(57)【要約】      （修正有）【課題】強皮症を高い信頼性で診断可能な強皮症の診断方法及びこれに用いる診断薬並びに、強皮症診断マーカーを提供する。【解決手段】特定の配列を有し、検体における強皮症特異的ペプチド断片を検出することを含む強皮症の診断方法。上記ペプチド断片は、補体Ｃ３ｆの断片、特に、特定位のアルギニン残基を欠如したＣ３ｆ群の断片、メチル化されたアミノ酸残基を有する補体Ｃ４の断片、アポリポプロテインＪの断片であることが好ましく、複数の特定の配列からなるいずれか１つで示されるアミノ酸配列を有するものであることが更に好ましい。このペプチド断片を検出する検出試薬を主成分として、強皮症の診断薬や強皮症診断マーカーに利用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体における強皮症特異的ペプチド断片を検出することを含む強皮症の診断方法。
【請求項２】
前記ペプチド断片が、１３２０位のアルギニン残基を欠如したＣ３ｆ群の断片であることを特徴とする請求項１記載の強皮症の診断方法。
【請求項３】
前記ペプチド断片が、配列番号１〜３の少なくともいずれか１つのアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする請求項１又は２記載の強皮症の診断方法。
【請求項４】
前記ペプチド断片が、メチル化されたアミノ酸残基を有する補体Ｃ４断片であることを特徴とする請求項１記載の強皮症の診断方法。
【請求項５】
前記ペプチド断片が、アポリポプロテインＪの断片であることを特徴とする請求項１記載の強皮症の診断方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載のペプチドの断片を検出する検出試薬を主成分とする強皮症の診断薬。
【請求項７】
前記検出試薬が抗体であることを特徴とする請求項６記載の強皮症の診断薬。
【請求項８】
請求項１〜５記載の強皮症特異的ペプチド断片である強皮症診断マーカー。
【請求項９】
上記ペプチド断片が、配列番号１〜３、４及び５のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項８記載の強皮症診断マーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、強皮症の診断方法、強皮症の診断薬及び強皮症診断マーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
強皮症（systemic sclerosis）は、原因不明の疾患であり、皮膚や多内部臓器の繊維化、小血管の機能的・構造的異常、液性及び細胞性免疫の異常を特徴とする疾患である。強皮症の根本的な治療方法は充分に確立されてなく、その一方で、種々の症状を示すため、強皮症であるか否かの診断はその後の対応を決定する上でも重要となる。
強皮症の診断には、現在、血清マーカーとして抗トポイソメラーゼＩ抗体、抗セントロメア抗体などの自己抗体が用いられている（非特許文献１）。
また強皮症患者に特異的に検出可能な抗体として、抗ＲＮＡポリメラーゼ抗体が報告されている（非特許文献２及び特許文献１）。この抗ＲＮＡポリメラーゼ抗体は、欧米白人強皮症患者では２０〜３０％の陽性頻度になっているが、日本人強皮症患者では約５％の陽性頻度にすぎない。
【非特許文献１】Arthritis Research & Therapy (2003) Vol.5, pp.80-93
【非特許文献２】Arthritis Rheum, (1994) Vol.37, pp.902-906
【特許文献１】特開２００３−１９４８１４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、これら強皮症に特異的とされる自己抗体は２０〜３０％以下の出現率であり、これらの検出されない強皮症患者も多く存在するなど、診断マーカーとして充分でない。そのため、自己抗体に限らず、強皮症の診断マーカーとして有用な物質あるいは指標が求められている。
従って、本発明の目的は、高い信頼性で強皮症を診断可能な強皮症の診断方法及びこれに用いる診断薬並びに、強皮症診断マーカーを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、上記課題について鋭意検討した結果、強皮症の患者からの検体に高頻度で検出可能な特定の強皮症特異的ペプチド断片が存在することを見出し、本発明を完成させた。
本発明の強皮症の診断方法は、検体における強皮症特異的ペプチド断片を検出することを含むことを特徴としている。
本発明の強皮症の診断薬は、強皮症特異的ペプチド断片を検出する検出試薬を主成分とすることを特徴としている。
ここで、上記ペプチド断片としては、１３２０位のアルギニン残基を欠如したＣ３ｆ群の断片、メチル化されたアミノ酸残基を有する補体Ｃ４断片、アポリポプロテインＪの断片を挙げることができる。
