(57)【要約】【課題】分離性能に優れ、洗浄効率が良く、加工が容易であり、実質的に同一の分離性能を有するものを大量に生産可能な核酸の分離精製方法、及び該方法を実施に適した核酸分離精製ユニットを提供する。更に、高収量、高純度を維持したまま、抽出操作時の目詰まりを改善し、ライセート溶液、洗浄液の通過速度を向上させる。【解決手段】二個以上の開口を有する容器内に、溶液が内部を通過可能な固体材料を収容した核酸分離精製カートリッジを用いて、以下の工程により、ライセート通過時間、洗浄液通過時間を短くし、目詰まりを改善する。（ａ）生体材料を分散液で分散する工程、（ｂ）生体材料をカオトロピック塩などの溶解液で溶解させることで核酸を溶出させる工程、（ｃ）ピペッティング、攪拌を行う工程、（ｄ）水溶性有機溶媒を加える工程、（ｅ）ピペッティング、攪拌を行う工程、（ｆ）固体材料に核酸を吸着させる工程、（ｇ）洗浄する工程、（ｈ）回収液によりＲＮＡを脱着させる工程【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程から構成された核酸抽出法。
（ａ）以下の(i)または(ii)の工程により溶液を含んだ生体材料を調製する工程
(i)  リン酸緩衝溶液もしくはＢｉｓ−Ｔｒｉｓ（N,N-bis (2-hydroxyethyl) iminotri
s (hydroxymethyl) methane）緩衝溶液を含んだ生体材料を調製する工程
(ii)  生体材料中に含まれている緩衝溶液をＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝溶液に置換する工程
（ｂ）生体材料を溶解液と接触させることで、生体材料を溶解させ、生体材料中に含まれ
ている核酸を溶出させる工程
（ｃ）該工程（ｂ）で得られる核酸を溶出させた溶液に対して水溶性有機溶媒を加えるこ
とでライセート溶液を調製する工程
（ｄ）ライセート溶液と固体材料とを接触させることで溶解液中に含まれている核酸を固
体材料に吸着させる工程
（ｅ）固体材料中に残存している抽出対象核酸以外の不純物および溶解液を洗浄する工程
（ｆ）吸着させた核酸を回収液により固体材料から脱着させる抽出工程
【請求項２】
前記工程（ａ）において溶液が分散液であることを特徴とする請求項１記載の核酸抽出
法。
【請求項３】
前記工程（ａ）において溶液の濃度が０．０１から１０ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨが３から９で
あることを特徴とする請求項１記載の核酸抽出法。
【請求項４】
前記工程（ｂ）において溶解液にカオトロピック塩を含むことを特徴とする請求項１記載
の核酸抽出法。
【請求項５】
請求項４記載のカオトロピック塩の濃度が０．１から１０ｍｏｌ／Ｌであることを特徴
とする核酸抽出法。
【請求項６】
前記工程（ｂ）において溶解液に水溶性有機溶媒の濃度が５０体積％以下含まれている
ことを特徴とする請求項１記載の核酸抽出法。
【請求項７】
請求項６記載の溶解液に含まれる水溶性有機溶媒がメタノール、エタノール、イソプロパ
ノールまたはブタノールであることを特徴とする核酸抽出法。
【請求項８】
前記工程（ｂ）において溶解液に界面活性剤が含まれていることを特徴とする請求項１
記載の核酸抽出法。
【請求項９】
請求項８記載の溶解液に含まれる界面活性剤の濃度が０．００１〜３０質量％であるこ
とを特徴とする核酸抽出法。
【請求項１０】
前記工程（ｂ）において溶解液を加えた後に、少なくとも１回のピペッティング操作を
行うことを特徴とする請求項１記載の核酸抽出法。
【請求項１１】
前記工程（ｂ）において溶解液を加えた後またはピペッティング操作の後に、攪拌を行
うことを特徴とする請求項１記載の核酸抽出法。
【請求項１２】
前記工程（ｃ）において核酸を含む溶解液に水溶性有機溶媒を１０体積％から６０体積
％になるように加えて、ライセート溶液を調製することを特徴とする請求項１記載の核酸
抽出法。
【請求項１３】
前記工程（ｃ）において用いる水溶性有機溶媒がメタノール、エタノール、イソプロパ
ノール、ブタノールであることを特徴とする請求項１２記載の核酸抽出法。
【請求項１４】
前記工程（ｃ）において水溶性有機溶媒を加えた後に、少なくとも一回のピペッティング
操作または攪拌を行うことを特徴とする請求項１記載の核酸抽出法。
【請求項１５】
請求項１４記載の攪拌時間が０．１から６００秒であることを特徴とする核酸抽出法。
【請求項１６】
前記工程（ｃ）において水溶性有機溶媒を加え、攪拌またはピペッティングを行った後
、さらにピペッティングまたは攪拌を行うことを特徴とする請求項１４記載の核酸抽出法。
【請求項１７】
請求項１６記載の攪拌時間が０．１から６００秒であることを特徴とする核酸抽出法。
【請求項１８】
前記工程（ｆ）において回収液の浸漬時間が０．１秒から１６００秒であることを特徴
とする請求項１記載の核酸抽出法。
【請求項１９】
細胞数が５０００００個以下の場合に、８００μＬ以下のライセート液量を用いること
を特徴とする請求項１記載の核酸抽出法。
【請求項２０】
細胞数が５０００００個以上の場合に、３００μＬ以上のライセート液量を用いること
を特徴とする請求項１記載の核酸抽出法。
【請求項２１】
前記工程（ｄ）において、表面が水酸基から構成されている固体材料を用いることを特
徴とする請求項１記載の核酸抽出法。
【請求項２２】
前記工程（ｄ）において、固体材料がカートリッジに保持されている容器を用いること
を特徴とする請求項１記載の核酸抽出法。
【請求項２３】
前記工程（ｄ）においてカオトロピック塩を含む溶液を予め通過させた固体材料とライ
セート溶液と接触させることを特徴とする請求項１記載の核酸抽出法。
【請求項２４】
前記工程（ｃ）においてライセート溶液を２つ以上の容器に分注することで抽出を行う
ことを特徴とする請求項１記載の核酸抽出法。
【請求項２５】
前記工程（ｃ）において一つのカートリッジにライセート溶液を二回以上入れることを
特徴とする請求項１の核酸抽出法。
【請求項２６】
前記工程（ｄ）、工程（ｅ）及び工程（ｆ）のいずれかにおいて、ライセート溶液、洗
浄液及び回収液のうちの少なくともいずれか一つが、圧力変化もしくは遠心により固体材
料と接触させる工程を含むことを特徴とする請求項１記載の核酸抽出法。
【請求項２７】
核酸がＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびプラスミドのうちのいずれかひとつまたはその
混合物であることを特徴とする請求項１記載の核酸抽出法。
【請求項２８】
生体材料が培養細胞、動物細胞、動物組織、植物細胞、植物組織、ウイルス、細菌、真
菌または核酸であることを特徴とする請求項１記載の核酸抽出法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体材料から核酸を抽出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
主として核酸の抽出法は、溶液状態で行う方法と、核酸を含む溶液と固体材料とを接触
させ核酸を吸着後、洗浄し、脱着することで行う固体材料を介した方法との二種類がある
。
溶液状態で行う方法の中で、最も古くから行われている抽出法は、エタノールで沈殿さ
せた核酸をガラス棒に絡ませて行う方法である。この方法は、非常に簡便であるが、収量
や純度に大きな問題がある。
【０００３】
これらを改良する方法として、例えば、ＲＮＡを抽出する場合、非特許文献１に記した
グアニジンチオシアネートを加えて細胞を溶解させた後、酸性条件下でフェノールを用い
て共存するＤＮＡを除去するＡＧＰＣ（Acid Guanidinium Phenol Chloroform）法、ＲＮ
ＡがＤＮＡやタンパク質と比較して浮遊密度が高いことを利用したグアニジン−塩化セシ
ウム遠心法などがある。しかしながら、フェノールやクロロホルムなどの有害な有機化合
物を使用すること、分子量が小さなＲＮＡの回収が困難であること、煩雑な操作が必要で
精度ある抽出を行うためには熟練した技術が必要であることなど多くの欠点がある。
【０００４】
これらの欠点を改良する方法として、細胞を溶解するとともに、ヌクレアーゼなどの核
酸の分解を促進する酵素の活性を阻害するグアニジンチオシアネートなどのカオトロピッ
ク塩を用い、エタノールを加えることで作成したライセート溶液とシリカなどの固体材料
とを接触させることで核酸を吸着し、洗浄後核酸を脱着させる方法が開発された（非特許
文献２）。
【０００５】
これとは別の方法で、磁性シリカ粒子を用いた核酸抽出法が開発され、反応効率、洗浄
効率の改善が行われた。さらに、多孔質膜を用いた核酸抽出法が開発され（特許文献１）
、高純度の核酸を短時間で、簡便な手法で得られるようになった。
【特許文献１】特開２００３−１２８６９１号公報
【非特許文献１】P.D.Siebert, A.Chenchik,Nucleic Acids Res.,21,2019-2020 (1993).
【非特許文献２】R. Boom et al., Journal of Clinical Microbiology, 28, 495-503 (1990).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明の目的は、検体中の核酸を固相表面に吸着させた後、洗浄等を経て脱着
させて核酸を分離精製する方法を提供することである。本発明の別の目的は、分離性能に
優れ、洗浄効率が良く、加工が容易であり、実質的に同一の分離性能を有するものを大量
に生産可能である固相を使用した核酸の分離精製方法、及びその方法を実施するのに適し
た核酸分離精製ユニットを提供することである。本発明のさらに別の目的は、特殊な技術
、複雑な操作、および特殊な装置を必要とせずに、簡便かつ迅速に小型の装置を用いて、
核酸を分離精製することである。本発明のさらに別の目的は、抽出操作時の目詰まりを改
善し、高収量、高純度を維持したまま、ライセート溶液、洗浄液の通過速度を向上させる
ことである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明では、生体材料を溶解させることで、生体材料中に含まれている核酸成分を、固
体材料、例えば、多孔質膜などをカートリッジなどの容器に固定化させた容器と接触させ
ることで、核酸を分離・精製することである。この際、ライセート溶液、洗浄液の通過時
間を短くするとともに、従来の方法では目詰まりし、処理できなかった細胞種、細胞数を
目詰まりせずに通過させるための方法に関するものである。この様な方法を開発するため
に、分散液、特にリン酸緩衝液、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液を用い、さらに、生体材料を溶
解する作用を持つ溶解液中の界面活性剤、カオトロピック塩の濃度、種類、溶解液添加後
のピペッティング、水溶性有機溶媒を添加した後の攪拌、固体材料を収納したカートリッ
ジ、例えば、二個の開口を有する容器内に多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジ
、このカートリッジに収納した膜の細孔サイズなど種々検討した条件を併用することで、
上記課題を達成できることを見出し、本発明を完成したものである。即ち、本発明は、下
記の構成よりなるものである。
【０００８】
１．以下の工程から構成された核酸抽出法
（ａ）以下の(i)または(ii)の工程により溶液を含んだ生体材料を調製する工程
(i)  リン酸緩衝溶液もしくはＢｉｓ−Ｔｒｉｓ（ N,N- bis (2-hydroxyethyl) iminot
ris (hydroxymethyl) methane）緩衝溶液を含んだ生体材料を調製する工程
(ii)  生体材料中に含まれている緩衝溶液をＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝溶液に置換する工程
（ｂ）生体材料を溶解液と接触させることで、生体材料を溶解させ、生体材料中に含まれ
ている核酸を溶出させる工程
（ｃ）該工程（ｂ）で得られる核酸を溶出させた溶液に対して水溶性有機溶媒を加えるこ
とでライセート溶液を調製する工程
（ｄ）ライセート溶液と固体材料とを接触させることで溶解液中に含まれている核酸を固
体材料に吸着させる工程
（ｅ）固体材料中に残存している抽出対象核酸以外の不純物および溶解液を洗浄する工程
（ｆ）吸着させた核酸を回収液により固体材料から脱着させる抽出工程
【０００９】
２．前記工程（ａ）において溶液が分散液であることを特徴とする上記第１項記載の核酸
抽出法
３．前記工程（ａ）において溶液の濃度が０．０１から１０ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨが３から９
であることを特徴とする上記第１項記載の核酸抽出法
４．前記工程（ｂ）において溶解液にカオトロピック塩を含むことを特徴とする上記第１
項記載の核酸抽出法
５．上記第４項記載のカオトロピック塩の濃度が０．１から１０ｍｏｌ／Ｌであることを
特徴とする核酸抽出法
【００１０】
６．前記工程（ｂ）において溶解液に水溶性有機溶媒の濃度が５０体積％以下含まれてい
ることを特徴とする上記第１項記載の核酸抽出法
７．上記第６項記載の溶解液に含まれる水溶性有機溶媒がメタノール、エタノール、イソ
プロパノール、ブタノールであることを特徴とする核酸抽出法
８．前記工程（ｂ）において溶解液に界面活性剤が含まれていることを特徴とする上記第
１項記載の核酸抽出法
９．上記第８項記載の溶解液に含まれる界面活性剤の濃度が０．００１〜３０質量％であ
ることを特徴とする核酸抽出法
１０．前記工程（ｂ）において溶解液を加えた後に、少なくとも１回のピペッティング操
作を行うことを特徴とする上記第１項記載の核酸抽出法
１１．前記工程（ｂ）において溶解液を加えた後もしくはピペッティング操作の後に、攪
拌を行うことを特徴とする上記第１項記載の核酸抽出法
【００１１】
１２．前記工程（ｃ）において核酸を含む溶解液に水溶性有機溶媒を１０体積％から６０
体積％になるように加えて、ライセート溶液を調製することを特徴とする上記第１項記載
の核酸抽出法
１３．前記工程（ｃ）において用いる水溶性有機溶媒がメタノール、エタノール、イソプ
ロパノール、ブタノールであることを特徴とする上記第１２項記載の核酸抽出法
１４．前記工程（ｃ）において水溶性有機溶媒を加えた後に、少なくとも一回のピペッテ
ィング操作もしくは攪拌を行うことを特徴とする上記第１項記載の核酸抽出法
１５．上記第１４項記載の攪拌時間が０．１から６００秒であることを特徴とする核酸抽
出法
１６．前記工程（ｃ）において水溶性有機溶媒を加え、攪拌もしくはピペッティングを行
った後、さらにピペッティングもしくは攪拌を行うことを特徴とする上記第１４項記載の
核酸抽出法
１７．上記第１６項記載の攪拌時間が０．１から６００秒であることを特徴とする核酸抽
出法
【００１２】
１８．前記工程（ｆ）において回収液の浸漬時間が０．１秒から１６００秒であることを
特徴とする上記第１項記載の核酸抽出法
１９．細胞数が５０００００個以下の場合に、８００μＬ以下のライセート液量を用いる
ことを特徴とする上記第１項記載の核酸抽出法
２０．細胞数が５０００００個以上の場合に、３００μＬ以上のライセート液量を用いる
ことを特徴とする上記第１項記載の核酸抽出法
【００１３】
２１．前記工程（ｄ）において、表面が水酸基から構成されている固体材料を用いること
を特徴とする上記第１項記載の核酸抽出法
２２．前記工程（ｄ）において、固体材料がカートリッジに保持されている容器を用いる
ことを特徴とする上記第１項記載の核酸抽出法
２３．前記工程（ｄ）においてカオトロピック塩を含む溶液を予め通過させた固体材料と
ライセート溶液と接触させることを特徴とする上記第１項記載の核酸抽出法
【００１４】
２４．前記工程（ｃ）においてライセート溶液を２つ以上の容器に分注することで抽出を
行うことを特徴とする上記第１項記載の核酸抽出法
２５．前記工程（ｃ）において一つのカートリッジにライセート溶液を二回以上入れるこ
とを特徴とする上記第１項記載の核酸抽出法
２６．前記工程（ｄ）、工程（ｅ）及び工程（ｆ）のいずれかにおいて、ライセート溶液
、洗浄液及び回収液のうちの少なくともいずれか一つが、圧力変化もしくは遠心により固
体材料と接触させる工程を含むことを特徴とする上記第１項記載の核酸抽出法
２７．核酸がＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、プラスミドのいずれかひとつもしくはそれらの
混合物であることを特徴とする上記第１項記載の核酸抽出法
