(57)【要約】【課題】セラミックス多孔体を利用して、ＣＤ３４陽性細胞を含むヒト由来の造血幹細胞または造血前駆細胞を、異種動物由来や不死化した支持細胞との懸濁培養系で培養し、増殖した造血幹細胞または造血前駆細胞のみを、危険因子や支持細胞を含むことなく、効率的に分離・回収することができるヒト造血幹細胞および造血前駆細胞の培養方法を提供する。【解決手段】ＣＤ３４陽性細胞を含むヒト由来の造血幹細胞または造血前駆細胞を、内部に連通する気孔を有するセラミックス多孔体に担持させた胎盤細胞または臍帯血由来のストローマ細胞に代表される支持細胞との共存下で、高密度培養する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ３４陽性細胞を含むヒト由来の造血幹細胞または造血前駆細胞を、内部に連通する気孔を有するセラミックス多孔体に担持させた支持細胞との共存下で、高密度培養することを特徴とするヒト造血幹細胞または造血前駆細胞の培養方法。
【請求項２】
前記セラミックスが、リン酸カルシウム、チタニア、アルミナおよびジルコニアのいずれかからなることを特徴とする請求項１記載のヒト造血幹細胞または造血前駆細胞の培養方法。
【請求項３】
前記セラミックス多孔体が、複数の球状の気孔が全体にわたって連通し、気孔率が７０％以上９５％以下、平均気孔径が５０μｍ以上１０００μｍ以下であり、各気孔間の連通部の径が該セラミックス多孔体に担持させた支持細胞の凝集体の径よりも小さいものであることを特徴とする請求項１または請求項２記載のヒト造血幹細胞または造血前駆細胞の培養方法。
【請求項４】
前記支持細胞が、前記セラミックス多孔体の気孔内において、細胞凝集体を形成していることを特徴とする請求項１から請求項３までのいずれかに記載のヒト造血幹細胞または造血前駆細胞の培養方法。
【請求項５】
前記セラミックス多孔体の表面接着部位には、孔径０．１μｍ以上５μｍ以下の微小孔が存在していることを特徴とする請求項１から請求項４までのいずれかに記載のヒト造血幹細胞または造血前駆細胞の培養方法。
【請求項６】
前記支持細胞を担持したセラミックス多孔体は、比重が１以上であることを特徴とする請求項１から請求項５までのいずれかに記載のヒト造血幹細胞または造血前駆細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨髄または臍帯血由来のストローマ細胞に代表される支持細胞を用い、ＣＤ３４陽性細胞を含むヒト由来の造血幹細胞または造血前駆細胞を増殖させ、かつ、効率的に分離・回収可能な培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
白血病等の重篤な血液疾患は、その治療において、患者とＨＬＡが適合する造血幹細胞を含む骨髄をできる限り多く移植する必要がある。
ところが、最近、臍帯血中にも造血幹細胞が含まれていることが明らかになり、血液疾患患者に対する臍帯血移植も盛んに行われるようになってきた。臍帯血移植は、骨髄や抹消血の移植に比べて、ドナー由来のＴ細胞の混入による重症の急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発症率が低く、移植治療に有用であるとされている。
【０００３】
また、放射線による血球系細胞の死滅処理を施したガン患者に対して、細胞表面抗原であるＣＤ３４分子を発現している細胞（ＣＤ３４陽性細胞）を移植したところ、造血系が再構成され、造血系を構築する造血系幹細胞が、臍帯血中に存在するＣＤ３４陽性細胞の集団の中に含まれることが明らかになった。
【０００４】
前記ＣＤ３４陽性細胞は、血液疾患患者の治療において、移植する細胞数が多いほど、疾患の改善率が高いが、臍帯血の採取量には限界がある。
しかも、ＣＤ３４陽性細胞は、ビオチンや磁気ビーズで標識したＣＤ３４抗体と臍帯血とを反応させた後、アビジンビーズや磁石を用いて、臍帯血から分離・回収することができるが、臍帯血に含まれる血液細胞中に、わずか１〜２％しか存在していない。
