(57)【要約】【課題】高い感度のセンサーや、高い出力のバイオ燃料電池、高い反応効率の電気化学反応装置として利用することが可能な酵素電極を提供する【解決手段】導電性基体と、該導電性基体に固定された融合タンパク質および電子伝達メディエーターとを有し、該融合タンパク質が反応基質１から反応生成物１を生じる化学反応を触媒する酵素１と反応基質２から反応生成物２を生じる化学反応を触媒する酵素２との融合タンパク質であり、反応生成物１の少なくとも一つの化学物質が反応基質２の少なくとも一つの化学物質と同一であること、を特徴とする酵素電極。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
導電性基体と、該導電性基体と電気的に接続される酵素とを有する酵素電極において、
前記酵素は、第１の反応基質から第１の反応生成物を生じる化学反応を触媒する第１の酵素と、第２の反応基質から第２の反応生成物を生じる化学反応を触媒する第２の酵素との融合タンパク質からなり、且つ該第１の反応生成物の少なくとも一部が、該第２の反応基質の少なくとも一部と同一であることを特徴とする酵素電極。
【請求項２】
前記酵素は、前記導電性基体に、電子伝達メディエータ―と共に固定化されている請求項１記載の酵素電極。
【請求項３】
前記第１の酵素がデヒドロゲナーゼであり、且つ前記第２の酵素がジアフォラーゼである請求項１に記載の酵素電極。
【請求項４】
前記デヒドロゲナーゼが、グルコースデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びグルタミン酸デヒドロゲナーゼから選ばれる請求項３に記載の酵素電極。
【請求項５】
前記第１の酵素がアルコールデヒドロゲナーゼであり、且つ前記第２の酵素がアルデヒドデヒドロゲナーゼであり、且つジアフォラーゼを有する請求項１に記載の酵素電極。
【請求項６】
前記第１の酵素がイソメラーゼであり、且つ前記第２の酵素がグルコースデヒドロゲナーゼであり、且つジアフォラーゼを有する請求項１に記載の酵素電極。
【請求項７】
前記デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼとの融合タンパク質が、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性およびジアフォラーゼ活性を有することを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の酵素電極；
（ａ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列において、前記の各活性が損なわれない範囲で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失、置換などの修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
【請求項８】
前記デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼとの融合タンパク質が、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性およびジアフォラーゼ活性を有することを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の酵素電極；
（ａ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列において、前記の各活性が損なわれない範囲で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失、置換などの修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
【請求項９】
前記デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼとの融合タンパク質が、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性およびジアフォラーゼ活性を有することを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の酵素電極；
（ａ）配列番号３５で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号３５で表されるアミノ酸配列において、前記の各活性が損なわれない範囲で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失、置換などの修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
【請求項１０】
前記デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼとの融合タンパク質が、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性およびジアフォラーゼ活性を有することを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の酵素電極；
（ａ）配列番号４４で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号４４で表されるアミノ酸配列において、前記の各活性が損なわれない範囲で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失、置換などの修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
【請求項１１】
前記デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼとの融合タンパク質が、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつ乳酸デヒドロゲナーゼ活性およびジアフォラーゼ活性を有することを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の酵素電極；
（ａ）配列番号５７で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号５７で表されるアミノ酸配列において、前記の各活性が損なわれない範囲で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失、置換などの修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
【請求項１２】
前記デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼとの融合タンパク質が、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつ乳酸デヒドロゲナーゼ活性およびジアフォラーゼ活性を有することを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の酵素電極；
（ａ）配列番号６９で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号６９で表されるアミノ酸配列において、前記の各活性が損なわれない範囲で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失、置換などの修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
【請求項１３】
前記デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼとの融合タンパク質が、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性およびジアフォラーゼ活性を有することを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の酵素電極；
（ａ）配列番号７９で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号７９で表されるアミノ酸配列において、前記の各活性が損なわれない範囲で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失、置換などの修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
【請求項１４】
前記デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼとの融合タンパク質が、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性およびジアフォラーゼ活性を有することを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の酵素電極；
（ａ）配列番号８８で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号８８で表されるアミノ酸配列において、前記の各活性が損なわれない範囲で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失、置換などの修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
【請求項１５】
前記デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼとの融合タンパク質が、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性およびジアフォラーゼ活性を有することを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の酵素電極；
（ａ）配列番号９７で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号９７で表されるアミノ酸配列において、前記の各活性が損なわれない範囲で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失、置換などの修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
【請求項１６】
前記デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼとの融合タンパク質が、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性およびジアフォラーゼ活性を有することを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の酵素電極；
（ａ）配列番号１０６で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１０６で表されるアミノ酸配列において、前記の各活性が損なわれない範囲で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失、置換などの修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
【請求項１７】
前記アルコールデヒドロゲナーゼとアルデヒドデヒドロゲナーゼとの融合タンパク質が、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する請求項５に記載の酵素電極；
（ａ）配列番号１１４で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１１４で表されるアミノ酸配列において、前記の各活性が損なわれない範囲で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失、置換などの修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
【請求項１８】
前記アルコールデヒドロゲナーゼとアルデヒドデヒドロゲナーゼとの融合タンパク質が、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する請求項５に記載の酵素電極；
（ａ）配列番号１２１で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１２１で表されるアミノ酸配列において、前記の各活性が損なわれない範囲で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失、置換などの修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
【請求項１９】
前記イソメラーゼとグルコースデヒドロゲナーゼとの融合タンパク質が、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつイソメラーゼ活性およびグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する請求項６に記載の酵素電極；
（ａ）配列番号１２８で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１２８で表されるアミノ酸配列において、前記の各活性が損なわれない範囲で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失、置換などの修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
【請求項２０】
前記イソメラーゼとグルコースデヒドロゲナーゼとの融合タンパク質が、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつイソメラーゼ活性およびグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する請求項６に記載の酵素電極；
（ａ）配列番号１３５で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１３５で表されるアミノ酸配列において、前記の各活性が損なわれない範囲で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失、置換などの修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
【請求項２１】
請求項１乃至２０のいずれかに記載の酵素電極を、物質を検知するための検知部位として用いることを特徴とするセンサ。
【請求項２２】
請求項１乃至２０のいずれかに記載の酵素電極を、アノードとして用いることを特徴とする燃料電池。
【請求項２３】
請求項１乃至２０のいずれかに記載の酵素電極を、反応極として用いることを特徴とする電気化学反応装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオセンサーやバイオ燃料電池、電気化学反応装置の電極として利用可能な酵素電極に関する。
【背景技術】
【０００２】
生細胞内で作られるタンパク質性の生体触媒である酵素は、通常の触媒と比べて温和な条件下で強力に作用する。また、酵素の作用を受けて化学反応を起こす物質である基質の特異性が高く、一般に各酵素は、一定基質の一定反応のみを触媒する。酵素、特に酸化還元酵素におけるこれらの特性を、電極における酸化還元反応に理想的に利用できれば、低過電圧、高選択性の電極が作成可能となる。
【０００３】
酵素電極における低過電圧な電子伝達反応を達成するための技術として、関連した反応に関与する２つの酵素を用いる構成が提案されている。すなわち、反応基質１から反応生成物１を生じる反応を触媒する酵素１と反応基質２から反応生成物２を生じる反応を触媒する酵素２とを同時に用いた電極であって、反応生成物１の一部が反応基質２の一部を含むような酵素電極が提案されている。
【０００４】
このような電極として例えば次に挙げる例を挙げることができる。
【０００５】
伊倉ら（特許文献１）は、ジアフォラーゼ、デヒドロゲナーゼおよびニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドシンセターゼを含む反応層の少なくとも一部を作用電極上に形成し、これらの酵素が作用電極の表面に固定されている酵素電極を開示した。
【特許文献１】特開2003-279525号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述したとおり、反応基質１から反応生成物１を生じる化学反応を触媒する酵素１と反応基質２から反応生成物２を生じる化学反応を触媒する酵素２とを同じ反応層において用いる酵素電極が知られている。この酵素電極では、反応基質１から電極までの低過電圧な電子伝達反応を行う上で熱力学的に有利である。しかし、酵素１と酵素２の相対的距離や配向はランダムであり、酵素１により生じた反応生成物１の一部が酵素２の反応基質２の一部として利用されるまでの拡散過程が律速段階になる。そのために、反応基質１から電極までの全体の電子伝達反応は、反応速度や低濃度の基質存在下での反応効率の点で最適化されているとはいえない。すなわち、従来のこの電極をセンサーとして用いた場合には反応基質１の酸化反応に伴って電極で観測される電流の測定値が小さく反応基質１に対する感度が低いという課題があった。
【０００７】
上記の２つの酵素を用いた酵素電極をバイオ燃料電池の電極として用いた場合には、電池としての出力が小さく、また出力低下が早いという課題があった。
【０００８】
なお、センサーしての感度を向上させるために、またバイオ燃料電池の出力を向上させるために、酵素１と酵素２の濃度を高くして同じ反応層に含有させることが通常考えられる。この場合、高価な酵素を大量に使用しなければならず、酵素電極自体のコストを高くさせる要因となっていた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の骨子は、
導電性基体と、該導電性基体と電気的に接続される酵素とを有する酵素電極において、
前記酵素は、第１の反応基質から第１の反応生成物を生じる化学反応を触媒する第１の酵素と、
第２の反応基質から第２の反応生成物を生じる化学反応を触媒する第２の酵素との融合タンパク質からなり、
且つ該第１の反応生成物の少なくとも一部が、該第２の反応基質の少なくとも一部と同一であることを特徴とする。
【００１０】
前記酵素は、前記導電性基体に、電子伝達メディエータ―と共に固定化されている構成が好ましい。
【００１１】
本発明の第２の骨子は、センサに関し、上記構成の酵素電極を、物質を検知するための検知部位として用いることを特徴とする。
【００１２】
本発明の第３の骨子は、燃料電池に関し、本発明の燃料電池は、上記構成の酵素電極を、アノードとして用いることを特徴とする。
【００１３】
本発明の第４の骨子は、電気化学反応装置に関し、本発明の電気化学反応装置は、上記構成の酵素電極を、反応極として用いることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の酵素電極では、融合タンパク質を構成する酵素１と酵素２との相対的距離が近接しており、酵素１の反応基質１から電極までの電子伝達反応が効率的に進行する。
【００１５】
このため、本発明の酵素電極を用いたセンサーにおいては基質の酸化に伴う電流値が大きく感度が高い。また本発明の酵素電極を用いた燃料電池においては、高い電流値を取り出すことが出来る。さらに本発明の酵素電極を用いた電気化学反応装置においては、高い反応効率を示す。
【００１６】
また好熱菌由来の酵素を利用した場合の本発明の酵素電極は、従来の酵素電極に比較して保存安定性に優れている。
【００１７】
また好熱菌由来の酵素を利用した場合の本発明の酵素電極を用いたセンサー、燃料電池、および電気化学反応装置は、高温で動作可能であり、高温で動作させることによって、拡散律速過程が加速され、より大きな感度、出力を得ることができる。
【００１８】
さらに本発明の酵素電極に用いられる酸化還元酵素はクロマトグラフィーなど煩雑な操作を必要とせず、加温という簡便な操作で、高純度にまで精製が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の酵素電極は、導電性基体と、導電性基体に固定された酵素と、電子伝達メディエーターとを有して構成されている。なお、導電性基体に酵素を固定化することと、電子伝達メディエーターとを用いることは必要に応じて行えばよく、本発明の必須の構成ではない。
【００２０】
本発明は、以下の関係を有する２つの酵素１及び２を融合させた融合タンパク質を少なくとも含有する。
（Ａ）酵素１は反応基質１から反応生成物１を生じる反応を触媒する。
（Ｂ）酵素２は反応基質２から反応生成物２を生じる反応を触媒する。
（Ｃ）反応生成物１が反応基質２となる（反応基質２となる反応生成物１は１種の化合物であっても、２種以上の化合物であってもよい）。
【００２１】
融合する酵素の好ましい組合せとしては、以下の各組合せを挙げることができる。
（１）デヒドロゲナーゼ（酵素１）とジアフォラーゼ（酵素２）の組合せ。
この場合、デヒドロゲナーゼとしては、グルコースデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼまたはグルタミン酸デヒドロゲナーゼが好ましい。更に、
（２）アルコールデヒドロゲナーゼ（酵素１）とアルデヒドデヒドロゲナーゼ（酵素２）の組合せ。
【００２２】
この場合、導電性基体上にジアフォラーゼを共存させて固定化することが好ましい。
（３）イソメラーゼ（酵素１）とグルコースデヒドロゲナーゼ（酵素２）の組合せ。
この場合、導電性基体上にジアフォラーゼを共存させて固定化することが好ましい。
【００２３】
より好ましい融合タンパク質としては以下のものを挙げることができる。
【００２４】
イ）以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列とを有し、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性およびジアフォラーゼ活性を有する融合タンパク質。
（ａ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列。
（ｂ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列において、上記の各活性が損なわれない範囲内で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失、置換などの修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
（ｃ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列。
（ｄ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸の付加、欠失、置換などの修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
【００２５】
ロ）以下の（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）のアミノ酸配列とを有し、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性およびジアフォラーゼ活性を有する融合タンパク質。
（ｅ）配列番号３５で表されるアミノ酸配列。
（ｆ）配列番号３５で表されるアミノ酸配列において、上記の各活性が損なわれない範囲内で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失、置換などの修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
（ｇ）配列番号４４で表されるアミノ酸配列。
（ｈ）配列番号４４で表されるアミノ酸配列において、上記の各活性が損なわれない範囲内で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失、置換などの修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
【００２６】
ハ）以下の（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）または（ｌ）のアミノ酸配列とを有し、かつ乳酸デヒドロゲナーゼ活性およびジアフォラーゼ活性を有する融合タンパク質。
（ｉ）配列番号５７で表されるアミノ酸配列。
（ｊ）配列番号５７で表されるアミノ酸配列において、上記の各活性が損なわれない範囲内で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失、置換などの修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
（ｋ）配列番号６９で表されるアミノ酸配列。
（ｌ）配列番号６９で表されるアミノ酸配列において、上記の各活性が損なわれない範囲内で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失、置換などの修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
【００２７】
ニ）以下の（ｍ）、（ｎ）、（ｏ）または（ｐ）のアミノ酸配列とを有し、かつリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性およびジアフォラーゼ活性を有する融合タンパク質。
（ｍ）配列番号７９で表されるアミノ酸配列。
（ｎ）配列番号７９で表されるアミノ酸配列において、上記の各活性が損なわれない範囲内で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失、置換などの修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
（ｏ）配列番号８８で表されるアミノ酸配列。
（ｐ）配列番号８８で表されるアミノ酸配列において、上記の各活性が損なわれない範囲内で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失、置換などの修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。  ホ）以下の（ｑ）、（ｒ）、（ｓ）または（ｔ）のアミノ酸配列とを有し、かつグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性およびジアフォラーゼ活性を有する融合タンパク質。
（ｑ）配列番号９７で表されるアミノ酸配列。
（ｒ）配列番号９７で表されるアミノ酸配列において、上記の各活性が損なわれない範囲内で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失、置換などの修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
（ｓ）配列番号１０６で表されるアミノ酸配列。
（ｔ）配列番号１０６で表されるアミノ酸配列において、上記の各活性が損なわれない範囲内で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失、置換などの修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
【００２８】
へ）以下の（ｕ）、（ｖ）、（ｗ）または（ｘ）のアミノ酸配列とを有し、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する融合タンパク質。
（ｕ）配列番号１１４で表されるアミノ酸配列。
（ｖ）配列番号１１４で表されるアミノ酸配列において、上記の各活性が損なわれない範囲内で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失、置換などの修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
（ｗ）配列番号１２１で表されるアミノ酸配列。
（ｘ）配列番号１２１で表されるアミノ酸配列において、上記の各活性が損なわれない範囲内で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失、置換などの修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
【００２９】
ト）以下の（ｙ）、（ｚ）、（ａａ）または（ａｂ）のアミノ酸配列とを有し、かつイソメラーゼ活性およびグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する融合タンパク質。
（ｙ）配列番号１２８で表されるアミノ酸配列。
（ｚ）配列番号１２８で表されるアミノ酸配列において、上記の各活性が損なわれない範囲内で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失、置換などの修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
（ａａ）配列番号１３５で表されるアミノ酸配列。
（ａｂ）配列番号１３５で表されるアミノ酸配列において、上記の各活性が損なわれない範囲内で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失、置換などの修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
【００３０】
上記構成の酵素電極を用いて、センサ、燃料電池及び電気化学反応装置を構成することができる。
【００３１】
本発明の酵素電極における導電性基体は、酵素電極の使用時には、外部回路と電気的に接続されるものである。この導電性基体としては、固定化酵素との界面に外部回路と電気的に接続可能な導電性の部分を少なくとも有し、かつ、保存、測定時に充分な剛性を有し、電極使用時において充分な電気化学的安定性を有するものが利用できる。
【００３２】
導電性基体を構成し得る材料の例としては、金属、導電性高分子、金属酸化物、炭素材料を挙げることができる。
【００３３】
金属の例としては、Ａｕ、Ｐｔ、Ａｇなどのうち少なくとも一種類の元素を含むものが挙げられ、これらの、合金であってもよい。また、適当な基材上にかかる金属のめっきを施して導電性基体としてもよい。
【００３４】
導電性高分子の例としては、ポリアセチレン類、ポリアリーレン類などのうち少なくともひとつの化合物を含むものが挙げられる。
【００３５】
金属酸化物の例としては、Ｉｎ、Ｓｎ、Ｚｎ、Ｔｉ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｚｒ、Ｎｂ、Ｍｇ、Ｂａ、Ｍｏ、Ｗ、Ｖ、Ｓｒのうち、少なくとも一種類の元素を含むものが挙げられる。金属酸化物からなる部分が導電性を有しない場合は、他の導電性材料によってこの部分に導電性を付与することができる。また、金属酸化物からなる部分が導電性を有する場合でも、他の導電性材料によってこの部分の導電性を向上させてもよい。金属酸化物に導電性を付与、あるいは、金属酸化物の導電性を向上させるための導電性材料の例としては、金属、導電性高分子、炭素材料などが挙げられる。導電性基体に用いられる炭素材料の例としては、グラファイト、カーボンブラック、カーボンナノチューブ、カーボンナノホーン、フラーレン化合物およびこれらの誘導体が挙げられる。また、炭素材料からなる部分が導電性を有しない場合は、他の導電性材料によってこの部分に導電性を付与することができる。また、炭素材料からなる部分が導電性を有する場合でも、他の導電性材料によってこの部分の導電性を向上させてもよい。
【００３６】
導電性基体は少なくとも一部に空隙を有していてもよい。この空隙は、一次元、二次元、もしくは三次元的に連結していてよい。一次元に連結した空隙の例としては柱状の空隙が挙げられる。二次元に連結した空隙の例としては、網状の空隙が挙げられる。、三次元に連結した空隙の例としては、スポンジ状、微小粒子を接合した後に生じる空隙、またそれらをテンプレートにして作成した構造材料の空隙が挙げられる。それらの空隙は、酵素が導入できる程度、かつ、または基質の流動、拡散が十分に行われる程度に大きく、投影面積に対する実効表面積の比が十分にえられる程度に小さいことが好ましい。空隙の平均径の例としては、５ナノメートルから、５００マイクロメートルの範囲、より好ましくは、１０ナノメートルから１０マイクロメートルが挙げられる。また、空隙を有する導電性基体の厚さは、酵素が導電性基体の深部にまで均一に導入できる程度、かつ、または基質の流動、拡散が十分に行われる程度に小さく、導電性基体の投影面積に対する実効表面積の比が十分にえられる程度に大きいことが好ましい。この空隙を有する導電性基体の厚さの例としては、１００ナノメートルから１センチメートル、より好ましくは、１マイクロメートルから５ミリメートルが挙げられる。この空隙を有する導電性基体の投影面積に対する実効表面積の比は、投影面積に対する実効表面積の比が十分にえられる程度に大きい必要がある。その例としては、１０倍以上、より好ましくは、１００倍以上が挙げられる。
【００３７】
この空隙を有する導電性基体の気孔率は以下の要件（１）〜（３）の少なくとも１つと、要件（４）とを満たすように設定されることが好ましい。
（１）導電性部材の投影面積に対する実効表面積の比が十分にえられる程度に大きい。
（２）充分な酵素、担体量が導入できる程度に大きい。
（３）基質の流動、拡散が充分に行われる程度に大きい。
（４）充分な機械的強度が得られる程度に小さい。
【００３８】
気孔率の例としては、２０％以上９９％以下、より好ましくは、３０％以上９８％以下が挙げられる。
【００３９】
多数の空隙を有する金属製導電性基体としては、発泡金属、電析金属、電解金属、焼結金属、繊維状金属、あるいは、これらの内の１種に、もしくは、複数種に該当する材料が挙げられる。
【００４０】
多数の空隙を有する導電性高分子の製造方法の例としては、以下の方法等の多孔質樹脂の製造に利用されている方法が例示できる。
（１）空隙となる部分を構成する鋳型としての物質を導電性高分子中に配置して所定の形状に成形した後、鋳型としての物質を除く方法。
（２）導電性高分子の前駆体中に空隙となる部分の鋳型としての物質を含有させ、前駆体を重合させて高分子とした後、鋳型としての物質を除く方法。
（３）空隙となる部分を構成する鋳型となる粒子からなる層を形成し、その粒子間の空隙に高分子を充填して層を形成し、この層から粒子を除去する方法。
（４）空隙となる部分を構成する鋳型となる粒子からなる層を形成し、その粒子間の空隙に高分子の前駆体を充填して層を形成し、前駆体を重合させて高分子層としてから粒子を除去する方法。
【００４１】
多数の空隙を有する金属酸化物の製造方法の例としては、電析、スパッタリング、焼結、化学気相成長法（ＣＶＤ）、電解およびこれらの組合せなどの方法を挙げることができる。
【００４２】
多数の空隙を有する炭素材料の製造方法の例としては、グラファイト、カーボンブラック、カーボンナノチューブ、カーボンナノホーン、フラーレン化合物、およびこれらの誘導体からなる繊維や粒子などを所定の形状に成形してから焼結する方法を挙げることができる。
【００４３】
本発明の酵素電極において酵素は、導電性基体に近接して固定される。すなわち、導電性基体の導電性を有する面上に直接固定化酵素層が積層される。このように導電性基体上に直接固定化酵素層が形成されることで、融合タンパク質および電子伝達メディエーターを導電性基体の物理的近傍に捕捉することができる。その結果、電子伝達メディエーターを介した酵素と導電性基体間の速やかな電子伝達反応を促進させ、更に融合タンパク質や電子伝達メディエーターの導電性基体近傍からの散逸を防止することができる。更に、かかる構成によって、酵素電極の繰返し使用を可能にするとともに、酵素電極の耐久性を向上させることができる。
【００４４】
酵素の固定化は、融合タンパク質を導電性基体の物理的近傍に捕捉するために用いられる当業者にとって公知の方法によって作製しうるものである。固定化酵素層を作製する具体的方法として、例えば以下に述べる（１）から（６）の方法を挙げることができる。
（１）共有結合法
導電性基体表面に直接官能基を導入し、この官能基と酵素とを共有結合させて酵素を固定化する。あるいは、導電性基体に接触して配置した担体に官能基を導入し、この官能基と酵素とを共有結合させて酵素を固定化する。
【００４５】
このような共有結合に利用できる官能基として例えば、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基等を挙げることができる。
【００４６】
また、アルキルチオールのチオール基が金などの金属に作用して結合し容易に単分子膜（自己組織化単分子膜）を形成できることを利用し、アルキルチオールのアルキル基に予め導入した官能基を介して共有結合により酵素を金属に結合させて酵素を固定化する。
【００４７】
アルキルチオールのアルキル基に予め導入した官能基と酵素との共有結合は、例えば二官能性試薬を用いて形成することができる。代表的な二官能性試薬としては、グルタルアルデヒド、過ヨウ素酸、等が挙げられる。
【００４８】
また導電性基体に接触して配置する担体としてはアガロース、アガロース分解物、κ−カラギーナン、寒天、アルギン酸、ポリアクリルアミド、ポリイソプロピルアクリルアミド、ポリビニルアルコール、およびこれらの共重合体等が挙げられる。
【００４９】
（２）架橋法：
グルタルアルデヒド等の架橋剤を用いて、酵素間に架橋を形成して酵素同士を結合させて固定化する。また、これにゼラチンやアルブミン等のマトリックス物質を加えて酵素とマトリックス物質との間に架橋を形成することにより、酵素をマトリックス物質と共に固定化する。固定化の際にポリアリルアミンやポリリジンなどの合成高分子を共存させ、酵素固定化層の特性、すなわち膜強度、基質透過特性などを制御することもできる。
【００５０】
（３）包括法：
酵素をアガロース、アガロース分解物、κ−カラギーナン、寒天など、およびこれらの共重合体等の高分子マトリックス中に封入して酵素を固定化する。
【００５１】
（４）吸着法（その１）
導電性基体と酵素との疎水性相互作用を利用した物理吸着法により酵素を固定化する。導電性基体への酵素の物理的吸着が不可能あるいは不十分である場合には、酵素が物理的吸着を起す担体介して酵素を固定化できる。この担体としては、ポリアリルアミン、ポリリジン、ポリビニルピリジン、アミノ基で変性したデキストラン（たとえばＤＥＡＥ−デキストラン）、キトサン、ポリグルタメート、ポリスチレンスルホン酸、硫酸デキストラン等のポリアニオンやポリカチオンからなる担体を用いることができる。担体と酵素との静電相互作用を利用したイオン結合法により酵素を担体に固定し、この酵素固定化担体を導電性基体に接触させ配置する。
【００５２】
（５）隔膜法：
ポリイミド膜、酢酸セルロース膜、ポリスルホン膜、パーフルオロスルフォン酸の重合体膜（例えば、デュポン社製、商品名「ナフィオン」）等の透過制限膜を隔膜として用い導電性基体上の酵素溶液を被覆して固定化する。
【００５３】
（６）吸着法（その２）
遺伝子組換えタンパク質の精製を容易にするために用いられる各種のアフィニティータグを利用して固定化する。例えば、ＨＡ（ヘマグルチニン）、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジンタグを利用して酵素を固定化する。
【００５４】
本発明の酵素電極における酵素の固定量は、特に限定されず、広い範囲で変えることができる。
【００５５】
本発明の酵素電極の有する融合タンパク質は、酵素１の酵素活性と酵素２の酵素活性を有する多機能酵素である。この融合タンパク質では、酵素１の酵素活性により生じる反応生成物１の少なくとも一つの化学物質は、酵素１の物理的近傍に存在する酵素２の反応基質として速やかに利用される。その結果、融合タンパク質による反応基質１から反応生成物２を生じる酵素活性は、酵素１と酵素２がそれぞれ切り離されて存在する場合よりも高くなる。
【００５６】
酵素１と酵素２の具体的組合せは、酵素１による反応生成物１の少なくとも一つの化学物質が酵素２の反応基質２の少なくとも一つの化学物質と同一であり、酵素電極用の酵素としての活性を有するものであれば特に限定されない。
【００５７】
なかでも、酵素１がデヒドロゲナーゼであり、酵素２がジアフォラーゼである場合、基質の酸化反応に伴って酵素電極で観測される電気化学的応答に対する酸素の影響を軽減することができ好適である。また多くのデヒドロゲナーゼはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を電子および水素原子の受容体として利用している。このことから、ジアフォラーゼと融合するデヒドロゲナーゼの種類を選択することによって、検出対象に対して汎用性の高いセンサーを作製することが可能となる。このようなデヒドロゲナーゼとして例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、１７Ｂヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、エストラジオール１７Ｂデヒドロゲナーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ等を挙げることができる。
例えば、酵素１としてグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を、酵素２としてジアフォラーゼ（Ｄｐ）を用いてこれらの融合タンパク質を構成要素とする酵素電極を作製した場合には、図１に示す状態を得ることができる。
【００５８】
すなわち、導電性基体上には、グルコースデヒドロゲナーゼＧＤＨとジアフォラーゼＤｐとの融合タンパク質および電子伝達メディエーターＭｅｄを有する酵素固定化層が接触して配置される。この酵素電極にグルコースを作用させた場合、グルコースはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）等の共存下グルコースデヒドロゲナーゼの触媒作用によって酸化される。その結果、グルコノラクトンと還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を生じる。
【００５９】
そして還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドは酸化型電子伝達メディエーター（Ｍｅｄox）の存在下グルコースデヒドロゲナーゼの物理的近傍に存在するジアフォラーゼの触媒作用によって直ちに酸化される。
【００６０】
その結果、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび還元型の電子伝達メディエーター（Ｍｅｄred）を生じる。こうして生じる還元型の電子伝達メディエーター（Ｍｅｄred）は導電性基体に電子を伝達することが出来る。
【００６１】
図１の場合は、本発明の第１の骨子における、第１の反応基質が、グルコースとＮＡＤ+であり、第１の反応生成物質がグルコノラクトンとＮＡＤＨということになる。ＮＡＤＨは、第２の反応基質でもある。また、ＮＡＤ+は、第２の反応生成物質でもある。
【００６２】
すなわち、第１の反応生成物の一部であるＮＡＤＨは、第２の反応基質の少なくとも一部と同一となっている。
【００６３】
従来知られたグルコースデヒドロゲナーゼとジアフォラーゼとが個別に電極上に固定化された場合よりも、本発明の酵素電極においては、より効率の高いグルコースから電極への電子伝達が達成される。したがって、このような図１に示す酵素電極は、検出感度の高いグルコースセンサーとして、また出力の大きなグルコース燃料電池として、さらにまた反応効率の高いグルコース電気化学反応装置として利用することができる。
【００６４】
特に好熱菌由来のグルコースデヒドロゲナーゼおよびジアフォラーゼの融合タンパク質を用いることによって耐熱性、耐久性、高温状態での応答性に優れた酵素電極とすることが出来る。
【００６５】
酵素１としてアルコールデヒドロゲナーゼを、酵素２としてジアフォラーゼを用いて酵素電極を作製した場合には、図２に示す状態を得ることができる。すなわち、導電性基体上に、アルコールデヒドロゲナーゼＡＤＨとジアフォラーゼＤｐとの融合タンパク質および電子伝達メディエーターＭｅｄを有する酵素固定化層が接触して配置される。この酵素電極にアルコールを作用させた場合、アルコールはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド等の共存下アルコールデヒドロゲナーゼの触媒作用によって酸化される。その結果、アルデヒドと還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを生じる。そして還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドは酸化型電子伝達メディエーターの存在下アルコールデヒドロゲナーゼの物理的近傍に存在するジアフォラーゼの触媒作用によって直ちに酸化される。その結果、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび還元型の電子伝達メディエーターを生じる。こうして生じる還元型の電子伝達メディエーターは導電性基体に電子を伝達することが出来る。
