(57)【要約】      （修正有）【課題】  カプロン酸生産量が向上した酵母変異株、このような変異株の製造方法、及び酵母のカプロン酸生産量の調節方法を提供する。【解決手段】  特定の配列からなるアミノ酸配列のアミノ酸番号７のアミノ酸がグルタミン酸である部分アミノ酸配列を有するＦＡＳ１を備える脂肪酸合成酵素を生産する酵母を変異処理し、変異処理酵母の中からセルレニン耐性を獲得した菌株を選択することにより酵母カプロン酸高生産株が得られる。上記アミノ酸をアスパラギン酸とグルタミン酸との間で変換することにより、カプロン酸生産量を調節することができる。【選択図】図１
2007068411.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号７のＸａａがグルタミン酸である部分アミノ酸配列を有するＦＡＳ１を備える脂肪酸合成酵素を生産する酵母を変異処理し、変異処理酵母の中からセルレニン耐性を獲得した菌株を選択することにより得られる酵母カプロン酸高生産株。
【請求項２】
実験室酵母、ワイン酵母、ウィスキー酵母、パン酵母、上面ビール酵母、ラガービール酵母、蒸留酒酵母、及び酵母基準株からなる群より選ばれる酵母を変異処理し、変異処理酵母の中からセルレニン耐性を獲得した菌株を選択することにより得られる酵母カプロン酸高生産株。
【請求項３】
実験室酵母ｉｔｒ００１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６３８）。
【請求項４】
実験室酵母Ｓ２８８ＣＲ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６３９）。
【請求項５】
配列番号１に示すアミノ酸配列においてアミノ酸番号７のＸａａがグルタミン酸である部分アミノ酸配列を有するＦＡＳ１と、配列番号２に示すアミノ酸配列においてアミノ酸番号４のＸａａがセリン、又はシステインである部分アミノ酸配列を有するＦＡＳ２とを備える脂肪酸合成酵素を生産する酵母カプロン酸高生産株。
【請求項６】
配列番号１に示すアミノ酸配列においてアミノ酸番号７のＸａａがグルタミン酸である部分アミノ酸配列を有するＦＡＳ１を備える脂肪酸合成酵素を生産する酵母を変異処理する工程と、変異処理酵母の中からセルレニン耐性を獲得した菌株を選択する工程とを含む酵母カプロン酸高生産株の製造方法。
【請求項７】
実験室酵母、ワイン酵母、ウィスキー酵母、パン酵母、上面ビール酵母、ラガービール酵母、蒸留酒酵母、及び酵母基準株からなる群より選ばれる酵母を変異処理する工程と、変異処理酵母の中からセルレニン耐性を獲得した菌株を選択する工程とを含む酵母カプロン酸高生産株の製造方法。
【請求項８】
清酒酵母、又は焼酎酵母の脂肪酸合成酵素ＦＡＳ１中に含まれる配列番号１に示す部分アミノ酸配列のアミノ酸番号７のＸａａをアスパラギン酸からグルタミン酸に置換する工程と、変異処理する工程と、変異処理酵母の中からセルレニン耐性を獲得した菌株を選択する工程とを含む酵母カプロン酸高生産株の製造方法。
【請求項９】
酵母の脂肪酸合成酵素ＦＡＳ１遺伝子中に含まれる配列番号３に示す部分塩基配列の塩基番号２１のｎを置換する工程を含む、酵母のカプロン酸生産量を調節する方法。
【請求項１０】
酵母を用いて酒類、又はパンを製造する方法であって、酵母として、請求項１、２、若しくは５に記載の酵母カプロン酸高生産株、又は請求項３、若しくは４の株を使用する方法。
【請求項１１】
