(57)【要約】      （修正有）【課題】長時間を要する培養法に比べて、きわめて短時間でTrichophyton属菌（白癬菌）の検出が可能であり、また培養法・鏡検法に対して高感度かつ正確に同菌を検出する方法を提供する。【解決手段】Trichophyton属菌のゲノムから得た、特定の塩基配列またはその相補配列のＤＮＡを、標的配列検出用のプライマー及びプローブとして利用し、ポリメラーゼ増幅反応とＤＮＡマイクロアレイを用いて、迅速・正確に同菌を検出する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリコフィトン（Trichophyton）属菌と特異的にハイブリダイズ可能である、配列番号：１の配列またはその相補配列からなる核酸断片。
【請求項２】
前記トリコフィトン属菌が、トリコフィトン  ルブルム（Trichophyton rubrum）、トリコフィトン  トンズランス（Trichophyton tonsurans）、トリコフィトン  メンタグロフィテス（Trichophyton mentagrophytes）、トリコフィトン  ビオラセウム（Trichophyton violaceum）、トリコフィトン  ベルコースム（Trichophyton verrucosum）からなる群より選ばれる請求項１記載の核酸断片。
【請求項３】
サンプル中に含まれるトリコフィトン（Trichophyton）属菌の核酸を検出するための方法であって、
該サンプル中に含まれる菌から配列番号：１の配列またはその相補配列を含む核酸を抽出する工程と、
該抽出核酸に含まれる配列番号：１記載の配列またはその相補配列を含む核酸部分を増幅して増幅産物を得る工程と、
前記増幅産物中における配列番号：１の配列またはその相補配列の存在の有無を、配列番号：１の配列またはその相補配列をプローブとして用いたハイブリダイゼーション法により検出する工程と、
を有することを特徴とするトリコフィトン（Trichophyton）属菌の核酸の検出方法。
【請求項４】
前記増幅が、プライマーを用いたＰＣＲによって行われ、該プライマーが検出用の標識を有する請求項３に記載の検出方法。
【請求項５】
前記増幅工程が、配列番号：１記載の配列またはその相補配列を含む核酸部分を増幅して増幅産物を得る第１の増幅工程と、該第１の増幅工程で得られた増幅産物と標識を有するプライマーを用いて標識化された増幅物を得る第２の増幅工程とを有する請求項３に記載の検出方法。
【請求項６】
前記標識が蛍光色素であることを特徴とする請求項４または５に記載の検出方法。
【請求項７】
前記トリコフィトン属菌が、トリコフィトン  ルブルム（Trichophyton rubrum）、トリコフィトン  トンズランス（Trichophyton tonsurans）、トリコフィトン  メンタグロフィテス（Trichophyton mentagrophytes）、トリコフィトン  ビオラセウム（Trichophyton violaceum）、トリコフィトン  ベルコースム（Trichophyton verrucosum）からなる群より選ばれる請求項３乃至６のいずれか記載の検出方法。
【請求項８】
前記サンプルが動物より採取されたものである請求項３乃至７のいずれかに記載の検出方法。
【請求項９】
前記動物がヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、リス、シカ、アザラシ、ヤギ及びブタのいずれかである請求項８に記載の検出方法。
【請求項１０】
前記プローブとしての配列番号：１の配列またはその相補配列からなる核酸断片を担体に固定化して用いる請求項３乃至９のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１１】
前記プローブが固定された担体がDNAマイクロアレイとしての形態を有する請求項１０記載の検出方法。
【請求項１２】
トリコフィトン（Trichophyton）属菌検出用のプローブ固定担体であって、
担体にプローブとしての配列番号：１の配列またはその相補配列からなる核酸断片を固定したことを特徴とするプローブ固定担体。
【請求項１３】
トリコフィトン（Trichophyton）属菌検出用のキットであって、
