(57)【要約】【課題】  ヒスタミンを０．０１３ｎＭの濃度まで検出可能な超高感度のヒスタミン計測用センサを提供する。【解決手段】  本センサは電気化学バイオセンサであって、ヒスタミン脱水素酵素、ルテニウム電子メデイエータ、金ナノ粒子、酢酸セルロース、金電極支持体から構成され、ヒスタミン脱水素酵素と基質との反応生成物である過酸化水素をルテニウム電子メデイエータが媒介する電気化学酸化反応により生ずる電流を極めて効率的に測定する。【選択図】図１
2007333714.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒスタミンとヒスタミン脱水素酵素との酸化反応生成物である過酸化水素をルテニウム電子メデイエータが媒介する電気化学酸化することにより生じる電流を測定するヒスタミン計測用電気化学バイオセンサ。
【請求項２】
上記センサは電極支持体とその上に担持した４層の被膜から構成される。すなわち下層から順に、電子メデイエータであるルテニウム錯体被膜（第１層）、酢酸セルロース被膜（第２層）、ヒスタミン脱水素酵素、金ナノ粒子およびルテニウム錯体の混合物被膜（第３層）およびの酢酸セルロース被膜（第４層）からなる被膜構造を有することを特徴とする請求項１記載のヒスタミン計測用センサ。
【請求項３】
上記センサは金（金を被覆した導電性材料を含む）電極支持体上に担持された、請求項２記載の被膜構造を有することを特徴とする請求項１記載のヒスタミン計測用センサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、魚肉などの生鮮食料品や生体組織中に含まれるヒスタミンの超微量分析用のヒスタミンセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】  ヒスタミンは組成式Ｃ５Ｈ９Ｎ３、分子量１１１．１５の生体活性アミンである。ヒスタミンは鮮魚、食肉、ワイン等に含まれるアミノ酸であるＬ−ヒスチジンと細菌が持つ脱炭酸酵素による酵素反応や、アルゲンと生体内細胞との抗原抗体反応によって生じ、神経伝達物質として種々の中枢神経機能および免疫システムと密接に関与する。それゆえヒスタミンを過剰に摂取すると吐き気、頭痛、神経障害、蕁麻疹などのアレルギー症状をおこす。ヒスタミンはそれ自身が有毒物質であるばかりか、食品中のヒスタミンの存在量は鮮度の程度を示す尺度であり、食品鮮度を保障するために高感度で測定容易なヒスタミン計測用センサが求められている。医療分野ではアレルゲン診断に超高感度のヒスタミンセンサが求められている。【０００３】  ヒスタミンの測定法は蛍光法が公定法として用いられる。この方法はヒスタミンとオルトフタルアルデヒドにより蛍光物質を合成し、この物質の発する蛍光強度からヒスタミンを定量する。【０００４】  高速液体クロマトグラフ法と蛍光法と高速液体クロマトグラフ法を組み合わせた測定方法（蛍光−ＨＰＬＣ法）（例えばＴ．Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ等Ｂｉｏｍｅｄ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１７巻，５０９−５１６頁，２００３年）は数多く報告されている。この方法は上記の報告によれば検出限界量が０．０１７ｎＭで、きわめて高感度であるが、分析操作が煩雑であり、分析に高度な技術を要する。さらに装置が大型で汎用に不向きであり、かつ高価でランニングコストが高い欠点がある。【０００５】  より簡便な測定法として、酵素反応と電気化学反応を組み合わせた電気化学バイオセンサが開発されている。この方法には（１）電極上にヒスタミン酸化酵素を担持し、これによってヒスタミンを酸化し、生じた過酸化水素を電気化学酸化して酸化電流を測定する方法、（２）おなじく上記の酵素反応で生じた過酸化水素を電気化学還元し，生じた還元電流を測定する方法、（３）ヒスタミン酸化酵素と酸素センサを組み合わせ、ヒスタミンの酸化によって生じる溶液中の溶存酸素の減少量を測定する方法がある。【０００６】  これらの方法の特徴に関しては、（１）の方法で作製したセンサのなかには検出限界濃度が０．０１μＭに達するものがあるが、この方法では測定系内の溶存酸素を除去しなければならないために測定装置が（２）の方法に比べて複雑になる欠点がある（例えばＳ．Ｉｗａｋｉ等  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３０４巻，２３６−２４３頁，２００２年）。【０００７】  （２）の方法で作製したセンサは溶存酸素による妨害がなく操作が簡便であるが，現在までに作製されたセンサの検出限界濃度が５０−１００μｍｏｌ／ｌ程度で、（１）に比べて著しく感度が劣る（例えばＪ．Ｌａｎｇｅ  ａｎｄ  Ｃ．