(57)【要約】【課題】マイクロサテライトマーカーを含むゲノムDNAの領域内の不安定性を検出するための手段の提供。【解決手段】反復ヌクレオチド配列を含む標的核酸の突然変異体を検出するための方法及びプローブ核酸。【選択図】図１
2007029093.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸の突然変異体の検出方法であって、以下のステップ：
少なくとも１つの反復ヌクレオチド配列を含んで成る少なくとも１つの標的核酸、及び／又は当該標的核酸のアンプリコンを準備すること；
上記反復ヌクレオチド配列の非突然変異体の少なくとも一部分に対して少なくとも実質的に相補的である第１ヌクレオチド配列を少なくとも１つ含んで成る少なくとも１つのプローブ核酸を、上記標的核酸、及び／又は上記標的核酸のアンプリコンに結合させること；並びに
もしあれば、上記標的核酸由来及び／又は上記標的核酸のアンプリコンからの上記プローブ核酸の二峰性の解離を検出し、この検出された二峰性の解離が上記反復ヌクレオチド配列の少なくとも１つの突然変異体と相関しており、それによって、上記標的核酸の突然変異体を検出すること、
を含んで成る方法。
【請求項２】
前記標的核酸が、以下の：ACTRII遺伝子、AIM2遺伝子、APAF-1遺伝子、APC遺伝子、AXIN-2遺伝子、BAX遺伝子、BCL-10遺伝子、BLM遺伝子、カスパーゼ-5遺伝子、CDX2遺伝子、CHK1遺伝子、E2F4遺伝子、FAS遺伝子、FRAXA/FMR-1遺伝子、GRB-14遺伝子、hG4-1遺伝子、hMSH1遺伝子、hMSH2遺伝子、hMSH6遺伝子、IGFIIR遺伝子、KIAAO977遺伝子、MBD-4遺伝子、MLH3遺伝子、MSH3遺伝子、MSH6遺伝子、NADH-UOB遺伝子、OGT遺伝子、PTEN遺伝子、RAD-50遺伝子、RHAMM遺伝子、RIZ遺伝子、SEC63遺伝子、SLC23AI遺伝子、TCF-4遺伝子、TGFβRII遺伝子、及びWISP-3遺伝子から成る群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子の少なくとも一部分に相当する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記プローブ核酸が、配列番号1〜4、及びその相補体から成る群から選ばれる配列を含んで成る、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記反復ヌクレオチド配列が、BAT-25反復及びBAT-26反復から成る群の中の少なくとも１つのモノヌクレオチド反復を含んで成る、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記プローブ核酸が、以下の：C5-メチル-dC、C5-エチル-dC、C5-エチル-dU、2,6-ジアミノプリン、C5-プロピニル-dC、C5-プロピニル-dU、C7-プロピニル-dA、C7-プロピニル-dG、C5-プロパルギルアミノ-dC、C5-プロパルギルアミノ-dU、C7-プロパルギルアミノ-dA、C7-プロパルギルアミノ-dG、7-デアザ-2-デオキシキサントシン、ピラゾロピリミジン・アナログ、疑似dU、ニトロ・ピロール、ニトロ・インドール、N4-エチル-dC、又はN6-メチル-dAの中の1つ以上を含む修飾ヌクレオチドを少なくとも１つ含んで成る、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記のプローブ核酸、標的核酸、及び／又は標的核酸のアンプリコンが、少なくとも１つの標識部分、及び／又は少なくとも１つのクエンチャー部分を含むか又はそれを伴っている、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つの反復ヌクレオチド配列を含んで成る少なくとも１つの標的核酸、及び／又は当該標的核酸のアンプリコン；並びに
上記反復ヌクレオチド配列の非突然変異体の少なくとも一部分に対して少なくとも実質的に相補的である第１ヌクレオチド配列を少なくとも１つ含んで成る少なくとも１つのプローブ核酸であって、少なくとも１つの変化のある条件下で、上記反復ヌクレオチド配列の少なくとも１つの突然変異体を含む結合した標的核酸から二峰性で解離するプローブ核酸、
を含んで成る反応混合物。
【請求項８】
前記反応混合物中の標的核酸、及び／又は標的核酸のアンプリコンの濃度が、約100nM〜約1.5μMである、請求項7に記載の反応混合物。
【請求項９】
前記プローブ核酸が、配列番号1〜4、及びその相補体から成る群から選ばれる配列を含んで成る、請求項7に記載の反応混合物。
【請求項１０】
１又は複数のトリス-（ヒドロキシメチル）アミノエタン、トリス-（ヒドロキシメチル）アミノメタン・リン酸ナトリウム、ビス（2-ヒドロキシエチル）-イミノ-トリス（ヒドロキシメチル）メタン、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、四ホウ酸ナトリウム、グリシン−水酸化ナトリウム、N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N’-2-エタン・スルホン酸、3-［（1,1-ジメチル-ヒドロキシエチル）アミノ］-2-ヒドロキシプロパン・スルホン酸、3-（シクロヘキシルアミノ）-2-ヒドロキシ-1-プロパン・スルホン酸、3-［N,N-ビス（ヒドロキシエチル）アミノ］-2-ヒドロキシプロパン・スルホン酸、N-（2-ヒドロキシエチル）ピペラジン-N'-2-ヒドロキシプロパン・スルホン酸、3-（N-モルフォリノ）-2-ヒドロキシプロパンスルホン・スルホン酸、ピペラジン-NN'-ビス（2-ヒドロキシプロパン・スルホン酸）、3-［N-トリス-（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］-2-ヒドロキシプロパン・スルホン酸、2-（N-モルフォリノ）-エタン・スルホン酸、3-（N-モルフォリノ）プロパン・スルホン酸、又はピペラジン-N,N'-ビス（エタン・スルホン酸）を含んで成る少なくとも１つの緩衝物質を含んで成る、請求項7に記載の反応混合物。
【請求項１１】
反復ヌクレオチド配列の非突然変異体の少なくとも一部分に対して少なくとも実質的に相補的である第１ヌクレオチド配列を少なくとも１つ含んで成るプローブ核酸であって、少なくとも１つの変化のある条件下で、上記反復ヌクレオチド配列の少なくとも１つの突然変異体を含んで成る、結合した標的核酸から二峰性で解離するプローブ核酸。
【請求項１２】
配列番号1〜4、及びその相補体から成る群から選ばれる配列を含んで成る、請求項11に記載のプローブ核酸。
【請求項１３】
反復ヌクレオチド配列の非突然変異体の少なくとも一部分に対して少なくとも実質的に相補的である第１ヌクレオチド配列を少なくとも１つ含む少なくとも１つのプローブ核酸であって、少なくとも１つの変化のある条件下で、上記反復ヌクレオチド配列の少なくとも１つの突然変異体を含む結合したポリヌクレオチドから二峰性で解離するプローブ核酸；並びに
上記反復ヌクレオチド配列を含む結合した標的核酸からの、及び／又は上記標的核酸の結合したアンプリコンからの上記プローブ核酸の解離を検出するための取扱説明書、
を含んで成るキット。
【請求項１４】
標的核酸の突然変異体を検出するためのシステムであって：
反復ヌクレオチド配列の非突然変異体に対して少なくとも実質的に相補的である第１ヌクレオチド配列を少なくとも１つ含んで成る少なくとも１つのプローブ核酸であって、少なくとも１つの変化のある条件下で、上記反復ヌクレオチド配列の少なくとも１つの突然変異体を含んで成る、結合した標的核酸から二峰性で解離するプローブ核酸；並びに
上記プローブ核酸が、上記標的核酸、及び／又は上記標的核酸のアンプリコンに結合し、そして1つ以上の変化のある条件にさらされた時に、当該標的核酸から、及び／又は当該標的核酸のアンプリコンからの上記プローブ核酸の解離を検出する少なくとも１つの検出器、
を含んで成るシステム。
【請求項１５】
変化のある条件を達成するために、前記プローブ核酸が標的核酸、及び／又は当該標的核酸のアンプリコンに結合した時に、当該プローブ核酸が曝露される温度を調節する少なくとも１つの温度調節器を含んで成る、請求項14に記載のシステム。
【請求項１６】
少なくとも検出器と動作可能に接続した少なくとも１つの制御装置であって、結合した標的核酸からの、及び／又は結合した標的核酸のアンプリコンからの前記プローブ核酸の二峰性の解離を、標的核酸が得られた対象の少なくとも１つの遺伝的障害、及び／又は少なくとも１つの病状の診断と相関させる制御装置を含んで成る、請求項14に記載のシステム。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの容器が前記プローブ核酸を含んで成る、請求項14に記載のシステム。
【請求項１８】
前記プローブ核酸が溶液中に存在する、請求項17に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
当該発明は、反復ヌクレオチド配列を含む標的核酸の検出に関する。例えば、本発明の１つの側面は、例えばマイクロサテライトマーカーといった縦列反復を含むゲノムDNAの領域の不安定性の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
例えば、順方向又は逆方向反復配列といった反復ヌクレオチド配列は、多くの生物で観察される。一例として、何十万ものマイクロサテライト遺伝子座がヒト遺伝子全体にわたって分散しているので、統計的に100,000塩基対につき約1回発生している。マイクロサテライト遺伝子座は、最も短い反復単位が通常1〜5ヌクレオチドの長さである短い縦列反復を含むゲノムDNA領域である。それ故に、特定のマイクロサテライト遺伝子座の反復単位は、規定どおり、モノ−、ジ−、トリ−、テトラ−、又はペンタ・ヌクレオチド反復遺伝子座と一般に呼ばれる。既知のマイクロサテライト遺伝子座は、通常、縦列配置で約10〜40個のこれらの反復単位を含んでいる。さらに、例えば哺乳動物種由来のゲノムDNAといった、大部分の二倍体種の通常のゲノムDNAの各々のマイクロサテライト遺伝子座は、各遺伝子座において2つの対立遺伝子を含んでいる。その2つの対立遺伝子は、長さが互いに同じであるか又は異なっていてもよく、そしてある個体と次の個体で異なっていてもよい。
【０００３】
マイクロサテライト不安定性（MSI）又は複製エラー（RER）は、腫瘍細胞がDNAを厳密に複製する能力を弱められた一部のヒト新生物で生じるゲノム不安定性の一例である。MSIは、ヒトDNA誤対合修復（MMR）遺伝子の潜在的な機能的不活化に関する一般的なマーカーである（Jeongら（2003年）「Microsatellite instability and mutations in DNA mismatch repair genes in sporadic colorectal cancers」、Dis Colon Rectum. 46（8）：1069〜1077ページ、Papadopoulosら（1994年）「Mutations of a mutL homolog in hereditary colon cancer」、Science 263：1625〜1629ページ、Ghimentiら（1999年）「Microsatellite instability and mismatch repair gene inactivation in sporadic pancreatic and colon tumours」、Br J Cancer. 80（1-2）：11〜16ページ、Fishelら（1993年）「The human mutator gene homolog MSH2 and its association with hereditary nonpolyposis colon cancer」、Cell 75：1027〜1038ページ、及びBronnerら（1994年）「Mutation in the DNA mismatch repair gene homologue hMLH1 is associated with hereditary non-polyposis colon cancer」、Nature 368：258〜261ページ、上記文献を本明細書中に援用する）。MMR遺伝子の機能低下は、コード領域の突然変異、ヘテロ接合性欠失（LOH）、及び／又はプロモーターのメチル化による2対立遺伝子の不活化のためだと考えられる（Goelら（2004年）「Frequent inactivation of PTEN by promoter hypermethylation in microsatellite instability-high sporadic colorectal cancers」、Cancer Res. 64（9）：3014〜3021ページ、Veiglら（1998年）「Biallelic inactivation of hMLH1 by epigenetic gene silencing, a novel mechanism causing human MSI cancers」、Proc Natl Acad Sci USA 95：8698〜8702ページ、及びPiaoら（2000年）「Frequent frameshift mutations of RIZ in sporadic gastrointestinal and endometrial carcinomas with microsatellite instability」、Cancer Res. 60：4701-4704ページ、上記文献を本明細書中に援用する）。さらに、MMR遺伝子の生殖細胞系突然変異が、大部分の遺伝性非ポリポーシス大腸癌（HNPCC）家系における常染色体の優性遺伝子の欠陥であることが示された（Eshlemanら（1995年）「Microsatellite instability in inherited and sporadic neoplasms」、Curr Opin Oncol 7：83〜89ページ、上記文献を本明細書中に援用する）。HNPCC個体の腫瘍細胞によって招かれる2番目の突然変異は、腫瘍のマイクロサテライトDNAの厳密な複製の低下を引き起こす特定のMMR遺伝子の2対立遺伝子不活化をもたらす（Hemminkiら（1994年）「Loss of the wild type MLH1 gene is a feature of hereditary nonpolyposis colorectal cancer」、Nat Genet 8：405〜410ページ、上記文献を本明細書中に援用する。よって、MSIは、潜在的なDNA誤対合修復欠陥のマーカーであり、そしてまたコードDNAの高められた突然変異率にも関係する（Eshlemanら（1995年）「Increased mutation rate at the hprt locus accompanies microsatellite instability in colon cancer」、 Oncogene 10：33〜37ページ、及びBhattacharyyaら（1994年）「Mutator phenotypes in human colorectal carcinoma cell lines」、Proc Natl Acad Sci USA 91：6319〜6323ページ、上記文献を本明細書中に援用する）。MMR欠陥から生じるこの突然変異誘発遺伝子の表現型が、MSIをもたらすことに加えて、各々等しい頻度で生じる、コード領域の塩基置換及び順方向反復配列でのフレームシフト突然変異の両方を引き起こす（Eshlemanら（1996年）「Diverse hypermutability of multiple expressed sequence motifs present in a cancer with microsatellite instability」、Oncogene 12：1425〜1432ページ、上記文献を本明細書中に援用する）。
【０００４】
MMR欠陥の発生及び結果として生じる突然変異誘発遺伝子の表現型は、腫瘍形成の初期現象であると考えられ（Parsonsら（1993年）「Hypermutability and mismatch repair deficiency in RER+ tumor cells」、Cell 75（6）：1227〜1236ページ及びShibataら（1994年）「Genomic instability in repeated sequences is an early somatic event in colorectal tumorigenesis that persists after transformation」、Nat Genet 6：273〜281ページ）、そして大腸異常腺窩巣ステージと同じ位早く生じることが示唆された（Augenlichtら（1996年）「Evidence for genomic instability in human colonic aberrant crypt foci」、Oncogene 12：1767〜1772ページ）。
【０００５】
HNPCC家系における生殖細胞系の欠陥が関係するにもかかわらず、MSIが散発性結腸直腸癌の約15〜20%でも見つかり（Aaltonenら（1993年）「Clues to the pathogenesis of familial colorectal cancer」、Science 260：812〜816ページ）、この所見はゲノム不安定性の全体的な増加も反映している。腫瘍におけるMSIの欠陥の所見は、ステージごとステージごとの対応腫瘍のより良い予後にも関係した（Thibodeauら（1993年）「Microsatellite instability in cancer of the proximal colon」、Science 260：816〜819ページ及びSankilaら（1996年）「Better survival rates in patients with MLH1-associated hereditary colorectal cancer」、Gastroenterologv 110：682〜687ページ）。よって、MSIを用いて腫瘍を特定することは、生殖細胞系MMRの欠陥（HNPCC家系）を関係させることだけでなく、予後の階層化にも臨床的に関連している。臨床徴候（ベセズダ・ガイドライン（Rodriguez-Bigasら（1997年）「A National Cancer Institute workshop on hereditary nonpolyposis colorectal cancer syndrome：meeting highlights and Bethesda guidelines」、J Natl Cancer Inst 89：1758〜1762ページ）及び組織病理学的徴候（Kimら（1994年）「Clinical and pathological characteristics of sporadic colorectal carcinomas with DNA replication errors in microsatellite sequences」、Am J Pathol 145：148〜156ページ）が、大腸腫瘍がマイクロサテライト不安定であり、かつ、おそらくHNPCC家系で生じたという疑いを引き起こす可能性がある一方で、臨床病理学的徴候は、MSIの存在を診断するには不十分だった。それ故に、臨床的に疑わしい腫瘍のMSI徴候を明らかにするために、分子的試験が利用されうる（Bolandら（1998年）「A National Cancer Institute workshop on microsatellite instability for cancer detection and familial predisposition：development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer」、Cancer Res 58：5248〜5257ページ）。
【０００６】
