(57)【要約】【課題】  レプチンの新規な使用方法を提供することを目的とする。【解決手段】  レプチンを含有する、レプチン受容体を発現する癌を治療するための医薬品であって、前記レプチンにより癌の増殖が抑制される、前記医薬品。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の検出方法であって、
(a) 体液をレプチン受容体に特異的な抗体もしくはそのフラグメント又はレプチンもしくはそのフラグメントと接触させ、そして
(b) 該体液中のレプチン受容体の存在を検出する、
ことを含んでなる方法。
【請求項２】
レプチンを含有する、レプチン受容体を発現する癌を治療するための医薬品であって、前記レプチンにより癌の増殖が抑制される、前記医薬品。
【請求項３】
レプチンが増殖抑制剤に結合されている、請求項２に記載の医薬品。
【請求項４】
レプチンを含有する、マクロファージの活性化を引き出すことによって損傷治癒を促進するための医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．序論
本発明は、造血および内皮細胞における種々の型の新規な受容体の発現に関する。この受容体の変異型が脳細胞において検出され、obese遺伝子産物であるレプチン(leptin)に結合することがわかった。特に、本発明はin vitroおよびin vivoにおいて受容体陽性の造血および内皮細胞の増殖および発生を刺激するためのレプチンの使用方法に関する。さらに、この受容体は長期再増殖能をもつ造血前駆細胞において選択的に発現される。したがって、この受容体と特異的に結合する作用物質を用いて様々な臨床用途のための前駆細胞を同定し、単離することができる。
【背景技術】
【０００２】
２．発明の背景
2.1.ヘマトポイエチン受容体遺伝子ファミリー
悪性疾患および免疫不全を含む種々の疾患は、リンパ-造血系における機能不全に関連している。これらの病態のいくつかは、前駆細胞を用いて造血系を再増殖させることによって軽減および／または治療することができる。分化にむけて引き金が引かれると、前駆細胞は患者の不全を克服するのである。したがって、造血を開始させ、調節する能力は非常に重要である(McCuneら，1988，Science 241:1632)。
【０００３】
自己複製能をもつ少数の幹細胞が系統特異的な前駆細胞を発生させ、これが次に増殖および分化して、成熟した循環性血液細胞を生成する血液細胞の形成プロセスは、少なくとも部分的に、特定のホルモンによって調節されていることがわかった。これらのホルモンは、造血増殖因子またはサイトカインと総称されている(Metcalf，1985，Science 229:16;Dexter，1987，J.Cell Sci．88:1;GoldeおよびGasson，1988，Scientific American，July:62;TabbaraおよびRobinson,1991，Anti-Cancer Res．11:81;Ogawa，1989，Environ．Health Presp．80:199;Dexter，1989，Br．Med．Bull．45:337)。
【０００４】
遺伝子組換え技術の出現によって、これらの分子の多数をコードする遺伝子が分子的にクローン化され、組換え形態で発現されている(Souzaら，1986，Science 232:61;Goughら，1984，Nature 309:763;Yokotaら，1984，Proc．Natl．Acad.Sci．USA 81:1070;Kawasakiら，1985，Science 230:291)。これらのサイトカインについて、その構造、生物学、および治療上の可能性までが研究されている。最もよく特徴づけられた因子のいくつかは、エリスロポエチン(EPO)、幹細胞因子(SCF)またはS1因子(steel factor)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、インターロイキン類(IL-1からIL-15)およびトロンボポエチンを含む。
【０００５】
これらのサイトカインは、血液細胞が発生する間に異なった段階で異なった細胞型に作用する。そして、これらサイトカインの医学における可能性のある用途は、輸血、骨髄移植、免疫抑制疾患の矯正、癌療法、損傷治癒、および免疫応答の活性化を含んで広範囲に及んでいる(GoldeおよびGasson，1988，Scientific American，July:62)。
【０００６】
造血前駆細胞の増殖および分化を誘導することとは別に、これらのサイトカインは成熟造血細胞の移動(migration)に影響を及ぼすこと（Weibartら，1986，J.Immunol．137:3584）も含めて、成熟血液細胞の多数の機能を活性化することも示されている(Stanleyら，1976，J.Exp．Med．143:631;Schraderら，1981，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78:323;Mooreら，1980，J.Immunol．125:1302;Kurlandら，1979，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 76:2326;HandmanおよびBurgess,1979，J.Immunol．122:1134;Vadasら，1983，Blood 61:1232;Vadasら，1983，J.Immunol．130:795)。
【０００７】
サイトカインは、特異的細胞表面受容体と結合することによって標的細胞に対する作用を達成する。多数のサイトカイン受容体が同定され、それらをコードする遺伝子が分子的にクローン化された。数個のサイトカイン受容体が最近ヘマトポイエチン受容体（ＨＲ）スーパーファミリーに分類された。これらの受容体の分類は、細胞外ドメインにおける重要なアミノ酸モチーフの保存に基づいてなされた(Bazan，1990，Immunology Today 11:350)。ＨＲファミリーは、そのメンバーの細胞外ドメインにおける３つの保存されたモチーフによって規定される。第１は、高度に保存された、膜貫通ドメインのアミノ末端に位置しているTrp-Ser-X-Trp-Ser（WSXWSボックス）モチーフである。ＨＲファミリーの殆どのメンバーはこのモチーフを含んでいる。第２は、細胞外領域のアミノ末端側半分に位置する４個の保存されたシステイン残基からなる。第３は、２つの離れた、保存されたフィブロネクチンIII(FN III)ドメイン内に、上記の保存されたシステインおよびWSXWSボックスの両方が見いだされるモチーフである。ＨＲファミリーのメンバーは、EPO、G-CSF(Fukunaga，1990，Cell 61:341)、GM-CSF、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-2（βサブユニット）、IL-12、IL-13、IL-15およびLIF（Cosman，1990，TIBS 15:265）等のリガンドの受容体を含む。
【０００８】
ＨＲのリガンドは、血液細胞の増殖、成熟および分化に決定的に関与している。例えば、IL-3は初期多系統多分化能幹細胞の増殖を促進し、またEPOと共働して赤血球を生成する。IL-6およびIL-3は共働して初期造血前駆細胞の増殖を誘導する。GM-CSFは顆粒球の増殖を誘導すること、およびマクロファージ機能を増大させることがわかっている。IL-7は、未成熟なＴおよびＢリンパ球を生成する際にある役割をはたす、骨髄由来のサイトカインである。IL-4は抗原によって感作された(antigen-primed)Ｂ細胞および抗原特異的Ｔ細胞の増殖を誘導する。このように、この受容体スーパーファミリーのメンバーは造血系の調節に関与している。
【０００９】
2.2.obese遺伝子、遺伝子産物およびその受容体
体重調節の分子的作用機構を研究するため、Zhangら(1994，Nature 372:425-432)はob/obマウス由来のマウスobese(ob)遺伝子をクローン化した。この遺伝子は、肥満した表現型をもたらす単一ヌクレオチド突然変異を含んでいる。単離した遺伝子フラグメントをプローブとして用いたノーザンブロット分析の結果、このフラグメントは白色脂肪組織においてのみＲＮＡとハイブリダイズするが、他のいかなる組織においてもＲＮＡとハイブリダイズしないことがわかった。さらに、ob遺伝子のコード配列は、試験したあらゆる脊椎動物のゲノムＤＮＡとハイブリダイズし、これは脊椎動物においてこの分子が高レベルに保存されていることを示した。推定されるアミノ酸配列はヒトとマウスの間で84%同一であり、両分子とも分泌タンパク質の特徴をそなえている。
【００１０】
ob遺伝子の生理的機能を理解しようとして、いくつかの独立した研究グループがin vivo試験のために組換えob遺伝子産物を細菌中に産生させた(Pelleymounterら，1995，Science 269:540-543;Halaasら，1995，Science 269:543-546;Campfieldら，1995，Science 269:546-549)。OBタンパク質（レプチンとしても知られている）をひどく肥満したマウス（ob遺伝子の突然変異したコピーを２個もっていた）に注射したところ、食欲の減退を示し、体重が低下し始めた。より重要なことに、Campfieldら(1995，Science 269:546-549)はレプチンを直接、側脳室に注射したところ、被験動物における食物摂取の減少が観察された。これは、レプチンが中枢神経ネットワークに作用して、食物摂取挙動およびエネルギー消費を調節することを示唆している。この結果は、レプチン応答性細胞が脳に存在するかもしれないということの証拠をも提供した。
【００１１】
最近、レプチン融合タンパク質が作製され、マウス脈絡叢（これは脳室と称する脳腔の内側にある組織である）から調製されたｃＤＮＡ発現ライブラリーをレプチン受容体(OB-R)についてスクリーニングするために使用された(Tartagliaら，1995，Cell 83:1263-1271)。このアプローチは、１つの型のOB-Rコード配列のクローン化をもたらした。この配列は、１つの膜にまたがる受容体(single membrane-spanning receptor)を明らかにし、この受容体はIL-6受容体のgp130シグナル伝達構成要素(Tagaら，1989，Cell 58:573-581)、G-CSF受容体(Fukunagaら，1990，Cell 61:341-350)および白血病阻止因子受容体(Gearingら，1991，EMBO J.10:2839-2848)等の数個のクラスＩサイトカイン受容体と構造的類似性を共有している。ノーザンブロット分析および逆転写ポリメラーゼチェーンリアクション(RT-PCR)は、OB-R ｍＲＮＡが肺、腎臓、全脳および視床下部を含むいくつかの組織で発現されることを示している。しかし、造血組織におけるOB-Rの発現に関する報告は皆無であった。
【００１２】
Tartagliaらによって単離されたマウスOB-Rは、他のクラスＩサイトカイン受容体と較べて比較的短い細胞内細胞質ドメインを含んでいる。次に、そのヒト相同体をヒト幼児脳ライブラリーから単離したとろ、予測されるタンパク質配列ははるかに長い細胞内ドメインを含んでいる。この発見を考えると、異なる型の受容体が存在するかもしれないことが推測された(Barinaga，1996，Science 271:29)。しかし、本発明以前には、OB-Rの複数の代替的な(alternative)型は同定されていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
３．発明の概略
本発明は、造血および内皮系統における前駆細胞を同定および単離するためのマーカーとしてのHu-B1.219変異型（OB-Rを含む）の使用方法、ならびに造血および内皮細胞の増殖および発生を刺激するためのob遺伝子およびその遺伝子産物レプチンの使用方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、本出願人によるＨＲファミリーの新規メンバー（Hu-B1.219と称する）の３つの型の発見に部分的に基づいている。これら３つの型はヒト胎児肝臓ｃＤＮＡライブラリーから単離された。これらの分子の配列をヒトOB-R配列と比較すると(Tartagliaら，1995，Cell 83:1263-1271)、細胞外ドメインにおいてはそれらはほぼ同一であることが分かる。したがって、これら４つの分子はリガンドとしてのレプチンに応答する受容体の変異型を表す。本明細書に記載する３つのイソ型(isoform)は、細胞外ドメインでは３つのアミノ酸の位置において報告されたOB-Rタンパク質と異なっているのみであるが、４個の変異型のすべては細胞内ドメインの３'末端において広範な相違を包含している。したがって、これらの受容体はレプチンに結合するが、リガンドに結合して、それらは異なるシグナルを伝達するのかもしれない。さらに、Hu-Bl.219は造血および内皮起源のいくつかの細胞系で発現される。組織発現分析は、胎児の肺および肝臓もまた高レベルのHu-B1.219 ｍＲＮＡを含むことを示している。さらに、ヒトCD34+骨髄細胞はHu-B1.219を発現する。マウス胎児肝細胞をAA4.1およびFcRの発現に基づいて幾つかの画分に分離すると、Hu-B1.219マウス相同体の発現がAA4.1+/FcR-集団にのみ検出される。この集団は、胎児肝臓発生のこの段階における全部ではないが殆どの、長期再増殖能を有する造血前駆細胞を含むことがわかった。さらに、骨髄および胎児肝細胞は、赤芽球コロニー形成単位(CFU-e)、赤芽球バースト形成単位(BFU-e)および顆粒球-マクロファージ(CFU-GM)コロニーを生成することにより、レプチン刺激に応答して増殖し、分化する。特に、レプチンは骨髄性系統の細胞を刺激してマクロファージおよび好中球に分化させる。また、レプチンは新たに単離されたマウス卵黄包細胞を刺激して増殖させ、そして赤芽球およびマクロファージの増殖をもたらす。さらに、Hu-B1.219は、胚の卵黄包に由来するある種の内皮細胞およびその前駆体において発現される。それゆえ、Hu-B1.219は造血および内皮前駆細胞のマーカーであり、Hu-Bl.219の種々のイソ型はレプチン刺激に対する応答性を与える。
【００１５】
本発明は多様な用途を包含する。その用途は以下のものを含むがそれらだけに限定されない。すなわち、造血および内皮前駆細胞の同定および単離のためのHu-B1.219特異的結合剤の使用；in vitroまたはex vivo増殖を目的とする上記前駆細胞の活性化のためのレプチンの使用；免疫不全および貧血を患っている患者における上記細胞集団のin vivo刺激のためのレプチンの使用；骨髄の増殖および発生を促進するためのレプチンの使用；および、脈管形成(angiogenesis)および血管形成(vasculogenesis)、ならびに骨髄移植後のドナー細胞の植え付けの増強を促進するためのレプチンの使用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
４．図面の簡単な説明
