(57)【要約】【課題】細胞を効率良く回収することができる細胞培養用中空糸束モジュールを提供する。【解決手段】半透膜素材からなる中空糸を束ねた中空糸束５と、この中空糸束５を収納するとともに培養液を導入する培養液導入部２ｄとその導入された培養液を排出する培養液排出部２ｅが備えられたハウジング２とを有する細胞培養用中空糸束モジュール１において、ハウジング２内に収納された中空糸束５の少なくとも一方端部を切断するための切断部６ａ，６ｂがハウジング２に形成されるとともに、その切断部６ａ，６ｂを解除可能に封止する熱収縮フィルム７が設けられ、さらにハウジング２の端部に、中空糸束５をハウジング２から抜脱するためのハウジング分割部２ｆが備えられていることを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
半透膜素材からなる中空糸を束ねた中空糸束と、
この中空糸束と培養液を収納するとともに培養液導入部と培養液排出部が備えられたハウジングと、を有する細胞培養用中空糸束モジュールにおいて、
上記ハウジング内に収納された上記中空糸束の少なくとも一方端部を切断するための切断用開口部が上記ハウジングに形成されるとともに、その切断用開口部を解除可能に封止する封止体が設けられ、
さらに上記ハウジングの端部に、一方端部で切断されて自由端を得た上記中空糸束を上記ハウジングから抜脱するためのハウジング分割部が備えられていることを特徴とする細胞培養用中空糸束モジュール。
【請求項２】
上記切断用開口部として上記ハウジングの筒軸方向と直交する方向に切り欠かれたスリットを有する請求項１記載の細胞培養用中空糸束モジュール。
【請求項３】
上記封止体として上記切断用開口部に熱収縮フィルムが巻き付けられている請求項１または２記載の細胞培養用中空糸束モジュール。
【請求項４】
上記スリット近傍の上記ハウジング外周壁にねじ部が形成され、上記封止体としてそのねじ部に螺合するユニオンナットを有する請求項２記載の細胞培養用中空糸束モジュール。
【請求項５】
上記スリットを挟んでその両側の上記ハウジング外周壁に鍔部または環状溝が形成され、上記封止体としてそれらの鍔部または環状溝に締め付け固定されるクランプを有する請求項２記載の細胞培養用中空糸束モジュール。
【請求項６】
上記クランプの内面に、上記切断用開口部に嵌合し得る凸部が形成されている請求項５記載の細胞培養用中空糸束モジュール。
【請求項７】
上記封止体として上記スリットに被着される樹脂製または金属製カバーを有する請求項２記載の細胞培養用中空糸束モジュール。
【請求項８】
上記スリット縁部にシール材が周設されている請求項４〜７のいずれか１項に記載の細胞培養用中空糸束モジュール。
【請求項９】
上記切断用開口部として上記ハウジングの一方端部から管軸方向と直交する方向に延設された筒状部を有し、この筒状部先端の開口を閉塞する蓋体または上記筒状部内を埋める栓体が備えられている請求項１記載の細胞培養用中空糸束モジュール。
【請求項１０】
上記ハウジング分割部に、雄ねじ部と雌ねじ部から構成される管継手が備えられている請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞培養用中空糸束モジュール。
【請求項１１】
上記中空糸束は、上記中空糸に沿わせて任意本数の細胞付着成育用繊維束を補助的に有するものである請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞培養用中空糸束モジュール。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療分野や医薬品製造分野において細胞を培養するのに好適な細胞培養用中空糸束モジュールに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞の機能解析や各種幹細胞の発見およびその分化誘導技術が進歩したことにより、従来では治療が困難とされていた種々の疾病についても治療の可能性が見込まれるようになってきている。
【０００３】
特に、欠失する組織の修復や機能改善をめざす再生医療に期待が高まっており、様々な取組みが行われつつある。
【０００４】
再生医療は、多くの場合、自家あるいは他家において目的とする機能を有する細胞を培養装置で増殖させて患者に移植する細胞培養技術がベースとなる。ところが、そのベースとなるべき細胞培養技術には解決されていないいくつかの基本的な課題が存在しており、再生医療の普及を阻んでいる。
【０００５】
その課題の一つとして、患者毎の細胞の厳格な識別性を確保しつつ、増殖させた細胞を効率良く回収することができる培養容器および培養システムの技術が現状で確立されていないことが挙げられる。
【０００６】
また、従来技術では、種とする細胞は患者自身の血液や組織より分離採取されるが、これを移植に必要とされる細胞数（１０７〜１０９個レベル）まで増殖させるには大量の血液や組織を必要とするため、患者の負担が大きくなることが避けられなかった。
