(57)【要約】【課題】ブタ小腸上皮由来の特定のアミノ酸配列を有するクルクミン還元酵素を提供する。【解決手段】ブタ小腸上皮の遠心上清部を硫安分画し、酵素活性の高い１又は２以上の画分を分離し、分離された画分をゲルろ過に供して酵素活性の高い画分を分離し、分離された酵素活性の高い画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供して分子量と純度を確認後、二次電気泳動に供し、塩基性のタンパクであることを確認した後、酵素活性の高いゲルろ過画分をnative−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、酵素活性の高いバンドを切り出すことにより、クルクミン還元酵素を得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタ小腸上皮の遠心上清部を硫安分画し、酵素活性の高い１又は２以上の画分を分離し、分離された画分をゲルろ過に供して酵素活性の高い画分を分離し、分離された酵素活性の高い画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供して分子量と純度を確認後、二次電気泳動に供し、塩基性のタンパクであることを確認した後、酵素活性の高いゲルろ過画分をｎａｔｉｖｅ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、酵素活性の高いバンドを切り出すことにより得られ、以下の理化学的性質（１）及び（２）、並びに部分アミノ酸配列（３）を有することを特徴とするクルクミン還元酵素。
（１）作用：クルクミンを還元してテトラヒドロクルクミンを生成する。
（２）分子量：４０ｋＤａ〜８０ｋＤａ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を示す。
（３）少なくとも次の４箇所の部分アミノ酸配列を有する。
i）Val-His-Ser-Phe-Pro-Thr-Leu
ii）Tyr-Leu-Ile-Pro-Asn-Ala
iii）Val-Phe-Tyr-Leu-Lys
vi）Arg-Ile-Ala-Tyr-Glu-Phe-Val-Glu-Met
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クルクミンに作用してテトラヒドロクルクミンを生成するクルクミン還元酵素に関し、より詳しくは、該還元酵素が、ブタ小腸上皮から得られる特定の理化学的性質と部分アミノ酸配列を有するクルクミン還元酵素に関する。
【背景技術】
【０００２】
香辛料、着色料として用いられるショウガ科クルクマ属の多年草のウコン根茎の乾燥粉末であるターメリックは、抗酸化作用、抗炎症作用、コレステロール低減作用、発癌抑制作用等の薬効を有することが明かにされたことから、ウコン、特にその根茎に多く含まれクルクミン類は、植物由来の安全な薬効成分として用いられている。このようなクルクミン類の還元体であるテトラヒドロクルクミン類は、クルクミン類より更に抗酸化作用が強く、抗白内障効果や大腸癌抑制効果がクルクミン類より高いことが知られている（例えば、特許文献１及び２参照）。
【０００３】
テトラヒドロクルクミン類の製造方法としては、金属触媒を用いたクルクミンの水素添加による製造法が知られているが、この方法により製造された合成テトラヒドロクルクミンを飲食品用途で使用することは食品衛生上問題がある。食用に利用可能なテトラヒドロクルクミン類を製造する方法として、クルクミン類をテトラヒドロクルクミン類に変換する活性を有する微生物の菌体等をクルクミン類に作用させてテトラヒドロクルクミン類を生成させるテトラヒドロクルクミン類の製造方法（例えば、特許文献３参照）が知られている。
【０００４】
しかしながら、クルクミンの水の溶解度は常温で０．１μｇ／ｍｌ以下と低く、菌等の微生物を使用する発酵処理を行なう場合、水に難溶性のクルクミン類はエタノール等クルクミン類を溶解する有機溶媒でまず溶解して用いているが、発酵処理物を摂取する関係上使用する有機溶媒の種類が制限され、使用量を増加すると菌等が不活性化してしまう等の不都合があった。有機溶媒を使用せずに水難溶性の化合物を水に分散させる技術としてエマルジョン化技術が知られているが、このエマルジョン化技術を利用したテトラヒドロクルクミン類を得る方法として、油脂成分と、乳化剤又は界面活性剤と、水性媒体とを混合、処理して得られるエマルジョンの存在下でクルクミン類に微生物を作用させ、テトラヒドロクルクミン類を含有する組成物を製造する方法（例えば、特許文献４参照）が報告されているが、テトラヒドロクルクミンへの変換率の更なる向上が望まれている。
