(57)【要約】【課題】  ヒト翻訳開始因子eIF1Aに関係して引き起こされる疾患の発症機構の解明、診断および治療に利用可能な物質、または翻訳などの細胞内プロセスの研究に利用可能な物質を提供する。【解決手段】  SELEX法によって得られ、ヒト翻訳開始因子eIF1Aと結合するRNA。【選択図】  なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜３のいずれかに記載の塩基配列で表されるRNA。
【請求項２】
請求項１に記載のRNAの塩基配列に１若しくは数個の塩基が置換、欠失若しくは挿入された塩基配列で表されるRNAであって、eIF1A若しくはそのフラグメントに対して結合活性を有するRNA。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のRNAに別のRNAを付加したRNAであって、eIF1A若しくはそのフラグメントに対して結合活性を有するRNA。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のRNAの一部を切断して短くしたRNAであって、eIF1A若しくはそのフラグメントに対して結合活性を有するRNA。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のRNAにおいて少なくとも1個の修飾ヌクレオチドが導入されているRNAであって、eIF1A若しくはそのフラグメントに対して結合活性を有するRNA。
【請求項６】
標識化されている請求項１〜５のいずれかに記載のRNA。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載のRNAの塩基配列に相補的な塩基配列を有するDNA。
【請求項８】
請求項７に記載のDNAが挿入されたベクター。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれかに記載のRNAを用いて、eIF1A若しくはそのフラグメントを検出または定量する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は翻訳開始因子eIF1Aに結合するリボ核酸に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
真核生物の翻訳開始反応はリボソームの40Sサブユニットの複合体がmRNAに結合し、スキャニングによって開始Metコドンに到達、60Sサブユニット複合体と結合して80Sリボソームを形成するまでの過程である。この過程には多くの翻訳開始因子（eukaryotic translation initiation factor; eIF）が協調的、連鎖的に働き、その反応を制御している。eIFのいくつかは細胞外シグナルの制御下に置かれ、翻訳量の調整を行っている。近年、eIFの発現異常とがんの関係が報告され、翻訳開始反応の制御異常が細胞増殖の恒常性に大きく影響することが示唆されてきている。例えば、がん組織でeIF2α、eIF2B、eIF3、eIF4A、eIF4Eの発現が上昇しているという臨床的知見が得られている。また、生化学的解析によって、培養細胞においてeIF4E、eIF4G、eIF3-p48、eIF2αを過剰発現させると、がん化が促進されることが報告されている。さらに、eIF4Eの過剰発現により、c-myc、cyclin D1, FGF、VEGF、オルニチンデカルボキシラーゼ、MMP-9など、がん化に関わる因子の翻訳量が著しく上昇している事が報告されている。これらのmRNAは、5’非翻訳領域が長く、GC含量が高く、二次構造性が高いなどの特徴を持ち、そのために正常細胞中での翻訳量は低い。このことより、eIFの高発現により、がんに関わる因子の翻訳量が上昇するため、細胞のがん化が引き起こされていると考えられる。
【０００３】
一方、いくつかのeIFに対する機能抑制が、培養細胞レベルでの抗がん効果がある事が報告されており、現在このタンパク質の翻訳過程を標的としたがん抑制剤の開発が進められている。このような翻訳抑制を目的とした治療薬として、ラパマイシン誘導体の研究が最も進んでいる。ラパマイシンはeIF4Eより上流の制御因子のリン酸化を制御し、eIF4Eの活性を抑制する。その結果、アポトーシスを誘発して腫瘍細胞を破壊する。ラパマイシンはがん細胞特異的に作用する治療薬として期待されており、米国ではCCI-779(Wyeth社)、RAD001(Novartis社)、AP23573（ARIAD pharmaceuticals社）の３種類のラパマイシン誘導体について、抗腫瘍薬として臨床試験が行われている。また、培養細胞レベルでeIF4EやeIF4A1に対するアンチセンスRNAが、抗腫瘍効果のある事が示されており、このうちIsis Pharmaceuticals社の開発したeIF4Eをターゲットとしたアンチセンス製剤・LY2275796は、Eli Lilly社との提携のもとで抗がん剤として研究開発が進められている。
