(57)【要約】【課題】  細胞の剥離や変形の少ない標本を得るための細胞固定液、並びに該細胞固定液を使用した細胞の固定方法を提供すること。【解決手段】  エタノール、イソプロパノール及びPEGを含んでなる細胞固定液及びこれを構成成分として含んで成る細胞固定用キット、該細胞固定液で細胞を処理することを特徴とする細胞の固定方法。  この細胞固定液を用いて固定した細胞を用いて標本を作製すれば、従来の標本作製の際に生じていた上記した如き問題をすべて解決した、優れた標本を作製することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エタノール、イソプロパノール及びポリエチレングリコールを含んでなる細胞固定液。
【請求項２】
細胞固定液が、エタノールとイソプロパノールを含有する溶解液に、ポリエチレングリコールを２〜１０ｗ／ｖ％溶解して調製したものである、請求項１に記載の細胞固定液。
【請求項３】
溶解液が、更に水又は生理食塩水を含有するものである、請求項２に記載の細胞固定液。
【請求項４】
アルコールの総量が、溶解液中の７０〜１００ｖ／ｖ％である、請求項２に記載の細胞固定液。
【請求項５】
アルコールの総量に対して７０〜９５ｖ／ｖ％のエタノール及び３０〜５ｖ／ｖ％のイソプロパノールを含有する、請求項４に記載の細胞固定液。
【請求項６】
アルコールの総量に対して７５〜９０ｖ／ｖ％のエタノール及び２５〜１０ｖ／ｖ％のイソプロパノールを含有する、請求項４に記載の細胞固定液。
【請求項７】
ポリエチレングリコールが分子量４００〜４０００のものである、請求項１に記載の細胞固定液。
【請求項８】
ポリエチレングリコールが分子量１０００〜２０００のものである、請求項１に記載の細胞固定液。
【請求項９】
細胞固定液中のポリエチレングリコールの含有量が２〜１０ｗ／ｖ％である、請求項１に記載の細胞固定液。
【請求項１０】
細胞固定液中のポリエチレングリコールの含有量が５〜１０ｗ／ｖ％である、請求項１に記載の細胞固定液。
【請求項１１】
細胞が液状検体に含まれるものである、請求項１に記載の細胞固定液。
【請求項１２】
細胞が尿沈渣中に含まれるものである、請求項１に記載の細胞固定液。
【請求項１３】
細胞を、エタノール、イソプロパノール及びポリエチレングリコールを含んでなる細胞固定液で処理することを特徴とする細胞の固定方法。
【請求項１４】
エタノール、イソプロパノール及びポリエチレングリコールを含んでなる細胞固定液を構成成分として含んでなる、細胞固定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば臨床検査等の分野に用いられる細胞固定液、該細胞固定液を使用した細胞の固定方法並びにキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査学等においては、細胞の形態や構造を観察するため、或いは細胞の数やその種類を検査するために、顕微鏡を用いた細胞の観察が広く行われている。
【０００３】
特に臨床検査分野では、検体の採取に制約が少なく、広範な対象に適用できること、更に患者に対する負荷が軽く、標本の作製が簡便・迅速であること等の理由から、集団検診、日常検査、精密検査等の広範囲において、各種疾患の鑑別や疾患の程度の判定、治療効果の判定等に顕微鏡による検査（鏡検）が行われている。
【０００４】
腎・尿路系の感染症、炎症性病変、変性病変、結石症、腫瘍などの疾患では、夫々の疾患に応じて、尿中に、例えば赤血球、白血球、上皮細胞、円柱、細菌、真菌、結晶、粘液糸など種々の有形成分が出現する。中でも尿中成分の分析は、腎・尿路系疾患の早期発見や異常部位を推定する上で特に重要である。
【０００５】
例えば、尿中赤血球の分析は、腎臓の糸球体から尿道に至る経路における出血の有無を判定する上で重要であり、また、赤血球の形態や円柱の種類を調べることにより、その由来部位を特定することもできる。また、尿中白血球の分析は、腎・尿路系の炎症、感染症を早期発見する上で重要である。更に、悪性細胞（癌細胞）の検出は、尿路系悪性腫瘍の早期発見やその有無を判断する上で重要となる。
【０００６】
従来、尿の検体処理方法としては、新鮮尿を遠心処理して得られた沈渣を引きガラス法により標本を作製する（直接塗末法）のが一般的であるが、細胞剥離が起こりやすい、または手技に個人差があるといった欠点がある。そのため、尿検体に市販の細胞固定液（細胞保存液）を添加し、標本作製の際の細胞剥離防止に努める施設も少なくない。
【０００７】
また、尿検体を遠心処理後、沈渣を剥離防止コーティングスライドグラスに塗末し、95％エタノールで固定する浸漬法、沈渣に市販の細胞固定液を添加し、その後5％ ポリエチレングリコール（以下、「PEG」と略記する。）を含む95％エタノールで固定した後塗末標本を得る方法（非特許文献１）、尿中に含まれる細胞を、第一固定液（0.2％アジ化ナトリウム，0.8％ EDTA-3Kを含む50％エタノール）と第二固定液（2％ PEGを含む95％イソプロピルアルコール）で固定した後塗末標本を得る方法（非特許文献２）、エタノールを主成分とし他に特定のジオール及びPEGを含有するアルコール水溶液を用い、尿等の液状検体に添加して細胞を固定する方法（特許文献１）等も検討されている。あるいは、スライドグラスに塗末後、スプレー固定した後乾燥させるスプレー法、オートスメアなどの機器を使用し、細胞を集める方法、フィルターを通過させ細胞を集める方法などがある。
【０００８】