２８．生体材料が培養細胞、動物細胞、動物組織、植物細胞、植物組織、ウイルス、細菌
、真菌、核酸であることを特徴とする上記第１項記載の核酸抽出法
【発明の効果】
【００１５】
検体中の核酸を固相表面に吸着させることができ、洗浄などを経て核酸を脱着させ、特
殊な技術、複雑な操作、および特殊な装置を必要とせずに、簡便かつ迅速に、分離精製、
抽出できる。さらに、本発明の抽出法により、従来の方法よりも、より多くの細胞数、詰
まりが発生しやすい細胞種を目詰まりすることなく、より短時間でライセート溶液、洗浄
液が通過し、同一細胞数では、従来法よりも高速な核酸抽出法を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
生体材料、例えば、細胞から核酸成分を分離精製する際、カオトロピック塩などを含む
溶解液により細胞を溶解し、水溶性有機溶媒を添加することでライセート溶液を作成する
が、この際に、溶解液中に溶解させた核酸を凝集させるとともに、核酸以外から由来する
成分も凝集し、この様な凝集物を含むライセート溶液を固体材料、例えば、多孔質膜を通
過させると、これらの成分が多孔質膜中の細孔を塞ぐ、もしくは、細孔表面に沈着するこ
とで、ライセート溶液、洗浄液の通過時間が長くなる。その結果、目詰まり成分が多い場
合、例えば、処理する細胞数が多い場合には、目詰まりが発生する可能性が高くなる。本
発明では、ライセート溶液調製法、抽出法、洗浄法、核酸回収法を種々検討することで、
これらの問題点を解決するに至った。
【００１７】
本発明の核酸抽出法は、下記の工程（ａ）〜（ｆ）を少なくとも含むものである。
（ａ）緩衝液等の分散液を用いて生体材料を分散させる工程（以下、「分散工程」とも言
う。）
（ｂ）生体材料を溶解液と接触させることで、生体材料を溶解させるとともに生体材料中
に含まれている核酸を溶出させる工程（以下、「溶解工程」とも言う。）
（ｃ）核酸を溶出させた溶液に対して水溶性有機溶媒を加えることでライセート溶液を調
製する工程（以下、「ライセート工程」とも言う。）
（ｄ）ライセート溶液と固体材料とを接触させることで溶解液中に含まれている核酸を固
体材料に吸着させる工程（以下、「吸着工程」とも言う。）
（ｅ）洗浄液により核酸が吸着した状態で固体材料を洗浄する工程（以下、「洗浄工程」
とも言う。）
（ｆ）回収液により固体材料から核酸を脱着させ、上記カートリッジ容器外に排出する工
程（以下、「回収工程」とも言う。）
【００１８】
本発明で言うところの目詰まりとは、ライセート溶液もしくは洗浄液の通過速度が０と
なった場合、もしくは、ライセート溶液もしくは洗浄液の通過時間がある敷居値以上、例
えば、１２０秒以上になった場合を目詰まりと呼ぶ。
【００１９】
生体材料から核酸を抽出する場合には、予めこれらの生体材料を適当な分散液に分散さ
せておくことが好ましい。この時、ペレット化した細胞を使用する場合には、凍結されて
いることが多いので、分散性の向上の観点から、融解しておくほうが好ましい。
分散液の種類は、浸透圧の違いによる生体材料の破裂、収縮が最小限であり、細胞を分
散させることが可能なものであれば、どの様なものでも用いることが出来る。この様な溶
液として、例えば、緩衝液を挙げることができる。
【００２０】
緩衝剤としては、通常用いられるｐＨ緩衝剤（buffer）を挙げることができる。この中
でも、生化学用のｐＨ緩衝剤が好ましい。本発明者らが鋭意検討を行った結果、緩衝液の
中でもＢｉｓ−Ｔｒｉｓ(N,N-bis (2-hydoroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) metha
ne）緩衝液は通過時間が短く、目詰まりを起こす可能性が低いことを明らかにしたので、
好適として用いることが出来る。
【００２１】
分散液の液量は特に指定しないが、細胞数が多いほど分散液量を増加させて使用するこ
とが好ましい。しかし、ライセート液量による制限を受ける場合には、ライセート中の生
体材料を溶解させる成分、例えば、細胞を溶解する能力を持ち、なおかつ、細胞から溶出
したＲＮＡなどのヌクレアーゼ分解酵素の働きを阻害する作用を有するカオトロピック塩
の濃度もしくは量が少なくなり、このことは、生体材料を十分に溶解できない可能性、Ｒ
ＮＡなどの核酸の分解作用を有するヌクレアーゼの活性を抑える作用が十分に機能せず収
量の低下を招く可能性が高くなる。この事から、分散液の液量は可能な限り少ない方が好
ましい。一方で、ライセート液量の制限を受けない場合、分散液量を多くすることは可能
であるが、分散液量を多くするとカオトロピック塩の濃度を一定以上にするためにはライ
セート液量を増加させる必要があり、ライセート液量の増加は通過時間の増加、特にライ
セート溶液の通過時間が長くなることから、ライセート液量を必要以上に増加させること
は好ましくない。これらのことから、本発明で使用する分散液の液量は、好ましくはライ
セート液量の８０体積％以下、更に好ましくは５０体積％以下、最も好ましくは２０体積
％以下の液量であることが好ましい。
【００２２】
分散液は、細胞が浸透圧などの作用により全壊もしくは部分的に分解しないような濃度
で使用することが好ましい。分散液の濃度は、ライセート溶液および洗浄液の通過時間に
影響を及ぼす。例えば、分散液としてＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．５）を用い、液
量として３０μＬを用いる場合、分散液の濃度が低いと、ライセート溶液、洗浄液の通過
時間が長くなる。分散液の濃度が高いと細胞が部分的に溶解し、細胞内の核酸やタンパク
などが溶出し、溶出した核酸分解酵素の作用などにより核酸が分解され、核酸の収量が低
下する可能性がある。これらのことから、本発明では、分散液の濃度は、０．０１ｍｏｌ
／Ｌ以上、１０ｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、さらに好ましくは、０．１ｍｏｌ
／Ｌ以上、１ｍｏｌ／Ｌ以下であることが望ましい。また分散液のｐＨは、好ましくは３〜９、さらに好ましくは５．５〜８．５である。
【００２３】
分散液の液量は、細胞数や細胞種によって調整することが出来る。例えば、ＨＬ６０の
場合、細胞数が５００００００個以下の場合、使用者の負荷軽減から分散液を使用せずと
も抽出は可能であるが、分散液を使用する方が再現性良く、高収量で核酸が得られること
が多いので使用する方が好ましい。細胞数が１００００００個以上の場合、分散液を使用
する方が好ましい。分散液を使用しない場合、また液量を少量しか使用しない場合には、
核酸の収量が低くなり、また、収量にバラツキが生じる可能性が高くなる場合がある。こ
れは、細胞の濃度が高くなり、溶解液を加えることで、細胞が十分に溶解しきれていない
未溶解物から構成された構造物を形成し、その結果、核酸などの抽出したい成分が構造物
内に取り込まれことが原因と推定している。以上の事から、本発明では、分散液を用いる
ことが好ましく、細胞数が多い場合には、分散液を用いることは特に好ましい。
【００２４】
ペレット化させた細胞を調製する際に一般的に使用されるＰＢＳ（Phsphate Buffered 
Saline）を可能な限り取り除きＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液に変更、もしくはＰＢＳを含むペ
レット化細胞にＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液を添加することで、抽出時のライセート溶液、洗
浄液の通過時間を大幅に短くすることができる。これらのことから、本発明では、ＰＢＳ
などの通過時間を長くさせる原因となる分散液もしくは成分を取り除いてから、別の分散
液を添加することで、細胞を再分散させることもできる。
【００２５】
溶解液中のカオトロピック塩としては、特に限定は無く、公知のカオトロピック塩を使
用することができる。カオトロピック塩としては、グアニジン塩、イソチアン酸ナトリウ
ム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、尿素、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化カ
ルシウム、臭化アンモニウム、過塩素酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシア
ン酸カリウム、アンモニウムイソチオシアネート、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化
アンモニウム等を使用することができる。中でもグアニジン塩が好ましい。グアニジン塩
としては、塩酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジン、グアニジンチオシアン酸塩（
チオシアン酸グアニジン）が挙げられ、中でも塩酸グアニジンまたはグアニジンチオシア
ン酸塩が好ましい。これらの塩は単独でも、複数組み合わせて用いてもよい。
【００２６】
溶解液中のカオトロピック塩の濃度は、本発明者らが鋭意検討を行った結果、細胞を十
分に溶解することが出来、調製したライセート溶液、洗浄液の通過時間が短い濃度を使用
すれば特に指定はしない。低濃度カオトロピック塩から調製した溶解液は、細胞を十分に
溶解させることができず、ライセート溶液、洗浄液の通過速度は著しく速くなったが、核
酸を全く回収することが出来なかった。通過速度が速くなった理由は、部分的に溶解した
細胞が、固体材料中の細孔内に入らず、固体材料の上面に堆積したためと推定している。
また、部分的に溶解した生体材料から、核酸を分解する酵素が溶出し、核酸を分解し、収
量が低下する可能性も高くなる。これらのことから、溶解液に用いるカオトロピック塩の
濃度は、高いほうが好ましい。
【００２７】
カオトロピック塩の濃度が高くなるとともに生体材料が徐々に分解し、それとともに核
酸回収量は増加したが、ライセート溶液、洗浄液の通過時間も大幅に長くなった。更に濃
度を高くすると、顕微鏡で観察する限りにおいて、細胞は完全に溶解し、ライセート溶液
、洗浄液の通過時間も短くなり、核酸の回収量も大幅に向上した。
【００２８】
更にカオトロピック塩の濃度を高くしても、ライセート溶液、洗浄液の通過時間は大幅
には短くならず、核酸の回収量もほぼ一定のままであった。しかし、カオトロピック塩を
含む溶解液の水に対する溶解性が低下し、溶解液の調製が困難になるとともに、低温下で
調製した溶解液からカオトロピック塩が析出する問題が発生した。
【００２９】
以上の事から、カオトロピック塩の濃度は高いほど好ましい。しかし、溶解液の調製の
しやすさ、カオトロピック塩の低温での析出を考慮すると、カオトロピック塩の濃度は、
０．１から１０ｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．５ｍｏｌ／Ｌから５ｍｏｌ／Ｌ以
下がより好ましく、３ｍｏｌ／Ｌから４．５ｍｏｌ／Ｌの範囲が最も好ましい。
【００３０】
ライセート溶液のｐＨが低いとライセート溶液の通過時間、洗浄液の通過時間は短くな
った。ライセート溶液のｐＨを制御する方法として、分散液に使用している緩衝液でｐＨ
を制御する方法、溶解液中に緩衝液を加えることでｐＨを制御する方法、ライセート溶液
を調製する際の水溶性有機溶媒に緩衝液を加える方法、洗浄液に緩衝液を加える方法、も
しくは予めこれらの溶液に添加しておくのではなく、緩衝液を準備しておき、後から添加
する方法などを用いることが出来る。
【００３１】
これらの方法で、使用可能な緩衝剤としては、通常用いられるｐＨ緩衝剤（ｂｕｆｆｅ
ｒ）を挙げることができる。好ましくは、生化学用のｐＨ緩衝剤が挙げられる。このよう
な緩衝剤としては、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液を用いることが出来る。
【００３２】
前記核酸可溶化試薬中の緩衝剤の濃度は、１〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることが好まし
く、溶解液調製後のｐＨは、好ましくはｐＨ３〜８、より好ましくはｐＨ４〜７、さらに
好ましくはｐＨ５〜７のものが用いることが好ましい。
【００３３】
溶解液は、核酸安定化剤を含むことが好ましい。本発明で言うところの核酸安定化剤と
は、検体中の核酸を安定に存在させることができる試薬のことである。これには、核酸そ
のものを安定に存在させることが出来る試薬であるとともに、核酸を不安定化、例えば、
核酸を分解するようなヌクレアーゼなどの核酸分解酵素による分解作用を低下もしくは完
全に阻害させることで、核酸を分解させない試薬をも含むものとする。核酸安定化剤は、
有機溶媒、カオトロピック塩、界面活性剤、緩衝剤および消泡剤の中から選ばれるいずれ
か１つ以上と共存させることが好ましい。
【００３４】
ヌクレアーゼの活性を不活性化させる作用を有する核酸安定化剤としては、一般的に還
元剤として使用される化合物を用いることができる。還元剤としては、水素、ヨウ化水素
、硫化水素、水素化アルミニウムリチウム、水素化ホウ素ナトリウム等の水素化化合物、
アルカリ金属、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム、亜鉛等の電気的陽性の大きい
金属、またはそれのアマルガム、アルデヒド類、糖類、ギ酸、シュウ酸などの有機酸化物
、メルカプト化合物等が挙げられる。中でもメルカプト化合物が好ましい。メルカプト化
合物としては、Ｎ−アセチルシステイン、メルカプトエタノールや、アルキルメルカプタ
ン等が挙げられる。メルカプト化合物は単独または複数組み合わせて用いてもよい。
【００３５】
核酸安定化剤は、溶解液における濃度が０．０１〜２０質量％であることが好ましく、
より好ましくは、０．０３〜１５質量％で用いることができる。メルカプト化合物は、溶
解液における濃度が０．０１〜２０質量％であることが好ましく、より好ましくは、０．
０５〜１５質量％で用いることができ、最も好ましくは、０．０５〜５質量％で用いるこ
とができる。
また、メルカプト化合物の溶解液中の濃度が高いほど、ライセート溶液、洗浄液の通過
時間を短くする効果をも有する。しかし、作業者の作業環境性からあまり高濃度を使用す
ることは出来ない。これらの点からも、メルカプト化合物の溶解液中の濃度は、０．０１
〜２０質量％であることが好ましく、より好ましくは、０．０５〜１５質量％で用いるこ
とができ、最も好ましくは、０．０５〜５質量％で用いることができる。
【００３６】
本発明者らは、溶解液中に界面活性剤を加えることによって、ライセート溶液の通過時
間、洗浄液の通過時間を短くすることが出来ることを見出した。加える界面活性剤として
は、例えば、ノニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、両性界面
活性剤が挙げられる。
【００３７】
本発明においてはノニオン界面活性剤およびカチオン界面活性剤を好ましく用いること
ができる。
ノニオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活
性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤、脂肪酸アルカノールアミドが
挙げられ、好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤である。ポリ
オキシエチレン（ＰＯＥ）アルキルエーテル系界面活性剤の中でも、ＰＯＥデシルエーテ
ル、ＰＯＥラウリルエーテル、ＰＯＥトリデシルエーテル、ＰＯＥアルキレンデシルエー
テル、ＰＯＥソルビタンモノラウレート、ＰＯＥソルビタンモノオレエート、ＰＯＥソル
ビタンモノステアレート、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット、ＰＯＥアル
キルアミン、ＰＯＥアセチレングリコールがさらに好ましい。
カチオン界面活性剤としては、セチルトリメチルアンモニウムプロミド、ドデシルトリ
メチルアンモニウムクロリド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルピ
リジニウムクロリドが挙げられる。
【００３８】
界面活性剤の濃度を鋭意検討した結果、界面活性剤の濃度を高くするとともに、ライセ
ート溶液通過時間、洗浄液通過時間が短くなった。しかし、界面活性剤の濃度を高くしす
ぎると、カオトロピック塩の種類によっては核酸回収量の低下を招くとともに、泡の発生
