(57)【要約】【課題】高温環境下において安定した活性を有する耐熱性カタラーゼの提供、並びに、当該耐熱性に加えて、広範なｐＨで安定的な活性を有する高性能カタラーゼの提供。【解決手段】下記の性質を有する耐熱性カタラーゼ活性を有するタンパク質。（Ａ）作用：過酸化水素に作用して水と酸素に分解する、（Ｂ）熱安定性：ｐＨ７．０の下で、ｐＨ７．０の下、３０℃〜５０℃で２０分間の熱処理により９５％以上、６０℃での熱処理により８０％以上、７０℃での熱処理により５０％以上のカタラーゼ活性が残存する、（Ｃ）ｐＨ安定性：ｐＨ６．０〜１０．０の下、室温で２０分間の処理により９５％以上、ｐＨ５での処理により４０％以上、ｐＨ４での処理により２０％以上の活性が残存する、（Ｄ）分子量：３３〜３５ＫＤａである、（Ｅ）由来：好熱性菌由来である【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の性質を有する耐熱性カタラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ａ）作用：過酸化水素に作用して水と酸素に分解する
（Ｂ）熱安定性：ｐＨ７．０の下、３０℃〜５０℃で２０分間の熱処理により９５％以上、６０℃での熱処理により８０％以上、７０℃での熱処理により５０％以上のカタラーゼ活性が残存する
（Ｃ）ｐＨ安定性：ｐＨ６．０〜１０．０の下、室温で２０分間の処理により９５％以上、ｐＨ５での処理により４０％以上、ｐＨ４での処理により２０％以上のカタラーゼ活性が残存する
（Ｄ）分子量：３３〜３５ｋＤａである
（Ｅ）由来：好熱性菌由来である
【請求項２】
好熱好酸性菌由来である請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列認識番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列認識番号２に示すアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、耐熱性カタラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項４】
配列認識番号４又は配列認識番号６のアミノ酸配列からなる請求項３に記載のタンパク質
【請求項５】
耐熱、耐酸性カタラーゼ活性を有する請求項３又は４に記載のタンパク質。
【請求項６】
請求項３〜５のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項７】
以下の（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子。
（ｃ）配列認識番号１に示す塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｄ）配列認識番号１に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ耐熱性カタラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項８】
配列認識番号３又は配列認識番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチドからなる請求項７に記載の遺伝子。
【請求項９】
耐熱、耐酸性カタラーゼ活性を有するタンパク質をコードする請求項７又は８に記載の遺伝子。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか一項に記載の遺伝子を含有する組換えベクター
【請求項１１】
請求項１０に記載の組換えベクターを含有する形質転換体。
【請求項１２】
請求項１１に記載の形質転換体を培養し、得られた培養物から耐熱性カタラーゼ活性を有するタンパク質を採取する耐熱性カタラーゼの製造方法。
【請求項１３】
前記形質転換体が大腸菌である場合に、１〜５ｍＭの塩化マンガンを含有する培地で培養する請求項１２に記載の耐熱性カタラーゼの製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質を、過酸化水素に接触させることにより、過酸化水素を分解する過酸化水素の分解方法。
【請求項１５】
燃料電池の正極側で副生される過酸化水素を分解する請求項１４に記載の過酸化水素の分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐熱性カタラーゼおよびその製造方法に関する。詳細には、耐熱性カタラーゼ、耐熱性カタラーゼ遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、及び該形質転換体を用いた耐熱性カタラーゼの製造方法に関する。更には、該耐熱性カタラーゼの過酸化水素分解等の産業上利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
カタラーゼは、過酸化水素を分解して酸素と水に変換する反応を触媒する酵素である。かかる性質から、体内における酸化ストレスに対する細胞防御システムの重要なメンバーの一つとして知られている。ここで、カタラーゼの基質となる過酸化水素は、強力な酸化分解能力を有する一方で、時間経過と共に自然分解される特徴を有し、分解すると無害な水と酸素となる。そのため、環境に対する負加が少ないとして、塩素系薬剤の代替として着目されている。例えば、繊維染色、食品加工、紙パルプ、および電子機器部品等に関連する様々な産業分野で殺菌剤、漂白剤、洗浄剤等として過酸化水素が利用されている。しかしながら、過酸化水素も排水中の残留量が限度を超えると生態系に悪影響を及ぼすことから適切な処理を施し二次的公害要因を排除することが必要である。かかる残留過酸化水素をカタラーゼにより分解除去する技術の実用化が進められている。また、燃料電池の正極側において副生する過酸化水素により、その性能が低下することが知られており、燃料電池の分野においても過酸化水素の除去技術の構築が求められている。
【０００３】
そして、過酸化水素を用いて漂白、洗浄、殺菌等を行なう場合には、処理の促進等のため、高温下で実行されることが多い。また、半導体ウェハ等の電子機器部品の洗浄は強酸性かつ高温の過酸化水素水を用いて行なうのが一般的である。また燃料電池の正極側も高温かつ酸性である。一方、繊維染色における漂白はアルカリ性の過酸化水素水を用いて行なわれている。したがって、残留過酸化水素含有媒体等に対する中和および冷却の必要性を回避、若しくは最小限にするべく、高温、かつ広範なｐＨ条件下で安定した活性を保持できるカタラーゼが特に求められていた。
【０００４】
カタラーゼは一般に自然界に広く存在しており、動物、植物、微生物等の様々な生物種で単離されている。しかし、工業的用途に利用可能なカタラーゼを取得する場合には、工業的大量生産の観点から微生物由来のカタラーゼを見出すことが有利である。そのような微生物由来のカタラーゼとして、サーモマイセス属（例えば、特許文献１を参照）、アスペルギウス属（例えば、特許文献２を参照）シタリジウム属およびフミコラ属（例えば、特許文献３を参照）、アルカリゲネス属およびミクロシラ属（例えば、特許文献４を参照）、ハロモナス属（例えば、非特許文献１を参照）、サーマス属（例えば、非特許文献２を参照）等が産生するカタラーゼが報告されている。
【０００５】
【特許文献１】特開平１０−２５７８８３号公報
【特許文献２】特開平１１−４６７６０号公報
【特許文献３】米国特許第５５７１７１９号明細書
【特許文献４】国際公開第０２／１０３０３２号パンフレット
【非特許文献１】Phucharoen K., Hoshino K., Takenaka Y., Shinozawa T.、Purification, characterization, and gene sequencing of a catalase from an alkali- and halo-tolerant bacterium, Halomonas sp. SK1.、Biosci Biotechnol Biochem.、２００２年、第６６巻、第９５５〜９６２頁
【非特許文献２】Mizobata T., Kagawa M., Murakoshi N., Kusaka E., Kameo K., Kawata Y., Nagai J.,、Overproduction of Thermus sp. YS 8-13 manganese catalase in Escherichia coli production of soluble apoenzyme and in vitro formation of active holoenzyme.、Eur J Biochem.、２０００年、第２６７巻、第４２６４〜４２７１頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、現在、報告されているカタラーゼのほとんどは、耐熱性の低い細菌由来である。一般的に、耐熱性の低い細菌が産生するタンパク質は高温下において変性し失活することが知られている。仮に、活性を示したとしても時間の経過と共にタンパク変性を生じ、活性が持続しない一時的な活性にすぎない。そのため、高温下の処理には適さないと考えられている。また、好熱性菌由来の耐熱性カタラーゼであっても、使用条件等によってはその耐熱性が十分でない場合がある等の問題点があった。また、耐酸性カタラーゼに関しての報告は少なく、このような耐酸性カタラーゼを遺伝子工学的手法で大量生産する方法に関しては報告がないのが現状である。
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、高温環境下において安定した活性を有し、過酸化水素の分解除去が必要な様々な産業分野で利用可能な耐熱性カタラーゼの提供を目的とする。好ましくは、当該耐熱性に加えて、広範なｐＨで安定的な活性を有する高性能カタラーゼの提供を目的とする。更に、当該耐熱性カタラーゼを遺伝子工学的手法により大量製造するための遺伝子操作材料と、これを用いた耐熱性カタラーゼの製造方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の如き課題を解決するため鋭意検討を重ねてきた。その結果、好熱好酸性菌であるMetallosphaera hakonensisから新規の耐熱性カタラーゼをコードするポリヌクレオチドの単離に成功した。更に、このポリヌクレオチドを用いて遺伝子工学的手法により新規の耐熱性カタラーゼを製造できることを見出した。さらに、この耐熱性カタラーゼが、当該耐熱性に加えて広範なｐＨにおいて安定した活性を示すことを見出した。これらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明は以下の［１］〜［１５］に示すものである。
［１］下記の性質を有する耐熱性カタラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ａ）作用：過酸化水素に作用して水と酸素に分解する
（Ｂ）熱安定性：ｐＨ７．０の下、ｐＨ７．０の下、３０℃〜５０℃で２０分間の熱処理により９５％以上、６０℃での熱処理により８０％以上、７０℃での熱処理により５０％以上のカタラーゼ活性が残存する
（Ｃ）ｐＨ安定性：ｐＨ６．０〜１０．０の下、室温で２０分間の処理により９５％以上、ｐＨ５での処理により４０％以上、ｐＨ４での処理により２０％以上の活性が残存する
