(57)【要約】【課題】比較的低分子のＲＮＡをクローニングするに際し、アイソトープを使用せずに、誤った分画をする恐れを極めて低くするとともに副生成物等を効果的に除去し、容易かつ安全に小分子ＲＮＡをクローニングする方法を提供する【解決手段】ＲＮＡのクローニングに際し、ＲＮＡの3'端側及び／又は5'端側に核酸鎖を結合させた核酸鎖結合産物の分画に使用する指標分子量マーカーである。そして、前記指標分子量マーカーは、核酸鎖結合産物のＲＮＡの3'端側及び／又は5'端側の核酸鎖の鎖長と同一又は２塩基差以下の鎖長とするとともに、前記核酸鎖結合産物の核酸鎖と同種又は同構成の核酸鎖とした合成核酸鎖を複数備えている。また、上記指標分子量マーカーを用い、電気泳動法により核酸鎖結合産物を分画する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
鎖長範囲がｍ塩基以上ｎ塩基以下（但しｍ：１５〜３０、ｎ：１８〜３５）であるＲＮＡのクローニングに際し、当該クローニング対象ＲＮＡの3'端側及び／又は5'端側にそれぞれ核酸鎖を結合した核酸鎖結合産物の分画に使用するものであって、下記(１)〜(５)のＢ鎖、Ｇ鎖、Ｈ鎖を備え、且つＣ鎖及び／又はＤ鎖を備えた指標分子量マーカー。
(１)鎖長がｎ塩基のＲＮＡ(これをＢ鎖とする)。
(２)鎖長がｍ塩基のＲＮＡ（これをＡ鎖とする）の3'端側に、クローニング対象ＲＮＡの3'端側に結合した3'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であるとともに、上記3'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して、上記3'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合した結合核酸鎖(これをＣ鎖とする)。
(３)上記Ｂ鎖の3'端側に、クローニング対象ＲＮＡの3'端側に結合した3'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であるとともに、上記3'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記3'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させた結合核酸鎖(これをＤ鎖とする)。
(４)Ａ鎖の3'端側に、クローニング対象ＲＮＡの3'端側に結合した3'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であって、上記3'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記3'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させるとともに、Ａ鎖の5'端側に、クローニング対象ＲＮＡの5'端側に結合した5'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であって、上記5'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記5'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させた結合核酸鎖(これをＧ鎖とする)。
(５)Ｂ鎖の3'端側に、クローニング対象ＲＮＡの3'端側に結合した3'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であって、上記3'端側核酸鎖がデオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記3'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させるとともに、Ｂ鎖の5'端側に、クローニング対象ＲＮＡの5'端側に結合した5'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であって、上記5'端側核酸鎖がデオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記5'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させた結合核酸鎖(これをＨ鎖とする)。
【請求項２】
電気泳動法により核酸鎖結合産物を分画する方法であって、請求項１に記載の指標分子量マーカーを用いて核酸鎖結合産物を分画することを特徴とする核酸鎖結合産物の分画方法。
【請求項３】
鎖長範囲がｍ塩基以上ｎ塩基以下（但しｍ：１５〜３０、ｎ：１８〜３５）であるＲＮＡのクローニングに際し、当該クローニング対象ＲＮＡの3'端側及び5'端側にそれぞれ核酸鎖を結合した核酸鎖結合産物の分画に使用するものであって、下記(１)〜(５)のＢ鎖、Ｇ鎖、Ｈ鎖を備え、且つＥ鎖及び／又はＦ鎖を備えた指標分子量マーカー。
(１)鎖長がｎ塩基のＲＮＡ(これをＢ鎖とする)。
(２)鎖長がｍ塩基のＲＮＡ（これをＡ鎖とする）の5'端側に、クローニング対象ＲＮＡの5'端側に結合した5'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であるとともに、上記5'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記5'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合した結合核酸鎖(これをＥ鎖とする)。
(３)上記Ｂ鎖の5'端側に、クローニング対象ＲＮＡの5'端側に結合した5'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であるとともに、上記5'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記5'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させた結合核酸鎖(これをＦ鎖とする)。
(４)Ａ鎖の3'端側に、クローニング対象ＲＮＡの3'端側に結合した3'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であって、上記3'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記3'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させるとともに、Ａ鎖の5'端側に、クローニング対象ＲＮＡの5'端側に結合した5'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であって、上記5'端側核酸鎖がデオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記5'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させた結合核酸鎖(これをＧ鎖とする)。
(５)Ｂ鎖の3'端側に、クローニング対象ＲＮＡの3'端側に結合した3'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であって、上記3'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記3'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させるとともに、Ｂ鎖の5'端側に、クローニング対象ＲＮＡの5'端側に結合した5'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であって、上記5'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記5'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させた結合核酸鎖(これをＨ鎖とする)。
【請求項４】
電気泳動法により核酸鎖結合産物を分画する方法であって、請求項３に記載の指標分子量マーカーを用いて核酸鎖結合産物を分画することを特徴とする核酸鎖結合産物の分画方法。
【請求項５】
鎖長範囲がｍ塩基以上ｎ塩基以下（但しｍ：１５〜３０、ｎ：１８〜３５）であるＲＮＡのクローニングに際し、当該クローニング対象ＲＮＡの3'端側及び／又は5'端側にそれぞれ核酸鎖を結合した核酸鎖結合産物の分画に使用するものであって、下記(１)〜(４)のＢ鎖、Ｇ鎖を備え、且つＣ鎖及び／又はＤ鎖を備えた指標分子量マーカー。
(１)鎖長がｎ塩基のＲＮＡ(これをＢ鎖とする)。
(２)鎖長がｍ塩基のＲＮＡ（これをＡ鎖とする）の3'端側に、クローニング対象ＲＮＡの3'端側に結合した3'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であるとともに、上記3'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記3'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合した結合核酸鎖(これをＣ鎖とする)。
(３)上記Ｂ鎖の3'端側に、クローニング対象ＲＮＡの3'端側に結合した3'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であるとともに、上記3'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記3'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させた結合核酸鎖(これをＤ鎖とする)。
(４)Ａ鎖の3'端側に、クローニング対象ＲＮＡの3'端側に結合した3'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であって、上記3'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記3'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させるとともに、Ａ鎖の5'端側に、クローニング対象ＲＮＡの5'端側に結合した5'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であって、上記5'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記5'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させた結合核酸鎖(これをＧ鎖とする)。
【請求項６】
電気泳動法により核酸鎖結合産物を分画する方法であって、請求項５に記載の指標分子量マーカーを用いて核酸鎖結合産物を分画することを特徴とする核酸鎖結合産物の分画方法。
【請求項７】
鎖長範囲がｍ塩基以上ｎ塩基以下（但しｍ：１５〜３０、ｎ：１８〜３５）であるＲＮＡのクローニングに際し、当該クローニング対象ＲＮＡの3'端側及び／又は5'端側にそれぞれ核酸鎖を結合した核酸鎖結合産物の分画に使用するものであって、下記(１)〜(４)のＢ鎖、Ｇ鎖を備え、且つＥ鎖及び／又はＦ鎖を備えた指標分子量マーカー。
(１)鎖長がｎ塩基のＲＮＡ(これをＢ鎖とする)。
(２)鎖長がｍ塩基のＲＮＡ（これをＡ鎖とする）の5'端側に、クローニング対象ＲＮＡの5'端側に結合した5'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であるとともに、上記5'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記5'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合した結合核酸鎖(これをＥ鎖とする)。
