(57)【要約】【課題】本発明は、TAAR1機能についてのノックアウト動物を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、TAAR1遺伝子の単一コードエキソンに隣接する上流および下流の領域に相同なゲノム配列、1つまたは複数の選択マーカー遺伝子、および任意にレポーター遺伝子を含むベクター構築物、ならびにその使用に関する。本発明はさらに、TAAR1ノックアウトマウス動物およびその使用を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
相同組換えに適したTAAR1遺伝子の単一コードエキソンに隣接する上流および下流の領域に相同であるゲノム配列、ならびに1つまたは複数の選択マーカー遺伝子を含むベクター構築物。
【請求項２】
レポーター遺伝子をさらに含み、かつレポーター遺伝子が相同なTAAR1隣接配列間に位置する、請求項1に記載のベクター構築物。
【請求項３】
レポーター遺伝子がLacZをコードする、請求項2に記載のベクター構築物。
【請求項４】
レポーター遺伝子がNLS配列に機能的に連結されている、請求項2または3のいずれか1項に記載のベクター構築物。
【請求項５】
選択マーカー遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子である、請求項1から4のいずれか1項に記載のベクター構築物。
【請求項６】
選択マーカー遺伝子がジフテリア毒素遺伝子である、請求項1から5のいずれか1項に記載のベクター構築物。
【請求項７】
選択マーカー遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子およびジフテリア毒素遺伝子である、請求項1から6のいずれか1項に記載のベクター構築物。
【請求項８】
相同配列がTAAR1プロモーターの少なくとも一部を含む、請求項1から7のいずれか1項に記載のベクター構築物。
【請求項９】
アクセッション番号DSM 17504の下で寄託されたプラスミドpSKDT-Tar1-NLS-PGK-Neoに組み込まれているベクター構築物TAAR-KO。
【請求項１０】
TAAR1遺伝子の一方または両方の対立遺伝子が、活性がより少ないTAAR1タンパク質または活性のないTAAR1タンパク質が発現されるような方法で変異導入および／または切断される、非ヒトノックアウト動物を作製する方法であって、
（a）相同組換えによって、請求項1〜9のいずれか1項に記載のベクター構築物を胚性幹細胞に導入する工程、
（b）該胚性幹細胞からヘテロ接合性および／またはホモ接合性のノックアウト動物を作製する工程、ならびに、それによって
（c）TAAR1遺伝子の一方または両方の対立遺伝子が、活性がより少ないTAAR1タンパク質または活性のないTAAR1タンパク質が発現されるような方法で変異導入および／または切断される、非ヒトノックアウト動物を作製する工程を含む方法。
【請求項１１】
（a）の胚性幹細胞がマウス株C57BL/6に由来する、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
請求項10または11のいずれか1項に記載の方法によって作製された非ヒトノックアウト動物。
【請求項１３】
TAAR1遺伝子の一方または両方の対立遺伝子が、活性がより少ないTAAR1タンパク質または活性のないTAAR1タンパク質が発現されるような方法で変異導入および／または切断される、非ヒトノックアウト動物。
【請求項１４】
TAAR1遺伝子の1つまたは両方の対立遺伝子がレポーター遺伝子によって置換される、請求項13に記載の非ヒトノックアウト動物。
【請求項１５】
レポーター遺伝子がLacZをコードする、請求項14に記載の非ヒトノックアウト動物。
【請求項１６】
齧歯類である、請求項12から15のいずれか1項に記載の非ヒトノックアウト動物。
【請求項１７】
齧歯類がマウスである、請求項16に記載の非ヒトノックアウト動物。
【請求項１８】
マウスが類似遺伝子型のC57BL/6マウスである、請求項17に記載の非ヒトノックアウト動物。
【請求項１９】
同じかまたは別の遺伝子型の動物を繁殖させることによって得られる、請求項12から18のいずれか1項に記載の非ヒトノックアウト動物の子孫。
【請求項２０】
請求項12から19のいずれか1項に記載の非ヒトノックアウト動物またはその子孫に由来する初代細胞培養物または二次細胞株。
【請求項２１】
請求項12から19のいずれか1項に記載の非ヒトノックアウト動物またはその子孫に由来する、組織もしくは器官の移植物またはその培養物。
【請求項２２】
請求項12から19のいずれか1項に記載の非ヒトノックアウト動物またはその子孫に由来する組織または細胞抽出物。
【請求項２３】
うつ病、不安障害、双極性障害、注意欠陥多動障害、ストレス関連障害、統合失調症などの精神病性障害、パーキンソン病などの神経疾患、アルツハイマー病などの神経変性障害、てんかん、片頭痛、高血圧、摂食障害などの物質乱用および代謝障害、糖尿病、糖尿病性合併症、肥満、異脂肪血症、エネルギー消費および同化の障害、体温恒常性の障害および機能不全、睡眠およびサーカディアンリズムの障害、ならびに心臓血管障害を含む障害における化合物の治療的効果を同定および試験するためのモデルとしての請求項12から19に記載の非ヒトノックアウト動物、または請求項20に記載の初代細胞培養物もしくは二次細胞株、または請求項21に記載の組織もしくは器官の移植物またはその培養物、または請求項22に記載の組織もしくは細胞抽出物の使用。
【請求項２４】
TAAR1機能を評価するためのツールとしての請求項12から19に記載の非ヒトノックアウト動物、または請求項20に記載の初代細胞培養物もしくは二次細胞株、または請求項21に記載の組織もしくは器官の移植物またはその培養物、または請求項22に記載の組織もしくは細胞抽出物の使用。
【請求項２５】
TAAR1の未知のリガンドを同定するための、およびTAAR1以外のTAARに対するリガンドの特徴付けのためのツールとしての請求項12から19に記載の非ヒトノックアウト動物、または請求項20に記載の初代細胞培養物もしくは二次細胞株、または請求項21に記載の組織もしくは器官の移植物またはその培養物、または請求項22に記載の組織もしくは細胞抽出物の使用。
【請求項２６】
TAAR1特異的効果以外の効果についてTAAR1阻害化合物を試験する方法であって、TAAR1アゴニスト、TAAR1部分アゴニスト、TAAR1モジュレーターまたはTAAR1阻害化合物を、請求項12から19に記載の非ヒトノックアウト動物、または請求項20に記載の初代細胞培養物もしくは二次細胞株、または請求項21に記載の組織もしくは器官の移植物またはその培養物、または請求項22に記載の組織もしくは細胞抽出物に投与する工程、ならびに生理学的パラメーターだけでなく神経機能、感覚機能、および認知的機能も扱う行動のおよび生理学的研究によって化合物の効果を決定する工程、ならびにこれらを野生型対照動物に対する同じ化合物の効果と比較する工程を含む方法。
【請求項２７】
TAAR1特異的効果以外の効果について、TAAR1アゴニスト、TAAR1部分アゴニスト、TAAR1モジュレーターまたはTAAR1阻害化合物を試験するためのツールとしての請求項12から19に記載の非ヒトノックアウト動物、または請求項20に記載の初代細胞培養物もしくは二次細胞株、または請求項21に記載の組織もしくは器官の移植物またはその培養物、または請求項22に記載の組織もしくは細胞抽出物の使用。
【請求項２８】
TAAR1に作用する化合物の特異性を決定するためのツールとしての請求項12から19に記載の非ヒトノックアウト動物、または請求項20に記載の初代細胞培養物もしくは二次細胞株、または請求項21に記載の組織もしくは器官の移植物またはその培養物、または請求項22に記載の組織もしくは細胞抽出物の使用。
【請求項２９】
TAARの細胞内輸送またはTAARに結合される他の細胞成分を研究するための請求項12から19に記載の非ヒトノックアウト動物、または請求項20に記載の初代細胞培養物もしくは二次細胞株、または請求項21に記載の組織もしくは器官の移植物またはその培養物、または請求項22に記載の組織もしくは細胞抽出物の使用。
【請求項３０】
TAAR1発現プロファイルを決定するための請求項14から19のいずれか1項に記載の非ヒトノックアウト動物の使用。
【請求項３１】
TAAR1特異的効果以外の効果について、TAAR1アゴニスト、TAAR1部分アゴニスト、TAAR1ポジティブおよびネガティブモジュレーターまたはTAAR1阻害化合物を試験するための試験系であって、請求項12から19に記載の非ヒトノックアウト動物、または請求項20に記載の初代細胞培養物もしくは二次細胞株、または請求項21に記載の組織もしくは器官の移植物またはその培養物、または請求項22に記載の組織もしくは細胞抽出物、ならびにTAAR1アゴニスト、TAAR1部分アゴニスト、TAAR1ポジティブおよびネガティブモジュレーターまたはTAAR1阻害化合物がTAAR1特異的効果以外の効果を示すか否かを決定するための手段を含む、試験系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、TAAR1機能についてのノックアウト動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
微量アミン（TA）は、生体アミン神経伝達物質に関連する内因性化合物であり、かつ極微量で哺乳動物神経系に存在する。過去何十年の間に微量アミンの薬理学および代謝に対する熱心な研究の取り組みは、うつ病、統合失調症、不安障害、双極性障害、注意欠陥多動障害、パーキンソン病などの神経疾患、てんかん、片頭痛、高血圧、摂食障害などの物質乱用および代謝障害、糖尿病、肥満、ならびに異脂肪血症などの種々のかなり蔓延した状態へのそれらの密な関連がきっかけとなっている（以下に概説されている：非特許文献1;非特許文献2;非特許文献3;非特許文献4）。しかし、分子レベルでの微量アミンの生理学に対する詳細な理解は、微量アミン結合受容体（TAAR;非特許文献5;非特許文献6;非特許文献7）と呼ばれるGタンパク質結合受容体の新規のファミリーの最近の同定によりようやく可能になった。これらの受容体のいくつかは微量アミンに対する感受性を示し、これらの独特な薬理学および発現パターンは、これらの受容体を、いくつかの疾患の状況における薬物開発における標的のための第1の候補にし、これらのいくつかは以前に微量アミンと結び付けられていた。系のレベルに対する微量アミン結合受容体およびそれらのリガンドの生理学的関連性を理解することの進捗状況は、それらの発現パターン、それらの薬理学およびシグナル伝達の様式の詳細な知見に決定的に依存する。この状況において、標的化された「ノックアウト」マウス系統などのトランスジェニック動物モデルだけでなく、TAARに対するアゴニスト、アンタゴニスト、またはポジティブもしくはネガティブなモジュレーターとして作用する化合物も、この受容体ファミリーの分子的機能を詳細に解析するための、および薬物開発において標的としてのそれらの可能性のある関連を十分に理解するための必須のツールである。
【０００３】
【非特許文献１】LindemannおよびHoner, Trends Pharmacol Sci. 2005; 26(5):274-81
【非特許文献２】Branchek, T.A.およびBlackburn, T.P. (2003) Curr. Opin. Pharmacol. 3, 90-97
【非特許文献３】Premont, R.T., Gainetdinov,R.R., Caron, M.G. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. 98, 9474-9475
【非特許文献４】Davenport, A.P. (2003) Curr. Opin. Pharmacol. 3, 127-134
【非特許文献５】Lindemann, L., Ebeling, M., Kratochwil, N.A., Bunzow J. R., Grandy, D.K., Hoener, M.C. (2005) Genomics 85, 372-385
【非特許文献６】Bunzowら、(2001) Mol. Pharmacol. 60, 1181-1188
【非特許文献７】Borowsky, B.ら、(2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 8966-8971
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、TAAR1機能についてのノックアウト動物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、標的化されたTAAR1遺伝子の欠失をそれらのゲノム内に含む非ヒトノックアウト動物を作製するためのベクター構築物および方法を提供する。該TAAR1ノックアウト動物もまた、それらを作製する方法と同様に、提供される。本発明はまた、化合物の治療効果のためのTAAR1以外のTAARの新規のリガンドの特徴付けのためだけでなく、TAAR1機能を評価するための、およびTAAR1の未知のリガンドを同定するための、TAAR1の組織分布を解析するための、TAAR1シグナル伝達機構を解析するための、インビボでのTAAR1の生理学的機能を解析するための、ならびに、うつ病、不安障害、双極性障害、注意欠陥多動障害、ストレス関連障害、統合失調症などの精神病性障害、パーキンソン病などの神経疾患、アルツハイマー病などの神経変性障害、てんかん、片頭痛、高血圧、摂食障害などの物質乱用および代謝障害、糖尿病、糖尿病性合併症、肥満、異脂肪血症、エネルギー消費および同化の障害、体温恒常性の障害および機能不全、睡眠およびサーカディアンリズムの障害、ならびに心臓血管障害を含む障害を治療および予防する際に化合物の治療効果を同定および試験するための、ツールとしてこれらの動物の使用に関する。
【０００６】
本発明（１）は、相同組換えに適したTAAR1遺伝子の単一コードエキソンに隣接する上流および下流の領域に相同であるゲノム配列、ならびに1つまたは複数の選択マーカー遺伝子を含むベクター構築物である。
本発明（２）は、レポーター遺伝子をさらに含み、かつレポーター遺伝子が相同なTAAR1隣接配列間に位置する、本発明（1）のベクター構築物である。
本発明（３）は、レポーター遺伝子がLacZをコードする、本発明（2）のベクター構築物である。
本発明（４）は、レポーター遺伝子がNLS配列に機能的に連結されている、本発明（2）または（3）のいずれか一発明のベクター構築物である。
本発明（５）は、選択マーカー遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子である、本発明（1）から（4）のいずれか一発明のベクター構築物である。
本発明（６）は、選択マーカー遺伝子がジフテリア毒素遺伝子である、本発明（1）から（5）のいずれか一発明のベクター構築物である。
本発明（７）は、選択マーカー遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子およびジフテリア毒素遺伝子である、本発明（1）から（6）のいずれか一発明のベクター構築物である。
本発明（８）は、相同配列がTAAR1プロモーターの少なくとも一部を含む、本発明（1）から（7）のいずれか一発明のベクター構築物である。
本発明（９）は、アクセッション番号DSM 17504の下で寄託されたプラスミドpSKDT-Tar1-NLS-PGK-Neoに組み込まれているベクター構築物TAAR-KOである。
本発明（１０）は、TAAR1遺伝子の一方または両方の対立遺伝子が、活性がより少ないTAAR1タンパク質または活性のないTAAR1タンパク質が発現されるような方法で変異導入および／または切断される、非ヒトノックアウト動物を作製する方法であって、
（a）相同組換えによって、本発明（1）〜（9）のいずれか一発明のベクター構築物を胚性幹細胞に導入する工程、
（b）該胚性幹細胞からヘテロ接合性および／またはホモ接合性のノックアウト動物を作製する工程、ならびに、それによって
（c）TAAR1遺伝子の一方または両方の対立遺伝子が、活性がより少ないTAAR1タンパク質または活性のないTAAR1タンパク質が発現されるような方法で変異導入および／または切断される、非ヒトノックアウト動物を作製する工程を含む方法である。
本発明（１１）は、（a）の胚性幹細胞がマウス株C57BL/6に由来する、本発明（10）の方法である。
本発明（１２）は、本発明（10）または（11）のいずれか一発明の方法によって作製された非ヒトノックアウト動物である。
