(57)【要約】  【課題】表皮におけるヒアルロン酸量を増大させるという効果、ひいては角層においてもヒアルロン酸の産生促進の効果を示し、また肌荒れやしわの発生を防ぐ効果の実効性を有し、安全性及び使用感に優れた皮膚外用剤、化粧料、医薬部外品、肌荒れ改善剤、しわ改善剤として使用されるヒアルロン酸産生促進剤を提供することを課題とする。  【解決手段】ヒアルロン酸産生促進剤に、アスパラガス抽出物、又はブッチャーブルーム抽出物の少なくとも１種を含有させたことを特徴とする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスパラガス抽出物、又はブッチャーブルーム抽出物の少なくとも１種を含有することを特徴とするヒアルロン酸産生促進剤。
【請求項２】
請求項１記載のヒアルロン酸産生促進剤を配合したことを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項３】
請求項１記載のヒアルロン酸産生促進剤を配合したことを特徴とする化粧料。
【請求項４】
請求項１記載のヒアルロン酸産生促進剤を配合したことを特徴とする医薬部外品。
【請求項５】
請求項１記載のヒアルロン酸産生促進剤を配合したことを特徴とする肌荒れ改善剤。
【請求項６】
請求項１記載のヒアルロン酸産生促進剤を配合したことを特徴とするしわ改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸産生促進剤、さらに詳しくは、表皮におけるヒアルロン酸の合成を促進し、ひいては角層でのヒアルロン酸産生量を増大させることで角層の水分量を増やし、角層の硬度を最適にすることによって、荒れ肌、しわの予防および改善が期待される、製剤中で安定なヒアルロン酸産生促進剤、及びそのようなヒアルロン酸産生促進剤を配合した皮膚外用剤、化粧料、医薬部外品、肌荒れ改善剤、しわ改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、皮膚、靱帯、関節液等、生体に広く分布し、たとえば皮膚においては細胞の保護、栄養の運搬、組織水分の保持、柔軟性の維持等に重要な役割を果たしている。このため、ヒアルロン酸は、化粧料等の分野において従来から代表的な保湿剤として使用されている。
【０００３】
このような保湿剤として使用は、従来では皮膚に直接塗布する等によって行われていたが、このように塗布するのみでは、洗浄等によって効果が持続しないおそれがあり、またヒアルロン酸は本来皮膚から吸収され易いものではなく、いずれにしても十分な効果が期待できないものである。
【０００４】
そこで、このような点に鑑みて下記特許文献１のような特許出願がなされている。この特許文献１に係る発明は、明細書の［０００４］にも記載されているように、ヒアルロン酸を外部から単に補給するのではなく、生体の自己回復力を利用し、細胞自身のヒアルロン酸合成能を促進することによって生体の機能を根本的に改善することを意図してなされたものである。
【０００５】
ところで、このようなヒアルロン酸合成促進剤としては、従来では数多くのものが存在するが、一般には下記特許文献２に示すように、皮膚内の線維芽細胞に作用するもの、つまり真皮におけるヒアルロン酸の合成を促進するものがほとんどである。
【０００６】
これに対して、上記特許文献１の［０００５］には、「ヒアルロン酸が表皮基底細胞、線維芽細胞、滑膜細胞などで作られ、中でも表皮基底細胞で合成されるヒアルロン酸は、保水性の向上、細胞の保護、栄養の補給等に関与することにより、皮膚を健康に保ち、張りや色つやを良くし、きめを細かくするのに重要な役割を担っている」ことが開示されている。すなわち、真皮よりも表皮で合成されたヒアルロン酸の重要性が示唆されている。
【０００７】
しかし、上記特許文献１では、表皮基底細胞におけるヒアルロン酸の合成促進効果が必ずしも試験等によって十分に裏付けられているわけではない。
【０００８】
【特許文献１】特開平９−１７６０３６号公報
