(57)【要約】【課題】核酸試料液中の核酸分子から特定物質と相互作用する核酸分子を効率よく得る。【解決手段】支持体を被覆した非膨潤性の固定化膜に特定物質を固定化し、固定化された特定物質と核酸試料液中の核酸分子と接触させ、支持体表面における近接場光を利用した分析を行うことにより、前記固定化特定物質と前記核酸分子との相互作用量を得ながら、得られた前記相互作用量に基づいて、前記核酸試料液中の核酸分子から前記特定物質と相互作用する核酸分子を選別する工程を含む核酸分子スクリーニング方法により、目的核酸分子を選別する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸試料液中の核酸分子から、核酸以外の特定物質に特異的に相互作用する核酸又は核酸誘導体である目的核酸分子をスクリーニングする核酸分子スクリーニング方法であって、
支持体上を被覆すると共に乾燥状態の膜厚と比較して３倍以下の水中平均膜厚を有する固定化膜に、前記特定物質を固定化して、固定化特定物質を得る固定化工程と、
前記核酸試料液中の核酸分子と前記固定化特定物質とを接触させる接触工程と、
前記支持体表面における近接場光を利用した分析を行って前記固定化特定物質と前記核酸分子との相互作用量を得ながら、得られた相互作用量に基づいて、前記核酸試料液中の核酸分子から前記目的核酸分子を選別する選別工程と、
を含む核酸分子スクリーニング方法。
【請求項２】
前記水中平均膜厚が３０ｎｍ以下である請求項１記載の核酸分子スクリーニング方法。
【請求項３】
前記固定化膜が、疎水性高分子膜又は自己組織化膜（ＳＡＭ）である請求項１又は２記載の核酸分子スクリーニング方法。
【請求項４】
前記自己組織化膜（ＳＡＭ）が、水酸基と、特定物質を結合するための官能基とを有することを特徴とした請求項３項に記載の核酸分子スクリーニング方法。
【請求項５】
前記選別工程によって選別された目的核酸分子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって増幅する増幅工程、を更に含む請求項１〜４のいずれか１項記載の核酸分子スクリーニング方法。
【請求項６】
前記増幅工程によって得られた増幅目的核酸分子を回収して、少なくとも前記接触工程及び選別工程を繰り返す請求項３記載の核酸分子スクリーニング方法。
【請求項７】
前記目的核酸分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びこれらの誘導体からなる群より選択されたものである請求項１〜６のいずれか１項記載の核酸分子スクリーニング方法。
【請求項８】
前記近接場光を利用した分析が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析である請求項１〜７項のいずれか１項記載の核酸分子スクリーニング方法。
【請求項９】
請求項１〜８項のいずれかに記載の核酸分子スクリーニング方法で得られた目的核酸分子を用いて、該目的核酸分子と相互作用する特定物質の検出又は定量を行う特定物質検出・定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸分子スクリーニング方法及び核酸分子スクリーニング装置に関し、特に、核酸試料液中の核酸分子から、選択された特定物質に特異的に相互作用する核酸又は核酸誘導体である目的核酸分子をスクリーニングする核酸分子スクリーニング方法及び、これにより得られた核酸分子を用いた特定物質検出・定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定のタンパク質、薬剤などの非核酸物質に結合する核酸及び／又はその誘導体を、その多種の候補の中から選択することは１９９０年以来行われており、その結合性の核酸及び／又はその誘導体はアプタマーと一般的に呼ばれている。アプタマーは、抗体と同様に目的とする特定物質に結合できるだけでなく、高い親和性を有しており、かつ抗体に比べて作製が容易であるため、特定の静置活性部位に特定的なアプタマーを医療分野等に利用することが期待されている。このようなアプタマーを得るための方法としては、アフィニティカラムによる分離や、ＰＣＲによる増幅などの手法が利用されている（例えば特許文献１及び特許文献２）。
アプタマーとタンパク質などの特定物質との結合性を評価する方法としては、標識が不要であることと感度の高さから近接場光、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用する方法が挙げられる（例えば、非特許文献１）。また、表面以外の影響を受けずにバックグラウンドノイズを抑制できる点からも近接場光、例えば近接場光蛍光を利用する方法が挙げられる（例えば非特許文献２）。特にスクリーニングの操作中に結合性の評価を行い、その評価に基づいて任意の結合能を持つアプタマーだけを回収することができるため、スクリーニング効率が高いという利点を有している。（例えば非特許文献３）
【特許文献１】特開２００１−６１４７５号公報
【特許文献２】特開２００５−２４５２５４号公報
【非特許文献１】Journal of Biological Chemistry (2001) Vol.276, pp.21476-21481
【非特許文献２】Analytical Chemistry, (1998) Vol.70, pp.3419-3425
【非特許文献３】Analytical Biochemistry, (2005) Vol.342, pp.312-317
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記のようなＳＰＲ用測定チップに用いられる固定化膜は、主として糖誘導体で構成されているため、水を含んで膨潤し、三次元的な網目構造を形成する。この網目構造中に特定物質を固定化するが、この状態の固定化特定物質にスクリーニング目的で核酸を供給すると、固定化特定物質に特異的に結合するものが網目構造中に残るだけでなく、物理的に捕捉される核酸が網目構造中に物理的に残留する。また、特定物質を固定化させるための固定化膜上の官能基が溶液中でイオン化して負電荷又は正電荷を保持するため、全体的に負に帯電する核酸、もしくは全体的に正に帯電するペプチド核酸を供給すると、網目構造中で本来の結合能とは異なる力が働いて排除又は残留する場合がある。
【０００４】
従って、本発明は、核酸試料液中の核酸分子から所望の核酸分子を効率よく且つ精度よく得ることができる核酸分子スクリーニング方法及び特定物質検出・定量方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の核酸分子スクリーニング方法は、核酸試料液中の核酸分子から、核酸以外の特定物質に特異的に相互作用する核酸又は核酸誘導体である目的核酸分子をスクリーニングする核酸分子スクリーニング方法であって、支持体上を被覆すると共に乾燥状態の膜厚と比較して３倍以下の水中平均膜厚を有する固定化膜に、前記特定物質を固定化して、固定化特定物質を得る固定化工程と、前記核酸試料液中の核酸分子と前記固定化特定物質とを接触させる接触工程と、前記支持体表面における近接場光を利用した分析を行って（以後、近接場光分析と表記する）前記固定化特定物質と前記核酸分子との相互作用量を得ながら、得られた相互作用量に基づいて、前記核酸試料液中の核酸分子から前記目的核酸分子を選別する選別工程と、を含むことを特徴としている。
【０００６】
上記核酸分子スクリーニング方法では、前記水中平均膜厚が３０ｎｍ以下であることが好ましい。