が問題となった。これらの結果から、本発明では界面活性剤の溶液中の濃度は、０．００１質量％〜３０質量％、特に好ましくは０．１質量％〜７．５質量％にすることが好ましい。また、界面活性剤を使用することで、ライセート溶液が泡立ち易くなるので、操作のし易さから界面活性剤を全く使用しなくとも十分な性能が得られるのであれば、使用しなくとも良いし、消泡剤を用いても良い。
【００３９】
消泡剤としては、シリコン系消泡剤（例えば、シリコーンオイル、ジメチルポリシロキ
サン、シリコーンエマルジョン、変性ポリシロキサン、シリコーンコンパウンドなど）、
アルコール系消泡剤（例えば、アセチレングリコール、ヘプタノール、エチルエキサノー
ル、高級アルコール、ポリオキシアルキレングリコールなど）、エーテル系消泡剤（例え
ば、ヘプチルセロソルブ、ノニルセロソルブ−３−ヘプチルコルビトールなど）、油脂系
消泡剤（例えば、動植物油など）、脂肪酸系消泡剤（例えば、ステアリン酸、オレイン酸
、パルミチン酸など）、金属セッケン系消泡剤（例えば、ステアリン酸アルミ、ステアリ
ン酸カルシウムなど）、脂肪酸エステル系消泡剤（例えば、天然ワックス、トリブチルホ
スフェートなど）、リン燐酸エステル系消泡剤（例えば、オクチルリン酸ナトリウムなど
）、アミン系消泡剤（例えば、ジアミルアミンなど）、アミド系消泡剤（例えば、ステア
リン酸アミドなど）、その他の消泡剤（例えば、硫酸第二鉄、ボーキサイトなど）などが
挙げられる。これらの消泡剤は、単独または複数組み合わせて用いてもよい。特に好まし
くは、シリコン系消泡剤とアルコール系消泡剤の２つの成分を組み合わせて使用すること
である。
消泡剤の溶解液中における濃度は０．１〜１０質量％であることが好ましい。
【００４０】
溶解液中に水溶性有機溶媒を混合しておくことで、洗浄液の通過時間を大幅に短くする
ことが出来る。本発明で言うところの水溶性有機溶媒とは、水溶性有機溶媒の濃度が水に
溶かした状態で１００％以下のものを含むものとする。本発明者らが鋭意検討した結果、
ライセート溶液、洗浄液の通過時間が短く、一回の溶出工程で核酸が抽出膜からより多く
溶出され、核酸の回収量が高くなる水溶性有機溶媒濃度を見出すに至った。
【００４１】
水溶性有機溶媒を添加する利点として、前記以外に、溶解液に含まれる各種試薬の溶解
性を上げることができる。また、溶解液量の増加による、ライセート溶液、洗浄液の通過
時間の短縮、核酸回収量増加の効果も挙げることが出来る。本発明のようなカートリッジ
を使用した抽出システムの場合、カートリッジサイズが固定されていることから、そのカ
ートリッジ内にアプライ可能な最大ライセート液量はカートリッジサイズに依存する。こ
れらのことは、選択したカートリッジサイズから計算されるアプライ可能な最大液量、す
なわちライセート液量を超えて抽出操作を行うためには、カートリッジをより大きなもの
に交換することが必要となり、抽出機の設計をやり直す可能性も生る。これらの問題を解
決するために、本発明者らが鋭意検討した結果、本発明のライセート溶液作成法として、
生体材料に対して溶解液を加えた後に、水溶性有機溶媒を加えているが、この水溶性有機
溶媒の液量を可能な限り減らし、減らすことで得られた液量分を溶解液量の液量増加に使
う方法を見出すに至った。この点からも、溶解液中に水溶性有機溶媒を混合しておくこと
は重要である。
【００４２】
溶解液中の水溶性有機溶媒の濃度を鋭意検討した結果、水溶性有機溶媒を加えれば加え
るほど、ライセート溶液通過時間、洗浄液通過時間が短く、核酸回収量も高くなった。し
かし、溶解液中の水溶性有機溶媒の濃度が高ければ高いほど、核酸回収工程における一回
の溶出操作で溶出可能な核酸収量が減少し、数回の抽出操作を行わなければ、予測した核
酸の収量を得ることが出来なかった。
この様に、アルコールの溶解液中での濃度を高くしすぎると、核酸の回収効率が低下す
ることから、溶解液中に水溶性有機溶媒を用いる場合には、溶解液中のアルコール濃度が
７０体積％以下であることが好ましく、５０体積％以下がより好ましく、２５体積％以下
が特に好ましい。
【００４３】
溶解液中に加える水溶性有機溶媒の種類は、アセトン、アルコール類、ジメチルホルム
アミド等が挙げられる。中でも、アルコール類が好ましい。アルコール類は、１級アルコ
ール、２級アルコール、３級アルコールのいずれでも良い。とりわけメタノール、エタノ
ール、プロパノール及びその異性体、ブタノール及びその異性体をより好ましく用いるこ
とができる。これらの中でも、環境負荷の低減、有毒性の観点からエタノールが特に好ま
しい。これらの水溶性有機溶媒は単独でも複数組み合わせて用いてもよい。
また、ライセート溶液、洗浄液の通過時間が十分に速ければ、水溶性有機溶媒を加えな
くとも良い。この様な例として、例えば、低細胞数を取り扱う場合を挙げることが出来る
。
【００４４】
検体は、溶解液を添加する前、溶解液を添加した後、ライセート溶液を調製した後、い
ずれの工程でホモジナイズ処理を行ってもかまわない。ホモジナイズ処理することで、通
過時間を遅くするような成分、すなわち、目詰まりの原因となる物質が粉砕され、目詰ま
りの改善および通過時間の向上を行うことが出来ると推定している。ホモジナイズ処理は
、例えば、超音波処理、鋭利な突起物を用いる処理、高速攪拌処理を用いる処理、微細空
隙から押し出す処理、針を備えた注射器での処理、ペレットペッスル処理、ピペッティン
グ、ガラス、ステンレス、ジルコニアなどのビーズを用いる処理、これらの組み合わせ等
で行うことができる。
【００４５】
ホモジナイズの方法は、特に限定されない。例えば、混合する際、攪拌装置により３０
から１００００ｒｐｍで１秒から３分間処理することが好ましく、３００から７０００ｒ
ｐｍで１秒から１分間処理がより好ましく、３０００から６０００ｒｐｍで５秒から３０
秒間処理が最も好ましい。
【００４６】
本発明では、溶解液を加えた後にピペッティングを行うことが好ましい。特に、細胞数
が多い場合、例えば、１００００００個以上の細胞を処理する場合には、ピペッティング
は有効である。ピペッティングを行う際は、溶解液を加えたピペットを用いて、溶解液を
加えると同時に行うことが望ましい。
【００４７】
ピペッティングの効果は以下のように推定している。分散液中の細胞濃度の増加に伴っ
て、分散させた細胞の密度が増加し、溶解液を加えることで、溶解した生体材料から構成
された構造物の密度が高い部分が発生する可能性が高くなる。この構造物が形成されると
構造物内部に存在する核酸が溶解液中およびライセート溶液中に放出されにくくなるとと
もに、カオトロピック塩の生体材料に対する濃度比が構造物内で低下し、生体材料の溶解
が進みにくくなるとともに、核酸を分解する酵素の活性に対する阻害作用が低下し、放出
された核酸が分解される可能性が高くなり、収量が低下し細胞半分解物が多孔質膜を詰ま
らせる推定している。ピペッティングを溶解液添加直後に行う理由は、この様な半溶解の
生体材料が形成される前に、ピペッティングもしくは攪拌によって半溶解した細胞の細胞
密度を低下させるため、もしくは、形成したとしてもピペッティングによりこの様な構造
物をバラバラにするためである。また、半溶解した構造物の形成状態にバラツキが生じれ
ば、核酸の収量のバラツキおよびライセート溶液、洗浄液の通過時間のバラツキに影響を
与えると推定している。ピペッティング及び攪拌操作はこれらのバラツキを低減させる効
果も有する。
【００４８】
以上から、本発明では、細胞数が多い場合には、ピペッティングを行うことが望ましく
、ピペッティング回数は特に指定しないが、少なくとも１回以上、５０回以下行うことが
好ましく、3回以上、10回以下行うことがより好ましい。また、細胞数が少ない場合、例
えば、５００００００個以下の場合、もしくはピペッティング操作を行わなくとも十分早
い通過速度が得られ、核酸の収量が高く、収量が安定しているのであれば、使用者の負担
を軽減すること、抽出操作前処理時間の短縮化の点からピペッティングをより少ない回数
にするか、全く行わなくとも良い。
【００４９】
本発明では、生体材料を溶解させることで調製した溶解液に対してピペッティング操作
を行って作成した溶解液、もしくは生体材料を溶解させることで調製した溶解液に対して
、攪拌操作を行うことが好ましい。攪拌時間を長くすればするほど、ライセート溶液通過
時間、洗浄液通過時間が短くなり、核酸回収量が増加し、核酸回収量が安定化する。攪拌
時間は、細胞数が少ない場合、例えば、浮遊細胞ＨＬ６０の場合、１００００００個以下
の場合には、この工程の前の工程、すなわち、ピペッティング工程のみで攪拌がなくとも
、もしくは攪拌時間が１分以下でも回収可能であることから、攪拌操作をなくしても、ま
た、攪拌時間を１分以下にしてもかまわない。
【００５０】
以上の工程によって調製した生体材料を溶解し核酸を溶出させた溶解液中に、水溶性有
機溶媒を添加し、核酸を吸着する固体材料と接触させる。該固体材料としては、特に限定
されず、ナイロン等を利用することもできるが、表面に水酸基を有する固体材料であるこ
とが好ましい。この操作により、試料溶液中の核酸が固体材料の表面に吸着、特に表面に
水酸基を有する有機高分子に吸着、多孔膜の場合はフイルター表面、細孔に捕捉および吸
着されるのが本発明の核酸吸着メカニズムと推定している。本発明では、水溶性有機溶媒
として、特に限定はしないが、アルコール類を好ましく用いることができる。アルコール
類としては、１級アルコール、２級アルコール、３級アルコールのいずれでもよく、メタ
ノール、エタノール、プロパノール又はその異性体、ブタノール又はその異性体を好まし
く用いることができる。これら水溶性有機溶媒は、単独でも複数組み合わせて用いてもよ
い。特に好ましい水溶性有機溶媒として、エタノールを用いることが出来る。
【００５１】
加える水溶性有機溶媒の濃度は、ライセート溶液を調製した時の濃度で１０体積％から
６０体積％になるように加える。水溶性有機溶媒の濃度が低いと核酸の収量は低下する。
これは、ライセート溶液が膜を通過している間に膜に保持すべき核酸が膜に結合せずに通
過液側に移動してしまい、核酸の回収量が低下すると推定している。水溶性有機溶媒の濃
度が高いと通過時間は短いもののその収量は著しく低下する。これは、目詰まりの原因と
なる物質が高水溶性有機溶媒濃度下で凝集することでそのサイズが大きくなり、その結果
、膜の細孔内に凝集物は入ることができず、膜の上面に堆積し、それら沈殿物から形成さ
れた堆積物内の空間を通って、ライセートなどの溶液、洗浄液が非常に通過しやすくなっ
たと推定している。
【００５２】
以上の検討結果から、本発明では水溶性有機溶媒の濃度は、ライセート溶液を調製した
時の濃度で１０体積％から６０体積％にすることが必要であり、特に好ましくは、２０体
積％から４０体積％が好ましい。
【００５３】
水溶性有機溶媒を加えた後、少なくとも一回のピペッティング操作もしくは攪拌操作も
しくはこれらの両方を行うことが好ましい。攪拌操作を行う場合には、試料一本ずつ行い
、一回で行うこともできるが、攪拌を二回行い、最初の攪拌では検体一本ずつ行い、二回
目の攪拌では検体をまとめて行うほうが使用者の負担軽減の観点からより好ましい。これ
らの操作は、検体数が多い場合には、特に有効である。
【００５４】
具体的には、例えば、一本以上の検体に対する抽出操作の場合、一回目の攪拌では一本
ずつ水溶性有機溶媒を添加した直後に攪拌を行い、二回目の攪拌では、検体をまとめて攪
拌を行う。一回目の攪拌を行う時は、可能な限り水溶性有機溶媒と生体材料を溶解させた
溶解液との接触面積が最小になるように、また、接触時間が最小になるように処理するこ
とが望ましい。この様な傾向は、細胞数が多ければ多いほど顕著である。この様な現象を
防止するために、水溶性有機溶媒を加えた直後に、攪拌を行うことが好ましい。
【００５５】
一回目の攪拌時間は、攪拌時間が長ければ長いほど、ライセート溶液および洗浄液の通
過速度が速くなり、核酸の収量も増加し、ライセート溶液、洗浄液通過時間、核酸回収量
も安定化する。これは、溶解液を加えることで生体材料が溶解した際の未溶解部分もしく
は水溶性有機溶媒を加えることで生成した目詰まり原因物質が、攪拌操作によって小さく
なることが原因と推定している。
【００５６】
二回目の攪拌時間も攪拌時間が長ければ長いほど、ライセート溶液および洗浄液の通過
速度は速くなり、核酸の回収量が増加し、ライセート溶液および洗浄液の通過速度、核酸
の収量が安定化する。理由は、一回目の攪拌と同じであると推定している。
【００５７】
さらに、攪拌時間が長ければ長いほど、一回の溶出操作で溶出する核酸の量が増加する
。例えば、細胞種としてＨＬ６０を用いた場合、細胞数が１０００００００個の場合には
、攪拌時間を一分以上にしなければ、一回の抽出操作で予測される収量が得られず、一分
以下では数回の溶出、もしくはより大容量の抽出液が必要となる。
【００５８】
攪拌時間は、一回目も二回目も０．１秒以上６００秒以下であれば良く、１０秒以上１
２０秒以下が特に好ましい。また、使用者の負担軽減から、一回目の攪拌時間を短く、二
回目の攪拌時間を一回目よりもより長くする方が好ましい。
攪拌操作と同様に、ピペッティングの回数を増やせば増やすほど、ライセート溶液、洗
浄液の通過時間が短くなり、核酸の収量が向上する。
【００５９】
使用する細胞数が少ない場合には、使用者の負担軽減の観点から、一回の攪拌操作、も
しくはピペッティング操作だけでもかまわない。
細胞数が少ない場合には、より少ないライセート液量でも細胞を十分に溶解させること
ができ、抽出も可能である。ライセート液量が少ないと、ライセート溶液の通過時間が短
くなる。また、核酸の回収量も増加する。これは、ライセート溶液中の生体材料の濃度が
増加することから、核酸の濃度が増加し、ライセート液中の核酸凝集物のサイズが大きく
なることで、多孔質膜に捕捉されやすくなる事が原因と推定している。
【００６０】
細胞数が多い場合には、細胞を十分に溶解させるためにより多くの溶解液が必要である
。溶解液量、すなわち、カオトロピック塩の量が不足していると、細胞を不十分に溶解さ
せるばかりではなく、核酸分解酵素の阻害作用が低下し、生体材料から溶出した核酸が分
解される可能性が高くなり、収量が低下すると予想される。
【００６１】
以上の事から、本発明では、細胞数が５０００００個以下の場合に、８００μＬ以下の
ライセート液量を用い、細胞数が５０００００個以上の場合に、３００μＬ以上のライセ
ート液量を用いることが好ましい。
【００６２】
ライセート溶液は、表面張力は０．０５Ｊ／ｍ2以下であることが好ましく、また、粘
度は、１〜１００００ｍＰａであることが好ましく、比重は、０．８〜１．２の範囲であ
ることが好ましい。この範囲の溶液にすることで、次の工程において、ライセート溶液を
固体材料、例えば、核酸吸着性多孔性膜に通過させて核酸を吸着させた後に、残渣を除去
しやすくすることができ、好ましい。
【００６３】
本発明の核酸吸着性多孔性膜は、溶液が内部を通過可能なものである。ここで「溶液が
内部を通過可能」とは、膜の一方の面が接する空間と膜の他方の面が接する空間の間に圧
力差を生じさせた場合に、高圧の空間側から低圧の空間側へと、膜の内部を溶液が通過す
ることが可能であることを意味する。または、膜に遠心力を掛けた場合に、遠心力の方向
に、膜の内部を溶液が通過することが可能であることを意味する。
【００６４】
また、本発明の核酸吸着性多孔性膜は、表面に親水基を有する膜であることが好ましい
。ここで親水基とは、水と相互作用を持つことができる有極性の基（原子団）を指し、核
酸の吸着に関与する全ての基（原子団）が当てはまる。親水基としては、水との相互作用
の強さが中程度のもの（化学大事典、共立出版株式会社発行、「親水基」の項の「あまり
親水性の強くない基」参照）が良く、例えば、水酸基、カルボキシル基、シアノ基、オキ
シエチレン基などを挙げることができる。好ましくは水酸基である。
【００６５】
ここで親水基を有する多孔性膜とは、多孔性膜を形成する材料自体が親水基を有する多
孔性膜、または多孔性膜を形成する材料を処理またはコーティングすることによって親水
基を導入した多孔性膜を意味する。多孔性膜を形成する材料は有機物、無機物のいずれで
も良い。例えば、多孔性膜を形成する材料自体が親水基を有する有機材料である多孔性膜
、親水基を持たない有機材料の多孔性膜を処理して親水基を導入した多孔性膜、親水基を
持たない有機材料の多孔性膜に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入
した多孔性膜、多孔性膜を形成する材料自体が親水基を有する無機材料である多孔性膜、
