(57)【要約】【課題】油脂の加水分解において、固定化酵素を充填した酵素塔を用いた場合に反応液全体の流れを均一化し、酵素活性を有効に発現させ、脂肪酸類を効率的に製造する。【解決手段】固定化酵素を充填した酵素塔に油相基質と水相基質とを供給し、同一方向に並流させ、油脂類を加水分解することにより脂肪酸類を製造する方法であって、酵素塔への油相基質の供給と水相基質の供給とを交互に行う脂肪酸類の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
固定化酵素を充填した酵素塔に油相基質と水相基質とを供給し、同一方向に並流させ、油脂類を加水分解することにより脂肪酸類を製造する方法であって、酵素塔への油相基質の供給と水相基質の供給とを交互に行う脂肪酸類の製造方法。
【請求項２】
次の式（１）で表される１度に供給される酵素塔内の水相基質の厚みＬwが５〜１５０mmの範囲である請求項１記載の脂肪酸類の製造方法。
Ｌw＝（Ｖw／Ｓ）×Ｔw×（１／ε）    （１）
〔Ｖw：水相の送液流量(mm3/秒)、Ｓ：酵素塔の断面積(mm2)、Ｔw：水相の供給時間(秒)、ε：充填層の空隙率〕
【請求項３】
次の式（２）で表される１度に供給される酵素塔内の油相基質の厚みＬoが１０〜２５０mmの範囲である請求項１又は２記載の脂肪酸類の製造方法。
Ｌo＝（Ｖo／Ｓ）×Ｔo×（１／ε）    （２）
〔Ｖo：油相の送液流量(mm3/秒)、Ｓ：酵素塔の断面積(mm2)、Ｔo：油相の供給時間(秒)、ε：充填層の空隙率〕
【請求項４】
（Ｌw／Ｌo）の値が０．２〜１である請求項２又は３記載の脂肪酸類の製造方法。
【請求項５】
前記油相基質が、植物油、動物油又はこれらの組み合わせの油脂類である請求項１〜４いずれか一項記載の脂肪酸類の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、油脂類を酵素により加水分解することによる脂肪酸類の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リパーゼ等の油脂分解酵素を触媒として油脂類を加水分解する方法として、酵素の回収、再利用を目的として、酵素を担体に固定化し、これに油相基質と水相基質を作用させる方法がある。固定化酵素の使用方法としては、流動床型反応装置に用いる場合（非特許文献１参照）、膜に酵素を固定化した膜型反応装置とする場合（非特許文献２参照）、又は  固定化酵素をカラム等に充填して固定床として用いる場合（特許文献１〜４参照）等がある。流動床型反応装置の場合は酵素の耐久性が低く、滞留時間が長いという問題点があり、また、膜型反応装置の場合は反応速度が非常に遅いという問題点があるため、固定化酵素をカラム等に充填して固定床とし、これに油相基質と水相基質を流通させる技術が一般的である。
【０００３】
この場合、油相基質と水相基質を向流で流通させる方法（特許文献１〜３参照）及び並流で流通させる方法（特許文献４参照）がある。油相基質と水相基質は本来混ざらないものであるため、反応を効果的に進行させるためには均一に混合する必要があり、エマルションとするのが一般的である。一方、エマルション粒子とすると担体内に吸着した酵素に到達し難いため、乳化させない通液速度とした技術もある（特許文献１参照）。
【０００４】
【非特許文献１】J. Am. Oil Chem. Soc. Vol.72, P.1281, 1995
【非特許文献２】J. Am. Oil Chem. Soc. Vol.62, P.1016, 1985
【特許文献１】特開昭６１−８５１９５号公報
【特許文献２】特開平１−９８４９４号公報
【特許文献３】特開平５−９５７９２号公報
【特許文献４】特開２０００−１６０１８８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前記固定化酵素を酵素塔に充填した固定床に、油相基質と水相基質を流通させて油脂類の加水分解を行う方法においては、酵素充填塔内において反応液の流れが不均一となり、酵素活性を有効に発現させることができないという問題があった。その結果、反応率を高めるために酵素と反応液の接触時間を長くする必要が生じ、生産性（流量）が低下するという問題もあった。
