(57)【要約】【課題】肺癌患者の予後又は転移可能性を予測する方法を提供する。【解決手段】ヒト肺癌患者の術後の予後又は転移可能性をインビトロで予測する方法であって、術後の予後がより良い又は転移可能性がより低い第１の患者群からの肺癌組織及び術後の予後がより悪い又は転移可能性がより高い第２の患者群からの肺癌組織の網羅的タンパク質発現プロファイルを取得すること、該網羅的タンパク質発現プロファイルについて該第１の患者群からの肺癌組織と該第２の患者群からの肺癌組織とを互いに区別可能なタンパク発現プロファイルを抽出すること、該第１の患者群と第２の患者群との間の該抽出された発現プロファイルを構成するタンパク質の相対的な発現レベルの差を指標にしてヒト肺癌患者の組織検体について術後の予後又は転移可能性を判定することを含む方法、並びにそのための組成物。【選択図】図１
2007263896.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
質量分析器を応用し、ヒト肺癌組織及び非癌組織の網羅的タンパク質発現プロファイルを取得すること、該網羅的タンパク質発現プロファイルについて該肺癌組織を該非癌組織から区別可能なタンパク質発現プロファイルを抽出すること、該肺癌組織と非癌組織との間の該抽出されたタンパク質発現プロファイルを構成するタンパク質の相対的な発現レベルの差を指標にしてヒト肺組織検体について肺癌を検出することを含み、ここで、該抽出された発現プロファイルを構成するタンパク質が、分子量([M+H]+) 4568.9 ±0.02％、12020.4 ±0.02％、6596.4 ±0.02％、7363.4 ±0.02％、11112.1 ±0.02％、19911.9 ±0.02％、10619.6 ±0.02％、9876.6 ±0.02％、19982.0 ±0.02％、19993.1 ±0.02％、11154.4 ±0.02％、11472.2 ±0.02％、19865.2 ±0.02％、12217.4 ±0.02％、19877.8 ±0.02％、2973.7 ±0.02％、7324.9 ±0.02％、11197.8 ±0.02％、4536.2 ±0.02％、15975.8 ±0.02％、4938.1 ±0.02％、4965.8 ±0.02％、4963.5 ±0.02％、6275.9 ±0.02％、6649.6 ±0.02％、6224.3 ±0.02％、5650.9 ±0.02％、11345.0 ±0.02％、5144.8 ±0.02％、5170.8 ±0.02％、14001.5 ±0.02％、2909.4 ±0.02％、7001.4 ±0.02％、11305.3 ±0.02％、11984.0 ±0.02％、10089.2 ±0.02％、6646.4 ±0.02％、14046.2 ±0.02％、2559.7 ±0.02％、及び2303.4 ±0.02％を有するタンパク質からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質であることを特徴とする、ヒト肺癌の検出方法。
【請求項２】
前記肺癌が肺非小細胞癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抽出されたタンパク質発現プロファイルを構成するタンパク質を同定することをさらに含む、請求項1又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記分子量([M+H]+)4938.1 ±0.02％、4963.5 ±0.02％、6275.9 ±0.02％、6649.6 ±0.02％、10089.2 ±0.02％、14001.5 ±0.02％及び14046.2 ±0.02％を有するタンパク質がそれぞれ、配列番号１、２、３、４、５、６又は７に示されるアミノ酸配列を含むものである、請求項１〜３のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
前記分子量([M+H]+)4568.9 ±0.02％、12020.4 ±0.02％、6596.4 ±0.02％、7363.4 ±0.02％、11112.1 ±0.02％、19911.9 ±0.02％、10619.6 ±0.02％、9876.6 ±0.02％、19982.0 ±0.02％、19993.1 ±0.02％、11154.4 ±0.02％、11472.2 ±0.02％、19865.2 ±0.02％、12217.4 ±0.02％、19877.8 ±0.02％、2973.7 ±0.02％、7324.9 ±0.02％、11197.8 ±0.02％、4536.2 ±0.02％、15975.8 ±0.02％、4938.1 ±0.02％、4965.8 ±0.02％、4963.5 ±0.02％、6275.9 ±0.02％、6649.6 ±0.02％、6224.3 ±0.02％、5650.9 ±0.02％、11345.0 ±0.02％、5144.8 ±0.02％、5170.8 ±0.02％、14001.5 ±0.02％、2909.4 ±0.02％、7001.4 ±0.02％、11305.3 ±0.02％、11984.0 ±0.02％、10089.2 ±0.02％、6646.4 ±0.02％、14046.2 ±0.02％、2559.7 ±0.02％、及び2303.4 ±0.02％を有するタンパク質からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質若しくはその変異体に対する抗体又はその断片、或いは該タンパク質若しくはその変異体をコードするポリヌクレオチド、それに相補的なポリヌクレオチド、又は15塩基以上のそれらの断片、を使用して前記発現レベルの差を測定する、請求項１〜４のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
ヒト肺癌患者の術後の予後又は転移可能性をインビトロで予測する方法であって、術後の予後がより良い又は転移可能性がより低い第１の患者群からの肺癌組織及び術後の予後がより悪い又は転移可能性がより高い第２の患者群からの肺癌組織の網羅的タンパク質発現プロファイルを取得すること、該網羅的タンパク質発現プロファイルについて該第１の患者群からの肺癌組織と該第２の患者群からの肺癌組織とを互いに区別可能なタンパク質発現プロファイルを抽出すること、該第１の患者群と第２の患者群との間の該タンパク質発現プロファイルを構成するタンパク質の相対的な発現レベルの差を指標にして、ヒト肺癌患者の組織検体について術後の予後又は転移可能性を判定することを含み、ここで、該抽出された発現プロファイルを構成するタンパク質が、分子量([M+H]+)12449.8 ±0.02％、17206.1 ±0.02％、12318.8 ±0.02％、6084.9 ±0.02％、13163.5 ±0.02％、15720.8 ±0.02％、17099.8 ±0.02％、10839.6 ±0.02％、6075.0 ±0.02％、13155.6 ±0.02％、18331.5 ±0.02％、16944.2 ±0.02％、15731.2 ±0.02％、11175.9 ±0.02％、15659.8 ±0.02％、17262.0 ±0.02％、6041.6 ±0.02％、8577.2 ±0.02％、17749.1 ±0.02％、13635.5 ±0.02％、17220.3 ±0.02％、16958.0 ±0.02％、12761.2 ±0.02％、7965.3 ±0.02％、及び12878.3 ±0.02％を有するタンパク質からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質であることを特徴とする方法。
【請求項７】
前記肺癌が肺非小細胞癌である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記抽出された発現プロファイルを構成するタンパク質を同定することをさらに含む、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記分子量([M+H]+)11175.9 ±0.02％、17220.3 ±0.02％及び17262.0 ±0.02％を有するタンパク質がそれぞれ、配列番号８、９又は10に示されるアミノ酸配列を含むものである、請求項６〜８のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
前記分子量([M+H]+)12449.8 ±0.02％、17206.1 ±0.02％、12318.8 ±0.02％、6084.9 ±0.02％、13163.5 ±0.02％、15720.8 ±0.02％、17099.8 ±0.02％、10839.6 ±0.02％、6075.0 ±0.02％、13155.6 ±0.02％、18331.5 ±0.02％、16944.2 ±0.02％、15731.2 ±0.02％、11175.9 ±0.02％、15659.8 ±0.02％、17262.0 ±0.02％、6041.6 ±0.02％、8577.2 ±0.02％、17749.1 ±0.02％、13635.5 ±0.02％、17220.3 ±0.02％、16958.0 ±0.02％、12761.2 ±0.02％、7965.3 ±0.02％、及び12878.3 ±0.02％を有するタンパク質からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質若しくはその変異体に対する抗体又はその断片、或いは該タンパク質若しくはその変異体をコードするポリヌクレオチド、それに相補的なポリヌクレオチド、又は15塩基以上のそれらの断片、を使用して前記発現レベルの差を測定する、請求項６〜９のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
ヒト肺組織由来の分子量([M+H]+)4568.9 ±0.02％、12020.4 ±0.02％、6596.4 ±0.02％、7363.4 ±0.02％、11112.1 ±0.02％、19911.9 ±0.02％、10619.6 ±0.02％、9876.6 ±0.02％、19982.0 ±0.02％、19993.1 ±0.02％、11154.4 ±0.02％、11472.2 ±0.02％、19865.2 ±0.02％、12217.4 ±0.02％、19877.8 ±0.02％、2973.7 ±0.02％、7324.9 ±0.02％、11197.8 ±0.02％、4536.2 ±0.02％、15975.8 ±0.02％、4938.1 ±0.02％、4965.8 ±0.02％、4963.5 ±0.02％、6275.9 ±0.02％、6649.6 ±0.02％、6224.3 ±0.02％、5650.9 ±0.02％、11345.0 ±0.02％、5144.8 ±0.02％、5170.8 ±0.02％、14001.5 ±0.02％、2909.4 ±0.02％、7001.4 ±0.02％、11305.3 ±0.02％、11984.0 ±0.02％、10089.2 ±0.02％、6646.4 ±0.02％、14046.2 ±0.02％、2559.7 ±0.02％、及び2303.4 ±0.02％を有するタンパク質からなる群から選択されるタンパク質若しくはそれらの変異体に対する抗体又はその断片を少なくとも１つ含む、ヒト肺癌を検出するための組成物。
【請求項１２】
ヒト肺組織由来の分子量([M+H]+)4568.9 ±0.02％、12020.4 ±0.02％、6596.4 ±0.02％、7363.4 ±0.02％、11112.1 ±0.02％、19911.9 ±0.02％、10619.6 ±0.02％、9876.6 ±0.02％、19982.0 ±0.02％、19993.1 ±0.02％、11154.4 ±0.02％、11472.2 ±0.02％、19865.2 ±0.02％、12217.4 ±0.02％、19877.8 ±0.02％、2973.7 ±0.02％、7324.9 ±0.02％、11197.8 ±0.02％、4536.2 ±0.02％、15975.8 ±0.02％、4938.1 ±0.02％、4965.8 ±0.02％、4963.5 ±0.02％、6275.9 ±0.02％、6649.6 ±0.02％、6224.3 ±0.02％、5650.9 ±0.02％、11345.0 ±0.02％、5144.8 ±0.02％、5170.8 ±0.02％、14001.5 ±0.02％、2909.4 ±0.02％、7001.4 ±0.02％、11305.3 ±0.02％、11984.0 ±0.02％、10089.2 ±0.02％、6646.4 ±0.02％、14046.2 ±0.02％、2559.7 ±0.02％、及び2303.4 ±0.02％を有するタンパク質からなる群から選択されるタンパク質若しくはそれらの変異体をコードするポリヌクレオチド又はそれに相補的なポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び15以上の連続した塩基を含むそれらの断片、からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、ヒト肺癌を検出するための組成物。
【請求項１３】
前記組成物がキット又はマイクロアレイの形態である、請求項11又は12に記載の組成物。
【請求項１４】
ヒト肺癌組織由来の分子量([M+H]+)12449.8 ±0.02％、17206.1 ±0.02％、12318.8 ±0.02％、6084.9 ±0.02％、13163.5 ±0.02％、15720.8 ±0.02％、17099.8 ±0.02％、10839.6 ±0.02％、6075.0 ±0.02％、13155.6 ±0.02％、18331.5 ±0.02％、16944.2 ±0.02％、15731.2 ±0.02％、11175.9 ±0.02％、15659.8 ±0.02％、17262.0 ±0.02％、6041.6 ±0.02％、8577.2 ±0.02％、17749.1 ±0.02％、13635.5 ±0.02％、17220.3 ±0.02％、16958.0 ±0.02％、12761.2 ±0.02％、7965.3 ±0.02％、及び12878.3 ±0.02％を有するタンパク質からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質若しくはそれらの変異体に対する抗体又はその断片を少なくとも１つ含む、ヒト肺癌患者の術後の予後又は転移可能性をインビトロで予測するための組成物。
【請求項１５】
ヒト肺癌組織由来の分子量([M+H]+)12449.8 ±0.02％、17206.1 ±0.02％、12318.8 ±0.02％、6084.9 ±0.02％、13163.5 ±0.02％、15720.8 ±0.02％、17099.8 ±0.02％、10839.6 ±0.02％、6075.0 ±0.02％、13155.6 ±0.02％、18331.5 ±0.02％、16944.2 ±0.02％、15731.2 ±0.02％、11175.9 ±0.02％、15659.8 ±0.02％、17262.0 ±0.02％、6041.6 ±0.02％、8577.2 ±0.02％、17749.1 ±0.02％、13635.5 ±0.02％、17220.3 ±0.02％、16958.0 ±0.02％、12761.2 ±0.02％、7965.3 ±0.02％、及び12878.3 ±0.02％を有するタンパク質からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質若しくはそれらの変異体をコードするポリヌクレオチド又はそれに相補的なポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び15以上の連続した塩基を含むそれらの断片、からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、ヒト肺癌患者の術後の予後又は転移可能性をインビトロで予測するための組成物。
