(57)【要約】【課題】  細胞数の違いによる細胞応答のばらつきをなくし、測定精度を向上させる。【解決手段】  プリズム（２）の反射面（３）に形成された金属薄膜（３ｂ）上に細胞を培養させた測定流路（Ｆ２〜Ｆ６）と、検査対象となる細胞が付着されていない細胞数特定用参照流路（Ｆ０）とを備えたＳＰＲバイオセンサ（１）を用い、刺激物質を含まないランニング溶液を送液したときの各測定流路（Ｆ２〜Ｆ６）の共鳴角と細胞数特定用参照流路（Ｆ０）の共鳴角との差に基づき、各測定流路（Ｆ２〜Ｆ６）に付着している細胞数を算出した後、各測定流路（Ｆ２〜Ｆ６）に刺激物質を含むサンプル溶液を送液する前後における共鳴角変化量を測定し、その変化量と先に求めた細胞数とに基づき、刺激物質に対する細胞単位個数当たりの共鳴角変化量を単位細胞共鳴角として算出するようにした。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の溝状流路が形成されたフローセルの底面をプリズムの反射面に形成された金属薄膜上に当接させ、当該流路中に検査対象となる細胞を培養させて刺激物質を送液することによりその刺激物質に対する前記細胞の応答を表面プラズモン共鳴現象を利用して測定する表面プラズモン共鳴バイオセンサであって、
前記流路が一以上の測定流路と少なくとも一の細胞数特定用参照流路とを備え、
前記金属薄膜上の測定流路となる部分が細胞を付着培養可能な物質でコーティングされ、細胞数特定用参照流路となる部分が前記細胞を付着培養不能な物質でコーティングされたことを特徴とする表面プラズモン共鳴バイオセンサ。
【請求項２】
前記流路として、前記測定流路及び前記細胞数特定用参照流路の他に、少なくとも一のノイズリダクション用参照流路を備え、
前記金属薄膜上のノイズリダクション用参照流路となる部分が細胞を付着培養可能な物質でコーティングされてなる請求項１記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサ。
【請求項３】
プリズムの反射面に形成された金属薄膜上に、検査対象となる細胞を培養させた測定流路と、検査対象となる細胞が付着されていない細胞数特定用参照流路とを備えた表面プラズモン共鳴バイオセンサを用いた細胞応答測定装置であって、
前記各流路に刺激物質を含まないランニング溶液及び刺激物質を含むサンプル溶液を選択的に送液する送液装置と、
各流路にランニング溶液及びサンプル溶液が送液されたときに表面プラズモン共鳴角を測定する共鳴角測定装置と、
ランニング溶液を送液したときの各測定流路の共鳴角と細胞数特定用参照流路の共鳴角との差に基づき、各測定流路に付着している細胞数を算出する細胞数算出手段と、
各測定流路にサンプル溶液を送液する前後における共鳴角変化と先に求めた細胞数とに基づき、刺激物質に対する細胞単位個数当たりの共鳴角変化量を単位細胞共鳴角として算出する細胞応答算出手段とを備えたことを特徴とする細胞応答測定装置。
【請求項４】
前記表面プラズモン共鳴バイオセンサに検査対象となる細胞を培養させたノイズリダクション用参照流路が形成され、
前記細胞数算出手段により算出されたノイズリダクション用参照流路に付着された細胞数と、ノイズリダクション用参照流路にランニング溶液を送液することにより測定される共鳴角変化とに基づき、細胞単位個数当たりの共鳴角変化量をノイズ共鳴角として算出するノイズ算出手段を備え、
前記細胞応答算出手段が、前記ノイズ共鳴角に基づいて、先に求めた単位細胞共鳴角を補正するノイズリダクション手段を備えた請求項３記載の細胞応答測定装置。
【請求項５】
プリズムの反射面に形成された金属薄膜上に、検査対象となる細胞を培養させた測定流路と、検査対象となる細胞が付着されていない細胞数特定用参照流路とを備えた表面プラズモン共鳴バイオセンサを用いた細胞応答測定方法であって、
前記各流路に刺激物質を含まないランニング溶液を送液して表面プラズモン共鳴角を測定し、
各測定流路の表面プラズモン共鳴角と細胞数特定用参照流路の共鳴角との差に基づき、各測定流路に付着している細胞数を算出した後、
各測定流路に刺激物質を含むサンプル溶液を送液する前後における共鳴角変化量を測定し、
その変化量と先に求めた細胞数とに基づき、刺激物質に対する細胞単位個数当たりの共鳴角変化量を単位細胞共鳴角として算出することを特徴とする細胞応答測定方法。
【請求項６】
前記表面プラズモン共鳴バイオセンサに、前記測定流路及び細胞数特定用参照流路と共に検査対象となる細胞を培養させたノイズリダクション用参照流路を形成し、
ノイズリダクション用参照流路の表面プラズモン共鳴角と細胞数特定用参照流路の共鳴角との差に基づき、ノイズリダクション用参照流路に付着している細胞数を算出し、
ノイズリダクション用参照流路にランニング溶液を送液することにより測定される共鳴角の変化量を測定し、
その変化量と先に算出された細胞数に基づき、細胞単位個数当たりの共鳴角変化量をノイズ共鳴角として算出し、