図１Ａ〜１Ｇ：１型Hu-B1.219のヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列。この分子の３'末端はヒトレトロトランスポゾン配列と98%同一である。
【００１７】
図２：１型、２型および３型Hu-B1.219の３'末端におけるヌクレオチド配列の比較。
【００１８】
図３Ａ〜３Ｆ：Hu-B1.219の１型(Hu-B1.219-1)、２型(Hu-B1.219-2)、３型(Hu-B1.219-3)、ヒトOB-R(HuOBR)およびマウスOB-R(MuOBR)のアミノ酸配列比較。
【００１９】
図４：Hu-B1.219の細胞外ドメインに由来するプローブを用いてヒト成人複数組織のノーザンブロット分析を製造者(Clontech，Palo Alto，CA)の指示にしたがって実施した。
【００２０】
図５Ａおよび５Ｂ：ヒトCD34+およびCD34-細胞におけるHu-B1.219発現のＰＣＲ分析。図５ＡはHu-B1.219プライマーを用いて検出し、図５ＢはCD34プライマーを用いて検出した。BMMNCは陽性対照としての骨髄単核細胞を表す。
【００２１】
図６Ａおよび６Ｂ：AA4.1およびFcRに対する抗体によって分離されたマウス胎児肝臓サブ集団におけるマウスHu-B1.219発現のＰＣＲ分析。図６ＡはHu-B1.219プライマーを用いて検出し、図６ＢはCD34プライマーを用いて検出した。NSは非選別細胞を、BMは対照としての骨髄細胞を表す。
【００２２】
図７Ａ〜Ｆ：造血組織におけるHu-B1.219イソ型の発現：０〜６日の分化しつつあるES細胞（７ＡおよびＢ）；８〜14日胚由来の卵黄包細胞（７ＣおよびＤ）；および13〜18日胚由来の胎児肝臓（７ＥおよびＦ）。発現はRT-PCRによって検出した。
【００２３】
図８Ａおよび８Ｂ：レプチンは卵黄包（８Ａ）および胎児肝臓（８Ｂ）の細胞増殖を刺激する。
【００２４】
図９Ａ〜Ｃ：レプチンは、コロニーアッセイにおいてマウス胎児肝臓に骨髄性コロニーの形成を誘導する。
【００２５】
図10Ａ〜Ｃ：レプチンは、コロニーアッセイにおいてマウス成体骨髄に骨髄性コロニーの形成を誘導する。
【００２６】
図11Ａおよび11Ｂ：レプチンはエンブロイド体(embroid body)(EB)由来前駆体にコロニー形成を誘導する。EB由来前駆体（６日）を、100ng/mlのS1因子および200ng/mlのレプチンを含むMeC中に再度播いた。
【００２７】
図12Ａおよび12Ｂ：レプチンおよびEPOは、正常なマウス骨髄からCFU-eを誘導するが、db/db骨髄からは誘導しない。正常系統およびdb/db系統由来の歳のそろったマウスを、赤芽球コロニー形成アッセイのための、低血清濃度を有する骨髄ドナーとして用いた。
【００２８】
図13：レプチンは、コロニー形成アッセイにおいてヒト骨髄からCFU-eを誘導する。すべてのグループは飽和レベルの組換えEPOを２U/mlの濃度で含んでいる。
【００２９】
５．発明の詳細な説明
5.1.造血細胞におけるOB-Rの発現
本発明は新規な造血前駆細胞マーカー、細胞の同定・単離のための該マーカーの使用、ならびにHu-B1.219として知られるこの受容体を介して造血および内皮の発生を刺激するためのレプチンの使用に関する。後出の第６節における特定の実施態様では、例として、この受容体のいくつかの型がクローン化され、特徴付けられた。これらの関連する分子のアミノ酸配列を刊行されているヒトOB-R配列(Tartagliaら，1995，Cell 83:1263-1271)と比較すると、細胞外ドメインでは３個のアミノ酸が異なっているのみであるが、細胞質ドメインでは広範な多様性が明らかになった。より具体的には、図１Ａ〜１Ｇは、本明細書に記載のHu-B1.219分子においてヌクレオチド残基#349〜351はアラニンをコードし、ヌクレオチド残基#421〜423はアルギニンをコードし、ヌクレオチド残基#763〜765はアルギニンをコードすることを示している。さらに、４つの型は、ヌクレオチド残基#2771以降は長さおよび配列組成の両方において相違している。この点に関連して、本明細書に記載の１型Hu-B1.219の細胞質ドメインは、レトロトランスポゾン配列(Onoら，1987，Nucl．Acid．Res．15:8725-8737)に高度に相同である。
【００３０】
Hu-B1.219変異型の分析は、ＨＲファミリーのＦＮ IIIドメインとの重大な相同性を明らかにし、これら変異型が受容体のＨＲファミリーに属することを示している。ノーザンブロットハイブリダイゼーション分析およびRT-PCR分析は、造血および内皮起源の細胞においてHu-B1.219ｍＲＮＡが高度に発現されることを示している。さらに、Hu-B1.219配列はある種の胎児組織および癌細胞系において発現される。したがって、レプチンによる体重調節のために脳で発現されるのに加え、Hu-B1.219（またはOB-R）は造血および内皮細胞でも発現され、それによってこれらの細胞をレプチンの作用に対して応答性にする。
【００３１】
この分子のさらに別の変異型が存在するかもしれないので、本明細書に開示するｃＤＮＡの任意の部分に対応する核酸フラグメントから作製した標識ＤＮＡプローブによって、ヒト胎児肝臓、ヒト肺、ヒト腎臓、ヒト脈絡叢、ヒト視床下部、ヒト前立腺およびヒト卵巣から調製したｃＤＮＡライブラリー中でそれらを同定することが可能である。より具体的には、上記ｃＤＮＡ配列の５'または３'末端に対応するオリゴヌクレオチドを用いて、より長いヌクレオチド配列を得ることが可能である。すなわち、上記ライブラリーをプレートに播き、各150mmプレートについて最大30,000pfuを生じさせる。約40枚のプレートをスクリーニングすればよい。プラークの直径が0.25mmに達するまで、またはプラークが相互に接しだすまで（３〜８時間）、プレートを37℃でインキュベートする。ナイロンフィルターをソフトトップアガロース(soft top agarose)の上に載せ、60秒後にフィルターを剥がし、0.4N水酸化ナトリウムからなるＤＮＡ変性溶液に浮遊させる。次に、1M Tris HCl，pH 7.5からなる中和溶液にフィルターを浸漬してから、空気乾燥させる。フィルターは、10%硫酸デキストラン、0.5M NaCl，50mM Tris HCl，pH 7.5，0.1%ピロリン酸ナトリウム、1%カゼイン、1%SDS，および0.5mg/mlの変性サケ精子ＤＮＡを含むカゼインハイブリダイゼーション緩衝液中で60℃で６時間、まえもってハイブリダイズさせる。次に、放射性標識プローブを95℃に２分間加熱することにより変性させ、そしてフィルターを含んでいる上記プレハイブリダイゼーション溶液に加える。フィルターを60℃で16時間ハイブリダイズさせる。次に、フィルターを1X洗浄混合物(10X洗浄混合物は3MNaCl，0.6M Tris塩基および0.02M EDTAを含む)中で２回５分間、両方とも室温で洗浄し、その後1%SDSを含む1X洗浄混合物中で60℃で30分間洗浄し、最後に0.1%SDSを含む0.3X洗浄混合物中で60℃で30分間洗浄する。次に、フィルターを空気乾燥させ、オートラジオグラフィーのためＸ線フィルムに暴露する。現像後、フィルムとフィルターを並べて、陽性プラークを選択する。単一の単離された陽性プラークが得られない場合は、プラークを
含有する寒天プラグ(plug)を取り出して、0.1M NaCl，0.01M硫酸マグネシウム、0.035M Tris HCl，pH 7.5,0.01%ゼラチンを含むラムダ希釈緩衝液中に入れる。次に、このファージを再度プレートに播いて再スクリーニングし、単一の、うまく単離された陽性プラークを得ることができる。公知のｃＤＮＡ配列に基づくプライマーを用いて陽性プラークを単離して、ｃＤＮＡクローンの配列を決定することができる。全長ｃＤＮＡが得られるまでこの工程を繰り返すことができる。
【００３２】
全ての３'末端イソ型を同定する方法の１つは、種々の組織（脈絡叢、視床下部、胎児肝臓、骨髄、卵巣または前立腺を含むがそれらだけに限定されない）由来の変異型ｃＤＮＡの３'末端をＰＣＲにより増幅することである。ｃＤＮＡの３'末端を得るため、オリゴdTプライマーを用いてｃＤＮＡの第１鎖を合成する。次に、遺伝子の保存された領域（例えばヌクレオチド2770の上流）に由来するHu-B1.219特異的プライマーおよびオリゴdTを用いて３'末端を増幅する。標準的技法によりＰＣＲフラグメントをクローン化し、配列決定する。いったんこれらの配列を得たならば、アミノ酸配列に翻訳し、連続したオープンリーディングフレーム、チロシンキナーゼ活性化に関連する調節領域、等の目だった特徴について調べ、そして最後に公知の変異型と構造が全般的に類似しているかどうか調べる。
【００３３】
5.2.前駆細胞マーカーとしてのHu-B1.219
Hu-B1.219は造血および内皮起源の細胞において発現される。後出の第７節における特定の実施態様では、Hu-B1.219は初期前駆細胞、および長期再増殖能を有する前駆体のうち数パーセントの細胞によって発現される。細胞の同定および単離のためのマーカーとしてHu-B1.219受容体を利用するために、このタンパク質に対する抗体等の特異的結合剤を作製することができる。
【００３４】
5.2.1.抗体の作製
天然または組換えHu-B1.219受容体のエピトープに対する抗体を作製するには、当分野で公知の種々の方法を用いることができる。これらの抗体は以下のものを含むがそれらだけに限定されない。すなわち、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、FabフラグメントおよびFab発現ライブラリーによって作製されるフラグメントである。中和性抗体、すなわち受容体のリガンド結合部位について競合する抗体は、診断および治療のために特に好ましい。
【００３５】
Hu-Bl.119に結合するモノクローナル抗体を放射性標識して、注射後それらが体内のどこに位置し、分散しているかを追跡することが可能である。放射性同位体で標識した抗体を、癌細胞、転位および胎児組織を新たにイメージするための非侵襲性の診断道具として用いることができる。
【００３６】
細胞傷害性作用物質を体内の特定部位に向かわせる免疫毒素を設計することも可能である。例えば、高親和性Hu-B1.219特異的モノクローナル抗体を共有結合によりジフテリア毒素またはリシンのような細菌毒素または植物毒素と複合体化することができる。抗体／ハイブリッド分子の一般的な調製方法は、SPDP等のチオール架橋試薬の使用を含む。この試薬は、抗体の第一級アミノ基を攻撃し、ジスルフィド交換によって毒素を抗体に結合させる。ハイブリッド抗体を用いて、Hu-B1.219を発現している癌細胞を特異的に除去することができる。
【００３７】
抗体を作製するためには、Hu-B1.219タンパク質、そのフラグメントまたは合成ペプチドを注射することによって、種々の宿主動物（ウサギ、マウス、ラット、ハムスターを含むが、これらだけに限定されない）を免疫感作することができる。免疫応答を増強するため、宿種の種によって種々のアジュバントを用いることができる。これらアジュバントは以下のものを含むがそれだけに限定されない。すなわち、フロイントアジュバント（完全および不完全）、水酸化アルミニウム等の鉱物ゲル、リソレシチン、プルロニックポリオール等の界面活性剤、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、スカシ貝ヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびBCG（カルメット-ゲラン杆菌）、コリネバクテリウム・パルバム（Corynebacterium parvum）等の有用な可能性のあるヒトアジュバントである。
【００３８】
Hu-B1.219に対するモノクローナル抗体は、培養下の連続した細胞系による抗体分子の産生をもたらす任意の技法を用いて作製することが可能である。これらの技法は以下のものを含むがそれらだけに限定されない。すなわち、KohlerおよびMilsteinによって最初に記述された技法(Nature，1975，256:495-497)、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Kosborら，1983，Immunology Today，4:72;Coteら，1983，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，80:2026-2030）およびEBVハイブリドーマ技法(Coteら，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp．77-96)である。さらに、適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的活性を有するヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングすることにより「キメラ抗体」を作製するために開発された技法(Morrisonら，1984，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，81:6851-6855;Neubergerら，1984，Nature 312:604-608;Takedaら，1985，Nature 314:452-454)を用いることができる。または、１本鎖抗体の作製のために記述された技法（米国特許第4,946,778号）を、Hu-B1.219特異的１本鎖抗体の作製のために適合させることができる。
【００３９】
Hu-B1.219の特異的結合部位を含む抗体フラグメントを公知の技法によって作製することができる。例えば、そのようなフラグメントは、抗体分子のペプシン消化によって作製できるF(ab')2フラグメント、およびこのF(ab')2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって作製できるFabフラグメントを含むが、これらだけに限定されない。または、Fab発現ライブラリーを構築し(Huseら，1989，Science 246:1275-1281)、Hu-B1.219に対する所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの迅速で容易な同定を可能とすることができる。
【００４０】
5.2.2.前駆細胞分離
ヒト造血前駆細胞は、Hu-B1.219タンパク質に対する抗体、レプチンリガンド、受容体結合ドメインを有するレプチンペプチドまたはレプチン融合タンパク質を用いて、当分野で周知の常用の細胞分離法により分離することができる。このようなHu-B1.219特異的結合剤は、抗CD34抗体等の他の作用物質と組み合わせて使用することができる。
【００４１】
骨髄が好ましい細胞源であるが、造血細胞の他の生理学的供給源（例えば、脾臓、胸腺、末梢血、サイトカイン可動化(cytokine-mobilized)血液、臍帯血、胚卵黄包または胎児肝臓）を使用することも可能である。好ましくは、骨髄を腸骨稜から採取するが、他の骨腔から採取してもよい。骨髄は当業者に周知の種々の方法によって骨腔から採取することができる。これらの方法には、生理的媒質、平衡塩溶液、生理緩衝液および他の天然に存在する因子の混合物を用いて骨を洗うことが含まれる。典型的には、骨髄を濾過し、遠心分離し、そして再懸濁する。
