(57)【要約】【課題】  短時間で微生物を含む沈殿物を沈降させることができるとともに、微生物の検出感度を高くすることができる微生物の分離方法を提供する。【解決手段】  濃縮タンク１３において、微生物を含有する試料水１に、陰イオン溶液３および陽イオン溶液５を加え、水に難溶性の無機物質の結晶を析出し、さらに鉄系凝集剤５を加え、この析出物を凝集させてフロックとして沈降させた後、試料精製部１６において、この沈降物を酸１７で溶解することで微生物を分離する。【選択図】  図１
2007236221.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物を含有する試料水に、陰イオン溶液および陽イオン溶液を加え、水に難溶性の無機物質の結晶を析出するステップと、
この試料水に鉄系凝集剤をさらに加え、前記析出物を凝集させてフロックとして沈降させるステップと、
この沈降物を酸で溶解して前記微生物を得るステップと
を含む微生物の分離方法。
【請求項２】
前記陰イオン溶液としてＳＯ42-、ＣＯ32-またはＰＯ43-を含む溶液を使用し、前記陽イオン溶液としてＭｇ2+、Ｃａ2+、Ｓｒ2+またはＢａ2+を含む溶液を使用する請求項１に記載の微生物の分離方法。
【請求項３】
前記鉄系凝集剤として塩化第二鉄を使用する請求項１に記載の微生物の分離方法。
【請求項４】
前記酸として塩酸を使用する請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物の分離方法。
【請求項５】
前記沈降物を酸で溶解して微生物を得るステップが、前記沈降物に前記酸を添加した後、前記酸が前記沈降物を溶解する溶解時間を経過してから、微生物を含む固体と前記析出物の溶解液とに分離するステップである請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の分離方法に関し、特に、河川および湖沼などの環境水や上下水道の各処理プロセスの処理水などの水中に存在する原虫、細菌、ウイルスといった感染性微生物を検出するために、採取した試料水から微生物を分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
環境中には多種多様な化学物質が存在するため、水道原水となる河川や湖沼などの環境水も様々な化学物質で汚染されていると考えられる。しかし、このような水環境の水質問題のほかにクリプトスポリジウムなどの原虫類、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７やレジオネラ菌などの細菌、ウイルスなどによる水系感染症の発生も大きな社会問題となっている。
【０００３】
例えば、新興の水系感染症の原因となっているクリプトスポリジウムやジアルジアなどの原虫の検査方法（例えば、非特許文献１）では、クリプトスポリジウムの検査手順は大きく分けて、試料採取、ろ過濃縮、剥離懸濁、分離精製、免疫蛍光染色、顕微鏡観察からなる。
【０００４】
しかし、このクリプトスポリジウム検査方法では、上記のように多くの工程が必要であり、作業が煩雑で検査終了まで半日以上と長時間を要するため作業者の負担が大きく、複数の試料を迅速に処理することができない。特に、上述の試験方法は一般的に試料中からクリプトスポリジウムを捕捉し回収するとき、試料の濁質によりディスクフィルターが目詰まりをおこし、短時間でろ過速度が低下するため全試験工程にかかる時間が長くなり迅速な測定ができず、大量の試料を効率よく処理できないという問題もある。さらに、上述のろ過濃縮および剥離懸濁にけるクリプトスポリジウムの回収率は数％〜８０％前後と低く、検出誤差も陰性と判断される可能性がある。
【０００５】
また、ろ過によらない分離濃縮方法として、炭酸カルシウムによるクリプトスポリジウムの濃縮方法（非特許文献２）が報告されている。この濃縮方法は、試料水に塩化カルシウム溶液と炭酸水素ナトリウム溶液を添加し、水酸化ナトリウム溶液でｐＨを１０に上げると不溶性の炭酸カルシウムの結晶が析出し、この炭酸カルシウムの微粒子に試料水中の検出対象微生物を吸着させ、その沈殿物を回収するものである。この濃縮方法の原理は以下のように考えられている。
