(57)【要約】【課題】キシラナーゼの新規なＤＮＡ、そのＤＮＡによってコードされるキシラナーゼ、そのＤＮＡが挿入された組換えベクターおよびその組換えベクターを有する形質転換体の取得。【解決手段】Ａ．ｐｕｌｌｕｌａｎｓ  ＡＴＣＣ  ２０５２４株を、キシランを炭素源として含む緩衝液により培養中のｐＨを６に維持した液体培地にて培養した。各種クロマトグラフィーに供し電気泳動的に単一に精製することにより、分子量３９，０００、等電点８．９の新規なキシラナーゼを得た。このタンパク質より得られた部分アミノ酸配列を用いて、本酵素をコードする遺伝子をクローニングした。このクローニングしたＤＮＡの塩基配列より、アミノ酸２６残基の菌体外分泌シグナルを含むアミノ酸３６１残基からなるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を推定した。この推定アミノ酸配列の相同性検索により、本酵素はＧＨファミリー１０に属するキシラナーゼであることが示唆された。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１の塩基配列で示される、キシラナーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項２】
アウレオバシジウム・プルランスの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列表の配列番号４および５を用いて増幅された塩基配列で示されるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、キシラナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードするアウレオバシジウム・プルランスＡＴＣＣ２０５２４株由来のＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＤＮＡによってコードされたキシラナーゼ。
【請求項４】
請求項１または２記載のＤＮＡを挿入された組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換えベクターを有する形質転換体である宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、新規なキシラナーゼをコードするＤＮＡ、そのＤＮＡの新規塩基配列によってコード化されたアミノ酸、及びそのＤＮＡの新規塩基配列を挿入された組換えベクター、更には該組換えベクターによって形質転換された酵母などの宿主細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】  アウレオバシジウム・プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ  ）は、原糖、果実の表面、醸造場や土壌中に生息している不完全菌類である。この菌は、α−１，６結合を持つ多糖プルランの生成やグルコン酸の生成、およびキシラン分解酵素の産生を行うものが存在することが知られている。キシランはヘミセルロースの大部分を占めており、バイオマス資源の一つとして今後の有効活用が期待されている。従って、新たな機能性を有するキシラン分解酵素の登場が期待されている。この期待のもとに、キシランを含む未利用ヘミセルロース分解酵素に関して、発明者を含めこれまでも数多くの研究がなされている。【０００３】
【特許文献１】特公２００３−５２２０８６号公報
【非特許文献１】Ｋａｚｕｙｏｓｈｉ  Ｏｈｔａ，Ｓａｔｏｓｈｉ  Ｍｏｒｉｙａｍａ，Ｈｉｄｅｎｏｒｉ  Ｔａｎａｋａ，Ｔａｋａｔｏ  Ｓｈｉｇｅ，ａｎｄ  Ｈｉｄｅｔｏｓｈｉ  Ａｋｉｍｏｔｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９２，２６２−２７０，２００１
【非特許文献２】Ｙｏｋｏ  Ｓａｔｏ，Ｙｏｓｈｉｈｉｔｏ  Ｎｉｉｍｕｒａ，Ｋｅｉ  Ｙｕｒａ，ａｎｄ  Ｍｉｔｉｋｏ  Ｇｏ，Ｇｅｎｅ，２３８，９３−１０１，１９９９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】  発明者の保有している保存菌株であるアウレオバシジウム・プルランスＡＴＣＣ２０５２４株からは既に、至適ｐＨ２．０であるグリコシル・ハイドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー１１に属する好酸性キシラナーゼを単離・精製し、そのコードする遺伝子をクローニングしている。そこで酸性域以外に、中性域に至適ｐＨを有する新たなキシラナーゼを得ることが出来れば、よりマイルドな条件下にキシロオリゴ糖などを得ることができる。