(57)【要約】【課題】植物抵抗性タンパク質及び当該タンパク質をコードする遺伝子、並びにその利用を提供する。【解決手段】本発明により、ジャガイモ植物由来の、カルシウム依存性タンパク質リン酸化酵素、及び当該酵素をコードする遺伝子が与えられた。カルシウム依存性タンパク質リン酸化酵素は植物の防御系の情報伝達に深く関与する酵素であると共に、病原菌のサプレッサーと結合することから、本発明のカルシウム依存性タンパク質リン酸化酵素をコードする遺伝子を植物に導入することにより、植物に病害抵抗性を付与することが可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジャガイモ植物に由来し、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質。
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルシウム依存性タンパク質リン酸化作用を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
請求項１記載のタンパク質をコードし、配列番号２記載の塩基配列からなることを特徴とし、ジャガイモ植物に由来する遺伝子。
【請求項４】
ジャガイモ植物に由来し、以下の（ｃ）又は（ｄ）に示す遺伝子。
（ｃ）配列番号３記載の塩基配列からなる遺伝子、
（ｄ）配列番号３記載の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ請求項１記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項５】
請求項２〜４記載のいずれか１つの遺伝子を植物に導入することにより、植物に病害抵抗性を付与したことを特徴とする病害抵抗性形質転換植物。
【請求項６】
請求項２〜４記載のいずれか１つの遺伝子を植物に導入することにより、植物に病害抵抗性を付与することを特徴とする病害抵抗性を付与する方法。
【請求項７】
植物疫病菌であるフィトフトラ・インフェスタンスのサプレッサーと結合し、前記サプレッサーの受容体として作用することを特徴とするカルシウム依存性タンパク質リン酸化酵素。
【請求項８】
ジャガイモ植物に由来し、以下の（ｅ）又は（ｆ）に示すタンパク質。
（ｅ）配列番号７記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｆ）配列番号７記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ活性酸素種生成作用を有するタンパク質。
【請求項９】
請求項８記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１０】
ジャガイモ植物に由来し、以下の（ｇ）又は（ｈ）に示す遺伝子。
（ｇ）配列番号８記載の塩基配列からなる遺伝子、
（ｈ）配列番号８記載の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ請求項８記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１１】
ジャガイモ植物に由来し、以下の（ｉ）又は（ｊ）に示すタンパク質。
（ｉ）配列番号９記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｊ）配列番号９記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ活性酸素種生成作用を有するタンパク質。
【請求項１２】
請求項１１記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１３】
ジャガイモ植物に由来し、以下の（ｋ）又は（ｌ）に示す遺伝子。
（ｋ）配列番号１０記載の塩基配列からなる遺伝子、
（ｌ）配列番号１０記載の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ請求項１１記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１４】
請求項９，１０，１２又は１３記載のいずれか１つの遺伝子を植物に導入することにより、活性酸素種生成を誘導し、植物に病害抵抗性を付与したことを特徴とする病害抵抗性形質転換植物。
【請求項１５】
請求項９，１０，１２又は１３記載のいずれか１つの遺伝子を植物に導入することにより、活性酸素種生成を誘導し、植物に病害抵抗性を付与することを特徴とする病害抵抗性を付与する方法。
【請求項１６】
抗ｐ４７phox抗体及び／又は抗ｐ６７phox抗体が認識し得る抗原決定基のアミノ酸配列に対応する遺伝子を植物に導入することにより、活性酸素種生成を誘導し、植物に病害抵抗性を付与したことを特徴とする病害抵抗性形質転換植物。
【請求項１７】
抗ｐ４７phox抗体及び／又は抗ｐ６７phox抗体が認識し得る抗原決定基のアミノ酸配列に対応する遺伝子を植物に導入することにより、活性酸素種生成を誘導し、植物に病害抵抗性を付与することを特徴とする病害抵抗性を付与する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物抵抗性タンパク質及び当該タンパク質をコードする遺伝子、並びにその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、植物の病原菌に対する抵抗性に関するメカニズムについて種々の研究がなされている。植物の抵抗性の一つとして、例えば、病原菌が感染を試みると、植物は積極的に防御機構を発揮して、これを排除しようとする防御反応が挙げられる。この防御反応としては、宿主の原形質膜に局在するスーパーオキシドアニオン（Ｏ2-）生成ＮＡＤＰＨ酸化酵素の活性化による活性酸素種（ＡＯＳ）の生産に始まり、防御遺伝子発現を伴った過敏感反応等が報告されている（非特許文献１〜５）。この他にも、低分子抗菌性物質ファイトアレキシンの蓄積、感染組織における物理防御壁としてのリグニンやパピラの主成分であるカロースの蓄積、リグニンの蓄積の土台となるヒドロキシプロリンに富んだ糖タンパク質の細胞壁での蓄積、感染特異的タンパク質（ＰＲ（Pathogenesis-Related）タンパク質：グルカナーゼ、キチナーゼ等）の増加等が知られている。
【０００３】
また、植物伝染病の８０％以上はカビ（糸状菌）によって引き起こされている。これらのカビは侵入に伴って、植物に付与するための高分子の糖タンパク質を分泌するが、植物は病原カビにより分泌された物質を異物として認識し、抵抗性を発揮する。しかし、病原カビは、植物の抵抗反応を停止する物質（サプレッサー）を分泌し、その結果、宿主組織は菌の全身的な侵攻を受けて疫病病徴を示す。
【０００４】
疫病菌とジャガイモ栽培品種間の相互作用において、疫病菌の分泌するサプレッサーグルカンは、抵抗反応の一つであるファイトアレキシンおよび宿主細胞死の反応をコントロールすることが知られている（非特許文献６〜８）。さらに、特許文献１には、エンドウ品種ミドリウスイ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ Ｌ．ｃｖ．Ｍｉｄｏｒｉｕｓｕｉ）由来の、植物細胞壁ヌクレオチドトリホスフェイト（ＮＴＰ）分解酵素がエリシター及びサプレッサーと結合し、エリシター及びサプレッサーの受容体として作用することが記載され、病原菌感染の「宿主−寄生者の特異性」のメカニズムを解明することにより、宿主特異性に関与する遺伝子、当該遺伝子を植物に導入することにより病害抵抗性を付与する方法及び病害抵抗性を付与した形質転換植物が開示されている。
【特許文献１】特開２００１−１７１７６号公報
【非特許文献１】Doke, N., "Generation of superoxide anion by potato tuber protoplasts during the hypersensitive response to hyphal wall components of Phytophthora infestans and specific inhibition of the reaction by suppressors of hypersensitivity", Plant Pathol. 23, 359-367 (1983)
【非特許文献２】Amicucci, E., Gaschler, K. & Ward, J. M., "NADPH oxidase genes from tomato (Lycopersicon esculentum) and curly-leaf pondweed (Potamogeton crispus)", Plant Biol. 1, 524-528 (1999)
【非特許文献３】Furuichi, N., "Signal transduction of potato and bean cells treated with suppressor and elicitor from Phytophthora infestans", Plant-Microbe Interact. Jpn. 3, 15-17 (1993)
【非特許文献４】Furuichi, N., Matsubara, M., Suzuki, Y., Kato, T. & Anderson, A. N., "The strategy for plant protection in physiological and molecular plant pathology", the Phytopathol. Society of Japan, 121-133 (1997)
