(57)【要約】【課題】  本発明は、天然物由来の植物用病害抵抗性誘導剤を提供することを目的とする。【解決手段】  以下のきのこ及び／又は植物の少なくとも１種の細胞破砕物又はこの水抽出物を有効成分とする、植物用病害抵抗性誘導剤。  きのこ：カベンタケ、ヒロヒダタケ、ホコリタケ、ニガクリタケ、カワラタケ、ハツタケ、ニオイコベニタケ及びワタゲヌメリイグチ  植物：ホタルブクロ、ハマエンドウ、シロタエギク、オレガノ、マツバボタン及びローズゼラニウム【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のきのこ及び／又は植物の少なくとも１種の細胞破砕物又はこの水抽出物を有効成分とする、植物用病害抵抗性誘導剤。
きのこ：カベンタケ（Ｃｌａｖｕｌｉｎｏｐｓｉｓ  ｐｕｌｃｈｒａ）、ヒロヒダタケ（Ｏｕｄｅｍａｎｓｉｅｌｌａ  ｐｌａｔｙｐｈｙｌｌａ）、ホコリタケ（Ｌｙｃｏｐｅｒｄｏｎ  ｐｅｒｌａｔｕｍ）、ニガクリタケ（Ｈｙｐｈｏｌｏｍａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｅ）、カワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、ハツタケ（Ｌａｃｔａｒｉｕｓ  ｈａｔｓｕｄａｋｅ）、ニオイコベニタケ（Ｒｕｓｓｕｌａ  ｍａｒｉａｅ）及びワタゲヌメリイグチ（Ｓｕｉｌｌｕｓ  ｔｏｍｅｎｔｏｓｕｓ）
植物：ホタルブクロ（Ｃａｍｐａｎｕｌａ  ｐｕｎｃｔａｔａ）、ハマエンドウ（Ｌａｔｈｙｒｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、シロタエギク（Ｃｅｎｔａｕｒｅａ  ｃｉｎｅｒａｒｉａ）、オレガノ（Ｏｒｉｇａｎｕｍ  ｌａｅｖｉｇａｔｕｍ）、マツバボタン（Ｐｏｒｔｕｌａｃａ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ）及びローズゼラニウム（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ  ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ）
【請求項２】
前記きのこは、きのこの子実体若しくは菌糸体又はこれらの乾燥物である請求項１に記載の植物用病害抵抗性誘導剤。
【請求項３】
前記植物は、植物の葉若しくは茎又はこれらの乾燥物である請求項１に記載の植物用病害抵抗性誘導剤。
【請求項４】
前記細胞破砕物は、粉末状細胞破砕物又は水中に分散された細胞破砕物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の植物用病害抵抗性誘導剤。
【請求項５】
前記水抽出物は、水中に分散された前記細胞破砕物の遠心上清である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の植物用病害抵抗性誘導剤。
【請求項６】
キュウリ用病害抵抗性誘導剤である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の植物用病害抵抗性誘導剤。
【請求項７】
植物の病害抵抗性を誘導する方法であって、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の植物用病害抵抗性誘導剤を前記植物に施用する工程を備える方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物用病害抵抗性誘導剤及び植物の病害抵抗性誘導方法に関し、特にきのこ及び／又は植物の細胞破砕物又はこの水抽出物を有効成分とする植物用病害抵抗性誘導剤並びに植物の病害抵抗性誘導方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
作物の病害防除は、現在殺菌を目的とする化学合成農薬に大きく依存している。しかし、化学合成農薬は長期的に使用すると、薬剤耐性株が生じることがあり、また環境汚染や残存農薬など多くの問題がある。
【０００３】
そこで、近年いわゆる病害抵抗性誘導物質（プラントアクチベーター）が次世代の農薬として注目されている。病害抵抗性誘導物質は、直接的な殺菌効果を示さないが植物自身が有する病害抵抗性を誘導することによって病害を防除する。抵抗性誘導物質は、効果は比較的に長期に維持され、また、病原菌特異性がないため、広範囲の病害に対して防除効果を示すうえ、薬剤耐性株が出現することも殆どない（非特許文献１）。
【０００４】
