒｏｂｅ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移して、ハイブリダイゼーションし、洗浄した。サザンブロットのためのプローブは、上記実施例１に記載したように標識した。
【００６０】
図１２に示すように、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化したゲノム性ＤＮＡは、それぞれレーン１、３とレーン２、４にある。ＧＡＤ６７ｃＤＮＡはレーン１及び２とハイブリダイゼーションさせ、一方ＧＡＤ６５ｃＤＮＡはレーン３及び４とハイブリダイゼーションさせた。ゲル横にある数字はキロベースで表したＤＮＡ断片サイズである。
【００６１】
このデータは、２個のｃＤＮＡは、異なるサイズのゲノム断片とハイブリダイズすることを示している。更に、ＧＡＤ６５とＧＡＤ６７ｃＤＮＡとの同一のヌクレオチド配列のうち最大の連続した配列は、たった１７ヌクレオチド塩基の長さである。従って、ＧＡＤ６７とＧＡＤ６５とは２個の異なる遺伝子によってコードされている。
Ｃ．ＧＡＤ６７及びＧＡＤ６５の酵素的比較
ＧＡＤ６７及びＧＡＤ６５の活性におけるＰＬＰの効果を比較する研究を行った。そのために、両方のｃＤＮＡをバクテリア中でその発現がてきるようなベクター中にサブクローニングした（Studier et al., J. Mol. Biol., 189:113, 1986）。ＧＡＤ６５ｃＤＮＡをｐＥＴ−８ｃベクターのＮｃｏＩ部位にサブクローニングし、かつＧＡＤ６７ｃＤＮＡをｐＥＴ−５ｃベクターのＮｈｅＩ部位にサブクローニングすることによって、“融合しない（ｆｕｓｉｏｎｌｅｓｓ）”ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７の過発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を実施した（Studier et al., J. Mol. Biol., 189:113, 1986）。
【００６２】
両方のｃＤＮＡを正しいフレーム内でサブクローニングするための両立性の付着末端を得るために、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ（ＵＳＢ）の指示する条件を用いて、混合物中における２００μＭ  ｄＮＴＰｓと１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２で、ＰＣＲによる選択的増幅を行い、ＡｍｐｌｉＴＡＱ（ＵＳＢ）の不確実さを減少するために５５℃、２０サイクルでアニーリングした。ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７に特異的なプライマーは、それぞれＮｃｏＩ及びＳｐｅＩ認識部位の１本のＤＮＡ鎖を含んでいた。ＧＡＤ６７のコーディング領域にはＮｈｅＩ制限部位があるので、ＳｐｅＩ（ＮｈｅＩと両立性）を用いた。
【００６３】
ＰＣＲ産物をそれぞれのｐＥＴベクターにサブクローニングし、ＤＨ５に形質転換して、上記のようにプレートした（Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Habor, NY, 1989）。コロニーを取り出して、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地中で一夜成育させた。正しい方向性を有するサブクローンを過発現のためにＢＬ２１（ＤＥ３）株（Studier et al., J.Mol.Biol. 189:113, 1986）に形質転換した。ネガティブコントロールとして、挿入物をもたないｐＥＴ−８ｃベクターを形質転換して、誘導した。１個のコロニーを取り出して、成育し、１ｍＭのイソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクト−ピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導して、文献（Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Habor, 17. 15-17. 16, 1989）記載のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。
【００６４】
ＧＡＤ活性を測定するために、ＯＤ６００−０．５のバクテリア培養物１０ｍｌを１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。誘導後２時間で、バクテリアを遠心して、ホモジェナイズ用バッファー（１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、１ｍＭ  臭化２−アミノエチルイソチオウロニウム（ＡＥＴ）、及び６０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．１）１ｍｌ中に再懸濁して、超音波処理した。超音波処理後、細胞カスを遠心で除去し、上澄み（少量の上澄みを−７０℃で貯蔵した）中のタンパク質濃度を測定した（Bradford, Anal. Biochem., 72:248, 1986）。文献（Legay et al., J.Neurochem., 46:1478, 1986）記載のように脳のホモジェネートを調製した。Krieger et al., J.Neurochem., 33:299, 1984の記載に従って、０．２ｍＭ  ＰＬＰの存在下、又は不存在下に、インキュベーション混合物中に脳ホモジェネート又はバクテリア溶菌物２０μｌを入れて、ＧＡＤ活性を測定した。バクテリア溶菌物中の１４ＣＯ２の生産量は、インキュベーション時間及びタンパク質濃度に比例していた。
