(57)【要約】【課題】生物学的活性を示しそして薬学的に用いられ得る人工蛋白質の製造。【解決手段】アルブミンまたはアルブミンの変異体にカプリングさせた、治療活性を示すポリペプチドから誘導される活性部分を含んでいるポリペプチドの提供。その活性部分は、全ペプチド構造または構造的修飾（１種以上の残基の変異、置換、付加および／または欠失）によって全ペプチド構造から誘導される治療活性を有する構造のポリペプチド類である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
成熟ヒトエリスロポイエチンと成熟ヒトアルブミンとを含んでなる、融合タンパク質。
【請求項２】
エリスロポイエチンがアルブミンのＮ末端に融合されてなる、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
エリスロポイエチンがアルブミンのＣ末端に融合されてなる、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
タンパク質が分泌用シグナル配列を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなる、核酸分子。
【請求項６】
ベクター配列を更に含んでなる、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
プロモーター配列を更に含んでなる、請求項５または６に記載の核酸分子。
【請求項８】
プロモーター配列が下記群から選択されるいずれかである、請求項７に記載の核酸分子：
ａ  ハイブリッドプロモーター、
ｂ  構成的プロモーター、
ｃ  調節可能プロモーター、
ｄ  酵母ホスホグリセラートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、
ｅ  酵母グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＤＰ）プロモーター、
ｆ  酵母ラクターゼ（ＬＡＣ４）プロモーター
ｇ  酵母エノラーゼ類（ＥＮＯ）プロモーター、
ｈ  酵母アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）プロモーター、
ｉ  酵母酸ホスフェート（ＰＨＯ５）プロモーター、
ｊ  ラムダバクテリオファージＰＬプロモーター、
ｋ  ラムダバクテリオファージＰＲプロモーター、
ｌ  トリプトファンＰｔｒｐプロモーター、および
ｍ  ラクトースＰｌａｃプロモーター。
【請求項９】
選択マーカーをコードする配列を更に含んでなる、請求項５〜８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１０】
選択マーカーが下記群から選択されるいずれかである、請求項９に記載の核酸分子：
ａ  ＵＲＡ３遺伝子、
ｂ  ゲネチシン耐性、
ｃ  金属イオン耐性、および
ｄ  アンピシリン耐性。
【請求項１１】
転写終止領域を更に含んでなる、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１２】
請求項５〜１１のいずれか一項に記載の核酸分子を含んでなる、宿主細胞。
【請求項１３】
宿主細胞が原核細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
宿主細胞が真核細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
宿主細胞が動物細胞である、請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
動物細胞がＣＨＯ細胞またはＣＯＳ細胞である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
宿主細胞が真菌である、請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
宿主細胞が酵母である、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
酵母がサッカロミセス属である、請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
融合タンパク質を生産する方法であって、
ａ  請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の宿主細胞を、核酸分子によりコードされる融合タンパク質の生産に適した条件下で培養すること、および
ｂ  融合タンパク質を回収すること
を含んでなる方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法により生産された融合タンパク質。
【請求項２２】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含んでなる、薬学組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な生物活性ポリペプチド類、それらの製造、並びにそれらを含んでいる薬学組成物に関する。
【０００２】
より詳細には、本発明は、アルブミンまたはアルブミンの変異体にカプリング（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）させた、治療活性を示す、天然もしくは人工ポリペプチドから誘導される活性部分を含んでいる、本質的に組換え型のポリペプチド類に関する。本発明のポリペプチド類が示す治療活性は直接的（病気の治療）または間接的（例えば、病気の予防、ワクチンの設計、医学画像形成技術などで用いられ得る）であり得ると理解する。
【背景技術】
【０００３】
このアルブミン変異体は、下記の明細書において、与えられた同型のヒト血清アルブミンをコードする遺伝子を遺伝工学技術で修飾（変異、欠失および／または付加）することによって得られる、高い血漿半減期を有する何らかの蛋白質、並びに上記遺伝子がコードする蛋白質を生体外で修飾することによって得られる、高い血漿半減期を有する何らかの巨大分子を示していると理解する。高度の多型性を示すアルブミンである天然変異体が数多く同定され、分類分けされている［Ｗｉｔｋａｍｐ  Ｌ．Ｒ．他「Ａｎｎ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、３７（１９７３）２１９］。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、生物学的活性を示しそして薬学的に用いられ得る人工蛋白質を製造することにある。実際、薬学的に開発することができなかった、効力のある１種以上の治療活性を示すポリペプチド類が数多く存在している。これは種々の理由を有している可能性があり、例えば特に、それらの生体内安定性が低いこと、それらの構造が複雑であるか或は脆いこと、産業的に許容される規模でそれらを製造するのが困難なことなどである。同様に、いくつかポリペプチド類は、投与、包装、薬物動態学などに関する問題から、生体内において期待される程の結果を与えていない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、これらの欠点に打ち勝つことを可能にするものである。本発明は、実際、これらのポリペプチド類が示す生物学的特性を最適に治療開発することを可能にする新規な分子を提供するものである。本発明は、特に、生物学的活性を示すポリペプチドから誘導した活性を示す構造のいずれかを、それらが示す上記生物学的特性を損なうことなく遺伝学的に、アルブミンを含んでいる別の蛋白質構造にカプリングさせることが可能であると言った証拠からもたらされたものである。本発明はまた、ヒト血清アルブミンを用いると活性部位が相互作用する部位にそれが効率良く提示され得ることと本発明のポリペプチドに高い血漿安定性が得られることを本出願者が示したことからもたらされたものである。従って、本発明のポリペプチド類は、与えられた生物学的活性を体の中に長期間に渡って維持することを可能にするものである。従って、これらは、投薬量を低くすることを可能にし、そしてある場合には、例えば投薬量が高いことによって生じる副作用を低くすることによって治療効果を高めることを可能にするものである。加うるに、本発明のポリペプチド類は、非常に小さい従って所望効果に高度に特異的な生物活性ポリペプチド類から誘導される構造を生じさせそして用いることを可能にするものである。治療学的に興味の持たれている生物活性ペプチドはまた、例えばランダムなペプチドライブラリーから単離された非天然ペプチド配列に相当していてもよいと理解する。更に、本発明のポリペプチドは体の中で特に有利な分布を示し、これによって、それらが示す薬学動態学的特性が修飾され、そしてこれは、それが示す生物活性を開発しそしてそれを用いる補助になる。加うるに、これらはまた、それらを用いる有機体に対して全く免疫原性を示さないか或は示しても弱いと言った利点を有している。最後に、組換え有機体は本発明のポリペプチド類を、それらを産業的に開発することを可能にするレベルで発現し得る（優先的に分泌し得る）。
【０００６】
従って、本発明の１つの目的は、アルブミンまたはアルブミンの変異体にカプリングさせた、治療活性を示すポリペプチドから誘導される活性部分を含んでいるポリペプチド類に関するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
特定の態様において、治療活性を示すこれらのペプチド類はヒト由来のものでない。例えば、血液のおよび間隙の区分（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）の病理学で有効性を示し得る特性を示すペプチド類またはそれらの誘導体、例えばヒルジン（ｈｉｒｕｄｉｎ）、トリグラミン（ｔｒｉｇｒａｍｉｎｅ）、アンチスタチン（ａｎｔｉｓｔａｔｉｎｅ）、マダニ抗凝血性ペプチド（ｔｉｃｋ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）（ＴＡＰ）、アリエチン（ａｒｉｅｔｉｎ）、アプラギン（ａｐｐｌａｇｉｎ）などが挙げられ得る。
【０００８】
より詳細には、本発明の分子において、治療活性を示すポリペプチドは、ヒト由来のポリペプチドまたは分子変異体である。例えば、これは、酵素、酵素阻害剤、抗原、抗体、ホルモン、凝固調節に関与している因子、インターフェロン、サイトカイン［インターロイキン類ばかりでなく、レセプター（類）に結合する天然の拮抗薬であるそれらの変異体、ＳＩＳ（誘発されて分泌される小型）型サイトカイン、並びに例えばマクロファージ炎症性蛋白質（ＭＩＰ）など］、成長因子および／または分化因子［例えば形質転換した成長因子（ＴＧＦ）、血液細胞分化因子（エリスロポイエチン、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦなど）、インシュリンおよびそれに類似している成長因子（ＩＧＦ）、或はまた細胞透過因子（ｃｅｌｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒｓ）（ＶＰＦ／ＶＥＧＦ）など］、骨組織の発生／吸収に関与している因子（例えばＯＩＦおよびオステオスポンチン（ｏｓｔｅｏｓｐｏｎｔｉｎ）、細胞運動性または移動に関与している因子［例えばオートクリン運動性因子（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ）（ＡＭＦ）、移動刺激因子（ＭＳＦ）、或はまたスキャター因子（ｓｃａｔｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ）（スキャター因子／肝細胞成長因子）］、殺菌もしくは抗真菌因子、化学走性因子［例えば血小板因子４（ＰＦ４）、或はまた単球化学誘引（ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔｉｎｇ）ペプチド類（ＭＣＰ／ＭＣＡＦ）または好中球化学誘引ペプチド類（ＮＣＡＦ）など］、細胞増殖抑制性因子（例えばガラクトシド類に結合する蛋白質）、血漿（例えばフォンビルブラント因子（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子）、フィブリノーゲンなど）または間隙性（ラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）、テナシン（ｔｅｎａｓｃｉｎ）、ビトロネクチン（ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）など）接着分子または細胞外マトリックス、或はまた、循環のおよび間隙の区分の病理学［例えば動脈および静脈の血栓形成、癌転移、腫瘍脈管形成、炎症性ショック、自己免疫病、骨および骨関節病理学など］に関与している分子および／または細胞間相互作用の拮抗薬または作動薬であるペプチド配列いずれかの、全てまたは一部であってもよい。
【０００９】
本発明のポリペプチド類の活性を示す部分は、例えば、治療活性全体を示すポリペプチド、それらから誘導される構造物、或はまたペプチドライブラリーから単離される非天然ポリペプチドから成っていてもよい。本発明の目的で、誘導される構造物は、治療活性を保持しているところの、修飾によって得られるポリペプチドいずれかを意味していると理解する。修飾は、遺伝的および／または化学的性質の変異、置換、欠失、付加または修飾いずれかを意味していると理解すべきである。上記誘導体は、種々の理由、例えば特に、該分子がそれの結合部位に対して示す親和力を上昇させる理由、それの産生レベルを改良する理由、プロテアーゼに対するそれの耐性を増大させる理由、それが示す治療効果を向上させる理由、或はまたそれの副作用を低くする理由、或はそれに新規な生物学的特性を与える理由などで生じさせ得る。例として、本発明のキメラポリペプチド類は、病気の予防または治療で用いられ得る薬物動態学特性および生物活性を示す。
【００１０】
本発明の特に有利なポリペプチド類は、その活性部分が、
（ａ）全ペプチド構造、または
（ｂ）構造的修飾（１種以上の残基の変異、置換、付加および／または欠失）によって（ａ）から誘導される、治療活性を示す構造、
を有しているポリペプチド類である。
【００１１】