【非特許文献５】Furuichi, N., Kato, M., Takamura, N., Terada, E. & Kato, T. "Potato defense response to Phytophthora infestans: Isolation of proteins related to generation of active oxygen species in the microsomal fraction of potato tubers", Proc. Assoc. Pl. Prot. Hokuriku 45, 41-44 (1997)
【非特許文献６】Furuichi, N. & Susuki, J., "Purification and properties of suppressor gulucan isolated from Phytophthora infestans", Ann. Phytopathol. Soc. Jpn. 56, 457-467 (1990)
【非特許文献７】Goodman, R. N. & Novacky, A., "The hypersensitive reaction in plants to pathogens, a resistance phoenomen", American Phytopathological Society, (1994)
【非特許文献８】Furuichi, N., Nishimura, S. & Langsdorf, G. "Effect of alternaric acid, a toxin of Alternaria solani, on the hypersensitive response of potato to Phytophthora infestans", Anal. Phytppathological Soc.Jpn. 58, 1-7 (1992)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記特許文献１に開示されているように、エンドウ品種ミドリウスイ由来の、植物細胞壁ヌクレオチドトリホスフェイト（ＮＴＰ）分解酵素をコードする遺伝子を植物に導入し、形質転換植物を作出した報告例は存在する。しかしながら、エンドウ品種以外の植物品種におけるサプレッサーの作用やそのメカニズムについてはほとんど解明されていないのが現状である。
【０００６】
そこで、本発明は以上の背景の下なされたものであって、植物抵抗性タンパク質及び当該タンパク質をコードする遺伝子、並びにその利用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題に鑑みて鋭意検討した結果、ジャガイモの疫病菌であるフィトフトラ・インフェスタンスの生産するサプレッサーに対する宿主受容体を単離し、前記サプレッサーに対する宿主受容体がカルシウム依存性タンパク質リン酸化酵素（ＣＤＰＫ）であることを見出した。さらに、防御応答の成立に必須の機能を果たしている新規のｒｂｏｈ（respiratory  burst  oxidase  homolog）ファミリーをジャガイモ植物から単離し、単離されたｒｂｏｈファミリーが活性酸素種（ＡＯＳ）の生成を制御することを見出し、またｐ４７phoxとｐ６７phoxのタンパク質がＡＯＳ活性化のタンパク質成分として機能することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明の請求項１は、ジャガイモ植物に由来し、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質である。
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルシウム依存性タンパク質リン酸化作用を有するタンパク質。
【０００９】
本発明の請求項２は、請求項１記載のタンパク質をコードする遺伝子である。
【００１０】
本発明の請求項３は、請求項１記載のタンパク質をコードし、配列番号２記載の塩基配列からなることを特徴とし、ジャガイモ植物に由来する遺伝子である。
【００１１】
本発明の請求項４は、ジャガイモ植物に由来し、以下の（ｃ）又は（ｄ）に示す遺伝子である。
（ｃ）配列番号３記載の塩基配列からなる遺伝子、
（ｄ）配列番号３記載の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ請求項１記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【００１２】
本発明の請求項５は、請求項２〜４記載のいずれか１つの遺伝子を植物に導入することにより、植物に病害抵抗性を付与したことを特徴とする病害抵抗性形質転換植物である。
【００１３】
本発明の請求項６は、請求項２〜４記載のいずれか１つの遺伝子を植物に導入することにより、植物に病害抵抗性を付与することを特徴とする病害抵抗性を付与する方法である。
【００１４】
本発明の請求項７は、植物疫病菌であるフィトフトラ・インフェスタンスのサプレッサーと結合し、前記サプレッサーの受容体として作用することを特徴とするカルシウム依存性タンパク質リン酸化酵素である。
【００１５】
本発明の請求項８は、ジャガイモ植物に由来し、以下の（ｅ）又は（ｆ）に示すタンパク質である。
（ｅ）配列番号７記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｆ）配列番号７記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ活性酸素種生成作用を有するタンパク質。
【００１６】
本発明の請求項９は、請求項８記載のタンパク質をコードする遺伝子である。
【００１７】
本発明の請求項１０は、ジャガイモ植物に由来し、以下の（ｇ）又は（ｈ）に示す遺伝子である。
（ｇ）配列番号８記載の塩基配列からなる遺伝子、
（ｈ）配列番号８記載の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ請求項８記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【００１８】
本発明の請求項１１は、ジャガイモ植物に由来し、以下の（ｉ）又は（ｊ）に示すタンパク質である。
（ｉ）配列番号９記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｊ）配列番号９記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ活性酸素種生成作用を有するタンパク質。
【００１９】
本発明の請求項１２は、請求項１１記載のタンパク質をコードする遺伝子である。
【００２０】
本発明の請求項１３は、ジャガイモ植物に由来し、以下の（ｋ）又は（ｌ）に示す遺伝子である。
（ｋ）配列番号１０記載の塩基配列からなる遺伝子、
（ｌ）配列番号１０記載の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ請求項１１記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【００２１】
本発明の請求項１４は、請求項９，１０，１２又は１３記載のいずれか１つの遺伝子を植物に導入することにより、活性酸素種生成を誘導し、植物に病害抵抗性を付与したことを特徴とする病害抵抗性形質転換植物である。
【００２２】
本発明の請求項１５は、請求項９，１０，１２又は１３記載のいずれか１つの遺伝子を植物に導入することにより、活性酸素種生成を誘導し、植物に病害抵抗性を付与することを特徴とする病害抵抗性を付与する方法である。
【００２３】
本発明の請求項１６は、抗ｐ４７phox抗体及び／又は抗ｐ６７phox抗体が認識し得る抗原決定基のアミノ酸配列に対応する遺伝子を植物に導入することにより、活性酸素種生成を誘導し、植物に病害抵抗性を付与したことを特徴とする病害抵抗性形質転換植物である。
【００２４】
本発明の請求項１７は、抗ｐ４７phox抗体及び／又は抗ｐ６７phox抗体が認識し得る抗原決定基のアミノ酸配列に対応する遺伝子を植物に導入することにより、活性酸素種生成を誘導し、植物に病害抵抗性を付与することを特徴とする病害抵抗性を付与する方法である。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、植物病原菌の生産する病原性毒素に対する宿主植物の受容体を明らかにしたことによって、新規の植物種の同毒素に対する罹病性をなくすことが可能である。また、植物疫病菌のサプレッサーに対する宿主受容体であるＣＤＰＫ遺伝子、特にＣＤＰＫ遺伝子中のサプレッサー結合部位を改変あるいは破壊することにより、病原抵抗性を示す植物体を作出することができる。また、サプレッサーに対して感受性を失ったＣＤＰＫ遺伝子を、通常の形質転換方法によって、種々の植物に導入し病害抵抗性形質転換植物を作出することができる。また、本発明の病害抵抗性形質転換植物により、食糧の増産はもとより農薬の使用や労働力の低減を可能にすることができる。
【００２６】
