(57)【要約】【課題】パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属するウイルスが有するウイルス構造タンパク質を認識する複数種の抗体から、簡便、迅速かつ確実に、特定の抗体を捕捉できる特異抗体捕捉方法および特異抗体捕捉体を提供すること。【解決手段】本発明の特異抗体捕捉方法は、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属するウイルスが有するウイルス構造タンパク質を認識する複数種の抗体から、特定の抗体を捕捉する特異抗体捕捉方法であり、所定の試薬で処理した前記ウイルスを担持した基体に、前記複数種の抗体を含有する試料を接触させることにより、前記特定の抗体を前記基体に捕捉することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属するウイルスが有するウイルス構造タンパク質を認識する複数種の抗体から、特定の抗体を捕捉する特異抗体捕捉方法であって、
所定の試薬で処理した前記ウイルスを担持した基体に、前記複数種の抗体を含有する試料を接触させることにより、前記特定の抗体を前記基体に捕捉することを特徴とする特異抗体捕捉方法。
【請求項２】
前記試薬は、タンパク質同士を架橋する架橋性試薬であり、
前記ウイルス構造タンパク質は、前記ウイルスが有するエンベロープに存在するタンパク質である請求項１に記載の特異抗体捕捉方法。
【請求項３】
前記架橋性試薬は、アルデヒド系試薬である請求項２に記載の特異抗体捕捉方法。
【請求項４】
前記架橋性試薬は、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドのいずれかを主成分とする請求項２または３に記載の特異抗体捕捉方法。
【請求項５】
前記試料中の前記架橋性試薬の含有率は、０．００１〜１０％である請求項２ないし４のいずれかに記載の特異抗体捕捉方法。
【請求項６】
前記特定の抗体は、抗Ｈ抗体および抗Ｆ抗体である請求項２ないし５のいずれかに記載の特異抗体捕捉方法。
【請求項７】
前記試薬は、タンパク質を変性させるタンパク質変性剤であり、
前記ウイルス構造タンパク質は、前記ウイルス内部に存在するタンパク質である請求項１に記載の特異抗体捕捉方法。
【請求項８】
前記タンパク質変性剤は、尿素または塩酸グアニジンのいずれかを主成分とする請求項７に記載の特異抗体捕捉方法。
【請求項９】
前記試料中の前記タンパク質変性剤の濃度は、１〜１６．５ｍｏｌ／Ｌである請求項７または８に記載の特異抗体捕捉方法。
【請求項１０】
前記特定の抗体は、抗ＮＰ抗体である請求項７ないし９のいずれかに記載の特異抗体捕捉方法。
【請求項１１】
前記ウイルスは、モルビリウイルス属（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）に属するウイルスである請求項１ないし１０のいずれかに記載の特異抗体捕捉方法。
【請求項１２】
前記モルビリウイルス属（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）に属するウイルスは、麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）である請求項１１に記載の特異抗体捕捉方法。
【請求項１３】
パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属するウイルスが有するウイルス構造タンパク質を認識する複数種の抗体から、特定の抗体を捕捉する特異抗体捕捉体であって、
基体に所定の試薬で処理した前記ウイルスを担持してなることを特徴とする特異抗体捕捉体。
【請求項１４】
前記基体は、その少なくとも表面付近がリン酸カルシウム系化合物を主材料として構成されるものである請求項１３に記載の特異抗体捕捉体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特異抗体捕捉方法および特異抗体捕捉体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスによる感染を診断するための診断方法のうち、抗原−抗体反応を利用したものとしては、例えば、ゲル拡散法、ラジオイムノアッセイ、沈降テスト等が知られている。
【０００３】
近年では、ポリアクリルアミドゲル、ポリスチレンラテックスビーズおよびハイドロキシアパタイトコートナイロンビーズ等の不活性担体に抗原を結合させた固定化抗原を調製し、この固定化抗原に複数種の抗体を含有する被検試料を接触させ、抗原−抗体反応により、特定の抗体を捕捉する抗体捕捉方法が検討されている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００４】
しかしながら、かかる方法を用いて、特定の抗体を特異的（高感度）に捕捉するには、高度に精製したウイルス構造タンパク質を抗原として担体に結合させる必要があることから、このタンパク質の精製に煩雑な工程を要し、時間がかかりコストが高くなるという問題がある。
【０００５】
【特許文献１】特開平７−１７４７６２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属するウイルスが有するウイルス構造タンパク質を認識する複数種の抗体から、簡便、迅速かつ確実に、特定の抗体を捕捉できる特異抗体捕捉方法および特異抗体捕捉体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
