(57)【要約】【課題】  長時間の反応や、繰り返し利用した場合でも、高い活性を維持できる、マンガンペルオキシダーゼとの結合力が強い担体に固定化された、固定化マンガンペルオキシダーゼ、その製法、それを用いた反応器、それを固定化するための担体の提供。【解決手段】  エポキシ基を有する担体にマンガンペルオキシダーゼが固定化されてなることを特徴とする固定化マンガンペルオキシダーゼ；かかる固定化マンガンペルオキシダーゼがカラムに充填されてなることを特徴とする反応器；エポキシ基を有する担体と、マンガンペルオキシダーゼを含む溶液とを接触させることを特徴とする固定化マンガンペルオキシダーゼの製造方法；エポキシ基を有することを特徴とするマンガンペルオキシダーゼ固定化用担体。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エポキシ基を有する担体にマンガンペルオキシダーゼが固定化されてなることを特徴とする固定化マンガンペルオキシダーゼ。
【請求項２】
前記エポキシ基を有する担体が、エポキシ基を有するポリマーである請求項１記載の固定化マンガンペルオキシダーゼ。
【請求項３】
前記ポリマーが多孔質体である請求項２記載の固定化マンガンペルオキシダーゼ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の固定化マンガンペルオキシダーゼがカラムに充填されてなることを特徴とする反応器。
【請求項５】
エポキシ基を有する担体と、マンガンペルオキシダーゼを含む溶液とを接触させることを特徴とする固定化マンガンペルオキシダーゼの製造方法。
【請求項６】
エポキシ基を有することを特徴とするマンガンペルオキシダーゼ固定化用担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固定化マンガンペルオキシダーゼ及びその製造方法、該固定化マンガンペルオキシダーゼを有する反応器、並びにマンガンペルオキシダーゼ固定化用担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素を触媒として用いた反応は、温和な条件で行われ、副反応や反応対象物の熱によるダメージ等を起こすことがないため有用な方法である。一方で、酵素はコストが高いため、酵素を効率的に使用し、かつ回収効率を高める目的で、酵素を固定化するための技術開発が進んでいる。例えば、マンガンペルオキシダーゼをメソポーラスシリカ多孔質担体へ固定化する方法が知られている（特許文献１参照）。
しかしながら、マンガンペルオキシダーゼのメソポーラスシリカ多孔質担体へ結合力は弱く、長時間の反応や繰り返し利用した際に、酵素が担体から剥がれてしまい、３価マンガンの生成量が低下してしまい、反応活性も低下していた。
【特許文献１】特開２００１−１２８６７２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、長時間の反応や、繰り返し利用した場合でも、高い活性を維持できる、マンガンペルオキシダーゼとの結合力が強い担体に固定化された、固定化マンガンペルオキシダーゼを提供することを目的とする。
また、本発明は、かる固定化マンガンペルオキシダーゼを用いた反応器を提供することを目的とする。
また、本発明は、かかる固定化マンガンペルオキシダーゼの製造方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、かかるマンガンペルオキシダーゼとの結合力が強いマンガンペルオキシダーゼ固定化用担体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは上記課題を解決するため、鋭意努力した結果、エポキシ基を有する担体を用い、エポキシ基との結合によりマンガンペルオキシダーゼを固定化することによって、マンガンペルオキシダーゼの担体からの脱離を抑制することを見出し、さらに、長時間の反応や繰り返し利用に際しても、３価マンガンの生成量の低下を抑制し、かつ反応活性の低下も抑制することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、エポキシ基を有する担体にマンガンペルオキシダーゼが固定化されてなることを特徴とする固定化マンガンペルオキシダーゼを提供するものである。