また、前記固定化膜が、疎水性高分子膜又は自己組織化膜（ＳＡＭ）であることが好ましく、ここで前記自己組織化膜（ＳＡＭ）の場合には、水酸基と、特定物質を結合するための官能基とを有するものであることが更に好ましい。
【０００７】
また、上記核酸分子スクリーニング方法では、前記選別工程によって選別された目的核酸分子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって増幅する増幅工程、を更に含むことが好ましい。
増幅工程を設けた場合には、前記増幅工程によって得られた増幅目的核酸分子を回収して、少なくとも前記接触工程及び選別工程、好ましくは前記接触工程、選別工程及び増幅工程を、少なくとも１回繰り返すことが好ましい。
【０００８】
上記核酸分子スクリーニング方法では、前記近接場光分析が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析であることが好ましい。
【０００９】
本発明の固定化膜検出・定量方法は、上記核酸分子スクリーニング方法で得られた目的核酸分子を用いて、該目的核酸分子と相互作用する特定物質の検出又は定量を行うことを特徴としている。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、特定物質が固定化される固定化膜に、乾燥状態の膜厚と比較して３倍以下の水中平均膜厚を有する固定化膜を用いているので、核酸試料液中の核酸分子から所望の核酸分子を効率よく且つ精度よく得ることができる核酸分子スクリーニング方法及び特定物質検出・定量方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の核酸分子スクリーニング方法は、核酸試料液中の核酸分子から、核酸以外の特定物質に特異的に相互作用する核酸又は核酸誘導体である目的核酸分子をスクリーニングする核酸分子スクリーニング方法であって、支持体上を被覆すると共に乾燥状態の膜厚と比較して３倍以下の水中平均膜厚を有する固定化膜に、前記特定物質を固定化して、固定化特定物質を得る固定化工程と、前記核酸試料液中の核酸分子と前記固定化特定物質とを接触させる接触工程と、前記支持体表面における近接場光分析を行って前記固定化特定物質と前記核酸分子との相互作用量を得ながら、得られた相互作用量に基づいて、前記核酸試料液中の核酸分子から前記目的核酸分子を選別する選別工程と、を含むものである。
【００１２】
本方法では、支持体上を被覆すると共に乾燥状態の膜厚と比較して３倍以下の水中平均膜厚を有する固定化膜に特定物質を固定化し、核酸分子のスクリーニングを行っている。このような固定化膜は、水を含んで膨潤状態となっても水中平均膜厚が乾燥状態の３倍以下であるので、特定物質が内部に固定される程の網目構造が形成されず、特定物質は固定化膜の内部に侵入しにくくなる。この結果、特定物質と核酸分子との相互作用に対する固定化膜の物理的影響や静電的な影響を小さくすることができるため、核酸試料液中の核酸分子から所望の核酸分子を効率よく且つ精度よく得ることができる。さらに、本方法においては前記固定化特定物質と前記核酸分子との相互作用量を得るにあたり、固定化膜の影響を小さくできることは、その相互作用量解析の精度を高めることになる。
なお、本発明における核酸分子と特定物質との相互作用とは、物理的、化学的、もしくは生化学的な結合・会合反応をいう。
【００１３】
本発明における核酸分子としては、核酸又は誘導体を挙げることができ、ＤＮＡ、ＲＮＡの他に、これらの誘導体、即ち、天然に存在するＤＮＡ、ＲＮＡの一部を改変したものを含む。核酸誘導体としては、例えば、ＤＮＡと類似した構造を有し、ペプチド結合により骨格を形成する化合物であるＰＮＡ（ペプチド核酸）を挙げることができる。このような核酸分子のうち、本発明における目的核酸分子は、選択された特定のペプチド分子と特異的に相互作用する性質を有し、一般にアプタマーと呼ばれているものである。
【００１４】
核酸試料液を構成する溶液としては、核酸分子を安定して保持することができるものであればよく、一般にバッファー液として用いられているもの、例えば公知の緩衝溶液（化学便覧応用編改訂２版、１３１２頁〜１３２０頁）を基本に、食塩、金属イオン（マグネシウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオンなど）、安定化剤（ＤＴＴなど）などを添加したものを用いることができる。特に、ＰＢＳバッファー（リン酸バッファー生理食塩水）、Ｔｒｉｓバッファー、ＨＥＰＥＳバッファーなどが好ましく用いられる。
【００１５】
アプタマーをスクリーニングする際に目的となる特定物質は、核酸以外であれば特に限定されず、例えば免疫タンパク質、非免疫タンパク質、酵素、ビタミン、薬剤、低分子有機化合物、無機材料などを挙げることができる。
【００１６】
免疫タンパク質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。非免疫タンパク質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン、成長因子、プリオン、Ｔａｔペプチドなどを使用することができる。酵素としても特に限定されることはなくリン酸化酵素、ポリメラーゼ、脱水素酵素などを例示することができる。
【００１７】
ビタミンとしては、ビオチン、シアノコバラミンなどが挙げられ、薬剤としては、テトラサイクリン、カナマイシン、ネオマイシンなどが挙げられる。
低分子化合物としては、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）やＦＭＮ（フラビンモノヌクレオチド）、コカインなどの生理活性物質から、マラカイトグリーンなどの有機染料などの一般的な化合物も使用することができる。
無機材料としては、無機顔料や無機材料の特定の結晶などに加えて、Ｍｇ2+などの無機イオンも使用することができる。
【００１８】
本発明における支持体としては、近接場光分析の適性に対応して、透明基板で構成されていてもよく、不透明基板で構成されていても良い。また、近接場光分析の適性に対応して基板の特定物質固定側に、必要であれば金属部と、この金属部上、もしくは支持体上に直接配置されると共に特定物質を固定化できる官能基を有する固定化膜を備えたものを挙げることができる。
【００１９】
透明基板としては、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
【００２０】
金属部を構成する金属としては、例えば、プラズモン共鳴が生じ得るようなものを挙げることができる。好ましくは、金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、金が特に好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
金属部の形状は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、膜状で膜厚が０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上１０ｎｍ以下であるのが好ましい。
【００２１】
金属部は、好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属部が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属部が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。
金属部の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。
【００２２】