【特許文献２】特開平１１−３３５２３４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明はこのような点に鑑みてなされたもので、表皮におけるヒアルロン酸量を増大させるという効果、ひいては角層においてもヒアルロン酸の産生促進の効果を示し、また肌荒れやしわの発生を防ぐ効果の実効性を有し、安全性及び使用感に優れた皮膚外用剤、化粧料、医薬部外品、肌荒れ改善剤、しわ改善剤として使用されるヒアルロン酸産生促進剤を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
角層は皮膚の最も外側に位置し、表皮細胞が分化して角層細胞となった死細胞が層状に堆積した構造体である。また、角層での水分量は角層の柔軟性や外的刺激に対するバリア機能において重要な役割をし、荒れ肌やしわの形成に関与していることが知られている。本発明者等は、このような点に鑑み、上記従来の問題点を改良せんとして鋭意研究を重ねた結果、アスパラガス抽出物、及びブッチャーブルーム抽出物に表皮、特に角層中のヒアルロン酸の産生を促進させ、角層中のヒアルロン酸量を増大させる作用があり、それによって肌荒れやしわを改善しうることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、請求項１記載の発明は、ヒアルロン酸産生促進剤に、アスパラガス抽出物、又はブッチャーブルーム抽出物の少なくとも１種を含有させたことである。ここで「アスパラガス抽出物、又はブッチャーブルーム抽出物の少なくとも１種を含有する」とは、ヒアルロン酸産生促進剤がアスパラガス抽出物若しくはブッチャーズブルーム抽出物のみからなる場合、又はこれら双方の抽出物からなる場合の他、アスパラガス抽出物又はブッチャーブルーム抽出物以外の成分を含んでいてもよいことを意味する。
【００１２】
また請求項２記載の発明は、請求項１記載のヒアルロン酸産生促進剤を配合したことを特徴とする皮膚外用剤の発明である。さらに請求項３記載の発明は、請求項１記載のヒアルロン酸産生促進剤を配合したことを特徴とする化粧料の発明である。
【００１３】
さらに請求項４記載の発明は、請求項１記載のヒアルロン酸産生促進剤を配合したことを特徴とする医薬部外品の発明である。さらに請求項５記載の発明は、請求項１記載のヒアルロン酸産生促進剤を配合したことを特徴とする肌荒れ改善剤の発明である。さらに請求項６記載の発明は、請求項１記載のヒアルロン酸産生促進剤を配合したことを特徴とするしわ改善剤の発明である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のアスパラガス抽出物、ブッチャーブルーム抽出物を含有するヒアルロン酸産生促進剤は、表皮、特に角層でのヒアルロン酸合成を有意に促進し、肌荒れ改善作用、皮膚のバリア機能改善作用およびしわ改善作用を有することが確認された。従って、本発明のヒアルロン酸産生促進剤が配合された組成物は、肌荒れを改善し、皮膚バリア機能を高め、しわを改善する優れた皮膚化粧料、医薬部外品、あるいは皮膚外用剤として好適に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤は、上述のようにアスパラガス抽出物、又はブッチャーブルーム抽出物の少なくとも１種を含有したものである。本発明で用いる抽出物とは、アスパラガス又はブッチャーブルームの全草又はそれらの葉、茎、根、果実、種子および花のうち１又は２以上の箇所を乾燥し、又は乾燥することなく粉砕した後、低温又は室温ないし加温下に溶媒により抽出するか、又はソックスレー抽出器などの抽出器具を用いて抽出することにより得られる各種溶媒抽出液、その希釈液、その濃縮液、或いはその乾燥末等を意味するものである。
【００１６】
抽出材料となる各植物の部位は特に限定されるものではないが、アスパラガス（Asparagus officinalis Linneユリ科、別名：ショウビャクブ（小百部）、オランダキジカクシ）は茎、ブッチャーブルーム（Ruscus aculeatus L. ユリ科、別名：ナギイカダ）は根茎を、それぞれ抽出材料として用いることが好ましい。
【００１７】
