(57)【要約】      （修正有）【課題】  アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子、当該遺伝子を含有する組み換えベクター、該組み換えベクターを含有する形質転換体を提供する。【解決手段】  Ｂａｃｉｌｌｕｓ由来のアルカリプロテアーゼをコードするＤＮＡからなる遺伝子。該遺伝子ＤＮＡがコードするアミノ酸配列からなるタンパク質、該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子：
（ａ）配列番号２、４、６、８または１０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
以下の（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡからなる遺伝子：
（ｃ）配列番号１、３、５、７または９に示す塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｄ）（ｃ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１または２に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項４】
請求項３記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項５】
宿主が微生物である請求項４記載の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は産業用酵素として有用な新規なアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
衣料用洗剤をはじめとする各種洗浄剤へ配合されているアルカリプロテアーゼは、洗浄力の向上に不可欠な一成分として重要な役割を果たしてきている。洗剤という大量消費剤に用いられることから、アルカリプロテアーゼは工業用酵素の中でも最も大量に生産されている酵素である。斯かるアルカリプロテアーゼの例としては、サビナーゼ（登録商標）、カンナーゼ（登録商標；ノボザイムズ）、マキサカル（登録商標；ジェネンコア）、ブラップ（登録商標；ヘンケル）及びＫＡＰ（花王）等が知られている（例えば、特許文献１〜３参照）。
【０００３】
これらのアルカリプロテアーゼは、バチルス属細菌由来であり、ズブチリシンスーパーファミリーの中においてファミリーＡを形成している。このファミリーはさらに真性ズブチリシン、高アルカリプロテアーゼ、菌体内アルカリプロテアーゼなどに分類されている（非特許文献１参照）。一般に洗剤用プロテアーゼは高アルカリプロテアーゼに属しており、それぞれの特性、分子量並びにアミノ酸配列の相同性は高いことが知られている。そこで公知のアルカリプロテアーゼとは異なる分子量、アミノ酸配列を有する洗剤用プロテアーゼを見出し、新たな遺伝子源として開発することが望まれていた。
【特許文献１】特開平４−３４９８８２号報
【特許文献２】特表平６−２９２５７７号報
【特許文献３】特表平８−５０８６４３号報
【非特許文献１】Siezen, R.J. & Leunissen, J.A.M., Protein Sci., 6, 501-523, 1997
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者らは、保有していた好アルカリ性バチルス属細菌のゲノムＤＮＡから従来公知のアルカリプロテアーゼとアミノ酸配列において同一性が低い新規なアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子を取得することに成功した。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
すなわち、本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子：
（ａ）配列番号２、４、６、８または１０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを提供するものである。
【０００６】
また、本発明は、以下の（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡからなる遺伝子：
（ｃ）配列番号１、３、５、７または９に示す塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｄ）（ｃ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを提供するものである。
【０００７】
また、本発明は、当該遺伝子を含有する組み換えベクター、該組み換えベクターを有する形質転換体を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の遺伝子を用いれば、衣料用洗浄剤をはじめ各種産業用の酵素として有用なアルカリプロテアーゼを単一かつ大量に生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の遺伝子は、（ａ）配列番号２、４、６、８または１０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｃ）配列番号１、３、５、７または９に示す塩基配列からなるＤＮＡ、または（ｄ）（ｃ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子である。
【００１０】
ここで、配列番号２、４、６、８または１０に示すアミノ酸配列に対し、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列には、１若しくは数個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれ、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
【００１１】
当該アミノ酸配列をコードするＤＮＡは、自然界から得ることも可能ではあるが、さらに部位特異的突然変異誘発法等の公知の手法を利用して調製することもできる。例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット[Mutan-super Express Km キット（タカラ）]等を用いて変異を導入し調製することができる。
【００１２】
