(57)【要約】      （修正有）【課題】被検者の慢性ストレスの状態を、簡便に、しかも客観的かつ高精度に評価するための新規な方法を提供する。【解決手段】被検者の末梢血由来のメッセンジャーＲＮＡを用いて、「慢性ストレスのマーカー遺伝子」として選定した特定のマーカー遺伝子の発現解析結果に基づき、該被検者の慢性ストレス状態を評価する。さらには被験者の遺伝子発現データとあらかじめ取得した健常者及び慢性ストレス状態者の遺伝子発現データとを比較解析する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者の末梢血由来のメッセンジャーRNAを用いて、表１から選ばれるいずれかのマーカー遺伝子の発現解析結果に基づき、該被検者の慢性ストレス状態を評価することを特徴とする慢性ストレスの評価方法。
【請求項２】
被検者の末梢血由来のメッセンジャーRNAを用いて、表１に記載されたマーカー遺伝子の発現解析結果に基づき、該被検者の慢性ストレス状態を評価することを特徴とする慢性ストレスの評価方法。
【請求項３】
前記遺伝子発現解析が、被検者の遺伝子発現プロファイルと、慢性ストレス状態者及び健常者の遺伝子発現プロファイルとを比較解析することにより行われることを特徴とする、請求項１又は２に記載の慢性ストレスの評価方法。
【請求項４】
前記遺伝子発現解析が、チップ、アレイ、メンブレンフィルター、及びビーズを含むDNA固相化試料のいずれかを用いて行われることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の慢性ストレスの評価方法。
【請求項５】
前記遺伝子発現解析が、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ノーザンブロット法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、及びディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法から選ばれるいずれかの方法を用いて行われることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の慢性ストレスの評価方法。
【請求項６】
表１に記載のマーカー遺伝子にそれぞれ特異的にハイブリダイズし、該遺伝子を検出するための各プローブを固相上に固定化したことを特徴とする慢性ストレスの評価用固相化試料。
【請求項７】
被検者の遺伝子発現データと、あらかじめ取得しておいた健常者及び慢性ストレス状態者の遺伝子発現データとを比較解析する手段を有することを特徴とする慢性ストレスの評価用システム。
【請求項８】
前記被検者、健常者及び慢性ストレス状態者の遺伝子発現データに、それぞれの年齢及び性別のデータを加えて比較解析する手段を有することを特徴とする請求項７に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、慢性ストレスの評価方法に関する。より詳しくは、被検者の末梢血由来のメッセンジャーRNAを用いて、選ばれたマーカー遺伝子の発現解析結果に基づき、該被検者の慢性ストレス状態を評価することを特徴とする慢性ストレスの評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、人が直面している生活様式の変化と社会構造の変革は、人の心身の健康にさまざまな影響をもたらしている。ストレスの増加は、狭義の精神疾患や心身疾患のみならず、生活習慣病や難治性慢性疾患の増加とも密接に結びついている。
【０００３】
生体が有害な環境や因子に曝されたときに生じる非特異的な反応が「ストレス」と定義されている。今日まで、各種疾患においてストレスで誘導される因子が同定され、病態との関連が指摘されているが、未だにストレスの程度を正確に評価する方法は確立されていない。この理由は、ストレスは複雑系の反応であり、心理学、社会学、生理学、臨床医学など多角的な評価が要求され、しかもそれぞれの評価法に確実な指標を欠いているためである。
【０００４】
例えば、従来、個人のストレス評価法として、ライフイベントや日常苛立ち事などのストレッサーの評価、性格判定テストなどの個人の生物学的特徴の評価が行われ、一定の成果を挙げてきた。しかし、これらの評価には膨大な時間と労力が必要であり、定量性や客観性に問題が残されている。また、ストレスホルモンなどの限られた因子を測定する方法、例えば、体液中のクロモグラミンの濃度を定量する方法（特許文献１）、副腎又は下垂体における一酸化窒素合成酵素の活性を測定する方法（特許文献２）、唾液における副腎性性ホルモン又はその代謝物の濃度を指標にする方法（特許文献３）、グルタチオン付加ヘモグロビン量を測定する方法（特許文献４）、唾液中のコルチゾール濃度を測定する方法（特許文献５）、モノアミン類の濃度変化率を測定する方法（特許文献６）、V-1遺伝子発現量又はV-1蛋白質量を測定する方法（特許文献７）、血中のKYN濃度の変化率を測定する方法（特許文献８）、perl遺伝子とperl2遺伝子の発現レベルを指標とする方法（特許文献９）など、多くの方法が提案されているが、これらの方法では、内分泌・神経・免疫による複雑系の反応(ストレス反応)を評価することは困難である。