（Ｄ）分子量：３３〜３５ｋＤａである
（Ｅ）由来：好熱性菌由来である
［２］好熱好酸性菌由来である上記［１］に記載のタンパク質。
【００１０】
上記［１］〜［２］の構成によれば、熱安定性の高い新規な耐熱性カタラーゼの提供が可能となる。更には、広範なｐＨ、特には酸性領域における安定性を有する。したがって、本発明によって提供されるカタラーゼが、熱安定性が高いという性質を有し、また、広範なｐＨ、特には酸性領域における安定性をも示すことで、様々な産業分野における過酸化水素の分解を要する技術に適用できる。
【００１１】
［３］以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列認識番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列認識番号２に示すアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、耐熱性カタラーゼ活性を有するタンパク質
［４］配列認識番号４又は配列認識番号６のアミノ酸配列からなる上記［３］に記載のタンパク質
［５］耐熱、耐酸性カタラーゼ活性を有する上記［３］又は［４］に記載のタンパク質。
［６］上記［３］〜［５］のいずれかに記載のタンパク質をコードする遺伝子。
［７］以下の（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子。
（ａ）配列認識番号１に示す塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）配列認識番号１に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ耐熱性カタラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
［８］配列認識番号３又は配列認識番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチドからなる上記［７］に記載の遺伝子。
［９］耐熱、耐酸性カタラーゼ活性を有するタンパク質をコードする上記［７］又は［８］に記載の遺伝子。
［１０］上記［７］〜［９］のいずれかに記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
［１１］上記［１０］に記載の組換えベクターを含有する形質転換体。
［１２］上記［１１］に記載の形質転換体を培養し、得られた培養物から耐熱性カタラーゼ活性を有するタンパク質を採取する耐熱性カタラーゼの製造方法。
［１３］前記形質転換体が大腸菌である場合に、１〜５ｍＭの塩化マンガンを含有する培地で培養する上記［１２］に記載の耐熱性カタラーゼの製造方法。
【００１２】
上記［４］〜［１３］の構成によれば、熱安定性の高い耐熱性カタラーゼを提供でき、また、広範なｐＨ、特には酸性領域における安定性を有するカタラーゼの提供が可能となることで、様々な産業分野における過酸化水素の分解を要する技術に適用できる。
また、本発明の耐熱性カタラーゼのアミノ酸配列、並びに塩基配列が明確になったことから、遺伝子工学的手法を用いて低コストかつ工業的に大量生産することが可能となった。
更には、本発明の耐熱性カタラーゼは熱安定性が高いため、その製造においても、加熱処理により容易に夾雑タンパク質を不溶性画分として容易に除去できるため簡便に調製が容易である。例えば、遺伝子工学的手法により製造する場合においても、宿主由来のその他のタンパク質を容易に除去することができる。したがって、精製度を向上させることができ、信頼性の高い酵素を製造できるという利点がある。
【００１３】
特に、上記［１３］の構成によれば、本発明の耐熱性カタラーゼの更に、効率的な大量生産を達成することができるという利点がある。つまり、本発明の耐熱性カタラーゼはその触媒機構にマンガンイオンを利用する「マンガン型カタラーゼ」である。そのため、過剰量のマンガンの存在が安定した活性発現、引いては、生産性の向上を導くことができる。
【００１４】
［１４］上記［１］〜［５］のいずれかに記載のタンパク質を、過酸化水素に接触させることにより、過酸化水素を分解する過酸化水素の分解方法。
［１５］燃料電池の正極側で副生される過酸化水素を分解する上記［１４］に記載の過酸化水素の分解方法。
【００１５】
上記［１４］の構成によれば、熱安定性の高い耐熱性カタラーゼを利用した過酸化水素の分解方法を提供でき、また、広範なｐＨ、特には酸性領域における安定性を有するカタラーゼを用いることで、様々な産業分野における過酸化水素の分解を要する技術に適用できる。
【００１６】
特に、上記［１５］の構成によれば、燃料電池の性能低下の要因となる正極側で副生する過酸化水素を効率よく除去でき、燃料電池の性能の向上に役立つ。本発明の耐熱性カタラーゼは、高温、好ましくは酸性条件下においても安定的にその活性を維持できる。したがって、高温かつ酸性である燃料電池の正極においてもその機能を十分に発揮できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１８】
（本発明の耐熱性カタラーゼの性質）
本発明の耐熱性カタラーゼの理化学的性質は以下の通りである。
【００１９】
（１）作用
従来公知のカタラーゼと同様、過酸化水素に作用して水と酸素に分解する。
【００２０】
（２）熱安定性
本発明の耐熱性カタラーゼは、熱安定性に優れる酵素である。
本発明の耐熱性カタラーゼは、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中での２０分間の熱処理に対して６０℃以下であれば実質的に活性が低下しないことが好ましい。本明細書で、実質的に活性が低下しないとは、測定誤差範囲を考慮し、９０％以上、好ましくは９５％以上の活性が残存する場合をいう。また、上記と同条件の７０℃での熱処理により５０％以上、８０℃での熱処理により３０％以上、９０℃での熱処理によっても２０％以上活性が残存することが好ましい。
【００２１】
更には、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中での５０分間の熱処理に対して６０℃以下であれば実質的に活性が低下しないことが好ましい。また、上記条件下で、７０℃での熱処理により５０％以上、８０℃での熱処理により２０％以上の活性が残存することが好ましい。
【００２２】
本発明の耐熱性カタラーゼは、耐熱性が高く、熱安定性が高いことから様々な産業分野における過酸化水素の分解を要する技術に適用できる。また常温における安定性をも有することから、保存性にも優れる。更に、本発明の耐熱性カタラーゼの製造においても、加熱処理により容易に夾雑タンパク質を不溶性画分として容易に除去できる。したがって、精製に際して、その精製度を向上させることができ、信頼性の高い酵素を製造できるという利点がある。
【００２３】
（３）ｐＨ安定性
本発明の耐熱性カタラーゼは、ｐＨ安定性に優れる酵素であることが好ましい。
本発明の耐熱性カタラーゼは、ｐＨ３．０〜４．０の５０ｍＭの酢酸緩衝液、ｐＨ５．０〜８．０の５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ９．０〜１０．０のグリシン−ＮａＯＨ緩衝液の各緩衝液中での室温で２０分間の処理に対して、ｐＨ６．０〜１０では、実質的に活性が低下しないことが好ましい。更に好ましくは、ｐＨ１１程度まで活性を保持でき、特に好ましくはｐＨ１２程度まで活性を保持できる。また、上記と同条件のｐＨ５での処理によって４０％以上、ｐＨ４での処理によって２０％程度の活性が残存することが好ましい。
【００２４】
本発明の耐熱性カタラーゼは、耐熱性に加え、耐酸性が高く、また、広範なｐＨにおいて安定性が高いことから、更に様々な産業分野における過酸化水素の分解を要する技術に適用できる。
【００２５】
（４）由来
本発明の耐熱性カタラーゼの由来は、好熱性菌である。好ましくは、好熱好酸性菌である。ここで、好熱性菌とは、一般に５５℃以上の高温環境下で生育する細菌である。特に、７５℃までの温度で生育する細菌を中等度好熱性菌と、７５℃以上で生育する細菌を高度好熱性菌と、また、９０℃以上で生育する細菌は超好熱性菌と分類される。本発明においては、いずれをも含むが、特には高度好熱性菌、および超好熱性菌を意味する。好熱性菌は、温泉、熱水域、深海熱水鉱床、工場排水等の人工的熱水環境等から多種分類されている。また、ここで、好熱好酸性菌とは、上記好熱性菌の性質に加え、低いｐＨ、一般には至適ｐＨがｐＨ５以下、特にはｐＨ３以下で生育可能な細菌である。そして、好熱好酸性菌は、高温酸性温泉、火山の硫気噴気口、海底の熱水噴気口付近等より分離されている。特には、箱根、伊豆等の高温かつ酸性の温泉に生息する細菌であることが好ましい。
【００２６】
つまり、本発明の耐熱性カタラーゼの産生菌は、極端な高温条件、好ましくは高温酸性条件に耐え得る生化学資質を有する細菌である。一般に、高温条件、並びに酸性条件下では、生化学反応の調節の乱れやタンパク質の変性を生じる。しかし、例えば、高温下で生育及び増殖ができる細菌由来の各生体成分は、かかる細菌の増殖率が最大限度である温度付近で最適に機能するよう適合させられていることが知られている。更には、耐熱性に加えて、変性剤、つまりコソルベント、化学修飾、極端なｐＨ等に対して、本質的に抵抗力があるとされている。そのため、本発明で利用される好熱性菌、好熱好酸性菌のような極限状態で生育できる細菌は、新しい産業的な生物変換処理技術の開発を許容することができるものとして期待されている。
【００２７】
ここで、本発明の耐熱性カタラーゼ産生菌の具体的な一例として、Sulfolobaceae族に属する細菌、好ましくは、Metallosphaera属に属する細菌が挙げられる。特には、Metallosphaera hakonensisが好ましい。
【００２８】
（５）分子量
本発明の耐熱性カタラーゼは、そのアミノ酸組成の違いにより異なる分子量を有していてもよいが、好ましくは、約３３〜３５ｋＤａの分子量を有する。
【００２９】
（６）マンガン型カタラーゼ
本発明の耐熱性カタラーゼは、所謂、マンガン型カタラーゼであると考えられる。そのため、下記実施例１０に示す通り、本発明の耐熱性カタラーゼは、アジ化ナトリウム等、活性部位に位置する鉄イオンに結合することでタンパク質の活性を阻害する様式で作用する阻害剤によっては、その活性が阻害されない。カタラーゼの多くは、その活性部位においてプロトポルフィリンＩＸ−鉄錯体を補欠分子族として有する、所謂「ヘム型カタラーゼ」である。しかしながら、プロトポルフィリンＩＸ−鉄錯体の代わりにマンガンイオンをその触媒機構に利用するカタラーゼが知られている。そして、「ヘム型カタラーゼ」と区別して「マンガン型カタラーゼ」と称される。このような、マンガン型カタラーゼとして、現在までに、Lactobacillus plantarum、Thermoleophilum album、及びThermus thermophilus HB8等の数種類程度が知れているのみである。また、これらの細菌の至適生育条件は、Lactobacillus plantarumは、３４．０℃、ｐＨ７．５であり、Thermoleophilum albumは、５５℃、ｐＨ７．５、及びThermus thermophilus HB8は、７５℃、ｐＨ７．５である。即ち、これらは、中温性、若しくは好熱性の好中性菌である。したがって、本発明の耐熱性カタラーゼの好適産生菌である好熱好酸性菌由来のマンガン型カタラーゼは、現在までには報告されていない。