また、本発明は、かかる固定化マンガンペルオキシダーゼがカラムに充填されてなることを特徴とする反応器を提供するものである。
また、本発明は、エポキシ基を有する担体と、マンガンペルオキシダーゼを含む溶液とを接触させることを特徴とする固定化マンガンペルオキシダーゼの製造方法を提供するものである。
また、本発明は、エポキシ基を有することを特徴とするマンガンペルオキシダーゼ固定化用担体を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、マンガンペルオキシダーゼの担体からの脱離を抑制することができる。さらに、本発明の固定化マンガンペルオキシダーゼ及び／又は該固定化マンガンペルオキシダーゼを充填したカラムを利用した酵素反応において、長時間の反応や繰り返し利用に際しても、３価マンガンの生成量の低下を抑制し、かつ反応活性の低下も抑制することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
（マンガンペルオキシダーゼ）
本発明で使用するマンガンペルオキシダーゼには、例えば、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ファネロカエテ・ソルディダ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｓｏｒｄｉｄａ）、カイガラタケ（Ｌｅｎｚｉｔｅｓ  ｂｅｔｕｌｉｎｕｓ）、ヒラタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｏｓｔｒｅａｔｕｓ）、シイタケ（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ  ｅｄｏｄｅｓ）等の担子菌類が生産するリグニン分解酵素を挙げることができる。これらのマンガンペルオキシダーゼは、単独で用いても、２種以上を併用してもよい。
【０００８】
ペルオキシダーゼを固定化に供する際には、反応性が高くなることから、ペルオキシダーゼを溶解した状態で使うことが好ましい。この際、溶媒としては、ペルオキシダーゼを溶解し、可溶化後のペルオキシダーゼの活性が維持できるものであれば特にこだわるものではない。そのような溶媒としては水性溶媒が好ましい。
水性溶媒としては、例えば、水、緩衝液、水又は緩衝液と有機溶媒との混合液等が用いられる。
緩衝液としては、例えば、マロン酸緩衝液、シュウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、クエン酸緩衝液及びリン酸緩衝液等が挙げられる。
水性溶媒が水と有機溶媒との混合液である場合は、有機溶媒の割合は１０体積％以下とすることが好ましく、５体積％以下とすることがより好ましい。有機溶媒の割合が高くなり過ぎると、固定化したマンガンペルオキシダーゼが失活しやすくなる。
また、ここで、用いることのできる有機溶媒としては、例えば、ヘキサン、トリクロロメタン、メチルエチルケトン、酢酸エチル、ブタノール、エタノール、メタノール、ジオキサン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ギ酸、ジメチルホルムアミド、アセトン、ｎ−プロパノール、イソプロパノール及びｔ−ブチルアルコール等が挙げられる。
【０００９】
（担体）
本発明の担体は、エポキシ基を含有し、マンガンペルオキシダーゼを固定化するのに特に適した担体である。かかる担体としては、エポキシ基を有しているものであれば、市販のものや従来公知の方法で製造されたものなど、本発明の効果を呈するものであれば特に限定することなく用いることができる。例えば、エポキシ基を有するカオリナイト及びガラス等の無機物や、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド及びポリスチレン等の有機物を用いることができる。表面にエポキシ基を有していない場合は、導入することが出来る。例えばガラス由来の担体に対しては、各種のシランカップリング剤を用いることにより、担体にエポキシ基を導入することが可能である。また、有機物由来の担体であれば、該有機物に存在する官能基を介する方法や、担体を合成する際にエポキシ基を持った化合物と共重合させることにより、担体にエポキシ基を導入することが可能となる。このうち、エポキシ基を有するポリマーが好ましい。また、該ポリマーはアクリル樹脂であることが特に好ましく、さらに、多孔質アクリル樹脂であることが最も好ましい。