【０００５】
本発明者らは、末梢白血球に現れる生体反応をマイクロアレイ（DNAチップ）を用いて網羅的に解析し、複雑系の反応であるストレス反応を、客観的に評価する新しい方法論を見出し、ストレス及びストレス関連疾患の診断に応用して来た。
【０００６】
発明者らは、既にストレス及びストレス関連疾患を評価するためのオリゴヌクレオチドアレイ及び検査方法を提供し（特許文献１０）、これを用いて、うつ病の評価方法（特許文献１１）、また、健常大学院生が学位論文の公開審査時に現れる急性の精神的ストレスを評価する方法（非特許文献１）を提供した。
【０００７】
今回提供するのは精神的ストレスが長期に持続する状態、いわゆる慢性ストレス時におけるストレス評価方法である。強度のストレスに曝された場合は、心的外傷後ストレス障害（PTSD）に陥る場合もあるが、ほとんどの急性ストレスは原因となるストレッサーがなくなるともとの状態に戻る。これに反して、ストレッサーに長期間持続的に曝される慢性ストレスは、ストレスに起因する疾患、例えば、うつ病などの精神疾患や、がん、アレルギー疾患、などの発症の原因となり、生活習慣病など、多くの疾患の増悪と密接に結びついている。この慢性ストレスの状態を簡便かつ的確に評価できれば、個人の日常生活や治療にフィードバックできる有用な情報となる。検診センター、職場の健康管理室、災害の避難現場等でも利用でき、予防医学の分野で国民生活の向上と医療費の削減に貢献することができる。
【０００８】
【特許文献１】特開平１１-２３５７２号公報
【特許文献２】特開平８-２６２０２５号公報
【特許文献３】特開平１１-３８００４号公報
【特許文献４】特開２０００-７４９２３号公報
【特許文献５】特開２０００-２７５２４８号公報
【特許文献６】特開２００２−１５６３７８号公報
【特許文献７】特開２００３−６１６５４号公報
【特許文献８】特開２００４−１９８３２５号公報
【特許文献９】特開２００５−１４３４２０号公報
【特許文献１０】特開２００２−３４０９１７号公報
【特許文献１１】特開２００４−２０８５４７号公報
【非特許文献１】Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、３８１（２００５）５７−６２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、慢性ストレス状態を、簡便に、しかも客観的かつ高精度に診断するための新規な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、慢性ストレスの状態を客観的に評価するために、検体として容易に得られ、しかも、ストレスに関連する因子の受容体の多くを発現する末梢血白血球に着目した。そして、ストレス応答に関連する約1500遺伝子のメッセンジャーRNAの発現パターンを網羅的に解析し、パターン化することで、慢性ストレスの状態を評価し得る方法を見出し、本発明の完成に至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、被検者の末梢血由来のメッセンジャーRNAを用いて、表１から選ばれるマーカー遺伝子の発現解析結果に基づき、該被検者の慢性ストレス状態を評価する。
【００１２】
表1に記載された遺伝子は有用な慢性ストレスのマーカー遺伝子である。これらは、Bonferroni補正をしたdoitall. pair有意差検定によりerror rateが０．０５以下で、健常者に比べて慢性ストレス状態者で発現が１．５倍以上増加している遺伝子１４個と１．５倍以上発現が減少している遺伝子１０個から成る。表１には、各マーカー遺伝子の遺伝子記号、発現比の平均値、ｐ値を示した。
【００１３】
本発明では、表１から選ばれるマーカー遺伝子の発現に関して、被検者の検体で検査し、該被検者が慢性ストレス状態にあるか否かを判定することができる。
【００１４】
なお、慢性ストレスのマーカー遺伝子に関しては、ここでは、以下に記載するように、医師国家試験受験をひかえ半年以上にわたり慢性ストレス状態が続き、試験前々日を迎えた６年次医学科学生（慢性ストレス状態者）１８名、及び、医師国家試験受験の１０ヶ月前で、まだストレスを感じていない６年次医学科学生（健常者）１３名から１６：００〜１８：００の空腹時に採血した全血よりRNAを抽出し、DNAチップを用いて遺伝子発現解析を行い、その結果に基づいて決定した。対象者は、本評価法開発のための研究に参加することについて文書により説明し同意を得た者である。評価は、採血に加えて、STAI（State-Trait Anxiety Inventory：状態−特性不安検査）質問票により状態不安と特性不安を調査し、対象者が感じている不安を評価することで、ストレスのかかりぐあいを間接的に評価する方法により実施した。
