(57)【要約】【課題】  簡便且つ高感度に脂質を定量できる方法を提供する。【解決手段】  定量の対象である脂質に対して特異的に結合可能な非抗体プローブ物質を準備する準備工程と、前記対象脂質を基材の表面に固定する固定工程と、前記基材表面に固定された対象脂質に前記非抗体プローブ物質を結合させる工程と、前記対象脂質に結合した非抗体プローブ物質を定量的に検出する工程と、を含む脂質定量方法とする。【選択図】      図１
2007040719.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
定量の対象である脂質に対して特異的に結合可能な非抗体プローブ物質を準備する準備工程と、
前記対象脂質を基材の表面に固定する固定工程と、
前記基材表面に固定された対象脂質に前記非抗体プローブ物質を結合させる工程と、
前記対象脂質に結合した非抗体プローブ物質を定量的に検出する工程と、
を含むことを特徴とする脂質定量方法。
【請求項２】
前記準備工程において、前記対象脂質と特異的に結合可能なドメインを複数含む非抗体プローブ物質を準備する、
ことを特徴とする請求項１に記載の脂質定量方法。
【請求項３】
前記準備工程において、前記対象脂質との結合に係る解離定数が１ｎＭ以上且つ１μＭ未満の範囲内である非抗体プローブ物質を準備する、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の脂質定量方法。
【請求項４】
前記対象脂質と、リポソームを形成可能なベース脂質と、を含むリポソームを形成するリポソーム形成工程をさらに含み、
前記固定工程において、前記形成されたリポソームを前記基材表面に固定することにより、前記対象脂質を前記基材表面に固定する、
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の脂質定量方法。
【請求項５】
前記リポソーム形成工程において、前記対象脂質と前記ベース脂質とを含む一重膜のリポソームを形成する、
ことを特徴とする請求項４に記載の脂質定量方法。
【請求項６】
前記固定工程において、前記形成されたリポソームを、長鎖アルキル基が固定された基材表面に固定する、
ことを特徴とする請求項４又は５に記載の脂質定量方法。
【請求項７】
特定の脂質と反応する酵素の活性を定量する方法であって、
前記特定脂質に対して特異的に結合可能な非抗体プローブ物質を準備する準備工程と、
前記特定脂質と、リポソームを形成可能なベース脂質と、を含むリポソームを形成する工程と、
前記形成されたリポソームを基材の表面に固定する工程と、
前記基材表面に固定されたリポソームに含まれる特定脂質と前記酵素とを反応させる工程と、
前記非抗体プローブ物質を、前記反応後に前記基材表面に固定されている特定脂質に結合させる工程と、
前記特定脂質に結合された非抗体プローブ物質を定量的に検出する工程と、
を含むことを特徴とする酵素活性定量方法。
【請求項８】
特定の脂質と反応し、他の脂質を生成する酵素の活性を定量する方法であって、
前記他の脂質に対して特異的に結合可能な非抗体プローブ物質を準備する準備工程と、
前記特定脂質と、リポソームを形成可能なベース脂質と、を含むリポソームを形成する工程と、
前記形成されたリポソームを基材の表面に固定する工程と、
前記基材表面に固定されたリポソームに含まれる特定脂質と前記酵素とを反応させる反応工程と、
前記反応工程において生成され、前記基材表面に固定されている前記他の脂質に前記非抗体プローブ物質を結合させる工程と、
前記他の脂質に結合された非抗体プローブ物質を定量的に検出する工程と、
を含むことを特徴とする酵素活性定量方法。
【請求項９】
前記他の脂質は、前記特定脂質と前記対象脂質との反応によって、前記特定脂質の１分子中に含まれる特定の官能基又は分子鎖の数又は結合位置が変更された脂質である、
ことを特徴とする請求項８に記載の酵素活性定量方法。
【請求項１０】
請求項１乃至６のいずれか一項に記載の脂質定量方法を用いて、生体から採取した脂質を定量する工程と、
前記脂質の定量結果に基づいて、前記生体の病態を評価する工程と、
を含むことを特徴とする病態評価方法。
【請求項１１】
請求項７乃至９のいずれか一項に記載の酵素活性定量方法を用いて、生体から採取した酵素の活性を定量する工程と、
前記酵素活性の定量結果に基づいて、前記生体の病態を評価する工程と、
を含むことを特徴とする病態評価方法。
【請求項１２】
定量の対象とする脂質に対して特異的に結合可能な非抗体プローブ物質と、
前記対象脂質を含むリポソームを形成可能なベース脂質と、
を含むことを特徴とする脂質定量キット。
【請求項１３】
特定の脂質と反応する酵素の活性を定量するキットであって、
前記特定脂質に対して特異的に結合可能な非抗体プローブ物質と、
前記特定脂質と、
前記特定脂質を含むリポソームを形成可能なベース脂質と、
を含むことを特徴とする酵素活性定量キット。
【請求項１４】
特定の脂質と反応し、他の脂質を生成する酵素の活性を定量するキットであって、
前記他の脂質に対して特異的に結合可能な非抗体プローブ物質と、
前記特定脂質と、
前記特定脂質を含むリポソームを形成可能なベース脂質と、
を含むことを特徴とする酵素活性定量キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質又は脂質を反応基質とする酵素の活性の定量、及び当該定量に基づく病態の評価に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂質は生体を構成する成分の１つであり、生体内の生理的プロセスにおいて重要且つ多様な役割を果たしている。すなわち、例えば、哺乳動物において、細胞膜を構成するリン脂質の１つであるホスホイノシチド（ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ）は、細胞内において、イノシトール１，４，５三リン酸やジアシルグリセロール等のセカンドメッセンジャーを生成するとともに、細胞のメンブレントラフィック、細胞骨格の再編成、細胞分裂、アポトーシス、細胞内代謝等に関連する様々なタンパク質と直接且つ特異的に相互作用し、当該タンパク質の機能を制御している。
【０００３】
また、このような重要な役割を果たす脂質の代謝は、特定の脂質を反応基質とする酵素（以下、脂質関連酵素）によって厳密に制御されていると考えられる。実際に、脂質の代謝異常は、癌、糖尿病、ミオパシー等の様々な病態を引き起こすことが明らかになってきている。
【０００４】
したがって、例えば、生体の特定の細胞に含まれる脂質又は脂質関連酵素の種類や活性を正確に測定することができれば、新たな医薬や病態の評価方法等の開発が可能になると期待される。
【０００５】
従来、脂質又は脂質関連酵素の測定方法としては、例えば、ラジオアイソトープによる方法（非特許文献１参照）、クロマトグラフィーによる方法（非特許文献２参照）、質量分析による方法（非特許文献３参照）等があった。
【非特許文献１】Ｍａｅｈａｍａ，Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７９，２４８−２５０（２０００）
【非特許文献２】Ｓｅｒｕｎｉａｎ，Ｌ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９８，７８−８７（１９９１）
【非特許文献３】Ｗｅｎｋ，Ｍ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１，８１３−８１７（２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記従来の測定方法は、技術的に煩雑な操作を要するため、例えば、多くの種類の脂質や脂質関連酵素を対象として、網羅的に、ハイスループットな解析を行うことは困難であった。
【０００７】
また、上記従来の測定方法は、その検出感度に限界があるため、例えば、細胞内に極微少量だけ含まれる種々のリン脂質について、リン酸基の数や結合位置が互いに異なる各リン脂質を正確に定量することは困難であった。
【０００８】
本発明は、上記問題に鑑みて為されたものであって、簡便且つ高感度に脂質又は脂質関連酵素活性を定量できる方法及び定量キット、さらに当該定量方法及び定量キットを用いた病態の評価方法を提供することをその目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記従来の課題を解決するため、本発明の一実施形態に係る脂質定量方法は、定量の対象である脂質に対して特異的に結合可能な非抗体プローブ物質を準備する準備工程と、前記対象脂質を基材の表面に固定する固定工程と、前記基材表面に固定された対象脂質に前記非抗体プローブ物質を結合させる工程と、前記対象脂質に結合した非抗体プローブ物質を定量的に検出する工程と、を含むことを特徴とする。
【００１０】
上記従来の課題を解決するため、本発明の一実施形態に係る酵素活性定量方法は、特定の脂質と反応する酵素の活性を定量する方法であって、前記特定脂質に対して特異的に結合可能な非抗体プローブ物質を準備する準備工程と、前記特定脂質と、リポソームを形成可能なベース脂質と、を含むリポソームを形成する工程と、前記形成されたリポソームを基材の表面に固定する工程と、前記基材表面に固定されたリポソームに含まれる特定脂質と前記酵素とを反応させる工程と、前記非抗体プローブ物質を、前記反応後に前記基材表面に固定されている特定脂質に結合させる工程と、前記特定脂質に結合された非抗体プローブ物質を定量的に検出する工程と、を含むことを特徴とする。
【００１１】
また、上記従来の課題を解決するため、本発明の一実施形態に係る酵素活性定量方法は、特定の脂質と反応し、他の脂質を生成する酵素の活性を定量する方法であって、前記他の脂質に対して特異的に結合可能な非抗体プローブ物質を準備する準備工程と、前記特定脂質と、リポソームを形成可能なベース脂質と、を含むリポソームを形成する工程と、前記形成されたリポソームを基材の表面に固定する工程と、前記基材表面に固定されたリポソームに含まれる特定脂質と前記酵素とを反応させる反応工程と、前記反応工程において生成され、前記基材表面に固定されている前記他の脂質に前記非抗体プローブ物質を結合させる工程と、前記他の脂質に結合された非抗体プローブ物質を定量的に検出する工程と、を含むことを特徴とする。
【００１２】
上記従来の課題を解決するため、本発明の一実施形態に係る脂質定量方法に基づく病態評価方法は、上記脂質定量方法を用いて、生体から採取した脂質を定量する工程と、前記脂質の定量結果に基づいて、前記生体の病態を評価する工程と、を含むことを特徴とする。
【００１３】
上記従来の課題を解決するため、本発明の一実施形態に係る酵素活性定量方法に基づく病態評価方法は、上記酵素活性定量方法を用いて、生体から採取した酵素の活性を定量する工程と、前記酵素活性の定量結果に基づいて、前記生体の病態を評価する工程と、を含むことを特徴とする。
【００１４】
上記従来の課題を解決するため、本発明の一実施形態に係る脂質定量キットは、定量の対象とする脂質に対して特異的に結合可能な非抗体プローブ物質と、前記対象脂質を含むリポソームを形成可能なベース脂質と、を含むことを特徴とする。
【００１５】
上記従来の課題を解決するため、本発明の一実施形態に係る酵素活性定量キットは、特定の脂質と反応する酵素の活性を定量するキットであって、前記特定脂質に対して特異的に結合可能な非抗体プローブ物質と、前記特定脂質と、前記特定脂質を含むリポソームを形成可能なベース脂質と、を含むことを特徴とする。
【００１６】
また、上記従来の課題を解決するため、本発明の一実施形態に係る酵素活性定量キットは、特定の脂質と反応し、他の脂質を生成する酵素の活性を定量するキットであって、前記他の脂質に対して特異的に結合可能な非抗体プローブ物質と、前記特定脂質と、前記特定脂質を含むリポソームを形成可能なベース脂質と、を含むことを特徴とする
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下に、本発明の一実施の形態について説明する。なお、本発明は本実施形態に示すものに限られない。まず、本実施形態に係る脂質定量方法（以下、本脂質定量方法）、脂質関連酵素活性の定量方法（以下、本酵素活性定量方法）、及び病態の評価方法（以下、本病態評価方法）の概要について説明する。
【００１８】
本脂質定量方法は、生体から取り出した血液や組織、生体から単離した初代細胞、樹立された株化細胞等に含まれる脂質や、遺伝子操作技術を用いて形質転換細胞に生産させた脂質等、任意の脂質を定量の対象とすることができる。
【００１９】
すなわち、例えば、脂肪酸とアルコールとのエステルを含むジアシルグリセロール、トリアシルグリセロール、グリセロリン脂質（イノシトールリン脂質、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン等を含む）、スフィンゴリン脂質（スフィンゴミエリン等を含む）、グリセロ糖脂質（セラミド、セレブロシド等を含む）、スフィンゴ糖脂質、及びこれらに任意の官能基や分子鎖を導入した誘導体等を定量することができる。
【００２０】
具体的に、例えば、ホスホイノシチド等のリン脂質のうち、１分子中に含まれるリン酸基の数や分子内結合位置等が互いに異なる複数種類のリン脂質を定量することができる。また、例えば、細胞内メンブレントラフィック、細胞骨格の再編成、細胞分裂、アポトーシス、細胞内代謝等に関連するシグナル伝達系において、特定のタンパク質と特異的に結合し、シグナル分子として機能する種々の脂質を定量することができる。
【００２１】
本脂質定量方法に特長的なことの１つとして、定量の対象とする脂質（以下、対象脂質）に対して特異的に結合可能な非抗体プローブ物質（以下、プローブ物質）を用いる点を挙げることができる。
【００２２】
すなわち、例えば、いわゆる酵素免疫測定（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）法においては、タンパク質を測定の対象とする場合、当該タンパク質に対する抗体が用いられる。
【００２３】
しかしながら、タンパク質に比べて分子量が小さい脂質については、当該脂質に対する抗体を作製することが容易でなく、特に、例えば、１分子に含まれる特定の官能基の数や結合位置等の違いを厳密に識別可能な抗体を作製することは困難である。
【００２４】
そこで、本脂質定量方法においては、例えば、生体内で実際に対象脂質と特異的に相互作用している非抗体タンパク質（抗体ではないタンパク質）分子の一部分であって、当該対象脂質と特異的に結合する部分（以下、脂質結合ドメイン）を含むペプチド又は非抗体タンパク質を、プローブ物質として用いる。
【００２５】
このプローブ物質は、例えば、基材表面に固定された対象脂質の量に応じた量で、当該対象脂質に特異的に結合するため、当該対象脂質を介して当該基材表面に結合したプローブ物質を定量的に検出することにより、当該対象脂質を簡便且つ高精度に定量することできる。
【００２６】
また、本脂質定量方法に特長的なことの１つとして、対象脂質を含むリポソームを形成し、当該リポソームを基材表面に固定することにより、当該対象脂質を当該基材表面に固定する点を挙げることができる。
【００２７】
すなわち、脂質は、タンパク質等に比べて水に対する溶解度が低いため、水溶液中で取り扱うことは容易でない。一方、脂質を有機溶媒等に溶解した場合には、例えば、生体内に存在する場合に比べて当該脂質の分子構造が変化してしまい、当該脂質の本来の特性を評価することが困難となる。
【００２８】
これに対し、本脂質定量方法においては、対象脂質を含むリポソームを形成する。このため、本脂質定量方法においては、対象脂質を水溶液中で取り扱うことが容易となる。すなわち、例えば、対象脂質を表面に埋め込んだリポソームを形成して水溶液中に均一に分散し、当該水溶液中において当該リポソームを基材表面に吸着させることにより、当該対象脂質を、生体内に類似した状態で当該基材表面に均一に固定することができる。
【００２９】
そして、この基材表面に均一に固定された対象脂質にプローブ物質を結合させ、当該対象脂質に結合したプローブ物質を定量的に検出することにより、水溶液中において、当該対象脂質を簡便且つ高精度に定量することができる。
【００３０】
本酵素活性定量方法は、生体から取り出した血液や組織、生体から単離した初代細胞、樹立された株化細胞等に含まれる脂質関連酵素や、遺伝子操作技術を用いて形質転換細胞に生産させた脂質関連酵素等、任意の脂質関連酵素を定量の対象とすることができる。
【００３１】
すなわち、例えば、特定の脂質と特異的に反応するキナーゼ（イノシトール脂質キナーゼ等を含む）、ホスファターゼ（ホスホイノシチドホスファターゼ等を含む）、ホスホリパーゼ（ホスホリパーゼＣ等を含む）等、上述の本脂質定量方法において定量の対象となり得る脂質を反応基質とする脂質関連酵素の活性を定量することができる。
【００３２】
