(57)【要約】【課題】修正のために用いる第２の蛍光信号を用いること無く、装置上の誤差要因を効果的に排除又は低減することができる核酸増幅生成物のリアルタイム検出装置を提供する。【解決手段】複数のウエル７Ａに温度サイクルを与え、各ウエル７Ａにおける核酸増幅生成物からの蛍光強度をリアルタイムで検出する。ウエル７Ａから得られる蛍光測定値［ＤＮＡ］ｒａｗと、このウエル７Ａ近傍における周辺の連結壁から得られる蛍光測定値［ＤＮＡ］ｂｇとを検出し、蛍光測定値［ＤＮＡ］ｒａｗから蛍光測定値［ＤＮＡ］ｂｇを差し引くことにより、当該ウエル７Ａの蛍光強度［ＤＮＡ］ｒｅａｌを決定する。【選択図】図２
2007236219.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の反応領域に温度サイクルを与え、各反応領域における核酸増幅生成物からの蛍光強度をリアルタイムで検出する装置であって、
前記反応領域から得られる蛍光測定値［ＤＮＡ］ｒａｗと、該反応領域近傍における反応領域外領域から得られる蛍光測定値［ＤＮＡ］ｂｇとを検出し、前記蛍光測定値［ＤＮＡ］ｒａｗから前記蛍光測定値［ＤＮＡ］ｂｇを差し引くことにより、当該反応領域の蛍光強度［ＤＮＡ］ｒｅａｌを決定することを特徴とする核酸増幅生成物のリアルタイム検出装置。
【請求項２】
前記蛍光測定値［ＤＮＡ］ｂｇは、前記反応領域近傍における複数の反応領域外領域から得られる蛍光測定値の単純平均、若しくは、所定の重み付けを行った後の平均値であることを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅生成物のリアルタイム検出装置。
【請求項３】
前記蛍光測定値［ＤＮＡ］ｒａｗの検出の都度、前記蛍光測定値［ＤＮＡ］ｂｇを検出し、当該蛍光測定値［ＤＮＡ］ｒａｗから蛍光測定値［ＤＮＡ］ｂｇを差し引くことで、前記蛍光強度［ＤＮＡ］ｒｅａｌの決定を行うことを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の核酸増幅生成物のリアルタイム検出装置。
【請求項４】
複数の反応領域に温度サイクルを与え、各反応領域における核酸増幅生成物からの蛍光強度をリアルタイムで検出する装置であって、
前記温度サイクルｎ回毎に各反応領域から得られる蛍光強度［ＤＮＡ］ｎを、当該蛍光強度［ＤＮＡ］ｎの最大値若しくはそれに関連する値［ＤＮＡ］ｍａｘを用いて正規化し、当該正規化された蛍光強度［ＤＮＡ］ｎＮを用いて描かれる増幅曲線の指数関数的増幅領域に閾値Ｔｈを設定することにより、閾値サイクル数Ｃｔを算出することを特徴とする核酸増幅生成物のリアルタイム検出装置。
【請求項５】
前記反応領域毎の蛍光強度［ＤＮＡ］ｎを、前記最大値若しくはそれに関連する値［ＤＮＡ］ｍａｘ、或いは、それに比較対象とする前記反応領域に対して共通する値を加えた値で除することにより前記蛍光強度［ＤＮＡ］ｎＮを算出することを特徴とする請求項４に記載の核酸増幅生成物のリアルタイム検出装置。
【請求項６】
前記指数関数的増幅領域以前の前記蛍光強度［ＤＮＡ］ｂａｓｅを、前記各反応領域毎の蛍光強度［ＤＮＡ］ｎ及び最大値若しくはそれに関連する値［ＤＮＡ］ｍａｘから差し引いて前記増幅曲線を描くことを特徴とする請求項４又は請求項５に記載の核酸増幅生成物のリアルタイム検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｎ：ＰＣＲ）から得られるポリヌクレオチド生成物をリアルタイムに検出する装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲはＤＮＡ鎖を複製する循環的な酵素反応で、前のサイクルで複製されたＰＣＲプロダクト（核酸増幅生成物）が連続するサイクルのテンプレートとして用いられることになる関係上、目的とする標的配列分子を指数関数的に増幅させることができる。リアルタイムＰＣＲは、例えば互いに干渉しあう二種類の蛍光色素で標識した配列特異的なプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）を用い、ＰＣＲプロダクトに励起光を当てて蛍光を励起させ、この蛍光強度を測定することでＰＣＲプロダクトの増幅をリアルタイムでモニタリングする。
【０００３】
そして、定量的に用いるときは、既知試料における増幅曲線の指数関数的増幅領域に閾値（図７の（６））を設定し、この閾値と増幅曲線が交わる点（閾値サイクル数Ｃｔ。図７の（８））を算出する。この閾値サイクル数Ｃｔと検査試料の初期ＤＮＡ量との間には初期ＤＮＡ量をＬｏｇ値で目盛ると直線関係があり、この直線関係を示す検量線を作成できる。この検量線をもとに検査試料の初期ＤＮＡ量を推定する。これにより、ＰＣＲの増幅速度論に基づいた正確な定量が可能である。