【０００６】
すなわち、クリプトスポリジウムの表面は負に帯電しており、塩化カルシウム溶液を加えると陽イオンのカルシウムイオンがクリプトスポリジウムの近傍に集まり、ついで炭酸水素ナトリウム溶液を加えると、陰イオンの炭酸イオンがクリプトスポリジウムの近傍にあるカルシウムイオンと結合し、炭酸カルシウムの結晶が析出すると同時にクリプトスポリジウムもその結晶内部に取り込まれ、さらに結晶が成長し沈降するものである。この炭酸カルシウムの結晶からクリプトスポリジウムを分離するには、炭酸カルシウムの沈殿物に酸であるスルファミン酸を加え、炭酸カルシウムのみを溶解し、クリプトスポリジウムを単離する。
【０００７】
しかし、この方法では、クリプトスポリジウムが吸着した炭酸カルシウムを沈殿させるために４時間以上、あるいは一晩静置させなければならず、全試験工程にかかる時間が長くなり迅速な測定ができないという問題がある。
【０００８】
一方、特許文献１には、真性細菌を含有する懸濁液に水酸化カルシウムを添加してｐＨを１０以上にして細菌を凝集し、さらに塩化第二鉄を添加して凝集物を成長させ、この成長した凝集物を遠心分離機等で脱水して真性細菌を分離する方法が記載されている。この方法では、沈殿物の含水率が６０〜８０％と大きなフロックを形成しており、沈殿物をプレスろ過器や遠心分離によって回収することができる。しかし、装置が複雑で大規模になるという問題がある。
【非特許文献１】「水道におけるクリプトスポリジウム暫定対策指針」、厚生労働省、１９９８年改定
【非特許文献２】ジー・ビージー（G．Vesey）ら著，「水からクリプトスポリジウムオーシストを濃縮する新手法（A new method for the concentration of Cryptosporidium oocysts from water）」，ジャーナル・オブ・アプライド・バクテリオロジー（Journal of Applied Bacteriology），１９９３年，７５巻，ｐ．８２−８６
【特許文献１】特公昭５５−４９８２６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで本発明は、上記の問題点に鑑み、短時間で微生物を含む沈殿物を沈降させることができるとともに、微生物の検出感度を高くすることができる微生物の分離方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の目的を達成するために、本発明に係る微生物の分離方法は、微生物を含有する試料水に、陰イオン溶液および陽イオン溶液を加え、水に難溶性の無機物質の結晶を析出するステップと、この試料水に鉄系凝集剤をさらに加え、前記析出物を凝集させてフロックとして沈降させるステップと、この沈降物を酸で溶解して前記微生物を得るステップとを含むことを特徴とする。
【００１１】
前記陰イオン溶液としてはＳＯ42-、ＣＯ32-またはＰＯ43-を含む溶液を使用し、前記陽イオン溶液としてはＭｇ2+、Ｃａ2+、Ｓｒ2+またはＢａ2+を含む溶液を使用することが好ましい。前記鉄系凝集剤としては塩化第二鉄を使用することが好ましい。前記酸としては塩酸を使用することが好ましい。前記沈降物を酸で溶解して微生物を得るステップとしては、前記沈降物に前記酸を添加した後、前記酸が前記沈降物を溶解する溶解時間を経過してから、微生物を含む固体と前記析出物の溶解液とに分離するステップが好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
このように、陰イオン溶液および陽イオン溶液を加え、微生物を取り込んだ水難溶性の無機物質を析出した後、さらに鉄系凝集剤を加えることで、この析出物が凝集してフロックを形成するので、沈降速度が大幅に向上し、短時間で上澄みと沈降物とに分離することができる。また、この沈降物を酸で溶解することで、微生物を検出する際にその検出感度を低下させることなく、沈降物の中から微生物を分離することができる。よって、微生物を分離する作業の省力化、自動化を図ることができる。さらに、上澄みを吸引除去するといった簡単な機構で固液分離する方法を適用できる。
