(57)【要約】      （修正有）【課題】高グリコシル化ゴナドトロピンのからなる妊婦の胎児のダウン症候群の存否をスクリーニングテストするための被検体を提供する。【解決手段】高グリコシル化ゴナドトロピンは絨毛ゴナドトロピンの変異体母集団、絨毛ゴナドトロピン−遊離β−サブユニット、β−コアフラグメント、及び／又はα−サブユニットからなり、これらは正常の胎児をもつ妊婦から得られるサンプル中で観察されるものと炭水化物含量が異なることを示す。正常のゴナドトロピン母集団を含有する対照サンプルからの高グリコシル化ゴナドトロピン母集団の炭水化物含量の相違の定量的又は定性的観察又はダウン症候群中に見られる変異体種の直接観察は女性の胎児がダウン症候群をもつことを示す。典型的なスクリーニングテストは炭水化物分析、免疫分析、又はこれらの組合せを含む。例えば、炭水化物部分に対して反応するコカバリンＡ、高グリコシル化種に対する抗体を用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
高グリコシル化ゴナドトロピンのからなる妊婦の胎児のダウン症候群の存否をスクリーニングテストするための被検体。
【請求項２】
スクリーニングテストがさらにエストリオールとα−フェトタンパクの分析からなる請求項１記載の被検体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は出生前女性のダウン症候群のスクリーニングに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血清中のα−フェトプロテイン、絨毛膜のゴナドトロピン及び非共役エストロゲンの３重のスクリーニングがダウン症候群の出生前の診断方として示唆されている［非特許文献１］。しかしながら、この診断法は遺伝的異常をもつ胎児のわずか６０〜６５％の検出を可能にし、そして５％の間違った陽性結果を与える。またこの診断法は妊娠のセコンドトリメスター（妊娠期間の１５〜２４週）に制限され、かなりの特許料が通常の方法を用いるヒト絨毛膜ゴナドトロピン分析を実施する研究所に支払われるので費用がかる［非特許文献２］。
【非特許文献１】Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｃ．，及びＰｌｕｍ，Ｆ．Ｃｅｃｉｌ’ｓ  Ｔｅｘｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６，１６５頁
【非特許文献２】Ａｕｘｔｅｒ，Ｓｏ．Ｃｌｉｎ．  Ｌａｂｏｒ  Ｎｅｗｓ  ２３：１−３（１９９７）
【０００３】
７００人中の１人の新生児に影響するダウン症候群を導く胎児の染色体異常の最も信頼できる出生前診断法は典型的にはその代わりに３ヶ月間の妊娠期間中に羊水細胞の培養を包含する。この方法は少量の羊水（羊水穿刺）の吸収、この流体中に含有される胎児細胞の培養及びこれらの細胞の核型の決定を包含する。従って妊娠３ヶ月後の胎児を包含する。染色体異常の検出のためにこの技術の使用の多くの適用は（出産予定の時に３５才の年齢以上の全ての母親に通常適用される）妊婦年齢、親の染色体異常の存在、又は先の三染色体胎児を身ごもった又は三染色体である核型の胎児を流産した経験のある妊婦に対してである。絨毛膜の絨毛の直接トランスサ−ビカル吸引（絨毛膜の絨毛のサンプリング又はＣＶＳ）がまた出生前診断法に使用される。
【０００４】
２つの方法が比較的に安全であり信頼できるものとして示されているが、これらは流産の危険を含むいくつかの危険を包含し、ＣＶＳの場合にはその方法後に生まれた胎児の手足の発育不全の危険を包含する。ダウン症候群に対する妊娠した女性をスクリーニングするために他の方法をもつことが好ましい。特に非侵入性であり且つ感度のよいスクリーンをもつことが好ましい。多くにダウン症候群のケースは若くして妊娠した女性、予定された出産の時が３５才以上の女性、又は多くの妊婦生ずる。より少ない身体への侵入のスクリーニングテストは、血清又は尿サンプルを用いることによって羊水穿刺又はＣＶＳの危険を望まないダウン症候群妊婦のために、高い危険度でこれらを同定することを要求される。
【０００５】
ヒト絨毛膜のゴナドトロピン（ｈＣＧ）は胎盤のトロホブラスト細胞によって比較的多量に分泌されるグリコプロテインホルモンである［非特許文献３］。ｈＣＧは非共有結合で結合される２つの異なるサブユニット、α（９２アミノ酸及びＮ−結合オリゴ糖類）及びβ（１４５アミノ酸及び２つのＮ−結合及び４つのＯ−結合オリゴ糖類）から構成され、妊婦の血清又は尿中に又はトロホブラスト疾病（水胞形の奇胎及び絨毛癌）をもつものに検出される。遊離のα−及びβ−サブユニット、及び分離したｈＣＧ及び遊離のサブユニット分子はまた血清及び尿サンプル中に検出される［非特許文献４］。分解した分子はβ−サブユニット残基４７及び４８（又は残基４３及び４４又は４４及び４５の間にこれは通常少ない）の間に各々開裂されたニックを入れた（ｎｉｃｋｅｄ）ｈＣＧ及びニックを入れた遊離のβ−サブユニットを含み、β−サブユニットはＣ−末端配列（β９３〜１４５）の全て又は一部を欠失し、及び末端分解生成物は尿サンプル中で主として見出されるジスルフィド結合によって一緒に保持される２つのフラグメント、β−サブユニット配列６〜４０及び５５〜９２からなる（図１）。末端分解生成物はＯ−結合オリゴ糖類及び分解Ｎ−結合オリゴ糖類、１つ又は２つのＮ−結合ペンタ糖類対遊離のβ−サブユニット及びｈＣＧ上に２つのウンデカ糖類をもたない（図２Ａ）．末端分解生成物は、第１にそのサイズが小さいので（〜９，０００ダルトン；ｈＣＧは３７，０００ダルトン）及び第２にｈＣＧβラジオイムノアッセイ又はβ−サブユニットコア抗血清（対Ｃ−末端他）免疫反応性（非特許文献５）のその保持の故に、β−コアフラグメントと呼ばれる（非特許文献６）。妊娠期間のほとんどを通じて、β−コアフラグメントは尿サンプル中の主なｈＣＧβ−サブユニット関連分子である。