抽出に用いる溶媒としては、通常の抽出に用いられる溶媒であれば任意に用いることができる。例えば水、メタノール、エタノールなどの低級１価アルコール、グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の液状多価アルコール、含水アルコール類等の１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。好ましい抽出方法の例としては、含水濃度２０〜８０容量％のエタノール又は１，３−ブチレングリコールを用い、室温にて１〜５日間抽出を行ったのち、濾過する方法が挙げられる。
【００１８】
本発明の皮膚外用剤、化粧料、医薬部外品、肌荒れ改善剤、しわ改善剤中のアスパラガス抽出物、ブッチャーブルーム抽出物等の各ヒアルロン酸産生促進剤の配合量は特に限定されるものではないが、乾燥固形物重量（複数の抽出物を含む場合はその合計量）で、総量を基準として０．０００１〜２０．０重量％であることが好ましい。配合量が０．０００１重量％未満であると、本発明の効果が充分に得られず、一方２０．０重量％を超えても、その増量に見合った効果の向上は認められないからである。この観点からは、０．０００５〜５．０重量％であることがより好ましい。
【００１９】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤は、皮膚外用剤として、たとえばローション類、乳液類、クリーム類、軟膏類、パック類、ファンデーション等の剤型とすることができる。本発明のヒアルロン酸産生促進剤には、形態に応じ、色素、防腐剤、界面活性剤、香料、顔料等を適宜配合することができる。
【実施例】
【００２０】
以下、本発明の実施例について説明する。
（実施例１）
本実施例は、アスパラガス抽出物を含有したヒアルロン酸産生促進剤の実施例である。アスパラガス抽出物の調製は次のようにして行う。すなわち、先ずアスパラガスの茎を乾燥して細かく砕いたもの１０ｇに、含水濃度５０容量％エタノール１００ｍLを加える。次に、室温（２０〜３０℃程度の温度）にて５日間抽出を行った後、濾過することによって、アスパラガス抽出物を得た。このとき、乾燥固形物量は、１．６１重量％であった。
【００２１】
（実施例２）
本実施例は、ブッチャーブルーム抽出物を含有したヒアルロン酸産生促進剤の実施例である。ブッチャーブルームの全草を乾燥して細かく砕いたもの１０ｇに、含水濃度５０容量％エタノール１００ｍLを加え、室温にて５日間抽出を行った後、濾過し、ブッチャーブルーム抽出物を得た。乾燥固形物量は、１．５７重量％であった。
【００２２】
（試験例１）
本試験例は、正常ヒト新生児包皮皮膚表皮角化細胞（ＮＨＥＫ、クラボウ）を用いたヒアルロン酸産生促進作用試験である。
【００２３】
正常ヒト新生児包皮皮膚表皮角化細胞（ＮＨＥＫ、クラボウ）を用い、ＮＨＥＫの培養には、ＮＨＥＫ培養用基礎培地（ＫＢ？２、クラボウ）をベースとし、ハイドロコーチゾン (０．５μｍｏｌ／ｍL)、インシュリン（５μｇ／ｍL）、ＥＧＦ（上皮細胞成長因子:１０ｎｇ／ｍL）、ＢＰＥ(牛脳下垂体抽出液)、及び抗生物質からなる添加剤セット（クラボウ）を添加し、表皮細胞培養用培地（ＫＧ？２）を用いた。
【００２４】
２４ｗｅｌｌ組織培養用プレート（ＩＷＡＫＩ社製）の各ｗｅｌｌに、５×１０-4（ｃｅｌｌ／ｍL）の細胞数でＫＧ−２に懸濁したＮＨＥＫを１ｍＬ播種した。培養は、９５％（v／v）空気−５％（v／v）炭酸ガスの雰囲気下３７℃で行い、培養３日目に実施例１のアスパラガス抽出物（アスパラガス抽出液）を添加し、さらに２４時間培養後の培養上清をサンプルとして、ＥＬＩＳＡ法にてヒアルロン酸（ＨＡ）量を測定した。
【００２５】
培養上清中のヒアルロン酸量の測定は、次のような方法で行った。すなわち、ヒアルロン酸固相化マイクロプレートに各培養上清（５０μL）を分注し、これにビオチン標識したヒアルロン酸結合タンパク質溶液（５０μL）を加えて１分間震盪混和後、３７℃で６０分間静置した。６０分間静置後、プレート内の溶液を除去した後、０．０２％のツイーン２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（４００μL）で３回洗浄した。