【００１３】
なお、水処理プロセス用の凝集剤としては、無機系凝集剤の中ではポリ塩化アルミニウム（ＰＡＣ）や硫酸アルミニウム（硫酸バンド）などのアルミニウム系凝集剤とポリ硫酸鉄や塩化第二鉄などの鉄系凝集剤があり、高分子などからなる有機系凝集剤にはポリアクリル酸やアルギン酸などがある。しかしながら、微生物を吸着した上記無機物質を酸で溶解することから、酸への溶解性の観点から有機系凝集剤の使用は困難である。また、無機系アルミニウム系凝集剤に関しては、アルミニウムがアルツハイマー病や脳神経系疾患の原因物質であると疑われているため、今後使用排出規制の対象となる方向にあり、使用を控えることが望ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に、添付図面を参照して、本発明の一実施の形態について説明する。図１は、本発明に係る微生物の分離方法を実施するのに好適な微生物の検出装置を示す模式図である。なお、以下は、検出対象微生物がクリプトスポリジウムの場合の説明であるが、本発明はこれに限定されず、原虫、細菌、ウイルス等の微生物について広く適用することができる。
【００１５】
図１に示すように、本実施の形態に係る微生物の検出装置は、試料水中の微生物を凝集させてフロックを形成する濃縮タンク１３と、フロックから微生物を分離する試料精製部１６と、微生物に蛍光標識抗体を加えて抗原抗体反応を行う抗体反応部２５と、微生物の検出を行う蛍光検出部３７と、検出された微生物を保存する試料保存部４４とから主に構成される。
【００１６】
先ず、濃縮タンク１３内には、試料水１を試料水供給ポンプ２により供給する。濃縮タンク１３内に設けられた攪拌機１４で試料水１を攪拌しながら、続いて塩化カルシウム溶液３を陽イオン溶液供給ポンプ４で濃縮タンク１３に供給し、炭酸水素ナトリウム溶液５を陰イオン溶液供給ポンプ６で濃縮タンク１３に供給する。そして、ｐＨを１０に上げて炭酸カルシウムを生成させるために、水酸化ナトリウム溶液７をｐＨ調整剤供給ポンプ８で濃縮タンク１３に供給する。これにより、クリプトスポリジウムが取り込まれた炭酸カルシウムが析出する。
【００１７】
炭酸カルシウムが析出したらついで、塩化第二鉄９を凝集剤供給ポンプ１０により濃縮タンク１３に供給する。これにより、炭酸カルシウムが凝集してフロックを形成する。その後、攪拌機１４を停止し、フロックを自然沈降させる。
【００１８】
次に、濃縮タンク１３の底に沈殿した沈殿物を試料精製部１６に供給する。濃縮タンク１３の逆円錐形状の底の最下端には、沈殿物溶解槽１９につながる配管が設けられており、この配管に設けられたバルブ１５を開くことで、クリプトスポリジウムが取り込まれた沈殿物を沈殿物溶解槽１９に送る。残った上澄みは、濃縮タンク１３の底部に別途設けられた配管（図示省略）により排出する。上澄みの排出後、洗浄水１１を洗浄水供給ポンプ１２で濃縮タンク１３に供給して洗浄してから、次の試料水を供給する。
【００１９】
沈殿物溶解槽１９内には、塩酸１７を酸供給ポンプ１８により注入する。これにより、クリプトスポリジウムが吸着した炭酸カルシウムの沈殿物のうち、炭酸カルシウムのみが溶解し、よって、クリプトスポリジウムが濃縮された濃縮試料液となる。
【００２０】
この濃縮試料液中にはカルシウムイオンなどの塩類が含まれ、塩酸によりｐＨが低下した状態にあるため、クリプトスポリジウムとクリプトスポリジウムを標識する蛍光標識抗体との結合の妨害になる。よって、塩類を除去するために、沈殿物溶解槽１９の下端のバルブ２０を開き、沈殿物溶解槽１９内の濃縮試料液を脱塩脱泡槽２１に供給する。
【００２１】
脱塩脱泡槽２１には、クリプトスポリジウム（直径５μｍ）が通過でき、検出対象微生物よりも大きい夾雑物を捕捉できる例えばポアサイズ１０μｍ以上の夾雑物除去フィルターと、クリプトスポリジウムを捕捉でき、高濃度の塩類を含む溶液を透過する例えばポアサイズ１μｍ以下の微生物捕捉フィルターとが上下２段に備えられている。これにより、濃縮試料液中の夾雑物と高濃度の塩類を含む溶液とを除去することができる。脱塩脱泡槽２１の微生物捕捉フィルターに捕捉されたクリプトスポリジウムを含む試料は、洗浄水供給ポンプにより供給される洗浄水２２で塩類を洗い流した後、バルブ２４を開いて、抗体反応部２５に供給する。
