(57)【要約】      （修正有）【課題】硫化水素産生能が低い下面ビール酵母（Ｓ．  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）株の選抜に用いるポリヌクレオチド、プローブ及びプライマーセットを提供し、さらには、硫化水素産生能が低い下面ビール酵母株を選抜する方法及び硫化水素含有量の少ない発泡性アルコール飲料の製造方法を提供すること。【解決手段】以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示される、硫化水素産生能が低い下面ビール酵母（Ｓ．  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）株の選抜に用いるポリヌクレオチド。（ａ）開示する特定の塩基配列からなるポリヌクレオチド（ｂ）上記（ａ）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチド（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）に記載のポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示される、硫化水素産生能が低い下面ビール酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）株の選抜に用いるポリヌクレオチド。
（ａ）配列表の配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチド
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）に記載のポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
【請求項２】
硫化水素産生能が低い下面ビール酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）株の選抜に用いるプローブであって、
配列表の配列番号１に示される塩基配列若しくはこれと相補的な塩基配列、に含まれる連続した少なくとも２０ｂｐ以上の塩基配列、又は、
これらの塩基配列からなるプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズする少なくとも２０ｂｐ以上の塩基配列、
を含むプローブ。
【請求項３】
硫化水素産生能が低い下面ビール酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）株の選抜に用いるプライマーセットであって、
配列表の配列番号４に示される塩基配列を含むプライマーと、
配列表の配列番号５に示される塩基配列を含むプライマーと、
から構成される、プライマーセット。
【請求項４】
硫化水素産生能が低い下面ビール酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）株の選抜方法であって、
配列表の配列番号１に示される塩基配列を含む遺伝子の発現量を発酵途中の下面ビール酵母株間で比較する比較ステップと、
前記遺伝子の発現量が低い又は発現が認められない下面ビール酵母株を、硫化水素産生能が低い下面ビール酵母株であると判断する判断ステップと、
を少なくとも備える、選抜方法。
【請求項５】
前記比較ステップは、
発酵途中の下面ビール酵母株からトータルＲＮＡを抽出するステップと、
前記トータルＲＮＡからｃＤＮＡを得るステップと、
前記ｃＤＮＡを鋳型に請求項３記載のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うステップと、を備える比較ステップであり、
前記判断ステップは、
前記ＰＣＲにおいて、配列表の配列番号１に示される塩基配列の第３４１番目から第１１９５番目の塩基配列からなるＤＮＡ断片の増幅量が低い又は増幅が認められない下面ビール酵母株を、硫化水素産生能が低い下面ビール酵母株であると判断する判断ステップである、請求項４記載の選抜方法。
【請求項６】
請求項４叉は５記載の選抜方法で選抜された下面ビール酵母株を用いた、硫化水素含有量が少ない発泡性アルコール飲料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
硫化水素産生能が低い下面ビール酵母（Ｓ．  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）株の選抜に用いるポリヌクレオチド、プローブ及びプライマーセット並びに硫化水素産生能が低い下面ビール酵母株の選抜方法及び硫化水素含有量の少ない発泡性アルコール飲料の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
