(57)【要約】【課題】修飾型の核酸の増幅に基づいてゲノムＤＮＡ試料中のメチル化パターンを決定し、そして特異的にアニールしたハイブリダイゼーションプローブの増幅依存性の置換に基づいてメチル化核酸を検出するための、改良した高処理的かつ定量的な方法の提供。【解決手段】ゲノムＤＮＡ試料を亜硫酸水素ナトリウムで処理してメチル化依存性の配列の差異を生成せしめ、続いて蛍光を基にした定量的ＰＣＲ技術を用いて検出する方法。【選択図】図１
2007068539.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡのゲノム試料中のシトシンのメチル化及びメチル化されたＣｐＧ島を検出するための方法であって、
（ａ）ＤＮＡのゲノム試料と、非メチル化シトシンを修飾して変換した核酸を生成せしめる修飾剤とを接触させ；
（ｂ）１又は複数の特異的なオリゴヌクレオチドプローブの存在下又は非存在下で、２つのオリゴヌクレオチドプライマーによって変換した核酸を増幅し、ここで、１又は複数のオリゴヌクレオチドプライマー及び／又は特異的なプローブは、非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別することができる；そして
（ｃ）前記プローブの増幅を介する消化に基づいてメチル化核酸を検出すること、
を含んで成る方法。
【請求項２】
増幅段階がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
修飾剤が亜硫酸水素塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
変換した核酸が、非修飾型核酸を含む試料に存在する非メチル化シトシン残基の代わりにウラシルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
プローブが更に１又は複数の蛍光ラベル部分を含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
増幅及び検出段階が蛍光に基づいた定量的ＰＣＲを含んで成る、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
メチル化ＣｐＧ含有核酸を検出するための方法であって、
（ａ）核酸含有試料と、非メチル化シトシンを修飾して変換した核酸を形成せしめる修飾剤とを接触させ；
（ｂ）ＣｐＧ特異的オリゴヌクレオチドプローブの存在下で、オリゴヌクレオチドプライマーによって試料中の変換した核酸を増幅し、ここで、前記プライマーではなく、ＣｐＧ特異的プライマーが、修飾型の非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別する；そして
（ｃ）ＣｐＧ特異的プローブの増幅を介する置換に基づいてメチル化核酸を検出すること、
を含んで成る方法。
【請求項８】
増幅段階がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含んで成る、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
修飾剤が亜硫酸水素塩を含んで成る、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
変換した核酸が、非修飾型核酸含有試料に存在する非メチル化シトシン残基の代わりにウラシルを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
検出方法が、ＣｐＧ特異的プローブの増幅を介する置換に基づいた蛍光シグナルの測定によるものである、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
増幅及び検出方法が、蛍光に基づいた定量的ＰＣＲを含んで成る、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
核酸試料中のメチル化量が、投入した核酸の量のためのコントロール反応との参照に基づいて定量的に決定される、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
メチル化ＣｐＧ含有核酸を検出するための方法であって、
（ａ）核酸含有試料と、非メチル化シトシンを修飾して変換した核酸を形成せしめる修飾剤とを接触させ；
（ｂ）オリゴヌクレオチドプライマーによって、そしてＣｐＧ特異的オリゴヌクレオチドプローブの存在下で試料中の変換した核酸を増幅し、ここで、前記プライマー及びＣｐＧ特異的プライマーの両方が、修飾型の非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別する；そして
（ｃ）ＣｐＧ特異的プローブの増幅を介する置換に基づいてメチル化核酸を検出すること、
を含んで成る方法。
【請求項１５】
増幅段階がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含んで成る、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
修飾剤が亜硫酸水素塩を含んで成る、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
変換した核酸が、非修飾型核酸含有試料に存在する非メチル化シトシン残基の代わりにウラシルを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
検出方法が、ＣｐＧ特異的プローブの増幅を介する置換に基づいて蛍光シグナルを測定することを含んで成る、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
増幅及び検出方法が、蛍光に基づいた定量的ＰＣＲである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
メチル化ＣｐＧ含有核酸の検出にとって有用なメチル化検出キットであって、これが
（ｉ）非メチル化シトシンを修飾して変換した核酸を生成せしめる修飾剤を含む第一容器；
（ii）変換した核酸の増幅のためのプライマーを含む第二容器；
（iii)コントロールの非修飾型核酸の増幅のためのプライマーを含む第三容器；及び
（iv）検出が増幅を介する置換に基づいている、特異的なオリゴヌクレオチドプローブを含む第四容器、
を含んで成る、１又は複数の容器を近接した制限で内部に収容するために区分されている輸送手段を含んで成り、プライマー及びプローブのそれぞれが非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別し得るか又はし得ないキット。
【請求項２１】
修飾剤が亜硫酸水素塩である、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
修飾剤がシトシン残基をウラシル残基へと変換する、請求項２０に記載のキット。
【請求項２３】
特異的なオリゴヌクレオチドプローブがＣｐＧ特異的オリゴヌクレオチドプローブであり、そして変換した核酸の増幅のためのプライマーではなく、プローブが修飾型非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別する、請求項２０に記載のキット。
【請求項２４】
特異的なオリゴヌクレオチドプローブがＣｐＧ特異的オリゴヌクレオチドプローブであり、そしてプローブ及び変換した核酸の増幅のためのプライマーの両方が、修飾型非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別する、請求項２０に記載のキット。
【請求項２５】
プローブが更に、直接的に又はリンカー部分を介してオリゴヌクレオチド塩基と連結した蛍光部分を含んで成る、請求項２０に記載のキット。
【請求項２６】
プローブが特異的な、二重標識したＴａｑＭａｎ（商標）プローブである、請求項２０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はゲノムＤＮＡ試料のメチル化パターンを決定するための向上した高処理量的かつ定量的方法を提供する。具体的には、本発明の方法は、ゲノムＤＮＡ試料を亜硫酸水素ナトリウムで処理して、メチル化依存性の配列の差異を生成せしめること、これに続く蛍光を基にした定量的ＰＣＲ技術を用いる検出を提供する。
【背景技術】
【０００２】
高等真核生物において、ＤＮＡはＣｐＧジヌクレオチドのグアノシンに対して５′側に位置するシトシンのみがメチル化される。この修飾は、それが遺伝子配列のプロモーター領域に位置するＣｐＧに富む領域（ＣｐＧ島）を含む場合に、支配的に遺伝子発現に対する重要な制御作用を有する。ＣｐＧの広範なメチル化は、選択の刷り込まれた遺伝子の転写不活性化及び雌の不活性Ｘ染色体上の遺伝子と関連づけられてきた。通常メチル化されていないＣｐＧ島の異常なメチル化は、不死化細胞及び形質転換した細胞における高頻度の事象として説明されており、そしてヒトのガンにおける腫瘍抑制遺伝子の転写不活性化としばしば関連づけられてきた。
【０００３】
ＤＮＡメチラーゼは、一般的なメチルドナー、例えばＳ−アデノシルメチオニン由来のメチル基を、ＤＮＡ上の特異的な部位へと転移させる。細菌におけるＤＮＡのメチル化の１つの生物学的機能は、同族の制限酵素による消化からのＤＮＡの保護である。哺乳類細胞は、グアニンの５′側に隣接しているＤＮＡ上のシトシン残基（ＣｐＧ）をメチル化するメチラーゼを有する。このメチル化は、遺伝子不活性化、細胞分化、腫瘍形成、Ｘ染色体の不活性化、及び遺伝子刷り込みにおける役割を果たしていると思われる。ＣｐＧ島は正常な細胞においてメチル化されていないままであるが、Ｘ染色体の不活性化及び５′側の制御領域のメチル化が転写の抑制を導き得る親の特異的刷り込みの間は除く。ＤＮＡのメチル化はまた、そのコード機能を変えること無く、ＤＮＡの塩基配列を変化させる機構である。ＤＮＡのメチル化は、遺伝的、可逆的、そして後成的な変化である。更に、ＤＮＡのメチル化は遺伝子の発現を変える潜在性を有しており、これは深い発生的かつ遺伝的な結果を有する。
【０００４】
メチル化反応は、標的シトシンをそのままの二重らせんの外へとはじき出し、酵素であるＤＮＡ（シトシン−５）−メチルトランスフェラーゼ（Klimasauskas et al., Cell 76 : 357-369, 1994）の間隙においてＳ−アデノシルメチオニン由来のメチル基を転移させて５−メチルシトシン（５−ｍＣｙｔ）を形成せしめることを可能にすることに関与する。この酵素的変換は、脊椎動物において存在することが知られているＤＮＡの唯一の後成的修飾であり、そして正常な胚発生に必須である（Bird, Cell 70 : 5-8, 1992 ; Laird and Jaenisch, Human Mol. Genet. 3 : 1487-1495, 1994 ; 及びLi et al., Cell 69 : 915-926, 1992）。ＣｐＧジヌクレオチドでの５−ｍＣｙｔの存在は、脊椎動物の進化の間、ゲノムにおけるこの配列の５倍の減少をもたらしており、これは恐らく５−ｍＣｙｔからＴへの自発的な脱アミノ化によるものであると思われる(Schoreret et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 957-961, 1992）。その様な抑制を示さないゲノムのそれらの領域は、「ＣｐＧ島」と称されている（Bird, Nature 321 : 209-213, 1986 ; 及びGardiner - Garden et al., J. Mol. Biol. 196 : 261-282, 1987）。これらのＣｐＧ島領域は、脊椎動物のゲノムの約１％を含んで成り、そしてまたＣｐＧジヌクレオチドの合計数の約１５％を占めている（Bird, Nature 321 : 209-213, 1986）。ＣｐＧ島は典型的に０．２〜約１kbの長さであり、そして多くのハウスキーピング遺伝子及び組織特異的遺伝子の上流に位置しているが、遺伝子のコード領域にも達し得る。それ故に、体細胞性の組織におけるＣｐＧ島内のシトシン残基のメチル化は、転写を変えることによって遺伝子の機能に影響を及ぼすと信じられている（Cedar, Cell 53 : 3-4, 1988）。
【０００５】
ある遺伝子のＣｐＧ島内に含まれるシトシン残基のメチル化は、遺伝活性と逆に相関させられてきた。これは、例えば局所的な染色質の構造の破壊、転写因子とＤＮＡとの結合の阻害を含む様々な機構による、又は転写因子の結合を間接的に妨害するメチル化配列と特異的に相互作用するタンパク質の動員による、遺伝子の発現の低下を導き得る。換言すると、メチル化がどの様にｍＲＮＡの転写及び遺伝子の発現に影響を及ぼすかということに関して複数の理論が存在しているが、正確な作用機構は全く理解されていない。いくつかの研究は、ＣｐＧ島のメチル化と遺伝子発現との間の逆の相関を示したが、常染色体上の多くのＣｐＧ島は生殖系列において非メチル化のままであり、そしてこれらの島のメチル化は通常遺伝子の発現と無関係である。組織特異的遺伝子は受容性の標的器官において通常メチル化されないが、生殖系列及び非発現性の成体の組織においてメチル化される。構成的に発現するハウスキーピング遺伝子のＣｐＧ島は、生殖系列及び体細胞の組織において通常メチル化されない。
【０００６】
腫瘍抑制遺伝子と関連しているＣｐＧ島の異常なメチル化も、遺伝子発現の低下をもたらし得る。その様な領域のメチル化の増大は、選択的な増殖の利点（すなわち悪性）を有する細胞群の選択をもたらす正常な遺伝子発現の進行性の低下を導き得る。
【０００７】