【００２２】
抗体反応部２５は、クリプトスポリジウムを含む試料とクリプトスポリジウムを標識する蛍光標識抗体を混合する抗体混合槽２６と、抗原抗体反応を行う抗体反応槽２７とから構成される。先ず、抗体混合槽２６ではクリプトスポリジウムを特異的に認識する蛍光標識抗体２８を標識抗体供給ポンプ２９により注入し、試料と混合する。このとき、１種類の蛍光標識抗体を用いる場合、夾雑物に非特結合した蛍光標識抗体を擬陽性として判定してしまう恐れがあるため、抗原認識部位の異なる複数の抗体を用意し、そのそれぞれに蛍光波長の異なる蛍光物質を結合した蛍光標識抗体で検出対象微生物を多重標識する方法が、検出対象微生物の検出精度が上がりより好ましい。
【００２３】
多くの市販品の抗体による抗原抗体反応は３７℃では２０〜３０分、室温条件では１時間以上とされており、より高頻度に測定を行うためには試料と蛍光標識抗体を混合した後、混合液を別の容器に移し、次の試料を供給できるような構造とすることが好ましい。さらに、クリプトスポリジウムを高頻度に測定するため、抗体反応槽２７は複数用意し、バルブ３４の切換えで試料ごとに別の抗体反応槽を供給することが好ましい。
【００２４】
そこで、図１に示すように、先ず、１番目の試料に蛍光標識抗体２８を混合した後、バルブ３３を開き洗浄水供給ポンプ３２からの洗浄水３１でこの混合液を押し流して抗体反応槽２７に供給する。そして、バルブ３６を開き、洗浄水３１で抗体混合槽２６を洗浄した後、バルブ３６を閉じ、抗体混合槽２６に２番目の試料を供給する。この２番目の試料は、１番目の試料と同様に蛍光標識抗体２８と混合し、この混合液を洗浄水３１で押し流して抗体反応槽２７に送る。このとき、バルブ３４の切換えにより１番目の混合液と別の抗体反応槽２７に２番目の混合液を供給する。
【００２５】
抗原抗体反応を効率よく進めるため、抗体反応部２５または抗体反応槽２７には試料温度を３７℃に保つ恒温器（図示省略）を備え付けていることが好ましい。抗原抗体反応が終了した試料は、それに対応するバルブ３４を開き、ポンプ３５により蛍光検出部３７へと供給する。
【００２６】
蛍光検出部３７では、蛍光標識抗体が結合したクリプトスポリジウムの蛍光強度を、蛍光顕微鏡観察やフローサイトメータ等の蛍光検出器３８で測定し、その測定データを判定部４０に送る。複数の蛍光標識抗体を用いる多重染色を行う場合は、複数の蛍光波長を同時に測定できる蛍光検出部とすることが好ましい。また、より検出精度を上げるため試料を蛍光検出器３８に循環して供給し、測定データを積分させることが好ましい。
【００２７】
そこで、図１に示すように、蛍光検出器３８の入口側に三叉の試料供給切換えバルブ４１を、出口側に三叉の試料排出切換えバルブ３９を設け、これらバルブ４１、３９を試料循環流路４３でつなぐとともに、蛍光検出器３８と試料排出切換えバルブ３９との間に試料循環ポンプ４２を設けることで、バルブ４１、３９の切り換えにより、蛍光検出器３８で測定した試料を試料循環流路４３により再び蛍光検出器３８に供給することができる。判定部４０では、測定データをもとにバルブ４１、３９の切り替えを行い、試料を循環するか、または試料保存部４４に送るかを制御することができる。
【００２８】
試料保存部４４では、蛍光検出器３８によって検出された測定データをもとに判定部４０で試料保存の要否を判定する。すなわち、蛍光検出器３８で試料中にクリプトスポリジウムが検出された場合は、三叉の流路切替えバルブ４６で流路を切り換えて、蛍光検出部３７から排出された試料を保存容器４５内に供給し、保存する。保存した試料は混入している検出対象微生物が生存しているかあるいは感染性があるか判定する試験に供与することができる。一方、クリプトスポリジウムが検出されなかった場合は廃棄する。
【００２９】
