(57)【要約】【課題】エバネッセント光照明技術を利用した物質の位置情報や変位情報を提供すること。【解決手段】エバネッセント光ＰＥの強度が、界面Ｓからの距離Ｚの増加とともに指数関数的に急速的に減衰するという性質を利用して、エバネッセント光ＰＥを発生し得る界面Ｓに検出物質Ｔを固定しておき、前記エバネッセント光ＰＥによって励起された前記検出物質Ｔ由来の蛍光強度Ｉに基づいて、前記検出物質Ｔの位置情報Ｚや変位情報（Δｚ）を取得する。この位置情報Ｚや変位情報（Δｚ）を用いて、物質の構造又はその変化、塩基配列、物質間の相互作用の有無又は進行状況などを捉える。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
エバネッセント光を発生し得る界面領域に検出物質を存在させておき、
前記エバネッセント光によって励起された前記検出物質由来の蛍光強度に基づいて、前記検出物質の位置情報を取得する物質情報取得方法。
【請求項２】
前記検出物質は、前記界面に固定されていることを特徴とする請求項１記載の物質情報取得方法。
【請求項３】
前記検出物質が存在する反応場の物理的又は化学的な条件の変化する前後の蛍光強度情報を取得することにより、該検出物質の変位情報を得ることを特徴とする請求項１記載の物質情報取得方法。
【請求項４】
前記変位情報は、物質の構造又は形態の変化によってもたらされるものであることを特徴とする請求項２記載の物質情報取得方法。
【請求項５】
前記励起蛍光の強度をリアルタイムでモニタリングすることを特徴とする請求項１記載の物質情報取得方法。
【請求項６】
前記位置情報は、ナノスケールの位置情報であることを特徴とする請求項１記載の物質情報取得方法。
【請求項７】
測定された前記蛍光強度に係るデータを、予め取得されている標準データに基づいて補正を行なうことによって前記位置情報を決定することを特徴とする請求項１記載の物質情報取得方法。
【請求項８】
光源と、
該光源からの出射光がエバネッセント光を発生し得る界面と、
前記エバネッセント光により励起され、前記界面に存在する検出物質から発せられた蛍光強度を検出する蛍光検出部と、
前記蛍光強度情報と界面からの距離に相関する前記エバネッセント光の減衰率情報に基づいて、前記反応場における検出物質の位置又は／及び変位を自動解析する解析部と、
を少なくとも備える物質情報測定装置。
【請求項９】
前記出射光が進行する側の反対側の界面が臨む反応場の物理的又は化学的条件を変化させ得る反応場条件制御部を備えることを特徴とする請求項７記載の物質情報測定装置。
【請求項１０】
前記反応場条件制御部は、前記反応場に対する電界印加手段を有することを特徴とする請求項８記載の物質情報測定装置。
【請求項１１】
核酸鎖の塩基又は塩基対と結合したときに構造変化するタンパク質を、エバネッセント光を発生し得る界面領域に保持させておく手順と、
前記核酸鎖と前記タンパク質を結合させる手順と、
前記エバネッセント光によって励起された前記タンパク質由来の蛍光の強度を時系列で連続的に測定する手順と、
この測定で得られた蛍光強度データと塩基又は塩基対の種類に相関する前記タンパク質の蛍光強度データベースとを自動照合する手順と、
を行うことによって一本鎖又は二本鎖の核酸の塩基配列を決定する方法。
【請求項１２】
前記タンパク質は、複数の塩基又は塩基対を認識単位として構造変化することを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
核酸鎖の塩基又は塩基対と結合したときに構造変化するタンパク質を蛍光物質により標識した上で保持させておくとともに、エバネッセント光を発生させるための界面と、
前記タンパク質由来の蛍光強度を、前記エバネッセント光の蛍光励起に基づいて連続的に測定可能な蛍光検出部と、
塩基又は塩基対の種類に相関する前記タンパク質の蛍光強度データベースを格納しておくデータベース格納部と、
前記測定で得られた蛍光強度データと前記蛍光強度データベースとを自動照合することによって核酸鎖の塩基配列を決定するデータ処理部と、
