(57)【要約】【課題】稲等の作物における突然変異系統を、作物の流通市場における任意の段階で正確に、かつ簡便に識別することが出来、特定産地間の農産物の識別（例えば、特定県産と他県産の農産物の識別や特定の栽培地域と他の栽培地域の農産物との識別）を可能にする検出方法を提供すること。【解決手段】試料から調製されたＤＮＡにおける塩基配列の変異の検出方法であって、競合ハイブリダイズを用いるドットブロット法によりＤＮＡ変異を検出することを特徴とする該検出方法、該方法を用いるサイレント突然変異系統識別方法及び農作物の産地識別法、並びに、該方法に使用される、競合ハイブリダイズを用いるドットブロット用キット。【選択図】  図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料から調製されたＤＮＡにおける塩基配列の変異の検出方法であって、競合ハイブリダイズを用いるドットブロット法によりＤＮＡ変異を検出することを特徴とする該検出方法。
【請求項２】
塩基配列の変異がサイレント突然変異である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
サイレント突然変異が人為的な突然変異誘発により作製されたものである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
サイレント突然変異がイントロン内の一塩基置換又は数塩基の欠失である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
試料が、作物に人為的に突然変異誘発を行い、ミスマッチ切断酵素を用いたスクリーニング法でサイレント突然変異を持つ変異体を選抜し、原品種に戻し交雑して作出したサイレント突然変異系統から調製されたものである、請求項２ないし４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
試料から調製されたＤＮＡを増幅した後に使用することを特徴とする、請求項１ないし５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＰＣＲによりＤＮＡを増幅する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
競合ハイブリダイズにおいて使用するプローブ溶液において、標識ＤＮＡプローブに対して無標識ＤＮＡプローブが１〜１０倍量（モル比）含まれていることを特徴とする、請求項１ないし７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
標識ＤＮＡプローブに対して無標識ＤＮＡプローブが約５倍量（モル比）含まれていることを特徴とする、請求８に記載の方法。
【請求項１０】
標識として非放射性物質を使用する請求項８又は９記載の方法。
【請求項１１】
標識としてジゴキシゲニン（ＤＩＧ）を使用し、これを標識抗ＤＩＧ抗体を反応させることを特徴とする、請求項８ないし１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
標識抗ＤＩＧ抗体がアルカリホスファターゼで標識された、抗ＤＩＧ−ＡＰ抗体である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
試料が農作物、その一部、それらの抽出又は精製物、又は、それらの加工品である、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
塩基配列の変異が産地識別マーカーとして機能する、請求項１ないし１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項２ないし１４のいずれか一項に記載の方法を用いるサイレント突然変異系統識別方法。
【請求項１６】
請求項１ないし１４のいずれか一項に記載の方法を用いる農作物の産地識別法。
【請求項１７】
請求項１ないし１６のいずれか一項に記載の方法に使用される、競合ハイブリダイズを用いるドットブロット用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は競合ハイブリダイズとドットブロット法を組み合わせることを主な技術的特徴とする、作物における一塩基多型（ＳＮＰ）等のＤＮＡ（遺伝子）突然変異の検出方法、該方法を利用した作物のサイレント突然変異系統識別方法及び農作物の産地識別法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでに、ゲノムＤＮＡ配列に基づく作物の品種及び産地等の識別方法が開発されている。例えば、特許文献１（特開2004-141079号公報）には、「稲の同質遺伝子系統識別方法及び当該技術を利用した米の産地識別方法」に関する発明が記載されている。この発明は、同質遺伝子系統に特異的なＤＮＡをＰＣＲによって増幅させ、増幅された数百〜千数百ｂｐのＤＮＡの種類によって識別を行うものである。尚、同質遺伝子系統とは形質発現する特定の遺伝子以外は特定の品種の遺伝子と同じものを連続戻し交雑により作出した系統で、形質発現しないサイレント突然変異とは異なる。