【００４２】
いったん造血細胞の供給源が得られたならば、Hu-B1.219によってコードされる細胞表面受容体タンパク質と特異的に結合する作用物質（特異的抗体またはレプチンリガンド等）を利用する種々の方法を用いて、その細胞混合物から造血前駆細胞を分離することができる。これらの技法は、例えば、蛍光活性化セルソーター(FACS)および特異的蛍光色素を用いるフローサイトメトリー、細胞表面マーカー特異的抗体に結合したビオチンまたは固相支持体（アフィニティーカラムマトリックスまたはプラスチック表面等）に結合したアビジンまたはストレプトアビジンを用いたビオチン−アビジンまたはビオチン−ストレプトアビジン分離、抗体を被覆した磁気ビーズを用いた磁気分離、抗体および補体もしくは細胞毒素または放射性同位体に結合した抗体、等の分解分離を含む。
【００４３】
抗体による細胞混合物の分離は、陰性または陽性分離選択手順によって実施することができる。陰性分離においては、所望しない造血細胞上に存在するマーカーに特異的な抗体が使用される。抗体が結合した細胞を除去または溶解し、残った所望の混合物を保持することができる。陽性分離においては、Hu-B1.219に特異的な抗体またはレプチンリガンドを使用することができる。抗体またはレプチンが結合した細胞を分離して保持する。陽性および陰性分離を実質的に同時に、または連続して用いうることが理解されるであろう。また、本発明が、本明細書に開示するHu-B1.219の発現に基づいて細胞を単離することのできる任意の分離技法を包含することも理解されるであろう。例えば、細胞混合物をまずCD34+画分およびCD34-画分に分離し、次にHu-B1.219特異的分離を実施することができる。
【００４４】
現在、抗体に基づく分離のための最も一般的な技法は、FACSによるもの等のフローサイトメトリーの使用である。典型的には、フローサイトメトリーによる分離は以下のように実施される。すなわち、造血細胞の懸濁混合物を遠心分離にかけ、媒質に再懸濁する。蛍光色素に結合させた抗体を添加して、抗体を特異的細胞表面マーカーと結合させる。次に、細胞を１回以上の遠心分離および再懸濁工程によって洗浄する。細胞をFACSに通すと、FACSは異なる蛍光特徴に基づいて細胞を分離する。多重カラー分析を含めて様々な性能と能力をもつFACS系が入手可能である。細胞は、大きさおよび粒状度、ならびに特定の細胞表面マーカーの陽性および／または陰性発現によって影響される、前方および側方分散の特徴的プロフィールによって同定されうる。
【００４５】
フローサイトメトリー以外の他の技法が、より早い分離を提供できるかもしれない。そのような方法の１つは、アフィニティークロマトグラフィーによるビオチン−アビジンに基づく分離である。典型的には、このような技法は、洗浄した造血細胞をビオチン結合レプチンまたは特異的マーカーに対する抗体と共にインキュベートし、次にこれをアビジンカラムに通すことによって実施される。ビオチン−抗体−細胞またはビオチン−レプチン−細胞複合体がビオチン−アビジン相互作用を介してカラムに結合する。他方、他の細胞はカラムを通過する。最後に、カラムに結合した細胞を摂動(perturbation)または他の方法によって放出させることができる。
【００４６】
フローサイトメトリーおよびビオチン−アビジン技法は、細胞分離の高度に特異的な手段を提供する。所望であれば、特異性のより低い、しかし造血細胞源から成熟血液細胞の大部分を除去することができる技法によって分離を始めてもよい。例えば、磁気ビーズ分離を用いて分化した造血細胞集団（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞およびマクロファージを含む）ならびにマイナーな細胞集団（巨核球、マスト細胞、好酸球および好塩基性細胞を含む）を最初に除去することができる。好ましくは、存在する全造血細胞の少なくとも約70%、そして通常は少なくとも約80%が除去できる。
【００４７】
好ましい最初の分離技法は、密度勾配分離法である。この方法では、骨髄または他の造血細胞混合調製物を遠心分離して、上清を除去する。細胞を、例えば10%FCSを含むRPMI 1640培地(Gibco)に再懸濁し、例えばFICOLLまたはPERCOLLまたはEUROCOLLINS媒質を用いて調製した密度勾配中に置く。次に、遠心分離によるか、またはCobel & Cell Separator'2991(Cobev，Lakewood，Colorado)を用いて自動的に分離を実施することができる。造血細胞混合物の供給源および造血細胞の含有量によっては、付加的な分離手順の実施が望ましいかもしれない。例えば、造血細胞の供給源として血液が用いられた場合、あらゆる画分の分離に先立って、赤血球を溶解することが望ましいであろう。さらに、水ひ(elutriation)も単独で、または本明細書に記載の他のすべての精製手順と組み合わせて、用いることができる(Nogaら，1990，Prog．Clin．Biol．Res．333:345;Nogaら，1992，Prog．Clin．Biol．Res．377:411)。
【００４８】
5.3.obese遺伝子産物レプチン
ヒトおよびマウスレプチンのヌクレオチドおよびアミノ酸配列がZhangらによって最近刊行された(1994，Nature 372:425-432)。その後、大腸菌中で機能性レプチンを発現させるためにマウスのコード配列が使用された(Pelleymounterら，1995，Science 269:540-543;Halaasら，1995，Science 269:543-546;Campfieldら，1995，Science 269:546-549)。さらに、ヒトレプチンもまた発現され、マウスを用いた実験において生物学的に活性であることがわかった(Halaasら，1995，Science 269:543-546)。したがって、ヒトおよびマウスのコード配列、および他の種由来の相同的コード配列を発現させることが可能であり、そして組換えタンパク質は抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィー等の常用の技法で精製することができる。または、脂肪細胞系等のレプチンを分泌する細胞から天然のタンパク質を直接精製することも可能である。
【００４９】
5.3.1.レプチンタンパク質の発現
本発明を実施するために、レプチンタンパク質、そのペプチドフラグメント、融合タンパク質またはそれらの機能性等価物をコードするヒトおよびマウスレプチンポリヌクレオチド配列を用いて、適切な宿主細胞中でそれらの発現を引き出す組換えＤＮＡ分子を作製することができる。
【００５０】
遺伝子暗号の縮重のため、実質的な同一な、または機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を、レプチンタンパク質のクローン化および発現のための本発明の実施に用いることができる。特に、このようなＤＮＡ配列は、ストリンジェントな条件下でヒトレプチン配列にハイブリダイズ可能なＤＮＡ配列を含む。
【００５１】
本発明にしたがって用いることのできる変更されたＤＮＡ配列は、同一の、または機能的に等価な遺伝子産物をコードする配列をもたらす、異なるヌクレオチド残基の欠失、付加または置換を含む。遺伝子産物それ自体が、表に現れない、したがって機能的に等価なレプチンタンパク質を産生する変化をもたらす、アミノ酸残基の欠失、付加または置換をコード領域内に含んでいてもよい。そのようなアミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、および／または両親媒性における類似に基づいてなされる。例えば、負に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ；正に荷電したアミノ酸にはリシン、ヒスチジンおよびアルギニンが含まれ；類似した親水性値をもつ非荷電の極性先端基(head group)を有するアミノ酸には以下のものが含まれる：グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシンである。そして、非極性先端基を有するアミノ酸にはアラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニン、トリプトファンが含まれる。
【００５２】
遺伝子産物のプロセシングおよび発現を改変する変更を含むがそれらだけに限定されない種々の目的のためにコード配列を変えるため、レプチンのＤＮＡ配列を工学的に作製することができる。例えば、当分野で周知の技法（部位特異的突然変異誘発、等）を用いて、新しい制限部位を導入するため、またはグリコシル化パターン、リン酸化、等を変更するため、等の目的で突然変異を導入することができる。
【００５３】
本発明の別の実施態様においては、レプチン配列または改変されたレプチン配列を異種配列に連結して、融合タンパク質をコードすることができる。市販の抗体によって認識される異種エピトープを発現するキメラレプチンタンパク質をコードすることもまた有用でありうる。融合タンパク質は、レプチンタンパク質が異種部分から開裂されうるように、レプチン配列と異種タンパク質配列の間に位置する開裂部位を含むように作製することも可能である。
【００５４】
本発明の別の実施態様においては、レプチンのコード配列の全部または一部を、当分野で周知の化学的方法を用いて合成することも可能であろう。例えば、Caruthersら，1980，Nuc．Acids Res．Symp．Ser．7:215-233:CreaおよびHorn，180，Nuc．Acids Res．9(10):2331;MatteucciおよびCaruthers，1980，Tetrahedron Letters 21:719;およびChowおよびKempe，1981，Nuc．Acids Res．9(12):2807-2817を参照されたい。または、レプチンアミノ酸配列を全部または部分的に合成する化学的方法を用いてタンパク質自体を作製することが可能であろう。例えば、固相技法によってペプチドを合成し、樹脂から開裂し、分取高速液体クロマトグラフィーによって精製することができる。（例えば、Creighton，1983，Proteins，Structures and Molecular Principles，W.H．Freeman and Co.，N.Y.pp．50-60参照）。合成ペプチドの組成はアミノ酸分析または配列決定によって確認することができる(例えば、エドマン分解法；Creighton，1983，Proteins，Structures and Molecular Principles，W.H．Freeman and Co.，N.Y．pp．34-49)。
【００５５】
生物学的に活性なレプチンタンパク質を発現させるために、レプチンをコードするヌクレオチド配列またはその機能的等価物を適切な発現ベクター、すなわち挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むベクターに挿入する。レプチン遺伝子産物、ならびに組換えレプチン発現ベクターによってトランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞または細胞系は、種々の用途に用いることができる。
【００５６】
5.3.2.レプチンの発現系
レプチンコード配列および適切な転写／翻訳調節シグナルを含む発現ベクターの構築には、当業者に周知の方法を用いることができる。これらの方法には、in vitro組換えＤＮＡ技法、合成技法およびin vivo組換え／遺伝子組換えが含まれる。例えば、Sambrookら，1989，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Springs Harbor Laboratory，N.Y.およびAusubelら、1989，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y．に記述されている技法を参照されたい。
【００５７】
レプチンコード配列を発現するために種々の宿主−発現ベクター系が使用できる。これらは以下のものを含むがそれだけに限定されない。すなわち、レプチンコード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターによって形質転換された細菌等の微生物；レプチンコード配列を含む組換え酵母発現ベクターによって形質転換された酵母；レプチンコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；レプチンコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスCaMV；タバコモザイクウイルスTMV）に感染した、またはレプチンコード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Tiプラスミド）によって形質転換された植物細胞系；または動物細胞系である。
【００５８】
これらの系の発現エレメントは、その強度と特異性において異なる。使用する宿主／ベクター系により、構成性プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む多数の適切な転写および翻訳エレメントの任意のものを発現ベクター中に使用できる。例えば、細菌系を用いてクローン化を行う場合は、バクテリオファージλのpL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lacハイブリッドプロモーター)等の誘導性プロモーターが使用できる；昆虫細胞系を用いてクローン化を行う場合は、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーター等のプロモーターが使用できる；植物細胞系を用いてクローン化を行う場合は、植物細胞ゲノム由来のプロモーター（例えば、熱ショックプロモーター；RUBISCOの小サブユニットのプロモーター；クロロフィルα／β結合タンパク質のプロモーター）または植物ウイルス由来のプロモーター（例えば、CaMVの35SＲＮＡプロモーター；TMVの外被タンパク質プロモーター）が使用できる；哺乳動物細胞系を用いてクローン化を行う場合は、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）、または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター）が使用できる；レプチンＤＮＡのコピーを多数含む細胞系を作製する場合は、SV40、BPV、およびEBVに基づくベクターを適切な選択マーカーと共に用いることができる。
【００５９】
