(57)【要約】【課題】炎症や２型糖尿病などのNF―κBに関与する疾患の予防及び治療に使用することができる安全性の高いＮＦ−κＢ活性化阻害剤を安価に提供する。【解決手段】下記化１の化学構造式（該式中、Ｒ１はヒドロキシ基を示し、Ｒ２はヒドロキシ基、メトキシ基あるいはアルコキシ基を示し、Ｒ３はトリテルペンからなるエステルおよびその塩類を表す。）で表される化合物またはその塩類を有効成分とするＮＦ−κＢ活性化阻害剤。【化１】2007332070.tif 000005【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化１の化学構造式（該式中、Ｒ１はヒドロキシ基を示し、Ｒ２はヒドロキシ基、メトキシ基あるいはアルコキシ基を示し、Ｒ３はトリテルペンを示す。）で表される化合物またはその塩類を有効成分とするＮＦ−κＢ活性化阻害剤。
【化１】
2007332070.tif 000004
【請求項２】
ヒドロキシ桂皮酸誘導体トリテルペンアルコールエステルまたはそれらの塩類を有効成分とする請求項１に記載のＮＦ−κＢ活性化阻害剤。
【請求項３】
シクロアルテニルフェルレートまたはそれらの塩類を有効成分とする請求項１又は２に記載のＮＦ−κＢ活性化阻害剤。
【請求項４】
βシトステリルフェルレートまたはそれらの塩類を有効成分とする請求項１又は２に記載のＮＦ−κＢ活性化阻害剤。
【請求項５】
スティグマステリルフェルレートまたはそれらの塩類を有効成分とする請求項１又は２に記載のＮＦ−κＢ活性化阻害剤。
【請求項６】
２４−メチレンシクロアルテニルフェルレートまたはそれらの塩類を有効成分とする請求項１又は２に記載のＮＦ−κＢ活性化阻害剤。
【請求項７】
カンペステリルフェルレートまたはそれらの塩類を有効成分とする請求項１又は２に記載のＮＦ−κＢ活性化阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症、２型糖尿病などの疾患の予防や治療に使用することができるＮＦ−κＢ活性化阻害剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の発現は、転写調節因子というＤＮＡ結合タンパク質がＤＮＡの特異的配列（応答配列）に結合することによって制御されている。転写調節因子として知られるNuclear Factor kappa B (ＮＦ−κＢ)は、免疫グロブリンkappa鎖遺伝子のエンハンサーに結合するＢ細胞に特異的な因子として同定された。その後、各種炎症に関連するサイトカインや受容体のプロモーター領域に結合することでこれらの遺伝子の発現を制御し、免疫応答や炎症などをコントロールする重要な転写調節因子として重要な働きをしていることが明らかになってきた。ＮＦ−κＢは、このように、免疫応答や炎症などの病態形成に重要な働きを持ち、ＮＦ−κＢ活性化を阻害する化合物はこれらの病態の改善および治癒に有用である。
【０００３】
このため、ＮＦ−κＢの活性化を阻害する薬物の探索が進められ、非ステロイド系抗炎症剤であるアスピリンやサリチル酸ナトリウムが比較的高濃度域でＮＦ−κＢの活性化を阻害する作用を有すること、プリン系化合物であるキサンチン誘導体がＮＦ−κＢ活性化阻害を起こすこと、ステロイド系化合物であるデキサメタゾンがＮＦ−κＢ活性化阻害を起こすこと、ウコンの成分であるクルクミンがＮＦ−κＢ活性化阻害を示すこと、プロポリスの成分である桂皮酸フェネチルエステルがＮＦ−κＢ活性化阻害を示すことなどが報告されている。
【０００４】
また、活性化されたＮＦ−κＢは脂肪細胞の分化誘導を制御し、脂質代謝全体を制御する核受容体型転写調節因子パーオキシゾーム増殖剤活性化受容体（ＰＰＡＲγ）の活性を阻害することが明らかにされている。
【０００５】
ところで、本発明に係るＮＦ−κＢ活性化阻害剤は、下記化１に示すような化学構造式の化合物からなり、この化合物はフェニル基を有するプロピオン酸誘導体にトリテルペンアルコールがエステル結合をした基本構造をしている。
【０００６】
【化１】
2007332070.tif 000002
【０００７】
