(57)【要約】 【課題】汎用性のある方法で担子菌を良好に培養し、一回の培養で得られるマンガンペルオキシダーゼの量を増やすことで、マンガンペルオキシダーゼを効率良く製造する方法を提供する。【解決手段】担子菌を培養至適温度±２℃の範囲内の温度で培養し、次いで当該温度と培養至適温度との差の絶対値より、培養至適温度との差の絶対値が大きくなるようにシフトさせた温度で培養することを特徴とするマンガンペルオキシダーゼの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
担子菌を培養至適温度±２℃の範囲内の温度で培養し、次いで当該温度と培養至適温度との差の絶対値より、培養至適温度との差の絶対値が大きくなるようにシフトさせた温度で培養することを特徴とするマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
【請求項２】
培地に酸素を含む気体を供給しながら、前記温度シフト後の担子菌培養を行う請求項１に記載のマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
【請求項３】
前記酸素を含む気体中の酸素分圧が３０％以上である請求項２に記載のマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
【請求項４】
前記温度シフトを、菌体増殖中期以降に行う請求項１〜３のいずれか一項に記載のマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
【請求項５】
ベラトリルアルコールを含む培地で培養を行う請求項１〜４のいずれか一項に記載のマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
【請求項６】
前記培養が撹拌培養である請求項１〜５のいずれか一項に記載のマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
【請求項７】
前記担子菌がファネロケーテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）属に属する菌である請求項１〜６のいずれか一項に記載のマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、担子菌を培養してマンガンペルオキシダーゼを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マンガンペルオキシダーゼは酸化還元酵素の一種であり、ビフェノールの合成に有用であるだけでなく、パルプ漂白やダイオキシンなど有害物質の分解除去への利用が考えられている。マンガンペルオキシダーゼは、白色腐朽菌などの担子菌を培養することによって、その産生物として得ることができるが、その際の担子菌の培養法としてこれまでに報告されているのは、静置培養又は振とう培養だけであり、撹拌培養で担子菌を良好に培養できるとの報告はなされていなかった。但し、ここでいう撹拌培養とは、菌体を担体等に担持せず培地中に浮遊させた状態とし、撹拌翼等により培地を撹拌しながら菌体を培養することを指す。
そして、一回の培養で得られるマンガンペルオキシダーゼの量も少なく、製造効率が低かった。
【０００３】
そこで、マンガンペルオキシダーゼの製造効率を高める方法として、例えば、担子菌の一種であるファネロケーテ  クリソスポリウム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）ＯＧＣ１０１株を静置培養中に、培養温度を上昇させてヒートショックを加える方法が提案されている（非特許文献１参照）。
【非特許文献１】Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．５９， Ｐ．４２９５−４２９９（１９９３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、非特許文献１に記載の方法では、一回の培養で得られるマンガンペルオキシダーゼの量を増やすことはできるが、まだ不充分であり、適用できる担子菌の培養法も静置培養だけなので、製造上の制約条件も多く、マンガンペルオキシダーゼの製造効率は已然不充分であるという問題点があった。
【０００５】