【００３０】
上記性質に関しては、下記で詳細に説明する実施例で検討した大腸菌にて発現させた結果に基づくものである。最近の研究によって好熱性菌由来の遺伝子の一部が大腸菌では十分に発現できないことが報告されている。その要因の一つとしては、発現した遺伝子産物が正しい高次構造を形成できないことが考えられている。かかる不具合を回避する手段しては、例えば、好適な好熱性菌の宿主・ベクター系を構築することが考案され、これにより好熱性菌由来の遺伝子を高発現できるものと期待されている。
【００３１】
したがって、本発明の耐熱性カタラーゼに関しても、正しい高次構造に再構築することが可能な宿主・ベクター系を構築することにより、更に熱安定性、並びに酸安定性を向上できる。つまり、好熱好酸性菌が高温、かつ酸性条件で生育かつ増殖できるのは、かかる菌体を構成する各生体高分子が、それぞれ耐熱、かつ耐酸性であるとするのが一般的である。つまり、好熱性菌のように高温下で生育できる菌体由来の各生体成分は、かかる菌体の成長率が最大限度を示す温度付近で最適に機能するように適合させられる。したがって、更に好適な宿主・ベクター系を構築することにより、由来する細菌がもつ性質である耐熱、耐酸性を十分に発揮できることが期待される。
【００３２】
（本発明の耐熱性カタラーゼのアミノ酸配列）
また、本発明の耐熱性カタラーゼとして、これに限定されるものではないが、配列認識番号２のアミノ酸配列を含むものが好適に例示される。更に、耐熱性カタラーゼの性質を保持している限り、配列認識番号２のアミノ酸配列において、特定のアミノ酸に改変が生じている改変部位を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。なお、本発明の耐熱性カタラーゼは広範なｐＨ環境下において安定性を示し、特に酸性条件下においても活性を保持できることが好ましい。改変とは、改変の基礎となるタンパク質のアミノ酸配列のうち、１または複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および付加の少なくとも１つからなる改変が生じていることを意味する。そして、「１または複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１つからなる改変」とは、改変の基礎となるタンパク質をコードする遺伝子に対する公知のＤＮＡ組換え技術、点変異導入方法等によって、欠失、置換、挿入又は付加することができる程度の数のアミノ酸が、欠失、置換、挿入又は付加されることを意味し、これらの組み合わせをも含む。
【００３３】
このような改変体は自然又は人工の突然変異により生じた突然変異体の中から当該活性を有するタンパク質をスクリーニングすることにより取得できる。或いは、下記で説明する本発明の耐熱性カタラーゼ遺伝子を用いて改変を施すことによっても取得できる、そのような遺伝子に改変を施す方法としては、特に制限はなく、当業者に公知の改変タンパク質作製のための変異導入技術を利用することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ法等を利用して点変異を導入するＰＣＲ突然誘発法、あるいは、トランスポゾン挿入突然変異誘発法などの公知の変異導入技術を利用することができる。市販の変異導入用キット（例えば、QuikChange（登録商標） Site-directed Mutagenesis Kit（Stratagene社製）等を利用してもよい。また、常法のホスホルアミダイト法等のＤＮＡ合成法を利用して、所望の改変を施したカタラーゼ遺伝子を構築することによっても調製することができる。
【００３４】
当業者はアミノ酸配列の改変に際して本発明の耐熱性カタラーゼ活性を保持する改変を容易に予測することができる、具体的には、例えばアミノ酸置換の場合には、タンパク質構造保持の観点から極性、電荷、親水性、若しくは疎水性等の点で置換前のアミノ酸と類似した性質を有するアミノ酸に置換することができる。このような置換は保守的置換として当業者には周知である。また、その後の精製、固相への固定化等の便宜のため、アミノ酸配列のＮ、又はＣ末端にHis-tag、FLAG-tag等を付加したものも好適に例示される。
【００３５】
そして、本発明の耐熱性カタラーゼとして、配列認識番号４のアミノ酸配列からなるものが特に好適に例示される。また、耐熱性カタラーゼの性質を保持している限り、配列認識番号４のアミノ酸配列において、上記のような特定アミノ酸に改変が生じている改変部位を有するものも含まれる。したがって、配列認識番号４のアミノ酸配列のＣ末端側にHis-Tagが付加したものも好適に例示され、配列認識番号６としてそのアミノ酸配列を開示する。このようなTagペプチドの導入は常法により行なうことができる。
【００３６】
本発明の耐熱性カタラーゼのアミノ酸配列が明確になったことから、かかる配列情報に基づいて、本発明のタンパク質を製造することができる。例えば、配列認識番号２、４又は６のアミノ酸配列の一部又は全部をコードする塩基配列を基にして作成したＤＮＡプローブとして用いるハイブリダイゼーション法により、好熱性菌、好ましくは好熱好酸性菌のゲノムＤＮＡから本発明のタンパク質をコードする核酸分子を調製することができる。また、配列認識番号２、４又は６のアミノ酸配列をコードするアミノ酸配列の一部をプライマーとして用いるＰＣＲ法によっても同様に本発明の耐熱性カタラーゼをコードする核酸分子を調製することができる。さらに、常法のホスホルアミダイト法等のＤＮＡ合成法を利用して、本発明の耐熱性カタラーゼをコードする核酸分子を化学的に合成することができる。そして、得られた耐熱性カタラーゼをコードする核酸分子を下記で詳細に説明する遺伝子組換え技術により本発明の耐熱性カタラーゼを製造することができる。
【００３７】
ここで、本発明の耐熱性カタラーゼの製造において、ＰＣＲ法を利用する場合に用いられるプライマーは常法に基づいて調製することができる。プライマーは、ホスホアミダイト法等に基づく化学合成法、既に標的となる核酸が取得されている場合にはその制限酵素断片等が利用可能である。化学合成法に基づきプライマーを調製する場合には、合成に先立って標的核酸の配列情報に基づいて設計される。プライマーの設計は、所望の領域を増幅するように、例えばプライマー設計支援ソフト等を利用して設計することができる。プライマーは合成後、ＨＰＬＣ等の手段により精製される。また、化学合成を行う場合には市販の自動合成装置を利用することも可能である。ここで、相補的とは、プライマーと標的核酸とが塩基対合則に従って特異的に結合し安定な二重鎖構造を形成できることを意味する。ここで、完全な相補性のみならず、プライマーと標的核酸が互いに安定な二重鎖構造を形成し得るのに十分である限り、いくつかの核酸塩基のみが塩基対合則に沿って適合する部分的な相補性であっても許容される。その塩基数は、標的核酸を特異的に認識するために十分に長くなければならないが、長すぎると逆に非特異的反応を誘発するので好ましくない。したがって、適当な長さはＧＣ含量等の標的核酸の配列情報、並びに、反応温度、反応液中の塩濃度等のハイブリダイゼーション反応条件など多くの因子に依存して決定されるが、好ましくは、２０〜５０塩基長である。
【００３８】
更には、本発明の耐熱性カタラーゼは、化学的合成技術によっても製造することができる。例えば、配列認識番号２に示されるアミノ酸配列の全部、又は一部を、ペプチド合成機を用いて合成し、得られるポリペプチドを適当な条件の下で、再構築することにより調製することができる。
【００３９】
（本発明の耐熱性カタラーゼ遺伝子）
本発明の耐熱性カタラーゼ遺伝子は、上記の本発明の耐熱性カタラーゼをコードする遺伝子である。例えば、配列認識番号２に記載されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、一具体例としては、配列認識番号１に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。ここで、本発明におけるポリヌクレオチドにはＤＮＡ及びＲＮＡの双方が含まれ、ＤＮＡである場合には、１本鎖であると、二本鎖であるとは問わない。
【００４０】
更に、上記本発明の耐熱性カタラーゼの性質を保持している限り、配列認識番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むものも本発明に含まれる。このようなポリヌクレオチドは、公知の変異導入技術を利用することにより作製できる。例えば、部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ法等を利用して点変異を導入するＰＣＲ突然誘発法、あるいは、トランスポゾン挿入突然変異誘発法などの公知の変異導入技術を利用することができる。市販の変異導入用キット（例えば、QuikChange（登録商標）Site-directed Mutagenesis Kit（Stratagene社製）等を利用してもよい。また、常法のホスホルアミダイト法等のＤＮＡ合成法を利用して、所望の改変を施したカタラーゼ遺伝子を構築することによって行なうことができる。もしくは、配列認識番号１の塩基配列を有するポリヌクレオチドに対してエキソヌクレアーゼを作用させることによって取得することができる。このようなポリヌクレオチドとしては、配列認識番号１の塩基配列において１または複数の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入されたものも含まれる。
【００４１】
そして、本発明の耐熱性カタラーゼ遺伝子として、配列認識番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドからなるものが特に好適に例示される。また、本発明の耐熱性カタラーゼの性質を保持している限り、上記のような配列認識番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなるものも含まれる。したがって、配列認識番号３の塩基配列の３’、又は５’末端にHis-Tag配列をコードする塩基配列が付加したものも好適に例示される。配列認識番号３の３’末端にHis-Tag配列をコードするポリヌクレオチドが付加したものを、配列認識番号５として示す。このようなTagペプチドをコードするポリヌクレオチドの導入は常法により行なうことができる。
【００４２】
ここで、ストリンジェントな条件とは、塩基配列において、６０％以上、好ましくは７０％、より好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上の同一性を有するＤＮＡがハイブリダイズし得る条件をいう。ストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーションの反応や洗浄の際の塩濃度及び温度を適宜変化させることによって調製することができる。例えば、Molecular Cloning：A Laboratory Manual  第２版（Sambrook他）に記載のサザンハイブリダイゼーションのための条件等が挙げられる。
【００４３】