【０００５】
またその他にも、クルクミン類にシクロデキストリンを添加して酵母等により発酵処理をすることにより、効率よくテトラヒドロクルクミン類を得る方法が知られており（例えば、特許文献５参照）、該方法によれば、金属触媒を用いて製造されたものとは異なり、微生物の発酵処理により得ることができるため、食品素材や食品として安全なテトラヒドロクルクミン類を得ることができる。
【０００６】
一方、クルクミンは、経口摂取の後に血中に移行するが、血中には主に四水素添加を受けた還元反応産物であるテトラヒドロクルクミン及びその抱合体である、グルクロン酸抱合体、硫酸抱合体、およびグルクロン酸と硫酸両者の抱合を同時に受けた抱合体として出現することが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。クルクミン及びテトラヒドロクルクミンの抱合体形成には、小腸に存在するＵＤＰ依存性グルクロン酸転移酵素群（ＵＤＰ−ＧＴｓ）と硫酸転移酵素群（sulfotransferases）が関与しているものと考えられる。これらは食品成分や外来異物xenobioticsの抱合化を行う一般的酵素で、基質の水溶性を上昇させ、吸収・輸送・解毒・排出などを容易にするとされている。いずれの酵素も複数のアイソザイムが存在し基質特異性を有することが知られているが、英国University of LeicesterのIresonらは、ヒトの体内でクルクミンの硫酸抱合化を行う硫酸転移酵素のアイソザイムをSULT1A1、SULT1A3の２つであると報告している（例えば、非特許文献２参照）。さらに、Iresonらのグループはラット肝ホモゲネートとクルクミンの反応産物として、テトラヒドロクルクミンとクルクミンに水素６個が付加した形のヘキサヒドロクルクミンの存在を報告している（例えば、非特許文献２及び３参照）。彼等はこれらの報告の中で、詳細なデータは示していないものの、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）がクルクミン還元反応を触媒する可能性についてコメントしている。
【０００７】
さらに、ソウル国立大学薬学部のYoung-Joon Surh助教授らは、クルクミンの構造の類似したショウガ成分（ジンゲロール、ショウガオール等）の代謝に関して、ラット肝臓に存在する酵素がこれらの成分を還元し水素付加体を生成することを報告している（非特許文献４及び５参照）。Surhらはその後の結果から、この反応はＮＡＤＰＨ要求性であることを示し、さらにこの酵素がステロイド代謝関連酵素である可能性を示唆している。
【０００８】
しかしながら、東北大学農学部の宮澤陽夫教授らはラットを用いた実験で、クルクミンは経口摂取後に血中にグルクロン酸及びグルクロン酸／硫酸抱合体クルクミンの形で出現するがテトラヒドロクルクミンは検出されず、クルクミンは還元反応を受けていないと報告している（例えば、非特許文献６参照）。さらに、日本大学の鳥居氏等は、生体内でのクルクミン還元の有無とその反応の局在を解明する目的で、ブタ小腸上皮からのクルクミン還元酵素の単離・同定を試みている（例えば、非特許文献７参照）。
【０００９】
【特許文献１】特開平２−４９７４７号公報
【特許文献２】特開平２−５１５９５号公報
【特許文献３】特開平１１−２３５１９２号公報
【特許文献４】特開２００３−３３１９５号公報
【特許文献５】特開２００５−３０４４０１号公報
【非特許文献１】Drug Metabolism and Deposition 27, 486-494 (1999)
【非特許文献２】Cancer Res. 61,1058-64 (2001)
【非特許文献３】Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 11, 105-11 (2002)
【非特許文献４】Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 84, 53-61 (1994)
【非特許文献５】Life Science 54, 321-6 (1994)
【非特許文献６】Life Science67, 2785-2793 (2000)
【非特許文献７】「食品酵素化学の最新技術と応用」、ｐ２０１−２０７、２００４年３月シーエムシー出版