【００１５】
本明細書の実施例では、慢性ストレス状態者及び健常者から得た全血よりRNAを抽出し、表１に記載のマーカー遺伝子について、DNAチップを用いて遺伝子発現解析を行った。DNAチップとは、ガラス等の支持基体上に多数の遺伝子に相当する塩基配列を有するDNA断片を固定化したものであり、ハイブリダイゼーションにより、サンプル中のRNAを検出するものである。解析は、遺伝子の網羅的な発現解析が可能であれば、上記DNAチップに代えて、他のDNA固相化試料（DNAアレイ、ビーズ、メンブレンフィルター等）や定量法を利用してもよい。
【００１６】
比較対照は、各慢性ストレス状態者に対し、健常者１３名のRNAサンプルを等量混合したもの（ユニバーサルRNA）とした。そして、慢性ストレス状態者RNAと健常者ユニバーサルRNA間の各遺伝子の発現量比を求め、慢性ストレス状態者／健常者比較データのすべてにおいて蛍光強度が300以上である遺伝子群を解析対象遺伝子とした。この解析対象遺伝子より、慢性ストレス状態者／健常者比較データにおいて、発現量が有意に増加もしくは減少している遺伝子を有意差検定により抽出した。そして、健常者に比べ、慢性ストレス状態者において発現量が１．５倍以上増加している遺伝子（１４遺伝子）、及び１．５倍以上減少している遺伝子（１０遺伝子）を、慢性ストレスの状態を評価するための指標、すなわち「慢性ストレスのマーカー遺伝子」として選定した。
【００１７】
被検者の慢性ストレスの状態の評価は、表１に記載されたマーカー遺伝子に関して、被検者、慢性ストレス状態者、健常者の遺伝子発現のプロファイルを比較解析することにより実施することができる。
【００１８】
例えば、被検者由来のRNAサンプルと、健常者ユニバーサルRNAサンプルを互いに発光波長の異なる蛍光色素でラベルした後、表１に記載の遺伝子を搭載した同一の慢性ストレス評価用ＤＮＡチップ上で競合ハイブリダイゼーションを行う。チップ上の各プローブの蛍光強度は、被検者と健常者の各遺伝子の発現強度比を示し、その発現プロファイルを上記の表１に記載の遺伝子の慢性ストレス状態者／健常者の発現比較した遺伝子発現プロフィル元データと比較解析することにより、被検者の慢性ストレスの状態を評価することができる。また、健常者ユニバーサルRNAサンプルの代わりに、慢性ストレス状態者と性、年齢を一致させた健常各人のRNAサンプルをコントロールサンプルとして用いて、表１に記載の遺伝子に関して、被検者、慢性ストレス状態者、健常者間の比較解析をしても良い。更に、ユニバーサルRNAサンプルの蛍光強度の代わりに、被検者、慢性ストレス状態者、健常者、それぞれの１色の蛍光強度をチップ間、遺伝子間でノーマリゼーションしたデータセットを基準として用いる、所謂、１色法でも実施することができる。
【００１９】
遺伝子の発現解析方法は、DNAチップに限定されず、DNAアレイやメンブレンフィルター等の他のDNA固相化試料を用いた核酸ハイブリダイゼーション法、RT-PCRやリアルタイムPCR等の定量的PCR法、ノーザンブロット法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、及びディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法等、当該技術分野で知られた任意の解析方法を用いることができる。特に、多数の遺伝子を一度に網羅的に解析できるという点で、DNAチップ、DNAアレイ、メンブレンフィルター、及びビーズ等のDNA固相化試料が好ましい。
【００２０】
遺伝子を検出するためのプローブは、周知の方法に従って、表１に記載された遺伝子から選ばれるマーカー遺伝子の特異性の高い領域（例えば、3’UTR部分）に相補的な配列として設計することができ、25−100塩基長の合成オリゴプローブ、あるいは300−1000塩基長のPCR産物を使用することができる。固相上へのプローブの固定化方法は、特に限定されず、周知の方法に従い、合成したプローブを固相上にスポットするか、プローブを固相上で合成すればよい。ＤＮＡチップを用いた検査システムの一例を図１に示す。