親水基を持たない無機材料の多孔性膜を処理して親水基を導入した多孔性膜、親水基を持
たない無機材料の多孔性膜に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入し
た多孔性膜などを使用することができるが、加工の容易性から、多孔性膜を形成する材料
は有機高分子などの有機材料を用いることが好ましい。
【００６６】
親水基を有する材料の多孔性膜としては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒド
ロキシエチルメタアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアク
リル酸、ポリメタクリル酸、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異
なるアセチルセルロースの混合物などで、形成された多孔性膜を挙げることができるが、
特に水酸基を有する有機材料の多孔性膜、とりわけ水酸基を有する有機高分子からなる多
孔性膜を好ましく使用することができる。
【００６７】
水酸基を有する有機材料の多孔性膜として、多糖構造を有する材料が好ましく、アセチ
ル価の異なるアセチルセルロースの混合物から成る有機高分子の多孔性膜をより好ましく
使用することができる。アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物として、トリア
セチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物、トリアセチルセルロースとモノアセ
チルセルロースの混合物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチ
ルセルロースの混合物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物を好ま
しく使用する事ができる。特にトリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物
を好ましく使用することができる。トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混
合比（質量比）は、９９：１〜１：９９である事が好ましく、９０：１０〜５０：５０で
ある事がより好ましい。
【００６８】
更に好ましい水酸基を有する有機材料としては、特開２００３−１２８６９１号公報に
記載のアセチルセルロースの鹸化物が挙げられる。アセチルセルロースの鹸化物とは、ア
セチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理したものであり、トリアセチル
セルロースとジアセチルセルロース混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとモノアセ
チルセルロース混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノ
アセチルセルロース混合物の鹸化物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混
合物の鹸化物も好ましく使用することができる。より好ましくは、トリアセチルセルロー
スとジアセチルセルロース混合物の鹸化物を使用することである。トリアセチルセルロー
スとジアセチルセルロース混合物の混合比（質量比）は、９９：１〜１：９９であること
が好ましい。更に好ましくは、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の
混合比は、９０：１０〜５０：５０であることである。この場合、鹸化処理の程度（鹸化
率）で多孔性膜表面の水酸基の量（密度）をコントロールすることができる。
【００６９】
核酸の分離効率をあげるためには、水酸基の量（密度）が多いことが好ましい。鹸化処
理により得られる有機材料の鹸化率（表面鹸化率）が５％以上１００％以下であることが
好ましく、１０％以上１００％以下であることが更に好ましい。
【００７０】
また、水酸基を有する有機材料の表面積を大きくするために、アセチルセルロースの多
孔性膜を鹸化処理することが好ましい。
多孔性膜は、表裏対称性の多孔性膜であってもよいが、表裏非対称性の多孔性膜を好ま
しく使用することができる。
【００７１】
ここで、鹸化処理とは、アセチルセルロースを鹸化処理液(例えば水酸化ナトリウム水
溶液)に接触させることを言う。これにより、鹸化処理液に接触したセルロースのエステ
ル誘導体のエステル基が加水分解され、水酸基が導入され再生セルロースとなる。こうし
て作成された再生セルロースは、本来のセルロースとは、結晶状態等の点で異なっている
。また、鹸化率を変えるには、水酸化ナトリウムの濃度や処理時間を変えて鹸化処理を行
えば良い。鹸化率は、ＸＰＳにより、容易に測定することができる（例えば、カルボニル
基のピーク減少の程度で定めることができる）。
【００７２】
親水基を持たない有機材料の多孔性膜に親水基を導入する方法として、ポリマー鎖内ま
たは側鎖に親水基を有するグラフトポリマー鎖を多孔性膜に結合することができる。有機
材料の多孔性膜にグラフトポリマー鎖を結合する方法としては、多孔性膜とグラフトポリ
マー鎖とを化学結合させる方法と、多孔性膜を起点として重合可能な二重結合を有する化
合物を重合させグラフトポリマー鎖とする２つの方法がある。
【００７３】
まず、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法においては、ポリマーの
末端または側鎖に多孔性膜と反応する官能基を有するポリマーを使用し、この官能基と、
多孔性膜の官能基とを化学反応させることでグラフトさせることができる。多孔性膜と反
応する官能基としては、多孔性膜の官能基と反応し得るものであれば特に限定はないが、
例えば、アルコキシシランのようなシランカップリング基、イソシアネート基、アミノ基
、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基、エポキシ基、アリル基、メタクリ
ロイル基、アクリロイル基等を挙げることができる。ポリマーの末端、または側鎖に反応
性官能基を有するポリマーとして特に有用な化合物は、トリアルコキシシリル基をポリマ
ー末端に有するポリマー、アミノ基をポリマー末端に有するポリマー、カルボキシル基を
ポリマー末端に有するポリマー、エポキシ基をポリマー末端に有するポリマー、イソシア
ネート基をポリマー末端に有するポリマーが挙げられる。この時に使用されるポリマーと
しては、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、具体的に
は、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれら
の塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル
酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレンなどを挙げることができる。
【００７４】
多孔性膜を起点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させ、グラフトポリマ
ー鎖とする方法は、一般的には表面グラフト重合と呼ばれる。表面グラフト重合法とは、
プラズマ照射、光照射、加熱などの方法で多孔性膜表面上に活性種を与え、多孔性膜と接
するように配置された重合可能な二重結合を有する化合物を重合によって多孔性膜と結合
させる方法を指す。多孔性膜に結合するグラフトポリマー鎖を形成するのに有用な化合物
は、重合可能な二重結合を有しており、核酸の吸着に関与する親水基を有するという、２
つの特性を兼ね備えていることが必要である。これらの化合物としては、分子内に二重結
合を有していれば、親水基を有するポリマー、オリゴマー、モノマーのいずれの化合物を
も用いることができる。特に有用な化合物は親水基を有するモノマーである。特に有用な
親水基を有するモノマーの具体例としては、次のモノマーを挙げることができる。例えば
、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリセロ
ールモノメタクリレート等の水酸性基含有モノマーを特に好ましく用いることができる。
また、アクリル酸、メタアクリル酸等のカルボキシル基含有モノマー、もしくはそのアル
カリ金属塩及びアミン塩も好ましく用いることができる。
【００７５】
親水基を持たない有機材料の多孔性膜に親水基を導入する別の方法として、親水基を有
する材料をコーティングすることができる。コーティングに使用する材料は、核酸の吸着
に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料の
ポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロ
キシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリド
ン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、アセチル
セルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などを挙げることができる
が、多糖構造を有するポリマーが好ましい。
【００７６】
また、親水基を持たない有機材料の多孔性膜に、アセチルセルロースまたは、アセチル
価の異なるアセチルセルロースの混合物をコーティングした後に、コーティングしたアセ
チルセルロースまたはアセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理するこ
ともできる。この場合、鹸化率が５％以上１００％以下であることが好ましい。さらには
、鹸化率が１０％以上１００％以下であることが好ましい。
【００７７】
親水基を有する無機材料である多孔性膜としては、シリカ化合物を含有する多孔性膜を
挙げることができる。シリカ化合物を含有する多孔性膜としては、ガラスフィルターを挙
げることができる。また、特許公報第３０５８３４２号に記載されているような、多孔質
のシリカ薄膜を挙げることができる。この多孔質のシリカ薄膜とは、二分子膜形成能を有
するカチオン型の両親媒性物質の展開液を基板上に展開した後、基板上の液膜から溶媒を
除去することによって両親媒性物質の多層二分子膜薄膜を調整し、シリカ化合物を含有す
る溶液に多層二分子膜薄膜を接触させ、次いで前記多層二分子膜薄膜を抽出除去すること
で作製することができる。
【００７８】
親水基を持たない無機材料の多孔性膜に親水基を導入する方法としては、多孔性膜と親
水基をもつグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、分子内に二重結合を有してい
る親水基を有するモノマーを使用して、多孔性膜を起点として、グラフトポリマー鎖を重
合する２つの方法がある。
【００７９】
多孔性膜と親水基をもつグラフトポリマー鎖とを化学結合させる場合は、グラフトポリ
マー鎖の末端の官能基と反応する官能基を無機材料に導入し、そこにグラフトポリマーを
化学結合させる。また、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用し
て、多孔性膜を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する場合は、二重結合を有する化
合物を重合する際の起点となる官能基を無機材料に導入する。
【００８０】
親水基を持つグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有する
モノマーとしては、上記親水基を持たない有機材料の多孔性膜に親水基を導入する方法に
おいて記載した、親水基を有するグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有してい
る親水基を有するモノマーを好ましく使用することができる。
【００８１】
親水基を持たない無機材料の多孔性膜に親水基を導入する別の方法として、親水基を有
する材料をコーティングすることができる。コーティングに使用する材料は、核酸の吸着
に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料の
ポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロ
キシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリド
ン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、アセチル
セルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などを挙げることができる
。
【００８２】
また、親水基を持たない無機材料の多孔性膜に、アセチルセルロースまたは、アセチル
価の異なるアセチルセルロースの混合物をコーティングした後に、コーティングしたアセ
チルセルロースまたはアセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理するこ
ともできる。この場合、鹸化率が５％以上１００％以下であることが好ましい。さらには
、鹸化率が約１０％以上１００％以下であることが好ましい。
【００８３】
親水基を持たない無機材料の多孔性膜としては、アルミニウム等の金属、ガラス、セメ
ント、陶磁器等のセラミックス、もしくはニューセラミックス、シリコン、活性炭等を加
工して作製した多孔性膜を挙げることができる。
【００８４】
上記の核酸吸着性多孔性膜は、溶液が内部を通過可能であり、厚さが１０μｍ〜５００
μｍであることが好ましい。さらに好ましくは、厚さが５０μｍ〜２５０μｍである。洗
浄がし易い点、ライセート溶液、通過時間の短さの点から、厚さが薄いほど好ましい。
上記の溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜は、最小孔径が０．２２μｍ以上で
あることが好ましい。さらに好ましくは、最小孔径が０．５μｍ以上である。また、最大
孔径と最小孔径の比が２以上である多孔性膜を用いる事が好ましい。これにより、核酸が
吸着するのに十分な表面積が得られるとともに、目詰まりし難い。さらに好ましくは、最
大孔径と最小孔径の比が５以上である。
【００８５】
上記の、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜は、空隙率が５０〜９５％である
ことが好ましい。さらに好ましくは、空隙率が６５〜８０％である。また、バブルポイン
トが、０．１〜１０ｋｇｆ／ｃｍ2である事が好ましい。さらに好ましくは、バブルポイ
ントが、０．２〜４ｋｇｆ／ｃｍ2である。
【００８６】
上記の、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜は、圧力損失が、０．１〜１００
ｋＰａである事が好ましい。これにより、過圧時に均一な圧力が得られる。さらに好まし
くは、圧力損失が、０．５〜５０ｋＰａである。ここで、圧力損失とは、膜の厚さ１００
μｍあたり、水を通過させるのに必要な最低圧力である。
【００８７】
上記の、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜は、２５℃で１ｋｇ／ｃｍ2の圧
力で水を通過させたときの透水量が、膜１ｃｍ2あたり１分間で１〜５０００ｍＬである
ことが好ましい。さらに好ましくは、２５℃で１ｋｇ／ｃｍ2の圧力で水を通過させたと
きの透水量が、膜１ｃｍ2あたり1分間で５〜１０００ｍＬである。
【００８８】
上記の、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜は、一辺が５ｍｍの正方形の多孔
性膜をトリフルオロ酢酸５ｍＬに浸漬したときに、１時間以内では溶解しないが４８時間
以内に溶解するセルロース誘導体が、好ましい。また、一辺が５ｍｍの正方形の多孔質膜
をトリフルオロ酢酸５ｍＬに浸漬したときに１時間以内に溶解するが、ジクロロメタン５
ｍＬに浸漬したときには２４時間以内に溶解しないセルロース誘導体も好ましい。中でも
、一辺が５ｍｍの正方形の多孔質膜をトリフルオロ酢酸５ｍＬに浸漬したときに１時間以
内に溶解するが、ジクロロメタン５ｍＬに浸漬したときには２４時間以内に溶解しないセ