【請求項１６】
前記組成物がキット又はマイクロアレイの形態である、請求項14又は15に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト肺癌の検出方法、ヒト肺癌患者の術後予後の予測方法、及びこれらの方法に使用可能な生物マーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
肺癌は、日本では年間55,000人以上が死亡する癌の死亡原因のトップであり、米国や他の多くの経済先進諸国でも癌の死亡原因の第1位として多数の生命を奪っている。外科切除術は、肺癌症例の80〜85％を占める非小細胞肺癌(NSCLC)患者の治療として最良と考えられるが、残念ながら、診断時に手術適応がある病期で発見される患者は、全体の約25％の患者のみである。さらには、それら患者の長期生存率は依然として満足のいくものではなく、術後5年以上生存可能な症例は、治癒切除術が施行された全症例の50％以下にとどまる。一方、それ以外の患者は、全身への遠隔転移或いは局所再発のために、死に至る。一般に、予後の悪い患者はアジュバント療法による恩恵を受けられると考えられており、また最近の解析によれば、実際に、アジュバント療法はNSCLCにおいて術後予後を改善する可能性が示されている。しかし、残念なことに、個々の患者の予後を正確に予測するための手段を依然欠いており、そのために、転移・再発を認めない患者を過剰治療する事無く、治療効果を最大にすることが不可能な現状にある。これまでも、血清マーカー、免疫組織化学による組織検出可能なマーカー、遺伝子及びエピジェネティックマーカーなどを含む種々の生物マーカーが同定されており、肺癌において臨床的な予後との関連に関する検討がなされてきたが、現在までに評価されたもののなかで臨床現場での有用性が実際に証明されたものはない。それゆえ、NSCLCの術後予後判定は、従来の臨床及び病理学的知見に依然として大きく依存している。
【０００３】
cDNAマイクロアレイ技術は、ヒトNSCLCにおいて、生存予測のための組織学特異的発現プロファイルと潜在的生物マーカーを同定するために利用されてきており、一定の成果が報告されている。しかし、mRNA発現レベルはタンパク質の発現レベルと密接には相関しておらず、さらには、ゲノムがコードする情報からは、タンパク質の機能調節に重要な役割を担う翻訳後修飾を予測することはできない。タンパク質発現解析技術である二次元ゲル電気泳動法は、新規生物マーカーの探索のために応用されてはいるが、時間と費用がかかるという欠点がある。したがって、これまで、ヒトNSCLCの正確な予後予測を臨床現場のレベルで応用可能とした生物マーカー或いは分析法は皆無と言える。
【０００４】
プロテオミクス技術、特に質量分析器（MS）の最近の急速な進歩は、ヒト癌の分子マーカー探索のために、生物材料を用いたタンパク質発現プロファイル解析を可能なものとしてきた。これまでの研究によれば、表面増強レーザー脱離イオン化（Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization）MSやMALDI MSを使用して、タンパク質発現プロファイルが種々の悪性腫瘍をもつ癌患者を対照から区別しうることが報告されてきた（非特許文献１〜５）。本発明者らも最近、MALDI MSを応用する事により得られたヒト肺癌のタンパク質プロファイルが、NSCLCと正常肺(NL)との間で、及び異なる組織型の腫瘍間で、違いを示したこと、並びに、プロテオミクスパターンがNSCLC患者を二群に分割可能にし、これらの群が中間無条件生存期間に最大差(6ヶ月対33ヶ月)を示すことを実証した（非特許文献６）。これらの結果は、質量分析器による解析方法が非常に有用である事を示しているが、この研究では、術後の平均観察期間が非常に短く、長期生存の予測モデル（例えば、5年生存予測モデル）を構築することができない点、あるいは、症例数が不十分である事から、独立したデータセットにおいて結果を確認することができない点などの問題点を有している。
【０００５】
【非特許文献１】EF Petricoinら, Lancet 2002, 359:572-7
【非特許文献２】EF Petricoinら, J. Natl. Cancer Inst. 2002, 94:1576-8
【非特許文献３】BL Adamら, Cancer Res. 2002, 62:3609-14
【非特許文献４】D Sidranskyら, J. Natl. Cancer Inst. 2003, 95:1711-7
【非特許文献５】MJ Campaら, Cancer Res. 2003, 63:1652-6
【非特許文献６】K Yanagisawaら, Lancet 2003, 362:433-9
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これまでに、ある特定の遺伝子又はタンパク質が癌の転移に関連している可能性が提案されてきた。しかし、実際、実験室レベルでは転移に関連していても他の系では転移との関連が確認できなかった、或いは阻害剤を開発して臨床応用しても十分な効果が得られなかった、という多くの事象が存在した。
【０００７】
このような状況において、本発明の目的は、転移が単一の遺伝子又はタンパク質によって起こるものではなく、複数の遺伝子又はタンパク質の協調的な相互作用によって起きることに着目し、ヒト肺癌患者の予後を判定できる有効な生物マーカーを見出すことである。
【０００８】
本発明の別の目的は、ヒト肺癌組織を非癌組織から区別することができる有効な生物マーカーを見出すことである。
【０００９】
上記の２組の生物マーカーを組み合わせることによって、患者が、肺癌を有するか否か、また転移の可能性に関する予後が良好であるか否かを同時に決定することが可能になる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
再発と死亡の危険性を正確に予測するための何らかの有用な指標を得るために、また、NSCLCのタンパク質発現プロファイルが臨床的に有用なツールであることを立証するために、本発明者らは、MALDI MSを使用して、174症例のNSCLC腫瘍及び27例のNLを含む201検体のタンパク質発現プロファイルを解析し、教師群の中で、NSCLCをNLから正確に区別する或いは患者の術後予後と有意に関連するタンパク質発現プロファイル抽出し、さらには、患者予後の個別診断法を構築することを可能にするタンパク質発現プロファイルを抽出することができた。本発明者らは、術後予後のタンパク質発現プロファイルに基づいた個別診断法を、テスト群から得られた独立のデータセットに適用し、患者の再発と死亡の予測におけるそれらの有用性を確認することに成功した。さらに、先進的なプロテオミクス解析を行う事によって、タンパク質発現プロファイルを構成する生物マーカー群を同定した。
【００１１】
したがって、本発明は、要約すると、以下の特徴を有する。
本発明は、第１の態様において、質量分析器を応用する事により、ヒト肺癌組織及び非癌組織の網羅的タンパク質発現プロファイルを得ること、該網羅的タンパク質発現プロファイルから、該肺癌組織を該非癌組織から区別可能なタンパク質発現プロファイルを抽出すること、該肺癌組織と非癌組織との間の該抽出されたタンパク質発現プロファイルを構成するタンパク質の相対的な発現レベルの差を指標にしてヒト肺組織検体について肺癌を検出することを含み、ここで、該抽出された発現プロファイルを構成するタンパク質が、分子量([M+H]+) 4568.9 ±0.02％、12020.4 ±0.02％、6596.4 ±0.02％、7363.4 ±0.02％、11112.1 ±0.02％、19911.9 ±0.02％、10619.6 ±0.02％、9876.6 ±0.02％、19982.0 ±0.02％、19993.1 ±0.02％、11154.4 ±0.02％、11472.2 ±0.02％、19865.2 ±0.02％、12217.4 ±0.02％、19877.8 ±0.02％、2973.7 ±0.02％、7324.9 ±0.02％、11197.8 ±0.02％、4536.2 ±0.02％、15975.8 ±0.02％、4938.1 ±0.02％、4965.8 ±0.02％、4963.5 ±0.02％、6275.9 ±0.02％、6649.6 ±0.02％、6224.3 ±0.02％、5650.9 ±0.02％、11345.0 ±0.02％、5144.8 ±0.02％、5170.8 ±0.02％、14001.5 ±0.02％、2909.4 ±0.02％、7001.4 ±0.02％、11305.3 ±0.02％、11984.0 ±0.02％、10089.2 ±0.02％、6646.4 ±0.02％、14046.2 ±0.02％、2559.7 ±0.02％、及び2303.4 ±0.02％を有するタンパク質からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質であることを特徴とする、ヒト肺癌の検出方法を提供する。
【００１２】
その実施形態において、前記肺癌が肺非小細胞癌である。
その別の実施形態において、本発明の前記方法が、前記抽出された発現プロファイルを構成するタンパク質を同定することをさらに含むことができる。
【００１３】
その別の実施形態において、前記分子量([M+H]+)4938.1 ±0.02％、4963.5 ±0.02％、6275.9 ±0.02％、6649.6 ±0.02％、10089.2 ±0.02％、14001.5 ±0.02％及び14046.2 ±0.02％を有するタンパク質がそれぞれ、配列番号１、２、３、４、５、６又は７に示されるアミノ酸配列を含むものである。
【００１４】
その別の実施形態において、前記分子量([M+H]+)4568.9 ±0.02％、12020.4 ±0.02％、6596.4 ±0.02％、7363.4 ±0.02％、11112.1 ±0.02％、19911.9 ±0.02％、10619.6 ±0.02％、9876.6 ±0.02％、19982.0 ±0.02％、19993.1 ±0.02％、11154.4 ±0.02％、11472.2 ±0.02％、19865.2 ±0.02％、12217.4 ±0.02％、19877.8 ±0.02％、2973.7 ±0.02％、7324.9 ±0.02％、11197.8 ±0.02％、4536.2 ±0.02％、15975.8 ±0.02％、4938.1 ±0.02％、4965.8 ±0.02％、4963.5 ±0.02％、6275.9 ±0.02％、6649.6 ±0.02％、6224.3 ±0.02％、5650.9 ±0.02％、11345.0 ±0.02％、5144.8 ±0.02％、5170.8 ±0.02％、14001.5 ±0.02％、2909.4 ±0.02％、7001.4 ±0.02％、11305.3 ±0.02％、11984.0 ±0.02％、10089.2 ±0.02％、6646.4 ±0.02％、14046.2 ±0.02％、2559.7 ±0.02％、及び2303.4 ±0.02％を有するタンパク質からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質若しくはその変異体に対する抗体又はその断片、或いは該タンパク質若しくはその変異体をコードするポリヌクレオチド、それに相補的なポリヌクレオチド、又は15塩基以上のそれらの断片、を使用して前記発現レベルの差を測定する。
【００１５】
本発明はまた、第２の態様において、ヒト肺癌患者の術後予後又は転移可能性をインビトロで予測する方法であって、術後の予後がより良い又は転移可能性がより低い第１の患者群からの肺癌組織及び術後の予後がより悪い又は転移可能性がより高い第２の患者群からの肺癌組織の網羅的タンパク質発現プロファイルを測定し取得すること、該網羅的タンパク質発現プロファイルについて該第１の患者群からの肺癌組織と該第２の患者群からの肺癌組織とを互いに区別可能なタンパク質発現プロファイルを抽出すること、該第１の患者群と第２の患者群との間の該抽出されたタンパク質発現プロファイルを構成するタンパク質の相対的な発現レベルの差を指標にして、ヒト肺癌患者の組織検体について術後の予後又は転移可能性を判定することを含み、ここで、該抽出された発現プロファイルを構成するタンパク質が、分子量([M+H]+)12449.8 ±0.02％、17206.1 ±0.02％、12318.8 ±0.02％、6084.9 ±0.02％、13163.5 ±0.02％、15720.8 ±0.02％、17099.8 ±0.02％、10839.6 ±0.02％、6075.0 ±0.02％、13155.6 ±0.02％、18331.5 ±0.02％、16944.2 ±0.02％、15731.2 ±0.02％、11175.9 ±0.02％、15659.8 ±0.02％、17262.0 ±0.02％、6041.6 ±0.02％、8577.2 ±0.02％、17749.1 ±0.02％、13635.5 ±0.02％、17220.3 ±0.02％、16958.0 ±0.02％、12761.2 ±0.02％、7965.3 ±0.02％、及び12878.3 ±0.02％を有するタンパク質からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質であることを特徴とする方法を提供する。
【００１６】
その実施形態において、前記肺癌が肺非小細胞癌である。
その別の実施形態において、本発明の前記方法が前記抽出された発現プロファイルを構成するタンパク質を同定することをさらに含むことができる。
【００１７】
その別の実施形態において、前記分子量([M+H]+)11175.9 ±0.02％、17220.3 ±0.02％及び17262.0 ±0.02％を有するタンパク質がそれぞれ、配列番号８、９又は10に示されるアミノ酸配列を含むものである。
【００１８】
その別の実施形態において、前記分子量([M+H]+)12449.8 ±0.02％、17206.1 ±0.02％、12318.8 ±0.02％、6084.9 ±0.02％、13163.5 ±0.02％、15720.8 ±0.02％、17099.8 ±0.02％、10839.6 ±0.02％、6075.0 ±0.02％、13155.6 ±0.02％、18331.5 ±0.02％、16944.2 ±0.02％、15731.2 ±0.02％、11175.9 ±0.02％、15659.8 ±0.02％、17262.0 ±0.02％、6041.6 ±0.02％、8577.2 ±0.02％、17749.1 ±0.02％、13635.5 ±0.02％、17220.3 ±0.02％、16958.0 ±0.02％、12761.2 ±0.02％、7965.3 ±0.02％、及び12878.3 ±0.02％を有するタンパク質からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質若しくはその変異体に対する抗体又はその断片、或いは該タンパク質若しくはその変異体をコードするポリヌクレオチド、それに相補的なポリヌクレオチド、又は15塩基以上のそれらの断片、を使用して前記発現レベルの差を測定する。
【００１９】