さらに、本発明によれば、ＡＯＳ生成を制御するｒｂｏｈ１、抗ｐ４７phox抗体及び／又は抗ｐ６７phox抗体を用いて、病害抵抗性形質転換植物を得ることができると共に、植物に病害抵抗性を付与することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明において、ジャガイモの疫病菌であるフィトフトラ・インフェスタンスの生産するサプレッサーに対する宿主受容体とは、カルシウム結合ドメイン（カルモジュリン様ドメイン）とタンパク質リン酸化酵素ドメインの両方を一分子内に持つ、植物特有のカルシウム結合Ｓｅｒ／Ｔｈｒタンパク質リン酸化酵素（ＣＤＰＫ）である。また、ＣＤＰＫは、カルシウムの結合により活性化されることから、カルシウムの濃度変化により活性制御され、その後下流でのシグナル伝達を解読し、翻訳する潜在的なセンサーとして機能すると推測されている（Kiba, A. et al., Specific inhibition of cell wall bound ATPases by fungal suppressor from Mycosphaerella pinodes. Plant Cell Physiol. 36, 809-817(1995)，Lecourieux, D. at al. Analysis and Effects of Cytosolic Free Calcium  Increases in Response to Elicitors in Nicotiana plumbaginifolia Cells. Plant Cell 14, 2627-2641(2002)，Pugin, A. et al. Early Events Induced by the Elicitor Cryptogein in Tobacco Cells:Involvement of a Plasma Membrane NADPH Oxidase and Activation of Glycolysis and the Pentose Phosphate Pathway. Plant Cell 9, 2077-2091(1997) ，Harmon, A.C., Gribskov, M. & Harper, J.F. CDPKs:a kinase for every Ca2＋ signal Trends Plant Sci 5, 154-159(2000) ）。後述の実施例に示すように、ＣＤＰＫは、植物の防御系の情報伝達に深く関与する酵素であると共に、病原菌のサプレッサーと結合してサプレッサーの受容体として作用している。そこで、宿主受容体であるＣＤＰＫが植物疫病菌のサプレッサーを認識することにより、ＮＡＤＰＨ酸化酵素をリン酸化し、サプレッサーシグナルを下流へ伝達して、活性酸素種生成が阻害され発病が生じることを考えると、本発明のＣＤＰＫ遺伝子、特にＣＤＰＫ遺伝子中のサプレッサー結合部位を改変あるいは破壊することにより、病原抵抗性を示す植物体を作出することができる。また、サプレッサーに対して感受性を失ったＣＤＰＫ遺伝子を、通常の形質転換方法によって、種々の植物に導入し病害抵抗性形質転換植物を作出することができる。従って、本発明のＣＤＰＫ遺伝子を植物に導入して形質転換を行う方法、形質転換された病害抵抗性を有する植物も、本発明の範囲内である。
【００２８】
本発明のジャガイモ植物由来のタンパク質（ＣＤＰＫ）は、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するＣＤＰＫ１（ＤＤＢＪアクセッション番号：ＡＢ０５５１８０８）を含み、配列番号１記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルシウム依存性タンパク質リン酸化作用を有するタンパク質も包含する。さらに、本発明のジャガイモ植物由来のタンパク質（ＣＤＰＫ）は、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するＣＤＰＫ２（ＤＤＢＪアクセッション番号：ＡＢ０５５１８０９）をも含み、配列番号４記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルシウム依存性タンパク質リン酸化作用を有するタンパク質をも包含する。また、ＣＤＰＫ１の塩基配列は、配列番号２及び配列番号３に記載した塩基配列により特定される。ＣＤＰＫ２の塩基配列は、配列番号５及び配列番号６に記載した塩基配列により特定される。
【００２９】
また、ジャガイモ疫病菌（フィトフトラ・インフェスタンス（Phytophthora  infestans））間のシグナル伝達経路を調べて、原形質膜に在局するＯ2-生成ＮＡＤＰＨ酸化酵素のｇｐ９１phoxの２つのホモログを、抵抗性及び罹病性のジャガイモｃＤＮＡライブラリーのジャガイモ品種「Ｅｎｉｗａ」（Ｒ１遺伝子）および「Ｍａｙｑｕｅｅｎ」（ｒ遺伝子）から分離した。
【００３０】
ここで得られた２つの遺伝子を、それぞれＥｎｒｂｏｈ１（ＤＤＢＪアクセッション番号ＡＢ０５５９７４１）およびＭｑｒｂｏｈ１と表す。この２つの遺伝子は、防御応答の成立に必須の機能を果たしているジャガイモ植物の新規のｒｂｏｈ（respiratory  burst  oxidase  homolog）ファミリーである。本発明のＥｎｒｂｏｈ１タンパク質は、配列番号７に示すアミノ酸配列を有するタンパク質を含み、配列番号７記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ活性酸素種生成作用を有するタンパク質をも包含する。また、Ｅｎｒｂｏｈ１の塩基配列は、配列番号８により特定される。また、本発明のＭｑｒｂｏｈ１タンパク質は、配列番号９に示すアミノ酸配列を有するタンパク質を含み、配列番号９記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ活性酸素種生成作用を有するタンパク質をも包含する。また、Ｍｑｒｂｏｈ１の塩基配列は、配列番号１０により特定される。
【００３１】
後述の実施例に示すように、ｒｂｏｈ１、抗ｐ４７phox抗体と抗ｐ６７phox抗体は、ＡＯＳ生成を制御することが認められた。従って、ｒｂｏｈ１遺伝子を植物の中に通常の形質転換方法によって導入することにより、防御機構の発現においてＡＯＳを強く生成する植物を作成することができる。また、抗ｐ４７phox抗体及び／又は抗ｐ６７phox抗体が認識し得る抗原決定基のアミノ酸配列に対応する遺伝子を作成し、この遺伝子を植物に導入することにより、抗原決定基アミノ酸ペプチドは細胞内で生成され、これがｒｂｏｈ１タンパク質に結合し、ＡＯＳ生成を活性化することができる。従って、ＡＯＳ生成を制御するｒｂｏｈ１、抗ｐ４７phox抗体及び抗ｐ６７phox抗体を用いて、病害抵抗性形質転換植物を作出することができる。
【００３２】
形質転換方法（遺伝子導入方法）としては、遺伝子を結合させた金属粒子を植物組織（細胞）に打ち込む方法（パーティクルガン法）、アグロバクテリウム利用した方法（アグロバクテリウム法）、あるいは電気的刺激を利用して遺伝子を導入する方法（エレクトロポレーション法）等を用いることができる。
【００３３】
本発明のＣＤＰＫやｒｂｏｈ１遺伝子は、ジャガイモ植物から得られたものであるが、その適用対象はジャガイモ植物に限られるものではなく、双子葉植物及び単子葉植物のいずれに属する植物に導入することが可能である。双子葉植物としては例えば、ナス科（ジャガイモ属、トマト属、タバコ属など）、マメ科（ダイズ属、エンドウ属など）、アブラナ科（ダイコン属など）、バラ科（ウメ属、モモ属、リンゴ属など）、ゴマ科などに分類される植物が挙げられ、一方単子葉植物としては例えば、イネ科（イネ属、トウモロコシ属、コムギ属、ライムギ属、オオムギ族、ハトムギ属など）、ユリ科（ネギ属、ニンニク属など）などに分類される植物が挙げられる。
【００３４】
以下に本発明の実施例によって、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
【００３５】
以下の実施例１〜７において使用される生物学的材料、実験方法等は次の通りである。
（生物学的材料の調製）ジャガイモ植物として、品種「Ｅｎｉｗａ」（Ｒ１遺伝子）および「Ｍａｙｑｕｅｅｎ」（ｒ遺伝子）のそれぞれの塊茎を、いずれも４℃に保存し供試した。
【００３６】
フィトフトラ・インフェスタンス（Ｍｏｎｔ）ｄｅＢａｒｙ単離株ＤＮ１０１（レース０）及びＰｉ８３１（レース１）を、２％シュークロース及び０．２％バクト酵母エキスを補充したライ麦寒天培地に１８℃にて暗中に保存した。菌の液体培養のためには、Doke，N．，et al．，In vitro activation of NADPH-dependent O2-generation system in a plasma membrane-rich fraction of potato tuber tissues by treatment with an elicitor from Phytophthora infestans or with digitonin. Physiol. Mol．Plant Pathol．46．，pp17-28(1995)に記載されている合成培地中で１８℃にて暗中で菌糸を２〜３週間培養した。菌体マットを濾過により回収後、洗浄し、そして−２０℃にて凍結した。
【００３７】
（ジャガイモ疫病菌（フィトフトラ・インフェスタンス：Phytophthora  infestans）の菌体壁成分エリシターの調製）