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、ウコン等に含まれるクルクミンが示す薬効に比しより有効性が高いテトラヒドロクルクミンを得るために、クルクミンを還元作用してテトラヒドロクルクミンを生成することのできるクルクミン還元酵素及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、長年、沖縄に自生するウコン等の薬草について、健康飲食品として或いは薬用として、体や病気に対して最適に作用・効果を奏し得る技術、さらに飲食や服用のし易すさ、長期保存等のための加工技術について研究してきたが、ウコンの薬効成分であるクルクミンに比して、その還元化合物であるテトラヒドロクルクミンの方が、薬効や物性においてより有効であることに注目し、金属原子などの触媒を用いる合成によらず、ある種の還元酵素を用いることにより安全なテトラヒドロクルクミンを生成し得るという予想のもとに、鋭意研究の結果、ブタ小腸上皮由来の酵素群の中から、食品に添加することができる安全な、クルクミンを還元する活性の高い特定の酵素を見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明は、ブタ小腸上皮の遠心上清部を硫安分画し、酵素活性の高い１又は２以上の画分を分離し、分離された画分をゲルろ過に供して酵素活性の高い画分を分離し、分離された酵素活性の高い画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供して分子量と純度を確認後、二次電気泳動に供し、塩基性のタンパクであることを確認した後、酵素活性の高いゲルろ過画分をｎａｔｉｖｅ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、酵素活性の高いバンドを切り出すことにより得られ、以下の理化学的性質（１）及び（２）、並びに部分アミノ酸配列（３）を有することを特徴とするクルクミン還元酵素
（１）作用：クルクミンを還元してテトラヒドロクルクミンを生成する。
（２）分子量：４０ｋＤａ〜８０ｋＤａ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を示す。
（３）少なくとも次の４箇所の部分アミノ酸配列を有する。
i）Val-His-Ser-Phe-Pro-Thr-Leu
ii）Tyr-Leu-Ile-Pro-Asn-Ala
iii）Val-Phe-Tyr-Leu-Lys
vi）Arg-Ile-Ala-Tyr-Glu-Phe-Val-Glu-Met
に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のクルクミン還元酵素は、クルクミンに作用してテトラヒドロクルクミンを生成することができ、該酵素の理化学的性質及びアミノ酸配列を特定することにより、健康上安全なテトラヒドロクルクミンを得ること、及び該化合物の定量的な製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明のクルクミン還元酵素としては、ブタ小腸上皮の遠心上清部を硫安分画し、酵素活性の高い１又は２以上の画分を分離し、分離された画分をゲルろ過に供して酵素活性の高い画分を分離し、分離された酵素活性の高い画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供して分子量と純度を確認後、二次電気泳動に供し、塩基性のタンパクであることを確認した後、酵素活性の高いゲルろ過画分をｎａｔｉｖｅ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、酵素活性の高いバンドを切り出すことにより得られ、以下の理化学的性質（１）及び（２）、並びに部分アミノ酸配列（３）を有するものであれば特に制限されるものではなく、ブタ小腸上皮を採取するブタの成育段階はいずれでもよいが、成ブタを用いることが好ましい。
（１）作用：クルクミンを還元してテトラヒドロクルクミンを生成する。
（２）分子量：４０ｋＤａ〜８０ｋＤａ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を示す。
（３）少なくとも次の４個のアミノ酸配列を有する。
i）Val-His-Ser-Phe-Pro-Thr-Leu（配列番号１）
ii）Tyr-Leu-Ile-Pro-Asn-Ala（配列番号２）
iii）Val-Phe-Tyr-Leu-Lys（配列番号３）
vi）Arg-Ile-Ala-Tyr-Glu-Phe-Val-Glu-Met（配列番号４）
【００１５】