酵素１として乳酸デヒドロゲナーゼを、酵素２としてジアフォラーゼを用いて酵素電極を作製した場合には、図３に示す状態を得ることができる。すなわち、導電性基体上に、乳酸デヒドロゲナーゼＬＤＨとジアフォラーゼＤｐとの融合タンパク質および電子伝達メディエーターＭｅｄを有する酵素固定化層が接触して配置される。この酵素電極に乳酸を作用させた場合、乳酸はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド等の共存下乳酸デヒドロゲナーゼの触媒作用によって酸化される。その結果、ピルビン酸と還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを生じる。そして還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドは酸化型電子伝達メディエーターの存在下乳酸デヒドロゲナーゼの物理的近傍に存在するジアフォラーゼの触媒作用によって直ちに酸化される。その結果、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび還元型の電子伝達メディエーターを生じる。こうして生じる還元型の電子伝達メディエーターは導電性基体に電子を伝達することが出来る。
酵素１としてリンゴ酸デヒドロゲナーゼを、酵素２としてジアフォラーゼを用いて酵素電極を作製した場合には、図４に示す状態を得ることができる。すなわち、導電性基体上に、リンゴ酸デヒドロゲナーゼＭＤＨとジアフォラーゼＤｐとの融合タンパク質および電子伝達メディエーターＭｅｄを有する酵素固定化層が接触して配置される。この酵素電極にリンゴ酸を作用させた場合、リンゴ酸はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド等の共存下リンゴ酸デヒドロゲナーゼの触媒作用によって酸化される。その結果、ピルビン酸と還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを生じる。そして還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドは酸化型電子伝達メディエーターの存在下リンゴ酸デヒドロゲナーゼの物理的近傍に存在するジアフォラーゼの触媒作用によって直ちに酸化される。その結果、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび還元型の電子伝達メディエーターを生じる。こうして生じる還元型の電子伝達メディエーターは導電性基体に電子を伝達することが出来る。
【００６６】
酵素１としてグルタミン酸デヒドロゲナーゼを、酵素２としてジアフォラーゼを用いて酵素電極を作製した場合には、図５に示す状態を得ることができる。すなわち、導電性基体上に、グルタミン酸デヒドロゲナーゼＥＤＨとジアフォラーゼＤｐとの融合タンパク質および電子伝達メディエーターＭｅｄを有する酵素固定化層が接触して配置される。この酵素電極にグルタミン酸を作用させた場合、グルタミン酸はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド等の共存下グルタミン酸デヒドロゲナーゼの触媒作用によって酸化される。その結果、２−オキソグルタル酸と還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを生じる。そして還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドは酸化型電子伝達メディエーターの存在下グルタミン酸デヒドロゲナーゼの物理的近傍に存在するジアフォラーゼの触媒作用によって直ちに酸化される。その結果、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび還元型の電子伝達メディエーターを生じる。こうして生じる還元型の電子伝達メディエーターは導電性基体に電子を伝達することが出来る。
【００６７】
従来知られたグルタミン酸デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼとが個別に電極上に固定化された場合よりも、本発明の酵素電極においては、より効率の高いグルタミン酸から電極への電子伝達が達成される。したがって、このような図５に示す酵素電極は、検出感度の高いグルタミン酸センサーとして、また出力の大きなグルタミン酸燃料電池として、さらにまた反応効率の高いグルタミン酸電気化学反応装置として利用することができる。
【００６８】
特に好熱菌由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼおよびジアフォラーゼの融合タンパク質を用いることによって耐熱性、耐久性、高温状態での応答性に優れた酵素電極とすることが出来る。
【００６９】
酵素１としてアルコールデヒドロゲナーゼを、酵素２としてアルデヒドデヒドロゲナーゼを用い、さらにジアフォラーゼを共存させて酵素電極を作製した場合には、図６に示す状態を得ることができる。すなわち、導電性基体上に、アルコールデヒドロゲナーゼＡＤＨとアルデヒドデヒドロゲナーゼＡＬＤＨとの融合タンパク質、ジアフォラーゼＤｐおよび電子伝達メディエーターＭｅｄを有する酵素固定化層が接触して配置される。この酵素電極にアルコールを作用させた場合、アルコールはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド等の共存下アルコールデヒドロゲナーゼの触媒作用によって酸化される。その結果、アルデヒドと還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを生じる。さらに生じたアルデヒドはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド等の共存下アルコールデヒドロゲナーゼの物理的近傍に存在するアルデヒドデヒドロゲナーゼの触媒作用によって直ちに酸化される。その結果、カルボン酸と還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを生じる。このようにして生じた還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドは酸化型電子伝達メディエーターの存在下ジアフォラーゼの触媒作用によって酸化される。その結果、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび還元型の電子伝達メディエーターを生じる。こうして生じる還元型の電子伝達メディエーターは導電性基体に電子を伝達することが出来る。またこの酵素電極においてはアルデヒド種が酵素電極近傍に蓄積することが防止され、アルデヒド種による酵素タンパク質の不活性化反応が軽減されるので、酵素電極の活性低下を抑えることができる。
【００７０】
酵素１としてイソメラーゼを、酵素２としてグルコースデヒドロゲナーゼを用い、さらにジアフォラーゼを共存させて酵素電極を作製した場合には、図７に示す状態を得ることができる。すなわち、導電性基体上に、イソメラーゼＩＳＯとグルコースデヒドロゲナーゼＧＤＨとの融合タンパク質、ジアフォラーゼＤｐおよび電子伝達メディエーターＭｅｄを有する酵素固定化層が接触して配置される。この酵素電極にフルクトースを作用させた場合、フルクトースはイソメラーゼの触媒作用によって異性化され、グルコースを生じる。生じたグルコースはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド等の共存下イソメラーゼの物理的近傍に存在するグルコースデヒドロゲナーゼの触媒作用によって直ちに酸化される。その結果、グルコノラクトンと還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを生じる。さらに生じた還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドは酸化型電子伝達メディエーターの存在下ジアフォラーゼの触媒作用によって酸化される。その結果、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび還元型の電子伝達メディエーターを生じる。こうして生じる還元型の電子伝達メディエーターは導電性基体に電子を伝達することが出来る。
本発明の酵素電極に用いられる融合タンパク質は遺伝子工学的手法を用いて製造することができる。まず、酵素１のアミノ酸配列をコードする遺伝子を有する第１のDNA配列と酵素２のアミノ酸配列をコードする遺伝子を有する第２のDNA配列を用意する。そして、第１のDNA配列と第２のDNA配列とを、これらの酵素が融合された融合タンパク質の発現を可能とする状態で結合する。例えば、第１のDNAの５’側上流または３’側下流に第２のDNA配列を連結して、融合タンパク質発現用の組換え遺伝子としてのDNA配列を得ることができる。この組換え遺伝子を適当な宿主−ベクター系に用いて発現させて、これにコードされた組換えタンパク質を得ることができる。発現した融合タンパク質を、単離、精製して、酵素電極用として利用することができる。
【００７１】
酵素１および酵素２のアミノ酸配列をコードする遺伝子DNA配列は、その機能が同定されていれば、その由来は特に限定されない。
【００７２】
融合タンパク質用のグルコースデヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.47）としては、下記の化学反応を触媒する機能が同定されており、遺伝子の塩基配列または酵素のアミノ酸配列が既知のものであれば利用できる。すなわち、その由来は特に限定されない。
反応式１：
beta-D-glucose + NAD(P)+ = D-glucono-1,5-lactone + NAD(P)H + H+
そのようなグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子としては、Bacillus属、例えばBacillus subtilis 168[Nature 390:249-56 (1997)]、Gloeobacter属、例えばGloeobacter violaceus PCC7421[DNA Res 10:137-45 (2003)]、Thermoplasma属、例えばThermoplasma acidophilum DSM 1728[Nature 407:508-13 (2000)]、Thermoplasma volcanium GSS1[Proc Natl Acad Sci U S A 97:14257-62 (2000)]、Picrophilus属、例えばPicrophilus torridus DSM 9790[Proc Natl Acad Sci U S A 101:9091-6 (2004)]、Pyrococcus属、例えばPyrococcus furiosus DSM 3638[Genetics 152:1299-305 (1999)]、Sulfolobus属、例えばSulfolobus solfataricus[Proc Natl Acad Sci U S A 98:7835-40 (2001)]、Sulfolobus tokodaii strain7[DNA Res 8:123-40 (2001)]等を挙げることができ、いずれも本発明の融合タンパク質の構成要素として利用することができる。特にPyrococcus furiosus、Sulfolobus solfataricus等由来の酵素は耐熱性があり、本発明に好適に利用し得る。
【００７３】
融合タンパク質用のアルコールデヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.1）としては、下記の化学反応を触媒する機能が同定されており、遺伝子の塩基配列または酵素のアミノ酸配列が既知のものであれば利用できる。すなわち、その由来は特に限定されない。
反応式２：
alcohol + NAD+ = aldehyde or ketone + NADH + H+
そのようなアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子としては、Saccharomyces属、例えばSaccharomyces cerevisiae S288C[Science 274:546-67 (1996)]、Pseudomonas属、例えばPseudomonas aeruginosa PA01[Nature 406:959-64 (2000)]、Pseudomonas putida KT2440[Environ Microbiol 4:799-808 (2002)]、Acinetobacter属、例えばAcinetobacter sp. ADP1[Nucleic Acids Res 32:5766-79 (2004)]、Bacillus属、例えばBacillus subtilis 168[Nature 390:249-56 (1997)]、Lactococcus属、例えばLactococcus lactis subsp. lactis IL1403[Genome Res 11:731-53 (2001)]、Lactobacillus属、例えばLactobacillus plantarum WCFS1[Proc Natl Acad Sci U S A 100:1990-5 (2003)]、Thermus属、例えばThermus thermophilus HB27[Nat Biotechnol 22:547-53 (2004)]、Aquifex属、例えばAquifex aeolicus VF5[Nature 392:353-8 (1998)]、Thermotoga属、例えばThermotoga maritima MSB8[Nature 399:323-9 (1999)]、Methanococcus属、例えばMethanococcus maripaludis S2[J Bacteriol 186:6956-69 (2004)]、Methanosarcina属、例えばMethanosarcina acetivorans C2A[Genome Res 12:532-42 (2002)]、Methanosarcina mazei Goe1[J Mol Microbiol Biotechnol 4:453-61 (2002)]、、Thermoplasma属、例えばThermoplasma acidophilum DSM 1728[Nature 407:508-13 (2000)]、Thermoplasma volcanium GSS1[Proc Natl Acad Sci U S A 97:14257-62 (2000)]、yrococcus属、例えばPyrococcus horikoshii OT3[DNA Res 5:55-76 (1998)]、Pyrococcus abyssi GE5、Pyrococcus furiosus DSM 3638[Genetics 152:1299-305 (1999), Mol Microbiol 38:684-93 (2000), Methods Enzymol 330:134-57 (2001)]、Aeropyrum属、例えばAeropyrum pernix K1[DNA Res 6:83-101, 145-52 (1999)]、Sulfolobus属、例えばSulfolobus solfataricus[Proc Natl Acad Sci U S A 98:7835-40 (2001)]、Sulfolobus tokodaii strain7[DNA Res 8:123-40 (2001)]、Pyrobaculum属、例えばPyrobaculum aerophilum IM2[Proc Natl Acad Sci U S A 99:984-9 (2002)]等を挙げることができ、いずれも本発明の融合タンパク質の構成要素として利用することができる。特にCorynebacterium efficiens 、Thermus thermophilus Aquifex aeolicus、Thermotoga maritima、 Archaeoglobus fulgidus、Pyrococcus horikoshii、Pyrococcus abyssi、Pyrococcus furiosus、Aeropyrum pernix、Pyrobaculum aerophilum等由来の酵素は耐熱性があり、本発明に好適に利用し得る。
【００７４】
融合タンパク質用のアルデヒドデヒドロゲナーゼとしては、下記の化学反応（１）または（２）を触媒する機能が同定されており、遺伝子の塩基配列または酵素のアミノ酸配列が既知のものであれば利用できる。すなわち、その由来は特に限定されない。
（１）電子受容体としてNADを要求する酵素（EC 1.2.1.3）。
反応式３：
aldehyde + NAD+ + H2O = acid + NADH + H+
（２）電子受容体としてNADまたはNADPを要求する酵素（EC 1.2.1.5）。
反応式４：
aldehyde + NAD(P)+ + H2O = acid + NAD(P)H + H+
なかでも、アセトアルデヒドを酸化するアルデヒドデヒドロゲナーゼとしては、下記の化学反応を触媒する機能が同定されており、遺伝子の塩基配列または酵素のアミノ酸配列が既知のものであれば利用できる。すなわち、その由来は特に限定されない。
反応式５：
acetaldehyde + CoA + NAD+ = acetyl-CoA + NADH + H+
そのようなアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子としては、電子受容体としてNADを要求するアルデヒドデヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.3）の場合、Acinetobacter属、例えばAcinetobacter sp. ADP1[Nucleic Acids Res 32:5766-79 (2004)]、Bacillus属、例えばBacillus subtilis 168[Nature 390:249-56 (1997)]、Thermus属、例えばThermus thermophilus HB27[Nat Biotechnol 22:547-53 (2004)]、Pyrococcus属、例えばPyrococcus furiosus DSM 3638[Genetics 152:1299-305 (1999), Mol Microbiol 38:684-93 (2000), Methods Enzymol 330:134-57 (2001)]、Aquifex属、例えばAquifex aeolicus VF5[Nature 392:353-8 (1998)]等を挙げることができ、いずれも本発明の融合タンパク質の構成要素として利用することができる。
【００７５】
また、前記電子受容体としてNADまたはNADPを要求するアルデヒドデヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.5）の場合、Caenorhabditis属、例えばCaenorhabditis elegans[Science 282:2012-8 (1998)]、Bacillus属、例えばBacillus thuringiensis 97-27 (serovar konkukian) 等を挙げることができ、いずれも本発明の融合タンパク質の構成要素として利用することができる。
【００７６】
また、前記アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.10）の場合、Bacillus属、例えばBacillus cereus ATCC 14579[Nature 423:87-91 (2003)]、Bifidobacterium属、例えばBifidobacterium longum NCC2705[Proc Natl Acad Sci U S A 99:14422-7 (2002)] 等を挙げることができ、いずれも本発明の融合タンパク質の構成要素として利用することができる。
【００７７】
特にThermus thermophilus 、Pyrococcus furiosus 、Aquifex aeolicus等由来の酵素は耐熱性があり、本発明に好適に利用し得る。
【００７８】
融合タンパク質用の乳酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.27）としては、下記の化学反応を触媒する機能が同定されており、遺伝子の塩基配列または酵素のアミノ酸配列が既知のものであれば利用できる。すなわち、その由来は特に限定されない。
反応式６：
(S)-lactate + NAD+ = pyruvate + NADH + H+
そのような乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子としては、Bacillus属、例えばBacillus subtilis 168[Nature 390:249-56 (1997)]、Lactococcus属、例えばLactococcus lactis subsp. lactis IL1403[Genome Res 11:731-53 (2001)]、Lactobacillus属、例えばLactobacillus plantarum WCFS1[Proc Natl Acad Sci U S A 100:1990-5 (2003)]、Lactobacillus johnsonii NCC 533[Proc Natl Acad Sci U S A : (2004)]、Deinococcus属、例えばDeinococcus radiodurans R1[Science 286:1571-7 (1999)]、Thermus属、例えばThermus thermophilus HB27[Nat Biotechnol 22:547-53 (2004)]、Thermotoga属、例えばThermotoga maritima MSB8[Nature 399:323-9 (1999)]等を挙げることができ、いずれも本発明の融合タンパク質の構成要素として利用することができる。特にThermus thermophilus、Thermotoga maritima等由来の酵素は耐熱性があり、本発明に好適に利用し得る。
【００７９】
融合タンパク質用のジアフォラーゼとしては、ジアフォラーゼ活性が確認されており、遺伝子DNAの塩基配列または酵素のアミノ酸配列が既知のものであれば利用できる。すなわち、その由来は特に限定されない。ジアフォラーゼ活性は、メチレンブルーや２，６−ジクロロフェノール−インドフェノールのような人工的電子受容体の存在下に、ＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨを酸化する触媒反応である。このようなジアフォラーゼ活性を有する酵素としては、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのいずれか、またはその両方に特異性を有するかに基づき次のように分類されている。
（１）EC 1.6.99.1 ; NADPH:(acceptor) oxidoreductase。
（２）EC 1.6.99.2 ; NAD(P)H:(quinone-acceptor) oxidoreductase。
（３）EC 1.6.99.3 ; NADH:(acceptor) oxidoreductase。
（４）EC 1.6.99.5 ; NADH:(quinone-acceptor) oxidoreductase。
（５）EC 1.8.1.4 ; protein-N6-(dihydrolipoyl)lysine:NAD+ oxidoreductase。
（６）EC 1.14.13.39 ; L-arginine,NADPH:oxygen oxidoreductase (nitric-oxide-forming)。
【００８０】
本発明の酵素電極においては、ジアフォラーゼと融合または共存させて用いられるデヒドロゲナーゼがＮＡＤＰＨ若しくはＮＡＤＨのいずれかに基質特異性を有するかにより、該デヒドロゲナーゼと同一の基質特異性を有するジアフォラーゼを選択して用いることが望ましい。
【００８１】
上記（１）のジアフォラーゼを用いる場合には、下記の化学反応を触媒する機能が同定されており、遺伝子の塩基配列または酵素のアミノ酸配列が既知のものであれば利用できる。すなわち、その由来は特に限定されない。
反応式７：
NADPH + H+ + acceptor = NADP+ + reduced acceptor
そのようなジアフォラーゼ遺伝子としては、Saccharomyces属、例えばSaccharomyces cerevisiae S288C[Science 274:546-67 (1996), Proc Natl Acad Sci U S A 92:3809-13 (1995), EMBO J 13:5795-809 (1994), Nature 357:38-46 (1992), Nature 387:75-8 (1997), Nature 387:78-81 (1997), Nat Genet 10:261-8 (1995), Nature 387:81-4 (1997), Science 265:2077-82 (1994), Nature 387:84-7 (1997), EMBO J 15:2031-49 (1996), Nature 369:371-8 (1994), Nature 387:87-90 (1997), Nature 387:90-3 (1997), Nature 387:93-8 (1997), Nature 387:98-102 (1997), Nature 387:103-5 (1997)], Candida属、例えばCandida albicans SC5314[Proc Natl Acad Sci U S A 101:7329-34 (2004)]等由来のものを挙げることができる。
【００８２】
上記（２）のジアフォラーゼを用いる場合には、下記の化学反応を触媒する機能が同定されており、遺伝子の塩基配列または酵素のアミノ酸配列が既知のものであれば利用できる。すなわち、その由来は特に限定されない。
反応式８：
NAD(P)H + H+ + acceptor = NAD(P)+ + reduced acceptor
そのようなジアフォラーゼ遺伝子としては、Pseudomonas属、例えばPseudomonas aeruginosa PA01[Nature 406:959-64 (2000)], Pseudomonas putida KT2440[Environ Microbiol 4:799-808 (2002)], Bacillus属、例えばBacillus cereus ATCC 14579[Nature 423:87-91 (2003)],等由来のものを挙げることができる。
【００８３】
上記（３）のジアフォラーゼを用いる場合には、下記の化学反応を触媒する機能が同定されており、遺伝子の塩基配列または酵素のアミノ酸配列が既知のものであれば利用できる。すなわち、その由来は特に限定されない。
反応式９：
NADH + H+ + acceptor = NAD+ + reduced acceptor
そのようなジアフォラーゼ遺伝子としては、Saccharomyces属、例えばSaccharomyces cerevisiae S288C[Science 274:546-67 (1996), Proc Natl Acad Sci U S A 92:3809-13 (1995), EMBO J 13:5795-809 (1994), Nature 357:38-46 (1992), Nature 387:75-8 (1997), Nature 387:78-81 (1997), Nat Genet 10:261-8 (1995), Nature 387:81-4 (1997), Science 265:2077-82 (1994), Nature 387:84-7 (1997), EMBO J 15:2031-49 (1996),Nature 369:371-8 (1994),Nature 387:87-90 (1997),Nature 387:90-3 (1997),Nature 387:93-8 (1997),Nature 387:98-102 (1997),Nature 387:103-5 (1997)] Pseudomonas属、例えばPseudomonas aeruginosa PA01[Nature 406:959-64 (2000)], Pseudomonas putida KT2440[Environ Microbiol 4:799-808 (2002)], Acinetobacter属、例えばAcinetobacter sp. ADP1[Nucleic Acids Res 32:5766-79 (2004)], Bacillus属、例えばBacillus subtilis 168[Nature 390:249-56 (1997)], Lactobacillus属、例えばLactobacillus plantarum WCFS1[Proc Natl Acad Sci U S A 100:1990-5 (2003)], Deinococcus属、例えばDeinococcus radiodurans R1[Science 286:1571-7 (1999)], Thermus属、例えばThermus thermophilus HB27[Nat Biotechnol 22:547-53 (2004)], Aquifex属、例えばAquifex aeolicus VF5[Nature 392:353-8 (1998)], Pyrococcus属、例えばPyrococcus abyssi GE5, Pyrococcus furiosus DSM 3638[Genetics 152:1299-305 (1999), Mol Microbiol 38:684-93 (2000), , Methods Enzymol 330:134-57 (2001)]等由来のものを挙げることができる。
【００８４】
上記（４）のジアフォラーゼを用いる場合には、下記の化学反応を触媒する機能が同定されており、遺伝子の塩基配列または酵素のアミノ酸配列が既知のものであれば利用できる。すなわち、その由来は特に限定されない。
反応式１０：
NADH + H+ + acceptor = NAD+ + reduced acceptor
そのようなジアフォラーゼ遺伝子としては、Burkholderia属、例えばBurkholderia mallei ATCC 23344[Proc Natl Acad Sci U S A 101:14246-51 (2004)], Haloarcula属、例えばHaloarcula marismortui ATCC 43049[Genome Res 14:2221-34 (2004)]等由来のものを挙げることができる。
【００８５】
上記（５）のジアフォラーゼを用いる場合には、下記の化学反応を触媒する機能が同定されており、遺伝子の塩基配列または酵素のアミノ酸配列が既知のものであれば利用できる。すなわち、その由来は特に限定されない。
反応式１１：
protein N6-(dihydrolipoyl)lysine + NAD+ = protein N6-(lipoyl)lysine + NADH + H+
そのようなジアフォラーゼ遺伝子としては、Saccharomyces属、例えばSaccharomyces cerevisiae S288C[Science 274:546-67 (1996), Proc Natl Acad Sci U S A 92:3809-13 (1995), EMBO J 13:5795-809 (1994), Nature 357:38-46 (1992), Nature 387:75-8 (1997), Nature 387:78-81 (1997), Nat Genet 10:261-8 (1995), Nature 387:81-4 (1997), Science 265:2077-82 (1994), Nature 387:84-7 (1997), EMBO J 15:2031-49 (1996),Nature 369:371-8 (1994),Nature 387:87-90 (1997),Nature 387:90-3 (1997),Nature 387:93-8 (1997),Nature 387:98-102 (1997),Nature 387:103-5 (1997)], Lactobacillus属、例えばLactobacillus plantarum WCFS1[Proc Natl Acad Sci U S A 100:1990-5 (2003)], Deinococcus属、例えばDeinococcus radiodurans R1[Science 286:1571-7 (1999)], Thermus属、例えばThermus thermophilus HB27[Nat Biotechnol 22:547-53 (2004)], Aquifex属、例えばAquifex aeolicus VF5[Nature 392:353-8 (1998)], Thermotoga属、例えばThermotoga maritima MSB8[Nature 399:323-9 (1999)], Sulfolobus属、例えばSulfolobus solfataricus[Proc Natl Acad Sci U S A 98:7835-40 (2001)], Sulfolobus tokodaii strain7[DNA Res 8:123-40 (2001)], Pyrobaculum属、例えばPyrobaculum aerophilum IM2[Proc Natl Acad Sci U S A 99:984-9 (2002)]等由来のものを挙げることができる。
【００８６】
上記（６）のジアフォラーゼを用いる場合には、下記の化学反応を触媒する機能が同定されており、遺伝子の塩基配列または酵素のアミノ酸配列が既知のものであれば利用できる。すなわち、その由来は特に限定されない。
反応式１２：
L-arginine + n NADPH + n H+ + m O2 = citrulline + nitric oxide + n NADP+
そのようなジアフォラーゼ遺伝子としては、Bacillus属、例えばBacillus cereus ATCC 14579[Nature 423:87-91 (2003)]等由来のものを挙げることができる。
特にThermus thermophilus 、Thermotoga maritima 、Sulfolobus tokodaii 、Pyrobaculum aerophilum等由来の酵素は耐熱性があり、本発明に好適に利用し得る。
【００８７】
融合タンパク質用のリンゴ酸デヒドロゲナーゼとしては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性が確認されており、遺伝子DNAの塩基配列または酵素のアミノ酸配列が既知のものであれば利用できる。すなわち、その由来は特に限定されない。リンゴ酸デヒドロゲナーゼは次のように分類されている：
（Ａ）EC 1.1.1.37 ; (S)-malate:NAD+ oxidoreductase
（Ｂ）EC 1.1.1.38 ; (S)-malate:NAD+ oxidoreductase (oxaloacetate-decarboxylating)
（Ｃ）EC 1.1.1.39 ; (S)-malate:NAD+ oxidoreductase (decarboxylating)
（Ｄ）EC 1.1.1.40 ; (S)-malate:NADP+ oxidoreductase (oxaloacetate-decarboxylating)
これらの内、EC 1.1.1.37の酵素は化学反応の平衡がリンゴ酸生成側に偏っているので、EC 1.1.1.38、EC 1.1.1.39、EC 1.1.1.40に分類される酵素がより望ましい。そのようなリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子としては、Bacillus属、例えばBacillus cereus ATCC 10987 [Nucleic Acids Res 32:977-88 (2004)]、Bacillus subtilis 168 [Nature 390:249-56 (1997)]、Lactobacillus属、例えばLactobacillus plantarum WCFS1 [Proc Natl Acad Sci U S A 100:1990-5 (2003)]、Pseudomonas属、例えばPseudomonas aeruginosa PA01 [Nature 406:959-64 (2000)]、Pseudomonas putida KT2440 [Environ Microbiol 4:799-808 (2002)]、Pyrococcus furiosus DSM 3638 [Genetics 152:1299-305 (1999), Mol Microbiol 38:684-93 (2000), , Methods Enzymol 330:134-57 (2001)]、Saccharomyces属、例えばSaccharomyces cerevisiae S288C [Science 274:546-67 (1996), Proc Natl Acad Sci U S A 92:3809-13 (1995), EMBO J 13:5795-809 (1994), Nature 357:38-46 (1992), Nature 387:75-8 (1997), Nature 387:78-81 (1997), Nat Genet 10:261-8 (1995), Nature 387:81-4 (1997), Science 265:2077-82 (1994), Nature 387:84-7 (1997), EMBO J 15:2031-49 (1996), Nature 369:371-8 (1994), Nature 387:87-90 (1997), Nature 387:90-3 (1997), Nature 387:93-8 (1997), Nature 387:98-102 (1997), Nature 387:103-5 (1997)]、Sulfolobus属、例えばSulfolobus solfataricus [Proc Natl Acad Sci U S A 98:7835-40 (2001)]、Sulfolobus tokodaii strain7 [DNA Res 8:123-40 (2001)]、Thermotoga属、例えばThermotoga maritima MSB8 [Nature 399:323-9 (1999)]、Thermus属、例えばThermus thermophilus HB27 [Nat Biotechnol 22:547-53 (2004)]等由来のものを挙げることができる。
特にThermus thermophilus 、Thermotoga maritima、Pyrococcus furiosus 、Sulfolobus tokodaii等由来の酵素は耐熱性があり、本発明に好適に利用し得る。
【００８８】
融合タンパク質用のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.4.1.2, EC 1.4.1.3, EC 1.4.1.4）としては、下記式の化学反応を触媒する機能が同定されており、遺伝子DNAの塩基配列または酵素のアミノ酸配列が既知のものであれば利用できる。すなわち、その由来は特に限定されない。
反応式１３：
L-glutamate + H2O + NAD(P)+ = 2-oxoglutarate + NH3 + NAD(P)H + H+
そのようなグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子としては、Bacillus属、例えばBacillus clausii KSM-K16、Bacillus subtilis 168[Nature 390:249-56 (1997)]、Burkholderia属、例えばBurkholderia mallei ATCC 23344[Proc Natl Acad Sci U S A 101:14246-51 (2004)]、Deinococcus属、例えばDeinococcus radiodurans R1[Science 286:1571-7 (1999)]、Geobacillus属、例えばGeobacillus kaustophilus HTA426[Nucleic Acids Res 32:6292-303 (2004)]、Lactobacillus属、例えばLactobacillus plantarum WCFS1[Proc Natl Acad Sci U S A 100:1990-5 (2003)] Pyrococcus属、例えばPyrococcus horikoshii OT3[DNA Res 5:55-76 (1998)]、Pseudomonas属、例えばPseudomonas aeruginosa PA01[Nature 406:959-64 (2000)]、Pseudomonas putida KT2440[Environ Microbiol 4:799-808 (2002)]、Pyrococcus属、例えばPyrococcus abyssi GE5、Pyrococcus furiosus DSM 3638[Genetics 152:1299-305 (1999), Mol Microbiol 38:684-93 (2000), Methods Enzymol 330:134-57 (2001)]、Sulfolobus属、例えばSulfolobus solfataricus[Proc Natl Acad Sci U S A 98:7835-40 (2001)]、Sulfolobus tokodaii strain7[DNA Res 8:123-40 (2001)]、Thermococcus属、例えばThermococcus kodakaraensis KOD1[Genome Res 15:352-63 (2005)]、Thermotoga属、例えばThermotoga maritima MSB8[Nature 399:323-9 (1999)]、Thermus属、例えばThermus thermophilus HB27[Nat Biotechnol 22:547-53 (2004)]、Thermus thermophilus HB8等由来のものを挙げることができる。特にThermus thermophilus 、Thermotoga maritima、Pyrococcus furiosus 、Sulfolobus tokodaii等由来の酵素は耐熱性があり、本発明に好適に利用し得る。
【００８９】
融合タンパク質用のイソメラーゼ（キシロースイソメラーゼ）（EC 5.3.1.5）としては、下記式の化学反応を触媒する機能が同定されており、遺伝子DNAの塩基配列または酵素のアミノ酸配列が既知のものであれば利用できる。すなわち、その由来は特に限定されない。
反応式１４：
D-xylose = D-xylulose
そのようなイソメラーゼ遺伝子としては、Escherichia属、例えば、Escherichia coli K-12 MG1655 [Science 277:1453-74 (1997)], Escherichia coli K-12 W3110 、Bacillus属、例えば、Bacillus subtilis 168 [Nature 390:249-56 (1997)], Lactococcus属、例えば、Lactococcus lactis subsp. lactis IL1403 [Genome Res 11:731-53 (2001)]、Thermotoga属、例えば、Thermotoga maritima MSB8 [Nature 399:323-9 (1999)] 等由来のものを挙げることができる。特にThermotoga maritima由来の酵素は耐熱性があり、本発明に好適に利用し得る。
【００９０】
前述したように本発明で用いる融合タンパク質のアミノ酸配列をコードするDNAの塩基配列は、酵素１のアミノ酸配列をコードする塩基配列の上流または下流に酵素２のアミノ酸配列をコードする塩基配列を連結して得ることができる。この連結形態は、この連結された塩基配列に基づいて発現する融合タンパク質において酵素１及び２のそれぞれが活性を有するものであればよい。
【００９１】
この融合タンパク質のアミノ酸配列において、酵素１のアミノ酸配列と酵素２のアミノ酸配列との間にはスペーサー配列を挿入することができる。スペーサー配列の構造及び長さは、以下の要件に基づいて選択されることが好ましい。
（１）酵素１と酵素２の各々が夫々固有のフォールディングをとることを可能にし夫々の酵素活性の維持を保証する。
（２）酵素１の触媒する酵素反応により生じる反応生成物１の内、酵素２の触媒する酵素反応の基質となる化学種ができるだけ速やかに酵素２にまで拡散により到達できる。
【００９２】
そのようなスペーサー配列の長さとしては、およそ３〜４００アミノ酸が好ましく、スペーサーの配列としては、上記性質を有するものであれば特には限定されない。例えば、ＧＧＧＧＳ（Ｇ：グリシン、Ｓ：セリン）、あるいはこの配列単位が２以上５以下程度繰り返されている配列を挙げることができる。また、Ｐａｔｒｉｃｋの文献（J.Mol.Biol.（1990）211,943-958）に記載される以下のものを用いることもできる。
タイプＩ（ＳＴＧタイプ）；
セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）および／またはグリシン（Ｇ）のみからなる配列。
タイプII：
セリン、トレオニンおよび／またはグリシンの他、一つの、アスパラギン酸（Ｄ）、リジン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、アラニン（Ａ）あるいはプロリン（Ｐ）からなる配列。
タイプIII（ＳＴＧＤＫＱＮＡタイプ）：
ＳＴＧタイプＩとIIのアミノ酸残基からなる組み合わせ配列。
（タイプIII（ＳＴＧＤＫＱＮＡタイプ））、
ＳＴＧタイプＩとIIのアミノ酸残基からなる組み合わせ配列ＳＴＧタイプＩとIIのアミノ酸残基からなる組み合わせ配列タイプＩとタイプIIであって、複数個のプロリンを有する配列。
タイプIV（Ｐｒｏタイプ）：
タイプＩとタイプIIであって、複数個のプロリンを有する配列。
タイプV：
タイプIIIに含まれるアミノ酸残基の任意の組み合わせであり、少なくとも８つのアミノ酸残基を有している配列。
【００９３】