本発明はさらに、第３の態様において、ヒト肺組織由来の分子量([M+H]+)4568.9 ±0.02％、12020.4 ±0.02％、6596.4 ±0.02％、7363.4 ±0.02％、11112.1 ±0.02％、19911.9 ±0.02％、10619.6 ±0.02％、9876.6 ±0.02％、19982.0 ±0.02％、19993.1 ±0.02％、11154.4 ±0.02％、11472.2 ±0.02％、19865.2 ±0.02％、12217.4 ±0.02％、19877.8 ±0.02％、2973.7 ±0.02％、7324.9 ±0.02％、11197.8 ±0.02％、4536.2 ±0.02％、15975.8 ±0.02％、4938.1 ±0.02％、4965.8 ±0.02％、4963.5 ±0.02％、6275.9 ±0.02％、6649.6 ±0.02％、6224.3 ±0.02％、5650.9 ±0.02％、11345.0 ±0.02％、5144.8 ±0.02％、5170.8 ±0.02％、14001.5 ±0.02％、2909.4 ±0.02％、7001.4 ±0.02％、11305.3 ±0.02％、11984.0 ±0.02％、10089.2 ±0.02％、6646.4 ±0.02％、14046.2 ±0.02％、2559.7 ±0.02％、及び2303.4 ±0.02％を有するタンパク質からなる群から選択されるタンパク質若しくはそれらの変異体に対する抗体又はその断片を少なくとも１つ含む、ヒト肺癌を検出するための組成物を提供する。
その一の実施形態において、前記組成物がキット又はマイクロアレイの形態である。
【００２０】
本発明はさらに、第４の態様において、ヒト肺組織由来の分子量([M+H]+)4568.9 ±0.02％、12020.4 ±0.02％、6596.4 ±0.02％、7363.4 ±0.02％、11112.1 ±0.02％、19911.9 ±0.02％、10619.6 ±0.02％、9876.6 ±0.02％、19982.0 ±0.02％、19993.1 ±0.02％、11154.4 ±0.02％、11472.2 ±0.02％、19865.2 ±0.02％、12217.4 ±0.02％、19877.8 ±0.02％、2973.7 ±0.02％、7324.9 ±0.02％、11197.8 ±0.02％、4536.2 ±0.02％、15975.8 ±0.02％、4938.1 ±0.02％、4965.8 ±0.02％、4963.5 ±0.02％、6275.9 ±0.02％、6649.6 ±0.02％、6224.3 ±0.02％、5650.9 ±0.02％、11345.0 ±0.02％、5144.8 ±0.02％、5170.8 ±0.02％、14001.5 ±0.02％、2909.4 ±0.02％、7001.4 ±0.02％、11305.3 ±0.02％、11984.0 ±0.02％、10089.2 ±0.02％、6646.4 ±0.02％、14046.2 ±0.02％、2559.7 ±0.02％、及び2303.4 ±0.02％を有するタンパク質からなる群から選択されるタンパク質若しくはそれらの変異体をコードするポリヌクレオチド又はそれに相補的なポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び15以上の連続した塩基を含むそれらの断片、からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、ヒト肺癌を検出するための組成物を提供する。
その一の実施形態において、前記組成物がキット又はマイクロアレイの形態である。
【００２１】
本発明はさらに、第５の態様において、ヒト肺癌組織由来の分子量([M+H]+)12449.8 ±0.02％、17206.1 ±0.02％、12318.8 ±0.02％、6084.9 ±0.02％、13163.5 ±0.02％、15720.8 ±0.02％、17099.8 ±0.02％、10839.6 ±0.02％、6075.0 ±0.02％、13155.6 ±0.02％、18331.5 ±0.02％、16944.2 ±0.02％、15731.2 ±0.02％、11175.9 ±0.02％、15659.8 ±0.02％、17262.0 ±0.02％、6041.6 ±0.02％、8577.2 ±0.02％、17749.1 ±0.02％、13635.5 ±0.02％、17220.3 ±0.02％、16958.0 ±0.02％、12761.2 ±0.02％、7965.3 ±0.02％、及び12878.3 ±0.02％を有するタンパク質からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質若しくはそれらの変異体に対する抗体又はその断片を少なくとも１つ含む、ヒト肺癌患者の術後の予後又は転移可能性をインビトロで予測するための組成物を提供する。
その一の実施形態において、前記組成物がキット又はマイクロアレイの形態である。
【００２２】
本発明はさらに、第６の態様において、ヒト肺癌組織由来の分子量([M+H]+)12449.8 ±0.02％、17206.1 ±0.02％、12318.8 ±0.02％、6084.9 ±0.02％、13163.5 ±0.02％、15720.8 ±0.02％、17099.8 ±0.02％、10839.6 ±0.02％、6075.0 ±0.02％、13155.6 ±0.02％、18331.5 ±0.02％、16944.2 ±0.02％、15731.2 ±0.02％、11175.9 ±0.02％、15659.8 ±0.02％、17262.0 ±0.02％、6041.6 ±0.02％、8577.2 ±0.02％、17749.1 ±0.02％、13635.5 ±0.02％、17220.3 ±0.02％、16958.0 ±0.02％、12761.2 ±0.02％、7965.3 ±0.02％、及び12878.3 ±0.02％を有するタンパク質からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質若しくはそれらの変異体をコードするポリヌクレオチド又はそれに相補的なポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び15以上の連続した塩基を含むそれらの断片、からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、ヒト肺癌患者の術後の予後又は転移可能性をインビトロで予測するための組成物を提供する。
その一の実施形態において、前記組成物がキット又はマイクロアレイの形態である。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によって、患者が肺癌であるか否かを、また肺癌外科切除後の再発・死亡の可能性を、個別的に高精度に予測することが可能となり、手術によって治癒する症例群の同定、或いは再発・死亡の原因となる術前の画像診断で検出不可能な微量残存癌細胞が存在すると考えられる症例群の同定に繋がる。また、再発・死亡が予測される症例に手術後の抗癌剤や分子標的薬治療による後治療を施し生存率の改善を得ることや、治癒予測群に対する無用の抗癌剤治療を避けることが可能となる、という肺癌治療に対して格別の作用効果を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
定義
本明細書中で使用する用語は、以下の意味を含む。
本明細書で使用する「術後予後」又は「術後の予後」という用語は、肺癌手術後の患者の予後を、代表的には術後５年時点での生存で判定することを意味する。予後は、癌の転移と深く関係しており、「予後が悪い」又は「予後が不良」とは、癌の浸潤性、転移性又は進行度が高いことを意味し、一方、「予後が良い」とは、そのような浸潤性、転移性又は進行度が低いことを意味する。
【００２５】
本明細書で使用する「転移（metastasis）」は、癌細胞が、その運動能と浸潤能によって、原発巣から遠隔部位の組織に移動し、そこで増殖し新生物を形成する一連の過程をいう。転移は、癌の再発を引き起すため、癌治療の大きな障害となっている。血管又はリンパ管内に浸潤した癌細胞は、種々の組織に居留して多発的に癌疾患を起こすことも知られている。本発明では、本発明の肺癌関連マーカーが関わる限りいずれの転移も対象となるが、例えばリンパ節転移も対象としうる。
本明細書で使用する「検体」は、ヒトから採取された肺組織又は細胞を指す。
【００２６】
本発明においては、肺癌組織又は細胞において、術後の予後がより良い又は転移可能性がより低い患者群由来のものと、術後の予後がより悪い又は転移可能性がより高い患者群由来のものとの間で、本発明に関わるタンパク質又は核酸マーカーの発現レベルに相対的な差異が認められる。あるいは、肺癌組織と非癌組織との間で、本発明に関わるタンパク質又は核酸マーカーの発現レベルに相対的な差異が認められる。
【００２７】
本明細書で使用するマーカーとしての「タンパク質」は、インタクトのタンパク質、翻訳後修飾されたタンパク質、プロテオリシスされたタンパク質などを包含する。それゆえ、タンパク質の中には、そのアミノ酸配列と測定された分子量が一致しないものも含まれるが、これは、翻訳後修飾、プロテオリシスなどに起因すると考えられる。
【００２８】
本明細書で使用する「変異体」は、例えば突然変異、多型性、選択的スプライシングなどの生物学的事象に起因して生じる変異体を包含する。変異体には、本発明に関わるタンパク質マーカーの変異体、あるいは該タンパク質マーカーをコードする遺伝子の変異体が含まれる。そのような変異体は、該タンパク質マーカー又は核酸マーカーの配列において１若しくは複数、好ましくは１若しくは数個、の置換、欠失、付加、挿入などの変異を有する変異体、該配列又はその部分配列と80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、99％以上の同一性を有する配列からなる変異体などを含む。ここで、「数個」とは、通常、２〜約１０個の整数を意味する。また、同一性（％）は、ギャップを導入した又はギャップを導入しない公知のBLASTやFASTAプラグラムを用いて決定することができる(S. F. Altschulら, J. Mol. Bio. 215:403-410, 1990)。一般に、全塩基数に対する一致した塩基数の百分率として同一性（％）を算出できる。
【００２９】
本明細書で使用する「ストリンジェントな条件」は、以下のものに限定されないが、少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、さらにより好ましくは少なくとも98％、の同一性を有するヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズするようなハイブリダイゼーション及び洗浄条件を意味し、例えばマイクロアレイ解析におけるハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、１M塩化ナトリウム／0.5%(W/V)サルコシル／30％ホルムアミド中、60℃、17時間のハイブリダイゼーション、その後、6×SSC/0.005%(W/V)トライトンX-102溶液中、室温、１０分間で一回、さらに、0.1×SSC/0.005%(W/V)トライトンX-102溶液中で０〜４℃に保ちながら５分間で一回の洗浄の条件である。ここで、1×SSCは150mM塩化ナトリウムと15mMクエン酸ナトリウム水溶液（pH7.2）である。ハイブリダイゼーションについては、F.M. Ausbelら, Short Protocols in Molecular Biology(3版)A Compendium of Method s from Current Protocols in Molecular Biology, 1995年, John Wiley & Sons, Inc.（米国）に記載されている。
【００３０】
詳細な説明
以下において、本発明をさらに詳細に説明する。
１．肺癌関連マーカー
本発明のヒト肺癌関連マーカーには、(i)非癌組織に比べて肺癌組織において該マーカーの発現レベルに有意な差が認められるものであって、これによって肺癌を検出することを可能にするマーカー、並びに、(ii)術後の予後がより良い又は転移可能性がより低い患者群からの肺癌組織と、術後の予後がより悪い又は転移可能性がより高い患者群からの肺癌組織との間で、該マーカーの発現レベルに有意な差が認められるものであって、これによって肺癌患者の術後の予後又は転移可能性の予測を可能にするマーカー、が含まれる。
【００３１】
本明細書で使用される「非癌組織」とは、正常肺組織を指し、そのような組織には、癌患者の癌に侵されていない肺組織部分も含まれる。
【００３２】
また、本明細書で使用される「肺癌組織」とは、癌に侵された肺組織を指し、またそのような癌には非小細胞癌（腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌、腺扁平上皮癌など）を含み、好ましい癌は非小細胞癌である。
【００３３】
上記のマーカーは、上記組織の網羅的タンパク質発現プロファイルを取得し、上記組織間で発現パターンを比較し、互いに区別可能な（すなわち、発現レベルに差のある）タンパク質発現プロファイルを抽出し、必要に応じてそれらを構成するタンパク質（若しくはポリペプチド）を同定し、さらにこれらの手順による多数の生物学的検体における肺癌の検出又は術後予後の良、不良の確定作業に基づいたマーカーとしての信頼性と判定の再現性を確認することによって見出された。
【００３４】
網羅的タンパク質発現プロファイルを取得するには、タンパク質の同定に使用されるものであればいずれの質量分析器も使用できる。そのような質量分析器の例は、表面増強レーザー脱離イオン化MS装置、マトリックス支援レーザー脱離イオン化MS装置（例えばMALDI MS）などを含む。本発明において特に好ましい質量分析器は、MALDI-TOF型MSである。この装置による具体的な分析条件は以下のとおりである。
【００３５】
正常又は腫瘍のヒト肺組織試料から、厚さ12μｍの凍結切片を作成し、試料台にのせ、コールドルームにて45分間吸引乾燥を行う。適切な解析部位を同一試料由来の染色標本から判断し、50％アセトニトリル/0.1%トリフルオロ酢酸溶液に溶解した20mg/ml濃度のシナピン酸100nlを滴下する。シナピン酸滴下部位から、マススペクトロメトリー（例えばアプライドバイオシステムズ社製、ボイジャーSTR）を用いて、タンパク質発現プロファイルを取得する。この際の機器の解析条件は、例えば加速電圧；25,000V、グリッド電圧；93%、遅延時間；200 ns、解析範囲；2,000〜20,000ダルトン(Da)である。得られたデータは、ABI社製解析ソフトウェアDataExplorerTMを使用して、内部標準分子であるヘモグロビンにより校正される。このようにして、約200を超える検体のヒト肺組織試料から得られたデータは、ABI社製解析ソフトウェアMarkerViewTMを使用して結合され、統計解析に用いられる。
【００３６】
統計解析手法としては、正常肺・腫瘍間の比較検討には、significance analysis of microarray（SAM）法がもちいられ、そのカットオフ値は、疑陽性率<0.1%である。肺癌患者予後に関する検討においては、フィッシャーの正確確率法、クラスカリスウォリス法、SAM法が用いられ、それぞれのカットオフ値は、P<0.001, P<0.001, 疑陽性率<1%である。これらの解析において有意差を認めたデータを、臨床情報予測最適モデルの構築に応用する。該予測モデルの構築には、例えばweighted voting法、signal-to-noise ratio法、10-fold cross-validation解析を用いることができる。
【００３７】
上記の統計解析の結果選出されたタンパク質発現プロファイルは、正常肺・腫瘍の判別或いは予後不良患者の判別に有用であると考えられる(図４〜図７)。選出されたタンパク質発現プロファイルは、発現レベルに差異のあるタンパク質群であり、正常肺と肺腫瘍間の場合、正常肺でより高発現されるタンパク質と、逆に肺腫瘍でより高発現されるタンパク質とを含み、また、肺癌の予後が良い症例と予後が悪い症例間の場合、予後が良い症例でより高発現されるタンパク質と、逆に予後が悪い症例でより高発現されるタンパク質とを含む。このようなタンパク群は、上記の手法にて解析するとき再現性良く選出可能であることから、分子量によって規定されるタンパク質発現プロファイル情報のみに基づいて正確な判定が可能である。