以下、この化合物について化学構造の観点から従来技術について述べる。化１において、Ｒ１がヒドロキシ基、Ｒ２がメトキシ基、Ｒ３がトリテルペンである化合物は、総称としてγ−オリザノールと呼ばれ、特許３４９３４５９号において皮脂分泌作用等を有するとされているが、その作用機序についてはまったく触れられておらず、本発明で主張するＮＦ−κＢ活性化阻害作用についてはなんら記載されていない。
【０００８】
Akihisaらは後述する非特許文献１で、γ−オリザノールの成分がホルボールエステルを用いて起こさせたマウス耳の炎症に対して抗炎症作用を示すことを報告しているが、ＮＦ−κＢ活性化阻害作用についてはなんら記載されていない。
【０００９】
また、 Ｒ１がヒドロキシ基、Ｒ２がメトキシ基、Ｒ３が水素である遊離フェルラ酸の誘導体については、後述する非特許文献２において抗酸化性物質として記載されているが、ＮＦ−κＢ活性化阻害作用についてはまったく触れられていない。
【００１０】
また、本発明の化合物は広く食用植物界に分布する化合物であり、これまでの長い食経験でその安全性が確認されているものであるが、これまでＮＦ−κＢ活性化阻害作用については述べられたことがない。  
【特許文献１】特許第３４９３４５９号公報
【特許文献２】特表２００５−５０１０４３号公報
【非特許文献１】Akihisa, T., Yamaura, K., Ukiya, M., Kimura, Y., Shimizu, N., Arai, K. Triterpene alcohol and sterol ferulates from rice bran and their anti-inflammatory effects. J. Agric. Food Chem., 48, 2313-2319 (2000)
【非特許文献２】Rice-Evans, C.A., Miller, N.J, Paganga, G. Structure-anitioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids. Free Radical Biology & Medicine, 20, 933-956 (1996).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、炎症、２型糖尿病などの疾患の予防や治療に使用することができる安全性の高いＮＦ−κＢ活性化阻害剤を提供する点にある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明に係るＮＦ−κＢ活性化阻害剤は、下記の化１で表される化合物またはその塩類を有効成分とするものである。
【００１３】
【化１】
2007332070.tif 000003
【００１４】
ここで、化１の化学構造式中、Ｒ１はヒドロキシ基を示し、Ｒ２はヒドロキシ基、メトキシ基あるいはアルコキシ基を示し、Ｒ３はステロールなどのトリテルペン骨格を示す。
【００１５】
化１の代表的な化合物としてはヒドロキシ桂皮酸誘導体トリテルペンアルコールエステルを挙げることができ、好ましい例としては、シクロアルテニルフェルレート、βシトステリルフェルレート、スティグマステリルフェルレート、２４−メチレンシクロアルテニルフェルレートもしくはカンペステリルフェルレートまたはそれらの塩類を挙げることができる。塩類とは、医薬として許容される塩類であればよく、たとえばアンモニウム塩などを挙げることができる。
【００１６】
なお、本発明に係るＮＦ−κＢ活性化阻害剤の投与は、例えば、非経口又は経口等の公知の用法で行うことができる。投与形態としては、非経口剤として用いる場合、その形態は限定されず、例えば、静脈内注射剤（点滴を含む）、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、皮下注射剤、点鼻薬、坐剤、軟膏、クリーム及び塗布液等のいずれであってもよい。さらに、経口剤として用いる場合、その形態は限定されず、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等のいずれであってもよいし、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。
【００１７】
