(57)【要約】【課題】  タンパク質を解析に際し、適当な担体にタンパク質を固定するための、効率的、且つ強固にタンパク質を固定するための汎用的方法を提供する。【解決手段】  タンパク質のＣ末端側に、不飽和官能基を有するピューロマイシン修飾体が導入された、修飾タンパク質を使用し、その不飽和官能基を利用して、共重合反応により、その修飾タンパク質を強固に担体に固定する。担体に固定されたタンパク質は、例えば、プロテインチップといったタンパク質の機能解析等を行うデバイスに応用される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質のＣ末端側に、不飽和官能基を有するピューロマイシン修飾体が導入された修飾タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質のＣ末端に不飽和官能基を有するピューロマイシン修飾体が導入された修飾タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ゲノムプロジェクトの進展により、生物の膨大な遺伝子情報が明らかとなり、その機能の解析が進められている。その機能解析のツールとして、DNAチップ（DNAマイクロアレイ）と呼ばれるデバイスを使用する方法が一般化しつつある。現在、DNAチップでは、例えば、ある生理的特徴を備えた細胞とコントロール細胞間で、細胞内で発現している遺伝子情報をmRNA量で比較し、その生理的特徴と遺伝子発現の相関を解析している。
【０００３】
しかし、実際に細胞内で機能的に発現しているタンパク質とmRNA量との相関は必ずしも高くないことから、タンパク質レベルを直接、解析する手法も注目されている。
【０００４】
例えば、タンパク質-医薬品の相互作用、タンパク質−タンパク質間の相互作用は、新規の医薬品開発、副作用の減弱化において重要な情報となる。
【０００５】
一方、直接、タンパク質を解析するには、適当な担体にタンパク質を固定する必要がある。タンパク質の固定化方法としては、担体にカルボキシル基の露呈させ、タンパク質のアミノ基とカップリングさせる方法（アミノカップリング法）、担体をチオール化し、カルボキシル基をＰＤＥＡ等で修飾したタンパク質とジスルフィド結合を通してカップリングさせる方法（チオールカップリング法）等が知られている。また、上記共有結合による固定ではなく、タンパク質にＨｉｓ−Ｔａｇを導入し、それをＮＴＡ（Nitrilotriacetic acid）で処理した担体にNi2+を通して結合させる方法も知られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、上述のアミノカップリングによるタンパク質の固定化方法では、酸性タンパク質は固定することはできない。また、チオールカップリングによる固定化方法では、酸性タンパク質は固定化できるものの、多量のタンパク質を必要とする。さらには、His-Tagを用いる固定化方法では、最初は固定されるものの徐々に解離するという問題があった。
【０００７】
本発明は上記問題点を解決した修飾タンパク質及びその固定化方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上述した問題点を解決するために鋭意検討を行った結果、タンパク質のＣ末端側に、不飽和官能基を有するピューロマイシン修飾体が導入された、修飾タンパク質を使用し、その不飽和官能基を利用して、共重合反応により、その修飾タンパク質を強固に担体に固定できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
即ち、本発明は、タンパク質のＣ末端側に、不飽和官能基を有するピューロマイシン修飾体が導入された、修飾タンパク質、である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、タンパク質をその種類に関係なく、共有結合により強固に担体に結合させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、「タンパク質のＣ末端側に、不飽和官能基を持つピューロマイシン修飾体が導入された、修飾タンパク質」である。
【００１２】
ここで「タンパク質」とは、オリゴペプチド、ポリペプチドを含む意味で用いる。
【００１３】
「ピューロマイシン」（化学式１参照）は、細菌及び動物細胞のタンパク質合成を阻害することが知られている（Nathans,D. (1964) Proc.Natl.Acad.Sci.USA,51,585-592、Takeda,Y. et al. (1960) J.Biochem. 48,169-177、Ferguson,J.J. (1962) Biochim.Biophys.Acta 57,616-617、Nemeth,A.M. & de la Haba,G.L. (1962)J.Biol.Chem. 237,1190-1193）。その機構は、ピューロマイシンの構造はアミノアシルtRNAの構造と類似しているため、ピューロマイシンがリボソームのＰサイトに結合しているペプチジルtRNAと反応し、ペプチジルピューロマイシンとしてリボソームから遊離するため、タンパク質合成が中断されることが知られている（Harris, R.J. (1971) Biochim.Biophys.Acta240,244-262）。
