(57)【要約】【課題】動物の免疫活性を調整する動物用免疫活性調整剤、及びその調整剤を含有する動物用飼料を提供すること。【解決手段】ＧＴＬ−００１、ＧＴＬ−００２、ＧＴＹ−００１、及びＧＴＹ−００２を培養して得られた培養液、或いはその培養液を粉末化したものによって達成される。上記４種類の微生物は、それぞれ独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センターに寄託されている。【選択図】          図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３５として寄託されているＧＴＬ−００１（Lactobacillus paracasei ssp paracasei）。
【請求項２】
受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３６として寄託されているＧＴＬ−００２（Lactobasillus paracasei ssp paracasei）。
【請求項３】
受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３７として寄託されているＧＴＹ−００１（Saccharomyces cerevisiae）。
【請求項４】
受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３８として寄託されているＧＴＹ−００２（Pichia membranifasciens）。
【請求項５】
ＧＴＬ−００１（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３５）、ＧＴＬ−００２（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３６）、ＧＴＹ−００１（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３７）、及びＧＴＹ−００２（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３８）を混合培養して得られたことを特徴とする動物用免疫活性調整剤。
【請求項６】
請求項５に記載の動物用免疫活性調整剤を含有することを特徴とする動物用飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物用免疫活性調整剤、及びその調整剤を含有する動物用飼料に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年には、イヌ・ネコなどのペットの飼育者が増大しており、これに伴ってペットなどの哺乳動物の健康に配慮した飼料の研究開発が盛んとなってきている。このような研究には、微生物を用いたものがある。例えば、特許文献１及び特許文献２には、そのような技術が開示されている。
【特許文献１】特開２００５−１５４３８７号公報
【特許文献２】特開２００５−０２１１５６号公報
【０００３】
特許文献１には、ラクトコッカス属乳酸球菌（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５５９）を用いた免疫調節機能を備えた動物用飼料が開示されている。また、特許文献２には、ラクトバチルス・パラカセイ属乳酸菌（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６９）を用いた動物用飼料が開示されている。
しかしながら、上記文献に開示された技術は、単一種類の微生物を用いたものであり、いくつかの微生物を組み合わせたときの効果を評価したものについては、十分な研究開発が行われていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、動物の免疫活性を調整する動物用免疫活性調整剤、及びその調整剤を含有する動物用飼料を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するために、本発明者は各地の土壌から有効な微生物を検索したところ、ついに愛知県半田市の土壌から４種類の微生物を分離するに至り、基本的には本発明を完成するに至った。これらの微生物は、本発明者らによって、ＧＴＬ−００１（Lactobacillus paracasei ssp paracasei）、ＧＴＬ−００２（Lactobasillus paracasei ssp paracasei）、ＧＴＹ−００１（Saccharomyces cerevisiae）、及びＧＴＹ−００２（Pichia membranifasciens）と銘々された。上記微生物は、それぞれ、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されている。
【０００６】