含硫化合物は、酵母を利用して醸造するアルコール飲料の香味に負の影響を与えることが知られ、酵母の含硫化合物の生成を抑制することは、アルコール飲料の品質の安定及び向上に役立つことが知られている。特に、発泡酒・雑酒に代表される低窒素麦汁を発酵させて醸造するアルコール飲料の場合には、硫黄臭の原因となる硫化水素が最終製品中に残存し、アルコール飲料の香味や品質に悪影響を与えることが問題となっている。このため、アルコール飲料の醸造に適した硫化水素低産酵母株の探索がなされてきた。
【０００３】
例えば、ワインの醸造に使用するワイン酵母では、硫化水素産生能が低い酵母株として、含硫アミノ酸アナログ（例えば、エチオニン、セレノメチオニン及びＳ−エチルシステイン）の耐性株が報告された（特許文献１）。
【０００４】
また、ビールの醸造に使用される下面ビール酵母では、主発酵工程における麦汁中のメチオニン濃度又はアンモニウムイオン濃度を高めることで、硫化水素の生成を抑えられることが報告された（非特許文献１）。
【０００５】
さらに、遺伝子組み換え技術を用いて硫化水素産生能の低い酵母株を作成した例として、１）硫化水素を生成しないＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｘ−２１８０株からクローニングした硫化水素生成抑制遺伝子を下面ビール酵母に遺伝子導入した酵母株（特許文献２、特許文献３）、２）硫化水素の前駆体である亜硫酸を菌体外に排出する蛋白質をコードするＳＳＵ１遺伝子を高発現させた酵母株（特許文献４）、３）硫化水素から硫黄原子をＯ-アセチルホモセリンに転移する酵素をコードする遺伝子を高発現させた酵母株（特許文献５）、が報告された。
【特許文献１】特願平７−５０３３１号公報
【特許文献２】特願平３−６３７１０号公報
【特許文献３】特許平４−８１４２９号公報
【特許文献４】特願２００３−２９９２０２号公報
【特許文献５】特願平６−９９８５５号公報
【非特許文献１】Ｊ．  ＡＳＢＣ、２００４年、６２巻、１号、ｐ．３５−４１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、発酵液に含硫アミノ酸アナログを添加したり、発酵液のメチオニン濃度又はアンモニウムイオン濃度を高めたりすることで、発酵過程における酵母の硫化水素生成量を減少させても、発酵速度の低下や香味成分等の減少が引き起こされ、好ましくない醸造特性が付与される問題があった。また、遺伝子組み換え技術によって作成された酵母株は、天然の酵母には存在しない異種生物のプロモーター遺伝子や薬剤耐性遺伝子等が使用されているため、安全性の観点から、ヒトが飲用するアルコール飲料等の醸造に使用することは困難であった。さらに、硫化水素産生能が低い下面ビール酵母の選抜に用いるマーカー遺伝子の報告はほとんどなく、これらを利用した硫化水素産生能が低い下面ビール酵母の選抜方法については報告がないのが現状であった。
【０００７】
そこで、本発明の目的は、硫化水素産生能が低い下面ビール酵母（Ｓ．  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）株の選抜に用いるポリヌクレオチド、プローブ及びプライマーセットを提供することにあり、さらには、硫化水素産生能が低い下面ビール酵母株を選抜する方法及び硫化水素含有量の少ない発泡性アルコール飲料の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するため、本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示される、硫化水素産生能が低い下面ビール酵母（Ｓ．  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）株の選抜に用いるポリヌクレオチドを提供する。
（ａ）配列表の配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）上記（ａ）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチド
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）に記載のポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
【０００９】
また、本発明は、硫化水素産生能が低い下面ビール酵母（Ｓ．  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）株の選抜に用いるプローブであって、配列表の配列番号１に示される塩基配列若しくはこれと相補的な塩基配列、に含まれる連続した少なくとも２０ｂｐ以上の塩基配列、又は、これらの塩基配列からなるプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズする少なくとも２０ｂｐ以上の塩基配列、を含むプローブを提供する。
【００１０】