【００３８】
上記のような判別に有用なタンパク質分子に関しては、その分子量情報をもとに、さらにアミノ酸配列を決定し、タンパクを同定すべく、例示としての以下の更なる解析を行うことができる。
【００３９】
すなわち、正常又は腫瘍の肺組織検体を500μlの抽出溶液(0.25 M sucrose, 0.01 M Tris-HCl及び0.1 mM PMSF)に溶解し、超音波破砕を行い、その後4℃、55,000gの条件で１時間遠心分離を行う。上清を、HPLCを用いて分画化するが、その際には、例えばアマシャム社製などのC18カラムを使用し、溶媒Aは0.1% TFA水溶液、溶媒Bは0.1% TFAアセトニトリル溶液を使用する。流速は1 ml/分で、グラディエントは0-5%のB溶媒勾配を5分間、その後5-60%のB溶媒勾配を75分間、さらに、60-95%のB溶媒勾配を20分間の条件で行う。また、分画は、1分毎に80分まで行う。得られた画分は、全て凍結乾燥され、トリプシンによる酵素消化の後、タンデムマス型質量分析器（サーモエレクトロン社製LCQ或いはABI社製QSTAR）により、画分中のペプチドのアミノ酸配列を網羅的に検討する。この検討により得られたデータは、例えばマトリックスサイエンス社製解析ソフトウェアMascotを使用して、データベースサーチを行い、アミノ酸配列、分子量情報を総合しマーカータンパクの同定を行うことができる。
【００４０】
上記の手法により、本発明者らは、ヒト肺癌組織と非癌組織の網羅的タンパク質発現プロファイルを取得する際に、両組織を識別可能にするタンパク質発現プロファイルを見出した。このようなタンパク発現プロファイルは、本発明のマーカーとしてのタンパク質で構成される。すなわち、肺癌と非癌を識別可能にする40個のタンパクで構成される発現プロファイルが見出され（図６、図７）、これらのタンパク質の分子量([M+H]+)は、以下のとおりである。
4568.9 ±0.02％、12020.4 ±0.02％、6596.4 ±0.02％、7363.4 ±0.02％、11112.1 ±0.02％、19911.9 ±0.02％、10619.6 ±0.02％、9876.6 ±0.02％、19982.0 ±0.02％、19993.1 ±0.02％、11154.4 ±0.02％、11472.2 ±0.02％、19865.2 ±0.02％、12217.4 ±0.02％、19877.8 ±0.02％、2973.7 ±0.02％、7324.9 ±0.02％、11197.8 ±0.02％、4536.2 ±0.02％、15975.8 ±0.02％、4938.1 ±0.02％、4965.8 ±0.02％、4963.5 ±0.02％、6275.9 ±0.02％、6649.6 ±0.02％、6224.3 ±0.02％、5650.9 ±0.02％、11345.0 ±0.02％、5144.8 ±0.02％、5170.8 ±0.02％、14001.5 ±0.02％、2909.4 ±0.02％、7001.4 ±0.02％、11305.3 ±0.02％、11984.0 ±0.02％、10089.2 ±0.02％、6646.4 ±0.02％、14046.2 ±0.02％、2559.7 ±0.02％、及び2303.4 ±0.02％。
【００４１】
ここで、「±0.02％」は、装置や測定条件等の違いによる誤差範囲を意味し、10,000Daあたり±2Daに相当する。
上記タンパク質のマススペクトル図の例は、図8〜図25に示されている。
【００４２】
また、分子量([M+H]+)4938.1 ±0.02％、4963.5 ±0.02％、6275.9 ±0.02％、6649.6 ±0.02％、10089.2 ±0.02％、14001.5 ±0.02％及び14046.2 ±0.02％を有するタンパク質はそれぞれ、配列番号１、２、３、４、５、６又は７に示されるアミノ酸配列を含む。
【００４３】
さらにまた、本発明者らは、上記と同様の手法により、術後の予後がより良い又は転移可能性がより低い第１の患者群からの肺癌組織及び術後の予後がより悪い又は転移可能性がより高い第２の患者群からの肺癌組織の網羅的タンパク質発現プロファイルを取得する際に、両組織を識別可能にするタンパク質発現プロファイルを見出した。上記の第１の患者群と第２の患者群とを識別可能にする、すなわち術後予後の良、不良を判定可能にする発現プロファイルを構成する25個のタンパク質の分子量([M+H]+)は、以下のとおりである。
12449.8 ±0.02％、17206.1 ±0.02％、12318.8 ±0.02％、6084.9 ±0.02％、13163.5 ±0.02％、15720.8 ±0.02％、17099.8 ±0.02％、10839.6 ±0.02％、6075.0 ±0.02％、13155.6 ±0.02％、18331.5 ±0.02％、16944.2 ±0.02％、15731.2 ±0.02％、11175.9 ±0.02％、15659.8 ±0.02％、17262.0 ±0.02％、6041.6 ±0.02％、8577.2 ±0.02％、17749.1 ±0.02％、13635.5 ±0.02％、17220.3 ±0.02％、16958.0 ±0.02％、12761.2 ±0.02％、7965.3 ±0.02％、及び12878.3 ±0.02％。
【００４４】
ここで、「±0.02％」は、上記と同じ意味を有する。
これらのタンパク質のマススペクトル図は、図26〜図37に示されている。
また、分子量([M+H]+)11175.9 ±0.02％、17220.3 ±0.02％及び17262.0 ±0.02％を有するタンパク質はそれぞれ、配列番号８、９又は10に示されるアミノ酸配列を含む。
【００４５】
本発明においては、癌関連マーカーとして、上記タンパク質に加えて、該タンパク質又はその変異体をコードするポリヌクレオチド又はそれに相補的なポリヌクレオチドも包含される。変異体は、上記定義のとおり、生体内で例えば突然変異、多型性、選択的スプライシングなどの生物学的事象の結果として生じた変異体を含む。本発明の核酸マーカーは、転写産物又は翻訳産物として核酸レベル又はタンパク質レベルで検出されうる。
【００４６】
転写産物の場合、それはmRNA、cRNA又はcDNAとして検出される。細胞又は組織からグアニジウム法などの慣用の方法で全RNAを抽出し、オリゴｄＴセルロースカラム法によってポリA(+)RNA又はmRNAを調製し、必要により、さらにmRNAからcDNA、cRNAを合成する（西郷薫ら訳、分子生物学実験プロトコルＩ、1997年、丸善）。
【００４７】
翻訳産物の場合、それは上記ポリヌクレオチド（若しくは、遺伝子）又はその変異体によってコードされるタンパク質又はその断片として検出される。
【００４８】
２．肺癌関連マーカー検出用組成物
Ａ．肺癌を検出するための組成物
本発明は、上記のとおり、ヒト肺癌組織及び非癌組織の網羅的タンパク質発現プロファイルを取得する事、該網羅的タンパク質発現プロファイルについて該肺癌組織を該非癌組織から区別可能なタンパク質発現プロファイルを抽出すること、該肺癌組織と非癌組織との間の該選択された発現プロファイルを構成するタンパク質の相対的な発現レベルの差を指標にしてヒト肺組織検体について肺癌を検出することを含み、ここで、該抽出された発現プロファイルを構成するタンパク質が、分子量([M+H]+) 4568.9 ±0.02％、12020.4 ±0.02％、6596.4 ±0.02％、7363.4 ±0.02％、11112.1 ±0.02％、19911.9 ±0.02％、10619.6 ±0.02％、9876.6 ±0.02％、19982.0 ±0.02％、19993.1 ±0.02％、11154.4 ±0.02％、11472.2 ±0.02％、19865.2 ±0.02％、12217.4 ±0.02％、19877.8 ±0.02％、2973.7 ±0.02％、7324.9 ±0.02％、11197.8 ±0.02％、4536.2 ±0.02％、15975.8 ±0.02％、4938.1 ±0.02％、4965.8 ±0.02％、4963.5 ±0.02％、6275.9 ±0.02％、6649.6 ±0.02％、6224.3 ±0.02％、5650.9 ±0.02％、11345.0 ±0.02％、5144.8 ±0.02％、5170.8 ±0.02％、14001.5 ±0.02％、2909.4 ±0.02％、7001.4 ±0.02％、11305.3 ±0.02％、11984.0 ±0.02％、10089.2 ±0.02％、6646.4 ±0.02％、14046.2 ±0.02％、2559.7 ±0.02％、及び2303.4 ±0.02％を有するタンパク質からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質であることを特徴とする、ヒト肺癌の検出方法を提供する。
【００４９】
本発明によれば、該患者由来の肺癌組織又は非癌組織検体中の上記タンパク質マーカー又はその変異体の少なくとも１つの発現レベル、あるいは、該タンパク質又はその変異体をコードするポリヌクレオチドのレベルを、該マーカーに対応するプローブを用いて測定し、肺癌組織と非癌組織との間の、上記タンパク質又はポリヌクレオチドの有意なレベル差を指標にして、肺癌を検出することができる。
【００５０】
本発明で使用されるプローブは、上記マーカーを検出可能なものであれば特に制限されないが、通常は、ポリヌクレオチド又は抗体である。したがって、このようなポリヌクレオチド又は抗体を含む組成物は、患者の肺癌をインビトロで検出するために使用されうる。
【００５１】
したがって、本発明は、ヒト肺組織由来の上記タンパク質若しくはそれらの変異体に対する抗体又はその断片を少なくとも１つ含む、ヒト肺癌を検出するための組成物を提供する。
【００５２】
本発明はまた、ヒト肺組織由来の上記タンパク質若しくはそれらの変異体をコードするポリヌクレオチド又はそれに相補的なポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び15以上、好ましくは30以上、より好ましくは50〜100又はそれ以上の連続した塩基を含むそれらの断片、からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、ヒト肺癌を検出するための組成物を提供する。
【００５３】
上記組成物は、例えば上記タンパク質の１又は２以上の混合形態であってもよいし、上記タンパク質の１の単体又は２以上の混合物を異なる容器に入れたキットであってもよいし、或いは、上記タンパク質の１又は２以上〜全部を含むマイクロアレイ又は固相（例えばポリマー性96穴プレート、フィルターなど）の形態であってもよい。
【００５４】
Ｂ．予後又は転移可能性を予測するための組成物
本発明はまた、上記のとおり、癌患者の術後の予後又は転移可能性をインビトロで予測する方法を提供し、この方法は、ヒト肺癌患者の術後の予後又は転移可能性をインビトロで予測する方法であって、術後の予後がより良い又は転移可能性がより低い第１の患者群からの肺癌組織及び術後の予後がより悪い又は転移可能性がより高い第２の患者群からの肺癌組織の網羅的タンパク質発現プロファイルを取得すること、該網羅的タンパク質発現プロファイルについて該第１の患者群からの肺癌組織と該第２の患者群からの肺癌組織とを互いに区別可能なタンパク質発現プロファイルを抽出すること、該第１の患者群と第２の患者群との間の該抽出された発現プロファイルを構成するタンパク質の相対的な発現レベルの差を指標にして、ヒト肺癌患者の組織検体について術後の予後又は転移可能性を判定することを含み、ここで、該抽出された発現プロファイルを構成するタンパク質が、分子量([M+H]+)12449.8 ±0.02％、17206.1 ±0.02％、12318.8 ±0.02％、6084.9 ±0.02％、13163.5 ±0.02％、15720.8 ±0.02％、17099.8 ±0.02％、10839.6 ±0.02％、6075.0 ±0.02％、13155.6 ±0.02％、18331.5 ±0.02％、16944.2 ±0.02％、15731.2 ±0.02％、11175.9 ±0.02％、15659.8 ±0.02％、17262.0 ±0.02％、6041.6 ±0.02％、8577.2 ±0.02％、17749.1 ±0.02％、13635.5 ±0.02％、17220.3 ±0.02％、16958.0 ±0.02％、12761.2 ±0.02％、7965.3 ±0.02％、及び12878.3 ±0.02％を有するタンパク質からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質であることを特徴とする。
【００５５】
本発明によれば、患者由来の肺癌組織検体中の上記タンパク質マーカー又はその変異体の少なくとも１つの発現レベル、あるいは、該タンパク質又はその変異体をコードするポリヌクレオチドのレベルを、該マーカーに対応するプローブを用いて測定し、術後の予後がより良い又は転移可能性がより低い第１の患者群からの肺癌組織と、術後の予後がより悪い又は転移可能性がより高い第２の患者群からの肺癌組織との間の、上記タンパク質又はポリヌクレオチドの有意なレベル差を指標にして、術後の予後又は転移可能性を予測することができる。
【００５６】
本発明で使用されるプローブは、上記マーカーを検出可能なものであれば特に制限されないが、通常は、ポリヌクレオチド又は抗体である。したがって、このようなポリヌクレオチド又は抗体を含む組成物は、癌患者の術後の予後又は転移可能性をインビトロで予測するために使用されうる。
【００５７】
すなわち、本発明は、ヒト肺組織由来の上記タンパク質若しくはそれらの変異体に対する抗体又はその断片を少なくとも１つ含む、ヒト肺癌患者の術後の予後又は転移可能性をインビトロで予測するための組成物を提供する。
【００５８】
本発明はまた、ヒト肺組織由来の上記タンパク質若しくはそれらの変異体をコードするポリヌクレオチド又はそれに相補的なポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び15以上の連続した塩基を含むそれらの断片、からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、ヒト肺癌患者の術後の予後又は転移可能性をインビトロで予測するための組成物を提供する。
【００５９】
上記組成物は、例えば上記タンパク質の１又は２以上の混合形態であってもよいし、上記タンパク質の１の単体又は２以上の混合物を異なる容器に入れたキットであってもよいし、或いは、上記タンパク質の１又は２以上〜全部を含むマイクロアレイ又は固相（例えば96穴プレートなど）の形態であってもよい。
【００６０】
２．１  抗体プローブ
本発明においては、肺癌関連マーカーを検出するためのプローブとして抗体を使用することができる。
【００６１】
本発明で使用されうる抗体は、以下のグループに分けられる。