細菌系においては、発現されたレプチンに意図される用途に応じて、多数の発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、抗体の生産あるいはペプチドライブラリーのスクリーニングのために多量のレプチンを製造する場合は、容易に精製できる融合タンパク質生成物の高いレベルの発現を導くベクターが望ましい。そのようなベクターとしては、限定するものではないが、E．coli発現ベクターpUR278(Rutherら、1983，EMBO J．2:1791)が挙げられ、これはレプチンコード配列をlacZコード領域を含むフレーム中でベクターに結合しハイブリッドAS-lacZタンパク質が生産されるようにすることができ、またpINベクター(Inouye & Inouye，1985，Nucleic acids Res．13:3101-3109;Van Heeke & Schuster，1989，J．Biol．Chem．264:5503-5509)等も挙げられる。pGEXベクターも、外来ポリペプチドをグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として発現するのに使用できる。一般にそのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズに対する吸着及びその後の遊離のグルタチオンの存在下における溶出により、溶解細胞から容易に精製することができる。ｐGEXベクターはトロンビンあるいはXa因子プロテアーゼ開裂部位を含み、対象となるクローン化ポリペプチドをGST部分から放出できるように設計されている。
【００６０】
酵母においては、構成的なあるいは誘導可能なプロモーターを含む多くのベクターを使用することができる。概説としては、Current Protocols in Molecular Biology，Vol．2，1988，Ed．Ausubelら、Greene Publish．Assoc．& Wiley Interscience，Ch．13;Grantら、1987，Expression and Secretion Vectors for Yeast，Method in Enzymoloogy，Eds．Wu & Grossman，1987，Acad．Press,N.Y.，Vol．153，pp．516-544;Glover，1986，DNA Cloning，Vol．II，IRL Press,Wash.,D.C.,Ch.3;及びBitter,1987,Heterologous Gene Expression in Yeast,Mehtods in Enzymology,Eds．Berger & Kimmel,Acad.Press，N.Y.,Vol．152,pp．673-684;及びThe Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces，1982,Eds.Strathernら、Cold Spring Harbor Press,Vols.I及びIIを参照されたい。
【００６１】
植物発現ベクターを使用する場合は、レプチンコード配列の発現は多数のプロモーターの任意のものにより駆動することができる。例えば、CaMVの35SRNA及び19S RNAプロモーター(Brissonら、1984,Nature310:511-514)、あるいはTMVのコートタンパク質プロモーター(Takamatsuら、1987，EMBO J．6:307-311)のようなウイルスプロモーターを使用でき、あるいは、RUBISCOの小サブユニットのような植物プロモーター(Coruzziら、1984，EMBO J．3:1671-1680;Broglieら、1984，Science 224:838-843);あるいは熱ショックプロモーター、例えば大豆hsp17.5-Eあるいはhsp-17.3-B(Gurleyら、1986，Mol．Cell.Biol．6:559-565)を使用することができる。これらの構築物は、Tiプラスミド、Riプラスミド、植物ウイルスベクター、直接のＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等を使用して植物細胞に導入することができる。このような技術の概観のためには、例えば、Weissbach & Weissbach,1988,Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,NY,Section VIII，pp．421-463;及びGrierson & Corey，1988，Plant Molecular Biology，2d Ed.,Blackie,London,Ch.7-9を参照されたい。
【００６２】
レプチンを発現するのに使用できるまた別の発現系は昆虫系である。一つのそのような系においては、Autographa californica核多角体病ウイルス(AcNPV)を外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用することができる。該ウイルスはSpodoptera frugiperda細胞中で増殖する。レプチンコード配列をこのウイルスの非必須領域(例えばポリヘドリン遺伝子)中にクローン化し、AcNPVプロモーター(例えばポリヘドリンプロモーター)の調節下に置くことができる。レプチンコード配列をうまく挿入することにより、ポリヘドリン遺伝子の不活性化と非閉塞組換体ウイルス(即ち、ポリヘドリン遺伝子によりコードされたタンパク質コートを欠いているウイルス)の生産が得られる。これらの組換体ウイルスを次にSpodoptera frugiperda細胞に感染させるのに使用し、この中で挿入された遺伝子が発現される(例えばSmithら、1983，J．Viol.46:584;Smith，アメリカ特許第4,215,051号を参照)。
【００６３】
哺乳類宿主細胞においては、ウイルスをベースとする多くの発現系を使用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合は、レプチンコード配列を、アデノウイルス転写／翻訳調節複合体、例えば後期プロモーター及び三分割リーダー配列に結合することができる。このキメラ遺伝子は次にin vitroまたはin vivo組換えによりアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域(例えばE1またはE3領域)に挿入することにより、生存可能で、感染した宿主中でレプチンを発現できる組換体ウイルスを得ることができる(例えば、Logan & Shenk，1984，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:3655-3659を参照)。あるいは、ワクシニア7.5Kプロモーターを使用することができる(例えば、Mackettら、1982，Proc．Natl．Acad. Sci．USA 79:7415-7419;Mackettら、1984，J．Virol.49:857-864;Panicaliら、1982，Proc．Natl.Acad.Sci．USA 79:4927-4931を参照)。
【００６４】
挿入されたレプチンコード配列の効率的な翻訳のためには特定の開始シグナルが必要な場合もある。これらのシグナルはATG開始コドン及び隣接配列を含む。それ自体の開始コドン及び隣接配列を含む全レプチン遺伝子を適当な発現ベクターに挿入する場合には追加の翻訳調節シグナルは必要ない。しかし、レプチンコード配列の一部分のみが挿入される場合は、ATG開始コドンを含む外来の翻訳調節シグナルが与えられなければならない。さらに、開始コドンは、レプチンコード配列のリーディングフレームと同位相にあり、インサート全体の翻訳を確実にさせるものでなければならない。これらの外来翻訳調節シグナル及び開始コドンは種々の起源のものであってよく、天然のものあるいは合成のものであってよい。発現の効率は、適当な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーター等を含ませることにより増強され得る(例えば、Bittnerら、1987，Methods in Enzymol.153:516-544を参照）。
【００６５】
さらに、挿入された配列の発現を変調させるか、あるいは遺伝子産物を所望の特異的な方式で修飾し、プロセシングする宿主細胞株を選択することができる。タンパク質生成物のそのような修飾(例えばグリコシル化)及びプロセシング(例えば開裂)は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。レプチンにいくつかの共通のN-グリコシル化部位が存在することは、適正な修飾がレプチンの機能に重要であり得る可能性を支持するものである。種々の宿主細胞が、タンパク質の翻訳後のプロセシング及び修飾のための特徴的で特異的なメカニズムを有している。適当な細胞系または宿主系を選択して、発現された外来タンパク質の正しい修飾及びプロセシングを確保することができる。この目的のためには、一次転写物の適正なプロセシング、遺伝子産物のクリコシル化及びリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を使用することができる。そのような哺乳類宿主細胞には、限定するものではないが、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、WI38等が含まれる。
【００６６】
組換体タンパク質の長期間の高い収率の生産のためには安定な発現が好ましい。例えば、レプチン配列を安定に発現する細胞系を作製することができる。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、適当な発現調節エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等)により調節されるレプチンＤＮＡ及び選択可能マーカーにより宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入の後、作製された細胞を富栄養化培地中で１〜２日増殖させ、その後選択培地に切り換えることができる。組換体プラスミド中の選択可能マーカーは、選択に対する抵抗性を与え、細胞がプラスミドをその染色体に安定に組み込み、増殖して形質転換体の集落を形成し、集落はその後、細胞系中にクローン化され増殖し得ることを可能とするものである。
【００６７】
多数の選択系を使用することができ、限定するものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wiglerら、1977，Cell 11:223)、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska & Szybalski，1962,Proc．Netl.Acad．Sci．USA 48:2026)及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowyら、1980，Cell 22:817)遺伝子を、tk-、hgprt-またはaprt-細胞中でそれぞれ使用することができる。また、抗代謝産物耐性を選択の基礎として使用することができ、メトトレキセートに対する耐性を与えるdhfr遺伝子についてのもの(Wiglerら、1980，Proc．Natl.Acad．Sci．USA 77;3567;O'Hareら、1981，Proc．Natl.Acad．Sci．USA 78;1527)、ミコフェノール酸に対する耐性を与えるgpt遺伝子についてのもの(Mulligan & Berg，1981,Proc.Natl．Acad.Sci.USA 78:2072)、アミノグリコシドG-418に対する耐性を与えるneo遺伝子についてのもの(Colberre-Garapinら、1981，J．Mol．Biol．150:1)、ハイグロマイシンに対する耐性を与えるhygro遺伝子についてのものがある(Santerreら、1984，Gene 30:147)。別の選択可能な遺伝子も報告されており、即ち、trpBは細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにするものであり、hisDは細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用できるようにするものであり(Hartman & Mulligan，1988，Proc．Natl．Acid．Sci．USA 85:8047)、ODC(オルニチンデカルボキシラーゼ)は、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、2-(ジフルオロメチル)-DL-オルニチン、DFMOに対する耐性を与えるものである(McConlogue L，1987，Current Communications in Molecular Biology，Cold Spring Harbor Laboratory ed.)。
【００６８】
レプチンタンパク質が上記の系のいずれかにより発現されたら、培養細胞の上清あるいは細胞溶解物をタンパク質精製の標準的な種々の方法にかけることができる。例えば、抗レプチン抗体あるいはHu-B1.219タンパク質を、前記物質をアフィニティクロマトグラフィーにより精製するのに使用することができる。あるいはレプチンはイオン交換クロマトグラフィーまたはHPLCにより精製することができる。その後、そのタンパク質の純度をSDS-PAGE等の種々の方法により確認することができ、タンパク質はすぐに使用するか、後の使用のために凍結保存する。細胞培養及びin vivo投与のためには、精製レプチンを使用の前に滅菌する必要がある。
【００６９】
5.4.レプチンによるHU-B1.219発現細胞の活性化
OB-Rを含む種々の形態のHU-B1.219は細胞外ドメインにおいて実質的に同一であるので、これらの受容体はリガンドとしてレプチンに結合できる。Hu-B1.219アイソフォームのレプチンに対する結合アフィニティを比較するため、変異体形態を標準的な発現ベクター、例えばＣＭＶプロモーター発現ベクター中にクローン化し、COS及びBaF3細胞にトランスフェクトする。その後抗-Hu-B1.219抗体への直接の結合により受容体の表面発現を評価する。さらに、レプチン融合タンパク質、あるいは放射性標識、蛍光染料、もしくは酵素に結合した可溶性レプチンを使用して、レプチン結合アッセイをTartagliaら(1995，Cell83:1263)により記載されたようにして行うこともできる。結果は陰性対照としての偽トランスフェクト細胞と比較する。
【００７０】
Hu-B1.219の４種の変異体は異なる細胞内ドメインを有するので、これらのアイソフォームをそのシグナル伝達能力について比較して、最も活性な形態を決定することができる。リガンドによる全部ではないにしても殆どの造血系受容体の刺激は、受容体及び細胞性プロテインキナーゼカスケードの両方においてチロシンの急速なリン酸化を生じる(Heidin，1995，Cell 80:213-233;Ihle，1995,Nature 377:591-594)。これらの分子のリン酸化はシグナルを活性化し、これは最終的に核に伝達されて遺伝子の活性化を生じる。ヘマトポエチン受容体へのリガンド結合の際、このような方式で活性化される最初の分子のいくらかはJAK(Janus)ファミリーのプロテインキナーゼである(Ziemieckiら、1994,Trends Cell Biol．4:207-212)。これらの活性化されたキナーゼが今度は分子のSTATファミリーのメンバーをリン酸化し、これは最終的には核に移動して活性転写複合体を形成する(Darnellら、1994，Science 264:1415-1421;Zhongら、1994，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:4806-4810;Houら、1994，Science 265:1701-1706)。