担体にプローブとしての配列番号：１の配列またはその相補配列からなる核酸断片を固定したプローブ固定担体と、配列番号：１記載の配列またはその相補配列を含む核酸断を増幅するためのプライマーと、を有することを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリコフィトン（Trichophyton）属菌の検出および同定に有用な核酸断片、担体、検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Trichophyton属とは、Trichophyton rubrum（トリコフィトン  ルブルム  以下T.rubrum）、Trichophyton mentagrophytes（トリコフィトン  メンタグロフィテス  以下T.mentagrophytes）に代表される菌群である。このTrichophyton属菌はヒト、家畜、イヌやネコ等の愛玩動物の組織、特に皮膚角化層に感染し、増殖により感染部に激しい掻痒感を引き起こす。菌の感染部は主に足の趾間であるが、陰部や体部等にも感染し、これらの部分の感染症は、陰部白癬や体部白癬と呼ばれている。
【０００３】
従来、白癬の診断は水酸化カリウム溶液に採取した角化層を溶解させ、顕微鏡下で菌糸を確認する方法（鏡検法）により行われる。さらには適切な培地において室温または３０℃で２〜３週間、患部から採取した菌を培養した後、その形態観察を行う。
【０００４】
またこのような方法に対して、検体中の遺伝子を検出することにより、菌の有無や存在量を確認する方法も行われている。その方法として、これまで多くの方法が考案されている。その中でも応用範囲が広く、検出対象によらず適用可能な方法として、検出対象とする遺伝子配列の特徴的な部分配列（標的配列）を選び、その部分配列の有無や量を調べる方法が広く用いられている。
【０００５】
具体的には、まず、標的配列の相補鎖に相当する配列を有する核酸断片(プローブ)を用意する。次に、検体中に含まれる標的配列とプローブがハイブリッドを形成する条件でこれらを反応（ハイブリダイゼーション）させた後、これらのハイブリッドの形成を何らかの手段で検出することにより、検体中の標的核酸の有無を調べる。
【０００６】
その一例に感染症の起炎菌検査がある。江崎らは特許文献１（特開２００１−２９９３９６号公報）において、ＤＮＡプローブとして染色体ＤＮＡが固定化されたＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）を用いる微生物同定法を提案している。この方法によれば、互いにＧＣ含量の異なる複数の既知微生物由来の染色体ＤＮＡと、検体中の未知微生物由来の染色体ＤＮＡとを反応させ、生じたハイブリダイゼーション複合体を検出することで検体中の未知微生物を検出することが可能である。
【０００７】
また、大野らは感染症の起炎菌検査のためのＤＮＡマイクロアレイに用いるプローブとして、以下の各プローブを提案している。
・特許文献２（特開平６−１３３７９８号公報）
制限酵素断片を利用した真菌の検出用プローブ
・特許文献３（特開平１０−３０４８９６号公報）
緑膿菌の検出用プローブ
・特許文献４（特開平１０−３０４８９７号公報）でEscherichia coli（エシェリキア  コリ）菌、klebsiella pneumoniae（クレブシエラ  ニューモニエ）菌ならびにEnterobacter cloacae（エンテロバクター  クロアカエ）菌の制限酵素断片を利用した検出用プローブ
【特許文献１】特開２００１−２９９３９６号公報
【特許文献２】特開平６−１３３７９８号公報
【特許文献３】特開平１０−３０４８９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
白癬は特に皮膚科領域で非常に患者の多い感染症疾患であるにも関わらず、その感染起炎菌の検出及び特定が難しい場合が多い。従来から行われている水酸化カリウム溶液に角化層を溶解させ、顕微鏡下で菌糸を確認する方法は、評価者の熟練を必要とする。また、培養法では２〜３週間の培養が必要である上に、その培養陽性率は６０％程度であり、いずれの方法においても正確に検出することが難しい。
【０００９】
また、上記従来技術に示したＤＮＡマイクロアレイは、染色体ＤＮＡ或いは制限酵素断片等のＤＮＡプローブを利用するものであり、いずれも微生物から直接取り出したＤＮＡを材料としている。そのため、一度に大量に調製することは困難であり、臨床診断用には適さないという問題があった。また、罹患患者の多い疾患であるにもかかわらず、白癬起炎菌に特異的なＤＮＡプローブによる検出はあまり行われていない。これにより、白癬起炎菌の検出においては依然培養法、鏡検法に頼らざるを得ない状況となっている。
【００１０】
本発明は、上記に鑑みてなされたものであり、長時間を要する培養法に比べてきわめて短時間でTrichophyton属菌を検出する方法を提供することを目的とする。また、培養法、鏡検法に対して高感度かつ正確にTrichophyton属菌を検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の核酸断片は、トリコフィトン（Trichophyton）属菌と特異的にハイブリダイズ可能である、配列番号：１の配列またはその相補配列からなることを特徴とする核酸断片である。
【００１２】