【００１０】
また、担体の形状は、単位体積当りのマンガンペルオキシダーゼ固定化量を増やすことによって、２価マンガンの酸化反応の反応性を高めることができることから、多孔質体であることが好ましく、その孔径はマンガンペルオキシダーゼの大きさよりも大きい方が好ましい。また、担体の形態としては、粉末状、顆粒状、シート状、膜状等があり、特に制限はないが、表面積の大きさを確保するという観点から粉末状、顆粒状が好ましい。
【００１１】
（固定化反応）
エポキシ基を有する担体にマンガンペルオキシダーゼを固定化するには、エポキシ基を有する担体と、ペルオキシダーゼを含む溶液とを接触させる。
活性の高い固定化マンガンペルオキシダーゼを得たい場合には、固定化に供するマンガンペルオキシダーゼの濃度を高くしてマンガンペルオキシダーゼを担体に対して過剰に供給し、担体使用量を少なくすることが好ましい。
固定化する際の温度は、高くなるほど担体表面のエポキシ基とマンガンペルオキシダーゼ中のアミノ基との反応が活性化される一方で、高くなるほどマンガンペルオキシダーゼの失活が起こりやすくなる。そのため固定化する際の温度範囲としては、４℃から３７℃が好ましい。
【００１２】
固定化する際には、固定化の効率を上げるために撹拌装置を使用して、前記エポキシ基を有する担体と、マンガンペルオキシダーゼを含む溶液とを攪拌しながら接触することが好ましい。ただし、激しく撹拌することは、固定化の効率を上げることにつながる一方、マンガンペルオキシダーゼの失活を招いてしまう。そのため、撹拌によりマンガンペルオキシダーゼを含む水性溶媒中にて担体が動き、且つマンガンペルオキシダーゼを含む水性溶媒が撹拌により泡立たない程度で撹拌することが好ましい。
【００１３】
（回収）
さらに、固定化反応を行った後、マンガンペルオキシダーゼを固定化した固定化酵素を含む水性溶媒中から該固定化酵素を分離し、回収する。該分離及び回収方法としては、例えば遠心分離、ろ過などの方法が上げられる。
【００１４】
（洗浄）
また、マンガンペルオキシダーゼを固定化させた後、共有結合で固定化されなかったマンガンペルオキシダーゼを該担体から除去するために、洗浄工程を行うことが好ましい。洗浄には、水性溶媒と同じものを用いることが好ましい。
本発明においては、前記洗浄と回収を数回繰り返すことが好ましい。
【００１５】
（反応器）
さらに、本発明の反応器は、カラムに前記固定化マンガンペルオキシダーゼを充填したものである。その場合、予めエポキシ基を有する担体にマンガンペルオキシダーゼを固定化してから、該担体をカラムに充填するか、もしくは、カラム中に担体を充填し、カラム内部の担体にマンガンペルオキシダーゼを含む水性溶媒を通過させることにより、マンガンペルオキシダーゼを固定化させることが出来る。後者の場合、一度通過したマンガンペルオキシダーゼを含む水性溶媒を再通過させることにより、無駄なくマンガンペルオキシダーゼを固定に供することが出来る。通過させる方向としては、カラムの上から下に向かって通過させる方法と、カラムの下から上へ通過させる方法があり、どちらも使用することが可能である。
【００１６】
また、予めエポキシ基を有する担体にマンガンペルオキシダーゼを固定化してから、該担体をカラムに充填した後、さらにカラム内部の担体にマンガンペルオキシダーゼを含む水性溶媒を通過させることにより、マンガンペルオキシダーゼを固定化した固定化酵素を得ることもできる。
【００１７】
（固定化マンガンペルオキシダーゼの使用方法）
本発明の固定化マンガンペルオキシダーゼと酸化剤と２価マンガンとを含む水性溶媒を接触させることにより、水性溶媒中で２価マンガンから３価マンガンを生成することができ、該３価マンガンで基質を酸化させ、酸化反応生成物を製造することができる。この際、基質と３価マンガンを含む水性溶媒を効率よく混合することで、基質の酸化反応が効果的に進行し、高い効率で酸化反応生成物を得ることができる。上記接触反応は、本発明の反応器中で行うことがより好ましい。
水性溶媒中に含まれる２価マンガンとしては、マンガンの酸化数が＋２であるマンガン化合物を用いればよく、特に限定されない。このようなものとして、例えば、硫酸マンガンを挙げることができる。