しかし、上記したような方法で尿検体を処理する方法は、直接塗末法よりは、標本作製の際の、細胞の剥離が少ないものの、細胞変性が強いといった欠点があった。また、細胞や赤血球の形態変化等が起こるため、満足する標本が得られていないのが実情である。
【０００９】
更に、尿を含む細胞診検査の際の細胞固定は、95％エタノールを用いて行われている場合も多い。しかし、95％エタノールによる固定処理だけでは、固定後それに続く染色過程で細胞が剥離してしまうという問題があった。特に、尿、腹水等の液状検体について95％エタノールによる固定処理を行っても、スライドガラスに細胞を付着させることが困難であった。また、95％エタノール固定液に浸したスライドガラスを固定液から取り出すと、細胞がすべて乾燥してしまうという問題もあった。
【００１０】
【特許文献１】特公平6-52264号公報
【非特許文献１】大崎博之、外３名，「尿細胞診の検体処理方法の検討」，日本臨床細胞学会雑誌，２００５年，第４４巻，第４号，ｐ．２１５−２１８
【非特許文献２】山本津由子、外４名，「新しい尿細胞診標本作製法−呉共済病院法−」，日本臨床細胞学会雑誌，１９９８年，第３７巻，第３号，ｐ．２９２−２９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は上記した如き状況に鑑みなされたもので、細胞の剥離や変形の少ない標本を得るための細胞固定液、並びに該細胞固定液を使用した細胞の固定方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するため、本発明は下記の構成から成る。
（１）エタノール、イソプロパノール及びPEGを含んでなる細胞固定液。
（２）細胞を、エタノール、イソプロパノール及びPEGを含んでなる細胞固定液で処理することを特徴とする細胞の固定方法。
（３）エタノール、イソプロパノール及びPEGを含んでなる細胞固定液を構成成分として含んでなる、細胞固定用キット。
【００１３】
即ち、本発明者らは、細胞の剥離や乾燥等のない標本を得る方法を開発すべく鋭意研究を行った結果、エタノール、イソプロパノール及びPEGを含んでなる細胞固定液を用いて固定した細胞を用いて標本を作製すれば、従来の標本作製の際に生じていた上記した如き問題をすべて解決した、優れた標本を作製し得ることを見出した。また、この細胞固定液及び該細胞固定液を用いる固定方法が、尿検体だけでなく、あらゆる検体の標本作製に応用できること、さらに臨床診断以外の分野においても応用できる、優れた方法であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の細胞固定液で試料中の細胞を固定し、これを用いて標本を作製すれば、細胞の剥離、乾燥、変形、核の過染色を防ぐことができ、優れた標本が得られる。
【００１５】
従来、細胞の乾燥や剥離を防ぐために、市販のスプレー固定が利用されているが、スライドグラスに塗末し、本発明の細胞固定液で固定したものを完全に乾燥させた塗末標本は、細胞の剥離もなく、染色後の乾燥がほとんど見られないのでスプレー処理が全く必要ない。また、この塗末標本は細胞の保持が良いため、郵送することも可能であることから、検診等、臨床検査を含めた幅広い分野に利用できる。
【００１６】
更に、本発明の固定方法では、本発明の細胞固定液のみを用いて固定処理を行えばよいので、市販の細胞固定液を購入する必要がなく、経済的である。
【００１７】
また、婦人科検体や呼吸器の検体標本をスプレー固定すると、スプレーの仕方によっては、細胞、乾燥がひどく、標本にならないという問題があったが、本発明の細胞固定液を用いれば、これらの問題は全て解決することができる。特に、これらの検体を、PEGを含有するアルコール溶液で固定するという考え方は、本発明が初めてである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の細胞固定液は、エタノール、イソプロパノール及びPEGを含んでなるものである。
【００１９】
本発明の細胞固定液に用いられるPEGとしては、重量平均分子量が400〜4,000のものが、好ましくは重量平均分子量が1,000〜2,000のものが、更に好ましくは重量平均分子量が1,540程度のものが挙げられる。分子量があまり小さいものを用いると、標本の細胞が剥離してしまう可能性がある。また、分子量が大きすぎると、得られた細胞固定液の粘度が高くなって取り扱いにくいし、これを用いて固定処理した細胞は、細胞の保湿性が保たれず、乾燥してしまうからである。
【００２０】
また、本発明の細胞固定液中には、要すれば水、生理食塩水等の水溶液が含まれていてもよい。
【００２１】
即ち、PEGは水分がないと低温（5℃以下）では白濁し、結晶化してしまう。そこで、本発明の細胞固定液に、更に水分を含有させることにより、低温保存中の該細胞固定液の白濁化、結晶化を防ぐことができるので、より好ましい。
【００２２】
本発明の細胞固定液に水分を含有させるためには、例えば水（好ましくは蒸留水）の他、生理食塩水等の適当な水溶液、蒸留水等（これらをまとめて、以下「生理食塩水等の水溶液」と記載する。）を本発明の細胞固定液に含有させればよい。
【００２３】
緩衝液としては、通常この分野で用いられているものであって、細胞液と等張で、細胞の変形等を起こさないものであればよく、特に限定されないが、具体的には、例えばトリス緩衝液，リン酸緩衝液，ベロナール緩衝液，ホウ酸緩衝液，グッド緩衝液等が挙げられ、その使用濃度としては、通常0.1mM〜10M、好ましくは1mM〜5M、より好ましくは5mM〜１Mである。また、当該緩衝液のｐＨとしては、物質の分離に悪影響を及ぼさないものであればよいが、通常2〜13、好ましくは4〜11、より好ましくは5〜9である。
