(57)【要約】      （修正有）【課題】Ａ型及びＢ型の両方のＲＳウイルスを精度良く検出することができるポリヌクレオチドを提供すること。【解決手段】ＲＳウイルスを検出するためのポリヌクレオチドを提供する。このポリヌクレオチドは、（ａ）特定な配列から選択される連続した１０ｍｅｒ以上の配列からなるポリヌクレオチド；及び（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドにおいて１個又は複数個のヌクレオチドの置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、前記配列の相補鎖にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド、からなる群より選択される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＳウイルスを検出するためのポリヌクレオチドであって、
（ａ）配列番号１の配列から選択される連続した１０ｍｅｒ以上の配列からなるポリヌクレオチド；及び
（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドにおいて１個又は複数個のヌクレオチドの置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、前記配列番号１の相補鎖にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド、
からなる群より選択されるＲＳウイルス検出用ポリヌクレオチド。
【請求項２】
核酸増幅法によりＲＳウイルスを検出するための第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドセットであって、
前記第１ポリヌクレオチドが以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択され：
（ａ）配列番号１の１〜２３０番目の配列から選択される連続した１０ｍｅｒ以上の配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドにおいて１個又は複数個のヌクレオチドの置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、前記配列番号１の相補鎖にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド、
前記第２ポリヌクレオチドが以下の（ｃ）及び（ｄ）からなる群より選択されるＲＳウイルス検出用ポリヌクレオチドセット：
（ｃ）配列番号１の配列において、前記（ａ）で選択された配列よりも下流の配列の相補配列から選択される連続した１０ｍｅｒ以上の配列からなるポリヌクレオチド；
（ｄ）前記（ｃ）のポリヌクレオチドにおいて１個又は複数個のヌクレオチドの置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、前記配列番号１の相補鎖にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド。
【請求項３】
核酸増幅法によりＲＳウイルスを検出するための第１ポリヌクレオチド、第２ポリヌクレオチド及び第３ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドセットであって、
前記第１ポリヌクレオチドが以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択され：
（ａ）配列番号１の１〜２２０番目の配列から選択される連続した１０ｍｅｒ以上の配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドにおいて１個又は複数個のヌクレオチドの置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、前記配列番号１の相補鎖にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド、
前記第２ポリヌクレオチドが以下の（ｃ）〜（ｅ）からなる群より選択され：
（ｃ）配列番号１の配列において、前記（ａ）で選択された配列よりも下流の領域の相補配列から選択される連続した１０ｍｅｒ以上の配列からなるポリヌクレオチド；
（ｄ）前記（ｃ）のポリヌクレオチドにおいて１個又は複数個のヌクレオチドの置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、前記配列番号１の相補鎖にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド、
（ｅ）前記（ｃ）又は（ｄ）の相補配列を有するポリヌクレオチド、
前記第３ポリヌクレオチドが以下の（ｆ）及び（ｇ）からなる群より選択され：
