(57)【要約】【課題】  チガヤにおける多芽体誘導とその育種的利用法に関し、チガヤにおける効率的で安定的な培養系を確立するため、生長点由来多芽体カルスを誘導し、植物体再分化に至る培養条件を提供するとともに、その多芽体を用いて重イオンビーム照射により変異体の作出する方法を提供する。【解決手段】  チガヤから摘出した生長点を、ＭＳ培地を基本培地とし、カルス誘導のための植物ホルモンとして2,4-DおよびBAPをそれぞれ組み合わせて添加した寒天培地に置床し、多芽体カルスを誘導した。次に、多芽体カルスに重イオンビームを照射した。さらに、多芽体カルスから再分化し、選抜した植物体を、焼土およびボラ土を2 : 1の割合で充填したプラスチックポットに移植し、適宜灌水を行い育成して、矮性チガヤを作出した。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多芽体に重イオンビームを照射する工程と、
前記多芽体を植物体に復元させる工程と、を含む矮性チガヤの作出方法。
【請求項２】
前記重イオンビームの照射条件がネオン20Gy照射であることを特徴とする請求項１記載の矮性チガヤの作出方法。
【請求項３】
チガヤから摘出した生長点を、2,4-DおよびBAPを組み合わせて添加した培地に置床する工程を含むことを特徴とする、チガヤの多芽体カルスの誘導方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明で作成する矮性チガヤは、緑化草種として様々な緑地帯、道路および河川のり面および工場などの跡地での緑化植物等に最も利用される。
【背景技術】
【０００２】
チガヤ（Imperata cylindrica L.）は、熱帯から温帯にかけて分布しているイネ科の多年生草本植物であり（Hubbard 1944）、わが国では、沖縄から北海道南部までの畦畔、河川堤防、法面および空き地などに生育している（Tominaga et al. 1989）。また、チガヤの生育特性としては、根茎が非常に発達し、乾燥にも強く、刈り取り後の再生も旺盛であることから、家畜の飼料としての野草利用やのり面等の緑化植物として利用されている。
【０００３】
しかしながら、チガヤを緑化植物として利用する場合には従来の植え付けによる緑化工法では対処することができないため、安価で大量、かつ、安定的に良質である資材が必要であるとともに、草刈り等の作業を軽減できる低管理品種の育成が望まれている。
【０００４】
作物の育種技術は、交雑育種法、選抜育種法、突然変異育種法および遺伝子組換え技術を基本とした分子育種がある。その中でも突然変異育種法は、自然突然変異を利用するか、又は、人為的に突然変異を誘発し、評価することで新規の変異体を利用するものである。突然変異源は、（1）ガンマ線、X線および中性子線などによる放射線処理、（2）エチルメタンスルフォン酸（EMS）などの薬剤処理が報告されている（非特許文献１参照）。
【非特許文献１】K. K. Kwon and T. Kameya（1993）Selection and characterization of a-5methyltryptophan resistant mutant in Zea mays L. Euphytica 69,95-101
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、ガンマ線やX線などの放射線は照射に多大な期間を必要とし、また、EMSなどの薬剤は突然変異を誘発するとともに植物体自体を損傷させてしまうため多数の突然変異体を得るのは困難である。一方、重イオンビームの照射による新規の突然変異誘発は、従来の突然変異育種法にくらべ照射が一瞬で、他の放射線よりも数十倍から数千倍の影響を与えることができる。
【０００６】
イオンビーム照射により誘発される突然変異は、自然界で起こっている突然変異（自然突然変異）と原理が同じである一方、エックス線・ガンマ線など従来から用いられている低LET線とは変異スペクトルが異なることが示唆されつつある。つまり新奇性の変異株を得られる、安全な新技術であると考えられる（阿部 2003）。また、イオンビームが物質を通過する際に与える影響として、他の放射線に比べて数十から数千倍もの大きな影響を極微小範囲の物質に与えるという特徴を持つことから、DNA障害を局所的に与えることが可能である。これは単一の遺伝子のみを欠損させる確立が高いことを意味し、すなわち目的を持った育種の年限短縮にもつながる。
