(57)【要約】      （修正有）【課題】医薬品等の原料として広い分野で有効に利用されるカルボン酸の光学活性体を、操作が煩雑でなく、かつ安全性にも優れた生化学的手法による方法で製造する方法を提供する。【解決手段】（Ｒ）体及び（Ｓ）体のカルボン酸を含む光学異性体混合物に、ルシフェラーゼ、ＡＴＰ、２価金属イオン及びＣｏＡを反応させた後、チオエステル化反応により生成した一方のカルボン酸光学異性体のＣｏＡエステルと、他方のカルボン酸光学異性体とを分離することを特徴とする、光学活性カルボン酸の製造法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｒ）体及び（Ｓ）体のカルボン酸を含む光学異性体混合物に、ルシフェラーゼ、ＡＴＰ、２価金属イオン及びコエンザイムＡを反応させた後、チオエステル化反応により生成した一方のカルボン酸光学異性体のコエンザイムＡエステルと、他方のカルボン酸光学異性体とを分離することを特徴とする、光学活性カルボン酸の製造方法。
【請求項２】
カルボン酸が、下記の化学式で示される、α−置換カルボン酸であることを特徴とする、請求項１記載の光学活性なカルボン酸の製造方法。
【化１】
2007029017.tif 000010
（化学式中、Ｒ１は置換または無置換のアリール基、置換または無置換のアリールオキシ基、置換または無置換の複素環基を表し、Ｒ２は置換または無置換のアルキル基を表す。）
【請求項３】
ルシフェラーゼが、甲虫由来であることを特徴とする、請求項１記載の光学活性なカルボン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品、農薬および機能性材料の原料、光学分割剤等として有用な光学活性カルボン酸を、ルシフェラーゼを用いて製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カルボン酸は、各種の産業分野で利用されている有機化合物であり、特にそれらの光学活性体は医薬品、農薬および機能性材料の原料等として有用な化合物である。カルボン酸の光学異性体混合物については容易に合成することが可能であり（非特許文献１、２参照）、異性体を簡便かつ安全に分離して光学活性なカルボン酸を製造する方法が求められている。
【０００３】
ルシフェラーゼはＡＴＰ、２価金属イオン（Ｍｇ２＋やＭｎ２＋等）および酸素の存在下、ルシフェリンを発光基質として、発光反応を触媒する酵素であり、その反応式は、以下の通りである。
【０００４】
【化１】
2007029017.tif 000003
【０００５】
ルシフェラーゼの代表的なものとして甲虫由来のルシフェラーゼがあり、例えばゲンジホタル（Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａ）、ヘイケホタル（Ｌｕｃｉｏｌａ  ｌａｔｅｒａｌｉｓ）、アメリカホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）を由来とする酵素が知られている。ルシフェラーゼは、組換え体の製造方法が確立しており（例えば、特許文献１、２参照。）、微生物や食品残渣由来のＡＴＰ量を測定する清浄度検査や微生物由来のＡＴＰ量を測定する菌数検査等の衛生検査分野で利用されるとともに、玩具、遊具、演出装置の発光材料等にも利用されている（非特許文献３参照）。
【０００６】
またビオチン化されたルシフェラーゼについても、ビオチン・アビジンを利用した高感度検出系を原理として臨床検査、衛生検査の分野で使用されている（非特許文献３、４参照）。
【０００７】
また従来から、ホタルルシフェラーゼが、アデノシン３リン酸（以下「ＡＴＰ」ともいう）およびマグネシウムイオン存在下にて、脂肪酸とコエンザイムＡ（以下「ＣｏＡ」ともいう）の反応を触媒する酵素であるアシルＣｏＡシンターゼと、アミノ酸配列において相同性を示すことが知られている。近年、ホタルルシフェラーゼがルシフェリン以外の脂肪酸を基質とするアシルＣｏＡシンターゼ活性を有することが示され（非特許文献５参照）、ルシフェラーゼを用いる脂肪酸ＣｏＡの製造方法について報告されており（特許文献３参照）、その反応は以下の通りである。