【００７１】
従って、レプチンによる細胞の活性化は、Hu-B1.219結合の後のJAK1-3のリン酸化のパターンを調べることにより評価することができる。これは、ゲンタマイシン(100μg/ml)、２ｍＭグルタミン(GIBCO)、10％FCS、及びレプチン(0〜500nM)を含むRPMI 1640(GIBCO)中で造血細胞あるいはHu-B1.219トランスフェクタント(1〜100ｘ103)を37℃で10〜60分間培養することにより行うことができる。インキュベーションの後、細胞を氷冷PBS中で洗浄し、溶解バッファー(1％TritonX-100、200mM NaCl、10ｍＭトリスpH7.5、2.5ｍＭp-ニトロフェニルグアニジノベンゾエート、100μM Na3VO4、１μＭペプスタチン、50μＭ3,4-ジクロロイソクマリン、１ｍＭ PMSF、10μg/mlロイペプチン、10μg/mlアプロチニン）中に４℃で30分間再懸濁し、その後遠心分離により核と不溶物質を除去する。細胞溶解物にJAK1及びJAK2に対するポリクローナル抗体(Upstate Biotechnology,Lake Placid,NY)あるいはJAKファミリーに関連するヒトキナーゼであるヒトTyk2(Santa Cruz，CA)を製造者の推奨条件に従って加える。この混合物を４℃で30〜60分間回転させ、その後100μｌの10％プロテインA-セファロース溶液(Sigma)を加え、４℃でさらに30分間回転させる。沈殿を溶解バッファーで洗浄し、標準的なSDS還元サンプルバッファー中に溶出し、SDS-PAGEで分離する。Immobilonメンブラン(Millipore)に移すことによりウェスタンブロットで分析する。メンブランをゼラチン(1％)でブロックし、製造者の推奨条件に従って抗-ホスホチロシン(4G10，Upstate Biotechnology,Lake Placid，ＮＹ)とインキュベートする。リン酸化タンパク質を125I標識タンパク質A(Amersham)で検出する。
【００７２】
上記の実験のためには、造血細胞はヒトCD34+骨髄及び脊髄血から得ることができる。ネズミでの実験のためには、三種の始原集団、例えばLy-6+系列陰性骨髄、あるいは胎児肝臓もしくはAA4..1+胎児肝臓におけるその等価物を評価することができる。
【００７３】
チロシンリン酸化は、リガンド-受容体相互作用から得られた細胞活性化の指標であるが、レプチンを使用して造血前駆体の増殖及び／または分化を誘導することにより細胞レベルでの活性化の別の顕在化をアッセイすることができる。細胞増殖は、3H-チミジン取り込みあるいは細胞数の視覚的計数により容易に調べることができる。造血細胞の分化は、種々の造血性コロニーのin vitroでの増殖及び分化を刺激するレプチンの能力を試験することによりアッセイすることができる。例えば、細胞混合物を卵黄嚢、胎児肝臓あるいは骨髄から単離し、レプチンの存在下(0.1〜500nM)でその他の種々のサイトカインとともにあるいはなしに、血清を補充して、あるいは補充せずに標準的なメチルセルロースコロニーアッセイで培養することができる(Metcalf，1984，Clonal Culture of Hematopoietic Cells:Techniques and Applications,Elsevier,NY)。
【００７４】
そのようなアッセイのための標準的なプロトコールでは、Ficoll-Hypaque(1.077gm/cm3)による細胞混合物の密度勾配遠心と、約１x106の生存可能細胞を0.5〜15％の牛胎児血清(FCS)を含むIscoveの改良Dulbecco培地(IMDM)中への再懸濁を行う。次に細胞(1〜100ｘ103/ml)を、メチルセルロース(1.3％)、FCS(0.5〜15％)、BSA(1％)、モノチオグリセロール(100μM)、ゲンタマイシン(50μg/ml)及びレプチン(0.1〜500nM)を含むIMDMと混合する。平行した培養においては、別のサイトカイン:IL-3(100pg/ml)、スチール(steel)因子又はc-Kitリガンド又はSCF(10ng/ml)、及びEPO(2U/ml)を含めることができる。混合した後、混合物の１mlを37℃の湿潤インキュベーター中の25ｍｍ細菌グレード培養皿に5〜18日間入れる。倒立顕微鏡を使用し、造血性コロニーの数と種類を調べる。コロニーの形態を使用して種々のコロニーの種類、例えばBFU-e、CFU-e、CFU-G、CFU-GM、CFU-M、CFU-芽細胞、あるいはCFU-繊維芽細胞を分類する(Metcalf，1984，C1onal Culture of Hematopoietic Cells:Techniques and Applications，Elsevier，N.Y.;Freshney，1994，Culture of Hematopoietic Cells，Wiley-Liss，Inc.,pp.265-68)。このアッセイにおけるレプチンの最適な濃度によりこれらの始原多能性コロニーのサイズと頻度を増加させ得る。
【００７５】
レプチンは単独でも使用できるが、造血細胞増殖を促進するいくつかのサイトカイン、例えば限定するものではないが、IL-1、IL-3、IL-6、EPO、スチール因子(SCF)及びGM-CSF(1ng/ml)とともに相乗的に使用することもできる。さらに、生物学的に活性なレプチンは牛胎児血清(FCS)に存在するので、FCSの0.5〜15％を含む培養物を試験することができる。FCS中のレプチンの比活性は抗-レプチン抗体または対照としてのHu-B1.219の可溶性変異体により阻害できる。
【００７６】
特に、レプチンの作用は、高い増殖能力を有する細胞(HPPC)を形成する始原前駆体(McNiece and Briddell，1994，Culture of Hematopoietic Cells,Wiley-Liss，Inc.，pp．23-40)及び芽細胞コロニー(Leary and Ogawa，1994，Culture of Hematopoietic Cells,Wiley-Liss，Inc.，pp．41-54)について試験することができる。これらのアッセイにおいてさらに始原的な細胞に対するレプチンの作用を評価するために、CD34+骨髄、脊髄血、及び胎児肝臓細胞を最初に抗体で選別し、上記のアッセイで試験することができる。最近得られた証拠によればCD34-幹細胞の存在が示唆されているので、CD34-Lin-集団もレプチンにより刺激され得る。
【００７７】
さらに、始原長期培養開始細胞(LTCIC)及び造血幹細胞に対するレプチンの作用を評価することができる。LTCICは長期造血培養を開始できる前駆体であり、造血幹細胞の機能体であると考えられている(Sutherland and Eaves，1994,Culture of Hematopoietic Cells，Wiley-Liss Inc.,pp．139-162;Van der Sluijsら、1990，Exp．Hematol．18:893-896;Traycoffら、1994，Exp．Hematol.22:215-222)。これらの培養条件の造血幹細胞を増殖させる能力は競合的再集団アッセイにより確認できる(Harrison，1980，Blood 55:77-81)。このアッセイにより造血幹細胞の定量が可能となる。
【００７８】
さらに、内皮細胞はHu-B1.219も発現するので、レプチンは初代内皮細胞を維持するための標準的な培養において0.1〜500nMの濃度で初代内皮細胞の増殖を刺激するのに使用できる(Masek and Sweetenham，1994，Br.J．Haematol.88:855-865;Visnerら、1994，Am.J．Physiol．267:L406-413;Moyerら、1988,In Vitro Cell Dev．Biol．24:359-368)。あるいは、レプチンはサイトカインを生成するように内皮細胞を誘導するのに使用できる(Broudyら、1987，J．Immunol．139:464-468;Seelentagら、1987，EMBO J．6:2261-2265)。レプチンの存在下、他のサイトカイン、例えば血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、繊維芽細胞増殖因子(FGF)、トランスフォーミング増殖因子(TGF)及び上皮増殖因子(EGF)とともに、あるいはそれらなしに培養した、2〜5日間の培養初代内皮細胞又は内皮細胞系の上清を回収し、上記の造血性コロニーアッセイにおける補充物として試験する。
【００７９】
本発明の別の態様においては、受容体は細胞表面でダイマーを形成することが多いので、最適なシグナル伝達を与える異なるHu-B1.219アイソフォームの組合せを増殖刺激及びリン酸化パターンにより測定することができる。標準的なＣＭＶ発現ベクターを使用して、Hu-B1.219増殖因子依存性指示細胞系(例えばBaF3)に前記アイソフォームの種々の組合せをトランスフェクトすることができる。細胞表面発現が示された後、レプチン(0.1〜500nM)を培養に加え、確立された方法により増殖速度とリン酸化パターンを測定する。その他の細胞系、例えばTF-1、FD5及びTS1も使用できる。
【００８０】
細胞質尾部が切断されたアイソフォームが発現されるために、別のタンパク質鎖を、Hu-B1.219と組合わせてシグナル発生分子としていずれかの組織中で使用することができる。そのような分子は、例えば胎児肝臓、CD34+骨髄、肺、卵巣等の種々の組織の発現ライブラリー由来のｃＤＮＡのプールを、切断（即ち、トランケート）型Hu-B1.219アイソフォームの１つを発現する構築物とともに増殖因子依存性細胞系(例えばBaF3)にトランスフェクトすることによりスクリーニングし選択することができる。レプチンの存在下で増殖する能力を読出値として使用することができる。特に、インシュリン受容体関連受容体(Zhang and Roth，1992，J．Biol．Chem．267:18320)、LIFRα、IL-2Rγ、IL-4Rα(Moselyら、1989，Cell 89:335)、IL-13Rα鎖(Hiltonら、1996，Proc．Natl.Acad．Sci.USA 93:497)はHu-B1.219活性の相補鎖として機能し得る。この相補性に起因するユニークなｃＤＮＡを同定する方法は当分野で十分に確立されている。
【００８１】
さらに、レプチンと同じ方法でHu-B1.219を活性化する物質をレプチンの代わりに使用することもできる。これらの物質としては小分子及びペプチドが挙げられ、それらは以下のようなスクリーニングアッセイにより選択できる。10,000個のBaF3及びBaF3/Hu-B1.219(完全長Hu-B1.219アイソフォームを発現するトランスフェクタント細胞)細胞を、マイクロタイタープレート中で、試験物質とインキュベートした後に増殖効果についてスクリーニングする。刺激がないとこれらの細胞は死滅する。トランスフェクト細胞系においてなんらかの増殖促進効果が見られ、BaF3宿主で見られなければ、試験物質がHu-B1.219受容体あるいはそのシグナル発生経路を特異的に活性化することを示す。このアッセイを使用して、ペプチド、オリゴヌクレオチド、及び化学物質ライブラリーを含む小分子をスクリーニングする。
【００８２】
5.5.レプチンのin vitroでの使用
種々の細胞種におけるHu-B1.219の発現からみて、レプチンを使用して培養中でこれらの細胞を活性化することができる。活性化された細胞は、増大した増殖により数が増加し、及び／またはより成熟した細胞へ分化する。これに関し、各細胞種に最適なレプチン有効濃度は、種々の量のレプチンを特定の細胞とインキュベートし、その活性化のレベルをチロシンリン酸化、増殖あるいは分化により測定する慣用の滴定実験により決定することができる。
【００８３】
特に、造血前駆細胞がHu-B1.219を発現する。造血細胞はin vitroでレプチンにさらすことにより活性化することができ、これによりin vitroまたはin vivoにおけるそれらの使用の前にその数を増加させることができる。このような造血細胞は、骨髄、末梢血(Demuynckら、1995，Ann．Hematol．71:29-33;Schedingら、1994，Stem．Cells 12:Suppl．1:203-210)、及び脊髄血から得られる。造血幹細胞の増殖を選択的に増進するためには、ドナー細胞混合物を最初にCD34+細胞に分離し、その後にレプチンにより刺激することができる。in vitro細胞毒性試験及び新しいサイトカインの発見のために、増殖させた細胞を骨髄移植のドナー細胞又は長期骨髄培養物として使用することができる(Ponchioら、1995，Blood 86:3314-3321;Testa and Dexter，1991，Curr．Opin．3:272-278;Naughton and Naugton，1991，アメリカ特許第5,032,508号)。
【００８４】
Hu-B1.219はいくつかの内皮細胞及びその前駆体においても発現されるので、レプチンを使用してin vitroで血管形成を誘発することができる。これには、レプチンを単独で、あるいはVEGF、PDGF、FGF又はTGF-αと組み合せて使用することができる。血管は２つの主要な過程の組み合わせにより形成される。ある種の血管増殖は、病的な状態と関連したものと類似の過程における脈管形成に依存する。例えば、CNSはその血管供給系の発生のために脈管形成にのみ依存する(Nodew，1989，Am．Rev．Respir．Dis．140:1097-1103;Risauら、1988,EMBO J．7:959-962)。第二の過程である血管形成は、発生中の血管への、移動性の個々の内皮細胞(血管芽細胞)の取り込みに依存する。レプチンを使用して、脈管形成及び血管形成の両方を促進することができる。
【００８５】
さらに、上記5.3節に従ってレプチンのコード配列を発現ベクターに挿入し、レプチン非生産細胞型に導入してレプチンの内在的発現を得ることができる。例えば、造血幹細胞を単離し、レプチンコード配列でトランスフェクトする。その後、細胞を骨髄移植物レシピエントに導入し、刺激性造血においてレプチンの内在的産生を生起する（アメリカ特許第5,399,346号）。
【００８６】
5.6.レプチンのin vivoでの使用