本発明の配列番号２、４、６、８または１０に示すアミノ酸配列はセリンプロテアーゼとして機能する推定成熟タンパク質のアミノ酸配列を含んでおり、またセリンプロテアーゼに高度に保存されたプロテアーゼ活性発現に必要な領域もしくはアミノ酸配列を保持している。本発明の配列番号２、４、６、８または１０に示すアミノ酸配列と従来公知のタンパク質のアミノ酸配列との同一性を調べると、配列番号２に示すアミノ酸配列は、Bacillus pseudofirmusの生産するアルカリ性セリンプロテアーゼVpr（Mol. Gen. Genet. 229 (2), 292-300 (1991)） との同一性が最も高く、その同一性は54.7％であり、配列番号４に示すアミノ酸配列はBacillus sp.KSM-K16株の生産する菌体外マイナーセリンプロテアーゼ（NCBI（ HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/" http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）のデータベース上に公開されているBacillus sp.KSM-K16のタンパク質番号；BAD63291で表わされる配列）との同一性が最も高く、その同一性は38.6％であり、配列番号６に示すアミノ酸配列は、Bacillus sp.LG12株の生産する菌体外マイナーアルカリ性セリンプロテアーゼSprB （Appl. Environ. Microbiol. 61 (12), 4490-4493 (1995)） との同一性が最も高く、その同一性は52.8%であり、配列番号８に示すアミノ酸配列は、Bacillus sp.LG12 株の生産するアルカリ性セリンプロテアーゼSprA（Appl. Environ. Microbiol. 61 (12), 4490-4493 (1995)） との同一性が最も高く、その同一性は76.6％であり、配列番号１０に示すアミノ酸配列は、Bacillus sp.LG12株の生産するアルカリ性セリンプロテアーゼSprB （Appl. Environ. Microbiol. 61 (12), 4490-4493 (1995)） との同一性が最も高く、その同一性は70.4％であった。このことは、配列番号２、４、６、８または１０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質が、従来公知のアルカリ性セリンプロテアーゼと完全に一致しない新規なアルカリプロテアーゼ、特にアルカリ性セリンプロテアーゼであることを示唆するものである。
【００１３】
すなわち、本発明の遺伝子には、配列番号２、４、６、８または１０に示すアミノ酸配列において相当する配列を適切にアライメントした時、配列番号２に示すアミノ酸配列の場合は60％以上、配列番号４に示すアミノ酸配列の場合は40％以上、配列番号６に示すアミノ酸配列の場合は65％以上、配列番号８に示すアミノ酸配列の場合は80%以上、そして配列番号１０に示すアミノ酸配列の場合は75%以上の同一性を示し、プロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が包含される。このうち、いずれの配列についても各アミノ酸配列に対する同一性が、好ましくは85%以上、より好ましくは90％以上、更に好ましくは95%以上、最も好ましくは98％以上を示し、プロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が好ましい。
【００１４】
尚、ここで述べるアミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法（Science, 227, 1435, (1985)）によって計算される。具体的には、GENETYX-WIN(Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発)のホモロジー解析（サーチホモロジ−）プログラムを用いて、Unit size compare (ktup)を1として解析を行うことで算出することができる。
【００１５】
本発明の遺伝子は、上述のとおり、配列番号２、４、６、８または１０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質または当該アミノ酸配列と等価のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものであればよいが、このうち、配列番号１、３、５、７または９に示す該塩基配列からなるＤＮＡにストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が好ましい。尚、配列番号１、３、５、７または９に示す塩基配列は、本発明のセリンプロテアーゼ様タンパク質のプレプロ領域並びに成熟タンパク質を含む前駆体をコードするものである。
【００１６】
なお、ここで「ストリンジエントな条件下」とは、例えばMolecular cloning - a Laboratory manual 2nd edition (Sambrookら、1989)に記載の条件等が挙げられる。例えば、６ＸＳＳＣ（１ＸＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％  ＳＤＳ、５Ｘデンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００１７】
かようなプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる本発明の遺伝子は、特にアルカリ性セリンプロテアーゼをコードするDNAからなる遺伝子であることが好ましい。
【００１８】
本発明の遺伝子は、例えばバチルス属に属する微生物、好ましくは特開２００４−０６５１７１に記載のBacillus sp. KSM-LD1株（FERM  P-18576）などから、ショットガン法、PCR法等を用いてクローニングすることにより得ることができ、さらに適当なベクターと宿主菌を用いれば大量に得ることができる。
【００１９】