【０００４】
ここで、実際のＰＣＲ効率は１００％ではないため、増幅されるＰＣＲプロダクトの濃度は式（１）で示される。
［ＤＮＡ］＝［ＤＮＡ］0（１＋ｅ）c    ・・・・（１）
［ＤＮＡ］ ：ＰＣＲプロダクトの濃度
［ＤＮＡ］0：標的テンプレートの初期濃度
ｅ：平均ＰＣＲ効率
ｃ：サイクル数
【０００５】
即ち、平均ＰＣＲ効率ｅが１００％（即ち、上記式（１）においてｅ＝１）であれば、ＰＣＲプロダクトの濃度［ＤＮＡ］は２のサイクル数乗で指数関数的に増幅していくが、サイクルの初期と中期と後期とで効率ｅが徐々に低下してくるため、増幅曲線は図７に示すような状況となる。図７の横軸はサイクル数、縦軸は蛍光強度を示しており、サイクル初期では指数関数的に増幅し（図７の（５））、サイクル中期では直線関数的となり（図７の（６））、サイクル後期ではプラトー効果により増幅しなくなる（図７の（７））。
【０００６】
尚、このプラトー効果を引き起こす化学反応的な要因としては次のようなものがある。
・ｄＮＴＰとプライマーの加水分解
・ＤＮＡポリメラーゼ（テンプレート（鋳型）のコピーをつくるためのＤＮＡ合成酵素）の熱による失活
・１本鎖ＰＣＲフラグメントの再会合によるプライマーアニーリング効率の低下
・非特異的ＰＣＲプロダクトによる競合素材
・ピロホスフェートのようなＰＣＲ阻害物質の蓄積
・ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によるＰＣＲプロダクトの加水分解
【０００７】
従って、リアルタイムＰＣＲにおいては上記式（１）の関係が成立する指数関数的増幅領域での測定が前提条件となる（特許文献１参照）。
【特許文献１】特表２００５−５１６６３０号公報
【特許文献２】特許第２９０９２１６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
また、リアルタイムＰＣＲに用いられる反応容器としては、複数のウエル（凹みから構成される反応領域。例えば９６個。）を有するマイクロプレートと称される容器が一般的に用いられ、各ウエルに所定の初期ＤＮＡ濃度の反応溶液が分注されるが、装置上の誤差要因としては次のようなものによって反応容器のウエル毎に増幅曲線がばらつく。
・光学系の誤差
・校正溶液の濃度誤差
・校正溶液の分注誤差
・反応容器の蓋やシールフィルムの光透過性誤差
・反応容器の汚れ誤差
・反応溶液の分注誤差
【０００９】
ここで、反応容器（マイクロプレート）は、片面の全域に接着剤が付いた前述したシールフィルムを貼り付けることでウエルに蓋をする方法が安価として主流となっている。そして、このシールフィルムを通して励起光が各ウエルに照射され、ＰＣＲプロダクト（反応物）が発した蛍光もこのシールフィルムを通してＣＣＤカメラなどの光検出部により検出される（これらが装置の光学系を構成する）。このようにシールフィルムや反応容器の本体は、蛍光強度の測定上光学系の重要な要素を構成しているにもかかわらず、これらは消耗品であるため、均一で精度の高い光学性能を期待することは困難である。
【００１０】
図４は光検出部により検出されるＰＣＲ前の反応容器の実際の画像である。反応容器のウエルの周囲は全体としては黒く見えるが、背景となるこの画像の各ピクセルの輝度（背景の蛍光強度）は必ずしも一定では無く、同図中に（１）で示すように光学系の汚れや、迷走光などにより斑が発生している。ＰＣＲ反応が開始されると、この斑は図５中に（２）で示すようにウエル部分の画像（図５に丸く映っている９６個の画像）に重なり、ウエル本体の蛍光強度に冗長されてしまう。
【００１１】
そこで従来では、最初にＤＮＡの入っていない空の反応容器を準備し、各ウエル毎に空の状態の蛍光強度を測定し、スタンダードな補正値として記憶する。そして、実際の蛍光強度の測定値から記憶された補正値を差し引く補正処理を行うことによって、このような光学系の校正を行っていた。しかしながら、空の反応容器の汚れによる誤差は各反応容器固有のものであるため、スタンダードとされた他の空の反応容器による補正値を用いた場合、測定値に誤差が生じる問題があった。
【００１２】
また、特許文献２では第１の蛍光信号を第２の蛍光信号で修正しているが、本来測定しなければならない第１の蛍光を発する溶液の他に、参照用の第２の蛍光を発する溶液を追加しなければならないので、作業が繁雑となると共にコストも高騰することになる。更に、第２の蛍光を発する溶液は非常に高精度に分注され、精度良く測定されなければ効果が得られない。更にまた、第２の蛍光を測定するために格別な光学フィルタを装備しなければならず、また、測定の都度、光学フィルタを第１の蛍光を発する溶液用と第２の蛍光を発する溶液用とで入れ替えなければならないなど、データの取得と処理に要する時間が余分に必要となる問題がある。
【００１３】