本酵素活性定量方法に特徴的なこととして、定量の対象とする脂質関連酵素（以下、対象酵素）の反応基質である特定の脂質（以下、特定脂質）を含むリポソームを形成する点と、当該特定脂質に対して特異的に結合可能なプローブ物質を用いる点と、を挙げることができる。
【００３３】
すなわち、本酵素活性定量方法においては、例えば、特定脂質を表面に埋め込んだリポソームを形成することにより、当該特定脂質を水溶液中に均一に分散するとともに、当該水溶液中において当該リポソームを当該基材表面に吸着させることにより、当該特定脂質を、生体内に類似した状態で当該基材表面に均一に固定することができる。この結果、本酵素活性定量方法においては、水溶液中で、特定脂質と対象酵素との特異的な反応を、生体内に類似した状態で、簡便に再現できる。
【００３４】
そして、基材表面で特定脂質と対象酵素とを所定時間反応させた後、例えば、当該基材表面に残存している未反応の特定脂質にプローブ物質を結合させ、当該プローブ物質を定量的に検出することにより、反応基質の消費量に基づく当該対象酵素の活性を簡便且つ高精度に定量することができる。
【００３５】
また、本酵素活性定量方法に特徴的なことの１つとして、基材表面に固定された特定脂質と対象酵素との反応によって他の脂質（以下、生成脂質）が生成される場合に、当該生成脂質が当該基材表面に固定された状態で生成される点を挙げることができる。
【００３６】
すなわち、例えば、基材表面に固定された脂質膜に埋め込まれている特定脂質と対象酵素との反応が、当該特定脂質分子に対する特定の官能基又は分子鎖の付加や、当該特定脂質分子に含まれている特定の官能基又は分子鎖の除去や分子内結合位置の転移等である場合（すなわち、生成脂質は、特定脂質の１分子中に含まれる特定の官能基又は分子鎖の数又は結合位置が変更された脂質である場合）には、当該反応により生成された生成脂質は、当該脂質膜に埋め込まれたまま当該基材表面に保持される。
【００３７】
この場合、生成脂質に対して特異的に結合可能なプローブ物質を、特定脂質と対象脂質との反応後に基材表面に固定されている生成脂質に結合させ、当該生成脂質に結合したプローブ物質を定量的に検出することにより、反応生成物の量に基づく当該対象脂質を簡便且つ高精度に定量することができる。
【００３８】
本病態評価方法においては、本脂質定量方法又は本酵素活性定量方法を用いて、生体から採取した血液、組織、細胞等に含まれる脂質又は脂質関連酵素の活性を定量し、当該定量結果に基づいて、当該生体の病態を評価することができる。
【００３９】
すなわち、例えば、ホスホイノシチドの代謝異常により引き起こされる癌や糖尿病等の病態に関連する細胞（例えば、癌の発生が疑われる組織の細胞等）を生体から採取し、当該細胞に含まれるホスホイノシチド又はホスホイノシチドを反応基質とする酵素の種類や量を、本脂質定量方法又は本酵素活性定量方法を用いて定量する。
【００４０】
そして、例えば、細胞に含まれるホスホイノシチド又はホスホイノシチドを反応基質とする酵素の種類や活性と、病態の進行度合い等と、の関連性を示すデータが予め得られている場合には、当該データと、本病態評価方法において得られた定量結果と、に基づいて、生体における病態の進行度合いを簡便且つ高精度に評価することができる。
【００４１】
次に、本実施形態の具体的な内容について説明する。本脂質定量方法は、プローブ物質等を準備する準備工程と、対象脂質を基材表面に固定する固定工程と、当該基材表面に固定された対象脂質に当該プローブ物質を結合させる結合工程と、当該対象脂質に結合したプローブ物質を定量的に検出する検出工程と、を含む。
【００４２】
準備工程においては、例えば、対象脂質に対して特異的に結合可能なプローブ物質を準備する。このプローブ物質としては、例えば、生体内で、対象脂質と特異的に結合することにより直接相互作用しているペプチド又は非抗体タンパク質、又は当該ペプチド又は非抗体タンパク質を構成するアミノ酸配列の一部であって、当該対象脂質に対して特異的に結合可能なアミノ酸配列部分からなる脂質結合ドメインを含むペプチド又は非抗体タンパク質を用いることができる。
【００４３】
すなわち、このプローブ物質としては、例えば、細胞内のシグナル伝達系において、脂質分子に含まれる特定種類の官能基の数や結合位置等の違いを識別し、当該細胞内に含まれる種々の脂質のうち、特定種類の官能基が、特定の数だけ、１分子中の特定の位置に結合している対象脂質に対して特異的に結合する脂質結合ドメインを含むペプチド又は非抗体タンパク質を用いることができる。
【００４４】
具体的に、このプローブ物質としては、例えば、細胞内において、１分子中に含まれるリン酸基の数又は結合位置に応じて互いに異なるシグナル分子としての役割を果たしている複数種類のホスホイノシチドのうち、特定の数のリン酸基が１分子中の特定の位置に結合している特定のホスホイノシチドを対象脂質とする場合には、当該特定のホスホイノシチドに対してのみ特異的に結合可能な脂質結合ドメインを含むペプチド又は非抗体タンパク質を用いることができる。
【００４５】
ここで、脂質結合ドメインとしては、例えば、細胞内において特定のホスホイノシチドと特異的に相互作用する非抗体タンパク質に含まれる球状ドメイン（ｇｌｏｂｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｄｏｍａｉｎ）（Ｉｔｏｈ，Ｔ  ｅｔ  ａｌ．；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ，１４，７３３−７４３（２００２）、Ｃｚｅｃｈ，Ｍ．Ｐ．；Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，６５，７９１−８１５（２００３）、Ｌｅｍｍｏｎ，Ｍ．Ａ．；Ｔｒａｆｆｉｃ，４，２０１−２１３（２００３）、Ｃｕｌｌｅｎ，Ｐ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ，１１，Ｒ８８２−８９３（２００１））や、様々なアクチン制御タンパク質やイオンチャネルに含まれる塩基性アミノ酸のクラスター（ａ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｂａｓｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）（Ｔａｋｅｎａｗａ，Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１５３３，１９０−２０６（２００１）、Ｊａｎｍｅｙ，Ｐ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，５，６５８−６６６（２００４）、Ｈｉｌｇｅｍａｎｎ，Ｄ．Ｗ．；Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，５９，１９３−２２０（１９９７）、Ｗｕ，Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｎａｔｕｒｅ，４１９，９４７−９５２（２００２））等を挙げることができる。
【００４６】
具体的に、例えば、７つのβストランドと１つのαへリックスとを含むプレクストリン相同性ドメイン（ｐｒｅｃｋｓｔｒｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｏｍａｉｎ）（以下、ＰＨドメイン）（Ｉｔｏｈ，Ｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ，１４，７３３−７４３（２００２）、Ｃｚｅｃｈ，Ｍ．Ｐ．；Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，６５，７９１−８１５（２００３）、Ｌｅｍｍｏｎ，Ｍ．Ａ．；Ｔｒａｆｆｉｃ，４，２０１−２１３（２００３））、Ｐｈｏｘ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ（ＰＸ）ドメイン（Ｅｌｌｓｏｎ，Ｃ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ，１１５，１０９９−１１０５（２００２））、Ｅｐｓｉｎ  Ｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ（ＥＮＴＨ）ドメイン（Ｉｔｏｈ，Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９１，１０４７−１０５１（２００１））、Ｆａｂ１，ＹＯＴＢ，Ｖａｃ１ｐ  ａｎｄ  ＥＥＡ１（ＦＹＶＥ）ドメイン（Ｇｉｌｌｏｏｌｙ，Ｄ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ；Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，３５５，２４９−２５８（２００１））、ｂａｎｄ４．１，Ｅｚｒｉｎ，Ｒａｄｉｘｉｎ  ａｎｄ  Ｍｏｅｓｉｎ（ＦＥＲＭ）ドメイン（Ｈａｍａｄａ，Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｅｍｂｏ  Ｊ，１９，４４４９−４４６２（２０００））、ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，Ｒａｂ−ｌｉｋｅ  ＧＴＰａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｍｙｏｔｕｂｕｌａｒｉｎｓ（ＧＲＡＭ）ドメイン（Ｄｏｅｒｋｓ，Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ，２５，４８３−４８５（２０００））、等の脂質結合ドメインを少なくとも１つ含むペプチド又は非抗体タンパク質を用いることができる。
【００４７】
さらに、ＰＨドメインとしては、例えば、ホスファチジルイノシトール（４，５）−２リン酸（以下、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２）に結合するホスホリパーゼＣδ１ＰＨドメイン（Ｖａｒｎａｉ，Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１４３，５０１−５１０（１９９８））、ホスファチジルイノシトール（３，４，５）−３リン酸（以下、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３）に結合するＧｒｐ１ＰＨドメイン（Ｇｒａｙ，Ａ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，３４４（Ｐｔ３），９２９−９３６（１９９９））、ホスファチジルイノシトール（３，４）−２リン酸（以下、ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２）とＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３とに結合するＡｋｔＰＨドメイン（Ｇｒａｙ，Ａ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，３４４（Ｐｔ３），９２９−９３６（１９９９））、ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２に結合するＴＡＰＰ１ＰＨドメイン（Ｄｏｗｌｅｒ，Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，３５１，１９−３１（２０００））、ホスファチジルイノシトール（４）−リン酸（以下、ＰｔｄＩｎｓ（４）Ｐ）に結合するＦＡＰＰ１ＰＨドメイン（Ｇｏｄｉ，Ａ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，６，３９３−４０４（２００４））、ＥＥＡ１タンパク質とＨｒｓタンパク質に含まれ、ホスファチジルイノシトール（３）−リン酸（以下、ＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ）に結合するＦＹＶＥジンクフィンガー（ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ）ドメイン（Ｇｉｌｌｏｏｌｙ，Ｄ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，３５５，２４９−２５８（２００１）、Ｋｕｔａｔｅｌａｄｚｅ，Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９１，１７９３−１７９６（２００１））、ｍｙｏｔｕｂｕｌａｒｉｎ（ＭＴＭＲ１）とＭｙｏｔｕｂｕｌａｒｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ２（ＭＴＭＲ２）に含まれ、ホスファチジルイノシトール（３，５）−２リン酸（以下、ＰｔｄＩｎｓ（３，５）Ｐ２）に結合するＧＲＡＭドメイン（Ｔｓｕｊｉｔａ，Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７９，１３８１７−１３８２４（２００４）、Ｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１００，１２１７７−１２１８２（２００３））等を挙げることができる。また、この他にも、イノシトール（１，４，５）−３リン酸に結合するＰＨドメインやＦＥＲＭドメインもある。本脂質定量方法においては、これら特定のホスホイノシチドと特異的に結合可能な脂質結合ドメインを少なくとも１つ含むペプチド又は非抗体タンパク質をプローブ物質として用いることができる。
【００４８】
これらのプローブ物質は、例えば、生体から採取し、又は遺伝子操作技術を用いて生産することができる。すなわち、例えば、細胞内で対象脂質と特異的に結合可能な非抗体タンパク質分子に含まれるアミノ酸配列のうち、少なくとも脂質結合ドメイン部分をコードするポリヌクレオチド（デオキシリボ核酸（ＤｅｏｘｙｒｉｂｏＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ；ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲｉｂｏＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ；ＲＮＡ））を所定の宿主細胞体に導入する。この宿主細胞体としては、形質転換によりプローブ物質を生産させることができるものであれば特に制限されず、例えば、大腸菌等の微生物や、Ｓｆ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）９細胞等の昆虫細胞、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ）細胞等の動物細胞等を用いることができる。
【００４９】
そして、例えば、この形質転換細胞体を所定期間培養することにより、当該形質転換細胞体に脂質結合ドメインを含むペプチド又は非抗体タンパク質を生産させ、当該生産されたペプチド又は非抗体タンパク質をプローブ物質として回収する。
【００５０】
また、例えば、生体内に存在する天然の脂質結合ドメイン又は当該天然の脂質結合ドメインと同一のアミノ酸配列からなる脂質結合ドメインを複数連結した、本来生体内には存在しない複合ドメインを含むプローブ物質を作製することもできる。この場合、例えば、１種類の脂質結合ドメインについて、１つの当該脂質結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを複数連結することにより、当該脂質結合ドメインが複数連結された複合ドメインをコードする複合ポリヌクレオチドを作製する。そして、この複合ポリヌクレオチドを導入した形質転換細胞体を作製することにより、当該形質転換細胞体が生産した複合ドメインを含むペプチド又は非抗体タンパク質をプローブ物質として回収することができる。
【００５１】
また、この準備工程においては、対象脂質に対する親和性が高いプローブ物質を選択的に準備することができる。すなわち、例えば、上述のように形質転換細胞体から回収されたプローブ物質と、対象脂質と、の結合に係る解離定数を測定し、解離定数が所定範囲内のプローブ物質を、高親和性プローブ物質として選択する。
【００５２】
具体的に、例えば、対象脂質との結合に係る解離定数が１ｎＭ以上且つ１μＭ未満のプローブ物質を選択する。なお、解離定数が１μＭ以上と大きい場合には、プローブ物質を用いた対象脂質の検出感度が悪くなる（すなわち、対象脂質の検出限界が大きくなる）ため、微量な脂質を検出することが困難となる場合がある。これに対し、親和性の高いプローブ物質は、より少ない量の対象脂質と結合するため、より微量な対象脂質の検出、定量が可能となる。ただし、解離定数が１ｎＭ未満と非常に小さい場合には、プローブ物質と対象脂質との結合が微量な脂質量でも飽和してしまう等、対象脂質の定量に不都合が生じることがある。