ルロース誘導体がより好ましい。
【００８９】
核酸吸着性多孔性膜中を、ライセート溶液を通過させる場合、ライセート溶液を一方の
面から他方の面へと通過させることが、液を多孔性膜へ均一に接触させることができる点
で、好ましい。核酸吸着性多孔性膜中を、ライセート溶液を通過させる場合、ライセート
溶液を核酸吸着性多孔性膜の孔径が大きい側から小さい側に通過させることが、目詰まり
し難い点で好ましい。
【００９０】
ライセート溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させる場合の流速は、液の多孔性膜への適
切な接触時間を得るために、膜の面積ｃｍ2あたり、２〜１５００μＬ／ｓｅｃである事
が好ましい。液の多孔性膜への接触時間が短すぎると十分な分離精製効果が得られず、長
すぎると操作性の点から好ましくない。さらに、上記流速は、膜の面積ｃｍ2あたり、５
〜７００μＬ／ｓｅｃである事が好ましい。
【００９１】
また、使用する溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜は、１枚であってもよいが
、複数枚を使用することもできる。複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、同一のものであって
も、異なるものであって良い。
複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、無機材料の核酸吸着性多孔性膜と有機材料の核酸吸着
性多孔性膜との組合せであっても良い。例えば、ガラスフィルターと再生セルロースの多
孔性膜との組合せを挙げることができる。また、複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、無機材
料の核酸吸着性多孔性膜と有機材料の核酸非吸着性多孔性膜との組合せであってもよい、
例えば、ガラスフィルターと、ナイロンまたはポリスルホンの多孔性膜との組合せを挙げ
ることができる。
【００９２】
少なくとも二個の開口を有する容器内に、上記のような溶液が内部を通過可能な核酸吸
着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジを好ましく使用することができる。ま
た、少なくとも二個の開口を有する容器内に、上記のような溶液が内部を通過可能な核酸
吸着性多孔性膜を複数枚収容した核酸分離精製カートリッジを好ましく使用することがで
きる。この場合、少なくとも二個の開口を有する容器内に収容される複数枚の核酸吸着性
多孔性膜は、同一のものであっても、異なるものであっても良い。
【００９３】
核酸分離精製カートリッジは、少なくとも二個の開口を有する容器内に、上記のような
溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を収容する以外、その他の部材を収容してい
ないことが好ましい。上記の容器の材料としては、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ
カーボネート、ポリ塩化ビニルなどのプラスチックを使用することができる。また、生分
解性の材料も好ましく使用することができる。また、上記の容器は透明であっても、着色
してあっても良い。
【００９４】
核酸分離精製カートリッジとして、個々の核酸分離精製カートリッジを識別する手段を
備えている核酸分離精製カートリッジを使用する事ができる。個々の核酸分離精製カート
リッジを識別する手段としては、バーコード、二次元バーコード、磁気テープ、ＩＣカー
ドなどが挙げられる。
また、少なくとも二個の開口を有する容器内から核酸吸着性多孔性膜を容易に取り出す
事が可能になっている構造を有した核酸分離精製カートリッジを使用することもできる。
【００９５】
核酸を膜から脱着させる場合の回収液と膜との浸漬時間を長くすることで、浸漬時間が
短い場合には、数回の抽出操作が必要であったのが、一回もしくはより少ない回数でより
多くの核酸を溶出させることが可能である。本発明者らが詳細に検討した結果、核酸を抽
出する際の浸漬時間が０．１秒以上６００秒以下であれば、十分な核酸を得ることが出来
た。
【００９６】
溶解液中の界面活性剤の濃度を上げると、ライセート溶液、洗浄液の通過時間が短くな
るが、予想される核酸の収量を得るためには、数回の抽出操作が必要となり、回収した核
酸の濃度が低下する問題点があったが、核酸を吸着させた膜と回収液との浸漬時間を増加
させることでより多くの核酸が回収できる。
【００９７】
作成したライセート溶液を二つ以上のカートリッジに分注することで、本来ならばより
少ない本数のカートリッジを使用した場合には、目詰まり、もしくはライセート溶液、洗
浄液の通過時間が遅くなるような検体でも通過させることが出来る。
【００９８】
洗浄工程により、最終的に得られるＲＮＡの回収量及び純度が向上し、必要なＲＮＡを
含む検体の液量を微量とすることができる。また、洗浄や回収操作を自動化することによ
って、操作を簡便かつ迅速に行うことが可能になる。洗浄工程は、迅速化のためには１回
の洗浄で済ませてもよく、また純度がより重要な場合には複数回洗浄を繰返すことが好ま
しい。
【００９９】
洗浄工程において、洗浄液は、チューブ、ピペット、又は自動注入装置、もしくはこれ
らと同じ機能をもつ供給手段を使用して、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カ
ートリッジへ供給される。供給された洗浄液は、核酸分離精製カートリッジの一の開口（
核酸混合物溶液を注入した開口）から供給され、該開口に結合された圧力差発生装置（例
えばスポイド、注射器、ポンプ、パワーピペットなど）を用いて核酸分離精製カートリッ
ジ内を加圧状態にして核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出さ
せることができる。また、洗浄液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させるこ
ともできる。さらには、核酸分離精製カートリッジの核酸混合物溶液を供給した一の開口
と異なる開口より洗浄液を供給し、排出させることも可能である。中でも、核酸分離精製
カートリッジの一の開口から供給し、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる
開口より排出させることが、洗浄効率が優れてより好ましい。
【０１００】
洗浄工程において、洗浄液の液温は４〜７０℃であることが好ましい。さらには、洗浄
液の液温を室温とすることがより好ましい。また洗浄工程において、洗浄工程と同時に核
酸分離精製カートリッジに器械的な振動や超音波による攪拌を与えることもできる。また
は遠心分離を行うことにより洗浄することもできる。
【０１０１】
洗浄工程において、洗浄液は、水溶性有機溶媒及び水溶性塩の少なくともいずれかを含
んでいる溶液であることが好ましい。洗浄液は、核酸吸着性多孔性膜に核酸と共に吸着し
た核酸混合物溶液中の不純物を洗い流す機能を有する必要がある。そのためには、核酸吸
着性多孔性膜から核酸は脱着させないが不純物は脱着させる組成であることが必要である
。この目的には、核酸はアルコール等の水溶性有機溶媒に対し難溶性であるので、核酸を
保持したまま核酸以外の成分を脱着させるのに水溶性有機溶媒が適している。また、水溶
性塩を添加することにより、核酸の吸着効果が高まるので、不純物および不要成分の選択
的除去作用を向上することができる。
【０１０２】
洗浄液に含まれる水溶性有機溶媒としては、アルコールを用いることができる。アルコ
ールとしては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−イソプロパノール、ブ
タノールが挙げられる。プロパノールとしては、イソプロパノール、ｎ−プロパノールの
いずれでもよく、ブタノールも直鎖状でも分岐状でもいずれでもよい。これらアルコール
は、複数種類を使用することもできる。中でもエタノールを用いることが好ましい。
洗浄液中に含まれる水溶性有機溶媒の量は、５〜１００質量％であることが好ましく、
５〜４０質量％であることがより好ましい。この範囲で、ＤＮＡのコンタミネーションが
増大することなく、目的のＲＮＡが多孔性膜から脱着することがなく、したがって、ＲＮ
Ａを純度よく、回収量を高くすることができ好ましい。
【０１０３】
一方、洗浄液に含まれる水溶性塩は、ハロゲン化物の塩であることが好ましく、中でも
塩化物が好ましい。また、水溶性塩は、一価または二価のカチオンであることが好ましく
、特にアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩が好ましく、中でもナトリウム塩及びカリウ
ム塩が好ましく、ナトリウム塩が最も好ましい。
水溶性塩が洗浄液中に含まれる場合、その濃度は１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好
ましく、その上限は不純物の溶解性を損なわない範囲であれば特に問わないが、１ｍｏｌ
／Ｌ以下であることが好ましく、０．１ｍｏｌ／Ｌ以下であることがより好ましい。より
さらに好ましくは、水溶性塩が塩化ナトリウムであり、とりわけ、塩化ナトリウムが２０
ｍｍｏｌ／Ｌ以上含まれていることが好ましい。
【０１０４】
洗浄液は、カオトロピック物質を含んでいないことが好ましい。これによって、回収工
程においてカオトロピック物質が混入する可能性を減らすことができる。回収工程時に、
カオトロピック物質が混入すると、しばしばＲＴ−ＰＣＲ反応等を行う場合の酵素反応を
阻害するので、後に酵素反応等を行う場合を考慮すると洗浄液にカオトロピック物質を含
まないことが理想的である。また、カオトロピック物質は、腐食性があり有害であるので
、この点でもカオトロピック物質を用いないで済むことは、実験者にとっても試験操作の
安全上極めて有利である。
ここで、カオトロピック物質とは、前記した尿素、塩酸グアニジン、イソチオシアン酸
グアニジン、チオシアン酸グアニジン、イソチオシアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム
、ヨウ化カリウムなどである。
【０１０５】
従来、核酸分離精製工程における洗浄工程の際、洗浄液がカートリッジなどの容器に対
する濡れ性が高いため、しばしば洗浄液が容器中に残留することになり、回収工程の際に
洗浄液が混入して核酸の純度の低下や次工程における反応性の低下などの原因となってい
る。したがって、カートリッジなどの容器を用いて核酸の吸着及び脱着を行う場合、吸着
、洗浄時に用いる液、特に洗浄液が、次工程以降に影響を及ぼさないように、カートリッ
ジ内に洗浄残液が残留しないことは重要である。
【０１０６】
したがって、洗浄工程における洗浄液が回収工程の回収液に混入することを防止して、
洗浄液のカートリッジ内への残留を最小限に留めるため、洗浄液の表面張力を０．０３５
Ｊ／ｍ2未満にすることが好ましい。表面張力が低いと、洗浄液とカートリッジの濡れ性
が向上し、残留する液量を抑えることができる。
しかし、洗浄効率を上げる為に、水の割合を増やすことができるが、この場合、洗浄液
の表面張力は上昇し、残留する液量が増える。洗浄液の表面張力が０．０３５Ｊ／ｍ2以
上の場合は、カートリッジの撥水性を高めることで、残留する液量を抑えることができる
。カートリッジの撥水性を高めることで、液滴を形成させ、その液滴が流れ落ちることに
よって残留する液量を抑制できる。撥水性を高める方法としては、カートリッジ表面にシ
リコン等の撥水剤をコートするか、カートリッジ成型時にシリコン等の撥水剤を練り込む
等の手段があるが、これに限らない。
【０１０７】
本発明に係る核酸吸着性多孔性膜を利用して洗浄工程を簡素化することができる。(1)
洗浄液が核酸吸着性多孔性膜を通過する回数を1回としてもよい、(2)洗浄工程を室温でで
きる。(3)洗浄工程の後、直ちに次工程を行うことができる。(4)前記(1)、(2)、(3)のい
ずれか１つもしくは２つ以上組み合わせることも可能である。従来法においては、洗浄液
中に含まれる有機溶媒を迅速に取り除くためには、しばしば乾燥工程を必要としたが、本
発明に用いる核酸吸着性多孔性膜は薄膜であるために乾燥工程を省略できる。
【０１０８】
従来、ＲＮＡの分離精製方法において、洗浄工程の際、しばしば洗浄液が飛散し他に付
着することによって、試料のコンタミネーション（汚染）が起きることが問題となってい
る。洗浄工程におけるこの種のコンタミネーションは、二個の開口を有する容器内に核酸
吸着性多性孔膜を収容した核酸分離精製カートリッジと廃液容器の形状とを工夫すること
によって抑止することができる。
【０１０９】
ＤＮＡとＲＮＡを含むライセート溶液からＲＮＡのみを選択的に分離精製するには、核
酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジに通過させ、核酸吸着性多孔性膜
に核酸を吸着させた（吸着工程）後、洗浄を行い（洗浄工程１）、ＤＮａｓｅを作用させ
る工程を経ることにより行うことが出来る。
ＤＮａｓｅは特に限定無く、いずれのＤＮａｓｅも用いることが出来る。
【０１１０】
核酸分離精製カートリッジの核酸吸着性多孔性膜でＤＮａｓｅを作用させる工程におけ
る時間は、ＤＮＡとＲＮＡを含む核酸混合物溶液中のＤＮＡ量と作用させるＤＮａｓｅ濃
度により異なるが５秒〜３６０分が好ましく、３０秒〜１８０分がより好ましい。また、
核酸分離精製カートリッジの核酸吸着性多孔性膜でＤＮａｓｅを作用させる工程における
温度は４℃以上であればよく、１０〜５０℃が好ましく、反応効率を高めるため高温、例
えば５０〜７０℃で行うこともできる。尚、「核酸吸着性多孔性膜でＤＮａｓｅを作用さ
せる」とは、核酸吸着性多孔性膜における、核酸が吸着している部位とＤＮａｓｅを作用
させることを意味し、「核酸吸着性多孔性膜で」とは、酸吸着性多孔性膜上に限らず、多
孔性膜における孔中や、膜の裏側の孔の出口等も含む。
また、本発明でのＤＮａｓｅの添加は、洗浄液の通過時間を短くする、もしくは目詰ま
りを改善する目的も有する。
【０１１１】
ＤＮａｓｅ以外に、タンパク分解酵素、脂質分解酵素、糖分解酵素、核酸分解酵素、ク
ロロホルムやメタノールなどの有機溶媒のいずれか一つもしくはこれらを混合したものを
添加することもできる。これらの添加により、膜上に残っている目詰まり原因物質の構成
成分を分解し、洗浄液の通過性を向上させ、洗浄液通過時間の短縮、目詰まりの改善を行
うことができる。
これらの添加は、ライセート溶液通過後に行ってもかまわないが、数回洗浄液による洗
浄を行った方がより好ましい。特に、タンパク分解酵素、脂質分解酵素、糖分解酵素、核
酸分解酵素を用いる場合には、膜上に残存しているカオトロピック塩の影響で、これらの
分解酵素が変性を受け、活性を阻害されることで、目詰まり原因物質の分解能力が低下し
、洗浄液通過時間が短くならない可能性が高いからである。
【０１１２】
回収液は、チューブ、ピペット、又は自動注入装置、もしくはこれらと同じ機能をもつ
供給手段を使用して、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジへ供給さ
れる。回収液は、核酸分離精製カートリッジの一の開口（核酸混合物溶液を注入した開口
）から供給され、該開口に結合された圧力差発生装置（例えばスポイド、注射器、ポンプ
、パワーピペットなど）を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にして核酸吸着
性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。また、回収
液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらには、核酸分
離精製カートリッジの核酸混合物溶液を供給した一の開口と異なる開口より回収液を供給
し、排出させることも可能である。中でも、核酸分離精製カートリッジの一の開口から供
給し、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出さる方法が、回収
効率が優れてより好ましい。
【０１１３】
検体から調整した核酸混合物溶液の体積に対して、回収液の体積を調整してＲＮＡの脱
着を行うことができる。分離精製されたＲＮＡを含む回収液量は、そのとき使用する検体
量による。一般的によく使われる回収液量は数１０から数１００μｌであるが、検体量が
極微量である時や、逆に大量のＲＮＡを分離精製したい場合には回収液量は１μｌから数