【０００７】
重イオンとは、水素とヘリウムを除いた元素、すなわち「重い元素」の原子から放電現象を利用して電子をはぎとり、プラスに帯電した粒子、すなわちイオン化した原子核で、これを加速器で高速に加速したものが重イオンビームである。このような加速器のうち、大気中で照射可能なビームラインを有する加速器施設は世界的にも少なく、日本国内において独立行政法人理化学研究所、原子力研究機構量子ビーム応用研究部門および放射線医学総合研究所など数ヶ所にしかなく、その生物利用が独創的であることから、現在、植物の変異原として注目されている。
【０００８】
また、突然変異体の作成の効率的な作成のためには、チガヤにおける効率的で安定的な培養系を確立することが必要である。これまで、イネ科植物における培養系は、エンブリオジェニックカルス形成→体細胞不定胚形成→植物体再分化といった一連の培養系が主流を占めており、また、チガヤにおける組織培養技術も1989年にAkashi and Ikedaにより報告されている。この報告では、チガヤの生長点を無菌的に摘出し、増殖することでカルスを誘導し、カルスからの植物体再分化を促したものであったが、再分化した植物体がカルス由来であることから、カルス当りの植物体再分化数も低く、また、長期培養に伴うソマクローナル変異も懸念されることから培養変異がなく大量培養により安定的に大量の植物体再分化できる培養系が必要となる。
【０００９】
本発明は、チガヤ（Imperata cylindrica L.）における多芽体誘導とその育種的利用法に関し、チガヤにおける効率的で安定的な培養系を確立するため、生長点由来多芽体カルスを誘導し、植物体再分化に至る培養条件を提供するとともに、その多芽体を用いて重イオンビーム照射により変異体を作出する方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（１）発明者は、大量の植物に変異を起こさせるために多芽体を作成するとともに、大量増殖技術を確立した。その結果、１つの生長点から多芽体を形成し継代培養を行うことで、無限に植物体を増殖することが可能となった。
【００１１】
本発明は、チガヤにおける効率的で安定的な培養系を確立するため、生長点からの多芽体カルス形成、そして多芽体カルスから植物体再分化に至る培養系を提供するものである。
【００１２】
すなわち、チガヤから摘出した生長点は、例えば、Murashige and Skoog 培地（以下MS培地と記す）を基本培地とし、カルス誘導のための植物ホルモンとして2,4-DおよびBAPをそれぞれ組み合わせて添加した寒天培地（0.3% ゲルライト）に置床し、多芽体カルスを誘導した。
【００１３】
2,4-DおよびBAPがチガヤの生長点由来多芽体カルスの形成に及ぼす影響について調査したところ、多芽体カルス形成率は、0.5mg/L 2,4D+1.0mg/L BAP添加区で50%と最も高く、次いで0.1mg/L 2,4-D+1.0mg/L BAPおよび0.1mg/L 2,4-D+2.0mg/L BAP添加区の40%であった。多芽体カルスは、0.1mg/L 2,4-D+2.0mg/L BAP添加区において増殖旺盛で再分化率の高い多芽体カルスを誘導することができた。
【００１４】
以上のことから、多芽体カルスから植物再分化に至る一連の培養系を確立することができた。また、生長点由来多芽体カルス誘導培地における2,4-DおよびBAPが植物体再分化に及ぼす影響について調査したところ、再分化率は0.1mg/L 2,4-D+2.0mg/L BAP添加区で90.5%と最も高く、また、カルスあたりのシュート数も10.8本と他の試験区よりも高い値を示した。
（２）本発明は、重イオンビームによりチガヤの多芽体カルスを用いて矮性の変異体の作出する方法である。
【００１５】