を少なくとも備える塩基配列決定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エバネッセント光を利用する物質情報の取得技術に関する。より詳しくは、エバネッセント光を蛍光励起光として利用して、界面に固定化された物質の構造、形態、相互作用、塩基配列などを測定又は決定する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
物質の位置変化（変位）を測定する手法は、その対象物の大きさにより様々である。マイクロスケールまでのものは光学顕微鏡等でその長さ、変位を測定することが可能である。しかしながら、光学顕微鏡の水平解像度の限界が数百ナノメートルであり、ナノスケールの物質の、物理的、化学的作用を与えられたときの大きさ等の変化をとられることは不可能である。
【０００３】
電子顕微鏡等は、真空中で測定することや蒸着が必要である等の問題で、任意の状態での動的な変化を測定することは不可能であり、例えば、液中でのタンパクやＤＮＡの構造変化に伴う変位を見ることはできない。唯一、原子間力顕微鏡は、これが可能であるが、測定準備と操作の難しく、測定確度が個々の探針へ依存してしまう等の問題がある。また、時間スケールの短い動的変化を捉えたい場合、一画像を得るのに測定時間が数十分単位で必要になるＡＦＭは適用できない。
【０００４】
ここで、臨界角以上の入射角条件（全反射条件）で、屈折率のより大きい媒質から屈折率のより小さい媒質へ光が入射すると、入射光の反対側界面の近接場にエバネッセント光が発生することが知られている。このエバネッセント光の強度は、界面からの距離の増加とともに指数関数的に急速的に減衰する。
【０００５】
このエバネッセント光を利用して物質の挙動や状態を解析する技術が特許文献１、特許文献２に開示されている。より詳しくは、特許文献１には、細胞中の検出物質に蛍光標識しておき、エバネッセント照明を行いながら前記検出物質から発せられる蛍光信号を複数の時点で経時的に検出し、この蛍光信号の変化を基に、検出物質の１分子あたりの挙動や状態を解析する技術が開示されている。特許文献２には、蛍光標識した染色体にエバネッセント光を照射する等して、染色体の構造や染色体上の遺伝子の配列やその状態を観察する技術が開示されている。
【特許文献１】特開２００３−２９４６３１号公報。
【特許文献２】特開平１０−２２１３３９号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在、物質間の相互作用、物質の状態（例えば、構造や塩基配列など）や動態（例えば、構造変化、反応の進行状況など）に係る情報を、水晶発振子原理、表面プラズモン共鳴原理、励起蛍光検出原理などのような検出原理に基づいて検出又は測定する技術が徐々に開発され始めている。しかしながら、いずれの技術においてもその検出精度に関してはいまだ改良の余地がある段階であり、ナノスケールレベルで物質の前記情報を正確に取得できる技術に至っているとは言えない。
【０００７】
そこで、本発明は、エバネッセント光照明技術を利用した物質の位置や変位に係る情報、特にナノスケールレベルの位置や変位に係る情報を取得する新規技術、そして、これらの情報を利用して物質の相互作用、状態、動態などを正確に検出又は測定する新規技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
臨界角以上の入射角条件（全反射条件）で、屈折率のより大きい媒質から屈折率のより小さい媒質へ光が入射すると、入射光が進行する側の反対側の界面の近接場にエバネッセント光（エバネッセント波）が発生する。本発明は、このエバネッセント光の強度が、界面からの距離の増加とともに指数関数的に減衰する性質を利用する。
【０００９】
本発明は、まずエバネッセント光を発生し得る界面領域に検出物質を存在させておき、前記エバネッセント光によって励起された前記検出物質由来の蛍光強度に基づいて、前記検出物質の位置情報を取得する物質情報取得方法を提供する。
【００１０】
即ち、本発明では、（１）検出物質をエバネッセント光の照射範囲である界面（入射光側の反対側の界面）近傍に存在させておくこと、（２）当該界面で発生したエバネッセント光を蛍光励起光として用いること、（３）検出物質に人為的に標識された蛍光色素や該検出物質それ自体が保有する蛍光をエバネッセント光で励起し、その励起蛍光の強度から検出物質の位置情報を取得すること、を主な特徴としている。この位置情報は、ナノスケールレベルで取得が可能であり、物質間の相互作用や物質の状態や動態を調べるために有用な情報となる。
