(57)【要約】      （修正有）【課題】  ヒトの新規な免疫応答調節蛋白質とその遺伝子、抗体ならびにそれらを利用した医薬組成物を提供する。【解決手段】  特定のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列における１若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、付加または他のアミノ酸残基に置換した配列を有するヒト免疫応答調節蛋白質と、この蛋白質をコードする特定の塩基配列、この蛋白質を特異的に認識する抗体、およびそれらを利用した癌、アレルギー、自己免疫疾患、炎症疾患を含む免疫関連疾患用医薬組成物。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの単離遺伝子であって、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２における１若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、付加または他のアミノ酸残基に置換した配列を有する免疫応答調節蛋白質をコードする免疫応答調節遺伝子。
【請求項２】
転写産物mRNAから合成されるcDNAが配列番号１の塩基配列を有する請求項１の免疫応答調節遺伝子。
【請求項３】
請求項１の免疫応答調節遺伝子のゲノムDNA、mRNA、cDNAまたはそれらの相補配列から精製されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１の免疫応答調節遺伝子または請求項３の精製ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１の免疫応答調節遺伝子または請求項３の精製ポリヌクレオチドをPCR増幅するプライマーセット。
【請求項６】
請求項３の精製ポリヌクレオチドあるいは請求項４のオリゴヌクレオチドを保有する組換えベクター。
【請求項７】
請求項６の組換えベクターによる形質転換細胞。
【請求項８】
ヒトの精製蛋白質であって、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２における１若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、付加または他のアミノ酸残基に置換した配列を有する免疫応答調節蛋白質。
【請求項９】
請求項１の免疫応答調節遺伝子または請求項３のポリヌクレオチドの発現産物である請求項９の免疫応答調節蛋白質。
【請求項１０】
請求項８の免疫応答調節蛋白質の一部分からなる精製または合成されたペプチド。
【請求項１１】
配列番号２における第1-164アミノ酸残基の連続８以上のアミノ酸配列からなる請求項１０のペプチド。
【請求項１２】
請求項８の免疫応答調節蛋白質および請求項１０のペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体。
【請求項１３】
請求項１２のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
【請求項１４】
免疫応答調節を目的とした医薬組成物であって、
(a)  請求項３のポリヌクレオチド；
(b)  請求項６の組換えベクター；
(c)  請求項８または９の免疫応答調節蛋白質；
(d)  請求項１０または１１のペプチド；および
(e)  請求項１２のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、
からなる群より選択される１以上を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１の免疫応答調節遺伝子の発現レベルを測定する方法であって、被験者から単離した生体試料における前記遺伝子の発現産物量を測定することを特徴とする遺伝子発現レベル測定方法。
【請求項１６】
遺伝子発現産物がmRNAである請求項１５の方法。
【請求項１７】
遺伝子発現産物が、請求項８の免疫応答調節蛋白質である請求項１５の方法。
【請求項１８】
請求項８の免疫応答調節蛋白質が過剰発現している細胞および動物。
【請求項１９】
任意の蛋白質に対する抗体を動物体内で作成する方法であって、請求項１８の動物に抗原物質を投与する工程と、この動物から抗体を単離する工程を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願の発明は、免疫応答を調節する新規なヒト免疫応答調節遺伝子とヒト免疫応答調節蛋白質に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
免疫システムは、生体防御に必須の役割を担っている。免疫システムの活性化は、細胞間、細胞内あるいは細胞外に分泌される多彩な微量蛋白物質によって調節されている。免疫細胞は、これらの分子を介して恒常性を保ちながら生体防御に働いている。一方、免疫システムの破綻は、重篤な感染症を引き起こすばかりでなく、自己免疫疾患、アレルギー、免疫不全や癌などさまざまな疾患を引き起こす。したがって、免疫を調節する微量蛋白物質の解明は、免疫システムが関与した様々な病態を正確に把握し有効な治療方針を立てるうえで重要であり、それらを医薬として使用すればさまざまな免疫異常疾患の克服が可能になると考えられている。
【０００３】
免疫応答の調節に関与する蛋白質としては、例えば、インターロイキン（ＩＬ）1〜29、リピドＡ、ホスホリパーゼＡ２、エンド毒素、ブドウ球菌エンテロトキシンＢおよび他の毒素、I型インターフェロン、II型インターフェロン、腫瘍壊死因子、トランスフォーミング増殖因子-β（「ＴＧＦ−β」）、リンホ毒素、遊走阻止因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（CSF）、単球マクロファージCSF、顆粒球CSF、血管上皮増殖因子、アンギオテンシン、トランスフォーミング増殖因子、熱ショックタンパク質、血液型の糖鎖部分、Rh因子、線維芽細胞増殖因子、ケモカイン等が知られているが、これらの既知の微量蛋白質のみではさまざまな免疫異常疾患の病態が説明できないことからさらに多数の未知免疫応答調節物質が存在することが予想されている。
【０００４】
また一方で、これらの免疫応答調節物質の有効な使用方法も大きく進展しており、例えば金属コロイド等と結合させた標識化送達系と、これを用いた免疫応答調節方法およびモノクローナル抗体の産生方法等が提案されている（特許文献１）。
【特許文献１】特表2002-503639号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
免疫応答を促進あるいは制御する微量蛋白質はそれ自身が発癌およびアレルギー、自己免疫疾患、慢性感染症などの免疫異常に関連した様々な疾患を予防あるいは是正する医薬品となりうるのみならず、病態を正確に把握するための診断マーカーとしても有用であり、また抗体医薬品や低分子医薬品を開発するためのターゲット蛋白質としての可能性を秘めている。また、免疫賦活作用を持ったものはワクチン添加物としても有用である。従って、できるだけ多くの免疫関連蛋白質を得ることが望まれている。この出願の発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、ヒトの新規な免疫応答調節蛋白質とその遺伝子、抗体ならびにそれらを利用した発明を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この出願は、前記の課題を解決するものとして、以下の発明を提供する。
【０００７】
すなわち、第１の発明は、ヒトの単離遺伝子であって、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２における１若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、付加または他のアミノ酸残基に置換した配列を有する免疫応答調節蛋白質をコードする免疫応答調節遺伝子である。
