(57)【要約】【課題】  亜硝酸酸化細菌を培養する方法において、亜硝酸酸化細菌を長期にわたり安定に培養する。【解決手段】  亜硝酸酸化細菌を培養する方法であって、亜硝酸態窒素濃度として３００ｍｇ／Ｌ以上の亜硝酸とマグネシウムと鉄とマンガンとリン酸とを含有する液体培地を供するステップと、親株培養液として亜硝酸酸化細菌の培養液を供するステップと、前記親株培養液の少なくとも一部を新鮮な前記液体培地と混合するステップと、得られた混合液を培養するステップとを含む方法が提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
亜硝酸酸化細菌を培養する方法であって、
亜硝酸態窒素濃度として３００ｍｇ／Ｌ以上の亜硝酸とマグネシウムと鉄とマンガンとリン酸とを含有する液体培地を供するステップと、
親株培養液として亜硝酸酸化細菌の培養液を供するステップと、
前記親株培養液の少なくとも一部を新鮮な前記液体培地と混合するステップと、
得られた混合液を培養するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記培養するステップにより得られた培養液を新たな親株培養液として用いて、前記混合するステップと前記培養するステップとを繰り返す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培養するステップにおいて、前記培養するステップにより得られた培養液に新鮮な前記液体培地を連続的に添加するとともに、前記培養液の一部を連続的に除去する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記液体培地における前記亜硝酸の含有量が、亜硝酸態窒素濃度として３００〜１０００ｍｇ／Ｌである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記液体培地が、銅、カルシウム、モリブデン、コバルトおよび亜鉛からなる群から選ばれる少なくとも１つをさらに含有する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の方法における前記培養するステップにより得られた培養液。
【請求項７】
３００ｍｇ／Ｌ以上の亜硝酸とマグネシウムと鉄とマンガンとリン酸とを含有する、亜硝酸酸化細菌を培養するための液体培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、廃水、下水およびし尿処理設備において窒素処理で使用され、また、土壌、海水および河川水など自然界に広く分布する硝化細菌のうち、亜硝酸酸化細菌を培養する方法およびそれにより得られた培養液に関する。
【背景技術】
【０００２】
硝化細菌はアンモニアを亜硝酸塩に酸化するアンモニア酸化細菌と、亜硝酸塩を硝酸塩に酸化する亜硝酸酸化細菌の２つの細菌群からなる。これらの細菌は二酸化炭素を唯一の炭素源とする独立栄養細菌であり、一般的な従属栄養細菌と比べて増殖速度が遅く、一定の菌体量を得るには長時間を要する。そのため、下水、廃水プロセスや浄化装置等において、馴致期間の短縮や硝化能力の向上を図りたい場合には、硝化細菌の硝化、増殖速度を向上させる必要がある。
【０００３】
また、硝化細菌は種々の外乱（温度、ｐＨの変動、有害化学物質の混入等）に対して極めて弱いことが知られている。その特性を利用して、有害化学物質検知用バイオセンサが開発され（特許文献１：特公平7-85072号公報）、実用化されている。前記バイオセンサは溶存酸素電極と硝化細菌固定化膜から構成され、硝化細菌の呼吸速度を連続モニタリングし、検水中に有害化学物質が混入した時の硝化細菌の呼吸速度の低下率を基に有害化学物質の検知を行う。なお、硝化細菌固定化膜は、アルギン酸ゲルを用いて硝化細菌をセルロース膜上に包括固定化することにより作成することができる。
【０００４】
前記バイオセンサの性能を保証するため、硝化細菌固定化膜の品質を安定化させる保存方法が提案されている（特許文献２：特開2003-329667号公報）。しかしながら、当該技術においては、継代培養による硝化細菌の菌株保存状態に大きな変動の無いことが望ましい。
【０００５】