本発明は、係る従来の技術的課題を解決するために成されたものであり、修正のために用いる第２の蛍光信号を用いること無く、装置上の誤差要因を効果的に排除又は低減することができる核酸増幅生成物のリアルタイム検出装置を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
請求項１の発明の装置は、複数の反応領域に温度サイクルを与え、各反応領域における核酸増幅生成物からの蛍光強度をリアルタイムで検出するものであって、反応領域から得られる蛍光測定値［ＤＮＡ］ｒａｗと、この反応領域近傍における反応領域外領域から得られる蛍光測定値［ＤＮＡ］ｂｇとを検出し、蛍光測定値［ＤＮＡ］ｒａｗから蛍光測定値［ＤＮＡ］ｂｇを差し引くことにより、当該反応領域の蛍光強度［ＤＮＡ］ｒｅａｌを決定することを特徴とする。
【００１５】
請求項２の発明の装置は、上記において蛍光測定値［ＤＮＡ］ｂｇは、反応領域近傍における複数の反応領域外領域から得られる蛍光測定値の単純平均、若しくは、所定の重み付けを行った後の平均値であることを特徴とする。
【００１６】
請求項３の発明の装置は、上記各発明において蛍光測定値［ＤＮＡ］ｒａｗの検出の都度、蛍光測定値［ＤＮＡ］ｂｇを検出し、当該蛍光測定値［ＤＮＡ］ｒａｗから蛍光測定値［ＤＮＡ］ｂｇを差し引くことで、蛍光強度［ＤＮＡ］ｒｅａｌの決定を行うことを特徴とする。
【００１７】
請求項４の発明の装置は、複数の反応領域に温度サイクルを与え、各反応領域における核酸増幅生成物からの蛍光強度をリアルタイムで検出するものであって、温度サイクルｎ回毎に各反応領域から得られる蛍光強度［ＤＮＡ］ｎを、当該蛍光強度［ＤＮＡ］ｎの最大値若しくはそれに関連する値［ＤＮＡ］ｍａｘを用いて正規化し、当該正規化された蛍光強度［ＤＮＡ］ｎＮを用いて描かれる増幅曲線の指数関数的増幅領域に閾値Ｔｈを設定することにより、閾値サイクル数Ｃｔを算出することを特徴とする。
【００１８】
請求項５の発明の装置は、上記において反応領域毎の蛍光強度［ＤＮＡ］ｎを、最大値若しくはそれに関連する値［ＤＮＡ］ｍａｘ、或いは、それに比較対象とする反応領域に対して共通する値を加えた値で除することにより蛍光強度［ＤＮＡ］ｎＮを算出することを特徴とする。
【００１９】
請求項６の発明の装置は、請求項４又は請求項５において指数関数的増幅領域以前の蛍光強度［ＤＮＡ］ｂａｓｅを、各反応領域毎の蛍光強度［ＤＮＡ］ｎ及び最大値若しくはそれに関連する値［ＤＮＡ］ｍａｘから差し引いて増幅曲線を描くことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２０】
本発明では、複数の反応領域に温度サイクルを与え、各反応領域における核酸増幅生成物からの蛍光強度をリアルタイムで検出する核酸増幅生成物のリアルタイム検出装置において、反応領域から得られる蛍光測定値［ＤＮＡ］ｒａｗと、この反応領域近傍における反応領域外領域から得られる蛍光測定値［ＤＮＡ］ｂｇとを検出し、蛍光測定値［ＤＮＡ］ｒａｗから蛍光測定値［ＤＮＡ］ｂｇを差し引くことにより、当該反応領域の蛍光強度［ＤＮＡ］ｒｅａｌを決定するので、各反応領域毎に当該反応領域及びその周辺の光透過性の誤差や汚れ、迷走光による背景の蛍光強度を除外した当該反応領域の核酸増幅生成物本来の蛍光強度［ＤＮＡ］ｒｅａｌを得ることができるようになる。これにより、正確な増幅曲線の作成と定量化を実現することが可能となる。この場合、第２の蛍光信号を用いる必要も無いので、コストの高騰や作業性の悪化も発生せず、データの取得と処理に要する時間を短縮することができるようになるものである。
【００２１】
請求項２の発明では、上記に加えて蛍光測定値［ＤＮＡ］ｂｇを、反応領域近傍における複数の反応領域外領域から得られる蛍光測定値の単純平均、若しくは、所定の重み付けを行った後の平均値としたので、より正確な背景の蛍光強度を算出して、精度の高い蛍光強度［ＤＮＡ］ｒｅａｌの決定を行うことができるようになる。
【００２２】
請求項３の発明では、上記各発明に加えて蛍光測定値［ＤＮＡ］ｒａｗの検出の都度、蛍光測定値［ＤＮＡ］ｂｇを検出し、当該蛍光測定値［ＤＮＡ］ｒａｗから蛍光測定値［ＤＮＡ］ｂｇを差し引くことで、蛍光強度［ＤＮＡ］ｒｅａｌの決定を行うようにしたので、反応中に背景の蛍光強度が変動しても、常に核酸増幅生成物本来の蛍光強度［ＤＮＡ］ｒｅａｌをリアルタイムで精度良く得ることができるようになる。
【００２３】