（１）分子量([M+H]+) 4568.9 ±0.02％、12020.4 ±0.02％、6596.4 ±0.02％、7363.4 ±0.02％、11112.1 ±0.02％、19911.9 ±0.02％、10619.6 ±0.02％、9876.6 ±0.02％、19982.0 ±0.02％、19993.1 ±0.02％、11154.4 ±0.02％、11472.2 ±0.02％、19865.2 ±0.02％、12217.4 ±0.02％、19877.8 ±0.02％、2973.7 ±0.02％、7324.9 ±0.02％、11197.8 ±0.02％、4536.2 ±0.02％、15975.8 ±0.02％、4938.1 ±0.02％、4965.8 ±0.02％、4963.5 ±0.02％、6275.9 ±0.02％、6649.6 ±0.02％、6224.3 ±0.02％、5650.9 ±0.02％、11345.0 ±0.02％、5144.8 ±0.02％、5170.8 ±0.02％、14001.5 ±0.02％、2909.4 ±0.02％、7001.4 ±0.02％、11305.3 ±0.02％、11984.0 ±0.02％、10089.2 ±0.02％、6646.4 ±0.02％、14046.2 ±0.02％、2559.7 ±0.02％、及び2303.4 ±0.02％を有するタンパク質及びそれらの変異体からなる群から選択されるタンパク質に対する抗体又はその断片。これらの抗体又はその断片は、肺癌と非癌を識別するタンパク質マーカーの発現レベルの差を測定するために使用される。
【００６２】
（２）分子量([M+H]+)12449.8 ±0.02％、17206.1 ±0.02％、12318.8 ±0.02％、6084.9 ±0.02％、13163.5 ±0.02％、15720.8 ±0.02％、17099.8 ±0.02％、10839.6 ±0.02％、6075.0 ±0.02％、13155.6 ±0.02％、18331.5 ±0.02％、16944.2 ±0.02％、15731.2 ±0.02％、11175.9 ±0.02％、15659.8 ±0.02％、17262.0 ±0.02％、6041.6 ±0.02％、8577.2 ±0.02％、17749.1 ±0.02％、13635.5 ±0.02％、17220.3 ±0.02％、16958.0 ±0.02％、12761.2 ±0.02％、7965.3 ±0.02％、及び12878.3 ±0.02％を有するタンパク質及びそれらの変異体からなる群から選択されるタンパク質又はその断片に対する抗体又はその断片。これらの抗体又はその断片は、肺癌患者の予後の良、不良又は転移の高可能性、低可能性を識別するタンパク質マーカーの発現レベルの差を測定するために使用される。
【００６３】
上記の各グループにおいて、組成物は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個、さらに好ましくは３個〜全数、例えば４個〜全数、５個〜全数のプローブを含むことができる。
【００６４】
上記変異体は、上記タンパク質の完全又は部分配列と、アミノ酸レベルで通常80%以上、85%以上、好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、97%以上、98%以上、99%以上の同一性を有するものである。
【００６５】
本発明で使用される抗体は、誘導体化されていてもよく、例えば、グリコシル化、リン酸化、硫酸化、アルキル化、アシル化、或いは酵素若しくは蛍光団などの化学修飾基によって化学修飾されていてもよい。
【００６６】
抗体はまた、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗ペプチド抗体などを含む。また、抗体の断片には、Fab、(Fab’)2、Fc、Fc'、Fd、Fv、scFVなどが含まれる。これらの抗体断片は、例えばパパイン、ペプシンなどのプロテアーゼによる抗体の限定分解、遺伝子組換え技術によって得ることができる。
【００６７】
各タンパク質又はその断片を、タンパク質合成又は遺伝子組換え技術を用いて合成し、その結果得られたタンパク質又はその断片を抗原としてウサギ、マウス、ラット、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジなどの動物を免疫し、それらの抗原に対する抗体を産生し、必要に応じて精製する。
【００６８】
ポリクローナル抗体は、前記動物を10〜300μｇ程度の抗原で皮下に免疫し、さらに約２週間後に追加免疫し、初回免疫から約３週間〜１か月後に採血し、抗血清から目的のポリクローナル抗体を含むＩｇＧ成分を硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーなどを使用して分離することを含む方法によって作製することができる。特異性を高めるために、得られたIgGを、目的タンパク質をセルロース又はアガロースなどの担体に結合して作製されたカラムに結合させたのち、高塩濃度のバッファーで溶出し、透析や限外ろ過などの方法で脱塩して、特異的ポリクローナル抗体を得ることもできる。抗体価は、通常の免疫測定法、例えば酵素免疫測定法（EIA、ELISA）、放射性免疫測定法（RIA）、蛍光抗体法などによって測定することができる。
モノクローナル抗体は、例えば以下の一般的方法によって作製することができる。
【００６９】
標的タンパク質又はその断片を、ポリクローナル抗体の作製と同様にマウス又はラット（例えばBalb/cマウス）の皮下に注射し、１〜４週間間隔で、約２〜４回追加免疫を行う。抗体価が頭打ちになったとき、抗原を静脈内又は腹腔内に注射し、最終免疫とする。２〜５日後、抗体産生細胞（例えば脾臓細胞又はリンパ節細胞）を採取する。次いで、抗体産生細胞を骨髄腫細胞株（好ましくはヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（HGPRT）欠損細胞株）に融合させてハイブリドーマ細胞を生成し、HAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミン）選択を行う。細胞融合は、血清を含まないDMEM、RPMI-1640培地などの動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞と骨髄腫細胞株とを約1:1〜20:1の割合で混合し、ポリエチレングリコールなどの細胞融合促進剤の存在下で実施する。目的の抗体かどうかの確認は、上記の免疫測定法によって行うことができる。さらに、ハイブリドーマの増殖のために、マウスの腹腔内にハイブリドーマを投与し、ハイブリドーマを増殖させたのち、１〜２週間後に腹水を採取する。抗体の精製は、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて行うことができる。
【００７０】
抗ペプチド抗体は、タンパク質の表面上のリニアーなペプチドに対する抗体であり、免疫学的特異性を高めることができる。そのようなペプチドは、例えばKyte-Doolittleらの親水性−疎水性領域の推定法、Eminiらによるタンパク質分子上の特定ペプチド部位の表面に位置する確率、タンパク質鎖の折れ曲がり程度、例えばChou-Fasmanらなどのαヘリックス、βシート、ターンを表示するタンパク質の二次構造予測、等を単独で又は組み合わせて使用して推定しうる。次いで、推定されたペプチドは、ペプチド合成機を用いて合成することができる。
【００７１】
標的タンパク質の合成については、例えば、上記のようにHPLC等でタンパク質を単離し、トリプシンなどの酵素で消化し、ペプチド断片を単離し、部分アミノ酸配列を決定したのち、決定されたアミノ酸配列に基づいて作成されたプローブを用いてcDNAクローニングを行うか、或いはデータベースから同定されたタンパク質又はそれをコードするDNAの配列に基づいて作成されたプライマーを用いて肺組織ライブラリーから目的のDNAを増幅し、cDNAクローン又は増幅DNAを発現ベクターに組み込み、該ベクターによって形質転換又はトランスフェクションされた原核又は真核宿主細胞を培養することによって該細胞又は培養上清から標的タンパク質を得ることができる。発現ベクターは市販のものを使用することができる。宿主細胞は、細菌などの原核細胞（例えば大腸菌、枯草菌、シュウドモナス属細菌など）、酵母（例えばサッカロマイセス属、ピチア属など）、昆虫細胞（例えばSf細胞）、哺乳動物細胞（例えばCHO、COS、BHK、HEK293など）などを含む。また、ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスなどからなり、標的タンパク質をコードするDNA、プロモーター、必要ならエンハンサー、ポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位、複製開始点、ターミネーター、選択マーカーなどを含むことができる。タンパク質の精製を容易にするために、標識ペプチド、例えば６〜10残基のヒスチジンタグ、FLAG、GFPタンパク質などをコードするDNA配列を含有させることもできる。遺伝子組換え技術については、Sambrook Jら, Molecular Cloning A Laboratory Manual,1989年, Cold Spring Harbor Laboratory Press(米国);Ausbelら（上記）に記載されており、それらに記載の技術を本発明のために使用することができる。
【００７２】
上記のようにして得られた標的タンパク質は、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、等電点電気泳動、電気泳動、限外ろ過、塩析、透析などを適宜組み合わせて精製することができる。
【００７３】
標的タンパク質又はその断片の配列は、GenBank又はUniGene受託番号に基づいてNCBI HomePageにアクセスすることによって入手可能である。
【００７４】
本発明の実施形態により、前記組成物は、キット、又はマイクロアレイ、又は96穴プレートなどの固相の形態であってもよく、すなわち、前記プローブは、キット又はマイクロアレイ又は固相に含まれる。マイクロアレイや固相の場合、プローブは、共有結合又は非共有結合によってアレイや固相の表面に結合されうる。
【００７５】
キットの場合、２つのグループの各タンパク質マーカーの１又は２以上から全数のマーカーを検出することが可能な抗体を、個別に又は２以上を組み合わせて適当な容器に包装することができる。
【００７６】
抗体は、上記の方法で作製されるようなポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗ペプチド抗体などであるが、それらに限定されないものとする。抗体の種類は、いずれのタイプ、クラス、サブクラスでもよく、例えばIgG、IgM、IgE、IgD、IgA、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2などを含む。また、抗体の断片は、Fab、(Fab’)2、Fc、Fd、Fv、scFvなどを含む。
【００７７】
２．２  ポリヌクレオチドプローブ
本発明に関わるポリヌクレオチドプローブは、以下のグループに分けられる。
（１）分子量([M+H]+)4568.9 ±0.02％、12020.4 ±0.02％、6596.4 ±0.02％、7363.4 ±0.02％、11112.1 ±0.02％、19911.9 ±0.02％、10619.6 ±0.02％、9876.6 ±0.02％、19982.0 ±0.02％、19993.1 ±0.02％、11154.4 ±0.02％、11472.2 ±0.02％、19865.2 ±0.02％、12217.4 ±0.02％、19877.8 ±0.02％、2973.7 ±0.02％、7324.9 ±0.02％、11197.8 ±0.02％、4536.2 ±0.02％、15975.8 ±0.02％、4938.1 ±0.02％、4965.8 ±0.02％、4963.5 ±0.02％、6275.9 ±0.02％、6649.6 ±0.02％、6224.3 ±0.02％、5650.9 ±0.02％、11345.0 ±0.02％、5144.8 ±0.02％、5170.8 ±0.02％、14001.5 ±0.02％、2909.4 ±0.02％、7001.4 ±0.02％、11305.3 ±0.02％、11984.0 ±0.02％、10089.2 ±0.02％、6646.4 ±0.02％、14046.2 ±0.02％、2559.7 ±0.02％、及び2303.4 ±0.02％を有するタンパク質及びそれらの変異体からなる群から選択されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、それに相補的なポリヌクレオチド、それらにストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又は少なくとも15塩基からなるそれらの断片。これらのポリヌクレオチド、相補的ポリヌクレオチド又は断片は、肺癌と非癌を識別するタンパク質マーカーの発現に対応する転写レベルの差を測定するために使用される。
【００７８】
（２）分子量([M+H]+)12449.8 ±0.02％、17206.1 ±0.02％、12318.8 ±0.02％、6084.9 ±0.02％、13163.5 ±0.02％、15720.8 ±0.02％、17099.8 ±0.02％、10839.6 ±0.02％、6075.0 ±0.02％、13155.6 ±0.02％、18331.5 ±0.02％、16944.2 ±0.02％、15731.2 ±0.02％、11175.9 ±0.02％、15659.8 ±0.02％、17262.0 ±0.02％、6041.6 ±0.02％、8577.2 ±0.02％、17749.1 ±0.02％、13635.5 ±0.02％、17220.3 ±0.02％、16958.0 ±0.02％、12761.2 ±0.02％、7965.3 ±0.02％、及び12878.3 ±0.02％を有するタンパク質及びそれらの変異体からなる群から選択されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、それに相補的なポリヌクレオチド、それらにストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又は少なくとも１５塩基からなるそれらの断片。これらのポリヌクレオチド、相補的ポリヌクレオチド又は断片は、肺癌患者の予後の良、不良又は転移の高可能性、低可能性を識別するタンパク質マーカーの発現に対応する転写レベルの差を測定するために使用される。
【００７９】
上記の各グループにおいて、組成物は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個、さらに好ましくは３個〜全数、例えば４個〜全数、５個〜全数のプローブを含むことができる。
【００８０】
本発明に関わる肺癌関連マーカーは、肺癌患者の予後の状態（生存者の割合）に応じて、次のように２つの群に分けることができる。すなわち、グループ１は、癌患者の術後予後がより良い場合であり、一方、グループ２は、肺癌患者の術後予後がより悪い場合である。
【００８１】
本明細書中で使用する「予後が良い」とは、癌の浸潤性、転移性又は進行度が低いことを意味し、このように判定される癌患者の５年生存者の割合は約70％以上であるのに対して、「予後が悪い」とは、癌の浸潤性、転移性又は進行度が高いことを意味し、癌患者の５年生存者の割合は約20％以下である。
【００８２】
本発明において、プローブとしての変異体は、上記のグループ１又はグループ２のポリヌクレオチドの塩基配列に１若しくは複数、好ましくは１若しくは数個、の置換、欠失、付加、挿入などの変異を有する変異体、該配列と通常80%以上、85%以上、好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、97%以上、98%以上、99％以上の同一性を有する配列からなる変異体などを含む。
【００８３】
さらに、本発明において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、上記定義のようなハイブリダイゼーション条件下で、上記のグループ１又はグループ２のポリヌクレオチド又はその相補的ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能なものであれば、特に制限されないものとする。患者の個体によっては、突然変異、多型性、選択的スプライシングなどの生物学的事象によって変化した遺伝子をもつこともありえるために、そのようなポリヌクレオチドは、標的核酸の検出を可能にする。