従来、微生物の保存法には継代培養法、凍結乾燥法、Ｌ−乾燥法などがあるが、硝化細菌については継代培養法が最も適した保存法であった。なお、継代培養法とは細菌を培地に植菌し、所定の温度で所定の期間培養した後（硝化細菌の場合は１週間程度）、得られた培養液の一部を新鮮な培地に再度植菌するという操作を繰り返すことによって菌株の保存を行う方法である。
【０００６】
【特許文献１】特公平7-85072号公報
【特許文献２】特開2003-329667号公報
【特許文献３】特許第3040507号公報
【特許文献４】特開2002-27976号公報
【非特許文献１】Aleem, M. I. H. and Alexander, M., J. Bacteriol., 76, 510-514 (1958), "Cell-free nitrification by Nitrobacter"
【非特許文献２】Tanaka, Y., Fukumori, Y. and Yamanaka, T., Purification of cytochrome a1c1 from Nitrobacter agilis and characterization of nitrite oxidation system of the bacterium, Arch. Microbiol., 135, p.265-271 (1983)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
一般に、微生物の継代培養法には、１）操作が煩雑で多くの労力を要する、２）遺伝的変異が起こりやすい、３）雑菌汚染の危険性が高い、といった問題点がある。特に硝化細菌の場合は、硝化、増殖速度が遅く、また外乱の影響も受けやすいことから、長期的に継代培養を行う場合、硝化、増殖速度の突発的あるいは経時的低下が起こりやすい。例えば、イオン交換水等の培地調製用の水の微妙な水質の違いによっても硝化、増殖速度が左右されてしまうことがある。
【０００８】
亜硝酸酸化細菌の代表菌株としてNitrobacterが挙げられるが、その継代培養用液体培地として、従来ＡＴＣＣ(American Type Culture Collection)や発酵研究所（ＩＦＯ）といった菌株保存機関の指定培地（表１．ａ，ｂ）や、AleemとAlexanderによって提案された培地など（表１．ｃ：非特許文献１、Aleem et al.）が用いられている。
【０００９】
【表１】
2007274968.tif 000002
【００１０】
しかしながら、実施例の欄で詳細に説明するように、前記菌株保存機関の指定液体培地を使用して継代培養を行った場合、品質保証の前提となるべき亜硝酸酸化細菌の培養状態にロット間でバラツキが見られたり、培養状態が次第に悪化し、継代培養が不可能となったりすることがあり、硝化菌固定化膜の品質保証が困難であった。原因として、前記培地組成は含有成分や濃度が最適でないことが考えられる。
【００１１】
また、特許文献３（特許第3040507号）において、亜硝酸酸化細菌の保存法が提案されている。当該技術においては、亜硝酸酸化細菌を凍結保存する際に、培地に各種有機酸を添加している。しかしながら、培地中の有機酸は雑菌の栄養源であることから、雑菌汚染のため純粋培養が継続できなくなる恐れがある。
【００１２】
本発明の目的は、特に保存のために、亜硝酸酸化細菌を培養する方法において、無機性液体培地の組成を改良して、亜硝酸酸化細菌を長期にわたり安定に培養することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の一の側面によると、亜硝酸酸化細菌を培養する方法であって、
亜硝酸態窒素濃度として３００ｍｇ／Ｌ以上の亜硝酸とマグネシウムと鉄とマンガンとリン酸とを含有する液体培地を供するステップと、
親株培養液として亜硝酸酸化細菌の培養液を供するステップと、
前記親株培養液の少なくとも一部を新鮮な前記液体培地と混合するステップと、
得られた混合液を培養するステップと
を含む方法が提供される。
【００１４】
本発明の他の側面によると、上記方法における前記培養するステップにより得られた培養液が提供される。
【００１５】
