(57)【要約】      （修正有）【課題】操作された組換え部位を有するDNAおよびベクターが、組換えタンパク質を用いるDNAセグメントの効率的かつ特異的な組換えを可能にする組換えクローニング方法における使用のために提供される。【解決手段】  組換えクローニングが、所望の特性（単数もしくは複数）および／またはDNAセグメント（単数もしくは複数）を有するキメラDNA分子を提供するための操作された組換え部位および組換えタンパク質を用いてDNA分子のセグメントを移動または交換するための、インビトロおよびインビボにおける、核酸、ベクターおよび方法の使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のDNAセグメントおよび第２のDNAセグメントを含むベクタードナーDNA分子であって、該第１のDNAセグメントまたは該第２のDNAセグメントは少なくとも１つの選択マーカーを含み、ここで該第１のセグメントおよび該第２のセグメントは、(i) 環状ベクタードナーにおいては、第１の組換え部位および第２の組換え部位により、または(ii) 直鎖状ベクタードナーにおいては、少なくとも第１の組換え部位により、のいずれかで分離され、ここで隣接する組換え部位の各々の対が操作され、そして互いに組換えない、ベクタードナーDNA分子。
【請求項２】
前記選択マーカーが以下：
(i) そうでなければ毒性の化合物に対する耐性を提供する産物をコードするDNAセグメント；
(ii) そうでなければレシピエント細胞において欠如している産物をコードするDNAセグメント；
(iii) 遺伝子産物の活性を抑制する産物をコードするDNAセグメント；
(iv) 容易に同定され得る産物をコードするDNAセグメント；
(v) 細胞の生存および／または機能に有害である産物をコードするDNAセグメント；
(vi) 該(i)〜(v)のDNAセグメントのいずれかの活性を阻害するDNAセグメント；
(vii) 基質を修飾する産物に結合するDNAセグメント；
(viii) 所望の分子の単離を提供するDNAセグメント；
(ix) そうでなければ非機能性であり得る特異的ヌクレオチド配列をコードするDNAセグメント；および
(x) 存在しない場合、直接的または間接的に、特定の化合物に対する感受性を与えるDNAセグメント、
からなる群より選択される少なくとも１つのDNAセグメントである、請求項１に記載のベクタードナーDNA分子。
【請求項３】
前記選択マーカーが、抗生物質耐性遺伝子、tRNA遺伝子、栄養要求マーカー、毒性遺伝子、表現型マーカー、アンチセンスオリゴヌクレオチド；制限エンドヌクレアーゼ；制限エンドヌクレアーゼ切断部位、酵素切断部位、タンパク質結合部位；およびPCRプライマーに相補的な配列、からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項２に記載のベクタードナーDNA分子。
【請求項４】
前記選択マーカーが少なくとも１つの選択マーカーの不活性フラグメントを含み、ここで該不活性フラグメントが前記第１の組換え部位または前記第２の組換え部位と、別の選択マーカーの不活性フラグメントを含むさらなるDNAセグメントとにわたって組換えられる場合に、機能性の選択マーカーを再構成し得る、請求項１に記載のベクタードナーDNA分子。
【請求項５】
第１の組換え部位および第２の組換え部位により隣接される所望のDNAセグメントを含むインサートドナーDNA分子であって、該第１の組換え部位および該第２の組換え部位は操作され、そして互いに組換えない、インサートドナーDNA分子。
【請求項６】
前記所望のDNAセグメントが、クローニング部位、制限部位、プロモーター、オペロン、複製起点、機能性DNA、アンチセンスRNA、PCRフラグメント、タンパク質またはタンパク質フラグメント、からなる群より選択される少なくとも１つをコードする、請求項５に記載のインサートドナーDNA分子。
【請求項７】
１つの区画でその中に厳重な封じ込めで収容するように区画化された容器を含むキットであって、ここで第１の区画は第１のDNAセグメントおよび第２のDNAセグメントを含むベクタードナーDNA分子を含み、該第１のDNAセグメントまたは該第２のDNAセグメントは少なくとも１つの選択マーカーを含み、ここで該第１のセグメントおよび該第２のセグメントは、(i) 環状ベクタードナードナーにおいては、第１の組換え部位および第２の組換え部位、または(ii) 直鎖状ベクタードナーにおいては、第１の組換え部位、のいずれかにより隣接され、ここで隣接する組換え部位の各々の対が操作され、そして互いに組換えない、キット。
【請求項８】
第１の組換え部位および第２の組換え部位により隣接される所望のDNAセグメントを含むインサートドナーDNA分子を含む第２の区画をさらに含み、ここで該第１の組換え部位および該第２の組換え部位が操作され、そして互いに組換えない、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
少なくとも１つの前記組換え部位を含むDNAセグメントを組換え得る少なくとも１つの組換えタンパク質を含むさらなる区画をさらに含む、請求項７に記載のキット。
【請求項１０】
選択マーカーまたは所望のDNAセグメントに隣接する少なくとも２つの組換え部位を有する少なくとも１つのDNAセグメントを含む核酸分子であって、ここで少なくとも１つの該組換え部位がコインテグレートDNAまたは産物DNAの形成においてインビトロで組換えを増強する少なくとも１つの操作された変異を有するコア領域を含む、核酸分子。
【請求項１１】
前記変異が少なくとも１つの前記組換えの増強を与え、該増強が実質的に、(i) 切り出し組換えの優先；(ii) 組み込み組換えの優先；(iii) 宿主因子の要求の軽減；(iv) 前記コインテグレートDNAまたは産物DNA形成の効率の増加；(v) 前記コインテグレートDNAまたは産物DNA形成の特異性の増加からなる群より選択され；そして該産物DNAに対する所望の特性に貢献する、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項１２】
前記組換え部位が、attB、attP、attLおよびattRからなる群より選択される少なくとも１つの組換え部位に由来する、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項１３】
前記att部位が、att1、att2およびatt3からなる群より選択される、請求項１２に記載の核酸分子。
【請求項１４】
前記コア領域が以下：
2007306931.tif 000016
からなる群より選択されるDNA配列、および対応するまたは相補的なDNAまたはRNA配列、を含み、ここでＲ＝ＡまたはＧ；Ｋ＝ＧまたはＴ／Ｕ；Ｙ＝ＣまたはＴ／Ｕ；Ｗ＝ＡまたはＴ／Ｕ；Ｎ＝ＡまたはＣまたはＧまたはＴ／Ｕ；Ｓ＝ＣまたはＧ；およびＢ＝ＣまたはＧまたはＴ／Ｕである、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項１５】
前記コア領域が以下：
2007306931.tif 000017
からなる群より選択されるDNA配列、および対応するまたは相補的なDNAまたはRNA配列、を含む、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項１６】
核酸分子を作製するための方法であって、配列番号１〜１６の少なくとも１つに少なくとも90％の相同性を有する少なくとも１つのDNA配列を含む少なくとも１つの操作された組換え部位を有する核酸分子を提供する工程を包含する、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法により提供される核酸分子。
【請求項１８】
請求項１０に記載の核酸分子を含む組成物。
【請求項１９】
少なくとも１つの区画でその中に厳重な封じ込めで収容するように区画化された容器を含むキットであって、ここで第１の区画が請求項１８に記載の組成物を含む、キット。
【請求項２０】
前記組換え部位を認識する少なくとも１つの組換えタンパク質を有する第２の区画をさらに含む、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
請求項２２に記載の方法に有用である、単離された形態の少なくとも１つの組換えタンパク質をその中に厳重な封じ込めで収容するように区画化された容器を含むキット。
【請求項２２】
コインテグレートDNA分子を作製する方法であって、以下の工程：
インビトロにおいて
(i) 第１の組換え部位および第２の組換え部位により隣接される所望のDNAセグメントを含むインサートドナーDNA分子、ここで該第１の組換え部位および該第２の組換え部位は互いに組換えない；
(ii) 第３の組換え部位および第４の組換え部位を含むベクタードナーDNA分子、ここで、該第３の組換え部位および該第４の組換え部位は互いに組換えない；および
(iii) 該第１の組換え部位および該第３の組換え部位または該第２の組換え部位および該第４の組換え部位を組換え得る少なくとも１つの部位特異的組換えタンパク質；
を組み合わせ、それにより、組換えを生じさせ、その結果該第１の組換え部位および該第３の組換え部位または該第２の組換え部位および該第４の組換え部位を含むコインテグレートDNA分子を産生する工程、
を包含する、方法。
【請求項２３】
産物DNA分子が前記コインテグレートDNAから、(i) 前記第１の組換え部位および前記第３の組換え部位、または(ii) 前記第２の組換え部位および前記第４の組換え部位の少なくとも１つを組換えることにより産生され、該産物DNAが前記所望のDNAセグメントを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記方法がまた副産物DNA分子も産生する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記産物DNA分子について選択する工程をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記ベクタードナーDNA分子が前記第３の組換え部位および前記第４の組換え部位により隣接されるベクターセグメントを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記ベクタードナーDNA分子がさらに(a)毒性遺伝子および(b)選択マーカーを含み、ここで該毒性遺伝子および該選択マーカーが異なるDNAセグメント上に存在し、該DNAセグメントが(i) 環状DNA分子においては、２つの組換え部位、または(ii) 直鎖状DNA分子においては、１つの組換え部位、のいずれかにより分離されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記ベクタードナーDNA分子がさらに(a) 抑制カセット、および(b) 該抑制カセットのリプレッサーにより抑制される選択マーカーを含み、ここで該選択マーカーおよび該抑制カセットが異なるDNAセグメント上に存在し、該DNAセグメントが(i) 環状DNA分子においては、２つの組換え部位、または(ii) 直鎖状DNA分子においては、１つの組換え部位、のいずれかにより分離されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記インサートドナーDNA分子および前記ベクタードナーDNA分子の少なくとも１つが環状DNA分子である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記インサートドナーDNA分子および前記ベクタードナーDNA分子の少なくとも１つが直鎖状DNA分子である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
前記選択する工程がインビトロまたはインビボにおいて実施される、請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
前記組換えタンパク質が少なくとも第１の組換えタンパク質および第２の組換えタンパク質を含み、該第２の組換えタンパク質が該第１の組換えタンパク質と異なる、請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
前記組換えタンパク質がIntである、請求項２２に記載の方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１つの組換えタンパク質が(i) IntおよびIHF、ならびに(ii) Int、Xis、およびIHFから選択される、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、組換えＤＮＡ技術に関する。操作された組換え部位を有するDNAおよびベクターが、組換えタンパク質を用いるDNAセグメントの効率的かつ特異的な組換えを可能にする組換えクローニング方法における使用のために提供される。このDNA、ベクターおよび方法は、インビトロまたはインビボにおける、DNAのサブクローニングのような種々のDNA交換のために有用である。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術）
部位特異的リコンビナーゼ。部位特異的リコンビナーゼは、いくつかのウイルスおよび細菌において存在する酵素であり、そしてエンドヌクレアーゼ特性およびリガーゼ特性の両方を有すると特徴付けられている。これらのリコンビナーゼは（いくつかの場合においては会合タンパク質とともに）、DNA中の特異的塩基の配列を認識し、そしてそれらのセグメントに隣接するDNAセグメントを交換する。リコンビナーゼおよび会合タンパク質は、集合的に「組換えタンパク質」といわれる（例えば、非特許文献１；Landy, A., Current Opinion in Biotechnology 3:699-707 (1993)を参照のこと）。
【０００３】
種々の生物由来の多数の組換え系が記載されている。例えば、非特許文献２；Hoessら、Nucleic Acids Research 14(6):2287 (1986); 非特許文献３；Abremskiら、J. Biol. Chem. 261(1):391 (1986); 非特許文献４；Campbell, J. Bacteriol. 174(23):7495 (1992); 非特許文献５；Qianら、J. Biol. Chem. 267(11):7794 (1992); 非特許文献６；Arakiら、J. Mol. Biol. 225(1):25 (1992); 非特許文献７；MaeserおよびKahnmann (1991) Mol. Gen. Genet. 230:170-176。
【０００４】
これらの多くは、リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーに属する（非特許文献８；Argosら、EMBO J. 5:433-440 (1986)）。おそらく、これらの中で最も十分に研究されたのは、バクテリオファージλ由来のインテグラーゼ/att系（非特許文献９；Landy. A. Current Opinions in Genetics and Devel. 3:699-707 (1993)）、バクテリオファージP1由来のCre/loxP系（非特許文献１０；HoessおよびAbremski (1990) Nucleic Acids and Molecular Biology、第４巻、EcksteinおよびLilley編、Berlin-Heidelberg: Springer-Verlag; 90-109頁）、およびSaccharomyces serevisiae２μ環状プラスミド由来のFLP/FRT系（非特許文献１１；Broachら、Cell 29:227-234 (1982)）である。
【０００５】
これらの組換え系は特定の生物について特徴付けられたが、関連技術は、インビボにおける組換えについて、組換え部位により隣接される組換えDNAを用いて教示されたのみである。
【０００６】
Backman（特許文献１；米国特許第4,673,640号）は、野生型組換え部位attBおよびattPを用いる酵素的部位特異的組換えによりDNAセグメントを産生するタンパク質を組み換えるためのλリコンビナーゼのインビボにおける使用を開示する。
【０００７】
HasanおよびSzybalski（非特許文献１２；Gene 56:145-151 (1987)）は、プロモーターに隣接する野生型attP部位とattB部位との間の分子内組換えのためのインビボにおけるλIntリコンビナーゼの使用を開示する。これらの部位の方向は互いに関して逆であるので、これは目的の遺伝子に対して不可逆的なプロモーター領域のフリッピング（flipping）を引き起こす。
【０００８】
Palazzoloら、非特許文献１３；Gene 88:25-36 (1990)は、クローン化されるDNA配列の外側および野生型loxP部位間に配置された制限部位を含有するバクテリオファージλアームを有するファージλベクターを開示する。これらのファージベクターでの、Creリコンビナーゼを発現するE. coli細胞の感染は、loxP部位間での組換えおよびプラスミドレプリコン（クローン化cDNAを含む）のインビボ切り出しを生じる。
【０００９】
Posfaiら（非特許文献１４；Nucl. Acids Res. 22:2392-2398 (1994)）は、ゲノムDNA中へ、２つの野生型FRT認識配列により隣接される選択マーカーを有する部分的発現ベクターを挿入するための方法を開示する。細胞中に存在するFLP部位特異的リコンビナーゼが、ベクターをゲノム中に所定の部位において組み込むために使用される。レプリコンが機能的である条件下において、このクローン化ゲノムDNAは増幅され得る。
【００１０】
Bebeeら（特許文献２；米国特許第5,434,066号）は、２つのloxP部位を含むDNAのためのCreのような部位特異的リコンビナーゼの使用が部位間のインビボ組換えのために使用されることを開示する。
【００１１】
Boyd（非特許文献１５；Nucl. Acids Res. 21:817-821 (1993)）は、E. coli宿主細胞中に存在するCre部位特異的リコンビナーゼにより作用される野生型loxP部位を含有する脱リン酸化されたベクターの分子間連結を促進する条件を用いて平滑末端DNAのクローニングを容易にする方法を開示する。
【００１２】
Waterhouseら（特許文献３；PCT第93/19172号および非特許文献１６；Nucleic Acids Res. 21(9):2265 (1993)）は、特定の抗体のＬ鎖およびＨ鎖がloxPおよびloxP 511部位の間で異なるファージベクター中にクローン化され、そしてそれを使用して新たなE. coli細胞を形質転換するインビボ方法を開示する。Cre（宿主細胞において２つの親分子（１つはプラスミド、１つはファージ）に作用する）は４つの産物を平衡して産生した：２つの異なるコインテグレート（cointegrate）（loxP部位またはloxP 511部位のいずれかにおける組換えにより産生される）、および２つの娘分子（その１つが所望された産物であった）。
【００１３】
他の関連技術とは対照的に、SchlakeおよびBobe（非特許文献１７；Biochemistry 33:12746-12751 (1994)）は、各々が野生型およびスペーサー変異されたFRT組換え部位により隣接される、規定された染色体位置において発現カセットを交換するためのインビボ方法を開示する。二重交換交叉（double-reciprocal crossover）が部位特異的組換えのためにこのFLP/FRT系を用いることにより培養哺乳動物細胞において媒介された。
【００１４】
トランスポゼース。酵素トランスポゼースのファミリーもまた、レプリコン間で遺伝子情報を移動するために使用されている。トランスポゾンは構造的に可変性であるが（単純（simple）または複合（compound）と記載される）、代表的には逆方向に構成されるDNA配列により隣接されるリコンビナーゼ遺伝子をコードする。トランスポゾンの組み込みは、ランダムであり得るかまたは高度に特異的であり得る。Tn7（これは高度に部位特異的である）のような代表物が、レプリコン間のDNAセグメントのインビボにおける移動に適用された（非特許文献１８；Lucklowら、J. Viol. 67:4566-4579 (1993)）。
【００１５】
DevineおよびBoeke Nucl. Acids Res. 22:3765-3772 (1994)（非特許文献１９）は、DNAセグメントのインビトロにおけるレシピエントDNA分子中への挿入のための人工トランスポゾンの構築を開示する。この系は、酵母TY1ウイルス様粒子のインテグラーゼを利用する。目的のDNAセグメントは、標準的な方法を用いて、トランスポゾン様エレメントTY1の末端間にクローン化される。TY1インテグラーゼの存在下において、生じるエレメントは第２の標的DNA分子中へランダムに組み込まれる。
【００１６】
DNAクローニング。DNAセグメントのクローニングは、現在、多数の研究所における日常的な慣例として、そして多数の遺伝子解析における事前に必要な工程として生じている。しかし、これらのクローニングの目的は多様であり、２つの一般的な目的は以下にように考えられ得る：(1) 大きなDNAまたはRNAセグメント（染色体、YAC、PCRフラグメント、mRNAなど）からのDNAの最初のクローニング（pUC、pGem、pBlueScriptのような比較的少ない公知のベクターにおいて実施される）、および(2) これらのDNAセグメントの特殊化されたベクター中への機能的分析のためのサブクローニング。多量の時間および努力が、DNAセグメントの最初のクローニングにおいて、およびDNAセグメントの最初のクローニングベクターからより特殊化されたベクターへの移動においての両方で費やされている。この移動なサブクローニングと呼ばれる。
【００１７】
クローニングのための基本的な方法は長年知られており、そしてその時間でほとんど変化していない。代表的なクローニングプロトコルは以下とおりである：
(1) 目的のDNAを１つまたは２つの制限酵素で消化し；
(2) 既知の場合目的のDNAセグメントをゲル精製し；
(3) 適切な制限酵素での切断、アルカリホスファターゼでの処理、ゲル精製など（適切なように）によりベクターを調製し；
(4) 未切断および自己連結されたベクターのバックグラウンドを概算するための適切なコントロールを有して、DNAセグメントをベクターに連結し；
(5) 生じるベクターをE. coli宿主細胞中に導入し；
(6) 選択されたコロニーをひろい、そして小培養物を一晩増殖させ；
(7) DNAミニプレップを作製し；そして
(8) アガロースゲルで（しばしば診断的制限酵素消化の後）またはPCRにより、単離されたプラスミドを分析する。