本発明（１３）は、TAAR1遺伝子の一方または両方の対立遺伝子が、活性がより少ないTAAR1タンパク質または活性のないTAAR1タンパク質が発現されるような方法で変異導入および／または切断される、非ヒトノックアウト動物である。
本発明（１４）は、TAAR1遺伝子の1つまたは両方の対立遺伝子がレポーター遺伝子によって置換される、本発明（13）の非ヒトノックアウト動物である。
本発明（１５）は、レポーター遺伝子がLacZをコードする、本発明（14）の非ヒトノックアウト動物である。
本発明（１６）は、齧歯類である、本発明（12）から（15）のいずれか一発明の非ヒトノックアウト動物である。
本発明（１７）は、齧歯類がマウスである、本発明（16）の非ヒトノックアウト動物である。
本発明（１８）は、マウスが類似遺伝子型のC57BL/6マウスである、本発明（17）の非ヒトノックアウト動物である。
本発明（１９）は、同じかまたは別の遺伝子型の動物を繁殖させることによって得られる、本発明（12）から（18）のいずれか一発明の非ヒトノックアウト動物の子孫である。
本発明（２０）は、本発明（12）から（19）のいずれか一発明の非ヒトノックアウト動物またはその子孫に由来する初代細胞培養物または二次細胞株である。
本発明（２１）は、本発明（12）から（19）のいずれか一発明の非ヒトノックアウト動物またはその子孫に由来する、組織もしくは器官の移植物またはその培養物である。
本発明（２２）は、本発明（12）から（19）のいずれか一発明の非ヒトノックアウト動物またはその子孫に由来する組織または細胞抽出物である。
本発明（２３）は、うつ病、不安障害、双極性障害、注意欠陥多動障害、ストレス関連障害、統合失調症などの精神病性障害、パーキンソン病などの神経疾患、アルツハイマー病などの神経変性障害、てんかん、片頭痛、高血圧、摂食障害などの物質乱用および代謝障害、糖尿病、糖尿病性合併症、肥満、異脂肪血症、エネルギー消費および同化の障害、体温恒常性の障害および機能不全、睡眠およびサーカディアンリズムの障害、ならびに心臓血管障害を含む障害における化合物の治療的効果を同定および試験するためのモデルとしての本発明（12）から（19）の非ヒトノックアウト動物、または本発明（20）の初代細胞培養物もしくは二次細胞株、または本発明（21）の組織もしくは器官の移植物またはその培養物、または本発明（22）の組織もしくは細胞抽出物の使用である。
本発明（２４）は、TAAR1機能を評価するためのツールとしての本発明（12）から（19）の非ヒトノックアウト動物、または本発明（20）の初代細胞培養物もしくは二次細胞株、または本発明（21）の組織もしくは器官の移植物またはその培養物、または本発明（22）の組織もしくは細胞抽出物の使用である。
本発明（２５）は、TAAR1の未知のリガンドを同定するための、およびTAAR1以外のTAARに対するリガンドの特徴付けのためのツールとしての本発明（12）から（19）の非ヒトノックアウト動物、または本発明（20）の初代細胞培養物もしくは二次細胞株、または本発明（21）の組織もしくは器官の移植物またはその培養物、または本発明（22）の組織もしくは細胞抽出物の使用である。
本発明（２６）は、TAAR1特異的効果以外の効果についてTAAR1阻害化合物を試験する方法であって、TAAR1アゴニスト、TAAR1部分アゴニスト、TAAR1モジュレーターまたはTAAR1阻害化合物を、本発明（12）から（19）の非ヒトノックアウト動物、または本発明（20）の初代細胞培養物もしくは二次細胞株、または本発明（21）の組織もしくは器官の移植物またはその培養物、または本発明（22）の組織もしくは細胞抽出物に投与する工程、ならびに生理学的パラメーターだけでなく神経機能、感覚機能、および認知的機能も扱う行動のおよび生理学的研究によって化合物の効果を決定する工程、ならびにこれらを野生型対照動物に対する同じ化合物の効果と比較する工程を含む方法である。
本発明（２７）は、TAAR1特異的効果以外の効果について、TAAR1アゴニスト、TAAR1部分アゴニスト、TAAR1モジュレーターまたはTAAR1阻害化合物を試験するためのツールとしての本発明（12）から（19）の非ヒトノックアウト動物、または本発明（20）の初代細胞培養物もしくは二次細胞株、または本発明（21）の組織もしくは器官の移植物またはその培養物、または本発明（22）の組織もしくは細胞抽出物の使用である。
本発明（２８）は、TAAR1に作用する化合物の特異性を決定するためのツールとしての本発明（12）から（19）の非ヒトノックアウト動物、または本発明（20）の初代細胞培養物もしくは二次細胞株、または本発明（21）の組織もしくは器官の移植物またはその培養物、または本発明（22）の組織もしくは細胞抽出物の使用である。
本発明（２９）は、TAARの細胞内輸送またはTAARに結合される他の細胞成分を研究するための本発明（12）から（19）の非ヒトノックアウト動物、または本発明（20）の初代細胞培養物もしくは二次細胞株、または本発明（21）の組織もしくは器官の移植物またはその培養物、または本発明（22）の組織もしくは細胞抽出物の使用である。
本発明（３０）は、TAAR1発現プロファイルを決定するための本発明（14）から（19）のいずれか一発明の非ヒトノックアウト動物の使用である。
本発明（３１）は、TAAR1特異的効果以外の効果について、TAAR1アゴニスト、TAAR1部分アゴニスト、TAAR1ポジティブおよびネガティブモジュレーターまたはTAAR1阻害化合物を試験するための試験系であって、本発明（12）から（19）の非ヒトノックアウト動物、または本発明（20）の初代細胞培養物もしくは二次細胞株、または本発明（21）の組織もしくは器官の移植物またはその培養物、または本発明（22）の組織もしくは細胞抽出物、ならびにTAAR1アゴニスト、TAAR1部分アゴニスト、TAAR1ポジティブおよびネガティブモジュレーターまたはTAAR1阻害化合物がTAAR1特異的効果以外の効果を示すか否かを決定するための手段を含む、試験系である。
本発明（３２）は、本明細書中に実質的に記載される、特に実施例に関する、ベクター構築物、方法、ノックアウト動物、試験系、および使用である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、TAAR1遺伝子の単一コードエキソンに隣接する上流および下流の領域に相同なゲノム配列、1つまたは複数の選択マーカー遺伝子、および任意にレポーター遺伝子を含むベクター構築物、ならびにその使用が提供された。本発明によりさらに、TAAR1ノックアウトマウス動物およびその使用も提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、相同組換えに適したTAAR1遺伝子の単一コードエキソンに隣接する上流および下流の領域に相同なゲノム配列、ならびに1つまたは複数の選択マーカー遺伝子を含むベクター構築物を提供する。
【０００９】
このベクター構築物は、染色体上の上流および下流のTAAR1エキソンに隣接する配列に相同であるゲノムDNA配列を含む。相同配列の長さは、それがTAAR1対立遺伝子との標的化された相同組換えを可能にするように選択される。この相同配列は、2.5〜300kbの長さを有してもよい。好ましくは、相同配列は、TAAR1プロモーターの少なくとも一部を含む。
【００１０】
好ましくは、このベクター構築物は、レポーター遺伝子をさらに含む。該レポーター遺伝子は、相同なTAAR1隣接配列間に位置する。好ましくは、該レポーター遺伝子の発現は、ゲノムへの組み込み後、TAAR1プロモーター、および任意の他のTAAR1調節エレメントの制御を受ける。レポーター遺伝子は、LacZまたはその誘導体、アルカリホスファターゼ、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、または様々な種類の組織もしくは細胞中で特異的に検出および定量化されることが可能である他の酵素もしくはタンパク質を含む群より選択されてもよい。好ましくは、このレポーター遺伝子はLacZである。好ましくは、このレポーター遺伝子はそのN末端で核移行配列（NLS）に機能的に連結される。好ましい態様において、このレポーター遺伝子は、TAAR1遺伝子の内因性開始コドンが保存されるように、TAAR1ゲノム配列に挿入される。
【００１１】
選択マーカー遺伝子は、ポジティブ選択マーカーであってもよい。ポジティブ選択マーカーは、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラスチシジンS耐性遺伝子、キサンチン/グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、またはゼオマイシン耐性遺伝子を含む群から選択されてもよい。ポジティブ選択マーカーは、成功した相同組換え現象の選択後のポジティブ選択マーカー遺伝子の切除を可能にするリコンビナーゼのための認識部位によって囲まれてもよい。それによって、レポーター遺伝子の発現に対するポジティブ選択マーカーの発現の任意の現象が回避されることができる。リコンビナーゼのための認識部位は、flpリコンビナーゼのためのfrt部位およびcreリコンビナーゼのためのloxP部位（変異したloxP部位を含む）を含む群より選択されてもよい。
【００１２】
選択マーカー遺伝子はまた、ネガティブ選択マーカーであってよい。ネガティブ選択マーカーは、ジフテリア毒素遺伝子およびHSVチミジンキナーゼ遺伝子からなる群より選択されてもよいがこれらに限定されない。好ましくは、ネガティブ選択マーカーは、ジフテリア毒素遺伝子である。
【００１３】
好ましくは、ベクター構築物は、ポジティブ選択マーカーおよびネガティブ選択マーカーを含む。より好ましくは、このベクター構築物は、ネオマイシン耐性遺伝子およびジフテリア毒素遺伝子を含む。
【００１４】
好ましい態様において、ベクター構築物は、アクセッション番号DSMZ 17504の下で寄託された（寄託日：2005年8月16日）プラスミドpSKDT-Tar1-NLS-PGK-Neoに組み込まれたベクター構築物TAAR-KOである。ベクター構築物TAAR-KOは図1Bに示される。
【００１５】
本発明はさらに、TAAR1遺伝子の一方または両方の対立遺伝子が、活性がより少ないTAAR1タンパク質または活性のないTAAR1タンパク質が発現されるような方法で変異導入および／または切断される、非ヒトノックアウト動物を作製する方法を提供し、この方法は以下の工程を含む：
（a）相同組換えによって、上記のようなベクター構築物を胚性幹細胞のゲノムに導入する工程、
（b）該胚性幹細胞からヘテロ接合性および／またはホモ接合性のノックアウト動物を作製する工程、ならびに、それによって
（c）TAAR1遺伝子の一方または両方の対立遺伝子が、活性がより少ないTAAR1タンパク質または活性のないTAAR1タンパク質が発現されるような方法で変異導入および／または切断される、非ヒトノックアウト動物を作製する工程。
【００１６】
好ましい態様において、記載された方法の工程（c）において、TAAR1遺伝子の一方または両方の対立遺伝子が、図1Aに示されるようなTAAR1NLSlacZ対立遺伝子を含む非ヒトノックアウト動物が作製されてもよい。別の好ましい態様において、記載された方法の工程（c）において、TAAR1遺伝子の一方または両方の対立遺伝子が、アクセッション番号DSMZ 17504の下で寄託された（寄託日：2005年8月16日）プラスミドpSKDT-Tar1-NLS-PGK-Neoに組み込まれた構築物TAAR1-KO（図1Bを参照されたい）を含む非ヒトノックアウト動物が、作製されてもよい。
【００１７】
さらなる態様において、上記の方法は、（d）工程（c）において作製されたノックアウト動物を、ポジティブ選択マーカーを囲んでいる認識部位を認識するリコンビナーゼについてトランスジェニックである動物と、さらに異種交配させる工程をさらに含む。
【００１８】
標的化された変異を有するノックアウト動物は、例えば、Joyner, A.L.（Gene Targeting. 1999, 第2版, The Practical Approach Series, Oxford University Press, New York） およびHogan, B.ら（Manipulating the mouse embryo. 1994, 第2版, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor.）によって提供されるように、当技術分野において日常的に得られる。
【００１９】
例えば、上記の方法のヘテロ接合性および/またはホモ接合性のノックアウト動物は、以下の工程によって作製されてもよい：上記のような標的化されたTAAR1対立遺伝子を保有する胚性幹（ES）細胞クローンを選択する工程、組換え胚性幹細胞クローンにおいて的化された変異を確認する工程、確認した組換え胚性幹細胞を野生型動物の胚盤胞に注入する工程、これらの注入された胚盤胞を偽妊娠乳母に移す工程、胚盤胞から生じたキメラを野生型動物まで繁殖させる工程、これらの繁殖から得られた子孫を、標的化された変異の存在について試験する工程、任意にホモ接合性動物を作製するために、ヘテロ接合性動物を繁殖させる工程。
【００２０】
本発明の方法においてもまた使用されてもよい、当技術分野において使用される胚性幹細胞には、例えば、C57BL/6、BALB/c、DBA/2、CBA/およびSV129などのマウス株に由来する胚性幹細胞が含まれる。好ましくは、C57BL/6マウスに由来する胚性幹細胞が使用される（Seong, Eら（2004）Trends Genet. 20, 59-62; Wolfer, D.P.ら、Trends Neurosci. 25（2002）: 336-340）。
【００２１】
本発明はさらに、上記の方法のいずれかによって作製された非ヒトノックアウト動物を提供する。
【００２２】
本発明の別の態様において、TAAR1遺伝子の一方または両方の対立遺伝子が、活性がより少ないTAAR1タンパク質または活性のないTAAR1タンパク質が発現されるような方法で変異導入および／または切断される、非ヒトノックアウト動物が提供される。好ましくは、非ヒトノックアウト動物のTAAR1遺伝子の1つまたは両方の対立遺伝子がレポーター遺伝子で置換される。好ましくは、このレポーター遺伝子はLacZである。
【００２３】
好ましい態様において、TAAR1遺伝子の一方または両方の対立遺伝子が、図1Aに示されるようなTAAR1NLSlacZ対立遺伝子を含む、非ヒトノックアウト動物が提供される。別の好ましい態様において、非ヒトノックアウト動物は、TAAR1遺伝子の一方または両方の対立遺伝子が、アクセッション番号DSM 17504の下で寄託された（寄託日：2005年8月16日）プラスミドpSKDT-Tar1-NLS-PGK-Neoに組み込まれた構築物TAAR1-KO（図1Bを参照されたい）を含む。
【００２４】
非ヒトノックアウト動物は、本発明の方法に使用されてもよい、当該技術分野において公知の任意の動物であってもよい。好ましくは、本発明の動物は哺乳動物であり、より好ましくは、本発明のノックアウト動物は齧歯類である。最も好ましくは、非ヒト動物はマウスである。さらにより好ましくは、この非ヒトノックアウト動物は、C57BL/6の類似遺伝子型変異体マウス株である。
【００２５】
本発明はまた、本発明によって提供され、同じまたは別の遺伝子型を用いて繁殖させることによって得られるような、非ヒトノックアウト動物の子孫（=後代）に関する。子孫はまた、同じ遺伝的なバックグラウンドを用いて繁殖させることによって得られてもよい。
【００２６】
このノックアウト動物は、初代培養細胞を調製するために、およびこれらの初代細胞調製物に由来する二次細胞株の調製のために使用することができる。さらに、ノックアウト動物は、組織または器官の移植物、およびその培養物の調製のために使用することができる。さらに、このノックアウト動物は、膜またはシナプトソーム調製物などの組織または細胞抽出物の調製のために使用されてもよい。
【００２７】
本発明はさらに、初代細胞培養物、ならびに本発明によって提供されるような非ヒトノックアウト動物またはその子孫に由来する二次細胞株を提供する。さらに、本発明は、組織または器官の移植物およびその培養物、ならびに本発明によって提供されるような非ヒトノックアウト動物またはその子孫に由来する組織または器官の移植物を提供する。組織または細胞の抽出物は、例えば、膜またはシナプトソーム調製物である。
【００２８】
ゲノムへの遺伝子構築物の組み込みは、単離された、例えば、動物の尾生検材料からのDNAを使用して、ゲノムサザンブロットおよびPCR解析を含む種々の方法によって検出することができる。
