(57)【要約】【課題】従来よりも少量の試料を用いて行うことの可能で、煩雑な作業を必要としない遺伝子の特定部位の解析方法を提供する。【課題手段】以下を具備する特定部位を解析する方法；検出対象となる核酸を用意し、核酸サンプルとすること；用意された核酸サンプルの一部を脱修飾化して第1の核酸とし、脱修飾化していない核酸サンプルを第2の核酸とすること；前記第1の核酸および第2の核酸を任意の制限酵素によりそれぞれ切断すること；クレノウフラグメントと任意に選択されたプライマーを用いて、増幅可能な条件で増幅を行うこと；第1の核酸の増幅に存在させる基質である1種類のモノマーに第1の識別可能な標識物質を付与しておくこと；第2の核酸の増幅に存在させる基質である１種類のモノマーに第2の識別可能な標識物質を付与しておくこと；第1の核酸の増幅産物と第2の核酸の増幅産物を混合し、標識物質からの信号を検出することによって、ゲノムの特定部位を解析を行うこと。【選択図】図１
2007143415.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を具備するゲノムの特定部位を解析する方法；
検出対象となる核酸を用意し、核酸サンプルとすること；
用意された核酸サンプルの一部を脱修飾化して第1の核酸とし、脱修飾化していない核酸サンプルを第2の核酸とすること；
前記第1の核酸および第2の核酸を任意の制限酵素によりそれぞれ切断すること；
クレノウフラグメントと任意に選択されたプライマーを用いて、増幅可能な条件で増幅を行うこと；
第1の核酸の増幅に存在させる基質である1種類のモノマーに第1の識別可能な標識物質を付与しておくこと；
第2の核酸の増幅に存在させる基質である１種類のモノマーに第2の識別可能な標識物質を付与しておくこと；および
第1の核酸の増幅産物と第2の核酸の増幅産物を混合し、標識物質からの信号を検出することによって、ゲノムの特定部位の解析を行うこと。
【請求項２】
前記ゲノムの特定部位の解析が、特定部位のメチル化を検出することである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
以下を具備するゲノムの特定部位を解析する方法；
検出対象となる核酸を用意すること；
検出対象となる核酸の特定部位に変異の存在しないことが予め明らかな第1の核酸とし、前記用意された検出対象となる核酸を第2の核酸とすること；
前記第1の核酸および第2の核酸を任意の制限酵素によりそれぞれ切断すること；
クレノウフラグメントと任意に選択されたプライマーを用いて、増幅可能な条件で増幅を行うこと；
第1の核酸の増幅に存在させる基質である1種類のモノマーに第1の識別可能な標識物質を付与しておくこと；
第2の核酸の増幅に存在させる基質である１種類のモノマーに第2の識別可能な標識物質を付与しておくこと；および
第1の核酸の増幅産物と第2の核酸の増幅産物を混合し、標識物質からの信号を検出することによって、ゲノムの特定部位の解析を行うこと。
【請求項４】
前記ゲノムの特定部位の解析が、核酸変異を検出することである方法。
【請求項５】
前記増幅可能な条件において使用されるプライマーが４９の種類のプライマーセットである請求項１から４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記脱修飾化が酵素により行われる請求項２または５の何れか1項に記載の方法。
【請求項７】
前記識別可能な標識物質が蛍光物質であり、第1の識別可能な標識物質と第2の識別可能な標識物質が異なる蛍光物質である請求項１から６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ゲノムの特定部位の解析を行うことが、任意の配列を有する固定化されたプローブと、第1の核酸の増幅産物と第2の核酸の増幅産物との混合物をハイブリダイズさせ、その結果得られる信号を検出することによって行われる請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記プローブが核酸マイクロアレイに固定化されたオリゴヌクレオチドプローブである請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、修飾塩基および核酸変異を解析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポストゲノムの時代になり、近年、後天的なDNA修飾による遺伝子発現抑制など、エピジェネティクス的な変異の形質発現への関与を研究する学問であるエピジェネティクスが注目を集めてきた。現在では、エピジェネティクス制御の中心は、DNAメチル化とヒストン修飾とされている。
