(57)【要約】【課題】従来よりも格段に高効率にモノクローナル抗体を含めたタンパク質を産生し得る方法、ならびにそのための新規細胞株を作製する。【解決手段】新規な細胞株ＣＨＯｈｐ１（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６５８）、および前記細胞株ＣＨＯｈｐ１に目的タンパク質をコードする構造遺伝子を含むベクターを導入し、目的タンパク質を産生し得るように形質転換されたものである形質転換細胞株、ならびに、前記細胞株ＣＨＯｈｐ１に目的タンパク質をコードする構造遺伝子を含むベクターを導入することによって形質転換し、得られた形質転換細胞株に目的タンパク質を発現させるタンパク質の産生方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞株ＣＨＯｈｐ１（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６５８）。
【請求項２】
細胞株ＣＨＯｈｐ１（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６５８）に目的タンパク質をコードする構造遺伝子を含むベクターを導入し、目的タンパク質を産生し得るように形質転換されたものである形質転換細胞株。
【請求項３】
目的タンパク質がモノクローナル抗体である、請求項２に記載の形質転換細胞株。
【請求項４】
モノクローナル抗体がヒトモノクローナル抗体である、請求項３に記載の形質転換細胞株。
【請求項５】
マーカータンパク質をコードする遺伝子を含むベクターがさらに導入されたものである、請求項２〜４のいずれかに記載の形質転換細胞株。
【請求項６】
前記マーカータンパク質が膜タンパク質であり、当該膜タンパク質に対する抗体を用いてMagnetic Cell Sortingされ得るものである、請求項５に記載の形質転換細胞株。
【請求項７】
細胞株ＣＨＯｈｐ１（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６５８）に目的タンパク質をコードする構造遺伝子を含むベクターを導入することによって形質転換し、得られた形質転換細胞株に目的タンパク質を発現させる、タンパク質の産生方法。
【請求項８】
目的タンパク質がモノクローナル抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
モノクローナル抗体がヒトモノクローナル抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
マーカータンパク質をコードする遺伝子を含むベクターをさらに導入することを特徴とする、請求項７〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記マーカータンパク質が膜タンパク質であり、当該膜タンパク質に対する抗体を用いてMagnetic Cell Sortingされ得るものである、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高効率でタンパク質を産生可能な新規細胞株、およびそれを用いた形質転換細胞株、タンパク質の産生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、モノクローナル抗体やサイトカイン類は動物培養細胞を用いて生産するバイオ医薬として大きな市場を形成している。中でも、ヒトモノクローナル抗体は人体に投与しても有害な免疫反応を引き起こさず、またその特異性の高さから抗体医薬として開発が進められている。
【０００３】
ヒトモノクローナル抗体を臨床に利用するためには、大量の投与が必要となるため、世界的にヒトモノクローナル抗体の生産能力の不足が問題となっている。この点は、ヒトモノクローナル抗体に限らず、その他の生物由来の抗体やサイトカイン類などを含めたバイオ医薬として用いられ得るタンパク質産生にかかわる問題となっている。
【０００４】
従来、抗体を人工的に作製する方法としては、従来、免疫感作により所望の抗体を産生し得る脾臓Ｂ細胞株とミエローマ細胞株を細胞融合してハイブリドーマ株を樹立し、当該ハイブリドーマ株により所望の抗体を作製せしめる方法が一般的である。またヒトモノクローナル抗体を作製する方法としては、（ａ）マウスを用い作製したマウスモノクローナル抗体のキメラ化（定常領域のキメラ化）やヒト化（ＣＤＲ以外は全てヒト化）、（ｂ）ヒト染色体を導入したマウスを用いたヒトモノクローナル抗体の産生、（ｃ）未感作ヒト末梢血リンパ球を用いたファージディスプレイ法などが広く知られている。
【０００５】