本発明のクルクミン還元酵素は、具体的には以下のようにして得られる。ブタの小腸上皮を包丁等で剥離して、ＣＭＦ−ＰＢＳ等の緩衝液に懸濁し、その後ホモジナイズした後、得られた粗酵素液を遠心分離機を用いて遠心分離して上清部（可溶性画分）を採取する。次に、遠心上清部を硫安分画に供する。硫安の飽和度によって沈殿する蛋白質が異なることを利用して分画する手法であり、硫安分画における硫安の飽和度はいろいろ定義があるが、Methods in Enzymology,Vol 1,p76(1955)のGreen等の方法等を用いることができる。
【００１６】
酵素活性を有する硫安画分を、次にゲルろ過に供する。ゲルろ過は、蛋白質を分子量の大きさで分ける手法であり、分子量の大きい順番に出てくる。サイズ排除クロマトグラフィ（Size exclusion chromatography,SEC）、ゲル浸透クロマトグラフィ（Gel permeation chromatography,GPC）ともよばれる。取得すべき酵素の分子量に応じて選択するが、例えばToyopearl HW-５５ｓ、Toyopearl HW-40F（東ソー株製）、Sephadex G-25、Sephadex G-100、Sephadex G-200（Pharmacia製）等を用いることができる。
【００１７】
また、硫安画分を、ゲルろ過で行う一方、陰イオン交換樹脂でも行うことで、より正確な酵素分離を確認することができる。本発明で用いる陰イオン交換樹脂は、弱イオン交換樹脂を用いることが好ましく、例えば、Diethylaminoethyl（DEAE)型等が挙げられることができる。
【００１８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動）は、Porzio&Pearsonの方法に従い、例えば、０．１％ＳＤＳ−７．５％ゲルと０．１％ＳＤＳ−１５０ｍＭ Tris-glycine緩衝液（ｐＨ８．６）を用いて行うことが挙げられる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供するとＳＤＳの影響により酵素活性がなくなる可能性があるため、酵素活性のある画分を得るには、ＳＤＳを添加しない、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥにサンプルを供するものである。ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥに供すると、種々のバンドを呈するので、酵素活性を測定し、活性を有する画分と活性のない画分について２次元電気泳動（例えば、２次元目：５−２０％グラジエントゲル）に供し、物性の確認を行う。前述のｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥによる結果から、活性の高いバンドの混合物を混合したものを切り出し、さらにｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥに供した。種々のバンド、例えば１０個のバンドを呈する。これらのバンドをそれぞれ酵素を抽出してその酵素活性をＨＰＬＣを用いて、コントロールと共に測定する。コントロールと比較し、相違する点があるか否かで、測定したバンドの中で目的のバンドを探索する。
【００１９】
見い出された目的のバンドのサンプルをリジルエンドペプチダーゼにてゲル内消化（基本的には、Rosennfeldらの方法による）させた後、逆相ＨＰＬＣに供して、断片ペプチドを分離・分取する。逆相ＨＰＬＣについてのフラクションの選択は、分取した画分中にシングルピークとなっていること、ピークの形状が対称（複数混在していないような形状）であること、内部配列分析の基本である８−１２残基程度のペプチドが溶出されそうな保持時間であること（短いペプチドは保持時間が早く、長いペプチドは保持時間が遅い傾向がある）を考慮して、行う。得られたフラクションをシークエンサーにて分析するが、シークエンサーとしては、例えば、Applied Biosystems (Foster City, CA)のProcise 494 cLC Protein Sequencing System等を挙げることができる。
【００２０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例】
【００２１】