(３)上記Ｂ鎖の5'端側に、クローニング対象ＲＮＡの5'端側に結合した5'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であるとともに、上記5'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記5'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させた結合核酸鎖(これをＦ鎖とする)。
(４)Ａ鎖の3'端側にクローニング対象ＲＮＡの3'端側に結合した3'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であって、上記3'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記3'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させるとともに、Ａ鎖の5'端側に、クローニング対象ＲＮＡの5'端側に結合した5'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であって、上記5'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記5'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させた結合核酸鎖(これをＧ鎖とする)。
【請求項８】
電気泳動法により核酸鎖結合産物を分画する方法であって、請求項７に記載の指標分子量マーカーを用いて核酸鎖結合産物を分画することを特徴とする核酸鎖結合産物の分画方法。
【請求項９】
鎖長範囲がｍ塩基以上ｎ塩基以下（但しｍ：１５〜３０、ｎ：１８〜３５）であるＲＮＡのクローニングに際し、当該クローニング対象ＲＮＡの3'端側及び／又は5'端側にそれぞれ核酸鎖を結合した核酸鎖結合産物の分画に使用するものであって、下記(１)〜(４)のＢ鎖、Ｈ鎖を備え、且つＣ鎖及び／又はＤ鎖を備えた指標分子量マーカー。
(１)鎖長がｎ塩基のＲＮＡ(これをＢ鎖とする)。
(２)鎖長がｍ塩基のＲＮＡ（これをＡ鎖とする）の3'端側に、クローニング対象ＲＮＡの3'端側に結合した3'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であるとともに、上記3'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記3'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合した結合核酸鎖(これをＣ鎖とする)。
(３)上記Ｂ鎖の3'端側に、クローニング対象ＲＮＡの3'端側に結合した3'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であるとともに、上記3'端側核酸鎖がデオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記3'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させた結合核酸鎖(これをＤ鎖とする)。
(４)Ｂ鎖の3'端側に、クローニング対象ＲＮＡの3'端側に結合した3'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であって、上記3'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記3'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させるとともに、Ｂ鎖の5'端側に、クローニング対象ＲＮＡの5'端側に結合した5'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であって、上記5'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記5'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させた結合核酸鎖(これをＨ鎖とする)。
【請求項１０】
電気泳動法により核酸鎖結合産物を分画する方法であって、請求項９に記載の指標分子量マーカーを用いて核酸鎖結合産物を分画することを特徴とする核酸鎖結合産物の分画方法。
【請求項１１】
鎖長範囲がｍ塩基以上ｎ塩基以下（但しｍ：１５〜３０、ｎ：１８〜３５）であるＲＮＡのクローニングに際し、当該クローニング対象ＲＮＡの3'端側及び／又は5'端側にそれぞれ核酸鎖を結合した核酸鎖結合産物の分画に使用するものであって、下記(１)〜(４)のＢ鎖、Ｈ鎖を備え、且つＥ鎖及び／又はＦ鎖を備えた指標分子量マーカー。
(１)鎖長がｎ塩基のＲＮＡ(これをＢ鎖とする)。
(２)鎖長がｍ塩基のＲＮＡ（これをＡ鎖とする）の5'端側に、クローニング対象ＲＮＡの5'端側に結合した5'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であるとともに、上記5'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記5'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合した結合核酸鎖(これをＥ鎖とする)。
(３)上記Ｂ鎖の5'端側に、クローニング対象ＲＮＡの5'端側に結合した5'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であるとともに、上記5'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記5'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させた結合核酸鎖(これをＦ鎖とする)。
(４)Ｂ鎖の3'端側に、クローニング対象ＲＮＡの3'端側に結合した3'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であって、上記3'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記3'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させるとともに、Ｂ鎖の5'端側に、クローニング対象ＲＮＡの5'端側に結合した5'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であって、上記5'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記5'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させた結合核酸鎖(これをＨ鎖とする)。
【請求項１２】
電気泳動法により核酸鎖結合産物を分画する方法であって、請求項１１に記載の指標分子量マーカーを用いて核酸鎖結合産物を分画することを特徴とする核酸鎖結合産物の分画方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一定の鎖長範囲内に分布する低分子のリボヌクレオチド(ＲＮＡ)をクローニングするに際し、正確な指標となる核酸鎖結合産物を分画する指標分子量マーカー及びこれを用いた核酸鎖結合産物の分画方法に関するものである。
【従来の技術】
【０００２】
鎖長の短いＲＮＡ分子が細胞内で重要な機能を持っていることはヒトゲノムプロジェクトが始まった頃には全く知られていなかったが、その後のshort interference ＲＮＡ（siＲＮＡ）による遺伝子ノックダウン法の革新の後、siＲＮＡの他に、マイクロＲＮＡ（miＲＮＡ）など生体内に存在するタンパク質をコードしないＲＮＡ、すなわち非翻訳ＲＮＡ分子が様々な生命現象の機能分子として働くことがわかってきた。特にmiＲＮＡは、１９９３年に初めて見つけられた分子である。当初は線虫等の限られた生物での狭い分野の研究であったが、その後、miＲＮＡの存在は、ゲノムからメッセンジャーＲＮＡ、そして翻訳蛋白質のセントラルドクマの流れに匹敵する重要な生命機能を示していることが明らかになりつつある。
【０００３】
このような研究背景を受け、miＲＮＡ等の小分子ＲＮＡをクローニングし、塩基配列を決定していく研究も行われている。即ち、下記の非特許文献１に記載の如く、Tuschlらは、アイソトープ標識二重鎖ＲＮＡにショウジョウバエの抽出液を加えてsiＲＮＡを生じせしめ、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分画している。そして、Ｔ４ＲＮＡライゲースを用い、後の工程で行うポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための特異的塩基配列を持つ核酸オリゴマーを、最初に上記siＲＮＡの3'端側に、その次に5'端側にライゲーションし、5'端側及び3'端側に特異的な核酸配列を結合させたsiＲＮＡを得る。そして、これを逆転写反応及びＰＣＲによって、目的のsiＲＮＡのｃＤＮＡをクローニングするものである。尚、5'端側および3'端側に核酸鎖をライゲーションする工程では、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動にてそれぞれライゲーション産物を分画している。
【０００４】
また、下記の非特許文献２に記載の如く、Bartelらはアイソトープ標識ＲＮＡ分子量マーカーを指標として変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動をおこないmiＲＮＡを分画している。分画されたmiＲＮＡは、前述の方法のように、後の工程で行うポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための特異的塩基配列を持つ核酸鎖を、3'端側にライゲーションさせて結合核酸鎖を得る。この工程では指標となる１８及び２４塩基の化学合成ＲＮＡをアイソトープ標識している。そして、これらも上記miＲＮＡと同様に、3'端側に同じ核酸配列の核酸鎖をライゲーションさせ、この化学合成ＲＮＡと核酸鎖との結合核酸鎖を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動における指標として、miＲＮＡの3'端側に特異的な核酸配列を結合した結合核酸鎖の電気泳動における位置を推察し、分画している。
【０００５】
【非特許文献１】RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide ＲＮＡs. Elbashir SM, Lendeckel W, Tuschl T. Genes Dev. 2001 Jan 15;15(2):188-200.
【非特許文献２】An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Lau NC, Lim LP, Weinstein EG, Bartel DP. Science. 2001 Oct 26;294(5543):858-62.
【０００６】
しかしながら、TuschlやBartelらの方法では核酸鎖結合産物を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分画しており、副生成物、ライゲーションに用いたクローニングに用いる核酸鎖を除去できるが、アイソトープを使用しており、安全性の確保、放射性廃棄物の処理の問題が生じる。またアイソトープの利用は小分子ＲＮＡクローニングにおけるコストを大きくするものであった。
【０００７】