具体的には、３０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド、０．６Ｍの塩化ナトリウム、０．０４Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、２．５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１％ＳＤＳ中の４２℃にて１６時間のハイブリダイゼーションが挙げられる。ホルムアミド濃度が２０％（ｖ／ｖ）であるときには、３４℃にて１６時間のハイブリダイゼーションが例示される。洗浄条件としては、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の５℃にて５分間の洗浄、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での６５℃にて３０分間〜４時間の洗浄が例示される。
【００４４】
本発明の遺伝子は、実施例１に示す通り、既知のカタラーゼの配列情報から構築されたプライマーを用いて、高度好熱菌、好ましくはM. hakonensisのゲノムＤＮＡをクローニングすることによって取得することができる。また、本発明の遺伝子配列が明確になったことから、かかる配列情報に基づいて、本発明の遺伝子を作成することができる。例えば、配列認識番号１、３又は５に示す塩基配列の一部又は全部の配列を基にして作成したＤＮＡプローブを用いるハイブリダイゼーション法により、好熱性菌、好ましくは好熱好酸性菌のゲノムＤＮＡから本発明のポリヌクレオチドを調製することができる。また、配列認識番号１、３又は５に示す塩基配列の一部をプライマーとして用いるＰＣＲ法によっても同様に本発明の耐熱性カタラーゼをコードする核酸分子を調製することができる。このとき用いられるプライマーの設計、及び調製については上記で説明した方法に準じて行なうことができる。さらに、常法のホスホルアミダイト法等のＤＮＡ合成法を利用して、本発明の耐熱性カタラーゼをコードする核酸分子を化学的に合成することができる。
【００４５】
（本発明の組換えベクター）
そして、本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の遺伝子を組み込むことによって取得することができる。利用可能なベクターとしては、外来ＤＮＡを組み込め、かつ宿主細胞中で自律的に複製可能なものであれば特に制限はない。したがって、ベクターは、本発明の耐熱性カタラーゼ遺伝子を挿入できる少なくとも１つの制限酵素部位の配列を含むものである。例えば、プラスミドベクター（pEX系、pUC系、及びpBR系等）、ファージベクター（λgt10、λgt11、及びλZAP等）、コスミドベクター、ウイルスベクター（ワクシニアウイルス、及びバキュロウイルス等）等が包含される。
【００４６】
そして、本発明の組換えベクターは、本発明の耐熱性カタラーゼ遺伝子がその機能を発現できるように組み込まれてある。したがって、遺伝子の機能に発現に必要な他の公知の塩基配列が含まれていてもよい。例えば、プロモータ配列、リーダー配列、シグナル配列、並びにリボソーム結合配列等が挙げられる。プロモータ配列としては、例えば、宿主が大腸菌の場合にはlacプロモータ、trpプロモータ等が好適に例示される。しかしながら、これに限定するものではなく公知のプロモータ配列を利用できる。更に、本発明の組換えベクターには、宿主において表現型選択を付与することが可能なマーキング配列等をも含ませることができる。このようなマーキング配列としては、薬剤耐性、栄養要求性などの遺伝子をコードする配列等が例示される。具体的には、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子等が例示される。
【００４７】
ベクターへの本発明の耐熱性カタラーゼ遺伝子等の挿入は、例えば、適当な制限酵素で本発明の遺伝子を切断し、適当なベクターの制限酵素部位、又はマルチクローニング部位に挿入して連結する方法などを用いることができるが、これに限定されない。連結に際しては、ＤＮＡリガーゼを用いる方法等、公知の方法を利用できる。また、DNA Ligation Kit（Takara-bio社）等の市販のライゲーションキットを利用することもできる。
【００４８】
（本発明の形質転換体）
本発明の形質転換体は、本発明の耐熱性カタラーゼ遺伝子を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞である。ここで、宿主細胞としては、本発明の耐熱性カタラーゼを効率的に発現できる宿主細胞であれば、特に制限はない。原核生物を好適に利用でき、特には大腸菌を利用することができる。その他、枯草菌、バシラス属細菌、シュードモナス属細菌等をも利用できる。大腸菌としては、例えば、E.coli DH5α、E.coli BL21、E.coli JM109等を利用できる。更に、原核生物に限定されず真核生物細胞を利用することが可能である。例えば、Saccharomyces cerevisiae等の酵母、Sf９細胞等の昆虫細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞等の動物細胞等を利用することも可能である。形質転換法としては、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソームフェクション法、マイクロインジェクション法等を公知の方法を利用することができる。
【００４９】
（本発明の耐熱性カタラーゼの製造方法）
本発明の耐熱性カタラーゼの製造方法は、上記本発明の形質転換体を培養し、得られた培養物から耐熱性カタラーゼ活性を有するタンパク質を採取することにより行なう。即ち、上記本発明の形質転換体を培養する培養工程と、前記培養工程で発現した前記タンパク質を回収する回収工程とを備える。このように、適当な宿主で発現させることによって、低コストで本発明の耐熱性カタラーゼの大量生産が可能となる。
【００５０】
培養工程は、本発明の形質転換体を適当な培地に接種し、常法に準じて培養することにより行なわれる。本発明の形質転換体の培養は、宿主細胞の栄養生理学的性質を勘案して、培養条件を選択すればよい。使用される培地としては、宿主細胞が資化し得る栄養素を含み、形質転換体におけるタンパク質の発現を効率的に行えるものであれば特に制限はない。したがって、宿主細胞の生育に必要な炭素源、窒素源その他必須の栄養素を含む培地であることが好ましく、天然培地、合成培地の別を問わない。例えば、炭素源として、グルコース、デキストラン、デンプン等が、また、窒素源としては、アンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、ペプトン、カゼイン等が挙げられる。他の栄養素としては、所望により、無機塩類、ビタミン類、抗生物質等とを含ませることができる。宿主細胞が大腸菌の場合には、ＬＢ培地、Ｍ９培地等が好適利用できる。また、培養形態についても特に制限はないが、大量培養の観点から液体培地が好適に利用できる。
【００５１】
特に、宿主細胞が大腸菌の場合には、本発明の耐熱性カタラーゼの安定した活性発現のため、塩化マンガンを添加することが好ましい。このとき、添加量は下記実施例にて示す通り、１ｍＭ以上とすることが安定した活性発現の観点から好ましい。また、５ｍＭ以上となると塩化マンガンが大腸菌の生育を阻害するため１〜５ｍＭの範囲とすることが特に好ましい。かかる塩化マンガン量は、従来公知の大腸菌培養用培地に含まれる塩化マンガン量の約１０〜５０倍である。
【００５２】
本発明の組換えベクターを保持する宿主細胞の選別は、例えば、マーキング配列の発現の有無により行なうことができる。例えば、マーキング配列として薬剤耐性遺伝子を利用する場合には、薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤含有培地で培養することによって行うことができる。
【００５３】
精製工程は、上記で培養工程において得られた形質転換体の培養物からの本発明の耐熱性カタラーゼを回収、即ち、単離精製することによって行えばよい。本発明の耐熱性カタラーゼの存在する画分に応じて、一般的なタンパク質の単離精製方法に準じた手法を適用すればよい。具体的には、本発明の耐熱性カタラーゼが宿主細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離、濾過等の手段により宿主細胞を除去して培養上清を得る。続いて、培養上清に、公知のタンパク質精製方法を適宜選択することにより、本発明の耐熱性カタラーゼを単離精製することができる。例えば、硫酸アンモニウム沈殿、透析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動、ゲル濾過、疎水、陰イオン、陽イオン、アフィニティークロマトグラフィ等の各種クロマトグラフィ等の公知の単離精製技術を単独、又は適宜組み合わせて適用することができる。また、本発明の耐熱性カタラーゼが宿主細胞内で産生される場合には、培養物を遠心分離、濾過等の手段により宿主細胞を回収する。続いて、リゾチーム処理などの酵素的破砕方法、又は超音波処理、凍結融解、浸透圧ショック等の物理的破砕方法等により、宿主細胞を破砕する。破砕後、遠心分離、濾過等の手段により可溶化画分を収集する。得られた可溶化画分を、上記の細胞外に生産できる場合と同様に処理することにより単離精製することができる。ここで、本発明で得られるカタラーゼは、熱安定性が高いことから、上記単離、精製工程において熱処理を併用することが有用かつ便利である。培養物から得られた宿主細胞及び培養上清には、当該宿主細胞由来の様々なタンパク質を含有する。しかし、熱処理を行なうことにより、宿主細胞由来の夾雑タンパク質は変性し凝縮沈殿する。これに対して、本発明の耐熱性カタラーゼは、耐熱性を有するため変性を生じないことから、遠心分離等により宿主由来の夾雑タンパク質と容易に分離できる。また、培養液をそのまま、若しくは粗抽出液を使用する場合においても、熱処理を行なうことにより、他のタンパク質が失活することから、実質的に本発明の耐熱性カタラーゼのみの酵素液として使用することができる。また、本発明の耐熱性カタラーゼは、耐熱性に加え、広範なｐＨ安定性を示すことから、精製過程においてｐＨ処理を行なうことも熱処理と同様有効である。したがって、本発明の耐熱性カタラーゼを遺伝子工学的手法により製造する場合においても、宿主由来のその他のタンパク質を容易に除去することができる。したがって、精製度を向上させることができ、信頼性の高い酵素を製造できるという利点がある。
【００５４】
単離精製されたタンパク質の性能確認は、カタラーゼ活性を測定することにより行なうことができる。カタラーゼ活性を測定する方法は公知の方法のいずれをも利用することができる。例えば、過酸化水素の分解に起因する過酸化水素の減少を光学的に測定する方法、過酸化水素の分解により生じる酸素の生成量を酸素電極で測定する方法、反応後の残留過酸化水素を滴定する方法、過酸化水素の分解に伴う生成熱を測定する方法等が挙げられる。しかし、これらに限定されるものではない。
【００５５】
（過酸化水素の分解方法）