また、出来るだけ多くのヘミセルロースを分解するためには、分解できる基質の範囲がやや狭いＧＨファミリー１１ではなく、基質特異性がより広範囲にわたるＧＨファミリー１０に属するキシラナーゼが望まれる。それ故、中性域に至適ｐＨを持ち、新たなＤＮＡの塩基配列を有するＧＨファミリー１０のキシラン分解酵素の提案が求められている。【０００５】  本発明の具体的な目的は、上記の機能とｐＨ特性を有するキシラナーゼの新規なＤＮＡ、そのＤＮＡによってコード化されるアミノ酸の配列を明らかにすると共に、そのＤＮＡが挿入された組換えベクターの構築およびその組換えベクターを有する形質転換体の取得を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】  前記目的を達成するために、発明者の保有するアウレオバシジウム・プルランスＡＴＣＣ２０５２４株を、キシランを炭素源として含む緩衝液により培養中のｐＨを６に維持した液体培地にて培養した。各種クロマトグラフィーに供し電気泳動的に単一に精製することにより、分子量３９，０００、等電点８．９の新規なキシラナーゼを得た。このタンパク質より得られた部分アミノ酸配列を用いて、本酵素をコードする遺伝子をクローニングした。このクローニングしたＤＮＡの塩基配列より、アミノ酸２６残基の菌体外分泌シグナルを含むアミノ酸３６１残基からなるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を推定した。この推定アミノ酸配列の相同性検索により、本酵素はＧＨファミリー１０に属するキシラナーゼであることが示唆された。【０００７】  得られた本酵素遺伝子のプロモーターは、ＴＡＴＡ配列のないプロモーター〔ＴＡＴＡ−ｌｅｓｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ〕であることが示唆された。さらにプロモーター領域には培養ｐＨに応答する発現制御に関与するＰａｃＣタンパク質が結合するコンセンサス配列が配列表の配列番号１の塩基番号６２８〜６３３番および９２０〜９２５番の２カ所に存在した。この配列の存在はアウレオバシジウム・プルランスにおいて初めて見出された。また、他のＧＨファミリー１０のキシラナーゼとのアミノ酸配列の多重整列より、本酵素にのみ存在する挿入配列が見いだされた。これらのことより得られたＤＮＡの塩基配列は新規と認められた。即ち、本発明は今迄に見いだされていない基質特異性を有する可能性も秘めた新たな塩基配列を有するキシラナーゼのＤＮＡである。【０００８】  リアルタイムＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を用いた発現定量により、本キシラナーゼ遺伝子は培養中のｐＨによって、発現が制御されていることが示唆された。これはプロモーター配列中にＰａｃＣ結合領域が存在することに起因するｐＨ制御であると思われる。また、アミノ酸配列に基づく分子系統樹により、本キシラナーゼは他とは異なるクラスターを形成することも示唆されている。従って、本発明のキシラナーゼは、配列番号１記載の塩基配列で示されるＤＮＡによってコードされたことを特徴とする。【０００９】  更に、本発明の組換えベクターは、上記のキシラナーゼをコードするＤＮＡが挿入された組換えベクターである。【００１０】  更に、本発明は、その組換えベクターを有する形質転換体である宿主細胞である。本発明の宿主細胞としては酵母が好ましい。
【発明の効果】
【００１１】  周知のように、機能性キシロオリゴ糖は、低カロリーでさわやかな甘みを有する甘味剤、整腸剤、あるいはカルシウム吸収促進剤としての作用効果が期待できる。本発明の新規なキシラナーゼは、分子量３９，０００、等電点８．９であり、これまで知られていない配列を有する新種である。これは従来公知のキシラナーゼとは異なり、これまで知られていないＤＮＡ塩基の挿入配列つまりこの塩基配列によりコードされているアミノ酸の挿入配列を有する新種である。さらにＧＨファミリー１０に属するので、ＧＨファミリー１１に属するキシラナーゼに比して、分解できる基質がより広範囲にわたるため、挿入配列の存在により中性域に至適ｐＨを有し、より広範囲のキシランを分解できる特性を有することが既に見出されている。加えて今後とも未利用基質の分解能がさらに拡がる可能性を有している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】  以下に、本発明を詳しく説明する。前記したように、本発明のキシラナーゼ遺伝子は、アウレオバシジウム属微生物に属する、高いキシラナーゼ生産能を有する好適株アウレオバシジウム・プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）ＡＴＣＣ２０５２４株に由来するものある。