【００２９】
例えば、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）またはノーザンブロットインサイチューハイブリダイゼーションによるmRNA定量化などのRNAレベルでの方法、ならびに組織化学、イムノブロット解析、およびインビトロ結合研究を含むタンパク質レベルでの方法を含む、レポーター遺伝子の発現を検出するために使用してもよい多数の解析手法が存在することは当業者には明白であると思われる。標的化された遺伝子の発現レベルは、当業者には一般的であるELISA技術によってさらに定量化されることができる。
【００３０】
定量的測定は、多くの標準的アッセイ法を使用して行うことができる。例えば、転写レベルは、RT-PCR法ならびにRNase保護、ノーザンブロット解析、およびRNAドットブロット解析を含むハイブリダイゼーション法を使用して測定することができる。タンパク質レベルは、ELISA、ウェスタンブロット解析によって、および免疫組織化学的にまたは組織化学的に染色した組織切片の比較によって、アッセイすることができる。免疫組織化学染色、酵素組織化学染色、ならびに免疫電子顕微鏡法もまた、TAAR1タンパク質の有無を評価するために使用することができる。TAAR1発現はまた、TAAR1非ヒトノックアウト動物中のNLSlacZレポーターを利用して、組織切片上の免疫組織化学的もしくは組織化学的なlacZ染色、または組織ホモジネートもしくは組織抽出物を用いて実行される定量的酵素lacZアッセイ法を使用して定量化されてもよい。このようなアッセイ法の特定の例は以下に提供される。
【００３１】
本発明のノックアウト動物は、免疫組織化学、電子顕微鏡法、磁気共鳴映像法（MRI）、ポジトロン放出断層撮影（PET）を含む当技術分野において公知の方法によって、ならびに生理学的な（例えば、代謝的な）パラメーターだけでなく、神経機能、感覚機能、および認知機能も扱う行動の研究および生理学的な研究によってさらに特徴付けされてもよい。行動のテストおよび生理学的試験の例は以下である：自発的行動、認知機能に関連する行動、薬理学的に破壊された行動、握力試験、水平ワイヤ試験、強制水泳試験、ロータロッド試験、自発運動、前パルス阻害試験、モリス水迷路試験、Y迷路試験、明暗嗜好試験、受動的および能動的回避試験、ガラス玉覆い試験、プラス迷路試験、学習無力条件付け試験、ストレス誘導性高熱、摂食量および経時的な体重の発達の測定、休止条件および基礎条件下でのならびに熱および低温曝露時の体温およびエネルギー消費の測定、温熱中間帯の決定、食物同化係数の決定（例えば、ボンベ熱量測定法によって）、エネルギー同化および糞便のエネルギー含量の決定、例えば、炭水化物および脂質の代謝の解析のための呼吸係数の決定、食物制限の間の物質利用率およびエネルギー消費の決定、酸素消費、CO2-および例えば、間接的熱量測定による熱の生成量の決定、休止条件下での心拍数および血圧の測定、基本条件下でのおよびストレス条件下での（例えば、遠隔測定法による）、体組成の決定（例えば、水分含量、脂肪量、および脂肪を含まない質量に関して）。
【００３２】
「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、ヌクレオチド塩基A、T、CおよびGから構成されるDNA、または塩基A、U（Tの代わりの置換物）、C、およびGから構成されるRNAであってもよい、一本鎖または二本鎖の分子を指す。オリゴヌクレオチドは、コード鎖またはその相補物を示してもよい。オリゴヌクレオチド分子は、天然に存在し、または代替的なコドンを含んでもよい配列、天然に存在する配列において見い出されるものと同じアミノ酸をコードする配列に対する配列が同一であってもよい（Lewin「Genes V」Oxford University Press 第7章, 1994, 171-174を参照されたい）。さらに、オリゴヌクレオチド分子は、記載されるようなアミノ酸の保存的置換を示すコドンを含んでもよい。このオリゴヌクレオチドは、ゲノムDNAまたはcDNAを示してもよい。
【００３３】
「対立遺伝子」という用語は、本明細書で使用されるように、特定の染色体遺伝子座を占めることができる遺伝子の任意の代替的な型を指す。
【００３４】
遺伝子の「プロモーター」という用語は、本明細書で使用されるように、遺伝子の発現を制御するDNAの領域を指す。TAAR1プロモーターは、実質的に、野生型動物においてTAAR1遺伝子の発現を制御するプロモーターである。任意に、ゲノム相同配列は、TAAR1プロモーターの一部またはTAAR1プロモーター全体を含んでもよい。この相同配列はまた、任意に、他のTAAR1調節配列エレメントを含んでもよい。
【００３５】
「ノックアウト動物」という用語は、本明細書で使用されるように、標的化された遺伝子機能のヌル変異を含む非ヒト動物を指す。
【００３６】
本発明のさらなる目的は、うつ病、不安障害、双極性障害、注意欠陥多動障害、ストレス関連障害、統合失調症などの精神病性障害、パーキンソン病などの神経疾患、アルツハイマー病などの神経変性障害、てんかん、片頭痛、高血圧、摂食障害などの物質乱用および代謝障害、糖尿病、糖尿病性合併症、肥満、異脂肪血症、エネルギー消費および同化の障害、体温恒常性の障害および機能不全、睡眠およびサーカディアンリズムの障害、ならびに心臓血管障害を含む障害における化合物の治療効果を同定および試験するためのモデルとしての、記載されるような非ヒトノックアウト動物、または初代細胞もしくは二次細胞株、組織もしくは器官の移植物およびその培養物、または該動物に由来する組織または細胞抽出物の使用である。
【００３７】
さらに、上記のようなこれらの非ヒトノックアウト動物、該動物に由来するこれらの細胞培養物、細胞株、組織もしくは器官の移植物、培養物、または組織もしくは細胞の抽出物が、TAARシグナル伝達経路を研究するためのモデルとして使用されてもよい。
【００３８】
さらに、上記のようなこれらの非ヒトノックアウト動物、該動物に由来するこれらの細胞培養物、細胞株、組織もしくは器官の移植培養物、または組織もしくは細胞の抽出物は、特に、うつ病、不安障害、双極性障害、注意欠陥多動障害、ストレス関連障害、統合失調症などの精神病性障害、パーキンソン病などの神経疾患、アルツハイマー病などの神経変性障害、てんかん、片頭痛、高血圧、摂食障害などの物質乱用および代謝障害、糖尿病、糖尿病性合併症、肥満、異脂肪血症、エネルギー消費および同化の障害、体温恒常性の障害および機能不全、睡眠およびサーカディアンリズムの障害、ならびに心臓血管障害およびカテコールアミン神経伝達物質関連障害などの障害におけるTAAR1機能を評価するためのツールとして使用されてもよい。
【００３９】
さらに、上記のようなこれらの非ヒトノックアウト動物、該動物に由来するこれらの細胞培養物、細胞株、組織もしくは器官の移植培養物、または組織もしくは細胞の抽出物はまた、TAAR1に対して作用する化合物の特異性を決定するためのツールとして使用されてもよい。
【００４０】
加えて、上記のようなこれらの非ヒトノックアウト動物、該動物に由来するこれらの細胞培養物、細胞株、組織もしくは器官の移植培養物、または組織もしくは細胞の抽出物は、TAAR1のこれまでに未知であったリガンドの同定のための、およびTAAR1以外のTAARに作用する新規のリガンドの特徴付けのためのツールとして使用されてもよい。
【００４１】
本発明はさらに、TAAR1特異的効果以外の効果について、TAAR1アゴニスト、TAAR1部分アゴニスト、TAAR1ポジティブもしくはネガティブモジュレーター（例えば、TAAR1エンハンサー）またはTAAR1阻害化合物を試験する方法を提供し、この方法は、TAAR1アゴニスト、TAAR1部分アゴニスト、TAAR1ポジティブもしくはネガティブモジュレーター（例えば、TAAR1エンハンサー）またはTAAR1阻害化合物を、上記のような非ヒトノックアウト動物、あるいは該非ヒトノックアウト動物またはその子孫に由来する初代細胞培養物、または二次細胞細胞株、または組織もしくは器官の移植物またはその培養物、または組織もしくは器官の抽出物に投与する工程、ならびに生理学的（例えば、代謝的）パラメーターだけでなく、神経機能、感覚機能、および認知機能も評価すること、ならびにこれらと野生型対照動物に対する同じ化合物の効果を比較することを含む化合物の効果を決定する工程を含む。これらの神経機能、感覚機能、および認知機能ならびに生理学的パラメーターは、これらの機能およびパラメーターを扱う行動研究および生理学的研究によって決定される。
【００４２】
対照は、TAAR1遺伝子が、活性がより少ないTAAR1タンパク質または活性のないTAAR1タンパク質が発現されるような方法では変異導入されない、または動物、初代細胞培養、または二次細胞株、または組織もしくは器官の移植物またはその培養物、または組織もしくは器官の抽出物が天然型のTAAR1遺伝子を含む、任意の動物、初代細胞培養、二次細胞株、組織もしくは器官の移植物またはその培養物、または組織もしくは器官の抽出物を含んでよい。
【００４３】
さらに、上記のような非ヒトノックアウト動物、または該非ヒト動物またはその子孫に由来する初代細胞培養物、または二次細胞株、または組織もしくは器官の移植物またはその培養物、または組織もしくは器官の抽出物の使用がTAAR1特異的効果以外の効果についての、TAAR1アゴニスト、TAAR1部分アゴニスト、TAAR1ポジティブもしくはネガティブモジュレーター（例えば、TAAR1エンハンサー）またはTAAR1阻害化合物の試験のために提供される。
【００４４】
TAAR1特異的効果以外の効果は、任意の他の分子との相互作用によって生じるTAAR1アゴニスト、TAAR1部分アゴニスト、TAAR1ポジティブもしくはネガティブモジュレーター（例えば、TAAR1エンハンサー）またはTAAR1阻害化合物の任意の副作用であってもよい。
【００４５】
「アゴニスト」という用語は、本明細書で使用されるように、受容体と結合しかつ複合体を形成し、および関与する受容体の性質に対して特異的である十分な薬理学的応答を誘発する化合物を指す。
【００４６】
「部分アゴニスト」という用語は、本明細書で使用されるように、受容体と結合しかつ複合体を形成し、および薬理学的応答を誘発し、これは完全なアゴニストとは異なり、受容体の最大応答に達しない化合物を指す。
【００４７】
「アンタゴニスト」という用語は、本明細書で使用されるように、受容体と結合しかつ複合体を形成し、およびアゴニストまたは部分アゴニストへの受容体の薬理学的応答に対して阻害的に作用する化合物を指す。定義により、アンタゴニストは、この受容体についてのアゴニストまたは部分アゴニストの非存在下で受容体シグナル伝達に対して影響を及ぼさない。
【００４８】
「モジュレーター」という用語は、本明細書で使用されるように、受容体と結合しかつ複合体を形成し、および定量的な様式で、アゴニストまたは部分アゴニストによって引き起こされた受容体の薬理学的応答を変化させる化合物を指す。
【００４９】
本発明はさらに、TAAR1特異的効果以外の効果について、TAAR1アゴニスト、TAAR1部分アゴニスト、TAAR1ポジティブもしくはネガティブモジュレーター（例えば、TAAR1エンハンサー）またはTAAR1阻害化合物を試験するための試験系に関連し、この試験系は、TAAR1遺伝子の一方または両方の対立遺伝子が、活性がより少ないTAAR1タンパク質または活性のないTAAR1タンパク質が発現されるような方法で変異導入および／もしくは切断される、非ヒトノックアウト動物、または該非ヒト動物またはその子孫に由来する初代細胞培養物、または二次細胞株、または組織もしくは器官の移植物またはその培養物、または組織もしくは器官の抽出物、ならびにTAAR1アゴニスト、TAAR1部分アゴニスト、TAAR1ポジティブもしくはネガティブモジュレーター（例えば、TAAR1エンハンサー）またはTAAR1阻害化合物がTAAR1特異的効果以外の効果を示すか否かを決定するための手段を含む。
【００５０】
加えて、本発明は、TAARの細胞内移動またはTAARに結合される他の細胞成分の細胞内移動を研究するための、TAAR1遺伝子の一方または両方の対立遺伝子が、活性がより少ないTAAR1タンパク質または活性のないTAAR1タンパク質が発現されるような方法で変異導入および／もしくは切断される、非ヒトノックアウト動物、または該非ヒト動物またはその子孫に由来する初代細胞培養物、または二次細胞株、または組織もしくは器官の移植物またはその培養物、または組織もしくは器官の抽出物の使用を提供する。
【００５１】
さらに、本発明は、TAAR1遺伝子の一方または両方の対立遺伝子が、TAAR1発現プロファイルを決定するためのレポーター遺伝子によって置換されている非ヒトノックアウト動物の使用を提供する。この発現プロファイルは、レポーター遺伝子が、野生型動物におけるTAAR1と同じ、TAAR1ノックアウトにおける空間時間的なプロファイルで発現されるので、容易に解析することができる。
【００５２】
本発明は、本明細書中で実質的に上記で説明されるようなノックアウト動物、方法、組成物、キット、および使用を、とりわけ下記の実施例に関して提供する。
【００５３】
ここで本発明を全般的に記載してきたが、他に特定されない限り、例示のみの目的のために含まれかつ限定であることは意図されない特定の実施例を、添付の図面と一緒に参照することによって、より良好に理解される。
【実施例】
【００５４】
本実施例において参照される市販の試薬は、他に示されない限り、製造元の説明書に従って使用した。
【００５５】
実施例1：
1）合成NLS-lacZコード配列による、TAAR1コード配列の遺伝子置換のためのストラテジー
マウス胚性幹細胞（ES細胞）中のTAAR1を標的とするために、遺伝子標的化ベクターを構築しかつ使用して、TAAR1の欠損を有するC57BL/6マウスを作製した。この遺伝子標的化ベクターは、コード配列の下流の約1.5kbのゲノム配列だけでなくTAAR1コード領域も、合成NLS-lacZ-PGK-Neoカセットで完全に置換している。
【００５６】
これは置換型の遺伝子標的化ベクターであり、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（PGK）の制御下で発現されるネオマイシン-ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Neo）を使用する、相同組換えされたES細胞のポジティブ選択を可能にする（Galceran J, Miyashita-Lin E.M., Devaney E, Rubenstein J.L.R., Grosschedl R., Development 127 (2000): 469-482）。ゲノムにランダムに組み込まれた標的化ベクターを保有するESクローンに対してネガティブ選択を可能にするために、ジフテリア毒素遺伝子を、TAAR1ゲノム配列の外側のベクターに挿入した（Gabernet L., Pauly-Evers M., Schwerdel C., Lentz M., Bluethmann H., Vogt K., Alberati D., Mohler H., Boison D. Neurosci Lett. 373 (2005): 79-84において記載）。
【００５７】
同時に、lacZレポーター遺伝子（Galceran J, Miyashita-Lin E.M., Devaney E, Rubenstein J.L.R., Grosschedl R., Development 127 (2000): 469-482）を、核シグナル配列（NLS）に融合させ、推定されるTAAR1プロモーターおよび調節エレメントの転写制御下に配置した。これによって、合成レポーターの開始コドンはTAAR1の開始コドンと同一である。このことは、lacZ遺伝子の産物についての組織化学的染色における内因性TAAR1制御領域によって与えられる発現パターンの感度のよい解析を可能にする。
【００５８】
2）ES細胞中での相同組換えによるTAAR1遺伝子へのNLS-lacZコード配列の標的化のためのプラスミドのクローニング
2.1）TAAR1遺伝子標的化ベクターの構築
得られる標的化ベクターは、ゲノム5'アーム（5'アーム）、NLS-lacZレポーター遺伝子、PGK-Neo耐性カセットおよび3'ゲノムアームからなる。ジフテリア毒素カセット（Dipht.）は標的化ベクターの3'側に配置されている（図1を参照されたい）。
【００５９】