請求項４の発明では、複数の反応領域に温度サイクルを与え、各反応領域における核酸増幅生成物からの蛍光強度をリアルタイムで検出する核酸増幅生成物のリアルタイム検出装置において、温度サイクルｎ回毎に各反応領域から得られる蛍光強度［ＤＮＡ］ｎを、当該蛍光強度［ＤＮＡ］ｎの最大値若しくはそれに関連する値［ＤＮＡ］ｍａｘを用いて正規化し、当該正規化された蛍光強度［ＤＮＡ］ｎＮを用いて描かれる増幅曲線の指数関数的増幅領域に閾値Ｔｈを設定することにより、閾値サイクル数Ｃｔを算出するようにしたので、光学系の誤差、校正溶液の濃度誤差、校正溶液の分注誤差や反応溶液の分注誤差などの装置上の誤差要因に伴う各反応領域の蛍光強度のバラツキを補正して低減し、確度の高い閾値サイクル数Ｃｔの算出が可能となる。
【００２４】
請求項５の発明では、上記に加えて反応領域毎の蛍光強度［ＤＮＡ］ｎを、最大値若しくはそれに関連する値［ＤＮＡ］ｍａｘ、或いは、それに比較対象とする反応領域に対して共通する値を加えた値で除することにより蛍光強度［ＤＮＡ］ｎＮを算出するようにしたので、正規化の効果を抑制して、閾値での補正効果を充分確保しながら、サイクル中期から後期の増幅曲線を実際のデータに近似させ、装置上の誤差要因以外の要因に伴うデータの挙動把握を容易にすることができるようになる。
【００２５】
請求項６の発明では、請求項４又は請求項５に加えて指数関数的増幅領域以前の蛍光強度［ＤＮＡ］ｂａｓｅを、各反応領域毎の蛍光強度［ＤＮＡ］ｎ及び最大値若しくはそれに関連する値［ＤＮＡ］ｍａｘから差し引いて増幅曲線を描くようにしたので、反応領域の反応溶液そのものから発生する蛍光の強度を排除した核酸増幅生成物そのものからの蛍光強度の状況を把握することができるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、図面に基づき本発明の実施形態を詳述する。
【実施例１】
【００２７】
図１は本発明の実施例のリアルタイム検出装置Ｒの構成図、図２は図１のリアルタイム検出装置Ｒを構成する反応検出装置１の縦断側面図、図３は反応検出装置１の平断面図である。本発明のリアルタイム検出装置Ｒは、反応検出装置１とこの反応検出装置１からの検出データをリアルタイムで処理するコンピュータから成る処理装置Ｃとから構成される。
【００２８】
実施例の反応検出装置１は、反応試料としての染色体ＤＮＡの増殖を行うと共に、当該増殖に関する反応状態を光学的測定方法により検出を行う装置である。この反応検出装置１は、上面に反応室４を形成した本体３と、当該反応室４の後方であって本体３の上面に配設された反応検出部５を備えている。そして、この反応室４には、アルミニウム等の熱伝導性材料にて形成された反応ブロック６が設けられている。この反応ブロック６には、内部にＤＮＡ（標的テンプレート：λＤＮＡなど）や各種試薬、培地となる溶液等を混合した反応溶液を収容した複数のウエル７Ａ・・を有する反応容器７を保持するための複数の保持穴８が形成されている。
【００２９】
本実施例において用いられる反応容器７は、縦に１２個、横に８個、合計９６個の反応領域としてのウエル７Ａ・・が一体に形成され、各ウエル７Ａ・・が連結壁（ウエル７Ａ（反応領域）外の領域、即ち、反応領域外領域）にて連結されたマイクロプレートである。尚、反応容器としてはウエルが一体成形されたものに限らず、複数本のチューブにて構成されるものであってもよい。また、当該ウエル７Ａの個数は、これに限られるものではなく、これ以外にも、例えば３８４個を一体に構成したものが、取り扱い性がよい。また、反応容器７の各ウエル７Ａは、上面に開口して形成されており、当該上面開口は、反応溶液の温度処理による蒸発を阻止するため、シール製の蓋９が貼り付けられている。また、本実施例において、蛍光強度の検出には当該蓋９を透過して検出が行われることから、光透過性の合成樹脂材料が使用される。
【００３０】
そして、この本体２内には、反応ブロック６を加熱、冷却するペルチェ素子１０を備えている。尚、このペルチェ素子１０は、図示しない制御装置により温度制御されることで、反応ブロック６をサイクル的に加熱・冷却し、これにより、反応容器７の各ウエル７Ａ内のＤＮＡ（反応試料）の培養（増幅）が行われる。
【００３１】
この本体２の後端上面に設けられた反応検出部５から他端、本実施例では、反応室４が形成される本体２前端上方にわたって暗室構成部１２が設けられる。この暗室構成部１２の前面は、前方に向けて開放して形成されていると共に、この前面開口には、前方に向けて低く傾斜して形成される前記カバー２が開閉自在に設けられる。そして、このカバー２は、暗室構成部１２の前方、即ち、本体３上面前部から該暗室構成部１２内後部にわたって構成されるレール部材１３により、前後に移動可能に構成され、後方に移動した状態で該カバー２は、暗室構成部１２内に収容される。
【００３２】
そして、このカバー２内には、該カバー２が閉塞された状態で反応室４の反応ブロック６に臨んで反応容器７を反応ブロック６に押しつけるための押さえ部材１５が一体に移動自在に設けられている。この押さえ部材１５は、熱伝導性の良いアルミニウム材などにより構成される板材であり、各ウエル７Ａの上面に対応して複数の透孔が形成されている。