このような目的は、下記（１）〜（１４）の本発明により達成される。
（１）  パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属するウイルスが有するウイルス構造タンパク質を認識する複数種の抗体から、特定の抗体を捕捉する特異抗体捕捉方法であって、
所定の試薬で処理した前記ウイルスを担持した基体に、前記複数種の抗体を含有する試料を接触させることにより、前記特定の抗体を前記基体に捕捉することを特徴とする特異抗体捕捉方法。
【０００８】
これにより、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属するウイルスが有するウイルス構造タンパク質を認識する複数種の抗体から、簡便、迅速かつ確実に、特定の抗体を捕捉することができる。
【０００９】
（２）  前記試薬は、タンパク質同士を架橋する架橋性試薬であり、
前記ウイルス構造タンパク質は、前記ウイルスが有するエンベロープに存在するタンパク質である上記（１）に記載の特異抗体捕捉方法。
【００１０】
試薬として、架橋性試薬を用いることにより、エンベロープに存在しているタンパク質同士を、架橋性試薬を介して結合・固定化することができ、前記ウイルスは、このタンパク質を外側に露出した状態となる。その結果、架橋性試薬で処理した前記ウイルスを担持した基体に、試料を接触させることにより、エンベロープに存在するタンパク質を抗原として認識する特定の抗体を捕捉することができる。
【００１１】
（３）  前記架橋性試薬は、アルデヒド系試薬である上記（２）に記載の特異抗体捕捉方法。
【００１２】
アルデヒド系試薬は、各タンパク質のＮ末端に存在するアミノ基同士を、アルデヒド系試薬を介して確実に共有結合させることができることから、架橋性試薬として好適に用いることができる。
【００１３】
（４）  前記架橋性試薬は、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドのいずれかを主成分とする上記（２）または（３）に記載の特異抗体捕捉方法。
【００１４】
ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびパラホルムアルデヒドは、いずれも、アミノ基との反応性が特に高いため、タンパク質同士をより確実に架橋することができる。
【００１５】
（５）  前記試料中の前記架橋性試薬の含有率は、０．００１〜１０％である上記（２）ないし（４）のいずれかに記載の特異抗体捕捉方法。
【００１６】
架橋性試薬の含有率を前記範囲内とすることにより、エンベロープに存在するタンパク質同士を確実に架橋することができる。
【００１７】
（６）  前記特定の抗体は、抗Ｈ抗体および抗Ｆ抗体である上記（２）ないし（５）のいずれかに記載の特異抗体捕捉方法。
【００１８】
タンパク質Ｈおよびタンパク質Ｆは、前記ウイルスのエンベロープに存在するものである。そのため、前記架橋性試薬で処理した前記ウイルスを担持した基体に、前記試料を接触させると、これらのタンパク質を抗原として認識する特定の抗体、すなわち、抗Ｈ抗体および抗Ｆ抗体を確実に捕捉することができる。
【００１９】
（７）  前記試薬は、タンパク質を変性させるタンパク質変性剤であり、
前記ウイルス構造タンパク質は、前記ウイルス内部に存在するタンパク質である上記（１）に記載の特異抗体捕捉方法。
【００２０】
試薬として、タンパク質変性剤を用いることにより、ウイルス粒子が壊れ、その内部に存在していたタンパク質を外側に露出する。その結果、タンパク質変性剤で処理した前記ウイルスを担持した基体に、前記試料を接触させることにより、前記ウイルスの内部に存在するタンパク質を抗原として認識する特定の抗体を捕捉することができる。
【００２１】
（８）  前記タンパク質変性剤は、尿素または塩酸グアニジンのいずれかを主成分とする上記（７）に記載の特異抗体捕捉方法。
【００２２】
尿素または塩酸グアニジンのいずれかを主成分としたタンパク質変性剤は、前記ウイルスが有するタンパク質を変性することができる。
【００２３】
（９）  前記試料中の前記タンパク質変性剤の濃度は、１〜１６．５ｍｏｌ／Ｌである上記（７）または（８）に記載の特異抗体捕捉方法。
【００２４】
タンパク質変性剤の濃度を前記範囲内とすることにより、前記ウイルスが有するタンパク質をより効果的に変性することができる。
【００２５】
（１０）  前記特定の抗体は、抗ＮＰ抗体である上記（７）ないし（９）のいずれかに記載の特異抗体捕捉方法。
【００２６】
タンパク質ＮＰは、前記ウイルスの内部に存在するものである。そのため、タンパク質変性剤で処理した前記ウイルスを担持した基体に、試料を接触させると、このタンパク質ＮＰを抗原として認識する特定の抗体、すなわち、抗ＮＰ抗体を確実に捕捉することができる。
【００２７】
（１１）  前記ウイルスは、モルビリウイルス属（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）に属するウイルスである上記（１）ないし（１０）のいずれかに記載の特異抗体捕捉方法。
【００２８】
パラミクソウイルス科に属するウイルスの中でもモルビリウイルス属に属するウイルスは、ウイルス構造タンパク質として、タンパク質Ｈ、タンパク質Ｆおよびタンパク質ＮＰをより多く含んでいることから、試料から、特定の抗体として、抗Ｈ抗体、抗Ｆ抗体および抗ＮＰ抗体を効率よく捕捉することができる。
【００２９】
換言すれば、かかるウイルスが有するウイルス構造タンパク質を認識する複数種の抗体から、本発明の特異抗体捕捉方法により、抗Ｈ抗体、抗Ｆ抗体および抗ＮＰ抗体のうちの少なくとも１種を優れた精度および再現性で捕捉することができる。