【０００５】
このため、ＣＤ３４陽性細胞は、臍帯血採取後、一旦、生体外で増殖させてから、移植に用いることが必要となり、その効率的な増殖方法の確立が求められている。
その研究の一つとして、不死化したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を株化したものや、マウス骨髄ストローマ株（ＨＥＳＳ−５）と組み合わせたものを支持細胞として、ＣＤ３４陽性細胞を維持・増殖させる方法が試みられている。
【０００６】
しかしながら、ヒト血液幹細胞の支持細胞として異種動物由来細胞を用いる場合は、ＣＤ３４陽性細胞の増殖後、患者に移植した際、生体内に他動物由来の細胞が混入する危険性がある。
また、不死化させたヒト骨由来間葉系幹細胞を支持細胞として用いる場合、不死化した細胞は、生体内に混入するとガン化する危険性がある。
【０００７】
したがって、これらの細胞をＣＤ３４陽性細胞の支持細胞として用いる方法においては、共培養後、支持細胞とＣＤ３４陽性細胞とを完全に分離する方法が求められていた。
【０００８】
従来、ストローマ細胞等の支持細胞から、ＣＤ３４陽性細胞を物理的に隔離する手段としては、ストローマ細胞と造血幹細胞を孔径１μｍ以下のポアを有するトランスメンブレンに代表されるような膜を用いて隔てる非接触培養等が利用されてきた（例えば、特許文献１参照）。
【特許文献１】特開平１０−２９５３６９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、上記のような従来技術を用いると、細胞の大量増殖に好適な懸濁培養等の高密度培養への応用が不可能であるため、培養系の規模を拡大し、ＣＤ３４陽性細胞を大量に得ることは困難であった。
【００１０】
したがって、ＣＤ３４陽性細胞を効率よく増殖させることができ、かつ、ヒト以外の異種動物由来の危険因子や不死化した支持細胞の混入を防ぐことができる懸濁培養系の開発が求められていた。
【００１１】
本発明は、上記技術的課題を解決するためになされたものであり、セラミックス多孔体を利用して、ＣＤ３４陽性細胞を含むヒト由来の造血幹細胞または造血前駆細胞を、異種動物由来や不死化した支持細胞との懸濁培養系で培養し、増殖した造血幹細胞または造血前駆細胞のみを、危険因子や支持細胞を含むことなく、効率的に分離・回収することができるヒト造血幹細胞および造血前駆細胞の培養方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明に係るヒト造血幹細胞または造血前駆細胞の培養方法は、ＣＤ３４陽性細胞を含むヒト由来の造血幹細胞または造血前駆細胞を、内部に連通する気孔を有するセラミックス多孔体に担持させた支持細胞との共存下で、高密度培養することを特徴とする。
セラミックス多孔体を培養担体として増殖させた胎盤細胞または臍帯血由来のストローマ細胞等を支持細胞として用いることにより、ヒト造血幹細胞または造血前駆細胞を高密度懸濁培養によって増殖させ、その後、支持細胞が混入することなく、容易に回収することができる。
【００１３】
前記培養方法においては、セラミックスが、リン酸カルシウム、チタニア、アルミナおよびジルコニアのいずれかからなることが好ましい。
これらのセラミックスは、生体安定性、生体親和性に優れており、細胞培養に好適に用いることができる。
【００１４】
また、前記セラミックス多孔体は、複数の球状の気孔が全体にわたって連通し、気孔率が７０％以上９５％以下、平均気孔径が５０μｍ以上１０００μｍ以下であり、各気孔間の連通部の径が該セラミックス多孔体に担持させた支持細胞の凝集体の径よりも小さいものであることが好ましい。
このような気孔構造を有するセラミックス多孔体を用いることにより、該セラミックス多孔体の内部に、支持細胞を、効率よく撒種し、定着させることができる。
【００１５】