また、２価マンガンの配合量は、用いる基質の種類に応じて適宜調整すればよいが、水性溶媒として前記緩衝液を用いた場合等、水性溶媒中に有機酸を含有する場合には、有機酸の１／２の量よりも少ない方が好ましい。このような量とすることで、２価マンガンの酸化反応に伴って生成する３価マンガンが、これら有機酸と効率的に錯体を形成する。
【００１８】
本発明の固定化マンガンペルオキシダーゼもしくは反応器を用いて基質の酸化反応を行う際の反応温度は、５０℃以下であることが好ましく、２５℃程度であることがより好ましい。温度が高すぎる場合は、３価マンガンが不安定となり、基質を酸化させる前に失活することがあり、温度が低すぎる場合は、３価マンガンと基質との反応が進行しにくくなることがある。
また、反応時間は、３価マンガン濃度と量、及び反応基質により適宜調整すればよく、例えば、３価マンガン濃度が１．０ｍＭ、液量が１ｍｌであり、基質が０．５ｍＭの２，６−ジメチルフェノールである場合には、基質を完全に反応させるために必要な時間は１〜１０分程度である。
【００１９】
本発明で用いる基質としては、３価マンガンによって酸化することができるすべての物質が対象となるが、特定の化学物質を効率よく製造するためには、該基質は、種々の物質の混合物ではなく、高純度の特定の化学物質であることが好ましい。このような基質としては、例えば、フェノール類やナフトール類などの芳香族ヒドロキシ化合物を挙げることができる。
本発明で用いる基質が芳香族ヒドロキシ化合物である場合、基質を３価マンガンの存在下で酸化すると、基質同士が重合して２量体もしくはポリマーが生成する。
【００２０】
本発明における基質としてフェノール類を用いる場合、酸化反応生成物として特定の化学物質を高い収率で得るためには、該フェノール類は、芳香環の水素原子がアルキル基で置換されたアルキルフェノール類であることが好ましく、置換されたアルキル基の数が複数であるアルキルフェノール類であることがより好ましい。なかでも反応性の観点から、フェノール性水酸基から見て芳香環の２位と６位にアルキル基が置換されたアルキルフェノール類であることが特に好ましい。例えば、２，６−ジアルキル置換フェノールは、その反応特異性が高いことが知られており、本発明で用いる基質として、最も好ましいものとして挙げることができる。
【００２１】
前記アルキル基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよく、特に限定されないが、炭素数が１〜４のアルキル基であるメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基及びｔｅｒｔ−ブチル基であることが好ましく、メチル基であることがより好ましい。また、前記アルキルフェノール類が、芳香環上に複数のアルキル基が置換されたものである場合には、複数のアルキル基は、同じ種類あるいは異なる種類のいずれもよい。
【００２２】
（酸化剤）
酸化剤としては、例えば、過酸化水素、メチル過酸化物、エチル過酸化物等の過酸化物等が挙げられるが、反応性、経済性の観点から過酸化水素が好ましい。
【００２３】
本発明の固定化マンガンペルオキシダーゼを用いて安定的に３価マンガンを産生することが出来、産生した３価マンガンを用いて種々の分野、例えば、各種芳香族化合物のポリマー化や、難分解性物質の分解等の用途に広く使用することができる。
以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。以下、単位「Ｍ」は「ｍｏｌ／Ｌ」を示す。
【００２４】
以下実施例、比較例においては、酵素としてマンガンペルオキシダーゼ、固定化担体にはエポキシ基を有する多孔質アクリル樹脂系担体であるオイパーギットＣ２５０Ｌ（「Ｅｕｐｅｒｇｉｔ  Ｃ２５０Ｌ」）（商品名；デグサジャパン（株）製））、多孔質セラミック球状担体であるトヨナイト２００（「Ｔｏｙｏｎｉｔｅ−２００」（商品名；東洋電化工業（株）製））、トヨナイト２００にアミノ基を修飾した多孔質セラミック球状担体であるトヨナイト２００A（「Ｔｏｙｏｎｉｔｅ−２００Ａ」（商品名；東洋電化工業（株）製））、トヨナイト２００にメタクリル基を修飾した多孔質セラミック球状担体であるトヨナイト２００M（「Ｔｏｙｏｎｉｔｅ−２００Ｍ」（商品名；東洋電化工業（株）製））、トヨナイト２００にフェノル基を修飾した多孔質セラミック球状担体であるトヨナイト２００P（「Ｔｏｙｏｎｉｔｅ−２００Ｐ」（商品名；東洋電化工業（株）製））、トヨナイト２００Aのアミノ基をアルデヒド基に変更したトヨナイト２００AGA、メタクリレート重合体であるレバチット１６００（商品名；バイエル（株）製）、を使用した。ｐＨ緩衝液としては、マロン酸二ナトリウム（和光純薬工業（株）製「マロン酸二ナトリウム」）を用いたマロン酸緩衝液（ｐＨ４．５）を使用し、酸化数＋２のマンガンを有するマンガン化合物として硫酸マンガン（ＭｎＳＯ４：和光純薬工業（株）製「硫酸マンガン」）を用いた。