【００３０】
（１２）  前記モルビリウイルス属（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）に属するウイルスは、麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）である上記（１１）に記載の特異抗体捕捉方法。
【００３１】
モルビリウイルス属に属するウイルスの中でも麻疹ウイルスは、ウイルス構造タンパク質として、タンパク質Ｈ、タンパク質Ｆおよびタンパク質ＮＰを特に多く含んでいることから、試料から、特定の抗体として、抗Ｈ抗体、抗Ｆ抗体および抗ＮＰ抗体をより効率よく捕捉することができる。
【００３２】
換言すれば、かかるウイルスが有するウイルス構造タンパク質を認識する複数種の抗体から、本発明の特異抗体捕捉方法により、抗Ｈ抗体、抗Ｆ抗体および抗ＮＰ抗体のうちの少なくとも１種をより優れた精度および再現性で捕捉することができる。
【００３３】
（１３）  パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属するウイルスが有するウイルス構造タンパク質を認識する複数種の抗体から、特定の抗体を捕捉する特異抗体捕捉体であって、
基体に所定の試薬で処理した前記ウイルスを担持してなることを特徴とする特異抗体捕捉体。
【００３４】
これにより、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属するウイルスが有するウイルス構造タンパク質を認識する複数種の抗体から、簡便、迅速かつ確実に、特定の抗体を捕捉し得る特異抗体捕捉体とすることができる。
【００３５】
（１４）  前記基体は、その少なくとも表面付近がリン酸カルシウム系化合物を主材料として構成されるものである上記（１３）に記載の特異抗体捕捉体。
【００３６】
基体をかかる構成のものとすることにより、表面に存在するリン酸カルシウム系化合物に所定の試薬で処理した前記ウイルスを確実に担持させることができる。
【発明の効果】
【００３７】
本発明によれば、パラミクソウイルス科に属するウイルス、特に麻疹ウイルスが有するウイルス構造タンパク質を認識する複数種の抗体から、特定の抗体を捕捉することができ、例えば、かかるウイルスの感染の有無の診断に用いられる診断剤等に適用が可能である。
【００３８】
また、特定の抗体を捕捉することにより、例えば、患者の血清の詳しい分析結果を得ることができ、より効果的なワクチンの改良などに役立つ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
以下、本発明の特異抗体捕捉方法および特異抗体捕捉体について、好適実施形態に基づいて詳細に説明する。
【００４０】
なお、以下では、所定の試薬で処理するパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属するウイルスとして、麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）を用いた場合を一例として説明する。
【００４１】
図１は、麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）の構造を表した模式図である。また、図２は、図１に示す麻疹ウイルスのエンベロープ付近の拡大図である。
【００４２】
麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）は、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）モルビリウイルス属（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）に属し、図１に示すように、その形状は、ほぼ球形であり、１５０〜２００ｎｍの直径を有している。
【００４３】
図１に示すように、ウイルスの外側は、エンベロープ（脂質二重膜）で覆われ、また、その内部には、遺伝子としてＲＮＡを有している。
【００４４】
また、麻疹ウイルスは、図１および図２に示すように、ウイルス構造タンパク質として、エンベロープに存在するタンパク質Ｈおよびタンパク質Ｆと、ウイルス内部に存在する、タンパク質ＮＰ、タンパク質Ｐ、タンパク質Ｌおよびタンパク質Ｍとを有している。
【００４５】
これらのうち、タンパク質Ｈおよびタンパク質Ｆは、その一部がエンベロープ中に入り込むようにして外側に露出するスパイクを形成している。
【００４６】
また、タンパク質ＮＰは、ＲＮＡをらせん状に取り巻きヌクレオカプシドを形成し、タンパク質Ｐおよびタンパク質Ｌは、ＲＮＡの複製に関与するものであり、このヌクレオカプシド中に存在している。
【００４７】
さらに、タンパク質Ｍは、エンベロープとヌクレオカプシドとの間に介在しこれらを結びつけている。
【００４８】
このような麻疹ウイルスを、所定の試薬としてタンパク質同士を架橋する架橋性試薬を用いて処理すると、エンベロープに存在しているタンパク質すなわちタンパク質Ｈおよびタンパク質Ｆ同士を、架橋性試薬を介して結合（固定）して、エンベロープの崩壊すなわち麻疹ウイルスの崩壊を確実に防止することができる。
【００４９】
そこで、架橋性試薬による処理が施された麻疹ウイルス（以下、「架橋麻疹ウイルス」という。）を基体に担持させると、架橋麻疹ウイルスは、固定化されたタンパク質Ｈおよびタンパク質Ｆを外側に露出した状態で基体に担持（固相化）されることとなる。