【００１８】
DNAセグメントをサブクローニングするために使用される特殊化されたベクターは、機能的に多様である。これらは、以下を包含するがこれらに限定されない：種々の生物において遺伝子を発現させるための；遺伝子発現を調節するための；タンパク質精製を補助するためのまたは細胞におけるタンパク質の追跡を可能にするためのタグを提供するための；クローン化されたDNAセグメントを改変するための（例えば、欠失の生成）；プローブの合成のための（例えば、リボプローブ）；DNA配列決定のためのテンプレートの調製のための；タンパク質コード領域の同定のための；種々のタンパク質コード領域の融合のための；多量の目的のDNAを提供するための、などのベクター。特定の研究が、目的のDNAセグメントをいくつかの異なる特殊化されたベクター中へサブクローニングする工程を包含することは一般的である。
【００１９】
当該分野において公知であるように、単純なサブクローニングは１日で実施され得る（例えば、DNAセグメントは大きくなく、そして制限部位がサブクローニングベクターの制限部位と適合性である）。しかし、他の多くのサブクローニング（特に、未知の配列、長いフラグメント、毒性遺伝子、制限部位の不適切な配置、高いバックグラウンド、不純な酵素などを含むサブクローニング）は、数週間かかり得る。従って、DNAフラグメントのサブクローニングは、しばしば、可能な限り少ない回数で実施されるべき面倒な仕事であるとみなされる。
【００２０】
DNAセグメントのクローニングを容易にするいくつかの方法が、例えば以下の参考文献におけるように記載されている。
【００２１】
Ferguson, J.ら、Gene 16:191 (1981)（非特許文献２０）は、酵母DNAのフラグメントのサブクローニングのためのベクターのファミリーを開示する。このベクターは、カナマイシン耐性をコードする。より長い酵母DNAセグメントのクローンが部分的に消化され得、そしてサブクローニングベクター中に連結され得る。もとのクローニングベクターがアンピシリンに対する耐性を有する場合には、形質転換の前に精製は必要ではない。なぜなら、選択はカナマイシンについてであるからである。
【００２２】
Hashimoto-Gotoh, T.ら、Gene 41:125 (1986)(非特許文献２１)は、ストレプトマイシン感受性遺伝子内のユニークなクローニング部位を有するサブクローニングベクターを開示し；ストレプトマイシン耐性宿主において、優勢感受性遺伝子における挿入または欠失を有するプラスミドのみが、ストレプトマイシン選択を生き残る。
【００２３】
従って、制限酵素およびリガーゼを用いる伝統的なサブクローニング方法は、時間がかかり、そして比較的信頼できない。かなりの労働が費やされ、そして２日以上後に所望のサブクローンが候補プラスミドの中で見出され得なければ、次いで、全体のプロセスが計画される別の条件で繰り返されなければならない。部位特異的リコンビナーゼがDNAをインビボにおいて組換えるために使用されたが、インビトロにおけるこのような酵素の成功する使用は、いくつかの問題を抱えると予想された。例えば、部位特異性および効率は、インビトロにおいて異なると予想され；トポロジー的に連結された産物が予想され；そしてDNA基質および組換えタンパク質のトポロジーがインビトロにおいて顕著に異なると予想された（例えば、Adamsら、J. Mol. Biol. 226:661-73 (1992)(非特許文献２２)を参照のこと）。インビボにおいて長時間続き得る反応は、酵素が不活性になる前にインビトロにおいて顕著に短い時間で生じると予想された。複数のDNA組換え産物が使用される生物学的宿主において予想され、サブクローニングの不満足な信頼性、特異性または効率を生じた。インビトロ組換え反応は、所望のレベルの産物を生じるに十分に効率的であるとは予想されなかった。
【００２４】
従って、制限酵素およびリガーゼの公知の使用を超えて利点を提供する別のサブクローニング系を提供する長い間感じられていた必要が存在する。
【特許文献１】米国特許第4,673,640号
【特許文献２】米国特許第5,434,066号
【特許文献３】PCT第93/19172号
【非特許文献１】Landy, A., Current Opinion in Biotechnology 3:699-707 (1993)
【非特許文献２】Hoessら、Nucleic Acids Research 14(6):2287 (1986)
【非特許文献３】Abremskiら、J. Biol. Chem. 261(1):391 (1986)
【非特許文献４】Campbell, J. Bacteriol. 174(23):7495 (1992)
【非特許文献５】Qianら、J. Biol. Chem. 267(11):7794 (1992)
【非特許文献６】Arakiら、J. Mol. Biol. 225(1):25 (1992)
【非特許文献７】MaeserおよびKahnmann (1991) Mol. Gen. Genet. 230:170-176
【非特許文献８】Argosら、EMBO J. 5:433-440 (1986)
【非特許文献９】Landy. A. Current Opinions in Genetics and Devel. 3:699-707 (1993)
【非特許文献１０】HoessおよびAbremski (1990) Nucleic Acids and Molecular Biology、第４巻、EcksteinおよびLilley編、Berlin-Heidelberg: Springer-Verlag; 90-109頁
【非特許文献１１】Broachら、Cell 29:227-234 (1982)
【非特許文献１２】HasanおよびSzybalski（Gene 56:145-151 (1987)）
【非特許文献１３】Palazzoloら、Gene 88:25-36 (1990)
【非特許文献１４】Posfaiら（Nucl. Acids Res. 22:2392-2398 (1994)）
【非特許文献１５】Boyd（Nucl. Acids Res. 21:817-821 (1993)）
【非特許文献１６】Waterhouseら Nucleic Acids Res. 21(9):2265 (1993)
【非特許文献１７】SchlakeおよびBobe Biochemistry 33:12746-12751 (1994)
【非特許文献１８】Lucklowら、J. Viol. 67:4566-4579 (1993)
【非特許文献１９】DevineおよびBoeke Nucl. Acids Res. 22:3765-3772 (1994)
【非特許文献２０】Ferguson, J.ら、Gene 16:191 (1981)
【非特許文献２１】Hashimoto-Gotoh, T.ら、Gene 41:125 (1986)
【非特許文献２２】Adamsら、J. Mol. Biol. 226:661-73 (1992)
【発明の開示】
【００２５】
（発明の要旨）
本発明は、インビトロまたはインビボにおいて、組換えタンパク質および操作された組換え部位を用いる、キメラ核酸を得るための、核酸、ベクターおよび方法を提供する。これらの方法は、関連する背景技術において開示または示唆される方法より、高度に特異的であり、迅速でありかつ労働集約的でない。本発明の改善された特異性、スピードおよび収率は、任意の関連する目的のために有用なDNAまたはRNAのサブクローニング、調節または交換を容易にする。このような目的は、DNAセグメントのインビトロにおける組換えおよび転写される、複製される、単離されるまたはゲノムのDNAまたはRNAの、インビトロまたはインビボにおける挿入または改変を包含する。
【００２６】
本発明は、少なくとも１つの操作された組換え部位および少なくとも１つの組換えタンパク質を用いて、所望の特性（単数または複数）および／あるいはDNAセグメント（単数または複数）を有するキメラDNA分子を提供する、DNAのセグメントを移動または交換するための、核酸、ベクターおよび方法に関する。一般に、１つ以上の親DNA分子が組換えられて、１つ以上の娘分子を与え、その少なくとも１つが所望の産物DNAセグメントまたはベクターである。従って、本発明は、交換をもたらすための、ならびに／または１つ以上の所望の産物を選択するための、DNA、RNA、ベクターおよび方法に関する。
【００２７】
本発明の１つの実施態様は、キメラDNAの作製方法に関し、この方法は以下の工程を包含する
(a) インビトロまたはインビボにおいて
(i) 第１の組換え部位および第２の組換え部位により隣接される所望のDNAセグメントを含む、インサートドナーDNA分子、ここで第１および第２の組換え部位は互いに組換えない；
(ii) 第３の組換え部位および第４の組換え部位を含むベクタードナーDNA分子、ここで、第３および第４の組換え部位は互いに組換えない；
(iii) 第１および第３の組換え部位ならびに／または第２および第４の組換え部位を組換え得る１つ以上の部位特異的組換えタンパク質；
を組み合わせ；
【００２８】
それにより、組換えを生じさせ、その結果少なくとも１つのコインテグレートDNA分子、上記所望のDNAセグメントを含む少なくとも１つの所望の産物DNA分子、および任意に副産物DNA分子を産生する工程；および、次いで、任意に、
(b) 産物または副産物DNA分子について選択する工程。
本発明の別の実施態様は、少なくとも１つの容器（container）をその中に受けるまたは保持するように区画化されたキャリア（carrier）または入れ物（receptacle）を含むキットに関し、ここで、第１の容器は、本明細書に記載のように、クローニング部位または選択マーカーに隣接する少なくとも２つの組換え部位を有するベクターを含むDNA分子を含む。キットは任意に、以下を含む：
(i) その一方もしくは両方が１つ以上の操作された組換え部位により隣接される、サブクローニングベクターおよび／または選択マーカーを含むベクタードナープラスミドを含む第２の容器；ならびに／あるいは
(ii) 少なくとも１つの上記組換え部位を認識し、そして組換え得る、少なくとも１つの組換えタンパク質を含む第３の容器。
【００２９】
他の実施態様は、本発明の方法において有用なDNAおよびベクターを包含する。特に、ベクタードナー分子が１つの実施態様において提供され、ここでベクタードナー内のDNAセグメントが、(i) 環状ベクタードナーにおいて、少なくとも２つの組換え部位において、または(ii) 直鎖状ベクタードナーにおいて、少なくとも１つの組換え部位において、のいずれかにより分離され、ここで、組換え部位は、好ましくは、組換えの特異性または効率を増強するように操作される。
【００３０】
１つのベクタードナーの実施態様は、第１のDNAセグメントおよび第２のDNAセグメントを含み、第１または第２のセグメントは選択マーカーを含む。第２のベクタードナーの実施態様は、第１のDNAセグメントおよび第２のDNAセグメントを含み、第１または第２のDNAセグメントは、毒性遺伝子を含む。第３のベクタードナーの実施態様は、第１のDNAセグメントおよび第２のDNAセグメントを含み、第１または第２のDNAセグメントは、少なくとも１つの選択マーカーの不活性フラグメントを含み、ここで選択マーカーの不活性フラグメントは、第１または第２の組換え部位を少なくとも１つの選択マーカーの別の不活性フラグメントをわたって組み換えられる場合に機能的な選択マーカーを再構成し得る。
【００３１】
本発明の組換えクローニング方法は、以前のインビボ方法を超えていくつかの利点を有する。組換え産物の単一の分子が生物学的宿主中へ導入され得、他のDNA分子（例えば、出発分子、中間体、および副産物）の非存在下における所望の産物DNAの増殖が、より容易に実現される。反応条件は、酵素活性を最適化するように自由に調整され得る。DNA分子は、所望の生物学的宿主に非適合性であり得（例えば、YAC、ゲノムDNAなど）、使用され得る。多様な供給源由来の組換えタンパク質が、一緒にまたは逐次的に用いられ得る。
【００３２】
他の実施態様は、当該分野において公知であることと組み合わせて本明細書に含まれる教示から当業者に明らかである。
【００３３】
好ましい実施態様の詳細な説明
サブクローニング反応が組換えクローニングを用いて提供され得るこいうことが、本発明において予想外に見出された。本発明による組換えクローニングは、操作された組換え部位および組換えタンパク質を用いて、DNA分子のセグメントの移動または交換のために、インビトロおよびインビボにおいて、DNA、ベクターおよび方法を使用する。これらの方法は、所望の特性（単数または複数）および／あるいはDNAセグメント（単数または複数）を有するキメラDNA分子を提供する。
【００３４】
従って、本発明は、インビトロまたはインビボにおいて、組換えタンパク質および操作された組換え部位を使用して、キメラ核酸を得るための、核酸、ベクターおよび方法を提供する。これらの方法は、関連背景技術において開示または示唆された方法より、高度に特異的であり、迅速であり、そして労働集約的でない。本発明の改善された特異性、スピードおよび収率は、任意の関連する目的に有用である、DNAまたはRNAのサブクローニング、調節または交換を容易にする。このような目的としては、DNAセグメントのインビトロ組換え、および転写される、複製される、単離されるまたはゲノムのDNAまたはRNAのインビトロまたはインビボにおける挿入または改変が挙げられる。
【００３５】
定義
以下の記載において、組換えDNA技術において使用される多数の用語が多く利用される。明細書および請求の範囲（こような用語に与えられるべき範囲を含む）の明確かつ一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。
副産物：これは、サブクローン化されることが所望されるDNAを欠く、娘分子（組換えクローニングプロセスの間に第２の組換え事象の後に産生される新たなクローン）である。
コインテグレート：これは、親（出発）DNA分子の両方を含む、本発明の少なくとも１つの組換え中間体DNA分子である。これは通常環状である。いくつかの実施態様においては、これは直鎖状であり得る。
宿主：これは、組換えクローニング産物のレシピエントであり得る、任意の原核生物または真核生物であり得る。本明細書において用いられる用語「宿主」は、遺伝子操作され得る原核生物または真核生物を包含する。このような宿主の例については、Maniatisら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)を参照のこと。
【００３６】
インサート：これは、本発明の方法により操作しようとする、所望のDNAセグメント（図１のセグメントＡ）である。インサートは、１つ以上の遺伝子を有し得る。
【００３７】
インサートドナー：これは、インサートを有する、本発明の２つの親DNA分子のうちの１つである。インサートドナーDNA分子は、両方の末端において組換えシグナルに隣接されるインサートを含む。インサートドナーは直鎖状または環状であり得る。本発明の１つの実施態様において、インサートドナーは環状DNA分子であり、そして組換えシグナルの外側のクローニングベクター配列をさらに含む（図１を参照のこと）。
【００３８】
産物：これは、組換えクローニングプロセスの間に第２の組換え事象の後に産生される、ＡおよびＤまたはＢおよびＣ配列を含む所望の娘分子の一方または両方である（図１を参照のこと）。産物は、クローン化またはサブクローン化されるべきであったDNAを含む。
【００３９】
プロモーター：これは、開始コドンの近位に位置する、遺伝子の5'領域であると一般に記載されるDNA配列である。隣接するDNAセグメントの転写はプロモーター領域から開始される。抑制性プロモーターの転写速度は、抑制物質に応答して減少する。誘導性プロモーターの転写速度は、誘導物質に応答して増加する。構成性プロモーターの転写速度は、一般的な代謝条件の影響下で変化し得るが、特異的に調節されていない。
【００４０】
認識配列：認識配列は、タンパク質、DNAまたはRNA分子（例えば、制限エンドヌクレアーゼ、修飾メチラーゼ、またはリコンビナーゼ）が認識し、そして結合する、特定のDNA配列である。例えば、Creリコンビナーゼのための認識配列は、８塩基対のコア配列に隣接する２つの13塩基対の逆方向反復（リコンビナーゼ結合部位として作用する）を含む34塩基対の配列である、loxPである。Sauer, B., Current Opinion in Biotechnology 5:521-527 (1994)の図１を参照のこと。認識配列の他の例としては、リコンビナーゼ酵素であるλインテグラーゼにより認識される、attB、attP、attL、およびattR配列である。attBは、２つの９塩基対のコア型Int結合部位および７塩基対の重複領域を含む約25塩基対の配列である。attPは、コア型Int結合部位およびアーム型Int結合部位、ならびに補助タンパク質IHF、FIS、およびXisのための部位を含む約240塩基対の配列である。Landy, Current Opinion in Biotechnology 3:699-707 (1993)を参照のこと。このような部位はまた、方法および産物を増強するように、本発明に従って操作される。
【００４１】
リコンビナーゼ：これは、特異的な組換え部位におけるDNAセグメントの交換を触媒する酵素である。
【００４２】
組換えクローニング：これは、本明細書において記載される方法であって、これによりDNA分子のセグメントが、インビトロまたはインビボにおいて、交換、挿入、置換（replace）、置換（substitute）または改変される。
組換えタンパク質：これは、１つ以上の組換え部位が関与する組換え反応に関与する、切り出しタンパク質または組み込みタンパク質、酵素、補因子または会合タンパク質を包含する。Landy (1994)（下記）を参照のこと。
抑制カセット：これは、サブクローニングベクター中に存在する選択マーカーのリプレッサーを含むDNAセグメントである。
【００４３】
選択マーカー：これは、しばしば特定の条件下で、それを含有する分子または細胞について、あるいはそれを含有する分子または細胞に対して選択することを可能にする、DNAセグメントである。これらのマーカーは、RNA、ペプチド、またはタンパク質の産生のような（これらに限定されない）活性をコードし得るか、あるいは、RNA、ペプチド、タンパク質、無機および有機化合物または組成物などのための結合部位を提供し得る。選択マーカーの例としては以下が挙げられるがそれらに限定されない：(1) そうでなければ毒性の化合物（例えば、抗生物質）に対する耐性を提供する産物をコードするDNAセグメント；(2) そうでなければレシピエント細胞において欠如している産物をコードするDNAセグメント（例えば、tRNA遺伝子、栄養要求マーカー）；(3) 遺伝子産物の活性を抑制する産物をコードするDNAセグメント；(4) 容易に同定され得る産物をコードするDNAセグメント（例えば、βガラクトシダーゼ、グリーン蛍光タンパク質（GFP）、および細胞表面タンパク質のような表現型マーカー）；(5) そうでなければ細胞の生存および／または機能に有害である産物に結合するDNAセグメント；(6) そうでなければ上記番号(1)〜(5)に記載のDNAセグメントのいずれかの活性を阻害するDNAセグメント（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）；(7) 基質を修飾する産物に結合するDNAセグメント（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）；(8) 所望の分子（例えば、特異的タンパク質結合部位）を単離するために使用され得るDNAセグメント；(9) そうでなければ非機能性であり得る特異的ヌクレオチド配列をコードするDNAセグメント（例えば、分子の亜集団のPCR増幅のための）；および／または(10) 存在しない場合、直接的または間接的に、特定の化合物に対する感受性を与えるDNAセグメント。
【００４４】
選択スキーム：これは、インサートドナー、ベクタードナー、および／または任意の中間体、（例えば、コインテグレート）副産物を含む混合物からの、所望の産物（単数または複数）の、選択、富化、または同定を可能にする任意の方法である。１つの好ましい実施態様の選択スキームは、組換えクローニングの間に連結されているまたは連結されていないのいずれかである、少なくとも２つの成分を有する。一方の成分は選択マーカーである。他方の成分は、選択マーカーのインビトロまたはインビボにおける発現、あるいは選択マーカーを有するプラスミドを有する細胞の生存を制御する。一般的に、この制御エレメントは、選択マーカーのリプレッサーまたはインデューサーであるが、選択マーカーの発現を制御するための他の手段が使用され得る。リプレッサーが使用されるかアクチベーターが使用されるかは、当業者に容易に明らかなように、マーカーがポジティブ選択用であるかネガティブ選択用であるか、および種々のDNAセグメントの正確な配列に依存する。好ましい必要性は、選択スキームが１つ以上の所望の産物のみの選択または富化を生じることである。本明細書において定義されるように、DNA分子について選択することは、(a) 所望のDNA分子の存在について選択または富化すること、および(b) 所望のDNA分子でないDNA分子の存在に対して選択または富化することを包含する。
【００４５】
１つの実施態様において、選択スキーム（これは、逆に実施され得る）は、３つの形態のうちの１つをとり、これは図１に関して議論される。第１（選択マーカーおよびそのリプレッサーについて本明細書において例証される）は、セグメントＤを有し、そしてセグメントＣを欠く分子について選択する。第２は、セグメントＣを有する分子に対しておよびセグメントＤを有する分子について選択する。第２の形態の可能な実施態様は、その中にインビトロ反応産物が導入されるべき細胞に対して毒性の遺伝子を有するDNAセグメントを有する。毒性遺伝子は、毒性遺伝子産物（毒性タンパク質またはRNA）として発現されるDNAであり得るか、またはそれ自体もしくはそれだけで毒性であり得る。（後者の場合において、毒性遺伝子はその古典的な定義の「遺伝性の特性（heritable trait）」を有すると理解される。）
【００４６】
このような毒性遺伝子産物の例は当該分野において周知であり、そして、制限エンドヌクレアーゼ（例えば、DpnI）および抑制機能の非存在下で宿主を傷害する遺伝子（例えば、kicB）を包含するがそれらに限定されない。あるいは、毒性遺伝子はインビトロにおいて選択され得る（例えば、制限部位）。
【００４７】
第２の形態において、セグメントＤは選択マーカーを有する。毒性遺伝子は、ベクタードナー、コインテグレート、および副産物分子を有する形質転換体を除去するが、選択マーカーは、産物を含有する細胞について、およびインサートドナーのみを有する細胞に対して選択するために使用され得る。