ＤＮＡメチル化のパターン、特にシトシン残基のメチル化の変化がゲノムの不安定性をもたらし、そして変異原性であるとみなされている。このことは、恐らく真核生物におけるＣｐＧメチル受容部位の抑制の８０％を導き、それらのゲノムをメチル化する。シトシンのメチル化は更に、多型性及び生殖系列の変異の生成並びに腫瘍抑制遺伝子を不活性化する転移変異に寄与する(Jones, Cancer Res. 56 : 2463-2467, 1996）。メチル化はまた、哺乳類の胚の形成に必要とされる（Li et al., Cell 69 : 915-926, 1992）。ＣｐＧに富むプロモーター領域のメチル化が、転写活性を阻害し得ると思われる。Ushijima等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 : 2284-2289, 1997）は、マウスの肝臓癌形成の間にメチル化の変化を示すＤＮＡを特徴づけ、そしてクローン化した。ガン細胞におけるメチル化部位の変化の一連の研究に由来するデータは、それが単にガンにおいて変化するＤＮＡメチル化の全体的なレベルではないが、メチル基の分布における変化であることを示す。
【０００８】
これらの研究は、ＣｐＧ島として知られている、ＣｐＧに富む配列でのメチル化が、腫瘍抑制遺伝子の不活性化のための代替経路を提供することを示唆している。腫瘍抑制遺伝子のプロモーターにおけるＣｐＧオリゴヌクレオチドのメチル化は、それらの不活性化を導き得る。他の研究は、正常なメチル化過程における変化がゲノムの不安定性と関連しているというデータを提供する(Lengauer et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 : 2545-2550, 1997）。その様な異常な後成的変化は多くのガンの型において見出すことができ、そして腫瘍形成の変換のための潜在的なマーカーとしての役割を果たすことがあり、これはその様な後成的な変化を素速く決定するための信頼できる手段が存在していることを示している。それ故に、好ましい後成的な変化としてメチル化を検出するための信頼でき、かつ素速い（高処理量）方法についての当業界での要望が存在している。
【０００９】
ＤＮＡのメチル化を決定するための方法
様々なゲノムのスキャニング法が存在しており、ガン細胞におけるメチル化部位の変化を同定するために使用されてきた。例えば、ある方法はＲＬＧＳ（restriction landmark genomic scanning）（Kawai et al., Mol. Cell. Biol. 14 : 7421-7427, 1994）を含み、そして別の例はメチル化感受性ＡＰ（arbitrarily primed）−ＰＣＲ(Gonzalgo et al., Cancer Res. 57 : 594-599, 1997）を含む。特異的なＣｐＧ部位におけるメチル化パターンの変化は、メチル化感受性制限酵素を用いたゲノムＤＮＡの消化、続く注目の領域のサザン解析（消化−サザン法）によって観察されてきた。消化−サザン法の直接的な方法であるが、それは大量の高分子量ＤＮＡ（少なくとも５μｇ又はそれ以上）を必要とし、そしてＣｐＧ部位の解析のための限定された範囲を有する（メチル化感受性制限酵素の認識部位の存在によって決定されるもの）という固有の欠点を有する。メチル化パターンの変化を解析するための別の方法は、ＰＣＲ増幅の前のメチル化感受性制限酵素を用いたゲノムＤＮＡの消化を含む、ＰＣＲに基づいた方法を含む（Singer - Sam et al., Nucl. Acids Res. 18 : 687, 1990）。しかしながら、この方法が有効であると示されていないのは、非効率的な酵素消化又はその次のＰＣＲ反応における過剰増幅による、偽のポジティブなシグナル（メチル化の存在）の程度の高さのためである。
【００１０】
ゲノムの配列決定は、亜硫酸水素塩処理を用いることによって、ＤＮＡのメチル化パターン及び５−メチルシトシンの分布の解析のために単純化されてきた(Frommer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 1827-1831, 1992）。ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理は非メチル化シトシンからメチル化型を識別するが、本来の亜硫酸水素塩ゲノム配列決定は、全体的なメチル化パターンを決定するために、多数のプラスミドクローンの大規模な配列決定を必要とすることによって、この技術が日常的な診断的アッセイの任意の型において、メチル化パターンを決定するために商業的に有用であることを妨げている。
【００１１】
更に、メチル化解析のための出発点として、ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理を利用する他の技術が報告されてきた。これらはメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）（Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 : 9821-9826, 1992）；及び亜硫酸水素塩で変換したＤＮＡから増幅したＰＣＲ生成物の制限酵素消化（Sadri and Hornsby, Nucl. Acids Res. 24 : 5058-5059, 1996 ; 及びXiong and Laird, Nucl. Acids Res. 25 : 2532-2534, 1997）を含む。
【００１２】
ＰＣＲ技術は遺伝子変異の検出（Kuppuswamy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 1143-1147, 1991）及び対立遺伝子特異的な発現の定量（Szabo and Mann, Genes Dev. 9 : 3097-3108, 1995 ; 及び Singer - Sam et al., PCR Methods Appl. 1 : 160-163, 1992）のために開発されてきた。その様な技術は内部プライマーを使用し、これはＰＣＲで生成した鋳型とアニーリングし、そしてアッセイすべき一塩基の５′側で直ちに終結する。しかしながら、対立遺伝子特異的な発現の技術は、ＤＮＡのメチル化パターンについてアッセイする状況において挑戦されていなかった。
【００１３】
特異的な遺伝子座、例えば複雑なゲノムＤＮＡにおけるＣｐＧ島を解析するために使用する多くの分子生物学的技術は、配列特異的増幅のいくつかの型を含み、これはＥ．コリにおけるクローニングによる生物学的増幅、ＰＣＲによる直接的な増幅又は可視化され得るプローブを用いたハイブリダイゼーションによるシグナル増幅のいずれかである。ＤＮＡのメチル化は、Ｅ．コリ又はＰＣＲ反応のいずれにも存在しない、専用の維持ＤＮＡメチルトランスフェラーゼによって複製後に加えられるので、その様なメチル化の情報は分子クローニング又はＰＣＲ増幅の間に失われる。更に、分子ハイブリダイゼーションがメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとを識別しないのは、シトシン上のメチル基が塩基の対合に参加しないためである。複雑なゲノムＤＮＡにおけるメチル化情報を増幅するための容易な方法の欠如は、恐らくＤＮＡのメチル化の研究に対する最も重大な障害であった。それ故に、特に定量的方法における、メチル化検出技術について改良するための当業界での要求が存在している。
【００１４】
開発されてきた特異的な遺伝子座でのＤＮＡのメチル化パターンの決定のための間接的な方法は、増幅の事象の前にメチル化依存性の挙動でゲノムＤＮＡを変化させる技術に頼っている。このメチル化依存性のＤＮＡ変化を達成するために利用されてきた２つの主要な方法が存在している。最初のものは、ＣｐＧ配列の前後の５−メチルシトシンにより、その活性に影響が及ぼされている制限酵素による消化である。開裂、又はその欠如は、サザンブロッティング又はＰＣＲによってその後に明らかにされ得る。近年の広範な使用を支えた他の技術は、亜硫酸水素ナトリウムを用いたゲノムＤＮＡの処理である。亜硫酸水素ナトリウム処理は、ＤＮＡ中の全ての非メチル化シトシン残基を脱アミノ化によってウラシルへと変換するが、メチル化シトシン残基はそのままにしておく。その後のＰＣＲ増幅はウラシル残基をチミンと置換し、そして５−メチルシトシン残基をシトシンと置換する。生じた配列の差異は、標準的なＤＮＡ配列検出技術、主にＰＣＲを用いて検出されてきた。
【００１５】
多くのＤＮＡメチル化検出技術は亜硫酸水素塩処理を利用する。現在、全ての亜硫酸水素塩処理を基にした方法が、ゲノム内の特異的な遺伝子座を解析するためのＰＣＲ反応に先行している。２つの原理的に異なる方法が存在しており、この中で亜硫酸水素ナトリウムで生じた配列の差異が明らかにされ得る。最初のものは、メチル化又は非メチル化のいずれかの変換したＤＮＡと独特にアニールするＰＣＲプライマーを設計することである。この技術は「メチル化特異的ＰＣＲ」又は「ＭＳＰ」と称されている。他の亜硫酸水素塩を基にした技術（例えば亜硫酸水素塩ゲノム配列決定、ＣＯＢＲＡ及びＭｓ−ＳＮｕＰＥ）の全てに使用される方法は、本来のゲノム配列においてＣｐＧジヌクレオチドを欠く部位でアニールするプライマーを用いて、亜硫酸水素塩で変換したＤＮＡを増幅することである。この方法において、ＰＣＲプライマーは、２つのプライマー間の配列を、本来のゲノムＤＮＡにおけるその配列のＤＮＡメチル化状態に関係無しに増幅し得る。これは異なるＰＣＲ生成物のプールをもたらし、これは全て長さが同一であり、そして２つのプライマー間に位置するＣｐＧの、潜在的なＤＮＡメチル化の部位でのみそれらの配列に差異がある。亜硫酸水素塩で変換した配列を処理するこれらの方法間の差異は、ＭＳＰの場合、メチル化情報がＰＣＲ生成物の発生又は発生の欠如に由来し、一方、他の技術の場合、生成物の混合物が常に生成し、そして混合物が引き続き解析されて、異なるメチル化状態の相対的な発生に対する定量的な情報を生成せしめることにある。
【００１６】
ＭＳＰは定性的な技術である。それが定量的でないという２つの理由が存在している。最初に、メチル化情報が２つの別のＰＣＲ反応（メチル化のものと非メチル化のもの）の比較に由来するということである。それには２つの異なるＰＣＲ反応の動力学的な比較を行う際の固有の難しさが存在している。ＭＳＰを用いる他の問題は、しばしばプライマーが１以上のＣｐＧジヌクレオチドを覆うことにある。その結果、複数の配列変異体が本来のゲノムＤＮＡのＤＮＡメチル化パターンに依存して生成し得る。例えば、上流プライマーが３つのＣｐＧを覆う２４マーのオリゴヌクレオチドであるならば、２3 ＝８の異なる理論的な配列の順列が、２４ヌクレオチドの配列内での亜硫酸水素塩の変換の後に、ゲノムＤＮＡにおいて起こり得る。万が一、完全にメチル化及び完全に非メチル化の反応が行われるならば、８個の可能なメチル化状態のうちの２個のみを現実に研究することだろう。この状況は、中間のメチル化状態が、効率は低下するが増幅を導くならば、更に複雑となる。それ故に、ＭＳＰ技術は非定量的である。それ故に、ＭＳＰ技術を改良し、そしてそれを更に定量的に変え、そしてその方法がより大量に処理することを可能にさせる要求が当業界には存在している。本発明は、より素速くかつ定量的なメチル化アッセイのためのこの要求に取り組む。
【００１７】
本発明の要約
本発明は、ＤＮＡのゲノム試料中のメチル化されたＣｐＧ島を検出するための方法であって、
（ａ）患者由来のＤＮＡのゲノム試料と、非メチル化シトシンを修飾して変換した核酸を生成せしめる修飾剤とを接触させ；
（ｂ）１又は複数の特異的なオリゴヌクレオチドプローブの存在下又は非存在下で、２つのオリゴヌクレオチドプライマーによって変換した核酸を増幅し、ここで、１又は複数のオリゴヌクレオチドプライマー及び／又はプローブは、非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別することができる；そして
（ｃ）前記プローブの増幅を介する消化に基づいてメチル化核酸を検出すること、
を含んで成る方法を提供する。好ましくは、増幅段階はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、そして修飾剤は亜硫酸水素塩である。好ましくは、変換した核酸は、ＤＮＡの非修飾型ゲノム試料に存在する非メチル化シトシン残基の代わりにウラシルを含む。好ましくは、プローブは更に蛍光標識部分を含んで成り、そして増幅及び検出段階は蛍光に基づいた定量的ＰＣＲを含んで成る。
【００１８】
本発明は、メチル化ＣｐＧ含有核酸を検出するための方法であって、
（ａ）核酸含有試料と、非メチル化シトシンを修飾して変換した核酸を形成せしめる修飾剤とを接触させ；
（ｂ）ＣｐＧ特異的オリゴヌクレオチドプローブの存在下で、オリゴヌクレオチドプライマーによって試料中の変換した核酸を増幅し、ここで、前記プライマーではなく、ＣｐＧ特異的プライマーが、非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別する；そして
（ｃ）ＣｐＧ特異的プローブの増幅を介する置換に基づいてメチル化核酸を検出すること、
を含んで成る方法を提供する。好ましくは、増幅段階はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含んで成り、そして修飾剤は亜硫酸水素塩を含んで成る。好ましくは、変換した核酸は、非修飾型核酸含有試料に存在する非メチル化シトシン残基の代わりにウラシルを含む。好ましくは、検出方法は、ＣｐＧ特異的プローブの増幅を介する置換に基づいた蛍光シグナルの測定によるものであり、そして増幅及び検出方法は、蛍光に基づいた定量的ＰＣＲを含んで成る。核酸試料中のメチル化量は、投入した核酸の量のためのコントロール反応との参照に基づいて定量的に決定される。