支持体上の固定化膜は、固定化膜の材料を支持体上に被覆することによって形成される。固定化膜は、乾燥状態の膜厚と比較して３倍以下の水中平均膜厚を有するものである。
このような固定化膜とすることにより、本固定化膜の内部に、固定化対象となる特定物質を侵入しにくくすることができる。ここで水中膜厚とは２５℃で純水中における支持体表面から末端までの平均距離をいい、例えば、エリプソメーターなどによって測定することができる。「乾燥状態」とは、固定化膜に触れている水分量が１重量％未満の状態をいい、エリプソメーターによって測定することができる。
特定物質と核酸分子との相互作用に対する、固定化膜の物理的な影響、静電的な影響を小さくするためには、固定化膜の最表面のみを利用することが好ましい。そのような形態の固定化膜を利用した場合、膜厚はできる限り薄くした方が近接場光の影響を受け易いため、好ましく、特に水中膜厚は３０ｎｍ以下が好ましい。ただし、膜厚のむらは近接場光分析の性能に大きな悪影響を与えるため、好ましくない。
このような固定化膜としては、疎水性高分子膜又は自己組織化膜（ＳＡＭ）を好ましく挙げることができる。
【００２３】
本発明における疎水性高分子膜に用いる疎水性高分子としては、水に対する溶解度が２０重量％以下である単量体を５０重量％以上含む疎水性高分子であることが指標として考えられる。このような疎水性高分子を用いた疎水性高分子膜であれば、一般に水に対して膨潤性が低いため、前記の理由により、固定化膜の物理的影響や静電的な影響を小さくすることができやすい。
疎水性高分子膜を形成する単量体の２５℃の水に対する溶解度は、新実験化学講座基本操作１（丸善化学、１９７５）に記載されている方法で測定することができる。この方法で測定すると上記本発明における単量体の２０℃の水に対する溶解度は、例えば２−エチルヘキシルメタクリレートで０．００重量％、スチレンで０．０３重量％、メチルメタクリレートで１．３５重量％、ブチルアクリレートで０．３２重量％、ブチルメタクリレートで０．０３重量％である。本発明における疎水性高分子膜としての水に対する溶解度の指標としては、１０重量％以下であることがより好ましく、１重量％以下であることが更に好ましい。
【００２４】
本発明で用いられる水に対する溶解度が２０重量％以下である単量体の具体例としては、ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類、ビニルケトン類等から任意に選ぶことができ、スチレン、メタクリル酸メチル、メタクリル酸ヘキサフルオロプロパン、酢酸ビニル、アクリロニトリルなどが挙げられる。疎水性高分子化合物としては、１種類のモノマーから成るホモポリマーでも、２種類以上のモノマーから成るコポリマーでもよい。
【００２５】
本発明では、前述の水に対する溶解度が２０重量％以下である単量体と共に、水に対する溶解度が２０重量％以上である単量体を共重合した高分子化合物を併用してもよい。
水に対する溶解度が２０重量％以上である単量体の具体例としては、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル、メタクリル酸、アクリル酸、アリルアルコール等が挙げられる。
【００２６】
疎水性高分子膜は、水に対する溶解度が２０重量％以下である上記単量体を５０重量％以上含むことがより妥当性が高く、水に対する溶解度が２０重量％以下である単量体を７５％以上含むことが更に妥当性が高い。
【００２７】
疎水性高分子膜の膜厚は、近接場光の存在範囲の観点から、好ましくは１００ｎｍ以下、より好ましくは３０ｎｍ以下である。ただし、近接場光に対する膜厚の影響は高分子膜の屈折率や温度などにも依存するので、これに限定はされない。
疎水性高分子の支持体表面への被覆は常法によって行うことができ、例えば、スピン塗布、エアナイフ塗布、バー塗布、ブレード塗布、スライド塗布、カーテン塗布、さらにはスプレー法、蒸着法、キャスト法、浸漬法等によって行うことができる。
【００２８】
本発明における自己組織化膜（ＳＡＭ）とは、外からの細かい制御を加えていない状態で、膜材料そのものがもつ機構によって形成される一定の秩序をもつ組織をもった超薄膜のことを言う。この自己組織化により、非平衡の状況で長距離にわたって秩序がある構造やパターンが形成される。例えば、チオールやジスルフィド類などの含硫黄化合物は金等の貴金属基板上に自発的に吸着し単分子サイズの超薄膜を与える。またその集合体は自己組織化膜と呼ばれている。
このような自己組織化膜は、例えば含硫黄化合物により形成することができる。含硫黄化合物によって金表面に自己組織化膜を形成することは、例えば、Nuzzo RG等（1983年）、J Am Chem Soc、105巻、4481〜4483頁、Porter MD等（1987年）、J Am Chem Soc、109巻、3559〜3568頁、Troughton EB等（1988年）、Langmuir、４巻、365〜385頁などに記載されている。
【００２９】
自己組織化膜を構成する分子としては、Ｘ1−Ｒ1−Ｙ1で示される化合物を使用することができる。以下、Ｘ1−Ｒ1−Ｙ1について説明する。
Ｘ1は金属膜に対する結合性を有する基である。具体的には、非対称又は対称スルフィド（−ＳＳＲ11Ｙ11、−ＳＳＲ1Ｙ1）、スルフィド（−ＳＲ11Ｙ11、−ＳＲ1Ｙ1）、ジセレニド（−ＳｅＳｅＲ11Ｙ11、−ＳｅＳｅＲ1Ｙ1）、セレニド（ＳｅＲ11Ｙ11、−ＳｅＲ1Ｙ1）、チオール（−ＳＨ）、ニトリル（−ＣＮ）、イソニトリル、ニトロ（−ＮＯ2）、セレノール（−ＳｅＨ）、３価リン化合物、イソチオシアネート、キサンテート、チオカルバメート、ホスフィン、チオ酸またはジチオ酸（−ＣＯＳＨ、−ＣＳＳＨ）が好ましく用いられる。
【００３０】
Ｒ1（とＲ11）は場合によりヘテロ原子により中断されており、好ましくは適当に密な詰め込みのため直鎖（枝分かれしていない）であり、場合により二重及び／又は三重結合を含む炭化水素鎖である。鎖の長さは１０原子を越えることが好ましい。炭素鎖は場合により過弗素化されることができる。
Ｙ1とＹ11は、生理活性物質などの特定物質を結合するための官能基である。Ｙ1とＹ11は好ましくは同一であり、特定物質に直接又は活性化後に結合できるような性質を持つ。具体的にはヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、アルデヒド、ヒドラジド、カルボニル、エポキシ、又はビニル基などを用いることができる。
自己組織化膜を構成する分子、Ｘ1−Ｒ1−Ｙ1の具体例としては、１０−カルボキシ−１−デカンチオール、４，４’−ジチオジブチリックアシッド、１１−ヒドロキシ−１−ウンデカンチオール、１１−アミノ−１−ウンデカンチオール、７−カルボキシ−１−ヘプタンチオール、１６−メルカプトヘキサデカン酸などが挙げられる。
【００３１】
これらの自己組織化膜の中でも特に、特定物質とアプタマーとの相互作用に対する影響が小さいこと、また目的以外の物質の非特異的な吸着が少ないとの観点から、水酸基を有することが好ましく、更に特定物質を結合するための官能基を有することが好ましいことから、これら両者を有する自己組織化膜であることが好ましい。更に、水酸基を有するチオール化合物と、特定物質を結合するための官能基を有するチオール化合物との混合物を使用することが更に好ましい。
【００３２】
自己組織化膜は、安定性の観点から、一層で形成されていることが好ましい。
自己組織化膜の被覆は、例えば、基板表面に金蒸着を施し、次いで、水酸基を有するチオール化合物と、特定物質を結合するための官能基を有するチオール化合物を含む混合液（例えば、エタノール溶液など）を上記の金表面に接触させて反応させることによって、金表面に自己組織化膜を形成すればよい。
