(57)【要約】【課題】高い感度のセンサーや、高い出力のバイオ燃料電池、高い反応効率の電気化学反応装置として利用することが可能な酵素電極を提供する【解決手段】導電性基体と、該導電性基体に接触した酵素固定化層と、該酵素固定化層に固定された会合タンパク質および電子伝達メディエーターとを有し、該会合タンパク質が反応基質１から反応生成物１を生じる化学反応を触媒する酵素１と反応基質２から反応生成物２を生じる化学反応を触媒する酵素２との会合タンパク質であり、反応生成物１の少なくとも一つの化学物質が反応基質２の少なくとも一つの化学物質と同一であること、を特徴とする酵素電極。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
導電性基体と酵素を有する酵素電極において、前記酵素が異なる２種以上の酵素タンパク質が会合した会合タンパク質からなることを特徴とする酵素電極。
【請求項２】
前記酵素は、前記導電性基体に固定化されており、且つ前記酵素と前記導電性基体とは、電子伝達メディエーターを介して電気的に接続されている請求項１記載の酵素電極。
【請求項３】
前記酵素は、第１の反応基質から第１の反応生成物を生じる化学反応を触媒する第１の酵素と、第２の反応基質から第２の反応生成物を生じる化学反応を触媒する第２の酵素と、の会合タンパク質からなり、
該第１の反応生成物の少なくとも一つの化学物質が、該第２の反応基質の少なくとも一つの化学物質と同一である請求項１または２記載の酵素電極。
【請求項４】
前記第１の酵素がデヒドロゲナーゼであり、前記第２の酵素がジアフォラーゼである請求項３に記載の酵素電極。
【請求項５】
前記デヒドロゲナーゼが、グルコースデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びグルタミン酸デヒドロゲナーゼから成る群より選ばれた少なくとも１種である請求項３に記載の酵素電極。
【請求項６】
前記第１の酵素がアルコールデヒドロゲナーゼであり、前記第２の酵素がアルデヒドデヒドロゲナーゼであり、前記酵素固定化層にさらにジアフォラーゼが担持されている請求項３に記載の酵素電極。
【請求項７】
前記第１の酵素がイソメラーゼであり、前記第２の酵素がグルコースデヒドロゲナーゼであり、前記酵素固定化層にさらにジアフォラーゼが担持されていることを特徴とする請求項３に記載の酵素電極。
【請求項８】
前記会合タンパク質を構成する複数の酵素タンパク質の少なくとも一種類の酵素タンパク質が好熱菌由来である請求項１から７のいずれかに記載の酵素電極。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれかに記載の酵素電極を、物質を検知するための検知部位として用いることを特徴とするセンサー。
【請求項１０】
請求項１乃至８のいずれかに記載の酵素電極を、アノード若しくはカソードとして用いることを特徴とする燃料電池。
【請求項１１】
請求項１乃至８のいずれかに記載の酵素電極を、反応極として用いることを特徴とする電気化学反応装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は酵素電極に関する。特に、バイオセンサーやバイオ燃料電池、電気化学反応装置の電極として利用可能な酵素電極に関する。
【背景技術】
【０００２】
生細胞内で作られるタンパク質性の生体触媒である酵素は、通常の触媒と比べて温和な条件下で強力に作用する。また、酵素の作用を受けて化学反応を起こす物質である基質の特異性が高く、一般に各酵素は、一定基質の一定反応のみを触媒する。酵素、特に酸化還元酵素におけるこれらの特性を、電極における酸化還元反応に理想的に利用できれば、低過電圧、高選択性の電極が作成可能となる。
【０００３】
酵素電極における低過電圧な電子伝達反応を達成するため技術として、関連した反応に関与する２つの酵素を用いる構成が提案されている。すなわち、反応基質１から反応生成物１を生じる反応を触媒する酵素１と反応基質２から反応生成物２を生じる反応を触媒する酵素２とを同時に用いた電極であって、前記反応生成物１の一部が前記反応基質２の一部を含むような酵素電極が提案されている。
【０００４】
このような電極として例えば次に挙げる例を挙げることができる。
【０００５】
伊倉ら（特許文献１）は、電極系上に形成され、ジアフォラーゼ、デヒドロゲナーゼおよびニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドシンセターゼを含む反応層を包含し、該反応層の少なくとも一部を作用電極上に位置し、該反応層中のその部分に含まれるジアフォラーゼ、デヒドロゲナーゼおよびニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドシンセターゼが該作用電極の表面に固定されていることを特徴とする酵素電極を開示した（特許文献１）。
【特許文献１】特開2003-279525号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述したとおり、反応基質１から反応生成物１を生じる化学反応を触媒する酵素１と反応基質２から反応生成物２を生じる化学反応を触媒する酵素２とを同じ反応層において用いる酵素電極が知られている。しかし、酵素１と酵素２の相対的距離や配向はランダムであり、酵素１により生じた反応生成物１の一部が酵素２の反応基質２の一部として利用されるまでの拡散過程が律速段階になる。そのために、反応基質１から電極までの全体の電子伝達反応は、反応速度や低濃度の基質存在下での反応効率の点で最適化されているとはいえない。すなわち、従来のこの電極をセンサーとして用いた場合には反応基質１の酸化反応に伴って電極で観測される電流の測定値が小さく反応基質１に対する感度が低いという課題があった。本発明が解決しようとする課題は、新規な酵素を利用した酵素電極を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の課題を解決するための本発明の手段は以下の通りである。
【０００８】
本発明の酵素電極は、導電性基体と酵素を有する酵素電極において、前記酵素が異なる２種以上の酵素タンパク質が会合した会合タンパク質からなることを特徴とする酵素電極である。
【０００９】
本発明のセンサーは、上記構成の酵素電極を、物質を検知するための検知部位として用いることを特徴とするセンサーである。本発明の燃料電池は、上記構成の酵素電極を、アノード若しくはカソードとして用いることを特徴とする燃料電池である。本発明の電気化学反応装置は、上記構成の酵素電極を、反応極として用いることを特徴とする電気化学反応装置である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、会合タンパク質を利用した新規な酵素電極が提供される。特に、会合タンパク質として、酵素１（第１の酵素）が関与する反応の生成物を酵素２（第２の酵素）が基質として利用する２種の酵素を会合させた場合には、酵素１と酵素２との相対的距離が近接している。従って、酵素１での反応から電極までの電子伝達反応が効率的に進行する。
【００１１】
このため、本発明の酵素電極を用いたセンサーにおいては基質の酸化に伴う電流値が大きく感度が高い。また本発明の酵素電極を用いた燃料電池においては、高い電流値を取り出すことが出来る。さらに本発明の酵素電極を用いた電気化学反応装置においては、高い反応効率を示す。また、好熱菌由来の酵素を利用した場合は、従来の酵素電極に比較して保存安定性に優れている。さらに本発明の酵素電極に用いられる異なる酵素を会合させた会合タンパク質、例えば酸化還元酵素は、クロマトグラフィーなど煩雑な操作を必要とせず、加温という簡便な操作で、高純度にまで精製が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の酵素電極は、導電性基体上に、電気化学反応に関与し得る酵素を酵素を固定した構成を有し、この酵素として、異なる２種以上の酵素タンパク質を会合させた会合タンパク質が少なくとも用いられる。なお、酵素の固定化は、必要に応じて行えばよく、本発明においては必須ではない。酵素は、導電性基体上に設けられた酵素固定化層中に固定されていることが好ましい。また、酵素固定化層には、酵素と導電性基体とを電気的に接続する電子伝達メディエーターを更に含むことが好ましい。本発明の効果が得られる２種以上の酵素タンパク質を組み合わせて会合タンパク質を構成することができる。会合タンパク質を構成する２種の酵素タンパク質の好ましい組合せとしては、以下の酵素１（第１の酵素）と酵素２（第２の酵素）の組合せを挙げることができる。
酵素１：
反応基質１（第１の反応基質）から反応生成物１（第１の反応生成物）を生じる化学反応を触媒する。
酵素２：
反応基質２（第２の反応基質）から反応生成物２（第２の反応生成物）を生じる化学反応を触媒する。酵素１が関与する反応の反応生成物１の少なくとも一つの化学物質が、反応基質２の少なくとも一つの化学物質と同一である。
【００１３】
好ましい酵素の組合せの具体例としては以下の組合せを挙げることができる。
（１）酵素１がデヒドロゲナーゼであり、前記酵素２がジアフォラーゼである。
（２）酵素１がアルコールデヒドロゲナーゼであり、酵素２がアルデヒドデヒドロゲナーゼである。この場合、酵素固定化層にさらにジアフォラーゼが固定されていることが好ましい。
（３）酵素１がイソメラーゼであり、酵素２がグルコースデヒドロゲナーゼである。この場合、酵素固定化層にさらにジアフォラーゼが固定されていることが好ましい。
【００１４】
本発明の酵素電極において導電性基体は、酵素固定化層に接触し、酵素電極の使用時には、外部回路と電気的に接続されるものである。この導電性基体としては、酵素固定化層との界面に外部回路と電気的に接続可能な導電性の部分を少なくとも有し、保存、測定時に充分な剛性を有し、電極が使用される条件において充分な電気化学的安定性を有する材ものであればよい。導電性基体の導電性の部分に用いられる材料の例としては、金属、導電性高分子、金属酸化物、炭素材料を挙げることができる。
【００１５】
金属の例としては、Ａｕ、Ｐｔ、Ａｇ等やこれらのうち少なくとも一種類の元素を含むものがあげらる。これらは、合金であってもよい。また、金属材料はめっき膜や層として用いられても良い。
【００１６】
導電性基体に用いられる導電性高分子の例としては、ポリアセチレン類、ポリアリーレン類、ポリアリーレンビニレン類等のうち少なくともひとつの化合物を含むものが挙げられる。導電性基体の形成に用いられる金属酸化物の例としては、Ｉｎ、Ｓｎ、Ｚｎ、Ｔｉ等のうち、少なくとも一種類の元素を含むものがあげられる。金属酸化物が導電性を有しない場合、あるいは導電性が十分でない場合には、金属酸化物と他の導電性材料を混合して、所望とする導電性を有する導電性基体用の材料とすることができる。このような金属酸化物と混合して用い得る導電材料としては、金属、導電性高分子、炭素材料などが挙げられる。炭素材料の例としては、グラファイト、カーボンブラック、カーボンナノチューブ、カーボンナノホーン、フラーレン化合物およびこれらの誘導体が挙げられる。また、炭素材料からなる部分が導電性を有しない場合は、他の導電性材料によってこの部分に導電性を付与することができる。また、炭素材料からなる部分が導電性を有する場合でも、他の導電性材料によってこの部分の導電性を向上させてもよい。
【００１７】
導電性基体は少なくとも一部に空隙を有していてもよく、空隙は、一次元、二次元、もしくは三次元的に連結していてよい。一次元に連結した空隙の例としては柱状の空隙、二次元に連結した空隙の例としては、網状の空隙が挙げられる。三次元に連結した空隙の例としては、スポンジ状、微小粒子を接合した後に生じる空隙、またそれらをテンプレートにして作成した構造材料の空隙が挙げられる。それらの空隙は、酵素が導入できる程度、かつ、または基質の流動、拡散が十分に行われる程度に大きく、投影面積に対する実効表面積の比が十分にえられる程度に小さいことが好ましい。空隙の平均径の例としては、５ｎｍから、５００μｍの範囲、より好ましくは、１０ｎｍから１０μｍが挙げられる。また、空隙を有する導電性基体の厚さは、酵素が導電性基体の深部にまで均一に導入できる程度、かつ、または基質の流動、拡散が十分に行われる程度に小さく、導電性基体の投影面積に対する実効表面積の比が十分にえられる程度に大きい必要がある。この空隙を有する導電性基体の厚さの例としては、１００ｎｍから１ｃｍ、より好ましくは、１μｍから５ｍｍが挙げられる。この空隙を有する導電性基体の投影面積に対する実効表面積の比は、投影面積に対する実効表面積の比が十分にえられる程度に大きい必要があり、その例としては、１０倍以上、より好ましくは、１００倍以上が挙げられる。
【００１８】
この空隙を有する導電性基体の気孔率は以下の要件（１）〜（３）の少なくとも１つと、要件（４）とを満たすように設定されることが好ましい。
（１）導電性部材の投影面積に対する実効表面積の比が十分にえられる程度に大きい。
（２）充分な酵素、担体量が導入できる程度に大きい。
（３）基質の流動、拡散が充分に行われる程度に大き
（４）充分な機械的強度が得られる程度に小さい。
【００１９】
気孔率の例としては、２０％以上９９％以下、より好ましくは、３０％以上９８％以下が挙げられる。
【００２０】
多数の空隙を有する金属製導電性基体としては、発泡金属、電析金属、電解金属、焼結金属、繊維状金属、あるいは、これらの内の１種に、もしくは、複数種に該当する材料が挙げられる。
【００２１】
多数の空隙を有する導電性高分子の製造方法の例としては、以下の方法等の多孔質樹脂の製造に利用されている方法が例示できる。
（１）空隙となる部分を構成する鋳型としての物質を導電性高分子中に配置して所定の形状に成形した後、鋳型としての物質を除く方法。
（２）導電性高分子の前駆体中に空隙となる部分の鋳型としての物質を含有させ、前駆体を重合させて高分子とした後、鋳型としての物質を除く方法。
（３）空隙となる部分を構成する鋳型となる粒子からなる層を形成し、その粒子間の空隙に高分子を充填して層を形成し、この層から粒子を除去する方法。
（４）空隙となる部分を構成する鋳型となる粒子からなる層を形成し、その粒子間の空隙に高分子の前駆体を充填して層を形成し、前駆体を重合させて高分子層としてから粒子を除去する方法。
【００２２】
多数の空隙を有する金属酸化物の製造方法の例としては、電析、スパッタリング、焼結、化学気相成長法（ＣＶＤ）、電解およびこれらの組合せなどの方法を挙げることができる。
【００２３】
多数の空隙を有する炭素材料の製造方法の例としては、グラファイト、カーボンブラック、カーボンナノチューブ、カーボンナノホーン、フラーレン化合物、およびこれらの誘導体からなる繊維や粒子などを所定の形状に成形してから焼結する方法を挙げることができる。
【００２４】
本発明の酵素電極が酵素固定化層を有する場合は、酵素固定化層は導電性基体に接触して配置される。すなわち、導電性基体の導電性を有する面上に直接酵素固定化層が積層される。このように導電性基体上に直接酵素固定化層が形成されることで、酵素および必要に応じて添加される電子伝達メディエーターを導電性基体の物理的近傍に捕捉することができる。その結果、必要に応じて電子伝達メディエーターを介した酵素と導電性基体間の速やかな電子伝達反応を促進させ、更に酵素や電子伝達メディエーターの導電性基体近傍からの散逸を防止することによって、酵素電極の繰返し使用を可能にするとともに、酵素電極の耐久性を向上させることができる。
【００２５】
酵素固定化層は、少なくとも酵素（会合タンパク質からなる酵素）を導電性基体の物理的近傍に補足するために用いられる当該分野の業者にとって公知の方法によって作製しうるものである。酵素固定化層を作製する具体的方法として例えば、以下に述べる（１）から（６）の方法を挙げることができる。
（１）共有結合法：
導電性基体表面に直接官能基を導入し、この官能基と酵素とを共有結合させて酵素を固定化する。あるいは導電性基体に接触して配置した担体に官能基を導入し、この官能基と酵素とを共有結合させて酵素を固定化する。
【００２６】
このような共有結合に利用できる官能基として例えば、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基等を挙げることができる。
【００２７】
あるいは、アルキルチオールのチオール基が金などの金属に作用して結合し容易に単分子膜（自己組織化単分子膜）を形成できることを利用し、アルキルチオールのアルキル基に予め導入した官能基を介して共有結合により酵素を固定化する。アルキルチオールのアルキル基に予め導入した官能基と酵素との共有結合は、例えば二官能性試薬を用いて形成することができる。代表的な二官能性試薬としては、グルタルアルデヒド、過ヨウ素酸、Ｎ，Ｎ'−ｏ−フェニレンジマレイミド等が挙げられる。
（２）架橋法：
グルタルアルデヒド等の架橋剤を用いて、酵素間に架橋を形成して酵素同士を結合させて固定化する。あるいは、酵素にゼラチンやアルブミン等のマトリックス物質を加えて酵素とマトリックス物質との間に架橋を形成することにより、酵素をマトリックス物質と共に固定化する。固定化の際にポリアリルアミンやポリリジンなどの合成高分子を共存させ、酵素固定化層の特性、すなわち膜強度、基質透過特性などを制御することもできる。
（３）包括法：
酵素をアガロース、アガロース分解物、κ−カラギーナン、寒天、アルギン酸、ポリアクリルアミド、ポリイソプロピルアクリルアミド、ポリビニルアルコール、およびこれらの共重合体等の高分子マトリックス中に封入して固定化する。
（４）吸着法（その１）：
担体と酵素との疎水性相互作用を利用した物理吸着により酵素を固定する。この担体としては、ポリアリルアミン、ポリリジン、ポリビニルピリジン、アミノ基で変性したデキストラン（たとえばＤＥＡＥ−デキストラン）、キトサン、ポリグルタメート、ポリスチレンスルホン酸、硫酸デキストラン等のポリアニオンやポリカチオンからなる担体を用いることができる。担体と酵素との静電相互作用を利用したイオン結合法により担体上に酵素を固定し、この酵素固定化担体を導電性基体に接触させ配置する。
（５）隔膜法：
ポリイミド膜、酢酸セルロース膜、ポリスルホン膜、パーフルオロスルフォン酸の重合体膜（例えば、デュポン社製、商品名「ナフィオン」）等の透過制限膜を隔膜として用い導電性基体上の酵素を被覆して固定する。
（６）吸着法（その２）
遺伝子組換えタンパク質の精製を容易にするために用いられる各種のアフィニティータグを利用して酵素を固定する。例えば、ＨＡ（ヘマグルチニン）、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジンタグを利用して酵素を固定化する。
【００２８】
本発明の酵素電極に用いる会合タンパク質は、異なる２種以上の酵素タンパク質が会合したものである。すなわち、本発明において用いられる会合タンパク質は、複数種の酵素タンパク質をそれぞれ用意して、これらが会合可能な条件にこれらを置くことで形成されるものである。従って、本発明において用いられる会合タンパク質は、遺伝子組換えを利用して製造される２種以上のタンパク質の融合体とは構造的に異なるものである。
【００２９】
本発明の効果が得られる複数種の酵素タンパク質を組み合わせて会合タンパク質を得ることができる。２種のタンパク質を組み合わせる場合の好ましい例としては、先に記載した酵素１と酵素２の組合せを挙げることができる。この場合の会合タンパク質は、酵素１の酵素活性と酵素２の酵素活性を有する多機能酵素である。酵素１の酵素活性により生じる反応生成物１の少なくとも一つの化学物質は、酵素１の物理的近傍に存在する酵素２の反応基質として速やかに利用される。その結果、会合タンパク質による反応基質１から反応生成物２を生じる酵素活性（反応速度）は、酵素１と酵素２がそれぞれ切り離されて存在する場合よりも高くなる。
【００３０】
酵素１と酵素２の具体的組合せは、酵素１による反応生成物１の少なくとも一つの化学物質が酵素２の反応基質２の少なくとも一つの化学物質と同一であれば特に限定されない。酵素１がデヒドロゲナーゼであり、酵素２がジアフォラーゼである場合、基質の酸化反応に伴って酵素電極で観測される電気化学的応答に対する酸素の影響を軽減することができ好適である。また多くのデヒドロゲナーゼはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を電子および水素原子の受容体として利用している。このことから、ジアフォラーゼと会合するデヒドロゲナーゼの種類を選択することによって、検出対象に対して汎用性の高いセンサーを作製することが可能となる。このようなデヒドロゲナーゼとして例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、１７Ｂヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、エストラジオール１７Ｂデヒドロゲナーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ等を挙げることができる。
【００３１】
例えば、酵素１（第１の酵素）としてグルコースデヒドロゲナーゼを、酵素２（第２の酵素）としてジアフォラーゼ（Ｄｐ）を用いてこれらの会合タンパク質を構成要素とする酵素電極を作製した場合には、図１に示す状態を得ることができる。すなわち、導電性基体上には、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）とジアフォラーゼとの会合タンパク質および電子伝達メディエーターを有する酵素固定化層が接触して配置される。この酵素電極にグルコース（第１の反応基質）を作用させた場合、グルコースはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）等の共存下グルコースデヒドロゲナーゼの触媒作用によって酸化さる。その結果、グルコノラクトン（第１の反応生成物）と還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を生じる。そして還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドは酸化型電子伝達メディエーターの存在下グルコースデヒドロゲナーゼの物理的近傍に存在するジアフォラーゼの触媒作用によって直ちに酸化される。その結果、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび還元型の電子伝達メディエーターを生じる。こうして生じる還元型の電子伝達メディエーターは導電性基体に電子を伝達することが出来る。グルコースデヒドロゲナーゼとジアフォラーゼとが個別に電極上に固定化された従来公知の場合よりも、本発明の酵素電極においては、より効率の高いグルコースから電極への電子伝達が達成される。したがって、このような図１に示す酵素電極は、検出感度の高いグルコースセンサーとして、また出力の大きなグルコース燃料電池として、さらにまた反応効率の高いグルコース電気化学反応装置として利用することができる。
【００３２】
特に好熱菌由来のグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアフォラーゼの会合タンパク質を用いることによって耐熱性、耐久性、高温状態での応答性に優れた酵素電極とすることが出来る。
【００３３】
上記例の場合は、第１の反応基質が、グルコースとＮＡＤ+であり、第１の反応性生物がグルコノラクトンとＮＡＤＨである。また、第２の反応基質がＮＡＤＨとＭｅｄoxであり、第２の反応生成物がＮＡＤ+とＭｅｄredである。すなわち、ＮＡＤＨは第１の反応性生物でもあり、第２の反応基質でもある。
【００３４】
酵素１としてアルコールデヒドロゲナーゼを、酵素２としてジアフォラーゼを用いて酵素電極を作製した場合には、図２に示す状態を得ることができる。すなわち、導電性基体上には、アルコールデヒドロゲナーゼとジアフォラーゼとの会合タンパク質および電子伝達メディエーターを有する酵素固定化層が接触して配置される。この酵素電極にアルコールを作用させた場合、アルコールはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド等の共存下アルコールデヒドロゲナーゼの触媒作用によって酸化される。その結果、アルデヒドと還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを生じる。そして還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドは酸化型電子伝達メディエーターの存在下アルコールデヒドロゲナーゼの物理的近傍に存在するジアフォラーゼの触媒作用によって直ちに酸化される。その結果、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび還元型の電子伝達メディエーターを生じる。
【００３５】
酵素１として乳酸デヒドロゲナーゼを、酵素２としてジアフォラーゼを用いて酵素電極を作製した場合には、図３に示す状態を得ることができる。すなわち、導電性基体上には、乳酸デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼとの会合タンパク質および電子伝達メディエーターを有する酵素固定化層が接触して配置される。この酵素電極に乳酸を作用させた場合、乳酸はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド等の共存下乳酸デヒドロゲナーゼの触媒作用によって酸化される。その結果、ピルビン酸と還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを生じる。そして還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドは酸化型電子伝達メディエーターの存在下乳酸デヒドロゲナーゼの物理的近傍に存在するジアフォラーゼの触媒作用によって直ちに酸化される。その結果、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび還元型の電子伝達メディエーターを生じる。
【００３６】
酵素１としてリンゴ酸デヒドロゲナーゼを、また前記酵素２としてジアフォラーゼを用いて酵素電極を作製した場合には、図４に示す状態を得ることができる。すなわち、導電性基体上には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼとの会合タンパク質および電子伝達メディエーターを有する酵素固定化層が接触して配置される。この酵素電極にリンゴ酸を作用させた場合、リンゴ酸はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド等の共存下リンゴ酸デヒドロゲナーゼの触媒作用によって酸化される。その結果、ピルビン酸と還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを生じる。そして還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドは酸化型電子伝達メディエーターの存在下リンゴ酸デヒドロゲナーゼの物理的近傍に存在するジアフォラーゼの触媒作用によって直ちに酸化される。その結果、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび還元型の電子伝達メディエーターを生じる。
【００３７】
酵素１としてグルタミン酸デヒドロゲナーゼを、酵素２としてジアフォラーゼを用いて酵素電極を作製した場合には、図５に示す状態を得ることができる。すなわち、導電性基体上には、グルタミン酸デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼとの会合タンパク質および電子伝達メディエーターを有する酵素固定化層が接触して配置される。この酵素電極にグルタミン酸を作用させた場合、グルタミン酸はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド等の共存下グルタミン酸デヒドロゲナーゼの触媒作用によって酸化される。その結果、２−オキソグルタル酸と還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを生じる。そして還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドは酸化型電子伝達メディエーターの存在下グルタミン酸デヒドロゲナーゼの物理的近傍に存在するジアフォラーゼの触媒作用によって直ちに酸化される。その結果、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび還元型の電子伝達メディエーターを生じる。
【００３８】
酵素１としてアルコールデヒドロゲナーゼを、酵素２としてアルデヒドデヒドロゲナーゼを用いて酵素電極を作製した場合には、図６に示す状態を得ることができる。すなわち、導電性基体上には、アルコールデヒドロゲナーゼとアルデヒドデヒドロゲナーゼとの会合タンパク質、ジアフォラーゼおよび電子伝達メディエーターを有する酵素固定化層が接触して配置される。この酵素電極にアルコールを作用させた場合、アルコールはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド等の共存下アルコールデヒドロゲナーゼの触媒作用によって酸化される。その結果、アルデヒドと還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを生じる。さらに生じたアルデヒドはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド等の共存下アルコールデヒドロゲナーゼの物理的近傍に存在するアルデヒドデヒドロゲナーゼの触媒作用によって直ちに酸化される。その結果、カルボン酸と還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを生じる。このようにして生じた還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドは酸化型電子伝達メディエーターの存在下ジアフォラーゼの触媒作用によって酸化され、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび還元型の電子伝達メディエーターを生じる。こうして生じる還元型の電子伝達メディエーターは導電性基体に電子を伝達することが出来る。またこの酵素電極においてはアルデヒド種が酵素電極近傍に蓄積することが防止され、アルデヒド種による酵素タンパク質の不活性化反応が軽減されるので、酵素電極の活性低下を抑えることができる。アルコールデヒドロゲナーゼとアルデヒドデヒドロゲナーゼとが個別に電極上に固定化された従来公知の場合よりも、本発明の酵素電極においては、より効率の高いアルコールからカルボン酸への酸化反応が達成され、また電極への電子伝達が達成される。したがって、このような図６に示す酵素電極は、検出感度の高いアルコールセンサーとして、また出力の大きなアルコール燃料電池として、さらにまた反応効率の高いアルコール電気化学反応装置として利用することができる。
【００３９】
特に好熱菌由来のアルコールデヒドロゲナーゼおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼの会合タンパク質を用いることによって耐熱性、耐久性、高温状態での応答性に優れた酵素電極とすることが出来る。
【００４０】
酵素１としてイソメラーゼを、酵素２としてグルコースデヒドロゲナーゼを用いて酵素電極を作製した場合には、図７に示す状態を得ることができる。すなわち、導電性基体上には、イソメラーゼとグルコースデヒドロゲナーゼとの会合タンパク質、ジアフォラーゼおよび電子伝達メディエーターを有する酵素固定化層が接触して配置される。この酵素電極にフルクトースを作用させた場合、フルクトースはイソメラーゼの触媒作用によって異性化される。その結果、グルコースを生じる。生じたグルコースはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド等の共存下イソメラーゼの物理的近傍に存在するグルコースデヒドロゲナーゼの触媒作用によって直ちに酸化され、グルコノラクトンと還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを生じる。さらに生じた還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドは酸化型電子伝達メディエーターの存在下ジアフォラーゼの触媒作用によって酸化される。その結果、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび還元型の電子伝達メディエーターを生じる。こうして生じる還元型の電子伝達メディエーターは導電性基体に電子を伝達することが出来る。
【００４１】
本発明の酵素電極を構成する会合タンパク質は三種類以上のタンパク質の会合したものであってもよい。例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼおよびジアフォラーゼの三種類の会合タンパク質を用いて酵素電極を作製した場合には、図８に示す状態を得ることができる。すなわち、導電性基体上には、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼおよびジアフォラーゼの会合タンパク質、電子伝達メディエーターを有する酵素固定化層が接触して配置される。この酵素電極にアルコールを作用させた場合、アルコールはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド等の共存下アルコールデヒドロゲナーゼの触媒作用によって酸化され、アルデヒドと還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを生じる。さらに生じたアルデヒドはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド等の共存下アルコールデヒドロゲナーゼの物理的近傍に存在するアルデヒドデヒドロゲナーゼの触媒作用によって直ちに酸化される。その結果、カルボン酸と還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを生じる。さらにこのようにして生じた還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドは酸化型電子伝達メディエーターの存在下アルコールデヒドロゲナーゼおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼの物理的近傍に存在するジアフォラーゼの触媒作用によって酸化される。その結果、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび還元型の電子伝達メディエーターを生じる。
【００４２】
（ポリペプチド会合部）
本発明の酵素電極に用いられる会合タンパク質としては、複数種の酵素タンパク質のポリペプチド鎖の一部を会合部として利用してこれらの酵素タンパク質が会合した構成を有するものが好ましい。このペプチドからなる会合部は、各タンパク質の機能（酵素活性）を妨げない上においてはどのような位置にあっても構わない。
【００４３】
各タンパク質の会合部を介した会合は、共有結合及び非共有結合のいずれによるものであってもよい。非共有結合には、ファン・デル・ワールスカ、水素結合、イオン結合、疎水相互作用などが含まれ、これらは会合部、特に会合部に含まれるアミノ酸残基に起因するものである。
【００４４】
２つの酵素タンパク質の会合部を相補的な相互作用を有する２つのペプチド鎖で形成することが好ましい。すなわち、酵素１と酵素２を会合させる場合、酵素１の会合部のペプチド鎖と相補的な相互作用を有するペプチド鎖を酵素２の会合部に配置する。この２種の酵素タンパク質の会合部の組合せを、３種以上の酵素タンパク質から選択した２種の組合せに適用することで、３種の酵素タンパク質を会合させることができる。この場合、相補的な相互作用を有するものであれば、会合部はオリゴペプチドやポリペプチド、更には複数のドメインから形成されるタンパク質であってもよい。具体的には、β−ガラクトシダーゼのアルファドメイン、オメガドメイン等の利用も挙げられる。抗体断片ＶＨ、ＶＬをポリペプチド会合部として使用することも可能である。また、天然のタンパク質構造にも多く見られるα−ヘリカルコイルドコイル構造を利用することも可能である。α−ヘリカルコイルドコイル構造は数本のα−ヘリックスが相互作用（会合）しながら巻き付き合った構造である。７残基のアミノ酸がヘリックス２回転に対応し、７つの位置は図９で示すようにａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇで表記されることが多い。ａ、ｄはヘリックス間の会合に重要な疎水アミノ酸（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、）やＧｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇが挙げられる。取り分けＶａｌ、Ｉｌｅであることが望ましい。これら会合面のアミノ酸の選択によっては複数のαヘリックスから構成されるコイルドコイルを作ることも可能である。また、ａ、ｄの位置にＨｉｓを導入することにより共存する金属イオンＣｏ（II）、Ｎｉ（II）によりコイルドコイル構造形成を誘導することも可能である。