本発明の検出方法は、サンプル中に含まれるトリコフィトン（Trichophyton）属菌の核酸を検出するための方法であって、
該サンプル中に含まれる菌から配列番号：１の配列またはその相補配列を含む核酸を抽出する工程と、
該抽出核酸に含まれる配列番号：１記載の配列またはその相補配列を含む核酸部分を増幅して増幅産物を得る工程と、
前記増幅産物中における配列番号：１の配列またはその相補配列の存在の有無を、配列番号：１の配列またはその相補配列をプローブとして用いたハイブリダイゼーション法により検出する工程と、
を有することを特徴とするトリコフィトン（Trichophyton）属菌の核酸の検出方法である。
【００１３】
本発明のプローブ固定担体は、トリコフィトン（Trichophyton）属菌検出用のプローブ固定担体であって、担体にプローブとしての配列番号：１の配列またはその相補配列からなる核酸断片を固定したことを特徴とするプローブ固定担体である。
【００１４】
本発明のキットは、トリコフィトン（Trichophyton）属菌検出用のキットであって、担体にプローブとしての配列番号：１の配列またはその相補配列からなる核酸断片を固定したプローブ固定担体と、配列番号：１記載の配列またはその相補配列を含む核酸断を増幅するためのプライマーと、を有することを特徴とするキットである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、従来法に対して高感度かつ正確にTrichophyton属菌の含まれる可能性のあるサンプルからTrichophyton属菌の検出を行うことが可能である。また、本発明ではサンプルから抽出した核酸にTrichophyton属菌以外に由来する核酸が存在した場合にも、正確にTrichophyton属菌の存在の有無を検出することが可能である。また本発明は、ＤＮＡマイクロアレイをはじめとする固相ハイブリダイゼーション反応において特に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明者らは、サンプル中でのTrichophyton属菌の存在の有無をハイブリダイゼーション法を用いて検出する際に、配列番号：１の配列またはその相補配列からなる核酸断片をプローブとして用いることで上記問題点が解決できることを見出した。このプローブとしての核酸断片は
5'  ggcggaaccagggcttttactgtga  3'（配列番号：１）
の配列またはその相補配列からなる。
【００１７】
また、本発明のサンプル中に含まれるトリコフィトン（Trichophyton）属菌の核酸を検出するための方法は、以下の工程を有する。
（１）サンプル中に含まれる菌から配列番号：１の配列またはその相補配列を含む核酸を抽出する工程。
（２）抽出核酸に含まれる配列番号：１記載の配列またはその相補配列を含む核酸部分を増幅して増幅産物を得る工程。
（３）増幅産物中における配列番号：１の配列またはその相補配列の存在の有無を、配列番号：１の配列またはその相補配列をプローブとして用いたハイブリダイゼーション法により検出する工程。
【００１８】
この核酸断片をプローブとして用いる本発明にかかるTrichophyton属菌の検出方法は、ヒトをはじめとする動物より得られるサンプルからも正確にTrichophyton属菌の検出を行うことが可能であることを特長とする。つまり、サンプルより核酸を抽出した際に、Trichophyton属菌以外に由来する核酸が存在した場合でも、正確にTrichophyton属菌の検出が可能であり、また、Trichophyton属菌以外に由来する核酸が存在し、Trichophyton属菌が存在しない場合はいずれの核酸も検出しないということである。
【００１９】
検出対象となるTrichophyton属の菌株としては、トリコフィトン  ルブルム（Trichophyton rubrum）、トリコフィトン  トンズランス（Trichophyton tonsurans）、トリコフィトン  メンタグロフィテス（Trichophyton mentagrophytes）、トリコフィトン  ビオラセウム（Trichophyton violaceum）及びトリコフィトン  ベルコースム（Trichophyton verrucosum）を挙げることができる。
【００２０】
検体としてのサンプルは、動物より採取されたものなど目的に応じて適宜選択される。サンプルの採取対象である動物としては、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、リス、シカ、アザラシ、ヤギ及びブタなどを挙げることができる。
【００２１】