【００４８】
第３の形態は、同一の分子上にシスでセグメントＡおよびセグメントＤの両方を有する細胞については選択するが、異なる分子上にトランスに両方のセグメントを有する細胞については選択しない。これは、２つの不活性なフラグメント（各々１つがセグメントＡおよびＤ上にある）に分割される選択マーカーにより具体化され得る。
【００４９】
フラグメントは、セグメントが組換え事象により一緒にされるときに、それらが機能性の選択マーカーを再構成するように、組換え部位に関して配列される。例えば、組換え事象はプロモーターを構造遺伝子と連結し得る、構造遺伝子の２つのフラグメントを連結し得る、または生存のために必要なヘテロダイマー遺伝子産物をコードする遺伝子を連結し得る、またはレプリコンの部分を連結し得る。
【００５０】
部位特異的リコンビナーゼ：これは、代表的には少なくとも以下の４つの活性を有するリコンビナーゼの型である：(1) １つまたは２つの特異的DNA配列の認識；(2) 前記DNA配列（単数または複数）の切断；(3) 鎖交換に関与するDNAトポイソメラーゼ活性；および(4) DNAの切断された鎖の再封鎖をするDNAリガーゼ活性。Sauer, B., Current Oponions in Biotechnology 5:521-527 (1994)を参照のこと。保存的部位特異的組換えは、両方のパートナーについての高度の特異性により、相同組換えおよび転位から区別される。鎖交換機構は、DNA合成の非存在下における特異的DNA配列の切断および再結合を含む（Landy, A. (1989) Ann. Rev. Biochem. 58:913-949）。
【００５１】
サブクローニングベクター：これは、適切なレプリコンを含む環状または直鎖状DNA分子を含むクローニングベクターである。本発明において、サブクローニングベクター（図１におけるセグメントＤ）はまた、最終産物中に組み込まれて、クローン化されたDNAインサート（図１におけるセグメントＡ）に対してまたはそれともに作用することが所望される、機能性および／または調節エレメントを含み得る。サブクローニングベクターはまた、選択マーカー（図１におけるセグメントＣに含まれる）を含み得る。
【００５２】
ベクター：これは、インサートに、有用な生物学的または生化学的性質を提供するDNAである。例としては、インビトロまたは宿主細胞において複製し得るかまたは複製され得る、あるいは所望のDNAセグメントを宿主細胞内の所望の位置に運搬し得る、プラスミド、ファージ、および他のDNA配列が挙げられる。ベクターは、そこにおいてDNA配列が、ベクターの本質的な生物学的機能の損失なしに決定可能な様式で切断され得、そしてその中にDNAフラグメントが、その複製およびクローニングを生じさせるためにスプライスされ得る、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有し得る。ベクターは、プライマー部位（例えば、PCRのための）、転写および／または翻訳開始および／または調節部位、組換えシグナル、レプリコン、選択マーカーなどをさらに提供し得る。明らかに、相同組換えまたは制限酵素の使用を必要としない所望のDNAフラグメントの挿入方法（例えば（これらに限定されない）、PCRフラグメントのUDGクローニング（米国特許第5,334,575号、その全体が本明細書中に参考として援用される）、T:Aクローニングなど）はまた、本発明に従って使用されるべきクローニングベクター中へDNAのフラグメントをクローン化するために適用され得る。クローニングベクターは、クローニングベクターで形質転換された細胞の同定における使用のために適切な選択マーカーをさらに含み得る。
【００５３】
ベクタードナー：これは、所望の産物の部分になるべきDNAベクターをコードするDNAセグメントを有する、本発明の２つの親DNA分子の１つである。ベクタードナーは、組換え部位により隣接される、サブクローニングベクターＤ（または、インサートドナーが既にクローニングベクターを含まない場合、これはクローニングベクターと呼ばれ得る）およびセグメントＣを含む（図１を参照のこと）。セグメントＣおよび／またはＤは、選択スキームについて上記したように、所望の産物娘分子についての選択に貢献するエレメントを含み得る。組換えシグナルは、同一であるかまたは異なり得、そして同一のまたは異なるリコンビナーゼにより作用され得る。さらに、ベクタードナーは直鎖状または環状であり得る。
【００５４】
説明
本発明のインビトロまたはインビボ方法についての１つの一般的なスキームを図１に示す。ここでインサートドナーおよびベクタードナーは、環状または直鎖状DNAのいずれかであり得るが、環状として示す。ベクターＤは、もとのクローニングベクターＡを交換する。エレメントＡおよびＤを含む娘ベクターについて、および１つ以上のコインテグレート（単数または複数）を含む他の分子に対して選択することが所望される。四角および丸は、組換え部位の異なる組である（例えば、lox部位またはatt部位）。セグメントＡまたはＤは、Ｄがこの例において使用される場合、少なくとも１つの選択マーカー、発現シグナル、複製起点、あるいは欠失、選択、発現、マッピングまたはDNA配列決定のための特殊化された機能を含み得る。
【００５５】
エレメントＡまたはＤの部分であり得る所望のDNAセグメントの例は、PCR産物、大きなDNAセグメント、ゲノムクローンまたはフラグメント、cDNAクローン、機能性エレメントなど、および有用な核酸またはタンパク質をコードする遺伝子または部分的遺伝子を包含するが、それらに限定されない。さらに、本発明の組換えクローニングは、タンパク質発現および／または遺伝子治療のための、エクスビボおよびインビボ遺伝子移入ビヒクルを作製するために使用され得る。
【００５６】
図１において、スキームは以下のようにベクターＤおよびＡを含む所望の産物を提供する。インサートドナー（ＡおよびＢを含む）は、組換えタンパク質により、ベクタードナー（ＣおよびＤを含む）と四角の組換え部位においてまず組換えて、Ａ-Ｄ-Ｃ-Ｂの各々を有するコインテグレートを形成する。次に、丸の組換え部位において組換えが生じて、産物DNA（ＡおよびＤ）ならびに副産物DNA（ＣおよびＢ）を形成する。しかし、所望であれば、２つ以上の異なるコインテグレートが形成されて、２つ以上の産物を生成し得る。
【００５７】
本発明のインビトロまたはインビボ組換えクローニング方法の１つの実施態様において、少なくとも１つの所望の産物DNAを選択するための方法が提供される。これは、図２に示されるプラスミドpEZC726のマップの考慮により理解され得る。２つの例示的な組換え部位は、attPおよびloxPである。これらの部位により規定される１つのセグメント上に、そのプロモーターがトランスポゾンTn10由来のtetOPオペレーター／プロモーターにより置換されているカナマイシン耐性遺伝子が存在する。tetリプレッサータンパク質の非存在下において、E. coli RNAポリメラーゼは、tetOPからカナマイシン耐性遺伝子を転写する。tetリプレッサーが存在する場合、それはtetOPに結合し、そしてカナマイシン耐性遺伝子の転写をブロックする。pEZC726の他のセグメントは、構成性プロモーターにより発現されるtetリプレッサー遺伝子を有する。従って、pEZC726により形質転換される細胞は、tetRと同じセグメント上のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のためにクロラムフェニコールに耐性であるが、カナマイシンに感受性である。組換え反応は、tetR遺伝子の調節されたカナマイシン耐性遺伝子からの分離を生じる。この分離は、所望の組換え産物のみを受ける細胞においてカナマイシン耐性を生じる。
【００５８】
２つの異なる組のプラスミドを、インビトロ方法を実証するために構築した。Creリコンビナーゼのみのでの使用のための１つの組（クローニングベクター602およびサブクローニングベクター629（図３））は、loxPおよびloxP 511部位を含んだ。Creおよびインテグラーゼでの使用のための第２の組（クローニングベクター705およびサブクローニングベクター726（図２））は、loxPおよびatt部位を含んだ。所望の娘プラスミドの産生の効率は、Cre単独を使用してよりも、両方の酵素を使用して、約60倍高かった。Cre単独反応由来の24コロニー中19が、所望の産物を含んだが、インテグラーゼ＋Cre反応由来の38コロニー中38が、所望の産物プラスミドを有した。
【００５９】
他の選択スキーム  それらがそのために組換えクローニングが実施される特定の目的に適合し得るとして当該分野において公知である種々の選択スキームが、使用され得る。個々の嗜好および要求に依存して、多数の異なる型の選択スキームが本発明の組換えクローニング方法において使用され得る。当業者は、多数のDNAセグメントまたはそれらを作製するための方法、および当該分野において慣例的に使用される異なる選択方法の利用可能性を利用し得る。このようなDNAセグメントは、活性（RNA、ペプチド、もしくはタンパク質の産生を包含するが、これらに限定されない）をコードするDNAセグメント、またはこのようなRNA、ペプチド、またはタンパク質のための結合部位を供給するDNAセグメントを包含するが、これらに限定されない。選択スキームの案出において使用されるDNA分子の例は、「選択スキーム」の定義のもとに、上記に与えられる。
【００６０】
さらなる例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：
【００６１】
(i) PCRのための新たなプライマー部位の生成（例えば、以前は並置されていなかった２つのDNA配列の並置）；
(ii) 制限エンドヌクレアーゼまたは他のDNA修飾酵素、化学物質、リボザイムなどにより作用されるDNA配列の含有；
(iii) DNA結合タンパク質、RNA、DNA、化学物質などにより認識されるDNA配列の含有（例えば、集団についての選択または集団からの排除のためのアフィニティータグとしての使用のための）（Davis, Nucl. Acids Res. 24:702-706 (1996); J. Virol. 69: 8027-8034 (1995)）；
(iv) ランダマイズされ、そしてcDNA由来のRNAライブラリーを用いることによる、エプスタインバールウイルスに発現されるRNAに会合するリボソームL22タンパク質についてのRNAリガンドのインビトロ選択；
(vi) その活性が特異的方向および並置を必要とする機能性エレメント（例えば、(a) トランスでは弱く反応するが、シスに配置されると、適切なタンパク質の存在下において、分子の特定の集団を破壊する組換え（例えば、インビトロRNA合成を可能にするプロモーター配列の再構成）を生じる組換え部位）の配置。RNAは直接使用され得るか、または逆転写されて所望のDNA構築物を得ることが出来る；
(vii) 分子（単数または複数）のサイズ（例えば、分画）または他の物理的性質による所望の産物の選択；および
(viii) その同定を可能にする特異的修飾（例えば、メチル化）のために必要とされるDNA配列の含有。
本発明の方法における産物および副産物の形成後、特定の組換えクローニング手順において任意に案出された特定の選択スキームに依存して、選択工程はインビトロまたはインビボのいずれかにおいて実施され得る。
【００６２】
例えば、選択のインビトロ方法は、インサートドナーおよびベクタードナーDNA分子について案出され得る。このようなスキームは、組換え事象の後に、希な切断部位が副産物中に至るように、出発環状ベクターにおいて希な制限部位を操作することを含む。従って、希な制限部位を結合し、そしてそれを切断する制限酵素がインビトロにおいて反応混合物に添加されると、希な切断部位を有するDNA分子（すなわち、出発DNA分子、コインテグレート、および副産物）の全ては、切断され、そして意図される宿主細胞において複製不能にされる。例えば、セグメントＢおよびＣにおける切断部位（図１を参照のこと）は、産物以外のすべての分子に対して選択するために使用され得る。あるいは、セグメントＤについて（例えば、Ｂ上に見出されない薬剤耐性遺伝子により）選択し得る場合、Ｃにおける切断部位のみが必要とされる。
【００６３】
同様に、直鎖状DNA分子を扱う場合、インビトロ選択方法が案出され得る。PCRプライマーに相補的なDNA配列が、産物分子にのみ、組換えクローニング方法を介して、移入されるように操作され得る。反応が完了した後、適切なプライマーが反応溶液に添加され、そしてサンプルがPCRに供される。従って、産物分子の全てまたは一部が増幅される。
【００６４】
他のインビボ選択スキームが、種々のE. coli細胞株を用いて使用され得る。１つのスキームは、サブクローニングプラスミドの一方のセグメント上にリプレッサー遺伝子を、そして同じプラスミドの他方のセグメント上にそのリプレッサーにより制御される薬剤マーカーを置くことである。別のスキームは、サブクローニングプラスミドのセグメントＣ上にキラー（killer）遺伝子を置くことである（図１）。もちろん、このようなプラスミドを増殖させるための方法が存在しなくてはならない。すなわち、それにおいてキラー遺伝子が死滅させない状況が存在しなければならない。E. coliの特定の株を必要とする公知の多数の遺伝子が存在する。１つのこのようなスキームは、制限酵素DpnI（これは、その認識配列GATCがメチル化されない限り切断しない）を使用することである。多数の普及した一般的なE. coli株はGATC配列をメチル化するが、その中でクローン化されたDpnIが害なしに発現され得る変異体が存在する。
【００６５】
もちろん、類似の選択スキームが他の宿主生物のために案出され得る。例えば、Tn10のtetリプレッサー／オペレーターが真核生物において遺伝子発現を制御するように適合させられた（Gossen, M.,およびBujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551 (1992)）。従って、本明細書において例証されるtetリプレッサーによる薬剤耐性の同じ制御が、真核生物細胞において産物を選択するために適用され得る。
【００６６】
組換えタンパク質
本発明において、DNAセグメントの交換は、組換えタンパク質(リコンビナーゼならびに会合する補因子およびタンパク質を含む)の使用によって達成される。種々の組換えタンパク質が当該分野において記載されている。このようなリコンビナーゼの例には以下が含まれる：
【００６７】
Cre:  バクテリオファージP1由来のタンパク質(AbremskiおよびHoess、J.Biol.Chem. 259(3):1509-1514 (1984))は、loxP(交叉の遺伝子座)部位と呼ばれる34bp DNA配列間の交換を触媒する(すなわち、組換えを引き起こす)(Hoessら、Nucl.Acids Res. 14(5):2287 (1986)を参照のこと)。Creは市販されている(Novagen、カタログNo.69247-1)。Creによって媒介される組換えは、自由に可逆的である。熱力学的考察からは、Cre媒介性組み込み(１つの分子を形成する２つの分子間の組換え)が、Cre媒介性切り出し(２つの娘分子を形成する同一分子中の２つのloxP部位間の組換え)より、はるかに効率的でないことは驚くべきことではない。Creは、当該分野において周知のように、補因子としてマグネシウムまたはスペルミジンのいずれかを含む単純な緩衝液中で働く。DNA基質は、直鎖状または超らせん状のいずれかであり得る。多くの変異体loxP部位が記載されている(Hoessら、前掲)。これらの１つloxP 511は、別のloxP 511部位と組換えるが、loxP部位とは組み換えない。
【００６８】
インテグラーゼ：λゲノムのE.coli染色体への組み込みを媒介する、バクテリオファージλ由来のタンパク質。バクテリオファージλInt組換えタンパク質は、溶原状態の形成または誘導の一部として、その基質att部位間の不可逆的な組換えを促進する。組換え反応の可逆性は、組み込み組換えおよび切り出し組換えのための２つの独立した経路から生じる。各経路は特有であるが重複する、att部位DNAを含む15のタンパク質結合部位のセットを使用する。４つのタンパク質(Int、Xis、IHFおよびFIS)が関与する協同的および競合的相互作用が組換えの方向を決定する。
【００６９】
組み込み組換えには、IntおよびIHFタンパク質、ならびに部位attP(240 bp)およびattB(25 bp)が関与する。組換えは、２つの新たな部位：attLおよびattRの形成を生じる。切り出し組換えは、attPおよびattBを生成するために、Int、IHF、およびXis、ならびに部位attLおよびattRを必要とする。特定の条件下で、FISは、切り出し組換えを刺激する。これらの正常な反応に加えて、attPおよびattBは、同一分子上に配置される場合、切り出し組換えを促進して２つの切り出し産物(attLを有するものおよびattRを有するもの)を生成し得ることを理解すべきである。同様に、attLを含む分子とattRを含む分子との間での分子間組換えは、Int、IHFおよびXisの存在下で、組み込み組換えならびにattPおよびattBの生成を生じ得る。従って、DNAセグメントを、操作したatt部位の適切な組合せと隣接させることによって、適切な組換えタンパク質の存在下で、切り出し組換えまたは組み込み組換えを、互いの逆反応として導き得る。
【００７０】
att部位のそれぞれは、15bpのコア配列を含む。機能的重要性の個々の配列エレメントは、この共通コアの境界の範囲内に、外側に、およびその境界を横切って存在する(Landy,A., Ann.Rev.Biochem. 58:913 (1989))。種々のatt部位間の効率的な組換えは、中心共通領域の配列が組換えパートナー間で同一であることを必要とする。しかし、現在は、正確な配列は改変可能であることが見出されている。その結果、コア内に変化を有する、att部位の誘導体が、少なくとも天然のコア配列と同程度に効率的に組換えることが、現在は見出されている。
【００７１】
インテグラーゼはバクテリオファージλ上のattP部位(約240 bp)をE.coliゲノム上のattB部位(約25 bp)と組換えて(Weisberg,R.A.およびLandy,A. Lambda II、p.211 (1983)、Cold Spring Harbor Laboratory)、attL(約100 bp)およびattR(約160 bp)部位によって隣接された、組み込まれたλゲノムを生成するように作用する。Xisの非存在下(下記参照のこと)で、この反応は本質的に不可逆的である。インテグラーゼおよびIHFによって媒介される組み込み反応は、インビトロで、スペルミジンを含む単純な緩衝液を用いて働く。インテグラーゼは、Nash,H.A.、Methods of Enzymology 100:210-216(1983)によって記載されるように入手され得る。IHFは、Filutowicz,M.ら、Gene 147:149-150 (1994)によって記載されるように入手され得る。
【００７２】
λタンパク質Xis(切り出し)の存在下で、インテグラーゼは、attRとattLとの反応を触媒してattPおよびattBを形成する。すなわち、インテグラーゼは、上記の反応の逆転を促進する。この反応もまた、本発明において適用され得る。
【００７３】
他の組換え系。種々の生物由来の多くの組換え系もまた、本明細書中に提供される教示およびガイダンスに基づいて、使用され得る。例えば、Hoessら、Nucleic Acids Research 14(6):2287 (1986)；Abremskiら、J.Biol.Chem. 261(1):391 (1986)；Campbell、J.Bacteriol. 174(23):7495 (1992)；Qianら、J.Biol.Chem. 267(11):7794(1992)；Arakiら、J.Mol.Biol. 225(1):25 (1992)を参照のこと。これらの多くは、リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーに属する(Argosら、EMBO J. 5:433-440 (1986))。おそらく、これらのうち、バクテリオファージλ由来のインテグラーゼ/att系(Landy,A. (1993) Current Opinions in Genetics and Devel. 3:699-707)、バクテリオファージP1由来のCre/loxP系(HoessおよびAbremski (1990) Nucleic Acids and Molecular Biology、第４巻、EcksteinおよびLilley編、Berlin-Heidelberg:Springer-Verlag；90-109頁)、およびSaccharomyces cerevisiae２μ環状プラスミド由来のFLP/FRT系(Broachら、Cell 29:227-234 (1982))が、最も良く研究されている。
【００７４】
部位特異的リコンビナーゼの第２のファミリーのメンバーであるリゾルベースファミリー(例えば、γδ、Tn3リゾルベース、Hin、Gin、およびCin)もまた公知である。リコンビナーゼのこの高度に関連するファミリーのメンバーは、代表的には、分子内反応(例えば、反転および切り出し)に制約され、そして宿主がコードする因子を必要とし得る。宿主因子の要求性のいくつか(MaeserおよびKahnmann (1991) Mol.Gen.Genet. 230:170-176)および分子内組換えの制約のいくつかを軽減する変異体が単離されている。
【００７５】
λIntに類似の他の部位特異的リコンビナーゼおよびP1 Creに類似の他の部位特異的リコンビナーゼは、IntおよびCreを置換し得る。このようなリコンビナーゼは公知である。多くの場合、このような他のリコンビナーゼの精製は、当該分野において記載されている。それらが公知でない場合、細胞抽出物が使用され得るか、またはCreおよびIntについて記載された手順を使用して、酵素が部分的に精製され得る。
【００７６】
CreおよびIntが例として詳細に記載されているが、多くの関連するリコンビナーゼ系が存在し、そして記載された発明に対するそれらの適用もまた、本発明に従って提供される。部位特異的リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーは、バクテリオファージλ、φ80、P22、P2、186、P4およびP1によりコードされる部位特異的組換えタンパク質のような、本発明のための別の組換えタンパク質および組換え部位を提供するために使用され得る。この群のタンパク質は、配列の予想し得ないほど大きな多様性を示す。この多様性にも関わらす、すべてのリコンビナーゼは、そのＣ末端側の半分においてアラインされ得る。
【００７７】
