(57)【要約】      （修正有）【課題】ＣＬＥＣ−２の生理的リガンドを同定すると共に、該生理的リガンドとＣＬＥＣ−２との結合を阻害または促進することにより、止血疾患治療用の医薬組成物を提供すること。【解決手段】配列番号１で示されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列、配列番号１に示されるアミノ酸配列の一部が欠損、置換または付加された組換え体のアミノ酸配列、前記アミノ酸配列の部分ペプチド、前記アミノ酸配列のフラグメント、または前記アミノ酸配列の塩のいずれか１つ以上を含有してなることを特徴とする止血疾患治療用の医薬組成物を提供する。【選択図】  図２
2007070359.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列、配列番号１に示されるアミノ酸配列の一部が欠損、置換または付加された組換え体のアミノ酸配列、前記アミノ酸配列の部分ペプチド、前記アミノ酸配列のフラグメント、または前記アミノ酸配列の塩のいずれか１つ以上を含有してなることを特徴とする止血疾患治療用の医薬組成物。
【請求項２】
配列番号１で示されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列、配列番号１に示されるアミノ酸配列の一部が欠損、置換または付加された組換え体のアミノ酸配列、前記アミノ酸配列の部分ペプチドまたは前記アミノ酸配列のフラグメントをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドと相補的な塩基配列または該塩基配列の一部からなるポリヌクレオチドのいずれか一つ以上を含有してなることを特徴とする止血疾患治療用の医薬組成物。
【請求項３】
配列番号１で示されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列、配列番号１に示されるアミノ酸配列の一部が欠損、置換または付加された組換え体のアミノ酸配列、前記アミノ酸配列の部分ペプチド、前記アミノ酸配列のフラグメント、または前記アミノ酸配列の塩のいずれかに対する抗体を含有してなることを特徴とする止血疾患治療用の医薬組成物。
【請求項４】
前記部分ポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の止血疾患治療用の医薬組成物。
【請求項５】
配列番号３に示されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列、配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列、配列番号３および配列番号４に示されるアミノ酸配列の一部が欠損、置換または付加された組換え体のアミノ酸配列、前記アミノ酸配列の部分ペプチド、前記アミノ酸配列のフラグメント、前記アミノ酸配列の塩のいずれか１つ以上を含有してなることを特徴とする止血疾患治療用の医薬組成物。
【請求項６】
配列番号３に示されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列、配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列、配列番号３および配列番号４に示されるアミノ酸配列の一部が欠損、置換または付加された組換え体のアミノ酸配列、前記アミノ酸配列の部分ペプチド、前記アミノ酸配列のフラグメントをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドと相補的な塩基配列、前記塩基配列の一部からなるポリヌクレオチドのいずれか１つ以上を含有してなることを特徴とする止血疾患治療用の医薬組成物。
【請求項７】
配列番号３に示されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列、配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列、配列番号３および配列番号４に示されるアミノ酸配列の一部が欠損、置換または付加された組換え体のアミノ酸配列、前記アミノ酸配列の部分ペプチド、前記アミノ酸配列のフラグメント、または前記アミノ酸配列の塩に対する抗体を含有してなることを特徴とする止血疾患治療用の医薬組成物。
【請求項８】
前記部分ポリペプチドは、配列番号５または配列番号６に示されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一であることを特徴とする請求項５から７のいずれかに記載の止血疾患治療用の医薬組成物。
【請求項９】