【０００８】
【化２】
2007029017.tif 000004
【０００９】
しかしながら、ホタルルシフェラーゼがルシフェリン以外の脂肪酸を基質とするときの立体認識能についてはこれまでに知見がなく、本酵素を光学活性な各種カルボン酸の製造に利用した例はこれまでに報告されていなかった。
【００１０】
【特許文献１】特開平０２−１３３７９号公報
【特許文献２】特開平０２−６５７８０号公報
【特許文献３】特開２００４−１２９５８９号公報
【非特許文献１】「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，（米国），２００３年，６８巻，ｐ．７２３４
【非特許文献２】「Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ」，（米国），２００４年，１５巻，ｐ．２９６５
【非特許文献３】「日本農芸化学会誌」，（日本），２００４年，７８巻，ｐ．６３０
【非特許文献４】「ＢＩＯ  ＩＮＤＵＳＴＲＹ」，（日本），２００２年，６８巻，ｐ．４０
【非特許文献５】「ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ」，（オランダ），２００３年，５４０巻，ｐ．２５１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明が解決しようとする課題は、簡便かつ安全な光学活性カルボン酸の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
そこで本発明者らは鋭意検討した結果、ルシフェラーゼを用いる生化学的手法が、上記課題を解決し得ることを見出し、これらの知見に基づき本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、
１．（Ｒ）体及び（Ｓ）体のカルボン酸を含む光学異性体混合物に、ルシフェラーゼ、ＡＴＰ、２価金属イオン及びＣｏＡを反応させた後、チオエステル化反応により生成した一方のカルボン酸光学異性体のＣｏＡエステルと、他方のカルボン酸光学異性体とを分離することを特徴とする、光学活性カルボン酸の製造方法。
２．カルボン酸が、下記の化学式で示される、α−置換カルボン酸であることを特徴とする、上記１記載の光学活性なカルボン酸の製造方法。
【００１４】
【化３】
2007029017.tif 000005
【００１５】
（化学式中、Ｒ１は置換または無置換のアリール基、置換または無置換のアリールオキシ基、置換または無置換の複素環基を表し、Ｒ２は置換または無置換のアルキル基を表す。）
３．ルシフェラーゼが、甲虫由来であることを特徴とする、上記１記載の光学活性なカルボン酸の製造方法。
に関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、操作が煩雑でなく、安全性にも優れた生化学的手法による、光学活性なカルボン酸の製造方法が提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、（Ｒ）体及び（Ｓ）体のカルボン酸を含む光学異性体混合物に、ルシフェラーゼ、ＡＴＰ、２価金属イオン及びＣｏＡを反応させた後、チオエステル化反応により生成した一方のカルボン酸光学異性体のＣｏＡエステルと、他方のカルボン酸光学異性体とを分離することを特徴とする、光学活性カルボン酸の製造方法に関する。
【００１８】
カルボン酸は、特に限定されないが、α−置換カルボン酸が好ましく、例えば、イブプロフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、プラノプロフェン、フェノプロフェン、チアプロフェン酸、ロキソプロフェン、２−フェニルプロピオン酸、スプロフェン、インドプロフェン、プロチジン酸、アルミノプロフェン、ベノキサプロフェン、ミロプロフェン、フルノキサプロフェン、２−（ヒドロキシメチル）フェニル酢酸（トロパ酸）、２−フェニル酪酸、４−クロロ−２−（１−メチルエチル）フェニル酢酸、２−フェノキシプロピオン酸、２−（４−クロロフェノキシ）プロピオン酸、２−（２−メチル−４−クロロフェノキシ）プロピオン酸、２−（２，４−ジクロロフェノキシ）プロピオン酸、２−メチル−３−フェニルプロピオン酸、３−メチル−２−フェニル酪酸、２−フェニルペンタン酸等が挙げられる。