【００４５】
このようなポリペプチド会合部のモデル構造としては、いくつかの反復アミノ酸を有するペプチドからなる転写因子ＧＣＮ４、癌遺伝子Ｆｏｓ、Ｊｕｎ等のロイシンジッパ−が挙げられる。
【００４６】
本発明の酵素電極における会合タンパク質は、複数の異なる酵素活性を有する多機能酵素であるので、２種の酵素を会合させる際に、融合するα−ヘリカルコイルドコイルはホモダイマーを形成し難いことが望ましい。このような意味においては、Ｊｕｎ／Ｆｏｓ等のヘテロダイマー、ヘテロ多量体を形成するためのα−ヘリカルコイルドコイルの構造を利用することが望ましい。また、２つのα−ヘリカルコイルドコイルの一方のｅ、ｇの位置をＧｌｕとし、他方におけるこれらの位置をＬｙｓとすることで安定なヘテロコイルドコイル構造が得られることが知られている。このヘテロコイルドコイル構造を２種の酵素タンパク質の会合に利用することができる。
【００４７】
α−ヘリカルコイルドコイル構造を酵素タンパク質のポリペプチド鎖の一部に設けるには、このポリペプチド鎖にα−ヘリカルコイルドコイルを遺伝子組み換え技術を利用して融合する方法が好適に利用できる。
【００４８】
一方、相反した荷電を有する２つのポリペプチド鎖のそれぞれを、２種の酵素タンパク質のそれぞれの会合部とすることも可能である。
【００４９】
上記のペプチド会合部のサイズとしては、各酵素タンパク質の生産性や活性に必要な構造形成を妨げないサイズが選択される。このサイズは、好ましくは、５０アミノ酸以下であり、より好ましくは１５乃至３５アミノ酸である。
【００５０】
また、ペプチド会合部またはその周辺において、会合する一対の会合部間に共有結合を形成させることも会合タンパク質の安定化という点において有効な手段である。具体的に図９に示すモデルにおける２つのポリペプチド会合部の一方のペプチド鎖のａ及び／またはｄの位置に、あるいはｇ及び／またはｅの位置に、他方のこれらの位置少なくとも１つに対応する位置で、双方の酵素活性を妨げない位置にＣｙｓを導入することにより分子間シスフィルド結合を形成させることも可能である。例えば、二本鎖からなるα−ヘリカルコイルドコイルの場合、ａ−ａ位置のジスルフィド結合よりもｄ−ｄ位置のジスルフィド結合を形成させる方がエネルギー的に安定であることが知られている。会合させる酵素タンパク質が三種以上である場合においても適宜選択して導入することが可能である。また、上記と同様な考え方において光架橋基修飾や光架橋基を導入した非天然アミノ酸をペプチドからなる会合部に導入してもよい。この場合、係わる全てのポリペプチドに各一つの光官能基等を導入することはなく、少なくとも二本のポリペプチド鎖に対して会合部及びその周辺に一つの光官能基等が導入されていることが望ましい。３種以上の酵素タンパク質のによる多量体を形成する場合、それらの導入位置は配置を踏まえた上で適宜検討することが好ましい。
【００５１】
各酵素に配置するペプチド会合部は、酵素活性を妨げないような配置になるように設計されることが好ましく、一例として、一般的に酵素ポリペプチド鎖のＣ末あるいはＮ末に融合された融合タンパク質として発現したものであることが好ましい。この融合タンパク質は、酵素タンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子の上流、下流、または内部に会合部のアミノ酸配列をコードするDNA配列をそれぞれの読み枠を合わせて連結または挿入した組換え遺伝子を用いて製造することができる。酵素タンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子の内部に会合部のアミノ酸配列をコードするDNA配列を挿入する場合には、会合後のこの酵素タンパク質の機能を阻害しないように挿入部位を選択する。この組換え遺伝子を適当な宿主−ベクター系を用いて組換えタンパク質として発現させ、発現された融合タンパク質を精製した後、夫々のポリペプチド会合部融合タンパク質を混合し、会合タンパク質として再構成して、会合タンパク質を調製することができる。夫々の組換え遺伝子を宿主細胞内で共発現させ、細胞内で発現と同時に会合タンパク質として再構成してもよい。
【００５２】
（スペーサーについて）
会合用の酵素タンパク質のアミノ酸配列への会合部を融合する際に、酵素タンパク質のアミノ酸配列と会合部のアミノ酸配列との間にはスペーサー配列を挿入することができる。スペーサー配列以下の要件を満たすものであることが好ましい。
（１）会合させる各酵素が夫々固有のフォールディングをとることを可能にし、夫々の酵素活性の維持を保証する。
（２）一方の酵素による反応生成物を他方の酵素の基質として利用する２種の酵素の組合せを用いる場合、スペーサーが上記（１）の条件を満たし、かつ、一方の酵素の反応生成物が他方の酵素にできるだけ速やかに拡散により到達可能とする配列及び長さを有する。
【００５３】
上記の（２）のスペーサー配列の長さとしては、およそ３〜４００アミノ酸が好ましい。スペーサーの配列としては、上記性質を有するものであれば特には限定されないが、例えば、ＧＧＧＧＳ（Ｇ：グリシン、Ｓ：セリン）、あるいはこの配列単位が２以上５以下程度繰り返されている配列を挙げることができる。また、Ｐａｔｒｉｃｋの文献（J.Mol.Biol.（1990）211,943-958）に記載される以下の配列を利用することもできる。
（１）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）および／またはグリシン（Ｇ）のみからなる配列（タイプＩ（ＳＴＧタイプ））。
（２）セリン、トレオニンおよび／またはグリシンの他、一つの、アスパラギン酸（Ｄ）、リジン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、アラニン（Ａ）あるいはプロリン（Ｐ）からなるペプチド（タイプII）。
（３）ＳＴＧタイプＩとIIのアミノ酸残基からなる組み合わせ配列（タイプIII（ＳＴＧＤＫＱＮＡタイプ））。
（４）タイプＩとタイプIIであって、複数個のプロリンを有する配列（タイプIV（Ｐｒｏタイプ））
（５）タイプIIIに含まれるアミノ酸残基の任意の組み合わせであり、少なくとも８つのアミノ酸残基を有している配列（タイプV）の他、ＧＳＧＳＧ、ＳＧＧＳＧ、ＮＧＧＧＧ、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ、ＳＫＳＴＳ、ＰＶＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＭ。
【００５４】
スペーサー配列をコードするDNA配列は、会合用の酵素タンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子と、会合部をコードするDNA配列の間に、これらの夫々の読み枠がずれないようにして挿入すればよく、当該分野の公知の方法を用いて挿入することができる。なお、会合部を会合用の酵素タンパク質のNまたはC末端に結合させる場合は、会合部と会合用の酵素タンパク質のNまたはC末端との間にスペーサーを配置することでは好ましい。また、会合用の酵素タンパク質のポリペプチド鎖の途中に会合部を挿入する場合には、会合部のN末端側及び／またはC末端側にスペーサーを挿入することができる。
【００５５】
会合用の酵素タンパク質を構成する酵素のアミノ酸配列をコードする遺伝子DNA配列は、その機能が同定されていれば、その由来は特に限定されない。
【００５６】
会合用のグルコースデヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.47）としては、下記の化学反応を触媒する機能が同定されており、遺伝子DNAの塩基配列または酵素のアミノ酸配列が既知のものであれば利用できる。
beta-D-glucose + NAD(P)+ = D-glucono-1,5-lactone + NAD(P)H + H+
そのようなグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子としては、Bacillus属、例えばBacillus subtilis 168[Nature 390:249-56 (1997)]、Gloeobacter属、例えばGloeobacter violaceus PCC7421[DNA Res 10:137-45 (2003)]、Thermoplasma属、例えばThermoplasma acidophilum DSM 1728[Nature 407:508-13 (2000)]、Thermoplasma volcanium GSS1[Proc Natl Acad Sci U S A 97:14257-62 (2000)]、Picrophilus属、例えばPicrophilus torridus DSM 9790[Proc Natl Acad Sci U S A 101:9091-6 (2004)]、Pyrococcus属、例えばPyrococcus furiosus DSM 3638[Genetics 152:1299-305 (1999)]、Sulfolobus属、例えばSulfolobus solfataricus[Proc Natl Acad Sci U S A 98:7835-40 (2001)]、Sulfolobus tokodaii strain7[DNA Res 8:123-40 (2001)]等に由来するものを挙げることができ、いずれも本発明の会合タンパク質の構成要素として利用することができる。特にPyrococcus furiosus、Sulfolobus solfataricus等由来の酵素は耐熱性があり、本発明に好適に利用し得る。
【００５７】
会合用のアルコールデヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.1）としては、としては、下記の化学反応を触媒する機能が同定されており、遺伝子DNAの塩基配列または酵素のアミノ酸配列が既知のものであれば利用できる。
alcohol + NAD+ = aldehyde or ketone + NADH + H+
そのようなアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子としては、Saccharomyces属、例えばSaccharomyces cerevisiae S288C[Science 274:546-67 (1996)]、Pseudomonas属、例えばPseudomonas aeruginosa PA01[Nature 406:959-64 (2000)]、Pseudomonas putida KT2440[Environ Microbiol 4:799-808 (2002)]、Acinetobacter属、例えばAcinetobacter sp. ADP1[Nucleic Acids Res 32:5766-79 (2004)]、Bacillus属、例えばBacillus subtilis 168[Nature 390:249-56 (1997)]、Lactococcus属、例えばLactococcus lactis subsp. lactis IL1403[Genome Res 11:731-53 (2001)]、Lactobacillus属、例えばLactobacillus plantarum WCFS1[Proc Natl Acad Sci U S A 100:1990-5 (2003)]、Thermus属、例えばThermus thermophilus HB27[Nat Biotechnol 22:547-53 (2004)]、Aquifex属、例えばAquifex aeolicus VF5[Nature 392:353-8 (1998)]、Thermotoga属、例えばThermotoga maritima MSB8[Nature 399:323-9 (1999)]、Methanococcus属、例えばMethanococcus maripaludis S2[J Bacteriol 186:6956-69 (2004)]、Methanosarcina属、例えばMethanosarcina acetivorans C2A[Genome Res 12:532-42 (2002)]、Methanosarcina mazei Goe1[J Mol Microbiol Biotechnol 4:453-61 (2002)]、Thermoplasma属、例えばThermoplasma acidophilum DSM 1728[Nature 407:508-13 (2000)]、Thermoplasma volcanium GSS1[Proc Natl Acad Sci U S A 97:14257-62 (2000)]、Pyrococcus属、例えばPyrococcus horikoshii OT3[DNA Res 5:55-76 (1998)]、Pyrococcus abyssi GE5、Pyrococcus furiosus DSM 3638[Genetics 152:1299-305 (1999), Mol Microbiol 38:684-93 (2000), Methods Enzymol 330:134-57 (2001)]、Aeropyrum属、例えばAeropyrum pernix K1[DNA Res 6:83-101, 145-52 (1999)]、Sulfolobus属、例えばSulfolobus solfataricus[Proc Natl Acad Sci U S A 98:7835-40 (2001)]、Sulfolobus tokodaii strain7[DNA Res 8:123-40 (2001)]、Pyrobaculum属、例えばPyrobaculum aerophilum IM2[Proc Natl Acad Sci U S A 99:984-9 (2002)]等に由来するものを挙げることができ、いずれも本発明の会合タンパク質の構成要素として利用することができる。特にCorynebacterium efficiens 、Thermus thermophilus Aquifex aeolicus、Thermotoga maritima、 Archaeoglobus fulgidus、Pyrococcus horikoshii、Pyrococcus abyssi、Pyrococcus furiosus、Aeropyrum pernix、Pyrobaculum aerophilum等由来の酵素は耐熱性があり、本発明に好適に利用し得る。
【００５８】
会合用のアルデヒドデヒドロゲナーゼとしては、下記の化学反応（１）または（２）を触媒する機能が同定されており、遺伝子DNAの塩基配列または酵素のアミノ酸配列が既知のものであれば利用できる。
（１）電子受容体としてNADを要求する酵素（EC 1.2.1.3）。
aldehyde + NAD+ + H2O = acid + NADH + H+
（２）電子受容体としてNADまたはNADPを要求する酵素（EC 1.2.1.5）。
aldehyde + NAD(P)+ + H2O = acid + NAD(P)H + H+
なかでも、アセトアルデヒドを酸化するアルデヒドデヒドロゲナーゼとしては、下記の化学反応を触媒する機能（EC 1.2.1.10）が同定されており、遺伝子の塩基配列または酵素のアミノ酸配列が既知のものであれば利用できる。
acetaldehyde + CoA + NAD+ = acetyl-CoA + NADH + H+
そのようなアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子としては、前記電子受容体としてNADを要求するアルデヒドデヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.3）の場合、Acinetobacter属、例えばAcinetobacter sp. ADP1[Nucleic Acids Res 32:5766-79 (2004)]、Bacillus属、例えばBacillus subtilis 168[Nature 390:249-56 (1997)]、Thermus属、例えばThermus thermophilus HB27[Nat Biotechnol 22:547-53 (2004)]、Pyrococcus属、例えばPyrococcus furiosus DSM 3638[Genetics 152:1299-305 (1999), Mol Microbiol 38:684-93 (2000), Methods Enzymol 330:134-57 (2001)]、Aquifex属、例えばAquifex aeolicus VF5[Nature 392:353-8 (1998)]、等を挙げることができ、いずれも本発明の会合タンパク質の構成要素として利用することができる。
【００５９】
また、前記電子受容体としてNADまたはNADPを要求するアルデヒドデヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.5）の場合、Caenorhabditis属、例えばCaenorhabditis elegans[Science 282:2012-8 (1998)]、Bacillus属、例えばBacillus thuringiensis 97-27 (serovar konkukian) 等に由来するものを挙げることができ、いずれも本発明の会合タンパク質の構成要素として利用することができる。
【００６０】
また、前記アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.10）の場合、Bacillus属、例えばBacillus cereus ATCC 14579[Nature 423:87-91 (2003)]、Bifidobacterium属、例えばBifidobacterium longum NCC2705[Proc Natl Acad Sci U S A 99:14422-7 (2002)] 等に由来するものを挙げることができ、いずれも本発明の会合タンパク質の構成要素として利用することができる。
【００６１】
特にThermus thermophilus 、Pyrococcus furiosus 、Aquifex aeolicus等由来の酵素は耐熱性があり、本発明に好適に利用し得る。
【００６２】
会合用の乳酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.27）としては、下記の化学反応を触媒する機能が同定されており、遺伝子の塩基配列または酵素のアミノ酸配列が既知のものであれば利用できる。
(S)-lactate + NAD+ = pyruvate + NADH + H+
そのような乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子としては、Bacillus属、例えばBacillus subtilis 168[Nature 390:249-56 (1997)]、Lactococcus属、例えばLactococcus lactis subsp. lactis IL1403[Genome Res 11:731-53 (2001)]、Lactobacillus属、例えばLactobacillus plantarum WCFS1[Proc Natl Acad Sci U S A 100:1990-5 (2003)]、Lactobacillus johnsonii NCC 533[Proc Natl Acad Sci U S A : (2004)]、Deinococcus属、例えばDeinococcus radiodurans R1[Science 286:1571-7 (1999)]、Thermus属、例えばThermus thermophilus HB27[Nat Biotechnol 22:547-53 (2004)]、Thermotoga属、例えばThermotoga maritima MSB8[Nature 399:323-9 (1999)]等に由来するものを挙げることができ、いずれも本発明の会合タンパク質の構成要素として利用することができる。特にThermus thermophilus、Thermotoga maritima等由来の酵素は耐熱性があり、本発明に好適に利用し得る。
【００６３】
会合用のジアフォラーゼとしては、ジアフォラーゼ活性が確認されており、遺伝子DNAの塩基配列または酵素のアミノ酸配列が既知のものであれば、いずれも本発明の会合タンパク質の構成要素として利用することができる。ジアフォラーゼ活性は、メチレンブルーや２，６−ジクロロフェノール−インドフェノールのような人工的電子受容体の存在下に、ＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨを酸化する反応の触媒活性である。このようなジアフォラーゼ活性を有する酵素としては、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのいずれか、またはその両方に特異性を有するかに基づき次のように分類されている。
EC 1.6.99.1 ; NADPH:(acceptor) oxidoreductase。
EC 1.6.99.2 ; NAD(P)H:(quinone-acceptor) oxidoreductase。
EC 1.6.99.3 ; NADH:(acceptor) oxidoreductase。
EC 1.6.99.5 ; NADH:(quinone-acceptor) oxidoreductase。
EC 1.8.1.4 ; protein-N6-(dihydrolipoyl)lysine:NAD+ oxidoreductase。
EC 1.14.13.39 ; L-arginine,NADPH:oxygen oxidoreductase (nitric-oxide-forming)。
【００６４】
本発明の酵素電極においては、ジアフォラーゼと会合または共存させて用いられるデヒドロゲナーゼがＮＡＤＰＨ若しくはＮＡＤＨのいずれかに基質特異性を有するかにより、該デヒドロゲナーゼと同一の基質特異性を有するジアフォラーゼを選択して用いることが望ましい。
【００６５】
上記（１）のジアフォラーゼを用いる場合には、下記の化学反応を触媒する機能が同定されており、遺伝子の塩基配列または酵素のアミノ酸配列が既知のものであれば利用できる。
NADPH + H+ + acceptor = NADP+ + reduced acceptor
そのようなジアフォラーゼ遺伝子としては、Saccharomyces属、例えばSaccharomyces cerevisiae S288C[Science 274:546-67 (1996), Proc Natl Acad Sci U S A 92:3809-13 (1995), EMBO J 13:5795-809 (1994), Nature 357:38-46 (1992), Nature 387:75-8 (1997), Nature 387:78-81 (1997), Nat Genet 10:261-8 (1995), Nature 387:81-4 (1997), Science 265:2077-82 (1994), Nature 387:84-7 (1997), EMBO J 15:2031-49 (1996), Nature 369:371-8 (1994), Nature 387:87-90 (1997), Nature 387:90-3 (1997), Nature 387:93-8 (1997), Nature 387:98-102 (1997), Nature 387:103-5 (1997)], , Candida属、例えばCandida albicans SC5314[Proc Natl Acad Sci U S A 101:7329-34 (2004)],等に由来のものを挙げることができる。
【００６６】
上記（２）のジアフォラーゼを用いる場合には、下記の化学反応を触媒する機能が同定されており、遺伝子の塩基配列または酵素のアミノ酸配列が既知のものであれば利用できる。
NAD(P)H + H+ + acceptor = NAD(P)+ + reduced acceptor
そのようなジアフォラーゼ遺伝子としては、Pseudomonas属、例えばPseudomonas aeruginosa PA01[Nature 406:959-64 (2000)], Pseudomonas putida KT2440[Environ Microbiol 4:799-808 (2002)], Bacillus属、例えばBacillus cereus ATCC 14579[Nature 423:87-91 (2003)],等に由来のものを挙げることができる。
【００６７】
上記（３）のジアフォラーゼを用いる場合には、下記の化学反応を触媒する機能が同定されており、遺伝子の塩基配列または酵素のアミノ酸配列が既知のものであれば利用できる。
NADH + H+ + acceptor = NAD+ + reduced acceptor
そのようなジアフォラーゼ遺伝子としては、Saccharomyces属、例えばSaccharomyces cerevisiae S288C[Science 274:546-67 (1996), Proc Natl Acad Sci U S A 92:3809-13 (1995), EMBO J 13:5795-809 (1994), Nature 357:38-46 (1992), Nature 387:75-8 (1997), Nature 387:78-81 (1997), Nat Genet 10:261-8 (1995), Nature 387:81-4 (1997), Science 265:2077-82 (1994), Nature 387:84-7 (1997), EMBO J 15:2031-49 (1996),Nature 369:371-8 (1994),Nature 387:87-90 (1997),Nature 387:90-3 (1997),Nature 387:93-8 (1997),Nature 387:98-102 (1997),Nature 387:103-5 (1997)], Pseudomonas属、例えばPseudomonas aeruginosa PA01[Nature 406:959-64 (2000)], Pseudomonas putida KT2440[Environ Microbiol 4:799-808 (2002)], Acinetobacter属、例えばAcinetobacter sp. ADP1[Nucleic Acids Res 32:5766-79 (2004)], Bacillus属、例えばBacillus subtilis 168[Nature 390:249-56 (1997)], Lactobacillus属、例えばLactobacillus plantarum WCFS1[Proc Natl Acad Sci U S A 100:1990-5 (2003)], Deinococcus属、例えばDeinococcus radiodurans R1[Science 286:1571-7 (1999)], Thermus属、例えばThermus thermophilus HB27[Nat Biotechnol 22:547-53 (2004)], Aquifex属、例えばAquifex aeolicus VF5[Nature 392:353-8 (1998)], Pyrococcus属、例えばPyrococcus abyssi GE5, Pyrococcus furiosus DSM 3638[Genetics 152:1299-305 (1999), Mol Microbiol 38:684-93 (2000), , Methods Enzymol 330:134-57 (2001)],等由来のものを挙げることができる。
【００６８】
上記（４）のジアフォラーゼを用いる場合には、下記の化学反応を触媒する機能が同定されており、遺伝子の塩基配列または酵素のアミノ酸配列が既知のものであれば利用できる。
NADH + H+ + acceptor = NAD+ + reduced acceptor
そのようなジアフォラーゼ遺伝子としては、Burkholderia属、例えばBurkholderia mallei ATCC 23344[Proc Natl Acad Sci U S A 101:14246-51 (2004)], Haloarcula属、例えばHaloarcula marismortui ATCC 43049[Genome Res 14:2221-34 (2004)]等に由来のものを挙げることができる。
【００６９】
上記（５）のジアフォラーゼを用いる場合には、下記の化学反応を触媒する機能が同定されており、遺伝子の塩基配列または酵素のアミノ酸配列が既知のものであれば利用できる。
protein N6-(dihydrolipoyl)lysine + NAD+ = protein N6-(lipoyl)lysine + NADH + H+
そのようなジアフォラーゼ遺伝子としては、Saccharomyces属、例えばSaccharomyces cerevisiae S288C[Science 274:546-67 (1996), Proc Natl Acad Sci U S A 92:3809-13 (1995), EMBO J 13:5795-809 (1994), Nature 357:38-46 (1992), Nature 387:75-8 (1997), Nature 387:78-81 (1997), Nat Genet 10:261-8 (1995), Nature 387:81-4 (1997), Science 265:2077-82 (1994), Nature 387:84-7 (1997), EMBO J 15:2031-49 (1996),Nature 369:371-8 (1994),Nature 387:87-90 (1997),Nature 387:90-3 (1997),Nature 387:93-8 (1997),Nature 387:98-102 (1997),Nature 387:103-5 (1997)], Lactobacillus属、例えばLactobacillus plantarum WCFS1[Proc Natl Acad Sci U S A 100:1990-5 (2003)], Deinococcus属、例えばDeinococcus radiodurans R1[Science 286:1571-7 (1999)], Thermus属、例えばThermus thermophilus HB27[Nat Biotechnol 22:547-53 (2004)], Aquifex属、例えばAquifex aeolicus VF5[Nature 392:353-8 (1998)], Thermotoga属、例えばThermotoga maritima MSB8[Nature 399:323-9 (1999)], Sulfolobus属、例えばSulfolobus solfataricus[Proc Natl Acad Sci U S A 98:7835-40 (2001)], , Sulfolobus tokodaii strain7[DNA Res 8:123-40 (2001)], Pyrobaculum属、例えばPyrobaculum aerophilum IM2[Proc Natl Acad Sci U S A 99:984-9 (2002)]等に由来のものを挙げることができる。
【００７０】
上記（６）のジアフォラーゼを用いる場合には、下記の化学反応を触媒する機能が同定されており、遺伝子の塩基配列または酵素のアミノ酸配列が既知のものであれば利用できる。
L-arginine + n NADPH + n H+ + m O2 = citrulline + nitric oxide + n NADP+
そのようなジアフォラーゼ遺伝子としては、Bacillus属、例えばBacillus cereus ATCC 14579[Nature 423:87-91 (2003)],等由来のものを挙げることができる。特にThermus thermophilus 、Thermotoga maritima 、Sulfolobus tokodaii 、Pyrobaculum aerophilum等に由来の酵素は耐熱性があり、本発明に好適に利用し得る。
【００７１】
会合用のリンゴ酸デヒドロゲナーゼとしては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性が確認されており、遺伝子DNAの塩基配列または酵素のアミノ酸配列が既知のものであれば利用できる。リンゴ酸デヒドロゲナーゼは次のように分類されている。
（Ａ）EC 1.1.1.37 ; (S)-malate:NAD+ oxidoreductase
（Ｂ）EC 1.1.1.38 ; (S)-malate:NAD+ oxidoreductase (oxaloacetate-decarboxylating)
（Ｃ）EC 1.1.1.39 ; (S)-malate:NAD+ oxidoreductase (decarboxylating)
（Ｄ）EC 1.1.1.40 ; (S)-malate:NADP+ oxidoreductase (oxaloacetate-decarboxylating)
これらの内、EC 1.1.1.37の酵素は化学反応の平衡がリンゴ酸生成側に偏っているので、EC 1.1.1.38、EC 1.1.1.39、EC 1.1.1.40に分類される酵素がより望ましい。そのようなリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子としては、Bacillus属、例えばBacillus cereus ATCC 10987 [Nucleic Acids Res 32:977-88 (2004)]、Bacillus subtilis 168 [Nature 390:249-56 (1997)]、Deinococcus属、例えばDeinococcus radiodurans R1 [Science 286:1571-7 (1999)]、Lactobacillus属、例えばLactobacillus plantarum WCFS1 [Proc Natl Acad Sci U S A 100:1990-5 (2003)]、Pseudomonas属、例えばPseudomonas aeruginosa PA01 [Nature 406:959-64 (2000)]、Pseudomonas putida KT2440 [Environ Microbiol 4:799-808 (2002)]、Pyrococcus furiosus DSM 3638 [Genetics 152:1299-305 (1999), Mol Microbiol 38:684-93 (2000), Methods Enzymol 330:134-57 (2001)]、Saccharomyces属、例えばSaccharomyces cerevisiae S288C [Science 274:546-67 (1996), Proc Natl Acad Sci U S A 92:3809-13 (1995), EMBO J 13:5795-809 (1994), Nature 357:38-46 (1992), Nature 387:75-8 (1997), Nature 387:78-81 (1997), Nat Genet 10:261-8 (1995), Nature 387:81-4 (1997), Science 265:2077-82 (1994), Nature 387:84-7 (1997), EMBO J 15:2031-49 (1996), Nature 369:371-8 (1994), Nature 387:87-90 (1997), Nature 387:90-3 (1997), Nature 387:93-8 (1997), Nature 387:98-102 (1997), Nature 387:103-5 (1997)]、Sulfolobus属、例えばSulfolobus solfataricus [Proc Natl Acad Sci U S A 98:7835-40 (2001)]、Sulfolobus tokodaii strain7 [DNA Res 8:123-40 (2001)]、Thermotoga属、例えばThermotoga maritima MSB8 [Nature 399:323-9 (1999)]、Thermus属、例えばThermus thermophilus HB27 [Nat Biotechnol 22:547-53 (2004)]等に由来のものを挙げることができる。特にThermus thermophilus 、Thermotoga maritima、Pyrococcus furiosus 、Sulfolobus tokodaii等由来の酵素は耐熱性があり、本発明に好適に利用し得る。
【００７２】
会合用のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.4.1.2, EC 1.4.1.3, EC 1.4.1.4）としては、下記式の化学反応を触媒する機能が同定されており、遺伝子DNAの塩基配列または酵素のアミノ酸配列が既知のものであれば利用できる。