【００５０】
そのため、架橋麻疹ウイルスを担持した基体（本発明の特異抗体捕捉体）に、麻疹ウイルスが有するウイルス構造タンパク質を認識する複数種の抗体を含有する試料（以下、単に「試料」という。）を接触させると、タンパク質Ｈおよびタンパク質Ｆを抗原として認識する抗体、すなわち、抗Ｈ抗体および抗Ｆ抗体との間で抗原−抗体反応が生じることとなる。これにより、試料（被処理液）から、特定の抗体として抗Ｈ抗体および抗Ｆ抗体を特異的に特異抗体捕捉体に捕捉することができる。
【００５１】
架橋性試薬としては、特に限定されないが、例えば、アルデヒド系試薬およびマレイミド系試薬等が挙げられる。これらの中でも、アルデヒド系試薬は、各タンパク質のＮ末端に存在するアミノ基同士を、アルデヒド系試薬を介して確実に共有結合させて、タンパク質同士の架橋を確実に行うことができるものである。これにより、エンベロープの崩壊をより確実に防止することができる。
【００５２】
アルデヒド系試薬としては、例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびパラホルムアルデヒド等が挙げられ、これらの中でも、ホルムアルデヒドを主成分とするものが好ましい。ホルムアルデヒドは、アミノ基との反応性が特に高いため、タンパク質同士をより確実に架橋することができる。
【００５３】
一方、麻疹ウイルスを、所定の試薬としてタンパク質を変性させるタンパク質変性剤を用いて処理すると、エンベロープを含むウイルス粒子が崩壊して、ウイルスの内部に存在するタンパク質ＮＰ、タンパク質Ｐ、タンパク質Ｌおよびタンパク質Ｍが外側に露出することとなる。
【００５４】
ところが、これらのタンパク質の中でも、タンパク質ＮＰは、その絶対量が他のタンパク質よりも多いため、タンパク変性剤による処理により、ウイルスの外側に露出しているものがより多く存在することとなる。
【００５５】
そこで、タンパク変性剤による処理が施された麻疹ウイルス（以下、「タンパク変性麻疹ウイルス」という。）を基体に担持させると、タンパク変性麻疹ウイルスは、タンパク質ＮＰをより多く外側に露出した状態で基体に担持されることとなる。
【００５６】
そのため、タンパク変性麻疹ウイルスを担持した基体（本発明の特異抗体捕捉体）に、試料を接触させると、タンパク質ＮＰを抗原として認識する抗体、すなわち、抗ＮＰ抗体との間で抗原−抗体反応が生じることとなる。これにより、試料から、特定の抗体として抗ＮＰ抗体を特異抗体捕捉体に特異的に捕捉することができる。
【００５７】
タンパク変性剤としては、特に限定されないが、例えば、尿素および塩酸グアニジン等が挙げられ、これらの中でも、尿素を主成分とするものが好ましい。これにより、タンパク質の高次構造を破壊し、ウイルス粒子を壊すことができる。
【００５８】
また、本発明者の検討では、尿素を用いることが大きな要因となって、特異抗体捕捉体に抗ＮＰ抗体を特異的に捕捉できるようになることが確認されている。
【００５９】
以上のように、麻疹ウイルスを処理する試薬の種類を適宜選択することにより、麻疹ウイルスが有するウイルス構造タンパク質のうち、所望のものをウイルスの外側に露出させることができる。これにより、かかる試薬により処理が施された麻疹ウイルスが認識する抗体（ウイルス構造タンパク質）を所望のものとすることができる。
【００６０】
そのため、基体に担持させる麻疹ウイルスの処理方法すなわち処理に用いる試薬の種類を適宜選択することにより、かかる試薬で処理した麻疹ウイルスを担持した基体（本発明の特異抗体捕捉体）に、試料から所望（特定）の抗体を捕捉する（本発明の特異抗体捕捉方法）ことができるようになる。
【００６１】
このように、本発明の特異抗体捕捉方法および特異抗体捕捉体によれば、麻疹ウイルスの処理に用いる試薬の種類を選択するという簡便な処理方法の変更で、試料から特定の抗体を迅速かつ確実に捕捉することができる。このような本発明の特異抗体捕捉方法および特異抗体捕捉体は、例えば、麻疹ウイルスの感染の有無の診断に用いられる診断剤等に適用が可能である。
【００６２】
ここで、所定の試薬で処理した麻疹ウイルスを担持させる基体の形状は、特に限定されず、例えば、粒子状（特に、球形状）、ペレット状、ブロック状およびプレート状のものが挙げられる。これらの中でも、基体の形状としては、球形状であるのが好ましい。基体をかかる形状のものとすることにより、特異抗体捕捉体と特定の抗体との抗原−抗体反応を凝集像として好適に観察することができる。
【００６３】
また、基体は、架橋麻疹ウイルスまたはタンパク変性麻疹ウイルス（以下、これらを総称して「試薬処理麻疹ウイルス」ということもある。）を担持し得るものであればよく、特に限定されるものではないが、その少なくとも表面付近がリン酸カルシウム系化合物で構成されているのが好ましい。リン酸カルシウム系化合物は、優れたタンパク質吸着能を有することから、タンパク質をその外側に露出する試薬処理麻疹ウイルスに対しても優れた吸着能を有している。そのため、基体をかかる構成のものとすることにより、表面に存在するリン酸カルシウム系化合物に試薬処理麻疹ウイルスを確実に担持（吸着）させることができる。
【００６４】
このような基体としては、例えば、リン酸カルシウム系化合物で構成されたもの、樹脂、セラミックス等で構成された母材の表面をリン酸カルシウム系化合物で被覆したもの等が挙げられる。
【００６５】