より詳細には、（ｂ）型の構造の中には、特定のＮ−もしくはＯ−グリコシル化部位が修飾もしくは抑制されている分子、１個以上の残基が置換されている分子、或は全てのシステイン残基が置換されている分子などが挙げられ得る。また、考えられる結合部位との相互作用に関与していないか或はあまり関与していない領域または望まれない活性を示す領域を欠失させることによって（ａ）から得られる分子、並びに（ａ）に比べて加えられた残基、例えばＮ末端メチオニンおよび／または分泌用シグナルおよび／または結合用ペプチドなどを含んでいる分子も挙げられ得る。
【００１２】
本発明の分子の活性を示す部分は直接か或は人工ペプチドを通してアルブミンにカプリングしていてもよい。更に、これは、この分子のＮ末端と共にＣ末端を構成していてもよい。好適には、本発明の分子における活性を示す部分は、このキメラのＣ末端部分を構成している。また、この生物学的活性を示す部分はそのキメラ内で繰り返し存在していてもよいと理解する。本発明の分子に関する図式的表示を図１に示す。
【００１３】
本発明の別の主題は、上に記述したキメラ分子の製造方法に関するものである。より詳細には、この方法は、所望ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を真核生物細胞または原核生物細胞宿主が発現するようにした後、それが産生したポリペプチドを収穫することにある。
【００１４】
本発明の枠内で用いられ得る真核生物細胞宿主の中には、動物細胞、酵母または菌・カビが挙げられ得る。特に、酵母に関しては、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、シュヴァニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）またはハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属の酵母が挙げられ得る。動物細胞に関しては、ＣＯＳ、ＣＨＯおよびＣ１２７細胞などが挙げられ得る。本発明で用いられ得る菌・カビの中には、より詳細には、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｓｐ）またはトリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｓｐ）が挙げられ得る。原核生物宿主に関しては大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）などの細菌、或はコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）またはストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する細菌を用いるのが好適である。
【００１５】
本発明の枠内で用いられ得るヌクレオチド配列は種々の方法で製造され得る。一般に、これらは、このポリペプチドの機能的部分各々をコードする配列を読み段階で組み立てることによって得られる。この後者は、本分野の技術者が有する技術によって単離可能であり、例えば細胞のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から直接か、或は相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライブラリーからの再クローニングによって単離可能であるか、或はまたこれらは、完全に合成されたヌクレオチド配列であってもよい。更に、これらのヌクレオチド配列をまたその後、例えば遺伝工学技術などによって修飾して、上記配列の誘導体または変異体を得ることも可能であると理解する。
【００１６】
より好適には、本発明の方法におけるヌクレオチド配列は、コントロール下に置かれているヌクレオチド配列の発現が宿主内で生じるのを可能にする、本発明のポリペプチド類をコードする転写開始領域（プロモーター領域）を含んでいる発現カセットの一部である。この領域は、用いる宿主細胞内で高度に発現する遺伝子のプロモーター領域由来のものであってもよく、ここで、この発現は構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）または調節可能（ｒｅｇｕｌａｔａｂｌｅ）であってもよい。酵母に関するプロモーターは、ホスホグリセラートキナーゼ（ＰＧＫ）、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）、ラクターゼ（ＬＡＣ４）、エノラーゼ類（ＥＮＯ）、アルコールデヒドロゲナーゼ類（ＡＤＨ）などのための遺伝子のプロモーターであってもよい。細菌に関するプロモーターは、ラムダバクテリオファージ由来の右側または左側遺伝子のプロモーター（ＰＬ、ＰＲ）、或はまた、トリプトファン（Ｐｔｒｐ）またはラクトース（Ｐｌａｃ）オペロンのための遺伝子のプロモーターであってもよい。加うるに、このコントロール領域を、例えば追加的コントロール要素または合成した配列を導入するか、或は元のコントロール要素を欠失させるか或は置き換えることによるインビトロ変異誘発によって修飾してもよい。この発現カセットはまた、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の直ぐ下流に位置している、当該宿主内で機能を果す転写停止領域を含んでいてもよい。
【００１７】
好適な様式において、真核生物または原核生物宿主内にヌクレオチド配列が発現しそして上記配列の発現の産物が培養培地に分泌される結果として、本発明のポリペプチド類が得られる。この組換えルートを用いるとその培養培地内で分子を直接得ることができることは、実際特に有利である。この場合、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の前に、その用いる宿主の分泌経路における発生期ポリペプチドの方向付けを行う「リーダー」配列（またはシグナル配列）が存在している。この「リーダー」配列は、生物学的活性を示すポリペプチドの天然シグナル配列［この場合、この後者は天然に分泌される蛋白質である］であるか、或は安定化構造のシグナル配列であってもよいが、これはまた他の何らかの機能的「リーダー」配列であるか或は人工の「リーダー」配列であってもよい。これらの配列の１つまたはその他の選択は、特に、その用いる宿主に従う。機能的シグナル配列の例には、性フェロモンまたは酵母の「キラー」トキシンのための遺伝子のシグナル配列が含まれる。
【００１８】
この発現カセットに加えて、この組換え型宿主を選択することを可能にするマーカーを１つまたはいくつか加えてもよく、例えば、酵母Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＵＲＡ３遺伝子、或はゲネチシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（Ｇ４１８）の如き抗生物質に対する耐性を与えるか或は特定の金属イオンの如き他の何らかの毒性化合物に対する耐性を与える遺伝子などを加えてもよい。
【００１９】
この発現カセットおよび選択マーカーによって生じるユニットを、当該宿主細胞に直接導入してもよいか、或は前以て機能的自己複製ベクターに挿入してもよい。上記１番目の場合として、好適には、宿主細胞のゲノムの中に存在している領域に相同性を示す配列を上記ユニットに加えた後、相同組換えによるこれらの配列の組み込みを目標として、その宿主のゲノムの中にそのユニットが組み込まれる頻度を上昇させるように、上記配列をその発現カセットおよび選択遺伝子の各側面に位置させる。この発現カセットを複製システムに挿入する場合、クルイベロミセス属の酵母に好適な複製システムは、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）由来の単離したプラスミドｐＫＤ１から誘導されたものであり、そしてサッカロミセス属の酵母に好適な複製システムは、Ｓ．セレビシエ由来の２μプラスミドから誘導されたものである。更に、この発現プラスミドは、上記複製システムの全てまたは一部を含んでいてもよいか、或はプラスミドｐＫＤ１および２μプラスミド両方から誘導された要素を組み合わせてもよい。
【００２０】
加うるに、これらの発現プラスミドは、大腸菌の如き細菌宿主と選択した宿主細胞との間のシャトルベクターであってもよい。この場合、この細菌宿主内で機能を果す複製開始点および選択マーカーが必要である。この発現ベクターの上に、その細菌を取り巻いている制限部位およびユニークな配列を位置させることも可能であり、これは、宿主細胞の形質転換を行う前にその端を切り取ったベクターをインビトロで切断して再連結することによって上記配列をサプレスする（ｓｕｐｐｒｅｓｓ）ことを可能にし、そしてこれによって、コピー数の増加がもたらされると共に、上記宿主における発現プラスミドの安定性が上昇し得る。例えば、上記制限部位は、これらの部位が極めて希でありそして一般に発現ベクターから失われている限り、５’−ＧＧＣＣＮＮＮＮＮＧＧＣＣ−３’（ＳｆｉＩ）または５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’（ＮｏｔＩ）の如き配列に相当していてもよい。
【００２１】
上記ベクターまたは発現カセットの構築を行った後、この後者を、文献に記述されている通常技術に従って、その選択した宿主細胞の中に導入する。これに関して、細胞の中に外来ＤＮＡを導入することを可能にする如何なる方法も用いられ得る。これは、特に形質転換、エレクトロポレーション、接合、或は本分野の技術者に知られている他の何らかの技術であってもよい。酵母型宿主の例として、用いる種々のクルイベロミセス株の全細胞を、Ｉｔｏ他が記述した技術［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３（１９８３）１６３］に従い、酢酸リチウムとポリエチレングリコールの存在下で処理することによって、これらの株の形質転換を行う。エチレングリコールおよびジメチルスルホキサイドを用いた、Ｄｕｒｒｅｎｓ他が記述した形質転換技術［Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１８（１９９０）７］も用いた。Ｋａｒｕｂｅ他が記述した方法［ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １８２（１９８５）９０］に従うエレクトロポレーションでこれらの酵母の形質転換を行うことも可能である。代替操作をまた以下の実施例の中に詳述する。
【００２２】
その形質転換した細胞を選択した後、上記ポリペプチド類を発現する細胞を接種し、そして「連続」方法ではその細胞が増殖している間か、或は「バッチ」培養ではその増殖が終了した時点で、上記ポリペプチド類の回収を実施することができる。次に、本発明の主題であるポリペプチド類をその培養上澄み液から精製して、それらの分子特徴付け、薬物動態学特徴付けおよび生物学的特徴付けを行う。
【００２３】
本発明のポリペプチド類に好適な発現システムは、宿主細胞としてクルイベロミセス属の酵母を用い、Ｋ．マルキシアヌス・ベル・ドロソフィラルム（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ  ｖａｒ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）由来の単離した染色体外レプリコンｐＫＤ１から誘導した特定のベクターで形質転換することにある。これらの酵母、特にＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）およびＫ．フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）は、一般に、上記ベクターを安定に複製する能力を有していることに加えて、Ｇ．Ｒ．Ａ．Ｓ．（「Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  Ａｓ  Ｓａｆｅ」）有機体のリストに含まれていると言った利点を有している。好ましい酵母は、好適には、プラスミドｐＫＤ１から誘導される上記プラスミドを安定に複製する能力を有しておりそして本発明のポリペプチド類を高レベルで分泌することを可能にする選択マーカーと共に発現カセットが挿入されている、産業用クルイベロミセス属酵母である。
【００２４】
本発明はまた、上記キメラポリペプチド類をコードするヌクレオチド配列、並びに上記配列を含んでいる真核生物もしくは原核生物の組換え型細胞にも関する。
【００２５】
本発明はまた、本発明に従うポリペプチド類を医学製品として応用することにも関係している。より詳細には、本発明の主題は、上述した如きポリペプチド類またはヌクレオチド配列を１種以上含んでいる全ての薬学組成物である。実際、これらのヌクレオチド配列は遺伝治療で用いられ得る。
【００２６】
説明的であり非制限的であると見なされるべき下記の実施例を用いて本発明を更に詳しく記述する。
【実施例】
【００２７】
一般クローニング技術
分子生物学で通常に用いられている方法、例えばプラスミドＤＮＡの予備抽出、塩化セシウム勾配におけるプラスミドＤＮＡの遠心分離、アガロースまたはアクリルアミドゲル上の電気泳動、電気溶離によるＤＮＡフラグメントの精製、フェノールまたはフェノール−クロロホルムを用いた蛋白質の抽出、食塩水培地内ＤＮＡのエタノールまたはイソプロパノール沈澱、大腸菌における形質転換などは、本分野の技術者によく知られており、そして文献の中に幅広く記述されている［Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．他「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８２；Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．他（編集）「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７］。
【００２８】
これらの制限酵素はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＢＲＬ）またはＡｍｅｒｓｈａｍから供給されたものであり、そして供給業者の推奨に従って用いた。
【００２９】
ｐＢＲ３２２およびｐＵＣ型のプラスミドおよびＭ１３シリーズのファージは市販のものである（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。