そこで、上記の如きアイソトープを使用せずに、小分子ＲＮＡと核酸鎖との核酸鎖結合産物を分画する方法が従来より知られている。即ち、小分子ＲＮＡに特異的な核酸配列を結合させた核酸鎖結合産物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分画する際に、簡便法として化学合成ＤＮＡ鎖を指標とする方法である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、ＤＮＡとＲＮＡは同じ鎖長でも電気泳動上異なった移動度を示すため、上記の如く化学合成ＤＮＡ鎖を指標とする方法では、小分子ＲＮＡと核酸鎖とを結合させた核酸鎖結合産物を正確に分画できず、誤った分画をするおそれが大きい。
【０００９】
本発明は上述の如き課題を解決しようとするものであって、１５塩基〜３５塩基の範囲内に分布する比較的低分子のＲＮＡをクローニングするに際し、安全性の確保、放射性廃棄物の処理等の問題が生じるアイソトープを使用せずに、誤った分画をする恐れを極めて低くするとともに副生成物等を効果的に除去し、容易に小分子ＲＮＡをクローニングする方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上述の如き課題を解決するため、本願の第１発明は、鎖長範囲がｍ塩基以上ｎ塩基以下（但しｍ：１５〜３０、ｎ：１８〜３５）であるＲＮＡのクローニングに際し、当該クローニング対象ＲＮＡの3'端側及び／又は5'端側にそれぞれ核酸鎖を結合した核酸鎖結合産物の分画に使用するものであって、下記(１)〜(５)のＢ鎖、Ｇ鎖、Ｈ鎖を備え、且つＣ鎖及び／又はＤ鎖を備えた指標分子量マーカーである。
(１)鎖長がｎ塩基のＲＮＡ(これをＢ鎖とする)。
(２)鎖長がｍ塩基のＲＮＡ（これをＡ鎖とする）の3'端側に、クローニング対象ＲＮＡの3'端側に結合した3'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であるとともに、上記3'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して、上記3'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合した結合核酸鎖(これをＣ鎖とする)。
(３)上記Ｂ鎖の3'端側に、クローニング対象ＲＮＡの3'端側に結合した3'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であるとともに、上記3'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記3'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させた結合核酸鎖(これをＤ鎖とする)。
(４)Ａ鎖の3'端側に、クローニング対象ＲＮＡの3'端側に結合した3'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であって、上記3'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記3'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させるとともに、Ａ鎖の5'端側に、クローニング対象ＲＮＡの5'端側に結合した5'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であって、上記5'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記5'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させた結合核酸鎖(これをＧ鎖とする)。
(５)Ｂ鎖の3'端側に、クローニング対象ＲＮＡの3'端側に結合した3'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であって、上記3'端側核酸鎖がデオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記3'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させるとともに、Ｂ鎖の5'端側に、クローニング対象ＲＮＡの5'端側に結合した5'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であって、上記5'端側核酸鎖がデオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記5'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させた結合核酸鎖(これをＨ鎖とする)。
【００１１】
また、本願の第２発明は、電気泳動法により核酸鎖結合産物を分画する方法であって、前記第１発明の指標分子量マーカーを用いて核酸鎖結合産物を分画するものである。
【００１２】
また、本願の第３発明は、鎖長範囲がｍ塩基以上ｎ塩基以下（但しｍ：１５〜３０、ｎ：１８〜３５）であるＲＮＡのクローニングに際し、当該クローニング対象ＲＮＡの3'端側及び5'端側にそれぞれ核酸鎖を結合した核酸鎖結合産物の分画に使用するものであって、下記(１)〜(５)のＢ鎖、Ｇ鎖、Ｈ鎖を備え、且つＥ鎖及び／又はＦ鎖を備えた指標分子量マーカーである。
(１)鎖長がｎ塩基のＲＮＡ(これをＢ鎖とする)。
(２)鎖長がｍ塩基のＲＮＡ（これをＡ鎖とする）の5'端側に、クローニング対象ＲＮＡの5'端側に結合した5'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であるとともに、上記5'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記5'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合した結合核酸鎖(これをＥ鎖とする)。
(３)上記Ｂ鎖の5'端側に、クローニング対象ＲＮＡの5'端側に結合した5'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であるとともに、上記5'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記5'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させた結合核酸鎖(これをＦ鎖とする)。
(４)Ａ鎖の3'端側に、クローニング対象ＲＮＡの3'端側に結合した3'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であって、上記3'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記3'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させるとともに、Ａ鎖の5'端側に、クローニング対象ＲＮＡの5'端側に結合した5'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であって、上記5'端側核酸鎖がデオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記5'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させた結合核酸鎖(これをＧ鎖とする)。
(５)Ｂ鎖の3'端側に、クローニング対象ＲＮＡの3'端側に結合した3'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であって、上記3'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記3'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させるとともに、Ｂ鎖の5'端側に、クローニング対象ＲＮＡの5'端側に結合した5'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であって、上記5'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記5'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させた結合核酸鎖(これをＨ鎖とする)。
【００１３】
また、本願の第４発明は、電気泳動法により核酸鎖結合産物を分画する方法であって、前記第３発明の指標分子量マーカーを用いて核酸鎖結合産物を分画するものである。
【００１４】
また、本願の第５発明は、鎖長範囲がｍ塩基以上ｎ塩基以下（但しｍ：１５〜３０、ｎ：１８〜３５）であるＲＮＡのクローニングに際し、当該クローニング対象ＲＮＡの3'端側及び／又は5'端側にそれぞれ核酸鎖を結合した核酸鎖結合産物の分画に使用するものであって、下記(１)〜(４)のＢ鎖、Ｇ鎖を備え、且つＣ鎖及び／又はＤ鎖を備えた指標分子量マーカーである。
(１)鎖長がｎ塩基のＲＮＡ(これをＢ鎖とする)。
(２)鎖長がｍ塩基のＲＮＡ（これをＡ鎖とする）の3'端側に、クローニング対象ＲＮＡの3'端側に結合した3'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であるとともに、上記3'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記3'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合した結合核酸鎖(これをＣ鎖とする)。
(３)上記Ｂ鎖の3'端側に、クローニング対象ＲＮＡの3'端側に結合した3'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であるとともに、上記3'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記3'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させた結合核酸鎖(これをＤ鎖とする)。
(４)Ａ鎖の3'端側に、クローニング対象ＲＮＡの3'端側に結合した3'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であって、上記3'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記3'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させるとともに、Ａ鎖の5'端側に、クローニング対象ＲＮＡの5'端側に結合した5'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であって、上記5'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記5'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させた結合核酸鎖(これをＧ鎖とする)。
【００１５】
また、本願の第６発明は、電気泳動法により核酸鎖結合産物を分画する方法であって、前記第５発明の指標分子量マーカーを用いて核酸鎖結合産物を分画するものである。
【００１６】
また、本願の第７発明は、鎖長範囲がｍ塩基以上ｎ塩基以下（但しｍ：１５〜３０、ｎ：１８〜３５）であるＲＮＡのクローニングに際し、当該クローニング対象ＲＮＡの3'端側及び／又は5'端側にそれぞれ核酸鎖を結合した核酸鎖結合産物の分画に使用するものであって、下記(１)〜(４)のＢ鎖、Ｇ鎖を備え、且つＥ鎖及び／又はＦ鎖を備えた指標分子量マーカーである。
(１)鎖長がｎ塩基のＲＮＡ(これをＢ鎖とする)。
(２)鎖長がｍ塩基のＲＮＡ（これをＡ鎖とする）の5'端側に、クローニング対象ＲＮＡの5'端側に結合した5'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であるとともに、上記5'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記5'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合した結合核酸鎖(これをＥ鎖とする)。