【０００８】
この第1発明の免疫応答調節遺伝子の一態様は、転写産物mRNAから合成されるcDNAが配列番号１の塩基配列を有する遺伝子である。
【０００９】
第２の発明は、前記第１発明の免疫応答調節遺伝子のゲノムDNA、mRNA、cDNAまたはそれらの相補配列から精製されたポリヌクレオチドである。
【００１０】
第３の発明は、前記第１発明の免疫応答調節遺伝子または第２発明の精製ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。
【００１１】
第４の発明は、前記第１発明の免疫応答調節遺伝子または第２発明の精製ポリヌクレオチドをPCR増幅するプライマーセットである。
【００１２】
第５の発明は、前記第２発明の精製ポリヌクレオチドあるいは前記第３発明のオリゴヌクレオチドを保有する組換えベクターである。
【００１３】
第６の発明は、前記第５発明の組換えベクターによる形質転換細胞である。
【００１４】
第７の発明は、ヒトの精製蛋白質であって、配列番号２のアミノ酸配列または配列番号２における１若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、付加または他のアミノ酸残基に置換した配列を有する免疫応答調節蛋白質である。
【００１５】
この第７発明の免疫応答調節蛋白質の一態様は、前記第１発明の免疫応答調節遺伝子または前記第２発明のポリヌクレオチドの発現産物である蛋白質である。
【００１６】
第８の発明は、前記第７発明の免疫応答調節蛋白質の一部分からなる精製または合成されたペプチドである。
【００１７】
この第８発明のペプチドの一態様は、配列番号２における第1-164アミノ酸残基の連続8以上のアミノ酸配列からなるペプチドである。
【００１８】
第９の発明は、前記第７発明の免疫応答調節蛋白質を特異的に認識するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。また第１０の発明は、前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞である。
【００１９】
第１１の発明は、免疫応答調節を目的とした医薬組成物であって、
(a)  前記第２発明のポリヌクレオチド；
(b)  前記第５発明の組換えベクター；
(c)  前記第７発明の免疫応答調節蛋白質；
(d)  前記第８発明のペプチド；および
(e)  前記第９発明のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、
からなる群より選択される１以上を含むことを特徴とする医薬組成物である。この医薬組成物には例えば、抗炎症剤、抗アレルギー剤、免疫応答調節剤、抗感染症剤、抗癌剤、免疫賦活剤、ワクチン製剤が包含される。
【００２０】
第１２の発明は、前記第１発明の免疫応答調節遺伝子の発現レベルを測定する方法であって、被験者から単離した生体試料における前記遺伝子の発現産物量を測定することを特徴とする遺伝子発現レベル測定方法である。この第１２発明の方法においては、遺伝子発現産物がmRNAであること、または第７発明の免疫応答調節蛋白質であることを具体的な態様としている。
【００２１】
第１３の発明は、前記第７発明の免疫応答調蛋白質が過剰に機能発現している細胞または動物である。
【００２２】
第１４の発明は、任意の蛋白質に対する抗体を動物体内で作成する方法であって、前記第１３発明の動物に抗原物質を投与する工程と、この動物から抗体を単離する工程を含むことを特徴とする方法である。
【００２３】
なお、この発明において、「ポリヌクレオチド」とは、プリンまたはピリミジンが糖にβ-N-グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ATP、GTP、CTP、UTP；またはdATP、dGTP、dCTP、dTTP）が100個以上結合した分子を言い、「オリゴヌクレオチド」とは2-99個連結した分子を言う。「蛋白質」および「ペプチド」とは、アミド結合（ペプチド結合）または非天然の残基連結によって互いに結合した複数個のアミノ酸残基から構成された分子を意味する。
【００２４】
またこの発明において、「１若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、付加または他のアミノ酸残基への置換」とは、この発明の免疫応答調節蛋白質の機能が実質的に変化しない範囲において、全アミノ酸配列における30％以下、好ましくは20％以下、さらに好ましくは10％以下のアミノ酸残基が付加、欠失または置換していることを意味する。
【００２５】
この出願の各発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、この発明の医薬組成物の調製はRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990に、遺伝子工学および分子生物学的技術はSambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等に記載されている。さらに、この発明における用語は基本的にはIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
この発明の免疫応答調節遺伝子は、免疫応答調節蛋白質（以下「UKC1」と記載することがある）をコードするヒト遺伝子であり、具体的には配列番号２のアミノ酸配列を有する免疫応答調節蛋白質をコードするヒト遺伝子である。そしてUKC1遺伝子はそのcDNAが配列番号１の塩基配列を有している。
【００２７】
UKC1遺伝子はこの発明によって提供されるオリゴヌクレオチドプローブを用いてヒトゲノムライブラリーを用いてスクリーニングすることによって単離することができる。プローブは、例えばこの発明によって提供される精製ポリヌクレオチド（例えばcDNA）の一部配列（15bp以上）またはその相補配列を利用する事ができる。プローブによるスクリーニングは、ゲノムDNAとプローブとの特異的なハイブリダイゼーションを可能とするストリンジェントな条件下で行うことができる。ストリンジェント条件は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程における塩濃度、有機溶媒（ホルムアルデヒド等）の濃度、温度条件等によって規定される。例えば、米国特許No.,6,100,037等に開示されている条件を採用することができる。またプローブの標識は、ラジオアイソトープ（RI）法または非RI法によって行うことができるが、非RI法を用いることが好ましい。非RI法としては、蛍光標識法、ビオチン標識法、化学発光法等が挙げられるが、蛍光標識法を用いることが好ましい。蛍光物質としては、オリゴヌクレオチドの塩基部分と結合できるものを適宜に選択して用いることができるが、シアニン色素（例えば、Cy DyeTMシリーズのCy3、Cy5等）、ローダミン6G試薬、N-アセトキシ-N2-アセチルアミノフルオレン（AAF）、AAIF（AAFのヨウ素誘導体）などを使用することができる。
【００２８】