【０００７】
このような細胞数の大量培養手段として、半透過性の中空糸膜を充填したモジュールを利用する培養装置が普及している。この種の培養装置は、個別識別性に優れ、複数の培養を同時に行うのにも適している。
【０００８】
例えば、特許文献１には、半透過性管状膜（キャピラリ：本願の「中空糸」に相当）束をガラス製の殻に内封して細胞培養ユニットとし、キャピラリに栄養素媒質を循環することによってキャピラリ表面に付着した細胞を増殖させる技術が開示されている。
【特許文献１】特開昭４９−４１５７９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、従来のモジュール培養は、モノクローナル抗体生産のように細胞の分泌成分を培養液中に回収することを目的としたものであり、モジュール内に増殖した細胞を回収するようには構成されておらず、内部に存在する細胞の生死や生理活性維持に配慮されているとも言えない。
【００１０】
すなわち、従来のモジュール培養においては菌汚染や液漏れ回避の観点から、培養操作において破損する虞れのない強度と密封性を備えたモジュールを使用することが是とされているため、モジュール内から付着性細胞を回収する場合、トリプシン処理によって細胞剥離を行うことが一般的であるが、モジュール構造における密封性の高さが障害となって細胞回収処理が行いにくく、細胞回収率が低かったり、また、過度の処理によって細胞を傷めるという問題があり実用的ではなかった。
【００１１】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、培養した細胞を傷めず効率良く回収することができる細胞培養用中空糸束モジュールを提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、半透膜素材からなる中空糸を束ねた中空糸束と、この中空糸束と培養液を収納するとともに培養液導入部と培養液排出部が備えられたハウジングと、を有する細胞培養用中空糸束モジュールにおいて、上記ハウジング内に収納された中空糸束の少なくとも一方端部を切断するための切断用開口部がハウジングに形成されるとともに、その切断用開口部を解除可能に封止する封止体が設けられ、さらにハウジング端部に、一方端部で切断されて自由端を得た中空糸束をハウジングから抜脱するためのハウジング分割部が備えられている細胞培養用中空糸束モジュールである。
【００１３】
本発明における細胞培養用中空糸束モジュールは、中空糸内に培養液を循環させ、その中空糸膜を透過した培養液成分を、中空糸外部に存在する細胞に供給するものであり、その中空糸は、例えば再生セルロース、セルロースエステル、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチルあるいはポリカーボネートから選択される１種類の材料から、或いは複数種類の材料を組み合わせた混合体から構成することができる。
【００１４】
本発明における中空糸束とは、１本または２本以上の中空糸がハウジング内にその長手方向に配置されたものを意味する。また、半透膜とは溶液の一部の成分は通過させるが、他の成分は通さない選択的透過性能を有するものであり、例えば、孔径によって通す成分を調整することができる多孔質膜等が示される。また、上記中空糸は、表面を親水化処理されたものを使用することが好ましい。細胞親和性が増すと共に、培養液成分の膜透過性も向上するからである。
【００１５】
本発明において、上記切断用開口部としてハウジングの筒軸方向と直交する方向に切り欠かれたスリットを有することができる。
【００１６】
本発明において、上記封止体として切断用開口部に熱収縮フィルムを巻き付けることができる。
【００１７】
本発明において、上記スリット近傍のハウジング外周壁にねじ部を形成し、封止体としてそのねじ部に螺合するユニオンナットを有することができる。
【００１８】
本発明において、上記スリットを挟んでその両側のハウジング外周壁に鍔部または環状溝を形成し、封止体としてそれらの鍔部または環状溝に締め付け固定されるクランプを有することができる。
【００１９】
本発明において、上記クランプの内面に、切断用開口部に嵌合し得る凸部を形成することができる。
【００２０】
本発明において、上記封止体としてスリットに被着される樹脂製または金属製カバーを有することができる。
【００２１】
本発明において、上記スリット縁部にシール材を周設することが好ましい。
【００２２】
本発明において、上記切断用開口部としてハウジングの一方端部から管軸方向と直交する方向に筒状部を延設し、この筒状部先端の開口を閉塞する蓋体または上記筒状部内を埋める栓体を備えることができる。
【００２３】
本発明において、上記ハウジング分割部に、雄ねじ部と雌ねじ部から構成される管継手を備えることができる。
【００２４】