酵母として、請求項１、２、若しくは５に記載の酵母カプロン酸高生産株、又は請求項３、若しくは４の株を使用して製造された酒類、又はパン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カプロン酸を高生産する酵母変異株、このような変異株の製造方法、及び酵母のカプロン酸の生産量の調節方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カプロン酸エチルは吟醸香の代表的な香気成分であり、吟醸酒の品質において重要な成分の一つである。カプロン酸エチルは前駆体であるカプロン酸がエステル化されて生じ、その生成量はカプロン酸の供給量に左右される。さらに、清酒中のカプロン酸は酵母の脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）により生合成されるが、カプロン酸として蓄積されずに代謝されてしまう。従って、カプロン酸からのカプロン酸エチルの生産量は一般にごく僅かである。
【０００３】
従って、カプロン酸生産性をより高め、あるいは逆に抑えることは、清酒のような嗜好品の品質の追及において重要な課題である。また、清酒に限らず酵母によって製造される食品の全てにおいても商品の差別化に活用しうる。
【０００４】
ここで、特許文献１は、カプロン酸を高生産する変異酵母の育種法としてセルレニン耐性変異法を教えている。同文献には、各種酵母を変異処理し、セルレニン含有培地で生育する菌株を選択すれば、カプロン酸及び／又はカプロン酸エチルを多く生成するようになった変異株が得られることが記載されている。実施例では、清酒酵母からカプロン酸生産能が向上した株を得ている。
【０００５】
また、非特許文献１によれば、酵母のセルレニン耐性株では、脂肪酸合成酵素のαサブユニットをコードするＦＡＳ２遺伝子の一塩基置換により、ＦＡＳ２に含まれる配列番号２に示される部分アミノ酸配列において、アミノ酸番号４のグリシンがセリンに置換されている。
【０００６】
また非特許文献２によれば、試験管内変異導入（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）で、上記グリシンをシステインに人為的に置換したセルレニン耐性酵母では、このグリシンがセリンに置換されたセルレニン耐性変異株よりカプロン酸生産量が高いことを教えている。
【特許文献１】特公平７−４６９８２号
【非特許文献１】Inokoshi et al, Mol. Gen Genet., 244,90-96 (1994)
【非特許文献２】Aritomi et al, Biosci. Biotechnol. Biochem., 68, 206-214 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、カプロン酸生産量が向上した酵母変異株、このような変異株の製造方法、及び酵母のカプロン酸生産量の調節方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために本発明者は研究を重ね、以下の知見を得た。
(i)  酵母の脂肪酸合成酵素のＦＡＳ１の配列番号１に示す部分アミノ酸配列においてアミノ酸番号７のＸａａがグルタミン酸である場合は、アスパラギン酸である場合より、その酵母のカプロン酸生産量が高い。
(ii)  ＦＡＳ１遺伝子の配列番号３に示す部分塩基配列において塩基番号２１のｎがＡ又はＴであることにより、ＦＡＳ１タンパク質が配列番号１に示す部分アミノ酸配列においてアミノ酸番号７のＸａａがグルタミン酸であるものとなる。
(iii)  清酒酵母、及び焼酎酵母のＦＡＳ１は配列番号１に示す部分アミノ酸配列においてアミノ酸番号７のＸａａがアスパラギン酸であるが、実験室酵母、ワイン酵母、ウィスキー酵母、パン酵母、上面ビール酵母、ラガービール酵母、蒸留酒酵母、及び酵母基準株は、Ｘａａがグルタミン酸になった対応する部分アミノ酸配列を有する。
【０００９】
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、以下の酵母カプロン酸高生産株などを提供する。