【００２６】
これにパーオキシダーゼ標識ストレプトアビジン溶液（１００μL）を分注した後、３７℃で６０分間静置した。６０分間静置後、プレート内の溶液を除去した後、０．０２％のツイーン２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（４００μL）で５回洗浄した。これに酵素基質溶液（１００μL）を分注した後、アルミホイルで遮光し、常温（１５〜２５℃）で３０分間静置した。これに反応停止液（１００μL）を添加した後、４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００２７】
また、ヒアルロン酸量の測定と同時に細胞数をカウントし、細胞あたりのヒアルロン酸量として評価し、試料を添加していない時の細胞あたりのヒアルロン酸量を１００とした値で表した。尚、このようなヒアルロン酸量の測定は、アスパラガス抽出物の濃度
（容量％）を変えて行った。具体的には、試験容器中での最終濃度がそれぞれ０．１容量％、０．２５容量％、又は０．５容量％となるよう、それぞれアスパラガス抽出物を添加した。その結果を表１に示す。
【００２８】
【表１】
2007262012.tif 000002
【００２９】
表１からも明らかなように、アスパラガス抽出物を添加しないＮＨＥＫの培養上清中のヒアルロン酸量を１００とすると、アスパラガス抽出物を添加したときの培養上清中のヒアルロン酸量は、アスパラガス抽出物濃度が０．１容量％の場合に１０５、０．２５容量％の場合に１１６、０．５容量％の場合に１３１と、アスパラガス抽出物の添加濃度に依存して表皮細胞からのヒアルロン酸の産生量が増加した。このことから、アスパラガス抽出物に、表皮細胞におけるヒアルロン酸の産生促進効果があり、また抽出物の濃度を高めることによって産生促進効果が高くなることがわかった。
【００３０】
（試験例２）
実施例２のブッチャーブルーム抽出物（ブッチャーブルーム抽出液）からなるヒアルロン酸産生促進剤を対象として、上記試験例１と同様にしてＮＨＥＫを用いたヒアルロン酸産生促進試験を行った。アスパラガス抽出物をブッチャーブルーム抽出物に変えたこと以外は、すべて同じ操作で試験を行った。その結果を表２に示す。
【００３１】
【表２】
2007262012.tif 000003
表２からも明らかなように、ブッチャーブルーム抽出物を添加しないＮＨＥＫの培養上清中のヒアルロン酸量を１００とすると、ブッチャーブルーム抽出物を添加したときの培養上清中のヒアルロン酸量は、ブッチャーブルーム抽出物濃度が０．１容量％の場合に１０２、０．２５容量％の場合に１１３、０．５容量％の場合に１１８と、ブッチャーブルーム抽出物の添加濃度に依存して表皮細胞からのヒアルロン酸の産生量が増加した。このことから、ブッチャーブルーム抽出物に、表皮細胞におけるヒアルロン酸の産生促進効果があり、また抽出物の濃度を高めることによって産生促進効果が高くなることがわかった。
【００３２】
（試験例３）
本試験例は、正常ヒト新生児包皮皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ、クラボウ）を用いたヒアルロン酸産生促進作用試験である。
【００３３】
ＮＨＤＦの培養には、５０容量％の牛胎児血清（ICN製）、１容量％の非必須アミノ酸溶液、１００ｕｎｉｔ／ｍLのペニシリンおよび１００μｇ／ｍLのストレプトマイシンを添加したdulbecco's MEM（SIGMA製）培地を使用した。
【００３４】
２４ｗｅｌｌ組織培養用プレート（ＩＷＡＫＩ製）の各ｗｅｌｌに、５×１０-4（ｃｅｌｌ／ｍL）の細胞数で懸濁したＮＨＤＦを１ｍLずつ播種した。培養は、９５％（v／v）空気−５％（v／v）炭酸ガスの雰囲気下３７℃で行い、培養３日目に上記試験例１と同様の各濃度のアスパラガス抽出物を添加し、さらに２４時間培養後の培養上清をサンプルとして、ＥＬＩＳＡ法にてヒアルロン酸（ＨＡ）量を測定した。
【００３５】