本発明において、上記中空糸束は、中空糸に沿わせて任意本数の細胞付着成育用繊維束を補助的に有することができる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、中空糸束モジュール内で培養した細胞が付着した中空糸束を、損傷また損失することなく容易に外部に取り出すことができるため、細胞の回収効率を高めることができるという長所を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
図１は本発明に係る細胞培養用中空糸束モジュール（以下、中空糸束モジュールと略称する）の構成を示したものであり、同図(ａ)は正面図、同図(ｂ)はそのＣ−Ｃ矢視側面図を示している。なお、図１(ａ)においてハウジングの中心軸Ａより上側は内部構成を示すために断面で表している。
【００２７】
ａ  ハウジング
中空糸束モジュール１は、樹脂製のハウジング２を有しており、このハウジング２は筒部２ａとこの筒部２ａの両端を封止するキャップ２ｂおよび２ｃとから主として構成されている。
【００２８】
各キャップ２ｂ，２ｃは筒部２ａの端部に形成されているねじ部に螺合されるようになっており、一方のキャップ２ｂには培養液を導入するための培養液導管（培養液導入部）２ｄが中心軸Ａ上に備えられ、他方のキャップ２ｃにはハウジング２内に導入された培養液を排出するための培養液排出管（培養液排出部）２ｅが同じく中心軸Ａ上に備えられている。
【００２９】
なお、上記培養液導管２ｄおよび培養液排出管２ｅは、中空糸束モジュール１の構成を説明するために便宜上区別したものであり、中空糸束モジュール１には方向性がないため、キャップ２ｃ側から培養液を導入すれば、２ｅが培養液導管、２ｄが培養液排出管となる。
【００３０】
なお、上記ハウジング２の材質としては例えば、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、アクリル樹脂などを挙げることができるが、このうち、ポリカーボネート、ポリスルホンを選択することが好ましい。これら材質は、耐熱性が高いため高圧蒸気滅菌を行うことが可能となり、効率的な滅菌処理を行うことができるからである。また、透明性が高いため細胞の培養状態を肉眼で確認しやすいという利点もある。
【００３１】
上記筒部２ａにおける下流側端部（ハウジングの端部）２ｆ（図中、Ｂで示す培養液の流れ方向において）は、筒部２ａに対しねじ部を介して接続される別部品からなり、筒部２ａと同じ内径を持つ筒形状をなしている。
【００３２】
なお、上記キャップ２ｅは上記下流側端部２ｆの胴部外壁に形成されているねじ部２ｇを介して螺合されるようになっている。したがって、ねじ部２ｇを介して接続される筒部２ａ端部と下流側端部２ｆは管継手を構成しており、ハウジング分割部として機能するようになっている。
【００３３】
また、図中、３はキャップ２ｂと筒部２ａとの隙間、筒部２ａと下流側端部２ｆとの隙間、下流側端部２ｆとキャップ２ｃとの隙間をそれぞれシールするＯリングである。
【００３４】
また、筒部２ａの下流側寄りおよび上流側寄りには細胞挿入管４ａ，４ｂがそれぞれ備えられており、各細胞挿入管４ａ，４ｂは中心軸Ａと直交する方向で且つ反対向きに筒部２ａから突設されている。なお、細胞挿入管４ａ，４ｂの配置は上記反対向きに限らず、同方向に離れて形成したものであってもよい。
【００３５】
なお、上記細胞挿入管４ａ，４ｂは、デッドスペースを作らずに細胞を効果的に挿入する目的で二つ配設されているものであり、いずれか一方がガス抜きとして使用されることもある。
【００３６】
さらに、筒部２ａの一方端部（本実施形態では上流側）には後述する中空糸束５を切断するためのスリット６ａ，６ｂが切断用開口部として形成されており、このスリット６ａ，６ｂを通じて、ハウジング２内に収納された中空糸束５の一部が露出するようになっている。
【００３７】
図１(ｂ)はそのスリット６ａ，６ｂの形状を説明すべく、図１(ａ)のＣ−Ｃ矢視方向から見た断面を表している。
【００３８】
図１(ｂ)に示すように、上側のスリット６ａは中心軸Ａと直交する方向に、且つ筒部２ａの胴部を円弧状に切り欠くことによって形成されている。下側のスリット６ｂはスリット６ａと点対称（中心軸Ａを中心として）となるように形成されている。また、スリット６ａとスリット６ｂは、連絡部２ｈおよび２ｉによって仕切られている。
【００３９】
上記スリット６ａ，６ｂの外側には封止体としての熱収縮フィルム７がリング状に被着され、加熱されることによって収縮しスリット６ａ，６ｂを閉塞するようになっている。それにより、培養液導管２ｄからハウジング２内に培養液を導入した際に、上記スリット６ａ，６ｂから培養液が漏出することを防止している。
【００４０】
なお、図中、Ｗは熱収縮フィルム７の幅を示しており、８はスリット６ａ，６ｂの縁部に設けられたＯリングを示している。
【００４１】