【００６５】
【表１】
2007236390.tif 000002
表１に示すように、ＧＡＤ６５又はＧＡＤ６７を含むバクテリア溶菌物は［１−１４Ｃ］−グルタミン酸と、ＧＡＢＡ及び１４ＣＯ２との変換を触媒する。
【００６６】
ＰＬＰは、ＧＡＤ６７よりもＧＡＤ６５の酵素活性を刺激する。このより大きな刺激は多分、Ｍａｒｔｉｎ及びその共同研究者（Martin, Cell. Mol. Neurobiol., 7:237, 1987）が提唱した不活化サイクルを通して、ＧＡＤ６５がより速く循環することを示している。このより速い循環は、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在するａｐｏ−ＧＡＤのプールに、ＧＡＤ６５がより貢献していることを示している（Miller et al., Brain Res. Bull., 5(Suppl. 2):89, 1980）。従って、ｉｎ  ｖｉｖｏではＰＬＰは、ＧＡＤ６７活性よりもＧＡＤ６５活性をより制御していると考えられる。
【００６７】
バクテリア溶菌物中のＧＡＤ６５活性は、ラット黒質から調製したシナプトソーム中に見られるＧＡＤ活性の５倍のＰＬＰ刺激にほぼ等しい（Miller et al.,
J. Neurochem., 33:533, 1979）。いずれのＧＡＤも、粗ラット脳ホモジェネート中のＧＡＤ活性よりもバクテリア中に加えたＰＬＰにより依存するので、バクテリア溶菌物の内在ＰＬＰの濃度は、ラット脳ホモジェネートよりも少ないかも知れない。
Ｄ．ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７の免疫学的同定
上記のようにしてラット脳ホモジェネートとバクテリア溶菌物を抽出した。Harlow et al., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Habor, NY, 1988に記載されたように、各サンプルに等量の電気泳動用バッファーを加えた。ＳＤＳ中の１０％アクリルアミドゲルで電気泳動を行って、タンパク質を分離し、電気泳動的にニトロセルロースに移した（Harlow et al., Antibodies, A Labratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory,
Cold Spring Habor, NY, 1988）。未反応部位を、２％ウシ血清アルブミン（フラクションＶ）、１％ゼラチン、及び１％トリトン−Ｘ−１００を含むリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）を用いて、４２℃で、１時間ブロックした。洗浄後、ニトロセルロースフィルターを３つの部分に切断し、以下の一次抗体と共にインキュベーションした：レーン１から４は、ＧＡＤ６７及びＧＡＤ６５の両方を認識するOertel et al., Neuroscience, 6:2689, 1981 の抗血清の１／２０００希釈液と共に；レーン５から８は、ＧＡＤ６５のみを認識するＫ−２抗血清の１／２０００希釈液と共に；レーン９から１２は、ＧＡＤ６５に特異的なＧＡＤ−６モノクローナル抗体（Chang et al., J. Neurosci., 8:2123, 1988）の１／２０００希釈液と共にインキュベーションした。全てのフィルターをよく洗浄して、適当な二次抗体をインキュベーションして、洗浄した。結合した抗体を１２５Ｉ−標識蛋白質Ａ及びオートラジオグラフィーにより検出した。各レーンは以下のものを含んでいた：レーン１、５及び９は、ＢＬ２１（ＤＥ３）＋ｐＥＴ−ＧＡＤ６７；レーン２、６及び１０は、ＢＬ２１（ＤＥ３）＋ｐＥＴ−ＧＡＤ６５；レーン３、７及び１１は、ラット脳ホモジェネート；そしてレーン４、８及び１２は、ＢＬ２１（ＤＥ３）＋ｐＥＴ−８ｃ。
【００６８】
バクテリア産出性のＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７のイムノブロットは、ＧＡＤ６５が脳抽出物中の小さいＧＡＤとよく対応し、そしてＧＡＤ６７は大きい形とよく対応することを示している（図１３）。これまでの研究は、ＧＡＤ６７がネコＧＡＤ６７及びマウスＧＡＤ６７にとっての大きいＧＡＤと対応することを示している（Katarova et al., Eur. J.Neurosci., 2:190, 1990; 235, 1987）。バクテリア産出性のＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７の可動性（Oertel et al., Neuroscience, 6:2689, 1981の抗血清で検出した場合）は、ラット脳ホモジェネートに見られる免疫反応ダブレットと同じである。
