(57)【要約】    【課題】  ポリヒドロキシアルカン酸を含有する微生物から、工業的規模での実施が容易で、効率的かつ高純度にポリヒドロキシアルカン酸を分離精製する方法を提供する。    【解決手段】  ポリヒドロキシアルカン酸を含有する微生物を培養物から分離洗浄した後、有機溶媒を含まない水に懸濁して界面活性剤を添加し、破砕処理をせずに加熱して処理することを特徴とするポリヒドロキシアルカン酸の分離精製方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヒドロキシアルカン酸を含有する微生物を培養物から分離洗浄した後、有機溶媒を含まない水に懸濁して界面活性剤を添加し、破砕処理をせずに加熱して処理することを特徴とするポリヒドロキシアルカン酸の分離精製方法。
【請求項２】
界面活性剤がアルキル硫酸塩であることを特徴とする請求項１に記載のポリヒドロキシアルカン酸の分離精製方法。
【請求項３】
ポリヒドロキシアルカン酸がポリ−３−ヒドロキシアルカン酸であることを特徴とする請求項１又は２に記載のポリヒドロキシアルカン酸の分離精製方法。
【請求項４】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸がポリ−３−ヒドロキシブチレートであることを特徴とする請求項３に記載のポリヒドロキシアルカン酸の分離精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヒドロキシアルカン酸（以下、「ＰＨＡ」と略する）を含有する微生物からＰＨＡを効率的かつ高純度に分離精製する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在我が国では、プラスチックが年間約１５００万トン生産されているが、大部分がポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリ塩化ビニール（ＰＢＣ）等の石油系プラスチックである。これらの石油系プラスチックが廃棄されると、リサイクルされるものもあるが、大半が埋立処分されるか、焼却処分される。石油系プラスチックは生分解されにくいため、埋立処分されても分解されずにそのまま残ることになる。その結果、埋立地の地盤弛緩などの問題点が発生する。ＰＥやＰＰは焼却に際して高熱を発するため焼却炉を傷めたり、ＰＢＣは焼却温度が低いとダイオキシン等の有害物質を生成するなどの問題がある。
【０００３】
廃棄された後のプラスチックの環境に与える負荷を減らすために、各種の生分解性プラスチックが開発されている。生分解性プラスチックは、埋立処分されたり自然界に放置されると土中の微生物により分解されるため、環境に与える負荷が少なく近年注目を集めている。
【０００４】
また最近はカーボンニュートラルという概念も重要視されるようになっている。石油系のプラスチックは、石油を原料としているため、これが焼却されると、石油として固定されていた二酸化炭素が大気中に放出される結果となり、二酸化炭素濃度が上昇して地球温暖化の要因となる。これに対し、植物由来の材料を原料とする一部の生分解性プラスチックは、焼却しても発生する二酸化炭素は空気中の二酸化炭素を植物が光合成によって固定したものであるため、大気中の二酸化炭素濃度の上昇を招かない。このような特性をカーボンニュートラルと称する。
【０００５】
これらの生分解性プラスチックの一つとして、ポリ−３−ヒドロキシブチレート（以下、「ＰＨＢ」と略称する）を代表とするＰＨＡが知られている。例えばＰＨＢは菌類等の微生物が種々の炭化水素をＰＨＢに変換することにより、細胞内にエネルギー蓄積物質として生成、蓄積される。ＰＨＢを初めとするＰＨＡは天然物であり、他の生分解性プラスチックに比べ特に嫌気状態での生分解性に優れ、近年注目を集めている。微生物により産生されたＰＨＡは、顆粒として微生物の細胞内に蓄積される。従って、いかに効率的かつ高純度で微生物の細胞内からＰＨＡを分離精製するかが、ＰＨＡの工業的製造において極めて重要であり、さらに分離精製に際してＰＨＡの分子量を低下させないことも重要である。
【０００６】
従来、微生物内に蓄積されたＰＨＡを分離回収する方法として、以下の方法が知られている。