フィトフトラ・インフェスタンス（Ｍｏｎｔ）ｄｅＢａｒｙ単離株ＤＮ１０１（レース０）を、ライ麦液体培地中で、１５℃で４週間培養後、菌体マットを濾過により回収し、凍結乾燥した。ここで得られた凍結した菌糸を、Furuichi, N., et al., Potato defense response to Phytophthora infestans: Isolation of proteins related to generation of active oxygen species in the microsomal fraction of potato tubers. Proc. Assoc. Pl. Prot. Hokuriku 45, 41-44(1997)に記載されている方法に従い、０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）中に入れ、３０分間ポリトロンホモジナイザーでホモジナイズした。ホモジナイズしたものを１２０℃で１０分間オートクレーブ処理した。オートクレーブ処理した懸濁液を冷却し、１２０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して上清を回収した。一方、得られた沈殿物を、１００ｍＭホウ酸緩衝液（１：２  ｖ／ｗ）に懸濁した。上記と同様な条件で、１２０℃で１０分間オートクレーブ処理し、１２０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。得られた上清を回収し、先の上清と合わせ、セルロース透析チューブ（分子量カット１０００）を用い、０．１Ｍホウ酸緩衝液に対して一晩透析し、凍結乾燥して菌体壁成分エリシターの乾燥標品を得た。
【００３８】
（フィトフトラ・インフェスタンス由来のサプレッサーの分離精製）
Furuichi, N., et al., Purification and properties of suppressor glucan isolated from Phytophthora infestans. Ann. Phytopathol. Soc. Jpn. 56, 457-467(1990)に記載の方法に従い、３週間培養した菌体マットを乾燥後、液体窒素で凍結し、得られた凍結菌体を乳鉢中で摩砕して、菌体粉末物を得た。この菌体粉末物を、１００ｍＭ／ｍｌのＰＭＳＦ（Phenylmethyl sulfonyl fluoride）（４ｍｌの酢酸緩衝液あたり１μｌのＰＭＳＦ）を含む０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）５倍量中でホモジェナイズした。このホモジネートを氷上で、１分間及び１．５分間の２度超音波処理し、そして４℃にて２０分間１２０００ｒｐｍで遠心分離した。
【００３９】
上清を回収し、その上清を、等量の８０％フェノールと混合し、３時間氷上でインキュベートした後、４℃にて１０分間１２０００ｒｐｍで遠心分離した。この上清を回収後、クロロホルム−メタノール混合液（１：１  ｖ／ｖ）を添加し、よく混合した。上清を含むクロロホルム−メタノール混合液を３時間氷上でインキュベートし、上清を回収した。この上清に水を加えて、フェノール臭がなくなるまで蒸発させた。このように希釈された試料を、−２０℃にて保存し供試した。なお、サプレッサー抽出の全工程は、氷水浴上で又は冷室中で、０〜４℃にて行った。
【００４０】
（ゲノムＤＮＡの単離及びサザンブロット分析）
Ausubel, F. M. et al. Current Proto. Mol. Biol. John Wiley Sons, New York., (1987)に記載の方法に従って、DNeasy  Plant  Mini  Kit（QIAGEN社製）を用いて、凍結ジャガイモ及びシロイヌナズナ（学名：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ｃｏｌｕｍｂｉａ株）の葉からゲノムＤＮＡを得た。１０μｇのゲノムＤＮＡを制限酵素で切断し、１．２％アガロースゲル電気泳動を行った。アルカリ性のＤＮＡをナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ+、Amersham社製）に写しとり、特定の標識化されたＡｔｒｂｏｈＦ  ｃＤＮＡプローブで５５℃にてハイブリダイズさせて検出した。プローブＤＮＡを、取り扱い説明書に従って、AlkPhos  Geneimages  DIRECT＋LABBELING検出キットによって標識化した。膜を、第１の洗浄液（２Ｍ  尿素、０．１％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  ナトリウムリン酸、ｐＨ７．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2及び０．２％のブロッキング試薬）にて６５℃で１０分間洗浄後、第２の洗浄液（５０ｍＭ  トリス塩基、１００ｍＭ  ＮａＣｌｏ及び２ｍＭ  ＭｇＣｌ2）にて５５℃で１０分間洗浄した。ポジティブｃＤＮＡクローンを、ＣＤＰ−Ｓｔａｒの化学蛍光検出試薬を用いて検出した。
【００４１】
（レポーターコンストラクト）
合成緑色蛍光タンパク質遺伝子と融合するカリフラワーモザイクウイルス（ＣＡＭＶ）の３５Ｓプロモーターを用いて、ＳｄＣＤＰＫ１又はＳｄＣＤＰＫ２を有するキメラ遺伝子を構築し、ｓｍＧＦＰ−ＣＤＰＫレポーターコンストラクトを作製した。
【００４２】
（ＲＮＡの単離及びＲＴ−ＰＣＲ）
Ausubel, F.M. et al. Current Proto. Mol. Biol. John Wiley Sons, New York., (1987)およびLogemann, J., Schell, J. & Willmitzer, L. Improved method for the isolation of RNA from plant tissues. Anal. Biochem. 163, 16-20 (1987) に記載されているグアニジン塩酸塩ＲＮＡ抽出法により、凍結された健全なジャガイモの葉から全ＲＮＡの抽出を行った。抽出された全ＲＮＡをＤＮaｓｅ処理することにより、微量のＤＮＡのコンタミを除去した後、１．２％アガロースゲル電気泳動により分離した。２μｇの全ＲＮＡを、１ｐＭオリゴｄ（Ｔ）16〜18プライマーを用いてReady-To-Go（商標）ＲＴ−ＰＣＲビーズ（TaKaRa社製）によって、一本鎖ｃＤＮＡに逆転写した。なお、ＲＴ−ＰＣＲの条件は４２℃で３０分、９５℃で５分とした。０．３μｇのｃＤＮＡ反応物を、ＡｔｒｂｏｈＦ特異的プライマーと共に５０μｌＰＣＲで使用した。ＰＣＲ反応液は、鋳型ｃＤＮＡ０．３μｇ、２unit／μｌ  ＥｘＴａｑポリメラーゼ（TaKaRa社製）及び酵素に付属するバッファー５μｌ、ｄＮＴＰ混合液４μｌ、５０ｐＭのプライマーを含む。使用するプライマーは次のとおりである：
Ｅｎｒｂｏｈ１に対するプライマー（Foward：5'-ATGAAACCGTTCTCAAAG-3' （配列番号１１）、 Reverse： 5'-ATGATCATGATCGGATTA-3' （配列番号１２））；
Ｍｑｒｂｏｈ１に対するプライマー（Foward (rbohF14FW)5'-ATGAAACCGTTCTCAAAG-3'（配列番号１３）(TM=55.0℃)、Reverse （rbohF1218RV）5'-ATGATCATGATCGGATTA-3'（配列番号１４）(TM=53.1℃）；Foward (rbohF1056FW)5'-CAAGCATTGAGCTGTACGAGCC-3'（配列番号１５）(TM=68.0℃)、Reverse (rbohF3061RV)5'-GCTTCTATCGAACCCCCTTG-3' （配列番号１６）(TM=64.6℃)；Foward (rbohF2208FW)5'-ATAGATGGACCGTACGGTGC-3'（配列番号１７）(TM=63.6℃)、Reverse (rbohF3061RV)5'-GCTTCTATCGAACCCCCTTG-3' （配列番号１６）(TM=64.6℃)；
ＳｄＣＤＰＫ１に対するプライマー（Foward：5'-ATGGGGAACACTTGTGTAGGAC-3' （配列番号１８）、 Reverse： 5'-TAGTTTTACTGCTTCTCTGAATCC-3' （配列番号１９））；及び
ＳｄＣＤＰＫ２に対するプライマー（Foward：5'-ATGGAACCAAAACCAGCAACTG-3' （配列番号２０）、 Reverse：5'-TAAGATTTCTTCACTCTGTACGAG-3' （配列番号２１））。ＰＣＲ反応は、TaKaRa社製のＰＣＲサーマルサイクラーで行った。ＰＣＲの条件は、まず９５℃で５分後、９５℃で１分、５５〜６５℃で１分、７２℃で１〜３分、７２℃で１０分を３５サイクル行った。
【００４３】
（ＲＮＡ転写解析）