上記の他、ＧＳＧＳＧ、ＳＧＧＳＧ、ＮＧＧＧＧ、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ、ＳＫＳＴＳ、ＰＶＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＭ等を更に挙げることができる。
【００９４】
スペーサー配列は、酵素１のアミノ酸配列をコードする塩基配列と、酵素２のアミノ酸配列をコードする塩基配列との間に、挿入する。その際、酵素１のアミノ酸配列をコードする塩基配列と、酵素２のアミノ酸配列をコードする塩基配列の夫々の読み枠がずれないようにして挿入する。この挿入は、当該分野の公知の方法を用いて行うことができる。
【００９５】
本発明で用いられる融合タンパク質において、酵素１あるいは酵素２の酵素活性の機能単位が単鎖のポリペプチド（モノマー）ではない場合であっても、以下に述べる何れかの構成を採用することによって本発明の目的を達成することができる。
【００９６】
（１）何れか一方の酵素の機能単位がホモオリゴマーである場合。
例えば酵素１の機能的なポリペプチド構成がαn [n>1の整数]と表され、酵素２の機能的なポリペプチド構成がβと表されるとする。目的のポリペプチド構成の融合タンパク質（αn::β）を得るためには、融合ポリペプチド（α::β）に加えて、ホモオリゴマーを機能単位とする酵素の構成ポリペプチド（α）を宿主細胞内で共発現させる。共発現されるべき２つのポリペプチド（α::βとα）は、同一のプラスミド上にコードされていても、また相異なるプラスミド上にコードされていてもよい。ただし相異なるプラスミドを用いる場合には、両者のプラスミドは不和合性を持たないことが必要である。この系では目的とする融合タンパク質（αn::β）に加えて、αnやαn-x(α::β)x [xはn+1> x > 0なる整数]などといったペプチド構成の目的外タンパク質が生成し得る。これらは例えば夫々の分子量の違いにより、ゲルろ過法や限外ろ過法を用いて分画・精製できる。なおαn-x(α::β)x [xはn+1> x > 0なる整数]なる構成の融合タンパク質でも、酵素１および酵素２双方の酵素活性が保持されていれば、本発明の酵素電極に供し得る。
【００９７】
（２）何れか一方の酵素の機能単位がヘテロオリゴマーである場合。
例えば酵素１の機能的なポリペプチド構成がαnα' [ただしα'はα以外のポリペプチド鎖をまとめて表現するものとし、nはｎ＞0の整数とする]と表わされ、酵素２の機能的なポリペプチド構成がβと表わされるものとする。目的のポリペプチド構成の融合タンパク質（αnα'::β）を得るためには、融合ポリペプチド(α::β)に加えて、ヘテロオリゴマーを機能単位とする酵素の構成ポリペプチド（α及びα'）を宿主細胞内で共発現させる。共発現されるべきポリペプチド鎖（α::β、αおよびα'）は、同一のプラスミド上にコードされていても、また相異なるプラスミド上にコードされていてもよい。ただし相異なるプラスミドを用いる場合には、両者のプラスミドは不和合性を持たないことが必要である。この系では目的とする融合タンパク質（αnα'::β）に加えて、αn-xα'(α::β)x [xはn+1> x > 0なる整数]やαnα'といったペプチド構成のタンパク質が生成し得る。これらは例えば夫々の分子量の違いにより、ゲルろ過法や限外ろ過法を用いて分画・精製できる。なおαn-xα'(α::β)x [xはn+1> x > 0なる整数]なる構成の融合タンパク質でも、酵素１および酵素２双方の酵素活性が保持されていれば、本発明の酵素電極に供し得る。このような融合タンパク質の生成を抑えるためには、ヘテロオリゴマーの構成ユニットの内、機能的な構成の中で最も数の少ないもの、すなわちn=1となるものをαとして選択することが望ましい。n=1のαを選択できる場合には共発現されるべきポリペプチド鎖はα::βおよびα'のみでよい。
【００９８】
（３）双方の酵素の機能単位がホモオリゴマーである場合。
例えば酵素１の機能的なポリペプチド構成がαn [n>1の整数]と表され、酵素２の機能的なポリペプチド構成がβm [m>1の整数]と表されるものとする。目的のポリペプチド構成の融合タンパク質（αn::βm）を得るためには、融合ポリペプチド（α::β）に加えて、ホモオリゴマーを機能単位とする酵素の構成ポリペプチド（αおよびβ）を宿主細胞内で共発現させる。共発現されるべき３つのポリペプチド（α::β、αおよびβ）は、同一のプラスミド上にコードされていても、また相異なるプラスミド上にコードされていてもよい。ただし相異なるプラスミドを用いる場合には、両者のプラスミドは不和合性を持たないことが必要である。この系では目的とする融合タンパク質（αn::βm）に加えて、αn、βmやαn-x(α::β)xβm-x [min(n,m) > x > 1]などといったペプチド構成の目的外タンパク質が生成し得る。これらは例えば夫々の分子量の違いにより、ゲルろ過法や限外ろ過法を用いて分画・精製できる。なおαn-x(α::β)xβm-x [min(n,m) > x > 0]なる構成の融合タンパク質でも、酵素１および酵素２双方の酵素活性が保持されていれば、本発明の酵素電極に供し得る。
【００９９】
（４）一方の酵素の機能単位がホモオリゴマーであり、他方の酵素の機能単位がヘテロオリゴマーである場合。
例えば酵素１の機能的なポリペプチド構成がαn [n>1の整数]と表され、酵素２の機能的なポリペプチド構成がβmβ' [ただしβ'はβ以外のポリペプチド鎖をまとめて表現するものとし、m＞0の整数とする]と表されるものとする。目的のポリペプチド構成の融合タンパク質（αn::βmβ'）を得るためには、融合ポリペプチド（α::β）に加えて、ホモオリゴマーを機能単位とする酵素の構成ポリペプチド（α、βおよびβ'）を宿主細胞内で共発現させる。共発現されるべきポリペプチド（α::β、α、βおよびβ'）は、同一のプラスミド上にコードされていても、また相異なるプラスミド上にコードされていてもよい。ただし相異なるプラスミドを用いる場合には、両者のプラスミドは不和合性を持たないことが必要である。この系では目的とする融合タンパク質（αn::βmβ'）に加えて、αn、βmβ'やαn-x(α::β)xβm-xβ' [min(n,m) > x > 0]などといったペプチド構成の目的外タンパク質が生成し得る。これらは例えば夫々の分子量の違いにより、ゲルろ過法や限外ろ過法を用いて分画・精製できる。なおαn-x(α::β)xβm-xβ' [min(n,m) > x > 0]なる構成の融合タンパク質でも、酵素１および酵素２双方の酵素活性が保持されていれば、本発明の酵素電極に供し得る。しかし、このような融合タンパク質の生成を抑えるためには、ヘテロオリゴマーの構成ユニットの内、機能的な構成の中で最も数の少ないもの、すなわちm=1となるものをβとして選択することが望ましい。m=1のβを選択できる場合には共発現されるべきポリペプチド鎖はα::β、αおよびβ'のみでよい。
【０１００】
（５）双方の酵素の機能単位がヘテロオリゴマーである場合。
例えば酵素１の機能的なポリペプチド構成がαnα' [ただしα'はα以外のポリペプチド鎖をまとめて表現するものとし、n＞0の整数とする]と表されるものとする。酵素２の機能的なポリペプチド構成がβmβ' [ただしβ'はβ以外のポリペプチド鎖をまとめて表現するものとし、m＞0の整数とする]と表されるものとする。目的のポリペプチド構成の融合タンパク質（αnα'::βmβ'）を得るためには、融合ポリペプチド（α::β）に加えて、ヘテロオリゴマーを機能単位とする酵素の構成ポリペプチド（α、α'、βおよびβ'）を宿主細胞内で共発現させる。共発現されるべきポリペプチド（α::β、α、α'、βおよびβ'）は、同一のプラスミド上にコードされていても、また相異なるプラスミド上にコードされていてもよい。ただし相異なるプラスミドを用いる場合には、両者のプラスミドは不和合性を持たないことが必要である。この系では目的とする融合タンパク質（αnα'::βmβ'）に加えて、αnα'、βmβ'、αn-xα'(α::β)xβm-xβ' [min(n,m) > x > 1]などといったペプチド構成の目的外タンパク質が生成し得る。これらは例えば夫々の分子量の違いにより、ゲルろ過法や限外ろ過法を用いて分画・精製できる。なおαn-xα'(α::β)xβm-xβ' [min(n,m) > x > 0]なる構成の融合タンパク質でも、酵素１および酵素２双方の酵素活性が保持されていれば、本発明の酵素電極に供し得る。しかし、このような融合タンパク質の生成を抑えるためには、ヘテロオリゴマーの構成ユニットの内、機能的な構成の中で最も数の少ないもの、すなわちn=1となるものをαとして、またm=1となるものをβとして選択することが望ましい。n=1のαおよびm=1のβを選択できる場合には共発現されるべきポリペプチド鎖はα::β、α'およびβ'のみでよい。
【０１０１】
なお上記（１）から（５）の全ての場合において、酵素１と酵素２の単語を入れ替えた表現の構成も可能である。
【０１０２】
また上記（１）から（５）の全ての場合において、細胞内共発現系ではなく、in vitro無細胞タンパク質合成系を採用することもできる。この場合、in vitroタンパク質合成装置にて夫々の構成ポリペプチドを合成後、これらを混合することによって目的のポリペプチド構成を持つ融合タンパク質を形成させることができる。
【０１０３】
本発明の酵素電極に用いられる融合タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを、適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、様々な宿主内で発現可能な融合タンパク質発現ベクターを構築することができる。当業者ならば、当該技術分野での常法に従い、任意の宿主細胞内で機能的な融合タンパク質発現ベクターを構築することができる。プロモーターは既知のものから適宜選択するか、あるいは新たに調製したものでもよい。また通常の技術を用いて修飾（例えば、プロモーターを交換する）することによって、融合タンパク質を高レベルに産生させることができる発現ベクターを構築することができる。
【０１０４】
融合タンパク質発現ベクターで形質転換するために用いられる宿主細胞は、大腸菌等の原核細胞、酵母等の真核細胞のいずれでもよく、さらには一般的に利用されている高等生物の細胞でもよい。宿主細胞としては、微生物［原核生物（細菌、例えば大腸菌や枯草菌等）、真核生物（例えば酵母）］、動物細胞又は培養植物細胞が挙げられる。微生物としては、原核生物や酵母が好ましい。原核生物としては、特にEscherichia属に属する菌株(例えば、E.coli等)が好ましい。酵母としては、特にSaccharomyces属に属する株（例えば、S.cerevisiae）やCandida属に属する株（例えば、C.boidinii）が好ましい。動物細胞株としては例えば、マウスＬ９２９細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞などを挙げることができる。
【０１０５】
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を使用するのに適した、発現ベクターは既知である。例えば、ｌａｃプロモーターやｔａｃプロモーター等の慣用のプロモーターを有するものを挙げることができる。酵母での融合タンパク質の発現のための発現ベクターとしては、ＧＡＬプロモーターやＡＯＤプロモーター等のプロモーターを含有するものが好ましい。又、哺乳動物細胞での融合タンパク質発現のための発現ベクターとしては、ＳＶ４０プロモーター等のプロモーターを有するものが挙げられる。しかしながら、操作及び入手の容易さを考慮して、宿主細胞としては原核性宿主が好ましく、特に大腸菌が好ましい。原核性宿主−ベクター系については、多くの成書があり、当該技術分野で既知であるが、以下に簡単に説明する。（例えばＭolecular Ｃloning：A LABOLATORY MANUAL, Cold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory Ｐressを参照。）
融合タンパク質をコードするＤＮＡを大腸菌で発現させるには、大腸菌を用いた形質転換に適するプラスミドのプロモーターの下流に該ＤＮＡを挿入する。
後述する実施例では、大腸菌での１つの態様の発現が記載されているが、他の態様での発現は、例えば、融合タンパク質をコードするＤＮＡを適当な酵素（例えば制限酵素、アルカリホスファターゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼなど）で処理することにより融合タンパク質コードするＤＮＡ断片を得、これを適当なベクターに組み込むことにより様々な宿主で融合タンパク質活性を有するペプチドを発現させることができる。
【０１０６】
タンパク質発現のためのベクターによる宿主細胞の形質転換方法は既知であり、この既知の方法を利用して本発明で用いる融合タンパク質の発現を行うことができる。例えば、原核性宿主の場合は、コンピテントセル作製法、真核性宿主の場合は、コンピテントセル作製法、哺乳動物細胞の場合はトランスフェクション法、エレクトロポレーション法により行うことができる。次いで、得られた形質転換体を適当な培地に培養する。培地は、炭素源（例えばグルコース、メタノール、ガラクトース、フルクトース等）及び無機また有機窒素源（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、カザミノ酸等）を含有していてよい。所望により、培地に他の栄養源（例えば無機塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム）、ビタミン類（例えばビタミンＢ1）、抗生物質（例えばアンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン等)）を加えてもよい。哺乳動物細胞の培養には、イーグル培地が適当である。
【０１０７】
形質転換体の培養は、通常、pＨ６.０〜８.０、好ましくはpＨ７.０、２５〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で８〜４８時間行えばよい。生産された融合タンパク質が培養液中に存在しているときは、培養物を濾過又は遠心分離する。精製は、回収した培養液上清から、天然又は合成のタンパク質の精製、単離に用いられる常法を用いて行うことができる。例えば透析、ゲル濾過、対応する抗融合タンパク質モノクロナール抗体を用いてのアフィニティカラムクロマトグラフィー、適当な吸着剤を用いてのカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を用いることができる。生産された融合タンパク質が培養形質転換体のペリプラズム及び細胞質中に存在するときは、濾過や遠心分離によって細胞を集め、それらの細胞壁及び／又は細胞膜を、たとえば超音波及び／又はリゾチーム処理によって破壊して細胞破砕物を得る。この細胞破砕物に適当な水溶液（例えば緩衝液）を混合し、常法によって、融合タンパク質を精製することができる。大腸菌中で生産された融合タンパク質を再生（リフォールディング）する必要があるときは、これを常法によって行うことができる。特に好熱菌由来の融合酵素を調製する場合には、上記細胞破砕液を70℃以上の温度で恒温保持することにより宿主常温菌由来のタンパク質を凝集させ、該凝集体を遠心分離操作などで除去することにより、簡便に精製することが出来る。また活性を有するフォールドへ変換することが出来る。
【０１０８】
尚、用途に応じて融合タンパク質は完全に精製されていなくとも良く、次の（１）〜（７）のいずれかであっても良い。
（１）生細胞：ろ過又は遠心分離等の通常の方法で培養物から分離された細胞。
（２）乾燥細胞：(１) に記載の生細胞を凍結乾燥又は真空乾燥したもの。
（３）細胞抽出物：(１)又は(２) に記載の細胞を通常の方法（例えば有機溶媒中での自己溶菌、アルミナや海砂と混合しての摩砕、又は超音波処理）で処理して得られたもの。
（４）酵素溶液：（３）に記載の細胞抽出物を常法通り精製するか部分精製することにより得られたもの。
（５）精製酵素：（４）に記載の酵素溶液をさらに精製し、不純物を含まないもの。
（６）酵素活性を有するフラグメント：（５）に記載の精製酵素等を適当な方法で断片化処理することにより得られたペプチドフラグメント。
【０１０９】
本発明の酵素電極に用いられる融合タンパク質は、例えば組換え大腸菌の細胞内で生合成させた場合には、フラビン化合物、金属原子（Ｆｅ、Ｃｕ、Ｍｏなど）、ヘム等などの補欠分子族が結合したホロ酵素として取得できることが多い。特に生合成時にこれらの補欠分子族を予め培地中に添加しておくことにより、ホロ酵素の回収率を増加させることできる。しかし無細胞タンパク質合成装置などを用いてin vitroで融合ペプチドを取得した場合などでは、補欠分子族の結合していないアポ酵素として取得される。この場合には取得されたアポ酵素を、これら補欠分子族を添加したバッファー中で保持する工程を加えることによって、ホロ酵素を再構成することができる。
【０１１０】
本発明の酵素電極に用いられる融合タンパク質の遺伝子塩基配列を基に遺伝子工学的に常用される方法を用いることにより、融合タンパク質のアミノ酸配列中に適宜変異を導入した相当するタンパク質を製造することができる。この変異は、１個ないし複数個以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入、転移あるいは付加によるものを挙げることができる。こうした変異・変換・修飾法は、以下の文献に記載されている。
日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法 II 」、ｐ１０５（広瀬進）、東京化学同人（１９８６）；日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸 III（組換えDNA 技術）」、ｐ２３３（広瀬進）、東京化学同人（１９９２）；R. Wu, L. Grossman, ed., "Methods inEnzymology", Vol. 154, p. 350 & p. 367, Academic Press, New York (1987)；R. Wu, L. Grossman, ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100, p. 457 & p. 468, Academic Press, New York (1983)；J. A. Wells  et al., Gene, 34: 315, 1985；T. Grundstroem et al., Nucleic Acids Res., 13: 3305, 1985 ；J.Taylor et al., Nucleic Acids Res., 13: 8765, 1985；R. Wu ed., "Methodsin Enzymology", Vol. 155, p. 568, Academic Press, New York（1987) ；A. R. Oliphant et al., Gene, 44: 177, 1986
例えば合成オリゴヌクレオチドなどを利用する位置指定変異導入法（部位特異的変異導入法）、 Kunkel 法、 dNTP[αS]法（Eckstein) 、亜硫酸や亜硝酸などを用いる領域指定変異導入法等の方法が挙げられる。
【０１１１】
さらに得られた融合タンパク質は、化学的な手法でその含有されるアミノ酸残基を修飾することもできる。更には、ペプチダーゼ、例えばペプシン、キモトリプシン、パパイン、ブロメライン、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼなどの酵素を用いて融合タンパク質を修飾したり、部分分解したりしてその誘導体などにすることができる。
【０１１２】
また精製用タグや移行シグナル配列を融合した融合タンパク質として発現させてもよい。こうした精製用タグや移行シグナル配列を融合した融合タンパク質の産生は遺伝子工学的に常用される融合産生法を用いることができる。精製用タグを融合した融合タンパク質はその精製用タグ部を利用してアフィニティクロマトグラフィーなどで精製することや、前述した酵素固定化層を形成するための固定化タグとしての利用が可能である。
【０１１３】
すなわち本発明の酵素電極における融合タンパク質は、１個以上のアミノ酸残基が同一性の点で酵素１および酵素２の天然のアミノ酸残基と異なるもの、１個以上のアミノ酸残基の位置が天然のものと異なるものであってもよい。融合タンパク質は、酵素１および酵素２の天然のタンパク質に特有なアミノ酸残基が１個以上（例えば、１〜８０個、好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個、特には１〜１０個など）欠けている欠失類縁体でもよい。また、融合タンパク質は、酵素１および酵素２の天然のタンパク質に特有のアミノ酸残基の１個以上が他の残基で置換されている置換類縁体であってもよい。この場合の置換のアミノ酸残基個数は、例えば１〜８０個、好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個、特には１〜１０個とすることができる。
【０１１４】
融合タンパク質は、酵素１および酵素２の天然のタンパク質に特有のアミノ酸残基の１個以上のアミノ酸残基が付加されている付加類縁体であってもよい。この場合の付加されるアミノ酸残基個数は、例えば、１〜８０個、好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個、特には１〜１０個とすることができる。これらの変異は、酵素１および酵素２の天然のタンパク質の特徴であるドメイン構造がそれぞれ維持されたものを含むことができる。また、これらの変異は、融合タンパク質は酵素１および酵素２の天然のタンパク質にそれぞれ実質的に同等の一次構造コンフォメーションあるいはその一部を有しているものも含むことができる。さらにこれらの変異は、酵素１および酵素２の天然のタンパク質と実質的に同等の生物学的活性を有しているものも含むことができる。したがって上記のごとき変異体は、全て本発明の酵素電極における融合タンパク質として使用できる。
【０１１５】
変異型の融合タンパク質として、配列表の配列番号１１、２３、３５、４４、５７、６９、７９、８８、９７、１０６、１１４、１２１、１２８若しくは１３５で示されるアミノ酸配列と高い相同性を有し、酵素１及び２の活性が維持されているものが挙げられる。この相同性としては、70%より高い相同性を有しているものが挙げられる、より好ましくは80%以上、特に好ましくは90%以上の相同アミノ酸配列を有するものが挙げられる。
【０１１６】
また、酵素１及び２の天然のタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡに対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする変異DNAから翻訳される変異融合タンパク質も本発明で使用可能である。このストリンジェントな条件での変異の基準となる塩基配列としては、配列番号１０、２２、３４、４３、５６、６８、７８、８７、９６、１０５、１１３、１２０、１２７及び１３４の塩基配列を挙げることができる。また、このストリンジェントな条件下でハイブリダイズする範囲内の変異は酵素１及び２の活性を損なわないものである。
【０１１７】
さらに、以下の酵素１及び２と実質的に同等の酵素活性を有する変異型融合タンパク質も、本発明の酵素電極における融合タンパク質として使用できる。
酵素１：
配列番号１０、２２、１２７および１３４：グルコースデヒドロゲナーゼ。
配列番号３４、４３、１１３および１２０：アルコールデヒドロゲナーゼ。
配列番号５６および６８：乳酸デヒドロゲナーゼ。
配列番号７８および８７：リンゴ酸デヒドロゲナーゼ。
配列番号９６および１０５：グルタミン酸デヒドロゲナーゼ。
酵素２：
配列番号１０、２２、３４、４３、５６、６８、７８、８７、９６および１０５：ジアフォラーゼ。
配列番号１１３および１２０：アルデヒドデヒドロゲナーゼ。
配列番号１２７および１３４：イソメラーゼ。
【０１１８】
ここで、上記の「ストリンジェントな条件下にハイブリダイズ」するＤＮＡとは、以下に示すＤＮＡをいう。すなわち、
（１）高イオン濃度下に、65℃の温度条件でハイブリダイズさせることにより、上記の基準となる塩基配列に対する相補配列からなるDNAと、変異を含む塩基配列からなるDANが、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成する。
（２）低イオン濃度下に、65℃の温度条件で30分間洗浄したあとでも上記（１）で得られたハイブリッドが維持される。
【０１１９】
なお、上記（１）の高イオン濃度条件は、6×SSC（900mMの塩化ナトリウム、90mMのクエン酸ナトリウム）により得ることができる。また、上記（２）の低イオン濃度条件は、0.1×SSC（15mMの塩化ナトリウム、1.5mMのクエン酸ナトリウム）により得ることあできる。
【０１２０】
具体的には、配列番号１０、２２、３４、４３、５６、６８、７８、８７、９６、１０５、１１３、１２０、１２７若しくは１３４の塩基配列に対して、アミノ酸残基の１または数個が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。この変異も、酵素１及び２の活性を損なわない範囲で行われる。
【０１２１】
酵素１および酵素２の天然のタンパク質と「実質的に同等」とはタンパク質の活性、例えば、触媒活性、生理的な活性、生物学的な活性が実質的に同じであることを意味する。
【０１２２】
アミノ酸の置換、欠失、あるいは挿入は、しばしばポリペプチドの生理的な特性や化学的な特性に大きな変化を生ぜしめない。こうした場合、その置換、欠失、あるいは挿入を施されたポリペプチドは、そうした置換、欠失、あるいは挿入のされていないものと実質的に同一であるとされる。アミノ酸配列中のアミノ酸の実質的に同一な置換体としては、そのアミノ酸が属するところのクラスのうちの他のアミノ酸類から選ぶことができうる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、トリプトファン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンなどが挙げられる。陽電荷をもつアミノ酸（塩基性アミノ酸）としては、アルギニン、リジン、ヒスチジンなどが挙げられ、陰電荷をもつアミノ酸（酸性アミノ酸）としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【０１２３】
本発明の酵素電極における電子伝達メディエーターは、酵素と導電性基体間の電子授受反応を促進し、測定感度・電流密度を高めるために電極系に含有される物質である。この電子伝達メディエーターとしては、上記のような物質である限り特に限定されない。例えば、中心金属とその配位子からなる金属錯体またはそのイオン化物、メタロセン類、フェナジンメトサルフェート、１−メトキシ−フェナジンメトサルフェート、キノン類、フェナジン、フェノチアジン、ビオローゲン、ベンジルビオローゲン、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（DCIP）、メチレンブルー、メルドーラブルー、トルイジンブルー、ガロシアニン、チオニン、ジメチルジスルホン化チオニン、ニューメチレンブルー、ブリリアントクレジルブルー、レソルフィン、アリザリンブリリアントブルー、サフラニン、およびこれらの誘導体などを挙げることができる。
【０１２４】
金属錯体化合物としては、中心金属として、Ｏｓ、Ｆｅ、Ｒｕ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ｖ、Ｍｏ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｐｔ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｓｒ、Ｂａ、Ｔｉ、Ｉｒ、Ｚｎ、Ｃｄ、Ｈｇ、Ｗの内から選ばれる少なくとも１種類を含むものが挙げられる。中心金属への配位子としては、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、１、２、３−または１、２、４−トリアゾール、テトラゾール、２、２’−ビイミダゾール、ピリジン、２、２’−ビチオフェン、２、２’−ビピリジン、２、２’：６’、２''−ターピリジン、エチレンジアミン、ポルフィリン、フタロシアニン、アセチルアセトン、キノリノール、アンモニア、シアンイオン、トリフェニルホスフィンオキサイド、シクロペンタジエニル環およびそれらの誘導体を挙げることができる。
【０１２５】
金属錯体及びそのイオン化物としては、具体的には、オスミウム、ルテニウム、コバルト、ニッケル等の金属とビピリジンとから形成されるビピリジン錯体、フェリシアンイオン、オクタシアノタングステン酸イオン、オクタシアノモリブデン酸イオン等の金属錯体イオンを挙げることができる。
【０１２６】
メタロセン類としては、例えばフェロセン、1,1'- ジメチルフェロセン、フェロセンカルボン酸、フェロセンカルボキシアルデヒド等のフェロセン誘導体を挙げることができる。
【０１２７】
これらの電子メディエーターは本発明の効果を損なわない範囲内でその２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【０１２８】
電子メディエーターは、本発明の酵素電極に全構成成分の０．５〜１０重量％、好適には１〜５重量％含有される。ここで全構成成分とは導電性基体上の酵素固定化層に含まれる成分である。
【０１２９】
本発明の酵素電極に、電子の授受を行なう配線を接続することで各種用途に利用できる酵素電極デバイス（バイオセンサ、燃料電池、および電気化学反応装置）を作製することができる。このデバイスは、上記の板状（あるいは膜状またはの層状）の酵素電極を単層で、あるいは、その複数を用いて構成することができる。その複数を用いる場合は、互いの表面と裏面が対向するように積層配置することができる。なお、複数の場合は、各酵素電極の特性を均一としても、異なる特性の酵素電極の組み合わせが含まれるようにしてもよい。例えば、後述する燃料電池における場合にように、アノードとカソードとが交互に配置されるようにすることができる。このデバイスは、電極を単層から多層へと段数を変更することで、要求される電圧、出力に対応することができる。酵素電極の触媒としての酵素は、一般に電気化学の分野で用いられている貴金属触媒（例えば白金）と比較して、高い基質選択性を有する。そのため、一方の電極と、他方の電極における反応物質を隔離する機構を必要とせず、その結果、デバイスを簡素化することが可能となる。
【０１３０】
本発明の好ましいひとつの形態であるセンサは、本発明にかかる酵素電極を物質を検知するための検知部位として用いる構成を有する。代表的な構成としては、酵素電極を作用電極として、参照電極及び対極とセットで使用し、酵素電極で（電極に固定した酵素の機能により）検知可能な電流を検知する構成を挙げることができる。この電流の有無や量を検知して、これらの電極が接している液体中の物質の有無や量を検出することができる。具体的には図８に示す構成のセンサを挙げることができる。図８のセンサは、作用電極４、白金線対極５、銀塩化銀参照電極６を有して構成され、それぞれの電極にはリード線７、８、９が配線され、ポテンショスタット１０と接続されている。このセンサを、蓋２で密閉可能なウォータージャケットセル１内の試料溶液３の貯溜領域に配置する。作用電極に電位を印加して定常電流を測定することで、電解質中での基質の検出を行うことができる。なお、不活性ガス雰囲気での測定が必要な場合は、ガスチューブ１２の外部末端のガス吹き込み口１１から窒素などの不活性ガスを導入する。また、温度は、温調水流入口１３及び温調水排出口１４を利用した温度調節用の液体の供給により行うことができる。
【０１３１】
本発明の好ましいひとつの形態である燃料電池は、酵素電極をアノードまたはカソードの少なくとも一方として用いることを特徴とする。この場合にも、酵素電極は、板状や層状として単層で、あるいは２以上の層の積層構造として用いることができる。更に、積層構造とした場合に、積層方向にアノードとカソードを所定の配列に配置してもよい。代表的な構成としては、燃料となる物質を含む電解液を貯溜し得る反応槽と、反応槽中に所定の間隔で配置されたアノードとカソードとを有し、このアノード及びカソードの少なくとも一方に本発明にかかる酵素電極を用いた構成を挙げることができる。なお、この燃料電池は電解液を補充あるいは循環させるタイプや、電解液の補充や循環しないタイプとすることができる。この燃料電子は、酵素電極が使用できるものであれば、燃料の種類、構造、機能などは制限されない。この際、酵素電極の触媒として用いられている酵素は、高い基質選択性を有するため、一方の電極と、他方の電極における反応物質を隔離する機構を必要とせず、その結果、デバイスを簡素化することが可能となる。この燃料電池は、電極反応の触媒として用いる酵素に特有の高い触媒作用によって、物質を低い過電圧で酸化還元できることにより、高い駆動電圧を得ることが可能であり、高い安定性、電流密度によって、長寿命、高出力化が可能となる。
【０１３２】
燃料電池の一例を図９に示す。この燃料電池のセルの構成は先に図８に示したセンサでの基質測定用装置とほぼ同一であり、同一部材には同じ番号を付している。図８で示したセンサの代わりに、アノード１５とカソード１６を多孔質ポリプロピレンフィルム１７を介して積層した構成の電極ユニットを用い、チューブ１２を介して酸素ガスをセル内に導入して、燃料電池として作用させる。
【０１３３】
本発明の好ましいひとつの形態である電気化学反応装置では、電極反応の触媒として用いる酵素に特有の基質の高い選択性、触媒能を得ることができる。これに加えて、電気化学反応の特徴である、反応の定量性を更に得ることが可能である。その結果、高選択的、高効率で定量的に制御可能であり、担体と複数のメディエーターを用いた酵素電極による、高い安定性、電流密度によって、長寿命、高出力化が可能となる。この場合にも、酵素電極は、板状や層状として単層で、あるいは２以上の層の積層構造として用いることができる。代表的な構成として、一対の電極と必要に応じて設けられた参照電極とを反応液を貯溜し得る反応層内に配置して、一対に電極間に電流を流して、反応液中の物質に電気化学的反応を起させて目的とする反応生成物、分解物などを得る構成を挙げることができる。この場合、一対の電極の少なくとも一方に本発明にかかる酵素電極を用いることができる。反応液の種類や反応の条件などにかかる装置構成は、酵素電極が利用できるものであれば特に限定されない。例えば、酸化還元反応による反応生成物の取得や、目的とする分解物の取得などに利用できる。
なお、複数種類の酵素から成る反応系に、２つの関連する反応のそれぞれを触媒する以下の酵素１と酵素２を融合した融合タンパク質を用いることが反応効率や反応速度を向上させるために有効である例が知られている。
酵素１：反応基質１から反応生成物１を生じる化学反応を触媒する。
酵素２：反応基質２から反応生成物２を生じる化学反応を触媒する。
【０１３４】
Seoら（Applied and Environmental Microbiology 66(6) 2000, 2484-2490）は、酵素の融合によるUDP-glucoseとglucose-6-phosphateからtrehalose-6-phosphateを経たtrehaloseへの合成反応に対する影響について開示している。ここでは、Trehalose-6-phosphate synthetaseとTrehalose-6-phosphate phosphataseの融合タンパク質を用いている。非特許文献１によれば、この融合タンパク質を用いた場合に、それぞれの酵素を遊離の状態で機能させた場合よりも3.5から4.0倍反応速度が向上している。
【０１３５】
しかしながら、上記文献にて知られていた融合タンパク質については、電極との電子授受は確認されておらず、酵素電極として用いることはできなかった。
そこで、本発明者らは、既述の通り、新規な融合タンパク質の作製を試み、本発明を成すに至っている。
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明の方法は、これらの実施例のみに限定されるものではない。
【実施例】
【０１３６】
（実施例１：Bacillus subtilis由来のグルコースデヒドロゲナーゼ（busGDH）とPseudomonas putida由来のジアフォラーゼ（ppuDp）との融合タンパク質（His-busGDH::ppuDp）[配列番号１０、１１]の調製）
Bacillus subtilis [ATCC 27370]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、８０５ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatGGATCCGtatccggatttaaaaggaaaagtcgtcgct-3' (BamHI) [配列番号１]
5'-aataatAAGCTTaccgcggcctgcctggaatgaaggatattg-3' (HindIII) [配列番号２]
このDNA増幅産物を制限酵素BamHIおよびHind IIIで切断し、pETDuet-1(Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、His-busGDH発現ベクターpETDuet-busGDHを作製する。
【０１３７】
次にPseudomonas putida KT2440 [ATCC 47054]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、７２９ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGcttgtgaatgtactgatcgtccacgctcac-3' (NdeI) [配列番号３]
5'-aataatCTCGAGtcacgtcagcgggtacaacgcttcatcgaa-3' (XhoI) [配列番号４]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pETDuet-busGDHの同じ制限酵素サイトに挿入し、His-busGDH、ppuDp共発現ベクターpETDuet-busGDH-ppuDpを作製する。
【０１３８】
次に、以下の5'末端リン酸化合成オリゴDNAをTEバッファー中で、等量混合し、加熱後徐冷することによってアニーリングする。
5'-AGCTTggcggcggcagcggcggcggcagcCA-3' [配列番号５]
5'-TATggctgccgccgccgctgccgccgccA-3' [配列番号６]
このDNA断片を、pETDuet-busGDH-ppuDpの制限酵素Hind IIIおよびNde Iの認識サイトに挿入し、His-busGDHとppuDpがスペーサー配列GGGSGGGSによって連結された融合タンパク質His-busGDH::ppuDp発現ベクターpETDuet-busGDH::ppuDp [配列番号７]を作製する。
【０１３９】
次にBacillus subtilis [ATCC 27370]のゲノムDNA鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、８０５ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'- aataatCCATGGcgccggatttaaaaggaaaagtcgtcgctattacagga-3' (Nco I) [配列番号８]
5'-aataatAAGCTTaccgcggcctgcctggaatgaaggatattg-3' (HindIII) [配列番号２]
このDNA増幅産物を制限酵素Nco IおよびHind IIIで切断し、pCDFDuet-1 (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、busGDH発現ベクターpCDFDuet-busGDHを作製する。
【０１４０】
次にPseudomonas putida KT2440 [ATCC 47054]のゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、７２９ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGcttgtgaatgtactgatcgtccacgctcac-3' (NdeI) [配列番号３]
5'-aataatCTCGAGtcacgtcagcgggtacaacgcttcatcgaa-3' (XhoI) [配列番号４]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pCDFDuet-busGDHの同じ制限酵素サイトに挿入し、busGDH、ppuDp共発現ベクターpCDFDuet-busGDH-ppuDp [配列番号９]を作製する。
【０１４１】
発現ベクターpETDuet-busGDH::ppuDpおよびpCDFDuet-busGDH-ppuDpにより、常法に従いE.coli BL21(DE3)を形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンおよびストレプトマイシンに対する耐性株として選別することができる。
【０１４２】
得られた形質転換体を抗生物質アンピシリン及びストレプトマイシンを添加したLB培地10mLで一晩プレ・カルチャー（前培養）した。その後、その0.2mLを、100mLのLB-Amp培地に添加し、30℃、170rpmで4時間振とう培養する。その後IPTGを添加 (終濃度 1mM) し、37℃で4~12時間培養を続ける。IPTG 誘導した形質転換体を集菌 (8000×g、 2分、4℃) し、1/10 量の 4℃ PBSに再懸濁する。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心 (8000×g、 10分、4℃)して固形夾雑物を取り除く。目的の発現タンパク質が上清に存在することをSDS-PAGEで確認した後、誘導発現されたHisタグ融合タンパク質をニッケルキレートカラムを用いて精製する。
【０１４３】
（比較例１：対照としてのbusGDHおよびppuDpの調製）
Bacillus subtilis [ATCC 27370]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、約８００ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATatgtatccggatttaaaaggaaaagtcgtcgct-3' (NdeI)[配列番号１２]
5'-aataatCTCGAGaccgcggcctgcctggaatgaaggatattg-3' (XhoI)[配列番号１３]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、busGDH-His発現ベクターpET21-busGDHを作製する。
【０１４４】
次にPseudomonas putida KT2440 [ATCC 47054]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、７２９ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGcttgtgaatgtactgatcgtccacgctcac-3' (NdeI) [配列番号３]
5'-aataatCTCGAGcgtcagcgggtacaacgcttcatcgaa-3' (XhoI) [配列番号１４]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、ppuDp-His発現ベクターpET21-ppuDpを作製する。
【０１４５】
発現ベクターpET21-busGDHおよびpET21-ppuDpをそれぞれ個別に用い、E.coli BL21(DE3)を常法に従い形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンに対する耐性株として選別することができる。
【０１４６】
得られたそれぞれの形質転換体を抗生物質アンピシリンを添加したLB培地10mLで一晩プレ・カルチャーした後、その0.2mLを、100mLのLB-Amp培地に添加し、30℃、170rpmで4時間振とう培養する。その後IPTGを添加 (終濃度 1mM) し、37℃で4~12時間培養を続ける。IPTG 誘導した形質転換体を集菌 (8000×g、 2分、4℃) し、1/10 量の 4℃ PBSに再懸濁する。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心 (8000×g、 10分、4℃)して固形夾雑物を取り除く。目的の発現タンパク質が上清に存在することをSDS-PAGEで確認した後、それぞれの誘導発現されたHisタグ融合タンパク質をニッケルキレートカラムを用いて精製する。
【０１４７】
（実施例２：グルコースセンサー）
図１０および図８を用いて実施例２を説明する。実施例２にかかるセンサーは試料溶液中のグルコースを定量するグルコースセンサーである。実施例２に係るグルコースセンサーの酵素電極部を図１０を用いて説明する。酵素電極部は以下の構成からなる。
【０１４８】
導電性基体２０は直径３ｍｍのグラッシーカーボンである。導電性基体２０上に、融合タンパク質（His-busGDH::ppuDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPoly(ethylene glycol) diglycigyl etherにより架橋されて固定されている。この融合タンパク質は、実施例１で調製したBacillus subtilis由来のグルコースデヒドロゲナーゼ（busGDH）とPseudomonas putida由来のジアフォラーゼ（ppuDp）との融合タンパク質である。なお、Poly(ethylene glycol) diglycigyl ether は以下PEGDEと略称する。
【０１４９】