L-glutamate + H2O + NAD(P)+ = 2-oxoglutarate + NH3 + NAD(P)H + H+
そのようなグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子としては、Bacillus属、例えばBacillus subtilis 168[Nature 390:249-56 (1997)]、Deinococcus属、例えばDeinococcus radiodurans R1[Science 286:1571-7 (1999)]、Geobacillus属、例えばGeobacillus kaustophilus HTA426[Nucleic Acids Res 32:6292-303 (2004)]、Lactobacillus属、例えばLactobacillus plantarum WCFS1[Proc Natl Acad Sci U S A 100:1990-5 (2003)]、Pyrococcus属、例えばPyrococcus horikoshii OT3[DNA Res 5:55-76 (1998)]、Pseudomonas属、例えばPseudomonas aeruginosa PA01[Nature 406:959-64 (2000)]、Pseudomonas putida KT2440[Environ Microbiol 4:799-808 (2002)]、Pyrococcus属、例えばPyrococcus abyssi GE5、Pyrococcus furiosus DSM 3638[Genetics 152:1299-305 (1999), Mol Microbiol 38:684-93 (2000), Methods Enzymol 330:134-57 (2001)]、Sulfolobus属、例えばSulfolobus solfataricus[Proc Natl Acad Sci U S A 98:7835-40 (2001)]、Sulfolobus tokodaii strain7[DNA Res 8:123-40 (2001)]、、Thermococcus属、例えばThermococcus kodakaraensis KOD1[Genome Res 15:352-63 (2005)]、Thermus属、例えばThermus thermophilus HB27[Nat Biotechnol 22:547-53 (2004)]、Thermus thermophilus HB8等に由来のものを挙げることができる。特にThermus thermophilus 、Thermotoga maritima、Pyrococcus furiosus 、Sulfolobus tokodaii等由来の酵素は耐熱性があり、本発明に好適に利用し得る。
【００７３】
会合用のイソメラーゼ（キシロースイソメラーゼ）（EC 5.3.1.5）としては、下記式の化学反応を触媒する機能が同定されており、遺伝子DNAの塩基配列または酵素のアミノ酸配列が既知のものであれば利用できる。
D-xylose = D-xylulose
そのようなイソメラーゼ遺伝子としては、Bacillus属、例えば、Bacillus subtilis 168 [Nature 390:249-56 (1997)], Lactococcus属、例えば、Lactococcus lactis subsp. lactis IL1403 [Genome Res 11:731-53 (2001)]、Thermotoga属、例えば、Thermotoga maritima MSB8 [Nature 399:323-9 (1999)] 等に由来のものを挙げることができる。特にThermotoga maritima由来の酵素は耐熱性があり、本発明に好適に利用し得る。
【００７４】
本発明の酵素電極に用いられる会合タンパク質において、酵素活性の機能単位が単鎖のポリペプチド（モノマー）ではない場合であっても、以下に述べる何れかの構成を採用することによって本発明の目的を達成することができる。
【００７５】
（１）何れかの酵素の機能単位がホモオリゴマーである場合：
例えば機能的なポリペプチド構成がαn [n>1の整数]と表されるとする。更に、ポリペプチド会合部のポリペプチドをβと表わすとする。この酵素を会合タンパク質の会合要素とするためには、融合ポリペプチド（α::β）に加えて、ホモオリゴマーを機能単位とする酵素の構成ポリペプチド（α）を宿主細胞内で共発現させる。このことによって（αn::β）なるポリペプチド構成の融合タンパク質を取得すればよい。共発現されるべき２つのポリペプチド（α::βとα）は、同一のプラスミド上にコードされていても、また相異なるプラスミド上にコードされていてもよい。ただし相異なるプラスミドを用いる場合には、両者のプラスミドは不和合性を持たないことが必要である。この系では目的とする融合タンパク質（αn::β）に加えて、αnやαn-x(α::β)x [xはn+1> x > 0なる整数]などといったペプチド構成の目的外タンパク質が生成し得る。これらは例えば夫々の分子量の違いにより、ゲルろ過法や限外ろ過法を用いて分画・精製できる。また融合ポリペプチドα::βに精製用のタグをさらに融合して発現させてもよい。なおαn-x(α::β)x [xはn+1> x > 0なる整数]なる構成の融合タンパク質でも、酵素活性が保持されていれば、本発明の酵素電極に用いられる会合タンパク質の会合要素として供し得る。
【００７６】
（２）何れかの酵素の機能単位がヘテロオリゴマーである場合：
例えば機能的なポリペプチド構成がαnα' [ただしα'はα以外のポリペプチド鎖をまとめて表現するものとし、nはｎ＞0の整数とする]と表わされるとする。更に、ポリペプチド会合部のポリペプチドをβと表わすとする。この酵素を会合タンパク質の会合要素とするためには、融合ポリペプチド（α::β）に加えて、ヘテロオリゴマーを機能単位とする酵素の構成ポリペプチド（α及びα'）を宿主細胞内で共発現させる。このことによって、（αnα'::β）なる構成の融合タンパク質を取得すればよい。共発現されるべきポリペプチド鎖（α::β、αおよびα'）は、同一のプラスミド上にコードされていても、また相異なるプラスミド上にコードされていてもよい。ただし相異なるプラスミドを用いる場合には、両者のプラスミドは不和合性を持たないことが必要である。この系では目的とする融合タンパク質（αnα'::β）に加えて、αn-xα'(α::β)x [xはn+1> x > 0なる整数]やαnα'といったペプチド構成のタンパク質が生成し得る。これらは例えば夫々の分子量の違いにより、ゲルろ過法や限外ろ過法を用いて分画・精製できる。なおαn-xα'(α::β)x [xはn+1> x > 0なる整数]なる構成の融合タンパク質でも、酵素活性が保持されていれば、本発明の酵素電極に供し得る。このような融合タンパク質の生成を抑えるためには、ヘテロオリゴマーの構成ユニットの内、機能的な構成の中で最も数の少ないもの、すなわちn=1となるものをαとして選択することが望ましい。n=1のαを選択できる場合には共発現されるべきポリペプチド鎖はα::βおよびα'のみでよい。またこの場合、融合ポリペプチドα::βに精製用のタグをさらに融合して発現させてもよい。
【００７７】
また上記（１）から（２）の何れの場合において、細胞内共発現系ではなく、in vitro無細胞タンパク質合成系を採用することもできる。この場合、in vitroタンパク質合成装置にて夫々の構成ポリペプチドを合成後、これらを混合することによって目的のポリペプチド構成を持つ融合タンパク質を形成させることができる。
【００７８】
次に、会合用の酵素タンパク質の遺伝子組換えを利用した生産方法について説明する。
【００７９】
会合用の酵素タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを、適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、様々な宿主内での会合用の酵素タンパク質の発現を可能とする組換えベクターを構築することができる。当業者ならば、当該技術分野での常法に従い、任意の宿主細胞内で機能的な会合タンパク質を構成するタンパク質発現ベクターを構築することができる。プロモーターは既知のものから適宜選択するか、あるいは新たに調製したものでもよい。また通常の技術を用いて修飾(例えば、プロモーターを交換する)することによって、会合タンパク質を構成するタンパク質を高レベルに産生させることができる発現ベクターを構築することができる。
【００８０】
会合タンパク質を構成するタンパク質発現ベクターで形質転換するために用いられる宿主細胞は、大腸菌等の原核細胞、酵母等の真核細胞のいずれでもよく、さらには一般的に利用されている高等生物の細胞でもよい。宿主細胞としては、微生物［原核生物（細菌、例えば大腸菌や枯草菌等）、真核生物（例えば酵母）］、動物細胞又は培養植物細胞が挙げられる。微生物としては原核細胞微生物や酵母が好ましい。原核細胞微生物としては、特にEscherichia属に属する菌株(例えば、E.coli等)が好ましい。酵母としては、特にSaccharomyces属に属する株（例えば、S.cerevisiae）やCandida属に属する株（例えば、C.boidinii）が好ましい。好ましい動物細胞株は例えば、マウスＬ９２９細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞などである。
【００８１】
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を使用するのに適した、発現ベクターは既知であり、例えば、ｌａｃプロモーターやｔａｃプロモーター等の慣用のプロモーターを有するものを挙げることができる。酵母での会合用の酵素タンパク質の発現のための発現ベクターとしては、ＧＡＬプロモーターやＡＯＤプロモーター等のプロモーターを含有するものが好ましい。又、哺乳動物細胞での会合用の酵素タンパク質のための発現ベクターとしては、ＳＶ４０プロモーター等のプロモーターを有するものが挙げられる。しかしながら、操作及び入手の容易さを考慮して、宿主細胞としては原核性宿主が好ましく、特に大腸菌が好ましい。原核性宿主−ベクター系については、多くの成書があり、当該技術分野で既知であるが、以下に簡単に説明する。（例えばＭolecular Ｃloning：A LABOLATORY MANUAL, Ｃold ＳpringＨarbor Ｌaboratory Ｐress参照。）
会合用の酵素タンパク質をコードするＤＮＡを大腸菌で発現させるには、大腸菌を用いた形質転換に適するプラスミドのプロモーターの下流に該ＤＮＡを挿入する。後述する実施例では、大腸菌での１つの態様の発現が記載されている。その他の態様での発現は、例えば、会合用の酵素タンパク質をコードするＤＮＡを適当な酵素で処理することにより会合タンパク質コードするＤＮＡ断片を得、これを適当なベクターに組み込むことにより様々な宿主で会合用の酵素タンパク質を発現させることができる。この処理に用いる酵素としては、例えば制限酵素、アルカリホスファターゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼなどが利用できる。
【００８２】
会合用の酵素タンパク質の発現ベクターによる宿主細胞の形質転換方法は既知であり、Ｍolecular Ｃloning：A LABOLATORY MANUAL, Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory Ｐressに記載の方法で行うことができる。例えば、原核細胞宿主の場合は、コンピテントセル作製法、真核性宿主の場合は、コンピテントセル作製法、哺乳動物細胞の場合はトランスフェクション法、エレクトロポレーション法により行うことができる。次いで、得られた形質転換体を適当な培地に培養する。培地は、炭素源（例えばグルコース、メタノール、ガラクトース、フルクトース等）及び無機また有機窒素源（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、カザミノ酸等）を含有していてよい。所望により、培地に他の栄養源（例えば無機塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム）、ビタミン類（例えばビタミンＢ1）、抗生物質（例えばアンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン等)）を加えてもよい。哺乳動物細胞の培養には、イーグル培地が適当である。
【００８３】
形質転換体の培養は、通常、pＨ６.０〜８.０、好ましくはpＨ７.０、２５〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で８〜４８時間行えばよい。生産された会合用の酵素タンパク質が培養液中に存在しているときは、培養物を濾過又は遠心分離する。精製は、回収した培養液上清から、天然又は合成のタンパク質を構成するタンパク質の精製、単離に用いられる常法を用いて行うことができる。この処理には、例えば透析、ゲル濾過、会合タンパク質を構成するタンパク質に対するモノクロナール抗体を用いてのアフィニティカラムクロマトグラフィー、適当な吸着剤を用いてのカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を利用することができる。生産された会合用の酵素タンパク質が培養形質転換体のペリプラズム及び細胞質中に存在するときは、濾過や遠心分離によって細胞を集め、それらの細胞壁及び／又は細胞膜を、たとえば超音波及び／又はリゾチーム処理によって破壊して細胞破砕物を得る。この細胞破砕物に適当な水溶液（例えば緩衝液）を混合し、常法によって、会合タンパク質を構成するタンパク質を精製することができる。
【００８４】
大腸菌中で生産された会合タンパク質を構成するタンパク質を再生（リフォールディング）する必要があるときは、これを常法によって行うことができる。
【００８５】
特に好熱菌由来の会合酵素を調製する場合には、上記細胞破砕液を70℃以上の温度で恒温保持することにより宿主常温菌由来のタンパク質を凝集させ、該凝集体を遠心分離操作などで除去することにより、簡便に精製することが出来る。また活性を有するフォールドへ変換することが出来る。
【００８６】
尚、用途に応じて会合用の酵素タンパク質および会合タンパク質は完全に精製されていなくとも良く、次の（１）〜（７）のいずれかであっても良い。
（１）生細胞：ろ過又は遠心分離等の通常の方法で培養物から分離された細胞。
（２）乾燥細胞：(１) に記載の生細胞を凍結乾燥又は真空乾燥したもの。
（３）細胞抽出物：(１)又は(２) に記載の細胞を通常の方法（例えば有機溶媒中での自己溶菌、アルミナや海砂と混合しての摩砕、又は超音波処理）で処理して得られたもの。
（４）酵素溶液：（３）に記載の細胞抽出物を常法通り精製するか部分精製することにより得られたもの。
（５）精製酵素：（４）に記載の酵素溶液をさらに精製し、不純物を含まないもの。
（６）酵素活性を有するフラグメント：（５）に記載の精製酵素等を適当な方法で断片化処理することにより得られたペプチドフラグメント。
【００８７】
本発明の酵素電極に用いられる会合用の酵素タンパク質は、例えば組換え大腸菌の細胞内で生合成させた場合には、フラビン化合物、金属原子（Ｆｅ、Ｃｕ、Ｍｏなど）、ヘム等などの補欠分子族が結合したホロ酵素として取得できることが多い。特に生合成時にこれらの補欠分子族を予め培地中に添加しておくことにより、ホロ酵素の回収率を増加させることできる。しかし無細胞タンパク質合成装置などを用いてin vitroで会合タンパク質を構成するタンパク質のペプチドを取得した場合などでは、補欠分子族の結合していないアポ酵素として取得される。この場合には取得されたアポ酵素を、これら補欠分子族を添加したバッファー中で保持する工程を加えることによって、ホロ酵素を再構成することができる。
【００８８】
遺伝子工学的に常用される方法を用いることにより、会合用の酵素タンパク質のアミノ酸配列中に適宜、１個ないし複数（数個）のアミノ酸の置換、欠失、挿入、転移あるいは付加したごとき変異を導入した相当するタンパク質を製造することができる。こうした変異・変換・修飾法としては、日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法 II 」、ｐ１０５（広瀬進）、東京化学同人（１９８６）；日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸 III（組換えDNA 技術）」、ｐ２３３（広瀬進）、東京化学同人（１９９２）；R. Wu, L. Grossman, ed., "Methods inEnzymology", Vol. 154, p. 350 & p. 367, Academic Press, New York (1987)；R. Wu, L. Grossman, ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100, p. 457 & p. 468, Academic Press, New York (1983)；J. A. Wells  et al., Gene, 34: 315, 1985；T. Grundstroem et al., Nucleic Acids Res., 13: 3305, 1985 ；J.Taylor et al., Nucleic Acids Res., 13: 8765, 1985；R. Wu ed., "Methodsin Enzymology", Vol. 155, p. 568, Academic Press, New York（1987) ；A. R. Oliphant et al., Gene, 44: 177, 1986などに記載の方法が挙げられる。例えば合成オリゴヌクレオチドなどを利用する位置指定変異導入法（部位特異的変異導入法）、 Kunkel 法、 dNTP[αS]法（Eckstein) 、亜硫酸や亜硝酸などを用いる領域指定変異導入法等の方法が挙げられる。
【００８９】
上記の各種の方法で得られた会合用の酵素タンパク質の遺伝子塩基配列を基に、化学的な手法でこの酵素タンパク質のアミノ酸残基を修飾することもできる。更には、ペプチダーゼなどの酵素を用いて上記の各種の方法で得られた会合用の酵素タンパク質を修飾したり、部分分解したりしてその誘導体などにすることができる。このペプチダーゼとしては、例えばペプシン、キモトリプシン、パパイン、ブロメライン、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼなどを用いることができる。
【００９０】
また精製用タグや移行シグナル配列を融合した融合タンパク質として会合用の酵素タンパク質を発現させてもよい。こうした精製用タグや移行シグナル配列を融合した会合タンパク質を構成するタンパク質の産生は遺伝子工学的に常用される融合産生法を用いることができ、精製用タグを融合した会合用の酵素タンパク質はその精製用タグ部を利用してアフィニティクロマトグラフィーなどで精製することや、前述した酵素固定化層を形成するための固定化タグとしての利用が可能である。
【００９１】
すなわち、会合用の酵素タンパク質は、１個以上のアミノ酸残基が同一性の点で天然のアミノ酸残基と異なるもの、あるいは、１個以上のアミノ酸残基の位置が天然のものと異なるものであってもよい。また、会合用の酵素タンパク質としては、天然のタンパク質に特有なアミノ酸残基が１個以上欠けている欠失類縁体であってもよい。この欠失したアミノ酸残基の個数としては、例えば、１〜８０個、好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個、特には１〜１０個の範囲を挙げることができる。また、会合用の酵素タンパク質としては、天然のタンパク質に特有のアミノ酸残基の１個以上が他の残基で置換されている置換類縁体であってもよい。この置換アミノ酸残基の個数としては、例えば、１〜８０個、好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個、特には１〜１０個などの範囲を挙げることができる。会合用の酵素タンパク質としては、天然のタンパク質に特有のアミノ酸残基の１個以上のアミノ酸残基が付加されている付加類縁体であってもよい。このアミノ酸残基の付加数は、例えば、１〜８０個、好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個、特には１〜１０個などの範囲を挙げることができる。これは酵素の天然のタンパク質の特徴であるドメイン構造がそれぞれ維持されていれば、会合用の酵素タンパク質に、所望の活性を有する天然のタンパク質と実質的に同等の一次構造コンフォメーションあるいはその一部を有しているものも含まれてよいと考えられる。さらに会合用の酵素タンパク質に、天然のタンパク質と実質的に同等の所望とする生物学的活性を有しているものも含まれてよいと考えられるからである。したがって上記のごとき変異体は、全て本発明の酵素電極における会合タンパク質として使用できる。
【００９２】
会合用の酵素タンパク質としての変異型のタンパク質は、例えば、配列表の配列番号15, 16, 27, 28, 36, 44, 61, 62, 73, 74, 82, 90, 98, 106, 114, 115, 121, 122, 128, 129, 135, 136, 150, 151, 152, 157, 158若しくは159で示されるアミノ酸配列と高い相同性を有し、所望とする酵素活性が維持されているものが挙げられる。この相同性としては、70%より高い相同性を有しているものが挙げられる、より好ましくは80%以上、特に好ましくは90%以上の相同アミノ酸配列を有するものが挙げられる。
【００９３】
酵素の天然のタンパク質と「実質的に同等」とはタンパク質の活性、例えば、触媒活性、生理的な活性、生物学的な活性が実質的に同じであることを意味する。アミノ酸の置換、欠失、あるいは挿入は、しばしばポリペプチドの生理的な特性や化学的な特性に大きな変化を生じさせない場合がある。こうした場合、その置換、欠失、あるいは挿入を施されたポリペプチドは、そうした置換、欠失、あるいは挿入のされていないものと実質的に同一であるとされる。アミノ酸配列中のアミノ酸の実質的に同一な置換体としては、そのアミノ酸が属するところのクラスのうちの他のアミノ酸類から選ぶことができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、トリプトファン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンなどが挙げられる。陽電荷をもつアミノ酸（塩基性アミノ酸）としては、アルギニン、リジン、ヒスチジンなどが挙げられ、陰電荷をもつアミノ酸（酸性アミノ酸）としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００９４】
（電子伝達メディエーター）
本発明の酵素電極における電子伝達メディエーターは、酵素と導電性基体間の電子授受反応を促進し、測定感度・電流密度を高めるために電極系に含有される物質である。本発明の酵素電極に使用される電子伝達メディエーターとしては、上記のような物質である限り特に限定されない。例えば、中心金属とその配位子からなる金属錯体またはそのイオン化物、メタロセン類、フェナジンメトサルフェート、１−メトキシ−フェナジンメトサルフェート、キノン類など、およびこれらの誘導体などを挙げることができる。
【００９５】
金属錯体化合物としては、中心金属として、Ｏｓ、Ｆｅ、Ｒｕ、Ｃｏ等の内から選ばれる少なくとも１種類を含むものが挙げられる。中心金属への配位子としては、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、１、２、３−または１、２、４−トリアゾール等およびそれらの誘導体を挙げることができる。
【００９６】
金属錯体及びそのイオン化物としては、具体的には、オスミウム、ルテニウム、コバルト、ニッケル等の金属とビピリジンとから形成されるビピリジン錯体、フェリシアンイオン、オクタシアノタングステン酸イオン、オクタシアノモリブデン酸イオン等の金属錯体イオンを挙げることができる。
【００９７】
メタロセン類としては、例えばフェロセン、1,1'- ジメチルフェロセン、フェロセンカルボン酸、フェロセンカルボキシアルデヒド等のフェロセン誘導体を挙げることができる。
【００９８】
これらの電子メディエーターは本発明の効果を損なわない範囲内でその２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００９９】
電子メディエーターは、本発明の酵素電極に全構成成分の０．５〜１０重量％、好適には１〜５重量％含有される。ここで全構成成分とは導電性基体上の酵素固定化層に含まれる成分である。
【０１００】
（電極系の構成）
本発明の酵素電極に、電子の授受を行なう配線を接続することで各種用途に利用できる酵素電極デバイス（バイオセンサ、燃料電池、および電気化学反応装置）を作製することができる。このデバイスは、上記の板状（あるいは膜状またはの層状）の酵素電極を単層で、あるいは、その複数を用いて構成することができる。その複数を用いる場合は、互いの表面と裏面が対向するように積層配置することができる。なお、複数の場合は、各酵素電極の特性を均一としても、異なる特性の酵素電極の組み合わせが含まれるようにしてもよい。例えば、後述する燃料電池における場合にように、アノードとカソードとが交互に配置されるようにすることができる。このデバイスは、電極を単層から多層へと段数を変更することで、要求される電圧、出力に対応することができる。酵素電極の触媒としての酵素は、一般に電気化学の分野で用いられている貴金属触媒（例えば白金）と比較して、高い基質選択性を有する。そのため、一方の電極と、他方の電極における反応物質を隔離する機構を必要とせず、その結果、デバイスを簡素化することが可能となる。
【０１０１】
（センサ）
本発明の好ましいひとつの形態であるセンサは、本発明にかかる酵素電極を物質を検知するための検知部位として用いる構成を有する。代表的な構成としては、酵素電極を作用電極として、参照電極及び対極とセットで使用し、酵素電極で（電極に固定した酵素の機能により）検知可能な電流を検知する構成を挙げることができる。この電流の有無や量を検知して、これらの電極が接している液体中の物質の有無や量を検出することができる。具体的には図８に示す構成のセンサを挙げることができる。
【０１０２】
図８のセンサは、作用電極４、白金線対極５、銀塩化銀参照電極６を有して構成され、それぞれの電極にはリード線７、８、９が配線され、ポテンショスタット１０と接続されている。このセンサを、蓋２で密閉可能なウォータージャケットセル１内の試料溶液３の貯溜領域に配置する。作用電極に電位を印加して定常電流を測定することで、電解質中での基質の検出を行うことができる。なお、不活性ガス雰囲気での測定が必要な場合は、ガスチューブ１２の外部末端のガス吹き込み口１１から窒素などの不活性ガスを導入する。また、温度は、温調水流入口１３及び温調水排出口１４を利用した温度調節用の液体の供給により行うことができる。
【０１０３】
（燃料電池）
本発明の好ましいひとつの形態である燃料電池は、酵素電極をアノードまたはカソードの少なくとも一方として用いることを特徴とする。この場合にも、酵素電極は、板状や層状として単層で、あるいは２以上の層の積層構造として用いることができる。更に、積層構造とした場合に、積層方向にアノードとカソードを所定の配列に配置してもよい。代表的な構成としては、燃料となる物質を含む電解液を貯溜し得る反応槽と、反応槽中に所定の間隔で配置されたアノードとカソードとを有し、このアノード及びカソードの少なくとも一方に本発明にかかる酵素電極を用いた構成を挙げることができる。なお、この燃料電池は電解液を補充あるいは循環させるタイプや、電解液の補充や循環しないタイプとすることができる。この燃料電子は、酵素電極が使用できるものであれば、燃料の種類、構造、機能などは制限されない。この際、酵素電極の触媒として用いられている酵素は、高い基質選択性を有するため、一方の電極と、他方の電極における反応物質を隔離する機構を必要とせず、その結果、デバイスを簡素化することが可能となる。この燃料電池は、電極反応の触媒として用いる酵素に特有の高い触媒作用によって、物質を低い過電圧で酸化還元できることにより、高い駆動電圧を得ることが可能であり、高い安定性、電流密度によって、長寿命、高出力化が可能となる。
【０１０４】
燃料電池の一例を図９に示す。この燃料電池のセルの構成は先に図８に示したセンサでの基質測定用装置とほぼ同一であり、同一部材には同じ番号を付している。図８で示したセンサの代わりに、アノード１５とカソード１６を多孔質ポリプロピレンフィルム１７を介して積層した構成の電極ユニットを用い、チューブ１２を介して酸素ガスをセル内に導入して、燃料電池として作用させる。
【０１０５】
（電気化学反応装置）
本発明の好ましいひとつの形態である電気化学反応装置では、電極反応の触媒として用いる酵素に特有の基質の高い選択性、触媒能を得ることができる。これに加えて、電気化学反応の特徴である、反応の定量性を更に得ることが可能である。その結果、高選択的、高効率で定量的に制御可能であり、担体と複数のメディエーターを用いた酵素電極による、高い安定性、電流密度によって、長寿命、高出力化が可能となる。この場合にも、酵素電極は、板状や層状として単層で、あるいは２以上の層の積層構造として用いることができる。代表的な構成として、一対の電極と必要に応じて設けられた参照電極とを反応液を貯溜し得る反応層内に配置して、一対に電極間に電流を流して、反応液中の物質に電気化学的反応を起させて目的とする反応生成物、分解物などを得る構成を挙げることができる。この場合、一対の電極の少なくとも一方に本発明にかかる酵素電極を用いることができる。反応液の種類や反応の条件などにかかる装置構成は、酵素電極が利用できるものであれば特に限定されない。例えば、酸化還元反応による反応生成物の取得や、目的とする分解物の取得などに利用できる。
【実施例】
【０１０６】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明の方法は、これらの実施例のみに限定されるものではない。
【０１０７】
なお、以下の実施例及び比較例における酵素電極を用いたセンサー、燃料電池及び電気化学反応装置としては、酵素電極を代える以外は以下の構造の装置を共通して用いる。
【０１０８】
（センサー）
センサーの共通の構造を図１０に模式的に示す。酵素電極を作用電極４として用いて、各酵素電極の測定対象とするセンサーを構成する。対極５は白金線、参照極６は銀／塩化銀電極で構成する。これらの電極は、それぞれポテンショスタット１０を介して電流などを測定する。試料溶液３としては、測定対象の化合物を所定濃度で含む溶液（例えば緩衝水溶液）である。測定温度は、恒温循環槽によって３７℃に保持される。測定対象化合物の定量は、次のようにして行う。作用電極４には参照極６に対して３００ｍVの電位を印加する。このとき、試料溶液３中の測定対象化合物は、用いた酵素電極と反応し、作用電極４を介した電子の移動による電流が生じる。この電流を測定する。
【０１０９】
（燃料電池）
燃料電池の共通の構造を図１１に模式的に示す。この装置では、酵素電極をアノード電極１５として用いる。カソード電極１６は０．５ｃｍ2の白金板からなる。電解質溶液３は、酵素電極と反応して電流を発生させることのできる化合物等を含む緩衝液からなる。アノード電極１５とカソード電極１６は、間に多孔質ポリプロピレンフィルム（厚さ２０μｍ）１７を挟んで配置され、これを蓋２付のウォータージャケットセル１中の電解液溶液３中（１０ｍＬ）に配置する。測定温度は、恒温循環槽によって３７℃に保持される。それぞれのリードをポテンショスタット（東方技研、モデル２０００）１０に接続し、−１．２Ｖから０．１Ｖまで電圧を変化させ、電圧−電流特性を測定した。
【０１１０】
（電気化学反応装置）
図１０に示した装置を電気化学反応装置として使用する。この場合、酵素電極を作用電極４として用い、銀塩化銀電極を参照電極６に、白金線を対極５とした三極セルを構成する。原料を含む緩衝液電解液を試料溶液３として使用し、その温度を恒温循環槽によってこれを３７℃に保持する。ウォータージャケットセル１中窒素雰囲気下０．３ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌの電位を１００分間印加し、生成物を高速液体クロマトグラフィーで定量する。
（酵素調製法）
また、形質転換体からの酵素の取得には以下の方法１または２を用いた。
（方法１）
形質転換体を、抗生物質としてアンピシリン及びストレプトマイシンの両方を添加したLB培地10mLで一晩プレ・カルチャーする。その後、その0.2mLを、100mLのLB-Amp培地に添加し、30℃、170rpmで4時間振とう培養する。その後IPTGを添加 (終濃度 1mM) し、37℃で4~12時間培養を続ける。IPTG 誘導した形質転換体を集菌 (8000×g、 2分、4℃) し、1/10 量の 4℃ PBSに再懸濁する。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心 (8000×g、 10分、4℃)して固形夾雑物を取り除く。目的の発現タンパク質が上清に存在することをSDS-PAGEで確認した後、誘導発現されたHisタグ融合タンパク質をニッケルキレートカラムを用いて精製する。
（方法２）
プレ・カルチャー用のLB培地に抗生物質としてアンピシリンのみを使用する以外は方法１と同様にして酵素を得る。
【０１１１】
（実施例１）
Bacillus subtilis由来のグルコースデヒドロゲナーゼ（busGDH）とPseudomonas putida由来のジアフォラーゼ（ppuDp）との会合タンパク質（His-busGDH-FosおよびppuDp-Jun）[配列番号１５、１６]の調製
Bacillus subtilis [ATCC 27370]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、８０５ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatGGATCCGtatccggatttaaaaggaaaagtcgtcgct-3' (BamHI) [配列番号１]
5'-aataatAAGCTTaccgcggcctgcctggaatgaaggatattg-3' (HindIII) [配列番号２]
このDNA増幅産物を制限酵素BamHIおよびHind IIIで消化切断し、pETDuet-1(Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、His-busGDH発現ベクターpETDuet-busGDHを作製する。
【０１１２】
次にPseudomonas putida KT2440 [ATCC 47054]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、７２９ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGcttgtgaatgtactgatcgtccacgctcac-3' (NdeI) [配列番号３]
5'-aataatCTCGAGcgtcagcgggtacaacgcttcatcgaactg-3' (XhoI) [配列番号４]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pETDuet-busGDHの同じ制限酵素サイトに挿入することによって、His-busGDH、ppuDp共発現ベクターpETDuet-busGDH-ppuDpを作製する。
【０１１３】
次に、5'末端リン酸化合成オリゴDNA（以下の配列番号５及び配列番号６）をTEバッファー中で、等量混合し、加熱後徐冷することによってアニーリングする。
5'-AAGCTTggcggcggcagcggcggcggcagcctgaccgataccctgcaggcggaaaccgatcagctggaagataaaaaaagcgcgctgcagaccgaaattgcgaacctgctgaaagaaaaagaaaaactggaatttattctggcggcgtattaaC-3' [配列番号５]
5'-TTAAGttaatacgccgccagaataaattccagtttttctttttctttcagcaggttcgcaatttcggtctgcagcgcgctttttttatcttccagctgatcggtttccgcctgcagggtatcggtcaggctgccgccgccgctgccgccgccA-3' [配列番号６]
このDNA断片（２本鎖）を、pETDuet-busGDH/ppuDpの制限酵素Hind IIIおよびAfl II の認識サイトに挿入することによって、His-busGDHのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳ−Fos配列[配列番号７]を融合した融合タンパク質とppuDpの共発現ベクターpETDuet-busGDH-Fos/ppuDpを作製する。
【０１１４】
次に、5'末端リン酸化合成オリゴDNA（以下の配列番号８及び配列番号９）をTEバッファー中で、等量混合し、加熱後徐冷することによってアニーリングする。