従って、そのＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列も、後述の如く新規であり、特に他のキシラナーゼが持ち合わせていない挿入配列を有している。【００１３】  本発明のキシラナーゼ遺伝子は、上記アウレオバシジウム属微生物から、以下のようにして入手することができる。まず、上記アウレオバシジウム属微生物菌株が十分に生育し、目的とする酵素を産生するような条件にて培養する。得られる培養液から菌体を除去して遠心分離の後、上清を回収する。この上清を用いて表１に示した方法にて精製を行う。精製の確認は、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法と等電点電気泳動によって単一であることを確認する。この手法により精製しておくのが、以下の事項をスムーズに行う点で望ましい。【００１４】  該キシラナーゼの分子量は３９ｋＤａ、等電点は８．９であり、比活性は２９．５Ｕ／ｍｇである。キシラナーゼ活性の最適反応条件はｐＨ６．０で７０°Ｃの時で、ｐＨ  ４．０から１０の範囲において元の活性の８０％以上が残存し、温度に関しては７０°Ｃまで安定である。またキシラナーゼ活性は、終濃度１ｍＭの条件下においてＥＤＴＡ、グアニジン塩酸塩、ｐ−Ｃｈｌｏｒｏｍｅｒｃｕｒｉｂｅｎｚｏａｔｅの影響を受けない。【００１５】  以下に本発明のＤＮＡの塩基およびアミノ酸配列について述べるが、配列表の配列番号１〜１１は以下の通りである。
配列番号１：染色体ＤＮＡより得られた該キシラナーゼのＤＮＡの塩基配列
配列番号２：ｃＤＮＡより得られた該キシラナーゼのＤＮＡの塩基配列
配列番号３：該キシラナーゼのアミノ酸配列
配列番号４：アミノ酸配列から作製した縮重プライマーのＤＮＡの塩基配列１
配列番号５：アミノ酸配列から作製した縮重プライマーのＤＮＡの塩基配列２
配列番号６：ｃＤＮＡ末端高速増幅法に用いるためのプライマーのＤＮＡの塩基配列１
配列番号７：ｃＤＮＡ末端高速増幅法に用いるためのプライマーのＤＮＡの塩基配列２
配列番号８：発現定量用を行うためのプライマーのＤＮＡの塩基配列１
配列番号９：発現定量用を行うためのプライマーのＤＮＡの塩基配列２
配列番号１０：組換えベクターを作製するためのプライマーのＤＮＡの塩基配列１
配列番号１１：組換えベクターを作製するためのプライマーのＤＮＡの塩基配列２【００１６】（アミノ酸配列）
該キシラナーゼについて、Ｎ末端および内部アミノ酸配列を同定した結果、配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号２７番目のＳｅｒから４４番目のＧｌｎまでの１８個の配列が明らかとなった。また、配列表の配列番号３で表されるア  ミノ酸配列において、アミノ酸番号７５番目のＡｓｎから８４番目のＰｒｏまでの１０個の配列が明らかとなった。さらに、配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号２７７番目のＬｅｕから２８６番目のＴｈｒまでの１０個の配列が明らかとなった。【００１７】（プローブ配列の取得）
これらのアミノ酸配列からＤＮＡの塩基配列を解読し、該配列を基にして１組のプライマー（配列表の配列番号４および５）を作製する。これら１組のプライマーを用い、該微生物より抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、常法に従いポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を行う。その結果、約１５０ｂｐの明瞭なバンドを得ることができる。【００１８】（プローブ配列の解析）
本発明者は、この約１５０ｂｐのバンド（ＰＣＲ産物）をクローニングし、そのＤＮＡの塩基配列を解読した結果、配列表の配列番号１の塩基番号１６１２〜１７６３番に示す１５２ｂｐよりなるＤＮＡの塩基配列を有することを見出した。さらに、得られた１５２ｂｐのＤＮＡの塩基配列をアミノ酸に翻訳したところ、先に得られたペプチドフラグメントのアミノ酸配列（配列表の配列番号３のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２７〜４４番、７５〜８４番）の一部に相当する配列の存在が認められた。このことから、この１５２ｂｐのＤＮＡの塩基配列は、キシラナーゼ遺伝子の一部であることが確認された。【００１９】（染色体上の該キシラナーゼとのハイブリダイゼーション）