ブタの小腸上皮を包丁で剥離して、ＣＭＦ−ＰＢＳ緩衝液（リン酸２水素ナトリウム（ナカライテスク社製）２８.５３ｇ、リン酸２水素ナトリウム２水和物（ナカライテスク社製）１５．４２ｇ、塩化ナトリウム（ナカライテスク社製）２６２．８ｇを蒸留水３Ｌに溶解し×１０ＰＢＳ緩衝液を作成した。この×１０ＰＢＳ緩衝液１００ｍＬに５００ｍＭ ＥＤＴＡ（株式会社同仁化学研究所製）１ｍＬを加え蒸留水で１ＬにメスアップしＣＭＦ−ＰＢＳ緩衝液とした。）に懸濁した。その後、ホモジナイズし、得られた粗酵素液を遠心分離機により遠心分離（１００００rｐｍ）し、遠心上清（可溶性画分）部を採取した。前記遠心上清部を硫安分画し、６０％画分と６５％画分に強い活性がみられたので、該６０％画分と６５％画分を等量ずつ混合したものをサンプルとして用いた。この混合物を、ゲルろ過に供した。該ゲルろ過は、カラムとしてTOYOPEARL  HW-55Sを、サイズ２×８８．５ｃｍを、溶離剤としてＰＢＳ（ｐＨ７．０）を用い、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、１ｍｌ／ｔｕｂｅにて行った。この結果を図１に示す。図１の矢印の画分について酵素活性、即ち、クルクミンに該画分を作用させてテトラヒドロクルクミンの生成量の程度を測定した。このゲルろ過分離後の酵素活性測定の結果を図２に示す。図２より、１１１前後の画分にクルクミンを還元してＴＨＵ１を生成する酵素活性があることを確認した。
【００２２】
一方、前述の硫安画分を陰イオン交換樹脂に供した。カラムとしてDEAEー650Cスターターキット(５ｍｌ)を用い、溶離液として２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ buffer（ｐＨ８．３）を、ｔｕｂｅとして５ｍｌ／ｔｕｂｅを使用した。分離結果を図３に示す。また、前述の陰イオン交換樹脂による硫安画分全てについて酵素活性の測定を行った。その結果を図４に示す。画分２０以降は活性が見られなかったため画分１９までを示した。図４から、画分４前後に酵素活性があることを確認した。なお、陰イオン交換樹脂による分離は、ゲルろ過による分離と比較すると各画分の酵素活性は低いことがわかった。
【００２３】
ゲルろ過画分とイオン交換法による活性画分についてポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分子量と純度を調べた。その結果を図５に示す。図５から、分子量は４万から８万であることがわかった。また、それぞれの画分には１０種類弱の酵素が含まれていることがわかった。
【００２４】
次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供するＳＤＳの影響により酵素活性がなくなる可能性があるため、ＳＤＳを添加しないｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥに同様にゲルろ過とイオン交換法により得られた各画分を供した。その結果を図６に示す。なお、図６における（１）〜（５）及びＭｉｘは、次のようにゲルろ過画分や混合物を表す。即ちゲルろ過画分（１）：９５−９９、（２）：１０４−１０８、（３）：１０９−１１３、（４）：１１４−１１８、（５）：１１９−１２３、Ｍｉｘ：（１）〜（５）の混合物を表す。また、図６における４、１１、１９はイオン交換画分、１１０、１１５はゲルろ過画分を表す。図６より活性のないイオン交換画分１１，１９及び活性の弱いゲルろ過画分（１）、（５）並びに活性のある各画分を比較すると、丸で囲ったバンド、即ちゲルろ過画分（２）、（３）、（４）や、ゲルろ過画分１１０，１１５及び（１）〜（５）の混合物の丸で囲ったバンドが目的の酵素である可能性が高いことがわかった。
【００２５】
さらに、活性のある画分と活性のない画分について２次元電気泳動に供した。その結果を図７に示す。図７より、活性を有する画分は塩基性側、活性のない画分は酸性側にスポットが見られ、これらのスポットは重なり合わなかった。
【００２６】
次に酵素活性の高いゲルろ過画分１０６−１２３の混合物をｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥに供した。この結果を図８に示す。図８に示すように、１０個のバンドが得られ、これらを切り出して酵素を抽出し、酵素活性測定を行った。
【００２７】
前述の回収したバンド９（サンプル名：ＲＢＲ−９）とコントロールの酵素活性を測定し、その結果を図９に示す。図９より、蛋白量が少ないにもかかわらずバンド９にのみわずかに矢印で示す部分に酵素活性を有することが確認でき、バンド９が目的の酵素であることがわかった。
【００２８】
（ゲル内消化）