【０００３】
癌抑制遺伝子がDNAのメチル化により転写抑制を受けることが発見されから、メチル化異常が癌細胞の大きな特徴の１であることも明らかとなってきた。例えば、メチル化は、真核生物の遺伝子のプロモーター領域にあるシトシンの５位がメチル化されることによって、その遺伝子の発現に影響を及ぼす。このような現象は主にCGペア(CG相補対との混同を避けるため以下「CpG」と記す)の配列に生じる。通常の正常な哺乳動物の細胞ではCpG含有量が少ない遺伝子領域のほとんどがメチル化されているが、GpG含量の多いCpGアイランドと呼ばれる配列は、メチル化されていない。
【０００４】
例えば、E-カドヘリン(E-cadherin)、ｐ１６およびｐ１５などの遺伝子は、メチル化された遺伝子としてよく知られている。シトシンのメチル化解析は、従来では主にメチル化感受性制限酵素による切断や、ゲノムDNAのシーケンシングで解析されている。しかしながら、この２つの方法には限界があり、制限酵素を使用した方法では、制限酵素の認識配列のメチル化しか検出することができない。また、シーケンシングによる方法では、手間がかかることや、混合系での検出が困難であることなどの問題点が存在する。
【０００５】
また、従来、サザンブロット(非特許文献１)、RLGS(Restriction landmark genome scanning)(特許文献１)、および質量分析(非特許文献２)などもメチル化の解析に利用されている。これらの場合、何れの方法も多量のゲノムを必要とし、また、何れも操作が煩雑で多くの工程を必要とする。また、シークエンサー反応には高価な機器が必要である。
【０００６】
Hatada らは、サンプルを制限酵素で切断し、その後切断部分にアダプターDNAを結合し、PCRを行って得られた標識化PCR産物についてマイクロアレイによりメチル化を検出する方法を示している(Hatadaら、"A microarray-based method for detecting methlated loci"、J Hum Genet、200２、47：448−451)。この方法は、制限酵素切断後にPCR増幅をするためのアダプター配列を結合することが特徴であり、当該アダプター配列に相補的なプライマーを当該PCRにおいて用いる。上述した他の従来技術と同様に、この方法も煩雑な多くの工程を必要とし、且つシークエンサーを使用するPCRを行うことが必要である。
【０００７】
Bisulfite-PCR(非特許文献３)は、メチル化されたシトシンの存在が必須であり、またバイサルフェイト化後にPCRが必要である。更に、そのPCR産物を解析するために、電気泳動や遺伝子解析などのシークエンス反応などの煩雑な工程を必要とする。従って、この方法でも高価な機器が必要である。
【特許文献１】特開２００５−０００１６７号公報
【非特許文献１】Pietrobono, R., et al., Nucleic Acids Research, 2002, Vol.30, No.14, p 3278-3285
【非特許文献２】Tamura, T., et al., Nucleic Acids Research, 1997, Vol.25, No.20, p 4162-4164
【非特許文献３】Olek, A., et al., Nucleic Acids Research, 1996, Vol.24, No.24, p 5064-5066
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そのような状況に鑑み、本発明の目的は、従来よりも少量の試料を用いて行うことの可能な核酸解析方法を提供することである。更なる本発明の目的は、煩雑な作業を必要としないゲノムの特定部位を解析する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は鋭意研究の結果、上記の課題を解決するための手段を見出した。即ち、
以下を具備するゲノムの特定部位を解析する方法；
検出対象となる核酸を用意し、核酸サンプルとすること；
用意された核酸サンプルの一部を脱修飾化して第1の核酸とし、脱修飾化していない核酸サンプルを第2の核酸とすること；
前記第1の核酸および第2の核酸を任意の制限酵素によりそれぞれ切断すること；