オリゴヌクレオチドを、マウスTAAR1遺伝子座の公開されたゲノム配列（マウスゲノム配列データベース、NCBIドラフト34、2005年5月）に基づいて設計し、商業的な供給業者（Microsynth AG, Balgach, Switzerland）から入手した。すべての分子クローニング技術は、本質的には、Sambrookら（Molecular Cloning: A laboratory manual. 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor.）ならびにキットおよび酵素の供給業者の説明書に従って実行した。
【００６０】
標的化ベクターpSKDT-Tar1-NLS-lacZ-PGK-Neoは、マウスTAAR1コード配列の5'の4.0kbゲノム配列およびマウスTAAR1コード配列の3'の1.7kbゲノム配列を含む（図1）。
【００６１】
これらの配列は、プルーフリーディングPCRを使用してゲノムC57BL/6 DNAから増幅し、クローニングベクターにクローニングした。
【００６２】
5'アームをクローニングするために、オリゴヌクレオチドmTar1-5'-KpnI-16cおよびオリゴヌクレオチドmTar1-755-ncを以下のPCR反応において使用した。
【００６３】
全量100μl中の、2ng/μgゲノムC57BL/6 DNA、200μM dNTP（PCRヌクレオチドミックス、Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）、0,5μMの各オリゴヌクレオチド、1×PCR緩衝液（Promega, Madison, WI, USA）、0,06U/μl Pfuポリメラーゼ（Promega, Madison, WI, USA）を、以下のプロトコールを用いてインキュベートした：PCRサーモサイクラーMJ Research PTC-200（MJ Research Inc., Watertown, USA）における95℃2分間、35×（95℃45秒間、59℃45秒間、72℃9分間）、72℃7分間、∞4℃。得られる4,702kbのPCR産物はTAAR1遺伝子座の5'アームを含んでおり、pPCR-Script Amp SK+（Invitrogen-Gibco, Carlsbad, CA, USA）のSrfI部位にクローニングした。
【００６４】
方向および配列の一部を、BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencingキット（Applied Biosystems）およびABIPrism 310 Genetic Analyzerを使用して配列決定することによって確認した。
【００６５】
得られたベクターはpPCR-Script-5'Tar1である。
【００６６】
3'アームをクローニングするために、オリゴヌクレオチドmTar1-33cおよびオリゴヌクレオチドmTar1-SmaI-11ncを以下のPCR反応において使用した。
【００６７】
全量100μl中の、2ng/μgゲノムC57BL/6 DNA、200μM dNTP（PCRヌクレオチドミックス、Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）、0,5μMの各オリゴヌクレオチド、1×PCR緩衝液（Promega, Madison, WI, USA）、0,06U/μl Pfuポリメラーゼ（Promega, Madison, WI, USA）を、以下のプロトコールを用いてインキュベートした：PCRサーモサイクラーMJ Research PTC-200（MJ Research Inc., Watertown, USA）における95℃2分間、35×（95℃45秒間、60℃45秒間、72℃4分間）、72℃7分間、∞4℃。
【００６８】
得られる1651kbのPCR産物を、pPCR-Script Amp SK+（Invitrogen-Gibco, Carlsbad, CA, USA）のSrfI部位にクローニングした。
【００６９】
方向および配列の一部を、BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencingキット（Applied Biosystems）およびABIPrism 310 Genetic Analyzerを使用して配列決定することによって確認した。
【００７０】
得られたベクターはpPCR-Script-3'Tar1である。
【００７１】
標的化ベクターを3段階で構築した。
【００７２】
段階1：
上記のようにクローニングした3'ゲノムアームおよび5'ゲノムアームを、Gabernetら（Enhancement of NMDA receptor function by reduction of glycine transporter-1 expression. Neurosci Lett. 373 (2005): 79-84）において記載されるように、ジフテリア毒素カセットを含むプラスミドバックボーンpSK（Stratagene, La Jolla, CA, USA）に組み立てられた。この目的のために、3'ゲノムアームを、ClaIおよびNotIを用いる制限酵素消化によってプラスミドpPCR-Script-3'Tar1から取り出し、得られる1.7kbゲノムフラグメントを、アガロースゲル電気泳動およびゲル抽出によって精製した。その後、この1.7kbゲノムDNAフラグメントを、事前にClaIおよびNotIで消化したプラスミドpSKにライゲーションした。得られるプラスミドをpSKDT-3'Tar1と称した。
【００７３】
引き続いて、上記のようにクローニングした5'ゲノムアームを、NsiIおよびKpnIを用いる制限酵素消化、ならびにその後のアガロースゲル電気泳動およびゲル抽出によって、プラスミドpPCR-Script-5'Tar1から取り出した。次に、4kbゲノムDNAフラグメントを、事前にNsiIおよびKpnIで消化したプラスミドpSKDT-3'Tar1にライゲーションし、プラスミドpSKDT-5'-3'Tar1を得た。
【００７４】
段階2：
いくつかの制限酵素部位（図2を参照されたい）ならびにNLS配列を有する合成配列を、プラスミドpSKDT-5'-3'Tar1に挿入した。この目的のために、5'リン酸化オリゴヌクレオチドmTar1-29cAおよびmTar1-29cBをアニーリングした。プラスミドpSKDT-5'-3'Tar1をNsiIで消化し、アニーリングしたオリゴヌクレオチドをこのプラスミドにライゲーションして、プラスミドpSKDT-5'-3'Tar1-NLSを得た。
【００７５】
段階3：
NLS-lacZ-PGK-Neoカセットを、プラスミドpSKDT-5'-3'Tar1-NLSに挿入した。この目的のために、プラスミドpSKDT-5'-3'Tar1-NLSを、StuI制限酵素消化により線状化した。NLS-lacZ-PGK-Neoカセットを、SmaI制限酵素消化ならびにその後のアガロースゲル電気泳動およびゲル抽出を用いて、プラスミドC8βgal（Galceran J, Miyashita-Lin E.M., Devaney E, Rubenstein J.L.R., Grosschedl R. Hippocampus development and generation of dendate gyrus granule cells is regulated by LEF1. Development 127 (2000): 469-482）から単離した。NLS-lacZ-PGK-NeoカセットDNAフラグメントを、StuIで線状化したプラスミドpSKDT-5'-3'Tar1-NLSにライゲーションし、標的化ベクターpSKDT-Tar1-NLS-lacZ-PGK-Neoを得た。
【００７６】
寄託データ：
遺伝子構築物TAAR1-KO（図1Bを参照されたい）を含むプラスミドpSKDT-Tar1-NLS-lacZ-PGK-Neoは、ブダペスト条約に基づき、the Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Germanyに、有効な寄託日2005年8月16日に、アクセッション番号DSM 17504で寄託された。
【００７７】
2.2）相同組換えによるマウスES細胞中でのTAAR1遺伝子の遺伝子標的化
2.2.1）C57BL/6 ES細胞の培養
ES細胞の取り扱いは、本質的には、Joyner（Gene Targeting. 1999, 第2版, 
The Practical Approach Series, Oxford University Press, New York）において記載されるように実行した。C57BL/6 ES細胞（Eurogentec, Seraing, Belgium）を、ネオマイシン耐性遺伝子を発現するマウス株CD1-Tg.neoRから単離された、有糸分裂が不活性化された初代マウス胚性線維芽細胞（MEF）の単層上で増殖させた（Stewart C.L., Schuetze S., Vanek M., Wagner E.F. Expression of retroviral vectors in transgenic mice obtained by embryo infection. EMBO J. 6 (1987): 383-8）。MEFを、（Joyner, AL編：Gene Targeting. A Practical Approach. 2000, Oxford University Press, New York）に記載されるように単離し、γ放射（Cs-137照射源において18sv）によって有糸分裂を不活性化した。
【００７８】
ES細胞を、15% FCS（Inotech/Biological Industries, Beit Haemek, Israel）、100 IU/ml ペニシリン/ストレプトマイシン（Invitrogen-Gibco, Carlsbad, CA, USA）、0.5mM β-メルカプトエタノール（Invitrogen-Gibco, Carlsbad, CA, USA）、非必須アミノ酸MEM（1×、Invitrogen-Gibco, Carlsbad, CA, USA）、2mM グルタミン（Invitrogen-Gibco, Carlsbad, CA, USA）および1000 U/ml白血球阻害因子（Chemicon, Temecula, CA, USA）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（Invitrogen-Gibco, Carlsbad, CA, USA）を含むES培地中で増殖させた。
【００７９】
2.2.2）標的化ベクターのES細胞へのエレクトロポレーション
SacII線状化標的化ベクターpSKDT-Tar1-NLS-lacZ-PGK-Neo（全量30μg）を、137mM NaCl、2.7mM KCl、90mM Na2HPO4、1.5mM KH2PO4、pH 7.4（PBS）を含む緩衝液中の30×106ES細胞に添加し、容量拡張装置を備えたBio-Rad Genepulzer（Bio-Rad, Hercules, CA, USA; 設定：280V、500μF）を用いてエレクトロポレーションを行った。その後、ES細胞をMEF単細胞層上にプレーティングし、350μg/ml G418（ジェネティシン、Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）を補充したES培地中で、ネオマイシン遺伝子の存在について選択した。
【００８０】
トランスフェクトされた細胞から生じた、個別の、ウェルによって分けられたESクローンを、48穴培養ディッシュに移し、10日間増殖させた。細胞の1/3を使用して、MagNAPure LCシステム（Roche Diagnostics, Basel, Switzerland; Laird, P.W., Zijderveld, A., Linders, K., Rudnicki, M.A., Jaenisch, R., Berns, A.: Simplified mammalian DNA isolation procedure. Nucleic Acids Res. 1991; 19 (15): 4293）を用いてゲノムDNAを単離し、PCRを使用して解析した。細胞の残りの2/3は、最終的に、さらなる解析のために、および胚盤胞注入に使用した。
【００８１】
2.2.3）TAAR1の正しい標的化のための、PCRを用いるモノクローナルES細胞のスクリーニング
62個のクローンにおいて、正しい遺伝子標的化現象を、標的化ベクターに含まれるゲノムDNAと、周囲のゲノム配列との間の変わり目をまたがっているDNAフラグメントのPCR増幅によって評価した。
【００８２】
3'アームにおける正しい組換えについて試験するために、PCRクローンを、オリゴヌクレオチドIL4-neoおよびmTar26ncを使用するPCRを用いて、以下のプロトコールでスクリーニングした。
【００８３】
20〜100ngのゲノムDNA、1×濃縮PCR緩衝液3（Expand High Fidelity PCR System; Roche Diagnostics, Mannheim, Germanyの一部）、500μMの各dNTP（PCR Nucleotide Mix, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）、500nMの各オリゴヌクレオチド（Microsynth AG）および3.75U/反応のExpand High Fidelity Enzyme Mix（Expand High Fidelity PCR System; Roche Diagnosticsの一部）。PCR反応を以下の温度プロトコールを用いて実行した。
94℃2分間、33×（94℃15秒間、62℃30秒間、68℃3,5分間）、68℃20分間、∞12℃。
【００８４】
このPCRは、ESクローンのゲノムDNAの存在下でのみPCR産物を生じており、このゲノムDNAにおいて、図1に示すように、標的化ベクターの3'アームと染色体DNAとの間の正しい相同組換え現象が起こっていた。陰性対照として野生型DNA（図3、レーン6）ならびに相同組換えが起こっていないいくつかのESクローン（図3、レーン3〜5）を解析に含めた。
【００８５】
重要なことに、クローンIIB1は、予測された3.2kbのサイズで増幅を示す（図3、レーン2）。
【００８６】
5'アームにおける正しい組換えについて試験するために、PCRクローンを、オリゴヌクレオチドIL4-revおよびmTar24cを使用するPCRを用いて、以下のプロトコールでスクリーニングした。
【００８７】
20〜100ngのゲノムDNA、1×濃縮PCR緩衝液3（Expand High Fidelity PCR System; Roche Diagnostics, Mannheim, Germanyの一部）、500μMの各dNTP（PCR Nucleotide Mix, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）、500μMの各オリゴヌクレオチド（Microsynth AG）および3.75U/反応のExpand High Fidelity Enzyme Mix（Expand High Fidelity PCR System; Roche Diagnosticsの一部）。PCR反応を以下の温度プロトコールを用いて実行した。
94℃2分間、33×（94℃15秒間、64℃30秒間、68℃12分間）、68℃20分間、∞12℃。
【００８８】
このPCRは、ESクローンのゲノムDNAの存在下でのみPCR産物を生じており、このゲノムDNAにおいて、図1に示すように、標的化ベクターの5'アームと染色体DNAとの間で正しい相同組換え現象が起こっていた。陰性対照として野生型DNA（図4、レーン6）ならびに相同組換えが起こっていないいくつかのESクローン（図4、レーン3〜5）を解析に含めた。
【００８９】
クローンIIB1のゲノムDNAを用いて実行した上記のPCRは、予測された9.8kbのサイズで増幅を示す（図4、レーン2、矢印）。
【００９０】
クローンIIB1を、第3章において記載する胚盤胞への注入のために選択した。
【００９１】
以下のオリゴヌクレオチド（すべての配列は5'→3'方向である）を使用した。
2007068537.tif 000002
【００９２】
3）変異体ES細胞株からのTAAR1-NLSlacZノックインマウス株の作製
すべての動物の取り扱いは、動物研究に対するスイス連邦および州の法律に従って実行し、および変異体マウス株の取り扱いは、2004年8月23日のTierversuchgenehmigung番号2055で、Kantonale Veterinaramt of Basel CItyから特別に認可された。