【０００７】
特許文献１は、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を含有する微生物菌体の懸濁液に界面活性剤を添加し、得られる混合液を物理的破砕処理することを特徴とするものである。
【０００８】
非特許文献１は、菌体懸濁液を次亜塩素酸ナトリウムで処理してポリ−３−ヒドロキシアルカン酸以外の菌体構成成分を可溶化してポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を得る方法が記載されている。
【０００９】
非特許文献２には、培地に直接界面活性剤を添加し、高温下条件で処理してポリ−３−メルカプトプロピオネートを菌体から回収する方法が記載されている。
【特許文献１】特開２００１−４６０９４公報
【非特許文献１】J. Gen. Microbiology, 19, p198-209(1958)
【非特許文献２】APPLIED AND ENVIROMENTAL MICROBIOLOGY, vol.71, No.2, p.835-841, Feb. 2005
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
特許文献１に記載された方法は、物理的破砕処理を必須とするため、超音波破砕機、高圧ホモジナイザー等の設備を必要とし、コストが増加することを避けることができず、ＰＨＡの工業的製法としては満足のいくものではなかった。
【００１１】
非特許文献１に記載された方法は、精製操作時にＰＨＢの分子量が低下するため、ＰＨＡのプラスチックとしての価値が低下するため、実用化されていない。
【００１２】
非特許文献２に記載された方法は、培地に直接界面活性剤を添加して処理するため、得られるポリ−３−メルカプトプロピオネートの純度が低く、ＰＨＡの工業的製法としては、不向きである。また、有機溶剤（エタノール、アセトン、エーテル）による後処理でポリ−３−メルカプトプロピオネートの純度を高めているが、有機溶剤の使用は、工業生産の実用化において非常に不利である。
【００１３】
本発明が解決しようとする課題は、ＰＨＡを含有する微生物から、工業的規模での実施が容易で、効率的かつ高純度にＰＨＡを分離精製する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題を解決するため、本発明者らが鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明の要旨は、以下のとおりである。
（１）  ポリヒドロキシアルカン酸を含有する微生物を培養物から分離洗浄した後、有機溶媒を含まない水に懸濁して界面活性剤を添加し、破砕処理をせずに加熱して処理することを特徴とするポリヒドロキシアルカン酸の分離精製方法。
（２）  界面活性剤がアルキル硫酸塩であることを特徴とする（１）に記載のポリヒドロキシアルカン酸の分離精製方法。
（３）  ポリヒドロキシアルカン酸がポリ−３−ヒドロキシアルカン酸であることを特徴とする（１）又は（２）に記載のポリヒドロキシアルカン酸の分離精製方法。
（４）  ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸がポリ−３−ヒドロキシブチレートであることを特徴とする（３）に記載のポリヒドロキシアルカン酸の分離精製方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、物理的破砕処理手段を必要とせず、ＰＨＡを含有する微生物から、効率的かつ高純度にＰＨＡを分離精製することができる。また分離精製に際して、有機溶媒を用いることがなく、得られるＰＨＡの分子量も低下することがない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明におけるＰＨＡとは、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートや（Ｒ）−３−ヒドロキシバレレート、（Ｒ）−３−ヒドロキシヘキサノエート、（Ｒ）−３−ヒドロキシオクタノエート、（Ｒ）−３−ヒドロキシデカノエート、（Ｒ）−３−ヒドロキシドデカノエート、あるいは（Ｒ）−４−ヒドロキシバレレートなどからなるヒドロキシアルカン酸のホモポリマーおよびその共重合体を示すが、特に（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートのモノポリマーや（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートと他の（Ｒ）−３−ヒドロキシアルカン酸との共重合体が、実用性の面から好ましい。
