(57)【要約】【課題】ヒアルロナン産生促進剤、ヒアルロナン分解抑制剤及びスキンケア剤を提供する。【解決手段】ヒアルロナンを有効成分として含有する薬剤である。ヒアルロナンとしては-Ｄ-グルクロン酸-β-１,３-D-Ｎ-アセチルグルコサミン-β-１,４-を１単位とし、これを２個含む４糖（HA4）であることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロナンを有効成分とする、ヒアルロナン産生促進剤。
【請求項２】
上記ヒアルロナンは、-Ｄ-グルクロン酸-β-１,３-D-Ｎ-アセチルグルコサミン-β-１,４-を１単位とし、これを２個含む４糖であることを特徴とする請求項１記載のヒアルロナン産生促進剤。
【請求項３】
ヒアルロナンを有効成分とする、ヒアルロナン分解抑制剤。
【請求項４】
上記ヒアルロナンは、-Ｄ-グルクロン酸-β-１,３-D-Ｎ-アセチルグルコサミン-β-１,４-を１単位とし、これを２個含む４糖であることを特徴とする請求項３記載のヒアルロナン分解抑制剤。
【請求項５】
ヒアルロナンを有効成分とする、スキンケア剤。
【請求項６】
上記ヒアルロナンは、-Ｄ-グルクロン酸-β-１,３-D-Ｎ-アセチルグルコサミン-β-１,４-を１単位とし、これを２個含む４糖であることを特徴とする請求項５記載のスキンケア剤。
【請求項７】
上記ヒアルロナンは、-Ｄ-グルクロン酸-β-１,３-D-Ｎ-アセチルグルコサミン-β-１,４-を１単位とし、これを１個含む２糖、これを２個含む４糖、これを３個含む６糖、これを４個含む８糖及びこれを５個含む１０糖を含む混合物であることを特徴とする請求項５記載のスキンケア剤。
【請求項８】
皮膚に対して塗布される剤形であることを特徴とする請求項５記載のスキンケア剤。
【請求項９】
経口投与に適した剤形であることを特徴とする請求項５記載のスキンケア剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロナンを有効成分とするヒアルロナン産生促進剤及びヒアルロナン分解抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロナンは、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとの２糖繰り返し単位から構成されている長鎖の多糖であり、一方、オリゴ糖も知られている。ヒアルロナンは鶏冠、さい体、皮膚、関節液などの生体組織からの抽出液、またはストレプトコッカス属の細菌を用いる発酵法などにより製造され、毒性学的および免疫学的作用が存在しないため、薬剤や化粧品として利用されており、例えばヒアルロナンの関節内注射による関節炎の治療がよく知られている。以下の説明において、４糖のヒアルロナンをHA4と記載する。
【０００３】
HA4には、臓器保存、肝障害および胃潰瘍に対する治療・抑制効果があることが報告されている（特許文献１参照）。また、HA4には、ストレス蛋白発現増強作用および細胞死抑制作用があることが知られている（非特許文献１参照）。
【０００４】
なお、一般に『ヒアルロン酸』と表現する場合、４糖のヒアルロナンを含み、糖の数に拘わらず広くヒアルロナンを含む意味である。現在まで、ヒアルロナンの産業への応用は広く研究されてきた。しかしヒアルロナン自体の合成を促進したり、ヒアルロナンの分解を抑制する手法は、十分に研究されていないのが実状であった。
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２００２／００４４７１
【非特許文献１】Xu H, Ito T, Tawada A, Maeda H, Yamanokuchi H, Isahara K, Yoshida K, Uchiyama Y, Asari A. Effect of hyaluronan oligosaccharides on the expression of heat shock protein 72. J Biol Chem. 2002 10;277(19):17308-14.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、新規なヒアルロナン産生促進剤及びヒアルロナン分解抑制剤を提供し、ヒアルロナン産生促進作用及びヒアルロナン分解抑制作用を利用したスキンケア剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述した目的を達成した本発明に係るヒアルロナン産生促進剤、ヒアルロナン分解抑制剤及びスキンケ剤は、４糖のヒアルロナンを有効成分として含有する。本発明に係るヒアルロナン産生促進剤は、細胞内のヒアルロナンの産生を促進、ヒアルロナンの分解を抑制する。また、本発明に係るスキンケア剤は、上記有効成分による細胞内のヒアルロナン産生促進作用及びヒアルロナン分解抑制作用によって、皮膚の保湿を向上させる。