【００９３】
すべての細胞において1)章に記載したようなTAAR1遺伝子の遺伝性の標的化された変異を有する変異体マウスを、Hoganら（Manipulating the mouse embryo. 1994, 第2版, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor.）において本質的には記載されているような標準的な手法に従って、Polygene AG（Rumlang, Switzerland）によって作製した。キメラ動物の作製のために、モノクローナル変異体ES細胞を（第2章において記載されるようなクローンIIB1）、胚性3.5〜4.5日（E3.5〜4.5）Balb/c胚盤胞に注入し、偽妊娠C57BL/6×CBA1 F1雌に移植した。これらの雌から生まれた子孫を、キメラ現象の程度について判断した（すなわち、キメラ動物へのES細胞の全体的な寄与の程度）。利用した繁殖代表例は、キメラ現象の程度を反映する毛皮中の黒色の毛のパーセンテージを用いて、キメラ現象の程度を見積もるためのパラメーターとして毛色を使用することを可能とした。
【００９４】
雄性の高いパーセンテージのキメラを、C57BL/6雌と自然に交尾させ、純粋に黒色の毛色を有するすべての子孫を、TAAR1NLSlacZ対立遺伝子の存在について解析した。この目的のために、ゲノムDNAを、核酸精製のためのMagNAPure LCシステム（Roche Applied Science, Rotkreuz, Switzerland）を用いて、製造業者の説明書に従って成体動物の尾生検から単離し、PCRによって、TAAR1野生型対立遺伝子（TAAR1+；破壊されていないTAAR遺伝子の存在を示す）ならびにネオマイシンホスホトランスフェラーゼコード配列（TAAR1NLSlacZ対立遺伝子の存在を示す）の存在について解析した。
【００９５】
PCR反応を、GenAmp 9700サーモサイクラー（Applied Biosystems, Rotkreuz, Switzerland）で、以下のように構成される（最終濃度/量）反応あたり50μlの全量中で実行した。
【００９６】
20〜100ngのゲノムDNA、20mM Tris-HCl（pH 8.4）、50mM KCl、1.5mM MgCl2、200nMの各オリゴヌクレオチド（Microsynth AG, Balgach, Switzerland）、200mMの各dNTP（Amersham）、5U/反応の組換えTaq DNAポリメラーゼ（Invitrogen）。標的化されたかまたは破壊されていないTAAR1対立遺伝子を、以下のオリゴヌクレオチドによる同じPCR反応において同時に検出した。
2007068537.tif 000003
【００９７】
PCR反応を、以下の温度プロファイルに従って実行した：95℃2分間、35×（95℃30秒間、57℃30秒間、72℃1分間）、72℃5分間、∞4℃。PCR産物を、Sambrookら（Molecular Cloning: A laboratory manual. 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor.）に記載されるように標準的なアガロースゲル電気泳動によって解析し、予測されるDNAフラグメントサイズは、破壊されていないTAAR1対立遺伝子について755bp、TAAR1NLSlacZ対立遺伝子について280bpであった。
【００９８】
4）TAAR1-NLSlacZノックアウトの特徴付け
4.1）TAAR1-NLSlacZノックアウトマウス株において遺伝されたTAAR1-NLSlacZ遺伝子置換の解析
TAAR1NLSlacZ対立遺伝子が2において記載されたように設計した変異型遺伝子と同等であることを証明するために、標的化された遺伝子座を、F2世代のホモ接合性変異体に由来するゲノムDNAに基づいて解析した。正しい遺伝子標的化現象を、標的化ベクターに含まれたゲノムDNAと周囲のゲノム配列との間の変わり目をまたがっているDNAフラグメントのPCR増幅およびDNA配列決定解析によって確認した（図7を参照されたい）。
【００９９】
DNAフラグメント1〜4（図7を参照されたい）を、鋳型としてのゲノムDNAからPCRによって増幅した。ゲノムDNAは、核酸精製のためのMagNAPure LCシステム（Roche Diagnostics, Basel, Switzerland）を用いて、2つのTAAR1+対立遺伝子（遺伝子型：TAAR1+/+）または2つのTAAR1NLSlacZ対立遺伝子（遺伝子型：TAAR1NLSlacZ/NLSlacZ）をいずれかを保有する成体動物の尾生検から抽出した。PCR反応を、GenAmp 9700サーモサイクラー（Applied Biosystems, Rotkreuz, Switzerland）で、以下のように構成される（最終濃度/量）反応あたり50μlの全量中で実行した。
【０１００】
20〜100ngのゲノムDNA、1×濃縮PCR緩衝液3（Expand High Fidelity PCR System; Roche Diagnostics, Mannheim, Germanyの一部）、500μMの各dNTP（Amersham）、300nMの各オリゴヌクレオチド（Microsynth AG）および3.75U/反応のExpand High Fidelity Enzyme Mix（Expand High Fidelity PCR System; Roche Diagnosticsの一部）。PCR反応を、表1に要約されるようなゲノムDNA鋳型、オリゴヌクレオチドおよびPCRプロトコールの組み合わせを使用して実行した。
【０１０１】
PCR反応は、以下の温度プロトコールの1つを用いて実行した。
プロトコール5.1.1：
94℃2分間、35×（94℃15秒間、62℃30秒間、68℃10分間）、68℃20分間、∞4℃。
プロトコール5.1.2：
94℃2分間、35×（94℃15秒間、63℃30秒間、68℃10分間）、68℃20分間、∞4℃。
プロトコール5.1.3：
94℃2分間、35×（94℃15秒間、62℃30秒間、68℃3.5分間）、68℃20分間、∞4℃。
【０１０２】
PCR産物を、Sambrookら（Molecular Cloning: A laboratory manual. 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor.）に記載されるように標準的なアガロースゲル電気泳動によって解析した。サイズおよび部分配列は、予測されたDNAフラグメントサイズの同一性を証明し、かつ標的化ベクターのTAAR1遺伝子座との相同組換えが、標的化ベクターの5'ならびに3'のゲノムアームについて正しい様式で起こったという証拠を示している。配列表1〜9に要約されるDNA配列決定の結果は、さらに、相同組換えが、ベクター構築物もしくはその一部のタンデム反復の染色体組み込み、または標的化ベクターに含まれるNLSlacZコード配列の喪失などの望ましくない副次的な現象を伴うことなく起こったことを証明する。加えて、DNAフラグメント1〜3（配列表1、4および5）のDNA配列解析は、NLSlacZコード配列が、TAAR1遺伝子座に標的化され、その結果、NLSlacZオープンリーディングフレームはTAAR1遺伝子の内因性開始コドンで開始すること、ならびにTAAR1+対立遺伝子からのTAAR1遺伝子の転写調節に関与する推定のプロモーターおよび他のエレメントを含む周囲のゲノム配列構造がTAAR1NLSlacZ対立遺伝子に保存されていることを実証する。結果的に、NLSlacZ転写物は、TAAR1NLSlacZ対立遺伝子から、TAAR1+対立遺伝子からのTAAR1転写物と同じ空間時間的なプロファイルで発現され、および変異型対立遺伝子を保有する動物中でのNLSlacZ発現は、野生型動物におけるTAAR1の内因性発現プロファイルを反映すると考えられる。TAAR1発現を解析するためのツールとしてのTAAR1NLSlacZ対立遺伝子からのNLSlacZ発現の使用についての例は以下に提供される。
【０１０３】
DNA配列解析のために、DNAフラグメント1〜4を、上記のように、PCRによってゲノムDNAから増幅し、アガロースゲル電気泳動に供した。予測サイズのPCR産物を、滅菌メス（Bayha, Tuttlingen, Germany）を用いてゲルから切断し、製造業者の説明書に従って、QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN AG, Basel, Switzerland）を使用してアガロースゲルスライスから抽出した。抽出したPCR産物を、冷エタノール/酢酸ナトリウムDNA沈殿により所定の濃度に調整し（Sambrook, J., Fritsch, E.F., およびManiatis, T.: Molecular Cloning: A laboratory manual. 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor.）、続いて必要量の10mM Tris/HCl pH 7.5中にDNA沈殿物を溶解した。PCR産物のDNA配列解析を、Microsynth AGにおいて、BigDyeケミストリーおよび3730キャピラリーDNA解析装置（Applied Biosystems）において実行し、ならびに個々の配列解析反応に使用したオリゴヌクレオチド、加えて、配列解析の結果を配列表1〜9に要約する（下記を参照されたい）。配列表は配列解析の結果の一部に限られており、これはクロマトグラムに基づいて信頼性があると判断された。
【０１０４】
（表１）TAAR1+/+マウスおよびTAAR1NLSlacZ/NLSlacZマウスの尾生検に由来するゲノムDNAからのDNAフラグメント1〜4（図7を参照されたい）のPCR増幅
2007068537.tif 000004
DNAフラグメントの部分DNA配列解析の結果によって支持されるPCR産物の得られたパターンにより、TAAR1NLSlacZ対立遺伝子におけるTAAR1遺伝子の正しい標的化が確認される。
【０１０５】
配列表1（SEQ. ID NO: 1）：オリゴヌクレオチドmTAR31c（表1）を用いるDNAフラグメント1（図7/表1）のDNA配列解析の結果
2007068537.tif 000005
【０１０６】
配列表2（SEQ. ID NO: 2）：オリゴヌクレオチドmTAR24c（表1）を用いるDNAフラグメント2（図7/表1）のDNA配列解析の結果
2007068537.tif 000006
【０１０７】
配列表3（SEQ. ID NO: 3）：オリゴヌクレオチドmTAR39c
2007068537.tif 000007
を用いるDNAフラグメント2（図7/表1）のDNA配列解析の結果
2007068537.tif 000008
【０１０８】
配列表4（SEQ. ID NO: 4）：オリゴヌクレオチドmTAR31c（表1）を用いるDNAフラグメント2（図7/表1）のDNA配列解析の結果
2007068537.tif 000009
【０１０９】
配列表5（SEQ. ID NO: 5）：オリゴヌクレオチドmTAR31c（表1）を用いるDNAフラグメント3（図7/表1）のDNA配列解析の結果
2007068537.tif 000010
【０１１０】
配列表6（SEQ. ID NO: 6）：DNAフラグメント3（図7/表1）のDNA配列解析の結果。列挙された配列は、オリゴヌクレオチドmTAR32nc（表1）およびIL4rev
2007068537.tif 000011
を用いるDNAフラグメントの配列解析から組み立てられたコンティグを示す。
2007068537.tif 000012
【０１１１】
配列表7（SEQ. ID NO: 7）：オリゴヌクレオチドPGK1（表1）を用いるDNAフラグメント4（図7/表1）のDNA配列解析の結果
2007068537.tif 000013
【０１１２】
配列表8（SEQ. ID NO: 8）：オリゴヌクレオチドmTAR1D11
2007068537.tif 000014
を用いるDNAフラグメント4（図3/表1）のDNA配列解析の結果
2007068537.tif 000015
【０１１３】
配列表9（SEQ. ID NO: 9）：オリゴヌクレオチドmTAR25nc（表1）を用いるDNAフラグメント4（図7/表1）のDNA配列解析の結果
2007068537.tif 000016
【０１１４】
転写レベルでの成功した遺伝子置換を確認するため、若年のTAAR1+/+マウスまたはTAAR1NLSlacZ/NLSlacZマウスの全脳に由来するcDNAを以下に記載するように調製した。
【０１１５】
RNAを、本質的にはChomczynskiおよびSacchi（Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction, Anal. Biochem. 162 (1987) 156-159.）に従って、組織試料から調製した。手短に述べると、生後11日のマウスの仔を屠殺し、全脳を取り出し、ガラスダンサー（Inotech AG, Dottikon, Switzerland）中で、10×量のTrizol試薬（Invitrogen, Paisley, UK）中でホモジナイズした。総RNAを製造業者の説明書に従って単離した。未処理RNAを10mM Tris/HCl pH 7.0中に溶解し、10mM Tris/HCl pH 7.0中でおよび10mM MgCl2とともに25U/μl DNAseI（Roche Diagnostics, Rotkreuz, Switzerland）で1時間処理した。DNAseIを、Sambrook, J., Fritsch, E.F., およびManiatis, T.: Molecular Cloning: A laboratory manual. 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor.に従って、フェノール/クロロホルム抽出によって除去した。RNAを沈殿させ、10mM Tris/HCl pH 7.0中で1mg/mlの最終濃度まで溶解し、第1鎖合成に使用した。
【０１１６】
cDNA合成のために、SuperscriptII RNAseH-逆転写酵素（Invitrogen, Paisley, UK）を、製造業者の説明書に従って使用した。手短に述べると、4μgの総RNAを、H2O中で1μgオリゴ(dT)12-18（Invitrogen, Paisley, UK）と、全量23μlで混合し、70℃で10分間インキュベートし、かつ氷上で冷却する。以下の成分を氷上で添加した（最終濃度）：50mM Tris/HCl（pH 8.3）、75mM KCl、3mM MgCl2、10mM DTT、0.5mMの各dNTP（Amersham, Otelfingen, Switzerland）、1U/μl RNAse Out RNAse inhibitor（Invitrogen）および10 U/μl逆転写酵素。反応は42℃で1時間インキュベートし、70℃で10分間のインキュベーションによって停止し、かつ10mM Tris/HCl pH 7.0を用いて100μlの全量まで希釈した。
【０１１７】
転写物のPCR増幅を、本質的には4において記載するように実行したが、以下の改変を伴った。PCR反応を、反応毎に以下から構成される（最終濃度/量）50μlの全量中で実行した。1μlのcDNA調製物（全量40ngの全脳総RNAに相当）、20mM Tris-HCl (pH 8.4)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、200nMの各オリゴヌクレオチド（Microsynth AG, Balgach, Switzerland）、200mMの各dNTP（Amersham）、5U/反応の組換えTaq DNAポリメラーゼ（Invitrogen）。個々のmRNA転写物の検出のために、以下のオリゴヌクレオチドおよび温度プロファイルを使用した。
【０１１８】
グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）：
オリゴヌクレオチド：
2007068537.tif 000017
温度プロファイル：
94℃2分間、22×（94℃15秒間、64℃30秒間、72℃1分間）、72℃5分間、∞4℃。
【０１１９】
TAAR1：
オリゴヌクレオチド：
2007068537.tif 000018
温度プロファイル：
94℃2分間、40×（94℃15秒間、53℃30秒間、72℃1分間）、72℃5分間、∞4℃。
【０１２０】
NLSlacZ：
オリゴヌクレオチド：
2007068537.tif 000019
