(57)【要約】【課題】DNAチップを用いた遺伝子発現解析において、１回の計測に必要とされる試料の量を減らし、そのコストと手間の削減を図ること。【解決手段】試料とのハイブリダイゼーションに使用される面積が100mm2以下であるDNA固相化試料を用いることにより、15μg以下のトータルRNAを含むサンプルの遺伝子発現解析を行う方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料とのハイブリダイゼーションに使用される面積が100mm2以下であるDNA固相化試料を用いることにより、15μg以下のトータルRNAを含むサンプルの遺伝子発現解析を行う方法。
【請求項２】
前記トータルRNAが2μg以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルが20〜30μlの液量である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルが100〜500μmの厚みで固相化試料に載せられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルが250〜300μmの厚みで固相化試料に載せられる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記試料とのハイブリダイゼーションに使用される面積が25mm2以下である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微量試料計測方法に関する。より詳細には、遺伝子発現解析で１回の計測に必要とされるトータルRNA量を低減することにより、微量試料中の遺伝子発現量の計測を可能にする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
複数遺伝子の発現解析を行う遺伝子診断では、操作の簡便さと必要とされる試料が少ないという点で、DNAチップが汎用されている。こうしたDNAチップを用いた遺伝子発現解析では、計測に必要な試料の量を減らすことにより、増幅反応を行うことなく目的遺伝子の発現解析を行うことができ、また逆転写反応で必要な試薬の量も低減させることができるため、全体としてのコスト低減を図ることができる。
【０００３】
一般に、DNAチップを用いた遺伝子発現解析では、増幅反応を行うことなく直接トータルRNAからcDNAを合成して解析に供する場合、１回の計測に大体20〜30μgのトータルRNAを必要とする（非特許文献１及び２）。一方、通常患者から無理なく採取される血液は2.5ml程度であり、ここから得られるトータルRNA量は約0.5〜10μg程度である。したがって、通常の採血量では、チップにかける前段階として増幅反応が不可欠となる。
【０００４】
もし、0.5〜10μg程度の微量なトータルRNA量による遺伝子発現解析が可能になれば、遺伝子診断は従来に比較して格段にコストと手間を削減することが可能となる。
【０００５】
【非特許文献１】Hughes, T.R. et al., “Expression profiling using microarray fabricated by an ink-jet oligonucleotide synthesizer.” Nature Biotechnol. 19, 342-347 (2001)
【非特許文献２】Barczak, A. et al., “Spotted long oligonucleotide arrays for human gene expression analysis.” Genome Res. 13, 1775-1785 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、DNAチップを用いた遺伝子発現解析において、１回の計測に必要とされる試料の量を減らし、そのコストと手間の削減を図ることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者らは上記課題を解決するため、プローブ数、サンプル量、ハイブリダイゼーション面積、液の厚み等、種々のパラメータと検出感度の関係について、実際のチップを用いて検討した。その結果、チップ上のハイブリダイゼーションに用いられる面積を縮小することにより、従来の検出感度を維持したまま、解析に必要な試料RNAの量を効果的に低減できることを確認した。
【０００８】
すなわち、一般に逆転写反応に用いられるトータルRNAの量は 20μgで、チップ上のハイブリダイゼーションに用いられる面積は25mm x 40mm = 1000mm2 である。本発明では、ハイブリ面積を従来の面積の1/10量である、10mm x 10mm ＝ 100mm2に縮小した。そして、従来の計測と同様の信号強度を得るために必要なトータルRNAの量も1/10の2μgにできることを確認した。