【００１９】
本発明は更に、メチル化ＣｐＧ含有核酸を検出するための方法であって、
（ａ）核酸含有試料と、非メチル化シトシンを修飾して変換した核酸を形成せしめる修飾剤とを接触させ；
（ｂ）オリゴヌクレオチドプライマーによって、そしてＣｐＧ特異的オリゴヌクレオチドプローブの存在下で、試料中の変換した核酸を増幅し、ここで、前記プライマー及びＣｐＧ特異的プライマーの両方が、修飾型の非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別する；そして
（ｃ）ＣｐＧ特異的プローブの増幅を介する置換に基づいてメチル化核酸を検出すること、
を含んで成る方法を提供する。好ましくは、増幅段階はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、そして修飾剤は亜硫酸水素塩である。好ましくは、変換した核酸は、非修飾型核酸含有試料に存在する非メチル化シトシン残基の代わりにウラシルを含む。好ましくは、検出方法は、ＣｐＧ特異的プローブの増幅を介する置換に基づいて蛍光シグナルを測定することを含んで成り、そして増幅及び検出方法は、蛍光に基づいた定量的ＰＣＲを含んで成る。
【００２０】
本発明は更に、メチル化ＣｐＧ含有核酸の検出にとって有用なメチル化検出キットであって、これが
（ｉ）非メチル化シトシンを修飾して変換した核酸を生成せしめる修飾剤を含む第一容器；
（ii）変換した核酸の増幅のためのプライマーを含む第二容器；
（iii)コントロールの非修飾型核酸の増幅のためのプライマーを含む第三容器；及び
（iv）検出が増幅を介する置換に基づいている、特異的なオリゴヌクレオチドプローブを含む第四容器、
を含んで成る、１又は複数の容器を近接した制限で内部に収容するために区分されている輸送手段を含んで成り、プライマー及びプローブのそれぞれが非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別し得るか又はし得ないキットを提供する。好ましくは、修飾剤は亜硫酸水素塩を含んで成る。好ましくは、修飾剤はシトシン残基をウラシル残基へと変換する。好ましくは、特異的なオリゴヌクレオチドプローブはＣｐＧ特異的オリゴヌクレオチドプローブであり、そして変換した核酸の増幅のためのプライマーではなく、プローブが修飾型非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別する。あるいは、特異的なオリゴヌクレオチドプローブはＣｐＧ特異的オリゴヌクレオチドプローブであり、そしてプローブ及び変換した核酸の増幅のためのプライマーの両方が、修飾型非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別する。好ましくは、プローブは更に、直接的に又はリンカー部分を介してオリゴヌクレオチド塩基と連結した蛍光部分を含んで成り、そしてプローブは特異的な、二重標識したＴａｑＭａｎプローブである。
【００２１】
本発明の詳細な説明
本発明は、核酸の試料におけるメチル化パターンを検出するための、素速い、感受性の、再現性がある高処理方法を提供する。本発明は、核酸のメチル化依存性修飾を提供し、核酸の本来の試料に存在するメチル化残基と非メチル化残基とを識別するために、核酸の増幅、検出、又はその両方の方法を使用する。好ましい態様において、本発明はゲノムＤＮＡの試料中のＣｐＧ島のメチル化状態を決定することを提供する。
【００２２】
メチル化パターンを決定するための以前の方法と対照的に、当該メチル化核酸の検出は比較的速く、そして特異的オリゴヌクレオチドの増幅を介する置換に基づいている。好ましい態様において、増幅及び検出は、事実、二重標識したＴａｑＭａｎ（商標）オリゴヌクレオチドプローブを用いる、蛍光に基づいたリアルタイム（ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ）定量的ＰＣＲ（「ＲＴ−ＰＣＲ」）によって測定されるのと同時に起こる。置換可能なプローブは、本来の、非修飾型核酸試料に存在するメチル化ＣｐＧ部位と非メチル化ＣｐＧ部位とを識別するために特異的に設計され得る。
【００２３】
メチル化特異的ＰＣＲの技術（「ＭＳＰ」；米国特許第５，７８６，１４６号）の様に、本発明は、メチル化パターンを決定するために使用される、以前のＰＣＲに基づいた方法及び他の方法（例えばサザン解析）以上の有意な利益を提供する。本発明は、実質的にサザン解析以上に感度があり、そして非常に小さな核酸試料、及びパラフィンが包埋した試料中の少数（パーセンテージ）のメチル化対立遺伝子の検出を容易にする。更に、ゲノムＤＮＡの場合、解析はメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによって認識されるＤＮＡ配列に限定されておらず、その結果より幅広いＣｐＧに富む領域を通過するメチル化パターンの精巧なマッピングを可能にしている。本発明はまた、以前のＰＣＲに基づくメチル化法に固有な、メチル化感受性制限酵素による不完全な消化に起因する、あらゆる偽のポジティブな結果を排除する。
【００２４】
本発明はまた、ＭＳＰ技術以上の有意な利益を提案する。それはメチル化の量を測定するための定量方法として利用されることがあり、そして実質的に更に素速い。ＭＳＰ技術以上の１つの重大な利益は、ゲル電気泳動が高処理の可能性を制限する時間のかかる手作業であるだけでなく、ＰＣＲの反応チューブの操作及び開口が試料の誤識の機会を増大させ、そしてそれが微量のＰＣＲ生成物による将来のＰＣＲ反応の汚染の機会を大きく増大させることである。ウラシルの取り込み及びウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＡｍｐＥｒａｓｅ）の使用によるＰＣＲ汚染を回避する標準的な方法は、亜硫酸水素塩処理したＤＮＡにおけるウラシルの存在により、亜硫酸水素塩技術と両立できない。それ故に、亜硫酸水素塩処理したＤＮＡを用いる高処理適用におけるＰＣＲ生成物汚染の回避は、非修飾型ＤＮＡの増幅よりも大きな技術的挑戦である。本発明はＰＣＲ後の操作又は処理を全く必要としない。これは亜硫酸水素塩処理したＤＮＡの解析に関わる仕事の量を大きく減少させるだけでなく、将来の反応を汚染し得るＰＣＲ生成物の扱いを回避する手段も提供する。
【００２５】
２つの要因が、よく見ても半定量的な適用にＭＳＰを制限する。最初に、ＭＳＰのメチル化情報は２つの別々のＰＣＲ反応（メチル化及び非メチル化のもの）の比較に由来する。そこには、以後の増幅反応、例えばリアルタイム定量的ＰＣＲの高度に定量的な方法無しに、２つの異なるＰＣＲ反応の動力学的な比較の実施における固有の困難性が存在する。他の問題は、ＭＳＰの増幅が特定のＣｐＧ特異的オリゴヌクレオチドによって、すなわち偏ったプライマーによって提供されるという事実に関連している。しばしば、その様なプライマーによって覆われるＤＮＡ配列は、増幅した配列が、本来のゲノムＤＮＡにおけるＤＮＡのメチル化パターンに依存して存在する複数の潜在的な配列変異体のわずかに１つを表すであろうという結果によって、１以上のＣｐＧジヌクレオチドを含む。例えば、上流プライマーが３つのＣｐＧを覆う２４マーのオリゴヌクレオチドであるならば、２3 ＝８の異なる理論的な配列の順列が、この２４ヌクレオチドの配列内での亜硫酸水素塩変換に続いて、ゲノムＤＮＡに起こり得る。万が一、完全にメチル化及び完全に非メチル化の反応が行われるならば、８つの可能なメチル化状態のうちのわずかに２つが解析される。
【００２６】
この状況は、中間のメチル化状態が完全にメチル化又は完全に非メチル化のプライマーによって非特異的に増幅されるならば、更に複雑となる。従って、ＭＳＰの特許は、２つの反応の動力学の比較というより、完全にメチル化される反応、それに対する完全に非メチル化される反応におけるＰＣＲ生成物の発生又は発生無しに基づいている非定量的技術を明示的に記載している。
【００２７】
対照的に、本発明の１つの態様は、本来の、非修飾型ＤＮＡ配列におけるＣｐＧ配列を全く覆わないプライマーを用いて、全ての可能なメチル化状態の偏っていない増幅を提供する。全てのメチル化パターンが等しく増幅される限り、ＤＮＡのメチル化パターンについての定量的な情報は、配列の差異を検出することができる技術のいずれかによって（例えば蛍光に基づいたＰＣＲによって）、生じたＰＣＲプールから引き出され得る。
【００２８】
更に、本発明はＭＳＰよりも実質的に速い。上文で指摘した様に、ＭＳＰはプライマーで覆われるＣｐＧ配列のメチル化状態を決定するために、メチル化反応対非メチル化反応におけるＰＣＲ生成物の発生又は発生無しに依存している。最低限、これはアガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動解析を行うことを必要とする（米国特許第５，７８６，１４６号の図２Ａ〜２Ｅ、及び３Ａ〜３Ｅを参照のこと）。更に、所定のＭＳＰの増幅領域内でのＣｐＧ部位のいずれかのメチル化状態の決定は、追加の解析、例えば（ａ）核酸の修飾及び増幅の前又は後のいずれかの制限エンドヌクレアーゼ解析（例えば、ＣＯＢＲＡ解析；Xiong and Laird, Nucleic. Acids Res. 25 : 2532-2534, 1997）、但し、注目の非修飾型配列がメチル化感受性部位を含むか、あるいは修飾（例えば亜硫酸水素塩）が制限部位の作制又は破壊をもたらす；（ｂ）一塩基プライマー伸長反応（Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ； Gonzalo and Jones, Nucleic Acids Res 25 : 2529-2531, 1997）；又は（ｃ）増幅生成物のＤＮＡ配列決定、を必要とするだろう。その様な追加の解析は、間違いが起こりやすいだけでなく（不完全な制限酵素消化）、例えばゲノムＤＮＡの試料のＣｐＧメチル化状態を決定する方法に、実質的な時間及び費用も加える。
【００２９】
対照的に、本発明の好ましい態様において、増幅及び検出は、特異的な二重標識のオリゴヌクレオチドプローブを用いる、蛍光を基にしたリアルタイム定量的ＰＣＲによって測定するのと同時に起こる。原則として、増幅された領域内のプローブ特異的配列のいずれかでのメチル化状態は、その後の操作又は解析の必要無しに、増幅と同時に決定され得る。
【００３０】
ＭＳＰの発明者によって開示されている様に、特徴づけられた領域内のほとんどのＣｐＧ部位のために、ＭＳＰよりも更に直接的な解析を提供し得る唯一の技術がゲノムの配列決定である（米国特許第５，７８６，１４６号、５ページの１５〜１７行目）。本発明は、事実、ゲノムＤＮＡの既知の（既に配列決定されている）領域内での修飾型ＣｐＧ部位の部分的な直接的配列決定のための方法を提供する。この様に、それぞれが所定の増幅されたＤＮＡ領域内の特定のメチル化部位に相当する、一連のＣｐＧ特異的ＴａｑＭａｎ（商標）プローブが構築される。この一連のプローブは、ゲノムＤＮＡの本来の非修飾型試料に存在している完全なメチル化パターンを同時に決定するために、単一の修飾型ＤＮＡ試料の一定分量を用いて、類似の増幅反応に引き続き利用される。これは、ゲノムＤＮＡの試料の直接的な配列決定に必要な時間及び費用の一部で達成され、そして実質的に更に感度がある。更に、本発明の１つの態様は、その様なメチル化パターンの定量的な評価を提供する。
【００３１】
本発明は、核酸試料（例えば、ゲノムＤＮＡ試料）中のＣｐＧのメチル化状態を定性的かつ定量的に決定するための、メチル化依存性核酸修飾剤（例えば、亜硫酸水素塩）を利用する、４つの方法の技術を発見し、そして診断キットを結びつけた。４つの方法は図３に概要を示しており、そしてＡ〜Ｄの文字で下方に標識されている。全体的に、メチル化ＣｐＧ配列の識別は、増幅、プローブハイブリダイゼーションのレベルで、又はその両方のレベルで行われる様に設計される。例えば、適用Ｃ及びＤは、修飾型の非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別し、そしてＰＣＲの増幅レベルでのメチル化ＣｐＧ配列の識別を提供する「偏った（ｂｉａｓｅｄ）」プライマーを利用する。方法Ｂは、修飾型核酸の偏っていない増幅を提供するために、「偏っていない（ｕｎｂｉａｓｅｄ）」プライマー（ＣｐＧのメチル化部位を覆わない）を使用するが、むしろ検出レベル（例えば、蛍光（又は発光）プローブのハイブリダイゼーションレベルでのみ）での定量的なメチル化ＣｐＧ配列の識別を提供するために、修飾型の非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別するプローブを利用する。方法Ａは、それ自身で、増幅又は検出レベルのいずれかでのメチル化ＣｐＧ配列の識別を提供しないが、投入ＤＮＡのためのコントロール反応を提供することによって、他の３つの適用を支え、そして有効にする。
【００３２】
方法Ｄ  最初の態様において（図３、適用Ｄ）、本発明はメチル化ＣｐＧ含有核酸を定性的に検出する方法であって、核酸含有試料と、非メチル化シトシンを修飾して変換した核酸を生成せしめる修飾剤とを接触させ、特異的なオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブの存在下で、２つのオリゴヌクレオチドプライマーによって変換した核酸を増幅させ（この中で、プライマー及びプローブの両方が修飾型の非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別する）、そして増幅を介するプローブの置換を基にして「メチル化」核酸を検出することを含む方法を提供する。