【００１１】
なお、本発明において「検出物質」とは、物質情報の取得の対象となる物質を意味し、エバネッセント光が発生する界面領域に経時的又は一時的に存在させた状態、例えば、該界面に固定又は保持させた状態で使用される。「位置情報」は、検出物質に人為的に標識された蛍光色素や検出物質の蛍光発生部位が存在する位置（以下、「蛍光発生位置」と称する）と界面との間の距離情報や該距離情報の変化に関する情報の両方を含む。
【００１２】
本発明では、検出物質が存在する反応場の物理的又は化学的な条件が変化する場合（例えば、人為的な操作によって変化させた場合）に、このような条件変化の前後の検出物質の蛍光強度情報を取得することによって、該検出物質の変位情報、より詳しくは検出物質の蛍光発生位置の界面からの距離の変化の程度を知ることができる。このような変位が物質の一次構造、二次構造、三次構造、高次構造などの構造又は形態の変化によってもたらされる場合、この変位情報は、物理的又は化学的な条件変化が物質の構造や形態へ与える影響に関する情報となる。
【００１３】
また、本発明では、励起蛍光の強度をリアルタイムでモニタリングすることによって、該検出物質の位置情報の経時的変化を追跡することができる。これにより、例えば、検出物質それ自体の外的条件変化による動態や該検出物質が係る相互作用の進行に係る情報などを取得できる。
【００１４】
さらに、本発明では、測定された前記蛍光強度に係るデータを、予め取得されている標準データに基づいて補正を行なうことで物質の位置情報を決定することによって、測定データの信頼性を向上させてもよい。標準データとは、例えば、分子長が正確に決定された蛍光標識物質を分子長違いで必要数準備しておき、これらの蛍光標識物質の界面からの距離の違いによって変化する蛍光強度データである。この蛍光強度データは、界面からの距離に応じた蛍光強度を正確に反映する。
【００１５】
次に、本発明では、光源と、該光源からの出射光がエバネッセント光を発生し得る界面と、前記エバネッセント光により励起され、前記界面に存在する検出物質から発せられた蛍光強度を検出する蛍光検出部と、前記蛍光強度情報と界面からの距離に相関する前記エバネッセント光の減衰率情報とに基づいて、前記反応場における検出物質の位置又は／及び変位を自動解析する解析部と、を少なくとも備える物質情報測定装置を提供する。さらにこの装置では、光源からの出射光が進行する側の反対側の界面が臨む反応場の物理的又は化学的条件を変化させ得る反応場条件制御部を設けてもよい。
【００１６】
本装置の反応場条件制御部は、反応場の物理的又は化学的条件を人為的に制御できる手段であって、例えば、温度、ｐＨ、圧力、物質濃度、塩濃度、溶媒種等の条件を自在に操作できる手段、前記反応場に対する電界印加手段、これらの手段を選択的に自在に操作できる手段などを挙げることができる。
【００１７】
次に本発明では、核酸鎖の塩基又は塩基対と結合したときに構造変化するタンパク質をエバネッセント光を発生し得る界面領域に保持させておく手順と、前記核酸鎖と前記タンパク質を結合させる手順と、前記エバネッセント光によって励起された前記タンパク質由来の蛍光の強度を時系列で連続的に測定する手順と、この測定で得られた蛍光強度データと塩基又は塩基対の種類に相関する前記タンパク質の蛍光強度データベースとを自動照合する手順と、を行うことによって一本鎖又は二本鎖の核酸の塩基配列を決定する方法を提供する。本方法で採用し得るタンパク質は、核酸鎖との結合によって構造変化する性質を有するものの中から選択でき、例えば、複数の塩基又は塩基対を認識単位として構造変化するタンパク質を採用できる。なお、タンパク質からの蛍光強度の検出は、当該タンパク質に蛍光物質を標識（ラベル）しておいて、この蛍光物質からの蛍光の強度を検出する方法、あるいは、当該タンパク質それ自体を構成するアミノ酸からの蛍光の強度を検出する方法などを目的に応じて適宜採用することができる。
【００１８】