Ｗｉｔｔｍａｎｎ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７２巻，２７６−２８３頁，２００２年）。これは過酸化水素の電気化学酸化反応が起こる電位領域で、反応の活性化に有効に機能する電子メデイエータが見出されていなかったことに起因する。【０００８】  （３）の方法による酸素電極を用いた測定システムはすでにキッコーマン株式会社から「ヒストマ���」として製品が販売されている。この製品はＨＰＬＣ−蛍光分析装置に比べて小型ではあるが、（１）の方法と同様、空気を遮断して測定を行うために測定装置が安価でない。またこの方法では測定試料中に含まれるバクテリアの呼吸による酸素の消費を考慮しなくてはならない（たとえばＴ．Ｒｉｎｋｅｎ等Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ６６巻，１３−２１頁，２００６年）。検出限界濃度は１μＭであり、（１）の方法よりも感度が劣る。【０００９】  したがって既報の電気化学バイオセンサによるヒスタミン計測システムは蛍光分光−液体クロマトグラフ法による計測システムより簡便でかつ安価であるが、検出感度が著しく劣る。
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】  本発明は、食品および生体組織試料中に含まれる極微のヒスタミン濃度を測定するための蛍光−ＨＰＣＬ分析計測システムに匹敵する超高感度電気化学バイオセンサであって、かつ上記の技術課題に鑑み、外気を遮断せずに測定できる簡便かつ安価なセンサを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】  上記の目的を達成するために、本ヒスタミン計測用センサは金電極支持体とヒスタミン脱水素酵素、ルテニウム電子メデイエータ、金ナノ粒子、酢酸セルロースを含む複数の被膜から構成されている電気化学バイオセンサであることを要旨とする。
【００１２】  請求項１記載の本センサは、水溶液中の極微のヒスタミンを測定するために、ヒスタミンとヒスタミン脱水素酵素の酸化反応生成物である過酸化水素の電気化学酸化反応を促進する電子メデイエータであるルテニウム錯体被膜により構成されていることを特徴とするヒスタミン計測用電気化学バイオセンサである。
【００１３】  請求項２および３記載の本発明は金電極支持体とその上に担持した被膜に関する。電極支持体は金（金を被覆した導電性材料を含む）薄板である。被膜は４層から構成される。下層から順に、第１層はルテニウム錯体の被膜で、ヒスタミンとヒスタミン脱水素酵素中で生じ、拡散によってルテニウム錯体層に到達した過酸化水素の電気化学酸化を媒介し、促進するメデイエータ被膜である。第２層は酢酸セルロースの被膜で、ルテニウム錯体被膜表面への第３層の酵素蛋白の直接付着によるメデイエータの失活を防ぐ。第３層はヒスタミン脱水素酵素、ルテニウム錯体および金ナノ粒子の混合物被膜で、この層で生じた過酸化水素が金ナノ粒子上で電気化学酸化され、生じた電子を互いに近接する金ナノ粒子を介して電極支持体に伝達する。この層におけるルテニウムは第１層におけるルテニウムと同様に、電子メデイエータとして金ナノ粒子上における過酸化水素の電気化学酸化反応を媒介、促進する。金ナノ粒子は過酸化水素を電気化学酸化する微小電極として機能し、センサの感度の増加に寄与するとともに、生じた電子を電極支持体まで伝達する機能も有する。第４層は酢酸セルロース被膜で、上記の第３層において生じた過酸化水素の電解質溶液中への逃散を防ぐ。
【００１４】  本センサは生体アミンのなかでヒスタミンのみを選択的に酸化する機能を持つヒスタミン脱水素酵素（キッコーマン（株）製）を酸化酵素に用い、過酸化水素を電気化学酸化する方式を採用しており、したがって外気開放状態で他の生体アミンの存在に影響されることなく、ヒスタミンを定量測定することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】  以下，図面を用いて本発明のヒスタミン計測用センサおよびヒスタミン計測用センサシステムに係わる実施の形態について説明する。【００１６】  図１は本発明に係わるヒスタミン計測用センサの基本的な構造図である。以下にヒスタミン計測用センサシステムに用いるヒスタミン計測用センサの製造工程について説明する。【００１７】  電極支持体には金薄板（１１）を用いる。【００１８】  この支持体上に、ヒスタミンとヒスタミン脱水素酵素の酸化反応によって生じた過酸化水素の電気化学酸化を媒介促進するメデイエータである、ルテニウム錯体層（１２）を形成する。酵素蛋白の付着によるメデイエータの失活を防ぐため、さらに上部に、酢酸セルロース被膜（１３）を形成する。【００１９】  酢酸セルロース被膜の上にはヒスタミンとヒスタミン脱水素酵素の参加反応で過酸化水素を生成する機能、生じた過酸化水素を金ナノ粒子上でルテニウム錯体を介して電気化学酸化する機能、さらにこの酸化反応で生じた電子を電極支持体に伝達させる機能を有するヒスタミン脱水素酵素、金ナノ粒子、ルテニウム錯体からなる被膜（１４）を形成する。最上層には生成した過酸化水素の電解質溶液中への逃散を防ぐ酢酸セルロース被膜（１５）を形成する。
