(57)【要約】【課題】  同所移植肺癌モデル動物を作製するための簡便でかつ再現性のある技法を提供すること。【解決手段】  肺癌細胞が生着している非ヒト動物を作製する方法であって、免疫力が低下した非ヒト動物を用意する工程、非ヒト動物の気管を露出する工程、及び肺癌細胞を気管内へ注入する工程を含む前記方法。この方法で作製され、肺癌細胞が生着している非ヒト動物。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺癌細胞が生着している非ヒト動物を作製する方法であって、
免疫力が低下した非ヒト動物を用意する工程、
非ヒト動物の気管を露出する工程、及び
肺癌細胞を気管内へ注入する工程
を含む前記方法。
【請求項２】
肺癌細胞をエチレンジアミン四酢酸と混合して、気管内へ注入する請求項１記載の方法。
【請求項３】
免疫力が低下した非ヒト動物がヌードマウスである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
肺癌細胞が、小細胞肺癌細胞又は非小細胞肺癌細胞である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
肺癌細胞がヒト由来である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
非ヒト動物１匹当たり107個〜108個の肺癌細胞を非ヒト動物の気管内へ注入する請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
肺、気管及び気管支樹からなる群より選択される少なくとも１つの器官に肺癌細胞が生着している非ヒト動物を作製する請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の方法で作製され、肺癌細胞が生着している非ヒト動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺癌移植モデル動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺癌は、世界で最も多くみられる悪性腫瘍である。アメリカ合衆国では、2002年に約170,000人の肺癌症例が診断され、うち、女性は80,000人、男性は90,000人であった（非特許文献1）。日本では、肺癌は、2001年の女性における癌に関連する死因の12.7％、男性における癌に関連する死因の22％であった（非特許文献2）。さらに、肺癌の治療後に生存していたのは、患者の14.9％以下であった。肺癌患者の予後が思わしくないのは、この癌の生物学的性質が侵襲性であること、ならびに早期の検出手順や治療が有効でないことを反映していることは、一般に認識されている。
【０００３】
in vivoモデルから肺癌の有効な治療薬を開発すべく尽力されてきた。例えば、ヒト小細胞肺癌（SCLC）の同所移植モデルによれば、シスプラチンに対しては感受性であり、マイトマイシンCに対しては抵抗性であることが実証され、このことは臨床における現状を反映している。これに対して、皮下移植した同じ腫瘍の異種移植片は、マイトマイシンCには応答したが、シスプラチンには応答せず、したがって、SCLCの臨床的挙動とは一致しなかった（非特許文献3）。Pagetsの「種子と土（seed and soil）」理論（非特許文献4）により最初に記載され、他の研究者（非特許文献5，6）によって確認されているように、器官の微小環境は、腫瘍細胞の表現型および化学療法に対する感受性に影響を及ぼすことがある。したがって、肺癌研究のために臨床的特徴をシミュレートする、臨床的に適切なin vivoモデルを確立することが非常に重要である。
【０００４】
齧歯類において肺癌の同所移植モデルが幾つか開発されている。例としては、ヒト癌組織の直接移植（非特許文献7）、ならびに齧歯類の気道（非特許文献8，9）、胸膜腔（非特許文献10，11）または皮膚切開後（非特許文献12）もしくは開胸後（非特許文献13，14）の肺実質への腫瘍細胞の注入が挙げられる。しかし、これらのモデルにおいて移植を行う技術は複雑なので、それらの使用を広く普及させるには限界があった。肺癌の新規な診断方法および治療薬の研究開発の多くは、今もなお皮下腫瘍モデルに依存しているが、これらのモデルは臨床的にそれほど適切ではない場合がある。
【０００５】
【非特許文献１】American Cancer Society. Cancer facts and figures 2002. Atlanta GA: American Cancer Society, 2002.