UKC1遺伝子はまた、適当なプライマーセットを用い、ヒトゲノムDNAあるいは本遺伝子を発現している細胞から調整したcDNAを鋳型としてPCR（Polymerase Chain Reaction）法によって増幅することもできる。プライマーセットはこの発明によって提供される精製ポリヌクレオチド（cDNA）から選択した一部配列（15bp以上）の２以上の組み合わせによって作成することができる。また、cDNAの5'側の１プライマーを用いた5' RACE法によって遺伝子の上流を、cDNAの3'側の１プライマーを用いた3' RACE法によって遺伝子の下流部分をPCR増幅することもできる。なお、プライマー設計の留意点として、例えば以下を指摘することもできる。プライマーのサイズ（塩基数）は、鋳型DNAとの間の特異的なアニーリングを満足させることを考慮し、15-40塩基、望ましくは15-30塩基である。ただし、LA(long and accurate) PCRを行う場合には、少なくても30塩基が効率的である。センス鎖（5'末端側）とアンチセンス鎖（3'末端側）からなる１組あるいは一対（２本）のプライマーが互いにアニールしないよう、両プライマー間の相補的配列を避けるようにする。さらに、鋳型DNAとの安定な結合を確保するためGC含量を約50％にし、プライマー内においてGC-richあるいはAT-richが偏在しないようにする。アニーリング温度はTｍ（melting temperature）に依存するので、特異性の高いPCR産物をえるため、Tｍ値が55-65℃で互いに近似したプライマーを選定する。また、PCRにおけるプライマー使用の最終濃度が約0.1から約1μMになるよう調整する等を留意することも必要である。また、プライマー設計用の市販のソフトウエア、例えばOligoTM [National Bioscience Inc.(米国)製]、GENETYX（ソフトウエア開発（株）（日本）製）等を用いることもできる。
【００２９】
このようにして得られた全長ゲノム遺伝子は、例えば、PCR法、NASBN (Nucleic acid sequence based amplification )法、TMA（Transcription−mediated amplification）法およびSDA（Strand Displacement Amplification）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することもできる。
【００３０】
そして、このUKC1ゲノム遺伝子はこの遺伝子が転写するmRNA、mRNAから合成したcDNAから精製ポリヌクレオチド（DNA断片やRNA断片）を調整することができる。例えば、cDNAはヒト細胞から抽出したポリ（A）+RNAを鋳型として合成することもできる。ヒト細胞としては、UKC1を発現していれば生体より摘出したものでも培養細胞でも良い。cDNAは、公知の方法（Mol.Cell.Biol.2, 167-170,1982; J.Gene 25,263-269,1983; Gene, 150, 243-250, 1994）を用いて合成することができる。あるいは、この発明によって提供される情報をもとにデザインしたプライマーセットを用いて、ヒト細胞から単離したmRNAを鋳型とするRT-PCR法を用いて、目的ｃDNAを合成することもできる。または、DNAオリゴ合成機によって部分配列を合成し、それを酵素的手法およびサブクローニングの手法を使ってつなぎ合わせる事によっても目的cDNAを合成することもできる。このようにして調整されるcDNAは、具体的には配列番号１の塩基配列を有している。これらのポリヌクレオチドは、UKC1蛋白質の遺伝子工学的な製造に使用することができる。また、これらのポリヌクレオチドは、生体にUKC1蛋白質を過剰発現させるための遺伝子材料（導入遺伝子）としても使用することができる。なお、UKC1蛋白質を遺伝子工学的に作成するため、あるいは導入遺伝子として使用する場合には、配列番号１の全長でなくてもよく、例えば少なくともそれぞれの蛋白質コード領域（CDS）を構成するポリヌクレオチド配列でよい。また目的の抗原に対する動物の抗原認識を向上させるために遺伝子導入する場合には、例えば、配列番号１の塩基配列のうちの連続60以上の塩基を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを使用することもできる。このようなオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、例えばcDNAを適当な制限酵素で切断して作成することもでき、あるいは文献（例えばCarruthers（1982）Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418; Adams（1983）J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov（1997）Nucleic Acid Res. 25:3440-3444; Frenkel（1995）Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers（1994）Biochemistry 33:7886-7896; Narang（1979）Meth. Enzymol. 68:90; Brown（1979）Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage（1981）Tetra. Lett. 22:1859; 米国特許第4,458,066号）に記載されているような周知の化学合成技術により、in vitroにおいて合成することができる。
【００３１】
この発明の組換えベクターはクローニングベクターまたは発現ベクターであり、インサートとしてのポリヌクレオチドの種類や、その使用目的等に応じて適宣のものを使用する。例えば、cDNAまたはそのORF領域をインサートとしてUKC1蛋白質を生産する場合には、インビトロ転写用の発現ベクターや、大腸菌、枯草菌等の原核細胞、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞のそれぞれに適した発現ベクターを使用することもできる。またUKC1遺伝子のゲノムDNAをインサートとする場合には、BAC（Bacterial Artificial Chromosome）ベクターやコスミドベクター等を使用することもできる。
【００３２】
この発明の形質転換細胞は、例えば、UKC1蛋白質を大量製造する場合には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。これらの形質転換細胞は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポゾーム法、DEAEデキストラン法など公知の方法によって組換えベクターを細胞に導入することによって調整することができる。
【００３３】
この発明のUKC1蛋白質は、ヒトの臓器、細胞株から特異的な抗体等を用いて単離する方法、配列番号２のアミノ酸配列に基づいて化学合成によってペプチドを調整する方法、あるいはこの発明によって提供される精製ポリヌクレオチド（cDNAまたはその翻訳領域）を用いて組換えDNA技術で生産する方法などにより取得できるが、組換えDNA技術で取得する方法が好ましく用いられる。例えば前記のポリヌクレオチドを有するベクターからインビトロ転写によってRNAを調整し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行うことによりインビトロで蛋白質を発現できる。またポリヌクレオチドを公知の方法により適当な発現ベクターに組換えれば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞で、ポリヌクレオチドがコードしている蛋白質を大量に発現させる事ができる。
【００３４】
UKC1蛋白質をインビトロでDNAを発現させて生産させる場合には、前記のポリヌクレオチドを、RNAポリメラーゼプロモーターを有するベクターに挿入して組換えベクターを作成し、このベクターを、プロモーターに対応するRNAポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加すれば、UKC1蛋白質をインビトロで生産することができる。RNAポリメラーゼプロモーターとしては、T3,T7,SP6などが例示できる。これらのRNAポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、pKA1，pCDM8，pT3／T718、pT7／319、pBluescriptIIなどが例示できる。
【００３５】