本発明の過酸化水素の分解方法は、本発明の耐熱性カタラーゼを、過酸化水素に接触させることにより行なわれる。即ち、過酸化水素を含む試料に、本発明の耐熱性カタラーゼを接触させる工程を備えて構成される。カタラーゼは過酸化水素を分解して無害な酸素と水を産生する性質を有する。更に、本発明の耐熱性カタラーゼは、特に高温、好ましくは広範囲なｐＨにおいて極めて安定に活性を示すという特徴を有している。そのため、食品、その他の産業分野において、残留過酸化水素の分解に極めて有効である。特には、高温、若しくは高温酸性条件下での適用に特に有用である。
【００５６】
ここで、試料として、過酸化水素が、殺菌剤、漂白剤、洗浄剤等として利用した後の排水等が例示される。このような排水は、例えば、繊維染色、食品加工、紙パルプ、および電子機器部品等に関連する産業分野で排出される。具体的には、繊維、紙パルプ等の漂白剤として、また、半導体ウェハ等の洗浄剤として過酸化水素を用いた場合の処理後の排水等が例示される。
【００５７】
また、本発明の過酸化水素の分解方法は、燃料電池の正極において副生する過酸化水素の分解除去にも好適に利用できる。正極側において副生する過酸化水素は、燃料電池の性能低下の要因となることが知られている。かかる過酸化水素の除去技術が求められている。しかしながら、燃料電池の正極における、温度が８０〜９０℃、また、ｐＨが４〜５と、高温かつ酸性下で持続した分解活性を示すことができる酵素の存在が知られていなかった。本発明により、熱安定が高く、また酸性条件下においても安定な活性を示すことができるカタラーゼが提供できた。これにより、燃料電池の正極側における過酸化水素の分解を持続的に行なうことが可能となり、燃料電池の性能向上を図れる。ここで、燃料電池への適用形態としては、燃料電池の正極側に送液ポンプなどにより注入する等、が好ましく例示される。
【００５８】
また、本発明の耐熱性カタラーゼを有効成分として含有する過酸化水素の分解剤として提供することができる。そして、過酸化水素の分解剤として、種々の形態で、例えば凍結乾燥剤として、または適切な保存溶液中の液剤として提供することができる。また、適当な担体に固定化した形態で提供することができる。固定化の方法は、当業者に公知の方法を利用できる。例えば、共有結合、イオン結合および物理的吸着による担体結合法、架橋法、包括法等その形態は問わない。具体的には、ＤＥＡＥセルロース、シリカ、酸化チタン吸着による担体結合、グルタルアルデヒドによる架橋、光触媒性樹脂プレポリマーによる包括等が挙げられる。
【実施例】
【００５９】
〔実施例１〕
カタラーゼ遺伝子のクローニング
Metallosphaera hakonensis（以下、「M.hakonensis」と略する場合がある。)のゲノムＤＮＡからカタラーゼをコードする遺伝子をクローニングするための検討を行った。
【００６０】
（方法）
クローニングは、M.hakonensis（ATCC Number：51241）から常法により調製したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ増幅することにより行なった。
【００６１】
反応液（５０μＬ）は、鋳型ＤＮＡであるM.hakonensisのゲノムＤＮＡを１０ｎｇ、TthRecAタンパク質を０．８μｇ、プライマーセットを各０．５μＭ（最終濃度）、ＤＮＡポリメラーゼを２.５unit、ｄＮＴＰ混合液を０．２ｍＭ（最終濃度）を、１ｘＰＣＲ反応緩衝液（Applied-Biosystems社製）に混合することにより調製した。
【００６２】
本実施例においては、ＤＮＡポリメラーゼとして、Tth DNA polymerase（Applied-Biosystems社製）を使用した。
【００６３】
また、本実施例で使用したTthRecAタンパク質は、Masui R, Mikawa T, Kato R, Kuramitsu S.著、Characterization of the oligomeric states of RecA protein: monomeric RecA protein can form a nucleoprotein filament.,  Biochemistry.、１９９８年１０月２０日、第３７巻、第４２号、第１４７８８〜１４７９７頁の記載を参照して本発明の発明者らが調製したものを用いた。
【００６４】
ここで、使用したプライマーセットとしては、カタラーゼ遺伝子のクローニングに適したプライマーセットを見出すため、３種類のプライマーセットを比較検討した。詳細には、本実施例で使用したプライマーセットは以下の通りである。プライマーセットは、既知のカタラーゼのアミノ酸配列の保存領域における配列情報を基に構築されたものである。なかでも、プライマーセットＣは、高度好熱菌であるThermus thermophilus（以下、「T.thermophilus」と略する場合がある。）由来の既知のカタラーゼのアミノ酸配列の配列情報に基づいて構築されたものである。
【００６５】
プライマーセットＡ
混合プライマーＡ１
５‘−gagcatatgttYctUagRat−３’  （配列認識番号７）
混合プライマーＡ２
５’−ctaaagcttaYttUgcYttYtc−３’  （配列認識番号８）
【００６６】
プライマーセットＢ
混合プライマーＢ１
５’−gagcatatgttYttRagRat−３’  （配列認識番号９）
混合プライマーＢ２
５’−ctaggatccaYttUgcYttYtc−３’  （配列認識番号１０）
【００６７】
プライマーセットＣ
プライマーＣ１
５’−gagcatatgttcctgagga−３’  （配列認識番号１１）
プライマーＣ２
５’−ctaaagcttacttggccttct−３’  （配列認識番号１２）
【００６８】
なお、混合塩基の国際表記法は以下の通りである。
Ｂ＝ｃ＋ｇ＋ｔ；  Ｄ＝ａ＋ｇ＋ｔ；  Ｈ＝ａ＋ｃ＋ｔ；  
Ｉ＝ｄＩ(イノシン)；  Ｋ＝ｇ＋ｔ；  Ｍ＝ａ＋ｃ；
Ｎ＝ａ＋ｃ＋ｇ＋ｔ；  Ｒ＝ａ＋ｇ；  Ｓ＝ｃ＋ｇ；  Ｕ＝ｄＵ(ウラシル)；
Ｖ＝ａ＋ｃ＋ｇ；  Ｗ＝ａ＋ｔ；  Ｙ＝ｃ＋ｔ
【００６９】
ここで、反応液中に、プライマーセットＡを混合したものをサンプル１と、プライマーセットＢを混合したものをサンプル２と、プライマーセットＣを混合したものをサンプル３と称する。
【００７０】
上記サンプル１〜３を同一の条件下でＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ増幅産物を得た。ＰＣＲ反応は、９４℃にて３０秒の熱変性の後、９４℃にて１０秒、５５℃にて３０秒、６８℃にて６０秒の反応を１サイクルとした４０サイクルの増幅反応後、６８℃にて３分の１サイクルの最終反応によって行った。
【００７１】
増幅後、各増幅反応液を１．２％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後のゲルをエチジウムブロミドで染色し、ＤＮＡのバンドを可視化した。
【００７２】
また同様に、Thermus aquaticus（以下、「T.aquaticus」と略する場合がある。）のゲノムＤＮＡからカタラーゼをコードする遺伝子のクローニングについても検討を行った。かかる検討は、上記手順において、M.hakonensisのゲノムＤＮＡに代えて、T.aquaticus（ATCC Number: 25104）から常法により調製したゲノムＤＮＡを用いたこと以外は、同様にサンプルを調製した。ここで、反応液中に、プライマーセットＡを混合したものをサンプル４と、プライマーセットＢを混合したものをサンプル５と、プライマーセットＣを混合したものをサンプル６と称する。サンプル調製後、上記手順に従って、ＰＣＲ反応を行なった後、電気泳動に供した。
【００７３】
（結果）
結果を図１に示す。図１中、レーン１〜６は、夫々、サンプル１〜６に対応する。
即ち、図１中、レーン１〜３は、M.hakonensisのゲノムＤＮＡからのカタラーゼ遺伝子のクローニング結果を示す。そして、レーン１はプライマーセットＡ、レーン２はプライマーセットＢ、レーン３はプライマーセットＣでの増幅結果を示す。
図１中、レーン４〜６は、T.aquaticusのゲノムＤＮＡからのカタラーゼ遺伝子のクローニング結果を示す。そして、レーン１はプライマーセットＡ、レーン２はプライマーセットＢ、レーン３はプライマーセットＣでの増幅結果を示す。
なお、図１中、レーンＭはＤＮＡサイズマーカー（Lambda DNA BstP I digest：Takara-bio社製）の電気泳動結果を示す。
【００７４】
図１の結果から、M.hakonensisゲノムＤＮＡから、プライマーセットＡの使用によりカタラーゼをコードすると思われる増幅産物が取得できることが確認された（レーン１）。一方、T.aquaticusに関しては、プライマーセットＣの使用によりカタラーゼをコードすると思われる増幅産物が取得できることが確認された（レーン６）。
【００７５】
プライマーセットＣは上述した通り、既知のT.thermophilusカタラーゼのアミノ酸配列の配列情報に基づいて構築されたものである。しかしながら、M.hakonensisのゲノムＤＮＡからは、プライマーセットＣによる増幅産物は確認できなかった（レーン３）。してみると、M.hakonensisのゲノムＤＮＡからプライマーセットＡを用いて取得された増幅産物が、既知のT.thermophilusカタラーゼとは異なる塩基配列を有する新規なカタラーゼをコードするものである可能性があることが示唆される。
【００７６】
〔実施例２〕
塩基配列決定並びにアミノ酸配列の推定
実施例１で取得したカタラーゼをコードすると思われる遺伝子の塩基配列の決定を行なった。また、得られた塩基配列の配列情報に基づいて、アミノ酸配列を推定した。
【００７７】
（方法）
実施例１で取得したM.hakonensisのゲノムＤＮＡからカタラーゼをコードすると思われる遺伝子の塩基配列の決定を行なった。詳細には、実施例１で取得したM.hakonensisのゲノムＤＮＡからの遺伝子断片（プライマーセットＡによる増幅断片、即ち、実施例１のサンプル１）を、プラスミドＤＮＡであるpGEM-T Easy Vector（Promega社製)に、pGEM-T Easy Vector System（Promega社製）を用いて製造業者の指示に従ってクローニングを行なった。クローニング後、反応液を大腸菌JM109株に形質転換し、形質転換体から調製したプラスミドＤＮＡを鋳型として塩基配列の決定を行なった。塩基配列の決定は、BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit V3.1（Applied-Biosystems社製）を用いて、製造業者の指示に従って、サイクルシーケンシング反応を実行した。このとき、シーケンシングプライマーとしては、SP6 Promoter primer（Promega社製）、並びにT7 Promoter primer（Promega社製）を使用した。反応後、反応液の全量をＤＮＡ蛍光シーケンサー（ABI PRISM 377, Applied-Biosystems社製）に供して、塩基配列を決定した。
【００７８】
また、実施例１で取得したT.aquaticusのゲノムＤＮＡからの遺伝子断片（プライマーセットＣによる増幅断片、即ち、実施例１のサンプル６）について同様にして塩基配列の決定を行なった。
【００７９】
（結果）
結果を図２に示す。
図２は、実施例１で取得されたM.hakonensisカタラーゼをコードすると思われる遺伝子の塩基配列（配列認識番号３）を示す。また、かかる塩基配列に基づく推定アミノ酸配列（配列認識番号４）を下段に提示する。