【実施例】
【００２０】  以下に本発明の実施の形態について，実施例によってさらに詳しく説明する。【００２１】  上記の実施の形態において説明した本発明のヒスタミン計測用センサの製作方法とその性能に関する実験結果の一例を示す。【００２２】  表面積０．５ｃｍ２，厚さ０．０３ｍｍの金板の表面をアルミナ研磨し，直径０．３ｍｍ長さ７ｃｍの金線をリード線としてスポットウエルドし、アセトンおよび精製水で順次超音波洗浄し、電極支持体とした。【００２３】  上記支持体を０．１ｍｇ／ｍｌの三塩化ルテニウムハイドレート溶液中に１０分間浸したのち１時間室内で乾燥させ、ルテニウム錯体被膜を形成した（図１（１２））．この電極を２ｍｇ／ｍｌの酢酸セルロースのアセトン溶液に５秒間浸したあと、室内で１時間乾燥させ、酢酸セルロース被膜を形成した（図１（１３））。【００２４】  つぎにヒスタミンデヒドロゲナーゼ２ｍｇを２５μｌの精製水に溶解させ，その酵素水溶液８μｌ、２ｍｇ／ｍｌの三塩化ルテニウム水溶液２．５μｌ、粒子サイズ５ｎｍ以下の０．０１％金コロイド溶液（ＳＩＧＭＡ社製）２．５μｌの混合溶液を片面６．５μｌずつ電極支持体両面上に塗布し、３時間室温で乾燥させ、混合被膜（図１（１４））を形成した。さらにこの電極支持体を２ｍｇ／ｍｌの酢酸セルロースアセトン溶液に５秒間浸し、酢酸セルロース被膜（図１（１５））を形成し、１時間室温で乾燥させ、ヒスタミン計測用センサを完成させた。【００２５】  このヒスタミン計測用センサ、参照電極、対向電極を電解容器中のリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）に浸し、ポテンシオスタット／ガルバノスタット（２０２０Ａトーホーテクニカルリサーチ社製）に接続した。参照電極は銀／塩化銀電極（ビーエーエス社製）、対向電極は白金線電極（ビーエーエス社製）を用いた。【００２６】  図２にヒスタミン計測用センサを含むヒスタミン計測システムを示す。センサ電極電位を参照電極に対して＋６００ｍＶに設定し、電解容器中のリン酸緩衝溶液にヒスタミンを加え、ヒスタミン濃度が１μＭになるように調整した溶液で計測したヒスタミン酸化による電流は２５ｎＡであった。【００２７】  一方ジアミン類のプトレシンやガタベリンの濃度が１０μＭになるように調整したリン酸緩衝液溶液ではこれらのアミンによる酸化電流は観測されず、本センサのヒスタミンに関する大きな選択性が確かめられた。Ｌ（＋）−アスコルビン酸および尿酸の存在によるヒスタミン酸化電流に対する干渉は１０μＭ以下のアスコルビン酸および尿酸の濃度範囲では観測されなかった。【００２８】  種々のヒスタミン濃度のヒスタミン−リン酸緩衝液におけるヒスタミン濃度と酸化電流の関係を図３および図４に示す。図３はヒスタミン濃度１０ｎＭ以上、図４はヒスタミン濃度１０ｎＭ以下の濃度領域のヒスタミン濃度と酸化電流の関係を示している。【００２９】  上記の二つのヒスタミン濃度領域でヒスタミン濃度と酸化電流の間には勾配の異なる直線関係が得られる。ヒスタミン濃度１０ｎＭ以上の濃度領域では勾配が０．５０であり、したがってヒスタミン酸化電流（Ｉ）とヒスタミン濃度（Ｃｈｉｓ）には以下の関係が成り立つ。
Ｉ  ＝  ｋ（Ｃｈｉｓ）１／２            式１【００３０】  ヒスタミン濃度１０ｎＭ以下の濃度領域では勾配が０．３１であり、ＩとＣｈｉｓには以下の関係が成り立つ。
Ｉ  ＝  ｋ（Ｃｈｉｓ）１／３            式２【００３１】  図４に示したようにヒスタミン濃度が０．０１ｎＭのきわめて希薄な濃度領域まで  （式２）で表される関係が成り立つ。【００３２】  一実施例として図５にヒスタミン濃度０．１０ｎＭおよび０．０１３ｎＭのリン酸緩衝溶液で測定した酸化電流の経時変化を示す。電流は約２０分で定常値に達する。この結果は本センサが濃度０．０１ｎＭまでのヒスタミンを検出することが可能であることを示しており、前述の蛍光分光法と高速液体クロマトグラフ法を結合させた測定システムの検出感度と同程度であり、ヒスタミン計測用電気化学バイオセンサとしては既報のセンサの検出感度を３オーダーも超えるものである。【００３３】  以上説明したように本発明によるヒスタミン計測用センサはきわめて高感度であり，外気開放下で測定でき、図２に示すようにシステム構造が簡単である。本実験ではビーエーエス社の参照銀／塩化銀電極を使用したが、もし銀板上に銀ペーストを担持させた簡易型電極を参照電極に使うなら、より小型のセンサシステムを構成することが可能で，携帯型の超高感度ヒスタミン計測システムの製作が期待される。【００３４】  本発明に関わるヒスタミン計測用センサは上記のすぐれた特徴を有するので、食肉、鮮魚、果実酒、乳製品などの食品検査の分野のみならず医学，生理学分野にもきわめて有効に用いられることが期待される。