（ｆ）配列番号１の配列において、前記（ａ）で選択された配列よりも下流であり、前記（ｃ）で選択された配列の相補配列よりも上流の領域の配列から選択される連続した１０ｍｅｒ以上の配列からなるポリヌクレオチド；
（ｇ）前記（ｆ）のポリヌクレオチドにおいて１個又は複数個のヌクレオチドの置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、前記配列番号１の相補鎖にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド、
前記第３ポリヌクレオチドの５’末端及び３’末端のうち何れかに第１標識物質を有し、他方に第２標識物質を有する、ＲＳウイルス検出用ポリヌクレオチドセット。
【請求項４】
前記第１標識物質及び前記第２標識物質は、所定の波長の光を照射することにより蛍光を発することができる物質であり、
前記第１標識物質と前記第２標識物質とが所定の距離未満に存在する場合、前記第１標識物質が前記所定の波長の光によって発せられる蛍光により前記第２標識物質の蛍光が消光され、
前記第１標識物質と前記第２標識物質とが所定の距離以上離隔して存在する場合、前記第１標識物質及び前記第２標識物質の両方が蛍光を発する、請求項３記載のポリヌクレオチドセット。
【請求項５】
前記第１ポリヌクレオチドの融解温度よりも前記第３ポリヌクレオチドの融解温度の方が高く、
前記第２ポリヌクレオチドの融解温度よりも前記第３ポリヌクレオチドの融解温度の方が高い、請求項３又は４記載のポリヌクレオチドセット。
【請求項６】
前記（ａ）のポリヌクレオチドの配列が、配列番号６又は７に記載の配列であり、
前記（ｃ）のポリヌクレオチドの配列が、配列番号８に記載の配列であり、
前記（ｆ）のポリヌクレオチドの配列が、配列番号９に記載の配列である、
請求項３〜５の何れかに記載のポリヌクレオチドセット。
【請求項７】
請求項２〜６の何れかに記載のポリヌクレオチドセットと、ｄＮＴＰｓと、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとを備えるＲＳウイルス検出用試薬キット。
【請求項８】
前記ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する請求項７記載の試薬キット。
【請求項９】
検体と請求項２〜６の何れかに記載のポリヌクレオチドセットとを混合し、前記検体中の配列番号１のヌクレオチド配列を検出することにより、前記検体中のＲＳウイルスを検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料に含まれるＲＳウイルス（呼吸器合胞体ウイルス：Respiratory syncytial virus）を検出するために用いられるポリヌクレオチド及びこのポリヌクレオチドを用いて生体試料中のＲＳウイルスを検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＳウイルスは、パラミクソウイルス科に属するウイルスであり、呼吸器疾患の病原体である。このウイルスは、直径８０〜３５０ｎｍの球形又はフィラメント状であり、エンベロープ中にゲノムとして一本鎖ＲＮＡ（マイナス鎖）を有する。ゲノムには、非構造タンパク（ＮＳ）遺伝子、Ｆタンパク遺伝子、Ｇタンパク遺伝子、Ｌタンパク遺伝子等が存在する。ＲＳウイルスは、宿主に寄生すると、宿主細胞内でウイルス由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの作用によりゲノムＲＮＡ（virus RNA：以下、ｖＲＮＡとする）からｍＲＮＡを合成する。このｍＲＮＡの配列に基づき、ウイルスの増殖に必要な様々なタンパク質が宿主のリボソームで生成される。
【０００３】
ＲＳウイルス感染症は、地理的な流行の偏りはないが、特に乳幼児が発症すると重篤となることがあり、乳幼児の肺炎の約５０％、細気管支炎の５０〜９０％を占めると報告されている。ＲＳウイルスには、Ａ型及びＢ型の血清型があるが、血清型の違いによる症状の違いは実質的になく、Ａ型とＢ型とを識別して検出する必要はない。
【０００４】
ＲＳウイルスの検出は、イムノクロマトグラフィーやＰＣＲによる検出が知られており、特にＰＣＲによる検出は特異性が高く、精度良くＲＳウイルスを検出することができる。ＰＣＲによるＲＳウイルス検出では、ＲＳウイルスゲノムの特定の領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドがプライマとして用いられる。非特許文献１には、ＲＳウイルス検出用プライマセットが開示されている。このプライマセットはnested PCRに用いられ、Ａ型ＲＳウイルスを検出できるプライマセット及びＢ型ＲＳウイルスを定性的に検出できるプライマセットが開示されている。
【０００５】