Ｃ末端付近の40残基領域は、すべてのタンパク質において、特によく保存されており、そして酵母２μプラスミドFlpタンパク質のＣ末端付近の領域と相同である。３つの位置がこのファミリー内で完全に保存されている：ヒスチジン、アルギニンおよびチロシンが、よく保存されたＣ末端領域内のそれぞれのアラインメント位置396、399および433に見出される。これらの残基は、このファミリーのリコンビナーゼの活性部位に寄与し、そしてチロシン-433が鎖切断および再結合の間にDNAと一時的に共有結合を形成することを示唆する。例えば、Argos,P.ら、EMBO J. 5:433-40 (1986)を参照のこと。
【００７８】
あるいは、IS231および他のBacillus thuringiensisの転移因子が、組換えタンパク質および組換え部位として使用され得る。Bacillus thuringiensisは、その毒性が、農業的な有害生物ならびにヒトおよび動物の疾患のベクターに対して活性である、胞子嚢中のデルタエンドトキシン結晶の存在に起因する、昆虫病原性(entomopathogenic)細菌である。これらの毒素タンパク質をコードする遺伝子のほとんどは、プラスミドに保有され、そして一般に、挿入配列(IS231、IS232、IS240、ISBT1およびISBT2)ならびにトランスポゾン(Tn4430およびTn5401)と構造的に関連している。これらの可動要素のいくつかは活性であり、そして結晶遺伝子の可動性に関与し、そのことによって細菌毒性の変動に寄与することが示されている。
【００７９】
イソIS231エレメントの構造分析により、それらがClostridium perfringens由来のIS1151に関連し、そしてEscherichia coli由来のIS4およびIS186に遠縁に関連する。他のIS4ファミリーのメンバーと同様に、それらは、他のISファミリーおよびレトロウイルスに見出される、保存されたトランスポゼース−インテグラーゼモチーフを含む。
【００８０】
さらに、Escherichia coliのIS231Aから収集した機能的データは、特異的な標的に対して優先性を有する、非複製様式の転位を示す。同様な結果はまた、Bacillus subtilisおよびB.thuringiensisにおいても得られた。例えば、Mahillon,J.ら、Genetica 93:13-26(1994)；Campbell、J.Bacteriol. 7495-7499 (1992)を参照のこと。
【００８１】
組換え反応を駆動するために添加されるリコンビナーゼの量は、公知のアッセイを用いることによって決定され得る。詳細には、力価アッセイを使用して、精製されたリコンビナーゼ酵素の適切な量または抽出物の適切な量を決定する。
【００８２】
操作された組換え部位。上記リコンビナーゼおよび対応するリコンビナーゼ部位は、本発明に従う組換えクローニングにおける使用に適切である。しかし、野生型組換え部位は、本発明の方法において適用されるような、組換え反応の効率または特異性を低下させる配列を含む。例えば、attB、attR、attP、attLおよびloxP組換え部位における複数の終止コドンが、両方の鎖上の複数のリーディングフレーム中に生じる。従って、組換えの効率は、例えば、コード配列が組換え部位を横切らなければならない(１つのリーディングフレームのみがloxPおよびattB部位の各鎖上で利用可能である)場合、低下するか、または(attP、attRもしくはattLにおいて)不可能である。
【００８３】
従って、本発明はまた、これらの問題を克服する操作された組換え部位を提供する。例えば、att部位は、組換え反応の特異性または効率および産物DNAの性質を増強するために(例えば、att1、att2、およびatt3部位)、逆反応を減少させるために(例えば、attBからのP1およびH1の除去)、１または複数の変異を有するように操作され得る。これらの変異体の試験は、どの変異体が、本発明に従う組換えサブクローニングに適切であるに十分な組換え活性を生じるかを決定する。
【００８４】
従って、変異は、部位特異的組換えを増強するために組換え部位に導入され得る。このような変異には、翻訳終止コドンを有さない組換え部位(これは、融合タンパク質がコードされることを可能にする)；同一のタンパク質によって認識されるが塩基配列が異なる組換え部位(その結果、これらは、それらの相同なパートナーと大きくまたは排他的に反応して、複数の意図されるべき反応を可能にする)が含まれれが、これらに限定されない。どの特定の反応が生じるかは、どの特定のパートナーが反応混合物中に存在するかによって特定され得る。例えば、三部分タンパク質融合体は、組換え部位attR1およびattR2；attL1およびattL3；ならびに/またはattR3およびattL2を含む親プラスミドを用いて達成され得る。
【００８５】
特定の変異を核酸配列に導入するための周知の手順が存在する。これらの多くはAusubel,F.M.ら、Current Protocols in Molecular Biology(Wiley Interscience, New York (1989-1996))に記載されている。変異は、オリゴヌクレオチド中に設計され得、これは、既存のクローニングされた配列を改変するために、または増幅反応において使用され得る。所望の変異体DNAまたはRNAを単離するために適切な選択方法が利用可能である場合、ランダム変異誘発もまた用いられ得る。所望の変異の存在は、核酸を周知の方法によって配列決定することにより確認され得る。
【００８６】
以下の限定されない方法が、所定の組換え部位のコア領域を操作して、本発明における使用に適切な変異した部位を提供するために、使用され得る：
１．部位特異的(例えば、attBを得るためのattLおよびattR)組換え機構または他の(例えば、相同)組換え機構による２つの親DNA配列の組換えによる。DNA親DNAセグメントは、最終的なコア配列を生じる１またはそれ以上の塩基変化を含む；
２．所望のコア配列の直接的な変異または変異誘発(部位特異的、PCR、ランダム、自発的など)による；
３．組み換えられて所望のコア配列を生じる親DNA配列の変異誘発(部位特異的、PCR、ランダム、自発的など)による；および
４．所望のコア配列をコードするRNAの逆転写による。
【００８７】
変異体組換え部位の機能性は、所望の特定の特性に依存する方法で示され得る。例えば、組換え部位における翻訳終止コドンの欠如は、適切な融合タンパク質を発現させることによって示され得る。相同なパートナー間の組換えの特異性は、適切な分子をインビトロ反応に導入し、そして組換え産物について、本明細書中に記載したように、または当該分野において公知のように、アッセイすることによって、示され得る。組換え部位における他の所望の変異は、制限部位、翻訳または転写開始シグナル、タンパク質結合部位、および核酸塩基配列の他の公知の機能が存在することまたは存在しないことを包含し得る。組換え部位における特定の機能的特性に関する遺伝子選択スキームは、公知の方法の工程に従って使用され得る。例えば、(相互作用しない一対の部位から)相互作用するパートナーを提供するための部位の改変は、毒性物質をコードするDNA配列のこれら部位間の組換えを介しての欠失を要求することよって達成され得る。同様に、翻訳終止配列を除去する部位についての選択、タンパク質結合部位の存在または非存在などは、当業者によって容易に案出され得る。
【００８８】
従って、本発明は、選択マーカーおよび/または所望のDNAセグメントに隣接する少なくとも２つの操作された組換え部位を有する少なくとも１つのDNAセグメントを含む核酸分子を提供する。ここで、上記組換え部位のうち少なくとも１つは、コインテグレートDNAまたは産物DNAの形成においてインビトロで組換えを増強する、少なくとも１つの操作された変異を有するコア領域を含む。
【００８９】
核酸分子は、上記組換えの少なくとも１つの増強を付与する、少なくとも１つの変異を有し得る。この増強は、(i)切り出し組み込みを優先すること；(ii)切り出し組換えを優先すること；(ii)宿主因子の要求性を軽減すること；(iii)上記コインテグレートDNAまたは産物DNA形成の効率を増加させること；および(iv)上記コインテグレートDNAまたは産物DNA形成の特異性を増加させることから実質的になる群より選択される。
【００９０】
核酸分子は、好ましくは、attB、attP、attLまたはattRに由来する少なくとも１つの組換え部位を含む。より好ましくは、att部位は、本明細書に記載のように、att1、att2、またはatt3から選択される。
【００９１】
好ましい実施態様において、コア領域は、以下からなる群より選択されるDNA配列：
2007306931.tif 000002
あるいは対応するまたは相補的なDNAもしくはRNA配列を含む。ここで、米国特許法施行規則§1.822(本明細書中に参考としてその全体を援用する)に示されているように、Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｋ＝ＧまたはＴ/Ｕ；Ｙ＝ＣまたはＴ/Ｕ；Ｗ＝ＡまたはＴ/Ｕ；Ｎ＝ＡまたはＣまたはＧまたはＴ/Ｕ；Ｓ＝ＣまたはＧ；そしてＢ＝ＣまたはＧまたはＴ/Ｕであり、コア領域は、１またはそれ以上のリーディングフレームにおいて終止コドンを含まない。
【００９２】
コア領域はまた、好ましくは、以下からなる群より選択されるDNA配列：
2007306931.tif 000003
あるいは対応するまたは相補的なDNAもしくはRNA配列を含む。
【００９３】
従って、本発明はまた、核酸分子を作製するための方法を提供する。この方法は、配列番号１〜16のうちの少なくとも１つに対して少なくとも80〜99％の相同性(あるいはその中の任意の範囲または値)を有する少なくとも１つのDNA配列を含む少なくとも１つの操作された組換え部位、または任意の適切な組換え部位を有する核酸分子、あるいは、当該分野において公知のように、ストリンジェントな条件下で、その核酸分子にハイブリダイズする核酸分子を提供する工程を包含する。
【００９４】
明らかなことではあるが、このような周知のインビトロおよびインビボ選択方法の種々のタイプおよび変更が存在する。これらの各々については、簡略にするために、本明細書に記載されない。しかし、このような変形および変更は、本発明の異なる実施態様であると意図されており、そしてそのようにみなされる。
【００９５】
インビトロ組換え反応である好ましい実施態様の結果として、非生物学的分子(例えば、PCR産物)が、本発明の組換えクローニング方法により操作され得ることに注目することが重要である。１つの例において、直鎖状分子を環状ベクターにクローニングすることが可能である。
【００９６】
本発明には多くの適用がある。これらの使用には、ベクターを変化させること、プロモーターを遺伝子の隣に並べること(apposing)、融合タンパク質に対する遺伝子を構築すること、コピー数を変化させること、レプリコンを変化させること、ファージにクローニングすること、ならびに例えば、PCR産物(一方の端にattB部位、そして他方の端にloxP部位を有する)、ゲノムDNAおよびcDNAをクローニングすることが含まれるが、これらに限定されない。
【００９７】
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施態様をさらに例示することを意図され、限定することを全く意図されない。
【実施例】
【００９８】
本発明の組換えクローニング法は、クローニングベクターの変化のような、あるものを使用者にとって有用にさせるための核酸セグメントの交換を達成する。これらのセグメントは、お互いに関して適切な方向にある組換えシグナルによって両側で隣接されなければならない。以下の実施例において、２つの親の核酸分子（例えば、プラスミド）を、インサートドナーおよびベクタードナーと呼ぶ。インサートドナーは、ベクタードナーによって寄与された新しいベクターに結合されるようになるセグメントを含む。両方の開始分子を含む組換え中間体（単数または複数）は、コインテグレート（単数または複数）と呼ばれる。第２の組換え事象は、２つの娘分子を産生し、これらは産物（所望の新しいクローン）および副産物と呼ばれる。
【００９９】
緩衝液
本発明の反応において、種々の公知の緩衝液を使用し得る。制限酵素については、製造者によって推奨される緩衝液の使用が望ましい。代替緩衝液が、文献から容易に見出され得るか、または当業者によって案出され得る。
【０１００】
実施例１〜３。λインテグラーゼのための１つの例示的な緩衝液には、50 mM Tris-HCl (pH 7.5〜7.8)、70 mM KCl、５mMスペルミジン、0.5 mM EDTA、および0.25 mg/ml ウシ血清アルブミン、ならびに必要に応じて10％グリセロールが含まれる。
【０１０１】
P1 Creリコンビナーゼのための１つの好ましい緩衝液には、50 mM Tris-HCl(pH 7.5)、33 mM NaCl、５mM スペルミジン、および0.5 mg/ml ウシ血清アルブミンが含まれる。
【０１０２】
λ IntおよびP1 Creに類似する他の部位特異的リコンビナーゼのための緩衝液は、当該分野で公知であるか、または特に上記の緩衝液に照らして、当業者によって経験的に決定され得るかのいずれかである。
【０１０３】
実施例１：CreならびにCreおよびIntを用いる組換えクローニング
２対のプラスミドを、２つの異なる方法においてインビトロ組換えクローニング法を行うために構築した。一方の対であるpEZC705およびpEZC726（図2A）を、Creおよびλインテグラーゼとともに用いられる、loxPおよびatt部位を有して構築した。他方の対であるpEZC602およびpEZC629（図3A）は、CreのためのloxP（野生型）部位および１塩基（全34中）においてloxPと異なる第２の変異体lox部位（loxP 511）を含んだ。本発明の組換えクローニングに対する最小の要求は、各プラスミドにおける２つの組換え部位（一般に、XおよびY、ならびにX'およびY'）である。いずれかまたは両方の型の部位が組換えて、コインテグレート（例えば、XおよびX'）を形成し得る場合、およびいずれかまたは両方の（しかし、コインテグレートを形成する型と異なる部位である必要がある）が、組換えて、コインテグレート（例えば、YおよびY'）から産物または副産物プラスミドを切り出し得る場合、組換えクローニングが起こる。同一のプラスミド上の組換え部位は、組換えないことが重要である。本発明の組換えクローニングは、Creのみを用いて行われ得ることが見出された。
【０１０４】
Creのみ
２つのプラスミドを、この概念を示すために構築した（図3Aを参照のこと）。pEZC629が、ベクタードナープラスミドであった。これは、構成性薬剤マーカー（クロラムフェニコール耐性）、複製起点、loxPおよびloxP 511部位、条件的薬剤マーカー（トランスポゾンTn10のテトラサイクリン耐性オペロンのオペレーター／プロモーターによってその発現が制御されるカナマイシン耐性）、およびtetリプレッサータンパク質に対する構成性に発現される遺伝子tetRを含んでいた。pEZC629を含むE.coli細胞は、30μg/mlのクロラムフェニコールに対して耐性であるが、100μg/mlのカナマイシンに対して感受性であった。pEZC602が、インサートドナープラスミドであり、これは、異なる薬剤マーカー（アンピシリン耐性）、複製起点、ならびにマルチクローニング部位に隣接しているloxPおよびloxP511部位を含んだ。
【０１０５】
本実験は、以下の２つのパートからなった：
パートI：各々約75μgのpEZC602およびpEZC629を全容積30μlのCre緩衝液（50mM Tris-HCl（pH7.5）、33mM NaCl、５mM スペルミジン-HCl、500μg/ml ウシ血清アルブミン）中で混合した。２つの10μlアリコートを、新しいチューブに移した。１つのチューブに、0.5μlのCreタンパク質（約４単位/μl；AbremskiおよびHoess、J. Biol. Chem. 259: 1509 (1984) に従って、部分精製した)を入れた。両方のチューブを、37℃で30分間インキュベートし、次いで、70℃で10分間インキュベートした。各反応物のアリコートを希釈し、そしてDH5αに形質転換した。発現後、アリコートを、30μg/ml クロラムフェニコール；100μg/ml アンピシリン＋200μg/mlメチシリン；または100μg/ml カナマイシン上にプレートした。結果：表１を参照のこと。Creを含まない反応物は、1.11×106個のアンピシリン耐性コロニー（インサートドナープラスミドpEZC602由来）；7.8×105個のクロラムフェニコール耐性コロニー（ベクタードナープラスミド由来）；および140個のカナマイシン耐性コロニー（バックグラウンド）を生じた。Creを添加した反応物は、7.5×105個のアンピリン耐性コロニー（インサートドナープラスミドpEZC602由来）；6.1×105個のクロラムフェニコール耐性コロニー（ベクタードナープラスミドpEZC629由来）；および760個のカナマイシン耐性コロニー（バックグラウンドコロニーおよび組換えクローニング産物プラスミド由来のコロニーの混合物）を生じた。分析：Creの存在において、カナマイシンプレート上のコロニーの数がずっと多かったので、それらの多数またはほとんどが所望の産物プラスミドを含むと予想された。
【０１０６】
【表１】
2007306931.tif 000004
【０１０７】
パートII：「＋Cre」カナマイシンプレート由来の24コロニーをひろい、そして100μg/mlカナマイシンを含む培地中に接種した。ミニプレップを行い、そしてミニプレップDNA（非切断あるいはSmaIまたはHindIIIで切断を電気泳動した。結果：24個のミニプレップ中19個は、産物プラスミドについて予想されるサイズの超らせん状のプラスミドを示した。19個の全ては、予想されるSmaIおよびHindIII制限フラグメントを示した。分析：Creのみのスキームを示した。詳細には、約70％（24個中19個）の産物コロニーを生じることが示された。効率は、約0.1％（6.1×105個のクロラムフェニコール耐性コロニーから760個のカナマイシン耐性クローンが得られた）であった。
【０１０８】
Cre＋インテグラーゼ
本方法を示すために使用されるプラスミドは、ベクタードナープラスミドであるpEZC726がloxP 511の代わりにattP部位を含んだこと、およびインサートドナープラスミドであるpEZC705がloxP 511の代わりにattB部位を含んだことを除き上記で使用されたプラスミドに正確に類似する（図2A）。
【０１０９】
この実験は、以下の３つのパートからなった：
パートI：約500ngのpEZC705（インサートドナープラスミド）を、アンピシリン耐性遺伝子内でプラスミドを直鎖化するScaIを用いて切断した。（λインテグラーゼ反応は、歴史的に直鎖状態のattBプラスミドを用いて行われている（H.Nash,私信）ので、これを行った）。しかし、インテグラーゼ反応は、超らせん状の両方のプラスミドを用いて良好に進行することが後に見出された。次いで、直鎖状プラスミドをエタノール沈殿し、そして20μlのλインテグラーゼ緩衝液（50mM Tris-HCl（約pH7.8）、70mM KCl、５mMスペルミジン-HCl、0.5mM EDTA、250μg/mlウシ血清アルブミン）中で溶解した。また、約500ngのベクタードナープラスミドpEZC726をエタノール沈殿し、そして20μlのλインテグラーゼ緩衝液中で溶解した。使用の直前に、λインテグラーゼ（２μl、393μg/ml）を融解し、そして18μlの冷λインテグラーゼ緩衝液を添加することにより希釈した。１μlのIHF（組み込み宿主因子、2.4mg/ml、アクセサリータンパク質）を、150μlの冷λインテグラーゼ緩衝液中で希釈した。アリコート（2μl）の各DNAを、全量10μlで、λインテグラーゼ緩衝液（各々１μｌのλインテグラーゼおよびIHFを含むまたは含まない）と混合した。混合物を、25℃で45分間インキュベートし、次いで、70℃で10分間インキュベートした。各反応物の半分をアガロースゲルに供した。結果：インテグラーゼおよびIHFの存在下で、全DNAの約５％が、直鎖状のコインテグレート形態に転換された。分析：インテグラーゼおよびIHFの活性を確認した。
【０１１０】
パートII：３μlの各反応物（すなわち、インテグラーゼおよびIHFを含むまたは含まない）を、27μlのCre緩衝液（上記）中で希釈し、次いで、各反応物を２つの10μlアリコートに分割した（全部で４つ）。これらの反応物の２つに、0.5μlのCreタンパク質（上記）を添加し、そして全ての反応物を37℃で30分間インキュベートし、次いで70℃で10分間インキュベートした。各反応物に、TE緩衝液（90μl；TE：10mM Tris-HCl（pH 7.5）、１mM EDTA）を添加し、そして各１μlを、E. coli DH5αに形質転換した。形質転換混合物を、100μg/ml アンピシリン＋200μg/ml メチシリン；30μg/ml クロラムフェニコール；または100μg/ml カナマイシン上にプレートした。結果：表２を参照のこと。
【表２】
2007306931.tif 000005
【０１１１】
分析：Creタンパク質は、形質転換を減少させた。この効果について調節した場合、カナマイシン耐性コロニー数は、Creおよびインテグラーゼの両方を用いた場合、コントロール反応物と比較して、100倍より多く増加した。これは、99％より高い特異性を示唆した。
【０１１２】
パートIII：38個のコロニーを、インテグラーゼ＋Creプレートからひろい、ミニプレップDNAを作製し、そしてHindIIIで切断して診断マッピング情報を得た。結果：38個全てが正確に予想されたフラグメントザイズを有した。分析：Cre+λインテグラーゼ法は、Creのみよりずっと高い特異性を有することが観察された。結論：Cre+λインテグラーゼ法を示した。効率および特異性は、Creのみよりもずっと高かった。
【０１１３】
実施例２：クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の真核生物細胞における発現のためのベクターへのサブクローン化のためのインビトロ組換えクローニングの使用（図4A）