これまで、実用化されている病害抵抗性誘導剤として、化学合成薬剤ではプロベナゾール（非特許文献２）、アシベンゾラル−Ｓ−メチル（非特許文献３）、及びチアニジル（非特許文献４）の３剤が知られている。一方、環境への負荷が少ないと考えられる天然物由来の物質に関しては、抗菌・殺虫効果を有するものが多く報告されているが、病害抵抗性誘導作用を有するものの報告は、オオイタドリ（Ｒｅｙｎｏｕｔｒｉａ  ｓａｃｈａｌｉｎｅｎｓｉｓ）の抽出物（非特許文献５）に限られている。また、抗菌剤として農薬登録されているシイタケ菌糸体抽出物（商品名：レンテミン）は、ある程度の抵抗性誘導作用があると考えられている。
【０００５】
病害抵抗性誘導剤が施用された植物では、病害抵抗性誘導剤で処理された部位だけでなく植物全身が病原菌に対する抵抗性を示す、全身獲得抵抗性（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ａｃｑｕｉｒｅｄ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；ＳＡＲ）と呼ばれる現象がみられている（非特許文献６）。このＳＡＲにおけるシグナル伝達系では、酸性ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）遺伝子の発現が増加すると報告されている（非特許文献７）。
【０００６】
【非特許文献１】有江  力（２００２）植物の成長調節、Ｖｏｌ．３７、Ｎｏ．１、５１−５７頁
【非特許文献２】YoshiokaK., Nakashita H., Klessig D. and Yamaguchi I. (2001) PlantJ., 25: 149-157
【非特許文献３】LawtonK.A., Friedrich L., Hunt M., Weymann K., Delaney T., Kessmann H., Staub T. andRyals J. (1996) Plant J., 10: 71-81
【非特許文献４】竹本剛・堀越守・山本好伸・西村昭・廣岡卓（２００２）日植病報、６８：２６４
【非特許文献５】FouadDaayf, Annegret Schmitt and Richard R. Belanger (1997) Plant Physiol., 113:719-727
【非特許文献６】RayalsJ. A., Neuenschwander U. H., Willits M. G., Molina A. and Steiner H. (1996)Plant Cell, 8: 275-324
【非特許文献７】Ishige,F., H. Mori, K. Yamazaki and H. Imaseki (1993) Plant Physiol., 101: 193-199
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記の背景技術を鑑みて、天然物由来の植物用病害抵抗性誘導剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、約２０００種類のきのこ及び植物の病害抵抗性誘導活性を評価したところ、８種類のきのこ及び６種類の植物の細胞破砕物で処理した植物体はキュウリ炭そ病に対して全身獲得抵抗性が認められることを見出した。さらに、上記きのこ又は植物の細胞破砕物をキュウリに塗布したところ、キュウリのペルオキシダーゼ遺伝子の発現量が増加することから、これらのきのこ又は植物が病害抵抗性誘導作用を有することを見出し、本発明の完成に至った。
【０００９】
即ち、本発明は、以下のきのこ及び／又は植物の少なくとも１種の細胞破砕物又はこの水抽出物を有効成分とする、植物用病害抵抗性誘導剤を提供する。
きのこ：カベンタケ（Ｃｌａｖｕｌｉｎｏｐｓｉｓ  ｐｕｌｃｈｒａ）、ヒロヒダタケ（Ｏｕｄｅｍａｎｓｉｅｌｌａ  ｐｌａｔｙｐｈｙｌｌａ）、ホコリタケ（Ｌｙｃｏｐｅｒｄｏｎ  ｐｅｒｌａｔｕｍ）、ニガクリタケ（Ｈｙｐｈｏｌｏｍａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｅ）、カワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、ハツタケ（Ｌａｃｔａｒｉｕｓ  ｈａｔｓｕｄａｋｅ）、ニオイコベニタケ（Ｒｕｓｓｕｌａ  ｍａｒｉａｅ）及びワタゲヌメリイグチ（Ｓｕｉｌｌｕｓ  ｔｏｍｅｎｔｏｓｕｓ）