重イオンビームを照射した多芽体カルスから得られた再分化個体の草丈、分げつ数および葉幅について調査したところ、無照射区の草丈は47.5-52.4cmであるのに対して、ネオン20Gy照射区の個体では19.4-48.6cmの範囲であり、草丈の極めて低い変異体が得られた。一方、分げつおよび草幅においては、無照射区における植物体と同様であった。すなわち、多芽体カルスに重イオンビームを照射することにより草丈の極めて低い変異体を作出することができた。
【００１６】
以上のように、従来のチガヤは、これまで改良されていないために草丈が高く、その管理に多くの労力を必要としていたが、本発明で得られた矮性チガヤは、日本在来の野生型の改良でるため日本の風土に適応し、また、草丈が矮性であるため従来のチガヤよりも低管理で栽培できる特性を保持している。さらに、本矮性チガヤは組織培養により大量に増殖できることから、従来の栄養繁殖技術による増殖よりも遥かに短期間で大量に増殖できる利点がある。すなわち、本発明の効果は、矮性であるため草刈り等の作業管理がほとんど必要なく、非管理下でも生育可能であること、草刈り等の作業が危険なのり面でも栽培が可能なことである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明を実施例を用いて説明する。
【実施例１】
【００１８】
（１）材料および方法
（１−1）供試材料
本実施例１に供試したチガヤは宮崎大学内圃場に自生するもので、その生長点をカルス誘導の外殖体として用いた。生長点を含んでいる分げつを上部から4〜5枚の葉鞘を残して、長さ5cm程度に切り取り、70%エタノールで1分、2%の次亜塩素酸ナトリウムで15分間表面殺菌を行い、次いで滅菌水で3回洗浄した後にクリーンベンチ内で表面の葉鞘を取り除き、生長点は葉原基を1〜2枚残し培養に供した。
（１−2）多芽体カルスの誘導
摘出した生長点は、Murashige and Skoog 培地（以下MS培地と記す）を基本培地とし、カルス誘導のための植物ホルモンとして2,4-DおよびBAPをそれぞれ組み合わせて添加した寒天培地（0.3% ゲルライト）に置床し、多芽体カルスを誘導した。培養を開始して30日後、形成した多芽体カルスは同培地で30日毎に継代培養した。なお、供試したすべての培地pHは5.7に調節し、培養条件は25-27℃、連続照明下で行った。
（１−3）植物体再分化および根誘導
植物体再分化は、増殖した多芽体カルスをホルモンフリーMS固形培地に置床し、明条件下でシュートを再生させることにより行った。その後、再分化したシュートは0.8%の寒天を添加した1/2MSホルモンフリー培地で発根させた。
（２）実験結果について
（２−1）多芽体カルス誘導
多芽体は、多数のシュートが1つの組織から形成されたもので、未分化組織の表面に多数の不定芽あるいは不定胚が混在し分化して形成される場合と、シュートの腋芽のみが連続的に発育して形成される場合とがある。通常、多芽体は生長点および幼腋芽などの分裂組織から誘導され、2,4-DおよびBAPを組み合わせたホルモン条件下で形成が認められており、園芸作物を中心に大量増殖技術の一つとして普及した。このことから、2,4-DおよびBAP濃度が多芽体カルス形成に及ぼす影響について調査した。
【００１９】
摘出した生長点をMS固形培地に置床し多芽体を誘導したところ培養開始13日頃に基部の切断面付近から淡黄色でコンパクトなカルスが形成され、その表面に多数の小粒状カルスが認められた（図 1  a-2）。その後、カルスは増殖しながら多くのドーム状の生長点を形成し、多芽体へ発育した（図 1  a-3〜a-5）。また、この多芽体はピンセットで細かく分割し、同培養条件下で培養することで継代することが可能であった（図1b）。
【００２０】
表1は、2,4-DおよびBAPがチガヤの生長点由来カルスの形成に及ぼす影響について調査した結果である。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
カルス形成率は、0.5mg/L 2,4-D+1.0mg/L BAP添加区で50%と最も高く、次いで0.1mg/L 2,4-D+1.0mg/L BAPおよび0.1mg/L 2,4-D+2.0mg/L BAP添加区の40%であり、0.5 mg/L 2,4-D+2.0mg/L BAP添加区では20%と最も低い値を示した。一方、カルスの生長は0.1mg/L 2,4-D+1.0mg/L BAPおよび0.1mg/L 2,4-D+2.0mg/L BAP添加区が旺盛であった。