大腸腫瘍に加えて、MSIは、他のタイプの癌及び他の遺伝的障害にも関係した。例えば、これらは、とりわけ、膵癌（Hanら（1993年）「Genetic instability in pancreatic cancer and poorly differentiated type of gastric cancer」、Cancer Res. 53：5087〜5089ページ）、胃癌（Panら（2004年）「Detection of frameshift mutations of RIZ in gastric cancers with microsatellite instability」、World J Gastroenterol. 10（18）：2719〜2722ページ、Frenchら（2004年）「Allelic imbalance of 8p indicates poor survival in gastric cancer」、J Mol Diagn. 6（3）：243〜252ページ、Rhyuら（1994年）「Microsatellite instability occurs frequently in human gastric carcinoma」、Oncogene 9：29〜32ページ、及びHanら（1993年）上記）、膀胱癌（Gonzalez-Zuluetaら（1993年）「Microsatellite instability in bladder cancer」、Cancer Res. 53：5620〜5623ページ）、前立腺癌（Schoenbergら（1994年）「Microsatellite mutation（CAG2418）in the androgen receptor gene in human prostate cancer」、Biochem. Biophys. Res. Commun. 198：74〜80ページ）、肺癌（Merloら（1994年）「Frequent microsatellite instability in primary small cell lung cancer」、Cancer Res. 54：2098〜2101ページ及びShridharら（1994年）「Genetic instability of microsatellite sequences in many non-small cell lung carcinomas」、Cancer Res. 54：2084〜2087ページ）、子宮癌（Burksら（1994年）「Microsatellite instability in endometrial carcinoma」、Oncogene 9：1163〜1166ページ及びMiyaiら（2004年）「Loss of heterozygosity analysis in uterine cervical adenocarcinoma」、Gynecol Oncol. 94（1）：115〜120ページ）、及び乳癌（Yangら（2004年）「High-resolution 19p13.2〜13.3 allelotyping of breast carcinomas demonstrates frequent loss of heterozygosity」、Genes Chromosomes Cancer 41（3）：250〜256ページ及びYeeら（1994年）「Microsatellite instability and loss of heterozygosity in breast cancer」、Cancer Res. 54：1641〜1644ページ）を含む。マイクロサテライト不安定性と関係があると考えられている他の代表的な遺伝子序列（genetic orders）は、例えばハンチントン病（HD）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（DRPLA）、球脊髄性筋萎縮症（SBMA）、筋緊張型筋ジストロフィー症（DM）、脆弱X染色体症候群、FRAXE精神遅滞及び脊髄小脳失調症（SCA）（Costa Limaら（2004年）「Dynamic mutation and human disorders：the spinocerebellar ataxias（概説）」、Int J Mol Med. 13（2）：299〜302ページ）、ブルートン型X染色体連鎖性無ガンマグロブリン血症（XLA）（Allenら（1994年）「Application of carrier testing to genetic counseling for X-linked agammaglobulinemia」、Am J Hum Genet. 54（1）：25〜35ページ）、ブルーム症候群（BS）（Foucaultら（1996年）「Stability of microsatellites and minisatellites in Bloom syndrome, a human syndrome of genetic instability」、Mutat Res. 362（3）：227〜236ページ及びKanekoら（1996年）「Microsatellite instability in B-cell lymphoma originating from Bloom syndrome」、Int J Cancer. 69（6）：480〜483ページ）、クラニオフロントネイザル（craniofrontonasal）症候群（CFNS）（Feldmanら（1997年）「A novel phenotypic pattern in X-linked inheritance：craniofrontonasal syndrome maps to Xp22」、Hum Mol Genet. 6（11）：1937〜1941ページ）、及び特発性肺線維症（IPF）（Moriら（2001年）「Microsatellite instability in transforming growth factor-beta 1 type II receptor gene in alveolar lining epithelial cells of idiopathic pulmonary fibrosis」、Am J Respir Cell Mol Biol. 24（4）：398〜404ページ）を含む。
【０００７】
先の論考を考慮すると、反復ヌクレオチド配列、例えばマイクロサテライトの分析が、数ある使用の中でも多くの診断的及び予後適用を有することが明らかである。既存のマイクロサテライト分析法の制限の1つは、分の単位で実施され得る迅速なアッセイがないことである。例えば、特定の既存のMSI検出方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって着目のマイクロサテライト遺伝子座を増幅し、ミニ配列分析反応を実施し、そしてゲル電気泳動法によって産物を分析するステップを含んでいる。これらの複雑な労働集約型の方法は、迅速な結果を提供するのに十分に適切なわけではない。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の概要
当該発明は、反復ヌクレオチド配列を含む核酸の突然変異体と非突然変異体とを迅速、かつ、確実に検出及び識別するためのアプローチを提供する。ある態様において、例えば、本明細書中に記載の方法は、診断的又は予後適用の一部として患者のマイクロサテライト不安定性を評価するために使用される。多くの態様において、所定の反復ヌクレオチド配列の様々な多型が、単一プローブ核酸を使って検出される。方法及びプローブに加えて、本発明は、関連する反応混合物、キット、及びシステムを提供する。
【０００９】
1つの側面において、本発明は、標的核酸の突然変異体を検出する方法を提供する。前記方法は、少なくとも１つの標的核酸、及び／又は上記標的核酸のアンプリコンを準備するステップを含む。前記標的核酸は、少なくとも１つの反復ヌクレオチド配列を含む。また、前記方法は、少なくとも１つのプローブ核酸を前記標的核酸に、及び／又は前記標的核酸のアンプリコンに結合させるステップ（例えば、ハイブリダイズするステップなど）も同様に含む。前記プローブ核酸は、前記反復ヌクレオチド配列の非突然変異体の少なくとも一部分に対して少なくとも実質的に相補的である第１ヌクレオチド配列を少なくとも１つ含む。さらに、前記方法は、前記標的核酸からの、及び／又は前記標的核酸のアンプリコンからの前記プローブ核酸の二峰性の解離を検出するステップも同様に含む。態様によっては、検出された二峰性の解離は、融解ピークの二峰性の分布を含む。さらに、検出された二峰性の解離は、前記反復ヌクレオチド配列の少なくとも１つの突然変異体と通常関連している。態様によっては、検出された非二峰性（例えば、単一モードなど）の解離は、前記反復ヌクレオチド配列の非突然変異体と関連している。
【００１０】
一般に、プローブ核酸、標的核酸、及び／又は標的核酸のアンプリコンは、少なくとも１つの標識部分、及び／又は少なくとも１つのクエンチャー部分を含むか又は伴う。これらの態様において、前記検出ステップは、前記標識部分によってもたらされる検出可能なシグナルを検出するステップを通常含んでいる。しかも、前記標的核酸からの、及び／又は前記標的核酸のアンプリコンからの前記プローブ核酸の二峰性の解離は、少なくとも１つの変化のある条件、例えば変化のある温度などの下で通常検出される。
【００１１】
他の側面において、本発明は反応混合物を提供する。前記反応混合物は、少なくとも１つの標的核酸、及び／又は上記標的核酸のアンプリコンを含む。前記標的核酸は、少なくとも１つの反復ヌクレオチド配列を含む。前記反応混合物は、前記反復ヌクレオチド配列の非突然変異体の少なくとも一部分に対して少なくとも実質的に相補的である第１ヌクレオチド配列を少なくとも１つ含む少なくとも１つのプローブ核酸も同様に含む。さらに、前記プローブ核酸は、少なくとも１つの変化のある条件下、前記反復ヌクレオチド配列の少なくとも１つの突然変異体を含む結合した標的核酸から二峰性を呈して解離する。
【００１２】
ある態様において、本発明の反応混合物は、様々な他の成分も同様に含む。例えば前記反応混合物は、少なくとも１つの塩（例えば、NaCl、KClなど）を任意で含む。態様によっては、前記反応混合物は、少なくとも１つの緩衝物質も同様に含む。前記緩衝物質は、通常、前記反応混合物のpHを約5.5〜約10.0に維持する。前記反応混合物は、任意で、少なくとも１つの補助因子、例えばMg2+（例えば、MgSO4、MgCl2など）、Mn2+（例えば、MnSO4、MnCl2など）なども同様に含む。
【００１３】
さらに別の側面において、本発明はプローブ核酸を提供する。前記プローブ核酸は、反復ヌクレオチド配列の非突然変異体の少なくとも一部分に対して少なくとも実質的に相補的である第１ヌクレオチド配列を少なくとも１つ含んで成る。さらに、前記プローブ核酸は、少なくとも１つの変化のある条件下、前記反復ヌクレオチド配列の少なくとも１つの突然変異体を含む結合した標的核酸から二峰性を呈して解離する。
【００１４】
他の側面において、本発明は、反復ヌクレオチド配列の非突然変異体の少なくとも一部分に対して少なくとも実質的に相補的である第１ヌクレオチド配列を少なくとも１つ含んで成る少なくとも１つのプローブ核酸を含んで成るキットを提供する。前記プローブ核酸は、少なくとも１つの変化のある条件下、前記反復ヌクレオチド配列の少なくとも１つの突然変異体を含む結合したポリヌクレオチドから二峰性を呈して解離する。通常、前記プローブ核酸は溶液で提供される。前記キットは、前記反復ヌクレオチド配列を含む結合した標的核酸からの、及び／又は結合した標的核酸のアンプリコンからの前記プローブ核酸の解離を検出するための取扱説明書も同様に含む。態様によっては、前記キットは、例えば対象から標的核酸を得るステップ、標的核酸の少なくとも一部分を増幅するステップ、プローブ核酸を標的核酸、及び／又は標的核酸のアンプリコンに結合させるステップ、少なくとも１つの条件を変えるステップ、検出された二峰性の解離を対象の少なくとも１つの遺伝的障害の、及び／又は少なくとも１つの病状の診断と相関させるステップなどの1つ以上に関する取扱説明書も同様に含む。さらに、前記キットは、任意で、例えば少なくとも１つの、ヌクレオチドを取り込む生体触媒、少なくとも１つのヌクレオチド、少なくとも１つのピロホスファターゼ、少なくとも１つのウラシルN-グリコシラーゼ、少なくとも１つの塩、少なくとも１つの緩衝物質、少なくとも１つの補助因子などから選ばれる1つ以上の成分も同様に含む。一般に、前記キットは、前記プローブ核酸、前記取扱説明書、及び／又は1つ以上の他の成分を包装するための少なくとも１つの容器も同様に含む。
【００１５】
さらに他の側面において、本発明は、標的核酸の突然変異体を検出するためのシステムを提供する。前記システムは、反復ヌクレオチド配列の非突然変異体に対して少なくとも実質的に相補的である第１ヌクレオチド配列を少なくとも１つ含む少なくとも１つのプローブ核酸を含む。前記プローブ核酸は、少なくとも１つの変化のある条件下、前記反復ヌクレオチド配列の少なくとも１つの突然変異体を含む結合した標的核酸から二峰性を呈して解離する。一般に、少なくとも１つの容器は、プローブ核酸を、例えば溶液の状態で含む。前記システムは、前記プローブ核酸が前記標的核酸、及び／又は前記標的核酸のアンプリコンに結合し、そして1つ以上の変化のある条件にさらされた時に、その標的核酸からの、及び／又はその標的核酸のアンプリコンからの上記プローブ核酸の解離を検出する少なくとも１つの検出器も同様に含む。態様によっては、前記システムは、前記プローブ核酸が標的核酸、及び／又は標的核酸のアンプリコンに結合した時に、そのプローブ核酸がさらされる温度を調節して、変化のある条件を達成するための少なくとも１つの温度調節器も同様に含む。ある態様において、前記システムは、少なくとも前記検出器と動作可能に接続した少なくとも１つの制御装置も同様に含み、その制御装置は、結合した標的核酸からの、及び／又は結合した標的核酸のアンプリコンからの前記プローブ核酸に関して検出された二峰性の解離と、標的核酸を得た対象の少なくとも１つの遺伝的障害、及び／又は少なくとも１つの病状の診断とを相関させる。
【００１６】
本発明の方法、反応混合物、キット、システム、及び他の側面で使用される標的核酸は、様々な態様を含む。例えば、前記標的核酸は、通常DNA又はRNAを含み、そして通常、少なくとも1人の対象から得られる。前記標的核酸の突然変異体は、通常、その標的核酸の突然変異体を含む対象の少なくとも１つの遺伝的障害（例えば、脆弱X染色体症候群など）、及び／又は少なくとも１つの病状（例えば、癌の少なくとも１つの形態など）の診断と関連がある。さらに、前記反復ヌクレオチド配列の突然変異体は、通常、その反復ヌクレオチド配列の非突然変異体と比べて少なくとも１つ欠失を含む。態様によっては、例えば、前記反復ヌクレオチド配列は、マイクロサテライトマーカー、モノヌクレオチド反復などに相当する。態様によっては、前記反復ヌクレオチド配列は、少なくとも１つのモノヌクレオチド反復（例えば、An、Tn、Gn、Cn、Unなど、ここで、nが、1より大きな整数である。）を含む。例えば、前記モノヌクレオチド反復は、その他の多くのものの中でも、BAT-25反復、BAT-26反復を任意で含む。ある態様において、前記モノヌクレオチド反復の検出された突然変異体は、22個以下のアデニン・ヌクレオチドを含む。さらに例えば、前記標的核酸の反復ヌクレオチド配列は、ある態様において、少なくとも１つのAT反復、少なくとも１つのGC反復、少なくとも１つのCGG反復、少なくとも１つのCGC反復、少なくとも１つのTAT反復、少なくとも１つのATT反復、及び／又は少なくとも１つのその相補的な反復を含む。
【００１７】
本発明の様々な側面において利用されるプローブ核酸は、異なる態様も同様に含む。態様によっては、例えば、前記第１ヌクレオチド配列は、前記反復ヌクレオチド配列の非突然変異体より長い。これらの態様において、前記反復ヌクレオチド配列の非突然変異体の長さを超えて伸びた第１ヌクレオチド配列の部分は、通常、その反復ヌクレオチド配列に隣接している標的核酸のヌクレオチド配列に対して実質的に相補的ではない。特定の理論に制約されないながら、これらの態様において、前記プローブ核酸が、少なくとも１つの選ばれた条件下で標的核酸の突然変異体又は標的核酸の突然変異体のアンプリコンに結合する時、そのプローブ核酸の少なくとも1セグメントが三重らせんを形成すると考えられる。ある態様において、前記プローブ核酸は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。ある態様において、前記プローブ核酸は、以下の：配列番号1〜4、及びその相補体から成る群から選ばれる配列を含む。固形支持体は、前記プローブ核酸を任意で含む。
【００１８】
前記プローブ核酸、標的核酸、及び／又は（例えば、アンプリコンを作製するために使用されるプライマー核酸などによる）上記標的核酸のアンプリコンは、少なくとも１つの標識部分、及び／又は少なくとも１つのクエンチャー部分を任意で含むか、又はそれらを伴っている。例えば、前記標識部分は、例えば蛍光色素、弱い蛍光標識、非蛍光標識、比色標識、化学発光標識、生物発光標識、抗体、抗原、ビオチン、ハプテン、酵素などの1つ以上を任意で含む。さらなる例示のために、前記蛍光色素は、例えばCy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、JOE、VIC、TET、HEX、FAM、R6G、R110、TAMRA、ROX、SYBR-Green、EtBrなどから成る群から任意で選ばれる。
【００１９】
詳細な説明
I. 定義
当該発明について詳細に説明する前に、当然のことながら、本願発明は、特定の態様に限定されない。また当然のことながら、本明細書中に使用される専門用語は、特定の態様について説明する目的のためだけのものであって、制限することを目的としていない。単位、接頭語、及び記号は、別段の指定がない限り、国際単位系（SI）によって推奨される形で表示される。数値範囲は、その範囲を規定している数を含めたものである。本願明細書及び添付の請求項で使用される場合、単数形「a」、「an」、及び「the」は、別段のはっきりと指図する文脈がない限り、複数の指示対象物も同様に含む。よって、例えば、「標的核酸」への言及は、本明細書中に記載される方法の特定の多重化された態様において同時に検出される複数の標的核酸も同様に含む。さらに、別段の規定がない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が関係する当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を持っている。以下に規定される用語、及びその文法的異形は、全体として当該明細書を参照することによってより完全に規定される。
【００２０】
「アンプリコン」は、他の分子を複製するか又は転写することによって作製された分子を表す。アンプリコンを作製することができる代表的な方法は、転写、クローン化、及び／又はポリメラーゼ連鎖反応法（「PCR」）、あるいは他の核酸増幅技術（例えば、鎖置換PCR増幅法（SDA）、デュプレックスPCR増幅法など）を含む。一般に、アンプリコンは、選ばれた核酸（例えば、鋳型又は標的核酸）の複製物であるか、又はそれらに対して相補的である。
【００２１】