前記止血疾患は、深刻な冠不全症候群、心筋梗塞、不安定狭心症、難治性の狭心症、血栓溶解療後の冠動脈内血栓性閉塞、冠動脈血管形成術後の冠動脈内血栓性閉塞、血栓による脳血管疾患、塞栓性脳卒中、血栓性脳卒中、一過性脳虚血発作、静脈血栓症、深部静脈血栓症、肺動脈塞栓、凝固障害、播種性血管内凝固症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、閉塞性血栓血管炎、ヘパリン起因性血小板減少症に伴う血栓症、体外循環による血栓合併症、心臓または他の血管内カテーテル、大動脈内バルーンポンプ、動脈ステントあるいは心臓弁などの器具による血栓合併症、および人工器官の取り付けを要する状態からなる群から選択される請求項１から８のいずれかに記載の止血疾患治療用の医薬組成物。
【請求項１０】
前記止血疾患は、血栓形成傾向、血小板減少等によるあるいは出血傾向（過剰出血）であることを特徴とする請求項１から９のいずれかに記載の止血疾患治療用の医薬組成物。
【請求項１１】
薬学的に許容しえるキャリア、アジュバンド、可溶化剤または希釈剤を含有してなることを特徴とする請求項１から１０のいずれかに記載の止血疾患治療用の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血小板活性を調節する止血疾患治療用の医薬組成物に関する。特に、血栓症または血栓合併症の抑制または治療するための医薬組成物、ならびに、血小板減少等による出血傾向を治療するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血小板は、止血作用および創傷の治癒に欠かせないものである。血小板は通常の状態では不活性の状態であるが、血管が破れたり損傷したりした際には活性化する。血小板の活性化は、血管内のコラーゲンなどの成分が露出し、それが血小板表面の受容体と結合することで惹起されることが知られている。そして、血小板の結合により、シグナル伝達が刺激され、血小板凝集や血液凝固および血栓形成が引き起こされることとなる。
【０００３】
血栓形成は、血管疾患の中でも主な病因因子の一つである。動脈硬化による血管内皮傷害や、アテローム性プラークの破綻により露出した内皮下組織と流血中の血小板が接触することで血小板が活性化され、凝集塊が形成される。この血小板血栓は流血中の血小板をさらに巻き込んだり、凝固因子が活性化されたりすることで増大し、下流の組織への血流が減少する。その結果、脳梗塞、心筋梗塞や、狭心症、一過性脳虚血、末梢血管障害、再環流療法後の再狭窄などの動脈血栓症が発症する。また、肺塞栓症などの静脈血栓症にも血小板が関わるといわれている。
【０００４】
特に、脳梗塞、心筋梗塞などの動脈血栓症は先進諸国の死因の多くを占めているだけでなく、脳梗塞はいわゆる「寝たきり」になる大きな原因となっている。血栓症の克服は現代社会の大きな課題のひとつであり、血栓形成の抑制または血小板凝集を軽減する抗血小板薬の市場規模は2200億円にも上っている。
【０００５】
これまでに、血小板表面受容体であるインテグリンαＩＩｂβ３受容体やセロトニンやADP受容体などG蛋白結合型受容体などをターゲットとして、複数の抗血小板薬が開発されているが、以下のような問題点が指摘されている。（非特許文献２）
（１）アラキドン酸代謝阻害剤：抗血小板薬としてもっとも広く利用されているアスピリン（aspirin）、オザグレル（ozagrel）等がこれにあたる。前者は、アスピリンに反応しないアスピリンレジスタンスが問題となっている。後者は、血小板凝集抑制効果が弱く、もっぱら膜下出血後の血管攣縮予防用として利用されている。
（２）ADP受容体阻害薬：チクロピジン（Ticlopidine）と、その後継薬であるクロピドグレル（Clopidogrel）は、前記アスピリンに次いで広く使用されている抗血小板薬である。前者は、副作用として血栓性血小板減少性紫斑病の発症がしばしば認められるという問題があり、後者は日本では未認可である。
（３）GPIIb/IIIa阻害薬：活性型GPIIb/IIIaへのフィブリノーゲンの結合を阻害する強力な抗血小板薬であり、経皮的冠動脈形成術やステント留置後の再狭窄予防には有効であることが示されているが、出血などの問題点も多く、日本では未認可である。
（４）セロトニン受容体阻害剤：セロトニン自体の血小板活性化作用が弱く、in vitro において血小板凝集抑制効果は認められない。
【０００６】
発明者は、これまでの研究により、強い血小板凝集を惹起する蛇毒蛋白ロドサイチン（rhodocytin）の受容体検索を通じて、新しい血小板表面受容体：ＣＬＥＣ−２（C-type lectin receptor 2）を見出した。血小板凝集を惹起する受容体としては、イムノグロブリンファミリー受容体Ｇ蛋白結合型受容体が知られているのみであり、ＣＬＥＣ−２が属するCタイプレクチンファミリー受容体が血小板凝集を惹起するとの知見はこれまでなかった。
これより、ＣＬＥＣ−２は、その強い血小板凝集能から生体内における生理的病的血栓形成への関与が期待され、抗血小板薬の新しいターゲットたんぱく質として利用できる可能性があることが明らかになっている。（非特許文献２）