【００５３】
また、この準備工程においては、例えば、所定の標識物質が結合したプローブ物質を準備することもできる。すなわち、例えば、上述のように形質転換細胞体から回収したプローブ物質に、周知の技術を用いて、フルオレセインイソチオシアネート（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ＩｓｏＴｈｉｏＣｙａｎａｔｅ；ＦＩＴＣ）やフィコエリスリン（ＰｈｙＣｏｅｒｙｔｈｒｉｎ；ＰＣ）等の蛍光物質や、特定の基質と反応して色素物質を生成するペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼ等の酵素を結合することができる。また、例えば、特定の物質に対して特異的に結合する標識物質（例えば、アビジンと特異的に結合するビオチン等）が結合したプローブ物質を作製することもできる。
【００５４】
固定工程においては、対象脂質を所定の基材の表面に固定する。この基材としては、その表面に対象脂質を固定し得るものであれば特に制限されず、例えば、合成樹脂（ポリ塩化ビニル、ポリスチレン，ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリアセタール、ポリウレタン、フッ素樹脂、メタクリル樹脂、尿素樹脂、フェノール樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、エポキシ樹脂，メラミン樹脂等を含む）、ガラス、金属、セラミクス、ゴム、合成された又は天然の高分子（ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、コラーゲン、ゼラチン、寒天等を含む）のゲル等からなる板状体、膜状体、多孔質体、繊維等、を用いることができる。
【００５５】
この固定工程においては、例えば、所定の基材表面上で、対象脂質を、当該対象脂質の特性（例えば、分子量、極性、荷電等）に基づいて、他の物質と分離するとともに、当該対象脂質を当該基材表面に固定することができる。
【００５６】
すなわち、例えば、種々のクロマトグラフィーにおいて、固定相上で、対象脂質を他の物質から分離しつつ、当該固定相表面に当該対象脂質を固定することができる。具体的に、例えば、薄層クロマトグラフィー（Ｔｈｉｎ  Ｌａｙｅｒ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＴＬＣ）において、ガラス、プラスチック、金属等からなる平板上にセルロース、シリカゲル、アルミナ等を塗布して作製されたＴＬＣプレート上で、対象脂質と他の物質とを分離しつつ、当該ＴＬＣプレート上に当該対象脂質を固定できる。また、例えば、電気泳動法において分子篩として用いられるゲル平板上で、対象脂質と他の物質とを分離しつつ、当該ゲル平板上に当該対象脂質を固定できる。
【００５７】
この対象脂質の基材表面への固定は、例えば、当該対象脂質を当該基材表面に吸着させ、又は当該対象脂質と当該基材表面との間で共有結合を形成させること等によって行うことができる。すなわち、例えば、対象脂質と基材表面を構成する化合物との間で所定の化学反応（例えば、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基等の間の縮合反応）を行わせることによって、当該対象脂質を当該基材表面に固定することもできる。
【００５８】
結合工程においては、固定工程で基材表面に固定された対象脂質に対して、準備工程で準備したプローブ物質を特異的に結合させる。すなわち、例えば、対象脂質が固定された基材表面を、所定濃度のプローブ物質を含む水溶液中に所定時間浸漬することによって、当該水溶液中で、当該対象脂質に当該プローブ物質を特異的に結合させる。この結果、結合工程においては、基材表面に固定されている対象脂質の量に応じた量のプローブ物質が、当該対象脂質を介して当該基材表面に固定されることとなる。なお、水溶液中のプローブ物質の濃度としては、例えば、プローブ物質として脂質結合ドメインを含むペプチド又は非抗体タンパク質を用いる場合、１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの範囲内の濃度を好ましく用いることができる。これは、１μｇ／ｍｌ未満の濃度では基材表面に固定されるプローブ物質の量が少なすぎ、また、１０μｇ／ｍｌより大きい濃度ではプローブ物質が基材表面に非特異的に結合することにより、後述の検出工程においてプローブ物質を定量的に検出する上で不都合が生じる場合があるためである。
【００５９】
検出工程においては、結合工程で基材表面に固定されたプローブ物質を定量的に検出する。すなわち、例えば、蛍光物質で標識されたプローブ物質を用いる場合には、蛍光顕微鏡やスキャナ装置等を用いて、基材表面に固定されているプローブ物質に結合されている当該蛍光物質の蛍光強度を測定することにより、当該プローブ物質を定量する。
【００６０】
また、例えば、特定の酵素で標識されたプローブ物質を用いる場合には、当該プローブ物質が固定されている基材表面を、当該酵素との反応により色素を生成する反応基質を含む水溶液中に浸漬することによって、当該プローブ物質に結合されている酵素と当該反応基質との発色反応を行わせる。そして、この反応によって生成された色素を含む水溶液の吸光度を測定することにより、プローブ物質を定量する。
【００６１】
また、例えば、プローブ物質又はプローブ物質に結合している標識物質に対する抗体が利用可能であれば、当該プローブ物質が固定されている基材表面を、当該抗体を含む水溶液中に浸漬することによって、当該プローブ物質に当該抗体を結合させる。そして、例えば、この抗体が蛍光物質で標識されている場合には、プローブ物質に結合した当該抗体に含まれる蛍光物質の蛍光強度を測定することにより、当該プローブ物質を定量する。
【００６２】
そして、本脂質定量方法においては、この検出工程で得られたプローブ物質の検出結果に基づいて、基材表面に固定されている対象脂質の量を算出することができる。すなわち、例えば、基材表面に固定されている対象脂質の量（例えば、基材表面の単位面積あたりに固定されている量）と、当該対象脂質に結合するプローブ物質の検出量（例えば、蛍光強度や吸光度等）と、の相関関係を示す検量データを予め取得しておき、当該検量データと、検出工程で得られたプローブ物質の検出結果（例えば、蛍光強度や吸光度等）と、に基づいて、当該プローブ物質が結合していた対象脂質の量（例えば、基材表面の単位面積あたりに固定されている量）を算出することができる。
【００６３】
また、本脂質定量方法は、対象脂質と、リポソームを形成可能なベース脂質と、を含むリポソームを形成するリポソーム形成工程をさらに含むこととしてもよい。この場合、本脂質定量方法においては、例えば、固定工程に先立って、対象脂質とベース脂質とを所定の比率で混合した混合脂質を調製し、当該混合脂質からなるリポソームを形成する。ここで、この対象脂質とベース脂質とを混合する比率としては、例えば、重量比で１：０．１〜１０（対象脂質１に対してベース脂質を０．１以上１０未満）の範囲内の比率を好ましく用いることができる。これは、対象脂質に対してベース脂質の量が多すぎると、例えば、当該対象脂質に結合したプローブ物質の検出に用いる標識抗体が、当該ベース脂質に非特異的に結合することにより、バックグラウンドのシグナルが大きくなる場合があるためである。また、対象脂質に対してベース脂質の量が少なすぎると、例えば、リポソームの形成が不十分となる場合がある。
【００６４】
このベース脂質は、リポソームを形成可能な脂質であれば特に制限されず、例えば、ホスファチジルコリン（ＰｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌＣｈｏｌｉｎｅ；ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌＥｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ；ＰＥ）、ホスファチジルセリン（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ）等を好適に用いることができる。なお、このベース脂質は１種類の脂質からなるもののみならず、複数種類の脂質が所定の割合で混合された混合脂質からなるものを用いることもできる。
【００６５】
また、このリポソーム形成工程においては、一重膜からなるリポソームを形成することとしてもよい。すなわち、例えば、対象脂質とベース脂質とを含む混合脂質を超音波処理する等の周知の技術を用いて、当該対象脂質が表面に埋め込まれた一重の脂質膜からなるリポソームを形成することができる。この場合、例えば、微量な対象脂質を効率的にリポソーム表面（すなわち、一重膜内）に埋め込むことができる。
【００６６】
そして、固定工程においては、リポソーム形成工程で形成された対象脂質を含むリポソームを基材表面に固定することにより、当該対象脂質を当該基材表面に固定する。すなわち、例えば、対象脂質が脂質膜表面に埋め込まれたリポソームを水溶液中に均一に分散し、基材表面を当該水溶液中に所定時間浸漬することにより、当該基材表面に当該リポソームを吸着させる。この結果、対象脂質は、ベース脂質を含む脂質膜に埋め込まれた状態で、基材表面全体に均一な密度で固定されることとなる。なお、基材表面の単位面積あたりに固定するリポソームの量を、１．５μｇ／ｃｍ２以下の範囲とすることにより、当該基材表面にリポソームを定量的に固定することができる。
【００６７】
また、本脂質定量方法において、対象脂質を固定する基材表面としては、例えば、長鎖アルキル基が固定された表面を用いることができる。すなわち、この場合、準備工程において、例えば、炭素数が所定数範囲の長鎖アルキル基を含む炭化水素化合物を所定濃度で溶解した溶媒中に基材表面を所定時間浸漬することにより、当該基材表面に当該炭化水素化合物を吸着させる。この疎水性の長鎖アルキル基を含む炭化水素化合物としては、例えば、炭素数が８以上のアルキル基を含む炭化水素化合物を用いることができ、特に、炭素数が１６以上２０以下の長鎖アルキル基を含む炭化水素化合物を好適に用いることができる。具体的に、例えば、炭素数が８の１−クロロオクタン（１−ｃｈｌｏｒｏｏｃｔａｎｅ）（以下、Ｃ８被覆物質）、炭素数が１６の塩化パルミトイル（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ）（以下、Ｃ１６被覆物質）、炭素数が１８の塩化ステアロイル（ｓｔｅａｒｏｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、炭素数が２０の塩化アラキドノイル（ａｒａｃｈｉｄｏｎｏｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）等を用いることができる。
【００６８】
また、基材表面には、長鎖アルキル基に加えて、ポリアミノ酸を被覆することもできる。すなわち、例えば、ポリ−Ｌ−リジン（Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ；ＰＬＬ）を溶解した水溶液中に基材表面を所定時間浸漬することにより、当該基材表面に当該ＰＬＬを吸着させる。
【００６９】
また、例えば、ポリアミノ酸で被覆された基材表面を、上述のように、長鎖アルキル基を含む炭化水素化合物を溶解した溶媒中に所定時間浸漬することにより、当該ポリアミノ酸に加えて、当該炭化水素化合物が被覆された基材表面を作製することもできる。
【００７０】
本実施形態に係る脂質の定量キット（以下、本脂質定量キット）は、上述の本脂質定量方法を実現するために必要な要素として、対象脂質に対して特異的に結合可能なプローブ物質と、対象脂質を含むリポソームを形成可能なベース脂質と、を含む。
【００７１】
すなわち、本脂質定量キットは、例えば、本脂質定量方法において利用可能な少なくとも１種類のプローブ物質を含む。具体的に、例えば、試料中に定量の対象とするホスホイノシチドが複数種類含まれている場合には、本脂質定量キットは、当該複数種類のホスホイノシチドの各々に対して特異的に結合可能な複数種類のプローブ物質を含む。この場合、例えば、これら複数種類のプローブ物質の各々には、互いに異なる標識物質（例えば、互いに異なる蛍光物質や酵素等）が結合されていてもよい。
【００７２】
また、本脂質定量キットに含まれるベース脂質は、対象脂質と所定の比率で混合された後、当該対象脂質を含むリポソームを形成可能な少なくとも１種類の脂質を含む。具体的に、例えば、ホスホイノシチドを定量の対象とする場合には、本脂質定量キットは、ベース脂質としてＰＥとＰＣとを含む。この場合、ベース脂質は、例えば、リポソームの形成に適した所定の比率でＰＥとＰＣとを混合した混合脂質であってもよい。
【００７３】
本脂質定量キットを用いた本脂質質定量方法においては、例えば、まず、対象脂質と、本脂質定量キットに含まれるベース脂質と、を所定の比率で混合した混合脂質を調製し、当該混合脂質からなるリポソームを形成する。そして、このリポソームを所定の基材表面に固定し、当該基材表面に固定されたリポソームに含まれる対象脂質に、本脂質定量キットに含まれるプローブ物質を結合させる。この基材表面上に固定された対象脂質に結合したプローブ物質を定量的に検出することにより、当該検出結果と所定の検量データとに基づいて、当該プローブ物質の検出結果を対象脂質の量に換算することができる。
【００７４】
次に、本酵素活性定量方法の具体的な内容について説明する。本酵素活性定量方法は、プローブ物質等を準備する準備工程と、当該特定脂質を含むリポソームを形成するリポソーム形成工程と、当該形成されたリポソームを基材表面に固定する固定工程と、当該基材表面に固定されたリポソームに含まれる特定脂質と当該対象酵素とを反応させる反応工程と、当該反応後に当該基材表面に固定されている特定脂質又は生成脂質と当該プローブ物質とを結合させる結合工程と、当該特定脂質又は生成脂質に結合されたプローブ物質を定量的に検出する検出工程と、を含む。
【００７５】
準備工程においては、特定脂質に対して特異的に結合可能なプローブ物質を準備する。すなわち、例えば、上述した本脂質定量方法に含まれる準備工程と同様に、形質転換細胞等を用いて、特定脂質と特異的に結合する脂質結合ドメインを少なくとも１つ含むペプチド又は非抗体タンパク質をプローブ物質として作製する。また、この準備工程においては、特定脂質を含むリポソームの固定に適した基材表面を準備する。すなわち、例えば、上述した本脂質定量方法に含まれる準備工程と同様に、長鎖アルキル基又はポリアミノ酸等が固定された基材表面を作製する。
【００７６】
リポソーム形成工程においては、特定脂質と、リポソームを形成可能なベース脂質と、を含むリポソームを形成する。すなわち、例えば、上述した本脂質定量方法に含まれるリポソーム形成工程と同様に、特定脂質とベース脂質とを所定の比率で混合した混合脂質を調製し、当該混合脂質からなるリポソームを形成する。なお、この特定脂質とベース脂質とを混合する比率としては、例えば、本脂質定量方法の場合と同様に、重量比で１：０．１〜１０（特定脂質１に対してベース脂質を０．１以上１０未満）の範囲内の比率を好ましく用いることができる。
【００７７】
固定工程においては、リポソーム形成工程で形成されたリポソームを、準備工程で準備された基材表面に固定する。すなわち、例えば、上述した本脂質定量方法に含まれる固定工程と同様に、特定脂質が脂質膜表面に埋め込まれたリポソームを均一に分散した水溶液中に、長鎖アルキル基が固定された基材表面を所定時間浸漬することにより、当該リポソームを当該基材表面に吸着させる。この結果、対象酵素の反応基質である特定脂質は、ベース脂質を含む脂質膜に埋め込まれた状態で、基材表面全体に均一な密度で固定されることとなる。なお、基材表面の単位面積あたりに固定する特定脂質の量については、例えば、対象酵素ＰＴＥＮ（Ｍａｅｈａｍａ，Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７３，１３３７５−１３３７８（１９９８）、Ｍｙｅｒｓ，Ｍ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９５，１３５１３−１３５１８（１９９８））の酵素活性を定量する場合、特定脂質ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３又はＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２を、１１０ｎｇ／ｃｍ２〜９１０ｎｇ／ｃｍ２の範囲の量で基材表面に固定することにより、当該各ホスホイノシチドをＧＲＰ１−ＰＨドメイン又はＰＬＣδ１−ＰＨドメインを用いて定量的に検出することができる。また、基材表面（例えば、長鎖アルキル基が固定された合成樹脂表面等）にリポソームを定量的に固定するため、例えば、リポソームの単位面積あたりの固定量として１．５μｇ／ｃｍ２を採用する場合には、特定脂質であるホスホイノシチドとベース脂質とを３：２の重量比で含むリポソームを形成し、ホスホイノシチド及びベース脂質がそれぞれ０．９μｇ／ｃｍ２及び０．６μｇ／ｃｍ２で固定されるよう当該リポソームを基材表面に固定する。