【００２３】
表2は、生長点由来カルス誘導培地における2,4-DおよびBAPが植物体再分
化に及ぼす影響についてまとめたものである。
【００２４】
【表２】
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【００２５】
再分化率は、0.1mg/L 2,4-D+2.0mg/L BAP添加区において90.5%と最も高く、また、カルスあたりのシュート数は10.8本と他の試験区よりも高い値を示した。このように、0.1mg/L 2,4-D+2.0mg/L BAP添加区では増殖旺盛で再分化率が高い多芽体カルスを誘導することができ（図 1  a-1〜a-5）、多芽体カルス誘導においては0.1mg/L2,4-D+2.0mg/LBAP添加MS培地が最適であるものと考えられる。
【００２６】
細胞レベルでの育種展開を考える上で最も重要なことの一つは、用いるカルスおよび細胞における再分化能をいかに保持するかにある。一般に、イネ科植物におけるアルビノ化は頻繁に起こる現象であり、その率は培養日数の増加に伴い上昇する傾向にある。しかしながら、本実施例１で適用した多芽体カルス誘導法はアルビノ化の原因とされる2,4-Dの使用量が微量であることから、培養開始4年以上を経過した現在もアルビノが発生せず、多くの増殖旺盛で緑色な植物体を維持することができたことから、大量増殖を可能とする。
【００２７】
さらに、多芽体カルスの表面上に多くのドーム状の生長点を有していたことから、今後、重イオンビームによる変異体の作出において、十分な標的材料として活用できる。
（２−２）植物体再分化および根誘導
さらに、これらの多芽体カルスはホルモンフリーMS固形培地に移すことによりシュートを再生させることができ、その後、再分化したシュートは0.8%の寒天を添加した1/2MSホルモンフリー培地で発根させることによって多くの植物体を再分化させることができた（図1  c,d）。
【実施例２】
【００２８】
本実施例２では、前記実施例１の方法で培養したチガヤの多芽体カルスを用いて、ネオンイオンおよび炭素イオンを照射し、変異体を作出した。
（１）材料および方法
（１−１）重イオンビーム
重イオンビームは、継代培養14日目におけるチガヤの生長点由来多芽体カルスを深型シャーレ（90mm×20mm）に21個置床し、理化学研究所加速器施設にて照射を行った。照射線量は、ネオンイオンが0、5、10、20、50、100 Gy、炭素イオンが0、5、10、20、50、100 Gyであり、1試験区に4シャーレ照射した。照射後多芽体カルスは再分化培地に置床し、シュート形成を促した。再分化した植物体は根誘導培地で十分に生育させ、馴化した後ポットへ移植した。
（１−２）供試材料
本実施例２に供試した変異体チガヤは、理化学研究所加速器施設で重イオンビームを照射し多芽体から再分化し、宮崎大学内圃場において選抜した植物体を用いた。各植物体は、無照射区3個体および照射区10個体であり（表 3）、2005年4月22日に焼土およびボラ土を2 : 1の割合で充填したプラスチックポット（容積 120Ｌ）に移植し、適宜灌水を行い育成した。
【００２９】
【表３】
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【００３０】
（１−３）形態的特性調査
形態的特性調査の調査に先立ち、2005年6月27日に全植物体は地際から5cmに刈り取った。刈り取り30日後に草丈、分げつ数および葉幅について以下の方法により調査した。すなわち、（ａ）草丈 : 地際から最頂端までの長さ。（ｂ）分げつ数 : 出現した分げつ数。（ｃ）葉幅 : 止葉下第1葉の幅である。
（１−４）重イオンビームの照射
理化学研究所加速器施設理研リングサイクロトロンにて、炭素（12C6+、1620MeV）およびネオン（20Ne10+、2700MeV）イオンを加速し、チガヤの多芽体カルスに照射した。全ての照射カルスは新鮮培地（MS+0.1mg/L 2,4-D+2.0mg/L BAP）に継代した。
（２）実験結果について
（２−１）重イオンビーム照射後の生存率、及びシュート数