【非特許文献１】Stockton, et al, Journal of Clinical Microbiology, Oct. 1998, p. 2990-2995.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、Ａ型及びＢ型の両方のＲＳウイルスを従来よりも精度良く検出することができるポリヌクレオチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ＲＳウイルスを検出するためのポリヌクレオチドを提供する。このポリヌクレオチドは、
（ａ）配列番号１の配列から選択される連続した１０ｍｅｒ以上の配列からなるポリヌクレオチド；及び
（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドにおいて１個又は複数個のヌクレオチドの置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、前記配列番号１の相補鎖にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド、
からなる群より選択される。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のポリヌクレオチドを用いると、血清型に関わらず精度良くＲＳウイルスを検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の一実施形態は、配列番号１のヌクレオチド配列（5'- GATCATTCAGGTAATACAGCAAAATCTAACCAACTTTACATCACCACTTCACATCAGACATCTTTAGTAAGGAATAGTGCATCACTTTATTGCATGCTTCCTTGGCATCATGTCAATAGATTTAACTTTGTATTTAGTTCCACAGGATGCAAGATCAGTATAGAGTATATTTTAAAAGATCTTAAGATTAAGGACCCCAGTTGTATAGCATTCATAGGTGAAGGAGCTGGTAACTTATTA-3'）から選択される連続した１０ｍｅｒ以上のポリヌクレオチドである。配列番号１の配列は、GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html）に登録されているAccession No. AF013254の13849〜14088番目の配列であり、ｖＲＮＡのＬタンパク遺伝子に対応するｍＲＮＡの部分配列である（ただし、配列中のＵをＴに変換して記載している）。即ち、配列番号１の配列から選択されたポリヌクレオチドは、ｖＲＮＡのＬタンパク遺伝子の部分領域（以下、領域Ｘとする）に相補的であり、領域Ｘにハイブリダイズ可能である。
【００１０】
検体としては、ＲＳウイルスに感染したことが疑われる患者から採取した、血液、血清、糞便、尿、唾液、鼻腔吸引液、気管支洗浄液、喀痰などの生体試料や、この生体試料に前処理（フィルターによる夾雑物の除去やウイルス培養など）を施した試料等を用いることができる。患者がＲＳウイルスに感染していた場合は、この検体にはｖＲＮＡ及びｍＲＮＡが含まれている。
【００１１】
本実施形態のポリヌクレオチドを、後述する核酸増幅法におけるプライマとして用いることができる。また、プローブとしてメンブレンやガラスなどに固定してＤＮＡマクロアレイやＤＮＡマイクロアレイ（以下、これらをＤＮＡチップという）を作製し、これを用いて検体中のウイルスを検出することもできる。
【００１２】
ＤＮＡチップを用いたウイルス検出は、例えば以下のようにして行うことができる。先ず、検体中のｍＲＮＡの３’末端に存在するポリＡ配列を利用して逆転写反応を行う。逆転写反応の際に例えばＣｙ３やＣｙ５などの蛍光物質で標識されたヌクレオチドを用いることにより、蛍光標識されたｃＤＮＡが合成される。これを本実施形態のポリヌクレオチドを固定化したチップと接触させると、このポリヌクレオチドと標識されたｃＤＮＡとが二本鎖を形成する。二本鎖を形成させた後、ｃＤＮＡの蛍光を検出することにより、ウイルスの存否を判定することができる。
【００１３】
ｍＲＮＡにおいて、領域Ｘｃ（ｖＲＮＡの領域Ｘに相補的なｍＲＮＡの領域）よりも下流に存在する領域Ｙｃにハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、第２ポリヌクレオチドとする）をさらに用いて検体中のウイルスを検出することが好ましい。第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドは少なくとも１０ｍｅｒの長さであり、好ましくは１２ｍｅｒ以上、より好ましくは１５ｍｅｒ以上である。このため、領域Ｘｃは配列番号１の１〜２３０番目の領域内に存在し、好ましくは１〜２２８番目、より好ましくは１〜２２５番目の領域内に存在する。また、これらのポリヌクレオチドは４０ｍｅｒ以下であることが好ましく、３０ｍｅｒ以下であることがより好ましい（なお、本明細書では、ポリヌクレオチドの長さを「ｍｅｒ」で表している。即ち、モノマーであるヌクレオチドが１０個連結した一本鎖ポリヌクレオチドの長さは１０ｍｅｒとなる）。
【００１４】