用語「増幅する」は、複数の複製物が1つ以上の核酸遺伝子座で作製される方法を表す。増幅は、これだけに制限されることなく、ポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）（Saikiら（1985年）「Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analyses for diagnosis of sickle cell anemia」、Science 230：1350〜1354ページ）、逆転写PCR（RT-PCR）（Joyce（2002年）「Quantitative RT-PCR. A review of current methodologies」、Methods Mol Biol. 193：83〜92ページ、及びEmrichら（2002年）「Quantitative detection of telomerase components by real-time, online RT-PCR analysis with the LightCycler」、Methods Mol Biol. 191：99〜108ページ）、リガーゼ連鎖反応法（LCR）（Lee（1996年）「Ligase chain reaction」、Biologicals 24（3）：197〜9ページ）、ポリメラーゼ・リガーゼ連鎖反応法（Baranyら（1991年）「The ligase chain reaction in a PCR world」、PCR Methods Appl. 1（1）：5〜16ページ）、Gap-LCR法（Abravayaら（1995年）「Detection of point mutations with a modified ligase chain reaction （Gap-LCR）」、 Nucleic Acids Res. 23（4）：675〜82ページ）、鎖置換増幅法（SDA）（Walker（1993年）「Empirical aspects of strand displacement amplification」、PCR Methods Appl. 3（1）： 1〜6ページ）、連結直鎖増幅法（linked linear amplification）（LLA）（Killeenら（2003年）「Linked linear amplification for simultaneous analysis of the two most common hemochromatosis mutations」、Clin Chem. 49（7）：1050〜7ページ）、ローリング−サークル増幅法（RCA）（Nilssonら（2002年）「Real-time monitoring of rolling-circle amplification using a modified molecular beacon design」、Nucleic Acids Res. 30（14）：e66ページ）、転写介在増幅法（TMA）（Emeryら（2000年）「Evaluation of performance of the Gen-Probe human immunodeficiency virus type 1 viral load assay using primary subtype A, C, and D isolates from Kenya」、T Clin Microbiol 38：2688〜2695ページ）、核酸配列増幅法（NASBA）（Maniら（1999年）「Plasma RNA viral load as  measured by the branched DNA and nucleic acid sequence-based amplification assays of HIV-1」、J Acquir Immune Defic Svndr 22：208〜209ページ、及びBerndtら（2000年）「Comparison between a nucleic acid sequence-based amplification and branched DNA test for quantifying HIV RNA load in blood plasma」、J Virol Methods 89：177〜181ページ）、及び自律的配列複製法（Self-sustained sequence replication）（3SR）（Muellerら（1997年）「Self-sustained sequence replication （3SR）：an alternative to PCR」、Histochem Cell Biol 108：431〜7ページ）を含む原則的にあらゆる核酸増幅技術を使って達成され得る。
【００２２】
「BAT-25反復」及び「BAT-26反復」は、モノヌクレオチド・マイクロサテライトである。それらは、健常対象において準単型対立遺伝子長分布を持つが、しかし突然変異誘発遺伝子表現型（例えば、RER+）を有する固形臓器腫瘍において不安定で短くされた対立因子を持つと考えられる。どちらのマーカーも、RER+結腸直腸癌に関して高感度であり、かつ、高度に特異的である（Faulknerら（2004年）「BAT-25 and BAT-26, two mononucleotide microsatellites, are not sensitive markers of microsatellite instability in acute myeloid leukaemia」、Br J Haematol. 124（2）：160〜165ページ）。
【００２３】
核酸との関連において「二峰性の解離」は、2つ以上の結合した核酸が2つのモード、ステップ、又はステージによって互いから離れる課程を表す。ある態様において、例えばプローブは、選ばれた条件下で、結合した標的核酸から2ステップで解離する。核酸との関連において「非二峰性の解離」は、2つ以上の結合した核酸が2つのモード、ステップ、又はステージ以外、例えば単一モード、ステップ、又はステージなどにより互いから離れる課程を表す。
【００２４】
核酸の融点分析との関連において「融解ピークの二峰性の分布」は、温度範囲を通じて核酸の互いからの解離が検出される2つの区別できるピークを有する検出可能なシグナルの形跡を表す。
【００２５】
用語「緩衝物質」は、pHの変化に抵抗力がある物質又は物質の混合物を表す。実例となる緩衝物質は、トリス-（ヒドロキシメチル）アミノエタン（TRIS）、トリス-（ヒドロキシメチル）アミノメタン・リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどを含む。
【００２６】
「補助因子」は、所望の効果を容易にするか、又はある効果を引き起こすために1つ以上の他の物質と一緒に作用する物質を表す。ある反応において、本明細書中に記載の混合物、例えば金属イオン、例えばMg2+、Mn2+などは、標的核酸の突然変異体の検出を容易にするために使用される。
【００２７】
核酸の「相補体」は、（例えば、逆平行会合などで）その核酸の少なくとも１つの部分配列と結合（例えば、ワトソン−クリック型の塩基対合則、フーグスティーン型の塩基対合則などに従ったハイブリダイズ）できる少なくとも１つの核酸セグメントを表す。会合は、例えば核酸内のヘアピンループの形態で、分子内であっても、又は、例えば、2つ以上の1本鎖核酸が互いにハイブリダイズする時には、分子間であってもよい。例えば、配列5’-AGTTC-3’は、配列5-GAACT-3'に対して相補的である。天然の核酸で一般に見られない特定の塩基が、相補的な核酸に含まれていてもよい。これらの例は、本明細書中で触れた多くの他のもの、又は当業者に知られるそれ以外のものの中でも、イノシン及び7-デアザグアニンを含む。用語「完全に相補的」又は「100%相補的」などは、その鎖又はその配列の領域の間の塩基の完璧な又は厳密な対合を有する相補的な配列、あるいは配列の領域（すなわち、その相補体の中に誤対合がないこと）を表す。しかし、相補性は、完璧でなくてもかまわず（すなわち、核酸は、「部分的に相補的」又は「実質的に相補的」であってもよく）；安定した2本鎖は、例えば誤対合塩基対又は不適合塩基を含んでもよい。
【００２８】
用語「部分的に相補的」は、その鎖又はその配列の領域の中に（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換による）1つ以上の誤対合塩基対を持つ相補的な配列、あるいは配列の領域を表す。さらに、用語「実質的に相補的」は、例えば、最大限に厳密な塩基対合のために鎖又は配列の領域を整列させた時に、ヌクレオチドの約80%以上（例えば、85%、90%、95%、100%、又はその間のあらゆる値）がその鎖又はその配列の領域の中の完璧な又は厳密な対合を持つ相補的な配列、あるいは配列の領域を表す。核酸技術に関する当業者は、例えば相補的な領域の長さ、相補的な領域内の塩基組成及びヌクレオチド配列、イオン強度、並びに誤対合塩基対の発生率を含む多数の変数を経験的に考慮することによって、例えば2重鎖又は3重鎖の安定性を判断できる。用語「その相補体」は、所定の核酸と同じ長さであり、かつ、厳密に相補的でもある核酸を表す。
【００２９】
「制御装置」は、システムの1つ以上の構成要素の目的とされる働きを制御するか、又はそれ以外の方法で達成する物体又はデバイスを表す。態様によっては、例えば、制御装置はコンピュータ又は他の論理回路を含む。
【００３０】
用語「相関がある」は、2つ以上の変数の間に相関関係を示すことを意味する。ある態様において、例えば検出された、反復ヌクレオチド配列を持つ標的核酸からのプローブの二峰性の解離は、その反復ヌクレオチド配列の少なくとも１つの突然変異体と相関がある。
【００３１】
核酸配列との関連において、用語「欠失」は、少なくとも１つのヌクレオチドが核酸配列から、例えば5’-末端から、3'-末端から、及び／又はその核酸配列の内側の位置から取り除かれる変更を表す。
【００３２】
「診断」は、対象の病状又は遺伝的障害を特定する行為を表す。態様によっては、例えば、対象由来の標的核酸の突然変異体が検出される時、病状及び遺伝的障害が診断される。
【００３３】
「遺伝子」は、生物学的機能に関係しているあらゆるDNAセグメントを表す。よって、遺伝子は、コード配列、及び任意でそれらの発現のために必要とされる調節配列を含む。遺伝子は、任意で、例えば他のタンパク質のための認識配列を形成する非発現DNAセグメントも同様に含む。
【００３４】
「遺伝的障害」又は「病状」は、遺伝子又は一連の遺伝子内の1以上の突然変異によって引き起こされたか、あるいはそれらとそれ以外で相関がある健康状態を表す。遺伝的障害の一般的なカテゴリーは、染色体障害、単一遺伝子障害、多因子性障害、及びミトコンドリア障害を含む。遺伝的障害又は病状は、生きた生物の体又はその構成部分の正常な機能を害するか、あるいはそのような機能的障害に対する素因又は感受性を示すかもしれない。代表的な遺伝的障害又は病状は、様々なタイプの癌腫、ハンチントン病（HD）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（DRPLA）、球脊髄性筋萎縮症（SBMA）、筋緊張型筋ジストロフィー症（DM）、脆弱X染色体症候群、FRAXE精神遅滞及び脊髄小脳失調症（SCA）、ブルーム症候群（BS）、クラニオフロントネイザル症候群（CFNS）、特発性肺線維症（IPF）などを含む。
【００３５】
核酸は、互いに結びつく時には、一般に溶液中で「ハイブリダイズする」か、又は「結合する」。核酸が、種々の十分に特徴づけされた物理化学的力、例えば水素結合、溶媒排除、塩基の積み重ねなどによりハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションは、完全に相補的な核酸鎖の間で、又は誤対合領域を包含する部分的に相補的な核酸鎖の間で生じ得る。許容される誤対合の程度は、通常、ハイブリダイゼーション条件の好適な調節によって制御され得る。さらに、核酸化学及び分子生物学に関する当業者は、例えば核酸の長さと塩基対濃度、イオン強度、及び誤対合塩基対の発生率を含めた多数の変数を経験的に考慮することによって2本鎖の安定性を断定できる。核酸のハイブリダイゼーションに対する幅広い手引きは、Tijssen（1993年） Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes、第I部第2章、「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays」、（Elsevier, New York）中、並びにAusubel（編）Current Protocols in Molecular Biology、第I、II、及びIII巻（1997年）中に見られる。Hames and Higgins（1995年）Gene Probes 1、IRL Press at Oxford University Press, Oxford, England,（Hames and Higgins 1）及びHames and Higgins（1995年）Gene Probes 2、IRL Press at Oxford University Press, Oxford, England（Hames and Higgins 2）は、オリゴヌクレオチドを含めたDNA及びRNAの合成、標識、検出、並びに定量についての詳細を提供する。
【００３６】
語句「溶液中」は、アッセイ又は反応の構成要素が固形支持体に付着しないで、液状媒質中に存在するアッセイ又は反応の条件を表す。代表的な液状媒質は、水性液体及び有機液体を含む。例えば、本発明のあるアッセイは、ハイブリダイゼーションを起こすために、溶液中で標的核酸のアンプリコンと一緒にプローブをインキュベートするステップを含む。
【００３７】
「標識」又は「標識部分」は、分子に（共有結合的に、若しくは非共有結合的に）付着するか、あるいは付着することができるか、又は関連し得る部分を表し、ここで、上記部分は、上記分子についての情報（例えば、その分子についての説明的情報、識別情報などの情報）、又は（例えば、ハイブリダイズなど）標識された分子が相互作用する他の分子についての情報を提供するか、又は提供することができる。代表的な標識は、（例えば、クエンチャー又は吸収体を含めた）蛍光標識、非蛍光標識、比色標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、質量修飾基、抗体、抗原、ビオチン、ハプテン、（例えば、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼなどを含めた）酵素などを含む。さらに例えば、蛍光標識は、陰性に荷電している色素、例えばフルオレセイン・ファミリーの色素、又は荷電が中性である色素、例えばローダミン・ファミリーの色素、あるいは陽性に荷電している色素、例えばシアニン・ファミリーの色素を含むことができる。
【００３８】
フルオレセイン・ファミリーの色素は、例えばFAM、HEX、TET、JOE、NAN、及びZOEを含む。ローダミン・ファミリーの色素は、例えばTexas Red、ROX、R110、R6G、及びTAMRAを含む。FAM、HEX、TET、JOE、NAN、ZOE、ROX、R110、R6G、及びTAMRAが、例えばPerkin-Elmer, Inc.（Wellesley, MA, USA）から市販されており、及びTexas Redは、例えばMolecular Probes, Inc.（Eugene, OR, USA）から市販されている。シアニン・ファミリーの色素は、例えばCy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、及びCy7を含み、そして、例えばAmersham Biosciences Corp.（Piscataway, NJ, USA）から市販されている。例えば、DNA結合色素は、例えばMolecular Probes, Inc.（Eugene, OR, USA）から市販されているSYBR-Greenグリーン、及び、例えばSigma-Aldrich Corp.（St. Louis, MO, USA）から市販されているEtBrを含む。
【００３９】
「マイクロサテライトマーカー」又は「マイクロサテライト遺伝子座」は、ヌクレオチド反復を含むゲノムDNAの領域を表す。これらの反復又は「反復単位」は、通常約1〜約7塩基対の長さである。マイクロサテライト遺伝子座は、通常、縦列配置で約10〜約40個のこれらの反復単位を含む。
【００４０】
「混合物」は、2つ以上の異なる成分の組み合わせを表す。「反応混合物」は、所定の反応に参加する、及び／又は容易にすることができる分子を含む混合物を表す。例えば、増幅反応混合物は、通常、増幅反応を実施するのに必要な試薬を含む溶液を含んでいて、通常、好適な緩衝液中に、プライマー、核酸ポリメラーゼ又は他のヌクレオチドを組み込む生体触媒、dNTPs、及び二価の金属陽イオンを含む。反応混合物は、反応を実施するのに必要な全ての試薬を含んでいれば、完全と呼ばれ、そして必要な試薬のサブセットだけを含んでいれば、不完全と呼ばれる。反応成分が、利便性、保存安定性の理由のため、又は成分濃度の適用に依存した調節を可能にするために全成分のサブセットを各々が含む別々の溶液として日常的に保存されること、並びに反応成分が、完全な反応混合物を作製するために反応前に組み合わせられることは、当業者によって理解される。
【００４１】
さらに、反応成分が製品化のために別々に包装されて、そして有用な市販のキットが反応成分の全てのサブセットを含み得ることは、当業者によって理解される。
【００４２】
「修飾ヌクレオチド」は、1つ以上の自然発生しない部分を含むヌクレオチドを表す。態様によっては、例えば修飾ヌクレオチドは、自然発生しない塩基部分、及び／又は糖部分を含む。一般に、修飾ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドを含む核酸（例えば、オリゴヌクレオチドなど）に所望の特性を与える。ある態様において、修飾ヌクレオチドは、対応の非修飾オリゴヌクレオチドの融解温度と比較してこれらのオリゴヌクレオチドの融解温度（Tm）を修飾する。さらに例えば、本発明の態様によっては、ある修飾ヌクレオチドは、（例えば、プライマー・ダイマー形成を最小限にするなど）非特異的核酸増幅を減らし、目的とする標的アンプリコンなどの収量を増やすことができる。これらのタイプの核酸修飾の例は、例えば1999年12月14日付けでWillに対して交付された「MODIFIED NUCLEIC ACID AMPLIFICATION PRIMERS」と題された米国特許第6,001,611号中に記載されている。本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチド内で置換され得る代表的な修飾ヌクレオチドは、例えばC5-メチル-dC、C5-エチル-dC、C5-エチル-dU、2,6-ジアミノプリン、C5-プロピニル-dC、C5-プロピニル-dU、C7-プロピニル-dA、C7-プロピニル-dG、C5-プロパルギルアミノ-dC、C5-プロパルギルアミノ-dU、C7-プロパルギルアミノ-dA、C7-プロパルギルアミノ-dG、7-デアザ-2-デオキシキサントシン、ピラゾロピリミジン・アナログ、疑似dU、ニトロ・ピロール、ニトロ・インドール、2’-0-メチルRibo-U、2’-0-メチルRibo-C、N4-エチル-dC、N6-メチル-dAなどを含む。本発明のオリゴヌクレオチド内で置換され得る多くの他の修飾ヌクレオチドは、本明細書中で参照されるか、又は別に当該技術分野で知られている。
【００４３】
「モノヌクレオチド反復」は、その中の各々のヌクレオチドが同じ塩基を含む反復を表す。例えば、いくつかのモノヌクレオチド反復は、An、Tn、Gn、Cn、又はUn｛ここで、nは、1より大きな整数である。｝から選ばれる配列を持つ。
【００４４】
核酸の「突然変異体」は、その核酸の非突然変異体又は野生型の形態に対応する変化したヌクレオチド配列を持つ。核酸の突然変異体を生じ得る代表的な変化は、ヌクレオチド置換、欠失、及び／又は挿入を含む。
【００４５】
核酸の「非突然変異体」は、生物の天然の集団又は生物の血統で優位を占めるヌクレオチド配列を持つ。
【００４６】
用語「核酸」は、リボース核酸（RNA）又はデオキシリボース核酸（DNA）ポリマーに対応させることができるモノマーのポリマー、あるいはそのアナログを表す。
【００４７】
これは、ヌクレオチド、例えばRNA及びDNAのポリマー、並びにその修飾された形態、ペプチド核酸（PNAs）、ロックド核酸（LNA（登録商標）s）などを含む。ある適用において、核酸は、複数のモノマー・タイプ、例えばRNA及びDNAサブユニットを含むポリマーであってもよい。核酸は、例えば染色体又は染色体セグメント、ベクター（例えば、発現ベクター）、発現カセット、裸のDNA又はRNAポリマー、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）又は他の核酸増幅反応の産物、オリゴヌクレオチド、プローブなどであっても、又はそれらを含んでもよい。核酸は、例えば1本鎖であっても、又は2本鎖であってもよい。別段の指示がない限り、特定の核酸配列は、はっきり示された全ての配列に加えて、相補的な配列を任意で含むか又はコードする。
【００４８】
核酸は、通常、1本鎖であるか又は2本鎖であり、そして本明細書中に概説されるように、一部の例では、例えば、かつ、制限されることなくホスホラミド（Beaucageら（1993年）Tetrahedron 49（10）：1925ページ及びその中の参考文献；Letsinger（1970年）I. Org. Chem. 35：3800ページ；Sprinzlら（1977年）Eur. L Biochem. 81：579ページ；Letsingerら（1986年）Nucl. Acids Res. 14：3487ページ；Sawaiら（1984年）Chem. Lett. 805ページ；Letsingerら（1988年）T. Am. Chem. Soc. 110：4470ページ；及びPauwelsら（1986年）Chemica Scripta 26：1419ページ）、ホスホロチオアート（Magら（1991年）Nucleic Acids Res. 19：1437ページ及び米国特許番号第5,644,048号）、ホスホロジチオアート（Briuら（1989年）I. Am. Chem. Soc. 111：2321ページ）、O-メチルホスホロアミダイト結合（Eckstein、Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach. Oxford University Press（1992年））、並びにペプチド核酸骨格及び結合（Egholm（1992年）T. Am. Chem. Soc. 114：1895ページ；Meierら（1992年）Chem. Int. Ed. Engl. 31：1008ページ；Nielsen（1993年）Nature 365：566ページ；及びCarlssonら（1996年）Nature 380：207ページ）を含む代替骨格を持ち得る核酸アナログが含まれるが、通常ホスホジエステル結合を含む。