【００６９】
ラット脳中のＧＡＤの低分子量及び高分子量形は、それぞれＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７ｃＤＮＡの産物と、抗原的にまた大きさ的に同じものである。その結果、ラット脳中の２つのＧＡＤは、ＧＡＤ６５とＧＡＤ６７である。このデータから、既に報告されているタピア（Ｔａｐｉａ）によるＰＬＰ−依存性ＧＡＤと、ＰＬＰ−非依存性ＧＡＤ（Bayon et al., J.Neurochem., 29:519, 1977）は、それぞれＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７と分子的に同じものである、と結論付けることができる。Ｍａｒｔｉｎ及びその共同研究者（Spink et al., Brain Res., 421:235, 1987）は、ラット脳ＧＡＤには４つの運動力学的に異なる形が存在することを報告している。しかしながら、これらの形のイムノブロッティング試験（ここで用いたような抗血清を用いる）については報告されていない。
Ｅ．脳組織中のＲＮＡにおけるＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７の分布
インサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーションを用いて、小脳のＲＮＡにおけるＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７の分布を決定するための実験を行った。
【００７０】
ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７ｃＤＮＡからの、それぞれ３．２ｋｂ及び２．３ｋｂの転写物を、Wuenschell et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83:6193, 1986 の方法に従って、３５Ｓで放射性標識した。２００ｂｐの加水分解断片を、ラット小脳の冠状セクションとハイブリダイズさせた。動物はハロタンで麻酔して断首した。脳をドライアイス中で急速に冷凍して、冠状凍結セクション（１２μｍ）を、新たに調製したリン酸緩衝液（ＰＢＳ；１３０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中の４％ホルムアルデヒド中で、３０分間固定した。組織を勾配化エタノール溶液中で脱水し、−７０℃で貯蔵した。
【００７１】
組織の透過性を増加するために、セクションを以下の前処理に付した：勾配化エタノール溶液（９５％、８５％、７０％、５０％及び３０％エタノール中に各５分）中での再水和；ＰＢＳ（５分）；０．０２Ｎ  ＨＣｌ（１０分）；ＰＢＳ（５分）；ＰＢＳ中の０．０１％トリトンＮ−１０１（１分）；ＰＢＳ（２×５分）；１μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（７．５分）；及びＰＢＳ中のグリシン（プロテイナーゼＫを阻害するため）（３×５分）。プロテイナーゼＫは使用前に３７℃で３０分間消化した。次いでセクションを３７℃、５０％ホルムアミド、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．２％  ＳＤＳ，０．０２％  ＢＳＡ、０．００２％  フィコル、０．０２％  ポリビニルピロリドン、２５０μｇ／ｍｌ  イーストｔＲＮＡ、２５０μｇ／ｍｌ  ポリＡ、及び２５ｍＭ  ＰＰＥＳ（ｐＨ６．８）中でインキュベーションした。
【００７２】
ハイブリダイゼーションのためには、１００ｍＭ  ＤＴＴ、１０％  硫酸デキストラン、及びセンス又はアンチセンスの３５Ｓ−ＲＮＡを、プレハイブリダイゼーション溶液に加えた。プローブ（センス又はアンチセンス）約３ｎｇ（１０６ｃｐｍ）を含むハイブリダイゼーション溶液の少量（５０μｌ）をスライド上に加えた。各スライドはカバーをして、５０℃で１６時間インキュベーションし、次いでシリコン処理したカバーを４×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ−１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、６０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）で短時間洗浄することによって除去した。
【００７３】
次いでセクションをリボヌクレアーゼＡ（０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  チオ硫酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．０中、５０μｇ／ｍｌ）で、３７℃、２０分間処理して、２×ＳＳＣ中、室温で２時間リンスし、１０ｍＭ  チオ硫酸ナトリウム中、５５℃で３０分間リンスした。セクションをエタノール中で脱水し、キシレン中で脱脂して、Ｋｏｄａｋ  ＮＴＢ２エマルジョンでコーティングし、４℃で１０日間露光した。エマルジョンをＫｏｄａｋ  Ｄ１９で現像して、組織をクレシルバイオレットで対比染色した。
【００７４】
