(57)【要約】【課題】灌流培養において、培養液内への気泡の蓄積による培養液量の減少を抑えることにより、培養液量を一定に維持し、長期間の灌流培養を可能にする細胞培養容器を提供する。【解決手段】培養液容器内の底部に培養液溜り部分を設け、該培養液容器内から容器外へと培養液を排出するための排出管の先端を該培養液溜りの液面と接するように配置することによって上記培養液溜りから気泡を除去する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養液を灌流しながら細胞を培養するための細胞培養容器であって、上面は蓋で密閉し、外部から培養液を流し入れ上記容器内に培養液溜りを作るための注入管と、該培養液溜りから上方外部へと培養液を排出するための排出管を取り付け、培養液溜りの培養液液面と排出管の容器内の先端とが上方から接するように配置して、上記培養液溜り内で発生あるいは培養液溜り内に混入した気泡を上記培養液溜りから除去し、培養液容器の培養液を一定の液量に維持することを特徴とする細胞培養容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は，細胞へ培養液や薬剤を連続的に供給して灌流培養するための細胞培養容器に関する。
【背景技術】
【０００２】  細胞を培養するための一手法である灌流培養は、送液ポンプなどを用いて連続的に培養液を流す培養方法であり、細胞への栄養分供給やガス交換、老廃物の除去などを効率よく行うことができることが知られている。また、この培養方法は連続的に培養液を供給、排出できることから、細胞への薬剤の投与による応答性を調べたり、細胞からの分泌物を回収する目的などにも用いられている。【０００３】  灌流培養用の細胞培養容器には目的に応じてさまざまな様式があるが、培養容器に外部からの配管を接続できるようになっているという基本構造は共通である。測定・観察用として一般的な灌流培養容器の一例を図２に示す。培養液容器９は、細胞を付着させるための平板状の基底面１２と培養液を保持するための側壁１３とで囲まれ、蓋１４で密閉されるような構造になっている。また、培養液を培養液容器９に注ぎ入れるための注入管１０と、培養液を培養液容器９から排出させるための排出管１１とが側壁１３に設けてある。【０００４】  このような細胞培養容器を用いて実際に灌流培養する際には、始めは培養液容器９が培養液で完全に満たされた状態になるが、徐々に配管内で発生した気泡が培養液容器９へ混入する。混入した気泡は培養液容器９の上層に留まり排出管から出て行き難い。そして次第に気泡が培養液容器９に蓄積していくと共に培養液容器９内の培養液量は減ってしまう。培養液量の減少は、栄養分の供給の効率低下に因り細胞の生育の妨げにつながる。また最悪の場合、培養液容器９内がほとんど気体で占められるまでに達し、培養液は基底面の隅を側壁に沿ってわずかに流れていくのみとなってしまい細胞が死滅してしまう結果となる。【０００５】  培養液体からの気泡の発生を防ぐ手段としては脱気があるが、細胞を生育させるためには酸素供給が不可欠であるため培養液を脱気することはできない。灌流培養液容器９の気泡の蓄積を防ぐ手段は、ある程度気泡が蓄積したところで培養液容器９に注射器を刺し込んで気泡を吸い出す方法や、培養容器へ接続する配管にエアトラップを設けて発生した気泡を除外する方法が採られている。しかし、前者の方法の場合は実験者が気泡の蓄積を監視してその都度除去操作を行わなければならず煩雑であり、後者の方法の場合はエアトラップと培養液溜りの間、および培養液容器内で発生した気泡は除外できない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  本発明は、灌流培養において、培養液溜り内への気泡の蓄積による培養液量の減少を抑えることにより培養液量を一定に維持し、長期間の灌流培養を可能にする細胞培養容器を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】  上記課題を解決するため、培養液容器内の底部に培養液溜り部分を設け、該培養液容器内から培養液容器外へと培養液を排出するための排出管の先端を培養液溜りの液面と接するように配置することによって、培養液溜り内に発生あるいは培養液溜り内へ混入した気泡が蓄積するのを防ぐために培養液溜りから気泡を除去し、培養液溜り内の培養液を一定の液量に維持できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【０００８】  本発明による細胞培養容器を用いることで、細胞の灌流培養において、培養液溜り内の気泡の蓄積による培養液量の減少を防ぐことができ、液位を一定に維持できる。