第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドは、融解温度（melting temperature：Ｔｍ値）が好ましくは５０〜６５℃、より好ましくは５５〜６５℃となるよう設計される。また、ＮＰ遺伝子と特異的にハイブリダイズすることができれば配列中に１個以上のヌクレオチドの変異（置換、欠失、挿入、付加など）を有していてもよい。一般的に、変異の割合は、好ましくは４０％以下であり、より好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１０％以下である。例えば、配列番号６〜９のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの場合、ヌクレオチドの変異は１０個以下であることが好ましく、より好ましくは５個以下である。
【００１５】
これら２種類のポリヌクレオチドを用いると、ＤＮＡチップや公知の核酸増幅法を用いることによってウイルス検出を行うことができる。ＤＮＡチップを用いる場合は、２種類のポリヌクレオチドを基板に固定し、上記と同様にしてウイルス検出を行うことができる。核酸増幅法を用いる場合、第１及び第２ポリヌクレオチドはプライマとして用いられる。ここで、「プライマ」とは、上記核酸増幅法において、ｖＲＮＡ又はｍＲＮＡの特定の領域にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる増幅反応の起点となることのできる機能（以下、プライマ機能とする）を有するポリヌクレオチドのことである。「ハイブリダイズ」とは、ストリンジェントな条件下で塩基の相補性に基づいて二種類の一本鎖ポリヌクレオチドが水素結合によって二本鎖ポリヌクレオチドを形成することをいう。「ストリンジェントな条件」とは、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行う際に当業者が一般的に用いる条件であって、本実施形態のプライマがｖＲＮＡ又はｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる条件であれば特に限定されない。ハイブリダイゼーション時のストリンジェンシーは、温度、塩濃度、プライマの鎖長、プライマのヌクレオチド配列のＧＣ含量及びハイブリダイゼーション緩衝液中のカオトロピック剤の濃度の関数であることが知られている。ストリンジェントな条件としては、例えば、Sambrook, J. et al. (1998) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載された条件などを用いることができる。具体的には、「５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．６、５×デンハーツ溶液、１０％デキストラン硫酸、及び２０μｇ／ｍｌの核酸を含む溶液中、ハイブリダイゼーション温度４２℃」を例示することができるが、これに限定されない。
【００１６】
核酸増幅法としては、ＰＣＲ法やＬＡＭＰ法（Loop mediated isothermal amplification：国際公開ＷＯ  ００／２８０８２号）などの公知の方法を用いることができる。増幅の標的となるのはｖＲＮＡ及び／又はｍＲＮＡであるため、検出には逆転写反応を含む核酸増幅法が用いられる。このような核酸増幅法としては、ＲＴＰＣＲ法（Reverse Transcription PCR）やＲＴＬＡＭＰ法（Reverse Transcription LAMP）などが挙げられる。例えば、核酸増幅法としてＲＴＰＣＲを用いる場合、先ず、検体、上記ポリヌクレオチドセット、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（以下、逆転写酵素とする）、及びＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（以下、ＤＮＡポリメラーゼとする）を混合して反応液を調製する。なお、逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼを用いる代わりに、逆転写酵素の活性及びＤＮＡポリメラーゼの活性の両方を有する酵素（例えば、Bca DNA polymeraseなど）を用いることもできる。検体がＲＳウイルス感染者に由来する場合、検体には、ｖＲＮＡ及びｍＲＮＡが含まれている。従って、第２ポリヌクレオチドはｖＲＮＡにハイブリダイズし、第１ポリヌクレオチドはｍＲＮＡにハイブリダイズする。次に逆転写酵素の作用によってそれぞれ対応するｃＤＮＡ（ｖＲＮＡに対応するｃＤＮＡ及びｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ）が合成される。さらにＤＮＡポリメラーゼの作用によって第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドをプライマとしてｃＤＮＡが増幅される。増幅産物をアガロースゲル電気泳動などの公知の方法によって検出することにより、検体中のウイルスが検出される。また、反応液に予め二本鎖ＤＮＡに結合可能なインターカレータ（例えば、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎなど）を添加しておくと、二本鎖ｃＤＮＡの増幅に伴って反応液の蛍光強度が強くなっていく。この蛍光をリアルタイムでモニターすることにより、定量的に検体中のウイルスを検出することも可能である。