また、本発明の強皮症診断マーカーは、上記強皮症特異的ペプチド断片であることを特徴としている。ここで本強皮症診断マーカーは、配列番号１〜３、５及び６のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を有するものであることが好ましい。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によれば、検体における強皮症特異的ペプチド断片を検出するので、高い信頼性で強皮症を診断可能な強皮症の診断方法及びこれを用いる診断薬並びに、強皮症診断マーカーを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明の強皮症の診断方法は、検体における強皮症特異的ペプチド断片を検出することを特徴としている。
ここで本発明における「ペプチド断片」とは、１００００ダルトン以下の分子量を有するポリペプチドをいい、好ましくは、質量分析などを用いた場合の検出容易性の観点から３０００ダルトン以下の分子量を有するポリペプチドをいうことができる。
このような強皮症特異的ペプチド断片としては、１３２０位のアルギニン残基を欠如する補体Ｃ３ｆ（Ｄｅｓ−Ａｒｇ−Ｃ３ｆ）、メチル化されたアミノ酸残基を有する補体Ｃ４断片及びアポリポプロテインＪの断片を挙げることができる。
【０００７】
補体Ｃ３ｆは、１位から２３位までのシグナルペプチドを含む１６６３個のアミノ酸で構成された補体Ｃ３前駆体ペプチドの分解物である。Ｃ３前駆体は、生体内で段階的に分解されて断片化することが知られており、補体Ｃ３ｆは、Ｃ３ｂ（７４９位から１６６３位のペプチド）から生成される。このうち、本発明にかかる強皮症特異的ペプチド断片は、１３０６位から１３１９位（配列番号１）、１３０５位から１３１９位（配列番号２）及び１３０４位から１３１９位（配列番号３）のものである。これらはいずれも、補体Ｃ３ｆとして認識されている１３０４位から１３２０位のアルギニンまでを含む断片（配列番号４）が更にカルボキシペプチダーゼによって分解されて得られた１３２０位のアルギニン残基を欠如するペプチド断片である。補体Ｃ３ｆ断片（配列番号４）は、平滑筋を収縮させること及び血管透過性を上昇させることが知られているが、強皮症との関連は報告されていない。１３２０位のアルギニンを欠いたペプチド（１３０４位から１３１９位）に関しては、血管透過性を上昇させるとの報告があるだけで、強皮症との関連性に関する報告はされていない。
また、配列番号３については、１３２０位のアルギニン残基以外であれば、上記補体Ｃ３ｆの配列番号１〜３で示されるアミノ酸残基に１以上のアミノ酸残基が付加されたものであってもよい。ここで付加されるアミノ酸残基は、いずれのものであってもよいが、Ｎ末側に付加されるアミノ酸残基に関しては、元々の補体Ｃ４において、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するペプチド断片に連続しているものであることが好ましい。
【０００８】
また、メチル化されたアミノ酸残基を有する補体Ｃ４断片（Ｃ４ａｄｇ）は、補体Ｃ４の分解によって生成されるペプチド断片である。そのアミノ残基配列は配列番号５で示されるものであり、さらにそのうちのひとつのアミノ残基がメチル化されている。このメチル化されたＣ４ａｄｇ断片について、これまで強皮症との関連性は報告されていない。
メチル化されているアミノ酸残基は、配列番号５で示されるアミノ酸配列中のアミノ酸のうちのいずれかひとつであり、メチル化可能なアミノ酸残基は、メチル化可能な側鎖を有するアミノ酸残基又はペプチド断片のＮ末端にあるアミノ酸残基であればよい。従って、メチル化可能なアミノ酸残基は、配列番号５で示されるアミノ酸残基のうち、Ｔ（スレオニン）、Ｎ（アスパラギン）、Ｒ（アルギニン）、Ｉ（イソロイシン）、Ｌ（ロイシン）のうちのいずれかひとつであればよい。
また、配列番号５で示されるアミノ酸残基に１以上のアミノ酸残基が付加されたものであってもよい。ここで付加されるアミノ酸残基は、いずれのものであってもよいが、元々の補体Ｃ４において、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するペプチド断片に連続しているものであることが好ましい。
【０００９】
アポリポプロテインＪは、補体活性化の調節、細胞保護作用、脂質転送、アポトーシスの調節などの機能の報告がある蛋白質である。本発明にかかるアポリポプロテインＪの断片としては、アポリポプロテインＪの分解産物であるペプチドのうち、特に配列番号６で示されるアミノ酸配列を示すものである。このようなペプチド断片としては、配列番号６で示されるアミノ酸残基を有するものであればよく、その前後に１以上のアミノ酸残基が付加されたものであってもよい。ここで付加されるアミノ酸残基は、いずれのものであってもよいが、元々のアポリポプロテインＪにおいて、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するペプチド断片に連続しているものであることが好ましい。
【００１０】