プローブと標的配列を有する核酸断片との反応（ハイブリダイゼーション）により得られるハイブリットの形成の有無は、この分野において公知の各種の方法により検出することができる。簡便な方法として、検出可能な標識がハイブリットに取り込まれるようにして、ハイブリッドの形成の有無を検出する方法がある。例えば、サンプル中にある核酸のうちの標的配列を含む核酸断片をＰＣＲにより増幅する際に、増幅される核酸断片の一部となるプライマーに予め標識を付与しておく方法や伸長反応に利用するオリゴヌクレオチドに標識を付与しておくことで、標的配列を含む核酸断片の増幅産物に標識を付与することができる。標識化された増幅産物をプローブと反応させて、標的配列とプローブ配列をハイブリダイゼーションさせることで標識を有するハイブリッドを得ることができる。このハイブリッドはそこに付与した標識により検出可能となる。
【００２２】
標識としては、種々の物質が利用でき、簡便な検出装置を利用するという点からは、蛍光色素が好ましい。
【００２３】
ＤＮＡマイクロアレイの形態のようにプローブを担体に固定してサンプルとしての核酸断片と反応させるとよい。
【００２４】
以下、本発明の好適な実施形態について更に詳細に説明する。
【００２５】
まず、配列番号：１の配列またはその相補配列からなる核酸断片とハイブリダイズ可能な配列を含む核酸部分を増幅するためのプライマーを設計する。このとき設計するプライマーは、配列番号：１またはその相補配列をプローブとして用いて特異的に検出可能な標的配列を有する部分を含む核酸断片のＰＣＲでの増幅を可能とするものであれば、Trichophyton属菌に特異的である必要はない。すなわち、検出は配列番号：１の配列またはその相補配列を有する核酸断片をプローブとして用いることで行われるからである。また、ここで設計したプライマーには検出可能な標識物質を付与しておく。こうすることで、プローブとハイブリダイズした増幅核酸断片を標識物質を介して検出し、Trichophyton属菌の有無を確認することが出来る。標識物質としては、どのような標識物質でも特に制限なく本発明に用いることが可能であるが、一般に高感度な検出が可能な蛍光物質等を用いる。中でも、Ｃｙ３、Ｃｙ５を代表とするＣｙＤｙｅ(アマシャムバイオサイエンス社製)は、核酸標識用の蛍光物質として良く用いられ、これらの蛍光物質は本発明において特に有効である。
【００２６】
このように設計・合成されたプライマーと、サンプルより抽出した核酸を含む、調整された規定の増幅混合液を調製し、増幅反応を行う。この増幅反応により、所望とする核酸部分を有する標識されたプライマーを有する増幅核酸断片からなる増幅産物（プライマー増幅産物）を得ることができる。なお、増幅は、配列番号：１記載の配列またはその相補配列を含む核酸部分を増幅して増幅産物を得る第１の増幅工程と、該第１の増幅工程で得られた増幅産物と標識を有するプライマーを用いて標識化された増幅物を得る第２の増幅工程とを有していてもよい。すなわち、標識を持たないプライマーを用いてサンプルより抽出した核酸のPCRによる増幅工程を１回以上行い、この増幅工程により得られた増幅産物に対して標識付与のためのPCRによる増幅を行ってもよい。
【００２７】
ここで得られたプライマー増幅産物とプローブ（配列番号：１の配列、またはその相補配列からなる核酸断片）とを適当な条件下においてハイブリダイズさせる。配列番号：１はTrichophyton属菌に特異的な配列であり、ハイブリダイズさせたときにTrichophyton属菌に由来する核酸断片のみがハイブリッドを形成する。つまりこのとき、初期サンプル中（ＰＣＲ前のサンプル）にTrichophyton属菌が含まれていなかった場合は、プローブとハイブリダイズしうる核酸がプライマー増幅産物中に存在しないため、ハイブリッドを形成しない。すなわち、本発明では、配列番号：１の配列またはその相補配列がプローブとして利用される。
【００２８】
なお、配列番号：１の配列またはその相補配列からなるプローブは、検出系の形態に応じて、プローブとしての機能が損なわれない範囲内で、固相（基板）への固定に必要な構造や塩基（またはリンカーとしての塩基配列）などが更に付加されていてもよい。
【００２９】
このようにしてハイブリダイズさせた後、ハイブリダイズしたプライマーにあらかじめ付与されていた標識物質を検出する。このとき、標識物質より得られるシグナルの強度は利用した標識物質の種類によって異なるが、サンプル中にTrichophyton属菌が存在しなかった場合はそのシグナル強度はバックグラウンドとほぼ同等の強度となる。しかしながら特に定量的に検出可能な標識物質を使用した場合、初期サンプル中に存在するTrichophyton属菌が微量であれば、シグナル強度はバックグラウンドに近い値となりうる。この場合は有無を確認するためにバックグラウンドに対するシグナル強度をS/N比として算出し、その有無を評価するのが望ましい。
【００３０】