こうして、本発明に係る動物用免疫活性調整剤は、ＧＴＬ−００１（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３５）、ＧＴＬ−００２（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３６）、ＧＴＹ−００１（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３７）、及びＧＴＹ−００２（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３８）を混合培養して得られたことを特徴とする。
また、上記発明に係る動物用免疫活性調整剤を含有する動物用飼料を提供することができる。
上記４種類の微生物の特徴を説明すると次のようである。
ＧＴＬ−００１は、ラクトバチルス・パラカセイ（Lactobacillus paracasei ssp paracasei）であった。ＧＴＬ−００１の特徴として、下表１に示すものが認められた。
【０００７】
【表１】
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【０００８】
ＧＴＬ−００２は、ラクトバチルス・パラカセイ（Lactobasillus paracasei ssp paracasei）であった。ＧＴＬ−００２の特徴として、下表２に示すものが認められた。
【０００９】
【表２】
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【００１０】
ＧＴＹ−００１は、サッカロミセス・セレヴィジエ（Saccharomyces cerevisiae）であった。ＧＴＹ−００１の特徴として、下表３に示すものが認められた。
【００１１】
【表３】
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【００１２】
ＧＴＹ−００２は、ピチア・メンブラニファシエンス（Pichia membranifasciens）であった。ＧＴＹ−００２の特徴として、下表４に示すものが認められた。
【００１３】
【表４】
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【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、動物に対して優れた免疫活性調整作用を備えた動物用免疫活性調整剤、及びその調整剤を配合した動物用飼料を提供することができる。この飼料は、各種動物の免疫効果を高めるために飼料、ペットフードとして用いることができる。また、本発明の調整剤は、動物の皮膚疾患に対する薬品などに適用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
次に、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
本実施形態の動物用免疫活性調整剤（以下には単に、「調整剤」という）は、適当な栄養を含む培地中で、ＧＴＬ−００１、ＧＴＬ−００２、ＧＴＹ−００１、及びＧＴＹ−００２を混合培養することにより得ることができる。そのような培地としては、例えば酵母抽出物、麦芽抽出物、ポリペプトン、ブドウ糖などを含有したものを用いることができる。適量の酵母抽出物、麦芽抽出物、ポリペプトン、ブドウ糖を混ぜ、適当量の水（精製水、井戸水、または水道水）を混合し、殺菌処理することにより、培地を作成することができる。
【００１６】
次に、上記培地中で、前記４種類の微生物を混合培養し、培養液を製造する。培養液の製造は、培地中への微生物の添加の後、通気培養による一次培養を行った後、冷温による二次培養を行い、加熱殺菌を行う。殺菌後の培養液は、そのまま、或いは粉末加工した後に、調整剤として使用することができる。また、この培養液は、そのまま或いは微生物を除去するために濾過した後に、粉末加工し、調整剤として用いることができる。
【００１７】
粉末加工品は、（１）飼料に混合して動物用飼料として、（２）動物用の皮膚外用剤として、或いは（３）動物用サプリメントとして使用することができる。動物とは、イヌ・ネコ等のペット、ウシ・ウマ・ブタ・ニワトリ等の家畜が含まれる。
【００１８】
次に、本発明の実施例について、詳細に説明する。
＜実施例１＞  培地の製造
調整剤の製造工程は、培地の製造（図１を参照）と、培養液の製造（図２を参照）とに大別される。まず、図１を参照しつつ、培地の製造について説明する。
まず、酵母抽出物（BactoTM Yeast extract (Becton, Dickinson and Company)）２７ｇ、麦芽抽出物(BactoTM Malt extract (Becton, Dickinson and Company))２７ｇ、ペプトン（BactoTM pepton (Becton, Dickinson and Company)）４５ｇ、Ｄ（＋）−グルコース（和光純薬工業株式会社）９０ｇ、及び米ぬか抽出物（RICEO-EX(TSUNO RICE FINE CHEMICALS CO., LTD.)）９０ｇと水を混合し、９リットルに調整した。水には、水道水を用いたが、この他にも井戸水、殺菌水などを用いることもできる。
