(57)【要約】 【課題】培地に含まれるマンガン塩などの成分をマンガンペルオキシダーゼの産生に適した濃度範囲に調整した培地を用いて担子菌を培養する、生産性の高いマンガンペルオキシダーゼの製造方法を提供する。【解決手段】マンガン塩を含有する培地で担子菌を培養し、マンガンペルオキシダーゼを製造する方法であって、該培地中のマンガン塩濃度が２５０〜９００μｍｏｌ／Ｌであることを特徴とするマンガンペルオキシダーゼの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンガン塩を含有する培地で担子菌を培養し、マンガンペルオキシダーゼを製造する方法であって、
該培地中のマンガン塩濃度が２５０〜９００μｍｏｌ／Ｌであることを特徴とするマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
【請求項２】
前記培地中のマンガン塩濃度が３００〜７００μｍｏｌ／Ｌである請求項１に記載のマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
【請求項３】
前記培地がグルコースを含有し、該培地中のグルコース濃度が１．５〜３．０質量％である請求項１又は２に記載のマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
【請求項４】
前記担子菌がファネロケーテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）属に属する菌である請求項１〜３のいずれか一項に記載のマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
【請求項５】
前記ファネロケーテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）属に属する菌が、ファネロケーテ  クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）種に属する菌である請求項４に記載のマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
【請求項６】
マンガンペルオキシダーゼの生産性が、２５ｍｇ／Ｌ以上及びバニラルアセトンを基質とした活性評価法による活性値として２４００ｎｍｏｌ／ｍｉｎ，ｍｌ以上である請求項１〜５のいずれか一項に記載のマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
【請求項７】
前記培養が撹拌培養である請求項１〜６のいずれか一項に記載のマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、担子菌を培養してマンガンペルオキシダーゼを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マンガンペルオキシダーゼは酸化還元酵素の一種であり、ビフェノールの合成に有用であるだけでなく、パルプ漂白やダイオキシンなど有害物質の分解除去への利用が考えられている。マンガンペルオキシダーゼは、白色腐朽菌などの担子菌を培養することによって、その産生物として得ることができるが、その際、培地中のマンガン塩濃度がマンガンペルオキシダーゼの生産性に影響することが従来から知られている（非特許文献１参照）。
【非特許文献１】Ｐ．Ｂｏｎｎａｒｍｅ  ａｎｄ  Ｔ．Ｗ．Ｊｅｆｆｒｉｅｓ，  Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．５６  Ｐ．２１０−２１７(１９９０)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、非特許文献１には、マンガンペルオキシダーゼの生産性を向上させることができるマンガン塩の最適な濃度範囲については記載されておらず、また、マンガン塩以外の培地中の成分とマンガンペルオキシダーゼの生産性との関係についても記載されていない上、さらに、非特許文献１に記載の製造方法では、マンガンペルオキシダーゼの生産性が１９１５ｎｍｏｌ／ｍｉｎ，ｍｌ（後述のバニラルアセトンを基質とした活性測定法による）と低く、商業生産を行う上で実際的ではないという問題点があった。
【０００４】