クレノウフラグメントと任意に選択されたプライマーを用いて、増幅可能な条件で増幅を行うこと；
第1の核酸の増幅に存在させる基質である1種類のモノマーに第1の識別可能な標識物質を付与しておくこと；
第2の核酸の増幅に存在させる基質である１種類のモノマーに第2の識別可能な標識物質を付与しておくこと；および
第1の核酸の増幅産物と第2の核酸の増幅産物を混合し、標識物質からの信号を検出することによって、ゲノムの特定部位の解析を行うこと
である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、従来よりも少量の試料を用いて行うことの可能な核酸解析方法が提供される。更に、本発明により、煩雑な作業を必要としないゲノムの特定部位を解析する方法、特に、修飾塩基および核酸変異を解析する方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、ゲノムの特異的部位の検出方法であり、例えば、修飾塩基および核酸変異を解析する方法するための方法である。
【００１２】
ここで使用される「ゲノムの特定部位」の語は、ゲノムの特定部位における塩基のメチル化および／またはアセチル化などの修飾や、SNP(即ち、１塩基多型)、マイクロサテライト多型などおよび突然変異などの核酸変異を示す。また、本発明においてはゲノム解析に留まらず、一般的な何れの核酸の解析に対しても使用することが可能である。
【００１３】
ここで使用される「核酸」とは、ゲノムDNA、天然および／または合成DNA、cDNA、mRNA、全RNA、hnRNA、天然および／または合成RNAなどを含む全てのDNAおよびRNAを指示する。
【００１４】
（１）核酸メチル化の検出
本発明の１態様に従うと、修飾塩基の解析方法が提供される。その態様の１例として核酸のメチル化を検出する方法が提供される。以下に、その１例を図１を用いて説明する。
【００１５】
本発明に従う検出の対象となる核酸を用意する。これを、検出対象となる核酸に応じて選択した任意の切断部位を切断可能な制限酵素で切断する（図1(A)）。その結果、制限部位のヌクレオチド４がメチル化されている場合、当該制限酵素による切断が進行せず、切断断片９は、メチル化されていない核酸２により得られる切断断片７に比べて長いものとなる（図１(B)）。
【００１６】
上述の核酸の処理と同時または別に、同様の核酸からコントロールとなる核酸１を調製する。検出の対象となる核酸を脱メチル化し、その後前述と同様の制限酵素により切断する（図１(B)）。コントロールとして非メチル化核酸１を使用するので、当該制限酵素により得られる核酸断片５は、当該制限部位において切断された短い断片となる(図１(B))。
【００１７】
次に、得られた核酸断片毎に別々にクレノウフラグメントによって核酸を増幅する。被検サンプルの増幅には、基質である核酸のモノマーの何れかに１種類に識別可能な第1の標識物質を付与した基質を存在させ、増幅可能な条件下で核酸の増幅を行う。同様に、コントロールについても、基質である核酸のモノマーの何れかに１種類に識別可能な第２の標識物質を付与した基質を存在させ、増幅可能な条件下で核酸の増幅を行う。ここで、第1の標識物質と第2の標識物質は、互いに識別可能である(図1(C))。図中、例として、第1の標識物質は赤色蛍光を生じる蛍光色素、第2の標識物質は緑色蛍光を生じる蛍光色素を使用した例を記した。
【００１８】
次に等量で、増幅標識化被検サンプル１０または８と、増幅標識化被検コントロール６とを混合し、固定化されたプライマーに対して競合的にハイブリダイズさせる。その後、ハイブリダイズしてない核酸断片を除去した後、当該標識物質を検出する。このとき、標識物質が蛍光物質であれば、検出の結果、当該核酸がメチル化していれば、被検サンプルに付された第1の標識物質由来の蛍光が検出のための信号として検出され、メチル化していなければ、第1の標識物質と第2の標識物質由来の中間の蛍光が検出のための信号として検出される(図２(D))。図中の例では、メチル化していれば赤色の蛍光が観察され、メチル化していなければ中間の黄色蛍光が検出される。
【００１９】
本発明により使用される制限酵素は、それ自体公知の何れの制限酵素でよく、検出しようとするゲノムなどの核酸の配列を考慮して、また、検出しようとする修飾に対する感受性のある酵素を任意に選択してよい。本態様におけるメチル化の検出においては、メチル化感受性のある酵素が好ましい。例えば、アセチル化を検出する場合には、アセチル化感受性のある酵素が好ましい。
【００２０】