in vivoにおけるヒト造血及び内皮発生に対するレプチンの適当な投与量及び処方は、まず動物モデルにおいて決定する。例えば、正常なマウスに致死量で放射線照射するか、あるいは化学物質により屠殺し、同系あるいは異系骨髄により再構成する。組換ヒトレプチンはマウス細胞に対して活性であることが示されているので、ドナー細胞の植付比率をレプチン処理群及び非処理群の間で比較することができる。始原造血細胞におけるHu-B1.219発現により、レプチンはレシピエントにおけるこれらの細胞増殖及び回復を促進する。これらの場合におけるin vivoでの造血的増殖及び分化に対するレプチンの効果は、致死量で放射線照射したマウス(900R)を正常な骨髄細胞(マウスあたり1〜5ｘ106)で再構成することにより評価することができる。動物の群に対照としてPBSを注射し、その他の群に種々の間隔でレプチンを与える(0.1〜10mg/kg)。血液プロフィール（例えばヘマトクリット、ＷＢＣカウント、分化等）の再正常化の速度及び安定性によりレプチンの活性をアッセイする。
【００８７】
さらに、新生児マウス、致死量未満で放射線照射した成体正常マウス、あるいはSCIDマウスを、骨髄、脊髄血、あるいはその分画から単離したヒト造血幹細胞により再構成することができる。これらのマウスにおいては、ヒト造血細胞が植付けられ、分化する(McCuneら、1988，Science 241:1632-1639;Sandhuら、1994，J．Immunol．152:3806-3813)。これらの動物におけるヒト細胞の増殖速度及び分化の程度を測定することによりレプチンの効果を評価することができる。
【００８８】
造血細胞機能を増加させる必要がある患者に有効量のレプチンを投与することができる。そのような必要は種々の形態の免疫不全（Ｂ細胞不全、Ｔ細胞不全、及び合併型不全）、骨髄抑制、貧血症、及び癌により発生する。これらの場合、レプチンは単独で、あるいはその他のサイトカインと組み合せて使用することができる。レプチンの骨髄増殖を刺激する能力は、それがマクロファージ及び好中球発生を誘導するのに特に有用であることを示している。これらの細胞型はリウマチ関節炎などの炎症反応に関与していることが知られているので、抗体又は可溶性OB-Rのようなレプチンの阻害剤を使用して炎症を阻害することができる。一方、マクロファージは創傷治癒の過程に関与しているので、レプチンを使用してマクロファージを刺激することにより創傷治癒を促進することができる。さらに、白血病細胞のようなある種の腫瘍細胞はHu-B1.219を発現するので、レプチンを治療的に使用してこれらの細胞の最終分化を誘発することにより腫瘍増殖を抑制することができる。あるいは、レプチンをリシン、ジフテリア毒素、あるいは化学療法剤のような増殖阻害剤に結合させて腫瘍細胞に特異的に向かわせ、破壊することができる。さらに、レプチンのアンタゴニスト、例えば修飾したレプチン分子あるいはその断片であって、その受容体には結合するが、シグナル伝達を誘発しないものを使用して、天然のレプチンがin vivoで腫瘍増殖を刺激している場合においてレプチンの刺激作用をブロックすることができる。
【００８９】
さらに、遺伝子治療に使用するために、ウイルスベクター中にレプチンコード配列を挿入することができる(Jolly，1994，Cancer Gene Therapy,1:51)。特に、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、及びアデノ関連ウイルスが好ましい。レプチンコード配列を担持するウイルスを患者に注射して、血流あるいは特定の標的組織への分泌によりレプチンを直接供給する。
【００９０】
5.6.1.投与量決定
本明細書に記載したレプチンタンパク質及び核酸配列を治療的に有効な量で患者に投与して種々の造血性疾患及び不全を治療し、あるいは改善することができる。治療的に有効な量とは、疾患の症状の改善を得るのに十分なタンパク質の量、あるいは疾患の改善をもたらす濃度の遺伝子産物を発現するのに十分な核酸配列の量をいう。
【００９１】
レプチンの毒性及び治療的効能は、例えばLD50（集団の50％に致死的な投与量）及びED50（集団の50％に治療上有功な投与量）を決定するための、細胞培養あるいは実験動物における標準的な薬理学的方法により判定することができる。毒性効果及び治療効果の投与量の比が治療指数であり、比LD50/ED50として表すことができる。高い治療指数を示す精製されたレプチンが好ましい。有害な副作用を示すレプチン調製物も使用できるが、正常な細胞に対する強い障害を最小限にし、それにより副作用を減じるために、そのような調製物を罹患組織の部位に向かわせる送達系を設計するのに注意をはらわなくてはならない。
【００９２】
細胞培養アッセイ及び動物実験から得たデータを使用してヒトにおける使用のための投与量範囲を決定することができる。レプチンの投与量は、毒性をほとんどあるいは全く示さないED50を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、使用する投与形態、及び使用する投与経路に応じてこの範囲内で変化させることができる。細胞培養で決定されたIC50（即ち、症状の半最大阻害を達成するレプチンの濃度）を含む循環血漿濃度範囲を得るように投与量を動物モデル中で決定することができる。このような情報を使用してヒトにおいて有用な投与量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【００９３】
5.6.2.製剤および投与
本発明に従って使用するための医薬組成物は、１以上の生理学的に許容される担体または賦形剤を使用して、常法により製剤化することができる（Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，1995，第６版、Williams & Wilkins）。組成物は、例えばボーラス注入または連続輸液による非経口投与用、すなわち静脈内、皮下、皮内または筋肉内投与用に製剤化することができる。注射用組成物は、添加保存剤と共に単位剤形、例えばアンプルまたは複数回量容器で提供できる。組成物は、油性または水性ビヒクルにおける懸濁物、溶液またはエマルジョンなどの形態をとることができ、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの製剤用添加剤を含むことができる。あるいは、活性成分は、使用前に適切なビヒクル、例えば発熱物質を含まない滅菌水で再調製するための粉末形態であってもよい。レプチンは、静脈内投与によって患者に導入し、血液前駆細胞を直接刺激するのが好ましい。
【００９４】
レプチンは、吸入もしくは吹入（口または鼻から）による投与または経口、口腔粘膜、局所もしくは直腸投与用に製剤化することもできる。
【００９５】
経口投与の場合、医薬組成物は、例えば、錠剤またはカプセルの形態をとることができ、結合剤（例えば、予めゼラチン化したトウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、乳糖、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、馬鈴薯澱粉またはグリコール酸澱粉ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される賦形剤を使用して常法により調製される。錠剤は、当技術分野で周知の方法によりコーティングできる。経口投与用の液体製剤は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁物の形態をとることができ、あるいは、使用前に水または他の適切なビヒクルで再調製するための乾燥製品として提供することもできる。そのような液体製剤は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分別植物油）；および安定剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピルまたはソルビン酸）などの薬学的に許容される添加剤を使用して常法により調製てきる。製剤は、適宜、緩衝塩、芳香剤、着色剤および甘味剤を含むこともできる。
【００９６】
経口投与用製剤は、適切に製剤化すると活性化合物の放出を制御することができる。
【００９７】
口腔粘膜（バッカル）投与の場合、組成物は、錠剤またはロゼンジの形態をとることができ、常法により製剤化できる。
【００９８】
吸入による投与の場合、本発明に従って使用するための組成物は、加圧パックまたはネブライザーから適切な推進剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切な気体を使用して、エーロゾル噴霧の形態で放出するのが便利である。加圧エーロゾルの場合、単位用量は、一目盛りの量を放出するためのバルブを備えることにより決定できる。吸入器または吹入器で使用するための例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、タンパク質と適切な粉末基剤（乳糖または澱粉など）との粉末混合物を含めて製剤化することができる。
【００９９】
また組成物は、例えばココアバターまたは他のグリセリドなどの通常の座薬用基剤を含む、座薬または保持浣腸などの直腸組成物に製剤化することができる。
【０１００】
上記した製剤の他に、組成物は、デポー製剤として製剤化することもできる。そのような長時間作用する製剤は、移植（例えば、皮下または筋肉内）または筋肉内注射によって投与することができる。すなわち、例えば、組成物は、適切なポリマーもしくは疎水性物質（例えば、許容される油におけるエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂を使用して、あるいは難溶性の誘導体、例えば難溶性の塩として製剤化できる。
【０１０１】
組成物は、所望により、活性成分を含む１以上の単位剤形を含むことができるパックまたはディスペンサー器具で提供できる。パックは、金属またはプラスチックホイル、例えばブリスターパック(blister pack)などを含むことができる。パックまたはディスペンサー器具には、投与のための取扱説明書を付けることができる。
【実施例】
【０１０２】
６．実施例：ＯＢ−Ｒは造血素受容の変異型であり、Hu-Bl.219と命名される
6.1.材料および方法
6.1.1.ノーザンブロット分析
Hu-B1.219遺伝子の発現を調べるために、種々のヒト組織から得たＲＮＡを含むノーザンブロット(Clontech，Palo Alto，CA)を、ヌクレオチド#578〜1107に相当する放射性標識した530塩基対(bp)のＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた（図１Ａ〜１Ｇを参照）。簡単に述べると、ブロットを、5X ＳＳＰＥ、10Xデンハルト溶液、100μg/mlの新たに変性して剪断したサケ精子ＤＮＡ、50%ホルムアミド（新たに脱イオン化）および2%のＳＤＳを含む溶液中、４２℃で３〜６時間プレハイブリダイズさせた。放射性標識したプローブを熱変性して、プレハイブリダイゼーション混合物に添加し、４２℃で１８〜２４時間絶えず振とうしながらハイブリダイズさせた。ブロットを、2XＳＳＣ、0.05％ＳＤＳで数回洗浄（室温）した後、0.1XＳＳＣ、0.1%ＳＤＳを含む洗浄溶液に移し、５０℃で４０分間攪拌した。次いで、ブロットをプラスチックのラップで覆い、ワットマン紙の上に載せ、増感板を使用して−７０℃でＸ線フィルムに露光した。
【０１０３】
6.1.2.逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ／ＰＣＲ）
全ＲＮＡを標準的な実験室手順を用いて単離した(Sambrookら、1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NY)。全ＲＮＡの約１μｇを逆転写させて、ｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅した(Perkin Elmer，Norwalk，CT)。ＰＣＲ増幅条件は、Hu-B1.219および１型発現分析の場合と同じであった。それらは、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒で、合計４０サイクルであった。増幅産物（Hu-B1.219の場合は224 bp、1型の場合は816 bp）は、アガロースゲル電気泳動によって分離し、エチジウムブロミド染色により可視化した。１型特異的アンプリマーは、GACTCATTGTGCAGTGTTCAG（上方）およびTAGTGGAGGGAGGGTCAGCAG（下方）であった。上方アンプリマーは、通常は３つ全ての型による共有であるが、下方アンプリマーは１型特異的であった。ＯＢ−Ｒ特異的（４型）アンプリマーは、ACATCTTCCCAAAATAGC（上方）およびTGCCTGGGCCTCTATCTC（下方）であった。
【０１０４】
6.2.結果
多数のｃＤＮＡクローンがヒト胎児肝臓ｃＤＮＡライブラリー(Clontech，Palo Alto，CA)から得られ、これらのクローンのいくつかのＤＮＡ配列が決定された。これらのクローン（Hu-B1.219 #4、#33、#34、#1、#36、#8、#55、#60、#3、#57、#62と命名）は重複配列を含んでおり、それらは、まとまって連続したヌクレオチド配列になっていた。かかる一つのｃＤＮＡからのヌクレオチド配列および予測されるタンパク質配列を図１Ａ〜１Ｇに示す。このｃＤＮＡ配列は、２つのＦＮ IIIドメインを含み、各ドメインはＨＲファミリーの遺伝子に特徴的な「ＷＳボックス」を含む。すなわち、このｃＤＮＡは、ＨＲ遺伝子ファミリーの新規メンバーを表し、これを、本明細書ではHu-B1.219と言う（表１）。図１Ａ〜１Ｇに提示されるHu-B1.219の配列に基づくと、翻訳開始部位は、＃97の位置に現れる。その配列は、ヌクレオチド＃2970までのオープンリーディングフレームをコードする。約ヌクレオチド＃2629〜約＃2682の配列は、膜貫通ドメインをコードすると考えられる。完全な配列は958アミノ酸からなるタンパク質をコードする。
【０１０５】
この分子の連続アミノ酸配列を他の発表されたタンパク質配列と比較すると、最近発表されたヒトＯＢ−Ｒタンパク質（Tartaglia，1995，Cell 83:1263-1271）との相同性が高いことが示された。これに関して、図１Ａ〜１Ｇに示すHu-B1.219の配列は、細胞外ドメインの３個のヌクレオチドの位置、すなわちHu-B1.219タンパク質では各々、アラニン、アルギニンおよびアルギニンのアミノ酸となるヌクレオチド残基＃349、＃422および＃764でのみ、その発表されたＯＢ−Ｒ配列と異なる。これら２つの分子は、膜貫通領域およびヌクレオチド＃2769（含む）までの細胞内ドメインの一部分が同一であり、ヌクレオチド＃2770およびそれを越えると、分岐している。
【表１】
2007163502.tif 000002
【０１０６】
