(57)【要約】【課題】間質性肺疾患を治療するために有効な手段の提供。【解決手段】ディスコイジンドメインレセプター１（ＤＤＲ１）の発現又は活性を抑制する手段を有効成分として含むことを特徴とする間質性肺疾患治療剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ディスコイジンドメインレセプター１（ＤＤＲ１）の発現又は活性を抑制する手段を有効成分として含むことを特徴とする間質性肺疾患治療剤。
【請求項２】
ＤＤＲ１が、ヒト、マウス、ラット又はチンパンジーのＤＤＲ１である、請求項１記載の治療剤。
【請求項３】
ＤＤＲ１の発現を抑制する手段が、ＤＤＲ１をコードする遺伝子に対する二本鎖ＲＮＡ分子、又は該二本鎖ＲＮＡ分子を転写することができる発現ベクターである、請求項１又は２記載の治療剤。
【請求項４】
二本鎖ＲＮＡ分子が１７〜２５塩基からなるｓｉＲＮＡ（short-interfering RNA）分子である、請求項３記載の治療剤。
【請求項５】
二本鎖ＲＮＡ分子が、配列番号９における１６０〜２４０番の塩基若しくは９３０〜１０２０番の塩基、又は配列番号１１における１６０〜２４０番の塩基、４１０〜４９０番の塩基、９３０〜１０２０番の塩基、若しくは１３００〜１３８０番の塩基を標的とするものである、請求項３又は４記載の治療剤。
【請求項６】
二本鎖ＲＮＡ分子が以下：
（ａ）配列番号１に示されるセンス配列と配列番号２に示されるアンチセンス配列とから形成される二本鎖ＲＮＡ分子、
（ｂ）配列番号３に示されるセンス配列と配列番号４に示されるアンチセンス配列とから形成される二本鎖ＲＮＡ分子、
（ｃ）配列番号５に示されるセンス配列と配列番号６に示されるアンチセンス配列とから形成される二本鎖ＲＮＡ分子、
（ｄ）配列番号７に示されるセンス配列と配列番号８に示されるアンチセンス配列とから形成される二本鎖ＲＮＡ分子
からなる群より選択される分子である、請求項３〜５のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項７】
ヒト又はマウスに投与される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項８】
経鼻投与される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項９】
間質性肺疾患が、突発性肺線維症、剥離性間質性肺炎、突発性間質性肺炎、呼吸細気管支炎に伴う間質性肺疾患、突発性閉塞性細気管支炎、リンパ球性間質性肺炎、びまん性間質性肺疾患、突発性器質化肺炎、及び膠原病に伴う間質性肺炎からなる群より選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項１０】
以下：
（ａ）配列番号１に示されるセンス配列と配列番号２に示されるアンチセンス配列とから形成される二本鎖ＲＮＡ分子、
（ｂ）配列番号３に示されるセンス配列と配列番号４に示されるアンチセンス配列とから形成される二本鎖ＲＮＡ分子、
（ｃ）配列番号５に示されるセンス配列と配列番号６に示されるアンチセンス配列とから形成される二本鎖ＲＮＡ分子、
（ｄ）配列番号７に示されるセンス配列と配列番号８に示されるアンチセンス配列とから形成される二本鎖ＲＮＡ分子
からなる群より選択される二本鎖ＲＮＡ分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間質性肺疾患治療剤に関する。具体的には、本発明は、ディスコイジンドメインレセプター１（ＤＤＲ１）の発現又は活性を抑制する手段を含む間質性肺疾患治療剤に関する。また本発明は、ＤＤＲ１をコードする遺伝子に対する二本鎖ＲＮＡ分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
間質性肺炎は、慢性進行性の肺を侵す原因不明の疾患で、肺に炎症がおこり線維化をきたして肺が硬化し、最終的には呼吸不全に至る疾患であり、発症後平均３〜４年で死亡する難治性の疾患である。
【０００３】
間質性肺炎の治療は、従来ステロイド剤や免疫抑制剤で行われている。しかしながら、それらの治療法は予後が悪く、また副作用の問題もあるため、新たな治療法の開発が望まれている。
【０００４】
従来、ブレオマイシンをマウスに投与すると間質性肺炎のマウスモデルが作製できることが知られている。新たな間質性肺炎治療法開発のために、このマウスモデルの肺炎の治療法の研究が世界中で行われているが、有効な治療法はまだ見出されていない。
【０００５】
また、本発明者のグループは、ディスコイジンドメインレセプター１（ＤＤＲ１）と称するタンパク質が、突発性間質性肺炎の病態に深く関与していることを見出した（非特許文献１）。しかしながら、ＤＤＲ１の発現又は活性を特異的に低減させる手法及び手段、そして特異的に低減させることによる効果については報告されていない。
【０００６】
一方、遺伝子工学分野では、ＲＮＡインターフェアランス（ＲＮＡｉ）という事象が注目されている。ＲＮＡインターフェアランスとは、細胞に、特定の遺伝子に対するアンチセンスＲＮＡ（ｍＲＮＡに相補的なＲＮＡ）をトランスフェクトすると、当該遺伝子の特異的な発現抑制が起こる事象である（非特許文献２）。最近では、長いＲＮＡを使用したＲＮＡｉでは、複数の遺伝子の発現が抑制制御されるが、短いＲＮＡでは単一の遺伝子の発現のみが特異的に抑制制御されることが分かっている。また、特異的発現抑制制御を指令する最も有効なＲＮＡ長は２１ｍｅｒで、３’末端に２塩基がオーバーハングした二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であることが報告されている（非特許文献３）。このような２０ｍｅｒ前後の短い２本鎖のＲＮＡは短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれている。また、近年の研究でｓｉＲＮＡ分子の経鼻投与で肺におけるタンパク質発現を特異的に抑制できることが報告されている（非特許文献４）。しかしながら、特定の遺伝子の発現を抑制することができるｄｓＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ分子の設計は、その個々の遺伝子の構造及び性質によって異なり、遺伝子の全長から約２０ｍｅｒ程度の配列を選び出す組み合わせが無数にあるため、非常に困難なものとなっている。
【０００７】
【非特許文献１】Matsuyama, W. et al. Journal of Immunology 第174巻第6490〜6498頁、2005年
【非特許文献２】Guo, S.及びKemphues, KJ. Cell 第81巻第611〜620頁、1995年
【非特許文献３】Sayda, M. et al. Genes & Dev. 第15巻第188〜200頁、2001年