項１．  配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号７のＸａａがグルタミン酸である部分アミノ酸配列を有するＦＡＳ１を備える脂肪酸合成酵素を生産する酵母を変異処理し、変異処理酵母の中からセルレニン耐性を獲得した菌株を選択することにより得られる酵母カプロン酸高生産株。
【００１０】
項２．  実験室酵母、ワイン酵母、ウィスキー酵母、パン酵母、上面ビール酵母、ラガービール酵母、蒸留酒酵母、及び酵母基準株からなる群より選ばれる酵母を変異処理し、変異処理酵母の中からセルレニン耐性を獲得した菌株を選択することにより得られる酵母カプロン酸高生産株。
【００１１】
項３．  実験室酵母ｉｔｒ００１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６３８）。
【００１２】
項４．  実験室酵母Ｓ２８８ＣＲ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６３９）。
【００１３】
項５．  配列番号１に示すアミノ酸配列においてアミノ酸番号７のＸａａがグルタミン酸である部分アミノ酸配列を有するＦＡＳ１と、配列番号２に示すアミノ酸配列においてアミノ酸番号４のＸａａがセリン、又はシステインである部分アミノ酸配列を有するＦＡＳ２とを備える脂肪酸合成酵素を生産する酵母カプロン酸高生産株。
【００１４】
項６．  配列番号１に示すアミノ酸配列においてアミノ酸番号７のＸａａがグルタミン酸である部分アミノ酸配列を有するＦＡＳ１を備える脂肪酸合成酵素を生産する酵母を変異処理する工程と、変異処理酵母の中からセルレニン耐性を獲得した菌株を選択する工程とを含む酵母カプロン酸高生産株の製造方法。
【００１５】
項７．  実験室酵母、ワイン酵母、ウィスキー酵母、パン酵母、上面ビール酵母、ラガービール酵母、蒸留酒酵母、及び酵母基準株からなる群より選ばれる酵母を変異処理する工程と、変異処理酵母の中からセルレニン耐性を獲得した菌株を選択する工程とを含む酵母カプロン酸高生産株の製造方法。
【００１６】
項８．  清酒酵母、又は焼酎酵母の脂肪酸合成酵素ＦＡＳ１中に含まれる配列番号１に示す部分アミノ酸配列のアミノ酸番号７のＸａａをアスパラギン酸からグルタミン酸に置換する工程と、変異処理する工程と、変異処理酵母の中からセルレニン耐性を獲得した菌株を選択する工程とを含む酵母カプロン酸高生産株の製造方法。
【００１７】
項９．  酵母の脂肪酸合成酵素ＦＡＳ１遺伝子中に含まれる配列番号３に示す部分塩基配列の塩基番号２１のｎを置換する工程を含む、酵母のカプロン酸生産量を調節する方法。
【００１８】
項１０．  酵母を用いて酒類、又はパンを製造する方法であって、酵母として、項１、２、若しくは５に記載の酵母カプロン酸高生産株、又は項３、若しくは４の株を使用する方法。
【００１９】
項１１．  酵母として、項１、２、若しくは５に記載の酵母カプロン酸高生産株、又は項３、若しくは４の株を使用して製造された酒類、又はパン。
【発明の効果】
【００２０】
従来、酵母の脂肪酸合成酵素のＦＡＳ２の変異により、カプロン酸の生産量が増大すると考えられてきたが、本発明により、ＦＡＳ１の変異によっても、カプロン酸生産量が増大することが見出された。
【００２１】
即ち、殆どの酵母において、ＦＡＳ１は、配列番号１に示す部分アミノ酸配列においてアミノ酸番号７がアスパラギン酸又はグルタミン酸であるが、カプロン酸の生産量は、このアミノ酸がグルタミン酸である酵母菌株ではアスパラギン酸である酵母菌株の約１．４倍である。また、実験室酵母、ワイン酵母、ウィスキー酵母、パン酵母、上面ビール酵母、ラガービール酵母、蒸留酒酵母、及び酵母基準株は、上記のアミノ酸（Ｘａａ）がグルタミン酸である。