【０００６】
従って、本発明の目的は、固定化酵素を酵素塔に充填した固定床に、油相基質と水相基質を流通させて油脂類の加水分解を行う方法において、酵素活性を有効に発現させ、生産性を向上させることにより、より効率的に脂肪酸類を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者は、固定化酵素を充填した酵素塔における反応液の流通の特徴を解析した結果、油相基質と水相基質とを同一方向で流通させ、かつ酵素塔への油相基質の供給と水相基質の供給とを交互に行うことにより、反応液の流れが均一化し、酵素活性を有効に発現させることができ、生産性が向上することを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、固定化酵素を充填した酵素塔に油相基質と水相基質とを供給し、同一方向に並流させ、油脂類を加水分解することにより脂肪酸類を製造する方法であって、酵素塔への油相基質の供給と水相基質の供給とを交互に行う脂肪酸類の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、油脂類の加水分解において、固定化酵素を充填した酵素塔を用いた場合に反応液全体の流れを均一化することができ、酵素活性を有効に発現させ、脂肪酸類を効率的に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明で用いる固定化酵素は、固定化担体に酵素が担持されたものであり、当該固定化担体は、セライト、ケイソウ土、カオリナイト、シリカゲル、モレキュラーシーブス、多孔質ガラス、活性炭、炭酸カルシウム、セラミックス等の無機担体、セラミックスパウダー、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、キトサン、イオン交換樹脂、疎水吸着樹脂、キレート樹脂、合成吸着樹脂等の有機高分子等が挙げられるが、特に保水力の点からイオン交換樹脂が好ましい。また、イオン交換樹脂の中でも、大きな表面積を有することにより酵素のより大きな吸着量を得ることができるという点から、多孔質であることが好ましい。
【００１１】
固定化担体として用いる樹脂の粒子径は１００〜１０００μmが好ましく、特に２５０〜７５０μmが好ましい。細孔径は１０〜１５０nmが好ましい。材質としては、フェノールホルムアルデヒド系、ポリスチレン系、アクリルアミド系、ジビニルベンゼン系等が挙げられ、特にフェノールホルムアルデヒド系樹脂（例えば、Rohm and Hass社製Duolite A-568）が好ましい。
【００１２】
本発明の固定化酵素に使用する酵素は特に限定はされないが、脂溶性脂肪酸等による活性の向上効果が高い点から、油脂類分解用酵素としてのリパーゼが好ましい。リパーゼは、動物由来、植物由来のものはもとより、微生物由来の市販リパーゼを使用することもできる。微生物由来リパーゼとしては、リゾプス（Rizopus）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、ムコール（Mucor）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ジオトリケム（Geotrichum）属、ペニシリウム（Penicillium）属、キャンディダ（Candida）属等の起源のものが挙げられる。
【００１３】