【００３０】
連結反応に関しては、アガロースもしくはアクリルアミドゲル上の電気泳動により大きさに従ってＤＮＡフラグメントを分離し、フェノールまたはフェノール／クロロホルム混合物を用いた抽出を行い、エタノールで沈澱させた後、製造業者の推奨に従い、ファージＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下でインキュベートした。
【００３１】
大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント（Ｂｉｏｌａｂｓ）を用い、供給業者の仕様書に従って、突き出ている５’末端の充填を実施する。ファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下、この製造業者の推奨に従って、その突き出ている３’末端の破壊を実施する。Ｓ１ヌクレアーゼを用いて調節した処理を行うことによって、その突き出ている５’末端の破壊を実施する。
【００３２】
Ａｍｅｒｓｈａｍが市販しているキットを用い、Ｔａｙｌｏｒ他が開発した方法［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３（１９８５）８７４９−８７６４］に従って、合成オリゴデオキシヌクレオチド類を用いたインビトロ部位特異的変異誘発を実施する。
【００３３】
「ＤＮＡサーマルサイクラー」（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）を用い、この製造業者の仕様書に従って、いわゆるＰＣＲ技術［ポリメラーゼ触媒連鎖反応、Ｓａｉｋｉ  Ｒ．Ｋ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０（１９８５）１３５０−１３５４；Ｍｕｌｌｉｓ  Ｋ．Ｂ．およびＦａｌｏｏｎａ  Ｆ．Ａ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５５（１９８７）３３５−３５０］によるＤＮＡフラグメントの酵素的増幅を実施する。
【００３４】
Ａｍｅｒｓｈａｍが市販しているキットを用い、Ｓａｎｇｅｒ他が開発した方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７４（１９７７）５４６３−５４６７］により、ヌクレオチド配列の立証を実施する。
【００３５】
本発明の蛋白質を発現させるためのプラスミド由来ＤＮＡを用いたＫ．ラクチスの形質転換を、本分野の技術者に知られている技術いずれかを用いて実施するが、この実施例を本明細書の中に示す。
【００３６】
特に明記されていない限り、用いる菌株は大腸菌ＭＣ１０６０（ＬａｃＩＰＯＺＹＡ、Ｘ７４、ｇａｌＵ、ｇａｌＫ、ｓｔｒＡｒ）または大腸菌ＴＧ１（ｌａｃ、ｐｒｏＡ、Ｂ、ｓｕｐＥ、ｔｈｉ、ｈｓｄＤ５／ＦｔｒａＤ３６、ｐｒｏＡ＋Ｂ＋、ｌａｃＩｑ、ｌａｃＺ、Ｍ１５）である。
【００３７】
用いる酵母は、出芽酵母に属しており、より詳細には、クルイベロミセス属の酵母に属している。特にＫ．ラクチスＭＷ９８−８Ｃ（ａ、ｕｒａＡ、ａｒｇ、ｌｙｓ、Ｋ＋、ｐＫＤ１°）およびＫ．ラクチスＣＢＳ２９３．９１株を用い、そしてＭＷ９８−８Ｃ株のサンプルを、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＣＢＳ）、Ｂａａｒｎ（オランダ）に１９８８年９月１８日付けで寄託し、番号ＣＢＳ５７９．８８の下で登録された。
【００３８】
プラスミドｐＥＴ−８ｃ５２Ｋで形質転換した細菌株（大腸菌）を番号ＡＴＣＣ６８３０６の下でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに１９９０年４月１７日付けで寄託した。
【００３９】
本発明の蛋白質をコードする発現プラスミドで形質転換した酵母株を、三角フラスコまたは２１パイロット発酵器（ＳＥＴＲＩＣ、フランス）中、豊富培地（ＹＰＤ：１％の酵母抽出液、２％のバクトペプトン、２％のグルコース；或はＹＰＬ：１％の酵母抽出液、２％のバクトペプトン、２％のラクトース）の中で一定撹拌しながら２８℃で培養する。
【００４０】
実施例１：ＳＡＨのＣ末端におけるカプリング
プラスミドｐＹＧ４０４はヨーロッパ特許出願公開第３６１  ９９１号の中に記述されている。このプラスミドは、Ｓ．セレビシエのＰＧＫ遺伝子を翻訳するための開始ＡＴＧの直ぐ上流に元々存在している２１個のヌクレオチドの後に、ｐｒｅｐｒｏ−ＳＡＨ遺伝子をコードするＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントを含んでいる。この制限フラグメントのヌクレオチド配列を図２の中に含める。コーディング配列の中に位置しているＭｓｔＩＩ部位、即ち翻訳の終了を指定するコドンから３個の残基は、翻訳段階でＳＡＨのＣ末端にカプリングさせることが望まれている生物活性ペプチドをクローニングするための部位として特に有効である。特定態様では、５’−ＣＣＴＴＡＧＧＣＴＴＡ［３ｘＮ］ｐＴＡＡＧＣＴＴ−３’型のＭｓｔＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントがコードする配列で表されるペプチドを用いるのが有効であり、ここで、この配列は生物学的活性を示すペプチドをコードする（ｐ個の残基は［３ｘＮ］ｐである）。３個のＣ最末端アミノ酸（ロイシン−グリシン−ロイシン残基）を除く、ＳＡＨをコードする遺伝子全体に相当するＨｉｎｄＩＩＩ−ＭｓｔＩＩ制限フラグメントへの上記フラグメントの連結反応により、ＳＡＨの「ｐｒｅｐｒｏ」エクスポート（ｅｘｐｏｒｔ）領域の直ぐ後にＳＡＨ−ペプチド型のキメラ蛋白質をコードするハイブリッド遺伝子（図１、パネルＡ）を含んでいるＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントが生じる。別の態様において、この生物学的活性を示すペプチドは、そのキメラの中に２回以上存在していてもよい。
【００４１】
実施例２：ＳＡＨのＮ末端におけるカプリング
特定態様において、部位特異的変異誘発とＰＣＲ増幅を一緒にした技術を用いることで、シグナルペプチド（例えばＳＡＨのｐｒｅｐｒｏ領域）と、生物学的活性を示すペプチドを含んでいる配列と、成熟形態のＳＡＨまたはそれの分子変異体の１つとの間の翻訳カプリングの結果として生じる、キメラ蛋白質をコードするハイブリッド遺伝子を構築することも可能である。これらのハイブリッド遺伝子は、好適には、翻訳開始ＡＴＧの５’および翻訳停止コドンの３’で、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に境を接しており、そしてこれらは、ペプチド−ＳＡＨ型（図１、パネルＢ）のキメラ蛋白質をコードする。さらなる特定態様において、この生物学的活性を示すペプチドは、そのキメラ内に２回以上存在していてもよい。
【００４２】
実施例３：ＳＡＨのＮ末端およびＣ末端におけるカプリング
実施例１および２に記述した部位特異的変異誘発とＰＣＲ増幅を一緒にした技術を用いることで、成熟形態のＳＡＨまたはそれの分子変異体の１つと、ＳＡＨのＮ末端およびＣ末端にカプリングさせた生物活性ペプチドとの間の翻訳カプリングの結果として生じる、キメラ蛋白質をコードするハイブリッド遺伝子を構築することができる。これらのハイブリッド遺伝子は、好適には、翻訳開始ＡＴＧの５’および翻訳停止コドンの３’で、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に境を接しており、そしてこれらは、ＳＡＨの「ｐｒｅｐｒｏ」エクスポート領域の直ぐ後に存在しているペプチド−ＳＡＨ−ペプチド型（図１、パネルＣ）のキメラ蛋白質をコードする。さらなる特定態様において、この生物学的活性を示すペプチドは、そのキメラ内に２回以上存在していてもよい。
【００４３】
実施例４：発現プラスミド類
機能的、調節可能または構成的プロモーター、例えばプラスミドｐＹＧ１０５（クルイベロミセス・ラクチスのＬＡＣ４プロモーター）、ｐＹＧ１０６（サッカロミセス・セレビシエのＰＧＫプロモーター）、ｐＹＧ５３６（Ｓ．セレビシエのＰＨＯ５プロモーター）の中に存在しているプロモーター、或はハイブリッドプロモーター、例えばヨーロッパ特許出願公開第３６１  ９９１号に記述されている如きプロモーターを用いて、上記実施例のキメラ蛋白質を酵母内で発現させることができる。本明細書では、これらのプラスミドｐＹＧ１０５およびｐＹＧ１０６が特に有効である、と言うのは、これらは、Ｋ．ラクチス内で機能を果す調節可能（ｐＹＧ１０５）または構成的（ｐＹＧ１０６）プロモーターを用いて、上記実施例に記述した如きＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントによってコードされそしてＨｉｎｄＩＩＩ部位に産生配向（転写のためのプロモーターに関して基部にアルブミンの「ｐｒｅｐｒｏ」領域を位置させる配向として定義する）でクローン化した遺伝子の発現を可能にするからである。このプラスミドｐＹＧ１０５は、ヨーロッパ特許出願公開第３６１  ９９１号に記述されているプラスミドｐＫａｎ７０７に相当しており、ここでは、ユニークでありそしてゲネチシン（Ｇ４１８）に対する耐性のための遺伝子の中に位置しているＨｉｎｄＩＩＩ制限部位が部位特異的変異誘発で壊されているが未変化蛋白質を保存している（オリゴデオキシヌクレオチド５’−ＧＡＡＡＴＧＣＡＴＡＡＧＣＴＣＴＴＧＣＣＡＴＴＣＴＣＡＣＣＧ−３’）。その後、その変異プラスミドのＵＲＡ３遺伝子をコードするＳａｌＩ−ＳａｃＩフラグメントを、Ｋ．ラクチスのＬＡＣ４プロモーター（ＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの形態で）およびＳ．セレビシエのＰＧＫ遺伝子のターミネーター（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩの形態で）から成る発現カセットを含んでいるＳａｌＩ−ＳａｃＩ制限フラグメントで置き換えた。このプラスミドｐＹＧ１０５はクルイベロミセス酵母内で分裂的に非常に高い安定性を示し、それの制限地図を図４に示す。プラスミドｐＹＧ１０５とｐＹＧ１０６が互いに異なっているのは、ＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントがコードする転写用プロモーターの性質のみである。
【００４４】
実施例５：酵母の形質転換
例えば、下記の如く適合させた、酢酸リチウムで全細胞を処理する技術［Ｉｔｏ  Ｈ．他「Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３（１９８３）１６３−１６８］を用いて、クルイベロミセス属に属する酵母、特にＫ．ラクチスのＭＷ９８−８Ｃ株およびＣＢＳ２９３．９１株の形質転換を行う。５０ｍＬのＹＰＤ培地中２８℃で撹拌しながら、６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００）が０．６から０．８になるまで、これらの細胞の増殖を行い、そして低速遠心分離で細胞を収穫し、ＴＥの無菌溶液（１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４；１ｍＭのＥＤＴＡ）で洗浄し、３−４ｍＬの酢酸リチウム（ＴＥ中０．１Ｍ）の中に再懸濁させることによって、細胞密度が約２ｘ１０８個細胞／ｍＬになるようにした後、穏やかに撹拌しながら１時間３０℃でインキュベートする。その得られる受容能のある細胞懸濁液の一定分量０．１ｍＬを、ＤＮＡの存在下、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００、Ｓｉｇｍａ）の最終濃度が３５％になるようにして、１時間３０℃でインキュベートする。４２℃で５分間熱ショックを与えた後、これらの細胞を２度洗浄し、０．２ｍＬの無菌水の中に再懸濁させ、そして２ｍＬのＹＰＤ培地中２８℃で１６時間インキュベートすることにより、Ｐｋ１プロモーター制御下で発現するＧ４１８耐性遺伝子の表現型発現を可能にし（ヨーロッパ特許出願公開第３６１  ９９１号参照）、そして次に、この細胞懸濁液の２００μＬを選択ＹＰＤ皿（Ｇ４１８、２００μｇ／ｍＬ）上で平板培養した。これらの皿を２８℃でインキュベートし、そして２から３日間細胞増殖を行った後、形質転換体が現れる。
【００４５】
実施例６：キメラの分泌
Ｇ４１８を補った豊富培地上で選択した後、組換えクローンを、キメラ蛋白質の成熟形態を分泌する能力を有しているか否かに関して試験した。ＳＡＨと生物活性部分との間のキメラを発現させるためのプラスミドによって形質転換した株ＣＢＳ２９３．９１またはＭＷ９８−８Ｃに相当しているいくつかのクローンを、２８℃のＹＰＤまたはＹＰＬ培地内でインキュベートする。これらの細胞が定常増殖段階に到達した時点で、細胞上澄み液を遠心分離で回収し、エタノールの最終濃度が６０％になるように−２０℃で３０分間沈澱させることによって任意に１０倍濃縮し、そして次に、８．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル使用電気泳動にかけた後、クーマシーブルーを用いたゲル染色によって直接的にか、或は生物活性部分に特異的な一次抗体またはＳＡＨに特異的なラビットポリクローナル血清を用いた免疫ブロッティングを行った後、それらの試験を行った。免疫学的検出のための実験を行っている間、最初にニトロセルロースフィルターを特異的一次抗体の存在下でインキュベートし、数回洗浄し、この一次抗体に特異的なヤギ抗体の存在下でインキュベートした後、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ（Ｂｉｏｓｙｓ  Ｓ．Ａ．、Ｃｏｐｉｅｇｎｅ、フランス）が市販している「ＡＢＣキット」を用い、アビジン−ペルオキシダーゼ複合体の存在下でインキュベートした。次に、３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩（Ｐｒｏｌａｂｏ）を添加し、この製造業者の推奨に従って、過酸化水素の存在下で免疫学的反応を明らかにする。
【００４６】
実施例７：フォンビルブラント因子から誘導したキメラ
Ｅ．７．１．  血小板に対するｖＷＦの結合に拮抗するフラグメント
Ｅ．７．１．１．  ｖＷＦのＴｈｒ４７０−Ｖａｌ７１３残基