しかし、上記（ａ）の方法では、ヒト疾患治療への応用のためには、マウス由来の抗原性を完全に消失させる必要があるが、それは非常に困難であり、また膨大な費用と時間を要するという不具合がある。また上記（ｂ）の方法では、得られる抗体は基本的にヒト抗体ではあるが、マウスで作製されることによる新たな抗原性の獲得の可能性などの問題がある。さらに上記（ｃ）の方法では、比較的容易に抗体が得られるものの、その効率が低く、膨大な数のスクリーニングを行なう必要性が生じるという問題がある。またそもそも、細胞融合により樹立されたハイブリドーマ株を用いた抗体産生は、ヒト抗体産生細胞を不死化する適切な融合パートナー細胞が現存せず、またその効率も低く、ハイブリドーマ化してからのクローニング、クローンの増幅過程に時間を要するため、抗体の大量生産には不向きであった。また、ハイブリドーマ株を用いた抗体産生では、融合効率が非常に低いだけでなく、特異性の高い抗体を産生し得るハイブリドーマ株の作製において融合効率が低く、また得られたハイブリドーマ株の増殖能も低いと考えられるため、結果的に特異性の低い抗体しか産生することができないと考えられる。また、ハイブリドーマ株を用いた抗体産生では、得られる抗体はＩｇＭ型抗体に限られ、抗体のサブクラスを自由に選択することができない。
【０００６】
このような状況下、モノクローナル抗体も含めたバイオ医薬として適用され得るタンパク質を従来と比較して迅速かつ大量に産生することができるシステムの開発が望まれている。
【特許文献１】特開２００４−１２１２３７号公報
【非特許文献１】Katakura et al., "Productivity enhancement of recombinant protein in CHO cells via specific promoter activation by oncogenes", Cytotechnology 31: 103-109, 1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、従来よりも格段に高効率にモノクローナル抗体を含めたタンパク質を産生し得る方法、ならびにそのための新規細胞株を作製することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究の結果、動物細胞を用いた有用組換えタンパク質を大量かつ安定に生産するためには、できるだけ生産性を保ち、かつ遺伝的に安定な細胞株を樹立することが極めて重要であることに着目し、ガン遺伝子駆動型プロモータ活性化法（Oncogene activated production system）により、従来より格段に高効率にタンパク質を産生し得る新規細胞株の樹立に成功し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下のとおりである。
【０００９】
本発明は、新規な細胞株ＣＨＯｈｐ１（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６５８）を提供する。
【００１０】
また本発明は、細胞株ＣＨＯｈｐ１（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６５８）に目的タンパク質をコードする構造遺伝子を含むベクターを導入し、目的タンパク質を産生し得るように形質転換されたものである形質転換細胞株を提供する。
【００１１】
本発明の形質転換細胞株において、前記目的タンパク質はモノクローナル抗体であるのが好ましく、モノクローナル抗体はヒトモノクローナル抗体であるのがより好ましい。
【００１２】
また本発明の形質転換細胞株は、マーカータンパク質をコードする遺伝子を含むベクターがさらに導入されたものであることが好ましい。また前記タンパク質が膜タンパク質であり、当該膜タンパク質に対する抗体を用いてMagnetic Cell Sortingされ得るものであることがより好ましい。
【００１３】
本発明はまた、細胞株ＣＨＯｈｐ１（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６５８）に目的タンパク質をコードする構造遺伝子を含むベクターを導入することによって形質転換し、得られた形質転換細胞株に目的タンパク質を発現させる、タンパク質の産生方法も提供する。
【００１４】
本発明のタンパク質の産生方法において、前記目的タンパク質はモノクローナル抗体であるのが好ましく、モノクローナル抗体はヒトモノクローナル抗体であるのがより好ましい。
【００１５】
また本発明のタンパク質の産生方法において、マーカータンパク質をコードする遺伝子を含むベクターをさらに導入することが、好ましい。また、前記マーカータンパク質は膜タンパク質であり、当該膜タンパク質に対する抗体を用いてMagnetic Cell Sortingされ得るものであることがより好ましい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、各種疾患の診断、予防、治療に用い得るヒトモノクローナル抗体を含めたタンパク質を従来よりも格段に高効率に作製することができる。また、本発明によれば、従来のハイブリドーマ株を利用した抗体産生とは異なり、ハイブリドーマ株作製の際の融合効率が影響しないため特異性の高い抗体を作製することが可能であり、ＩｇＭ型抗体に限らず、抗体のサブクラスを自由に選択して産生することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
〔１〕新規細胞株ＣＨＯｈｐ１（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６５８）