【非特許文献３】Ｍａｓｕｒｅ，  Ｈ．Ｒ．，他  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．  ５３：１０１４−１０２０（１９８１）
【非特許文献４】Ｂｉｒｋｅｎ，  Ｓ．，他  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２２：５７２−５８３（１９８８）
【非特許文献５】Ｂｉｒｋｅｎ，  Ｓ．，他  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２２：５７２−５８３（１９８８）
【非特許文献６】β−ｃｏｒｅ，  Ｂｌｉｔｈｅ；  Ｄ．，他  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２２：１７３−１８０（１９８８）
【０００６】
血清及び尿遊離β−サブユニットは３つの源；トロホブラスト細胞による直接分泌、循環するｈＣＧの遊離のα−及びβ−サブユニットへの遅い解離、そしてトロホブラスト組織と関連のあるマクロファージ及びニュートロフィル酵素によるｈＣＧのニッキングによる直接分泌、そして循環中のニックを入れられたｈＣＧより速い解離、に由来する（図１）。遊離β−サブユニットは循環中に酵素をニッキングすることによりニックを入れ得る。尿β−コアフラグメントは腎臓中のニックを入れた遊離のβ−サブユニットの解離から誘導されるように思われる。
【０００７】
１９８０年の終り頃に、上記記載のトリプルマーカーテストがダウン症候群の妊婦に対するスクリーニングのために開発された。それは妊婦の年齢をｈＣＧ、α−フェトプロテイン、及び非結合エストリオールと組合わせた［非特許文献７］、［特許文献１］、［非特許文献８］、［非特許文献９］。より最近では、血清遊離β−ザブユニット及び遊離β−サブユニット−α−フェトプロテインの組合せが別法のダウン症候群スクリーニング方法として紹介されている［非特許文献１０］、［非特許文献１１］。しかしながら、最良の血清遊離β−サブユニット結合、又は最適のトリプルマーカーテストは５％の間違った陽性割合をもつ、たった６０〜６５パーセントのダウン症候群ケースを検出するにすぎない。これらの間違った陽性割合及び検出では、ほぼ８０の羊水穿刺がダウン症候群の単一のケースを検出するために実施されることが必要であり、無視できない数のダウン症候群ケースの見落としがある［非特許文献１2］。出産前スクリーニング方法の改良の必要性がある。
【非特許文献７】Ｂｏｇａｒｔ，  Ｍ．Ｈ．、他  Ｐｒｅｎａｔ，Ｄｉａｇｎ．７：６２３−６３０（１９８７）
【特許文献１】Ｂｏｇａｒｔ  Ｗａｌｄ，Ｎ．Ｊ．他  米国特許第４，８７４，６９３
【非特許文献８】Ｂｒ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎａｅｃｏｌ．９５：３３４−３４１（１９８８）
【非特許文献９】Ｃａｎｉｃｋ，Ｊ．Ａ．，  Ｊ．Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  １３：３０−３３（１９９０）
【非特許文献１０】Ｍａｃｒｉ，Ｊ．Ｎ．他  Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．  １６３；１２４８−１２５３（１９９０）
【非特許文献１１】Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｋ．，他  Ａｎｎ．  Ｃｌｉｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３０：３９４−４０１（１９９３）
【非特許文献１２】Ｃｏｌｅ，Ｌ．Ａ．他  Ｐｒｅｎａｔａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  １７：６０７−６１４（１９９７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本願発明の目的はダウン症候群妊婦用の出産前スクリーニングテストを提供することにある。
【０００９】
本願発明の他の１つの及びより具体的な目的は妊婦中のダウン症候群胎児のための感度の高い、非侵入性（ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ）のテストを提供することである。
【００１０】
本願発明のさらなる目的は間違いのない陽性割合を示すトリプルマーカテストの改善を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