Hu-B1.219の１型と称する図１Ａ〜１Ｇの配列およびＯＢ−Ｒであると報告されたその変異型の他に、２型および３型として知られる、３'末端付近で１型と異なる配列を含む他のλクローンが発見された。３つの型は全て、ヌクレオチド＃2770までは同一の配列を含み、ヌクレオチド＃2771およびそれを越えると分岐する（図２）。３つの型全てとＯＢ−Ｒの推定されるアミノ酸配列のアライメント（並列化）を図３Ａ〜３Ｆに示す。最初に単離したλクローンの２つ、すなわち＃36および＃８は、各々、１型および２型の３'末端配列を含む。Hu-B1.219の種々の型は、別のスプライシング機構により、共通の前駆体ｍＲＮＡから誘導され得る。この領域の配列は、公知のスプライス接合部と一致する。ヌクレオチド＃2768から末端までの１型のＤＮＡ配列が、ヒト内因性レトロウイルスＤＮＡ配列から誘導されると考えられるヒトレトロトランスポゾン配列と９８％の同一性をもつことは注目に値する(Singer，1982，Cell 28:433;Weinerら、1986，Ann.Rev．Biochem．55:631;Lowerら、1993，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:4480;Onoら、1987，Nucl．Acid Res．15:8725-8735)。
【０１０７】
前記を鑑みると、Tartaglia(1995，Cell 83:1263)によって最近発表されたヒトＯＢ−Ｒは、前記の３つの型との構造類似性（図３Ａ〜３Ｆ）から、Hu-B1.219の４型に相当する。ＯＢ−Ｒには３つのアミノ酸置換があるが、かかる相違は、遺伝子的に分岐した個体間の対立遺伝子の相違により生じたと考えられる。それらの細胞質ドメインの相違は、異なる細胞においてこれらの受容体変異型により用いられる異なるシグナル伝達経路に関与している可能性がある。
【０１０８】
ｃＤＮＡの変異型の発現を調べるために、ＲＴ／ＰＣＲを、いくつかのヒト細胞系を使用して行った。表２の結果は、１型がＫ−５６２細胞およびヒト胎児肝臓ｃＤＮＡ調製物においてＲＮＡとして発現されたことを示す。Hu-B1.219は、ヒト胎児肝臓ｃＤＮＡライブラリーからクローン化されたので、これを陽性の対照として使用した。しかし、他のいくつかのヒト細胞系に関しては、１型は検出されなかったが、Hu-B1.219発現は陽性てあった。例えば、１型は、ＫＧｌａ細胞では発現されなかったが、３型は発現された。かくして、Hu-B1.219の種々の型は、同一細胞で同時には発現されない可能性がある。特定の細胞集団では、ある種の型の選択的発現が存在するかもしれない。さらに、表３は、造血、内皮、中枢神経系（ＣＮＳ）、胸および筋肉などの起源の異なる細胞系におけるHu-B1.219の発現を示す。なお、ＯＢ−Ｒであると報告された変異型(Hu-B1.219.4)がこれらの細胞、特に造血細胞系、ＨＥＬおよびＫ５６２でも検出されることは興味深い（表３）。
【表２】
2007163502.tif 000003
【０１０９】
各種ヒト組織ＲＮＡを、図１Ａ〜１Ｇに示した＃578〜＃1107のヌクレオチド番号に対応する放射性標識したHu-B1.219フラグメントでプローブしてノーザンブロット分析を行った。サイズの異なる２つのｍＲＮＡが検出された。この結果は、別の相同遺伝子が存在するか、単一のＲＮＡ転写産物の別のスプライシングがあることを示唆している。Hu-B1.219発現は、ヒト胎児組織、特に肝臓および肺において断然高かった。いくつかの成人組織では、痕跡量が確認された。興味深いことに、慢性骨髄性白血病細胞系Ｋ５６２は、その発現に対してかなり陽性であった（表２）が、いくつかの発現は、肺癌細胞系であるＡ５４９細胞でも検出された（表４）。いくつかのヒト組織でのHu-B1.219の発現を示す代表的ノーザンブロットを図４に示す。より感度の高いＰＣＲを使用すると、Hu-B1.219は骨髄でも検出された。
【表３】
2007163502.tif 000004
【０１１０】
【表４】
2007163502.tif 000005
【０１１１】
まとめると、これらのデータは、Hu-B1.219がヒト造血受容体フアミリーの新規メンバーを表すことを示している。それは、当初、造血組織である胎児肝臓からクローン化された。それは、ある種の胎児組織によって発現され、造血発生に影響を及ぼし得るリガンドと相互作用するいくつかの受容体との構造的相同性を有する。これに関して、それは、IL-6R、IL-4R、G-CSFR、IL-3R β鎖、gp130、IL-12RおよびLIFRとの配列相同性を有する。それは、FN IIIドメインの保存アミノ酸の正しい間隔、FN IIIドメインのブロック３の両親媒性配列ならびにFN IIIドメインのブロック６の交互に存在する疎水性および塩基性のアミノ酸を有する２つの「ＷＳボックス」モチーフを含む。また、それは、FN IIIドメインの上流のシステインに富む領域に保存されたシステインも含む。
【０１１２】
造血細胞によって発現される受容体との構造的類似性にもかかわらず、Hu-B1.219の細胞外ドメインは、脳で発現されるヒトＯＢ−Ｒとほぼ同一である。事実、Hu-B1.219の３つの変異型が単離されており、それらは、主に細胞内細胞質ドメインで広範囲にわたる配列多様性を示すので、ＯＢ−Ｒは、同じ受容体の別のイソ型であると考えられる。表３に示すデータは、ＯＢ−Ｒが脳の細胞だけでなく、造血および内皮細胞においても発現されることをさらに確証するものである。従って、レプチンはＯＢ−Ｒに結合するので、レプチンはこれらの受容体変異型を発現する造血および内皮細胞においてHu-B1.219のある種のイソ型の活性化を誘発することができるリガンドでもある。
【０１１３】
７．実施例： Hu-B1.219は長期再増殖性の造血前駆細胞により発現される
7.1.材料および方法
7.1.1.ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成
全ＲＮＡをRNAzol試薬(Biotecx，Houston，Texas)の推薦された手順を使用して抽出した。ＲＮＡは、ランダムヘキサマーでプライムしたＲＴｃＤＮＡ合成反応物20μｌに対して１μｇで添加した。偽ＲＴ反応も、実験サンプルの各々に対して行った。ＲＴ反応は、室温で１０分間、４２℃で１５分間、９９℃で５分間インキュベートし、４℃に保持した。全てのＰＣＲ試薬は、Perkin Elmer(Foster City，California)から得た。
【０１１４】
7.1.2.ＰＣＲ条件
各ｃＤＮＡおよび偽ｃＤＮＡの質を、β-アクチン遺伝子の増幅の相対レベルにより決定した。アクチンの増幅条件は94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒を27〜30サイクル行い、続いて伸長を72℃で５分行い、４℃に維持するというものであった。β−アクチンプライマーのＤＮＡ配列は、（フォワード）5'-GTGACGGCCCAGAGCAAGAG-3'および（リバース）5'-AGGGGCCGGACTCATCGTACTC-3'であった。
【０１１５】
Hu-B1.219およびCD34のマウス相同体のためのＰＣＲ増幅条件は、94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で30秒を40〜45サイクル行い、続いて伸長を72℃で５分行い、４℃に維持するというものであった。Hu-B1.219用のプライマー配列は、（フォワード）5'-GGTCAGAAGATGTGGGAAA-3'および（リバース）5'-GTGCCCAGGAACAATTCTT-3'であった。これらのＰＣＲプライマーはヒトとマウスの両方の配列を増幅した。ヒトのCD34プライマー配列は、（フォワード）5'-CTCTTCTGTCCAGTCACAGACC-3'および（リバース）5'-GAATAGCTCTGGTGGCTTGC-3'であった。マウスのCD34プライマー配列は、（フォワード）5'-CTACCACGGAGACTTCTACAC-3'および（リバース）5'-TGGATCCCCAGCTTTCTCAA-3'であった。ＰＣＲ産物は緩衝液１mlあたり0.5μｇのエチジウムブロミドを含有する1.5%TAEアガロースゲル上で分析した。
【０１１６】
Hu-B1.219のマウス相同体を検出するための追加のプライマーは、（フォワード）5'-GTCAGAAGATGTGG GAAA-3'および（リバース）5'-GTGCCCAGGAACAATTCTT-3'であった。OB-Rを検出するプライマーは、（フォワード）5'-ATTATTTCCTCTTGTGTCCTA-3'および（リバース）5'-GTCTGATAAAAGGAAAA ATGT-3'であった。３型のHu-B1.219のマウス相同体を増幅したプライマーは、（フォワード）5'-GTCAGAAGATGTGGGAAA-3'および（リバース）5'-AAGTTGGTAGATTGGGTTCA-3'であった。予想されたＰＣＲ産物は、アクチンについては934-bpの産物、Hu-B1.219イソ型については581-bpの産物、OB-Rについては582-bpの産物、３型のマウス相同体については661-bpの産物であった。
【０１１７】
7.1.3.ES細胞培養物
15%FBSおよびrLIFを含有するDMEM上にCCE ES細胞を維持した。分化開始の２日前に、15%FBS含有IMDMで細胞を継代培養した。分化０日目に細胞をトリプシン処理し、15%FBS含有IMDM中に再懸濁した。ペトリ皿(100mm)に4500個／mlでまいた。ＥＢ体を沈降させ、指定した日に集めた。
【０１１８】
7.2.結果
上記第6.2節は、Hu-B1.219が造血および内皮細胞において発現されることを実証する。これに関連して、胎児肝臓におけるその発現は胎児肝臓での高造血活性と一致し、また、胎児肺におけるその発現は胎児肺での高レベルの内皮発生と一致する。さまざまな造血細胞の集団におけるHu-B1.219の発現をより正確に調べるために、CD34発現に基づいたセルソーティング（細胞選別）によりヒト骨髄細胞を造血幹細胞に関して高度に富化させた(Collinsら，1994，Stem Cells 12:577-585;Berenson，1993，J. Hematother．2:347-349;Civin and Gore，1993,J. Hematother．2:137-144)。ヒトCD34+およびCD34-骨髄画分から抽出したＲＮＡをＰＣＲでHu-B1.219プライマーと反応させたとき、両方の画分からHu-B1.219メッセージが検出された（図５Ａ）。CD34+画分のみがＰＣＲでCD34メッセージを発現したという事実は、選別された集団が純化されたことを示す（図５Ｂ）。CD34-画分はいくつかの細胞型を含んでいたので、検出されたHu-B1.219メッセージは内皮細胞により産生された可能性がある。あるいはまた、Hu-B1.219はCD34-造血幹細胞により発現されるのかもしれない。
【０１１９】
マウス胎児肝細胞におけるFc受容体(FcR)およびAA4.1抗原の発現を用いて、個々の胎児肝前駆細胞の亜集団が樹立されている(Carlssonら，1995，Eur．J. Immunol．25:2308-2317;Jordanら，1995，Exp．Hematol．23:1011-1015;Trevisan and Iscove，1995，J. Exp. Med. 181:93-103)。これら２つのマーカーの発現に基づいてマウス胎児肝細胞（12日目）を選別すると、原始的な造血幹細胞が高度に富化されているAA4.1+およびFcR-細胞の小さな（２〜４％）亜集団が単離された。動物再増殖実験から、この表現型をもつ胎児肝細胞は、リンパ-造血系の破壊されたレシピエントに養子免疫細胞移入したとき、長期の再増殖能をもつことが示された。したがって、AA4.1およびFcRの発現に基づいて胎児肝細胞を種々の画分に選別し、その発現を検出するために、Hu-B1.219メッセージのマウス相同体を増幅させるHu-B1.219から設計されたプライマーを使用した。図６Ａおよび６Ｂからは、高度に富化されたAA4.1+/FcR-亜集団がこの段階でHu-B1.219のマウス相同体を発現する唯一の集団であるが、CD34 mRNAは調べた全ての画分において検出されることがわかる。この結果は、ヒト造血前駆細胞のマーカーとしてCD34が使用されてきたが、Hu-B1.219はCD34+画分に含まれる長期再増殖性細胞をより特異的にマークすることを示している。
【０１２０】
さらに、Hu-B1.219のマウス相同体の発現はまた、Ly-6発現について選別された（ただし、成熟系列マーカーについては陰性の）マウス成体骨髄の亜集団においても観察された。この分画法は骨髄から造血幹細胞の高精製集団を単離するための十分に確立された技法である(Liら，1992，J. Exp. Med. 175:1443-1447;Spangrude and Brooks，1993，Blood 82:3327-3332;Szilvassy and Cory,1993，Blood 81:2310-2320)。さらにまた、Mac-1マーカーの発現を利用する最近開発された方法により長期再増殖性細胞を富化させたマウス胎児肝細胞もHu-B1.219のマウス相同体を発現した(Morrisonら，1995，Proc．Natl．Acad.Sci．USA92:10302-10306)。
【０１２１】
これらの結果をまとめると、上記のマウスおよびヒトの研究から、Hu-B1.219はCD34+画分内の初期前駆細胞の亜集団のマーカーであることが示される。特に、長期再増殖性細胞におけるHu-B1.219発現は、該細胞を単離するためのマーカーとしてのその使用を可能にする。この点に関して、Hu-B1.219またはレプチンに特異的な抗体を単独で、または抗CD34のような前駆細胞特異的抗体と組み合わせて使用することができる。例えば、初めに、ヒト骨髄細胞をCD34+細胞へと分離し、次にHu-B1.219ソーティングを行ってこのような前駆細胞を得ることができる。さらに、Hu-B1.219発現はCD34-亜集団において検出されるので、CD34-幹細胞を分離するためのマーカーとしても使用できる。
【０１２２】
初期胚の卵黄包細胞は造血細胞と内皮細胞の両方を生じさせる能力があると記載されている(Wagner and Antczak，1995，WO95/02038)。卵黄包では、内皮細胞もまた造血分化／増殖のための微小環境をつくり出す。内皮細胞能のある卵黄包細胞がやはりHu-B1.219のマウス相同体を発現するとわかったことは重要である。それゆえ、Hu-B1.219はまた内皮前駆細胞のマーカーとして使用できる可能性がある。
【０１２３】
胚幹(embryonic stem：ＥＳ)細胞分化培養物は非造血前駆細胞からの赤芽球発生のin vitroモデルを提供する(Schmittら，Genes Dev．5:728-740)。ＥＳ細胞は胚様体(embryoid body：ＥＢ)に分化するので、最初の赤芽球前駆細胞は分化の４日目（ｄ４）に現れ、ｄ６まで頻度が増加する(Kellerら，1993，Mol. Cell. Biol. 13:473)。Hu-B1.219の発現は、その発現を赤芽球造血分化と相関させるためにＥＳ分化の間に評価した。Hu-B1.219変異体OB-Rはｄ3.5で最初に検出され、分化のｄ６まで次第に増加した（図７ＡおよびＢ）。この発現パターンはＥＢにおいて発生する赤芽球前駆細胞の文献に記載の出現と一致した。
【０１２４】