本発明に従う方法により使用される核酸は、ゲノムDNA、天然および／または合成DNA、cDNA、mRNA、全RNA、hnRNA、天然および／または合成RNAなどを含む全てのDNAおよびRNAなど何れか核酸でもよいが、ゲノムDNAを用いて、当該DNAについてのメチル化修飾を検出することが好ましい。
【００２１】
本発明に従う方法において使用される増幅用の酵素は、核酸合成酵素であればよく、それ自身公知の何れの酵素であるDNAポリメラーゼ、特に、エクソクレノウフラグメントなどが好ましく使用される。
【００２２】
また、本発明に従う方法では、何れの操作の段階においても商業的に入手可能な何れのキットなどを使用することも可能である。
【００２３】
本発明に従う標識物質は、それ自身公知の何れの識別可能な標識物質を使用してもよいが、好ましくは蛍光物質を使用してよい。好ましい蛍光物質の例は、Cy-dye、Alexa Fluor
およびFITCなどであり、第1の標識物質と第2の標識物質の選択は、互いに識別可能であればどのような組み合わせであってもよい。第1の標識物質および第2の標識物質の何れの物質を、コントロール核酸と被検核酸の何れに対して使用してもよい。
【００２４】
本発明に従う方法におけるコントロールのための脱メチル化の手段は、それ自身公知の何れの脱メチル化手段を使用してよい。例えば、酵素、脱メチル化剤、例えば、5-aza-2'-deoxycytidineなどを使用してよいが、好ましくは、酵素が使用される。好ましい酵素の例は、Phi酵素などである。メチル化以外の修飾を検出する場合には、目的とする修飾に適切な手段により脱修飾を行えばよく、そのような手段は公知の手段を利用可能である。
【００２５】
本発明に従う方法における「増幅可能な条件下」とは、増幅しようとする核酸が増幅することが可能な条件であればよく、使用する酵素に応じた至適温度、基質、プライマーおよび緩衝剤などの存在するそれ自身当業者に公知の環境であればよい。
【００２６】
本発明に従う方法において、基質となるモノマーは、当該核酸がDNAである場合、それ自身公知の通常のｄNTP混合物を使用すればよく、そのうちの1種類に対して標識物質を付与すればよい。第1の標識物質と第2の標識物質で標識されるモノマーは同じ種類のモノマーであっても、異なる種類のモノマーであってもよいが、同じ種類のモノマーであることが望ましい。
【００２７】
本発明に従う方法における増幅のために使用されるプライマーは、任意に選択した、または任意に無作為に選択した配列を有する任意の長さを有するプライマーでよい。好ましいプライマーは、互いに異なる任意の配列を有する５塩基から１５塩基、好ましくは５塩基から１０塩基、より好ましくは５塩基から８塩基であればよい。また、使用するプライマーの種類は少なくとも１種類であればよく、好ましくは１種類であってもよい。
【００２８】
検出には、オリゴヌクレオチドプローブを固定化したそれ自身公知の何れかの核酸マイクロアレイ(以下、「核酸アレイ」とも記す)を使用してもよい。以下の実施例では、簡易な手法によって作製したDNAマイクロアレイ(以下、「DNAアレイ」とも記す)を使用する例を示すが、それに限定するものではない。
【００２９】
また、必ずしもDNAアレイなどの核酸アレイを使用しなくてもよい。例えば、それ自身公知の何れかの電気泳動に供してもよく、またはそれ自身公知のその他のプローブを介した反応を利用して検出してもよい。
【００３０】
本発明に従う方法によると、サザンブロットなどの従来の方法では多量に必要とされた試料を少量に抑えて解析を実行することが可能である。
【００３１】
本発明に従う方法によると、被検核酸を制限酵素切断した後に迅速で簡便なサンプル調製で従来よりも簡便にメチル化を検出することが可能である。
【００３２】
本発明に従う方法は、アダプターの付加を必要としないので切断部の状態を増幅する簡便な手法である。また、エクソクレノウフラグメント(exo-Klenow fragment)を用いるので、複雑な温度管理の必要がなく一定温度で増幅することが可能であり、操作が簡便である。それに比べて、従来のPCRを利用する方法では、特異的な配列、即ち、アダプターの付加が必要であり、温度を上下に変化する工程が必要であり、且つサーマルサイクラーが必要である。従って、煩雑な操作が必要であり、且つ高価な装置が必要である。
【００３３】
本発明の方法に従うと種々の長さの標識化断片が被検サンプルより得ることが可能である。
【００３４】