【００３３】
これらの固定化膜は、支持体の最表面に特定物質を固定化することができる官能基を有している。好ましい官能基としては−ＣＯＯＨ、−ＮＲ2Ｒ3（式中、Ｒ2及びＲ3は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＳＨ、−ＣＨＯ、−ＮＲ4ＮＲ2Ｒ3（式中、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、エポキシ基、またはビニル基などが挙げられる。ここで、低級アルキル基における炭素数は特に限定されないが、一般的にはＣ1〜Ｃ10程度であり、好ましくはＣ1〜Ｃ6である。また、特に安定性と反応の簡易さから−ＣＯＯＨがより好ましい。
【００３４】
疎水性高分子膜の最表面にそれらの官能基を導入する方法としては、それらの官能基の前駆体を含有する高分子を金属表面あるいは金属膜上にコーティングした後、化学処理により最表面に位置する前駆体からそれらの官能基を生成させる方法が挙げられる。例えば−ＣＯＯＣＨ3基を含有する高分子化合物であるポリメチルメタクリレートを金属膜上にコーティングした後、その表面をＮａＯＨ水溶液（１Ｎ）に４０℃１６時間接触させると、最表面に−ＣＯＯＨ基が生成する。
このように支持体表面において、上記の官能基を介して生理活性物質を共有結合させることによって、特定物質を固定化することができる。
【００３５】
本方法においては、固定化膜に非膨潤性の膜を利用することで、核酸分子に対する固定化膜の影響を小さくしている。この影響は主に物理的な影響と静電的な影響によるが、この静電的な影響を更に小さくするためには、固定化膜における特定物質を固定化するための官能基量は、特定物質の最大固定化量に必要な量、あるいはそれよりも少ない量であることが好ましい。
自己組織化膜においては、例えば、水酸基を有するチオール化合物と、特定物質を結合するための官能基を有するチオール化合物との混合比を調整することによって、結合官能基の量を容易に調節することができる。この場合、全チオール化合物中における、特定物質を結合するための官能基を有するチオール化合物の混合比は５割以下であることが好ましく、また１割以下であることがより好ましい。また、疎水性高分子膜においては、前述したような官能基を生成する条件を調節することによって、結合官能基の量を容易に調節できる。
また、非膨潤性膜においては、主に表面の官能基のみの調節を行えば十分であるため、比較的容易である。
【００３６】
本スクリーニング方法における固定化工程では、上記固定化膜に特定物質を固定化する。
対象となる特定物質が多くのタンパク質のように表面にアミノ基ないしはチオール基を有する場合、その固定化は、生理活性物質のアミノ基、チオール基を利用し、固定化膜表面の官能基に共有結合させることで行うことができる。このような固定化方法としては、支持体表面のカルボキシル基と特定物質中のアミノ基等とを共有結合により固定化するアミノカップリング法が、簡便性及び安定性の観点から好ましい。この目的で用いられるアミノカップリング法は、常法に従って行えばよく、例えば、Ｎ−エチル−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）とを用いる方法などを挙げることができる。
【００３７】
接触工程では、固定化工程によって得られた固定化特定物質に、試料液中の核酸分子を接触させる。この接触により、核酸試料溶液中に存在する核酸分子の多くが、固定化特定物質と特異的に又は非特異的に相互作用する。
【００３８】
選別工程では、前記支持体表面における近接場光分析を行って前記固定化特定物質と前記核酸分子との相互作用量を得ながら、得られた相互作用量に基づいて、前記核酸試料液中の核酸分子から前記目的核酸分子を選別する。
接触工程での接触直後では、特異的に固定化特定物質と相互作用するアプタマー以外にも、低い親和性で非特異的に固定化特定物質に相互作用する核酸分子や本来は相互作用しないが物理的に結合・捕捉状態にある核酸分子（以下、「非特異的核酸分子」という）が固定化特定物質に相互作用している。その後、このような非特異的核酸分子は固定化特定物質から解離することにより、固定化特定物質と相互作用する核酸分子群より排除され、固定化特定物質に相互作用している核酸分子としてアプタマーを選別することができる。
【００３９】
本スクリーニング方法に適用可能な近接場光分析方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析、ローカル・プラズモン・レゾナンス、グレーティング・カップルド・レゾナンス、二面偏波式干渉分析、近接場蛍光測定、表面増強ラマン散乱測定などを挙げることができる。このうちでも、高感度かつ簡便に経時的な相互作用量を監視することが可能なＳＰＲ分析であることが好ましい。
【００４０】
ＳＰＲ分析は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の反射面の逆側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料中の分子を分析することができる。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。
この装置を用いることによって、検出された全反射減衰の状態から、支持体上の固定化特定物質と核酸分子との相互作用量を得ることができる。この相互作用量は、固定化特定物質に相互作用する核酸分子の量に応じて変化する。即ち、固定化特定物質と核酸分子とを接触させると、相互作用量は飽和量まで上昇し、それに続く洗浄工程によって、非特異的に相互作用する核酸分子が固定化特定物質から解離することによって、相互作用量は低下する。
【００４１】
上述したように、相互作用量は、非特異的核酸分子が固定化特定物質から解離することによって低下するため、核酸分子の選別は、相互作用量の変化量として容易に評価することができる。
選別工程を終了すべき程度まで選別が行われたか否かの評価は、しきい値となる特定の相互作用量を予め設定して行ってもよく、また接触工程直後の最大相互作用量からの変化率を用いた場合のしきい値となる特定の変化率を用いて行ってもよい。また、後述するように繰り返し選別工程を行う場合には、前回の選別工程で得られた変化率との比較として評価してもよい。
【００４２】
これらの評価に用いられる値の設定は、選別工程終了時で得られる目的核酸分子の所望量に応じて適宜設定することができる。例えば、後述するように選別工程を繰り返し行うことによって効率よく目的核酸分子を選別することができるため、１回の選別工程で非特異的核酸分子の含有率を極端に下げる必要はない。このため、繰り返し選別工程を行う場合には、含有する非特異的核酸分子の量が多くなる値を設定しても、効率よく目的核酸分子を選別することができる。
【００４３】
選別工程において効率よく選別を行うために、バッファー液等を流して、弱く相互作用する核酸分子を積極的に解離させてもよい。このようなバッファー液の供給は、所望されるスクリーニングの精度に応じて、選別の時間や流速等を調製することができ、これにより、固定化特定物質と相互作用している核酸分子の量を調整することができる。
【００４４】
選別工程によって固定化特定物質と相互作用することによって選別された核酸分子は、その後、固定化特定物質から強制的に分離させることによって回収することができる。相互作用している核酸分子を分離するには、両者の相互作用を解消するための分離手段を用いることができる。このような分離手段としては、アプタマー及び特定物質に対して影響が少ない分離溶液を選択することが好ましく、このような分離溶液としては、７Ｍ尿素溶液などのカオトロピック試薬や１Ｍ塩化ナトリウム溶液などの高塩濃度溶液を挙げることができる。