UKC1蛋白質を大腸菌などの微生物でDNAを発現させて生産させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、DNAクローニング部位、ターミネーター配列等を有する発現ベクターに前記のポリヌクレオチドを組換えた発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、このポリヌクレオチドがコードしている蛋白質を微生物内で大量生産することができる。この際、任意の翻訳領域の前後に開始コドンと停止コドンを付加して発現させれば、任意の領域を含む蛋白質断片を得ることもできる。あるいは、他の蛋白質との融合蛋白質として発現させることもできる。この融合蛋白質を適当なプロテアーゼで切断することによってもこのポリヌクレオチドがコードする蛋白質部分のみを取得することもできる。大腸菌用発現ベクターとしては、pUC系、ｐBluescriptII、pET発現システム、ｐGEX発現システムなどが例示できる。
【００３６】
UKC1蛋白質を、真核細胞でDNAを発現させて生産させる場合には、前記ポリヌクレオチドを、プロモーター、スプラインシング領域、ポリ（A）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作成し、真核細胞内に導入すれば、UKC1蛋白質を真核細胞内で生産することができる。発現ベクターとしては、pKA1, pCDM8, pSVK3, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBVベクター、pRS, pYE82 などが例示できる。また、pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C１などを発現ベクターとして用いれば、Hisタグ、FLAGタグ、GFPなど各種タグを付加した融合蛋白質として発現させることもできる。真核細胞としては、サル腎臓細胞COS-7、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHOなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、UKC1蛋白質を発現できるものであれば、いかなる真核細胞でもよい。発現ベクターを真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポゾーム法、DEAEデキストラン法など公知の方法を用いることができる。
【００３７】
UKC1蛋白質を原核細胞や真核細胞で発現させた後、培養物から目的蛋白質を単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、SDS−PAGE,等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（タグ配列を利用した方法およびUKC1に特異的なポリクローナル抗体、モノクローナル抗体を用いる方法も含む）、などが挙げられる。
【００３８】
なお、以上の方法によって得られる組換えUKC1蛋白質には、他の任意の蛋白質との融合蛋白質も含まれる。例えば、グルタチオン‐S-トランスフェラーゼ（GST）や緑色蛍光蛋白質（GFP）との融合蛋白質などが例示できる。さらに、前記発明の蛋白質は、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。従って、修飾された蛋白質も前記発明の蛋白質の範囲に含まれる。このような翻訳後の修飾としては、N末端メチオニンの脱離、N末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミストレイル化、イソプレニル化、リン酸化などが例示できる。
【００３９】
この発明のペプチドは、UKC1蛋白質の一部分からなるペプチド断片である。すなわち、配列番号２における連続８アミノ酸配列、９〜30アミノ酸配列、31〜60アミノ酸配列、61〜110アミノ酸配列、111〜160アミノ酸配列のペプチドである。さらに具体的には、配列番号２における第1-164アミノ酸残基の連続８以上のアミノ酸配列からなるペプチドである。すなわち、後記実施例で示したように、UKC1蛋白質は免疫細胞活性化作用を有している。従って、UKC1の部分ペプチドは、例えば抗原を融合させることによって、動物に抗原認識を向上させる原料と用いることができると共に、過剰投与等により動物に免疫寛容を生じさせるために使用することもできる。
【００４０】
これらのペプチドは、前記のUKC1蛋白質を任意の蛋白分解酵素で切断することによって調整することができる。また、配列番号２のアミノ酸配列に基づき、公知のペプチド合成法（Merrifield, R.B. J. Solid phase peptide synthesis I. The synthesis of tetrapeptide. J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154, 1963； Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. A Practical Approach. Chan, W.C. and White, P.D., Oxford University Press, 2000）によって作成することもできる。また、これらのペプチドは天然のアミド結合以外の残基連結からなるものであってもよい。天然のアミド結合以外の残基連結は、例えばグルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、２官能マレイミド、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、またはN,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）等の化学結合またはカップリング手段を例示することができる。また、ペプチド結合の代替となり得る連結基は、例えばケトメチレン（例えば、-C（=O）-CH2-に対する-C（=O）-NH-）、アミノメチレン（CH2-NH）、エチレン、オレフィン（CH＝CH）、エーテル（CH2-O）、チオエーテル（CH2-S）、テトラゾール（CN4-）、チアゾール、レトロアミド、チオアミド、またはエステルを含む（例えば、Spatola (1983) in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357, "Peptide Backbone Modifications," Marcell Dekker, NYを参照）。
【００４１】
この発明の抗体は動物由来のUKC1に特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。具体的には、精製UKC1蛋白質やその部分ペプチドを抗原として調整される抗体である。この発明の抗体には、UKC1蛋白質のエピトープに結合することができる全体分子、およびFab, F(ab')2, Fv断片等が全て含まれる。
【００４２】
例えばポリクローナル抗体の場合には、前記のUKC1蛋白質またはペプチドを抗原として動物を免役した後、血清から得ることができる。動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、ニワトリなどが用いられる。また、ヒトへの治療を目的としてヒト型抗体を得たい場合はヒト免疫グロブリン遺伝子を保有する組換え動物も用いられる。免疫抗原ペプチドによる動物の免疫は公知の方法（例えば、村松繁、他編、実験生物学講座 14 、免疫生物学、丸善株式会社、昭和60年、日本生化学会編、続生化学実験講座５、免疫生化学研究法、東京化学同人、1986年、日本生化学会編、新生化学実験講座12、分子免疫学III、抗原・抗体・補体、東京化学同人、1992年などに記載された方法）に準じて行うことができる。例えば、一般的方法としては、抗原ペプチドを哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより免疫を行うことができる。また、抗原ペプチドをアジバントと共に投与してもよい。アジュバントとしては、例えばフロイント完全（または不完全）アジュバント、リビ(Ribi)アジュバント、百日咳ワクチン、BCG、リピッドＡ、リポソーム、水酸化アルミニウム、シリカなどが挙げられる。