【００４９】
他の相似型の核酸は、陽性荷電した骨格を持つもの（Denpcyら（1995年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92：6097ページ）；非イオン性骨格を持つもの（米国特許番号第5,386,023号、同第5,637,684号、同第5,602,240号、同第5,216,141号、及び同第4,469,863号；Angew（1991年）Chem. Intl .Ed. English 30：423ページ；Letsingerら（1988年）I. Am. Chem. Soc. 110：4470ページ；Letsingerら（1994年）Nucleoside & Nucleotide 13：1597ページ；第2及び3章、ASCシンポジウム・シリーズ580、「Carbohydrate Modifications in Antisense Research」、Ed. Y. S. Sanghvi and P. Dan Cook；Mesmaekerら（1994年）Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4：395；Jeffsら（1994年）T. Biomolecular NMR 34：17ページ；Tetrahedron Lett. 37：743ページ（1996年））、そして米国特許番号第5,235,033号及び同第5,034,506号、並びに第6及び7章、ASCシンポジウム・シリーズ580、アンチセンス研究の中の炭水化物の修飾、Ed. Y. S. Sanghvi及びP. Dan Cook.中に記載のものを含む非リボース骨格をもつものを含む。1つ以上の炭素環式糖を含む核酸は、核酸の定義の中に同様に含まれる（Jenkinsら（1995年）Chem. Soc. Rev、169〜176ページ）。いくつかの核酸アナログが、例えば1997年6月2日付けのRawlsのC&E News、35ページ中に同様に記載される。リボース−リン酸骨格のこれらの修飾は、追加部分、例えば標識部分の付加を容易にするために、又は生理学的な環境におけるそのような分子の安定性及び半減期を変えるために行なわれてもよい。
【００５０】
一般に核酸内に見られる自然発生する複素環式塩基（例えば、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、及びウラシル）に加えて、核酸アナログは、その多くが本明細書中に記載されるか又は別な方法で参照される自然発生しない複素環式塩基又は他の修飾された塩基を持つものも同様に含む。具体的には、多くの、自然発生しない塩基が、さらに、例えばSeelaら（1991年）Helv. Chim. Acta 74：1790ページ、Greinら（1994年）Bioorg. Med. Chem. Lett. 4：971〜976ページ、及びSeelaら（1999年）Helv. Chim. Acta 82：1640ページ中に記載されている。さらに例えば、融解温度（Tm）調節物質として作用するヌクレオチドに使用される特定の塩基が、任意で含まれる。例えば、これらのいくつかは、7-デアザプリン（例えば、7-デアザグアニン、7-デアザアデニンなど）、ピラゾロ［3,4-d］ピリミジン、プロピニル-dN（例えば、プロピニル-dU、プロピニル-dCなど）などを含む。例えば、1999年11月23日付けでSeelaに対して交付された「SYNTHESIS OF 7-DEAZA-2’-DEOXYGUANOSINE NUCLEOTIDES」と題された米国特許番号第5,990,303号を参照のこと。そして、前記文献を本明細書中に援用する。他の代表的な複素環式塩基は、例えばヒポキサンチン、イノシン、キサンチン；2-アミノプリン、2,6-ジアミノプリン、2-アミノ-6-クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシン、及びキサンチンの8-アザ誘導体；アデニン、グアニン、2-アミノプリン、2,6-ジアミノプリン、2-アミノ-6-クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシン、及びキサンチンの7-デアザ-8-アザ誘導体；6-アザシトシン；5-フルオロシトシン；5-クロロシトシン；5-ヨードシトシン；5-ブロモシトシン；5-メチルシトシン；5-プロピニルシトシン；5-ブロモビニルウラシル；5-フルオロウラシル；5-クロロウラシル；5-ヨードウラシル；5-ブロモウラシル；5-トリフルオロメチルウラシル；5-メトキシメチルウラシル；5-エチニルウラシル；5-プロピニルウラシルなどを含む。
【００５１】
修飾された塩基及びヌクレオチドの例は、例えば1996年1月16日付けでFroehlerらに交付された「OLIGONUCLEOTIDES CONTAINING 5-PROPYNYL PYRIMIDINES」と題された米国特許番号第5,484,908号、1997年7月8日付けでFroehlerらに交付された「ENHANCED TRIPLE〜HELIX AND DOUBLE-HELIX FORMATION WITH OLIGOMERS CONTAINING MODIFIED PYRIMIDINES」と題された米国特許番号第5,645,985号、1998年11月3日付けでFroehlerらに交付された「METHODS OF USING OLIGOMERS CONTAINING MODIFIED PYRIMIDINES」と題された米国特許番号第5,830,653号、2003年10月28日付けでKochkineらに交付された「SYNTHESIS OF [2.2.1] BICYCLO NUCLEOSIDES」と題された米国特許番号第6,639,059号、2001年10月16日付けでSkouvに交付された「ONE STEP SAMPLE PREPARATION AND DETECTION OF NUCLEIC ACIDS IN COMPLEX BIOLOGICAL SAMPLES」と題された米国特許番号第6,303,315、及び2003年5月15日付けで公開されたKochkineらによる「SYNTHESIS OF [2.2.1] BICYCLO NUCLEOSIDES」と題された米国特許出願公開番号第2003/0092905号の中にも同様に記載されている。
【００５２】
「ヌクレオシド」は、糖部分（例えば、リボース糖など）、糖部分の誘導体、又は糖部分の機能的同等物（例えば、アナログ、例えば炭素環式環）を共有結合した、塩基又は（例えば、少なくとも１つの単素環式環、少なくとも１つの複素環式環、少なくとも１つのアリール基などを含む）塩基性基を含む核酸の構成要素を表す。例えば、ヌクレオシドが糖部分を含む時、その塩基は、一般にその糖部分の1’位に連結される。先に記載のとおり、塩基は、自然発生するもの（例えば、プリン塩基、例えばアデニン（A）又はグアニン（G）、ピリミジン塩基、例えばチミン（T）、シトシン（C）、又はウラシル（U））であっても、あるいは自然発生しないもの（例えば、7-デアザプリン塩基、ピラゾロ［3,4-d］ピリミジン塩基、プロピニル-dN塩基など）であってもよい。代表的なヌクレオシドは、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、ジデオキシリボヌクレオシド、炭素環式ヌクレオシドなどを含む。
【００５３】
「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドのエステルを表す。態様によっては、例えば、ヌクレオチドは、ヌクレオシドのリン酸エステルである。例えば、ヌクレオチドは、当該ヌクレオシドの糖部分の5’位に共有結合した1個、2個、3個、又はそれ以上のリン酸基を含み得る。
【００５４】
「ヌクレオチド取り込み生体触媒」は、核酸内へのヌクレオチドの取り込みを触媒する。ヌクレオチド取り込み生体触媒は一般に酵素である。「酵素」は、他の化合物又は「基質」を伴う化学反応の活性化エネルギーを下げるように作用するタンパク質ベースの触媒である。「ヌクレオチド取り込み酵素」は、核酸内へのヌクレオチドの取り込みを触媒する酵素を表す。代表的なヌクレオチド取り込み酵素は、例えばDNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、末端転移酵素、逆転写酵素、テロメラーゼ、ポリヌクレオチド・ホスホリラーゼなどを含む。他の生体触媒は、DNAベース（「DNAzymes」）であっても、又はRNAベース（「リボザイム」）であってもよい。
【００５５】
システム構成要素との関連において、用語「動作可能にに接続」は、それらの成分がシステム内の目的とされた機能を実施できるように互いに通じ合うシステム構成要素の能力を表す。
【００５６】
用語「プローブ核酸」又は「プローブ」は、好適な条件下、標的又は鋳型核酸に選択的にハイブリダイズすることができる標識又は非標識オリゴヌクレオチドを表す。一般に、プローブは、核酸サンプル中に含まれている特定の標的配列に対して、選ばれたハイブリダイゼーション条件下で、上記標的配列との安定したハイブリダイゼーション2本鎖を形成するために十分に相補的である。十分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でプローブを使って実施されるハイブリダイゼーション・アッセイは、特定の標的配列、例えば核酸の突然変異体の選択的な検出を可能にする。用語「ハイブリッド形成する領域」は、標的配列に対して厳密に又は実質的に相補的であることから上記標的配列にハイブリダイズする核酸のその領域を表す。標的核酸の突然変異体と非突然変異体との配列内の1つ以上のヌクレオチドの違いの識別のためのハイブリダイゼーション・アッセイにおける使用のために、ハイブリッド形成する領域は、通常、約8〜約100ヌクレオチドの長さである。ハイブリッド形成する領域は、通常、オリゴヌクレオチド全体を表すが、プローブは、例えば当該プローブ配列を固形支持体などに取り付けるための部位を提供するためのリンカー結合部位として機能する追加のヌクレオチド配列を含んでもよい。ある態様において、サンプル中の標的核酸からの上記プローブの解離を検出するために利用され得る1つ以上の標識（例えば、リポーター色素、クエンチャー部分など）を含む本発明のプローブ、例えば5’-ヌクレアーゼ・プローブ、FRETプローブ、分子ビーコンなどは、核酸に含まれる。態様によっては、前記プローブのハイブリッド形成する領域は、標的配列に対して完全に相補的である。しかし、通常、完全な相補性が必要なわけではない（すなわち、核酸は互いに部分的に相補的であることができる）；安定した2本鎖は、誤対合塩基又は不適合塩基を含むかもしれない。ストリンジェンシー条件の修飾は、1つ以上の塩基対誤対合又は不適合塩基を有する安定したハイブリダイゼーション2本鎖を許容するために必要であるかもしれない。
【００５７】
Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.（2001年）は、好適な修飾のための手引きを提供する。標的/プローブ2本鎖の安定性は、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドの塩基組成及び配列、温度、並びにイオン条件を含む多数の変数に依存する。当業者は、通常、所定のプローブの厳密な相補体がプローブとして同じように有用であることを認識している。当業者は、ある態様において、プローブ核酸がプライマー核酸としても使用され得ることも同様に認識している。
【００５８】
「ピロホスファターゼ」は、ATPを利用する多くの生合成反応の産物として形成されるピロリン酸（PPi）を加水分解する酵素（EC：3.6.1.1）である。本発明の態様によっては、例えば、ピロホスファターゼがピロリン酸分解を最小限にするために反応混合物に含まれている。ピロホスファターゼの活性は、通常、二価の金属陽イオン、例えばマグネシウムの存在によって高められる。
【００５９】
「クエンチャー部分」又は「クエンチャー」は、さもなければこの放射を放出したであろう源からの放射、例えば蛍光又は発光性の放射の検出可能な放出を減らす、及び／又は減らすことができる部分を表す。クエンチャーは、一般に、源によって放出された検出可能な放射を少なくとも50%まで、一般に少なくとも80%まで、そしてより一般に少なくとも90%まで減らす。特定のクエンチャーは、そのクエンチャーに特徴的なシグナルで、例えば蛍光色素から吸収したエネルギーを再放出することができるため、クエンチャーは「標識」でもあり得る。この現象は、通常、蛍光共鳴エネルギー転移又はFRETとして知られている。あるいは、クエンチャーは、光以外の形態、例えば熱として蛍光色素から吸収したエネルギーを放散するかもしれない。FRETで通常使用される分子は、例えばフルオレセイン、FAM、JOE、ローダミン、R6G、TAMRA、ROX、DABCYL、及びEDANSを含む。蛍光色素が標識であるか、クエンチャーであるかは、励起及び発光スペクトル、並びに対にされる蛍光色素によって規定される。例えば、FAMは、488nmの波長の光によって最も効率よく励起され、そして500〜650nmのスペクトル、かつ、525nmの発光極大を有する光を放出する。FAMは、例えば514nmにその励起極大を有する、クエンチャーとしてのTAMRAとの使用に好適なドナー標識である。蛍光色素から吸収したエネルギーを放散する代表的な非蛍光又はダーククエンチャーは、Biosearch Technologies, Inc.（Novato, CA, USA）によって販売されているBlack Hole Quenchers（登録商標）を含む。Black Hole Quenchers（登録商標）は、置換又は非置換アリール若しくはヘテロアリール、又はその組み合わせから選ばれる少なくとも3つのラジカルを含む構造であり、ここで、残基の少なくとも2つが環外ジアゾ結合によって連結される（例えば、Cookらによる、2001年11月15日付けで公開された「DARK QUENCHERS FOR DONOR-ACCEPTOR ENERGY TRANSFER」と題された国際公開番号第WO01/86001を参照のこと）。代表的なクエンチャーは、例えば2002年10月15日付けでHornらに交付された「OLIGONUCLEOTIDE PROBES BEARING QUENCHABLE FLUORESCENT LABELS, AND METHODS OF USE THEREOF」と題された米国特許番号第6,465,175号の中にも同様に提供されている。
【００６０】
「反復ヌクレオチド配列」は、所定の核酸内で1回以上繰り返されるヌクレオチド配列（例えば、反復単位）を表す。一般に、これらの反復単位は、（例えば、順方向に又は逆方向に）縦に並んで繰り返される。モノヌクレオチド反復に加えて、代表的な反復ヌクレオチド配列は、AT反復、GC反復、CGG反復、CGC反復、TAT反復、ATT反復、及び／又はその相補的な反復を含む。
【００６１】
「塩」は、H+以外の陽イオン、及び水酸化物イオン、OH-又は酸化物イオン、O2-以外の陰イオンを含む化合物である。
【００６２】
「固形の支持体」は、化学物質部分、例えばオリゴヌクレオチド・プローブなどを用いて誘導体化され得るか、又はそれ以外の方法でそれらが取り付けられ得る固形材料を表す。代表的な固形支持体は、プレート、ビーズ、マイクロビーズ、チューブ、線維、ウィスカー、くし、（マイクロアレイ基板、例えばGeneChip（登録商標）プローブ・アレイ（Affymetrix, Inc, Santa Clara, CA, USA）などで使用されるものを含む）ハイブリダイゼーション・チップ、膜、単結晶、セラミック層、自己組織化単分子膜などを含む。
【００６３】
核酸の「配列」は、その核酸におけるヌクレオチドの順序及び独自性を表す。配列は、通常、5’から3’の方向に読まれる。
【００６４】
「対象」は生物を表す。主として、前記生物は、哺乳類の生物、特に人体である。ある態様において、例えば、対象は、1つ以上の遺伝子座にマイクロサテライト不安定性を有すると疑われる患者である。
【００６５】
「システム」は、所望の目的を実施するためのネットワークを形成する物体、及び／又はデバイスのグループを表す。態様によっては、例えば、本発明のシステムは、標的核酸の突然変異体（例えば、マイクロサテライトマーカーの不安定性）を検出するために一緒に利用されるプローブ核酸、温度調節器、制御装置、及び検出器を含む。
【００６６】
用語「鋳型核酸」又は「標的核酸」は、増幅されるか、検出されるか、又はそれ以外のやり方で分析される核酸を表す。
【００６７】
「温度調節器」は、当該調節器と熱伝導の状態にある1つ以上の物体の温度を選択的に調節するデバイス又は機器を表す。態様によっては、温度調節器は、核酸の融解点分析の一部として反応混合物の温度を計画的に変えるために利用される温度循環デバイスを表す。
【００６８】
核酸との関連において「三重らせん」は、3本目の鎖の塩基上の置換基との特異的水素結合接触を作り出す2本鎖DNA塩基を含む複合体を表す。三重らせんは、分子間、及び／又は分子内の結合相互作用を含むことができる。
【００６９】
「ウラシルN-グリコシラーゼ」は、（2本鎖又は1本鎖の）ウラシルを含むDNAからの遊離のウラシルの放出を加水分解する酵素である。
【００７０】
II. 序論
当該発明は、反復ヌクレオチド配列を含む核酸の突然変異体と非突然変異体とを検出し、そして識別するための高処理技術に関する。これらの技術のある適用において、そのような標的核酸の突然変異体は遺伝的障害と相関があり、それ故に、検出により、その標的核酸を得た対象についての診断上の情報、及び／又は予後の情報を提供する。いくつかの側面において、例えば、本発明は、標的核酸の増幅及びプローブ核酸の融点分析を含む方法によりマイクロサテライト不安定性の検出を提供する。これらの検出方法は、通常、多くの先在しているアプローチ、例えばマイクロサテライトをミニ配列分析することに基づいたものと比べてより迅速であり、かつ、より手間がかからない。
【００７１】
本発明のある側面をさらに説明するために、所定の反復ヌクレオチド配列の様々な多型が、単一のプローブ核酸を使って一般に検出される。これらの態様において、プローブ核酸は、通常、標的反復ヌクレオチド配列の非突然変異体よりも長く、そして突然変異体から、例えば欠失を持っているものからに比べて、これらの非突然変異体からの異なった解離をする。例えば、図1は、標的核酸（104及び106）に結合したプローブ（100）を図式的に描く。プローブ（100）は、その分子の5'末端に蛍光標識（102）（例えば、FAMなど）を含む。標識（102）は、プローブ（100）が核酸に結合している時にはクエンチされる。プローブ（100）が核酸から解離する時に、標識（102）からの蛍光が検出可能な程度に増加する。標的核酸（104及び106）は、ヒト突然変異誘発遺伝子である、マイクロサテライトマーカーBAT-26を含むhMSH2遺伝子の第5エクソンの部分配列として示されている。標的核酸（104）が、BAT-26の非突然変異体又は野生型形態（26個のデオキシアデノシン・ヌクレオチド又は（dA）26）を含むのに対して、標的核酸（106）は、BAT-26の突然変異体（（dA）22）を含む。図のように、プローブ（100）は、標的核酸（106）のBAT-26の突然変異体よりも長い。それ故に、プローブ（100）は、より短い塩基対合のため、プローブ（100）が標的核酸（104）から解離するのに比べて、より低い温度で標的核酸（106）を解離するか、又は「溶け落ちる」。結果として、標識（102）からの蛍光の検出可能な増加は、プローブ（100）がより低い温度で標的核酸（106）から解離する時に観察される。
【００７２】