次に、この混合液を１２１℃にて２０分間、加熱殺菌した後、冷却することにより培地を得た。以後、この培地を「ＧＴ培地」という。
【００１９】
＜実施例２＞  培養液の製造
次に、図２を参照しつつ、培養液の製造方法について説明する。
実施例１で調製したＧＴ培地に、前述のＧＴＬ−００１、ＧＴＬ−００２、ＧＴＹ−００１、及びＧＴＹ−００２の４種類の微生物を添加して混合した。
３７℃で２４時間或いは４８時間の通気培養（一次培養）を行った後、４℃で２週間或いは４週間の低温培養（二次培養）を行った。
二次培養の後に、１２１℃、２０分間の加熱殺菌を行った。この培養液を４℃で冷蔵保存した。
【００２０】
＜実施例３＞  ＩＣＲ系マウス脾細胞に対する効果
ＧＴ培地及び実施例２で得た培養液について、ＩＣＲ系マウスの脾細胞を用いた活性化試験を行った。
ＩＣＲ系マウスから定法に従って脾細胞を抽出した。この脾細胞をＧＴ培地、及び培養液に添加し、４５０ｎｍの吸光度を測定することにより免疫活性を測定した。
【００２１】
また、免疫細胞を刺激する物質であるｃｏｎＡ（コンカナバリンＡ）、及びＬＰＳ（リポポリサッカライド）を使用し、ＩＣＲ系マウスの脾細胞を用いた試験を行なって免疫活性を測定した。
培養液としては、２４時間の一次培養と４週間の二次培養を行ったもの（以下、この培養液を用いた試験群を「Ａ群」という）、４８時間の一次培養と２週間の二次培養を行ったもの（以下、この培養液を用いた試験群を「Ｂ群」という）、及び４８時間の一次培養と４週間の二次培養を行ったもの（以下、この培養液を用いた試験群を「Ｃ群」という）の３種類を用いた。
【００２２】
また、ＧＴ培地及び培養液を用いた試験においては、ｘ１００、ｘ５０、ｘ２５、及びｘ１２.５の４種類の希釈倍率としたものを用いた。すなわち、下表１に示すように、ＧＴ培地群（Ｎｏ.４〜Ｎｏ.７）、Ａ群（Ｎｏ.８〜Ｎｏ.１１）、Ｂ群（Ｎｏ.１２〜Ｎｏ.１５）、及びＣ群（Ｎｏ.１６〜Ｎｏ.１９）として試験を行った。
試薬には、タカラバイオ株式会社のPremix WST-1 Cell Proliferation Assay System を用いた。また、計測装置として、BIO−RAD社製のMICROPLATE READER Model 550 を用いた。
表１及び図３には、試験結果を示した。データは、いずれの群についてもＮ＝３とし、それらのデータについて平均値及び標準偏差を求めた。なお、有意差は、コントロールとの比較において、危険率５％（ｐ＜０.０５）で計算した（表２においても同様である）。
【００２３】
【表５】
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【００２４】
コントロールに比べると、ＬＰＳでは、免疫応答が有意（ｐ＜０.０５）に上昇した。また、ＧＴ培地（微生物を培養していないもの）を用いた場合にも、免疫応答の上昇が認められた。特に、ｘ２５及びｘ１２.５の希釈倍率においては、有意（ｐ＜０.０５）に免疫応答の上昇が認められた。このことから、ＧＴ培地そのものにも免疫活性を上昇させる成分が含有されていることが分かった。
【００２５】
本実施例の培養液を用いた場合には、Ａ群〜Ｃ群の全ての群において、コントロールに比べて有意（ｐ＜０.０５）に免疫応答の上昇が認められた。その上昇割合は、いずれもＧＴ培地よりも高かった。このことから、４種類の微生物を用いた培養液は、ＩＣＲ系マウス脾細胞に対する免疫応答を有意に上昇させることがわかった。また、Ａ群〜Ｃ群については、一部に逆転したデータがあるものの、いずれも濃度依存的に免疫応答を上昇させる傾向が認められた。但し、Ａ群〜Ｃ群の間には、有意な差は認められなかった。
【００２６】
＜実施例４＞  Ｃ５７ＢＬ／６系マウス脾細胞に対する効果
実施例３のＩＣＲ系マウス脾細胞に代えて、Ｃ５７ＢＬ／６系マウス脾細胞を用い、実施例３と同様の試験を行なった。但し、培養液は、Ａ群及びＣ群の２群とした。コントロール及び比較対照については、実施例３と同じものを用いた。
【００２７】
表２及び図４には、試験結果を示した。データは、Ａ群のｘ５０及びｘ２５を除き、いずれもＮ＝３とし、それらのデータについて平均値及び標準偏差を求めた。
【００２８】
【表６】
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【００２９】
コントロールに比べると、ＬＰＳでは、免疫応答が有意（ｐ＜０.０５）に上昇した。ＧＴ培地（微生物を培養していないもの）を用いた場合には、ｘ２５及びｘ１２.５の希釈倍率において、コントロールよりも高い値が認められた。