【非特許文献２】Vital statistics of Japan, Statistics and Information Dept., Minister’s Secretarial, Ministry of Health, Labor and Welfare, 2001
【非特許文献３】Kuo TH, Kubota T, Watanabe M, Furukawa T, Kase S, Tanino H, Saikawa Y, Ishibiki K, Kitajima M, Hoffman RM. Site-specific chemosensitivity of human small-cell lung carcinoma growing orthotopically compared to subcutaneously in SCID mice: the importance of orthotopic models to obtain relevant drug evaluation data. Anticancer Res 1993;13:627-30
【非特許文献４】Paget S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer Metastasis Rev 1989;8:98-101
【非特許文献５】Wilmanns C, Fan D, O'Brian CA, Bucana CD, Fidler IJ. Orthotopic and ectopic organ environments differentially influence the sensitivity of murine colon carcinoma cells to doxorubicin and 5-fluorouracil. Int J Cancer 1992;52:98-104
【非特許文献６】Fidler IJ, Wilmanns C, Staroselsky A, Radinsky R, Dong Z, Fan D. Modulation of tumor cell response to chemotherapy by the organ environment. Cancer Metastasis Rev 1994;13:209-22
【非特許文献７】Hoffman RM, Orthotopic metastatic mouse models for anticancer drug discovery and evaluation: a bridge to the clinic. Invest New Drugs 1999;17:343-59
【非特許文献８】McLemore TL, Liu MC, Blacker PC, Gregg M, Alley MC, Abbott BJ, Shoemaker RH, Bohlman ME, Litterst CC, Hubbard WC, Brennan RH, McMahon JB, Fine DL, Eggleston JC, Mayo JG, and Boyd MR. Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice. Cancer Res 1987;47:5132-40
【非特許文献９】Howard RB, Chu H, Zeligman BE, Marcell T, Bunn PA, McLemore TL, Mulvin DW, Cowen ME, Johnston MR. Irradiated nude rat model for orthotopic human lung cancers. Cancer Res 1991;51:3274-80
【非特許文献１０】McLemore TL, Eggleston JC, Shoemaker RH, Abbott BJ, Bohlman ME, Liu MC, Fine DL, Mayo JG, Boyd MR. Comparison of intrapulmonary, percutaneous intrathoracic, and subcutaneous models for the propagation of human pulmonary and nonpulmonary cancer cell lines in athymic nude mice. Cancer Res 1988;48:2880-6
【非特許文献１１】Kraus-Berthier L, Jan M, Guilbaud N, Naze M, Pierre A, Atassi G. Histology and sensitivity to anticancer drugs of two human non-small cell lung carcinomas implanted in the pleural cavity of nude mice. Clin Cancer Res 2000;6:297-304
【非特許文献１２】Doki Y, Murakami K, Yamaura T, Sugiyama S, Misaki T, Saiki I. Mediastinal lymph node metastasis model by orthotopic intrapulmonary implantation of Lewis lung carcinoma cells in mice. Br J Cancer 1999;79:1121-6
【非特許文献１３】Wang HY, Ross HM, Ng B, Burt ME. Establishment of an experimental intrapulmonary tumor nodule model. Ann Thorac Surg 1997;64:216-9
【非特許文献１４】Miyoshi T, Kondo K, Ishikura H, Kinoshita H, Matsumori Y, Monden Y. SCID mouse lymphogenous metastatic model of human lung cancer constructed using orthotopic inoculation of cancer cells. Anticancer Res 2000;20:161-3