【非特許文献１】井上克枝，尾崎由基男：血小板活性化機構とその作用点．血栓と循環 13 : 25-9, 2005
【非特許文献２】国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３０９０６６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
発明者は、ＣＬＥＣ−２の生理的なリガンドを探索するあたり、先ず、ＣＬＥＣ−２の生理的なリガンドは、ＣＬＥＣ−２と結合することが明らかになったロドサイチン（Rhodocytin）と類似するアミノ酸配列を有する可能性がる点に着目し、ロドサイチン（Rhodocytin）のアミノ酸配列をクエリ配列として、NCBI（National Center for Biotechnology Information）が提供するデータベースprotein-protein BLAST（blastp）を用いてホモロジー検索を行った。具体的には、ロドサイチン（Rhodocytin）のα鎖と、β鎖のそれぞれをクエリ配列として検索を行った。
【０００８】
その結果、ロドサイチン（Rhodocytin）のα鎖 とβ鎖とアミノ酸配列の相同性の高いたんぱく質として、細胞外マトリックスの一種であり、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンに属するたんぱく質あるバーシカン（versican）、アグリカン（aggrecan）、ニューロカン（neurocan）の３つのたんぱく質がヒットした。
【０００９】
本発明は、ＣＬＥＣ−２の生理的リガンドを同定すると共に、該生理的リガンドとＣＬＥＣ−２との結合を阻害または促進することにより、止血疾患治療用の医薬組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために、以下の発明を提供するものである。
本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列、配列番号１に示されるアミノ酸配列の一部が欠損、置換または付加された組換え体のアミノ酸配列、前記アミノ酸配列の部分ペプチド、前記アミノ酸配列のフラグメント、または前記アミノ酸配列の塩のいずれか１つ以上を含有してなる止血疾患治療用の医薬組成物を提供する。
【００１１】
さらに、本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列、配列番号１に示されるアミノ酸配列の一部が欠損、置換または付加された組換え体のアミノ酸配列、前記アミノ酸配列の部分ペプチドまたは前記アミノ酸配列のフラグメントをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドと相補的な塩基配列または該塩基配列の一部からなるポリヌクレオチドのいずれか一つ以上を含有してなる止血疾患治療用の医薬組成物を提供する。
【００１２】
さらに、本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列、配列番号１に示されるアミノ酸配列の一部が欠損、置換または付加された組換え体のアミノ酸配列、前記アミノ酸配列の部分ペプチド、前記アミノ酸配列のフラグメント、または前記アミノ酸配列の塩のいずれかに対する抗体を含有してなる止血疾患治療用の医薬組成物を提供する。
【００１３】
さらに、本発明は、配列番号３に示されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列、配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列、配列番号３および配列番号４に示されるアミノ酸配列の一部が欠損、置換または付加された組換え体のアミノ酸配列、前記アミノ酸配列の部分ペプチド、前記アミノ酸配列のフラグメント、前記アミノ酸配列の塩のいずれか１つ以上を含有してなる止血疾患治療用の医薬組成物を提供する。
【００１４】
さらに、本発明は、配列番号３に示されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列、配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列、配列番号３および配列番号４に示されるアミノ酸配列の一部が欠損、置換または付加された組換え体のアミノ酸配列、前記アミノ酸配列の部分ペプチド、前記アミノ酸配列のフラグメントをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドと相補的な塩基配列、前記塩基配列の一部からなるポリヌクレオチドのいずれか１つ以上を含有してなる止血疾患治療用の医薬組成物を提供する。
【００１５】