ジャガイモ植物の品種「Ｅｎｉｗａ」（Ｒ１遺伝子）及び「Ｍａｙｑｕｅｅｎ」（ｒ遺伝子）を温室で栽培しこれらの葉を洗浄し、試料として供試した。２種類の葉１００ｍｇ（直径１．５ｃｍ）を暗下で準備した。疫病菌菌体壁成分（ＨＷＣ)エリシター及びサプレッサーを、上述のようにフィトフトラ・インフェスタンスの菌糸より調製した。ＨＷＣエリシター（２００μｇ／ｍｌ）及びサプレッサー（２００μｇ／ｍｌ）溶液１００μｌを、葉の表面に塗布し、２分間浸潤させることにより浸透させた。処理された葉を暗中で２０℃にてインキュベートした。インキュベート後、葉（新鮮重１００ｍｇ）を凍結し、Logemann et al.(1987)に記載されているようにグアニジン塩酸塩ＲＮＡ抽出法により全ＲＮＡを抽出した。抽出された全ＲＮＡをＤＮaｓｅ処理することにより、微量のＤＮＡのコンタミを除去した後、１．２％アガロース−ホルムアルデヒドゲル電気泳動により分離した。２μｇの全ＲＮＡを、１ｐＭオリゴｄ（Ｔ）16〜18プライマーを用いてReady-To-Go（商標）ＲＴ−ＰＣＲビーズ（TaKaRa社製）によって、一本鎖ｃＤＮＡに逆転写した。なお、ＲＴ−ＰＣＲの条件は４２℃で３０分、９５℃で５分とした。０．１μｇのｃＤＮＡ反応物を、コントロールとしてβ−アクチンのプライマーセット及び特異的プライマーと共に２５μｌＰＣＲで使用した。ＰＣＲ反応液は、鋳型ｃＤＮＡ０．１μｇ、１unit／μｌ  ＥｘＴａｑポリメラーゼ（TaKaRa社製）及び酵素に付属するバッファー２．５μｌ、ｄＮＴＰ混合液２μｌ、２５ｐＭの各プライマー５´及び３´を含む。ＰＣＲ反応は、TaKaRa社製のＰＣＲサーマルサイクラーで行った。対数増殖下でＤＮＡのＰＣＲ増幅を止めるため、ＰＣＲ増幅の反応速度を解析し、反応速度の結果より、２０サイクルでＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、まず９５℃で５分後、９５℃で１分、５５〜６５℃で１分、７２℃で１〜３分、７２℃で１０分を２０サイクル行った。
【００４４】
（クローニング及びシークエンス解析）
ＰＣＲ産物を、ｐＣＲＴ７ＣＴ  ＴＯＰＯプラスミドベクター（Invitrogen社製）にクローニングし、サーモシークエンス蛍光標識化プライマーサイクルシーケンシングキット（Amercham  Bioscience社製）及びALFexpress（商標）DNAシーケンサー（Pharmacia  Biotech社製）を用いてヌクレオチド配列を決定した。
【００４５】
（HighFive昆虫細胞系での組換えタンパク質の発現）
ポリ／リジンが被覆された２４wellプレートに細胞を、エクスプレスファイブ無血清培地（Invitrogen社製）で２．４×１０5cells／well播種し、少なくとも１時間接触させた。
【００４６】
（組換えタンパク質の精製）
融合タンパク質の精製のため、Xpress（商標）Systemタンパク質精製プロトコールに従った。ポリヒスチジン−標識融合タンパク質を、細胞溶液緩衝液により平衡化したProBondヒスチジン結合樹脂カラムに付加した。カラムを８ｍｌの変性結合緩衝液（８Ｍ  尿素、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、５００ｍＭ  塩化ナトリウム）により洗浄した。最後に、タンパク質を、５ｍｌの変性溶出緩衝液（８Ｍ  尿素、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、５００ｍＭ  塩化ナトリウム、ｐＨ４．０８）により溶出した。溶出液を１０ｍＭ  Tris−HCl、ｐＨ８．０、Triton  X−１００に対して、４℃にて一晩透析して尿素を除去した。この間に、透析液を４回交換した。この精製タンパク質濃度を標準として牛血清アルブミン（ＢＳＡ）でＢＣＡタンパク質アッセイキット（Pierce社製）を使用して測定した。
【００４７】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンイムノブロット分析）
融合タンパク質を、Leammli, U.K. et al., Nature Vol.227, pp.680-681 (1970)に記載の方法に従って、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）をminiPAGE System（ATTO社製）を用いて分離し、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）Ｇ−２５０により染色し検出した。ウエスタンイムノブロット分析のため、融合タンパク質を、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（Immoblin（商標）P、孔サイズ０．４５μｍ、MILLIPORE社製）に移送した。この膜を、ブロック緩衝液（３％（ｖ／ｗ）ＢＳＡ、ＴＢＳ（２０ｍＭ  Tris-20））でブロックして、希釈緩衝液（ＴＢＳＴ＋１％ＢＳＡ）により１／５０００に希釈した抗Ｈiｓ（Ｃ末端）−マウスモノクローナルＩｇＧ２ｂ抗体で一晩インキュベートした。ＴＢＳＴで２回洗浄した後、２５０倍に希釈したアルカリホスフェターゼ結合ラビット抗マウス抗体（Ｄ０３１４，DAKO社製）で、室温にて１時間インキュベートした。この膜を、ＴＢＳＴで洗浄後、アルカリホスファターゼ緩衝液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、ｐＨ９．５）で洗浄し、ＡＰ結合基質キット（BioRad社製）を用いて、抗原−抗体複合体を検出した。
【００４８】
（活性酸素種（ＡＯＳ：active oxygen species）の測定）
蓄積したＯ2-を、ホタルルシフェラーゼ誘導体（ＣＬＡ）を用いて測定した（Furuichi, N. et al., Potato defence response to Phytophthora infestans: Isolation of proteins related to generation of active oxygen species in the microsolam fraction of potato tubes. Proc. Assoc. Pl. Prot. Hokuriku 45, 41-44 (1997) ）。試料タンパク質を、４２６μｌの３９ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、５μｌの１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2又はＣａＣｌ2、５μｌの１０ｍ  ＭＥＧＴＡ、１．５μｌの１０ｍＭグアノシン５´−トリホスフェート（ＧＴＰ）−γ−Ｓ、１５μｌのＣＬＡを含む１５ｍｌのサンプル管に加えた。なお、ＣＬＡは最後に加えた。サンプル管を３７℃にて３分間インキュベートし、２３μｌの３．３ｍＭ  ＮＡＤＰＨの添加直後から１５分間の間隔で、放射される光のカウントをルミネセンスリーダー（ATTO社製）で測定した。
【００４９】
（遺伝子銃による遺伝子導入法及び共焦点レーザスキャン顕微鏡）
遺伝子銃による遺伝子導入法は、Biolistic PDS-1000／He particle  Deliverly system（BioRad社製）を用いて行った。ペトリ皿の中のＭＳ培地のジャガイモ懸濁細胞に、１１００p.s.i.（〜７．６ＭＰａ）の条件で遺伝子導入を行った。遺伝子導入後、２〜４０時間、遺伝子が導入されたジャガイモ懸濁細胞を共焦点レーザスキャン顕微鏡ＬＳＭ５１０（Carl Zeiss社製）で解析した。緑色蛍光のＧＦＰ(Green Fluorescent Protein) をアルゴンレーザー（４８８ｎｍ）で励起させ、また赤色蛍光のローダミンをヘリウム−ネオンレーザー（５４３ｎｍ）で励起させ、フィルターセット（ＨＱ５３０／６０及びＥＳ７０ＬＰ）で連続して収集した。双方の蛍光の画像を処理し、レーザーシャーププログラムシステム（Carl Zeiss社製）を用いてデータをまとめた。
【００５０】
（ＮＡＤＰＨ酸化酵素及びＨｉｓ−ＣＤＰＫのリン酸化分析）
上述のように精製されたＰｉＰＥエリシター（Ｐｉ由来のエリシター約２μｇ、ＤＮ１０１）及びＮＡＤＰＨ酸化酵素を含むミクロソーム分画を、１μＣｉ〔γ−32ｐ〕ＡＴＰを含むリン酸化反応液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．１）、５０μＭ  ＣａＣｌ2、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＤＴＴ、２０μＭ  ＡＴＰ、１％  tritonＸ−１００及び１０％  グリセロール）中で、精製されたＨｉｓ−ＳｄＣＤＰＫ１と共に３０℃で１０分間培養した。このように処理されたタンパク質を、４℃で１０分間インキュベート後、２ｍＭのＡＴＰを添加し、さらに４℃で１０分間培養した後、Takano, M. et al.， Regulation of Binding of Lamin B Receptor to Chromatin by SR Protein Kinase and cdc2 Kinase in Xenopus Egg Extracts. J. Biol. Chem. 279, 13265-13271(2004)に記載されているＭｅＯＨ／ＣＨ3Ｃｌ沈殿法によって沈殿させた。沈殿させたタンパク質を、１％ＳＤＳに溶解させ、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＣＢＢ  Ｒ−２５０により視覚化した。このゲルを乾燥後、Thypoon（Amersham Pharmacia社製）を用いてリン酸化タンパク質を検出した。
【００５１】
（ＦＣＣＳ測定）