そして、本発明による細胞培養容器があれば、他に特別な器具を用意したり、培養中に実験者が特別な操作をすることなく上記効果を得ることができるので簡便である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】  図１は本発明実施による最良の形態の細胞培養容器を示したもので、図１（Ａ）は上面図、図１（Ｂ）は縦断面図である。培養液溜り４は、細胞を付着させるための平板状の基底面５が底となり、培養液保持のための側壁で囲まれ、培養容器は、上から蓋６で密閉される。蓋６には注入管２および排出管３が設けてあり、これらの管を通じて培養液の注入、排出を行う。排出管の容器内先端８の位置は、培養液溜り４の液面に接するように調整する。
以上のように配置された排出管を備えることにより、培養液溜り４の培養液液面７が規定位置に維持されることを以下、詳細に説明する。【００１０】  図１に示す細胞培養容器１において、注入管２から培養液容器内に入り込む培養液は培養液溜り４の液位を上昇させる。そして、液面７が規定位置に達すると、その液面が排出管先端８と接し、排出管３から培養液容器外へ培養液が排出される。培養液を長時間流し入れていると、度々、培養液溜り４内の培養液に気泡が発生、あるいは注入管を通じて気泡が混入し始める。気泡は培養液溜り４の上方に浮き上がるか、あるいは培養液溜り４の側壁の表面に付着する。この付着した気泡も徐々に成長してある程度大きくなると上方へ浮き上がってくる。【００１１】  培養液容器１は密閉されているので、気泡の蓄積によって培養液の液面７が規定より押し下げられる。すると、排出管先端８と培養液面とが離れ、培養液が排出管３から排出されなくなる。一方で注入管２からの培養液の流入は継続しているので培養液溜り４の液面は上昇する。この上昇に押されて排出管３から培養液溜り４内の空気が排出される。培養液の液面７が上がると、排出管先端８と培養液面とが接するようになり、再び排出管３から培養液が排出されるようになる。これら挙動の繰り返しにより、培養液溜り４内への気泡の蓄積で増えた余分な空気が排出され、液面７を規定に維持することができる。
【実施例】
【００１２】  次に、本発明による実施の一例を説明する。
まず、図１に示すような細胞培養容器１を作製するのに市販の１２穴培養プレートを培養液溜り４として利用し、シリコーン栓をカットして蓋６とした。この蓋に穴を２箇所開け、これらの穴へ内径１ｍｍのピークチューブを挿入し、それぞれ注入管２、排出管３とした。排出管先端８の高さ位置は、培養液溜り４として０．５ｍＬの培養液を入れた際の液面に接するように調整した。また、以下の方法により培養液溜り４の基底面５にコラーゲンをコーティングした。【００１３】  タイプＩコラーゲンのｐＨ３．０、１ｍＭ希塩酸溶液を培養液容器１に注いで基底面５に薄く引き伸ばし余分な液を吸い出した。そしてクリーンベンチで乾燥させた後、リン酸緩衝液で２回洗浄した。
次にこの細胞培養容器を用いて灌流培養を行うための準備を行った。まず２種類の培養液を以下のようにして調製した。
培養液（Ａ）：ダルベッコ改変イーグル培地にウシ胎仔血清を１０％になるように加える。
培養液（Ｂ）：培養液（Ａ）にＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）緩衝液を２０ｍＭになるように加える。
ラット繊維芽細胞株Ｒａｔ１を１×１０５個／ｍＬになるように培養液（Ａ）に懸濁し、この細胞懸濁液０．５ｍＬを細胞培養容器１に注いで培養液溜り４とし、３７℃、５％ＣＯ２に設定した恒温槽で静置培養した。【００１４】  ２日間培養した後、細胞培養容器１を恒温槽から取り出し、培養液溜り４の培養液を培養液（Ｂ）０．５ｍＬに交換した。また、灌流培養前後での細胞の状態を比較するため、倒立型顕微鏡で細胞を観察し、顕微鏡に接続したＣＣＤカメラで画像を撮影した。その画像を図４（Ａ）に示す。【００１５】  続いて、灌流培養を行うために、細胞培養容器１を図３に示すような装置内に接続し装置全体を３７℃恒温槽内に設置した。細胞培養容器１の注入管、排出管にそれぞれシリコーン製で内径１ｍｍの送液チューブ２０を接続し、注入管側の送液チューブの先に培養液ボトル１６を、排出管側の送液チューブの先に排液ボトル１７を接続した。培養液ボトル１６には培養液（Ｂ）を２００ｍＬ入れ、雑菌などが混入しないよう密栓してエア・フィルタ１８を接続した。また、排液ボトル１７も同様に密栓してエア・フィルタ１８を接続した。さらに、培養液ボトル１６と細胞培養容器１の間の送液チューブ２０にペリスタルティック型の送液ポンプ１９を接続した。