【０００３】
又、特許文献２（特開2004-248635号公報）には、「イネゲノムの１塩基多型判別法の開発とイネ品種識別への応用」に関する発明が記載されている。該発明の特徴は、ＰＣＲ法を用いて１塩基多型を含む数百ｂｐのＤＮＡを増幅する際に使用するプライマーの塩基にある。
【特許文献１】特開2004-141079号公報
【特許文献２】特開2004-248635号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記の特開2004-141079号公報及び特開2004-248635号公報に記載の発明は対立遺伝子特異的増幅法（Allele specific amplification: ASA）と呼ばれる方法の一種であって、ＰＣＲにより検出対象であるＤＮＡ断片の増幅を行ない、増幅されたＤＮＡ断片を電気泳動にかけ、その結果得られるバンドに基づき特定のＤＮＡ増幅の有無を識別するものである。従って、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅の有無は様々な要因に影響される為に、これらの方法は分析精度が高くない上に多数検体分析には適さない。一方、ＤＮＡシークエンス法では突然変異を正確に検出されるが、多数の検体から迅速に産地を識別する方法としては非現実的である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、これまでのＤＮＡ変異の検出方法における上記の課題を解決することを主な目的として、鋭意研究の結果、競合ハイブリダイズとドットブロット法を組み合わせることによって、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
本発明は、以下の各態様に係るものである。
［１］試料から調製されたＤＮＡにおける塩基配列の変異の検出方法であって、競合ハイブリダイズを用いるドットブロット法によりＤＮＡ変異を検出することを特徴とする該検出方法。
［２］塩基配列の変異がサイレント突然変異である、上記１記載の方法。
［３］サイレント突然変異が人為的な突然変異誘発により作製されたものである、上記２に記載の方法。
［４］サイレント突然変異がイントロン内の一塩基置換又は数塩基の欠失である、上記３に記載の方法。
［５］試料が、作物に人為的に突然変異誘発を行い、ミスマッチ切断酵素を用いたスクリーニング法でサイレント突然変異を持つ変異体を選抜し、原品種に戻し交雑して作出したサイレント突然変異系統から調製されたものである、上記２ないし４のいずれか一項に記載の方法。
［６］試料から調製されたＤＮＡを増幅した後に使用することを特徴とする、上記１ないし５のいずれか一項に記載の方法。
［７］ＰＣＲによりＤＮＡを増幅する、上記６記載の方法。
［８］競合ハイブリダイズにおいて使用するプローブ溶液において、標識ＤＮＡプローブに対して無標識ＤＮＡプローブが１〜１０倍量（モル比）含まれていることを特徴とする、上記１ないし７のいずれか一項に記載の方法。
［９］標識ＤＮＡプローブに対して無標識ＤＮＡプローブが約５倍量（モル比）含まれていることを特徴とする、請求８に記載の方法。
［１０］標識として非放射性物質を使用する上記８又は９記載の方法。
［１１］標識としてジゴキシゲニン（ＤＩＧ）を使用し、これを標識抗ＤＩＧ抗体を反応させることを特徴とする、上記８ないし１０のいずれか一項に記載の方法。
［１２］標識抗ＤＩＧ抗体がアルカリホスファターゼで標識された、抗ＤＩＧ−ＡＰ抗体である、上記１１記載の方法。
［１３］試料が農作物、その一部、それらの抽出又は精製物、又は、それらの加工品である、上記１記載の方法。
［１４］塩基配列の変異が産地識別マーカーとして機能する、上記１ないし１３のいずれか一項に記載の方法。
［１５］上記２ないし１４のいずれか一項に記載の方法を用いるサイレント突然変異系統識別方法。
［１６］上記１ないし１４のいずれか一項に記載の方法を用いる農作物の産地識別法。