また、本実施例の培養液を用いた場合には、Ａ群及びＣ群のいずれについても、コントロールに比べて免疫応答の上昇が認められた。但し、培養液の効果は、ｃｏｎＡに比べると高かったものの、ＬＰＳの効果には僅かに至らなかった。こうして、培養液の免疫活性効果は、ＩＣＲ系マウスに対する効果には及ばないものの、Ｃ５７ＢＬ／６系マウスに対しても認められることがわかった。
【００３０】
＜実施例５＞
動物種イヌに、培養液から調整した免疫調整剤を体重あたり10-4ｇ／日、８週間連続給餌した。その結果、免疫機能が良好となることが分かった。
＜実施例６＞
上記実施例５の追試を行うと共に、イヌ以外の動物種における効果確認を行った。
表７及び表８に示す４匹のイヌまたはネコを用いた免疫調整剤の効果確認試験を行った。表７には、各動物の基礎的なデータを、表８には、免疫調整剤を投与前の病状を示した。
【表７】
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【００３１】
【表８】
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【００３２】
上記４匹の動物に対して、培養液から調製した免疫調整剤を２ｇ／日、通常の餌に混ぜて投与した。８週間連続給餌した後の副作用、及び病状の改善程度を表９に示した。
【表９】
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【００３３】
表中、改善評価のスコアは、３：改善、２：やや改善、１：変化なし、０：悪化とした。また、いずれの例においても併用薬はなかった。免疫調整剤の投与によって、食性に問題はなく、試験期間内に消化不良など、消化器系へのネガティブな反応はなかった。試験期間の経過後には、全例において、病状の改善が認められた。
特に、Ｎｏ．１のイヌにおける結果を図５に示した。免疫調整剤を投与前（図５（Ａ）では、腹部全体に掻痒による発赤・角化過剰・脱毛が広範囲に見られ、脂漏性皮膚炎と診断した。投与後１〜３週間は、顕著な変化は見られなかった（図５（Ｂ））。しかし、投与後４週後に掻痒・発赤の軽減が見られ、新たな発毛が見られた（図５（Ｃ））。更に、投与後８週間では、さらに掻痒・発赤の軽減が見られ腹部皮膚の軟化が見られ、角化過剰も改善された（図５（Ｄ））。新たな発毛により、腹部全体が体毛に覆われていた。なお、一般血液性状・体重においても、特に記述するべき変化はなかった。
【００３４】
アトピー性皮膚炎やアレルギーによる皮膚炎では、引掻きによる自傷行動が更に皮膚炎の症状を悪化させるため、引掻き行動の抑制が治療にとって重要となる。本実施形態の免疫調整剤の投与では、投与後１−３週間では、臨床的な顕著な変化は現れなかったが、その期間での症状悪化は見られなかった。このことは、皮膚炎を悪化する引掻き行動の抑制を意味していることを示唆している。また、投与後４週目の発毛は、角化過剰を抑制し、明らかな皮膚組織の修復が進行を示していた。
【００３５】
本実施形態の免疫調整剤には、生菌は含まれていない。一般的なプロバイオティクスでは、生菌を摂取することが多いが、生菌を投与する場合、従来その個体が保持する腸内細菌層を変化させる可能性がある。その点においては、免疫調整剤は直接的に腸内へ影響するのではく、比較的マイルドに腸内細菌層や腸そのものに影響を与えていると考える。最近の報告では、腸内の死菌はそのまま腸内細菌の栄養源となることから、免疫調整剤は投与した個体が持つ菌類の活性を促すことで整腸作用をもたらす可能性も考えられる。また、免疫調整剤の投与は脾細胞の免疫活性を確認していることから、TH1およびTH2細胞の活性バランスにも関連している可能性も示唆される。
こうして、本実施例の培養液から調整した免疫調整剤（或いは、動物用飼料）は、イヌ及びネコなどの動物においても免疫調整機能を示すことが明らかとなった。
【００３６】
このように本実施形態によれば、動物に対して優れた免疫活性調整作用を有する動物用免疫活性調整剤、及びその調整剤を配合した動物用飼料を提供することができた。この飼料は、各種動物の免疫効果を高めるために飼料、ペットフードとして用いることができる。また、調整剤は、動物の皮膚疾患に対する薬品などに適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】培地の製造方法を示すフローチャートである。
【図２】培養液の製造方法を示すフローチャートである。
【図３】ＩＣＲ系マウス脾細胞に対する培養液の免疫効果を確認した結果を示すグラフである。
【図４】Ｃ５７ＢＬ／６系マウス脾細胞に対する培養液の免疫効果を確認した結果を示すグラフである。
【図５】イヌに免疫調整剤の投与したときのアレルギー性皮膚炎の状態の変化を示す写真図である。（Ａ）免疫調整剤の投与前、（Ｂ）投与３週間後、（Ｃ）投与１ヶ月後、及び（Ｄ）投与２ヶ月後の状態を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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