【００２２】
従って、実験室酵母、ワイン酵母、ウィスキー酵母、パン酵母、上面ビール酵母、ラガービール酵母、蒸留酒酵母、及び酵母基準株のような上記アミノ酸がグルタミン酸であるような酵母菌株を変異させてセルレニン耐性を獲得したＦＡＳ２変異株を選択すれば、ＦＡＳ１及びＦＡＳ２の双方の構造に起因してカプロン酸生産量が非常に高い酵母変異株が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）酵母カプロン酸高生産株、及びその製造方法
本発明の酵母カプロン酸高生産株は、アミノ酸配列（Asn Thr Asp Asp Tyr Phe Xaa Glu Leu Arg；配列番号１）においてアミノ酸番号７のＸａａがグルタミン酸である部分アミノ酸配列を有するＦＡＳ１を備える脂肪酸合成酵素を生産する酵母を変異処理する工程と、変異処理酵母の中からセルレニン耐性を獲得した菌株を選択する工程とを含む方法により得られる。
【００２４】
配列番号１のアミノ酸番号７のアミノ酸（以下、「目的アミノ酸」という）は、酵母標準菌株である実験室酵母Ｓ２８８Ｃ株のＦＡＳ１では第１７１番目に位置するアミノ酸である。実験室酵母Ｓ２８８Ｃ株のＦＡＳ１のアミノ酸配列を配列番号１０に示す。ＦＡＳ１の対応する部分アミノ酸配列中のこのアミノ酸がグルタミン酸である酵母としては、例えば、実験室酵母、ワイン酵母、ウィスキー酵母、パン酵母、上面ビール酵母、ラガービール酵母（Saccharomyses carlsbergensis)、蒸留酒酵母、及び酵母基準株などが挙げられる。
【００２５】
清酒酵母、焼酎酵母などでは、本来上記の目的アミノ酸がアスパラギン酸であるが、清酒酵母、焼酎酵母においてこの目的アミノ酸がグルタミン酸に置換された変異株を用いることもできる。ＦＡＳ１遺伝子において、上記目的アミノ酸をコードするのは、その部分塩基配列であるAAC ACC GAC GAC TAC TTT GAn GAA TTG CGT（配列番号３）において塩基番号１９〜２１のＧＡｎからなるコドンである。配列番号３の塩基配列において塩基番号２１のｎ（以下、「目的塩基」という）は、実験室酵母Ｓ２８８Ｃ株のＦＡＳ１遺伝子配列では５１３番目に位置する。実験室酵母Ｓ２８８Ｃ株のＦＡＳ１遺伝子の塩基配列を配列番号１１に示す。清酒酵母や焼酎酵母では、上記の目的塩基がＣであるが、この塩基がＡ又はＧである場合に、上記の目的アミノ酸がグルタミン酸になる。従って、例えば、清酒酵母や焼酎酵母のＦＡＳ１遺伝子の目的塩基をＣからＡ又はＧに置換する部位特異的変異により、目的アミノ酸がグルタミン酸であるＦＡＳ１を生産する変異株が得られる。
【００２６】
変異処理方法は、特に限定されず、公知の方法を使用できる。例えば、エチルメタンスルホン酸、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、アクリジン系色素などでの化学処理；紫外線照射；放射線照射などの方法が挙げられる。
【００２７】
次いで、変異処理した酵母の中から、セルレニンに対する耐性を獲得した株を選択する。セルレニンは脂肪酸合成酵素を阻害する物質であり、また特許文献１によれば、セルレニン耐性株にはカプロン酸を含む中級脂肪酸の生産量が親株に比べて向上した株が多く存在する。従って、ＦＡＳ１の１７１番目のアミノ酸がグルタミン酸であることに起因してカプロン酸生産量が多い菌株の変異処理菌株の中から、ＦＡＳ２に変異を有してセルレニンに対する耐性を獲得した株を選択すれば、カプロン酸生産量が非常に高い酵母変異株が得られる。
【００２８】