実際の臨床検査の現場では、被検者の遺伝子発現データと、あらかじめ取得しておいた健常者及び慢性ストレス状態者の遺伝子発現データとを比較解析する手段を有するシステムを用意する。当該システムでは、被検者、健常者及び慢性ストレス状態者の遺伝子発現データに加えて、それぞれの年齢及び性別などの臨床データを加えて比較解析すると更に良い。例えば、慢性ストレス状態者及び健常者の発現データを年齢、性別に分けてデータベースとして蓄えて置けば、データベースから被検者と年齢、性別が合致したデータを取り出すだけで、被検者と慢性ストレス状態者、健常者の比較解析を行うことができる。許容される年齢差としては５歳以内が望ましい。また、慢性ストレス状態者及び健常者の発現データをコンピュータにあらかじめ学習させておき、被検者の発現データが慢性ストレス状態者と健常者のどちらの発現パターンに近いかをコンピュータに判断させることにより、被検者の慢性ストレスの状態を評価することもできる。
【００２１】
データの解析方法は、クラスタ解析に限定されず、サポートベクターマシン等の機械学習のアルゴリズム等、当該技術分野で知られた任意の解析方法を用いることができる。評価システムの概要を図２に示す。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、慢性ストレスの状態を、被検者のほんの数ｃｃの末梢血から得たＲＮＡの遺伝子発現解析により、簡便に、しかも客観的かつ高精度に診断することができ、従来、困難であった慢性ストレスの評価を容易に実施することができる。本発明の方法は、従来の限られた因子を測定する方法に比べ、数多くのRNA発現量から生体機能を多面的に把握することになるので、慢性ストレスのような複雑な状態を評価する方法として原理的にも適切であり、効用大なるものである。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２４】
〔実施例１〕
１．慢性ストレス状態者及び健常者
対象者は、徳島大学医学部医学科６年次学生のうち、本評価法開発のための研究に参加することについて文書により説明し同意を得た者とした。本研究は徳島大学病院倫理委員会の承認を得ている。
【００２５】
慢性ストレス状態者としては、医師国家試験受験をひかえ半年以上にわたり慢性ストレス状態が続き、試験前々日を迎えた６年次医学科学生１８名を選んだ。１８名は、男性１０名、女性８名で、平均年齢は２５．４歳、２３〜３２歳からなる。この１８名について、試験前々日に、各人の血液サンプルを採取するとともに、その状態不安と特性不安をSTAI質問票でスコアー化して評価した。
【００２６】
一方、健常者としては、まだ医師国家試験準備に伴う慢性ストレス状態にない医師国家試験１０ヶ月前の徳島大学医学医学科６年次学生１３名を選んだ。１３名は、男性５名、女性８名で、平均年齢２３．８歳、２３〜２７歳からなる。この１３名について、慢性ストレス状態者の場合と同様に、各人の血液サンプルを採取するとともに、その状態不安と特性不安をSTAI質問票でスコアー化して評価した。
【００２７】
図３に、STAI尺度によりスコアー化した慢性ストレス状態者１８名の状態不安と、健常者１３名の状態不安の平均値（コントロール）を示した。
【００２８】
２．遺伝子発現解析
慢性ストレス状態者１８名から、PAXgene Blood RNA System（キアゲン社製）を用いて5 cc採血し、トータルRNAを抽出した。採血は、午後４時から午後６時までの空腹時とし、医師が安静下に肘静脈より採血した。トータルRNAの収量は、5-15マイクログラムであった。
【００２９】
次に、各慢性ストレス状態者より抽出したトータルRNAを5マイクログラムずつ取り出し、T7プロモータ配列を付加したオリゴ(dT)24プライマーをアニールさせ、まず、First strand DNA合成を行った。次に、このFirst strand DNAを鋳型にして、T7プロモータ配列を有するSecond strand DNAを合成した。最後にSecond strand DNAを鋳型にして、T7 RNA polymeraseによるRNA合成を行った。合成したRNA 6マイクログラムに対し、ランダムヘキサマーをアニールさせ逆転写酵素反応を行い、Cy5-dCTPを鎖中に取り込ませることで蛍光標識したcDNAを合成した。
【００３０】
健常コントロール者１３名から、慢性ストレス状態者の場合と同様に5 cc採血した後トータルRNAを抽出し、等量を混合してユニバーサルサンプルとした後、蛍光ラベルとしてCy5-dCTP の代わりにCy3-dCTPを用いた以外は同様の手順でcDNAを合成した。
【００３１】
比較解析を行う2種類のcDNAを等量混合した後、DNAチップ（日立製作所社製薬物応答解析用DNAチップ）にかけてハイブリダイゼーションを62℃で12時間行った。洗浄後、スキャナー（GSI-Lumonics社製 ScanArray 5000）により各スポットの蛍光強度を測定し、慢性ストレス状態者サンプルと健常者ユニバーサルサンプルの各遺伝子における発現量の比を求めた。
【００３２】
３．データ解析（慢性ストレスのマーカー遺伝子の選定）