本発明の驚異的な側面の中には、本明細書中に記載のプローブ核酸が、通常、反復ヌクレオチド配列の突然変異体から二峰性を呈して解離するが、上記反復ヌクレオチド配列の非突然変異体から単一モードで解離することが含まれる。プローブ融点分析が標的核酸からのプローブ核酸の解離を検出するために使用される時、二峰性の解離は、通常、その核酸の融解ピークの二峰性の分布を含む。操作の特定の理論に制限されないながら、本明細書中に記載のプローブ核酸の少なくとも１つのセグメントは、選ばれた条件（例えば、温度条件など）の下、上記プローブが標的核酸の反復ヌクレオチド配列の突然変異体に結合する時に、標的核酸と三重らせんを形成すると考えられる。対照的に、同じプローブが標的核酸の反復ヌクレオチド配列の非突然変異体に結合する時、そのプローブは、それらの選ばれた条件下、そのような三重らせんを形成しないと考えられる。この三重らせん形成は、反復ヌクレオチド配列の突然変異体からプローブの観察された二峰性、又は2段階の解離の説明となり得る。とにかく、この差異的な解離を、単一プローブ核酸を使った標的核酸の反復ヌクレオチド配列の突然変異体と非突然変異体とを検出し、そして識別するために使用することができる。この差異的な解離は、以下に提供された実施例でも同様に説明される。
【００７３】
当該発明を実施する中で、分子生物学及び組み換えDNAの多くの従来技術が任意で使用される。これらの技術は、よく知られており、そして、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology、第I、II、及びIII巻、1997年（R M. Ausubel編）；Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, N.Y.、2001年；Berger及びKimmel、Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology第152巻、Academic Press, Inc.、San Diego, CA（Berger）、DNA Cloning：A Practical Approach第I及びII巻、1985年（D. N. Glover編）；Oligonucleotide Synthesis、1984年（M. L. Gait編）；Nucleic Acid Hybridization、1985年（Hames及びHiggins）；Transcription and Translation、1984年（Hames及びHiggins編）；Animal Cell Culture、1986年（Freshney編）；Immobilized Cells and Enzymes、1986年（IRL Press）；Perbal、1984年、A Practical Guide to Molecular Cloning； the series, Methods in Enzymology（Academic Press, Inc.）；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells、1987年（J. H, Miller and M. P. Calos編、Cold Spring Harbor Laboratory）；Methods in Enzvmology第154巻と第155巻（それぞれ、Wu及びGrossman編、とWu編）の中に記載されている。
【００７４】
標的核酸の突然変異体を検出するための方法及びプローブに加えて、当該発明は、以下でさらに説明される関連の反応混合物、キット、及びシステムも同様に提供する。
【００７５】
III. 標的核酸
原則的に、反復ヌクレオチド配列を含むあらゆる核酸が、本明細書中の記載のプローブ及び方法を使って標的化されることができる。結果として、可能性のある標的核酸の全てを言及することを本明細書中ではしようとしない。例えば、しかし、ある態様において、標的核酸（例えば、DNA又はRNA）の突然変異体は、上記標的核酸の突然変異体を有する対象の遺伝的障害又は病状の診断と相関がある。一般に、反復ヌクレオチド配列の突然変異体は、その反復ヌクレオチド配列の非突然変異体と比べて少なくとも１つの欠失を含む。前記反復ヌクレオチド配列は、例えば、マイクロサテライトマーカーに相当するかもしれない。マイクロサテライト不安定性と関係があると考えられている典型的な病状又は遺伝的障害は、例えば（例えば、ある特定のタイプの結腸直腸癌（例えば、HNPCCなど）、膵癌、胃癌、膀胱癌、前立腺癌、肺癌、子宮癌、乳癌などを含めた）様々なタイプの癌、ハンチントン病（HD）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（DRPLA）、球脊髄性筋萎縮症（SBMA）、筋緊張型筋ジストロフィー症（DM）、脆弱X染色体症候群、FRAXE精神遅滞及び脊髄小脳失調症（SCA）、ブルートン型X染色体連鎖性無ガンマグロブリン血症（XLA）、ブルーム症候群（BS）、クラニオフロントネイザル症候群（CFNS）、及び特発性肺線維症（IFF）を含む。数ある中でも、これらの病状又は遺伝的障害のいずれかに関係しているマイクロサテライトマーカーは、本明細書中に記載のプローブ及び方法を使って任意で評価される。任意で、複数のマイクロサテライト遺伝子座の安定性が、特定の多重化された態様において同時に評価される。態様によっては、例えば、本明細書中に記載の方法は、例えば高頻度のMSIを有するもの（MSH-H）、低頻度のMSIを有するもの（MSI-L）、又はマイクロサテライト安定（MSS）に腫瘍を分類するために使用され得る（Bolandら（1998年）「A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition： development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer」、Cancer Res 58：5248〜5257ページ）。
【００７６】
さらに例えば、遺伝的障害に関係する長さの多型又はマイクロサテライト不安定性を有する遺伝子のいくつかの例に関する一覧が、表Iに提供される。腫瘍形成及び他の病気に関係する反復配列を有する遺伝子が、例えば、Duvalら（2002年）「Mutations at Coding Repeat Sequences in Mismatch Repair-deficient Human Cancers：Toward a New Concept of Target Genes for Instability」、Cancer Research 62：2447〜2454ページ、Houlstonら（2001年）「Polymorphisms and Colorectal Tumor Risk」、Gastroenterology 121：282〜301ページ、Olipitzら（2002年）「Defective DNA-mismatch repair：a potential mediator of leukemogenic susceptability in therapy-related myelodysplasia and leukemia」、Genes, Chromosomes, and Cancer 34（2）：243〜248ページ、Kolomietzら（2002年）「The Role of Alu Repeat Clusters as Mediators of Recurrent Chromosomal Aberrations in Tumors」、Genes. Chromosomes, and Cancer 35（1）：97〜112ページ、及びAndrewら（2001年）「DNA Instability and Human Disease」、American Journal of Pharmacogenomics 1（1）：21〜28ページの中にも同様に記載される。
【００７７】
【表１】
2007029093.tif 000003
【００７８】
【表２】
2007029093.tif 000004
【００７９】
態様によっては、例えば、前記反復ヌクレオチド配列又はマイクロサテライトは、少なくとも１つのモノヌクレオチド反復（例えば、単型又は準単型モノヌクレオチド反復遺伝子座）を含む。さらに例えば、モノヌクレオチド反復は、通常、An、Tn、Gn、Cn、Un｛ここで、nは、1より大きい整数である。｝などのポリヌクレオチド配列を含む。モノヌクレオチド反復の例は、数ある中でも、BAT-25反復及びBAT-26反復を含む（Hardissonら（2003年）「Tissue microarray immunohistochemical expression analysis of mismatch repair（hMLH1 and hMSH2 genes） in endometrial carcinoma and atypical endometrial hyperplasia： relationship with microsatellite instability」、Mod Pathol. 16（11）：1148〜1158ページ）。ヒトの突然変異誘発遺伝子hMSH2遺伝子の第5エクソンの部分配列が、（さらに先に説明されている）図1中に提供される。BAT-26の非突然変異体が、例えば26個のdAsを有するモノヌクレオチド反復を含む一方で、この遺伝子座の10〜22個のdAsの長さの多型は、例えば大腸癌と関係していた（例えば、Pucciarelliら（2003年）「Early-age-at-onset colorectal cancer and microsatellite instability as markers of hereditary nonpolyposis colorectal cancer」、Dis Colon Rectum 46（3）：305〜312ページを参照のこと）。
【００８０】
本明細書中に記載のとおり、モノヌクレオチド反復以外の反復ヌクレオチド配列を含む標的核酸も同様に任意で分析される。標的核酸の他の代表的な反復ヌクレオチド配列は、反復、例えば（AT）n、（GC）n、（CGG）n、（CGC）n、（TAT）n、（ATT）n｛ここで、nは、1であるか、若しくは1より大きな整数である。｝、及び／又はその相補的な反復を有するものを含む。
【００８１】
サンプル調製及び標的核酸の増幅は、さらに以下で説明される。
【００８２】
IV. プローブ核酸
本発明のプローブ核酸は、分析のために選ばれた反復ヌクレオチド配列に結合する。これらのプローブ核酸は、通常、反復ヌクレオチド配列の非突然変異体、例えば非突然変異マイクロサテライト遺伝子座の少なくとも一部分に対して少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含む。態様によっては、これらのヌクレオチド配列は、前記反復ヌクレオチド配列の非突然変異体より長い。本発明のプローブ核酸は、通常、例えば融点分析の一環として使用される温度範囲といった変化のある条件下で、反復ヌクレオチド配列の突然変異体を含んで成る、結合した標的核酸から二峰性を呈して解離する。対照的に、これらのプローブは、通常、同じ条件下で、反復ヌクレオチド配列の非突然変異体を含む標的核酸から単一モードで解離する。これらの差異的な解離様式が、本発明のある態様においてMSIを検出するために使用される。
【００８３】
本発明のプローブは様々な態様を含み、その態様は標的核酸を検出するために各々が任意で利用される。態様によっては、例えば、プローブは、それらがハイブリダイズした標的核酸から当該プローブが解離する場合に、強度を増した蛍光を発する蛍光標識を含む。これらのタイプのプローブ核酸の例は、配列番号1〜4、その実質的に同一な変異体（例えば、配列番号1〜4から選ばれる配列と比べて1つ以上の挿入、欠失、及び／又は置換を含む配列）、ここで、上記変異体は、配列番号1〜4のいずれか1つに対して少なくとも80%の配列同一性を有する：並びに配列番号1〜4及び上記変異体の相補体から選ばれる配列を持ったものを含む。配列番号1〜4は、表IIで示される。
【００８４】
【表３】
2007029093.tif 000005
【００８５】
表IIで示すとおり、Uが5-プロピニル-dUを表す。これらの代表的なプローブは、ヒト突然変異誘発遺伝子hMSH2遺伝子の第5エクソン内に見られるマイクロサテライトマーカーBAT-26を検出するアッセイにおいて任意で利用される。これらのプローブの中のいくつかの使用を説明する例が、以下で提供される。本明細書中に記載の方法を実施する際の使用に任意で適合する他の代表的なプローブ形式は、分子ビーコン及びFRETプローブ対を含む。分子ビーコンは、そのプローブは標的反復ヌクレオチド配列遺伝子座から解離した場合にクエンチされるために蛍光を発しているフルオロフォア−クエンチャー対を含む。分子ビーコンは、例えばTsourkasら（2003年）「Shedding light on health and disease using molecular beacons」、Brief Funct Genomic Proteomic. 1（4）：372〜384ページ、Fangら（2002年）「Molecular beacons：fluorogenic probes for living cell study」、Cell Biochem Biophys. 37（2）：71〜81ページ、及びBroude（2002年）「Stem-loop oligonucleotides：a robust tool for molecular biology and biotechnology」、Trends Biotechnol. 20（6）：249〜256ページの中にも同様に説明されている。さらに例えば、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）ハイブリダイゼーション・プローブは、本明細書中に記載のとおり標的核酸を検出する際の使用にも任意で適合する。FRETハイブリダイゼーション・プローブ形式は、通常、対のハイブリダイゼーション・プローブ、つまり両方のプローブが標的核酸上で互いに隣接してハイブリダイズした時に、FRET対として一緒に作用する蛍光標識を含んだ各プローブを利用する。標的核酸からの解離によって、プローブから放出される検出可能な蛍光が増大する。FRETハイブリダイゼーション・プローブは、例えばRasmussenetalによる、1997年12月11日付で公開された「MONITORING HYBRIDIZATION DURING PCR」と題された国際特許公開番号WO97/46714の中でも同様に説明されている。プローブの設計及び標識は、さらに以下で説明される。
【００８６】
態様によっては、本発明のプローブ核酸は、修飾ヌクレオチド置換基、好ましくは少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。プローブ配列内への修飾ヌクレオチド置換基の導入は、例えばらせん（例えば、3本鎖及び2本鎖）を安定させること、高いG-C含有量のオリゴヌクレオチドにおける誤対合の識別を改善することなどもできる。ある態様において、これは、標的核酸とプローブの間の配列内の1つ以上の誤対合の存在下であっても、対応する非修飾オリゴヌクレオチドと比べてより高い感受性を得ることができる。修飾ヌクレオチド置換基を持つプローブの例は、表IIで提供される。本発明のプローブ核酸内で置換され得る代表的な修飾ヌクレオチドは、例えばC5-エチル-dC、C5-エチル-dU、2,6-ジアミノプリン、C5-プロピニル-dC、C7-プロピニル-dA、C7-プロピニル-dG、C5-プロパルギルアミノ-dC、C5-プロパルギルアミノ-dU、C7-プロパルギルアミノ-dA、C7-プロパルギルアミノ-dG、7-デアザ-2-デオキシキサントシン、ピラゾロピリミジン・アナログ、疑似dU、ニトロ・ピロール、ニトロ・インドール、2’-0-メチルRibo-U、2'-0-メチルRibo-C、8-アザ-dA、8-アザ-dG、7-デアザ-dA、7-デアザ-dG、N4-エチル-dC、N6-メチル-dA、などを含む。
【００８７】
さらに例えば、修飾ヌクレオチド置換基の他の例は、1つ以上のLNA（登録商標）モノマーを持ったオリゴヌクレオチドを含む。これらのようなヌクレオチド・アナログは、さらに、例えば2003年10月28日付けでKochkineらに交付された「SYNTHESIS OF [2.2.1] BICYCLO NUCLEOSIDES」と題された米国特許番号第6,639,059号、2001年10月16日付けでSkouvに交付された「ONE STEP SAMPLE PREPARATION AND DETECTION OF NUCLEIC ACIDS IN COMPLEX BIOLOGICAL SAMPLES」と題された米国特許番号第6,303,315号、及びKochkineらによる、2003年5月15日に公開された「SYNTHESIS OF [2.2.1] BICYCLO NUCLEOSIDES」と題された米国特許出願公開番号第2003/0092905号の中に記載されている。LNA（登録商標）モノマーを含むオリゴヌクレオチドは、例えばExiqon A/S（Vedbaek, DK）を通して市販されている。追加のヌクレオチド修飾は、本明細書中で言及され、先に提供された定義の中に盛り込まれる。これらの修飾の多くが、任意で当該発明の方法を実施する際に使用されるプライマー核酸にも同様に組み込まれることは、認識される。合成及び標識を含めて、本明細書中に記載のとおり利用されるプローブ及びプライマーの他の側面が、以下で提供される。
【００８８】
他の長さが任意で利用されるが、本発明のプローブは、典型的に長さが約12〜約100ヌクレオチド、より典型的に長さが約15〜約75ヌクレオチド、なおより典型的に長さが約20〜約50ヌクレオチド、そしてさらにより典型的に長さが約25〜約35ヌクレオチドの配列を一般に含む。標的とされた実質的に相補的な反復ヌクレオチド配列より長いヌクレオチド配列を持つプローブは、典型的に約1〜約20ヌクレオチドまで、より典型的に約2〜約15ヌクレオチドまで、そしてさらにより典型的に約3〜約10ヌクレオチドまでそれらの配列を超えて伸びる。プローブの調製方法、例えば核酸合成は、さらに以下で説明される。
【００８９】
特定の標的反復ヌクレオチド配列にハイブリダイズするプローブを設計するために、様々なアプローチが当業者によって利用され得る。例えば、DNASTAR, Inc（Madison, WI）から入手可能なDNAstarソフトウェア・パッケージを、配列アラインメントのために使用することができる。例えば、標的反復ヌクレオチド配列を含む核酸配列と非標的配列を、別個のファイルとしてDNAstar EditSeqプログラム中にアップロードすることができる。さらに例えば、何組もの配列ファイルを、DNAstar MegAlign配列アラインメント・プログラムで開くことができ、そしてアラインメントのClustal W法を適用することができる。Clustal Wアラインメントのために使用される指標は、任意で、そのソフトウェアのデフォルト設定である。MegAlignは、通常、2つの配列の間の同一性パーセントの概要を提供しない。これは通常手作業で計算される。アラインメントから、例えば互いに85%未満の同一性を有する領域が一般に同定されて、そしてこれらの領域内のオリゴヌクレオチド配列を選ぶことができる。同様に、多くの他の配列アラインメント・アルゴリズム及びソフトウェア・パッケージが、任意で利用される。配列アラインメント・アルゴリズムは、例えば、Mount、Bioinformatics：Sequence and Genome Analysis. Cold Spring Harbor Laboratory Press（2001年）及びDurbinら、Biological Sequence Analysis：Probabilistic Models of Proteins and Nucleic Acids, Cambridge University Press （1998年）の中でも同様に説明されている。
【００９０】
さらに例えば、比較のための配列の最適なアラインメントは、例えばSmith & Waterman（1981年）Adv. Appl. Math, 2：482ページのローカル・ホモロジー・アルゴリズムによって、Needleman & Wunsch（1970年）J. Mol. Biol. 48：443ページのホモロジー・アラインメント・アルゴリズムによって、Pearson & Lipman（1988年）Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85：2444ページの類似法の探索によって、及びこれらのアルゴリズム（Wisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group（Madison, WI）中のGAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA）のコンピュータ実装によって、又はたとえ目視検査によってでも実施することができる。
【００９１】