これらのそして他の目的は、女性から生物学的テストサンプルを得、そしてこのサンプル中の高グリコシル化ゴナドトロピン（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）の観察によってダウン症候群の存在を決定することからなる、出産前の女性の胎児におけるダウン症候群の存在又は非存在についてスクリーニングする新規な診断法を提供する本願発明によって達成される。これは典型的には、テストサンプル中の高グリコシル化ゴナドトロピン、その遊離のβ−サブユニット、その遊離のα−サブユニット、及び／又はそのβ−コアフラグメントの濃度を測定し、そしてこのテストサンプル母集団（ポピュレーション）中の濃度が通常の高グリコシル化ゴナドトロピン又は遊離のα−サブユニット、遊離のβ−サブユニット、又はβ−コアフラグメント母集団と異なるか、及び／又はダウン症候群母集団と同じか又は類似することを観察することによってダウン症候群の存在を決定することを包含する。好ましい態様では、テストサンプルは尿、唾液、血漿又は血清であり、母集団は高グリコシル化ｈＣＧ，β−コアフラグメント、遊離のα−サブユニット、遊離のβ−サブユニット、及びこれらの混合物からなり、そして通常の及びダウン症候群サンプル中で観察される特性間の相違はグリコポリペプチド及び／又はグリコペプチドの炭水化物含量で観察される相違を反映する。
【００１２】
炭水化物組成又は構造分析、イムノアッセイ及びこれらの方法の組合せは一般に採用されている。ある態様では、高グリコシル化ゴナドトロピンは少なくとも１つの高グリコシル化種、例えば変異体ｈＣＧ，遊離β−サブユニット、遊離α−サブユニット及び／又はβ−コアフラグメントに対する分析によって直接決定される。これらのスクリーニング（又はスクリーン、ｓｃｒｅｅｎｓ）は典型的にはＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット等において高グリコシル化又は炭水化物−変異体ｈＣＧ種に対するモノクローナル、ポリクローナル又は融合ファージ抗体を使用する。他の態様では、単糖類（モノサッカライド）の高レベルがダウン症候群に対する陽性サンプル中に観察される。他のスクリーンは炭水化物部分を結合するレクチン、ｈＣＧのグリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）変異体を検出するクロマトグラフィー、化学又は電気泳動又は等電点電気泳動（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ）テストを使用する。レクチンはイムノアッセイ前に異常型の炭水化物部分をもつｈＣＧ種を分離及び／又は濃縮するためにまた使用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は正常な胎児をもつ妊婦からではなくダウン症候群胎児をもつ妊婦の尿又は血清から得られたｈＣＧ種（高グリコシル化ゴナドトロピン）中の異常型炭水化物プロフィールの観察に基づくものである。
【００１４】
本発明の実施において、妊婦の胎児中のダウン症候群の存在又は非存在は女性からの生物学的テストサンプルを得て、そしてそのサンプル中の高グリコシル化ゴナドトロピンを分析することによって決定される。これはテストサンプル中の絨毛膜のゴナドトロピン母集団又は物理特性が通常の絨毛膜ゴナドトロピン母集団を含有する対応する対照サンプルと異なるかどうかの決定を含み、及び／又はそのサンプルがダウン症候群中で観察された高グリコシル化ゴナドトロピン母集団の少なくとも１種の高レベルを含有することの決定を含む。
【００１５】
ここで使用される如く、「絨毛膜ドナドトロピン母集団（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）」は絨毛膜ゴナドトロピン、α−サブユニット、β−サブユニット、β−コアフラグメント、及びこれらの混合物を含み、そして特にダウン症候群ｈＣＧ母集団中に観察されるこれらの如く高グリコシル化される又はオリゴ糖類部分中の異常な単糖類組成物をもつこれらの種の異性体を包含する。用語「高グリコシル化ゴナドトロピン（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）」は正常レベルに比べて異常型炭水化物プロフィール及び／又は異常型炭水化物レベルを示す高グリコシル化ゴナドトロピン、ニックを入れたゴナドトロピン、α−サブユニット、β−サブユニット、β−コアフラグメント及びこれらの混合物からなる、これらの後者の種を絨毛膜ゴナドトロピン母集団内に一般に包含する。
【００１６】