ＦＣＣＳ測定及びそのデータ解析は、主に蛍光相互相関分光法（ＦＣＣＳ；Fluorescence Cross Correlation Spectroscopy）とレーザ顕微鏡（コンフォコ２（Carl Zeiss社製））を使用して行った。このＦＣＣＳとレーザ顕微鏡を用いた技法は、Rigler, R. & Elson, E.L. Fluorescence Correlation Spectroscopy:Theory and Applications (Springer-Verlag, Berlin,2001)；Saito, K. et al., Direct detection of caspase-3 activation in single live cells by cross-correlation analysis. Biochem. Biophys. Acta 324, 849-854(2004)；Yoshida, N. et al., Microenvironment of endosomal aqueous phase investigated by the mobility of microparticles using fluorescence correlation spectroscopy. Biochem Biophys Res Commun 280, 312-318(2001)；Pack, C. G. et al., Effect of electrostatic interactions on the binding of charged substrate to GroEL studied by highly sensitive fluorescence correlation spectroscopy. Biochem Biophys Res Commun 267, 300-304(2000)に記載されているように、溶液内及び生細胞内の分子の回転拡散係数を測定するための唯一の技法として開発されたものである。この技法を生物系へ適用することにより、植物中における病原体毒素及び細胞受容体の状態などの種々の分子活力の新規な側面をもたらすことができる。
【００５２】
共焦点の小孔の直径を９０μｍに調整し、緑色蛍光のＧＦＰ(Green Fluorescent Protein) をアルゴンレーザー（４８８ｎｍ）で励起させ、また赤色蛍光のローダミンをヘリウム−ネオンレーザー（５４３ｎｍ）で励起させた。放出シグナルを２色性ミラー（５７０ｎｍビームスピリッター）により分離し、ｓｍＧＦＰの緑色チャンネルによる５０５−５３０ｎｍを検出し、またローダミンの赤色チャンネルによる６００−６５０ｎｍを検出した。
【００５３】
赤色チャンネル及び緑色チャンネルの蛍光自身の相互相関関数（それぞれＧr(τ)、Ｇg(τ)）及び蛍光相関関数（Ｇc(τ)）を、Saito, K. et al., Direct detection of caspase-3 activation in single live cells by cross-correlation analysis. Biochem. Biophys. Acta 324, 849-854(2004)に記載されている方法で算出した。種々のサンプル間の相互相関の定量的評価に関して、Ｇc(0)をＧg(0)により標準化した。なお、Ｇc(0)は、結合したタンパク質Ｎｃの数に比例し、ＧＦＰ−ＣＤＰＫとローダミン−サプレッサー間の結合の減少は、Ｇc(0)／Ｇg(0)の減少として観察することができる。
【実施例１】
【００５４】
疫病菌であるフィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｉ）を、品種「Ｅｎｉｗａ」（Ｒ１遺伝子）のジャガイモ懸濁細胞に接種した際に起こる過敏感反応死を調べた。ジャガイモ懸濁細胞に、疫病菌を接種して３時間後、疫病菌は細胞膜へ侵入し、５分以内に菌糸先端が原形質膜表面に結合した。ジャガイモ懸濁細胞は、疫病菌接種６時間後に防御機構を示し、過敏感細胞死が起こった。侵入された細胞とその隣接細胞が細胞死を示している。過敏感細胞死は、原形質分離や、ニュートラルレッド（５ｍＭ）による染色性などを測定することにより確認した。図１−ａは、フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｉ）の菌糸先端が原形質膜と結合した状態を示す写真である。また、図１−ｂは、過敏感細胞死を起こしたジャガイモ懸濁細胞を示す写真である。なお、図１−ａ及び図１−ｂに示されるＰＭはジャガイモ細胞の原形質膜を示し、ＺはＰｉの遊走子を示す。
【００５５】
また、ジャガイモ葉（品種「Ｍａｙｑｕｅｅｎ」（ｒ遺伝子）、品種「Ｅｎｉｗａ」（Ｒ１遺伝子）における水処理（Ｍｏｃｋ）、菌糸細胞壁エリシター（ＰｉＰＥelicitor）処理又はサプレッサー（Suppressor）グルカン処理後の時間変化（０、２４、４８時間）における影響を調べた。結果を図２に示す。
【００５６】
図２に示されるように、ＰｉＰＥエリシター処理後４８時間後、抵抗性品種「Ｅｎｉｗａ」（Ｒ１遺伝子）では、強い過敏感反応を示した。一方、サプレッサー処理したものでは、どちらの品種も、４８時間後までは、表面での反応はほぼ無反応であった。すなわち、サプレッサー処理により、過敏感反応が誘導されないことが示された。
【実施例２】
【００５７】
（活性酸素種（ＡＯＳ）の生成活性測定）
ＧＦＰ−ＣＤＰＫ１過剰発現ジャガイモ細胞では、活性酸素の生成がどのような影響を受けるのかを検討した。カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターの制御下で、ジャガイモ細胞由来の遺伝子形質転換体を用いて、ＧＦＰ−ＣＤＰＫ１過剰発現ジャガイモ細胞（品種「Ｒｉｓｈｉｒｉ」）を作製した。
【００５８】
図３は、ＰｉＰＥエリシター処理後のｓｍＧＦＰ−ＣＤＰＫ１過剰発現ジャガイモ細胞内におけるＡＯＳ生成を、活性酸素種の指標であるＣＬＡ指数を用いて測定した結果を示すグラフである。なお、以下の試料に対して測定を行った：ＧＦＰ−ＳｄＣＤＰＫ１＋ＰｉＰＥ；懸濁細胞（品種「Ｒｉｓｈｉｒｉ」）＋ＰｉＰＥ；ＧＦＰ−ＳｄＣＤＰＫ１；懸濁細胞（品種「Ｒｉｓｈｉｒｉ」）。図３からわかるように、ｓｍＧＦＰ−ＣＤＰＫ１過剰発現ジャガイモ細胞を、ＰｉＰＥエリシターと反応させた結果、ＡＯＳ生成が３０分以内に著しく高まり、非組換えジャガイモ懸濁細胞より高レベルのＡＯＳ生成を確認した。
【００５９】
次に、ジャガイモ細胞の発現濃度と、その影響を検討した。結果を図４及び図５に示す。
【００６０】
図４は、ジャガイモ（品種「Ｅｎｉｗａ」（Ｒ１遺伝子））のミクロソーム分画（ＭＦ；Microsomal Fraction）に、Ｈｉｓ−ＮＡＤＰＨ酸化酵素を添加したものと添加しなかったものの、ＡＯＳ生成を測定した結果を示すグラフである。また、ミクロソーム分画に、ＡＯＳの特異的捕捉剤としてタイロン（Ｔｉｒｏｎ）を添加したものについてもＡＯＳ生成を測定した。以下の試料に対して測定を行った：ＭＦ（５μｇ）＋Ｈｉｓ−ＮＡＤＰＨ酸化酵素（３６ｎＭ）；ＭＦ（５μｇ）＋Ｈｉｓ−ＮＡＤＰＨ酸化酵素（３．６ｎＭ）；ＭＦ（５μｇ）＋Ｈｉｓ−ＮＡＤＰＨ酸化酵素（３６ｎＭ）＋Ｔｉｒｏｎ（１０ｍＭ）；ＭＦ（５μｇ）；ＭＦ（５μｇ）＋Ｔｉｒｏｎ（１０ｍＭ）。図４に示されるように、３６ｎＭのＨｉｓ−ＮＡＤＰＨ酸化酵素処理区では、ＡＯＳ生成は著しく高まり、一方、Ｔｉｒｏｎ添加区では強く阻害された。この結果から、ＭＦに、Ｈｉｓ−ＮＡＤＰＨ酸化酵素を添加することでＡＯＳ生成が増加することを確認した。
【００６１】
また、Ｒｂｏｈ１タンパク質がＡＯＳ生成に伴って生じるか否かを分析するため、Ｈｉｓ−ｒｂｏｈ１を発現させ、宿主細胞におけるＨｉｓ−ｒｂｏｈ１のＡＯＳ生成活性を測定した。また、ジャガイモのミクロソーム分画中のＡＯＳ生成において、予想されるｐ６７phox（アミノ酸配列：DEPKESEKADANNQ（配列番号２２））とｐ４７phox（アミノ酸配列：PGPQSPGSPLEEERQ（配列番号２３））のエピトープ（抗原決定基）の影響についても調べた。図５は、以下の試料に対して測定を行った結果を示す：ＭＦ（５μｇ）＋Ｈｉｓ−ｒｂｏｈ１（３６ｎＭ）；ＭＦ（５μｇ）＋Ｈｉｓ−ｒｂｏｈ１（３６ｎＭ）＋抗ｐ４７phoxとｐ６７phox抗体；ＭＦ（５μｇ）＋Ｈｉｓ−ｒｂｏｈ１（３６ｎＭ）＋抗ｐ６７phox抗体；ＭＦ（５μｇ）＋Ｈｉｓ−ｒｂｏｈ１（３６ｎＭ）＋抗ｐ４７phox抗体；ＭＦ（５μｇ）。図５の結果から、Ｈｉｓ−ＮＡＤＰＨ酸化酵素処理区単独区と比較し、抗ｐ４７phox抗体、抗ｐ６７phox抗体処理区では、ＡＯＳの生成が阻害された。この結果から、ジャガイモ細胞膜でのＡＯＳ生成において、ｐ４７phox、ｐ６７phoxタンパク質が重要な活性化タンパク質であることが明らかとなった。
【００６２】
また、図６は、以下の試料に対して測定を行った結果を示す：ＭＦ（５μｇ）＋Ｈｉｓ−ｒｂｏｈ１（１３２μｇ／ｍｌ）；ＭＦ（５μｇ）＋Ｈｉｓ−ｒｂｏｈ１（１３２μｇ／ｍｌ）＋抗ｐ４７phox抗体；ＭＦ（５μｇ）＋Ｈｉｓ−ｒｂｏｈ１（１３２μｇ／ｍｌ）＋抗ｐ６７phox抗体；ＭＦ（５μｇ）＋Ｈｉｓ−ｒｂｏｈ１（１３２μｇ／ｍｌ）＋抗ｐ４７phoxと抗ｐ６７phox抗体；ＭＦ（５μｇ）。
【００６３】
図６に示されるように、ジャガイモ細胞膜において、ＮＡＤＰＨ酸化酵素タンパク質（Ｈｉｓ−ｒｂｏｈ１）を１３２μｇ／ｍｌ加えると、ＡＯＳの生成が１５分以内に高まり、抗ｐ４７phox抗体あるいは抗ｐ６７phox抗体を添加処理した場合は、ＡＯＳの生成が強く阻害された。すなわち、ジャガイモ細胞膜では、ＡＯＳの生成において、ＮＡＤＰＨ酸化酵素が主要な酵素成分として役割を果たし、ｐ４７phoxとｐ６７phoxのタンパク質が活性化のタンパク質成分として働いていることが明らかになった。また、ＡＯＳは、全身抵抗性の誘発において重要な役割を果たしていることが知られている（Alvarez, M. E. at al. Reactive oxygen intermediates mediate a systemic signal network in the establishment of plant immunity. Cell 92, 773-784(1998)）ことから、ｒｂｏｈ１タンパク質及び／又はｐ４７phoxとｐ６７phoxのタンパク質を利用することにより、病害耐性作物の作出を可能なものとすることが示された。