また、本発明では、核酸鎖の塩基又は塩基対と結合したときに構造変化するタンパク質を蛍光標識した上で保持させておくとともに、エバネッセント光を発生させるための界面と、前記タンパク質由来の蛍光強度を、前記エバネッセント光の蛍光励起に基づいて連続的に測定可能な蛍光検出部と、塩基又は塩基対の種類に相関する前記タンパク質の蛍光強度データベースを格納しておくデータベース格納部と、前記測定で得られた蛍光強度データと前記蛍光強度データベースとを自動照合することによって核酸鎖の塩基配列を決定するデータ処理部と、を少なくとも備える塩基配列決定装置を提供する。
【００１９】
即ち、これらの塩基配列決定に係る方法や装置では、界面領域に保持（例えば、固定）されているタンパク質が一本鎖又は二本鎖の核酸鎖に沿って移動していく際に、塩基又は塩基対の種類によって構造変化するときの蛍光強度の変化（蛍光物質の位置変化）を連続的に追跡することによって得られた蛍光強度データを、予め取得してある塩基又は塩基対の種類に相関する前記タンパク質の蛍光強度データベースと自動照合することによって核酸鎖の塩基配列を決定することを特徴としている。
【発明の効果】
【００２０】
本発明では、エバネッセント光照明によって、界面に固定された物質の位置情報や変位情報、特にナノスケールレベルの位置情報や変位情報を取得できる。より詳しくは、対象となる検出物質のナノスケールレベルの位置情報や変位情報を、非接触で、高精度に数値化することができる。これにより、物質間の相互作用の有無や進行状況、物質の構造や塩基配列などの状態や動態を検出又は測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明を実施するための好適な形態について、添付図面を参照しながら説明する。なお、添付図面に示された各実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００２２】
まず図１、図２は、本発明に係る方法や装置で用いるエバネッセント光照射の基本的な原理を説明するための図である。
【００２３】
図１には、光源Ｑと、該光源Ｑからの出射光Ｐがエバネッセント光ＰＥを発生し得る界面Ｓと、前記エバネッセント光ＰＥにより励起され、前記界面Ｓの近接場Ａに存在する検出物質（図１では示さず。）から発せられた蛍光ｆの強度を検出する蛍光検出部Ｄと、この蛍光強度情報と界面Ｓからの距離に相関する前記エバネッセント光ＰＥの減衰率情報に基づいて、反応場Ｒにおける検出物質の位置又は／及び変位を自動解析する解析部Ｃと、を備える物質情報測定装置が示されている。
【００２４】
なお、検出物質からの蛍光強度の検出は、当該検出物質に蛍光物質を標識（ラベル）しておいて、この蛍光物質からの蛍光の強度を検出する方法、あるいは、当該検出物質それ自体を構成する蛍光発光性の物質からの蛍光の強度を検出する方法などを目的に応じて適宜採用することができる。
【００２５】
蛍光検出部Ｄは、蛍光ｆを集光し平行光に変換するレンズＬ１、光検出器（フォトディテクタ）ＰＤ、該光検出器ＰＤへ蛍光ｆを集光するレンズＬ２、蛍光ｆに混ざって進行してくる光ＰをカットするためのフィルターＨ、光進行方向を変更するための図示しないミラー（例えば、ダイクロイックミラー）などを必要に応じて備えている。
【００２６】
解析部Ｃは、コンピュータであって、蛍光強度と界面Ｓからの距離に相関する前記エバネッセント光ＰＥの減衰率情報がデータベースとして予め格納されているとともに、このデータベースと実際に測定された蛍光強度とを照合して、蛍光ｆの発生源である蛍光物質が存在する位置を、界面Ｓから距離として自動演算して算出するプログラムが格納されている。
【００２７】
ここで、エバネッセント光照射原理について説明すると、光源Ｑから臨界角以上の入射角条件（全反射条件）で、屈折率のより大きい媒質Ｍ１から屈折率のより小さい媒質Ｍ２へ光Ｐが入射されると、この入射光Ｐの反対側界面Ｓの近接場Ａにエバネッセント光（エバネッセント波）ＰＥが発生する。このエバネッセント光ＰＥの強度（電場の二乗）は、界面Ｓからの距離Ｚの増加とともに指数関数的に急速的に減衰するという性質を有しており（図２参照）、この性質は、以下の数式群を用いて具体的に説明することができる。なお、以下の数式群に示された符号の意味は、「符号の説明」の欄にまとめて記載する。
【００２８】
まず、電場分布は、次の「数式１」で示すことができる（大津元一著 近接場光の基礎 p.26-29）。
【００２９】
【数１】