【００３３】
更に、この押さえ部材１５の上側には光学レンズとしてのフレネルレンズ２１が配設される。このフレネルレンズ２１は、一般に平面上に複数の溝が形成されており、これによって、入射した光を屈折させて拡大するものである。このとき、フレネルレンズ２１は、入射した光を屈折させて拡大するに際して、入射光を平行若しくは平行に近い状態に収束させて透過する光学特性を有しており、これにより、入射光は、各光路の歪みが修整された状態で、投光されることとなる。
【００３４】
一方、反応ブロック６の上方において、反応室４の前上方を閉塞するカバー２の反応室４側を構成する面には、反射板２２が配設される。本実施例における反射板２２は、平板にて構成されるミラーなどから構成されており、詳細は後述する光源ランプ２３からの光をフレネルレンズ２１に向けて屈曲させるものである。
【００３５】
他方、反応検出部５内には、光源ランプ２３と、複数のバンドパスフィルタを備えたフィルタ装置３５と、反射板２６、ＣＣＤカメラ２７と、フィルタ装置３５を回転させるフィルタ駆動装置２８とを備えている。
【００３６】
光源ランプ２３は、反応液内の検出対象となるＤＮＡプロダクトの量に応じて当該反応溶液から蛍光を励起させるための励起光を含む光を照射するランプであり、一般にハロゲンランプが用いられる。反射板２６は、光源ランプ２３から照射された所定の波長の光を所定の角度に屈曲させることで、反射板２２に偏光させるものである。また、この反射板２６は、所定の蛍光を透過する性質を有している。本実施例では、反応検出部５の側部に配設される光源ランプ２３からの光を当該反射板２６によって前方に屈曲させることで、当該光源ランプ２３の光が反射板２２に照射される。
【００３７】
フィルタ装置３５は、数種類のバンドパスフィルタを輪状に配置することにより構成される装置であり、フィルタ駆動装置２８により回転することで、光源ランプ２３と反射板２６との間や反射板２２とカメラ２７との間に所定のバンドパスフィルタを選択して位置させるものである。尚、図中、光源ランプ２３と反射板２６との間に位置させるものをバンドパスフィルタ２４とし、反射板２２とカメラ２７との間に位置させるものをバンドパスフィルタ２５とする。
【００３８】
バンドパスフィルタ２４は、光源ランプ２３からの光の成分のうち、反応溶液から蛍光を励起するのに必要な波長の光だけを透過する性質を有する光学フィルタであり、当該フィルタ２４を通過した光は、反応溶液の特定成分から蛍光を励起させるための励起光とされる。
【００３９】
バンドパスフィルタ２５は、反射板２２を介して反応容器７の各ウエル７Ａ内の反応溶液から発する蛍光及び反射光から所定の蛍光成分だけを透過する性質を有する光学フィルタであり、ここで、当該蛍光以外の反射光は遮断される。
【００４０】
カメラ２７は、バンドパスフィルタ２５を透過した蛍光を検出する装置であり、当該カメラ２７にて検出された蛍光画像が前記制御装置に取り込まれ、処理装置Ｃに送信されて各反応溶液の濃度、即ち増幅量が分析される。尚、これらバンドパスフィルタ２４、２５は、検出対象となる反応溶液、更には、これに対応して用いられる蛍光染料の種類に基づいて、これらバンドパスフィルタ２４、２５の組み合わせが任意に決定され、選択的に使用されるものとする。
【００４１】
以上の構成により、前記制御装置は、前記ペルチェ素子１０を制御し、反応ブロック６の保持穴８に保持された反応容器７内の反応溶液を例えば＋９５℃の熱変性温度とし、反応溶液を熱変性させる熱変性工程を行う。次いで、制御装置は、ペルチェ冷却素子１０を制御し、反応ブロック６を例えば＋６０℃に冷却して、反応容器７内に収容されて熱変性された反応溶液中のＤＮＡのアニーリング工程と伸張工程を行う。制御装置は、この熱変性工程と、アニーリング工程と、伸張工程を１サイクルとして複数回、例えば４０回繰り返すことにより、ＰＣＲ法によるＤＮＡ等の培養（増幅）を行う。
【００４２】
この培養の過程又は、終了時において、反応検出部５は、反応容器７内の反応溶液のＤＮＡの増幅状態を検出するため、一サイクル終了後など、定期的に検出動作を実行する。検出動作は、まず、光源ランプ２３から照射された光がバンドパスフィルタ２４を介して反射板２６に到達する。バンドパスフィルタ２４は、光源ランプ２３からの光のうち、蛍光を励起させるのに必要な波長の光、即ち、励起光だけを透過させる。当該励起光は、反射板２６により暗室構成部１２内を通過して反射板２２方向に照射され、更に、反射板２２によって当該励起光は、反応ブロック６に臨んで設けられるフレネルレンズ２１に向けて、即ち、上から下方向に向かって照射される。
【００４３】