本発明は、上記事情に鑑みて為されたものであり、培地に含まれるマンガン塩などの成分をマンガンペルオキシダーゼの産生に適した濃度範囲に調整した培地を用いて担子菌を培養する、生産性の高いマンガンペルオキシダーゼの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、マンガンペルオキシダーゼの産生に最適な培地中のマンガン塩濃度が、従来知られていなかった特定の範囲に存在すること、さらに、培地中のグルコース濃度にも最適な濃度範囲が存在すること、これまでにない高い生産性でマンガンペルオキシダーゼを得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、マンガン塩を含有する培地で担子菌を培養し、マンガンペルオキシダーゼを製造する方法であって、該培地中のマンガン塩濃度が２５０〜９００μｍｏｌ／Ｌであることを特徴とするマンガンペルオキシダーゼの製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、担子菌培養によるマンガンペルオキシダーゼの生産性を、従来に比し飛躍的に向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明について詳しく説明する。なお、以下において、単位「ｍＭ」は「ｍｍｏｌ／Ｌ」を、単位「μＭ」は「μｍｏｌ／Ｌ」をそれぞれ示す。
[使用する微生物]
本発明で使用される担子菌としては、例えば、ファネロケーテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）属、フレビア（Ｐｈｌｅｂｉａ）属、レンティヌラ（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ）属、フェルリナス（Ｐｈｅｌｌｉｎｕｓ）属などに属する白色腐朽菌を挙げることができる。これらの中でも、ファネロケーテ属に属する菌が好ましい。ファネロケーテ属に属する菌の中でも、好ましいものとして、例えば、ファネロケーテ  クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ファネロケーテ  フラヴィド−アルバ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｆｌａｖｉｄｏ−ａｌｂａ）、ファネロケーテ  ソルディダ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｓｏｒｄｉｄａ）、ファネロケーテ  マグノリエ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ）に属する菌等を挙げることができ、より好ましいものとして、ファネロケーテ  クリソスポリウムに属する菌を挙げることができる。具体的には、例えば、ファネロケーテ  クリソスポリウムＢＫＭ−Ｆ−１７６７（ＡＴＣＣ２４７２５）、ファネロケーテ  クリソスポリウムＳＣ２６（ＡＴＣＣ６４３１４）、ファネロケーテ  クリソスポリウムＭＥ４４６（ＡＴＣＣ３４５４１）、ファネロケーテ  クリソスポリウムＨＨＢ−６２５１−ｓｐ（ＡＴＣＣ３４５４０）、ファネロケーテ  クリソスポリウムＯＧＣ１０１（ＡＴＣＣ２０１５４２）、ファネロケーテ  クリソスポリウム  ＩＮＡ−１２（ＣＮＣＭ  Ｉ−３９８）、ファネロケーテ  クリソスポリウムＩ−１５１２  （ＣＮＣＭ  Ｉ−１５１２）を挙げることができ、中でも特に好ましいものとしてファネロケーテ  クリソスポリウムＢＫＭ−Ｆ−１７６７（ＡＴＣＣ２４７２５）が挙げられる。
また、これらを宿主とした遺伝子組換え体であってもよい。
【０００９】
[培地成分]
（マンガン塩）
本発明で用いる培地は、必須成分としてマンガン塩を含む。そして、使用することができるマンガン塩としては、例えば、硫酸マンガン、塩化マンガン、酢酸マンガン、炭酸マンガン、シュウ酸マンガン、硝酸マンガン、リン酸マンガン及びこれらの水和物などが挙げられる。
本発明では、これらマンガン塩の培地中濃度を２５０μＭ以上、好ましくは２５０〜９００μＭ、より好ましくは３００〜７００μＭとなるよう設定することで、担子菌の培養を良好に行うことができ、マンガンペルオキシダーゼの生産性を飛躍的に向上させることができる。担子菌の培養によってマンガンペルオキシダーゼを製造する場合、培地中のマンガン塩濃度がマンガンペルオキシダーゼの生産性に影響を与えることは報告されている（非特許文献１）が、マンガンペルオキシダーゼの生産性を向上させるのに適したマンガン塩濃度についてはこれまで知られておらず、本発明では、例えば、非特許文献１に記載の方法に対して２〜３倍程度の高い生産性でマンガンペルオキシダーゼを製造することができる。
【００１０】
（炭素源）