ｈＣＧ及びβ−コアフラグメントは多くの態様で使用される。本願発明の利点は妊娠血清が多量のｈＣＧを含有すること、ｈＣＧが妊娠血清中に全β−免疫反応性の９９％以上を占めていることである。同様に、妊婦の尿は大きい母集団のβ−コアフラグメントをもつ。実際に、β−コア母集団は妊婦の尿中の全β−免疫反応性の７０％と同程度を占める（上記非特許文献６）。従って、本願発明の好ましい態様では、豊富な種、血清中のｈＣＧ及び尿中のβ−コアフラグメント及びイムノアッセイを含む標準的な技術を用いて容易に検出されるもの、ここで説明されるそして上記非特許文献５及び６に記載されている同様の臨床測定、又はダウン症候群ｈＣＧ種の炭化水素中に観察される変異体の故に、炭化水素に特異的にレクチンの使用の如き炭水化物分析、単糖類組成物テストの使用、グリコシル化変異体を検出するための電気泳動又は等電点電気泳動に対するスクリーニング方法を提供する。ダウン症候群及び関連異常妊娠中に観察される種々の変異種は図３に記載され、［非特許文献１３］に記載される。多くの高グリコシル化ダウン症候群ｈＣＧ種は、ｈＣＧβ−サブユニット中にマンノースコアに結合したシアリルラクトサミン（ＮｅｕＡｃ−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ）ビアンテナリー構造の代りに（図２）、追加のシアリルラクトサミンをもつトリアンテナリー構造（図３）をもつ。他の高グリコシル化特性はフコース含有（対フコース遊離）N−結合オリゴ糖類の増加したレベルを含有し、そしてβ−サブユニットＯ−結合炭化水素部位にヘキサ糖類構造を含有する（図３ｃ）。従って、高グリコシル化はダウン症候群ｈＣＧ種中に著しく高められる。
【非特許文献１３】Ｅｌｉｏｔｔ，Ｍ．Ｍ．，他  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｊ．，７巻（１９９７）
【００１７】
本発明の方法では生物学的サンプルはいずれのものも使用される。次のものを含むがこれらに限定されない。尿、唾液、血清、血漿、涙、及び羊膜流体等が使用できるが、涙、尿、血清又は血漿が好ましい。これらのサンプルは多量に存在し、そしてサンプリングが胎児を傷つける恐れがない。第１期（第１トリメスター）（一般に約9週〜１３週として定義される）又は第２期（一般に約１４〜２８週）の妊婦から得られる尿がある態様では特に好ましい。本願発明の利点は［特許文献２］（１８〜２５週）に記載されたもののように胎盤の機能不全を評価する先に記載された方法よりも妊娠においてより早く第1期（第１トリメスター）中に分析することができることである。妊娠期間の１１〜１９週に使用するのに適するスクリーニング方法は、例えば、次の実施例に及び図４に説明される。
【特許文献２】米国特許第４，８７４，６９３号
【００１８】
本発明のダウン症候群スクリーニング（又はスクリーン）は高グリコシル化ゴナドトリピンの検出用に炭水化物分析、イムノアッセイ、又はこれらの方法の組合せを一般に使用するが、高グリコシル化ゴナドトロピンのサンプル濃度中の変化を通常のレベルから質的又は量的に決定するために機能する、及び／又はサンプル中のゴナドトロピン母集団中の異常な炭水化物ｈCG部分を検出するいずれの分析も本発明の実施に使用できる。変異体ダウン症候群の絨毛膜ゴナドトロピン母集団の少なくとも一員の直接分析が好ましい。あるスクリーンは炭水化物部分を分析するレクチン、クロマトグラフィー、化学的又は電気泳動又は等電点電気泳動テストを使用し、ｈＣＧに対する抗体を検出する。
【００１９】
イムノアッセイはこれに限定されないが標準方法で生じた高グリコシル化ゴナドトロピンに対する特異的抗体を使用する分析、及び標準的方法を用いてダウン症候群ｈＣＧ又は絨毛癌ｈＣＧをテスト動物へのブラインド注射によって得られるひ特異的に限定された抗体を用いる分析を包含する。融合ファージの任意のタイプ、モノクローナル又はポリクローナル抗体は、抗体が正常の種を認識することなく変異体ダウン症候群高グリコシル化ｈＣＧ種に対するマーカーとして、又は通常及び変異体母集団中に観察されることなったレベルの測定として再生型で使用できる限り、本発明のイノムアッセイで使用でき、又は正常及び変異体母集団中に観察される異なるレベルの測定として使用できるし、そして特にフラグメントの変異体炭化水素部分に対する抗体を包含できる。絨毛癌患者から得られたニックを入れた高グリコシル化ｈＣＧを認識するが正常のｈＣＧを検出しないB１５２として示される、抗体は下記に記載されるイムノアッセイで使用される。
【００２０】
本発明の典型的なイムノアッセイでは、B１５２の如き高グリコシル化変異体用の特異的な抗体がｈＣＧ、β−コアフラグメント、α−サブユニット、及び／又はβ−サブユニットに対する第２標識抗体をもつ捕獲用抗体として使用でき、そのポリペプチドの特異性をもつ分析を提供する。第２抗体上のラベルは酵素結合イムノソーベントアッセイ（ＥＬＩＳＡｓ）で使用される任意の化学的、放射性活性、ランタニド、着色顔料又は遺伝子タグからなり、ウエスタンブロット及び周知の方法論を用いる他の高感度且つ特異的なイムノアッセイ及びイムノラジオメトリックアッセイに使用できる。これらは典型的には比色、蛍光、発光物質を用いて容易に測定し得るホースラディシュパーオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼと抗体を結合することからなる。遺伝子ラベルは、ルシフェラーゼはその基質、ルシフリンとインキュベートされるとき、バイオルミネセンス分子を生成するので、使用されるホタルルシフェラーゼを包含する。別の態様は他の抗体の存在を検出するために第三の抗体を用いる。
【００２１】
他の態様は捕獲抗体としてペプチド−特異的抗体を用いる。そして高グリコシル化又は炭水化物−変異体ゴナドトロピン及び／又はその異常な炭水化物部分に対する特異的抗体は上記記載のイムノアッセイのいずれかの第２標識抗体からなる。Ｂ１５２のような抗体を用いる、競合イムノアッセイが高グリコシル化ゴナドトロピンを競合的に検出するためにまた使用され得る。コンカナバリンＡ又は他の炭水化物−特異的レクチンを用いる別の態様は捕獲抗体又は標識抗体の代りに使用できる。ある態様はイムノアッセイ前に炭水化物−変異体ｈＣＧを抽出するためにレクチン又はクロマトグラフィ−方法を使用する。