【００１７】
ポリヌクレオチドをプライマとして用いる場合、ポリヌクレオチドの３’末端側の３ｍｅｒがハイブリダイズする領域と完全に相補的であることが好ましく、３’末端側の５ｍｅｒが完全に相補的であることがより好ましい。
【００１８】
さらに、領域Ｍ（領域Ｘ及び領域Ｙの間に存在）又は領域Ｍｃ（領域Ｘｃ及び領域Ｙｃの間に存在）にハイブリダイズする第３ポリヌクレオチドと、上記の第１及び第２ポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドセットを用いてウイルス検出を行うことができる。上述のようにポリヌクレオチドセットを基板に固定したＤＮＡチップや公知の核酸増幅法によりウイルスの検出を行うことができる。このポリヌクレオチドセットを用いた核酸増幅法としては、例えばTaqMan（ロシュダイアグノスティクス社の登録商標）PCR法（Heid et al, 1996, Genome Research, Vol.6(10), 986-994）が好適に用いられる。
【００１９】
以下、本実施形態の一例としてTaqManPCR法に用いられるポリヌクレオチドセットについて説明する。このポリヌクレオチドセットと、検出対象となるｍＲＮＡ及びｖＲＮＡの模式図を図１に示す。このポリヌクレオチドセットは、ｖＲＮＡの領域Ｘにハイブリダイズする第１ポリヌクレオチド（第１プライマ）と、ｍＲＮＡの領域Ｙｃにハイブリダイズ可能な第２ポリヌクレオチド（第２プライマ）と、領域Ｍにハイブリダイズ可能な第３ポリヌクレオチド（TaqManプローブ、以下単にプローブともいう）とを含む。
【００２０】
第１プライマ及び第２プライマは上記の第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドと同様のものを用いることができる。
プローブの５’末端及び３’末端の一方には第１標識物質が結合しており、もう一方には第２標識物質が結合している（図１には、５’末端に第１標識物質、３’末端に第２標識物質が結合したプローブを示した）。前記第１標識物質及び前記第２標識物質は、所定の波長の光を照射することにより蛍光を発することができる物質（蛍光物質）であることが好ましい。第１標識物質と第２標識物質とが所定の距離未満に位置する場合、第１標識物質が前記所定の波長の光によって蛍光を発し、この蛍光によって、第２標識物質の蛍光が消光される。また、これらが所定の距離以上離れている場合は、第１標識物質の蛍光が第２標識物質まで達しないため、反応液に所定の波長の光を照射することによって反応液中の第１標識物質及び第２標識物質の両方が蛍光を発する。
【００２１】
第１標識物質の蛍光を第２標識物質が消光できれば、第１標識物質及び第２標識物質の組み合わせは特に限定されない。例えば、第１標識物質としては、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＴＥＴ）、２，７−ジメトキシ−４，５−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ヘキソクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＨＥＸ）等が挙げられ、第２標識物質としては、６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（ＴＡＭＲＡ）等が挙げられる。
【００２２】
第２標識物質が第１標識物質の発する蛍光を消光するためには、これらの物質が所定の距離以内である必要がある。この所定の距離は、標識物質の種類によって異なるが、約１００Å以下であることが好ましい。この距離は約３０ｍｅｒのポリヌクレオチドに相当するため、プローブの長さは３０ｍｅｒ以内であることが好ましい。また、第１プライマ及び第２プライマと同様に特異性を維持するために、このプローブは１０ｍｅｒ以上、好ましくは１２ｍｅｒ以上、より好ましくは１５ｍｅｒ以上の長さである。
【００２３】
TaqMan PCR法を用いた場合は、ＲＳウイルスに由来する核酸を含む検体に、上記のポリヌクレオチドセット、ｄＮＴＰｓ、逆転写酵素、及びＤＮＡポリメラーゼ（５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する）を添加し、標識物質の励起波長を照射しながら以下の反応を進行させる。