【０００４】
eIF1Aは低分子のタンパク質因子で、現在までに報告されている機能は多岐にわたる。このeIF1AはJak/Stat伝達系の活性化により発現量が上昇する事が報告されている。また、Hedgehog伝達系の下流にeIF1Aが位置しており、Hedgehog伝達系は翻訳量を上げて細胞増殖を促進させていると推測されている。細胞外のシグナルを細胞内へと伝達する経路は細胞の増殖に重要な役割を担っており、一度その経路が破壊されると細胞の恒常性が維持できず、がん化へとつながる。しかし、eIF1Aの翻訳開始反応における役割はまだ詳細には分かっておらず、eIF1Aの機能解明と、さらにがん疾患との関連性を分子レベルで明らかにする必要がある。
【０００５】
ところで、in vitroにおいてある標的物質と特異的に結合するRNAを選択・濃縮する手法として、SELEX法と呼ばれる新たな手法が開発されている(C. Tuerk & L. Gold, Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase, Science 249:505-510, 1990)。SELEX法は、PCRプライマー用の配列（一方にはT7ポリメラーゼの配列を含む）を両端に含む適当な長さのランダム配列を持つRNAを合成し、これを標的タンパク質と会合させ固相化する。結合しなかったRNAを洗浄後、結合したRNAを回収し、RT-PCRで増幅後、次のラウンドで用いるRNAのテンプレートとする。これを１０ラウンド前後繰り返すことにより、標的タンパク質と特異的に結合するRNAアプタマーを取得する。この方法では、標的タンパク質の機能を促進や阻害するような生理活性を持つRNAを取得することが可能である。このことは病原タンパク質をターゲットにしてSELEXを行うことにより、得られたアプタマーを医薬品として応用できることを示唆している。従来の創薬に比べこのSELEX法を用いた創薬の優れている点として（１）従来の化学物質のスクリーニングより大規模の母集団よりスクリーニングをシステマティックに行える。（２）試験管内で容易に大量合成することができる。（３）免疫排除がない。（４）容易に合目的に改良を行える。（５）保存性が高く抗体を作ることが困難なタンパク質を標的にできる。などがあげられる。
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−３４４００８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ヒト翻訳開始因子eIF1Aに関係して引き起こされる疾患の発症機構の解明、診断および治療に利用可能な物質、または翻訳などの細胞内プロセスの研究に利用可能な物質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、このような物質の候補としてeIF1Aに対するRNAアプタマーを作製した。すなわち、eIF1Aを標的タンパク質としてSELEXを行ない、得られたアプタマーの標的タンパク質との結合活性を調べ、その有用性を示した。本発明は、これらの知見に基づいて、完成されたものである。
【０００９】
本発明の要旨は以下の通りである。
【００１０】
（１）配列番号１〜３のいずれかに記載の塩基配列で表されるRNA。
【００１１】
（２）（１）に記載のRNAの塩基配列に１若しくは数個の塩基が置換、欠失若しくは挿入された塩基配列で表されるRNAであって、eIF1A若しくはそのフラグメントに対して結合活性を有するRNA。
【００１２】
（３）（１）又は（２）に記載のRNAに別のRNAを付加したRNAであって、eIF1A若しくはそのフラグメントに対して結合活性を有するRNA。
【００１３】
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載のRNAの一部を切断して短くしたRNAであって、eIF1A若しくはそのフラグメントに対して結合活性を有するRNA。
【００１４】
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載のRNAにおいて少なくとも1個の修飾ヌクレオチドが導入されているRNAであって、eIF1A若しくはそのフラグメントに対して結合活性を有するRNA。
【００１５】
（６）標識化されている（１）〜（５）のいずれかに記載のRNA。
【００１６】
（７）（１）〜（４）のいずれかに記載のRNAの塩基配列に相補的な塩基配列を有するDNA。
【００１７】
（８）（７）に記載のDNAが挿入されたベクター。
【００１８】
（９）（１）〜（５）のいずれかに記載のRNAを用いて、eIF1A若しくはそのフラグメントを検出または定量する方法。
【００１９】