【０００９】
以上の知見に鑑み、本発明は、試料とのハイブリダイゼーションに使用される面積が100mm2以下であるDNA固相化試料を用いることにより、15μg以下のトータルRNAを含むサンプルの遺伝子発現解析を行う方法を提供する。
【００１０】
上記方法において、トータルRNAを含むサンプルの液量は、20〜30μl程度であることが適当である。
【００１１】
また、DNA固相化試料に載せられるサンプルの厚みは、100〜500μm程度が適当であり、250〜300μm程度がより適当である。
【００１２】
試料とのハイブリダイゼーションに使用される面積は、25mm2以下に縮小すると、さらに微量の試料を測定することが可能となる。
【００１３】
本発明の方法では、前記トータルRNAが2μg以下であっても、十分な検出感度で遺伝子発現解析を行うことができる。通常患者から無理なく採取される2.5mlの血液から得られるトータルRNAを用いて感度よい遺伝子発現解析を行うことができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、チップ上のハイブリダイゼーションに用いられる面積を従来の1/10程度に縮小することにより、逆転写反応に必要なトータルRNAの量を1/10の2μgまで低減することができる。この方法では、ハイブリ面積が減るため、固相化試料の固定可能なプローブ数も減るが、診断向けに絞り込まれたマーカー遺伝子を搭載したチップ等による遺伝子発現解析には、有用な技術である。本発明の方法により、酵素、蛍光色素などの試薬代を削減し、検出コストを低減することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１６】
実施例１：各種パラメータの検討
以下各種パラメータを変化させ、増幅反応なしで検出可能な組合せについて検討した。
プローブ数  ：１〜８１００（１００μｍピッチ）
サンプル量  ：０．２〜５μｇ
液      量  ：２０〜３０μｌ
ハイブリ面積：１０×１０ｍｍ２以下
液の厚み    ：２５０〜３００μｍ
【００１７】
10x10 mm2 の領域において可能なスポット数を検討した。最もスポット間が近接した状態として、100μｍピッチでスポットすることが可能である。１つのピンがスポットできる領域は、4.5x4.5 mm2であるため、45 x 45 = 2025 スポット/ピンでスポットすることが可能である。10x10 mm2 の領域においては4本のピンを用いるので、最大2025スポット/ピンx 4本=8100のスポットが可能である。
【００１８】
ハイブリを行うためにチャンバーは、両面テープを加工したものを用いた。この場合、液量が少なければ少ないほどターゲット液の濃度は濃くなる。しかし、液量を少なくし過ぎると、液厚も小さくなる。一方、ハイブリダイゼーション中にハイブリ液から気泡が発生するが、その気泡を円滑に回転させることは均一なハイブリダイゼーションを行うために必須である。異なる厚みの両面テープを用いて実験を行った結果、最も良好なハイブリダイゼーション結果を与えるテープの厚みは 300 μm 程度であることがわかった。
【００１９】
液の厚みが決まれば、ハイブリに必要な液量も決定される。10 mm x 10 mm x 0.3 mm = 30 mm3 = 30 μl となり、ハイブリ液量は 30 μlと決定された。
【００２０】
実施例２：ハイブリ面積と検出感度の関係
１．チップの作製方法
チップにはポリリジン・スライドを用いた。市販のスライドガラスをスライドラックにセットし、アルカリ洗浄液内に浸し、2 時間振盪した。アルカリ洗浄液の組成は、超純水560 ml、NaOH 140 ml、95% エタノール 840 ml の比率とした。超純水は汲み立てで新鮮なものを用いた。次に、超純水を適量（約1200 〜1500 ml）入れた 2 l のビーカーに線上が終了したスライドラックを入れ、5 〜6回程度激しく上下させてリンスした。この洗浄作業を5回繰り返し、スライドガラスについているアルカリ洗浄溶液を完全に洗い流した。
【００２１】
次に、ポリリジン溶液を作製した。ポリリジン溶液の組成は、ポリリジン 140 ml, PBS 140 ml, 超純水 1120 ml である。ポリリジン溶液にスライドラックを浸し、1 時間振盪した後、再び超純水による洗浄を5回繰り返し、スライドに付着している余分なポリリジンを迅速に完全に洗い流した。超純水の洗浄が終了したスライドラックの水を切り、 800rmp, 5分間遠心した。完全にスライドに付着している水滴がなくなったら、真空乾燥機にスライドラックを移し、真空乾燥機内を始動させて、庫内を真空状態にすると同時に、温度を80℃まで上げて、4時間スライドを乾燥させた。乾燥したスライドを保持するスライドラックを真空乾燥機から取り出し、スポットをおこなうまで窒素雰囲気下で保存した。