本発明の他の側面によると、３００ｍｇ／Ｌ以上の亜硝酸とマグネシウムと鉄とマンガンとリン酸とを含有する、亜硝酸酸化細菌を培養するための液体培地が提供される。
【発明の効果】
【００１６】
以下に詳細に説明するように、本発明によると、無機性液体培地を用いた培養による亜硝酸酸化細菌の長期保存が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。もっとも、本発明は、以下に説明する実施の形態によって限定されるものではない。
【００１８】
上記したように、本発明の一の側面によると、亜硝酸酸化細菌を培養する方法であって、
亜硝酸態窒素濃度として３００ｍｇ／Ｌ以上の亜硝酸とマグネシウムと鉄とマンガンとリン酸とを含有する液体培地を供するステップと、
親株培養液として亜硝酸酸化細菌の培養液を供するステップと、
前記親株培養液の少なくとも一部を新鮮な前記液体培地と混合するステップと、
得られた混合液を培養するステップと
を含む方法が提供される。
【００１９】
本発明にかかる培養方法は、実施例で後述するように、亜硝酸態窒素濃度として３００ｍｇ／Ｌ以上の亜硝酸とマグネシウムと鉄とマンガンとリン酸とを含有する液体培地を供するステップを含む。また、前記液体培地が、銅、カルシウム、モリブデン、コバルトおよび亜鉛からなる群から選ばれる少なくとも１つをさらに含有することが好ましい。
【００２０】
前記液体培地は水溶液であることが好ましい。また、当業者に明らかなように、本明細書において、液体培地が亜硝酸およびリン酸を含有するとは、液体培地が亜硝酸およびリン酸をイオンの状態で含有することを含む。すなわち、亜硝酸およびリン酸は、それらの塩として液体培地に添加することができる。具体的には、亜硝酸およびリン酸は、ナトリウム、カリウム等との塩として液体培地に添加することができる。
【００２１】
当業者に明らかなように、本明細書において、液体培地がマグネシウム等の金属を含有するとは、液体培地が当該金属を金属イオン、金属酸化物イオンその他の任意の状態で含有することを含む。当該金属は、その塩の状態で液体培地に添加することができる。具体的には、当該金属は、塩化物イオン等のハロゲン化物イオン、硝酸イオン、硫酸イオン等との塩として液体培地に添加することができる。また、当該金属は、当該金属の酸化物と適当な金属との塩（例えばＮａ2ＭｏＯ4）として液体培地に添加することができる。
【００２２】
前記液体培地における前記亜硝酸の含有量が、実施例で後述するように、亜硝酸態窒素濃度として３００ｍｇ／Ｌ以上であることが好ましく、３００〜１０００ｍｇ／Ｌ以上であることがさらに好ましく、４００ｍｇ／Ｌであることがさらに好ましい。理論に束縛されるべきではないが、亜硝酸は、亜硝酸酸化細菌の生育に必要なエネルギーを得るための成分（基質）であリ、培地が充分量の基質を有することで、菌の活性の低下や長期培養におけるバラツキを防ぐことができると考えられるためである。
【００２３】
なお、本明細書において、亜硝酸その他の成分の濃度は、特に断らない限り、新鮮な際の（すなわち、菌を培養する前の）培地における成分の濃度を意図する。また、亜硝酸の含有量は、亜硝酸態窒素濃度（単位容積あたりの、培地中の窒素のうち亜硝酸または亜硝酸イオンの状態で存在している窒素の重量）として表す。
【００２４】
また、前記液体培地のｐＨが、７．５〜８．０であることが好ましい。
【００２５】
本発明にかかる培養方法は、親株培養液として亜硝酸酸化細菌の培養液を供するステップをさらに含む。ここで、前記親株培養液が亜硝酸酸化細菌以外の菌を含まないことが好ましい。特に、前記親株培養液が前記亜硝酸酸化細菌の純粋培養液であることが好ましい。すなわち、前記亜硝酸酸化細菌が、単離された亜硝酸酸化細菌であることが好ましい。例えば、アンモニア酸化細菌と混合培要した場合、アンモニア酸化細菌の基質であるアンモニアが亜硝酸酸化細菌の生育に阻害作用を示すおそれがあるためである。
【００２６】
本発明にかかる培養方法においては、任意の亜硝酸酸化細菌を用いることができる。具体的には、亜硝酸酸化細菌の例には、ニトロバクター（Nitrobacter）属、ニトロコッカス（Nitrococcus）属、ニトロスピナ（Nitrospina）属に属する亜硝酸酸化細菌が含まれる。