各成分は、それぞれ、以下の最適の濃度により固定されている。すなわちHis-busGDH::ppuDp（busGDH：０．３ユニット、ppuDp：０．６ユニット）、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０１５０】
この酵素電極部を、図８における作用電極４として用いることによってグルコースセンサーを構成する。対極５は白金線、参照極６は銀／塩化銀電極で構成する。これらの電極は、それぞれポテンショスタット１０を介して電流などを測定する。試料溶液３としては、所定濃度のグルコース、および１ｍM  NADを含む０．１M  PIPES−NaOH緩衝水溶液（ｐH７．５）を用いる。測定温度は、恒温循環槽によって３７℃に保持される。
【０１５１】
前述のグルコースセンサーを用いて次のように定量を行う。作用電極４には参照極６に対して３００ｍVの電位を印加する。このとき、試料溶液３中のグルコースはグルコースデヒドロゲナーゼの存在下でグルコノラクトンに酸化され、この反応でＮＡＤがNADHに還元される。次に前記グルコースデヒドロゲナーゼに融合したジアフォラーゼの存在下でNADHはNADに酸化される。この反応で電子伝達メディエータであるフェロセンが酸化され、フェリシニウムイオンが生成される。（作用電極４には参照極６に対して３００ｍVの電位が印加されているため、）フェリシニウムイオンは作用電極４から電子をうけとりフェロセンに還元される。作用電極４での電子の移動による電流を測定することにより、試料溶液中のグルコース濃度を測定する。
【０１５２】
実施例２における測定結果の傾向の一例を図１１に示す。図１１の実線Ａは、前記作用電極４において測定された還元電流の変化量とグルコース濃度の関係図である。図１１より、還元電流の変化量とグルコース濃度は、良好な比例関係を示すことが確認される。よって実施例２のグルコースセンサーを用いてグルコースを正確に定量できる。
（比較例２：グルコースセンサー）
図１２および図８を用いて比較例２を説明する。比較例２にかかるセンサーは試料溶液中のグルコースを定量するグルコースセンサーである。比較例２に係るグルコースセンサーの酵素電極部を図１２を用いて説明する。
【０１５３】
酵素電極部は以下の構成からなる。導電性基体２０は直径３ｍｍのグラッシーカーボンである。導電性基体２０上にグルコースデヒドロゲナーゼ（busGDH）、ジアフォラーゼ（ppuDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。グルコースデヒドロゲナーゼ（busGDH）は、比較例１で調製したBacillus subtilis由来のグルコースデヒドロゲナーゼである。ジアフォラーゼ（ppuDp）は、Pseudomonas putida由来のジアフォラーゼである。各成分は各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により固定されている。すなわちbusGDH：０．３ユニット、ppuDp：０．６ユニット、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０１５４】
この酵素電極部を、図８における作用電極４として用いることによってグルコースセンサーを構成し、実施例２と同様に、測定すると、図１１のＢの傾向を示す。
【０１５５】
実施例２と比較例２から、実施例２のグルコースセンサーの方が、比較例２のグルコースセンサーよりも、グルコース濃度に対する感度が高く、より低濃度のグルコースを定量出来ることが明らかとなった。酵素電極上に固定されているグルコースデヒドロゲナーゼ及びジアフォラーゼの量は同じにもかかわらず、実施例２の酵素電極においては、グルコースデヒドロゲナーゼとジアフォラーゼが融合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、NAD／NADHを介した両酵素間の電子授受が速やかに行われるためと考えられる。
【０１５６】
（実施例３：グルコース燃料電池）
図１０及び図９を用いて実施例３を説明する。実施例３にかかる燃料電池はグルコースを燃料とするグルコース燃料電池である。実施例３に係るグルコース燃料電池のアノード電極部を図１０を用いて説明する、アノード電極部は以下の構成からなる。
【０１５７】
導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンである。導電性基体２０上に実施例１で調製した融合タンパク質（His-busGDH::ppuDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。各成分は、各成分は、それぞれ以下の最適の濃度比により導電性基体２０上に固定されている。His-busGDH::ppuDp（busGDH：０．３ユニット、ppuDp：０．６ユニット）、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０１５８】
実施例３に係るグルコース燃料電池のカソード電極１６は０．５ｃｍ2の白金板からなる。電解質溶液３は、１００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭグルコース、および１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）である。
前記アノード電極１５とカソード電極１６は、間に多孔質ポリプロピレンフィルム（厚さ２０μｍ）１７を挟んで配置され、これを蓋２付のウォータージャケットセル１中の前記電解液溶液３中（１０ｍＬ）に配置する。測定温度は、恒温循環槽によって３７℃に保持される。それぞれのリードをポテンショスタット（東方技研、モデル２０００）１０に接続し、−１．２Ｖから０．１Ｖまで電圧を変化させ、電圧−電流特性を測定した。
短絡電流密度：９８７μＡ／ｃｍ2
最大電力：１００μＷ／ｃｍ2
の電池出力が観測される。
【０１５９】
（比較例３：グルコース燃料電池）
図１２及び図９を用いて比較例３を説明する。比較例３にかかる燃料電池はグルコースを燃料とするグルコース燃料電池である。比較例３に係るグルコース燃料電池のアノード電極部を図１２を用いて説明する、アノード電極部は以下の構成からなる。
【０１６０】
導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンである。導電性基体２０上にグルコースデヒドロゲナーゼ（busGDH）、ジアフォラーゼ（ppuDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。グルコースデヒドロゲナーゼ（busGDH）は、比較例１で調製したBacillus subtilis由来のグルコースデヒドロゲナーゼである。ジアフォラーゼ（ppuDp）は、Pseudomonas putida由来のジアフォラーゼである。各成分は、各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により導電性基体２０上に固定されている。すなわち、busGDH：０．３ユニット、ppuDp：０．６ユニット、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０１６１】
実施例３と同様に、電圧−電流特性を測定した。
短絡電流密度：２９６μＡ／ｃｍ2
最大電力：３１μＷ／ｃｍ2
の電池出力が観測される。
【０１６２】
実施例３と比較例３から、実施例３のグルコース燃料電池の方が、比較例３のグルコース燃料電池よりも、電流密度が高く、より大きな電流を取り出せることが明らかとなった。酵素電極上に固定されているグルコースデヒドロゲナーゼ及びジアフォラーゼの量は同じであるにもかかわらず、実施例３の燃料電池においては、グルコースデヒドロゲナーゼとジアフォラーゼが融合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、NAD／NADHを介した両酵素間の電子授受が速やかに行われるためと考えられた。
【０１６３】
（実施例４：グルコース電気化学反応装置）
図１０および図８を用いて実施例４を説明する。実施例４にかかる電気化学反応装置はグルコースを基質としてグルコノラクトンを生産するグルコース電気化学反応装置である。
実施例４に係るグルコース電気化学反応装置の酵素電極部を図１０を用いて説明する。酵素電極部は以下の構成からなる。導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンである。導電性基体２０上に実施例１で調製した融合タンパク質（His-busGDH::ppuDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。各成分は、各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により固定されている。すなわちHis-busGDH::ppuDp（busGDH：０．３ユニット、ppuDp：０．６ユニット）、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０１６４】
この酵素電極を図８における作用電極４として用いることによってグルコース電気化学反応装置を構成する。銀塩化銀電極を参照電極６に、白金線を対極５とした三極セルを構成する。１００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭグルコース、および１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）電解液を試料溶液３として使用する。恒温循環槽によって３７℃に保持し、ウォータージャケットセル１中窒素雰囲気下０．３ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌの電位を１００分間印加し、生成物を高速液体クロマトグラフィーで定量する。
【０１６５】
反応電解液からは、グルコノラクトンが検出され、反応電荷量と、生成グルコノラクトン量には、高い相関関係があり、反応が定量的に進行することがわかる。
【０１６６】
（比較例４：グルコース電気化学反応装置）
図１２および図８を用いて比較例４を説明する。比較例４にかかる電気化学反応装置はグルコースを基質としてグルコノラクトンを生産するグルコース電気化学反応装置である。比較例４にかかるグルコース電気化学反応装置の酵素電極部を図１２を用いて説明する。
【０１６７】
酵素電極部は以下の構成からなる。導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンである。導電性基体２０上にグルコースデヒドロゲナーゼ（busGDH）、ジアフォラーゼ（ppuDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。グルコースデヒドロゲナーゼ（busGDH）は比較例１で調製したBacillus subtilis由来のグルコースデヒドロゲナーゼである。ジアフォラーゼ（ppuDp）は、Pseudomonas putida由来のジアフォラーゼである。各成分は、各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により固定されている。すなわちbusGDH：０．３ユニット、ppuDp：０．６ユニット、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０１６８】
この酵素電極を、実施例４と同様に、生成物を高速液体クロマトグラフィーで定量する。
【０１６９】
反応電解液からは、グルコノラクトンが検出され、反応電荷量と、生成グルコノラクトン量には、高い相関関係があり、反応が定量的に進行することがわかる。しかしながら実施例４の場合よりも単位時間あたりの反応電荷量は小さい値であることがわかる。実施例４と比較例４から、実施例４のグルコース電気化学反応装置の方が、比較例４のグルコース電気化学反応装置よりも、単位時間あたりの反応電荷量が高く、より効率的にグルコースをグルコノラクトンに変換出来ることが明らかとなる。酵素電極上に固定されているグルコースデヒドロゲナーゼ及びジアフォラーゼの量は同じにもかかわらず、実施例４の電気化学反応装置においては、グルコースデヒドロゲナーゼとジアフォラーゼが融合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、NAD／NADHを介した両酵素間の電子授受が速やかに行われるためと考えられた。
（実施例５：Pyrococcus furiosus由来のグルコースデヒドロゲナーゼ（pfuGDH）とPyrococcus horikoshii由来のジアフォラーゼ（phoDp）との融合タンパク質（His-pfuGDH::phoDp）[配列番号２２、２３]の調製）
Pyrococcus furiosus [ATCC 43587]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、７９９ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatGGATCCGaacattttaataacagcttcttcaagagga-3' (BamHI) [配列番号１５]
5'-aataatAAGCTTaagaagaacgctcctagtcattgctccatc-3' (HindIII) [配列番号１６]
このDNA増幅産物を制限酵素BamHIおよびHind IIIで切断し、pETDuet-1(Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、His-pfuGDH発現ベクターpETDuet-pfuGDHを作製する。
【０１７０】
次にPyrococcus horikoshii KT2440 [ATCC 700860]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１３４４ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGaagatagtagttataggatctggaactgct-3' (NdeI) [配列番号１７]
5'-aataatCTCGAGtcatgacttaaattttctcatggccatttc-3' (XhoI) [配列番号１８]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pETDuet-pfuGDHの同じ制限酵素サイトに挿入し、His-pfuGDH、phoDp共発現ベクターpETDuet-pfuGDH-phoDpを作製する。
【０１７１】
次に、以下の5'末端リン酸化合成オリゴDNAをTEバッファー中で、等量混合し、加熱後徐冷することによってアニーリングする。
5'-AGCTTggcggcggcagcggcggcggcagcCA-3' [配列番号５]
5'-TATggctgccgccgccgctgccgccgccA-3' [配列番号６]
このDNA断片を、pETDuet-pfuGDH-phoDpの制限酵素Hind IIIおよびNde Iの認識サイトに挿入する。このことによって、His-pfuGDHとphoDpがスペーサー配列GGGSGGGSによって連結された融合タンパク質His-pfuGDH::phoDp発現ベクターpETDuet-pfuGDH::phoDp [配列番号１９]を作製する。
【０１７２】
次にPyrococcus furiosus [ATCC 43587]のゲノムDNA鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、７９７ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'- aataatCCATGGcgattttaataacagcttcttcaagaggaataggcttc-3' (Nco I) [配列番号２０]
5'-aataatAAGCTTaagaagaacgctcctagtcattgctccatc-3' (HindIII) [配列番号１６]
このDNA増幅産物を制限酵素Nco IおよびHind IIIで切断し、pCDFDuet-1 (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、pfuGDH発現ベクターpCDFDuet-pfuGDHを作製する。
【０１７３】
次にPyrococcus horikoshii KT2440 [ATCC 700860]のゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１３４４ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGaagatagtagttataggatctggaactgct-3' (NdeI) [配列番号１７]
5'-aataatCTCGAGtcatgacttaaattttctcatggccatttc-3' (XhoI) [配列番号１８]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde I及びXho Iで切断し、pCDFDuet-pfuGDHの同じ制限酵素サイトに挿入し、pfuGDH、phoDp共発現ベクターpCDFDuet-pfuGDH-phoDp [配列番号２１]を作製する。
【０１７４】
発現ベクターpETDuet-pfuGDH::phoDpおよびpCDFDuet-pfuGDH-phoDpを用い、常法に従いE.coli BL21(DE3)を形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンおよびストレプトマイシンに対する耐性株として選別することができる。
【０１７５】
得られた形質転換体を抗生物質アンピシリン及びストレプトマイシンを添加したLB培地10mLで一晩プレ・カルチャーした後、その0.2mLを、100mLのLB-Amp培地に添加し、30℃、170rpmで4時間振とう培養する。その後IPTGを添加 (終濃度 1mM) し、37℃で4~12時間培養を続ける。IPTG 誘導した形質転換体を集菌 (8000×g、 2分、4℃) し、1/10 量の 4℃ PBSに再懸濁する。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心 (8000×g、 10分、4℃)して固形夾雑物を取り除く。目的の発現タンパク質が上清に存在することをSDS-PAGEで確認した後、誘導発現されたHisタグ融合タンパク質をニッケルキレートカラムを用いて精製する。
【０１７６】
こうして得られた融合タンパク質は、例えばグルコースセンサー、グルコース燃料電池、グルコース電気化学反応装置、に適用できる。
（比較例５：対照としてのpfuGDHおよびphoDpの調製）
Pyrococcus furiosus [ATCC 43587]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、約８００ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATatgaacattttaataacagcttcttcaagagga-3' (NdeI)[配列番号２４]
5'-aataatCTCGAGaagaagaacgctcctagtcattgctccatc-3' (XhoI)[配列番号２５]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、pfuGDH-His発現ベクターpET21-pfuGDHを作製する。
【０１７７】
次にPyrococcus horikoshii KT2440 [ATCC 700860]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１３４４ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGaagatagtagttataggatctggaactgct-3' (NdeI) [配列番号１７]
5'-aataatCTCGAGtgacttaaattttctcatggccatttc-3' (XhoI) [配列番号２６]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、phoDp-His発現ベクターpET21-phoDpを作製する。
【０１７８】
発現ベクターpET21-pfuGDHおよびpET21-phoDpをそれぞれ個別に用い、E.coli BL21(DE3)を常法に従い形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンに対する耐性株として選別することができる。
【０１７９】
得られたそれぞれの形質転換体を抗生物質アンピシリンを添加したLB培地10mLで一晩プレ・カルチャーした後、その0.2mLを、100mLのLB-Amp培地に添加し、30℃、170rpmで4時間振とう培養する。その後、実施例５と同様に精製する。
（実施例６：グルコースセンサー）
図１０および図８を用いて実施例２を説明する。実施例２にかかるセンサーは試料溶液中のグルコースを定量するグルコースセンサーである。実施例６に係るグルコースセンサーの酵素電極部を図１０を用いて説明する。酵素電極部は以下の構成からなる。
【０１８０】
導電性基体２０は直径３ｍｍのグラッシーカーボンである。導電性基体２０上に実施例５で調製した融合タンパク質（His-pfuGDH::phoDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。各成分は各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により固定されている。すなわちHis-pfuGDH::phoDp（pfuGDH：０．３ユニット、phoDp：０．６ユニット）、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０１８１】
この酵素電極部を、実施例２と同様に測定する。図１１のＣの傾向を示す。すなわち、Ａよりも傾きが大きい。
（比較例６：グルコースセンサー）
図１２および図８を用いて比較例６を説明する。比較例６にかかるセンサーは試料溶液中のグルコースを定量するグルコースセンサーである。比較例６に係るグルコースセンサーの酵素電極部を図１２を用いて説明する。
【０１８２】
酵素電極部は以下の構成からなる。導電性基体２０は直径３ｍｍのグラッシーカーボンである。導電性基体２０上にグルコースデヒドロゲナーゼ（pfuGDH）、Pyrococcus horikoshii由来のジアフォラーゼ（phoDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。グルコースデヒドロゲナーゼ（pfuGDH）は、比較例５で調製したPyrococcus furiosus由来のグルコースデヒドロゲナーゼである。各成分は、各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により固定されている。すなわちpfuGDH：０．３ユニット、phoDp：０．６ユニット、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０１８３】
この酵素電極部を、実施例６と同様に測定する。図１１のＤの傾向を示す。傾きとしてＢよりも大きくなる。
（実施例７：グルコース燃料電池）
図１０及び図９を用いて実施例7を説明する。実施例7にかかる燃料電池はグルコースを燃料とするグルコース燃料電池である。実施例７に係るグルコース燃料電池のアノード電極部を図１０を用いて説明する、アノード電極部は以下の構成からなる。
【０１８４】
導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンである。導電性基体２０上に実施例５で調製した融合タンパク質（His-pfuGDH::phoDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。各成分は、各成分は、それぞれ以下の最適の濃度比により導電性基体２０上に固定されている。すなわち、His-pfuGDH::phoDp（pfuGDH：０．３ユニット、phoDp：０．６ユニット）、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０１８５】
実施例7に係るグルコース燃料電池のカソード電極１６は０．５ｃｍ2の白金板からなる。電解質溶液３は、１００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭグルコース、および１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）である。アノード電極１５とカソード電極１６は、間に多孔質ポリプロピレンフィルム（厚さ２０μｍ）１７を挟んで配置され、これを蓋２付のウォータージャケットセル１中の前記電解液溶液３中（１０ｍＬ）に配置する。測定温度は、恒温循環槽によって7５℃に保持される。それぞれのリードをポテンショスタット（東方技研、モデル２０００）１０に接続し、−１．２Ｖから０．１Ｖまで電圧を変化させ、電圧−電流特性を測定した。
短絡電流密度：１３２０μＡ／ｃｍ2
最大電力：７０１２５μＷ／ｃｍ2
の電池出力が観測される。
（比較例７：グルコース燃料電池）
図１２及び図９を用いて比較例７を説明する。比較例７にかかる燃料電池はグルコースを燃料とするグルコース燃料電池である。比較例７に係るグルコース燃料電池のアノード電極部を図１２を用いて説明する、アノード電極部は以下の構成からなる。
【０１８６】
導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンである。導電性基体２０上にグルコースデヒドロゲナーゼ（pfuGDH）、Pyrococcus horikoshii由来のジアフォラーゼ（phoDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。グルコースデヒドロゲナーゼ（pfuGDH）は比較例５で調製したPyrococcus furiosus由来のグルコースデヒドロゲナーゼである。各成分は各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により導電性基体２０上に固定されている。すなわち、pfuGDH：０．３ユニット、phoDp：０．６ユニット、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０１８７】
比較例７に係るグルコース燃料電池について、実施例７と同様に測定する。
短絡電流密度：４２２μＡ／ｃｍ2
最大電力：４０μＷ／ｃｍ2
の電池出力が観測される。
【０１８８】
実施例７と比較例７から、実施例７のグルコース燃料電池の方が、比較例７のグルコース燃料電池よりも、電流密度が高く、より大きな電流を取り出せることが明らかとなった。酵素電極上に固定されているグルコースデヒドロゲナーゼ及びジアフォラーゼの量は同じであるにもかかわらず、実施例７の燃料電池においては、グルコースデヒドロゲナーゼとジアフォラーゼが融合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、NAD／NADHを介した両酵素間の電子授受が速やかに行われるためと考えられた。
【０１８９】
（実施例８：グルコース電気化学反応装置）
図１０および図８を用いて実施例８を説明する。実施例８にかかる電気化学反応装置はグルコースを基質としてグルコノラクトンを生産するグルコース電気化学反応装置である。実施例８に係るグルコース電気化学反応装置の酵素電極部を図１０を用いて説明する。酵素電極部は以下の構成からなる。
【０１９０】
導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンである。導電性基体２０上に実施例５で調製した融合タンパク質（His-pfuGDH::phoDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。各成分は、各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により固定されている。すなわちHis-pfuGDH::phoDp（pfuGDH：０．３ユニット、phoDp：０．６ユニット）、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０１９１】
この酵素電極を用いて、実施例４と同様に、生成物を高速液体クロマトグラフィーで定量する。反応電解液からは、グルコノラクトンが検出され、反応電荷量と、生成グルコノラクトン量には、高い相関関係があり、反応が定量的に進行することがわかる。
【０１９２】
（比較例８：グルコース電気化学反応装置）
図１２および図８を用いて比較例８を説明する。比較例８にかかる電気化学反応装置はグルコースを基質としてグルコノラクトンを生産するグルコース電気化学反応装置である。比較例８にかかるグルコース電気化学反応装置の酵素電極部を図１２を用いて説明する。酵素電極部は以下の構成からなる。
【０１９３】
導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンである。導電性基体２０上にグルコースデヒドロゲナーゼ（pfuGDH）、Pyrococcus horikoshii由来のジアフォラーゼ（phoDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。グルコースデヒドロゲナーゼ（pfuGDH）は、比較例５で調製したPyrococcus furiosus由来のグルコースデヒドロゲナーゼである。各成分は、各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により固定されている。すなわちpfuGDH：０．３ユニット、phoDp：０．６ユニット、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０１９４】
この酵素電極を用いて、実施例８と同様に、生成物を高速液体クロマトグラフィーで定量する。
【０１９５】
反応電解液からは、グルコノラクトンが検出され、反応電荷量と、生成グルコノラクトン量には、高い相関関係があり、反応が定量的に進行することがわかる。しかしながら実施例８の場合よりも単位時間あたりの反応電荷量は小さい値であることがわかる。
【０１９６】
実施例８と比較例８から、実施例８のグルコース電気化学反応装置の方が、比較例８のグルコース電気化学反応装置よりも、単位時間あたりの反応電荷量が高く、より効率的にグルコースをグルコノラクトンに変換出来ることが明らかとなる。酵素電極上に固定されているグルコースデヒドロゲナーゼ及びジアフォラーゼの量は同じであるにもかかわらず、実施例８の電気化学反応装置においては、グルコースデヒドロゲナーゼとジアフォラーゼが融合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、NAD／NADHを介した両酵素間の電子授受が速やかに行われるためと考えられた。
（実施例９：Saccharomyces cerevisiae由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（sceADH）とPseudomonas putida由来のジアフォラーゼ（ppuDp）との融合タンパク質（His-sceADH::ppuDp）[配列番号３６、３７]の調製）
Saccharomyces cerevisiae [ATCC 47058]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１０７５ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatGGATCCGccttcgcaagtcattcctgaaaaacaaaag-3' (BamHI) [配列番号２７]
5'-aataatAAGCTTtttagaagtctcaacaacatatctaccaac-3' (HindIII) [配列番号２８]
このDNA増幅産物を制限酵素BamHIおよびHind IIIで切断し、pETDuet-1(Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、His-sceADH発現ベクターpETDuet-sceADHを作製する。
【０１９７】
次にPseudomonas putida KT2440 [ATCC 47054]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、７２９ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGcttgtgaatgtactgatcgtccacgctcac-3' (NdeI) [配列番号３]
5'-aataatCTCGAGtcacgtcagcgggtacaacgcttcatcgaa-3' (XhoI) [配列番号４]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pETDuet-sceADHの同じ制限酵素サイトに挿入し、His-sceADH、ppuDp共発現ベクターpETDuet-sceADH-ppuDpを作製する。
【０１９８】
次に、以下の5'末端リン酸化合成オリゴDNAをTEバッファー中で、等量混合し、加熱後徐冷することによってアニーリングする。
5'-AGCTTagcggcggcagcggcagcggcggcagcggcCA-3' [配列番号２９]
5'-TATGgccgctgccgccgctgccgctgccgccgctA-3' [配列番号３０]
このDNA断片を、pETDuet-sceADH-ppuDpの制限酵素Hind IIIおよびNde Iの認識サイトに挿入し、His-sceADHとppuDpがスペーサー配列SGGSGSGGSGによって連結された融合タンパク質His-sceADH::ppuDp発現ベクターpETDuet-sceADH::ppuDp [配列番号３１]を作製する。
【０１９９】
次にSaccharomyces cerevisiae [ATCC 47058]のゲノムDNA鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１０７３ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'- aataatCCATGGcgtcgcaagtcattcctgaaaaacaaaaggct-3' (Nco I) [配列番号３２]
5'-aataatAAGCTTtttagaagtctcaacaacatatctaccaac-3' (HindIII) [配列番号２８]
このDNA増幅産物を制限酵素Nco IおよびHind IIIで切断し、pCDFDuet-1 (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、sceADH発現ベクターpCDFDuet-sceADHを作製する。
【０２００】
次にPseudomonas putida KT2440 [ATCC 47054]のゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、７２９ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGcttgtgaatgtactgatcgtccacgctcac-3' (NdeI) [配列番号３]
5'-aataatCTCGAGtcacgtcagcgggtacaacgcttcatcgaa-3' (XhoI) [配列番号４]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pCDFDuet-sceADHの同じ制限酵素サイトに挿入し、sceADH、ppuDp共発現ベクターpCDFDuet-sceADH-ppuDp [配列番号３３]を作製する。
【０２０１】
発現ベクターpETDuet-sceADH::ppuDpおよびpCDFDuet-sceADH-ppuDpを用い、常法に従いE.coli BL21(DE3)を形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンおよびストレプトマイシンに対する耐性株として選別することができる。
【０２０２】
得られた形質転換体を抗生物質アンピシリン及びストレプトマイシンを添加したLB培地10mLで一晩プレ・カルチャーした後、その0.2mLを、100mLのLB-Amp培地に添加し、30℃、170rpmで4時間振とう培養する。その後IPTGを添加 (終濃度 1mM) し、37℃で4~12時間培養を続ける。IPTG 誘導した形質転換体を集菌 (8000×g、 2分、4℃) し、1/10 量の 4℃ PBSに再懸濁する。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心 (8000×g、 10分、4℃)して固形夾雑物を取り除く。目的の発現タンパク質が上清に存在することをSDS-PAGEで確認した後、誘導発現されたHisタグ融合タンパク質をニッケルキレートカラムを用いて精製する。
（比較例９：対照としてのsceADHおよびppuDpの調製）
Saccharomyces cerevisiae [ATCC 47058]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、約１０７４ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATatgccttcgcaagtcattcctgaaaaacaaaag-3' (NdeI)[配列番号３６]
5'-aataatCTCGAGtttagaagtctcaacaacatatctaccaac-3' (XhoI)[配列番号３７]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、sceADH-His発現ベクターpET21-sceADHを作製する。
【０２０３】
次にPseudomonas putida KT2440 [ATCC 47054]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、７２９ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGcttgtgaatgtactgatcgtccacgctcac-3' (NdeI) [配列番号３]
5'-aataatCTCGAGcgtcagcgggtacaacgcttcatcgaa-3' (XhoI) [配列番号１４]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、ppuDp-His発現ベクターpET21-ppuDpを作製する。
【０２０４】
発現ベクターpET21-sceADHおよびpET21-ppuDpをそれぞれ個別に用い、E.coli BL21(DE3)を常法に従い形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンに対する耐性株として選別することができる。
【０２０５】
得られたそれぞれの形質転換体を抗生物質アンピシリンを添加したLB培地10mLで一晩プレ・カルチャーした後、その0.2mLを、100mLのLB-Amp培地に添加し、30℃、170rpmで4時間振とう培養する。その後IPTGを添加 (終濃度 1mM) し、37℃で4~12時間培養を続ける。IPTG 誘導した形質転換体を集菌 (8000×g、 2分、4℃) し、1/10 量の 4℃ PBSに再懸濁する。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心 (8000×g、 10分、4℃)して固形夾雑物を取り除く。目的の発現タンパク質が上清に存在することをSDS-PAGEで確認した後、それぞれの誘導発現されたHisタグ融合タンパク質をニッケルキレートカラムを用いて精製する。
（実施例１０：アルコールセンサー）
図１６および図８を用いて実施例１０を説明する。実施例１０にかかるセンサーは試料溶液中のアルコールを定量するアルコールセンサーである。実施例１０に係るアルコールセンサーの酵素電極部を図１６を用いて説明する。酵素電極部は以下の構成からなる。
【０２０６】
導電性基体２０は直径３ｍｍのグラッシーカーボンである。導電性基体２０上に実施例９で調製した融合タンパク質（His-sceADH::ppuDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。各成分は、各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により固定されている。すなわちHis-sceADH::ppuDp（sceADH：０．３ユニット、ppuDp：０．６ユニット）、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０２０７】
この酵素電極部を、図８における作用電極４として用いることによってアルコールセンサーを構成する。対極５は白金線、参照極６は銀／塩化銀電極で構成する。これらの電極は、それぞれポテンショスタット１０を介して電流などを測定する。試料溶液３としては、所定濃度のアルコール（エタノール）、および１ｍM  NADを含む０．１M  PIPES−NaOH緩衝水溶液（ｐH７．５）を用いる。測定温度は、恒温循環槽によって３７℃に保持される。
【０２０８】
前述のアルコールセンサーを用いて次のように定量を行う。作用電極４には参照極６に対して３００ｍVの電位を印加する。このとき、試料溶液３中のアルコールはアルコールデヒドロゲナーゼの存在下でアセトアルデヒドに酸化され、この反応でＮＡＤがNADHに還元される。次に前記アルコールデヒドロゲナーゼに融合したジアフォラーゼの存在下でNADHはNADに酸化され、この反応で電子伝達メディエータであるフェロセンが酸化され、フェリシニウムイオンが生成される。（作用電極４には参照極６に対して３００ｍVの電位が印加されているため、）フェリシニウムイオンは作用電極４から電子をうけとりフェロセンに還元される。作用電極４での電子の移動による電流を測定することにより、試料溶液中のアルコール濃度を測定する。
【０２０９】
（比較例１０：アルコールセンサー）
図１８および図８を用いて比較例１０を説明する。比較例１０にかかるセンサーは試料溶液中のアルコールを定量するアルコールセンサーである。比較例１０に係るアルコールセンサーの酵素電極部を図１８を用いて説明する。酵素電極部は以下の構成からなる。
【０２１０】
導電性基体２０は直径３ｍｍのグラッシーカーボンである。導電性基体２０上にアルコールデヒドロゲナーゼ（sceADH）、Pseudomonas putida由来のジアフォラーゼ（ppuDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。アルコールデヒドロゲナーゼ（sceADH）は比較例９で調製したSaccharomyces cerevisiae由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（sceADH）である。各成分は、各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により固定されている。すなわちsceADH：０．３ユニット、ppuDp：０．６ユニット、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０２１１】
この酵素電極部を用いて、アルコールセンサーを構成して実施例１０と同様に測定を行うと、実施例１０のセンサーと比較例１０のセンサー感度の相違は、図１１のＡとＢの関係に類似する。
【０２１２】
（実施例１１：アルコール燃料電池）
図１６及び図９を用いて実施例１１を説明する。実施例１１にかかる燃料電池はアルコールを燃料とするアルコール燃料電池である。実施例１１に係るアルコール燃料電池のアノード電極部を図１６を用いて説明する、アノード電極部は以下の構成からなる。
【０２１３】
導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンである。導電性基体２０上に実施例９で調製した融合タンパク質（His-sceADH::ppuDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。各成分は、各成分は、それぞれ以下の最適の濃度比により導電性基体２０上に固定されている。すなわち、His-sceADH::ppuDp（sceADH：０．３ユニット、ppuDp：０．６ユニット）、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０２１４】
実施例１１に係るアルコール燃料電池のカソード電極１６は０．５ｃｍ2の白金板からなる。電解質溶液３は、１００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭアルコール（エタノール）、および１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）である。アノード電極１５とカソード電極１６は、間に多孔質ポリプロピレンフィルム（厚さ２０μｍ）１７を挟んで配置され、これを蓋２付のウォータージャケットセル１中の前記電解液溶液３中（１０ｍＬ）に配置する。測定温度は、恒温循環槽によって３７℃に保持される。それぞれのリードをポテンショスタット（東方技研、モデル２０００）１０に接続し、−１．２Ｖから０．１Ｖまで電圧を変化させ、電圧−電流特性を測定した。
短絡電流密度：８２０μＡ／ｃｍ2
最大電力：７９μＷ／ｃｍ2
の電池出力が観測される。
（比較例１１：アルコール燃料電池）
図１８及び図９を用いて比較例１１を説明する。比較例１１にかかる燃料電池はアルコールを燃料とするアルコール燃料電池である。比較例１１に係るアルコール燃料電池のアノード電極部を図１８を用いて説明する、アノード電極部は以下の構成からなる。
【０２１５】