loxP部位とattB部位の間でクローン化され、その結果loxP部位が遺伝子の５’末端に位置する、E. coliのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含む、インサートドナープラスミドであるpEZC843を構築した（図4B）。loxP部位に隣接するサイトメガロウイルス真核生物プロモーターを含む、ベクタードナープラスミドであるpEZC1003を構築した（図4C）。１μlアリコートの各超らせん状のプラスミド（約50ngの粗製ミニプレップDNA）を、等量のλインテグラーゼ緩衝液（50mM Tris-HCl（pH7.8）、70mM KCl、５mM スペルミジン、0.5mM EDTA、0.25mg/ml ウシ血清アルブミン）およびCreリコンビナーゼ緩衝液（50mM Tris-HCl（pH7.5）、33mM NaCl、５mM スペルミジン、0.5mg/ml ウシ血清アルブミン）、２単位のCreリコンビナーゼ、16ngの組み込み宿主因子、および32ng λインテグラーゼを含む10μlの反応物中で合わせた。30℃で30分間インキュベートした後、75℃で10分間インキュベートし、１μlをコンピテントE. coli DH5α株（Life Technologies,Inc.）に形質転換した。形質転換体のアリコートを、200μg/ml カナマイシンを含む寒天プレート上に広げ、そして37℃で一晩インキュベートした。それ以外の同一のコントロール反応は、ベクタードナープラスミドのみを含んだ。コントロール反応形質転換の10％を受けたプレートから、１つのコロニーを得た；組換えクローニング反応の10％を受けたプレートからは144のコロニーを得た。これらの数は、99％より多い組換えクローニングコロニーが、所望の産物プラスミドを含んだことを示唆した。６個の組換えクローニングコロニーから作製したミニプレップDNAから、予想されたサイズのプラスミド（5026塩基対）であるCMVProdを得た。NcoIを用いた制限消化から、６個全てのプラスミドについてCMVプロモーターの下流にクローン化したクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼと予想されるフラグメントを得た。
【０１１４】
実施例３：終止コドンを有さないattB部位によって隣接されるサブクローン化されたDNAセグメント
パートI：背景
上記の実施例は、転写が組換え部位を横切る転写融合に適する。しかし、attR部位およびloxP部位の両方は、両方の鎖に複数の終止コドンを含み、従って、コード配列が組換え部位を横断しなければならない（１つのリーディングフレームのみがloxP部位の各鎖上で利用可能である）場合、転写融合は困難であり得るか、または不可能であり得る（attRまたはattLにおいて）。
【０１１５】
サブクローニングのための主要な理由は、タンパク質ドメインを融合することである。例えば、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）ドメインの目的のタンパク質への融合は、融合タンパク質がグルタチオンアガロース（Pharmacia,Inc.、1995カタログ）のアフィニティークロマトグラフィーによって精製されることを可能にする。目的のタンパク質が連続的なヒスチジンの連続（例えば、His6）に融合される場合、融合タンパク質は、金属イオンを含むキレート樹脂（Qiagen,Inc.）のアフィニティークロマトグラフィーによって精製され得る。活性、溶解性、安定性などについてアミノ末端融合体とカルボキシ末端融合体とを比較することがしばしば望まれる。
【０１１６】
バクテリオファージλ組み込み系のattB部位を、loxPに対する代替物として試験した。なぜなら、それらは小さく（25 bp）、そしていくらかの配列可撓性を有するからである（Nash,H.A.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:4049-4053(1987)）。全ての終止コードを取り除く複数の変異により、組換えサブクローニングのための有用な組換え部位を得るであろうことは以前には示唆されていなかった。
【０１１７】
λバクテリオファージにおける部位特異的組換えのための標準的な表記（Weisber, Lambda III,Hendrixら編、Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor NY (1989)）を用いて、E. coli宿主細胞における組換え反応に関与する核酸領域を以下に示す：
（以下余白）
2007306931.tif 000006
ここで：Oは、ファージおよびE. coliゲノムの両方に見出される15 bpコアDNA配列を示す；BおよびB'は、E. coliゲノム中のコアに隣接する約５塩基を示す；およびP1、H1、P2、X、H2、C、C'、H'、P'1、P'2、およびP'3は、バクテリオファージλゲノム中のタンパク質結合ドメインをコードする公知のDNA配列を示す。
【０１１８】
反応は、タンパク質Xis（エキシジョナーゼ）の存在下で可逆的であり；attLとattRとの間の組換えは、その組み込まれた状態からλゲノムを正確に切り出し、attP、およびattBを含む直鎖状E. coliゲノムを含む環状λゲノムを再生する。
【０１１９】
パートII：変異体att部位を含むプラスミドの構築および試験
変異体attL部位および変異体attR部位を構築した。重要なことに、Landyら（Ann. Rev. Biochem. 58:913 (1989)）は、attPのP1およびH1ドメインの欠失が、切り出し反応を促進し、そして組み込み反応を除去し、その結果切り出し反応を不可逆的にさせることを観察した。従って、変異がattRに導入されて、P1およびH1ドメインもまた欠失されたので、本実施例におけるattR部位は、P1領域およびH1領域を欠き、そして取り除かれたNdeI部位を有し（塩基27630をCからGに改変した）、そしてバクテリオファージ座標27619〜27738（GenBank release 92.0,bp:LAMCG、「バクテリオファージλの完全な配列」）に対応する配列を含む。
【０１２０】
野生型attLおよびattR部位の組換えによって産生されるattBの配列は以下のとおりである：
2007306931.tif 000007
終止コドンを斜体にし、そして下線を引いた。attL、attR、およびattPの配列はattB配列に由来し得、そしてバクテリオファージλの境界は、attLおよびattR内（座標27619〜27818）に含まれたことに留意のこと。
【０１２１】
変異体attR1部位およびattL1部位を組み換えた場合、配列attB1が産生された（変異を太字の、大きな文字で表す）：
2007306931.tif 000008
４つの終止コドンが消失していることに留意のこと。
【０１２２】
attR1配列およびattL1配列（太字）にさらなる変異を導入した場合、attR2部位およびattL2部位を得た。attR2およびattL2の組換えは、attB2部位を産生した：
2007306931.tif 000009
【０１２３】
上記のattL部位およびattR部位の組換え活性を以下のようにアッセイした。プラスミドpEZC705のattB部位（図2B）を、attLwt、attL1、またはattL2と置換した。プラスミドpEZC726のattP部位（図2C）を、attRwt（P1およびH1領域を欠く）、attR1、またはattR2と置換した。従って、得られたプラスミドは、 Creによって媒介されて、それらのloxP部位を介して組換え得、そしてInt、Xis、およびIHFによって媒介されて、それらのattR部位およびattL部位を介して組換え得る。プラスミドの対を、Cre、Int、Xis、およびIHFと混合しそして反応させ、E. coliコンピテント細胞に形質転換し、そしてカナマイシンを含有する寒天上にプレートした。結果を表３に示す：
【０１２４】
【表３】
2007306931.tif 000010
上記のデータは、野生型att部位およびatt1部位は低い程度に組換えたが、att1部位およびatt2部位は互いに検出可能には組換えないことをを示す。
【０１２５】
パートIII：目的のDNAセグメントに隣接する両方のattB部位のコア領域が終止コドンを含まない場合の、組換えが示された。関与するプラスミドの物理的な状態が、組換え効率に影響することが見出された。
【０１２６】
適切なatt部位を、pEZC705およびpEZC726中に移動し、プラスミドpEZC1405（図5G）（attR1およびattR2）ならびにpEZC1502（図5H）（attL1およびattL2）を作製した。本実験における所望のDNAセグメントは、pEZC1502の２つのattL部位の間にクローン化されたクロラムフェニコール耐性遺伝子のコピーであった。プラスミドの対を、Int、Xis、およびIHF（loxP部位が存在しなかったのでCreはなし）を用いてインビトロで組換えた。表４に示すように、親プラスミドの両方が環状である場合、または一方のプラスミドが環状でありかつ他方が直鎖状の場合に、所望のカナマイシン耐性コロニーの収率を決定した：
【表４】
2007306931.tif 000011
分析：変異体attR部位および変異体attL部位を用いる組換えクローニングを確認した。所望のDNAセグメントは、いずれの鎖においても終止コドンを全く含まないattB部位の間にサブクローン化される。両方の関与する分子が超らせん状であり、そしてタンパク質が制限されている場合、切り出し反応がより効率的であった初期の観察のために、（一方の親が直鎖状の場合の）産物DNAの増大した収率は、予想外であった（Nunes-Dubyら、Cell 50:779-788(1987)）。
【０１２７】
実施例４：逆方向反復を有さない組換えクローニングの実証
パートI：原理
上記実施例３は、適切な組換え部位の逆方向反復を含むプラスミド（例えば、プラスミドpEZC1502中のattL1およびattL2）（図5H）が、組換えて、これも逆方向で終止コドンを有さないattB部位によって隣接される所望のDNAセグメントが得られ得ることを示した。逆方向反復のインビボおよびインビトロでの影響が危惧された。例えば、逆方向でattB部位によって隣接される所望のDNAセグメントの転写は、ヘアピン構造を形成し得る一本鎖RNA分子を生じ、その結果、翻訳を阻害し得る。
【０１２８】
類似の組換え部位の逆方向を、部位を直列反復配置のatt部位に配置することにより回避し得る。親プラスミドの各々が野生型attL部位および野生型attR部位を直列反復で有する場合、Int、Xis、およびIHFタンパク質は、分子内反応においてそれらの部位によって隣接されるDNAセグメントを単に取り除く。しかし、上記の実施例３に記載の変異体部位は、分子内組換えを所望のように進行させながら、分子内反応を阻害することが可能であり得ることを示唆した。
【０１２９】
パートII：組換えクローニングのための逆方向反復を有さないプラスミドの構造
プラスミドpEZC1405（図5G）中のattR2配列を、反対方向でのattL2と置換し、pEZC1603（図6A）を作製した。pEZC1502（図5H）のattL2配列を、反対方向でのattR2と置換し、pEZC1706（図6B）を作製した。これらのプラスミドの各々は、att1コアとatt2コアの間の分子内反応を非常に非効率的にするコア領域中の変異を含んだ（実施例３、上記を参照のこと）。
【０１３０】
プラスミドpEZC1405、pEZC1502、pEZC1603およびpEZC1706を、Qiagenカラム（Qiagen,Inc.）で精製した。プラスミドpEZC1405およびpEZC1603のアリコートを、XbaIを用いて直鎖化した。プラスミドpEZC1502およびpEZC1706のアリコートを、AlwNIを用いて直鎖化した。100ngのプラスミドを、Int（43.5ng）、Xis（4.3ng）、およびIHF（8.1ng）を含む最終容量10μlの緩衝液（等容量の50mM Tris HCl（pH7.5）、25mMTris HCl（pH8.0）、70mM KCl、５mMスペルミジン、0.5mM EDTA、250μg/ml BSA、10％グリセロール)中で混合した。反応物を25℃で45分間、65℃で10分間インキュベートし、そして１μlをE. coli DH5αに形質転換した。発現後、アリコートを、200μg/mlのカナマイシンを含有する寒天プレート上に広げ、そして37℃でインキュベートした。
【０１３１】
コロニー数/１μlの組換え反応物として表現した結果を表５に示す：
【０１３２】
【表５】
2007306931.tif 000012
【０１３３】
分析：全ての配置において（すなわち、環状または直鎖状）、pEZC1405×pEZC1502対（逆方向反復配置でのatt部位を有する）は、pEZC1603×pEZC1706対（ヘアピン形成を回避するために変異されたatt部位を有する）よりもより効率的であった。pEZC1603×pEZC1706対は、pEZC1405×pEZC1502対より高いバックグラウンドおよびより低い効率を与えた。より低い効果であるが、pEZC1603×pEZC1706反応由来の80％以上のコロニーが、所望のプラスミド産物を含むと予想された。１つのパートナーを直鎖状にすることが、全ての場合において反応を刺激した。
【０１３４】
パートIII：産物プラスミドの構造の確認
直鎖状pEZC1405（図5G）×環状pEZC1502（図5H）、環状pEZC1405×直鎖状pEZC1502、直鎖状pEZC1603（図6A）×環状pEZC1706（図6B）、および環状pEZC1603×直鎖状pEZC1706反応由来の各々６個のコロニーを、富化培地にひろい、そしてミニプレップDNAを調製した。Ssp Iを用いる診断的切断により、24個のコロニーについて予想される制限フラグメントを得た。
【０１３５】
分析：同一の分子上の変異体attL部位および変異体attR部位を有するプラスミド間の組換え反応により、高い程度の特異性を有して、所望のプラスミド産物を得た。
【０１３６】
実施例５：毒性遺伝子を用いる組換えクローニング
パートI：背景
制限酵素Dpn Iは、配列GATCを認識し、そしてAがdamメチラーゼによってメチル化された場合のみ、この配列を切断する。大部分の一般的に使用されるE. coli株は、dam+である。細胞の染色体が多数の断片に切断されるので、E. coliのdam+株におけるDpn Iの発現は致死性である。しかし、dam−細胞において、Dpn Iの発現は無害である。なぜなら染色体は、Dpn I切断に対して免疫性であるからである。
【０１３７】
ベクタードナーが、組換え部位によって分離される２つのセグメントCおよびDを含む一般的な組換えクローニングスキームにおいて、所望の産物の選択は、セグメントDの存在およびセグメントCの非存在についての選択に依存する。元の実施例において、セグメントDは、セグメントC上に見出されるリプレッサー遺伝子によってネガティブに制御される薬剤耐性遺伝子（Km）を含んだ。Cが存在する場合、Dを含む細胞は、耐性遺伝子がオフになっていたのでカナマイシンに対して耐性ではなかった。
【０１３８】
Dpn I遺伝子は、上記実施態様のリプレッサー遺伝子を置換し得る毒性遺伝子の例である。セグメントCがDpn I遺伝子産物を発現するする場合、dam+宿主へのプラスミドCDの形質転換は細胞を死滅させる。セグメントDを、例えば組換えクローニングによって新しいプラスミド移入する場合、毒性遺伝子がもはや存在しないので、薬剤マーカーについての選択は成功する。
【０１３９】
パートII：毒性遺伝子としてDpn Iを用いるベクタードナーの構築
Dpn Iエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子を、プライマー５’CCA CCA CAA ACG CGT CCA TGG AAT TAC ACT TTA ATT TAG３’（配列番号17）および５’CCA CCA CAA GTC GAC GCA TGC CGA CAG CCT TCC AAA TGT３’（配列番号18）ならびに鋳型としてDpn I遺伝子を含むプラスミド（Sanford A.Lacks, Brookhaven National Laboratory,Upton,New Yorkから入手したプラスミド由来であり；またATCC 67494としてアメリカンタイプカルチャーコレクションから入手可能である）を用いるPCRによって増幅した。
【０１４０】
さらなる変異を、所望の塩基変化を含むプライマーを用いる既存のattLドメインおよびattRドメインを増幅することによって、それぞれ、attLおよびattRのB領域およびB'領域に導入した。変異体attL3（オリゴXis115を用いて作製された）およびattR3（オリゴXis112を用いて作製された）の組換えにより、以下の配列（太字がattB1と異なる）を有するattB3を得た：
2007306931.tif 000013
既存の遺伝子ドナープラスミドのattL2の代わりにattL3配列をクローン化し、プラスミドpEZC2901を得た（図7A）。既存のベクタードナープラスミドのattR2の代わりにattR3配列をクローン化し、プラスミドpEZC2913を得た（図7B）。DpnI遺伝子をプラスミドpEZC2913にクローン化して、tetリプレッサー遺伝子を置換した。得られたベクタードナープラスミドをpEZC3101と名付けた（図7C）。pEZC3101をdam-SCS110株（Stratagene）に形質転換した場合、数百のコロニーを得た。同じプラスミドをdam+DH5α株に形質導入した場合、たとえDH5α細胞がSCS110細胞より約20倍コンピテントであっても、ほんの１コロニーを生じただけであった。Dpn I遺伝子を含まない関連するプラスミドを同じの２つの細胞株に形質転換した場合、DH5α細胞から448のコロニーが得られたが、SCS110細胞からは28個のコロニーが生じた。これは、Dpn I遺伝子がプラスミドpEZC3101（図7C）上で発現され、そしてdam+DH5α細胞を死滅させるが、dam-SCS110細胞を死滅させないという証拠である。
【０１４１】
パートIII：Dpn I選択を用いる組換えクローニングの実証
プラスミド対を使用し、毒性遺伝子Dpn Iに依存する産物についての選択を用いる組換えクローニングを示した。プラスミドpEZC3101（図7C）を、Mlu Iを用いて直鎖状にし、そして環状プラスミドpEZC2901（図7A）と反応させた。リプレッサー遺伝子による薬剤耐性の制御に基づく選択を用いるプラスミドの第２の対を、コントロールとして使用した：プラスミドpEZC1802（図7D）を、Xba Iを用いて直鎖状にし、そして環状プラスミドpEZC1502（図5H）と反応させた。以前の実施例におけると同一の緩衝液ならびにタンパク質Xis、Int、およびIHFを含む８マイクロリットルの反応物を、25℃で45分間、次いで75℃で10分間インキュベートし、そして１μlアリコートを、表６に示すようにDH5α（すなわち、dam+）コンピテント細胞に形質転換した。
【０１４２】
【表６】
2007306931.tif 000014
ミニプレップDNAを、反応＃２由来の４つのコロニーから調製し、そして制限酵素Ssp Iを用いて切断した。全てから予想されるフラグメントを得た。
【０１４３】
分析：毒性遺伝子を用いる選択を用いるサブクローニングを示した。予想される構造のプラスミドを産生した。
【０１４４】
実施例６：融合タンパク質作製のための、ウラシルDNAグリコシラーゼを用いる遺伝子のクローニングおよび組換えクローニングを用いる遺伝子のサブクローニング
パートI：既存の発現ベクターの組換えクローニングのためのベクタードナーへの変換
既存のベクターの機能的ベクタードナーへの変換に有用なカセットを、以下のように作製した。プラスミドpEZC3101（図7C）を、Apa IおよびKpn Iを用いて消化し、末端を平滑にするためにT4 DNAポリメラーゼおよびdNTPで処理し、所望でないDNAフラグメントを小さくするためにSma I、HpaI、およびAlwN Iを用いてさらに消化し、そしてattRI-CmR-Dpn I-attR-3ドメインを含む2.6kbカセットをゲル精製した。精製されたカセットの濃度を、約75ngDNA/μlであると評価した。
【０１４５】
プラスミドpGEX-2TK（図8A）（Pharmacia）は、タンパク質グルタチオンSトランスフェラーゼと、そのマルチクローニング部位に挿入され得る任意の第２のコード配列との間の融合を可能にする。pGEX-2TK DNAを、Sma Iを用いて消化し、そしてアルカリホスファターゼで処理した。約75ngの上記の精製DNAカセットを、約100ngのpGEX-2TKベクターと５μl連結物中で2.5時間連結し、次いで、１μlをコンピテントBRL3056細胞（DH10Bのdam-誘導体；市販のdam-株は、Life Technologies,Inc.,由来のDM1およびStratagene由来のSCS110を含む）に形質転換した。形質転換混合物のアリコートを、100μl/mlアンピシリン（耐性遺伝子は、pGEX-2TK上に存在する）および30μl/mlクロラムフェニコール（耐性遺伝子は、DNAカセット上に存在する）を含有するLB寒天上にプレートした。コロニーをひろい、そしてミニプレップDNAを作製した。pGEX-2TK中のカセットの方向を、EcoR Iを用いる診断的切断によって決定した。所望の方向を有するプラスミドを、pEZC3501（図8B）と名付けた。
【０１４６】
パートII：３つのリーディングフレームでのレポーター遺伝子の組換えクローニング遺伝子ドナープラスミドへのクローニング
ウラシルDNAグリコシラーゼ（UDG）クローニングは、クローニングベクターへPCR増幅産物をクローニングするための方法である（米国特許第5,334,515号、本明細書中でその全体が参考として援用される）。簡単に述べれば、所望のDNAセグメントのPCR増幅を、それらの５’末端にチミジン塩基の代わりにウラシル塩基を含むプライマーを用いて実施する。このようなPCR産物を酵素UDGと共にインキュベートする場合、ウラシル塩基は特異的に取り除かれる。これらの塩基の欠損は、PCR産物DNAの末端における塩基対合を弱め、そして適切な温度（例えば、37℃）でインキュベートした場合、このような産物の末端は、主として一本鎖化される。PCR産物の３’末端に相補的である突出した３’テールを含む直鎖状クローニングベクターの存在下でこのようなインキュベーションを行った場合、塩基対合は、効率的にクローニングベクターにPCR産物をアニーリングする。アニーリングされた産物を、形質転換によってE. coli細胞に導入した場合、インビボプロセスは、効率的にそれを組換えプラスミドに変換する。
【０１４７】