また、ＦＡＳ１の変異とＦＡＳ２の変異との順序を入れ替えてもよい。即ち、清酒酵母、又は焼酎酵母を変異処理して得られるセルレニン耐性株の中から、カプロン酸生産量が高くなった株を選択し、次いで、ＦＡＳ１遺伝子の５１３番目の塩基の部位特異的変異などによりＦＡＳ１の１７１番目のアミノ酸をグルタミン酸に置換することもできる。これによっても、カプロン酸生産量が非常に高い菌株が得られる。
【００２９】
セルレニン耐性株は、１０〜５０μＭ程度のセルレニンを添加した、例えばＹＰＤ寒天培地（ＹＰＤ培地に寒天２％を加えたもの）に、変異処理した株を塗布して、１５〜３７℃程度で、２〜１０日間程度培養することにより選抜できる。この中から、カプロン酸の生産量が高い菌株を選択すればよい。
【００３０】
また、目的アミノ酸がグルタミン酸であるＦＡＳ１と、配列番号２のアミノ酸配列においてアミノ酸番号４のＸａａがセリン又はシステインである部分アミノ酸配列を有する変異したＦＡＳ２とを備える脂肪酸合成酵素を生産する酵母も、カプロン酸生産量が非常に多い。このようなＦＡＳ２変異は、変異処理及びセルレニン耐性株の選抜による他、ＦＡＳ２遺伝子の部位特異的変異によっても引き起こすことができる。
（ＩＩ）カプロン酸生産量の調節方法
本発明の酵母のカプロン酸生産量を調節する方法は、酵母の脂肪酸合成酵素遺伝子ＦＡＳ１の目的塩基を置換する工程を含む方法である。前述したように、目的塩基とは、ＦＡＳ１遺伝子の部分塩基配列であって、配列番号３に示す塩基配列において塩基番号２１の塩基ｎをいう。酵母の脂肪酸合成酵素ＦＡＳ１遺伝子の５１３番目の塩基が、Ｃ又はＴである場合にこれをＡ又はＧに置換すれば、カプロン酸生産量を増大させることができる。一方、ＦＡＳ１遺伝子の目的塩基がＡ又はＴである場合にこれをＣに置換すれば、カプロン酸生産量を低減させることができる。
【００３１】
酵母のカプロン酸生産量は、カプロン酸エチルの生産量を左右することから、清酒製造などに使用する酵母のカプロン酸生産量を調節することにより、吟醸香などの香りを制御することができる。
（ＩＩＩ）酒類又はパン、及びその製造方法
本発明の酒類、又はパンの製造方法は、酵母として、上記説明した本発明のカプロン酸高生産株を用いる方法である。本発明の酵母株は、カプロン酸の生産量が高いことから、カプロン酸エチルの生産量が高い。この方法により得られる酒類やパンはカプロン酸エチルによる香気が非常に高いものとなる。酒類は特に限定されず、清酒、焼酎、ビール、ウィスキー、ワインなどが挙げられる。
実施例
以下、本発明を実施例を挙げてより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【実施例１】
【００３２】
ＦＡＳ１遺伝子の置換によるセルレニン耐性変異酵母のカプロン酸生産性の改変
＜セルレニン耐性株のＦＡＳ１遺伝子の破壊＞
清酒酵母の日本醸造協会７号の変異処理及びセルレニン耐性選択により得たカプロン酸高生産変異株７−Ｃ−８（ＦＥＲＭ−Ｐ−８４５２；特公平７−４６９８２）のＦＡＳ１を、ｋａｎＭＸマーカーの両端にＦＡＳ１相同配列を有する遺伝子破壊用カセットで形質転換して、ＦＡＳ１破壊株を得た。
【００３３】
具体的には、７−Ｃ−８株から調整したゲノムＤＮＡを鋳型に、下記のフォワードプライマーＦＡＳ１Ｆ（ACTATGCGGTCTCGTCCTCTACGAATAT ；配列番号４）、及びリバースプライマー（ACACTTACGCATTTTTATTTCTCTTC ；配列番号５）を用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＴａＫａＲａ  ＢＫＬキットで平滑化し５’末端をリン酸化した後、制限酵素ＰｖｕＩＩで切断しＣＩＰ処理したｐＡＧ２５ベクターにライゲーションした。作製したプラスミドはＣ−８ＦＡＳ１−ｐＡＧ２５と名づけた。
【００３４】