本発明の細胞株ＣＨＯｈｐ１は、ガン遺伝子駆動型プロモータ活性化法（Oncogene activated production system）によって、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣；Chinese Hamster Ovary）細胞にｒａｓガン遺伝子を導入して形質転換することにより、高効率でタンパク質を発現し得るように作製された細胞株である。当該細胞株は、増殖効率が８０％以上（好ましくは９０％以上）のものである。かかる細胞株は新規なものであるため、本出願人らは、この細胞株ＣＨＯｈｐ１を独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託を行った（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６５８）。
【００１８】
ここで、ガン遺伝子駆動型プロモータ活性化法とは、ガン遺伝子を細胞株に導入して形質転換せしめることで、プロモータを活性化して高効率にタンパク質産生可能な形質転換細胞株を得る手法であり、この方法自体は公知である（たとえば非特許文献１を参照）。本発明の細胞株ＣＨＯｈｐ１に、後述するように高効率で発現させたい目的タンパク質をコードする構造遺伝子を含むベクターを導入することにより、当該ベクターに含まれる構造遺伝子がコードする目的タンパク質についても高効率で発現されることになる。したがってこのような細胞株を用いることにより、従来よりも格段に高効率にタンパク質を産生することができるシステムの構築が可能となる。また、本発明の細胞株ＣＨＯｈｐ１は、高い増殖効率を有するものであり、従来と比較してクローニング、増殖に要する時間を短縮でき、格段に迅速にタンパク質を産生することができる。
【００１９】
〔２〕形質転換細胞株
本発明の形質転換細胞株は、上記細胞株ＣＨＯｈｐ１に目的タンパク質をコードする構造遺伝子を含むベクターを導入し、目的タンパク質を産生し得るように形質転換されたものである形質転換細胞株を提供する。上述のように、細胞株ＣＨＯｈｐ１は、ＣＨＯ細胞にＲａｓガン遺伝子を導入して形質転換されて作製されたものであるが、本発明の形質転換細胞は、細胞株ＣＨＯｈｐ１をさらに（いわば二重に）形質転換して作製される。
【００２０】
形質転換細胞株においては、ベクターに含まれる構造遺伝子によりコードされた目的タンパク質が、高効率で発現される。たとえば、本発明の形質転換細胞株を用いることによって、１２０μｇ／108細胞／日もの産生効率に向上される。
【００２１】
本発明の形質転換細胞株により産生されるタンパク質としては、特に制限されるものではなく、たとえばモノクローナル抗体（ヒトモノクローナル抗体）、サイトカイン類などが挙げられる。中でも、精製の容易さや応用可能性の広さの観点から、目的タンパク質はモノクローナル抗体であるのが好ましく、さらにヒト疾患治療への応用を考慮すると、モノクローナル抗体はヒトモノクローナル抗体であるのがより好ましい。当該目的タンパク質をコードする遺伝子は、たとえば特許文献１に開示された方法を利用することにより得ることができ、従来公知の遺伝子工学的手法を用いてベクターに組み込むことができる。
【００２２】
本発明の形質転換細胞株に導入されたベクターは、前記タンパク質を形質転換細胞株で産生せしめ得るものであれば特に制限されるものではなく、たとえば染色体、エピソーム、ウイルスに由来するベクター（たとえば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０などのパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクターなど）、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、およびこれらの組合せに由来するベクター（コスミドベクターなど）を挙げることができる。中でも遺伝子の安定性および発現効率の観点からは、動物細胞発現用として用いられるベクターが特に好ましい。
【００２３】
本発明の形質転換細胞株に導入されたベクターは、通常、構造遺伝子の上流側に組み込まれたプロモータ配列を有する。プロモータ配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、β−アクチンプロモータ、メタロチオネインＩＩＡプロモータ、ＳＶ４０Ｅプロモータ、ＳＲαプロモータなどが挙げられるが、中でも本発明の細胞株ＣＨＯｈｐ１の形質転換細胞株を用いて特に高効率にタンパク質を生成し得ることから、ＣＭＶプロモータを用いるのが好ましい。プロモータ配列は、従来公知の遺伝子工学的手法を用いてベクターに組み込むことができる。また、所望のプロモータ配列が予め組み込まれ製品化されたベクター（たとえば、ｐＣＤＮＡ、ｐＣＭＶ）を用いてもよい。
【００２４】