【００１９】
カルボン酸の光学異性体混合物における（Ｒ）体と（Ｓ）体との混合比は任意であり、１：１のラセミ体でもよく、一方の比率が高いものであってもよい。当該ラセミ体は市販品を用いることができるが、例えば、非特許文献１、２記載の方法で合成することも可能である。
カルボン酸の一例は、下記の化学式で示される、α−置換カルボン酸である。
【００２０】
【化４】
2007029017.tif 000006
【００２１】
（化学式中、Ｒ１は置換または無置換のアリール基、置換または無置換のアリールオキシ基、置換または無置換の複素環基を表し、Ｒ２は置換または無置換のアルキル基を表す。）
化学式中のＲ１のアリール基、アリールオキシ基としては、例えば、フェニル基、ナフチル基、フェニルオキシ基、ナフチルオキシ基等が挙げられる。複素環基としては、異種原子として、窒素、酸素、硫黄の少なくとも１種を１個から３個含み、３から１５の炭素から構成される複素環からなるものが好ましい。このような複素環としては、例えば、チオフェン、インドール等が挙げられる。化学式中のＲ２のアルキル基は炭素数１から８のものが望ましく、炭素数１から３のものが特に好ましい。これらのアリール基、アリールオキシ基、複素環基、アルキル基の炭素および窒素に結合している水素は、各種の置換基によって置換されていてもよい。かかる置換基としては、例えば、フッ素、塩素、ヨウ素、臭素等のハロゲン、ヒドロキシ基、チオール基、ニトロ基、アミノ基、フェニル基やナフチル基のようなアリール基、フェニルオキシ基やナフチルオキシ基のようなアリールオキシ基、異種原子として窒素、酸素、硫黄の少なくとも１種を１個から３個含み、３から１５個の炭素から構成される複素環および炭素数が１から８のアルキル基、ベンジル基、炭素数が１から８のアルコキシ基、炭素数１から１０のアシル基等が挙げられる。これらの置換基中の炭素および窒素に結合した水素が、さらに、上述の置換基で置換されていてもよい。
【００２２】
ルシフェラーゼとは、ＡＴＰ、２価金属イオン（Ｍｇ２＋やＭｎ２＋等）および酸素の存在下、ルシフェリンを発光基質として、発光反応を触媒する酵素であり、本発明においてはさらにＡＴＰ、２価金属イオン及びＣｏＡの存在下で、カルボン酸の一方の光学異性体を選択的に認識してチオエステル化し、カルボン酸のＣｏＡエステルに変換する活性も有する酵素である。ルシフェラーゼがカルボン酸の（Ｒ）体と（Ｓ）体のどちらをチオエステル化するかは、カルボン酸の種類により異なる。
【００２３】
ルシフェラーゼとして好適なものとしては甲虫、例えばゲンジホタル（Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａ）、ヘイケホタル（Ｌｕｃｉｏｌａ  ｌａｔｅｒａｌｉｓ）、アメリカホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）を由来とするルシフェラーゼが挙げられ、上記の甲虫の発光器に含まれるもの、クローニングされたルシフェラーゼ遺伝子を含有する組換え体により生産されたものが挙げられる。組換え体の宿主として、大腸菌等の微生物、植物、動物細胞等を用いることができる。また、ルシフェラーゼは天然型ルシフェラーゼに限定されず、変異型ルシフェラーゼであってもよい。
【００２４】
本発明のルシフェラーゼは、それ自体を含有する上記の甲虫の発光器又は細胞、組換え体生産微生物もしくは組換え体生産細胞等の形で反応に利用しても良いが、当該ルシフェラーゼを含有する組織、培養物から分離して粗酵素や精製酵素等の形で反応に利用しても良い。このような粗酵素や精製酵素等は、例えば、１）超音波処理、２）ガラスビーズ又はアルミナを用いる摩砕処理、３）フレンチプレス処理、４）リゾチーム等の酵素処理、５）ワーリングブレンダー処理等により細胞、組織または菌体等を破砕し、得られた破砕物から６）硫安などを用いる塩析、７）有機溶媒、ポリエチレングリコール等の有機ポリマーによる沈澱、８）イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の各種のクロマトグラフィー、９）電気泳動等の通常の方法により調製することができる。さらにまた、ルシフェラーゼを、共有結合、イオン結合、吸着などにより担体に結合させる担体結合法、高分子の網目構造の中に閉じ込める包括法等の固定化の方法によって不溶化し、反応液から容易に分離可能な状態に加工した固定物の形で利用することもできる。