【非特許文献４】Bitko, V. et al. Nat.Med. 第11巻第50〜55頁、2005年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、間質性肺疾患を治療するために有効な手段又は方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、ディスコイジンドメインレセプター１（ＤＤＲ１）の発現をＲＮＡｉにより抑制したところ、マウス及びヒト細胞においてＤＤＲ１の発現が低減し、また間質性肺炎モデルマウスの肺において間質性肺炎の症状を改善することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、ディスコイジンドメインレセプター１（ＤＤＲ１）の発現又は活性を抑制する手段を有効成分として含むことを特徴とする間質性肺疾患治療剤である。
【００１１】
上記間質性肺疾患治療剤において、ＤＤＲ１は、例えばヒト、マウス、ラット又はチンパンジーのＤＤＲ１でありうる。また、ＤＤＲ１の発現を抑制する手段としては、例えば、ＤＤＲ１をコードする遺伝子に対する二本鎖ＲＮＡ分子、又は該二本鎖ＲＮＡ分子を転写することができる発現ベクターが挙げられる。ここで、二本鎖ＲＮＡ分子は、１７〜２５塩基からなるｓｉＲＮＡ（short-interfering RNA）分子であることが好ましい。
【００１２】
上記二本鎖ＲＮＡ分子は、例えば、ヒトＤＤＲ１（配列番号９）における１６０〜２４０番の塩基若しくは９３０〜１０２０番の塩基、又はマウスＤＤＲ１（配列番号１１）における１６０〜２４０番の塩基、４１０〜４９０番の塩基、９３０〜１０２０番の塩基、若しくは１３００〜１３８０番の塩基を標的とするものとすることができる。
【００１３】
また具体的な二本鎖ＲＮＡ分子としては、例えば限定されるものではないが、
（ａ）配列番号１に示されるセンス配列と配列番号２に示されるアンチセンス配列とから形成される二本鎖ＲＮＡ分子、
（ｂ）配列番号３に示されるセンス配列と配列番号４に示されるアンチセンス配列とから形成される二本鎖ＲＮＡ分子、
（ｃ）配列番号５に示されるセンス配列と配列番号６に示されるアンチセンス配列とから形成される二本鎖ＲＮＡ分子、
（ｄ）配列番号７に示されるセンス配列と配列番号８に示されるアンチセンス配列とから形成される二本鎖ＲＮＡ分子
が挙げられる。
【００１４】
上記間質性肺疾患治療剤は、例えば限定されるものではないが、ヒト又はマウスに投与することができる。また上記間質性肺疾患治療剤は、例えば経鼻投与されるものである。また、間質性肺疾患としては、突発性肺線維症、剥離性間質性肺炎、突発性間質性肺炎、呼吸細気管支炎に伴う間質性肺疾患、突発性閉塞性細気管支炎、リンパ球性間質性肺炎、びまん性間質性肺疾患、突発性器質化肺炎、及び膠原病（リウマチなど）に伴う間質性肺炎が含まれる。
【００１５】
さらに本発明は、以下：
（ａ）配列番号１に示されるセンス配列と配列番号２に示されるアンチセンス配列とから形成される二本鎖ＲＮＡ分子、
（ｂ）配列番号３に示されるセンス配列と配列番号４に示されるアンチセンス配列とから形成される二本鎖ＲＮＡ分子、
（ｃ）配列番号５に示されるセンス配列と配列番号６に示されるアンチセンス配列とから形成される二本鎖ＲＮＡ分子、
（ｄ）配列番号７に示されるセンス配列と配列番号８に示されるアンチセンス配列とから形成される二本鎖ＲＮＡ分子
からなる群より選択される二本鎖ＲＮＡ分子である。
【００１６】
またさらに本発明は、間質性肺疾患に罹患している又はその罹患が疑われる被験体においてディスコイジンドメインレセプター１（ＤＤＲ１）の発現又は活性を抑制することを特徴とする間質性肺疾患の治療方法である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、間質性肺疾患治療剤が提供される。かかる間質性肺疾患治療剤は、被験体における間質性肺疾患を効果的に治療することができる。また本発明により、ディスコイジンドメインレセプター１（ＤＤＲ１）をコードする遺伝子に対する二本鎖ＲＮＡ分子が提供される。かかる二本鎖ＲＮＡ分子は、ＤＤＲ１の発現を特異的かつ効率的に抑制するものであるため、例えば間質性肺疾患の治療に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．ＤＤＲ１の発現又は活性を抑制するための手段
本発明は、ディスコイジンドメインレセプター１（ＤＤＲ１）の発現又は活性の抑制が、間質性肺疾患に対する治療効果を示すという知見に基づいている。従って、ＤＤＲ１の発現又は活性を抑制するための手段は、間質性肺疾患の治療に有効である。
【００１９】
ＤＤＲ１は、近年発見されたチロシンキナーゼ活性を有する膜タンパク質受容体であり、コラーゲンをリガンドとし、ヒトの肺においては肺胞マクロファージ、肺線維芽細胞、気管支上皮に発現している。ＤＤＲ１は多くの動物において見出されており、例えばヒト、ラット、チンパンジー、マウスなどに存在することが報告されている。本発明においては、ＤＤＲ１であれば任意のＤＤＲ１の発現又は活性を抑制することができ、特に限定されるものではない。
【００２０】
ＤＤＲ１の具体的な配列情報は公のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋなど）に登録されており、当業者であればデータベースから詳細な配列情報を入手し、また既知の配列情報に基づいて他の種の相同配列を見出すことができる。例えば、ヒトＤＤＲ１は、配列番号９に示される塩基配列によりコードされ、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有する（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ０７００７０）。マウスＤＤＲ１は、配列番号１１に示される塩基配列によりコードされ、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ０６５９９８）。ラットＤＤＲ１は、配列番号１３に示される塩基配列によりコードされ、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１３１３７）。チンパンジーＤＤＲ１は、例えばアクセッション番号ＡＹ４１２９４２に登録された配列を有する。
【００２１】
本発明において用いることができる、ＤＤＲ１の発現又は活性を抑制するための手段としては、
（１）ＤＤＲ１をコードする遺伝子の翻訳を抑制可能な手段
（２）ＤＤＲ１をコードする遺伝子の転写を抑制可能な手段
（３）ＤＤＲ１に対する抗体
が挙げられる。
【００２２】
（１）ＤＤＲ１をコードする遺伝子の翻訳を抑制可能な手段
（１−１）二本鎖ＲＮＡ
ＤＤＲ１をコードする遺伝子の翻訳を抑制するために、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を利用することが可能である。具体的には、標的とするＤＤＲ１をコードする遺伝子の塩基配列に相補的な二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入するとＤＤＲ１をコードする内在性遺伝子のｍＲＮＡが分解されて、結果としてその細胞での遺伝子発現が特異的に抑制されることとなる。この手法は、哺乳動物細胞などにおいても確認されている（Hannon,GJ., Nature (2002) 418,244-251 (review)；特表２００２−５１６０６２号公報；特表平８−５０６７３４号公報）。