これら各種用法に用いる製剤（経口剤や非経口剤等）は、薬剤製造上一般に用いられる賦形材、充填材、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等を適宜選択して使用し、常法により調製することができる。また、用途として、化粧料、食料、飲料、家畜飼料、ペットフードへの応用が考えられる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に係る化合物は、ＮＦ−κＢの活性化を阻害する作用を有し、ＮＦ−κＢ活性化が関与する幅広い炎症性疾患（潰瘍性大腸炎とクローン病を含む腸炎等）や、アディポネクチンが関与する疾患（例えばインスリン耐性を伴う２型糖尿病）などの予防及び治療に使用することができるという効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
ＮＦ−κＢの活性化を阻害することによって炎症、２型糖尿病などの疾患を予防したり治療するという目的を、長い食経験でその安全性が確認されている穀物（米糠）に含まれている成分を用いることによって実現した。
【００２０】
以下、本発明の実施例を示すが、これらの例は本発明をよりよく理解するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００２１】
［ヒドロキシ桂皮酸誘導体トリテルペンアルコールエステルの抽出例］  クロロホルムメタノール混液を用いて米糠より全脂質を抽出した。得られた抽出液の溶媒を、アセトニトリル(国産化学)、酢酸(国産化学)、蒸留水(国産化学)９４：２：６(v/v)混合溶液に置換し、０．５０μmミクロフィルター(PTFE、ADVANTEC TOYO)でろ過した。
【００２２】
移動相をアセトニトリル(国産化学)、酢酸(国産化学)、蒸留水(国産化学)９４：２：６(v/v)混合溶液とし、固定相を逆相HPLCカラムであるMightysil RP-18 GP250-4.6 3μm(関東化学)、流速を１ｍｌ／ｍｉｎとした高速液体クロマトグラフィーシステムで分離し、RF-10A(島津製作所)にて励起波長３３０ｎｍ、蛍光波長３９０ｎｍの蛍光強度で検出したところ、図１に示す通りの結果が得られた。
【００２３】
図１に示す結果から、ヒドロキシ桂皮酸誘導体トリテルペンアルコールエステルの一種であるシクロアルテニルフェルレート、２４−メチレンシクロアルテニルフェルレート、カンペステリルフェルレート、β−シトステリルフェルレートが米糠中から抽出できたことがわかる。
【実施例２】
【００２４】
［ヒドロキシ桂皮酸誘導体トリテルペンアルコールエステルの合成］  前述した非特許文献１の方法に従い、ヒドロキシ桂皮酸誘導体トリテルペンアルコールエステルの合成を行った。まず、５ｇのtransフェルラ酸および５ｇの無水プロピオン酸（Aldrich）を１５ｍｌのピリジン(Aldrich)に溶解させ、窒素雰囲気下で４８時間撹拌した。得られた１．２ｇの4-プロピオニルフェルラ酸および４００ｍｇのコレステロール(SIGMA）を１００ｍｌのジクロロメタンに溶解し、９００ｍｇの2-chloro-1,3-dimethylimidazolinium（DMC; Aldrich）を加えた。
【００２５】
次いで、十分に冷却しながら２００ｍｇのピリジンをゆっくりと加え、４時間室温で撹拌した。その後、１０００ｍｌの蒸留水を加え、ジクロロメタン層を１０００ｍｌの希塩酸次いで飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。下層を採取して、無水硫酸ナトリウムで脱水後、エバポレーターにて溶媒を除去した。得られた乾固物をクロロホルムに溶解させた後、Slica60プレートに着点し、クロロホルムを展開溶媒とする薄層クロマトグラフィーにて分離した。
【００２６】
３６５ｎｍの紫外光で蛍光を発するとともに５０％硫酸検出で赤色を呈するスポットを掻き取り、シリカをクロロホルム：メタノール（１：１，ｖ／ｖ）溶媒で溶出した。得られたコレステロール4-プロピオニルフェルラ酸エステルに0.1Mの水酸化カリウムメタノール溶液を加え、５０℃で２０分間加水分解を行い、コレステロールフェルラ酸エステルを得た。
【００２７】
また、コレステロールに変えて他のトリテルペンアルコールを用いることにより、その他のヒドロキシ桂皮酸誘導体トリテルペンアルコールエステルを得た。
【実施例３】
【００２８】