【００２４】
これらの中でも、生理食塩水を用いると細胞の収縮などの変性を防ぐ働きがあるので、好ましい。
【００２５】
本発明の細胞固定液を調製する方法としては、まず、エタノールとイソプロパノールを、要すれば更に水、又は生理食塩水等の水溶液を含有する溶解液を調製する。次いで、この溶解液に所望の濃度になるように、PEGを溶解する方法がある。
【００２６】
細胞固定液中のPEGの含有量は、2〜10w／v％、好ましくは5〜10w／v％、より好ましくは7〜10w／v％、更に好ましくは8〜9w／v％である。
【００２７】
該溶解液中のアルコールの総量は、70〜100v／v％、好ましくは90〜100v／v％、更に好ましくは93〜95v／v％である。
【００２８】
該溶解液中のアルコールの総量に対するエタノールの含有量は、70〜95v／v％、好ましくは75〜90v／v％、更に好ましくは80〜90v／v％である。
【００２９】
該溶解液中のアルコールの総量に対するイソプロパノールの含有量は、30〜5v／v％、好ましくは25〜10v／v％、更に好ましくは20〜10v／v％である。
【００３０】
該溶解液中に要すれば含有させる水、又は生理食塩水等の水溶液の含有量は、溶解液中に0〜10v／v％、好ましくは5〜7v／v％程度である。
【００３１】
本発明の細胞固定液の具体的な調製方法としては、例えばまずエタノールを70〜95v／v％、イソプロパノールを30〜5v／v％含有する溶解液を調製する。次いで、この溶解液にPEGを加えて溶解させ、PEGの終濃度が2〜10w／v％になるように加えて調製すれば、本発明の細胞固定液が得られる。
【００３２】
更に水溶液を含有する本発明の細胞固定液を調製するには、例えばまずエタノールを70〜95v／v％、イソプロパノールを30〜5v／v％含有するアルコール混合液を調製する。次いでこのアルコール混合液95〜93容量部に水、又は生理食塩水等の水溶液5〜7容量部を添加して溶解液を調製する。得られた溶解液にPEGを加えて溶解させ、PEGの終濃度が2〜10w／v％になるように調製すればよい。
【００３３】
本発明の細胞の固定方法を実施するには、本発明の細胞固定液を用いて細胞を処理するだけでよい。簡便な方法としては、固定すべき細胞を含有する試料又は沈渣を、本発明の細胞固定液に懸濁させる方法や、固定すべき細胞を含有する懸濁液と本発明の細胞固定液と混合する方法等がある。
【００３４】
細胞を固定する際の、本発明の細胞固定液の液量は、通常、細胞（あるいは沈渣）体積の2倍量以上あれば良いが、あまり多すぎるのは試薬の無駄使いになるので、細胞体積の2〜30倍量、好ましくは3〜20倍量、より好ましくは5〜10倍量用いられる。
【００３５】
処理時間については特に制約はないが、通常は約10〜60分間程度かければ十分である。
【００３６】
より具体的には、例えば以下のように行えばよい。
【００３７】
即ち、例えば尿試料等の液状検体を用いる場合には、まず、採取した尿を尿中成分が均等になるように充分混和する。次いで、5〜50mlを遠心管に分注し、3000rpm（1500G）程度で2〜5分間遠心分離処理する。遠心後、上清を取り除き、尿沈渣を得る。得られた尿沈渣に、尿沈渣量に対して上記した如き量の本発明の細胞固定液を加え、充分に混和した後、約10〜60分間程度静置することにより尿沈渣中の細胞を固定することができる。
【００３８】
本発明の固定方法で固定した細胞を用いて標本を作製する方法は、臨床検査学の分野等において通常行われる、自体公知の病理組織標本の作製方法に従って行うことで足りる。
【００３９】
例えば、本発明の固定方法で細胞を固定した後、遠心操作等で固定した細胞を集め、これを例えばスライドグラスに塗沫後、自然乾燥させて、塗末標本を作製すればよい。
【００４０】
得られた塗末標本は、細胞の性質に合わせて適宜選択したパパニコロウ(Papanicolaou)染色等の自体公知の染色処理等を行えばよい。また、それに使用される試薬等も、この分野における自体公知のものを適宜選択して用いれば良い。
【００４１】
尚、本発明の固定方法で固定された細胞を用いて作製した塗末標本は、乾燥後すぐ染色処理することもできるが、染色処理する前に、細胞を固定する際に用いたのと同じ組成の本発明の細胞固定液で再固定すれば、より鮮明な細胞像が得られるので、好ましい。
【００４２】
即ち、本発明の固定方法は、本発明の細胞固定液だけを用いる方法である。再固定する場合にも、従来用いられてきた95％エタノールを別に調製して用いる必要はなく、細胞固定に使用した本発明の細胞固定液を用いて、再固定を行えばよいので、試薬調製の煩雑さも軽減される。
【００４３】
本発明の細胞固定用キットは、エタノール、イソプロパノール及びPEGを含んでなる本発明の細胞固定液を構成成分として含んでなるものであり、夫々の構成要素の好ましい態様や具体例は先に述べた通りである。
【００４４】
尚、上記キットには、更に自体公知の細胞染色用試薬等を組み合わせても良い。
【００４５】
本発明の細胞固定液は、病理用に限定されるものではなく、動植物の細胞組織や微生物等、幅広い試料について利用することができる。
【００４６】
例えば、本発明が適用される試料としては、例えば血液，血清，血漿，腹水，胸水、心のう液、胆汁，髄液，滑液，リンパ液等の体液、尿，糞便のような排泄物、喀痰、咽頭粘液、胃液、気管支洗浄液、経気管支採取物、婦人科の膣脂膏，頸部，内膜、尿、胃洗浄液、膀胱洗浄液等の沈渣、膿，皮膚由来物、乳腺や甲状腺などの穿刺物およびその針洗浄液、組織の捺印等の生体由来試料等が挙げられる。
【００４７】