先ず検体に含まれるｖＲＮＡの領域Ｘに第１プライマが結合し、ｍＲＮＡの領域Ｙｃに第２プライマが結合する。逆転写酵素によって、それぞれのプライマの３’末端からｖＲＮＡに対応するｃＤＮＡとｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡとが合成される（逆転写反応）。このｃＤＮＡにさらにプライマが結合し、ｃＤＮＡが増幅される（核酸増幅反応）。
核酸増幅反応が始まると、ｍＲＮＡを鋳型として合成されたｃＤＮＡに第１プライマ及びプローブが結合する。プローブの両末端には第１標識物質及び第２標識物質が結合しているが、この時点では第１標識物質の蛍光は第２標識物質によって消光されているため、反応液の蛍光は実質的に検出されない。ＤＮＡポリメラーゼはこの第１プライマの３’末端を基点として、このｃＤＮＡの上流に向かってＤＮＡを伸長させる。この伸長鎖がｃＤＮＡにハイブリダイズしているプローブの５’末端に到達すると、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって、プローブが分解され、プローブを構成するヌクレオチドが反応液中に遊離する。この場合、プローブの５’末端のヌクレオチドに結合している第１標識物質とプローブの３’末端のヌクレオチドに結合している第２標識物質との距離が、所定の距離以上となるため、第１標識物質の蛍光を第２標識物質が消光できず、第１標識物質及び第２標識物質の両方が蛍光を発する。以上のように、核酸増幅反応が進むと、第１標識物質及び第２標識物質の両方に由来する蛍光が検出されるため、ｃＤＮＡの増幅に伴って反応液の蛍光強度が上昇していく。この蛍光強度をリアルタイムでモニターし、蛍光強度が所定の値に達した時間に基づいて検体に含まれているＲＮＡを定量的に検出することができる。
【００２４】
また、上記のように、プライマの伸長反応中、プローブはｃＤＮＡに結合している状態である必要があるため、プライマのＴｍ値よりもプローブのＴｍ値の方が高いことが好ましい。より好ましくは、プローブのＴｍ値はプライマのＴｍ値よりも８〜１２℃高い。これにより、同じストリンジェンシーではプライマよりもプローブの方がＤＮＡに強固に結合することができる。
【００２５】
Ｔｍ値はプライマの配列や長さに左右される。プライマの配列中にＧＣが多いほど、及び／又は、プライマの長さが長いほどＴｍ値が高くなる。また、プローブにＤＮＡの副溝（Minor groove）に結合する副溝結合物質（ＭＧＢ：Minor groove binder）を結合させるとプローブのＴｍ値が上昇するため、同じＴｍ値でより短いプローブを設計することができる。
【００２６】
なお、領域Ｘと領域Ｙとの間（又は領域Ｘｃと領域Ｙｃとの間）に２種類のプローブ（第１プローブ及び第２プローブ）を設計してもよい。この場合、第１プローブに第１標識物質を結合させ、第２プローブに第２標識物質を結合させる。また、第１プローブの両末端にそれぞれ上記のような第１標識物質及び第２標識物質を結合させ、さらに第２プローブの両末端にもそれぞれ第１標識物質及び第２標識物質を結合させることもできる。これによって反応液の蛍光強度を増大させることができる。
【００２７】
上述したポリヌクレオチドは公知の方法によって製造することができ、例えば化学的に合成することができる。具体的には、ＡＢＩ社製  Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  Ｍｏｄｅｌ  ８９０９  ＤＮＡ合成機等を用いて合成することができる。また、上記のような塩基配列で構成されるように天然の核酸を制限酵素などによって切断し、本実施形態のポリヌクレオチドとして用いることも可能である。
【００２８】
＜実施例＞
（１）ポリヌクレオチドセットの設計
数種類のＲＳウイルスゲノムのヌクレオチド配列を比較し、血清型に関わらず高度に保存的な領域を探索した。具体的には、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている表１のＲＳウイルスのゲノム配列を用いてマルチプルアラインメントを行い、TaqMan PCR用ポリヌクレオチドセットを設計した。これらの配列はＲＳウイルスのｍＲＮＡの配列であり、マルチプルアラインメントにはＬタンパク遺伝子に対応するｍＲＮＡの部分配列（配列番号１〜４）を用いた。図２にマルチプルアラインメント結果を示す。なお、マルチプルアラインメントは、Ｇｅｎｅｔｙｘ−ｗｉｎ（ソフトウェア開発株式会社）により行った。
【００２９】
【表１】
2007306817.tif 000002
【００３０】
図２において、矩形に囲まれた部分の配列に基づいて下記の第１プライマＡ及び第１プライマＢ、第２プライマ及びプローブからなるＲＳウイルス検出用ポリヌクレオチドセットを設計した。
【００３１】
第１プライマＡ
5'- GGTAATACAGCAAAATCCAACCAACTT -3'（配列番号６：Ｔｍ値６０．６℃）
第１プライマＢ
5'- AGGTAATACAGCCAAATCTAACCAACTT -3'（配列番号７：Ｔｍ値５９．０℃）
【００３２】
第２プライマ
5'- GCTCCTTCACCTATGAATGCTATACA -3'（配列番号８：Ｔｍ値５８．８℃）