前記ノイズ共鳴角に基づき、前記単位細胞共鳴角を補正することを特徴とする請求項５記載の細胞応答測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン共鳴（以下、本明細書において「ＳＰＲ」と略す。）を利用して、細胞活性を測定するためのＳＰＲバイオセンサと、それを用いた測定装置及び測定方法に関するものであり、より詳しくは、ＳＰＲバイオセンサを用いて、刺激に対する細胞応答を正確に測定する方法及び装置に関し、特に、薬剤や毒性物質の評価を行なうのに好適なものである。
【背景技術】
【０００２】
以下に，バックグラウンドとなるＳＰＲバイオセンサおよび細胞応答測定について概説する。
【０００３】
［ＳＰＲ現象］
ＳＰＲ現象について以下に説明する。金属薄膜表面に誘電体が接触すると、金属薄膜表面にプラズモン波が発生し、誘電体の誘電率変化に対応して、プラズモン波の波数が変化する。
一方、金属薄膜の裏面（誘電体とは反対側の面）に光を照射すると、全反射すると同時に金属薄膜表面にエバネッセント波を発生する。
エバネッセント波は光の入射角度によってその波数が変化するが、プラズモン波の波数、波動ベクトルが一致すると、エバネッセント波がプラズモン励起に使われるため、反射光の強度が低下する（このとき波動ベクトルを一致させるために、入射する光はＰ偏光であることが必要）。
この現象を表面プラズモン共鳴と呼ぶ。
表面プラズモン共鳴の発生する光の入射角度（共鳴角度）は、誘電体の誘電率の影響を受けるため、金属薄膜表面での誘電率変化（屈折率変化）を共鳴角度の変化として測定することができる。
【０００４】
［ＳＰＲバイオセンサの原理］
ＳＰＲ現象を、たんぱく質などの生体分子の定量測定に応用したものが、ＳＰＲバイオセンサである。
例えば、金属薄膜表面にリガンドとなる抗原を固定化しておき、アナライトである抗体を添加すると、抗原−抗体反応により抗体が金属薄膜表面の抗原と結合する。
抗体が結合すると金属薄膜表面の誘電率（屈折率）が変化するので、結合した抗体の量を共鳴角度の変化から定量することができ、１ｍｍ２あたりの結合量が１ｐｇのとき、０.１ｍｄｅｇの共鳴角度変化に相当するとされている。
ＳＰＲバイオセンサの特長としては、蛍光色素などの標識を必要とせずリアルタイムで行なうことができるため、生体分子の濃度測定のほか、相互作用解析（速度論解析）に適用されることが多く、解離定数、結合定数、解離速度定数、結合速度定数を求めることができる。
【０００５】
［光学系の構成］
共鳴角度を測定するために、初期にはＬＤ光源を動かして入射角度を変化させ、受光部（ＰＤ）もそれに対応して角度を変化させて反射光強度を測定していた。反射光強度が低い時の入射角度が共鳴角度に相当する。
しかし、ＳＰＲバイオセンサとしてリアルタイム測定を行なう場合、この方式では反応に追従できない。
そこで、あらかじめ入射角度を変化させて反射光強度を測定して共鳴カーブ（入射角度と反射光強度の関係）を求めておき、測定時は入射角度を共鳴角度付近で固定し、反射光強度の変化から共鳴角度を計算で求める方式があり製品化されている。
他には、例えば振動ミラーを用いて高速に入射角度をスキャンすることも可能であり、このような光源可動方式も製品化されている。
一方、特許文献１に示されるように、入射角度を変化させる代わりに、くさび形の入射光を使用する方式（固定光学系）のＳＰＲ角度測定装置が提案されており、この原理に基づき製品化されている。光源や受光素子を動かす必要がないので装置全体を小型化できるメリットがある。受光素子としては一定の範囲の共鳴角度を測定する必要があるため、ＰＤアレイやＣＣＤカメラが用いられる。
【特許文献１】特許第２７５８９０４号
【０００６】
［測定チップ］                                          
ＳＰＲバイオセンサの測定チップとしては、表面上に金属薄膜が形成されたプリズム（材質はガラス）が使用されてきた。
金属薄膜としては、一般的に金が用いられるが、金とガラスの密着性を改善するためにクロム薄膜が形成されており、金−クロム−ガラスの構成となっている。
薄膜はスパッタ法あるいは蒸着法で形成され、金の膜厚は約５０ｎｍ、クロムの膜厚は約１ｎｍである。一方、ガラスなどの基板表面に金薄膜が形成されたもの（金薄膜チップ）を、マッチングオイルなどを介してプリズムに密着させて使用する方法もあり、金薄膜チップのみを交換して測定を行なうことができる。金薄膜が形成されたプリズムに比べて金薄膜チップは安価であるが、マッチングオイル等を使用するため取り扱いが煩わしいという欠点がある。
また、金薄膜表面に抗原などのリガンドを固定化するために、自己組織化膜などが用いられる。金薄膜表面に自己組織化膜を形成し、次に活性化した後、リガンドを固定化して用いる。
【０００７】
［流路系の構成］
ＳＰＲバイオセンサの場合、測定サンプルは液体であり、サンプルをセンシング部分である金薄膜チップ表面に導入するためにフローセル、バルブ、ポンプ及び配管などから構成された流路系を使用する。
フローセルは例えば、特許文献２に示されるように、シリコーンゴムのような基体にスリットが形成され、金薄膜チップをフローセルに圧接させることにより、スリットと金薄膜表面に囲まれた流路を形成させる。
シリコーンゴムと金薄膜は圧接しているだけなので、シリコーンゴムから測定チップを取り外すだけで容易に交換することができる。