［１７］上記１ないし１５のいずれか一項に記載の方法に使用される、競合ハイブリダイズを用いるドットブロット用キット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によって、ドットブロット法により、ＳＮＰ等のＤＮＡにおける塩基配列の全ての変異（遺伝子変異）を精度よく検出できることを初めて示すことができた。即ち、本発明方法においては、ＰＣＲ等による遺伝子増幅物をドットブロッティングし、これを競合ハイブリダイズする為に、遺伝子増幅物を電気泳動する必要がなく、従って、多数の検体から目的の遺伝子変異の有無を網羅的かつ簡便に精度よく検出することができる。従って、例えば、米等が流通段階でブレンドされたとしても、その中の一粒一粒ごとに遺伝子変異の有無を検出することができる。又、遺伝子変異として形質に影響を与えないサイレント突然変異をマーカー（突然変異体）として使用する場合には、多数の突然変異系統を容易に作製することが出来るので、一年毎にマーカー（突然変異体）を切替えることも可能である。このようなサイレント突然変異を産地識別マーカーとして用いた本発明方法により、遺伝子変異に基づく細かな産地識別法が初めて実現可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明方法は、競合ハイブリダイズを用いるドットブロット法により、ＤＮＡにおける塩基配列の変異、即ち、ＤＮＡ（遺伝子）変異を検出する方法に関する。塩基配列の変異には、例えば、蛋白質のコード領域の塩基に変異があり、コードするアミノ酸が変化した場合などのように、突然変異体としての表現型が現れる場合と、突然変異体としての表現型が現れない「サイレント突然変異」と呼ばれるタイプがある。このサイレント突然変異は、遺伝子のイントロン又はその他の非コード領域に塩基の変異が見られる場合や、蛋白質のコード領域の塩基に変異があってもコードするアミノ酸が変化しない場合、又は性質が類似するアミノ酸への変化であって表現型には影響を与えない場合などがある。
【０００９】
本発明方法では、上記のいずれの種類のＤＮＡ変異も検出可能であるが、表現型には現れない「サイレント突然変異」、特に、イントロン内での塩基の変異を検出する場合に有用である。
【００１０】
又、本発明で検出対象となるＤＮＡ変異に特に制約はなく、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）のような一塩基又は数塩基の置換、一塩基〜数塩基の挿入若しくは欠失等の様々な態様のＤＮＡ変異を検出することが可能である。
【００１１】
尚、このようなＤＮＡ変異は、農作物に天然状態で存在しているものでも良い。或いは、本明細書に記載されているように、ガンマ線照射のような当業者に公知の任意の手段を用いて作物に人為的に突然変異誘発を行い、その後、例えば、当業者に公知の植物由来（例えば、セロリ）のミスマッチ切断酵素（市販品あり）を用いたスクリーニング法（ミスマッチ化学切断法）でサイレント突然変異を持つ変異体を選抜し、原品種に戻し交雑して作出したサイレント突然変異系統に含まれる場合がある。
【００１２】
このようにして作出したサイレント突然変異系統に存在するサイレント突然変異は、その目的に応じて各種マーカーとして検出対象となる。例えば、特定の地域で産出される或る作物についての産地識別マーカーとして機能する。
【００１３】
試料から抽出したＤＮＡの量が検出に十分であれば、特に増幅することなく、以後の操作に供することが出来る。通常は、PCR（Polymerase Chain Reaction）法又はRT-PCR法、並びに、その他のICAN（Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids）法、NASBA（Nucleic acid sequence based amplification）法、TMA（Transcription-mediated amplification）法およびSDA（Strand Displacement Amplification）法等の当業者に公知の任意の遺伝子増幅法により適当な量に増幅した後に、ドットプロットによる検出にかけることが好ましい。
【００１４】
このような遺伝子増幅法に用いる各種プライマーは、夫々の検出対象となるＤＮＡ変異を含む適当な長さ（百数十〜数百ｂｐ）のＤＮＡ断片（遺伝子又はその一部を含む）が増幅されるように、適当に調製することができる。又、各種の公知遺伝子情報（例えば、イネについては、RGP (Rice Genome Research Program（http://rgp.dna.affrc.gp.jp/）で各種ＰＣＲマーカーが公表されているので、それらの情報を参考にして、当業者であれば容易に作製することができる。これらプライマーの長さは、通常、数十ｂｐ程度の長さを有する。
【００１５】
本発明方法の特徴の一つは、ドットブロット法において競合ハイブリダイズを用いることである。以下の実施例に具体的に記載されているように、この競合ハイブリダイズにおいては、或るＤＮＡ変異を検出する為に使用するプローブ溶液には、当該ＤＮＡ変異と特異的にハイブリダイズする塩基配列を有するプローブであって適当な標識物質で標識されたプローブ（検出用プローブ）と、該ＤＮＡ変異に対して野生型である塩基配列に対して特異的にハイブリダイズする塩基配列を有するプローブであって標識されていないプローブ（競合用プローブ）を、検出用プローブに対して競合用プローブが適当に過剰となるような割合、例えば、標識ＤＮＡプローブに対して無標識ＤＮＡプローブが１〜１０倍量、好ましくは約５倍量（モル比）含まれている。その結果、高特異性及び高感度の検出結果を得ることが出来るのである。