プローブ
ＦＡＭ−5'- CATCACTTTATTGCATGCTTCCTTGGCATC -3'−ＴＡＭＲＡ（配列番号９：Ｔｍ値６９．１℃）
【００３３】
上記配列を有するポリヌクレオチドを化学合成し、プローブの５’末端にはＦＡＭを、３’末端にはＴＡＭＲＡを結合させた。
【００３４】
（２）ウイルス株の検出
上記（１）で設計されたポリヌクレオチドセット（第１プライマＡ、第２プライマ、及びプローブ）と、検出用キット（タカラバイオ社：One-Step RT-PCR Kit Perfect Realtime）とを用いて、検体中のウイルスの検出を行った。
検体は、表２に示す株を用いた。
【００３５】
【表２】
2007306817.tif 000003
【００３６】
「ＲＳ−７５」、「９３２９」、「２００３  １２０９２２」、「２００４  １６４」、「２００４  ２００」、及び「２００４  １５４」は、ＲＳウイルス感染者から分離されたウイルスを株化したものである。また、「Ｌｏｎｇ」、「ＢＷＴ（B wild type）」及び「Ａ２」は、一般的に用いられているラボラトリーストレイン(Laboratory Strain)である。
【００３７】
各検体を１０倍に段階希釈してそれぞれ５検体ずつ調製した。濃度の高い順に１〜５をそれぞれＡ〜Ｉに付し、検体番号をＡ１〜５、Ｂ１〜５、Ｃ１〜５、Ｄ１〜５、Ｅ１〜５、Ｆ１〜５、Ｇ１〜５、Ｈ１〜５、Ｉ１〜５とした。
【００３８】
以下の組成を含む反応液（計２５μＬ）を調製し、7500 Realtime PCR system（アプライドバイオシステムズ社）によりリアルタイムＲＴＰＣＲを行った。
検体  ５μＬ
RNase free dH2O  ３．２５μＬ
２× One step RT-PCR buffer（ｄＮＴＰｓ及びＭｇ２＋を含む）  １２．５μＬ
M-MLV RTase（RNase H free）  ０．２５μＬ
RNase Inhibitor  ０．５μＬ
Takara ExTaq  ０．５μＬ
ROX Reference DyeII  ０．５μＬ
０．２ｐｍｏｌ／μＬプライマ溶液（第１及び第２プライマを含む）  １．２５μＬ
０．２５ｐｍｏｌ／μＬプローブ溶液  １．２５μＬ
【００３９】
ＰＣＲ条件は以下の通りである。
４２℃  １５分
９５℃    ２分
（下記を５０サイクル）
９５℃  １０秒
６０℃  ４５秒
【００４０】
反応液の蛍光強度がThreshold（7500 Realtime PCR systemに搭載されたＳＤＳソフトウェアで自動的に設定された値）を超えた時のサイクル数（以下、検出サイクル数とする）を表３〜１１に示す。また、各検体の検出サイクル数のグラフを図３に示す（縦軸：サイクル数、横軸：各検体の希釈系列（対数目盛））。表３〜１１の「傾き」は、図３に示すグラフの傾きを示す。
【００４１】
【表３】
2007306817.tif 000004
【００４２】
【表４】
2007306817.tif 000005
【００４３】
【表５】
2007306817.tif 000006
【００４４】
【表６】
2007306817.tif 000007
【００４５】
【表７】
2007306817.tif 000008
【００４６】
【表８】
2007306817.tif 000009
【００４７】
【表９】
2007306817.tif 000010
【００４８】
【表１０】
2007306817.tif 000011
【００４９】
【表１１】
2007306817.tif 000012
【００５０】
ＰＣＲにおいては、プライマが特異的に標的核酸に結合して増幅反応が行われていれば理論的にｎサイクルでｃＤＮＡが２ｎ倍増幅されるため、検体を１０倍に希釈すると検出サイクル数が約３〜４サイクル増加する。しかし、プライマの、鋳型に対する特異性が低いとＰＣＲ効率が低下しｎサイクルでも２ｎ倍以下の増幅効率となる。
【００５１】
表３〜１１及び図３より、各検体の希釈系列において傾きが３〜４となった。これは、１０倍に希釈した検体を用いると、希釈前の検体よりも、平均で検出サイクル数が３〜４サイクル増加することを示す。これらの値は、１０倍希釈した際の理論的な値とほぼ同等であり、本実施形態のポリヌクレオチドが高い特異性で標的の核酸に結合したことがわかる。従って、本実施形態のポリヌクレオチドを用いるとＰＣＲの増幅反応が効率的に行われることが確認された。また、異なる株間でも反応の特異性に差がなかった。
【００５２】
（３）第１プライマＡ及びＢを用いた検出
Ｃ５をさらに１０倍希釈した検体をＣ６、１００倍希釈した検体をＣ７、Ｄ５をさらに１０倍希釈した検体をＤ６、１００倍希釈した検体をＤ７とし、Ｃ１〜Ｃ７及びＤ１〜Ｄ７を検体として用いた。
【００５３】
ポリヌクレオチドとして、第１プライマＡと第２プライマとプローブとからなるポリヌクレオチドセットＡ、及び第１プライマＢと第２プライマとプローブとからなるポリヌクレオチドセットＢの何れかを用い、上記（２）の反応液を調製し、リアルタイムＰＣＲを行った。Ｃ１〜Ｃ７の検出結果を表１２に、Ｄ１〜Ｄ７の検出結果を表１３に示す。
