(57)【要約】【課題】子宮内膜ガンの危険がある被験体または子宮内膜ガンに罹患したと疑われる被験体における子宮内膜ガンの存在および／または危険性をアッセイする非侵襲性の方法を提供すること。【解決手段】本発明は、子宮洗浄物におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ−２および／またはマトリックスメタロプロテイナーゼ−９のレベルの測定により、子宮内膜ガンの存在および／または危険性をアッセイする方法に関する。本方法は、定性的または定量的であり得、そして大規模スクリーニングおよび臨床試験に適応性である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
子宮内膜ガンの危険がある被験体または子宮内膜ガンに罹患したと疑われる被験体における子宮内膜ガンの存在を検出する非侵襲性の方法であって、該方法が、該被験体の子宮腔から取得した子宮洗浄物のサンプルにおけるマトリックスメタロプロテイナーゼ−２（MMP-2）および／またはマトリックスメタロプロテイナーゼ−９（MMP-9）の濃度または活性を測定する工程を包含し、
ここで、コントロールと比較した場合に、該被験体からの洗浄物におけるMMP-2および／またはMMP-9の増加した濃度または活性は、子宮内膜ガンが該被験体に存在することを示し、それによって子宮内膜ガンの存在を検出する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガン、特に子宮内膜ガンの検出に関する。本発明の方法は、例えば、子宮内膜ガンの危険性が増加した女性における大規模スクリーニングをしやすい。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
現在、多くの悪性腫瘍において、腫瘍の攻撃力と腫瘍細胞によるプロテアーゼ発現との間の高い相関関係が、明らかである。過去７年間において、例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼファミリーのメンバーが腫瘍浸潤および腫瘍転移と直接的に関係するという説得力のある証拠が蓄積されている。
【０００３】
臨床医は、長い間、ガンの早期検出のため、および悪性腫瘍を有する患者を処置する場合の予後の因子を評価するための客観的診断基準を開発することの必要性に気付いている。一般的に、子宮内膜ガンの段階、子宮筋層への浸潤の程度、腫瘍の組織学的グレードおよび型、ならびにリンパ管腔の浸潤の程度は、疾患の攻撃力についてのいくらかの予測価を有する。しかし、これらの因子のいずれも正確ではなく、そしてすべて主観的な評価に依存する。例えば、腫瘍の型およびグレードは、組織学的検査により決定され、そしてこれらの評価は、個々の異なる病理学者間で85%まで不一致の数字を生じ得ることが報告されている（BaakおよびOort，1991）。従って、現在、個々の患者の予後を予測する手段は存在しない。
【０００４】
子宮内膜ガンの過程の正確な予測、および種々の型の処置後の生存確率もまた、悪性細胞の内因性の性質、および悪性細胞と宿主との相互作用に依存することが明らかになりつつある（非特許文献１）。従って、この分野の研究の主要な目的は、腫瘍の浸潤および転移の潜在能力を決定する生物学的性質を発見することにある。
【０００５】
他の種類のガンの研究により、腫瘍細胞生物学に関連する定量的技術（例えば、DNA倍数性（非特許文献２;非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）、細胞−細胞接着を媒介するＥカドヘリンの発現（非特許文献７）、および細胞浸潤に関わるマトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）の分泌（非特許文献８；非特許文献９）は、新生物細胞の挙動に関連した再現性のある客観的測定を提供することにより、予後の評価および生存の予測を改善し得ることが公知である。細胞DNA含量の変化（倍数性）の変化は、卵巣ガン、乳ガン、大腸ガン、肺ガン、および前立腺ガン（非特許文献１０）ならびに子宮悪性疾患（非特許文献１１；非特許文献３）の生物学的挙動と相関することが示されている。一般的に、正常な２倍体DNA含量を有するガンは、異常な、異数体DNA含量または倍数体DNA含量を有するガンよりも良好な予後を有する。従って、子宮内膜ガンおよび他のガンにおけるDNA倍数性の決定は、この疾患の再発と関連する予後および生存率を評価するための強力な道具となり、そして分子マーカーまたは遺伝マーカーよりも良好な予測物である（非特許文献６）。
【０００６】
現在、多くの悪性疾患において、腫瘍の攻撃力と腫瘍組織におけるプロテアーゼ発現との間に高い相関関係が存在することが明らかである。過去７年間において、例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）ファミリーのメンバーおよびメタロプロテイナーゼ組織インヒビター（TIMP）が腫瘍浸潤および腫瘍転移に直接的に関係するという説得力のある証拠が蓄積している（非特許文献９により概説される）。生物学的液体におけるMMPの（特にTIMPとの複合体としての）検出は、転移性ガンの検出のために用いられ得ることが示唆されている（特許文献１（Zuckerによる米国特許第5,324,634号））。これらの酵素はまた、生理学的な組織再構築（月経）および浸潤（胚着床）の間に、正常細胞によって合成され、そして分泌される（非特許文献１２、非特許文献１３）。MMPは、組織において、十分に活性な形態、または酵素活性を示し得る前に活性化を必要とする潜在形態のいずれかで存在し得る。
【０００７】
本発明者らは、近年、マーモセットの卵巣周期および妊娠初期の間の子宮腔に、MMPが放出されることを確立した（本発明者らの未発表の結果）。さらに、これらの酵素の過剰発現は、多くの腫瘍細胞（例えば、結腸直腸ガンおよび扁平上皮ガンの腫瘍細胞）において生じることが報告されている。
【０００８】
近年、卵巣ガン細胞は、MMP-2およびMMP-9（これらは、直接、基底膜タンパク質を分解する）に類似のマトリックスメタロプロテイナーゼを増強したレベルで分泌するが、正常な卵巣上皮細胞は分泌しないことが立証されている（Moserら、1994；非特許文献１３）。このタンパク質分解能力は、卵巣悪性疾患の浸潤潜在能力と相関した。さらに、モノクローナル抗体を用いる免疫組織化学は、子宮内膜ガンを含む種々の新生物細胞の細胞質および原形質膜にMMP-2を位置決めするために用いられており、それに対し、TIMP-2は主にこれらの組織の支質に位置決めされた（Hoyhtyaら、1994）。これに加えて、子宮内膜ガンにおけるMMPおよびTIMPの発現についてはほとんど知られていない。このような情報は、子宮内膜型および他の型の悪性疾患の生物学的挙動の制御のストラテジーの開発に必須である。
【特許文献１】米国特許第5,324,634号明細書
【非特許文献１】Baak，J．P．A．Manual  of  Quantitative  Pathology  in  Cancer  Diagnosis  and  Prognosis，1991年
【非特許文献２】Iversen，O．E．Am．J．Obstet．Gynecol．，1986年，第155巻，pp．770-776