本発明は固相上でのハイブリダイゼーション反応に特に有効である。固相上に検出されうる核酸に対するプローブをそれぞれ複数固定もしくは吸着させたプローブ固定担体としておくことにより、より正確な判定を行うことが可能である。固相ハイブリダイゼーションを利用した検出デバイスとしては、代表的な固相材料としてガラス、プラスチック、金属などが用いられるが、本発明はこれらに特に制限なく適用可能である。中でも平板状のデバイスに多数のDNAプローブが固定されたDNAチップ（DNAマイクロアレイ、遺伝子チップ）などは、本発明の方法が特に有効である。
【００３１】
上記の構成のプローブ固定担体と、配列番号１の配列またはその相補配列を含む核酸断片の増幅を行うためのプライマーとを少なくとも用いてTrichophyton属菌検出用のキットを構成することができる。
【実施例】
【００３２】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
＜実施例１＞ T.rubrumの検出
（１）核酸の抽出
MP Biomedicals社製細胞破砕装置 FastPrep FP100A、及び核酸抽出キット FastDNA SPIN Kit for Soilを用いてT.rubrum（ATCC10218）からの核酸抽出を行った。手法は核酸抽出キット付属のマニュアルに従った。
（２）標識用プライマーの設計
T.rubrumを検出するために、標識物質を結合させた配列R1を有するプライマーを設計した。また配列R1の5'末端部分にＣｙ３を標識した。
R1：（Cy3）5' gtgcggcccagaacatctaagg 3'（配列番号：２）
（３）標識用プライマーの合成
実施例１の（2）で設計した標識用プライマーを合成した。プライマーの合成は定法に従ってDNA合成機で合成した。配列R1の5'末端側にCy3をそれぞれ結合させた。精製はＨＰＬＣ精製によって行った。得られたプライマーは、ＴＥバッファーにて１０μＭの濃度に希釈した。
（4）標識PCR増幅
実施例１の（3）で合成した標識プライマー、T.rubrumの核酸が存在するサンプル、タカラバイオ株式会社製PCRキット  TaKaRa Ex Taqを用いてPCR反応を行った。PCRの反応条件は以下のようなプロトコルによって行った。
【００３３】
【表１】
2007236338.tif 000002
【００３４】
上記表１の組成の反応液を図１のプロトコルにしたがって、市販のサーマルサイクラーを用いて増幅反応を行った。反応終了後、精製用カラム（QIAGEN QIAquick PCR Purification Kit）を用いて精製した。精製後の液量が50μlになるように調製した。
【００３５】
(5)DNAマイクロアレイの作製
(5)-1ガラス基板の洗浄
合成石英のガラス基板（サイズ：25mmｘ75mmｘ1mm、飯山特殊ガラス社製）を耐熱、耐アルカリのラックに入れ、所定の濃度に調製した超音波洗浄用の洗浄液に浸した。一晩洗浄液中で浸した後、20分間超音波洗浄を行った。続いて基板を取り出し、軽く純水ですすいだ後、超純水中で20分超音波洗浄をおこなった。次に80℃に加熱した１N水酸化ナトリウム水溶液中に10分間基板を浸した。再び純水洗浄と超純水洗浄を行い、DNAチップ用の石英ガラス基板を用意した。
(5)-2表面処理
シランカップリング剤KBM-603(信越シリコーン社製)を、1%の濃度となるように純水中に溶解させ、2時間室温で攪拌した。続いて、先に洗浄したガラス基板をシランカップリング剤水溶液に浸し、20分間室温で放置した。ガラス基板を引き上げ、軽く純水で表面を洗浄した後、窒素ガスを基板の両面に吹き付けて乾燥させた。次に乾燥した基板を120℃に加熱したオーブン中で1時間ベークし、カップリング剤処理を完結させ、基板表面にアミノ基を導入した。次いで同仁化学研究所社製のN-マレイミドカプロイロキシスクシイミド(N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimido)（以下EMCSと略す）を、ジメチルスルホキシドとエタノールの1:1混合溶媒中に最終濃度が0.3mg/mlとなるように溶解したEMCS溶液を用意した。ベークの終了したガラス基板を放冷し、調製したEMCS溶液中に室温で2時間浸した。この処理により、シランカップリング剤によって表面に導入されたアミノ基とEMCSのスクシイミド基が反応し、ガラス基板表面にマレイミド基が導入された。EMCS溶液から引き上げたガラス基板を、先述のＥMCSを溶解した混合溶媒を用いて洗浄し、さらにエタノールにより洗浄した後、窒素ガス雰囲気下で乾燥させた。
(5)-3 プローブDNAの合成
配列番号：１の配列（5' ggcggaaccagggcttttactgtga 3'）からなるプローブAを合成した。プローブDNAはガラス基板に対して共有結合させるため、定法に従って5'末端にチオール化処理を施したのち、DNA合成時に副反応を避けるために結合してある保護基を全て除去し、さらにHPLC精製および脱塩処理を施した。得られたプローブDNAは純水に溶解し、それぞれ、最終濃度（インク溶解時）10μMとなるように分注した後、凍結乾燥を行い、水分を除いた。