最後に、本発明は、配列番号３に示されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列、配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列、配列番号３および配列番号４に示されるアミノ酸配列の一部が欠損、置換または付加された組換え体のアミノ酸配列、前記アミノ酸配列の部分ペプチド、前記アミノ酸配列のフラグメント、または前記アミノ酸配列の塩に対する抗体を含有してなる止血疾患治療用の医薬組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
前記配列番号１のアミノ酸配列で示されるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンであるバーシカンは、動脈硬化部位や再狭窄部位に多く集積し、血小板粘着を促進することが報告されている（Mazzucato M, Cozzi MR, Pradella P, Perissinotto D, Malmstrom A, Morgelin M, Spessotto P, Colombatti A, De Marco L, Perris R. Vascular PG-M/versican variants promote platelet adhesion at low shear rates and cooperate with collagens to induce aggregation. FASEB J. 2002;16:1903-16)。
【００１７】
そのため、本発明の血小板凝集の作動薬として機能するバーシカンのアミノ酸配列、組換え体、ペプチド等またはこれらをコードするポリヌクレオチドまたは抗体等によって、ＣＬＥＣ−２とバーシカンとの結合を抑制または阻害することにより、動脈硬化部位や再狭窄部位での病的血栓形成のみを効果的に抑制し、生理的な止血は阻害しない血小板凝集する新しい抗血小板薬を開発することができると期待される。
【００１８】
また、血小板凝集を惹起するＣＬＥＣ−２は、新しいターゲットたんぱく質であるから、既存の抗血小板薬の問題点を解決したり、作用機序を補足する新しい抗血小板薬を開発するこができる可能性もある。新しい作用機序を有する抗血小板薬が得られれば、単独投与だけでなく、既存の抗血小板薬剤との併用による相乗／相加効果も期待することができる。
さらに、ＣＬＥＣ−２とバーシカンの結合は、バーシカンの一次構造が関与していると考えられるため、ＣＬＥＣ−２とバーシカンの結合を抑制または阻害／促進する化合物の合成が容易であると考えられる。
【００１９】
一方で、本発明の血小板凝集の作動薬として機能するバーシカンのアミノ酸配列、組換え体、ペプチド等またはこれらをコードするポリヌクレオチドまたは抗体等によって、ＣＬＥＣ−２とバーシカンとの結合を促進することにより、血小板減少等による出血傾向の治療薬の開発もできると期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
発明者は、これまでの研究により、ＣＬＥＣ−２は、細胞質内尾部のモチーフＩＴＡＭ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif）の半分の構造にあたるＹＸＸＬ配列の中に単一のチロシンを含む構造を有し、Ｓｒｃキナーゼのロドサイチン下流による活性化の際に、チロシンがリン酸化を受けて、チロシンキナーゼのＳｙｋファミリーに含まれるＳｙｋの２つのＳＨ２と結合し、血小板活性化を引き起こすことを明らかにしている。
ロドサイチン結合と同様にＣＬＥＣ−２に結合して強い血小板凝集を惹起する生体内リガンドの同定により、ＣＬＥＣ−２を介した血小板凝集を抑制または阻害／促進するまったく新しい止血疾患治療用の医薬組成物を提供することができると考えられる。
【００２１】
ここで、止血疾患とは、過度の出血や異常な血液凝固を含む症状や疾患を示しており、具体的には、深刻な冠不全症候群、心筋梗塞、不安定狭心症、難治性の狭心症、血栓溶解療後の冠動脈内血栓性閉塞、冠動脈血管形成術後の冠動脈内血栓性閉塞、血栓による脳血管疾患、塞栓性脳卒中、血栓性脳卒中、一過性脳虚血発作、静脈血栓症、深部静脈血栓症、肺動脈塞栓、凝固障害、播種性血管内凝固症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、閉塞性血栓血管炎、ヘパリン起因性血小板減少症に伴う血栓症、体外循環による血栓合併症、心臓または他の血管内カテーテル、大動脈内バルーンポンプ、動脈ステントあるいは心臓弁などの器具による血栓合併症、および人工器官の取り付けを要する状態を含む疾患に関連するが、これに限定されるものではない。
【００２２】
本出願において、配列番号１、３または４に示すアミノ酸配列の一部が欠損、置換または付加された組換え体のアミノ酸配列とは、配列番号１、３または４の配列と少なくとも７５％の相同性を有するアミノ酸配列であり、より好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸配列を、さらには、９０％、最適には９５％のアミノ酸配列の相同性をものである。