【００１９】
代表的なＰＨＡであるＰＨＢとは、熱可塑性の生分解性プラスチック、ポリヒドロキシアルカン酸の１種で、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸を単量体とする重縮合物である。Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａなどの自然界に存在する微生物が、糖や植物油などから合成し、エネルギー貯蔵物質として菌体内に蓄積する。バイオマス（植物原料）から生合成されるため、大気中の炭酸ガス増加を伴わないカーボンニュートラルなプラスチック原料であり、また、微生物により速やかに炭酸ガスと水に分解されるため、地球環境へ悪影響を及ぼさないと考えられる。
【００２０】
本発明に用いられる微生物は、細胞内にＰＨＡを蓄積する微生物であれば特に限定されないが、例えば、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｒｏｔｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ属、Ｔｈｉｏｃｙｓｔｉｓ属、Ｚｏｏｇｌｏｅａ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ属など、またこれらの微生物由来のＰＨＡ合成酵素群の遺伝子が導入された遺伝子組換え微生物、例えばＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のＰＨＢ合成酵素群の遺伝子が導入されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等を挙げることができる。
【００２１】
上述の微生物を培養してＰＨＡを生成し、微生物の細胞内にＰＨＡを蓄積させるための培養方法としては、例えば炭素源や窒素源を制御する方法（Applied Microbial Biotechnology 24 (1986) 370-374）や溶存酸素濃度を制御する方法（Applied and Environmental Microbiology 63 (1997) 4765-4769）、また遺伝子組換え大腸菌においては遺伝子発現誘導物質を培地中に添加してＰＨＢの合成を誘導する方法（Polymer Degradation and Stability 87 (2005) 161-169）を挙げることができる。
【００２２】
本発明は、培養により細胞内にＰＨＡが蓄積された微生物を、まず培養物から分離洗浄することである。分離方法は特に限定されないが、例えば遠心分離や分離膜を用いる濾過が挙げられる。
【００２３】
洗浄方法としては、いったん分離した菌体を水等の液体に懸濁し、再び遠心分離や分離膜を用いた濾過を繰返す方法などが挙げられる。また遠心分離や濾過単独あるいは両者を組み合わせて、培養物からの微生物の分離と洗浄を同時に行うことも可能である。
【００２４】
次いで、培養物から分離洗浄したＰＨＡを含有する微生物を水に分散させる。濃度は特に限定されないが、例えば微生物菌体重量（湿菌体換算）１重量部に対して１〜２０容量倍の水に分散させることが可能であり、特に、操作や分散の容易さの点から５〜１０容量倍の水に分散させることが好ましい。ここで、微生物菌体重量（湿菌体換算）１重量部に対して１０容量倍の水とは、菌体の重さに対して１０倍の体積（１ｍｌを１ｇと換算）の水を言い、例えば微生物菌体重量（湿菌体換算）１ｇに対して１０ｍＬの水を意味する。
【００２５】