図３は、実施例１で取得されたT.aquaticusカタラーゼをコードすると思われる遺伝子の塩基配列（配列認識番号１３）を示す。また、かかる塩基配列に基づく推定アミノ酸配列（配列認識番号１４）を下段に提示する。
【００８０】
なお、アミノ酸配列の下線部は、GENETYX-Winプログラムで予想された推定シグナルペプチド配列を示す。
【００８１】
〔実施例３〕
相同性検索
実施例２にて判明したM.hakonensisカタラーゼをコードすると思われる推定アミノ酸配列と、公知の高度好熱性菌であるPyrobaculum calidifontis、Thermoleophilum album、Thermus brockianus及びThermus thermophilus由来の既知のカタラーゼのアミノ酸配列のアラインメントを行なった。
【００８２】
結果を図４に示す。
図４中、（＊）は、アライメントを行なった５種類全てのアミノ酸残基が同じ箇所を示す。
図４中、（・）は、アライメントを行なった５種類のうち、３、又は４種類のアミノ酸残基が同じ箇所を示す。
【００８３】
図４の結果より、実施例１で取得されたM.hakonensisカタラーゼをコードすると思われる遺伝子の推定アミノ配列は、既知のカタラーゼと類似性を有することが判明した。したがって、実施例１で取得されたM.hakonensisカタラーゼをコードすると思われる遺伝子は、カタラーゼをコードする遺伝子であることが強く示唆された。一方で、既知のカタラーゼとは異なる塩基配列を有することから、新規なカタラーゼをコードする遺伝子であることも判明した。また、５種類のカタラーゼが同一性を示す領域は、マンガン結合部位などの、マンガン型カタラーゼの酵素活性に重要な領域であることが予想される。
【００８４】
〔実施例４〕
組換えカタラーゼの製造方法の検討−１
大腸菌を宿主細胞として用いて、組換えカタラーゼの発現系を構築すると共に、大腸菌からの精製手法についての検討を行った。なお、本実施例においては、大腸菌からの精製手法中における、熱処理、及び酸処理の有効性に関して検討を行った。
【００８５】
（方法）
上記実施例１で取得されたM.hakonensisカタラーゼ遺伝子のＰＣＲ増幅産物（プライマーセットＡによる増幅断片、即ち、実施例１のサンプル１）を精製した。精製には、ＤＮＡ  purification kit（ＧＥ社製）を用いた。精製後、制限酵素Nde I−Hind IIIで切断してＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を、制限酵素Nde I−Hind IIIで切断されたプラスミドＤＮＡ(pET22b：Novagen社製)に連結した。連結に際して、DNA Ligation Kit（Takara-bio社製）を用いた。連結後、大腸菌、E.coli BL21（DE3）を形質転換して形質転換体を作成した。
【００８６】
上記で得られたM.hakonensisカタラーゼ遺伝子を保持する形質転換体を、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン、及び１ｍＭの塩化マンガンを含む１０ｍＬのＬＢ液体培地中で培養した。培養後の培養液０．１ｍｌを分取し、１ｍＭの塩化マンガン、及び３０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む１００ｍＬのＬＢ液体培地に接種し、ＯＤ６００＝０．６に達するまで培養した。なお、培養条件は、大腸菌の一般的な培養条件に従って行なった。次に、プラスミドの発現量を高めるため、１．０ｍＭのＩＰＴＧを添加して更に４時間培養した。培養後、５０００×ｇにて５分間の遠心分離にて菌体を集菌し、２０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８．０）で洗浄後、再度、遠心分離にて菌体を集菌し、菌体を液体窒素で凍結させた。菌体を、５０ｍＬの緩衝液−Ａに溶解させた後、２０００unitのLysozyme solution（Novagen社製）、及び１２５０unitのBenzonase nuclease（Novagen社製）を添加した。続いて、４℃にて６０分間反応させた後に超音波破砕処理にて菌体を破砕して菌体破砕処理液を得た。前記菌体破砕処理液を、等量のタンパク可溶化液（１２５ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ６．８）、４％  ＳＤＳ、５％  メルカプトエタノール、２０％  グリセロール、０．０１％  ブロモフェノールブルー）と混合した。以下、サンプルＩ−１と称する。
【００８７】
混合後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５〜２０％、e-PAGEL、ATTO社製  E-T520L）にて電気泳動した。電気泳動後、クマシーブリリアントブルー（以下、ＣＢＢと略する）染色によりタンパク質を可視化することにより組換えタンパク質の発現確認を行なった。
【００８８】
また、大腸菌からの精製方法を検討するため、以下のサンプルをも調製した。
上記で得られた細胞破砕処理液を４０００×ｇにて４℃で３０分間の遠心分離を行ない、上澄み液を収集した。以下、サンプルＩ−２と称する。
【００８９】
上記で得られた細胞破砕処理液に対して、６８℃で１０分間の熱処理を行なった。続いて、０℃に急冷却した後、４０００×ｇにて４℃で３０分間の遠心分離を行ない、上澄み液を収集した。以下、サンプルＩ−３と称する。
【００９０】
上記で得られた細胞破砕処理液に対して、緩衝液−Ｂ、緩衝液−Ｃの順で透析を行なった。透析後、１００ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ３．０）にて酸処理を行なった後、４０００×ｇにて４℃で３０分間の遠心分離を行ない、上澄み液を収集した。以下、サンプルＩ−４と称する。
【００９１】
上記で得られたサンプルＩ−２〜４をサンプルＩ−１と同様の手順に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、組換えタンパク質の発現確認を行なった。
【００９２】
ここで、使用した緩衝液の組成は以下の通りである。
緩衝液−Ａ：
５０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５)、５ｍＭ  Ｂ−メルカプトエタノール、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ
緩衝液−Ｂ：
５０ｍＭ  トリス−塩酸、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  ＤＴＴ
緩衝液−Ｃ：
５０ｍＭ  トリス−塩酸、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  ＤＴＴ、５０％  グリセロール
【００９３】
また、上記手順に従って、T.aquaticusカタラーゼ遺伝子を保持する形質転換体を調製した後、上記と同様のサンプルを調製した。以下、サンプルＩＩ−１〜４と称する。なお、形質転換体の調製は、M.hakonensisカタラーゼ遺伝子のＰＣＲ増幅産物に代えて、上記実施例１で取得されたT.aquaticusカタラーゼ遺伝子のＰＣＲ増幅産物（プライマーセットＣによる増幅断片、即ち、実施例１のサンプル３）を用いた以外は、上記と同様に行なった。そして、上記手順に従って、サンプルＩＩ−１〜４を電気泳動に供した。
【００９４】
そして、上記M.hakonensisカタラーゼ遺伝子を保持する形質転換体からのサンプル調製において、６８℃にて１０分間の熱処理に代えて、５５℃にて１０分間の熱処理を行なったサンプルを調製した。以下、サンプルＩＩＩ−１〜４と称する。上記手順に従って、サンプルＩＩＩ−１〜４を電気泳動に供した。
【００９５】
更に、上記T.aquaticusカタラーゼ遺伝子を保持する形質転換体からのサンプル調製において、６８℃にて１０分間の熱処理に代えて、５５℃にて１０分間の熱処理を行なったサンプルを調製した。以下、サンプルＩＶ−１〜４と称する。上記手順に従って、サンプルＩＶ−１〜４を電気泳動に供した。
【００９６】
更に、His-tagが付加されたM.hakonensisカタラーゼ遺伝子を保持する形質転換体を調製した。プラスミドＤＮＡとしてpET22bに代えて、ｐET28a（Novagen社製）を用いた以外は、上記と同様に調製した。
（結果）
結果を図５に示す。
図５（Ａ）中、レーン１〜４は、夫々、サンプルＩ−１〜４に対応する。即ち、M.hakonensisカタラーゼ遺伝子を保持する形質転換体からのカタラーゼの製造を検討した結果であり、熱処理を、６８℃にて１０分間の条件下にて行なったサンプルである。
詳細には、図５（Ａ）中、レーン１は、サンプルＩ−１（超音波破砕処理＋蛋白可溶化処理）の電気泳動結果を示す。
図５（Ａ）中、レーン２は、サンプルＩ−２（超音波破砕処理＋遠心分離）の電気泳動結果を示す。
図５（Ａ）中、レーン３は、サンプルＩ−３（超音波破砕処理＋熱処理＋遠心分離）の電気泳動結果を示す。
図５（Ａ）中、レーン４は、サンプルＩ−４（超音波破砕処理＋透析＋酸処理＋遠心分離）の電気泳動結果を示す。
【００９７】
図５（Ｂ）中、レーン１〜４は、夫々、サンプルＩＩ−１〜４に対応する。即ち、T.aquaticusカタラーゼ遺伝子を保持する形質転換体からのカタラーゼの製造を検討した結果であり、熱処理を、６８℃にて１０分間の条件下にて行なったサンプルである。
詳細には、図５（Ｂ）中、レーン１は、サンプルＩＩ−１（超音波破砕処理＋蛋白可溶化処理）の電気泳動結果を示す。
図５（Ｂ）中、レーン２は、サンプルＩＩ−２（超音波破砕処理＋遠心分離）の電気泳動結果を示す。
図５（Ｂ）中、レーン３は、サンプルＩＩ−３（超音波破砕処理＋熱処理＋遠心分離）の電気泳動結果を示す。
図５（Ｂ）中、レーン４は、サンプルＩＩ−４（超音波破砕処理＋透析＋酸処理＋遠心分離）の電気泳動結果を示す。
【００９８】
図５（Ｃ）中、レーン１〜４は、夫々、サンプルＩ−１〜４に対応する。即ち、M.hakonensisカタラーゼ遺伝子を保持する形質転換体からのカタラーゼの製造を検討した結果であり、熱処理を、５５℃にて１０分間の条件下にて行なったサンプルである。
詳細には、図５（Ｃ）中、レーン１は、サンプルＩＩＩ−１（超音波破砕処理＋蛋白可溶化処理）の電気泳動結果を示す。
図５（Ｃ）中、レーン２は、サンプルＩＩＩ−２（超音波破砕処理＋遠心分離）の電気泳動結果を示す。
図５（Ｃ）中、レーン３は、サンプルＩＩＩ−３（超音波破砕処理＋熱処理＋遠心分離）の電気泳動結果を示す。
図５（Ｃ）中、レーン４は、サンプルＩＩＩ−４（超音波破砕処理＋透析＋酸処理＋遠心分離）の電気泳動結果を示す。
【００９９】
図５（Ｄ）中、レーン１〜４は、夫々、サンプルＩＶ−１〜４に対応する。即ち、T.aquaticusカタラーゼ遺伝子を保持する形質転換体からのカタラーゼの製造を検討した結果であり、熱処理を、５５℃にて１０分間の条件下にて行なったサンプルである。
詳細には、図５（Ｄ）中、レーン１は、サンプルＩＶ−１（超音波破砕処理＋蛋白可溶化処理）の電気泳動結果を示す。
図５（Ｄ）中、レーン２は、サンプルＩＶ−２（超音波破砕処理＋遠心分離）の電気泳動結果を示す。
図５（Ｄ）中、レーン３は、サンプルＩＶ−３（超音波破砕処理＋熱処理＋遠心分離）の電気泳動結果を示す。