反射偏光を用いてオートラジオグラフ粒子を検出し、粒子数、密度、ｎｄ細胞領域をＡｎａｌｙｔｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓイメジアナライザーシステムで測定した。バックグラウンドレベルが低いために、細胞が“標識された”と定義するための基準を、５以上の集団化した粒子の存在においた。ＧＡＤ標識された細胞が脳中に分散して見受けられ、個々の細胞上の粒子数の測定を可能とした。細胞と、粒子によって覆われた領域との境界によって、１細胞当たりの領域数の計算が可能となった。染色された細胞と、上におかれた粒子とを同時に見ることができるように、反射偏光と透過光との両方を用いて、高倍率（８００×）で分析を行った。数は、“ｎ”細胞の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である。
【００７５】
【表２】
2007236390.tif 000003
全ての神経性細胞タイプにおいて、ＧＡＤ６７ｍＲＮＡレベルの方が大きい。ｉｎ  ｓｉｔｕでのハイブリダイゼーションにおける観察は、小脳中の非依存性ＧＡＤ活性に対するＰＬＰの依存率は、試験した脳領域中で最も低いものの一つである、という従来の知見（Nitsch, J. Neurochem., 34:822, 1980; Denner et
al., J. Neurochem., 44:957, 1985; Itoh et al, Neurochem. Res. 6:1283, 1981）と一致している。更に、表２に示すように、ＧＡＤ６７ｍＲＮＡに対する量は、プルキニエ＞ゴルジＩＩ＞籠＞星細胞の順であり、一方ＧＡＤ６５に対する量は、ゴルジＩＩ＞プルキニエ＞籠＞星細胞の順である。
【００７６】
このようにＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７ｍＲＮＡの発現はニューロンのクラスによって異なる。つまり、全ＧＡＤ活性に対するそれぞれの貢献度が、いかにＧＡＢＡ生産が制御されているかに影響している。例えば、黒質は、ＰＬＰ−非依存性ＧＡＤ活性に対して、最も高いＰＬＰ−依存率の一つを含む（Nitsch, J. Neurochem., 34:822, 1980）。ＧＡＢＡ異化作用の阻害剤を局部的に注射することによって、黒質におけるＧＡＢＡ濃度を増加させることは、発作感受性（ｓｅｉｚｕｒｅ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）の減少に特に有効である（Gale, Fed. Proc., 44:2414, 1985）。従って、ＰＬＰ−アンタゴニストによって誘導される発作を受ける実験動物は、特に黒質内の神経末端におけるＧＡＤ６５の阻害のために、発作の伝達を阻害することができない。
Ｆ．ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７の無細胞系配置
ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７の分布をＳ２及びシナプトソーム無細胞分画において評価した。Ｓ２は、脳中の全細胞の細胞質ゾルからなる高速上澄みであり、一方シナプトソーム分画は、主として神経終末からなる（Gray et al., J.Anat., Lond, 96:79, 1962）。これらの研究のためには、全ラット脳分画を、Booth and
Clark（Booth, et al.）Biochem.J., 176:365, 1978に記載するように行った。タンパク質濃度をSchaffner and Weissman (Schaffner et al., Anal. Biochem.
56:502, 1973）の方法によって測定した。Kaise et al., DNA Cloning, Vol. 1, A Practical Approach, D. M. Glover ed., IRL Press, Oxford, 1985, pp. 38-40 に記載の方法でサンプルを調製し、ＧＡＤ−６モノクローナル抗体及びＫ−２抗血清を用いて上記のようにしてイムノブロッティングを行った。等量のタンパク質（１６μｇ）を各レーンに加えた。オートラジオグラフィーは、１、３、１０、３０、１００μｇのタンパク質濃度で、Ｋ−２抗血清及びＧＡＤ−６モノクローナル抗体の両方と抗体結合した１２５Ｉ−タンパク質Ａの量が線状に増加する応答を示している（データ示さず）。
【００７７】
この結果は、どちらの分画にも等量のＧＡＤ６７が存在することを示している。Ｓ２分画は神経膠（及びその他の非ニューロン性）の細胞質ゾルタンパク質と、ニューロン細胞とを含んでいるので、ＧＡＤ６７の濃度は、神経末端よりもニューロン細胞体部における方が大きいに違いない。これとは対照的に、ＧＡＤ６５の濃度はＳ２よりもシナプトソームにおける方が大きい。これらの無細胞分画実験は、ＧＡＤ６５とは対照的に、神経末端よりもニューロンの細胞体部において、はるかに大きいＧＡＤ６７分画が存在することを示唆している。従って、免疫組織化学的研究におけるのと同様に、無細胞分画化は、ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７が異なる無細胞分布を有していることを示している。
【００７８】