【００４５】
本発明のスクリーニング方法では、選別工程において選別されたアプタマーを、ＰＣＲ法によって増幅する増幅工程を行うことが好ましい。これにより、特定物質に相互作用するアプタマーの量を増やすことができる。増幅工程で用いられるＰＣＲは、アプタマーの種類に応じたポリメラーゼ及びヌクレオチドと、アプタマーに応じて作成されたプライマーとを用いたポリメラーゼ連鎖反応によってアプタマーを合成し増幅可能ないずれの方法によって行ってもよい。
【００４６】
増幅工程を行う際には、核酸分子の種類によっては、ＰＣＲ処理を効率よく実施するために好適な種類の核酸に変換するための変換工程を設けてもよい。このような変換工程としては、例えば、回収されたアプタマーがＲＮＡである場合には逆転写酵素を用いたＤＮＡへの逆転写工程を挙げることができる。
【００４７】
また本発明のスクリーニング方法では、選別工程において選別されたアプタマーを回収して、再度、接触工程及び選別工程（以下、この２工程をまとめて「スクリーニング工程」という）、場合によっては、これら２工程に加えて更に増幅工程を含めた３工程を、少なくとも１回、場合によって複数回、繰り返すことが好ましい。
図１には、増幅工程を含むスクリーニング工程を繰り返し行う場合の概念図が示されている。図１に示されるように、最初の接触工程では、核酸試料液中には多種の核酸分子が混在しているが、選別工程を経ることにより、特定物質に特異的に相互作用するアプタマーが選別される。このとき、最初の選別工程で回収された核酸分子中にアプタマーと共に非特異的核酸分子が存在していたとしても、２回目のスクリーニング工程で再度選別され、排除される結果、２回目のスクリーニング工程後の核酸分子中のアプタマーの比率は、１回目のスクリーニング工程後の核酸分子中での比率よりも高くなる。
従って、これを繰り返すことにより、目的とするアプタマーをより一層効率よく且つ大量に得ることができる。
また、スクリーニング工程を繰り返し行うことにより一層効率よくアプタマーの選別を行うことができるので、選別工程における非特異的核酸分子の除去を長時間かけて行う必要がなく、さらに短時間で効率よくアプタマーを得ることができる。
【００４８】
スクリーニング工程の繰り返し回数は、特定物質やアプタマーの種類等によって適宜変更することができるが、得られたアプタマーの量や、スクリーニング工程後の核酸試料液中に存在する非特異的核酸分子の量に基づいて判断することができる。
【００４９】
なお、本スクリーニング方法で用いられる装置、流路、支持体表面など、核酸分子と接触する部材及び部位に対しては、核酸分子の分解を排除するための処理を接触工程の前に予め行っておくことが好ましい。このような処理としては、ヌクレアーゼ除去処理を挙げることができる。ヌクレアーゼ除去処理では、ジエチルプロカーボネート（ＤＥＰＣ）、過酸化水素などの溶液を、核酸分子と接触する部材及び部位に接触させればよい。更に、核酸試料液の接触しうる部材、少なくとも流路部材を、ＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネート）又は過酸化水素を含む溶液に浸すことがより好ましい。また、この場合ヌクレアーゼ除去処理後に該部材を高温に加熱することで、該ヌクレアーゼ除去処理に用いた処理液を揮発させて除いてもよい。
【００５０】
本スクリーニング方法には、市販のＳＰＲ装置及びＰＣＲ装置をそのまま適用することができる。また、ＳＰＲとＰＣＲとを共に備えたスクリーニング装置を用いることによって、より効率よく目的とするアプタマーを得ることができる。図２には、本発明のスクリーニング方法を適用可能なスクリーニング装置１００が示されている。スクリーニング装置１００は、ＳＰＲ部１０２及びＰＣＲ部１０４とで構成された動作部１０６と、これらの駆動を制御する制御部６０とを備えている。また、図示しない搬送部及び回収部を備えることによってスクリーニング方法を連続して実行可能とすることができる。
このようなＳＰＲ部１０４の一例を、以下に図面を参照しながら説明する。
【００５１】
図３には、本発明に使用可能なＳＰＲ装置として好適なバイオセンサー１０が示されている。
バイオセンサー１０は、金属膜の表面に発生する表面プラズモンを利用して、特定物質Ｐと核酸分子との相互作用を測定する、いわゆる表面プラズモンセンサーである。
図３に示すように、バイオセンサー１０は、トレイ保持部１２、搬送部１４、容器載置台１６、液体吸排部２０、光学測定部５４及び制御部６０を備えている。
トレイ保持部１２は、載置台１２Ａ及びベルト１２Ｂを含んで構成されている。載置台１２Ａは、矢印Ｙ方向に架け渡されたベルト１２Ｂに取り付けられており、ベルト１２Ｂの回転により矢印Ｙ方向に移動可能とされている。載置台１２Ａ上には、２枚のトレイＴが位置決めして載置される。トレイＴには、センサースティック４０が８本収納されている。センサースティック４０は、特定物質Ｐが固定されるチップであり、詳細については後述する。載置台１２Ａの下には、センサースティック４０を後述するスティック保持部材１４Ｃの位置まで押し上げるための図示しない押上機構が配置されている。
【００５２】
センサースティック４０は、図４及び図５に示すように、誘電体ブロック４２、流路部材４４、保持部材４６、接着部材４８及び蒸発防止部材４９で構成されている。
【００５３】
誘電体ブロック４２は、光ビームに対して透明な透明樹脂等で構成されており、断面が台形の棒状とされたプリズム部４２Ａと、プリズム部４２Ａの両端部にプリズム部４２Ａに対して一体的に形成された被保持部４２Ｂとを備えている。プリズム部４２Ａの互いに平行な２面の内の広い側の上面には、図６にも示すように金属膜５０が形成されている。誘電体ブロック４２は、いわゆるプリズムとして機能し、バイオセンサー１０での測定の際には、プリズム部４２Ａの対向する互いに平行でない２つの側面の内の一方から光ビームが入射され、他方から金属膜５０との界面で全反射された光ビームが出射される。
【００５４】
金属膜５０の表面には、図６に示すように、固定化膜５０Ａが形成されている。固定化膜５０Ａは、特定物質Ｐを金属膜５０上に固定化するためのものである。固定化膜５０Ａは、前述した本発明にかかる固定化膜により構成されている。
【００５５】
固定化膜５０Ａ上には、特定物質Ｐが固定された測定領域Ｅ１と、特定物質Ｐが固定されず、測定領域Ｅ１の信号測定に際しての参照信号を得るための参照領域Ｅ２とが形成される。即ち、参照領域Ｅ２は、特定物質Ｐが固定された測定領域Ｅ１から得られるデータを補正するために設けられた領域である。この参照領域Ｅ２は、上述した固定化膜５０Ａを製膜する際に形成される。形成方法としては、例えば、固定化膜５０Ａに対して表面処理を施して、特定物質Ｐと結合する結合基を失活させる。これにより、固定化膜５０Ａの一部が測定領域Ｅ１となり、残りの部分が参照領域Ｅ２となる。
図７にも示すように、参照領域Ｅ２と、参照領域Ｅ２よりも上流側に位置する測定領域Ｅ１とには、各々光ビームＬ２、Ｌ１が入射される。
【００５６】
プリズム部４２Ａの両側面には、上側の端辺に沿って保持部材４６と係合される係合凸部４２Ｃが、下側の端辺に沿ってプリズム部４２Ａの上面と垂直な仮想面の延長上に構成される垂直凸部４２Ｄが、各々７箇所に形成されている。また、誘電体ブロック４２の下面の長手方向に沿った中央部には、係合溝４２Ｅが形成されている。
【００５７】