３つ全てのリーディングフレームでの任意のPCR産物のクローニングを可能にするUDGクローニングベクターをpEZC3201（図8K）から以下のように調製した。８つのオリゴヌクレオチドが、Life Technologies,Inc.から得られた（全て５’→３’で記載される：rf1 上部（GGCC GAT TAC GAT ATC CCA ACG ACC GAA AAC CTG TAT TTT CAG GGT）（配列番号19）、rf1 下部（CAG GTT TTC GGT CGT TGG GAT ATC GTA ATC）（配列番号20）、rf2 上部（GGCCA GAT TAC GAT ATC CCA ACG ACC GAA AAC CTG TAT TTT CAG GGT）（配列番号21、rf2 下部（CAG GTT TTC GGT CGT TGG GAT ATC GTA ATCT）（配列番号23）、rf3 上部（GGCCAA GAT TAC GAT ATC CCA ACG ACC GAA AAC CTG TAT TTT CAG GGT）（配列番号23）、rf3 下部（CAG GTT TTC GGT CGT TGG GAT ATC GTA ATC TT）（配列番号24）、カルボキシ上部（ACC GTT TAC GTG GAT）（配列番号25）、およびカルボキシ下部（TCGA GTC CAC GTA AAC GGT TCC CAC TTA TTA）（配列番号26））。rf1、２および３上部鎖ならびにカルボキシ下部鎖を、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてその５’末端上でリン酸化し、次いで各対の相補的な鎖をハイブリダイズした。プラスミドpEZC3201（図8K）をNot IおよびSal Iを用いて切断し、そして切断プラスミドのアリコートをカルボキシ-オリゴ二重鎖（Sal I末端）およびrf1、rf2、またはrf3二重鎖のいずれか（Not I末端）と混合した（250pmolカルボキシオリゴ二重鎖と10μl（約５pmol）切断プラスミドとを混合し、３つの20μl容積に分割し、rf1、rf2、またはrf3二重鎖の５μl（250pmol）および２μl=２単位T4 DNAリガーゼを各反応物に添加した）。室温での90分の連結後、各反応物を調製用アガロースゲルに供し、そして2.1kbのベクターバンドを溶出し、そして50μlのTEに溶解した。
【０１４８】
パートIII：CATおよびphoA遺伝子のPCR
プラスミドpACYC184由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺伝子およびE. coli由来のアルカリホスファターゼ遺伝子であるphoAを増幅するために、プライマーをLife Technologies, Inc.,から得た。プライマーは、ウラシル塩基を含む12塩基５’伸長を有し、その結果ウラシルDNAグリコシラーゼ（UDG）でのPCR産物の処理は、DNAの各末端での塩基対合を弱め、そして３’鎖が上記のrf1、rf2、およびrf3ベクターの突出す３’末端とのアニーリングを可能にする。プライマーの配列（全て５’→３’で記載）は以下のとおりであった：CAT左、UAU UUU CAG GGU ATG GAG AAA AAA ATC ACT GGA TAT ACC（配列番号27）；CAT右、UCC CAC UUA UUA CGC CCC GCC CTG CCA CTC ATC（配列番号28）；phoA左、UAU UUU CAG GGU ATG CCT GTT CTG GAA AAC CGG（配列番号29）；およびphoA右、UCC CAC UUA UUA TTT CAG CCC CAG GGC GGC TTT C（配列番号30）。次いで、プライマーを公知の方法工程（例えば、米国特許第5,334,515号（これは本明細書中にその全体が参考として援用される）を参照のこと）を用いるPCR反応のために使用し、そしてこれらのプライマーを用いて得られたポリメラーゼ連鎖反応増幅産物は、開始ATGを有するがいかなる転写シグナルも有さないCATまたはphoA遺伝子を含んだ。さらに、アミノ末端上のウラシル含有配列は、TEVプロテアーゼ（Life Technologies,Inc.）の切断部位をコードし、そしてカルボキシ末端上のウラシル含有配列は、連続的なTAAナンセンスコドンをコードした。
【０１４９】
非精製PCR産物（約30ng）を、１×REact4緩衝液(LTI)および１単位のUDG（LTI）を含む10μlの反応物中で、ゲル精製された、直鎖状rf1、rf2、またはrf3クローニングベター（約50ng）と混合した。37℃での30分後、各反応の１μlアリコートを、コンピテントE. coli DH5α細胞（LTI）に形質転換し、そして50μg/mlのカナマイシンを含有する寒天上にプレートした。コロニーをひろい、そしてミニプレップDNAの分析は、CAT遺伝子が、リーディングフレーム１（pEZC3601）（図8C）、リーディングフレーム２（pEZC3609）（図8D）、およびリーディングフレーム３（pEZC3617）（図8E）でクローン化され、そしてphoA遺伝子が、リーディングフレーム１（pEZC3606）（図8F）、リーディングフレーム２（pEZC3613）（図8G）、およびリーディングフレーム３（pEZC3621）（図8H）でクローン化されたことを示した。
パートIV：CATまたはphoAのUDGクローニングベクターからGST融合ベクターへのサブクローニング
【０１５０】
３つ全てのリーディングフレームでのGSTとCATまたはphoAのいずれかとの間の融合物をコードするプラスミドを、以下の組換えクローニングによって構築した。GSTベクタードナーpEZC3501（図8B）（上記のPharmaciaプラスミドpGEX-2TK由来）のミニプレップDNAを、Cla Iを用いて直鎖状にした。約５ngのベクタードナーを、緩衝液および組換えタンパク質Int、Xis、およびIHF（上記）を含む８μlの反応物中、CATまたはphoAを含む各約10ngの適切な環状遺伝子ドナーベクターと混合した。インキュベーション後、１μlの各反応物を、E. coliDH5α株に形質転換し、そして表７に示すようにアンピシリン上にプレートした。
【０１５１】
【表７】
2007306931.tif 000015
【０１５２】
パートV：融合タンパク質の発現
各形質転換由来の２つのコロニーを、100μg/mlのアンピシリンを含有する17×100mmのプラスチックチューブ（Falcon 2059,Becton Dickinson）中の２mlのリッチ培地（CircleGrow, Bio101 Inc.）中にひろい、そして37℃で約４時間強く振盪し、その時培養物は視覚的に濁っていた。１mlの各培養物を、GSTの発現を誘導するために10μlの10％（w/v）IPTGを含む新しいチューブに移した。さらなる２時間のインキュベーション後、全ての培養物は、ほぼ同じ濁度を有した；１つの培養物のA600は、1.5であった。0.35mlの各培養物由来の細胞を回収し、そしてサンプル緩衝液（SDSおよびβ-メルカプトエタノールを含む）で処理し、そして細胞の約0.15 A600単位に等価なアリコートを、Novex ４〜20％勾配ポリアクリルアミドゲルに供した。電気泳動後、ゲルをクーマシーブルーを用いて染色した。
【０１５３】
結果：単一のタンパク質のバンドの増大した発現は、12の培養物の全てで見出された。これらのタンパク質の観察されたサイズは、３つのリーディングフレームでCATまたはphoAに（終止コドンを含まないattB組換え部位を介して）融合されたGSTの予想したサイズと良く一致した：CAT rf1=269アミノ酸；CAT rf2=303アミノ酸；CAT rf3=478アミノ酸；phoA rf1=282アミノ酸；phoA rf2=280アミノ酸；およびphoA rf3=705アミノ酸。
【０１５４】
分析：CATおよびphoA遺伝子の両方を、３つ全てのリーディングフレームでGST融合ベクターにサブクローン化し、そして６つの融合タンパク質の発現を示した。
【０１５５】
上記発明は、明瞭化および理解の目的で幾らか詳細に記載されているが、形式および詳細における種々の変化が、本発明および添付の請求の範囲の真の範囲から逸脱することなくなされ得ることが、本開示の解釈から当業者によって認識される。本明細書中で引用された全ての特許および刊行物は、本明細書中にその全てが参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】図１は、本明細書の１つの一般的な方法を示す。ここで、開始（親）DNA分子は、環状または直鎖状であり得る。目標は、新たなサブクローニングベクターＤをもとのクローニングベクターＢと交換することである。１つの実施態様において、ＡＤについて、およびすべての他の分子（コインテグレートを含む）に対して選択することが所望される。四角および丸は、組換えの部位（例えば、loxP部位、att部位など）である。例えば、セグメントＤは、発現シグナル、新たな薬剤マーカー、新たな複製起点、またはマッピングもしくはDNA配列決定のための特殊化された機能を含み得る。
【図２Ａ】図２Ａは、インサートドナープラスミド（ここでは、pEZC705）をベクタードナープラスミド（ここでは、pEZC726）と組換え、そして産物DNAおよび副産物娘分子を得るインビトロにおける方法を示す。２つの組換え部位は、ベクタードナー上のattPおよびloxPである。これらの部位により規定される１つのセグメント上に、そのプロモーターがトランスポゾンTn10由来のtetOPオペレーター／プロモーターにより置換されているカナマイシン耐性遺伝子が存在する。Sizemoreら、Nucl. Acids Res. 18(10):2875 (1990)を参照のこと。tetリプレッサータンパク質の非存在下において、E. coli RNAポリメラーゼは、tetOPからカナマイシン耐性遺伝子を転写する。tetリプレッサーが存在する場合、それはtetOPに結合し、そしてカナマイシン耐性遺伝子の転写をブロックする。pEZC726の他のセグメントは、構成性プロモーターにより発現されるtetリプレッサー遺伝子を有する。従って、pEZC726により形質転換される細胞は、tetRと同じセグメント上のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のためにクロラムフェニコールに耐性であるが、カナマイシンに感受性である。リコンビナーゼ媒介性反応は、tetR遺伝子の、調節されたカナマイシン耐性遺伝子からの分離を生じる。この分離は、所望の組換え産物のみを受ける細胞においてカナマイシン耐性を生じる。第１の組換え反応はインテグラーゼと呼ばれるリコンビナーゼの添加により駆動される。第２の組換え反応はリコンビナーゼCreをコインテグレート（ここでは、pEZC7 Cointegrate）へ添加することにより駆動される。
【図２Ｂ】図２Ｂは、pEZC705の制限地図を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、pEZC726の制限地図を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、pEZC7 Cointegrateの制限地図を示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、Intprodの制限地図を示す。
【図２Ｆ】図２Ｆは、Intbyproの制限地図を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、インサートドナープラスミド（ここでは、pEZC602）をベクタードナープラスミド（ここでは、pEZC629）と組換え、そして産物（ここでは、EZC6prod）および副産物（ここでは、EZC6Bypr）娘分子を得るインビトロにおける方法を示す。２つの組換え部位は、loxPおよびloxP 511である。これらの部位により規定されるpEZC629の１つのセグメント上に、そのプロモーターがトランスポゾンTn10由来のtetOPオペレーター／プロモーターにより置換されているカナマイシン耐性遺伝子が存在する。tetリプレッサータンパク質の非存在下において、E. coli RNAポリメラーゼは、tetOPからカナマイシン耐性遺伝子を転写する。tetリプレッサーが存在する場合、それはtetOPに結合し、そしてカナマイシン耐性遺伝子の転写をブロックする。pEZC629の他のセグメントは、構成性プロモーターにより発現されるtetリプレッサー遺伝子を有する。従って、pEZC629により形質転換される細胞は、tetRと同じセグメント上のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のためにクロラムフェニコールに耐性であるが、カナマイシンに感受性である。反応は、tetR遺伝子の、調節されたカナマイシン耐性遺伝子からの分離を生じる。この分離は、所望の組換え産物のみを受ける細胞においてカナマイシン耐性を生じる。第１および第２の組換え事象は、同じリコンビナーゼCreの添加により駆動される。
【図３Ｂ】図３Ｂは、EZC6Byprの制限地図を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、EZC6prodの制限地図を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、pEZC602の制限地図を示す。
【図３Ｅ】図３Ｅは、pEZC629の制限地図を示す。
【図３Ｆ】図３Ｆは、EZC6cointの制限地図を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、組換えクローニングのインビトロ方法の、真核生物細胞における発現のために、ベクター中へクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子をサブクローン化するための適用を示す。インサートドナープラスミドpEZC843は、loxP部位が遺伝子の5'末端に位置するようにloxP部位とattB部位との間にクローン化されたE. coliのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含む。ベクタードナープラスミドpEZC1003は、loxP部位に並置されたサイトメガロウイルス真核生物プロモーターを含む。超らせんプラスミドをλインテグラーゼおよびCreリコンビナーゼとインビトロで組み合わせた。インキュベーション後、コンピテントなE. coli細胞を組換え反応溶液を用いて形質転換した。形質転換のアリコートをカナマイシンを含有する寒天プレート上に広げて、産物分子（ここでは、CMVProd）を選択した。
【図４Ｂ】図４Ｂは、pEZC843の制限地図を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、pEZC1003の制限地図を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、CMVByproの制限地図を示す。
【図４Ｅ】図４Ｅは、CMVProdの制限地図を示す。
【図４Ｆ】図４Ｆは、CMVcointの制限地図を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、pEZC1301の制限地図を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、pEZC1305の制限地図を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、pEZC1309の制限地図を示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、pEZC1313の制限地図を示す。
【図５Ｅ】図５Ｅは、pEZC1317の制限地図を示す。
【図５Ｆ】図５Ｆは、pEZC1321の制限地図を示す。
【図５Ｇ】図５Ｇは、pEZC1405の制限地図を示す。
【図５Ｈ】図５Ｈは、pEZC1502の制限地図を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、pEZC1603の制限地図を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、pEZC1706の制限地図を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、pEZC2901の制限地図を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、pEZC2913の制限地図を示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、pEZC3101の制限地図を示す。
【図７Ｄ】図７Ｄは、pEZC1802の制限地図を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、pGEX-2TKの制限地図を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、pEZC3501の制限地図を示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、pEZC3601の制限地図を示す。
【図８Ｄ】図８Ｄは、pEZC3609の制限地図を示す。
【図８Ｅ】図８Ｅは、pEZC3617の制限地図を示す。
【図８Ｆ】図８Ｆは、pEZC3606の制限地図を示す。
【図８Ｇ】図８Ｇは、pEZC3613の制限地図を示す。
【図８Ｈ】図８Ｈは、pEZC3621の制限地図を示す。
【図８Ｉ】図８Ｉは、GST-CATの制限地図を示す。
【図８Ｊ】図８Ｊは、GST-phoAの制限地図を示す。
【図８Ｋ】図８Ｋは、pEZC3201の制限地図を示す。
【図１】
2007306931.tif 000018
【図２Ａ】
2007306931.tif 000019
【図２Ｂ】
2007306931.tif 000020
【図２Ｃ】
2007306931.tif 000021
【図２Ｄ】
2007306931.tif 000022
【図２Ｅ】
2007306931.tif 000023
【図２Ｆ】
2007306931.tif 000024
【図３Ａ】
2007306931.tif 000025
【図３Ｂ】
2007306931.tif 000026
【図３Ｃ】
2007306931.tif 000027
【図３Ｄ】
2007306931.tif 000028
【図３Ｅ】
2007306931.tif 000029
【図３Ｆ】
2007306931.tif 000030
【図４Ａ】
2007306931.tif 000031
【図４Ｂ】
2007306931.tif 000032
【図４Ｃ】
2007306931.tif 000033
【図４Ｄ】
2007306931.tif 000034
【図４Ｅ】
2007306931.tif 000035
【図４Ｆ】
2007306931.tif 000036
【図５Ａ】
2007306931.tif 000037
【図５Ｂ】
2007306931.tif 000038
【図５Ｃ】
2007306931.tif 000039
【図５Ｄ】
2007306931.tif 000040
【図５Ｅ】
2007306931.tif 000041
【図５Ｆ】
2007306931.tif 000042
【図５Ｇ】
2007306931.tif 000043
【図５Ｈ】
2007306931.tif 000044
【図６Ａ】
2007306931.tif 000045
【図６Ｂ】
2007306931.tif 000046
【図７Ａ】
2007306931.tif 000047
【図７Ｂ】
2007306931.tif 000048
【図７Ｃ】
2007306931.tif 000049
【図７Ｄ】
2007306931.tif 000050
【図８Ａ】
2007306931.tif 000051
【図８Ｂ】
2007306931.tif 000052
【図８Ｃ】
2007306931.tif 000053
【図８Ｄ】
2007306931.tif 000054
【図８Ｅ】
2007306931.tif 000055
【図８Ｆ】
2007306931.tif 000056
【図８Ｇ】
2007306931.tif 000057
【図８Ｈ】
2007306931.tif 000058
【図８Ｉ】
2007306931.tif 000059
【図８Ｊ】
2007306931.tif 000060
【図８Ｋ】
2007306931.tif 000061
【配列表】
2007306931000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年8月2日(2007.8.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一核酸セグメントおよび第二核酸セグメントを含む核酸分子であって、該第一核酸セグメントまたは第二核酸セグメントは、選択マーカーの少なくとも１つの不活性フラグメントを含み、ここで該第一核酸セグメントまたは第二核酸セグメントは、少なくとも第一の操作された組み換え部位および第二の操作された組み換え部位に隣接しており、該第一の操作された組み換え部位および第二の操作された組み換え部位はお互いに組み換えられない、核酸分子。 
【請求項２】
請求項１に記載の核酸分子であって、ここで前記選択マーカーが、以下：
（ｉ）毒性である化合物に対する耐性を提供する産物をコードする核酸セグメント；
（ｉｉ）レシピエント細胞において欠失される産物をコードする核酸セグメント；
（ｉｉｉ）遺伝子産物の活性を抑制する産物をコードする核酸セグメント；
（ｉｖ）容易に同定され得る産物をコードする核酸セグメント；
（ｖ）細胞生存、および／または細胞機能に対して有害である産物をコードする核酸セグメント；
（ｖｉ）上記（ｉ）〜（ｖ）の核酸セグメントのいずれかの活性を阻害する核酸セグメント；
（ｖｉｉ）基質を修飾する産物に結合する核酸セグメント；
（ｖｉｉｉ）所望の分子の単離を提供する核酸セグメント；
（ｉｘ）非機能的であり得る特定のヌクレオチド配列をコードする核酸セグメント；ならびに 
（ｘ）存在しない場合、特定の化合物に対する感受性を直接的または間接的に付与する核酸セグメント、
からなる群より選択される少なくとも１つの核酸セグメントである、核酸分子。 
【請求項３】
請求項２に記載の核酸分子であって、前記選択マーカーが、抗生物質耐性遺伝子、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求マーカー、毒性遺伝子、表現型マーカー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、制限エンドヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ切断部位、酵素切断部位、タンパク質結合部位、およびＰＣＲプライマー配列に相補的な配列、からなる群より選択される少なくとも１つのマーカーを含む、核酸分子。
【請求項４】
請求項１に記載の核酸分子であって、前記選択マーカーの前記不活性フラグメントは、前記第一または第二の組み換え部位にわたって、該選択マーカーの別の不活性フラグメントを含むさらなる核酸フラグメントと組み換えられた場合、機能的選択マーカーを再構成し得る、核酸分子。 
【請求項５】