【利用分野】
【技術分野】
【００３５】  本発明は食肉、鮮魚、果実酒、乳製品等の食品の品質、鮮度検査や、アレルギーおよび神経性症状の原因の特定において，食品や血漿，随液など生体組織に含まれる極めて微量のヒスタミンの検出および定量分析をするためのヒスタミンセンサに関する。
【背景技術】
【００３６】  ヒスタミンの検出には蛍光−ＨＰＬＣ法が公定法となっている。蛍光−ＨＰＬＣ法は前述のとおりヒスタミンの検出感度が極めて高いのであるが、妨害物質の影響を受けやすく、その除去処理、蛍光試薬の使用など測定操作が複雑で、測定に長時間を要し、かつ高度な分析技術が必要である。【００３７】  より簡便な測定方法として、酵素反応と電気化学反応を組み合わせたヒスタミン計測用センサが開発された。このセンサには二つの形式があり、一つは試料溶液に酵素を溶かし、酵素によるヒスタミンの酸化反応と酸素センサを組み合わせてヒスタミンを検出する方法である。この方法による検出器はすでに市販され（ヒストマン  キッコーマン（株））、検出限界濃度が１μＭである。しかしこの検出器はヒスタミンと酵素反応によって減少する溶存酸素量を測定するため、測定は外気を遮断して行わなくてはならない。また試料によっては滅菌処理をした試料で計測を行う必要がある。【００３８】  他の一つは電極支持体上に酵素や電子メデイエータを担持した電気化学バイオセンサを用いる形式である。この形式にはヒスタミンと酵素の反応で生じた過酸化水素を電気化学還元し、生じた還元電流を測定する電気化学還元方式と、過酸化水素を電気化学酸化し、生じた酸化電流を測定する電気化学酸化方式がある。【００３９】  電気化学還元方式は西洋わさびペルオキシダーゼが過酸化水素の電気化学還元の電子メデイエータとしてよく機能するため、検出感度が比較的高く、検出限界濃度２０ｎＭを有する電気化学センサが開発されている（林他，特開平１１−２４０８２５号公報参照）。しかしこの方式は西洋わさびペルオキシダーゼが高価であり、また酸素の還元電流による干渉を除去するために、酵素反応と酸素センサとを組み合わせた形式と同様に、測定は外気を遮断して行わなくてはならず、センサシステムが複雑になる。【００４０】  一方電気化学酸化方式は酸素による影響がなく、外気開放下での測定が可能になり、センサシステムが非常に簡便になる。しかし従来の方法では、ヒスタミンと酵素の反応で生じた過酸化水素を電気化学酸化するに要する酸素可逆電位近傍の電位で有効に機能する電子メデイエータが見出せず、検出感度が電気化学還元方式に比べて低く、もっとも感度の高い場合でも検出限界濃度は５μＭ程度であった（Ｍ．Ｇ．Ｌｏｕｇｈｒａｎ  ｅｔ．ａｌ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ＆．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，１０巻，５６９−５７６頁，１９９５年）。【００４１】  さらに電気化学バイオセンサを用いる形式では、電気化学還元方式も電気化学酸化方式でも用いたヒスタミン酸化酵素、ヒスタミンペルオキシダーゼ、の他の生体アミンに対するヒスタミン選択性に関する機能が必ずしも十分とはいえなかった。
【発明の効果】
以上説明したように本発明の電極センサは下記の効果を有する．
【００４２】１．本電極センサは極めて高感度であり、０．０１ｎＭから３０μＭにわたる広範囲な濃度領域でヒスタミンを定量的に測定することができる。
【００４３】２．ヒスタミン脱水素酵素を用いているためヒスタミン以外の生体アミンによる干渉をうけない。
【００４４】３．過酸化水素酸化方式のため外気開放下で測定でき、センサの計測システムが簡便かつ安価になり、測定操作が容易である。
【００４５】  したがって本発明のヒスタミン計測用電気化学バイオセンサを用いたヒスタミン計測システムは医療分野，生理学分野，食品分野を問わず広い産業および科学研究分野で応用されることが期待できる。
【課題】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は，上記課題にかんがみてなされたもので，試料中の極めて微少量のヒスタミンを定量的に測定することができ，さらにヒスタミンを根粒バクテリアからとった新しいタイプのヒスタミンヒドロゲナーゼを用いて過酸化水素を生成させ，これを電気化学酸化する電極センサ方式を採用することで，室内空気を遮断せず測定を行うことができ，極めてヒスタミンにたいする選択性に富んだ，小型で，簡便で，かつ安価な微量ヒスタミン計測用センサを提供することを目的とする。