さらにまた、前記支持細胞は、前記セラミックス多孔体の気孔内において、細胞凝集体を形成していることが好ましい。
支持細胞は、凝集体化することにより、ＣＤ３４陽性細胞の支持能を向上させることができ、また、セラミックス多孔体の気孔内からの流出が抑制され、増殖したＣＤ３４陽性細胞との分離が容易になる。
【００１６】
また、前記セラミックス多孔体の表面接着部位には、孔径０．１μｍ以上５μｍ以下の微小孔が存在していることが好ましい。
このような微小孔が形成されていることにより、セラミックス多孔体に、支持細胞をさらに強固に接着させることができる。
【００１７】
また、前記支持細胞を担持したセラミックス多孔体は、比重が１以上であることが好ましい。
これにより、高密度培養後、培地中に浮遊しているＣＤ３４陽性細胞のみを、セラミックス多孔体が担持している支持細胞から、容易に分離・回収することができる。
【発明の効果】
【００１８】
上述したとおり、本発明に係る培養方法によれば、セラミックス多孔体を培養担体として用いることにより、ＣＤ３４陽性細胞を含むヒト由来の造血幹細胞または造血前駆細胞を、異種動物由来や不死化した支持細胞との懸濁培養系で培養し、増殖した造血幹細胞または造血前駆細胞のみを、危険因子や支持細胞を含むことなく、効率的に分離・回収することができる。
したがって、本発明によれば、臍帯血等に含まれる貴重な造血幹細胞または造血前駆細胞を、高密度細胞培養によって、大量に、かつ、効率的に培養することができる。また、本発明に係る培養方法による増殖した造血幹細胞または造血前駆細胞は、血液疾患患者に対する移植にも、安全に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明についてより詳細に説明する。
本発明に係るヒト造血幹細胞または造血前駆細胞の培養方法は、ＣＤ３４陽性細胞を含むヒト由来の造血幹細胞または造血前駆細胞を培養するのに際し、セラミックス多孔体を利用し、該セラミックス多孔体に胎盤細胞または臍帯血由来のストローマ細胞に代表される支持細胞を担持させ、これらの細胞と共培養するものである。
このように、セラミックス多孔体内で増殖させた胎盤細胞または臍帯血由来のストローマ細胞等を支持細胞として用いることにより、ヒト造血幹細胞または造血前駆細胞を高密度懸濁培養によって増殖させることができる。
また、本発明によれば、支持細胞として、異種動物由来や不死化したストローマ細胞を用いることができ、培養したヒト造血細胞または造血前駆細胞を、前記ストローマ細胞と分離・回収可能であるため、移植における安全性も確保することができる。
【００２０】
ここで、支持細胞とは、ＣＤ３４陽性細胞が増殖する過程で生じる分化を抑制し、ＣＤ３４陽性細胞自体を増殖させるための細胞であり、胎盤や臍帯血由来の間葉系細胞を用いることが好ましく、ヒト由来のものを用いることがより好ましいが、本発明においては、上述のように、異種動物由来のストローマ細胞や不死化したストローマ細胞も用いることができる。
【００２１】
具体的には、まず、異種動物由来や不死化したストローマ細胞（支持細胞）を、セラミックス多孔体内で培養する。
次に、ＣＤ３４陽性細胞と支持細胞とを担持させたセラミックス多孔体を、スピナーフラスコ内等で低速で撹拌して懸濁させ、ＣＤ３４陽性細胞を増殖させる。
そして、撹拌を停止し、セラミックス多孔体を沈殿させ、増殖したＣＤ３４陽性細胞が浮遊している培地を回収し、さらに、ＣＤ３４陽性細胞のみを、危険因子や支持細胞を含むことなく回収する。
【００２２】
ＣＤ３４陽性細胞は、培養担体に接着しなくても増殖可能な浮遊細胞であり、懸濁培養の際、支持細胞が担持されているセラミックス多孔体に接着することはない。
よって、高密度細胞培養で、ＣＤ３４陽性細胞と支持細胞とを共培養後、セラミックス多孔体と培養液とを分離することによって、培地中に浮遊しているＣＤ３４陽性細胞を容易に単離することができる。
【００２３】