また、上記実施形態ではスリット６ａとスリット６ｂを対向した状態で上下に二カ所形成したが、各スリットの配置については上下に限らず、左右或いは斜めに対向して配置することもできる。なお、スリットの配置については対向配置に限定されるものではない。
【００４２】
また、スリットの個数は、連結部の強度が確保できる範囲内であれば二カ所以上形成することができ、これら各スリットは筒部２ａにおける胴部円周上に等間隔または任意の間隔で配置することができる。
【００４３】
上記構成を有するハウジング２によれば、ＩＣＳ（中空糸内の空間）とＥＣＳ（中空糸外側とハウジング２によって形成される空間）が隔離された状態で形成され、ＩＣＳには培養液導管２ｄおよび培養液排出管２ｅが連通し、ＥＣＳには細胞挿入管４ａ，４ｂが連通しているため、ハウジング２のＥＣＳ内に細胞を投入し、培養液導管２ｄおよび培養液排出管２ｅを通じて培養液を循環させれば、循環する培養液の流れに細胞は直接接触することなく、半透膜機能を有する中空糸束５の各中空糸膜孔を通過した培養必要成分のみが細胞と接触することになる。それにより、培養液流による剪断力の影響を受けることなく細胞を培養することが可能になる。
【００４４】
ｂ  中空糸束
中空糸束５は、半透膜機能を有する中空糸５ａを複数本束ねたものからなり、ルーメンに培養液を循環させることにより、ＥＣＳに存在する細胞に対し培養液中に含まれる生育必須成分を提供するようになっている。また、同様に、細胞の分泌する老廃成分が培養液中に排出される。
【００４５】
上記中空糸束５は、細胞との親和性を考慮して例えば、再生セルロース、セルロースエステル、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチルあるいはポリカーボネートの中から選択される１種のポリマー、または２種以上の混合体で構成することができる。
【００４６】
さらに、表面を親水化処理することにより、ポリエチレン、ポリプロピレン、ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフルオライド）等の疎水性ポリマーを素材として使用することもできる。親水化処理を行うことによって、細胞親和性が増すと共に、培養液成分の膜透過性も向上する。
【００４７】
かかる例示において、中空糸束５が１種のポリマーからなるとは、各中空糸５ａのすべてがそのポリマーからなることを意味する。また、混合体で構成されるとは、中空糸束５が、結果として複数のポリマーを有していればよい。例えば、各中空糸５ａそれぞれがすべてその混合体から構成されてもよく、また、一部の中空糸５ａは任意の１種のポリマーからなり、別の中空糸５ａは別の任意のポリマーからなり、全体として束を形成したときに複数のポリマーを含むような構成も含まれる。
【００４８】
本発明の中空糸束モジュール１に使用する中空糸束５は、上記したポリマーのうち、再生セルロース、セルロースエステル、ポリスルホン、ポリエーテルスルホンから構成したものであることがより好ましい。なぜなら、細胞の培養においては、予め中空糸束モジュール１を滅菌しておくことが必要であるから、耐熱性の高い再生セルロース、セルロースエステル、ポリスルホン、ポリエーテルスルホンを用いれば、高圧蒸気滅菌が可能となり、滅菌処理を効率的に行うことができるからである。
【００４９】
また、上記親水化処理方法としては、例えば、ポリビニルピロリドン、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、アルコールなどによる処理が挙げられ、アルコールとしては、エタノール、イソプロパノール等が挙げられる。このうち、ポリビニルピロリドン処理は中空糸表面により安定的な親水性を付与することができる点で好ましい。
【００５０】
上記中空糸５ａの半透膜における孔径（以下、膜孔径という）は、培養液中の培養必要成分を中空糸のＩＣＳからＥＣＳに通過させることができ、また、逆に、細胞分泌老廃成分をＥＣＳからＩＣＳへ通過させることができ、培養しようとする細胞を通過させないものであれば特に限定されるものではない。
【００５１】
ただし、膜孔径が小さくなれば膜強度は強くなる反面、物質交換率は小さくなる。一方、膜孔径が大きくなれば膜強度は弱くなるが、物質交換率は大きくなる。したがって、これらの特性において所望の膜強度と物質交換率を得ようとすれば、中空糸５ａの平均膜孔径は、０．００１〜２μｍであることが好ましく、より好ましくは０．００５〜０．２μｍである。
【００５２】
また、種々の細胞増殖因子、分化誘導因子を添加する必要がある場合、これら因子をＥＣＳ内に封入することができ、且つコスト削減を可能にすることも考慮すれば、孔径は、０．００５〜０．０１μｍであることがより好ましい。
【００５３】
上記中空糸５ａの内径としては、培養液を循環させることができる太さであれば、特に限定されないが、高い膜透過性を確保する観点から細い中空糸が好ましく、０．１〜３ｍｍの範囲のものを使用することができるが、加工が容易であること、また、培養液中に生じた不溶成分による目詰まりを抑制し得ることも考慮すると、０．２〜１ｍｍの範囲のものを選択することがより好ましい。