【００８４】
さらにまた、本発明において、ポリヌクレオチドの断片は、15塩基数〜全塩基数未満のサイズを有する。断片は、この範囲の任意の塩基数、例えば20塩基以上、30塩基以上、50塩基以上、70塩基以上、100塩基以上、150塩基以上、200塩基以上、250塩基以上などの塩基数である。
【００８５】
本発明で使用されるポリヌクレオチドプローブは、慣用の化学的DNA合成技術や遺伝子組換え技術によって合成されうる。
【００８６】
ポリヌクレオチドが約100塩基以下のDNA分子であれば、ホスホアミダイト法を利用するDNA自動合成装置（例えばApplied Biosystems、米国）を用いて合成することができる。
【００８７】
或いは、上記ポリヌクレオチドは、cDNAクローニングによって作製することができる。ヒト肺の対象の癌組織又は正常組織から全RNAを取得し、オリゴdTセルロースカラム処理によってポリA(+)RNAを得たのち、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）法によってcDNAライブラリーを作製し、このライブラリーから、GenBankやUniGeneなどのデータバンクに登録された配列検索によって入手可能な塩基配列に基づいて予め作製したプローブ（15以上、好ましくは30以上、より好ましくは、50〜100又はそれ以上の塩基長）とのハイブリダイゼーションによりcDNAクローンを得ることができる。取得したクローンは、例えば市販されるような発現ベクターに組み込んだのち大腸菌、枯草菌などの適当な宿主細胞に導入し、宿主細胞を増殖することによって、或いはデータバンクに登録された配列に基づいて予め作製したプライマー（通常15〜30塩基、好ましくは17〜25塩基長）を使用し、かつ前記cDNAクローンを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応（PCR)によって、増幅することができる。cDNAクローニング及びPCR法の具体的手順や試薬等については、市販のキット、装置、試薬を使用することができるし、また、例えばSambrook Jら, Molecular Cloning A Laboratory Manual,1989年, Cold Spring Harbor Laboratory Press(米国);F.M. Ausbelら, Short Protocols in Molecular Biology(3版)A Compendium of Method s from Current Protocols in Molecular Biology, 1995年, John Wiley & Sons, Inc.(米国)などに教示されている。
【００８８】
本発明の組成物は、本発明の肺癌関連マーカーを検出するための抗体又はポリヌクレオチドプローブの少なくとも１つを含む混合物の形態であってもよいし、あるいは個々の又は２以上のプローブを容器に入れて包装された、いわゆるキットの形態であってもよいし、あるいはマイクロアレイの形態であってもよい。
【００８９】
キットにはさらに、ハイブリダイゼーションを行うための試薬類、例えばバッファー、逆転写酵素、標識二次抗体などを含有させてもよい。
【００９０】
マイクロアレイの場合、アレイは、DNAマイクロアレイ（DNAチップともいう）、組織アレイ又はタンパク質マイクロアレイである。
【００９１】
これらのマイクロアレイにはそれぞれ、プローブとしての上記のポリヌクレオチド或いは上記の抗体又はその断片が結合される。すなわち、アレイの表面に、上記核酸マーカー又は転写若しくは翻訳産物を検出することができる、核酸マーカー又はその変異体とハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチド、或いはそれらの遺伝子によってコードされるタンパク質、又はその変異体若しくは誘導体と特異的に結合反応することができる抗体又はその断片が、プローブとして結合される。
【００９２】
アレイの基板としては、ガラス又は樹脂（ポリマー）が通常使用され、その表面に例えばポリＬ−リジン、シラン又は高密度化アミノ基が導入される。また、基板上へのポリヌクレオチド又は抗体の結合は、スポット法又はインクジェット法によって行われる。
【００９３】
３．検出又は予測方法
本発明は、第1の態様において、質量分析器を応用しヒト肺癌組織及び非癌組織の網羅的タンパク質発現プロファイルを取得すること、該網羅的タンパク質発現プロファイルについて該肺癌組織を該非癌組織から区別可能なタンパク発現プロファイルをを抽出すること、該肺癌組織と非癌組織との間の該抽出された発現プロファイルを構成するタンパク質の相対的な発現レベルの差を指標にしてヒト肺組織検体について肺癌を検出することを含み、ここで、該抽出された発現プロファイルを構成するタンパク質が、分子量([M+H]+)4568.9 ±0.02％、12020.4 ±0.02％、6596.4 ±0.02％、7363.4 ±0.02％、11112.1 ±0.02％、19911.9 ±0.02％、10619.6 ±0.02％、9876.6 ±0.02％、19982.0 ±0.02％、19993.1 ±0.02％、11154.4 ±0.02％、11472.2 ±0.02％、19865.2 ±0.02％、12217.4 ±0.02％、19877.8 ±0.02％、2973.7 ±0.02％、7324.9 ±0.02％、11197.8 ±0.02％、4536.2 ±0.02％、15975.8 ±0.02％、4938.1 ±0.02％、4965.8 ±0.02％、4963.5 ±0.02％、6275.9 ±0.02％、6649.6 ±0.02％、6224.3 ±0.02％、5650.9 ±0.02％、11345.0 ±0.02％、5144.8 ±0.02％、5170.8 ±0.02％、14001.5 ±0.02％、2909.4 ±0.02％、7001.4 ±0.02％、11305.3 ±0.02％、11984.0 ±0.02％、10089.2 ±0.02％、6646.4 ±0.02％、14046.2 ±0.02％、2559.7 ±0.02％、及び2303.4 ±0.02％を有するタンパク質からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質であることを特徴とする、ヒト肺癌の検出方法を提供する。
【００９４】
本発明は、第２の態様において、ヒト肺癌患者の術後の予後又は転移可能性をインビトロで予測する方法であって、質量分析器を応用して、術後の予後がより良い又は転移可能性がより低い第１の患者群からの肺癌組織及び術後の予後がより悪い又は転移可能性がより高い第２の患者群からの肺癌組織の網羅的タンパク質発現プロファイルを取得すること、該網羅的タンパク質発現プロファイルについて該第１の患者群からの肺癌組織と該第２の患者群からの肺癌組織とを互いに区別可能なタンパク質発現プロファイルを抽出すること、該第１の患者群と第２の患者群との間の該抽出された発現プロファイルを構成するタンパク質の相対的な発現レベルの差を指標にしてヒト肺癌患者の組織検体について術後の予後又は転移可能性を判定することを含み、ここで、該抽出された発現プロファイルを構成するタンパク質が、分子量([M+H]+)12449.8 ±0.02％、17206.1 ±0.02％、12318.8 ±0.02％、6084.9 ±0.02％、13163.5 ±0.02％、15720.8 ±0.02％、17099.8 ±0.02％、10839.6 ±0.02％、6075.0 ±0.02％、13155.6 ±0.02％、18331.5 ±0.02％、16944.2 ±0.02％、15731.2 ±0.02％、11175.9 ±0.02％、15659.8 ±0.02％、17262.0 ±0.02％、6041.6 ±0.02％、8577.2 ±0.02％、17749.1 ±0.02％、13635.5 ±0.02％、17220.3 ±0.02％、16958.0 ±0.02％、12761.2 ±0.02％、7965.3 ±0.02％、及び12878.3 ±0.02％を有するタンパク質からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質であることを特徴とする方法を提供する。
【００９５】
ここで、発現レベルは、生物学的検体中の上記タンパク質について、転写又は翻訳産物レベルで、肺癌患者からの検体における、肺癌組織と非癌組織との間で、あるいは、術後の予後がより良い又は転移可能性がより低い患者群からの検体と、術後の予後がより悪い又は転移可能性がより高い患者群からの検体との間で、該タンパク質の相対的な発現レベルを比較したときの差を意味する。
【００９６】
発現レベルの差を示す上記タンパク質を同定することによって、肺癌をインビトロで検出することができるし、あるいは、肺癌患者の術後の予後又は転移可能性をインビトロで予測することができる。
【００９７】
本発明によれば、発現レベルの差は、生物学的検体において、マーカーとしての該タンパク質又はそれに対応するポリヌクレオチド（mRNA、cDNAなど）の存在又は量を測定することによって、あるいはマススペクトル上の各タンパク質に対応するピークの強度に基づいて決定することができる。
【００９８】
生物学的検体は、肺癌患者の組織又細胞を含み、手術によって切除された肺癌組織、生検によって得られた組織又は細胞などである。
【００９９】
肺癌は小細胞癌と非小細胞癌（腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌等を含む）に大別されるが、本発明は、その80〜85％を占める非小細胞癌の検出、あるいは、非小細胞癌をもつ患者の予後の予測のために特に有効である。
以下に、これらの２つの異なる方法について具体的に説明する。
【０１００】
３．１  ポリヌクレオチドによる方法
本発明に関わるタンパク質マーカーを検出するために、それらの各タンパク質マーカーをコードする核酸とハイブリダイズする上記ポリヌクレオチドを使用する。検出すべきマーカーの数は、グループ毎に１又は２以上であり、好ましくは２以上、より好ましくは３から全数、例えば４から全数、５以上から全数である。検出すべきマーカーの数が多いほど、予測の確度が向上する。
【０１０１】
ハイブリダイゼーションは、マイクロアレイ法、ブロット法、例えばノーザン若しくはサザンブロット、ノーザン若しくはサザンハイブリダイゼーション法、in situハイブリダイゼーション法、定量RT-PCR法などの方法で実施することができる。好ましいハイブリダイゼーション法は、マイクロアレイ、定量RT-PCR又はブロット法である。また、好ましいマイクロアレイの例は、DNAマイクロアレイ及びタンパク質マイクロアレイである。
【０１０２】
DNAマイクロアレイ法では、上記マーカー遺伝子群（１〜全数）とハイブリダイズする核酸プローブを基板に結合したDNAマイクロアレイを作製し使用する。
【０１０３】
DNAマイクロアレイは、核酸プローブを固相化できるものであればいずれの種類の基板も使用できる。固相には、例えばガラス、ポリマーなどが含まれ、さらに核酸を共有結合するための反応性基を含むスペーサーやクロスリンカーを導入することができる。このようなチップは市販されているため、それらを使用することができる。
【０１０４】
核酸プローブの固相化は、特に制限はないが、一般的な方法、例えばスポッター又はアレイヤーと呼ばれる高密度分注機を用いてDNAをスポットする方法、ノズルから液滴を噴射するインクジェット方式などの方法を用いて実施することができる。
【０１０５】
生物学的検体中のDNA又はRNA、それから誘導されたcDNA、cRNAなどの核酸を、Cy染料(Cr3又はCy5)などの蛍光物質で標識した核酸を、DNAマイクロアレイ上のプローブとハイブリダイズさせる。レーザースキャンによる読み取り装置を用いて蛍光強度を読み取り、コンピュータでデータを解析する。
【０１０６】
ブロット法では、本発明の核酸プローブを放射性同位元素（例えば、32P及び35S）や蛍光物質（フルオレサミン誘導体、ローダミン誘導体、Cy染料、ダンシル誘導体など）などで標識したのち、ナイロンなどのポリマーメンブレンに転写した生物学的試料中のDNA又はRNA、それから誘導されたcDNA、cRNAなどの核酸との間でハイブリダイゼーションを行う。シグナルを、放射線検出器又は蛍光検出器を用いて検出し、その強度を測定する。
【０１０７】
定量RT―PCR法では、生物学的検体中のRNAから作製したcDNAを鋳型として標的の各遺伝子の領域が増幅できるように、プライマーをcDNAとアニーリングさせPCRを行い、得られた二本鎖DNAを検出する。プライマーを予め放射性同位元素や蛍光物質で標識しておくか、或いは、PCR産物をアガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドなどで二本鎖DNAを染色するなどの方法で、標的遺伝子を検出、定量することができる。
【０１０８】
PCR条件は、例えば変性:92〜94℃で30〜60秒；アニーリング：50〜55℃で30〜60秒;伸長:68〜72℃で30秒〜10分を１サイクルとして20〜40サイクルの反応を含む。逆転写酵素は、市販の酵素、例えばSuperScript(登録商標)III(Invitrogen、米国)、AMV Reverse Transcriptase (Promega、米国)、M-MLV(RNaseH-)（宝酒造、京都）などを使用することができる。
【０１０９】
本発明において、ハイブリダイゼーションは、DNA-DNAハイブリダイゼーション、DNA-RNAハイブリダイゼーション、RNA-RNAハイブリダイゼーションのいずれでもよい。
【０１１０】
ハイブリダイゼーションは、通常、ストリンジェントな条件下で行われる。このような条件は、例えば、１M塩化ナトリウム／0.5%(W/V)サルコシル／30％ホルムアミド中、60℃、17時間のハイブリダイゼーション、その後、6×SSC/0.005%(W/V)トライトンX-102溶液中、室温、10分間で一回、さらに、0.1×SSC/0.005%(W/V)トライトンX-102溶液中で０〜４℃に保ちながら５分間で一回の洗浄を含む。或いは、別のハイブリダイゼーション条件は、例えば、約45〜50℃で2〜6×SSC中でのハイブリダイゼーションと、それに続く、約50〜65℃での0.2〜2×SSC/0.1〜1%SDSによる洗浄；或いは、60〜65℃で6×SSC、Denhardt溶液、0.2%SDS中でのハイブリダイゼーションののち、60〜65℃での0.2×SSC、0.1%SDSによる洗浄を含む。ハイブリダイゼーションの条件及び方法については、例えば、Ausubelら, Curent Protocols in Molecular Biology, 1995, John Wiley and Sons, USA)を参照することができる。
【０１１１】
３．２  抗体による方法
上記タンパク質マーカーの測定法は、免疫学的方法である。
上記のように作製された抗体を、生物学的検体中の標的タンパク質又はその断片の検出のために使用することができる。
【０１１２】
多数の抗体をマイクロアレイ基板上に結合したタンパク質マイクロアレイを作製することによって、或いは、多数の抗体をPVDF膜などのフィルター上にドット状にスポットすることによって、一度に多数の標的タンパク質を検出又は定量することが可能になる。或いは、慣用の免疫学的測定法、例えば酵素免疫測定法（ELISA、EIA）、蛍光抗体法、放射性免疫測定法（RIA）、発光免疫測定法、免疫比濁法、ラテックス凝集反応、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応、粒子凝集反応又はウェスタンブロット法などによって、生物学的検体中の標的タンパク質又はその断片を検出又は定量することができる。