(３)上記Ｂ鎖の5'端側に、クローニング対象ＲＮＡの5'端側に結合した5'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であるとともに、上記5'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記5'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させた結合核酸鎖(これをＦ鎖とする)。
(４)Ａ鎖の3'端側にクローニング対象ＲＮＡの3'端側に結合した3'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であって、上記3'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記3'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させるとともに、Ａ鎖の5'端側に、クローニング対象ＲＮＡの5'端側に結合した5'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であって、上記5'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記5'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させた結合核酸鎖(これをＧ鎖とする)。
【００１７】
また、本願の第８発明は、電気泳動法により核酸鎖結合産物を分画する方法であって、前記第７発明の指標分子量マーカーを用いて核酸鎖結合産物を分画するものである。
【００１８】
また、本願の第９発明は、鎖長範囲がｍ塩基以上ｎ塩基以下（但しｍ：１５〜３０、ｎ：１８〜３５）であるＲＮＡのクローニングに際し、当該クローニング対象ＲＮＡの3'端側及び／又は5'端側にそれぞれ核酸鎖を結合した核酸鎖結合産物の分画に使用するものであって、下記(１)〜(４)のＢ鎖、Ｈ鎖を備え、且つＣ鎖及び／又はＤ鎖を備えた指標分子量マーカーである。
(１)鎖長がｎ塩基のＲＮＡ(これをＢ鎖とする)。
(２)鎖長がｍ塩基のＲＮＡ（これをＡ鎖とする）の3'端側に、クローニング対象ＲＮＡの3'端側に結合した3'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であるとともに、上記3'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記3'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合した結合核酸鎖(これをＣ鎖とする)。
(３)上記Ｂ鎖の3'端側に、クローニング対象ＲＮＡの3'端側に結合した3'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であるとともに、上記3'端側核酸鎖がデオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記3'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させた結合核酸鎖(これをＤ鎖とする)。
(４)Ｂ鎖の3'端側に、クローニング対象ＲＮＡの3'端側に結合した3'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であって、上記3'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記3'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させるとともに、Ｂ鎖の5'端側に、クローニング対象ＲＮＡの5'端側に結合した5'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であって、上記5'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記5'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させた結合核酸鎖(これをＨ鎖とする)。
【００１９】
また、本願の第１０発明は、電気泳動法により核酸鎖結合産物を分画する方法であって、前記第９発明の指標分子量マーカーを用いて核酸鎖結合産物を分画するものである。
【００２０】
また、本願の第１１発明は、鎖長範囲がｍ塩基以上ｎ塩基以下（但しｍ：１５〜３０、ｎ：１８〜３５）であるＲＮＡのクローニングに際し、当該クローニング対象ＲＮＡの3'端側及び／又は5'端側にそれぞれ核酸鎖を結合した核酸鎖結合産物の分画に使用するものであって、下記(１)〜(４)のＢ鎖、Ｈ鎖を備え、且つＥ鎖及び／又はＦ鎖を備えた指標分子量マーカーである。
(１)鎖長がｎ塩基のＲＮＡ(これをＢ鎖とする)。
(２)鎖長がｍ塩基のＲＮＡ（これをＡ鎖とする）の5'端側に、クローニング対象ＲＮＡの5'端側に結合した5'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であるとともに、上記5'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記5'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合した結合核酸鎖(これをＥ鎖とする)。
(３)上記Ｂ鎖の5'端側に、クローニング対象ＲＮＡの5'端側に結合した5'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であるとともに、上記5'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記5'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させた結合核酸鎖(これをＦ鎖とする)。
(４)Ｂ鎖の3'端側に、クローニング対象ＲＮＡの3'端側に結合した3'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であって、上記3'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記3'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させるとともに、Ｂ鎖の5'端側に、クローニング対象ＲＮＡの5'端側に結合した5'端側核酸鎖と同じ鎖長又は２塩基差以下の鎖長であって、上記5'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記5'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を結合させた結合核酸鎖(これをＨ鎖とする)。
【００２１】
また、本願の第１２発明は、電気泳動法により核酸鎖結合産物を分画する方法であって、前記第１１発明の指標分子量マーカーを用いて核酸鎖結合産物を分画するものである。
【発明の効果】
【００２２】
本発明は上述の如く構成したものであるため、１５塩基〜３５塩基の範囲内に分布する比較的低分子のＲＮＡのクローニングに際し、クローニング対象ＲＮＡと核酸鎖との核酸鎖結合産物の分画時にアイソトープを使用しないため、安全性を確保することができるとともに、放射性廃棄物の処理等の問題が起こることなく、扱いを容易なものとすることができる。
【００２３】
また、指標分子量マーカーを構成する核酸鎖の鎖長や種類及び構成を、クローニング対象ＲＮＡとリンカーやプライマー等の核酸鎖との核酸鎖結合産物に対応させたものとしているため、核酸鎖結合産物と指標分子量マーカーとの移動度を揃えることが可能となる。そのため、副生成物等を効果的に除去することが可能となり、誤った分画をする恐れが極めて低く、正確な指標となることができる指標分子量マーカーを得ることができる。以上より、重要な生命機能を有している小分子ＲＮＡをクローニングすることが容易になり、生命現象を明らかにして、医療、医薬、その他の生命原理の利用技術に有用に働くものとなる。
【発明の実施の形態】
【００２４】
＜クローニング対象ＲＮＡ＞
以下、本発明の実施方法および実施態様について説明する。クローニング対象ＲＮＡの鎖長はその研究目的によって異なるが、siＲＮＡ及びmiＲＮＡの鎖長は１５塩基〜３５塩基に分布し、その多くのものは、１８塩基〜２８塩基、大半は２１塩基〜２４塩基に分布する。そして、本発明の指標分子量マーカーは、特に鎖長が１５〜３５の範囲に分布する比較的低分子のＲＮＡのクローニングに使用するものである。そのため、本発明ではクローニング対象ＲＮＡの鎖長範囲をｍ塩基以上ｎ塩基以下とし、ｍを１５〜３０、ｎを１８〜３５としている。
【００２５】
そして、上記クローニング対象ＲＮＡをクローニングに際し、クローニング対象ＲＮＡの3'端側及び5'端側に、それぞれリンカーやプライマー等のクローニングに必要な塩基配列の核酸鎖を結合させる。即ち、クローニング対象ＲＮＡの3'端側に、１７塩基から２０塩基ほどの鎖長の塩基配列を持つ核酸鎖を結合させる。以下、このようにクローニング対象ＲＮＡに結合した核酸鎖を3'端側核酸鎖とする。また、クローニング対象ＲＮＡの5'端側にも同様に、１７塩基から２０塩基ほどの鎖長のリンカーやプライマー等の核酸鎖を結合する。以下、このようにクローニング対象ＲＮＡに結合した核酸鎖を5'端側核酸鎖とする。
【００２６】
また、3'端側核酸鎖及び5'端側核酸鎖は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、又は、これら各種ヌクレオチドの混合鎖により構成される。ここで、本発明における各種ヌクレオチドの混合鎖とは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及びヌクレオチド誘導体のうち、２種以上の核酸鎖が混合したものを言う。具体的には、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの混合鎖である場合、ヌクレオチド誘導体とデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドとの混合鎖である場合、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及びヌクレオチド誘導体の混合鎖である場合等がある。
【００２７】
また、結合する順序は3'端側が先でも5'端側が先でもよい。尚、3'端側が先では、以下に記載のＭ型の指標分子量マーカーを用い、5'端側が先では、以下に記載のＮ型の指標分子量マーカーを用いる。
【００２８】
＜指標分子量マーカー＞
次に、本発明の指標分子量マーカーについて説明する。
核酸鎖結合産物を分画する本発明の指標分子量マーカーは、図１及び以下に示すＢ鎖、Ｃ鎖、Ｄ鎖、Ｇ鎖、Ｈ鎖の全て又はいずれか複数を含むもの（以下、Ｍ型と呼ぶ）、又は、Ｂ鎖、Ｅ鎖、Ｆ鎖、Ｇ鎖、Ｈ鎖の全て又はいずれか複数を含むもの（以下、Ｎ型と呼ぶ）である。
【００２９】
即ち、まずクローニング対象ＲＮＡの鎖長範囲において最も短いｍ塩基のＲＮＡをＡ鎖とし、クローニング対象ＲＮＡの鎖長範囲において最も長いｎ塩基のＲＮＡをＢ鎖とする。従って、例えば鎖長範囲が１８塩基〜２８塩基のＲＮＡのクローニングに於いては、Ａ鎖は１８塩基のＲＮＡとなり、Ｂ鎖は２８塩基のＲＮＡとなる。
【００３０】