流路部材４４は、誘電体ブロック４２よりもわずかに狭幅の直方体状とされ、図５に示すように、誘電体ブロック４２の金属膜５０上に６個並べて配置されている。各々の流路部材４４の下面には流路溝４４Ａが形成されており、上面に形成された供給口４５Ａ及び排出口４５Ｂと連通されて、金属膜５０との間に、液体流路４５が構成される。したがって、１本のセンサースティック４０には、独立した６個の液体流路４５が構成される。流路部材４４の側壁には、保持部材４６の内側の図示しない凹部に圧入されて保持部材４６との密着性を確保するための凸部４４Ｂが形成されている。
【００５８】
保持部材４６は、長尺とされ、上面板４６Ａ及び２枚の側面板４６Ｂで構成されている。側面板４６Ｂには、誘電体ブロック４２の係合凸部４２Ｃと係合される係合孔４６Ｃが形成されている。保持部材４６は、６個の流路部材４４を間に挟んで係合孔４６Ｃと係合凸部４２Ｃとが係合されて、誘電体ブロック４２に取り付けられる。これにより、流路部材４４は、誘電体ブロック４２に取り付けられる。上面板４６Ａには、流路部材４４の供給口４５Ａ及び排出口４５Ｂと対向する位置に、流路部材４４に向けて狭くなるテーパー状のピペット挿入孔４６Ｄが形成されている。また、隣り合うピペット挿入孔４６Ｄとピペット挿入孔４６Ｄとの間には、位置決め用のボス４６Ｅが形成されている。
【００５９】
保持部材４６の上面には、蒸発防止部材４９が接着部材４８を介して接着されている。接着部材４８のピペット挿入孔４６Ｄと対向する位置にはピペット挿入用の孔４８Ｄが形成され、ボス４６Ｅと対向する位置には位置決め用の孔４８Ｅが形成されている。また、蒸発防止部材４９のピペット挿入孔４６Ｄと対向する位置には十字状の切り込みであるスリット４９Ｄが形成され、ボス４６Ｅと対向する位置には位置決め用の孔４９Ｅが形成されている。ボス４６Ｅを孔４８Ｅ及び４９Ｅに挿通させて、蒸発防止部材４９を保持部材５２の上面に接着することにより、蒸発防止部材４９のスリット４９Ｄと流路部材４４の供給口４５Ａ及び排出口４５Ｂとが対向するように構成される。ピペットチップＣＰの非挿入時には、スリット４９Ｄ部分が供給口４５Ｂを覆い、液体流路４５に供給されている液体の蒸発が防止される。
【００６０】
図３に示すように、バイオセンサー１０の搬送部１４は、上部ガイドレール１４Ａ、下部ガイドレール１４Ｂ及びスティック保持部材１４Ｃ、を含んで構成されている。上部ガイドレール１４Ａ及び下部ガイドレール１４Ｂは、トレイ保持部１２及び光学測定部５４の上部で、矢印Ｙ方向と直交する矢印Ｘ方向に水平に配置されている。上部ガイドレール１４Ａには、スティック保持部材１４Ｃが取り付けられている。スティック保持部材１４Ｃは、センサースティック４０の両端部の被保持部４２Ｂを保持可能とされていると共に、上部ガイドレール１４Ａに沿って移動可能とされている。スティック保持部材１４Ｃに保持されたセンサースティック４０の係合溝４２Ｅと下部ガイドレール１４Ｂとが係合され、スティック保持部材１４Ｃが矢印Ｘ方向に移動することにより、センサースティック４０が光学測定部５４上の測定部５６に搬送される。
【００６１】
容器載置台１６には、化合物溶液プレート１７、バッファー液ストック容器１８、廃棄液容器１９及び図示しない分離液容器が載置されている。化合物溶液プレート１７は、９６に区画されており、核酸試料液をストック可能とされている。バッファー液ストック容器１８は、容器１８Ａ〜１８Ｅで構成されており、容器１８Ａ〜１８Ｅには、後述するピペットチップＣＰを挿入可能な開口Ｋが形成されている。
廃棄液容器１９は、複数の容器１９Ａ〜１９Ｅで構成されており、容器１８Ａ〜１８Ｅと同様にピペットチップＣＰを挿入可能な開口Ｋが形成されている。
【００６２】
液体吸排部２０は、上部ガイドレール１４Ａと、ガイドレール１６Ｂよりも上方で、矢印Ｙ方向に架け渡された横断レール２２と、ヘッド２４とを含んで構成されている。横断レール２２は、図示しない駆動機構により、矢印Ｘ方向へ移動可能とされている。また、ヘッド２４は、横断レール２２に取り付けられ、矢印Ｙ方向に移動可能とされている。また、ヘッド２４は、図示しない駆動機構により、鉛直方向（矢印Ｚ方向）にも移動可能とされている。ヘッド２４は、図８に示すように、２本のピペット部２４Ａ、２４Ｂを備えている。ピペット部２４Ａ、２４Ｂには、先端部にピペットチップＣＰが取り付けられ、個々にＺ方向の長さを調整可能とされている（図８（Ａ）〜（Ｂ）参照）。ピペットチップＣＰは、図示しないピペットチップストッカーに多数ストックされており、必要に応じて交換可能とされている。
【００６３】
なお、本バイオセンサー１０においてはセンサースティック４０への液体供給はピペットチップＣＰにより行われるが、ピペットチップの代わりに、一端が上記各溶液プレートに接続され、他端がセンサースティック４０に接続可能とされたインジェクションチューブを設け、送液ポンプにより液体の供給を行ってもよい。
【００６４】
光学測定部５４は、図９に示すように、光源５４Ａ、第１光学系５４Ｂ、第２光学系５４Ｃ、受光部５４Ｄ、信号処理部５４Ｅを含んで構成されている。光源５４Ａからは、発散状態の光ビームＬが出射される。光ビームＬは、第１光学系５４Ｂを介して、２本の光ビームＬ１、Ｌ２となり、測定部５６に配置された誘電体ブロック４２の測定領域Ｅ１と参照領域Ｅ２に入射される。測定領域Ｅ１及び参照領域Ｅ２において、光ビームＬ１、Ｌ２は、金属膜５０と誘電体ブロック４２との界面に対して種々の入射角成分を含み、かつ全反射角以上の角度で入射される。光ビームＬ１、Ｌ２は、誘電体ブロック４２と金属膜５０との界面で全反射される。全反射された光ビームＬ１、Ｌ２も、種々の反射角成分をもって反射される。この全反射された光ビームＬ１、Ｌ２は、第２光学系５４Ｃを経て受光部５４Ｄで受光されて、各々光電変換され、光検出信号が信号処理部５４Ｅへ出力される。信号処理部５４Ｅでは、入力された光検出信号に基づいて所定の処理が行なわれ、測定領域Ｅ１の測定データＧ１と参照領域Ｅ２の参照データＧ２とが求められる。この測定データＧ１、参照データＧ２が制御部６０へ出力される。
【００６５】
制御部６０は、ＰＣＲ部１０４と共に、ＳＰＲ部１０２であるバイオセンサー１０の全体を制御する機能を有し、図９に示すように、光源５４Ａ、信号処理部５４Ｅ及びバイオセンサー１０の図示しない駆動系と接続されている。制御部６０には、図２に示されるように、各種の情報を表示する表示部６２と、各種の指示、情報を入力するための入力部６４と接続されている。
【００６６】
制御部６０には図示しないメモリが備えられており、バイオセンサー１０を制御するための各種プログラムや、各種データ及び、スクリーニングプログラムが記憶されている。
制御部６０に記憶される参照データＧ２は、特定物質Ｐが固定化されていない固定化膜５０Ａ上にランニングバッファーを供給した際に求められる基準点と、核酸分子Ａを供給した際に求められる信号との変化量ＲＵ（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｕｎｉｔ、およそ１ＲＵ＝１ｐｇ／ｍｍ2に相当）で示されている。
【００６７】
このように、本バイオセンサー１０では、センサースティック４０が測定部５６へ搬送され、入力部６４から測定開始の指示が入力されると、制御部６０では、測定処理が実行される。この相互作用量測定処理では、核酸試料液を液体流路４５へ供給し、光源５４Ａ、信号処理部５４Ｅ及び図示しない駆動系を駆動して、測定領域Ｅ１から測定データＧ１を取得し、参照領域Ｅ２から参照データＧ２を取得する。次いで、測定データＧ１を参照データＧ２で補正して、相互作用量データＧ３を算出する。核酸試料液の供給が終了するとバッファー液の供給を開始する。その間、相互作用量データＧ３の算出を継続し、得られた相互作用量データＧ３が経時的に記憶される。ここでは、バッファー液の供給によって非特異的核酸分子の排除が行われて選別が進むため、相互作用量データＧ３は時間と共に小さい値になる。