ＧＡＢＡの合成及び分解阻害剤を用いるｉｎ  ｖｉｖｏの実験において、ニューロン細胞体部におけるＧＡＢＡプールは、神経末端におけるＧＡＢＡブールとは異なることを示唆している（Iadarola et al., Mol. Cell. Biochem., 39:305, 1981）。ＧＡＤ６７によって生産されるＧＡＢＡは細胞代謝において（例えばＧＡＢＡシャントにおいて）、そして神経細胞樹状突起シナプスにおいて、より係わっている。僧帽樹状突起と共に神経細胞樹状突起シナプスを形成し（Shepard, Physiol.Rev., 52:864, 1972）、そして多分ＧＡＢＡを放出している（McLennan, Brain Res., 29:177-184, 1971）嗅神経球にある顆粒細胞の樹状突起は、Ｋ−２抗血清で強く標識する。ここに示してはいないが、嗅神経球においてはＧＡＤ６５よりもＧＡＤ６７ｍＲＮＡレベルの方が大きい（２−３倍）ことが見いだされている。この分布は、嗅神経球におけるＧＡＤ活性のほとんどがシナプトソームにではなく、Ｓ２及びＰ１（粗核ペレット）に存在する、という知見（Quinn et al., Neurochem., 35:583, 1980）と一致している。
【００７９】
ＧＡＤ６５とＧＡＤ６７の無細胞分布の相違は、細胞体質の係留性（ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  ａｎｃｈｏｒｉｎｇ) 又は未知のタンパク質標的機構によるものかも知れない。いくつかの細胞体質タンパク質では、ＧＡＤ６５とＧＡＤ６７で似た分布を有している。例えば、培養交感神経細胞において、Peng et al.,
J. Cell. Biol., 102:252, 1986は、タウの８４％は軸索に存在するが、一方ＭＡＰ−２の１００％が細胞体及び樹状突起に存在することを示した。更に、細胞体質タンパク質である、４３ｋｄのタンパク質が、アセチルコリンレセプターをその下にある膜細胞体質に係留するためのものである、と考えられている（Flucher et al., Neuron, 3:163, 1989）。
【００８０】
実施例３：臨床標本中のＧＡＤ自己抗体の検出
Ａ．材料及び方法
１．患者標本：  Ａｔｋｉｎｓｏｎ及びその共同研究者（Atkinson et al., Lancet, 335:1357-1360, 1990）の以前の研究から、４グループの患者の血清を選択した。このグループは以下のものからなる：グループ（１）以前にはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｆｌｏｒｉｄａ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃｌｉｎｉｃｓと呼ばれていた権威あるＮａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｄａｔａ  Ｇｒｏｕｐ（ＮＤＤＧ）の基準（Gleichman et al., Diabetes, 36:578-584, 1987）に従って診断された、１人の新規発病ＩＤＤ患者；グループ（２）家族に自己免疫疾患の病歴をなんら持たない、５人の無作為に選択された小島細胞細胞質抗体（ｉｓｌｅｔ  ｃｅｌｌ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＩＣＡ）ネガティブの非−糖尿病性コントロール；グループ（３）ＩＤＤの発病が記録される前の３から６６カ月間、血清が収集されてきた１３人；グループ（４）非−糖尿病性コントロール及び親族、及びＩＤＤ発病前に研究された人達；及びグループ（５）ＩＤＤＭの危険があるが、まだ発病には至っていない３人の患者。この後者のグループは、ＩＤＤ発端者の第１級親族５０００人以上、及び一般人８２００人（このうち４８１３人が学童である）の継続的ＩＣＡスクリーニングによって確認した。
２．小島細胞自己抗体：  血液型Ｏのクリオカット（ｃｒｙｏｃｕｔ）膵炎を間接免疫蛍光法でＩＣＡアッセイした（Atkinson et al., Lancet, 335:1357-1360, 1990）。全ての結果をコードしたサンプルで、各バッチにおけるネガティブ及びポジティブコントロール血清と比較しつつ解釈した。ＩＣＡポジティブの程度はＩＣＡ標準化（Gleichman et al., Diabetes, 36:578-584, 1987）のためのＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ（ＩＤＷ）によって確立されたガイドラインに沿って分析した。全てのポジティブな血清を端点（ｅｎｄ  ｐｏｉｎｔ）希釈によって滴定し、あらかじめ８０ユニットの国際若年層糖尿病協会（Ｊｕｖｅｎｉｌｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ：ＪＤＦ）標準に調製しておいた標準血清との比較によって、ＪＤＦユニットを測定した。ここで報告する研究においては、ポジティブなＩＣＡ結果とは１０ＪＤＦユニット又はそれ以上の応答力価で定義される。
３．ＨＬＡ  ＤＲタイピング：  ＤＲトレイ（Ｏｎｅ  Ｌａｍｄａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、Van Rood and Van Leuwen （Nature, 262:795-797, 1976 ）に記載の方法でＨＬＡ  ＤＲタイピングを実施した。