測定チップと密接した面とは反対側のフローセルの開口部に配管を接続し、ぺリスタリックポンプ、シリンジポンプあるいはプランジャーポンプなどのポンプを使用して、サンプルを送液する。さらにインジェクションバルブを配管で接続することにより、所定の量のサンプルを容易にフローセルに導入することができる。
【特許文献２】特許第３２９４６０５号公報
【０００８】
［細胞応答測定］
細胞表面に存在する受容体（レセプター）と薬剤（リガンド）の結合を調べることは、薬剤の開発にとって重要である。
例えば、Ｇ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を発現させたＣＨＯ細胞を金薄膜チップ上に接着し、いろいろな化合物に対する応答をＳＰＲバイオセンサにより測定して、最適な化合物をスクリーニングすることが可能となる。
あるいは肥満細胞を金薄膜チップ上に接着し、ＩｇＥで感作させた後、抗原を加えると、ＳＰＲバイオセンサにより肥満細胞の抗原による応答を測定することができる。
ここでさらにブロッキング化合物を加えて細胞応答を測定することにより、アレルギー反応を抑える最適な薬剤をスクリーニングすることができる。
【０００９】
特許文献３には、外部刺激に対する細胞の生理活性をＳＰＲバイオセンサで測定する方法が示されている。
以下に測定方法を簡単に説明すると、まず、細胞培養用のシャーレに金薄膜チップを入れ、培地と細胞懸濁液を加えて、３７℃で１日間培養する。
金薄膜チップ上には細胞が接着しており、これをＳＰＲバイオセンサ装置に設置する。
フローセルにはｐＨバッファもしくは培地を送液し、フローセル温度を３７℃で一定に制御することにより、フローセル内で細胞を生きたままの状態で保つ。
刺激物質をフローセルに送液すると、細胞表面の受容体に刺激物質が結合して、細胞内シグナル伝達の結果、例えば細胞の形態が変化する（２次応答）。
細胞の形態変化により、金薄膜表面の誘電率が変化するため、ＳＰＲバイオセンサによりその変化を測定することができる。すなわちＳＰＲバイオセンサにより細胞応答を測定することができる。
【特許文献３】特開２００２−８５０８９号公報
【００１０】
ここでは、測定部とコントロール部の２チャンネルの流路を有するＳＰＲバイオセンサを使用して応答を測定している。
このＳＰＲバイオセンサ４１は、図９に示すように、細胞Ｃが培養された金薄膜チップ４２をプリズム４３の反射面４４にセットし、その金薄膜チップ４２の上に二本の流路Ｆ１１、Ｆ１２を有するフローセル４５を装着して使用する。
光源４６からプリズム４３に対して光を照射し、その光の入射角度に対する反射光強度を受光素子４７で測定し、反射光強度から計算により共鳴角度を算出し、ＳＰＲ応答を測定している。
【００１１】
このとき、細胞Ｃは二本の流路Ｆ１１、Ｆ１２内に培養されているが、一方のチャンネル（センシングチャンネル）のみに刺激物質を送液し、他方のチャンネル（リファレンスチャンネル）には刺激物質を送液しない。
センシングチャンネル及びリファレンスチャンネルの応答を測定し、その差分応答を利用することにより、バックグラウンドノイズやドリフトなどの影響を取り除くことができる。
これによれば、特許文献３に示された生細胞の生理活性をリアルタイムで測定し刺激物質（生理活性物質）をスクリーニングするのに適している。
【００１２】
また、特許文献４にはイメージングＳＰＲによって測定された、プレート上に固定された細胞に起因する反射光強度から、細胞に関するパラメータ（細胞数、細胞の接着面積、細胞の大きさ）を算出する方法が示されている。
【特許文献４】特開２００４−２７１３３７号公報
【００１３】
ここでは、ＳＰＲバイオセンサとして、図１０（ａ）に示すように、プレート５２の表面に形成された金薄膜５３上に抗体などの生体分子が５×５箇所スポッティングされ、これらの生体分子に測定対象となる細胞Ｃを特異的に接着した細胞マイクロアレイ５１が提案されている。
この細胞マイクロアレイ５１をイメージングＳＰＲで測定するためには、図１０（ｂ）に示すように、プリズム５４の反射面５５上に細胞マイクロアレイ５１を設置し、面光源５６による均一平行光を所定の角度でプリズム５４に照射し、その入射角度に対する反射光をＣＣＤカメラ５７などで撮像する。
この画像は細胞マイクロアレイ５１に対応しており、細胞Ｃが接着した各ポイントの反射光強度を測定し、共鳴角度を計算してＳＰＲ応答を決定する。このＳＰＲ応答は、細胞数、細胞の接着面積及び細胞の大きさと相関関係があり、これをもとに計算することができる。
この方法は、多くの細胞の中から生体分子と特異的に結合する細胞をスクリーニングする場合に最適である。
【００１４】
ところで、特許文献３では、ＳＰＲバイオセンサを使用してリアルタイムに細胞応答を測定する方法が示されており、センシングチャンネルとリファレンスチャンネルの応答の差を利用してバックグラウンドの影響を排除している。
しかし、測定された応答の大きさは金薄膜のセンシングポイント上に培養された細胞数に比例するため、測定ごとに細胞数が異なる場合、応答を単純に比較できないという問題がある。