【００５４】
また、上記中空糸５ａの本数、膜厚は、本発明の細胞培養を可能とするものであれば特に限定されないが、必要とする細胞数、培養細胞の栄養、酸素要求性、中空糸束モジュール１内のＥＣＳの体積との関係等で適宜調整することが好ましい。
【００５５】
なお、上記中空糸５ａは、ハウジング２内に収納された後、中空糸両端部の開口を保持した状態で封止材を用いて中空糸間隙が封鎖され、両端部が糊付け固定される。具体的には、束ねられた中空糸５ａの一方端部は、ハウジング２を構成している筒部２ａにおいてその上流側端部の胴部内壁に固定され、他方端部は筒部２ａに対し螺合によって接続されている下流側端部２ｆの胴部内壁に固定される。なお、中空糸５ａを固定する封止材としては、例えばウレタン樹脂、エポキシ樹脂などを使用することができる。
【００５６】
このようにして構成された半透膜機能を有する中空糸束５は、培養液導管２ｄおよび培養液排出管２ｅを通じてＩＣＳに培養液を循環させることによりＥＣＳに存在する細胞に生育必須成分を供給し、代謝成分を拡散除去することができる。
【００５７】
ｃ  培養液
上記培養液は、培養しようとする細胞の生育必須成分を含有するものであれば、従来公知のいかなる培養液も用いることができ、特に限定されない。また、細胞の生育必須成分とは、培養しようとする細胞が増殖するうえで必要不可欠な成分であり、種々の有機物、無機物で構成され、酸素等を供給するための溶存ガスも含まれる。かかる培養液として例えば、ダルベッコＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ハムＦ１２等の汎用培地に、血清あるいは各種増殖因子、分化誘導因子を添加して作成した培地等が用いられる。
【００５８】
尚、培養に際して培養液は、適当な容器に収納し、ポンプにて繰り返しＩＣＳ内を循環させるが、一過性の培養液の供給を排除するものではない。本発明において、培養液の「循環」には、一過性の供給が含まれる。
【００５９】
上記中空糸束５に対する、ＥＣＳの体積比率は、細胞の種類、培養細胞密度等必要に応じて適宜設定することができるが、１以上２０以下が好ましい。１以上とすることにより、モジュール内に投入する細胞量を多くすることができ、細胞が増殖する空間も十分に供給することができる。
【００６０】
また、２０以下とすることにより、中空糸束モジュール１内の細胞への生育必須成分の供給不足を回避することが可能となる。最も好適に細胞培養を行うには、２以上６以下が好ましい。尚、上記体積比率における中空糸束５の体積は、各中空糸５ａのうち、モジュール内でＥＣＳと接触する部分の体積であり、中空糸５ａ断面外周によって形成される断面積（中空部分も含む）と中空糸長さの積の総和で表すことができる。
【００６１】
なお、後述する細胞付着成育用繊維束を使用した場合、中空糸束５の体積とは、中空糸５ａの断面積と中空糸長さを乗じた値と、細胞付着成育用繊維束の断面積と細胞付着成育用繊維束の長さを乗じた値とを加えた総和で表すことができる。
【００６２】
このような体積比率となるよう、上記中空糸束５の本数などを適宜設定することが好ましい。
【００６３】
ｄ  細胞培養方法および培養細胞回収方法
次に上記構成を有する中空糸束モジュール１を用いた細胞培養方法および培養された細胞の回収方法について説明する。
【００６４】
細胞は、中空糸膜を通じて十分な栄養成分および酸素の供給を受けるので、高密度に増殖することができる。
【００６５】
ＥＣＳ内で高密度化した培養細胞は、中空糸５ａ表面に直接付着するか、あるいは細胞付着担体、具体的には、中空糸に沿わせて任意本数用意された、細胞親和性を有する例えばポリオレフィン系樹脂、ポリエステル系樹脂等の高分子材料からなる細胞付着成育用繊維束、または、セラミックス、ガラス等の無機材料からなる細胞付着成育用繊維束を介して間接的に中空糸５ａ表面に付着する。なお、間接的に付着するとは、中空糸５ａの間隙あるいは中空糸５ａとハウジング１との間隙に存在することも含む。
【００６６】
また、培養細胞を回収するとは、中空糸５ａ表面に直接、あるいは細胞付着担体を介して間接的に付着した細胞を回収することを表し、中空糸５ａ間隙に存在する細胞あるいは中空糸５ａとハウジング１との間隙に存在する細胞を回収することも含む。
【００６７】
再生医療用の細胞増殖手段としては、細胞本来の機能を保持した増殖が可能な三次元培養が必要とされ、一般に、中空糸束モジュールによる培養は三次元培養の条件を備えていると考えられている。この三次元培養では、適切な細胞付着担体（上記した細胞付着成育用繊維束）を細胞増殖空間に介在させることが好ましい。
【００６８】
なお、本発明の細胞付着成育用繊維束は、細胞親和性を有する繊維を糸条の形態で、あるいは短冊状の繊維片として中空糸束５間に介在させた形態（例えば特開2002−112763号）で、または、断面方向から見て渦巻き状となるように巻回されたシート体として中空糸束５間に挟み込んだ形態で、それぞれ使用することができる。