核酸分子であって、少なくとも第一の操作された組み換え部位および第二の操作された組み換え部位に隣接した所望の核酸セグメントを含み、該第一の操作された組み換え部位および第二の操作された組み換え部位はお互いに組み換えられず、該所望の核酸分子は選択マーカーの少なくとも１つの不活性フラグメントを含む、核酸分子。 
【請求項６】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで前記所望の核酸セグメントは、クローニング部位、制限部位、プロモーター、オペロン、複製起点、機能的核酸、アンチセンスＲＮＡ、ＰＣＲフラグメント、タンパク質コード配列、およびタンパク質フラグメントコード配列、からなる群より選択された少なくとも１つの配列をさらに含む、核酸分子。 
【請求項７】
第一の核酸セグメントおよび第二の核酸セグメントを含む少なくとも１つの第一の核酸分子を備えるキットであって、該第一の核酸セグメントまたは第二の核酸セグメントは、選択マーカーの少なくとも１つの不活性フラグメントを含み、ここで該第一の核酸セグメントまたは第二の核酸セグメントは、少なくとも第一の操作された組み換え部位および第二の操作された組み換え部位に隣接しており、該第一の操作された組み換え部位および第二の操作された組み換え部位は、お互いに組み換えられない、キット。
【請求項８】
請求項７に記載のキットであって、少なくとも第一の操作された組み換え部位および第二の操作された組み換え部位に隣接する所望の核酸セグメントを含む少なくとも１つの第二の核酸分子をさらに含み、該第一の操作された組み換え部位および第二の操作された組み換え部位は、お互いに組み換えられない、キット。
【請求項９】
少なくとも１つの組み換えタンパク質をさらに含む、請求項７に記載のキット。
【請求項１０】
キットであって、単離された形態の少なくとも１つの組み換えタンパク質、ならびに、以下：
ｉ）第一の操作された組み換え部位および第二の操作された組み換え部位に隣接する選択マーカーの少なくとも１つの不活性フラグメントを含む所望の核酸セグメントを含む第一の核酸分子であって、ここで該第一および第二の組み換え部位は、お互いに組み換えられない、第一の核酸分子
ｉｉ）第三の操作された組み換え部位および第四の操作された組み換え部位を含む第二の核酸分子であって、ここで該第三および第四の組み換え部位は、お互いに組み換えられない、第二の核酸分子をさらに含み；そして
ここで、該組み換えタンパク質は、該第一および第三の組み換え部位、ならびに／または該第二の組み換え部位および第四の組み換え部位を組み換え得る、
キット。
【請求項１１】
プロモーターおよび遺伝子または部分的遺伝子を並置するためのインビトロ方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該プロモーターおよび少なくとも１つの第１の組換え部位を含む第１の核酸分子と、該遺伝子または部分的遺伝子および少なくとも１つの第２の組換え部位を含む第２の核酸分子を混合する工程；ならびに 
（ｂ）少なくとも該第１の組換え部位と該第２の組換え部位との組換えをもたらすのに十分な条件下で、少なくとも１つの組換えタンパク質の存在下で該混合物をインキュベートする工程であって、それによって該プロモーターおよび該遺伝子または部分的遺伝子を並置する、工程、
を包含する、方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの組換えタンパク質が、バクテリオファージλ、φ８０、Ｐ２２、Ｐ２、１８６、Ｐ４およびＰ１からなる群より選択されるバクテリオファージによりコードされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの組換えタンパク質が、バクテリオファージλによってコードされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの組換えタンパク質が、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、およびＣｒｅからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの組換えタンパク質が、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、およびＸｉｓからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの組換えタンパク質がαγ、Ｔｎ３リゾルベース、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、ＣｉｎおよびＦｌｐからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの組換えタンパク質がＣｒｅである、請求項１１に記載の方法。 
【請求項１８】
前記第１の組換え部位または前記第２の組換え部位がａｔｔ部位およびｌｏｘ部位からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１の組換え部位または前記第２の組換え部位がａｔｔ部位である、請求項１１に記載の方法。 
【請求項２０】
前記第１の組換え部位または前記第２の組換え部位がｌｏｘ部位である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１の核酸分子がベクターである、請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
前記第２の核酸分子がベクターである、請求項１１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１の核酸分子および前記第２の核酸分子がベクターである、請求項１１に記載の方法。
【請求項２４】
前記プロモーターが、抑制性プロモーター、誘導性プロモーターおよび構成性プロモーターからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２５】
前記プロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、請求項１１に記載の方法。
【請求項２６】
前記遺伝子または部分的遺伝子がタグ配列をコードする核酸配列を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２７】
前記タグ配列が、ＧＳＴタグおよびＨｉｓタグからなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１の核酸分子が、選択マーカー、クローニング部位、制限部位、オペロン、および複製起点からなる群より選択される少なくとも１つのさらなる核酸配列をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２９】
前記第２の核酸分子が、選択マーカー、クローニング部位、制限部位、オペロン、および複製起点からなる群より選択される少なくとも１つのさらなる核酸配列をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項３０】
前記選択マーカーが、抗生物質耐性遺伝子および毒性遺伝子からなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記選択マーカーが、抗生物質耐性遺伝子および毒性遺伝子からなる群より選択される、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
前記遺伝子または部分的遺伝子を発現させてタンパク質を産生する工程をさらに包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項３３】
前記タンパク質が融合タンパク質である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記融合タンパク質がタグ配列を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記タグ配列が、ＧＳＴタグおよびＨｉｓタグからなる群より選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記融合タンパク質がアミノ末端タグ配列を含む、請求項３３に記載の方法。 
【請求項３７】
前記融合タンパク質がカルボキシ末端タグ配列を含む、請求項３３に記載の方法。 
【請求項３８】
前記タグ配列が、ＧＳＴタグおよびＨｉｓタグからなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記タグ配列が、ＧＳＴタグおよびＨｉｓタグからなる群より選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
請求項１１に記載の方法であって、ここで、前記組換え部位のうちの少なくとも１つが、配列番号１〜１６からなる群より選択される少なくとも１つの核酸配列、またはそれらに相補的な核酸配列を含む、方法。 
【請求項４１】
前記組換えられた第１の核酸分子および第２の核酸分子を細胞に導入する工程をさらに包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項４２】
前記第１の核酸分子がベクターである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記第２の核酸分子がベクターである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記第１の核酸分子および前記第２の核酸分子がベクターである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記プロモーターが、抑制性プロモーター、誘導性プロモーターおよび構成性プロモーターからなる群より選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項４６】
前記プロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、請求項１１に記載の方法。
【請求項４７】
前記遺伝子または部分的遺伝子がタグ配列をコードする核酸分子を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項４８】
前記タグ配列が、ＧＳＴタグおよびＨｉｓタグからなる群より選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記第１の核酸分子が、選択マーカー、クローニング部位、制限部位、オペロン、および複製起点からなる群より選択される少なくとも１つのさらなる核酸配列をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項５０】
前記第２の核酸分子が、選択マーカー、クローニング部位、制限部位、オペロン、および複製起点からなる群より選択される少なくとも１つのさらなる核酸配列をさらに含む、請求項１１記載の方法。
【請求項５１】
前記選択マーカーが、抗生物質耐性遺伝子および毒性遺伝子からなる群より選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記選択マーカーが、抗生物質耐性遺伝子および毒性遺伝子からなる群より選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記遺伝子または部分的遺伝子を発現させてタンバク質を産生する工程をさらに包含する、請求項４１に記載の方法。
【請求項５４】
前記タンパク質が融合タンパク質である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記融合タンパク質がタグ配列を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記タグ配列が、ＧＳＴタグおよびＨｉｓタグからなる群より選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記融合タンパク質がアミノ末端タグ配列を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記融合タンパク質がカルボキシ末端タグ配列を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
前記タグ配列が、ＧＳＴタグおよびＨｉｓタグからなる群より選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記タグ配列が、ＧＳＴタグおよびＨｉｓタグからなる群より選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
請求項４１に記載の方法であって、ここで、前記組換え部位のうちの少なくとも１つが、配列番号１〜１６からなる群より選択される少なくとも１つの核酸配列、および相補的なＤＮＡ配列を含む、方法。
【請求項６２】
前記細胞が真核生物細胞である、請求項４１に記載の方法。 
【請求項６３】
インビトロクローニングのための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）少なくとも１つの第１の組換え部位を含む第１のベクターと少なくとも１つの第２の組換え部位を含む第２のベクターとをインビトロで混合する工程；ならびに
（ｂ）少なくとも該第１の組換え部位および該第２の組換え部位の組換えをもたらすのに十分な条件下で、少なくとも１つの組換えタンパク質の存在下で該混合物をインキュベートする工程、
を包含し、
ここで、該第１の組換え部位および／または該第２の組換え部位は、配列番号６〜１６の１つ以上の核酸配列、これらに相補的なＤＮＡ配列、およびこれらに対応するＲＮＡ配列からなる群より選択される少なくとも１つの第１の核酸配列を含む、方法。
【請求項６４】
核酸セグメントのインビトロクローニングのためのキットであって、該キットは、少なくとも１つの単離された組換えタンパク質および少なくとも１つの単離された核酸分子を備え、該核酸分子は、配列番号６〜１６、それに対する相補的ＤＮＡ配列、およびそれに対応するＲＮＡ配列からなる群より選択される、少なくとも１つの第１の核酸配列を含む、キット。
【請求項６５】
前記キットが、少なくとも２つの組換えタンパク質を含む、請求項６４に記載のキット。
【請求項６６】
前記キットが、少なくとも３つの組換えタンパク質を含む、請求項６４に記載のキット。
【請求項６７】
キットであって、該キットは、少なくとも１つの単離された組換えタンパク質および少なくとも１つの単離された核酸分子を備え、該核酸分子は、少なくとも第１の組換え部位を含み、該組換え部位は、コインテグレー卜核酸分子または産物核酸分子の形成におけるインビトロでの組換え効率または組換え特異性を増強するコア領域を含み、ここで、該コア領域が、以下：
ａ）AGCCTGCTTTTTTGTACAAACTTGT（ａｔｔＢ１）（配列番号６）；
ｂ）AGCCTGCTTTCTTGTACAAACTTGT（ａｔｔＢ２）（配列番号７）；
ｃ）ACCCAGCTTTCTTGTACAAACTTGT（ａｔｔＢ３）（配列番号８）；
ｄ）GTTCAGCTTTTTTGTACAAACTTGT（ａｔｔＲ１）（配列番号９）；
ｅ）GTTCAGCTTTCTTGTACAAACTTGT（ａｔｔＲ２）（配列番号１０）；
ｆ）GTTCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG（ａｔｔＲ３）（配列番号１１）；
ｇ）AGCCTGCTTTTTTGTACAAAGTTGG（ａｔｔＬ１）（配列番号１２）；
ｈ）AGCCTGCTTTCTTGTACAAAGTTGG（ａｔｔＬ２）（配列番号１３）；
ｉ）ACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG（ａｔｔＬ３）（配列番号１４）；
ｊ）GTTCAGCTTTTTTGTACAAAGTTGG（ａｔｔＰ１）（配列番号１５）；
ｋ）GTTCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG（ａｔｔＰ２、Ｐ３）（配列番号１６）；ならびに
対応する、または相補的な、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列からなる群より選択される核酸配列を含む、キット。
【請求項６８】
請求項６７に記載のキットであって、前記組換え部位が、以下：
（ｉ）切り出し組換えの増強；（ｉｉ）組み込み組換えの増強；（ｉｉｉ）宿主因子の要求性の減少；（ｉｖ）前記コインテグレート核酸分子または前記産物核酸分子の組換えによる形成反応の効率の増加；（ｖ）前記コインテグレート核酸分子または前記産物核酸分子の組換えによる形成反応の特異性の増加；および(ｖｉ）該産物核酸分子のその後の組換え反応またはその後の単離の特異性または収率の増加、からなる群より選択される、少なくとも１つの増強を付与する、キット。
【請求項６９】
前記組換えタンパク質が、γδ、Ｔｎ３レソルバーゼ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、Ｃｉｎ、およびＦｌｐからなる群より選択される、請求項６４または６７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７０】
記組換えタンパク質が、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、ＸｉｓおよびＣｒｅからなる群より選択される、請求項６４または６７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７１】
前記組換えタンパク質が、Ｉｎｔ、ＩＨＦおよびＸｉｓからなる群より選択される、請求項６４または６７のいずれか１項に記載のキット。 
【請求項７２】
前記組換えタンパク質のうちの少なくとも１つが、Ｉｎｔである、請求項６４または６７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７３】
前記組換えタンパク質のうちの少なくとも１つが、バクテリオファージλ、φ８０、Ｐ２２、Ｐ２、１８６、Ｐ４およびＰ１からなる群より選択される生物によりコードされる、請求項６４または６７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７４】
前記組換えタンパク質のうちの少なくとも１つが、バクテリオファージλによりコードされる、請求項６４または６７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７５】
前記組換えタンパク質のうちの少なくとも１つが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓによりコードされる、請求項６４または６７のいずれか１項に記載のキット。 
【請求項７６】
前記キットがＩｎｔおよびＩＨＦを含む、請求項６４または６７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７７】
前記キットがＸｉｓをさらに含む、請求項７６に記載のキット。
【請求項７８】
前記少なくとも２つの組換えタンパク質が、互いに異なる、請求項６５に記載のキット。
【請求項７９】
前記少なくとも３つの組換えタンパク質が、互いに異なる、請求項６６に記載のキット。
【請求項８０】
前記第１および第２の操作された組換え部位が、組換え効率を増大させるように操作されている、請求項１に記載の核酸分子。 
【請求項８１】
前記第１および第２の操作された組換え部位が、組換え効率を増大させるように操作されている、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項８２】
前記第１および第２の操作された組換え部位が、組換え効率を増大させるように操作されている、請求項７、８または９のいずれかに記載のキット。
【請求項８３】
核酸分子を産生する方法であって、以下：
（ａ）第１の遺伝子の少なくとも１つの部分および少なくとも１つの第１の組換え部位を含む、第１の核酸分子を提供する工程；
（ｂ）第２の遺伝子の少なくとも１つの部分および少なくとも１つの第２の組換え部位を含む、第２の核酸分子を提供する工程；ならびに
（ｃ）インビトロにおいて該第１の組換え部位と該第２の組換え部位との間で組換えを起こすに十分な条件下において、インビトロで、該第１の核酸分子および該第２の組換え分子ならびに少なくとも１つの組換えタンパク質とで混合物を形成させて、それにより、該第１の遺伝子の部分および該第２の遺伝子の部分が作動可能に連結されて機能的遺伝子を形成する第３の核酸分子を形成させる工程、を包含する、方法。 
【請求項８４】
前記第１の遺伝子および前記第２の遺伝子が同一である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記第１の遺伝子または前記第２の遺伝子が、選択マーカーをコードする、請求項８３に記載の方法。 
【請求項８６】
前記第１の遺伝子または前記第２の遺伝子が、抗生物質耐性遺伝子である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８７】
前記抗生物質耐性遺伝子が、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、メチシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、およびカナマイシン耐性遺伝子からなる群より選択される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記抗生物質耐性遺伝子が、クロラムフエニコール耐性遺伝子である、請求項８６に記載の方法。 
【請求項８９】
前記第１の遺伝子の少なくとも１つの部分または前記第２の遺伝子の少なくとも１つの部分が、プロモーターを含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項９０】
前記第１の遺伝子の少なくとも１つの部分または前記第２の遺伝子の少なくとも１つの部分が、構造遺伝子のフラグメントである、請求項８３に記載の方法。
【請求項９１】
前記第１の遺伝子または前記第２の遺伝子が、ヘテロダイマー遺伝子産物をコードする、請求項８３に記載の方法。
【請求項９２】
前記第１の組換え部位および前記第２の組換え部位が、ｌｏｘ部位およびａｔｔ部位からなる群より選択される、請求項８３記載の方法。
【請求項９３】
前記第１の組換え部位および前記第２の組換え部位が、ｌｏｘ部位である、請求項８３に記載の方法。
【請求項９４】
前記ｌｏｘ部位がｌｏｘＰ部位である、請求項９３に記載の方法.