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、同所移植肺癌モデル動物を作製するための簡便でかつ再現性のある技法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ヒト肺癌の臨床的特徴に非常に類似したヌードマウスにおける同所腫瘍移植モデルを確立した。ヒト肺腺癌A549細胞系および扁平上皮癌SQ5細胞系を用いた。0.01Mのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を同時投与しながら、または同時投与せずに、無血清培地に懸濁させた腫瘍細胞を、麻酔した無胸腺ヌードマウス（７〜９週齢）の主気管支に直接注入した。いくつかの実験では、皮下移植した腫瘍から得た肺癌細胞を再培養し、気管内移植に用いた。肺で形成された腫瘍小結節を計数し、組織学的検査により確認した。A549細胞をEDTAと共に投与すると、生着率は70％になった（n＝10）。EDTAを用いずに再培養したA549細胞、またはEDTAと共に再培養したA549細胞の生着率は、それぞれ20％（n＝５）および80％（n＝５）であった。SQ5細胞をEDTAを用いずに投与した場合、またはEDTAと共に投与した場合の生着率は、それぞれ50％（n＝４）および67％（n＝６）であった。再培養したSQ5細胞をEDTAと共に投与すると、生着率が100％（n＝６）までさらに増大した。多数の腫瘍が、主に左肺および右肺上葉に形成された。EDTAを同時投与すると、より多数の腫瘍小結節が肺に生じた。組織学的所見から、A549腫瘍小結節が主に肺胞に分布していることが明らかになった。SQ5固形腫瘍は細気管支に浸潤し、肺胞を満たした。この再現性のある同所移植モデルは、ヒト肺癌の臨床的特徴をシミュレートする腫瘍増殖をもたらした。本発明は、これらの知見に基づいて完成された。
【０００８】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）肺癌細胞が生着している非ヒト動物を作製する方法であって、
免疫力が低下した非ヒト動物を用意する工程、
非ヒト動物の気管を露出する工程、及び
肺癌細胞を気管内へ注入する工程
を含む前記方法。
（２）肺癌細胞をエチレンジアミン四酢酸と混合して、気管内へ注入する（１）記載の方法。
（３）免疫力が低下した非ヒト動物がヌードマウスである（１）又は（２）に記載の方法。
（４）肺癌細胞が、小細胞肺癌細胞又は非小細胞肺癌細胞である（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）肺癌細胞がヒト由来である（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）非ヒト動物１匹当たり107個〜108個の肺癌細胞を非ヒト動物の気管内へ注入する（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）肺、気管及び気管支樹からなる群より選択される少なくとも１つの器官に肺癌細胞が生着している非ヒト動物を作製する（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）（１）〜（７）のいずれかに記載の方法で作製され、肺癌細胞が生着している非ヒト動物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、再現性のある技法を用いて新規な同所移植ヒト肺癌モデルが開発された。
本発明のモデルは、in vivoでのヒト肺癌の生物学的挙動および治療の研究に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
本発明は、肺癌細胞が生着している非ヒト動物を作製する方法であって、免疫力が低下した非ヒト動物を用意する工程、非ヒト動物の気管を露出する工程、及び肺癌細胞を気管内へ注入する工程を含む前記方法を提供する。
【００１１】
まず、免疫力が低下した非ヒト動物を用意する。非ヒト動物は、肺癌細胞が生着可能な程度に免疫力が低下しているとよい。免疫力が低下した非ヒト動物としては、種々の免疫不全動物（例えば、ヌードマウス、ヌードラット、スキッドマウス、ALYマウスなど）が市販されており、利用することができる。さらに、免疫力を低下させるために、非ヒト動物にＸ線などの放射線を照射してもよい。
【００１２】
用意する非ヒト動物は成体であるとよく、例えば、マウスの場合には、７〜９週令であるとよく、ラットの場合には、８〜１０週令であるとよい。非ヒト動物は、免疫力低下の度合いに応じて、感染を防御した環境下で飼育されるとよい。感染防御の目的で、非ヒト動物に抗生剤を投与してもよい。
【００１３】
次に、非ヒト動物の気管を露出する。例えば、免疫力が低下した非ヒト動物を麻酔し、仰向けにした後、台の上に固定し、頸部の皮膚をメスなどで切開することにより、気管を露出させることができる。
次いで、露出した気管の内腔に肺癌細胞を注入する。例えば、注射針を装着した注射筒を用いて、気管内に肺癌細胞を注入することができる。肺癌細胞は気管のどの位置で注入されてもよいが、好ましくは、上から１／３くらいの位置で注入される。
【００１４】
肺癌細胞としては、小細胞肺癌細胞、非小細胞肺癌細胞（例えば、肺腺癌細胞、肺扁平上皮癌細胞等）などを挙げることができる。肺癌細胞はヒト由来のものであるとよい。ヒト由来の肺癌細胞としては、ヒト小細胞肺癌細胞、ヒト非小細胞肺癌細胞（例えば、肺腺癌細胞系A549PC14, PC9、肺扁平上皮細胞系SQ5、Ma44, NCI-H226 等）などを挙げることができる。肺癌細胞は、動物の腫瘍から採取したものであっても、それを継代培養したものであってもよい。あるいはまた、継代培養した肺癌細胞を皮下移植した動物から腫瘍を採取し、それを再度継代培養したものでもよい。
非ヒト動物１匹当たり107個〜108個の肺癌細胞を非ヒト動物の気管内へ注入するとよい。
【００１５】
肺癌細胞は、無血清培地（例えば、αMEM, RPMI1640等）やPBSなどに懸濁させてから、非ヒト動物の気管内に注入するとよい。肺癌細胞懸濁液をマウスに注入する場合には、肺癌細胞懸濁液の容量は100 μl以下であるとよく、好ましくは30μl〜50μlである。他の非ヒト動物に注入する場合には、動物の体重に基づいて、上記の値から肺癌細胞懸濁液の容量を換算するとよいであろう。注入に用いる肺癌細胞懸濁液は、肺癌細胞の生存率が90％以上のものであるとよく、好ましくは肺癌細胞の生存率が９５％を超えるものである。肺癌細胞の生存率は、Trypan blue dye exclusionにより、測定することができる。簡単に説明すると、細胞液とTrypan blue液を混ぜる。Trypan blueの終濃度は0.02%である。顕微鏡で細胞を観察し、青く染色される細胞は死細胞とする。トータル５００個以上細胞を数えて、細胞の生存率を計算する。