本発明においては、酵素が固定化されていることが必須である。酵素の固定化を行う温度は、酵素の特性によって決定することができるが、酵素の失活が起きない０〜６０℃、特に５〜４０℃が好ましい。また固定化時に使用する酵素溶液のｐＨは、酵素の変性が起きない範囲であればよく、温度同様酵素の特性によって決定することができるが、ｐＨ３〜９が好ましい。このｐＨを維持するためには緩衝液を使用するが、緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等が挙げられる。上記酵素溶液中の酵素濃度は、固定化効率の点から酵素の飽和溶解度以下で、かつ十分な濃度であることが好ましい。また酵素溶液は、必要に応じて不溶部を遠心分離で除去した上澄や、限外濾過等によって精製したものを使用することもできる。また用いる酵素質量はその酵素活性によっても異なるが、担体１００質量部に対して５〜１０００質量部、特に１０〜５００質量部が好ましい。
【００１４】
酵素を固定化する場合、担体と酵素を直接吸着してもよいが、高活性を発現するような吸着状態にするため、酵素吸着前に予め担体を脂溶性脂肪酸又はその誘導体で処理することが好ましい。脂溶性脂肪酸又はその誘導体と担体の接触法としては、水又は有機溶剤中にこれらを直接加えてもよいが、分散性を良くするため、有機溶剤に脂溶性脂肪酸又はその誘導体を一旦分散、溶解させた後、水に分散させた担体に加えてもよい。この有機溶剤としては、クロロホルム、ヘキサン、エタノール等が挙げられる。脂溶性脂肪酸又はその誘導体の使用質量は、担体１００質量部に対して１〜５００質量部、特に１０〜２００質量部が好ましい。接触温度は０〜１００℃、特に２０〜６０℃が好ましく、接触時間は５分〜５時間程度が好ましい。この処理を終えた担体は、ろ過して回収するが、乾燥してもよい。乾燥温度は室温〜１００℃が好ましく、減圧乾燥を行ってもよい。
【００１５】
予め担体を処理する脂溶性脂肪酸又はその誘導体のうち、脂溶性脂肪酸としては、炭素数４〜２４、好ましくは炭素数８〜１８の飽和又は不飽和の、直鎖又は分岐鎖の、水酸基を有していてもよい脂肪酸が挙げられる。具体的には、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、リノール酸、α-リノレン酸、リシノール酸、イソステアリン酸等が挙げられる。また前記脂溶性脂肪酸の誘導体としては、これらの脂溶性脂肪酸と一価若しくは多価アルコール又は糖類とのエステル、リン脂質、及びこれらのエステルにエチレンオキサイドを付加したもの等が挙げられる。具体的には、上記脂肪酸のメチルエステル、エチルエステル、モノグリセライド、ジグリセライド、それらのエチレンオキサイド付加体、ポリグリセリンエステル、ソルビタンエステル、ショ糖エステル等が挙げられる。これら脂溶性脂肪酸及びその誘導体はいずれも常温で液状であることが酵素を担体に固定化する工程上好ましい。これら脂溶性脂肪酸又はその誘導体としては、上記２種以上を併用してもよく、菜種脂肪酸、大豆脂肪酸等の天然由来の脂肪酸を用いることもできる。
【００１６】
固定化酵素の加水分解活性は２０Ｕ／ｇ以上、更に１００〜１００００Ｕ／ｇ、特に５００〜５０００Ｕ／ｇの範囲であることが好ましい。ここで酵素の１Ｕは、４０℃において、油脂類：水＝１００：２５（質量比）の混合液を攪拌混合しながら３０分間加水分解をさせたとき、１分間に１μｍｏｌの遊離脂肪酸を生成する酵素の分解能を示す。
【００１７】
油脂類の単位質量当りに付与した固定化酵素の加水分解活性（Ｕ／ｇ−ｏｉｌ）と、ある加水分解率に到達するまでの所要時間は、略反比例の関係にある。固定化酵素を充填した充填層（酵素塔）を用いて加水分解を行う場合、送液条件（通液速度、温度等）により分解速度は異なるが、加水分解所要時間（充填層内の滞留時間）と充填層内に存在する油脂類の重量（ｇ−ｏｉｌ）及び固定化酵素の充填重量（ｇ）から固定化酵素の見かけ活性（発現活性）（Ｕ／ｇ）が求められる。
【００１８】
本発明に使用する油相基質としては、菜種油、大豆油、ヒマワリ油、パーム油及びアマニ油等の植物油、牛脂、豚脂及び魚油等の動物油等、又はこれらの組み合わせの油脂類が挙げられる。これら油脂類は、脱臭油の他、予め脱臭されていない未脱臭油脂を用いることができるが、これら油脂類の一部又は全部に未脱臭油脂を使用することが、トランス不飽和脂肪酸、共役不飽和脂肪酸を低減し、原料油脂由来の植物ステロール、植物ステロール脂肪酸エステル、トコフェロールを残存させることができる点から好ましい。油相基質中には、前記油脂類の他に脂肪酸等の油溶性成分が混合されていても良い。