本発明の細胞固定液は、細胞保持率が高いため、該細胞固定液で固定した細胞を用いて標本を作製した場合には、細胞の剥離、乾燥、変形、核の過染色を防ぐことができ、優れた標本が得られる。また、赤血球の保存も良いため、本発明の細胞固定液で処理した細胞を用いて標本を作製すれば、この標本のみで臨床診断を行うことが可能になる。
【００４８】
従来、液状検体中の細胞固定には、市販の固定液で固定処理した後、塗末標本を作製、乾燥処理後、更に95％エタノール中で保存したものを染色処理する必要があった。それは、市販の固定液中のエタノール濃度が低い場合が多く、市販の固定液で固定しただけでは不十分で、95％エタノールによる再固定が必要であったからである。これに対し、本発明の細胞固定液を用いて細胞を固定すれば、95％エタノールによる再固定処理は必須ではない。また、再固定する場合でも、本発明の細胞固定液で再固定すれば良く、95％エタノールで固定処理する必要がない。しかも市販の固定液を購入しなくても細胞の固定処理を行うことができるので、経済的である。なお、この場合の本発明の細胞固定液を用いての細胞固定であるが、市販の固定液あるいは95％エタノールよりは核のヘマトキシリンの過染が抑えられるが、薄い染色性を好まれる場合は、ヘマトキシリンを半量にすることもある。
【００４９】
また、本発明の細胞固定液で固定したものは、ＰＡＳ染色やアルシャンブルー染色などの特殊染色においても優れた染色性を示し、95%エタノールで固定したものより陽性が
明瞭で、判定に迷うことはない。なお、免疫組織学的染色においても優れた染色性を示し、非常に優れた固定液であることが証明された。
【００５０】
以下に実験例及び実施例を挙げて、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらによって何等限定されるものではない。
【００５１】
実験例１．PEG添加量の設定
〔試料〕
病理診断の結果、膀胱癌（Ｇ２〜Ｇ３）と診断された患者の自然尿のうち、炎症細胞が多く、標本を作製した際に細胞が剥離しやすいと思われる２種類の尿を使用した。
〔細胞固定液の調製〕
95w／v％エタノール水溶液に、2〜14w／v％となるようにポリエチレングリコール1540（以下、PEG1540と記載する。）を溶解させたものを調製し、細胞固定液とした。
〔固定処理〕
試料（自然尿）を50mL遠心管に採り、3000rpm(1500G)で2分間遠心処理した。上清を除去し、沈渣の水分を十分にとった後、上記で調製した細胞固定液10mLを加えてよく混和した。30分間静置して固定処理を行った後、同様に3000rpm(1500G)で2分間遠心処理し、ピペット法で、沈渣をスライドグラスに塗沫して標本を作製した。塗沫標本は翌日まで自然乾燥して完全に乾燥させ、95％エタノール水溶液（PEGなし）に保存した後、通常のパパニコロウ(Papanicolaou)染色を行った。
尚、以下の実施例において、スライドガラスは全て、シラン・コーティングガラスを使用した。
【００５２】
[結果]
得られた塗末標本の写真を、図１に示す。
図１において、上段は左から2、4，6，8，10，12，14w／v％のPEG1540を含有する細胞固定液を用いた場合の結果をそれぞれ示す。下段は、上段とは別の沈渣が少なかった自然尿検体を試料として用い、左から2、4，6，8，10，12w／v％のPEG1540を含有する細胞固定液を用いた場合の結果をそれぞれ示す。
【００５３】
図１から明らかな如く、PEG1540の濃度が10w／v％より高くなると細胞が剥離し、細胞が集合化する傾向が見られる。これは、PEG1540の濃度が10w／v％を越えて、溶液の粘稠度が高くなってしまったために、細胞が固まってしまったこと、またスライドガラスに固定することができなかったのだと考えられる。更に、PEG1540の濃度が14w／v％になると、明らかに細胞が剥離していることが判る。
【００５４】
また、顕微鏡写真は示していないが、光学顕微鏡観察により、PEG1540の濃度が2〜4w／v％の場合には、細胞の乾燥が目立ったことが確認された。
【００５５】
以上のことから、細胞固定液中のPEG1540の濃度は、10w／v％以下が好ましいことが判る。
【００５６】
実施例１．本発明の細胞固定液
〔試料〕
実験例１の図１上段の標本に用いたのと同じ自然尿を用いた。
〔細胞固定液の調製〕
（１）本発明の細胞固定液
86v／v％エタノールと14v／v％イソプロパノールのアルコール混合液を調製した。このアルコール混合液95容量部に生理食塩水5容量部を添加して溶解液を調製し、該溶解液にPEG1540を10w／v％、又は12w／v％となるように溶解させたものを調製し、本発明の細胞固定液とした。
（２）95％エタノール細胞固定液
95w／v％エタノール水溶液に、8w／v％又は10w／v％となるようにPEG1540を溶解させたものをそれぞれ調製し、95％エタノール細胞固定液とした。
〔固定処理〕
細胞固定液として、上記で調製した本発明の細胞固定液又は95％エタノール細胞固定液を用いた以外は、実験例１と同様に尿試料の処理、固定処理後、塗沫標本を作製し、塗末標本は翌日まで自然乾燥して完全に乾燥させた。本発明の細胞固定液で固定処理した細胞の塗末標本は本発明の細胞固定液（PEG10w/v%）に、95％エタノール細胞固定液で固定処理した細胞の塗末標本は95％エタノール(PEGなし)に保存した後、通常のパパニコロウ染色を行った。
【００５７】
〔結果〕
得られた塗末標本の写真を、図２に示す。