［RAW264.7マウスマクロファージ細胞株におけるＬＰＳ刺激によるＮＦ−κＢ活性の測定］  マウスマクロファージRAW264.7細胞を１０%牛胎児血清を含むＤＭＥＭで維持し、１μM cycloartenyl ferulate (CAFを含むＤＭＥＭにて22時間処理した。次いで、１μg/mlリポポリサッカライド (ＬＰＳ)で2時間刺激した。
【００２９】
RAW 264.7細胞の核タンパク質を、Transfactor Extraction kit (BD Biosciences, USA)を用いて抽出し、１００mM HEPES (pH 7.6)，５mM ＥＤＴＡ，５０mM Ammonium Sulfate，５mM DTT，１５０mM KCl，１% (v/v) Tween 20，0.0001% poly (dI-dC) (Amersham Biosciences, USA)からなる反応溶液中で下記に示すＮＦ−κＢのビオチン化応答コンセンサス配列と６０分間結合させた。
【００３０】
ＮＦ−κＢのコンセンサス配列：5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’
【００３１】
これらの実験群以外に、対照として９０倍の非標識コンセンサス配列と反応させたコールド群と、anti-p50ポリクローナル抗体 (Abcam, USA) およびanti-p65 ポリクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology, INC.,USA)を用いたスーパーシフト群を設けた。
【００３２】
結合反応物を１．０ % Tris/borate/ＥＤＴＡ 緩衝液を含む６．０% ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、続いてナイロンメンブレン(Presoak Pall Biodyne B, Whatman, USA)に転写した。転写後のメンブレンを８５℃で３０分間加熱してＤＮＡを架橋してStreptavidin標識ペルオキシダーゼ (SIGMA, USA)と１５分間反応させた。
【００３３】
そして、ペルオキシダーゼ活性をImmobilon Western Chemiluminescent HRP substrate (Millipore, USA)を用いて検出し、発光強度をImage J (National Institutes of Health, USA)を用いて数値化したところ、図２に示す通りとなった。
【００３４】
また、この実施例において、ヒドロキシ桂皮酸誘導体トリテルペンアルコールエステルのひとつであるシクロアルテニルフェルレート(1 μM: ＣＡＦ)と、生体内でのその代謝産物と考えられるフェルラ酸(１μM：FA)の存在下でＮＦ−κＢ活性を調べたところ、図２に示す通りとなった。
【００３５】
図２に示す結果から、RAW264.7細胞は無刺激時においても比較的高いＮＦ−κＢ活性が得られ、ＬＰＳ刺激によりＮＦ−κＢ活性は増加傾向を示すことがわかる。また、フェルラ酸はこのＮＦ−κＢ活性をほとんど抑制しないが、ヒドロキシ桂皮酸誘導体トリテルペンアルコールエステルの一つであるシクロアルテニルフェルレートはＮＦ−κＢ活性を顕著に抑制することがわかる。
【実施例４】
【００３６】
［RAW264.7マウスマクロファージ細胞株におけるＬＰＳ刺激によるiNOSとIL-1β mRNA発現量の半定量的RT-PCR解析］  各刺激を行ったRAW246.7細胞から全RNAをSepazol-RNA (Nacalai tesque Inc., Japan)にて抽出し、２６０ｎｍの吸収強度からＲＮＡ量を定量した。得られた全ＲＮＡから、M-MLV Reverse transcriptase (Promega. USA)、Oligo (dT)12-18 primerおよびRNase inhibitorを含む反応液を用いてcＤＮＡを得た。得られたcＤＮＡにつき、下に示す特異的なプライマーおよびTaq ＤＮＡ polymerase (TaKaRa, Japan)を用いて標的ＤＮＡを増幅した。
【００３７】