【００２５】
マンガンペルオキシダーゼとしては、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）の培養菌床から得られたマンガンペルオキシダーゼを用いた。このマンガンペルオキシダーゼの調製方法は以下の通りとした。
白色腐朽菌ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ２４７２５を、カーク液体培地（組成を表１に示す。）で３７℃にて培養した。培養は２Ｌ三角フラスコ中で上記した培地１Ｌにて培養し、３７℃で３日間培養後、１００％酸素をパージし、その後毎日一回酸素パージを行った。所定時間培養した後、培養液を吸引濾過して培養濾液を得、得られた培養濾液を粗酵素溶液とした。粗酵素溶液のｐＨを７．２に調整後、ｐＨ７．２のリン酸緩衝液にて膨潤させた後カラムに充填したトヨパールＤＥＡＥ６５０Ｍ（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＤＥＡＥ６５０Ｍ）（商品名；東ソー（株）製）にチャージした。カラム中に充填されたトヨパールＤＥＡＥ６５０Ｍに吸着されたマンガンペルオキシダーゼを、ｐＨ  ６．０のリン酸緩衝液にて流出させ、回収しマンガンペルオキシダーゼ溶液とした。
【００２６】
【表１】
2007068518.tif 000002
【００２７】
上記物質を蒸留水に溶解しｐＨを４．５に調整した後、１０００ｍＬに定容したものをカーク液体培地とした。
【００２８】
【表２】
2007068518.tif 000003
【００２９】
上記物質を蒸留水に溶解しｐＨを４．５に調整した後、１０００ｍＬに定容したものをカークトレースエレメンツとした。
【実施例１】
【００３０】
得られたマンガンペルオキシダーゼ溶液を５０ｍｇ／Ｌとなるように調製し、その３５ｍｌと、１．２５ｇのオイパーギットＣ２５０Ｌとをチューブに入れ、４℃の冷蔵庫中で、振とう機（「ダブルシェーカーＮＲ−３０」（商品名；タイテック（株）製））を用いて１２０〜１４０ｍｉｎ−１の速さで一昼夜撹拌することで固定化を行った。撹拌後のチューブを１０分間４０００ｒｐｍにて遠心し、オイパーギットＣ２５０Ｌを沈殿させ、上清を取り除いた。沈殿しているオイパーギットＣ２５０Ｌを洗浄するため、３５ｍｌの滅菌水を加え撹拌した後１０分間４０００ｒｐｍにて遠心し、オイパーギットＣ２５０Ｌを沈殿させ、上清を取り除いた。このオイパーギットＣ２５０Ｌの洗浄操作を合計３回行った。３回洗浄後得られたオイパーギットＣ２５０Ｌを、固定したマンガンペルオキシダーゼとした。
【００３１】
（比較例１）
固定化に使用する担体をトヨナイト２００としたこと以外は、担体の実施例中に記載の方法により、固定したマンガンペルオキシダーゼの比較例１とした。
【００３２】
（比較例２）
固定化に使用する担体をトヨナイト２００Aとしたこと以外は、担体の実施例中に記載の方法により、固定したマンガンペルオキシダーゼの比較例２とした。
【００３３】
（比較例３）
固定化に使用する担体をトヨナイト２００Mとしたこと以外は、担体の実施例中に記載の方法により、固定したマンガンペルオキシダーゼの比較例３とした。
【００３４】
（比較例４）
固定化に使用する担体をトヨナイト２００Pとしたこと以外は、担体の実施例中に記載の方法により、固定したマンガンペルオキシダーゼの比較例４とした。
【００３５】
（比較例５）
固定化に使用する担体をレバチット１６００としたこと以外は、担体の実施例中に記載の方法により、固定したマンガンペルオキシダーゼの比較例５とした。
【００３６】
（比較例６）
１６ｍｌの５％グルタルアルデヒド溶液と、トヨナイト２００Aを１．０ｇとをチューブに入れ、室温中で、前述の振とう機を用いて１２０〜１４０ｍｉｎ−１の速さで一時間撹拌し、トヨナイト２００A表面のアミノ基をアルデヒド化した。撹拌後のチューブを１０分間４０００ｒｐｍにて遠心し、トヨナイト２００Aを沈殿させ、上清を取り除いた。沈殿しているトヨナイト２００Aを洗浄するため、３５ｍｌの滅菌水を加え撹拌した後１０分間４０００ｒｐｍにて遠心し、トヨナイト２００Aを沈殿させ、上清を取り除いた。このトヨナイト２００Aの洗浄操作を合計３回行った。３回洗浄後得られたトヨナイト２００Aを、トヨナイト２００AGAとした。