本発明は、上記事情に鑑みて為されたものであり、汎用性のある方法で担子菌を良好に培養し、一回の培養で得られるマンガンペルオキシダーゼの量を増やすことで、マンガンペルオキシダーゼを効率良く製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、担子菌の過剰増殖がマンガンペルオキシダーゼ産生に悪影響を及ぼしていることを見出した。そこで、更に検討した結果、培養の後期に温度をシフトさせることで過剰増殖を抑制することができ、高いマンガンペルオキシダーゼ生産性が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、担子菌を培養至適温度±２℃の範囲内の温度で培養し、次いで当該温度と培養至適温度との差の絶対値より、培養至適温度との差の絶対値が大きくなるようにシフトさせた温度で培養することを特徴とするマンガンペルオキシダーゼの製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、一回の担子菌の培養でより多くのマンガンペルオキシダーゼを得ることができ、培養法として撹拌培養を適用できるので、通常汎用される発酵槽を用いることができ、マンガンペルオキシダーゼを効率良く製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明について詳しく説明する。なお、以下において、単位「Ｍ」は「ｍｏｌ／Ｌ」を、単位「ｍＭ」は「ｍｍｏｌ／Ｌ」を、単位「μＭ」は「μｍｏｌ／Ｌ」をそれぞれ示す。
[使用する微生物]
本発明で使用される担子菌としては、例えば、ファネロケーテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）属、フレビア（Ｐｈｌｅｂｉａ）属、レンティヌラ（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ）属、フェルリナス（Ｐｈｅｌｌｉｎｕｓ）属などに属する白色腐朽菌を挙げることができる。これらの中でも、ファネロケーテ属に属する菌が好ましい。ファネロケーテ属に属する菌の中でも、好ましいものとして、例えば、ファネロケーテ  クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ファネロケーテ  フラヴィド−アルバ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｆｌａｖｉｄｏ−ａｌｂａ）、ファネロケーテ  ソルディダ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｓｏｒｄｉｄａ）、ファネロケーテ  マグノリエ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ）に属する菌等を挙げることができ、より好ましいものとして、ファネロケーテ  クリソスポリウムに属する菌を挙げることができる。具体的には、例えば、ファネロケーテ  クリソスポリウムＢＫＭ−Ｆ−１７６７（ＡＴＣＣ２４７２５）、ファネロケーテ  クリソスポリウムＳＣ２６（ＡＴＣＣ６４３１４）、ファネロケーテ  クリソスポリウムＭＥ４４６（ＡＴＣＣ３４５４１）、ファネロケーテ  クリソスポリウムＨＨＢ−６２５１−ｓｐ（ＡＴＣＣ３４５４０）、ファネロケーテ  クリソスポリウムＯＧＣ１０１（ＡＴＣＣ２０１５４２）、ファネロケーテ  クリソスポリウム  ＩＮＡ−１２（ＣＮＣＭ  Ｉ−３９８）、ファネロケーテ  クリソスポリウムＩ−１５１２  （ＣＮＣＭ  Ｉ−１５１２）を挙げることができ、中でも特に好ましいものとしてファネロケーテ  クリソスポリウムＢＫＭ−Ｆ−１７６７（ＡＴＣＣ２４７２５）が挙げられる。
また、これらを宿主とした遺伝子組換え体であってもよい。
【００１０】
[培地成分]
（マンガン塩）
本発明で用いるマンガン塩としては、硫酸マンガン、塩化マンガン、酢酸マンガン、炭酸マンガン、シュウ酸マンガン、硝酸マンガン、リン酸マンガン及びこれらの水和物などが挙げられる。これらマンガン塩の培地中濃度は、マンガンペルオキシダーゼの高い生産性向上効果が得られることから、好ましくは２５０μＭ以上、より好ましくは２５０〜９００μＭであり、特に好ましくは３００〜７００μＭとなるよう設定する。
【００１１】
（炭素源）
本発明で使用する培地には炭素源が含まれるが、該炭素源としては担子菌の培地に通常用いられる炭素源が利用でき、好ましいものとしてグルコース、グリセロール及びセルロースなどが挙げられ、特に好ましいものとしてグルコースが挙げられる。培地中のグルコース濃度は、菌の増殖やマンガンペルオキシダーゼの生産性に影響することから、好ましくは０．５質量％以上、より好ましくは１〜４質量％、特に好ましくは１．５〜３質量％となるよう設定する。
【００１２】
（その他の培地成分）
また本発明の培地は、前記のマンガン塩や炭素源以外に、窒素源、ビタミン、リン酸、界面活性剤、緩衝液、マンガン以外の各種金属塩等を含んでいてもよい。例えば、窒素源としては、酒石酸アンモニウムを始めとするアンモニウム塩などが挙げられる。ビタミンとしては、例えば、チアミンなどが挙げられる。界面活性剤としては、例えば、ツイーン８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、トリトンＸ−１００（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、ホウ酸緩衝液などが挙げられる。マンガン以外の各種金属塩としては、例えば、硫酸マグネシウム、硫酸コバルト、硫酸亜鉛、硫酸カリウムアルミニウム、硫酸銅、硫酸第一鉄などの硫酸鉄、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、リン酸二水素カリウムなどのリン酸カリウム、モリブデン酸ナトリウムなど、あるいはこれらの水和物などが挙げられる。またｐＨ調整剤として、塩酸、硫酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなど、通常使用される各種酸、アルカリを含んでいてもよい。これらの他、キレート剤としてニトリロ三酢酸などを含んでいてもよい。