【００１６】
肺癌細胞懸濁液には、エチレンジアミン四酢酸を添加するとよい。エチレンジアミン四酢酸を添加することにより、レシピエントにおける肺癌細胞の生着率が上昇する。エチレンジアミン四酢酸は、0.01〜0.02 Mの濃度で添加するとよく、好ましくは、0.01 Mの濃度で添加する。
肺癌細胞を気管内に注入した後、非ヒト動物を適当な期間飼育すると、肺癌細胞の生着を確認することができる。肺癌細胞は、肺（例えば、左肺、右肺の上葉、中葉、下葉、後葉）、気管（肺癌細胞を注入する部位の気管）、気管支樹などの器官に生着しうる。例えば、マウスの気管内に肺癌細胞を注入した場合、４週間以上経つと肺組織に腫瘍の生着を肉眼で確認できる。肺癌細胞の生着は、腫瘍小結節の数を肉眼観察で計数したり、胸内器官をパラフィンに包埋した後、5 μm厚さの切片にスライスし、この切片をヘマトキシリン-エオシン染色することにより観察することができる。
【００１７】
本発明は、上記の方法で作製され、肺癌細胞が生着している非ヒト動物も提供する。本発明の非ヒト動物において、肺癌細胞はそれらの元来の特性を反映する適切な部位で増殖しうる。
本発明の方法により作製された、肺癌細胞が生着している非ヒト動物を用いることにより、癌治療薬の開発、治療効果の検証、担癌正常肺組織の癌治療による副作用の検証、肺癌を検出及びイメジングする試薬の開発などが可能となる。
【実施例】
【００１８】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１９】
〔実施例1〕
材料および方法
細胞培養および送達用調製
ヒト肺腺癌細胞系A549は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）の細胞系リポジトリから入手した。ヒト肺扁平上皮癌細胞系SQ5は、茨城県立医療大学のKubota博士から提供していただいた。両者の細胞系は、L-グルタミンを含有し、10％熱不活性化ウシ胎児血清（Equitech-Bio Inc., Kerrville, TX）、50ユニット/mlのペニシリンおよび50μg/mlのストレプトマイシンを補充したαMEM培地（Sigma, St. Louis, MO）中で維持した。細胞は、加湿インキュベーター内で37°Cおよび５％CO2にて指数増殖期で維持した。0.25％トリプシン／0.02％EDTAにさっと暴露することによって、接着性の腫瘍細胞をコンフルエントに達する直前の培養物から収集した。トリプシン処理は、10％の血清を含有する培地を用いて停止させ、細胞を１回洗浄し、無血清培地に再懸濁させた。トリパンブルー染色を用いて、細胞の生存率を評価し、生存率が95％を超える単一細胞懸濁物のみを注入に用いた。
幾つかの実験では、気管内送達を行う直前に、腫瘍細胞懸濁物にエチレンジアミン四酢酸（EDTA, 0.01M, Sigma）を補充した。このEDTAの濃度は、本発明者らの研究においても、また他の研究者らの研究においても、腫瘍細胞およびマウスにより十分に許容されるものであった（March TH, Marron-Terada PG, Belinsky SA. Refinement of an orthotopic lung cancer model in the nude rat. Vet Pathol 2001;38:483-90）。
【００２０】
実験動物
病原体を持たない雌性BALB/c nu/nuマウス（チャールスリバー, 日本国，東京）を、７〜９週齢において、A549細胞系またはSQ5細胞系を気管内または皮下で異種移植した。マウスを特に病原体を持たない条件下で維持し、オートクレーブ処理した食餌と水を与え、厳密に無菌の条件下で取り扱った。この研究の開始前１週間にわたり、マウスを順化させた。
【００２１】
腫瘍細胞の気管内および皮下移植
マウスをイソフルラン（メルク・ホエイ, 日本国, 大阪）で麻酔し、仰向けにし、テープでそっと固定した。頸部の皮膚から１cm長の腹部切開を行って、気管を露出させた。27-3/4ゲージの針（テルモ, 日本国, 東京）を約135°の角度に傾け、これを用いて腫瘍細胞懸濁物を各種の容量および濃度で主気管支に直接注入した（図１）。切開部を１個の外科用クリップで閉じ、マウスを完全に目覚めるまで暖かいランプ下で回復時間に供した（Terry NH, Brinkley J, Doig AJ, Ma J, Patel N, White RA, Mahajan N, Kang Y. Cellular kinetics of murine lung: model system to determine basis for radioprotection with keratinocyte growth factor. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2004;58:435-44）。皮下移植の場合は、麻酔していないマウスの脇腹に、100 μlの腫瘍懸濁物（１×107個）を直接注入した。
【００２２】
腫瘍形成性の増大に関する細胞系のin vivo選定
上記の皮下注入技術では、A549細胞およびSQ5細胞をヌードマウスの脇腹に注入した。腫瘍がそれぞれ６〜10mm（直径）になったらマウスを屠殺した。腫瘍を無菌的に収集し、ハサミで細かく切り刻み、１〜２継代にわたって培養した。この再培養した細胞を気管内注入に用いた。
【００２３】
臨床的評価および組織病理学
腫瘍細胞の注入後、マウスを毎日観察し、創傷治癒の障害の兆候、腫瘍発生の証拠、および身体活動の低下についてモニターした。マウスの体重を週に２回計測した。マウスは、瀕死状態になるか８週間後に屠殺した。全ての動物について剖検を行った。胸内器官を摘出し、中性緩衝ホルマリン中で少なくとも24時間固定した。それぞれの肺における腫瘍小結節の数を肉眼観察により計数した。次に、組織学的に調べるために、これらの胸内器官をパラフィンに包埋した。５μm厚の切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
【００２４】
増殖曲線および倍加時間
細胞（１×105個）を６cmのシャーレに接種した。１日毎に、サンプルをそれぞれ３つずつ収集し、コールターカウンター（Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA）で計数した。細胞数を各時間間隔について平均した。指数増殖期の細胞から倍加時間を算出した。
【００２５】
結果
腫瘍懸濁物を気管内送達するための適切な容量および技法