【非特許文献３】van  der  Putten，H．W．H．M．ら，Cancer，1989年，第63巻，pp．1378-1387
【非特許文献４】Berchuck  A．ら，Gynecol．Oncol．，1992年，第44巻，pp．61-65
【非特許文献５】Podratz，K．C．ら，Am．J．Obstet．Gynecol．，1993年，第168巻，pp．1206-1215
【非特許文献６】Lukes，A．S．ら，Cancer，1994年，第73巻，pp．2380-2385
【非特許文献７】Sakuragi，N．ら，Gynecol．Oncol．，1994年，第53巻，pp．183-189
【非特許文献８】Liotta，L．A．ら，Ann．Rev．Biochem．，1986年，第55巻，pp．1037-1057
【非特許文献９】Stetler-Sevenson,W.G.ら，Ann．Rev．Cell Biol．，1993年，第9巻，pp．541-573
【非特許文献１０】Seckinger,D.ら，Arch.Pathol.Lab.Med.,1989年，第113巻，pp．619-626
【非特許文献１１】Moberger，B．ら，Cytometry．，1985年，第5巻，pp．430-436
【非特許文献１２】Salamonsen,L.A.ら，J.Reprod.Fertil.Suppl.,1995年，第49巻，pp．29-37
【非特許文献１３】Salamonsen,L.A.，Trends in Endocrinology,1996年，第7巻，pp．28-34
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
子宮内膜ガンの危険がある被験体または子宮内膜ガンに罹患したと疑われる被験体における子宮内膜ガンの存在および／または危険性をアッセイする非侵襲性の方法を提供すること。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ここで、子宮内膜ガン患者の子宮洗浄物においてマトリックスメタロプロテイナーゼを検出し得るが、コントロール女性の類似の洗浄物においては検出し得ないことを予想外に発見した。この知見は、最小の侵襲を伴って行われ得る感度の良い診断試験、および危険性のある集団もしくは一般的な集団のスクリーニングまたは推定の処置の臨床試験における使用について利用され得るスクリーニング試験を可能とする。この試験はまた、処置の効力のモニターおよび再発の検出のために適切である。
【００１１】
本発明は、上記課題を解決するために、例えば、以下の手段を提供する。
項目１．子宮内膜ガンの存在および／または危険性を検出する方法であって、該方法が、子宮内膜ガンの危険がある被験体または子宮内膜ガンに罹患したと疑われる被験体の子宮腔から希釈子宮液サンプルを取得する工程、および該希釈子宮液におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）のレベルを測定する工程を包含する、方法。
項目２．前記希釈子宮液における総ゼラチン分解酵素が、測定される、項目１に記載の方法。
項目３．MMP-2および／またはMMP-9の活性のレベルが、測定される、項目１に記載の方法。
項目４．MMP活性が、必要に応じてデンシトメトリー測定と組み合わせた、ザイモグラフィーによって検出される、項目１または項目３に記載の方法。
項目５．総酵素レベルが、ELISA、蛍光定量アッセイ、化学発光アッセイ、またはラジオイムノアッセイを用いて測定される、項目１または項目２に記載の方法。
項目６．MMPレベルが、ELISAまたは化学発光アッセイによって測定される、項目５に記載の方法。
項目７．MMPレベルが、ELISAによって測定される、項目６に記載の方法。
項目８．前記子宮液におけるメタロプロテイナーゼの組織インヒビターのレベルもまた、測定される、項目１〜７のいずれか１項に記載の方法。
項目９．ａ）前記希釈子宮液を取得すると同時に、浅在子宮内膜細胞サンプルを収集し、
ｂ）該子宮内膜細胞を、倍数性および核形態の決定のための細胞学的検査に供し、そして
ｃ）前記希釈子宮液におけるMMPレベルを、子宮内膜ガンが存在する場合の子宮内膜ガンの予後の指標としてのDNA倍数性と相関させる、項目１〜８のいずれか１項に記載の方法。
項目１０．子宮内膜ガンの予後の評価のための方法であって、以下の工程：
ａ）子宮内膜ガンの手術を受ける患者の子宮腔から手術前に取得された希釈子宮液サンプルにおけるMMP活性を測定する工程、
ｂ）該患者より子宮内膜細胞サンプルを取得する工程、
ｃ）組織学的検査のために腫瘍サンプルおよび隣接する正常子宮内膜のサンプルを取得する工程、および
ｄ）予後の指標としてのMMP活性、DNA倍数性、ならびに腫瘍のグレードおよび型を相関させる工程、
を包含する、方法。
項目１１．原発性子宮内膜ガンについて保存療法を受けた患者における、子宮内膜ガンの再発の検出方法であって、該方法が、該患者の子宮腔からの子宮液サンプルを取得する工程、および該液におけるMMPレベルを測定する工程を包含する、方法。
項目１２．患者において、子宮内膜ガンについての推定の処置の効力をモニターする方法であって、該方法が、該患者の子宮腔からの希釈子宮液サンプルを取得する工程、および洗浄物におけるMMPレベルを測定し、これにより子宮内膜ガンが再発したか否かを検出する工程を包含する、方法。
項目１３．前記子宮液における総ゼラチン分解活性が、測定される、項目１１または項目１２に記載の方法。
項目１４．MMP-2および／またはMMP-9の活性のレベルが、測定される、項目１１または項目１２に記載の方法。
項目１５．MMP活性が、必要に応じてデンシトメトリー測定と組み合わせた、ザイモグラフィーによって検出される、項目１１または項目１２に記載の方法。
項目１６．酵素レベルが、ELISA、蛍光定量アッセイ、化学発光アッセイ、またはラジオイムノアッセイを用いて測定される、項目１１または項目１２に記載の方法。
項目１７．MMPレベルが、ELISAまたは化学発光アッセイによって測定される、項目１６に記載の方法。
項目１８．MMPレベルが、ELISAによって測定される、項目１７に記載の方法。
項目１９．MMP-2およびMMP-9のレベルが、定量的デンシトメトリーザイモグラフィーまたはELISAによって測定される、項目１４に記載の方法。
項目２０．子宮内膜ガンの危険がある被験体または子宮内膜ガンに罹患したと疑われる被験体における子宮内膜ガンの存在および／または危険性を検出するためのキットであって、
（ａ）該被験体の子宮腔を灌注するための適切な希釈剤、ならびに
（ｂ）希釈子宮液を、送達、回収および収集するための手段、ならびに
（ｃ）該希釈液におけるMMPレベルを決定するための手段、を備える、キット。
項目２１．さらに、
（ｄ）子宮内膜上皮サンプルを取得するための手段、
（ｅ）１枚以上の顕微鏡スライド、および
（ｆ）組織学的固定液を含む容器、
のうちの１つ以上を備える、項目２０に記載のキット。
項目２２．（ａ）前記被験体の子宮腔を灌注するための生理学的に許容可能な滅菌溶液、
（ｂ）滅菌シリンジ、
（ｃ）滅菌チューブまたはカテーテル、
（ｄ）前記希釈子宮液を受け取るための容器、ならびに必要に応じて、