【図１】
2007333714.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年8月25日(2006.8.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、魚肉などの生鮮食料品や生体組織中に含まれるヒスタミンの超微量分析用のヒスタミンセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】  ヒスタミンは組成式Ｃ５Ｈ９Ｎ３、分子量１１１．１５の生体活性アミンである。ヒスタミンは鮮魚、食肉、ワイン等に含まれるアミノ酸であるＬ−ヒスチジンと細菌が持つ脱炭酸酵素による酵素反応や、アルゲンと生体内細胞との抗原抗体反応によって生じ、神経伝達物質として種々の中枢神経機能および免疫システムと密接に関与する。それゆえヒスタミンを過剰に摂取すると吐き気、頭痛、神経障害、蕁麻疹などのアレルギー症状をおこす。ヒスタミンはそれ自身が有毒物質であるばかりか、食品中のヒスタミンの存在量は鮮度の程度を示す尺度であり、食品鮮度を保障するために高感度で測定容易なヒスタミン計測用センサが求められている。医療分野ではアレルゲン診断に超高感度のヒスタミンセンサが求められている。【０００３】  ヒスタミンの測定法は蛍光法が公定法として用いられる。この方法はヒスタミンとオルトフタルアルデヒドにより蛍光物質を合成し、この物質の発する蛍光強度からヒスタミンを定量する。【０００４】  高速液体クロマトグラフ法と蛍光法と高速液体クロマトグラフ法を組み合わせた測定方法（蛍光−ＨＰＬＣ法）（例えばＴ．Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ等Ｂｉｏｍｅｄ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１７巻，５０９−５１６頁，２００３年）は数多く報告されている。この方法は上記の報告によれば検出限界量が０．０１７ｎＭで、きわめて高感度であるが、分析操作が煩雑であり、分析に高度な技術を要する。さらに装置が大型で汎用に不向きであり、かつ高価でランニングコストが高い欠点がある。【０００５】  より簡便な測定法として、酵素反応と電気化学反応を組み合わせた電気化学バイオセンサが開発されている。この方法には（１）電極上にヒスタミン酸化酵素を担持し、これによってヒスタミンを酸化し、生じた過酸化水素を電気化学酸化して酸化電流を測定する方法、（２）おなじく上記の酵素反応で生じた過酸化水素を電気化学還元し，生じた還元電流を測定する方法、（３）ヒスタミン酸化酵素と酸素センサを組み合わせ、ヒスタミンの酸化によって生じる溶液中の溶存酸素の減少量を測定する方法がある。【０００６】  これらの方法の特徴に関しては、（１）の方法で作製したセンサのなかには検出限界濃度が０．０１μＭに達するものがあるが、この方法では測定系内の溶存酸素を除去しなければならないために測定装置が（２）の方法に比べて複雑
になる欠点がある（例えばＳ．Ｉｗａｋｉ等  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３０４巻，２３６−２４３頁，２００２年）。【０００７】  （２）の方法で作製したセンサは溶存酸素による妨害がなく操作が簡便であるが，現在までに作製されたセンサの検出限界濃度が５０−１００μｍｏｌ／ｌ程度で、（１）に比べて著しく感度が劣る（例えばＪ．Ｌａｎｇｅ  ａｎｄ  Ｃ．Ｗｉｔｔｍａｎｎ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３７２巻，２７６−２８３頁，２００２年）。これは過酸化水素の電気化学酸化反応が起こる電位領域で、反応の活性化に有効に機能する電子メデイエータが見出されていなかったことに起因する。【０００８】  （３）の方法による酸素電極を用いた測定システムはすでにキッコーマン株式会社から「ヒストマン」として製品が販売されている。この製品はＨＰＬＣ−蛍光分析装置に比べて小型ではあるが、（１）の方法と同様、空気を遮断して測定を行うために測定装置が安価でない。またこの方法では測定試料中に含まれるバクテリアの呼吸による酸素の消費を考慮しなくてはならない（たとえばＴ．Ｒｉｎｋｅｎ等Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ６６巻，１３−２１頁，２００６年）。検出限界濃度は１μＭであり、（１）の方法よりも感度が劣る。【０００９】  したがって既報の電気化学バイオセンサによるヒスタミン計測システムは蛍光分光−液体クロマトグラフ法による計測システムより簡便でかつ安価であるが、検出感度が著しく劣る。