ＤＤＲ１に対する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子の設計及び作製、その投与方法などの詳細については後述する。
【００２３】
（１−２）アンチセンス法
また、ＤＤＲ１をコードする遺伝子の翻訳を抑制する手段としては、いわゆるアンチセンス核酸を用いる方法が挙げられる。すなわち、当該遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡを転写するＤＮＡを、プラスミドとして導入するか又は被験者のゲノムに組み込み、当該アンチセンスＲＮＡを過剰発現させることで、ＤＤＲ１をコードする遺伝子のｍＲＮＡの翻訳が抑制される。アンチセンスＲＮＡに関する技術は、例えば哺乳動物を宿主とした場合でも知られている（Han et al.(1991) Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 88,4313-4317; Hackett et al.(2000) Plant Physiol., 124,1079-86）。
【００２４】
（２）ＤＤＲ１をコードする遺伝子の転写を抑制可能な手段
ＤＤＲ１をコードする遺伝子の転写を抑制する手段としては、対象となる被験者における当該遺伝子の転写プロモーター領域を転写抑制型プロモーターと置換するために用いることが可能な発現ベクターが挙げられる。また、ＤＤＲ１をコードする遺伝子の転写を抑制する手段としては、当該遺伝子の転写に関わる領域に転写抑制活性のある塩基配列を挿入するための発現ベクターを用いてもよい。上記のような発現ベクターの設計及び調製は当業者には周知である。
【００２５】
（３）ＤＤＲ１に対する抗体
ＤＤＲ１に対する抗体は、ＤＤＲ１と特異的に結合することにより、該ＤＤＲ１の活性を抑制することができる。ＤＤＲ１に対する抗体は、当技術分野で公知の抗体作製方法によって作製することができる。簡単に説明すると、ＤＤＲ１の全長タンパク質（例えば配列番号１０、１２又は１４のアミノ酸配列を有するタンパク質）又はその部分ペプチドを用いて免疫原を調製し、免疫原を適当な動物（マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、トリなど）に適当な回数で投与することにより、該動物においてＤＤＲ１に対する抗体を誘起することができる。免疫した動物から抗血清を採取することによりポリクローナル抗体を得ることができる。また免疫した動物の脾細胞又は抗体産生細胞を不死化細胞（ミエローマ細胞など）と融合してハイブリドーマを作製し、目的の抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングし、該ハイブリドーマから抗体を採取することによってモノクローナル抗体を得ることができる。その他、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体フラグメントなども用いることができ、それらは全て当技術分野で公知の方法に従って作製することができる。
【００２６】
２．ＤＤＲ１に対する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子
前述の通り、ＤＤＲ１をコードする遺伝子の塩基配列に相補的な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、ＤＤＲ１の発現を特異的に抑制することができる。本発明においては、ＲＮＡインターフェアランスによりＤＤＲ１遺伝子の発現を効果的に抑制又は低減するｄｓＲＮＡ分子及び該ｄｓＲＮＡ分子を転写することができる発現ベクターを提供する。本発明において用いることができるｄｓＲＮＡ分子は、ＤＤＲ１遺伝子（例えば配列番号９、１１又は１３）の塩基配列の少なくとも１０〜１００個の連続する塩基、好ましくは１０〜８０個の連続する塩基、より好ましくは１０〜３０個の連続する塩基を標的とするものである。すなわち、ｄｓＲＮＡ分子の２本のＲＮＡ鎖のうち、第１鎖はＤＤＲ１遺伝子の塩基配列の少なくとも１０〜１００個の連続する塩基、好ましくは１０〜８０個の連続する塩基、より好ましくは１０〜３０個の連続する塩基に対応するＲＮＡ配列を有し、第２鎖は第１鎖のＲＮＡ配列に対して相補的なＲＮＡ配列を有する。本発明においては、ｄｓＲＮＡ分子は、１７〜２５塩基からなるｓｉＲＮＡ（short-interfering RNA）分子であることが特に好ましい。
【００２７】
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子は、２つの別個の鎖から構成される１つの二本鎖ＲＮＡ分子であってもよいし、あるいは１本の鎖がステムループ構造をとることにより形成される二本鎖ＲＮＡ分子であってもよい。またそれぞれの鎖の３’側に２塩基のオーバーハングを持たせることにより、遺伝子の発現抑制作用を増強することもできる（ＷＯ０１／７５１６４号パンフレット）。
【００２８】
ｄｓＲＮＡ分子の設計に用いる配列及び長さや構造については、当業者であれば、様々な改変を試みて、最も遺伝子発現抑制作用の強いｄｓＲＮＡｉ分子を至適化することが可能である。
【００２９】
例えば、本発明において、ｄｓＲＮＡ分子は、ヒトＤＤＲ１をコードする塩基配列（配列番号９）のうち、１６０〜２４０番の塩基、又は９３０〜１０２０番の塩基を標的とする。またマウスＤＤＲ１をコードする塩基配列（配列番号１１）のうち、１６０〜２４０番の塩基、４１０〜４９０番の塩基、９３０〜１０２０番の塩基、又は１３００〜１３８０番の塩基を標的とする。
【００３０】
より具体的には、本発明においては、以下のｄｓＲＮＡ分子を用いることができる：
（ａ）配列番号１に示されるセンス配列と配列番号２に示されるアンチセンス配列とから形成される二本鎖ＲＮＡ分子（ヒトＤＤＲ１の１９２〜２１０番の塩基、又はマウスＤＤＲ１の１８５〜２０３番の塩基を標的とする）
（ｂ）配列番号３に示されるセンス配列と配列番号４に示されるアンチセンス配列とから形成される二本鎖ＲＮＡ分子（マウスＤＤＲ１の４４５〜４６３番の塩基を標的とする）
（ｃ）配列番号５に示されるセンス配列と配列番号６に示されるアンチセンス配列とから形成される二本鎖ＲＮＡ分子（ヒトＤＤＲ１の９６６〜９８５番の塩基、又はマウスＤＤＲ１の９６２〜９８１の塩基を標的とする）
（ｄ）配列番号７に示されるセンス配列と配列番号８に示されるアンチセンス配列とから形成される二本鎖ＲＮＡ分子。（マウスＤＤＲ１の１３３３〜１３５２番の塩基を標的とする）
【００３１】
また、上記の通り設計されたｄｓＲＮＡ分子を転写することができる発現ベクターも、当業者であれば容易に作製することができる。ｄｓＲＮＡ分子を転写することができる発現ベクターは、例えば公知のベクター（アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターなど）に、ｄｓＲＮＡ分子に対応するＤＮＡ配列を適当な発現制御配列と共に連結することによって作製しうる。このようにして作製される発現ベクターは、それが被験体又は細胞に投与された場合に、被験体又は細胞内でｄｓＲＮＡ分子を転写し、そのｄｓＲＮＡ分子が特異的にＤＤＲ１遺伝子の発現を抑制することができる。
【００３２】