なお、図１では、陽イオン溶液供給ポンプ４から塩化カルシウム溶液３を、陰イオン溶液供給ポンプ６から炭酸ナトリウム溶液５を供給し、炭酸カルシウムを生成したが、これに限定されず、水に不溶性でかつ酸性溶液下で溶解する沈殿を生成する陽イオン溶液と陰イオン溶液の組み合わせを採用することができる。例えば、陽イオン溶液としてはＭｇ2+、Ｃａ2+、Ｓｒ2+またはＢａ2+を含む溶液を使用して、陰イオン溶液としてＳＯ42-、ＣＯ32-またはＰＯ43-を含む溶液を使用することができる。これにより生成する沈殿物は、例えば、炭酸マグネシウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸ストロンチウム、炭酸ストロンチウム、炭酸バリウム、リン酸バリウムなどである。
【００３０】
また、図１では、ｐＨ調整剤供給ポンプ８から水酸化ナトリウム溶液７を供給したが、ｐＨ調整剤としてはその他に、水酸化カリウムやアンモニア水等を使用することができる。凝集剤供給ポンプ１０からは塩化第二鉄９を供給したが、鉄系凝集剤としてはその他に、ポリ硫酸鉄やポリシリカ鉄等を使用することができる。酸供給ポンプ１８からは塩酸１７を供給したが、酸としてはその他に、硝酸、クエン酸、酢酸、等を使用することができる。酸は、濃度１モル／Ｌのものを、沈殿物１ｇに対し、２０ｍLで添加することが好ましい。また、沈殿溶解槽１９において沈殿物に酸を添加してから、脱塩脱泡槽２１において微生物を分離するまでの間に、酸を添加した濃縮試料液を１０分間以上にわたり放置して溶解時間を設けることが好ましい。なお、溶解時間の間は、撹拌を行い、積極的に溶解を促進することが好ましい。
【００３１】
さらに、図１では、脱塩脱泡槽２１として、メンブレンフィルター（精密ろ過膜）を用いた場合を説明したが、脱塩脱泡の方法はこれに限らず、分離対象となる微生物の大きさによって適切に微生物と、限外ろ過膜による方法や透析膜による透析等でもよいし、遠心分離機による方法でもよい。
【実施例】
【００３２】
（鉄系凝集剤の沈降性試験）
鉄系凝集剤の中では一般的にはポリ硫酸鉄や塩化第二鉄がよく使用されることから、これらの凝集剤の中から微生物の分離方法に適しているものをスクリーニングした。すなわち、純水中に炭酸カルシウムを生成させ、ここに凝集剤を添加して炭酸カルシウムを沈降させ、この懸濁液を静置し、一定時間ごとに上澄みの濁度を測定することで、凝集剤による沈殿の沈降性を比較した。以下、詳細に説明する。
【００３３】
純水１Ｌをポリプロピレン製ビーカーにとり、２５℃の恒温水槽を備えたジャーファーメンターで攪拌を行いながら、まず、１ｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム溶液および１ｍｏｌ／Ｌの炭酸水素ナトリウム溶液を加えた。つぎに、１Ｎ（１規定）の水酸化ナトリウム溶液を添加し、ｐＨを１０に調整し、不溶性の炭酸カルシウムを生成した。そして、各凝集剤を注入率２．５、５．０、７．５、１０．０ｍｇ−Ｆｅ／Ｌで添加し、４０、５０、６０、７０ｃｍ／ｓの速さで急速攪拌を１分間行い、１５ｃｍ／ｓで緩速攪拌を１０分間行い、その後静置した。
【００３４】
上澄みを一定時間ごとに採取し、吸光光度計にて６６０nmの吸光度を測定し、濁度を算出した。濁度は予め濁度標準液１００度（ポリスチレン）（和光純薬社製）を用い、検量線を作成し、上澄みの吸光度から濁度を算出した。その結果を表１に示す。表１中の○は、静置から４５分後に上澄み濁度が０．１以下になったこと、△は、６０分後に上澄み濁度が０．１以下になったこと、×は、６０分後でも上澄み濁度が０．１以下にならなかったことを表し、ｎｔは、試験を実施しなかったことを表す。
【００３５】
【表１】
2007236221.tif 000003
【００３６】
表１に示すように、炭酸カルシウムを鉄系凝集剤で凝集させて、沈殿させる条件としては、塩化第二鉄を用い、注入率は２．５ｍｇ−Ｆｅ／Ｌで添加し、急速攪拌強度が５０または７０ｃｍ／ｓが適していることがわかった。さらに、この条件で急速攪拌強度５０と７０ｃｍ／ｓで比較すると７０ｃｍ／ｓの方が上澄み濁度の減少速度が速く、炭酸カルシウムの沈降性が良好であった。
【００３７】
（酸の微生物回収性および標識性試験）