【発明の効果】
【０００８】
本発明に係るヒアルロナン産生促進剤、ヒアルロナン分解抑制剤及びスキンケア剤は、４糖のヒアルロナンを有効成分とするものであるから、比較的安価にかつ容易に大量生産できる利点がある。また、４糖のヒアルロナンは毒性や抗原性がほとんどないこと、生体が元来有している治療作用や疾患の防止作用を増強することから副作用の極めて少ない剤として期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明に係るヒアルロナン産生促進剤は、細胞によるヒアルロナンの産生を促進する機能を有する薬剤である。また、本発明に係るヒアルロナン分解抑制剤は、産生されたヒアルロナンの分解を抑制する薬剤である。さらに、本発明に係るスキンケア剤は、細胞におけるヒアルロナン産生促進作用及びヒアルロナン分解抑制作用を介して皮膚の保湿性を改善する薬剤である。
【００１０】
以下の説明において、本発明に係るヒアルロナン産生促進剤、ヒアルロナン分解抑制剤及びスキンケア剤を単に薬剤と称する。本発明に係る薬剤に含まれるヒアルロナンとしては、基本的にはβ−Ｄ−グルクロン酸の１位とβ−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンの３位とが結合した２糖単位を少なくとも１個含む２糖以上のものでかつβ−Ｄ−グルクロン酸とβ−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンとから基本的に構成されるものであれば、２糖単位が１個または複数個結合したものにそれらの要素が結合した糖であってもよく、またこれらの誘導体、例えば、アシル基等の加水分解性保護基を有したもの等も使用し得る。該糖は不飽和糖であってもよく、不飽和糖としては、非還元末端糖、通常、グルクロン酸の４，５位炭素間が不飽和のもの等が挙げられる。本発明で使用するヒアルロナンとしては、具体的には動物等の天然物から抽出されたもの、微生物を培養して得られたもの、化学的もしくは酵素的に合成されたものなどいずれも使用することができる。例えば鶏冠、さい体、皮膚、関節液などの生体組織から公知の抽出法と精製法によって得ることができる。またストレプトコッカス属の細菌等を用いた発酵法によっても製造できる。
【００１１】
本発明においては、ヒアルロナンオリゴ糖もヒアルロナンに包含され、上記２糖単位１個からなる２糖およびその誘導体のような低分子量のヒアルロナンも含まれる。より好ましくは２〜２０糖程度のヒアルロナンを挙げることができる。
【００１２】
特に、本発明においてヒアルロナンとしては、-Ｄ-グルクロン酸-β-１,３-D-Ｎ-アセチルグルコサミン-β-１,４-を１単位とし、これを１個含む２糖、これを２個含む４糖、これを３個含む６糖、これを４個含む８糖及びこれを５個含む１０糖を含む混合物であることが好ましい。
【００１３】
ヒアルロナンのうち分子量の低いものは、具体的には、酵素分解法、アルカリ分解法、加熱処理法、超音波処理法(Biochem., 33(1994)p6503-6507)等の公知の方法によってヒアルロナンを低分子化する方法、化学的もしくは酵素的に合成する方法(Glycoconjugate J., (1993)p435-439、WO93/20827) などで製造することが好ましい。例えば酵素分解法としては、ヒアルロナン分解酵素（ヒアルロニダーゼ（睾丸由来）、ヒアルロニダーゼ（Streptomyces由来）、ヒアルロニダーゼＳＤなど）、コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＡＣII、コンドロイチナーゼＡＣIII 、コンドロイチナーゼＡＢＣなどのヒアルロナンを分解する酵素をヒアルロナンに作用させてヒアルロナンオリゴ糖を生成する方法（新生化学実験講座「糖質II−プロテオグリカンとグリコサミノグリカン−」p244-248、1991年発行、東京化学同人 参照）などが挙げられる。
【００１４】
また、アルカリ分解法としては、例えばヒアルロナンの溶液に１Ｎ程度の水酸化ナトリウム等の塩基を加え、数時間加温して、低分子化させた後、塩酸等の酸を加えて中和して、低分子量のヒアルロナンを得る方法などが挙げられる。本発明で用いるヒアルロナンは、塩の形態を包含し、製剤上の必要に応じて、その薬学上許容できる塩を用いることができる。例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、トリ（ｎ−ブチル）アミン塩、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、アミノ酸塩等のアミン塩などであることができる。
【００１５】