プラスミドＣ−８ＦＡＳ１−ｐＡＧ２５を制限酵素ＰｖｕＩＩで切断してＦＡＳ１のコーディングリージョンの大部分を切り出し、選択マーカーｋａｎＭＸと置き換えた。選択マーカーｋａｎＭＸは、プラスミドｐＦＡ６ａ-ｋａｎＭＸ４（Ｗａｃｈ  Ａ  ｅｔ．ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  １０，１７９３−１８０８（１９９４））を鋳型に、フォワードプライマーｋａｎＦ（ATCGATGAATTCGAGCTCG；配列番号６）、リバースプライマーｋａｎＲ（ACGTACGCTGCAGGTCGAC；配列番号７）をプライマーとしてＰＣＲを行い調整した。この選択マーカーｋａｎＭＸをＴａＫａＲａ  ＢＫＬキットで平滑化し５'末端をリン酸化した後、Ｃ−８ＦＡＳ１−ｐＡＧ２５を制限酵素ＰｖｕＩＩで切断しゲル電気泳動で精製した約６．７ｋｂｐの断片とライゲーションした。得られたプラスミドを鋳型に、ＦＡＳ１Ｆ、ＦＡＳ１ＲをプライマーとしてPCRを行って得られるＰＣＲ増幅断片を遺伝子破壊カセットとして酵母ＦＡＳ１遺伝子の破壊に用いた。
＜変異ＦＡＳ１の導入＞
ＦＡＳ１を破壊した７−Ｃ−８株に、(i)部位特異的変異によってＦＡＳ１の１７１番目のアミノ酸をグルタミン酸に置換したＦＡＳ１クローン；(ii)本来的にＦＡＳ１のアミノ酸がグルタミン酸である実験室酵母Ｓ２８８Ｃ株及びＤ４５８−５Ａ株の各ＦＡＳ１アレル；及び(iii)ＦＡＳ１（コントロール）を、それぞれ導入した。
【００３５】
具体的には、(i)ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いてプラスミドＣ−８ＦＡＳ１−ｐＡＧ２５のＦＡＳ１の５１３番目の塩基をＣからＡに変換した。方法はキットのプロトコルに準じた。変異導入のために、フォワードプライマーＤ１７１Ｅ−１Ｆ（ACACCGACGACTACTTTGAAGAATTGCGTGATCTATATC；配列番号８）、及びリバースプライマーＤ１７１Ｅ−１Ｒ（GATATAGATCACGCAATTCTTCAAAGTAGTCGTCGGTGT；配列番号９）を用いた。
【００３６】
また、(ii)実験室酵母Ｓ２８８Ｃ株、及びＤ４５８−５Ａ株の各ＦＡＳ１は、以下のようにして得た。Ｓ２８８Ｃ株、及びＤ４５８−５Ａ株からそれぞれ調整したゲノムＤＮＡを鋳型に、上記フォワードプライマーＦＡＳ１Ｆ、及びリバースプライマーＦＡＳ１Ｒを用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＴａＫａＲａ  ＢＫＬキットで平滑化し５’末端をリン酸化した後、制限酵素ＰｖｕＩＩで切断しＣＩＰ処理したｐＡＧ２５ベクターにライゲーションした。作製したプラスミドはＳ２８８ＣＦＡＳ１−ｐＡＧ２５、及びＤ４５８ＦＡＳ１−ｐＡＧ２５と名づけた。
【００３７】
(iii)については、プラスミドＣ−８ＦＡＳ１−ｐＡＧ２５をそのまま用いた。
＜形質転換方法＞
上記の(i)、(ii)、及び(iii)のプラスミドを用いて、７−Ｃ−８株のＦＡＳ１破壊株の形質転換を行った。形質転換は、Ｇｉｅｔｚ  ｅｔ．ａｌ．Ｙｅａｓｔ  １１，３５５−３６０（１９９５）らの酢酸リチウム法に準じた。すなわち、ＹＰＤ培地（２%グルコース、２%ポリペプトン、１%酵母エキス）で一晩振盪培養した酵母を、新鮮なＹＰＤ培地２〜５×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌになるように接種し、２〜３時間３０℃で振盪培養し集菌した。この酵母菌体を１０ｍｌの滅菌水で２回、１０ｍｌのＴＥ／ＬｉＡｃ溶液（１００ｍＭ−酢酸リチウムｐＨ７．５、１０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ7．