（１）のRNAはeIF1A若しくはそのフラグメントに対して結合活性を有する。ここで「結合活性を有する」とは、ランダム配列のRNAプールより高い結合活性を有していることを意味する。「eIF1Aのフラグメント」とは、eIF1Aの一部で、そのアミノ酸配列からそれがeIF1Aの一部であると認識できるものをいう。
【００２０】
（２）のRNAは（１）のRNAに変異を導入してSELEXを再度行なうことで得ることができる。ここで得られる進化したRNAは（１）のRNAよりも結合活性や生理活性が高い可能性がある。このようにRNAに変異を導入することにより、種々の目的に合ったRNAアプタマーを作製することができる。置換、欠失若しくは挿入される塩基の個数は、数個以内であればよいが、好ましくは5個以下であり、最も好ましくは１個である。
【００２１】
（３）のRNAにおいて、付加されるRNAの長さは特に限定されないが、100mer以下であることが好ましく、30mer以下であることが更に好ましい。このように別のRNAを付加することにより、種々の目的に合ったRNAアプタマーを作製することができる。
【００２２】
（４）のRNAは、（１）〜（３）のRNAを目的に応じて短くしたものである。短くするのは、5'末端又は3'末端のいずれか一方でもよく、また、両方の末端でもよい。また、二次構造上、塩基対合を取らないループ領域を欠失させたものでもよい。切断する長さは特に限定されないが、3〜20merであることが好ましく、3〜10merであることが更に好ましい。
【００２３】
（５）のRNAは（１）〜（４）のRNAのリボースの部分または核酸塩基の部分または5'末端または3'末端を修飾したもので、（１）〜（４）のRNAの安定性、結合活性、生理活性を高めることができる。例えば、ピリミジンヌクレオチドのリボースの2'-OHをフルオロ化するとリボヌクレアーゼ耐性になり、安定性が飛躍的に向上する。なお、修飾ヌクレオチドにはデオキシリボヌクレオチドも含まれる。
【００２４】
（６）の標識化されているRNAはeIF1Aの検出と定量に用いることができる。例えば、蛍光物質で標識化したアプタマーを細胞内に導入することで、細胞内でのeIF1Aの挙動が観察できる。また、5'末端をビオチン化し固相化することで、RNAアプタマーを用いたeIF1A分離カラムを作製することができる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によりeIF1Aに対して結合能を有するRNAアプタマーが提供される。本発明のRNAアプタマーはeIF1Aの機能解析やがんなどの疾患の診断および治療に利用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明において用いたSELEX法の概略を図１に示す。
【００２７】
eIF1Aに対するRNAアプタマーの選択は、N末端にヒスチジンタグが融合したものを大腸菌内で高発現させ、それをNi-NTA agarose（Qiagenn社）で一次精製し、Rsourese Qカラム（Amersham biotech社）で二次精製したものを標的タンパク質に用いた。以下、実験で用いているeIF1Aはヒスチジン融合タンパク質のことをいう。これをNi-NTA agarose（Qiagen社）またはTALON metal affinity resin（Clontech社）に固相化し、40 merのランダム配列を持つRNAプールに対してselectionを行なった。9ラウンドまでselectionのサイクルを回した後、濃縮されてきたRNAに対応するcDNAをpGEM T-EASY Vectorにクローン化し、塩基配列を決定した。その結果、5種類の収束している配列がそれぞれのselectionより見られた（図2）。これらをそれぞれapt1（配列番号１）、apt2(配列番号２)、apt3(配列番号３)、seq1、seq2と名付けた。apt2はapt1の２塩基、apt3はapt1の１塩基置換されたものである。
【００２８】
収束したRNAの結合活性をみるため、ニトロセルロースフィルターを用いたフィルター結合実験を行った。32Pで標識されたRNAとeIF1Aを混合し、これをニトロセルロースフィルターに通した。フィルターを洗浄してeIF1Aに結合していないRNAを洗い流した後、フィルター上に残った32Pのカウントをシンチレーター（Beckman社）で測定した。eIF1Aの濃度を振って結合したRNAのカウントをグラフにプロットした（図３）。apt1、apt2、apt3はeIF1Aに対して結合活性を持っていた。プロットから算出した結合定数Kdは、約10 nMであった。seq1、seq2はeIF1Aには結合しなかった。
【００２９】