ｄｓＲＮＡ分子によるＲＮＡインターフェアランスは、ｅｘ ｖｉｖｏで（例えば、被験体に由来する細胞をｄｓＲＮＡ分子又は発現ベクターと共に培養することによって行う）、あるいはｉｎ ｖｉｖｏで（例えば、ｄｓＲＮＡ分子又は発現ベクターを被験体に投与することによって行う）実施することができる。
【００３３】
ｄｓＲＮＡ分子は、標的部位（例えば肺）に局所的に送達してもよい。例えば、経鼻投与することによって、肺に局所送達することが可能である。また、発現ベクターを用いる場合には、組織特異的プロモーターの制御下にｄｓＲＮＡ分子が発現するように発現ベクターを設計することによって、局所送達することが可能となる。
【００３４】
また、ｄｓＲＮＡ分子を標的組織又は細胞に送達するために用いられる遺伝子送達系の他の例としては、コロイド分散系、リポソーム誘導系及び人工ウイルスエンベロープが挙げられる。具体的には、例えば高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル及びリポソームなどを送達系として用いることができる。
【００３５】
ｄｓＲＮＡ分子又は発現ベクターは、経鼻投与、静脈内注射（連続注入を含む）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、又は他の投与経路によって直接投与することができる（ｉｎ ｖｉｖｏ法）。あるいは、ｄｓＲＮＡ分子又は発現ベクターは、まず被験体から得られた細胞又は組織に導入し、その後、該細胞又は組織を被験体に投与することによっても送達することができる（ｅｘ ｖｉｖｏ法）。ｄｓＲＮＡ分子又は発現ベクターの細胞又は組織への導入は、慣用の遺伝子導入法、例えばリン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション、又はリポフェクションなどにより行うことができる。ｄｓＲＮＡ分子を発現している細胞又は組織の投与は、ｄｓＲＮＡ分子又は発現ベクターの直接投与の場合と同様に行うことができる。
【００３６】
ｄｓＲＮＡ分子又は発現ベクターの投与量は、被験体の年齢、性別、症状、投与経路、投与頻度、及び剤形などに応じて適宜異なるが、当技術分野で慣用の方法（例えば疾患モデルを用いる試験）などを行って好適な投与量を選択することができる。例えば、ｄｓＲＮＡ分子又は発現ベクターは、経鼻投与する場合、１回当たり約３０〜１００ｎＭ、好ましくは約３０〜７０ｎＭの濃度で、約３０〜１００μｌ、好ましくは約３０〜７０μｌを投与し、例えば１〜６日おき、１〜４週間おきに、例えば１週間〜１年にわたり投与することができる。
【００３７】
３．医薬組成物
上述したディスコイジンドメインレセプター１（ＤＤＲ１）の発現又は活性を抑制する手段は、ＤＤＲ１の発現又は活性を抑制することにより、間質性肺疾患を治療することができるものである。従って、本発明は、ＤＤＲ１の発現又は活性を抑制する手段を有効成分として含むことを特徴とする間質性肺疾患治療剤を提供する。
【００３８】
本発明の治療剤は、間質性肺疾患を罹患している被験体、及び間質性肺疾患の罹患が疑われる被験体に投与することができる。被験体は、例えば哺乳動物及び鳥類動物を含む動物でありうる。例えば、哺乳動物としては、ヒト、実験動物（マウス、ラット、サル、ウサギ、チンパンジー等）、ペット動物（ネコ、イヌ等）、家畜動物（ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等）が挙げられる。
【００３９】
本発明において治療対象となる疾患は間質性肺疾患であり、具体的には例えば突発性間質性肺疾患（突発性肺線維症、剥離性間質性肺炎、突発性間質性肺炎、呼吸細気管支炎に伴う間質性肺疾患、突発性閉塞性細気管支炎、リンパ球性間質性肺炎、突発性器質化肺炎、膠原病（リウマチ等）に伴う間質性肺炎など）、びまん性間質性肺疾患などが含まれる。
【００４０】
また、本発明の治療剤による治療の成果は、投与された被験体に少なくとも健康に良い効果をもたらすことであり、好ましくは間質性肺疾患の少なくとも１つの症状を軽減若しくは緩和すること、又は間質性肺疾患の進行若しくは再発を阻止することなどである。そのような間質性肺疾患の症状としては、限定されるものではないが、咳、発熱、喀痰、呼吸困難、異常呼吸音などが挙げられる。
【００４１】
本発明の治療剤は、１以上の薬学的に許容される担体又は賦形剤を用いて慣用的に製剤化することができる。例えば、本発明の治療剤は、経鼻投与、経口投与、直腸投与、注射による投与などにより投与するための組成物に製剤化しうる。また、投与は全身性又は局所的のいずれであってもよい。
【００４２】
本発明の治療剤は、その投与経路に応じて、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸薬、ペレット、カプセル剤、散剤、徐放性製剤、坐剤、エアロゾル、スプレーなど、使用に適したいかなる他の剤形であってもよい。
【００４３】
経鼻投与では、有効成分を、適当な溶媒（生理食塩水、アルコールなど）に溶解し、その溶液を鼻に注入又は点鼻することによって送達することができる。あるいは、経鼻又は吸入による投与では、有効成分を、適切な噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又はその他の適切な気体を用いて、加圧パック又はネブライザからエアロゾルスプレーを噴出させる形で都合良く送達することができる。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、計量分が送達されるように弁を設けることにより決定することができる。
【００４４】
注射の場合、有効成分は、例えばボーラス注射又は連続注入による非経口投与（すなわち静脈内又は筋肉内投与）用に溶剤として処方することができ、好ましくはハンクス液やリンガー液、生理食塩水などの、生理学的に適合性のある緩衝液として処方することができる。この溶剤は、懸濁剤や安定剤、及び／又は分散剤などの、処方可能な薬剤を含有してよい。あるいは有効成分は、使用前に、例えば滅菌した発熱性物質を含まない水などの適切な賦形剤と共に再構成するために、粉末形態にすることができる。注射用製剤は、保存剤を添加して、例えばアンプル又は複数回投与容器中の単位投与剤形として提供することができる。
【００４５】
経口投与する場合には、本発明の治療剤は、例えば錠剤、ロゼンジ、水性又は油性懸濁液、顆粒、散剤、乳剤、カプセル、シロップ、又はエリキシルの形態であり得る。錠剤又は丸薬形態の場合は、胃腸管内での分散及び吸収を遅延させ、それにより長時間持続した作用をもたらすために、組成物をコーティングすることができる。
【００４６】
その他の投与経路に適した製剤の形態及び製剤化方法は、当技術分野で公知であり、それらの任意の形態及び製剤化方法を用いて本発明の治療剤を製造することができる。
【００４７】
薬学的に許容される担体又は賦形剤としては、限定されるものではないが、液体（例えば水、油、生理食塩水、デキストロース水溶液、エタノールなど）、固体（例えばアカシアガム、ゼラチン、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、タルク、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、ケラチン、コロイド状シリカ、乾燥脱脂乳、グリセロールなど）が挙げられる。また、本発明の治療剤は、通常の医薬組成物に配合される補助剤、防腐剤、安定化剤、濃化剤、潤滑剤、着色剤、湿潤剤、乳化剤、及びｐＨ緩衝剤などのうち適当なものを含有してもよい。