【００７８】
反応工程においては、固定工程において基材表面に固定された特定脂質と、対象酵素と、を反応させる。すなわち、例えば、特定脂質が固定された基材表面を、所定濃度の対象酵素を含む水溶液中に所定時間浸漬することによって、当該水溶液中において当該特定脂質と当該対象酵素とを反応させる。この結果、例えば、固定工程において基材表面に固定された特定脂質の総量のうち、対象酵素の量（水溶液中濃度等）及び活性に応じた量の特定脂質が消失し、又は他の化合物に変化することとなる。なお、対象酵素と特定脂質とを水溶液中で反応させる場合、当該水溶液中における対象酵素の濃度は、例えば、モル比で対象酵素が特定脂質に対して過剰量となるように設定することができる。具体的に、本酵素活性定量方法においては、例えば、対象酵素ＰＴＥＮの濃度として０．１μｇ／μｌ以下、対象酵素ｐ１１０α（Ｆｒｕｍａｎ，Ｄ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．；Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，６７，４８１−５０７（１９９８））の濃度として３０ｎｇ／μｌ以下の範囲を好適に用いることができる。
【００７９】
結合工程においては、反応工程における対象酵素との反応後に基材表面に固定されている特定脂質に、準備工程で準備したプローブ物質を結合させる。すなわち、例えば、上述した本脂質定量方法に含まれる結合工程と同様に、反応工程における反応の後、未反応の特定脂質が残存している基材表面を、所定濃度のプローブ物質を含む水溶液中に所定時間浸漬することによって、当該未反応の特定脂質に当該プローブ物質を結合させる。この結果、基材表面に残存している未反応の特定脂質の量に応じた量のプローブ物質が、当該未反応の特定脂質を介して当該基材表面に固定されることとなる。
【００８０】
検出工程においては、結合工程で基材表面に固定されたプローブ物質を定量的に検出する。すなわち、例えば、上述した本脂質定量方法に含まれる検出工程と同様に、プローブ物質が蛍光物質で標識されている場合には、基材表面に固定されているプローブ物質の蛍光強度を測定することにより、当該プローブ物質を定量する。そして、本酵素活性定量方法においては、この検出工程で得られたプローブ物質の定量結果に基づいて、基材表面に固定されている特定脂質の量を算出することにより、対象酵素の活性を定量することができる。
【００８１】
すなわち、例えば、固定工程において基材表面に固定された特定脂質を対象酵素と反応させることなく、反応基質プローブ物質と結合させ、当該特定脂質に結合した反応基質プローブを定量することにより、対象酵素と反応させた特定脂質の総量（すなわち、反応前の特定脂質の総量）を算出する。一方、反応工程で対象酵素と反応させた後、検出工程において基材表面に残存している未反応の特定脂質に結合した反応基質プローブ物質を定量することにより、当該未反応の特定脂質の量を算出する。そして、これら反応前の特定脂質の量と反応後の特定脂質の量との差分から、特定脂質の反応量（すなわち、対象酵素との反応によって消費された量）を算出することにより、対象酵素の活性を定量できる。
【００８２】
また、本酵素活性定量方法において、特定の脂質と反応することにより、他の脂質（生成脂質）を生成する対象酵素の活性を定量する場合には、当該生成脂質に対して特異的に結合可能なプローブ物質を用いることもできる。
【００８３】
すなわち、例えば、対象酵素が特定脂質と反応することによって、当該特定脂質に特定の官能基又は分子鎖を付加し、又は当該特定脂質に含まれる特定の官能基又は分子鎖を除去し若しくは分子内の結合位置を転移させる場合には、固定工程において基材表面に固定された特定脂質のうち、当該対象酵素と反応した特定脂質（すなわち、当該対象酵素の量及び活性に応じた量の特定脂質）が、当該基材表面に固定されたまま、当該対象酵素によって、当該特定の官能基を付加され、除去され、又は転移されることとなる。この結果、対象酵素の量及び活性に応じた量の生成脂質が、基材表面に固定された状態で生成される。
【００８４】
すなわち、例えば、対象酵素と、所定数のリン酸基が所定位置に結合した第一のホスホイノシチドを反応基質と、の反応によって、当該第一のホスホイノシチドに含まれるよりも多い若しくは少ないリン酸基を含み、又は当該第一のホスホイノシチドと異なる位置にリン酸基が結合された第二のホスホイノシチドが生成される場合には、基材表面に固定された当該第一のホスホイノシチドと当該対象酵素とを反応させることによって、当該基材表面に固定された当該第二のホスホイノシチドが生成される。具体的に、例えば、対象酵素として、ＰＴＥＮはＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３を反応基質としてＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２を生成し、ＳＫＩＰ（Ｉｊｕｉｎ，Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７５，１０８７０−１０８７５（２０００））、ＳＨＩＰ（Ｈｅｌｇａｓｏｎ，Ｃ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ，１２，１６１０−１６２０（１９９８））、ＳＨＩＰ２（Ｃｈｕａｎｇ，Ｙ．Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，６４，８２７１−８２７５（２００４））、Ｐｈａｒｂｉｎ（Ａｓａｎｏ，Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，２６１，１８８−１９５（１９９９））はＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３を反応基質としてＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２を生成し、ｓｙｎａｐｔｏｊａｎｉｎ１（Ｖｅｒｓｔｒｅｋｅｎ，Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｎｅｕｒｏｎ，４０，７３３−７４８（２００３））、ｓｙｎａｐｔｏｊａｎｉｎ２（Ｓｌｅｅｍａｎ，Ｍ．Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｎａｔ  Ｍｅｄ，１１，１９９−２０５（２００５））、ＯＣＲＬ（Ｕｎｇｅｗｉｃｋｅｌｌ，Ａ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１０１，１３５０１−１３５０６（２００４））はＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２を反応基質としてＰｔｄＩｎｓ（４）Ｐを生成し、ＩｐｇＤ（Ｎｉｅｂｕｈｒ，Ｋ．  ｅｔ  ａｌ；Ｅｍｂｏ  Ｊ，２１，５０６９−５０７８（２００２））はＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２を反応基質としてＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐを生成し、Ｍｙｏｔｕｂｌａｒｉｎ、ＭＴＭＲ２はＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐを反応基質としてＰｔｄＩｎｓを生成する。
【００８５】
そこで、この場合、準備工程においては、生成脂質に対して特異的に結合可能なプローブ物質を準備する。すなわち、例えば、上述した本脂質定量方法に含まれる準備工程と同様に、形質転換細胞等を用いて、生成脂質と特異的に結合する脂質結合ドメインを少なくとも１つ含むペプチド又は非抗体タンパク質をプローブ物質として作製する。
【００８６】
そして、結合工程においては、反応工程における特定脂質と対象酵素との反応後に、当該反応によって生成され、基材表面に固定されている生成脂質に、準備工程で準備したプローブ物質を結合させる。すなわち、例えば、上述した本脂質定量方法に含まれる結合工程と同様に、反応工程における反応の後、生成脂質が固定されている基材表面を、所定濃度のプローブ物質を含む水溶液中に所定時間浸漬することによって、当該生成脂質に当該プローブ物質を結合させる。この結果、基材表面に固定されている生成脂質の量に応じた量のプローブ物質が、当該生成脂質を介して当該基材表面に固定されることとなる。
【００８７】
そして、検出工程においては、結合工程で基材表面に固定されたプローブ物質を定量的に検出する。すなわち、例えば、上述した本脂質定量方法に含まれる検出工程と同様に、プローブ物質が蛍光物質で標識されている場合には、基材表面に固定されているプローブ物質の蛍光強度を測定することにより、当該プローブ物質を定量する。この場合、本酵素活性定量方法においては、この検出工程で得られたプローブ物質の定量結果に基づいて、基材表面に固定されている生成脂質の量（すなわち、特定酵素と対象酵素との反応による反応生成物の量）を算出することにより、対象酵素の活性を定量できる。
【００８８】
このように、基材表面に固定された特定脂質と対象酵素との反応後に、生成脂質が当該基材表面に固定されている場合には、例えば、当該基材表面を浸漬する溶液（プローブ物質を含む溶液や洗浄用の溶液等）を交換する簡便な操作により、対象酵素の活性を定量できる。
【００８９】
また、本酵素活性定量方法においては、プローブ物質として、特定脂質に対して特異的に結合可能な反応基質用プローブ物質と、生成脂質に対して特異的に結合可能な生成物用プローブ物質と、の両方を用いることとしてもよい。すなわち、この場合、例えば、互いに異なる標識物質（互いに異なる波長の蛍光を発する蛍光物質等）を結合した反応基質用プローブ物質と生成物用プローブ物質とを用いて、対象酵素との反応後に残存している特定脂質の量と、当該反応によって生成された生成脂質の量と、の両方を定量することにより、当該対象酵素の活性をより高精度に定量することができる。
【００９０】
また、本酵素活性定量方法においては、一重膜のリポソームを形成することによって、特定脂質を脂質膜の外表面に固定し、対象酵素との反応を効率的に行わせることができるとともに、当該脂質膜の外表面に固定された生成脂質を生成することができる。
【００９１】
本実施形態に係る脂質関連酵素活性の定量キット（以下、本酵素活性定量キット）は、本酵素活性定量方法を実現するために必要な要素として、特定脂質に対して特異的に結合可能なプローブ物質、又は生成脂質に対して特異的に結合可能なプローブ物質、のうち少なくとも一方と、当該特定脂質と、当該特定脂質を含むリポソームを形成可能なベース脂質と、を含む。
【００９２】
すなわち、例えば、対象酵素が第一のホスホイノシチドを反応基質とし、当該第一のホスホイノシチドに含まれるよりも多い若しくは少ないリン酸基を含み、又は当該第一のホスホイノシチドと異なる位置にリン酸基が結合された第二のホスホイノシチドを生成する場合には、本酵素活性定量キットは、当該第一のホスホイノシチドに対して特異的に結合可能な反応基質用プローブ物質、又は当該第二のホスホイノシチドに対して特異的に結合可能な生成物用プローブ物質のうち少なくとも一方を含む。この場合、例えば、反応基質用プローブ物質と生成物用プローブ物質とは、互いに異なる標識物質（例えば、互いに異なる蛍光物質や酵素等）が結合されていてもよい。
【００９３】
また、本酵素活性定量キットに含まれるベース脂質は、特定脂質と所定の比率で混合された後、当該特定脂質を含むリポソームを形成可能な少なくとも１種類の脂質を含む。具体的に、例えば、ホスホイノシチドを反応基質とする対象酵素の活性を定量する場合には、本酵素活性定量キットは、ベース脂質としてＰＥとＰＣとを含む。この場合、ベース脂質は、例えば、リポソームの形成に適した所定の比率でＰＥとＰＣとを混合した混合脂質であってもよい。
【００９４】
本酵素活性定量キットを用いた本酵素質定量方法においては、例えば、まず、対象酵素の反応基質である特定脂質と、本酵素活性定量キットに含まれるベース脂質と、を所定の比率で混合した混合脂質を調製し、当該混合脂質からなるリポソームを形成する。そして、このリポソームを所定の基材表面に固定し、当該基材表面に固定されたリポソームに含まれる特定脂質と、対象酵素と、を反応させる。そして、この反応後の基材表面に固定されている未反応の特定脂質又は生成された生成脂質と、本脂質定量キットに含まれる反応基質用プローブ物質又は生成物用プローブ物質とを結合させる。この基材表面上に固定された特定脂質に結合した反応基質用プローブ物質の検出結果から対象酵素によって消費された特定脂質を定量し、又は当該基材表面上に固定された生成脂質に結合した生成物用プローブ物質の検出結果から対象酵素によって生成された生成脂質を定量することにより、当該対象酵素の活性を定量できる。
【００９５】
次に、本病態評価方法の具体的な内容について説明する。本病態評価方法は、生体から採取した対象脂質を本脂質定量方法により定量する脂質定量工程、又は生体から採取した対象酵素を本酵素活性定量方法により定量する酵素活性定量工程のうち少なくとも一方と、当該脂質定量工程又は酵素活性定量工程における定量結果に基づいて、当該生体の病態を評価する病態評価工程と、を含む。
【００９６】
すなわち、本病態評価方法においては、例えば、生体の血液や、病態に関連する特定の組織又は細胞に含まれる１種類以上の脂質又は１種類以上の脂質関連酵素のうち少なくとも一方を採取する。そして、例えば、この採取した各脂質を対象脂質として、当該各対象脂質に対して特異的に結合可能なプローブ物質を用いた本脂質定量方法により定量する。また、例えば、この採取した各脂質関連酵素を対象酵素として、当該各対象酵素の反応基質である特定脂質に対して特異的に結合可能な反応基質用プローブ物質、又は当該各対象酵素と当該特定脂質との反応により生成される生成脂質に対して特異的に結合可能な生成物用プローブ物質、のうち少なくとも一方を用いた本酵素活性定量方法により定量する。
【００９７】
この結果、例えば、生体の血液、組織、細胞に含まれている脂質又は脂質関連酵素の種類や活性と、病態の種類や程度と、の関連性を示す病態関連データが予め得られている場合には、当該病態関連データと、本脂質定量方法又は本酵素活性定量方法による定量結果と、に基づいて、当該各対象脂質又は各脂質関連酵素が採取された生体に係る病態の種類や程度を評価することができる。
【００９８】
この結果、例えば、生体の血液、組織、細胞に含まれている脂質関連酵素の種類や活性と、病態の種類や程度と、の関連性を示す病態関連データが予め得られている場合には、当該病態関連データと、本酵素活性定量法による各対象酵素活性の定量結果と、に基づいて、当該各対象酵素が採取された生体に係る病態の種類や程度を評価することができる。
【００９９】
なお、本病態評価方法においては、本脂質定量キットを用いて対象脂質を定量し、又は本酵素活性定量キットを用いて対象酵素の活性を定量することができる。すなわち、上述の本脂質定量キット及び本酵素活性定量キットは、例えば、生体の病態を評価するキットとしても用いることができる。
【０１００】
次に、本脂質定量方法の一実施例について説明する。本例においては、１分子中に含まれるリン酸基の数又は結合位置が互いに異なる６種類のホスホイノシチド、すなわち、ＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ（４）Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２、ＰｔｄＩｎｓ（３，５）Ｐ２、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３を定量の対象とした。
【０１０１】
そこで、本例においては、上記６種類のホスホイノシチドの各々に対して特異的に結合可能な脂質結合ドメインを含む非抗体タンパク質をプローブ物質として準備した。すなわち、形質転換細胞体を用いて、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２に対して特異的に結合可能なＰＬＣδ１のＰＨドメイン、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３に対して特異的に結合可能なＧＲＰ１のＰＨドメイン、ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２に対して特異的に結合可能なＴＡＰＰ１のＰＨドメイン、ＰｔｄＩｎｓ（３，５）Ｐ２に対して特異的に結合可能なＭＴＭＲ１のＧＲＡＭドメイン、ＰｔｄＩｎｓ（４）Ｐに対して特異的に結合可能なＦＡＰＰ１のＰＨドメイン、ＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐに対して特異的に結合可能なＥＥＡ１のＦＹＶＥドメイン又はＨｒｓのＦＹＶＥドメイン、のうち１種類を１つ又は２つ含み、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＧＳＴ）が結合されたタンパク質（以下、ＧＳＴ融合タンパク質）をプローブ物質として作製した。