４．ヒトの小島細胞：  ヒト膵臓小島をカダベリン性（ｃａｄａｖｅｒｉｃ）膵炎から単離し、上記したように（Ricoedi et al., Diabetes, 37:413-420, 1988）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持した。小島細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで（９５％空気／５％ＣＯ２）３５Ｓメチオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，  Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）で代謝的に標識した。
５．小島細胞の抽出及び免疫沈降：  Atkinson et al., （Lancet, 335:1357-1360, 1990）に記載の方法で、以下の修飾を用いて小島細胞を抽出した。免疫沈降の研究のためには、小島細胞溶解物を、各１０００小島細胞毎にコントロール、ＩＤＤ血清（１００μｌ）、又はＧＡＤ−６（Chang et al., J. Neuro., 8:2123-2130, 1988）（トリスバッファー９９μｌ中に１μｌ）（Atkinson et al., Lancet, 335:1357-1360, 1990）のいずれかと共にインキュベーションする（２時間、４℃）ことによって、２度前処理した。次いで免疫複合体を、過剰のタンパク質ＡセファロースＣＬ−４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＮＪ）に吸着させた。次いで、非結合性（前処理した）溶解物を含む１０００個の小島細胞を含む少量を、ＩＤＤ又はコントロール血清（２５μｌ）、又はＧＡＤ−６（Chang et al., J.Neuro., 8:2123-2130, 1988 ）（トリスバッファー２５μｌ中に１μｌ）でインキュベーションした。タンパク質ＡセファロースＣＬ−４Ｂでもう一度インキュベーションした（１時間、４℃）後、複合体を０．１％  ＳＤＳ、１．０％  トリトンＸ−１１４、及び２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ７．４）で５回洗浄し、次いで二重蒸留水で１回洗浄した。タンパク質ＡセファロースＣＬ−４Ｂを次いでＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（Laemmli, Nature, 227:680-685, 1970）中で煮沸し、そのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＥｎｈａｎｃｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ）を用いる蛍光ラジオグラフィー（Ｋｏｄａｋ，Ｘ−ｏｍａｔ  ＡＲ５）に付した。或いは、オートラジオグラフをＢＥＴＡＧＥＮ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）アナライザーによって分析した。６４ＫＡのポジティブ又はネガティブの血清を各アッセイで用いて、アッセイ内コントロールとした。全ての蛍光ラジオグラフィーを分析して、既知のアッセイ内コントロールと比較してポジティブ又はネガティブと区分けした。ポジティブな血清サンプルは、もしもサンプルが６４，０００Ｍｘバンドの低い強度の免疫沈降であったなら、これを１とし、もしも中程度の強度のバンドが観察されたら２とし、そしてもしも免疫沈降タンパク質の強度が大きいときは、これを３とした。免疫沈降した３５Ｓ−ＧＡＤ６５及び３５Ｓ−ＧＡＤ６７に対応するバンドの強度についても同様の区分けを用いた。
６．免疫沈降：  ３５Ｓ−ＧＡＤ６５又は３５Ｓ−ＧＡＤ６７、及びヒト脳ホモジェネートからのＧＡＤを含むバクテリア溶解物の免疫沈降を、上記のヒト小島細胞抽出物の免疫沈降研究で記載したのと同様に行った。
７．ＧＡＤアッセイ：  ヒト脳ホモジェネートを、上記のヒト小島細胞で記載したように、患者血清と共にインキュベーションした。吸着及び洗浄後、タンパク質Ａアガローススラリーの少量を３回、等量で採取し、ＧＡＤ活性をKrieger et
al., Neurochem. 33:299, 1984に記載のように測定した。簡単に言うと、タンパク質Ａアガロースビーズを（１−１４Ｃ）−グルタミン酸（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共に、指定のインキュベーション混合物（Krieger et al., Neurochem., 33:299, 1984）中でインキュベーションし、液体シンチレーションカウンターで１４ＣＯ２の生産を定量した。