これらの強皮症特異的ペプチド断片は、いずれも本発明にかかる強皮症診断マーカー（診断用ペプチド）として使用することができ、配列番号１〜３、５及び６で示される上記ペプチド断片であることが、強皮症診断を高い精度で診断するために好ましい。これらの配列番号１〜３、５及び６で示される上記ペプチド断片には、上述の通り、１以上のアミノ酸が付加されていてもよい。
【００１１】
本発明における強皮症の診断方法では、上記強皮症特異的ペプチド断片のうち、いずれか１つ又は複数を検出することによって診断してもよく、診断の信頼性を高めるために複数を用いることが好ましい。この場合、組み合わせて検出の対象とすることができるペプチド断片としては、いずれであってもよい。
【００１２】
検体としては、血清、血漿および尿等を挙げることができるが、簡便に検出するためには、血清であることが好ましい。
【００１３】
本発明における強皮症特異的ペプチド断片の検出は、このようなペプチド断片を検出する際に通常用いられる手段をそのまま適用することができる。例えば、抗体を用いた抗体検出方法としては、放射免疫分析法（ＲＩＡ）、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫分析法、免疫ブロット分析法等を挙げることができ、１種の抗体を用いた直接検出方法であっても、２種以上の抗体を用いたサンドイッチ法であってもよい。
また、質量分析を用いた検出方法として飛行時間型質量分析装置や３連四重極型質量分析装置等、あるいはアミノ酸分析による検出方法としてエドマン分解によるアミノ酸配列決定装置など、ペプチド断片の配列決定に用いることができるものであれば、いずれも挙げることができる。
【００１４】
検体の種類によっては、検出の際に前処理を行ってもよい。このような前処理としてはフィルターによる高分子蛋白の除去あるいは検体の濃縮等を挙げることができる。
【００１５】
本発明の診断薬は、上記強皮症特異的ペプチド断片を検出する検出試薬を主成分とすることを特徴としている。
このような検出試薬としては、上記強皮症特異的ペプチド断片に対する抗体であることが好ましい。このような抗体は、上記強皮症特異的ペプチド断片、好ましくは配列番号１〜３、５及び６で示されるアミノ酸配列のペプチド断片を免役することにより常法に従って容易に作成することができる。抗体は、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよく、いずれであっても公知の方法に従って作成することができる。
なお、検出試薬として抗体を用いた場合には、容易に検出可能とするため、蛍光試薬や放射性同位元素などの標識試薬で標識化してもよく、このような標識試薬による標識化も当業者には容易に実施することができる。
【００１６】
また、上記強皮症特異的ペプチド断片に対する抗体は、固相に結合したものであってもよい。これにより、強皮症特異的ペプチド断片をより効率よく検出することができる。この用途に用いられる固相としては、粒子状、板状等のいずれの形態であってもよく、ガラス、メチルセルロース、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、セルロース、アガロース等を挙げることができる。
このような固相結合抗体は、緩衝剤、希釈剤、蛍光標識化剤、酵素基質等と共に、診断キットを構成してもよい。
【実施例】
【００１７】
以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。また実施例中の％は、特に断らない限り、重量（質量）基準である。
【００１８】
強皮症特異的ペプチド断片の特定は、強皮症患者および対照疾患患者、さらに健常人より採取した血清から、Ｃ１８樹脂を用いて、その血清試料中に含まれているペプチドを精製濃縮する。さらに、質量分析計にてそのペプチドを検出する。検出されたペプチドのイオン化強度を各グループ間で比較し、強皮症患者特異的に出現するペプチドを検出する。さらにそのアミノ酸配列を質量分析計によるde novo アミノ酸配列決定法で決定した。以下、詳細に説明する。
【００１９】
まず、強皮症（ＳＳｃ）患者４２名、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者３０例、関節リウマチ（ＲＡ）患者２１例、変形性関節症（ＯＡ）患者３０例、および２６例の健常者（ＮＣ）より、血液を採取し、血清を調整した。
Ｃ１８樹脂の結合した磁気ビーズ（Magnetic Beads Based Hydrophobic Interaction Chromatography、ブルカー社製：以下、ＭＢ−ＨＩＣ１８）の溶液をよくかき混ぜた後、その５μＬをプラスチックチューブにとり、これにＭＢ−ＨＩＣ結合溶液１０μＬを加え、ピペッティング操作により混和した。
次にこの混合溶液に血清を５μＬ加え、同様にピペッティング操作により混和した。その混合溶液を２分間静置し、Ｃ１８樹脂に血清中のペプチドを結合させた。その後、専用の磁気ビーズ分離装置にそのチューブを入れ、ペプチドの結合したＭＢ−ＨＩＣ１８磁気ビーズをチューブ壁面に集め、溶液部分を取り除いた。