【００１６】
このようなドットブロット法に用いる各種プローブは、夫々の検出対象となるＤＮＡ変異を含むＤＮＡ断片と特異的にハイブリダイズ可能な適当な長さ、通常、約１０〜２０塩基対程度を有しており、上記のプライマーと同様に、各種の公知の遺伝子情報に基づき当業者が容易に設計することが出来る。
【００１７】
プローブの標識物質としては当業者に公知の任意の物質を使用することが出来る。例えば、放射性同位元素である32Ｐ等で標識されたヌクレオチドによる放射能標識、又は、非放射能標識として、卵黄由来のビタミンＢ群の一種であるビオチン及びジギタリス由来のストロイドハプテンであるジゴキシゲニン（ＤＩＧ）等を代表的例として挙げることが出来る。非放射能標識は放射能の危険もなく安全管理の点で好ましい。これらの標識は、夫々の性質に応じて、当業者に公知の適当な方法でプローブに結合させ、均質標識又は末端標識とすることが出来る。例えば、ビオチンの場合にはビオチン標識したビオチン−ｄＵＴＰ（ＴＴＰ）を用いるか、又は光活性基を導入したフォトビオチンを使用して直接ＤＮＡに結合させることができる。又、ジゴキシゲニンの場合には、環境汚染の心配もなく好適である。これらの非放射能標識は、その後に、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）又はペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）と結合したアビジンや抗ＤＩＧ−ＡＰ抗体等の二次物質（二次抗体）と反応させ、結合した酵素による化学発光又は発色反応によって測定することが出来る。或いは、ＡＲＥＳ法等によってＤＮＡに蛍光色素を直接結合させることも可能である。
【００１８】
尚、ハイブリダイゼーションは、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987））等に記載の当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販の装置・器具を使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００１９】
ＤＮＡを調製する試料の代表例としては、例えば、イネ等の各種農作物、その一部（例えば、種子、葉及び茎等）、それらの抽出又は精製物、又は、それらの加工品を挙げることが出来る。加工品の具体例としては、籾、玄米、精米及び米粉、並びに、それらを更に加工した餅及び米菓等を挙げることが出来る。
【００２０】
尚、試料から調製されるＤＮＡの種類に特に制限はないが、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、及びｃＤＮＡ等を挙げることが出来る。これらはその性質、並びに、試料の種類・性質等に応じた当業者に公知の適当な方法で抽出・精製することが出来る。例えば、ゲノムＤＮＡの場合には、ＣＴＡＢ法、ボイル法、及び必要に応じて、アミラーゼ又はプロテアーゼなど処理を伴う酵素法を使用することもできる。
【００２１】
又、本発明において、ＰＣＲ等の各種遺伝子増幅におけるプライマー、又は、ドットブロットにおけるプローブとして使用する各種のオリゴヌクレオチド（オリゴＤＮＡ）は、当業者に公知の方法、例えば、Carruthers（1982）Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418; Adams（1983）J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov（1997）Nucleic Acid Res. 25:3440-3444; Frenkel（1995）Free Radic. Biol. Med. 19:373-380;Blommers（1994）Biochemistry 33:7886-7896; Narang（1979）Meth. Enzymol. 68:90;Brown（1979）Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage（1981）Tetra. Lett. 22:1859; 米国特許第4,458,066号）に記載されているような周知の化学合成技術により、in vitroにおいて合成することもできる。
【００２２】