（ｅ）該希釈液におけるMMPレベルを決定するための手段、
（ｆ）子宮ブラシ、および／または
（ｇ）少なくとも１枚の顕微鏡スライド、
を備える、項目２０または項目２１のいずれか１項に記載のキット。
項目２３．組織学的固定液を含む容器をさらに備える、項目２２に記載のキット。
項目２４．前記固定液が、４％パラホルムアルデヒドである、項目２２または項目２３に記載のキット。
項目２−１．子宮内膜ガンの存在および／または危険性をアッセイする方法であって、該方法が、子宮内膜ガンの危険がある被験体または子宮内膜ガンに罹患したと疑われる被験体から子宮洗浄物のサンプルを取得する工程、および該洗浄物におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）のレベルを測定する工程を包含する、方法。
項目２−２．前記子宮洗浄物における総ゼラチン分解酵素が、測定される、項目２−１に記載の方法。
項目２−３．MMP-2および／またはMMP-9の活性のレベルが、測定される、項目２−１に記載の方法。
項目２−４．MMP活性が、必要に応じてデンシトメトリー測定と組み合わせた、ザイモグラフィーによって検出される、項目２−１または項目２−３に記載の方法。
項目２−５．総酵素レベルが、ELISA、蛍光定量アッセイ、化学発光アッセイ、またはラジオイムノアッセイを用いて測定される、項目２−１または項目２−２に記載の方法。
項目２−６．MMPレベルが、ELISAまたは化学発光アッセイによって測定される、項目２−５に記載の方法。
項目２−７．MMPレベルが、ELISAによって測定される、項目２−６に記載の方法。
項目２−８．メタロプロテイナーゼの組織インヒビターのレベルもまた、測定される、項目２−１〜２−７のいずれか１項に記載の方法。
項目２−９．前記子宮洗浄物を取得すると同時に、浅在子宮内膜細胞サンプルを収集し、該子宮内膜細胞を、倍数性および核形態の決定のための細胞学的検査に供し、そして、前MMPレベルを、子宮内膜ガンが存在する場合の子宮内膜ガンの予後の指標としてのDNA倍数性と相関させる、項目２−１〜２−８のいずれか１項に記載の方法。
項目２−１０．子宮内膜ガンの予後の評価のための方法であって、子宮内膜ガンの手術を受ける患者から手術前に取得された子宮洗浄物におけるMMP活性を測定する工程、該患者より子宮内膜細胞サンプルを取得する工程、組織学的検査のために腫瘍サンプルおよび隣接する正常子宮内膜のサンプルを取得する工程、ならびに、予後の指標としてのMMP活性、DNA倍数性、ならびに腫瘍のグレードおよび型を相関させる工程、を包含する、方法。
項目２−１１．原発性子宮内膜ガンについて保存療法を受けた患者における、子宮内膜ガンの再発の検出方法であって、該方法が、該患者からの子宮洗浄物サンプルを取得する工程、および該洗浄物におけるMMPレベルを測定する工程を包含する、方法。
項目２−１２．子宮内膜ガンについての推定の処置の効力をモニターする方法であって、該方法が、該患者から子宮洗浄物サンプルを取得する工程、および該洗浄物におけるMMPレベルを測定し、これにより子宮内膜ガンが再発したか否かを検出する工程を包含する、方法。
項目２−１３．前記子宮洗浄物における総ゼラチン分解活性が、測定される、項目２−１１または項目２−１２に記載の方法。
項目２−１４．MMP-2および／またはMMP-9の活性のレベルが、測定される、項目２−１１または項目２−１２に記載の方法。
項目２−１５．MMP活性が、必要に応じてデンシトメトリー測定と組み合わせた、ザイモグラフィーによって検出される、項目２−１１または項目２−１２に記載の方法。
項目２−１６．酵素レベルが、ELISA、蛍光定量アッセイ、化学発光アッセイ、またはラジオイムノアッセイを用いて測定される、項目２−１１または項目２−１２に記載の方法。
項目２−１７．MMPレベルが、ELISAまたは化学発光アッセイによって測定される、項目２−１６に記載の方法。
項目２−１８．MMPレベルが、ELISAによって測定される、項目２−１７に記載の方法。
項目２−１９．MMP-2およびMMP-9のレベルが、定量的デンシトメトリーザイモグラフィーまたはELISAによって測定される、項目２−１４に記載の方法。
項目２−２０．子宮内膜ガンの存在および／または危険性を検出するためのキットであって、
（ａ）該被験体の子宮腔を灌注するための適切な溶液、ならびに
（ｂ）子宮洗浄物を、送達、回収および収集するための手段、
を備える、キット。
項目２−２１．さらに、
（ｃ）前記洗浄物におけるMMPレベルを決定するための手段、
を備える、キット。
項目２−２２．さらに、
（ｄ）子宮内膜上皮サンプルを取得するための手段、
（ｅ）１枚以上の顕微鏡スライド、および
（ｆ）組織学的固定液を含む容器、
のうちの１つ以上を備える、項目２−２０または項目２−２１に記載のキット。
項目２−２３．（ａ）前記被験体の子宮腔を灌注するための生理学的に許容可能な滅菌溶液、
（ｂ）滅菌シリンジ、
（ｃ）滅菌チューブまたはカテーテル、
（ｄ）前記子宮洗浄物を受け取るための容器、ならびに必要に応じて、
（ｅ）子宮ブラシ、および／または
（ｆ）少なくとも１枚の顕微鏡スライド、
を備える、項目２−２０〜項目２−２２のいずれか１項に記載のキット。
項目２−２４．組織学的固定液を含む容器をさらに備える、項目２−２３に記載のキット。
項目２−２５．前記固定液が、４％パラホルムアルデヒドである、項目２−２３または項目２−２４に記載のキット。
【００１２】
発明の要旨
１つの局面において、本発明は、子宮内膜ガンの存在および／または危険性についてのアッセイ方法を提供し、この方法は、子宮内膜ガンの危険性がある被験体または子宮内膜ガンに罹患したと疑われる被験体から子宮洗浄物のサンプルを取得する工程、および洗浄物におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）のレベルを測定する工程を包含する。
【００１３】
本明細書の目的のために、表現「子宮内膜ガンの検出」は、最も広範な意味で用いられ、そしてガンの存在もしくは不在の可能性、または前ガン状態もしくはガンの発生初期段階にある細胞の決定を含む。従って、本発明は、活性な子宮内膜ガンの検出のみならず、そのような活性なガンが発生する危険性の検出もまた含む。
【００１４】
子宮洗浄物は、子宮腔へ送達され次に試験のために回収され収集される任意の適切な溶液を用いることにより取得され得る。適切な溶液は、当業者にとって容易に明らかであり、そしてMMPの測定を妨害しない任意の滅菌非毒性溶液を含む。適切な溶液の例は、滅菌生理食塩水である。洗浄液の送達および回収のための任意の数の手段が利用され得、一例としては、シリンジおよびチューブが都合よく用いられる。洗浄物は、回収手段において収集され得、または別の容器に移され得る。送達、回収および収集手段は、患者および臨床医の双方に、快適さおよび都合よさを提供するように、日常的に選択される。
【００１５】