リン酸カルシウム系化合物としては、特に限定されず、Ｃａ／Ｐ比が１．０〜２．０の各種化合物を用いることができ、例えば、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｆ２、Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｃｌ２、Ｃａ３（ＰＯ４）２、Ｃａ２Ｐ２Ｏ７、Ｃａ（ＰＯ３）２、ＣａＨＰＯ４等のうちの１種または２種以上を用いることができる。
【００６６】
これらの中でも、リン酸カルシウム化合物は、ハイドロキシアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）を主成分とするものが最適である。ハイドロキシアパタイトは、試薬処理麻疹ウイルスの担持能に特に優れている。
【００６７】
また、本発明の特異抗体捕捉体は、基体表面における試薬処理麻疹ウイルスが担持されていない部分の少なくとも一部（より好ましくは、ほぼ全て）が、抗体との相互作用が低いタンパク質（ブロッキング剤）により被覆されているのが好ましい。
【００６８】
なお、ここで言う「抗体」とは、試料に含有される複数種の抗体を含み、一般的な抗体のことを指す。また、「抗体との相互作用が低い」とは、抗体を担持（吸着）する能力、抗体と結合する能力等が無いか、極めて低いことを言う。
【００６９】
これにより、特異抗体捕捉体を用いて、特定の抗体を捕捉する際に、特定の抗体以外の抗体が特異抗体捕捉体に非特異的に結合（吸着）することが好適に防止される。
【００７０】
このタンパク質としては、リン酸カルシウム系化合物に吸着する性質を有するものが好適に用いられる。すなわち、試薬処理麻疹ウイルスが担持されていない部分は、基体の表面にタンパク質を吸着させることにより、被覆されているのが好ましい。
【００７１】
このようなタンパク質としては、例えば、カゼインのようなリンタンパク質、トランスフェリン、フェレドキシンのような金属タンパク質、アルブミン、ゼラチン、ビテリン、ホスビチン等が挙げられる。これらの中でも、タンパク質としては、カゼイン、アルブミン、ゼラチンを用いるのが好ましい。これらのタンパク質は、リン酸カルシウムへの吸着能に優れている。さらに、これらの中でも、タンパク質としては、カゼインが最適である。カゼインは、リン酸カルシウム系化合物への吸着能に優れ、かつ、抗体との相互作用が極めて低い。
【００７２】
さらに、特異抗体捕捉体において、試薬処理麻疹ウイルスは、安定化されているのが好ましい。これにより、基体に担持された試薬処理麻疹ウイルスが安定化し、基体から試薬処理麻疹ウイルスが遊離することが防止されるようになる。このため、得られる特異抗体捕捉体は、経時的に劣化しにくくなる。
【００７３】
このような試薬処理麻疹ウイルスの安定化は、特異抗体捕捉体を安定化剤で処理することにより行うのが好ましい。かかる処理方法は、簡易かつ最も効果的な試薬処理麻疹ウイルスの安定化方法である。
【００７４】
この安定化剤としては、例えば、架橋剤が好適に用いられる。これにより、試薬処理麻疹ウイルス中に含まれるタンパク質同士の間に、共有結合が形成され、これらを強固に固定することができる。その結果、基体から抗体が遊離することが確実に防止されることとなる。
【００７５】
この架橋剤としては、種々のものを用いることができるが、特に、二価性架橋剤を用いるのが好適である。二価性架橋剤を用いれば、試薬処理麻疹ウイルスを好適に安定化させることができる。
【００７６】
このような二価性架橋剤としては、例えば、グルタルアルデヒド、ｐ−ベンゾキノン、ｍ−マレイミド安息香酸、Ｎ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミド等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００７７】
なお、安定化剤としては、前記架橋剤の他、例えば、ホルムアルデヒド、シランカップリング剤のような結合剤、四塩化オスミウム等を用いることもできる。
【００７８】
以下、このような特異抗体捕捉体の調製方法（製造方法）について説明する。
まず、特異抗体捕捉体を調製するに先立って、前述したような基体を用意する。
【００７９】
ほぼ全てがリン酸カルシウム系化合物で構成される球形状の基体は、例えば、次のようにして得ることができる。
【００８０】
まず、公知の方法で湿式合成したリン酸カルシウム系化合物の結晶粒子（一次粒子）を基体として用いることができる。
【００８１】
また、この結晶粒子を懸濁したスラリーを、直接噴霧乾燥等により造粒することにより得られた多孔質な二次粒子を基体として用いることができる。
【００８２】
さらに、基体をより高気孔率なものとする場合には、例えば、前記二次粒子を再びスラリー状に懸濁して、湿式成形または加圧による乾式成形等により、ブロック体を成形し、このブロック体を焼成した後、粉砕して分級することにより基体を得ることができる。
【００８３】
また、表面がリン酸カルシウム系化合物で構成された（被覆された）基体は、例えば、前述したような一次粒子および／または二次粒子を母材に物理的に衝突させる物理的衝突により得ることができる。
【００８４】
次に、前述したような試薬処理麻疹ウイルスを調製する。
試薬処理麻疹ウイルスとして、架橋麻疹ウイルスを調製する場合、前述したような架橋性試薬を含有する架橋性試薬溶液を麻疹ウイルスに接触させることにより行うことができる。
【００８５】
この溶液中における架橋性試薬の含有率は、０．００１〜１０％程度であるのが好ましく、０．１〜１％程度であるのがより好ましい。架橋性試薬の含有率が低すぎると、エンベロープに存在するタンパク質に対する架橋性試薬の含有量が少なくなり、架橋性試薬の種類等によっては、タンパク質の架橋が十分に行なわれないおそれがある。また、架橋性試薬の含有率を高くしても、それ以上の効果の増大が期待できない。