【００６４】
さらに、ジャガイモのミクロソーム分画及びＨｉｓ−ｒｂｏｈ１中のＡＯＳ生成において、予想されるＣＤＰＫのエピトープの影響について調べた。以下の試料に対して測定を行った：ＭＦ（５μｇ）＋Ｈｉｓ−ｒｂｏｈ１（１３２μｇ／ｍｌ）；ＭＦ（５μｇ）＋Ｈｉｓ−ｒｂｏｈ１（１３２μｇ／ｍｌ）＋抗ＣＤＰＫ抗体；ＭＦ（５μｇ）＋Ｈｉｓ−ｒｂｏｈ１（１３２μｇ／ｍｌ）＋抗ＣＤＰＫ抗体＋抗ｐ４７phoxと抗ｐ６７phox抗体；ＭＦ（５μｇ）。結果を図７に示す。図７に示されるように、ＮＡＤＰＨ酸化酵素を、抗ＣＤＰＫ抗体で処理すると、ＡＯＳの生成が阻害された。また、抗ｐ４７phox抗体及び抗ｐ６７phox抗体を加えた場合も、同様にＡＯＳの生成が阻害されたことから、ジャガイモの細胞膜では、ＣＤＰＫがＮＡＤＰＨのリン酸化に働き、ＡＯＳ生成活性を制御することが示唆された。
【実施例３】
【００６５】
（ＧＦＰ−ＣＤＰＫ１とフィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｉ）のサプレッサーとの結合のＦＣＣＳ分析）
蛍光相互相関分光法（ＦＣＣＳ；Fluorescence Cross Correlation Spectroscopy）とレーザ顕微鏡（コンフォコ２（Carl Zeiss社製））を用いて、受容体としてのＧＦＰ−ＣＤＰＫ１（分子タグとして蛍光性のタンパク質ＧＦＰ(Green Fluorescent Protein)を利用）と、ジャガイモ懸濁細胞（品種「Ｒｉｓｈｉｒｉ」（Ｒ１遺伝子））におけるＰｉ由来のサプレッサーグルカンとの間の生体内における結合の分析を行った。
【００６６】
分析を行うためｓｍＧＦＰ−ＣＤＰＫ１を構築し、パーティクルガン法によりジャガイモ細胞の中に形質転換体を作製した。この形質転換ジャガイモ細胞と共にサプレッサーグルカンをインキュベート後、このジャガイモ細胞を、ローダミン抗サプレッサーグルカンモノクロナール抗体で処理した。前述の処理を行うことにより、ローダミン標識抗体で染色後のサプレッサーグルカンを、ジャガイモの細胞質ゾル、膜部位及び原形質膜中に導入し、ＦＣＣＳシステム下で所定の時間間隔で測定した。なお、本実施例において、原位置でＰｉのサプレッサーグルカンと共にｓｍＧＦＰ−ＣＤＰＫ１の拡散又は結合が測定可能か否かをまず調べた。そして、サプレッサーグルカンを添加後、ジャガイモ細胞におけるサプレッサーグルカンとｓｍＧＦＰ−ＣＤＰＫ１との間の結合を、ジャガイモ細胞におけるｓｍＧＦＰ−ＣＤＰＫ１の局在の動態変化、及び宿主中における種々の微小動態レベルにおいて調べた。また、コントロールとして、サプレッサーと抗サプレッサー抗体を除いた同様の処理を行った（図示せず）。
【００６７】
ジャガイモ懸濁細胞中のＦＣＣＳ分析の結果を図８に示す。図８ａは、ジャガイモ懸濁細胞中のＧＦＰ−ＣＤＰＫ１とローダミン抗サプレッサー抗体を有するサプレッサーグルカン間結合の相互相関振幅を測定したＦＣＣＳ分析結果を示すグラフである。また、図８ｂは、ジャガイモ細胞を、サプレッサーと抗サプレッサーモノクローナル抗体で処理したＦＣＣＳ分析結果を示すグラフである。また、図８ｃは、ジャガイモ細胞を、サプレッサーで処理した後、ローダミン抗マウスモノクローナル抗体を有する抗サプレッサー抗体で処理したＦＣＣＳ分析結果を示すグラフである。さらに、図８ｄは、サプレッサーとＨｉｓ−ＣＤＰＫ１との間の結合の散布図を示すグラフである。なお、図８ｄ中のプロットされた点のサプレッサー濃度は、それぞれ０、２５、５０、７０、１００μＭである。図８のＦＣＣＳ分析結果において、ＧＦＰ−ＣＤＰＫ１が短時間（０．０１ｍｓｅｃ）内にサプレッサーグルカンと結合することを示した。また、ＧＦＰ−ＣＤＰＫ１をＦＣＣＳで観察した場合、ジャガイモ細胞の原形質膜において緩慢な動作を示すものが確認された。すなわち、ジャガイモの膜にＣＤＰＫ１が存在していることを示唆する。さらに、このＦＣＣＳ分析の結果より、この時間周期の間、サプレッサーシグナルが宿主細胞内のＮＡＤＰＨ酸化酵素に変換されることが示唆された。
【実施例４】
【００６８】
（ＧＦＰ−ＣＤＰＫ１及びローダミン標識抗サプレッサーグルカン抗体の局在化）
抗ＣＤＰＫ抗体を使用し、ジャガイモ細胞におけるＣＤＰＫ１の局在化を蛍光免疫化学法により調べた。レーザスキャン顕微鏡を使用して、ｓｍＧＦＰ−ＣＤＰＫ１過剰発現ジャガイモ細胞を観察した写真を図９に示す。図９−１は、ｓｍＧＦＰ−ＣＤＰＫ１がジャガイモ細胞の細胞壁及び原形質膜に局在している状態を示す写真である。図９−２はジャガイモ細胞の光学顕微鏡写真であり、図９−３は図９−２の写真をＧＦＰ画像に起こした写真である。また、図１０−１〜３は、ｓｍＧＦＰ−ＣＤＰＫ１過剰発現ジャガイモ細胞を、フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｉ）のサプレッサーと抗グルカン抗体で処理した結果を示す写真である。なお、緑色はｓｍＧＦＰ−ＣＤＰＫ１タンパク質を示し、赤色はローダミン標識抗サプレッサーグルカン抗体を示す。これらの結果により、ＧＦＰ−ＣＤＰＫ１とフィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｉ）のサプレッサーとの結合を確認することができた。図９及び１０により、ＣＤＰＫ１が原形質膜に局在することが確認され、ＣＤＰＫ１がサプレッサーグルカンの受容体タンパク質であることが認められた。また、未処理のジャガイモ懸濁細胞は、原形質膜と異なったＧＦＰ蛍光を示し、細胞壁との関連を強く示唆した。
【００６９】
さらに、ウエスタンブロット分析により、未処理の原形質膜と、ジャガイモ塊茎から調製されたミクロソーム分画とを比較し、ｓｍＧＦＰ−ＣＤＰＫ１の原形質膜の局在を確認した（図示せず）。この結果は、原形質膜分画におけるＣＤＰＫ１の存在を示した。さらに、ジャガイモ懸濁細胞又はジャガイモの葉からの原形質膜のプロテオミクス分析により、ジャガイモ懸濁細胞とジャガイモ葉の材料のそれぞれにおいて、唯一のグルカン結合タンパク質として同定されたＣＤＰＫ１を確認した（図示せず）。この結果は、ＣＤＰＫ１が原形質膜に比較的豊富に含まれていることを示唆するものである。
【実施例５】
【００７０】
（ＮＡＤＰＨ酸化酵素及びＨｉｓ−ＣＤＰＫのリン酸化分析）
ＮＡＤＰＨ酸化酵素及び上述したＨｉｓ−融合物として精製されたＮＡＤＰＨ酸化酵素を含むミクロソーム分画を、精製し、１μＣｉ〔γ−32ｐ〕ＡＴＰを含むリン酸化反応液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．１、５０μＭ  ＣａＣｌ2、及びＣａ2+とＭｇ2+）中で、精製されたＨｉｓ−ＳｄＣＤＰＫ１と共に３０℃で１０分間培養した。このように処理されたタンパク質を、４℃で１０分間インキュベート後、２ｍＭのＡＴＰを添加し、さらに４℃で１０分間培養した後、Takano, M. et al. Regulation of Binding of Lamin B Receptor to Chromatin by SR Protein Kinase and cdc2 Kinase in Xenopus Egg Extracts. J. Biol. Chem. 279, 13265-13271(2004)に記載されているＭｅＯＨ／ＣＨ3Ｃｌ沈殿法によって沈殿させた。
【００７１】
図１１は、ＰｉＰＥエリシター処理によるＳｄＣＤＰＫ２の自己リン酸化分析の結果を示す図である。リン酸化反応液中の精製されたＨｉｓ−ＣＤＰＫ２（レーン１）、２ｍＭのＥＧＴＡを含むリン酸化反応液（レーン２）、又は約２μｇのＰｉＰＥを含むリン酸化反応液（レーン３）を、１μＣｉ〔γ−32ｐ〕ＡＴＰの存在下、３０℃で１０分間培養した。処理済のＨｉｓ−ＣＤＰＫ２を沈殿させ、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて、オートラジオグラフィーにより検出した。この結果は、ＳｄＣＤＰＫ２が自己リン酸化し、このリン酸化活性がＥＧＴＡ及びＰｉＰＥエリシターによって阻害されたことを示す。
【００７２】
さらに、カルシウムイオン添加の影響、或いはリン酸化酵素活性におけるエリシター及びサプレッサーの添加の影響を調べた。エリシター（１００μｇ／ｍｌ）と共に、Ｃａ2+（１００μＭ）とＭｇ2+（５０ｍＭ）の２イオン化状態では、５〜１０分以内にＨｉｓ−ＣＤＰＫ１の自己リン酸化を刺激した（図示せず）。また、これらの２イオンと、サプレッサーの添加は、ＣＤＰＫ１の自己リン酸化を刺激した。これは、ＣＤＰＫがＮＡＤＰＨ酸化酵素と共に優れた活性によって、ジャガイモ膜分画におけるＡＯＳ生成の活性化を刺激することを示唆する。
【００７３】