【００２３】
次に、ＣＬＥＣ−２の生理的なリガンドの同定に至る過程について説明する。
【００２４】
＊実施例１：Protein-protein BLAST（blastp）による検索
ＣＬＥＣ−２の生理的なリガンドの探索にあたり、該リガンドは、ロドサイチン（Rhodocytin）に類似したアミノ酸配列を持つのではないかという仮説に基づいて、ロドサイチンのα鎖と、β鎖のアミノ酸配列をクエリ配列として、Protein-protein BLAST (blastp)を用いてホモロジー検索を行った。検索は、期待値の閾値：0.005 以下の条件設定において行った。
【００２５】
検索に用いたロドサイチンのアミノ酸配列は、ロドサイチンと同じ蛇毒たんぱく質とされるアグレチン（aggretin）の配列を用いた。（Chung CH, Au LC, Huang TF. Molecular cloning and sequence analysis of aggretin, a collagen-like platelet aggregation inducer. Biochem Biophys Res Commun. 1999;263:723-7）
【００２６】
＜ロドサイチン・α鎖の検索結果＞
ロドサイチン・α鎖をクエリ配列としたホモロジー検索の結果を表１に示している。
検索結果の値については、「スコア」が高いほど類似性が高く、逆に「期待値」が低い (0に近づく) ほど類似性が高いことを示している。また、「一致残基」は完全に一致するアミノ酸残基数 (％) を示し、「類似残基」は性質が類似のアミノ酸残基数 (％)を示している。
【００２７】
表１に示されるように、細胞外マトリックスの一種であり、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンに属するたんぱく質あるバーシカン（versican）、アグリカン（aggrecan）、ニューロカン（neurocan）の３種類のたんぱく質について相同性が認められた。
もっとも高い相同性を有するバーシカンについては、表１に記載されたヒトとマウスのものだけでなく、検索結果の詳細は記載しないが、ラット、チンパンジー、ゼブラフィシュ由来のバーシカンについても相同性が認められた。
バーシカンに次いで、アグリカンとの相同性が高く、ニューロカンとの相同性は低いものであった。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
＜ロドサイチン・β鎖の検索結果＞
ロドサイチン・β鎖をクエリ配列としたホモロジー検索の結果を表１に示している。
前記α鎖と同様に、バーシカン、アグリカン、ニューロカンの３種類のたんぱく質について相同性が認められた。
β鎖については、アグリカンとの相同性がもっとも高く、検索結果の詳細は記載しないが、ヒト、マウス、ラット、ウシ由来のアグリカンについても相同性が認められた。
また、バーシカンとニューロカンとは、同程度の相同性を示しており、ニューロカンは、α鎖との相同性は低いが、β鎖とは高い相同性を有する。
【００３０】
【表２】
2007070359.tif 000004
【００３１】
バーシカンは、進行した動脈硬化巣の脂質に富んだ壊死部分や、プラークと血栓の境界部分、再狭窄部位に多く集積し、血小板粘着を促進することが知られており、血栓形成における役割が示唆されている。（Wight TN, Merrilees MJ. Proteoglycans in atherosclerosis and restenosis: key roles for versican. Circ Res. 2004;94:1158-67）。また、大動脈から精製したバーシカンが、低ずり応力下で血小板粘着を支持したり、コラーゲンによる血小板凝集を促進したりする作用が報告されている（Mazzucato M, Cozzi MR, Pradella P, Perissinotto D, Malmstrom A, Morgelin M, Spessotto P, Colombatti A, De Marco L, Perris R. Vascular PG-M/versican variants promote platelet adhesion at low shear rates and cooperate with collagens to induce aggregation. FASEB J. 2002;16:1903-16)。
【００３２】
上記報告と、ロドサイチンと相同性を有することを考え合わせると、バーシカンはＣＬＥＣ−２の生理的リガンドである可能性が高いと考えられる。
一方、アグリカンやニューロカンについては、単体では血小板粘着を支持しないこと報告されているが、今回の検索結果から、バーシカンや、コラーゲンといった血小板粘着、活性化を支持するマトリックスと共存する状態において、ＣＬＥＣ−２を介しての血小板凝集に何らかの役割を果している可能性があると考えられる。