なお、このような培養方法は、ＣＤ３４陽性細胞の培養のみならず、分化能および自己複製能を兼ね備えた浮遊細胞を、ストローマ細胞やフィーダ細胞に代表される支持細胞で、維持または増殖させる場合にも応用することができる。
【００２４】
上述のように、本発明に係るストローマ細胞に代表される支持細胞の培養担体は、セラミックス多孔体からなることを特徴とするものである。
セラミックス多孔体を培養担体として用いることにより、支持細胞をスフェロイド化（凝集体化）することができ、ＣＤ３４陽性細胞が増殖の過程で分化することを抑制し、ＣＤ３４陽性細胞自身の増殖を可能にする能力、すなわち、支持細胞によるＣＤ３４陽性細胞の支持能を向上させることができる。
したがって、前記支持細胞は、セラミックス多孔体の気孔内において、細胞凝集体を形成していることが好ましい。
【００２５】
前記セラミックスには、ハイドロキシアパタイトに代表されるリン酸カルシウム、チタニア、ジルコニア、アルミナから選ばれたいずれかが好適に用いられる。
これらからなるセラミックスは、生体安定性、生体親和性に優れているため、好適に用いることができる。
【００２６】
また、前記セラミックス多孔体は、複数の球状の気孔が全体にわたって連通しており、気孔率が７０％以上９５％以下、平均気孔径が５０μｍ以上１０００μｍ以下であり、各気孔間の連通部の径が該セラミックス多孔体に担持させた胎盤細胞または臍帯血由来のストローマ細胞に代表される支持細胞の凝集体の径よりも小さいものであることが好ましい。
このような気孔構造を有することにより、セラミックス多孔体の内部に、ストローマ細胞等の支持細胞を、効率よく、撒種し、定着させることができるようになる。
ここで、連通部とは、隣り合う略球状の気孔同士が接触して開口した部分をいう。
なお、前記気孔率は、多孔体の密度と理論密度から導くことができる。また、平均気孔径は、特許第３４００７４０号公報に記載の樹脂封埋による方法で求められ、連通孔径は、水銀圧入法により求めることができる。
【００２７】
前記セラミックス多孔体の気孔率が７０％未満である場合、また、平均気孔径が５０μｍ未満である場合、支持細胞が容易に多孔体内部に侵入できるような連通孔を得ることが難しい。
一方、前記気孔率が９５％を超える場合、また、平均気孔径が１０００μｍを超える場合、多孔体内部に侵入した支持細胞が流出しやすく、セラミックス多孔体上に定着し難くなるとともに、培養担体の形状を保つことが難しい。
前記気孔率は、より好ましくは、７５％以上９０％以下であり、さらに、８０％以上９０％以下であることが好ましい。また、平均気孔径は、２５０μｍ以上８００μｍ以下であることがより好ましい。
【００２８】
また、上述のように、前記セラミックス多孔体の各気孔間の連通部の径は、セラミックス多孔体の気孔内で凝集体化した支持細胞の流出を防ぎ、多孔体内部に定着しやすくする観点から、支持細胞の凝集体の径よりも小さいものであることが好ましい。
前記連通部の径は、連通性も十分に確保する観点から、１０μｍ以上２００μｍ以下であることが好ましく、２０μｍ以上１５０μｍ以下であることがより好ましい。
【００２９】
上記のようなセラミックス多孔体は、スポンジ状の有機多孔体にスラリーを塗布して有機多孔体を焼き抜くセラミックフォームや、スラリーを撹拌起泡して焼結する特許第３４００７４０号に記載されている方法等によって得ることができるが、後者の方法により得ることがより好ましい。
【００３０】
また、前記セラミックス多孔体の細胞接着部位には、孔径０．１μｍ以上５μｍ以下の微小孔が存在していることが好ましい。
このような微小孔は、有機物からなる微小片の焼き抜きやセラミックス成形体の低温焼成等の方法によって、セラミックスの粒子間に形成されるものであり、部分的に存在させてもよいが、セラミックス全体に存在させることが好ましい。
これにより、セラミックス多孔体に、支持細胞をさらに強固に接着させることが可能になる。