また本発明の形質転換細胞株は、当該形質転換細胞株を効率よく選択し、取得し得る観点から、目的タンパク質以外にマーカータンパク質を発現し得るように実現されることが好ましい。当該マーカータンパク質は、上述した構造遺伝子を含むベクターであって当該構造遺伝子の上流にマーカータンパク質をコードする遺伝子をさらに含むベクターを導入することによって発現させてもよいし、上述した構造遺伝子を含むベクターとは別にマーカータンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを導入することによって発現させてもよい。中でも、目的のタンパク質に応じた構造遺伝子を含むベクターとは別途に予め構築したマーカータンパク質発現ベクターを準備できること、ならびに、ベクターの構築に際してフレームを合わせる手間が少なくて済むことから、上述した構造遺伝子を含むベクターとは別にマーカータンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを導入することによって、形質転換細胞株がマーカータンパク質を発現し得るように実現されることが好ましい。マーカータンパク質をコードする遺伝子は、従来公知の遺伝子工学的手法を用いてベクターに組み込むことができる。
【００２５】
本発明の形質転換細胞株を得るためには、細胞株ＣＨＯｈｐ１にベクターを導入した後の細胞から、正常に形質転換が行われた細胞株（本発明の形質転換細胞株）を選択して取得する必要がある。ここで、形質細胞転換細胞株の選択には、たとえば薬剤（Ｇ４１８、ブラストサイジンＳなど）を用いて行う方法が知られているが、この方法では時間を要するため、増殖力の弱い形質転換細胞株の選択・取得には向いていなかった。
【００２６】
上述のように、本発明の形質転換細胞株が前記目的タンパク質以外にマーカータンパク質を発現し得るように実現されることで、正常に形質転換が行われた細胞株を容易に識別することができ、ＭＡＣＳ（Magnetic Activated Cell Sorting）法を利用することで当該形質転換細胞株を効率よく選択し、短時間で取得することができるようになる。
【００２７】
本発明の形質転換細胞株により発現させるマーカータンパク質としては、膜タンパク質、ＣＤ４、ＭＨＣクラスＩ分子、レセプター分子など従来公知の適宜のマーカータンパク質を特に制限なく用いることができるが、ＭＡＣＳ法でのマーカータンパク質特異的抗体を用いたセルソーティングが可能となることから、膜タンパク質をマーカータンパク質として用いるのが好ましい。このような膜タンパク質としては、具体的にはＣＤ４抗原、ＭＨＣクラスＩ分子（ＫK抗原）が挙げられる。膜タンパク質としてＣＤ４抗原を用いる場合、たとえば市販のＭＡＣＳキット（Miltenyi Biotech社製）を好適に用いることができる。どの膜タンパク質を選択するかは、導入先の細胞の性質・相性によって決められる。
【００２８】
なお、本発明に用いられる膜タンパク質は、上述のように特異的抗体を用いたセルソーティングが可能であり、そのソーティング効率が数十％（より望ましくは８０〜９０％）以上であることが望ましい。ソーティング効率が数十％に満たない場合には、細胞の立ち上がりに時間を要し、方法の効率、迅速さに多大な影響を及ぼす傾向にあるためである。
【００２９】
本発明の細胞株ＣＨＯｈｐ１に導入されて形質転換細胞株を作製するために用いられるベクターは、従来公知の適宜の方法にて構築することができ、その作製方法は特に制限されるものではない。
【００３０】
〔３〕タンパク質の産生方法
図１は、本発明のタンパク質の産生方法の好ましい一例を示す概略図である。本発明は、上述した本発明の細胞株ＣＨＯｈｐ１に目的タンパク質をコードする構造遺伝子を含むベクターを導入することによって形質転換し、得られた形質転換細胞株に目的タンパク質を発現させるタンパク質の産生方法も提供する。本発明のタンパク質の産生方法において、前記ベクターの導入は、従来公知の適宜の手法、たとえばエレクトロポレーション法、ジーンガン法、リポソーム法、細胞融合法、ウイルスベクター法などにより行うことができ、特に制限されるものではない。
【００３１】
本発明のタンパク質の産生方法においても、上述と同様に目的タンパク質はモノクローナル抗体であるのが好ましく、ヒトモノクローナル抗体であるのがより好ましい。
【００３２】
また、本発明のタンパク質の産生方法において用いられるベクターも、上述したのと同様に、構造遺伝子の上流にプロモータ配列を含むことが好ましい。
【００３３】
本発明のタンパク質の産生方法は、マーカータンパク質が膜タンパク質であり、その膜タンパク質に対する抗体を用いて、Magnetic Cell Sortingした形質転換細胞株をセルソーティング法によりクローニングする工程を含むことが好ましい。上述のように、たとえば膜タンパク質であるマーカータンパク質を発現するベクターと構造遺伝子を発現するベクターを同時に導入することで、正常に形質転換が行なわれた細胞株では膜タンパク質も同時に発現され、Magnetic Cell Sorting法により形質転換細胞株を容易に識別できるため、ベクター導入後即座にセルソーティングを行なうことができ、タンパク質産生に要する時間を大幅に短縮することができる。
【００３４】