配列同一性パーセントを測定するのに好適なアルゴリズムの他の例は、例えば、Altschulら（1990年）J. Mol. Biol. 215：403〜410ページの中に説明されているBLASTアルゴリズムである。BLAST分析の稼動バージョンのソフトウェアは、2005年7月25日現在でワールドワイドウェブ上のncbi.nlm.nih.govの全米バイオテクノロジー情報センターを通して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインした時にいくつかの正の値の閾値スコアTと合致するか又は満足させるクエリー配列内で長さWの短いワードを識別することによって高スコア配列ペア（HSPs）を同定することを伴う。Tは、近接ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschulら、上記）。これらの最初の近接ワード・ヒットは、より長いHSPsを含有するそれらを見つけ出すための探索を開始するためのシードとしての役割を果たす。そして、前記ワード・ヒットを、累積配列スコアを増やすことができる限り各配列に沿って両方向に延長する。ヌクレオチド配列に関して、累積スコアを前記指標M（適合残基対のリワード・スコア）；常に>0）及びN（誤対合残基のペナルティー・スコア；常に<0）を使って計算する。アミノ酸配列に関して、累積スコアを計算するために、スコアリング・マトリックスを使用する。各方向のワード・ヒットの延長は、以下の：累積配列スコアが、その最大の達成値から数量Xまで低下する時；1つ以上の負のスコアを持つ残基のアラインメントの蓄積のために、累積スコアが0以下になった時；又はどちらの配列の末端に達した時に停止される。BLASTアルゴリズムの指標W、T、及びXは、アラインメントの感度及び速度を決定する。（ヌクレオチド配列に関して）BLASTNプログラムは、デフォルとして11のワード長（W）、10の期待値（E）、100のカットオフ、M=5、N=-4、及び両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に関して、BLASTPプログラムは、デフォルトとして3のワード長（W）、10の期待値（E）、及びBLOSUM62スコアリング・マトリックスを使用する（Henikoff & Henikoff（1989年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：10915ページを参照のこと）。
【００９２】
配列同一性パーセントを計算することに加えて、BLASTアルゴリズムは、2つの配列の間の類似性に関して統計的分析も同様に実施する（例えば、Karlin & Altschul（1993年）Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90：5873〜5787ページを参照のこと）。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の1つの尺度は、2つのヌクレオチド又はアミノ酸配列の間の適合が偶然によって生じるであろう確率の目安を提供する最小合計確率（the smallest sum probability）（P（N））である。例えば、試験核酸対参照核酸の比較で最小合計確率が約0.1未満、約0.01未満、又はさらに約0.001未満の場合、その核酸が上記参照配列に類似している（従って、相同である）と考えられる。
【００９３】
本明細書中に記載のとおり使用されるプローブ及び他の核酸、例えばプライマーは、原則的に当該技術分野で知られているいずれかの技術を使って任意で調製される。態様によっては、例えば、クローン化及び制限消化過程が、所望のオリゴヌクレオチドを調製するために利用される。さらに例えば、プローブ及びプライマーは、例えばLetsingerら（1976年）「Synthesis of thymidine oligonucleotides by phosphite triester intermediates」、J Am Chem Soc. 98（12）：3655〜3661ページ及びBeaucageら（1981年）「Deoxynucleoside phosphoramidites：A new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis」、Tetrahedron Lett. 22：1859〜1862ページによって説明される固相ホスホラミダイト法によるものを含む様々な核酸合成方法を使って、任意で化学的に合成される。さらに、オリゴヌクレオチドを、ジエステル法（例えば、Brownら（1979年）「Chemical synthesis and cloning of a tyrosine tRNA gene」、Methods Enzymol. 68：109〜151ページを参照のこと）又はトリエステル法（例えば、Capaldiら（2000年）「Highly efficient solid phase synthesis of oligonucleotide analogs containing phosphorodithioate linkages」、Nucleic Acids Res. 28（9）：e40ページ、Eldrupら（1994年）「Preparation of oligodeoxyribonucleoside phosphorodithioates by a triester method」、Nucleic Acids Res. 22（10）：1797〜1804ページ、及びNarangら（1979年）「Improved phosphotriester method for the synthesis of gene fragments」、Methods Enzymol. 68：90〜98ページを参照のこと）を使っても合成することができる。例えば、Needham-VanDevanterら（1984年）「Characterization of an adduct between CC-1065 and a defined oligodeoxynucleotide duplex」、Nucleic Acids Res. 12：6159〜6168ページの中で説明される自動合成装置を使うことを含めた、当該技術分野で知られている他の合成技術も同様に利用することができる。多種多様な機器が、自動オリゴヌクレオチド合成のために市販されている。マルチヌクレオチド合成アプローチ（例えば、トリヌクレオチド合成など）も同様に任意で利用される。
【００９４】
本明細書中に記載のプローブは、例えばアンプリコン、標的核酸などの検出を可能にするために任意で標識される。一般に、標識は、核酸に取り付けられることができ、かつ、検出可能なシグナル（例えば、定量可能なシグナル）を提供することができるあらゆる部分であり得る。標識が、当該技術分野で知られている種々の技術によって直接的又は間接的にプローブに取り付けられることができる。例えば、使用される標識のタイプに依存して、その標識は、ヌクレオチドの末端（プローブの5’若しくは3’末端）又は非末端に取り付けられることができ、かつ、リンカー又は様々なサイズ及び組成物のスペーサー・アームを通して間接的に取り付けられることができる。市販のホスホラミダイト試薬を使うことによって、当業者は、適切に保護されたホスホラミダイトによって5'又は3'末端のいずれかに官能基（例えば、チオール若しくは1級アミン）を含むプローブを作製することができ、そしてInnisら（編）PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications、Elsevier Science & Technology Books（1990年）の中に説明されるプロトコールを使ってそのようなオリゴヌクレオチドを標識することができる。
【００９５】
原則的に、当該技術分野で周知の技術によって核酸を標識するために、あらゆる標識部分が任意で利用される。態様によっては、例えば、標識は、蛍光色素（例えば、ローダミン色素（例えば、R6G、R110、TAMRA、ROX、JA270、LC610、LC640など）、フルオレセイン色素（例えば、JOE、VIC、TET、HEX、FAMなど）、ハロフルオレセイン色素、シアニン色素（例えば、CY3、CY3.5、CY5、CY5.5、LC670、LC705など）、BODIPYR（登録商標）色素（例えば、FL、530/550、TR、TMRなど）、ALEXA FLUOR（登録商標）色素（例えば、488、532、546、568、594、555、653、647、660、680など）、ジクロロローダミン色素、エネルギー転移色素（例えば、BIGDYE（登録商標）、v1色素、BIGDYE（登録商標）v2色素、BIGDYE（登録商標）v3色素など）、ルシファー色素（例えば、ルシファー・イエローなど）、CASCADE BLUE（登録商標）、Oregon Greenなど）を含む。追加の蛍光色素の例は、例えばHaugland、Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Products、Ninth Ed.（2003年）、及びその最新版の中に提供される。蛍光色素は、例えばMolecular Probes, Inc.（Eugene, OR, USA）、Amersham Biosciences Corp.（Piscataway, NJ, USA）、Applied Biosystems（Foster City, CA, USA）、Roche Applied Sciences（Indianapolis, IN, USA）などを含めた様々な市販向け供給業者から一般に容易に入手可能である。他の標識は、例えばビオチン、弱い蛍光標識（Yinら（2003年）Appl Environ Microbiol. 69（7）：3938ページ、Babendureら（2003年）Anal. Biochem. 317（1）：1ページ、及びJankowiak ら（2003年）Chem Res Toxicol. 16（3）：304ページ）、非蛍光標識、比色標識、化学発光標識（Wilsonら（2003年）Analyst. 128（5）：480ページ及びRodaら（2003年） Luminescence 18（2）：72ページ）、ラマン標識、電気化学的標識、生物発光標識（Kitayamaら（2003年）Photochem Photobiol. 77（3）：333ページ、Arakawaら（2003年）Anal. Biochem. 314（2）：206ページ、及びMaeda（2003年）J Pharm. Biomed. Anal 30（6）：1725ページ）、並びに、例えば2002年11月22日に出願された米国特許仮出願番号60/428,484号の中に記載されるアルファ−メチル−PEG標識試薬を含む。
【００９６】
さらに例えば、原則的に、あらゆる核酸（及び標準的か又は非標準的かに関わらず、実質的にあらゆる標的核酸）、種々の市販向け供給業者、例えばThe Midland Certified Reagent Company（Midland, TX, USA）、Operon Technologies Inc.（Alameda, CA, USA）、Proligo LLC（Boulder, CA, USA）、Sigma-Genosys（The Woodlands, TX, USA）、及びその他多数の中のいずれかから特別注文、あるいは標準注文され得る。
【００９７】
ある態様において、標的核酸にハイブリダイズするように設計されたプローブは、共有結合的に又は非共有結合的に固形支持体に取り付けられる。これらの態様において、標的核酸由来の標識アンプリコンを、ハイブリダイゼーション及び検出を達成するために、これらの固形支持体に結合したプローブと一般に接触させる。他の態様において、アンプリコンを、固形支持体に取り付け、そして標識プローブと接触させる。さらに他の態様において、核酸は溶液中、遊離状態で検出される。
【００９８】
原則的に、あらゆる基板材料を、固形支持体としての使用のために任意で適合させる。ある態様において、例えば基質は、シリコン、ガラス、又は高分子材料から製造される（例えば、ガラス若しくは重合体の顕微鏡用スライド、シリコンウエハー、マイクロウェルプレートのウェルなど）。顕微鏡用スライドを含めた好適なガラス又は重合体の基板は、例えばFisher Scientific（Pittsburgh, PA, USA）などの様々な市販向け供給業者から入手可能である。態様によっては、本発明で利用される固形支持体は膜である。好適な膜材料は、任意で、例えばポリアラミド膜、ポリカーボネート膜、多孔性プラスチック・マトリックス膜（例えば、POREX（登録商標）多孔性プラスチックなど）、ナイロン膜、セラミック膜、ポリエステル膜、ポリテトラフルオロエチレン（TEFLON（登録商標））膜、ポリプロピレン膜、ニトロセルロース膜などから選ばれる。これらの膜材料の多くが、様々な市販向け供給業者、例えばP. J. Cobert Associates, Inc.（St. Louis, MO, USA）、Millipore Corporation（Bedford, MA, USA）などから幅広く入手可能である。任意で利用される他の代表的な固形支持体は、例えばセラミックス、金属、樹脂、ゲル、板、ビーズ（例えば、磁性マイクロビーズなど）、ウィスカー、繊維、くし、単結晶、自己組織化単分子膜などを含む。
【００９９】
核酸は、（例えば、リンカー、例えばウシ血清アルブミン（BSA）などを介して）直接的又は間接的に、例えばいずれかの利用可能な化学的又は物理的な方法によって支持体に取り付けられる。幅広い種類の連結化学反応が、幅広い種類の固形支持体への分子の連結のために利用可能である。より特に、核酸は、共有結合によって、例えばカップリング剤を用いた結合によって、又は非共有結合、例えば静電相互作用、水素結合、若しくは抗体−抗原カップリングによって、あるいはその組み合わせによって固形支持体に取り付けられ得る。典型的なカップリング剤は、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）プロテインA／IgG抗体Fcフラグメント、及びストレプトアビジン／プロテインAキメラ（Sanoら（1991年）Bio/Technology 9：1378ページ）、あるいはこれらの剤の誘導体又は組み合わせ物を含む。核酸は、光開裂性結合、静電気結合、ジスルフィド結合、ペプチド結合、ジエステル結合、又はこれらの結合の組み合わせによって固形支持体に取り付けられ得る。核酸は、任意で、選択的に放出可能な結合、例えば4,4’-ジメトキシトリチル又はその誘導体によっても同様に固形支持体に取り付けられる。
【０１００】
例えば、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴポリアミド、オリゴアクリルアミド、オリゴエチレン・グリセロール、約6〜20個の炭素原子から成るアルキル鎖、及びその組み合わせ物を含む開裂性の付着は、プローブと固形支持体の間に開裂性化学部分を取り付けることによって作製され得る。これらの部分は、例えば、追加の化学剤、電磁放射、又は酵素によって切断され得る。酵素によって切断されうる代表的な付着は、プロテアーゼによって切断され得るペプチド結合、及びヌクレアーゼによって切断され得るホスホジエステル結合を含む。
【０１０１】
化学剤、例えばβ-メルカプトエタノール、ジチオスレイトール（DTT）、及び他の還元剤が、ジスルフィド結合を切断する。有用かもしれないその他の剤は、酸化剤、水和剤（hydrating agent）、及び他の選択的に活性な化合物を含む。電磁放射、例えば紫外線、赤外線、及び可視光が、光開裂性結合を切断する。付着は、例えば、熱又は酸素処理を使って可逆的であってもよい、つまり可逆的な化学的な又は磁性の付着であってもよい。放出及び再付着は、例えば磁場又は電場を使って実施されることができる。
【０１０２】
多数の配列システムが説明されており、そして標的核酸の検出における使用に適合させることができる。アレイの作成及び使用の側面は、例えば、Sapolskyら（1999年）「High-throughput polymorphism screening and genotyping with high-density oligonucleotide arrays」、Genetic Analysis：Biomolecular Engineering 14：187〜192ページ、Lockhart（1998年）「Mutant yeast on drugs」、Nature Medicine 4：1235〜1236ページ、Fodor（1997年）「Genes, Chips and the Human Genome」、FASEB Journal 11：A879ページ、Fodor（1997年）「Massively Parallel Genomics」、Science 277：393〜395ページ、及びGheeら（1996年）「Accessing Genetic Information with High-Density DNA Arrays」、Science 274：610〜614ページの中でも同様に説明されている。
【０１０３】
V. 反応混合物
本発明の反応混合物は、通常、1つ以上の標的核酸の突然変異体又は非突然変異体を識別するためのハイブリダイゼーション・プローブ融点分析を実施するために使用される。よって、本明細書中に記載のプローブに加えて、反応混合物は、通常、標的核酸、及び／又はその標的核酸のアンプリコンも同様に含む。1単独の標的反復ヌクレオチド配列遺伝子座がアッセイされる態様において、通常、たった1つだけのプローブ・タイプが混合物中に含まれる。複数の標的遺伝子座が同時に評価される多重化形式において、通常、上記標的遺伝子座の各々に対応するプローブが反応混合物中に含まれる。これらの態様において、通常、様々なプローブ・タイプが、反応混合物中のその対応の標的核酸からの各々のプローブの解離について別々の検出を容易にするために異なる標識部分を含む。核酸標識は、さらに先に記載されている。他の濃度が任意で利用されるが、プローブと、標的核酸、及び／又はそれらの標的のアンプリコンの各々は、通常、約100nM〜約1.5μMの濃度（すなわち、100μLの反応混合物中、約10pmol〜約150pmol）で反応混合物中に存在する。
【０１０４】
態様によっては、反応混合物は、融点分析を容易にするように作用する様々な追加の構成要素も同様に含む。例えば、反応混合物は、任意で、塩（例えば、NaCl、KClなど）を含む。これらの態様において、前記反応混合物の塩濃度は、通常、約10mM〜約100mMである。ある態様において、反応混合物は、緩衝物質も同様に含む。緩衝物質は、通常、反応混合物のpHを約5.5〜約10.0に維持するために使用される。任意で利用される代表的な緩衝物質は、1つ以上の、例えばトリス-（ヒドロキシメチル）アミノエタン、トリス-（ヒドロキシメチル）アミノメタン・リン酸ナトリウム、ビス（2-ヒドロキシエチル）-イミノ-トリス（ヒドロキシメチル）メタン、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、四ホウ酸ナトリウム、グリシン−水酸化ナトリウム、N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N’-2-エタン・スルホン酸、3-［（1,1-ジメチル-ヒドロキシエチル）アミノ］-2-ヒドロキシプロパン・スルホン酸、3-（シクロヘキシルアミノ）-2-ヒドロキシ-1-プロパン・スルホン酸、3-［N,N-ビス（ヒドロキシエチル）アミノ］-2-ヒドロキシプロパン・スルホン酸、N-（2-ヒドロキシエチル）-ピペラジン-N'-2-ヒドロキシプロパン・スルホン酸、3-（N-モルフォリノ）-2-ヒドロキシプロパンスルホン・スルホン酸、ピペラジン-N,N’-ビス（2-ヒドロキシプロパン・スルホン酸）、3-［N-トリス-（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］-2-ヒドロキシプロパン・スルホン酸、2-（N-モルフォリノ）-エタン・スルホン酸、3-（N-モルフォリノ）プロパン・スルホン酸、ピペラジン-N,N’-ビス（エタン・スルホン酸）などを含む。これらの態様において、所定の反応混合物中の緩衝物質の濃度は、通常、約5mM〜約100mMである。反応混合物は、任意で、少なくとも１つの補助因子、例えばMg2+（例えば、MgSO4、MgCl2など）、Mn2+（例えば、MnSO4、MnCl2など）なども同様に含む。好ましくは、Mg2+及び／又はMn2+が、補助因子として使用される。これらの態様において、反応混合物中の補助因子の濃度は、通常、約0.1mM〜約25mMである。
【０１０５】
さらに例えば、代表的な反応混合物は、以下の通り：