【０１１３】
固相上で反応を行うときには、固相担体として、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンなどのポリマーの膜（フィルター）、プレート、チューブ、ストリップなど、ラテックス、磁性体などの粒子、などが含まれる。固相化は、物理的に或いは化学的に行うことができる。化学的結合のためには、例えばマレイル化試薬、臭化シアンなどの試薬で固相を処理し、タンパク質のアミノ基などと反応する官能基を固相に導入することができる。
【０１１４】
標的の検出のために、抗体を標識してもよいし、或いは標識二次抗体を使用してもよい。標識としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどの酵素、フルオレセイン、ローダミン、それらの誘導体などの蛍光物質、ルシフェラーゼ系、ルミノール系などの発光物質、32P、125I、35Sなどの放射性同位元素などが含まれる。標識化は、例えばグルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、クロラミンT法、ボルトンハンター法などを含む。
【０１１５】
３．３  マススペクトルによる方法
本発明はさらに、マススペクトルデータからの肺癌の検出法、術後の予後の良、不良又は転移可能性の予測法を提供する。
【０１１６】
これらの方法は、ヒト肺癌患者又は肺癌を疑われる被験者からの患部の肺組織試料から、厚さ12μｍの凍結切片を作成し、試料台にのせ、コールドルームにて45分間吸引乾燥を行い、適切な解析部位を同一試料由来の染色標本から判断し、50％アセトニトリル/0.1%トリフルオロ酢酸溶液に溶解した20mg/ml濃度のシナピン酸100μｌを滴下し、シナピン酸滴下部位から、マススペクトロメトリー（例えばアプライドバイオシステムズ社製、ボイジャーSTR）を用いて、タンパク質発現プロファイルを得ることを含む。解析条件は、例えば加速電圧；25,000V、グリッド電圧；93%、遅延時間；200 ns、解析範囲；2,000〜20,000ダルトン(Da)である。得られたデータは、例えばABI社製解析ソフトウェアDataExplorerTMを使用して、内部標準分子であるヘモグロビンにより校正される。得られたデータは、例えばABI社製解析ソフトウェアMarkerViewTMを使用して、上記の統計解析に掛けられる。
【０１１７】
本発明においては、マススペクトル上の指定された分子量のピークの強度に基づいて、対応のタンパク質の発現レベルを決定し、該サンプルの発現レベルと対照サンプルの発現レベルとの差を決定することを含む。あるいは、本発明の方法は、検体のマススペクトルのピークパターン（若しくはプロファイル）を標準サンプル、陽性サンプル又は陰性サンプルのものと対比することを含む。
【０１１８】
肺癌の検出においては、例えば図５に示されるような肺癌の場合の網羅的発現プロファイル（NSCLC）が得られるならば、検体は肺癌であることを示し、一方、非癌の場合の網羅的発現プロファイル（NL）が得られるならば、検体は非癌であることを示す。あるいは、発現レベルの差に基づいて、非癌組織において高発現するタンパク質（分子量([M+H]+)4568.9 ±0.02％、12020.4 ±0.02％、6596.4 ±0.02％、7363.4 ±0.02％、11112.1 ±0.02％、19911.9 ±0.02％、10619.6 ±0.02％、9876.6 ±0.02％、19982.0 ±0.02％、19993.1 ±0.02％、11154.4 ±0.02％、11472.2 ±0.02％、19865.2 ±0.02％、12217.4 ±0.02％、19877.8 ±0.02％、2973.7 ±0.02％、7324.9 ±0.02％、11197.8 ±0.02％、4536.2 ±0.02％、及び15975.8 ±0.02％のピーク）、又は肺癌組織において高発現するタンパク質（分子量([M+H]+)4938.1 ±0.02％、4965.8 ±0.02％、4963.5 ±0.02％、6275.9 ±0.02％、6649.6 ±0.02％、6224.3 ±0.02％、5650.9 ±0.02％、11345.0 ±0.02％、5144.8 ±0.02％、5170.8 ±0.02％、14001.5 ±0.02％、2909.4 ±0.02％、7001.4 ±0.02％、11305.3 ±0.02％、11984.0 ±0.02％、10089.2 ±0.02％、6646.4 ±0.02％、14046.2 ±0.02％、2559.7 ±0.02％、及び2303.4 ±0.02％のピーク）を決定することができる。
【０１１９】
術後の予後又は転移可能性の予測においても、上記と同様に、タンパク質発現プロファイルあるいは発現プロファイル構成タンパク質の発現レベルの差に基づいて、術後の予後がより良い又は転移可能性がより低い患者と、術後の予後がより悪い又は転移可能性がより高い患者（分子量([M+H]+)12449.8 ±0.02％、17206.1 ±0.02％、12318.8 ±0.02％、6084.9 ±0.02％、13163.5 ±0.02％、15720.8 ±0.02％、17099.8 ±0.02％、10839.6 ±0.02％、6075.0 ±0.02％、13155.6 ±0.02％、18331.5 ±0.02％、16944.2 ±0.02％、15731.2 ±0.02％、11175.9 ±0.02％、15659.8 ±0.02％、17262.0 ±0.02％、6041.6 ±0.02％、8577.2 ±0.02％、17749.1 ±0.02％、13635.5 ±0.02％、17220.3 ±0.02％、16958.0 ±0.02％、12761.2 ±0.02％、7965.3 ±0.02％、及び12878.3 ±0.02％のピークによって判定される。）とを識別することができる。
【０１２０】
上記のようにして決定された各タンパク質の相対的発現レベルを多数の症例について系統的かつ網羅的なクラスター解析(例えば、ME Garberら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 13784-13789, 2001; A Bhattacharjeeら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98:13790-13795, 2001) を行うと、図６及び図７に示されるように、肺癌と非癌とが明瞭に区別されることがわかる。また、術後予後について判定された患者群についてカプラン−マイヤー生存曲線をとるならば、予測された判定結果が裏づけられる（図１〜図３）。
【０１２１】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。しかし、本発明の範囲は、これらの実施例によって制限されないものとする。
【実施例】
【０１２２】
（材料と実験）
１．調査対象
1995年12月から1999年12月までの間に可能な治癒切除術を行い成功した、111症例の肺腺癌、36症例の扁平上皮癌、19症例の大細胞癌及び８症例の腺扁平上皮癌を含む一連の174 NSCLC症例を、愛知県がんセンター（日本国、名古屋）、病理分子診断科のファイルから選択した。教師・テストモデル解析のため、174症例を教師群又はテスト群のいずれかに無作為に割り付けた。教師群及びテスト群の両群の患者の特徴を表1に要約したが、この表は、臨床病理学的性質に関していかなる有意な差異もないことを示している。検体のすべては、検討組織委員会から必要な承認を得た後で−80℃で保存された。また、患者からインフォームドコンセントを得た。
【０１２３】
【表１】
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【０１２４】
２．プロテオミクス解析
凍結した組織切片を切り出し、MALDI MS検体プレート(PE Biosystems, Foster City, CA)上に移し、デシケータ中で45分間乾燥した。ガイドとしての隣接する切片をギムザ染色し、分析すべき領域を、愛知県がんセンター病院の外科病理学者が正確にマークした。100nLのマトリックス溶液(水/アセトニトリル/トリフルオロ酢酸(500/500/1; v/v/v)中の飽和シナピン酸)を、１組織切片上に多スポットで塗布し、各検体を、本質的に文献記載(Lancet 2003, 362:433-9; Proteomics 2001, 1:1320-6; J Am Soc Mass Spectrom 2002, 1:1320-6; Cancer Res. 2005, 65:7674-81)のようにして、マトリックススポットの表面上から得た（図４）。この分析では、質量対荷電数(m/z)比が2,000〜20,000の範囲内のシグナルを考慮に入れた。各スペクトルは、Data ExplorerTMソフトウエア(Applied Biosystems)を用いて、ヘモグロビンβ鎖([M+H]+=15,868.2)或いはα−ヘモグロビン([M+2H]2+=7,564.2)のピークを用いた内部標準較正と、ピークを滑らかにする処理を行った。ピークの検出と帰属は、MarkerViewTMソフトウエア(Applied Biosystems)を用いて行い、その結果、教師群のデータセットでは、2,630個のユニークなシグナルを検出する事が可能であった。全シグナルイオン強度の最大総和により、スペクトルを互いに正規化した。その最大総和数を各スペクトルの和で割り算して、各スペクトルの正規化率を求め、さらにこの正規化率を用いて各スペクトルについて各データ点を乗じた。ヒト材料を使用するMALDI MS分析の精度と再現性は、これまでの研究によって実証されている（例えばJ Natl Cancer Inst 2003, 95:1711-7; Cancer Res 2003, 63:1652-6など）。本発明者らは、教師群中の20個のNSCLC検体において、1組織上の2つのスポットを調べることによって、プロテオミクス解析の精度と再現性を確認した。1つの組織検体からの2つのスペクトルのトップ500ピークは、20検体すべてにわたって顕著な相関（平均R2=0.99）を示した。
【０１２５】
３．統計解析
MALDI MSにより得られたタンパク質プロファイルを、Fisherの正確確率法（発現レベルを有る無しに二分する）、Kruskal-Wallisテスト（発現値により全てのデータをランク付けする）、及びマイクロアレイの有意分析(SAM；各発現値を連続データとして評価する)を用いて解析し、情報を提供するシグナルを選択した。各方法のカットオフ点及び偽発見率(FDR)はそれぞれp<0.001及びFDR<1%であった。これら3つの選択基準の少なくともいずれかを満たしたシグナルを以下の解析のために使用した。その後、本発明者らは、予後予測に十分確立された技法、すなわち、線形弁別器による重み付き投票を用いた。重み付き投票では、各重み値がシグナル対ノイズ(S/N)比として計算される。予測モデルを構成する分子数は、種々のマイクロアレイ研究で判明しているように、予測精度に強く影響を及ぼすために、本発明者らは、本研究において10,000回のランダムな繰り返しを伴う10倍クロス確認分析を実施して、予測モデルに使用したタンパク質数を最適化した。カプラン−マイヤープロットとCox比例解析(Stata 7.0)を用いて、タンパク質発現プロファイルに基づいた分類因子と生存期間及び/又は無再発生存期間との間の関連を確定した。
【０１２６】
４．プロテオミクス解析によるタンパク質同定
NSCLC検体の一部(350mg)を抽出バッファー(0.25Mスクロース、0.01M Tris-HCl及び0.1mM PMSF)に浸漬し、超音波処理し、3回遠心分離した。遠心分離は、680gで10分、10,000gで10分、55,000gで１時間行い、また、各回ごとに、可溶性画分を新しいチューブに移した。得られた画分は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)ポンプを用いてポリマー製カラム(Amersham Biosciences, Upsalaa, Sweden)にて分離された。溶媒Aは0.1％TFAであり、溶媒Bはアセトニトリル中の0.1％TFAであった。流速1ml/分にて、5％溶媒Bまで5分、次いで60％溶媒Bまで75分、次いで95％溶媒Bまで20分のグラジエントを行った。80分まで1分ごとにHPLC画分を採取し、凍結乾燥し、0.4M重炭酸アンモニウム10μl及び45mM DTT 5μlにて再構成し、100mMヨードアセトアミド10μlで処理し、200nMマスグレードのトリプシン(Promega, Madison, WI)で4時間処理した。マイクロキャピラリー逆相(RP) HPLC-MS/MS分析を、LCQ (Thermo Electron社製) 及び、QSTAR XL (ABI社製)とオンライン接続されたHPLCポンプを用いて実施した。MS/MSスペクトルを、１フルMSスキャン、次いでもっとも強い前駆体質量数の１MS/MSスキャンによるデータ依存性スキャニング方式で得た。MS/MSスペクトルを、Mascot(Matrix Science Inc., Boston, MA)を用いて、ヒトデータベース配列と一致させた。最少2つのペプチドの一致、並びに、MALDI MSで検出されたm/z比と登録データベース上のタンパク質の分子量（翻訳後修飾を含む）との間の一致が、タンパク質同定に必要な条件であった。
【０１２７】
（結果）
１．ヒト肺組織検体からのプロテオミクスMSシグナル
本発明者らは、116症例の肺非小細胞癌(NSCLC)及び20例の正常肺(NL)からなる136個の凍結ヒト肺組織検体のタンパク質発現プロファイルをMALDI MSを用いて分析し、2,630の異なるMSシグナルを得た。ヒト肺検体からのスペクトルの代表例を、図4及び5に示した。本発明者らは、NSCLCをNLから正確に区別することが可能であるタンパク質発現プロファイルを探索し、その結果、NSCLCとNLとの間で有意に発現差を認める334個のシグナルから構成されるタンパク質発現プロファイルを、SAMを用いて抽出した(FDR<0.1)。上位40シグナルを使用した系統的かつ網羅的なクラスター解析により、このタンパク質発現プロファイルが完璧にNSCLCをNLから区別した（図6）。
【０１２８】
２．教師群におけるNSCLCの再発関連死予測モデルの構築
NSCLC手術患者のうち、微小残存腫瘍をもつ患者を選別するための有効な手法のない今日の状況を克服するために、治癒切除術を受けたNSCLC患者の術後予後を予測できるタンパク質発現プロファイルを抽出することを試みた。個々の予後予測モデルを構築するために、本発明者らは、教師群において、再発のために5年以内に死亡した患者(n=46)と、5年以上生存しかつ観察期間中に再発の兆候を示さなかった患者(n=52)とを選別した。前者は、一般に予後の悪い患者を代表し、後者は、手術によって治癒した患者を代表する。3つの異なる統計解析法（Kruskal-Wallisテスト、Fisherの正確確率法及びSAM）を用いて、種々の視点からMSプロフィールを評価した。本発明者らの統計的基準により、上記2群の間で有意に発現差を認める178個のシグナルから構成されるタンパク質発現プロファイルを見出した。これらのシグナルはさらに、シグナル対ノイズ(S/N)測定法によってランク付けされ、これを用いて、再発により死亡した患者を治癒した患者からもっとも明瞭に区別する個々の術後予後予測モデルを構築した。予測シグナル数漸増させ、各モデルの学習誤差を、10倍クロス確認により、ランダムに割り当てた症例群を用いて10,000回計算した。その結果、25個の予測シグナル（以下、再発関連死パターンという）を使用する重み付き投票モデルが、NSCLC患者の結果予測のもっとも高い正確さをもつことが判明した。次に、本発明者らは、この予測分類法を116症例からなる全教師群に適用した。