本発明のタンパク質の産生方法においては、好ましくは、セルソーティングを２回行う。すなわち、まず、まず組換えタンパク質を選別するためのマーカータンパク質とそれに対するビース化された抗体を用いたMagnetic Activated Cell Sorting（ＭＡＣＳ）を行い、その後、得られた組換え細胞をCell Sorterに供して、Single Cell Sortingを行うのが好ましい。２回目のセルソーティングであるSingle Cell Sortingでは、マーカータンパク質に対する蛍光標識抗体を用いて、その蛍光強度（たとえばＦＩＴＣ）が１０2〜１０3以上のものを抗ＣＤ４  ＦＩＴＣ抗体にて染色し（氷上１５〜３０分）、その細胞をCell Sorter（BD Aria）に供し、ＦＩＴＣ蛍光強度が１０3以上の細胞を９６ウェルプレートにシングルセルソーティングする。
【００３５】
セルソーティング後、選別された形質転換細胞株は、たとえば１細胞／ウェルの状態で播種され、クローニングされる。これにより、大量のクローンから形質転換細胞株を選択することが可能となる。
【００３６】
本発明のタンパク質の産生方法によれば、従来のＣＨＯ細胞を用いたタンパク質の産生方法と比較して、（１）セルソーティング後のクローニング効率が大幅に改善され（本発明の方法：210/1000、従来法：0/1000）、（２）組換え細胞中の抗体産生陽性細胞（本発明の形質転換細胞株）の取得効率が改善され（本発明の方法：188/1000、従来法：0/1000）、（３）タンパク質産生能が大幅に改善され（本発明の方法：１２０μg/106cells/日、従来法：数μg/106cells/日）、さらに、（４）本発明の形質転換細胞株樹立までの期間が大幅に短縮（本発明の方法：約２週間、従来法：数ヶ月）という格別の効果が得られた。
【００３７】
以下、実験例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３８】
（１）細胞株ＣＨＯｈｐ１の作製
非特許文献１に開示された方法に従って、ＣＨＯ細胞にｒａｓガン遺伝子を導入して形質転換して、ｒａｓ  ｃｌｏｎｅＩ細胞を作製した。得られたｒａｓ  ｃｌｏｎｅＩ細胞を９６ウェルプレートに１細胞／ウェルにて播種し、増殖効率（１細胞からの立ち上がり効率）が高い細胞（８０％以上）を選択した。この選択された細胞株をＣＨＯｈｐ１と名づけた（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６５８）。
【００３９】
（２）遺伝子導入
３×１０6cell/１０ml dishで細胞を播種した。翌日、無血清ＤＭＥＭ培地に交換後、LipofectAMINE plus Reagentsを１５μｌとLipofectAMINEを１５μｌと抗体遺伝子発現ベクターを８μｇと膜タンパク質発現ベクターを１μｇとを添加して、３時間培養した。なお、抗体遺伝子発現ベクターとしては、抗体として肺ガン特異的ヒトモノクローナル抗体をコードする抗体遺伝子のうち、重鎖遺伝子をｐＣＭＶベクターのプロモータ下流のＥｃｏＲＩとＮｏｔＩ制限部位に、軽鎖遺伝子を同プロモータ下流のＰｓｔＩ制限部位に組み込んだものを用い、膜タンパク質発現ベクターとしては、市販のＭＡＣＳキット（Miltenyi Biotech社製）を用いた。３時間後、５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地に交換し、培養を続けた。
【００４０】
（３）ＭＡＣＳ法
遺伝子導入４８時間後（無血清培地での培養３時間も含む）の細胞を回収し、抗ＣＤ４抗体−micro beads複合体（ＣＤ４  Micro Beads，human、Miltenyi Biotech社製）と反応（氷上１０分）させ、専用カラム（AutoMACS）に通した。カラム中に残った細胞（＝ＣＤ４発現細胞＝形質転換細胞株）のみを回収し、数日間、回復培養した。
【００４１】
（４）形質転換細胞のクローニング
形質転換細胞を回収し、抗ＣＤ４  ＦＩＴＣ抗体（T4−FITC、BECKMAN COULTER社製）にて染色した。その細胞をCell Sorter（BD Aria）に供し、ＦＩＴＣ蛍光強度が１０3以上の細胞を、９６ウェルプレートへシングルセルソーティングを行なった。
【００４２】
（５）タンパク質産生効率の評価
anti−immnogloblin抗体（Goat  anti−Human IgG UnconjugateおよびGoat anti−Human IgG HRP−Conjugate、BIOSOURCE社製）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により評価した。評価結果を図２に示す。
【００４３】
今回開示された実施の形態および実施例は、全ての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内での全ての変更が含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明のタンパク質の産生方法の好ましい一例を示す概略図である。
【図２】実験例での大量クローンからの本発明の形質転換細胞株の選択を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
2007319032.tif 000004