本発明のポリヌクレオチド及びプローブは、配列表の配列番号１に示される塩基配列を含む下面ビール酵母特有の遺伝子の発現量を調べるために使用できる。また、この遺伝子の発現量が低い下面ビール酵母株は、硫化水素産生能が低い下面ビール酵母株であるため、本発明のポリヌクレオチド及びプローブは、硫化水素産生能が低い下面ビール酵母株の選抜に使用できる。
【００１１】
ここで、上記（ａ）に記載した配列表の配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、配列表の配列番号２叉は３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドであってもよく、配列表の配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの場合と同様に硫化水素産生能が低い下面ビール酵母株の選抜に使用できる。
【００１２】
また、本発明は、硫化水素産生能が低い下面ビール酵母（Ｓ．  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）株の選抜に用いるプライマーセットであって、配列表の配列番号４に示される塩基配列を含むプライマーと、配列表の配列番号５に示される塩基配列を含むプライマーとから構成される、プライマーセットを提供する。
【００１３】
本発明のプライマーセットを用いれば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を含む、下面ビール酵母の硫化水素産生能のマーカーとなる下面ビール酵母遺伝子を、ＰＣＲでｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ種特異的に増幅できる。また、この遺伝子の発現量が低い下面ビール酵母株は、硫化水素産生能が低い下面ビール酵母株であるため、本発明のプライマーセットは、硫化水素産生能が低い下面ビール酵母株の選抜に利用できる。
【００１４】
ここで、上記の配列表の配列番号４に示される塩基配列を含むプライマーと配列表の配列番号５に示される塩基配列を含むプライマーとから構成されるプライマーセットは、配列表の配列番号６に示される塩基配列を含むプライマーと配列表の配列番号７に示される塩基配列を含むプライマーとから構成されるプライマーセット、叉は配列表の配列番号８に示される塩基配列を含むプライマーと配列表の配列番号９に示される塩基配列を含むプライマーとから構成されるプライマーセットであってもよく、配列表の配列番号４に示される塩基配列を含むプライマーと配列表の配列番号５に示される塩基配列を含むプライマーとから構成されるプライマーセットの場合と同様に硫化水素産生能が低い下面ビール酵母株の選抜に使用できる。
【００１５】
また、本発明は、硫化水素産生能が低い下面ビール酵母（Ｓ．  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）株の選抜方法であって、配列表の配列番号１に示される塩基配列を含む遺伝子の発現量を発酵途中の下面ビール酵母株間で比較する比較ステップと、この遺伝子の発現量が低い又は発現が認められない下面ビール酵母株を、硫化水素産生能が低い下面ビール酵母株であると判断する判断ステップと、を少なくとも備える選抜方法を提供する。
【００１６】
さらに、上記の比較ステップは、発酵途中の下面ビール酵母株からトータルＲＮＡを抽出するステップと、このトータルＲＮＡからｃＤＮＡを得るステップと、このｃＤＮＡを鋳型に上記のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うステップと、を備える比較ステップであり、上記の判断ステップは、このＰＣＲにおいて、配列表の配列番号１に示される塩基配列の第３４１番目から第１１９５番目の塩基配列からなるＤＮＡ断片の増幅量が低い又は増幅が認められない下面ビール酵母株を硫化水素産生能が低い下面ビール酵母株であると判断する判断ステップであることが好ましい。
【００１７】
本発明の選抜方法を用いれば、発酵液に含硫アミノ酸アナログを添加したり、発酵液のメチオニン濃度又はアンモニウムイオン濃度を高めたりすることなく、また、酵母の遺伝子を人為的に組み換えることなく、硫化水素産生能が低い下面ビール酵母株を選抜できる。さらに、こうして選抜された下面ビール酵母株を用いてアルコール飲料を醸造すれば、硫黄臭の原因となる硫化水素のアルコール飲料中への残存を防ぐことができ、アルコール飲料の香味や品質に及ぼす悪影響を防ぐことができる。
【００１８】
ここで、上記のプライマーセットを、配列表の配列番号４に示される塩基配列を含むプライマーと配列表の配列番号５に示される塩基配列を含むプライマーとから構成されるプライマーセット以外に、配列表の配列番号６に示される塩基配列を含むプライマーと配列表の配列番号７に示される塩基配列を含むプライマーとから構成されるプライマーセット、叉は配列表の配列番号８に示される塩基配列を含むプライマーと配列表の配列番号９に示される塩基配列を含むプライマーとから構成されるプライマーセットとし、上記のＰＣＲにおいて、それぞれ配列表の配列番号２に示される塩基配列の第２８２１番目から第３３８４番目の塩基配列からなるＤＮＡ断片、叉は配列表の配列番号３に示される塩基配列の第２４７番目から第６９７番目の塩基配列からなるＤＮＡ断片、の増幅量を調べても、硫化水素産生能が低い下面ビール酵母株を選抜できる。