本発明者らのパイロット実験において、マウスは、２×107〜２×108個/mlの濃度の腫瘍細胞懸濁物30 μl〜50 μlの気管内送達を許容したが、100μlの腫瘍細胞懸濁物はほとんど許容しなかった（データは示さず）。上記の実験は全て、50μlの気管内注入容量で行った。
この腫瘍移植モデルでは、気管を容易に露出させることができ、腫瘍細胞懸濁物は正確に主気管支に注入された。全50匹のマウスのうち、麻酔中に死亡したのは１匹だけであった。手術中または手術直後に死亡したマウスはいなかった。マウスにおいて、それぞれの手術創は３日以内に治癒し、感染は全く起こらなかった。
【００２６】
A549細胞の腫瘍形成性
気管内腫瘍移植の15週間後までは、６×105個または３×106個のA549細胞を注入しても、目に見える腫瘍は形成されなかった（n＝５）。高い腫瘍形成性を得るために、ヌードマウス内でのin vivo皮下継代から得たA549細胞を選定した。それらを皮下腫瘍から収集してin vitroで１回継代した後、高投与量（１×107個）の再培養A549細胞をヌードマウスに気管内注入した。同所腫瘍発生の発生率は、移植の60日後には20％（n＝５）であった（表１）。本実験におけるこの低い腫瘍形成性は、癌細胞の投与量を増加させるには限界があり、不十分であることが示唆された。
腫瘍細胞の増殖にとってより良好な環境を作るために、EDTAを同時投与した。これは、肺実質の上皮層および／またはサーファクタント層をわずかに破壊する可能性がある。A549細胞または再培養A549細胞（１×107個）を0.01MのEDTAと共に、各群５〜10匹のマウスに気管内注入した。EDTAを同時投与した場合、A549細胞では70％（n＝10）、再培養A549細胞では80％（n＝５）において腫瘍形成を誘発した（表１）。１つの肺当たりの腫瘍小結節の平均個数は、EDTAを用いずに再培養A549細胞を投与したマウスでは２個、EDTAと共に再培養A549細胞を投与したマウスでは16個であった（表２）。マウスは、瀕死状態になる２〜３日前に体重が減少した。体重変化は、肺における腫瘍増殖の早期検出の感知性のパラメーターではなかった。
【００２７】
SQ5細胞の腫瘍形成性
１×107個のSQ5細胞を注入したところ、移植の42日後の腫瘍形成性は50％であった（n＝４）。0.01MのEDTAを同時投与すると、SQ5細胞では腫瘍形成性は67％となり、再培養SQ5細胞では腫瘍形成性は100％となった（n＝６）（表１）。SQ5細胞をEDTAと共に投与すると、１つの肺当たりの腫瘍小結節の平均個数は２個から４個へと増大を示した（表２）。
このモデルにおいて、A549細胞またはSQ5細胞のいずれかを移植したマウスの肺は、胸膜壁と接着せず、胸膜腔に浸出液は見られなかった。EDTAを同時投与したか否かに関係なく、主に左肺および右肺上葉に多数の腫瘍小結節が形成された（図２、表２）。
【００２８】
組織学
組織学的試験から、A549腫瘍細胞が主に肺胞壁に浸潤し、肺胞に分布することが示された（図3A、B）。このA549の結節性異種移植片は非常に数が多く、大きさも様々であり、主に肺葉の周縁部で増殖した（図3B）。腺癌由来であるA549腫瘍は、部分的に不完全な腺構造を示した（図3C）。腫瘍塊の中心部分には壊死が見られた。正常な肺組織および血管は、腫瘍塊によって押し縮められていた（図3C）。
組織学的試験から、SQ5腫瘍が、本来は細気管支の壁面および終末細気管支に浸潤する固形の肺扁平上皮癌として増殖することが確認された（図4A、B）。腫瘍は、比較的はっきり区別できる境界線を有しているように見えた。細気管支は腫瘍によって押し縮められていた（図4C）。大きな塊の中心にある壊死は一般的なものであった（図4C）。結節性の異種移植片の数は多く、大きさは様々であり、肺葉の中心領域と周縁部との双方に散在していた。また、組織学的試験から、SQ5細胞が転移して縦隔リンパ節へと浸潤していることも示された（図4D）。
顕微鏡観察による正常な肺組織はEDTAを投与したか否かに関係なく差異は示されなかった。またEDTAを投与したか否かに関係なく、A549またはSQ5のいずれかを移植したマウスにおいて肺組織に生着した腫瘍の分布に差異は示されなかった。
【００２９】
腫瘍細胞系の増殖曲線および倍加時間
再培養した細胞は、元の培養細胞よりも高い腫瘍形成性を有していた。ここで、元の培養細胞および再培養細胞について増殖曲線を作成して、in vitroにおける腫瘍細胞の増殖を測定した。倍加時間は、指数増殖中の細胞から算出した。A549細胞およびSQ5細胞の双方において、元の培養細胞の増殖曲線は、再培養細胞のものとほぼ同じであった（データは示さず）。A549細胞および再培養A549細胞の倍加時間は、それぞれ19.2±0.68時間および17.7±0.33時間（平均±SE）であった。SQ5細胞および再培養SQ5細胞の倍加時間は、それぞれ20.8±0.5時間および20.8±0.13時間（平均±SE）であった。いずれの細胞系においても、元の培養細胞の倍加時間は、再培養した細胞と比較して有意な差異は見られなかった。
【表１】
2007274950.tif 000002
【表２】
2007274950.tif 000003
考察
本研究の目的は、ヒト肺癌の臨床的特徴をシミュレートする、再現性のある同所移植モデルを開発することであった。同所腫瘍誘発を促進して、新規な肺癌生物学および治療剤の評価に適する本モデルを作製した。
【００３０】
現在まで、ヒト肺癌を研究するために、幾つかの齧歯類同所移植モデルが開発されてきた。ヒト肺癌の同所治療モデルは、最初は気管支内技法によって開発された(McLemore TL, Liu MC, Blacker PC, Gregg M, Alley MC, Abbott BJ, Shoemaker RH, Bohlman ME, Litterst CC, Hubbard WC, Brennan RH, McMahon JB, Fine DL, Eggleston JC, Mayo JG, and Boyd MR. Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice. Cancer Res 1987;47:5132-40)。ヒト肺癌のフラクションも手術によって同所移植することができる(Hoffman RM, Orthotopic metastatic mouse models for anticancer drug discovery and evaluation: a bridge to the clinic. Invest New Drugs 1999;17:343-59)。