【００４３】
ポリクローナル抗体を含む抗血清は、免疫された動物を所定の期間飼育した後、その動物から採血した血液から調製することができる。
【００４４】
また、モノクローナル抗体は公知のモノクローナル抗体作製法（「単クローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、1990年； "Monoclonal Antibody" James W. Goding, third edition, Academic Press, 1996； Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.79-97, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987 など）に従い作製することができる。
【００４５】
またこの発明の抗体には、各種の標識（酵素、放射性同位体、蛍光色素、ビオチン等の低分子、毒素等）を結合したものも含まれる。
【００４６】
これらの抗体は、例えば、血液、尿、組織片等の臨床検体や培養細胞中のUKC1蛋白質を検出し病態を把握する診断的目的に用いられる。その場合は目的に合わせてウエスタンブロッティング、免疫沈降法、免疫組織化学的方法、フローサイトメトリー、RIA、ELISA法などが使用できる。また、これらの抗体は、後述の実施例に示すように、天然型UKC1あるいはリコンビナントUKC1を含む資料からUKC1を精製する際に有用である。また特異的抗体は実験動物等に投与することにより内在性UKC1を中和し免疫応答を調節する目的にも使用することができる。また、動物由来モノクローナル抗体をヒト化したもの、あるいはヒト免疫グロブリン遺伝子を保有する動物より作成したヒト型モノクローナル抗体はヒトへ投与して疾患の診断や治療、予防の目的で使用される。
【００４７】
第１１発明は、前記のポリヌクレオチド、組換えベクター、免疫応答調節蛋白質、ペプチドおよび抗体からなる群より選択される１以上の成分を含むことを特徴とする、免疫応答調節を目的とした医薬組成物である。前記の各成分は、公知の方法・手段によって、生体あるいは細胞内に導入可能な形態として製剤化される。薬剤形態としては、ポリペプチド発現ベクターを、例えば生体認識分子を提示した中空ナノ粒子、または公知のウイルスベクター（レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等）に組み込むようにすればよい。このような薬剤を遺伝子治療の手法により生体内に導入することによって、生体細胞内で免疫応答調節蛋白質を発現させることができる。また、免疫応答調節蛋白質またはペプチドを生体内に導入可能な形態とするためには、例えば、この蛋白質やペプチドの構造や機能を変更することなく、かつ薬理学的に許容される担体溶液に蛋白質またはペプチドを混合して製剤化することができる。生体の組織あるいは細胞を一旦体外に取り出し、インビトロでこれらのUKC1蛋白質あるいはペプチドで処理し所望の形質を誘導した後に生体に戻す方法もある。また、生体より取り出した組織あるいは細胞にUKC1遺伝子発現ベクターを導入した後に生体に戻すことも治療のひとつの形態として可能である。そのような場合は、例えばマイクロインジェクション法により細胞内に導入することができる。あるいは脂質による細胞内導入法（BioPORTER（Gene Therapy Systems社、米国）、Chariot（Active Motif社、米国）等）を採用することもできる。このようにして製剤化された医薬組成物は例えば、抗炎症剤、抗アレルギー剤、免疫応答調節剤、抗感染症剤、抗癌剤、免疫賦活剤、ワクチン製剤等である。
【００４８】
第１２の発明は、前記第１発明の免疫応答調節遺伝子の発現レベルを測定する方法であって、被験者から単離した生体試料における前記遺伝子の発現産物量を測定することを特徴とする遺伝子発現レベル測定方法である。
【００４９】
発現産物としてmRNAを対象とする場合には、例えば、定量的なプローブハイブリダイゼーションやマイクロアレイを用いて行うことができる。標識DNAプローブを用いたハイブリダイゼーション法としては、具体的には、例えばAllele-specific Oligonucleotide Probe法、Oligonucleotide Ligation Assay法、Invader法等の公知の方法を採用することができる。また、マイクロアレイでの測定は、例えば以下のとおりに行うことができる。すなわち、被験者の生体試料（例えば血液等）から単離したmRNAを鋳型として、cDNAを合成し、PCR増幅する。その際に、標識dNTPを取り込ませて標識cDNAとする。この標識cDNAをマクロアレイに接触させ、マイクロアレイのキャプチャープローブ（オリゴヌクレオチド）にハイブリダイズしたcDNAを定量的に検出する。ハイブリダイゼーションは、96穴もしくは384穴プラスチックプレートに分注して標識cDNA水性液を、マイクロアレイ上に点着することによって実施することができる。点着の量は、1〜100nl程度とすることができる。ハイブリダイゼーションは、室温〜70℃の温度範囲で、6〜20時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の標識cDNAを除去する。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが好ましい。
【００５０】
あるいはまた、被験者から単離したmRNAを鋳型とし、前記第４発明のプライマーセットを用いた定量的RT-PCRによってもmRNA量を測定することができる。
【００５１】
さらに、発現産物としてこの発明の免疫応答調節蛋白質を対象とする場合には、第９発明の抗体を用いる方法が好ましい。特に標識化抗体を用いることによって、簡便かつ高精度の検出が可能となる。標識は、酵素、放射性同位体または蛍光色素を使用することができる。酵素は、turnover numberが大であること、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たすものであれば特段の制限はなく、通常のEIAに用いられる酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース−６−リン酸化脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることもできる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、3,3',5,5'−テトラメチルベンジシンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。放射性同位体としては、125Ｉや3Ｈ等の通常のRIAで用いられているものを使用することができる。蛍光色素としては、フルオレッセンスイソチオシアネート（FITC）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。放射生同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定する。また、蛍光色素を用いる場合には、蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置によって蛍光量を測定すればよい。また、フローサイトメーターを用いて測定することもできる。さらに、１次抗体と標識化２次抗体を用いたサンドイッチ法（標識として酵素を用いた場合には「ELISA法」）も好ましく用いることができる。