【００２５】
本発明のＡＴＰは市販のＡＴＰでも、ＡＴＰ産生酵素によって試料中のほかの化合物から生成されたものでもよい。ＡＴＰ産生酵素としてはアセテートキナーゼ、ピルベートオルトフォスフェートジキナーゼ（ＰＰＤＫ）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
本発明のＣｏＡは市販のＣｏＡでも、ＣｏＡ産生酵素によって試料中のほかの化合物から生成されたものでもよい。組換え体でルシフェラーゼを発現させる場合、ＡＴＰ産生酵素やＣｏＡ産生酵素を共発現させ、ＡＴＰやＣｏＡを生合成させることもできる。
【００２７】
本発明において、以下に示すように、ルシフェラーゼにより生成するカルボン酸のＣｏＡエステルを化学的もしくは酵素的にラセミ化し、加水分解させて、一方の光学活性カルボン酸に収束させる（デラセミ化させる）こともできる。組換え体でルシフェラーゼを発現させる場合、ラセミ化酵素や加水分解酵素を共発現させてデラセミ化を行うことも可能である。
【００２８】
【化５】
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【００２９】
本発明の２価金属イオンは、好ましくはＭｇ２＋、Ｍｎ２＋等であるが、特にこれらに限定されない。
カルボン酸の光学異性体混合物、ルシフェラーゼ、２価金属イオン及びＣｏＡの反応温度は、１０〜７０℃が可能であるが、酵素の至適温度と安定性の点から、２０〜５０℃の範囲がより好ましい。温度３０℃における、チオエステル化反応を図１に示した。
【００３０】
本発明の反応は通常緩衝液中で行うが、必要に応じ、エチレングリコールやグリセロール等の酵素の安定化剤や基質を溶解するためにエタノール等の有機溶媒や界面活性剤を添加してもよい。緩衝液としては、ｐＨ５〜９の通常の緩衝液、例えばリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、各種グッドバッファー等を挙げることができる。酵素の至適ｐＨと安定性の点から、ｐＨ６〜８で反応を行うことがさらに好ましい。
本発明の反応時間はいかなる時間でもよいが、１分間から１週間、さらに具体的には３０分間から３日間程度で反応を停止させるのが好ましい。
【００３１】
上記のチオエステル化反応により、ＣｏＡチオエステル化合物として、一方のカルボン酸光学異性体のＣｏＡエステルが生成する。他方のカルボン酸光学異性体は、未反応のまま、反応系に残される。反応終了後の反応系から、生成した一方のカルボン酸光学異性体のＣｏＡエステルと、他方のカルボン酸光学異性体とを分離する方法は任意である。分離法としては、例えば、反応液のｐＨを塩酸等の酸で酸性にした後にジエチルエーテルや酢酸エチル等の有機溶媒を用いて抽出する方法、シリカゲルやイオン交換樹脂等を用いるクロマトグラフィーの方法、再結晶等を適宜用いることができる。
【００３２】
未反応のまま残ったカルボン酸光学異性体については、反応液を塩酸酸性とした後、ジエチルエーテルを用いて抽出後、有機溶媒を減圧濃縮し、適宜、各種クロマトグラフィーで精製すればよい。また反応生成物であるカルボン酸のＣｏＡエステルについては、塩酸酸性条件下にてジエチルエーテルを用いて抽出操作を十分に行った水相に含まれているので、これを濃縮し、各種クロマトグラフィーで精製すればよい。
【００３３】