【００８６】
また、架橋性試薬溶液のｐＨは、４．５〜８．０程度とするのが好ましく、５．５〜７.０程度とするのがより好ましい。
架橋性試薬溶液の温度は、室温付近（０〜４０℃）とするのが好ましい。
【００８７】
さらに、架橋性試薬溶液を麻疹ウイルスに接触させる時間は、０．１〜３時間程度とするのが好ましく、０．５〜１．５時間程度とするのがより好ましい。
【００８８】
架橋性試薬溶液を麻疹ウイルスに接触させる際の条件を前記のような範囲内に設定することにより、エンベロープに存在するタンパク質同士を確実に架橋することができる。
【００８９】
また、試薬処理麻疹ウイルスとして、タンパク変性麻疹ウイルスを調製する場合、麻疹ウイルスを前述したようなタンパク変性剤を含有するタンパク変性剤溶液に接触させることにより行うことができる。
【００９０】
この溶液中におけるタンパク変性剤の濃度は、１〜１６．５ｍｏｌ／Ｌ程度であるのが好ましく、４〜１０ｍｏｌ／Ｌ程度であるのがより好ましい。タンパク質変性剤の濃度が低すぎると、タンパク質に対するタンパク質変性剤の含有量が少なくなり、タンパク質変性剤の種類等によっては、タンパク質の変性が十分に行なわれないおそれがある。また、タンパク質変性の濃度を高くしても、それ以上の効果の増大が期待できない。
【００９１】
また、タンパク変性剤溶液のｐＨは、６．５〜９．０程度とするのが好ましく、７．０〜８．０程度とするのがより好ましい。
タンパク変性剤溶液の温度は、室温付近（０〜４０℃）とするのが好ましい。
【００９２】
さらに、タンパク変性剤溶液を麻疹ウイルスに接触させる時間は、０．１〜３時間程度とするのが好ましく、０．５〜１．５時間程度とするのがより好ましい。
【００９３】
タンパク変性剤溶液を麻疹ウイルスに接触させる際の条件を前記のような範囲内に設定することにより、麻疹ウイルスが有するタンパク質を変性させて、ウイルス内部に存在するタンパク質をウイルスの外側に確実に露出させることができる。
【００９４】
次に、用意した基体および調製した試薬処理麻疹ウイルスを用いて、以下のようにして特異抗体捕捉体を調製する。
【００９５】
［１］まず、試薬処理麻疹ウイルスを、基体に担持させる。
これは、例えば、上述したような架橋麻疹ウイルスおよびタンパク変性麻疹ウイルスのうちのいずれか一方を含有する試薬処理麻疹ウイルス溶液と、基体とを混合すること等により、試薬処理麻疹ウイルスを基体に接触させることにより行うことができる。
【００９６】
この場合、試薬処理麻疹ウイルス溶液のｐＨは、５．５〜９．０程度とするのが好ましく、６．５〜８．０程度とするのがより好ましい。
【００９７】
さらに、試薬処理麻疹ウイルスを基体に接触させる時間は、０．１〜２時間程度とするのが好ましく、０．５〜１．０時間程度とするのがより好ましい。
【００９８】
試薬処理麻疹ウイルスを基体に接触させる際の条件を前記のような範囲内に設定することにより、試薬処理麻疹ウイルスを基体に確実に吸着させることができる。
【００９９】
［２］次に、基体に担持された試薬処理麻疹ウイルスを安定化させる。
これは、例えば、試薬処理麻疹ウイルスが担持された基体を、前述したような安定化剤を含有する安定化剤溶液に混合すること等により行うことができる。
【０１００】
この場合、安定化剤溶液のｐＨは、４．５〜８．０程度とするのが好ましく、５．５〜７．０程度とするのがより好ましい。
【０１０１】
さらに、試薬処理麻疹ウイルスが担持された基体を安定化剤溶液に接触させる時間は、５〜９０分程度とするのが好ましく、１５〜６０分程度とするのがより好ましい。
【０１０２】
試薬処理麻疹ウイルスが担持された基体を安定化剤溶液に混合する際の条件を前記のような範囲内に設定することにより、基体に担持された試薬処理麻疹ウイルスを確実に安定化させることができる。その結果、得られた特異抗体捕捉体は、より経時的な劣化が生じにくいものとなる。
【０１０３】
［３］次に、基体表面における試薬処理麻疹ウイルスが担持されていない部分の少なくとも一部をタンパク質により被覆（ブロッキング）する。
【０１０４】
これは、例えば、試薬処理麻疹ウイルスが担持された基体を、前述したようなタンパク質を含有するタンパク質溶液に混合すること等により行うことができる。
【０１０５】
この場合、タンパク質溶液のｐＨは、５．５〜９．０程度とするのが好ましく、６．５〜８．０程度とするのがより好ましい。
【０１０６】
さらに、試薬処理麻疹ウイルスが担持された基体をタンパク質溶液に接触させる時間は、０．１〜３時間程度とするのが好ましく、０．５〜２．０時間程度とするのがより好ましい。
【０１０７】
試薬処理麻疹ウイルスが担持された基体をタンパク質溶液に混合する際の条件を前記のような範囲内に設定することにより、基体表面における試薬処理麻疹ウイルスが担持されていない部分のほぼ全てを被覆することができる。
【０１０８】
なお、これら各工程［１］〜［３］は、それぞれ、例えば、室温付近（０〜４０℃）で好適に行うことができる。
【０１０９】
以上の工程を行うことにより、試薬処理麻疹ウイルスを基体に確実に担持させることができる。すなわち、特異抗体捕捉体を得ることができる。
【０１１０】
なお、前記工程［２］の前において、前記工程［３］と同様の操作を行うようにしてもよい。また、前記工程［３］の後において、前記工程［２］と同様の操作を行ってもよいし、前記工程［２］および前記工程［３］と同様の操作を繰返し行うようにしてもよい。また、前記工程［２］および［３］は、省略するようにしてもよい。
【０１１１】