本発明の薬剤は、ある分子量のヒアルロナン単独又は種々の分子量のヒアルロナンを組み合わせたものなど特に限定することなく使用できる。本発明の薬剤は、ヒアルロナンを有効成分とするものであり、その有効量をヒトを含む哺乳動物に投与することによって生体に悪影響を与えることなく、ヒアルロナンの産生を促進し、細胞内外のヒアルロナンの分解を抑制することができる。
【００１６】
本発明の薬剤は、ヒアルロナン又はその塩を、そのまままたは必要に応じて担体、賦形剤、その他の添加物と共に、経口的あるいは非経口的に投与（関節内投与、静脈内、筋肉内、皮下などの組織内投与（注射）、経腸投与、経皮投与など）するための医薬品として、任意の剤形に製剤化することが可能であり、任意の投与方法で患者に投与される。特に、本発明に係る薬剤は、経口製剤とすることが好ましい。
【００１７】
経口製剤としては、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤等の固形製剤；シロップ剤、エリキシル剤、乳剤等の液状製剤を挙げることができる。散剤は、例えば、乳糖、デンプン、結晶セルロース、乳酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、無水ケイ酸等の賦形剤と混合して得ることができる。顆粒剤は、上記賦形剤のほか、必要に応じ、例えば白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤や、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等の結合剤や、カルボキシメチルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤をさらに加え、湿式又は乾式で造粒して得ることができる。錠剤は、上記散剤又は顆粒剤をそのまま、或いはステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤を加えて打錠して得ることができる。また、上記錠剤又は顆粒剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタアクリル酸メチルコポリマー等の腸溶性基剤で被覆し、或いはエチルセルロース、カルナウバロウ、硬化油等で被覆し、これらを腸溶性或いは持続性製剤にすることができる。硬カプセル剤は、上記散剤又は顆粒剤を硬カプセルに充填して得ることができる。また軟カプセル剤は、ヒアルロナン又はその塩を、グリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オリーブ油等に混合し、これをゼラチン膜で被覆して得ることができる。シロップ剤は、白糖、ソルビトール、グルセリン等の甘味剤とヒアルロナン又はその塩とを、水に溶解して得ることができる。また、甘味剤及び水のほかに、精油、エタノール等を加えてエリキシル剤とするか、或いはアラビアゴム、トラガカント、ポリソルベート８０、カルボキシメチルセルロースナトリウム等を加えて乳剤又は懸濁剤にすることができる。またこれらの液状製剤には必要に応じ、矯味剤、着色剤、保存剤等を加えることができる。
【００１８】
非経口製剤としては、注射剤、直腸投与剤、ペッサリー、皮膚外用剤、吸入剤、エアゾール剤、点眼剤等を挙げることができる。注射剤は、ヒアルロナン又はその塩に塩酸、水酸化ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等のｐＨ調節剤；塩化ナトリウムウム、ブドウ糖等の等張化剤；及び注射用蒸留水を加え、滅菌濾過した後、アンプルに充填して得ることができる。また、更にマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチン等を加えて真空凍結乾燥し、用時溶解型の注射剤とすることができる。またヒアルロナン又はその塩にレシチン、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の乳化剤を加えた後、水中で乳化された注射用乳剤とすることもできる。
【００１９】
直腸投与剤は、ヒアルロナン又はその塩にカカオ脂肪酸のモノ、ジ又はトリグリセリド、ポリエチレングリコール等の坐剤用基剤を加えた後、加温して溶解し、これを型に流し込んで冷却するか、或いはヒアルロナン又はその塩をポリエチレングリコール、大豆油等に混合した後、ゼラチン膜で被覆して得ることができる。皮膚外用剤は、ヒアルロナン又はその塩に、白色ワセリン、ミツロウ、流動パラフィン、ポリエチレングリコール等を加え、必要に応じて加温し、混練して得ることができる。テープ剤は、ヒアルロナン又はその塩を、ロジン、アクリル酸アルキルエステル重合体等の粘着剤と混練し、これを不織布等に展延して得ることができる。吸入剤は、例えば薬学的に許容される不活性ガス等の噴射剤に、ヒアルロナン又はその塩を溶解又は分散し、これを耐圧容器に充填して得ることができる。