本発明方法で検出対象として、人為的に作出されたサイレント突然変異系統に存在するサイレント突然変異を使用する場合には、そのサイレント突然変異は、各種の目的に応じたマーカーとして利用することができる。例えば、特定の地域(例えば、特定の国、地方、県市町村等の一定の地理的まとまり)で産出される或る作物にサイレント突然変異を導入した場合には、該マーカーは産地識別マーカーとして機能する。その結果、本発明方法を用いて、サイレント突然変異系統同士を互いに識別したり（サイレント突然変異系統識別方法）、農作物の産地を識別することが可能となる。或いは、既に記載のように、特定の地域で産出される農作物のみに共通して天然状態で存在するＤＮＡ変異がある場合には、このようなＤＮＡ変異を本発明における産地識別マーカーとして使用することも可能である。
【００２３】
本発明は、更に本発明方法に使用するドットブロット用キットを提供する。このキットは、ＤＮＡ増幅用の各種プライマーセット及び／又はプローブ、その他、当業者に公知の他の要素又は成分、例えば、各種試薬、酵素、緩衝液、並びに反応プレート（容器）等の中からその構成・目的等に応じて、適宜、必要なものから構成される。
【００２４】
本明細書において使用される用語は特に言及しない場合には、当該技術分野において通常使用される意味で用いられている。
【００２５】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。又、特に記載のない場合には、以下の実施例は、例えば、Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Molecular cloning third.ed.（Cold Spring Harbor Lab.Press，2001）; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等に記載されている、当業者に公知の標準的な遺伝子工学及び分子生物学的技術に従い、実施することが出来る。又、本明細書中に引用された文献の記載内容は本明細書の開示内容の一部を構成するものである。
【００２６】
［参考例１］アブラナ科野菜の葉柄抽出タンパク質(Brassica petiole extract; BPE)を用いたサイレント突然変異の探索
１．アブラナ科野菜からのBPE抽出
ミズナ、小松菜、チンゲンサイの葉柄約50gを、ホモジェナイザーを用いて抽出buffer (100mM Tris-HCl pH7.5, 100μM PMSF) 30ml中で粉砕した。また、液体窒素で凍結した葉柄を用いた場合は、粉砕した後抽出bufferを加えた。2,700 gで20分間遠心した後、回収した上清に25%飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、4℃で30分間振盪した。13,000gで40分間遠心した後、回収した上清に80%飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、4℃で30分間振盪した。13,000gで60分間遠心して生じた沈殿物に抽出buffer 0.5-2 mlを加え完全に溶解した。得られた抽出タンパク質を100mM Tris-HCl (pH7.5)溶液中で透析したものをBPEとした。BPEは、野生型DNAと変異型DNAのヘテロ二本鎖の切断が最も明瞭に確認できる濃度に希釈した。
【００２７】
２．サイレント突然変異の探索
ガンマ線照射したコシヒカリのM1から採取したM2集団600個体を5個体ずつバルクにしてDNAを抽出し(No.1-120)、それを鋳型としてPCRを行った。PCRの条件は、鋳型DNAを3μl (20 ng), 10´ExTaq buffer (TaKaRa)を1μl, 2.5 mM each dNTP Mixtureを1μl, ExTaq (TaKaRa)を0.05μl, プライマーを0.5μl, 滅菌水を4.5μlを混合したものを、94℃ 1分、94℃ 30秒; 60℃ 30秒; 72℃ 1分を40サイクル、72℃ 3分で反応させた。得られたPCR産物を、98℃ 5分、85℃ 2分、65℃ 1分、55℃ 1分、45℃ 1分、25℃ 1分の条件で処理し、ヘテロ二本鎖を形成させた。BPEによる反応は、サンプルDNA を10μl, 5×BPE buffer (50 mM HEPES pH7.5, 50 mM MgSO4, 50 mM KCl) を6μl, 0.1% Triton X-100を0.6μl, 0.1%BSAを0.6μl, BPEを1μl, 滅菌水11.8μlを混合し、45℃で15分間保温した後、500mM EDTAを2.5μl加え反応を停止させた。BPE処理したサンプルは、あらかじめSYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain (Cambrex Bio Science Rockland, Inc)を10,000倍希釈になるように添加した2% アガロースゲルで電気泳動しバンドを検出した。スクリーニングに用いたプライマーはRGP (Rice Genome Research Program)で公表されているPCRマーカーの中で、1.0kb-1.5kbのDNA断片を増幅できるものを26個選んで用いた。