導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンである。導電性基体２０上にアルコールデヒドロゲナーゼ（sceADH）、Pseudomonas putida由来のジアフォラーゼ（ppuDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。アルコールデヒドロゲナーゼ（sceADH）は、比較例９で調製したSaccharomyces cerevisiae由来のアルコールデヒドロゲナーゼである。各成分は、各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により導電性基体２０上に固定されている。すなわち、sceADH：０．３ユニット、ppuDp：０．６ユニット、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。実施例１１と同様にして、電圧−電流特性を測定した。
短絡電流密度：２４５μＡ／ｃｍ2
最大電力：２４μＷ／ｃｍ2
の電池出力が観測される。
【０２１６】
実施例１１と比較例１１から、実施例１１のアルコール燃料電池の方が、比較例１１のアルコール燃料電池よりも、電流密度が高く、より大きな電流を取り出せることが明らかとなった。酵素電極上に固定されているアルコールデヒドロゲナーゼ及びジアフォラーゼの量は同じであるにもかかわらず、実施例１１の燃料電池においては、アルコールデヒドロゲナーゼとジアフォラーゼが融合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、NAD／NADHを介した両酵素間の電子授受が速やかに行われるためと考えられた。
【０２１７】
（実施例１２：アルコール電気化学反応装置）
図１６および図８を用いて実施例１２を説明する。実施例１２にかかる電気化学反応装置はアルコール（エタノール）を基質としてアセトアルデヒドを生産するアルコール電気化学反応装置である。実施例１２に係るアルコール電気化学反応装置の酵素電極部を図１６を用いて説明する。酵素電極部は以下の構成からなる。
【０２１８】
導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンである。導電性基体２０上に実施例９で調製した融合タンパク質（His-sceADH::ppuDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。各成分は、各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により固定されている。すなわちHis-sceADH::ppuDp（sceADH：０．３ユニット、ppuDp：０．６ユニット）、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０２１９】
この酵素電極を図８における作用電極４として用いることによってアルコール電気化学反応装置を構成する。銀塩化銀電極を参照電極６に、白金線を対極５とした三極セルを構成する。１００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭアルコール、および１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）電解液を試料溶液３として使用する。恒温循環槽によって３７℃に保持し、ウォータージャケットセル１中窒素雰囲気下０．３ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌの電位を１００分間印加し、生成物を高速液体クロマトグラフィーで定量する。反応電解液からは、アセトアルデヒドが検出され、反応電荷量と、生成アセトアルデヒド量には、高い相関関係があり、反応が定量的に進行することがわかる。
（比較例１２：アルコール電気化学反応装置）
図１８および図８を用いて比較例１２を説明する。比較例４にかかる電気化学反応装置はアルコール（エタノール）を基質としてアセトアルデヒドを生産するアルコール電気化学反応装置である。比較例１２にかかるアルコール電気化学反応装置の酵素電極部を図１８を用いて説明する。酵素電極部は以下の構成からなる。
【０２２０】
導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンである。導電性基体２０上にアルコールデヒドロゲナーゼ（sceADH）、Pseudomonas putida由来のジアフォラーゼ（ppuDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。アルコールデヒドロゲナーゼ（sceADH）は、比較例９で調製したSaccharomyces cerevisiae由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（sceADH）である。各成分は、各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により固定されている。すなわちsceADH：０．３ユニット、ppuDp：０．６ユニット、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０２２１】
この酵素電極を用いて、実施例１２と同様に、生成物を高速液体クロマトグラフィーで定量する。
【０２２２】
反応電解液からは、アセトアルデヒドが検出され、反応電荷量と、生成アセトアルデヒド量には、高い相関関係があり、反応が定量的に進行することがわかる。しかしながら実施例１２の場合よりも単位時間あたりの反応電荷量は小さい値であることがわかる。
【０２２３】
実施例１２と比較例１２から、実施例１２のアルコール電気化学反応装置の方が、比較例１２のアルコール電気化学反応装置よりも、単位時間あたりの反応電荷量が高く、より効率的にアルコールをアセトアルデヒドに変換出来ることが明らかとなる。酵素電極上に固定されているアルコールデヒドロゲナーゼ及びジアフォラーゼの量は同じにもかかわらず、実施例１２の電気化学反応装置においては、アルコールデヒドロゲナーゼとジアフォラーゼが融合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、NAD／NADHを介した両酵素間の電子授受が速やかに行われるためと考えられた。
（実施例１３：Pyrococcus furiosus由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（pfuADH）とPyrococcus horikoshii由来のジアフォラーゼ（phoDp）との融合タンパク質（His-pfuADH::phoDp）[配列番号４３、４４]の調製）
Pyrococcus furiosus [ATCC 43587]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１１４７ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatGGATCCGtttttcctaaagactaagattatcgaggga-3' (BamHI) [配列番号３８]
5'-aataatAAGCTTatctccatagaaggccctctcataaattct-3' (HindIII) [配列番号３９]
このDNA増幅産物を制限酵素BamHIおよびHind IIIで切断し、pETDuet-1(Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、His-pfuADH発現ベクターpETDuet-pfuADHを作製する。
【０２２４】
次にPyrococcus horikoshii KT2440 [ATCC 700860]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１３４４ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGaagatagtagttataggatctggaactgct-3' (NdeI) [配列番号１７]
5'-aataatCTCGAGtcatgacttaaattttctcatggccatttc-3' (XhoI) [配列番号１８]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pETDuet-pfuADHの同じ制限酵素サイトに挿入し、His-pfuADH、phoDp共発現ベクターpETDuet-pfuADH-phoDpを作製する。
【０２２５】
次に以下の5'末端リン酸化合成オリゴDNAをTEバッファー中で、等量混合し、加熱後徐冷することによってアニーリングする。
5'-AGCTTagcggcggcagcggcagcggcggcagcggcCA-3' [配列番号２９]
5'-TATGgccgctgccgccgctgccgctgccgccgctA-3' [配列番号３０]
このDNA断片を、pETDuet-pfuADH-phoDpの制限酵素Hind IIIおよびNde Iの認識サイトに挿入し、His-pfuADHとphoDpがスペーサー配列SGGSGSGGSGによって連結された融合タンパク質His-pfuADH::phoDp発現ベクターpETDuet-pfuADH::phoDp [配列番号４０]を作製する。
【０２２６】
次にPyrococcus furiosus [ATCC 43587]のゲノムDNA鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１１４５ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'- aataatCCATGGcgttcctaaagactaagattatcgagggaagg-3' (Nco I) [配列番号４１]
5'-aataatAAGCTTatctccatagaaggccctctcataaattct-3' (HindIII) [配列番号３９]
このDNA増幅産物を制限酵素Nco IおよびHind IIIで切断し、pCDFDuet-1 (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、pfuADH発現ベクターpCDFDuet-pfuADHを作製する。
【０２２７】
次にPyrococcus horikoshii KT2440 [ATCC 700860]のゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１３４４ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGaagatagtagttataggatctggaactgct-3' (NdeI) [配列番号１７]
5'-aataatCTCGAGtcatgacttaaattttctcatggccatttc-3' (XhoI) [配列番号１８]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pCDFDuet-pfuADHの同じ制限酵素サイトに挿入し、pfuADH、phoDp共発現ベクターpCDFDuet-pfuADH-phoDp [配列番号４２]を作製する。
【０２２８】
発現ベクターpETDuet-pfuADH::phoDpおよびpCDFDuet-pfuADH-phoDpを用い常法に従いE.coli BL21(DE3)を形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンおよびストレプトマイシンに対する耐性株として選別することができる。
【０２２９】
得られた形質転換体を抗生物質アンピシリン及びストレプトマイシンを添加したLB培地10mLで一晩プレ・カルチャーした後、その0.2mLを、100mLのLB-Amp培地に添加し、30℃、170rpmで4時間振とう培養する。その後IPTGを添加 (終濃度 1mM) し、37℃で4~12時間培養を続ける。IPTG 誘導した形質転換体を集菌 (8000×g、 2分、4℃) し、1/10 量の 4℃ PBSに再懸濁する。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心 (8000×g、 10分、4℃)して固形夾雑物を取り除く。目的の発現タンパク質が上清に存在することをSDS-PAGEで確認した後、誘導発現されたHisタグ融合タンパク質をニッケルキレートカラムを用いて精製する。
こうして得られる好熱菌由来の融合タンパク質を用いて、アルコールセンサーや燃料電池等を上述の実施例同様に作製できる。
（実施例１７：Lactobacillus plantarum由来の乳酸デヒドロゲナーゼ（lplLDH）とGluconobacter oxydans由来のジアフォラーゼ（goxDp）との融合タンパク質（His-lplLDH::goxDp）[配列番号５６、５７]の調製）
Lactobacillus plantarum [ATCC 10241]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、９８２ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatGGATCCGtcaagcatgccaaatcatcaaaaagttgtg-3' (BamHI) [配列番号４７]
5'-aataatAAGCTTtttattttctaattcagctaaaccgtcgtt-3' (HindIII) [配列番号４８]
このDNA増幅産物を制限酵素BamHIおよびHind IIIで切断し、pETDuet-1(Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、His-lplLDH発現ベクターpETDuet-lplLDHを作製する。
【０２３０】
次にGluconobacter oxydans [ATCC 621H]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１４２８ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGtgcgatacgttcgatctgattgttgttggt-3' (NdeI) [配列番号４９]
5'-aataatCTCGAGtcagatatgcagcgggccgtcgaaggccgc-3' (XhoI) [配列番号５０]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pETDuet-lplLDHの同じ制限酵素サイトに挿入し、His-lplLDH、goxDp共発現ベクターpETDuet-lplLDH-goxDpを作製する。
【０２３１】
次に以下の5'末端リン酸化合成オリゴDNAをTEバッファー中で、等量混合し、加熱後徐冷することによってアニーリングする。
5'-AGCTTgaaggcaaaagcagcggcagcggcagcgaaagcaaaagcaccCA-3' [配列番号５１]
5'-TATGggtgcttttgctttcgctgccgctgccgctgcttttgccttcA-3' [配列番号５２]
このDNA断片を、pETDuet-lplLDH-goxDpの制限酵素Hind IIIおよびNde Iの認識サイトに挿入し、His-lplLDHとgoxDpがスペーサー配列EGKSSGSGSESKSTによって連結された融合タンパク質His-lplLDH::goxDp発現ベクターpETDuet-lplLDH::goxDp [配列番号５３]を作製する。
【０２３２】
次にLactobacillus plantarum [ATCC 10241]のゲノムDNA鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、９８０ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'- aataatCCATGGcgagcatgccaaatcatcaaaaagttgtgtta-3' (Nco I) [配列番号５４]
5'-aataatAAGCTTtttattttctaattcagctaaaccgtcgtt-3' (HindIII) [配列番号４８]
このDNA増幅産物を制限酵素Nco IおよびHind IIIで切断し、pCDFDuet-1 (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、lplLDH発現ベクターpCDFDuet-lplLDHを作製する。
【０２３３】
次にGluconobacter oxydans  [ATCC 621H]のゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１４２８ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGtgcgatacgttcgatctgattgttgttggt-3' (NdeI) [配列番号４９]
5'-aataatCTCGAGtcagatatgcagcgggccgtcgaaggccgc-3' (XhoI) [配列番号５０]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pCDFDuet-lplLDHの同じ制限酵素サイトに挿入し、lplLDH、goxDp共発現ベクターpCDFDuet-lplLDH-goxDp [配列番号５５]を作製する。
【０２３４】
発現ベクターpETDuet-lplLDH::goxDpおよびpCDFDuet-lplLDH-goxDpを用い、常法に従いE.coli BL21(DE3)を形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンおよびストレプトマイシンに対する耐性株として選別することができる。
【０２３５】
得られた形質転換体を抗生物質アンピシリン及びストレプトマイシンを添加したLB培地10mLで一晩プレ・カルチャーした後、その0.2mLを、100mLのLB-Amp培地に添加し、30℃、170rpmで4時間振とう培養する。その後IPTGを添加 (終濃度 1mM) し、37℃で4~12時間培養を続ける。IPTG 誘導した形質転換体を集菌 (8000×g、 2分、4℃) し、1/10 量の 4℃ PBSに再懸濁する。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心 (8000×g、 10分、4℃)して固形夾雑物を取り除く。目的の発現タンパク質が上清に存在することをSDS-PAGEで確認した後、誘導発現されたHisタグ融合タンパク質をニッケルキレートカラムを用いて精製する。
【０２３６】
（比較例１７：対照としてのlplLDHおよびgoxDpの調製）
Lactobacillus plantarum [ATCC 10241]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、約９８０ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATatgtcaagcatgccaaatcatcaaaaagttgtg-3' (NdeI)[配列番号５８]
5'-aataatCTCGAGtttattttctaattcagctaaaccgtcgtt-3' (XhoI)[配列番号５９]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、lplLDH-His発現ベクターpET21-lplLDHを作製する。
【０２３７】
次にGluconobacter oxydans  [ATCC 621H]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、約１４２０ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGtgcgatacgttcgatctgattgttgttggt-3' (NdeI) [配列番号４９]
5'-aataatCTCGAGgatatgcagcgggccgtcgaaggccgccag-3' (XhoI) [配列番号６０]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、goxDp-His発現ベクターpET21-goxDpを作製する。
【０２３８】
発現ベクターpET21-lplLDHおよびpET21-goxDpをそれぞれ個別に、E.coli BL21(DE3)を常法に従い形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンに対する耐性株として選別することができる。
【０２３９】
得られたそれぞれの形質転換体を抗生物質アンピシリンを添加したLB培地10mLで一晩プレ・カルチャーした後、その0.2mLを、100mLのLB-Amp培地に添加し、30℃、170rpmで4時間振とう培養する。その後IPTGを添加 (終濃度 1mM) し、37℃で4~12時間培養を続ける。IPTG 誘導した形質転換体を集菌 (8000×g、 2分、4℃) し、1/10 量の 4℃ PBSに再懸濁する。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心 (8000×g、 10分、4℃)して固形夾雑物を取り除く。目的の発現タンパク質が上清に存在することをSDS-PAGEで確認した後、それぞれの誘導発現されたHisタグ融合タンパク質をニッケルキレートカラムを用いて精製する。
【０２４０】
（実施例１８：乳酸センサー）
図２２および図８を用いて実施例１８を説明する。実施例１８にかかるセンサーは試料溶液中の乳酸を定量する乳酸センサーである。実施例１８に係る乳酸センサーの酵素電極部を図２２を用いて説明する。
【０２４１】
酵素電極部は以下の構成からなる。導電性基体２０は直径３ｍｍのグラッシーカーボンである。導電性基体２０上に実施例１７で調製した融合タンパク質（His-lplLDH::goxDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。各成分は各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により固定されている。すなわちHis-lplLDH::goxDp（lplLDH：０．３ユニット、goxDp：０．６ユニット）、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０２４２】
この酵素電極部を、図８における作用電極４として用いることによって乳酸センサーを構成する。対極５は白金線、参照極６は銀／塩化銀電極で構成する。これらの電極は、それぞれポテンショスタット１０を介して電流などを測定する。試料溶液３としては、所定濃度の乳酸（L‐乳酸）、および１ｍM  NADを含む０．１M  PIPES−NaOH緩衝水溶液（ｐH７．５）を用いる。測定温度は、恒温循環槽によって３０℃に保持される。
【０２４３】
前述の乳酸センサーを用いて次のように定量を行う。作用電極４には参照極６に対して３００ｍVの電位を印加する。このとき、試料溶液３中の乳酸は乳酸デヒドロゲナーゼの存在下でピルビン酸に酸化され、この反応でＮＡＤがNADHに還元される。次に前記乳酸デヒドロゲナーゼに融合したジアフォラーゼの存在下でNADHはNADに酸化され、この反応で電子伝達メディエータであるフェロセンが酸化され、フェリシニウムイオンが生成される。（作用電極４には参照極６に対して３００ｍVの電位が印加されているため、）フェリシニウムイオンは作用電極４から電子をうけとりフェロセンに還元される。作用電極４での電子の移動による電流を測定することにより、試料溶液中の乳酸濃度を測定する。
【０２４４】
（比較例１８：乳酸センサー）
図２４および図８を用いて比較例１８を説明する。比較例１８にかかるセンサーは試料溶液中の乳酸を定量する乳酸センサーである。比較例１８に係る乳酸センサーの酵素電極部を図２４を用いて説明する。
【０２４５】
酵素電極部は以下の構成からなる。導電性基体２０は直径３ｍｍのグラッシーカーボンであうる。導電性基体２０上に乳酸デヒドロゲナーゼ（lplLDH）、ジアフォラーゼ（goxDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。乳酸デヒドロゲナーゼ（lplLDH）は比較例１７で調製したLactobacillus plantarum由来の乳酸デヒドロゲナーゼ（lplLDH）である。ジアフォラーゼ（goxDp）は、Gluconobacter oxydans由来のジアフォラーゼである。各成分は、各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により固定されている。すなわちlplLDH：０．３ユニット、goxDp：０．６ユニット、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０２４６】
この酵素電極部を、実施例１８と同様に試料溶液中の乳酸濃度を測定する。実施例１８の結果と比較例１８の結果の相違は、図１１のＡとＢの相違に類似する。
【０２４７】
実施例１８と比較例１８から、実施例１８の乳酸センサーの方が、比較例１８の乳酸センサーよりも、乳酸濃度に対する感度が高く、より低濃度の乳酸を定量出来ることが明らかとなった。酵素電極上に固定されている乳酸デヒドロゲナーゼ及びジアフォラーゼの量は同じであるにもかかわらず、実施例１８の酵素電極においては、乳酸デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼが融合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、NAD／NADHを介した両酵素間の電子授受が速やかに行われるためと考えられた。
【０２４８】
（実施例１９：乳酸燃料電池）
図２２及び図９を用いて実施例１９を説明する。実施例１９にかかる燃料電池は乳酸を燃料とする乳酸燃料電池である。実施例１９に係る乳酸燃料電池のアノード電極部を図２２を用いて説明する。
【０２４９】
アノード電極部は以下の構成からなる。導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンである。導電性基体２０上に実施例１７で調製した融合タンパク質（His-lplLDH::goxDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。各成分は各成分は、それぞれ以下の最適の濃度比により導電性基体２０上に固定されている。すなわち、His-lplLDH::goxDp（lplLDH：０．３ユニット、goxDp：０．６ユニット）、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０２５０】
実施例１９に係る乳酸燃料電池のカソード電極１６は０．５ｃｍ2の白金板からなる。電解質溶液３は、１００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ乳酸（L‐乳酸）、および１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）である。アノード電極１５とカソード電極１６は、間に多孔質ポリプロピレンフィルム（厚さ２０μｍ）１７を挟んで配置され、これを蓋２付のウォータージャケットセル１中の前記電解液溶液３中（１０ｍＬ）に配置する。測定温度は、恒温循環槽によって３０℃に保持される。それぞれのリードをポテンショスタット（東方技研、モデル２０００）１０に接続し、−１．２Ｖから０．１Ｖまで電圧を変化させ、電圧−電流特性を測定した。
短絡電流密度：１３３０μＡ／ｃｍ2
最大電力：１２０μＷ／ｃｍ2
の電池出力が観測される。
【０２５１】
（比較例１９：乳酸燃料電池）
図２４及び図９を用いて比較例１９を説明する。比較例１９にかかる燃料電池は乳酸を燃料とする乳酸燃料電池である。比較例１９に係る乳酸燃料電池のアノード電極部を図２４を用いて説明する。
【０２５２】
アノード電極部は以下の構成からなる。導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンである。導電性基体２０上に乳酸デヒドロゲナーゼ（lplLDH）、ジアフォラーゼ（goxDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。乳酸デヒドロゲナーゼ（lplLDH）は比較例１７で調製したLactobacillus plantarum由来の乳酸デヒドロゲナーゼである。ジアフォラーゼ（goxDp）はGluconobacter oxydans由来のジアフォラーゼである。各成分は、各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により導電性基体２０上に固定されている。すなわち、lplLDH：０．３ユニット、goxDp：０．６ユニット、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０２５３】
比較例１９に係る乳酸燃料電池のカソード電極を用いて実施例１９と同様に、電圧−電流特性を測定した。
短絡電流密度：３９６μＡ／ｃｍ2
最大電力：３７μＷ／ｃｍ2
の電池出力が観測される。
【０２５４】
実施例１９と比較例１９から、実施例１９の乳酸燃料電池の方が、比較例１９の乳酸燃料電池よりも、電流密度が高く、より大きな電流を取り出せることが明らかとなった。酵素電極上に固定されている乳酸デヒドロゲナーゼ及びジアフォラーゼの量は同じであるにもかかわらず、実施例１９の燃料電池においては、乳酸デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼが融合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、NAD／NADHを介した両酵素間の電子授受が速やかに行われるためと考えられた。
【０２５５】
（実施例２０：乳酸電気化学反応装置）
図２２および図８を用いて実施例２０を説明する。実施例２０にかかる電気化学反応装置は乳酸（L‐乳酸）を基質としてピルビン酸を生産する乳酸電気化学反応装置である。実施例２０に係る乳酸電気化学反応装置の酵素電極部を図２２を用いて説明する。酵素電極部は以下の構成からなる。
【０２５６】
導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンである。導電性基体２０上に実施例１７で調製した融合タンパク質（His-lplLDH::goxDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。各成分は、各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により固定されている。すなわちHis-lplLDH::goxDp（lplLDH：０．３ユニット、goxDp：０．６ユニット）、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０２５７】
この酵素電極を図８における作用電極４として用いることによって乳酸電気化学反応装置を構成する。銀塩化銀電極を参照電極６に、白金線を対極５とした三極セルを構成する。１００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ乳酸（L‐乳酸）、および１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）電解液を試料溶液３として使用し、恒温循環槽によって３０℃に保持される。ウォータージャケットセル１中窒素雰囲気下０．３ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌの電位を１００分間印加し、生成物を高速液体クロマトグラフィーで定量する。
【０２５８】
反応電解液からは、ピルビン酸が検出され、反応電荷量と、生成ピルビン酸量には、高い相関関係があり、反応が定量的に進行することがわかる。
【０２５９】
（比較例２０：乳酸電気化学反応装置）
図２４および図８を用いて比較例２０を説明する。比較例２０にかかる電気化学反応装置は乳酸（L‐乳酸）を基質としてピルビン酸を生産する乳酸電気化学反応装置である。比較例２０にかかる乳酸電気化学反応装置の酵素電極部を図２４を用いて説明する。
【０２６０】
酵素電極部は以下の構成からなる。導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンである。導電性基体２０上に乳酸デヒドロゲナーゼ（lplLDH）、ジアフォラーゼ（goxDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。乳酸デヒドロゲナーゼ（lplLDH）は、比較例１７で調製したLactobacillus plantarum由来の乳酸デヒドロゲナーゼである。ジアフォラーゼ（goxDp）はGluconobacter oxydans由来のジアフォラーゼである。各成分は、各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により固定されている。すなわちlplLDH：０．３ユニット、goxDp：０．６ユニット、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０２６１】
この酵素電極を用いて実施例２０と同様に、生成物を高速液体クロマトグラフィーで定量する。
【０２６２】
反応電解液からは、ピルビン酸が検出され、反応電荷量と、生成ピルビン酸量には、高い相関関係があり、反応が定量的に進行することがわかる。しかしながら実施例２０の場合よりも単位時間あたりの反応電荷量は小さい値であることがわかる。実施例２０と比較例２０から、実施例２０の乳酸電気化学反応装置の方が、比較例２０の乳酸電気化学反応装置よりも、単位時間あたりの反応電荷量が高く、より効率的に乳酸をピルビン酸に変換出来ることが明らかとなる。酵素電極上に固定されている乳酸デヒドロゲナーゼ及びジアフォラーゼの量は同じであるにもかかわらず、実施例２０の電気化学反応装置においては、乳酸デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼが融合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、NAD／NADHを介した両酵素間の電子授受が速やかに行われるためと考えられた。
（実施例２１：Thermotoga maritima由来の乳酸デヒドロゲナーゼ（tmaLDH）とThermotoga maritima由来のジアフォラーゼ（tmaDp）との融合タンパク質（His-tmaLDH::tmaDp）[配列番号６８、６９]の調製）
Thermotoga maritima [ATCC 43589]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、９７９ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatGGATCCGaaaataggtatcgtaggactcggaagggtt-3' (BamHI) [配列番号６１]
5'-aataatAAGCTTaccgctggtgttctggtgcttgttctcttc-3' (HindIII) [配列番号６２]
このDNA増幅産物を制限酵素BamHIおよびHind IIIで切断し、pETDuet-1(Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、His-tmaLDH発現ベクターpETDuet-tmaLDHを作製する。
【０２６３】
次にThermotoga maritima [ATCC 43589]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１３７１ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGtacgatgctgtgatcataggaggaggaccc-3' (NdeI) [配列番号６３]
5'-aataatCTCGAGtcacagatgaatgggttttcctgagacccc-3' (XhoI) [配列番号６４]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pETDuet-tmaLDHの同じ制限酵素サイトに挿入し、His-tmaLDH、tmaDp共発現ベクターpETDuet-tmaLDH-tmaDpを作製する。
【０２６４】
次に、以下の5'末端リン酸化合成オリゴDNAをTEバッファー中で、等量混合し、加熱後徐冷することによってアニーリングする。
5'-AGCTTgaaggcaaaagcagcggcagcggcagcgaaagcaaaagcaccCA-3' [配列番号５１]
5'-TATGggtgcttttgctttcgctgccgctgccgctgcttttgccttcA-3' [配列番号５２]
このDNA断片を、pETDuet-tmaLDH-tmaDpの制限酵素Hind IIIおよびNde Iの認識サイトに挿入し、His-tmaLDHとtmaDpがスペーサー配列EGKSSGSGSESKSTによって連結された融合タンパク質His-tmaLDH::tmaDp発現ベクターpETDuet-tmaLDH::tmaDp [配列番号６５]を作製する。
【０２６５】
次にThermotoga maritima [ATCC 43589]のゲノムDNA鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、９７７ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'- aataatCCATGGcgataggtatcgtaggactcggaagggttggt-3' (Nco I) [配列番号６６]
5'-aataatAAGCTTatctccatagaaggccctctcataaattct-3' (HindIII) [配列番号６２]
このDNA増幅産物を制限酵素Nco IおよびHind IIIで切断し、pCDFDuet-1 (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、tmaLDH発現ベクターpCDFDuet-tmaLDHを作製する。
【０２６６】
次にThermotoga maritima  [ATCC 43589]のゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１３７１ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGtacgatgctgtgatcataggaggaggaccc-3' (NdeI) [配列番号６３]
5'-aataatCTCGAGtcacagatgaatgggttttcctgagacccc-3' (XhoI) [配列番号６４]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pCDFDuet-tmaLDHの同じ制限酵素サイトに挿入し、tmaLDH、tmaDp共発現ベクターpCDFDuet-tmaLDH-tmaDp [配列番号６７]を作製する。
【０２６７】
発現ベクターpETDuet-tmaLDH::tmaDpおよびpCDFDuet-tmaLDH-tmaDpを用い、常法に従いE.coli BL21(DE3)を形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンおよびストレプトマイシンに対する耐性株として選別することができる。
【０２６８】
得られた形質転換体を抗生物質アンピシリン及びストレプトマイシンを添加したLB培地10mLで一晩プレ・カルチャーした後、その0.2mLを、100mLのLB-Amp培地に添加し、37℃、170rpmで4時間振とう培養する。その後IPTGを添加 (終濃度 1mM) し、37℃で4~12時間培養を続ける。IPTG 誘導した形質転換体を集菌 (8000×g、 2分、4℃) し、1/10 量の 4℃ PBSに再懸濁する。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心 (8000×g、 10分、4℃)して固形夾雑物を取り除く。目的の発現タンパク質が上清に存在することをSDS-PAGEで確認した後、誘導発現されたHisタグ融合タンパク質をニッケルキレートカラムを用いて精製する。
【０２６９】
こうして得られた好熱菌由来の融合タンパク質は、乳酸センサー等に適用できる。
（実施例２５：Pseudomonas putida由来のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ppuMDH）とGluconobacter oxydans由来のジアフォラーゼ（goxDp）との融合タンパク質（His-ppuMDH::goxDp）[配列番号７８、７９]の調製）
Pseudomonas putida [ATCC 47054]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１２８８ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatGGATCCGtcagacctgaaaaccgccgctctcgaatat-3' (BamHI) [配列番号７３]
5'-aataatAAGCTTgccgttgaacacttcatccacgctggtcag-3' (HindIII) [配列番号７４]
このDNA増幅産物を制限酵素BamHIおよびHind IIIで切断し、pETDuet-1(Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、His-ppuMDH発現ベクターpETDuet-ppuMDHを作製する。
【０２７０】
次にGluconobacter oxydans [ATCC 621H]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAとして用いてPCRを行い、１４２８ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGtgcgatacgttcgatctgattgttgttggt-3' (NdeI) [配列番号４９]
5'-aataatCTCGAGtcagatatgcagcgggccgtcgaaggccgc-3' (XhoI) [配列番号５０]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pETDuet-ppuMDHの同じ制限酵素サイトに挿入し、His-ppuMDH、goxDp共発現ベクターpETDuet-ppuMDH-goxDpを作製する。
【０２７１】
次に、以下の5'末端リン酸化合成オリゴDNAをTEバッファー中で、等量混合し、加熱後徐冷することによってアニーリングする。
5'-AGCTTgaaggcaaaagcagcggcagcggcagcgaaagcaaaagcaccCA-3' [配列番号５１]
5'-TATGggtgcttttgctttcgctgccgctgccgctgcttttgccttcA-3' [配列番号５２]
このDNA断片を、pETDuet-ppuMDH-goxDpの制限酵素Hind IIIおよびNde Iの認識サイトに挿入し、His-ppuMDHとgoxDpがスペーサー配列EGKSSGSGSESKSTによって連結された融合タンパク質His-ppuMDH::goxDp発現ベクターpETDuet-ppuMDH::goxDp [配列番号７５]を作製する。
【０２７２】
次にPseudomonas putida [ATCC 47054]のゲノムDNA鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１２８６ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'- aataatCCATGGcggacctgaaaaccgccgctctcgaatatcac-3' (Nco I) [配列番号７６]
5'-aataatAAGCTTgccgttgaacacttcatccacgctggtcag-3' (HindIII) [配列番号７４]
このDNA増幅産物を制限酵素Nco IおよびHind IIIで切断し、pCDFDuet-1 (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、ppuMDH発現ベクターpCDFDuet-ppuMDHを作製する。
【０２７３】
次にGluconobacter oxydans  [ATCC 621H]のゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１４２８ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGtgcgatacgttcgatctgattgttgttggt-3' (NdeI) [配列番号４９]
5'-aataatCTCGAGtcagatatgcagcgggccgtcgaaggccgc-3' (XhoI) [配列番号５０]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pCDFDuet-ppuMDHの同じ制限酵素サイトに挿入し、ppuMDH、goxDp共発現ベクターpCDFDuet-ppuMDH-goxDp [配列番号７７]を作製する。
【０２７４】
発現ベクターpETDuet-ppuMDH::goxDpおよびpCDFDuet-ppuMDH-goxDpを用い、常法に従いE.coli BL21(DE3)を形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンおよびストレプトマイシンに対する耐性株として選別することができる。
【０２７５】
得られた形質転換体を抗生物質アンピシリン及びストレプトマイシンを添加したLB培地10mLで一晩プレ・カルチャーした後、その0.2mLを、100mLのLB-Amp培地に添加し、30℃、170rpmで4時間振とう培養する。その後IPTGを添加 (終濃度 1mM) し、37℃で4~12時間培養を続ける。IPTG 誘導した形質転換体を集菌 (8000×g、 2分、4℃) し、1/10 量の 4℃ PBSに再懸濁する。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心 (8000×g、 10分、4℃)して固形夾雑物を取り除く。目的の発現タンパク質が上清に存在することをSDS-PAGEで確認した後、誘導発現されたHisタグ融合タンパク質をニッケルキレートカラムを用いて精製する。