また、Ｃ鎖は、クローニング対象ＲＮＡの3'端側核酸鎖と同一又は２塩基差以下の鎖長を有するものである。また、上記3'端側核酸鎖が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖即ちＤＮＡ鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖即ちＲＮＡ鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、Ｃ鎖はこれに対応して上記3'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を、Ａ鎖の3'端側に結合したものである。即ち、3'端側核酸鎖がＤＮＡである場合は、Ｃ鎖はＤＮＡ鎖をＡ鎖の3'端側に結合したものとなり、3'端側核酸鎖がＲＮＡである場合は、Ｃ鎖はＲＮＡをＡ鎖の3'端側に結合したものとなり、また、3'端側核酸鎖がヌクレオチド誘導体である場合は、Ｃ鎖はヌクレオチド誘導体をＡ鎖の3'端側に結合したものとなる。
【００３１】
また、3'端側核酸鎖が各種ヌクレオチドの混合鎖である場合には、Ｃ鎖は、前記3'端側核酸鎖と同構成の各種ヌクレオチドの混合核酸鎖を、Ａ鎖の3'端側に結合したものとなる。尚、本発明で言う「3'端側核酸鎖と同構成の各種ヌクレオチドの混合核酸鎖」とは、3'端側核酸鎖が混合鎖である場合において、Ｃ鎖は、前記3'端側核酸鎖と同種のヌクレオチドを混合した混合核酸鎖をＡ鎖の3'端側に結合したものとなる。また、この混合核酸鎖の各種ヌクレオチドの鎖長は、それぞれ5'端側核酸鎖の各種ヌクレオチドの鎖長と同一、又は２塩基差以内であり、且つ前記混合核酸鎖の全長を、5'端側核酸鎖の鎖長と同一又は２塩基差以内としている。また、以下のＤ鎖、Ｇ鎖、Ｈ鎖についても同様である。
【００３２】
従って、例えば3'端側核酸鎖がＤＮＡであってその鎖長が１８塩基である場合は、Ｃ鎖は、１６塩基〜２０塩基のＤＮＡ鎖を１８塩基のＡ鎖の3'端側に結合したものとなり、その全鎖長は３４塩基〜３８塩基となる。
【００３３】
また、Ｄ鎖は、クローニング対象ＲＮＡの3'端側核酸鎖と同一又は２塩基差以下の鎖長を有するものである。また、上記3'端側核酸鎖がデオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記3'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を、Ｂ鎖の3'端側に結合したものである。即ち、3'端側核酸鎖がＤＮＡである場合は、Ｄ鎖はＤＮＡ鎖をＢ鎖の3'端側に結合したものとなり、3'端側核酸鎖がＲＮＡである場合は、Ｄ鎖はＲＮＡをＢ鎖の3'端側に結合したものとなり、また、3'端側核酸鎖がヌクレオチド誘導体である場合は、Ｄ鎖はヌクレオチド誘導体をＢ鎖の3'端側に結合したものとなる。また、3'端側核酸鎖が各種ヌクレオチドの混合鎖である場合には、Ｄ鎖は、前記3'端側核酸鎖と同構成の各種ヌクレオチドの混合核酸鎖を、Ｂ鎖の3'端側に結合したものとなる。
【００３４】
従って、例えば3'端側核酸鎖がＤＮＡであって鎖長が１８塩基である場合は、Ｄ鎖は、１６塩基〜２０塩基のＤＮＡを、２８塩基のＢ鎖の3'端側に結合したものとなり、全鎖長は４４塩基〜４８塩基となる。
【００３５】
また、Ｅ鎖は、クローニング対象ＲＮＡの5'端側核酸鎖と同一又は２塩基差以下の鎖長を有し、且つ、5'端側核酸鎖がデオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記5'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を、Ａ鎖の5'端側に結合したものである。即ち、5'端側核酸鎖がＤＮＡである場合は、Ｅ鎖はＤＮＡ鎖をＡ鎖の5'端側に結合したものとなり、5'端側核酸鎖がＲＮＡである場合は、Ｅ鎖はＲＮＡをＡ鎖の5'端側に結合したものとなり、また、5'端側核酸鎖がヌクレオチド誘導体である場合は、Ｅ鎖はヌクレオチド誘導体をＡ鎖の5'端側に結合したものとなる。
【００３６】
また、5'端側核酸鎖が各種ヌクレオチドの混合鎖である場合には、Ｅ鎖は、前記5'端側核酸鎖と同構成の各種ヌクレオチドの混合核酸鎖を、Ａ鎖の5'端側に結合したものとなる。尚、本発明で言う「5'端側核酸鎖と同構成の各種ヌクレオチドの混合核酸鎖」とは、5'端側核酸鎖が混合鎖である場合において、Ｅ鎖は、Ａ鎖の5'端側に、前記5'端側核酸鎖と同種のヌクレオチドを混合した混合核酸鎖を結合したものとなる。また、この混合核酸鎖の各種ヌクレオチドの鎖長は、それぞれ5'端側核酸鎖の各種ヌクレオチドの鎖長と同一、又は２塩基差以内であり、且つ前記混合核酸鎖の全長を、5'端側核酸鎖の鎖長と同一又は２塩基差以内としている。また、以下のＦ鎖、Ｇ鎖、Ｈ鎖についても同様である。
【００３７】
従って、例えば5'端側核酸鎖が１７塩基のＲＮＡである場合は、Ｅ鎖は、１５塩基〜１９塩基のＲＮＡを、１８塩基のＡ鎖の5'端側に結合した核酸鎖であって、その全鎖長は３３塩基〜３７塩基となる。
【００３８】
また、Ｆ鎖は、クローニング対象ＲＮＡの5'端側核酸鎖と同一又は２塩基差以下の鎖長を有し、且つ、5'端側核酸鎖がデオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、これに対応して上記5'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖を、Ｂ鎖の5'端側に結合したものである。即ち、上記5'端側核酸鎖がＤＮＡである場合は、Ｆ鎖はＤＮＡ鎖をＢ鎖の5'端側に結合したものとなり、5'端側核酸鎖がＲＮＡである場合は、Ｆ鎖はＲＮＡをＢ鎖の5'端側に結合したものとなり、また、5'端側核酸鎖がヌクレオチド誘導体である場合は、Ｆ鎖はヌクレオチド誘導体をＢ鎖の5'端側に結合したものとなる。また、5'端側核酸鎖が各種ヌクレオチドの混合鎖である場合には、Ｆ鎖は、前記5'端側核酸鎖と同構成の各種ヌクレオチドの混合核酸鎖をＢ鎖の5'端側に結合したものとなる。
【００３９】
従って、例えば5'端側核酸鎖が１７塩基のＲＮＡである場合は、Ｆ鎖は、１５塩基〜１９塩基のＲＮＡを、２８塩基のＢ鎖の5'端側に結合した核酸鎖であって、その全鎖長は４３塩基〜４７塩基となる。
【００４０】
また、Ｇ鎖は、クローニング対象ＲＮＡの3'端側核酸鎖と同一又は２塩基差以下の鎖長を有する核酸鎖を、Ａ鎖の3'端側に結合するとともに、クローニング対象ＲＮＡの5'端側核酸鎖と同一又は２塩基差以下の鎖長を有する核酸鎖を、Ａ鎖の5'端側に結合した核酸鎖である。また、3'端側核酸鎖がデオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合、Ａ鎖の3'端側に結合させる核酸鎖は、これに対応して上記3'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖となるとともに、5'端側核酸鎖がデオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、Ａ鎖の5'端側に結合させる核酸鎖は、これに対応して上記5'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖となる。
【００４１】
即ち、クローニング対象ＲＮＡの3'端側核酸鎖がＤＮＡである場合は、Ｇ鎖はＤＮＡ鎖をＡ鎖の3'端側に結合したものとなり、3'端側核酸鎖がＲＮＡである場合は、Ｇ鎖はＲＮＡをＡ鎖の3'端側に結合したものとなり、また、3'端側核酸鎖がヌクレオチド誘導体である場合は、Ｇ鎖はヌクレオチド誘導体をＡ鎖の3'端側に結合したものとなる。また、3'端側核酸鎖が各種ヌクレオチドの混合鎖である場合には、Ｇ鎖は、前記3'端側核酸鎖と同構成の各種ヌクレオチドの混合核酸鎖をＡ鎖の3'端側に結合したものとなる。
【００４２】
また、クローニング対象ＲＮＡの5'端側核酸鎖がＤＮＡである場合は、Ｇ鎖はＤＮＡ鎖をＡ鎖の5'端側に結合したものとなり、5'端側核酸鎖がＲＮＡである場合は、Ｇ鎖はＲＮＡをＡ鎖の5'端側に結合したものとなり、また、5'端側核酸鎖がヌクレオチド誘導体である場合は、Ｇ鎖はヌクレオチド誘導体をＡ鎖の5'端側に結合したものとなる。また、5'端側核酸鎖が各種ヌクレオチドの混合鎖である場合には、Ｇ鎖は、前記5'端側核酸鎖と同構成の各種ヌクレオチドの混合核酸鎖をＡ鎖の5'端側に結合したものとなる。
【００４３】
従って、例えば3'端側核酸鎖が１８塩基で塩基配列がＤＮＡであるとともに、5'端側核酸鎖が１７塩基で塩基配列がＲＮＡである場合は、Ｇ鎖は、Ａ鎖の3'端側に、鎖長が１６塩基〜２０塩基であるＤＮＡを結合するとともに、Ａ鎖の5'端側に、鎖長が１５塩基〜１９塩基のＲＮＡを結合した核酸鎖となる。また、Ｇ鎖の全鎖長は、４９塩基〜５７塩基となる。
【００４４】
また、Ｈ鎖は、クローニング対象ＲＮＡの3'端側核酸鎖と同一又は２塩基差以下の鎖長を有する核酸鎖を、Ｂ鎖の3'端側に結合するとともに、クローニング対象ＲＮＡの5'端側核酸鎖と同一又は２塩基差以下の鎖長を有する核酸鎖を、Ｂ鎖の5'端側に結合した核酸鎖である。また、3'端側核酸鎖がデオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、Ｂ鎖の3'端側に結合させる核酸鎖は、これに対応して上記3'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖となるとともに、5'端側核酸鎖がデオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖である場合は、Ｂ鎖の5'端側に結合させる核酸鎖は、これに対応して上記5'端側核酸鎖と同種又は同構成とした核酸鎖となる。
【００４５】
即ち、クローニング対象ＲＮＡの3'端側核酸鎖がＤＮＡである場合は、Ｈ鎖はＤＮＡ鎖をＢ鎖の3'端側に結合したものとなり、3'端側核酸鎖がＲＮＡである場合は、Ｈ鎖はＲＮＡをＢ鎖の3'端側に結合したものとなり、また、3'端側核酸鎖がヌクレオチド誘導体である場合は、Ｈ鎖はヌクレオチド誘導体をＢ鎖の3'端側に結合したものとなる。また、3'端側核酸鎖が各種ヌクレオチドの混合鎖である場合には、Ｈ鎖は、前記3'端側核酸鎖と同構成の各種ヌクレオチドの混合核酸鎖を、Ｂ鎖の3'端側に結合したものとなる。
【００４６】
また、クローニング対象ＲＮＡの5'端側核酸鎖がＤＮＡである場合は、Ｈ鎖はＤＮＡ鎖をＢ鎖の5'端側に結合したものとなり、5'端側核酸鎖がＲＮＡである場合は、Ｈ鎖はＲＮＡをＢ鎖の5'端側に結合したものとなり、また、5'端側核酸鎖がヌクレオチド誘導体である場合は、Ｈ鎖はヌクレオチド誘導体をＢ鎖の5'端側に結合したものとなる。また、5'端側核酸鎖が各種ヌクレオチドの混合鎖である場合には、Ｈ鎖は、前記5'端側核酸鎖と同構成の各種ヌクレオチドの混合核酸鎖を、Ｂ鎖の5'端側に結合したものとなる。
【００４７】
従って、例えば3'端側核酸鎖が１８塩基で塩基配列がＤＮＡであるとともに、5'端側核酸鎖が１７塩基で塩基配列がＲＮＡである場合は、Ｈ鎖は、Ｂ鎖の3'端側に、鎖長が１６塩基〜２０塩基であるＤＮＡを結合するとともに、Ｂ鎖の5'端側に、鎖長が１５塩基〜１９塩基のＲＮＡを結合した核酸鎖となる。また、Ｈ鎖の全鎖長は、５９塩基〜６７塩基となる。
【００４８】
上記の如く、クローニング対象ＲＮＡの3'端側及び／又は5'端側の核酸鎖の塩基配列が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖により構成されている場合に、Ｃ鎖〜Ｈ鎖において、Ａ鎖及びＢ鎖の3'端側及び／又は5'端側に結合させる核酸鎖を、クローニング対象ＲＮＡの3'端側及び／又は5'端側の核酸鎖に対応させて、3'端側及び／又は5'端側の核酸鎖と同種又は同構成の核酸鎖とすることにより、核酸鎖結合産物の電気泳動上の移動度を指標分子量マーカーとほぼ同一のものとすることが可能となる。そのため、核酸鎖結合産物の分画をより正確なものとすることが可能となる。
【００４９】
また、Ｍ型の指標分子量マーカーに於いて、Ｂ鎖とＣ鎖の鎖長差が７塩基差以内、好ましくは３塩基差以内であれば、Ｂ鎖又はＣ鎖のいずれか一方を省略することが可能である。このようにＢ鎖又はＣ鎖のいずれか一方を省略しても、Ｂ鎖とＣ鎖の鎖長が極めて近いか同一であるため、分画の際に、目的とする核酸鎖結合産物以外の核酸鎖が混在する可能性が極めて低いものとなる。従って、目的とする核酸鎖結合産物の正確な分画が可能となる。また、上記と同様の理由によって、Ｄ鎖とＧ鎖の鎖長差が６塩基以内、好ましくは３塩基以内であれば、Ｄ鎖又はＧ鎖のいずれか一方を省略することが可能である。