また、細胞数を一定にして金薄膜上で培養できたとしても、金薄膜チップをＳＰＲバイオセンサ装置に設置したあとに細胞が活性を失って金薄膜チップ表面より脱落する可能性があり、細胞数を一定に保つことが難しい。 
【００１５】
特許文献４には、イメージングＳＰＲの原理に基づき、プレート上に固定された細胞に起因する反射光強度から、細胞数を算出する方法及び装置が示されている。
しかし、この反射光強度は細胞のみに起因するわけではなく、ｐＨバッファや培地など細胞周囲の溶液成分の影響も受けるため、測定により算出した細胞数が誤差を含みやすいという問題があった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
そこで本発明は、細胞数の違いによる細胞応答のばらつきをなくし、測定精度を向上させることを技術的解決課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明に係るＳＰＲバイオセンサは、複数の溝状流路が形成されたフローセルの底面をプリズムの反射面に形成された金属薄膜上に当接させ、当該流路中に検査対象となる細胞を培養させて刺激物質を送液することによりその刺激物質に対する前記細胞の応答を表面プラズモン共鳴現象を利用して測定する表面プラズモン共鳴バイオセンサであって、前記流路が一以上の測定流路と少なくとも一の細胞数特定用参照流路とを備え、前記金属薄膜上の測定流路となる部分が細胞を付着培養可能な物質でコーティングされ、細胞数特定用参照流路となる部分が前記細胞を付着培養不能な物質で形成されたことを特徴としている。
【００１８】
本発明に係る細胞応答測定装置は、プリズムの反射面に形成された金属薄膜上に、検査対象となる細胞を培養させた測定流路と、検査対象となる細胞が付着されていない細胞数特定用参照流路とを備えた表面プラズモン共鳴バイオセンサを用いた細胞応答測定装置であって、前記各流路に刺激物質を含まないランニング溶液及び刺激物質を含むサンプル溶液を選択的に送液する送液装置と、各流路にランニング溶液及びサンプル溶液が送液されたときに表面プラズモン共鳴角を測定する光学系と、ランニング溶液を送液したときの各測定流路の共鳴角と細胞数特定用参照流路の共鳴角との差に基づき、各測定流路に付着している細胞数を算出する細胞数算出手段と、各測定流路にサンプル溶液を送液する前後における共鳴角変化と先に求めた細胞数とに基づき、刺激物質に対する細胞単位個数当たりの共鳴角変化量を単位細胞共鳴角として算出する細胞応答算出手段とを備えたことを特徴としている。
【００１９】
本発明に係る細胞応答測定方法は、プリズムの反射面に形成された金属薄膜上に、検査対象となる細胞を培養させた測定流路と、検査対象となる細胞が付着されていない細胞数特定用参照流路とを備えた表面プラズモン共鳴バイオセンサを用いた細胞応答測定方法であって、前記各流路に刺激物質を含まないランニング溶液を送液して表面プラズモン共鳴角を測定し、各測定流路の表面プラズモン共鳴角と細胞数特定用参照流路の共鳴角との差に基づき、各測定流路に付着している細胞数を算出した後、各測定流路に刺激物質を含むサンプル溶液を送液する前後における共鳴角変化量を測定し、その変化量と先に求めた細胞数とに基づき、刺激物質に対する細胞単位個数当たりの共鳴角変化量を単位細胞共鳴角として算出することを特徴としている。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のＳＰＲバイオセンサによれば、プリズムの反射面に蒸着された金属薄膜上に測定流路と細胞数特定用参照流路が形成され、金属薄膜上の測定流路となる部分が細胞を付着培養可能な物質でコーティングされ、細胞数特定用参照流路となる部分が前記細胞を付着培養不能な物質でコーティングされている。
したがって、このプリズムの金属薄膜上で対象となる細胞を培養すれば、測定流路部分のみに細胞が付着され、細胞数特定用参照流路には細胞が付着していないＳＰＲバイオセンサが得られる。
【００２１】
そして、測定流路と細胞数特定用参照流路に刺激物質を含まないランニング溶液を送液して表面プラズモン共鳴角を測定すると、測定流路と細胞数特定用参照流路とで異なる共鳴角が測定される。
この共鳴角の差は細胞数に起因すると考えられ、細胞一個当り共鳴角の単位変化量は約０.４ｍｄｅｇといわれているので、共鳴角の差を単位変化量で除せば細胞数が算出される。
【００２２】
次いで、刺激物質を含んだサンプル溶液を送液する前後における各測定流路の共鳴角変化量を測定し、その変化量と先に求めた細胞数とに基づき、刺激物質に対する細胞単位個数（例えば一個）当たりの共鳴角変化量を単位細胞共鳴角として算出すれば、一定の細胞数が付着された場合の刺激物質に対する共鳴角の変化に換算できるので、測定流路に付着した細胞の数に係わらず、細胞の変化の度合いを正確に知ることができる。
なお、刺激物質は、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、ヌクレオチド、サッカライド、脂質、ホルモン、リガンドその他、細胞に生理的変化を与える物質である。
【００２３】