【００５４】
【表１２】
2007306817.tif 000013
【００５５】
【表１３】
2007306817.tif 000014
【００５６】
表１２より、ポリヌクレオチドセットＡ及びポリヌクレオチドセットＢの何れを用いてもＡ型ＲＳウイルスを検出できることが確認された。また、何れのポリヌクレオチドセットを用いても希釈系列（Ｃ１〜Ｃ７）のウイルス検出の際の傾きが３〜４であり、ポリヌクレオチドセットが特異的に標的のｍＲＮＡに結合して効率的にＰＣＲ反応が行われたことが判った。
【００５７】
表１３より、ポリヌクレオチドセットＡ及びポリヌクレオチドセットＢの何れを用いてもＢ型ＲＳウイルスを検出できることが確認された。また、何れのポリヌクレオチドセットを用いても希釈系列（Ｄ１〜Ｄ７）のウイルス検出の際の傾きが３〜４であり、ポリヌクレオチドセットが特異的に標的のｍＲＮＡに結合して効率的にＰＣＲ反応が行われたことが判った。
【００５８】
（４）臨床検体を用いたウイルス検出
ＲＳウイルス感染者３２名の鼻腔から吸引して採取した鼻腔吸引液（検体１〜３２）中のウイルス検出を行った。なお、これらの検体は、市販のＲＳウイルス迅速診断キットによりＲＳウイルス陽性と判定されたもので、このキットによると、検体１〜２５はＡ型ＲＳウイルス陽性、検体２６〜３２はＢ型ＲＳウイルス陽性であった。
【００５９】
検体１〜３２を用いて上記（２）の反応液を調製し、リアルタイムＰＣＲを行った。なお、検出にはポリヌクレオチドセットＡを用いた。検出結果を表１４に示す。
【００６０】
【表１４】
2007306817.tif 000015
【００６１】
表１４より、何れの検体においても核酸の増幅が検出され、ウイルスが検出された。従って、本実施例のポリヌクレオチドセットを用いると臨床検体を用いた場合でもウイルスの血清型にかかわらずウイルスの検出を行えることが確認された。
【００６２】
（５）従来のプライマとの検出感度の比較
ＲＳウイルス感染者７８名の鼻腔吸引液（検体３３〜１１１）中のウイルス検出を行った。なお、これらの検体は、市販のＲＳウイルス迅速診断キットによりＲＳウイルス陽性と判定されたものである。
【００６３】
ＲＳウイルス定性検出用プライマとして知られている下記配列番号１０〜１５（Stockton et al, 1998, Journal of Clinical Microbiology, p.2990-2995）のプライマを用いて定性ＰＣＲ（nested PCR）を行った。
【００６４】
＜定性検出用プライマ＞
ＲＳＶＡＢ  Ｆ：5'-GTCTTACAGCCGTGATTAGG-3'（配列番号１０）
ＲＳＶＡＢ  Ｆ：5'-GGGCTTTCTTTGGTTACTTC-3'（配列番号１１）
ＲＳＶＡ  Ｆ：5'-GATGTTACGGTGGGGAGTCT-3'（配列番号１２）
ＲＳＶＡ  Ｒ：5'-GTACACTGTAGTTAATCACA-3'（配列番号１３）
ＲＳＶＢ  Ｆ：5'-AATGCTAAGATGGGGAGTTC-3'（配列番号１４）
ＲＳＶＢ  Ｒ：5'-GAAATTGAGTTAATGACAGC-3'（配列番号１５）
【００６５】
nested PCRにおいては、ＲＳＶＡＢ  Ｆ及びＲＳＶＡＢ  Ｒを用いてprimary PCRを行い、primary PCR反応後の反応液にＲＳＶＡ  Ｆ、ＲＳＶＡ  Ｒ、ＲＳＶＢ  Ｆ及びＲＳＶＢ  Ｒを添加してsecondary PCRを行った。secondary PCR後の反応液をアガロースゲルのウェルに注入し、電気泳動により増幅産物の定性的検出を行った。
【００６６】
また、本実施例のポリヌクレオチドセットＡを用いて上記（２）の反応液を調製し、リアルタイムＰＣＲを行った。定性検出用プライマを用いた検出及びポリヌクレオチドセットＡを用いた検出の結果を表１５に示す。
【００６７】
【表１５】
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【００６８】
定性用プライマでは、７８の陽性検体のうち、５検体が陰性と判定された（偽陰性）。本実施例のポリヌクレオチドセットＡでは、７８検体全てを陽性と判定することができた。
【００６９】
以上より、本実施例のポリヌクレオチドセットは、従来よりも精度良く、且つウイルスの血清型に関わらずＲＳウイルスを検出できることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】ｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、及びポリヌクレオチドの模式図である。
【図２】実施例（１）におけるマルチプルアラインメントの結果である。
【図３】実施例（２）の検出結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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