プラスミドｐＥＴ−８ｃ５２Ｋは、ヒトｖＷＦの残基４４５から７３３をコードするｖＷＦ  ｃＤＮＡのフラグメントを含んでおり、従って一方ではｖＷＦと血小板との間の相互作用に関する重要な決定基をいくつか含んでおり、そして他方では、基底膜および内皮下（ｓｕｂ−ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ）組織の特定要素を含んでおり、特にｖＷＦとＧＰ１ｂ［Ｍｏｒｉ  Ｈ．他「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３（１９８８）１７９０１−１７９０４］の間の相互作用に拮抗するペプチドＧ１０とＤ５を含んでいる。このペプチド配列は、Ｔｉｔａｎｉ他［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５（１９８６）３１７１−３１８４］が記述した相当する配列と同じである。これらの遺伝決定基の増幅は、例えば増幅すべき配列のどちらかの側に位置している隣接残基をコードするオリゴデオキシヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲ増幅技術により、プラスミドｐＥＴ８ｃ５２Ｋを用いて実施され得る。次に、この増幅したフラグメントをＭ１３型のベクターにクローン化し、多重クローニング部位のどちらかの側に位置している普遍プライマーを用いるか或はいくつかの同型を示す配列が知られているｖＷＦ遺伝子の増幅領域に特異的なオリゴデオキシヌクレオチドを用いた配列決定を行うことによって、それらの立証を行う［Ｓａｄｌｅｒ  Ｊ．Ｅ．他「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２（１９８５）６３９４−６３９８；Ｖｅｒｗｅｉｊ  Ｃ．Ｌ．他「ＥＭＢＯ  Ｊ．５（１９８６）１８３９−１８４７；Ｓｈｅｌｔｏｎ−Ｉｎｌｏｅｓ  Ｂ．Ｂ．他「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５（１９８６）３１６４−３１７１；Ｂｏｎｔｈｒｏｎ  Ｄ．他「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７（１９８６）７１２５−７１２７］。このように、オリゴデオキシヌクレオチドである５′−ＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＴＡＧＧＣＴＴＡＡＣＣＴＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＣ−３′（Ｓｑ１９６９、ＭｓｔＩＩ部位にアンダーラインを引く）および５′−ＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＧＡＣＴＴＧＴＧＣＣＡＴＧＴＣＧ−３′（Ｓｑ２０２９、ＨｉｎｄＩＩＩ部位にアンダーラインを引く）を用いたプラスミドｐＥＴ−８ｃ５２ＫのＰＣＲ増幅により、ｖＷＦのＴｈｒ４７０からＶａｌ７１３残基を含んでいるＭｓｔＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントが生じる（図４、パネルＥ）。３個のＣ最末端アミノ酸を除き（図２参照）、ＳＡＨをコードする遺伝子全体に相当しているＨｉｎｄＩＩＩ−ＭｓｔＩＩ制限フラグメントに上記フラグメントを連結することにより、ＳＡＨの「ｐｒｅｐｒｏ」エクスポート領域の直ぐ後にＳＡＨ−ペプチド型のキメラ蛋白質をコードするハイブリッド遺伝子を含んでいるＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントが生じる（図１、パネルＡ）。この制限フラグメントを、プラスミドｐＹＧ１０５のＨｉｎｄＩＩＩ部位に産生配向でクローン化し、これによって、発現プラスミドｐＹＧ１２４８が生じる（ＳＡＨ−ｖＷＦ４７０−７１３）。
【００４７】
Ｅ．７．１．２．  分子変異体：
別の態様において、ｖＷＦの結合部位は、成熟ｖＷＦのＴｈｒ４７０からＡｓｐ４９８残基を含んでいるペプチドである。ペプチドＧ１０を含んでいる上記配列（Ｃｙｓ４７４−Ｐｒｏ４８８）は、Ｍｏｒｉ他［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３（１９８８）１７９０１−１７９０４］に記述されており、ヒト血小板のＧＰ１ｂとヒトｖＷＦとの相互作用に拮抗し得る。例えば、オリゴデオキシヌクレオチドＳｑ１９６９および５′−ＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＧＴＣＣＴＣＣＡＣＡＴＡＣＡＧ−３′（Ｓｑ１９７０、ＨｉｎｄＩＩＩ部位にアンダーラインを引く）を用いたプラスミドｐＥＴ−８ｃ５２ＫのＰＣＲ増幅により、最初に、ＭｓｔＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメント（図５、パネルＢ）の中に、上記ペプチドＧ１０に相当している配列を含め、これによって、ペプチドＧ１０を含んでいるＭｓｔＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントが生じ、そしてこれの配列は、５′−ＣＣＴＴＡＧＧＣＴＴＡＡＣＣＴＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＣＣＡＧＧＡＧＣＣＧＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣＴＣＣＣＡＣＡＧＡＴＧＣＣＣＣＧＧＴＧＡＧＣＣＣＣＡＣＣＡＣＴＣＴＧＴＡＴＧＴＧＧＡＧＧＡＣＴＡＡＧＣＴＴ−３′である（このペプチドＧ１０をコードする配列を太字で示す）。３個のＣ最末端アミノ酸を除き（図２参照）、ＳＡＨをコードする遺伝子全体に相当しているＨｉｎｄＩＩＩ−ＭｓｔＩＩ制限フラグメントに上記フラグメントを連結することにより、ＳＡＨの「ｐｒｅｐｒｏ」エクスポート領域の直ぐ後にＳＡＨ−ペプチド型のキメラ蛋白質をコードするハイブリッド遺伝子を含んでいるＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントが生じる（図１、パネルＡ）。この制限フラグメントを、プラスミドｐＹＧ１０５のＨｉｎｄＩＩＩ部位に産生配向でクローン化し、これによって、発現プラスミドｐＹＧ１２１４が生じる。
【００４８】
別の態様において、合成オリゴデオキシヌクレオチド、例えばオリゴデオキシヌクレオチド５′−ＴＴＡＧＧＣＣＴＣＴＧＴＧＡＣＣＴＴＧＣＣＣＣＴＧＡＡＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴＡＣＴＣＴＧＣＣＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＴＡ−３′および５′−ＧＡＴＣＴＡＡＧＣＴＴＡＧＧＧＧＧＧＣＡＧＡＧＴＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＣＴＴＣＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＣＡＣＡＧＡＧＧＣＣ−３′を用いて、ｖＷＦをＧＰ１ｂに結合させるための部位を直接設計する。これらのオリゴデオキシヌクレオチドを対にすることにより、ｖＷＦのＬｅｕ６９４からＰｒｏ７０８残基が範囲を限定しているペプチドＤ５に相当しているＭｓｔＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（図５、パネルＣ）を含んでいるＭｓｔＩＩ−ＢｇｌＩＩ制限フラグメントが生じる。３個のＣ最末端アミノ酸を除き（図２参照）、ＳＡＨをコードする遺伝子全体に相当しているＨｉｎｄＩＩＩ−ＭｓｔＩＩ制限フラグメントに上記ＭｓｔＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを連結することにより、ＳＡＨの「ｐｒｅｐｒｏ」エクスポート領域の直ぐ後にＳＡＨ−ペプチド型のキメラ蛋白質をコードするハイブリッド遺伝子を含んでいるＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントが生じる（図１、パネルＡ）。この制限フラグメントを、プラスミドｐＹＧ１０５のＨｉｎｄＩＩＩ部位に産生配向でクローン化し、これによって、発現プラスミドｐＹＧ１２０６が生じる。
【００４９】
ペプチドＧ１０とＧ５の間の部位特異的変異誘発、例えばコラーゲンおよび／またはヘパリンおよび／またはボトロセチンおよび／またはスルファチドおよび／またはリストセチンに結合する部位に特異的な変異誘発により、プラスミドｐＥＴ−８ｃ５２Ｋの有効な変異体を削除する。１つの例は、残基Ｃｙｓ５０９とＩｌｅ６６２との間を部位特異的変異誘発によって削除したプラスミドｐＭＭＢ９である。オリゴデオキシヌクレオチドＳｑ１９６９およびＳｑ２０２９を用いた上記プラスミドのＰＣＲ増幅により、Ｔｈｒ４７０からＴｙｒ５０８およびＡｒｇ６６３からＶａｌ７１３残基、特にｖＷＦのペプチドＧ１０およびＤ５を含んでいるが特に残基Ｇｌｕ５４２とＭｅｔ６２２の間に位置しているコラーゲン結合部位が欠失しているＭｓｔＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントが生じる（図５、パネルＤ）［Ｒｏｔｈ  Ｇ．Ｊ．他「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５（１９８６）８３５７−８３６１］。３個のＣ最末端アミノ酸を除き（図２参照）、ＳＡＨをコードする遺伝子全体に相当しているＨｉｎｄＩＩＩ−ＭｓｔＩＩ制限フラグメントに上記フラグメントを連結することにより、ＳＡＨの「ｐｒｅｐｒｏ」エクスポート領域の直ぐ後にＳＡＨ−ペプチド型のキメラ蛋白質をコードするハイブリッド遺伝子を含んでいるＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントが生じる（図１、パネルＡ）。この制限フラグメントを、プラスミドｐＹＧ１０５のＨｉｎｄＩＩＩ部位に産生配向でクローン化し、これによって、発現プラスミドｐＹＧ１２２３が生じる。
【００５０】
別の態様において、部位特異的変異誘発とＰＣＲ増幅を一緒にした技術を用いることにより、スルファチドおよび／またはボトロセチンおよび／またはヘパリンおよび／またはコラーゲンに結合する部位が１個以上欠失しておりそして／またはＩＩＢ型病状がｖＷＦに関連して現れることに関与している何らかの残基で置換されている、図５のパネルＡのＭｓｔＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントの変異体を自由自在に生じさせることができる。
【００５１】
プラスミドｐＥＴ−８ｃ５２Ｋの他の有効な変異体において、例えば部位特異的変異誘発による変異を導入して、ヒトｖＷＦの４７１、４７４、５０９および６９５位に存在している１組のシステインの全てまたは一部を置き換えるか或はサプレスする。特定例は、一方では４７１および４７４位に存在しているシステイン、他方では４７１、４７４、５０９および６９５位に存在しているシステインが、それぞれグリシン残基で置き換えられているところの、プラスミドｐ５Ｅおよびｐ７Ｅである。オリゴデオキシヌクレオチドＳｑ２１４９（５′−ＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＴＡＧＧＣＴＴＡＡＣＣＧＧＴＧＡＡＧＣＣＧＧＣ−３′、ＭｓｔＩＩ部位にアンダーラインを引く）およびＳｑ２０２９を用いた上記プラスミドのＰＣＲ増幅により、少なくとも４７１と４７４位のシステイン残基がグリシン残基に変異している以外は天然ｖＷＦのＴｈｒ４７０からＶａｌ７１３残基を含んでいるＭｓｔＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントを生じさせることができる。３個のＣ最末端アミノ酸を除き（図２参照）、ＳＡＨをコードする遺伝子全体に相当しているＨｉｎｄＩＩＩ−ＭｓｔＩＩ制限フラグメントに上記フラグメントを連結することにより、ＳＡＨの「ｐｒｅｐｒｏ」エクスポート領域の直ぐ後にＳＡＨ−ペプチド型のキメラ蛋白質をコードするハイブリッド遺伝子を含んでいるＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントが生じる（図１、パネルＡ）。これらの制限フラグメントを、プラスミドｐＹＧ１０５のＨｉｎｄＩＩＩ部位に産生配向でクローン化し、これによって、発現プラスミドｐＹＧ１２８３（キメラＳＡＨ−ｖＷＦ４７０−７１３、Ｃ４７１Ｇ、Ｃ４７４Ｇ）およびｐＹＧ１２７９（キメラＳＡＨ−ｖＷＦ４７０−７１３、Ｃ４７１Ｇ、Ｃ４７４Ｇ、Ｃ５０９Ｇ、Ｃ６９５Ｇ）が生じる。
【００５２】
他の特に有効な変異は、ｖＷＦ関連ＩＩＢ型病状に関与している少なくとも１つの残基、例えば残基Ａｒｇ５４３、Ａｒｇ５４５、Ｔｒｐ５５０、Ｖａｌ５５１、Ｖａｌ５５３、Ｐｒｏ５７４またはＡｒｇ５７８などに対して影響を与えるものである（ＧＰ１ｂに対してｖＷＦが示す固有親和力の向上）。インビトロにおける遺伝組換え技術を用いることでもまた、ｖＷＦの配列に１個以上の追加的残基を自由自在に導入することができ、例えば位置Ａｓｐ５３９とＧｌｕ５４２の間に余分のメチオニンを導入することができる。
【００５３】
Ｅ．７．２．  内皮下に対するｖＷＦの結合に拮抗するフラグメント