図２において、左から8w／v％PEG1540を含有する95％エタノール細胞固定液を用いた場合、10w／v％PEG1540を含有する95％エタノール細胞固定液を用いた場合、10w／v％PEG1540を含有する本発明の細胞固定液を用いた場合、12w／v％PEG1540を含有する本発明の細胞固定液を用いた場合の結果をそれぞれ示す。
【００５８】
図２から明らかな如く、95％エタノール細胞固定液を用いた場合には、PEG1540の濃度にかかわらず、細胞が真っ黒に染色してしまったが、本発明の細胞固定液を用いた場合には、細胞の過染色が抑えられ、好ましい染色標本が得られた。但し、PEG1540の濃度が12w／v％になると、細胞が剥離する傾向が見られた。
【００５９】
尚、顕微鏡を用いた観察により、95％エタノール細胞固定液を用いた場合には、細胞の萎縮が強く、核が真っ黒に染色してしまったことを確認している。
【００６０】
以上のことより、エタノール、イソプロパノール及びPEGを含有する本発明の細胞固定液は、エタノールとPEGのみを含有する細胞固定液よりも明らかに優れていることが判る。
【００６１】
実施例２．本発明の細胞固定液−PEG濃度の検討
〔試料〕
実験例１の図１の上段標本に用いたのと同じ自然尿を用いた。
〔本発明の細胞固定液の調製〕
86v／v％エタノールと14v／v％イソプロパノールのアルコール混合液を調製した。このアルコール混合液95容量部に生理食塩水5容量部を添加して溶解液を調製し、該溶解液にPEG1540を4，6，7，8，9，10，12w／v％となるように溶解させたものをそれぞれ調製し、細胞固定液とした。
〔固定処理〕
細胞固定液として、上記で調製した細胞固定液を用いた以外は、実験例１と同様に尿試料の処理、固定処理後、塗末標本は翌日まで自然乾燥して完全に乾燥させた。本発明の細胞固定液（PEG10w/v%含有）に保存した後、通常のパパニコロウ染色を行った。
【００６２】
〔結果〕
得られた塗末標本の写真を、図３に示す。
図３において、左から4，6，7，8，9，10，12w／v％となるようにPEG1540を含有する細胞固定液を用いた場合の結果をそれぞれ示す。
【００６３】
図３から明らかな如く、4w／v％〜6w／v％のPEG1540を含有する細胞固定液で固定した場合には、細胞が萎縮し、固まりとなって集まっている状態になっている。これは、このPEGの濃度では、細胞そのものの伸びが悪く、塗沫標本を作製する際にも、塗沫しづらかったことが関係していると考えられる。また、PEG1540の濃度が4w／v％の場合は、少数の細胞剥離が見られる。顕微鏡写真は示していないが、顕微鏡観察したところ、PEG1540の濃度が4w／v％〜6w／v％の場合は、細胞が赤く染色されており、細胞の乾燥が見られた。
【００６４】
これに対し、PEG1540の濃度が7w／v％〜10w／v％の場合には、細胞がよく伸び、スライドガラスに付着していることがわかる。顕微鏡観察によると細胞の乾燥は、ほとんど見られなかった。
【００６５】
しかし、PEG1540の濃度が12w／v％になると、細胞がスライドガラスに付着出来ず、広がってしまっていることが判る。おそらく、これは細胞固定液中のPEG1540の濃度が過剰になってしまったために、細胞の固定が不十分になってしまったからだと考えられる。
【００６６】
以上のことより、本発明の細胞固定液中のPEG濃度は、7〜10w／v％が好ましいことが判る。
【００６７】
実施例３．
〔試料〕
実験例１の図１の上段標本に用いたのと同じ自然尿を用いた。
〔細胞固定液の調製〕
（１）本発明の細胞固定液
86v／v％エタノールと14v／v％イソプロパノールのアルコール混合液を調製した。このアルコール混合液95容量部に生理食塩水5容量部を添加して溶解液を調製し、該溶解液にPEG1540を9w／v％となるように溶解させたものを調製し、本発明の細胞固定液とした。
（２）95％エタノール細胞固定液
95w／v％エタノール水溶液に、9w／v％となるようにPEG1540を溶解させたものを調製し、95％エタノール細胞固定液とした。
〔固定処理〕
細胞固定液として、上記で調製した本発明の細胞固定液又は95％エタノール細胞固定液を用いた以外は、実験例１と同様に尿試料の処理、固定処理後、塗沫標本を作製し、塗末標本は翌日まで自然乾燥して完全に乾燥させた。本発明の細胞固定液で固定処理した細胞の塗末標本は本発明の細胞固定液（PEG9w/v％含有）に、95％エタノール細胞固定液で固定処理した細胞の塗末標本は95％エタノール細胞固定液に夫々保存した後、通常のパパニコロウ染色を行った。
【００６８】
〔結果〕
得られた塗沫標本の光学顕微鏡写真を、図４に示す。
図４において、（１）は本発明の細胞固定液を用いた場合、（２）は95％エタノール細胞固定液を用いた場合の結果をそれぞれ示す。図４の左上の写真は、（２）と同じ標本の変性、乾燥している細胞である。
【００６９】
顕微鏡観察の結果から、95％エタノール細胞固定液を用いた場合には、細胞が赤く染色しており、細胞が乾燥してしまっていることがわかる。これに対し、本発明の細胞固定液を用いた場合には、細胞の乾燥もなく、好ましい標本が得られたことが判る。
【００７０】
以上のことより、顕微鏡観察でも、エタノール、イソプロパノール及びPEGを含有する本発明の細胞固定液は、エタノールとPEGのみを含有する細胞固定液よりも明らかに優れていることが判る。
【００７１】
実施例４
〔試料〕
病理診断の結果、卵巣癌と診断された患者の腹水を使用した。
〔細胞固定液の調製〕
（１）本発明の細胞固定液
86v／v％エタノールと14v／v％イソプロパノールのアルコール混合液を調製した。このアルコール混合液95容量部に生理食塩水5容量部を添加して溶解液を調製し、該溶解液にPEG1540を9w／v％となるように溶解させたものを調製し、本発明の細胞固定液とした。