続いて、配列表の配列番号１の塩基番号１６１２〜１７６３番に示す１５２ｂｐよりなるＤＮＡの塩基配列をプローブとして、該微生物のゲノムＤＮＡを用いてサザン・ハイブリダイゼーション法を行う。まず、配列表の配列番号１の塩基番号１６１２〜１７６３番に示す１５２ｂｐよりなるＤＮＡの塩基配列をランダムプライム法にて化学修飾したものをプローブとする。次に、制限酵素ＥｃｏＲＩにて切断されナイロン膜に転写した該微生物のゲノムに対して、先に作製した該酵素遺伝子配列の一部を含むプローブをハイブリダイズする。ハイブリダイズは、７％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡを含む０．５Ｍチャーチリン酸緩衝液の存在下で６５℃に保った状態で１６時間行った。【００２０】（染色体上の該キシラナーゼのＤＮＡの塩基配列）
その結果、シグナルが確認できた約９，０００ｂｐのＥｃｏＲＩ断片を、ｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩの部位に挿入してプラスミドｐＸＹＮ２０４を作る。ｐＸＹＮ２０４に含まれる約３，８００ｂｐのＸｂａＩとＫｐｎＩ断片は、ｐＵＣ１８にさらにサブクローニングされｐＸＹＮ２０５を作る。この断片をＫｐｎＩサイト側から３２９３ｂｐの配列を決定し、該キシラナーゼを含むＤＮＡの塩基配列を得ることができる（配列表の配列番号１）。【００２１】（ｃＤＮＡの該キシラナーゼのＤＮＡの塩基配列）
ｃＤＮＡの塩基配列を決定するために、該微生物を酵素生産時と同じ条件にて培養を行い、菌体を回収しＩＳＯＧＥＮ（和光純薬社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡよりポリアデニル化されたメッセンジャーＲＮＡを精製した。このメッセンジャーＲＮＡを鋳型とし、先に得られた配列表の配列番号１の塩基番号１６１２〜１７６３番に示す１５２ｂｐよりなるＤＮＡの塩基配列よりプライマーを作製し（配列表の配列番号６および７）その配列を起点とし、５′ｃＤＮＡ末端高速増幅（ＲＡＣＥ）法および３′ＲＡＣＥ法により該キシラナーゼ遺伝子を含むｃＤＮＡの塩基配列を得ることができる（配列表の配列番号２）。【００２２】（分泌シグナルの位置の推定）
配列表の配列番号１と２の比較により、２カ所のイントロンを含むキシラナーゼ前駆体のＤＮＡの塩基配列およびその転写調節部位を同定した。このことと、先に同定したＮ末端アミノ酸配列（配列表の配列番号３のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２７〜４４番）より配列表の配列番号１の塩基番号１５９４番目以降がキシラナーゼの成熟タンパク質コード領域であることが明らかにされた。また、これらのことより配列表の配列番号３のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号１〜２６番が菌体外に分泌するために必要な分泌シグナルであることが推定された。【００２３】（プロモーター部位におけるＤＮＡの塩基配列の特徴）
配列表の配列番号１に含まれる該キシラナーゼ遺伝子の転写調節部位には、アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）においてカーボンカタボライト抑制に関与するＣｒｅＡリプレッサー結合領域は配列表の配列番号１の塩基番号１１６６〜１１７１番に１カ所存在する。さらに、アスペルギルス・ニジュランスにおいて周囲のｐＨによって遺伝子の発現が調節されるジンクフィンガー転写因子ＰａｃＣ結合部位が、配列表の配列番号１の塩基番号６２８〜６３３番および９２０〜９２５番の２カ所に存在する。【００２４】  該キシラナーゼ遺伝子が培養時における周囲のｐＨによって制御されているか調べるために、１組のプライマー（配列表の配列番号６および７）を作製し、定量的リアルタイムＰＣＲ法にて相対定量を行った。その結果、ｐＨを調整しない培養と比べて、ｐＨを６．０と８．０に調整したものは、それぞれ８倍と２２倍に転写量が増大した。故に、配列表の配列番号１には、周囲のｐＨにより発現が制御されるシスエレメントが存在する転写調節部位が含まれている。【００２５】（本配列の新規性）
本発明のキシラナーゼ遺伝子のアミノ酸配列のホモロジー検索の結果、ＧＨファミリー１０に属するキシラナーゼであると推定される。また、類似のキシラナーゼのアミノ酸配列と多重整列を行った結果、他の類似のキシラナーゼには含まれていない機能未知の挿入配列の存在が明らかとなった。【００２６】  多重整列の結果を基に無根系統樹をＴＲＥＥＣＯＮソフトウエアにて作成した（図１、参照。）。図１は、アウレオバシジウム・プルランス由来該遺伝子配列のコードするアミノ酸配列と既知の比較的相同性の高いキシラナーゼのアミノ酸配列の触媒部位における系統関係を無根系統樹で表したものである。枝上に表示してある数値は、１０００回計算したものを基としたブートストラップ値の百分率である。ただし５０％以下は表示していない。左上のスケールバーは一カ所で０．１アミノ酸が置換することに相当する。その結果、本発明の該キシラナーゼ遺伝子がコードするアミノ酸配列は、非特許文献２にて区分されている２つのグループ（Ｉ又はＩＩ）のいずれにも属していない新規なものであった。【００２７】  本発明のキシラナーゼ遺伝子を含むプラスミドは、上記のキシラナーゼ遺伝子を常法によりプラスミドに導入することによって得ることができるが、その１例を以下に示す。【００２８】（組換えベクターの調製）