【０１０２】
具体的に、まず、上記各脂質結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドベクターを作製した。すなわち、例えば、ＥＦハンドモチーフを含むＰＬＣδ１のＰＨドメイン（アミノ酸１〜１３０）（以下、ＰＬＣδ１−ＰＨ）をコードするポリヌクレオチドを、５’プライマ−としてＡＧＡＴＣＴＡＴＧＧＡＣＴＣＣＧＧＴＣＧＧＧＡＣＴＴ（５’末端のヌクレオチド配列ＡＧＡＴＣＴはＢｇｌＩＩ制限酵素部位）（配列番号１）を用い、３’プライマーとしてＧＧＡＴＣＣＣＴＴＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＴＣＣＡＴＧＧ（３’末端のヌクレオチド配列ＧＧＡＴＣＣはＢａｍＨＩ制限酵素部位）（配列番号２）を用いて、マウス脳の相補的ＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ；ｃＤＮＡ）ライブラリから、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）により増幅し、クローニングベクターｐＤｒｉｖｅ（Ｑｉａｇｅｎ）にサブクローニングした。
【０１０３】
そして、この結果得られたベクターをＢｇｌＩＩ制限酵素及びＢａｍＨＩ制限酵素により消化し、ＰＬＣδ１−ＰＨをコードするポリヌクレオチド含むフラグメントを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＧＥＸ６ｐ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のＢａｍＨＩ部位にサブクローニングした。
【０１０４】
また、２つのＰＬＣδ１−ＰＨをコードするポリヌクレオチドを準備し、一方のポリヌクレオチドのＢｇｌＩＩ部位と他方のポリヌクレオチドのＢａｍＨＩ部位とを連結することにより、２つのＰＬＣδ１−ＰＨが直列に連結したタンデムドメイン（以下、ＰＬＣδ１−２×ＰＨ）を発現するベクターを作製した。なお、このタンデムドメインを作製する場合には、当該タンデムドメインを含むタンパク質の立体構造を安定化させる等の目的で、一方のドメインと他方のドメインとのつなぎ目に数個のアミノ酸配列（いわゆるリンカー）を挿入することもできるが、本例においては、当該リンカーを用いる代わりに、各ドメインの前後数十個のアミノ酸配列を含めてクローニングすることにより、当該数十個のアミノ酸配列にリンカーの役割を果たさせるとともに、タンパク質の立体構造を安定化させ、さらに解離定数の向上をも図った。
【０１０５】
また、同様に、ＧＲＰ１のＰＨドメイン（アミノ酸２５３〜３９２）（以下、ＧＲＰ１−ＰＨ）をコードするポリヌクレオチドを、５’プライマ−としてＡＧＡＴＣＴＧＡＣＧＡＣＧＧＧＡＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣ（５’末端のＡＧＡＴＣＴはＢｇｌＩＩ制限酵素部位）（配列番号３）を用い、３’プライマ−としてＧＧＡＴＣＣＣＣＴＣＧＴＴＧＣＣＡＡＣＡＴＧＴＣＡＴ（３’末端のＧＧＡＴＣＣはＢａｍＨＩ制限酵素部位）（配列番号４）を用いて、ヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  Ｖｅｉｎ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ；ＨＵＶＥＣ）のｃＤＮＡライブラリからクローニングし、当該ＧＲＰ１−ＰＨを発現するベクターを作製した。
【０１０６】
また、ＥＥＡ１のＦＹＶＥフィンガードメイン（アミノ酸１３３６〜１４１１）（以下、ＥＥＡ１−ＦＹＶＥ）を、５’プライマ−としてＡＧＡＴＣＴＣＴＴＣＡＧＡＴＣＡＡＡＣＡＴＡＣＡＣＡ（５’末端のＡＧＡＴＣＴはＢｇｌＩＩ制限酵素部位）（配列番号５）を用い、３’プライマ−としてＧＧＡＴＣＣＴＣＣＴＴＧＣＡＡＧＴＣＡＴＴＧＡＡＣＡ（３’末端のＧＧＡＴＣＣはＢａｍＨＩ制限酵素部位）（配列番号６）を用いて、マウス腎臓のｃＤＮＡライブラリから単離した。また、同様にして、ＦＡＰＰ１−ＰＨドメイン（以下、ＦＡＰＰ１−ＰＨ）を発現するベクターも作製した。
【０１０７】
また、上述のＰＬＣδ１−２×ＰＨを発現するベクターを作製する場合と同様にして、２つのＧＲＰ１−ＰＨが直列に連結したタンデムドメイン（以下、ＧＲＰ１−２×ＰＨ）、２つのＦＡＰＰ１−ＰＨが直列に連結したタンデムドメイン（以下、ＦＡＰＰ１−２×ＰＨ）、又は２つのＥＥＡ１−ＦＹＶＥが直列に連結したタンデムドメイン（以下、ＥＥＡ１−２×ＦＹＶＥ）を発現するベクターを作製した。
【０１０８】
また、ＢｇｌＩＩ部位を含むＴＡＰＰ１のＰＨドメイン（アミノ酸１８０〜４０５）（以下、ＴＡＰＰ１−ＰＨ）をコードするポリヌクレオチド配列を、５’プライマ−としてＧＧＡＴＣＣＣＣＴＴＡＣＴＴＴＡＣＴＣＣＴＡＡＡＣＣ（５’末端のＧＧＡＴＣＣはＢａｍＨＩ制限酵素部位）（配列番号７）を用い、３’プライマ−としてＧＡＡＴＴＣＣＡＣＧＴＣＡＣＴＧＡＣＣＧＧＡＡＧＧＣ（３’末端のＧＡＡＴＴＣはＥｃｏＲＩ制限酵素部位）（配列番号８）を用いて、また、５’プライマ−としてＧＡＡＴＴＣＣＣＴＴＡＣＴＴＴＡＣＴＣＣＴＡＡＡＣＣ（５’末端のＧＡＡＴＴＣはＥｃｏＲＩ制限酵素部位）（配列番号９）を用い、３’プライマ−としてＧＴＣＧＡＣＣＡＣＧＴＣＡＣＴＧＡＣＣＧＧＡＡＧＧＣ（３’末端のＧＴＣＧＡＣはＳａｌＩ制限酵素部位）（配列番号１０）を用いて、ＨＵＶＥＣのｃＤＮＡライブラリからＰＣＲにより増幅し、そのフラグメントを発現ベクターｐＧＥＸ６ｐ−１のＢａｍＨＩ  ＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした。
【０１０９】
また、上述のＰＬＣδ１−２×ＰＨを発現するベクターを作製する場合と同様にして、２つのＴＡＰＰ１−ＰＨが直列に連結したタンデムドメイン（以下、ＴＡＰＰ１−２×ＰＨ）を発現するベクターを作製した。
【０１１０】
また、２つのＨｒｓ−ＦＹＶＥドメインが直列に連結したタンデムドメイン（以下、Ｈｒｓ−２×ＦＹＶＥ）を発現するベクターを、以前に報告された方法（Ｇｉｌｌｏｏｌｙ，Ｄ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｅｍｂｏ  Ｊ，１９，４５７７−４５８８（２０００））により作製した。また、同様にして、ＭＴＭＲ１のＧＲＡＭドメイン（以下、ＭＴＭＲ１−ＧＲＡＭ）を発現するベクターも作製した。
【０１１１】
次に、上述のように作製した発現ベクターにより大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９細胞を形質転換し、当該形質転換細胞を７００ｍｌのＬＢ培地（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ  ｂｒｏｔｈ）中、３７℃で、３時間培養した。さらに、このＬＢ培地に、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩｓｏＰｒｏｐｙｌ  β−Ｄ−ＴｈｉｏＧａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ；ＩＰＴＧ）（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）とβ−メルカプトエタノールとをそれぞれ最終濃度１ｍＭとなるように添加することにより、形質転換細胞におけるＧＳＴ融合タンパク質の発現を誘導した。
【０１１２】
そして、この形質転換細胞を２５℃で３時間培養した後、１０，０００×ｇ、１０分間の遠心処理により回収し、細胞ペレットを、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む１０ｍｌの溶解バッファー中に再懸濁して溶解し、４℃で５分間、超音波処理した。この溶液を１００，０００×ｇで３０分間、超遠心した後、当該溶液の上清を、溶解バッファー中で平衡化した０．１ｍｌのグルタチオン−セファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともに、４℃で２時間インキュベーションした。そして、このビーズを、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む１０ｍｌの洗浄バッファーで３回洗浄した後、当該ビーズに、５０ｍＭのグルタチオンと５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）とを含む溶液を添加することにより、ＧＳＴ融合タンパク質を溶出した。
【０１１３】
このようにして、図１に示すように、ＥＥＡ１−２×ＦＹＶＥ、Ｈｒｓ−２×ＦＹＶＥ、ＦＡＰＰ１−ＰＨ、ＦＡＰＰ１−２×ＰＨ、ＴＡＰＰ１−ＰＨ、ＴＡＰＰ１−２×ＰＨ、ＭＴＭＲ１（Ｍｙｏｔｕｂｌａｒｉｎ）−ＧＲＡＭ、ＰＬＣδ１−ＰＨ、ＧＲＰ１−ＰＨ等、１種類の脂質結合ドメインを１つ又は２つ含むＧＳＴ融合タンパク質を作製した。なお、対照物質としてドメインを含まないＧＳＴも作製した。
【０１１４】
また、本例においては、上述のように作製したＧＳＴ融合タンパク質について、ホスホイノシチドとの結合に係る解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ；Ｋｄ）を、以前に報告されたように（Ｏｉｋａｗａ，Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，６，４２０−４２６（２００４））、二面偏波式干渉計（Ａｎａｌｉｇｈｔ  Ｂｉｏ２００、Ｆａｒｆｉｅｌｄ  Ｓｅｎｓｏｒｓ）を用いて測定した。
【０１１５】
ここで、ホスホイノシチドとしては、ＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ（４）Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２、ＰｔｄＩｎｓ（３，５）Ｐ２、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｓ）を用いた。
【０１１６】
すなわち、各ホスホイノシチドとＰＣとＰＥとを、０．２：１：１（モル比）の比率で混合し、窒素ガス下で乾燥させた後、リポソームバッファー中で一晩水和させた。そして、この水和させた混合リン脂質を超音波浴で１０分間処理し、凍結融解サイクルを３回繰り返した後、０．１μｍ孔径のフィルターから押出すことにより、ホスホイノシチドを含むリポソームを形成した。この形成されたリポソームを、所定のプロトコール（Ｆａｒｆｉｅｌｄ  Ｓｅｎｓｏｒｓ）に従い、二面偏波式干渉計に付属のＣ１８センサチップ（炭素数が１８の長鎖アルキル基を固定化したシリコンチップ）の表面にコーティングした。
【０１１７】
そして、このセンサチップ表面に、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡを含むバッファーで透析されたＧＳＴ融合タンパク質を種々の濃度で導入することにより、当該センサチップ表面上のリポソームに含まれるホスホイノシチドと当該ＧＳＴ融合タンパク質との結合に係る解離定数を測定した。なお、１つの脂質結合ドメインを含むＧＳＴ融合タンパク質については、１：１（タンパク質：脂質）結合モデルを用い、２つの脂質結合ドメインを含むＧＳＴ融合タンパク質については、１：２（タンパク質：脂質）結合モデルを用いて、解離定数を算出した。
【０１１８】
その結果、ＧＳＴ融合タンパク質とホスホイノシチドとの結合に係る解離定数はそれぞれ、ＥＥＡ１−２×ＦＹＶＥとＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐとの結合については３１７ｎＭ、Ｈｒｓ−２×ＦＹＶＥとＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐとの結合については１３．９ｎＭ、ＦＡＰＰ１−ＰＨとＰｔｄＩｎｓ（４）Ｐとの結合については５８０ｎＭ、ＦＡＰＰ１−２×ＰＨとＰｔｄＩｎｓ（４）Ｐとの結合については１８．８ｎＭ、ＴＡＰＰ１−ＰＨとＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２との結合については４０．１ｎＭ、ＴＡＰＰ１−２×ＰＨとＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２との結合については４．４７ｎＭＭＴＭＲ１−ＧＲＡＭとＰｔｄＩｎｓ（３，５）Ｐ２との結合については１．１２μＭ、ＰＬＣδ１−ＰＨとＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２との結合については１３６ｎＭ、ＧＲＰ１−ＰＨとＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３との結合については５９．２ｎＭであった。
【０１１９】
すなわち、ＴＡＰＰ１−ＰＨとＦＡＰＰ１−ＰＨについては、当該脂質結合ドメインを直列に２つ連結することにより、当該脂質結合ドメインが１つの場合に比べて、ホスホイノシチドに対する結合に係る解離定数が大幅に増加した。
【０１２０】
本例においては、上記解離定数の測定結果に基づいて、ＰｔｄＩｎｓ（３）ＰについてはＨｒｓ−２×ＦＹＶＥ、ＰｔｄＩｎｓ（４）ＰについてはＦＡＰＰ１−２×ＰＨ、ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２についてはＴＡＰＰ１−２×ＰＨ、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２についてはＰＬＣδ１−ＰＨ、ＰｔｄＩｎｓ（３，５）Ｐ２についてはＭＴＭＲ１−ＧＲＡＭ、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３についてはＧＲＰ１−ＰＨを含むＧＳＴ融合タンパク質をそれぞれ後述の解析で用いるプローブ物質として選択した。
【０１２１】
次に、ＴＬＣブロットにより、上述のように作製したプローブ物質を用いて、基材上に固定されたホスホイノシチドを定量可能であることを確認した。本例においては、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２、ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３を定量の対象とし、当該各ホスホイノシチドを定量するために用いるプローブ物質として、ＰＬＣδ１−ＰＨ、ＴＡＰＰ１−２×ＰＨ、ＧＲＰ１−ＰＨを含むＧＳＴ融合タンパク質をそれぞれ準備した。
【０１２２】
そして、クロロホルム：メタノール：１ＮのＨＣｌを８０：８０：１の比率で混合した溶媒に各ホスホイノシチドを種々の濃度で溶解し、当該各ホスホイノシチドを含む溶液をニトロセルロース膜上にスポットし、乾燥させることにより、当該各ホスホイノシチドを当該ニトロセルロース膜上に固定した。このニトロセルロース膜を５％の脱脂乳と１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とを含むＰＢＳ中、５５℃で一晩ブロッキングした。そして、このニトロセルロース膜を０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳで１回洗浄した後、各ＧＳＴ融合タンパク質を０．５μｇ／ｍｌで含み、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ中、室温で１時間インキュベーションした。その後、このニトロセルロース膜を０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳで３回洗浄した後、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳで２０００倍に希釈された抗ＧＳＴウサギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともに３０分間インキュベーションした。そして、このニトロセルロース膜を３回洗浄した後、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳで７５００倍に希釈されたアルカリホスファターゼ結合抗ウサギＩｇＧ（Ｐｒｏｍｅｇａ）とともに３０分間インキュベーションした。このニトロセルロース膜をＮＢＴ（Ｎｉｔｒｏ−Ｂｌｕｅ  Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ）／ＢＣＩＰ（５−Ｂｒｏｍｏ−４−Ｃｈｌｏｒｏ−３’−ＩｎｄｏｌｙｌＰｈｏｓｐｈａｔｅ）溶液中でインキュベーションし、当該ニトロセルロース膜上に固定されたアルカリホスファターゼによる発色反応を行わせることにより、当該ニトロセルロース膜上に各ホスホイノシチドを介して各ＧＳＴ融合タンパク質が固定されている領域を染色した。そして、ニトロセルロース膜上において染色された部分の面積を、画像解析ソフトウェアＩＭＡＧＥ  Ｊ．（ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／より入手）を用いて定量した。