【００１９】
本発明に使用する水相基質は水であるが、グリセリン等その他の水溶性成分が混合されていても良い。
【００２０】
本発明において使用する酵素塔は、その形状は使用するポンプの押し込み圧に耐えられるものであれば良い。また、酵素塔の周囲にジャケットを設け、酵素塔内に流通する反応液を酵素反応に適した温度に調整できるものであることが好ましい。酵素塔内の温度は、固定化酵素の活性をより有効に引き出すために、０〜６０℃、更に２０〜４０℃とすることが好ましい。酵素塔の長さは、所望の分解率を得るのに必要な長さとすれば良いが、反応性、塔内圧力損失等の点から０．０１〜１０ｍ、好ましくは０．１〜５ｍの範囲とすることが好ましい。
【００２１】
本発明においては、固定化酵素を充填した酵素塔に油相基質と水相基質を供給し、同一方向に並流させることが必要である。酵素塔への各基質の供給は、塔頂から塔底へ下方流で行っても、塔底から塔頂へ上方流で行っても良い。
【００２２】
反応液の通液線速度（空塔基準速度）は、好ましくは１〜４００ｍｍ／分（０．０１７〜６．６７ｍｍ／秒）、更に５〜２００ｍｍ／分（０．０８３〜３．３３ｍｍ／秒）であるのが好ましい。この通液線速度（ｍｍ／分、又はｍｍ／秒）は、１分間（又は１秒間）当りの送液流量（ｍｍ3／分、又はｍｍ3／秒）（又は（１０-3ｍＬ／分）ともいう）を充填層断面積（ｍｍ2）で除した商で表わされる値をいう。通液線速度を上げることによる充填塔内圧力の増大に伴ない、通液が困難となり、耐圧性の高い酵素充填塔が必要となる他に、固定化酵素が塔内圧力増加により破砕される場合が生じることもあるため、通液線速度は４００ｍｍ／分以下（６．６７ｍｍ／秒以下）とすることが好ましい。また、生産性の点から通液線速度は１ｍｍ／分以上（０．０１７ｍｍ／秒以上）とすることが好ましい。固定化酵素の発現活性は、通液線速度により変化するため、最適な通液線速度を選定して反応条件を決定することで、所望の生産能力、製造コストに見合った反応を行うことができる。
【００２３】
酵素塔内の反応液の滞留時間は、加水分解反応の平衡状態を回避し、固定化酵素の活性をより有効に引き出し、生産性を向上させる点から３０秒〜６０分、更に１〜４０分、特に１〜３０分とすることが好ましい。滞留時間（分）とは、充填層の厚み（ｍｍ）に空隙率を乗じ、これを通液線速度（ｍｍ／分）で除した値で表わされる。
【００２４】
本発明においては、酵素塔への油相基質の供給と水相基質の供給とを交互に行うことが必要である。当該交互に供給する方法としては、それぞれ別々に酵素塔へ直結する配管にて交互に供給を行っても良く、又は共有の配管にて交互に供給を行っても良いが、水相と油相の乳化回避の点及び操作性の点から、別々に酵素塔へ直結する配管にて交互に供給を行うことが好ましい。酵素塔への油相基質の供給と水相基質の供給とを交互に切り替えるタイミング（供給時間）は、反応液の通液線速度や滞留時間等にもよるが、生産性、反応性等の点からそれぞれの一回の供給時間を１０秒〜１０分、更に３０秒〜５分とすることが好ましい。
【００２５】
また、１度に供給される酵素塔内の水相基質の厚みＬwを次の式（１）で表した場合、Ｌwを５〜１５０ｍｍ、更に１５〜１２０ｍｍの範囲とすることが、酵素塔内の反応液全体の流れを均一化し、酵素活性を有効に発現させ、脂肪酸類を効率的に製造することができる点から好ましい。
Ｌw＝（Ｖw／Ｓ）×Ｔw×（１／ε）    （１）
〔Ｖw：水相の送液流量(mm3/秒)、Ｓ：酵素塔の断面積(mm2)、Ｔw：水相の供給時間(秒) 、ε：充填層の空隙率〕
【００２６】
更に、１度に供給される酵素塔内の油相基質の厚みＬoを次の式（２）で表した場合、Ｌoを１０〜２５０ｍｍ、更に３０〜２２０ｍｍの範囲とすることが、酵素塔内の反応液全体の流れを均一化し、酵素活性を有効に発現させ、脂肪酸類を効率的に製造することができる点から好ましい。