50mM KCl；
10mM トリス-HCl（pH8.3〜9.0）；
1.5mM MgCl2；
40pmol プローブ核酸（100μLの反応混合物中、400nM）；及び
40pmol 標的核酸（100μLの反応混合物中、400nM）、
を含む。
【０１０６】
通常、ハイブリダイゼーション・プローブ融点分析を実施する前に、選ばれた標的核酸を増幅する。標的がさらなる分析に供される前に増幅される態様において、そのアンプリコンは、任意で、そのプローブを含む反応混合物に加えられる前に、他の増幅試薬から分離されるか、又は、当業者に周知の方法（例えば、電気泳動的、クロマトグラフィー的など）によって別の方法で精製される。
【０１０７】
原則的に、選ばれた標的核酸を増幅するか又は共増幅するために、あらゆる核酸増幅技術を使用することができる。ある態様において、核酸を増幅するために使用される反応混合物は、特定の増幅方法を実施するために有用な場合がある様々な他の試薬（例えば、伸長可能なヌクレオチド、ピロホスファターゼ、ウラシルN-グリコシラーゼ（UNG）、緩衝物質、塩、グリセロール、金属イオン、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ポリrAなど）に加えて、ヌクレオチド取り込み生体触媒（例えば、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、DNAリガーゼなど）、プライマー核酸、及びプローブ核酸（例えば、5’-ヌクレアーゼ・プローブ、分子ビーコン、又は「リアルタイム」モニタリングのための同様のもの）を含む。
【０１０８】
当業者は、個々のマイクロサテライト遺伝子座の増幅に好適なプライマーを容易に選ぶことができる。しかも、オリゴヌクレオチドの設計及び合成に関する代表的な手引きは、先に記載されている。例えば、しかし、選ばれた遺伝子座を増幅するのに有用かもしれない代表的なプライマーは、表IIIに提供されている。
【０１０９】
【表４】
2007029093.tif 000006
【０１１０】
核酸増幅反応混合物は、通常、生体触媒及びプライマー核酸を組み込んだ選ばれたヌクレオチドを、実施される特定の核酸伸長若しくは増幅方法を実施するために十分である多数の選ばれた核酸増幅試薬と組み合わせることによって製造される。標的核酸の調製方法及び所定の反応混合物中に含まれる核酸増幅試薬の分量は、選ばれた核酸伸長又は増幅方法を考慮の上で当業者に周知である。例えば、しかし、プライマー核酸及び伸長可能なヌクレオチド（例えば、4種類のdNTPs（dGTP、dCTP、dATP、dTTP））は、通常、本発明の反応混合物中に大きなモル濃度過剰の状態で各々が存在する。
【０１１１】
核酸増幅反応混合物中及び本発明の他の側面において利用されるヌクレオチド取り込み生体触媒は、通常、酵素、例えばポリメラーゼ（例えば、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼなど）、末端転移酵素、逆転写酵素、テロメラーゼ、ポリヌクレオチド・ホスホリラーゼ、リガーゼなどを含む。好適なヌクレオチド取り込み生体触媒は、プライマー及び鋳型に依存したDNA合成を触媒することが知られており、かつ、通常、例えば「リアルタイム」モニタリングを達成するために5’-ヌクレアーゼ反応を実施するための、5’から3'へのヌクレアーゼ活性を有する酵素である。このタイプの代表的なDNAポリメラーゼは、E.コリ（E. coli）DNAポリメラーゼＩ、Tth DNAポリメラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）DNAポリメラーゼ、Taq DNAポリメラーゼ、サーマス属（Thermits sp.）ZO5 DNAポリメラーゼ、サーモトガ・マリティマ（Thermatoga maritima）DNAポリメラーゼ、サーモトガ・ネアポリタナ（Thermatoga neopolitana）DNAポリメラーゼ、及びサーモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）DNAポリメラーゼを含む。他の特性（例えば、蛍光色素で標識したヌクレオチドの取り込み、リボヌクレオチドの取り込みなど）を有するこれらの酵素の誘導体も同様に要望どおり利用されるであろう。これらのDNAポリメラーゼによってDNA合成を触媒するための反応条件は、当業者に周知である。
【０１１２】
耐熱性ポリメラーゼは、通常、PCRサイクル中に高温（例えば、約95℃）にさらすことによって二本鎖伸長産物の変性を達成する自動化工程で使用される。例えば、1989年12月26日付けでGelfandらに交付された「PURIFIED THERMOSTABLE ENZYME」と題された米国特許番号第4,889,818号が、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）から単離された代表的な耐熱性酵素を開示している。追加の代表的な耐熱性のポリメラーゼは、例えば、耐熱性細菌サーマス・フラバス（Thermus flavus）、サーマス・ルバー（Thermus ruber）、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）、（列挙された他のものより幾分低い最適温度を有する）バチルス・ステアロサーモフィラス、サーマス・ラクテウス（Thermus lacteus）、サーマス・ルーベンス（Thermus rubens）、サーモトガ・マリティマ、サーモトガ・ネアポリタナ、サーモシフォ・アフリカヌス、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus littoralis）、及びメタノサーマス・フェルビズス（Methanothermus fervidus）から抽出されたポリメラーゼを含む。
【０１１３】
ある態様において、追加の試薬が、核酸増幅反応混合物に同様に加えられる。例えば、これらの反応混合物は、任意で、例えばピロリン酸分解を最小限にするのに使用するためにピロホスファターゼ（耐熱性ピロホスファターゼ）、及び例えば汚染の持ち越しに対する防護のためにdUTP、及びウラシルN-グリコシラーゼ（UNG）（例えば、Roche Diagnostics Corporation （Indianapolis, IN, USA）から市販されているAMPERASE（登録商標））なども同様に含む。
【０１１４】
VI. 標的核酸の突然変異体の検出方法
本発明の方法は、反復ヌクレオチド配列を持つ標的核酸の突然変異体の検出を提供する。例えば、これらの方法は、所定のゲノム内の1つ以上の遺伝子座でのマイクロサテライト不安定性を評価するために使用され得る。これは、標的核酸を得た対象に対する情報、例えば特定の病状に対する素因、所定の遺伝的障害の診断などを提供できる。前記方法は、通常、標的核酸にプローブ核酸を結合させるステップ（例えばハイブリダイズ・ステップなど）、そして少なくとも１つの変化のある条件、例えば融点分析の一環として利用される変化のある温度の下で、上記標的核酸からの上記プローブ核酸の二峰性の解離を検出するステップを含む。例えば、特定のプローブに関する融解ピークの二峰性分布の形態で検出された二峰性の解離は、通常、分析下で前記標的核酸の突然変異体と相関する。ある態様において、非二峰性の解離の検出は、非突然変異体遺伝子型の存在を表わしている。アッセイする所定の標的核酸の量を増やすために、その標的は、通常、プローブ：標的の解離を検出する前に増幅される。
【０１１５】
本明細書中に記載の方法に従って増幅されるか又は共増幅されるゲノムDNAは、一般に、個々の対象、通常、哺乳動物、例えばヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、マウス、ラット、ウサギ、サルなどに由来する生物学的物質が起源である。前記生物学的物質は、あらゆる組織、細胞、又はゲノムDNAを含むその対象からの体液であり得る。前記生物学的物質は、通常、例えば腫瘍組織、播種性細胞、糞便、血球、血漿、血清、リンパ腺、尿、及び他の体液から選ばれる。当該発明の方法の好ましい態様の1つは、その方法の中で、標的核酸、DNA、又はRNAが少なくとも1の対象から得られることである。
【０１１６】
生物学的物質のサンプルは、原則的にあらゆる採取技術を使って得られる。態様によっては、例えば、大便又は尿サンプルが患者から採取される一方で、他の態様において、例えば特定の患者の子宮頸部、尿道、直腸、膣、口腔咽頭、眼などからサンプルを取るために、スワブ、ブラシ、又はループ（loops）が利用される。レーヨン繊維が先端に付いたスワブ、綿棒、DACRON（登録商標）スワブなどを含めた多数のスワブ・タイプが、これらのサンプルを採取するために好適である。任意で、スワブはコートされている（例えば、血清又はウシ・アルブミンでコートしたスワブ、カルシウム−アルギン酸塩スワブなど）。尿又はスワブで拭き取られた検体は、通常、サンプル容器、例えばポリプロピレン試験管、ねじ蓋付きプラスチック試験管などの中に置かれる。前記生物学的物質は、任意で、ホルマリン中で固定され、そしてパラフィン（PET）内に包埋された組織サンプルの形態である。バイオプシーからの組織サンプルは、普通、長期保存のためにPET内に保存される。さらに、血液サンプルは、通常、静脈穿刺によって得られる。検体の保存方法、細胞の培養方法、これらの源からの標的核酸の単離方法及び調製方法は、一般に、当業者に知られている。
【０１１７】
生物学的物質サンプル内で又はそこから標的核酸を増幅するために任意で利用される方法は、例えば様々なポリメラーゼ、リガーゼ、又は逆転写酵素が介在した増幅方法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、逆転写PCR（RT-PCR）などを含む。これらの又は他の増幅方法の使用に関する詳細を、例えば、先に参照されているBerger、Sambrook、Ausubel 1及び2、並びにInnisを含めた種々の標準的な教本のいずれかの中に見ることができる。多くの入手可能な生物学の教本もまた、PCR及び関連する増幅方法に関する論考を伝えた。核酸増幅は、例えばMullisら（1987年）米国特許番号第4,683,202号、並びにSooknanan及びMalek（1995年）Biotechnology 13：563ページの中でも同様に説明されている。PCRによる大きな核酸を増幅する改良された方法は、Chengら（1994年）Nature 369：684ページ中に概説されている。ある態様において、2本鎖PCRが、標的核酸を増幅するために利用される。2本鎖PCR増幅は、例えばGabrielら（2003年）「Identification of human remains by immobilized sequence-specific oligonucleotide probe analysis of mtDNA hypervariable regions I and II」、Croat Med. J. 44（3）：293ページ、及びLaら（2003年）「Development of a duplex PCR assay for detection of Brachyspira hyodysenteriae and Brachyspira pilosicoli in pig feces」、J. Clin. Microbiol. 41（7）：3372ページ中にさらに説明されている。
【０１１８】
標的核酸、及び／又はそのアンプリコンを検出するために利用可能なあらゆる方法を、例えば増幅反応を監視するために使用することができる。共有のアプローチは、5’-ヌクレアーゼ・プローブ又は分子ビーコンによるリアルタイム増幅検出、挿入色素の検出、増幅プローブ又は増幅された核酸自身に組み込まれた標識の検出、例えば、取り込まれていない標識からの増幅産物の電気泳動的な分離に続く、ハイブリダイゼーション・ベースのアッセイ（例えば、アレイ・ベースのアッセイ）、及び／又は核酸に結合する二次試薬の検出を含む。例えば、5’-ヌクレアーゼ・プローブ又は分子ビーコンは、任意で、特定の標的核酸を結合するオリゴヌクレオチド配列を含むように設計される。分子ビーコン又は5’-ヌクレアーゼ・プローブは、さらに以下で説明される。これらの一般的なアプローチは、例えばSambrook、並びにAusubel 1及び2の中でも同様に説明されている。
【０１１９】
ある態様において、1つ以上の5’-ヌクレアーゼ・プローブを含むリアルタイムPCRアッセイ・システムが、増幅された標的核酸を検出するために使用される。これらのシステムは、そのクエンチャーと標識を含むオリゴヌクレオチドを伴わないクエンチャー又は標識を切断するために特定のポリメラーゼの内在性エンドヌクレアーゼ活性を使って、上記標識の非クエンチ状態をもたらすことによって作動する。前記ポリメラーゼは、複製開始の時点だけ、すなわちオリゴヌクレオチドが鋳型に結合し、そしてポリメラーゼがプライマーを伸長する時にだけ、クエンチャー又は標識を切断する。よって、所定の増幅方法を監視するために、適切に標識されたプローブ核酸及び適当なヌクレアーゼ活性を含むポリメラーゼを使用することができる。例えば、FRETなど（及び関連するリアルタイム逆転写PCR）によるリアルタイムPCR産物分析は、本明細書中に記載の方法との使用に適合させられ得る種々の状況で使用されたリアルタイムPCRモニタリングに関する周知の技術を提供する（Laurendeauら（1999年）「TaqMan PCR-based gene dosage assay for predictive testing in individuals from a cancer family with INK4 locus haploinsufficiency」、Clin Chem 45（7）：982〜6ページ；Laurendeauら（1999年）「Quantitation of MYC gene expression in sporadic breast tumors with a real-time reverse transcription-PCR assay」、Clin Chem 59（12）：2759〜65ページ；及びKreuzerら（1999年）「LightCycler technology for the quantitation of bcr/ab1 fusion transcripts」、Cancer Research 59（13）：3171〜4ページを参照のこと）。
【０１２０】
分子ビーコンは、標的核酸のリアルタイム検出及び定量化のために設計されたオリゴヌクレオチドである。分子ビーコンの5’及び3’末端は、その分子ビーコンの検出可能な特性を与える一対の部分をまとめて含む。末端の一方がフルオロフォアに取り付けられて、そして他方がフルオロフォアの蛍光放出をクエンチすることができるクエンチャー分子に取り付けられる。例えば、フルオロフォア−クエンチャー対の一例は、例えば5’末端のフルオロフォア、例えばEDANS又はフルオレセイン、及び例えば3’末端のクエンチャー、例えばDabcylを使うことができる。分子ビーコンが溶液中にて遊離型で存在する時、すなわち、別の核酸にハイブリダイズしていない時、その分子ビーコンの本幹は相補的塩基対合によって安定化される。この自己相補的対合は、フルオロフォアとクエンチング部分が互いに隣接する前記分子ビーコンの「ヘアピンループ」構造をもたらす。この確証において、蛍光部分はクエンチング部分によってクエンチされる。分子ビーコンのループは、通常、オリゴヌクレオチド・プローブを含み、そして標的内の相補的な配列に対するループのハイブリダイゼーションがその本幹の解離を強制し、それによって、フルオロフォア及びクエンチャーを互いから引き離すように標的核酸内の検出されるべき配列に対して結果的に相補的である。これは、フルオロフォアの非クエンチングをもたらし、そして分子ビーコンの蛍光の増加を引き起こす。
【０１２１】
分子ビーコンの作製及び使用の標準的な方法に関する詳細は、文献で十分に確立されており、分子ビーコンは多数の市販試薬の供給業者から入手可能である。分子ビーコンの製造及び使用の方法に関するさらなる詳細は、例えばLeoneら（1995年）「Molecular beacon probes combined with amplification by NASBA enable homogenous real-time detection of RNA」、Nucleic Acids Res. 26：2150〜2155ページ；Kostrikisら（1998年）「Molecular beacons：spectral genotyping of human alleles」、Science 279：1228〜1229ページ；Fangら（1999年）「Designing a novel molecular beacon for surface-immobilized DNA hybridization studies」、J. Am. Chem. Soc. 121：2921〜2922ページ；及びMarrasら（1999年）「Multiplex detection of single-nucleotide variation using molecular beacons」、Genet. Anal. Biomol. Eng. 14：151〜156ページの中に見られる。以下のOswel Research Products Ltd.（UK）、Research Genetics（Invitrogenの一部門、Huntsville, AL, USA）、the Midland Certified Reagent Company（Midland, TX, USA）、及びGorilla Genomios, LLC（Alameda, CA, USA）を含めた種々の市販向け供給業者が標準的な及び特別注文の分子ビーコンを製造する。分子ビーコンを利用する種々のキットもまた市販されている、例えばStratagene（La Jolla, CA, USA）製のSentinel（登録商標）Molecular Beacon Allelic Discriminationキット、並びにEurogentec SA（Belgium）及びIsogen Bioscience BV（Netherlands）製の様々なキット。
【０１２２】
アンプリコンは、適宜、電気泳動、クロマトグラフィー、沈殿、透析、ろ過、及び／又は遠心沈殿を含めた当業者に周知の多数の方法のいずれかによって他の反応構成要素から回収及び精製される。核酸精製の側面が、例えばDouglasら、DNA Chromatography、Wiley, John & Sons, Inc.（2002年）、及びSchott、Affinity Chromatography：Template Chromatography of Nucleic Acids and Proteins、Chromatographic Science Series, #27、Marcel Dekker（1984年）中に説明されている。ある態様において、例えばプローブ融点分析が増幅直後に核酸反応混合物を使って実施される時、検出前にアンプリコンを精製しない。
【０１２３】
標的核酸へのプローブのハイブリダイゼーションは、適当なハイブリダイゼーション条件を選ぶことによって達成され得る。プローブ：標的核酸ハイブリッドの安定性は、通常、安定したハイブリッドがプローブと標的核酸の間だけで形成されるようなアッセイ及び洗浄条件と適合するように選ばれる。1つ以上の異なるアッセイ指標の操作が、特別なハイブリダイゼーション・アッセイの厳密な感度及び特異性を決定する。
【０１２４】
より特に、核酸の相補的な塩基間のハイブリダイゼーションは、温度、塩濃度、静電気強度、緩衝物質組成などが異なる幅広い条件下で生じる。これらの条件、及びそれらを適用するための方法の例が、例えばTijssen、Hybridization with Nucleic Acid Probes, Vol. 24、Elsevier Science（1993年）、並びにHames及びHiggins、上記の中に説明されている。ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズされるべき配列の性質及びその長さに依存して、通常、約0℃〜約70℃で、約1分〜約2時間の期間、実施する。しかし、ハイブリダイゼーションが、反応条件に依存して、数秒ないし何時間の内に生じ得ることは認識されている。例えば、2つの20塩基長の混合物のための典型的なハイブリダイゼーション条件は、その混合物を68℃にして、続いて2μLでは5分間で室温（22℃）まで、又は非常に低温、例えば2℃にて冷やすことである。核酸の間のハイブリダイゼーションを、緩衝物質、例えばトリス-EDTA（TE）、トリス-HCl、並びにHEPES、塩溶液（例えば、NaCl、KCl、CaCl2）又は他の水溶液、試薬、及び薬品を使って促進してもよい。これらの試薬の例は、1本鎖結合タンパク質、例えばRecAタンパク質、T4遺伝子32プロテイン、E.コリ1本鎖結合タンパク質、及び主要な又は微量な核酸溝結合タンパク質を含む。そのような試薬及び薬品の他の例は、二価イオン、多価イオン、及び挿入剤、例えば臭化エチジウム、アクチノマイシンD、ソラレン、及びアンゲリシンを含む。