in vivoでは、最初の造血前駆細胞は発生の７〜８日目に卵黄包に出現する。マウスでは妊娠のｄ１２までに、胎児肝臓が赤血球形成の主要部位となる(Hara and Ogawa，1977，Exp．Hematol．5:141;Moore and Metcalf，1970，Br. J. Haematol. 18:279)。この波は造血活性が骨髄に移行する１８日目まで続く。RT-PCRは、OB-RとHu-B1.219 3型がどちらも卵黄包（図７ＣおよびＤ）と胎児肝臓（図７ＥおよびＦ）において造血発生に相当するレベルで発現されることを示した。
【０１２５】
８．実施例： 組換えレプチンは骨髄コロニー形成を刺激する
8.1.材料および方法
8.1.1.組換えレプチンの生産
RNAzol法を使って、C57Bマウス由来の褐色脂肪組織から全ＲＮＡを単離した。Boehringer Mannheim社の「High Fidelity PCR System」を用いてRT-PCRを実施した。ＰＣＲプライマー：マウスレプチン(moB) U462 GGAATTCCATATGGTGCCTATCCAGAAおよびL462 GCGGATCCTCAGCATTCAGGGCTAAを、Genbank配列U18812に基づいて設計した(Zhangら，1994，Nature 372:425-432)。ＰＣＲ産物はPromega Wizardカラムを使って精製した。ＰＣＲ断片をNdelとBamHIで切断し、NdelとBamHIで開裂したpETl5bベクター(Novagen)にクローニングした。最初に大腸菌DH10B株(GibcoBRL)中にクローンを得、次に生産のためにBL21(DE3)(Novagen)宿主に移した。moBの２つのスプライシング変異体が同定された。一方の変異体は開始Metから49番目のアミノ酸残基のグルタミンを欠失しており、他方はその位置にグルタミンを保持していた。両クローンからタンパク質を生産させた。マウスレプチンはアミノ末端にポリヒスチジンをもつ融合タンパク質として大腸菌から得た。組換えマウスレプチンを不溶性の封入体として産生させ、Sambrookら（前掲）に記載されるように精製した。不溶性の物質を変性し、「再生」(refolded)して、生物学的に活性なレプチンとした。封入体を8M尿素と100mM DTT中に室温で２時間溶解し、「再生反応緩衝液」(100mM Tris pH8.3，100mM(NH4)2SO4，100μM トリトンX100，2mM還元型グルタチオン，0.4mM酸化型グルタチオン)で1/100に希釈して４℃で３〜５日間インキュベートした。再生したレプチンを回収するためにヒスチジン結合性樹脂(Novagen)を１時間添加した。この樹脂を遠心により回収し、Novagen「結合緩衝液」およびNovagen「洗浄緩衝液」で洗った。レプチンをNovagen「溶離緩衝液」＋1Mイミダゾールにより樹脂から溶離した。最終ステップとしてPBS中での透析を行った。市販されているHPLC精製レプチン(Peprotech Inc.，Rocky Hill，NJ)も使用し、同様の結果を得た。
【０１２６】
8.1.2.メチルセルロースコロニー形成アッセイ
正常なC57BL/6雌マウス、ob/obマウスおよびdb/dbマウスから成体骨髄細胞を単離した。さらに、マウス胎児肝臓および卵黄包細胞、ならびにヒト骨髄細胞を通常の方法により単離した。生存能のある細胞約１×106個を、0.5〜15%のウシ胎児血清(FCS)を含有するIMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)中に懸濁した。次に、細胞(1〜100×103/ml)を、メチルセルロース(1.3%)(Sawyer-Biddle，NY，NY)，FCS(4%), BSA(1%), モノチオグリセロール(100μM), ゲンタマイシン(50μg/ml)，精製組換えレプチン(1ng/ml)を含み、IL-3(100pg/ml)，GM-CSF(1ng/ml)またはEPO(2U/ml)を含むまたは含まないIMDMと共に混合した。混合後、１mlの混合物を加湿インキュベーター内37℃にて細菌グレードの25mm培養皿に分注し、数日間維持した。倒立顕微鏡を使って、CFU-e、BFU-eおよびGEMM>４細胞を、それぞれ３日目、10日目および13日目頃にカウントした(Metcalf，1984，Clonal Culture of Hematopoietic Cells:Techniques and Applications，Elsevier，N.Y. ;Freshney，1994，in Culture of Hematopoietic Cells，Wiley-Liss，Inc.，pp.265-68)。
【０１２７】
8.1.3.増殖アッセイ
10日目と14日目のマウス胚からそれぞれマウス卵黄包および胎児肝臓を単離し、機械的に単細胞へと分離させた。マイクロタイタープレートに2% FBSを含みかつ指示したサイトカイン(R & D, Minneapolis, MN)を追加したIMDM 50μl中の2.5×104個の細胞をまいた。このプレートを5%CO2のもとで37℃で72時間インキュベートした。細胞数を比色MTSアッセイ(Promega，Madison，WI)により測定した。
【０１２８】
8.2.結果
卵黄包および胎児肝細胞はHu-B1.219受容体を発現するので、これらの細胞を刺激して増殖させる能力が組換えレプチンにあるかを試験した。培養下で、レプチンは卵黄包細胞（図８Ａ）と胎児肝細胞（図８Ｂ）の両方の増殖を用量依存的に顕著に刺激した。発生の13日目に、胎児肝細胞の80〜90%が後期赤芽球系列のマーカーであるTer119を発現する(Okutaら，1990，Cell 62:863)。ソーティング分析から、この段階で、レプチン応答細胞がTer119陰性亜集団中に含まれていたが、この集団をレプチンと共に４日培養した後では、マクロファージ／単球マーカーであるMac-1(CD11b)およびF4/80を発現する細胞の数が４倍増加したことが示され、このことはレプチンが骨髄系列を刺激していたことを示している。
【０１２９】
レプチンによって影響される造血系列をさらに評価するためにメチルセルロースコロニーアッセイを用いた。レプチンは胎児肝臓（図９Ａ〜Ｃ）と成体骨髄（図１０Ａ〜Ｃ）の両方からのマクロファージおよび好中球系列の系列拘束(lineage-committed)コロニー形成前駆細胞を刺激した。非系列拘束前駆細胞が刺激された唯一の状況がＥＳ分化培養物および骨髄からのＧＭにおいて観察された。ＥＳ細胞培養物では、レプチンが赤芽球系列とマクロファージ系列（図１１ＡおよびＢ）の両方を生み出す能力がある「E/Mac」両能性前駆細胞を刺激した。赤芽球／マクロファージ応答にはS1因子(steel factor:SLF)の添加が必要であったが、マクロファージ応答には必要でなかった。これらの培養は低度から中程度の細胞密度で行ったが、これらのコロニーが単一の前駆細胞の結果であるのか、あるいは組合せの前駆細胞の結果であるのか、今のところはっきりしない。
【０１３０】
さらに、成体骨髄を利用するメチルセルロースコロニーアッセイからは、レプチン単独でマクロファージコロニーの数を増加し、そしてEPOと協力してコロニー形成単位赤芽球(CFU-e)を刺激することが実証された（図１２ＡおよびＢ）。CFU-eに対する効果はEPO依存性であったものの、コロニーの数はEPOのみの飽和レベルで観測された数の２倍になった。db/dbマウス（その突然変異はOB-R発現の劇的な低下をもたらす）由来の骨髄のレプチンに対する非応答性は、観測された成果へのHu-B1.219の直接的な係わりを示しており、また、この成果がレプチンに依存するもので、調製物中の混入物に依存するものでないことを示している。これらの実験でのCFU-eのカウント数はインプット細胞数と直線的な関係にあり、このことはCFU-eに対するレプチンの直接作用を示している。さらに、レプチンとEPOは正常ヒト骨髄からのCFU-eカウントを協力して刺激したが、どのような刺激効果を引き出すにもEPOが必要であった（図１３）。
【０１３１】
正常マウス骨髄細胞をIL-3、GM-CSFおよびEPOの存在下でレプチンと共にインキュベートしたとき、レプチンを除いたサイトカインを含む培地で刺激した細胞と比べて、この場合もCFU-eの数の２倍増加が観察された。同様に、レプチンはob/obマウス骨髄からのCFU-eの数を増加させた。対照的に、レプチンはdb/dbマウス骨髄からのCFU-eを刺激しなかった。この観察はこの種の動物により発現される異常なOB-Rの事実と一致していた(Chenら，1996 Cell 84:491-495)。
【０１３２】
要するに、Hu-B1.219/OB-Rは初期造血前駆細胞において発現されるだけでなく、それはこれらの細胞をレプチン刺激（細胞増殖およびさまざまな造血系列の細胞型への分化をもたらす）に対して応答性にする。したがって、レプチンは造血前駆細胞の増殖分化因子である。
【０１３３】
９．微生物の寄託
以下の生物は、20852メリーランド州、ロックビル、パークローンドライブ12301所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された。
【０１３４】
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【０１３５】
本発明は、例示した具体例によりその範囲を制限されるものではない。これらの具体例は本発明の個々の形態を例示したものである。実際、本明細書中に示し記載したものに加えて、本発明のさまざまな変更が前記の説明および添付の図面から当業者には明らかだろう。このような変更も特許請求の範囲に含まれるものとする。
【０１３６】
本明細書で引用した刊行物はすべて、その全体を参考としてここに組み入れる。
【０１３７】
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【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１Ａ】図１Ａは、1型Hu-B1.219のヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａの続きである。
【図１Ｃ】図１Ｃは、図１Ｂの続きである。
【図１Ｄ】図１Ｄは、図１Ｃの続きである。
【図１Ｅ】図１Ｅは、図１Ｄの続きである。
【図１Ｆ】図１Ｆは、図１Ｅの続きである。
【図１Ｇ】図１Ｇは、図１Ｆの続きである。
【図２】図２は、1型、2型および3型Hu-B1.219の3'末端におけるヌクレオチド配列の比較を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、Hu-B1.219の1型(Hu-B1.219-1)、2型(Hu-B1.219-2)、3型(Hu-B1.219-3)、ヒトOB-R(HuOBR)およびマウスOB-R(MuOBR)のアミノ酸配列比較を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、図３Ａの続きである。
【図３Ｃ】図３Ｃは、図３Ｂの続きである。
【図３Ｄ】図３Ｄは、図３Ｃの続きである。
【図３Ｅ】図３Ｅは、図３Ｄの続きである。
【図３Ｆ】図３Ｆは、図３Ｅの続きである。
【図４】図４は、Hu-B1.219の細胞外ドメインに由来するプローブを用いたヒト成人複数組織のノーザンブロット分析の結果を示す。
【図５Ａ−Ｂ】図５Ａは、ヒトCD34+およびCD34-細胞におけるHu-B1.219発現のＰＣＲ分析においてHu-B1.219プライマーを用いた検出結果を示す。図５Ｂは、ヒトCD34+およびCD34-細胞におけるHu-B1.219発現のＰＣＲ分析においてCD34プライマーを用いた検出結果を示す。
【図６Ａ−Ｂ】図６Ａは、AA4.1およびFcRに対する抗体によって分離されたマウス胎児肝臓サブ集団におけるマウスHu-B1.219発現のＰＣＲ分析においてHu-B1.219プライマーを用いた検出結果を示す。図６Ｂは、AA4.1およびFcRに対する抗体によって分離されたマウス胎児肝臓サブ集団におけるマウスHu-B1.219発現のＰＣＲ分析においてCD34プライマーを用いた検出結果を示す。
【図７Ａ−Ｃ】図７Ａは、造血組織におけるHu-B1.219イソ型の発現(0〜6日の分化しつつあるES細胞)を示す。図７Ｂは、造血組織におけるHu-B1.219イソ型の発現(0〜6日の分化しつつあるES細胞)を示す。図７Ｃは、造血組織におけるHu-B1.219イソ型の発現(8〜14日胚由来の卵黄包細胞)を示す。
【図７Ｄ−Ｆ】図７Ｄは、造血組織におけるHu-B1.219イソ型の発現(8〜14日胚由来の卵黄包細胞)を示す。図７Ｅは、造血組織におけるHu-B1.219イソ型の発現(13〜18日胚由来の胎児肝臓)を示す。図７Ｆは、造血組織におけるHu-B1.219イソ型の発現(13〜18日胚由来の胎児肝臓)を示す。
【図８Ａ−Ｂ】図８Ａは、レプチンが卵黄包の細胞増殖を刺激することを示す。図８Ｂは、レプチンが胎児肝臓の細胞増殖を刺激することを示す。
【図９Ａ−Ｃ】図９Ａ−Ｃは、レプチンがコロニーアッセイにおいてマウス胎児肝臓に骨髄性コロニーの形成を誘導することを示す。
【図１０Ａ−Ｃ】図１０Ａ−Ｃは、レプチンがコロニーアッセイにおいてマウス成体骨髄に骨髄性コロニーの形成を誘導することを示す。
【図１１Ａ−Ｂ】図１１Ａ−Ｂは、レプチンがエンブロイド体(embroid body)(EB)由来前駆体にコロニー形成を誘導することを示す。
【図１２Ａ−Ｂ】図１２Ａ−Ｂは、レプチンおよびEPOが正常なマウス骨髄からCFU-eを誘導するが、db/db骨髄からは誘導しないことを示す。
【図１３】図１３は、レプチンがコロニー形成アッセイにおいてヒト骨髄からCFU-eを誘導することを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図６Ａ−Ｂ】
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【図７Ａ−Ｃ】
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【図７Ｄ−Ｆ】
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【図８Ａ−Ｂ】
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【図９Ａ−Ｃ】
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【図１０Ａ−Ｃ】
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【図１１Ａ−Ｂ】
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【図１２Ａ−Ｂ】
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【図１３】
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【配列表】
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