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】  本発明は、食品および生体組織試料中に含まれる極微のヒスタミン濃度を測定するための蛍光−ＨＰＣＬ分析計測システムに匹敵する超高感度電気化学バイオセンサであって、かつ上記の技術課題に鑑み、外気を遮断せずに測定できる簡便かつ安価なセンサを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】  上記の目的を達成するために、本ヒスタミン計測用センサは金電極支持体とヒスタミン脱水素酵素、ルテニウム電子メデイエータ、金ナノ粒子、酢酸セルロースを含む複数の被膜から構成されている電気化学バイオセンサであることを要旨とする。
【００１２】  請求項１記載の本センサは、水溶液中の極微のヒスタミンを測定するために、ヒスタミンとヒスタミン脱水素酵素の酸化反応生成物である過酸化水素の電気化学酸化反応を促進する電子メデイエータであるルテニウム錯体被膜により構成されていることを特徴とするヒスタミン計測用電気化学バイオセンサである。
【００１３】  請求項２および３記載の本発明は金電極支持体とその上に担持した被膜に関する。電極支持体は金（金を被覆した導電性材料を含む）薄板である。被膜は４層から構成される。下層から順に、第１層はルテニウム錯体の被膜で、ヒスタミンとヒスタミン脱水素酵素中で生じ、拡散によってルテニウム錯体層に到達した過酸化水素の電気化学酸化を媒介し、促進するメデイエータ被膜である。第２層は酢酸セルロースの被膜で、ルテニウム錯体被膜表面への第３層の酵素蛋白の直接付着によるメデイエータの失活を防ぐ。第３層はヒスタミン脱水素酵素、ルテニウム錯体および金ナノ粒子の混合物被膜で、この層で生じた過酸化水素が金ナノ粒子上で電気化学酸化され、生じた電子を互いに近接する金ナノ粒子を介して電極支持体に伝達する。この層におけるルテニウムは第１層におけるルテニウムと同様に、電子メデイエータとして金ナノ粒子上における過酸化水素の電気化学酸化反応を媒介、促進する。金ナノ粒子は過酸化水素を電気化学酸化する微小電極として機能し、センサの感度の増加に寄与するとともに、生じた電子を電極支持体まで伝達する機能も有する。第４層は酢酸セルロース被膜で、上記の第３層において生じた過酸化水素の電解質溶液中への逃散を防ぐ。
【００１４】  本センサは生体アミンのなかでヒスタミンのみを選択的に酸化する機能を持つヒスタミン脱水素酵素（キッコーマン（株）製）を酸化酵素に用い、過酸化水素を電気化学酸化する方式を採用しており、したがって外気開放状態で他の生体アミンの存在に影響されることなく、ヒスタミンを定量測定することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】  以下，図面を用いて本発明のヒスタミン計測用センサおよびヒスタミン計測用センサシステムに係わる実施の形態について説明する。【００１６】  図１は本発明に係わるヒスタミン計測用センサの基本的な構造図である。以下にヒスタミン計測用センサシステムに用いるヒスタミン計測用センサの製造工程について説明する。【００１７】  電極支持体には金薄板（１１）を用いる。【００１８】  この支持体上に、ヒスタミンとヒスタミン脱水素酵素の酸化反応によって生じた過酸化水素の電気化学酸化を媒介促進するメデイエータである、ルテニウム錯体層（１２）を形成する。酵素蛋白の付着によるメデイエータの失活を防ぐため、さらに上部に、酢酸セルロース被膜（１３）を形成する。【００１９】  酢酸セルロース被膜の上にはヒスタミンとヒスタミン脱水素酵素の参加反応で過酸化水素を生成する機能、生じた過酸化水素を金ナノ粒子上でルテニウム錯体を介して電気化学酸化する機能、さらにこの酸化反応で生じた電子を電極支持体に伝達させる機能を有するヒスタミン脱水素酵素、金ナノ粒子、ルテニウム錯体からなる被膜（１４）を形成する。最上層には生成した過酸化水素の電解質溶液中への逃散を防ぐ酢酸セルロース被膜（１５）を形成する。
【実施例】
【００２０】  以下に本発明の実施の形態について，実施例によってさらに詳しく説明する。【００２１】  上記の実施の形態において説明した本発明のヒスタミン計測用センサの製作方法とその性能に関する実験結果の一例を示す。【００２２】  表面積０．５ｃｍ２，厚さ０．０３ｍｍの金板の表面をアルミナ研磨し，直径０．３ｍｍ長さ７ｃｍの金線をリード線としてスポットウエルドし、アセトンおよび精製水で順次超音波洗浄し、電極支持体とした。【００２３】  上記支持体を０．１ｍｇ／ｍｌの三塩化ルテニウムハイドレート溶液中に１０分間浸したのち１時間室内で乾燥させ、ルテニウム錯体被膜を形成した（図１（１２））。