【００２２】
炭水化物分析は下記の実施例に記載する正常及びダウン症候群ｈＣＧ母集団の間の物理的特性の相違の定性的観察を包含する。炭水化物同定は標準レクチンスクリーニング方法によって得られるダウン症候群の変異体炭水化物に対して特異的な植物レクチンを使用する。又は他のフィンガープリント技術が定量的又は定性的炭水化物組成物分析を包含する。ｈCGの炭水化物部分中の３のマンノース単位に結合する（図２）、固体担体に付着したコンカナバリンAを用いる例が下記に説明する態様で使用されるが、高グリコシル化対正常ｈCG種の特異的結合を示す任意のレクチンが本発明に包含される方法で使用できる。
【００２３】
1つの態様において、例えば、妊婦の胎児におけるダウン症候群の存在又は非存在は、女性からの尿、唾液、血漿又は血清テストサンプル、好ましくは血清又は尿を得る、テストサンプル中のｈＣＧの炭水化物含量を決定し、得られた炭水化物含量を正常ｈＣＧ母集団を含む対応するサンプルの炭水化物含量と比べ、そしてｈＣＧ母集団の炭水化物が対照サンプルと相違することを観察することによってダウン症候群の存在を決定することからなる方法で決定される。少なくとも1つの高グリコシル化種のレベルで少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約５０％、の観察増加が好ましい。
【００２４】
図３に記載されているものの如く、正常なｈＣＧサンプル中では全く観察されない異常型種の観察が特に好ましい。
【００２５】
本発明の1つの態様ではダウン症候群の存在は、テストサンプル中の単糖類含量が対照サンプルに比べて高められることを観察することによって決定される。これは、下記に述べる如く、溶離パターンの相違の観察又はＮ−アセチルグルコサミンの分析を含む。少なくとも約50％の増加が典型的な分析で観察される。
【００２６】
別法として、サンプル中の絨毛膜ゴナドトロピン母集団の特性はｈＣＧのグリコシル化変異体を検出する電気泳動、等電点電気泳動テスト、クロマトグフラフィー及びこれらの技術の組合せを用いることによって決定される。クロマトグフラフィー法は下記に記載するＢｌｕｅ  Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）を用いる如き、疎水性相互作用又は他のリガンドクロマトグフラフィーを使用するものを包含するが、グリコポリペプチド又はグリコペプチドの物理的特性を比べる任意の方法、例えば、溶離パターンが相違する単純な定性的な観察を採用し得る。これらは、しかし限定するものではないが、カラムクロマトグフラフィー、被覆ビーズ、被覆テストテューブ又は板、示差結合、抽出液等、及びこれらの技術の組合せを包含する。本発明の利点はβ−コアフラグメントが分析される場合、マーカーは少量で且つ溶解することにある。
【００２７】
本発明の多くのスクリーニングで対照（コントロール）として使用される正常の絨毛膜ゴナドトロピン母集団は正常のカロタイプ胎児をもつ女性から得ることができ又はクローンでき、又は商業的に得ることができる。
【００２８】
ｈＣＧβ−コアフラグメントは、例えば、上記引用された非特許文献５によって記載されているＯｒｇａｎｏｎ  Ｄｉｏｓｙｎｔｈ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｏｓｓ，Ｈｏｌｌａｎｄ）から得られるｈＣＧ調製剤から抽出することができる。
【００２９】
本発明のスクリーニング方法は単独で、又は他のスクリーニング方法と組合せて使用できる。他のスクリーニング方法は、限定するものではないが、非共役及び／又は共役エストリオール測定法、ｈＣＧ分析、β−コアフラグメント分析、遊離β−サブユニット又は遊離α−サブユニット分析、ＰＡＰＰ−Ａ又はＣＡ１２５分析、α−フェトプロテイン分析、インヒビン分析、血清中の胎児細胞の観察及び超音波を包含する。
【００３０】
本発明の利点は方法が上記記載のトリプルマーカーテストで現在使用されるｈＣＧ決定方法に取り替えることができ、それによってその感度及び信頼性を改善することである。上記の如く、トリプルマーカー又は他のテスト中の通常のｈＣＧ分析の代わりをするものとして本発明の方法を使用することにより、高グリコシル化ｈＣＧスクリーンが第１期（第１トリメスター）で使用できるので、ダウン症候群のより早い分析のさらなる利点を提供する。この高グリコシル化ｈＣＧスクリーンは妊娠の第１期（第１トリメスター）で使用できる。より早い診断によって、女性は最小のモニター又は出生ロスによって、非外科的方法によって妊娠をより早く決定する選択権をもつ。
【実施例】
【００３１】
次に本発明の実施例を示すがこれはいかなる観点においても本発明を制限するものではない。
【００３２】
例１：