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【００３０】
エバネッセント光ＰＥを照明源に用いることによって、例えば、固液界面近傍のみの蛍光情報を取り出すことができることが知られており、この手法は、実際にTIRF顕微鏡などに応用されている。ここで、蛍光強度はエバネッセント光ＰＥの線形関数であり、その時間平均を考える場合、位置（ｘ）に依らないので、前掲した電場分布の「数式１」から、次の「数式２」のように書き換えることができる。
【００３１】
【数２】
2007040979.tif 000004
【００３２】
さらに、次の「数式３」のように置くと、さらに続く「数式４」を導くことができる。
【００３３】
【数３】
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【００３４】
【数４】
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【００３５】
上記数式３，４のｄは、各媒質と入射角と波長に依存し、これが小さいほどより短距離でエバネッセント光ＰＥの強度は減衰する。ここで、エバネッセント光ＰＥを蛍光励起光として用いる場合、同じエバネッセント光場中で、蛍光物質の位置（ｚ）が、１の状態から２の状態へ変化するような現象の前後で、蛍光強度（=kI(z)）の変化を得ることができると、先の数式４から次の数式５のように、蛍光物質の位置変化（変位）を算出し解析することができる。
【００３６】
【数５】
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【００３７】
次に、エバネッセント光ＰＥを蛍光励起光として用いて、前掲の数式５などに基づいて、界面Ｓの近接場Ａに存在する蛍光物質の位置情報を測定することを利用する測定系の実施形態例について、図３、図４に基づいてより具体的に説明する。
【００３８】
まず、図３に示す実施形態例では、エバネッセント光ＰＥを形成し得る界面Ｓに対して核酸鎖である検出物質Ｔの一端が固定され、この検出物質Ｔの他端部に蛍光物質（蛍光色素）Ｆが標識されている。初期状態（Ｉ）では、この検出物質Ｔ（Ｔ１）がランダムコイル状に絡みあって存在し、蛍光物質Ｆは界面Ｓに近接した位置に存在している。このときのエバネッセント光ＰＥによって得られる蛍光強度を仮にＩ１とする。
【００３９】
次に、反応場Ｒの物理的条件又は化学的条件を変化させる。例えば、反応場Ｒに電界を印加させると、核酸鎖である検出物質Ｔが、その一端が固定された状態のままで伸張させることが可能であるため、界面Ｓから蛍光物質Ｆまでの距離が長くなる（図３中の符号Ｔ２参照）。このときのエバネッセント光ＰＥによって得られる蛍光強度Ｉ２は、前記蛍光強度Ｉ１よりも減衰した値となる（再び、図２参照）。
【００４０】
ここで、初期状態（Ｉ）で得られた蛍光強度Ｉ１と反応場Ｒの物理的条件又は化学的条件を変化させた後の蛍光強度Ｉ２とを上記数式５に代入すると、検出物質Ｔに標識された蛍光物質Ｆの界面Ｓからの距離変化、即ち変位量（Δｚ、図２参照）を数値化することができる。このような測定系では、例えば、外的条件の変化が核酸鎖の高次構造などの物質の構造や形態などに及ぼす影響を知ることができる。
【００４１】
なお、核酸分子は、液相中において電界の作用を受けると伸張又は移動することが知られている。その原理は、骨格をなすリン酸イオン（陰電荷）とその周囲にある水がイオン化した水素原子（陽電荷）とによってイオン曇を作っていると考えられ、これらの陰電荷及び陽電荷により生じる分極ベクトル（双極子）が、高周波高電圧の印加により全体として一方向を向き、その結果として伸長し、加えて、不均一電界が印加された場合、電気力線が集中する部位に向かって移動する（Seiichi Suzuki，Takeshi Yamanashi,Shin-ichi Tazawa,Osamu Kurosawa and Masao Washizu:“Quantitative analysis on electrostatic orientation of DNA in stationary AC electric field using fluorescence anisotropy”,IEEE Transaction on Industrial Applications,Vol.34,No.1,P75-83(1998)）。