5'-TCGAGggcggcggcagcggcggcggcagccgtattgcgcgtctggaagaaaaagtgaaaaccctgaaagcgcagaacagcgaactggcgagcaccgcgaacatgctgcgtgaacaggtggcgcagctgaaacagaaagtgatgaactattaaC-3' [配列番号８]
5'-CTAGGttaatagttcatcactttctgtttcagctgcgccacctgttcacgcagcatgttcgcggtgctcgccagttcgctgttctgcgctttcagggttttcactttttcttccagacgcgcaatacggctgccgccgccgctgccgccgccC-3' [配列番号９]
このDNA断片（二本鎖）を、pETDuet-busGDH-Fos/ppuDpの制限酵素Xho IおよびAvr IIの認識サイトに挿入することによって、His-busGDHのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳ−Fos配列[配列番号７]を融合した融合タンパク質とppuDpのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳ−Jun配列[配列番号１０]を融合した融合タンパク質の共発現ベクターpETDuet-busGDH-Fos/ppuDp-Jun [配列番号１１]を作製する。
【０１１５】
次にBacillus subtilis [ATCC 27370]のゲノムDNA鋳型にして、以下の配列番号１２の合成オリゴDNA及び以下の配列番号２のDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、８０５ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'- aataatCCATGGcgccggatttaaaaggaaaagtcgtcgctattacagga-3' (Nco I) [配列番号１２]
5'-aataatAAGCTTaccgcggcctgcctggaatgaaggatattg-3' (HindIII) [配列番号２]
このDNA増幅産物を制限酵素Nco IおよびHind IIIで消化切断し、pCDFDuet-1 (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、busGDH発現ベクターpCDFDuet-busGDHを作製する。
【０１１６】
次にPseudomonas putida KT2440 [ATCC 47054]のゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、７２９ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGcttgtgaatgtactgatcgtccacgctcac-3' (NdeI) [配列番号３]
5'-aataatCTCGAGtcacgtcagcgggtacaacgcttcatcgaa-3' (XhoI) [配列番号１３]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pCDFDuet-busGDHの同じ制限酵素サイトに挿入することによって、busGDH、ppuDp共発現ベクターpCDFDuet-busGDH-ppuDp [配列番号１４]を作製する。
【０１１７】
発現ベクターpETDuet-busGDH-Fos/ppuDp-JunおよびpCDFDuet-busGDH-ppuDpを常法に従いE.coli BL21(DE3)に形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンおよびストレプトマイシンに対する耐性株として選別することができる。この形質転換体を用いて方法１により酵素を調製した。
【０１１８】
[比較例１]対照としてのbusGDHおよびppuDpの調製
Bacillus subtilis [ATCC 27370]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、約８００ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATatgtatccggatttaaaaggaaaagtcgtcgct-3' (NdeI)[配列番号１７]
5'-aataatCTCGAGaccgcggcctgcctggaatgaaggatattg-3' (XhoI)[配列番号１８]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、busGDH-His発現ベクターpET21-busGDHを作製する。
【０１１９】
次にPseudomonas putida KT2440 [ATCC 47054]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、配列番号３の合成オリゴDNA及び配列番号４の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、７２９ｂｐのDNA増幅産物を得る。
【０１２０】
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、ppuDp-His発現ベクターpET21-ppuDpを作製する。
【０１２１】
発現ベクターpET21-busGDHおよびpET21-ppuDpをそれぞれ個別に、E.coli BL21(DE3)に常法に従い形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンに対する耐性株として選別することができる。
【０１２２】
これらの形質転換体を個々に用いて方法２により酵素を調製した。
【０１２３】
（実施例２）グルコースセンサー
酵素電極の構成を図１２に模式的に示す。導電性基体２０は直径３ｍｍのグラッシーカーボンである。導電性基体２０上には、実施例１で調製したBacillus subtilis由来のグルコースデヒドロゲナーゼ（busGDH）とPseudomonas putida由来のジアフォラーゼ（ppuDp）との会合タンパク質（His-busGDH/ppuDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPoly(ethylene glycol) diglycigyl ether（PEGDE)を用いた架橋により以下の配合比で固定されている。
・His-busGDH-Fos/ppuDp-Jun（busGDH：０．３ユニット、ppuDp：０．６ユニット）
・Fc-PAA：１６μｇ
・PEGDE：１０μｇ
酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０１２４】
この酵素電極部を、図１０における作用電極４として用いる。また、試料溶液３としては、所定濃度のグルコース、および１ｍM  NADを含む０．１M  PIPES−NaOH緩衝水溶液（ｐH７．５）を用いる。作用電極４に所定の電位を印加すると、試料溶液３中のグルコースはグルコースデヒドロゲナーゼの存在下でグルコノラクトンに酸化され、この反応でＮＡＤがNADHに還元される。次に、グルコースデヒドロゲナーゼに会合したジアフォラーゼの存在下でNADHはNADに酸化され、この反応で電子伝達メディエータであるフェロセンが酸化され、フェリシニウムイオンが生成される。作用電極４には参照極６に対して所定の電位が印加されているため、フェリシニウムイオンは作用電極４から電子をうけとりフェロセンに還元される。作用電極４での電子の移動による電流を測定することにより、試料溶液中のグルコース濃度に応じた還元電流の変化を測定するを測定する。
【０１２５】
測定結果の一例を図１３に示す。図１３は、作用電極４において測定された還元電流の変化量とグルコース濃度の関係図（直線のＡ）である。
【０１２６】
（比較例２）グルコースセンサー
基体上に比較例１で調製したBacillus subtilis由来のグルコースデヒドロゲナーゼ（busGDH）、Pseudomonas putida由来のジアフォラーゼ（ppuDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）をPEGDEにより以下の配合で架橋固定する以外は実施例２と同様にして酵素電極を得る。
・busGDH：０．３ユニット
・ppuDp：０．６ユニット
・Fc-PAA：１６μｇ
・PEGDE：１０μｇ
この酵素電極部を用いて実施例２と同様にしてグルコースセンサーを構成し、作用電極４での電子の移動による電流を測定することにより、試料溶液中のグルコース濃度に応じた還元電流の変化を測定する測定する。
【０１２７】
比較例２における測定結果の一例を図１３のＢとして示すＡで示した実施例２の場合よりも比例係数は小さい値である。
【０１２８】
実施例２と比較例２から、実施例２のグルコースセンサーの方が、比較例２のグルコースセンサーよりも、グルコース濃度に対する感度が高く、より低濃度のグルコースを定量出来ることが明らかとなった。酵素電極上に固定されているグルコースデヒドロゲナーゼ及びジアフォラーゼの量は同じである。それにもかかわらず、実施例２の酵素電極においては、グルコースデヒドロゲナーゼとジアフォラーゼが会合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、NAD／NADHを介した両酵素間の電子授受が速やかに行われるためと考えられた。
【０１２９】
（実施例３）グルコース燃料電池
導電性基体として０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンを用いる以外は実施例２と同様にして酵素電極を作製する。得られた酵素電極は図１２の構成を有する。
【０１３０】
この酵素電極を、図１１のアノード電極として用いて燃料電池を作製する。電解質溶液３は、１００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭグルコース、および１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）である。アノード電極１５とカソード電極１６間に所定の電圧を印加し、電圧−電流特性を測定し、以下の結果を得た。
・短絡電流密度：９８８μＡ／ｃｍ2
・最大電力：１０１μＷ／ｃｍ2
（比較例３）グルコース燃料電池
実施例１の酵素を用いる以外は実施例３と同様にして図１４の構成の酵素電極及び図１１の構成の燃料電池を作製し、電圧−電流特性を測定し、以下の結果を得た。
・短絡電流密度：２９７μＡ／ｃｍ2
・最大電力：３２μＷ／ｃｍ2
実施例３と比較例３から、実施例３のグルコース燃料電池の方が、比較例３のグルコース燃料電池よりも、電流密度が高く、より大きな電流を取り出せることが明らかとなった。酵素電極上に固定されているグルコースデヒドロゲナーゼ及びジアフォラーゼの量は同じである。それにもかかわらず、実施例３の燃料電池においては、グルコースデヒドロゲナーゼとジアフォラーゼが会合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、NAD／NADHを介した両酵素間の電子授受が速やかに行われるためと考えられた。
【０１３１】
（実施例４）グルコース電気化学反応装置
実施例３で作製した酵素電極を用い図１０に示す電気化学反応装置を作製した。１００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭグルコース、および１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）電解液を試料溶液３として使用し、窒素雰囲気下０．３ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌの電位を１００分間印加し、生成物を高速液体クロマトグラフィーで定量する。反応電解液からは、グルコノラクトンが検出され、反応電荷量と、生成グルコノラクトン量には、高い相関関係があり、反応が定量的に進行することがわかる。
【０１３２】
（比較例４）グルコース電気化学反応装置
比較例３で作製した酵素電極を用いる以外は実施例４と同様にして、電気化学反応装置を作製し、グルコースを基質としてグルコノラクトンの生産を行った。反応電解液からは、グルコノラクトンが検出され、反応電荷量と、生成グルコノラクトン量には、高い相関関係があり、反応が定量的に進行することがわかる。しかしながら実施例４の場合よりも単位時間あたりの反応電荷量は小さい値であることがわかる。
【０１３３】
実施例４と比較例４から、実施例４のグルコース電気化学反応装置の方が、比較例４のグルコース電気化学反応装置よりも、単位時間あたりの反応電荷量が高く、より効率的にグルコースをグルコノラクトンに変換出来ることが明らかとなる。酵素電極上に固定されているグルコースデヒドロゲナーゼ及びジアフォラーゼの量は同じである。それにもかかわらず、実施例４の電気化学反応装置においては、グルコースデヒドロゲナーゼとジアフォラーゼが会合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、NAD／NADHを介した両酵素間の電子授受が速やかに行われるためと考えられた。
【０１３４】
（実施例５）Pyrococcus furiosus由来のグルコースデヒドロゲナーゼ（pfuGDH）とPyrococcus horikoshii由来のジアフォラーゼ（phoDp）との会合タンパク質（His-pfuGDH-FosおよびphoDp-Jun）[配列番号２７、２８]の調製
Pyrococcus furiosus [ATCC 43587]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、７９９ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatGGATCCGaacattttaataacagcttcttcaagagga-3' (BamHI) [配列番号１９]
5'-aataatAAGCTTaagaagaacgctcctagtcattgctccatc-3' (HindIII) [配列番号２０]
このDNA増幅産物を制限酵素BamHIおよびHind IIIで消化切断し、pETDuet-1(Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、His-pfuGDH発現ベクターpETDuet-pfuGDHを作製する。
【０１３５】
次にPyrococcus horikoshii KT2440 [ATCC 700860]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１３４４ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGaagatagtagttataggatctggaactgct-3' (NdeI) [配列番号２１]
5'-aataatCTCGAGtgacttaaattttctcatggccatttc-3' (XhoI) [配列番号２２]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pETDuet-pfuGDHの同じ制限酵素サイトに挿入することによって、His-pfuGDH、phoDp共発現ベクターpETDuet-pfuGDH-phoDpを作製する。
【０１３６】
次に、実施例１と同様にして5'末端リン酸化合成オリゴDNA（配列番号５の及び配列番号６）を用いてDNA断片を調製する。このDNA断片を、pETDuet-pfuGDH-phoDpの制限酵素Hind IIIおよびAfl IIの認識サイトに挿入する。その結果、His-pfuGDHのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳ−Fos配列[配列番号７]を融合した融合タンパク質とphoDpの共発現ベクターpETDuet-pfuGDH-Fos/phoDpを作製することができる。
【０１３７】
次に、実施例１と同様にして5'末端リン酸化合成オリゴDNA（配列番号８の及び配列番号９）を用いてDNA断片を調製する。このDNA断片を、pETDuet-pfuGDH-Fos/ppuDpの制限酵素Xho IおよびAvr IIの認識サイトに挿入する。その結果、His-pfuGDHのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳ−Fos配列[配列番号７]を融合した融合タンパク質とphoDpのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳ−Jun配列[配列番号１０]を融合した融合タンパク質発現ベクターpETDuet-pfuGDH-Fos/phoDp-Jun [配列番号２３]を作製することができる。
【０１３８】
次にPyrococcus furiosus [ATCC 43587]のゲノムDNA鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、７９７ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'- aataatCCATGGcgattttaataacagcttcttcaagaggaataggcttc-3' (Nco I) [配列番号２４]
5'-aataatAAGCTTaagaagaacgctcctagtcattgctccatc-3' (HindIII) [配列番号２０]
このDNA増幅産物を制限酵素Nco IおよびHind IIIで消化切断し、pCDFDuet-1 (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、pfuGDH発現ベクターpCDFDuet-pfuGDHを作製する。
【０１３９】
次にPyrococcus horikoshii KT2440 [ATCC 700860]のゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１３４４ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGaagatagtagttataggatctggaactgct-3' (NdeI) [配列番号２１]
5'-aataatCTCGAGtcatgacttaaattttctcatggccatttc-3' (XhoI) [配列番号２５]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pCDFDuet-pfuGDHの同じ制限酵素サイトに挿入することによって、pfuGDH、phoDp共発現ベクターpCDFDuet-pfuGDH-phoDp [配列番号２６]を作製する。
【０１４０】
発現ベクターpETDuet-pfuGDH-Fos/phoDp-JunおよびpCDFDuet-pfuGDH-phoDpを常法に従いE.coli BL21(DE3)に形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンおよびストレプトマイシンに対する耐性株として選別することができる。この形質転換体を用いて方法１により酵素を調製した。
【０１４１】
（比較例５）対照としてのpfuGDHおよびphoDpの調製
Pyrococcus furiosus [ATCC 43587]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、約８００ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATatgaacattttaataacagcttcttcaagagga-3' (NdeI)[配列番号２９]
5'-aataatCTCGAGaagaagaacgctcctagtcattgctccatc-3' (XhoI)[配列番号３０]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、pfuGDH-His発現ベクターpET21-pfuGDHを作製する。
【０１４２】
次にPyrococcus horikoshii KT2440 [ATCC 700860]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、配列番号２１の合成オリゴDNA及び配列番号２２の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１３４４ｂｐのDNA増幅産物を得る。
【０１４３】
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、phoDp-His発現ベクターpET21-phoDpを作製する。
【０１４４】
発現ベクターpET21-pfuGDHおよびpET21-phoDpをそれぞれ個別に、E.coli BL21(DE3)に常法に従い形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンに対する耐性株として選別することができる。
【０１４５】
これらの形質転換体を個々に用いて方法２により酵素を調製した。
【０１４６】
（実施例６）グルコースセンサー
実施例５で調製した酵素を用いる以外は実施例２と同様にして図１２の構成の酵素電極を作製する。この酵素電極に固定された成分の配合は以下のとおりである。
・His-pfuGDH-Fos/phoDp-Jun（pfuGDH：０．３ユニット、phoDp：０．６ユニット）
・Fc-PAA：１６μｇ
・PEGDE：１０μｇ
次に、この酵素電極を用いる以外は実施例２と同様にしてグルコースセンサーを構成し、試料溶液中のグルコース濃度に応じた還元電流を測定する。実施例６における測定結果の一例を図１３のＣ（Ａよりも傾きは大きくなる。）として示す。
【０１４７】
（比較例６）グルコースセンサー
比較例５で調製した酵素を用いる以外は実施例６と同様にして図１４の構成の酵素電極を作製する。この酵素電極に固定された成分の配合は以下のとおりである。
・pfuGDH：０．３ユニット
・phoDp：０．６ユニット
・Fc-PAA：１６μｇ
・PEGDE：１０μｇ
この酵素電極を用いる以外は実施例６と同様にして図１０の構成のグルコースセンサーを構成し、試料溶液中のグルコース濃度に応じた還元電流を測定する。
【０１４８】
比較例６における測定結果の一例を図１３のＤに示す。Ｃで示した実施例６の場合よりも比例係数は小さい値であった。実施例６と比較例６から、実施例６のグルコースセンサーの方が、比較例６のグルコースセンサーよりも、グルコース濃度に対する感度が高く、より低濃度のグルコースを定量出来ることが明らかとなった。酵素電極上に固定されているグルコースデヒドロゲナーゼ及びジアフォラーゼの量は同じである。それにもかかわらず、実施例６の酵素電極においては、グルコースデヒドロゲナーゼとジアフォラーゼが会合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、NAD／NADHを介した両酵素間の電子授受が速やかに行われるためと考えられた。
【０１４９】
（実施例７）グルコース燃料電池
実施例５で調製した酵素を用いる以外は実施例３と同様にして図１２の構成の酵素電極を作製する。この酵素電極に固定された成分の配合は以下のとおりである。
・His-pfuGDH-Fos/phoDp-Jun（pfuGDH：０．３ユニット、phoDp：０．６ユニット）
・Fc-PAA：１６μｇ
・PEGDE：１０μｇ
この酵素電極を用いる以外は実施例３と同様にして、図１０の構成の燃料電池を構成し、電圧−電流特性を測定し、以下の結果を得た。
・短絡電流密度：１３２１μＡ／ｃｍ2
・最大電力：１２６μＷ／ｃｍ2
（比較例７）グルコース燃料電池
比較例５で調製した酵素を用いる以外は実施例７と同様にして図１４の構成の酵素電極を作製する。酵素電極に固定された成分の配合は以下のとおりである。
・pfuGDH：０．３ユニット
・phoDp：０．６ユニット
・Fc-PAA：１６μｇ
・PEGDE：１０μｇ
この酵素電極を用いる以外は実施例７と同様にして燃料電池を構成し、電圧−電流特性を測定し、以下の結果を得た。
・短絡電流密度：４２３μＡ／ｃｍ2
・最大電力：４１μＷ／ｃｍ2
実施例７と比較例７から、実施例７のグルコース燃料電池の方が、比較例７のグルコース燃料電池よりも、電流密度が高く、より大きな電流を取り出せることが明らかとなった。酵素電極上に固定されているグルコースデヒドロゲナーゼ及びジアフォラーゼの量は同じである。それにもかかわらず、実施例７の燃料電池においては、グルコースデヒドロゲナーゼとジアフォラーゼが会合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、NAD／NADHを介した両酵素間の電子授受が速やかに行われるためと考えられた。
【０１５０】
（実施例８）グルコース電気化学反応装置
実施例７で作製した酵素電極を用いる以外は、実施例４と同様にして図１０に示す構成の電気化学反応装置を構成し、電気化学反応を行った。反応電解液からは、グルコノラクトンが検出され、反応電荷量と、生成グルコノラクトン量には、高い相関関係があり、反応が定量的に進行することがわかる。
【０１５１】
（比較例８）グルコース電気化学反応装置
比較例７で作製した酵素電極を用いる以外は、実施例８と同様にして図１０に示す構成の電気化学反応装置を構成し、電気化学反応を行った。反応電解液からは、グルコノラクトンが検出され、反応電荷量と、生成グルコノラクトン量には、高い相関関係があり、反応が定量的に進行することがわかる。しかしながら実施例８の場合よりも単位時間あたりの反応電荷量は小さい値であることがわかる。
【０１５２】
実施例８と比較例８から、実施例８のグルコース電気化学反応装置の方が、比較例８のグルコース電気化学反応装置よりも、単位時間あたりの反応電荷量が高く、より効率的にグルコースをグルコノラクトンに変換出来ることが明らかとなる。酵素電極上に固定されているグルコースデヒドロゲナーゼ及びジアフォラーゼの量は同じである。それにもかかわらず、実施例８の電気化学反応装置においては、グルコースデヒドロゲナーゼとジアフォラーゼが会合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、NAD／NADHを介した両酵素間の電子授受が速やかに行われるためと考えられた。
【０１５３】
（実施例９）Saccharomyces cerevisiae由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（sceADH）とPseudomonas putida由来のジアフォラーゼ（ppuDp）との会合タンパク質（His-sceADH-FosおよびppuDp-Jun）[配列番号３６、１６]の調製
Saccharomyces cerevisiae [ATCC 47058]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１０７５ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatGGATCCGccttcgcaagtcattcctgaaaaacaaaag-3' (BamHI) [配列番号３１]
5'-aataatAAGCTTtttagaagtctcaacaacatatctaccaac-3' (HindIII) [配列番号３２]
このDNA増幅産物を制限酵素BamHIおよびHind IIIで消化切断し、pETDuet-1(Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、His-sceADH発現ベクターpETDuet-sceADHを作製する。
【０１５４】
次にPseudomonas putida KT2440 [ATCC 47054]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、配列番号３の合成オリゴDNA及び配列番号４の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、７２９ｂｐのDNA増幅産物を得る。
【０１５５】
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pETDuet-sceADHの同じ制限酵素サイトに挿入することによって、His-sceADH、ppuDp共発現ベクターpETDuet-sceADH-ppuDpを作製する。
【０１５６】
次に、実施例１と同様にして5'末端リン酸化合成オリゴDNA（配列番号５の及び配列番号６）を用いてDNA断片を調製する。このDNA断片を、pETDuet-sceADH-ppuDpの制限酵素Hind IIIおよびAfl IIの認識サイトに挿入する。その結果、His-sceADHのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳ−Fos配列[配列番号７]を融合した融合タンパク質とppuDp共発現ベクターpETDuet-sceADH-Fos/ppuDpを作製することができる。
【０１５７】
次に、実施例１と同様にして、5'末端リン酸化合成オリゴDNA（配列番号８および配列番号９）からDNA断片を調製する。このDNA断片を、pETDuet-sceADH-Fos/ppuDpの制限酵素Xho IおよびAvr IIの認識サイトに挿入する。その結果、His-sceADHのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳ−Fos配列[配列番号７]を融合した融合タンパク質とppuDpのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳ−Jun配列[配列番号１０]を融合した融合タンパク質発現ベクターpETDuet-busGDH-Fos/ppuDp-Jun [配列番号３３]を作製することができる。
【０１５８】
次にSaccharomyces cerevisiae [ATCC 47058]のゲノムDNA鋳型にして、合成オリゴDNA：
5'- aataatCCATGGcgtcgcaagtcattcctgaaaaacaaaaggct-3' (Nco I) [配列番号３４]、および
5'-aataatAAGCTTtttagaagtctcaacaacatatctaccaac-3' (HindIII) [配列番号３２]
をプライマーとして用いてPCRを行い、１０７３ｂｐのDNA増幅産物を得る。
このDNA増幅産物を制限酵素Nco IおよびHind IIIで消化切断し、pCDFDuet-1 (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、sceADH発現ベクターpCDFDuet-sceADHを作製する。
【０１５９】
次にPseudomonas putida KT2440 [ATCC 47054]のゲノムDNAを鋳型にして、配列番号３の合成オリゴDNA及び配列番号１３の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、７２９ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pCDFDuet-sceADHの同じ制限酵素サイトに挿入することによって、sceADH、ppuDp共発現ベクターpCDFDuet-sceADH-ppuDp [配列番号３５]を作製する。
【０１６０】
発現ベクターpETDuet-sceADH-Fos/ppuDp-JunおよびpCDFDuet-sceADH-ppuDpを常法に従いE.coli BL21(DE3)に形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンおよびストレプトマイシンに対する耐性株として選別することができる。この形質転換体を用いて方法１により酵素を調製した。
【０１６１】
[比較例９]対照としてのsceADHおよびppuDpの調製
Saccharomyces cerevisiae [ATCC 47058]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA：
5'-aataatCATatgccttcgcaagtcattcctgaaaaacaaaag-3' (NdeI)[配列番号３７]および
5'-aataatCTCGAGtttagaagtctcaacaacatatctaccaac-3' (XhoI)[配列番号３８]
をプライマーとして用いてPCRを行い、約１０７４ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、sceADH-His発現ベクターpET21-sceADHを作製する。
【０１６２】
次に、Pseudomonas putida KT2440 [ATCC 47054]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、配列番号３の合成オリゴDNAおよび配列番号４の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、７２９ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、ppuDp-His発現ベクターpET21-ppuDpを作製する。
【０１６３】
発現ベクターpET21-sceADHおよびpET21-ppuDpをそれぞれ個別に、E.coli BL21(DE3)に常法に従い形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンに対する耐性株として選別することができる。
【０１６４】
これらの形質転換体を個々に用いて方法２により酵素を調製した。
【０１６５】
（実施例１０）アルコールセンサー
導電性基体２０は直径３ｍｍのグラッシーカーボンであり、導電性基体２０上に実施例９で調製したSaccharomyces cerevisiae由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（sceADH）とPseudomonas putida由来のジアフォラーゼ（ppuDp）との会合タンパク質（His-sceADH-Fos/ppuDp-Jun）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPoly(ethylene glycol) diglycigyl ether(PEGDE)により架橋されて固定されている。酵素電極に固定された成分の配合は以下のとおりである。
・His-sceADH-Fos/ppuDp-Jun（sceADH：０．３ユニット、ppuDp：０．６ユニット）
・Fc-PAA：１６μｇ
・PEGDE：１０μｇ
この酵素電極を、図１０における作用電極４として用いることによってアルコールセンサーを構成する。試料溶液３としては、所定濃度のアルコール（エタノール）、および１ｍM  NADを含む０．１M  PIPES−NaOH緩衝水溶液（ｐH７．５）を用いる。作用電極４には参照極６に対して３００ｍVの電位を印加する。このとき、試料溶液３中のアルコールはアルコールデヒドロゲナーゼの存在下でアセトアルデヒドに酸化され、この反応でＮＡＤがNADHに還元される。次にアルコールデヒドロゲナーゼに会合したジアフォラーゼの存在下でNADHはNADに酸化され、この反応で電子伝達メディエータであるフェロセンが酸化され、フェリシニウムイオンが生成される。作用電極４には参照極６に対して３００ｍVの電位が印加されているため、フェリシニウムイオンは作用電極４から電子をうけとりフェロセンに還元される。作用電極４での電子の移動による電流を測定することにより、試料溶液中のアルコール濃度に応じた還元電流を測定する。
【０１６６】
[比較例１０]アルコールセンサー
比較例９で調製した酵素を用いた以外は、実施例１０と同様にして酵素電極を作製し、更に、図１０に示す構成のセンサーを作製する。酵素電極の各成分の配合は以下のとおりである。
・sceADH：０．３ユニット
・ppuDp：０．６ユニット
・Fc-PAA：１６μｇ
・PEGDE：１０μｇ
このセンサーを用いて実施例１０と同様にしてエタノールに応じた還元電流の変化を測定する。実施例１０と比較例１０における測定結果の相違は、図１０のＡとＢの相違に類似する。
【０１６７】
実施例１０と比較例１０から、実施例１０のアルコールセンサーの方が、比較例１０のアルコールセンサーよりも、アルコール濃度に対する感度が高く、より低濃度のアルコールを定量出来ることが明らかとなった。酵素電極上に固定されているアルコールデヒドロゲナーゼ及びジアフォラーゼの量は同じであるにもかかわらず、実施例１０の酵素電極においては、アルコールデヒドロゲナーゼとジアフォラーゼが会合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、NAD／NADHを介した両酵素間の電子授受が速やかに行われるためと考えられた。
【０１６８】
（実施例１１）アルコール燃料電池
導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンであり、導電性基体２０上に実施例９で調製したSaccharomyces cerevisiae由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（sceADH）とPseudomonas putida由来のジアフォラーゼ（ppuDp）との会合タンパク質（His-sceADH-Fos::ppuDp-Jun）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPoly(ethylene glycol) diglycigyl ether(PEGDE)により架橋されて固定されている。この酵素電極に固定された成分の配合は以下のとおりである。