【００３３】
用語「修飾」は、本明細書で使用する場合、修飾剤による別のヌクレオチドへの非メチル化シトシンの変換であって、本来の核酸試料中のメチル化シトシンから、非メチル化シトシンを識別する変換を意味する。好ましくは、修飾剤は非メチル化シトシンをウラシルに修飾する。好ましくは、非メチル化シトシンを修飾するために使用する修飾剤は亜硫酸水素ナトリウムであるが、メチル化シトシンではなく、非メチル化シトシンを選択的に修飾する他の相当する修飾剤は、本発明の方法において置き換えられ得る。亜硫酸水素ナトリウムは、シトシンの５，６位の二重結合と容易に反応するが、メチル化シトシンとは反応せず、その結果、ウラシルを生成するアルカリ性の条件下で脱アミノ化を受けるスルホン化シトシンが生成する（例１）。Ｔａｑポリメラーゼがチミンとしてウラシルを、そしてシチジンとして５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を認識するので、亜硫酸ナトリウム処理及びＰＣＲ増幅の時系列の組み合わせは、非メチル化シトシン残基からチミン（Ｃ→Ｕ→Ｔ）、及びメチル化シトシン残基（「ｍＣ」）からシトシン（ｍＣ→ｍＣ→Ｃ）への最終的な変換をもたらす。この様に、ゲノムＤＮＡの亜硫酸水素ナトリウム処理は、非メチル化シトシンをウラシルに変換することによってメチル化依存性の配列の差異を作制し、そしてＰＣＲによって生じた生成物は、メチル化シトシンが非修飾型核酸において発生する位置でのみシトシンを含む。
【００３４】
オリゴヌクレオチド「プライマー」は、本明細書で使用する場合、修飾型又は非修飾型核酸の相補鎖と配列特異的なハイブリダイゼーション（アニーリング）が可能な、直線状の、一本鎖の、オリゴマーのデオキシリボ核酸又はリボ核酸分子を意味する。本明細書で使用する場合、特異的なプライマーは、好ましくはＤＮＡである。本発明のプライマーは、増幅過程の間、特異的かつ効率的な重合化（プライマー伸長）の開始を提供する様な、適当な配列及び十分な長さのオリゴヌクレオチドを包含する。本発明の方法において使用する場合、オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的に１２〜３０ヌクレオチド又はそれ以上を含むが、小数のヌクレオチドも含み得る。好ましくは、プライマーは１８〜３０ヌクレオチドを含む。正確な長さは、温度（増幅の間）、緩衝液、及びヌクレオチドの組成を含む複数の要因に依存するだろう。好ましくは、プライマーは一本鎖であるが、鎖が最初に分離されるならば二本鎖プライマーも使用され得る。プライマーは、任意の適当な方法、例えば常用のホスホトリエステル及びホスホジエステル法又は当業界で一般的に知られている自動化された態様を用いて調製され得る。
【００３５】
本明細書の発明の態様において使用する場合、特異的なプライマーは、好ましくは注目のゲノムの遺伝子座のそれぞれの鎖に対して実質的に相補的である様に設計される。典型的に、一方のプライマーは遺伝子座のマイナス（−）鎖（平行に位置する二本鎖ＤＮＡ分子の「下方」の鎖）に対して相補的であり、そして他方はプラス（＋）鎖（「上方」の鎖）に対して相補的である。適用Ｄの態様において使用する場合、プライマーは、好ましくはＤＮＡのメチル化の潜在的な部位（ＣｐＧヌクレオチド）を覆い、そしてメチル化ＤＮＡから、修飾型の非メチル化ＤＮＡを識別する様に設計される。好ましくは、この配列の識別は、好ましくは対合したオリゴヌクレオチド対誤対合したオリゴヌクレオチドの異なるアニーリング温度に基づいている。適用Ｄの態様において、プライマーは典型的に１ないし複数のＣｐＧ配列を覆う様に設計される。好ましくは、それらは１〜５のＣｐＧ配列、そして最も好ましくは１〜４のＣｐＧ配列を覆う様に設計される。対照的に、本発明の定量的な態様において、プライマーはＣｐＧ配列を全く覆わない。
【００３６】
完全に「非メチル化した」（修飾型の非メチル化核酸鎖と相補的な）プライマーの組み合わせの場合、アンチセンスプライマーは、相当する（−）鎖配列において、グアノシン残基（「Ｇｓ」）の代わりにアデノシン残基（「Ａｓ」）を含む。これらのアンチセンスプライマーにおいて置換されたＡｓは、非メチル化Ｃ残基（「Ｃｓ」）の亜硫酸水素塩修飾及びその後の増幅から生じる相当する（＋）鎖領域におけるウラシル及びチミジン残基（「Ｕｓ」及び「Ｔｓ」）に対して相補的であるだろう。センスプライマーは、この場合において、好ましくはアンチセンスプライマー伸長生成物に対して相補的である様に設計され、そして相当する（＋）鎖配列において非メチル化Ｃｓの代わりにＴｓを含む。これらのセンスプライマーにおいて置換されたＴｓは、本来の（＋）鎖における修飾型Ｃｓ（Ｕｓ）に対して相補的な位置で、アンチセンスプライマーの伸長生成物に組み込まれたＡｓに対して相補的だろう。
【００３７】
完全にメチル化されたプライマー（メチル化ＣｐＧ含有核酸鎖に対して相補的）の場合、アンチセンスプライマーは、本来の（＋）鎖においてメチル化Ｃｓに対して相補的な相当する（−）鎖配列（すなわち、ｍＣｐＧ配列）のＧｓの代わりにＡｓを含まないだろう。同様に、この場合のセンスプライマーは、相当する（＋）鎖のｍＣｐＧ配列におけるメチル化Ｃｓの代わりにＴｓを含まないだろう。しかしながら、完全にメチル化したプライマーによって覆われる領域のＣｐＧ配列にはなく、そしてメチル化されていないＣｓは、非メチル化プライマーについて上文に記載した、完全にメチル化したプライマーの組み合わせにおいて表されるだろう。
【００３８】
好ましくは、適用Ｄの態様において利用される場合、増幅過程は、特異的なオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブの存在下で、２つのオリゴヌクレオチドプライマーによる、亜硫酸水素塩で変換した核酸の増幅を提供する。プライマー及びプローブは共に、修飾型の非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別する。更に、「メチル化」核酸の検出は、増幅を介するプローブの蛍光に基づいている。１つの態様において、蛍光はポリメラーゼ酵素の５′から３′へのエキソヌクレアーゼ活性によるプローブの分解によって生成する。別の態様において、蛍光は２つの隣接性のハイブリダイズしているプローブ間（Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（商標）の技術）又はハイブリダイズしているプローブとプライマーとの間の蛍光のエネルギー移動作用によって生じる。別の態様において、蛍光はプライマー自身によって生じる（Ｓｕｎｒｉｓｅ（商標）の技術）。好ましくは、増幅過程は、オリゴヌクレオチドプライマーを使用する、関与する反応段階の数に比例して、標的遺伝子座から指数関数的な量の増幅生成物を生成せしめる酵素的な連鎖反応である。
【００３９】
上述の様に、プライマーの組み合わせの一方のメンバーは（−）鎖と相補的であり、同時に他方のものが（＋）鎖と相補的である。プライマーは、増幅し得る注目の領域、すなわち「アンプリコン」を一括すべく選択される。変性した標的核酸に対するプライマーのハイブリダイゼーション、それに続くＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレオチドを用いるプライマー伸長は、アンプリコンに相当する新規な核酸鎖の合成をもたらす。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼは、当業界で一般的に使用される様にＴａｑポリメラーゼである。しかし、５′から３′へのヌクレアーゼ活性を有する相当のポリメラーゼが代わりになり得る。新規アンプリコン配列がプライマー及びポリメラーゼの鋳型でもあるので、変性、プライマーのアニーリング、及び伸長の周期の繰り返しは、アンプリコンの指数関数的な生成をもたらす。連鎖反応の生成物は、適用される特異的なプライマーの末端によって特徴づけられる終端を有する、アンプリコン配列に相当する別個の核酸の二本鎖である。好ましくは、使用される増幅方法は、ＰＣＲのものであり（Mullis et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 51 : 263-273 ; Gibbs, Anal. Chem. 62 : 1202-1214, 1990）、又は更に好ましくは、当業界で一般に知られている、その自動化された態様のものである。
【００４０】
好ましくは、メチル化依存性の配列の差異は、蛍光を基にした定量的ＰＣＲ（リアルタイム定量的ＰＣＲ、Heid et al., Genome Res. 6 : 986-994, 1996 ; Gibson et al., Genome Res. 6 : 995-1001, 1996）を基にした方法によって検出される（例えば、「ＴａｑＭａｎ（商標）」、「Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（商標）」、及び「Ｓｕｎｒｉｓｅ（商標）」の技術）。ＴａｑＭａｎ（商標）及びＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（商標）の技術の場合、配列の識別は２つの段階、（１）増幅段階、又は（２）蛍光検出段階、のいずれか又はその両方で起こり得る。「Ｓｕｎｒｉｓｅ（商標）」の技術の場合、増幅及び蛍光の段階は同一のものである。ＦＲＥＴハイブリダイゼーションの場合、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドのいずれか又はその両方である、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（商標）上でのプローブの形式は、配列の差異を識別するために使用され得る。最も好ましくは、増幅過程は、本明細書の全ての発明の態様で適用される様に、蛍光を基にしたリアルタイム定量的ＰＣＲのものであり（Heid et al., Genome Res. 6 : 986-994, 1996）、これは二重標識した蛍光オリゴヌクレオチドプローブを適用している（ABI Prism 7700 Sequence Detection System, Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, Californiaを用いる、ＴａｑＭａｎ（商標）ＰＣＲ）。
【００４１】
「ＴａｑＭａｎ（商標）」ＰＣＲ反応は、上流と下流（すなわち、センスとアンチセンス）のプライマー間に位置するＧＣに富む配列とハイブリダイズする様に設計される、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブと称される、延長不可能な疑問のオリゴヌクレオチドに沿う増幅プライマーの対を使用する。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブは、更にＴａｑＭａｎ（商標）オリゴヌクレオチドのヌクレオチドに結合する、リンカー部分（例えば、ホスホラミダイト）と共有結合した蛍光「レポーター部分」及び「クエンチャー部分」を含んで成る。適当なレポーター及びクエンチャー分子の例は、５′蛍光レポーター色素６ＦＡＭ（「ＦＡＭ」；２，７−ジメトキシ−４，５−ジクロロ−６−カルボキシ−フルオレセイン）、及びＴＥＴ（６−カルボキシ−４，７，２′，７′−テトラクロロフルオロセイン）；並びに３′クエンチャー色素ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルロダミン）（Livak et al., PCR Methods Appl. 4 : 357-362, 1995 ; Gibson et al., Genome Res. 6 : 995-1001 ; and 1996 ; Heid et al., Genome Res. 6 : 986-994, 1996）である。
【００４２】
適当なＴａｑＭａｎ（商標）プローブを設計するための１つの方法は、特異的な配列（ＡＴ塩基対と比較して、ＧＣのより強い結合）、又はプライマーの長さのいずれかに起因する少なくとも１０℃の融解温度の差異（プライマーの融解温度との比較）を提供するために、ＧＣに富む配列中のＣｐＧ島の位置の変化を決定し得る、手段を容易にするソフトウェア、例えば「Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ」の利用を含む。
【００４３】
ＴａｑＭａｎ（商標）プローブは、使用される特定の発明の方法に依存して、既知のＣｐＧメチル化部位を覆うこともあり、又は覆わないこともある。好ましくは、適用Ｄの態様において、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブは、１〜５のＣｐＧ配列を覆うことによって、修飾型の非メチル化核酸とメチル化核酸とを識別する様に設計される。完全に非メチル化及び完全にメチル化したプライマーの組み合わせについて上文に記載した様に、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブは、非修飾型核酸に対して、あるいは適当な塩基置換によって、本来の非修飾型核酸試料中の完全に非メチル化し、又は完全にメチル化した、そのいずれかの亜硫酸水素塩で修飾した配列に対して、そのいずれかに相補的であるべく設計され得る。
【００４４】