本発明に従う方法によると、メチル化検出などの修飾検出の感度が向上される。従って、腫瘍抑制因子遺伝子の機能解析や、関与するゲノムにおける特定部位核酸のメチル化を簡便に早く検出することが可能になる。それにより、早期腫瘍発見に寄与することが可能である。
【００３５】
また、増幅断片の長さが多様であるので、高次構造によるプライマーへの結合障害のない短いものだけを選択して使用することも可能である。また、選択しなくとも、プライマーに結合する増幅断片が検出可能に反応することが可能である。
【００３６】
例えば、任意に短い増幅断片を回収する、或いは場合によって長い増幅断片を回収するためには、それ自身公知の遠心手段、遠心濾過、クロマトグラフィーおよびゲル濾過などの手段を使用することが可能である。例えば、Millipore(登録商標)の遠心用フィルターユニットなどのPCR精製カラムやQIAgenから入手可能なDNAクリーンアップ手段やなど、商業的に入手可能な何れの手段を使用してもよい。
【００３７】
以上、核酸の修飾を検出する態様の１例を、メチル化を例に説明した。同様に、アセチル化などの他の修飾についても、上述の本発明の方法に従って検出を達成することが可能である。
【００３８】
（２）変異の検出
（ａ）上述の（１）に記載の方法を用いてSNPなどや突然変異などの特定部位を検出することが可能である。DNAメチル化の検出で記載した手順と同様に変異配列を有していないコントロールサンプルを作製または用意し、検出対象サンプルとコントロールサンプルをそれぞれ増幅し、その後標識する。これを核酸配列毎に混合し、第１の認識可能な標識物質と第2の認識可能な標識物質を被検サンプルとコントロールサンプルに付与する。それらの混合物を適切なプローブの存在する条件下でハイブリダイゼーションし、当該2種類の認識可能な標識物質から得られる信号を検出することによって、特定部位の核酸変異の有無を検出することが可能である。
【００３９】
即ち、当該制限酵素認識部位に変異がない場合には当該ゲノム核酸は切断されるが、変異が存在する場合には切断されない、という事象を利用することによって本発明に従う１態様である方法によって、特定部位の核酸変異を検出することが可能となるのである。従って、検出しようとする核酸の配列に応じた制限酵素を選択することが重要である。それ以外の条件は上述した特定部位の修飾を検出するための方法の手順に従って行うことが可能である。それにより、簡便に且つ安価に変異部位の検出を行うことが可能である。
【００４０】
（ｂ）以下更に、本発明の1態様に従う変異の検出について説明する。上述の通り、本発明の１態様に従うと、SNPなどや突然変異などの特定部位の変異の検出が可能である。この場合では、コントロール用の核酸は、検出対象となる核酸またはゲノム核酸と変異部位以外同じ塩基配列を有する核酸であり、且つ予め突然変異の含まれないことが明らかな核酸を用意する。続く検出方法は、上述した（１）核酸メチル化の検出に記載したのと同様に、増幅操作と標識操作を行えばよい。更に検出は、最終的に目的とする配列を検出するためのプローブを設計して使用すればよい。プローブの長さは１０から３０塩基でよく、好ましくは２０から２５塩基である。
【００４１】
従来のPCRを利用する方法では、特異的な配列、即ち、アダプターの付加が必要であり、温度を上下に変化する工程が必要であり、且つサーマルサイクラーが必要である。従って、煩雑な操作が必要であり、且つ高価な装置を必要とする。しかし、本発明に従う方法によれば、一定の温度における操作により増幅を実行することが可能である。
【００４２】
また、増幅断片の長さが多様であるので、高次構造によるプライマーへの結合障害のない短いものだけを選択して使用することも可能である。また、選択しなくとも、プライマーに結合する増幅断片が検出可能に反応することが可能である。
【００４３】
例えば、任意に短い増幅断片を回収するためには、或いは場合によって長い増幅断片を回収するためには、それ自身公知の遠心手段、遠心濾過、クロマトグラフィーおよびゲル濾過などの手段を使用することが可能である。例えば、Millipore(登録商標)の遠心用フィルターユニットなどのPCR精製カラムやQIAgenから入手可能なDNAクリーンアップ手段やなど、商業的に入手可能な何れの手段を使用してもよい。
【００４４】
（ｃ）また、コントロール用の核酸を用意せずに、検出用核酸について変異の検出を行ってもよい。この場合、検出方法は上述した（１）核酸メチル化の検出に記載の通りに増幅操作までを行い、検出は、最終的に目的とする配列を検出するためのプローブを設計して使用すればよい。プローブの長さは１０から３０塩基でよく、好ましくは２０から２５塩基である。