【０１２５】
原則的に、融解曲線分析を実施するためのあらゆるアプローチが、本明細書中に記載の標的の突然変異体の検出を達成するための標的核酸からのプローブの解離を検出するために適宜利用される。例えば、約0.1℃/秒〜約1.0℃/秒の割合での連続的な検出を伴った、約35℃の温度から始めてその温度を約95℃まで上げてアンプリコンとプローブを共にインキュベートすることによって、標的増幅に続いて融解特性を確立することができる。標的核酸を検出するか、及び／又は核酸融解曲線分析を実施するために適宜利用される代表的な市販のシステムは、例えばRoche Diagnostics Corporation（Indianapolis, IN, USA）から共に入手可能であるLIGHTCYCLER（登録商標）システム又はCOBAS AMPLICOR（登録商標）Analyzer、Luminex Corporation（Austin, TX, USA）から入手可能であるLUMINEX 100（登録商標）システムなどを含む。システムは、さらに以下でも同様に説明されている。
【０１２６】
VII. システム
本発明は、標的核酸の突然変異体を検出するためのシステムも同様に提供する。前記システムは、本明細書中に記載のとおり1つ以上のプローブ核酸を含む。ある態様において、前記プローブは固形支持体上に整列させられる一方で、他の態様において、それらは、例えば溶液中で実施されるアッセイのために1つ以上の容器（例えば、マルチ・ウェル・プレートなど）内に提供される。さらに、前記システムは、プローブ核酸が標的核酸に結合して、そして1つ以上の変化のある条件、例えば温度範囲を受けた時の、選ばれた標的核酸からのプローブ核酸の解離を検出する検出器（例えば、スペクトロメーターなど）も同様に含む。前記システムは、通常、容器内又は固形支持体上の温度を調節するために作動するように容器又は固形支持体に接続された温度調節器（例えば、温度循環デバイスなど）、並びに、例えば容器内又は固形支持体上で核酸増幅過程、及び／又は融解曲線分析を実施するために、流体を容器又は固形支持体に、及び／又はそこから移す流体移動要素（例えば、自動ピペッターなど）も同様に含む。
【０１２７】
検出器は、通常、例えば特定のシステムの中、又は他の構成要素に隣接して（例えば、容器の中、固形支持体の上など）、検出可能なシグナルを検出するために構築される。適宜利用されるか、又は使用のために適合させた好適なシグナル検出器は、本明細書中で、例えば蛍光、リン光、放射能、光吸収、屈折率、ルミネッセンス、質量などを検出する。検出器は、例えば所定のアッセイ・ステップの実行の上流、及び／又は下流からの1つ又は大多数のシグナルを適宜監視する。例えば、検出器は、適宜、例えば融解曲線分析の一環として、適所において「リアルタイム」結果に相当する大多数の光学的なシグナルを監視する。検出器又はセンサーの例は、光電子増倍管、CCDアレイ、光学センサー、温度センサー、圧力センサー、pHセンサー、伝導性センサー、走査検出器などを含む。本発明の方法を実行する上で適宜利用されるより具体的な代表的な検出器は、例えば共鳴光散乱検出器、放出分光器、蛍光分光器、リン光分光器、ルミネッセンス分光器、分光光度計、光度計などを含む。検出器は、例えばSkoogら、Principles of Instrumental Analysis第5版、Harcourt Brace College Publishers（1998年）及びCurrell、Analytical Instrumentation：Performance Characteristics and Quality、John Wiley & Sons, Inc.（2000年）の中にも同様に説明されている。
【０１２８】
本発明のシステムは、通常、構成要素の制御動作のためにそのシステムの1つ以上の構成要素（例えば、検出器、温度調節器、流体移動要素など）と動作可能に接続した制御装置も同様に含む。より具体的に、制御装置は、通常、例えば検出器からデータを受け取る、容器内の温度を達成する、及び／又は調節する、選ばれた容器への又はそこからの流量を達成する、及び／又は調節するなどのために利用される別個の又は一体型のシステム構成要素として含まれる。制御装置、及び／又は他のシステム構成要素は、あらかじめプログラムされた又は使用者が入力した命令に従ってこれらの機器の動作を命令し、これらの機器からデータ及び情報を受け取り、そしてこの情報を解釈し、操作し、かつ、使用者に報告する働きをする適切にプログラムされたプロセッサー、コンピュータ、デジタル・デバイス、又は（例えば、必要に応じて、アナログからデジタルへの、デジタルからアナログへの変換機を含めた）他の情報器械と適宜連結される。例えば、制御装置は、結合している標的核酸からのプローブ核酸に関する検出された二峰性の解離を、標的核酸が得られた対象の遺伝的障害又は病状の診断と相関させるように通常設定される。好適な制御装置は、一般に、当該技術分野で知られていて、そして様々な市販向け供給業者から入手可能である。
【０１２９】
あらゆる制御装置又はコンピュータが、多くの場合、ブラウン管（「CRT」）ディスプレイ、フラットパネル・ディスプレイ（例えば、アクティブマトリクス液晶ディスプレイ、液晶ディスプレイなど）又はその他のものであるモニターを任意で含む。コンピュータ回路は、多くの場合、多数の集積回路チップ、例えばマイクロプロセッサー、メモリー、インターフェイス回路などを含む箱の中に置かれる。前記箱は、任意で、ハードディスク・ドライブ、フロッピー（登録商標）ディスク・ドライブ、大容量の取り外し可能なドライブ、例えば書き込み可能なCD-ROM、及び他の普通の周辺機器の要素も同様に含む。入力デバイス、例えばキーボード又はマウスが、使用者からの入力を適宜提供する。これらの構成要素は、さらに以下で説明される。
【０１３０】
前記コンピュータは、通常、例えば1組の指標欄内への使用者入力の形態で、例えばGUIで、又は、例えば種々の異なる具体的な動作に関して事前にプログラムされた、事前にプログラムされた命令の形態でのいずれかで、使用者の命令を受けるために適当なソフトウェアを含む。そして前記ソフトウェアは、所望の動作を実施するためにこれらの命令を1つ以上の制御装置の動作を命令する適当な言語に変換する。その後そのコンピュータは、例えばそのシステム内に含まれるセンサー／検出器からのデータを受け取り、そしてそのデータを解釈して、使用者の理解した形式でそれを提供するか、又は例えば重量計などから受け取った流体重量データに応答して流量調節器を制御するプログラミングに従ってさらなる制御装置命令を開始するためにそのデータを使用するかのいずれかである。
【０１３１】
図2は、当該発明の様々な側面を具体化することができる論理回路を含む代表的なシステムを示す概略図である。本明細書中に提供された教示から当業者に理解されるとおり、本発明は、適宜、ハードウェア、及び／又はソフトウェアにおいて実施される。態様によっては、本発明の異なる側面が、クライアント側の論理又はサーバー側の論理のいずれかで実施される。当該技術分野で理解されるとおり、本発明又はその構成要素は、適切に構成されたコンピューティング・デバイス内にロードされた時に本発明に従ってそのデバイスを作動させる論理命令、及び／又はデータを含む媒体プログラム要素（例えば、固定された媒体要素）によって具体化されるであろう。同様に当該技術分野で理解されるとおり、論理命令を含む固定された媒体は、観察者のコンピュータ内に物理的にロードされる固定された媒体上で観察者にデリバリーされても、又は論理命令を含む固定された媒体は、観察者がプログラム要素をダウンロードするために通信媒体を通してアクセスするリモート・サーバ上に存在してもよい。
【０１３２】
特に、図2は、検出器（202）及び流体移動要素（204）が作動するように接続されたコンピュータ（200）を図示する。任意で、検出器（202）、及び／又は流体移動要素（204）は、サーバーを介してコンピュータ（200）に作動するように接続される（図2には未掲載）。動作中、流体移動要素（204）は、通常、流体、例えば反応混合物要素をマルチウェルプレート（206）のウェルに移す。さらに示されるように、温度調節器（208）も同様にコンピュータ（200）と動作可能に接続される。温度調節器（208）は、例えば融点又は曲線分析の一環として、通常、マルチウェルプレート（206）のウェル内に配置された反応混合物の温度調節を達成するために使用される。検出器（202）は、通常、所定の融解曲線分析が実施された場合、それらがマルチウェルプレート（206）のウェル内の標的核酸から解離する時に標識プローブによって産生される検出可能なシグナル（例えば、蛍光の放出など）を検出する。
【０１３３】
VIII. キット
本発明は、本発明の方法を実施するための本明細書中に記載のプローブ核酸を含むキットも同様に提供する。態様によっては、プローブ核酸は溶液中に提供される一方で、他の態様において、準備されたそれらは固形支持体に付着していた。前記キットは、結合した標的核酸からのプローブ核酸の解離を検出するための取扱説明書も同様に含む。ある態様において、キットは、例えば、対象から標的核酸を得ること、標的核酸を増幅すること、標的核酸にプローブ核酸を結合させること、少なくとも１つの条件（例えば、融解曲線分析の一環としての温度条件）を変えること、検出された二峰性の解離を対象の遺伝的障害又は病状の診断と相関させることなどの中の1つ以上に関する取扱説明書も同様に含む。さらに、前記キットは、適宜、例えばヌクレオチド取り込み生体触媒、伸長可能なヌクレオチド、ピロホスファターゼ、ウラシルN-グリコシラーゼ、塩、緩衝物質、補助因子などから選ばれる1つ以上の構成要素も同様に含む。態様によっては、キットは、機器及び試薬性能に関する陽性、及び／又は陰性対照としての役割を果たす精製された核酸標的も同様に含む。通常、前記キットは、プローブ核酸、取扱説明書、及び／又は1つ以上の他の構成要素を包装するための少なくとも１つの容器も同様に含む。
【実施例】
【０１３４】
IX. 実施例
当然のことながら、本明細書中に記載の実施例及び態様は、単に説明目的のためのものであって、請求項に記載の本発明の範囲を制限することを意図していない。同様に当然のことながら、本明細書中に記載の実施例及び態様を踏まえた様々な修飾又は変更が、当業者に提示され、そして本願出願の精神及び範囲、並びに添付の請求項の範囲の範囲内に含まれるべきである。
【０１３５】
実施例I：核酸の融点分析
この実施例は、様々なオリゴヌクレオチドを使って実施された融点分析について説明する。これらの分析で使用されたオリゴヌクレオチドの配列を、表IVで提供する。
【０１３６】
【表５】
2007029093.tif 000007
【０１３７】
この実施例に記載の分析の各々を、LIGHTCYCLER（登録商標）システム（Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA）のPCR緩衝液（50mMのKCl、1.5mMのMgCl2、10mMのトリスHCl、0.001%のゼラチン、pH 8.3）を含む反応混合物を使って実施し。これらの分析で使用される反応混合物に含まれる特定のプローブ及び標的核酸は、以下で指定されている。F1にて連続的な蛍光検出をしながら、30℃で30秒間から始まり、そして温度を0.1℃/秒の割合で95℃まで上げる前記反応混合物のインキュベートによって、融解特性を確立した。
【０１３８】
CDN29融点分析
この項に記載の融点分析で使用されるプローブ核酸は、CDN29だった。これらの分析で使用される反応混合物に含まれる標的核酸は、CDN22、CDN23、CDN24、CDN25、及びCDN26だった。各々の反応混合物は、20pmol（100μLの反応混合物中に200nM）のCDN29プローブ、及び20pmol（100μLの反応混合物中に200nM）の前記標的核酸の1つを含んでいた。さらに、各分析を2回反復した。
【０１３９】
これらの融点分析の結果は、図3のパネルA及びBに示される。図3のパネルAは、このデータの融解曲線プロットであって、ここで、y軸は絶対蛍光発光（F1）を表し、そしてx軸は温度（℃）を表す。図3のパネルBは、このデータの融解曲線プロットであって、ここで、y軸は相対的な蛍光発光（-d（F1）/dT）を表し、そしてx軸は温度（℃）を表す。各々のトレースに関係する特定の標的核酸は、図3に含まれる凡例内に示されている。図3のパネルBで示すとおり、全ての標的核酸が、各々1つだけ融解温度（Tm）ピークを呈して融解した。
【０１４０】
CDN28融点分析
この項に記載の融点分析で使用されるプローブ核酸は、CDN28だった。これらの分析で使用される反応混合物に含まれる標的核酸は、CDN22、CDN23、CDN24、CDN25、CDN26、CDN32、CDN33、及びCDN34だった。各々の反応混合物は、20pmol（100μLの反応混合物中に200nM）のCDN28プローブ、及び20pmol（100μLの反応混合物中に200nM）の前記標的核酸の1つを含んでいた。さらに、各分析を2回反復した。
【０１４１】
これらの融点分析の結果は、図4のパネルA及びBに示される。図4のパネルAは、このデータの融解曲線プロットであって、ここで、y軸は絶対蛍光発光（F1）を表し、そしてx軸は温度（℃）を表す。図4のパネルBは、このデータの融解曲線プロットであって、ここで、y軸は相対的な蛍光発光（-d（F1）/dT）を表し、そしてx軸は温度（℃）を表す。各々のトレースに関係する特定の標的核酸は、図4に含まれる凡例内に示されている。陰性対照として、一組の分析に関して反応混合物が標的核酸を欠いた。図4のパネルBで示すとおり、18個以下のdAを持つ反復ヌクレオチド配列を含む標的核酸が、各々2つのTmピークを呈して融解したのに対して、22又は26個のdAを持つ反復ヌクレオチド配列を含むものは、各々1つだけTmピークを呈して融解した。
【０１４２】
CDN30融点分析
この項に記載の融点分析で使用されるプローブ核酸は、CDN30だった。これらの分析で使用される反応混合物に含まれる標的核酸は、CDN22、CDN23、CDN24、CDN25、CDN26、CDN32、CDN33、及びCDN34だった。各々の反応混合物は、40pmol（100μLの反応混合物中に400nM）のCDN30プローブ、及び40pmol（100μLの反応混合物中に400nM）の前記標的核酸の1つを含んでいた。さらに、各分析を2回反復した。
【０１４３】
これらの融点分析の結果は、図5のパネルA及びBに示される。図5のパネルAは、このデータの融解曲線プロットであって、ここで、y軸は絶対蛍光発光（F1）を表し、そしてx軸は温度（℃）を表す。図5のパネルBは、このデータの融解曲線プロットであって、ここで、y軸は相対的な蛍光発光（-d（F1）/dT）を表し、そしてx軸は温度（℃）を表す。各々のトレースに関係する特定の標的核酸は、図5に含まれる凡例内に示されている。陰性対照として、一組の分析に関して反応混合物が標的核酸を欠いた。図5のパネルBで示すとおり、22個以下のdAを持つ反復ヌクレオチド配列を含む標的核酸が、各々2つのTmピークを呈して融解したのに対して、26個のdAを持つ反復ヌクレオチド配列を含むものは、各々1つだけTmピークを呈して融解した。
【０１４４】
明確さ及び理解の目的のために先の発明を少し詳しく説明したが、形態及び詳細の様々な変更が本発明の真の範囲から逸脱することなく成され得ることは、この開示を読み取ることで当業者には明らかである。例えば、先に記載の技術及び装置の全てが、様々な組み合わせで使用されることができる。全ての刊行物、特許、特許出願、及び／又はこの出願で引用された他の文書を、各々別個の刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文書をあらゆる目的のために個別に本明細書中に援用したのと同一程度にあらゆる目的のためにその全体を本明細書中に援用する。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】プローブ核酸がBAT-26の突然変異体又は非突然変異体を持つ標的核酸から別個に解離するアッセイを図式的に説明する。
【図２】本発明の1つの態様による代表的なシステムを示すブロック図である。
【図３】プローブ核酸としてCDN29を使って得られた融解曲線プロット（パネルA及びB）を含むスクリーン・ショットである。
【図４】プローブ核酸としてCDN28を使って得られた融解曲線プロット（パネルA及びB）を含むスクリーン・ショットである。
【図５】プローブ核酸としてCDN30を使って得られた融解曲線プロット（パネルA及びB）を含むスクリーン・ショットである。
【図１】
2007029093.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
2007029093000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年10月12日(2006.10.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸の突然変異体の検出方法であって、以下のステップ：
少なくとも１つの反復ヌクレオチド配列を含んで成る少なくとも１つの標的核酸、及び／又は当該標的核酸のアンプリコンを準備すること；
上記反復ヌクレオチド配列の非突然変異体の少なくとも一部分に対して少なくとも実質的に相補的である第１ヌクレオチド配列を少なくとも１つ含んで成る少なくとも１つのプローブ核酸を、上記標的核酸、及び／又は上記標的核酸のアンプリコンに結合させること；並びに
もしあれば、上記標的核酸由来及び／又は上記標的核酸のアンプリコンからの上記プローブ核酸の二峰性の解離を検出し、この検出された二峰性の解離が上記反復ヌクレオチド配列の少なくとも１つの突然変異体と相関しており、それによって、上記標的核酸の突然変異体を検出すること、
を含んで成る方法。
【請求項２】
少なくとも１つの反復ヌクレオチド配列を含んで成る少なくとも１つの標的核酸、及び／又は当該標的核酸のアンプリコン；並びに
上記反復ヌクレオチド配列の非突然変異体の少なくとも一部分に対して少なくとも実質的に相補的である第１ヌクレオチド配列を少なくとも１つ含んで成る少なくとも１つのプローブ核酸であって、少なくとも１つの変化のある条件下で、上記反復ヌクレオチド配列の少なくとも１つの突然変異体を含む結合した標的核酸から二峰性で解離するプローブ核酸、
を含んで成る反応混合物。
【請求項３】
反復ヌクレオチド配列の非突然変異体の少なくとも一部分に対して少なくとも実質的に相補的である第１ヌクレオチド配列を少なくとも１つ含んで成るプローブ核酸であって、少なくとも１つの変化のある条件下で、上記反復ヌクレオチド配列の少なくとも１つの突然変異体を含んで成る、結合した標的核酸から二峰性で解離するプローブ核酸。
【請求項４】
反復ヌクレオチド配列の非突然変異体の少なくとも一部分に対して少なくとも実質的に相補的である第１ヌクレオチド配列を少なくとも１つ含む少なくとも１つのプローブ核酸であって、少なくとも１つの変化のある条件下で、上記反復ヌクレオチド配列の少なくとも１つの突然変異体を含む結合したポリヌクレオチドから二峰性で解離するプローブ核酸；並びに
上記反復ヌクレオチド配列を含む結合した標的核酸からの、及び／又は上記標的核酸の結合したアンプリコンからの上記プローブ核酸の解離を検出するための取扱説明書、
を含んで成るキット。
【請求項５】
標的核酸の突然変異体を検出するためのシステムであって：
反復ヌクレオチド配列の非突然変異体に対して少なくとも実質的に相補的である第１ヌクレオチド配列を少なくとも１つ含んで成る少なくとも１つのプローブ核酸であって、少なくとも１つの変化のある条件下で、上記反復ヌクレオチド配列の少なくとも１つの突然変異体を含んで成る、結合した標的核酸から二峰性で解離するプローブ核酸；並びに
上記プローブ核酸が、上記標的核酸、及び／又は上記標的核酸のアンプリコンに結合し、そして1つ以上の変化のある条件にさらされた時に、当該標的核酸から、及び／又は当該標的核酸のアンプリコンからの上記プローブ核酸の解離を検出する少なくとも１つの検出器、
を含んで成るシステム。
【外国語明細書】
2007029093000001.pdf