ＴａｑＭａｎ（商標）ＰＣＲ反応における各オリゴヌクレオチドプライマー又はプローブは、それぞれ亜硫酸水素塩処理後の２つの異なる配列変異体（ mＣｐＧ、又はＵｐＧ）を生じ得る、ゼロないし多数の異なるＣｐＧジヌクレオチドのどこにでも及び得る。例えば、オリゴヌクレオチドが３つのＣｐＧジヌクレオチドに及ぶならば、ゲノムＤＮＡにおいて生じる可能性のある配列変異体の数は、２3 ＝８の異なる配列である。上流及び下流プライマーがそれぞれ３つのＣｐＧに及び、そしてプローブオリゴヌクレオチド（又はＦＲＥＴ形式の場合、両方が一緒のオリゴヌクレオチド）が別の３つのものに及ぶならば、配列の順列の合計数は、８×８×８＝５１２となる。理論的に、これらの５１２の配列変異体のそれぞれの相対的な量を定量的に解析するために、別々のＰＣＲ反応が設計され得る。実際には、定量的なメチル化情報の相当量が、それよりかなり少ない数の配列変異体の解析に由来し得る。この様に、最も単純な形態において、本発明の方法は、仮設上の例（図３の適用Ｄを参照のこと）において最も極端な配列変異体を表す完全にメチル化した変異体及び完全に非メチル化した変異体のための反応を設計することによって行われ得る。これら２つの反応間の比率、又は代わりとしてメチル化反応とコントロール反応（図３、適用Ａ）との間の比率は、この遺伝子座でのＤＮＡのメチル化レベルの測定を提供するだろう。定性的なものの更に詳細な概要を図４に示す。
【００４５】
適用Ｄの態様におけるメチル化の検出は、本明細書の他の態様の様に、プローブの増幅を介する置換に基づいている。理論的には、プローブの置換方法は、プローブをそのままにしておくか、又はプローブの消化をもたらす様に設計され得る。好ましくは、本明細書で使用する場合、プローブの置換は、増幅の間のプローブの消化によって起こる。ＰＣＲ周期の伸長期の間、蛍光ハイブリダイゼーションプローブは、ＤＮＡポリメラーゼの５′から３′へのヌクレアーゼ活性によって開裂される。プローブの開裂時、レポーター部分の発光は、もはや効率的にクエンチング部分に移されず、５１８nmでのレポーター部分の蛍光−発光スペクトルの増大をもたらす。クエンチング部分（例えば、ＴＡＭＲＡ）の蛍光強度は、ＰＣＲ増幅の間、非常に小さく変化する。複数の要因がＴａｑＭａｎ（商標）ＰＣＲ反応の効率に影響を及ぼすことがあり、これはマグネシウム及び塩の濃度；反応条件（時間及び温度）；プライマー配列；及びＰＣＲの標的サイズ（すなわちアンプリコンのサイズ）及び組成を含む。所定のゲノムの遺伝子座にとっての最適な蛍光強度を生むための、これらの要因の最適化はＰＣＲの業界の者にとって明らかであり、そして好ましい条件は更に本明細書の「例」において例示する。アンプリコンは５０〜８，０００塩基対、又はそれ以上のサイズに及ぶことがあるが、より小さいこともある。典型的に、アンプリコンは１００〜１０００塩基対であり、そして好ましくは１００〜５００塩基対である。好ましくは、反応は、９６穴のオプティカルトレイ及びキャップを用いてＰＣＲ増幅を行い、そして配列検出器（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ）を用いて、ＰＣＲ増幅の間、連続的にサーマルサイクラーの全ての９６穴の蛍光スペクトルの測定を行うことによってリアルタイムに監視される。好ましくは、方法Ｄは投入核酸の量のためのコントロールを提供し、そしてトレイからトレイへのデータを標準化するために、方法Ａ（図３）と組み合わせて行われる。
【００４６】
適用Ｃ  本発明の方法は、ＰＣＲ生成物の検出レベルでの配列の識別を避けるために修飾され得る。この様に、追加の定性的な方法の態様において（図３、適用Ｃ）、ＣｐＧジヌクレオチドを覆うプライマーのみが設計され、そして配列の識別は増幅のレベルで単独に起こる。好ましくは、この態様において使用されるプローブはなおもＴａｑＭａｎ（商標）プローブであるが、本来の非修飾型核酸に存在するＣｐＧ配列のいずれも覆わない様に設計される。適用Ｃの態様は、ＭＳＰ技術の高処理の、蛍光を基にしたリアルタイムのものを表し、この中で実質的な改良が、メチル化ＣｐＧ配列の検出に必要とれさる時間の減少によって達成された。好ましくは、反応は、９６穴のオプティカルトレイ及びキャップを用いてＰＣＲ増幅を行い、そして配列検出器（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ）を用いて、ＰＣＲ増幅の間、連続的にサーマルサイクラーの全ての９６穴の蛍光スペクトルの測定を行うことによってリアルタイムに監視される。好ましくは、方法Ｃは投入核酸の量のためのコントロールを提供し、そしてトレイからトレイへのデータを標準化するために、方法Ａと組み合わせて行われる。
【００４７】
適用Ｂ  本発明の方法はまた、ＰＣＲの増幅レベルでの配列の識別を避けるために修飾され得る（図３、Ａ及びＢ）。定量的な方法の態様において（図３、適用Ｂ）、ＣｐＧジヌクレオチドを覆うプローブのみが設計され、そして配列の識別は、プローブハイブリダイゼーションのレベルでのみ起こる。好ましくは、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブが使用される。この型において、亜硫酸水素塩による変換段階から生じる配列変異体は、固有な増幅の偏りが無い限り、等しい効率で増幅される（Warnecke et al., Nucleic Acids Res. 25 : 4422-4426, 1997）。特定のメチル化パターンと関連する異なる配列変異体のそれぞれについての、異なるプローブの設計（例えば、３つのＣｐＧの場合、２3 ＝８のプローブ）は、ＰＣＲ生成物の混合プールにおけるそれぞれの配列の順列の相対的な普及の定量的な決定を可能にするだろう。好ましくは、反応は、９６穴のオプティカルトレイ及びキャップを用いてＰＣＲ増幅を行い、そして配列検出器（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ）を用いて、ＰＣＲ増幅の間、連続的にサーマルサイクラーの全ての９６穴の蛍光スペクトルの測定を行うことによってリアルタイムに監視される。好ましくは、方法Ｂは投入核酸の量のためのコントロールを提供し、そしてトレイからトレイへのデータを標準化するために、方法Ａと組み合わせて行われる。
【００４８】
適用Ａ  方法Ａ（図３）は、それ自身では増幅又は検出のいずれかのレベルでのメチル化ＣｐＧ配列の識別を提供しないが、投入ＤＮＡの量のためのコントロール反応を提供することによって、そしてトレイからトレイへのデータを標準化するために、他の３つの適用を支持し、そして有効にする。この様に、プライマーもプローブもＣｐＧジヌクレオチドを覆わないならば、反応は偏っていない増幅を表し、そして蛍光を基にした定量的なリアルタイムＰＣＲを用いる増幅の測定は、投入ＤＮＡの量のためのコントロールを務める（図３、適用Ａ）。好ましくは、方法Ａはプライマー及びプローブにおいてＣｐＧジヌクレオチドを欠くだけでなく、増幅過程での亜硫酸水素塩処理のあらゆる差示的な作用を完全に回避するために、アンプリコン中にＣｐＧを全く含まない。好ましくは、方法Ａのアンプリコンは、コピー数の変化、例えば遺伝子増幅又は欠失にほとんどかけられないＤＮＡの領域である。
【００４９】
前記技術の定性的なもので得られる結果を以下の例に記載する。何十ものヒト腫瘍の試料が、優れた結果を有するこの技術を用いて解析されてきた。ＴａｑＭａｎ（商標）の機械を用いる高処理は、１つのＴａｑＭａｎ（商標）の機械によって、３日間で１１００の解析を可能にした。
【００５０】
例１
最初の実験は、ゲノムＤＮＡにおけるＣｐＧ島のメチル化状態の評価のための本発明の戦略を有効にするために行った。この実験は、４つの異なる遺伝子における、特異的な、過剰なメチル化が可能なＣｐＧ島のメチル化状態に関して、ヒト精子ＤＮＡ（高度に非メチル化されていることが知られている）とＨＣＴ  １１６ＤＮＡ（多くのＣｐＧ部位で高度にメチル化されていることが知られている、ヒト結腸直腸細胞系に由来）との間の比較を示す。ＣＯＢＲＡ（combined bisulfite restriction analysis ; Xiong and Laird, Nucleic Acids Res. 25 : 2532-2534, 1997）は、メチル化状態の独立した測定として使用した。
【００５１】
ＤＮＡの単離及び亜硫酸水素塩処理  要約すると、ゲノムＤＮＡはプロティナーゼＫ消化及びフェノール−クロロホルム抽出の標準的な方法によってヒト精子又はＨＣＴ１１６細胞から単離した（Wolf et al., Am. J. Hum. Genet. 51 : 478-485, 1992）。次にＤＮＡは、最初に０．２Ｍ  ＮａＯＨ中で変性させ、続いて亜硫酸水素ナトリウム及びヒドロキノンの添加（それぞれ３．１Ｍ、及び０．５Ｍの最終濃度まで）、５５℃で１６時間のインキュベーション、脱塩（DNA Clean-Up System ; Promega）、０．３Ｍ  ＮａＯＨによる脱スルホン化、及び最後のエタノール沈澱により、亜硫酸水素ナトリウムを用いる処理がされた（Xiong and Laird（上記）、Sadri and Hornsby, Nucleic Acids Res. 24 : 5058-5059, 1996 ; Frommer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 1827-1831, 1992も参照のこと）。亜硫酸水素塩処理後、ＤＮＡは上述したＣＯＢＲＡ解析（Xiong and Laird（上記））又は蛍光を基にしたリアルタイム定量ＰＣＲ（Heid et al., Genome Res. 6 : 986-994, 1996 ; Gibson et al., Genome Res. 6 : 995-1001, 1996）を用いる本発明の方法のいずれかにかけられた。
【００５２】
ＣＯＢＲＡ及びＭｓＳＮｕＰＥ反応  ＥＳＲ１及びＡＰＣ遺伝子は、ＣＯＢＲＡ(Combined Bisulfite Restriction Analysis）を用いて解析した。ＣＯＢＲＡ解析の場合、メチル化依存性の差異は、Frommer 等によって記述されている方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 1827-1831, 1992）に従う標準的な亜硫酸水素塩処理によってゲノムＤＮＡに導入された（１μｇのサケ精子ＤＮＡが、ゲノムＤＮＡを亜硫酸水素ナトリウムで処理する前にキャリヤーとして加えられた）。亜硫酸水素塩で変換したＤＮＡのＰＣＲ増幅は、注目のＣｐＧ島に特異的なプライマーを用いて行い、引き続いて制限エンドヌクレアーゼ消化、ゲル電気泳動、及び特異的な標識されたハイブリダイゼーションプローブを用いる検出を行った。ＥＳＲ１及びＡＰＣ遺伝子に使用する上流及び下流プライマーの組み合わせは：それぞれTCCTAAAACTACACTTACTCC〔配列番号３５〕、GGTTATTTGGAAAAAGAGTATAG〔配列番号３６〕（ＥＳＲ１プロモーター）；及びAGAGAGAAGTAGTTGTGTTAAT〔配列番号３７〕、 ACTACACCAATACAACCACAT〔配列番号３８〕（ＡＰＣプロモーター）である。ＥＳＲ１のＰＣＲ生成物は、制限エンドヌクレアーゼＴａｑＩ及びＢｓｔＵＩによって消化され、一方、ＡＰＣ由来の生成物はＴａｑＩ及びＳｆａＮＩによって消化され、ＡＰＣの場合には３つのＣｐＧ、そしてＥＳＲ１の場合には４つのＣｐＧのメチル化が測定された。消化されたＰＣＲ生成物は、変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけられ、そしてエレクトロブロッティングによってナイロン膜(Zetabind ; American Bioanalytical）に転写された。膜は注目の消化型ＤＮＡフラグメント及び末梢化型ＤＮＡフラグメントの両方を可視化するために、５′末端が標識されたオリゴヌクレオチドによってハイブリダイズされた。使用されるプローブは次の通りである：ＥＳＲ１，AAACCAAAACTC〔配列番号３９〕；及びＡＰＣ，CCCACACCCAACCAAT〔配列番号４０〕。定量は Phosphoimager 445SI（Molecular Dynamics）で行った。計算はＭｉｃｒｏｓｏｆｔのＥｘｃｅｌで行った。研究されたＣｐＧ部位でのＤＮＡのメチル化レベルは、消化したＰＣＲフラグメントの割合を計算することによって決定した（Xiong and Laird（上記））。
【００５３】
ＭＬＨ１及びＣＤＫＮ２ＡはＭｓＳＮｕＰＥ（Methylation - sensitive Single Nucleotide Primer Extension Assay）を用いて解析され、これはＧｏｎｚａｌｇｏ及びＪｏｎｅｓによって記述されている様に行った(Nucleic Acids Res. 25 : 2529-2531）。亜硫酸水素塩で変換したＤＮＡのＰＣＲ増幅は、注目のＣｐＧ島に特異的なプライマーを用いて行い、そして検出は追加の特異的プライマー（伸長プローブ）を用いて行った。ＭＬＨ１及びＣＤＫＮ２Ａ遺伝子に使用される上流及び下流プライマーの組み合わせは：それぞれ GGAGGTTATAAGAGTAGGGTTAA〔配列番号４１〕、CCAACCAATAAAAACAAAAATACC〔配列番号４２〕（ＭＬＨ１プロモーター）；GTAGGTGGGGAGGAGTTTAGTT〔配列番号４３〕、TCTAATAACCAACCAACCCCTCC〔配列番号４４〕（ＣＤＫＮ２Ａプロモーター）；及びTTGTATTATTTTGTTTTTTTTGGTAGG〔配列番号４５〕、CAACTTCTCAAATCATCAATCCTCAC〔配列番号４６〕（ＣＤＫＮ２Ａエキソン２）である。ＭｓＳＮｕＰＥの伸長プローブは、解析すべきＣｐＧの５′側の近くに位置し、そして配列は： TTTAGTAGAGGTATATAAGTT〔配列番号４７〕、TAAGGGGAGAGGAGGAGTTTGAGAAG〔配列番号４８〕（それぞれＭＬＨ１プロモーター部位１及び２）；TTTGAGGGATAGGGT〔配列番号４９〕、TTTTAGGGGTGTTATATT〔配列番号５０〕、TTTTTTTGTTTGGAAAGATAT〔配列番号５１〕（それぞれプロモーター部位１，２、及び３）；及びGTTGGTGGTGTTGTAT〔配列番号５２〕、AGGTTATGATGATGGGTAG〔配列番号５３〕、 TATTAGAGGTAGTAATTATGTT〔配列番号５４〕（それぞれエキソン２部位１，２、及び３）である。一組の反応は、一塩基伸長のための３２ｐ−ｄＣＴＰ又は３２ｐ−ｄＴＴＰのいずれかを用いて各試料について設定した。伸長したＭｓＳＮｕＰＥプライマー（プローブ）は、変性ポリアクリルアミドゲルによって分離した。定量はＰｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒを用いて行った。