１０ｍｌの範囲で変える事ができる。
【０１１４】
回収液としては好ましくは精製蒸留水、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡバッファー等が使用できる
。また、工程後に回収したＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）に供す
る場合、ＲＴ−ＰＣＲ反応において用いる緩衝溶液（例えば、ＫＣｌ  ７５ｍｍｏｌ／Ｌ
、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭｇＣｌ2  ３．０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＤＴＴ  １
０ｍｍｏｌ／Ｌを最終濃度とする水溶液）を用いることもできる。
【０１１５】
回収液のｐＨは、ｐＨ１〜１０であることが好ましい。さらには、ｐＨ２〜７であるこ
とが好ましい。また特にイオン強度と塩濃度は吸着ＲＮＡの溶出に効果を及ぼす。回収液
は、５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下のイオン強度であることが好ましい。塩濃度は、０．５ｍｏ
ｌ／Ｌ以下であることが好ましく、さらには、０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ以上５０ｍｍｏｌ／
Ｌ以下であることが好ましい。こうすることで、ＲＮＡの回収率が向上し、より多くのＲ
ＮＡを回収できることができる。
【０１１６】
回収液の体積を少なくすることによって、濃縮された核酸を含む回収液を得ることがで
きる。好ましくは、(回収液体積)：(核酸混合物溶液体積)＝１：１００〜９９：１００、
更に好ましくは、(回収液体積)：(核酸混合物溶液体積)＝１：１０〜９：１０にすること
ができる。これにより核酸分離精製後工程において濃縮のための操作をすることなく、簡
単に核酸を濃縮できる。これらの方法により検体よりも核酸が濃縮されている核酸溶液を
得る方法を提供できる。
【０１１７】
また別の態様としては、回収液の体積を調整することで核酸の脱着を行うことにより、
希望の濃度の核酸を含む回収液を得ることができ、次工程、例えばＲＴ−ＰＣＲなどを行
う場合に適した濃度の核酸を含む回収液を得ることができる。好ましくは、(回収液体積)
：(核酸混合物溶液体積)＝１：１〜５０：１、更に好ましくは、(回収液体積)：(核酸混
合物溶液体積)＝１：１〜５：１にすることができる。これにより核酸分離精製後に濃度
調整をする煩雑さがなくなるというメリットを得られる。更に、十分量の回収液を使用す
ることにより、多孔性膜からの核酸回収率の増加を図ることができる。
また、吸着させた核酸を回収液により固体材料から脱着させる際に、固体材料を回収液に浸漬させる時間を長くすることによって核酸回収量を増加させることが可能である。その浸漬時間は０．１秒〜１６００秒であることが好ましく、さらに好ましくは５秒〜６００秒であることが望ましい。
【０１１８】
また、目的に応じて回収液の温度を変化させることで簡便に核酸を回収することができ
る。例えば、回収液の温度を０〜１０℃にして多孔性膜からの核酸の脱着を行うことで、
酵素による分解を防止する何らかの試薬や特別な操作を加えることなく核酸分解酵素の働
きを抑制して、核酸の分解を防ぎ、簡便に、効率よく核酸溶液を得ることができる。
また、回収液の温度を１０〜３５℃とした場合、一般的な室温で核酸の回収を実施する
ことが出来、複雑な工程を必要とせずに核酸を脱着させて分離精製することができる。
【０１１９】
また別の態様としては、回収液の温度を高温、例えば３５〜７０℃することで、多孔性
膜からの核酸の脱着を煩雑な操作を経ず簡便に高い回収率で実施することができる。
回収液の注入回数は限定されるものではなく、１回でも複数回でもよい。通常、迅速、
簡便に核酸を分離精製する場合は、１回の回収で実施するが、大量の核酸を回収する場合
等複数回にわたり回収液を注入してもよい。
【０１２０】
回収工程においては、核酸の回収液をその後の工程に使用できる組成にしておくことが
可能である。分離精製された核酸は、しばしばＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼチェイ
ンリアクション）法が適用される。この場合、分離精製された核酸溶液はＲＴ−ＰＣＲ法
に適したバッファー液で希釈する必要がある。本方法による回収工程において、回収液に
ＲＴ−ＰＣＲ法に適したバッファー液を用いることで、その後のＲＴ−ＰＣＲ工程へ簡便
、迅速に移行することができる。
【０１２１】
また、回収工程において、核酸の回収液に回収した核酸の分解を防ぐための安定化剤を
添加しておくことも可能である。安定化剤としては、抗菌剤、抗カビ剤や核酸分解抑制剤
などを添加することができる。核酸分解抑制剤としては、核酸分解酵素の阻害剤が挙げら
れ、具体的にはＥＤＴＡなどが挙げられる。また別の実施態様として、回収容器にあらか
じめ安定化剤を添加しておくこともできる。
【０１２２】
回収工程で用いられる回収容器には特に限定はないが、２６０ｎｍの吸収が無い素材で
作製された回収容器を用いることができる。この場合、回収した核酸溶液の濃度を、他の
容器に移し替えずに測定できる。２６０ｎｍに吸収のない素材は、例えば石英ガラス等が
挙げられるがこれに限定されるものではない。
【０１２３】
上記の、少なくとも二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分
離精製カートリッジと圧力差発生装置を用いて、核酸を含む検体から核酸を分離精製する
方法はその含まれる工程を自動で行う自動装置を用いて行うことができる。また、前記の
キットの使用を自動で行う自動装置を用いて行うことができる。自動装置により、操作が
簡便化および迅速化するだけでなく、作業者の技能によらず一定の水準の、核酸を得るこ
とが可能になる。
【０１２４】
以下に、少なくとも二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分
離精製カートリッジと圧力差発生装置を用いて、核酸を含む検体から核酸を分離精製する
工程を自動で行う自動装置の例を示すが、本発明の自動装置はこれに限定されるものでは
ない。
【０１２５】
自動装置は、溶液が内部を通過可能な、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カ
ートリッジを用い、該核酸分離精製カートリッジに核酸を含む核酸混合物溶液を注入し加
圧して該核酸混合物溶液中の核酸を前記核酸吸着性多孔性膜に吸着させた後、前記核酸分
離精製カートリッジに洗浄液を分注し加圧して不純物を除去し、前記核酸分離精製カート
リッジにＤＮａｓｅを分注して核酸吸着性多孔性膜でＤＮａｓｅを作用させ、加圧してＤ
Ｎａｓｅが核酸吸着性多孔性膜内部を通過した後、前記核酸分離精製カートリッジに洗浄
液を分注し、加圧して分解されたＤＮＡを除去した後、前記核酸分離精製カートリッジに
、回収液を分注し核酸吸着性多孔性膜に吸着したＲＮＡを脱着して回収液とともに回収す
る、分離精製動作を自動的に行うＲＮＡの選択的分離精製装置であって、前記核酸分離精
製カートリッジ、前記核酸混合物溶液残渣、ＤＮａｓｅおよび洗浄液の排出液を収容する
廃液容器および前記ＲＮＡを含む回収液を収容する回収容器を保持する搭載機構と、前記
核酸分離精製カートリッジに加圧エアを導入する加圧エア供給機構と、前記核酸分離精製
カートリッジに洗浄液、ＤＮａｓｅおよび回収液を分注する分注機構とを備えてなること
が好適である。
【０１２６】
前記搭載機構は、装置本体に搭載されるスタンドと、該スタンドに上下移動可能に支持
され前記核酸分離精製カートリッジを保持するカートリッジホルダーと、該カートリッジ
ホルダーの下方で前記核酸分離精製カートリッジに対する位置を交換可能に前記廃液容器
および前記回収容器を保持する容器ホルダーとを備えてなるものが好適である。
【０１２７】
また、前記加圧エア供給機構は、下端部より加圧エアを噴出するエアノズルと、該エア
ノズルを支持して前記カートリッジホルダーに保持された前記核酸分離精製カートリッジ
に対し前記エアノズルを昇降移動させる加圧ヘッドと、該加圧ヘッドに設置され前記搭載
機構のラックにおける核酸分離精製カートリッジの位置決めをする位置決め手段とを備え
てなるものが好適である。
【０１２８】
また、前記分注機構は、前記洗浄液を分注する洗浄液分注ノズルと、前記ＤＮａｓｅを
分注するＤＮａｓｅ分注ノズルと、前記回収液を分注する回収液分注ノズルと、前記洗浄
液分注ノズル、前記ＤＮａｓｅ分注ノズルおよび前記回収液分注ノズルを保持し前記搭載
機構に保持された核酸分離精製カートリッジ上を順に移動可能なノズル移動台と、洗浄液
を収容した洗浄液ボトルより洗浄液を吸引し前記洗浄液分注ノズルに供給する洗浄液供給
ポンプと、ＤＮａｓｅを収容したＤＮａｓｅボトルよりＤＮａｓｅを吸引し前記ＤＮａｓ
ｅ分注ノズルに供給するＤＮａｓｅ供給ポンプと、回収液を収容した回収液ボトルより回
収液を吸引し前記回収液分注ノズルに供給する回収液供給ポンプとを備えてなるものが好
適である。
【０１２９】
核酸分離精製カートリッジ、廃液容器および回収容器を保持する搭載機構と、核酸分離
精製カートリッジに加圧エアを導入する加圧エア供給機構と、核酸分離精製カートリッジ
に洗浄液、ＤＮａｓｅおよび回収液を分注する分注機構とを備えた、例えば前記のような
自動装置によれば、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジに核酸を含
む試料液を注入加圧し核酸を核酸吸着性多孔性膜に吸着させ、洗浄液を分注して不純物を
洗浄排出し、前記核酸分離精製カートリッジにＤＮａｓｅを分注し核酸吸着性多孔性膜で
ＤＮａｓｅを作用させ加圧してＤＮａｓｅが核酸吸着性多孔性膜内部を通過し、前記核酸
分離精製カートリッジに洗浄液を分注し加圧して分解されたＤＮＡを除去し、回収液を分
注して核酸吸着性多孔性膜に吸着したＲＮＡを脱着して回収するＲＮＡ分離精製工程を自
動的に行って、短時間で効率よく核酸混合物溶液中のＲＮＡを自動的に分離精製できる機
構をコンパクトに構成することができる。
【０１３０】
また、前記搭載機構を、スタンドと、核酸分離精製カートリッジを保持する上下移動可
能なカートリッジホルダーと、廃液容器および回収容器を交換可能に保持する容器ホルダ
ーとを備えて構成すると、核酸分離精製カートリッジおよび両容器のセット並びに廃液容
器と回収容器の交換が簡易に行える。
【０１３１】
また、前記加圧エア供給機構を、エアノズルと、該エアノズルを昇降移動させる加圧ヘ
ッドと、核酸分離精製カートリッジの位置決めをする位置決め手段とを備えて構成すると
、簡易な機構で確実な加圧エアの供給が行える。
また、前記分注機構を、洗浄液分注ノズルと、ＤＮａｓｅ分注ノズルと、回収液分注ノ
ズルと、核酸分離精製カートリッジ上を順に移動可能なノズル移動台と、洗浄液ボトルよ
り洗浄液を吸引し洗浄液分注ノズルに供給する洗浄液供給ポンプと、回収液ボトルより回
収液を吸引し回収液分注ノズルに供給する回収液供給ポンプとを備えて構成すると、簡易
な機構で順次洗浄液および回収液の分注が行える。
【０１３２】
本発明において使用できる検体は、核酸を含むものであれば特に制限はなく、例えば診
断分野においては、検体として採取された全血、血漿、血清、尿、便、精液、唾液等の体
液、あるいは植物（又はその一部）、動物（またはその一部）、細菌、ウイルス、培養細
胞、あるいはそれらの溶解物およびホモジネート物などの生物材料が対象となる。培養細
胞としては、浮遊系細胞、接着系細胞等が挙げられる。浮遊系細胞とは培養液中で容器壁
に付着することなく漂いながら生育、増殖する細胞を指し、例えばＨＬ６０，Ｕ９３７，
ＨｅＬａＳ３等が代表的な細胞株として挙げられる。接着系細胞とは培養液中で容器壁底
面に付着し生育、増殖する細胞を指し、例えばＮＩＨ３Ｔ３，ＨＥＫ２９３，ＨｅＬａ，
ＣＯＳ，ＣＨＯ細胞等が代表的な細胞株として挙げられる。検体として用いられる動物（
またはその一部）としては、動物組織が挙げられる。例えば、動物を解剖したとき或いは
生検により採取可能な、肝臓、腎臓、脾臓、脳、心臓、肺や胸腺など個体を構成する組織
全てを使用することができる。
【０１３３】
これらの検体は、細胞膜・核膜を溶解して核酸を溶出する試薬を含む水溶液、いわゆる
核酸可溶化試薬で処理することが好ましい。これにより細胞膜・核膜が溶解されて、核酸
が水溶液内に分散した核酸混合物溶液を得ることができる。
【０１３４】
本発明において「核酸」は一本鎖、二本鎖、三本鎖、四本鎖のいずれかもしくはそれら
の混合物のいずれでもよく、また、分子量の制限も無い。また、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それら
が修飾されたもの、およびそれらの混合物、いずれのものでも良い。
【実施例】
【０１３５】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるもの
ではない。
（実施例１）分散液の置換がＲＮＡ回収量、通過時間へ及ぼす影響
ＰＢＳで洗浄し、遠心後、洗浄液を除去し凍結保存していた約１０００００００個のペ
レット化培養細胞ＨＬ６０を調製した。このペレットには、ＰＢＳが含まれている。凍結
保存しておいたペレットを解凍し、以下の表１に示す処理を行った。
【０１３６】
【表１】
2007117084.tif 000002
【０１３７】
表１における（ｂ）と（ｄ）の場合は、ピペッティングもしくはボルテックス処理を行
うことで細胞を分散させた。ここに、ＬＲ００１（富士写真フイルム株式会社製）を６１
０μＬ加えた直後に、ピペッティング処理を５回行った。溶解液は、３．６６ｍｏｌ／Ｌ
グアニジンチオシアネート、１体積％の２−メルカプトエタノール、３０μＬのエタノー
ルから構成されているものを使用した。細胞を溶解後、ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１
０００（ＥＹＥＬＡ製）を用いて攪拌処理（２５００ｒ．ｐ．ｍ．）を１分間行い、遠心
によりスピンダウさせた。
【０１３８】
次に、エタノールを１９０μＬ加え、直ちに、５秒間ボルテックス処理を行った。この
際、攪拌処理は１本ずつ行った。その後、５５秒間ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１００
０を用いて攪拌（２５００ｒ．ｐ．ｍ．）を行った。この際、攪拌処理は４本一度に行っ
た。遠心によりスピンダウンさせた後、ライセート溶液を調製した。
【０１３９】
ＮＥＸＴカートリッジ（富士写真フイルム株式会社製、口径７ｍｍ、細孔２．５μｍ）
、洗浄液（ＷＲＣ）、回収液（ＣＲＣ）をＱｕｉｃｋ  Ｇｅｎｅ  ８００（富士写真フイ
ルム株式会社製）にセットした後、ＮＥＸＴカートリッジにライセート溶液を入れ、Ｑｕ
ｉｃｋ  Ｇｅｎｅ  ８００のＲＮＡモードで抽出を行った。この時、洗浄液量を５００μ
Ｌ、回収液量を１００μＬ、回収液の浸漬時間を３０秒に、加圧時間、すなわち目詰まり
判定時間を１２０秒に設定した。
【０１４０】
ＲＮＡ回収の定量および純度の決定は、紫外可視分光光度計ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｎａｎ
ｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて測定し、回収量は２６０ｎｍの吸
光度から、核酸の純度は２６０ｎｍと２８０ｎｍの比率から決定し、この比率が１．８以
上であれば、純度は良好と判断した。ＤＮＡの混入などはゲル電気泳動を用いて分析した
。ゲル電気泳動の条件は、バッファーとしてＴＡＥ（Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ）を用い
、試料５μＬとローディングバッファー（１０×Ｂｌｕｅ  Ｊｕｉｃｅ）とを混合後、全
量電気泳動した。
【０１４１】
結果を図１に示した。（ａ）の未処理のものは目詰まりした。ＰＢＳを除去した後、Ｂ
ｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝溶液を加えた（ｂ）は、目詰まりしなかったがライセートの通過時間
は７７秒と長くなった。これに対して、（ｂ）、（ｃ）のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝溶液を加
