(57)【要約】【課題】新しい作用機序に基づいた血管新生を亢進又は抑制する化合物のスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】ＰＩＶＫＡ−ＩＩを亢進する化合物を血管新生亢進物質とするスクリーニング方法、及びＰＩＶＫＡ−ＩＩを抑制する化合物を血管新生抑制物質とするスクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件において細胞を培養する工程と、
培養したそれぞれの細胞におけるＰＩＶＫＡ−ＩＩの産生量を測定する工程と、
被検化合物の存在下において培養した細胞におけるＰＩＶＫＡ−ＩＩの産生量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるＰＩＶＫＡ−ＩＩの産生量よりも多い場合に、当該被検化合物を血管新生亢進物質であると判定する工程と、
を備える血管新生亢進物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件において細胞を培養する工程と、
培養したそれぞれの細胞におけるＰＩＶＫＡ−ＩＩの産生量を測定する工程と、
被検化合物の存在下において培養した細胞におけるＰＩＶＫＡ−ＩＩの産生量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるＰＩＶＫＡ−ＩＩの産生量よりも少ない場合に、当該被検化合物を血管新生抑制物質であると判定する工程と、
を備える血管新生抑制物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生を亢進又は抑制する化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は、固形腫瘍や糖尿病性網膜症、リュウマチなどの発症や進行に深く関与することが知られており、これらの疾患の治療及び予防をすべく血管新生抑制作用を有する化合物の開発が進められている。一方で、血管新生を亢進することによる虚血性疾患（心筋梗塞、狭心症、脳梗塞など）の治療方法の検討も試みられている。
【０００３】
【特許文献１】特開２００４−２０３７４５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、血管新生は非常に複雑なプロセスであり、詳細な作用機序は解明されていない。新たな作用機序を解明することは、上記疾患の新しい治療及び予防薬への開発に結びつく。したがって、本発明の目的は、血管新生の新しい作用機序を解明することであり、また、新しい作用機序に基づいた血管新生を亢進又は抑制する化合物のスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、異常プロトロンビンＰＩＶＫＡ−ＩＩ（protein induced by Vitamin K absence or antagonist-II）が、血管内皮細胞の細胞増殖及び細胞移動能を顕著に亢進すること、及びその作用がＶＥＧＦＲ２−ＰＬＣγ−ＭＡＰＫ情報伝達経路によるものであることを発見し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、以下のスクリーニング方法を提供する：
（１）被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件において細胞を培養する工程と、培養したそれぞれの細胞におけるＰＩＶＫＡ−ＩＩの産生量を測定する工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞におけるＰＩＶＫＡ−ＩＩの産生量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるＰＩＶＫＡ−ＩＩの産生量よりも多い場合に、当該被検化合物を血管新生亢進物質であると判定する工程と、を備える血管新生亢進物質のスクリーニング方法；及び
（２）被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件において細胞を培養する工程と、培養したそれぞれの細胞におけるＰＩＶＫＡ−ＩＩの産生量を測定する工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞におけるＰＩＶＫＡ−ＩＩの産生量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるＰＩＶＫＡ−ＩＩの産生量よりも少ない場合に、当該被検化合物を血管新生抑制物質であると判定する工程と、を備える血管新生抑制物質のスクリーニング方法。
【０００７】
ＰＩＶＫＡ−ＩＩはプロトロンビンの前駆体であり、ビタミンＫの欠乏や肝障害（例えば、肝細胞癌）などにより血中に出現する。ＰＩＶＫＡ−ＩＩは、Ｎ末端領域のグルタミン酸がカルボキシル化されておらず、プロトロンビンと異なり凝固活性を持たない。また、ＰＩＶＫＡ−ＩＩは肝細胞癌のマーカーとして利用されており、最近では、ＰＩＶＫＡ−ＩＩがＪＡＫ−ＳＴＡＴ系を介して肝癌細胞増殖を亢進していることが明らかとなった（例えば、特許文献１）。
【０００８】
しかしながら、ＰＩＶＫＡ−ＩＩが血管新生の亢進に関与していることや、血管内皮細胞の増殖や移動を亢進することについては今まで知られておらず、本発明者らが初めて見出した。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のスクリーニング方法は、ＰＩＶＫＡ−ＩＩが血管新生の亢進に関与しているという作用機序に基づくものであり、今までは作用機序や作用部位が異なる血管新生亢進物質及び血管新生抑制物質を提供することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００１１】