本発明で使用する培地は、炭素源としてグルコースを含むことが好ましい。担子菌の培養で通常使用する炭素源としては、グルコース以外にグリセロール及びセルロースなどが挙げられ、本発明でもこれらを培地に含んでも良いが、培地中のグルコース濃度を好ましくは０．５質量％以上、より好ましくは１〜４質量％、特に好ましくは１．５〜３質量％となるよう設定することで、他の炭素源を用いた場合よりも、担子菌の培養を良好に行うことができ、マンガンペルオキシダーゼの生産性を飛躍的に向上させることができる。マンガンペルオキシダーゼの生産性を向上させるために適切な培地中のグルコース濃度はこれまで知られておらず、本発明では、培地中のグルコース濃度を上記範囲、中でも１．５〜３質量％とすることで、特に高いマンガンペルオキシダーゼの生産性向上効果が得られる。前記の培地成分のマンガン塩濃度、及び炭素源としてのグルコース濃度を最適な条件とすることで、通常の２倍以上のマンガンペルオキシダーゼの生産性向上効果が得られる。
【００１１】
（その他の培地成分）
また本発明の培地は、前記のマンガン塩や炭素源以外に、窒素源、ビタミン、リン酸、界面活性剤、緩衝液、マンガン以外の各種金属塩等を含んでいてもよい。例えば、窒素源としては、酒石酸アンモニウムを始めとするアンモニウム塩などが挙げられる。ビタミンとしては、例えば、チアミンなどが挙げられる。界面活性剤としては、例えば、ツイーン８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、トリトンＸ−１００（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、ホウ酸緩衝液などが挙げられる。マンガン以外の各種金属塩としては、例えば、硫酸マグネシウム、硫酸コバルト、硫酸亜鉛、硫酸カリウムアルミニウム、硫酸銅、硫酸第一鉄などの硫酸鉄、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、リン酸二水素カリウムなどのリン酸カリウム、モリブデン酸ナトリウムなど、あるいはこれらの水和物などが挙げられる。
またｐＨ調整剤として、塩酸、硫酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなど、通常使用される各種酸、アルカリを含んでいてもよい。これらの他、キレート剤としてニトリロ三酢酸などを含んでいてもよい。
さらに、担子菌の培養を良好に行うことができることから、ベラトリルアルコールを含む培地を使用することが好ましく、この時の培地中のベラトリルアルコールの濃度は、０．５〜１０ｍＭとすることが好ましい。
なお、培地は調製後にオートクレーブ滅菌することが好ましい。
【００１２】
[培養条件]
本発明における担子菌の培養方法は、固体培養、液体培養のいずれであってもよいが、培養のし易さから液体培養が好ましい。担子菌の培養に適した培養温度は２０〜４５℃であるが、３５〜３７℃程度であることがより好ましい。また、培地のｐＨは３．５〜７．５が好ましく、４．０〜７．０がより好ましい。ｐＨの調整には各種の緩衝液や塩酸又は硫酸など通常用いられる酸、あるいは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はアンモニアなど、通常用いられるアルカリを使用することができる。
【００１３】
担子菌の培養は、静置培養、振とう培養及び撹拌培養のいずれでも行うことができる。従来、担子菌の培養を撹拌培養で良好に行うことは困難であったが、例えば、培養至適温度±２℃の温度で培養し、次いで当該温度と培養至適温度との差の絶対値より、培養至適温度との差の絶対値が大きくなるようにシフトさせた温度で培養を行うことによって、撹拌培養でも担子菌を良好に培養することができ、マンガンペルオキシダーゼの生産性を向上させることができる。
この時、温度シフトのタイミングは、菌体増殖中期以降となるようにすることが好ましい。ここで菌体増殖中期とは、菌体の増殖が最も活発な対数増殖期を過ぎた直後の時期を指す。そして、撹拌培養とは、菌体を担体等に担持せず培地中に浮遊させた状態とし、撹拌翼等により培地を撹拌しながら菌体を培養することを指す。撹拌培養を行う際の撹拌速度は、培地量等により適宜選択すれば良い。
そして、温度シフト後の培養においては、酸素を含む気体、好ましくは分圧８０〜１００％の酸素を供給することが好ましい。
【００１４】