温度プロファイル：
94℃2分間、40×（94℃15秒間、60℃30秒間、72℃1分間）、72℃5分間、∞4℃。
【０１２１】
予想されるように、GAPDH転写物を、TAAR1+/+マウスとTAAR1NLSlacZ/NLSlacZマウスの脳からの両方のcDNA調製物中で検出し、このことは、cDNA調製がそれ自体成功したことを示す。PCR解析は、TAAR1転写物をTAAR1+/+マウス脳cDNAにおいてのみ検出したが、TAAR1NLSlacZ/NLSlacZマウス脳cDNAにおいては検出しなかったのに対して、NLSlacZ転写物は、TAAR1NLSlacZ/NLSlacZマウス脳cDNAにおいてのみ検出されたがTAAR1+/+マウス脳cDNAにおいては検出されなかった。
【０１２２】
これらのデータは、TAAR1NLSlacZ/NLSlacZマウス脳においてはTAAR1発現が存在せず、このことは、TAAR1NLSlacZ/NLSlacZマウス株におけるTAAR1コード配列の欠失と一致している。TAAR1NLSlacZ/NLSlacZマウス脳におけるNLSlacZ mRNA転写物の存在は、内因性TAAR1遺伝子の遺伝子座からのTAAR1NLSlacZ/NLSlacZ変異体におけるNLSlacZの発現のための証拠を示している。図9cから明らかであるTAAR1+/+マウス脳からのNLSlacZ転写物の非存在は、NLSlacZが哺乳動物種では天然には存在せず、かつPCR条件の特異性を支持するという事実と一致している。
【０１２３】
（表２）GAPDH、TAAR1およびNLSlacZ mRNAの転写物の存在についてのTAAR1+/+マウス脳およびTAAR1NLSlacZ/NLSlacZマウス脳に由来するcDNAの解析の結果
2007068537.tif 000020
【０１２４】
4.2）TAAR1-NLSlacZノックインマウス株の遺伝子バックグラウンドの解析
遺伝子改変したマウス株の遺伝子バックグラウンドは、それらの表現型に深刻な影響を与え、例えば、いわゆる混合遺伝子バックグラウンドによって引き起こされるマウス株の個々の動物間の遺伝子バックグラウンドの変動性は、変異型マウス株の意味のあるかつ一貫した表現型の特徴、または例えば、行動薬理学におけるその使用を、困難にし、または不可能にさえする（Gerlai, R., Gene-targeting studies of mammalian behavior: is it the mutation or the background genotype? Trends Neurosci. 19 (1996) 177-181.; Bucan および Abel, The mouse: genetics meets behaviour. Nat. Rev. Genet. 3 (2002) 114-123; Banburry Conference on Genetic Background in Mice (1997): Mutant Mice and Neuroscience: Recommendations Concerning Genetic Background. Neuron 19, 755-759）。歴史的および実用的な理由のために、標的とされるマウス変異体は、種々のSV129同系交配マウス株の1つに由来するES細胞を使用して最も頻繁に作製される（Hogan, B., Beddington, R., Costantini, F., およびLacy, E.: Manipulating the mouse embryo. 1994, 第2版, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor.; Threadgill, D.W., Yee, D., Matin, A., Nadeau, J.H., Magunuson, T., Genealogy of the 129 inbred strains: 129/SvJ is a contaminated inbred strain. Mamm Genome. 8 (1997) 390-393）。神経解剖学、繁殖性、および行動に関連するSV129マウス株の好ましくない特性のために、SV129ES細胞を使用して作製されたマウスは、数年間の作業を必要とする少なくとも10世代の間の所望の遺伝子バックグラウンドのマウスとの戻し交配によって、均質でありかつより好ましい遺伝子バックグラウンドに移される必要がある（Silver, L.M.: Mouse Genetics. 1995, Oxford University Press, New York）。
【０１２５】
適切な繁殖スキームと組み合わせた、C57BL/6マウス由来のES細胞の使用（Kontgen, F., Suss, G., Stewart, C., Steinmetz, M., Bluethmann H., Targeted disruption of the MHC class II Aa gene in C57BL/6 mice. Int Immunol. 5 (1993) 957-964）は、本発明者らが、純粋なC57BL/6遺伝子バックグラウンドにTAAR1NLSlacZ対立遺伝子を保有する変異体マウス株を作製することを可能にした。遺伝子バックグラウンドの均質性は、生殖系列キメラの作製に使用されるES細胞株についてだけでなく、F1世代の5体のヘテロ接合性変異体でのマイクロサテライト解析によっても実験的に確認された。
【０１２６】
この解析のために、ゲノムDNAを、TAAR1NLSlacZ対立遺伝子を有するF1世代の5匹のマウスの尾生検から、ならびに生殖系列キメラの作製に使用されるES細胞の試料から、核酸精製のためのMagNAPure LCシステム（Roche Diagnostics, Basel, Switzerland）を用いて単離した。類遺伝子性のC57BL/6マウス、DBAマウス、およびSV129マウスのゲノムDNAを標準として使用し、PCRによって同時に解析した。類遺伝子性の同系交配マウス株C57BL/6、DBA、およびSV129のゲノムDNAを、Jackson Laboratory（Bar Harbor, Maine, USA）から購入した。
【０１２７】
PCR反応を、GenAmp 9700サーモサイクラー（Applied Biosystems）で、以下（最終濃度/量）のように構成される反応あたり全量20μlで実行した。
【０１２８】
10〜20ngのゲノムDNA、67mM Tris-HCl pH 8.8、16.6mM (NH4)2SO4、0.1mg/ml BSA、2mM MgCl2、200μMの各dNTP（Amersham）、200nMの各オリゴヌクレオチド（Microsynth AG）および1U/反応のTaq DNAポリメラーゼ（Invitrogen）。すべてのマイクロサテライトPCR反応を以下の温度プロファイルを用いて実行した。
94℃2分間、35×（94℃15分間、55℃45秒間、72℃1分間）、72℃5分間、∞4℃。PCR産物を、Elchrom電気泳動ユニット（Elchrom Scientific AG, Cham, Switzerland）を使用して解析した。
【０１２９】
TAAR1NLSlacZ対立遺伝子を含む変異体マウス株の遺伝子バックグラウンドの均質性を確認するために、約2個のマーカーの密度のプロ染色体を使用し、以下のマイクロサテライトを解析に含めた。
2007068537.tif 000021
（オリゴヌクレオチド配列は、Jaxon Lab Mouse Informatics Database; Eppig, J.T.ら、The Mouse Genome Database (MGD): from genes to mice-a community resourse for mouse biology. Nucleic Acids Res. 33, D471-D475 2005に従って選択した）。
【０１３０】
マイクロサテライト解析は、すべての試験したマイクロサテライトについて、TAAR1NLSlacZ対立遺伝子を有する変異型マウス株が野生型C57BL/6マウスと一致することを明らかにし（例えば、図10を参照されたい）、TAAR1NLSlacZ対立遺伝子を有する変異型マウスが純粋なC57BL/6遺伝子バックグラウンドを有し、DBAまたはSV129のいずれかからの可能性のある夾雑を有さないことを確認した。
【０１３１】
4.3）TAAR1発現の組織分布を解析するためのツールとしてのTAAR1-NLSlacZ遺伝子置換の使用についての概念の証明
TAAR1NLSlacZ変異型マウス株を、第1章に記載されるような遺伝子置換ストラテジーを使用して作製した。結果として、組織学的マーカーNLSlacZは、その発現が、野生型動物におけるTAAR1発現の空間時間的な組織分布を反映するように、TAAR1遺伝子座に標的化された。この目的のために、TAAR1NLSlacZ変異型マウス株は、特異的抗体または放射性リガンドなどのTAAR1特異的プローブを作製および確認する必要のない、詳細なTAAR1発現研究を可能にする、強力なツールとなる。
【０１３２】
染色体の遺伝子座からの合成コード配列の発現は、例えば、遺伝子サイレンシング現象によって、または不十分な発現レベルによっておそらく損なわれることが可能であり、これらの両方は、関心対象の実際の変異体に由来する実験データなしでは予測することが困難である。組織学的マーカーとして、TAAR1NLSlacZ変異体マウスにおけるTAAR1遺伝子座に標的化されたNLSlacZコード配列の機能性を証明するために、lacZ染色を、成体TAAR1NLSlacZ/NLSlacZおよびTAAR1+/+のマウス脳の組織切片で実行した。
【０１３３】
成体TAAR1NLSlacZ/NLSlacZマウスおよびTAAR1+/+マウスを、本質的には、Romeis（Mikroskopische Technik. 1989, 17., neubearbeitete Auflage, Urban and Schwarzenberg; Munchen, Wien, Baltimore）に記載されているように、末端イソフルラン麻酔下で経心臓により灌流した。この動物を、連続して、10mlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS; 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 90mM Na2HPO4, 1.5mM KH2PO4, pH 7.4）および15mlの固定液（PBS中の2% w/v パラホルムアルデヒドおよび0.2% w/v グルタルアルデヒド）で灌流した。脳を頭蓋から取り出し、固定液中で4℃で4時間、後固定し、かつ4℃で一晩、PBS中の0.5Mスクロースに浸漬した。脳を、OCT化合物（Medite Medizintechnik, Nunningen, Switzerland）中で、Peel-A-Way組織包埋モールド（Polysciences Inc., Warrington, USA）に包埋させ、液体窒素で凍結させた。脳を、凍結ミクロトーム（Leica Microsystems AG, Glattbrugg, Switzerland）で、矢状面に平行な方向で50μmで切断し、ゼラチンコートしたガラススライド（Fisher Scientific, Wohlen, Switzerland）上にマウントし、融解した。組織切片を室温で2時間風乾し、室温（RT）にてPBS中でそれぞれ10分間、5回洗浄し、および平面振盪機で37℃にて遮光した容器中のlacZ染色溶液（PBS中の1mg/ml 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド、5mM K3Fe(CN)6、5mM K4Fe(CN)6、2mM MgCl2）中で16〜24時間インキュベートした。染色プロセスは、組織切片を、PBS中で各10分間、RTで5回洗浄することによって停止した。組織切片を、濃度上昇する一連のエタノールによって脱水し、キシレンに平衡化し、およびDePex（Serva GmbH, Heidelberg, Germany）でカバースリップをのせた。組織切片を、Axiocam CCDカメラシステム（Carl Zeiss AG）を備えたAxioplan I顕微鏡（Carl Zeiss AG, Feldbach, Switzerland）で解析した。
【０１３４】
組織切片のlacZ染色は、TAAR1NLSlacZ/NLSlacZマウス脳切片における強力かつ特異的な染色を示し、これは、TAAR1+/+マウス脳の相当する領域の組織切片には存在しなかった。この結果により、TAAR1NLSlacZ変異体マウスにおけるTAAR1遺伝子座によるNLSlacZ発現が、マウスにおけるTAAR1発現を解析するための組織学的マーカーとして機能することを確認される（図11）。
【０１３５】
TAAR1遺伝子の標的化された変異のまれな存在によって生じる場合がある、TAAR1NLSlacZ変異体マウス株の自発的行動または感覚能力および生理学的条件における起こりうる欠損を除外するために、ベースライン条件を、3つすべての遺伝子型および両方の性別の3月齢の成体動物において分析した。
【０１３６】
この目的のために、動物の身体的状態を、出生後最初の3ヶ月での体重の増加に関して、直腸温度に関して、および巣作り行動に関して試験した。動物の神経状態を、強硬症、運動失調、震え、流涙、および流涎の起こりうる発生、ならびに新規の環境への動物の移動に応答した覚醒の程度に関して、分析した。動物の機敏さおよび協調性を、握力および自発的水平歩行活動を分析することによって、ならびに、いわゆるロータロッドおよび水平ワイヤ試験（例えば、Crawley, J.N. (2000) What's Wrong With My Mouse? 1. Edition, Wiley & Sons, ISBN 0471316393; Irwin, S. Comprehensive observational assessment: Ia. A systematic, quantitative procedure for assessing the behavioral and physiologic state of the mouse. Psychopharmacologia 13, 222-257, 1968）において試験した。
【０１３７】
いずれのテストおよび試験も遺伝子型の比較において有意な差異を示さず、このことは、疾患モデルにおいてTAAR1の可能性のある役割を細かく調べることに向けた、または薬理学的化合物の特徴付けに向けた、行動モデルにおける変異型マウスの特徴に影響を与えることができる、自発的行動、感覚能力、または生理学的状態において欠損は存在しないことを示す。
【０１３８】
実施例2：
方法
行動の表現型解析
動物を、一定の温度（22±2℃）および湿度（55〜65%）の条件下で維持し、すべてのマウスを研究の期間中個々に収容した。食餌および水は自由に利用可能であった。すべての実験を、明/暗サイクル（光点灯：6a.m.〜6p.m.）の明期の間に実行した。すべての動物実験を、動物保護に対するスイス連邦の規則、およびthe Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC)の規則を厳密に遵守して、地方の獣医学的当局の明確な認可を伴って実行した。
【０１３９】
行動評価
マウスを、標準的な生理学的パラメーター（体温、体重の増加）について、ならびに、握力（g）、水平ワイヤ試験、ロータロッド試験、および歩行活動を含むいくつかの神経学的および行動的試験において評価した。
【０１４０】
体重は、HANNA instruments温度計（Ronchi di Villafranca, Italy）によって、潤滑剤を付けたサーミスタープローブ（2mm直径）を直腸に20mm挿入することによって、最も近い0.1℃まで測定し；マウスを、この測定の間、尾の基部で手で保持し、安定した読み取りが得られるまで、サーミスタープローブをその場所に放置した（〜15秒間）。
【０１４１】
体重（g）を12〜24週の齢のマウスで、種々の時点で体重をチェックした。
【０１４２】
水平ワイヤ試験：
マウスを尾で保持し、最大1分間の間、面から30cm上の高さで水平位置に固定された1.5mm直径の棒を握り、これからぶら下がる必要があった。マウスが落下するまでの時間を測定し、60秒のカットオフ、または3回の試行からの落下までの最大の時間のスコアのいずれかを使用した。
【０１４３】
ロータロッド試験：