【請求項９５】
前記第１の組換え部位および前記第２の組換え部位が、ａｔｔ部位である、請求項８３に記載の方法。
【請求項９６】
前記ａｔｔ部位が、ａｔｔＢ部位、ａｔｔＰ部位、ａｔｔＬ部位およびａｔｔＲ部位からなる群より選択される、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記第１の核酸分子または前記第２の核酸分子がさらに、少なくとも１つのさらなる組換え部位を含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項９８】
前記少なくとも１つのさらなる組換え部位が、ｌｏｘ部位およびａｔｔ部位からなる群より選択される、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記少なくとも１つのさらなる組換え部位が、少なくとも１つのｌｏｘ部位である、請求項９７に記載の方法。 
【請求項１００】
前記少なくとも１つのさらなる組換え部位が、ｌｏｘ部位である、請求項９７に記載の方法。 
【請求項１０１】
前記ｌｏｘ部位がｌｏｘＰ部位である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記少なくとも１つのさらなる組換え部位が、少なくとも １つのａｔｔ部位である、請求項９７に記載の方法。 
【請求項１０３】
前記少なくとも１つのさらなる組換え部位が、ａｔｔ部位である、請求項９７に記載の方法。 
【請求項１０４】
前記ａｔｔ部位が、ａｔｔＢ部位、ａｔｔＰ部位、ａｔｔＬ部位およびａｔｔＲ部位からなる群より選択される、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記第１の遺伝子の前記少なくとも１つの部分が、前記第１の組換え部位と隣接して位置付けられる、請求項８３記載の方法。
【請求項１０６】
前記第２の遺伝子の前記少なくとも１つの部分が、前記第２の組換え部位と隣接して位置付けられる、請求項８３に記載の方法。
【請求項１０７】
前記第１の核酸分子または前記第２の核酸分子が、少なくとも１つのクローニング部位を含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項１０８】
前記少なくとも１つの組換えタンパク質が、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、 ＦＬＰ、γδ、Ｔｎ３リゾルベース、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、Ｃｉｎおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項８３に記載の方法。
【請求項１０９】
前記少なくとも１つの組換えタンパク質がＣｒｅである、請求項８３に記載の方法。 
【請求項１１０】
前記少なくとも１つの組換えタンパク質が、Ｉｎｔ、ＩＨＦおよびＸｉｓからなる群より選択される、請求項８３に記載の方法。
【請求項１１１】
前記少なくとも１つの組換えタンパク質がＩｎｔである、請求項８３に記載の方法。 
【請求項１１２】
前記少なくとも１つの組換えタンパク質がＩＨＦである、請求項８３に記載の方法。
【請求項１１３】
前記少なくとも１つの組換えタンパク質がＸｉｓである、請求項８３に記載の方法。
【請求項１１４】
前記第１の核酸分子または前記第２の核酸分子または前記第３の核酸分子がベクターである、請求項８３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記ベクターが発現ベクターである、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記第１の核酸分子または前記第２の核酸分子が、直鎖状である、請求項８３に記載の方法。
【請求項１１７】
前記第１の遺伝子の前記少なくとも１つの部分または前記第２の遺伝子の前記少なくとも１つの部分がＰＣＲ産物である、請求項８３に記載の方法。
【請求項１１８】
前記機能的遺伝子を発現させる工程をさらに包含する、請求項８３に記載の方法。
【請求項１１９】
少なくとも１つの宿主細胞を前記混合物と接触させる工程、および前記第３の核酸分子を含む宿主細胞をポジティブ選択する工程をさらに包含する、請求項８３に記載の方法。 
【請求項１２０】
前記第１の核酸分子または前記第２の核酸分子を含む宿主細胞をネガティブ選択する工程をさらに包含する、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
前記第１の核酸分子および前記第２の核酸分子を含む宿主細胞をネガティブ選択する工程をさらに包含する、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２２】
前記選択された宿主細胞において、前記機能的遺伝子を発現させる工程をさらに包含する、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２３】
前記宿主細胞が原核生物細胞である、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２４】
前記宿主細胞が細菌細胞である、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２５】
前記宿主細胞が Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞である、請求項１１９に記載の方法。 
【請求項１２６】
核酸分子を産生する方法であって、以下：
（ａ）抗生物質耐性遺伝子の第１の部分および少なくとも１つの第１の組換え部位を含む、第１の核酸分子を提供する工程；
（ｂ）該抗生物質耐性遺伝子の第２の部分および少なくとも１つの第２の組換え部位を含む、第２の核酸分子を提供する工程；ならびに 
（ｃ）インビトロにおいて該第１の組換え部位と該第２の組換え部位との間で組換えを起こすに十分な条件下において、インビトロで、該第１の核酸分子および該第２の組換え分子ならびに少なくとも１つの組換えタンパク質とで混合物を形成させて、それにより、該遺伝子の該第１の部分および該第２の部分が作動可能に連結されて機能的な抗生物質耐性遺伝子を形成した第３の核酸分子を産生させる工程、
を包含する、方法。
【請求項１２７】
前記抗生物質耐性遺伝子が、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、メチシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、およびカナマイシン耐性遺伝子からなる群より選択される、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記抗生物質耐性遺伝子が、クロラムフェニコール耐性遺伝子である、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２９】
前記遺伝子の前記第１の部分または前記第２の部分が、プロモーターを含む、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１３０】
前記第１の組換え部位および前記第２の組換え部位が、ｌｏｘ部位およびａｔｔ部位からなる群より選択される、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１３１】
前記第１の組換え部位および前記第２の組換え部位が、ｌｏｘ部位である、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１３２】
前記ｌｏｘ部位がｌｏｘＰ部位である、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記第１の組換え部位および前記第２の組換え部位が、ａｔｔ部位である、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１３４】
前記ａｔｔ部位が、ａｔｔＢ部位、ａｔｔＰ部位、ａｔｔＬ部位およびａｔｔＲ部位からなる群より選択される、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
前記第１の核酸分子または前記第２の核酸分子がさらに、少なくとも１つのさらなる組換え部位を含む、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１３６】
前記少なくとも１つのさらなる組換え部位が、ｌｏｘ部位およびａｔｔ部位からなる群より選択される、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
前記少なくとも１つのさらなる組換え部位が、少なくとも１つのｌｏｘ部位である、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３８】
前記少なくとも１つのさらなる組換え部位が、ｌｏｘ部位である、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３９】
前記ｌｏｘ部位がｌｏｘＰ部位である、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
前記少なくとも１つのさらなる組換え部位が、少なくとも１つのａｔｔ部位である、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１４１】
前記少なくとも１つのさらなる組換え部位が、１つのａｔｔ部位である、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１４２】
前記ａｔｔ部位が、ａｔｔＢ部位、ａｔｔＰ部位、ａｔｔＬ部位、およびａｔｔＲ部位からなる群より選択される、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
前記遺伝子の第１の部分が、前記第１の組換え部位に隣接して位置する、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１４４】
前記遺伝子の第２の部分が、前記第２の組換え部位に隣接して位置する、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１４５】
前記第１の核酸分子または前記第２の核酸分子が、少なくとも１つのクローニング部位を含む、請求項１２６に記載の方法。 
【請求項１４６】
前記少なくとも１つの組換えタンパク質が、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、ＦＬＰ、γδ、Ｔｎ３レソルバーゼ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、Ｃｉｎ、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１４７】
前記少なくとも１つの組換えタンパク質が、Ｃｒｅである、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１４８】
前記少なくとも１つの組換えタンパク質が、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、およびＸｉｓからなる群より選択される、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１４９】
前記第１の核酸分子、または前記第２の核酸分子、または前記第３の核酸分子が、ベクターである、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１５０】
前記ベクターが、発現ベクターである、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
前記第１の核酸分子または前記第２の核酸分子が、直鎖状である、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１５２】
前記遺伝子の第１の部分または第２の部分が、ＰＣＲ産物である、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１５３】
少なくとも１つの宿主細胞を前記混合物と接触させる工程と、前記第３の核酸分子を含む宿主細胞をポジティブ選択する工程とをさらに包含する、請求項１２６に記載の方法。 
【請求項１５４】
前記第１の核酸分子または前記第２の核酸分子を含む宿主細胞をネガティブ選択する工程をさらに包含する、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５５】
前記第１の核酸分子および前記第２の核酸分子を含む宿主細胞とネガティブ選択する工程をさらに包含する、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５６】
前記宿主細胞が、原核生物細胞である、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５７】
前記宿主細胞が、細菌細胞である、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５８】
前記宿主細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞である、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５９】
前記第３の核酸分子を宿主細胞に導入する工程をさらに包含する、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１６０】
前記第３の核酸分子を宿主細胞に導入する工程と、前記抗生物質耐性遣伝子を発現させる工程とをさらに包含する、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１６１】
前記宿主細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞である、請求項１６０に記載の方法。
【請求項１６２】
核酸分子を産生する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）少なくとも１つのプロモーターおよび少なくとも１つの第１の組換え部位を含む、第１の核酸分子を提供する工程；と
（ｂ）少なくとも１つの抗生物質耐性遺伝子および少なくとも１つ第２の組換え部位を含む、第２の核酸分子を提供する工程；と
（ｃ）該第１の組換え部位と該第２の組換え部位との間の組換えをインビトロで引き起こすのに十分な条件下で、該第１および第２の核酸分子ならびに少なくとも１つの組換えタンパク質とで混合物をインビトロで形成させて、それにより、第３の核酸分子を産生する工程であって、該第３の核酸分子において、該プロモーターと該抗生物質耐性遺伝子は、作動可能に連結されている、工程、とを包含する、方法。
【請求項１６３】
前記抗生物質耐性遺伝子が、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、メチシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、およびカナマイシン耐性遺伝子からなる群より選択される、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１６４】
前記抗生物質耐性遺伝子が、クロラムフェニコール耐性遺伝子である、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１６５】
前記第１の組換え部位および前記第２の組換え部位が、ｌｏｘ部位およびａｔｔ部位からなる群より選択される、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１６６】
前記第１の組換え部位および前記第２の組換え部位が、ｌｏｘ部位およびａｔｔ部位からなる群より選択される、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１６７】
前記第１の組換え部位および前記第２の組換え部位が、ｌｏｘ部位である、請求項１６６に記載の方法。
【請求項１６８】
前記第１の組換え部位および前記第２の組換え部位が、ａｔｔ部位である、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１６９】
前記ａｔｔ部位が、ａｔｔＢ部位、ａｔｔＰ部位、ａｔｔＬ部位、およびａｔｔＲ部位からなる群より選択される、請求項１６８に記載の方法。
【請求項１７０】
前記第１の核酸分子または前記第２の核酸分子が、少なくとも１つのさらなる組換え部位をさらに含む、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１７１】
前記少なくとも１つのさらなる組換え部位が、ｌｏｘ部位およびａｔｔ部位からなる群より選択される、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７２】
前記少なくとも１つのさらなる組換え部位が、少なくとも１つのｌｏｘ部位である、請求項１７０に記載の方法。 
【請求項１７３】
前記少なくとも１つのさらなる組換え部位が、ｌｏｘ部位である、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７４】
前記ｌｏｘ部位が、ｌｏｘＰ部位である、請求項１７３に記載の方法。
【請求項１７５】
前記少なくとも1つのさらなる組換え部位が、少なくとも1つのａｔｔ部位である、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７６】
前記少なくとも１つのさらなる組換え部位が、ａｔｔ部位である、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７７】
前記ａｔｔ部位が、ａｔｔＢ部位、ａｔｔＰ部位、ａｔｔＬ部位およびａｔｔＲ部位からなる群より選択される、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１７８】
前記プロモーターが、前記第１の組換え部位に隣接して位置する、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１７９】
前記抗生物質耐性遺伝子が、前記第２の組換え部位に隣接して位置する、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１８０】
前記第１の核酸分子または前記第２の核酸分子が、少なくとも１つのクローニング部位を含む、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１８１】
前記少なくとも１つの組換えタンパク質が、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、ＦＬＰ、γδ、Ｔｎ３レソルバーゼ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、Ｃｉｎ、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１８２】
前記少なくとも１つの組換えタンパク質が、Ｃｒｅである、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１８３】
前記少なくとも１つの組換えタンパク質が、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、およびＸｉｓからなる群より選択される、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１８４】
前記第１の核酸分子、または前記第２の核酸分子、または前記第３の核酸分子が、ベクターである、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１８５】
前記ベクターが、発現ベクターである、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１８６】
前記第１の核酸分子または前記第２の核酸分子が、直鎖状である、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１８７】
前記遺伝子の第１または第２の部分が、ＰＣＲ産物である、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１８８】
少なくとも１つの宿主細胞を前記混合物と接触させる工程と、前記第３の核酸分子を含む宿主細胞をポジティブ選択する工程とをさらに包含する、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１８９】
前記第１の核酸分子または前記第２の核酸分子を含む宿主細胞をネガティブ選択する工程をさらに包含する、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９０】
前記第１の核酸分子および前記第２の核酸分子を含む宿主細胞をネガティブ選択する工程をさらに包含する、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９１】
前記宿主細胞が、原核生物細胞である、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９２】
前記宿主細胞が、細菌細胞である、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９３】
前記宿主細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞である、請求項１８８に記載の方法。 
【請求項１９４】
前記第３の核酸分子を宿主細胞に導入する工程をさらに包含する、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１９５】
前記核酸分子を宿主細胞に導入する工程と、前記抗生物質耐性遺伝子を発現させる工程とをさらに包含する、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１９６】
前記宿主細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞である、請求項１９５に記載の方法。 
【請求項１９７】
核酸分子を産生する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）少なくとも１つのプロモーターおよび少なくとも１つの第１のｌｏｘＰ部位を含む、第１の核酸分子を提供する工程；と 
（ｂ）少なくとも１つの抗生物質耐性遺伝子および少なくとも１つの第２のｌｏｘＰ部位を含む、第２の核酸分子を提供する工程；と 
（ｃ）該第１のｌｏｘＰ部位と該第２のｌｏｘＰ部位との間の組換えをインビトロで引き起こすのに十分な条件下で、該第１および第２の核酸分子ならびに少なくとも１つのＣｒｅ組換えタンパク質とで混合物をインビトロで形成させて、それにより、第３の核酸分子を産生する工程であって、該第３の核酸分子において、該プロモーターと該抗生物質耐性遺伝子は、作動可能に連結されている、工程、 
とを包含する、方法。 
【請求項１９８】
前記抗生物質耐性遺伝子が、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、メチシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、およびカナマイシン耐性遺伝子からなる群より選択される、請求項１９７に記載の方法。 
【請求項１９９】
前記抗生物質耐性遺伝子が、クロラムフェニコール耐性遺伝子である、請求項１９７に記載の方法。
【請求項２００】
前記第３の核酸分子を宿主細胞に導入する工程をさらに包含する、請求項１９７に記載の方法。
【請求項２０１】
前記第３の核酸分子を宿主細胞に導入する工程と、前記抗生物質耐性遺伝子を発現させる工程とをさらに包含する、請求項１９７に記載の方法。
【請求項２０２】
前記宿主細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞である、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２０３】
目的の核酸のインビトロクローニングのための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）少なくとも１つの第１の組換え部位を含む第１のベクターと、少なくとも１つの第２の組換え部位を含む第２のベクターをインビトロで混合する工程であって、ここで、該第１および／または第２のベクターは、目的の核酸をさらに含む、工程；と 
（ｂ）少なくとも１つの組換えタンパク質の存在下において、少なくとも該第 １の組換え部位と該第２の組換え部位との組換えを引き起こすのに十分な条件下で、該混合物をインキュベートし、それにより目的の該核酸を含むキメラ核酸分子を産生する工程；と
（ｃ）１つ以上の宿主を該混合物と接触させる工程：と 
（ｄ）該キメラ核酸分子を含む宿主をネガティブ選択する工程と、該第１のベクターを含む宿主と該第２のベクターを含む宿主をネガティブ選択する工程であって、それにより目的の該核酸をクローニングする、工程；
とを包含する、方法。 
【請求項２０４】
前記少なくとも1つの組換えタンパク質が、バクテリオファージλ、φ８０、Ｐ２２、Ｐ２、１８６、Ｐ４およびＰ１からなる群より選択されるバクテリオファージによりコードされている、請求項２０３に記載の方法。 
【請求項２０５】
前記少なくとも１つの組換えタンパク質が、バクテリオファージλによりコードされている、請求項２０３に記載の方法。
【請求項２０６】
前記少なくとも１つの組換えタンパク質が、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、およびＣｒｅからなる群より選択される、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２０７】
前記少なくとも１つの組換えタンパク質が、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、およびＸｉｓからなる群より選択される、請求項２０３に記載の方法。
【請求項２０８】
前記少なくとも１つの組換えタンパク質が、αδ、Ｔｎ３レソルバーゼ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、Ｃｉｎ、およびＦｌｐからなる群より選択される、請求項２０３に記載の方法。
【請求項２０９】
前記少なくとも１つの組換えタンパク質が、Ｃｒｅである、請求項２０３に記載の方法。
【請求項２１０】
前記組換え部位が、ａｔｔ部位およびｌｏｘＰ部位からなる群より選択される、請求項２０３に記載の方法。 
【請求項２１１】
前記組換え部位が、ａｔｔ部位である、請求項２０３に記載の方法。
【請求項２１２】
前記組換え部位が、ｌｏｘＰ部位である、請求項２０３に記載の方法。
【請求項２１３】
前記方法が、前記第１および第２のベクターを含むキメラベクターを産生する、請求項２０３に記載の方法。
【請求項２１４】
前記第１および／または第２の組換え部位が、配列番号１〜１６、これらに相補的なＤＮＡ配列、およびこれらに対応するＲＮＡ配列からなる群より選択される少なくとも１つの第１の核酸配列を含む、請求項２０３に記載の方法。
【請求項２１５】
前記宿主が、Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項２０３に記載の方法。
【請求項２１６】
前記選択が、少なくとも１つの選択マーカーを用いて達成される、請求項２０３に記載の方法。
【請求項２１７】
前記選択マーカーが、抗生物質耐性遺伝子および毒性遺伝子からなる群より選択される、請求項２０３に記載の方法。