【００５４】
本発明のメチル化解析  亜硫酸水素塩で変換したゲノムＤＮＡは、５′蛍光レポーター色素（６ＦＡＭ）及び３′クエンチャー色素（ＴＡＭＲＡ）を有するオリゴヌクレオチドプローブに隣接する遺伝子座特異的ＰＣＲプライマーを用いて増幅した（Livak et al., PCR Methods Appl. 4 : 357-362, 1995）(メチル化解析に使用されるプライマー及びプローブは、本明細書の後文の「遺伝子、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔプライマー及びプローブの配列」に列記する）。この例において、上流及び下流プライマー並びに相当する蛍光原性プローブは、亜硫酸水素塩変換したＤＮＡの完全にメチル化した分子又は完全に非メチル化した分子のいずれかの間で識別するために設計された（本明細書の「本発明の詳細な説明、方法Ｄ」の中のプライマーの設計の考察を参照のこと）。プライマー及びプローブは、投入ＤＮＡの量のためのコントロール反応として完全にＣｐＧジヌクレオチドを欠く、ＭＹＯＤ１遺伝子（筋原性分化遺伝子）の伸展のためにも設計された。平行の反応は、亜硫酸水素塩処理した精子及びＨＣＴ１１６  ＤＮＡ試料上で、メチル化及び非メチル化（Ｄ）、又はコントロールオリゴ（Ａ）による本発明の方法を用いて行った。メチル化及び非メチル化反応のために得られる値は、表１（下文）に示す比率を与えるために、ＭＹＯＤ１コントロール反応の値に対して標準化された。
【００５５】
ＴａｑＭａｎ（商標）のプロトコールにおいて、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５′から３′側へのヌクレアーゼ活性はプローブを開裂し、そしてレポーターを放出し、この蛍光は ABI Prism 7700 Sequence Detection System（Perkin - Elmer, Foster City, CA）のレーザー検出器によって検出された。蛍光の検出の閾値を超えた後、ＰＣＲ増幅は、生成されるＰＣＲ生成物の量に比例して蛍光シグナルを生成した。開始時の鋳型の量は、蛍光シグナルがＰＣＲ反応の対数期の閾値を超える周期数から導かれ得る。複数の参照試料が、プレートからプレートへの一貫性を検証するために、それぞれのアッセイプレートに含められた。プレートは、これらの参照試料を用いて互いに標準化された。ＰＣＲ増幅は、６００nMの各プライマー、２００nMのプローブ、２００μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、４００μＭのｄＵＴＰ、５．５mMのＭｇＣｌ2 、参照色素を含む１×ＴａｑＭａｎ（商標）緩衝液Ａ、及び亜硫酸水素塩で変換したＤＮＡ又は変換していないＤＮＡから成る最終反応混合物により、５０℃で２分、９５℃で１０分、続いて４０周期、９５℃で１５秒及び６０℃で１分の条件に従い、９６穴オプティカルトレイ及びキャップを用いて行った。
【００５６】
遺伝子、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔプライマー及びプローブの配列  ４つのヒト遺伝子を解析のために選択した：（１）ＡＰＣ（腺腫性多発結腸ポリープ）（Hiltunen et al., Int. J. Cancer 70 : 644-648, 1997）；（２）ＥＳＲ１（エストロゲン受容体）(Issa et al., Nature Genet. 7 : 536-40, 1994）；（３）ＣＤＫＮ２Ａ（ｐ１６）(Ahuja, Cancer Res. 57 : 3370-3374, 1997）；及び（４）ｈＭＬＨＩ（ミスマッチ修復）（Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95 : 6870-6875, 1998 ; Veigl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95 : 8698-8702, 1998）。これらの遺伝子が選択されたのは、それらが全ての正常及び腫瘍試料中のヒト結腸直腸組織において新規のメチル化を受けることが知られている過剰なメチル化が可能なＣｐＧを含むためである。ヒトＡＰＣ遺伝子は、例えば結腸直腸ガンの発生と結びつけられており、そして当該遺伝子の制御配列中のＣｐＧ部位は、正常な結腸の粘膜と比較して、結腸ガンにおいてより明確にメチル化されているが、前悪性ガンにおいてはメチル化されていないことが知られている（Hiltunen et al.(上記））。ヒトＥＳＲ遺伝子はその５′末端にてＣｐＧ島を含み、これは年齢と共に結腸直腸の粘膜において段々とメチル化され、そして解析された全てのヒト結腸直腸腫瘍において重度にメチル化されている（Issa et al.(上記））。ＣＤＫＮ２Ａ（ｐ１６）遺伝子のプロモーターが関連するＣｐＧ島の過剰なメチル化は、複数の塩基のミスマッチ修復遺伝子の１つの欠陥により、マイクロサテライト不安定性（ＭＩ）を示す結腸直腸ガンのうちの６０％において見られた（Ahuja et al.（上記））。ミスマッチ修復遺伝子ＭＬＨ１は、ミスマッチ修復欠損結腸直腸腫瘍の散発性のものの発生において中心的な役割を果たしている(Thibodeau et al., Science 260 : 816-819, 1993）。ＭＬＨ１は、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を導く、そのプロモーター領域のＤＮＡの過剰なメチル化によって転写的にサイレンスとなり得る（Kane et al., Cancer Res. 57 : 808-811, 1997 ; Ahuja et al.（上記）；Cunningham et al., Cancer Res. 58 : 3455-3460, 1998 ; Herman et al.（上記）；Veigl et al.（上記））。
【００５７】
亜硫酸水素塩で変換したＤＮＡ配列について特異的に設計した、ＰＣＲプライマーとプローブの５つの組み合わせは：（１）ＥＳＲ１遺伝子のための完全にメチル化したＤＮＡと完全に非メチル化したＤＮＡを表す組み合わせ；（２）ＭＬＨ１遺伝子のための完全に非メチル化した組み合わせ；（３）ＡＰＣ遺伝子のための完全にメチル化したものと完全に非メチル化したものとの組み合わせ；及び（４）ＣＤＫＮ２Ａ（ｐ１６）遺伝子のための完全にメチル化したものと完全に非メチル化したものとの組み合わせ；及び投入ＤＮＡのためのコントロールに対するＭＹＯＤ１遺伝子のための内部標識の組み合わせを使用した。メチル化及び非メチル化プライマー並びに相当するプローブは、１〜５個の潜在的なＣｐＧジヌクレオチド部位を覆うために設計された。ＭＹＯＤ１内部標準プライマー及びプローブは、メチル化状態に関係無く、ゲノムＤＮＡの偏っていないＰＣＲ増幅を可能にするために、ＣｐＧジヌクレオチドのいずれかを完全に欠くＭＹＯＤ１遺伝子の領域を覆う様に設計された。上文で言及した様に、平行のＴａｑＭａｎ（商標）ＰＣＲ反応は、亜硫酸塩で変換したメチル化及び／又は非メチル化遺伝子配列に特異的なプライマー並びにＭＹＯＤ１標準プライマーを用いて行った。プライマー及びプローブの配列を以下に列記する。全ての場合において、最初に列記したプライマーは上流ＰＣＲプライマーであり、第２番目のものはＴａｑＭａｎ（商標）プローブであり、そして第３番目のものは下流ＰＣＲプライマーである。ＥＳＲ１メチル化（GGCGTTCGTTTTGGGATTG〔配列番号１〕、６ＦＡＭ  5'-CGATAAAACCGAACGACCCGACGA-3' TAMRA〔配列番号２〕、GCCGACACGCGAACTCTAA〔配列番号３〕）；ＥＳＲ１非メチル化（ACACATATCCCACCAACACACAA〔配列番号４〕、６ＦＡＭ  5'-CAACCCTACCCCAAAAACCTACAAATCCAA-3'  ＴＡＭＲＡ〔配列番号５〕、AGGAGTTGGTGGAGGGTGTTT〔配列番号６〕）；ＭＬＨ１メチル化（CTATCGCCGCCTCATCGT〔配列番号７〕、６ＦＡＭ  5'-CGCGACGTCAAACGCCACTACG-3'  ＴＡＭＲＡ〔配列番号８〕、CGTTATATATCGTTCGTAGTATTCGTGTTT〔配列番号９〕）；ＡＰＣメチル化（TTATATGTCGGTTACGTGCGTTTATAT〔配列番号１０〕、６ＦＡＭ  5'-CCCGTCGAAAACCCGCCGATTA-3'  ＴＡＭＲＡ〔配列番号１１〕、GAACCAAAACGCTCCCCAT〔配列番号１２〕）；ＡＰＣ非メチル化（GGGTTGTGAGGGTATATTTTTGAGG〔配列番号１３〕、６ＦＡＭ  5'-CCCACCCAACCACACAACCTACCTAACC-3'  ＴＡＭＲＡ〔配列番号１４〕、CCAACCCACACTCCACAATAAA〔配列番号１５〕）；ＣＤＫＮ２Ａメチル化（AACAACGTCCGCACCTCCT〔配列番号１６〕、６ＦＡＭ  5'-ACCCGACCCCGAACCGCG-3'  ＴＡＭＲＡ〔配列番号１７〕、TGGAATTTTCGGTTGATTGGTT〔配列番号１８〕）；ＣＤＫＮ２Ａ非メチル化（CAACCAATCAACCAAAAATTCCAT〔配列番号１９〕、６ＦＡＭ  5'-CCACCACCCACTATCTACTCTCCCCCTC-3'  ＴＡＭＲＡ〔配列番号２０〕、GGTGGATTGTGTGTGTTTGGTG〔配列番号２１〕）；及びＭＹＯＤ１、（CCAACTCCAAATCCCCTCTCTAT〔配列番号２２〕、６ＦＡＭ  5'-TCCCTTCCTATTCCTAAATCCAACCTAAATACCTCC-3'  ＴＡＭＲＡ〔配列番号23〕、TGATTAATTTAGATTGGGTTTAGAGAAGGA〔配列番号２４〕）。
【００５８】
表１及び表２は、４つの遺伝子；ＡＰＣ，ＥＳＲ１，ＣＤＫＮ２Ａ（ｐ１６）、及びｈＭＬＨ１中のＣｐＧ島のメチル化状態についてのヒト精子及びＨＣＴ１１６  ＤＮＡの解析結果を示す。結果は、メチル化及び非メチル化反応とコントロール反応（ＭＹＯＤ１）との比率として表す。表１は、精子ＤＮＡが「非メチル化」プライマー及びプローブでのみポジティブな比率をもたらしたことを示し、これは精子ＤＮＡの既知の非メチル化状態と一致しており、そしてＣＯＢＲＡ解析によって決定されるパーセントのメチル化の値と一致している。すなわち、亜硫酸水素塩処理したＤＮＡ上でのプライミングは、相当するゲノムＤＮＡにおけるＣｐＧ配列の非メチル化シトシンを含む領域から起こり、そしてそれ故に、亜硫酸水素塩処理によって脱アミノ化（ウラシルへの変換）された。
【表１】
2007068539.tif 000003
※  値はパーセンテージを表してないが、コントロール遺伝子との標準化の後に、同一反応についての異なるＤＮＡ試料間で定量的に比較され得る任意の単位の値である。
※※  Ｍｓ−ＳＮｕＰＥに基づく。
【００５９】
表２は、４つの遺伝子；ＡＰＣ，ＥＳＲ１，ＣＤＫＮ２Ａ（ｐ１６）、及びｈＭＬＨ１中のＣｐＧ島のメチル化状態についてのＨＣＴ１１６  ＤＮＡの解析結果を示す。結果は、メチル化特異的反応とコントロール反応（ＭＹＯＤ１）との間の比率として表されている。ＥＳＲ遺伝子の場合、ポジティブな比率は「メチル化」プライマー及びプローブでのみ得られ；これはＨＣＴ１１６  ＤＮＡの既知のメチル化状態、及びＣＯＢＲＡ解析と一致している。ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子の場合、ＨＣＴ１１６  ＤＮＡは、「メチル化」及び「非メチル化」プライマー及びプローブの両方でポジティブな比率を生み；これはＨＣＴ１１６  ＤＮＡの既知のメチル化状態、並びに当該遺伝子のこの領域のわずかに部分的なメチル化を示すＣＯＢＲＡ解析と一致している。対照的に、ＡＰＣ遺伝子は非メチル化反応でのみポジティブな結果を与えた。しかしながら、これはＣＯＢＲＡ解析と一致しており、そしてこのＡＰＣ遺伝子の領域がＨＣＴ１１６  ＤＮＡにおいて非メチル化であることを示している。このことは、ＨＣＴ１１６細胞系由来のＤＮＡの、この特定のＡＰＣ遺伝子制御領域のメチル化状態が、結腸ガンのもの（明確によりメチル化されていることが知られている）よりむしろ、正常な結腸の粘膜又は前悪性ガンのものにより類似していることを示唆し得る。
【表２】
2007068539.tif 000004
※  値はパーセンテージを表してないが、コントロール遺伝子での標準化の後に、同一の反応についての異なるＤＮＡ 試料間で定量的に比較され得る任意の単位の値である。
※※  Ｍｓ−ＳＮｕＰＥに基づく。
【００６０】
例２