【００４５】
（ｄ）上述の（１）に記載の方法を用いてSNPなどや突然変異などの特定部位の修飾を検出することが可能である。上述の（１）核酸メチル化の検出に記載の通りに行い、検出用のプローブの設計を検出しようとする配列に従って行い、検出を行えば、変異部位についての修飾（上記の例ではメチル化）を検出することが可能である。
【００４６】
（３）DNAメチル化の検出と変異の検出を同時に行う方法
上述の（１）核酸メチル化の検出と（２）変異の検出を同時に行ってもよい。その場合、検出方法は上述した（１）核酸メチル化の検出に記載の通りに増幅操作まで行い、検出のための操作は、試料を２分したものをそれぞれに使用してもよく、増幅断片の選別の後に、それぞれに好ましい増幅断片を用いてそれぞれの検出を行えばよい。検出は、上述した通りのそれぞれの検出手段により行えばよい。
【００４７】
［実施例１］
１．DNAメチル化の検出
（１）サンプル調製
種々の癌細胞由来のゲノム、即ち、MCF7（American Type Culture Collection社(以下、「ATCC社」と記す)から入手、以後「ゲノムサンプル１」と記す）、Hela（ATCC社から入手、以後「ゲノムサンプル２」と記す）およびA431（ATCC社から入手、以後「ゲノムサンプル３」と記す）のゲノムを被検サンプルとして用意した。以下、各ゲノムについてそれらゲノム全体について処理した。
【００４８】
更に、それぞれの癌細胞についてコントロールサンプルを作製する。ゲノムサンプル１、ゲノムサンプル２およびゲノムサンプル３を、それぞれにPhi酵素（アマシャム・バイオサイエンス社から入手）でメチル基を外した。具体的には、各ゲノムサンプルの0.1mgを20u／1μLの濃度のPhi29DNAポリメラーゼ（アマシャム・バイオサイエンス社から入手）を1μLと30℃で16時間処理することによりメチル基を外した。脱メチル化したサンプルを、以後、それぞれ脱メチル化ゲノムサンプル１は「脱メチル化サンプル１」、脱メチル化ゲノムサンプル２は「脱メチル化サンプル２」、および脱メチル化ゲノムサンプル３は「脱メチル化サンプル３」と記す。
【００４９】
以上６種類の被検サンプル、即ち、ゲノムサンプル１、２および３、並びに脱メチル化サンプル１、２および３をそれぞれ別の試験チューブに1μｇずつ入れ、これらに20u／1μLの濃度の制限酵素Bst UI（New England Biolab.社から入手）を1μL添加し、６５℃で1時間処理してゲノムを切断した。当該制限酵素Bst UIは、それが認識する特定の制限部位が非メチル化の場合には当該制限部位で切断され、当該制限部位がメチル化されている場合には切断されない。
【００５０】
次に、それぞれ、切断後サンプルを含む各チューブにエクソクレノウフラグメント（アマシャム・バイオサイエンス社から入手）を20ｕ／μＬを1μＬずつ添加し、核酸のモノマーであるdNTP混合物を添加して37℃で2時間インキュベーションした。エクソクレノウフラグメントは、4種類の塩基から作成可能な全ての９塩基長のプライマーセット、即ち、４９種類のプライマーセットを予め用意し、それらのプライマーを一緒に使用した。蛍光標識は1種類のモノマーに付与した。ここでは、アミノアリル化ウラシル(dUTP)を取り込ませ、そのアミノアリル基を介して蛍光標識した。
【００５１】
実際の操作は、インビトロジェン(インビトロジェン)社の Bio Prime(登録商標)プライスアレイCGH(comparative Genomic Hybridization)ジェノミックラベリングシステム(インビトロジェン社から入手)を使用し、提供元の使用説明書に従って、ワンステップでサンプルの蛍光標識を行った。
【００５２】
使用した標識物質は、コントロールである脱メチル化サンプル１、２および３には、緑色の蛍光を生ずるAlexaFlour555(インビトロジェン社製)を用い、被検サンプルであるゲノムサンプル1、２および３には、赤色の蛍光を生ずるAlexaFlour645(インビトロジェン社製)を用いた。
【００５３】
（２）DNAアレイの作製
住友ベークライト社より入手可能な「誰でもDNAアレイ」を使用して提供元の使用説明書に従って作製した。具体的には、当該キットに具備されるプラスチック基板に、表1および表２に示した２４種類のオリゴヌクレオチドプローブを１μLずつピペットマンで滴下した。
【表１】
2007143415.tif 000003