【００２７】
本発明にかかる培養方法は、前記親株培養液の少なくとも一部を新鮮な前記液体培地と混合するステップと、得られた混合液を培養するステップとをさらに含む。ここで、本発明に置いて、亜硝酸酸化細菌の培養は、バッチ培養（継代培養）または連続培養のいずれでもよい。
【００２８】
バッチ培養を行う場合、前記培養するステップにより得られた培養液を新たな親株培養液として用いて、前記混合するステップと前記培養するステップとを繰り返すことが好ましい。
【００２９】
なお、親株培養液の少なくとも一部を新鮮な液体培地と混合する（植菌するとも記す。）際に、上記培養液は、以下の状態を満たすことが好ましい。すなわち、植菌する際に、培養液の個数濃度が、１．０×１０7個／ｍＬ以上であることが好ましい。植菌する際に、培養液は、対数増殖期または定常期の状態であることが好ましい。植菌する際に、培養液は、培養開始後（すなわち、親株培養液を新鮮な液体培地と混合した後）３〜７日であることが好ましく、４〜６日であることがさらに好ましい。培養液の個数濃度および培養令（菌体活性）が上記範囲外であると、生育不良の可能性が高くなるためである。また、亜硝酸酸化細菌の増殖速度を亜硝酸消費速度や菌体個数濃度の推移で判定し、培養令が対数増殖期〜定常期となるよう培養日数を調整することが可能であるが、バイオセンサで用いる亜硝酸酸化細菌固定化膜の製造工程を円滑に管理するためには、培養日数は上記範囲が好ましい。
【００３０】
また、植菌する際は、接種量（培養液の希釈率、すなわち新鮮な液体培地の体積に対する親株培養液の体積）は、５〜２０％であることが好ましく、１０％であることがさらに好ましい。親株培養液の個数濃度の多寡によって、接種量は調整可能であるが、バイオセンサで用いる亜硝酸酸化細菌固定化膜の製造工程を円滑に管理するためには１０％が好ましい。
【００３１】
培養は、以下の条件で行うことが好ましい。すなわち、培養温度は２５〜３０℃であることが好ましく、２８℃であることがさらに好ましい。生育の最適温度が２５〜３０℃、酵素反応速度が極大を示すのが２８℃であるためである。また、硝化細菌は酸素を用いて基質を酸化するため、好気的条件下で行われることが好ましい。通気方法は培養器静置、または回転振盪による培養液中への溶解や、ポンプによる空気供給のいずれでもよい。
【００３２】
連続培養を行う場合、前記培養するステップにおいて、前記培養するステップにより得られた培養液に新鮮な前記液体培地を連続的に添加するとともに、前記培養液の一部を連続的に除去することが好ましい。
【００３３】
なお、新鮮な前記液体培地を連続的に添加する速度と、前記培養液を連続的に除去する速度とは実質的に同一であることが好ましい。また、培養温度および通気方法は上記と同様であることが好ましい。
【００３４】
本発明の他の側面によると、前記培養するステップにより得られた培養液が提供される。上記したように、本発明により得られた培養液は、例えば、硝化細菌固定化膜の調製に好適に用いることができる。また、本発明により得られた培養液は、下排水中の亜硝酸処理製剤（固定化担体）に好適に用いることができる。
【００３５】
なお、特許文献４（特開2002-27976号公報）には、培養液中に残存する亜硝酸態窒素イオン濃度が５００ｍｇ／Ｌ以下で保存温度が０〜３０℃である条件下で硝化細菌を保存する技術が記載されている（要約等参照）。当該技術では、硝化細菌（アンモニア酸化細菌と亜硝酸酸化細菌との混合物）培養後残留阻害物としての亜硝酸濃度が５００ｍｇ／Ｌ以下とすることに特徴がある。一方で、本発明は、培養前添加基質としての亜硝酸態窒素を調整するものであり、上記文献に記載の技術とは本質的に異なるものである。
【実施例】
【００３６】
以下に、本発明の実施例を説明する。もっとも、本発明は、以下に説明する実施例によって限定されるものではない。
【００３７】
［比較例１、２］