組換えベクター、好ましくはｐＰＩＣ３．５（インビトロゲン社製）を予め制限酵素分解する。この制限酵素切断プラスミドとＤＮＡの塩基配列が合致するよう、本発明のキシラナーゼ遺伝子の塩基配列を基に、１組のプライマー（配列表の配列番号１０および１１）を化学合成する。先に作製した本発明のキシラナーゼ遺伝子を含むｃＤＮＡを鋳型として、上記両プライマーを用いてＰＣＲ法によりキシラナーゼ遺伝子の全長をコードするＤＮＡを増幅する。得られた増幅産物に制限酵素を作用させて制限酵素切断ＤＮＡ断片とし、これに、先の制限酵素切断プラスミドｐＰＩＣ３．５を接合することにより、組換えベクターを調製する。【００２９】（宿主細胞の取得）
宿主細胞、好ましくは酵母ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の染色体上に組み込むため先の組換えベクターを制限酵素ＳａｃＩにて直鎖状にし、エレクトロポレーション法により導入し形質転換体を取得することができる。【００３０】  キシラナーゼ遺伝子の発現は、上述の形質転換体である酵母を培養し、培養上清中の酵素活性を測定して確認することができる。また、この培養上清中より常法によって精製することにより、該キシラナーゼを得ることができる。
【実施例】
【００３１】  以下に本発明のキシラナーゼの遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定、及び推定アミノ酸配列とｘｙｎＩＩ遺伝子産物の酵素活性について実施例により説明する。
実施例１
（工程１：培養液調製・精製・電気泳動）
アウレオバシジウム・プルランスＡＴＣＣ  ２０５２４株を、カラスムギ由来キシラン１％、イースト・ニトロゲン・ベース０．６７％を含み、終濃度０．１Ｍのリン酸緩衝液にて培地中のｐＨを６．０に維持した培地で培養した後、遠心分離により菌体を除去し培養上清を回収した。この上清を濃縮・脱塩し、陽イオン交換クロマトグラフィー用担体ＣＭ−Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ（生化学工業社製）を充填したカラムに吸着させた。吸着したタンパク質を塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させると、ｐＨ６．０で活性を測定したとき１つのキシラナーゼのピークを得ることができた。一方、太田らによって非特許文献１に精製とその諸性質が報告されているファミリー１１のキシラナーゼ（ＸｙｎＩ）の大部分はこの条件において担体には吸着しなかった。次にゲルろ過担体のＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇ（アマシャム・バイオサイエンス社製）を充填したカラムによって活性とタンパク質のピークが一致した状態で溶出させた。この手順により、培養上清からこのキシラナーゼは４８倍２７％の回収率で精製された。この酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと等電点電気泳動によって単一であることを確認し、分子量は３９ｋＤａ、等電点は８．９であった。この精製された酵素の比活性は２９．５Ｕ／ｍｇであった。【００３２】（工程２：基質特異性）
該キシラナーゼの基質特異性を調べた。この酵素は表１に示すとおりカバノキ由来のキシランをカラスムギ由来のキシランと同程度加水分解した。ｐＮＰ−β−Ｄ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｉｄｅとｐＮＰ−β−Ｄ−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅに対しては弱い活性を示し、カルボキシメチルセルロースとｐＮＰ−α−Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅに対しては活性を検出できなかった。【００３３】（工程３：分解生成物の確認）
薄層クロマトグラフィーを用いた分析において、このキシラナーゼによるカバノキ由来のキシランの初期の加水分解で、２もしくはそれ以上の重合度を持つオリゴ糖が得られたことが示された。キシロトリオースが中間産物として生産され、これが最終的にキシロビオースとキシロースに切断される。この酵素はキシロトリオース、キシロテトラオース、キシロペンタオースを加水分解するが、キシロビオースは分解しなかった。これらの性状より該キシラナーゼはエンド−１，４−β−キシラナーゼである。【００３４】