（２）混合アルコール細胞固定液
86v／v％エタノールと14v／v％イソプロパノールのアルコール混合液を調製した。このアルコール混合液95容量部に水5容量部を添加した混合液を調製し、混合アルコール細胞固定液とした。
〔固定処理〕
試料（腹水）を50mL遠心管に採り、3000rpm(1500G)で2分間遠心処理した。上清を除去し、沈渣の水分を十分にとった後、沈渣をスライドガラスに塗沫して標本を作製した。塗沫標本は翌日まで自然乾燥して完全乾燥させ、本発明の細胞固定液で固定処理した細胞の塗末標本は本発明の細胞固定液（PEG9w/v％含有）に、混合アルコール細胞固定液で固定処理した細胞の塗末標本は混合アルコール細胞固定液に夫々保存した後、通常のパパニコロウ染色を行った。
【００７２】
〔結果〕
得られた塗沫標本の光学顕微鏡写真を図５に示す。
図５において、（１）は本発明の細胞固定液を用いた場合、（２）は混合アルコール細胞固定液を用いた場合の結果をそれぞれ示す。
【００７３】
顕微鏡観察の結果から、本発明の細胞固定液を用いた場合には、非常に立体感があり、細胞の乾燥や核の変形のない、好ましい標本が得られたことが判る。
【００７４】
以上のことより、エタノール、イソプロパノール及びPEGを含有する本発明の細胞固定液は、エタノールとイソプロパノールのみを含有する混合アルコール細胞固定液よりも明らかに優れていることが判る。
【００７５】
また、本発明の細胞固定液で30分間固定し、完全乾燥して得られた標本は、細胞の保持が非常に良かったことから、検診等において得られた標本を郵送することもできる可能性が示唆され、本発明の細胞固定液は、この点においても極めて優れた細胞固定液であることがわかる。
【００７６】
実施例５．従来の直接塗沫法との比較
〔試料〕
病理診断の結果、膀胱癌（Ｇ２〜Ｇ３）と診断された患者の自然尿（２例）を使用した。
〔本発明の細胞固定液の調製〕
86v／v％エタノールと14v／v％イソプロパノールのアルコール混合液を調製した。このアルコール混合液95容量部に生理食塩水5容量部を添加して溶解液を調製し、該溶解液にPEG1540を10w／v％となるように溶解させたものを調製し、本発明の細胞固定液とした。
〔固定処理〕
試料（自然尿）を50mL遠心管に採り、3000rpm(1500G)で2分間遠心処理した。上清を除去し、沈渣の水分を十分にとった後、パスツールピペットで、沈渣の一部を取り、引きガラス法にてスライドガラス上に塗布した標本2枚を作製し、一枚の標本は通常のパパニコロウ染色、もう一枚の標本は通常のギムザ染色を行った。残りの沈渣に上記で調製した細胞固定液10mLを加えてよく混和した。30分間静置して固定処理を行った後、同様に3000rpm(1500G)で2分間遠心処理し、ピペット法で、沈渣をスライドガラスに塗沫して標本を作製した。塗沫標本は30分自然乾燥後、本発明の細胞固定液に保存した後、通常のパパニコロウ染色を行った。
【００７７】
〔結果〕
得られた塗末標本の写真を、図６に示す。
図６において、（１）は従来の直接塗沫・パパニコロウ染色を行った場合、（２）は本発明の細胞固定液を用いて固定後パパニコロウ染色を行った場合、（３）は従来の直接塗沫・ギムザ染色を行った場合の結果をそれぞれ示す。
【００７８】
図６から明らかな如く、従来の直接塗沫法（図６(１)及び(３)）では細胞が剥離してしまっており、また、引きガラス法によりスライドグラスに塗沫したため、カバーグラスを引いた引き終わりの位置（図６(１)及び(３)の矢印で示した位置）に細胞が集まって固まってしまっていることが判る。
【００７９】
これに対して、本発明の細胞固定液を用いて固定した後、パパニコロウ染色した場合（図６(２)）には、細胞がスライドグラス上に均一に広がり、また細胞の剥離も見られないことが判る（図６(２) の矢印で囲まれた範囲）。
【００８０】
また、沈渣の少なかった試料を、図６に用いた試料と同様に処理したものを用いて作製した、塗末標本の写真を図７に示す。
【００８１】
図７において、（１）は従来の直接塗沫・パパニコロウ染色を行った場合、（２）は本発明の細胞固定液を用いて固定後パパニコロウ染色を行った場合、（３）は従来の直接塗沫・ギムザ染色を行った場合の結果をそれぞれ示す。
【００８２】
図７から明らかな如く、従来の直接塗沫法（図７(１)及び(３)）では細胞が剥離してしまっていることが判る。これに対して、本発明の細胞固定液を用いて固定した後、パパニコロウ染色した場合（図７(２)）には、細胞の剥離もなく、細胞がスライドグラス上に均一に広がっており（図７(２) の矢印で囲まれた範囲）、試料が少ない場合であっても、良好な標本が得られたことが判る。
【００８３】
また、上記した直接塗沫・パパニコロウ染色した場合（図６(１)）と、本発明の細胞固定液を用いて固定した後、パパニコロウ染色した場合（図６(２)）の塗末標本の光学顕微鏡写真を、夫々図８に示す。
【００８４】
図８において、（１）は従来の直接塗沫・パパニコロウ染色を行った場合、（２）は本発明の細胞固定液を用いて固定後、パパニコロウ染色を行った場合の結果をそれぞれ示す。また、上段の顕微鏡写真は、下段の顕微鏡写真を拡大したものである。
【００８５】
図８から明らかな如く本発明の細胞固定液を用いて固定した標本の方（図８(２)）が、直接塗沫法で得られた標本（図８(１)）よりも細胞の歩留まりが良く、立体的に観察される。
【００８６】
また、上記した、沈渣の少ない試料を、直接塗沫・パパニコロウ染色した場合（図７（１））と本発明の細胞固定液を用いて固定した後、パパニコロウ染色した場合（図７(２)）の光学顕微鏡写真を図９に示す。