【０１２９】
カプラン−マイヤー生存曲線は、分類により高度に有意な差異を示し(P<0.0001)、再発関連死パターン群(n=49)の中間無条件生存期間は26か月であったのに対して、低リスク群(n=67)は、中間生存期間に到達しなかった（図1A）。さらに、本発明者らはまた、このモデルを、再発に関する情報を得ることができる教師群の患者に適用したとき、それが無再発生存を予測するものでもあることを確認した。再発関連死パターンをもつ群に割付けられた患者は、低リスク群に割付けられた患者と比べて有意に低い無再発生存率を有していた（図1B；2年の時点で23％対88％、5年の時点で10％対75％）。
【０１３０】
３．独立の盲検データセットを使用することによる予測モデルの汎用性の確認
MALDI MSを用いるプロテオミクス解析への使用可能性を評価するために、独立の検査データセットによる有効性が極めて重要である。したがって、本発明者らは、教師群データセットに基づいて構築された再発関連死パターンを、58症例のNSCLC検体と7例のNL組織検体から得られた独立のテストデータセットに適用した。はじめに、本発明者らは、NSCLCをNLから区別するピークプロファイルを、上記データセットに適用し、系統的かつ網羅的クラスター解析における明瞭な区別を確認した。クラスター解析パターンは、MSピークプロファイルと組織分類との間の強い相関を反映し、NSCLCのすべてがNL検体と正しく識別されることを示した（図7）。次に、本発明者らは、独立の検査群に再発関連死パターンを適用することによって、本発明者らは、再発関連死パターンをもつ群に割付けられた患者が、低リスク群に割付けられた患者群と比べて、有意により低い生存率を有していた（図2A；2年の時点で50％対97％；5年の時点で14％対89％）。分類による生存期間に関するカプラン−マイヤー生存曲線は、再発関連死パターンをもつ群（中間生存＝24か月、n=22）と、低リスク群（中間生存＝未達、n=36）との間に統計的に有意な差異を示した（図2A、log-ランクテストによるP<0.0001）。同様に、本発明の再発関連死パターンは明らかに、再発関連死パターンをもつ患者と低リスク群の患者との間で術後生存期間の点で明瞭な差異を示し（2年の時点で35％対86％；5年の時点で5％対72％）、カプラン−マイヤー生存曲線解析において顕著な差異を示した(図2B、logランクテストによるP<0.0001)。
【０１３１】
COX回帰単変量解析により、再発関連死パターン（生存と無再発生存の両方についてP<0.001）及び病理学的病期(それぞれ生存と無再発生存についてP=0.003及び0.001)がともにNSCLC患者の臨床予後と有意に相関することを示した（表２）。
【０１３２】
多変量COX比例ハザードモデルは、再発関連死パターンが術後予後を予測する唯一の有意な因子であり(P<0.001)、一方、再発関連死パターンと臨床病期はともに、患者年齢、性別、喫煙暦、組織学について調整した後、無再発生存の有意な因子であることを示した（それぞれP<0.001及びP=0.026）（表３）。
【０１３３】
【表２】
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【０１３４】
【表３】
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【０１３５】
（センサード1症例を除く）再発関連死パターンをもつ全ての患者は観察期間に死亡した。
上記の結果は、ヒト肺癌検体の直接分析を通して網羅的タンパク質発現プロファイルに基づいた指標の有用性と臨床応用の可能性を示唆していると考えられる。
【０１３６】
４．早期のNSCLC患者における予後予測分類法の有用性
本発明者らはさらに、教師群の早期NSCLC及び進行NSCLC症例群における再発関連死パターンの区別力を評価した。（センサード1症例を除く）再発関連死パターンを持つ臨床病期Ｉ期の患者のすべてが、再発を経験し、観察期間中に死亡した（全生存に関して図3A、無再発生存に関して図3B；ともに、logランクテストによるP<0.0001）。本発明の分類法による臨床病期II〜III期患者の全生存及び無再発生存はまた、再発関連死パターンをもつ群（中間生存期間＝20、中間無再発生存期間＝22、n=14）と、低リスク群（中間生存期間＝未達、無再発生存期間＝29、n=10）との間で有意差を認めた（図3C及び3D；logランクテストによる生存についてP<0.0028、無再発生存についてP<0.0456）。
【０１３７】
したがって、早期NSCLC患者においても、再発関連死パターンと術後予後との間に非常に有意な関連があることを見出した。
【０１３８】
５．NSCLCにおけるマーカータンパク質の同定
本発明者らは、転移・再発の分子生物学的機構解明のための最初のステップとして、分類及び予後予測に関して有用であると思われるNSCLCにおいて特異的に発現するタンパク質並びに再発関連死パターンを構成するタンパク質の同定をすすめた。外科的に切除されたヒトNSCLC検体からの抽出タンパク質をHPLCによって適当なサイズ範囲に分画した。各画分は、トリプシン処理後、RP HPLCに接続されたMSMS型質量分析器を用いてペプチドの配列分析にかけた。その結果、タンパク質をサイモシン(Thymosin)β4と同定した。このタンパク質は、腫瘍組織と正常組織とを区別するタンパク質の1つとして既に同定されているものである(K. Yanagisawaら, Lancet 2003, 362:433-9；M. Stoeckliら, Nature Med. 2001, 7:493-6)。この事は、ヒト組織検体の網羅的タンパク質発現プロファイル取得のためのMALDI MS技術の再現性と正確さを示していると考えられる。本発明者らは、この技術を用いてより多くのタンパク質を同定した。そのようなタンパク質は、NLと比べてNSCLCで特異的に発現されうるものであり、例えばサイモシンβ10([M+H]+=4937.5)、リボソームタンパク質L39([M+H]+=6276.5)、リボソームタンパク質S30([M+H]+=6647.8)、カルサイクリン(Calcyclin)([M+H]+=10091.6)、ヒストンH2A.2([M+H]+=14004.3)などを含む（表４）。
【０１３９】
本発明者らはさらに、再発関連死パターン を構成するタンパク質、例えばアシルホスファターゼ([M+H]+=11172.8)及びPhosphoprotein enriched in astrocytes 15 ([M+H]+=17218.5)などを同定し、再発関連死パターン群でより高い発現を観察した（表４）。
【０１４０】
【表４】
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【０１４１】
（考察）
非常に少量（ナノグラムオーダー）の外科切除NSCLC検体を用いて網羅的タンパク質発現プロファイルを解析するためにMALDI MSを応用して、本発明者らは、タンパク質発現プロファイルが、再発の高い危険性を高精度で予測することを可能にする十分な情報を含むこと、並びに、患者を、個々に術後予後良好・不良群に判別可能である事を実証した。今回見出された分類因子は、再発関連死パターンとして教師群から選択された25個の異なるピークであるが、これらは、独立のテスト群に対しても、応用可能であったことから、本検討は、MALDI MSによる組織検体の直接的タンパク質発現プロファイルの良好な再現性を示すものと考える。興味深いことに、多変量解析により、年齢、性別、喫煙暦、組織学、腫瘍グレード、及び病期の調整後に、再発関連死パターンは非常に強い独立した予後因子であることが示された。このとき、病期は、単変量Cox回帰解析において有意であるにも関わらず、多変量解析では、有意な予後判定因子ではなく、このことは、再発関連死パターンがさらに臨床病期の情報を含むことを示唆している。本研究は、60ヶ月以上の観察期間を有しかつ詳細な臨床病理学的情報を伴う手術検体を用いたタンパク質発現プロファイル解析を遂行する事により、個々の高い精度の予後予測分類因子の構築に成功した最初の報告である。
【０１４２】
臨床病期Ｉ期の肺癌患者の70〜80％が再発を経験しないため、そのような早期症例のすべてにおいてアジュバント療法が施行される事は、過剰治療であると考えられる。この点では、本発明者らが見出した高い精度の術後予後予測分類因子は、高リスクの患者群に対して選択的にアジュバント療法による利益をもたらすはずである。これは、今回判明した再発関連死パターンが、早期のNSCLCと診断された患者においても、治癒切除後の治癒群と、再発・癌死群を、高い統計学的優位差をもって明確に分類する能力をもつと思われるからである。実際に、今回見出された分類因子により、臨床病期I期のNSCLC症例で再発関連死パターンをもつ群であると割付けられた患者は、低リスクの患者群に割付けられたものと比べて、非常に低い術後生存率を示した（2年時で63％対100％；5年時で13％対96％）。
【０１４３】
結論として、本発明者らは、未処理の凍結組織検体に対して直接MALDI MSを適用し、教師群と独立のテスト群との両方において、短期間に再発・癌死するNSCLC患者と、良好な予後をもつ患者とを区別することができる再発関連死パターンを見出した。この事実は、この解析法が、NSCLCの臨床管理の戦略のために将来的に応用される事を示唆するものと考える。
【産業上の利用可能性】
【０１４４】
本発明によって、ヒト肺癌を高い精度で検出できる、またこれに加えて、ヒト肺癌患者の術後の予後又は転移可能性を高い精度で予測できる。このため、肺癌患者の予後の管理又は治療計画の策定のために有効に利用することができる。このように、肺癌医療において、本発明は多大なる貢献をすることが可能であろう。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】ヒト肺非小細胞癌患者群の術後のカプラン−マイヤー生存曲線を示す。図1Aは全生存期間(overall survival)、図１Ｂは無再発生存期間(relapse free survival)をそれぞれ示す。
【図２】図１と異なるヒト肺非小細胞癌患者群の術後のカプラン−マイヤー生存曲線を示す。図2Aは全生存期間、図2Bは無再発生存期間をそれぞれ示す。
【図３】病期の異なるヒト肺非小細胞癌患者群の術後のカプラン−マイヤー生存曲線を示す。病期Ｉ期の患者群について、図3Aは再発の有無と無関係な全生存期間、図3Bは無再発生存期間をそれぞれ示す。病期II〜IIIの患者群について、図3Cは再発の有無と無関係な全生存期間、図3Dは無再発生存期間をそれぞれ示す。
【図４】肺癌を含む周辺組織（T1、T2、N1〜N3）から採取した検体の各マススペクトルパターンを示す。各スペクトルグラムの右上の数字はイオン強度を示す。
【図５】典型的な肺癌（NSCLC）及び非癌(NL)のマススペクトルパターンを示す。
【図６】教師群における、マススペクトル上、肺癌又は非癌を識別可能にするシグナル１から40に相当するタンパク質の発現レベルと肺癌、非癌組織分類とに基づいて作成されたクラスター解析の結果を示す。
【図７】テスト群における、マススペクトル上、肺癌又は非癌を識別可能にするシグナル１から40に相当するタンパク質の発現レベルと肺癌、非癌組織分類とに基づいて作成されたクラスター解析の結果を示す。
【図８】肺癌と正常肺との識別可能タンパク質マーカー(MW4569, MW10619)のマススペクトルを示す。MWは分子量を表す。また、各スペクトルグラムの右上の数字はイオン強度を示し、この値に相対強度の割合を乗じた値がタンパク質の含量である((注)図９〜図37についても同様である)。
【図９】肺癌と正常肺との識別可能タンパク質マーカー(MW11112, MW11472)のマススペクトルを示す。
【図１０】肺癌と正常肺との識別可能タンパク質マーカー(MW6596, MW7324)のマススペクトルを示す。
【図１１】肺癌と正常肺との識別可能タンパク質マーカー(MW9876, MW11154)のマススペクトルを示す。
【図１２】肺癌と正常肺との識別可能タンパク質マーカー(MW12217, MW2973)のマススペクトルを示す。
【図１３】肺癌と正常肺との識別可能タンパク質マーカー(MW11197, MW19865, MW19877,MW19911)のマススペクトルを示す。
【図１４】肺癌と正常肺との識別可能タンパク質マーカー(MW12020, MW19993)のマススペクトルを示す。
【図１５】肺癌と正常肺との識別可能タンパク質マーカー(MW7363, MW15975)のマススペクトルを示す。
【図１６】肺癌と正常肺との識別可能タンパク質マーカー(MW19982, MW4536)のマススペクトルを示す。
【図１７】肺癌と正常肺との識別可能タンパク質マーカー(MW2303, MW2559)のマススペクトルを示す。
【図１８】肺癌と正常肺との識別可能タンパク質マーカー(MW2909, MW4938, MW4965, MW5144, MW5170)のマススペクトルを示す。
【図１９】肺癌と正常肺との識別可能タンパク質マーカー(MW4963, MW5650)のマススペクトルを示す。
【図２０】肺癌と正常肺との識別可能タンパク質マーカー(MW6224, MW6275)のマススペクトルを示す。
【図２１】肺癌と正常肺との識別可能タンパク質マーカー(MW6646, MW6649)のマススペクトルを示す。
【図２２】肺癌と正常肺との識別可能タンパク質マーカー(MW7001, MW10089)のマススペクトルを示す。
【図２３】肺癌と正常肺との識別可能タンパク質マーカー(MW11305, MW11345)のマススペクトルを示す。
【図２４】肺癌と正常肺との識別可能タンパク質マーカー(MW11984, MW14001)のマススペクトルを示す。
【図２５】肺癌と正常肺との識別可能タンパク質マーカー(MW14046)のマススペクトルを示す。
【図２６】肺癌患者の予後予測関連タンパク質マーカー(MW6041, MW6075)のマススペクトルを示す。
【図２７】肺癌患者の予後予測関連タンパク質マーカー(MW6084, MW7965)のマススペクトルを示す。
【図２８】肺癌患者の予後予測関連タンパク質マーカー(MW8577, MW10839)のマススペクトルを示す。
【図２９】肺癌患者の予後予測関連タンパク質マーカー(MW11175, MW12318)のマススペクトルを示す。
【図３０】肺癌患者の予後予測関連タンパク質マーカー(MW12449, MW12761)のマススペクトルを示す。
【図３１】肺癌患者の予後予測関連タンパク質マーカー(MW12878, MW13155, MW13163)のマススペクトルを示す。
【図３２】肺癌患者の予後予測関連タンパク質マーカー(MW13635, MW15659)のマススペクトルを示す。
【図３３】肺癌患者の予後予測関連タンパク質マーカー(MW15720, MW15731)のマススペクトルを示す。
【図３４】肺癌患者の予後予測関連タンパク質マーカー(MW16944, MW16958)のマススペクトルを示す。
【図３５】肺癌患者の予後予測関連タンパク質マーカー(MW17099, MW17206)のマススペクトルを示す。
【図３６】肺癌患者の予後予測関連タンパク質マーカー(MW17220, MW17262)のマススペクトルを示す。
【図３７】肺癌患者の予後予測関連タンパク質マーカー(MW17749, MW18331)のマススペクトルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2007263896.tif 000013
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【配列表】
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