当該フレネルレンズ２１に照射された励起光は、当該レンズ２１の光学特性により、光を集束し、反応ブロック６に収容される反応容器７の各ウエル７Ａに対して平行若しくは、平行に近い角度に入射角度が変更される。これにより、当該レンズ２１を透過した励起光は、押さえ部材１５に形成された各透孔を介して平行若しくは、平行に近い角度の入射角度にて各ウエル７Ａに入射される。
【００４４】
各ウエル７Ａ内に平行若しくは平行に近い角度にて入射された励起光は、予め所定の蛍光染料が添加されたウエル７Ａ内のＤＮＡに照射されることで、ＰＣＲプロダクトの量に応じた蛍光を発する。この発生した蛍光及びその他のＰＣＲプロダクトからの反射光は、同様に押さえ部材１５に形成された各透孔及びフレネルレンズ２１を介して反射板２２に到達する。
【００４５】
その後、反射板２２に到達した蛍光及びその他の反射光は、該反射板２２の作用によって暗室構成部１２内を略水平方向に光路を形成しながら、当該反射板２２に対向して設けられるバンドパスフィルタ２５を介してカメラ２７に到達する。尚、この場合において、暗室構成部１２内は、カバー２が閉塞されていることにより、暗室とされていることから、蛍光が減衰等される不都合を抑制することができる。
【００４６】
このとき、反射板２６は、蛍光を透過可能とする材料にて構成されていることから、当該反射板２６を透過した反射光及び蛍光は、バンドパスフィルタ２５に照射されることとなる。バンドパスフィルタ２５では、上述したように、当該フィルタ２５の種類に応じて、所定の蛍光のみが透過可能とされているため、その後方に配設されるカメラ２７には、所定の蛍光のみが照射されることとなる。
【００４７】
そして、カメラ２７では、受光された蛍光を撮影することにより、反応容器７の各ウエル７Ａ内のＰＣＲプロダクトの蛍光状態を検出する。そして、この検出された各ＰＣＲプロダクトの蛍光状態に関する検出データ（図４〜図６に示す画像データ）は、制御装置から処理装置Ｃに送出され、この処理装置Ｃにて分析されることにより、各試料の濃度、即ち、ＤＮＡ等の増幅量を検出することができる。各ウエル７Ａの位置と画像の位置関係は予め分かっているので、ウエル７Ａの画像の各ピクセルの輝度を求めることで、ウエル７Ａそれぞれの蛍光強度が測定でき、この蛍光強度からＰＣＲプロダクトの量を把握することができる。
【００４８】
処理装置Ｃは、図１１に示すように反応検出装置１から送信される検出データの処理を行う演算処理部（ＣＰＵ）３１と、この演算処理部３１に接続された記憶装置（記憶手段）３２、キーボード（或いはマウスなどの入力手段）３３、ディスプレイ（出力手段）３４、プリンタ（出力手段）３６、ＦＤ、ＣＤ、ＤＶＤ、メモリなどの外部記憶装置３７などから構成されている。反応検出装置１から送信された検出データは記憶装置３２に記憶され、演算処理部３１により後述する処理が行われてディスプレイ３４などに表示出力される。
【００４９】
次に、この処理装置Ｃにおける検出データの処理手順について説明する。図５、図６は反応検出装置１から処理装置Ｃに送られてくる検出データの画像である。各画像で白く映っている９６個の丸画像がそれぞれのウエル７Ａ内のＰＣＲプロダクトから発せられた蛍光である。尚、実施例では、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標）をベースとし、ＰＣＲ  Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒと、ＰＣＲ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒと、Ｔｅｍｐｌａｔｅ（初期値として与えるλＤＮＡ）と、ｄＨ2Ｏ  から反応溶液を調整する。また、図５、図６では上半分の４８個のウエル７Ａ内に０．２ｐｇ／μＬの濃度の反応溶液が分注されており（Ｘグループ）、下半分の４８個のウエル７Ａ内にはその倍の濃度の０．４ｐｇ／μＬの反応溶液が分注されている（Ｙグループ）。そして、温度サイクルは４０回である。
【００５０】
反応開始から温度サイクルの回数が進むと、ＤＮＡの増幅量に応じて蛍光強度が増加する。この過程をプロットしたものが前述した図７の増幅曲線である。この増幅曲線は各ウエル７Ａ毎に得られ、ディスプレイ３４に表示される（図８）。そして、キーボード（マウス）３３を用いて指数関数的増幅領域（図７の（５））に閾値Ｔｈ（図７の（１１））を設定すると、そのときのサイクル数Ｃｔ（閾値サイクル数Ｃｔ）はこの図では２４．５と読み取れる。この閾値サイクル数Ｃｔと検査試料の初期ＤＮＡ量との間には相関関係があり、この直線関係を示す検量線を作成できる。演算処理部３１はこの検量線をもとに検査試料の初期ＤＮＡ量を推定する。これにより、ＰＣＲの増幅速度論に基づいた正確な定量が可能となる。
【００５１】
（Ａ）装置上の誤差要因の除去