【００４２】
次に、図４は、界面Ｓの近接場Ａに存在する蛍光物質の位置情報を測定する他の実施形態例を説明するための図、即ち、本発明を適用した一例であり、ハイブリダイゼーションを検出する場合の概念を示す図である。
【００４３】
まず、この実施形態例では、自己ループ構造をとり得る塩基配列構造を有し、蛍光物質（蛍光色素）Ｆが末端に標識されたプローブ核酸鎖Ｘの他端を界面Ｓに固定しておくようにする。図３の（Ｉ）に示す状態のプローブ核酸鎖Ｘ１は自己ループ構造を形成した状態にあるため、蛍光物質Ｆは、界面Ｓに近接した位置に存在する。このときのエバネッセント光ＰＥによって得られる蛍光強度を仮にＩ１とする。
【００４４】
次に、界面Ｓ上の反応場Ｒに対して、プローブ核酸鎖Ｘと相補的な塩基配列部位を備える核酸鎖Ｙを導入すると、核酸鎖Ｘ（Ｘ１）の自己ループ構造が解け、核酸鎖Ｙと二本鎖を形成する。このとき、核酸鎖Ｘ（Ｘ２）の蛍光色素Ｆと界面Ｓとの距離は長くなる（図４（ＩＩ）参照）。このときのエバネッセント光ＰＥによって得られる蛍光強度を仮にＩ２（Ｉ２＜Ｉ１）する。
【００４５】
ここで、初期状態（Ｉ）で得られた蛍光強度Ｉ１と前記蛍光強度Ｉ２を上記数式５に代入すると、プローブ核酸鎖Ｘに標識された蛍光物質Ｆの界面Ｓからの距離変化、即ち変位量（Δｚ）を具体的に数値化することができる。このような測定系では、例えば、プローブ核酸鎖Ｘのハイブリダイゼーションの有無や進行状況を検出することができる。
【００４６】
図３や図４に示した実施形態例から明らかなように、本発明によれば、物質の構造変化や物質間の相互作用に係る情報を得ることができ、また、蛍光強度をリアルタイムでモニタリング測定することによって、物質の経時的な動態変化や相互作用の進行状況などを知ることができる。
【００４７】
次に図５は、本発明に係る塩基配列決定方法の一実施形態例の概念を模式的に示す図である。
【００４８】
本実施形態では、まず、核酸鎖の塩基又は塩基対と結合したときに構造変化するタンパク質Ｅに蛍光物質Ｆを標識した上で界面Ｓ領域に保持（例えば、固定）させておくようにする。なお、固定などの保持手段は目的などに応じて適宜決定できる。
【００４９】
タンパク質Ｅは、図５中に符号Ｎで示した核酸鎖に結合するときに、該タンパク質Ｅ（又は核酸鎖Ｎ）がスライドするように移動する機能を有するもので、核酸鎖Ｎに結合したときに、その結合する塩基（あるいは、塩基対）の種類によって特有の構造変化を伴う性質を有するものが好適に採用される。例えば、ＤＮＡヘリカーゼやポリメラーゼを採用できる。
【００５０】
図５の（Ｉ）は、タンパク質Ｅ（Ｅ１）が界面Ｓ上の反応場Ｒに導入された核酸鎖Ｎに結合しているある時点の様子が示されている。このとき、タンパク質Ｅ１に標識された蛍光物質Ｆは、界面Ｓから距離ｚ１の位置に存在し、エバネッセント光ＰＥ（図５では示さず。図１参照）によって、強度Ｉ１の蛍光を発する。
【００５１】
なお、核酸鎖Ｎは、図５においては一本鎖で示されているが、二本鎖であってもよい。また、本実施形態では、タンパク質Ｅに蛍光物質Ｆを標識する方法が例示されているが、該タンパク質Ｅを構成する蛍光発光性のアミノ酸（例えば、トリプトファン等）からの蛍光の強度を検出する方法も目的に応じて適宜採用することができる。
【００５２】
図５の（ＩＩ）は、タンパク質Ｅに対して核酸鎖Ｎが一塩基分又は数塩基単位でスライドした状態を示している。このときにタンパク質Ｅが結合する塩基種又は塩基の組み合わせ（核酸鎖Ｎが二本鎖では塩基対の種類や塩基対の組み合わせ）が異なると、タンパク質Ｅの構造が変化する（図５（ＩＩ）の符号Ｅ２参照）。このとき、タンパク質Ｅに標識された蛍光物質Ｆは、界面Ｓから距離ｚ２（例えば、ｚ２＜ｚ１）の位置に存在し、エバネッセント光ＰＥ（図５では示さず。図１参照）によって、強度Ｉ１よりも減衰した強度Ｉ２（即ち、Ｉ２＞Ｉ１）の蛍光を発する。
【００５３】
このような蛍光強度測定を行う前に、塩基又は塩基対の種類や組み合わせに相関する（界面Ｓ上での）タンパク質Ｅの蛍光強度を予め測定しておいて、これをデータベース化しコンピュータ（図１の解析部Ｃに相当）の記憶部に格納しておく。そして、前記コンピュータのデータ処理部において、前記データベースと測定された蛍光強度Ｉ１やＩ２とを予め格納されているコンピュータプログラムに基づいて自動的に照合することにより、当該核酸鎖Ｎの塩基配列を自動的に決定する。