えたものは、ライセートの通過時間は５０秒台とかなり低くなった。
【０１４２】
（比較例１）分散液の種類および分散液量とＲＮＡ回収量、通過時間との関係
凍結保存していた約１０００００００個のペレット化した培養細胞ＨＬ６０を解凍し、
ＰＢＳもしくは０．５ｍｏｌ／Ｌ  Ｂｉｓ  Ｔｒｉｓ  （ｐＨ６．５）を所定量加え、ピ
ペッティングもしくはボルテックス処理を行うことで細胞を分散させた。ここに、溶解液
を５４０μＬ加えた直後に、ピペッティングを５回行った。溶解液は、３．６６ｍｏｌ／
Ｌ  グアニジンチオシアネート（ＧＴＣ）、１体積％の２−メルカプトエタノール、３０
μＬのエタノールから構成されているものを使用した。細胞を溶解後、ＣＵＴＥ  ＭＩＸ
ＥＲ  ＣＭ−１０００を用いて攪拌処理（２５００ｒ．ｐ．ｍ．）を１分間行い、遠心に
よりスピンダウンさせた。
【０１４３】
次に、エタノールを２３０μＬ加え、直ちに、５秒間ボルテックス処理を行った。その
後、５５秒間ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００を用いて攪拌（２５００ｒ．ｐ．ｍ
．）を行い、遠心によりスピンダウンさせた後、ライセート溶液を調製した。但し、試料
が１つの場合には、エタノール添加後の攪拌時間は、５秒と５５秒とに分けずに、エタノ
ール添加後、直ちに６０秒間ボルテックスを行うことで、ライセート溶液を調製した。
ＲＮＡ抽出方法、回収量の算出、純度の決定は（実施例１）と同様の手法で行った。
【０１４４】
結果を図２に示した。分散液がない場合には、ライセートの通過時間は９０秒と長くな
り、２回目の洗浄で目詰まりした。一方、分散液がある場合には、ライセートの通過時間
が約３５％〜約６０％短くなり、通過性が大幅に向上した。なお、通過時間が１２０秒を
超えると目詰まりと判断するように設定している。分散液の種類と通過時間との関係では
、Ｂｉｓ  Ｔｒｉｓ緩衝溶液はＰＢＳ緩衝液と比較して、ライセート通過時間が約２０％
〜３０％短くなり、洗浄液の通過時間は約７０％と大幅に短くなった。分散液の液量と通
過時間との関係では、分散液の量が多いと若干通過時間が短くなるが、３０μＬ以上あれ
ば十分であった。以上から、分散液がある方が望ましく、分散液の種類としてＢｉｓ  Ｔ
ｒｉｓバッファーを用い、液量は少なくとも３０μＬ以上あれば望ましいな結果を示す。
【０１４５】
（実施例２）分散液の濃度とＲＮＡ回収量、通過時間との関係
凍結保存していた約１０００００００個のペレット化した培養細胞ＨＬ６０を解凍し、
０．５ｍｏｌ／Ｌの３０μＬのＢｉｓ  Ｔｒｉｓ  （ｐＨ６．５）を加え、ピペッティン
グもしくはボルテックス処理を行うことで細胞を分散させた。ここに、溶解液を４９０μ
Ｌ加えた。溶解液は、５ｍｏｌ／Ｌグアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）、１体積％の２−メ
ルカプトエタノール、Ｔｗｅｅｎ２０が２．５体積％（溶解液中の濃度）から構成されて
いるものを使用した。細胞を溶解後、ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００を用いて攪
拌処理（２５００ｒ．ｐ．ｍ．）を１分間行い、遠心によりスピンダウンさせた。
次に、エタノールを２８０μＬ加え、６０秒間ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００
を用いて１分間攪拌（２５００ｒ．ｐ．ｍ．）を行い、遠心によりスピンダウンすること
で、ライセート溶液を調製した。
ＲＮＡ抽出の方法、回収量の算出、純度の決定は（実施例１）と同様の手法で行った。
【０１４６】
結果を図３に示した。Ｂｉｓ  Ｔｒｉｓ濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌの時には、洗浄液の通
過時間が１１８秒とかなり長いが、濃度が０．５ｍｏｌ／Ｌ以上の時には、約５５秒と大
幅に短くなった。なお、Ｂｉｓ  Ｔｒｉｓ濃度が１ｍｏｌ／Ｌの時には、細胞がきれいに
分散せずに凝集した。
以上から、Ｂｉｓ  Ｔｒｉｓの濃度は０．５ｍｏｌ／Ｌが望ましい。
【０１４７】
（実施例３）溶解液の種類とＲＮＡ回収量、通過時間との関係
凍結保存していた約１０００００００個のペレット化した培養細胞ＨＬ６０を解凍し、
０．５の３０μＬのＢｉｓ  Ｔｒｉｓ  （ｐＨ６．５）を加え、ピペッティングもしくは
ボルテックス処理を行うことで細胞を分散させた。ここに、溶解液１、３、４の場合には
溶解液を５４０μＬ、溶解液２の場合には溶解液を５１０μＬ加えた直後に、ピペッティ
ングを５回行った。溶解液は、表２の組成のものを用いた。細胞を溶解後、ＣＵＴＥ  Ｍ
ＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００を用いて攪拌処理（２５００ｒ．ｐ．ｍ．）を１分間行い、遠
心によりスピンダウンさせた。
【０１４８】
【表２】
2007117084.tif 000003
【０１４９】
次に、エタノールを溶解液１、３、４の場合は２３０μＬ、溶解液２の場合は２６０μ
Ｌ加え（いずれもライセート溶液中の濃度が３２．５体積％）、直ちに、５秒間ボルテッ
クス処理を行った。その後、５５秒間ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００を用いて攪
拌（２５００ｒ．ｐ．ｍ．）を行い、遠心によりスピンダウンさせることで、ライセート
溶液を調製した。但し、試料が１つの場合には、エタノール添加後の攪拌時間は、５秒と
５５秒とに分けずに、エタノール添加後、直ちに６０秒間ボルテックスを行うことで、ラ
イセート溶液を調製した。
ＲＮＡ抽出法、回収量の算出、純度の決定は（実施例１）と同様の手法で行った。
【０１５０】
結果を図４に示した。溶解液３、すなわちＧｕＨＣｌから構成された溶解液はライセー
ト通過時間が長く、洗浄液の通過時間も大幅に長くなり、回収量も他のものと比較して低
くなった。溶解液の中でも特に、溶解液１、すなわち、ＧＴＣから構成された溶解液は良
好な結果を示した。
【０１５１】
（実施例４）溶解液中のカオトロピック塩の濃度とＲＮＡ回収量、通過時間との関係
凍結保存していた約１００００００個のペレット化した培養細胞ＨＬ６０を解凍し、０
．５ｍｏｌ／Ｌの３０μＬのＢｉｓ  Ｔｒｉｓ  （ｐＨ６．５）を加え、ピペッティング
もしくはボルテックス処理を行うことで細胞を分散させた。ここに、溶解液を３５０μＬ
加えた。溶解液は、所定濃度のＧＴＣ、１体積％の２−メルカプトエタノール（いずれも
ライセート中の濃度）から構成されているものを使用した。細胞を溶解後、ＣＵＴＥ  Ｍ
ＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００を用いて攪拌処理（２５００ｒ．ｐ．ｍ．）を１分間行い、遠
心によりスピンダウンさせた。
次に、７０体積％エタノールを３５０μＬ加え、６０秒間ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ
−１０００を用いて攪拌（２５００ｒ．ｐ．ｍ．）を行い、遠心によりスピンダウンさせ
ることで、ライセート溶液を調製した。
ＲＮＡ抽出方法、回収量の算出、純度の決定は（実施例１）と同様の手法で行った。
【０１５２】
回収量の結果を図５に、通過時間の結果を図６に示した。ＧＴＣの濃度が３ｍｏｌ／Ｌ
以上で高い回収量が得られ、ＧＴＣ濃度が３．６６ｍｏｌ／Ｌ以上で通過時間が短くなっ
た。
【０１５３】
（実施例５）ライセート液量とＲＮＡ回収量、通過時間との関係
凍結保存していた約１０００００００個のペレット化した培養細胞ＨＬ６０を解凍し、
０．５ｍｏｌ／Ｌの３０μＬのＢｉｓ  Ｔｒｉｓ  （ｐＨ６．５）を加え、ピペッティン
グもしくはボルテックス処理を行うことで細胞を分散させた。ここに、溶解液を３９７μ
Ｌ（ライセート液量６００μＬの場合）、４６９μＬ（ライセート液量７００μＬの場合
）、５４０μＬ（ライセート液量８００μＬの場合）加えた。溶解液は、３．６６ｍｏｌ
／ＬのＧＴＣ、１体積％の２−メルカプトエタノール、５．５体積％のエタノール（いず
れもライセート中の濃度）から構成されているものを使用した。細胞を溶解後、ＣＵＴＥ
ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００を用いて攪拌処理（２５００ｒ．ｐ．ｍ．）を１分間行い
、遠心によりスピンダウンさせた。
【０１５４】
次に、エタノールを１７３μＬ（ライセート液量６００μＬの場合）、２０２μＬ（ラ
イセート液量７００μＬの場合）、２３０μＬ（ライセート液量８００μＬの場合）加え
（いずれもライセート溶液中の濃度が３２．５体積％）、直ちに、５秒間ボルテックス処
理を行った。その後、５５秒間ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００を用いて攪拌（２
５００ｒ．ｐ．ｍ．）を行い、遠心によりスピンダウンさせることで、ライセート溶液を
調製した。但し、試料が１つの場合には、エタノール添加後の攪拌時間は、５秒と５５秒
とに分けずに、エタノール添加後、直ちに６０秒間ボルテックスを行うことで、ライセー
ト溶液を調製した。
ＲＮＡ抽出法、回収量の算出、純度の決定は（実施例１）と同様の手法で行った。
【０１５５】
通過時間の結果を図７に示した。ライセート通過時間は液量が増えると増加したが、洗
浄液の通過時間は減少した。回収量は、液量にかかわらずほぼ一定となった。
【０１５６】
（実施例６）溶解液中のエタノール量とＲＮＡ回収量、通過時間との関係
凍結保存していた約１０００００００個のペレット化した培養細胞ＨＬ６０を解凍し、
０．５ｍｏｌ／Ｌの３０μＬのＢｉｓ  Ｔｒｉｓ  （ｐＨ６．５）を加え、ピペッティン
グもしくはボルテックス処理を行うことで細胞を分散させた。ここに、溶解液を５１０μ
Ｌ〜７７０μＬ加えた。溶解液は、３．６６ｍｏｌ／ＬのＧＴＣ、１体積％の２−メルカ
プトエタノール、０〜２６０μＬのエタノール（いずれもライセート中の濃度）から構成
されているものを使用した。細胞を溶解後、ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００を用
いて攪拌処理（２５００ｒ．ｐ．ｍ．）を１分間行い、遠心によりスピンダウンさせた。
【０１５７】
次に、エタノールを２６０μＬ〜０μＬ加え（いずれもライセート溶液中の濃度が３２
．５体積％）、直ちに、５秒間ボルテックス処理を行った。その後、５５秒間ＣＵＴＥ  
ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００を用いて攪拌（２５００ｒ．ｐ．ｍ．）を行い、遠心により
スピンダウンさせることで、ライセート溶液を調製した。但し、試料が１つの場合には、
エタノール添加後の攪拌時間は、５秒と５５秒とに分けずに、エタノール添加後、直ちに
６０秒間ボルテックスを行うことで、ライセート溶液を調製した。
ＲＮＡ抽出法、回収量の算出、純度の決定は（実施例１）と同様の手法で行った。
【０１５８】
通過時間の結果を図９に示した。洗浄液の通過時間は、溶解液中のエタノールの量が３
０μＬの時に短くなり、６０μＬで長くなった後、溶解液中のエタノールの体積％が増加
するとともに通過時間は短くなった。図７には、溶解液中のエタノール濃度と回収量との
関係を示した。どのエタノール量においても、回収量は約１１０μｇとほぼ一定したが、
エタノール量が少ない時や、エタノール量が多いときには回収液の液量がより多く必要で
あるという結果となった。
以上から、溶解液中のエタノール量は、３０μＬが好ましい。
【０１５９】
（実施例７）ライセート中のエタノール量とＲＮＡ回収量、通過時間との関係
凍結保存していた約１０００００００個のペレット化した培養細胞ＨＬ６０を解凍し、
０．５ｍｏｌ／Ｌの３０μＬのＢｉｓ  Ｔｒｉｓ  （ｐＨ６．５）を加え、ピペッティン
グもしくはボルテックス処理を行うことで細胞を分散させた。ここに、溶解液を５８０μ
Ｌ〜５００μＬ加えた。溶解液は、３．６６ｍｏｌ／ＬのＧＴＣ、１体積％の２−メルカ
プトエタノール、３０μＬのエタノール（いずれもライセート中の濃度）から構成されて
いるものを使用した。細胞を溶解後、ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００を用いて攪
拌処理（２５００ｒ．ｐ．ｍ．）を１分間行い、遠心によりスピンダウンさせた。
【０１６０】
次に、エタノールを１９０μＬ〜２７０μＬ加え（ライセート溶液中の濃度は２７．５
〜３７．５体積％）、直ちに、５秒間ボルテックス処理を行った。その後、５５秒間ＣＵ
ＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００を用いて攪拌（２５００ｒ．ｐ．ｍ．）を行い、遠心
によりスピンダウンさせることで、ライセート溶液を調製した。但し、試料が１つの場合
には、エタノール添加後の攪拌時間は、５秒と５５秒とに分けずに、エタノール添加後、
直ちに６０秒間ボルテックスを行うことで、ライセート溶液を調製した。
ＲＮＡ抽出方法、回収量の算出、純度の決定は（実施例１）と同様の手法で行った。
【０１６１】
ＲＮＡの回収量の結果を図１０に示した。ライセート中のエタノール濃度が３２．５体
積％の時が最も回収量が高くなった。
【０１６２】
（実施例８）エタノール添加後の攪拌時間とＲＮＡ回収量、通過時間との関係
凍結保存していた約１０００００００個のペレット化した培養細胞ＨＬ６０を解凍し、
０．５ｍｏｌ／Ｌの３０μＬのＢｉｓ  Ｔｒｉｓ  （ｐＨ６．５）を加え、ピペッティン
グもしくはボルテックス処理を行うことで細胞を分散させた。ここに、溶解液を５４０μ
Ｌ加えた。溶解液は、３．６６ｍｏｌ／ＬのＧＴＣ、１体積％の２−メルカプトエタノー
ル、３０μＬのエタノール（いずれもライセート中の濃度）から構成されているものを使
用した。細胞を溶解後、ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００を用いて攪拌処理（２５
００ｒ．ｐ．ｍ．）を１分間行い、遠心によりスピンダウンさせた。
【０１６３】
次に、エタノールを２３０μＬ加え（ライセート溶液中の濃度は３２．５体積％）、直
ちに、５秒間ボルテックス処理を行った。その後、所定の時間ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  Ｃ
Ｍ−１０００を用いて攪拌（２５００ｒ．ｐ．ｍ．）を行い、遠心によりスピンダウンさ
せることで、ライセート溶液を調製した。但し、試料が１つの場合には、エタノール添加
後の攪拌時間は、５秒と５５秒とに分けずに、エタノール添加後、直ちに６０秒間ボルテ
ックスを行うことで、ライセート溶液を調製した。
ＲＮＡ抽出方法、回収量の算出、純度の決定は（実施例１）と同様の手法で行った。
【０１６４】
通過時間の結果を図１１に示した。エタノール添加後の攪拌時間が長くなるとともに、
通過時間は短くなった。回収量は、エタノール添加後の攪拌時間が３５秒以上であれば、
ＲＮＡの回収量は高い水準を維持しているが、３５秒の攪拌時間では、回収液量が２００
μＬでも核酸が溶出されており（図１２）、膜に吸着させた核酸をすばやく溶出させるた
めには、エタノール添加後、５５秒以上の攪拌時間を行うことが望ましい。
【０１６５】
（実施例９）エタノール添加後のピペッティング処理と攪拌処理との違いがＲＮＡ回収量
、通過時間に及ぼす影響
凍結保存していた約１０００００００個のペレット化した培養細胞ＨＬ６０を解凍し、
０．５ｍｏｌ／Ｌの３０μＬのＢｉｓ  Ｔｒｉｓ  （ｐＨ６．５）を加え、ピペッティン
グもしくはボルテックス処理を行うことで細胞を分散させた。ここに、溶解液を５４０μ
Ｌ加えた。溶解液は、３．６６ｍｏｌ／ＬのＧＴＣ、１体積％の２−メルカプトエタノー
ル、３０μＬのエタノール（いずれもライセート中の濃度）から構成されているものを使
用した。細胞を溶解後、ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００を用いて攪拌処理（２５
００ｒ．ｐ．ｍ．）を１分間行い、遠心によりスピンダウンさせた。
【０１６６】
次に、エタノールを２３０μＬ加え（ライセート溶液中の濃度は３２．５体積％）、直
ちに、５秒間ボルテックス処理もしくは５回のピペッティング処理を行った。その後、５
５秒間ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００を用いて攪拌（２５００ｒ．ｐ．ｍ．）を
行い、遠心によりスピンダウンさせることで、ライセート溶液を調製した。