図５（Ｄ）中、レーン４は、サンプルＩＶ−４（超音波破砕処理＋透析＋酸処理＋遠心分離）の電気泳動結果を示す。
【０１００】
また、図５中、レーンＭはタンパクサイズマーカー（Pre-stained protein marker：NEN社製）の電気泳動結果を示す。
【０１０１】
図５の結果より、M.hakonensisカタラーゼが大腸菌を宿主として発現できることが確認された（図５（Ａ）及び図５（Ｃ））。さらに、精製過程において熱処理を施すことにより精製度が向上することが確認された（図５（Ａ）レーン１及び２と、レーン３の比較、並びに図５（Ｃ）レーン１及び２と、レーン３の比較）。また、より温度の高い６８℃での処理を行なう方が、低い温度の熱処理に比べて精製度が向上することが確認された（図５（Ａ）レーン３と図５（Ｃ）レーン３の比較）。以上の結果から、大腸菌を宿主細胞として発現させたM.hakonensisカタラーゼは、７０℃付近まで安定な分子構造を有するタンパク質であることが判明した。したがって、宿主細胞である大腸菌由来のタンパク質は変性し凝縮することから、精製過程において熱処理を施すことにより、M.hakonensisカタラーゼを粗精製可能であることが判明した。
【０１０２】
また、図５の結果より、T.aquaticusカタラーゼが大腸菌を宿主として発現できることが確認された（図５（Ｂ）及び図５（Ｄ））。しかしながら、精製過程において熱処理を施すことによってタンパク質のバンドが消失することが確認された（図５（Ｂ）レーン１及び２と、レーン３の比較、並びに図５（Ｄ）レーン１及び２と、レーン３の比較）。以上の結果から、大腸菌を宿主細胞として発現させたT.aquaticus カタラーゼは、熱に対して不安定な分子構造を有するタンパク質であることが判明した。したがって、T.aquaticusカタラーゼについては、熱処理による精製が適用できないことが判明した。
【０１０３】
〔実施例５〕
組換えカタラーゼの製造方法の検討−２
実施例４に続いて、更に、大腸菌を宿主細胞として用いて、組換えカタラーゼの発現系を構築すると共に、大腸菌からの精製手法についての検討を行った。なお、本実施例においては、宿主細胞である大腸菌の培養培地に含まれる塩化マンガン濃度に関して検討を行った。
【０１０４】
（方法）
本実施例において、宿主細胞である大腸菌の培養培地に含まれる塩化マンガン濃度の、カタラーゼの発現量、及び熱安定に与える影響に関して検討を行った。ここで、検討した塩化マンガン濃度は０．１ｍＭ、及び１ｍＭである。
【０１０５】
詳細には、実施例４のサンプルＩ−１〜３の調製において、M.hakonensisカタラーゼ遺伝子を保持する形質転換体を、塩化マンガン添加量を１０ｍＭに代えて、０．１ｍＭとした以外は同様にしてサンプルを調製した。以下、サンプルＶ−１〜３と称する。
【０１０６】
実施例４のサンプルＩＩ−１〜３の調製において、T.aquaticusカタラーゼ遺伝子を保持する形質転換体を、塩化マンガン添加量を１０ｍＭに代えて、０．１ｍＭとした以外は同様にしてサンプルを調製した。以下、サンプルＶＩ−１〜３と称する。
【０１０７】
実施例４のサンプルＩＩＩ−１〜３の調製において、M.hakonensisカタラーゼ遺伝子を保持する形質転換体を、塩化マンガン添加量を１０ｍＭに代えて、１ｍＭとした以外は同様にしてサンプルを調製した。以下、サンプルＶＩＩ−１〜３と称する。
【０１０８】
実施例４のサンプルＩＶ−１〜３の調製において、T.aquaticusカタラーゼ遺伝子を保持する形質転換体を、塩化マンガン添加量を１０ｍＭに代えて、１ｍＭとした以外は同様にしてサンプルを調製した。以下、サンプルＶＩＩＩ−１〜４と称する。
【０１０９】
サンプル調製後、実施例４の手順に従って、上記サンプルＶ−１〜３、ＶＩ−１〜３、ＶＩＩ−１〜３並びにＶＩＩＩ−１〜３を電気泳動に供した。
【０１１０】
（結果）
結果を図６に示す。
図６（Ａ）中、レーン１〜３は、夫々、サンプルＶ−１〜３に対応する。即ち、M.hakonensisカタラーゼ遺伝子を保持する形質転換体からのカタラーゼの製造を検討した結果であり、培養を０．１ｍＭ濃度の塩化マンガンの存在下で行なったサンプルである。
詳細には、図６（Ａ）中、レーン１は、サンプルＶ−１（超音波破砕処理＋蛋白可溶化処理）の電気泳動結果を示す。
図６（Ａ）中、レーン２は、サンプルＶ−２（超音波破砕処理＋遠心分離）の電気泳動結果を示す。
図６（Ａ）中、レーン３は、サンプルＶ−３（超音波破砕処理＋熱処理＋遠心分離）の電気泳動結果を示す。
【０１１１】
図６（Ａ）中、レーン４〜６は、夫々、サンプルＶＩ−１〜３に対応する。即ち、T.aquaticusカタラーゼ遺伝子を保持する形質転換体からのカタラーゼの製造を検討した結果であり、培養を０．１ｍＭ濃度の塩化マンガンの存在下で行なったサンプルである。
詳細には、図６（Ａ）中、レーン４は、サンプルＶＩ−１（超音波破砕処理＋蛋白可溶化処理）の電気泳動結果を示す。
図６（Ａ）中、レーン５は、サンプルＶＩ−２（超音波破砕処理＋遠心分離）の電気泳動結果を示す。
図６（Ａ）中、レーン６は、サンプルＶＩ−３（超音波破砕処理＋熱処理＋遠心分離）の電気泳動結果を示す。
【０１１２】
図６（Ｂ）中、レーン１〜３は、夫々、サンプルＶＩＩ−１〜３に対応する。即ち、M.hakonensisカタラーゼ遺伝子を保持する形質転換体からのカタラーゼの製造を検討した結果であり、培養を１ｍＭ濃度の塩化マンガンの存在下で行なったサンプルである。
詳細には、図６（Ｂ）中、レーン１は、サンプルＶＩＩ−１（超音波破砕処理＋蛋白可溶化処理）の電気泳動結果を示す。
図６（Ｂ）中、レーン２は、サンプルＶＩＩ−２（超音波破砕処理＋遠心分離）の電気泳動結果を示す。
図６（Ｂ）中、レーン３は、サンプルＶＩＩ−３（超音波破砕処理＋熱処理＋遠心分離）の電気泳動結果を示す。
【０１１３】
図６（Ｂ）中、レーン４〜６は、夫々、サンプルＶＩＩＩ−１〜３に対応する。即ち、T.aquaticusカタラーゼ遺伝子を保持する形質転換体からのカタラーゼの製造を検討した結果であり、培養を１ｍＭ濃度の塩化マンガンの存在下で行なったサンプルである。
詳細には、図６（Ｂ）中、レーン４は、サンプルＶＩＩＩ−１（超音波破砕処理＋蛋白可溶化処理）の電気泳動結果を示す。
図６（Ｂ）中、レーン５は、サンプルＶＩＩＩ−２（超音波破砕処理＋遠心分離）の電気泳動結果を示す。
図６（Ｂ）中、レーン６は、サンプルＶＩＩＩ−３（超音波破砕処理＋熱処理＋遠心分離）の電気泳動結果を示す。
【０１１４】
なお、図６（Ａ）、及び図６（Ｂ）中、レーンＭはタンパクサイズマーカー（Pre-stained protein marker：NEN社製）の電気泳動結果を示す。
【０１１５】
M.hakonensisカタラーゼ遺伝子を保持する形質転換体を０．１ｍＭ、１ｍＭの塩化マンガンを含有する培地で培養した場合に取得された組換えタンパク質は、いずれも熱処理に対して安定であることが確認された（図６（Ａ）レーン１及び２と、レーン３の比較、図６（Ｂ）レーン１及び２と、レーン３の比較）。したがって、大腸菌で発現させたM.hakonensisカタラーゼは、上述の実施例４の結果と併せて、塩化マグネシウムの有無に係わらず、熱に対して安定であることが判明した。
【０１１６】
一方、T.aquaticusカタラーゼ遺伝子を保持する形質転換体を０．１ｍＭ、１ｍＭの塩化マンガンを含有する培地で培養した場合に取得された組換えタンパク質は、いずれも熱処理に対して不安定であることが確認された（図６（Ａ）レーン４及び５と、レーン６の比較、図６（Ｂ）レーン４及び５と、レーン６の比較）。したがって、大腸菌で発現させたT.aquaticusカタラーゼは、塩化マグネシウムの有無に係わらず、熱に対して不安定なタンパク質であることが判明した。
【０１１７】
〔実施例６〕
組換えカタラーゼの製造方法の検討−３
大腸菌を宿主細胞として用いて、組換えカタラーゼの発現系を構築すると共に、大腸菌からの精製手法についての検討を行った。本実施例においては、異なる塩化マンガン濃度で形質転換体を培養することにより製造した組換えカタラーゼについてカタラーゼ活性の測定を行い、塩化マンガン濃度が組換えカタラーゼの活性に与える影響を検討した。
【０１１８】
（方法）
上記実施例５において調製された組換えカタラーゼの活性を測定することにより、培養時における塩化マンガン濃度の活性に与える影響を検討した。ここで、検討したサンプルは、実施例５で調製したサンプルＶ−３、ＶＩ−３、ＶＩＩ−３、及びＶＩＩＩ−３である。
【０１１９】
即ち、サンプルＶ−３、及びＶＩＩ−３は、M.hakonensisカタラーゼ遺伝子を保持する形質転換体からカタラーゼの製造を行ったサンプルである。そして、サンプルＶ−３は、形質転換体の培養を０．１ｍＭ濃度の塩化マンガンの存在下で、サンプルＶＩＩ−３は、１ｍＭ濃度の塩化マンガンの存在下で行ったサンプルである。
【０１２０】
そして、サンプルＶＩ−３、及びＶＩＩＩ−３は、T.aquaticusカタラーゼ遺伝子を保持する形質転換体からカタラーゼの製造を行ったサンプルである。そして、サンプルＶＩ−３は、形質転換体の培養を０．１ｍＭ濃度の塩化マンガンの存在下で、サンプルＶＩＩＩ−３は、１ｍＭ濃度の塩化マンガンの存在下で行ったサンプルである。
【０１２１】
ここでは、カタラーゼ活性の測定は、サンプル中の過酸化水素濃度の減少を波長２４０ｎｍの吸光度を測定することによって求め、カタラーゼ活性とした。
詳細には、０．１％過酸化水素と、上記で取得したカタラーゼサンプル１００μＬとを、５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に混合し、６０℃にて３０分間反応させた。反応後、過酸化水素濃度を波長２４０ｎｍの吸光度で測定し、過酸化水素の分解量を求めてカタラーゼ活性とした。そして、サンプルＶＩＩ−３（即ち、形質転換体：M.hakonensisカタラーゼ、塩化マンガン濃度：０．１ｍＭ）による過酸化水素の分解量を１００％として、各サンプルについて相対活性を算出した。
【０１２２】
（結果）
結果を図７に示す。
０．１ｍＭの塩化マンガンを含む培地で培養したM.hakonensisカタラーゼ遺伝子を保持する大腸菌から調製した組換えカタラーゼは、カタラーゼ活性を示さなかった（サンプルＶ−３）。一方、１ｍＭの塩化マンガンを含む培地で培養した大腸菌から調製したカタラーゼは、高いカタラーゼ活性を示した（サンプルＶＩＩ−３）。
以上の結果より、０〜０．１ｍＭの塩化マンガン濃度下での培養では、活性の有するカタラーゼが取得できないことが判明した。一方、１ｍＭ以上の塩化マンガン濃度下での培養においては、高い活性の有するカタラーゼが取得できることが判明した。したがって、実施例４、及び５の結果とも併せて、１ｍＭ以上の塩化マンガン濃度での培養によって、熱安定性が高く、かつ、活性の高い組換えカタラーゼを製造できることが判明した。
【０１２３】
一方、T.aquaticusカタラーゼ遺伝子を保持する大腸菌から調製した組換えカタラーゼは、いずれの塩化マグネシウム濃度下でも、カタラーゼ活性が認められなかった（サンプルＶＩ−３、及びサンプルＶＩＩＩ−３）。以上の結果より、T.aquaticusカタラーゼ遺伝子からのカタラーゼの製造は、塩化マンガンの有無に係わらず、熱によってその分子構造は変性し、活性を維持することができないことが判明した。
【０１２４】
〔実施例７〕
組換えカタラーゼの活性確認−１