【００２８】
BPE処理(タンパク質の濃度は4.5μg/μl)によってPCRマーカーR3385（以下の実施例１で使用するプライマー対２１２と同じもの）を用いた場合No. 23に、 R887の場合No.94に変異が導入された個体が存在することが分かった(図１)。No. 23とNo. 94のバルクを構成する5個体それぞれからDNAを抽出し、どの個体に変異があるか特定した。変異の存在する領域のPCR産物の塩基配列をDNAシーケンサーを用いて決定し、変異を同定した。No. 23はG→Cへの変異で、R3385遺伝子のイントロンに存在するものであった（図１）。一方で、No. 94は、R887遺伝子のアミノ酸変異を伴うC→Aへの変異を持っていた。このため、産地判別にはNo.23で見つかったR3385のサイレント突然変異（以下、「ＫＨＭ２３−３」という）を用いることにした。
【００２９】
［参考例２］  PCR-RF-SSCP (PRS)法によるサイレント突然変異の探索
ガンマ線照射した日本晴のM2  3系統(NBM1, NBM2, NBM3)を用いた。この3系統より抽出したゲノムDNAを鋳型とし、PRS分析に用いたプライマーはPCRによって2kbの増幅断片が得られるように設計した288組を用いた。増幅されたPCR産物を適当な4塩基認識の制限酵素で消化したものと、ホルムアミド色素液(96％(v/v) formamide, 0.1％(w/v) xylene cyanol, 0.1％ bromophenol blue, 20mM EDTA) を1:4の比率で混合し95℃、5分間保温後、急冷し変性した。PRSは5％グリセロールを添加した6%ポリアクリルアミドゲルを用いて、0.5×TBE(tris-borate, EDTA)泳動buffer 10℃-18℃、300-400Vの条件で電気泳動を行った。ゲルをGelStar nucleic acid gel stain (BioWhittaker Molecular Applications)を用いて染色後、Molecular Imager FX(Bio-Rad)でバンドを検出した。NBM3で多型が検出される領域が見つかり(図２)、変異領域の塩基配列を決定した。変異を検出したマーカー番号117 (117F: 5’-GGACTGAGATGGAATGTGCT-3’（配列番号１）, 117R: 5’-GTAGAGTGATGACAAAATGACAA-3’（配列番号２）)はESTクローンS2539が座乗するゲノムDNAを増幅させる。ESTクローンS2539の配列を用いてイネ完全長cDNAデータベースを検索すると、cDNAクローン001-006-E04と一致した。これは4つのエキソンからなり、NBM3の変異は、第１イントロンの32塩基目から35塩基目までの4塩基 (TTTG)の欠失であることが明らかとなり、サイレントミューテーションであると考えられた。
【実施例１】
【００３０】
サイレント突然変異のドットブロット法による検出
イネ（日本晴とコシヒカリ）の葉及び種子を粉砕後、DNA抽出緩衝液（200 mM Tris-HCl緩衝液 pH 7.5, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0.5% SDS）を加え、良く混和し、遠心分離後に上清を回収し、等量のイソプロパノールを加え、DNAを析出させた。再び遠心分離を行い、沈殿を1xTE（10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA）緩衝液に溶かし、DNA溶液とした。10 μlのPCR反応液（10 ng DNA, 10 pmol プライマー対, 1x ExTaq buffer, 2 μmol dNTP, 0.5 U Taq polymerase（ExTaq, TaKaRa Biomedicals社））を、94℃で1分間保温した後、94℃で30秒、58℃で30秒、72℃で30秒の反応を40回行い、最後に72℃で1分間保温することで、SNPを含むゲノムDNA領域を増幅させた。増幅したDNA溶液に等量のアルカリ変性液（0.8 N NaOH, 20 mM EDTA）を加え、マルチピンブロッター（ATTO社）を用いて、ナイロンメンブラン（NytranN, Schleicher & Schuell社）にドットブロットし、UVクロスリンカーでDNAをメンブランに結合させた。ハイブリダイゼーション溶液（5×SSC, 0.1% sarcosyl, 0.02% SDS, 1% Blocking Reagent（Roche社））によるプレハイブリダイゼーションを50℃で1時間以上行い、ハイブリダイゼーションを一晩50℃で行った。