【００４８】
本発明の治療剤は、ＤＤＲ１の発現又は活性を抑制する手段を有効量で含有する。有効量とは、治療対象の被験体に健康に良い効果をもたらすのに十分な有効成分の量を意味する。
【００４９】
本発明の治療剤の毒性及び治療効力は、例えばＬＤ５０（集団の５０％が致死となる量）及びＥＤ５０（集団の５０％に対して治療上有効な量）を決定するため、標準的な手順により、細胞培養物又は実験動物において決定することができる。毒性作用を示す用量と治療効果を示す用量の比は治療インデックスであり、比ＬＤ／ＥＤとして表すことができる。
【００５０】
治療インデックスが高い治療剤が好ましく、毒性が高い場合には、治療剤が罹患組織の部位に標的化するような送達系を設計して、非罹患細胞が受ける可能性のある損傷を最小限に抑え、それにより副作用を低減することに注意すべきである。
【００５１】
細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータを用いて、ヒトにおける使用のための用量範囲を決定しうる。そのような治療剤の投与量は、ほとんど又は全く毒性のないＥＤ５０を含む循環血漿濃度の範囲内であることが好ましい。投与量は、この範囲内で、使用する投与剤形、及び採用する投与経路に応じて異なる。本発明の治療剤については、まず細胞培養アッセイから有効量を推定しうる。細胞培養で決定したＩＣ５０（すなわち、症状の最大半分の抑制を達成する試験治療剤の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて決定しうる。このような情報は、ヒトにおける有効量をより詳細に決定するために用いることができる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【００５２】
被験体の症状及び年齢、並びに／又は投与経路に応じて、当業者であれば、本発明の治療剤の適切な用量を選択することができる。例えば、本発明の治療剤にＤＤＲ１に対するｄｓＲＮＡ分子又は発現ベクターを約３０〜１００ｎＭ、好ましくは約３０〜７０ｎＭの濃度で配合し、経鼻投与する場合には、１回当たり約３０〜１００μｌ、好ましくは約３０〜７０μｌを投与し、例えば１〜６日おき、１〜４週間おきに、例えば１週間〜１年にわたって投与することができる。
【００５３】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５４】
本実施例においては、ディスコイジンドメインレセプター１（ＤＤＲ１）に対するｓｉＲＮＡ分子を作製した。
【００５５】
具体的には、下記表１に示されるディスコイジンドメインレセプター１（ＤＤＲ１）に対するｓｉＲＮＡ分子を設計した。ｓｉＲＮＡ１及びｓｉＲＮＡ３分子は、それぞれヒトＤＤＲ１の塩基配列（配列番号９）の１９２〜２１０番の塩基及び９６６〜９８５番の塩基に対するものである。またｓｉＲＮＡ１〜４分子は、マウスＤＤＲ１の塩基配列（配列番号１１）の１８５〜２０３番の塩基、４４５〜４６３番の塩基、９６２〜９８１番の塩基及び１３３３〜１３５２番の塩基に対するものである。
【００５６】
【表１】
2007319009.tif 000002
【００５７】
上記のｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成し、ＨＰＬＣ精製法にて精製して使用した。
【実施例２】
【００５８】
本実施例においては、マウス肺胞マクロファージを用いて実施例１で作製したｓｉＲＮＡ分子の効果を検証した。
【００５９】
上述の通り作製したｓｉＲＮＡ分子を用いて、ＤＤＲ１及びアクチンに対するノーザンブロット解析及びウエスタンブロット解析を行った。対照として、SantaCruz社よりルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡを購入し実験に使用した。
【００６０】
２×１０６個のマウス肺胞マクロファージに、何もトランスフェクションしない場合（トランスフェクションなし）、トランスフェクション試薬のみを使用した場合（陰性対照）、実施例１で作製したｓｉＲＮＡ１分子をトランスフェクションした場合（ｓｉＲＮＡ１）、ｓｉＲＮＡ２分子をトランスフェクションした場合（ｓｉＲＮＡ２）、ｓｉＲＮＡ３分子をトランスフェクションした場合（ｓｉＲＮＡ３）、ｓｉＲＮＡ４分子をトランスフェクションした場合（ｓｉＲＮＡ４）、ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡをトランスフェクションした場合（ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃ）に分けて、１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン及び２ｍＭグルタミンを含むＤＭＥＭ培養液内で培養した。トランスフェクション試薬としてカイアジェン社のTransfectene Reagentを用いた。
【００６１】
ノーザンブロット解析の場合には、２４時間培養後、細胞を回収し、TRIZol Reagentを用いてＲＮＡを抽出し、ホルマリン含有アガロースゲルにアプライし、５０Ｖで３時間電気泳動を行った。その後、ニトロセルロースメンブレンに塩濃度勾配法にて転写した。Amersham社のRediprime II Random Prime Labeling Systemを用いてα−３２ＰをラベルしたマウスＤＤＲ１に対するｃＤＮＡ又はβアクチンに対するｃＤＮＡをプローブとして、先のメンブレンに６５℃で３時間ハイブリダイゼーションを行った。その後洗浄し、Amersham社のHyperfilmECLに露光して解析した。
【００６２】
この結果を図１Ａに示す。レーン１〜５は、それぞれ、トランスフェクションなし（レーン１）、陰性対照（レーン２）、ｓｉＲＮＡ１（レーン３）、ｓｉＲＮＡ３（レーン４）、ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃ（レーン５）を示す。この結果から、ｓｉＲＮＡ１分子又はｓｉＲＮＡ３分子をトランスフェクトした場合には、マウス肺胞マクロファージにおけるＤＤＲ１の発現が低減したことが示された。
【００６３】