沈殿物を溶解するために使用する酸の種類によっては、沈殿物を完全に溶解できず、残留した沈殿物が微生物検出の妨害となったり、検出対象微生物の細胞膜上にある抗原決定基が酸により変性し標識抗体との結合性が低下し、結果として標識抗体の標識性が低下したりするので、酸の選定を行った。すなわち、クリプトスポリジウムを添加した純水に所定の溶液および凝集剤を加えて、クリプトスポリジウムが取り込まれた沈殿物を得、これを各種酸で溶解し、分離回収したクリプトスポリジウムを標識抗体で蛍光標識し、フローサイトメータで検出することで、酸による微生物の回収率および標識性を比較した。以下、詳細に説明する。
【００３８】
純水１Ｌをポリプロピレン製ビーカーにとり、２５℃の恒温水槽を備えたジャーファーメンターで攪拌を行いながら、クリプトスポリジウムオーシスト（ウォーターボーン社製）を約１０００個添加し、次の溶液を加えていった。まず、１ｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム溶液および１ｍｏｌ／Ｌの炭酸水素ナトリウム溶液を加え攪拌し、つぎに、１Ｎ（１規定）の水酸化ナトリウム溶液を添加し、ｐＨを１０に調整し、不溶性の炭酸カルシウムを生成させた。そして、塩化第二鉄を注入率２．５ｍｇ−Ｆｅ／Ｌで添加し、７０ｃｍ／ｓの速さで急速攪拌を１分間行い、１５ｃｍ／ｓで緩速攪拌を１０分間行い、その後静置した。１時間後に上澄みを吸引ポンプで吸引して除去し、残留した沈殿物に、各種酸を添加した。比較検討に用いた酸は、従来法で用いられているスルファミン酸、無機酸の塩酸、硝酸、硫酸、有機酸のクエン酸である。
【００３９】
酸を添加して得られた酸溶解液を遠心ボトルに移し、加速度３０００ｇで１０分間遠心分離し、その後上澄みを取り除き、沈殿物を１％ＰＥＴ（０．０２％ピロリン酸ナトリウム、０．０３％ＥＤＴＡ−３Ｎａ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０）３０ｍＬに懸濁し、５０ｍＬのポリプロピレン製の遠心チューブに移した。再度、加速度３０００ｇで１０分間遠心分離し、その後上澄みを取り除き、沈殿物を１％ＰＥＴ（０．０２％ピロリン酸ナトリウム、０．０３％ＥＤＴＡ−３Ｎａ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０）１ｍＬに懸濁し、１．５ｍＬのポリプロピレン製のマイクロチューブに移した。これを、１５０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上澄みを取り除いた後、沈殿をＰＢＳ１ｍＬに再懸濁し、クリプトスポリジウム濃縮試料とした。
【００４０】
この濃縮試料に蛍光物質のＦＩＴＣ（フルオレッセインシソチオシアネート）を結合した標識抗体（ＥａｓｙＳｔａｉｎ Ｃ＋Ｇ、和光純薬社製）を１００μＬ添加し、３７℃で３０分間または室温で１時間抗原抗体反応をさせた。蛍光標識したクリプトスポリジウムの前方散乱光強度およびＦＩＴＣ蛍光強度、６５０ｎｍの蛍光強度（ＦＬ３）はフローサイトメータ（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｂｕｒ、ベクトンディッキンソン社製）で測定した。ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒの場合、光照射部の光源はアルゴンレーザー（４８８ｎｍ）を用い、ＦＳＣ（前方散乱光）、ＳＳＣ（側方散乱光）、ＦＬ１（５３０±１５ｎｍ）、ＦＬ２（５８５±２１ｎｍ）、ＦＬ３（６５０ｎｍ以上）に分光されて、対応する光検出器で光信号が検出される。今回の測定ではＦＳＣ、ＦＬ１、ＦＬ３の測定結果を用いた。ＦＬ１はＦＩＴＣに由来する蛍光を表すため、ＦＩＴＣ標識抗体が結合したクリプトスポリジウムのＦＬ１強度は大きくなる。一方、ＦＬ３は渦鞭毛藻由来の光合成器官構成物質で蛍光物質であるＰｅｒＣＰ（ペリジニンクロロフィルプロテイン）の蛍光を表すため、藻類のクロロフィルの検出として用いることができる。
【００４１】
クリプトスポリジウムの回収率は、添加したクリプトスポリジウムを未処理で標識した試料で検出されたクリプトスポリジウムの個数と、上記の手順で得た濃縮試料を標識し、検出されたクリプトスポリジウムの個数との比から算出した。その結果を表２に示す。
【００４２】
【表２】
2007236221.tif 000004