【０２７６】
（比較例２５：対照としてのppuMDHおよびgoxDpの調製）
Pseudomonas putida [ATCC 47054]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、約１２９０ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATatgtcagacctgaaaaccgccgctctcgaatat-3' (NdeI)[配列番号８０]
5'-aataatCTCGAGgccgttgaacacttcatccacgctggtcag-3' (XhoI)[配列番号８１]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、ppuMDH-His発現ベクターpET21-ppuMDHを作製する。
【０２７７】
次にGluconobacter oxydans  [ATCC 621H]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、約１４２０ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGtgcgatacgttcgatctgattgttgttggt-3' (NdeI) [配列番号４９]
5'-aataatCTCGAGgatatgcagcgggccgtcgaaggccgccag-3' (XhoI) [配列番号６０]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、goxDp-His発現ベクターpET21-goxDpを作製する。
【０２７８】
発現ベクターpET21-ppuMDHおよびpET21-goxDpをそれぞれ個別に用い、E.coli BL21(DE3)を常法に従い形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンに対する耐性株として選別することができる。
【０２７９】
得られたそれぞれの形質転換体を抗生物質アンピシリンを添加したLB培地10mLで一晩プレ・カルチャーした後、その0.2mLを、100mLのLB-Amp培地に添加し、30℃、170rpmで4時間振とう培養する。その後IPTGを添加 (終濃度 1mM) し、37℃で4~12時間培養を続ける。IPTG 誘導した形質転換体を集菌 (8000×g、 2分、4℃) し、1/10 量の 4℃ PBSに再懸濁する。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心 (8000×g、 10分、4℃)して固形夾雑物を取り除く。目的の発現タンパク質が上清に存在することをSDS-PAGEで確認した後、それぞれの誘導発現されたHisタグ融合タンパク質をニッケルキレートカラムを用いて精製する。
（実施例２６：リンゴ酸センサー）
図２８および図８を用いて実施例２６を説明する。実施例２６にかかるセンサーは試料溶液中のリンゴ酸を定量するリンゴ酸センサーである。実施例２６に係るリンゴ酸センサーの酵素電極部を図２８を用いて説明する。
【０２８０】
酵素電極部は以下の構成からなる。導電性基体２０は直径３ｍｍのグラッシーカーボンである。導電性基体２０上に実施例２５で調製した融合タンパク質（His-ppuMDH::goxDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。各成分は、各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により固定されている。すなわちHis-ppuMDH::goxDp（ppuMDH：０．３ユニット、goxDp：０．６ユニット）、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０２８１】
この酵素電極部を、図８における作用電極４として用いることによってリンゴ酸センサーを構成する。対極５は白金線、参照極６は銀／塩化銀電極で構成する。これらの電極は、それぞれポテンショスタット１０を介して電流などを測定する。試料溶液３としては、所定濃度のリンゴ酸、および１ｍM  NADを含む０．１M  PIPES−NaOH緩衝水溶液（ｐH７．５）を用いる。測定温度は、恒温循環槽によって３０℃に保持される。
【０２８２】
前述のリンゴ酸センサーを用いて次のように定量を行う。作用電極４には参照極６に対して３００ｍVの電位を印加する。このとき、試料溶液３中のリンゴ酸はリンゴ酸デヒドロゲナーゼの存在下でピルビン酸に酸化され、この反応でＮＡＤがNADHに還元される。次に前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼに融合したジアフォラーゼの存在下でNADHはNADに酸化され、この反応で電子伝達メディエータであるフェロセンが酸化され、フェリシニウムイオンが生成される。（作用電極４には参照極６に対して３００ｍVの電位が印加されているため、）フェリシニウムイオンは作用電極４から電子をうけとりフェロセンに還元される。作用電極４での電子の移動による電流を測定することにより、試料溶液中のリンゴ酸濃度を測定する。
【０２８３】
（比較例２６：リンゴ酸センサー）
図３０および図８を用いて比較例２６を説明する。比較例２６にかかるセンサーは試料溶液中のリンゴ酸を定量するリンゴ酸センサーである。比較例２６に係るリンゴ酸センサーの酵素電極部を図３０を用いて説明する。
【０２８４】
酵素電極部は以下の構成からなる。導電性基体２０は直径３ｍｍのグラッシーカーボンである。導電性基体２０上にリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ppuMDH）、ジアフォラーゼ（goxDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ppuMDH）は、比較例２５で調製したPseudomonas putida由来のリンゴ酸デヒドロゲナーゼである。ジアフォラーゼ（goxDp）は、Gluconobacter oxydans由来のジアフォラーゼである。各成分は、各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により固定されている。すなわちppuMDH：０．３ユニット、goxDp：０．６ユニット、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０２８５】
この酵素電極部を用いて、実施例２６と同様にして、試料溶液中のリンゴ酸濃度を測定する。
【０２８６】
実施例２６と比較例２６における結果の相違は、図１１のＡとＢの相違に類似した傾向を示す。
【０２８７】
実施例２６と比較例２６から、実施例２６のリンゴ酸センサーの方が、比較例２６のリンゴ酸センサーよりも、リンゴ酸濃度に対する感度が高く、より低濃度のリンゴ酸を定量出来ることが明らかとなった。酵素電極上に固定されているリンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びジアフォラーゼの量は同じであるにもかかわらず、実施例２６の酵素電極においては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼが融合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、NAD／NADHを介した両酵素間の電子授受が速やかに行われるためと考えられた。
（実施例２７：リンゴ酸燃料電池）
図２８及び図９を用いて実施例２７を説明する。実施例２７にかかる燃料電池はリンゴ酸を燃料とするリンゴ酸燃料電池である。実施例２７に係るリンゴ酸燃料電池のアノード電極部を図２８を用いて説明する。
【０２８８】
アノード電極部は以下の構成からなる。導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンである。導電性基体２０上に実施例２５で調製した融合タンパク質（His-ppuMDH::goxDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。各成分は、各成分は、それぞれ以下の最適の濃度比により導電性基体２０上に固定されている。すなわち、His-ppuMDH::goxDp（ppuMDH：０．３ユニット、goxDp：０．６ユニット）、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０２８９】
実施例２７に係るリンゴ酸燃料電池のカソード電極１６は０．５ｃｍ2の白金板からなる。電解質溶液３は、１００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭリンゴ酸、および１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）である。アノード電極１５とカソード電極１６は、間に多孔質ポリプロピレンフィルム（厚さ２０μｍ）１７を挟んで配置され、これを蓋２付のウォータージャケットセル１中の前記電解液溶液３中（１０ｍＬ）に配置する。測定温度は、恒温循環槽によって３０℃に保持される。それぞれのリードをポテンショスタット（東方技研、モデル２０００）１０に接続し、−１．２Ｖから０．１Ｖまで電圧を変化させ、電圧−電流特性を測定した。
短絡電流密度：１０２５μＡ／ｃｍ2
最大電力：９８μＷ／ｃｍ2
の電池出力が観測される。
（比較例２７：リンゴ酸燃料電池）
図３０及び図９を用いて比較例２７を説明する。比較例２７にかかる燃料電池はリンゴ酸を燃料とするリンゴ酸燃料電池である。比較例２７に係るリンゴ酸燃料電池のアノード電極部を図３０を用いて説明する。
【０２９０】
アノード電極部は以下の構成からなる。導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンである。導電性基体２０上にリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ppuMDH）、ジアフォラーゼ（goxDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ppuMDH）は、比較例２５で調製したPseudomonas putida由来のリンゴ酸デヒドロゲナーゼである。ジアフォラーゼ（goxDp）は、Gluconobacter oxydans由来のジアフォラーゼである。各成分は、各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により導電性基体２０上に固定されている。すなわち、ppuMDH：０．３ユニット、goxDp：０．６ユニット、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０２９１】
比較例２７に係るリンゴ酸燃料電池を用いて、実施例２７と同様に電圧−電流特性を測定した。
短絡電流密度：２９７μＡ／ｃｍ2
最大電力：３０μＷ／ｃｍ2
の電池出力が観測される。
【０２９２】
実施例２７と比較例２７から、実施例２７のリンゴ酸燃料電池の方が、比較例２７のリンゴ酸燃料電池よりも、電流密度が高く、より大きな電流を取り出せることが明らかとなった。酵素電極上に固定されているリンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びジアフォラーゼの量は同じであるにもかかわらず、実施例２７の燃料電池においては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼが融合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、NAD／NADHを介した両酵素間の電子授受が速やかに行われるためと考えられた。
【０２９３】
（実施例２８：リンゴ酸電気化学反応装置）
図２８および図８を用いて実施例２８を説明する。実施例２８にかかる電気化学反応装置はリンゴ酸を基質としてピルビン酸を生産するリンゴ酸電気化学反応装置である。実施例２８に係るリンゴ酸電気化学反応装置の酵素電極部を図２８を用いて説明する。
【０２９４】
酵素電極部は以下の構成からなる。導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンである。導電性基体２０上に実施例２５で調製した融合タンパク質（His-ppuMDH::goxDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。各成分は、各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により固定されている。すなわちHis-ppuMDH::goxDp（ppuMDH：０．３ユニット、goxDp：０．６ユニット）、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０２９５】
この酵素電極を図８における作用電極４として用いることによってリンゴ酸電気化学反応装置を構成する。銀塩化銀電極を参照電極６に、白金線を対極５とした三極セルを構成する。１００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭリンゴ酸、および１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）電解液を試料溶液３として使用し、恒温循環槽によって３０℃に保持される。ウォータージャケットセル１中窒素雰囲気下０．３ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌの電位を１００分間印加し、生成物を高速液体クロマトグラフィーで定量する。
【０２９６】
反応電解液からは、ピルビン酸が検出され、反応電荷量と、生成ピルビン酸量には、高い相関関係があり、反応が定量的に進行することがわかる。
（比較例２８：リンゴ酸電気化学反応装置）
図３０および図８を用いて比較例２８を説明する。比較例２８にかかる電気化学反応装置はリンゴ酸を基質としてピルビン酸を生産するリンゴ酸電気化学反応装置である。比較例２８にかかるリンゴ酸電気化学反応装置の酵素電極部を図３０を用いて説明する。
【０２９７】
酵素電極部は以下の構成からなる。導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンである。導電性基体２０上にリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ppuMDH）、ジアフォラーゼ（goxDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ppuMDH）は、比較例２５で調製したPseudomonas putida由来のリンゴ酸デヒドロゲナーゼである。ジアフォラーゼ（goxDp）はGluconobacter oxydans由来のジアフォラーゼである。各成分は、各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により固定されている。すなわちppuMDH：０．３ユニット、goxDp：０．６ユニット、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０２９８】
この酵素電極を用いて、実施例２８と同様に、生成物を高速液体クロマトグラフィーで定量する。
【０２９９】
反応電解液からは、ピルビン酸が検出され、反応電荷量と、生成ピルビン酸量には、高い相関関係があり、反応が定量的に進行することがわかる。しかしながら実施例２８の場合よりも単位時間あたりの反応電荷量は小さい値であることがわかる。
実施例２８と比較例２８から、実施例２８のリンゴ酸電気化学反応装置の方が、比較例２８のリンゴ酸電気化学反応装置よりも、単位時間あたりの反応電荷量が高く、より効率的にリンゴ酸をピルビン酸に変換出来ることが明らかとなる。酵素電極上に固定されているリンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びジアフォラーゼの量は同じであるにもかかわらず、実施例２８の電気化学反応装置においては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼが融合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、NAD／NADHを介した両酵素間の電子授受が速やかに行われるためと考えられた。
（実施例２９：Pyrococcus furiosus由来のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（pfuMDH）とThermotoga maritima由来のジアフォラーゼ（tmaDp）との融合タンパク質（His-pfuMDH::tmaDp）[配列番号８７、８８]の調製）
Pyrococcus furiosus [ATCC 43587]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１３２７ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatGGATCCGgctaggatcactgaggaacaaagaaggaaa-3' (BamHI) [配列番号８２]
5'-aataatAAGCTTagtaatgtactgtttccttctttcatttaa-3' (HindIII) [配列番号８３]
このDNA増幅産物を制限酵素BamHIおよびHind IIIで切断し、pETDuet-1(Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、His-pfuMDH発現ベクターpETDuet-pfuMDHを作製する。
【０３００】
次にThermotoga maritima [ATCC 43589]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１３７１ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGtacgatgctgtgatcataggaggaggaccc-3' (NdeI) [配列番号６３]
5'-aataatCTCGAGtcacagatgaatgggttttcctgagacccc-3' (XhoI) [配列番号６４]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pETDuet-pfuMDHの同じ制限酵素サイトに挿入し、His-pfuMDH、tmaDp共発現ベクターpETDuet-pfuMDH-tmaDpを作製する。
【０３０１】
次に、以下の5'末端リン酸化合成オリゴDNAをTEバッファー中で、等量混合し、加熱後徐冷することによってアニーリングする。
5'-AGCTTgaaggcaaaagcagcggcagcggcagcgaaagcaaaagcaccCA-3' [配列番号５１]
5'-TATGggtgcttttgctttcgctgccgctgccgctgcttttgccttcA-3' [配列番号５２]
このDNA断片を、pETDuet-pfuMDH-tmaDpの制限酵素Hind IIIおよびNde Iの認識サイトに挿入し、His-pfuMDHとtmaDpがスペーサー配列EGKSSGSGSESKSTによって連結された融合タンパク質His-pfuMDH::tmaDp発現ベクターpETDuet-pfuMDH::tmaDp [配列番号８４]を作製する。
【０３０２】
次にPyrococcus furiosus [ATCC 43587]のゲノムDNA鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１３２５ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'- aataatCCATGGcgaggatcactgaggaacaaagaaggaaactt-3' (Nco I) [配列番号８５]
5'-aataatAAGCTTagtaatgtactgtttccttctttcatttaa-3' (HindIII) [配列番号８３]
このDNA増幅産物を制限酵素Nco IおよびHind IIIで切断し、pCDFDuet-1 (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、pfuMDH発現ベクターpCDFDuet-pfuMDHを作製する。
【０３０３】
次にThermotoga maritima  [ATCC 43589]のゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１３７１ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGtacgatgctgtgatcataggaggaggaccc-3' (NdeI) [配列番号６３]
5'-aataatCTCGAGtcacagatgaatgggttttcctgagacccc-3' (XhoI) [配列番号６４]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pCDFDuet-pfuMDHの同じ制限酵素サイトに挿入し、pfuMDH、tmaDp共発現ベクターpCDFDuet-pfuMDH-tmaDp [配列番号８６]を作製する。
【０３０４】
発現ベクターpETDuet-pfuMDH::tmaDpおよびpCDFDuet-pfuMDH-tmaDpを用い常法に従いE.coli BL21(DE3)を形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンおよびストレプトマイシンに対する耐性株として選別することができる。
【０３０５】
得られた形質転換体を抗生物質アンピシリン及びストレプトマイシンを添加したLB培地10mLで一晩プレ・カルチャーした後、その0.2mLを、100mLのLB-Amp培地に添加し、3７℃、170rpmで4時間振とう培養する。その後IPTGを添加 (終濃度 1mM) し、37℃で4~12時間培養を続ける。IPTG 誘導した形質転換体を集菌 (8000×g、 2分、4℃) し、1/10 量の 4℃ PBSに再懸濁する。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心 (8000×g、 10分、4℃)して固形夾雑物を取り除く。目的の発現タンパク質が上清に存在することをSDS-PAGEで確認した後、誘導発現されたHisタグ融合タンパク質をニッケルキレートカラムを用いて精製する。
【０３０６】
こうして得られる好熱菌由来の融合タンパク質を用いて、リンゴ酸センサーや燃料電池等を構成できる。
（実施例３３：Burkholderia mallei由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（bmaEDH）とGluconobacter oxydans由来のジアフォラーゼ（goxDp）との融合タンパク質（His-bmaEDH::goxDp）[配列番号９６、９７]の調製）
Burkholderia mallei [ATCC 23344]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１３２４ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatGGATCCGtcttcgcaatcgcagtccccgtccgtcgcg-3' (BamHI) [配列番号９１]
5'-aataatAAGCTTggggtacagaccgcgcatttcgcgcgccat-3' (HindIII) [配列番号９２]
このDNA増幅産物を制限酵素BamHIおよびHind IIIで切断し、pETDuet-1(Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、His-bmaEDH発現ベクターpETDuet-bmaEDHを作製する。
【０３０７】
次にGluconobacter oxydans [ATCC 621H]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１４２８ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGtgcgatacgttcgatctgattgttgttggt-3' (NdeI) [配列番号４９]
5'-aataatCTCGAGtcagatatgcagcgggccgtcgaaggccgc-3' (XhoI) [配列番号５０]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pETDuet-bmaEDHの同じ制限酵素サイトに挿入し、His-bmaEDH、goxDp共発現ベクターpETDuet-bmaEDH-goxDpを作製する。
【０３０８】
次に以下の5'末端リン酸化合成オリゴDNAをTEバッファー中で、等量混合し、加熱後徐冷することによってアニーリングする。
5'-AGCTTgaaggcaaaagcagcggcagcggcagcgaaagcaaaagcaccCA-3' [配列番号５１]
5'-TATGggtgcttttgctttcgctgccgctgccgctgcttttgccttcA-3' [配列番号５２]
このDNA断片を、pETDuet-bmaEDH-goxDpの制限酵素Hind IIIおよびNde Iの認識サイトに挿入し、His-bmaEDHとgoxDpがスペーサー配列EGKSSGSGSESKSTによって連結された融合タンパク質His-bmaEDH::goxDp発現ベクターpETDuet-bmaEDH::goxDp [配列番号９３]を作製する。
【０３０９】
次にBurkholderia mallei [ATCC 23344]のゲノムDNA鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１３２２ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'- aataatCCATGGcgtcgcaatcgcagtccccgtccgtcgcgcag-3' (Nco I) [配列番号９４]
5'-aataatAAGCTTggggtacagaccgcgcatttcgcgcgccat-3' (HindIII) [配列番号９２]
このDNA増幅産物を制限酵素Nco IおよびHind IIIで切断し、pCDFDuet-1 (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、bmaEDH発現ベクターpCDFDuet-bmaEDHを作製する。
【０３１０】
次にGluconobacter oxydans  [ATCC 621H]のゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１４２８ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGtgcgatacgttcgatctgattgttgttggt-3' (NdeI) [配列番号４９]
5'-aataatCTCGAGtcagatatgcagcgggccgtcgaaggccgc-3' (XhoI) [配列番号５０]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pCDFDuet-bmaEDHの同じ制限酵素サイトに挿入し、bmaEDH、goxDp共発現ベクターpCDFDuet-bmaEDH-goxDp [配列番号９５]を作製する。
【０３１１】
発現ベクターpETDuet-bmaEDH::goxDpおよびpCDFDuet-bmaEDH-goxDpを用い、常法に従いE.coli BL21(DE3)を形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンおよびストレプトマイシンに対する耐性株として選別することができる。
【０３１２】
得られた形質転換体を抗生物質アンピシリン及びストレプトマイシンを添加したLB培地10mLで一晩プレ・カルチャーした後、その0.2mLを、100mLのLB-Amp培地に添加し、30℃、170rpmで4時間振とう培養する。その後IPTGを添加 (終濃度 1mM) し、37℃で4~12時間培養を続ける。IPTG 誘導した形質転換体を集菌 (8000×g、 2分、4℃) し、1/10 量の 4℃ PBSに再懸濁する。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心 (8000×g、 10分、4℃)して固形夾雑物を取り除く。目的の発現タンパク質が上清に存在することをSDS-PAGEで確認した後、誘導発現されたHisタグ融合タンパク質をニッケルキレートカラムを用いて精製する。
【０３１３】
（比較例３３：対照としてのbmaEDHおよびgoxDpの調製）
Burkholderia mallei [ATCC 23344]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、約１３２０ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATatgtcttcgcaatcgcagtccccgtccgtcgcg-3' (NdeI)[配列番号９８]
5'-aataatCTCGAGggggtacagaccgcgcatttcgcgcgccat-3' (XhoI)[配列番号９９]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、bmaEDH-His発現ベクターpET21-bmaEDHを作製する。
【０３１４】
次にGluconobacter oxydans  [ATCC 621H]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、約１４２０ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGtgcgatacgttcgatctgattgttgttggt-3' (NdeI) [配列番号４９]
5'-aataatCTCGAGgatatgcagcgggccgtcgaaggccgccag-3' (XhoI) [配列番号６０]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、goxDp-His発現ベクターpET21-goxDpを作製する。
【０３１５】
発現ベクターpET21-bmaEDHおよびpET21-goxDpをそれぞれ個別に、E.coli BL21(DE3)を常法に従い形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンに対する耐性株として選別することができる。
【０３１６】
得られたそれぞれの形質転換体を抗生物質アンピシリンを添加したLB培地10mLで一晩プレ・カルチャーした後、その0.2mLを、100mLのLB-Amp培地に添加し、30℃、170rpmで4時間振とう培養する。その後IPTGを添加 (終濃度 1mM) し、37℃で4~12時間培養を続ける。IPTG 誘導した形質転換体を集菌 (8000×g、 2分、4℃) し、1/10 量の 4℃ PBSに再懸濁する。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心 (8000×g、 10分、4℃)して固形夾雑物を取り除く。目的の発現タンパク質が上清に存在することをSDS-PAGEで確認した後、それぞれの誘導発現されたHisタグ融合タンパク質をニッケルキレートカラムを用いて精製する。
【０３１７】
（実施例３４：グルタミン酸センサー）
図３４および図８を用いて実施例３４を説明する。実施例３４にかかるセンサーは試料溶液中のグルタミン酸を定量するグルタミン酸センサーである。
実施例３４に係るグルタミン酸センサーの酵素電極部を図３４を用いて説明する。
【０３１８】
酵素電極部は以下の構成からなる。導電性基体２０は直径３ｍｍのグラッシーカーボンである。導電性基体２０上に実施例３３で調製した融合タンパク質（His-bmaEDH::goxDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により固定されている。すなわちHis-bmaEDH::goxDp（bmaEDH：０．３ユニット、goxDp：０．６ユニット）、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０３１９】
この酵素電極部を、図８における作用電極４として用いることによってグルタミン酸センサーを構成する。対極５は白金線、参照極６は銀／塩化銀電極で構成する。これらの電極は、それぞれポテンショスタット１０を介して電流などを測定する。試料溶液３としては、所定濃度のグルタミン酸、および１ｍM  NADを含む０．１M  PIPES−NaOH緩衝水溶液（ｐH７．５）を用いる。測定温度は、恒温循環槽によって３０℃に保持される。
【０３２０】
前述のグルタミン酸センサーを用いて次のように定量を行う。作用電極４には参照極６に対して３００ｍVの電位を印加する。このとき、試料溶液３中のグルタミン酸はグルタミン酸デヒドロゲナーゼの存在下で２−オキソグルタル酸に酸化され、この反応でＮＡＤがNADHに還元される。次に前記グルタミン酸デヒドロゲナーゼに融合したジアフォラーゼの存在下でNADHはNADに酸化され、この反応で電子伝達メディエータであるフェロセンが酸化され、フェリシニウムイオンが生成される。（作用電極４には参照極６に対して３００ｍVの電位が印加されているため、）フェリシニウムイオンは作用電極４から電子をうけとりフェロセンに還元される。作用電極４での電子の移動による電流を測定することにより、試料溶液中のグルタミン酸濃度を測定する。
【０３２１】
（比較例３４：グルタミン酸センサー）
図３６および図８を用いて比較例３４を説明する。比較例３４にかかるセンサーは試料溶液中のグルタミン酸を定量するグルタミン酸センサーである。比較例３４に係るグルタミン酸センサーの酵素電極部を図３６を用いて説明する。
【０３２２】
酵素電極部は以下の構成からなる。導電性基体２０は直径３ｍｍのグラッシーカーボンである。導電性基体２０上にグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（bmaEDH）、ジアフォラーゼ（goxDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（bmaEDH）は、比較例３３で調製したBurkholderia mallei由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼである。ジアフォラーゼ（goxDp）は、Gluconobacter oxydans由来のジアフォラーゼである。各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により固定されている。すなわちbmaEDH：０．３ユニット、goxDp：０．６ユニット、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０３２３】
この酵素電極部を用いて、実施例３４と同様に、試料溶液中のグルタミン酸濃度を測定する。実施例３４と比較例３４との相違は、図１１のＡとＢとの相違に類似する。
【０３２４】
実施例３４と比較例３４から、実施例３４のグルタミン酸センサーの方が、比較例３４のグルタミン酸センサーよりも、グルタミン酸濃度に対する感度が高く、より低濃度のグルタミン酸を定量出来ることが明らかとなった。酵素電極上に固定されているグルタミン酸デヒドロゲナーゼ及びジアフォラーゼの量は同じであるにもかかわらず、実施例３４の酵素電極においては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼが融合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、NAD／NADHを介した両酵素間の電子授受が速やかに行われるためと考えられた。
【０３２５】
（実施例３５：グルタミン酸燃料電池）
図３４及び図９を用いて実施例３５を説明する。実施例３５にかかる燃料電池はグルタミン酸を燃料とするグルタミン酸燃料電池である。実施例３５に係るグルタミン酸燃料電池のアノード電極部を図３４を用いて説明する。
【０３２６】
アノード電極部は以下の構成からなる。導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンである。導電性基体２０上に実施例３３で調製した融合タンパク質（His-bmaEDH::goxDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。各成分は、それぞれ以下の最適の濃度比により導電性基体２０上に固定されている。すなわち、His-bmaEDH::goxDp（bmaEDH：０．３ユニット、goxDp：０．６ユニット）、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０３２７】
実施例３５に係るグルタミン酸燃料電池のカソード電極１６は０．５ｃｍ2の白金板からなる。電解質溶液３は、１００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭグルタミン酸、および１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）である。前記アノード電極１５とカソード電極１６は、間に多孔質ポリプロピレンフィルム（厚さ２０μｍ）１７を挟んで配置され、これを蓋２付のウォータージャケットセル１中の前記電解液溶液３中（１０ｍＬ）に配置する。測定温度は、恒温循環槽によって３０℃に保持される。それぞれのリードをポテンショスタット（東方技研、モデル２０００）１０に接続し、−１．２Ｖから０．１Ｖまで電圧を変化させ、電圧−電流特性を測定した。
短絡電流密度：１２２５μＡ／ｃｍ2
最大電力：１０５μＷ／ｃｍ2
の電池出力が観測される。
【０３２８】
（比較例３５：グルタミン酸燃料電池）
図３６及び図９を用いて比較例３５を説明する。比較例３５にかかる燃料電池はグルタミン酸を燃料とするグルタミン酸燃料電池である。比較例３５に係るグルタミン酸燃料電池のアノード電極部を図３６を用いて説明する。
【０３２９】
アノード電極部は以下の構成からなる。導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンである。導電性基体２０上にグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（bmaEDH）、ジアフォラーゼ（goxDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（bmaEDH）は、比較例３３で調製したBurkholderia mallei由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼである。ジアフォラーゼ（goxDp）は、Gluconobacter oxydans由来のジアフォラーゼである。各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により導電性基体２０上に固定されている。すなわち、bmaEDH：０．３ユニット、goxDp：０．６ユニット、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０３３０】
比較例３５に係るグルタミン酸燃料電池を用いて実施例３５と同様に、電圧−電流特性を測定した。
短絡電流密度：３８６μＡ／ｃｍ2
最大電力：３３μＷ／ｃｍ2
の電池出力が観測される。
【０３３１】
実施例３５と比較例３５から、実施例３５のグルタミン酸燃料電池の方が、比較例３５のグルタミン酸燃料電池よりも、電流密度が高く、より大きな電流を取り出せることが明らかとなった。酵素電極上に固定されているグルタミン酸デヒドロゲナーゼ及びジアフォラーゼの量は同じであるにもかかわらず、実施例３５の燃料電池においては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼが融合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、NAD／NADHを介した両酵素間の電子授受が速やかに行われるためと考えられた。
【０３３２】
（実施例３６：グルタミン酸電気化学反応装置）
図３４および図８を用いて実施例３６を説明する。実施例３６にかかる電気化学反応装置はグルタミン酸を基質として２−オキソグルタル酸を生産するグルタミン酸電気化学反応装置である。実施例３６に係るグルタミン酸電気化学反応装置の酵素電極部を図３４を用いて説明する。
【０３３３】
酵素電極部は以下の構成からなる。導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンである。導電性基体２０上に実施例３３で調製した融合タンパク質（His-bmaEDH::goxDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により固定されている。すなわちHis-bmaEDH::goxDp（bmaEDH：０．３ユニット、goxDp：０．６ユニット）、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０３３４】
この酵素電極を図８における作用電極４として用いることによってグルタミン酸電気化学反応装置を構成する。銀塩化銀電極を参照電極６に、白金線を対極５とした三極セルを構成する。１００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭグルタミン酸、および１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）電解液を試料溶液３として使用し、恒温循環槽によって３０℃に保持される。ウォータージャケットセル１中窒素雰囲気下０．３ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌの電位を１００分間印加し、生成物を高速液体クロマトグラフィーで定量する。
【０３３５】
反応電解液からは、２−オキソグルタル酸が検出され、反応電荷量と、生成２−オキソグルタル酸量には、高い相関関係があり、反応が定量的に進行することがわかる。
【０３３６】
（比較例３６：グルタミン酸電気化学反応装置）
図３６および図８を用いて比較例３６を説明する。比較例３６にかかる電気化学反応装置はグルタミン酸を基質として２−オキソグルタル酸を生産するグルタミン酸電気化学反応装置である。比較例３６にかかるグルタミン酸電気化学反応装置の酵素電極部を図３６を用いて説明する。
【０３３７】
酵素電極部は以下の構成からなる。導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンである。導電性基体２０上にグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（bmaEDH）、ジアフォラーゼ（goxDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（bmaEDH）は、比較例３３で調製したBurkholderia mallei由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼである。ジアフォラーゼ（goxDp）は、Gluconobacter oxydans由来のジアフォラーゼである。各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により固定されている。すなわちbmaEDH：０．３ユニット、goxDp：０．６ユニット、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０３３８】
この酵素電極を用いて実施例３６と同様に、生成物を高速液体クロマトグラフィーで定量する。
【０３３９】
反応電解液からは、２−オキソグルタル酸が検出され、反応電荷量と、生成２−オキソグルタル酸量には、高い相関関係があり、反応が定量的に進行することがわかる。しかしながら実施例３６の場合よりも単位時間あたりの反応電荷量は小さい値であることがわかる。
【０３４０】
実施例３６と比較例３６から、実施例３６のグルタミン酸電気化学反応装置の方が、比較例３６のグルタミン酸電気化学反応装置よりも、単位時間あたりの反応電荷量が高く、より効率的にグルタミン酸を２−オキソグルタル酸に変換出来ることが明らかとなる。酵素電極上に固定されているグルタミン酸デヒドロゲナーゼ及びジアフォラーゼの量は同じであるにもかかわらず、実施例３６の電気化学反応装置においては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼが融合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、NAD／NADHを介した両酵素間の電子授受が速やかに行われるためと考えられた。
【０３４１】
（実施例３７：Pyrococcus furiosus由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（pfuEDH）とThermotoga maritima由来のジアフォラーゼ（tmaDp）との融合タンパク質（His-pfuEDH::tmaDp）[配列番号１０５、１０６]の調製）
Pyrococcus furiosus [ATCC 43587]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１２８２ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatGGATCCGgttgagcaagacccctatgaaattgttatt-3' (BamHI) [配列番号１００]