なお、前記微小孔による空間は、ここでいう多孔体の気孔部分には含まれないものとする。この微小孔の孔径は、水銀圧入法により測定することができる。
【００３１】
また、前記セラミックス多孔体の比重は、１以上であることが好ましい。
これにより、高密度細胞培養後、支持細胞が担持されているセラミックス多孔体は、培養槽底部に沈み、培地中に浮遊しているＣＤ３４陽性細胞のみを、遠心分離等の方法により、容易に分離・回収することができる。
【００３２】
前記培養方法においては、ＣＤ３４陽性細胞の自己増幅を促進するために、必要に応じて、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン６受容体（ＳＩＬ−６Ｒ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒状コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）等のサイトカインを組み合わせて使用することが好ましい。
【００３３】
また、本発明において用いられる培地は、特に限定されるものではなく、培養する細胞に応じて、適宜選択することができる。例えば、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、イーグル培地等が好適に用いられる。
これらの培地には、さらに、ＦＢＳ（fetal bovine serum；ウシ胎児血清）、ＫＳＲ（KnockOutTM Serum Replacement）、ＬＩＦ（leukemia inhibitory factor；白血病阻害因子）、非必須アミノ酸、ピルビン酸、抗生物質等の細胞を維持するために必要な物質を添加することが好ましい。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに具体的に説明するが、本発明は、下記実施例により制限されるものではない。
まず、９６穴プレート内で、直径３００〜６００μｍ（平均粒径５００μｍ）の球状のチタニアセラミックス多孔体（気孔率８５％）に、支持細胞としてマウス胎仔由来のＤＡＳ１０４−８を１×１０6個撒種し、ＦＢＳ、ピルビン酸、非必須アミノ酸、ＬＩＦ、ペニシリンを含んだＤＭＥＭ培地にて、５％ＣＯ2インキュベータ内で、３７℃で、適宜、培地交換を行いながら、ＤＡＳ１０４−８を３，７，１０日間培養した。
【００３５】
３，７，１０日培養後のチタニアセラミックス多孔体をアルデヒド系固定液で固定し、細胞の増殖の様子をＳＥＭにより観察したところ、約７日間で、チタニアセラミックス多孔体の気孔内で、細胞がコンフルエントに達していることが認められた。
【００３６】
次に、１％ＢＳＡ添加Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地１００ｍｌを入れた１２５ｍｌスピナーフラスコに、上記において支持細胞（ＤＡＳ１０４−８）を担持させたチタニアセラミックス多孔体１．８ｇ／ｍｌを添加し、低速撹拌により懸濁させた。
これに、ＣＤ３４陽性細胞５×１０3個／ｍｌとサイトカイン（ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＥＬ）５０ｎｇ／ｍｌを添加し、５％ＣＯ2インキュベータ内で、３７℃で７日間、ＣＤ３４陽性細胞とＤＡＳ１０４−８細胞とを共培養した。
【００３７】
上記共培養後、セラミックス多孔体を培地と分離し、培地に浮遊している細胞を遠心分離により回収した。
さらに、２次培養として、プラスチックシャーレに共培養後回収したＣＤ３４陽性細胞を３００個撒種し、メソカルト（登録商標）ＧＦ Ｈ４４３４Ｖ培地にて、５％ＣＯ2インキュベータ内で、３７℃で１４日間培養し、コロニーを形成させた。
【００３８】
得られたコロニーについて、メイギムザ染色により、ＣＤ３４陽性細胞の増幅幅と分化・未分化の状態を解析したところ、未分化の状態を維持しているＣＤ３４陽性細胞が３５％存在していることが認められた。