【００４３】
表２に示すように、スルファミン酸を添加した後、直ぐに濃縮処理をした場合では、濃縮試料中に凝集剤の鉄成分が残留したと思われる褐色の沈殿が残留した。クリプトスポリジウムの回収率も１０％未満と低く、この褐色沈殿が標識抗体の標識性を低下させている原因と考えられた。そこで、褐色沈殿が残留しないようにするため、添加量を２０ｍＬから３０ｍＬに増やし、さらにスルファミン酸を添加した後、沈殿の溶解のために１０分間撹拌してから、濃縮処理を行った。その結果、濃縮試料中の褐色沈殿は消滅したが、クリプト回収率が約１０％と依然低く、凝集剤の鉄成分とスルファミン酸の組合せが標識抗体の標識性に何らかの悪影響を及ぼしていると考えられた。
【００４４】
一方、塩酸、硝酸、クエン酸を用いた場合は、濃縮試料に褐色沈殿は残留せず、炭酸カルシウムはほぼ完全に溶解した。なお、硫酸を用いた場合は、酸で溶解して生成したカルシウムイオンと硫酸イオンとが結合し、水難溶性の硫酸カルシウムの白色沈殿が生成し、微生物の分離方法には適さなかった。
【００４５】
クリプトスポリジウムの回収率で比較すると、塩酸では約８０％、クエン酸では約７７％となり比較的良好な回収率となることがわかった、一方、硝酸では約４１％となった。
【００４６】
次に、標識性の評価について詳細に説明する。蛍光標識したクリプトスポリジウムの前方散乱光（ＦＳＣ）およびＦＩＴＣ蛍光強度（ＦＬ１）、ＦＬ３強度をフローサイトメータで測定し、その比較を行った。
【００４７】
ＦＳＣ（前方散乱光）は粒子の粒径に相当するため、あらかじめクリプトスポリジウムを測定することで、クリプトスポリジウムの粒径に相当するＦＳＣ強度を把握することができる。ＰＢＳにクリプトスポリジウムを懸濁し、ＦＩＴＣ標識された抗クリプトスポリジウム抗体を加えた試料を測定した。
【００４８】
図２は未処理のクリプトスポリジウムを標識抗体で標識したＦＬ３とＦＬ１のドットプロットであり、図３はＦＳＣとＦＬ１のドットプロットである。各ドットプロットでクリプトスポリジウムが存在する領域（図中の実線枠内）を設定した。図４および図５は、図２および図３の各ドットプロット内で設定したクリプトスポリジウム存在領域に分布する粒子の中で、図２および図３の両方のドットプロット内に設定したクリプトスポリジウム存在領域に分布する粒子のみを抽出したドットプロットである。これにより、例えば図２のドットプロットの内で設定したクリプトスポリジウム存在域に分布する粒子のうち、図３のドットプロットの内で設定したクリプトスポリジウム存在領域に入らない粒子を排除すると、図４のドットプロットに示すように、擬陽性を示す夾雑物を排除することができる。
【００４９】
同様に、図６は炭酸カルシウムの溶解に塩酸を用いたときの、標識抗体で標識されたクリプトスポリジウムのＦＬ３とＦＬ１のドットプロット、図７はＦＳＣとＦＬ１のドットプロットである。ドットプロット中の実線枠は図２および図３で設定したクリプトスポリジウムが存在する領域である。図８および図９は、図６および図７の各ドットプロット内で設定したクリプトスポリジウム存在領域に分布する粒子の中で、図６および図７の両方のドットプロット内に設定したクリプトスポリジウム存在領域に分布する粒子のみを抽出したドットプロットである。
【００５０】
未処理のクリプトスポリジウムの分布と炭酸カルシウムの溶解に塩酸を用いた濃縮したクリプトスポリジウムの分布を比較すると、ＦＩＴＣの蛍光強度はほとんど変化しなかった。塩酸を用いた試料ではＦＬ３強度が若干上昇したが、クリプトスポリジウム存在領域に夾雑物が混入する可能性は小さかった。なお、スルファミン酸や硝酸でも同様な結果であった。
【００５１】
図１０は炭酸カルシウムの溶解にクエン酸を用いたときの、標識抗体で標識されたクリプトスポリジウムのＦＬ３とＦＬ１のドットプロット、図１１はＦＳＣとＦＬ１のドットプロットである。ドットプロット中の実線枠は図２および図３で設定したクリプトスポリジウムが存在する領域である。クエン酸を用いた結果から、標識抗体で標識されたクリプトスポリジウムの存在する領域が未処理のクリプトスポリジウムの分布と異なっていたことから、クエン酸を用いた結果では標識抗体で標識されたクリプトスポリジウムの存在する領域を点線枠で示した。