【００２０】
特に本発明に係るスキンケア剤の具体的な剤形としては、特に限定されず、乳液、クリーム、ローション及びシート状含水ゲル等の剤形を挙げることができる。本発明に係るスキンケア剤は、上述した有効成分の他、一般的にスキンケア剤として含有されるその他の成分を含めることができる。その他の成分としては、基剤、可溶化剤、保湿剤、乳化剤、溶解安定剤、防腐剤、抗酸化剤、ｐＨ調整剤、けん化剤及び溶剤を挙げることができる。本発明に係るスキンケア剤は、これら他の成分から選ばれる１以上の成分を含むことができる。
【００２１】
可溶化剤としては、特に限定されないが、例えば、モノラウリン酸デカグリセリル、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリオキシエチレンラノリンアルコール、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテルなどを挙げることができる。保湿剤としては、特に限定されないが、例えば、グリセリン、キシリット、ソルビット、ジプロピレングリコール、ブチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（２００、４００、６００、１０００、２０００等）、高重合ポリエチレングリコール、メチルグルセス、Ｄ−マンニット、ヒドロキシプロリンなどを挙げることができる。溶解安定剤としては、特に限定されないが、例えば、塩化カリウム、塩化ナトリウム、クエン酸、亜硫酸ナトリウムなどを挙げることができる。防腐剤としては、特に限定されないが、例えば、パラオキシ安息香酸エステル、塩酸クロルヘキシジン、オルトフェニルフェノール、グルコン酸クロルヘキシジン、トリクロサン、トリクロカルバン、フェノキシエタノールを挙げることができる。抗酸化剤としては、特に限定されないが、例えば、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＥ（ｄｌ−α−トコフェロール）、クエン酸、クエン酸ナトリウム、ジブチルヒドロキシトルエンを挙げることができる。ｐＨ調節剤としては、特に限定されないが、例えば、コハク酸、クエン酸、無水クエン酸、クエン酸ナトリウム、アルギニン、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、リン酸ナトリウムを挙げることができる。基剤としては、特に限定されないが、例えば、ラノリン、セレシン、パラフィン、マイクロクリスタリンワックス、ワセリン、ホホバ油、トリ（カプリル・カプリン酸）グリセリン、イソステアリン酸、オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ベヘン酸、ミリスチン酸、高級アルコール（イソステアリルアルコール、オレイルアルコール、オクチルドデカノール、コレステロール、セタノール、ステアリルアルコール、デシルテトラデカノール、フィトステロール、ヘキシルデカノールなど）、パルミチン酸セチル、パルミチン酸オクチル、ラノリン酸イソプロピルを挙げることができる。乳化剤としては、特に限定されないが、例えば、水素添加大豆リン脂質、ジステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸ポリオキシエチレングリセリン、モノステアリン酸ソルビタン、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、モノステアリン酸ポリエチレングリコール、ジステアリン酸ポリエチレングリコール、Ｎ−ステアロイル−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、Ｎ−アシル−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン、親油型モノステアリン酸グリセリンを挙げることができる。けん化剤としては、特に限定されないが、例えば、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、トリエタノールアミンを挙げることができる。
【００２２】
また、他の成分としては、通常の医薬品、医薬部外品、化粧品等に用いられる成分、たとえばコンディショニング成分、色素、顔料などの着色剤、粘度調整剤、ｐＨ調節剤、塩類、ビタミン剤、香料、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、金属封鎖剤、粘度調整剤、乳化安定剤などを挙げることができる。
【００２３】
（投与方法）本発明のヒアルロナンを有効成分とする薬剤の投与方法は、特に限定されないが、静脈内投与、経口投与、関節内投与及び皮膚塗布を挙げることができる。