【００６８】
制御部６０では、得られた相互作用量データＧ３が、所定の測定終了値になった場合又は外部から停止の信号が入力された場合に測定処理を終了し、バッファー液に代えて分離溶液を液体流路４５へ供給すると共に、測定領域Ｅ１から分離した核酸分子を回収する。所定時間の回収が完了すると、バイオセンサー１０での処理を完了し、ＰＣＲ部１０４でのＰＣＲ処理への切り替えを指示する。
なお、測定処理の終了を指示するために用いられる所定の測定終了値は、経時的に算出される相互作用量データＧ３に対するしきい値としてもよく、相互作用量データＧ３の変化率に対するしきい値としてもよい。
【００６９】
ＳＰＲ部１０２としてのバイオセンサー１０と、ＰＣＲ部１０４とを備えたスクリーニング装置１００を用いることによって、核酸溶液中の核酸分子から目的とするアプタマーを効率よくスクリーニングすることができる。
【００７０】
上記スクリーニング方法によって得られたアプタマーは、目的とする特定物質に相互作用するものであるため、目的とする特定物質の検出ないしは定量に好ましく用いられる。
即ち、本発明の特定物質の検出・定量方法は、上記スクリーニング方法によって得られたアプタマーを用いて特定物質の検出・定量を行うものである。
特定物質の検出ないしは定量は、本スクリーニング方法で得られたアプタマーを標識化することにより、標識に基づいて近接場光分析を利用しないで検出・定量してもよいが、アプタマーを、本スクリーニング方法での特定物質と同様に、支持体上に固定化して近接場光分析に基づいて検出・定量することが好ましい。近接場光分析を用いることによって、相互作用量に基づいて高感度且つ安定且つ簡便に、目的の特定物質を検出ないしは定量を行うことができる。
【００７１】
なお、本発明において「検出ないしは定量」とは、特定物質の検出及び定量の双方であってもよく、これらのいずれかであってもよいことを意味し、相互作用量データを用いることにより、検出と定量の双方を同時に行うことができる。
【実施例】
【００７２】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これにより本発明は限定されるものではない。
本実施例では、近接場光分析としてＳＰＲ分析を用いた場合を例に説明する。
【００７３】
［実施例１］
各種溶液の調製及び特定物質の固定化
（１）ランダムＲＮＡ混合溶液の調製
まず、ランダムＲＮＡを得るための任意配列を有する１１４ｂｐのオリゴＤＮＡを化学合成によって得る。本ＤＮＡは、５’末端から４０ｂｐに下記に示す５’プライマー結合配列を有し、３’末端から２４ｂｐに下記の３’プライマー結合配列を有し、内部の５０ｂｐはランダム配列を有している。
【００７４】
【表１】
2007236313.tif 000003
【００７５】
次いで、Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、ｐｒｉｍｅｒ（５’プライマー：上記結合配列、３’プライマー：上記結合配列の相補鎖），ｄＮＴＰ混合液を加え、６０℃（５０秒）、７２℃（７０秒）、９５℃（７０秒）のＰＣＲ反応を１５Ｃｙｃｌｅ行う。ＰＣＲ反応の詳細はタカラバイオ社推奨条件に従う。
ＰＣＲ反応終了後、イソプロパノール沈殿を行って抽出し、ＰＣＲ産物を抽出し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Promega社製）を用いてインヴィトロ転写反応を３７℃で３時間行う。インヴィトロ転写反応の詳細はPromega社推奨条件に従う。反応後、フェノール・クロロホルム処理、イソプロパノール沈殿を行って転写産物のランダムＲＮＡ混合溶液を得る。
【００７６】
（２）固定化膜の調製
（ａ）  ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）膜の作成
金属膜として５０ｎｍの金が蒸着された本発明のセンサースティック４０をＭｏｄｅｌ−２０８ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（ＴＥＣＨＮＯＶＩＳＩＯＮ ＩＮＣ．）で３０分間処理した後、１ｍｇ／ｍｌのポリメチルメタクリレートのメチルエチルケトン溶液５μｌを金属膜に接触するように添加し２５℃で１５分間静置する。
１Ｍ ＮａＯＨ水溶液をＰＭＭＡ膜に接触するように添加し、６０℃５時間静置した後、水で３回洗浄する。このサンプルをＰＭＭＡ膜と呼ぶ。
【００７７】
（ｂ）  ポリメチルメタクリレート−ポリスチレンコポリマー膜の作成
金属膜として５０ｎｍの金が蒸着された本発明のセンサースティック４０をＭｏｄｅｌ−２０８ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（で３０分間処理した後、１ｍｇ／ｍｌのポリメチルメタクリレート−ポリスチレンコポリマー（仕込みモル比５：５、平均分子量２０，０００）のメチルエチルケトン溶液５μｌを金属膜に接触するように添加し２５℃で１５分間静置した。
１Ｍ ＮａＯＨ水溶液をＰＭＭＡ膜に接触するように添加し、６０℃５時間静置した後、水で３回洗浄する。
生成したカルボン酸表面をＥＤＣ ４００ｍＭと、ＮＨＳ １００ｍＭとの等量混合液に６０分接触させたのち、５-アミノ吉草酸（１ｍｏｌ／ｌ，ｐＨ８．５に調整）溶液に16時間接触させ、超純水で洗浄をおこなった。このサンプルをＰＭＭＡ／ＰＳｔ−リンカー膜と呼ぶ。
【００７８】
（ｃ）  自己組織化膜の作成
１１−ヒドロキシ−１−ウンデカンチオール（ＡＬＤＲＩＣＨ製）９．２ｍｇ，１６−メルカプトヘキサデカン酸（ＡＬＤＲＩＣＨ製）１．４ ｍｇ、超純水２ｍｌ及びエタノール８ｍｌを４０℃にて十分混合する。
金属膜として５０ｎｍの金が蒸着された本発明のセンサースティック４０をＭｏｄｅｌ−２０８ＵＶ−オゾンクリーニングシステムで３０分間処理した後、上記ＳＡＭ液を接触させ、４０℃１時間反応させた後、エタノールおよび超純水にて各１回ずつ洗浄を行った。このサンプルをＳＡＭ膜と呼ぶ。
【００７９】
（３）カルモジュリンの固定化
ＳＰＲ装置に用いられるセンサースティック４０に備えられた流路部材４４、保持部材４６を、０．１重量％ＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネート）に３７℃で２時間浸し、滅菌水で数回ゆすいだ後、１００℃で１５分間加熱して、ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅの除去を行う。
（２）で製膜した各センサースティックに測定領域Ｅ１と参照領域Ｅ２を空間的に分断するウェルを形成する敷居をセットする。ＨＢＳ−Ｐバッファー（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）でウェルを満たす。バッファーを除き、活性化液（０．２ＭのＥＤＣと０．０５ＭのＮＨＳの等量混合液）１００μｌをウェルに１秒間で注入し、３０分放置する。続けて、活性化液を除き、ＨＢＳ−Ｐバッファー１００μｌをウェルに１秒間で注入し、そのあと速やかにバッファーを除いて測定領域Ｅ１には断片ペプチド溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ、ＡｃｅｔａｔｅバッファーｐＨ６．０希釈）１００μｌを、参照領域Ｅ２にはＨＢＳ−Ｐをウェルに１秒間で注入し、３０分放置する。続けて、ペプチド溶液を除き、ＨＢＳ−Ｐバッファー１００μｌをウェルに１秒間で注入し、そのあと、バッファーを除き、ブロッキング液（１Ｍ  エタノールアミン・ＨＣｌ  ｐＨ８．５）１００μｌをウェルに１秒間で注入し、３０分放置する。続けて、ブロッキング液を除き、ＨＢＳ−Ｐバッファー１００μｌをウェルに１秒間で注入し、続けて、１０ｍＭ  ＮａＯＨ溶液１００μｌとＨＢＳ−Ｐでウェルを順に洗浄する。本操作によりカルモジュリン固定化膜を得る。