この電極を２ｍｇ／ｍｌの酢酸セルロースのアセトン溶液に５秒間浸したあと、室内で１時間乾燥させ、酢酸セルロース被膜を形成した（図１（１３））。【００２４】  つぎにヒスタミンデヒドロゲナーゼ２ｍｇを２５μｌの精製水に溶解させ，その酵素水溶液８μｌ、２ｍｇ／ｍｌの三塩化ルテニウム水溶液２．５μｌ、粒子サイズ５ｎｍ以下の０．０１％金コロイド溶液（ＳＩＧＭＡ社製）２．５μｌの混合溶液を片面６．５μｌずつ電極支持体両面上に塗布し、３時間室温で乾燥させ、混合被膜（図１（１４））を形成した。さらにこの電極支持体を２ｍｇ／ｍｌの酢酸セルロースアセトン溶液に５秒間浸し、酢酸セルロース被膜（図１（１５））を形成し、１時間室温で乾燥させ、ヒスタミン計測用センサを完成させた。【００２５】  このヒスタミン計測用センサ、参照電極、対向電極を電解容器中のリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）に浸し、ポテンシオスタット／ガルバノスタット（２０２０Ａトーホーテクニカルリサーチ社製）に接続した。参照電極は銀／塩化銀電極（ビーエーエス社製）、対向電極は白金線電極（ビーエーエス社製）を用いた。【００２６】  図２にヒスタミン計測用センサを含むヒスタミン計測システムを示す。センサ電極電位を参照電極に対して＋６００ｍＶに設定し、電解容器中のリン酸緩衝溶液にヒスタミンを加え、ヒスタミン濃度が１μＭになるように調整した溶液で計測したヒスタミン酸化による電流は２５ｎＡであった。【００２７】  一方ジアミン類のプトレシンやガタベリンの濃度が１０μＭになるように調整したリン酸緩衝液溶液ではこれらのアミンによる酸化電流は観測されず、本センサのヒスタミンに関する大きな選択性が確かめられた。Ｌ（＋）−アスコルビン酸および尿酸の存在によるヒスタミン酸化電流に対する干渉は１０μＭ以下のアスコルビン酸および尿酸の濃度範囲では観測されなかった。【００２８】  種々のヒスタミン濃度のヒスタミン−リン酸緩衝液におけるヒスタミン濃度と酸化電流の関係を図３および図４に示す。  図３はヒスタミン濃度１０ｎＭ以上、図４はヒスタミン濃度１０ｎＭ以下の濃度領域のヒスタミン濃度と酸化電流の関係を示している。【００２９】上記の二つのヒスタミン濃度領域でヒスタミン濃度と酸化電流の間には勾配の異なる直線関係が得られる。  ヒスタミン濃度１０ｎＭ以上の濃度領域では勾配が０．５０であり、したがってヒスタミン酸化電流（Ｉ）とヒスタミン濃度（Ｃｈｉｓ）には以下の関係が成り立つ。
Ｉ  ＝  ｋ（Ｃｈｉｓ）１／２                          式１【００３０】  ヒスタミン濃度１０ｎＭ以下の濃度領域では勾配が０．３１であり、ＩとＣｈｉｓには以下の関係が成り立つ。
Ｉ  ＝  ｋ（Ｃｈｉｓ）１／３                          式２【００３１】  図４に示したようにヒスタミン濃度が０．０１ｎＭのきわめて希薄な濃度領域まで（式２）で表される関係が成り立つ。【００３２】  一実施例として図５にヒスタミン濃度０．１０ｎＭおよび０．０１３ｎＭのリン酸緩衝溶液で測定した酸化電流の経時変化を示す。電流は約２０分で定常値に達する。この結果は本センサが濃度０．０１ｎＭまでのヒスタミンを検出することが可能であることを示しており、前述の蛍光分光法と高速液体クロマトグラフ法を結合させた測定システムの検出感度と同程度であり、ヒスタミン計測用電気化学バイオセンサとしては既報のセンサの検出感度を３オーダーも超えるものである。【００３３】  以上説明したように本発明によるヒスタミン計測用センサはきわめて高感度であり，外気開放下で測定でき、図２に示すようにシステム構造が簡単である。本実験ではビーエーエス社の参照銀／塩化銀電極を使用したが、もし銀板上に銀ペーストを担持させた簡易型電極を参照電極に使うなら、より小型のセンサシステムを構成することが可能で，携帯型の超高感度ヒスタミン計測システムの製作が期待される。【００３４】  本発明に関わるヒスタミン計測用センサは上記のすぐれた特徴を有するので、食肉、鮮魚、果実酒、乳製品などの食品検査の分野のみならず医学，生理学分野にもきわめて有効に用いられることが期待される。
【利用分野】
【技術分野】
【００３５】  本発明は食肉、鮮魚、果実酒、乳製品等の食品の品質、鮮度検査や、アレルギーおよび神経性症状の原因の特定において，食品や血漿，随液など生体組織に含まれる極めて微量のヒスタミンの検出および定量分析をするためのヒスタミンセンサに関する。
【背景技術】