【００２４】
（投与量）投与量は、対象とする疾患、患者の年令、健康状態、体重等に応じ適宜決定するが、静脈内投与、経口投与及び関節内投与の場合、一般には０．０５〜５０mg/kgを１日１回あるはそれ以上に分けて投与する。また、皮膚塗布の場合、一般には、0.01〜１０%濃度を１日数回投与する。
【００２５】
（毒性）本発明で使用するヒアルロナンは、医薬としての生物活性を示す投与量において細胞毒性はほとんどもしくは全く認められなかった。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明に係る薬剤を、実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２７】
〔実施例１〕
本実施例では、本発明に係る薬剤による細胞内外におけるヒアルロナンの存在状態を、１０糖以上のヒアルロナンに結合する物質を用いて測定した。当該物質としては、ビオチン標識ヒアルロナン結合性タンパク質（ビオチン標識HABP；生化学工業株式会社製）を使用した。
【００２８】
賦活対象細胞
本実施例では、測定対象の細胞としてHT1080（ヒト繊維肉腫細胞）を使用した。HT1080は理化学研究所より入手可能である。
【００２９】
被検物質の調製
本実施例では、1μg/mlのHA4を調整した。具体的に、HA4は、Tawadaらの方法（Tawada A, Masa T, Oonuki Y, Watanabe A, Matsuzaki Y, Asari A. Large-scale preparation, purification, and characterization of hyaluronan oligosaccharides from 4-mers to 52-mers. Glycobiology. 2002; 12(7):421-6.）により調製し、生理食塩水で濃度を調節した。
【００３０】
実験方法
取得したHT1080細胞をトリプシン処理することで剥離した後、以下の条件でMEM培地に播種し、培養した(１×１０5個/ml、９６穴)。
１群  無添加
２群  HA4を培地に添加し（１μg/ml）、２４時間インキュベート。
【００３１】
培養の後、冷メタノールで固定した。続いて、0.5%BSA（仔牛血清）添加PBS（BSA-PBS）にて洗浄後、ビオチン標識HABPでインキュベートした。インキュベートの条件は４℃にて２４時間とした。その後、BSA-PBSにて洗浄後、FITC標識ストレプトアビジンでインキュベートした（室温（２４℃）にて３０分）。インキュベート後、BSA-PBSにて洗浄した。
【００３２】
蛍光顕微鏡（ニコン社製）にて観察後、撮影した。また、顕微鏡下にて、ランダムに選択した３視野（２００倍）において、細胞表面に拡散性（diffuse）HA染色像を持つ細胞を数えた。
【００３３】
結果
各群について撮影した画像を図１に示し、拡散性HAを持つ細胞数を測定した結果を図２に示す。図１に示した結果から、１０糖以上のヒアルロナンはいずれの群においても細胞質内に顆粒状に染色された。そのような染色像に加え、HA4処理群（２群）では拡散性HA染色像を持つ細胞が、無添加群に比べ多く認められた（図１及び図２）。また図１に示したように、顆粒状HAは、無添加群（１群）に多く認められた。
【００３４】
考察
HAは、細胞膜に存在するヒアルロナン合成酵素（HAS）にて合成され、細胞膜の小孔より細胞外に分泌される。したがって、細胞内に認められた顆粒状HAは、合成途上にあるHAではなく、細胞外から細胞内のエンドゾーム、ファゴゾーム・リソゾームに取り込まれ、分解への運命をたどるHAであると考えられる。一方、拡散性HAは、CD44あるいはHASによって細胞表面に係留されているHAである。HASにより係留されているHAは、産生されたばかりのHAである。したがって、拡散性HAを多く含む細胞は、HAの産生が活発であることを示している。
【００３５】
上記の結果において、HA4処理群では、拡散性HAを含む細胞が多かったことを示している。したがって、HA4には、ヒアルロナン産生促進作用があることが示された。また、上記の結果において、HA4処理群では、分解途上にあるHAを示す顆粒状HAの量がH少なかったことを示している。したがって、HA4には、ヒアルロナン分解抑制作用があることが示された。
【００３６】
〔実施例２〕
本実施例では、本発明に係る薬剤によるヒアルロナン産生促進作用を、ヒト皮膚組織を用いて実証した。
【００３７】
皮膚組織
東洋紡株式会社製のTESTSKINTM LSEを使用した。TESTSKINTM LSEは、付属のアッセイ培地を用いて、付属の6ウェルプレートを用いて培養することで、ヒト皮膚組織モデルを構築することができる。なお、6ウェルプレートにおける１つのウェルの模式図を図３に示す。図３に示すように、6ウェルプレートにおける個々のウェルは、底面に透過膜１を備えたトランスウェル２から構成されている。TESTSKINTM LSEは、トランスウェル２内及びトランスウェル２の底面の下方空間３にアッセイ培地を充填することによって、トランスウェルの底面上に培養され、ヒト皮膚組織モデル４を形成することとなる。