ダウン症候群と正常な妊娠β−コアフラグメントとの間の識別のために構造的な処理をした。β−コアフラグメントの試料を、３人が正常な核型をもち、３人がダウン症候群第２トリメスター妊娠の計６人の女性の尿から精精し、また２人の正常な核型の患者からの２つの試料を用いた。β−コアフラグメントを２容量のアセトンを用いて４℃で抽出した。このアセトン沈殿を集め、乾燥し、ホスフェートバッファーの生理食塩水（ＰＢＳ）に入れた。これらの試料をＰＢＳで洗浄したブルーデキストランセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製、登録商標）のカラムに付与し、０．６ＭのＮａＣｌを含有するＰＢＳ及び次いで１．０ＭのＮａＣｌを含有するＰＢＳで連続的に溶解した。溶解液中のβ−コアフラグメント濃度を測定した。３つのダウン症候群β−コアフラグメント試料のすべてを０．６ＭのＮａＣｌを含有するＰＢＳで上記ブルーデキストランカラムから溶解し、一方５つの正常な核型試料を次の段階で１．０ＭのＮａＣｌを含有するＰＢＳで同じカラムから溶離した。これはダウン症候群β−コアフラグメントの物理的性質に差があることを示している。
【００３３】
２つの個々ダウン症候群β−コアフラグメント試料、即ち１の個別対照β−コアフラグメント試料とプールされた対照尿から精製した１つのβ−コアフラグメント試料、から得た精製フラグメントについてＮ−末端ペプチドシーケンス分析を行った。精製した試料はいずれも前記の非特許文献４（Ｂｉｒｋｅｎ他）が記載しているものと同じＮ−末端ペプチドシーケンスをもたらした。個別試料とプールした対照試料は、他の正常核型β−コアフラグメント試料のために前記の非特許文献６（Ｂｌｉｔｈｅ等）が記載しているものと同じ炭水化物組成（マンノース残基５、フコース残基０．５及びＮ−アセチルグルコサミン残基２）をもっていた。（図２．Ｂの構造参照。Ｎ−アセチルグルコサミン含量は加水分解瀬生物、グルコサミンとして測定した。）しかし２個のダウン症候群試料は、Ｎ−アセチルグルコサミン残基がかなり多いという幾分異なる組成を示した（即ち、それぞれ、マンノース残基３、フコース残基１及びＮ−アセチルグルコサミン残基３、及びマンノース残基３、フコース残基１及びＮ−アセチルグルコサミン残基３、図３．Ｂの構造参照）。
【００３４】
図１に示すように、β−コアフラグメントはｈＣＧのβ−サブユニットから誘導される。異なるダウン証拠群β−コアフラグメント上の炭水化物部分が追加のＮ−アセチルグルコサミン残基を含有している場合には、β−コアフラグメントが誘導されるｈＣＧのβ−サブユニットに異なる量のＮ−アセチルグルコサミンと同様に増加した量のシアリルラクトサミン触角（ｓｉａｌｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ  ａｎｔｅｎｎａｅ）を、サブユニットの分解のしかたに応じて、含有している。ダウン症候群β−コアフラグメントの異常性炭水化物組成はブルーデキストランセファロースから異常性のある溶出プロフィールを示す。
【００３５】
例２
尿β−サブユニットのアガロース−結合したコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ）への結合を調べた。Ｃｏｎ  Ａは正常妊娠ｈＣＧにみられるようにバイアンテナリー型のＮ−結合したオリゴサッカライドでオリゴタッカライドとグリコプロテインに結合している。グリコプロテインは競争阻害剤のα−メチルマンノシドでＣｏｎ  Ａから遊離しうる。トリアンテナリーオリゴサッカライド、たとえば高グリコシル化したｈＣＧ、をもつ分子はＣｏｎ  Ａとゆるく結合する。それ故Ｃｏｎ  Ａ結合をダウン症候群妊娠のスクリーニングに用いた。
【００３６】
Ｃｏｎ  Ａ−アガロース０．１５ｍｌを１．５ｍｌの円錐形遠心チューブに入れ、０．５ｍｌの尿をさらに加え、さらに０．５ｍｌ  ＰＢＳ，ｐＨ７．３バッファを加えた。チューブを１５分間ゆすり、次いで５００ｘｇで回転させゲルを沈降させた。結合していない尿−ＰＢＳを除いた。次いで、ゲルを１ｍｌ  ＰＢＳで洗浄した。洗浄によりゆるやかに結合していたタンパクが分離した。チューブを再びゆすり、回転させ、洗浄を終えた。次にＣｏｎ  Ａを０．０５Ｍのα−メチルマンノシドを含有する１ｍｌのＰＢＳで特別に溶離した。再度チューブをゆすり、回転させ溶離液を除いた。次いで、免疫検定法により洗液と溶離液の遊離のサブユニットを調べた。
【００３７】
尿のないβ−サブユニットの大部分が結合しており、α−メチルマンノシドで溶離しうるだけだが、少量のしかし異なる成分がゆるやかに結合しておりＰＢＳ洗液に抽出した。フリーのβ−サブユニット（＞０．５ｎｇ／ｍｌ）が１０９（１７％）の対照試料洗液の１８個及び１５（１６％）のダウン症候群試料洗液の９個中に検出された。より高い濃度のフリーのβ−サブユニット（＞１７ｎｇ／ｍｌ）が１０９（８％）の対照試料洗液の９個及び１５（４７％）のダウン症候群試料洗液の7個にみられた。異なる妊娠年齢での対照試料についてメディアン（中央値）を求めた。すべてのメディアンが０（＜０．５んｇ・ｍｌ）だったのでフリーのβ−サブユニットと妊娠年齢間に相関のないことが判った。ＲＯＣ分析を用いてカットオフ濃度と独立の測定法の有効性をしらべた。ＲＯＣ曲線の下の領域は０．６８であり、試料間の識別率６８％を示した。洗液ともとの尿試料中のフリーのβ−サブユニット濃度の間の関係をしらべた。相関がないことが観察され（ｒ２＜０．５）、それらが独立の変数であることを示している。結果は、ダウン症候群妊娠における非Ｃｏｎ  Ａ結合分子、又はオリゴサッカライド変異分子の割合が高いことを示している。
【００３８】