さらに、ドリフトやその他の原因のノイズを除去する場合には、ＳＰＲバイオセンサに、前記測定流路及び細胞数特定用参照流路と共に検査対象となる細胞を培養させたノイズリダクション用参照流路を形成しておき、ノイズリダクション用参照流路の表面プラズモン共鳴角と細胞数特定用参照流路の共鳴角との差に基づき、ノイズリダクション用参照流路に付着している細胞数を算出する。
その後、ノイズリダクション用参照流路に刺激物質を含まないランニング溶液を送液することにより共鳴角の変化量を測定すると、その変化量はノイズに起因するものと考えられる。
そして、測定された変化量と先に算出された細胞数に基づき、細胞単位個数当たりの共鳴角変化量をノイズ共鳴角として算出し、このノイズ共鳴角に基づき、単位細胞共鳴角を補正すれば、測定流路に付着した細胞の数及び測定装置の温度変化などに起因するドリフトやノイズを除去して、刺激物質に対する細胞の変化の度合い表す単位細胞共鳴角を正確に知ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本例では、細胞数の違いによる細胞応答のばらつきをなくし、測定精度を向上させるという課題を達成するために、プリズムの反射面に形成された金属薄膜上に、検査対象となる細胞を培養させた測定流路と、検査対象となる細胞が付着されていない細胞数特定用参照流路とを備えた表面プラズモン共鳴バイオセンサを用い、前記各流路に刺激物質を含まないランニング溶液を送液して表面プラズモン共鳴角を測定し、各測定流路の表面プラズモン共鳴角と細胞数特定用参照流路の共鳴角との差に基づき、各測定流路に付着している細胞数を算出した後、各測定流路に刺激物質を含むサンプル溶液を送液する前後における共鳴角変化量を測定し、その変化量と先に求めた細胞数とに基づき、刺激物質に対する細胞単位個数当たりの共鳴角変化量を単位細胞共鳴角として算出するようにした。
【００２５】
図１は本発明に係るＳＰＲバイオセンサの一例を示す説明図、図２はＳＰＲバイオセンサのパターニング手順を示す説明図、図３は本発明に係るＳＰＲ測定装置を示す説明図、図４はその流体回路の概略説明図、図５は反射光と受光素子の関係を示す説明図、図６は本発明に係るＳＰＲ測定方法を示す説明図、図７は共鳴角の測定結果を示すグラフ、図８は刺激物質に対する単位細胞共鳴角を示すグラフである。
【実施例１】
【００２６】
図１に示すＳＰＲバイオセンサ１は、ガラス製の半円柱形プリズム２と、その直径を通る平面部分に形成されたセンサ面３に当接されて、そのセンサ面３上に流路を形成するフローセル４からなる。
センサ面３には、ガラス面の上に膜厚約１ｎｍのクロム３ａが蒸着され、その上に膜厚約５０ｎｍの金薄膜３ｂが形成されている。
本例で用いたプリズム２の大きさは約２０×２０×９ｍｍである。
ＳＰＲバイオセンサ１として、このようなプリズム２と金薄膜３ｂが一体化したものの他に、ガラス基板表面に金薄膜が形成されたもの（金薄膜チップ）を、マッチングオイルを介してプリズムに密着させて使用することも可能である。この場合、金薄膜チップの大きさは２０×１３×０.７ｍｍである。
【００２７】
また、フローセル４はフッ素ゴムで形成され、センサ面３に当接される底面４Ｂ側に０.４×０.８×１.５ｍｍ程度の複数の溝状流路Ｆ０〜Ｆｎが形成されており、上面４Ｔ側に各流路の一端側に連通される流入口５in及び流出口５outが形成されている。
溝状流路Ｆ０〜Ｆｎとして、一以上の測定流路Ｆ２〜Ｆｎと、少なくとも一の細胞数特定用参照流路Ｆ０と、少なくとも一のノイズリダクション用参照流路Ｆ１が形成されており、センサ面３の金薄膜３ｂ上の測定流路Ｆ２〜Ｆｎとなる部分及びノイズリダクション用参照流路Ｆ１となる部分は測定対象となる細胞が付着培養可能な物質でコーティングされ、細胞数特定用参照流路Ｆ０となる部分は測定対象となる細胞が付着培養不能な物質でコーティングされている。
【００２８】
図２に細胞のパターニングのフローチャートを示す。
工程Ｐ１で金薄膜３ｂ表面に自己組織化膜６ａを形成した。
本例では、センサ面３の金薄膜３ｂ表面に形成する自己組織化膜６ａとして４，４−ジチオジブチリックアシッド（ＤＤＡ）を使用した。
センサ面３をＵＶオゾンクリーナー等で洗浄した後、ＤＤＡエタノール溶液（１０μＭ）に３０分間、室温にて浸漬し、金薄膜表面にＤＤＡ膜を形成した。
【００２９】
次いで、工程Ｐ２で自己組織化膜６ａを活性化させる。
本例では、カルボジイミドヒドロクロライド２５ｍｇおよびＮ−ヒドロキシコハク酸イミド１５ｍｇを１−４，ジオキサン９０％溶液１０ｍＬに溶解したものに、センサ面３を室温で３０分間浸漬することによりＤＤＡのカルボキシル基を活性化した。
【００３０】
工程Ｐ３でプリズム２をフローセル４に装着し、工程Ｐ４で細胞数特定用参照流路Ｆ０以外の流路Ｆ１〜Ｆｎに、細胞接着性付与物質６ｂであるフィブロネクチンをフォスフェートバッファセリン（ｐＨ７.２）に溶解した溶液（５０μｇ/ｍＬ）を導入した。
フィブロネクチンのアミノ基が、ＤＤＡのカルボキシル基と結合してフィブロネクチンが固定化される。
【００３１】
工程Ｐ５でプリズム２を室温で１時間放置後、純水で洗浄し、フローセル４をプリズム２から取り外した。