解析対象とする遺伝子は、１８組のデータすべてにおいて蛍光強度が300以上である遺伝子群（１２３５個）とした。まず、慢性ストレス状態者／健常者ユニバーサル比較データにおいて、発現量が有意に増加もしくは減少している遺伝子を有意差検定（Bonferroni補正あり：doitall.pair：error rate＜０．０５）により抽出し、更に、変動が１．５倍以上の遺伝子を選び出した。健常者と比べ、慢性ストレス状態者において発現量が有意に増加している遺伝子は１４個、有意に減少している遺伝子が１０個であった。これらの遺伝子を表１に示す。これらの遺伝子は、被検者が慢性ストレス状態にあるか否かを評価するマーカー遺伝子として有用である。
【００３３】
【表１】
2007306883.tif 000003
【００３４】
〔実施例２〕被検者のマーカー遺伝子による慢性ストレスの評価
１．被検者
実施例１の１．１と同様に、医師国家試験１ヶ月前の３名（ここでは、慢性ストレス状態者とする）医師国家試験１２ヶ月前の３名（ここでは健常者とする）を被検者とした。６名の被検者は慢性ストレス状態者か健常者か分からないようにサンプル名をブラインドとし、被検者A, B, C, D, E, Fとした。
【００３５】
２．遺伝子発現解析
被検者より、PAXgene Blood RNA System（キアゲン社製）を用いて各々5 cc採血し、トータルRNAを抽出した。トータルRNAの収量は、5-10 マイクログラムであった。各被検者より抽出したトータルRNA 5マイクログラムに対して、T7プロモータ配列を付加したオリゴ(dT)24プライマーをアニールさせ、まず、First strand DNA合成を行った。次に、このFirst strand DNAを鋳型にして、T7プロモータ配列を有するSecond strand DNAを合成した。最後にSecond strand DNAを鋳型にして、T7 RNA polymeraseによるRNA合成を行った。RNA 6 マイクログラムに対し、ランダムヘキサマーをアニールさせて逆転写酵素反応を行い、Cy5-dCTPを鎖中に取り込ませることで蛍光標識したcDNAを合成した。
【００３６】
健常者のユニバーサルコントロールとしては実施例１と同じサンプルを用いた。それぞれの被検者サンプルから作製したCy5-cDNAと、ユニバーサルコントロールサンプルから作製したCy3-cDNAを6 マイクログラムずつ等量混合した後、DNAチップ（日立製作所社製  薬物応答解析用DNAチップ）にかけハイブリダイゼーションを62℃で12時間行った。洗浄後スキャナー（GSI-Lumonics社製 ScanArray 5000）により各スポットの蛍光強度を測定し、数値化ソフトウエア（GSI-Lumonics社製 QuantArray）を用いて各遺伝子におけるユニバーサルコントロールサンプルと各被検者サンプルとの発現強度比を求めた。
【００３７】
３．被検者の評価
上記６人の被検者を先に解析した慢性ストレス状態者／健常者ユニバーサル比較の１８名と合わせ、クラスタ間の重み無しコサイン係数距離による階層型クラスタリング法によりクラスタ解析を行ったところ、被検者B,D,Eは慢性ストレス状態者群に、被験者A, C, Fは健常者群に分類された。ブラインドしてあったサンプル名とクラスタリングの結果を照合すると、被験者B, D, Eは医師国家試験１ヶ月前の慢性ストレス状態者、被検者A, C, Fは医師国家試験１２ヶ月前の健常者であり、クラスタリングの結果と完全に合致することが確認された。
【００３８】
以上の結果より、表１に記載された特定遺伝子群の発現解析結果に基づく慢性ストレス状態の評価は、有効性が非常に高く、効用大なるものであることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明の方法は、臨床現場はもとより、職場や学校等の日常生活における慢性ストレスの客観的な評価方法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、本発明の慢性ストレスのＤＮＡチップを用いた検査システムの概念図である。図中、F1はDNAチップ、F2は本発明で選択された遺伝子に相当するプローブDNA、F3は励起光源及び蛍光検出器、F4は蛍光検出器制御コンピュータを表す。
【図２】図２は、本発明の慢性ストレスの評価システムの概念図である。図中、個人情報データベースには性、年齢等の情報管理が格納されている。
【図３】図３は、STAI尺度によりスコアー化した慢性ストレス状態者１８名の状態不安と健常者１３名の状態不安の平均値を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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