【００３８】
被検物質の調製
実施例１と同様に調製したHA4を使用した。
【００３９】
実験方法
先ず、以下のように群分けして、TESTSKINTM LSEを6ウェルプレートにて、37℃、5% CO2で24時間培養した。
１群[HA4(-)]：アッセイ培地1.2mlを添加した6wellプレートに、TESTSKINTM LSEの入ったトランスウェルを設置し、トランスウェル内に1mlのアッセイ培地を添加した。
２群[HA4(+)]：1μg/mlの濃度でHA4を含むアッセイ培地1.2mlを添加した6wellプレートに、TESTSKINTM LSEの入ったトランスウェルを設置し、トランスウェル内に1μg/mlの濃度でHA4を含むアッセイ培地1mlを添加した。
【００４０】
次に、トランスウェルを切り取り、OCTコンパウンドに包埋し、凍結切片を作製した（厚さ10μm)。次に、実施例１と同様にヒアルロン酸結合タンパク質(HABP)によるヒアルロン酸染色を実施した。
【００４１】
具体的には、凍結切片を4%パラホルムアルデヒド/PBSを用い、室温にて30分固定した、PBSで三回洗浄した。さらに、0.3% H2O2/メタノールを用い、4℃にて30分間処理し、内因性のペルオキシダーゼのブロッキングを行い、PBSで三回洗浄した。次に、内因性のビオチンを内因性アビジンビオチンブロッキングキット（ニチレイ）を用い、プロトコールどおりにブロッキングした。次に、100 mM Sodium acetate bufferを加え、37℃で15分インキュベートした後、各群から選ばれた陰性コントロール群には、20TRUの放線菌由来ヒアルロニダーゼ（生化学工業）を添加し、60℃で2時間インキュベートした。PBSで三回洗浄した後、1％ BSA/PBSを加え、室温で1時間ブロッキングした。ブロッキング剤を除き、1% BSA/PBSで2 ug/mlに希釈したビオチン標識HABP（生化学工業）を加え、室温で1時間インキュベートし、PBSで三回洗浄した。1% BSA/PBSで200ng/mlに希釈したストレプトアビジン-HRP（カルビオケム）を添加し、室温で1時間インキュベートし、PBSで三回洗浄した後、DAB（Zymed)で発色させ、顕微鏡下で観察した。
【００４２】
結果
各群について撮影した画像を図４に示した。なお、図４におけるA)は１群[HA4(-)]のヒト皮膚組織モデルであり、B)は２群[HA4(+)]のヒト皮膚組織モデルである。又、図４におけるC)は１群[HA4(-)]のヒト皮膚組織モデルに対して20TRUの放線菌由来ヒアルロニダーゼ処理したサンプルであり、D)は２群[HA4(+)]のヒト皮膚組織モデルに対して20TRUの放線菌由来ヒアルロニダーゼ処理したサンプルである。
【００４３】
図４に示すように２群[HA4(+)]のヒト皮膚組織モデルにおいては、矢印で示すようにHABP染色陽性の細胞が多数検出された。これに対して、１群[HA4(-)]のヒト皮膚組織モデルにおいてはHABP染色陽性の細胞が極めて少ない。また、ヒアルロナンは細胞の周囲に観察された。一方、図４におけるC)及びd)に示すように、ヒアルロニダーゼ処理によって染色性は消失した。
【００４４】
考察
以上の結果から、HA4はヒト皮膚組織モデルにおいてヒアルロナン産生を促進する作用があることが実証された。
【００４５】
〔実施例３〕
本実施例では、本発明に係る薬剤を経口投与した場合のスキンケア効果を、実験動物を用いて実証した。
【００４６】
実験動物
本実施例では、C57BL6マウスを使用した。
【００４７】
被検物質の調製
本実施例では、塩酸加水分解法によって図５に示すような組成を有するヒアルロナンオリゴ糖混合物（以下、HAオリゴ糖混合物）を準備した。ヒアルロナンオリゴ糖混合物は、以下に示すように所謂塩酸加水分解法によって調製した。塩酸加水分解法において原料としてはヒアルロン酸Ｎａ（株式会社 紀文フードケミファ社製、規格名：FCH-SU）を使用した。先ず、1Lビーカーに蒸留水450mlを正確に測り取り、70℃に昇温した。次に、原料50gを、スターラーバー撹拌下、数回に分けて、上記蒸留水（70℃）に入れた。粉体の溶解並びに溶液温度70℃を確認した後、6N 塩酸を正確に50ml加えた。なお、塩酸投入時点を反応開始時点とした。溶液を70℃に維持しながら、反応開示時点より16時間撹拌反応した。16時間経過後、直ちに、約等量（500ml）の蒸留水に注ぎ込み、2N NaOHにて中和（pH6-7）した。その後、溶液（約1L)をエバポレーターにて、200mlまで濃縮した。得られた濃縮溶液10mlを脱塩処理（Sephadex G25）した。その後、HAオリゴ糖を含有する脱塩画分を集め、凍結乾燥した。なお、HAオリゴ糖の確認は、カルバゾール反応及びHPLCによった。その結果、凍結乾燥粉体として、1.96ｇのHAオリゴが得られた（組成を図５に示した）。