工程Ｐ６では、細胞接着性のない物質溶液の中にセンサ面３を浸漬し、金薄膜３ｂ表面の細胞接着性付与物質６ｂが固定化されていない部分に細胞接着性阻害物質６ｃを固定化する。本例では、牛血清アルブミンをフォスフェートバッファセリンに溶解した溶液（５０μｇ/ｍＬ）の中に測定チップを室温で１時間浸漬し、金薄膜表面のフィブロネクチンが固定化された以外の部分に細胞接着性阻害物質６ｃとなるアルブミンを吸着させる。
【００３２】
工程Ｐ７で，プリズム２を測定対象となる細胞を培養した細胞培養液の中に浸漬して、インキュベーター内で培養すると、細胞は細胞接着性付与物質６ｂのみに接着する。
本例では、プリズム２を純水で洗浄後、細胞数を３×１０６個／ｍＬに調整した細胞培養液（ミニマムエッセンシャル培地に添加して調整した）の中に浸漬し、インキュベーター内で約１日間培養する（３７℃、ＣＯ２濃度５％）。
細胞はＨｅｌａ細胞を使用したが、細胞接着性付与物質としてはフィブロネクチンが最適である。
そして、工程Ｐ８で培養液から取り出せば、細胞はフィブロネクチン上に接着して培養され、アルブミン上には接着しないので、細胞数特定用参照流路Ｆ０以外の測定流路Ｆ２〜Ｆｎ及びノイズリダクション用参照流路Ｆ１にのみ細胞を接着させることができる。
【００３３】
なお、これ以外にも細胞のマイクロパターニング技術としてよく知られているマイクロコンタクトプリンティング法、光酸化法、電極表面上の酸化法やフォトリソグラフィ技術によるリフトオフ法ももちろん適用可能である。
細胞接着性を付与する化合物として、フィブロネクチンのほかコラーゲン、ラミリン、ポリリシンなどが知られており、細胞の種類に応じて最適なものを選択して使用する。
【００３４】
図３に示す細胞応答測定装置１１は、上述したＳＰＲバイオセンサ１を用いて各測定流路Ｆ２〜Ｆｎで生ずる細胞応答をＳＰＲ現象により測定する装置であって、各流路５に刺激物質を含まないランニング溶液及び刺激物質を含むサンプル溶液を選択的に送液する送液装置１２と、各流路Ｆ０〜Ｆｎにランニング溶液及びサンプル溶液が送液されたときに表面プラズモン共鳴角を測定するＳＰＲ測定装置１３と、測定された共鳴角に基づいて演算処理を行う演算処理装置１４を備えている。
【００３５】
送液装置１２は、図４に示すように、ランニング溶液供給源Ｓ０及びサンプル溶液供給源Ｓ２〜Ｓｎから送給されるランニング溶液及びサンプル溶液を各測定流路Ｆ２〜Ｆｎに択一的に供給するランニング溶液／サンプル溶液切換バルブＶ２〜Ｖｎを介装した測定流路送液系１５と、細胞数特定用参照流路Ｆ０及びノイズリダクション用参照流路Ｆ１にランニング溶液を供給する参照流路送液系１６を備えており、それぞれに送液ポンプ１７及び１８が介装されている。
ポンプ１７及び１８の送液により各流路Ｆ０〜Ｆｎを通過したランニング溶液やサンプル溶液は、廃液ボトル（図示せず）に保存される。
なお、ポンプ１７及び１８、切換バルブＶ２〜Ｖｎの動作はマイコン（図示せず）により制御されている。
【００３６】
ＳＰＲ測定装置１３は、ＳＰＲバイオセンサ１のセンサ面３に対し所定の角度範囲で集光する入射光束を形成する照射光学系２０と、そのセンシングポイントＭから反射する反射光束を受光して入射角に応じた光強度を測定する測定光学系３０とを備えている。
【００３７】
照射光学系２０は、半円形プリズム２の円弧面側から共鳴角近傍の入射角度（例えば入射角６５°）でその中心に向かう照射光軸ＺＬに沿って、中心波長７７０ｎｍの光を照射する発光ダイオード２１と、直径２００μｍのピンホール２２と、光束径を広げて平行化する球面平凸レンズ２３、Ｐ波偏光フィルタ２４、センシングポイントＭとなる半円形プリズム２の中心に対して所定の角度範囲（中心入射角６５°±１０°）で集光させる円筒面平凸レンズ２５が配されている。
これにより、発光ダイオード２１から出射された光は、ピンホール２２を通り、球面平凸レンズ２３により平行光となり、偏光フィルタ２４でＰ波偏光にされた後、円筒面平凸レンズ２５により集光されて、センシングポイントＭとなる半円形プリズム２の中心に対して所定の角度範囲（中心入射角６５°±１０°）で照射される。
【００３８】
測定光学系３０は、センシングポイントＭから反射する反射光軸ＺＲ上に沿って、プリズム２から広がって出射してくる光束を平行光にする円筒面平凸レンズ３１と、その平行光を幅方向に絞り込む円筒面平凸レンズ３２と、迷光を除去する干渉フィルタ３３と、反射光強度を二次元的に測定するＰＤアレイやＣＣＤカメラなどの受光素子３４を備えており、その受光素子３４が演算処理装置１４に接続されている。
これにより、センサ面３で反射された光は、図５に示すように、円筒面平凸レンズ３１で平行化され、さらに結像レンズ３２により受光素子３４上に結像される。
【００３９】
演算処理装置１４では、受光素子３４から出力された反射光強度に基づいて共鳴カーブを作成する。
受光素子３４は、図５に示すように、Ｘ軸方向が流路位置に対応し、Ｙ軸方向が入射角度に対応するので、ＳＰＲが発生している部分は反射光が減衰するため画像で黒いパターンとなることから、各流路Ｆ０〜ＦｎごとにＹ軸方向の画素（入射角）に対応する反射光強度を読み出し、入射角−反射光強度の関係をプロットすることにより、共鳴カーブを作成することができる。