【００５４】
【表２】
2007143415.tif 000004
【００５５】
これを８０℃で１時間維持し、UVランプ下で１分間UV照射して当該オリゴヌクレオチドプローブをプラスチック基板に固定化した。これをDNAマイクロアレイとした。各スポットに固定化されたオリゴヌクレオチドプローブの位置は、図２（C）に示した通りである。各升目に記載の番号は、固定化されたオリゴヌクレオチドプローブの配列を記す表１および２の番号に対応する。このようなDNAアレイを3枚用意し、DNAアレイ１、DNAアレイ２およびDNAアレイ３とした。
【００５６】
（３）検出
上記（２）で作製されたDNAアレイを用いて、検体のメチル化を検出した。（１）で調製した被検サンプルについて、同じ遺伝子毎に、例えば、ゲノムサンプル１と脱メチル化サンプル１を同量ずつ混合し、そこに６ｘSSPE、0.05％ Tween20をハイブリダイゼーション緩衝液として70μL添加した。得られた混合物をサンプル１に由来する混合物を以下「混合物１」と、サンプル２に由来する混合物を以下「混合物２」と、サンプル３に由来する混合物を以下「混合物３」と記す。
【００５７】
次に、混合物1をDNAアレイ１に、混合物２をDNAアレイ２に、混合物３をDNAアレイ３に、各スポット毎に70μLずつオリゴヌクレオチドプローブ固定化部位に滴下し、ハイブリダイゼーションチャンバーで温度を十分に保ったまま50℃で12時間ハイブリダイゼーションを行った。
【００５８】
その後、以下の４種類の洗浄液、第1の洗浄液：６ｘSSPE、0.05％ Tween20、第2の洗浄液：3ｘSSPE、0.05％ Tween20、第3の洗浄液：0.05ｘSSPE、0.05％ Tween20、第４の洗浄液：２ｘPBS、それぞれに浸すことによって、各洗浄液について１回ずつ洗浄を行った。
【００５９】
洗浄後、蛍光スキャナーであるGenePix（登録商標）（AXON社製）を用いて検出を行った。その結果を図２（A）および（B）に示す。図２（A）はHela細胞に由来のサンプルについての結果であり、図２（B）はMCF7細胞に由来のサンプルについての結果である。
【００６０】
（３）結果
得られた結果は、中間色である黄色以外に赤色に強く蛍光シグナルが生じていた。このことは、そのスポットの遺伝子配列がメチル化しているために強く蛍光が生じていると示唆される。
【００６１】
詳細には、図２（A）では、中間色である黄色の蛍光がほとんどであり、スポット２３が薄いオレンジ色であった。図２（B）は、スポット２４が強い黄色の蛍光が見られ、スポット１３、１４、１９および２３に薄い赤の蛍光が見られ、スポット２、３、４および６にそれよりも強い赤い蛍光が見られ、スポット１１および２２に強めの赤い蛍光、スポット２４に強い黄色の蛍光が見られた。これにより、赤い蛍光の観察されたプローブに相当する遺伝子部位がメチル化されていると示唆された。図２(A)および(B)中、破線および斜線は黄色の蛍光を示し、実線および黒色は赤色の蛍光を示した。それぞれの強度は、斜線の多さ、黒色の強さで示した。
【００６２】
上述したように、本発明に従う１態様は、高価な装置を使用することなく簡便にDNAのメチル化を検出することが可能となった。
【００６３】
また、上述の実施例のようにマイクロアレイを用いてDNAのメチル化を検出することにより、多く遺伝子について網羅的に解析することが可能である。
【００６４】
［実施例２］
２．変異の検出
（１）サンプル調製
種々の癌細胞由来のゲノムであり、変異を有していない配列を有するゲノムを用意する。即ち、MCF7（ATCC社から入手、以後「ゲノムサンプル１」と記す）、Hela（ATCC社から入手、以後「ゲノムサンプル２」と記す）およびA431（ATCC社から入手、以後「ゲノムサンプル３」と記す）であり、これらのゲノムをコントロールサンプルとして用意する。一方、同じ癌細胞由来のゲノムであり、変異の有無の不明なサンプルを用意する。これらは以後、「被検ゲノムサンプル1」、「被検ゲノムサンプル２」および「被検ゲノムサンプル３」と記す。
【００６５】
以上３種類のゲノムサンプル１、２および３並びに被検ゲノムサンプル１、２および３をそれぞれ別々の試験チューブに0.1μｇずつ入れ、これらに20u／1μLの濃度の制限酵素Bst UI（New England Biolab社から入手）を1μL添加し、６５℃で1時間処理してゲノム核酸を切断する。当該制限酵素認識部位に変異がない場合には当該ゲノム核酸は切断されるが、変異が存在する場合には切断されない。