８．３５Ｓ−ＧＡＤ６５及び３５Ｓ−ＧＡＤ６７の生産：  ラットＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７ｃＤＮＡを上記したようにバクテリア発現系にサブクローンした。３５Ｓ−ＧＡＤの標識は、ＩＰＴＧ誘導化バクテリア（最小培地で成育）をＴＲＡＮ３５Ｓ−ラベル（ＩＣＮ）１５分間パルスすることによって行った。次いで培養物を遠心して、ホモジェナイズバッファー［１ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフロリド（ＰＭＳＦ），１ｍＭ  ２−アミノエチルイソチオウロニウムブロミド（ＡＥＴ）及び６０ｍＭ  リン酸カリウム、ｐｈ７．１］中に再懸濁して、超音波処理した。超音波処理の後、遠心によって細胞カスを除去し、上澄み（上澄みは−７０℃で少量貯蔵した）中のタンパク質濃度を測定した（Bradford, Anal. Biochem., 72:248, 1986）。
Ｂ．ＩＤＤＭ標本の免疫反応性
ＩＤＤＭを有する患者からの血清を用いて、ヒト脳ホモジェネートからのＧＡＤを沈降させる能力を試験した。
【００８１】
【表３】
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表３に示すように、ＩＤＤＭの危険があるか、或いはＩＤＤＭ患者の（５例のうち）４例の血清は、コントロール患者の血清よりも、有意に大量のヒト脳抽出物の酵素的に活性がＧＡＤと結合している。更に、患者のうちの１人からの血清は前−ＩＤＤＭ時期に採取されており、従ってＧＡＤに対する自己抗体はＩＤＤＭ症状の発病前に存在していたことになる（下のＣ参照）。
【００８２】
更に別の実験（結果を示さず）では、ＩＤＤＭの危険がある患者２人（ＤＡ，ＤＣ）からの血清は、組換え法で生産された３５Ｓ−ＧＡＤ６５を免疫沈降させるが、一方組換え法で生産された３５Ｓ−ＧＡＤ６７は、患者ＤＡの血清のみによって認識された（そしてこれは３５Ｓ−ＧＡＤ６５よりも弱い）ことを示した。またそれ以降の研究で、神経病の合併症を有するＩＤＤＭ患者の血清中には、ＧＡＤ６５よりもＧＡＤ６７自己抗体の力価が大きいことが見いだされた（ここでは示さず）。
【００８３】
患者ＤＡの血清を用いる別の研究において、ヒト膵臓小島細胞で生産される特異的ポリペプチドを認識する抗体の存在が示された。結合ポリペプチドの電気泳動分析によって、他の研究者によって以前にヒトＩＤＤＭ（Baekkeskov et al.,
Nature, 298:167-169, 1982）及び動物モデル（Baekkeskov et al., Science, 224:1348-1350, 1984; Atkinson et al., Diabetes, 37:1587-1590, 1988）で示されたような、６４ｋＤの成分に対する自己抗体の存在が明らかとなった。ＧＡＤ６５を認識するが、ＧＡＤ６７は認識しない、ＧＡＤ−６モノクローナルで、或いはバクテリアで生産されるＧＡＤ６５でこれらの血清をあらかじめ吸着させると、６４ｋＤの膵臓ポリペプチドを血清が認識する能力が失われる。従って６４ｋＤの自己抗原に対する自己抗体によって認識されるエピトープがＧＡＤ６５中に存在し、このことは該自己抗原がＧＡＤ６５であることを示唆している。ＧＡＤ６５の予測される値を調査するために、ＩＤＤＭの臨床的発現の発病前の患者から血清を採取して、このＧＡＤ６５に対する自己抗体を調べた。
【００８４】
【表４】
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表４に示すように、１２標本中の９標本（７５％）は３５Ｓ−ＧＡＤ６５と免疫反応性であった。更に、２人の患者（ＪＡ及びＶＣ）はこの条件下でＧＡＤ６７と免疫反応性であったが、ＧＡＤ６５とは免疫反応性でなかった。従って、組み合わせると、これらの患者の血清の１２例中、１１例（９１％）にＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７に対する自己抗体が存在した。このことは、ＧＡＤ６５に対する自己抗体はＧＡＤ６７に対する自己抗体よりも一般的であるが、アッセイにおいて両方の組換えＧＡＤ（ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７）を用いると、ＩＤＤＭをより広く予測できるようになることを示唆している。これらの血清についての以前の試験（Atkinson et al., Langet, 335:1357-1360, 1990）は、１２例のうちの１１例、又は９２％がヒト膵臓小島細胞からの３５Ｓ−６４ｋＤ分子と免疫反応性であることを示している。６４ｋＤ分子に対する検出可能な自己抗体を含むが、ＧＡＤ６５に対する自己抗体は含んでいない血清は、６４ｋＤ分子にとって最低の力価（又は“１”）を含む血清であった。従って、ここで得られた誤りのネガティブはこのアッセイの感度が低いために起きたことである。更に、このアッセイは、６４Ｋに対してネガティブな１人の患者（ＢＲ）においてＩＤＤＭを予測している。
【００８５】
これらの結果は、ヒト膵臓のβ−細胞中に同定された６４ｋＤ分子は、ラットＧＡＤ６５とサイズ及び抗原性が同一であることを示している。更に、ＩＤＤＭ発病前の患者から採取した血清は、ＧＡＤ６５に対する自己抗体を含んでいる。結論として、ＧＡＤ６５組換え分子は、ＩＤＤＭ予測の診断手段として非常に有用である。実際に症状がでる前に医師がＩＤＤＭを診断できるということは、疑いもなくインシュリン治療が必要となるまでの時間がおおいに伸びる結果となる。このような免疫アッセイの感度は、膵臓のβ−細胞に存在するＧＡＤ形を表すヒト由来の組換えＧＡＤ６５を用いて改良されるであろう。