ＰＨＢを含有する微生物の懸濁水に、添加する界面活性剤としては、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、ヘキサデシル硫酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸、ポリオキシエチレンドデシルエーテル、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、ポリオキシエチレングリコールオクチルフェニルエーテル等を挙げることができる。特に、ドデシル硫酸ナトリウム（以下、「ＳＤＳ」と略する）が添加効果や使用量ならびに価格の点で好ましい。
【００２６】
界面活性剤を添加する時期は特に限定されないが、ＰＨＡを含有する微生物の懸濁液に添加してもよく、ＰＨＡを含有する微生物と同時に水に添加しても良く、予め界面活性剤を添加した水にＰＨＡを含有する微生物を加えても良い。
【００２７】
界面活性剤の濃度は、例えば微生物菌体重量（湿菌体換算）１００重量部に対して５〜
５０重量部が好ましく、添加効果が良好な点から２０〜４０重量部がより好ましい。
【００２８】
本発明は有機溶媒を使用せずにＰＨＡを効率的かつ高純度に精製分離できる。
【００２９】
ＰＨＡを含有する微生物と界面活性剤を添加した懸濁水を、加熱して処理することにより、ＰＨＢを効率的かつ高純度に精製分離することができる。処理条件としては、反応条件は４０℃以上が好ましく、得られるＰＨＡの純度が良好な点から、６０℃以上がより好ましい。攪拌方法は特に制限されないが、加熱処理中も時折適当な方法で攪拌することが好ましい。反応時間は、１５分以上が好ましく、得られるＰＨＡの純度が良好なことから、４５分以上が特に好ましい。
【００３０】
本発明方法により、ＰＨＡを含有する微生物からＰＨＡを高純度で得ることができる。本発明方法では、超音波破砕機、高圧ホモジナイザー等の物理的破砕手段を使用することなくＰＨＡを効率的かつ高純度で得ることができる。また、有機溶媒を使用することがないので、脱溶媒に要する工程を省略することができ、コストを低減することができる。
【実施例１】
【００３１】
１．菌株
Ralstonia eutropha由来のＰＨＡ（ＰＨＢ）合成酵素群遺伝子を組み込んだプラスミド、pJRDTrcphaCABReを、大腸菌XL1-Blueに導入した株を使用した。（Polymer Degradation and Stability 87 (2005) 161-169）
【００３２】
２．培養
（１）栄養培地による小スケール培養
前培養は−８０℃の保存菌液１００μＬを５ｍＬのＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス ５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）の入った試験管に接種し、３７℃で12時間〜16時間培養した。この培養液１ｍＬを５００ｍＬの坂口フラスコに１００ｍＬの上記培地（２０ｇ／Ｌグルコースを含むＬＢ培地）が入ったものに接種し、３７℃で24時間培養した。培養10〜12時間目に終濃度1ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（イソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノシド）を添加し、ＰＨＢ合成酵素の発現を誘導した。
（２）合成培地による大量培養
Polymer Degradation and Stability 87 (2005) 161-169に記載の方法に順じ、５００L容のファーメンターに終了時容量が２５０〜３００Lとなるような流加培養を行った。
【００３３】
３．精製
（１）培地洗浄の効果
大量培養した菌体液（１００ｇ湿菌体／Ｌ）を、1ｇの湿菌体を含むように10ｍｌずつ分取した。一方には培養液に直接０．２ｇのＳＤＳ粉末を加え、もう一方は遠心して菌体を回収した後、湿菌体に対して容量が１０倍（ｖ／ｗ）、ＳＤＳ濃度が２０％(w/w)になるよう２％ＳＤＳ溶液を１０ｍｌ添加した。充分に攪拌した後、６０分、８０℃を維持して反応を行わせた。反応中も時折攪拌し懸濁した状態を維持した。反応終了後室温にて９０００×ｇ、２０分の遠心を行って沈殿を得た。得られた沈殿は更に蒸留水に懸濁し、同じ条件で遠心することを３回繰返して洗浄した。得られた沈殿物のＰＨＢ純度を測定した。結果は表１に示した。