【００１９】
また、本発明は、上記の選抜方法で選抜された下面ビール酵母株を用いた、硫化水素含有量が少ない発泡性アルコール飲料の製造方法を提供する。
【００２０】
本発明の製造方法を用いれば、硫黄臭の原因となる硫化水素が最終製品中への残存を防ぐことができ、さらに、最終製品から硫化水素を取り除く作業が短縮できるため、醸造期間の短縮が可能となる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のポリヌクレオチド、プローブ及びプライマーセットを用いれば、下面ビール酵母の硫化水素産生能のマーカーとなる下面ビール酵母遺伝子をｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ種特異的に検出し、かつ定量でき、硫化水素産生能が低い下面ビール酵母株を選抜できる。また、本発明の選抜方法によれば、下面ビール酵母の硫化水素産生を抑制するために必要な物質を発酵液に添加したり、人為的に遺伝子を組み換えた下面ビール酵母株を用いることなく、硫化水素産生能が低い下面ビール酵母株を選抜できる。こうして選抜された下面ビール酵母株を用いてアルコール飲料を醸造すれば、硫黄臭の原因となる硫化水素のアルコール飲料中への残存を防ぐことができ、醸造期間の短縮も可能とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００２３】
本発明のポリヌクレオチドは、硫化水素産生能が低い下面ビール酵母株の選抜に用いるポリヌクレオチドであって、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヌクレオチドであることを特徴としている。
（ａ）配列表の配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）上記（ａ）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチド
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）に記載のポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
【００２４】
ここで、「下面ビール酵母」とは、学名がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓに分類される酵母のことをいい、ビールの醸造に使用した場合に、主発酵後期に凝集沈降する性質を有する酵母である。従来は、下面ビール酵母の学名として、Ｓ．  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓが使用されていたが、現在は、Ｓ．  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓはＳ．  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓに改名され、「下面ビール酵母」の学名は、Ｓ．  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓに統一されている。
【００２５】
「ポリヌクレオチド」とは、プリン塩基又はピリミジン塩基が糖にβ−Ｎ−グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（リボヌクレオチド叉はデオキシリボヌクレオチド)が複数個結合した分子のことをいう。
【００２６】
「硫化水素産生能が低い下面ビール酵母株」とは、下面ビール酵母の発酵過程で硫化水素を産生する能力が低いか又は欠損している下面ビール酵母株のことをいい、複数の下面ビール酵母株間で発酵液中の硫化水素含量を比較した場合に、比較対照とする下面ビール酵母株よりも硫化水素の生成量が低い酵母株が該当する。例えば、対照とする下面ビール酵母株としては、Ｗ３４／７０株が挙げられる。Ｗ３４／７０株は、ビール等の発泡性アルコール飲料の醸造に汎用されている下面ビール酵母株である。
【００２７】
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハーツ溶液、１０％デキストラン硫酸、及び２０μｇ／ｍｌのＤＮＡを含む溶液中、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションした後、室温で２×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳ中で一次洗浄し、次いで、約６５℃において０．１×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳで二次洗浄した後においてもハイブリダイズしていることをいう。