植物：ホタルブクロ（Ｃａｍｐａｎｕｌａ  ｐｕｎｃｔａｔａ）、ハマエンドウ（Ｌａｔｈｙｒｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、シロタエギク（Ｃｅｎｔａｕｒｅａ  ｃｉｎｅｒａｒｉａ）、オレガノ（Ｏｒｉｇａｎｕｍ  ｌａｅｖｉｇａｔｕｍ）、マツバボタン（Ｐｏｒｔｕｌａｃａ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ）及びローズゼラニウム（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ  ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ）
【００１０】
上記の植物用病害抵抗性誘導剤は、きのこ又は植物といった天然物由来であるため、環境への負荷が少ないと予想される。また、継続的に使用しても耐性株が出現しにくいことが考えられる。
【００１１】
上記きのこは、きのこの子実体若しくは菌糸体又はこれらの乾燥物であることが好ましい。子実体と菌糸体とでは効果の差異があるものの、同様に防除効果を示すため、きのこの子実体若しくは菌糸体又はこれらの乾燥物のいずれかを使用しても本発明の植物用病害抵抗性誘導剤を得ることができる。
【００１２】
上記植物は、植物の葉若しくは茎又はこれらの乾燥物であることが好ましい。葉と茎とでは効果の差異があるものの、同様に防除効果を示すため、植物の葉若しくは茎又はこれらの乾燥物のいずれかを使用しても本発明の植物用病害抵抗性誘導剤を得ることができる。
【００１３】
上記細胞破砕物は、粉末状細胞破砕物又は水中に分散された細胞破砕物であることが好ましい。粉末状のものと水中に分散されたものとでは、成分が殆ど相違せず、同様に植物において病害抵抗性誘導効果が得られる。
【００１４】
上記水抽出物は、水中に分散された前記細胞破砕物の遠心上清であることが好ましい。細胞破砕物は細胞成分が露出されたものであるため、これを水中に分散すると細胞内の有効成分が水中に溶解され、その他の有効成分でない不溶成分を遠心することによって除去できる。このような水抽出物は細胞破砕物と同様に植物において病害抵抗性誘導効果が得られる。
【００１５】
上記植物用病害抵抗性誘導剤は、キュウリ用病害抵抗性誘導剤であることが好ましい。本発明の植物用病害抵抗性誘導剤はキュウリ炭そ病菌に感染したキュウリに対して高い防除効果を有し、また、本発明の植物用病害抵抗性誘導剤で処理したキュウリにおけるペルオキシダーゼの発現量が増加することが証明されている。本発明の植物用病害抵抗性誘導剤は、特にキュウリにおいて抵抗性誘導作用を有する。
【００１６】
本発明は、また、上記の植物用病害抵抗性誘導剤を植物に施用する工程を備える植物の病害抵抗性を誘導する方法を提供する。本方法によれば、防除価が高く環境への負荷が少ない、植物の病害抵抗性誘導を可能とする。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、環境への負荷が少ないと考えられる天然物由来の植物用病害抵抗性誘導剤が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明に原料として使用されるきのこは、カベンタケ（Ｃｌａｖｕｌｉｎｏｐｓｉｓ  ｐｕｌｃｈｒａ）、ヒロヒダタケ（Ｏｕｄｅｍａｎｓｉｅｌｌａ  ｐｌａｔｙｐｈｙｌｌａ）、ホコリタケ（Ｌｙｃｏｐｅｒｄｏｎ  ｐｅｒｌａｔｕｍ）、ニガクリタケ（Ｈｙｐｈｏｌｏｍａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｅ）、カワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、ハツタケ（Ｌａｃｔａｒｉｕｓ  ｈａｔｓｕｄａｋｅ）、ニオイコベニタケ（Ｒｕｓｓｕｌａ  ｍａｒｉａｅ）及びワタゲヌメリイグチ（Ｓｕｉｌｌｕｓ  ｔｏｍｅｎｔｏｓｕｓ）である。きのこは、子実体若しくは菌糸体又はこれらの乾燥物であってよく、またきのこの全体でもよく、一部でもよい。
【００１９】
本発明に原料として使用される植物は、ホタルブクロ（Ｃａｍｐａｎｕｌａ  ｐｕｎｃｔａｔａ）、ハマエンドウ（Ｌａｔｈｙｒｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、シロタエギク（Ｃｅｎｔａｕｒｅａ  ｃｉｎｅｒａｒｉａ）、オレガノ（Ｏｒｉｇａｎｕｍ  ｌａｅｖｉｇａｔｕｍ）、マツバボタン（Ｐｏｒｔｕｌａｃａ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ）及びローズゼラニウム（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ  ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ）である。植物は、植物の根、茎、葉又は花いずれでもよく、好ましくは葉若しくは茎又はこれらの乾燥物である。