【００３１】
プローブには、5’末端をDigoxigenin標識した、野生型のSNPが中央（9塩基目）にある17塩基の5 μlの100 μM合成オリゴDNA（検出用プローブ）を10 mlのハイブリダイゼーション溶液に加えたものを用い、変異型のSNPを持つ無標識の25 μlの100 μM合成オリゴDNAを競合用プローブとして加えた。これが、野生型対立遺伝子検出用プローブ液となる。逆に、変異型対立遺伝子検出用のプローブ溶液は、変異型SNPを持つ5’末端Dig標識の5 μlの100 μM合成オリゴDNA（検出用プローブ）と、野生型SNPを持つ無標識の25 μlの100 μM合成オリゴDNA（競合用プローブ）を10 mlのハイブリダイゼーション溶液に加えて作った。プローブは、使用前に10分間、熱湯中で変性させ急冷した。メンブランを2×SSC/0.1% SDSで5分間、室温で2回洗浄し、次に0.1×SSC/0.1%SDSで20分間、50℃で2回洗浄した。メンブランをTBS（50 mM Tris-HCl緩衝液, 0.9% NaCl, 0.02% NaN3, pH 8.0）で5分間、室温で洗浄し、ブロッキング溶液（TBS中に1% Blocking Reagentを加える）によるブロッキングを30分間以上、室温で行なった。2次抗体反応を30分間、室温で行った。2次抗体は、Anti-Digoxgenin-AP Fab fragment（Roche社）をブロッキング液で5000倍に希釈して作った。メンブランをTBSで10分間、室温で3回洗浄した。メンブランをAP 9.5（100 mM Tris-HCl緩衝液, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, pH 9.5）に室温で3分間浸した後、メンブランをCSPD溶液（CSPD（Roche社）をAP 9.5で500倍に希釈）で5分間、37℃で浸した。X線フィルムに露光し、シグナルを検出した。
【００３２】
NBM3（日本晴）の場合：
S2539の変異箇所を挟み込むように設計した、日本晴で160塩基対のDNA断片を増幅させるプライマー対 (117F: 5’-GGACTGAGATGGAATGTGCT-3’, 117-NBM3: 5’-CGCACATTGAAGTTCAGATG-3’（配列番号３）)を用いてPCRを行い、PCR産物をメンブランにドットブロットした。この変異が自然突然変異ではなく、人為突然変異であることを確認するために、国内外の207品種 (国産195品種、中国産5品種、台湾産2品種、インド産2品種、フィリピン産1品種、リベリア産1品種、ブータン産1品種)も併せて分析した。変異型検出用プローブは、117mu-DIG: 5’-DIG-GCATCTGTGGTAAAAGA-3’であり、競合用プローブとして117wt: 5’-ATCTGTGCAAAGTAAAA-3’（配列番号４）を用いた。逆に、野生型検出用プローブは、117wt-DIG: 5’-DIG-ATCTGTGCAAAGTAAAA-3’であり、競合用プローブとして117mu: 5’- GCATCTGTGGTAAAAGA -3’ （配列番号５）を用いた。ハイブリダイゼーションの温度は50℃で、2次洗浄は1x SSC/0.1% SDSで20分間50℃の条件で2回行った。シグナルは、変異型検出用プローブを用いたときにはNBM3にのみ検出され、他の207品種では検出されなかった。逆に、野生型検出用プローブを用いたときには、207品種でシグナルが検出され、NBM3のみでシグナルが検出されなかった（図３左）。したがって、この変異は人為突然変異であると考えられ、NBM3はこの変異をホモで持つことが明らかとなった。
【００３３】
KHM23-3（コシヒカリ）の場合：
変異箇所を挟み込むように設計した、コシヒカリで336塩基対のDNA断片を増幅させるプライマー対 (212F: 5’-CCACCATCTCCATCATCCTC-3’（配列番号６）, 212dotR: 5’-GGGCCAGTTAAGGTACACTG-3’（配列番号７）)を用いてPCRを行い、PCR産物をメンブランにドットブロットした。この変異が自然突然変異ではなく、人為突然変異であることを確認するために、国内外の207品種 (国産195品種、中国産5品種、台湾産2品種、インド産2品種、フィリピン産1品種、リベリア産1品種、ブータン産1品種)も併せて分析した。変異型検出用プローブは、212mu-DIG: 5’-DIG-GATTCCAGCTCGTTTGA-3’であり、競合用プローブとして212wt: 5’-GATTCCAGGTCGTTTGA-3’(配列番号８)を用いた。逆に、野生型検出用プローブは、212wt-DIG: 5’-DIG-GATTCCAGGTCGTTTGA-3’であり、競合用プローブとして212mu: 5’-GATTCCAGCTCGTTTGA-3’ （配列番号９）を用いた。ハイブリハイブリダイゼーションの温度は50℃で、2次洗浄は0.1x SSC/0.1% SDSで20分間50℃の条件で2回行った。シグナルは、変異型検出プローブを用いたときにはKHM23-3にのみ検出され、他の207品種では検出されなかった。野生型検出プローブを用いたときには、KHM23-3と207品種でシグナルが検出された（図３右）。したがって、この変異は人為突然変異であると考えられ、KHM23-3はこの変異をヘテロで持つことが明らかとなった。