この装置は、16rpmまたは32rpmのいずれかの速度で回転する固定速度のロータロッド（Ugo Basile, Biological Research Appratus, Varese, Italy）からなっていた。棒は10cm幅、3cm直径、および作業台から上に25cmである。回転しているロッド上の動きの協調運動不能は、棒からの動物の落下と解釈する。試験の日に、対象は、ロータロッド上に配置され、それらが落下するまでの時間が測定された。すべてのマウスを、16rpmと32rpmの両方で試験し、両方の試験において、120秒のカットオフまたは3回の試行からの落下までの最大の時間を使用した。
【０１４４】
歩行活動
コンピュータ化されたDigiscan 16 Animal Activity Monitoring System（Omnitech Electronics, Colombus, OH）を使用して、自発的歩行活動を定量化した。データは、12時間の明/暗サイクルを有する防音室中に配置した8個のDigiscan活動チャンバーから同時に入手した。すべての試験を、明期（6a.m.〜6p.m.）の間に実行した。各活動モニターは、目に見えない水平方向および垂直方向の赤外線センサービームによって取り囲まれた床に敷かれたおがくずを有するPlexiglasボックス（20×20×30.5cm）からなった。ケージは、ビームの状態の情報を定常的に収集するPCに連結されたDigiscan Analyzerに接続された。このシステムを用いて、水平活動および垂直活動、全体の移動距離（cmで）、および常同性などの異なる行動パラメーターを測定することができた。マウスを、偽ラテン方格設計を介して、週に2回、2回の連続する試験セッションの間に少なくとも10日間の間隔を伴って試験した。媒体（生理食塩水0.9%）またはd-アンフェタミン（0.4mg/kg、1mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、腹腔内）を、試験の直前に、野生型マウス（n=16）およびTAAR1-KOマウス（n=12）に投与した。歩行活動を、マウスをケージに配置した直後に開始して、90分間記録した。
【０１４５】
統計学
行動観察を、平均値SEとして記録し、独立t検定で分析した。歩行活動データ（全体の距離）を、2因子（遺伝子型および用量）ANOVAを用いて、反復した測定を用いて分析した。各遺伝子型における用量効果の比較を、反復測定ANOVAを用いて行い、続いて有意な場合においては対応t検定によって行った。0.05のp値が、統計学的に有意な値であると受け入れられた。
【０１４６】
生体アミンの細胞外レベルの評価
4月齢雄性マウスをこれらの実験に使用した。このレポートに記載された実験に使用される手法は、動物の維持および試験に対する連邦および地方の規則への遵守に基づく、the City of Basel Cantonal Animal Protection Committeeからの事前認可を受けた。
【０１４７】
微小透析プローブの外科手術および移植
麻酔の45分前に、マウスは皮下的に0.075mg/kgのブプレノルフィンを受けた。次いで、マウスをイソフルランで麻酔し、2つの操作アームおよび麻酔マスクを備えた定位装置中に配置した。麻酔を、イソフルラン0.8-1.2%（v/v；支持気体酸素/空気、2:1）で維持した。頭部を剃毛し、皮膚を正中線に沿って切断し、頭蓋を露出させた。頭蓋中に小さな穿孔穴を作製し、線条体中の微小透析プローブ（2mmポリアクリロニトリル透析膜を有する垂直プローブ；Brains On-line, Groningen, The Netherlands）の定位固定的挿入を可能にした（座標：A 0.9mm, L-1.8mm, V-4.6mm）。プローブを、二成分歯科用セメントを使用して、所定の位置に固めた。一旦セメントが硬くなると、創傷を、縫合用の絹糸（Silkam）で閉じ、動物を定位器具からはずし、そのケージに戻した。外科手術の最後および24時間後に、マウスをメロキシカム 1mg/kg皮下投与により処理した。動物の体重を、外科手術の前および翌日に測定して、外科手術からの動物の回復をモニターした。
【０１４８】
微小透析実験
すべての微小透析実験を、覚醒している、自由に動けるマウスで、外科手術の3〜4日後に実行した。実験の日に、移植した透析プローブの注入口を、微小灌流ポンプ（CMA/Microdialysis, Sweden）に接続し、流出口をフラクションコレクターに接続した。次いで、微小透析プローブに、リンガー液（NaCl 147mM、KCl 3mM、CaCl2 1.2mM、MgCl2 1.2mM）を、1.5μl/分の一定の流速で灌流し、透析液を、37.5μlの酢酸0.02Mを含むプラスチックバイアル中で15分アリコートで回収した。4つの透析液の試料を、薬理学的処理の前に回収し、生体アミンおよびそれらの代謝物のベースラインレベルを決定した。次いで、マウスを、2.5mg/kgのアンフェタミンで腹腔内処理し、さらに2.5時間透析試料を回収した。透析試料を、分析まで-80℃に凍結保存した。
【０１４９】
微小透析液の分析
凍結した透析試料を、モノアミンおよびそれらの代謝物のアッセイ法のために、ドライアイス中でBrains On-Lineに送った。ドーパミン、DOPAC、セロトニン、5-HIAAおよびノルアドレナリンの濃度を、van der Vegtら（2003）の手法に従って、電気化学的検出器を備えたHPLCの使用によって測定した。
【０１５０】
生体アミン神経伝達物質レベルのインビボ微小透析評価
ノルエピネフリン、ドーパミン、およびセロトニンの濃度を、HPLC分離および電気化学的検出によって、同じ試料中で決定した。試料を2つのアリコートに分けた。一方はノルエピネフリンおよびドーパミンの同時分析に使用し、他方はセロトニンの分析に使用した。
【０１５１】
ノルエピネフリンおよびドーパミン
アリコート（20μl）を、シリンジポンプ（Gilson, モデル402）、マルチカラムインジェクター（Gilson, モデル233XL）、および温度調節器（Gilson, モデル832）からなる、冷却されたマイクロサンプラーシステムによってHPLCカラムに注入した。クロマトグラフィーによる分離を、逆相150×2.1mm（3μm）C18 Thermo BDS Hypersilカラム（Keystone Scientific）で実行した。移動相（均一濃度）は、2.5% v/vメタノール、150mg/L Titriplex（EDTA）、150mg/L 1-オクタンスルホン酸、および150mg/L テトラメチルアンモニウムクロライドを有する酢酸ナトリウム緩衝液（4.1g/L Na酢酸）（氷酢酸でpH=4.1に調整）からなった。移動相を、HPLCポンプ（Shimadzu, モデルLC-10AD vp）によって、0.35mL/分の流速でシステムに流した。
【０１５２】
ノルエピネフリンおよびドーパミンを、+500mV vs. Ag/AgClに設定したガラス状炭素電極（Antec Leyden）に適合させたポテンシオスタット（Antec Leyden, モデルIntro）を使用して電気化学的に検出した。データを、クロマトグラフィーデータシステム（Shimadzu, クラス-vp）ソフトウェアによって分析した。モノアミンの濃度を、外部標準法によって定量化した。
【０１５３】
セロトニン
アリコート（20μl）を、ノルエピネフリンおよびドーパミンについて記載されたものと同様にHPLCカラムに注入した。クロマトグラフィーによる分離を、逆相100×2mm（3μm）C18 ODS Hypersilカラム（Phenomenex）で実行した。移動相（均一濃度）は、4.5% v/vメタノール、500mg/L Titriplex（EDTA）、50mg/L 1-ヘプタンスルホン酸、および30μL/L テトラエチルアンモニウムクロライドを有する酢酸ナトリウム緩衝液（4.1g/L Na酢酸）（氷酢酸でpH=4.74に調整）からなった。移動相を、HPLCポンプ（Shimadzu, モデルLC-10AD vp）によって、0.4mL/分の流速でシステムに流した。セロトニンを、ノルエピネフリンおよびドーパミンについて記載されたものと同じ方法を使用して、電気化学的に検出した。
【０１５４】
腹側被蓋部（VTA）における切片の電気生理学
中脳の水平切片（250μm厚、VT1000ビブラトーム、Leica）を、25〜60日齢のTAAR1ノックアウトマウスおよび同腹仔野生型マウスから調製した。切片を、119 NaCl, 2.5 KCl, 1.3 MgCl2, 2.5 CaCl2, 1.0 NaH2PO4, 26.2 NaHCO3および11 グルコースをmMで含む人工の脳脊髄液（ACSF）中で冷却した。切片を、95% O2および5% CO2で連続的に通気し、1時間後に、32〜34℃にてACSFを灌流した（1.5ml/分）記録チャンバーに移した。VTAを、副視索の中央末端核に対して中心である領域として定義した。可視化された全細胞電流クランプ記録技術を使用して、自発的興奮速度およびニューロンの保持電流を測定した。統計学的解析に使用したすべての細胞は、30分より長い安定な興奮活動を示した。ドーパミン作動性ニューロンを、大きなIh電流によって同定した。内部溶液はmMで以下を含んだ。140 グルコン酸カリウム、4 NaCl、2 MgCl2、1.1 EGTA、5 HEPES、2 Na2ATP、5 クレアチンリン酸ナトリウム、および0.6 Na2GTP; pHをKOHで7.3に調整した。データを、Axopatch 200B（Axon Instruments, Union City, CA, USA）を用いて入手し、2kHzでフィルターにかけ、10kHzでデジタル化し、pClamp9（Axon Instruments, Union City, CA, USA）を用いて取得および解析した。値を平均±semで表されている。統計学的な比較のために、本発明者らは、Kolmogorov-Smirnov検定を使用した。有意さのレベルはP=0.05に設定した。
【０１５５】
結果
TAAR1LacZ/LacZマウスの身体的および行動的特性
TAAR1LacZ/LacZマウス株の全般的健康、身体的状態、および感覚機能を、遺伝的に改変したマウスの行動的な表現型解析に使用される標準的手法の改変バージョンに従って試験した（Irwin, S. Comprehensive observational assessment: Ia. A systematic, quantitative procedure for assessing the behavioral and physiologic state of the mouse. Psychopharmacologia 13, 222-257 (1968); Hatcher, J.P.ら、Development of SHIRPA to characterise the phenotype of gene-targeted mice. Behav. Brain Res. 125, 43-47 (2001)）。TAAR1+/LacZマウスおよびTAAR1LacZ/LacZマウスの、それらの野生型同胞との比較は、それらの全般的健康状態、それらの生存度、繁殖性、寿命、巣作り行動（図12a）、体重（図12b）、ならびにそれらの体温（図12c）に関して、いかなる有意な差異も示さなかった。全般的運動機能および行動に関しては、機敏さおよび運動協調性（図12d〜f）ならびに自発的歩行活動（図12g）を分析すると、遺伝子型の間では有意な差異は観察されなかった。
【０１５６】
TAAR1LacZ/LacZマウスは精神刺激薬に対して感受性の上昇を示す
最近の観察は、微量アミンの薬理学的効果の少なくとも一部が、カテコールアミン神経伝達の調節に起因することを示す（Berry, M.D. Mammalian central nervous system trace amines. Pharmacologic amphetamins, physiologic neuromodulators. J. Neurochem. 90, 275-271 (2004); Geracitano, R., Federici, M., Prisco, S., Bernardi, G. および Mercuri N.B. Inhibitory effects of trace amines on rat midbrain dopaminergic neuron. Neuropharmacol. 46, 807-814 (2004)）。加えて、TAAR1は、顕著なドーパミン作動性およびセロトニン作動性の神経伝達を伴って、脳の領域に局在化されることが見い出されてきた（Borowsky,B.ら、Trace amines: identification of a family of mammalian G protein-coupled receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 8966-8971 (2001)）。アンフェタミンは、細胞質ゾルのドーパミンおよびノルエピネフリンの放出を誘導することによって、それらの薬理学的効果を得る間接的なカテコールアミンアゴニストとして作用することが公知である（King, G.R. および Ellinwood, E.H. Amphetamines and other stimulants. In Lowinson, J.H., Ruiz, P., Milman, R.B. および Langrod, J.G., 編. Sustance abuse: a comprehensive textbook, Williams および Wilkins., Baltimore, 1992）。これらの神経伝達物質の増加した細胞内レベルは、次には、過剰な歩行活動を生じる。それゆえに、歩行運動機能に対するd-アンフェタミン（2.5mg/kg腹腔内）の効果を、TAAR1LacZ/LacZマウスとTAAR1+/+マウスとの間で比較した。d-アンフェタミン注入後に、移動した全体の距離に関して、野生型マウスにおいて歩行活動が減少したのに対して、TAAR1LacZ/LacZマウスは最初に活動的であり、次いで、野生型同腹仔よりも有意に多く動いた（図12g）。同様の結果は、水平活動および常同性の観察時に見られた（結果示さず）。アンフェタミン適用前の基本歩行活動は、両方の遺伝子型の間で同等であった（図12g）。
【０１５７】
行動の変化を、微小透析研究においてさらに調べた。線条体におけるカテコールアミンの細胞外レベルに対するd-アンフェタミンの効果は、野生型マウスと比較して、TAAR1LacZ/LacZにおけるドーパミンおよびノルエピネフリンのレベルの2.3倍の増加を示した（図13aおよび13c）。ドーパミン（TAAR1+/+およびTAAR1LacZ/LacZにおいて、それぞれ、2.23+/-0.65□Mおよび2.27+/-0.68μM）およびノルエピネフリン（TAAR1+/+マウスおよびTAAR1LacZ/LacZマウスにおいて、それぞれ、0.30+/-0.12μMおよび0.38+/-0.18μM）の基本レベルにおいて有意な差異は見られなった。TAAR1LacZ/LacZマウスにおいて、ドーパミンおよびノルエピネフリンのレベルは、それぞれ11倍および4.9倍増加した。ドーパミン代謝物DOPACの基本レベルにおける有意な変化はTAAR1LacZ/LacZマウスにおいて観察されなかったのに対して（基本レベル：148+/-36μM）、DOPACレベルは野生型対照に対して、d-アンフェタミン投与の45分後に有意に減少し、TAAR1LacZ/LacZマウスにおいては135分後に基本レベルまで戻った（図13b；基本レベル：132+/-44μM）。セロトニンレベルは、野生型動物においてはd-アンフェタミン適用後に変化しないままであったが（基礎レベル：0.35μM）、TAAR1LacZ/LacZマウスにおいては2.5倍増加した。5-HT代謝物である5-HIAAのレベルの有意な変化は、両方の遺伝子型において見られなかった（基礎レベル：TAAR1+/+において124+/-19μMおよびTAAR1LacZ/LacZにおいて119+/-18μM）。
【０１５８】
TAAR1活性はVTAにおけるドーパミン作動性ニューロンの自発的興奮速度を減少させる