【０１２３】
図２に、この定量結果の一部を示す。図２ａ、図２ｂ、図２ｃの各々において、横軸はニトロセルロース膜上に固定した各ホスホイノシチドの量（ｐｍｏｌ）、縦軸はニトロセルロース膜上の各ホスホイノシチドが固定された部分の染色面積、をそれぞれ示す。図２ａはＰＬＣδ１−ＰＨを用いてＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２を定量した結果、図２ｂはＴＡＰＰ１−２×ＰＨを用いてＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２を定量した結果、図２ｃはＧＲＰ１−ＰＨを用いてＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３を定量した結果、をそれぞれ示す。
【０１２４】
図２ａ〜図２ｃに示すように、本脂質定量方法においては、ニトロセルロース膜上に固定されたホスホイノシチドの量と、当該ホスホイノシチドに結合したＧＳＴ融合タンパク質の検出量と、の間に直線的な相関関係があることが示された。
【０１２５】
すなわち、例えば、図２ａ〜図２ｃに示すような、基材上に固定されたホスホイノシチドの量と、当該ホスホイノシチドに結合させたプローブ物質の量と、の相関関係を表すデータを検量データとして取得することにより、当該検量データと本脂質定量方法による実測値（プローブ物質の検出量）とに基づいて、対象脂質を定量できることが示された。
【０１２６】
次に、動物細胞に含まれる３種類のホスホイノシチド、すなわち、ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２、又はＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３を、それぞれＴＡＰＰ１−２×ＰＨ、ＰＬＣδ１−ＰＨ、又はＧＲＰ１−ＰＨを含むＧＳＴ融合タンパク質を用いて定量した。
【０１２７】
すなわち、まず、インスリン受容体を過剰に発現しているＣＨＯ細胞（以下、ＣＨＯ−ＩＲ細胞）を１５ｃｍ径の培養皿内で１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。このＣＨＯ−ＩＲ細胞が培養皿内でコンフルエントに達したところで、培養液を無血清ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｎｉｓｓｕｉ）に交換し、当該ＣＨＯ−ＩＲ細胞を一晩栄養枯渇状態で維持した。その後、培養液中にインスリンを最終濃度１００ｎＭとなるように添加することにより、ＣＨＯ−ＩＲ細胞に対するインスリン刺激を行った。そして、このインスリン刺激から所定時間経過後の細胞内に含まれるリン脂質を抽出した。なお、細胞内に存在するホスホイノシチドは微量であり、且つキナーゼ、ホスファターゼ、又はホスホリパーゼＣ等により容易に代謝されるため、当該各ホスホイノシチドの量は、当該細胞に含まれるリン脂質の総量で正規化して評価することが好ましい。このため、本例においては、細胞に含まれるリン脂質の総量を、過塩素酸（ｐｅｒｃｈｌｏｒｉｃ  ａｃｉｄ）を用いた消化による常法により測定した。
【０１２８】
次に、スフィンゴ糖脂質の検出に用いられるＴＬＣブロッティング法（Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，３１２，１４５−１５７（２０００））を用いて、細胞から抽出したリン脂質に含まれるホスホイノシチドを分離するとともに、定量した。なお、このＴＬＣにより、リン酸基の数に応じてホスホイノシチドを分離可能であることを予め確認しておいた。
【０１２９】
１．２％のシュウ酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｏｘａｌａｔｅ）を含み、メタノールと水とを２：３（ｖ／ｖ）の比率で混合した溶媒でＴＬＣプレート（Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ−６０、Ｍｅｒｃｋ）を前処理し、当該ＴＬＣプレートにホスホイノシチドをスポットする前に当該ＴＬＣプレートを１１０℃で１５分間加熱した。そして、細胞から抽出した脂質サンプルを、クロロホルムとメタノールとを２：１（ｖ／ｖ）の比率で混合した１０ｍｌの溶媒に溶解し、ＴＬＣプレート上にスポットした。その後、このＴＬＣプレートを、クロロホルムとアセトンとメタノールと酢酸と水とを８０：３０：２６：２４：１４（ｖ／ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）の比率で混合した展開溶媒中に浸漬した。このＴＬＣにより、細胞から抽出した脂質サンプルに含まれる種々のホスホイノシチドを、リン酸基の数に応じてＴＬＣプレート上で分離した。このＴＬＣプレートを０．２％の塩化カルシウムとメタノールと２−プロパノールとを２０：７：４０（ｖ／ｖ／ｖ）の比率で含む溶液に３０秒間浸漬した。そして、このＴＬＣプレート上にポリフッ化ビニリデン（ＰｏｌｙＶｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ＤｉＦｌｕｏｒｉｄｅ；ＰＶＤＦ）膜を載置し、ＴＬＣサーマルブロッタ−（ＡＴＴＯ）を用いて、当該ＴＬＣプレートとＰＶＤＦ膜とを１８０℃、０．０７Ｐａで圧着することにより、当該ＴＬＣプレートで分離されていたリン脂質を当該ＰＶＤＦ膜上に転写した。このリン脂質が固定されたＰＶＤＦ膜を乾燥後、メタノールに１分間浸漬し、３％の脱脂乳と１％のＢＳＡとを含むブロッキング溶液中に室温で少なくとも３０分間浸漬した。
【０１３０】
そして、このＰＶＤＦ膜を、ＴＡＰＰ１−２×ＰＨ、ＰＬＣδ１−ＰＨ、又はＧＲＰ１−ＰＨを含むＧＳＴ融合タンパク質を最終濃度２μｇ／ｍｌで添加した、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ中に、１時間浸漬した。その後、このＰＶＤＦ膜を０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳで２０００倍に希釈された抗ＧＳＴウサギ抗体とともに３０分間インキュベーションした。さらに、このＰＶＤＦ膜を３回洗浄し、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳで７５００倍に希釈したアルカリホスファターゼ結合抗ウサギＩｇＧ抗体とともに３０分間インキュベーションした。このＰＶＤＦ膜を洗浄した後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液中でインキュベーションすることにより、当該ＰＶＤＦ膜に固定された抗ウサギＩｇＧ抗体のアルカリホスファターゼと、当該ＮＢＴ／ＢＣＩＰと、の発色反応を行わせた。この結果、ＰＶＤＦ膜上において、ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３がそれぞれ固定されている範囲が染色された。このＰＶＤＦ膜上の染色された部分の面積を、画像解析ソフトウェアＩＭＡＧＥ  Ｊ．を用いて定量した。
【０１３１】
この定量結果の一部を図３に示す。図３ａ、図３ｂにおいて、横軸は、ＣＨＯ−ＩＲ細胞に対するインスリン刺激後の経過時間（分）、縦軸は、各経過時間において、ＣＨＯ−ＩＲ細胞に含まれる各ホスホイノシチドの量（ｍｍｏｌ又はμｍｏｌ）を、当該ＣＨＯ−ＩＲ細胞に含まれるリン脂質の総量（ｔｏｔａｌ  Ｐｉ）（ｍｏｌ）で正規化した含有量レベル（ｍｍｏｌ／ｍｏｌ又はμｍｏｌ／ｍｏｌ）をそれぞれ示す。図３ａには、ＴＡＰＰ１−２×ＰＨを用いて定量したＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２の含有量レベル（白抜き四角形のシンボル）と、ＧＲＰ１−ＰＨを用いて定量したＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の含有量レベル（白抜き三角形のシンボル）と、の経時変化を示す。また、図３ｂには、ＰＬＣδ１−ＰＨを用いて定量したＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２の含有量レベルの経時変化を示す。
【０１３２】
図３ａに示すように、ＣＨＯ−ＩＲ細胞内においてインスリン刺激に応答したＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の生成が検出された。すなわち、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の含有量レベルは、インスリン刺激後３０秒で最高値（経過時間ゼロ秒におけるレベルの１０倍）に達し、その後急速に減少した。また、図３ａに示すように、ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２の含有量レベルもまた刺激後３０秒まで増加し、その後徐々に減少した。これに対し、図３ｂに示すように、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２の含有量レベルは、インスリン刺激１分後、刺激前（ゼロ分）の約６０％程度まで減少し、刺激後１０分までに当該刺激前の値まで回復した。
【０１３３】
また、本例においては、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌＩｎｏｓｉｔｏｌ  ３−ｋｉｎａｓｅ；ＰＩ３−キナーゼ）のインヒビターであるＷｏｒｔｍａｎｎｉｎ又はＬＹ２９４００２（Ｗａｌｋｅｒ，Ｅ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ，６，９０９−９１９（２０００））が、培養細胞内におけるＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２及びＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の生成に及ぼす影響についても検討した。すなわち、インスリン刺激に先立って、ＣＨＯ−ＩＲ細胞を１００ｎＭのＷｏｒｔｍａｎｎｉｎ又は２５ｍＭのＬＹ２９４００２（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）で３０分間処理した。そして、これらインヒビターによる前処理を施されたＣＨＯ−ＩＲ細胞に対して、インスリン刺激を与え、細胞内におけるＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２の含有量レベルを、それぞれＴＡＰＰ１−２×ＰＨ、ＧＲＰ１−ＰＨ、ＰＬＣδ１−ＰＨを用いて定量した。
【０１３４】
この定量結果の一部を図４に示す。図４ａ及び図４ｂには、Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ、ＬＹ２９４００２、又はこれらの溶媒として用いたＤＭＳＯのみで前処理した場合（横軸）の、ＣＨＯ−ＩＲ細胞における各ホスホイノシチドの含有量レベル（ｍｍｏｌ／ｍｏｌ又はμｍｏｌ／ｍｏｌ）（縦軸）を示す。なお、図４ｂにおいて、白抜きのバーはＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２の含有量レベル、黒塗りのバーはＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の含有量レベル、をそれぞれ示す。
【０１３５】
図４ａ及び図４ｂに示すように、Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ、ＬＹ２９４００２のいずれのインヒビターも、細胞内におけるＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２とＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の生成を阻害したが、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２の含有量にはほとんど影響を与えなかった。
【０１３６】
次に、本脂質定量方法の他の実施例を示す。本例においては、４種類のホスホイノシチド、すなわち、ＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３を、それぞれＨｒｓ−２×ＦＹＶＥ、ＴＡＰＰ１−２×ＰＨ、ＰＬＣδ１−ＰＨ、ＧＲＰ１−ＰＨを含むＧＳＴ融合タンパク質をプローブ物質として用いて定量した。
【０１３７】
また、本例においては、ポリアミノ酸又は長鎖アルキル基の少なくとも一方を固定した基材表面を準備した。すなわち、ポリ塩化ビニル（Ｐｏｌｙ−Ｖｉｎｙｌ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ；ＰＶＣ）製又はポリスチレン（ＰｏｌｙＳｔｙｒｅｎｅ；ＰＳ）製の９６ウェルプレート、及び所定の表面処理が施されたポリスチレン製の９６ウェルプレートＩｍｍｕｌｏｎ  ２ＨＢ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）のウェルの底面に、ＰＬＬ、Ｃ８被覆物質、Ｃ１６被覆物質（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、のうち少なくとも１つを被覆した基材表面を作製した。
【０１３８】
具体的に、各ウェルに、０．１ＭのＮａＨＰＯ４と０．２５ｍｇ／ｍｌのＰＬＬとを含む水溶液を入れて少なくとも２時間インキュベーションすることにより、当該ＰＬＬで被覆されたウェル底面を作製した。また、このようにウェルの底面をＰＬＬで被覆した後、当該ウェルにメタノールで５０倍に希釈したＣ８被覆物質又はＣ１６被覆物質を入れて２時間インキュベーションすることにより、ＰＬＬとＣ８被覆物質又はＣ１６被覆物質とを被覆したウェル底面を作製した。
【０１３９】
また、本例においては、ＰＬＬ又は長鎖アルキル基を被覆したウェル底面の脂質に対する親和性を評価した。すなわち、蛍光標識されたＰＥ（Ｎ−ｄａｎｓｙｌ  ＰＥ）と標識されていないＰＥとを０．１：１（モル比）の比率で混合したリン脂質からなる１０μｇ／ｍｌのリポソームを、ＰＬＬ、Ｃ８被覆物質又はＣ１６被覆物質のうち少なくとも１つで被覆され、又は被覆されていない各ウェルに入れて２時間インキュベーションすることにより、当該リポソームを当該各ウェルの底面に吸着させた。そして、各ウェル底面を０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳで洗浄した後、分光光度計ＦＵＳＩＯＮ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて、当該ウェル底面の蛍光強度（３３５／５２０ｎｍ）を測定した。
【０１４０】
この測定結果を図５に示す。図５において、横軸はウェル底面の被覆条件（プラス記号「＋」は、ＰＬＬ、Ｃ８被覆物質、Ｃ１６被覆物質が被覆されたことを示す）、縦軸は各条件で被覆されたウェル底面の蛍光強度、をそれぞれ示す。この図５において、白抜きのバーはＰＳ製のウェル底面、灰色のバーはＩｍｍｕｌｏｎ  ２ＨＢのウェル底面、黒色のバーはＰＶＣ製のウェル底面、についての結果をそれぞれ示す。
【０１４１】
図５に示すように、Ｃ１６被覆物質のみ、Ｃ８被覆物質とＣ１６被覆物質の両方、又はＰＬＬとＣ１６被覆物質の両方、を被覆したＰＶＣ製のウェル底面で顕著に高い蛍光強度が測定された。すなわち、これら３種類の条件で被覆したウェル底面にリン脂質を効果的に固定できることが示された。
【０１４２】
そこで、さらに、このＰＬＬとＣ１６被覆物質とを被覆したＰＶＣ製のウェル底面にリポソームを吸着させる上で好ましいインキュベーション時間と、当該ウェル底面あたりに必要とされるリン脂質の総量と、を検討した。
【０１４３】
この検討結果の一部を図６及び図７に示す。図６において、横軸はウェル内にリポソーム溶液を入れてからのインキュベーション時間（時間）、縦軸は各ウェル底面に固定されたリポソームに含まれるＰＥの蛍光強度、をそれぞれ示す。また、図７において、横軸はウェルあたりに加えたＰＥ（すなわち、ＰＥからなるリポソーム）の量（ｎｍｏｌ）、縦軸は各ウェル底面に固定されたリポソームに含まれるＰＥの蛍光強度を示す。