【００５０】
また、Ｎ型の指標分子量マーカーに於いても同様に、Ｂ鎖とＥ鎖の鎖長差が７塩基差以内、好ましくは３塩基差以内であれば、Ｂ鎖又はＥ鎖のいずれか一方を省略することが可能であるとともに、Ｆ鎖又はＧ鎖の鎖長差が６塩基差以内、好ましくは３塩基差以内であれば、Ｆ鎖又はＧ鎖のいずれか一方を省略することができる。
【００５１】
＜指標分子量マーカーによる核酸鎖複合産物の分画方法＞
次に、上記の如く作成したＭ型の指標分子量マーカーによる測定方法について説明する。
１  クローニング対象ＲＮＡと、このクローニング対象ＲＮＡの3'端側に結合させる核酸鎖との結合
精製単離したクローニング対象ＲＮＡを、場合によっては脱リン酸化し、逆転写反応に用いる塩基配列を持つ核酸鎖を結合させて、3'端側核酸鎖結合産物を形成する。上記3'端側核酸鎖の塩基配列は、クローニングに使用できるものであれば特に限定されず、また、鎖長を１５塩基〜３５塩基とするのが好ましい。
【００５２】
２  3'端側核酸鎖結合産物の電気泳動での分離
次に、上記の如く形成した3'端側核酸鎖結合産物は電気泳動に供せられる。尚、本発明では、siＲＮＡ及びmiＲＮＡ等の比較的低分子のＲＮＡをクローニングの対象としているため、特に分子ふるい効果の高いポリアクリルアミドゲル電気泳動を行うのが好ましい。そして、上記3'端側核酸鎖結合産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動に供する場合には、本発明の指標分子量マーカーと並べて核酸鎖結合産物をポリアクリルアミドゲルのウェルにロードする。
【００５３】
上記指標分子量マーカーは、広い鎖長範囲に分布する3'端側核酸鎖結合産物のうち、目的とする鎖長範囲の展開領域を挟む核酸バンドを含んでいる。そのため、電気泳動を行うことにより、展開された3'端側核酸鎖結合産物のうち、目的とする鎖長範囲の3'端側核酸鎖結合産物が指標分子量マーカーにより明示され、この3'端側核酸鎖結合産物画分を得ることができる。
【００５４】
３  3'端側核酸鎖結合産物と、クローニング対象ＲＮＡの5'端側に結合させる核酸鎖との結合
上記の如く分画した3'端側核酸鎖結合産物画分は、上記１の工程でクローニング対象ＲＮＡをリン酸化した場合には、リン酸化する。そして、上記の如く3'端側に核酸鎖を結合したクローニング対象ＲＮＡの5'端側に、逆転写反応に用いる塩基配列を持つ核酸鎖を結合させる。尚、クローニング対象ＲＮＡの5'端側に結合させる核酸鎖の塩基配列は、クローニングに使用できるものであれば特に限定されず、また、鎖長を１５塩基〜３０塩基とするのが好ましい。
【００５５】
４  3'端側及び5'端側核酸鎖結合産物のポリアクリルアミドゲル電気泳動での分離
上記の如く結合した3'端側及び5'端側核酸鎖結合産物は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供せられる。即ち、3'端側及び5'端側核酸鎖結合産物を、本発明の指標分子量マーカーと並べてポリアクリルアミドゲルのウェルにロードする。尚、上記指標分子量マーカーは、目的とする鎖長範囲の3'端側及び5'端側核酸鎖結合産物の展開領域を挟む核酸バンドを含んでいる。そして、電気泳動を行い、この電気泳動により展開された3'端側及び5'端側核酸鎖ＲＮＡのうち、目的とする鎖長範囲の3'端側及び5'端側核酸鎖結合産物が指標分子量マーカーにより明示され、この3'端側及び5'端側核酸鎖結合産物画分を得ることができる。
【００５６】
５  逆転写反応による3'端側及び5'端側核酸鎖結合産物からのｃＤＮＡの作製
上記の如く分画した3'端側及び5'端側核酸鎖結合産物に逆転写用プライマーをアニーリングさせる。その後、逆転写反応により3'端側及び5'端側核酸鎖結合産物に相補的なｃＤＮＡを合成する。そして、更にこのｃＤＮＡの相補鎖が合成され、場合によってはＰＣＲ等により増幅され、プラスミドベクターにクローニングされる。
【００５７】
また、Ｎ型の指標分子量マーカーについても、上記Ｍ型の指標分子量マーカーと同様にして3'端側及び5'端側核酸鎖結合産物画分を得ることができ、その工程は以下の通りである。
１  クローニング対象ＲＮＡと、このクローニング対象ＲＮＡの5'端側に結合させる核酸鎖との結合
２  5'端側核酸鎖結合産物の電気泳動での分離
３  5'端側核酸鎖結合産物と、当該5'端側核酸鎖結合産物クローニング対象ＲＮＡの3'端側に結合させる核酸鎖との結合
４  3'端側及び5'端側核酸鎖結合産物のポリアクリルアミドゲル電気泳動での分離
５  逆転写反応による3'端側及び5'端側核酸鎖結合産物からのｃＤＮＡの作製
【００５８】
ここで、一例として、鎖長範囲が１８塩基〜２８塩基であるクローニング対象ＲＮＡのクローニングの際の、Ｍ型の指標分子量マーカーを使用した核酸鎖結合産物の抽出方法について、以下に詳細に説明する。
【００５９】
まず、クローニング対象ＲＮＡの3'端側に１８塩基の核酸鎖を結合させて、3'端側核酸鎖結合産物を得る。このように、最初にクローニング対象ＲＮＡの3'端側から核酸鎖を結合させる場合には、Ｍ型の指標分子量マーカーを用いる。そして、この3'端側核酸鎖結合産物を、Ｍ型の指標分子量マーカーを並べてポリアクリルアミドゲル電気泳動に供与する。尚、図１に電気泳動におけるＭ型及びＮ型の指標分子量マーカーの移動度を模式的に示す。
【００６０】
上記Ｍ型の指標分子量マーカーは、好ましくは２８塩基鎖（Ｂ鎖）、３６塩基鎖（Ｃ鎖）、４６塩基鎖の核酸鎖（Ｄ鎖）、５３塩基鎖（Ｇ鎖）、６３塩基鎖（Ｈ鎖）を含み、電気泳動において、Ｍ型指標分子量マーカーの３６塩基鎖（Ｃ鎖）と４６塩基鎖（Ｄ鎖）を指標に、３６塩基〜４６塩基に分布する3'端側核酸鎖結合産物が明示される。
【００６１】
この時、クローニング対象ＲＮＡの3'端側に結合した核酸鎖の塩基配列が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖で構成されている場合は、Ａ鎖及びＢ鎖の3'端側に結合させる核酸鎖の塩基配列を、クローニング対象ＲＮＡの3'端側に結合した核酸鎖と同種又は同構成の核酸鎖としている。そのため、電気泳動上の移動度をより正確なものとすることが可能となり、３６塩基〜４６塩基の3'端側核酸鎖結合産物を確実に分画することができる。そして、Ｍ型指標分子量マーカーの３６塩基鎖（Ｃ鎖）と４６塩基鎖（Ｄ鎖）を指標に、３６塩基〜４６塩基の3'端側核酸鎖結合産物をゲルから切り出して抽出する。
【００６２】
次に、3'端側核酸鎖結合産物のクローニング対象ＲＮＡの5'端側に、１７塩基の核酸鎖を結合させ、3'端側及び5'端側核酸鎖結合産物を作製する。この5'端側の核酸鎖の結合に伴い、目的とする鎖長範囲の3'端側及び5'端側核酸鎖結合産物は、５３塩基〜６３塩基に分布するものとなる。そして、上記の如く作製した3'端側及び5'端側核酸鎖結合産物と、Ｍ型の指標分子量マーカーとを並べてポリアクリルアミドゲル電気泳動を行う。この電気泳動により、Ｍ型の指標分子量マーカーの５３塩基鎖（Ｇ鎖）と６３塩基鎖（Ｈ鎖）を指標に、５３塩基〜６３塩基に分布する3'端側及び5'端側核酸鎖結合産物が明示される。
【００６３】
この時、上記3'端側核酸鎖結合産物のクローニング対象ＲＮＡの5'端側に結合した核酸鎖の塩基配列が、デオキシリボヌクレオチドから成る核酸鎖、リボヌクレオチドから成る核酸鎖、ヌクレオチド誘導体から成る核酸鎖、又は、上記各種ヌクレオチドの混合鎖で構成されている場合は、Ｇ鎖中のＡ鎖、及びＨ鎖中のＢ鎖の5'端側に結合させる核酸鎖を、クローニング対象ＲＮＡの5'端側に結合した核酸鎖に対応させた同種又は同構成の核酸鎖としている。そのため、５３塩基〜６３塩基の3'端側及び5'端側核酸鎖結合産物を、より正確に分画することができる。
【００６４】
そして、Ｍ型の指標分子量マーカーの５３塩基鎖（Ｇ鎖）と６３塩基鎖（Ｈ鎖）を指標に５３塩基〜６３塩基の3'端側及び5'端側核酸鎖結合産物をゲルから切り出して抽出し、以後のクローニング操作を行う。尚、上記ではクローニング対象ＲＮＡの3'端側から先に核酸鎖を結合させるためＭ型の指標分子量マーカーを使用しているが、5'端側から先に結合する場合は、Ｎ型の指標分子量マーカーを用い、上記と同様の工程を経ることにより、3'端側及び／又は5'端側核酸鎖結合産物の抽出を行うことができる。
【実施例１】
【００６５】
本発明の実施例１として、指標分子量マーカーを用いたクローニング対象ＲＮＡのクローニング実験について、以下に詳細に示す。本実施例では鎖長範囲が１８塩基〜２８塩基の小分子ＲＮＡをクローニング対象ＲＮＡとしており、この小分子ＲＮＡの3'端側に結合する3'端側核酸鎖は、以下に示す3'リンカーであるとともに、5'端側に結合する5'端側核酸鎖は、以下に示す5'リンカーである。また、3'リンカーは１８塩基のＤＮＡ鎖であり、5'リンカーは１７塩基のＲＮＡ鎖である。
１．ライゲーション産物を分画する指標分子量マーカーの作製
核酸自動合成機（アプライドバイオシステム社製）を用いて、上記の小分子ＲＮＡ、3'端側核酸鎖、及び5'端側核酸鎖に基づき、図３及び以下に示すA-1鎖、B-1鎖、C-1鎖、D-1鎖、G-1鎖、H-1鎖の核酸オリゴマーを合成した。図３に示す如く、A-1鎖及びB-1鎖はＲＮＡの核酸鎖であり、C-1鎖、D-1鎖、G-1鎖、H-1鎖はＲＮＡ鎖とＤＮＡ鎖から成る核酸鎖である。
【００６６】
また、上記核酸鎖の合成に際しては、アクチベーター試薬としてテトラゾール／アセトニトリル溶液（アプライドバイオシステム社製）、キャッピング試薬として無水酢酸／ピリジン／テトラハイドロフラン（アプライドバイオシステム社製）、1-メチルイミダゾール／テトラハイドロフラン（アプライドバイオシステム社製）、酸化試薬として、イオジン／水／ピリジン／テトラハイドロフラン（アプライドバイオシステム社製）、脱保護試薬として、トリクロロ酢酸／ジクロロメタン（アプライドバイオシステム社製）を用いた。
【００６７】
そして、A-1鎖とB-1鎖は、ＲＮＡホスホアミダイトを用いて核酸自動合成機のＲＮＡ合成プログラムによって合成した。また、C-1鎖、D-1鎖、G-1鎖、H-1鎖は、核酸自動合成機に2',3'-ジデオキシチジンヌクレオシドCPGサポートをセットし、ＤＮＡ合成プログラムによってＤＮＡ鎖を合成した後、ＤＮＡアミダイド試薬を、ＲＮＡアミダイド試薬に変えて、ＲＮＡ合成プログラムにより合成した。
【００６８】
上記合成反応によってA-1鎖、B-1鎖、C-1鎖、D-1鎖、G-1鎖、H-1鎖の合成核酸鎖を得た後、核酸自動合成機から、前記合成核酸鎖が結合したCPGサポートを入れたカラムを取り出した。そして、このカラムに入った合成核酸鎖結合CPGサポートをアンモニウムヒドロキシド：エタノール溶液（1:1）に入れて、55℃で反応させた。そして3時間後、冷蔵庫に移して冷やし、その後、溶液中のCPGサポートの沈殿を含まないよう上精を取った。そして、更に沈殿をエタノール：アセトニトリル：水(3:1:1)で洗い、この洗浄液も上精に加えた後、該上精を真空乾燥機にて乾燥固化させた。
【００６９】
上記の如く固化させた乾固物を、トリエチルアミントリヒドロフルオリド：ジメチルホルムアミド(3:1)にて溶解し、55℃で2時間反応させた。そして、反応物をセファデックスG25カラムに通して脱塩した後、真空乾燥機にて乾燥固化させた。
【００７０】
そして、A-1鎖以外のB-1鎖、C-1鎖、D-1鎖、G-1鎖、H-1鎖を、YMC-Pack Pro C18カラム（YMC社製, S-5 μm, 12 nm  250×10 mm（内径））を用い、HPLC（東ソー社製）によりアセトニトリルを含む酢酸アンモニウム水溶液 pH 5.9でアセトニトリル勾配で分離した。そして、このように分離した分離液を、UV-8020（東ソー社製）でモニターして精製画分を集め、これら画分を真空乾燥機にて乾燥固化させて少量の超純水に溶かした後、セファデックスG25カラムで脱塩した。
【００７１】