洗浄物中のMMPレベルを決定するための任意の適切な技術は、本発明の方法において使用され得る。適切な技術の例としては、酵素活性の決定に基づく技術、および／または酵素の存在もしくはレベルの決定に基づく技術が挙げられる。潜在性MMP、活性MMP、およびTIMP結合MMPを含む総MMPが、測定され得る。当業者は、必要な場合、ポジティブコントロールサンプルおよびネガティブコントロールサンプルを用いて、技術が適切か否かを容易に決定し得る。例えば、ゼラチンザイモグラフィーは全ての形態のMMP-2およびMMP-9の検出に適切である。各酵素型および各酵素形態（すなわち、潜在性または活性）の半定量的評価を提供するために、ザイモグラフィーアッセイは、必要に応じて、デンシトメトリーと結び付けられ得る。活性酵素はまた、基質に基づく活性アッセイを用いてアッセイされ得る。
【００１６】
子宮洗浄物中に存在する総ゼラチン分解活性（gelatinolytic  activity）は、測定され得る；これは、存在する異なる型のMMPを区別しないが、総MMP活性の迅速な推定値を生じる。しかし、好ましくは、MMP-2および／またはMMP-9の活性のレベルが測定される。
【００１７】
あるいは、総酵素レベルは、ELISA、蛍光定量アッセイ（fluorometric  assay）、化学発光アッセイ、またはラジオイムノアッセイのような方法を用いて測定され得る。ELISAまたは化学発光アッセイ方法は、迅速であり、感度が良く、および特異的であり、ならびに大規模スケールでの使用のために容易に自動化されるので、これらは、特に好ましい。これらの方法はまた、定性的決定を提供する。これらの酵素を測定するための多くの適切な方法は、Barrett（1995）において詳細に述べられている。
【００１８】
メタロプロテイナーゼ組織インヒビター（TIMP）の必要に応じたレベルはまた、子宮洗浄物において、例えば、逆ザイモグラフィーまたはELISAによって、決定され得る。
【００１９】
本発明のさらなる実施態様において、例えば、子宮ブラシを子宮腔に挿入することにより、浅在子宮内膜細胞サンプル(superficial  endometrial  cells)を、子宮洗浄物が取得されるのと同時に収集し、この子宮内膜細胞を倍数性および核形態の決定のための細胞学的検査に供し、そしてMMPレベル（上記のように決定される）を、子宮内膜ガンが存在する場合の子宮内膜ガンの予後の指標としてのDNA倍数性と相関させる。
【００２０】
標準的な画像細胞数測定技術および自動化装置は、倍数性および核形態を決定するために用いられ得る。
【００２１】
第２の局面において、本発明は、子宮内膜ガンの予後を評価する方法を提供することにより、この方法は、子宮内膜ガンの手術を受ける患者における手術前に取得された子宮洗浄物におけるMMP活性を測定する工程、この患者より子宮内膜細胞サンプルを取得する工程、組織学的検査のために腫瘍サンプルおよび隣接する正常子宮内膜のサンプルを取得する工程、ならびに予後の指標としてMMP活性、DNA倍数性、ならびに腫瘍のグレードおよび型を相関させる工程を包含する。
【００２２】
何らかの理由により子宮の除去手術が不可能である場合、子宮内膜ガンの主要な処置は、放射線治療、化学療法、子宮内膜の切除（例えば、子宮摘出よりはむしろ光力学的治療、または掻爬術を用いる）を用いる保存療法であり得る；いくつかのケースにおいて、掻爬術は、他の方法と組み合わせて用いられる。このような保存療法を受ける患者において、追跡調査およびガンの再発の検出が特に重要である。
【００２３】
従って、第３の局面において、本発明は子宮内膜ガンの処置の効力をモニターする方法を提供し、この方法は、このような処置を受ける患者から子宮洗浄物のサンプルを取得する工程、および洗浄物におけるMMPレベルを測定する工程を包含する。この方法はまた、推定の処置の効力をモニターするためにもまた、適用され得る。
【００２４】
第４の局面において、本発明は、原発性子宮内膜ガンについて保存療法を受けた患者における子宮内膜ガンの再発を検出する方法を提供し、この方法は、患者から子宮洗浄物サンプルを取得する工程、および洗浄物におけるMMPレベルを測定する工程を含有する。
【００２５】
MMP-2およびMMP-9の活性は、上記のように、好ましくは定量的デンシトメトリーのザイモグラフィーまたはELISAによって測定する。
【００２６】
本発明の方法は、無症候性もしくは健康な女性、または、例えば、糖尿病の女性もしくは閉経後のホルモン補充治療を受けた女性のような、危険のある集団のスクリーニングに適切である。
【００２７】
第５の局面において、本発明は、以下を備える、子宮内膜ガンの存在および／または危険性をアッセイするためのキットを提供する：
（ａ）子宮腔を洗浄するための適切な溶液、および
（ｂ）子宮洗浄物を送達、回収、および収集するための手段。
【００２８】
好ましくは、キットはさらに以下を含む：
（ｃ）その洗浄物中のMMPレベルを測定するための手段。
【００２９】
キットは、さらに、必要に応じて以下のうちの１つ以上を備え得る：
（ｄ）子宮内膜上皮サンプルを取得するための手段、
（ｅ）１枚以上の顕微鏡スライド、および
（ｆ）組織学的固定液を含む容器。
【００３０】
１つの好ましい実施態様において、キットは以下を備える：
（ａ）子宮腔を洗浄するための生理学的に受容可能な滅菌溶液、
（ｂ）滅菌シリンジ、
（ｃ）滅菌栄養管またはカテーテル、
（ｄ）子宮洗浄物の容器、および必要に応じて、
（ｅ）子宮ブラシ、および／または
（ｆ）１枚以上の顕微鏡スライド。
【００３１】
好ましくはキットは組織学的固定液を含む容器をさらに備える；より好ましくは、固定液は4％パラホルムアルデヒドである。
【００３２】
本明細書の目的のために、用語「含む」は、「含むがそれに限定されない」を意味すること、および用語「含有する」は対応する意味を有することが、明確に理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
発明の詳細な説明
患者
本発明は、ここで、次の非限定的な実施例および図面に対してのみ、参考の目的で詳細に記載される。
【００３４】
Royal  Women's  Hospitalにおいて子宮内膜ガンの外科的処置を受けたほとんどすべての患者が、研究群に含まれる（表１）。
【００３５】
他の状態についての外科的または診断的手順を有し、そして子宮灌注に対する同意が得られた女性は、コントロール群に含まれる。
【００３６】
研究集団のサイズをより急速に増大させるために、Mercy  Hospitalにおいて子宮ガンについて処置されている患者もまた、含まれる。
【００３７】
１つの研究集団は、子宮出血について研究されている閉経後の女性、および閉経周辺期の女性を含む。これらの患者において、診断的な子宮鏡検査および拡大および掻爬を行われる前に、子宮腔の減圧灌注が行われる。
【００３８】
２つめの集団は、子宮内膜ガンの手術を有する女性を含む。この群においては子宮腔は手術の開始時に灌注される。
【００３９】
３つめの集団は、先の研究群と同じ年齢の範囲で、コントロール群として、子宮灌注および子宮内膜上皮細胞診を有する、無症候性の女性を含む。
【００４０】
すべてのガン患者において、次のサンプルは本明細書に記載される研究のために収集されている。
【００４１】
（１）ザイモグラフィーによる分泌酵素（MMP）およびそれらのインヒビター（TIMP）の分析のための子宮洗浄物の無細胞上清。今日まで、MMP-2およびMMP-9は、ゼラチンザイモグラフィー（表１）、ELISA、およびイムノブロッティングによって検査されてきた。本発明者らの、カゼインザイモグラフィーを用いるMMP-1およびMMP-3の測定は、これらの酵素が存在しないか、または非常に低いレベルで子宮分泌物中に放出されることを示した。