５）で１回洗浄し２×１０９ｃｅｌｌ／ｍｌになるようＴＥ／ＬｉＡｃ溶液に懸濁し３０℃で１５分間インキュベーションした。懸濁液５０μｌを滅菌したエッペンドルフチューブにとり、一本鎖キャリアＤＮＡ５μｌ(５０μｇ)、ＤＮＡ５μｌ(１０μg)、ＰＥＧ／ＴＥ／ＬｉＡｃ溶液（４０%（ｗ／ｖ）ＰＥＧ３３５０、１００ｍＭ-酢酸リチウムｐＨ７．５、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．５）３００μｌを加えボルテックスでよく攪拌後、３０℃で３０分間インキュベーション、さらに４２℃で２０分間のヒートショック処理後、１５秒間遠心し集菌した酵母菌体をＹＰＤ培地に懸濁して２時間３０℃で振盪培養、培養液を遠心し集菌した酵母菌体を選択培地に塗布した。ＦＡＳ１遺伝子破壊株の選択培地はＹＰＤ＋ＦＡ+Ｇ４１８寒天培地（２%グルコース、２%ポリペプトン、１%酵母エキス、２mMミリスチン酸ナトリウム、０．５%Ｔｗｅｅｎ４０、１０００ｐｐｍＧ４１８ (ジェネティシン)、２%寒天）、ＦＡＳ１形質転換体の選択培地としてはＹＰＤ＋ＮＡＴ寒天培地（２%グルコース、２%ポリペプトン、１%酵母エキス、２００ｐｐｍ  ｃｌｏｎＮＡＴ（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）、２%寒天）を使用した。
【００３８】
以上説明した７−Ｃ−８株のＦＡＳ１の置換の様子を図１に示す。
＜カプロン酸生産量の測定方法＞
５ｍｌのＹＰＤ培地で、３０℃、２日間振盪培養した各形質転換酵母菌体を集菌し、α米７．８ｇ、乾燥麹１．９ｇ、水２３．２ｍｌ、５０%醸造乳酸１５μｌと混合し１５℃一定で２０日間醗酵した。得られた発酵もろみの遠心上清０．８ｍｌをバイアルにとり、１００ｐｐｍの４−メチル−２−ペンタノール(内部標準液)を１０μl加え密栓し、バイアルのヘッドスペースにＳＰＭＥ（固相マイクロ抽出）ファイバーを挿入し、３０℃で２０分間ファイバーを振盪させながら抽出処理を行った後、ＳＰＭＥファイバーをガスクロマトグラフィーに注入し分析した。
【００３９】
結果を図２に示す。図２のＣ−８ＦＡＳ１は(iii)Ｃ−８株のＦＡＳ１を有するコントロールを示し、Ｄ１７１Ｅは(i)７−Ｃ−８株のＦＡＳ１の１７１番目のアミノ酸をグルタミン酸に置換したＦＡＳ１変異体を示し、Ｓ２８８ＣＦＡＳ１及びＤ４５８ＦＡＳ１は、それぞれ(ii)ＦＡＳ１の１７１番目が本来的にグルタミン酸である実験室酵母のＦＡＳ１を有する変異体を示す。図２から、ＦＡＳ１の１７１番目のアミノ酸がグルタミン酸である場合のカプロン酸生産量は、アスパラギン酸である場合のカプロン酸生産量の１．３〜１．４倍であることが分かる。
【実施例２】
【００４０】
酵母のＦＡＳ１の多型
清酒酵母、焼酎酵母、ワイン酵母、上面ビール酵母（エール酵母）、蒸留酒酵母、ウィスキー酵母、パン酵母、実験室酵母、ラガービール酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、及び酵母基準株について、ＦＡＳ１のアミノ酸配列、及びＦＡＳ１遺伝子の塩基配列を解析した。
【００４１】
結果を以下の表１に示す。
【００４２】
【表１】
2007068411.tif 000003
【００４３】
清酒酵母及び焼酎酵母は、分離年代も分離場所も異なるにもかかわらず、ＦＡＳ１遺伝子の５１３番目の塩基が１株の例外を除きＣであり、ＦＡＳ１の１７１番目のアミノ酸が１株の例外を除き、アスパラギン酸であった。清酒酵母と焼酎酵母の共通の祖先に生じた変異が多型として定着したものと推測される。なお、清酒酵母協会２号だけは例外であったが、協会２号は、現在主に使用されている清酒酵母のグループとは異なることがゲノム多型解析から示されている（Ａｚｕｍｉ  ｅｔ．ａｌ．Ｙｅａｓｔ  １８，１１４５−１１５４（２００１））。一方、その他の酵母では、ＦＡＳ１遺伝子の５１３番目の塩基がＡであり、ＦＡＳ１の１７１番目のアミノ酸がグルタミン酸であった。