【００８７】
図９において、（１）は従来の直接塗沫・パパニコロウ染色を行った場合、（２）は本発明の細胞固定液を用いて固定後パパニコロウ染色を行った場合の結果をそれぞれ示す。また、上段の顕微鏡写真は、下段の顕微鏡写真を拡大したものである。
【００８８】
図９から明らかな如く、本発明の細胞固定液を用いて固定した場合には、試料が少ない場合でも、細胞の歩留まりが良いため、細胞診を行う際に、極めて有効であることが判る。また、大きな細胞集塊を含む検体でも、良好な保湿効果と染色性が得られたことがわかる。
【００８９】
実施例６．従来の細胞固定液との比較
〔試料〕
実施例５と同じ自然尿を用いた。
【００９０】
〔細胞固定液の調製〕
（１）本発明の細胞固定液
86v／v％エタノールと14v／v％イソプロパノールのアルコール混合液を調製した。このアルコール混合液95容量部に生理食塩水5容量部を添加して溶解液を調製し、該溶解液にPEG1540を10w／v％となるように溶解させたものを調製し、細胞固定液とした。
（２）市販の細胞固定液
下記４種の市販の細胞固定液を用いた。各細胞固定液の組成は、それぞれの製品の取扱説明書に記載されたものを示した。
（ａ）市販の細胞固定液Ａ
組成：エタノール50％、PEG1540 2％含有。
（ｂ）市販の細胞固定液Ｂ
組成：エタノール50％、PEG1540（濃度は不明）、ジチオスレイトール、リファンピシン含有。
（ｃ）市販の細胞固定液Ｃ
組成：エタノール50％、PEG1540 数％、粘液融解剤 微量含有。
（ｄ）市販の細胞固定液Ｄ
組成：25％エタノール、トルエン、クエン酸含有。
【００９１】
〔固定処理〕    
試料（自然尿）を50mL遠心管に採り、3000rpm(1500G)で2分間遠心処理した。上清を除去し、沈渣の水分を十分に取った後、パスツールピペットで、沈渣の一部を取り、引きガラス法にてスライドガラス上に塗布した標本1枚を作製し、通常のパパニコロウ染色を行った。残りの沈渣を5本の試験管に分けた後、上記で調製した本発明の細胞固定液、又は市販の細胞固定液それぞれ10mLを加えてよく混和した。30分間静置して固定処理を行った後、同様に3000rpm(1500G)で2分間遠心処理し、スライドラック（(株)医学生物学研究所製）を使用して、沈渣をスライドガラスに塗沫して標本を作製した。塗沫標本は30分自然乾燥後、本発明の細胞固定液に保存した後、通常のパパニコロウ染色を行った。
【００９２】
〔結果〕
得られた塗末標本の写真を、図１０に示す。
図１０において、（１）は直接塗沫法を行った場合、（２）は本発明の細胞固定液で固定した場合、（３）は市販の細胞固定液Ａで固定した場合、（４）は市販の細胞固定液Ｂで固定した場合、（５）は市販の細胞固定液Ｃで固定した場合、（６）は市販の細胞固定液Ｄで固定した場合の結果をそれぞれ示す。
【００９３】
図１０の結果から明らかな如く、塗沫標本を肉眼で観察した場合には、本発明の細胞固定液で固定した場合（図１０(２)）と、市販の細胞固定液Ａで固定した場合（図１０(３)）は、細胞が剥離していなかった。直接塗沫法を行った場合（図１０(１)）及び他の市販の細胞固定液で固定した場合（図１０(４)〜(６)）には、細胞が剥離してしまっていることが判る。
【００９４】
また、得られた塗末標本の光学顕微鏡写真を図１１及び図１２に示す。
【００９５】
図１１において、（１）は直接塗沫法を行った図１０(１)の場合、（２）は本発明の細胞固定液で固定した図１０(２)の場合、（３）は市販の細胞固定液Ａで固定した図１０(３)の場合、（４）は市販の細胞固定液Ｂで固定した図１０(４)の場合で得られた、塗沫標本の顕微鏡写真をそれぞれ示す。
【００９６】
市販の細胞固定液Ａで固定した場合、肉眼で塗沫標本を観察したところでは、本発明の細胞固定液で固定した場合と同様に、細胞の剥離が見られず、一見したところ良好な標本が得られたようであった（図１０(３)）が、顕微鏡で観察したところ、細胞が膨張してしまっていることが判る（図１１(３)の矢印で示した細胞）。また、市販の細胞固定液Ｂで固定した場合には、細胞の核が真っ黒に染まってしまい、核小体を観察することができなかった（図１１(４)）。更に、図１１(１)、(３)及び(４)では、大きい細胞、即ち癌細胞しか観察されないが、本発明の細胞固定液で固定した場合には、赤血球もオレンジGにきれいに染色されて、観察された（図１１(２) の矢印で示した細胞）。また、細胞の膨張も見られず、核の形も変形していない、極めて良好な標本が得られたことが判る。
【００９７】
図１２において、（１）は直接塗沫法を行った図１０(１)の場合、（２）は本発明の細胞固定液で固定した図１０(２)の場合、（３）は市販の細胞固定液Ｃで固定した図１０(５)の場合、（４）は市販の細胞固定液Ｄで固定した図１０(６)の場合で得られた、塗沫標本の顕微鏡写真をそれぞれ示す。
【００９８】
図１２から明らかな如く、市販の細胞固定液Ｃで固定した場合は、細胞が膨張していることが判る（図１２(３) の矢印で示した細胞）。また、市販の細胞固定液Ｄで固定した場合には、細胞の核の形が歪んでしまっていることが判る（図１２(４) の矢印で示した細胞）。更に、図１２（１）、（３）及び（４）では、大きい細胞、即ち癌細胞しか観察されない。一方、本発明の細胞固定液で固定した場合には、赤血球もオレンジGにきれいに染色されて、観察され（図１２(２) の矢印で示した細胞）、細胞の膨張も見られず、核の形も変形していない、極めて良好な標本が得られたことが判る。
【００９９】
実施例７．
〔試料〕
病理診断の結果、胆管癌と診断された患者の胆汁を使用した。