【００２２】
次に、ポリリジン・スライドをスポッタに並べ、オリゴヌクレオチド或いは cDNA をスポットしていく。オリゴヌクレオチドあるいはcDNAはあらかじめ384プレート内に分注されている。ポリリジン・スライドガラス上に複数の遺伝子をスポットした後、ブロッキング工程を行った。これは、ポリリジン・スライドガラス上に遺伝子が載っていない領域にターゲットとして投与する、ラベリングされた遺伝子の非特異的吸着を低減するためである。ブロッキング溶液の組成は、1-Methyl-2-pyrrolidone 335ml, 無水コハク酸5.5g, 1M Sodium Borate (pH 8.0) 15mlとした。ポリリジン・スライドガラスを保持したスライドラックをブロッキング溶液に沈め、5回程度上下させて液体とガラスを馴染ませた後、振盪機で20分振盪させた。スライドラックを95℃の超純水に入ったガラスチャンバーに入れ、5回上下させた後、1〜2分振盪させ、次いで95%エタノールの入ったガラスチャンバーに入れ、5回上下させた後、1〜2分振盪させた。このスライドラックを遠心機にセットし、800rpmにて約１分遠心乾燥し、ハイブリダイゼーションの操作を行うまでスライドケースに入れて保存した。
【００２３】
２．チップへのハイブリダイゼーションと検出方法
被験者より採取された血液 2.5 ml からtotal RNA 5μgを精製した。精製にはPAXgene (Qiagene 社)を使用した。Total RNA 2μgを用いて、蛍光標識された cDNA ターゲットを作製した。これを前項記載のチップにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションインキュベーターには Hybridization incubator HP-100（Taitec 社）を用いた。注入口はシールで密封した。
【００２４】
一昼夜ハイブリダイゼーション反応を行った後、スライドを洗浄した。その後、スライドを遠心機（Himac CF7D2, 日立製作所）により遠心し、乾燥させた後、蛍光検出スキャナー(Agilent DNA microarray scanner, G2565BA)にて測定を行った。
【００２５】
３．Total RNA量と検出感度の関係
従来法としてハイブリ面積25mm×40mm＝1000mm2で検出を行い、本発明の方法としてハイブリ面積10mm×10mm＝100mm2で検出を行った。結果を表１に示す。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
また、従来法としてハイブリ面積25mm×10mm＝250mm2で検出を行い、本発明の方法としてハイブリ面積5mm×5mm＝25mm2で検出を行った。結果を表２に示す。
【００２８】
【表２】
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【００２９】
1000mm2/arrayから100mm2/arrayへ面積を1/10 にすることで検出可能なターゲットの濃度を10倍に高め、検出感度を結果として10倍にすることができた。また、100mm2/arrayから25mm2/arrayへ面積を1/4 にすることでターゲットの濃度を4倍に高め、検出感度を結果として4倍にすることができた。以上のように、面積を小さくすればするほど、ターゲット液の濃度を高めることができ、微量な試料を感度よく検出できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明によれば、患者に負担のかからない2.5ml の血液量で、DNAチップ等による遺伝子発現解析ができる。よって、本発明は遺伝子診断をはじめとするDNAチップを用いた遺伝子発現解析において極めて有用な技術である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、トータルRNA量と検出感度の関係を、本法：100mm2 arrayと従来法：1000mm2 arrayで比較したグラフである。
【図２】図２は、トータルRNA量と検出感度の関係を、本法：25mm2 arrayと従来法：250mm2 arrayで比較したグラフである。
【図１】
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【図２】
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