【表１】
2007068521.tif 000002
2007068521.tif 000003
【００３５】（工程４：部分アミノ酸配列の決定）
この精製酵素を用いて、プロサイス４９２プロテインシーケンサー（アプライド・バイオシステムズ社製）により、そのＮ末端アミノ酸配列１８残基（配列表の配列番号３のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２７〜４４番）を決定した。さらにスタフィロコッカス・アウレウスＶ８由来のプロテアーゼを用いて精製酵素を部分消化し、２つの断片のアミノ酸配列をそれぞれ１０残基（配列表の配列番号３のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号７５〜８４番および２７７〜２８６番）決定した。このうち配列表の配列番号３のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２７〜４４番および７５〜８４番の配列の中から、コドンの縮重の少ない領域をそれぞれ１カ所選び出し、フォワードおよびリバースの縮重プライマー（配列表の配列番号４および５）を化学合成した。【００３６】（工程５：プローブ配列の取得）
アウレオバシジウム・プルランスＡＴＣＣ２０５２４株から、ＩＳＯＰＬＡＮＴ（和光純薬社製）を使用しゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記２つのプライマー（配列表の配列番号４および５）を用いてＰＣＲ反応により増幅させた。その結果、約１５０ｂｐの明瞭なバンドが得られた。【００３７】（工程６：プローブ配列の解析）
得られたバンドをクローニングし、ビッグダイ・ターミネーター・サイクルシークエンシング・キット（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてＤＮＡの塩基配列をＰＲＩＳＭ３１０（アプライド・バイオシステムズ社製）にて解読した。その結果、配列表の配列番号１の塩基番号１６１２〜１７６３番に示す１５２ｂｐよりなるＤＮＡの塩基配列を有することを見出した。さらに、得られた１５２ｂｐのＤＮＡの塩基配列をアミノ酸に翻訳したところ、先に得られたペプチドフラグメントのアミノ酸配列（配列表の配列番号３のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２７〜４４番、７５〜８４番）の一部に相当する配列の存在が認められた。故に、該配列はキシラナーゼ遺伝子の一部であることが判明した。また、この１組のプライマー（配列表の配列番号４および５）は、該微生物のゲノムＤＮＡを鋳型としたとき、該キシラナーゼの一部を特異的に増幅するものである。【００３８】（工程７：プローブ配列の標識）
そこで、このＰＣＲ産物すなわち１５２ｂｐのＤＮＡの塩基配列（配列表の配列番号１の塩基番号１６１２〜１７６３番）を、ジゴキシゲニン化学発光核酸検出システム（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）に従いランダムプライム法によりジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰを標識し、キシラナーゼ遺伝子の全長をクローニングするためのプローブとして用いた。【００３９】（工程８：プローブ配列のハイブリダイズ）
一方、先のＰＣＲで鋳型として用いたアウレオバシジウム・プルランスＡＴＣＣ２０５２４株のゲノムＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩで完全分解した。得られた制限酵素分解物をアガロースゲル電気泳動で分離後、正荷電を帯びたナイロン膜に核酸を転写し、標識されたプローブを用いてサザン・ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイズは、７％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡを含む０．５Ｍチャーチリン酸緩衝液の存在下で６５℃に保ち１６時間行った。その結果、約９．０ｋｂｐのＤＮＡ断片にプローブがハイブリダイズした。このことは、目的とするキシラナーゼ遺伝子が両端にＥｃｏＲＩの認識配列を持つ約９．０ｋｂｐの断片中に含まれることを示すものである。【００４０】（工程９：染色体上での該キシラナーゼのＤＮＡ塩基配列の決定）
次に約９．０ｋｂｐのＥｃｏＲＩ断片を、ｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩの部位に挿入してプラスミドｐＸＹＮ２０４を作った。ｐＸＹＮ２０４に含まれている約３．８ｋｂｐのＸｂａＩとＫｐｎＩ断片をサブクローニングしたｐＸＹＮ２０５を作り、ＫｐｎＩサイト側から３２９３ｂｐの配列（配列表の配列番号１）を決定した。【００４１】（工程１０：ｃＤＮＡの該キシラナーゼの塩基配列の決定）