【００４２】
（２）DNA倍数性の決定のための子宮内膜細胞：各々の患者において、そのような細胞を、子宮洗浄物由来の細胞ペレットから、子宮ブラシを用いて回収された子宮内膜上皮から、および悪性腫瘍の触診痕跡物（touch  imprint）または顕微鏡スライドから取得する。各々の調製物は、倍数性分析のために使用され、そして用いられた３つの方法により、一貫した結果が得られた。倍数性決定は、ガン患者において予後を評価するための目標および再現性のあるパラメーターを提供することが以前に報告されている。
【００４３】
（３）腫瘍片および隣接する正常子宮内膜片を、カルノワ固定液およびパラホルムアルデヒド中で固定する。これらの組織の組織学的切片を、免疫組織化学によってMMPの存在について、そして、インサイチュハイブリダイゼーションを使用してこれらの酵素およびインヒビターの遺伝子の転写について研究した。何人かの患者からの腫瘍サンプルおよび隣接する正常組織のサンプルをまた、続くさらなる研究、例えば組織におけるMMPの直接分析のために凍結した。
【００４４】
子宮液および細胞の収集
5mlの生理食塩水を含むシリンジを、栄養管に取り付ける。栄養管を、頚部を通して挿入し、子宮腔を灌注し、そしてシリンジに戻して収集した液を、試験管に移す。子宮ブラシをまた、子宮腔に挿入し、細胞診のために浅在子宮内膜細胞を収集する。
【００４５】
子宮液を、3000rpmで10分間遠心分離する。上清のアリコートを収集し、続くMMP/TIMP分析のために-80℃で保存する。子宮内膜細胞のペレットおよび子宮ブラシから得られた子宮内膜の細胞診サンプルを、2％  3-アミノプロピルトリエトキシシラン（AAS）でコートしたスライドに塗沫する。これらの細胞学的スライドを、4％パラホルムアルデヒド中で固定し、次いで画像細胞数測定を用いてDNA倍数性の評価のためにFeulgen染色する。
【００４６】
子宮内容物の加工
ガンおよびコントロール研究群において、子宮洗浄物をすぐに3000rpmで10分間遠心分離し、細胞をペレットにし、そして上清を続くMMPおよびTIMP研究のために凍結する。両方の群からの細胞ペレットを、下記のように画像細胞数測定を用いてDNA倍数性を決定するために調製する。子宮内膜ガンの外科的切除を受けた患者では、次のサンプルを調製した。切り出した子宮を開いた後、少なくとも２つの触診調製物を、細胞ペレットを用いる場合のように、DNA倍数性決定のために腫瘍の表面から取得した。さらに、特に浸潤領域における悪性組織のサンプル、および隣接する正常な子宮内膜組織のサンプルは、組織病理学的検査のために子宮の残りが加工される前に、免疫組織化学的研究およびインサイチュハイブリダイゼーション研究のために切り出される。後者は、子宮筋層の浸潤の深さならびに腫瘍のグレードおよび型の評価を含む。さらに、リンパ節および付属器の転移の存在または非存在を決定する。
【００４７】
DNA倍数性研究
子宮洗浄物から得られた剥離した上皮細胞のペレットを、分散し、培養培地で洗浄し、再懸濁し、そして60μmナイロンメッシュフィルターを通してろ過する。細胞の懸濁液を、ポリリジンコートしたスライドガラスに、cytospin遠心分離によって貼りつける。これらの調製物において、および子宮腫瘍の触診痕跡物について、コンピューター化された光学画像分析系を、DNAのFeulgen染色を定量化するために使用する。機器を、スライドの１つの端で試験サンプルとともに染色された、既知量のDNAを有する細胞（ラット肝細胞）を使用して較正する。200〜300個の細胞が、選択されそして分析された。個々の核が走査されることによって、１細胞あたりのDNA含量のヒストグラムが生じ、そして倍数性の決定は、主要なピークおよび二次的なピークの位置によって、これらのヒストグラムに基づいて作成される（二倍体DNA指数1.0±0.1）。
【００４８】
子宮洗浄物中のMMPおよびTIMPの分析
子宮洗浄物中の酵素活性を、ゼラチン（MMP-2、MMP-9）またはカゼイン（MMP-1、MMP-3、MMP-7）ザイモグラフィーによって分析する。サンプルを、非還元条件下で、ゼラチンまたはカゼイン（それぞれ1mg/ml）のいずれかを含む10％アクリルアミドゲルのSDS-PAGEに供する。50mmol/L  Tris-HCl、5mmol/L  CaCl2、NaN3、0.02%（w/v；pH7.5)、および1% Triton X-100を含む緩衝液中で洗浄後、ゲルをTritonを含まない同じ緩衝液中で、37℃、2〜24時間インキュベートし、そしてクマシーブリリアントブルーで染色する。ゼラチナーゼまたはカゼイナーゼ活性を、ゲルの陰性染色によって可視化する。SDSは潜在性MMPを活性化させるので、潜在性MMPおよび活性MMPの両方がこの技術によって検出される。適切な場合、MMPインヒビターを、インキュベ−ションの間に加える（5mmol/L  EDTAおよび2.5mmol/L  o-フェナントロリン）。定量化のために、個体間の子宮洗浄物のタンパク質含量の広い変動性を補うために、ロードする容量は、子宮洗浄物の総容量に相関し、従って各々の個体の子宮管腔における相対MMP濃度の評価を可能にする。ゲルを、目的の酵素または個々のサンプルのいずれかについてのレーンプロフィールを通してプロットされたピークの下の面積を測定することによって、ゲルプロットマクロに適合させたDeskscanソフトウェアおよびNIH  Imageプログラムversion  1.54を用いる、HP  Desk  Scannerを使用するデンシトメトリー分析に供する。１枚だけのゲル内で、または平行して注がれ、そして泳動されたゲルのセット内で、定量的な比較が行われる。各々のゲルは、標準物質の少なくとも２つの希釈物を含み、そして各々のゲルのセットは、この標準物質の４つの希釈物を含む。目的の酵素の活性が非常に高い場合には、サンプルをさらに希釈および再泳動する。定量的な技術としての、このような方法におけるザイモグラフィーの使用は記載されている（KleinerおよびStetler-Stevenson、1994、およびそこに列挙される文献）。この技術は非常に敏感であり、検出限界は、サンプルあたりngの範囲内の検出限界を有するELISAのような方法よりもはるかに低く、MMP-2およびMMP-9の両方について検出限界はサンプルあたり2pgのオーダーである（1nM）。
【００４９】
ゼラチナーゼ活性アッセイ
このアッセイは、14C-標識コラーゲン基質とサンプルとのインキュベーションを含む。基質を、モルモット皮膚から単離し、透析し、14Cで標識し、そして使用直前に、60℃で20分間、熱変性させて、酵素MMP-2およびMMP-9によって消化され得る、14C-ゼラチンの形態に転換させる。
【００５０】