培養上清中のヒアルロン酸量の測定は、次のような方法で行った。すなわち、ヒアルロン酸固相化マイクロプレートに各培養上清（５０μL）を分注し、これにビオチン標識したヒアルロン酸結合タンパク質溶液（５０μL）を加えて１分間震盪混和後、３７℃で６０分間静置した。６０分間静置後、プレート内の溶液を除去した後、０．０２％のツイーン２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（４００μL）で３回洗浄した。
【００３６】
これにパーオキシダーゼ標識ストレプトアビジン溶液（１００μL）を分注した後、３７℃で６０分間静置した。６０分間静置後、プレート内の溶液を除去した後、０．０２％のツイーン２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（４００μL）で５回洗浄した。これに酵素基質溶液（１００μL）を分注した後、アルミホイルで遮光し、常温（１５〜２５℃）で３０分間静置した。これに反応停止液（１００μL）を添加した後、４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００３７】
また、ヒアルロン酸量の測定と同時に細胞数をカウントし、細胞あたりのヒアルロン酸量として評価し、試料を添加していない時の細胞あたりのヒアルロン酸量を１００とした値で表した。尚、各抽出物は上記試験例１と同様、試験容器中に最終濃度０．１容量％、０．２５容量％、又は０．５容量％となるようそれぞれ添加した。その結果を表３に示す。
【００３８】
【表３】
2007262012.tif 000004
【００３９】
表３からも明らかなように、アスパラガス抽出物を添加しないＮＨＤＦの培養上清中のヒアルロン酸量を１００とすると、アスパラガス抽出物を添加したときの培養上清中のヒアルロン酸量は、アスパラガス抽出物濃度が０．１容量％の場合に１０２、０．２５容量％の場合に１１０、０．５容量％の場合に１３１と、アスパラガス抽出物の添加濃度に依存して表皮細胞からのヒアルロン酸の産生量が増加した。このことから、アスパラガス抽出物に、線維芽細胞におけるヒアルロン酸の産生促進効果があり、また抽出物の濃度を高めることによって産生促進効果が高くなることがわかった。
【００４０】
そして、この試験例３の線維芽細胞での試験と、上記試験例１の表皮細胞での試験結果から、実施例１のアスパラガス抽出物は、表皮におけるヒアルロン酸の産生量を増加するだけでなく、真皮におけるヒアルロン酸の産生量も増加することがわかった。
【００４１】
（試験例４）
本試験例は、肌荒れ改善作用試験の試験例である。上記実施例の肌荒れに対する改善効果を評価するため、肌荒れモデルを作成したモルモットを使用し、試料の適用試験を実施した。尚、試料は実施例１、２にて得られた各抽出物を含水濃度５０容量％エタノールで希釈して、固形分濃度０．１％となるように調製した。また比較例として含水濃度５０容量％エタノールのみについても実施した。
【００４２】
背部を除毛したハートレー系モルモット（雌性、５週齢、１群３匹）に、白色ワセリンにて３重量％に調整したラウリル硫酸ナトリウム（０．２ｇ）を３日間連続解放塗布して肌荒れを作成した。肌荒れ作成部位を４分し、各試料（１．０ｍL）を１日３回、３日間連続塗布し、肌荒れの状態を観察した。肌荒れの度合いは定められた判定基準（スコア）に従って評価した。結果を表４に示す。
【００４３】
【表４】
2007262012.tif 000005
【００４４】
尚、本試験例における判定基準（スコア）は次のとおりである。
紅斑、落屑ともほとんどみられない    １点
紅斑を伴わない軽度の落屑            ２点
紅斑を伴わない中等度の落屑          ３点
弱い紅斑を伴った落屑                ４点
中等度の紅斑を伴った落屑            ５点
著しい紅斑を伴った落屑              ６点
【００４５】
表４からも明らかなように、実施例１及び２のヒアルロン酸産生促進剤ともに、比較例に比べてスコアの合計が小さく、肌荒れ改善作用が優れていることがわかった。
【００４６】
（処方例１）