また、ＮＡＤＰＨ酸化酵素（約９７ｋＤ）及び精製されたＮＡＤＰＨ酸化酵素を含むミクロソーム分画のＨｉｓ−ＣＤＰＫ２によるリン酸化分析を行った。ＮＡＤＰＨ酸化酵素（図１２のレーン１）及び精製されたＮＡＤＰＨ酸化酵素（図１２のレーン２）を含むミクロソーム分画を、精製されたＨｉｓ−ＣＤＰＫ２と共に培養し、オートラジオグラフィーにより検出した。図１２中の矢印は、Ｈｉｓ−ＮＡＤＰＨ酸化酵素を示し、矢じり形は、Ｈｉｓ−ＣＤＰＫ２を示す。左側に示される分子マーカーは、上からそれぞれ９６、６６、４３、２９ｋＤａを示す。この結果、精製ＮＡＤＰＨ酸化酵素（図１２中の矢じり形で示されたもの）はＣＤＰＫ２によってリン酸化されたものの、ミクロソーム分画中のＮＡＤＰＨ酸化酵素はリン酸化されなかった。また、図１２中の矢印で示された８４ｋＤには、ＮＡＤＰＨ酸化酵素から分解されたペプチドを含むことが観測された。この結果から、ＣＤＰＫ２シグナルはジャガイモ細胞中のｇｐ９１phoxに対し下流に存在することが示唆された。
【００７４】
（サプレッサーの過敏感細胞死制御）
ＳｄＣＤＰＫ１は、ジャガイモ細胞の原形質膜中のＮＡＤＰＨ酸化酵素をリン酸化し、サプレッサーシグナルを下流へ伝達し、過敏感反応及び宿主細胞の細胞死を阻害することを示唆した。本発明者は、フィトフトラ・インフェスタンスの適合性レースのサプレッサーが過敏感細胞死及びファイトアレキシン等を阻害することを既に報告している（Furuichi, N. & Suzuki, J. Purification and properties of suppressor glucan isolated from Phytophthora infestans. Ann. Phytopathol. Soc. Jpn. 56, 457-467(1990)）。また、サプレッサーが、宿主病原菌の相互作用の適合性相互作用におけるＡＯＳ生成を阻害したことが道家らにより報告されている（Doke, N. et al. the oxidative burst protests plant against pathogen attack: Mechanism and role as an emergency signal for plant bio-defence. Gene 179, 45-51(1996)）。これらの報告からも、ＡＯＳシグナルが、植物中の過敏感に関する上流シグナルであり、ＡＯＳ生成が過敏感細胞死自体を誘発することが強く示唆される。
【実施例６】
【００７５】
（抵抗性宿主および罹病性宿主におけるシグナル遺伝子の発現分析）
ジャガイモの抵抗性品種「Ｅｎｉｗａ」（Ｒ１遺伝子）及びジャガイモの罹病性品種「Ｍａｙｑｕｅｅｎ」（ｒ遺伝子）に対して、ＨＷＣ処理、ＰｉＰＥ処理及びＰｉサプレッサー処理のそれぞれの処理を行い、０、１、３、６、９、１２時間後に、全ＲＮＡを抽出し、プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。「Ｅｎｉｗａ」（Ｒ１遺伝子）においては、Ｅｎｒｂｏｈ１、ＳｔＣＤＰＫ１、ＳｔＣＤＰＫ２、トマトＰｔｏ遺伝子ホモログ、及びコントロールとしてβアクチンを観察した。また同様に「Ｍａｙｑｕｅｅｎ」（ｒ遺伝子）においても、Ｍｑｒｂｏｈ１、ＳｔＣＤＰＫ１、ＳｔＣＤＰＫ２、トマトＰｔｏ遺伝子ホモログ、及びコントロールとしてβアクチンを観察した。定量的なＲＴ−ＰＣＲの結果を図１３に示す。
【００７６】
図１３に示すように、Ｍｑｒｂｏｈ１は、ＨＷＣエリシター処理区においてｒ−遺伝子では、６時間から９時間で発現し、Ｒ１抵抗性品種のＥｎｒｂｏｈ１は、１時間、３時間、６時間で強く発現を誘導した。一方、ＰｉＰＥエリシター処理では、抵抗性品種において６時間後にＥｎｒｂｏｈ１が発現した。ＳｔＣＤＰＫ２は、ＨＷＣエリシターでは、３、６、９時間で誘導発現が起こった。
【００７７】
抵抗性品種では、同じく３、６、９時間で誘導されるが、より高濃度の発現が起った。一方、サプレッサー処理区では、１、３、６時間で、ＳｔＣＤＰＫ２が誘導されるが、９、１２時間後には速やかにその遺伝子発現量が低下した。
【００７８】
一方、ＳｔＣＤＰＫ１は、抵抗性品種、罹病性品種においてＨＷＣエリシター、ＰｉＰＥエリシター、サプレッサー処理区、いずれにおいても処理直後から遺伝子が発現しており、１２時間後までその発現量が維持されていることが判明した。従って、ＳｔＣＤＰＫ１は、恒常的に発現していることが明らかとなり、ＳｔＣＤＰＫ２は３〜９時間の間に誘導され、発現することが明らかとなった。また、トマトＰｔｏ遺伝子ホモログはいずれの処理区においても恒常的に発現していることが明らかとなった。
【００７９】
以上の結果より、ＳｔＣＤＰＫ１はジャガイモの細胞膜において恒常的に発現され、防御反応シグナルを伝達する役割を担うことが明らかとなった。
【実施例７】
【００８０】
ジャガイモ品種「Ｅｎｉｗａ」のｒｂｏｈ１（Ｅｎｒｂｏｈ１）、「Ｍａｙｑｕｅｅｎ」のｒｂｏｈ１（Ｍｑｒｂｏｈ１）、ＳｔｒｂｏｈＡ及びＳｔｒｂｏｈＢの４種類の推定アミノ酸配列を比較した図を図１４に示す。アミノ酸のそれぞれ異なる部分を黒のボックスで囲んでいる。６つのトランスメンブラン貫通ドメイン（ＴＭＤ１−６）を、バーで上部に示す。アミノ酸配列の点線で示した部分は、Ｎ−グルコシレイションの部分を示し、糖タンパク質の糖が結合する部分と考えられる。アミノ酸配列の点線で示した部分は、ヒトのｇｐ９１phoxと相同な部分を示す。なお、この配列決定は、ＤＮＡＳＩＳプログラムを用いて行った。なお、ＳｔｒｂｏｈＡ及びＳｔｒｂｏｈＢはジャガイモ植物のｇｐ９１phoxホモログであり、Ａタイプは傷や発育過程で常時発現し、Ｂタイプは感染誘導性のＭＡＰＫ（mitogen-activated protein kinase）カスケードの制御下で発現する。植物のｇｐ９１phoxホモログの共通した特色として、６カ所の膜貫通ドメイン（２カ所にＦｅ結合モチーフ）とＣ末端の細胞質側にＮＡＤＰＨとフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）の結合サイトを持ちｇｐ９１phoxと高い相同性もっているが、細胞質側にＮ末端領域をさらに伸ばしており、そこにはＣａ2+の結合サイトのＥＦハンドを２カ所持っていることが知られている。
【００８１】
これまで述べてきた本発明における、疫病菌のサプレッサーによって活性化されたジャガイモ細胞におけるＣＤＰＫシグナル伝達の機構を、図１５に示す。サプレッサーグルカンが宿主細胞壁及び原形質膜を貫通し、ＣＤＰＫ１受容体部位に結合し、防御反応の阻害を誘導する。ＣＤＰＫ１はジャガイモ細胞の細胞壁及び原形質膜に局在し、ＣＤＰＫ２は細胞質内に局在する。ＣＤＰＫ１によるリン酸化がジャガイモ細胞中のＡＯＳ生成を誘発するため、膜結合ＣＤＰＫ１はｇｐ９１phox活性を制御することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】図１−ａは、フィトフトラ・インフェスタンスの菌糸先端がジャガイモ懸濁細胞の原形質膜と結合した状態を示す写真であり、また図１−ｂは、過敏感細胞死を起こしたジャガイモ懸濁細胞を示す写真である。
【図２】ジャガイモ葉（品種「Ｍａｙｑｕｅｅｎ」（ｒ遺伝子）、品種「Ｅｎｉｗａ」（Ｒ１遺伝子）における水処理（Ｍｏｃｋ）、菌糸細胞壁エリシター（ＰｉＰＥelicitor）処理又はサプレッサー（Suppressor）グルカン処理後の時間変化における結果を示す図である。
【図３】ＰｉＰＥエリシター処理後のｓｍＧＦＰ−ＣＤＰＫ１過剰発現ジャガイモ細胞内におけるＡＯＳ生成を測定した結果を示すグラフである。
【図４】ジャガイモのミクロソーム分画に、Ｈｉｓ−ＮＡＤＰＨ酸化酵素を添加したものと添加しなかったものの、ＡＯＳ生成を測定した結果を示すグラフである。
【図５】ジャガイモのミクロソーム分画に、Ｈｉｓ−ｒｂｏｈ１（３６ｎＭ）、抗ｐ４７phox又はｐ６７phoxを添加した場合のＡＯＳ生成を測定した結果を示すグラフである。
【図６】ジャガイモのミクロソーム分画に、Ｈｉｓ−ｒｂｏｈ１（１３２μｇ／ｍｌ）、抗ｐ４７phox又は抗ｐ６７phox抗体を添加した場合のＡＯＳ生成を測定した結果を示すグラフである。
【図７】ジャガイモのミクロソーム分画に、Ｈｉｓ−ｒｂｏｈ１（１３２μｇ／ｍｌ）、抗ＣＤＰＫ抗体、抗ｐ４７phox又は抗ｐ６７phox抗体を添加した場合のＡＯＳ生成を測定した結果を示すグラフである。
【図８】ジャガイモ懸濁細胞中のＦＣＣＳ分析の結果を示すグラフである。
【図９】ｓｍＧＦＰ−ＣＤＰＫ１過剰発現ジャガイモ細胞を観察した写真である。
【図１０】ｓｍＧＦＰ−ＣＤＰＫ１過剰発現ジャガイモ細胞を、フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｉ）のサプレッサーと抗グルカン抗体で処理した結果を示す写真である。
【図１１】ＰｉＰＥエリシター処理によるＳｄＣＤＰＫ２の自己リン酸化分析の結果を示す図である。
【図１２】ＮＡＤＰＨ酸化酵素（約９７ｋＤ）及び精製されたＮＡＤＰＨ酸化酵素を含むミクロソーム分画のＨｉｓ−ＣＤＰＫ２によるリン酸化分析の結果を示す図である。
【図１３】品種「Ｅｎｉｗａ」（Ｒ１遺伝子）及び「Ｍａｙｑｕｅｅｎ」（ｒ遺伝子）の定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【図１４】Ｅｎｉｗａ  ｒｂｏｈ１（Ｅｎｒｂｏｈ１）、Ｍａｙｑｕｅｅｎ  ｒｂｏｈ１（Ｍｑｒｂｏｈ１）、ＳｔｒｂｏｈＡ及びＳｔｒｂｏｈＢの推定アミノ酸配列を示す。
【図１５】疫病菌のサプレッサーによって活性化されたジャガイモ細胞におけるＣＤＰＫシグナル伝達の機構を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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