【００５２】
次に、UKC1蛋白質が過剰に機能発現している第１３発明の細胞または動物について説明する。この動物または細胞は、例えば、動物にUKC1蛋白質溶液を注射する方法；特許文献１に記載されているような金属コロイドとUKC1蛋白質を結合させて動物に投与する方法；レトロウイルスベクターやアデノウイルスベクターを用いた遺伝子治療の方法に準じて動物に活性型UKC1遺伝子（すなわち、高発現プロモーター等を連結した精製ポリヌクレオチド）を導入する方法；リン酸カルシウム法、リポソームや赤血球ゴーストを使用する方法、エレクトロポーレーション法、ガラスピペットを用いた微量注入法等によって細胞にUKC1遺伝子を導入する方法等によって作成することができる。
【００５３】
さらに、これらの動物や細胞は、公知のトランスジェニック動物作成法（例えば、Proc. Natl. Acad. Scl. USA 77;7380-7384, 1980）に従って作成することができる。すなわち、活性型UKC1遺伝子を非ヒト動物（好ましくはマウスまたはラット）の分化全能性細胞に導入し、この細胞を個体へと発生させ、体細胞のゲノム中にUKC1遺伝子が組み込まれた個体を選別することによって目的とするトランスジェニック動物を作成することができる。分化全能性細胞への遺伝子導入法としては、トランスジェニック動物個体の産出高率や次代への導入遺伝子の伝達効率を考慮した場合、外来遺伝子DNAの物理的注入（マイクロインジェクション）法が最適である。遺伝子を注入した受精卵は、次に仮親の卵管に移植され、個体まで発生し出生した動物を里親につけて飼育させたのち、体の一部（尾部先端等）からDNAを抽出し、サザンブロット解析やPCRアッセイにより導入した外来遺伝子の存在を確認することによって、２倍体染色体の一方に外来遺伝子が導入された初代のヘテロ接合体動物が得られ、このヘテロ接合体同士を交配することによってホモ接合体動物が獲られる。この発明のトランスジェニック動物には、初代ヘテロ接合体動物、ヘテロ接合体同士を交配して得られるホモ接合体動物、それらの子孫動物、またはそれらの胎児が含まれる。
【００５４】
第１４の発明は、任意の蛋白質に対する抗体を動物体内で作成する方法であって、前記第１３発明の動物に抗原を投与する工程と、この動物から抗体を単離する工程を含むことを特徴とする方法である。具体的には、第１３発明の動物作成と同一の手段（例えば、動物にUKC1蛋白質を投与する方法や、遺伝子治療の方法に準じて動物にUKC1遺伝子を導入する方法等）で動物体内でのUKC1蛋白質の活性を上昇させると共に、任意の抗原物質を動物に投与する。UKC1蛋白質の投与や高発現によって動物の免疫応答が活性化されるため、効率よく抗体を作成することが可能となる。またこの第１４発明における別の態様は、活性型UKC1遺伝子を体細胞に有するトランスジェニック動物を用いて抗体を作成する方法である。この動物は導入UKC1遺伝子の高発現によってUKC1蛋白質を過剰に発現し、高い免疫応答能を有するため、効率良く抗体を産生する。なお、抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、前記第９発明の抗体と同一の手続で作成することができる。
【００５５】
次に実施例を示しこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明はこれらの例に限定されるものではない。なお、DNAの組換えに関する基本的な操作および酵素反応は、文献("Molecular Cloning, Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)に従った。制限酵素および各種修飾酵素は特に記載のない場合には、Invitrogen社製のものを用いた。各酵素反応の緩衝液組成、並びに反応条件は付属の説明書に従った。
【実施例１】
【００５６】
ヒトTh１およびTh２細胞は既報[Nagata et al.. J Immunol: 1999; 162(3):1278-8630] に従い健常人末梢血リンパ球より作成した。UKC1遺伝子発現検出用のプローブは、22 merのセンスプライマー（CAGCCCAGCCATCCGGGCATAT：配列番号３）および22 merのアンチセンスプライマー（CCGAGGGCTCCCCCAGGGAG：配列番号４）を用い、ヒトTh２細胞のpoly(A)+RNAを鋳型としてRT-PCR法により増幅して得た。得られたPCR産物（590 bp）をランダムプライミング法を用いた市販の32Ｐ標識用キット（宝酒造製）を用いて標識し、これを放射性プローブとして、ノーザンブロティング法にて種々のヒト組織や細胞株におけるUKC1 mRNAの発現を調べた。種々のヒト組織由来mRNAを含む市販のマルチティシューブロットメンブレン（Clonetech社製）を用いて調べたところいずれの組織においても明瞭なmRNAの発現は確認されなかった。次にTh1およびTh2細胞におけるUKC1 mRNAの発現を調べた。Th1およびTh2細胞をPMA (20 ng/ml)とionomycin (1 μg/ml)の存在下および非存在下に37℃で６時間培養後、細胞からtotal RNAを抽出し、ノーザンブロッティング法でUKC1 mRNAの発現を解析したところ、刺激したTh２細胞に約1.1 kbのUKC1 mRNAが顕著に発現しており、非刺激Th１、Th２細胞および刺激したTh１細胞には殆ど発現していなかった（図１）。このようにUKC1遺伝子の発現はヒト組織中で極めて限定されており、1例としては刺激を受けたTh２細胞で選択的に発現されることが分かった。
【実施例２】
【００５７】
所望のcDNAの全長をクローニングするために、UKC1 mRNAの発現が高い細胞からλファージcDNAライブラリーを調製した。すなわち、PMA (20 ng/ml)とionomycin (1 μg/ml)の存在下37℃で６時間培養後のヒトTh２細胞よりtotal RNAを抽出し、オリゴ（dT）ビーズ（Promega社製）を用いて、poly(A)+RNAを精製した。次に、市販のcDNAクローニングキット（Invitrogen社製）を用いて、２本鎖cDNAを合成し、その両端にEcoRI(NotI)アダプターを付加した後に、ZAP Express（Stratagene社製）のEcoRIサイトにクローニングした。これに引続き、市販のキット（Stratagene社製）を用いて、インビトロで上記λファージにおけるパッケージングを完了した。このパッケージング産物を大腸菌XL1-Bleu MRF'（Stratagene社製）に感染させ、約1.7×105個の組換えλファージを得た。次に、上記実施例１で作成した590 bpのPCR産物をランダムプライミング法を用いた市販の32Ｐ標識用キット（宝酒造製）を用いて標識し、これを放射性プローブとして、プラークハイブリダイゼーション法によりλファージライブラリーのスクリーニングを行い複数のcDNAクローンを得た。最も長いcDNAクローンはpoly (A)部分を除いて全長913bpからなり、492bpのオープンリーディングフレーム（ORF）、37 bpの5'非翻訳領域および384 bpの3'非翻訳領域からなる構造を有していた（配列番号１）。ORFは164アミノ酸残基からなる蛋白質をコードおり、分泌蛋白質の特徴的なシグナル配列が存在していた（配列番号２）。
【実施例３】
【００５８】
上記実施例２でクローニングしたUKC1 cDNAクローンの全長（アダプター配列を含む）をpcDNA3.1(-) (Invitrogen社製)のBamHI/HindIIIサイトにサブクローニングし哺乳類細胞用の発現ベクターを作成した（以下pcD-UKC1と呼ぶ）。また一方で、上記実施例２でクローニングしたUKC1 cDNAクローンの翻訳領域をpQE30ベクター（キアゲン）にサブクローニングし、HisタグのC末にUKC1蛋白質の全長が融合した融合蛋白質を発現する大腸菌用の発現ベクターを作成した（以下pQE-H-ss-UKC1と呼ぶ）。さらには、上記実施例２でクローニングしたUKC1 cDNAクローンの翻訳領域のうちシグナルペプチド配列を除いた分泌蛋白質部分に相当する領域だけを含み、サブクローニング用の制限酵素サイトを付加したフラグメントをPCRにより増幅した．PCRプライマーはNdeIサイトを付加した30 merのセンスプライマー（AAACATATGTCCCACACGTTGCCCGTCCGT:
配列番号5）とXhoIサイトを付加した30 merのアンチセンスプライマー（TTTCTCGAGAGTGGTGGCCTGTTGGGCTCC：配列番号6）を用いた。
【００５９】
PCR産物をKODポリメラーゼ（東洋紡社製）により平滑化し、pZero-2.0のEcoRV部位に挿入し、宿主大腸菌DH-5αFT（Invitorgen社製）に形質転換を行った。得られたクローンの塩基配列を決定し、PCR反応中に増幅エラーが生ぜず、目的の構造を有するクローンを選択した。このプラスミドからNdeIからXhoIのフラグメントをpET30-A(Novagen社製)のNdeIからXhoIの間に挿入し宿主大腸菌DH-5αFT（Invitorgen社製）に形質転換を行った。塩基配列を確認し、ｃDNAのORFのHisタグが融合した蛋白質として発現されるクローンを選択した。このクローンをLB培地で37℃で１６時間培養し、発現プラスミドDNA（pET-UKC-H）を精製した。
【００６０】
プラスミドPQE-H-ss-UKCとpET-UKC-Hはそれぞれ宿主大腸菌JM-109（東洋紡社製）とBL21-Codon Plus (Stratagene社製)に形質転換を行った。次にIPTGにより蛋白質の誘導を行い、宿主にUKC1蛋白質の発現を誘導した。大腸菌を遠心により回収後、８M尿素を含むPBS緩衝液に懸濁し、凍結融解処理を行った後、超音波で破砕した。破砕液を遠心操作により上清を分離し、ニッケルNTA-レジン（Qiagen社製）により精製した。尿素を含む精製液をゲル濾過により分離し、UKC1蛋白質を含む画分を集めた後、PBSに対して透析し、遠心操作により不溶物を除去した。得られたリコンビナント蛋白質はそれぞれHis-ss-UKC1およびUKC1-Hisと称し以下の実験に用いた（図２）。
【００６１】
また、バキュロウイルスで分泌型のUKC1蛋白質を作らせることもできる。まずバキュロウイルス発現プラスミドpAC-GP67-B（Invitrogen社製）を鋳型として、センスプライマー（AATCCATgggAATgCTACTAgTAAATCAgT：配列番号７）とUKC1の配列を含むアンチセンスプライマー（CAACGTGTGGGACGCCGCAAAGGCAGAATG：配列番号８）を用いてPCRを行い、バキュロウイルスのシグナル配列を増幅した。プラスミドDNA（pcD-UKC1）を鋳型として、バキュロウイルスの一部シグナル配列を含み配列番号８の相補鎖であり、かつUKC1のシグナル配列の切断点の下流の配列を含むプライマー（TTTGCGGCGTCCCACACGTTGCCCGTCCGT：配列番号９）とアンチセンスプライマー（TTTGAATTCTTAAGTGGTGGCCTGTTGGG：配列番号10）を用いてPCRを行い、UKC1の部分cDNAを増幅した。このcDNAと前述のバキュロウイルスのシグナル配列のDNAの混合物を鋳型として、センスプライマー（配列番号７）とアンチセンスプライマー（配列番号10）を用いてPCRを行い、バキュロウイルスのシグナル配列とUKC1のシグナル配列の切断点の下流の配列が融合したDNA（配列番号11）を増幅し、KODポリメラーゼ（東洋紡社製）により平滑化し、pZero-2.0のEcoRV部位に挿入し、宿主大腸菌DH-5αFT（Invitorgen社製）に形質転換を行った。目的の構造を持つクローンを選択し、プラスミドを精製した。このプラスミドをSpeIとEcoRIで切断し、得られたフラグメントをバキュロウイルス発現プラスミドpAC-GP67-BのSpeIとEcoRIの間に挿入し、宿主大腸菌DH-5αFT（Invitorgen社製）に形質転換を行った。目的の構造を持つクローンを選択し、プラスミドを精製した。得られたプラスミドをPharmingen社のプロトコルに従い、UKC1蛋白質を発現する組換えバキュロウイルスを作成し、UKC蛋白質を無蛋白質培地の中に放出させると共に、昆虫細胞を回収した。上清と細胞からSDSにより蛋白質を溶解させ、ウエスタンブロットをおこない、UKC蛋白質が発現し、放出されていることを確認すると共に、糖鎖修飾がされていることを電気泳動的に確認した。
【実施例４】
【００６２】
実施例３で得られた大腸菌由来のリコンビナントUKC1蛋白質His-ss-UKC1をフロイント完全アジュバントとともにBALB/cマウスの腹腔に免疫した。二回目以降は同一蛋白質をフロイント不完全アジュバントとともにほぼ2週間のインターバルをおいて数回追加免疫を行った。最終免疫から２週間後に採血し、ポリクローナル抗体を精製すると共に、脾臓細胞からモノクローナル抗体の作成を行った。モノクローナル抗体はCOS-7細胞に発現させたUKC1蛋白質に対する反応性をもとにスクリーニングした。すなわち、pcD-UKC1およびコントロールのpcDNA3.1(-)プラスミドを遺伝子導入して２４時間培養後のCOS-7細胞をトリプシン・EDTA処理でいったん回収し、スライドグラス上にてさらに６時間培養後、ホルマリン固定、NP-40処理を施したものをそれぞれ抗原陽性および抗原陰性スライドとし、FITC標識ヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体（Biosource International社製）を用いた蛍光抗体間接法にてUKC1特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択した。1回の細胞融合で２４種のUKC1特異的モノクローナル抗体を得た。このうちウエスタンブロッティングに使えなおかつ互いにエピトープが異なる２種のモノクローナル抗体（CX-2およびCX-10、いずれもマウスIgG1抗体）を選択した。
【実施例５】
【００６３】
UKC1蛋白質は実施例４で述べたように特異的な抗体を用いて免疫組織化学的に検出できる他、分子の性状の解析や定性の目的ではウエスタンブロッティングなどでも検出できる。例えば図３にはウエスタンブロッティングの結果を示す。ここでは、まずpcD-UKC1およびコントロールプラスミドpcDNA3.1(-)を導入したCOS-7の培養上清および、PMA (20 ng/ml)とionomycin (1 μg/ml)の存在下、非存在下で６時間培養したヒトTh２細胞の培養上清を抗UKC1モノクローナル抗体CX-2で免疫沈降した。次にそれぞれの免疫沈降物を２等分し、一方はそのまま、もう一方はEndoF処理をして全ての糖鎖をはずした後にSDS-PAGEに供し、ビオチン標識CX-2抗体をプローブとしてウェスタンブロット解析を行った結果を示している。図３に示す結果より、アミノ酸配列から予想されたようにUKC1が分泌蛋白質であり、糖鎖が付加されており、糖鎖をはずした場合の分子量は約16Kダルトンであることが確認された。またpcD-UKC1に由来するUKC1蛋白質がTh2細胞に由来する天然型のUKC1と同様の分子構造を有することが確認された。さらに、図１に示すような遺伝子発現解析の結果から予想されたようにUKC1は刺激に応答して産生分泌されることが蛋白質のレベルで確認された。
【実施例６】
【００６４】
UKC1蛋白質は既存の免疫学的定量法例えばELISA法などを用いて簡便に定量することができる。UKC1を定量するに当たってはできるだけ天然型に近いUKC1標準品を調整する必要がある。この目的で、pcD-UKC1を遺伝子導入したCOS-7細胞の培養上清を、CX-2抗体を結合したAffi-Gel 10（バイオラド社製）のカラムにアプライし、PBSおよび2MのNaClを含むPBSでよく洗浄した後にpH2.5のグリシン塩酸バッファーで溶出したところ高純度のUKC1標準品を得ることができた（図４）。この標準品中の主要蛋白質がUKC1であることはEndoFで糖鎖をはずすと約16Kダルトンの単一分子量のバンドになること（図４）およびウエスタンブロッティングでモノクローナル抗体に特異的に反応することで確認された。次にCX-10抗体を固相化抗体、ビオチン化したCX-2抗体を検出抗体とするサンドウィッチELISAを構築した。上記UKC1標準品を用いた標準曲線を図５に示す。また実際にヒトTh１細胞およびTh２細胞の刺激、非刺激培養上清を測定した結果を図６に示す。