【００２８】
上記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示されるポリヌクレオチドは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）に記載された方法に従って、配列表の配列番号１の塩基配列情報をもとに合成した標識ｃＤＮＡプローブを用いて、下面ビール酵母のｃＤＮＡライブラリー又はゲノムライブラリーからクローニングできる。
【００２９】
さらに、上記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示されるポリヌクレオチドは、下面ビール酵母から抽出したトータルＲＮＡ又はポリＡ＋ＲＮＡを鋳型として配列表の配列番号１の塩基配列情報をもとにデザインしたプライマーセットを用いれば、ＲＴ−ＰＣＲ法で合成できる。さらに、上記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示されるポリヌクレオチドの部分配列をＤＮＡ合成機で合成し、酵素的手法及びサブクローニングの手法を使ってつなぎ合わせ、目的とするサイズのポリヌクレオチドを作成することもできる。
【００３０】
また、上記の方法を用いれば、配列表の配列番号２叉は３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドも同様に取得できる。
【００３１】
本発明のプローブは、硫化水素産生能が低い下面ビール酵母株の選抜に用いるプローブであって、配列表の配列番号１に示される塩基配列若しくはこれと相補的な塩基配列、に含まれる連続した少なくとも２０ｂｐ以上の塩基配列、又は、これらの塩基配列からなるプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズする少なくとも２０ｂｐ以上の塩基配列、を含むことを特徴とする。
【００３２】
「プローブ」とは、相補的な配列を有するｍＲＮＡの発現やｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡの検出に用いるポリヌクレオチドのことをいい、配列表の配列番号１の塩基配列情報をもとに、上記のポリヌクレオチドの取得方法によって取得できる。プローブの長さは、２０ｂｐ以上であれば好ましく使用できるが、より好ましくは１００ｂｐ〜５００ｂｐであり、さらに好ましくは２５０ｂｐ〜１．５ｋｂｐである。
【００３３】
また、上記の方法を用いれば、配列表の配列番号２叉は３に示される塩基配列若しくはこれと相補的な塩基配列、に含まれる連続した少なくとも２０ｂｐ以上の塩基配列、又は、これらの塩基配列からなるプローブとストリンジェントな条件でハイブリダイズする少なくとも２０ｂｐ以上の塩基配列、を含むプローブも同様に取得できる。
【００３４】
本発明のプライマーセットは、硫化水素産生能が低い下面ビール酵母株の選抜に用いるプライマーセットであって、配列表の配列番号４に示される塩基配列を含むプライマーと、配列表の配列番号５に示される塩基配列を含むプライマーとから構成されることを特徴とする。
【００３５】
このプライマーセットは、配列表の配列番号４の塩基配列情報をもとに、それぞれＤＮＡ合成機で合成できる。
【００３６】
また、ＤＮＡ合成機を用いれば、配列表の配列番号６に示される塩基配列を含むプライマーと配列表の配列番号７に示される塩基配列を含むプライマーとから構成されるプライマーセット、叉は配列表の配列番号８に示される塩基配列を含むプライマーと配列表の配列番号９に示される塩基配列を含むプライマーとから構成されるプライマーセットも、それぞれ合成できる。
【００３７】
本発明の硫化水素産生能が低い下面ビール酵母株の選抜方法は、配列表の配列番号１に示される塩基配列を含む遺伝子の発現量を発酵途中の下面ビール酵母株間で比較する比較ステップと、この遺伝子の発現量が低い又は発現が認められない下面ビール酵母株を、硫化水素産生能が低い下面ビール酵母株であると判断する判断ステップとを少なくとも備えることを特徴とする。
【００３８】
比較ステップでは、発酵途中の下面ビール酵母株からトータルＲＮＡを抽出し、配列表の配列番号１に示される塩基配列を含む遺伝子の発現量を、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティング又はマイクロアレイ等の手法により検出し、定量して比較できる。
【００３９】
例えば、発酵途中の下面ビール酵母株からトータルＲＮＡを抽出し、このトータルＲＮＡからｃＤＮＡを取得し、このｃＤＮＡを鋳型に配列表の配列番号４及び５記載のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことで、配列表の配列番号１に示される塩基配列を含む遺伝子の発現量を検出し、定量して比較できる。
【００４０】