【００５４】
このような塩基配列決定方法を実施できる装置は、例えば、図１に示すような装置構成を備える。まず、当該装置は、核酸鎖Ｎの塩基又は塩基対と結合したときに構造変化するタンパク質Ｅに蛍光物質Ｆを標識した上で保持させておくとともに、エバネッセント光を発生させることができる界面Ｓを有している。
【００５５】
そして、前記タンパク質Ｅに標識された蛍光物質Ｆを前記エバネッセント光ＰＥによって励起し、発生した蛍光励起光Ｆに基づいて連続的に測定することができる蛍光検出部Ｄを備え、さらに、塩基又は塩基対の種類に相関する前記タンパク質Ｅの蛍光強度データベース（基礎データベース）を格納しておくデータベース格納部と、前記測定で得られた蛍光強度データと前記蛍光強度データベースとを自動照合することによって核酸鎖の塩基配列を決定するデータ処理部と、を少なくとも備える塩基配列決定装置を提供する。なお、データベース格納部とデータ処理部は、図１に示す解析部Ｃに設けられている。
【００５６】
即ち、これらの塩基配列決定に係る方法や装置では、界面Ｓ領域に保持（例えば、固定）されているタンパク質Ｅに対して一本鎖又は二本鎖の核酸鎖が移動していく際に、塩基又は塩基対の種類によって、該タンパク質Ｅが構造変化するときの蛍光強度の変化（蛍光物質の位置（界面からの距離）変化）を連続的に追跡することによって得られた蛍光強度データを、予め取得してある塩基又は塩基対の種類に相関する前記タンパク質の蛍光強度データベースと自動照合することによって、核酸鎖の塩基配列を連続的に自動決定することができる。
【実施例１】
【００５７】
上記説明した測定原理や方法に基づいて、短鎖のＤＮＡに対して電界を印加したときの該ＤＮＡの平均長変化測定に関する実験を行った。
【００５８】
より具体的には、垂直方向に対向電極を持つセル（口径２００μｍ、高さ（深さ）５μｍの反応場）を形成し、このセルの底面にエバネセント光を発生させた。ＤＮＡの一端をこのセル底面に化学結合により固定し、他端を蛍光色素(Cy3)で標識した。そして、この蛍光色素の位置に応じて変化するであろう蛍光強度を、電界印加前後で測定した。測定は顕微鏡上で行った。
【００５９】
ここで、全反射入射だけでの測定では、エバネッセント光の強度変化に起因する蛍光強度変化と電界印加による温度変化に起因する蛍光強度変化とを分離することができないという問題が生じると考えられる。
【００６０】
そこで、本実施例では、さらに実験測定系に変更を加えて、垂直全入射光での測定も同時に行うことで、温度変化による蛍光強度の変化を分離するように工夫した。すなわち、垂直入射光による励起では、基板からの高さによって励起光強度は変化しないため、反応場での蛍光色素（Cy3分子）は位置に関係なく同じ蛍光強度を発する。この蛍光強度は、温度のみの関数となる。このような測定系に基づいて、エバネッセント励起光の高さ（界面からの距離）に依存する蛍光強度変化を測定した結果を図６に示す。
【００６１】
この図６は、１ｍｅｒ、３０ｍｅｒ、９０ｍｅｒの３種類のCy3修飾合成オリゴＤＮＡに対し、６．５Ｖｐｐ／μｍの電界を印加したときのエバネッセント光励起(図６中のTIRFに対応)と垂直入射励起(図６中のTRANSに対応)の蛍光強度の変化を示している。
【００６２】
１ｍｅｒの場合では、エバネッセント励起(TIRF)と垂直入射励起(TRANS)とで、蛍光強度の変化は、ノイズレベル程度の差しかないが（図６中の一番下のグラフ参照）、３０ｍｅｒ、９０ｍｅｒの場合では、ノイズレベル以上の明確な差が得られた（図６参照）。なお、それぞれ、温度上昇による強度変化は２．５〜３．０％程度であり、これは別途蛍光強度温度特性の結果より算出すると、１℃弱の温度上昇に対応する。
【００６３】
このベースラインから、３０ｍｅｒ、９０ｍｅｒの場合は、それぞれ１．７％程度がエバネッセント励起(TIRF)の場合に蛍光強度はさらに低下する。この結果を基に、ＤＮＡの伸張した長さを算出したところ、３０ｍｅｒ、９０ｍｅｒのＤＮＡでは、双方とも３ｎｍ程度平均長が変化したことがわかった。
【００６４】