【００３４】
【表１】
2007028987.tif 000002
【００３５】
（２）ＳＤＳ濃度と反応液量
培養後遠心して回収した1ｇの湿菌体に、湿菌体重量に対して１０％、２０％もしくは４０％（ｗ／ｗ）のＳＤＳを含む、湿菌体重量の等容量、２倍容量もしくは１０倍容量（ｖ／ｗ）の水を加えて懸濁し、８０℃で１時間反応させた。反応中も時折攪拌し懸濁した状態を維持した。反応終了後、（１）培地洗浄の効果と同様の操作を行い、得られた沈殿物のＰＨＢ純度を測定した。得られたＰＨＢの純度を表２に示す。
【００３６】
【表２】
2007028987.tif 000003
【００３７】
（３）反応温度
培養後遠心して回収した1ｇの湿菌体に、湿菌体重量に対して２０％（ｗ／ｗ）のＳＤＳを含む、湿菌体重量の１０倍容量（ｖ／ｗ）の水を加えて懸濁し、室温、４０℃、６０℃もしくは８０℃で１時間反応させた。反応中も時折攪拌し懸濁した状態を維持した。反応終了後（１）培地洗浄の効果と同様の操作を行い、得られた沈殿物のＰＨＢ純度を測定した。結果を表３に示す。
【００３８】
【表３】
2007028987.tif 000004
【００３９】
（４）反応時間
培養後遠心して回収した1ｇの湿菌体に、湿菌体重量に対して２０％（ｗ／ｗ）のＳＤＳを含む、湿菌体重量の１０倍容量（ｖ／ｗ）の水を加えて懸濁し、８０℃で、１５分、３０分、４５分、もしくは６０分反応させた。反応中も時折攪拌し懸濁した状態を維持した。反応終了後（１）培地洗浄の効果と同様の操作を行い、得られた沈殿物のＰＨＢ純度を測定した。結果を表４に示す。
【００４０】
【表４】
2007028987.tif 000005
【００４１】
（５）分子量
ＬＢ培地で培養した菌体、1ｇの湿菌体に、湿菌体重量に対して２０％（ｗ／ｗ）のＳＤＳを含む、湿菌体重量の１０倍容量（ｖ／ｗ）の水を加えて懸濁し、８０℃で１時間反応させた。反応中も時折攪拌し懸濁した状態を維持した。反応終了後（１）培地洗浄の効果と同様の操作を行い、得られた沈殿物のＰＨＢ純度を測定した。得られたＰＨＢは純度が９８〜１００％、重量平均分子量は３４０万と菌体中のＰＨＢと同等であり、高純度のＰＨＢを分子量を低下させることなく精製することが出来た。なお、ＰＨＢの純度測定および重量平均分子量の測定は以下の方法により行った。
【００４２】
４．ＰＨＢの定量（純度測定）
文献記載の方法に準じ、３−ヒドロキシ酪酸をクロトン酸に変換して行った。（Applied and Environmental Microbiology, 46 (1983) 1339-1344）
乾燥した菌体もしくは沈殿物（ＰＨＢとして１〜５００ｍｇを含む）に濃硫酸１ｍＬを加え、８０℃の湯浴中で１．５時間反応させた。反応後、氷中で急冷し、４ｍＬの０．０１４Ｎ硫酸を氷中で攪拌しながらゆっくり加え、ＰＨＢから生成したクロトン酸をＨＰＬＣで測定して、菌体中のＰＨＢ量、もしくは沈殿物のＰＨＢ純度を求めた。
【００４３】
分析条件；カラム      BIO-RAD  Aminex  HPX-87H  Ion  Exclusion  Column  
300×7.8mm
カラム温度  60℃
流速        0.7ml/min
波長        210nm
【００４４】
５．重量平均分子量の測定
ＰＨＢを蓄積した菌体を遠心洗浄し（９０００×ｇ、１５分、3回）、精製したＰＨＢはそのまま凍結乾燥した。乾燥した菌体もしくは精製したＰＨＢはクロロホルムにＰＨＢ濃度０．２５〜０．５ｇ／Ｌの濃度になるよう懸濁し、常温で３日間溶解させた。溶解後、０．２μｍＰＶＤＦ膜にてろ過し、サンプルとした。測定は多角レーザー絶対分子量分析計（Wyatt  Technology社製  DAWN）を使用し、ＰＨＢの重量平均分子量を求めた。
【００４５】
分析条件；カラム      Shodex  GPC  K-806L
カラム温度  40℃
流速        1.0ml/min
【産業上の利用可能性】
【００４６】
有機溶媒や物理的破砕手段を使用することなく、ＰＨＡを含む微生物から効率的かつ高純度にＰＨＡを分離精製することができるので、環境負荷の少ないＰＨＡを低コストで提供でき、環境問題に資するところが極めて大きい。