結合活性が見られたRNAアプタマーのうちselectionの出現頻度が高かったapt1について、このRNAアプタマーが翻訳反応に与える影響を、ウサギ網状赤血球ライセート中におけるin vitroでの翻訳系を用いて検証した (図４)。キャッピングしたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）のmRNAを基質とし、翻訳産物量の経時変化をSDS-PAGEで検出したところ、apt1存在下で翻訳の阻害効果が見られた。
【００３０】
この翻訳阻害効果がどのような機構で起こっているのかを明らかにするため、eIF1Aと他の翻訳関連因子との結合に対するRNAアプタマーの影響をpull-down実験により検証した。ヒスチジンタグ付きのeIF1Aを用いて、HeLa細胞破砕液よりこれと共沈するeIF2β、eIF3-p66、S6リボソームタンパク質を検出する系を構築した（図５）。RNAアプタマーをこの系に加えるとeIF2βとの共沈には影響なかったが、eIF3-p66とS6リボソームタンパク質の共沈は阻害された（図６）。このことから、eIF1Aに対するRNAアプタマーは少なくともeIF1AとeIF3およびリボソームとの結合を阻害する事により、翻訳反応を阻害している事が示唆された。
【００３１】
以上のように本発明ではeIF1Aに対するRNAアプタマーを取得した。これらのアプタマーが細胞内での翻訳阻害活性を有していれば、多くの癌遺伝子の発現抑制を行うことが可能である。また、腫瘍細胞に対して特異的に働かせる系を確立すれば、原因遺伝子に関わらず癌細胞の増殖を抑制する万能な治療薬となりうることも考えられる。
【００３２】
これら、eIF1Aに対するRNAアプタマーを利用して以下のことが可能となる。
【００３３】
(１)解析ツールおよびバイオセンシングの素子としての利用:  このアプタマーはeIF1Aに作用して翻訳反応を阻害するので、これによりeIF1Aの機能解析や、発症機構の分かっていないeIF1Aが関わる疾患についてその発症機構を解明する研究に解析ツールとして用いる事ができる。また、RNAアプタマーは抗体の特徴を有しているが、これはRNAアプタマーを抗体の代わりに「RNA抗体」として用いることができることを意味する。これまで抗体を用いて行われていた免疫染色・ELISAなどでこのRNA抗体を用いた新規の検出系が構築できる。すなわち、このアプタマーを用いたeIF1Aの定量的測定が可能である。eIF1Aは白血病細胞で発現が亢進している事が報告されており、アプタマーを用いてeIF1Aの発現量の差や変異を認識できる系をELISAやアプタマーのチップ化などで確立し、安価で簡便な疾患の診断が可能となる。
【００３４】
(２)治療薬としての応用:  シグナル伝達の異常による炎症性疾患、自己免疫疾患、腫瘍などは、このシグナル伝達を阻害する事により治療可能なものが多い。eIF1Aは細胞のがん化と関連性があるJak/StatおよびHedgehog伝達系に関与している事が示唆されている。本発明のアプタマーは細胞内でこのシグナル伝達の阻害効果を期待できる。さらに、アプタマーはその塩基配列に変異を導入する事によって、容易に改変を行なう事ができ、化学修飾も容易である事から、本発明のアプタマーを基にシグナル伝達を阻害する治療薬の開発が可能となる。また、本発明のアプタマーの改変により、より結合特異性の高いものへの改変も可能である。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明の実験の手法を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００３６】
［実施例1］精製タンパク質
本発明で用いたヒトeIF1Aはヒスチジンタグのついた融合タンパク質として大腸菌内で過剰発現させ、Ni-NTAアガロース（キアゲン社製）を用いて粗精製し、さらに陰イオン交換カラムResource Q（アマシャムバイオサイエンス社製）により精製した。
【００３７】
［実施例2］RNAアプタマーの取得
SELEX法を用いたin vitro RNA selectionはEllingtonらの方法（Ellington A.D. and Szostak J.W., In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands, Nature, 346:818-22, 1990）及びTuerkらの方法（Tuerk C. and Gold L., Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase, Science, 249:505-510, 1990）を改良して行った。in vitro selectionに用いたRNA poolは化学合成した以下のプライマー及びランダム配列テンプレート（オペロン社に合成依頼）より作製した。PCRで増幅させたランダム配列のDNA断片を転写のテンプレートとし、プライマーP1に含まれるT7 RNAポリメラーゼのプロモーターにより、in vitroでT7 RNAポリメラーゼにより転写し、フェノール抽出とゲルろ過により精製した。