【実施例２】
【００３４】
混合した米粒を用いた変異の識別
日本晴（野生型）に少量のＮＢＭ３（変異型）が混入した米試料と、ＮＢＭ３に少量の日本晴（野生型）が混入した米試料を用いて、実施例１と同様な方法を用いて米１粒からＤＮＡを抽出し、実施例１と同様にドットプロット法でＳ２５３９遺伝子の変異を検出した。その結果を図４に示す。日本晴（野生型）に少量のＮＢＭ３が混入した米試料（Ａ）では、野生型検出用プローブで９１粒のＤＮＡが検出され、変異型検出用プローブで５粒のＤＮＡが検出された。一方、ＮＢＭ３に少量の日本晴（野生型）が混入した米試料（Ｂ）を用いた場合には、野生型検出用プローブで４粒のＤＮＡが検出され、変異型検出用プローブで９２粒のＤＮＡが検出された（図４）。これらの結果から、米試料（Ａ）では、日本晴（野生型）９１粒に対してＮＢＭ３（変異型）が５粒混入しており、米試料（Ｂ）では、ＮＢＭ３（変異型）９２粒に対して日本晴（野生型）４粒が混入していることを識別することが出来た。従って、このような本発明方法において、産地毎に異なるＤＮＡ変異（産地識別マーカー）を有するサイレント突然変異系統に存在する該変異を検出することにより、作物の産地識別を容易に行うことが出来る。
【実施例３】
【００３５】
コシヒカリ（野生型）に少量のササニシキ（変異型）が混入した米試料を用いて、葉からＤＮＡを抽出し、実施例１と同様にドットブロット法でS4655遺伝子(増幅に用いるプライマーはS4655F: 5’-TATCCGGCACTTGTTTGTCAC-3’（配列番号１０）とS4655dotR: 5’-GCCTCATAAAGCCCAAGATG-3’（配列番号１１）)の変異を検出した。その結果を図 ５に示す。５倍量の変異型競合用プローブ (S4655mu: 5’- GAGACATCGTGCAACTA-3’（配列番号１２）)を含む野生型検出用プローブ (S4655wt:5’-DIG-GAGACATCATGCAACTA-3’)で６粒のＤＮＡが検出され（図５、Ｂ）、５倍量の野生型競合用プローブ (S4655wt: 5’-GAGACATCATGCAACTA-3’（配列番号１３）)を含む変異型検出用プローブ (S4655mu: 5’-DIG-GAGACATCGTGCAACTA-3’)で９０粒のＤＮＡが検出された（図５、Ｃ）。これらの結果から、コシヒカリ（野生型）９０粒に対してササニシキ（変異型）が６粒混入していることを識別することが出来た。これらに対して、変異型検出用プローブに野生型競合用プローブを加えない場合、コシヒカリ (野生型)のDNAにもシグナルが検出された (図５、Ａ)。従って、本発明方法において、一定倍量の競合用プローブを加えることによって、特異的なシグナルを高感度で検出することが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
例えば、稲等の作物におけるサイレント突然変異系統を検出対象として本発明の検出方法を用いることによって、該作物にサイレント突然変異系統が使われているかどうかの識別、及び使用されたサイレント突然変異系統同士の識別を、正確かつ簡便に行うことが出来る。又、本発明方法は、作物の流通市場における任意の段階で正確に、かつ簡便に行うことが出来る、特定産地間の農産物の識別（例えば、特定県産と他県産の農産物の識別や特定の栽培地域と他の栽培地域の農産物との識別）を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】コシヒカリのＲ３３８５遺伝子に導入されたサイレント突然変異系統：ＮＨＭ２３−３（一塩基置換）について示す。
【図２】日本晴のＳ２５３９遺伝子に導入されたサイレント突然変異系統：ＮＢＭ３（四塩基欠失）について示す。
【図３】国内外の２０７品種とサイレント突然変異系統：ＮＢＭ３及びサイレント突然変異系統：ＮＨＭ２３−３を試料として用いたドットブロット検出の結果を示す。
【図４】サイレント突然変異系統：ＮＢＭ３を含む混合した米粒を試料として用いたドットブロット検出の結果を示す。
【図５】本発明のドットブロット法における競合ハイブリダイズの効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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