さらに、前記工程［１］〜前記工程［３］の他、必要に応じて、任意の目的で、１または２以上の工程を追加するようにしてもよい。
【０１１２】
なお、本実施形態では、パラミクソウイルス科に属するウイルスとして、麻疹ウイルスを用いた場合を代表として説明したが、このような場合に限定されず、パラインフルエンザウイルス（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）、シミアンウイルス４１（Ｓｉｍｉａｎ  ｖｉｒｕｓ  ４１）、ムンプスウイルス（Ｍｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓ）、センダイウイルス（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）、ニューカッスル病ウイルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）のようなパラミクソウイルス属（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）、ジステンパーウイルス（Ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、牛疫ウイルス（Ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）のようなモルビリウイルス属（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）、および、ＲＳウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）のようなニューモウイルス属（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）等に属するウイルスを用いた場合にも、本発明の特異抗体捕捉方法および特異抗体捕捉体を適用することができる。これらのウイルスは、ウイルス構造タンパク質として、タンパク質Ｈ、タンパク質Ｆおよびタンパク質ＮＰを比較的多く含んでいることから、特定の抗体として、抗Ｈ抗体、抗Ｆ抗体および抗ＮＰ抗体を効率よく捕捉することができる。
【０１１３】
これらの中でも、本発明の特異抗体捕捉方法および特異抗体捕捉体を適用するパラミクソウイルス科に属するウイルスは、モルビリウイルス属に属するウイルスであるのが好ましい。パラミクソウイルス科に属するウイルスの中でもモルビリウイルス属に属するウイルスは、ウイルス構造タンパク質として、タンパク質Ｈ、タンパク質Ｆおよびタンパク質ＮＰをより多く含んでいることから、特定の抗体として、抗Ｈ抗体、抗Ｆ抗体および抗ＮＰ抗体を効率よく捕捉することができる。
【０１１４】
換言すれば、かかるウイルスが有するウイルス構造タンパク質を認識する複数種の抗体から、抗Ｈ抗体、抗Ｆ抗体および抗ＮＰ抗体のうちの少なくとも１種を優れた精度および再現性で捕捉（検出）することができる。
【０１１５】
さらに、モルビリウイルス属に属するウイルスは、麻疹ウイルスであるのが好ましい。モルビリウイルス属に属するウイルスの中でも麻疹ウイルスは、ウイルス構造タンパク質として、タンパク質Ｈ、タンパク質Ｆおよびタンパク質ＮＰを特に多く含んでいることから、前述したような効果が特に顕著に発揮されることとなる。
【０１１６】
以上、本発明の特異抗体捕捉方法および特異抗体捕捉体を好適実施形態に基づいて説明したが、本発明は、これに限定されるものではない。
【実施例】
【０１１７】
次に、本発明の具体的実施例について説明する。
１．粒状ポリマー複合体の製造
まず、以下に示すようにして、粒状ポリマー複合体（ナイロンビーズハイドロキシアパタイト）を製造した。
【０１１８】
すなわち、ナイロンビーズおよびハイドロキシアパタイト粒子をＮＡＲＡハイブリダイゼーションシステムＮＨＳ−１（奈良機械製作所製、定格動力５．５ｋｗ、定格電流２３Ａ）にセットし、このハイブリダイゼーションシステムを８０００回転／分、加熱温度３２〜５０℃の条件で５分間稼動させた。
【０１１９】
これにより、ナイロンビーズ表面がハイドロキシアパタイトで被覆された平均粒径７μｍ、密度１．０３ｇ／ｃｍ３の粒状ポリマー複合体（ナイロンビーズハイドロキシアパタイト粒子）を得た。
【０１２０】
２．架橋性試薬処理ウイルス固定ビーズの調製
次に、以下に示すようにして、パラホルムアルデヒドで処理した麻疹ウイルスを粒状ポリマー複合体に固定させることにより、架橋性試薬処理ウイルス固定ビーズを得た。
【０１２１】
−１Ａ−  まず、麻疹ウイルスを加えた２ｍＬパラホルムアルデヒド処理液に、前記１．で製造した粒状ポリマー複合体を２００μＬ加えた後、室温（２５℃）で１時間放置した。
【０１２２】
−２Ａ−  次に、０．１％グルタルアルデヒド水溶液２ｍＬを加え、室温（２５℃）で３０分間インキュベートした。
【０１２３】
−３Ａ−  次に、カゼインを含むブロッキング剤（雪印乳業社製、「ブロックエース」）２ｍＬを加え、３７℃で１時間インキュベートした。
【０１２４】
−４Ａ−  次に、０．１％グルタルアルデヒド水溶液２ｍＬをさらに加え、３７℃で３０分間インキュベートした。
【０１２５】
−５Ａ−  次に、前記工程−４Ａ−が施された粒状ポリマー複合体をリン酸緩衝生理食塩水により洗浄した後、この複合体にブロッキング剤２ｍＬを加え、３７℃で１時間インキュベートした。
【０１２６】
−６Ａ−  次に、前記工程−５Ａ−が施された粒状ポリマー複合体に、ブロッキング剤を更に加えて１０倍に希釈した。
【０１２７】