なお、ＰＣＲにはホットスタート法を用い、PCR System (Bio-Rad, Japan)を使用して９４℃，５ｍｉｎ反応させたのち、９４℃，１ｍｉｎ，５５℃，１．５ｍｉｎ，７２℃，１ｍｉｎを３５サイクル繰り返した後、７２℃，５ｍｉｎ反応させた。iNOSとIL-1βおよびβ-actin プライマーはそれぞれ４７９，３８７，３７４および３４９bpのフラグメントを増幅した。得られたフラグメントを２%アガロースゲル電気泳動で分離し、臭化エチジウムで染色して、その染色強度をImageJ (National Institutes of Health, USA)にて数値化したところ、図３及び図４に示す通りとなった。
【００３８】
iNOS: forward primer, 5’-GCCTCGCTCTGGAAAGA-3’;
reverse primer 5’-TCCATGCAGACAACCTT-3’;
IL-1β: forward primer, 5’-TGCAGAGTTCCCCAACTGGTACATC-3’
reverse primer 5’-GTGCTGCCTAATGTCCCCTTGAATC-3’
β-actin: forward primer, 5’-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3’
reverse primer 5’-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3’
【００３９】
また、ヒドロキシ桂皮酸誘導体トリテルペンアルコールエステルのひとつであるシクロアルテニルフェルレート(1 μMと10 μM：CAF)の効果について検討したところ、図３及び図４に示す通りとなった。
【００４０】
図３及び図４に示す結果から、RAW264.7細胞は無刺激時においても比較的高いiNOSとIL-1βのｍＲＮＡ発現が認められる。これは、無刺激時での高いＮＦ−κＢ活性に合致した結果と考えられる。また、RAW264.7細胞はＬＰＳ刺激により、iNOSとIL-1βのmRNA発現量がさらに増加することがわかる。これに対し、ヒドロキシ桂皮酸誘導体トリテルペンアルコールエステルのひとつであるシクロアルテニルフェルレート(１μMと１０μM：CAF)はiNOSとIL-1βのmRNA発現を顕著に抑制することがわかる。
【実施例５】
【００４１】
［炎症性腸疾患モデル］  デキストラン硫酸(ＤＳＳ： MW36000-50000, MP Biomedicals)を３%、１％、０．５%溶液になるように蒸留水に溶解し、C57BL/6Jマウス（オス、８週齢）に自由飲水させ、３%ＤＳＳ投与群は投与開始７日目で、１%ならびに０．５%ＤＳＳ投与群は１４日目に安楽死させ、結腸病変部を摘出した。
【００４２】
また、実施例１で示したヒドロキシ桂皮酸誘導体トリテルペンアルコールエステルの混合物であるγ−オリザノールはカルボキシメチルセルロース０．５%と０．０１% Tween20を含む生理食塩水にγ−オリザノールを懸濁液として調整し、５０mg/kg/dayをＤＳＳ自由飲水開始前２日から経口投与を開始した。
【００４３】
Control群：溶媒のみ  6匹
３%ＤＳＳ群：溶媒のみ経口投与＋３%ＤＳＳ自由飲水  ５匹
３%ＤＳＳ+γ−オリザノール群：γ−オリザノール経口投与＋３% ＤＳＳ自由飲水  ５匹
１%ＤＳＳ群：溶媒のみ経口投与＋１%ＤＳＳ自由飲水  ６匹
１%ＤＳＳ+γ−オリザノール群：γ−オリザノール経口投与＋１%ＤＳＳ自由飲水  ６匹
０．５%ＤＳＳ群：溶媒のみ経口投与＋０．５%ＤＳＳ自由飲水  ６匹
０．５%ＤＳＳ+γ−オリザノール群：γ−オリザノール経口投与＋０．５%ＤＳＳ自由飲水  ６匹
【００４４】
1) Disease Activity Index (ＤＡＩ)：  自由飲水開始後、毎日午前中に体重測定、便硬度の触診、血便の有無（潜血判定キット使用）について解析し、下記の規定に基づきDisease Activity Index (ＤＡＩ)を算出した。
(A) 体重減少：なし（0）, 1-5% (1), 5-10% (2), 10-15% (3), >15% (4)
(B) 便の形状：通常 (0), 軟便 (2), 下痢便 (4)
(C) 潜血キット判定：なし(0)、 わずかな緑色(1)、 ３秒以内に緑色(2)、 反応後すぐに鮮緑色(3)、 反応後すぐに暗青色(4)
｛(A)+(B)+(C)｝／３＝ＤＡＩ
【００４５】
2) HE染色：  ３%ＤＳＳ投与群において、ＤＳＳ投与７日目の結腸病変部（横行結腸〜上行結腸）を摘出し、中性ホルマリンにて固定して、HE染色による病理切片を作製した。