【００１４】
＜式１＞
2007070294.tif 000002
「不飽和官能基を持つピューロマイシン修飾体」とは、ピューロマイシンの○○位に不飽和官能基が導入された修飾体をいう。ここで、不飽和官能基としては、ビニル基、アクリロイル基、等が挙げられる。そのようなピューロマイシン修飾体を得る方法としては、例えばビニル化剤としてアクリダイト (AcryditeTM，Acrylamide phosphoramidite)を用いて、ピューロマイシンに不飽和官能基を導入する方法が挙げられる。
【００１５】
次に、上記不飽和官能基を持つピューロマイシン修飾体をタンパク質のＣ末端に導入する方法を説明する。
【００１６】
タンパク質合成において、低濃度のピューロマイシン存在下では、リボソームのＡサイトに終止コドンが来たときペプチジルトランスフェラーゼの作用により、ピューロマイシンが終止因子と競合しながらタンパク質のＣ末端と結合することが知られている（Nemoto et al. (1999) FEBS Lett. 462, 43-46）。例えば、原核または真核生物の無細胞転写翻訳系、例えば大腸菌の無細胞転写翻訳系において、低濃度のピューロマイシン、もしくはピューロマイシンに蛍光性色素を化学結合させた化合物を混合しておくことにより、タンパク質のＣ末端側にピューロマイシン、又はピューロマイシンに蛍光性色素を化学結合させた化合物を付加されたタンパク質を得ることができる（特開2000-139468号参照）。上述の現象を利用し、例えば、原核または真核生物の無細胞転写翻訳系、例えば大腸菌の無細胞転写翻訳系に、低濃度の不飽和官能基を有するピューロマイシン修飾体を混合しておくことにより、タンパク質のＣ末端に不飽和官能基を有するピューロマイシン修飾体が導入されたタンパク質修飾物を得る。
【００１７】
このように調製された「タンパク質のＣ末端側に不飽和官能基を有するピューロマイシン修飾体が導入されたタンパク質修飾物」は、例えば、重合性モノマーと共重合することにより、タンパク質が固定（包含）された高分子材料を得ることができる。
【００１８】
重合性モノマーとしては、特に制限されないが、例えば、アクリルアミド、N,Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリルロイルアミノエトキシエタノール、Ｎ−アクリルロイルアミノプロパノール、N−メチロールアクリルアミド、N−ビニルピロリドン、ヒドロキシエチルメタクリレート、（メタ）アクリル酸、アリルデキストリン等から選ばれた少なくとも一種類以上の単量体と、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等の多官能性単量体を、水性媒体中で共重合させ、タンパク質が固定（包含）されたゲルを得る。好ましくは、アクリルアミド系のゲルである。
【００１９】
上述の固定化方法は、様々なタンパク質検査装置に使用される。例えば、キャピラリー電気泳動法で使用するキャピラリーにおいて、その中空部にアクリルアミドモノマーと上述のタンパク質修飾物とを含む重合溶液を導入し、中空部内で重合反応を実施することにより、キャピラリーの中空部にタンパク質が固定されたアクリルアミドゲルが保持されたキャピラリーを得ることができる。
【００２０】
また、平面基板上にモノマー溶液と上述のタンパク質修飾物とを含む重合溶液を滴下し、平面基板上で重合反応を行うことにより、平面基板上に多数のタンパク質が固定されたタンパク質チップを作成することも可能である。
【００２１】
さらには、繊維型ＤＮＡチップ（GenopalTM）のDNAプローブに替え、タンパク質を使用することにより、タンパク質チップを作成することもできる（WO00/53736号公報参照）。
【００２２】
以上、本発明におけるタンパク質修飾物の使用の一例を示したが、使用方法はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。
【００２４】
＜実施例１＞
不飽和官能基を有するピューロマイシン修飾体の調製及びその修飾体を用いたの修飾タンパク質の調製
（１）不飽和官能基を有するピューロマイシン修飾体の調製：アクリルアミド修飾したピューロマイシンの合成
材料：ピューロマイシン（puromycin, 3'-[ α-Amino-p-methoxyhydrocinnamamido]-3'-deoxy-
N,N'-dimethyladenosine, I）はシグマから、アクリダイト（AcryditeTM ，Acrylamide phosphoramidite）はMatrix Technologiesから、テトラゾールは日本ミリポアから、クロマト用シリカゲルはメルクからそれぞれ購入した。
【００２５】