Ｌo＝（Ｖo／Ｓ）×Ｔo×（１／ε）    （２）
〔Ｖo：油相の送液流量(mm3/秒)、Ｓ：酵素塔の断面積(mm2)、Ｔo：油相の供給時間(秒) 、ε：充填層の空隙率〕
【００２７】
また、酵素塔内の反応液全体の流れを均一化し、酵素活性を有効に発現させ、脂肪酸類を効率的に製造することができる点から、Ｌw／Ｌoの値を０．１〜１０、更に０．２〜１とすることが好ましい。
【００２８】
本発明においては、反応率、生産性等の兼ね合いから、酵素塔を通過した反応液をそのまま反応終了物としても良く、また、一旦油水分離を行った後に上記と同様の方法で再度同一の酵素塔へ供給し、所望の反応率が得られるまで循環反応を行っても良い。また、一旦油水分離を行った後に上記と同様の方法で再度、別の酵素塔へ供給して連続反応を行っても良い。油水分離としては、自然沈降型、遠心分離型等の油水分離器が一般に使用されるが、特に限定されない。
【実施例】
【００２９】
＜実施例１＞
イオン交換樹脂（Duolite A-568、ダイヤモンドシャムロック社）にリパーゼＡＹ（天野製薬(株)）を固定した固定化リパーゼ１２１０ｇ（乾燥重量）を、ジャケット付きのステンレス製カラム（内径７０ｍｍ、充填高さ１３００ｍｍ）に充填し、ジャケットにて３５℃に保温した。なお、使用した固定化リパーゼの加水分解活性は３１５４Ｕ／ｇ（乾燥重量）であった。カラム上部より菜種油と蒸留水を交互に送液し、加水分解反応を行った。送液操作における条件は、菜種油は１回につき送液流量７７ｍＬ／分（１２８３ｍｍ3／秒）で供給時間０．９分間、蒸留水は１回につき送液速度７７ｍＬ／分（１２８３ｍｍ3／秒）で供給時間０．５分間とし、それぞれ交互に１２６回ずつ、合計で菜種油は８１００ｇ、蒸留水は４８６０ｇ供給した。加水分解反応を行った結果を表１に示す。なお、表中の分解率は、分析により求めた酸価をケン化価で除することにより算出した。
【００３０】
＜実施例２＞
実施例１に記載した方法に準じ、送液操作における条件を、菜種油は１回につき送液速度７７ｍＬ／分（１２８３ｍｍ3／秒）で供給時間１．９分間、蒸留水は１回につき送液速度７７ｍＬ／分（１２８３ｍｍ3／秒）で供給時間１分間とし、それぞれ交互に６３回ずつ、合計で菜種油は８１００ｇ、蒸留水は４８６０ｇ供給した。加水分解反応を行った結果を表１に示す。
【００３１】
＜実施例３＞
実施例１に記載した方法に準じ、送液操作における条件を、菜種油は１回につき送液速度７７ｍＬ／分（１２８３ｍｍ3／秒）で供給時間５．５分間、蒸留水は１回につき送液速度７７ｍＬ／分（１２８３ｍｍ3／秒）で供給時間３分間とし、それぞれ交互に２１回ずつ、合計で菜種油は８１００ｇ、蒸留水は４８６０ｇ供給した。加水分解反応を行った結果を表１に示す。
【００３２】
＜比較例１＞
菜種油８１００ｇと蒸留水４８６０ｇをジャケット付きガラス製攪拌槽（基質供給槽）に仕込み、４００ｒｐｍ で攪拌して反応液を調製後、実施例１に記載した固定化リパーゼ充填カラム上部より反応液を定量ポンプにて送液した。送液速度は７７ｍＬ／分（１２８３ｍｍ3／秒）とした。加水分解反応を行った結果を表１に示す。
【００３３】
＜比較例２＞
加水分解活性９９７Ｕ／ｇ（乾燥重量）の固定化リパーゼを使用し、固定リパーゼの充填量を１２２０ｇ（乾燥重量）とした以外は比較例１と同様の手順で加水分解反応を行った。結果を表１に示す。
【００３４】
＜比較例３＞
比較例２に記載した固定化リパーゼ充填カラム上部より菜種油と蒸留水を予め混合せずに同時に送液し、加水分解反応を行った。送液速度は、菜種油５０ｍＬ／分（８３３ｍｍ3／秒）、蒸留水２７ｍＬ／分（４５０ｍｍ3／秒）とした。加水分解反応を行った結果を表１に示す。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
油水を混合した状態で、または予め混合せずに同時に送液する条件に対して、菜種油、蒸留水を交互に間欠供給する事により、分解率が向上し、固定化酵素の（見掛け）活性が有効に発現した。