総ゼラチン分解活性を、100μg/mlのトリプシンと基質とをインキュベートすることによって測定する。サンプルを、処理しないか、または潜在性のMMPを活性化するためにアミノフェニル酢酸第二水銀とプレインキュベーションする。アッセイサンプルを、37℃で4〜24時間インキュベートし、そして反応を、30％トリクロロ酢酸／1％タンニン酸の添加によって停止する。未消化の基質の沈殿が形成される。任意の酵素活性を、消化され、上清に放出された標識基質の量を計数することによって測定する。このアッセイ系を使用することによって、各々のサンプル中の比活性を計算することが可能である；活性の１ユニットは、37℃で1分あたり1μgの基質を分解し得る酵素量と定義される。このアッセイは、サンプル中ですでに活性である酵素活性、および潜在性酵素の活性化後に潜在的に利用可能な活性の両方を規定するうえで有用である；生理学的な用語において、これは、サンプル中の酵素が、細胞外マトリックス成分を分解している速度を表現する。このアッセイは、総ゼラチナーゼ活性のみを測定する；それは、MMP-2およびMMP-9のようなゼラチナーゼ間の活性を区別しない。特定のMMPは、ザイモグラフィーによって区別され得る。
【００５１】
免疫組織化学およびインサイチュハイブリダイゼーション
MMPおよびTIMPの分析のための、特異的な試薬および方法は、文献に記載された（例えば、Rawdanowiczら、1994；Jeziorskaら、1996；SalamonsenおよびWoolley、1996）。抗血清は現在市販されており（例えば、Biogenesis  Ltd.，U.K.，Triple  Point  Biologics，Oregon  U.S.A.，The  Binding  Site，U.K.から）、そして純粋酵素およびTIMPもまた、利用可能である（Calbiochem，Cambridge  MA，U.S.A.）。すべての関連性の遺伝子はクローニングされており、そしてその配列は公表され、パブリックドメインで利用可能である。
【００５２】
免疫組織化学が、カルノワ固定されたか、またはパラホルムアルデヒド固定された、ワックスに包埋された組織について、上記に詳細に述べた抗血清およびアルカリホスファターゼ／抗アルカリホスファターゼ（APAAP）検出系（Serotec）（Salamonsenら、1991；Salamonsenら、1993；Rawdanowiczら、1994）を用いて行われる。パラホルムアルデヒド固定は、一般的により都合よく、そして少量のサンプルでよりよい結果を与える。インサイチュハイブリダイゼーションは、ジゴキシゲニン標識されたDNAまたはRNAプローブを使用する。
【実施例】
【００５３】
実施例１ 子宮内膜ガンについて研究された患者の子宮腔に放出されるMMP
子宮内膜ガンを有する52人の患者からのサンプル、および子宮出血または他の婦人科状態について診断手順を受けた40人のコントロール患者を、ザイモグラフィーによってMMP-2およびMMP-9について、ならびに画像細胞数測定によって浅在子宮内膜細胞のDNA倍数性測定について調べた。子宮内膜ガンを有することが見出された患者について、悪性疾患のグレードを評価した。MMP-2およびMMP-9を、さらに次の推定分子の型に分離した：潜在性MMP-2、活性MMP-2、二量体MMP-9、グリコシル化されたプロMMP-9および活性MMP-9。潜在性および活性MMP-2およびMMP-9の同一性を、後の実施例において記載するように、引き続いて確認した。
【００５４】
結果を、表１および表２に要約した。さらに、MMP-1、MMP-3およびMMP-7を、カゼインザイモグラフィーを用いて測定したが、検出可能なレベルは、コントロールでも子宮内膜ガンの子宮洗浄物でも、いずれにおいても見い出されなかった。
【００５５】
表１は、この群における、他の臨床的および病理学的パラメーターに関して種々のグレードの子宮内膜ガンを有する患者から得られた、ザイモグラフィーの結果を要約する。ゼラチナーゼザイモグラフィーは、２つの分子形態のMMP-2に、および３つの分子形態のMMP-9に分離した。今日までに子宮内膜ガンからの子宮洗浄物中で検出された最も低いゼラチン分解活性は、J.O.とコードされる患者において、１つの形態のMMP-2（＋が割り当てられる）、および２つの形態のMMP-9（両方とも＋が割り当てられる）を示した。任意のMMP部分のレベルの合計として評点された３つの＋の合計が、子宮内膜ガンの陽性の診断に必要とされる最低のレベルとして設定される場合には、表２に示したコントロールのいずれもが、偽陽性として診断されない。今日まで、子宮内膜ガン群で偽陰性結果（いかなるMMP活性も存在しない）には遭遇したことはない。ガン患者からの個々の子宮洗浄物に関して、観察されたゼラチン分解活性のレベルは、3〜22＋の範囲であった。
【００５６】
【表１−１】
2007202556.tif 000002
【００５７】
【表１−２】
2007202556.tif 000003
【００５８】
【表１−３】
2007202556.tif 000004
表２は、コントロール（臨床的に検出可能な子宮内膜ガンのない）患者において得られたザイモグラフィー結果、ならびにこの群における臨床的パラメーターおよび病理学的パラメーターをまとめる。ゼラチナーゼザイモグラフィーによって、５人の患者において非常に低いレベルの潜伏性のMMP-2、ならびに１人の患者において非常に低いレベルの120kDaゼラチナーゼ（推定MMP-9）の存在が明らかになった。今日まで、他の形態のMMPは、ザイモグラフィーアッセイのために希釈された子宮洗浄物において検出されていない。大部分のコントロールの患者の子宮洗浄物における検出可能なゼラチン分解活性の非存在、または非常に低い活性の単一分子形態のMMPは、最大の１つの＋として評価され、これは、子宮洗浄物においていくつかのMMP部分が検出される場合、特異的かつ感受性の子宮内膜ガンの診断がなされ得ることを示唆する。
【００５９】
【表２−１】
2007202556.tif 000005
【００６０】
【表２−２】
2007202556.tif 000006
実施例２：MMP-9およびMMP-2のELISAアッセイ
BiotrakTM  MMP-9  ELISAキット（CalbiochemR）は、子宮洗浄物サンプルにおいてMMP-9の単純かつ特異的な決定を提供する。アッセイの感度は、0.6ng/mlである。このアッセイは、MMP-9の異なるエピトープに指向される２つの抗体を使用する。サンプルまたは標準に存在する任意のMMP-9は、抗MMP-9で予めコーティングしたマイクロタイタープレートに結合する。これに、第二のインキュベーション工程が続き、ここで、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合体化された検出抗体を添加し、そして固定化された複合体が形成される。各ウェルにおけるペルオキシダーゼ複合体の量を、各ウェルにテトラメチルベンジジン基質の添加を含む発色反応によって決定する。得られた青色を、マイクロタイタープレート分光光度計（Beckman）において630nmで測定する。
【００６１】
標準曲線を、630nmでの平均光学密度を標準のng/mlに対してプロットすることによって生成する。これから、各サンプルの濃度（ng/ml）をグラフからの外挿によって決定する。
【００６２】
１つのマイクロタイタープレート（96ウェル）は、二連での標準曲線の構築および40の未知の測定を可能にする。ELISAプロトコルは、結果が１日で得られることを可能にする。
【００６３】