亜硝酸酸化細菌の継代培養を以下の条件で行った。亜硝酸酸化細菌として、亜硝酸酸化細菌の代表菌株であるNitrobacter winogradskyi (ATCC25391)を用いた。また、培地として、ＡＴＣＣ指定培地（比較例１）またはＩＦＯ指定培地（比較例２）を用いた（表２参照）。ただし、両者の結果を比較するため、培地中の亜硝酸態窒素（基質）濃度をＩＦＯ指定培地の２００ｍｇ／Ｌ（亜硝酸ナトリウムとして１ｇ／Ｌ）に統一した。なお、培地調製用の水として、Millipore社製純水製造装置(Elix10)で製造した純水を用いた。当該純水の比抵抗はいずれの場合も１５ＭΩ以上であった。また、培地ｐＨ７．５、前培養液１０％接種、培養温度２８℃、培養日数７日間、培養周期２週間、静置条件で培養を行った。なお、亜硝酸酸化細菌の培養には高圧滅菌した培地を用い、操作は全て無菌的に行った。
【００３８】
図１にＡＴＣＣ指定培地を用いた場合（比較例１）、図２にＩＦＯ指定培地を用いた場合（比較例２）の継代培養状態の推移を示す。なお、亜硝酸酸化細菌の培養状態の良否は、培養液の亜硝酸消費量で判定した。培養液における亜硝酸態窒素濃度の測定はＪＩＳ  Ｋ  ０１０１（工業用水試験法３７．１．１ナフチルエチレンジアミン吸光光度法）に従って行った。
【００３９】
図１に示す通り、ＡＴＣＣ指定培地の場合（比較例１）、継代５回目において培養初期の亜硝酸消費速度が低下し、継代６回目では全亜硝酸消費量が大幅に減少し、継代７回目では亜硝酸を殆ど消費せず、継代培養が不可能な状態になった。また、このように継代培養状態が経時的に悪化する現象は再現性が見られた。
【００４０】
図２に示す通り、ＩＦＯ指定培地の場合（比較例２）、ＡＴＣＣ培地とは異なり、継代培養が不可能な状態にはならなかった。しかしながら、ロット間で亜硝酸消費量にバラツキが見られ（全亜硝酸消費量の変動係数２８．７％）、安定した継代培養を行うことができなかった。なお、全亜硝酸消費量の変動係数は、以下の（１）式のように算出した。
【００４１】
【数１】
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ここで、Ｃvは全亜硝酸消費量の変動係数、χは、全亜硝酸消費量、ｎは継代培養回数である。そして、上記の計算においては、χが１９４，１９９，９８，１２９，１１０，２００，２００，１２７ｍｇ／Ｌでｎが８であり、これを計算すると標準偏差が４５．０５ｍｇ／Ｌ、平均値が１５７．１３ｍｇ／Ｌとなることから、Ｃvは２８．７％となる。
【００４２】
以上の結果から、亜硝酸以外のＡＴＣＣ指定培地とＩＦＯ指定培地との共通する成分（リン酸、マグネシウム、鉄、マンガン）が生育のために必須であり、ＡＴＣＣ指定培地は上記成分の濃度不足のため、継代培養が不可能となったと考えられる。
【００４３】
［実施例１］
本発明者等は、基質濃度不足が、上記ＩＦＯ指定培地を用いた継代培養におけるバラツキ原因の一つであると考えた。そこで、ＩＦＯ指定培地の基質濃度を３００ｍｇ／Ｌ（亜硝酸ナトリウムとして１．５ｇ／Ｌ）に増量し、その他は比較例２と同様の条件で、継代培養を行った。
【００４４】
図３に実施例１にかかる培地（ＩＦＯ指定培地の基質濃度を３００ｍｇ／Ｌに変更したもの）を用いた場合の継代培養状態の推移を示す。この時の全亜硝酸消費量の変動係数は５．７％であった。このように、基質濃度２００ｍｇ／Ｌの場合（比較例２）と比較して安定した継代培養を行うことができた。ここから、亜硝酸酸化細菌の培養に際しては、基質濃度は３００ｍｇ／Ｌ以上が適していることが分かった。しかし、継代５，１１，１９回目のように、全亜硝酸消費量が時折低下する場合があった。原因として、基質以外の要因、すなわち亜硝酸酸化細菌の酵素活性および代謝活性を増進するための成分が最適でないことが考えられる。
【００４５】
［実施例２］
表２に記載のＡＴＣＣ指定培地とＩＦＯ指定培地の組成を比較すると、亜硝酸酸化細菌の酵素活性および代謝活性を増進するための成分として、ＡＴＣＣ指定培地はマグネシウム、鉄、銅、マンガン、カルシウム、モリブデン、コバルト、亜鉛、リン酸の９成分を含有していることが分かる。一方、ＩＦＯ指定培地はマグネシウム、鉄、マンガン、リン酸の４成分を含有し、ＡＴＣＣ指定培地で含有している銅、カルシウム、モリブデン、コバルト、亜鉛を含有していない。また、各共通成分の濃度も異なっており、特に、菌中の亜硝酸を酸化する酵素の酵素活性を増進する効果が大きいことが報告されているマンガンについては（非特許文献２：Tanaka et al.）、ＩＦＯ指定培地はＡＴＣＣ指定培地の約１６倍のマンガンを含有している。