ウエスタンブロット解析の場合には、４８時間培養後、細胞を回収し、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及び１０％グリセロールを含んだ細胞溶解液で溶解し、それぞれ１０μｌをサンプルバッファー（２０％グリセロール、６％ＳＤＳ、１０％ ２−メルカプトエタノール）１０μｌと混合し、１０分間９５℃でインキュベーションし、冷却後２０μｌを１０％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅポリアクリルアミドゲル（Invitrogen社製）にアプライして電気泳動を１５ｍＡで９０分間行った。その後、電気泳動を行ったゲルからHybond-ECL Membrane（Amersham社製）へタンパク質をトランスファーした。トランスファーは膜の面積×１ｍＡで６０分間行った。そうして得られた膜を、ＴＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有）で洗浄した。その後、膜をブロッキングバッファー（ブロックエース  大日本住友製薬株式会社製）中に浸して３７℃で１時間インキュベートし、その後、膜をＴＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有）で洗浄した。続いて、一次抗体反応を、ウサギポリクローナル抗ＤＤＲ１抗体又はウサギポリクローナル抗アクチン抗体（Santa-Cruz社製）をDako Cytomation社製DAKO Antibody Diluent with Background Reducing Components （Catalog number:S3022）で１００倍に希釈して用いて、４℃で１０時間インキュベートすることにより行った。その後、膜をＴＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有）で洗浄し、Dako Cytomation社製DAKO Antibody Diluent with Background Reducing Components で１０００倍希釈したＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Amersham社製）を用いて二次抗体反応を行った。次に、膜をＴＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有）で洗浄し、Amersham社製ＥＣＬ−ｐｌｕｓキットを用いて膜を発色させ、Amersham社のHyperfilmECLに露光して解析した。
【００６４】
この結果を図１Ｂ及びＣに示す。図１Ｂにおいて、レーン１〜５は、それぞれ、トランスフェクションなし（レーン１）、陰性対照（レーン２）、ｓｉＲＮＡ１（レーン３）、ｓｉＲＮＡ３（レーン４）、ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃ（レーン５）を示す。また図１Ｃにおいて、レーン１〜５は、それぞれ、トランスフェクションなし（レーン１）、陰性対照（レーン２）、ｓｉＲＮＡ２（レーン３）、ｓｉＲＮＡ４（レーン４）、ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃ（レーン５）を示す。これらの結果から、ｓｉＲＮＡ１分子、ｓｉＲＮＡ２分子、ｓｉＲＮＡ３分子又はｓｉＲＮＡ４分子をトランスフェクトした場合には、マウス肺胞マクロファージにおけるＤＤＲ１の発現が低減したことが示された。
【００６５】
また、図１Ｂのウエスタンブロット解析で得られたバンドの濃度をNIH image version 1.62（NIH；http://rsb.inf.nih.gov/nih-image/より入手可）を用いて解析数値化し、マイクロソフト社エクセルソフトウエアを用いてグラフ化した。この結果を図２に示す。この結果からも、ｓｉＲＮＡ１分子又はｓｉＲＮＡ３分子をトランスフェクトした場合には、マウス肺胞マクロファージにおけるＤＤＲ１の発現が低減することが明らかである。
【実施例３】
【００６６】
本実施例においては、ヒト肺胞マクロファージを用いて実施例１で作製したｓｉＲＮＡ分子の効果を検証した。
【００６７】
実施例１で作製したｓｉＲＮＡ１分子及びｓｉＲＮＡ３分子を合成し、ＨＰＬＣ精製法にて精製して使用した。また対照としてSantaCruz社よりヒトのルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡを購入し実験に使用した。
【００６８】
２×１０６個のヒト肺胞マクロファージに、何もトランスフェクションしない場合（トランスフェクションなし）、トランスフェクション試薬のみを使用した場合（陰性対照）、ｓｉＲＮＡ１分子をトランスフェクションした場合（ｓｉＲＮＡ１）、ｓｉＲＮＡ３分子をトランスフェクションした場合（ｓｉＲＮＡ３）、ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡをトランスフェクションした場合（ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃ）に分けて、１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン及び２ｍＭのグルタミンを含むＤＭＥＭ培養液内で培養した。トランスフェクションにはカイアジェン社のTransfectene Reagentを用いた。
【００６９】
４８時間培養後、細胞を回収し、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及び１０％グリセロールを含んだ細胞溶解液で溶解し、それぞれ１０μｌをサンプルバッファー（２０％グリセロール、６％ＳＤＳ、１０％ ２−メルカプトエタノール）１０μｌと混合し、１０分間９５℃でインキュベーションし、冷却後２０μｌを１０％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅポリアクリルアミドゲル（Invitrogen社製）にアプライして電気泳動を１５ｍＡで９０分間行った。その後、電気泳動を行ったゲルからHybond-ECL Membrane（Amersham社製）へタンパク質をトランスファーした。トランスファーは膜の面積×１ｍＡで６０分間行った。そうして得られた膜を、ＴＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有）で洗浄した。その後、膜をブロッキングバッファー（ブロックエース  大日本住友製薬株式会社製）中に浸して３７℃で１時間インキュベートし、その後、膜をＴＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有）で洗浄した。続いて、一次抗体反応を、ウサギポリクローナル抗ＤＤＲ１抗体又はマウスモノクローナル抗アクチン抗体（Santa-Cruz社製）をDako Cytomation社製DAKO Antibody Diluent with Background Reducing Components （Catalog number:S3022）で１００倍に希釈して用いて、４℃で１０時間インキュベートすることにより行った。その後、膜をＴＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有）で洗浄し、Dako Cytomation社製DAKO Antibody Diluent with Background Reducing Components で１０００倍希釈したＨＲＰ標識抗ウサギ又はマウスＩｇＧ抗体（Amersham社製）を用いて二次抗体反応を行った。次に、膜をＴＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有）で洗浄し、Amersham社製ECL-plusキットを用いて膜を発色させ、Amersham社のＨｙｐｅｒｆｉｌｍＥＣＬに露光して解析した。