【００２０】
本発明のきのこ又は植物を単独に使用してもよく、２以上のきのこ及び／又は植物の混合物を使用してもよい。混合物を原料として使用する場合は、単一の原料に比べ適用植物・病害によって効果の差異があるが、同様に病害抵抗性誘導作用を有すると考えられる。
【００２１】
本発明の細胞破砕物は、きのこ又は植物の細胞壁が破砕された破砕物であり、固体状又は液体状のいずれであってもよい。固体状細胞破砕物は、きのこ又は植物を粉砕して得た粉末状のもの、及び液体状細胞破砕物から液体を除去して得た固体状のものを含む。液体状細胞破砕物は、きのこ又は植物に液体を加えて又は加えずに均質化することによって得た均質液、及び固体状細胞破砕物を液体に分散することなどによって得た懸濁液を含む。
【００２２】
本発明に使用される破砕方法は、概ね物理的な方法と化学的な方法とがある。物理的な方法は、例えば、きのこ又は植物の乾燥物をパワーミルなどの粉砕機で粉砕する方法、きのこ又は植物を液体窒素中で凍結させた後に粉砕する方法、又は液体を加えて又は加えずにホモジナイザーなどの機械で均質化する方法が挙げられる。化学的な方法は、例えば、細胞壁を破壊する酵素や緩衝液で処理する方法が挙げられ、このような酵素や緩衝液は一般的に知られている。特に物理的な方法は、化学変化を伴わないため、好適である。
【００２３】
本発明の細胞破砕物の水抽出物は、細胞破砕物が固体状である場合は水に分散してから、細胞破砕物が水に分散された液体状である場合はそのまま又はさらに水に分散してから、水溶性でない成分を除去して得られる。水溶性でない成分の除去は、一般的な手法を用いればよく、例えば、試料を遠心してから水溶性でない成分を沈殿として除去することが簡便で好適である。また、本発明の水抽出物は、きのこ原料又は植物原料を破砕せずにそのまま水で抽出しても同様に得られると考えられる。本発明の水抽出物は、０〜１００℃、好ましくは０〜７０℃、より好ましく５〜５０℃、さらに好ましくは５〜３０℃の温度で抽出する。ここで、水は広く水性液を意味し、Ｈ２Ｏ、生理食塩水、培地及び一般的な緩衝液などの水溶液を含む。
【００２４】
本発明の植物用病害抵抗性誘導剤は、必要に応じて様々な剤型、例えば、液剤、粉末剤、顆粒剤、水和剤、乳剤、油剤、又はエアゾール剤などにしてもよい。また、植物への付着性や浸透性を高めるために、必要に応じて、ｐＨを調整したり、界面活性剤などを添加したりすることも可能である。
【００２５】
本発明の植物用病害抵抗性誘導剤の適用作物は、全ての栽培植物が含まれる。例えば、キュウリ、メロン及びカボチャなどのウリ科植物、イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ及びエンバクなどのイネ科植物、トマト、ナス及びジャガイモなどのナス科植物、エンドウ、ダイズ、インゲンマメ、アルファルファ、ラッカセイ及びソラマメなどのマメ科植物、ダイコン、ハクサイ及びキャベツなどのアブラナ科植物、イチゴ、リンゴ及びナシなどのバラ科植物、クワなどのクワ科植物、ワタなどのアオイ科植物、ニンジン、パセリ及びセロリーなどのセリ科植物、ゴボウ、ヒマワリ、キク及びレタスなどのキク科植物、ブドウなどのブドウ科などである。
【００２６】
本発明の植物用病害抵抗性誘導剤の適用病害は、病害抵抗性誘導剤が一般的に病原菌特異性を有しないため、細菌、カビ又はウイルスを病原菌とする全ての上記作物の植物病害が含まれる。例えば、キュウリ炭そ病菌、イネいもち病菌、イネごま葉枯病菌、ジャガイモ粉状そうか病菌、ジャガイモ疫病菌、ダイズべと病菌、オオムギうどんこ病菌、コムギうどんこ病菌、ムギ類赤かび病菌、エンドウ褐紋病菌、ムギ類雪腐大粒菌核病菌、コムギ赤さび病菌、トウモロコシ黒穂病菌、オオムギ株腐病菌、ジャガイモ黒あざ病菌、イネ紋枯れ病、ジャガイモ夏疫病菌、ダイズ紫斑病菌、サツマイモつる割病菌、メロンつる割病菌、レタス根腐病菌、トマト萎凋病菌、ホウレンソウ萎凋病菌、トマト半身萎凋病菌、アブラナ科根こぶ病菌、キュウリ苗立枯病菌、イチゴ灰色かび病菌、トマト炭そ病菌、オオムギ、コムギ黒節病菌、ジャガイモ黒あし病菌、イネ白葉枯病菌、ジャガイモそうか病菌、ムギ類萎縮ウイルス、ダイズモザイクウイルス、アルファルファモザイクウイルス、及びジャガイモ葉巻ウイルスによる病害などが挙げられる。
【００２７】