そして培養液が培養液ボトル１６から細胞培養容器１の方向へ流速１ｍＬ／ｈで流れるように送液ポンプ１９を設定し、送液を開始した。【００１６】  ４日間灌流培養を継続させた後、細胞培養容器を観察すると、培養液溜り内の培養液は０．５ｍＬに保たれていた。また、倒立顕微鏡で細胞を観察し、顕微鏡に接続したＣＣＤカメラで画像を撮影した。図４（Ｂ）にその画像を示す。この画像から、衰弱や死による細胞の培養液溜りの底面からの剥離がほとんど見られず、４日間、細胞の生育が良好に維持されていたことが示された。【００１７】  次に性能の比較の為、図２に示すような従来型の細胞培養容器を用いて同様の培養実験を行った。まず、従来型の細胞培養容器９の作製について説明する。厚さ３ｍｍ、縦２６ｍｍ×横４０ｍｍのシリコーン・シートの中央に直径１６ｍｍの穴をあけ、これを厚さ１ｍｍ、縦２６ｍｍ×横７６ｍｍのスライドガラスの上面に密着させ培養容器９を作製した。また、以下の方法により培養容器９の基底面１２にコラーゲンをコーティングした。【００１８】  タイプＩコラーゲンのｐＨ３．０、１ｍＭ希塩酸溶液を培養容器９に注いで薄く引き伸ばし、余分な液を吸い出した。そしてクリーンベンチで乾燥させた後、リン酸緩衝液で２回洗浄した。【００１９】  次に、ラット繊維芽細胞株Ｒａｔ１を１×１０５個／ｍＬになるように培養液（Ａ）に懸濁し、この細胞懸濁液０．６ｍＬを培養容器９に注いで、３７℃、５％ＣＯ２に設定した恒温槽で静置培養した。２日間培養した後、細胞培養容器を恒温槽から取り出し、この培養液を培養液（Ｂ）０．６ｍＬに交換した。そして、培養容器９に用いたものと同じサイズのスライドガラスを培養液上面に被せて密着させて細胞培養容器の蓋１４とし、液漏れを防ぐために上下のスライドガラスをクリップで挟んだ。また、灌流培養前後での細胞の状態を比較するため、倒立型顕微鏡で細胞を観察し、顕微鏡に接続したＣＣＤカメラで画像を���影した。その画像を図５（Ａ）に示す。【００２０】  続いて、内径０．７ｍｍのシリンジ針を培養容器９の左右の側面から差し込み、それぞれ注入管１０、排出管１１とし、灌流培養を行うために、図３に示すような装置を組み立てた。ただし、図３に示す細胞培養容器１５を図２に示す従来型の培養容器９に置き換えた。培養容器９の注入管側の送液チューブの先に培養液ボトル１６を、排出管側の送液チューブの先に排液ボトル１７を接続し、培養液ボトル１６には培養液（Ｂ）を２００ｍＬ入れ、雑菌などが混入しないよう密栓してエア・フィルタ１８を接続した。また、排液ボトル１７も同様に密栓してエア・フィルタ１８を接続した。さらに、培養液ボトル１６と培養容器９の間の送液チューブ２０にペリスタルティック型の送液ポンプ１９を接続し、装置全体を３７℃恒温槽内に設置した。そして培養液が培養液ボトル１６から培養容器９の方向へ流速１ｍＬ／ｈで流れるように送液ポンプ１９を設定し、送液を開始した。【００２１】  ４日間灌流培養を継続させた後、細胞培養容器を観察すると、培養容器内のほとんどが空気層で満たされており、培養液は基底面の隅を側壁に沿って流れていくのみであった。また、倒立顕微鏡で細胞を観察し、顕微鏡に接続したＣＣＤカメラで画像を撮影した。図５（Ｂ）にその画像を示す。この画像から、細胞は当初の形態と大きく異なり小さく萎縮しており、剥離している箇所も多く見られ、ほとんど死滅していると判断できる状態であった。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明による細胞培養容器の実施例を示す上面図（Ａ）及び縦断面図（Ｂ）である。
【図２】従来の灌流培養用細胞培養容器の一例を示す上面図（Ａ）及び縦断面図（Ｂ）である。
【図３】本発明による細胞培養容器を用いた灌流培養を示す装置全体の図である。
【図４】本発明による細胞培養容器を用いた灌流培養前後の細胞の顕微鏡画像である。
【図５】従来の細胞培養容器を用いた灌流培養前後の細胞の顕微鏡画像である。
【符号の説明】
【００２３】１  細胞培養容器
２  培養液注入管
３  培養液排出管
４  培養液溜り
５  基底面
６  蓋
７  培養液溜り液面
８  排出管先端
９  培養液容器
１０  培養液注入管
１１  培養液排出管
１２  基底面
１３  側壁
１４  蓋
１５  細胞培養容器
１６  培養液ボトル
１７  排液ボトル
１８  エア・フィルタ
１９  送液ポンプ
２０  送液チューブ
２１  培養液
２２  細胞
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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