【００６９】
これらの細胞培養法では、細胞とともにマイクロキャリアあるいはゲルを、上記細胞挿入管４ａ（または４ｂ）から投入し、上述した培養液を、培養液導管２ｄおよび培養液排出管２ｅによってＩＣＳに循環させることによって細胞を培養することができる。また、培養液循環速度、培地交換の有無、酸素添加方法といった培養条件は、細胞の種類、細胞濃度等に応じて適宜設定することができる。
【００７０】
上記のａ，ｂ，ｃ，ｄに示した各構成要素および回収方法に関しては、夫々の項で説明した技術手段に限定されず、従来公知のモジュール構造や細胞培養手段、さらにはそれらの改良、改善技術を本発明の課題達成に悪影響を与えない範囲で自由に適用することが可能である。
【００７１】
本発明のモジュール構造の特徴的部分を実施例に基づいて説明するが、もとより、これらの説明は例示的なものに過ぎず、限定的なものではない。
【００７２】
実施例
内径２００μｍ、膜厚１０μｍの再生セルロース製中空糸を約１５００本（中空糸内総面積は約９２０ｃｍ２）束ねて中空糸束として、次に、細胞支持体として繊維直径２５０μｍのポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）繊維を２００本束ねた繊維束（長さ１３１ｍｍ）を用意し、上記中空糸束：ＰＥＴ繊維束＝１３：２の割合で各中空糸間に均等に分散配置し、これら中空糸およびＰＥＴ繊維からなる繊維束をポリカーボネート製ハウジング（長さ１７７ｍｍ，直径３０ｍｍ）内に配置し封入した。
【００７３】
なお、中空糸と細胞支持体の両端の一方はウレタン樹脂を用いて筒部２ａの端部に、他方は下流側端部２ｆにそれぞれ固定した。
【００７４】
また、中空糸の孔径は０．００２〜０．００５μｍであり、ハウジング２内の容積に対し中空糸と細胞支持体が占める容積は約３２％となるように調整した。
【００７５】
図２は本発明の中空糸束モジュール１を用いて組み立てられた小型培養装置の培養回路図を示したものである。
【００７６】
細胞培養を行う前に、回路、中空糸束モジュール１はＥＯＧ滅菌を行った。
【００７７】
培養液ボトル１０には１００ｍｌの液体培地（The mES cell culture medium consisted of 80％ (V/V) knockout(KO) DMEM, 4mM Gultamine, 100μM MEM-non-essential acid, 55 μM 2-mercaptoethanol 〔2-ME〕(invitorogen) 100U/ml penicillin and 100μg/ml streptomycin (Sigma)  を入れた。
【００７８】
小型培養装置 CellMax (Spectrum)に循環させる液体培地は、培養液ボトル１０から循環ポンプ１１を介して吐出され、ガス交換機１２により炭酸ガス濃度が５％に調整され、５０ｍＬ／分の流速で回路１３，１４を循環させた。
【００７９】
ハウジング２内の細胞培養スペース１５には、上述した液体培地に１０３U/ml LIF (ESGRO, Chemicon International Temecula.CA), 20％(v/v) of Fetal bovine serum (JRH Biosciences)を加えた。
【００８０】
細胞培養スペース１５（１２．２ｍｌ）にマウス胚性幹細胞（Ｒ1細胞）を２．９×１０５個／ｍｌとなるように注入し、２１日間培養を行った。
【００８１】
細胞回収は、中空糸束モジュール１をＰＢＳで洗浄した後、その中空糸束モジュール１に設けられているスリット６ａ，６ｂ（図１(ａ)参照）をカバーしている熱収縮フィルム７を切断して取り除き、スリット６ａ，６ｂから覗くことができる中空糸束５の上流側端部を、メスを用いて直径方向に切断した。
【００８２】
次いで、キャップ２ｃと共に下流側端部２ｆを筒部２ａから外せば、中空糸束５を簡単にハウジング２から抜き出すことができる。
【００８３】
抜き出した中空糸束５を観察すると、細胞コロニーが中空糸数本に跨がった状態で付着していることが確認された。
【００８４】
その後、トリプシンを用いて培養細胞を中空糸から剥離させた。回収した細胞数は、１．０×１０９個、細胞密度は８．７×１０７／ｍｌに達した。生存率は７４％であった。
【００８５】
従来の静置培養では６．０×１０５／ｍｌ程度の細胞密度しか得られなかったため、１４５倍の高密度の細胞が回収できたことになる。
【００８６】
回収した細胞は引き続き、５日間、シャーレで培養を行い、無菌的に回収できたことを確認した。
【００８７】
図３は本発明に係る中空糸束モジュールの第二実施形態を示したものである。
【００８８】
なお、以下に説明する各図において図１(ａ)と同じ構成要素については同一符号を付してその説明を省略する。
【００８９】