【０１４４】
図６に示すように、約２時間のインキュベーション時間まで、インキュベーション時間と蛍光強度との直線関係が確認された。また、図７に示すように、ＰＥの固定量として約１ｎｍｏｌ（すなわち、約０．７μｇ）まで、ＰＥの固定量と蛍光強度との直線関係が確認された。したがって、ウェル底面にリポソームを固定する条件としては、例えば、インキュベーション時間は２時間以上とし、ウェルあたりには０．５μｇ以下のリン脂質を加えることが好ましいと考えられた。すなわち、ウェルに加えたリポソーム量（リン脂質量）に比例した量で当該リポソームを当該ウェル底面に固定する（リポソームをウェル底面に定量的に固定する）ために、当該ウェル底面の単位面積あたりに加えるリン脂質量として１．５２μｇ／ｃｍ２以下の範囲を好適に用いることができた。
【０１４５】
また、本例においては、上述したように形質転換細胞体を用いて、Ｈｒｓ−２×ＦＹＶＥ、ＦＡＰＰ１−２×ＰＨ、ＴＡＰＰ１−２×ＰＨ、ＰＬＣδ１−ＰＨ、又はＧＲＰ１−ＰＨを含む４種類のＧＳＴ融合タンパク質を作製した。
【０１４６】
さらに、本例においては、各ＧＳＴ融合タンパク質にビオチンを結合させた標識プローブ物質を作製した。すなわち、各ＧＳＴ融合タンパク質に対して、モル比で２０倍過剰量の標識用ビオチン（ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ、ＰＩＥＲＣＥ）を加え、室温で１時間インキュベーションすることにより、当該標識用ビオチンを当該各ＧＳＴ融合タンパク質に結合させた。
【０１４７】
また、本例においては、定量の対象とするＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ（４）Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３のうち１種類のホスホイノシチドを含むリポソームを形成した。すなわち、クロロホルムとメタノールとを２：１（ｖ／ｖ）の比率で混合した溶媒に、各ホスホイノシチドを最終濃度５ｎｇ／μｌとなるように溶解した。そして、このホスホイノシチドを含む溶液とＰＣとＰＥとを０．２：１：１の重量比で混合した混合脂質を調製した。このホスホイノシチドとベース脂質（ＰＣ及びＰＥ）とを含む混合脂質を窒素ガス流通下で乾燥させた後、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＧＴＡ、５０ｍＭのショ糖を含むバッファー中で超音波処理することにより再水和させ、当該混合脂質からなる一重膜のリポソームを形成した。
【０１４８】
このリポソームを、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＧＴＡを含む水溶液で１０倍に希釈し、当該水溶液を、各ウェルに入れて、少なくとも２時間、室温でインキュベーションすることにより、当該リポソームを当該ウェルの底面に吸着させた。
【０１４９】
そして、この底面にリポソームを固定したウェルに、当該リポソームに含まれるホスホイノシチドに特異的に結合可能なビオチン標識ＧＳＴ融合タンパク質を含む水溶液を加え、所定時間インキュベーションすることにより、当該ホスホイノシチドに当該ビオチン標識ＧＳＴ融合タンパク質を特異的に結合させた。
【０１５０】
この底面にビオチン標識ＧＳＴ融合タンパク質が固定されたウェルに、ペルオキシダーゼ結合アビジン（Ｓｉｇｍａ）を含む水溶液を加えて所定時間インキュベーションすることにより、当該ＧＳＴ融合タンパク質のビオチンに、当該ペルオキシダーゼ結合アビジンを結合させた。このペルオキシダーゼ結合アビジンが固定されたウェル底面に、ｏ−フェニレンジアミン（Ｏ−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ  Ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；ＯＰＤ）を含む水溶液を加えて所定時間インキュベーションすることにより、当該アビジンのペルオキシダーゼと当該ＯＰＤとの発色反応を行わせた。この発色反応を、ウェルに８Ｎの硫酸を加えることにより停止させた後、各ウェル内の水溶液の吸光度を所定の分光光度計を用いて測定した。
【０１５１】
この測定結果の一部を図８に示す。図８において、横軸は各ウェルあたりに固定されたリポソームに含まれる各ホスホイノシチドの量（ｐｍｏｌ）を示し、縦軸は各ウェル内における発色反応後の水溶液の吸光度（４９０ｎｍ）を示す。この図８において、白抜き丸形のシンボルはＧＲＰ１−ＰＨを用いてＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３を定量した結果、白抜き四角形のシンボルはＴＡＰＰ１−２×ＰＨを用いてＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２を定量した結果、黒塗り丸形のシンボルはＰＬＣδ１−ＰＨを用いてＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２を定量した結果、黒塗り菱形のシンボルはＨｒｓ−２×ＦＹＶＥを用いてＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐを定量した結果、白抜き三角形のシンボルはＦＡＰＰ１−２×ＰＨを用いてＰｔｄＩｎｓ（４）Ｐを定量した結果、をそれぞれ示す。なお、この図８の横軸に示すウェルあたりのホスホイノシチドの量は、ウェルあたりに加えるリポソームの量を変化させることにより調整した。
【０１５２】
図８に示すように、１つのウェル底面あたりに固定された各ホスホイノシチドの量が増加するにつれて、当該ウェル内における発色強度、すなわち、当該ホスホイノシチドに結合したＧＳＴ融合タンパク質の量も増加した。また、１つのウェルあたりに約３００ｐｍｏｌ（約３００ｎｇ）以下の範囲、すなわち、ウェル底面の単位面積あたり９００ｐｍｏｌ／ｃｍ２（約０．９μｇ／ｃｍ２）以下の範囲でホスホイノシチドを固定することにより、特に定量を好適に行うことができると考えられた。
【０１５３】
このように、本脂質定量方法を用いることにより、ＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ（４）Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３を、それぞれＨｒｓ−２×ＦＹＶＥ、ＦＡＰＰ１−２×ＰＨ、ＴＡＰＰ１−２×ＰＨ、ＰＬＣδ１−ＰＨ、Ｇｒｐ１−ＰＨを含むＧＳＴ融合タンパク質をプローブ物質として用いることにより、簡便且つ高精度に定量可能であることが示された。
【０１５４】
次に、本酵素活性定量方法の一実施例について説明する。本例においては、２種類のＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３ホスファターゼ、すなわち、ＰＴＥＮ及びＳＫＩＰの活性を定量した。ＰＴＥＮは、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３を反応基質として、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）を生成する３−ホスファターゼであり（Ｍａｅｈａｍａ，Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７３，１３３７５−１３３７８（１９９８）、Ｍｙｅｒｓ，Ｍ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９５，１３５１３−１３５１８（１９９８））、ＳＫＩＰは、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３を反応基質として、ＰｔｄＩｎｓ（３，４）を生成する５−ホスファターゼである（Ｉｊｕｉｎ，Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７５，１０８７０−１０８７５（２０００））。
【０１５５】
本例においては、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞のｃＤＮＡライブラリからクローニングしたヒトＰＴＥＮをコードするポリヌクレオチドを、発現ベクターｐＧＥＸ６ｐ−１にサブクローニングし、当該発現ベクターにより形質転換された大腸菌細胞体から、所定のプロトコール（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＢＩｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従い、組み換えヒトＰＴＥＮを含むＧＳＴ融合タンパク質（以下、ＧＳＴ−ＰＴＥＮ）を精製した。また、バキュロウイルス発現系（ｂａｃ−ｔｏ−ｂａｃ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から、所定のプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従い、組み換えＳＫＩＰを含むＧＳＴ融合タンパク質（以下、ＧＳＴ−ＳＫＩＰ）を精製した。
【０１５６】
また、本例においては、形質転換細胞体を用いて、ＧＳＴ−ＰＴＥＮ及びＧＳＴ−ＳＫＩＰの反応基質であるＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３を検出するプローブ物質としてＧＲＰ１−ＰＨを含むビオチン標識ＧＳＴ融合タンパク質を、ＧＳＴ−ＰＴＥＮの反応生成物であるＰｔｄＩｎｓ（４，５）を検出するプローブ物質としてＰＬＣδ１―ＰＨを含むビオチン標識ＧＳＴ融合タンパク質を、ＧＳＴ−ＳＫＩＰの反応生成物であるＰｔｄＩｎｓ（３，４）を検出するプローブ物質としてＴＡＰＰ１―２×ＰＨを含むビオチン標識ＧＳＴ融合タンパク質を、それぞれ作製した。
【０１５７】
また、本例においては、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３とＰＣとＰＥとを、１：１：１の重量比で含むリポソームを調製し、ＰＬＬとＣ１６被覆物質とをコートした各ウェル底面に、当該リポソームを１μｇずつ固定した。
【０１５８】
そして、この底面にリポソームを固定した各ウェルに、ＧＳＴ−ＰＴＥＮ又はＧＳＴ−ＳＫＩＰを含む水溶液を入れてインキュベーションすることにより、当該リポソームに含まれるＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３と、当該ＧＳＴ−ＰＴＥＮ又はＧＳＴ−ＳＫＩＰとを反応させた。この反応後、各ウェル底面を０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳで洗浄した。
【０１５９】
そして、上述の脂質定量方法の例と同様に、各ウェル底面に固定されているＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）、ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２に、それぞれＧＲＰ１−ＰＨ、ＰＬＣδ１−ＰＨ、ＴＡＰＰ１−２×ＰＨを含むビオチン標識ＧＳＴ融合タンパク質を結合させ、当該各ホスホイノシチドに結合したＧＳＴ融合タンパク質をペルオキシダーゼ結合アビジンによる発色反応により定量的に検出した。
【０１６０】
図９及び図１０に、この定量結果の一部を示す。図９は、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３とＧＳＴ−ＰＴＥＮとを反応させた場合の定量結果を示す。図９ａにおいて、横軸は、各ウェル底面に固定されたＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３とＧＳＴ−ＰＴＥＮとの反応時間（分）、縦軸は、各ウェルにおけるホスホイノシチドの定量結果（ｐｍｏｌ）をそれぞれ示す。また、図９ｂにおいて、横軸は、各ウェル内に加えたＧＳＴ−ＰＴＥＮの量（μｇ）、縦軸は、各ウェルにおけるホスホイノシチドの定量結果（ｐｍｏｌ）をそれぞれ示す。これら図９ａ及び図９ｂにおいて、丸型のシンボルはＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２の定量結果を、また四角形のシンボルはＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の定量結果を、それぞれ示す。また、図１０は、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３とＧＳＴ−ＳＫＩＰとを反応させた場合の定量結果を示す。図１０ａにおいて、横軸は、各ウェル底面に固定されたＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３とＧＳＴ−ＳＫＩＰとの反応時間（分）、縦軸は、各ウェルにおけるＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２の定量結果（ｐｍｏｌ）をそれぞれ示す。また、図１０ｂにおいて、横軸は、各ウェル内に加えたＧＳＴ−ＳＫＩＰの量（μｇ）、縦軸は、各ウェルにおけるＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２の定量結果（ｐｍｏｌ）をそれぞれ示す。
【０１６１】
図９ａ及び図９ｂに示すように、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３とＧＳＴ―ＰＴＥＮとの反応時間、及び各ウェルに加えたＧＳＴ−ＰＴＥＮの濃度、に依存して、各ウェル底面に固定されているＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の量は減少し、各ウェル底面に固定されているＰｔｄＩｎｓ（４，５）の量は増加した。
【０１６２】
また、図１０ａ及び図１０ｂに示すように、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３とＧＳＴ−ＳＫＩＰとを反応させた場合には、当該ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３とＧＳＴ−ＳＫＩＰとの反応時間、及び各ウェルに加えたＧＳＴ−ＳＫＩＰの濃度、に依存して、各ウェル底面に固定されているＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２の量は増加した。また、この場合、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３とＧＳＴ−ＳＫＩＰとの反応時間、及び各ウェルに加えたＧＳＴ−ＳＫＩＰの濃度、に依存して、各ウェル底面に固定されているＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の量は減少した（図示せず）。
【０１６３】
次に、本酵素活性定量方法の他の実施例について説明する。本例においては、ＰＩ３−キナーゼｐ１１０αサブユニットを用いて、ＰＩ３−キナーゼの活性を定量した。このＰＩ３−キナーゼは、ＰｔｄＩｎｓ、ＰｔｄＩｎｓ（４）Ｐ、又はＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２をリン酸化して（すなわち、これら３種類のホスホイノシチドの各々を反応基質として）、それぞれＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３を生成する。
【０１６４】
本例においては、ＨＵＶＥＣのｃＤＮＡライブラリからクローニングされた、ヒトＰＩ３−キナーゼ触媒サブユニットｐ１１０αをコードするポリヌクレオチドを、発現ベクターｐＦａｓｒＢａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。そして、バキュロウイルス発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から、所定のプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従い、Ｎ末端にＧＳＴが結合し、Ｃ末端にＨｉｓ（ヒスチジン）が結合した、ヒト組み換えＰＩ３−キナーゼ触媒サブユニットｐ１１０αを含む融合タンパク質（以下、ＰＩ３−キナーゼタンパク質）を精製した。
【０１６５】
また、本例においては、形質転換細胞体を用いて、ＰＩ３−キナーゼタンパク質の反応生成物であるＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐに対するプローブ物質としてＨｒｓ−２×ＦＹＶＥを含むビオチン標識ＧＳＴ融合タンパク質を、ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２に対するプローブ物質としてＴＡＰＰ１−２×ＰＨを含むビオチン標識ＧＳＴ融合タンパク質を、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３に対するプローブ物質としてＧＲＰ１−ＰＨを含むビオチン標識ＧＳＴ融合タンパク質を、それぞれ作製した。