（血管新生亢進物質のスクリーニング方法）
本発明の血管新生亢進物質のスクリーニング方法は、以下の工程を備える：
被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件において細胞を培養する工程、
培養したそれぞれの細胞におけるＰＩＶＫＡ−ＩＩの産生量を測定する工程、及び
被検化合物の存在下において培養した細胞におけるＰＩＶＫＡ−ＩＩの産生量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるＰＩＶＫＡ−ＩＩの産生量よりも多い場合に、当該被検化合物を血管新生亢進物質であると判定する工程。
【００１２】
本スクリーニング方法に用いる細胞は、ＰＩＶＫＡ−ＩＩを産生し得る細胞であれば特に限定されず、例えば、血管内皮細胞（ヒト臍帯血静脈内皮細胞など）、肝癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂなど）が挙げられる。細胞を被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件で培養する。用いる細胞に応じて、適切な培養条件を当業者は設定することができる。細胞の被検化合物への曝露時間や被検化合物の濃度についても、当業者は適宜設定することができる。
【００１３】
次に、培養したそれぞれの細胞におけるＰＩＶＫＡ−ＩＩの産生量を測定する。ここで、ＰＩＶＫＡ−ＩＩの産生量とは、タンパク質の量である。ＰＩＶＫＡ−ＩＩの産生量は、抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗体を用いて慣用されているイムノアッセイにより測定することができる。例えば、エイテストＰＩＶＫＡ−ＩＩやピコルミＰＩＶＫＡ−ＩＩ、ルミパルスＰＩＶＫＡ−ＩＩエーザイ（以上、いずれも三光純薬株式会社）などの市販の試薬を利用することも可能である。
【００１４】
ＰＩＶＫＡ−ＩＩの産生量の測定の結果、被検化合物の存在下において培養した細胞におけるＰＩＶＫＡ−ＩＩの産生量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるＰＩＶＫＡ−ＩＩの産生量よりも多い場合に、当該被検化合物を血管新生亢進物質であると判定できる。「産生量が多い」とは、ＰＩＶＫＡ−ＩＩの量が１．３倍以上、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上となることをいう。
【００１５】
このようにして得られた血管新生亢進物質は、心筋梗塞、狭心症及び脳梗塞などの虚血性疾患の治療及び予防薬として利用することができる。
【００１６】
（血管新生抑制物質のスクリーニング方法）
本発明の血管新生抑制物質のスクリーニング方法は、以下の工程を備える：
被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件において細胞を培養する工程、
培養したそれぞれの細胞におけるＰＩＶＫＡ−ＩＩの産生量を測定する工程、及び
被検化合物の存在下において培養した細胞におけるＰＩＶＫＡ−ＩＩの産生量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるＰＩＶＫＡ−ＩＩの産生量よりも少ない場合に、当該被検化合物を血管新生抑制物質であると判定する工程。
【００１７】
細胞を培養する工程及びＰＩＶＫＡ−ＩＩの産生量を測定する工程は、上述の血管新生亢進物質のスクリーニング方法と同様である。
【００１８】
ＰＩＶＫＡ−ＩＩの産生量の測定の結果、被検化合物の存在下において培養した細胞におけるＰＩＶＫＡ−ＩＩの産生量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるＰＩＶＫＡ−ＩＩの産生量よりも少ない場合に、当該被検化合物を血管新生抑制物質であると判定できる。「産生量が少ない」とは、ＰＩＶＫＡ−ＩＩの量が０．８倍以下、好ましくは０．６倍以下、より好ましくは０．５倍以下となることをいう。
【００１９】
このようにして得られた血管新生抑制物質は、腫瘍、糖尿病性網膜症及びリュウマチなどの治療及び予防薬として利用することができる。
【実施例】
【００２０】
細胞の培養
ヒト臍帯血静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を常法（例えば、新生化学実験講座“細胞培養技術”、ｐ．１９７−２０２）に従って単離し、５％ＣＯ２インキュベーター（３７℃）中で培養した。培地は、２％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．０４％（ｖ／ｖ）ヒドロコルチゾン、０．１％（ｖ／ｖ）アスコルビン酸、０．１％（ｖ／ｖ）硫酸ゲンタマイシン、０．１％（ｖ／ｖ）アンホテリシンＢを含むＥＢＭ−２培地（三光純薬株式会社）を使用した。
【００２１】
実施例１：細胞増殖能アッセイ
ＨＵＶＥＣを１２ウェルプレートに播き、０．２％ＦＢＳを含むＥＢＭ−２培地に培地を交換し、２４時間インキュベートした。ＰＩＶＫＡ−ＩＩ（２又は２０ｎｇ／ｍｌ）、プロトロンビン（２又は２０ｎｇ／ｍｌ）又はＶＥＧＦ−Ａ（１．２５又は１２．５ｎｇ／ｍｌ；ペプロテック社）を加えて、１２時間インキュベートした。［３Ｈ］チミジンを５μＣｉ／ウェル加えて、１２時間インキュベートした。ＨＵＶＥＣを洗浄し、回収し、チミジンの取り込み量をβカウンターで計測した。