３．タンパク質変性剤処理ウイルス固定ビーズの調製
次に、以下に示すようにして、尿素で処理した麻疹ウイルスを粒状ポリマー複合体に固定させることにより、タンパク質変性剤処理ウイルス固定ビーズを得た。
【０１２８】
−１Ｂ−  まず、麻疹ウイルスに尿素の終濃度が６．０ｍｏｌ／Ｌとなるように加え、３７℃で１時間インキュベートした。
【０１２９】
−２Ｂ−  次に、尿素含有リン酸緩衝生理食塩水にリン酸緩衝生理食塩水を添加して、この生理食塩水中に含まれる尿素濃度を２ｍｏｌ／Ｌに低下させることにより、尿素処理液を得た。
【０１３０】
−３Ｂ−  次に、４ｍＬの尿素処理液に、前記１．で製造した粒状ポリマー複合体を５００μＬ加えた後、室温（２５℃）で１時間放置した。
【０１３１】
−４Ｂ−  次に、リン酸緩衝生理食塩水５ｍＬをさらに加えて室温（２５℃）で１０分間放置した。
【０１３２】
−５Ｂ−  次に、前記工程−４Ｂ−が施された粒状ポリマー複合体をリン酸緩衝生理食塩水により洗浄した後、この複合体に０．１％グルタルアルデヒド水溶液５ｍＬを加え、室温（２５℃）で３０分間インキュベートした。
【０１３３】
−６Ｂ−  次に、前記工程−５Ｂ−と同様に洗浄した後、カゼインを含むブロッキング剤（雪印乳業社製、「ブロックエース」）５ｍＬを加え、３７℃で１時間インキュベートした。
【０１３４】
−７Ｂ−  次に、前記工程−６Ｂ−が施された粒状ポリマー複合体に０．１％グルタルアルデヒド水溶液５ｍＬを加え、３７℃で３０分間インキュベートした。
【０１３５】
−８Ｂ−  次に、前記工程−７Ｂ−が施された粒状ポリマー複合体をリン酸緩衝生理食塩水により洗浄した後、この複合体にブロッキング剤５ｍＬを加え、３７℃で１時間インキュベートした。
【０１３６】
−９Ｂ−  次に、前記工程−８Ｂ−が施された粒状ポリマー複合体を５ｍＬのブロッキング剤に再懸濁した後、ブロッキング剤で１０倍に希釈した。
【０１３７】
４．アッセイ系の調製
−１Ｃ−  ９６穴Ｖ底プレートに１０μｇ／ｍＬのビオチン結合性タンパク質（ＰＩＥＲＣＥ社製、「ＮｅｒｔｒＡｖｉｄｉｎｅ」）を５０μＬ加えて、３７℃で３０分インキュベートした。
【０１３８】
−２Ｃ−  次に、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝生理食塩水でプレートを３回洗浄した。
【０１３９】
−３Ｃ−  次に、ビオチン標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製、「Gt x Rbt IgG Fc : Biotin」）を加え、３７℃で３０分間インキュベートした。
【０１４０】
−４Ｃ−  次に、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝生理食塩水でプレートを再度３回洗浄した。
【０１４１】
−５Ｃ−  次に、各麻疹ウイルス構造タンパク質に対するウサギポリクローナル抗体（抗Ｈ抗体、抗Ｐ抗体、抗ＮＰ抗体、抗Ｆ抗体、および抗Ｍ抗体）、ウサギ麻疹ウイルス抗血清および陰性ウサギ血清（ｎｏｒｍａｌ  ｒａｂｂｉｔ  ｓｅｒｕｍ）を１００倍から２０４８００倍まで２倍段階希釈して室温で３０分間インキュベートした。
【０１４２】
−６Ｃ−  次に、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝生理食塩水でプレートを再度３回洗浄した。
【０１４３】
５．特定の抗体の捕捉
（実施例１）
前記４．で調製した９６穴Ｖ底プレートに、前記２．で調製した架橋性試薬処理ウイルス固定ビーズを１００μＬずつ加え、室温で１時間静置した。
【０１４４】
（実施例２）
前記４．で調製した９６穴Ｖ底プレートに、前記３．で調製したタンパク質変性剤処理ウイルス固定ビーズを１００μＬずつ加え、室温で１時間静置した。
【０１４５】
６．評価
各実施例について、９６穴Ｖ底プレートに添加したビーズの凝集像を観察した。
【０１４６】
また、麻疹ウイルス構造タンパク質に対する抗体の特異性はウエスタンブロット法により確認した。
【０１４７】
その結果、実施例１の架橋性試薬処理ウイルス固定ビーズは、麻疹ウイルス抗血清、抗Ｈ抗体および抗Ｆ抗体と反応（凝集）した。なお、抗Ｈ抗体に対する凝集像が２０４８００倍に希釈しても見られ、抗Ｆ抗体対する凝集像が５１２００倍に希釈しても見られた。
【０１４８】
また、実施例２のタンパク質変性剤処理ウイルス固定ビーズは、麻疹ウイルス抗血清および抗ＮＰ抗体と反応した。なお、抗ＮＰ抗体に対する凝集像が、１２８００倍に希釈しても見られた。
【０１４９】
以上のことから、架橋性試薬で処理したウイルスを担持させた基体は、ウイルス表面（エンベロープ）上のタンパク質に対する抗体を捕捉できることが明らかとなった。
【０１５０】
一方、タンパク質変性剤で処理したウイルスを担持させた基体は、ウイルス内部のタンパク質に対する抗体を捕捉できることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
【図１】麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）の構造を表した模式図である。
【図２】図１に示す麻疹ウイルスのエンベロープ付近の拡大図である。
【符号の説明】
【０１５２】
Ｆ      タンパク質Ｆ
Ｈ      タンパク質Ｈ
Ｌ      タンパク質Ｌ
Ｍ      タンパク質Ｍ
ＮＰ    タンパク質ＮＰ
Ｐ      タンパク質Ｐ
【図１】
2007147574.tif 000002
【図２】
2007147574.tif 000003