即ち、本実験により、電界印加による反応溶液の温度変化による蛍光強度の変化を排除した上で、エバネッセント光の強度変化に起因する蛍光強度変化に基づいて、ＤＮＡの高次構造変化（電界による伸張）を検出することができた。
【実施例２】
【００６５】
実施例２では、上記説明した測定原理や方法に基づいて、生体高分子の塩濃度環境変化における平均長変化測定に関する実験を行った。
【００６６】
ガラスボトムディッシュのガラス上に、９０ｍｅｒのｓｓＤＮＡの一端を固定し、他端を蛍光色素（Cy3）で標識した。そこに、純水あるいは塩水を満たした。ガラス界面に全反射条件を満足させて励起レーザー光を入射し、エバネッセント光を発生させた。
【００６７】
純水環境のとき（I）、純水環境にあった系に対し１５秒経過後に１０ｍＭのＮａＣｌを滴下し終濃度２ｍＭにしたとき（II）、２ｍＭ ＮａＣｌ環境にあった系に対し更に１５秒経過後に２ｍＭのＮａＣｌを滴下したとき（III）の蛍光色素の位置に応じて変化する蛍光強度を時系列測定した。結果を図７に示す。
【００６８】
図７に示す通り、純水中のｓｓＤＮＡを標識する蛍光の強度が、塩滴下後に増大することが分かる。すなわち、塩滴下に伴い、蛍光標識が、ガラス界面に接近したことが分かる。これは、図８に示すように、純水中ではＤＮＡ鎖を構成するイオン同士の静電的反発により、鎖が伸張した状態であるが（図８（I）参照）、塩滴下により、ガラス上に満たされた溶液のイオン強度が増すことで、ＤＮＡ鎖を構成するイオンが遮蔽され、鎖内の反発力が低減し、構造が縮退することによると考えられる（図８（II）参照）。
【００６９】
蛍光強度変化を前述した数式５により計算すると、ｓｓＤＮＡを標識した蛍光の塩滴下前後の変位は、約２ｎｍであった。従って、本発明に係る方法により、ナノメートルオーダーの極めて微小な変位の測定が可能であることが分かった。また、本発明に係る方法を利用し、塩濃度等による分子構造の変化、例えば、核酸の高次構造の変化を追跡できることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明は、例えば、物質の構造（例えば、生体物質の一次構造、二次構造、三次構造、高次構造など）の変化、形態変化、ハイブリダイゼーション・抗原抗体反応・タンパク質間相互作用・高分子-高分子間・高分子-低分子・低分子−低分子間の反応などの相互作用の発生やその進行状況、タンパク質のユニット構造の変化、物質の拡散状態などの検出技術やこれらの変化のモニタリング技術として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】本発明に係る物質情報取得方法や物質情報測定装置で用いるエバネッセント光照射の基本的な原理を説明するための図である。
【図２】同原理を説明するための他の図である。
【図３】本発明の適用例であって、核酸鎖が伸張状態へ変化することを検出する方法の概念の一例を示す図である。
【図４】本発明の適用例であって、ハイブリダイゼーションを検出する方法の概念の一例を示す図である。
【図５】本発明に係る塩基配列決定方法又は装置の一実施形態例の概念を模式的に示す図である。
【図６】実施例１に係る実験結果を示す図面代用グラフである。
【図７】実施例２に係る実験結果を示す図面代用グラフである。
【図８】実施例２に係るｓｓＤＮＡの構造変化の様子を模式的に示す図である。
【符号の説明】
【００７２】
Ｉ  蛍光強度
Ｐ  光（入射光）
ＰＥ  エバネッセント光（エバネッセント照明光）
Ｓ  界面
Ｔ  検出物質
Ｚ  界面（Ｓ）からの蛍光物質の位置（距離）情報
Δｚ  変位情報
Ｅ（ｘ，ｚ）  （ｘ，ｚ）における電場強度
Ｔｏ  電場振幅
ω  角周波数
ｋ２  媒質２中の波数
ｎ  屈折率比
θ１  入射角
Ｉｏ  蛍光強度の基準強度（規格化強度）
ｎ１  媒質Ｍ１における屈折率
ｎ２  媒質Ｍ２における屈折率
ｄ  蛍光強度（エバネッセント光強度の厚み基準）
ｚ１  １の状態での位置（界面からの距離）
ｚ２  ２の状態での位置（界面からの距離）
Ｉ１  １の状態における蛍光強度
Ｉ２  ２の状態における蛍光強度
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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