分解能を向上させるために、得られた共鳴カーブに対し最小二乗法によるカーブフィッティング式を求め、この式から画素間を補完し共鳴角度を計算する。最も光強度の低い共鳴角度の変化（ＳＰＲ応答）を１秒ごとにタイムコースデータとして保存する。
【００４０】
演算処理装置１４では、このようにして得られた共鳴角の時間変化に基づき、各測定流路Ｆ２〜Ｆｎ及びノイズリダクション用参照流路Ｆ１に付着している細胞数を算出する細胞数算出手段４１と、刺激物質に対する細胞単位個数当たりの共鳴角変化量を単位細胞共鳴角として算出する細胞応答算出手段４２とを備えている。
細胞数算出手段４１は、ランニング溶液を送液したときの各測定流路Ｆ２〜Ｆｎ及びノイズリダクション用参照流路Ｆ１の共鳴角と、細胞数特定用参照流路Ｆ０の共鳴角との差に基づき、各流路Ｆ１〜Ｆｎに付着している細胞数を算出する。
細胞一個当りの共鳴角変化は０.４ｍｄｅｇであるので、前記共鳴角の差を０.４で除せば、夫々の流路Ｆ１〜Ｆｎに付着している細胞の数が求まる。
【００４１】
細胞応答算出手段４２は、各測定流路Ｆ２〜Ｆｎにサンプル溶液を送液する前後における共鳴角変化と先に求めた細胞数とに基づき、刺激物質に対する細胞単位個数当たりの共鳴角変化量を単位細胞共鳴角として算出する。
また、本例では、ノイズリダクション用参照流路Ｆ１に付着された細胞数と、ノイズリダクション用参照流路にランニング溶液を送液することにより測定される共鳴角変化とに基づき、細胞単位個数（例えば一個）当たりの共鳴角変化量をノイズ共鳴角として算出するノイズ算出手段４３と、そのノイズ共鳴角に基づいて、先に求めた単位細胞共鳴角を補正するノイズリダクション手段４４を備えている。
【００４２】
次いで、本発明に係る細胞応答測定方法について説明する。
図６が測定方法の手順を示す説明図である。
工程Ｐ１１で、流路Ｆ１〜Ｆｎ内に細胞を培養付着させたＳＰＲバイオセンサ１をＳＰＲ測定装置１１にセットする。
工程Ｐ１２で、送液装置１２から刺激物質が含まれていないランニング溶液としてフォスフェートバッファーセリン（ｐＨ７.２）もしくは培地を送液し、フローセル温度３７℃で一定とし、フローセル内で細胞を生きたままの状態で保つ。
工程Ｐ１３では、ＳＰＲバイオセンサの応答が安定した後、各流路Ｆ０〜Ｆｎの共鳴角を測定し、細胞数特定用参照流路Ｆ０の共鳴角を基準とし、その他の流路Ｆ１〜Ｆｎとの差分を算出する。
次いで、工程Ｐ１４で、各流路Ｆ１〜Ｆｎのセンシングポイント付近の細胞数を計算する。細胞数とＳＰＲ応答の関係は細胞の種類によって異なるが、本例の場合は１個／ｍｍ２が０.４ｍｄｅｇに相当するので、この関係を利用して算出した。
【００４３】
次に、工程Ｐ１５で、送液装置１２から刺激物質が含まれたサンプル溶液を測定流路Ｆ２〜Ｆｎに送液し、ノイズリダクション用参照流路Ｆ１には刺激物質が含まれていないランニング溶液を送液を続ける。
工程Ｐ１６では、刺激物質に対するＳＰＲ応答を測定する。すなわち、サンプル溶液が測定流路Ｆ２〜Ｆｎ内に達すると、刺激物質そのものの応答の後に刺激物質が細胞表面に結合して、細胞内シグナル伝達の結果、細胞が変化することによるＳＰＲ応答が発生する（２次応答）ので、そのときの各測定流路Ｆ２〜Ｆｎの共鳴角を記録し、サンプル溶液を供給する前（細胞数測定時）の共鳴角との差分を求めれば、その差分が刺激物質に対する細胞応答を示す。
ただし、この差分は細胞個数による影響が反映されているので、工程Ｐ１７では、細胞の単位個数あたりの共鳴角変化を単位細胞共鳴角として算出する。
【００４４】
さらに、工程Ｐ１８では、測定流路Ｆ２〜ＦｎのＳＰＲ応答を測定するのと同期させて、ノイズリダクション用参照流路Ｆ１の共鳴角を測定し、細胞数測定時の共鳴角との差分を求めれば、その差分がノイズによる共鳴角変換の影響を示す。
ただし、この差分は参照流路Ｆ１の細胞個数による影響が反映されているので、工程Ｐ１９で、先に算出された細胞数に基づき、細胞単位個数当たりの共鳴角変化量をノイズ共鳴角として算出する。
そして、工程Ｐ２０では、各測定流路Ｆ２〜Ｆｎについて算出された単位細胞共鳴角とノイズ共鳴角との差を求めることにより単位細胞共鳴角を補正すれば、細胞の数やバックグラウンドの変化の影響を受けないＳＰＲ応答（共鳴角変化）を求めることができる。
【００４５】
以上が本発明の構成例であり、次にその作用について説明する。
ＳＰＲバイオセンサ１のセンサ面３には、測定流路Ｆ２〜Ｆｎとなる部分及びノイズリダクション用参照流路Ｆ１にＨｅｌａ細胞を付着培養させた。
ＳＰＲバイオセンサ１をＳＰＲ測定装置１１にセットし、送液装置１２からランニング溶液用ポンプによりランニング溶液としてミニマムエッセンシャル培地を流量６μＬ／ｍｉｎで送液し、フローセル温度３７℃で一定とした。
【００４６】
図７にＳＰＲ測定装置１１で測定され共鳴角の経時変化を示す。
ランニング溶液を送液開始して、１０００秒程度経過すると、ＳＰＲバイオセンサ１の出力は細胞数特定用参照流路Ｆ０については減少して安定し、それ以外の流路Ｆ１〜Ｆ６は増加して安定した。
送液を開始して２２００秒経過した時点で、各流路Ｆ０〜Ｆｎについての共鳴角を読み取った。