本発明の製造方法によれば、培地中のマンガン塩濃度を２５０〜９００μｍｏｌ／Ｌとすることで、マンガンペルオキシダーゼの生産性を従来よりも飛躍的に向上させることができ、例えば、非特許文献１に記載の方法における生産性の最高値が１９．７８ｍｇ／Ｌ（バニラルアセトンを基質とした活性評価法による活性値として１９１５ｎｍｏｌ／ｍｉｎ，ｍｌ、培地単位体積あたりの産生量）であるのに対して、本発明では２５ｍｇ／Ｌ（バニラルアセトンを基質とした活性評価法による活性値として約２４００ｎｍｏｌ／ｍｉｎ，ｍｌ）以上、特に３０〜５４ｍｇ／Ｌ（バニラルアセトンを基質とした活性評価法による活性値として約２９００〜約５２００ｎｍｏｌ／ｍｉｎ，ｍｌ）程度のマンガンペルオキシダーゼが得られる。また、培地中のグルコース濃度を特に好ましくは１．５〜３．０質量％と設定することで、マンガンペルオキシダーゼの生産性を従来よりも飛躍的に向上させることができる。さらに、担子菌の培養は撹拌培養でも良好に行うことができるので、通常汎用される発酵槽を用いることもでき、製造上の制約条件も低いので、マンガンペルオキシダーゼを効率良く低コストで製造することができる。なお、マンガンペルオキシダーゼの生産性は、例えば、後述の実施例に記載のように、バニラルアセトンを基質とした活性評価法によるマンガンペルオキシダーゼの活性値を測定することで算出することができる。また、この時得られた活性値を、濃度既知のＭｎＰ溶液の活性値と比較することにより、マンガンペルオキシダーゼの濃度ｍｇ／Ｌを算出しても良い。
【実施例】
【００１５】
以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下の実施例に何ら限定されるものではない。
[実施例１]マンガン塩濃度とマンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）の生産性
（培地）
下記表１に示した各培地１Lを調製した。なお、表１中の６×トレースエレメンツの組成を表２に示した。そして、２L容量の三角フラスコに各培地を入れ、通気性の栓をして１２１℃、２０分間のオートクレーブ処理で滅菌した。
【００１６】
【表１】
2007319113.tif 000002
【００１７】
【表２】
2007319113.tif 000003
【００１８】
（培養）
前記の各培地にファネロケーテ  クリソスポリウム  ＢＫＭ−Ｆ−１７６７ （ＡＴＣＣ２４７２５）を植菌し、３５℃、１２０ｒｐｍで振盪（回転）培養を開始した。３日後、ベラトリルアルコールをそれぞれ０．４２ｍｌ添加し、栓を通気用チューブの付いたシリコン栓に交換してから、フラスコ内の空気を酸素で置換した。通気用チューブをピンチコックで止め、培養を継続した。その後は１日２回、培養液のサンプリングと前記酸素供給操作を繰り返した。採取したサンプルは下記酵素活性測定に供した。
【００１９】
（ＭｎＰ活性測定）
ＭｎＰ活性は、４−（４−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−ｂｕｔｅｎｅ−２−ｏｎｅ（バニラルアセトン）を基質とした酸化反応の光学的測定により決定した。すなわち、分光光度計用石英セルを反応容器とし、この反応容器中に、蒸留水３８９μＬ、５００ｍＭ酒石酸ナトリウム（ｐＨ５．０）１００μＬ、５０ｍＭ硫酸マンガン１μＬ、２０ｍＭバニラルアセトン２．５μＬ、培養液（希釈）サンプル５μＬを入れ、これに対し１０ｍＭ過酸化水素２．５μＬを添加することで反応を開始した。
そして、分光光度計ＵＶ−１６５０ＰＣ（株式会社島津製作所製）を用いて、反応液のＵＶ３３４ｎｍにおける吸収の減少をモニタすることで反応初速度を測定した。バニラルアセトンのモル吸光係数として１８３００Ｍ−１ｃｍ−１を採用し、ＭｎＰ活性ｎｍｏｌ／ｍｉｎ，ｍｌを算出した。また、ここで得られた活性値を、濃度既知のＭｎＰ溶液の活性値と比較することにより、培養液サンプル中のＭｎＰの濃度ｍｇ／Ｌも併せて算出した。
試験区ａ〜ｆそれぞれにおけるＭｎＰの濃度の最高値を採用し、培地中硫酸マンガン濃度との関係を図１にまとめた。その結果、硫酸マンガン濃度が４５２．４μＭのとき最もＭｎＰ活性（生産性）が高く、５２２７ｎｍｏｌ／ｍｉｎ，ｍｌ（５４ｍｇ／Ｌ）となった。
【００２０】
[実施例２]グルコース濃度とＭｎＰの生産性
各試験区の培養液組成が下記表３の通りであること以外は実施例１と同様の方法にて担子菌の培養を行い、ＭｎＰの活性を測定した。試験区ｇ〜ｋそれぞれにおけるＭｎＰの濃度の最高値を採用し、培地中グルコース濃度との関係を図２にまとめた。その結果、グルコース濃度が２％のとき最もＭｎＰ活性（生産性）が高く、４２ｍｇ／Ｌとなった。
【００２１】
【表３】
2007319113.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００２２】
本発明は、安価なマンガンペルオキシダーゼの供給に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】実施例１における、培地中の硫酸マンガン濃度とマンガンペルオキシダーゼの生産性との関係を示したグラフである。
【図２】実施例２における、培地中のグルコース濃度とマンガンペルオキシダーゼの生産性との関係を示したグラフである。
【図１】
2007319113.tif 000005
【図２】
2007319113.tif 000006