【００４８】
実験方法
本実施例では、先ず、HAオリゴ糖混合物を含む蒸留水を給水瓶に入れ、C57BL6マウスに2週間飲ませた（1日あたりHAオリゴ糖混合物を２００mg／ｋｇ体重の割合で摂取するように、1日あたりの平均摂水量から換算して、HAオリゴ糖混合物の濃度を調整した）。
【００４９】
2週間の摂取後、C57BL6マウスの背部皮膚を8mm径の大きさで２個摂取し、採取直後の重量を測定した。その結果得られた重量を湿重量とした。次に、凍結乾燥を48時間行い、凍結乾燥後の重量を測定した。その結果得られた重量を乾燥重量とした。そして、湿重量から乾燥重量を差し引くことによって、背部皮膚における水分量を算出した。
【００５０】
また、本実施例では、実施例１と同様にして調製したHA4をC57BL6マウスに経口投与し（100mg/kg）、30分後に採血（門脈血及び動脈血）し、血中のHA4の存在をHPLCにて検出した。また、HA4を分解する酵素であるchondroitinase ABC（生化学工業株式会社製）にて試料を処理し（1unit/ml、pH6.0、37℃及び１時間の処理条件とした）、HA4の位置に出現するピークが確かにHA4であることを確認した。
【００５１】
結果
HAオリゴ糖混合物を経口投与したC57BL6マウス及び対照として蒸留水のみを投与したC57BL6マウスについて、背部皮膚における水分量を測定した結果を図６に示す。図６に示すように、HAオリゴ糖混合物を経口投与したC57BL6マウスにおいては、対照のマウスと比較して湿重量及び乾燥重量ともに増加しており、且つ、水分量も増加していることが判明した。
【００５２】
また、HA4を経口投与したC57BL6マウスから採取した門脈血及び動脈血をHPLCに供した結果として得られたプロファイルを図７に示す。図７（a）は門脈血についてHPLCを行った結果であり、（b）は動脈血についてHPLCを行った結果であり、（c）は採取した動脈血にchondroitinase ABC処理を施した後にHPLCを行った結果である。図７に示すように、HA4を経口投与したマウスの動脈血には、矢印に示す位置に顕著なピークが観察された（図７（a）及び（b））。このピークは、HA4の出現位置に一致し、また図７（c）に示すようにchondroitinase ABC処理によって消滅していることからHA4に相当するピークであることが判った。
【００５３】
考察
以上の結果から、HA4を含むHAオリゴ糖混合物を経口摂取すると、血液を介して皮膚に移行し、皮膚における水分及びその他の皮膚成分を増加させること、すなわち、皮膚がみずみずしくなること（スキンケア効果）を示すことが実証された。
【００５４】
〔実施例４〕
本実施例では、本発明に係る薬剤を皮膚塗布した場合のスキンケア効果を、実験動物を用いて実証した。
【００５５】
実験動物
本実施例では、生後七ヶ月齢の雌の肉用ブタ（LWD種）を使用した。実験動物は、温湿度自然環境下、及び照明時間12時間（午前8時から午後8時）に設定された飼育室内で飼育した。飼育に際して、飲料水は自由摂取とし、飼料（ハイブリード70)は一日二回の制限給餌とした。また、朝・夕刻時に豚房内を水洗した。
【００５６】
被検物質の調製
本実施例では、実施例３と同様にして調製したHAオリゴ糖混合物を、表１に記載の組成からなる基材に0.1重量％となるように混合した塗布クリームとして準備した。また、比較例として、HAオリゴ糖混合物を高分子ヒアルロナン（平均分子量８０万）とした以外は同様に配合した塗布クリーム及び基材のみからなる塗布クリームを準備した。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
実験方法
飼育している実験動物の背部皮膚を2cmの間隔で一区画3cm四方に区分けし、上記塗布クリームを一日一回0.1gずつ塗布した。塗布クリームの塗布は７日間行った。最終塗布の翌日に麻酔科にて放血致死させ、背部皮膚を脂肪層ごと摘出し、一部をOCTコンパウンドに包埋し、一部を凍結した。
【００５９】
（ヒアルロナン結合タンパク質によるヒアルロナン染色実験）