VTAにおけるドーパミン作動性ニューロンの自発的興奮速度を、電流クランプ条件下で決定した。TAAR1+/+（n=22）およびTAAR1LacZ/LacZ（n=25）における平均スパイク頻度は、それぞれ2.3±0.8Hzおよび17.2±1.2Hz（p<0.0001、図14a）であり、従って、TAAR1LacZ/LacZニューロンにおける有意に増加した興奮速度を示す。このデータは、野生型マウスにおいて、TAAR1は、内因性リガンドの周囲濃度によって持続的に活性化されることを示唆する。本発明者らはさらに、TAAR1LacZ/LacZマウスにおける休止膜電位（-33.53±0.55mV、n=26）が、野生型マウス（-47.82±0.66mV、n=22）と比較して脱分極したことを観察した。この脱分極した休止膜ポテンシャルは、ある程度まで増加した興奮速度の根底にある可能性があるが、代替的には、増加した興奮速度の結果でもあり得る。本発明者らは、次に、p-チラミンの適用が野生型マウスのVTAにおいてドーパミン作動性ニューロンの自発的興奮速度を減少するか否かを試験した。p-チラミン（10μM）の浴適用は、TAAR+/+におけるスパイク頻度の有意な減少を引き起こしたが（対照：F=2.1±0.3Hz、p-チラミン：F=0.63±0.04Hz、n=19、p<0.0001）、TAAR1LacZ/LacZマウスにおいてはそうではなかった（対照：F=16.73±1.15Hz、p-チラミン：F=16.57±1.35Hz、n=15、p>0.05；図14b）。このことは、TAAR1活性がVTAにおけるドーパミン作動性ニューロンの自発的興奮を阻害可能であることを直接的に示す。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１Ａ】制限酵素部位の選択を伴う、TAAR1野生型対立遺伝子TAAR+/+対立遺伝子（上）の模式図を示す図である。矢印は、ゲノムDNAからの標的化ベクター（下）の5'アームおよび3'アームのPCR増幅に使用したオリゴヌクレオチドを示す。標的化ベクターに含まれた野生型遺伝子座のゲノム配列エレメントは破線によって示す。標的化ベクターにこれらのゲノムアームをクローニングするために使用するNsiI部位に太字で印を付す。得られた標的化ベクターpSKDT-Tar1-NLS-lacZ-PGK-Neo（下）は、ゲノム5'アーム（5'アーム）、NLS-lacZレポーター遺伝子、PGK-Neo耐性遺伝子および3'ゲノムアーム（3'アーム）からなる遺伝子構築物を含む。ジフテリア毒素遺伝子（Dipht.）は構築物の3'側に配置されている。
【図１Ｂ】TAAR1-KO構築物の模式図を示す図である。
【図２】lacZレポーター遺伝子の合成N末端NLS-シグナルを示す。NsiI部位に挿入されたオリゴヌクレオチドmTar1-29cA（下線を付した5'-3'鎖）およびmTar1-30ncB（下線を付した3'-5'鎖）および得られるアミノ酸のNLS（PKKKRKV）配列の一文字アミノ酸コードを示す図である。mTAAR1の開始コドン（ATG）を太字で示す。lacZ-PGK-Neoカセットを挿入するために使用したStuI部位を図に示す。
【図３】NLSlaZ構築物の3'アームにおける正しい標的化を有するクローンを同定するためのPCRを示す図である。ES細胞クローンに対するオリゴヌクレオチドIL4-neoおよびmTar26ncを用いるPCR反応の0.8%アガロースゲルを示す。レーン1：DNA分子量マーカーIV（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）、レーン2：クローンIIB1、レーン3：クローンIIB2、レーン4：クローンIIB3、レーン5：クローンIIB4、レーン6：C57BL/6 ES細胞DNA（陰性対照）、レーン7：水対照を示す。
【図４】5'アームにおける正しい標的化を有するクローンを同定するためのPCRを示す図である。ES細胞クローンに対するオリゴヌクレオチドIL4-revおよびmTar24cを用いるPCR反応の0.8%アガロースゲルを示す。レーン1：DNA分子量マーカーX（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）、レーン2：クローンIIB1、レーン3：クローンIIB2、レーン4：クローンIIB3、レーン5：クローンIIB4、レーン6：C57BL/6 ES細胞DNA（陰性対照）。矢印は、クローンIIB1から得られた増幅産物を示す。
【図５】Balb/c胚盤胞および上記のような変異型C57BL/6マウス胚性幹細胞から作製したマウスを示す図である。毛色を、キメラ現象の程度の指標として使用することができる。毛皮における黒色対白色の毛の量は、全体のキメラ現象の程度についての大まかな定量的基準を示す。
【図６】PCRによる遺伝子型解析を示す図である。ゲノムDNAを、それぞれの動物の遺伝子型を示す、TAAR1+/+またはTAAR1NLSlacZ対立遺伝子の存在について解析した。50bp DNAラダー（Invitrogen）を、分子量標準として使用した。M：50bpラダー、レーン1：TAAR1NLAlacZ/NLSlacz、レーン2：TAAR1+/NLSlacz、レーン3：TAAR1+/+を示す。
【図７】TAAR1+（上）およびTAAR1NLSlacZ対立遺伝子（下）の模式的構造を示す図である。示されたDNAフラグメント（フラグメント1〜4；配列1〜9）のPCR増幅および部分配列解析により、TAAR1NLSlacZ対立遺伝子の正しい相同組換えが確認された。■は、配列決定したストレッチ（配列1〜9）を示す。
【図８】表1において要約されるようなPCR増幅されたDNAフラグメントの電気泳動のアガロースゲルを示す図である。図8Aは、PCRプロトコール5.1.1（表1）の条件下で、2.72kb PCR産物（フラグメント1、図7）をTAAR1+/+ゲノムDNAから増幅し、5.05kb（フラグメント3、図7）PCR産物を、TAAR1NLSlacZNLSlacZゲノムDNAから増幅した。M：1kbラダー、レーン1：φテンプレート（テンプレートなし）、レーン2：TAAR1+/+、レーン3：TAAR1NLSlacZ/NLSlacZを示す。図8Bは、PCRプロトコール5.1.2（表1）の条件下で、7.33kb PCR産物（フラグメント2、図7）をTAAR1NLSlacZNLSlacZゲノムDNAから増幅したが、TAAR1+/+ゲノムDNAからは生成物が得られなかった。M：1kbラダー、レーン1：φテンプレート（テンプレートなし）、レーン2：TAAR1+/+、レーン3：TAAR1NLSlacZ/NLSlacZを示す。図8Cは、PCRプロトコール5.1.3（表1）の条件下で、2.86kb PCR産物（フラグメント4、図7）をTAAR1NLSlacZNLSlacZゲノムDNAから増幅したが、TAAR1+/+ゲノムDNAからは生成物が得られなかった。M：1kbラダー、レーン1：φテンプレート（テンプレートなし）、レーン2：TAAR1+/+、レーン3：TAAR1NLSlacZ/NLSlacZを示す。1kb DNAラダー（Invitrogen）を、分子量標準として使用した。
【図９】表2に要約されるようなTAAR1+/+およびTAAR1NLSlacZ/NLSlacZマウス脳cDNA調製物からそれぞれ増幅したPCR産物の電気泳動のアガロースゲルを示す図である。図9Aは、TAAR1+/+およびTAAR1NLSlacZ/NLSlacZマウス脳cDNA調製物に対するGAPDH（上記を参照のこと）に特異的なPCR反応を示す。両方のcDNAから452bp PCR産物を増幅した。M：50bpラダー、レーン1：φテンプレート（テンプレートなし）、レーン2：TAAR1NLSlacZ/NLSlacZ、レーン3：TAAR1+/+を示す。図9Bは、TAAR1+/+およびTAAR1NLSlacZ/NLSlacZマウス脳cDNA調製物に対するNLSlacZ（上記を参照のこと）に特異的なPCR反応を示す。TAAR1NLSlacZ/NLSlacZマウス脳cDNAから631bp PCR産物を増幅したが、TAAR1+/+マウス脳cDNAからは増幅しなかった。M：50bpラダー、レーン1：φテンプレート（テンプレートなし）、レーン2：TAAR1NLSlacZ/NLSlacZ、レーン3：TAAR1+/+を示す。図9Cは、TAAR1+/+およびTAAR1NLSlacZ/NLSlacZマウス脳cDNA調製物に対するTAAR1（上記を参照のこと）に特異的なPCR反応を示す。TAAR1+/+マウス脳cDNAから936bp PCR産物を増幅したが、TAAR1NLSlacZ/NLSlacZマウス脳cDNAからは増幅しなかった。M：1kbラダー、レーン1：φテンプレート（テンプレートなし）、レーン2：TAAR1NLSlacZ/NLSlacZ、レーン3：TAAR1+/+を示す。50bp DNAラダー（Invitrogen A、B）およびラダー1kb DNAラダー（Invitrogen C）を、分子量標準として使用した。
【図１０】F1世代の5匹のTAAR1+/NLSlacZマウス、生殖細胞系列キメラの世代のために使用したES細胞株、ならびにマウス同系交配株C57BL/6、DBA、およびSV129の試料についてのマイクロサテライト解析（マイクロサテライトマーカーD5MIT259についての結果）からのPCR産物の電気泳動のアガロースゲルを示す図である。C57BL/6についての標準試料のすべての試験試料との一致は、TAAR1+/NLSlacZ対立遺伝子を保有するマウス変異型系統がC57BL/6遺伝子バックグラウンド上にあるという証拠を示している。10bp DNAラダー（Invitrogen）を分子量標準として使用した。M：10bpラダー、レーン1：C57BL/6、レーン2：DBA、レーン3：SV129、レーン4：ES TAAR1+/NLSlacZ、レーン5：F1 #1 TAAR1+/NLSlacZ、レーン6：F1 #2 TAAR1+/NLSlacZ、レーン7：F1 #3 TAAR1+/NLSlacZ、レーン8：F1 #4 TAAR1+/NLSlacZ、レーン9：F1 #5 TAAR1+/NLSlacZを示す。
【図１１】成体TAAR1NLSlacZ/NLSlacZマウス脳およびTAAR1+/+マウス脳の組織学的切片のLacZ染色を示す図である。図11Aは、TAAR1NLSlacZ/NLSlacZマウス脳切片は、濃い特異的染色を示す図である。図11Bは、図11Aにおいて四角で囲った領域のより高倍率の図を示す図である。図11Cは、染色はTAAR1+/+マウス脳切片には見られない。両方の切片を、同等の脳領域から矢状方向で切断した（切片が切断された脳の領域の概略図についてはDを参照されたい）。
【図１２Ａ】TAAR1LacZマウス変異体の身体的特性をグラフで示す図である。TAAR1+/+マウス（n=22）、TAAR1+/LacZマウス（n=21）およびTAAR1LacZ/LacZマウス（n=21）の巣作り行動は、遺伝子型間で差異を示さなかった。
【図１２Ｂ】TAAR1LacZマウス変異体の身体的特性のグラフ表示を示す図である。体重の発達は、遺伝子型間で差異を示さなかった
【図１２Ｃ】TAAR1LacZマウス変異体の身体的特性のグラフ表示を示す図である。TAAR1+/+マウス（n=22）、TAAR1+/LacZマウス（n=21）およびTAAR1LacZ/LacZマウス（n=21）の直腸体温を示す。遺伝子型間で、体温の統計学的に有意な差異は観察されなかった。
【図１２Ｄ】TAAR1LacZマウス変異体の身体的特性をグラフで示す図である。水平ワイヤ試験によるTAAR1+/+マウス（n=22）、TAAR1+/LacZマウス（n=21）およびTAAR1LacZ/LacZマウス（n=21）の身体強度の評価は、遺伝子型間でのいかなる有意な差異も示さなかった。
【図１２Ｅ】TAAR1LacZマウス変異体の身体的特性をグラフで示す図である。握力によるTAAR1+/+マウス（n=22）、TAAR1+/LacZマウス（n=21）およびTAAR1LacZ/LacZマウス（n=21）の身体強度の評価は、遺伝子型間でのいかなる有意な差異も示さなかった。
【図１２Ｆ】TAAR1LacZマウス変異体の身体的特性をグラフで示す図である。ロータロッドでの行動によって示された運動協調性および平衡を示す。遺伝子型間での有意な差異は観察されなかった。
【図１２Ｇ】TAAR1LacZマウス変異体の身体的特性をグラフで示す図である。d-アンフェタミンの単回適用（2.5mg/kg腹腔内、n=12）後のTAAR1+/+マウスおよびTAAR1LacZ/LacZマウスの歩行活動を示す。アンフェタミン投与によって引き起こされる歩行活動の増加は、TAAR1LacZ/LacZにおいてはそれらの野生型同腹仔（黒記号、実線）と比較して有意により高かったのに対して、媒体処理動物（白抜き記号、破線）においては遺伝子型間で有意な差異はなかった。
【図１３Ａ】インビボ微量透析法によって明らかにされた、TAAR1の非存在下での線条体中の、アンフェタミンによって引き起こされる伝達物質放出の増加をグラフで示す図である。インビボ微量透析法によって明らかにされた、d-アンフェタミンの単回適用（2.5mg/kg腹腔内、n=7〜8）後のTAAR1+/+マウスおよびTAAR1LacZ/LacZマウスの線条体中のドーパミン、3,4-ジヒドロキシフェニル酢酸（DOPAC）、ノルアドレナリンおよびセロトニンの細胞外レベルを示す。同じ動物の透析物を、4種すべての化合物について解析した。細胞外ドーパミンレベルのアンフェタミン誘発性の増加は、TAAR1LacZ/LacZマウスの線条体中では、それらのTAAR1+/+同腹仔の2.3倍の大きさである。
【図１３Ｂ】インビボ微量透析法によって明らかにされた、TAAR1の非存在下での線条体中の、アンフェタミンによって引き起こされる伝達物質放出の増加をグラフで示す図である。インビボ微量透析法によって明らかにされた、d-アンフェタミンの単回適用（2.5mg/kg腹腔内、n=7〜8）後のTAAR1+/+マウスおよびTAAR1LacZ/LacZマウスの線条体中のドーパミン、3,4-ジヒドロキシフェニル酢酸（DOPAC）、ノルアドレナリンおよびセロトニンの細胞外レベルを示す。同じ動物の透析物を、4種すべての化合物について解析した。アンフェタミンに応答したTAAR1LacZ/LacZ動物とTAAR1+/+動物の両方において、ドーパミン異化代謝産物DOPACレベルにおいて最低限の減少のみであり、遺伝子型間で有意な差異はない。
【図１３Ｃ】インビボ微量透析法によって明らかにされた、TAAR1の非存在下での線条体中の、アンフェタミンによって引き起こされる伝達物質放出の増加をグラフで示す図である。インビボ微量透析法によって明らかにされた、d-アンフェタミンの単回適用（2.5mg/kg腹腔内、n=7〜8）後のTAAR1+/+マウスおよびTAAR1LacZ/LacZマウスの線条体中のドーパミン、3,4-ジヒドロキシフェニル酢酸（DOPAC）、ノルアドレナリンおよびセロトニンの細胞外レベルを示す。同じ動物の透析物を、4種すべての化合物について解析した。アンフェタミン投与に応答したノルアドレナリンのレベルの増加は、野生型動物の2.4倍の大きさである。
【図１３Ｄ】インビボ微量透析法によって明らかにされた、TAAR1の非存在下での線条体中の、アンフェタミンによって引き起こされる伝達物質放出の増加をグラフで示す図である。インビボ微量透析法によって明らかにされた、d-アンフェタミンの単回適用（2.5mg/kg腹腔内、n=7〜8）後のTAAR1+/+マウスおよびTAAR1LacZ/LacZマウスの線条体中のドーパミン、3,4-ジヒドロキシフェニル酢酸（DOPAC）、ノルアドレナリンおよびセロトニンの細胞外レベルを示す。同じ動物の透析物を、4種すべての化合物について解析した。アンフェタミンによって誘発されるセロトニンレベルの2.5倍の増加が、TAAR1LacZ/LacZマウスにおいてのみ観察されたが、それらのTAAR1+/+同腹仔では観察されなかった。
【図１４Ａ】TAAR1LacZ/LacZマウスおよび野生型マウスのVTAにおけるドーパミン作動性ニューロンの電気生理学的解析をグラフで示す図である。ドーパミン作動性ニューロンの自発的興奮速度は、TAAR1LacZ/LacZマウス（右）よりも野生型（左のパネル）における方が低い。野生型マウス（黒色のトレース）およびTAAR1LacZ/LacZマウス（灰色）のスパイク間隔の累積確率ヒストグラムを示す。TAAR1LacZ/LacZマウスにおいて、イベント間の間隔の分布は左に有意にシフトし、自発的スパイク頻度の増加を示す。
【図１４Ｂ】TAAR1LacZ/LacZマウスおよび野生型マウスのVTAにおけるドーパミン作動性ニューロンの電気生理学的解析をグラフで示す図である。TAAR1アゴニストp-チラミンは、野生型マウス（左）におけるイベント間の間隔の累積確率ヒストグラムのシフトによって示されるが、TAAR1LacZ/LacZマウス（右）によっては示されないように、野生型においてドーパミン作動性ニューロンの興奮速度を減少するが、TAAR1LacZ/LacZマウスにおいては減少しない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【配列表】
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