【実施例３】
【００４４】
カプロン酸高生産株の単離
実験室酵母Ｄ４５８−５Ａ株、及びＳ２８８Ｃ株の変異処理によりカプロン酸高生産株を得た。具体的には、０．２Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ８．０)９．２ｍｌ、４０%グルコース溶液０．５ｍｌ、ＥＭＳ(エチルメタンスルホネート)０．３ｍｌに約１×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌとなるように酵母を加え３０℃で６０分間ゆっくり振盪させた。処理後の酵母菌体を集菌し、水で数回洗浄後、２５μMセルレニンを含むＹＰＤ寒天培地に酵母懸濁液をまいた。プレートを３０℃で３日〜７日間インキュベーションし、生育してきたコロニーをセルレニン耐性変異株とした。
【００４５】
各株のカプロン酸生産量を実施例１と同様にして測定し、カプロン酸生産量が最も多い菌株を選択し、Ｄ４５８−５Ａの変異株をｉｔｒ００１株と命名し、Ｓ２８８Ｃ株の変異株をＳ２８８ＣＲ株と命名した。ｉｔｒ００１株は産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−２０６３８として寄託済みであり、Ｓ２８８ＣＲ株も同センターにＦＥＲＭ  Ｐ−２０６３９として寄託済みである。
【実施例４】
【００４６】
清酒製造
７−Ｃ−８株、ｉｔｒ００１株、及びＳ２８８ＣＲ株及びそれぞれの親株（Ｇ１１０３株、Ｄ４５８−５Ａ株、Ｓ２８８Ｃ株）を用いて清酒を製造した。７−Ｃ−８株は、特許文献１に記載されているように、清酒酵母協会７０１号から分離した一倍体酵母Ｇ１１０３株のＥＭＳ変異処理により分離したセルレニン耐性株である。清酒醸造は次のようにして行った。５ｍｌのＹＰＤ培地で、３０℃、２日間振盪培養した酵母菌体を集菌し、α米７．８ｇ、乾燥麹１．９ｇ、水２３．２ｍｌ、５０%醸造乳酸１５μｌと混合し１５℃一定で２０日間醗酵した。
【００４７】
得られた醗酵もろみの遠心上清０．８ｍｌをバイアルにとり、１００ｐｐｍの４−メチル−２−ペンタノール(内部標準液)を１０μl加え密栓し、バイアルのヘッドスペースにＳＰＭＥ（固相マイクロ抽出）ファイバーを挿入し、３０℃で２０分間ファイバーを振盪させながら抽出処理を行った後、ＳＰＭＥファイバーをガスクロマトグラフィーに注入し分析した。
【００４８】
結果を図３に示す。セルレニン耐性が付与された７−Ｃ−８株、ｉｔｒ００１株、及びＳ２８８ＣＲ株ではそれぞれの親株の２．５倍から３倍以上のカプロン酸生産量となっていた。また、セルレニン耐性株の中でも、ＦＡＳ１の１７１番目のアミノ酸がグルタミン酸である実験室酵母のＦＡＳ２変異で得られたｉｔｒ００１株、及びＳ２８８ＣＲ株では、ＦＡＳ１の１７１番目のアミノ酸がアスパラギン酸である清酒酵母のＦＡＳ２変異で得られた７−Ｃ−８株に比べて、カプロン酸生産量が約１．４倍であった。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】実施例１で行った７−Ｃ−８株のＦＡＳ１の置換を説明する図である。
【図２】実施例１で行った７−Ｃ−８株のＦＡＳ１の置換によるカプロン酸生産量の変化を示すグラフである。
【図３】変異処理に供する酵母のＦＡＳ１の１７１番目のアミノ酸がグルタミン酸であることにより、変異処理で得られたセルレニン耐性株のカプロン酸生産量が多くなることを示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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