・His-sceADH::ppuDp（sceADH：０．３ユニット、ppuDp：０．６ユニット）
・Fc-PAA：１６μｇ
・PEGDE：１０μｇ
この酵素電極を図１１のアノード電極として用いて燃料電池を作製する。電解質溶液３は、１００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭアルコール（エタノール）、および１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）である。アノード電極１５とカソード電極１６間に所定の電圧を印加し、電圧−電流特性を測定し、以下の結果を得た。
短絡電流密度：８２１μＡ／ｃｍ2
最大電力：８０μＷ／ｃｍ2
[比較例１１]アルコール燃料電池
比較例９で調製した酵素を用いる以外は実施例１１と同様にして酵素電極を作製する。酵素電極に固定した成分の配合は以下のとおりである。
・sceADH：０．３ユニット
・ppuDp：０．６ユニット
・Fc-PAA：１６μｇ
・PEGDE：１０μｇ
この酵素電極を用いる以外は実施例１１と同様にして図１１に示す構成の燃料電池を作製し、電圧−電流特性を測定し、以下の結果を得た。
・短絡電流密度：２４６μＡ／ｃｍ2
・最大電力：２５μＷ／ｃｍ2
実施例１１と比較例１１から、実施例１１のアルコール燃料電池の方が、比較例１１のアルコール燃料電池よりも、電流密度が高く、より大きな電流を取り出せることが明らかとなった。酵素電極上に固定されているアルコールデヒドロゲナーゼ及びジアフォラーゼの量は同じであるにもかかわらず、実施例１１の燃料電池においては、アルコールデヒドロゲナーゼとジアフォラーゼが会合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、NAD／NADHを介した両酵素間の電子授受が速やかに行われるためと考えられた。
【０１６９】
（実施例１２）アルコール電気化学反応装置
実施例１１で作製した酵素電極を用い、図１０ｎ構成の電気化学反応装置を作製する。１００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭアルコール、および１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）電解液を試料溶液３として使用し、所定の条件で電位を印加し、生成物を液体高速クロマトグラフィーで定量する。反応電解液からは、反応電解液からは、アセトアルデヒドが検出され、反応電荷量と、生成アセトアルデヒド量には、高い相関関係があり、反応が定量的に進行することがわかる。
【０１７０】
[比較例１２]アルコール電気化学反応装置
比較例１１で作製した酵素電極を用いる以外は、実施例１２と同様にして図１０に示す構成の電気化学反応装置を構成し、電気化学反応を行った。反応電解液からは、アセトアルデヒドが検出され、反応電荷量と、生成アセトアルデヒド量には、高い相関関係があり、反応が定量的に進行することがわかる。しかしながら実施例１２の場合よりも単位時間あたりの反応電荷量は小さい値であることがわかる。
【０１７１】
実施例１２と比較例１２から、実施例１２のアルコール電気化学反応装置の方が、比較例１２のアルコール電気化学反応装置よりも、単位時間あたりの反応電荷量が高く、より効率的にアルコールをアセトアルデヒドに変換出来ることが明らかとなる。酵素電極上に固定されているアルコールデヒドロゲナーゼ及びジアフォラーゼの量は同じであるにもかかわらず、実施例１２の電気化学反応装置においては、アルコールデヒドロゲナーゼとジアフォラーゼが会合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、NAD／NADHを介した両酵素間の電子授受が速やかに行われるためと考えられた。
【０１７２】
（実施例１３）Pyrococcus furiosus由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（pfuADH）とPyrococcus horikoshii由来のジアフォラーゼ（phoDp）との会合タンパク質（His-pfuADH-Fos/phoDp-Jun）[配列番号４４、２８]の調製
Pyrococcus furiosus [ATCC 43587]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA：
5'-aataatGGATCCGtttttcctaaagactaagattatcgaggga-3' (BamHI) [配列番号３９]、および
5'-aataatAAGCTTatctccatagaaggccctctcataaattct-3' (HindIII) [配列番号４０]
をプライマーとして用いてPCRを行い、１１４７ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素BamHIおよびHind IIIで消化切断し、pETDuet-1(Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、His-pfuADH発現ベクターpETDuet-pfuADHを作製する。
【０１７３】
次にPyrococcus horikoshii KT2440 [ATCC 700860]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、配列番号２１の合成オリゴDNAおよび配列番号２２の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１３４４ｂｐのDNA増幅産物を得る。
【０１７４】
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pETDuet-pfuADHの同じ制限酵素サイトに挿入することによって、His-pfuADH、phoDp共発現ベクターpETDuet-pfuADH-phoDpを作製する。
【０１７５】
次に、実施例１と同様にして、5'末端リン酸化合成オリゴDNA（配列番号５および配列番号６）を用いてDNA断片（二本鎖）を調製する。このDNA断片を、pETDuet-pfuADH-phoDpの制限酵素Hind IIIおよびAfl IIの認識サイトに挿入する。その結果、His-pfuADHのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳ−Fos配列[配列番号７]を融合した融合タンパク質とphoDpの共発現ベクターpETDuet-pfuADH-Fos/phoDpを作製することができる。
【０１７６】
次に、実施例１と同様にして5'末端リン酸化合成オリゴDNA（配列番号８および配列番号９）からDNA断片（二本鎖）を調製する。このDNA断片を、pETDuet-pfuADH-Fos/ppuDpの制限酵素Xho IおよびAvr IIの認識サイトに挿入する。その結果、His-pfuADHのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳ−Fos配列[配列番号７]を融合した融合タンパク質とphoDpのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳ−Jun配列[配列番号１０]を融合した融合タンパク質発現ベクターpETDuet-pfuADH-Fos/phoDp-Jun [配列番号４１]を作製することができる。
【０１７７】
次にPyrococcus furiosus [ATCC 43587]のゲノムDNA鋳型にして、合成オリゴDNA：
5'- aataatCCATGGcgttcctaaagactaagattatcgagggaagg-3' (Nco I) [配列番号４２]、および
5'-aataatAAGCTTatctccatagaaggccctctcataaattct-3' (HindIII) [配列番号４０]
をプライマーとして用いてPCRを行い、１１４５ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nco IおよびHind IIIで消化切断し、pCDFDuet-1 (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、pfuADH発現ベクターpCDFDuet-pfuADHを作製する。
【０１７８】
次にPyrococcus horikoshii KT2440 [ATCC 700860]のゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA配列番号２１および配列番号２５をプライマーとして用いてPCRを行い、１３４４ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pCDFDuet-pfuADHの同じ制限酵素サイトに挿入することによって、pfuADH、phoDp共発現ベクターpCDFDuet-pfuADH-phoDp [配列番号４３]を作製する。
【０１７９】
発現ベクターpETDuet-pfuADH::phoDpおよびpCDFDuet-pfuADH-phoDpを常法に従いE.coli BL21(DE3)に形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンおよびストレプトマイシンに対する耐性株として選別することができる。この形質転換体を用いて方法１により酵素を調製した。こうして得られる好熱菌由来の酵素を用いて、酵素電極等を構成することができる。
【０１８０】
（実施例１７）Lactobacillus plantarum由来の乳酸デヒドロゲナーゼ（lplLDH）とGluconobacter oxydans由来のジアフォラーゼ（goxDp）との会合タンパク質（His-lplLDH-Dzip1およびgoxDp-Dzip2）[配列番号６１、６２]の調製
Lactobacillus plantarum [ATCC 10241]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA：
5'-aataatGGATCCGtcaagcatgccaaatcatcaaaaagttgtg-3' (BamHI) [配列番号４７]、および
5'-aataatAAGCTTtttattttctaattcagctaaaccgtcgtt-3' (HindIII) [配列番号４８]
をプライマーとして用いてPCRを行い、９８２ｂｐのDNA増幅産物を得る。
このDNA増幅産物を制限酵素BamHIおよびHind IIIで消化切断し、pETDuet-1(Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、His-lplLDH発現ベクターpETDuet-lplLDHを作製する。
【０１８１】
次にGluconobacter oxydans [ATCC 621H]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA配列番号４９および配列番号５０をプライマーとして用いてPCRを行い、１４２８ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pETDuet-lplLDHの同じ制限酵素サイトに挿入することによって、His-lplLDH、goxDp共発現ベクターpETDuet-lplLDH-goxDpを作製する。
【０１８２】
次に5'末端リン酸化合成オリゴDNA：
5'-AGCTTggcggcggcagcggcggcggcagcggcggcggcagcaccgtggcgcagctggaagaaaaagtgaaaaccctgcgtgcgcagaactatgaactgaaaagccgtgtgcagcgtctgcgtgaacaggtggcgcagctggcgtaaC -3' [配列番号５１]、および
5'-TTAAGttacgccagctgcgccacctgttcacgcagacgctgcacacggcttttcagttcatagttctgcgcacgcagggttttcactttttcttccagctgcgccacggtgctgccgccgccgctgccgccgccgctgccgccgccA -3' [配列番号５２]
をTEバッファー中で、等量混合し、加熱後徐冷することによってアニーリングする。このDNA断片を、pETDuet-lplLDH-goxDpの制限酵素Hind IIIおよびAfl IIの認識サイトに挿入することによって、His-lplLDHのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip1配列[配列番号５３]を融合した融合タンパク質とgoxDpの共発現ベクターpETDuet-lplLDH-Dzip1/goxDpを作製する。
【０１８３】
次に5'末端リン酸化合成オリゴDNA：
5'-TCGAGggcggcggcagcggcggcggcagcggcggcggcagcagcgtggatgaactgcaggcggaagtggatcagctgcaggatgaaaactatgcgctgaaaaccaaagtggcgcagctgcgtaaaaaagtggaaaaactgtaaC-3' [配列番号５４]、および
5'-CTAGGttacagtttttccacttttttacgcagctgcgccactttggttttcagcgcatagttttcatcctgcagctgatccacttccgcctgcagttcatccacgctgctgccgccgccgctgccgccgccgctgccgccgccC-3' [配列番号５５]
をTEバッファー中で、等量混合し、加熱後徐冷することによってアニーリングする。
このDNA断片を、pETDuet-lplLDH-goxDpの制限酵素Xho IおよびAvr IIの認識サイトに挿入することによって、His-lplLDHのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip1配列[配列番号５３]を融合した融合タンパク質とgoxDpのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip2配列[配列番号５６]を融合した融合タンパク質の共発現ベクターpETDuet-lplLDH-Dzip1/goxDp-Dzip2[配列番号５７]を作製する。
【０１８４】
次にLactobacillus plantarum [ATCC 10241]のゲノムDNA鋳型にして、合成オリゴDNA：
5'- aataatCCATGGcgagcatgccaaatcatcaaaaagttgtgtta-3' (Nco I) [配列番号５８]、および
5'-aataatAAGCTTtttattttctaattcagctaaaccgtcgtt-3' (HindIII) [配列番号４８]
をプライマーとして用いてPCRを行い、９８０ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nco IおよびHind IIIで消化切断し、pCDFDuet-1 (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、lplLDH発現ベクターpCDFDuet-lplLDHを作製する。
【０１８５】
次にGluconobacter oxydans  [ATCC 621H]のゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA：
5'-aataatCATATGtgcgatacgttcgatctgattgttgttggt-3' (NdeI) [配列番号４９]、および
5'-aataatCTCGAGtcagatatgcagcgggccgtcgaaggccgc-3' (XhoI) [配列番号５９]
をプライマーとして用いてPCRを行い、１４２８ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pCDFDuet-lplLDHの同じ制限酵素サイトに挿入することによって、lplLDH、goxDp共発現ベクターpCDFDuet-lplLDH-goxDp [配列番号６０]を作製する。
【０１８６】
発現ベクターpETDuet-lplLDH-Dzip1/goxDp-Dzip2およびpCDFDuet-lplLDH-goxDpを常法に従いE.coli BL21(DE3)に形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンおよびストレプトマイシンに対する耐性株として選別することができる。この形質転換体を用いて方法１により酵素を調製した。
【０１８７】
[比較例１７]対照としてのlplLDHおよびgoxDpの調製
Lactobacillus plantarum [ATCC 10241]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA：
5'-aataatCATatgtcaagcatgccaaatcatcaaaaagttgtg-3' (NdeI)[配列番号６３]および
5'-aataatCTCGAGtttattttctaattcagctaaaccgtcgtt-3' (XhoI)[配列番号６４]
をプライマーとして用いてPCRを行い、約９８０ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、lplLDH-His発現ベクターpET21-lplLDHを作製する。
【０１８８】
次にGluconobacter oxydans  [ATCC 621H]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA：
5'-aataatCATATGtgcgatacgttcgatctgattgttgttggt-3' (NdeI) [配列番号４９]、および
5'-aataatCTCGAGgatatgcagcgggccgtcgaaggccgccag-3' (XhoI) [配列番号５０]
をプライマーとして用いてPCRを行い、約１４２８ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、goxDp-His発現ベクターpET21-goxDpを作製する。
【０１８９】
発現ベクターpET21-lplLDHおよびpET21-goxDpをそれぞれ個別に、E.coli BL21(DE3)に常法に従い形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンに対する耐性株として選別することができる。
【０１９０】
これらの形質転換体を個々に用いて方法２により酵素を調製した。
【０１９１】
（実施例１８）乳酸センサー
導電性基体２０は直径３ｍｍのグラッシーカーボンである。導電性基体２０上に実施例１７で調製したLactobacillus plantarum由来の乳酸デヒドロゲナーゼ（lplLDH）とGluconobacter oxydans由来のジアフォラーゼ（goxDp）との会合タンパク質（His-lplLDH-Dzip1/goxDp-Dzip2）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPoly(ethylene glycol) diglycigyl ether(PEGDE)により架橋されて固定されている。この酵素電極に固定された成分の配合は以下のとおりである。
・His-lplLDH-Dzip1/goxDp-Dzip2（lplLDH：０．３ユニット、goxDp：０．６ユニット）
・Fc-PAA：１６μｇ
・PEGDE：１０μｇ
この酵素電極を、図１０における作用電極４として用いることによって乳酸センサーを構成する。試料溶液３としては、所定濃度の乳酸（L‐乳酸）、および１ｍM  NADを含む０．１M  PIPES−NaOH緩衝水溶液（ｐH７．５）を用いる。作用電極４には参照極６に対して３００ｍVの電位を印加する。このとき、試料溶液３中の乳酸は乳酸デヒドロゲナーゼの存在下でピルビン酸に酸化され、この反応でＮＡＤがNADHに還元される。次に前記乳酸デヒドロゲナーゼに会合したジアフォラーゼの存在下でNADHはNADに酸化され、この反応で電子伝達メディエータであるフェロセンが酸化され、フェリシニウムイオンが生成される。作用電極４には参照極６に対して３００ｍVの電位が印加されているため、フェリシニウムイオンは作用電極４から電子をうけとりフェロセンに還元される。作用電極４での電子の移動による電流を測定することにより、試料溶液中の乳酸濃度に応じた還元電流を測定する。
【０１９２】
[比較例１８] 乳酸センサー
比較例１７で調製した酵素を用いる以外は実施例１８と同様にして図２６の構成の酵素電極を作製する。酵素電極に固定された成分の配合は以下のとおりである。
・lplLDH：０．３ユニット
・goxDp：０．６ユニット
・Fc-PAA：１６μｇ
・PEGDE：１０μｇ
この酵素電極を、図１０における作用電極４として用いることによって乳酸センサーを構成し、実施例１８と同様にして乳酸濃度に応じた還元電流の変化を測定する。
【０１９３】
実施例１８と比較例１８における測定結果の相違は、図１３のＡとＢの相違に類似する。
【０１９４】
（実施例１９）乳酸燃料電池
導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンである。導電性基体２０上に実施例１７で調製したLactobacillus plantarum由来の乳酸デヒドロゲナーゼ（lplLDH）とGluconobacter oxydans由来のジアフォラーゼ（goxDp）との会合タンパク質（His-lplLDH-Dzip1/goxDp-Dzip2）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPoly(ethylene glycol) diglycigyl ether(PEGDE)により架橋されて固定されている。この酵素電極に固定された成分の配合は以下のとおりである。
・His-lplLDH-Dzip1/goxDp-Dzip2（lplLDH：０．３ユニット、goxDp：０．６ユニット）
・Fc-PAA：１６μｇ
・PEGDE：１０μｇ
この酵素電極を図１１のアノード電極として用いて燃料電池を作製する。電解質溶液３は、１００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ乳酸（L‐乳酸）、および１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）である。アノード電極１５とカソード電極１６の間に所定の電圧を印加し、電圧−電流特性を測定し、以下の結果を得た。
・短絡電流密度：１３３１μＡ／ｃｍ2
・最大電力：１２１μＷ／ｃｍ2
[比較例１９]乳酸燃料電池
比較例１７で調製した酵素を用いる以外は実施例１９と同様にして図２６に示す構成の酵素電極を作製した。この酵素電極に固定された成分の配合は以下のとおりである。
・lplLDH：０．３ユニット
・goxDp：０．６ユニット
・Fc-PAA：１６μｇ
・PEGDE：１０μｇ
この酵素電極を用いる以外は実施例１９と同様にして図１１に示す構成の燃料電池を作製し、電圧−電流特性を測定し、以下の結果を得た。
・短絡電流密度：３９７μＡ／ｃｍ2
・最大電力：３８μＷ／ｃｍ2
実施例１９と比較例１９から、実施例１９の乳酸燃料電池の方が、比較例１９の乳酸燃料電池よりも、電流密度が高く、より大きな電流を取り出せることが明らかとなった。酵素電極上に固定されている乳酸デヒドロゲナーゼ及びジアフォラーゼの量は同じであるにもかかわらず、実施例１９の燃料電池においては、乳酸デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼが会合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、NAD／NADHを介した両酵素間の電子授受が速やかに行われるためと考えられた。
【０１９５】
（実施例２０）乳酸電気化学反応装置
実施例１９で作製した酵素電極を用い図１０に示す電気化学反応装置を作製する。１００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ乳酸（L‐乳酸）、および１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）電解液を試料溶液３として使用し、窒素雰囲気下０．３ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌの電位を１００分間印加し、生成物を高速液体クロマトグラフィーで定量する。反応電解液からは、ピルビン酸が検出され、反応電荷量と、生成ピルビン酸量には、高い相関関係があり、反応が定量的に進行することがわかる。
【０１９６】
[比較例２０] 乳酸電気化学反応装置
比較例１９で作製した酵素電極を用いる以外は実施例２０と同様にして図１０に示す電気化学反応装置を作製し、電気化学反応を行なう。反応電解液からは、ピルビン酸が検出され、反応電荷量と、生成ピルビン酸量には、高い相関関係があり、反応が定量的に進行することがわかる。しかしながら実施例２０の場合よりも単位時間あたりの反応電荷量は小さい値であることがわかる。
【０１９７】
実施例２０と比較例２０から、実施例２０の乳酸電気化学反応装置の方が、比較例２０の乳酸電気化学反応装置よりも、単位時間あたりの反応電荷量が高く、より効率的に乳酸をピルビン酸に変換出来ることが明らかとなる。酵素電極上に固定されている乳酸デヒドロゲナーゼ及びジアフォラーゼの量は同じであるにもかかわらず、実施例２０の電気化学反応装置においては、乳酸デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼが会合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、NAD／NADHを介した両酵素間の電子授受が速やかに行われるためと考えられた。
【０１９８】
（実施例２１）Thermotoga maritima由来の乳酸デヒドロゲナーゼ（tmaLDH）とThermotoga maritima由来のジアフォラーゼ（tmaDp）との会合タンパク質（His-tmaLDH-Dzip1およびtmaDp-Dzip2）[配列番号７３、７４]の調製
Thermotoga maritima [ATCC 43589]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA：
5'-aataatGGATCCGaaaataggtatcgtaggactcggaagggtt-3' (BamHI) [配列番号６５]、および
5'-aataatAAGCTTaccgctggtgttctggtgcttgttctcttc-3' (HindIII) [配列番号６６]
をプライマーとして用いてPCRを行い、９７９ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素BamHIおよびHind IIIで消化切断し、pETDuet-1(Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、His-tmaLDH発現ベクターpETDuet-tmaLDHを作製する。
【０１９９】
次にThermotoga maritima [ATCC 43589]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA：
5'-aataatCATATGtacgatgctgtgatcataggaggaggaccc-3' (NdeI) [配列番号６７]、および
5'-aataatCTCGAGcagatgaatgggttttcctgagaccccttc-3' (XhoI) [配列番号６８]
をプライマーとして用いてPCRを行い、１３７１ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pETDuet-tmaLDHの同じ制限酵素サイトに挿入することによって、His-tmaLDH、tmaDp共発現ベクターpETDuet-tmaLDH-tmaDpを作製する。
【０２００】
次に、実施例１５と同様にして配列番号５１および配列番号５２からDNA断片（二本鎖）を得る。このDNA断片を、pETDuet-tmaLDH-tmaDpの制限酵素Hind IIIおよびAfl IIの認識サイトに挿入する。その結果、His-tmaLDHのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip1配列[配列番号５３]を融合した融合タンパク質とtmaDpの共発現ベクターpETDuet-tmaLDH-Dzip1/tmaDpを作製することができる。
【０２０１】
次に、実施例１７と同様にして5'末端リン酸化合成オリゴDNA配列番号５４および配列番号５５からDNA断片（二本鎖）を得る。このDNA断片を、pETDuet-tmaLDH-Dzip1/tmaDpの制限酵素Xho IおよびAvr IIの認識サイトに挿入する。その結果、His-tmaLDHのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip1配列[配列番号５３]を融合した融合タンパク質とtmaDpのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip2配列[配列番号５６]を融合した融合タンパク質の共発現ベクターpETDuet-tmaLDH-Dzip1/tmaDp-Dzip2[配列番号６９]を作製することができる。
【０２０２】
次にThermotoga maritima [ATCC 43589]のゲノムDNA鋳型にして、合成オリゴDNA：
5'- aataatCCATGGcgataggtatcgtaggactcggaagggttggt-3' (Nco I) [配列番号７０]、および
5'-aataatAAGCTTatctccatagaaggccctctcataaattct-3' (HindIII) [配列番号６６]
をプライマーとして用いてPCRを行い、９７７ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nco IおよびHind IIIで消化切断し、pCDFDuet-1 (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、tmaLDH発現ベクターpCDFDuet-tmaLDHを作製する。
【０２０３】
次にThermotoga maritima  [ATCC 43589]のゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA：
5'-aataatCATATGtacgatgctgtgatcataggaggaggaccc-3' (NdeI) [配列番号６７]、および
5'-aataatCTCGAGtcacagatgaatgggttttcctgagacccc-3' (XhoI) [配列番号７１]
をプライマーとして用いてPCRを行い、１３７１ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pCDFDuet-tmaLDHの同じ制限酵素サイトに挿入することによって、tmaLDH、tmaDp共発現ベクターpCDFDuet-tmaLDH-tmaDp [配列番号７２]を作製する。
【０２０４】
発現ベクターpETDuet-tmaLDH-Dzip1/tmaDp-Dzip2およびpCDFDuet-tmaLDH-tmaDpを常法に従いE.coli BL21(DE3)に形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンおよびストレプトマイシンに対する耐性株として選別することができる。この形質転換体を用いて方法１により酵素を調製した。こうして得られる好熱菌由来の酵素を用いて、酵素電極等を構成することができる。
【０２０５】
（実施例２５）Pseudomonas putida由来のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ppuMDH）とGluconobacter oxydans由来のジアフォラーゼ（goxDp）との会合タンパク質（His-ppuMDH-Dzip1およびgoxDp-Dzip2）[配列番号８２、６２]の調製
Pseudomonas putida [ATCC 47054]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA：
5'-aataatGGATCCGtcagacctgaaaaccgccgctctcgaatat-3' (BamHI) [配列番号７７]、および
5'-aataatAAGCTTgccgttgaacacttcatccacgctggtcag-3' (HindIII) [配列番号７８]
をプライマーとして用いてPCRを行い、１２８８ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素BamHIおよびHind IIIで消化切断し、pETDuet-1(Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、His-ppuMDH発現ベクターpETDuet-ppuMDHを作製する。
【０２０６】
次にGluconobacter oxydans [ATCC 621H]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA（配列番号４９および配列番号５０）をプライマーとして用いてPCRを行い、１４２８ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pETDuet-ppuMDHの同じ制限酵素サイトに挿入することによって、His-ppuMDH、goxDp共発現ベクターpETDuet-ppuMDH-goxDpを作製する。
【０２０７】
次に、実施例１７と同様にして5'末端リン酸化合成オリゴDNA（配列番号５１および配列番号５２）からDNA断片（二本鎖）を得る。このDNA断片を、pETDuet-ppuMDH-goxDpの制限酵素Hind IIIおよびAfl IIの認識サイトに挿入する。その結果、His-ppuMDHのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip1配列[配列番号５３]を融合した融合タンパク質とgoxDpの共発現ベクターpETDuet-ppuMDH-Dzip1/goxDpを作製することができる。
【０２０８】
次に、実施例１７と同様にして5'末端リン酸化合成オリゴDNA（配列番号５４および配列番号５５）からDNA断片（二本鎖）を得る。このDNA断片を、pETDuet-ppuMDH-Dzip1/goxDpの制限酵素Xho IおよびAvr IIの認識サイトに挿入する。その結果、His-ppuMDHのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip1配列[配列番号５３]を融合した融合タンパク質とgoxDpのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip2配列[配列番号５６]を融合した融合タンパク質の共発現ベクターpETDuet-ppuMDH-Dzip1/goxDp-Dzip2[配列番号７９]を作製する。
【０２０９】
次にPseudomonas putida [ATCC 47054]のゲノムDNA鋳型にして、合成オリゴDNA：
5'- aataatCCATGGcggacctgaaaaccgccgctctcgaatatcac-3' (Nco I) [配列番号８０]、および
5'-aataatAAGCTTgccgttgaacacttcatccacgctggtcag-3' (HindIII) [配列番号７８]
をプライマーとして用いてPCRを行い、１２８６ｂｐのDNA増幅産物を得る。
このDNA増幅産物を制限酵素Nco IおよびHind IIIで消化切断し、pCDFDuet-1 (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、ppuMDH発現ベクターpCDFDuet-ppuMDHを作製する。
【０２１０】
次にGluconobacter oxydans  [ATCC 621H]のゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA（配列番号４９および配列番号５９）をプライマーとして用いてPCRを行い、１４２８ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pCDFDuet-ppuMDHの同じ制限酵素サイトに挿入することによって、ppuMDH、goxDp共発現ベクターpCDFDuet-ppuMDH-goxDp [配列番号８１]を作製する。
【０２１１】