その方法では、局所部位における高い腫瘍増殖と、もう一方の肺、リンパ節、および他の臨床的に関連する部位への転移が起こった（Hoffman RM, Orthotopic metastatic mouse models for anticancer drug discovery and evaluation: a bridge to the clinic. Invest New Drugs 1999;17:343-59; Wang X, Fu X, Kubota T, Hoffman RM. A new patient-like metastatic model of human small-cell lung cancer constructed orthotopically with intact tissue via thoracotomy in nude mice. Anticancer Res. 1992;12:1403-6）。しかし、これらのモデルの一番の制約は、移植手順に高レベルの外科的技術が必要なことである。手術に関連する死亡率は約５％であった。これに対して、本発明者らのモデルに要求される技術は簡易であり、かつ再現性がある。全ての手順は素早く行うことができ（すなわち、外科的手順はマウス１匹について１分以内に完了させることができる）、簡単に他者へ教えられる。本発明者らの方法には、手順に関連した動物の死亡もほとんど伴わず、大規模な適用に好都合である。このマウスモデルでは、ラットモデル（March TH, Marron-Terada PG, Belinsky SA. Refinement of an orthotopic lung cancer model in the nude rat. Vet Pathol 2001;38:483-90）では必要であった事前の動物への照射も、抗生物質による動物の維持も必要なかった。
【００３１】
本発明者らの同所移植モデルにおいて、SQ5細胞系は、同じマウス肺環境において、A549細胞系よりも腫瘍形成率が高かった（表１）。この結果から、この肺癌モデルが、移植した癌細胞の特徴を反映していることが示された。一方、宿主組織の微小環境もまた、腫瘍増殖にとって重要な要因である。EDTAを同時投与することによって、両者の細胞系における腫瘍形成率は増大した（表１）。これらの結果は、腫瘍細胞をヌードラットの気管から送達したMarchの研究（March TH, Marron-Terada PG, Belinsky SA. Refinement of an orthotopic lung cancer model in the nude rat. Vet Pathol 2001;38:483-90）と一致している。EDTAは、正常な気管支上皮細胞の完全性の維持にとって重要なカルシウム依存性のカドヘリン媒介細胞間接着を破壊する可能性がある（Smythe WR, Williams JP, Wheelock MJ, Johnson KR, Kaiser LR, Albelda SM. Cadherin and catenin expression in normal human bronchial epithelium and non-small cell lung cancer. Lung Cancer 1999;24:157-68; Takeichi M. Cadherin cell adhesion receptors as a morphogenetic regulator. Science 1991;251:1451-5）。EDTAは、実間質マトリックス（parenchymal interstitial matrix）を露出させ、そうして結合を促進し、移植した細胞のその後のクリアランスを低下させることができる。本発明者らの肺腫瘍モデルにおけるデータから、肺組織の特定の微小環境における腫瘍形成が、腫瘍細胞の特徴と宿主組織環境との両者に依存することが示された。
【００３２】
in vivo肺癌モデルを開発するために、腫瘍細胞の胸内および肺内注入を行ったところ、局所的な腫瘍増殖は５％〜100％であり、胸腔内転移は０％〜100％であった（Boehle AS, Dohrmann P, Leuschner I, Kalthoff H, Henne-Bruns D. An improved orthotopic xenotransplant procedure for human lung cancer in SCID bg mice. Ann Thorac Surg 2000;69:1010-5; Ishikura H, Kondo K, Miyoshi T, Kinoshita H, Hirose T, Monden Y. Artificial lymphogenous metastatic model using orthotopic implantation of human lung cancer. Ann Thorac Surg 2000;69:1691-5; Onn A, Isobe T, Itasaka S, Wu W, O'Reilly MS, Ki Hong W, Fidler IJ, Herbst RS. Development of an orthotopic model to study the biology and therapy of primary human lung cancer in nude mice. Clin Cancer Res 2003;9:5532-9）。肺内モデルにおいて、肺における腫瘍増殖は、顕微鏡観察により、移植後７日目に見出された。これに対して、縦隔への微小転移巣は５日目に見られた。人為的環境における腫瘍増殖は、腫瘍細胞の高圧注入によりもたらされると考えられた（Ishikura H, Kondo K, Miyoshi T, Kinoshita H, Hirose T, Monden Y. Artificial lymphogenous metastatic model using orthotopic implantation of human lung cancer. Ann Thorac Surg 2000;69:1691-5）。マトリゲルは、エンゲルブレスホルムスワム（Engelbreth-Holm-Swarm）マウス肉腫から抽出した基底膜マトリックス調製物である。