【００６６】
次に、それぞれ、切断後サンプルを含む各チューブにエクソクレノウフラグメント（アマシャム社から入手）を20ｕ／μＬを1μＬずつ添加し、核酸のモノマーであるdNTP混合物を添加して37℃で2時間インキュベーションする。エクソクレノウフラグメントは、4種類の塩基から作成可能な全ての９塩基長のプライマーセット、即ち、４９種類のプライマーセットを予め用意し、それらのプライマーを一緒に使用する。蛍光標識は1種類のモノマーにだけ付与する。
【００６７】
実際の操作は、インビトロジェン(invitrogen)社の Bio Prime(登録商標)プライスアレイCGH(comparative Genomic Hybridization)ジェノミックラベリングシステム(インビトロジェン社から入手)を使用し、提供元の使用説明書に従って、ワンステップでサンプルの蛍光標識を行う。
【００６８】
使用した標識物質は、コントロールであるゲノムサンプル１、２および３には、緑色の蛍光を生ずるAlexaFlour555(インビトロジェン社製)を用い、被検サンプルである被検ゲノムサンプル1、２および３には、赤色の蛍光を生ずるAlexaFlour645(インビトロジェン社製)を用いる。
【００６９】
（２）DNAアレイの作製
住友ベークライト社より入手可能な「誰でもDNAアレイ」を使用して提供元の使用説明書に従って作製する。具体的には、当該キットに具備されるプラスチック基板に、検出を目的とする塩基配列を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブを１μLずつピペットマンで滴下する。
【００７０】
これを８０℃で１時間維持し、UVランプ下で１分間UV照射して当該オリゴヌクレオチドプローブをプラスチック基板に固定化し、これをDNAマイクロアレイとし、３枚用意し、DNAアレイ１、DNAアレイ２、DNAアレイ３とする。
【００７１】
（３）検出
上記（２）で作製されたDNAアレイを用いて、変異の検出変異を検出する。（１）で調製したゲノムサンプルについて、同じ遺伝子毎に、例えば、ゲノムサンプル１と被検ゲノムサンプル１を同量ずつ混合し、６ｘSSPE、0.05％ Tween20をハイブリダイゼーション緩衝液として70μL添加する。他のサンプルについても同様に混合物を作成する。得られた混合物をゲノムサンプル１に由来する混合物を以下「混合物１」と、ゲノムサンプル２に由来する混合物を以下「混合物２」と、ゲノムサンプル３に由来する混合物を以下「混合物３」と記す。
【００７２】
次に、混合物1をDNAアレイ１に、混合物２をDNAアレイ２に、混合物３をDNAアレイ３に、各スポット毎に70μLずつオリゴヌクレオチドプローブ固定化部位に滴下し、ハイブリダイゼーションチャンバーで温度を十分に保ったまま50℃で12時間ハイブリダイゼーションを行う。
【００７３】
その後、以下の４種類の洗浄液、第1の洗浄液：６ｘSSPE、0.05％ Tween20、第2の洗浄液：3ｘSSPE、0.05％ Tween20、第3の洗浄液：0.05ｘSSPE、0.05％ Tween20、第４の洗浄液：２ｘPBS、それぞれに浸すことによって、各洗浄液について１回ずつ洗浄を行う。
【００７４】
洗浄後、蛍光スキャナーであるGenePix（登録商標）（AXON社製）を用いて検出を行う。
【００７５】
得られた結果は、中間色である黄色以外に赤色に強く蛍光シグナルが生じる。このことから、そのスポットの遺伝子配列に変異が存在しているために赤色蛍光が生じていることが示唆される。
【００７６】
また、上述の実施例のようにマイクロアレイを用いてDNAのメチル化を検出することにより、多く遺伝子について網羅的に解析することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】本発明の1例である１態様を示す図である。
【図２】実施例１の結果を示す図である（実施例１）。
【符号の説明】
【００７８】
１    核酸
２    非メチル化されていない核酸
３    メチル化核酸
４    制限部位のヌクレオチド
５    核酸断片
６    増幅された標識化被検コントロール
７    核酸断片
８    増幅された標識化被検サンプル
９    被検サンプル
１０  増幅された標識化被検サンプル
【図１】
2007143415.tif 000005
【図２】
2007143415.tif 000006
【配列表】
2007143415000001.app