【００５２】
図１２および図１３は、図１０および図１１の各ドットプロット内で設定したクリプトスポリジウム存在領域（点線枠内）に分布する粒子の中で、図１０および図１１の両方のドットプロット内に設定したクリプトスポリジウム存在領域に分布する粒子のみを抽出したドットプロットである。
【００５３】
未処理のクリプトスポリジウムの分布と炭酸カルシウムの溶解にクエン酸を用いた濃縮したクリプトスポリジウムの分布を比較すると、クエン酸を用いた試料では、ＦＩＴＣの蛍光強度が低下し、ＦＬ３強度が上昇したためクリプトスポリジウム存在領域に夾雑物が混入する可能性が大きいことがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明に係る微生物の分離方法を実施するのに好適な微生物の検出装置を示す模式図である。
【図２】未処理のクリプトスポリジウムのＦＬ３とＦＬ１の２次元ドットプロットである。
【図３】未処理のクリプトスポリジウムのＦＳＣとＦＬ１の２次元ドットプロットである。
【図４】図２および図３のクリプトスポリジウム存在領域の両方に分布粒子のみを抽出したＦＬ３とＦＬ１の２次元ドットプロットである。
【図５】図２および図３のクリプトスポリジウム存在領域の両方に分布粒子のみを抽出したＦＳＣとＦＬ１の２次元ドットプロットである。
【図６】塩酸を用いたときのＦＬ３とＦＬ１の２次元ドットプロットである。
【図７】塩酸を用いたときのＦＳＣとＦＬ１の２次元ドットプロットである。
【図８】図６および図７のクリプトスポリジウム存在領域の両方に分布粒子のみを抽出したＦＬ３とＦＬ１の２次元ドットプロットである。
【図９】図６および図７のクリプトスポリジウム存在領域の両方に分布粒子のみを抽出したＦＳＣとＦＬ１の２次元ドットプロットである。
【図１０】クエン酸を用いたときのＦＬ３とＦＬ１の２次元ドットプロットである。
【図１１】クエン酸を用いたときのＦＳＣとＦＬ１の２次元ドットプロットである。
【図１２】図１０および図１１のクリプトスポリジウム存在領域の両方に分布粒子のみを抽出したＦＬ３とＦＬ１の２次元ドットプロットである。
【図１３】図１０および図１１のクリプトスポリジウム存在領域の両方に分布粒子のみを抽出したＦＳＣとＦＬ１の２次元ドットプロットである。
【符号の説明】
【００５５】
１  試料水
２  試料水供給ポンプ
３  塩化カルシウム溶液
４  陽イオン溶液供給ポンプ
５  炭酸水素ナトリウム溶液
６  陰イオン溶液供給ポンプ
７  水酸化ナトリウム溶液
８  ｐＨ調整剤供給ポンプ
９  塩化第二鉄溶液
１０  凝集剤供給ポンプ
１１、２２、３１  洗浄水
１２、２３、３２  洗浄水供給ポンプ
１３  濃縮タンク
１４  攪拌機
１５、２０、２４、３０、３３、３４、３６  バルブ
１６  試料精製部
１７  塩酸溶液
１８  酸供給ポンプ
１９  沈殿溶解槽
２１  脱塩脱泡槽
２５  抗体反応部
２６  抗体混合槽
２７  抗体反応槽
２８  蛍光標識抗体
２９  標識抗体供給ポンプ
３５  ポンプ
３７  蛍光検出部
３８  蛍光検出器
３９  試料排出切換えバルブ
４０  判定部
４１  試料供給切換えバルブ
４２  試料循環ポンプ
４３  試料循環流路
４４  試料保存部
４５  試料保存容器
４６  流路切換えバルブ
【図１】
2007236221.tif 000005
【図２】
2007236221.tif 000006
【図３】
2007236221.tif 000007
【図４】
2007236221.tif 000008
【図５】
2007236221.tif 000009
【図８】
2007236221.tif 000010
【図９】
2007236221.tif 000011
【図１２】
2007236221.tif 000012
【図１３】
2007236221.tif 000013
【図６】
2007236221.tif 000014
【図７】
2007236221.tif 000015
【図１０】
2007236221.tif 000016
【図１１】
2007236221.tif 000017