切り出したバンド９をリジルエンドペプチダーゼ（WAKO社製）にてゲル内消化をRosenfeldらの方法にしたがって実施した。
【００２９】
（逆相ＨＰＬＣによる分離）
前記消化液を逆相ＨＰＬＣに供して、断片ペプチドを分離・分取した。
ＨＰＬＣの分離条件は下記のとおりである。
カラム  ：  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８  （１．０  ×  １５０ｍｍ，  ３．５  ｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒ，  Ｗａｔｅｒｓ）
溶媒  Ａ  ：  ０．１％  ＴＦＡ  ｉｎ  ２％  acetonitrile
溶媒  Ｂ  ：  ０．０９％  ＴＦＡ  ｉｎ  ９０％  acetonitrile
流速      ：  ５０  ｍｉｃｒｏＬ／ｍｉｎ
温度      ：  室温
検出      ：  ２１０  ｎｍ，  ２８０  ｎｍ
グラジエント  ：    ０（ｍｉｎ）                    ０（％Ｂ）
６                              ０
１１                            １０
８６                            ５０
９１                          １００
９６                          １００
１０１                              ０
分取      ：  ５０  ｍｉｃｒｏＬ／Ｆｒａｃｔｉｏｎ
以上の条件による逆相HPLCに供した結果を図１０に、また、同一条件でゲルブランクを逆相HPLCに供した結果を図１１に示す。
【００３０】
（アミノ酸配列分析）
逆相ＨＰＬＣについてのフラクションの選択は、分取した画分中にシングルピークとなっていること、ピークの形状が対称（複数混在していないような形状）であること、内部配列分析の基本である８−１２残基程度のペプチドが溶出されそうな保持時間であること（短いペプチドは保持時間が早く、長いペプチドは保持時間が遅い傾向がある）を考慮した。その結果、フラクション番号３１及び３４を選んだ。これらのフラクションをシークエンサーにて分析した。シークエンサーとしては、Applied Biosystems (Foster City, CA)のProcise 494 cLC Protein Sequencing Systemを使用した。
【００３１】
（同定結果）
上記シークエンサーによる分析の結果、フラクション番号３１及び３４には数種類の蛋白が混在している可能性があり、各フラクションについて、２種類ずつアミノ酸配列を、下記のとおり決定した。
フラクション番号３１
i）Val-His-Ser-Phe-Pro-Thr-Leu
ii）Tyr-Leu-Ile-Pro-Asn-Ala
フラクション番号３４
iii）Val-Phe-Tyr-Leu-Lys
vi）Arg-Ile-Ala-Tyr-Glu-Phe-Val-Glu-Met
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明のブタ小腸上皮酵素由来の酵素について硫安６０％画分と６５％画分を等量ずつ混合したサンプルをゲルろ過した結果を示す。
【図２】本発明の、図１の矢印の画分についての酵素活性測定結果を示す。
【図３】本発明のブタ小腸上皮酵素由来の酵素について硫安６０％画分と６５％画分を等量ずつ混合したサンプルを陰イオン交換樹脂により分離した結果を示す。
【図４】陰イオン交換樹脂分離後の酵素活性測定結果を示す。
【図５】ゲルろ過とイオン交換法により得られた各画分についてSDS-PAGEに供した結果を示す。
【図６】ゲルろ過とイオン交換法により得られた各画分についてSDSを添加しないnative-PAGEに同様に供した結果を示す。
【図７】図６における活性のあるものとないものの画分について２次元電気泳動に供した結果を示す。
【図８】酵素活性の高いゲルろ過画分１０６−１２３の混合物をnative−PAGEに供した結果を示す。
【図９】バンド９とコントロールの酵素活性を測定した結果を示す。
【図１０】バンド９について逆相ＨＰＬＣに供した結果を示す。
【図１１】ゲル  ブランクについて逆相ＨＰＬＣに供した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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