β−コアフラグメントはＮ−アセチルグルコサミン残基２．０及びフコース残基０．５をマンノース残基３．０用にもつ分解したＮ−結合したオリゴサッカライドをもつ［非特許文献１４］［非特許文献１５］。アセトン及びエタノール抽出及びゲルろ過、ブルーセパロース及びＤＥＡＥ−セパロースクロマトグラフィー、の組合せを用いてβ−コアフラグメントを２つの第２トリメスターダウン症候群尿と２つの対照調合物から精製した。Ｎ−末端ペプチドシーケンス分析（１５ラウンド）を行った。対照試料はマンノース残基３．０に対しＮ−アセチルグルコサミン残基２．１及び２．０、及びフコース残基０．６及び０．５を含有しており、上記非特許文献１４及び１５（Ｂｌｉｔｈｅｒ及びＥｎｄｏ等）が示した組成と一致した。ダウン症候群試料はマンノース残基３．０に対し異なる組成、Ｎ−アセチルグルコサミン残基３．５及び３．２、及びフコース残基０．８及び１．４をもっていた。これはダウン症候群からのβ−コアフラグメント上のオリゴサッカライド構造がより複雑であることを示している。
【非特許文献１４】Ｂｌｉｔｈｅ，Ｄ．Ｌ．他  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２５：２２６７−２２７２（１９８９）
【非特許文献１５】Ｅｎｄｏ，Ｔ．他  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｉｌｏｇｙ  １３０:２０５２−２０５８（１９９２）
【００３９】
例３
この例はダウン症候群妊娠用の免疫検定を示す。
【００４０】
個々の正常妊娠（６人の女性）、嚢腫型奇胎（３人の女性）及び絨毛癌（４人の女性）からのｈＣＧ組成物を前記［非特許文献１６］したように妊婦の尿から分離し、精製した。簡潔に述べると、ｈＣＧをアセトンにより尿から抽出し、次いで、エタノールで沈澱させ、セファクリルＳ−２００によるサイズ除去クロマトグラフィー及びＤＥＡＥ−セファロースを用いるイオン交換クロマトグラフィー及びさらに高分解性セファクリルＳ−２００によるサイズ除去クロマトグラフィーを行った。クロマトグラフィーによる操作中すべてのｈＣＧフラクションを回収するように注意した。
【非特許文献１６】Ｋａｒｄａｎａ，Ａ．他  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２９：１５４１−１５５０（１９９１）
【００４１】
種々のｈＣＧ形のペプチドシーケンスとＮ−及びＯ−結合したオリゴサッカライド構造を前記［非特許文献１７］［非特許文献１８］のようにして求めた。高フリコシル化したＮ−及びＯ−結合したオリゴサッカライド（ｈＣＧバッチＣ５）をもつ非ニックｈＣＧ、インタクトｈＣＧ、フリーβ−サブユニット、β−コアフラグメント及び絨毛癌ｈＣＧに対するモノクローナル抗体を上記
のｈＣＧ組成物を用いて標準法［非特許文献１９］に従ってつくった。簡潔に述べると、マウスをｈＣＧ試料で免疫し、約３週間第２感作を与え、そしてそれらの脾臓をそれらの血液抗体濃度が試料に対し正しい応答を示した後にとった。その細胞を骨髄腫と共に融合しそしてハイブリドーマセルラインを得た。妊娠尿の分析用のそれらのモノクローナルの使用は１９９６年１０月３〜６日の早期妊娠に関する第３回世界会議でアブストラクト番号６６で報告された。
【非特許文献１７】Ｅｌｉｏｔｔ，Ｍ．他  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｊ．，Ｖｏｌ．７，１９９７
【非特許文献１８】Ｃｏｌｅ，Ｌ．Ａ．，Ｂｉｒｋｅｎ，Ｓ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｉｎｏｌ，２：８２５−８３０（１９８８）
【非特許文献１９】Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，他  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  印Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  第２編、１９９２，ユニット１１
【００４２】
これらのモノクローナルを例２のＣｏｎ  Ａレクチン法を用いて分析した尿試料のスクリーンに用いた。高グリコシル化したｈＣＧ（ｈＣＧバッチＣ５）に対する１のモノクローナルくをＢ１５２として示した。これは正常ｈＣＧの＜１％であり、レクチン法で陽性とされた試料の６０％であった。
【００４３】
次いで、Ｂ１５２モノクローナルを正常な胎児をもつ１３０人の妊婦及びダウン症の胎児をもつ９人の妊婦から得た１３９の尿試料をスクリーンするのに用いた。キャプチャー抗体としてＢ１５２を用い、トレーサーとしてｈＣＧβ、バッチ４００１に対するパーオキシターゼで標識したモノクローナル抗体（Ｇｅｎｚｙｍｅ，カルフォルニア州サンカーロス）を用いて前記した免疫検定法［非特許文献２０］［非特許文献２１］を用いる２段サンドイッチ免疫検定法で調べた。純粋な高グリコシル化したゴナドトロピン（上記したＣｏｌｅ他（非特許文献１６）の１９８８年に記載されているバッチＣ７）をこの分析法を標準化するために用いた。正規のｈＣＧ（ｈＣＧダイマーのすべての形）の濃度を標準としてＮ１ＨＣＲ１２７  ｈＣＧを用いる２段サンドイッチ法で求めた。正規ｈＣＧと高グリコシル化したゴナドトロピン濃度値を例１に記載したようにクレアチニン濃度を標準化した。