10人のガン患者および10人のコントロール患者からのサンプルを、希釈せずに、および1：4に希釈して調製し、次いでMMP-9の存在または非存在についてアッセイする。図７は、生データを表す。ここで、マイクロタイタープレートにおける各ウェルについての光学密度を示す。図８は、マイクロタイタープレートにおいて得られた発色反応のグレースケールの代表図である；次いで、これは子宮洗浄物サンプルに存在するMMP-9の量のおおまかな代表図である。すべてのガンサンプルは、ガンサンプルの測定値が標準曲線の外側に存在したほどにまで、コントロールより有意に大きな光学密度の値を有する。この研究の継続として、多数のサンプルを連続希釈し、そしてELISA試験を用いてアッセイした。この力価測定手順は、子宮ガンを検出するためにMMP-9（ng/ml）のカットオフ値または基底レベルを確立する。
【００６４】
この方法はまた、BiotrakTM  MMP-2  ELISAキット（これもまた、CalbiochemRから入手される）を用いて、MMP-2を測定するのに使用され得る。
【００６５】
実施例３：細胞生物学研究
子宮ガンを有することがわかっている患者において、処置手順の一部として子宮摘出を行った。子宮の切除後、可能であれば、子宮内膜組織を２つの部位から切り出した：
(a)  悪性病巣の場所に対応する部位
(b)  子宮内膜が肉眼検査で正常であるとみえる部位。
【００６６】
腫瘍組織サンプルおよび正常組織サンプルの両方を、0.15M  NaCl、10mM  CaCl2、および0.05％  Brij  35を含む50mM  Tris-HCl緩衝液(pH7.5)中で氷上でホモジナイズした。上清を遠心分離により得、そしてタンパク質濃度を、BioRadタンパク質アッセイ試薬を使用した色素結合法によって決定した。
【００６７】
組織ホモジネートにおけるMMP発現をゼラチンザイモグラフィーにより検査した。１レーンあたり等量のタンパク質に修正した上清を、上記のようにゼラチン含浸ゲルを用いるSDS-PAGEに供した。
【００６８】
ザイモグラムは、MMP-9およびMMP-2の両方がすべての組織サンプルから放出されたことを示す。しかし、正常子宮内膜の領域からの組織サンプルが、同一の患者由来の腫瘍組織サンプルよりも有意に少ないレベルのMMPを放出していたことは明らかであった。従って、腫瘍組織において、特にMMP-9のアップレギュレーションが存在するようである。
【００６９】
これらの研究は、以前の節において記載されている、本発明の手段によって検出されたMMP-9およびMMP-2のレベルの上昇が、非ヒト組織に由来するというよりは、子宮に存在するガン組織の分泌に主に由来していたことを示す。
【００７０】
実施例４：子宮内膜ガン細胞の培養
腫瘍の部位に由来する子宮内膜組織を、上記のように子宮摘出後に子宮から切り出した。この組織サンプルをより小さな片に切り刻み、次いで、10％FCSを含むα最少必須培地（MEM）中で洗浄した。次いで、腫瘍組織断片をコラゲナーゼ／MEM溶液（FCSを含まない）中にて40分間37℃でインキュベートした。剥離した細胞をMEM＋10％FCS中で洗浄し、次いで７cm2培養ディッシュに播種した。
【００７１】
急激に増殖する細胞は、３〜４日でコンフルエントになり、そして形態学的に均質な集団の細胞を含むようであった。対照的に、子宮内膜の正常領域に由来する上皮細胞は、同じ期間には適切な単層を確立しなかった。腫瘍細胞がコンフルエントになった場合、培養培地を無血清MEMと置換した。細胞を、培地を収集してザイモグラフィーにより分泌されたMMPのプロフィールを決定する前に24時間、無血清条件下で培養した。
【００７２】
プロMMP-2およびプロMMP-9の両方を、ゲル上で同定した。この研究は、培養されたガン細胞が、子宮腔におけるガン細胞によって分泌されるものに類似する酵素プロフィールを分泌することを示した。
【００７３】
実施例５  イムノブロッティング
子宮洗浄物のサンプルを、10％ゲルを用いたSDS-PAGEに供した。サンプルを、還元条件下で泳動し、次いで、それらをポリビニリデンジフルオリドメンブレンに移した。メンブレンをブロッキング緩衝液で洗浄し、その後モノクローナルMMP-2抗体（IM33L、CalbiochemR）でプローブした。これに、３回のTBS（pH7.4）中での10分間の洗浄、および西洋ワサビペルオキシダーゼに結合体化した検出抗体とのインキュベーションが続いた。次いで、化学発光反応を使用して、固定化されたMMP-2抗原を検出した。この反応において、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素は、ルミノール試薬の酸化に由来する光放出を触媒する。エンハンサー試薬を使用して放出を増加させる。膜上の抗原の量に依存する、放出された光をオートラジオグラフィーフィルム上で捕獲する。これは、結果の永続的な記録を生成する。
【００７４】
MMP-9を、特異的なモノクローナルMMP-9抗体（IM37L、CalbiochemR）を使用する同様な方法で検出した。
【００７５】
この技術は、子宮内膜ガンを有する患者の子宮洗浄物において検出された酵素の同定を明らかに規定する。イムノブロッティングは、ザイモグラフィーによって検出された２つの主要な酵素がMMP-2およびMMP-9であったことを示した。更なるバンドもまた検出されたが、これらのゼラチナーゼの分子的性質はまだ同定されていない。暫定的に、これらは、MMP-2およびMMP-9のオルタナティブ形態（例えば、表１に示したMMP-2およびMMP-9の推定形態）であるとみなされている。
【００７６】
実施例６ 子宮内膜ガンの検出のための子宮超音波および子宮液MMPの分析
この見込みのある試行の目的は、膣超音波検査によって異常な子宮出血について検査される女性において子宮内膜ガンを検出するための子宮液MMPアッセイの感度および特異性を評価することであった。この検査は、生理食塩水注入子宮(超）音波検査を含んでいたので、初期の子宮洗浄サンプルは、試験を受けることに同意した患者において、本発明者らの研究室においてMMPの分析のために提供された。検査される集団は、閉経前および閉経後の45〜65歳の女性を含む。この研究は、子宮ガンを有する危険の高い女性の集団における子宮MMPの発症率の増加レベルが、年齢の一致した無症候性の女性よりも、高いことを明らかにすることが期待された。危険のある集団における子宮内膜ガンの発症率は、２〜10％に及ぶと見積もられた。
【００７７】
表３に、得られた結果をまとめる。子宮液をゼラチンザイモグラフィーによって研究した105人の患者のうち、８人（7.6％）の患者では、MMPのレベルが上昇していた。この８人のMMP試験陽性の患者のうち、５人がそれらの子宮内膜組織の組織病理学的検査によって子宮ガンを有することが見い出された。他の３人の患者には、組織学的検査によっては異常は検出されなかった。それにもかかわらず、子宮液における上昇したMMPのレベルは、このような患者の定期的な追跡、特にこの上昇が子宮ガンの発症の危険の上昇と関連するか否かを決定することを、保証し得る。偽陰性の結果は得られなかった。
【００７８】
【表３】
2007202556.tif 000007