マトリゲルは、腫瘍細胞を胸膜腔に移植して腫瘍細胞を注入部位に固定して操作による死亡を低減させるのに一般的に用いられていた（Boehle AS, Dohrmann P, Leuschner I, Kalthoff H, Henne-Bruns D. An improved orthotopic xenotransplant procedure for human lung cancer in SCID bg mice. Ann Thorac Surg 2000;69:1010-5; Ishikura H, Kondo K, Miyoshi T, Kinoshita H, Hirose T, Monden Y. Artificial lymphogenous metastatic model using orthotopic implantation of human lung cancer. Ann Thorac Surg 2000;69:1691-5; Onn A, Isobe T, Itasaka S, Wu W, O'Reilly MS, Ki Hong W, Fidler IJ, Herbst RS. Development of an orthotopic model to study the biology and therapy of primary human lung cancer in nude mice. Clin Cancer Res 2003;9:5532-9; Jin H, Yang R, Fong S, Totpal K, Lawrence D, Zheng Z, Ross J, Koeppen H, Schwall R, Ashkenazi A. Apo2 ligand/tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand cooperates with chemotherapy to inhibit orthotopic lung tumor growth and improve survival. Cancer Res 2004;64:4900-5; Fukunaga M, Takamori S, Hayashi A, Shirouzu K, Kosai K. Adenoviral herpes simplex virus thymidine kinase gene therapy in an orthotopic lung cancer model. Ann Thorac Surg 2002;73:1740-6)。しかし、研究によれば、マトリゲルを同時注入すると、局所的な腫瘍増殖率は増大するが、同時に肺癌細胞系の薬剤耐性も増大することが示された（Ishikura H, Kondo K, Miyoshi T, Kinoshita H, Hirose T, Monden Y. Artificial lymphogenous metastatic model using orthotopic implantation of human lung cancer. Ann Thorac Surg 2000;69:1691-5; Fridman R, Giaccone G, Kanemoto T, Martin GR, Gazdar AF, Mulshine JL. Reconstituted basement membrane (matrigel) and laminin can enhance the tumorigenicity and the drug resistance of small cell lung cancer cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A 1990;87:6698-702）。EDTAは組織培養に一般的に用いられ、高価ではない。EDTAを同時投与すると、腫瘍形成率は80％〜100％になるが、担腫瘍正常組織(tumor-bearing normal tissue)には損傷を与えず、組織学的に見て腫瘍分布に影響はなかった（表１および２、ならびに図３および４）。これらの結果から、EDTAの同時投与がin vivoでの腫瘍形成の増大に有効であることが示された。それを使用することにより、このin vivoモデルが研究の用途に適するものになった。
【００３３】
多病巣性異種移植片が、この同所肺腫瘍モデルにおいて形成された。腫瘍小結節は、左肺よりも右肺の方で高い頻度で存在し、頻度の高いほうから上葉、下葉、中葉の順番であった。これは、ヒトにおける肺癌の位置と類似している（MacFarlane JCW, Doughty BJ, Crosbie WA. Carcinoma of the lung: An analysis of 362 cases diagnosed and treated in one year. Br J Dis Chest 1962;56:57-63; Lisa JR, Trinidad S, Rosenblatt MB. Site of origin, histogenesis, and cytostructure of bronchogenic carcinoma. Am J Clin Pathol 1965;44:375-84; Byers TE, Vena JE, Rzepka TF. Predilection of lung cancer for the upper lobes: an epidemiologic inquiry. J Natl Cancer Inst 1984;72:1271-5）。また、多病巣性異種移植片は、ヒトの症状を模倣することができる。報文から、第Ｉ期の肺癌のために切除を受けている患者の25％〜40％において第２の原発性腫瘍が発生することが示されている（Boice JD Jr, Fraumeni JF Jr. Second cancer following cancer of the respiratory system in Connecticut, 1935-1982. Natl Cancer Inst Monogr 1985;68:83-98; Harpole DH Jr, Herndon JE 2nd, Wolfe WG, Iglehart JD, Marks JR. A prognostic model of recurrence and death in stage I non-small cell lung cancer utilizing presentation, histopathology, and oncoprotein expression. Cancer Res 1995;55:51-6）。組織学的な発現から、腺癌A549の腫瘍小結節が主に肺胞に分布しており、不完全な状態の腺構造を示していることが示された（図３）。