【００４６】
3) ミエロペルオキシダーゼ活性 (ＭＰＯ活性)：  結腸病変部（横行結腸〜上行結腸）を摘出し、腸内容物を除去した後、腸管病変部における総タンパク量当たりのＭＰＯ酵素活性を測定し、好中球浸潤の指標とした。
【００４７】
1) ＤＡＩスコアー：  体重は１%ＤＳＳならびに０．５%ＤＳＳ投与群いずれにおいても対照群と比べて有意な差は認められなかった。また、γ−オリザノール投与群においてもそれぞれの対照群と差は認められなかった。
【００４８】
ＤＡＩスコアー評価法において、０．５%ＤＳＳ投与群は対照群と比べて差はなく、ＤＡＩスコアーは０であった。一方、１%ＤＳＳ投与群は、図５に示す通り、ＤＳＳ投与開始後１０日目から便の軟化と軽度の潜血便が認められ、ＤＳＳ投与後１４日目のＤＡＩスコアーは０．７２±０．１３と有意に上昇していた。γ−オリザノール投与群ではＤＡＩスコアーは全ての個体で０となり、有意な病態改善効果が認められた。
【００４９】
2) ＭＰＯ活性：  ＭＰＯ活性は図６に示す通りであり、０．５%ＤＳＳ投与群ならびに１%ＤＳＳ投与群の結腸病変部において、好中球浸潤の指標となるミエロペルオキシダーゼ活性はＤＳＳの濃度に依存して増加することがわかる。また、γ−オリザノール投与群では０．５%ＤＳＳ投与の場合はほぼ完全にＭＰＯ活性を静止レベルまで低下させたが、１%ＤＳＳ投与群においては抑制傾向を示すものの、有意な差は認められないことがわかる。
【００５０】
3) HE染色：  HE染色は図７に示す通りであり、３%ＤＳＳ投与１週間目の結腸病変部は、同図（ｂ）に示す通り、粘膜上皮が脱落し、粘膜下織への炎症性細胞の浸潤と肥厚ならびに筋層部の肥厚が認められる。一方、γ−オリザノール投与群では、同図（ｃ）に示す通り、粘膜下織への炎症性細胞の浸潤は認められるが、明らかに粘膜下織と筋層の肥厚は軽減し、粘膜上皮の脱落もＤＳＳ投与群に比べて軽度であることがわかる。なお、同図（ａ）はcontrolである。
【実施例６】
【００５１】
マウス3T3-L1前駆脂肪細胞（IFO50416, HSRRB）を購入し、24ウェルプレートを用いて、１０%FBS（SIGMA）を含むタルベッコ変法イーグル増殖培地（ＤＭＥＭ）（日水製薬）で培養した。４８ｈごとに培地を交換して細胞を増殖させ、２５cm2フラスコ、７５cm2フラスコへ細胞を継代した。増やした細胞を回収してBICELL（日本冷凍）にて１分約１℃で−８５℃まで冷却し、−８５℃で保存した。
【００５２】
［脂肪細胞への分化］  マウス3T3-L1前駆脂肪細胞を７５cm2フラスコからトリプシン-ＥＤＴＡ（免疫生物研究所）を用いて５０ｍｌプラスチックチューブに回収した。１０００ｒｐｍ、５分間遠心し、上清を除いた。新しい培地を加え、細胞を懸濁させた。細胞液を６ウェルプレートへ分注し、コンフルエントに達するまで培養した。細胞がコンフルエントに達した後、5μg/mlインスリン（和光純薬工業）、0.5mmol/l 3-isobutyl-1-methyl-xanthine（IBMX）（SIGMA）、および１μmol/lデキサメタゾン（和光純薬工業）を加えた分化誘導培地に交換した。４８時間ごとに新しい分化誘導培地に交換し、７日間培養した。その後、増殖培地に交換し、さらに２日間培養した。
【００５３】
［脂肪細胞アディポネクチンへの影響］  １μMγ−オリザノール、１μM βシトステロール、１μM trans-フェルラ酸、１μM コレステロールあるいは１μM トログリタゾンを含む試験培地をそれぞれ１００μlずつ加えた。ポジティブコントロールとしてトログリタゾンを、ネガティブコントロールとしてDMSOのみを含む培地を用いた。２２時間処理して培地を除いた後、１μg/ml ＬＰＳ、５０ng/ml recombinant TNF-α、100 U/ml recombinant IFN-γを加えた培地で２時間培養し、ＮＦ−κＢを活性化させた。２時間後ＮＦ−κＢ活性化培地を除いて、試験培地による処理開始から通算して２４時間後それぞれの培地を回収した。回収した培地を SDS-PAGE sample bufferと混合し、３分間ボイルした。 SDS-PAGEおよびウエスタンブロッティングを行った。
【００５４】