特定態様において、例えばオリゴデオキシヌクレオチドＳｑ２２５８（５′−ＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＧＧＣＴＧＴＧＣＡＧＣＡＧＧＣＴＡＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＴＣ−３′、ＭｓｔＩＩ部位にアンダーラインを引く）およびＳｑ２２５９（５′−ＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＡＡＣＡＧＡＧＧＴＡＧＣＴＡＡＣＧＡＴＣＴＣＧＴＣＣＣ−３′ＨｉｎｄＩＩＩ部位にアンダーラインを引く）を用いたプラスミドｐＥＴ−８ｃ５２ＫのＰＣＲ増幅［これは、天然ｖＷＦのＣｙｓ５０９からＣｙｓ６９５残基をコードするＭｓｔＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントを生じさせる］により、内皮下組織の成分、例えばコラーゲンにｖＷＦが結合する部位を作り出す。スルファチドおよび／またはボトロセチンおよび／またはヘパリンおよび／またはコラーゲンそして／またはＧＰ１ｂに対してｖＷＦが示す親和性（ｖＷＦ関連ＩＩ型病状）を修飾する一因となる何らかの残基に対してｖＷＦが結合する部位間の何らかの所望組み合わせを含んでいる、欠失分子変異体または修飾変異体も生じる。別の態様において、このコラーゲンに結合し得るドメインはまた、Ｐａｒｅｔｉ他［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８７）２６２：１３８３５−１３８４１］が記述した、残基９１１と１１１４との間に存在しているｖＷＦフラグメント由来のものであってもよい。３個のＣ最末端アミノ酸を除き（図２参照）、ＳＡＨをコードする遺伝子全体に相当しているＨｉｎｄＩＩＩ−ＭｓｔＩＩ制限フラグメントに上記フラグメントを連結することにより、ＳＡＨの「ｐｒｅｐｒｏ」エクスポート領域の直ぐ後にＳＡＨ−ペプチド型のキメラ蛋白質をコードするハイブリッド遺伝子を含んでいるＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントが生じる（図１、パネルＡ）。これらの制限フラグメントを、プラスミドｐＹＧ１０５のＨｉｎｄＩＩＩ部位に産生配向でクローン化し、これによって、相当する発現プラスミド、例えばプラスミドｐＹＧ１２７７（ＳＡＨ−ｖＷＦ５０９−６９５）が生じる。
【００５４】
Ｅ．７．３．  ＳＡＨとｖＷＦとの間のキメラの精製および分子特徴
例えば実施例Ｅ．７．１．およびＥ．７．２．に従う発現プラスミドを用いて形質転換したＣＢＳ２９３．９１株に相当している培養物上澄み液の中に存在しているキメラの特徴付けを、最初の場合として、ＳＡＨ部分およびｖＷＦ部分に特異的な抗体を用いて行う。図７から９の結果は、ＳＡＨとｖＷＦのフラグメントとの間のキメラ蛋白質を酵母Ｋ．ラクチスが分泌する能力を有しており、そしてこれらのキメラが免疫学的反応性を示すことを表している。これらのキメラのいくつかを精製することもまた望ましい可能性がある。次に、この培養物を遠心分離（１０，０００ｇ、３０分間）にかけ、その上澄み液を０．２２ｍｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通した後、分別閾値が３０ｋＤａの所にある膜を用いた限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ）で濃縮した。この得られる濃縮物を、次に、トリス−ＨＣｌ溶液（５０ｍＭ、ｐＨ８）に対して透析した後、カラムを用いた精製を行う。例えば、Ｂｌｕｅ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ（ＩＢＦ）使用アフィニティークロマトグラフィーにより、プラスミドｐＹＧ１２０６で形質転換したＣＢＳ２９３．９１株の培養上澄み液に相当する濃縮物の精製を行う。イオン交換クロマトグラフィーによる精製もまた用いられ得る。例えば、キメラＳＡＨ−ｖＷＦ４７０−７１３の場合、限外濾過後に得られる濃縮物をトリス−ＨＣｌ溶液（５０ｍＭ、ｐＨ８）に対して透析した後、同じ緩衝液内で平衡にしてカチオン交換カラム（５ｍＬ）（Ｓ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の上にその画分２０ｍＬを置く。次に、このカラムをトリス−ＨＣｌ溶液（５０ｍＭ、ｐＨ８）で数回洗浄した後、ＮａＣｌ勾配（０から１Ｍ）により、そのキメラ蛋白質をそのカラムから溶離させる。次に、このキメラ蛋白質を含んでいる画分をプールし、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ溶液（ｐＨ８）に対して透析した後、再びＳＦａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムの上に置く。このカラムの溶離を行った後、蛋白質を含んでいる画分をプールし、水に対して透析し、凍結乾燥した後、例えば下記の特徴を示す：酵母ＣＢＳ２９３．９１が分泌する蛋白質の配列決定［ＳＡＨ−ｖＷＦ４７０−７０４  Ｃ４７１Ｇ、Ｃ４７４Ｇ］を行うことにより（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）、ＳＡＨで期待されるＮ末端配列（Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｈｉｓ．．．）が得られ、このことは、ＳＡＨの「ｐｒｏ」領域の残基Ａｒｇ−Ａｒｇの二重項のＣ末端に接して、このキメラの妥当な成熟が生じていることを示している。ＳＡＨとｖＷＦとの間のキメラ蛋白質が示す必須単量体特徴もまた、ＴＳＫ３０００カラム［東洋曹達株式会社（Ｔｏｙｏ  Ｓｏｄａ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、０．２ＭのＮａ２ＳＯ４が入っているカコジル酸塩溶液（ｐＨ７）で平衡にした］を用いた時得られる溶離プロファイルによって立証され、例えばキメラ［ＳＡＨ−ｖＷＦ４７０−７０４  Ｃ４７１Ｇ、Ｃ４７４Ｇ］は、この条件下で、見掛け分子量が９５ｋＤａの蛋白質であるような挙動を示し、このことは、それが単量体特徴を有していることを示している。
【００５５】
実施例８：ウロキナーゼから誘導したキメラ
Ｅ．８．１．  構築物
例えばＰｈａｒｍａｃｉａが市販しているＲＴ−ＰＣＲキットを用い、特定ヒト癌細胞の相当するメッセンジャーＲＮＡから、ウロキナーゼのアミノ末端フラグメントに相当しているフラグメント（ＡＴＦ：ＥＧＦ様ドメイン＋クリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ）ドメイン）を入手することができる。ヒトウロキナーゼのＡＴＦを含んでいるＭｓｔＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントを図１０に示す。このＭｓｔＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントにプラスミドｐＹＧ４０４のＨｉｎｄＩＩＩ−ＭｓｔＩＩフラグメントを連結させることにより、ＳＡＨ分子が遺伝的にＡＴＦにカプリングしているキメラ蛋白質をコードするプラスミドｐＹＧ１３４１のＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを生じさせることができる（ＳＡＨ−ＵＫ１→１３５）。同様に、プラスミドｐＹＧ１３４０は、ヒトウロキナーゼの最初の４６残基の直ぐ前にＳＡＨを含んでいるキメラをコードするＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを含んでいる（ＳＡＨ−ＵＫ１→４６、図１０参照）。このプラスミドｐＹＧ１３４０（ＳＡＨ−ＵＫ１→４６）のＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントをプラスミドｐＹＧ１０５（ＬＡＣ４）およびｐＹＧ１０６（ＰＧＫ）のＨｉｎｄＩＩＩ部位に産生配向でクローニングすることにより、それぞれ発現プラスミドｐＹＧ１３４３およびｐＹＧ１３４２が生じる。同様に、このプラスミドｐＹＧ１３４１（ＳＡＨ−ＵＫ１→１３５）のＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントをプラスミドｐＹＧ１０５（ＬＡＣ４）およびｐＹＧ１０６（ＰＧＫ）のＨｉｎｄＩＩＩ部位に産生配向でクローニングすることにより、それぞれ発現プラスミドｐＹＧ１３４５およびｐＹＧ１３４４が生じる。
【００５６】
Ｅ．８．２．  ハイブリッドの分泌
Ｇ４１８を補った豊富培地上で選択を行った後、キメラ蛋白質ＳＡＨ−ＵＫを成熟形態で分泌する能力を有しているか否かに関して、これらの組換えクローンを試験する。実施例Ｅ．９．１．に従う発現プラスミドで形質転換した、Ｋ．ラクチスＣＢＳ２９３．９１株に相当しているいくつかのクローンを、２８℃の選択完全液状培地内でインキュベートする。次に、この細胞上澄み液を、８．５％アクリルアミドゲル使用電気泳動にかけた後、クーマシーブルーを用いたゲル染色により直接か、或はヒトアルブミンに特異的か或はヒトウロキナーゼに特異的なラビットポリクローナル血清を一次抗体として用いた免疫ブロッティングにかけた後、それらの試験を行う。図１１の結果は、ハイブリッド蛋白質であるＳＡＨ−ＵＫ１→４６およびＳＡＨ−ＵＫ１→１３５を酵母クルイベロミセスが特に良好に分泌することを示している。
【００５７】
Ｅ．８．３．  ＳＡＨとウロキナーゼとの間のキメラの精製
実施例Ｅ．８．１．に従う発現プラスミドで形質転換したＣＢＳ２９３．９１株の培養物を遠心分離にかけた後、この細胞上澄み液を、０．２２ｍｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通し、そして次に、分別閾値が３０ｋＤａの所にある膜を用いた限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ）で濃縮した。この得られる濃縮物を、次に、１Ｍのトリス−ＨＣｌストック溶液（ｐＨ７）で始めて５０ｍＭのトリス−ＨＣｌに調整した後、同じ緩衝液内で平衡にしたアニオン交換カラム（３ｍＬ）（Ｄ−Ｚｅｐｈｙｒ、Ｓｅｐｒａｃｏｒ）の上にその画分２０ｍＬを置く。次に、ＮａＣｌ勾配（０から１Ｍ）により、そのキメラ蛋白質（ＳＡＨ−ＵＫ１→４６またはＳＡＨ−ＵＫ１→１３５）をそのカラムから溶離させる。次に、このキメラ蛋白質を含んでいる画分をプールし、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ溶液（ｐＨ６）に対して透析した後、再び同じ緩衝液で平衡にしたＤ−Ｚｅｐｈｙｒカラムの上に置く。このカラムの溶離を行った後、蛋白質を含んでいる画分をプールし、水に対して透析し、凍結乾燥した後、それらが示す生物活性の特徴付け、特に細胞のレセプタからウロキナーゼを追い出す能力に関する特徴付けを行う。
【００５８】
実施例９：Ｇ−ＣＳＦから誘導したキメラ
Ｅ．９．１．  構築物
Ｅ．９．１．１．  ＳＡＨのＣ末端におけるカプリング
例えば下記の方策に従い、ヒトＧ−ＣＳＦの成熟形態を含んでいるＭｓｔＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントを生じさせる。最初に、鋳型として働くプラスミドＢＢＧ１３に対するプライマーとしてオリゴデオキシヌクレオチドＳｑ２２９１（５′−ＣＡＡＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＣＡＧＧＧＣＴＧＣＧＣＡＡＧＧＴＧＧＣＧＴＡＧ−３′、ＨｉｎｄＩＩＩ部位にアンダーラインを引く）およびＳｑ２２９２（５′−ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＴＴＡＧＧＣＴＴＡＡＣＣＣＣＣＣＴＧＧＧＣＣＣＴＧＣＣＡＧＣ−３′、ＫｐｎＩ部位にアンダーラインを引く）を用いた酵素的ＰＣＲ増幅技術により、ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントを入手する。プラスミドＢＢＧ１３は、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、英国から入手した、Ｂ形態の成熟ヒトＧ−ＣＳＦ（１７４個のアミノ酸）をコードする遺伝子を含んでいる。次に、約５５０個のヌクレオチドから成る酵素増幅産物を、制限酵素ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化させた後、同じ酵素で切断したベクターｐＵＣ１９にクローン化し、これによって組換え型プラスミドｐＹＧ１２５５が生じる。このプラスミドは、ＳＡＨの直ぐ下流にＧ−ＣＳＦを融合させることを可能にするＭｓｔＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントの給源であり、これのヌクレオチド配列を図１２に示す。
【００５９】
ＳＡＨ部分とＧ−ＣＳＦとの間にペプチドリンカーを挿入して、例えば形質導入部分の機能的提示を良好にするのも望ましい可能性がある。例えば、オリゴデオキシヌクレオチドＳｑ２７４２（５′−ＴＴＡＧＧＣＴＴＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＡＣＣＣＣＣＣＴＧＧＧＣＣ−３′、この特別なリンカーのグリシン残基をコードするコドンにアンダーラインを引く）およびＳｑ２７４１（５′−ＣＡＧＧＧＧＧＧＴＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＡＡＧＣＣ−３′）［これらは対になってＭｓｔＩＩ−ＡｐａＩフラグメントを生じる］を用い、プラスミドｐＹＧ１２５５のＭｓｔＩＩ−ＡｐａＩフラグメントの置換を行うことによって、ＭｓｔＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントを生じさせる。従って、このようにして生じさせたプラスミドはＭｓｔＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントを含んでおり、この配列は、ＭｓｔＩＩ−ＡｐａＩフラグメントを除き図１２のそれと同じである。
【００６０】
プラスミドｐＹＧ１２５５のＭｓｔＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントにプラスミドｐＹＧ４０４のＨｉｎｄＩＩＩ−ＭｓｔＩＩフラグメントを連結させることにより、キメラ蛋白質をコードするプラスミドｐＹＧ１２５９のＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを生じさせることが可能であり、ここでは、翻訳段階における遺伝的カプリングにより、そのＳＡＨ分子のＣ末端にそのＢ形態の成熟Ｇ−ＣＳＦが位置する（ＳＡＨ−Ｇ．ＣＳＦ）。
【００６１】
翻訳段階における遺伝的カプリングにより該ＳＡＨ分子のＣ末端にそのＢ形態の成熟Ｇ−ＣＳＦが位置するキメラ蛋白質と共に特定のペプチドリンカーをコードするところの、ＭｓｔＩＩ−ＡｐａＩフラグメント以外は同じＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントもまた容易に生じさせ得る。例えば、このリンカーは、プラスミドｐＹＧ１３３６のＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの中に４個のグリシン残基を含んでいる（キメラＳＡＨ−Ｇｌｙ４−Ｇ．ＣＳＦ）。