5'-aataatAAGCTTgtgcttgacccatccacggtcaagcattgc-3' (HindIII) [配列番号１０１]
このDNA増幅産物を制限酵素BamHIおよびHind IIIで切断し、pETDuet-1(Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、His-pfuEDH発現ベクターpETDuet-pfuEDHを作製する。
【０３４２】
次にThermotoga maritima [ATCC 43589]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNA：
5'-aataatCATATGtacgatgctgtgatcataggaggaggaccc-3' (NdeI) [配列番号６３]
5'-aataatCTCGAGtcacagatgaatgggttttcctgagacccc-3' (XhoI) [配列番号６４]
をプライマーとして用いてPCRを行い、１３７１ｂｐのDNA増幅産物を得る。
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pETDuet-pfuEDHの同じ制限酵素サイトに挿入し、His-pfuEDH、tmaDp共発現ベクターpETDuet-pfuEDH-tmaDpを作製する。
次に、以下の5'末端リン酸化合成オリゴDNAをTEバッファー中で、等量混合し、加熱後徐冷することによってアニーリングする。
5'-AGCTTgaaggcaaaagcagcggcagcggcagcgaaagcaaaagcaccCA-3' [配列番号５１]
5'-TATGggtgcttttgctttcgctgccgctgccgctgcttttgccttcA-3' [配列番号５２]
このDNA断片を、pETDuet-pfuEDH-tmaDpの制限酵素Hind IIIおよびNde Iの認識サイトに挿入し、His-pfuEDHとtmaDpがスペーサー配列EGKSSGSGSESKSTによって連結された融合タンパク質His-pfuEDH::tmaDp発現ベクターpETDuet-pfuEDH::tmaDp [配列番号１０２]を作製する。
【０３４３】
次にPyrococcus furiosus [ATCC 43587]のゲノムDNA鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１２８０ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'- aataatCCATGGcggagcaagacccctatgaaattgttattaag-3' (Nco I) [配列番号１０３]
5'-aataatAAGCTTgtgcttgacccatccacggtcaagcattgc-3' (HindIII) [配列番号１０１]
このDNA増幅産物を制限酵素Nco IおよびHind IIIで切断し、pCDFDuet-1 (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、pfuEDH発現ベクターpCDFDuet-pfuEDHを作製する。
【０３４４】
次にThermotoga maritima  [ATCC 43589]のゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１３７１ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGtacgatgctgtgatcataggaggaggaccc-3' (NdeI) [配列番号６３]
5'-aataatCTCGAGtcacagatgaatgggttttcctgagacccc-3' (XhoI) [配列番号６４]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pCDFDuet-pfuEDHの同じ制限酵素サイトに挿入し、pfuEDH、tmaDp共発現ベクターpCDFDuet-pfuEDH-tmaDp [配列番号１０４]を作製する。
【０３４５】
発現ベクターpETDuet-pfuEDH::tmaDpおよびpCDFDuet-pfuEDH-tmaDpを用い、常法に従いE.coli BL21(DE3)を形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンおよびストレプトマイシンに対する耐性株として選別することができる。
【０３４６】
得られた形質転換体を抗生物質アンピシリン及びストレプトマイシンを添加したLB培地10mLで一晩プレ・カルチャーした後、その0.2mLを、100mLのLB-Amp培地に添加し、3７℃、170rpmで4時間振とう培養する。その後IPTGを添加 (終濃度 1mM) し、37℃で4~12時間培養を続ける。IPTG 誘導した形質転換体を集菌 (8000×g、 2分、4℃) し、1/10 量の 4℃ PBSに再懸濁する。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心 (8000×g、 10分、4℃)して固形夾雑物を取り除く。目的の発現タンパク質が上清に存在することをSDS-PAGEで確認した後、誘導発現されたHisタグ融合タンパク質をニッケルキレートカラムを用いて精製する。
こうして得られる好熱菌由来の融合タンパク質を用いて、グルタミンセンサー等を構成することができる。
（実施例４１：Saccharomyces cerevisiae由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（sceADH）とGluconobacter oxydans由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（goxALDH）との融合タンパク質（His-sceADH::goxALDH）[配列番号１１３、１１４]の調製）
Saccharomyces cerevisiae [ATCC 47058]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１０７５ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatGGATCCGccttcgcaagtcattcctgaaaaacaaaag-3' (BamHI) [配列番号２７]
5'-aataatAAGCTTtttagaagtctcaacaacatatctaccaac-3' (HindIII) [配列番号２８]
このDNA増幅産物を制限酵素BamHIおよびHind IIIで切断し、pETDuet-1(Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、His-sceADH発現ベクターpETDuet-sceADHを作製する。
【０３４７】
次にGluconobacter oxydans  [ATCC 621H]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１５６０ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGacggcatctctccgttgcgaagtggcagcg-3' (NdeI) [配列番号１０９]
5'-aataatCTCGAGtcaggcgtccgccgaaccgccatacacatc-3' (XhoI) [配列番号１１０]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pETDuet-sceADHの同じ制限酵素サイトに挿入し、His-sceADH、goxALDH共発現ベクターpETDuet-sceADH-goxALDHを作製する。
【０３４８】
次に、以下の5'末端リン酸化合成オリゴDNAをTEバッファー中で、等量混合し、加熱後徐冷することによってアニーリングする。
5'-AGCTTagcggcggcagcggcagcggcggcagcggcCA-3' [配列番号２９]
5'-TATGgccgctgccgccgctgccgctgccgccgctA-3' [配列番号３０]
このDNA断片を、pETDuet-sceADH-goxALDHの制限酵素Hind IIIおよびNde Iの認識サイトに挿入し、His-sceADHとgoxALDHがスペーサー配列SGGSGSGGSGによって連結された融合タンパク質His-sceADH::goxALDH発現ベクターpETDuet-sceADH::goxALDH [配列番号１１１]を作製する。
【０３４９】
次にSaccharomyces cerevisiae [ATCC 47058]のゲノムDNA鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１０７３ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'- aataatCCATGGcgtcgcaagtcattcctgaaaaacaaaaggct-3' (Nco I) [配列番号３２]
5'-aataatAAGCTTtttagaagtctcaacaacatatctaccaac-3' (HindIII) [配列番号２８]
このDNA増幅産物を制限酵素Nco IおよびHind IIIで切断し、pCDFDuet-1 (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、sceADH発現ベクターpCDFDuet-sceADHを作製する。
【０３５０】
次にGluconobacter oxydans  [ATCC 621H]のゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１５６０ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGacggcatctctccgttgcgaagtggcagcg-3' (NdeI) [配列番号１０９]
5'-aataatCTCGAGtcaggcgtccgccgaaccgccatacacatc-3' (XhoI) [配列番号１１０]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pCDFDuet-sceADHの同じ制限酵素サイトに挿入し、sceADH、goxALDH共発現ベクターpCDFDuet-sceADH-goxALDH [配列番号１１２]を作製する。
【０３５１】
発現ベクターpETDuet-sceADH::goxALDHおよびpCDFDuet-sceADH-goxALDHを用い、常法に従いE.coli BL21(DE3)を形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンおよびストレプトマイシンに対する耐性株として選別することができる。
【０３５２】
得られた形質転換体を抗生物質アンピシリン及びストレプトマイシンを添加したLB培地10mLで一晩プレ・カルチャーした後、その0.2mLを、100mLのLB-Amp培地に添加し、30℃、170rpmで4時間振とう培養する。その後IPTGを添加 (終濃度 1mM) し、37℃で4~12時間培養を続ける。IPTG 誘導した形質転換体を集菌 (8000×g、 2分、4℃) し、1/10 量の 4℃ PBSに再懸濁する。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心 (8000×g、 10分、4℃)して固形夾雑物を取り除く。目的の発現タンパク質が上清に存在することをSDS-PAGEで確認した後、誘導発現されたHisタグ融合タンパク質をニッケルキレートカラムを用いて精製する。
【０３５３】
次にPseudomonas putida KT2440 [ATCC 47054]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、７２９ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGcttgtgaatgtactgatcgtccacgctcac-3' (NdeI) [配列番号３]
5'-aataatCTCGAGcgtcagcgggtacaacgcttcatcgaa-3' (XhoI) [配列番号１４]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、ppuDp-His発現ベクターpET21-ppuDpを作製する。
【０３５４】
発現ベクターpET21-ppuDpを、E.coli BL21(DE3)を常法に従い形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンに対する耐性株として選別することができる。
【０３５５】
得られた形質転換体を抗生物質アンピシリンを添加したLB培地10mLで一晩プレ・カルチャーした後、その0.2mLを、100mLのLB-Amp培地に添加し、30℃、170rpmで4時間振とう培養する。その後IPTGを添加 (終濃度 1mM) し、37℃で4~12時間培養を続ける。IPTG 誘導した形質転換体を集菌 (8000×g、 2分、4℃) し、1/10 量の 4℃ PBSに再懸濁する。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心 (8000×g、 10分、4℃)して固形夾雑物を取り除く。目的の発現タンパク質が上清に存在することをSDS-PAGEで確認した後、それぞれの誘導発現されたHisタグ融合タンパク質をニッケルキレートカラムを用いて精製する。
こうして得られた融合タンパク質をアルコールセンサー等に適用できる。
（比較例４１：対照としてのsceADHおよびgoxALDHの調製）
Saccharomyces cerevisiae [ATCC 47058]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、約１０７４ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATatgccttcgcaagtcattcctgaaaaacaaaag-3' (NdeI)[配列番号３６]
5'-aataatCTCGAGtttagaagtctcaacaacatatctaccaac-3' (XhoI)[配列番号３７]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、sceADH-His発現ベクターpET21-sceADHを作製する。
【０３５６】
次にGluconobacter oxydans  [ATCC 621H]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１５５７ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGacggcatctctccgttgcgaagtggcagcg-3' (NdeI) [配列番号１０９]
5'-aataatCTCGAGggcgtccgccgaaccgccatacacatcgaa-3' (XhoI) [配列番号１１５]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、goxALDH-His発現ベクターpET21-goxALDHを作製する。
【０３５７】
次にPseudomonas putida KT2440 [ATCC 47054]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、７２９ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGcttgtgaatgtactgatcgtccacgctcac-3' (NdeI) [配列番号３]
5'-aataatCTCGAGcgtcagcgggtacaacgcttcatcgaa-3' (XhoI) [配列番号１４]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、ppuDp-His発現ベクターpET21-ppuDpを作製する。
【０３５８】
発現ベクターpET21-sceADH、pET21-goxALDHおよびpET21-ppuDpをそれぞれ個別に用い、E.coli BL21(DE3)を常法に従い形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンに対する耐性株として選別することができる。
【０３５９】
得られたそれぞれの形質転換体を抗生物質アンピシリンを添加したLB培地10mLで一晩プレ・カルチャーした後、その0.2mLを、100mLのLB-Amp培地に添加し、30℃、170rpmで4時間振とう培養する。その後IPTGを添加 (終濃度 1mM) し、37℃で4~12時間培養を続ける。IPTG 誘導した形質転換体を集菌 (8000×g、 2分、4℃) し、1/10 量の 4℃ PBSに再懸濁する。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心 (8000×g、 10分、4℃)して固形夾雑物を取り除く。目的の発現タンパク質が上清に存在することをSDS-PAGEで確認した後、それぞれの誘導発現されたHisタグ融合タンパク質をニッケルキレートカラムを用いて精製する。
【０３６０】
（実施例４２：アルコールセンサー）
図４０および図８を用いて実施例４２を説明する。実施例４２にかかるセンサーは試料溶液中のアルコールを定量するアルコールセンサーである。実施例４２に係るアルコールセンサーの酵素電極部を図４０を用いて説明する。
【０３６１】
酵素電極部は以下の構成からなる。導電性基体２０は直径３ｍｍのグラッシーカーボンである。導電性基体２０上に実施例４１で調製した融合タンパク質（His-sceADH::goxALDH）、Pseudomonas putida由来のジアフォラーゼ（ppuDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により固定されている。すなわちHis-sceADH::goxALDH（sceADH：０．３ユニット、goxALDH：０．６ユニット）、ppuDp：０．６ユニット、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０３６２】
この酵素電極部を、図８における作用電極４として用いることによってアルコールセンサーを構成する。対極５は白金線、参照極６は銀／塩化銀電極で構成する。これらの電極は、それぞれポテンショスタット１０を介して電流などを測定する。試料溶液３としては、所定濃度のアルコール（エタノール）、および１ｍM  NADを含む０．１M  PIPES−NaOH緩衝水溶液（ｐH７．５）を用いる。測定温度は、恒温循環槽によって３７℃に保持される。
【０３６３】
前述のアルコールセンサーを用いて次のように定量を行う。作用電極４には参照極６に対して３００ｍVの電位を印加する。このとき、試料溶液３中のアルコールはアルコールデヒドロゲナーゼの存在下でアセトアルデヒドに酸化され、この反応でＮＡＤがNADHに還元される。次に前記アルコールデヒドロゲナーゼに融合したアルデヒドデヒドロゲナーゼの存在下でアセトアルデヒドはカルボン酸に酸化されると同時にNADがNADHに還元される。アルコールデヒドロゲナーゼおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼの両酵素反応により生成したNADHはジアフォラーゼの存在下でNADに酸化され、この反応で電子伝達メディエータであるフェロセンが酸化され、フェリシニウムイオンが生成される。（作用電極４には参照極６に対して３００ｍVの電位が印加されているため、）フェリシニウムイオンは作用電極４から電子をうけとりフェロセンに還元される。作用電極４での電子の移動による電流を測定することにより、試料溶液中のアルコール濃度を測定する。
【０３６４】
（比較例４２：アルコールセンサー）
図４２および図８を用いて比較例４２を説明する。比較例４２にかかるセンサーは試料溶液中のアルコールを定量するアルコールセンサーである。比較例４２に係るアルコールセンサーの酵素電極部を図４２を用いて説明する。
【０３６５】
酵素電極部は以下の構成からなる。導電性基体２０は直径３ｍｍのグラッシーカーボンである。導電性基体２０上にアルコールデヒドロゲナーゼ（sceADH）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（goxALDH）、ジアフォラーゼ（ppuDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。アルコールデヒドロゲナーゼ（sceADH）は比較例４１で調製したSaccharomyces cerevisiae由来のアルコールデヒドロゲナーゼである。アルデヒドデヒドロゲナーゼ（goxALDH）は、Gluconobacter oxydans由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼである。ジアフォラーゼ（ppuDp）は、Pseudomonas putida由来のジアフォラーゼである。各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により固定されている。すなわちsceADH：０．３ユニット、goxALDH：０．６ユニット、ppuDp：０．６ユニット、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０３６６】
この酵素電極部を用いて、実施例４２と同様に測定した。実施例４２と比較例４２との相違は、図１１のＡとＢの相違に類似する。
【０３６７】
実施例４２と比較例４２から、実施例４２のアルコールセンサーの方が、比較例４２のアルコールセンサーよりも、アルコール濃度に対する感度が高く、より低濃度のアルコールを定量出来ることが明らかとなった。酵素電極上に固定されているアルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ及びジアフォラーゼの量は同じであるにもかかわらず、実施例４２の酵素電極においては、アルコールデヒドロゲナーゼとアルデヒドデヒドロゲナーゼが融合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、単位時間内に生成するNADHの量が多いためと考えられた。
【０３６８】
（実施例４３：アルコール燃料電池）
図４０及び図９を用いて実施例４３を説明する。実施例４３にかかる燃料電池はアルコールを燃料とするアルコール燃料電池である。実施例４３に係るアルコール燃料電池のアノード電極部を図４０を用いて説明する。
【０３６９】
アノード電極部は以下の構成からなる。導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンである。導電性基体２０上に実施例４１で調製した融合タンパク質（His-sceADH::goxALDH）、Pseudomonas putida由来のジアフォラーゼ（ppuDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。各成分は、それぞれ以下の最適の濃度比により導電性基体２０上に固定されている。すなわち、His-sceADH::goxALDH（sceADH：０．３ユニット、goxALDH：０．６ユニット）、ppuDp：０．６ユニット、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０３７０】
実施例４３に係るアルコール燃料電池のカソード電極１６は０．５ｃｍ2の白金板からなる。電解質溶液３は、１００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭアルコール（エタノール）、および１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）である。アノード電極１５とカソード電極１６は、間に多孔質ポリプロピレンフィルム（厚さ２０μｍ）１７を挟んで配置され、これを蓋２付のウォータージャケットセル１中の前記電解液溶液３中（１０ｍＬ）に配置する。測定温度は、恒温循環槽によって３７℃に保持される。それぞれのリードをポテンショスタット（東方技研、モデル２０００）１０に接続し、−１．２Ｖから０．１Ｖまで電圧を変化させ、電圧−電流特性を測定した。
短絡電流密度：１６２０μＡ／ｃｍ2
最大電力：１７２μＷ／ｃｍ2
の電池出力が観測される。
【０３７１】
（比較例４３：アルコール燃料電池）
図４２及び図９を用いて比較例４３を説明する。比較例４３にかかる燃料電池はアルコールを燃料とするアルコール燃料電池である。比較例４３に係るアルコール燃料電池のアノード電極部を図４２を用いて説明する。
【０３７２】
アノード電極部は以下の構成からなる。導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンである。導電性基体２０上にアルコールデヒドロゲナーゼ（sceADH）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（goxALDH）、ジアフォラーゼ（ppuDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。アルコールデヒドロゲナーゼ（sceADH）は、比較例４１で調製したSaccharomyces cerevisiae由来のアルコールデヒドロゲナーゼである。アルデヒドデヒドロゲナーゼ（goxALDH）は、Gluconobacter oxydans由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼである。Pseudomonas putida由来のジアフォラーゼ（ppuDp）は、Pseudomonas putida由来のジアフォラーゼである。各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により導電性基体２０上に固定されている。すなわち、sceADH：０．３ユニット、goxALDH：０．６ユニット、ppuDp：０．６ユニット、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０３７３】
比較例４３に係るアルコール燃料電池を用いて、実施例４３と同様に、電圧−電流特性を測定した。
短絡電流密度：５０２μＡ／ｃｍ2
最大電力：５０μＷ／ｃｍ2
の電池出力が観測される。
【０３７４】
実施例４３と比較例４３から、実施例４３のアルコール燃料電池の方が、比較例４３のアルコール燃料電池よりも、電流密度が高く、より大きな電流を取り出せることが明らかとなった。酵素電極上に固定されているアルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、およびジアフォラーゼの量は同じであるにもかかわらず、実施例４３の燃料電池においては、アルコールデヒドロゲナーゼとアルデヒドデヒドロゲナーゼが融合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、単位時間内に生成するNADHの量が多いためと考えられた。
【０３７５】
（実施例４４：アルコール電気化学反応装置）
図４０および図８を用いて実施例４４を説明する。実施例４４にかかる電気化学反応装置はアルコール（エタノール）を基質としてカルボン酸（酢酸）を生産するアルコール電気化学反応装置である。実施例４４に係るアルコール電気化学反応装置の酵素電極部を図４０を用いて説明する。
【０３７６】
酵素電極部は以下の構成からなる。導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンである。導電性基体２０上に実施例４１で調製した融合タンパク質（His-sceADH::goxALDH）、Pseudomonas putida由来のジアフォラーゼ（ppuDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により固定されている。すなわちHis-sceADH::goxALDH（sceADH：０．３ユニット、goxALDH：０．６ユニット）、ppuDp：０．６ユニット、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０３７７】
この酵素電極を図８における作用電極４として用いることによってアルコール電気化学反応装置を構成する。銀塩化銀電極を参照電極６に、白金線を対極５とした三極セルを構成する。１００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭアルコール、および１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）電解液を試料溶液３として使用し、恒温循環槽によって３７℃に保持される。ウォータージャケットセル１中窒素雰囲気下０．３ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌの電位を１００分間印加し、生成物を高速液体クロマトグラフィーで定量する。
【０３７８】
反応電解液からは、カルボン酸（酢酸）が検出され、反応電荷量と、生成カルボン酸（酢酸）量には、高い相関関係があり、反応が定量的に進行することがわかる。
【０３７９】
（比較例４４：アルコール電気化学反応装置）
図４２および図８を用いて比較例４４を説明する。比較例４にかかる電気化学反応装置はアルコール（エタノール）を基質としてカルボン酸（酢酸）を生産するアルコール電気化学反応装置である。比較例４４にかかるアルコール電気化学反応装置の酵素電極部を図４２を用いて説明する。
【０３８０】
酵素電極部は以下の構成からなる。導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンである。導電性基体２０上にアルコールデヒドロゲナーゼ（sceADH）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（goxALDH）、ジアフォラーゼ（ppuDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。アルコールデヒドロゲナーゼ（sceADH）は、比較例４１で調製したSaccharomyces cerevisiae由来のアルコールデヒドロゲナーゼである。アルデヒドデヒドロゲナーゼ（goxALDH）は、Gluconobacter oxydans由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼである。ジアフォラーゼ（ppuDp）は、Pseudomonas putida由来のジアフォラーゼである。各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により固定されている。すなわちsceADH：０．３ユニット、goxALDH：０．６ユニット、ppuDp：０．６ユニット、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０３８１】
この酵素電極を用いて、実施例４４と同様に、生成物を高速液体クロマトグラフィーで定量する。
【０３８２】
反応電解液からは、カルボン酸（酢酸）が検出され、反応電荷量と、生成カルボン酸（酢酸）量には、高い相関関係があり、反応が定量的に進行することがわかる。しかしながら実施例４４の場合よりも単位時間あたりの反応電荷量は小さい値であることがわかる。
実施例４４と比較例４４から、実施例４４のアルコール電気化学反応装置の方が、比較例４４のアルコール電気化学反応装置よりも、単位時間あたりの反応電荷量が高く、より効率的にアルコールをカルボン酸に変換出来ることが明らかとなる。酵素電極上に固定されているアルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、及びジアフォラーゼの量は同じであるにもかかわらず、実施例４４の電気化学反応装置においては、アルコールデヒドロゲナーゼとアルデヒドデヒドロゲナーゼが融合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、単位時間内に生成するNADHの量が多いためと考えられた。
（実施例４５：Pyrococcus furiosus由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（pfuADH）とThermus thermophilus由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（tthALDH）との融合タンパク質（His-pfuADH::tthALDH）[配列番号１２０、１２１]の調製）
Pyrococcus furiosus [ATCC 43587]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１１４７ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatGGATCCGtttttcctaaagactaagattatcgaggga-3' (BamHI) [配列番号３８]
5'-aataatAAGCTTatctccatagaaggccctctcataaattct-3' (HindIII) [配列番号３９]
このDNA増幅産物を制限酵素BamHIおよびHind IIIで切断し、pETDuet-1(Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、His-pfuADH発現ベクターpETDuet-pfuADHを作製する。
【０３８３】
次にThermus thermophilus  [ATCC BAA-163]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１６１４ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGcgcaaggcggcaggcaagtacgggaacacc-3' (NdeI) [配列番号１１６]
5'-aataatCTCGAGttaaagccccagcacctccccccagggcgt-3' (XhoI) [配列番号１１７]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pETDuet-pfuADHの同じ制限酵素サイトに挿入し、His-pfuADH、tthALDH共発現ベクターpETDuet-pfuADH-tthALDHを作製する。
【０３８４】
次に、以下の5'末端リン酸化合成オリゴDNAをTEバッファー中で、等量混合し、加熱後徐冷することによってアニーリングする。
5'-AGCTTagcggcggcagcggcagcggcggcagcggcCA-3' [配列番号２９]
5'-TATGgccgctgccgccgctgccgctgccgccgctA-3' [配列番号３０]
このDNA断片を、pETDuet-pfuADH-tthALDHの制限酵素Hind IIIおよびNde Iの認識サイトに挿入し、His-pfuADHとtthALDHがスペーサー配列SGGSGSGGSGによって連結された融合タンパク質His-pfuADH::tthALDH発現ベクターpETDuet-pfuADH::tthALDH [配列番号１１８]を作製する。
【０３８５】
次にPyrococcus furiosus [ATCC 43587]のゲノムDNA鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１１４５ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'- aataatCCATGGcgttcctaaagactaagattatcgagggaagg-3' (Nco I) [配列番号４１]
5'-aataatAAGCTTatctccatagaaggccctctcataaattct-3' (HindIII) [配列番号３９]
このDNA増幅産物を制限酵素Nco IおよびHind IIIで切断し、pCDFDuet-1 (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、pfuADH発現ベクターpCDFDuet-pfuADHを作製する。
【０３８６】
次にThermus thermophilus  [ATCC BAA-163]のゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１６１４ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGcgcaaggcggcaggcaagtacgggaacacc-3' (NdeI) [配列番号１１６]
5'-aataatCTCGAGttaaagccccagcacctccccccagggcgt-3' (XhoI) [配列番号１１７]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pCDFDuet-pfuADHの同じ制限酵素サイトに挿入し、pfuADH、tthALDH共発現ベクターpCDFDuet-pfuADH-tthALDH [配列番号１１９]を作製する。
【０３８７】
発現ベクターpETDuet-pfuADH::tthALDHおよびpCDFDuet-pfuADH-tthALDHを用い、常法に従いE.coli BL21(DE3)を形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンおよびストレプトマイシンに対する耐性株として選別することができる。
【０３８８】
得られた形質転換体を抗生物質アンピシリン及びストレプトマイシンを添加したLB培地10mLで一晩プレ・カルチャーした後、その0.2mLを、100mLのLB-Amp培地に添加し、30℃、170rpmで4時間振とう培養する。その後IPTGを添加 (終濃度 1mM) し、37℃で4~12時間培養を続ける。IPTG 誘導した形質転換体を集菌 (8000×g、 2分、4℃) し、1/10 量の 4℃ PBSに再懸濁する。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心 (8000×g、 10分、4℃)して固形夾雑物を取り除く。目的の発現タンパク質が上清に存在することをSDS-PAGEで確認した後、誘導発現されたHisタグ融合タンパク質をニッケルキレートカラムを用いて精製する。
【０３８９】
次にPyrococcus horikoshii KT2440 [ATCC 700860]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１３４４ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGaagatagtagttataggatctggaactgct-3' (NdeI) [配列番号１７]
5'-aataatCTCGAGtgacttaaattttctcatggccatttc-3' (XhoI) [配列番号２６]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、phoDp-His発現ベクターpET21-phoDpを作製する。
【０３９０】
発現ベクターpET21-phoDpを、E.coli BL21(DE3)を常法に従い形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンに対する耐性株として選別することができる。
【０３９１】
得られた形質転換体を抗生物質アンピシリンを添加したLB培地10mLで一晩プレ・カルチャーした後、その0.2mLを、100mLのLB-Amp培地に添加し、30℃、170rpmで4時間振とう培養する。その後IPTGを添加 (終濃度 1mM) し、37℃で4~12時間培養を続ける。IPTG 誘導した形質転換体を集菌 (8000×g、 2分、4℃) し、1/10 量の 4℃ PBSに再懸濁する。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心 (8000×g、 10分、4℃)して固形夾雑物を取り除く。目的の発現タンパク質が上清に存在することをSDS-PAGEで確認した後、それぞれの誘導発現されたHisタグ融合タンパク質をニッケルキレートカラムを用いて精製する。
こうして得られた融合タンパク質をアルコールセンサー等に適用できる。
（実施例４９：Bacillus subtilis由来のグルコースデヒドロゲナーゼ（busGDH）とEscherichia coli由来のキシロースイソメラーゼ（ecoISO）との融合タンパク質（His-busGDH::ecoISO）[配列番号１２７、１２８]の調製）
Bacillus subtilis [ATCC 27370]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、８０５ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatGGATCCGtatccggatttaaaaggaaaagtcgtcgct-3' (BamHI) [配列番号１]
5'-aataatAAGCTTaccgcggcctgcctggaatgaaggatattg-3' (HindIII) [配列番号２]
このDNA増幅産物を制限酵素BamHIおよびHind IIIで切断し、pETDuet-1(Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、His-busGDH発現ベクターpETDuet-busGDHを作製する。
【０３９２】
次にEscherichia coli  [ATCC 29425]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１３４４ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGcaagcctattttgaccagctcgatcgcgtt-3' (NdeI) [配列番号１２３]
5'-aataatCTCGAGttatttgtcgaacagataatggtttaccag-3' (XhoI) [配列番号１２４]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pETDuet-busGDHの同じ制限酵素サイトに挿入し、His-busGDH、ecoISO共発現ベクターpETDuet-busGDH-ecoISOを作製する。
【０３９３】
次に、以下の5'末端リン酸化合成オリゴDNAをTEバッファー中で、等量混合し、加熱後徐冷することによってアニーリングする。
5'-AGCTTagcggcggcagcggcagcggcggcagcggcCA-3' [配列番号２９]
5'-TATGgccgctgccgccgctgccgctgccgccgctA-3' [配列番号３０]
このDNA断片を、pETDuet-busGDH-ecoISOの制限酵素Hind IIIおよびNde Iの認識サイトに挿入し、His-busGDHとecoISOがスペーサー配列SGGSGSGGSGによって連結された融合タンパク質His-busGDH::ecoISO発現ベクターpETDuet-busGDH::ecoISO [配列番号１２５]を作製する。
【０３９４】
次にBacillus subtilis [ATCC 27370]のゲノムDNA鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、８０５ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'- aataatCCATGGcgcgccggatttaaaaggaaaagtcgtcgctattacagga-3' (Nco I) [配列番号８]
5'-aataatAAGCTTaccgcggcctgcctggaatgaaggatattg-3' (HindIII) [配列番号２]
このDNA増幅産物を制限酵素Nco IおよびHind IIIで切断し、pCDFDuet-1 (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、busGDH発現ベクターpCDFDuet-busGDHを作製する。
【０３９５】
次にEscherichia coli  [ATCC 29425]のゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１３４４ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGcaagcctattttgaccagctcgatcgcgtt-3' (NdeI) [配列番号１２３]
5'-aataatCTCGAGttatttgtcgaacagataatggtttaccag-3' (XhoI) [配列番号１２４]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pCDFDuet-busGDHの同じ制限酵素サイトに挿入し、busGDH、ecoISO共発現ベクターpCDFDuet-busGDH-ecoISO [配列番号１２６]を作製する。
【０３９６】
発現ベクターpETDuet-busGDH::ecoISOおよびpCDFDuet-busGDH-ecoISOを常法に従いE.coli BL21(DE3)に形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンおよびストレプトマイシンに対する耐性株として選別することができる。
【０３９７】