発現ベクターpETDuet-ppuMDH-Dzip1/goxDp-Dzip2およびpCDFDuet-ppuMDH-goxDpを常法に従いE.coli BL21(DE3)に形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンおよびストレプトマイシンに対する耐性株として選別することができる。この形質転換体を用いて方法１により酵素を調製した。
【０２１２】
[比較例２５]対照としてのppuMDHおよびgoxDpの調製
Pseudomonas putida [ATCC 47054]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA：
5'-aataatCATatgtcagacctgaaaaccgccgctctcgaatat-3' (NdeI)[配列番号８３]および
5'-aataatCTCGAGgccgttgaacacttcatccacgctggtcag-3' (XhoI)[配列番号８４]
をプライマーとして用いてPCRを行い、約１２９０ｂｐのDNA増幅産物を得る。
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、ppuMDH-His発現ベクターpET21-ppuMDHを作製する。
【０２１３】
次にGluconobacter oxydans  [ATCC 621H]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA（配列番号４９および配列番号５０）をプライマーとして用いてPCRを行い、約１４２０ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、goxDp-His発現ベクターpET21-goxDpを作製する。
【０２１４】
発現ベクターpET21-ppuMDHおよびpET21-goxDpをそれぞれ個別に、E.coli BL21(DE3)に常法に従い形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンに対する耐性株として選別することができる。
【０２１５】
これらの形質転換体を個々に用いて方法２により酵素を調製した。
【０２１６】
（実施例２６）リンゴ酸センサー
酵素電極の構成を図３０に示す。導電性基体２０は直径３ｍｍのグラッシーカーボンである。導電性基体２０上に実施例２５で調製したPseudomonas putida由来のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ppuMDH）とGluconobacter oxydans由来のジアフォラーゼ（goxDp）との会合タンパク質（His-ppuMDH-Dzip1/goxDp-Dzip2）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPoly(ethylene glycol) diglycigyl ether(PEGDE)により架橋されて固定されている。この酵素電極に固定された成分の配合は以下のとおりである。
・His-ppuMDH-Dzip1/goxDp-Dzip2（ppuMDH：０．３ユニット、goxDp：０．６ユニット）
・Fc-PAA：１６μｇ
・PEGDE：１０μｇ
この酵素電極を、図１０における作用電極４として用いることによってリンゴ酸センサーを構成する。試料溶液３としては、所定濃度のリンゴ酸、および１ｍM  NADを含む０．１M  PIPES−NaOH緩衝水溶液（ｐH７．５）を用いる。作用電極４には参照極６に対して３００ｍVの電位を印加する。このとき、試料溶液３中のリンゴ酸はリンゴ酸デヒドロゲナーゼの存在下でピルビン酸に酸化され、この反応でＮＡＤがNADHに還元される。次に前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼに会合したジアフォラーゼの存在下でNADHはNADに酸化され、この反応で電子伝達メディエータであるフェロセンが酸化され、フェリシニウムイオンが生成される。（作用電極４には参照極６に対して３００ｍVの電位が印加されているため、）フェリシニウムイオンは作用電極４から電子をうけとりフェロセンに還元される。作用電極４での電子の移動による電流を測定することにより、試料溶液中のリンゴ酸濃度に応じた還元電流を測定する。
【０２１７】
[比較例２６]リンゴ酸センサー
比較例２５で調製した酵素を用いる以外は実施例２６と同様にして図３２の構成の酵素電極を作製する。この酵素電極に固定された成分の配合は以下のとおりである。
・ppuMDH：０．３ユニット
・goxDp：０．６ユニット
・Fc-PAA：１６μｇ
・PEGDE：１０μｇ
この酵素電極を、図１０における作用電極４として用いることによってリンゴ酸センサーを構成し、実施例２６と同様にして試料溶液中のリンゴ酸濃度に応じた還元電流の変化を測定する。実施例２６と比較例２６における相違は、図１３のＡとＢの相違に類似する。
【０２１８】
（実施例２７）リンゴ酸燃料電池
図３０に酵素電極の構成を示す。導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンである。導電性基体２０上に実施例２５で調製したPseudomonas putida由来のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ppuMDH）とGluconobacter oxydans由来のジアフォラーゼ（goxDp）との会合タンパク質（His-ppuMDH-Dzip1/goxDp-Dzip2）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPoly(ethylene glycol) diglycigyl ether(PEGDE)により架橋されて固定されている。この酵素電極に固定された成分の配合は以下のとおりである。
・His-ppuMDH-Dzip1/goxDp-Dzip2（ppuMDH：０．３ユニット、goxDp：０．６ユニット）
・Fc-PAA：１６μｇ
・PEGDE：１０μｇ
この酵素電極を図１１のアノード電極として用いて燃料電池を作製する。電解質溶液３は、１００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭリンゴ酸、および１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）である。アノード電極１５とカソード電極１６の間に所定の電圧を印加し、電圧−電流特性を測定し、以下の結果を得た。
・短絡電流密度：１０２６μＡ／ｃｍ2
・最大電力：９９μＷ／ｃｍ2
[比較例２７]リンゴ酸燃料電池
比較例２５で調製した酵素を用いる以外は実施例２７と同様にして酵素電極を作製する。この酵素電極に固定された成分の配合は以下のとおりである。
・ppuMDH：０．３ユニット
・goxDp：０．６ユニット
・Fc-PAA：１６μｇ
・PEGDE：１０μｇ
この酵素電極を用いて図１１の構成の燃料電池を作製する。電解質溶液３として、１００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭリンゴ酸、および１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いる以外は実施例２７と同様にして、電圧−電流特性を測定し、以下の結果を得た。
・短絡電流密度：２９８μＡ／ｃｍ2
・最大電力：３１μＷ／ｃｍ2
実施例２７と比較例２７から、実施例２７のリンゴ酸燃料電池の方が、比較例２７のリンゴ酸燃料電池よりも、電流密度が高く、より大きな電流を取り出せることが明らかとなった。酵素電極上に固定されているリンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びジアフォラーゼの量は同じであるにもかかわらず、実施例２７の燃料電池においては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼが会合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、NAD／NADHを介した両酵素間の電子授受が速やかに行われるためと考えられた。
【０２１９】
（実施例２８）リンゴ酸電気化学反応装置
実施例２７で作製した酵素電極を用い図１０に示す電気化学反応装置を作製する。１００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭリンゴ酸、および１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）電解液を試料溶液３として使用し、窒素雰囲気下０．３ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌの電位を１００分間印加し、生成物を高速液体クロマトグラフィーで定量する。反応電解液からは、ピルビン酸が検出され、反応電荷量と、生成ピルビン酸量には、高い相関関係があり、反応が定量的に進行することがわかる。
【０２２０】
[比較例２８]リンゴ酸電気化学反応装置
比較例２７で作製した酵素電極を用いる以外は実施例２８と同様にして図１０の構成の電気化学反応装置を作製し、電気化学反応を行なう。反応電解液からは、ピルビン酸が検出され、反応電荷量と、生成ピルビン酸量には、高い相関関係があり、反応が定量的に進行することがわかる。しかしながら実施例２８の場合よりも単位時間あたりの反応電荷量は小さい値であることがわかる。
【０２２１】
実施例２８と比較例２８から、実施例２８のリンゴ酸電気化学反応装置の方が、比較例２８のリンゴ酸電気化学反応装置よりも、単位時間あたりの反応電荷量が高く、より効率的にリンゴ酸をピルビン酸に変換出来ることが明らかとなる。酵素電極上に固定されているリンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びジアフォラーゼの量は同じであるにもかかわらず、実施例２８の電気化学反応装置においては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼが会合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、NAD／NADHを介した両酵素間の電子授受が速やかに行われるためと考えられた。
【０２２２】
（実施例２９）Pyrococcus furiosus由来のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（pfuMDH）とThermotoga maritima由来のジアフォラーゼ（tmaDp）との会合タンパク質（His-pfuMDH-Dzip1およびtmaDp-Dzip2）[配列番号９０、７４]の調製
Pyrococcus furiosus [ATCC 43587]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA：
5'-aataatGGATCCGgctaggatcactgaggaacaaagaaggaaa-3' (BamHI) [配列番号８５]、および
5'-aataatAAGCTTagtaatgtactgtttccttctttcatttaa-3' (HindIII) [配列番号８６]
をプライマーとして用いてPCRを行い、１３２７ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素BamHIおよびHind IIIで消化切断し、pETDuet-1(Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、His-pfuMDH発現ベクターpETDuet-pfuMDHを作製する。
【０２２３】
次にThermotoga maritima [ATCC 43589]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA：
5'-aataatCATATGtacgatgctgtgatcataggaggaggaccc-3' (NdeI) [配列番号６７]、および
5'-aataatCTCGAGcagatgaatgggttttcctgagacccc-3' (XhoI) [配列番号６８]
をプライマーとして用いてPCRを行い、１３７１ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pETDuet-pfuMDHの同じ制限酵素サイトに挿入することによって、His-pfuMDH、tmaDp共発現ベクターpETDuet-pfuMDH-tmaDpを作製する。
【０２２４】
次に、実施例１７と同様にして5'末端リン酸化合成オリゴDNA（配列番号５１および配列番号５２）からDNA断片（二本鎖）を得る。このDNA断片を、pETDuet-pfuMDH-tmaDpの制限酵素Hind IIIおよびAfl IIの認識サイトに挿入することによって、His-pfuMDHのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip1配列[配列番号５３]を融合した融合タンパク質とtmaDpの共発現ベクターpETDuet-pfuMDH-Dzip1/tmaDpを作製することができる。
【０２２５】
次に、実施例１７と同様にして5'末端リン酸化合成オリゴDNA（配列番号５４および配列番号５５）からDNA断片（二本鎖）を得る。このDNA断片を、pETDuet-pfuMDH-Dzip1/tmaDpの制限酵素Xho IおよびAvr IIの認識サイトに挿入することによって、His-pfuMDHのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip1配列[配列番号５３]を融合した融合タンパク質とtmaDpのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip2配列[配列番号５６]を融合した融合タンパク質の共発現ベクターpETDuet-pfuMDH-Dzip1/tmaDp-Dzip2[配列番号８７]を作製することができる。
【０２２６】
次にPyrococcus furiosus [ATCC 43587]のゲノムDNA鋳型にして、合成オリゴDNA：
5'- aataatCCATGGcgaggatcactgaggaacaaagaaggaaactt-3' (Nco I) [配列番号８８]、および
5'-aataatAAGCTTagtaatgtactgtttccttctttcatttaa-3' (HindIII) [配列番号８６]
をプライマーとして用いてPCRを行い、１３２５ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nco IおよびHind IIIで消化切断し、pCDFDuet-1 (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、pfuMDH発現ベクターpCDFDuet-pfuMDHを作製する。
【０２２７】
次にThermotoga maritima  [ATCC 43589]のゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA：
5'-aataatCATATGtacgatgctgtgatcataggaggaggaccc-3' (NdeI) [配列番号６７]、および
5'-aataatCTCGAGtcacagatgaatgggttttcctgagacccc-3' (XhoI) [配列番号７１]
をプライマーとして用いてPCRを行い、１３７１ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pCDFDuet-pfuMDHの同じ制限酵素サイトに挿入することによって、pfuMDH、tmaDp共発現ベクターpCDFDuet-pfuMDH-tmaDp [配列番号８９]を作製する。
【０２２８】
発現ベクターpETDuet-pfuMDH-Dzip1/tmaDp-Dzip2およびpCDFDuet-pfuMDH-tmaDpを常法に従いE.coli BL21(DE3)に形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンおよびストレプトマイシンに対する耐性株として選別することができる。この形質転換体を用いて方法１により酵素を調製した。こうして得られる好熱菌由来の酵素を用いて酵素電極等を構成できる。
【０２２９】
（実施例３３）Burkholderia mallei由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（bmaEDH）とGluconobacter oxydans由来のジアフォラーゼ（goxDp）との会合タンパク質（His-bmaEDH-Dzip1およびgoxDp-Dzip2）[配列番号９８、６２]の調製
Burkholderia mallei [ATCC 23344]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA：
5'-aataatGGATCCGtcttcgcaatcgcagtccccgtccgtcgcg-3' (BamHI) [配列番号９３]、および
5'-aataatAAGCTTggggtacagaccgcgcatttcgcgcgccat-3' (HindIII) [配列番号９４]
をプライマーとして用いてPCRを行い、１３２４ｂｐのDNA増幅産物を得る。
このDNA増幅産物を制限酵素BamHIおよびHind IIIで消化切断し、pETDuet-1(Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、His-bmaEDH発現ベクターpETDuet-bmaEDHを作製する。
【０２３０】
次にGluconobacter oxydans [ATCC 621H]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA（配列番号４９および配列番号５０）をプライマーとして用いてPCRを行い、１４２８ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pETDuet-bmaEDHの同じ制限酵素サイトに挿入することによって、His-bmaEDH、goxDp共発現ベクターpETDuet-bmaEDH-goxDpを作製する。
【０２３１】
次に、実施例１７と同様にして5'末端リン酸化合成オリゴDNA（配列番号５１および配列番号５２）からDNA断片（二本鎖）を得る。このDNA断片を、pETDuet-bmaEDH-goxDpの制限酵素Hind IIIおよびAfl IIの認識サイトに挿入することによって、His-bmaEDHのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip1配列[配列番号５３]を融合した融合タンパク質とgoxDpの共発現ベクターpETDuet-bmaEDH-Dzip1/goxDpを作製することができる。
【０２３２】
次に、実施例１７と同様にして5'末端リン酸化合成オリゴDNA（配列番号５４および配列番号５５）からDNA断片（二本鎖）を得る。このDNA断片を、pETDuet-bmaEDH-Dzip1/goxDpの制限酵素Xho IおよびAvr IIの認識サイトに挿入することによって、His-bmaEDHのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip1配列[配列番号５３]を融合した融合タンパク質とgoxDpのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip2配列[配列番号５６]を融合した融合タンパク質の共発現ベクターpETDuet-bmaEDH-Dzip1/goxDp-Dzip2[配列番号９５]を作製する。
【０２３３】
次にBurkholderia mallei [ATCC 23344]のゲノムDNA鋳型にして、合成オリゴDNA：
5'- aataatCCATGGcgtcgcaatcgcagtccccgtccgtcgcgcag-3' (Nco I) [配列番号９６]、および
5'-aataatAAGCTTggggtacagaccgcgcatttcgcgcgccat-3' (HindIII) [配列番号９４]
をプライマーとして用いてPCRを行い、１３２２ｂｐのDNA増幅産物を得る。
このDNA増幅産物を制限酵素Nco IおよびHind IIIで消化切断し、pCDFDuet-1 (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、bmaEDH発現ベクターpCDFDuet-bmaEDHを作製する。
【０２３４】
次にGluconobacter oxydans [ATCC 621H]のゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA（配列番号４９および配列番号５９）をプライマーとして用いてPCRを行い、１４２８ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pCDFDuet-bmaEDHの同じ制限酵素サイトに挿入することによって、bmaEDH、goxDp共発現ベクターpCDFDuet-bmaEDH-goxDp [配列番号９７]を作製する。
【０２３５】
発現ベクターpETDuet-bmaEDH-Dzip1/goxDp-Dzip2およびpCDFDuet-bmaEDH-goxDpを常法に従いE.coli BL21(DE3)に形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンおよびストレプトマイシンに対する耐性株として選別することができる。この形質転換体を用いて方法１により酵素を調製した。
【０２３６】
[比較例３３]対照としてのbmaEDHおよびgoxDpの調製
Burkholderia mallei [ATCC 23344]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA：
5'-aataatCATatgtcttcgcaatcgcagtccccgtccgtcgcg-3' (NdeI)[配列番号９９]および
5'-aataatCTCGAGggggtacagaccgcgcatttcgcgcgccat-3' (XhoI)[配列番号１００]
をプライマーとして用いてPCRを行い、約１３２０ｂｐのDNA増幅産物を得る。
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、bmaEDH-His発現ベクターpET21-bmaEDHを作製する。
【０２３７】
次にGluconobacter oxydans  [ATCC 621H]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA（配列番号４９および配列番号５０）をプライマーとして用いてPCRを行い、約１４２０ｂｐのDNA増幅産物を得る。
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、goxDp-His発現ベクターpET21-goxDpを作製する。
【０２３８】
発現ベクターpET21-bmaEDHおよびpET21-goxDpをそれぞれ個別に、E.coli BL21(DE3)に常法に従い形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンに対する耐性株として選別することができる。
【０２３９】
これらの形質転換体を個々に用いて方法２により酵素を調製した。
【０２４０】
（実施例３４）グルタミン酸センサー
導電性基体２０は直径３ｍｍのグラッシーカーボンである。導電性基体２０上に実施例３３で調製したBurkholderia mallei由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（bmaEDH）とGluconobacter oxydans由来のジアフォラーゼ（goxDp）との会合タンパク質（His-bmaEDH-Dzip1/goxDp-Dzip2）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPoly(ethylene glycol) diglycigyl ether(PEGDE)により架橋されて固定されている。この酵素電極に固定された成分の配合は以下のとおりである。
・His-bmaEDH-Dzip1/goxDp-Dzip2（bmaEDH：０．３ユニット、goxDp：０．６ユニット）
・Fc-PAA：１６μｇ
・PEGDE：１０μｇ
この酵素電極を、図１０における作用電極４として用いることによってグルタミン酸センサーを構成する。試料溶液３としては、所定濃度のグルタミン酸、および１ｍM  NADを含む０．１M  PIPES−NaOH緩衝水溶液（ｐH７．５）を用いる。作用電極４には参照極６に対して３００ｍVの電位を印加する。このとき、試料溶液３中のグルタミン酸はグルタミン酸デヒドロゲナーゼの存在下で２−オキソグルタル酸に酸化され、この反応でＮＡＤがNADHに還元される。次に前記グルタミン酸デヒドロゲナーゼに会合したジアフォラーゼの存在下でNADHはNADに酸化され、この反応で電子伝達メディエータであるフェロセンが酸化され、フェリシニウムイオンが生成される。（作用電極４には参照極６に対して３００ｍVの電位が印加されているため、）フェリシニウムイオンは作用電極４から電子をうけとりフェロセンに還元される。作用電極４での電子の移動による電流を測定することにより、試料溶液中のグルタミン酸濃度に応じた還元電流を測定する。
【０２４１】
[比較例３４] グルタミン酸センサー
比較例３３で調製した酵素を用いる以外は実施例３４と同様にして図３８の構成の酵素電極を作製する。この酵素電極に固定された成分の配合は以下のとおりである。
・bmaEDH：０．３ユニット
・goxDp：０．６ユニット
・Fc-PAA：１６μｇ
・PEGDE：１０μｇ
この酵素電極を、図１０における作用電極４として用いることによってグルタミン酸センサーを構成し、実施例３４と同様にして試料溶液中のグルタミン酸濃度に応じた還元電流の変化を測定する。
実施例３４と比較例３４との相違は、図１３におけるＡとＢとの相違に類似する。
【０２４２】
（実施例３５）グルタミン酸燃料電池
酵素電極の構成を図３６に示す。導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンである。導電性基体２０上に実施例３３で調製したBurkholderia mallei由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（bmaEDH）とGluconobacter oxydans由来のジアフォラーゼ（goxDp）との会合タンパク質（His-bmaEDH-Dzip1/goxDp-Dzip2）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPoly(ethylene glycol) diglycigyl ether(PEGDE)により架橋されて固定されている。この酵素電極に固定された成分の配合は以下のとおりである。
・His-bmaEDH-Dzip1/goxDp-Dzip2（bmaEDH：０．３ユニット、goxDp：０．６ユニット）
・Fc-PAA：１６μｇ
・PEGDE：１０μｇ
この酵素電極を図１１のアノード電極として燃料電池を作製する。電解質溶液３は、１００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭグルタミン酸、および１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）である。アノード電極１５とカソード電極１６の間に所定の電圧を印加し、電圧−電流特性を測定し、以下の結果を得た。
・短絡電流密度：１２２６μＡ／ｃｍ2
・最大電力：１０６μＷ／ｃｍ2
[比較例３５]グルタミン酸燃料電池
比較例３３で調製した酵素を用いる以外は実施例３５と同様にして図３８の構成の酵素電極を作製する。この酵素電極に固定された成分の配合は以下のとおりである。
・bmaEDH：０．３ユニット
・goxDp：０．６ユニット
・Fc-PAA：１６μｇ
・PEGDE：１０μｇ
この酵素電極を図１１のアノードとして燃料電池を作製し、実施例３５と同様にして電圧−電流特性を測定し、以下の結果を得た。
・短絡電流密度：３８７μＡ／ｃｍ2
・最大電力：３４μＷ／ｃｍ2
実施例３５と比較例３５から、実施例３５のグルタミン酸燃料電池の方が、比較例３５のグルタミン酸燃料電池よりも、電流密度が高く、より大きな電流を取り出せることが明らかとなった。酵素電極上に固定されているグルタミン酸デヒドロゲナーゼ及びジアフォラーゼの量は同じであるにもかかわらず、実施例３５の燃料電池においては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼが会合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、NAD／NADHを介した両酵素間の電子授受が速やかに行われるためと考えられた。
【０２４３】
（実施例３６）グルタミン酸電気化学反応装置
実施例３５で作製した酵素電極を用い図１０に示す電気化学反応装置を作製する。１００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭグルタミン酸、および１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）電解液を試料溶液３として使用し、窒素雰囲気下０．３ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌの電位を１００分間印加し、生成物を高速液体クロマトグラフィーで定量する。反応電解液からは、２−オキソグルタル酸が検出され、反応電荷量と、生成２−オキソグルタル酸量には、高い相関関係があり、反応が定量的に進行することがわかる。
【０２４４】
[比較例３６]グルタミン酸電気化学反応装置
比較例３５で作製した酵素電極を用いる以外は実施例３６と同様にして電気化学反応装置を作製し、電気化学反応を行なう。反応電解液からは、２−オキソグルタル酸が検出され、反応電荷量と、生成２−オキソグルタル酸量には、高い相関関係があり、反応が定量的に進行することがわかる。しかしながら実施例３６の場合よりも単位時間あたりの反応電荷量は小さい値であることがわかる。
【０２４５】
実施例３６と比較例３６から、実施例３６のグルタミン酸電気化学反応装置の方が、比較例３６のグルタミン酸電気化学反応装置よりも、単位時間あたりの反応電荷量が高く、より効率的にグルタミン酸を２−オキソグルタル酸に変換出来ることが明らかとなる。酵素電極上に固定されているグルタミン酸デヒドロゲナーゼ及びジアフォラーゼの量は同じであるにもかかわらず、実施例３６の電気化学反応装置においては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼが会合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、NAD／NADHを介した両酵素間の電子授受が速やかに行われるためと考えられた。
【０２４６】
（実施例３７）Pyrococcus furiosus由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（pfuEDH）とThermotoga maritima由来のジアフォラーゼ（tmaDp）との会合タンパク質（His-pfuEDH-Dzip1およびtmaDp-Dzip2）[配列番号１０６、７４]の調製
Pyrococcus furiosus [ATCC 43587]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA：
5'-aataatGGATCCGgttgagcaagacccctatgaaattgttatt-3' (BamHI) [配列番号１０１]、および
5'-aataatAAGCTTgtgcttgacccatccacggtcaagcattgc-3' (HindIII) [配列番号１０２]
をプライマーとして用いてPCRを行い、１２８２ｂｐのDNA増幅産物を得る。
このDNA増幅産物を制限酵素BamHIおよびHind IIIで消化切断し、pETDuet-1(Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、His-pfuEDH発現ベクターpETDuet-pfuEDHを作製する。
【０２４７】
次にThermotoga maritima [ATCC 43589]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA（配列番号６７および配列番号６８）をプライマーとして用いてPCRを行い、１３７１ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pETDuet-pfuEDHの同じ制限酵素サイトに挿入することによって、His-pfuEDH、tmaDp共発現ベクターpETDuet-pfuEDH-tmaDpを作製する。
【０２４８】
次に実施例１７と同様にして5'末端リン酸化合成オリゴDNA（配列番号５１および配列番号５２）からDNA断片（二本鎖）を得る。このDNA断片を、pETDuet-pfuEDH-tmaDpの制限酵素Hind IIIおよびAfl IIの認識サイトに挿入することによって、His-pfuEDHのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip1配列[配列番号５３]を融合した融合タンパク質とtmaDpの共発現ベクターpETDuet-pfuEDH-Dzip1/tmaDpを作製することができる。
【０２４９】
次に実施例１７と同様にして5'末端リン酸化合成オリゴDNA（配列番号５４および配列番号５５）からDNA断片（二本鎖）を得る。このDNA断片を、pETDuet-pfuEDH-Dzip1/tmaDpの制限酵素Xho IおよびAvr IIの認識サイトに挿入することによって、His-pfuEDHのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip1配列[配列番号５３]を融合した融合タンパク質とtmaDpのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip2配列[配列番号５６]を融合した融合タンパク質の共発現ベクターpETDuet-pfuEDH-Dzip1/tmaDp-Dzip2[配列番号１０３]を作製することができる。
【０２５０】
次にPyrococcus furiosus [ATCC 43587]のゲノムDNA鋳型にして、合成オリゴDNA：
5'- aataatCCATGGcggagcaagacccctatgaaattgttattaag-3' (Nco I) [配列番号１０４]、および
5'-aataatAAGCTTgtgcttgacccatccacggtcaagcattgc-3' (HindIII) [配列番号１０２]
をプライマーとして用いてPCRを行い、１２８０ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nco IおよびHind IIIで消化切断し、pCDFDuet-1 (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、pfuEDH発現ベクターpCDFDuet-pfuEDHを作製する。
【０２５１】
次にThermotoga maritima  [ATCC 43589]のゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA（配列番号６７および配列番号７１）をプライマーとして用いてPCRを行い、１３７１ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pCDFDuet-pfuEDHの同じ制限酵素サイトに挿入することによって、pfuEDH、tmaDp共発現ベクターpCDFDuet-pfuEDH-tmaDp [配列番号１０５]を作製する。
【０２５２】
発現ベクターpETDuet-pfuEDH-Dzip1/tmaDp-Dzip2およびpCDFDuet-pfuEDH-tmaDpを常法に従いE.coli BL21(DE3)に形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンおよびストレプトマイシンに対する耐性株として選別することができる。この形質転換体を用いて方法１により酵素を調製した。こうして得られる好熱菌由来の酵素を利用して酵素電極等が構成できる。
【０２５３】
（実施例４１）Saccharomyces cerevisiae由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（sceADH）とGluconobacter oxydans由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（goxALDH）との会合タンパク質（His-sceADH-Dzip1およびgoxALDH-Dzip2）[配列番号１１４、１１５]の調製
Saccharomyces cerevisiae [ATCC 47058]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA：