ＲＮＡ抽出方法、回収量の算出、純度の決定は（実施例１）と同様の手法で行った。
【０１６７】
ピペッティング処理を行ったもの、攪拌処理を行ったもの、両方ともライセート、洗浄
液の通過時間は約７０秒とほとんど変わらなかった。しかし、ピペッティングを行ったも
のはＲＮＡの回収量が７５μｇであったのに対して、攪拌を行ったものは１０４μｇと大
幅にＲＮＡの回収量が増加した。
以上から、エタノール添加後、ピペッティング操作よりも攪拌を行ったほうがより好ま
しい。
【０１６８】
（実施例１０）フイルターの細孔径と通過時間、回収量との関係
凍結保存していた約１０００００００個のペレット化した培養細胞ＨＬ６０を氷上で溶
かし、０．５ｍｏｌ／Ｌの３０μＬのＢｉｓ  Ｔｒｉｓ  （ｐＨ６．５）を加え、ピペッ
ティングもしくはボルテックス処理を行うことで細胞を分散させた。ここに、溶解液を５
４０μＬ加えた。溶解液は、３．６６ｍｏｌ／ＬのＧＴＣ、１体積％の２−メルカプトエ
タノール、３０μＬのエタノール（いずれもライセート中の濃度）から構成されているも
のを使用した。細胞を溶解後、ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００を用いて攪拌処理
（２５００ｒ．ｐ．ｍ．）を１分間行い、遠心によりスピンダウンさせた。
【０１６９】
次に、エタノールを２３０μＬ加え（ライセート溶液中の濃度は３２．５体積％）、直
ちに、５秒間ボルテックス処理を行った。その後、５５秒間ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ
−１０００を用いて攪拌（２５００ｒ．ｐ．ｍ．）を行い、遠心によりスピンダウンさせ
ることで、ライセート溶液を調製した。
ＲＮＡ抽出方法、回収量の算出、純度の決定は（実施例１）と同様の手法で行った。
【０１７０】
通過時間の結果を図１３に示した。細孔サイズの増大に伴って、ライセートの通過時間
は若干増加したが、洗浄液の通過時間は大幅に短くなった。回収量の結果を図１４に示し
た。細孔サイズが増加するとＲＮＡの回収量は約１５％低下した。
【０１７１】
（実施例１１）カートリッジを２個使用した場合の通過時間、回収量との関係
凍結保存していた約１０００００００個のペレット化した培養細胞ＨＬ６０を解凍し、
０．５ｍｏｌ／Ｌの３０μＬのＢｉｓ  Ｔｒｉｓ  （ｐＨ６．５）を加え、ピペッティン
グもしくはボルテックス処理を行うことで細胞を分散させた。ここに、溶解液を１０００
μＬ加えた。溶解液は、３．６６ｍｏｌ／ＬのＧＴＣ、１体積％の２−メルカプトエタノ
ール、５５μＬのエタノール（いずれもライセート中の濃度）から構成されているものを
使用した。細胞を溶解後、ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００を用いて攪拌処理（２
５００ｒ．ｐ．ｍ．）を１分間行い、遠心によりスピンダウンさせた。
【０１７２】
次に、エタノールを４００μＬ加え（ライセート溶液中の濃度は３２．５体積％）、直
ちに、５秒間ボルテックス処理を行った。その後、５５秒間ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ
−１０００を用いて攪拌（２５００ｒ．ｐ．ｍ．）を行い、遠心によりスピンダウンさせ
ることで、ライセート溶液を調製した。
ＮＥＸＴカートリッジを２個、洗浄液（ＷＲＣ）、回収液（ＣＲＣ）をＱｕｉｃｋ  Ｇ
ｅｎｅ  ８００にセットした後、ＮＥＸＴカートリッジにライセート溶液をそれぞれ５０
０μＬずつ入れ、Ｑｕｉｃｋ  Ｇｅｎｅ  ８００のＲＮＡモードで抽出を行った。この時
、回収液の浸漬時間は３０秒に設定した。
ＲＮＡ回収量の算出、純度の決定は（実施例１）と同様の手法で行った。
【０１７３】
カートリッジを１個使用した場合（ライセート液量は８００μＬ）には、ライセートの
通過時間は５０秒であったのが、カートリッジを２個使用すると通過時間はそれぞれ３１
秒と３４秒となり大幅に減少した。洗浄液の通過時間は、カートリッジが１個の場合には
約７０秒であったのが、カートリッジ２個では、２０秒以下となり大幅に通過時間は減少
した。回収量は、カートリッジ１個の場合は、１０４μｇであったが、カートリッジ２個
の場合には、５０μｇと５４μｇとであり、合計１０４μｇとなり、カートリッジ１個の
場合と同じ結果であった。
【０１７４】
（実施例１２）接着細胞Ｈｅｋ２９３、ＨｅＬａを用いた時の通過時間、回収量との関係
３．５ｃｍのｏｎ  ｄｉｓｈ上で培養した接着細胞Ｈｅｋ２９３（細胞数約１７０００
００個）、Ｈｅｌａ（細胞数約１５０００００個）の培養液を吸引により除去し、ＰＢＳ
を１ｍＬ加え、軽く揺さぶった後、ｄｉｓｈ上の溶液を吸引により除去した。ここに溶解
液を５４０μＬ加えた。溶解液は、３．６６ｍｏｌ／ＬのＧＴＣ、１体積％の２−メルカ
プトエタノール、３０μＬのエタノール（いずれもライセート中の濃度）から構成されて
いるものを使用した。ｄｉｓｈにへばりついている細胞をピペットチップの裏側でこする
ことで、ｄｉｓｈから細胞をはがすとともに細胞を溶解させた。溶解液を１．７ｍＬのエ
ッペンドルフチューブに移し、ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００を用いて攪拌処理
（２５００ｒ．ｐ．ｍ．）を１分間行い、遠心によりスピンダウンさせた。
【０１７５】
次に、エタノールを２３０μＬ加え（ライセート溶液中の濃度は３２．５体積％）、直
ちに、５秒間ボルテックス処理を行った。その後、５５秒間ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ
−１０００を用いて攪拌（２５００ｒ．ｐ．ｍ．）を行い、遠心によりスピンダウンさせ
ることで、ライセート溶液を調製した。
ＲＮＡ抽出法、回収量の算出、純度の決定は（実施例１）と同様の手法で行った。
【０１７６】
Ｈｅｋ２９３、Ｈｅｌａのライセート溶液の通過時間は、それぞれ２７秒、２５秒であ
った。洗浄液の通過時間は、９秒、１１秒であった。ＲＮＡの回収量は、それぞれ、３０
μｇ、３９μｇであった。一方、遠心機を用いた二酸化ケイ素を主成分とするフイルター
を用いた抽出法では、それぞれ２０μｇ、１９μｇと本発明の手法よりも大幅に少ない回
収量しか得ることが出来なかった。
【０１７７】
（実施例１３）回収液浸漬時間と回収量との関係
凍結保存していた約２０００００００個のペレット化した培養細胞ＨＬ６０を解凍し、
０．５ｍｏｌ／Ｌの３０μＬのＢｉｓ  Ｔｒｉｓ  （ｐＨ６．５）を加え、ピペッティン
グもしくはボルテックス処理を行うことで細胞を分散させた。ここに、溶解液を６３０μ
Ｌ加えた。溶解液は、３．６６ｍｏｌ／ＬのＧＴＣ、１体積％の２−メルカプトエタノー
ル、１２０μＬのエタノール、２．５体積％のＴｗｅｅｎ８０（いずれもライセート中の
濃度）から構成されているものを使用した。細胞を溶解後、ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ
−１０００を用いて攪拌処理（２５００ｒ．ｐ．ｍ．）を１分間行い、遠心によりスピン
ダウンさせた。
【０１７８】
次に、エタノールを１４０μＬ加え（ライセート溶液中の濃度は３２．５体積％）、直
ちに、５秒間ボルテックス処理を行った。その後、５５秒間ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ
−１０００を用いて攪拌（２５００ｒ．ｐ．ｍ．）を行い、遠心によりスピンダウンさせ
ることで、ライセート溶液を調製した。
ＮＥＸＴカートリッジ（口径７ｍｍ、細孔３．５μｍ）、洗浄液（ＷＲＣ）、回収液（
ＣＲＣ）をＱｕｉｃｋ  Ｇｅｎｅ  ８００にセットした後、ＮＥＸＴカートリッジにライ
セート溶液を入れ、Ｑｕｉｃｋ  Ｇｅｎｅ  ８００のＲＮＡモードで抽出を行った。この
時、回収液の浸漬時間は３０秒もしくは１２０秒に設定した。
【０１７９】
回収液の浸漬時間が３０秒の時には、１００μＬの回収液で４８μｇしか回収できなか
ったが、浸漬時間が１２０秒の時にはＲＮＡの回収量は９８μｇと大幅に増加した。
【０１８０】
（実施例１４）ライセート溶液量と回収量との関係
凍結保存していた約１０００００００個のペレット化した培養細胞ＨＬ６０を解凍し、
０．５ｍｏｌ／Ｌの３０μＬのＢｉｓ  Ｔｒｉｓ  （ｐＨ６．５）を加え、ピペッティン
グもしくはボルテックス処理を行うことで細胞を分散させた。ここに、溶解液を２５−１
５００μＬ加えた。溶解液は、３．６６ｍｏｌ／ＬのＧＴＣ、１体積％の２−メルカプト
エタノール、３０μＬのエタノールから構成されているものを使用した。細胞を溶解後、
ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００を用いて攪拌処理（２５００ｒ．ｐ．ｍ．）を１
分間行い、遠心によりスピンダウンさせた。
【０１８１】
この溶液に対して、ライセート中のエタノール濃度が３５％になるように７０％エタノ
ールを２５−１５００μＬ加え（合計液量、５０−３０００μＬ）、５秒間ＣＵＴＥ  Ｍ
ＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００を用いて攪拌（２５００ｒ．ｐ．ｍ．）を行い、遠心によりス
ピンダウンすることで、ライセート溶液を調製した。
ＲＮＡ抽出法、回収量の算出、純度の決定は（実施例１）と同様の手法で行った。
【０１８２】
結果を図１５に示した。ライセート液量が増加するとともにＲＮＡの回収量が増加し、
ライセート液量が９００μＬで予測回収量の０．９μｇが得られ、更にライセート液量を
増加させると回収量は低下した。
【０１８３】
（実施例１５）予め溶解液で固相をコーティングしておく場合の回収量依存性
１体積％の２−メルカプトエタノールを含むＲＬＴ（株式会社キアゲン社製）を６００
μＬ、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉカラム（株式会社キアゲン社製）に入れ、１００００ｒｐ
ｍで１５秒間遠心させることで、核酸吸着用固体材料をＲＬＴでコーティングさせた。ま
た、コーティングしていないＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉカラムも準備した。
【０１８４】
直径６ｃｍのｄｉｓｈ上で培養させた接着細胞Ｈｅｋ２９３（細胞数は約５８００００
０個）の培養液を吸引により除去し、ＰＢＳを１ｍＬ加え、軽く揺さぶった後、ｄｉｓｈ
上のＰＢＳ溶液を吸引により除去した。ここに、１体積％の２−メルカプトエタノールを
含む細胞溶解液ＲＬＴを６００μＬ加え、細胞にへばりついている細胞をピペットチップ
の裏側でこすることで、ｄｉｓｈから細胞をはがすとともに細胞を溶解させた。この溶解
液をＳｈｒｅｄｄｅｒ  ｍｉｎｉカラム（株式会社キアゲン社製）に入れ、１５０００ｒ
ｐｍで２分間遠心させた。通過液に７０％のエタノールを６００μＬ加え、ピペッティン
グを７回行った。
【０１８５】
この様にして調製したライセート溶液をＲＬＴでコーティングしたＲＮｅａｓｙ  ｍｉ
ｎｉカラムもしくは未コーティングのＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉカラムに入れ、１００００
ｒｐｍで１５秒間遠心を行った。
【０１８６】
通過液を捨てて、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉカラムにＲＷ１液（株式会社キアゲン社製）
を７００μＬ加え、１００００ｒｐｍで１５秒間遠心させた。通過液を捨てて、ＲＮｅａ
ｓｙ  ｍｉｎｉカラムにＲＰＥ液（株式会社キアゲン社製）を５００μＬ加え、１０００
０ｒｐｍで１５秒間遠心した。さらに、通過液を捨てて、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉカラム
にＲＰＥ液を５００μＬ加え、１００００ｒｐｍで２分間遠心した。
ＤＥＰＣ（Ｄｉｅｔｙｌ  Ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）水をＲＮｅａｓｅｍｉｎｉカ
ラムに５０μＬ加え、１００００ｒｐｍで１分間遠心し、通過液を回収した。さらに、Ｄ
ＥＰＣ水をＲＮｅａｓｅ  ｍｉｎｉカラムに５０μＬ加え、１００００ｒｐｍで１分間遠
心し、通過液を回収した。
ＲＮＡ回収量の算出、純度の決定は（実施例１）と同様の手法で行った。
【０１８７】
結果を図１６に示した。
核酸吸着担体を先にＲＬＴでコーティングしたものは、ＲＮＡの回収量が１００μｇと
ほぼ一定の値を示した。しかし、コーティングしなかったものは、平均回収量は１００μ
ｇであったが、数値は８８μｇから１２４μｇまでバラツキが見られた。
この様に、核酸吸着用固体材料に対して、先に溶解液を加えておくことは、ＲＮＡ回収
量の安定に役立つ。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】ＰＢＳが含まれているペレット化ＨＬ６０細胞をＰＢＳ緩衝溶液で０．５ｍｏｌ／Ｌ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝溶液に置換した時の通過時間。
【図２】分散液の種類および分散液量に対するＲＮＡ回収量、通過時間との関係を示した。緩衝溶液名の横の数値は、分散に使用した緩衝溶液の液量（単位μＬ）である。ＰＢＳは、１３７ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化ナトリウム、２．７ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化カリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸水素二ナトリウム、２ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸二水素カリウムを含む溶液である。
【図３】０．５ｍｏｌ／Ｌ  Ｂｉｓ  Ｔｒｉｓ緩衝溶液（ｐＨ６．５）の濃度に対するライセートおよび洗浄液１（一回目の洗浄液）の通過時間、ＲＮＡの回収量のプロット。
【図４】溶解液の種類とライセートおよび洗浄液１の通過時間、ＲＮＡ回収量との関係。
【図５】グアニジンチオシアネート濃度とＲＮＡ回収量との関係。
【図６】グアニジンチオシアネート濃度と洗浄液通過時間との関係。
【図７】ライセート液量とライセートおよび洗浄液１通過時間、ＲＮＡ回収量との関係。
【図８】溶解液中エタノール量とライセート、洗浄液１、洗浄液２の通過時間との関係。
【図９】溶解液中エタノール量と回収液量ごとのＲＮＡ回収量との関係。右側の１００μＬから７００μＬ数値は、一本の抽出カラムに対して回収液量を１００μＬずつ加えた時の合計液量。
【図１０】ライセート中のエタノール濃度とＲＮＡ回収量との関係。
【図１１】エタノール添加後の攪拌時間とライセートおよび洗浄液１および洗浄液２の通過時間との関係。
【図１２】エタノール添加後の攪拌時間とＲＮＡ回収量との関係。右側の１００μＬから３００μＬ数値は、一本の抽出カラムに対して回収液量を１００μＬずつ加えた時の合計液量。
【図１３】膜の細孔サイズとライセートおよび洗浄液１および洗浄液２の通過時間との関係。
【図１４】膜の細孔サイズとＲＮＡ回収量との関係。
【図１５】ライセート液量と回収量との関係。
【図１６】予め溶解液で固相をコーティングしておいた場合の核酸回収量依存性。
【図１】
2007117084.tif 000004
【図２】
2007117084.tif 000005
【図３】
2007117084.tif 000006
【図４】
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【図５】
2007117084.tif 000008
【図６】
2007117084.tif 000009
【図７】
2007117084.tif 000010
【図８】
2007117084.tif 000011
【図９】
2007117084.tif 000012
【図１０】
2007117084.tif 000013
【図１１】
2007117084.tif 000014
【図１２】
2007117084.tif 000015
【図１３】
2007117084.tif 000016
【図１４】
2007117084.tif 000017
【図１５】
2007117084.tif 000018
【図１６】
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