【実施例７】
【００６５】
健常成人末梢血より単核細胞（以下PBMCと略す）を分離し、His-ss-UKC1および対照の大腸菌由来のHisタグ付きリコンビナント蛋白質［ここでは造血器型プロスタグランディンD２合成酵素（hPGDS）を用いた］の存在下に23時間培養し、培養上清中のサイトカインをHuman Cytokine LINCOplex kit（Linco Research社製）で測定した。UKC1を添加するとIL-6、IL-10、IL-13、IFN-γの産生が誘導されることからUKC1は免疫細胞とりわけ単球系の細胞を強力に活性化することが確認された（表１の上段）。次に、低濃度のPHA刺激下に同様の実験を行った。その結果UKC1はTh１関連のサイトカインであるIL-12やIFN-γの産生を有意に促進し、一方でTh２関連サイトカインであるIL-4、IL-5、IL-13の産生を抑制した（表１の下段）。この結果はUKC1はアレルギー性の免疫応答に抑制的に作用することを示している。このことを確認するために、PBMCのスギ花粉アレルゲン、PPD（典型的なTh１関連抗原、結核菌成分）および低濃度のPHAに対する増殖応答を3H-thymidine （１mCi）の取り込みで測定する系に、COS-7由来のUKC1（1mg/ml）を添加して影響を調べた。その結果UKC1はPPDやPHAに対する増殖応答には影響せず、スギ花粉アレルゲンに対する増殖応答だけを選択的に抑制した（図７）。
【００６６】
【表１】
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【実施例８】
【００６７】
リポポリサッカライド（LPS）非応答性マウスC3H/HeJの脾臓細胞から、B220に対するmagnetic beads 付着抗体（BD社製）を用いてB細胞を分離した。９６ウェルプレートに６ｘ105個のB細胞をUKC1蛋白の存在、非存在下で４０時間培養した。培養24〜40時間に3H-thymidine （１mCi）をパルスし、その取り込みを液体シンチレーションカウンター（BD社製）で測定した。それぞれのUKC蛋白は、大腸菌で発現させ、モノクローナル抗体（CX-2）アフィニティーカラムを用いて精製した。この結果は図8に示したとおり、His-ss-UKC1蛋白およびUKC-His蛋白は、C3H/HeJマウスB細胞に対し増殖活性を示した。なお、コントロールのHis-hPGDS蛋白では増殖活性は認められなかった。このように、UKC1はB細胞に作用して増殖活性を示す蛋白であることが確認された。
【実施例９】
【００６８】
スギ花粉アレルゲンCry j 1 に特異的に増殖するマウスTh2細胞株２ｘ104個、マイトマイシン処理した抗原提示細胞６ｘ105個、および抗原としてCry j 1 （2.5 mg/ml） にUKC１蛋白の存在、非存在下で64時間培養した。培養48〜64時間に3H-thymidine （１mCi）をパルスし、その取り込みを液体シンチレーションカウンター（BD社製）で測定した。それぞれのUKC蛋白は、大腸菌で発現させ、モノクローナル抗体（CX?２）アフィニティーカラムを用いて精製した。この結果はこの図9に示したとおり、UKC1はスギ花粉アレルゲンCry j 1 特異的Th2細胞のCry j 1 に対する増殖反応を抑制することができる蛋白であることが確認された。このようにUKC1蛋白は、Th2細胞の抗原特異的増殖反応を抑制する活性をもつ蛋白である。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
以上に詳しく説明したとおり、この発明によってヒトを含む動物に免疫を活性化させる免疫応答調節蛋白質とその遺伝子および特異的抗体が提供される。また、この発明のポリヌクレオチドを利用することによって、前記蛋白質を大量に製造することができる。この遺伝子、蛋白質あるいは抗体は癌、アレルギー、自己免疫疾患、種々の炎症性疾患を含む免疫関連疾患の予防、治療に効果を発揮することが期待される。ワクチンの効果増強物質としても有用である。また遺伝子あるいは抗体は上記免疫関連疾患の病態の把握や治療効果の評価に有用である。また、本発明の免疫応答調節蛋白質とその特異的なレセプターの相互作用に対するアンタゴニスト、アゴニストのスクリーニング系を提供する。そのようなアンタゴニスト、アゴニストも上記免疫関連疾患の予防、治療薬として有望である。一方、蛋白質および融合蛋白質を、実験動物を免疫する際に用いる事により、効率良く免疫を行うことができ、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体において、簡便に多種な抗体を得ることができる。実験動物において免疫を効率良く行える事は、自己免疫疾患等の免疫異常のモデルマウス作成が効率良く行える。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】Th1およびTh2細胞におけるUKC1mRNAの発現をノーザンブロッティング法で解析した結果を示す。
【図２】大腸菌由来のUKC1リコンビナント蛋白質のSDS-PAGE解析の結果を示す。クマジーブリリアントブルー染色。
【図３】pcDNA3.1(-)を遺伝子導入したCOS-7細胞（Control）、pcD-UKC1を遺伝子導入したCOS-7細胞（UKC1）、非刺激Th２細胞（Control）およびPMA/ionomycin刺激したTh２細胞（PMA/ion）のそれぞれの培養上清をCX-2抗体を用いて免疫沈降し、EndoF処理（+）あるいは非処理（-）後にウェスターンブロット解析した結果を示す。
【図４】COS-7細胞由来UKC1蛋白質のSDS-PAGE解析像。中央のレーンはCX2抗体結合カラムを用いて精製したUKC1蛋白質、右のレーンは精製UKC1をEndo Fで処理し糖鎖を除いた標品のSDS-PAGE像を示す。
【図５】UKC1 ELISAの標準曲線。２種の抗UKC1モノクローナル抗体（CX２およびCX１０）を用いたサンドイッチELISAにおける標準UKC1蛋白質の反応曲線を示す。縦軸は５９２ナノメーターにおけるOD値を示す。
【図６】Th1およびTh2細胞におけるUKC1の産生。Th1およびTh2細胞をPMA+ionomycin存在下（刺激）および非存在下（非刺激）に３７度Cで２４時間培養した培養上清中のUKC1の濃度をELISAで定量した結果を示す。
【図７】スギ花粉、PPDおよびPHAに対するヒト末梢血単核細胞の増殖応答におよぼすUKC1の影響を示す。ヒト末梢血単核球を精製UKC1の存在下（UKC1）および非存在下（Control）に、スギ抗原、PPDおよびPHAで刺激し、５日目の細胞のDNA合成を３H-thymidineの取り込みで評価した。
【図８】UKC1蛋白によるマウスB細胞の増殖刺激活性能を示す。
【００７１】
UKC1蛋白によるB細胞増殖刺激活性は、培養24〜40時間に3H-thymidineをパルスして
B細胞の増殖反応をDNA合成能として評価した。
【図９】UKC1蛋白による抗原特異的Th2細胞の増殖抑制活性を示す。UKC1蛋白存在下で、スギ花粉アレルゲンCry j 1 特異的なマウスTh2細胞のCry j 1 に対する増殖反応を抑制できるか、培養48〜64時間に3H-thymidineをパルスして、T細胞の増殖反応をDNA合成能として評価した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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