5'-aataatGGATCCGccttcgcaagtcattcctgaaaaacaaaag-3' (BamHI) [配列番号３１]、および
5'-aataatAAGCTTtttagaagtctcaacaacatatctaccaac-3' (HindIII) [配列番号３２]
をプライマーとして用いてPCRを行い、１０７５ｂｐのDNA増幅産物を得る。
このDNA増幅産物を制限酵素BamHIおよびHind IIIで消化切断し、pETDuet-1(Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、His-sceADH発現ベクターpETDuet-sceADHを作製する。
【０２５４】
次にGluconobacter oxydans  [ATCC 621H]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA：
5'-aataatCATATGacggcatctctccgttgcgaagtggcagcg-3' (NdeI) [配列番号１０９]、および
5'-aataatCTCGAGggcgtccgccgaaccgccatacacatcgga-3' (XhoI) [配列番号１１０]
をプライマーとして用いてPCRを行い、１５６０ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pETDuet-sceADHの同じ制限酵素サイトに挿入することによって、His-sceADH、goxALDH共発現ベクターpETDuet-sceADH-goxALDHを作製する。
【０２５５】
次に、実施例１７と同様にして5'末端リン酸化合成オリゴDNA（配列番号５１および配列番号５２）からDNA断片（二本鎖）を得る。このDNA断片を、pETDuet-sceADH-goxALDHの制限酵素Hind IIIおよびAflIIの認識サイトに挿入することによって、His-sceADHのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip1配列[配列番号５３]を融合した融合タンパク質とgoxALDHの共発現ベクターpETDuet-sceADH-Dzip1/goxALDHを作製することができる。
【０２５６】
次に、実施例１７と同様にして5'末端リン酸化合成オリゴDNA（配列番号５４および配列番号５５）からDNA断片（二本鎖）を得る。このDNA断片を、pETDuet-sceADH-Dzip1/goxALDHの制限酵素Xho IおよびAvr IIの認識サイトに挿入することによって、His-sceADHのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip1配列[配列番号５３]を融合した融合タンパク質とgoxALDHのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip2配列[配列番号５６]を融合した融合タンパク質の共発現ベクターpETDuet-sceADH-Dzip1/goxALDH-Dzip2[配列番号１１１]を作製することができる。
【０２５７】
次にSaccharomyces cerevisiae [ATCC 47058]のゲノムDNA鋳型にして、合成オリゴDNA（配列番号３４および配列番号３２）をプライマーとして用いてPCRを行い、１０７３ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nco IおよびHind IIIで消化切断し、pCDFDuet-1 (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、sceADH発現ベクターpCDFDuet-sceADHを作製する。
【０２５８】
次にGluconobacter oxydans  [ATCC 621H]のゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA：
5'-aataatCATATGacggcatctctccgttgcgaagtggcagcg-3' (NdeI) [配列番号１０９]、および
5'-aataatCTCGAGtcaggcgtccgccgaaccgccatacacatc-3' (XhoI) [配列番号１１２]
をプライマーとして用いてPCRを行い、１５６０ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pCDFDuet-sceADHの同じ制限酵素サイトに挿入することによって、sceADH、goxALDH共発現ベクターpCDFDuet-sceADH-goxALDH [配列番号１１３]を作製する。
【０２５９】
発現ベクターpETDuet-sceADH::goxALDHおよびpCDFDuet-sceADH-goxALDHを常法に従いE.coli BL21(DE3)に形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンおよびストレプトマイシンに対する耐性株として選別することができる。この形質転換体を用いて方法１により酵素を調製した。
【０２６０】
次にPseudomonas putida KT2440 [ATCC 47054]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA（配列番号３および配列番号４）をプライマーとして用いてPCRを行い、７２９ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、ppuDp-His発現ベクターpET21-ppuDpを作製する。
【０２６１】
発現ベクターpET21-ppuDpを、E.coli BL21(DE3)に常法に従い形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンに対する耐性株として選別することができる。この形質転換体を用いて方法１により酵素を調製した。
【０２６２】
[比較例４１]対照としてのsceADHおよびgoxALDHの調製
Saccharomyces cerevisiae [ATCC 47058]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA（配列番号３７および配列番号３８）をプライマーとして用いてPCRを行い、約１０７４ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、sceADH-His発現ベクターpET21-sceADHを作製する。
【０２６３】
次にGluconobacter oxydans  [ATCC 621H]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA：
5'-aataatCATATGacggcatctctccgttgcgaagtggcagcg-3' (NdeI) [配列番号１０９]、および
5'-aataatCTCGAGggcgtccgccgaaccgccatacacatcgaa-3' (XhoI) [配列番号１１０]
をプライマーとして用いてPCRを行い、１５５７ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、goxALDH-His発現ベクターpET21-goxALDHを作製する。
【０２６４】
次にPseudomonas putida KT2440 [ATCC 47054]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA（配列番号３および配列番号４）をプライマーとして用いてPCRを行い、７２９ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、ppuDp-His発現ベクターpET21-ppuDpを作製する。
【０２６５】
発現ベクターpET21-sceADH、pET21-goxALDHおよびpET21-ppuDpをそれぞれ個別に、E.coli BL21(DE3)に常法に従い形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンに対する耐性株として選別することができる。
【０２６６】
これらの形質転換体を個々に用いて方法２により酵素を調製した。
【０２６７】
（実施例４２）アルコールセンサー
導電性基体２０は直径３ｍｍのグラッシーカーボンである。導電性基体２０上に実施例４１で調製したSaccharomyces cerevisiae由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（sceADH）とGluconobacter oxydans由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（goxALDH）との会合タンパク質（His-sceADH-Dzip1/goxALDH-Dzip2）、Pseudomonas putida由来のジアフォラーゼ（ppuDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPoly(ethylene glycol) diglycigyl ether(PEGDE)により架橋されて固定されている。この酵素電極に固定された成分の配合は以下のとおりである。
・His-sceADH-Dzip1/goxALDH-Dzip2（sceADH：０．３ユニット、goxALDH：０．６ユニット）
・ppuDp：０．６ユニット
・Fc-PAA：１６μｇ
・PEGDE：１０μｇ
この酵素電極を、図１０における作用電極４として用いることによってアルコールセンサーを構成する。試料溶液３としては、所定濃度のアルコール（エタノール）、および１ｍM  NADを含む０．１M  PIPES−NaOH緩衝水溶液（ｐH７．５）を用いる。作用電極４には参照極６に対して３００ｍVの電位を印加する。このとき、試料溶液３中のアルコールはアルコールデヒドロゲナーゼの存在下でアセトアルデヒドに酸化され、この反応でＮＡＤがNADHに還元される。次に前記アルコールデヒドロゲナーゼに会合したアルデヒドデヒドロゲナーゼの存在下でアセトアルデヒドはカルボン酸に酸化されると同時にNADがNADHに還元される。アルコールデヒドロゲナーゼおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼの両酵素反応により生成したNADHはジアフォラーゼの存在下でNADに酸化され、この反応で電子伝達メディエータであるフェロセンが酸化され、フェリシニウムイオンが生成される。作用電極４には参照極６に対して３００ｍVの電位が印加されているため、フェリシニウムイオンは作用電極４から電子をうけとりフェロセンに還元される。作用電極４での電子の移動による電流を測定することにより、試料溶液中のアルコール濃度に応じた還元電流の変化を測定する。
【０２６８】
（比較例４２）アルコールセンサー
比較例４１で調製した酵素を用いる以外は実施例４２と同様にして図４４の構成の酵素電極を作製する。この酵素電極に固定された成分の配合は以下のとおりである。
・sceADH：０．３ユニット
・goxALDH：０．６ユニット
・ppuDp：０．６ユニット
・Fc-PAA：１６μｇ
・PEGDE：１０μｇ
この酵素電極を、図１０における作用電極４として用いることによってアルコールセンサーを構成し、実施例４２と同様にして試料溶液中のアルコール濃度に応じた還元電流を測定する。実施例４２と比較例４２における相違は、図１３における相違と類似する。
【０２６９】
（実施例４３）アルコール燃料電池
酵素電極の構成を図４２に示す。導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンである。導電性基体２０上に実施例４１で調製したSaccharomyces cerevisiae由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（sceADH）とGluconobacter oxydans由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（goxALDH）との会合タンパク質（His-sceADH-Dzip1/goxALDH-Dzip2）、Pseudomonas putida由来のジアフォラーゼ（ppuDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPoly(ethylene glycol) diglycigyl ether(PEGDE)により架橋されて固定されている。この酵素電極に固定された成分の配合は以下のとおりである。
・His-sceADH-Dzip1/goxALDH-Dzip2（sceADH：０．３ユニット、goxALDH：０．６ユニット）
・ppuDp：０．６ユニット
・Fc-PAA：１６μｇ
・PEGDE：１０μｇ
この酵素電極を図１１のアノード電極として燃料電池を作製する。電解質溶液３は、１００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭアルコール（エタノール）、および１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）である。アノード電極１５とカソード電極１６の間に所定の電圧を印加し、電圧−電流特性を測定し、以下の結果を得た。
・短絡電流密度：１６２１μＡ／ｃｍ2
・最大電力：１７３μＷ／ｃｍ2
（比較例４３）アルコール燃料電池
比較例４１で調製した酵素を用いる以外は実施例４３と同様にして図４４の構成の酵素電極を作製する。この酵素電極に固定された成分の配合は以下のとおりである。
・sceADH：０．３ユニット
・goxALDH：０．６ユニット
・ppuDp：０．６ユニット
・Fc-PAA：１６μｇ
・PEGDE：１０μｇ
この酵素電極を図１１のアノードとして燃料電池を作製し、実施例４３と同様にして電圧−電流特性を測定し、以下の結果を得た。
・短絡電流密度：５０３μＡ／ｃｍ2
・最大電力：５１μＷ／ｃｍ2
実施例４３と比較例４３から、実施例４３のアルコール燃料電池の方が、比較例４３のアルコール燃料電池よりも、電流密度が高く、より大きな電流を取り出せることが明らかとなった。酵素電極上に固定されているアルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、およびジアフォラーゼの量は同じであるにもかかわらず、実施例４３の燃料電池においては、アルコールデヒドロゲナーゼとアルデヒドデヒドロゲナーゼが会合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、単位時間内に生成するNADHの量が多いためと考えられた。
【０２７０】
（実施例４４）アルコール電気化学反応装置
実施例４３で作製した酵素電極を用い図１０に示す電気化学反応装置を作製する。１００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭアルコール、および１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）電解液を試料溶液３として使用し、窒素雰囲気下０．３ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌの電位を１００分間印加し、生成物を高速液体クロマトグラフィーで定量する。反応電解液からは、カルボン酸（酢酸）が検出され、反応電荷量と、生成カルボン酸（酢酸）量には、高い相関関係があり、反応が定量的に進行することがわかる。
【０２７１】
（比較例４４）アルコール電気化学反応装置
比較例４３で作製した酵素電極を用いる以外は実施例４４と同様にして電気化学反応装置を作製し、電気化学反応を行なう。反応電解液からは、カルボン酸（酢酸）が検出され、反応電荷量と、生成カルボン酸（酢酸）量には、高い相関関係があり、反応が定量的に進行することがわかる。しかしながら実施例４４の場合よりも単位時間あたりの反応電荷量は小さい値であることがわかる。
【０２７２】
実施例４４と比較例４４から、実施例４４のアルコール電気化学反応装置の方が、比較例４４のアルコール電気化学反応装置よりも、単位時間あたりの反応電荷量が高く、より効率的にアルコールをカルボン酸に変換出来ることが明らかとなる。酵素電極上に固定されているアルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、及びジアフォラーゼの量は同じである。それにもかかわらず、実施例４４の電気化学反応装置においては、アルコールデヒドロゲナーゼとアルデヒドデヒドロゲナーゼが会合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、単位時間内に生成するNADHの量が多いためと考えられた。
【０２７３】
（実施例４５）Pyrococcus furiosus由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（pfuADH）とThermus thermophilus由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（tthALDH）との会合タンパク質（His-pfuADH-Dzip1/tthALDH-Dzip2）[配列番号１２１、１２２]の調製
Pyrococcus furiosus [ATCC 43587]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA（配列番号３９及び配列番号４０）をプライマーとして用いてPCRを行い、１１４７ｂｐのDNA増幅産物を得る。
【０２７４】
このDNA増幅産物を制限酵素BamHIおよびHind IIIで消化切断し、pETDuet-1(Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、His-pfuADH発現ベクターpETDuet-pfuADHを作製する。
【０２７５】
次にThermus thermophilus  [ATCC BAA-163]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１６１４ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGcgcaaggcggcaggcaagtacgggaacacc-3' (NdeI) [配列番号１１６]
5'-aataatCTCGAGaagccccagcacctccccccagggcgtggg-3' (XhoI) [配列番号１１７]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pETDuet-pfuADHの同じ制限酵素サイトに挿入することによって、His-pfuADH、tthALDH共発現ベクターpETDuet-pfuADH-tthALDHを作製する。
【０２７６】
次に、実施例１７と同様にして5'末端リン酸化合成オリゴDNA（配列番号５１及び配列番号５２）からDNA断片（二本鎖）を得る。このDNA断片を、pETDuet-pfuADH-tthALDHの制限酵素Hind IIIおよびAfl IIの認識サイトに挿入することによって、His-pfuADHのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip1配列[配列番号５３]を融合した融合タンパク質とtthALDHの共発現ベクターpETDuet-pfuADH-Dzip1/tthALDHを作製することができる。
【０２７７】
次に、実施例１７と同様にして5'末端リン酸化合成オリゴDNA（配列番号５５及び配列番号５５）からDNA断片（二本鎖）を得る。このDNA断片を、pETDuet-pfuADH-Dzip1/tthALDHの制限酵素Xho IおよびAvr IIの認識サイトに挿入することによって、His-pfuADHのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip1配列[配列番号５３]を融合した融合タンパク質とtthALDHのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip2配列[配列番号５６]を融合した融合タンパク質の共発現ベクターpETDuet-pfuADH-Dzip1/tthALDH-Dzip2[配列番号１１８]を作製する。
【０２７８】
次にPyrococcus furiosus [ATCC 43587]のゲノムDNA鋳型にして、合成オリゴDNA（配列番号４２及び配列番号４０）をプライマーとして用いてPCRを行い、１１４５ｂｐのDNA増幅産物を得る。
【０２７９】
このDNA増幅産物を制限酵素Nco IおよびHind IIIで消化切断し、pCDFDuet-1 (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、pfuADH発現ベクターpCDFDuet-pfuADHを作製する。
【０２８０】
次にThermus thermophilus  [ATCC BAA-163]のゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１６１４ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGcgcaaggcggcaggcaagtacgggaacacc-3' (NdeI) [配列番号１１６]
5'-aataatCTCGAGttaaagccccagcacctccccccagggcgt-3' (XhoI) [配列番号１１９]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pCDFDuet-pfuADHの同じ制限酵素サイトに挿入することによって、pfuADH、tthALDH共発現ベクターpCDFDuet-pfuADH-tthALDH [配列番号１２０]を作製する。
【０２８１】
発現ベクターpETDuet-pfuADH-Dzip1/tthALDH-Dzip2およびpCDFDuet-pfuADH-tthALDHを常法に従いE.coli BL21(DE3)に形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンおよびストレプトマイシンに対する耐性株として選別することができる。この形質転換体を用いて方法１により酵素を調製した。
【０２８２】
次にPyrococcus horikoshii KT2440 [ATCC 700860]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA（配列番号２１及び配列番号２２）をプライマーとして用いてPCRを行い、１３４４ｂｐのDNA増幅産物を得る。
【０２８３】
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、phoDp-His発現ベクターpET21-phoDpを作製する。
【０２８４】
発現ベクターpET21-phoDpを、E.coli BL21(DE3)に常法に従い形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンに対する耐性株として選別することができる。この形質転換体を用いて方法１により酵素を調製した。こうして得られる酵素を利用して、酵素電極を構成できる。
【０２８５】
（実施例４９）Bacillus subtilis由来のグルコースデヒドロゲナーゼ（busGDH）とEscherichia coli由来のキシロースイソメラーゼ（ecoISO）との会合タンパク質（His-busGDH-Dzip1/ecoISO-Dzip2）[配列番号１２８、１２９]の調製
Bacillus subtilis [ATCC 27370]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA（配列番号１及び配列番号２）をプライマーとして用いてPCRを行い、８０５ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素BamHIおよびHind IIIで消化切断し、pETDuet-1(Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、His-busGDH発現ベクターpETDuet-busGDHを作製する。
【０２８６】
次にEscherichia coli  [ATCC 29425]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１３４４ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGcaagcctattttgaccagctcgatcgcgtt-3' (NdeI) [配列番号１２３]
5'-aataatCTCGAGtttgtcgaacagataatggtttaccagatt-3' (XhoI) [配列番号１２４]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pETDuet-busGDHの同じ制限酵素サイトに挿入することによって、His-busGDH、ecoISO共発現ベクターpETDuet-busGDH-ecoISOを作製する。
【０２８７】
次に、実施例１７と同様にして5'末端リン酸化合成オリゴDNA（配列番号５１及び配列番号５２）からDNA断片（二本鎖）を得る。このDNA断片を、pETDuet-busGDH-ecoISOの制限酵素Hind IIIおよびAfl IIの認識サイトに挿入することによって、His-busGDHのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip1配列[配列番号５３]を融合した融合タンパク質とecoISOの共発現ベクターpETDuet-busGDH-Dzip1/ecoISOを作製することができる。
【０２８８】
次に、実施例１７と同様にして5'末端リン酸化合成オリゴDNA（配列番号５５及び配列番号５５）からDNA断片（二本鎖）を得る。このDNA断片を、pETDuet-busGDH-Dzip1/ecoISOの制限酵素Xho IおよびAvr IIの認識サイトに挿入することによって、His-busGDHのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip1配列[配列番号５３]を融合した融合タンパク質とecoISOのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip2配列[配列番号５６]を融合した融合タンパク質の共発現ベクターpETDuet-busGDH-Dzip1/ecoISO-Dzip2[配列番号１２５]を作製することができる。
【０２８９】
次にBacillus subtilis [ATCC 27370]のゲノムDNA鋳型にして、合成オリゴDNA（配列番号１２及び配列番号２）をプライマーとして用いてPCRを行い、８０５ｂｐのDNA増幅産物を得る。
【０２９０】
このDNA増幅産物を制限酵素Nco IおよびHind IIIで消化切断し、pCDFDuet-1 (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、busGDH発現ベクターpCDFDuet-busGDHを作製する。
【０２９１】
次にEscherichia coli  [ATCC 29425]のゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１３４４ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGcaagcctattttgaccagctcgatcgcgtt-3' (NdeI) [配列番号１２３]
5'-aataatCTCGAGttatttgtcgaacagataatggtttaccag-3' (XhoI) [配列番号１２６]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pCDFDuet-busGDHの同じ制限酵素サイトに挿入することによって、busGDH、ecoISO共発現ベクターpCDFDuet-busGDH-ecoISO [配列番号１２７]を作製する。
【０２９２】
発現ベクターpETDuet-busGDH::ecoISOおよびpCDFDuet-busGDH-ecoISOを常法に従いE.coli BL21(DE3)に形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンおよびストレプトマイシンに対する耐性株として選別することができる。この形質転換体を用いて方法１により酵素を調製した。
【０２９３】
次にPseudomonas putida KT2440 [ATCC 47054]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA（配列番号３及び配列番号４）をプライマーとして用いてPCRを行い、７２９ｂｐのDNA増幅産物を得る。
【０２９４】
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、ppuDp-His発現ベクターpET21-ppuDpを作製する。
【０２９５】
発現ベクターpET21-ppuDpを、E.coli BL21(DE3)に常法に従い形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンに対する耐性株として選別することができる。この形質転換体を用いて方法１により酵素を調製した。
【０２９６】
（比較例４９）対照としてのbusGDHおよびecoISOの調製
Bacillus subtilis [ATCC 27370]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA（配列番号１７及び配列番号１８）をプライマーとして用いてPCRを行い、約８００ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、busGDH-His発現ベクターpET21-busGDHを作製する。
【０２９７】
次にEscherichia coli  [ATCC 29425]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１３４１ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGcaagcctattttgaccagctcgatcgcgtt-3' (NdeI) [配列番号１２３]
5'-aataatCTCGAGtttgtcgaacagataatggtttaccagatt-3' (XhoI) [配列番号１２４]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、ecoISO-His発現ベクターpET21-ecoISOを作製する。
【０２９８】
次にPseudomonas putida KT2440 [ATCC 47054]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA（胚列番号３及び配列番号４）をプライマーとして用いてPCRを行い、７２９ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、ppuDp-His発現ベクターpET21-ppuDpを作製する。
【０２９９】
発現ベクターpET21-busGDH、pET21-ecoISOおよびpET21-ppuDpをそれぞれ個別に、E.coli BL21(DE3)に常法に従い形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンに対する耐性株として選別することができる。
【０３００】
これらの形質転換体を個々に用いて方法２により酵素を調製した。
【０３０１】
（実施例５０）フルクトースセンサー
酵素電極の構成を図４８に示す。導電性基体２０は直径３ｍｍのグラッシーカーボンである。導電性基体２０上に実施例４９で調製したBacillus subtilis由来のグルコースデヒドロゲナーゼ（busGDH）とEscherichia coli由来のキシロースイソメラーゼ（ecoISO）との会合タンパク質（His-busGDH-Dzip1/ecoISO-Dzip2）、Pseudomonas putida由来のジアフォラーゼ（ppuDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。この酵素電極に固定された成分の配合は以下のとおりである。
・His-busGDH-Dzip1/ecoISO-Dzip2（busGDH：０．３ユニット、ecoISO：０．６ユニット）
・ppuDp：０．６ユニット
・Fc-PAA：１６μｇ
・PEGDE：１０μｇ
この酵素電極を、図１０における作用電極４として用いることによってフルクトースセンサーを構成する。試料溶液３としては、所定濃度のフルクトース、および１ｍM  NADを含む０．１M  PIPES−NaOH緩衝水溶液（ｐH７．５）を用いる。作用電極４には参照極６に対して３００ｍVの電位を印加する。このとき、試料溶液３中のフルクトースはキシロースイソメラーゼの存在下でグルコースに変換される。次に前記キシロースイソメラーゼに会合したグルコースデヒドロゲナーゼの存在下でグルコースはグルコノラクトンに酸化されると同時にNADがNADHに還元される。生成したNADHはジアフォラーゼの存在下でNADに酸化され、この反応で電子伝達メディエータであるフェロセンが酸化され、フェリシニウムイオンが生成される。作用電極４には参照極６に対して３００ｍVの電位が印加されているため、フェリシニウムイオンは作用電極４から電子をうけとりフェロセンに還元される。作用電極４での電子の移動による電流を測定することにより、試料溶液中のフルクトース濃度を測定する。
【０３０２】
（比較例５０）フルクトースセンサー
比較例４９で調製した酵素を用いる以外は実施例５０と同様にして図５０の構成の酵素電極を作製する。この酵素電極に固定された成分の配合は以下のとおりである。
・busGDH：０．３ユニット
・ecoISO：０．６ユニット
・ppuDp：０．６ユニット
・Fc-PAA：１６μｇ
・PEGDE：１０μｇ
この酵素電極を、図１０における作用電極４として用いることによってフルクトースセンサーを構成し、実施例５０と同様にしてフルクトース濃度に応じた還元電流を測定する。
実施例５０と比較例５０との相違は、図１３のＡとＢの相違に類似する。
【０３０３】
（実施例５１）フルクトース燃料電池
酵素電極の構成を図４８に示す。導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンである。導電性基体２０上に実施例４９で調製したBacillus subtilis由来のグルコースデヒドロゲナーゼ（busGDH）とEscherichia coli由来のキシロースイソメラーゼ（ecoISO）との会合タンパク質（His-busGDH-Dzip1/ecoISO-Dzip2）、Pseudomonas putida由来のジアフォラーゼ（ppuDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。この酵素電極に固定された成分の配合は以下のとおりである。
・His-busGDH-Dzip1/ecoISO-Dzip2（busGDH：０．３ユニット、ecoISO：０．６ユニット）
・ppuDp：０．６ユニット
・Fc-PAA：１６μｇ
・PEGDE：１０μｇ
この酵素電極を図１１におけるアノード電極として燃料電池を作製する。電解質溶液３は、１００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭフルクトース、および１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）である。アノード電極１５とカソード電極１６の間に所定の電圧を印加し、電圧−電流特性を測定し、以下の結果を得た。
・短絡電流密度：１１０６μＡ／ｃｍ2
・最大電力：１０１μＷ／ｃｍ2
（比較例５１）フルクトース燃料電池
比較例４９で調製した酵素を用いる以外は実施例５１と同様にして図５０の構成の酵素電極を作製した。この酵素電極に固定された成分の配合は以下のとおりである。
・busGDH：０．３ユニット
・ecoISO：０．６ユニット
・ppuDp：０．６ユニット
・Fc-PAA：１６μｇ
・PEGDE：１０μｇ
この酵素電極を用いる以外は実施例５１と同様にして燃料電池を作製し、電圧−電流特性を測定し、以下の結果を得た。
・短絡電流密度：３１０μＡ／ｃｍ2
・最大電力：３１μＷ／ｃｍ2
実施例５１と比較例５１から、実施例５１のフルクトース燃料電池の方が、比較例５１のフルクトース燃料電池よりも、電流密度が高く、より大きな電流を取り出せることが明らかとなった。酵素電極上に固定されているグルコースデヒドロゲナーゼ、キシロースイソメラーゼ、およびジアフォラーゼの量は同じであるにもかかわらず、実施例５１の燃料電池においては、グルコースデヒドロゲナーゼとキシロースイソメラーゼが会合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、グルコースを介したフルクトースからグルコノラクトンへの変換・酸化反応が速やかに行われ、結果として単位時間内に生成するNADHの量が多いためと考えられた。