図３に示す中空糸束モジュール２０が上記の中空糸束モジュール１と異なる点は、筒部２ａとその下流側端部２ｆ′が螺合されておらず、単に突き合わされた状態で接続されていることにある。
【００９０】
詳しくは、筒部２ａと下流側端部２ｆ′における接続側端部にはそれぞれＯリング２１，２１が周設されており、このＯリング２１，２１を備えた両接続側端部に跨がって熱収縮フィルム２２がリング状に設けられている。この熱収縮フィルム２２は上記した熱収縮フィルム７と同様の方法で両接続側端部に被着され、筒部２ａと下流側端部２ｆ′とを解除可能に接続している。なお、上記筒部２ａと下流側端部２ｆ′はハウジング分割部として機能する。
【００９１】
このように、下流側端部２ｆ′を突き合わせによって筒部２ａと接続する構成によれば、スリット６ａ，６ｂをカバーしている熱収縮フィルム７を切断して取り除き、中空糸束５の上流側端部を切断した後、熱収縮フィルム２２を切り取れば、中空糸束５を簡単に筒軸方向Ａに引き抜くことができるという利点がある。
【００９２】
図４は本発明に係る中空糸束モジュールの第三実施形態を示したものである。
【００９３】
同図に示す中空糸束モジュール３０が上記の中空糸束モジュール１と異なる点は、スリット６ａおよび６ｂを備えておらず、筒部２ａの上流側端部２ｊが分割できる構成になっていることにある。
【００９４】
詳しくは、筒部２ａの下流側端部２ｆ′は上記図３に示した下流側端部２ｆ′と同じ構成からなり、筒部２ａと下流側端部２ｆ′とは突き合わされた状態で接続され、その突き合わせ部分に熱収縮フィルム２２が被着され両者を固定している。
【００９５】
一方、筒部２ａに対しその上流側端部２ｊも独立した部品で構成されており、上流側端部２ｊも下流側端部２ｆ′と同様に突き合わされた状態で筒部２ａに接続されている。筒部２ａと上流側端部２ｊにおける接続側端部にはそれぞれＯリング３１，３１が装着されており、このＯリング３１，３１を備えた両接続側端部に跨がって熱収縮フィルム３２が被着され、両者を固定している。
【００９６】
このように、筒部２ａの上流側端部２ｊおよび下流側端部２ｆ′をそれぞれ突き合わせによって接続し、容易に分離することができるように構成すれば、熱収縮フィルム２２を切り取ると、筒部２ａと上流側端部２ｊとの間に隙間が生じて切断用開口部が形成される。その切断用開口部を利用して中空糸束５の上流側端部を切断することができ、さらに、熱収縮フィルム３２を切り取れば、中空糸束５を筒軸方向Ａに引き抜くことができ、中空糸束５のみを筒部２ａから簡単に取り外すことができる。
【００９７】
また、上流側端部２ｊと下流側端部２ｆ′は実質的に同じ構成であるため、いずれか一方を切断用開口部とすれば、他方はハウジング分割部となり、この逆に、いずれか一方をハウジング分割部とすれば、他方は切断用開口部として機能することになる。
【００９８】
図５(ａ)〜(ｅ)は、図１に示した中空糸束モジュール１のスリットを封止する封止構造の変形例を模式的に示したものである。
【００９９】
図５(ａ)に示す中空糸束モジュール４０は、熱収縮フィルムによる封止に代えてユニオンシール方式を採用したものである。
【０１００】
スリット６ａ，６ｂの上流側縁部には鍔部２ｋが周設されており、この鍔部２ｋの外周面にユニオンねじ２ｋ′が形成されている。また、鍔部２ｋにおける外周縁にＯリング４１ａが装着されている。一方、スリット６ａ，６ｂの下流側縁にも鍔部２ｍが周設されており、この鍔部２ｍにおける下流側の環状側壁にＯリング４１ｂが装着されている。
【０１０１】
４２は筒部２ａを軸通させる貫通孔を有し、断面Ｌ字状（正面から見て）に形成されたユニオンナットであり、その胴部内壁には上記ユニオンねじ２ｋ′と螺合し得るねじ部が備えられている。このユニオンナット４２をユニオンねじ２ｋ′に螺合させて締め付ければ、Ｏリング４１ｂを挟み込んだ状態でスリット６ａ，６ｂを封止することができる。
【０１０２】
図５(ｂ)に示す中空糸束モジュール４５は、熱収縮フィルムによる封止に代えてリングベルトシール方式を採用したものである。
【０１０３】
スリット６ａ，６ｂの上流側縁部および下流側縁部にはそれぞれ鍔部２ｎおよび２ｐが周設されており、これらの鍔部２ｎおよび２ｐを跨がるようにしてリング状のゴム製ベルト４６が被着され、このベルト４６の外側から金属製のクランプバンド４７を締め付けることにより、スリット６ａおよび６ｂを封止することができる。
【０１０４】
図５(ｃ)に示す中空糸束モジュール５０は、熱収縮フィルムによる封止に代えてＯリングシール方式を採用したものである。
【０１０５】
スリット６ａ，６ｂの上流側縁部および下流側縁部にはそれぞれＯリング５１，５１が装着されており、これらのＯリング５１，５１の外側から金属製のクランプバンド５２を締め付けることにより、スリット６ａおよび６ｂを封止することができる。なお、図中２ｑは筒部２ａの胴部外壁に形成された環状溝であり、クランプバンド５２においてその管軸方向両端部に内向きに形成されている環状突部を係合させるためのものである。
【０１０６】