【００３８】
P1:  5'-TAATACGACTCACTATAGGGACACAATGGACG-3'（配列番号４）
P2:  5'-CTCTCATGTCGGCCGTTA-3'（配列番号５）
ランダム配列テンプレート：
5’- TAATACGACTCACTATAGGGACACAATGGACG(40N)TAACGGCCGACATGAGAG-3’（配列番号６）
RNAとタンパク質との結合はバッファーA[20 mM Tris-HCl(pH7.6), 80 mM potassium acetate, 2.5 mM magnesium acetate, 1 mM dithiothreitol]中で行われた。eIF1AとRNAとの反応後、Ni-NTAアガロース（キアゲン社製）またはTALON metal affinity resin（Clontech社製）によりeIF1Aをpull-down後、RNAを精製し、RT-PCRで増幅の後、in vitroで転写を行ない、次のラウンドのRNAを得た。毎ラウンド、RNAはeIF1Aと反応させる前にNi-NTAアガロース（キアゲン社製）またはTALON metal affinity resinと混ぜ、これに結合するRNAを取り除いた。9ラウンドselectionを行った後、PCR産物はpGEM-T Easy vector（Promega社製）にサブクローニング後、大腸菌株NovaBlue（Novagen社製）に形質転換し、単一クローンを得た。これらは、plasmidを抽出後DNA sequencer（model 3100, ABI社製）で、以下のsequence primerを用いて塩基配列を決定した。
【００３９】
sequence primer:  5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3'（配列番号７）
得られた塩基配列は遺伝情報処理ソフトウェアGENETYX-MAC（ソフトウェア開発社製）によりRNAの二次構造予測を行った。
【００４０】
［実施例3］結合活性の評価
9ラウンド後に得られたRNAのうち5種類のRNA（図２）のeIF1Aに対する結合活性を、ニトロセルロースフィルターを用いたフィルター結合実験によって評価した。32Pで標識されたRNAとeIF1AをバッファーA中で混合し、室温で30分保持した後、この混合液をニトロセルロースフィルターでろ過した。ニトロセルロースフィルターにタンパク質は吸着するが核酸は吸着しないので、eIF1Aに結合したRNAだけがフィルター上に残る。フィルターをバッファーAで洗浄してeIF1Aに結合していないRNAを洗い流した後、フィルター上に残った32Pのカウントをシンチレーター（Beckman社製）で測定した。結合率は系に加えた全RNAの32Pのカウントに対するフィルターに吸着したRNAの32Pのカウントの相対量で表した。結合定数はeIF1Aの濃度を変えた実験をおこない、RNAinitial/RNAtrapped=Kd/[eIF1A]initialの関係から求めた。
【００４１】
以上の実験の結果を図３に示す。図に示すように、配列番号１〜３で表されるapt1、apt2、apt3はeIF1Aに対して結合活性を示したが、seq1とseq2は結合活性を示さなかった。
【００４２】
［実施例4］In vitro翻訳系
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）とルシフェラーゼ（LUC）の遺伝子を含むmRNA（Cap-CAT/HCV IRES/LUC）を基質とするin vitro翻訳系を使ってapt1の翻訳阻害実験を行った。
【００４３】
基質としたmRNA中のCAT遺伝子は、5'末端がキャッピングされており、また、LUC遺伝子の上流には、HCVのIRESが付加されている（図４Ａ）。CAT遺伝子のキャッピングは、T7ポリメラーゼによる転写の際にm7GpppGキャップアナログを加え、以下の反応組成で行なった。
【００４４】
【表１】
2007028932.tif 000002
【００４５】
転写反応後にDNase Iを加え、37℃ 30 minでテンプレートdsDNAを分解し、フェノール／クロロホルム処理、クロロホルム処理してタンパク質を除き、エタノール沈澱により目的の長さのRNAのみを精製した。さらに、脱イオン水で置換したスピンカラムにRNA溶液を通し、NTPを完全に除去した。
【００４６】
in vitro翻訳は、Cap-CAT/HCV IRES/LUC mRNAを基質とし、ウサギ網状赤血球ライセートを用い、以下の組成で行なった。
【００４７】
【表２】
2007028932.tif 000003
【００４８】
各反応時間ごとにライセートを3μlとりSDS-PAGEした後、ゲルを乾燥させてプレートリーダーに８時間感光、BAS-2000 (FUJIFILM)にて解析を行なった。