【００２２】
結果を図１に示す。因子を添加しなかったとき（ネガティブ・コントロール）のチミジン取り込み量を１とする相対値で、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ及びプロトロンビンの細胞増殖能の亢進の程度を表した。図１から明らかなように、２０ｎｇ／ｍｌのＰＩＶＫＡ−ＩＩの添加により、ＨＵＶＥＣの細胞増殖能の亢進が確認された。
【００２３】
実施例２：細胞移動能アッセイ
ＨＵＶＥＣを６ウェルプレートに播き、０．２％ＦＢＳを含むＥＢＭ−２培地に培地を交換し、２４時間インキュベートした。ラバーポリスマン（フィッシャー・サイエンティフィック社）で細胞を直線的に剥ぎ取り、顕微鏡下で写真を撮影した。ＰＩＶＫＡ−ＩＩ（２又は２０ｎｇ／ｍｌ）、プロトロンビン（２又は２０ｎｇ／ｍｌ）又はＶＥＧＦ−Ａ（１．２５又は１２．５ｎｇ／ｍｌ）を加えて、２４時間インキュベートした。培養細胞の移動後の写真を撮影し、移動前の写真と比較して細胞の移動距離を計測した。
【００２４】
結果を図２に示す。ネガティブ・コントロールの細胞の移動距離を１とする相対値で、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ及びプロトロンビンの細胞移動能の亢進の程度を表した。図２から明らかなように、２０ｎｇ／ｍｌのＰＩＶＫＡ−ＩＩの添加により、ＨＵＶＥＣの細胞移動能の亢進が確認された。
【００２５】
実施例３：ウエスタンブロットアッセイ
ＨＵＶＥＣを６ウェルプレートに播き、０．２％ＦＢＳを含むＥＢＭ−２培地に培地を交換し、２４時間インキュベートした。ＰＩＶＫＡ−ＩＩ（２又は２０ｎｇ／ｍｌ）、プロトロンビン（２又は２０ｎｇ／ｍｌ）又はＶＥＧＦ−Ａ（１．２５又は１２．５ｎｇ／ｍｌ）を加えて、５〜３０分間インキュベートした。ＨＵＶＥＣを冷したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、１５０μｌの２×サンプルバッファーを加えて回収し、５分間煮沸した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ＨｙＢｏｎｄ−Ｐ  ＰＶＤＦメンブレン（アマシャムバイオサイエンス社）にブロットした。１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＴＢＳ−Ｔ（Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝生理食塩水）でメンブレンを１時間ブロッキングした。
【００２６】
以下の抗体を用いて、４℃にて一晩、一次抗体を反応させた：抗リン酸化Ｍｅｔ（Ｔｙｒ１２３４／１２３５）（１０００倍希釈；セル・シグナリング・テクノロジー社）、抗リン酸化ＪＡＫ１（ｐＴｙｒ１０２２／１０２３）（５０００倍希釈；シグマ社）、抗リン酸化ＳＴＡＴ３（Ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ７０４）（１００００倍希釈；シグマ）、抗リン酸化チロシン（１０００倍希釈；ＢＤトランスダクション・ラボラトリーズ社）、抗リン酸化ホスホリパーゼＣγ１（ＰＬＣγ１）（Ｔｙｒ７８３）（１０００倍希釈；アップステート・セル・シグナリング社）、抗リン酸化ｐ４２／４４ＭＡＰＫ（Ｔｙｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（２０００倍希釈；セル・シグナリング・テクノロジー社）及び抗リン酸化ＶＥＧＦＲ２（Ｔｙｒ１１７５）（１０００倍希釈；セル・シグナリング・テクノロジー社）。
【００２７】
ＴＢＳ−Ｔでメンブレンを３回洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼで標識した二次抗体を反応させ、化学発光（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ；アマシャムバイオサイエンス社）によりタンパク質を検出した。
【００２８】
一次抗体として抗リン酸化ＶＥＧＦＲ２、抗リン酸化ＰＬＣγ１及び抗リン酸化ｐ４２／４４ＭＡＰＫを用いたときの結果を、それぞれ図３〜５に示す。この結果から、ＰＩＶＫＡ−ＩＩは、ＶＥＧＦＲ２に作用し、ＰＬＣγ−ＭＡＰＫシグナル伝達経路を介して、細胞増殖及び細胞移動を促進することが示唆された。一方、プロトロンビンは、同シグナル伝達経路に対して有意な影響を示さなかった。また、肝癌培養細胞（Ｈｅｐ３Ｂ）において認められるＰＩＶＫＡ−ＩＩによるＭｅｔ−ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路の活性化は、ＨＵＶＥＣにおいては示されなかった。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】細胞増殖能アッセイの結果を示す図である。
【図２】細胞移動能アッセイの結果を示す図である。
【図３】ウエスタンブロットアッセイ（抗リン酸化ＶＥＧＦＲ２）の結果を示す図である。
【図４】ウエスタンブロットアッセイ（抗リン酸化ＰＬＣγ１）の結果を示す図である。
【図５】ウエスタンブロットアッセイ（抗リン酸化ｐ４２／４４ＭＡＰＫ）の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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