本発明の遺伝子を用いれば、アルカリプロテアーゼを単一かつ大量に生産することができ、具体的には、目的とする宿主内で遺伝子を発現するのに適した任意のベクターに、上記アルカリプロテアーゼ遺伝子を組み込み、該組み換えベクターを用いて宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、当該培養物からアルカリプロテアーゼを採取すればよい。ここで用いられる宿主としては、特に制限されないが微生物が好ましく、微生物としてはBacillus属（枯草菌）等のグラム陽性菌、Escherichia coli（大腸菌）等のグラム陰性菌、Streptomyces属（放線菌）、Saccharomyces属（酵母）、Aspergillus属（カビ）等の真菌が挙げられ、このうち、Escherichia coli（大腸菌）HB101株が好ましい。また、ここで用いられるベクターとしては、大腸菌を宿主とする場合には、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられ、枯草菌を宿主にする場合には、ｐＵＢ１１０、ｐＨＳＰ６４(Sumitomoら、Biosci. Biotechnol, Biocem., 59, 2172-2175,1995)あるいはｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられる。培養は微生物の質化可能な炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に摂取し、常法に従って行えばよい。
【００２０】
かくして得られた培養物中からのアルカリプロテアーゼの採取及び精製は、一般の方法に準じて行うことができる。即ち、培養物から遠心分離または濾過することで菌体を除き、得られた培養物上清から常法手段により目的酵素を濃縮することが出来る。このようにして得られた酵素液または乾燥粉末はそのまま用いることもできるが、さらに公知の方法により結晶化や造粒化することができる。
【実施例】
【００２１】
実施例1  Bacillus sp. KSM-LD1株由来アルカリプロテアーゼ（ＳＦ）遺伝子のクローニングおよび塩基配列の決定
枯草菌が産生するセリンプロテアーゼファミリー１において高度に保存されている領域である６４番目のＨｉｓ周辺および２２１番目のＳｅｒ周辺のアミノ酸配列His-Gly-Thr-His-Val-Ala-GlyおよびGly-Thr-Ser-Met-Ala-Ser-Pro-His-Val-Ala-Glyに対して、これらの領域間を増幅させるように設計したプライマー１（配列番号１１：５’−ＣＡＹＧＧＮＡＣＮＣＡＹＧＴＮＧＣＮＧＧ−３’）、プライマー２（配列番号１２：５’−ＣＣＮＧＣＮＡＣＲＴＧＮＧＧＮＧＮＮＧＣＣＡＴＮＧＡＮＧＴＮＣＣ−３’）、プライマー３（配列番号１３：５’−ＣＣＮＧＣＮＡＣＲＴＧＮＧＧＮＧＮＮＧＣＣＡＴＲＣＴＮＧＴＮＣＣ−３’）を合成した。ここで、アミノ酸番号はズブチリシンＢＰＮ’を基準に示したものである。
【００２２】
Bacillus sp. KSM-LD1株を1％トリプトン（ディフコ）、０．５％酵母エキス（ディフコ）、１％塩化ナトリウム（和光純薬）から成る培地にて３０℃、２４時間、好気的に振盪培養を行い、遠心分離により菌体を集めた。得られた菌体から斎藤と三浦の方法（Biochim. Biophys. Acta, 72, 619-629, 1963）に準じ、ゲノムＤＮＡを調製し、プライマー１と２、１と３の組み合わせを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件はゲノムＤＮＡ１０〜１００ｎｇ、２０ｎｍｏｌの各プライマー、Pyrobest (Takara)から成る反応液（５０μＬ）に対し、Biometra：T-Gradient Thermocycler(ワットマン)を用いて９４℃で１分間の熱変性後、９４℃で１分間、４０〜６０℃で１分間、７２℃で３分間を１サイクルとし３０サイクル行った。得られたＰＣＲ断片をHigh Pure PCR Product Purification キット（ロッシュ）を用いて精製し、SmaIにて消化したpUC18に連結し、大腸菌HB101株に導入した。形質転換体よりHigh Pure Plasmid Isolation キット（ロッシュ）を用いてプラスミドを調製し、EcoRI、HindIIIで消化後1.2%アガロースゲル電気泳動により挿入断片の有無と大きさを確認した。挿入断片の大きさが200 bp〜1500 bpのもの選び、BigDye  Terminator  Cycle  Sequencingキット（パーキンエルマー）及びDNAシークエンサー（377型：アプライドバイオシステムズ）を用いて塩基配列を決定した。なお、プライマーは、BcaBEST Sequencing Primer RV-M（Takara）またはBcaBEST Sequencing Primer M13-47（Takara）を用いた。塩基配列を比較し異なるものを選抜し、上流および下流方向の塩基配列決定に適したプライマー（同一種、同一方向につき2種ずつ：外側、内側）を合成した。Bacillus sp. KSM-LD1株のゲノムＤＮＡを、EcoRIまたはHindIIIで消化し、LA PCR in vitro cloning キット（Takara）中のEcoRIまたはHindIIIカセットに上記消化断片をそれぞれ連結させ、各々の外側プライマーと付属のプライマーＣ１にてＰＣＲを行なった。ＰＣＲの反応条件はカセットに連結されたＤＮＡ断片０．１〜１．０ｎｇ、各プライマー１０〜２０ ｐｍｏｌ並びにPyrobestから成る反応系（50μL）に対し、９４℃で１分間の熱変性後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で４分間を１サイクルとし３０サイクル行った。その後、増幅ＤＮＡ断片を各々の内側プライマーと付属のプライマーＣ２でＰＣＲを行い増幅させた。この際のＰＣＲ条件は先に得られた増幅ＤＮＡ断片を１００００倍希釈したもの１μＬを鋳型に１０〜２０ｐｍｏｌのプライマーを用い（５０μL）、９４℃で１分間の熱変性後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間を１サイクルとし３０サイクルにて行った。増幅した断片の塩基配列を前述の方法と同様に決定した。新たに得られた塩基配列情報をもとに上流域、下流域の塩基配列を決定するためのプライマーを合成し、同様の手法によりアルカリプロテアーゼ（ＳＦ）をコードすると思われる領域およびその上流、下流領域の全塩基配列（配列番号１）を決定した。
【００２３】
実施例２  Bacillus sp. KSM-LD1株由来アルカリプロテアーゼ（ＳＧ、ＳＨ、ＳＩ、ＳＪ）遺伝子のクローニングおよび塩基配列の決定
実施例１の方法に準じて、Bacillus sp. KSM-LD1株由来アルカリプロテアーゼ（ＳＧ、ＳＨ、ＳＩ、ＳＪ）の全塩基配列（配列番号３，５，７，９）を決定した。
【配列表】
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