図2および図3は、ネオンおよび炭素イオンビーム照射14日目における多芽体カルスの生存率およびシュート数に及ぼす影響について調査したものである。カルス生存率はネオンおよび炭素イオンを50Gy照射した照射区からカルスの生存率が低下する傾向が認められ、ネオンイオン100Gyおよび炭素イオン50Gyのときに半致死量であった。その結果、生存率が中庸な照射区は炭素が5Gyで、ネオンが20Gryであったことから、これらの照射区を最適照射量と定めた。
【００３１】
一方、シュート数は照射量が高くなるにつれ徐々に低下する傾向がみられ、ネオンおよび炭素イオンの両イオンにおいて50Gy試験区からカルスが褐変し再分化が認められなかった（図4）。また、アルビノ個体の発現はネオンおよび炭素イオンの両イオン照射区において認められなかった。
【００３２】
図5は、ネオンおよび炭素イオン照射後におけるカルスの生長を示したものである。ネオンイオン照射区では、カルスの生長は照射量が高くなるにつれ抑制された。また、炭素イオン照射区においてこのような傾向は認められなかった。
（２−２）形態的特性調査
重イオンビームを照射した多芽体は植物体に復元させ、ポットに約1000個体鉢上げした。鉢上げ1年目は十分に生長させ、2年目は草丈、葉幅および分けつを測定したところ、草丈の低い62個体を選抜した。3年目は前年度選抜した62個体のうち10個体について、草丈、葉幅および分けつを調査したところ、最も草丈が低く分けつ数が多い1個体（本発明）を選抜した。
【００３３】
重イオンビームを照射した多芽体カルスから得られた再分化個体の草丈、分げつ数および葉幅の調査結果を表 3にまとめ、図6にグラフ化した。無照射区における草丈は47.5-52.4cmの範囲で、その平均値は50.1cmであるのに対して、照射区における草丈は19.4-48.6cmであった。最大草丈を示した個体はコントロール2であった。一方、最小の草丈を示した個体は、No.4であった。
【００３４】
無照射区における分げつ数は109-124本の範囲で、その平均値は115.7本であるのに対して、照射区における分げつ数は93-129本であった。分げつ数の最も多い個体はNo.1であった。一方、最も分げつ数の少ない個体はNo.3であった。
【００３５】
無照射区における葉幅は0.7-0.8cmの範囲で、その平均値は0.7cmであるのに対して、照射区における葉幅は0.7-1.1cmであった。葉幅はNo.7およびNo.9が最大であった。一方、コントロール2、コントロール3、No.1、No.3およびNo.10において葉幅は最も狭かった。
【００３６】
特に、草丈においてはコントロール個体の最大草丈の52.4cmよりも約30cmも低く、草丈の極めて低い変異体が得られた（図 7d, e, f）。一方、分げつ数および葉幅においては、その差異は認められなかった。
【００３７】
本実施例では、ネオン20Gy照射区の植物体において、草丈の極めて低い変異体を作出することができた。さらに、ネオン20Gy照射区における再分化植物体は生存率が高く選抜した植物体の中に最も多く含まれていた。このことから重イオンビームの照射においてネオンイオン20Gyの照射量が最適であったと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】チガヤにおける多芽体カルス形成および植物体再分化を表す写真である。
【図２】ネオン照射後におけるカルス生存率およびシュート数を表すグラフである。
【図３】炭素照射後におけるカルス生存率およびシュート数を表すグラフである。
【図４】ネオン及び炭素イオン照射１４日目における、各処理区における多芽体カルスの成長を表す写真である。
【図５】ネオン及び炭素イオン照射量とカルスの成長との関係を表す写真である。
【図６】重イオンビーム照射カルスから再分化した植物体における形態的特性を表すヒストグラムである。
【図７】重イオンビームを照射した多芽体から再分化した植物体と変異個体を表す写真である。
【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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