Ｈｅｌａ細胞の場合、細胞数による共鳴角の変化量は１個／ｍｍ２が０.４ｍｄｅｇに相当するので、これに基づき、細胞が培養された各流路Ｆ１〜Ｆ６までの各流路のセンシングポイント付近の細胞数を計算した。
例えば、測定流路Ｆ６と細胞数特定用参照流路Ｆ０の共鳴角の出力差が２６４０ｍｄｅｇであることから、測定流路Ｆ６の１ｍｍ２あたりの細胞数は約６６００個と推定でき、また、ノイズリダクション用参照流路Ｆ１と細胞数特定用参照流路Ｆ０の共鳴角の出力差が２５６０ｍｄｅｇであることから、ノイズリダクション用参照流路Ｆ１の１ｍｍ２あたりの細胞数は約６４００個と推定できる。
【００４７】
次に、刺激物質としてヒスタミンが含まれたサンプル溶液を濃度別に各測定流路Ｆ２〜Ｆ６に送液した。
測定流路Ｆ２には１０−１０Ｍ、測定流路Ｆ３には１０−８Ｍ、測定流路Ｆ４には１０−６Ｍ、測定流路Ｆ５には１０−４Ｍ、測定流路Ｆ６には１０−２Ｍとなるようにヒスタミンをランニング溶液と同じミニマムエッセンシャル培地に溶解したものをサンプル溶液として供給した。
また、ノイズリダクション用参照流路Ｆ１には、ヒスタミンの含まれていないミニマムエッセンシャル培地のみを送液した。
【００４８】
測定流路Ｆ２〜Ｆ３では出力の増加が認められないが、測定流路Ｆ４〜Ｆ６では顕著な増加が認められる。
この出力増加はサンプル溶液がすべてフローセル４を通過した後にも続いているため、ヒスタミンそのものの応答ではなく、ヒスタミンがＨｅｌａ細胞表面の受容体に結合して、細胞内シグナル伝達の結果、細胞形態が変化したことなどにより発生する２次応答と考えることができる。
各流路の２２００秒と３３００秒の共鳴角の差分を計算し、先に求めた細胞数で割ることにより細胞１個（単位個数）当たりのＳＰＲ応答が算出される。
【００４９】
測定流路Ｆ６の場合、２２００秒の共鳴角をα６、３３００秒の共鳴角β６とし、細胞数Ｎ６とし、細胞一個当たりの共鳴角変化量を単位細胞共鳴角φ６とすると、測定流路Ｆ６の単位細胞共鳴角φ６は、
φ６＝（β６−α６）／Ｎ６＝０.０６６ｍｄｅｇ
α６＝６６.５７１ｄｅｇ、
β６＝６７.００４ｄｅｇ
Ｎ６＝６６００
で表され、これにより細胞数によるバラツキを排除することができる。
【００５０】
一方、バックグラウンドノイズやドリフトの影響をなくすために、ノイズリダクション用参照流路Ｆ１の共鳴角から細胞単位個数あたりの共鳴角変化量をノイズ共鳴角として算出する。
参照流路Ｆ１の場合、２２００秒の共鳴角をα１、３３００秒の共鳴角β１とし、細胞数Ｎ１とすると、
参照流路Ｆ１のノイズ共鳴角φ１は、
φ１＝（β１−α１）／Ｎ１＝−０.００２ｍｄｅｇ
α６＝６６.４９４ｄｅｇ、
β６＝６６.４８２ｄｅｇ
Ｎ１＝６４００
で表される。
したがって、この値で、測定流路Ｆ６の単位細胞共鳴角φ６を補正すると、補正された単位細胞共鳴角φ６’は、
φ６’＝φ６−（φ１）＝０.０６６−（−０.００２）＝０.０６８ｍｄｅｇ
となり、これにより細胞数だけでなくバックグラウンドノイズ及びドリフトによる影響をも排除できたことになる。
【００５１】
図８は、このようにして算出した測定流路Ｆ２〜Ｆ６の補正された単位細胞共鳴角φと、刺激物質であるヒスタミン濃度の関係を示すグラフである。
ヒスタミン濃度が１０−８Ｍ以下では細胞応答を起さず、ヒスタミン濃度が１０−８Ｍを超えるあたりから細胞応答が観察された。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
以上述べたように、本発明は、表面プラズモン共鳴を利用して刺激物質に対する細胞応答を測定する用途、特に、薬剤や毒性物質に対する細胞応答ひいてはこれらの物質が細胞に与える影響を評価する用途に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】本発明に係るＳＰＲバイオセンサの一例を示す説明図。
【図２】ＳＰＲバイオセンサのパターニング手順を示す説明図。。
【図３】本発明に係る細胞応答測定装置の一例を示す説明図。。
【図４】その流体回路の概略説明図。
【図５】反射光と受光素子の関係を示す説明図。
【図６】本発明に係る細胞応答測定方法の一例を示す説明図。
【図７】共鳴角の測定結果を示すグラフ。
【図８】刺激物質に対する単位細胞共鳴角を示すグラフ。
【図９】従来のＳＰＲバイオセンサを示す説明図。
【図１０】従来のＳＰＲバイオセンサを示す説明図。
【符号の説明】
【００５４】
１    ＳＰＲバイオセンサ
２    プリズム
３    センサ面（反射面）
３ｂ  金薄膜（金属薄膜）
４    フローセル
４Ｂ  底面
Ｆ０  細胞数特定用参照流路
Ｆ１  ノイズリダクション用参照流路
Ｆ２〜Ｆｎ  測定流路
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2007333612.tif 000009
【図８】
2007333612.tif 000010
【図９】
2007333612.tif 000011
【図１０】
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