【００６２】
プラスミドｐＹＧ１２５９のＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントを、発現プラスミドｐＹＧ１０５のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に産生配向でクローン化し、これによって、発現プラスミドｐＹＧ１２６６が生じる（ＳＡＨ−Ｇ．ＣＳＦ）。別の例において、プラスミドｐＹＧ１２５９のＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントを、プラスミドｐＹＧ１０６のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に産生配向でクローン化することにより、プラスミドｐＹＧ１２６７が生じる。プラスミドｐＹＧ１２６６とｐＹＧ１２６７は、Ｋ．ラクチスのＬＡＣ４プロモーター（プラスミドｐＹＧ１２６６）またはＳ．セレビシエのＰＧＫプロモーター（プラスミドｐＹＧ１２６７）をコードするＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントを除き互いに同質の遺伝子である。
【００６３】
別の例において、プラスミドｐＹＧ１３３６（キメラＳＡＨ−Ｇｌｙ４−Ｇ．ＣＳＦ）のＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントを、プラスミドｐＹＧ１０５（ＬＡＣ４）およびｐＹＧ１０６（ＰＧＫ）のＨｉｎｄＩＩＩ部位に産生配向でクローン化することにより、それぞれ発現プラスミドｐＹＧ１３５１およびｐＹＧ１３５２が生じる。
【００６４】
Ｅ．９．１．２．  ＳＡＨのＮ末端におけるカプリング
特定態様において、部位特異的変異誘発とＰＣＲ増幅を一緒にした技術を用いることで、シグナルペプチド（例えばＳＡＨのｐｒｅｐｒｏ領域）と、Ｇ−ＣＳＦ活性を示す遺伝子を含んでいる配列と、成熟形態のＳＡＨまたはそれの分子変異体の１つとの間の翻訳カプリングの結果として生じる、キメラ蛋白質をコードするハイブリッド遺伝子を構築することができる（パネルＢのキメラ、図１参照）。これらのハイブリッド遺伝子は、好適には、翻訳開始ＡＴＧの５’および翻訳停止コドンの３’で、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に境を接している。例えば、オリゴデオキシヌクレオチドＳｑ２３６９（５′−ＧＴＴＣＴＡＣＧＣＣＡＣＣＴＴＧＣＧＣＡＧＣＣＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＧＡＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧＡＧＴＧＡＧＧＴＴＧＣＴＣＡＴＣＧＧ−３′、アンダーラインを引いた残基（任意）は、この特別なキメラにおいて、４個のグリシン残基を含んでいるペプチドリンカーに相当している）を用いた部位特異的変異誘発により、プラスミドＢＢＧ１３が有する成熟形態のヒトＧ−ＣＳＦを成熟形態のＳＡＨの直ぐ上流に翻訳段階で位置させることができ、これによって、中間プラスミドＡが生じる。同様に、オリゴデオキシヌクレオチドＳｑ２３３８［５′−ＣＡＧＧＧＡＧＣＴＧＧＣＡＧＧＧＣＣＣＡＧＧＧＧＧＧＴＴＣＧＡＣＧＡＡＡＣＡＣＡＣＣＣＣＴＧＧＡＡＴＡＡＧＣＣＧＡＧＣＴ−３′（非コーディングストランド）、成熟形態のヒトＧ−ＣＳＦが有する最初のＮ末端残基をコードするヌクレオチドに相補的なヌクレオチドにアンダーラインを引く］を用いた部位特異的変異誘発により、成熟形態のヒトＧ−ＣＳＦの直ぐ上流にＳＡＨのｐｒｅｐｒｏ領域を翻訳読み段階でカプリングさせることができ、これによって、中間プラスミドＢが生じる。次に、このプラスミドＢのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｓｔＩフラグメント（ＳＡＨの結合用ｐｒｅｐｒｏ領域＋成熟Ｇ−ＣＳＦのＮ末端フラグメント）とプラスミドＡのＳｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−フラグメント［結合用成熟Ｇ−ＣＳＦ−（グリシン）ｘ４−成熟ＳＡＨ］を結合させることによって、ペプチド−ＳＡＨ型のキメラ蛋白質をコードするＨｉｎｄＩＩＩフラグメントが生じる（図１、パネルＢ参照）。プラスミドｐＹＧ１３０１は、ＳＡＨのｐｒｅｐｒｏ領域の直ぐ下流に融合しているキメラＧ．ＣＳＦ−Ｇｌｙ４−ＳＡＨをコードする上記特異的ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントを含んでいる（図１３）。このＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントをプラスミドｐＹＧ１０５（ＬＡＣ４）およびｐＹＧ１０６（ＰＧＫ）のＨｉｎｄＩＩＩ部位に産生配向でクローン化することにより、それぞれ発現プラスミドｐＹＧ１３０２およびｐＹＧ１３０３が生じる。
【００６５】
Ｅ．９．２．  ハイブリッドの分泌
Ｇ４１８を補った豊富培地上で選択した後、組換えクローンを、ＳＡＨとＧ−ＣＳＦとの間のキメラ蛋白質の成熟形態を分泌する能力を有しているか否かに関して試験した。プラスミドｐＹＧ１２６６またはｐＹＧ１２６７（ＳＡＨ−Ｇ．ＣＳＦ）、ｐＹＧ１３０２またはｐＹＧ１３０３（Ｇ．ＣＳＦ−Ｇｌｙ４−ＳＡＨ）或はまたｐＹＧ１３５１またはｐＹＧ１３５２（ＳＡＨ−Ｇｌｙ４−Ｇ．ＣＳＦ）で形質転換した株Ｋ．ラクチスＣＢＳ２９３．９１に相当しているいくつかのクローンを、２８℃の選択完全液状培地内でインキュベートする。次に、これらの細胞上澄み液を、８．５％アクリルアミドゲル使用電気泳動にかけた後、クーマシーブルーを用いたゲル染色によって直接的にか、或はヒトＧ−ＣＳＦに特異的なラビットポリクローナル抗体またはヒトアルブミンに特異的なラビットポリクローナル血清を一次抗体として用いた免疫ブロッティングを行った後、それらの試験を行った。図１５の結果は、ヒトアルブミン（パネルＣ）およびヒトＧ−ＣＳＦ（パネルＢ）両方に特異的な抗体がそのハイブリッド蛋白質ＳＡＨ−Ｇ．ＣＳＦを認識することを示している。図１６の結果は、酵母クルイベロミセスがキメラＳＡＨ−Ｇｌｙ４−Ｇ．ＣＳＦ（レーン３）を特に良好に分泌することを示しいるが、これは恐らくは、このキメラが分泌経路内を通っている間これらの２つの部分が独立して折り畳まれるにはそのＳＡＨ部分とＧ−ＣＳＦ部分との間にペプチドリンカーが存在している方が好ましいことによるものであろう。更に、この酵母クルイベロミセスはまたＮ末端融合物（Ｇ．ＣＳＦ−Ｇｌｙ４−ＳＡＨ）も分泌する（図１６、レーン１）。
【００６６】
Ｅ．９．３．  ＳＡＨとＧ−ＣＳＦとの間のキメラの精製および分子特徴
例えば実施例Ｅ．９．１．に従う発現プラスミドを用いて形質転換したＣＢＳ２９３．９１株の培養物を遠心分離にかけた後、その培養上澄み液を０．２２ｍｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通し、そして次に、分別閾値が３０ｋＤａの所にある膜を用いた限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ）で濃縮した。この得られる濃縮物を、次に、１Ｍのトリス−ＨＣｌストック溶液（ｐＨ６）を用い５０ｍＭのトリス−ＨＣｌに調整した後、同じ緩衝液内で平衡にしたイオン交換カラム（５ｍＬ）（Ｑ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の上にその画分２０ｍＬを置く。次に、ＮａＣｌ勾配（０から１Ｍ）により、そのキメラ蛋白質をそのカラムから溶離させる。次に、このキメラ蛋白質を含んでいる画分をプールし、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ溶液（ｐＨ６）に対して透析した後、再び同じ緩衝液で平衡にしたＱ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（１ｍＬ）の上に置く。このカラムの溶離を行った後、蛋白質を含んでいる画分をプールし、水に対して透析し、凍結乾燥した後、例えば下記の特徴を示す：酵母ＣＢＳ２９３．９１が分泌する蛋白質ＳＡＨ−Ｇ．ＣＳＦの配列決定を行うことにより（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）、ＳＡＨで期待されるＮ末端配列（Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｈｉｓ．．．）が得られ、このことは、ＳＡＨの「ｐｒｏ」領域の残基Ａｒｇ−Ａｒｇの二重項のＣ末端に接して、このキメラの妥当な成熟が生じていることを示している（図２）。
【００６７】
実施例１０：免疫グロブリンから誘導したキメラ
Ｅ．１０．１．  構築物
リンカーペプチド［Ｂｉｒｄ他、「Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９８８）２４２：４２３；Ｈｕｓｔｏｎ他（１９８８）「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５８７９］により免疫グロブリン（Ｉｇ）の重鎖と軽鎖を互いに連結させた可変フラグメントをコードするＦｖ’フラグメントを、遺伝工学技術で構築することができる。図式的には、与えられたＩｇが有する重鎖と軽鎖の可変領域（約１２０個の残基）を、例えばＰｈａｒｍａｃｉａが市販しているＲＴ−ＰＣＲキット（マウスＳｃＦｖモジュール）を用いて、相当するハイブリドーマのメッセンジャーＲＮＡからクローン化する。第二段階で、合成した連結用ペプチド、例えばリンカー（ＧＧＧＧＳ）ｘ３を用いた遺伝工学により、これらの可変領域を遺伝的にカプリングさせる。マウスのハイブリドーマが分泌する免疫グロブリンのＦｖ’フラグメントを含んでいるＭｓｔＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントを図１７に示す。このＭｓｔＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントにプラスミドｐＹＧ４０４のＨｉｎｄＩＩＩ−ＭｓｔＩＩフラグメントを連結させることにより、プラスミドｐＹＧ１３８２のＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを生じさせることが可能であり、これは、図１７のＦｖ’フラグメントにＳＡＨ分子が遺伝的にカプリングしているキメラ蛋白質（キメラＳＡＨ−Ｆｖ’）をコードする。プラスミドｐＹＧ１３８２のＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントを、プラスミドｐＹＧ１０５（ＬＡＣ４）およびｐＹＧ１０６（ＰＧＫ）のＨｉｎｄＩＩＩ部位に産生配向でクローン化することにより、それぞれ発現プラスミドｐＹＧ１３８３およびｐＹＧ１３８４が生じる。
【００６８】
Ｅ．１０．２．  ハイブリッドの分泌
Ｇ４１８を補った豊富培地上で選択した後、組換えクローンを、キメラ蛋白質ＳＡＨ−Ｆｖ’の成熟形態を分泌する能力を有しているか否かに関して試験した。プラスミドｐＹＧ１３８３またはｐＹＧ１３８４（ＳＡＨ−Ｆｖ’）で形質転換した株Ｋ．ラクチスＣＢＳ２９３．９１に相当しているいくつかのクローンを、２８℃の選択完全液状培地内でインキュベートする。次に、これらの細胞上澄み液を、８．５％アクリルアミドゲル使用電気泳動にかけた後、クーマシーブルーを用いたゲル染色によって直接的にか、或はヒトアルブミンに特異的なラビットポリクローナル血清を一次抗体として用いた免疫ブロッティングを行った後、それらの試験を行うか、或はマウス由来の免疫グロブリンに特異的なビオチニル化抗体と一緒に直接培養する。図１８の結果は、そのハイブリッド蛋白質ＳＡＨ−Ｆｖ’がヒトアルブミンに特異的な抗体によって認識され（パネルＣ）そしてマウス免疫グロブリンに対して免疫学的反応性を示すビオチニル化ヤギ抗体と反応する（パネルＢ）ことを示している。
【００６９】
実施例１１：キメラが示す生物学的活性
Ｅ．１１．１．  インビトロにおける生物学的活性
Ｅ．１１．１．１．  ＳＡＨとｖＷＦとの間のキメラ
Ｐｒｉｏｒ他［Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）１０：６６］が記述した方法に従って、パラホルムアルデヒドで固定したヒト血小板凝集の用量依存阻害を測定することによって、これらの産物が示す拮抗作用を決定する。血小板凝集計（ＰＡＰ−４、Ｂｉｏ  Ｄａｔａ、Ｈｏｒｓｈａｍ、ＰＡ、ＵＳＡ）内で上記測定を実施するが、これは、ｖＷＦの存在下３７℃で撹拌しながら、ボトロセチン（８．２ｍｇ／ｍＬ）と種々の希釈率（濃度）の試験産物が示す光学透過率の経時的変動を記録するものである。各測定において、パラホルムアルデヒド（０．５％）で安定化した後、［ＮａＣｌ（１３７ｍＭ）；ＭｇＣｌ２（１ｍＭ）；ＮａＨ２ＰＯ４（０．３６ｍＭ）；ＮａＨＣＯ３（１０ｍＭ）；ＫＣｌ（２．７ｍＭ）；グルコース（５．６ｍＭ）；ＳＡＨ（３．５ｍｇ／ｍＬ）；ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．３５）］の中に再懸濁させたヒト血小板の懸濁液の４００ｍＬ（８ｘ１０７個の血小板）を、該血小板凝集計に備わっている筒状タンク（８．７５ｘ５０ｍｍ、Ｗｅｌｌｃｏｍ  Ｄｉｓｔｒｉｗｅｌｌ、１５９  ｒｕｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ、パリ）の中で４分間３７℃で前インキュベートした後、非発熱性調剤用賦形剤［マンニトール（５０ｇ／Ｌ）；クエン酸（１９２ｍｇ／Ｌ）；Ｌ−リジン一塩酸塩（１８２．６ｍｇ／Ｌ）；ＮａＣｌ（８８ｍｇ／Ｌ）；ＮａＯＨ（１Ｍ）を添加することによってｐＨを３．５に調整］の中で試験産物を種々の希釈率で希釈した溶液またはこの調剤用賦形剤単独（コントロールアッセイ）を３０ｍＬ補充する。次に、その得られる懸濁液を３７℃で１分間インキュベートした後、ヒトｖＦＷ［Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ、ＵＳＡ；ホルムアルデヒド（２ｘ１０５個の血小板／ｍＬ）で固定した血小板と、ｖＦＷを０から１００％含んでいるヒト血漿とリストセチン（１０ｍｇ／ｍＬ）を用いたＰＡＰ−４（Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（商標））の使用に関する推奨に従って測定したフォンビルブラント活性１１％、３６−４５頁参照：ｖＷＰｒｏｇｒａｍ（商標）］の１２．