【００４９】
apt1（配列番号１）（濃度2.5μM）を用いた上記翻訳阻害実験の結果を図４Bに示す。図に示すように、RNAアプタマー存在下ではcap依存型のCATの翻訳も、HCV  IRESに依存型のLUCの翻訳も阻害された。
【００５０】
［実施例５］Pull-down実験
約１x105 cells/mlのHeLa細胞をprotease inhibitor cocktail(complete, EDTA free、Roch社)を加えたバッファーAで溶解し、液体窒素で凍結・融解を５回繰り返して、12000 rpmで15分遠心後、上清を取り、これをHeLa細胞破砕液とした。このHeLa細胞破砕液に、最終濃度１μMのヒスチジンタグ付きのeIF1AとNi-NTA agrose(Qiagen社)を加え、室温で１５分反応させた後、2100x gで数十秒遠心後、上清を捨て、150 μlのバッファーAで三回洗浄し、バッファーAに250 mMのイミダゾールを加えた溶液で溶出し、共沈物を得た。これに対してeIF3-p66、eIF2β、S6 リボソームタンパク質に対する抗体でWestern blottingを行ったところ、これらがeIF1Aに特異的に共沈してくる事が確認できた（図５）。この系に濃度を振ってapt1（配列番号１）を加えたところ、eIF3-p66とS6 リボソームタンパク質の共沈がapt1濃度依存的に阻害された（図6）。eIF2βの共沈にapt1での阻害効果は見られなかった。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】SELEX法の概略を示す図。T7 RNAポリメラーゼプロモーター配列とランダム領域を含むDNAを合成し、P1, P2をプライマーとしてPCRを行い、テンプレートを得る。これから合成したRNAを標的物質と会合させ、結合したRNAを回収する。回収したRNAからRT-PCRにより次のラウンドへのテンプレートを得る。本発明ではこれを９ラウンド繰り返した。最終ラウンドでのRTーPCR産物をクローニング、塩基配列決定に回す。
【図２】SELEX法によって選択されたRNAの配列を示す図。選択されてきた９ラウンド目のRNAプールの塩基配列を決定したところ、RNAは５タイプの配列に収束していた。それぞれのselectionでの出現頻度を図中に示した。これらのRNAを図中の配列の上よりapt1、apt2、apt3、seq1、seq2とした。apt2はapt1の２塩基、apt3はapt1の１塩基置換されたものである。
【図３】ニトロセルロースフィルターを用いたフィルター結合実験の結果を示す図。apt1、apt2、apt3はeIF1Aに対して結合活性を有し、その解離定数は約10 nMと算出された。一方、seq1、seq2はeIF1Aに対して結合活性を有していなかった。
【図４】翻訳阻害実験の結果を示す図。(A)翻訳に用いたmRNAの概略図。(B)翻訳反応時間を0、5、10、20、30、45分と振って35S-Metを取り込ませた翻訳産物をSDS-PAGEに流して、それをオートラジオグラムとして検出したもの。(C)バンドの濃さを定量し、グラフにしたもの。
【図５】Pull-down実験によるeIF1Aとの共沈物の検出を示す図。HeLa細胞破砕液よりeIF1Aと共沈する因子の試料を得てSDS-PAGEに流し、膜にblottingし、eIF3-p66（上段）、eIF2β（中段）、S6リボソームタンパク質（RPS6;下段）に対する抗体でそれぞれのタンパク質を検出した。レーン１はHeLa細胞破砕液、レーン２はNi-NTA agarpse resinのみでpull-down、レーン３はヒスチジンタグ付きのeIF1Aを加え、Ni-NTA agarpse resinでpull-downさせた試料を流している。
【図６】eIF1Aとの相互作用に対するRNAアプタマーの阻害効果を示す図。eIF3-p66（上段）、eIF2β（中段）、S6リボソームタンパク質（RPS6;下段）に対する抗体でそれぞれのタンパク質を検出している。Pull-downの系に加えているeIF1Aの濃度は1μMである。Random RNAと書かれているレーンはそれぞれの濃度のランダム配列のRNAが、apt1と書かれているレーンはそれぞれの濃度のapt1が系に加えられている。eIF2βはapt1添加ではeIF1Aとの相互作用は阻害されなかったが、eIF3-p66とS6リボソームタンパク質は阻害された。
【図２】
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【図３】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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