扁平上皮癌SQ5の腫瘍小結節は、主に細気管支および終末細気管支に浸潤した（図４）。これらの結果から、この同所モデルにおいて、腫瘍細胞は、それらの元来の特性を反映する適切な部位で増殖することが示された。右主気管支を経由させて移植した肺腫瘍モデルでは、１％の対側転移が見られた（McLemore TL, Liu MC, Blacker PC, Gregg M, Alley MC, Abbott BJ, Shoemaker RH, Bohlman ME, Litterst CC, Hubbard WC, Brennan RH, McMahon JB, Fine DL, Eggleston JC, Mayo JG, and Boyd MR. Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice. Cancer Res 1987;47:5132-40）。本発明者らの肺癌モデルでは、多数の腫瘍小結節が右肺と左肺の双方で形成された。
【００３４】
臨床的に、リンパ節転移は、ヒト肺癌の重要な転移経路であることが知られている。リンパ節転移度は、病期分類、治療の指定、患者の予後の評価に非常に重要である（Mountain CF. Revisions in the International System for Staging Lung Cancer. Chest 1997;111:1710-7）。SQ5細胞の縦隔リンパ節への転移は、１匹のマウスで見られた（図4D）。この研究では、組織スライドは、主に肺の腫瘍小結節をターゲットにして作られたものであり、縦隔をターゲットとして作ったものではなかった。これが、縦隔リンパ節転移の検出率が低い原因になっている可能性がある。
【００３５】
再培養A549細胞またはSQ5細胞では、元の培養細胞よりも高い腫瘍形成率が見られた（表１）。しかし、両者の再培養細胞集団の増殖曲線および倍加時間は、それらの元の培養細胞との有意な差異を示さなかった。動物内でヒト細胞を増殖させるためには、腫瘍細胞の高い浸潤性および／または接着能が組織微小環境における腫瘍増殖において重要な役割を担っていることが、先の研究から報告されている（Kikkawa H, Miyamoto D, Imafuku H, Koike C, Suzuki Y, Okada S, Tsukada H, Irimura T, Oku N. Role of sialylglycoconjugate(s) in the initial phase of metastasis of liver-metastatic RAW117 lymphoma cells. Jpn J Cancer Res 1998;89:1296-305; Greene GF, Kitadai Y, Pettaway CA, von Eschenbach AC, Bucana CD, Fidler IJ. Correlation of metastasis-related gene expression with metastatic potential in human prostate carcinoma cells implanted in nude mice using an in situ messenger RNA hybridization technique. Am J Pathol 1997;150:1571-82）。Lauらは、連続移植によるマウス・レシピエントの数代にわたるヒト肺腫瘍異種移植片により、移植した腫瘍においてヒト遺伝子の喪失およびマウスDNAの獲得が起こることを示している（Lau DH, Lu D, Hammond WG, Schmid CW, Benfield JR. Loss of nm23 and Alu DNA in human lung cancer propagated in nude mice. Cancer Lett 1995;97:163-8）。この現象は第４代目以後に見られたが、初期の代では移植した細胞にDNA改変は見られなかった。皮下注入したヌードマウスにおいて１回増殖させた再培養細胞により腫瘍形成が増大したことは、宿主組織に対してより侵襲性の高い表現型の腫瘍細胞を選定したことによるものと考えられる。
【００３６】
以上をまとめると、本発明により、ヒト肺癌研究のための再現性があり簡易な同所in vivo動物モデルが提供された。ヒト肺癌の臨床的および病理学的特徴をシミュレートする肺組織の腫瘍特異的環境において、多数の小結節が増殖した。本発明により、ヒト肺癌生物学の研究および有望な治療剤の効能評価のための適切なin vivoモデルが提供された。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明により、肺癌細胞が生着している非ヒト動物が提供される。この動物を用いることにより、癌治療薬の開発、治療効果の検証、担癌正常肺組織の癌治療による副作用の検証、肺癌を検出及びイメジングする試薬の開発などが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】腫瘍細胞のBALB/cヌードマウスへの気管内送達。27-3/4ゲージ針を用いて、50μl容量の細胞を主気管支へ直接注入した。
【図２】BALB/cヌードマウスの肺における扁平細胞SQ5腫瘍の小結節形成。SQ5腫瘍の増殖は、0.01MのEDTAと共にヌードマウスの主気管へ同時投与した60日後に見られた（a）。aと同じマウスから得たホルマリン固定した肺組織サンプル。腫瘍は右肺の上葉および中葉に局在していた（b）。
【図３】１×107個のA549細胞を0.01MのEDTAと共に気管内送達した63日後の、ヘマトキシリンおよびエオシン染色による肺の組織学的試験。腫瘍細胞は、肺胞壁に浸潤した（a）。腫瘍細胞は、肺胞にまで広がり、腫瘍小結節は主に肺組織周縁部で形成された（b）。腫瘍塊は、壊死細胞が混在する不完全な腺構造を示した（c）。
【図４】１×107個のSQ5細胞を0.01MのEDTAと共に気管内送達した60日後の、ヘマトキシリンおよびエオシン染色による肺の組織学的試験。腫瘍細胞は細気管支の壁面に浸潤した（a）。腫瘍細胞は終末細気管支の壁面に侵入した（b）。大きな腫瘍塊が肺胞および細気管支を押し縮め、中心に壊死塊が見られた（c）。縦隔リンパ節転移（d）。BV：血管；BT：気管支；N：壊死。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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