【００７０】
この結果を図３に示す。レーン１〜５は、それぞれ、トランスフェクションなし（レーン１）、陰性対照（レーン２）、ｓｉＲＮＡ１（レーン３）、ｓｉＲＮＡ３（レーン４）、ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃ（レーン５）を表す。この結果から、ｓｉＲＮＡ１分子又はｓｉＲＮＡ３分子をトランスフェクトした場合には、ヒト肺胞マクロファージにおけるＤＤＲ１の発現が低減したことが示された。
【実施例４】
【００７１】
実施例１において作製したｓｉＲＮＡ分子を間質性肺炎モデルマウスに投与し、その効果を検証した。
【００７２】
（１）間質性肺炎モデルマウスにおけるＤＤＲ１量の変化
まず、実施例１で作製したｓｉＲＮＡ１分子７５μｇをそれぞれ５０μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解した（１５ｍｇ／ｍｌ ｓｉＲＮＡ）。また、３６匹のＣ５７ＢＬ／６雌マウスに、１．８ｍｇ／ｍｌのブレオマイシン５０μｌを１回２７ゲージの注射針を用いて経気管支投与し、投与（０日）から３日目に間質性肺炎モデルマウスとした（Watanabe M et al. Molecular Therapy. 2005 Jul;12(1):58-67）。この間質性肺炎モデルマウスをケタラール・フェノバルビタールによる麻酔で眠らせた後、１２匹に対してはブレオマイシン投与３日目に上記のｓｉＲＮＡ１分子の溶液を一回当たり５０μｌ点鼻し、経鼻投与した。別の１２匹に対してはSanta-Cruz社より購入したルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃ）を１．５ｍｇ／ｍｌの濃度にＰＢＳに溶解し、５０μｌを投与した。これらの投与を３日毎に６回、すなわちブレオマイシン投与（０日）から３日、６日、９日、１２日、１５日及び１８日目に行った。残りの１２匹に対してはブレオマイシン投与のみとした。
【００７３】
上記の３つのグループ（ブレオマイシン投与のみ、ブレオマイシン＋ｓｉＲＮＡ１分子投与、及びブレオマイシン＋ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃ投与）について、ブレオマイシン投与後０日目、３日目、７日目、１４日目及び２１日目に、それぞれのグループの３匹のマウスからケタラール・フェノバルビタールによる麻酔で眠らせた後に肺を摘出した。
【００７４】
それぞれ摘出した肺１ｍｇを５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、及び１０％グリセロールを含んだ溶解液に入れ、超音波ホモゲナイザーで溶解した。その溶解液それぞれ１０μｌをサンプルバッファー（２０％グリセロール、６％ＳＤＳ、１０％ ２−メルカプトエタノール）１０μｌと混合し、１０分間９５℃でインキュベーションし、冷却後２０μｌを１０％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅポリアクリルアミドゲル（Invitrogen社製）にアプライして電気泳動を１５ｍＡで９０分間行った。その後、電気泳動を行ったゲルからHybond-ECL Membrane（Amersham社製）へタンパク質をトランスファーした。トランスファーは膜の面積×１ｍＡで６０分間行った。そうして得られた膜を、ＴＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有）で洗浄した。その後、膜をブロッキングバッファー（ブロックエース  大日本住友製薬株式会社製）中に浸して３７℃で１時間インキュベートし、その後、膜をＴＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有）で洗浄し、続いて一次抗体反応を、ウサギポリクローナル抗ＤＤＲ１抗体（Santa-Cruz社製）をDako Cytomation社製DAKO Antibody Diluent with Background Reducing Components （Catalog number:S3022）で１００倍に希釈して用いて、４℃で１０時間インキュベートすることにより行った。その後、膜をＴＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有）で洗浄し、Dako Cytomation社製DAKO Antibody Diluent with Background Reducing Components で１０００倍希釈したＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Amersham社製）を用いて二次抗体反応を行った。次に、膜をＴＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有）で洗浄し、Amersham社製ＥＣＬ−ｐｌｕｓキットを用いて膜を発色させ、Amersham社のＨｙｐｅｒｆｉｌｍＥＣＬに露光して解析した。
この結果を図４に示す。図４に示される結果から、ｓｉＲＮＡ１分子を投与した場合には、間質性肺炎モデルマウスの肺におけるＤＤＲ１量が低減したことが示された。
【００７５】
（２）間質性肺炎モデルマウスにおけるＤＤＲ１量の定量的変化
６０匹のＣ５７ＢＬ／６雌マウスを、ブレオマイシン単独投与群、実施例１で作製したｓｉＲＮＡ１分子投与群、ブレオマイシン及びルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ投与群の３つに分け、それぞれを上記（１）の実験と同様に処理し、ブレオマイシン投与３日目、７日目、１４日目、２１日目に各群５匹ずつ肺を摘出した。
【００７６】
摘出した肺を（１）に示した方法で溶解し、ＤＤＲ１及びアクチンに対するウエスタンブロット解析を（１）に示した方法で行い、得られたバンドの濃度をNIH image version 1.62（NIH；http://rsb.inf.nih.gov/nih-image/より入手可）を用いて解析数値化し、マイクロソフト社エクセルソフトウエアを用いてグラフ化した。
この結果を図５に示す。図５に示される結果から、ｓｉＲＮＡ１分子を投与した場合には、間質性肺炎モデルマウスの肺におけるＤＤＲ１量が有意に低減したことが示された。
【００７７】
（３）間質性肺炎モデルマウスの各臓器におけるＤＤＲ１量の変化
２匹のＣ５７ＢＬ／６雌マウスにケタラール・フェノバルビタールによる麻酔で眠らせた後、１．８ｍｇ／ｍｌのブレオマイシン５０μｌを１回２７ゲージの注射針を用いて経気管支投与し、間質性肺炎モデルマウスとした。１匹に対してはブレオマイシン投与３日目に、実施例１で作製したｓｉＲＮＡ１分子を１．５ｍｇ／ｍｌの濃度にＰＢＳに溶解した５０μｌを、ケタラール・フェノバルビタールによる麻酔で眠らせた後経鼻投与した。この投与をこの１匹に対しては３日ごとに４回行った。
【００７８】