固定化に使用する担体を前記手法により調整したトヨナイト２００AGAとしたこと以外は、担体の実施例中に記載の方法により、固定したマンガンペルオキシダーゼの比較例６とした。
【００３７】
（試験例１）
（担体の活性測定）
実施例１および比較例１〜６にて記載の方法で作製した７種の担体５０ｍｇをエッペンチューブに量り取り、これに５０ｍＭマロン酸、０．１ｍＭ過酸化水素水、２．０ｍＭ硫酸マンガンを含む緩衝液（ｐＨ４．５）を全量で０．８ｍｌとなるように調製し、エッペンドルフチューブに加え、撹拌しながら１分間反応を行った。反応後のエッペンチューブを、１５，０００ｒｐｍにて１分間遠心分離し、３価マンガン濃度として上清の２７０ｎｍにおける吸光度を測定し、担体活性の指標とした。測定はＵＶ−１６５０ＰＣ（商品名；（株）島津製作所製）を用いて行った。測定値が分光光度計の測定限界を超える場合には、ｐＨ緩衝液にて３価マンガンを含む水性媒質を適宜希釈し、測定を行った。担体の活性と担体１ｇ当たりのマンガンペルオキシダーゼの固定量を表３に示す。
実施例１の固定化マンガンペルオキシダーゼは、担体１ｇ当たりのマンガンペルオキシダーゼの固定量としては、例えば比較例２、６よりも少ないが、担体活性は各比較例に比し高く、マンガンペルオキシダーゼ単位固定量当たりの活性がきわめて高いことがわかる。その理由は必ずしも明らかではないが、マンガンペルオキシダーゼのアミノ基が担体のエポキシ基と強固な共有結合を形成し、その結果、マンガンペルオキシダーゼの活性中心が基質と接触しやすい配向をとることも理由の１つではないか、と推測される。
【００３８】
【表３】
2007068518.tif 000004
【００３９】
（試験例２）
（反復使用による担体活性（比活性）の測定）
（マンガンペルオキシダーゼを固定したカラムの作成）
オイパーギットＣ２５０Ｌに固定したマンガンペルオキシダーゼ（実施例１）０．７ｇを、５０ｍＭマロン酸を含むｐＨ緩衝液（ｐＨ４．５）に懸濁し、懸濁液を低圧クロマトグラフィー用ガラスカラム（「エコノカラム」（底面積４．９１ｃｍ２）（商品名；日本バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製））に充填し、マロン酸緩衝液を排出することによりマンガンペルオキシダーゼを固定したカラムを得た。該緩衝液排出後に、固定したマンガンペルオキシダーゼの占める高さは約１ｃｍとなり、体積にして約４．９１ｃｍ３であった。
【００４０】
（水性媒質の調製）
５０ｍＭマロン酸、０．５ｍＭ過酸化水素水、２．０ｍＭ硫酸マンガンを含むｐＨ緩衝液（ｐＨ４．５）を水性媒質として調製した。
【００４１】
（２価マンガンの酸化反応）
調製した該水性媒質を、ペリスタルティックポンプを用い流速１ｍｌ／分にて送液し、前記固定カラムの入口から供給した。供給された該水性媒質は、前記固定カラムに充填されている固定したマンガンペルオキシダーゼ部分を通過することにより、硫酸マンガンの一部が３価に変換された３価マンガンを含む水性媒質へと変化し、前記固定カラムの出口より排出された。
【００４２】
（３価マンガン濃度の検出）
固定カラムの出口より排出された３価マンガンを含む水性媒質をフラクションコレクター（商品名ＤＣ−１２００；ＥＹＥＬＡ製）にて１０分後毎に分画した。それぞれの画分について、変換された３価マンガンを含む水性媒質中の３価マンガン濃度を２７０ｎｍにて測定した。
【００４３】
最初に得られた画分の活性を１００とした場合の各画分の比活性を、経時的に表した結果を表４に示す。比較例１〜５のマンガンペルオキシダーゼを用いて、上記と同様に非活性を測定した。結果を表４に示す。
表４から、本発明の固定化マンガンペルオキシダーゼは、反復使用による活性の低下がきわめて少ないことが明らかである。
【００４４】
【表４】
2007068518.tif 000005
【実施例２】
【００４５】
（芳香族ヒドロキシ化合物のオリゴマー製造）
（マンガンペルオキシダーゼを固定したカラムの作成）