図５(ｄ)に示す中空糸束モジュール５５は、図５(ｃ)に示したＯリングシール方式においてクランプバンド５２に代えて凸型クランプ５６を採用したものである。
【０１０７】
この凸型クランプ５６は、スリット６ａおよび６ｂに嵌合し得る凸部５６ａ，５６ａを備えており、それらの凸部５６ａ，５６ａをスリット６ａ，６ｂに嵌め込むことにより凸型クランプ５６を位置決めした状態で、スリット６ａおよび６ｂを封止することができるようになっている。
【０１０８】
図５(ｅ)に示す中空糸束モジュール６０は、一つのスリット６ｃを有し、そのスリット６ｃをワンタッチで封止できるように構成したものである。
【０１０９】
スリット６ｃの開口周囲に沿ってガスケット６１が装着されており、スリット６ｃの開口を閉じるようにして着脱式のカバー６２が装着される。このカバー６２は円弧状に成形されており、その長手方向両端にはフック６２ａ，６２ａが突出した状態で形成されている。一方、筒部２ａの胴部外壁にはそれらのフック６２ａ，６２ａと対応してスリット６ｃの近傍にフック溝６３ａ，６３ａ（図では手前側のみ図示）が形成されている。
【０１１０】
したがって、カバー６２のフック６２ａ，６２ａをフック溝６３ａ，６３ａに嵌め込めば、ガスケット６１を介してスリット６ｃを封止することができる。
【０１１１】
次に、図６(ａ)〜(ｃ)は図１に示した中空糸束モジュール１について切断部の変形例を模式的に示したものである。
【０１１２】
図６(ａ)に示す中空糸束モジュール６５は、筒部２ａの一部に切断部としての円筒部（筒状部）６６を中心軸Ａと直交する方向に立設したものである。
【０１１３】
この円筒部６６の上端部外周面には雄ねじ部６６ａが形成されており、この雄ねじ部６６ａと螺合し得る雌ねじ部を備えた円盤状のキャップ（蓋体）６７が、円筒部６６の開口を封止する蓋として取り付けられるようになっている。なお、円筒部６６の開口縁部にはＯリング６８が装着されている。
【０１１４】
この構成ではキャップ６７を取り外し、円筒部６６の上部開口からメス等の切断具を挿入すれば、中空糸束５を切断することができる。
【０１１５】
図６(ｂ)に示す中空糸束モジュール７０は図６(ａ)のモジュールと同様に筒部２ａの一部に、切断部としての円筒部７１を備えている。
【０１１６】
ただし、円筒部７１の先端縁部にはＯリング７２が装着されており、このＯリング７２の外側から円盤状のキャップ（蓋体）７３を装着するようになっている。また、キャップ７３の側面には円筒部７１の先端部外壁に係止し得るフック７３ａ，７３ａが備えられており、フック７３ａ，７３ａを円筒部７１に係止させれば、Ｏリング７２を挟んだ状態で円筒部７１の上部開口を封止することができる。
【０１１７】
図６(ｃ)に示す中空糸束モジュール７５は、筒部２ａの側面の一部に切断部としての角筒部（筒状部）７６を中心軸Ａと直交する方向に形成している。
【０１１８】
この角筒部７６の先端縁部にはガスケット７７が矩形状に装着されており、このガスケット７７の外側から矩形状のキャップ（蓋体）７８を装着するようになっている。キャップ７８の４辺の側壁には角筒部７６の側面に係止し得るフック７８ａ〜７８ｄが備えられており、フック７８ａ〜７８ｄを角筒部７６に係止させれば、ガスケット７７を挟んだ状態で角筒部７６の開口を封止することができる。
【０１１９】
なお、上記蓋体６７、７３、７８に代えて、各筒部６６、７１、７６に嵌合して筒部内を埋める栓体を装着することもできる。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】(ａ)は本発明に係る中空糸束モジュールの構成を一部断面で示した正面図、(ｂ)は図１(ａ)のＣ−Ｃ矢視断面図である。
【図２】中空糸束モジュールを用いた細胞培養回路図である。
【図３】中空糸束モジュールの第二実施形態を示す正面図である。
【図４】中空糸束モジュールの第三実施形態を示す正面図である。
【図５】(ａ)〜(ｅ)は中空糸束モジュールに係るスリット封止構造の変形例を示す模式図である。
【図６】(ａ)〜(ｃ)は中空糸束モジュールに係る切断部の変形例を示す模式図である。
【符号の説明】
【０１２１】
１  中空糸束モジュール
２  ハウジング
２ａ  筒部
２ｂ，２ｃ  キャップ
２ｄ  培養液導管（培養液をＢ方向に循環させた場合）
２ｅ  培養液排出管（培養液をＢ方向に循環させた場合）
２ｆ  下流側端部（培養液をＢ方向に循環させた場合）
２ｇ  ねじ部
２ｈ，２ｉ  連絡部
３  Ｏリング
４ａ，４ｂ  細胞挿入管
５  中空糸束
６ａ，６ｂ  スリット
７  熱収縮フィルム
８  Ｏリング
１０  培養液ボトル
１１  循環ポンプ
１２  ガス交換機
１３，１４  回路
１５  細胞培養スペース（ＥＣＳ）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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