ｃＤＮＡの塩基配列を決定するために、該微生物を酵素生産時と同じ条件にて培養を行い、菌体を回収しＩＳＯＧＥＮ（和光純薬社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡよりポリアデニル化されたメッセンジャーＲＮＡをＰｏｌｙＡＴｒａｃｔメッセンジャーＲＮＡ単離システムＩＶ（プロメガ社製）にて精製した。このメッセンジャーＲＮＡを鋳型とし、先に得られた配列表の配列番号１の塩基番号１６１２〜１７６３番に示す１５２ｂｐよりなるＤＮＡの塩基配列よりプライマーを作製し（配列表の配列番号６および７）その配列を起点とし、５′ＲＡＣＥおよび３′ＲＡＣＥ法をＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ増幅キット（クローンテック社製）により行った。これにより該キシラナーゼ遺伝子を含むｃＤＮＡの塩基配列（配列表の配列番号２）が得られ、２箇所の転写開始点が−６０、−５４に存在したことと、終止コドンから下流１１４ｂｐ、１１９ｂｐ、１３８ｂｐの３つの点でポリアデニル化されていたことが明らかとなった。転写開始点から下流にあるはじめのＡＴＧは、開始コドンであると推定され、このＡより３残基前には保存されているＡが存在した。【００４２】（工程１１：イントロン位置の決定）
ゲノムＤＮＡより得られたＤＮＡの塩基配列（配列表の配列番号１）とＲＡＣＥ法により得られたｃＤＮＡの塩基配列（配列表の配列番号２）の比較により、２カ所のイントロンを含むキシラナーゼ前駆体のＤＮＡの塩基配列およびその転写調節部位を同定した。この２カ所のイントロンは分泌シグナルと成熟タンパク質のコード領域にそれぞれ５６ｂｐおよび７３ｂｐの塩基長で存在し、どちらのイントロンもＧＴ／ＡＧルールに則っていた。【００４３】（工程１２：アミノ酸配列の推定）
このキシラナーゼ前駆体のＤＮＡの塩基配列から翻訳したアミノ酸配列（配列表の配列番号３）を、最初に判明したキシラナーゼのＮ末端のアミノ酸配列（配列表の配列番号３のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２７〜４４番）と比較したところ、配列表の配列番号１の塩基番号１５９４番目以降がキシラナーゼの成熟タンパク質コード領域であることが明らかにされた。また、これらのことより配列表の配列番号３のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号１〜２６番が菌体外に分泌するために必要な分泌シグナルであることが推定された。さらに配列表の配列番号３中にアウレオバシジウム・プルランスより精製され決定された３つの部分アミノ酸配列（配列表の配列番号３のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２７〜４４番、７５〜８４番、２７７〜２８６番）の全てが存在することが確認され、精製により得られたキシラナーゼの遺伝子配列が得られたことが確認された。【００４４】（工程１３：転写調節部位の解析）
配列表の配列番号１に含まれる該キシラナーゼ遺伝子の転写調節部位には、ＴＡＴＡＡＡとＣＣＡＡＴモチーフは存在しなかった。アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）においてカーボンカタボライト抑制に関与するＣｒｅＡリプレッサー（５′−ＳＹＧＧＲＧ−３′）結合領域は、配列表の配列番号１の塩基番号１１６６〜１１７１番（ＧＴＧＧＧＧ）に存在した。さらに、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓにおいて周囲のｐＨによって遺伝子の発現が調節されるジンクフィンガー転写因子ＰａｃＣ結合部位（５′−ＧＣＣＡＲＧ−３′）が、配列表の配列番号１の塩基番号６２８〜６３３番（完全一致の形でＧＣＣＡＡＧ）と９２０〜９２５番（相補鎖に部分一致の形でＧＣＣＡＴＧ）に存在した。しかしながら、アスペルギルス・ニジュランスにおけるキシラン関連の転写活性化因子ＸｌｎＲの結合モチーフである５′−ＧＧＣＴＡＡＡ−３′は存在しなかった。【００４５】  該キシラナーゼ遺伝子の転写調節部位が周囲のｐＨによって制御されているがどうかを調べるために、該微生物を該キシラナーゼ遺伝子の取得を行った培養条件で培養した。ただし、培養時におけるｐＨを０．１Ｍリン酸緩衝液で６．０または８．０に調整したものと、ｐＨを調整していない３条件で７２時間培養を行った。ｐＨを調整していないものでは初発ｐＨ６．０が２．７まで低下し、菌の十分な生育と暗色の菌糸による黒色化が見られた。