本発明の植物の病害抵抗性を誘導する方法は、本発明の植物用病害抵抗性誘導剤を対象植物に施用する工程を含む。施用する工程は、特に限定されないが、例えば、植物の全体または一部（例えば、葉）への直接的な散布・塗布工程が挙げられる。また、植物の根への浸漬、土壌や水栽培液への混合工程なども含まれる。施用するタイミングは、特に限定されないが、施用してから植物が病害に対して抵抗性を獲得するまでにタイムラグがあるため、病害の発生に先駆けて施用することが好適である。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２９】
実施例１  ８種類のきのこ及び６種類の植物の破砕液によるキュウリ炭そ病の抵抗性誘導作用
きのこの場合は、子実体又はＳＭＹ培地（ショ糖１％、麦芽エキス１％、酵母エキス０．４％）で２２℃にて培養した菌糸体を使用した。植物の場合は、新鮮な茎及び葉を使用した。子実体若しくは菌糸体１ｇ又は植物の茎及び葉１ｇに水４ｍＬを加え、ホモジナイザー（ヒスコトロン；日音医理科器械製作所製）を用いて、氷浴中又は室温にて１００００ｒｐｍで１０秒間破砕し、細胞破砕液を得た。
【００３０】
得た細胞破砕液をキュウリ（品種：相模半白節成）の実生０．５葉期に子葉表面に綿棒で約１００μＬ／個体で塗布した。１処理は３個体／鉢の２鉢とし、水処理を対照とした。処理２日後に、胞子濃度１×１０６／ｍＬに調節したキュウリ炭そ病菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅ）の胞子懸濁液をキュウリに約２ｍＬ／個体ずつ噴霧接種した。キュウリ植物体は２４時間暗黒湿潤条件に置いた後、２５℃で３０００ｌｕｘ／１６時間の日長条件に設定した環境制御室に設置し、３〜４日後に発病度を評価した。
【００３１】
発病度は病斑面積を５％以下、５〜２５％、２５〜５０％、５０〜７５％及び７５〜１００％の５段階で達観評価し、各階級の中央値（即ち、２．５％、１５％、３７．５％、６２．５％及び８７．５％）を用いて、以下の式によって水処理に対する各処理の防除価（％）を算出した。
防除価（％）＝１００−{（各処理の中央値の平均値）／（水処理の中央値の平均値）×１００}
【００３２】
８種類のきのこ及び６種類の植物の破砕液で処理したキュウリ植物体のキュウリ炭そ病菌に対する防除価を表１に示す。表１から、各種きのこ又は植物は高い防除価を有することが判明した。病害防除が認められた植物個体では、細胞破砕液で処理した葉のみならず、植物体全体において病害防除効果が認められた。
【００３３】
【表１】
2007262015.tif 000002
【００３４】
実施例２  １種類のきのこ及び６種類による植物のＰＯＤ発現誘導作用
実施例１と同様に、きのこ及び植物の細胞破砕液でキュウリ植物体を処理した。処理２４時間後に、キュウリ本葉を採取し、即座に凍結してＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ及びＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により全ＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡの合成はＰｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）を用いて行った。Ｍｘ３０００Ｐ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ法によるリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ解析によって遺伝子の発現量を測定した。
【００３５】
ＰＯＤ遺伝子の発現量を遺伝子特異的プライマーセット：５’−ｔｃａｇｇａｔｇｇｇａａａｔｃｔｃｇａｃ−３’（配列番号１）及び５’−ｃｇｔｇｇｃｃａａｃｔｃａｔａｃａｃａｃ−３’（配列番号２）を用いて調査した。ＰＣＲは、ポリメラーゼ活性化を９５℃にて１０秒行った後、ＤＮＡ変性を９５℃にて５秒、アニーリング・伸長を６４℃にて３０秒のサイクルを４０回行った。内部標準遺伝子としてアクチン遺伝子の発現量を遺伝子特異的プライマーセット：５’−ｔｇｃｔｇｇｔｃｇｔｇａｃｃｔｔａｃｔｇ−３’（配列番号３）及び５’−ｇａａｔｃｔｃｔｃａｇｃｔｃｃｇａｔｇｇ−３’（配列番号４）を用いて測定した。
【００３６】
各サンプルのＰＯＤ遺伝子の発現量をアクチン遺伝子の発現量に対して標準化した。水処理に比する相対的発現量を解析し、その結果を表２に示す。表２からきのこ及び植物の細胞破砕液で処理することによって、キュウリ植物体におけるＰＯＤの発現量が増加したことが判明した。
【００３７】
【表２】
2007262015.tif 000003
【配列表】
2007262015000001.app