なお、培地は調製後にオートクレーブ滅菌することが好ましい。
【００１３】
[培養条件]
本発明における担子菌の培養方法は、固体培養、液体培養のいずれであってもよいが、培養のし易さから液体培養が好ましい。担子菌の培養に適した培養温度は２０〜４５℃である。また、培地のｐＨは３．５〜７．５が好ましく、４．０〜７．０がより好ましい。ｐＨの調整には各種の緩衝液や塩酸又は硫酸など通常用いられる酸、あるいは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はアンモニアなど、通常用いられるアルカリを使用することができる。
【００１４】
[製造方法１]
本発明の製造方法は、担子菌を培養至適温度±２℃の範囲内の温度で培養し、次いで当該温度と培養至適温度との差の絶対値より、培養至適温度との差の絶対値が大きくなるようにシフトさせた温度で培養することを特徴とする。担子菌の培養は前述の条件で行えば良い。ここで、培養至適温度とは、任意の培地で担子菌を培養した時に、担子菌の増殖速度が最大となる温度のことを指す。
【００１５】
温度シフト前の培養は、培地へ空気を供給しながら行うことが好ましく、この場合の空気の供給量は、２００〜２０００ｍＬ／ｍｉｎ／Ｌ培養液であることが好ましい。
温度シフト後の培養は、培地に酸素を含む気体を供給しながら行うことが好ましい。この時供給する気体中の酸素分圧は３０％以上であることが好ましく、８０〜１００％であることがより好ましい。そして、この時の培地への酸素の供給量は、１〜１００ｍＬ／ｍｉｎ／Ｌ培養液であることが好ましい。
【００１６】
温度シフト前の培養温度は、３７℃程度であることが好ましい。また、温度シフト後の培養温度は、温度シフト前の培養温度より低い温度が好ましい。シフト後の温度が４２℃程度であると、マンガンペルオキシダーゼの産生量は増えるが、急激に失活することがある。
【００１７】
培養温度のシフトは、一度だけでなく、多段階で行っても良い。ただし、最初の温度シフトを昇温とした場合には、その後の温度シフトも昇温とすることが好ましく、最初の温度シフトを冷却とした場合には、その後の温度シフトも冷却とすることが好ましい。培養温度のシフトを多段階で行う場合、二回目以降の温度のシフト幅は特に限定されない。
また、温度シフトに要する時間は特に限定されないが、できるだけ速やかにシフトすることが好ましい。
【００１８】
担子菌の培養は、ベラトリルアルコールを含む培地で行うことが好ましい。この場合、ベラトリルアルコールは温度シフト前の段階から培地に添加しても良いし、温度シフト時に添加してもよい。培地中のベラトリルアルコールの濃度は、０．５〜１０ｍＭであることが好ましい。
【００１９】
最初の温度シフトを行うまでの担子菌培養時間は、種菌の植菌量にも影響されるが、最初の温度シフトのタイミングが菌体増殖中期以降となるようにすることが好ましく、この場合、前述の培養条件下であれば概ね２〜４日である。そして、最初の温度シフト後の培養時間は、マンガンペルオキシダーゼの産生量が最大となるように設定すれば良いが、前述の培養条件下であれば、２〜４日であることが好ましい。それぞれこのように時間設定することで、マンガンペルオキシダーゼを最も効率良く製造することができる。なお、ここで菌体増殖中期とは、菌体の増殖が最も活発な対数増殖期を過ぎた直後の時期を指す。
【００２０】
担子菌の培養は、静置培養あるいは振とう培養でも行うことができるが、撹拌培養であることが好ましい。この場合の撹拌速度は、培地量等により適宜選択すれば良い。本発明の構成により、担子菌を用いたマンガンペルオキシダーゼ産生培養を初めて撹拌培養で良好に行うことができる。
なお、本発明でいう撹拌培養とは、菌体を担体等に担持せず培地中に浮遊させた状態とし、撹拌翼等により培地を撹拌しながら菌体を培養することを指す。
【００２１】
[製造方法２]
また、マンガンペルオキシダーゼは、少なくとも、担子菌を増殖させる工程と、次いで培地に酸素を含む気体を供給しながら該増殖工程の温度から±１℃以上シフトさせた温度で担子菌にマンガンペルオキシダーゼを産生させる工程とを有する製造方法でも高い生産性で製造できる。
ここで、担子菌を増殖させる工程では、前述の温度シフト前の条件で担子菌培養を行えば良く、担子菌にマンガンペルオキシダーゼを産生させる工程では、少なくとも、前記増殖工程から±１℃以上培養温度をシフトさせて培地に酸素を含む気体を供給しながら培養を継続すれば良い。