なお、カルボン酸のＣｏＡエステルは、それを含む水相に水酸化ナトリウム等のアルカリを添加し、アルカリ性条件下にて加水分解反応を行って生成するカルボン酸を、塩酸酸性条件下にてジエチルエーテルを用いて抽出後、有機溶媒を減圧濃縮して、適宜、各種クロマトグラフィーで精製して、カルボン酸の形で回収することも可能である。この方法により、カルボン酸のＣｏＡエステルは、光学活性なカルボン酸として回収することができる。カルボン酸のＣｏＡエステルはエピメリ化されやすいため、これを意図的にエピメリ化させる条件下で加水分解してラセミ体のカルボン酸に変換し、これをルシフェラーゼによる光学分割反応の原料として再利用することも可能である。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例を示し、本発明を説明するが、本発明の技術的範囲はこれによって何ら限定されることはない。
〔光学活性カルボン酸の製造方法〕
５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４，５００μｌ）に、表１記載の各種カルボン酸のラセミ体（０．２５ｍＭ）、ＡＴＰ（１０ｍＭ）、ＣｏＡ （２ｍＭ）、塩化マグネシウム（１０ｍＭ）及びエチレングリコール（３％ｖ／ｖ）となるように溶解した。３０℃にて３分間保温した後に、ルシフェラーゼ溶液（ヘイケホタル由来、キッコーマン社製、１４２μｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を添加し、反応を開始した。６０分後、２Ｍ塩酸（１００μｌ）およびジエチルエーテル（１ｍｌ）を加えて撹拌し、１５，０００ｒｐｍにて５分間遠心した。直ちに−８０℃にて水相を凍結し有機相を回収し、遠心濃縮機にて溶媒を留去し、未反応のカルボン酸を回収した。
【００３５】
カルボン酸のＣｏＡエステルを含有する凍結した水相については、室温に放置して融解し、未回収のカルボン酸を完全に取り除くためジエチルエーテルによる上記の抽出操作をさらに２回行った。その後２Ｍ水酸化ナトリウム（１２０μｌ）を添加し、室温にてカルボン酸のＣｏＡエステルの加水分解を行った。３０分後、２Ｍ塩酸（１２０μｌ）にて再度酸性とし、上記と同様にジエチルエーテルによる抽出、溶媒の留去を行い、カルボン酸として回収した。
得られたカルボン酸は、ヘキサン：イソプロピルアルコール＝９：１で溶解し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて鏡像体過剰率（ｅｅ）を決定した。
表１に各種カルボン酸のＨＰＬＣの分析条件（カラム、溶媒、流速、検出波長）と保持時間（ｔＲ）を示す。
【００３６】
【表１】
2007029017.tif 000008
【００３７】
表２に、未反応のカルボン酸および反応生成物のチオエステルを加水分解して得たカルボン酸の鏡像体過剰率の分析結果を示す。表２に示される基質を用いた場合、図１に示されるとおり、（Ｒ）体が優先的にチオエステルに変換されていることがわかった。中でもイブプロフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン、フルルビプロフェンについては（Ｒ）体の反応速度が大きく、（Ｓ）体のカルボン酸を高い鏡像体過剰率で回収することができた。特にイブプロフェン、ナプロキセンを基質とした場合は反応の立体選択性が高く、（Ｒ）体についても比較的高い鏡像体過剰率で得ることができた。トロパ酸については、反応速度は小さいものの、立体選択性が高かったため、（Ｒ）体を高い鏡像体過剰率で得ることができた。
【００３８】
【表２】
2007029017.tif 000009
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明は、カルボン酸の光学活性体を簡便、かつ安全に提供するものである。本発明により得られるカルボン酸は医薬品等の原料として広い分野で有効に利用される。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】（Ｒ）体及び（Ｓ）体のカルボン酸を含む光学異性体混合物、ルシフェラーゼ、ＡＴＰ、２価金属イオン及びＣｏＡのチオエステル化反応によって、カルボン酸のＣｏＡエステルが生成することを示す図。（Ｒ）体のカルボン酸が選択的にチオエステル化される場合を示す。
【図１】
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