更に、A-1鎖及びB-1鎖は、それぞれ200 μgを、200ユニットのT4ポリヌクレオキナーゼ、2 μmolのATPと50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM MgCl2, 5 mM DTTの緩衝液中で37℃、1時間で反応させた後、5'末端をリン酸化させ、反応後の溶液をセファデックスG25カラムで脱塩した。そして、この溶液を等量のTE緩衝液（10mM Tris-HC1, 1mM EDTA（pH8.0））飽和フェノールで抽出し、続いて等量のクロロホルムで2回抽出後、終濃度0.3 Mの酢酸ナトリウム、終濃度0.1 μg/mlのグリコーゲンを加えた。
【００７２】
その後、3.5倍量のエタノールを加え、混合後-80℃に約1時間置いた後、微量高速遠心分離機（CF150、日立製作所製）に上記のエタノール混合液が入ったチューブをセットし、15,000 rpm、10分、4℃で回転させて沈殿を生じせしめた。上記チューブから上精を吸引除去し、エタノール沈殿をバキュウムエバポレーター（岩城硝子株式会社）で乾固した。
【００７３】
そして、上記A-1鎖及びB-1鎖の乾固物は超純水にて再溶解し溶液にした後、また、C-1鎖、D-1鎖、G-1鎖、H-1鎖の水溶液はそのまま、分光々度計（日立製作所製）にて核酸濃度を測定した。そして、この測定値をもとに核酸鎖を混ぜ、図３及び以下に示すA-1鎖、B-1鎖、C-1鎖、D-1鎖、G-1鎖、H-1鎖を含む、0.12 μg/μlの Ｍ型の指標分子量マーカー（以下、ＧＳＭとする。）を作製した。
【００７４】
A-1鎖(配列表の配列番号１)
ugagguaguagguuguau
B-1鎖(配列表の配列番号２)
agaagucagcaacuugauuccagcagua
C-1鎖(配列表の配列番号３)
ugagguaguagguuguauctatagttcgggtcaatddc
D-1鎖(配列表の配列番号４)
agaagucagcaacuugauuccagcaguactatagttcgggtcaatddc
G-1鎖(配列表の配列番号５)
cauacucuaaagcaaccagaagucagcaacuugauctatagttcgggtcaatddc
H-1鎖(配列表の配列番号６)
cauacucuaaagcaaccagaagucagcaacuugauuccagcaguactatagttcgggtcaatddc
尚、C-1鎖、D-1鎖、G-1鎖、及びH-1鎖末端の「ddc」は、ジデオキシシチジンヌクレオチドである。
【００７５】
上記の如く、A-1鎖は１８塩基、B-1鎖は２８塩基、C-1鎖は３６塩基、D-1鎖は４６塩基、G-1鎖は５３塩基、H-1鎖は６３塩基である。  また、上記A-1鎖は、小分子ＲＮＡの鎖長範囲のうち、最も短い鎖長のＲＮＡ鎖であり、B-1鎖は最も長い鎖長のＲＮＡ鎖である。また、C-1鎖は、１８塩基のＲＮＡ鎖(ugagguaguagguuguau)の3'端側に、小分子ＲＮＡの3'端側核酸鎖と同一鎖長及び同種の核酸鎖である１８塩基のＤＮＡ鎖(ctatagttcgggtcaatddc)を結合したものである。また、D-1鎖は、２８塩基のＲＮＡ鎖(agaagucagcaacuugauuccagcagua)の3'端側に、小分子ＲＮＡの3'端側核酸鎖と同一鎖長及び同種の核酸鎖である１８塩基のＤＮＡ鎖(ctatagttcgggtcaatddc)を結合したものである。また、G-1鎖は、１８塩基のＲＮＡ鎖(agaagucagcaacuugau)の3'端側に、小分子ＲＮＡの3'端側核酸鎖と同一鎖長及び同種の核酸鎖である１８塩基のＤＮＡ鎖(ctatagttcgggtcaatddc)を結合するとともに、5'端側に、小分子ＲＮＡの5'端側核酸鎖と同一鎖長及び同種の核酸鎖である１７塩基のＲＮＡ鎖(cauacucuaaagcaacc)を結合したものである。
【００７６】
また、H-1鎖は、２８塩基のＲＮＡ鎖(agaagucagcaacuugauuccagcagua)の3'端側に、小分子ＲＮＡの3'端側核酸鎖と同一鎖長及び同種の核酸鎖である１８塩基のＤＮＡ鎖(ctatagttcgggtcaatddc)を結合するとともに、5'端側に、小分子ＲＮＡの5'端側核酸鎖と同一鎖長及び同種の核酸鎖である１７塩基のＲＮＡ鎖(cauacucuaaagcaacc)を結合したものである。上記の如く、ＧＳＭの各核酸鎖を、小分子ＲＮＡの3'端側核酸鎖、及び5'端側核酸鎖の鎖長及び種類に対応させたものとすることにより、電気泳動における移動度の誤差を生じにくいものとし、正確な核酸鎖結合産物の分画を行うことが可能となる。
【００７７】
また、上記A-1鎖、B-1鎖、C-1鎖、 D-1鎖、G-1鎖、H-1鎖と同様に、以下のクローニング用5'リンカー、3'リンカー、5'プライマー、3'プライマーも核酸自動合成機にて合成した。尚、3'リンカーについては2-[2-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)エチルスルフォニル]エチル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホアミアイトを合成反応の最終サイクルで用い、5'末端をリン酸化した。      3'リンカー       pctgtaactcgggtcaatddc(配列表の配列番号７)
5'リンカー        aucgucucgggaugaaa(配列表の配列番号８)
3'プライマー      5'attgacccgagttacag(配列表の配列番号９)
5'プライマー      5'atcgtctcgggatgaaa(配列表の配列番号１０)
尚、3'リンカーは１８塩基であり、5'リンカー、3'プライマー、及び5'プライマーは全て１７塩基である。
【００７８】
そして、核酸自動合成機上でアンモニア水にてCPGサポートからＤＮＡ鎖を切り出した後、アンモニア水で55℃で18時間処理する。その後、真空乾燥機にて乾燥固化させ、最終的に5'リンカー及び3'リンカーは100 μM、5'プライマー及び3'プライマーは50 μMになるよう、超純水に溶解した。
【００７９】
２．チャイニーズハムスター卵巣細胞からの全ＲＮＡの抽出と１８塩基〜２８塩基の小分子ＲＮＡの分画
チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）を10 %の仔牛血清（ハイクローン社製）、100 U/mlのペニシリン、100 U/mlのストレプトマイシン、1.25 μg/ml のFungizone  (インビトロゲン株式会社製)、を含むα-MEM (インビトロゲン株式会社製)培地を用い、150cm2フラスコ5個にて炭酸ガス培養器内で37℃で培養し、これから細胞を採取した。尚、細胞の採取は、上記フラスコにTrypsin-EDTA溶液（0.05 % Trypsin, 0.53 mM EDTA ・4Na）を加え、細胞をフラスコ壁面からはずした。そして、上記細胞をリン酸緩衝液にて洗浄後、低速遠心分離で回収し、液体窒素で直ちに凍結した。
【００８０】
そして、上記の如く凍結した全凍結CHO細胞から、Piotr Chomczynskiらの方法で全ＲＮＡを抽出し(Single-step method of ＲＮＡ isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Chomczynski P. and Sacchi N. 1987. Anal. Biochem. 162:156-159.) 、エタノール沈殿を行うことにより乾固した全ＲＮＡを得た。そして、この全ＲＮＡを 20 μlのＲＮＡ Loading buffer PA（株式会社バイオダイナミクス研究所製）に溶解して混合した。また、10 μlの0.12 μg/μl ＧＳＭを10 μlのＲＮＡ Loading buffer PAと混合した。そして、上記の各混合液は、70℃で3分間処理した後、直ちに氷上に置いた。
【００８１】
そして、上記の熱処理液を、7.5 M尿素を含む15 %ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲルの厚みは1.5 mm、レーンの幅は23 mm）に供与した。電気泳動は1 × TBE緩衝液（89 mM Tris-Borate, 2 mM EDTA）にて行い、ＲＮＡ Loading buffer PAに含まれるブロモフェノールブルー色素が、ポリアクリルアミドゲル端の約2 cmのところまで移動したところで止めた。
【００８２】
そして、電気泳動装置からポリアクリルアミドゲルを外してトレイに移し、Gel Indicator ＲＮＡ Staining Solution（株式会社バイオダイナミクス研究所製）にて約30分間室温にて染色した。このように染色されたゲルは、ＧＳＭの各バンドが青く染色されていた。ゲルにおいてＧＳＭの各バンドが染色された状態を、図４に示す。そして、ＧＳＭのA-1鎖(１８塩基)とB-1鎖(２８塩基)のバンドに挟まれるゲルを全ＲＮＡをロードしたレーンから切り出し、このゲルの重量を測った。その後、上記の如く切り出したゲルをかみそりの刃で更に細かく切り刻み、これにＲＮＡ Extraction Buffer（20mM Tris-Cl (pH8), 0.1 mM EDTA, 0.3M NaCl, 0.1 % SDS）をゲルの3倍量加え、ゆっくり震盪して、クローニング対象ＲＮＡである１８塩基〜２８塩基の小分子ＲＮＡ画分を抽出した。
【００８３】
尚、本実施例では上記の如く、A-1鎖、B-1鎖、C-1鎖、D-1鎖、G-1鎖、H-1鎖を含むＧＳＭを用いて、当該ＧＳＭのA-1鎖とB-1鎖から、１８塩基〜２８塩基の小分子ＲＮＡを分画し、この小分子ＲＮＡ画分を以下の更なる分画に用いているが、他の異なる実施例では、任意の方法により分画した１８塩基〜２８塩基の小分子ＲＮＡ画分を予め準備しておき、以下の更なる分画に用いることも可能である。この場合、小分子ＲＮＡの分画にのみ使用するＡ鎖は必要ないため、Ａ鎖を含まないＢ鎖、Ｃ鎖、Ｄ鎖、Ｇ鎖、Ｈ鎖のみから成るものを指標分子量マーカーとして用いることができる。
【００８４】
そして、上記小分子ＲＮＡ画分の抽出液を、更に等量のフェノールで抽出し、続いて等量のクロロホルムで2回抽出した。その後、抽出液に終濃度0.3 Mの酢酸ナトリウム、及び0.1 μg/mlのグリコーゲンを加え、更に3.5倍量のエタノールを加えて混合した。そして、この混合液を-80℃に30分以上置いた後チューブに入れ、このチューブを微量高速遠心分離機にセットして15,000 rpm、10分、4℃で回転させて沈殿を生じせしめた。
【００８５】
そして、上記チューブから上精を吸引除去し、エタノール沈殿をバキュウムエバポレーターで乾固し、１８塩基〜２８塩基の小分子ＲＮＡ画分の乾固物を得た。そして、この１８塩基〜２８塩基の小分子ＲＮＡ画分の乾固物を、次の工程に入るまで−80℃で保存した。
【００８６】
３．１８塩基〜２８塩基の小分子ＲＮＡ画分の脱リン酸化と3'リンカーライゲーション
上記の如く得られた小分子ＲＮＡ画分の乾固物を、35μlの超純水に溶解し、以下に示す表１に示す組成で混合し、チューブ内で小分子ＲＮＡ画分を大腸菌アルカリホスファターゼと37℃で1時間反応させ、小分子ＲＮＡ画分の脱リン酸化を行った。
【００８７】
【表１】
2007319147.tif 000003
【００８８】
上記反応後、反応液に110 μlの純水を混ぜて混合し、続いて150 μlのフェノールを加えて抽出し、更に150 μlのクロロホルムで2回抽出した。そして、抽出液に、15 μlの3 Mの酢酸ナトリウムと3 μlの5 μg/mlのグリコーゲンを加えた後、500 μlのエタノールを加えて混合した。そして、この混合液を-80℃に30分以上置いた後チューブに入れ、このチューブを微量高速遠心分離機にセットし、15,000 rpm、10分、4℃で回転させて沈殿を生じせしめた。そして、上記チューブから上精を吸引除去し、該チューブをバキュウムエバポレーターにかけ、乾固した脱リン酸化小分子ＲＮＡを得た。
【００８９】
そして、上記の如く乾固した脱リン酸化小分子ＲＮＡを、18 μlの超純水に溶解し、以下の表２に示す組成でチューブ内にて37℃で1時間反応させ、脱リン酸化小分子ＲＮＡの3'端側に3'リンカーをライゲーションさせた。