【００２０】
ＭＢ−ＨＩＣ１８磁気ビーズを含むチューブに、ＭＢ−ＨＩＣ洗浄溶液を１００μＬ加え、磁気ビーズ分離装置にチューブをセットし、隣接した穴にチューブを前後に２０回移動させて、更に、試料を洗浄した。上記と同様に磁気ビーズ分離装置を用い、ペプチドの結合したＭＢ−ＨＩＣ１８磁気ビーズをチューブ壁面に集め、溶液部分を取り除く工程を５回繰り返す。
チューブを磁気ビーズ分離装置からはずし、これに５μｌの５０％アセトニトリルを加え、ピペッティング操作により、ＭＢ−Ｃ１８磁気ビーズを懸濁させる。
再度、磁気ビーズ分離装置にいれ２分間放置し、ＭＢ−Ｃ１８磁気ビーズを壁面に集める。上清を新しいチューブに移した後、溶出液１μＬとマトリックス溶液（α-cyano-4-hydroxy-ciannamic acid；ＨＣＣＡ  ０．３ｇ／Ｌ  ｉｎエタノール：アセトン  ２：１(v/v)）１０μＬを混和し、うち１μＬを試料台（ブルカー社、Anchor Chip）に載せ、乾固する。
さらに再結晶溶液（エタノール：アセトン：０．１％ＴＦＡ＝６：３：１）を１μＬ載せ、乾固する。
【００２１】
試料を載せた試料台をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（ブルカー社製、ultraflex）にセットし、測定を行う。試料台上のサンプルスポットにレーザーを照射することで、イオン化させたペプチドの質量を測定する。
得られたスペクトルデータは ClinProTools（登録商標）ソフトウェア（ブルカー社製）を用いてスペクトルの発現パターンを各グループ間で比較し、強皮症患者特異的に出現するペプチドを検出する。
ClinProToolsソフトウェアにより見出されたバイオマーカー候補ペプチドは、さらにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を用いて、同じ試料スポットからスペクトルを選択し続けてＭＳ／ＭＳ測定、解析をしてアミノ酸配列を決定する。
結果を図１並びに表１に示す。図１において実線が強皮症患者の血清を示している。また表２は、得られたデータに基づいて強皮症患者における各ペプチド断片の検出頻度を示している。
【００２２】
【表１】
2007185114.tif 000002
【００２３】
【表２】
2007185114.tif 000003
【００２４】
図１に示されるように、ピーク（分子量）１８６４、１７７７、１６９０、２５６５、１５３０のペプチド断片は、健常者（ＮＣ：図１（Ａ）、破線）、全身性エリテマトーデス患者（ＳＬＥ：図１（Ｂ）、破線）、リウマチ患者（ＲＡ：図１（Ｃ）、破線）並びに変形性関節症（ＯＡ：図１（Ｄ），破線）と比較して、強皮症患者（ＳＳｃ：図１実線）の血清に特異的に検出された。これらのペプチド断片のアミノ酸配列決定から、それぞれ補体Ｃ３ｆ群（配列番号１〜３）と、メチル化補体Ｃ４ａｄｇ（配列番号５）及びアポリポプロテインＪ（配列番号６）であることがわかった。
【００２５】
特に、表２で明らかなように、配列番号１で示されるアミノ酸配列のペプチド断片は、健常者での強度と比較して１９倍であるのに対して、ＲＡ及びＯＡではほとんど差がなく（１．０２及び０．７６）、強皮症患者での特異性は特に高い。これに対してアルギニン残基を有する配列番号４のペプチド断片（ピーク２０２１）は、ＲＡ、ＯＡと同程度の相関性しかなかった。従って、１３２０位のアルギニン残基の有無に基づいて、高い精度で強皮症を診断できることが明らかであった。
【００２６】
また表２から、強皮症患者に特異的に検出されたペプチド断片（ピーク１８６４、１７７７、１６９１、２５６５、１５３０）の強皮症患者での検出頻度は、いずれも５割以上であり、特にピーク１７７７のペプチド断片（配列番号２）及びピーク１８６４のペプチド断片（配列番号１）は、強皮症患者の９０％で検出されていることが明らかとなった。このように本発明のペプチド断片を用いることによって、高い精度で強皮症を診断することができる。
【００２７】
また、配列番号１〜３、５及び６はいずれも強皮症の診断マーカーとして用いることができる。診断マーカーとして使用する場合には、被検者の検体を対象に、配列番号１〜３、５及び６で表されるアミノ酸配列のペプチドの検出を実施する。これにより、高い信頼性で強皮症の診断を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の実施例にかかる患者血清をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析で解析して得られたペプチドピークであり、（Ａ）は強皮症患者（実線）と、健常者（破線）、（Ｂ）は強皮症患者（実線）と全身性エリスマトーデス患者（破線）、（Ｃ）は強皮症患者（実線）と関節リウマチ患者（破線）、（Ｄ）は強皮症（実線）と変形関節炎患者（破線）のものをそれぞれ比較したものである。
【図１】
2007185114.tif 000004
【配列表】
2007185114000001.app