【０３０４】
（実施例５２）フルクトース電気化学反応装置
実施例５１で作製した酵素電極を用い図１０に示す電気化学反応装置を作製する。１００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭフルクトース、および１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）電解液を試料溶液３として使用し、窒素雰囲気下０．３ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌの電位を１００分間印加し、生成物を高速液体クロマトグラフィーで定量する。反応電解液からは、グルコノラクトンが検出され、反応電荷量と、生成グルコノラクトン量には、高い相関関係があり、反応が定量的に進行することがわかる。
【０３０５】
（比較例５２）フルクトース電気化学反応装置
比較例５１で作製した酵素電極を用いる以外は実施例５２と同様にして電気化学反応装置を作製し、電気化学反応を行なう。反応電解液からは、グルコノラクトンが検出され、反応電荷量と、生成グルコノラクトン量には、高い相関関係があり、反応が定量的に進行することがわかる。しかしながら実施例５２の場合よりも単位時間あたりの反応電荷量は小さい値であることがわかる。
【０３０６】
実施例５２と比較例５２から、実施例５２のフルクトース電気化学反応装置の方が、比較例５２のフルクトース電気化学反応装置よりも、単位時間あたりの反応電荷量が高く、より効率的にフルクトースをグルコノラクトンに変換出来ることが明らかとなる。酵素電極上に固定されているグルコースデヒドロゲナーゼ、キシロースイソメラーゼ、及びジアフォラーゼの量は同じである。それにもかかわらず、実施例５２の電気化学反応装置においては、グルコースデヒドロゲナーゼとキシロースイソメラーゼが会合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、グルコースを介したフルクトースからグルコノラクトンへの変換・酸化反応が速やかに行われ、結果として単位時間内に生成するNADHの量が多いためと考えられた。
【０３０７】
（実施例５３）
Pyrococcus furiosus由来のグルコースデヒドロゲナーゼ（pfuGDH）とThermotoga maritima由来のキシロースイソメラーゼ（tmaISO）との会合タンパク質（His-pfuGDH-Dzip1およびtmaISO-Dzip2）[配列番号１３５、１３６]の調製
Pyrococcus furiosus [ATCC 43587]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA（配列番号１９及び配列番号２０）をプライマーとして用いてPCRを行い、７９９ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素BamHIおよびHind IIIで消化切断し、pETDuet-1(Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、His-pfuGDH発現ベクターpETDuet-pfuGDHを作製する。
【０３０８】
次にThermotoga maritima  [ATCC 43589]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１３５６ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGgcagaatttttcccagaaatcccaaagatt-3' (NdeI) [配列番号１３０]
5'-aataatCTCGAGcctcagttctgctattgtcttcactatgta-3' (XhoI) [配列番号１３１]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pETDuet-pfuGDHの同じ制限酵素サイトに挿入することによって、His-pfuGDH、tmaISO共発現ベクターpETDuet-pfuGDH-tmaISOを作製する。
【０３０９】
次に、実施例１７と同様にして5'末端リン酸化合成オリゴDNA（配列番号５１及び配列番号５２）からDNA断片（二本鎖）を得る。このDNA断片を、pETDuet-pfuGDH-tmaISOの制限酵素Hind IIIおよびAfl IIの認識サイトに挿入することによって、His-pfuGDHのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip1配列[配列番号５３]を融合した融合タンパク質とtmaISOの共発現ベクターpETDuet-pfuGDH-Dzip1/tmaISOを作製する。
【０３１０】
次に、実施例１７と同様にして5'末端リン酸化合成オリゴDNA（配列番号５４及び配列番号５５）からDNA断片を得る。このDNA断片を、pETDuet-pfuGDH-Dzip1/tmaISOの制限酵素Xho IおよびAvr IIの認識サイトに挿入することによって、His-pfuGDHのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip1配列[配列番号５３]を融合した融合タンパク質とtmaISOのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip2配列[配列番号５６]を融合した融合タンパク質の共発現ベクターpETDuet-pfuGDH-Dzip1/tmaISO-Dzip2[配列番号１３２]を作製する。
【０３１１】
次にPyrococcus furiosus [ATCC 43587]のゲノムDNA鋳型にして、合成オリゴDNA（配列番号２４及び配列番号２０）をプライマーとして用いてPCRを行い、７９７ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nco IおよびHind IIIで消化切断し、pCDFDuet-1 (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、pfuGDH発現ベクターpCDFDuet-pfuGDHを作製する。
【０３１２】
次にThermotoga maritima  [ATCC 43589]のゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１３５６ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGgcagaatttttcccagaaatcccaaagatt-3' (NdeI) [配列番号１３０]
5'-aataatCTCGAGtcacctcagttctgctattgtcttcactat-3' (XhoI) [配列番号１３３]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pCDFDuet-pfuGDHの同じ制限酵素サイトに挿入することによって、pfuGDH、tmaISO共発現ベクターpCDFDuet-pfuGDH-tmaISO [配列番号１３４]を作製する。
【０３１３】
発現ベクターpETDuet-pfuGDH::tmaISOおよびpCDFDuet-pfuGDH-tmaISOを常法に従いE.coli BL21(DE3)に形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンおよびストレプトマイシンに対する耐性株として選別することができる。この形質転換体を用いて方法１により酵素を調製した。
【０３１４】
次にPyrococcus horikoshii KT2440 [ATCC 700860]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA（配列番号２１及び配列番号２２）をプライマーとして用いてPCRを行い、１３４４ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、phoDp-His発現ベクターpET21-phoDpを作製する。
【０３１５】
発現ベクターpET21-phoDpを、E.coli BL21(DE3)に常法に従い形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンに対する耐性株として選別することができる。この形質転換体を用いて方法１により酵素を調製した。こうして得られる酵素を用いて、酵素電極等を構成できる。
【０３１６】
（実施例５７）
Saccharomyces cerevisiae由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（sceADH）、Gluconobacter oxydans由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（goxALDH）およびPseudomonas putida 由来のジアフォラーゼ（ppuDp）との会合タンパク質（His-sceADH-Dzip3、goxALDH-Dzip4/ppuDp-Dzip4およびppuDp-Dzip5）[配列番号１５０、１５１、１５２]の調製
Saccharomyces cerevisiae [ATCC 47058]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA（配列番号３１及び配列番号３２）をプライマーとして用いてPCRを行い、１０７５ｂｐのDNA増幅産物を得る。
【０３１７】
このDNA増幅産物を制限酵素BamHIおよびHind IIIで消化切断し、pETDuet-1(Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、His-sceADH発現ベクターpETDuet-sceADHを作製する。
【０３１８】
次にGluconobacter oxydans  [ATCC 621H]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１５６０ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGacggcatctctccgttgcgaagtggcagcg-3' (NdeI) [配列番号１０９]
5'-aataatCTCGAGggcgtccgccgaaccgccatacacatcgga-3' (XhoI) [配列番号１１０]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pETDuet-sceADHの同じ制限酵素サイトに挿入することによって、His-sceADH、goxALDH共発現ベクターpETDuet-sceADH-goxALDHを作製する。
【０３１９】
次に以下の配列番号１３７の5'末端リン酸化合成オリゴDNA及び配列番号１３８のDNAをTEバッファー中で、等量混合し、加熱後徐冷することによってアニーリングする。
5'-AGCTTggcggcggcagcggcggcggcagcggcggcggcagcgcggaaattgcggcgattgaatatgaacaggcggcgattaaagaagaaattgcggcgattaaagataaaattgcggcgattaaagaatatattgcggcgatttaaC-3' [配列番号１３７]
5'-TTAAGttaaatcgccgcaatatattctttaatcgccgcaattttatctttaatcgccgcaatttcttctttaatcgccgcctgttcatattcaatcgccgcaatttccgcgctgccgccgccgctgccgccgccgctgccgccgccA-3' [配列番号１３８]
このDNA断片を、pETDuet-sceADH-goxALDHの制限酵素Hind IIIおよびAflIIの認識サイトに挿入することによって、His-sceADHのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip3配列[配列番号１３９]を融合した融合タンパク質とgoxALDHの共発現ベクターpETDuet-sceADH-Dzip3/goxALDHを作製する。
【０３２０】
次に5'末端リン酸化合成オリゴDNA（配列番号１４０及び配列番号１４１）をTEバッファー中で、等量混合し、加熱後徐冷することによってアニーリングする。
5'-TCGAGggcggcggcagcggcggcggcagcggcggcggcagcgaaaaaattgcggcgattaaagaagaacaggcggcgattgaagaagaaattcaggcgattaaagaagaaattgcggcgattaaatatctgattgcggcgatttaaC-3' [配列番号１４０]
5'-CTAGGttaaatcgccgcaatcagatatttaatcgccgcaatttcttctttaatcgcctgaatttcttcttcaatcgccgcctgttcttctttaatcgccgcaattttttcgctgccgccgccgctgccgccgccgctgccgccgccC-3' [配列番号１４１]
このDNA断片を、pETDuet-sceADH-Dzip3/goxALDHの制限酵素Xho IおよびAvr IIの認識サイトに挿入することによって、His-sceADHのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip3配列[配列番号１３９]を融合した融合タンパク質とgoxALDHのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip4配列[配列番号１４２]を融合した融合タンパク質の共発現ベクターpETDuet-sceADH-Dzip3/goxALDH-Dzip4[配列番号１４３]を作製する。
【０３２１】
次にSaccharomyces cerevisiae [ATCC 47058]のゲノムDNA鋳型にして、合成オリゴDNA（配列番号３４及び配列番号３２）をプライマーとして用いてPCRを行い、１０７３ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nco IおよびHind IIIで消化切断し、pCDFDuet-1 (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、sceADH発現ベクターpCDFDuet-sceADHを作製する。
【０３２２】
次にGluconobacter oxydans  [ATCC 621H]のゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１５６０ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGacggcatctctccgttgcgaagtggcagcg-3' (NdeI) [配列番号１０９]
5'-aataatCTCGAGtcaggcgtccgccgaaccgccatacacatc-3' (XhoI) [配列番号１１２]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pCDFDuet-sceADHの同じ制限酵素サイトに挿入することによって、sceADH、goxALDH共発現ベクターpCDFDuet-sceADH-goxALDH [配列番号１１３]を作製する。
【０３２３】
次にPseudomonas putida KT2440 [ATCC 47054]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、７２５ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCCATGGttgtgaatgtactgatcgtccacgctcacc-3' (NcoI) [配列番号１４４]
5'-aataatAAGCTTcgtcagcgggtacaacgcttcatcgaactg-3' (HindIII) [配列番号１４５]
このDNA増幅産物を制限酵素Nco IおよびHin dIIIで消化切断し、pCOLADuet-1 (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、ppuDp発現ベクターpCOLADuet-ppuDpを作製する。
【０３２４】
また、Pseudomonas putida KT2440のゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA（配列番号３及び配列番号１３）をプライマーとして用いてPCRを行い、７２９ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pCOLADuet-ppuDpの同じ制限酵素サイトに挿入することによって、ppuDp共発現ベクターpCOLADuet-ppuDp/ppuDpを作製する。
【０３２５】
次に以下の配列番号１４６の5'末端リン酸化合成オリゴDNA及び配列番号１４７のDNAをTEバッファー中で、等量混合し、加熱後徐冷することによってアニーリングする。
5'-AGCTTggcggcggcagcggcggcggcagcggcggcggcagcgcggaaattgcggcgattaaatataaacaggcggcgattaaaaacgaaattgcggcgattaaacaggaaattgcggcgattgaacagatgattgcggcgatttaaC-3' [配列番号１４６]
5'-TTAAGttaaatcgccgcaatcatctgttcaatcgccgcaatttcctgtttaatcgccgcaatttcgtttttaatcgccgcctgtttatatttaatcgccgcaatttccgcgctgccgccgccgctgccgccgccgctgccgccgccA-3' [配列番号１４７]
このDNA断片を、pCOLADuet-ppuDp/ppuDpの制限酵素Hind IIIおよびAflIIの認識サイトに挿入することによって、ppuDpのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip5配列[配列番号１４８]を融合した融合タンパク質とppuDpの共発現ベクターpCOLADuet-ppuDp-Dzip5/ppuDp[配列番号１４９]を作製する。
【０３２６】
発現ベクターpETDuet-sceADH-Dzip4/goxALDH-Dzip5、pCDFDuet-sceADH-goxALDHおよびpCOLADuet-ppuDp-Dzip5/ppuDpを常法に従いE.coli BL21(DE3)に形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリン、ストレプトマイシンおよびカナマイシンに対する耐性株として選別することができる。この形質転換体を用いて方法１により酵素を調製した。
【０３２７】
（実施例５８）アルコールセンサー
酵素電極の構成を図５４に示す。導電性基体２０は直径３ｍｍのグラッシーカーボンである。導電性基体２０上に実施例５７で調製したSaccharomyces cerevisiae由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（sceADH）、Gluconobacter oxydans由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（goxALDH）およびPseudomonas putida 由来のジアフォラーゼ（ppuDp）の会合タンパク質（His-sceADH-Dzip3/goxALDH-Dzip4/ppuDp-Dzip5）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。この酵素電極に固定された成分の配合は以下のとおりである。
・His-sceADH-Dzip3/goxALDH-Dzip4/ppuDp-Dzip5（sceADH：０．３ユニット、goxALDH：０．６ユニット、ppuDp：０．６ユニット）
・Fc-PAA：１６μｇ
・PEGDE：１０μｇ
この酵素電極を、図１０における作用電極４として用いることによってアルコールセンサーを構成する。試料溶液３としては、所定濃度のアルコール（エタノール）、および１ｍM  NADを含む０．１M  PIPES−NaOH緩衝水溶液（ｐH７．５）を用いる。作用電極４には参照極６に対して３００ｍVの電位を印加する。このとき、試料溶液３中のアルコールはアルコールデヒドロゲナーゼの存在下でアセトアルデヒドに酸化され、この反応でＮＡＤがNADHに還元される。次に前記アルコールデヒドロゲナーゼに会合したアルデヒドデヒドロゲナーゼの存在下でアセトアルデヒドはカルボン酸に酸化されると同時にNADがNADHに還元される。さらにアルコールデヒドロゲナーゼおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼの両酵素反応により生成したNADHは両酵素に会合したジアフォラーゼの存在下でNADに酸化される。この反応で電子伝達メディエータであるフェロセンが酸化され、フェリシニウムイオンが生成される。作用電極４には参照極６に対して３００ｍVの電位が印加されているため、フェリシニウムイオンは作用電極４から電子をうけとりフェロセンに還元される。作用電極４での電子の移動による電流を測定することにより、試料溶液中のアルコール濃度に応じた還元電流の変化を測定する。
【０３２８】
実施例５８と比較例４２すると、実施例５８のアルコールセンサーの方が、比較例４２のアルコールセンサーよりも、アルコール濃度に対する感度が高く、より低濃度のアルコールを定量出来ることが明らかとなった。酵素電極上に固定されているアルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ及びジアフォラーゼの量は同じである。それにもかかわらず、実施例５８の酵素電極においては、アルコールデヒドロゲナーゼとアルデヒドデヒドロゲナーゼ及びジアフォラーゼが会合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、単位時間内に生成するNADHの量が多いためと考えられる。
実施例５８の酵素を用いて、アルコール燃料電池等も構成できる。
【０３２９】
（実施例６１）Pyrococcus furiosus由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（pfuADH）、Thermus thermophilus由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（tthALDH）およびPyrococcus horikoshii由来のジアフォラーゼ（phoDp）との会合タンパク質（His-pfuADH-Dzip3、tthALDH-Dzip4およびphoDp-Dzip5）[配列番号１５７、１５８、１５９]の調製
Pyrococcus furiosus [ATCC 43587]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA（配列番号３９及び配列番号４０）をプライマーとして用いてPCRを行い、１１４７ｂｐのDNA増幅産物を得る。
【０３３０】
このDNA増幅産物を制限酵素BamHIおよびHind IIIで消化切断し、pETDuet-1(Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、His-pfuADH発現ベクターpETDuet-pfuADHを作製する。
【０３３１】
次にThermus thermophilus  [ATCC BAA-163]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１６１４ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGcgcaaggcggcaggcaagtacgggaacacc-3' (NdeI) [配列番号１１６]
5'-aataatCTCGAGaagccccagcacctccccccagggcgtggg-3' (XhoI) [配列番号１１７]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pETDuet-pfuADHの同じ制限酵素サイトに挿入することによって、His-pfuADH、tthALDH共発現ベクターpETDuet-pfuADH-tthALDHを作製する。
【０３３２】
次に5'末端リン酸化合成オリゴDNA（配列番号１３７及び配列番号１３８）をTEバッファー中で、等量混合し、加熱後徐冷することによってアニーリングする。
5'-AGCTTggcggcggcagcggcggcggcagcggcggcggcagcgcggaaattgcggcgattgaatatgaacaggcggcgattaaagaagaaattgcggcgattaaagataaaattgcggcgattaaagaatatattgcggcgatttaaC-3' [配列番号１３７]
5'-TTAAGttaaatcgccgcaatatattctttaatcgccgcaattttatctttaatcgccgcaatttcttctttaatcgccgcctgttcatattcaatcgccgcaatttccgcgctgccgccgccgctgccgccgccgctgccgccgccA-3' [配列番号１３８]
このDNA断片を、pETDuet-pfuADH-tthALDHの制限酵素Hind IIIおよびAfl IIの認識サイトに挿入することによって、His-pfuADHのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip3配列[配列番号１３９]を融合した融合タンパク質とtthALDHの共発現ベクターpETDuet-pfuADH-Dzip3/tthALDHを作製する。
【０３３３】
次に5'末端リン酸化合成オリゴDNA（配列番号１４０及び配列番号１４１）をTEバッファー中で、等量混合し、加熱後徐冷することによってアニーリングする。
5'-TCGAGggcggcggcagcggcggcggcagcggcggcggcagcgaaaaaattgcggcgattaaagaagaacaggcggcgattgaagaagaaattcaggcgattaaagaagaaattgcggcgattaaatatctgattgcggcgatttaaC-3' [配列番号１４０]
5'-CTAGGttaaatcgccgcaatcagatatttaatcgccgcaatttcttctttaatcgcctgaatttcttcttcaatcgccgcctgttcttctttaatcgccgcaattttttcgctgccgccgccgctgccgccgccgctgccgccgccC-3' [配列番号１４１]
このDNA断片を、pETDuet-pfuADH-Dzip3/tthALDHの制限酵素Xho IおよびAvr IIの認識サイトに挿入することによって、His-pfuADHのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip3配列[配列番号１３９]を融合した融合タンパク質とtthALDHのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip4配列[配列番号１４２]を融合した融合タンパク質の共発現ベクターpETDuet-pfuADH-Dzip3/tthALDH-Dzip4[配列番号１５３]を作製する。
【０３３４】
次にPyrococcus furiosus [ATCC 43587]のゲノムDNA鋳型にして、合成オリゴDNA（配列番号４２及び配列番号４０）をプライマーとして用いてPCRを行い、１１４５ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nco IおよびHind IIIで消化切断し、pCDFDuet-1 (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、pfuADH発現ベクターpCDFDuet-pfuADHを作製する。
【０３３５】
次にThermus thermophilus  [ATCC BAA-163]のゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１６１４ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGcgcaaggcggcaggcaagtacgggaacacc-3' (NdeI) [配列番号１１６]
5'-aataatCTCGAGttaaagccccagcacctccccccagggcgt-3' (XhoI) [配列番号１１９]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pCDFDuet-pfuADHの同じ制限酵素サイトに挿入することによって、pfuADH、tthALDH共発現ベクターpCDFDuet-pfuADH-tthALDH [配列番号１２０]を作製する。
【０３３６】
次にPyrococcus horikoshii [ATCC 700860]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１３４４ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCCATGGagatagtagttataggatctggaactg-3' (NcoI) [配列番号１５４]
5'-aataatAAGCTTtgacttaaattttctcatggccatttcagc-3' (HindIII) [配列番号１５５]
このDNA増幅産物を制限酵素Nco IおよびHin dIIIで消化切断し、pCOLADuet-1 (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、phoDp発現ベクターpCOLADuet-phoDpを作製する。
【０３３７】
また、Pyrococcus horikoshiiのゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA（配列番号２１及び配列番号２５）をプライマーとして用いてPCRを行い、１３４４ｂｐのDNA増幅産物を得る。このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで消化切断し、pCOLADuet-phoDpの同じ制限酵素サイトに挿入することによって、phoDp共発現ベクターpCOLADuet-phoDp/phoDpを作製する。
【０３３８】
次に5'末端リン酸化合成オリゴDNA（配列番号１４６の及び配列番号１４７）をTEバッファー中で、等量混合し、加熱後徐冷することによってアニーリングする。
5'-AGCTTggcggcggcagcggcggcggcagcggcggcggcagcgcggaaattgcggcgattaaatataaacaggcggcgattaaaaacgaaattgcggcgattaaacaggaaattgcggcgattgaacagatgattgcggcgatttaaC-3' [配列番号１４６]
5'-TTAAGttaaatcgccgcaatcatctgttcaatcgccgcaatttcctgtttaatcgccgcaatttcgtttttaatcgccgcctgtttatatttaatcgccgcaatttccgcgctgccgccgccgctgccgccgccgctgccgccgccA-3' [配列番号１４７]
このDNA断片を、pCOLADuet-phoDp/phoDpの制限酵素Hind IIIおよびAflIIの認識サイトに挿入することによって、phoDpのＣ末側に会合部位配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ−Dzip5配列[配列番号１４８]を融合した融合タンパク質とphoDpの共発現ベクターpCOLADuet-phoDp-Dzip5/phoDp[配列番号１５６]を作製する。
【０３３９】
発現ベクターpETDuet-pfuADH-Dzip3/tthALDH-Dzip4、pCDFDuet-pfuADH-tthALDHおよびpCOLADuet-phoDp-Dzip5/phoDpを常法に従いE.coli BL21(DE3)に形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリン、ストレプトマイシンおよびカナマイシンに対する耐性株として選別することができる。
【０３４０】
この形質転換体を用いて方法１により酵素を調製する。こうして得られる酵素を用いて、酵素電極や燃料電池を構成できる。
【０３４１】
なお、以上実施例、比較例を用いて本発明につき説明したが、好熱菌由来の酵素の会合タンパク質を用いた方が、常温菌由来の酵素の会合タンパク質を用いた場合に比して、時間が経過しても検出感度の低下がより少なく、耐久性に優れている。また、これらの酵素を用いて燃料電池を構成した場合にも、好熱菌由来の酵素の方が、時間経過に対する出力低下の傾向は、より小さい。
【図面の簡単な説明】
【０３４２】
【図１】本発明の酵素電極における一形態として、グルコースデヒドロゲナーゼ（GDH）とジアフォラーゼ（Dp）との会合タンパク質を構成要素とする酵素電極の概念図である。
【図２】本発明の酵素電極における一形態として、アルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）とジアフォラーゼ（Dp）との会合タンパク質を構成要素とする酵素電極の概念図である。
【図３】本発明の酵素電極における一形態として、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）とジアフォラーゼ（Dp）との会合タンパク質を構成要素とする酵素電極の概念図である。
【図４】本発明酵素電極における一形態として、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（MDH）とジアフォラーゼ（Dp）との会合タンパク質を構成要素とする酵素電極の概念図である。
【図５】本発明の酵素電極における一形態として、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（EDH）とジアフォラーゼ（Dp）との会合タンパク質を構成要素とする酵素電極の概念図である。
【図６】本発明の酵素電極における一形態として、アルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）とアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ALDH）との会合タンパク質を構成要素とする酵素電極の概念図である。
【図７】本発明の酵素電極における一形態として、イソメラーゼ（ISO）とグルコースデヒドロゲナーゼ（GDH）との会合タンパク質を構成要素とする酵素電極の概念図である。
【図８】本発明の酵素電極における一形態として、アルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ALDH）およびジアフォラーゼ（Dp）の会合タンパク質を構成要素とする酵素電極の概念図である。
【図９】本発明の実施の形態におけるポリペプチド会合部模式図である。
【図１０】本発明の酵素電極を用いて構成したセンサーの概念図である。
【図１１】本発明の酵素電極を用いて構成した燃料電池の概念図である。
【図１２】本発明の実施例に係るグルコースデヒドロゲナーゼとジアフォラーゼとの会合タンパク質を構成要素とする酵素電極部の概念図である。
【図１３】実施例２に係るグルコースセンサーを用いて測定された基質濃度と電流密度の関係を示す図である。
【図１４】本発明の比較例に係るグルコースデヒドロゲナーゼとジアフォラーゼとを構成要素とする酵素電極部の概念図である。
【符号の説明】
【０３４３】
１  ウォータージャケットセル
２  蓋
３  試料溶液
４  作用電極
５  白金線対極
６  銀塩化銀参照電極
７  作用極リード
８  対極リード
９  参照極リード
１０  ポテンショスタット
１１  ガス吹込み口
１２  ガスチューブ
１３  温調水流入口
１４  温調水排出口
１５  アノード
１６  カソード
１７  多孔質ポリプロピレンフィルム
１８  ガス排出口
１９  電解質溶液
２０  導電性基体
【図１】
2007163268.tif 000002
【図２】
2007163268.tif 000003
【図３】
2007163268.tif 000004
【図４】
2007163268.tif 000005
【図５】
2007163268.tif 000006
【図６】
2007163268.tif 000007
【図７】
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【図８】
2007163268.tif 000009
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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