それぞれをブレオマイシン投与１４日後にケタラール・フェノバルビタールによる麻酔で眠らせ、腋下動脈を切断し脱血してマウスを死亡させた後、肺、腎臓及び肝臓を摘出した。それぞれ摘出した臓器１ｍｇを５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及び１０％グリセロールを含んだ溶解液に入れ、超音波ホモゲナイザーで溶解した。その溶解液それぞれ１０μｌをサンプルバッファー（２０％グリセロール、６％ＳＤＳ、１０％ ２−メルカプトエタノール）１０μｌと混合し、１０分間９５℃でインキュベーションし、冷却後２０μｌを１０％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅポリアクリルアミドゲル（Invitrogen社製）にアプライして電気泳動を１５ｍＡで９０分間行った。その後、電気泳動を行ったゲルからHybond-ECL Membrane（Amersham社製）へタンパク質をトランスファーした。トランスファーは膜の面積×１ｍＡで６０分間行った。そうして得られた膜を、ＴＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有）で洗浄した。その後、膜をブロッキングバッファー（ブロックエース  大日本住友製薬株式会社製）中に浸して３７℃で１時間インキュベートし、その後、膜をＴＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有）で洗浄した。続いて、一次抗体反応を、ウサギポリクローナル抗ＤＤＲ１抗体（Santa-Cruz社製）をDako Cytomation社製DAKO Antibody Diluent with Background Reducing Components （Catalog number:S3022）で１００倍に希釈して用いて、４℃で１０時間インキュベートすることにより行った。その後、膜をＴＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有）で洗浄し、Dako Cytomation社製DAKO Antibody Diluent with Background Reducing Components で１０００倍希釈したＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Amersham社製）を用いて二次抗体反応を行った。次に、膜をＴＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有）で洗浄し、Amersham社製ＥＣＬ−ｐｌｕｓキットを用いて膜を発色させ、Amersham社のＨｙｐｅｒｆｉｌｍＥＣＬに露光して解析した。
この結果を図６に示す。この結果から、作製したｓｉＲＮＡ１分子は、間質性肺炎モデルマウスにおけるＤＤＲ１タンパク質の発現を肺特異的に抑制したことがわかった。
【００７９】
（４）ｓｉＲＮＡ分子による間質性肺炎モデルマウスの肺炎に対する影響
１２匹のＣ５７ＢＬ／６雌マウスを、ブレオマイシン単独投与群、ブレオマイシン及びｓｉＲＮＡ１分子投与群、ブレオマイシン及びルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ投与群の３つに分け、それぞれを上記の（１）の実験と同様に処理し、ブレオマイシン投与３日目、７日目、１４日目及び２１日目に各群１匹ずつ肺を摘出した。
【００８０】
摘出した肺をホルマリンにて固定後、パラフィン包埋処理を行い、４μｍにプレパラートに薄切した後、ヘマトキシリンエオジン染色を行い、光学顕微鏡にて観察した。
その結果を図７に示す。この結果から、作製したｓｉＲＮＡ１分子は、間質性肺炎モデルマウスにおける肺炎に対して治療的効果を有することが示された。
【００８１】
（５）ｓｉＲＮＡ分子による間質性肺炎モデルマウスの体重に対する影響
８４匹のＣ５７ＢＬ／６雌マウスを、ブレオマイシン単独投与群、ブレオマイシン及びｓｉＲＮＡ１分子投与群、ブレオマイシン及びルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ投与群の３つに分け、それぞれを上記の（１）の実験と同様に処理し、ブレオマイシン投与０日目、７日目、１４日目及び２１日目に各群７匹ずつ体重を測定した。
この結果を図８に示す。図８において、菱形（◆）はブレオマイシン単独投与群、四角（■）はブレオマイシン＋ｓｉＲＮＡ１分子投与群、三角（▲）はブレオマイシン＋ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃ）投与群を表す。ブレオマイシン単独投与群及びブレオマイシン＋ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃ投与群は、体重は増えないかやや低下気味であるのに対して、ブレオマイシン＋ｓｉＲＮＡ１投与群では体重が増えた（図８）。マウスには餌及び水分を与えているため日時の経過と共に体重が増加するのが正常である。従って、ＤＤＲ１に対するｓｉＲＮＡ分子の投与には治療効果があるのに対して、ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ分子の投与には治療効果がないことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明により、間質性肺疾患治療剤が提供される。かかる間質性肺疾患治療剤は、被験体における間質性肺疾患を効果的に治療することができる。また本発明により、ディスコイジンドメインレセプター１（ＤＤＲ１）をコードする遺伝子に対する二本鎖ＲＮＡ分子が提供される。かかる二本鎖ＲＮＡ分子は、ＤＤＲ１の発現を特異的かつ効率的に抑制するものであるため、例えば間質性肺疾患の治療に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】作製したｓｉＲＮＡ分子がマウス肺胞マクロファージにおけるＤＤＲ１に及ぼす抑制効果を示す実験結果である。
【図２】作製したｓｉＲＮＡ分子がマウス肺胞マクロファージにおけるＤＤＲ１に及ぼす抑制効果を定量的に示す実験結果である。
【図３】作製したｓｉＲＮＡ分子がヒト肺胞マクロファージにおけるＤＤＲ１に及ぼす抑制効果を定量的に示す実験結果である。
【図４】ブレオマイシン投与して作製した間質性肺炎モデルマウスにｓｉＲＮＡを経鼻投与した後のマウス肺におけるＤＤＲ１量の経時変化を示す。
【図５】ブレオマイシン投与して作製した間質性肺炎モデルマウスにｓｉＲＮＡを経鼻投与した後のマウス肺におけるＤＤＲ１量の経時変化を示すグラフである。
【図６】ブレオマイシン投与して作製した間質性肺炎モデルマウスにｓｉＲＮＡを経鼻投与した後のマウス各臓器におけるＤＤＲ１量を示す。
【図７】ブレオマイシン投与して作製した間質性肺炎モデルマウスにｓｉＲＮＡを経鼻投与した後のマウス肺の組織学的変化を示す写真である。
【図８】ブレオマイシン投与して作製した間質性肺炎モデルマウスにｓｉＲＮＡを経鼻投与した後のマウス体重の経時変化を示すグラフである。
【配列表フリーテキスト】
【００８４】
配列番号１〜８：合成ＲＮＡ
【図１】
2007319009.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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