【０１６６】
また、本例においては、ＰＩ３−キナーゼタンパク質の反応基質であるＰｔｄＩｎｓ、ＰｔｄＩｎｓ（４）Ｐ、又はＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２とＰＣとＰＥとを、１：１：１の重量比で含むリポソームを調製し、当該リポソームを、ＰＬＬとＣ１６被覆物質とをコートした各ウェル底面に１μｇずつ固定した。
【０１６７】
この底面にホスホイノシチドが固定された各ウェルに、ＰＩ３−キナーゼタンパク質（ｐ１１０αサブユニット）、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＡＴＰを含む水溶液を加え、２０分間、室温でインキュベーションすることにより、当該各ホスホイノシチドと、当該ＰＩ３−キナーゼタンパク質と、を反応させた。この反応を各ウェルに１ｍＭのＨＣｌを加えることにより停止させた後、当該各ウェルの底面をＰＢＳで洗浄し、当該各ウェルに５％のＢＳＡを含むＰＢＳを加えて、少なくとも１時間インキュベーションした。
【０１６８】
その後、各ウェルに、上述のように作製したビオチン標識ＧＳＴ融合タンパク質を１μｇ／ｍｌで溶解した５％のＢＳＡを含むＰＢＳを入れて、１時間インキュベーションすることにより、当該各ウェルの底面に固定されているホスホイノシチドに、当該ビオチン標識ＧＳＴ融合タンパク質を結合させた。
【０１６９】
各ウェルの底面を０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳで３回洗浄した後、当該各ウェルにペルオキシダーゼ結合アビジンを溶解した５％のＢＳＡを含むＰＢＳを加え、３０分間インキュベーションすることにより、当該各ウェル底面に固定されたＧＳＴ融合タンパク質のビオチンに当該ペルオキシダーゼ結合アビジンを結合させた。各ウェル表面を０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳで６回洗浄した後、上述した本脂質定量方法の例と同様に、ペルオキシダーゼの発色反応を行い、当該各ウェル内の水溶液の発色強度を測定した。すなわち、本例においては、各ウェル底面に固定されたリポソームに含まれるＰｔｄＩｎｓ、ＰｔｄＩｎｓ（４）Ｐ、又はＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２と、ＰＩ３−キナーゼタンパク質と、を反応させた後、当該各ウェル底面に固定されているＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３に、それぞれＨｒｓ−２×ＦＹＶＥ、ＴＡＰＰ１−２×ＰＨ、ＧＲＰ１−ＰＨを含むビオチン標識ＧＳＴ融合タンパク質を結合させ、当該各ウェル底面に固定されたＧＳＴ融合タンパク質を定量的に検出した。
【０１７０】
この定量結果の一部を図１１に示す。図１１ａ及び図１１ｂは、反応基質としてＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２をウェル底面に固定し、当該ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２とＰＩ３−キナーゼタンパク質との反応後、当該ウェル底面に固定されている生成されたＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３を定量した結果の一例を示す。図１１ａにおいて、横軸は、各ウェル底面に固定されたＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２とＰＩ３−キナーゼタンパク質との反応時間（分）、縦軸は、各ウェルにおいて生成されたＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の定量結果（ｐｍｏｌ）をそれぞれ示す。また、図１１ｂにおいて、横軸は、各ウェルに入れたＰＩ３−キナーゼタンパク質（ｐ１１０ａと示す）の量（ｎｇ）、縦軸は、各ウェルにおいて生成されたＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の定量結果（ｐｍｏｌ）をそれぞれ示す。
【０１７１】
図１１ａ及び図１１ｂに示すように、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２とＰＩ３−キナーゼタンパク質との反応時間、及び各ウェルに加えたＰＩ３−キナーゼタンパク質の濃度、に依存して、各ウェル底面に固定されているＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の量は増加した。
【０１７２】
また、本例においては、本酵素活性定量方法がＰＩ３−キナーゼインヒビターの定量方法としても利用可能であることを確認した。すなわち、まず、ＰＩ３−キナーゼを、当該ＰＩ３−キナーゼのインヒビターであるＷｏｒｔｍａｎｎｉｎ又はＬＹ２９４００２とともに３０分間インキュベーションした。そして、このインヒビターで前処理したＰＩ３−キナーゼを、底面にＰｔｄＩｎｓ、ＰｔｄＩｎｓ（４）Ｐ、又はＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２が固定された各ウェル内に入れてインキュベーションすることにより、当該ＰＩ３−キナーゼと当該各ホスホイノシチドとを２０分間反応させた後、当該各ウェルに１ｍＭのＨＣｌを加えることにより当該反応を停止させた。そして、この反応後の各ウェル底面に固定されているＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３を、それぞれＨｒｓ−２×ＦＹＶＥ、ＴＡＰＰ１−２×ＰＨ、ＧＲＰ１−ＰＨを含むビオチン標識ＧＳＴ融合タンパク質を用いて定量した。
【０１７３】
この場合の定量結果の一部を図１２に示す。図１２ａ、図１２ｂ及び図１２ｃにおいて、横軸は、各ウェルに添加した各インヒビターの濃度（μＭ）、縦軸は、インヒビターが添加されない場合にウェル内で生成された各反応生成物（すなわち、ＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２又はＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３）の量に対する、インヒビターが添加された場合にウェル内で生成された当該各反応生成物の量の割合（％）をそれぞれ示す。これら図１２ａ、図１２ｂ及び図１２ｃにおいて、四角形のシンボルはＷｏｒｔｍａｎｎｉｎを用いた場合、丸形のシンボルはＬＹ２９４００２を用いた場合の結果をそれぞれ示す。図１２ａは、反応基質としてＰｔｄＩｎｓを用いた場合におけるＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐの生成量、図１２ｂは、反応基質としてＰｔｄＩｎｓ（４）Ｐを用いた場合におけるＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２の生成量、図１２ｃは、反応基質としてＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２を用いた場合におけるＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の生成量、についての結果をそれぞれ示す。
【０１７４】
図１２ａ、図１２ｂ、図１２ｃに示すように、各インヒビターの添加濃度に依存して、ＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２又はＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３のいずれも生成量が減少し、当該各インヒビターがＰＩ３−キナーゼとホスホイノシチドとの反応を阻害していることが確認された。
【０１７５】
すなわち、本酵素活性定量方法においては、ＰＩ３−キナーゼとホスホイノシチドとの特異的な反応に基づき、当該ＰＩ３−キナーゼの活性を簡便且つ高精度に定量可能であることが示されるとともに、当該ＰＩ３−キナーゼに対する各インヒビターの活性をも簡便且つ高精度に定量可能であることが確認された。
【０１７６】
次に、本脂質定量方法を用いた本病態評価方法の一実施例について説明する。いくつかの癌細胞ではＰＴＥＮが欠如し、当該癌細胞内のＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３量が増加することにより、癌の形成を誘発しているとの報告がある。そこで、本例においては、病態の評価モデルの１つとして、種々の癌細胞におけるＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３及びＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２の含有量を定量することとした。
【０１７７】
本例においては、転移性の高い、Ｂ１６細胞株由来の３種類のマウス悪性メラノーマＢ１６細胞、Ｂ１６Ｆ１細胞、及びＢ１６Ｆ１０細胞と、ＰＴＥＮの発現又は機能を欠如している３種類のヒト膠芽細胞腫(glioblastoma)Ａ１７２細胞、Ｔ９８Ｇ細胞、Ｕ８７ＭＧ細胞と、を用いた。すなわち、１５ｃｍ径の培養皿内において、Ｂ１６細胞、Ｂ１６Ｆ１細胞、Ｂ１６Ｆ１０細胞、Ｕ８７ＭＧ細胞は、１０％のＦＢＳを添加したＤＭＥ（Ｎｉｓｓｕｉ）培地中で培養し、Ａ１７２細胞、Ｔ９８Ｇ細胞は、１０％のＦＢＳを添加したＲＰＭＩ培地中で培養した。
【０１７８】
そして、上述の本脂質定量方法の例と同様に、ＴＬＣブロッティングにより、各癌細胞から抽出した脂質に含まれるＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３及びＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２を分離するとともに、それぞれＧＲＰ１−ＰＨを含むＧＳＴ融合タンパク質、ＰＬＣδ１−ＰＨを含むＧＳＴ融合タンパク質とを用いた本脂質定量方法により定量した。
【０１７９】
この定量結果の一部を図１３と図１４とに示す。図１３及び図１４において、横軸は用いた癌細胞の種類、縦軸は、各癌細胞に含まれるＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３又はＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２の量（μｍｏｌ又はｍｍｏｌ）を、当該各癌細胞に含まれるリン脂質の総量（ｔｏｔａｌ  Ｐｉ）（ｍｏｌ）で正規化した含有量レベル（μｍｏｌ／ｍｏｌ又はｍｍｏｌ／ｍｏｌ）をそれぞれ示す。
【０１８０】
図１３ａに示すように、Ｂ１６Ｆ１０細胞におけるＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３のレベルは、Ｂ１６細胞及びＢ１６Ｆ１細胞のレベルの２倍と高値であった。これに対し、図１３ｂに示すように、Ｂ１６Ｆ１０細胞のＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２レベルは、Ｂ１６細胞のレベルの３分の１と低値であった。
【０１８１】
また、３種類の膠芽腫細胞株は機能しないＰＴＥＮを有すると報告されているが、図１４ａに示すように、Ｕ８７ＭＧ細胞のみで高いＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３レベルが確認された。また、図１４ａに示すように、ＰＴＥＮを欠いているＡ１７２細胞において、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３レベルは低値であった。また、図１４ｂに示すように、３種類の膠芽腫細胞株のうち、Ｕ８７ＭＧ細胞においてＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２レベルが最も低値であった。
【０１８２】
このように、本例において、実際に病態と関連のある癌細胞に含まれる種々のホスホイノシチドを簡便且つ高精度に定量することができた。また、本例の結果において、全てのＰＴＥＮ欠損細胞株においてＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３レベルが高いわけではなかったことから、細胞に含まれるホスホイノシチドの種類や量と病態との関連性を詳細に検討する上では、種々の癌細胞に含まれる種々のホスホイノシチドを実際に高い精度で定量する必要があると考えられた。
【０１８３】
また、ホスファターゼの異常は、癌や糖尿病等の種々の病気を引き起こすことが知られているため、この酵素の阻害剤や賦活剤に関する研究はこれらの病気の治療法を探る上で重要である。本酵素活性定量方法を用いた病態評価方法によれば、上述の本脂質定量方法を用いた病態評価方法と同様に、細胞に含まれる脂質関連酵素の変化を簡便且つ高感度に定量できる。
【０１８４】
また、本脂質定量方法及び本酵素活性定量方法において定量可能なホスホイノシチドの限界量は、例えば、図２に示したような検量データを得るための検討において、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２については０．０２ｎｍｏｌ、ＰｔｄＩｎｓ（３、４，５）Ｐ３については０．００３ｎｍｏｌであることが確認された（結果は図示せず）。
【０１８５】
すなわち、例えば、従来法の１つである、ホスファターゼと反応基質を反応させ、当該反応によって生じたリン酸を検出するマラカイトグリーン（ｍａｌａｃｈｉｔｅ  ｇｒｅｅｎ）法における検出限界が１００ｎｍｏｌ程度であったことに比べれば、本脂質定量方法及び本酵素活性定量方法の感度は、少なくとも当該従来法の１０００倍であった。
【図面の簡単な説明】
【０１８６】
【図１】本発明の一実施形態において作製したプローブ物質の一部を示す図である。
【図２】本発明の一実施形態において、ニトロセルロース膜上に固定したホスホイノシチドを定量した結果の一例を示す図である。
【図３】本発明の一実施形態において、インスリン刺激後の細胞内に含まれるホスホイノシチドを定量した結果の一例を示す図である。
【図４】本発明の一実施形態において、インスリン刺激後の細胞内ホスホイノシチド量に対してインヒビターが与える影響を定量した結果の一例を示す図である。
【図５】本発明の一実施形態において、基材表面と脂質との親和性を評価した結果の一例を示す図である。
【図６】本発明の一実施形態において、基材表面と脂質とのインキュベーション時間と、当該基材表面への当該脂質の固定量との関係を評価した結果の一例を示す図である。
【図７】本発明の一実施形態において、基材表面に加える脂質の量と、当該基材表面への当該脂質の固定量との関係を評価した結果の一例を示す図である。
【図８】本発明の一実施形態において、基材表面に加える脂質の量と、当該脂質に結合したプローブ物質の検出量と、の関係を評価した結果の一例を示す図である。
【図９】本発明の一実施形態において、ホスファターゼの活性を定量した結果の一例を示す図である。
【図１０】本発明の一実施形態において、ホスファターゼの活性を定量した結果の他の例を示す図である。
【図１１】本発明の一実施形態において、キナーゼの活性を定量した結果の一例を示す図である。
【図１２】本発明の一実施形態において、キナーゼインヒビターの活性を定量した結果の一例を示す図である。
【図１３】本発明の一実施形態において、癌細胞に含まれるホスホイノシチドを定量した結果の一例を示す図である。
【図１４】本発明の一実施形態において、癌細胞に含まれるホスホイノシチドを定量した結果の他の例を示す図である。
【図１】
2007040719.tif 000003
【図２】
2007040719.tif 000004
【図３】
2007040719.tif 000005
【図４】
2007040719.tif 000006
【図５】
2007040719.tif 000007
【図６】
2007040719.tif 000008
【図７】
2007040719.tif 000009
【図８】
2007040719.tif 000010
【図９】
2007040719.tif 000011
【図１０】
2007040719.tif 000012
【図１１】
2007040719.tif 000013
【図１２】
2007040719.tif 000014
【図１３】
2007040719.tif 000015
【図１４】
2007040719.tif 000016
【配列表】
2007040719000001.app