(5)-4 BJプリンターによるDNA吐出、および基板への結合
グリセリン7.5重量（wt）%、チオジグリコール7.5wt%、尿素7.5wt%、アセチレノールEH(川研ファインケミカル社製)1.0wt%を含む水溶液を用意した。続いて、先に用意したプローブを上記の混合溶媒に規定濃度(10μM)となるように溶解した。得られたDNA溶液をバブルジェットプリンター（商品名：BJF-850  キヤノン社製）用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。なおここで用いたバブルジェットプリンターは平板への印刷が可能なように改造を施したものである。またこのバブルジェットプリンターは、所定のファイル作成方法に従って印字パターンを入力することにより、約5ピコリットルのDNA溶液を約120マイクロメートルピッチでスポッティングすることが可能となっている。続いて、この改造バブルジェットプリンターを用いて、印字操作をおこなった。1枚のDNAチップあたり、16スポットの吐出が行われるよう印字のパターンをあらかじめ作成し、印字した。印字が確実に行われていることを拡大鏡等により確認した後、30分間加湿チャンバー内に静置し、ガラス基板表面のマレイミド基と核酸プローブ末端のチオール基とを反応させた。
【００３６】
(5)-5洗浄
30分間の反応後、100mMのNaClを含む10mMのリン酸緩衝液(pH7.0)により表面に残ったDNA溶液を洗い流し、ガラス基板表面に一本鎖DNAが固定したDNAマイクロアレイを得た。
【００３７】
(6)ハイブリダイゼーション
実施例１の(5)で作製したDNAマイクロアレイと実施例1の（4）で作製したPCR産物を用いて検出反応を行った。
(6)-1 DNAマイクロアレイのブロッキング
BSA（牛血清アルブミンFraction V：Sigma社製）を1wt％となるように100mM NaCl / 10mM Phosphate Bufferに溶解し、この溶液に4で作製したDNAマイクロアレイを室温で2時間浸し、ブロッキングを行った。ブロッキング終了後、0.1wt％SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む２ｘSSC溶液（NaCl 300mM 、Sodium Citrate (trisodium citrate dihydrate, C6H5Na3・2H2O) 30mM、p.H. 7.0）で洗浄を行った後、純水でリンスしてからスピンドライ装置で水切りを行った。
（6）-2 ハイブリダイゼーション溶液の調製
最終濃度が下記の構成となるようハイブリダイゼーション溶液を調製した。
【００３８】
＜ハイブリダイゼーション溶液＞
6 x SSPE / 10% Formamide / 0.05% SDS / PCR産物
(6xSSPE: NaCl 900mM、NaH2PO4・H2O 60mM、EDTA 6mM、p.H. 7.4)
（6）-3 ハイブリダイゼーション
水切りしたDNAマイクロアレイをハイブリダイゼーション装置（Genomic Solutions Inc.   Hybridization Station）にセットし、以下に示すハイブリダイゼーション条件でハイブリダイゼーション反応を行った。
【００３９】
＜ハイブリダイゼーション条件＞
Injection →  92℃  2min  →  50℃  4hr  →  Wash  2ｘSSC / 0.1% SDS  at 25℃  →  Wash  2 x SSC at 20℃  → (Rinse with H2O  :  Manual)  →  Spin dry
(7) 蛍光測定
ハイブリダイゼーション反応終了後のDNAマイクロアレイをDNAマイクロアレイ用蛍光検出装置（Axon社製、GenePix 4000B）を用いで蛍光測定を行った。励起波長５３２nmの測定モードによってＣｙ３の蛍光輝度を測定した。Cｙ３蛍光輝度の測定結果を下記表２に示す。また、測定は2回実施してその平均値を測定結果とした。
【００４０】
【表２】
2007236338.tif 000003
【００４１】
これらの結果から、Trichophyton属菌を検出するための配列番号：１を有するプローブを用いることでT.rubrumが検出できることを確認した。
【００４２】
＜比較例１＞ Candida albicansの検出
（1）核酸の抽出
実施例１の（1）に記載の方法によりC.albicans(ATCC18804)から核酸を抽出した。
（2）標識用プライマーの設計
実施例１の（2）に記載の方法によりプライマー配列を決定した。
（3）標識プライマーの合成