OTCコンパウンドに包埋したブタ背部皮膚を用い、凍結切片を作製した（厚さ18μm)。切片を4%パラホルムアルデヒド/PBSを用い、室温にて30分固定した、PBSで三回洗浄した。さらに、0.3% H2O2/メタノールを用い、4℃にて30分間処理し、内因性のペルオキシダーゼのブロッキングを行い、PBSで三回洗浄した。次に、内因性のビオチンを内因性アビジンビオチンブロッキングキット（ニチレイ）を用い、プロトコールどおりにブロッキングした。次に、100 mM Sodium acetate bufferを加え、37℃で15分インキュベートした後、陰性コントロール群には、20TRUの放線菌由来ヒアルロニダーゼ（生化学工業）を添加し、60℃で2時間インキュベートした。PBSで三回洗浄した後、1％ BSA/PBSを加え、室温で1時間ブロッキングした。ブロッキング剤を除き、1% BSA/PBSで2 ug/mlに希釈したビオチン標識ヒアルロン酸結合性タンパク質（生化学工業）を加え、室温で1時間インキュベートし、PBSで三回洗浄した。1% BSA/PBSで200ng/mlに希釈したストレプトアビジン-HRP（カルビオケム）を添加し、室温で1時間インキュベートし、PBSで三回洗浄した後、DAB（Zymed)で発色させ、顕微鏡下で観察した。
【００６０】
（皮膚内ヒアルロナン含量の測定実験）
ブタ皮膚を60℃にて一晩乾燥させ、1mgあたり100ulの1%プロナーゼ（Merck)を添加し、40℃で17時間酵素消化した。100℃で10分しプロナーゼを不活化した後、15000rpmで10分遠心し、上清をヒアルロン酸画分とした。
【００６１】
分子量75万のHAを50 mM クエン酸-リン酸バッファー（pH 5）で0.1 μg/mlになるよう調製し、アミノプレート（住友ベークライト）に50μlずつ添加し、室温で15分放置した。蒸留水で10 mg/mlに調製した水素化シアノホウ素ナトリウム 10μlをプレートに添加し、室温で1時間放置した。TBSで三回洗浄後、200μlのブロックエース（大日本住友製薬）で4℃にて3日ブロッキングした。PBS/0.05 % Tweenで三回洗浄し、10倍に希釈したブロックエースで75倍に希釈したブタ皮膚ヒアルロン酸画分を50ul添加し、さらに100ng/mlになるよう10倍に希釈したブロックエースで調製したビオチン標識ヒアルロン酸結合性タンパク質（生化学工業）を50μl添加し、37℃で1時間インキュベートした。PBS/0.05 % Tweenで三回洗浄し、100μlの10倍希釈したブロックエースで4000倍希釈したストレプトアビジン-HRP（Calbiochem)を添加し、37℃で1時間インキュベートした。PBS/0.05 % Tweenで三回洗浄し、100μlのTMB(MOSS)を加え、発色させた後、１Nの塩酸で反応を停止させた。A450/630nmを測定した。
【００６２】
結果
上述した「ヒアルロナン結合タンパク質によるヒアルロナン染色実験」の結果を図７に示す。図７に示すように、基材のみを含有する塗布クリーム及び高分子HAを含有する塗布クリームを使用した場合には、背部皮膚にヒアルロナンの産生は認められなかった。これに対して、HAオリゴ糖混合物を含有する塗布クリームを使用した場合には、背部皮膚にヒアルロナン染色が検出された。また、図７に示すように、ヒアルロニダーゼ処理によってその染色性は消失したことから、HAオリゴ糖混合物を含有する塗布クリームを使用した場合には、ヒアルロナンの産生が促進されていることが実証された。
【００６３】
また、上述した「皮膚内ヒアルロナン含量の測定実験」の結果を図８に示す。図８に示すように、HAオリゴ糖混合物を含有する塗布クリームを使用した場合には、基材のみからなる塗布クリーム及び高分子HAを含有する塗布クリームを使用した場合と比較して、ヒアルロナン含量が有意に増加した。この結果からも、HAオリゴ糖混合物を含有する塗布クリームを使用した場合には、ヒアルロナンの産生が促進されていることが実証された。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】実施例１で調製した各群の細胞を撮像した写真である。
【図２】実施例１で調製した各群で、細胞表面に拡散性HAを有する細胞の数を測定した結果を示す特性図である。
【図３】実施例２で使用した6ウェルプレートにおける１つのウェルの模式図である。
【図４】実施例２の各群におけるヒト皮膚組織モデルの切片を撮像した写真である。
【図５】実施例３で調製したHAオリゴ糖混合物の組成を示す特性図である。
【図６】実施例３の各群におけるマウス背部皮膚の湿重量、乾燥重量及び水分量を示す特性図である。
【図７】実施例３の各群におけるマウスから採取した門脈血及び動脈血をHPLCに供した結果として得られた特性図である。
【図８】実施例４の各群におけるブタ背部皮膚を用いたヒアルロナン結合タンパク質によるヒアルロナン染色実験の結果を示す写真である。
【図９】実施例４の各群におけるブタ背部皮膚を用いた皮膚内ヒアルロナン含量の測定実験の結果を示す特性図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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