【００４６】
そこで、ＡＴＣＣ指定培地の前記９成分を全て含有し、ＡＴＣＣ指定培地とＩＦＯ指定培地に共通する４成分についてはＩＦＯ培地組成と同一の濃度である培地（表２参照）を用い、その他は比較例２と同様の条件で、継代培養を行った。ただし、培地中の基質濃度は３００ｍｇ／Ｌ（亜硝酸ナトリウムとして１．５ｇ／Ｌ）とした。
【００４７】
図４に本発明の実施例２にかかる培地を用いた場合の継代培養状態の推移を示す。継代１〜１６回目の全ての場合において、全亜硝酸消費量は３００ｍｇ／Ｌであり、安定した継代培養を行うことができた。また、培養４日目までの亜硝酸消費量に着目すると１６ロット中、１４ロットで３００ｍｇ／Ｌであり、培養期間の半ばで全ての基質を消費する程の高活性であった。
【００４８】
実施例１および実施例２の結果を比較すると、ＡＴＣＣ指定培地のみに含有される銅、カルシウム、モリブデン、コバルト、亜鉛は、生育に必須ではないが、酵素反応および代謝を活性化させ、継代培養を安定化させる作用があることが分かった。
【００４９】
［実施例３］
上記したように、基質のない状態で培養を継続すると、菌の活性が低下する可能性があると考えられる。このため、本発明の培地組成では基質濃度を３００ｍｇ／Ｌよりも更に高い濃度に設定した方が好ましいと考えられる。そこで、基質濃度を４００ｍｇ／Ｌ（亜硝酸ナトリウムとして２ｇ／Ｌ）とし、その他は実施例２と同様の条件で、継代培養を行った。
【００５０】
図５に本発明の実施例３にかかる培地（基質濃度４００ｍｇ／Ｌ）を用いた場合の継代培養状態の推移を示す。継代１〜１１回目の全ての場合において、全亜硝酸消費量は４００ｍｇ／Ｌであり、安定した継代培養を行うことができた。また、培養４日目までの亜硝酸消費量に着目すると１１ロット中、７ロットで４００ｍｇ／Ｌであり、培養期間の半ばで全ての基質を消費する程の高活性であった。
【００５１】
［実施例４］
さらに、親株培養液を共通とし、培地の基質濃度を４００、６００、８００、１０００ｍｇ／Ｌの４条件とし、その他は実施例２と同様の条件で２回培養を行った時の平均亜硝酸消費速度を比較した。図７にその結果を示す。基質濃度が高くなるほど、平均亜硝酸消費速度が低下したことから、基質濃度は４００ｍｇ／Ｌが最適であることが分かった。基質濃度が高くなりすぎると、誘導期が長くなる、すなわち培養初期の増殖速度が低下するためと考えられる。
【００５２】
【表２】
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【００５３】
表３に、比較例２および実施例１〜３における、培養１，４，７日目それぞれにおける亜硝酸消費量平均値および培養４日目までの平均亜硝酸消費速度を示す。また、図６に、比較例２および実施例１〜３における、培養１，４，７日目それぞれにおける亜硝酸消費量平均値を示す。比較例２＜実施例１＜実施例２＜実施例３の順に平均亜硝酸消費速度が大きくなったことから、基質濃度および他の必須成分を最適化することにより、亜硝酸酸化細菌の活性を増進させることができたことが分かる。
【００５４】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】ＡＴＣＣ指定培地（基質濃度２００ｍｇ／Ｌ）使用時の亜硝酸酸化細菌の亜硝酸消費量の推移を示す。
【図２】ＩＦＯ指定培地使用時の亜硝酸酸化細菌の亜硝酸消費量の推移を示す。
【図３】本発明の実施例１にかかる培地（ＩＦＯ指定培地の基質濃度を３００ｍｇ／Ｌに変更したもの）使用時の亜硝酸酸化細菌の亜硝酸消費量の推移を示す。
【図４】本発明の実施例２にかかる培地（基質濃度３００ｍｇ／Ｌ）使用時の亜硝酸酸化細菌の亜硝酸消費量の推移を示す。
【図５】本発明の実施例３にかかる培地（基質濃度４００ｍｇ／Ｌ）使用時の亜硝酸酸化細菌の亜硝酸消費量の推移を示す。
【図６】比較例２および実施例１〜３における平均亜硝酸消費量を示す。
【図７】実施例３における平均亜硝酸消費速度を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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