実施例１の（3）に記載の方法でプライマー R1を合成した。また配列R1の5'末端部分にCy3を標識した。
（4）標識PCR増幅
実施例１の（4）に記載の方法で標識PCR増幅を行った。
【００４３】
(5)  DNAマイクロアレイの作製
実施例１の（5）に記載の方法でDNAマイクロアレイを作製した。
（6）ハイブリダイゼーション
実施例２の(5)で作製したDNAマイクロアレイと実施例2の（4）で作製したPCR産物を用いて検出反応を行った。
(7) 蛍光測定
実施例１の（７）に記載の方法でCy3の蛍光輝度を測定した。Cy3の蛍光輝度の測定結果を下記表３に示す。
【００４４】
【表３】
2007236338.tif 000004
【００４５】
これらの結果からTrichophyton属菌を検出するための配列番号：１を有するプローブではCandida albicansは検出できないことを確認した。
【００４６】
＜実施例２＞ 増幅ステップを加えたT.rubrumの検出
（1）核酸の抽出
実施例１の（1）に記載の方法によりT.rubrum(ATCC10218)より核酸を抽出した。
（2）増幅用プライマーの設計
実施例２の（1）で抽出した核酸に対し、配列番号：１に記載の配列を有する核酸部分、またはその相補配列を有する核酸部分を増幅可能である以下の配列からなるプライマーを2種類設計した。
F1：5' gccctatcaactttcgatggtaggatag 3' （配列番号：３）
R2：5' aatgctctatccccagcacgac 3' （配列番号：４）
（3）増幅用プライマーの合成
実施例２の（2）で設計した増幅用プライマーを合成した。プライマーの合成は定法に従ってDNA合成機で合成した。精製はHPLC精製によって行った。得られたプライマーはそれぞれTEバッファーにて１０μMの濃度に希釈した。
（4）PCR増幅
実施例２の（3）で合成したプライマー、実施例３の（1）で抽出した核酸、タカラバイオ株式会社製PCRキット  TaKaRa Ex Taqを用いてPCR反応を行った。PCRの反応条件は以下のようなプロトコルによって行った。
【００４７】
【表４】
2007236338.tif 000005
【００４８】
上記表４の組成の反応液を図２のプロトコルにしたがって、市販のサーマルサイクラーを用いて増幅反応を行った。反応終了後、精製用カラム（QIAGEN QIAquick PCR Purification Kit）を用いて精製した。精製後の液量が50μlになるように調製した。得られたPCR産物の一部を取り、定法に従って電気泳動を行い、1200bp相当のバンドが出ていることを確認した。電気泳動の画像を図３に示す。
（5）標識用プライマー設計
実施例１の（2）に記載の方法によりプライマー配列を決定した。
（6）標識用プライマーの合成
実施例１の（3）に記載の方法でプライマー R1を合成した。また配列R1の5'末端部分にCy3を標識した。
（7）標識PCR増幅
実施例２の（6）で合成した標識プライマーR1、実施例２の（4）で調製したT.rubrumのＰＣＲ産物、タカラバイオ株式会社製PCRキット  TaKaRa Ex Taqを用いてPCR反応を行った。PCRの反応条件は以下のようなプロトコルによって行った。
【００４９】
【表５】
2007236338.tif 000006
【００５０】
上記表５の組成の反応液を図１のプロトコルにしたがって、市販のサーマルサイクラーを用いて増幅反応を行った。反応終了後、精製用カラム（QIAGEN QIAquick PCR Purification Kit）を用いて精製した。精製後の液量が50μlになるように調製した。
【００５１】
(8)  DNAマイクロアレイの作製
実施例１の（5）に記載の方法でDNAマイクロアレイを作製した。
（9）ハイブリダイゼーション
実施例２の(8)で作製したDNAマイクロアレイと実施例３の（7）で作製したPCR産物を用いて検出反応を行った。
(10) 蛍光測定
実施例１の（７）に記載の方法でCy3の蛍光輝度を測定した。Cy3の蛍光輝度の測定結果を下記表６に示す。
【００５２】
【表６】
2007236338.tif 000007
【００５３】
この結果から、Trichophyton属菌を検出するための配列番号：１を有するプローブを用いることで、増幅ステップを加えてもT.rubrumが検出できることを確認した。
【００５４】
＜比較例２＞ 増幅ステップを加えたCandida albicansの検出
（1）核酸の抽出
実施例１の（1）に記載の方法によりCandida albicans(ATCC18804)から核酸を抽出した。
（2）増幅用プライマーの設計
実施例２の（2）に記載の方法で増幅用プライマーを決定した。
（3）増幅用プライマーの合成
実施例２の（3）に記載の方法で増幅用プライマーを合成した。
（4）PCR増幅