前述した如く反応開始前において、反応検出装置１のカメラ２７で撮影された画像データでは、各ピクセルの輝度は必ずしも一定では無く、図４の（１）に示すように光学系の汚れや迷走光などにより斑が発生する。反応が進むとこの斑は図５の（２）に示すようにウエル７Ａの画像に重なってウエル７Ａ本来の蛍光強度に冗長されてしまう。
【００５２】
そこで、処理装置Ｃの演算処理部３１では、ウエル本来の蛍光強度を求めるために次の処理を実行する。即ち、例えば図６の右から２番目で且つ上から二段目（Ｂ１１）のウエル７Ａの場合、当該Ｂ１１のウエル７Ａ（図６の（４））の蛍光測定値［ＤＮＡ］ｒａｗＢ１１を測定し、記憶装置３２に記憶する。次に、当該Ｂ１１のウエル７Ａの近傍の連結壁部分における周囲４点の蛍光測定値［ＤＮＡ］ｂｇ１、［ＤＮＡ］ｂｇ２、［ＤＮＡ］ｂｇ３、［ＤＮＡ］ｂｇ４を測定し、これら４点の蛍光測定値の平均値（背景の蛍光測定値）を求めて記憶装置３２に記憶する。そして、式（２）の如く蛍光測定値［ＤＮＡ］ｒａｗＢ１１からこの平均値を差し引くことで、Ｂ１１のウエル７Ａ本来の蛍光強度［ＤＮＡ］ｒｅａｌＢ１を算出する。
［ＤＮＡ］ｒｅａｌＢ１１＝［ＤＮＡ］ｒａｗＢ１１−（（［ＤＮＡ］ｂｇ１＋［ＤＮＡ］ｂｇ２＋［ＤＮＡ］ｂｇ３＋［ＤＮＡ］ｂｇ４）／４）  ・・・・（２）
【００５３】
この処理を蛍光測定値［ＤＮＡ］ｒａｗの検出の都度、９６個全てのウエルについてそれぞれ実行し、全てのウエル７Ａ本来の蛍光強度［ＤＮＡ］ｒｅａｌを決定する。これにより、各ウエル７Ａ（反応領域）毎に当該ウエル７Ａ及びその周辺の光透過性の誤差や汚れ、迷走光による背景の蛍光測定値［ＤＮＡ］ｂｇを除外した当該ウエル７ＡのＤＮＡプロダクト本来の蛍光強度［ＤＮＡ］ｒｅａｌが得られる。
【００５４】
従って、正確な増幅曲線の作成と定量化を実現することが可能となる。この場合、従来例で説明した第２の蛍光信号を用いる必要も無く、処理装置Ｃにおける演算処理のみで済むので、コストの高騰や作業性の悪化も発生せず、データの取得と処理に要する時間を短縮することができるようになる。
【００５５】
尚、実施例ではウエル７Ａの周囲４点の蛍光測定値［ＤＮＡ］ｂｇ１、［ＤＮＡ］ｂｇ２、［ＤＮＡ］ｂｇ３、［ＤＮＡ］ｂｇ４を測定してその平均値を蛍光測定値［ＤＮＡ］ｒａｗから差し引いたが、それに限らず、１点或いは２点若しくは３点の平均でもよい。但し、実施例のように４点の平気値を用いれば、より正確は背景の蛍光強度を算出して精度の高い蛍光強度［ＤＮＡ］ｒｅａｌの決定を行うことができるようになる。また、実施例ではウエル７Ａ周囲４点の蛍光測定値の単純平均を使用したが、それに限らず、汚れ具合の斑も考慮し、各点毎に所定の重み付けを行った後に平均してもよい。
【００５６】
また、反応前と反応後で背景の蛍光強度の変動（ドリフト）は明確ではない。しかしながら、実施例では蛍光測定値［ＤＮＡ］ｒａｗの検出の都度、蛍光測定値［ＤＮＡ］ｂｇ１〜［ＤＮＡ］ｂｇ４を検出し、蛍光測定値［ＤＮＡ］ｒａｗから蛍光測定値［ＤＮＡ］ｂｇ１〜［ＤＮＡ］ｂｇ４の平均値を差し引き、蛍光強度［ＤＮＡ］ｒｅａｌを決定しているので、反応中に背景の蛍光強度が変動しても、常にＤＮＡプロダクト本来の蛍光強度［ＤＮＡ］ｒｅａｌをリアルタイムで精度良く得ることができる。
【００５７】
（Ｂ）正規化１
次に、図８は９６個の全てのウエル７Ａの増幅曲線を示している。横軸は温度サイクル数、縦軸は蛍光強度である。前述した如く図５、図６の上半分のＸグループと下半分のＹグループで濃度の異なる反応溶液が分注してある関係上、本来ならば反応曲線は２本の線に見えなければならない。また、閾値サイクル数Ｃｔも２点となるはずである。しかしながら、前述した光学系の誤差、校正溶液の濃度誤差、校正溶液の分注誤差や反応溶液の分注誤差などの装置上の誤差要因により、各ウエル７Ａの増幅曲線はバラツキ、閾値サイクル数Ｃｔも（８）、（９）のように複数生じる（バラツキ）。
【００５８】
そこで、演算処理部３１はキーボード（マウス）３３からの所定の選択指令に基づき、データの正規化を行う。即ち、演算処理部３１は、温度サイクル数ｎ毎に決定して記憶装置３２に記憶している蛍光強度［ＤＮＡ］ｎ（温度サイクル数ｎ回目の本来の蛍光強度［ＤＮＡ］ｒｅａｌ）と、各ウエル７Ａ毎の蛍光強度の最大値［ＤＮＡ］ｍａｘ（温度サイクル数ｎ回目までの蛍光強度［ＤＮＡ］ｒｅａｌのうちで最大のもの。記憶装置３２に記憶されている。）と、比較対象とするウエル７Ａ（実施例では全ウエル７Ａ）に共通する値Ｚを用い、式（３）の演算により正規化された蛍光強度［ＤＮＡ］ｎＮを得る。
［ＤＮＡ］ｎＮ＝［ＤＮＡ］ｎ／（［ＤＮＡ］ｍａｘ＋Ｚ）    ・・・（３）
【００５９】
この処理により、各ウエル７Ａの蛍光強度は正規化される。図９はＺ＝０の場合である。この正規化により、各ウエル７Ａの装置上の誤差要因に伴う蛍光強度のバラツキが補正低減されるので、Ｘグループ、Ｙグループそれぞれで閾値サイクル数Ｃｔのバラツキが図８の場合に比して低減される。これにより、確度の高い閾値サイクル数の算出が可能となる。尚、図９では全体のスケールを適当な値にするために［ＤＮＡ］ｎＮに全ウエル共通の値を乗算して表示している。