この例はヒト結腸直腸細胞系ＨＣＴ１１６及びヒト精子ＤＮＡのエストロゲン受容体（ＥＳＲ１）遺伝子と関連するＣｐＧ島のメチル化状態を決定するための、本発明の方法（図３のＡ及びＤ）と独立したＣＯＢＲＡ法（上文の「方法」を参照のこと）との比較である。このＣｐＧ島は、ＨＣＴ１１６において高度にメチル化され、そしてヒト精子ＤＮＡにおいて非メチル化されていることが報告されてきた(Xiong and Caird（上記）；Issa et al.(上記））。ＣＯＢＲＡ解析は上文に記載されている。このＣｐＧ島中の２つのＴａｑＩ部位は、これが精子ＤＮＡのメチル化の欠如及びＨＣＴ１１６  ＤＮＡのほぼ完全なメチル化を示していることを確認した（図５Ａ）。更に、亜硫酸水素塩で処理したＤＮＡと処理していないＤＮＡを用いた結果が比較された。
【００６１】
解析のために、完全に「メチル化した」ＥＳＲ１及び完全に「非メチル化した」ＥＳＲ１、並びにコントロールＭＹＯＤ１のプライマー及びプローブは、上文の「例１」に記載されている様に設計された。精子及びＨＣＴ１１６  ＤＮＡの両方に対する「メチル化」、「非メチル化」又はコントロールオリゴのいずれかを用いる３つの異なる実験が行われた。上文の例１に記載の様に、メチル化及び非メチル化反応で得られた値は、図５Ｂに示した比率を与えるために、ＭＹＯＤ１コントロール反応の値に対して標準化された。精子ＤＮＡは非メチル化プライマー及びプローブでのみポジティブな比率をもたらし、これはその非メチル化状態と一致している。対照的に、主にメチル化されているＥＳＲ１対立遺伝子を有するＨＣＴ１１６  ＤＮＡは、メチル化反応においてのみポジティブな比率を生じた（図５Ｂ）。精子及びＨＣＴ１１６  ＤＮＡは共にＭＹＯＤ１反応においてポジティブな値を生み、これはそこに各試料にとって十分な投入ＤＮＡが存在していたことを示唆している。予想される様に、メチル化オリゴヌクレオチド又は非メチル化オリゴヌクレオチドのいずれかを用いて亜硫酸水素塩で変換しなかったＤＮＡ（図５Ｂ）は増幅されなかった。これらの結果はＣＯＢＲＡでの発見と一致しており（図５Ａ）、これは本発明のアッセイがＥＳＲ１遺伝子のメチル化対立遺伝子と非メチル化対立遺伝子とを識別し得ることを示唆している。更に、反応は亜硫酸水素塩で変換したＤＮＡに特異的であり、これは不完全な亜硫酸水素塩変換に起因する偽のポジティブな結果の生成を除外している。
【００６２】
例３
この例は、本発明のプライマー及びプローブの特異性を決定した。図６は、既知のメチル化状態のＤＮＡに対するメチル化及び非メチル化オリゴヌクレオチドの特異性を更に試験するための、プライマーとプローブの全ての可能性のある組み合わせの試験を示す。ＥＳＲ１「メチル化」及び「非メチル化」上流及び下流プライマー及びプローブの８個の異なる組み合わせ（上文の「例１」に記載）は、２つ１組で精子及びＨＣＴ１１６  ＤＮＡに対して、本発明のアッセイにおける異なる組み合わせで試験された。当該アッセイは上文の例１に記載の様に行われた。パネルＡ（図６）は、ＥＳＲ１オリゴの組み合わせに使用される命名法を示す。「Ｕ」は、亜硫酸水素塩変換した非メチル化ＤＮＡとアニールするオリゴ配列を意味し、一方、「Ｍ」はメチル化型を意味する。位置１は上流ＰＣＲプライマー、位置２はプローブ、そして位置３は下流プライマーを示す。８つの反応に使用される組み合わせは、２つ１組の実験を表す、棒の対のそれぞれの下方に示される。結果はＥＳＲ１の値とＭＹＯＤ１コントロール値との比率として表される。パネルＢはヒト精子ＤＮＡの解析を表す。パネルＣはヒト結腸直腸細胞系ＨＣＴ１１６から得られるＤＮＡの解析を表す。
【００６３】
完全に非メチル化した組み合わせ（反応１）又は完全に非メチル化した組み合わせ（反応８）だけが、精子及びＨＣＴ１１６、それぞれについてのポジティブな反応をもたらした。他の組み合わせはネガティブであり、これは当該ＰＣＲ条件が誤対合のオリゴヌクレオチドの弱いアニーリングを可能にしないことを示唆している。このことは、選択的に本発明の方法が、高い特異性の程度により、完全にメチル化した対立遺伝子と非メチル化対立遺伝子とを識別し得ることを示唆している。
【００６４】
例４
この例は、本発明の方法が再現可能であることを示している。図７は、メチル化及び非メチル化対立遺伝子の異種の集団を研究するために、同一の患者に由来する原発性結腸直腸ガン及び対応する正常な粘膜由来のＤＮＡ試料（図８の試料１０Ｎ及び１０Ｔ）中のＥＳＲ１遺伝子座のメチル化状態の解析を例示する。結腸直腸組織の試料は、下文の例５に記載する様に回収した。更に、本発明の方法の再現性は、各アッセイについての８個の独立した反応を行うことによって試験された。ＥＳＲ１反応及びＭＹＯＤ１コントロール反応の結果は、個々の反応の標準誤差が評価され得る様に、比率ではなく、これらの反応について得られた生の絶対値を表す。この値はプレート標準化されたが、投入ＤＮＡについて補正はされなかった。棒は８個の独立した反応で得られた平均値を示す。誤差棒は平均値の標準誤差を表す。
【００６５】
図７は、メチル化反応の平均値が正常な組織と比較して、腫瘍においてより高いことを示し、一方、非メチル化反応は反対の結果を示した。８個の独立した測定について得られた標準誤差は比較的小幅であり、そしてＴａｑＭａｎ（商標）技術を利用している他の研究で報告されたものに相当していた（Fink et al., Nature Med. 4 : 1329-1333, 1998）。本発明の方法の可変性のうちのいくつかは確率的ＰＣＲ（ＰＣＲバイアス）の結果であり、これは低い鋳型の濃度で起こり得る（Warnecke et al., Nucleic Acids Res. 25 : 4422-4426, 1997）。要約すれば、これらの結果は、本発明の方法が複雑な、異種ＤＮＡ試料について、再現性がある結果をもたらし得ることを示唆している。
【００６６】
例５
この例は２５個の一対組み合わせのヒト結腸直腸試料における、ＭＬＨＩ発現、マイクロサテライト不安定性及びＭＬＨ１プロモーターのメチル化の比較を示す。本発明の方法の主な利益は、特定の遺伝子座のメチル化状態のために、ヒト腫瘍を素速くスクリーニングする能力である。更に、遺伝子発現のための代理のマーカーとしてのＤＮＡメチル化の解析は、腫瘍についての臨床的に有用な情報を得るための新規な方法である。我々は、ＭＬＨ１プロモーターのメチル化状態を問い合わせることによって、本発明の方法の有用性を試験した。ミスマッチ修復遺伝子ＭＬＨ１は、ミスマッチ修復欠損結腸直腸腫瘍の散発性の病気の進行において中心的な役割を果たしている（Thibodeau et al., Science 260 : 816-819, 1993）。ＭＬＨ１は、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を導く、そのプロモーター領域のＤＮＡの過剰なメチル化によって転写的にサイレンスと成り得ることが報告されてきた（Kane et al., Cancer Res. 57 : 808-811, 1997 ; Ahuja et al., Cancer Res. 57 : 3370-3374, 1997 ; Cunningham et al., Cancer Res. 58 : 3455-3460, 1998 ; Herman, J. G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 : 6870-6875, 1998 ; Veigl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 : 8698-8702, 1998）。
【００６７】
高処理の本発明の方法を用いて、例１の適用Ｄに記載されている様に、２５個の一対組み合わせのヒト結腸直腸腺ガン及び正常な粘膜から成る５０個の試料が、ＭＬＨ１のＣｐＧ島のメチル化状態について解析された。ＡＣＴＢ（β−アクチン）に対して標準化されたＭＬＨ１の発現レベルの定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ（商標））解析が研究された。更に、各試料のマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）の状態が、ＢＡＴ２５及びＢＡＴ２６の遺伝子座のＰＣＲによって解析された（Parsons et al., Cancer Res. 55 : 5548-5550, 1995）。２５個の対になった腫瘍と正常な粘膜組織の試料は、原発性結腸直腸腺ガンを有する２５人の患者から得た。この患者は、平均年齢６８．８才の、３９〜８８才の年齢に及ぶ１６人の男性及び９人の女性から構成された。正常な検体に対する腫瘍からの粘膜の距離は１０〜２０cmであった。約２ｇの外科的に摘出した組織は直ちに液体窒素中で冷凍され、そしてＲＮＡ及びＤＮＡの単離まで−８０℃で保存された。
【００６８】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ及びマイクロサテライト不安定性解析  ｍＲＮＡレベルの定量は、リアルタイム蛍光検出を用いて行った。ＴａｑＭａｎ（商標）反応は、１ＵのＡｍｐＥｒａｓｅ（ウラシルＮ−グリコシラーゼ）の添加を除いて、上文の前記アッセイについて記載されている様に行った。ＲＮＡの単離後、ｃＤＮＡは概説されている様に各試料から調製した（Bender et al., Cancer Res. 58 : 95-101, 1998）。要約すると、ＲＮＡは、グアニジンイソチオシアネート（４Ｍ）、Ｎ−ラウリルサルコシン（０．５％）、クエン酸ナトリウム（２５mM）、及び２−メルカプトエタノール（０．１Ｍ）を含む緩衝液中での組織の溶解、標準的なフェノール−クロロホルム抽出、及び５０％イソプロパノール／５０％溶解緩衝液中での沈澱によって単離した。ｃＤＮＡの調製のために、ＲＮＡ試料は、ランダムヘキサマー、デオキシヌクレオチド三リン酸、及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔII（商標）逆転写酵素(Life Technologies, Inc. Palo Alto, CA）を用いて逆転写した。生じたｃＤＮＡは、続いてＭＬＨ１及びＡＣＴＢに特異的なプライマーで増幅された。ゲノムＤＮＡによるＲＮＡ試料の汚染は、事前のｃＤＮＡ変換無しに全てのＲＮＡ試料の解析によって排除された。相対的な遺伝子発現は、ＭＬＨ１遺伝子及び内部標準遺伝子ＡＣＴＢの限界のサイクル（特異的なプローブによる検出に必要とされるＰＣＲサイクルの数）に基づいて決定された。ＡＣＴＢ及びＭＬＨ１遺伝子の上流プライマー、プローブ及び下流プライマーの配列は：ＡＣＴＢ（TGAGCGCGGCTACAGCTT〔配列番号２５〕、６ＦＡＭ  5'-ACCACCACGGCCGAGCGG-3'  ＴＡＭＲＡ〔配列番号２６〕、CCTTAATGTCACACACGATT〔配列番号２７〕）；及びＭＬＨ１（GTTCTCCGGGAGATGTTGCATA〔配列番号２８〕、６ＦＡＭ
5'-CCTCAGTGGGCCTTGGCACAGC-3'  ＴＡＭＲＡ〔配列番号２９〕、TGGTGGTGTTGAGAAGGTATAACTTG〔配列番号３０〕）である。
【００６９】
多数のポリアデニン（「ｐＡ」）配列の変化は、ゲノムを通して広範に分布しており、これはマイクロサテライト不安定性を用いて腫瘍を特徴づけるのに有用な特性である（Ionov et al., Nature 363 : 558-561, 1993）。マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）は、概説されている様に、ＢＡＴ２５（ｃ−ｋｉｔ発ガン遺伝子のイントロン由来の２５塩基対のｐＡトラクト）及びＢＡＴ２６（ミスマッチ修復遺伝子ｈＭＳＨ２のイントロン由来の２６塩基対のｐＡトラクト）の遺伝子座のＰＣＲ及び配列解析によって決定した（Parsons et al., Cancer Res. 55 : 5548-5550, 1995）。要約すると、ＢＡＴ２５及びＢＡＴ２６の遺伝子座のセグメントは、各遺伝子座についての１つの32Ｐ標識プライマー及び１つの未標識プライマーを用いて、３０サイクル増幅された。反応は尿素−ホルムアミドゲル上で解明し、そしてフィルムに暴露した。ＢＡＴ２５及びＢＡＴ２６の増幅に使用した上流及び下流プライマーは：ＢＡＴ２５（TCGCCTCCAAGAATGTAAGT〔配列番号３１〕、TCTGCATTTTAACTATGGCTC〔配列番号３２〕）；及びＢＡＴ２６（TGACTACTTTTGACTTCAGCC〔配列番号３３〕、AACCATTCAACATTTTTAACCC〔配列番号３４〕）である。
【００７０】
図８は、本発明の方法によって決定される場合のＭＬＨ１遺伝子発現、ＭＳＩ状態及びＭＬＨ１のプロモーターのメチル化の間の相関を示す。上側のチャートは、対応する正常（斜線の棒）及び腫瘍（黒棒）の結腸直腸試料の定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ（商標））によって測定されたＭＬＨ１の発現レベルを示す。発現レベルはＭＬＨ１とＡＣＴＢとの間の測定値の比率として表される。マイクロサテライト不安定性状態（ＭＳＩ）は、２つのチャートの間に位置している丸によって示される。ＢＡＴ２５及びＢＡＴ２６の遺伝子座の解析によって決定される場合に、黒丸はＭＳＩポジティブであることを示し、一方、白丸は試料がＭＳＩネガティブであることを示す。下側のチャートは、本発明の方法によって決定される場合のＭＬＨ１遺伝子座のメチル化状態を示す。メチル化レベルは、ＭＬＨ１メチル化反応とＭＹＯＤ１反応との間の比率として表される。
【００７１】