M.hakonensisカタラーゼのｐＨ安定性を検討した。
【０１２５】
（方法）
ｐＨ３．０、４．０、５．０、６．０、８．０、９．０、及び１０．０の各ｐＨ条件下におけるカタラーゼ活性を測定することにより、M.hakonensisカタラーゼのｐＨ安定性を検討した。M.hakonensisカタラーゼとしては、上記実施例５で調製したサンプルＶＩＩ−３を用い、原液を１００倍希釈して用いた。即ち、M.hakonensisカタラーゼ遺伝子を保持する形質転換体を１ｍＭの塩化マンガン存在下で培養した後、菌体の超音波破砕処理、熱処理、及び遠心分離によってカタラーゼを精製単離したサンプルを用いた。
【０１２６】
ここで、各ｐＨ環境を調製するための緩衝液は以下の通り調製した。
ｐＨ３．０、及び４．０の各緩衝液は、５０ｍＭの酢酸緩衝液にて調製し、所望のｐＨ条件に調整した。
ｐＨ５．０、６．０、７．０、及び８．０の各緩衝液は、５０ｍＭのリン酸緩衝液にて調製し、所望のｐＨ条件に調整した。
ｐＨ９．０、及び１０．０の各緩衝液は、５０ｍＭのグリシン−ＮａＯＨ緩衝液にて調製し、所望のｐＨ条件に調整した。
【０１２７】
ここで、カタラーゼ活性の測定は、実施例６と同様に行なった。詳細には、０．１％過酸化水素を含む各ｐＨ緩衝液２００μＬのサンプルと、１μｇのM.hakonensisカタラーゼを含む各ｐＨ緩衝液２００μＬのサンプルを調製した。調製後の各サンプルを、室温で２０分間放置した後に等量混合した。混合後、過酸化水素濃度を波長２４０ｎｍの吸光度で測定し、過酸化水素の分解量を求めた。そして、ｐＨ８．０での過酸化水素の分解量を１００％とした、各処理ｐＨについての処理後の相対活性を算出した。
【０１２８】
（結果）
結果を図８に示す。
ｐＨ５．０においても、ｐＨ８．０における約４０％のカタラーゼ活性を保持できることが確認された。また、ＰＨ４．０においても約２０％のカタラーゼ活性を残存していることが確認された。以上の結果より、酸性条件下においても、本発明のカタラーゼは、その活性を残存できることが判明した。また、アルカリ性条件下においても、ｐＨ９．０〜１０．０においてもカタラーゼ活性を実質的に保持できることが確認された。また、ｐＨ１１．０、若しくはｐＨ１２．０付近まで活性を維持できることが推測される。
【０１２９】
以上の結果より、本発明のカタラーゼは広範なｐＨ領域でその活性を安定的して発揮できる産業上利用価値の高い酵素であることが判明した。
【０１３０】
〔実施例８〕
組換えカタラーゼの活性確認
M.hakonensisカタラーゼの熱安定性を更に検討した。
【０１３１】
（方法）
３０、４０、５０、６０、７０、８０、及び９０℃の各温度条件下におけるカタラーゼ活性を測定することにより、M.hakonensisカタラーゼの熱安定性を検討した。ここで、M.hakonensisカタラーゼとしては、実施例７で活性測定に用いたのと同じサンプル、即ち、実施例５で調製したサンプルＶＩＩ−３を用いた。
【０１３２】
カタラーゼ活性の測定は、上記実施例６と同様に行なった。詳細には、０．１％過酸化水素を含む２００μＬの５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）のサンプルと、１μｇのM.hakonensisカタラーゼを含む２００μＬの１００μＬの５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）のサンプルを調製した。調製後の各サンプルを、３０〜９０℃の各温度で２０分間保温した後に等量混合した。混合後、過酸化水素濃度の減少を波長２４０ｎｍの吸光度で測定し、過酸化水素の分解量を求めた。次いで、３０℃での過酸化水素の分解量を１００％とした、各処理温度についての熱処理後の相対活性を算出した。
【０１３３】
（結果）
結果を図９に示す。
３０℃〜６０℃においては、M.hakonensisカタラーゼは、ほぼ１００％の活性を保持できることが確認できた。また、７０℃においても、５０％のカタラーゼ活性を残存できることが確認でき、８０〜９０℃においても２０〜３０％程度の活性を残存できることが確認できた。以上の結果より、本発明で製造されたM.hakonensisカタラーゼは、高温条件下においても安定してその活性を発揮できる熱安定性に優れた酵素であることが判明した。
【０１３４】
以上の結果、及び上記実施例４、５、及び６の結果とも併せて、本発明で製造されたM.hakonensisカタラーゼは耐熱耐酸性を有し、広範な産業分野において利用価値の高い酵素であることが理解される。
【０１３５】
〔実施例９〕
組換えカタラーゼの活性確認−３
実施例８に続いて、M.hakonensisカタラーゼの熱安定性を更に検討した。
【０１３６】
（方法）
６０、７０、８０、９０℃の各温度条件下におけるカタラーゼ活性を測定することにより、M.hakonensisカタラーゼの熱安定性を検討した。ここで、M.hakonensisカタラーゼとしては、実施例７、及び８で活性測定に用いたのと同じサンプル、即ち、実施例５で調製したサンプルＶＩＩ−３を用いた。
【０１３７】
カタラーゼ活性の測定は、以下の通り行った。実施例５で調製したサンプルＶＩＩ−３を１００μＬの５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に混合した。混合後、６０〜９０℃の各温度で０〜５０分間インキュベートした後、更に６０℃で３０分間反応させた。反応後、過酸化水素濃度の減少を波長２４０ｎｍの吸光度で測定し、過酸化水素の分解量を求めた。次いで、インキュベーション０時間でのサンプルにおけるカタラーゼの過酸化水素の分解量を１００％とした各処理温度における熱処理後のサンプルの相対活性を算出した。
【０１３８】
（結果）
結果を図１０に示す。
１ｍＭの塩化マンガンを含む培地で培養した大腸菌から調製したM.hakonensisカタラーゼは、８０℃までの熱処理に対して安定した活性を示すことが確認された。詳細には、６０℃までの熱処理に対しては、M.hakonensisカタラーゼ活性の実質的な低下は確認されなかった。また、７０℃にて５０分間の熱処理に対しては、M.hakonensisカタラーゼ活性は６０％以上の活性を、８０℃にて５０分間の熱処理に対しても、M.hakonensisカタラーゼ活性は２０％以上の活性を保持できることが確認された。
【０１３９】
以上の結果、及び上記実施例４、５、６、及び８の結果とも併せて、本発明で製造されたM.hakonensisカタラーゼは耐熱性を有し、広範な産業分野において利用価値の高い酵素であることが理解される。
【０１４０】
〔実施例１０〕
組換えカタラーゼの活性確認−４
カタラーゼ阻害剤として知られているアジ化ナトリウムによって、その活性が影響されるかどうかを検討することにより、M.hakonensisカタラーゼの反応機構の解明を行なった。
【０１４１】
（方法）
カタラーゼ阻害剤であるアジ化ナトリウム存在下におけるM.hakonensisカタラーゼの活性に与える影響を検討した。M.hakonensisカタラーゼとしては、実施例７、８、及び９で活性測定に用いたのと同じサンプル、即ち、実施例５で調製したサンプルＶＩＩ−３を用いた。
【０１４２】
カタラーゼ阻害剤としては、アジ化ナトリウムを使用した。アジ化ナトリウムは、強力なカタラーゼ阻害剤であり、カタラーゼの活性部位における鉄イオンと結合することによってカタラーゼ活性を阻害する。かかる作用機構により、所謂、ヘム型カタラーゼの活性を阻害する。一方で、所謂、マンガン型カタラーゼの活性を阻害することはできないことが知られている。
【０１４３】
アジ化ナトリウムとの接触、及びカタラーゼ活性の測定は、以下の通り行った。実施例５で調製したサンプルＶＩＩ−３を１０％過酸化水素及び０〜５０ｍＭのアジ化ナトリウムを含む１００μＬの５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に混合した後、６０℃にて３０分間反応させた。反応後、過酸化水素濃度の減少を波長２４０ｎｍの吸光度で測定し、過酸化水素の分解量を求めた。次いで、アジ化ナトリウム不在下でのサンプルにおけるカタラーゼの過酸化水素の分解量を１００％とした、アジ化ナトリウム処理後サンプルにおける相対活性を算出した。
【０１４４】
コントロールとして、ヘム型カタラーゼであるマウス肝臓抽出カタラーゼ調製液（SIGMA社製）についても上記と同様に活性の測定を行なった。
【０１４５】
（結果）
結果を図１１に示す。
本発明により製造されたM.hakonensisカタラーゼは、アジ化ナトリウムによっては、その酵素活性が影響されなかった。
一方、コントロールとして用いたマウス肝臓抽出カタラーゼ調製液は、アジ化ナトリウムによってその酵素活性が阻害された。
以上の結果より、本発明のM.hakonensisカタラーゼがヘム型カタラーゼではなく、マンガン型カタラーゼであろうことが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】M.hakonensisカタラーゼ遺伝子のクローニングを検討した実施例１の結果を示す電気泳動図
【図２】M.hakonensisカタラーゼ遺伝子の塩基配列と、その推定アミノ酸配列を示す配列データ
【図３】T.aquaticusカタラーゼ遺伝子の塩基配列と、その推定アミノ酸配列を示す配列データ
【図４】M.hakonensisカタラーゼと、既知の高度好熱菌カタラーゼのアミノ酸配列のアラインメント図
【図５】（Ａ）  組換えM.hakonensisカタラーゼの製造及び精製方法（熱処理：６８℃）を検討した実施例４の結果を示す電気泳動図、（Ｂ）  組換えT.aquaticusカタラーゼの製造及び精製方法（熱処理：６８℃）を検討した実施例４の結果を示す電気泳動図、（Ｃ）  組換えM.hakonensisカタラーゼの製造及び精製方法（熱処理：５５℃）を検討した実施例４の結果を示す電気泳動図、（Ｄ）  組換えT.aquaticusカタラーゼの製造及び精製方法（熱処理：５５℃）を検討した実施例４の結果を示す電気泳動図
【図６】（Ａ）  組換えM.hakonensisカタラーゼ、及び組換えT.aquaticusカタラーゼの製造及び精製方法（塩化マンガン濃度：０．１ｍＭ）を検討した実施例５の結果を示す電気泳動図、（Ｂ）  組換えM.hakonensisカタラーゼ、及び組換えT.aquaticusカタラーゼの製造及び精製方法（塩化マンガン濃度：１ｍＭ）を検討した実施例５の結果を示す電気泳動図
【図７】組換えM.hakonensisカタラーゼ、及び組換えT.aquaticusカタラーゼの活性確認（塩化マンガン濃度：０．１、１ｍＭ）を行なった実施例６の結果を示すグラフ
【図８】M.hakonensisカタラーゼの活性確認（ｐＨ安定性の検討）を検討した実施例７の結果を示すグラフ
【図９】M.hakonensisカタラーゼの活性確認（熱安定性）を検討した実施例８の結果を示すグラフ
【図１０】M.hakonensisカタラーゼの活性確認（熱安定性）を検討した実施例９の結果を示すグラフ
【図１１】M.hakonensisカタラーゼの活性確認（アジ化ナトリウムへの耐性）を検討した実施例１０の結果を示すグラフ
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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