【００２２】
担子菌増殖工程は、培地へ空気を供給しながら行うことが好ましく、この場合の空気の供給量は、２００〜２０００ｍＬ／ｍｉｎ／Ｌ培養液であることが好ましい。
また、マンガンペルオキシダーゼを産生させる工程において、培地へ供給する、酸素を含む気体中の酸素分圧は、３０％以上であることが好ましく、８０〜１００％であることがより好ましい。そして、この時の培地への酸素の供給量は、１〜１００ｍＬ／ｍｉｎ／Ｌ培養液であることが好ましい。
担子菌増殖工程の温度は、３７℃程度であることが好ましい。また、マンガンペルオキシダーゼ産生工程の温度は、担子菌増殖工程の温度±１℃であるが、担子菌増殖工程の温度より１℃以上低い温度が好ましい。シフト後の温度が４２℃程度であると、マンガンペルオキシダーゼの産生量は増えるが、急激に失活することがある。
上記の点以外は、担子菌増殖工程は、前記製造方法１の温度シフト前の培養条件を適用し、マンガンペルオキシダーゼ産生工程は、前記製造方法１の温度シフト後の培養条件を適用すれば良い。
【００２３】
本発明の製造方法１または２によれば、マンガンペルオキシダーゼの生産性（単位時間当たりの培地単位体積あたりの産生量、ｍｇ／Ｌ培養液）は従来よりも高く、例えば、非特許文献１に記載の方法に対して約６倍以上であり、培地１Ｌあたり４０ｍｇ程度のマンガンペルオキシダーゼが得られる。さらに、通常汎用される発酵槽を用いることもでき、製造上の制約条件も低いので、マンガンペルオキシダーゼを効率良く低コストで製造することができる。なお、マンガンペルオキシダーゼの生産性は、例えば、後述の実施例に記載のように、マンガンペルオキシダーゼの活性を測定することで算出することができる。
【実施例】
【００２４】
以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下の実施例に何ら限定されるものではない。
[実施例]温度シフト培養
（培地）
表１に示した培地各２．５Ｌを５試験区用意した。なお、表１中の６×トレースエレメンツの組成を表２に示した。そして、ｐH電極を備えた５Ｌ容量発酵槽Ｂｉｏｎｅｅｒ−Ｎ型（株式会社丸菱バイオエンジ製）５台に前記培地をそれぞれ仕込み、１２１℃、２０分間のオートクレーブ処理で滅菌した。
【００２５】
【表１】
2007319114.tif 000002
【００２６】
【表２】
2007319114.tif 000003
【００２７】
（培養）
前記の各発酵槽にファネロケーテ  クリソスポリウム  ＢＫＭ−Ｆ−１７６７ （ＡＴＣＣ２４７２５）を植菌し、３７℃、空気供給０．５ｖｖｍ、フルゾーン翼（神鋼パンテック株式会社製）１５０ｒｐｍの条件で撹拌培養を開始した。培養中、培養液のｐＨは４．５を維持するよう、硫酸及び水酸化ナトリウムを用いて制御した。
３日後、ベラトリルアルコールをそれぞれ１．０５ｍｌ添加し、空気の供給を停止すると共に３０ｍｌ／ｍｉｎで酸素供給を開始した。更にこのとき、培養温度を３７℃からそれぞれ、ａ：２３℃、ｂ：２５℃、ｃ：２８℃、ｄ：３２℃、ｅ：４２℃にシフトさせた。各々の条件で培養を継続し、経時的に培養液を採取した。採取したサンプルを下記酵素活性測定に供し、マンガンペルオキシダーゼ濃度を算出した。
【００２８】
（マンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）の活性測定）
ＭｎＰの活性は、硫酸マンガンを基質とした酸化反応（Ｍｎ３＋−マロン酸錯体形成）の光学的測定により決定した。すなわち、分光光度計用石英セルを反応容器とし、この反応容器中に蒸留水４３５μＬ、５００ｍＭマロン酸二ナトリウム−ＨＣｌ（ｐＨ４．５）５０μＬ、５０ｍＭ硫酸マンガン５μＬ、培養液サンプル５μＬを入れ、これに対し１０ｍＭ過酸化水素５μＬを添加することで酸化反応を開始した。
そして、分光光度計ＵＶ−１６５０ＰＣ（株式会社島津製作所製）を用いて、反応液のＵＶ２７０ｎｍにおける吸収の増加をモニタすることで反応初速度を測定した。濃度既知のＭｎＰ溶液との反応初速度比較により、培養液サンプル中のＭｎＰの濃度（ｍｇ／Ｌ）を算出した。
試験区ａ〜ｅのそれぞれにおけるＭｎＰの最高濃度を表３に示す。ａ〜ｅ全試験区において、後述の比較例試験区ｆよりも高いＭｎＰ濃度、即ち高い生産性が認められた。ただし、試験区ｅでは、ＭｎＰの濃度が最高値に達した後、急激な失活が認められた。
【００２９】
[比較例]定温度培養
培養３日後以降も温度をシフトさせることなく、３７℃で培養を継続したこと以外は、実施例と同様にして培地調製、培養及び酵素活性測定を行った（試験区ｆ）。その結果、表３に示すように、ＭｎＰの濃度は実施例よりも低い値となった。
【００３０】
【表３】
2007319114.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明は、安価なマンガンペルオキシダーゼの供給に有用である。