４つの結腸直腸腫瘍は、相当する正常な組織と比較して、有意にメチル化レベルが増大した。これらのうちの１つ（腫瘍１７）が、本発明の方法によって計測される場合に、ＭＬＨ１メチル化の特に高い程度を示した。腫瘍１７は共にＭＳＩポジティブ（黒丸）であった唯一の試料であり、そしてＭＬＨ１が転写的にサイレンスであることを示した。残りのメチル化腫瘍は小幅なレベルでＭＬＨ１を発現し、そしてＭＳＩネガティブ（白丸）であった。これらの結果は、ＭＬＨ１が腫瘍１７において複対立遺伝子的にメチル化され、後成的なサイレンス及びその結果としてのマイクロサテライト不安定性が生じることを示し、一方、他の腫瘍はＭＬＨ１プロモーターの過剰なメチル化の程度がより低いことを示し、そして未変化の対立遺伝子からの発現を可能にする、唯一のメチル化対立遺伝子を１つだけ有し得る。従って、本発明の方法は重大な生物学的情報、例えばガンの過程に関する遺伝子の転写的なサイレンスと関係している、ヒト腫瘍におけるプロモーターのＣｐＧ島の過剰なメチル化の情報を素速くもたらすことができる。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１は、最初にメチル化ＤＮＡと非メチル化（亜硫酸水素塩で変換した）ＤＮＡとを識別するＰＣＲプライマーを用いる、ＭＳＰ技術（従来技術）の概要を示す。上側の部分は、非メチル化一本鎖ゲノムＤＮＡが、最初に亜硫酸水素ナトリウム変換（非メチル化シトシン残基の、ウラシルへの脱アミノ化）、続いて変換した鋳型を用いるＰＣＲ反応にかけられた場合のＭＳＰ方法の結果を示しており、この中で、ＰＣＲ生成物は変換した（そしてその結果、メチル化されてない）ＤＮＡと特異的にアニーリングするプライマーを用いる場合にのみ出現する。下側の部分は、メチル化一本鎖ゲノムＤＮＡを使用する場合の対照的な結果を示す。また、この方法は、最初に亜硫酸水素塩処理を、続いてＰＣＲ生成物が変換されていない（そしてその結果、最初にメチルされた）ＤＮＡに特異的にアニーリングするプライマーを用いた場合にのみ出現する様なＰＣＲ反応を提供する。
【図２】図２は、特異的な遺伝子座を増幅するための、非識別性（メチル化状態に関して）の上流及び下流ＰＣＲプライマーを用いて、亜硫酸水素ナトリウムで処理したゲノムＤＮＡを用いたＤＮＡのメチル化を評価するための代替方法を示す。この例示において、変性した（すなわち一本鎖の）ゲノムＤＮＡは、解析のための試料において典型的に見られるであろう、混合したメチル化状態が提供される。試料は標準的な亜硫酸水素ナトリウム反応で変換され、そして混合した生成物はいずれのＣｐＧジヌクレオチドも覆わないプライマーを用いるＰＣＲ反応によって増幅される。これは、ＰＣＲ生成物の偏っていない（メチル化状態に関して）異種なプールを生成する。混合型又は異種のプールは、引き続いて配列の差異を検出することができる技術によって解析されることがあり、これは直接的なＤＮＡの配列決定、ＰＣＲフラグメントのサブクローニングに続く代表的なクローンの配列決定、一塩基プライマー伸長反応（ＭＳ−ＳＮｕＰＥ）、又は制限酵素消化（ＣＯＢＲＡ）を含む。
【図３】図３は、ＰＣＲ生成物の解析のための複数の、しかし全てではない、代替の態様における本発明の方法の流れ図を示す。検出方法の変更、例えば二重プローブ技術（Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（商標））又は蛍光プライマー（Ｓｕｎｒｉｓｅ（商標）技術）の使用は、この図に示していない。具体的には、本発明の方法は、亜硫酸水素ナトリウム反応において、標準的な方法に従い、メチル化依存性で配列が異なる混合されたプールに変換されるゲノムＤＮＡの混合試料を用いて開始される（亜硫酸塩の過程は、非メチル化シトシン残基をウラシルに変換する）。蛍光に基づいたＰＣＲは、引き続いて既知のＣｐＧメチル化部位を覆わないプライマーを用いる、「偏っていない」ＰＣＲ反応（図３の左側）、又は既知のＣｐＧジヌクレオチドを覆うＰＣＲプライマーを用いる、「偏った」反応（図３の右側）のいずれかで行われる。配列の識別は、増幅過程のレベル（Ｃ及びＤ）で、又は蛍光検出過程のレベル（Ｂ）のいずれかで、あるいはその両方（Ｄ）で起こり得る。ゲノムＤＮＡ試料中のメチル化パターンについての定量試験を左側に示し（Ｂ）、この中で配列の識別はプローブハイブリダイゼーションのレベルで起こる。この型において、ＰＣＲ反応は特定の推定上のメチル化部位を覆う蛍光プローブの存在下での偏っていない増幅を提供する。投入したＤＮＡの量のための偏っていないコントロールは、プライマー又はプローブのいずれもＣｐＧジヌクレオチドの上に横たわらない反応によって提供される（Ａ）。あるいは、図３の右側に示す様に、ゲノムのメチル化のための定性的試験は、既知のメチル化部位を「覆わない」コントロールオリゴヌクレオチド（Ｃ；ＭＳＰ技術の蛍光を基にしたもの）、又は潜在的なメチル化部位を覆うオリゴヌクレオチド（Ｄ）のいずれかを用いて偏ったＰＣＲプールを試験することによって達成される。
【図４】図４は、増幅過程において「ＴａｑＭａｎ（商標）」プローブを利用する、本発明の方法のフローチャートの概略を示す。要約すると、二本鎖ゲノムＤＮＡを亜硫酸水素ナトリウムで処理し、そしてＴａｑＭａｎ（商標）プローブを用いる、すなわち偏っていないプライマー及びＴａｑＭａｎ（商標）プローブ（左の列）、又は偏っていないプライマー及びＴａｑＭａｎ（商標）プローブ（右の列）のいずれかを用いる、２組のＰＣＲ反応の１つにかけられる。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブは、蛍光「レポーター」（図４において「Ｒ」と表す）及び「クエンチャー（ｑｅｎｃｈｅｒ）」（「Ｑ」と表す）分子を用いて二重標識され、そしてそれが上流又は下流プライマーよりも、ＰＣＲサイクルにおいて約１０℃以上高い温度で溶解する様に、比較的高いＧＣ含有領域について特異性がある様に設計される。このことは、ＰＣＲのアニーリング／伸長段階の間に、それを完全にハイブリダイズしたままにすることを可能にする。ＴａｑポリメラーゼがＰＣＲの間に新規の鎖を酵素的に合成する様に、それは最終的にはＴａｑＭａｎ（商標）プローブのアニーリングに達するだろう。Ｔａｑポリメラーゼの５′から３′へのエンドヌクレアーゼ活性は引き続いて、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブを消化して、本明細書に記載のリアルタイムの蛍光システムを用いる、その時点で消失していないそのシグナルの定量的な検出のための蛍光レポーター分子を放出せしめることによって、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブを置換するだろう。
【図５ａ】図５は、常用のＣＯＢＲＡアッセイに対する本発明のアッセイの比較を示す。パネルＡは、メチル化状態が既知のＤＮＡ（精子、非メチル化）及びＨＣＴ１１６（メチル化）における、ＥＳＲ１の遺伝子座でのＤＮＡのメチル化レベルを決定するために使用されるＣＯＢＲＡゲルを示す。開裂した生成物の相対的な量をゲルの下に示す。５６bpのフラグメントは、ハイブリダイゼーションプローブと近接しているＴａｑＩ部位が本来のゲノムＤＮＡにおいてメチル化されているＤＮＡ分子を表す。８６bpのフラグメントは、近位のＴａｑＩ部位がメチル化されておらず、そして遠位の部位がメチル化されているＤＮＡ分子を表す。パネルＢはＣＯＢＲＡの結果を要約しており、そして本発明のアッセイ方法のメチル化及び非メチル化版で得られた結果とそれらを比較する。この結果は、メチル化特異的反応とコントロール反応との比率として表される。亜硫酸水素塩処理した試料の場合、コントロール反応は例１に記載のＭＹＯＤ１アッセイとした。未処理試料の場合、ＲＴ−ＰＣＲ反応のために記載したＡＴＣＢプライマーが、未変換型ＤＮＡ試料の投入を証明するためのコントロールとして使用された（ＡＣＴＢプライマーはイントロンにかからない）。「ＰＣＲ無し」は、ＰＣＲ生成物が、亜硫酸水素塩で変換したＤＮＡ配列を増幅するために設計したＣＯＢＲＡプライマーを用いて、未変換型ゲノムＤＮＡ上で得られなかったことを示す。
【図５ｂ】図５は、常用のＣＯＢＲＡアッセイに対する本発明のアッセイの比較を示す。パネルＡは、メチル化状態が既知のＤＮＡ（精子、非メチル化）及びＨＣＴ１１６（メチル化）における、ＥＳＲ１の遺伝子座でのＤＮＡのメチル化レベルを決定するために使用されるＣＯＢＲＡゲルを示す。開裂した生成物の相対的な量をゲルの下に示す。５６bpのフラグメントは、ハイブリダイゼーションプローブと近接しているＴａｑＩ部位が本来のゲノムＤＮＡにおいてメチル化されているＤＮＡ分子を表す。８６bpのフラグメントは、近位のＴａｑＩ部位がメチル化されておらず、そして遠位の部位がメチル化されているＤＮＡ分子を表す。パネルＢはＣＯＢＲＡの結果を要約しており、そして本発明のアッセイ方法のメチル化及び非メチル化版で得られた結果とそれらを比較する。この結果は、メチル化特異的反応とコントロール反応との比率として表される。亜硫酸水素塩処理した試料の場合、コントロール反応は例１に記載のＭＹＯＤ１アッセイとした。未処理試料の場合、ＲＴ−ＰＣＲ反応のために記載したＡＴＣＢプライマーが、未変換型ＤＮＡ試料の投入を証明するためのコントロールとして使用された（ＡＣＴＢプライマーはイントロンにかからない）。「ＰＣＲ無し」は、ＰＣＲ生成物が、亜硫酸水素塩で変換したＤＮＡ配列を増幅するために設計したＣＯＢＲＡプライマーを用いて、未変換型ゲノムＤＮＡ上で得られなかったことを示す。
【図６ａ】図６はオリゴヌクレオチドの特異性の決定を例示する。８つの異なる上流プライマー、プローブ及び下流プライマーの組み合わせが、ＥＳＲ１の遺伝子座における既知のメチル化を有するか、又はメチル化の欠如についてＤＮＡ試料上で試験された。パネルＡはＥＳＲ１オリゴの組み合わせに使用した命名法を示す。「Ｕ」は亜硫酸水素塩で変換した非メチル化ＤＮＡとアニールするオリゴ配列を言及し、一方、「Ｍ」はメチル化したものを言及する。位置１は上流ＰＣＲプライマーを示し、位置２はプローブ、そして位置３は下流プライマーを示す。８つの反応のために使用される組み合わせは、２回１組の実験を表す、棒の対のそれぞれ下方に示す。結果は、ＥＳＲ１値とＭＹＯＤ１のコントロール値との間の比率として表される。パネルＢは、ヒト精子ＤＮＡの解析を表す。パネルＣは、ヒト結腸直腸ガン細胞系ＨＣＴ１１６から得られるＤＮＡの解析を表す。
【図６ｂ】図６はオリゴヌクレオチドの特異性の決定を例示する。８つの異なる上流プライマー、プローブ及び下流プライマーの組み合わせが、ＥＳＲ１の遺伝子座における既知のメチル化を有するか、又はメチル化の欠如についてＤＮＡ試料上で試験された。パネルＡはＥＳＲ１オリゴの組み合わせに使用した命名法を示す。「Ｕ」は亜硫酸水素塩で変換した非メチル化ＤＮＡとアニールするオリゴ配列を言及し、一方、「Ｍ」はメチル化したものを言及する。位置１は上流ＰＣＲプライマーを示し、位置２はプローブ、そして位置３は下流プライマーを示す。８つの反応のために使用される組み合わせは、２回１組の実験を表す、棒の対のそれぞれ下方に示す。結果は、ＥＳＲ１値とＭＹＯＤ１のコントロール値との間の比率として表される。パネルＢは、ヒト精子ＤＮＡの解析を表す。パネルＣは、ヒト結腸直腸ガン細胞系ＨＣＴ１１６から得られるＤＮＡの解析を表す。
【図６ｃ】図６はオリゴヌクレオチドの特異性の決定を例示する。８つの異なる上流プライマー、プローブ及び下流プライマーの組み合わせが、ＥＳＲ１の遺伝子座における既知のメチル化を有するか、又はメチル化の欠如についてＤＮＡ試料上で試験された。パネルＡはＥＳＲ１オリゴの組み合わせに使用した命名法を示す。「Ｕ」は亜硫酸水素塩で変換した非メチル化ＤＮＡとアニールするオリゴ配列を言及し、一方、「Ｍ」はメチル化したものを言及する。位置１は上流ＰＣＲプライマーを示し、位置２はプローブ、そして位置３は下流プライマーを示す。８つの反応のために使用される組み合わせは、２回１組の実験を表す、棒の対のそれぞれ下方に示す。結果は、ＥＳＲ１値とＭＹＯＤ１のコントロール値との間の比率として表される。パネルＢは、ヒト精子ＤＮＡの解析を表す。パネルＣは、ヒト結腸直腸ガン細胞系ＨＣＴ１１６から得られるＤＮＡの解析を表す。
【図７】図７は、反応の再現性の試験を示す。アッセイは、複合型起源の試料上での再現性を決定するために、８つの独立した反応で行った。原発性ヒト直腸結腸腺ガン及び対応する正常な粘膜が、この目的のために使用された（図８に示す試料１０Ｎ及び１０Ｔ）。この図に示す結果は、アッセイにおいて得られる生の値を表す。値はプレート標準化されたが、投入ＤＮＡについては補正しなかった。棒は、８つの別々の反応について得られた平均値を示す。誤差棒は、平均の標準誤差を表す。
【図８】図８は、２５個の一対組み合わせのヒト直腸結腸試料のＭＬＨ１発現、マイクロサテライト不安定性及びＭＬＨ１プロモーターのメチル化の比較を例示する。上側のチャートは、対応する正常な（斜線の棒）試料及び腫瘍（黒棒）結腸直腸の試料における、定量的な、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ（商標））によって測定されるＭＬＨ１の発現レベルを示す。発現レベルは、ＭＬＨ１とＡＣＴＢとの測定値の比率として示される。マイクロサテライト不安定状態（ＭＳＩ）は、２つのチャートの間に位置する丸によって示される。黒丸はＭＳＩポジティブであることを示し、一方、白丸は、ＢＡＴ２５及びＢＡＴ２６の遺伝子座の解析によって決定される様に、試料がＭＳＩネガティブであることを示している。下側のチャートは、本発明の方法によって決定される様なＭＬＨ１の遺伝子座のメチル化状態を示す。メチル化レベルは、ＭＬＨ１メチル化反応とＭＹＯＤ１反応との間の比率として表される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図５ａ】
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【配列表】
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