〔本発明の細胞固定液の調製〕
86v／v％エタノールと14v／v％イソプロパノールのアルコール混合液を調製した。このアルコール混合液95容量部に生理食塩水5容量部を添加して溶解液を調製し、該溶解液にPEG1540を10w／v％となるように溶解させたものを調製し、細胞固定液とした。
〔固定処理〕
胆汁を50mL遠心管に採り、3000rpm(1500G)で2分間遠心処理した。上清を除去し、沈渣の水分を十分に取った後、上記で調製した細胞固定液10mLを加えてよく混和した。30分間静置して固定処理を行った後、同様に3000rpm(1500G)で2分間遠心処理し、沈渣をスライドガラスに塗沫して標本を作製した。塗沫標本は30分自然乾燥後、本発明の細胞固定液に保存した後、通常のパパニコロウ染色を行った。
【０１００】
〔結果〕
得られた塗沫沫標本の光学顕微鏡写真を図１３に示す。
図１３より明らかな如く、本発明の細胞固定液を用いれば、胆汁試料を用いた場合でも、細胞の剥離が少ない極めて優れた標本が得られ、立体的に観察され、細胞診による判定が容易であることが判る。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】実験例１において得られた、膀胱癌患者の自然尿の沈渣を固定処理したものを用いて作製した塗末標本の写真である。
【図２】実施例１において得られた、膀胱癌患者の自然尿の沈渣を固定処理したものを用いて作製した塗末標本の写真である。
【図３】実施例２において得られた、膀胱癌患者の自然尿の沈渣を固定処理したものを用いて作製した塗末標本の写真である。
【図４】実施例３において得られた、膀胱癌患者の自然尿の沈渣を固定処理したものを用いて作製した塗末標本の光学顕微鏡写真である。  図4(1)は本発明の細胞固定液を用いた場合、(2)は９５％エタノール細胞固定液を用いた場合である。図４の左上の写真は、(2)と同じ標本の変性、乾燥している細胞の光学顕微鏡写真である。
【図５】実施例４において得られた、卵巣癌と診断された患者の腹水を固定処理したものを用いて作製した塗末標本の光学顕微鏡写真である。  図5(1)は本発明の細胞固定液を用いた場合、(2)は混合アルコール細胞固定液を用いた場合である。
【図６】実施例５において得られた、膀胱癌と診断された患者の自然尿を固定処理したものを用いて作製した塗末標本の写真である。  図6(1)は従来の直接塗沫・パパニコロウ染色を行った場合、(2)は本発明の細胞固定液を用いて固定後パパニコロウ染色を行った場合、(3)は従来の直接塗沫・ギムザ染色を行った場合である。
【図７】実施例５において得られた、膀胱癌と診断された患者の自然尿（沈渣の少なかった試料）を固定処理したものを用いて作製した塗末標本の写真である。  図7(1)は従来の直接塗沫・パパニコロウ染色を行った場合、(2)は本発明の細胞固定液を用いて固定後パパニコロウ染色を行った場合、(3)は従来の直接塗沫・ギムザ染色を行った場合である。
【図８】実施例５において得られた、膀胱癌と診断された患者の自然尿を固定処理したものを用いて作製した塗末標本の光学顕微鏡写真である。  図8(1)は従来の直接塗沫・パパニコロウ染色を行った場合、(2)は本発明の細胞固定液を用いて固定後、パパニコロウ染色を行った場合である。また、上段の顕微鏡写真は、下段の顕微鏡写真を拡大したものである。
【図９】実施例５において得られた、膀胱癌と診断された患者の自然尿（沈渣の少なかった試料）を固定処理したものを用いて作製した塗末標本の光学顕微鏡写真である。  図9(1)は従来の直接塗沫・パパニコロウ染色を行った場合、(2)は本発明の細胞固定液を用いて固定後パパニコロウ染色を行った場合である。また、上段の顕微鏡写真は、下段の顕微鏡写真を拡大したものである。
【図１０】実施例６において得られた、膀胱癌と診断された患者の自然尿を固定処理したものを用いて作製した塗末標本の写真である。  図10(1)は直接塗沫法を行った場合、(2)は本発明の細胞固定液で固定した場合、(3)は市販の細胞固定液Ａで固定した場合、(4)は市販の細胞固定液Ｂで固定した場合、(5)は市販の細胞固定液Ｃで固定した場合、(6)は市販の細胞固定液Ｄで固定した場合である。
【図１１】実施例６において得られた、膀胱癌と診断された患者の自然尿を固定処理したものを用いて作製した塗末標本の光学顕微鏡写真である。  図11(1)は直接塗沫法を行った場合、(2)は本発明の細胞固定液で固定した場合、(3)は市販の細胞固定液Ａで固定した場合、(4)は市販の細胞固定液Ｂで固定した場合である。
【図１２】実施例６において得られた、膀胱癌と診断された患者の自然尿を固定処理したものを用いて作製した塗末標本の光学顕微鏡写真である。  図12(1)は直接塗沫法を行った場合、(2)は本発明の細胞固定液で固定した場合、(3)は市販の細胞固定液Ｃで固定した場合、(4)は市販の細胞固定液Ｄで固定した場合である。
【図１３】実施例７において得られた、胆管癌と診断された患者の胆汁を固定処理し他ものを用いて作製した塗末標本の光学顕微鏡写真である。
【図１】
2007202472.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2007202472.tif 000009
【図９】
2007202472.tif 000010
【図１０】
2007202472.tif 000011
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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