本処方例は、上記実施例１のヒアルロン酸産生促進剤であるアスパラガス抽出物を化粧料の一例としてのクリームに配合した場合の処方例である。
【００４７】
クリームの調製は次のようにして行った。すなわち、スクワレン、セチルイソオクタノエートおよびマイクロクリスタリンワックスを加熱溶解後、粘土鉱物およびPOEグリセロールトリイソステアリン酸エステル(界面活性剤)を加え、７０℃に調整し、これらを均一に分散・溶解させて油性ゲルを得た。 次に、アスパラガス抽出物を所定濃度精製水に溶解し、油性ゲルの中へ、十分に攪拌しながらゆっくりと添加した。ホモミキサーで均一に混合した後、脱気、ろ過し、３０℃まで冷却し、クリームを得た。得られた処方例１のクリームの組成および配合比は以下の通りである。
【００４８】
組成                                          配合比（重量％）
スクワレン                                ２０．０％
セチルイソオクタノエート                          ８．５％
マイクロクリスタリンワックス                １．０％
粘土鉱物                                    １．３％
ＰＯＥグリセロールトリイソステリン酸エステル      ０．２％
アスパラガス抽出物                                １．０％
水                                      残量
【００４９】
（処方例２）
本処方例は、上記実施例２のヒアルロン酸産生促進剤であるブッチャーブルーム抽出物を化粧料の一例としてのクリームに配合した場合の処方例である。クリームの調製は上記処方例１と同様に行った。得られた処方例２のクリームの組成および配合比は以下の通りである。
【００５０】
組成                                          配合比（重量％）
スクワレン                                ２０．０％
セチルイソオクタノエート                          ８．５％
マイクロクリスタリンワックス                １．０％
粘土鉱物                                    １．３％
ＰＯＥグリセロールトリイソステリン酸エステル      ０．２％
ブッチャーブルーム抽出物                          １．０％
水                                      残量
【００５１】
（試験例５）
上記のように調製した処方例１及び２のクリームを用いて、皮膚バリア機能改善試験を行った。すなわち、処方例１及び２のクリームを、それぞれ女子被験者(２５から４５歳)２５人を対象にして、顔に１日２回３ヶ月間連続塗布した。
【００５２】
一方、クリーム基剤の組成および配合比は処方例１及び２と同じであって、ヒアルロン酸産生促進剤であるアスパラガス抽出物又はブッチャーブルーム抽出物が配合されていないクリームを調製した。得られたクリームについて、比較例として上記処方例と同様の試験を行った。皮膚バリア機能改善試験の評価は、連続塗布前の経皮水分蒸散量を１００とし、連続塗布後の経皮水分蒸散量変化率の平均で示した。試験結果を表５に示す。
【００５３】
【表５】
2007262012.tif 000006
【００５４】
表５から明らかなように、処方例１及び２では、比較例と比べて、被験者の経皮水分蒸散量を大きく低下させ、皮膚バリア機能改善効果が高いことが分かった。
【００５５】
（試験例６）
上記処方例１及び２、並びに比較例のそれぞれのクリームを用いて、前記被験者２５人に対して皮膚のしわ改善試験を行った。被験者２５人のうち、しわが改善されたと回答した人数を表６に示した。
【００５６】
【表６】
2007262012.tif 000007
【００５７】
表６から明らかなように、処方例１及び２では、比較例と比較して、しわが改善されたと回答した人数が２倍もしくはそれ以上あり、皮膚のしわ改善効果が大きいことがわかった。