５ｍＬを加え、３７℃で１分間インキュベートした後、１２．５ｍＬのボトロセチン溶液［Ｓｕｇｉｍｏｔｏ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９１）２６６：１８１７２が記述した操作に従って、ボトロプス・ジャララカ（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ｊａｒａｒａｃａ）の凍結乾燥毒液（Ｓｉｇｍａ）から精製］を添加する。次に、そのタンクの中に入れた磁気棒（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｄｉｓｔｒｉｗｅｌｌ）を用いこの血小板凝集計が与える１，１００ｒｐｍの磁気撹拌で撹拌しながら２分間、その透過率の読みを時間の関数として記録する。従って、経時的光学透過率の平均変動（各希釈毎にｎ３５）は、この試験産物が種々の濃度で存在しているか或は存在していない場合の、ｖＷＦとボトロセチンが存在していることが原因となる血小板凝集の尺度である。次に、このような記録から、その産物の各濃度によって生じる血小板凝集の阻害％を決定し、そしてｌｏｇ−ｌｏｇ目盛りの中に、その産物希釈率の逆数の関数として、その阻害％を与える直線をプロットする。次に、ＩＣ５０（即ち、この凝集の５０％阻害をもたらす産物濃度）を上記直線から決定する。図８の表は、本発明のＳＡＨ−ｖＷＦキメラのいくつかが示すＩＣ５０値を比較したものであり、これらのいくつかは、Ｐｒｉｏｒ他［Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）１０：６６］が記述しそして標準値としてそのアッセイの中に含めている産物ＲＧ１２９８６よりも良好な、血小板凝集の拮抗薬であることを示している。ブタ血漿のｖＷＦ（Ｓｉｇｍａ）存在下で同じヒト血小板凝集阻害試験を行うことにより、更に、本発明のハイブリッドのいくつか、特にいくつかのＩＩＢ型変移体が、ボトロセチン型補助因子の存在なしで血小板凝集の非常に良好な拮抗薬であることを示すことが可能である。また、Ｗａｒｅ他［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９１）８８：２９４６］が最初に記述した操作に従い、新鮮な血小板存在下（１０８個の血小板／ｍＬ）２２℃で３０分間インキュベートすると、血小板ＧＰＩｂ［Ｈａｎｄａ  Ｍ．他（１９８６）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１２５７９］にｖＷＦが結合するのを競合的に阻害する阻害剤であるモノクローナル抗体１２５Ｉ−ＬＪ−ＩＢ１（１０ｍｇ／ｍＬ）が追い出されることにより、これらの特定キメラが示すボトロセチン非依存拮抗作用が実証され得る。
【００７０】
Ｅ．１１．１．２．  ＳＡＨとＧ−ＣＳＦとの間のキメラ
本質的にＴｓｕｃｈｉｙａ他［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８６）８３  ７６３３］が記述した操作に従い、トリチウム化したチミジンの取り込みを測定することにより、その精製したキメラがＩＬ３依存マウス系ＮＦＳ６０をインビトロ増殖させる能力を有するか否かを試験する。各キメラにおいて、１ゾーン内の３地点試験（産物の３種希釈率）において３回から６回測定を実施する、即ち活性を示す産物の量と標識チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の取り込みとの間の関係は直線関係にある。哺乳動物細胞内で発現する組換え型ヒトＧ−ＣＳＦから成る参照産物が示す活性もまた、各ミクロタイタープレートの中に計画的に組み入れる。図２０の結果は、酵母クルイベロミセスが分泌しそして実施例Ｅ．９．３．に従って精製したキメラＳＡＨ−Ｇ．ＣＳＦ（ｐＹＧ１２６６）はＮＦＳ６０系が細胞増殖するためのシグナルをインビトロで形質導入する能力を有していることを示している。この特別の場合において、このキメラが示す特異的活性（ｃｐｍ／モル濃度）は、参照Ｇ−ＣＳＦ（カプリングしていない）のそれよりも約７倍低い。
【００７１】
Ｅ．１１．２．  インビボにおける生物学的活性
ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ／ＣＤ、２５０−３００ｇ、８−９週）に皮下注射した後、ＳＡＨ／Ｇ−ＣＳＦキメラがインビボで顆粒球形成に対して示す刺激活性を試験し、そして哺乳動物細胞を用いて発現させた参照Ｇ−ＣＳＦのそれと比較する。７匹の動物から成る割合で試験する各産物を、連続して７日間（Ｄ１−Ｄ７）１００ｍＬの割合で背肩甲領域に皮下注射する。日Ｄ−６、Ｄ２（２回目の注射をする前）、Ｄ５（５回目の注射を行う前）およびＤ８に５００ｍＬの血液を採取し、そして血球算定を実施する。この試験においてキメラＳＡＨ−Ｇ．ＣＳＦ（ｐＹＧ１２６６）が示す特異的活性（好中球形成（ｎｅｕｔｒｏｐｏｉｅｓｉｓ）単位／注射モル）は参照Ｇ−ＣＳＦのそれと同じである（図２１）。この特異的キメラはインビトロで参照Ｇ−ＣＳＦのそれよりも７倍低い特異的活性を示していたことから（図２０）、これは従って、ＳＡＨ上にＧ−ＣＳＦを遺伝的にカプリングさせるとそれの薬物動態学特性が好適に修飾されることを示している。
【００７２】
本発明は以下の通りである。
（１）アルブミンまたはアルブミンの変異体に遺伝的にカプリングしている、治療学的活性を示すポリペプチドから誘導される活性部分を含んでいる組換えポリペプチド。
（２）治療学的活性を示す該ポリペプチドがヒト由来のポリペプチドである（１）記載のポリペプチド。
（３）治療学的活性を示す該ポリペプチドが、酵素、酵素阻害剤、抗原、抗体、ホルモン、凝固因子、インターフェロン、サイトカイン、成長因子および／または分化因子、骨組織の発生／吸収に関与している因子、化学走性因子、細胞運動性または移動因子、細胞増殖抑制性因子、殺菌または抗真菌因子、或は血漿または間隙性接着分子または細胞外マトリックスの、全てまたは一部から選択されることを特徴とする（２）記載のポリペプチド。
（４）治療学的活性を示す該ポリペプチドが、循環のおよび間隙の区分の病理学に関与している分子および／または細胞相互作用の作動薬または拮抗薬であるいずれかのペプチド配列から選択されることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載のポリペプチド。
（５）該活性部分が、
（ａ）全ペプチド構造、または
（ｂ）（ａ）のフラグメントまたは構造的修飾（１種以上の残基の変異、置換、付加および／または欠失）によって（ａ）から誘導されそして治療学的活性を保持している構造、から選択される構造を有していることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載のポリペプチド。
（６）該活性部分をアルブミンのＮ末端にカプリングさせることを特徴とする（１）〜（５）のいずれかに記載のポリペプチド。
（７）該活性部分をアルブミンのＣ末端にカプリングさせることを特徴とする（１）〜（５）のいずれかに記載のポリペプチド。
（８）該活性部分が数回現れていることを特徴とする（１）〜（７）のいずれかに記載のポリペプチド。
（９）（１）〜（８）のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
（１０）発現したポリペプチドの分泌を可能にする「リーダー」配列を含んでいることを特徴とする（９）記載のヌクレオチド配列。
（１１）転写開始領域および任意の転写停止領域の制御下で（９）または（１０）に記載のヌクレオチド配列を含んでいる発現カセット。
（１２）（１１）記載の発現カセットを含んでいる自己複製プラスミド。
（１３）（９）または（１０）に記載のヌクレオチド配列、または（１１）記載の発現カセット、または（１２）記載のプラスミドが挿入されている、真核もしくは原核の組換え細胞。
（１４）酵母、動物細胞、菌・カビまたは細菌であることを特徴とする（１３）記載の組換え細胞。
（１５）酵母であることを特徴とする（１４）記載の組換え細胞。
（１６）サッカロミセスまたはクルイベロミセス属の酵母であることを特徴とする（１５）記載の組換え細胞。
（１７）（１３）〜（１６）のいずれかに記載の組換え細胞を発現に適した条件下で培養した後、産生されるポリペプチドを回収することを特徴とする（１）〜（８）のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法。
（１８）（１）〜（８）のいずれかに記載のポリペプチド類を１種以上含んでいる薬学組成物。
（１９）遺伝治療で用いられ得る、（９）〜（１１）のいずれかに記載のヌクレオチド配列を含んでいる薬学組成物。
【００７３】
配列表
（２）配列同定番号１に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１８５９個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖：２本鎖
（Ｄ）トポロジー：線形
（ｉｉ）分子型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）仮定：なし
（ｉｉｉ）アンチセンス：なし
（ｉｘ）性質：
（Ａ）名称／鍵：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：２６．．．１８５５
（Ｃ）他の情報：／産物＝「ＳＡＨ−ペプチド型キメラ」
（ｉｘ）性質：
（Ａ）名称／鍵：混ざり合った性質（ｍｉｓｃ  ｆｅａｔｕｒｅ）
（Ｂ）位置：１８４２．．．１８４８
（Ｃ）他の情報：／標準名＝「Ｍｓｔ  ＩＩ部位」
【表１】
2007306939.tif 000002
【表２】
2007306939.tif 000003
【００７４】
（２）配列同定番号２に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：７５０個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖：２本鎖
（Ｄ）トポロジー：線形
（ｉｉ）分子型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）仮定：なし
（ｉｉｉ）アンチセンス：なし
（ｉｘ）性質：
（Ａ）名称／鍵：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：３．．．７４６
（Ｃ）他の情報：／産物＝「キメラＳＡＨ−ｖＷＦ４７０のＣ末端（Ｃ−ｔｅｒ）フラグメント」
【表３】
2007306939.tif 000004
【００７５】
（２）配列同定番号３に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：４２３個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖：２本鎖
（Ｄ）トポロジー：線形
（ｉｉ）分子型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）仮定：なし
（ｉｉｉ）アンチセンス：なし
（ｉｘ）性質：
（Ａ）名称／鍵：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：３．．．４１９
（Ｃ）他の情報：／産物＝「キメラＳＡＨ−ＵＫ１−１３５のＣ末端フラグメント」
【表４】
2007306939.tif 000005
【００７６】
（２）配列同定番号４に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：５４１個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖：２本鎖
（Ｄ）トポロジー：線形
（ｉｉ）分子型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）仮定：なし
（ｉｉｉ）アンチセンス：なし
（ｉｘ）性質：
（Ａ）名称／鍵：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：３．．．５３６
（Ｃ）他の情報：／産物＝「キメラＳＡＨ−Ｇ．ＣＳＦのＣ末端フラグメント」
【表５】
2007306939.tif 000006
【００７７】
（２）配列同定番号５に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：２４５５個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖：２本鎖
（Ｄ）トポロジー：線形
（ｉｉ）分子型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）仮定：なし
（ｉｉｉ）アンチセンス：なし
（ｉｘ）性質：
（Ａ）名称／鍵：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：２６．．．２３８９
（Ｃ）他の情報：／産物＝「ＳＡＨのｐｒｅｐｒｏ領域の下流にあるキメラＧ．ＣＳＦ−Ｇｌｙ４−ＳＡＨ」
（ｉｘ）性質：
（Ａ）名称／鍵：ｍｉｓｃ  ｒｅｃｏｍｂ
（Ｂ）位置：６２０．．６３１
（Ｃ）他の情報：／標準名＝「ＰｏｌｙＧｌｙリンカー」
（ｉｘ）性質：
（Ａ）名称／鍵：ｍｉｓｃ  ｆｅａｔｕｒｅ
（Ｂ）位置：１０６．．１１１
（Ｃ）他の情報：／標準名＝「Ａｐａ  Ｉ部位」
【表６】
2007306939.tif 000007
【表７】
2007306939.tif 000008
【００７８】
（２）配列同定番号６に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：７５６個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖：２本鎖
（Ｄ）トポロジー：線形
（ｉｉ）分子型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）仮定：なし
（ｉｉｉ）アンチセンス：なし
（ｉｘ）性質：
（Ａ）名称／鍵：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：３．．．７５２