比較例２の（3）で合成したプライマー、比較例２の（1）で抽出した核酸、タカラバイオ株式会社製PCRキット  TaKaRa Ex Taqを用いてPCR反応を行った。また、PCR増幅の反応条件は実施例２の（4）に記載の方法で行った。反応終了後、精製用カラム（QIAGEN QIAquick PCR Purification Kit）を用いて精製した。精製後の液量が50μlになるように調製した。得られたPCR産物の一部を取り、定法に従って電気泳動を行い、1200bp相当のバンドが出ていることを確認した。電気泳動の画像を図４に示す。
（5）標識用プライマー設計
実施例１の（2）に記載の方法によりプライマー配列を決定した。
（6）標識用プライマーの合成
実施例１の（3）に記載の方法でプライマー R1を合成した。また配列R1の5'末端部分にCy3を標識した。
（7）標識PCR増幅
比較例２の（6）で合成した標識プライマーR1、比較例２の（4）で調製したT.rubrumのＰＣＲ産物、タカラバイオ株式会社製PCRキット  TaKaRa Ex Taqを用いてPCR反応を行った。また、標識PCR増幅の反応条件は実施例３の（7）に記載の方法で行った。
(8)  DNAマイクロアレイの作製
実施例1の（5）に記載の方法でDNAマイクロアレイを作製した。
(9）ハイブリダイゼーション
比較例２の(8)で作製したDNAマイクロアレイと実施例4の（7）で作製したPCR産物を用いて検出反応を行った。
(10) 蛍光測定
実施例1の（７）に記載の方法でCy3の蛍光輝度を測定した。Cy3の蛍光輝度の測定結果を下記表７に示す。
【００５５】
【表７】
2007236338.tif 000008
【００５６】
この結果から、Trichophyton属菌を検出するための配列番号：１を有するプローブで、Candida albicansが検出されないことを確認した。
【００５７】
＜実施例３＞ 足白癬患者からのTrichophyton属菌の検出
（1）核酸の抽出
実施例１の（1）に記載の方法により、T.rubrumによる足白癬患者から採取した皮膚組織より核酸を抽出した。
（2）増幅用プライマーの設計
実施例２の（2）に記載の方法で増幅用プライマーを決定した。
（3）増幅用プライマーの合成
実施例２の（3）に記載の方法で増幅用プライマーを合成した。
（4）PCR増幅
実施例３の（3）で合成したプライマー、実施例３の（1）で抽出した核酸、タカラバイオ株式会社製PCRキット  TaKaRa Ex Taqを用いてPCR反応を行った。また、PCR増幅の反応条件は実施例２の（4）に記載の方法で行った。反応終了後、精製用カラム（QIAGEN QIAquick PCR Purification Kit）を用いて精製した。精製後の液量が50μlになるように調製した。得られたPCR産物の一部を取り、定法に従って電気泳動を行い、1200bp相当のバンドが出ていることを確認した。電気泳動の画像を図５に示す。
（5）標識用プライマー設計
実施例１の（2）に記載の方法によりプライマー配列を決定した。
（6）標識用プライマーの合成
実施例１の（3）に記載の方法でプライマー R1を合成した。また配列R1の5'末端部分にCy3を標識した。
（7）標識PCR増幅
実施例３の（6）で合成した標識プライマーR1、実施例３の（4）で調製したＰＣＲ産物、タカラバイオ株式会社製PCRキット  TaKaRa Ex Taqを用いてPCR反応を行った。また、標識PCR増幅の反応条件は実施例３の（7）に記載の方法で行った。
【００５８】
(8)  DNAマイクロアレイの作製
実施例1の（5）に記載の方法でDNAマイクロアレイを作製した。
（9）ハイブリダイゼーション
実施例３の(8)で作製したDNAマイクロアレイと実施例５の（7）で作製したPCR産物を用いて検出反応を行った。
(10)蛍光測定
実施例１の（７）に記載の方法でCy3の蛍光輝度を測定した。Cy3の蛍光輝度の測定結果を下記表８に示す。
【００５９】
【表８】
2007236338.tif 000009
【００６０】
この結果から、ヒトより採取されたサンプルから、Trichophyton属菌を検出するための配列番号：１を有するプローブでT.rubrumが検出されることを確認した。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ＰＣＲ増幅におけるプロトコルを示す図である。
【図２】ＰＣＲ増幅におけるプロトコルを示す図である。
【図３】増幅産物の電気泳動の結果を示す図である。
【図４】増幅産物の電気泳動の結果を示す図である。
【図５】増幅産物の電気泳動の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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