【００６０】
（Ｃ）正規化２
ここで、サイクル後期のプラトー領域で蛍光強度がばらつく要因としては、上述した装置上の誤差要因だけでなく、ケミカルな反応のバラツキによっても発生する。そして、その要因に関しては指数関数的増幅領域の蛍光強度に比例的に影響しないことが考えられる。即ち、プラトー効果の領域での蛍光強度を完全に一致させないほうが良い場合もある。
【００６１】
その場合は、キーボード（マウス）３３を用いて式（３）のＺの値を大きくする。図１０はＺ＝２００００とした場合の各ウエル７Ａ毎の増幅曲線を示している。Ｚの値を大きくすると云うことは、正規化の効果を弱くしていることになる。しかしながら、図１０では特にサイクル中期から後期の増幅曲線の挙動が実際の蛍光強度の動き（図８）に近似していることが分かる。一方で、閾値での補正効果は充分確保されていることが分かる。これにより、正規化の効果を抑制して、閾値での補正効果を充分確保しながら、サイクル中期から後期の増幅曲線を実際のデータに近似させ、装置上の誤差要因以外の要因に伴うデータの挙動把握を容易にすることができるようになる。
【００６２】
ここで、このような不完全な正規化を行う際には、式（４）のようにＺの値を決定してもよい。
Ｚ＝α［ＤＮＡ］ｍａｘ＋β    ・・・（４）
α、βは各ウエル７Ａに共通する係数。
また、演算処理部３１は前述した最大値［ＤＮＡ］ｍａｘを、蛍光強度の移動平均で算出している。なぜならば蛍光強度［ＤＮＡ］ｒｅａｌは実際にはのこぎり状を呈するからである。しかしながら、正規化に使用する最大値としては、このノコギリのピーク値であってもよく、当該ピーク値の例えば９０％などの数値（何れも最大値に関連する値）を使用しても差し支えない。
【００６３】
（Ｄ）ベースラインの補正
ここで、図８の（１０）はサイクル初期で反応結果を検出できないレベルの領域であるが、ウエル７Ａ内の反応溶液そのものが最初から一定の蛍光を発生しているので、この領域でも一般的には蛍光強度は０では無い。そこで、キーボード（マウス）３３からの指示に基づき、演算処理部３１はベースラインの補正を行う。即ち、演算処理部３１は、サイクル初期の領域（１０）での各ウエル７Ａの蛍光強度の平均値［ＤＮＡ］ｂａｓｅをベースラインとし、この平均値を前述した［ＤＮＡ］ｎ及び［ＤＮＡ］ｍａｘから差し引いてから上述した正規化の処理を行っている。図９、図１０で初期の蛍光強度が０となっているのは、この処理を行っているためである（［ＤＮＡ］ｂａｓｅは［ＤＮＡ］ｎの最小値を使用しても差し支えない）。
【００６４】
これにより、ウエル７Ａ内の反応溶液そのものから発生する蛍光の強度を排除したＰＣＲプロダクトそのものからの蛍光強度の状況を把握することができるようになる。
【００６５】
尚、上記実施例で示した物質、量、数はそれに限定されるものでないことは云うまでもない。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】本発明の実施例のリアルタイム検出装置の構成図である。
【図２】図１のリアルタイム検出装置を構成する反応検出装置の縦断側面図である。
【図３】図２の反応検出装置の平断面図である。
【図４】反応容器の背景の蛍光強度の状態を示す図である。
【図５】反応後の蛍光強度の状態を示す図である。
【図６】反応後の蛍光強度の状態を示すもう一つの図である。
【図７】或るウエルのＤＮＡ増幅曲線である。
【図８】全ウエルのＤＮＡ増幅曲線である。
【図９】図８のデータを正規化した場合のＤＮＡ増幅曲線である。
【図１０】図８のデータの不完全な正規化を行った場合のＤＮＡ増幅曲線である。
【図１１】図１のリアルタイム検出装置を構成する処理装置の機能ブロック図である。
【符号の説明】
【００６７】
１  反応検出装置
７  反応容器
７Ａ  ウエル（反応領域）
１０  ペルチェ素子
２７  カメラ
３１  演算処理部
３４  ディスプレイ
Ｃ  処理装置
Ｒ  リアルタイム検出装置
【図１】
2007236219.tif 000003
【図２】
2007236219.tif 000004
【図３】
2007236219.tif 000005
【図１１】
2007236219.tif 000006
【図４】
2007236219.tif 000007
【図５】
2007236219.tif 000008
【図６】
2007236219.tif 000009
【図７】
2007236219.tif 000010
【図８】
2007236219.tif 000011
【図９】
2007236219.tif 000012
【図１０】
2007236219.tif 000013