得られた形質転換体を抗生物質アンピシリン及びストレプトマイシンを添加したLB培地10mLで一晩プレ・カルチャーした後、その0.2mLを、100mLのLB-Amp培地に添加し、30℃、170rpmで4時間振とう培養する。その後IPTGを添加 (終濃度 1mM) し、37℃で4~12時間培養を続ける。IPTG 誘導した形質転換体を集菌 (8000×g、 2分、4℃) し、1/10 量の 4℃ PBSに再懸濁する。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心 (8000×g、 10分、4℃)して固形夾雑物を取り除く。目的の発現タンパク質が上清に存在することをSDS-PAGEで確認した後、誘導発現されたHisタグ融合タンパク質をニッケルキレートカラムを用いて精製する。
【０３９８】
次にPseudomonas putida KT2440 [ATCC 47054]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、７２９ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGcttgtgaatgtactgatcgtccacgctcac-3' (NdeI) [配列番号３]
5'-aataatCTCGAGcgtcagcgggtacaacgcttcatcgaa-3' (XhoI) [配列番号１４]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、ppuDp-His発現ベクターpET21-ppuDpを作製する。
【０３９９】
発現ベクターpET21-ppuDpを用いて、E.coli BL21(DE3)を常法に従い形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンに対する耐性株として選別することができる。
【０４００】
得られた形質転換体を抗生物質アンピシリンを添加したLB培地10mLで一晩プレ・カルチャーした後、その0.2mLを、100mLのLB-Amp培地に添加し、30℃、170rpmで4時間振とう培養する。その後IPTGを添加 (終濃度 1mM) し、37℃で4~12時間培養を続ける。IPTG 誘導した形質転換体を集菌 (8000×g、 2分、4℃) し、1/10 量の 4℃ PBSに再懸濁する。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心 (8000×g、 10分、4℃)して固形夾雑物を取り除く。目的の発現タンパク質が上清に存在することをSDS-PAGEで確認した後、それぞれの誘導発現されたHisタグ融合タンパク質をニッケルキレートカラムを用いて精製する。
【０４０１】
（比較例４９：対照としてのbusGDHおよびecoISOの調製）
Bacillus subtilis [ATCC 27370]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、約８００ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATatgtatccggatttaaaaggaaaagtcgtcgct-3' (NdeI)[配列番号１２]
5'-aataatCTCGAGaccgcggcctgcctggaatgaaggatattg-3' (XhoI)[配列番号１３]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、busGDH-His発現ベクターpET21-busGDHを作製する。
【０４０２】
次にEscherichia coli  [ATCC 29425]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１３４１ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGcaagcctattttgaccagctcgatcgcgtt-3' (NdeI) [配列番号１２３]
5'-aataatCTCGAGtttgtcgaacagataatggtttaccagatt-3' (XhoI) [配列番号１２９]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、ecoISO-His発現ベクターpET21-ecoISOを作製する。
【０４０３】
次にPseudomonas putida KT2440 [ATCC 47054]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、７２９ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGcttgtgaatgtactgatcgtccacgctcac-3' (NdeI) [配列番号３]
5'-aataatCTCGAGcgtcagcgggtacaacgcttcatcgaa-3' (XhoI) [配列番号１４]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、ppuDp-His発現ベクターpET21-ppuDpを作製する。
【０４０４】
発現ベクターpET21-busGDH、pET21-ecoISOおよびpET21-ppuDpをそれぞれ個別に用い、E.coli BL21(DE3)を常法に従い形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンに対する耐性株として選別することができる。
【０４０５】
得られたそれぞれの形質転換体を抗生物質アンピシリンを添加したLB培地10mLで一晩プレ・カルチャーした後、その0.2mLを、100mLのLB-Amp培地に添加し、30℃、170rpmで4時間振とう培養する。その後IPTGを添加 (終濃度 1mM) し、37℃で4~12時間培養を続ける。IPTG 誘導した形質転換体を集菌 (8000×g、 2分、4℃) し、1/10 量の 4℃ PBSに再懸濁する。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心 (8000×g、 10分、4℃)して固形夾雑物を取り除く。目的の発現タンパク質が上清に存在することをSDS-PAGEで確認した後、それぞれの誘導発現されたHisタグ融合タンパク質をニッケルキレートカラムを用いて精製する。
【０４０６】
（実施例５０：フルクトースセンサー）
図４６および図８を用いて実施例５０を説明する。実施例５０にかかるセンサーは試料溶液中のフルクトースを定量するフルクトースセンサーである。実施例５０に係るフルクトースセンサーの酵素電極部を図４６を用いて説明する。
【０４０７】
酵素電極部は以下の構成からなる。導電性基体２０は直径３ｍｍのグラッシーカーボンである。導電性基体２０上に実施例４９で調製した融合タンパク質（His-busGDH::ecoISO）、ジアフォラーゼ（ppuDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。ジアフォラーゼ（ppuDp）はPseudomonas putida由来のジアフォラーゼである。各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により固定されている。すなわちHis-busGDH::ecoISO（busGDH：０．３ユニット、ecoISO：０．６ユニット）、ppuDp：０．６ユニット、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０４０８】
この酵素電極部を、図８における作用電極４として用いることによってフルクトースセンサーを構成する。対極５は白金線、参照極６は銀／塩化銀電極で構成する。これらの電極は、それぞれポテンショスタット１０を介して電流などを測定する。試料溶液３としては、所定濃度のフルクトース、および１ｍM  NADを含む０．１M  PIPES−NaOH緩衝水溶液（ｐH７．５）を用いる。測定温度は、恒温循環槽によって３７℃に保持される。
【０４０９】
前述のフルクトースセンサーを用いて次のように定量を行う。作用電極４には参照極６に対して３００ｍVの電位を印加する。このとき、試料溶液３中のフルクトースはキシロースイソメラーゼの存在下でグルコースに変換される。次に前記キシロースイソメラーゼに融合したグルコースデヒドロゲナーゼの存在下でグルコースはグルコノラクトンに酸化されると同時にNADがNADHに還元される。生成したNADHはジアフォラーゼの存在下でNADに酸化され、この反応で電子伝達メディエータであるフェロセンが酸化され、フェリシニウムイオンが生成される。（作用電極４には参照極６に対して３００ｍVの電位が印加されているため、）フェリシニウムイオンは作用電極４から電子をうけとりフェロセンに還元される。作用電極４での電子の移動による電流を測定することにより、試料溶液中のフルクトース濃度を測定する。
【０４１０】
（比較例５０：フルクトースセンサー）
図４８および図８を用いて比較例５０を説明する。比較例５０にかかるセンサーは試料溶液中のフルクトースを定量するフルクトースセンサーである。比較例５０に係るフルクトースセンサーの酵素電極部を図４８を用いて説明する。
【０４１１】
酵素電極部は以下の構成からなる。導電性基体２０は直径３ｍｍのグラッシーカーボンである。導電性基体２０上にグルコースデヒドロゲナーゼ（busGDH）、キシロースイソメラーゼ（ecoISO）、ジアフォラーゼ（ppuDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。グルコースデヒドロゲナーゼ（busGDH）は、比較例４９で調製したBacillus subtilis由来のグルコースデヒドロゲナーゼである。キシロースイソメラーゼ（ecoISO）は、Escherichia coli由来のキシロースイソメラーゼである。ジアフォラーゼ（ppuDp）は、Pseudomonas putida由来のジアフォラーゼである。各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により固定されている。すなわちbusGDH：０．３ユニット、ecoISO：０．６ユニット、ppuDp：０．６ユニット、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０４１２】
この酵素電極部を用いて、実施例５０と同様に、試料溶液中のフルクトース濃度を測定する。実施例５０と比較例５０との相違は、図１１のＡとＢの相違と同様である。
【０４１３】
実施例５０と比較例５０から、実施例５０のフルクトースセンサーの方が、比較例５０のフルクトースセンサーよりも、フルクトース濃度に対する感度が高く、より低濃度のフルクトースを定量出来ることが明らかとなった。酵素電極上に固定されているグルコースデヒドロゲナーゼ、キシロースイソメラーゼ及びジアフォラーゼの量は同じであるにもかかわらず、実施例５０の酵素電極においては、グルコースデヒドロゲナーゼとキシロースイソメラーゼが融合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、グルコースを介したフルクトースからグルコノラクトンへの変換・酸化反応が速やかに行われ、結果として単位時間内に生成するNADHの量が多いためと考えられた。
【０４１４】
（実施例５１：フルクトース燃料電池）
図４６及び図９を用いて実施例５１を説明する。実施例５１にかかる燃料電池はフルクトースを燃料とするフルクトース燃料電池である。実施例５１に係るフルクトース燃料電池のアノード電極部を図４６を用いて説明する。
【０４１５】
アノード電極部は以下の構成からなる。導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンである。導電性基体２０上に実施例４９で調製した融合タンパク質（His-busGDH::ecoISO）、Pseudomonas putida由来のジアフォラーゼ（ppuDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。各成分は、それぞれ以下の最適の濃度比により導電性基体２０上に固定されている。すなわち、His-busGDH::ecoISO（busGDH：０．３ユニット、ecoISO：０．６ユニット）、ppuDp：０．６ユニット、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
実施例５１に係るフルクトース燃料電池のカソード電極１６は０．５ｃｍ2の白金板からなる。
【０４１６】
電解質溶液３は、１００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭフルクトース、および１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）である。アノード電極１５とカソード電極１６は、間に多孔質ポリプロピレンフィルム（厚さ２０μｍ）１７を挟んで配置され、これを蓋２付のウォータージャケットセル１中の前記電解液溶液３中（１０ｍＬ）に配置する。測定温度は、恒温循環槽によって３７℃に保持される。それぞれのリードをポテンショスタット（東方技研、モデル２０００）１０に接続し、−１．２Ｖから０．１Ｖまで電圧を変化させ、電圧−電流特性を測定した。
短絡電流密度：１１０５μＡ／ｃｍ2
最大電力：１００μＷ／ｃｍ2
の電池出力が観測される。
【０４１７】
（比較例５１：フルクトース燃料電池）
図４８及び図９を用いて比較例５１を説明する。比較例５１にかかる燃料電池はフルクトースを燃料とするフルクトース燃料電池である。比較例５１に係るフルクトース燃料電池のアノード電極部を図４８を用いて説明する。
【０４１８】
アノード電極部は以下の構成からなる。導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンである。導電性基体２０上にグルコースデヒドロゲナーゼ（busGDH）、キシロースイソメラーゼ（ecoISO）、ジアフォラーゼ（ppuDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。グルコースデヒドロゲナーゼ（busGDH）は、比較例４９で調製したBacillus subtilis由来のグルコースデヒドロゲナーゼである。キシロースイソメラーゼ（ecoISO）は、Escherichia coli由来のキシロースイソメラーゼである。ジアフォラーゼ（ppuDp）は、Pseudomonas putida由来のジアフォラーゼである。各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により導電性基体２０上に固定されている。すなわち、busGDH：０．３ユニット、ecoISO：０．６ユニット、ppuDp：０．６ユニット、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０４１９】
比較例５１に係るフルクトース燃料電池を用いて、実施例５０と同様に、電圧−電流特性を測定した。
短絡電流密度：３０９μＡ／ｃｍ2
最大電力：３０μＷ／ｃｍ2
の電池出力が観測される。
【０４２０】
実施例５１と比較例５１から、実施例５１のフルクトース燃料電池の方が、比較例５１のフルクトース燃料電池よりも、電流密度が高く、より大きな電流を取り出せることが明らかとなった。酵素電極上に固定されているグルコースデヒドロゲナーゼ、キシロースイソメラーゼ、およびジアフォラーゼの量は同じであるにもかかわらず、実施例５１の燃料電池においては、グルコースデヒドロゲナーゼとキシロースイソメラーゼが融合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、グルコースを介したフルクトースからグルコノラクトンへの変換・酸化反応が速やかに行われ、結果として単位時間内に生成するNADHの量が多いためと考えられた。
【０４２１】
（実施例５２：フルクトース電気化学反応装置）
図４６および図８を用いて実施例５２を説明する。実施例５２にかかる電気化学反応装置はフルクトースを基質としてグルコノラクトンを生産するフルクトース電気化学反応装置である。実施例５２に係るフルクトース電気化学反応装置の酵素電極部を図４６を用いて説明する。
【０４２２】
酵素電極部は以下の構成からなる。導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンである。導電性基体２０上に実施例４９で調製した融合タンパク質（His-busGDH::ecoISO）、Pseudomonas putida由来のジアフォラーゼ（ppuDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により固定されている。すなわちHis-busGDH::ecoISO（busGDH：０．３ユニット、ecoISO：０．６ユニット）、ppuDp：０．６ユニット、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０４２３】
この酵素電極を図８における作用電極４として用いることによってフルクトース電気化学反応装置を構成する。銀塩化銀電極を参照電極６に、白金線を対極５とした三極セルを構成する。１００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭフルクトース、および１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）電解液を試料溶液３として使用し、恒温循環槽によって３７℃に保持される。ウォータージャケットセル１中窒素雰囲気下０．３ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌの電位を１００分間印加し、生成物を高速液体クロマトグラフィーで定量する。反応電解液からは、グルコノラクトンが検出され、反応電荷量と、生成グルコノラクトン量には、高い相関関係があり、反応が定量的に進行することがわかる。
【０４２４】
（比較例５２：フルクトース電気化学反応装置）
図４８および図８を用いて比較例５２を説明する。比較例４にかかる電気化学反応装置はフルクトースを基質としてグルコノラクトンを生産するフルクトース電気化学反応装置である。比較例５２にかかるフルクトース電気化学反応装置の酵素電極部を図４８を用いて説明する。
【０４２５】
酵素電極部は以下の構成からなる。導電性基体２０は０．５ｃｍ2のグラッシーカーボンである。導電性基体２０上にグルコースデヒドロゲナーゼ（busGDH）、キシロースイソメラーゼ（ecoISO）、ジアフォラーゼ（ppuDp）、及びフェロセン結合ポリアリルアミン（Fc−PAA）がPEGDEにより架橋されて固定されている。グルコースデヒドロゲナーゼ（busGDH）は、比較例４９で調製したBacillus subtilis由来のグルコースデヒドロゲナーゼである。キシロースイソメラーゼ（ecoISO）は、Escherichia coli由来のキシロースイソメラーゼである。ジアフォラーゼ（ppuDp）は、Pseudomonas putida由来のジアフォラーゼである。各成分は、それぞれ以下の最適の濃度により固定されている。すなわちbusGDH：０．３ユニット、ecoISO：０．６ユニット、ppuDp：０．６ユニット、Fc-PAA：１６μｇ、PEGDE：１０μｇで調製されている。酵素電極部の作製は上記成分の各水溶液を電極上で混合後、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより行う。
【０４２６】
この酵素電極を用いて、実施例５２と同様に、生成物を高速液体クロマトグラフィーで定量する。
【０４２７】
反応電解液からは、グルコノラクトンが検出され、反応電荷量と、生成グルコノラクトン量には、高い相関関係があり、反応が定量的に進行することがわかる。しかしながら実施例５２の場合よりも単位時間あたりの反応電荷量は小さい値であることがわかる。
実施例５２と比較例５２から、実施例５２のフルクトース電気化学反応装置の方が、比較例５２のフルクトース電気化学反応装置よりも、単位時間あたりの反応電荷量が高く、より効率的にフルクトースをグルコノラクトンに変換出来ることが明らかとなる。酵素電極上に固定されているグルコースデヒドロゲナーゼ、キシロースイソメラーゼ、及びジアフォラーゼの量は同じであるにもかかわらず、実施例５２の電気化学反応装置においては、グルコースデヒドロゲナーゼとキシロースイソメラーゼが融合しているために、両酵素が物理的近傍に保持されている。このため、グルコースを介したフルクトースからグルコノラクトンへの変換・酸化反応が速やかに行われ、結果として単位時間内に生成するNADHの量が多いためと考えられた。
（実施例５３：Pyrococcus furiosus由来のグルコースデヒドロゲナーゼ（pfuGDH）とThermotoga maritima由来のキシロースイソメラーゼ（tmaISO）との融合タンパク質（His-pfuGDH::tmaISO）[配列番号１３４、１３５]の調製）
Pyrococcus furiosus [ATCC 43587]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、７９９ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatGGATCCGaacattttaataacagcttcttcaagagga-3' (BamHI) [配列番号１５]
5'-aataatAAGCTTaagaagaacgctcctagtcattgctccatc-3' (HindIII) [配列番号１６]
このDNA増幅産物を制限酵素BamHIおよびHind IIIで切断し、pETDuet-1(Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、His-pfuGDH発現ベクターpETDuet-pfuGDHを作製する。
【０４２８】
次にThermotoga maritima  [ATCC 43589]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１３５６ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGgcagaatttttcccagaaatcccaaagatt-3' (NdeI) [配列番号１３０]
5'-aataatCTCGAGtcacctcagttctgctattgtcttcactat-3' (XhoI) [配列番号１３１]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pETDuet-pfuGDHの同じ制限酵素サイトに挿入し、His-pfuGDH、tmaISO共発現ベクターpETDuet-pfuGDH-tmaISOを作製する。
【０４２９】
次に、以下の5'末端リン酸化合成オリゴDNAをTEバッファー中で、等量混合し、加熱後徐冷することによってアニーリングする。
5'-AGCTTagcggcggcagcggcagcggcggcagcggcCA-3' [配列番号２９]
5'-TATGgccgctgccgccgctgccgctgccgccgctA-3' [配列番号３０]
このDNA断片を、pETDuet-pfuGDH-tmaISOの制限酵素Hind IIIおよびNde Iの認識サイトに挿入し、His-pfuGDHとtmaISOがスペーサー配列SGGSGSGGSGによって連結された融合タンパク質His-pfuGDH::tmaISO発現ベクターpETDuet-pfuGDH::tmaISO [配列番号１３２]を作製する。
【０４３０】
次にPyrococcus furiosus [ATCC 43587]のゲノムDNA鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、７９７ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'- aataatCCATGGcgattttaataacagcttcttcaagaggaataggcttc-3' (Nco I) [配列番号２０]
5'-aataatAAGCTTaagaagaacgctcctagtcattgctccatc-3' (HindIII) [配列番号１６]
このDNA増幅産物を制限酵素Nco IおよびHind IIIで切断し、pCDFDuet-1 (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、pfuGDH発現ベクターpCDFDuet-pfuGDHを作製する。
【０４３１】
次にThermotoga maritima  [ATCC 43589]のゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１３５６ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGgcagaatttttcccagaaatcccaaagatt-3' (NdeI) [配列番号１３０]
5'-aataatCTCGAGtcacctcagttctgctattgtcttcactat-3' (XhoI) [配列番号１３１]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pCDFDuet-pfuGDHの同じ制限酵素サイトに挿入し、pfuGDH、tmaISO共発現ベクターpCDFDuet-pfuGDH-tmaISO [配列番号１３３]を作製する。
【０４３２】
発現ベクターpETDuet-pfuGDH::tmaISOおよびpCDFDuet-pfuGDH-tmaISOを用い、常法に従いE.coli BL21(DE3)を形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンおよびストレプトマイシンに対する耐性株として選別することができる。
【０４３３】
得られた形質転換体を抗生物質アンピシリン及びストレプトマイシンを添加したLB培地10mLで一晩プレ・カルチャーした後、その0.2mLを、100mLのLB-Amp培地に添加し、30℃、170rpmで4時間振とう培養する。その後IPTGを添加 (終濃度 1mM) し、37℃で4~12時間培養を続ける。IPTG 誘導した形質転換体を集菌 (8000×g、 2分、4℃) し、1/10 量の 4℃ PBSに再懸濁する。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心 (8000×g、 10分、4℃)して固形夾雑物を取り除く。目的の発現タンパク質が上清に存在することをSDS-PAGEで確認した後、誘導発現されたHisタグ融合タンパク質をニッケルキレートカラムを用いて精製する。
【０４３４】
次にPyrococcus horikoshii KT2440 [ATCC 700860]から常法に従いゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、以下の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、１３４４ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatCATATGaagatagtagttataggatctggaactgct-3' (NdeI) [配列番号１７]
5'-aataatCTCGAGtgacttaaattttctcatggccatttc-3' (XhoI) [配列番号２６]
このDNA増幅産物を制限酵素Nde IおよびXho Iで切断し、pET-21a(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入し、phoDp-His発現ベクターpET21-phoDpを作製する。
【０４３５】
発現ベクターpET21-phoDpを用い、E.coli BL21(DE3)を常法に従い形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンに対する耐性株として選別することができる。
【０４３６】
得られた形質転換体を抗生物質アンピシリンを添加したLB培地10mLで一晩プレ・カルチャーした後、その0.2mLを、100mLのLB-Amp培地に添加し、30℃、170rpmで4時間振とう培養する。その後IPTGを添加 (終濃度 1mM) し、37℃で4~12時間培養を続ける。IPTG 誘導した形質転換体を集菌 (8000×g、 2分、4℃) し、1/10 量の 4℃ PBSに再懸濁する。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心 (8000×g、 10分、4℃)して固形夾雑物を取り除く。目的の発現タンパク質が上清に存在することをSDS-PAGEで確認した後、それぞれの誘導発現されたHisタグ融合タンパク質をニッケルキレートカラムを用いて精製する。
こうして得られる好熱菌由来の融合タンパク質をフルクトースセンサーや燃料電池に適用できる。
【０４３７】
こうして得られる好熱菌由来の融合タンパク質を用いて、既述の実施例のようにフルクトースセンサー等を構成することができる。
【０４３８】
以上、複数の実施例及び比較例を用いて説明したが、好熱菌由来の融合タンパク質を用いたセンサーや燃料電池の方が、時間経過に対する出力の低下は少なく、また耐久性にもすぐれている。
【図面の簡単な説明】
【０４３９】
【図１】本発明の酵素電極における一形態として、グルコースデヒドロゲナーゼ（GDH）とジアフォラーゼ（Dp）との融合タンパク質を構成要素とする酵素電極の概念図である。
【図２】本発明の酵素電極における一形態として、アルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）とジアフォラーゼ（Dp）との融合タンパク質を構成要素とする酵素電極の概念図である。
【図３】本発明の酵素電極における一形態として、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）とジアフォラーゼ（Dp）との融合タンパク質を構成要素とする酵素電極の概念図である。
【図４】本発明酵素電極における一形態として、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（MDH）とジアフォラーゼ（Dp）との融合タンパク質を構成要素とする酵素電極の概念図である。
【図５】本発明の酵素電極における一形態として、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（EDH）とジアフォラーゼ（Dp）との融合タンパク質を構成要素とする酵素電極の概念図である。
【図６】本発明の酵素電極における一形態として、アルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）とアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ALDH）との融合タンパク質を構成要素とする酵素電極の概念図である。
【図７】本発明の酵素電極における一形態として、イソメラーゼ（ISO）とグルコースデヒドロゲナーゼ（GDH）との融合タンパク質を構成要素とする酵素電極の概念図である。
【図８】本発明の酵素電極を用いて構成したセンサーの概念図である。
【図９】本発明の酵素電極を用いて構成した燃料電池の概念図である。
【図１０】本発明の実施例に係るグルコースデヒドロゲナーゼとジアフォラーゼとの融合タンパク質を構成要素とする酵素電極部の概念図である。
【図１１】実施例２に係るグルコースセンサーを用いて測定された基質濃度と電流密度の関係を示す図である。
【図１２】本発明の比較例に係るグルコースデヒドロゲナーゼとジアフォラーゼとを構成要素とする酵素電極部の概念図である。
【符号の説明】
【０４４０】
１  ウォータージャケットセル
２  蓋
３  試料溶液
４  作用電極
５  白金線対極
６  銀塩化銀参照電極
７  作用極リード
８  対極リード
９  参照極リード
１０  ポテンショスタット
１１  ガス吹込み口
１２  ガスチューブ
１３  温調水流入口
１４  温調水排出口
１５  アノード
１６  カソード
１７  多孔質ポリプロピレンフィルム
１８  ガス排出口
１９  電解質溶液
２０  導電性基体
【図１】
2007163185.tif 000002
【図２】
2007163185.tif 000003
【図３】
2007163185.tif 000004
【図４】
2007163185.tif 000005
【図５】
2007163185.tif 000006
【図６】
2007163185.tif 000007
【図７】
2007163185.tif 000008
【図８】
2007163185.tif 000009
【図９】
2007163185.tif 000010
【図１０】
2007163185.tif 000011
【図１１】
2007163185.tif 000012
【図１２】
2007163185.tif 000013
【配列表】
2007163185000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年1月6日(2006.1.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項７】
前記デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼとの融合タンパク質が、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性およびジアフォラーゼ活性を有することを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の酵素電極；
（ａ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列において、前記の各活性が損なわれない範囲で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失または置換の修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項８】
前記デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼとの融合タンパク質が、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性およびジアフォラーゼ活性を有することを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の酵素電極；
（ａ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列において、前記の各活性が損なわれない範囲で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失または置換の修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項９】
前記デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼとの融合タンパク質が、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性およびジアフォラーゼ活性を有することを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の酵素電極；
（ａ）配列番号３５で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号３５で表されるアミノ酸配列において、前記の各活性が損なわれない範囲で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失または置換の修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１０】
前記デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼとの融合タンパク質が、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性およびジアフォラーゼ活性を有することを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の酵素電極；
（ａ）配列番号４４で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号４４で表されるアミノ酸配列において、前記の各活性が損なわれない範囲で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失または置換の修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
【手続補正５】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１１】
前記デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼとの融合タンパク質が、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつ乳酸デヒドロゲナーゼ活性およびジアフォラーゼ活性を有することを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の酵素電極；
（ａ）配列番号５７で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号５７で表されるアミノ酸配列において、前記の各活性が損なわれない範囲で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失または置換の修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
【手続補正６】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１２】
前記デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼとの融合タンパク質が、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつ乳酸デヒドロゲナーゼ活性およびジアフォラーゼ活性を有することを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の酵素電極；
（ａ）配列番号６９で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号６９で表されるアミノ酸配列において、前記の各活性が損なわれない範囲で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失または置換の修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
【手続補正７】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１３】
前記デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼとの融合タンパク質が、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性およびジアフォラーゼ活性を有することを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の酵素電極；
（ａ）配列番号７９で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号７９で表されるアミノ酸配列において、前記の各活性が損なわれない範囲で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失または置換の修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
【手続補正８】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１４】
前記デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼとの融合タンパク質が、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性およびジアフォラーゼ活性を有することを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の酵素電極；
（ａ）配列番号８８で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号８８で表されるアミノ酸配列において、前記の各活性が損なわれない範囲で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失または置換の修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
【手続補正９】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１５】
前記デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼとの融合タンパク質が、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性およびジアフォラーゼ活性を有することを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の酵素電極；
（ａ）配列番号９７で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号９７で表されるアミノ酸配列において、前記の各活性が損なわれない範囲で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失または置換の修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１６】
前記デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼとの融合タンパク質が、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性およびジアフォラーゼ活性を有することを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の酵素電極；
（ａ）配列番号１０６で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１０６で表されるアミノ酸配列において、前記の各活性が損なわれない範囲で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失または置換の修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１７】
前記アルコールデヒドロゲナーゼとアルデヒドデヒドロゲナーゼとの融合タンパク質が、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する請求項５に記載の酵素電極；
（ａ）配列番号１１４で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１１４で表されるアミノ酸配列において、前記の各活性が損なわれない範囲で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失または置換の修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１８】
前記アルコールデヒドロゲナーゼとアルデヒドデヒドロゲナーゼとの融合タンパク質が、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する請求項５に記載の酵素電極；
（ａ）配列番号１２１で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１２１で表されるアミノ酸配列において、前記の各活性が損なわれない範囲で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失または置換の修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１９】
前記イソメラーゼとグルコースデヒドロゲナーゼとの融合タンパク質が、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつイソメラーゼ活性およびグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する請求項６に記載の酵素電極；
（ａ）配列番号１２８で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１２８で表されるアミノ酸配列において、前記の各活性が損なわれない範囲で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失または置換の修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２０】
前記イソメラーゼとグルコースデヒドロゲナーゼとの融合タンパク質が、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつイソメラーゼ活性およびグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する請求項６に記載の酵素電極；
（ａ）配列番号１３５で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１３５で表されるアミノ酸配列において、前記の各活性が損なわれない範囲で、１から複数個のアミノ酸の付加、欠失または置換の修飾が単独あるいは複数の組合せで実施されているアミノ酸配列。