【００８０】
［実施例２］
スクリーニング
カルモジュリンを固定化したセンサースティックからウェルを形成する敷居を取り外し、バイオセンサー１０にセットする。流路をＨＢＳ−Ｐバッファーで満たし、その状態で、実施例１で作製したランダムＲＮＡ混合溶液１００μｌを流路に１秒間で注入し断片ペプチド固定化膜に接触させ、５分放置する。このとき、固定化カルモジュリンと核酸分子とが相互作用を開始するため、ＳＰＲ信号は上昇する。次いで、ＨＢＳ−Ｐバッファー１００μｌを流路に１秒間で注入し、その後、ＨＢＳ−Ｐバッファーを３０μｌずつゆっくり注入していく。この時、ＳＰＲ信号により相互作用の測定を行う。
ＳＰＲ信号がベースラインと解離開始の信号の中間の値になるまで非特異的核酸分子が解離したら、７Ｍ  尿素を含むＨＥＰＥＳバッファー１００μｌを供給し、上記特定物質に結合した核酸分子（アプタマー）を溶出し、回収する。
これにより、カルモジュリンに特異的に相互作用するアプタマーを得ることができる。
【００８１】
次いで、回収された核酸分子のアプタマーを増幅するためにＰＣＲを行う。
まず、回収された核酸溶液にイソプロパノール沈殿を行い、核酸分子溶液を濃縮する。濃縮された核酸分子（ＲＮＡ）に対して、逆転写酵素（Ｉｍｐｒｏｍ−ＩＩ ＴＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、３０分間反応させて、ＤＮＡに変換する。逆転写反応の詳細はＰｒｏｍｅｇａ社推奨条件下で行う。得られたＤＮＡを含む溶液に、実施例１と同じ条件でＰＣＲ１５Ｃｙｃｌｅを行う。ＰＣＲ反応終了後、イソプロパノール沈殿を行って抽出し、ＰＣＲ産物を抽出する。これにより、最初のスクリーニングによって得られたアプタマーを大量に得ることができる。
【００８２】
上記ＰＣＲで得られた増幅アプタマーを含む核酸溶液に対して、転写工程、接触工程、回収工程、逆転写工程及びＰＣＲ工程の上述した一連の操作を３回繰り返す。これにより、カルモジュリンに対して相互作用するアプタマーを効率よく増幅しながらスクリーニングすることができ、目的とするアプタマーを効率よく得ることができる。
【００８３】
［実施例３］
アプタマーによるカルモジュリンの検出
実施例１と同様に、固定化膜５０Ａとして、各種固定化膜（ＰＭＭＡ膜、ＰＭＭＡ／ＰＳｔ−リンカー膜、ＳＡＭ膜）を形成させたセンサースティックにアプタマーを固定化する。固定化方法は実施例１のカルモジュリン固定化方法に従う。ただし、カルモジュリン溶液の代わりに、実施例２で回収されたアプタマー溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ ＨＢＳ−Ｐ）１００μｌを測定領域Ｅ１に反応させる。本操作によりアプタマー固定化膜を得る。
ＳＰＲ信号により相互作用量を測定しながら、得られた特定物質溶液を、流路を介して供給し、アプタマー固定化膜に接触させる。固定化膜上のアプタマーがカルモジュリンに効率良く結合する場合は、ＳＰＲ信号が上昇する。これにより、アプタマー固定化膜の測定領域Ｅ１において、参照領域Ｅ２と比べ、高いＳＰＲ信号（相互作用量）が得られた。本実施例にかかる分析結果を表２に示す。
【００８４】
［比較例１］
膨潤性の高いデキストラン膜を固定化膜として利用した際の操作
金属膜として５０ｎｍの金が蒸着された本発明にかかるセンサースティック４０をＭｏｄｅｌ−２０８ＵＶ−オゾンクリーニングシステムで３０分間処理した後、エタノール／水（８０／２０）中１１−ヒドロキシ−１−ウンデカンチオールの５．０ｍＭ溶液を金属膜に接触するように添加し、２５℃で１８時間表面処理を行った。その後、エタノールで５回、エタノール／水混合溶媒で１回、水で５回洗浄を行った。
次に、１１−ヒドロキシ−１−ウンデカンチオールで被覆した表面を１０重量％のエピクロロヒドリン溶液（溶媒：０．４Ｍ水酸化ナトリウム及びジエチレングリコールジメチルエーテルの１：１混合溶液）に接触させ、２５℃の振盪インキュベーター中で４時間反応を進行させた。表面をエタノールで２回、水で５回洗浄した。
【００８５】
次に、２５重量％のデキストラン（Ｔ５００，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）水溶液４０．５ｍｌに４．５ｍｌの１Ｍ水酸化ナトリウムを添加し、その溶液をエピクロロヒドリン処理表面上に接触させた。次に振盪インキュベーター中で、２５℃で２０時間インキュベートした。表面を５０℃の水で１０回洗浄した。
続いて、ブロモ酢酸３．５ｇを２７ｇの２Ｍ水酸化ナトリウム溶液に溶解した混合物を上記デキストラン処理表面に接触させて、２８℃の振盪インキュベーターで１６時間インキュベートした。表面を水で洗浄し、その後上述の手順を１回繰り返した。このサンプルをデキストラン膜と呼ぶ。
【００８６】
デキストラン膜を形成させたセンサースティックを用いて、実施例２と同様にアプタマーのスクリーニングを行う。続いて、得られたアプタマーを用いて、実施例３と同様にカルモジュリンの検出操作を行う。結果を表２に示す。
【００８７】
【表２】
2007236313.tif 000004
【００８８】
表２より、実施例にかかる非膨潤性膜を利用した場合、アプタマー固定化膜の測定領域Ｅ１においては、参照領域Ｅ２と比べおよそ１５〜３０ＲＵの信号が得られ、カルモジュリンがアプタマーに結合することによって、カルモジュリンの検出が行えたことが示される。
一方、比較例にかかる膨潤性の高いデキストラン膜を利用した場合、５ＲＵ以下の信号しか得られず、バックグラウンドノイズに隠れてしまった。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】本発明のスクリーニング方法を説明する概念図である。
【図２】本発明に適用可能なスクリーニング装置の概略ブロック図である。
【図３】本発明において使用可能なＳＰＲ部の全体斜視図である。
【図４】本発明において使用可能なセンサースティックの斜視図である。
【図５】本発明において使用可能なセンサースティックの分解斜視図である。
【図６】本発明において使用可能なセンサースティックの１の液体流路部分の断面図である。
【図７】本発明において使用可能なセンサースティックの測定領域、参照領域へ光ビームが入射している状態を示す図である。
【図８】（Ａ）〜（Ｃ）は本発明において使用可能な液体供給部を構成するピペット部の側面図である。
【図９】本発明において使用可能なＳＰＲ部の光学測定部付近の概略図である。
【符号の説明】
【００９０】
１０    バイオセンサー
４０    センサースティック
５０    金属膜
５０Ａ  固定化膜
５４    光学測定部
６０Ｄ  メモリ
６０    制御部
６２    表示部
６４    入力部
Ｐ      特定物質
Ｅ１    測定領域
Ｅ２    参照領域
１００  スクリーニング装置
１０２  ＳＰＲ部
１０４  ＰＣＲ部
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図３】
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【配列表】
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