【００３３】
＊実施例２：ＣＬＥＣ−２とバーシカンの結合についての検証  
次に、上記Protein-protein BLAST（blastp）による検索において、ＣＬＥＣ−２の生理的リガンドである可能性が高いという結果が得られたバーシカンについて、字再にＣＬＥＣ−２と結合するかどうかについて検証を行った。
バーシカンは、ウシ大動脈中・内膜抽出物をＤＥＡＥカラム（Amersham Biosciences）で粗分画することにより得られたものを用いた。
【００３４】
図１に、前記ＤＥＡＥカラムの各フラクションについて糖鎖を切断するコンドロイチナーゼ処理前後で電気泳動を行い、抗ヒトバーシカン抗体でウエスタンブロットした結果を示している。バーシカンに糖鎖が結合している状態では分子量が大きく、ゲル内に泳動されてこないため、コンドロイチナーゼ処理後に現れた図１(a)中の矢印で示されるバンドがバーシカンと考えられる。これより、フラクション２＞フロースルー＞フラクション３の順に、バーシカンが多く含有されることが明らかとなった。
【００３５】
次に、ビアコア（Biacore）のセンサーチップに、ＣＬＥＣ−２リコンビナントたんぱく質を固相化し、粗分画で得られたバーシカンを含有する各フラクション（フロースルー、フラクション２、フラクション３）をアナライトとして流し、ＣＬＥＣ−２とバーシカンが結合するか否かについての検証実験を行った。
【００３６】
図２に、上記ビアコア実験の結果を示している。縦軸のビアコアのレゾナンス・ユニット（resonance unit）の数値が高いほど、バーシカンの結合量が多いことを示している。バーシカンの含有量が多いフラクションほど、ＣＬＥＣ−２へのたんぱく質の結合量が多いことが分かる。また、バーシカンをほとんど含まないフラクション２については、たんぱく質濃度は最も高いにもかかわらず、ネガティブコントロールのＰＢＳと同程度のわずかな結合しか認められない。
これより、バーシカンはＣＬＥＣ−２に結合することが明らかになった。
【００３７】
ＣＬＥＣ−２とバーシカンとの結合が、バーシカン表面の糖鎖（コンドロイチン硫酸）を認識するものかどうかを検討するために、フラクション３についてコンドロイチナーゼ処理なし／処理ありのサンプルをアナライトとしてとして流し、ＣＬＥＣ−２とバーシカンの結合の変化について調べた。図３(a)(b)にビアコア実験の結果を示している。
これによれば、コンドロイチンキナーゼ処理の有無に関係なく、ＣＬＥＣ−２とバーシカンとの結合に変化は見られなかった。
【００３８】
次に、ＣＬＥＣ−２とバーシカンとの結合が、バーシカンの高次構造を認識するものかどうかを検討するために、フラクション３について加熱処理（100℃、10分）なし／処理ありのサンプルをアナライトとして流し、ＣＬＥＣ−２とバーシカンの結合の変化について調べた。図４(a)にビアコア実験の結果を示している。
これによれば、加熱処理の有無に関係なく、ＣＬＥＣ−２とバーシカンとの結合に変化は見られなかった。
【００３９】
次に、フラクション３についてコンドロイチナーゼ処理後、さらに、加熱処理（100℃、10分）を行ったサンプルをアナライトとして流し、ＣＬＥＣ−２とバーシカンの結合の変化について調べた。図４(b)にビアコア実験の結果を示している。
これによれば、前記単独処理のバイト同様に、ＣＬＥＣ−２とバーシカンとの結合に変化は見られなかった。
【００４０】
これより、ＣＬＥＣ−２は、コンドロイチン硫酸以外の糖鎖を認識している可能性は残るものの、バーシカンたんぱく質の一次構造を認識している可能性が高いと考えられる。
【００４１】
以上の結果より、バーシカンはＣＬＥＣ−２の生理的リガンドと考えられる。
また、バーシカンは、血小板凝集が発生している動脈硬化部位や再狭窄部位に多く集積していることから、ＣＬＥＣ−２とバーシカンの結合を抑制または阻害することにより、病的血栓形成のみを効果的に抑制し、生理的な止血は阻害することが可能な抗血小板薬の開発、血栓形成に対する効果的な治療の実施を行うことができると考えられる。
一方、ＣＬＥＣ−２とバーシカンの結合を促進することにより、出血傾向の疾患の治療薬の開発、効果的な止血治療の実施を行うことができると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ウシ大動脈中・内膜抽出物の粗分画の各フラクションの電気泳動結果を示す写真である。
【図２】粗分画の各フラクションについてのビアコアの結果を示すグラフである。
【図３】バーシカンのコンドロイチンキナーゼ処理前後についてのビアコアの結果を示すグラフである。
【図４】バーシカンの加熱処理前後についてのビアコアの結果を示すグラフである。
【配列表フリーテキスト】
【００４３】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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