方法：ピューロマイシン（26 mg、48 μmol）を3 mlの乾燥ピリジンに溶かし、減圧下で蒸発させ、脱水させた。この操作を３回繰り返した。これに5 mlの4%テトラゾール/アセトニトリル溶液とアクリダイトを加え、室温で撹拌させた。反応はシリカゲルの薄層クロマトグラフィー（TLC、展開溶媒：クロロフォルム：メタノール=9:1）でモニターした。上記反応を2時間で終了し、反応終了後、溶媒を減圧下で除去した。、これに0.1 Mのヨウ素をテトラヒドロフラン/ピリジン/水=80:40:2に溶かした溶液 2 mlを加え、室温で撹拌させながら生成したホスファイト-トリエステルを酸化させた。１時間半後、溶媒を減圧下で除去し、残部をクロロフォルムで抽出した。抽出液は無水硫酸マグネシウム存在下で乾燥させた後、減圧下で溶媒を除去した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、クロロフォルム/メタノール=90:10で溶出させた。保護基のついた不飽和官能基を持つピューロマイシン誘導体化物は、シリカゲルTLC（展開溶媒：クロロフォルム：メタノール=9:1）でRf 0.19のところに溶出される。次に保護基の脱保護を行う。保護基のついた不飽和官能基を持つピューロマイシン誘導体化物を濃アンモニア水/エタノール=2:1の混合溶液 1 ml に加え、β-シアノエチル基を除去するとアクリルアミド修飾されたピューロマイシン修飾体化物（化学式２参照）が6mg得られた。合成品が不飽和官能基を持つピューロマイシン誘導体化物であることは、MALDI/TOFマススペクトロメトリーで[M+H]+の分子イオンがm/z 735に現れることから同定された。
【００２６】
＜式２＞
2007070294.tif 000003
（２）プラスミドの調製
T7プロモーターを含むプラスミド(pET-23a)に、プラスミド(PGEX-2T)から得られるグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（GST、アミノ酸220 残基、分子量26kDa）のコーディング領域を遺伝子組換え法にて組込み、プラスミド(pET-23a-GST)を作製した。ここで用いたプラスミド遺伝子の組み換えは、制限酵素を用いた一般的な方法による（羊土社  改定遺伝子工学実験ノート等）。
【００２７】
なお、プラスミド(pET-23a)はノバジェンから、プラスミド(pGEX-2T)はアマシャムバイオサイエンスから、また制限酵素はタカラバイオから購入した。
【００２８】
宿主には大腸菌のBL21(DE3)株を用いた。作製したプラスミド(pET-23a-GST)を有する大腸菌のBL21(DE3)株をLB培地でアンピシリン（最終濃度40μg/ml）存在下、37℃、10時間培養し、遠心分離により菌体を採取した。プラスミド(pET-23a-GST)DNAは、QIAGEN製QIAprep Spin Miniprep Kitにより精製した。
【００２９】
（３）アクリルアミド修飾したピューロマイシンによるタンパク質の修飾
調整したプラスミド(pET-23a-GST)DNAは、大腸菌の無細胞転写翻訳系WakoPURE systemにおいてアクリルアミド修飾したピューロマイシン修飾体の最終濃度が１μＭになるように加え、３０℃で６０分反応させた。得られたGSTが不飽和官能基を有するビニル化ピューロマイシン修飾体であることは、MALDI/TOFマススペクトロメトリーで [M+H]+の分子イオンがm/z 26,735に現れることから同定された。
【００３０】
＜比較例１＞
実施例１（３）において、アクリルアミド修飾したピューロマイシン修飾体を加えず、大腸菌の無細胞転写翻訳系において３０℃で６０分反応させた。その結果、得られたタンパク質のMALDI/TOFマススペクトロメトリーで [M+H]+の分子イオンがm/z 26,000に現れ、得られたタンパク質はピューロマイシンが導入されていないGSTであった。
【００３１】
＜比較例２＞
アクリルアミド修飾したピューロマイシン修飾体の替わりに、ピューロマイシンを加え、大腸菌の無細胞転写翻訳系において３０℃で６０分反応させた。その結果、得られたタンパク質はMALDI/TOFマススペクトロメトリーで [M+H]+の分子イオンがm/z 26,491に現れ、得られたタンパク質はC末端にピューロマイシンが導入されているGSTであった。
【００３２】
＜実施例２＞
本実施例、比較例は、不飽和官能基を有するピューロマイシンによるタンパク質修飾体のアクリルアミドゲルへの固定化及び評価に関する。
【００３３】
表１に示したゲル前駆体水溶液を調製し、マイクロピペットにてガラススライド上に0.1μｌ滴下し、実施例１で得られたアクリルアミド修飾したピューロマイシンの導入されたGST、及び比較例２で得られたピューロマイシンの導入されたGSTを、アクリルアミドゲルへ固定した。
【００３４】
［表１］
2007070294.tif 000004
蛍光標識化されたCy5 Labeled Antibody-GST（モレキュラープローブから購入）40μｇ／ｍｌ溶液を用いて、上記スライドガラス上にて、アクリルアミド修飾したピューロマイシンの導入されたGSTのアクリルアミドゲルへの固定化に関して定量的に評価した。ここで利用した評価法はタンパク質チップに用いるタンパク質の相互作用の評価法として一般的に用いられる方法による（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，ｖｏｌ．２８９，ｐ．１７６０）。
【００３５】
スライドガラス上に固定化されたタンパク質に対し、相互作用する蛍光標識化された抗体量を、蛍光スキャナーＧｅｎｅＴＡＣ  ＬＳＩＶ（ＧＥＮＯＭＩＣ  ＳＯＬＵＴＩＯＮＳ）にて読み取り、その蛍光強度から固定化されたタンパク質量を定量したところ、アクリルアミド修飾したピューロマイシンの導入されたGSTは、アクリルアミド修飾されていないピューロマイシンの導入されたGSTと比較して、その強度は約１０倍であった。