ｐＨを緩衝液にて調整したものは、ｐＨを６．０と８．０に保たれ、培地はｐＨを調整していないものと比べ菌の生育が遅れ、色調は黄色もしくはクリーム色であった。このそれぞれよりＩＳＯＧＥＮ（和光純薬社製）により全ＲＮＡを抽出し、オリゴｄＴプライマーを用いて逆転写反応を行った。これにより作製した１本鎖ｃＤＮＡを該キシラナーゼ遺伝子に特異的なリアルタイムＰＣＲ用プライマー（配列表の配列番号６および７）を用いて増幅し、その増幅反応をＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎによるアッセイ法でリアルタイムＰＣＲのシステムであるＰＲＩＳＭ７０００（アプライド・バイオシステムズ社製）により検出した。その結果、ｐＨ無調整でｐＨ２．７に達した培養と比べて、ｐＨを６．０と８．０に調整したものは、それぞれ８倍と２２倍に転写量が増大した。故に、配列表の配列番号１には、周囲のｐＨにより発現が制御されるＰａｃＣ様の転写調節因子が結合するシスエレメントが存在する転写調節部位が含まれている。【００４６】（工程１４：組換えベクターの作製と形質転換体の取得）
先に作製した本発明のキシラナーゼ遺伝子を含むｃＤＮＡを鋳型として、制限酵素ＥｃｏＲＩ認識部位を付加した１組のプライマー（配列表の配列番号１０および１１）を用いてＰＣＲ法により菌体外分泌シグナルをコードする領域も含むキシラナーゼ遺伝子を伸長する。この伸長配列を付加した部位を認識する制限酵素にて切断し、同制限酵素により同じく切断したメタノール資化性酵母ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｄｔｏｒｉｓ）における組換えベクターｐＰＩＣ３．５（インビトロゲン社製）に挿入し、ｐＸＹＮ２０７を作製する。このプラスミドを制限酵素ＳａｃＩにて直鎖状にし、エレクトロポレーション法によりピチア・パストリスの染色体上に組み込み形質転換体を取得する。この形質転換体（ｐＸＹＮ２０７）を７２時間生育させると、培養上清に０．１２Ｕ／ｍｌのキシラナーゼ活性が検出された。一方、組換えベクターｐＰＩＣ３．５のみを形質転換したものをコントロール株としたが、菌体外キシラナーゼ活注は検出されたなかった。【００４７】（工程１５：形質転換体の分泌する該キシラナーゼの精製）
この菌体外タンパク質を陽イオン交換体ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（アマシャム・バイオサイエンス社製）に供すると、２つのキシラナーゼのピーク（Ｐ−ＩとＰ−ＩＩ）に分離され、それぞれの画分を回収してゲルろ過担体Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇカラムにより個別に精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによると、精製されたリコンビナントキシラナーゼのＰ−ＩはＰ−ＩＩよりも分子量が若干大きかった。Ｐ−ＩＩのＮ末端アミノ酸配列は、本来のキシラナーゼと同じであったが、Ｐ−Ｉは本来切断されるべき点よりも６残基上流から多く含まれていた。培養液中のリコンビナントキシラナーゼ（Ｐ−ＩおよびＰ−ＩＩ）の濃度は、その比活性に基づくと、それぞれ６．５ｍｇ／Ｌおよび３６ｍｇ／Ｌとなった。この結果は、該キシラナーゼ遺伝子がコードする前駆タンパク質のほとんどはピチア・パストリスの分泌経路において正確に認識され処理されていることを示している。このことから該キシラナーゼ遺伝子がコードするアウレオバシジウム・プルランス由来菌体外分泌シグナルは、酵母であるピチア・パストリスにおいてその菌体外に分泌するという機能を発揮することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４８】  本発明の新規な塩基配列を有するキシラナーゼは、基質特異性がより広範囲にわたるＧＨファミリー１０に属し、中性域に至適ｐＨを有するので、多くのヘミセルロースを分解することができ、よりマイルドな条件下でキシロオリゴ糖を得ることができるキシラナーゼとして有用である。なお、キシランからキシラナーゼにより生産されるキシロオリゴ糖は、低カロリーでさわやかな甘みを有する甘味剤、整腸剤、あるいはカルシウム吸収促進剤としての優れた機能性を有する物質として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】Ｉ及びＩＩのいずれにも属していないことを示す無根系統樹である。
【図１】
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【配列表】
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