なお、検出にはビオチンとアビジンの結合能を利用したABC法を用いた。すなわち、一次抗体にはBiotinylated Anti-mouse Adiponectin polyclonal antibody （R&D Systems, Inc）を反応させた。続いてhorseradish peroxidase 標識ビオチンとアビジンの複合体を含むABC溶液（和光純薬工業）を反応させた。次いでChemiluminescent HRP Substrate（MILLIPORE）を用いて化学発光法、もしくはSigma FAST DAB tabletを用いて検出した。検出されたバンドをフラットベッドデジタルスキャナで取り込み、Image-Jを用いて画像解析を行ってアディポネクチンレベルを測定したところ、図８に示す通りとなった。
【００５５】
図８に示す結果から、ＬＰＳ等の刺激によるＮＦ−κＢ活性化状態のマウス脂肪細胞において中程度の濃度のヒドロキシ桂皮酸誘導体トリテルペンアルコールエステル（TTAHCE）はアディポネクチンの分泌を有意に促進することが明わかる。すなわち、ヒドロキシ桂皮酸誘導体トリテルペンアルコールエステルはＮＦ−κＢ活性化を阻害し、抗２型糖尿病因子アディポネクチン分泌促進を引き起こすことがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】ヒドロキシ桂皮酸誘導体トリテルペンアルコールエステル類の分離例を示すグラフである。
【図２】RAW264.7マクロファージにおけるＮＦ−κＢ活性に対するシクロアルテニルフェルレートの作用を示すグラフである。
【図３】RAW264.7マクロファージにおけるｉＮＯＳｍＲＮＡ発現に対するシクロアルテニルフェルレート（ＣＡＦ）の影響を示すグラフである。
【図４】RAW264.7マクロファージにおけるＩＬ−１βｍＲＮＡ発現に対するシクロアルテニルフェルレート（ＣＡＦ）の影響を示すグラフである。
【図５】ＤＳＳ腸炎におけるＤＡＩスコアーに対するγ−オリザノールの影響を示すグラフである。
【図６】ＤＳＳ腸炎におけるＭＰＯ活性に対するγ−オリザノールの影響を示すグラフである。
【図７】ＨＥ染色したマウスの結腸の顕微鏡写真である。
【図８】ＮＦ-κＢ活性化阻害がマウス脂肪細胞アディポネクチン分泌に及ぼす影響を示すグラフである。
【図１】
2007332070.tif 000006
【図２】
2007332070.tif 000007
【図３】
2007332070.tif 000008
【図４】
2007332070.tif 000009
【図５】
2007332070.tif 000010
【図６】
2007332070.tif 000011
【図８】
2007332070.tif 000012
【図７】
2007332070.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成19年9月25日(2007.9.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
ＮＦ−κＢのコンセンサス配列：5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’（配列番号１）
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
iNOS: forward primer, 5’-GCCTCGCTCTGGAAAGA-3’;              （配列番号２）
reverse primer 5’-TCCATGCAGACAACCTT-3’;                      （配列番号３）
IL-1β: forward primer, 5’-TGCAGAGTTCCCCAACTGGTACATC-3’    （配列番号４）
reverse primer 5’-GTGCTGCCTAATGTCCCCTTGAATC-3’            （配列番号５）
β-actin: forward primer, 5’-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3’  （配列番号６）
reverse primer 5’-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3’          （配列番号７）