【００３６】  ヒスタミンの検出には蛍光−ＨＰＬＣ法が公定法となっている。蛍光−ＨＰＬＣ法は前述のとおりヒスタミンの検出感度が極めて高いのであるが、妨害物質の影響を受けやすく、その除去処理、蛍光試薬の使用など測定操作が複雑で、測定に長時間を要し、かつ高度な分析技術が必要である。【００３７】  より簡便な測定方法として、酵素反応と電気化学反応を組み合わせたヒスタミン計測用センサが開発された。このセンサには二つの形式があり、一つは試料溶液に酵素を溶かし、酵素によるヒスタミンの酸化反応と酸素センサを組み合わせてヒスタミンを検出する方法である。この方法による検出器はすでに市販され（ヒストマン  キッコーマン（株））、検出限界濃度が１μＭである。しかしこの検出器はヒスタミンと酵素反応によって減少する溶存酸素量を測定するため、測定は外気を遮断して行わなくてはならない。また試料によっては滅菌処理をした試料で計測を行う必要がある。【００３８】  他の一つは電極支持体上に酵素や電子メデイエータを担持した電気化学バイオセンサを用いる形式である。この形式にはヒスタミンと酵素の反応で生じた過酸化水素を電気化学還元し、生じた還元電流を測定する電気化学還元方式と、過酸化水素を電気化学酸化し、生じた酸化電流を測定する電気化学酸化方式がある。【００３９】  電気化学還元方式は西洋わさびペルオキシダーゼが過酸化水素の電気化学還元の電子メデイエータとしてよく機能するため、検出感度が比較的高く、検出限界濃度２０ｎＭを有する電気化学センサが開発されている（林他，特開平１１−２４０８２５号公報参照）。しかしこの方式は西洋わさびペルオキシダーゼが高価であり、また酸素の還元電流による干渉を除去するために、酵素反応と酸素センサとを組み合わせた形式と同様に、測定は外気を遮断して行わなくてはならず、センサシステムが複雑になる。【００４０】  一方電気化学酸化方式は酸素による影響がなく、外気開放下での測定が可能になり、センサシステムが非常に簡便になる。しかし従来の方法では、ヒスタミンと酵素の反応で生じた過酸化水素を電気化学酸化するに要する酸素可逆電位近傍の電位で有効に機能する電子メデイエータが見出せず、検出感度が電気化学還元方式に比べて低く、もっとも感度の高い場合でも検出限界濃度は５μＭ程度であった（Ｍ．Ｇ．Ｌｏｕｇｈｒａｎ  ｅｔ．ａｌ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ＆．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，１０巻，５６９−５７６頁，１９９５年）。【００４１】  さらに電気化学バイオセンサを用いる形式では、電気化学還元方式も電気化学酸化方式でも用いたヒスタミン酸化酵素、ヒスタミンペルオキシダーゼ、の他の生体アミンに対するヒスタミン選択性に関する機能が必ずしも十分とはいえなかった。
【発明の効果】
以上説明したように本発明の電極センサは下記の効果を有する．
【００４２】  １．本電極センサは極めて高感度であり、０．０１ｎＭから３０μＭにわたる広範囲な濃度領域でヒスタミンを定量的に測定することができる。
【００４３】  ２．ヒスタミン脱水素酵素を用いているためヒスタミン以外の生体アミンによる干渉をうけない。
【００４４】  ３．過酸化水素酸化方式のため外気開放下で測定でき、センサの計測システムが簡便かつ安価になり、測定操作が容易である。
【００４５】  したがって本発明のヒスタミン計測用電気化学バイオセンサを用いたヒスタミン計測システムは医療分野，生理学分野，食品分野を問わず広い産業および科学研究分野で応用されることが期待できる。
【課題】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は，上記課題にかんがみてなされたもので，試料中の極めて微少量のヒスタミンを定量的に測定することができ，さらにヒスタミンを根粒バクテリアからとった新しいタイプのヒスタミンヒドロゲナーゼを用いて過酸化水素を生成させ，これを電気化学酸化する電極センサ方式を採用することで，室内空気を遮断せず測定を行うことができ，極めてヒスタミンにたいする選択性に富んだ，小型で，簡便で，かつ安価な微量ヒスタミン計測用センサを提供することを目的とする。
【図面の簡単な説明】
【００４６】図１  センサ電極の側面図を示す図である。
図２  センサ電極および計測システムを示す図である。
図３  １０ｎＭ以上のヒスタミン濃度領域におけるヒスタミン濃度とヒスタミン酸化電流の関係を示す図である。
図４  １０ｎＭ以下のヒスタミン濃度領域におけるヒスタミン濃度とヒスタミン酸化電流の関係を示す図である。
図５  ヒスタミン濃度０．０１３ｎＭおよび０．１０ｎＭリン酸緩衝溶液におけるヒスタミン酸化電流の経時変化を示す図である。
【符号の説明】
【００４７】１１  金電極支持体
１２  ルテニウム錯体被膜
１３  酢酸セルロース被膜
１４  ヒスタミン脱水素酵素、ルテニウム錯体、金ナノ粒子混合物被膜
１５  酢酸セルロース被膜
２１  電気化学バイオセンサ
２２  銀／塩化銀参照電極
２３  白金対照電極
２４  テフロン被覆
２５  テフロン製キャップ
２６  ポテンシオスタット
２７  レコーダー