（Ｃ）他の情報：／産物＝「キメラＳＡＨ−Ｆｖ’のＣ末端フラグメント」
（ｉｘ）性質：
（Ａ）名称／鍵：ｍｉｓｃ  ｒｅｃｏｍｂ
（Ｂ）位置：３８４．．４２８
（Ｃ）他の情報：／標準名＝「合成リンカー」
【表８】
2007306939.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【００７９】
下記の図の中に示すプラスミドの表示は、一定の割合でプロットしたものでなく、実施したクローニングを理解するに重要な制限部位のみを示したものである。
【図１】ＳＡＨ−ペプチド型（Ａ）またはペプチド−ＳＡＨ型（Ｂ）またはペプチド−ＳＡＨ−ペプチド型（Ｃ）のキメラの図式的表示。用いる省略形は下記の通りである：Ｍ／ＬＰ  −  翻訳開始メチオニン残基（任意に、分泌のためのシグナル配列が後に続いている）；ＳＡＨ  −  成熟したアルブミンまたはそれの分子変異体の１つ；ＰＥＰ  −  与えられた治療特性を示す天然もしくは人工源のペプチド。このＰＥＰ配列は、Ａ型、Ｂ型またはＣ型分子内に数回存在している可能性がある。黒色矢印は、この成熟した蛋白質のＮ末端を示している。
【図２】ｐｒｅｐｒｏ−ＳＡＨ−ペプチド型のキメラ蛋白質をコードするＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントのヌクレオチド配列の例。黒色矢印は、ＳＡＨの「前（ｐｒｅ）」と「後ろ（ｐｒｏ）」領域の末端を示している。ＭｓｔＩＩ制限部位にアンダーラインを引き、そして翻訳の停止を指定するコドンを太字で示す。
【図３】図２の続きである。
【図４】プラスミドｐＹＧ１０５に関する制限地図、並びに本発明のキメラ蛋白質を発現させるためのプラスミドの構築を行う遺伝方策。用いる省略形：Ｐ  −  転写プロモーター；Ｔ  −  転写ターミネーター；ＩＲ  −  プラスミドｐＫＤ１の逆方向反復配列；ＬＰ  −  分泌用シグナル配列；ＡｐｒとＫｍｒはそれぞれアンピシリン（大腸菌）およびＧ４１８（酵母）に対する耐性のための遺伝子を示している。
【図５】フォンビルブラント因子から誘導したＭｓｔＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントのヌクレオチド配列の例。プラスミドｐＹＧ１２４８（パネルＡ）、ｐＹＧ１２１４（パネルＢ）、ｐＹＧ１２０６［パネルＣ、この特別なキメラでは、このｖＷＦのＬｅｕ６９４残基もまたこのＳＡＨの最終残基（Ｌｅｕ５８５）である］およびｐＹＧ１２２３（パネルＤ）のＭｓｔＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの構造の表示；これらのアミノ酸の番号付けは、Ｔｉｔａｎｉ他［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５（１９８６）３１７１−３１８４］に従う成熟ｖＷＦの番号付けに相当している。これらのＭｓｔＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位にアンダーラインを引き、そして翻訳停止コドンを太字で示す。
【図６】プラスミドｐＹＧ１２４８のＭｓｔＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントのヌクレオチド配列。これらのアミノ酸の番号付け（右側のコラム）は、成熟したキメラ蛋白質ＳＡＨ−ｖＷＦ４７０→７１３（８２９個の残基）に相当している。この成熟ｖＷＦのＴｈｒ４７０、Ｌｅｕ４９４、Ａｓｐ４９８、Ｐｒｏ５０２、Ｔｙｒ５０８、Ｌｅｕ６９４、Ｐｒｏ７０４およびＰｒｏ７０８残基にアンダーラインを引く。
【図７】プラスミドｐＹＧ１２４８（ＳＡＨ−ｖＷＦ  Ｔｈｒ４７０→Ｖａｌ７１３のキメラを発現させるためのプラスミド）およびｐＫａｎ７０７（コントロールプラスミド）で形質転換した菌株ＣＢＳ２９３．９１を４日間培養（三角フラスコ）した後分泌される材料の特徴。この実験では、パネルＡ、ＢおよびＣで得られるものを同じゲル（８．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で泳動させた後、個別に処理した。  Ａ、クーマシーブルー染色；分子量標準（レーン２）；ＹＰＬ培地内においてプラスミドｐＫａｎ７０７で形質転換した培養物の５０μＬに相当する上澄み液（レーン１）、またはＹＰＤ培地内におけるｐＹＧ１２４８（レーン３）またはＹＰＬ培地内におけるｐＹＧ１２４８（レーン４）。  Ｂ、ヒトｖＷＦに特異的なマウス抗体を用いた後分泌される材料の免疫学的特徴：ビオチニル化した分子量標準を用いる以外はＡと同じレジェンド。  Ｃ、ヒトアルブミンに特異的なラビット抗体を用いた後分泌される材料の免疫学的特徴：ＹＰＬ培地内においてプラスミドｐＫａｎ７０７で形質転換した培養物の５０μＬに相当する上澄み液（レーン１）、またはＹＰＤ培地内におけるｐＹＧ１２４８（レーン２）またはＹＰＬ培地内におけるｐＹＧ１２４８（レーン３）。
【図８】プラスミドｐＹＧ１２０６で形質転換した菌株ＣＢＳ２９３．９１が本発明のキメラを分泌する時の速度論（ＳＡＨ−ｖＷＦ  Ｌｅｕ６９４−Ｐｒｏ７０８）。  Ａ、クーマシーブルー染色；分子量標準（レーン１）；「Ｆｅｄバッチ」培養物をＹＰＤ培地に２．５μＬ入れて２４時間（レーン２）、４０時間（レーン３）または４６時間（レーン４）増殖させたものに相当する上澄み液。  Ｂ、ヒトｖＷＦに特異的なマウス抗体を用いた後分泌される材料の免疫学的特徴：ビオチニル化した分子量標準を用いる以外はＡと同じレジェンド。
【図９】プラスミドｐＫａｎ７０７（コントロールプラスミド、レーン２）、ｐＹＧ１２０６（レーン３）、ｐＹＧ１２１４（レーン４）およびｐＹＧ１２２３（レーン５）で形質転換したＫ．ラクチスが分泌する材料の特徴；分子量標準（レーン１）。これらの堆積物は、ＹＰＤ培地中で増殖させた後の静置培養物から得られる上澄み液の５０μＬを８．５％のアクリルアミドゲル上で泳動させた後クーマシーブルーで染色したものに相当している。
【図１０】プラスミドｐＹＧ１３４１のＭｓｔＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントのヌクレオチド配列（ＳＡＨ−ＵＫ１→１３５）。プラスミドｐＹＧ１３４０のＭｓｔＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントの中に存在しているＥＧＦ様ドメイン（ＵＫ１→４６）の範囲を示している。これらのアミノ酸の番号付けは、成熟したキメラ蛋白質ＳＡＵ−ＵＫ１→１３５（７２０個の残基）に相当している。
【図１１】プラスミドｐＹＧ１３４３（ＳＡＨ−ＵＫ１−４６）およびｐＹＧ１３４５（ＳＡＨ−ＵＫ１−１３５）で個別に形質転換した菌株ＣＢＳ２９３．９１を用い、４日間増殖させた後（ＹＰＬ＋Ｇ４１８培地）のＳＡＨ−ＵＫ１−４６およびＳＡＨ−ＵＫ１−１３５キメラ分泌。これらの堆積物（５０μＬの培養物に相当している）を、８．５％のＰＡＧＥ−ＳＤＳゲル上で泳動させた後、クーマシーブルーで染色した：プラスミドｐＫａｎ７０７（レーン１）、ｐＹＧ１３４３（レーン３）またはｐＹＧ１３４５（レーン４）で形質転換したクローンから得られる上澄み液；分子量標準（レーン２）。
【図１２】プラスミドｐＹＧ１２５９のＭｓｔＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントのヌクレオチド配列（ＳＡＨ−Ｇ．ＣＳＦ）。Ｇ−ＣＳＦ部分の範囲（１７４個の残基）を示している。ＡｐａＩおよびＳｓｔＩ（ＳｓｔＩ）制限部位にアンダーラインを引く。これらのアミノ酸の番号付けは、成熟したキメラ蛋白質ＳＡＨ−Ｇ．ＣＳＦ（７５９個の残基）に相当している。
【図１３】プラスミドｐＹＧ１３０１のＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントのヌクレオチド配列（キメラＧ．ＣＳＦ−Ｇｌｙ４−ＳＡＨ）。黒色矢印は、ＳＡＨの「前（ｐｒｅ）」と「後ろ（ｐｒｏ）」領域の末端を示している。ＡｐａＩ、ＳｓｔＩ（ＳａｃＩ）およびＭｓｔＩＩ制限部位にアンダーラインを引く。Ｇ．ＣＳＦ（１７４個の残基）とＳＡＨ（５８５個の残基）ドメインを合成リンカーＧＧＧＧが分離している。これらのアミノ酸の番号付けは、成熟したキメラ蛋白質Ｇ．ＣＳＦ−Ｇｌｙ４−ＳＡＨ（７６３個の残基）に相当している。翻訳停止コドンとＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に存在しているヌクレオチド配列は、ヨーロッパ特許出願公開第３６１  ９９１号の中に記述されている如きＳＡＨ相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）由来のものである。
【図１４】図１３の続きである。
【図１５】プラスミドｐＹＧ１２６６（ＳＡＨ−Ｇ．ＣＳＦ型のキメラを発現させるためのプラスミド）およびｐＫａｎ７０７（コントロールプラスミド）で形質転換した菌株ＣＢＳ２９３．９１を４日間培養（三角フラスコ）した後分泌される材料の特徴。この実験では、パネルＡ、ＢおよびＣで得られるものを同じゲル（８．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で泳動させた後、個別に処理した。  Ａ、クーマシーブルー染色；分子量標準（レーン２）；ＹＰＬ培地内においてプラスミドｐＫａｎ７０７で形質転換した培養物の１００μＬに相当する上澄み液（レーン１）、またはＹＰＤ培地内におけるｐＹＧ１２６６（レーン３）またはＹＰＬ培地内におけるｐＹＧ１２６６（レーン３）。  Ｂ、ヒトＧ−ＣＳＦに特異的な一次抗体を用いた後分泌される材料の免疫学的特徴：Ａと同じレジェンド。  Ｃ、ヒトアルブミンに特異的な一次抗体を用いた後分泌される材料の免疫学的特徴：Ａと同じレジェンド。
【図１６】プラスミドｐＹＧ１２６７（キメラＳＡＨ−Ｇ．ＣＳＦ）、ｐＹＧ１３０３（キメラＧ．ＣＳＦ−Ｇｌｙ４−ＳＡＨ）およびｐＹＧ１３５２（キメラＳＡＨ−Ｇｌｙ４−Ｇ．ＣＳＦ）で形質転換した菌株ＣＢＳ２９３．９１を４日間培養（三角フラスコ、ＹＰＤ培地中）した後分泌される材料を８．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動させた後の特徴。  Ａ、クーマシーブルー染色；プラスミドｐＹＧ１３０３（レーン１）、ｐＹＧ１２６７（レーン２）またはｐＹＧ１３５２（レーン３）で形質転換した培養物の１００μＬに相当する上澄み液；分子量標準（レーン４）；  Ｂ、ヒトＧ−ＣＳＦに特異的な一次抗体を用いた後分泌される材料の免疫学的特徴：Ａと同じレジェンド。
【図１７】プラスミドｐＹＧ１３８２のＭｓｔＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントのヌクレオチド配列（ＳＡＨ−Ｆｖ’）。このＦｖ’フラグメントのＶＨ（１２４個の残基）とＶＬ（１０７個の残基）ドメインを合成リンカー（ＧＧＧＧＳ）ｘ３が分離している。これらのアミノ酸の番号付けは、成熟したキメラ蛋白質ＳＡＨ−Ｆｖ’（８３１個の残基）に相当している。
【図１８】プラスミドｐＹＧ１３８３（ＬＡＣ４）で形質転換した菌株ＣＢＳ２９３．９１を、三角フラスコ中２８℃で、ＹＰＤ培地（レーン２）またはＹＰＬ（レーン３）内で４日間増殖した後のキメラＳＡＨ−Ｆｖ’分泌；分子量標準（レーン１）。２００μＬの培養物に相当している堆積物（エタノールで沈澱）をＰＡＧＥ−ＳＤＳゲル（８．５％）上で泳動させる。  Ａ、このゲルのクーマシーブルー染色。  Ｂ、ＳＡＨに特異的な一次抗体を用いた後分泌される材料の免疫学的特徴。
【図１９】ホルムアルデヒドで固定したヒト血小板凝集に関するインビトロ拮抗作用のアッセイ：標準ＲＧ１２９８６と比較したハイブリッドＳＡＨ−ｖＷＦ６９４−７０８、［ＳＡＨ−ｖＷＦ４７０−７１３  Ｃ４７１Ｇ、Ｃ４７４Ｇ］および［ＳＡＨ−ｖＷＦ４７０−７０４  Ｃ４７１Ｇ、Ｃ４７４Ｇ］のＩＣ５０。Ｃ．Ｐｒｉｏｒ他が記述した方法［Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）１０  ６６］に従い、ヒトｖＷＦの存在下３７℃で撹拌しながらボトロセチン（ｂｏｔｒｏｃｅｔｉｎ）（８．２ｍｇ／ｍＬ）と種々の希釈率の試験産物が示す光学透過率の変動を記録する血小板凝集計を用い、この血小板凝集の用量依存阻害測定を実施する。次に、コントロール凝集（産物の存在なし）を半分阻害することを可能にするその産物の濃度を決定する（ＩＣ５０）。
【図２０】マウス株ＮＦＳ６０のインビトロ細胞増殖に対する活性。６時間インキュベートした後、細胞核の中に取り込まれる放射能（３Ｈ−チミジン）をｙ軸上に示し（ｃｐｍ）、そしてｘ軸上に表す産物の量をモル濃度（任意単位）で示す。
【図２１】ラットにおける顆粒球形成に対するインビボ活性。好中球の数（７匹の動物の平均）を時間の関数としてｙ軸上に示す。試験した産物は、キメラＳＡＨ−Ｇ．ＣＳＦ（ｐＹＧ１２６６）（４または４０ｍｇ／ラット／日）、参照Ｇ−ＣＳＦ（１０ｍｇ／ラット／日）、クルイベロミセス・ラクチス上澄み液から精製した組換え型ＳＡＨ（ＳＡＨ、３０ｍｇ／ラット／日、ヨーロッパ特許出願公開第３６１  ９９１号を参照）、または生理食塩水である。
【図１】
2007306939.tif 000010
【図２】
2007306939.tif 000011
【図３】
2007306939.tif 000012
【図４】
2007306939.tif 000013
【図５】
2007306939.tif 000014
【図６】
2007306939.tif 000015
【図７】
2007306939.tif 000016
【図８】
2007306939.tif 000017
【図９】
2007306939.tif 000018
【図１０】
2007306939.tif 000019
【図１１】
2007306939.tif 000020
【図１２】
2007306939.tif 000021
【図１３】
2007306939.tif 000022
【図１４】
2007306939.tif 000023
【図１５】
2007306939.tif 000024
【図１６】
2007306939.tif 000025
【図１７】
2007306939.tif 000026
【図１８】
2007306939.tif 000027
【図１９】
2007306939.tif 000028
【図２０】
2007306939.tif 000029
【図２１】
2007306939.tif 000030