【非特許文献２０】Ｅｌｉｏｔｔ，Ｍ．他  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｊ．，Ｖｏｌ．７，１９９７
【非特許文献２１】Ｃｏｌｅ，Ｌ．他  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，Ｍｅｔａｂ．７６：７０４−７１０（１９９３）
【００４４】
妊娠の１１〜１９週間に集めた試料からデータを図４のグラフに示す。ここで黒丸印は正常試料値を示しそして白丸印はダウン症候群の値を示す。標準統計法を用いて結果を分析した。１３０対照試料用の妊娠年齢特異的メディアン（中央値）はすべて、影響のない妊娠とダウン症候群データ（影響のない試料のメディアン、ＭｏＭの倍数で示す）の両方にとって、第５センチルと第９５センチルの間で対数ガウス分布に合致した。スクリーン精度を評価するため、メディアンと対数標準偏差（２．５６で割ったｌｏｇ  ＭｏＭ値の第１０センチルから第９０センチルの差によって推測）を求め、得た検知率（即ちダウン症候群ケースと影響のない妊娠の第９５センチルをこえるレベルとの比）を記録した。メディアンライン用の式＝３９０（０．８２６Ｘ）であり、ここでｙはメディアンでありｘは妊娠年齢である。対照試料の対数メディアンは−０．００７であり、対数標準偏差は０．４５である。９つのダウン症候群ケースはいずれも影響のない妊娠の第７０センチルをこえた。ダウン症候群のメディアン高グリコシド化ゴナドトロピン濃度は影響のないメディアン（対数メディアン＝０．０６５）の４．４倍だった。３つの第１トリメスターケースのうちの２つと６つの第２トリメスターケースのうちの４つを含む。９つのダウン症候群試料のうちの６つ（６７％）は第９５センチルを超えており、９つの試料のうちの３つ（３３％）は影響のない妊婦の第１００センチルをこえていた。
【００４５】
正規ｈＣＧ濃度を求めた。高グリコシル化ゴナドトロピンは正常妊娠において正規ｈＣＧ分子の３．７％を示し、（それぞれ平均２９ｎｇ／ｍｇ及び７８１ｎｇ／ｍｇクレアチニン）、そしてダウン症候群妊婦試料において正規ｈＣＧ分子の１１％を示した（それぞれ平均１９３ｎｇ／ｍｇ及び１６９０ｎｇ／ｍｇ）。
【００４６】
結果はモノクローナルＢ１５２がｈＣＧ炭水化物変異を認識しており、本発明の方法における高グリコシル化ｈＣＧ用の免疫検知法に用いうることを示している。
【００４７】
上記の記載は本発明方法をどのように実施するかを当業者に教示する目的でなされており、そこから当業者が理解できることまで詳細に記載することは意図していない。しかし、それらの自明の態様や変形はすべて特許請求の範囲に記載した本発明の範囲に含まれる。前記した文献及び特許はそれらの全体が参考としてここに含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１はｈＣＧ関連分子の構造を説明する図解のライン図である。太いラインはペプチドバックボーン、数字はアミノ酸の位置を示す。そして細いラインはジスルフィド結合の部位を示す。文字はオリゴ糖類側鎖の単糖類を示す。Ｓ＝シアル酸；Ｇ＝ガラクトース；Ａ＝Ｎ−アセチルグルコサミン；Ｍ＝マンノース；及びＬ＝Ｎ−アセチルガラクトサミンである。
【図２】図２はＮ−結合オリゴ糖類の図解説明図である。Ａの構造は通常の妊婦ｈＣＧ及びその遊離β−サブュニット、及びα−サブユニット上のＮ−結合オリゴ糖類を説明する。Ｂの構造は通常の妊娠β−コアフラグメント上の分解されたＮ−結合オリゴ糖類を示す。Ｃの構造は通常の妊娠ｈＣＧの遊離β−サブユニットとしてのｈＣＧ上のＯ−結合オリゴ糖類を示す。略語は、Ｍａｎはマンンース、Ｇａｌはガラクトース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン、Ｆｕｃはフコース及びＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミンを示すものとして使用される。変異性（ｂａｒｉａｂｌｅ）は±で示される。
【図３】図３はダウン症候群及び／又は絨毛癌のような関連する異常状態で発見される異常なｈＣＧ種上の高グリコシル化Ｎ−結合及びＯ−結合オルゴ糖類を説明する。Ａは高グリコシル化ゴナドトロピン及びその遊離のβ−サブユニット及び遊離のα−サブユニット上のＮ−結合オリゴ糖類を示す。Ｂは高グリコシル化ゴナドトピンβ−コアフラグメント上のＮ−結合オリゴ糖類を示す。Ｃは高グリコシル化ゴナドトトピン及びその遊離のβ−サブユニット上のＯ−結合オリゴ糖類を示す。略語は図２で用いたものと同じである。
【図４】図４は１３０人の通常の胎児（黒丸）をもつ妊婦及び９人のダウン症候群の胎児（白丸）をもつ妊婦から所定の周期的間隔で採取された尿サンプル中の高グリコシル化ｈＣＧについてのイムノアッセイにおけるモノクローナルＢ１５２活性のプロットである。中央値が決定されそしてサンプルが通常の妊娠中央値の倍数として表現された。長いガウスラインは妊娠年齢（第５０センチル）に調整された通常の妊娠中央値に対して一致した。第９５センチルがまた決定された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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