【００８６】
ここに本発明を十分に開示したので、本発明の範囲を逸脱することなく、多くの変更並びに修飾が可能なことが当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７特異的ｃＤＮＡプローブを得るためのクローニング手順を示す。
【図２】ラットＧＡＤ６５のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列を示す（その１）。図２−図４が連続してラットＧＡＤ６５のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列を示すものである。
【図３】ラットＧＡＤ６５のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列を示す（その２）。
【図４】ラットＧＡＤ６５のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列を示す（その３）。
【図５】ヒトＧＡＤ６５のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列を示す（その１）。図５〜図８が連続してヒトＧＡＤ６５のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列を示すものである。
【図６】ヒトＧＡＤ６５のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列を示す（その２）。
【図７】ヒトＧＡＤ６５のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列を示す（その３）。
【図８】ヒトＧＡＤ６５のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列を示す（その４）。
【図９】ラットＧＡＤ６５とヒトＧＡＤ６５のアミノ酸配列の比較を示す（その１）。
【図１０】ラットＧＡＤ６５とヒトＧＡＤ６５のアミノ酸配列の比較を示す（その２）。
【図１１】ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７ｃＤＮＡの異なるサイズのＲＮＡへのハイブリダイズを示す。
【図１２】ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７に特異的なｃＤＮＡプローブでハイブリダイスしたサザンブロットを示す。
【図１３】ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７の免疫学的同定を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年4月9日(2007.4.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療的に有効量のＧＡＤポリペプチドを含み、ここで該ＧＡＤポリペプチドはリセプターと結合するものである、自己免疫応答を改善するための医薬組成物。
【請求項２】
ＧＡＤがＧＡＤ６５である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
ＧＡＤがＧＡＤ６７である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
ＧＡＤがＧＡＤ６５とＧＡＤ６７との混合物である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項５】
ＧＡＤがヒトＧＡＤである、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項６】
リセプターが、抗体及びＴ−ヘルパー細胞からなる群から選択される、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項７】
自己免疫疾患が、ＩＤＤＭ及びスティッフマン病からなる群から選択される、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項８】
非経口的に投与される、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項９】
非経口的投与を、皮下、筋肉内、腹腔内、空洞内、経皮、又は静脈内注射によって行う、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
投与を、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／回から約２０００ｍｇ／ｋｇ／回までの投与量で行う、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１１】
組換えＧＡＤ６５ポリペプチドを治療的に標識する、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１２】
治療的標識が、放射性同位体、医薬、レクチン、及び毒素からなる群から選択される、請求項１１記載の医薬組成物。