本発明者らは、本研究における子宮内膜ガンを有する女性全員の子宮分泌物が、コントロール群の子宮分泌物における非存在または非常に低いレベルと比べて、顕著に上昇したレベルのMMP-2およびMMP-9を含むことを見い出した。ガンとコントロール群との間のこの識別性かつ一貫した酵素レベルにおける差異は、子宮分泌物におけるMMP分析が子宮内膜ガンの全段階について高感度かつ信頼性のある診断試験として有用であることを示唆する。
【００７９】
子宮灌注は、比較的単純かつ非侵襲性の手順であるので、子宮洗浄物サンプルのゼラチンザイモグラフィーによるアッセイ、またはMMPアッセイの別の手段（例えば、ELISA）は、子宮内膜作製度について日常的なスクリーニング試験として、必要に応じて、子宮頸疾患についてのPapスメアとともに使用され得る。予備的な統計学的分析は、本発明に従う試験の感度が100％であることを示唆する。これは、従来のPapスメアで通常観察される80％の感度に対して非常に有利に比較される。ELISAまたは化学発光アッセイは、容易に自動化され得、そして大規模スクリーニングおよび臨床試験における使用に適している。
【００８０】
さらに、本発明者らの現在の知見は、MMP-2およびMMP-9が子宮内膜ガンの発達、そしておそらく子宮における腫瘍の拡散に関与することを示唆する。これは、子宮ガンの管理全体において、他の処置様式とともに特異的な酵素インヒビターを使用するための原理を提供し得る。
【００８１】
子宮内膜腺ガンの各段階の患者の数が少なすぎて、子宮筋の浸潤の組織学的等級または深さに関して、MMP-2およびMMP-9のレベルについて結論を導くことは何らできなかった。しかし、一般的に、両方のMMPの最高のレベルが最深の浸潤を有していた２人の患者において見出された。これらの女性の各々はまた、ポリープ状腫瘍細胞および推測で中程度の悪性の等級を有していたことが見い出された（表１）。これは、MMP-2およびMMP-9のレベルがこれまでの公知である予後指標の有用な補完を提供することを示唆する。
【００８２】
本発明は、明確さおよび理解の目的のために、いくらか詳細に記載されているが、本明細書において記載される実施態様および方法への種々の改変および変更が本明細書に開示された本発明の概念の範囲を逸脱することなくなされ得ることは当業者に明らかである。
【００８３】
本明細書において引用された参考文献は、以下の頁に列挙され、そして本明細書において参考として援用される。
【００８４】
【表４−１】
2007202556.tif 000008
【００８５】
【表４−２】
2007202556.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１−１】図１は、子宮内膜ガンを有する患者からの子宮洗浄物のサンプルの連続希釈を用いた、ザイモグラフィーの結果を示す。
【図１−２】図１は、子宮内膜ガンを有する患者からの子宮洗浄物のサンプルの連続希釈を用いた、ザイモグラフィーの結果を示す。
【図２−１】図２は、子宮内膜ガンを有する患者からの子宮洗浄物の一連のサンプルについて得られた結果を比較し、ここでザイモグラフィーを、MMP活性の特定のインヒビターの非存在下（ゲルの左半分）または存在下（ゲルの右半分）で行った。
【図２−２】図２は、子宮内膜ガンを有する患者からの子宮洗浄物の一連のサンプルについて得られた結果を比較し、ここでザイモグラフィーを、MMP活性の特定のインヒビターの非存在下（ゲルの左半分）または存在下（ゲルの右半分）で行った。
【図３ａ−１】図３は、子宮内膜ガンを有する患者の子宮洗浄物サンプル（図３ａ）と、コントロールの被験体からのサンプル（図３ｂ）を用いて得られた、ザイモグラフィーの結果を比較する。コントロールサンプルを、ガン患者からのサンプルの４倍の濃度でロードした。
【図３ａ−２】図３は、子宮内膜ガンを有する患者の子宮洗浄物サンプル（図３ａ）と、コントロールの被験体からのサンプル（図３ｂ）を用いて得られた、ザイモグラフィーの結果を比較する。コントロールサンプルを、ガン患者からのサンプルの４倍の濃度でロードした。
【図３ｂ−１】図３は、子宮内膜ガンを有する患者の子宮洗浄物サンプル（図３ａ）と、コントロールの被験体からのサンプル（図３ｂ）を用いて得られた、ザイモグラフィーの結果を比較する。コントロールサンプルを、ガン患者からのサンプルの４倍の濃度でロードした。
【図３ｂ−２】図３は、子宮内膜ガンを有する患者の子宮洗浄物サンプル（図３ａ）と、コントロールの被験体からのサンプル（図３ｂ）を用いて得られた、ザイモグラフィーの結果を比較する。コントロールサンプルを、ガン患者からのサンプルの４倍の濃度でロードした。
【図４−１】図４は、子宮内膜ガンを有する患者からの子宮洗浄物サンプル（レーン３）と、種々のコントロールの被験体からのサンプルからのザイモグラフィーの結果を比較する。レーン５と７および６と８はそれぞれ同じ被験体由来であるが、しかし、レーン７および８のサンプルは、レーン５および６のサンプルの４倍の濃度である。
【図４−２】図４は、子宮内膜ガンを有する患者からの子宮洗浄物サンプル（レーン３）と、種々のコントロールの被験体からのサンプルからのザイモグラフィーの結果を比較する。レーン５と７および６と８はそれぞれ同じ被験体由来であるが、しかし、レーン７および８のサンプルは、レーン５および６のサンプルの４倍の濃度である。
【図５−１】図５および６は各々、子宮内膜ガンを有する患者からの一連の異なるサンプルを示す。これらは、サンプル間の直接的な比較を可能にするために同一の濃度で泳動した。
【図５−２】図５および６は各々、子宮内膜ガンを有する患者からの一連の異なるサンプルを示す。これらは、サンプル間の直接的な比較を可能にするために同一の濃度で泳動した。
【図６−１】図５および６は各々、子宮内膜ガンを有する患者からの一連の異なるサンプルを示す。これらは、サンプル間の直接的な比較を可能にするために同一の濃度で泳動した。
【図６−２】図５および６は各々、子宮内膜ガンを有する患者からの一連の異なるサンプルを示す。これらは、サンプル間の直接的な比較を可能にするために同一の濃度で泳動した。
【図７】図７は、MMP-9のELISAアッセイの結果を示し、マイクロタイタープレート中の各々のウェルの光学密度を示す。
【図８】図８は、マイクロタイタープレート中の呈色反応のグレースケール表示を示す。
【図１−１】
2007202556.tif 000010
【図１−２】
2007202556.tif 000011
【図２−１】
2007202556.tif 000012
【図２−２】
2007202556.tif 000013
【図３ａ−１】
2007202556.tif 000014
【図３ａ−２】
2007202556.tif 000015
【図３ｂ−１】
2007202556.tif 000016
【図３ｂ−２】
2007202556.tif 000017
【図４−１】
2007202556.tif 000018
【図４−２】
2007202556.tif 000019
【図５−１】
2007202556.tif 000020
【図５−２】
2007202556.tif 000021
【図６−１】
2007202556.tif 000022
【図６−２】
2007202556.tif 000023
【図７】
2007202556.tif 000024
【図８】
2007202556.tif 000025