【００９０】
【表２】
2007319147.tif 000004
【００９１】
上記反応後、反応液に110μlの純水を混ぜて混合し、続いて150μlのフェノールを加え抽出し、更に150μlのクロロホルムで2回抽出した。その後、抽出液に15μlの3 Mの酢酸ナトリウムと3μlの5μg/mlのグリコーゲンとを加えた後、500μlのエタノールを加えて混合した。そして、この混合液を-80℃に30分以上置いた後、チューブに入れて微量高速遠心分離機にセットし、15,000 rpm、10分、4℃で回転させ、沈殿を生じせしめた。
【００９２】
そして、上記チューブから上精を吸引除去し、該チューブをバキュウムエバポレーターにかけ、乾固した3'リンカー結合小分子ＲＮＡを得た。そして、この3'リンカー結合小分子ＲＮＡを、10μlのＲＮＡ Loading buffer PAに溶解して混合した。また、5μlの0.12μg/μl ＧＳＭと5μlのＲＮＡ Loading buffer PAとを混合した。そして、上記各混合液を70℃で3分間処理した後、直ちに氷上に置いた。そして、この熱処理液を7.5 M尿素を含む10 %ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲルの厚みは1.5 mm、レーンの幅は5 mm）に供与した。
【００９３】
前述の方法で電気泳動を行い、前述と同様にGel Indicator ＲＮＡ Staining Solutionにて染色した。染色されたＧＳＭのC-1鎖(３６塩基)とD-1鎖(４６塩基)のバンドにはさまれるゲルを、3'リンカー結合小分子ＲＮＡをロードしたレーンから切り出した。そして、切り出したゲルを更に細かく切り刻み、ゲルの4倍量のＲＮＡ Extraction Buffer（20 mM Tris-Cl (pH 8), 0.1 mM EDTA, 0.3 M NaCl, 0.1 % SDS ）にて抽出した。
【００９４】
そして、この抽出液を等量のフェノールで抽出し、続いて等量のクロロホルムで2回抽出後、抽出液に終濃度0.3 Mの酢酸ナトリウム、0.1μg/mlのグリコーゲンを加え、更に3.5倍量のエタノールを加えて混合した。そして、この混合液を-80℃に30分以上置いた後チューブに入れ、このチューブを微量高速遠心分離機にセットして15,000 rpm、10分、4℃で回転させ、沈殿を生じせしめた。そして、上記チューブから上精を吸引除去し、該チューブをバキュウムエバポレーターにかけ、乾固した3'リンカー結合小分子ＲＮＡ画分を得た。
【００９５】
４．3'リンカー結合小分子ＲＮＡのリン酸化と5'リンカーライゲーション
上記の如く得られた乾固した3'リンカー結合小分子ＲＮＡ画分を、34μlの超純水に溶解し、以下の表３に示す組成でチューブ内において37℃で30分反応させて、3'リンカー結合小分子ＲＮＡのリン酸化を行った。
【００９６】
【表３】
2007319147.tif 000005
【００９７】
そして、上記反応後110μlの純水を混ぜて混合し、続いて150 μlのフェノールを加えて抽出し、更に150μlのクロロホルムで2回抽出した。そして、この抽出液に、15μlの3 Mの酢酸ナトリウムと、3μlの5 μg/mlのグリコーゲンとを加えた後、500μlのエタノールを加えて混合した。そして、この混合液を-80℃に30分以上置いた後チューブに入れ、このチューブを微量高速遠心分離機にセットした。そして、15,000 rpm、10分、4℃で回転させ、沈殿を生じせしめた。
【００９８】
そして、上記チューブから上精を吸引除去し、該チューブをバキュウムエバポレーターにかけ、乾固した脱リン酸化3'リンカー結合小分子ＲＮＡを得た。そして、この乾固した脱リン酸化3'リンカー結合小分子ＲＮＡを18μlの超純水に溶解し、以下の表４に示す組成で37℃で1時間チューブ内で反応させ、脱リン酸化3'リンカー結合小分子ＲＮＡ中の小分子ＲＮＡの5'端側に5'リンカーをライゲーションさせた。
【００９９】
【表４】
2007319147.tif 000006
【０１００】
上記反応後、反応液に10μlの純水を混ぜて混合し、続いて150μlのフェノールを加えて抽出し、更に150μlのクロロホルムで2回抽出した。そして、この抽出液に15μlの3 Mの酢酸ナトリウムと、3μlの5μg/mlのグリコーゲンとを加えた後、500μlのエタノールを加え、混合した。そして、この混合液を-80℃に30分以上置いた後チューブに入れ、このチューブを微量高速遠心分離機にセットした。そして、15,000 rpm、10分、4℃で回転させ、沈殿を生じせしめた。
【０１０１】
そして、上記チューブから上精を吸引除去し、該チューブをバキュウムエバポレーターにかけて、乾固した5'リンカー及び3'リンカー結合小分子ＲＮＡを得た。そして、この乾固した5'リンカー及び3'リンカー結合小分子ＲＮＡを10μlのＲＮＡ Loading buffer PAに溶解して混合した。また、5μlの0.12μg/μl ＧＳＭと5μlのＲＮＡ Loading buffer PAを混合した。そして、各混合液を70℃で3分間処理し、直ちに氷上に置いた。そして、この熱処理液を7.5 M尿素を含む10 %ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲルの厚みは1.5 mm、レーンの幅は5 mm）に供与した。
【０１０２】
そして、前述と同様の方法で電気泳動を行い、Gel Indicator ＲＮＡ Staining Solutionにて染色した。染色されたＧＳＭのG-1鎖(５３塩基)とH-1鎖(６３塩基)のバンドにはさまれるゲルを、5'リンカー及び3'リンカー結合小分子ＲＮＡをロードしたレーンから切り出した。そして、切り出したゲルを更に細かく切り刻み、ゲルの4倍量のＲＮＡ Extraction Buffer（20 mM Tris-Cl (pH 8), 0.1 mM EDTA, 0.3 M NaCl, 0.1 % SDS ）にて抽出した。
【０１０３】
そして、この抽出液を等量のフェノールで抽出し、更に等量のクロロホルムで2回抽出した。その後、この抽出液に、終濃度0.3 Mの酢酸ナトリウム、0.1 μg/mlのグリコーゲンを加え、更に3.5倍量のエタノールを加えて混合した。そして、この混合液を-80℃に30分以上置いた後チューブに入れ、このチューブを微量高速遠心分離機にセットして15,000 rpm、10分、4℃で回転させ、沈殿を生じせしめた。そして、上記チューブから上精を吸引除去し、該チューブをバキュウムエバポレーターにかけ、乾固した5'リンカー及び3'リンカー結合小分子ＲＮＡ画分を得た。
【０１０４】
５．逆転写反応およびPCR増幅
上記の如く乾固した5'リンカー及び3'リンカー結合小分子ＲＮＡ画分を、12μlの超純水に溶解し、0.5 mlのチューブに移した。そして、このチューブ内に1μlの50μM 3'プライマー を加えて70℃で3分アニーリングさせ、室温に2分置いて氷上に移した。そして、この13μlの溶液を用い、以下の表５に示す組成で逆転写させた。尚、反応温度及び時間は、最初に37℃を10分、次に42℃を1時間、最後に85℃を5分である。
【０１０５】
【表５】
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【０１０６】
上記逆転写反応終了後、得られた反応液のうち5μlの反応液を用いて以下の表６に示す組成でＰＣＲを行った。尚、反応温度及び時間は、最初に94℃で1分、次に、94℃、50℃、72℃をこの順にそれぞれ1分づつ25回繰り返し、最後に72℃で10分である。
【０１０７】
【表６】
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【０１０８】
図５はＰＣＲ反応液を3 %アガロースゲル電気泳動に供したものである。5'リンカー及び3'リンカー結合小分子ＲＮＡに対応する約60 bpを中心にＤＮＡが見られる。
【０１０９】
６．Tベクターへのクローニング
上記ＰＣＲ終了後、得られた反応液のうち 5μlを用い、以下の表７に示す組成でＴベクターにライゲーションさせた。Ｔベクターは、pUC19ベクターのマルチクローニング部位に、XcmI制限酵素部位を2つ並べて導入したプラスミドベクターをXcmI制限酵素で切断し、精製したものを用いた。
【０１１０】
【表７】
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【０１１１】
ライゲーションは16℃で30分行い、この反応液（ライゲーション混液）を5μl用いて、以下の如くコンピテントセル（Jet Competent Cell、株式会社バイオダイナミクス研究所）の形質転換操作を行った。まず、凍結コンピテントセル（100μl）を氷上に置いて融解した後、直ちに5 μlのライゲーション混液をコンピテントセルに加え、5分後、室温の0.9 mlのRecovery Medium（Jet Competent Cellに付属）にコンピテントセルを移した。
【０１１２】
そして、5分間このまま静置した後、Recovery Mediumに懸濁された菌液50mg/mlのアンピシリンを含むLB寒天プレート（直径8.5cm、寒天培地量25ml）に接種し、37℃で18時間、保温した。そして、この培養によって上記LB寒天プレート上の大腸菌コロニーを取り出し、50mg/mlのアンピシリンを含む3mlのLB液体培地に接種した。そして、37℃で18時間培養した。そして、この培養によって得られた菌体からQiagen Plasmid Purification Kit（株式会社キアゲン製）によりプラスミドを調製した。
【０１１３】
得られたプラスミドについて塩基配列を調べたところ、ほほすべてのプラスミドに5'リンカー配列と3'リンカー配列に挟まれる塩基配列が含まれていた。そして、5'リンカー配列と3'リンカー配列に挟まれる塩基配列を塩基配列データベースにより解析したところ、いくつかの動物のゲノム配列と一致し、かつmＲＮＡにならない塩基配列が得られた。これらはmiＲＮＡと推察され、本実施例に於いてmiＲＮＡがクローニングされたことが確認できた。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】図１は、本発明の指標分子量マーカーを構成する各核酸鎖を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動の移動度順に表したものである。本発明の核酸鎖結合産物を分画する指標分子量マーカーは、Ｂ鎖、Ｃ鎖、Ｄ鎖、Ｇ鎖、Ｈ鎖を含むＭ型と、Ｂ鎖、Ｅ鎖、Ｆ鎖、Ｇ鎖、Ｈ鎖を含むＮ型がある。尚、電気泳動における移動度は模式的である。
【図２】図２は、本発明の指標分子量マーカーの各核酸鎖の分子構成を、模式的に表したものである。尚、図中の「ＲＮＡ」は、クローニング対象の最短鎖ＲＮＡ及び最長鎖ＲＮＡであり、これに各核酸鎖が結合している。
【図３】図３は、本発明の実施例１の指標分子量マーカーの各核酸鎖の塩基配列を表したものである。
【図４】図４は、実施例１に示す指標分子量マーカーを、10%変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲルは7.5 Mの尿素を含み、泳動緩衝液は1 × TBE）に供した後、Gel Indicator ＲＮＡ Staining Solutionにて染色した図である。
【図５】図５は、小分子ＲＮＡクローニングにおいて得られた小分子ＲＮＡのｃＤＮＡを3 %アガロースゲル、1 × TAE緩衝液による電気泳動に供与したものである。左端レーン1はDynaMarker DNA Low（株式会社バイオダイナミクス研究所製）、次のレーン2、3はPCR反応液を2、または5 μlをロードした。5'リンカー及び3'リンカー結合小分子ＲＮＡに対応する約60 bpを中心にＤＮＡが見られる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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