オイパーギットＣ２５０Ｌに固定化したマンガンペルオキシダーゼ５．０ｇを、５０ｍＭマロン酸を含むｐＨ緩衝液（ｐＨ４．５）に懸濁し、懸濁液を低圧クロマトグラフィー用ガラスカラム（「エコノカラム」（底面積４．９１ｃｍ２）（商品名；日本バイオ・ラッドラボラトリーズ（株）製））に充填し、マロン酸緩衝液を排出することによりマンガンペルオキシダーゼを固定したカラムを得た。該緩衝液排出後に、固定したマンガンペルオキシダーゼの占める高さは約１ｃｍとなり、体積にして約４．９１ｃｍ３であった。
【００４６】
（水性媒質の調製）
５０ｍＭマロン酸、１０ｍＭ過酸化水素水、２０ｍＭ硫酸マンガンを含むｐＨ緩衝液（ｐＨ４．５）を水性媒質として調製した。
【００４７】
（２価マンガンの酸化反応）
調製した該水性媒質を、ペリスタルティックポンプを用い流速１ｍｌ／分にて送液し、前記固定カラムの入口から供給した。供給された該水性媒質は、前記固定カラムに充填されている固定したマンガンペルオキシダーゼ部分を通過することにより、硫酸マンガンの一部が３価に変換された３価マンガンを含む水性媒質へと変化し、前記固定カラムの出口より排出された。
【００４８】
（３価マンガンを含む水性媒質の反応器への供給）
前記で得られた３価マンガンを含む水性媒質中のうち１．９８ｍｌをピペットにて分取し、反応器であるガラス製の蓋付試験管に供給し、芳香族ヒドロキシ化合物である基質として、５０ｍＭの２，６−ジメチルフェノールの２０μｌをピペットにて前記反応器へと供給した。室温にて１分間撹拌することによって、３価マンガンによる芳香族ヒドロキシ化合物の酸化を行った。
【００４９】
反応終了後の反応器に、０．２ｇの亜ジチオン酸ナトリウムを加えた後、２ｍｌの酢酸エチルを加え、基質ならびに２，６−ジメチルフェノール二量体を含む反応生成物の抽出を行った。
【００５０】
前記抽出物中における２，６−ジメチルフェノール二量体濃度について、下記条件でＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）による測定を行った。
検出装置：ＳＰＤＭ１０Ａ（商品名；（株）島津製作所製）
カラム：イナートシルＯＤＳ−３（商品名；ジーエルサイエンス（株））
溶出条件：水とアセトニトリルによるグラジエント溶出
０−５分：２０％  水／８０％  アセトニトリル
５−２１分：グラジエント
２１−３１分：０％  水／１００％  アセトニトリル
送液速度：１．０  ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：２７０ｎｍ
【００５１】
上記条件によるＨＰＬＣ測定において検出された吸収ピークの強度から、抽出物に含まれる２，６‐ジメチルフェノールのモル濃度αを求めた。
前記モル濃度αと、供給した２，６‐ジメチルフェノールの濃度との比率によって表される値を、２，６−ジメチルフェノールの残存率（以下「残存率」）とし、下式により算出した。
（残存率）［％］＝α／（供給した２，６‐ジメチルフェノールモル濃度）×１００
本実施例において残存率は５％であった。
さらに、供給した２，６‐ジメチルフェノール全量を１００とし、そこから残存率を引いた値をオリゴマー率とし、下式により算出した。
（オリゴマー率）［％］＝１００−（残存率）
本実施例においてオリゴマー率は９５％であった。
【実施例３】
【００５２】
供給する２，６‐ジメチルフェノールの濃度を１．０ｍＭとしたこと以外は実施例２と同様に行った。その結果、２，６‐ジメチルフェノールの残存率は６％であり、オリゴマー率は９４％であった。
【実施例４】
【００５３】
供給する２，６‐ジメチルフェノールの濃度を１．５ｍＭとしたこと以外は実施例２と同様に行った。その結果、２，６‐ジメチルフェノールの残存率は４％であり、オリゴマー率は９６％であった。
実施例２〜４における残存率とオリゴマー率を表５に示す。
【００５４】
【表５】
2007068518.tif 000006
【００５５】
以上結果から明らかなように、エポキシ基を有する担体に固定化したマンガンペルオキシダーゼを用いて、芳香族ヒドロキシ化合物のオリゴマーを安定した収率で、効率よく得ることが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明の固定化マンガンペルオキシダーゼは、担体活性及び反復使用による活性低下が少ないため、マンガンペルオキシダーゼを用いた酸化反応を行う技術分野で有用である。