判断ステップでは、比較ステップで実施されたＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティング又はマイクロアレイ等の手法により得られた配列表の配列番号１に示される塩基配列を含む遺伝子の発現量を比較した結果、発現量の低い下面ビール酵母株を硫化水素産生能が低い下面ビール酵母株であると判断すればよい。例えば、対照とする下面ビール酵母株としてＷ３４／７０株を用い、配列表の配列番号１に示される塩基配列を含む遺伝子の発現量が、Ｗ３４／７０株よりも低い下面ビール酵母株を硫化水素産生能が低い下面ビール酵母株であると判断できる。
【００４１】
例えば、配列表の配列番号４及び５記載のプライマーセットを用いたＲＴ−ＰＣＲにおいて、配列表の配列番号１に示される塩基配列の第３４１番目から第１１９５番目の塩基配列からなるＤＮＡ断片の増幅量が低い又は増幅が認められない下面ビール酵母株を、硫化水素産生能が低い下面ビール酵母株であると判断すればよい。
【００４２】
また、上記のプライマーセットの代わりに、配列表の配列番号６に示される塩基配列を含むプライマーと配列表の配列番号７に示される塩基配列を含むプライマーとから構成されるプライマーセット、叉は配列表の配列番号８に示される塩基配列を含むプライマーと配列表の配列番号９に示される塩基配列を含むプライマーとから構成されるプライマーセットを使用し、上記のＰＣＲにおいて、それぞれ配列表の配列番号２に示される塩基配列の第２８２１番目から第３３８４番目の塩基配列からなるＤＮＡ断片、叉は配列表の配列番号３に示される塩基配列の第２４７番目から第６９７番目の塩基配列からなるＤＮＡ断片、の増幅量を調べ、比較及び判断することによっても、硫化水素産生能が低い下面ビール酵母株を選抜できる。
【００４３】
次に、本発明の硫化水素含有量が少ない発泡性アルコール飲料の製造方法について説明する。
【００４４】
本発明の発泡性アルコール飲料の製造方法は、発泡性アルコール飲料の醸造過程で上記の選抜方法で選抜された硫化水素産生能が低い下面ビール酵母株を使用することを特徴とする。例えば、ビール等の麦芽を主原料とする発泡性アルコール飲料の製造方法は、糖化工程、発酵工程、濾過工程を備えるが、発酵工程で上記の硫化水素産生能が低い下面ビール酵母株を使用すること以外は通常と同じ工程作業をすれば、硫化水素含有量が少ない発泡性アルコール飲料を製造できる。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４６】
１．発酵試験
下面ビール酵母（Ｓ．  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）を用いた発酵試験を以下の条件で行った。
・麦汁エキス濃度：  約１１％
・麦汁容量：  ２．５Ｌ
・麦汁溶存酸素濃度：  約５〜１０ｐｐｍ
・発酵温度：  １５℃
・下面ビール酵母投入量：２０〜２４ｇ湿酵母菌体
・メチオニン添加量：麦汁容量に対して２０ｐｐｍ又は無添加
【００４７】
図１は、２０ｐｐｍのメチオニンを麦汁に添加して発酵させた場合（以下、Ｍｅｔ２０ｐｐｍ試験区）とメチオニンを添加することなく麦汁中で発酵させた場合（以下、対照区）の発酵過程における仮性エキスの量（重量％）を経時的に示したグラフである。ここで、仮性エキスとは、麦汁中に残存する糖分のことをいう。麦汁中の糖分は発酵が進むに連れて消費されるため、仮性エキスを指標に発酵経過を観察できる。仮性エキス（Ｅ）は、発酵液の比重（ＳＧ）を測定することにより、Ｅ（重量％）＝−４６０．２３４＋６６２．６４９ＳＧ−２０２．４１４ＳＧ２の式から算出した。この結果、Ｍｅｔ２０ｐｐｍ試験区及び対照区の仮性エキスはほとんど同じペースで消費され、いずれも同じ発酵経過を辿ることが確認された。
【００４８】
図２は、Ｍｅｔ２０ｐｐｍ試験区及び対照区の発酵過程における浮遊酵母数を経時的に示したグラフである。この結果、Ｍｅｔ２０ｐｐｍ試験区の浮遊細胞数は、対照区と比較してやや少ない傾向が認められるものの、浮遊細胞数は、いずれも発酵開始後１９時間目にピークを迎え、１２０時間目まで減少していくことが確認された。
【００４９】
図３は、Ｍｅｔ２０ｐｐｍ試験区及び対照区の発酵過程における硫酸イオンの消費量を経時的に示したグラフである。この結果、Ｍｅｔ２０ｐｐｍ試験区は、対照区と比較して硫酸イオンの消費が顕著に抑制されることが明らかとなった。
【００５０】
図４は、Ｍｅｔ２０ｐｐｍ試験区及び対照区の発酵過程における亜硫酸の生成量を経時的に示したグラフである。この結果、Ｍｅｔ２０ｐｐｍ試験区は、対照区と比較して亜硫酸の生成が顕著に抑制されることが明らかとなった。
【００５１】
図５は、Ｍｅｔ２０ｐｐｍ試験区及び対照区の発酵過程及び貯酒終了時の硫化水素の生成量を経時的に示したグラフである。この結果より、Ｍｅｔ２０ｐｐｍ試験区は、対照区と比較して硫化水素の生成が顕著に抑制されることが明らかとなった。
【００５２】
以上より、２０ｐｐｍのメチオニンを麦汁に添加して下面ビール酵母を発酵させると、硫化水素の生成が顕著に抑制されることが明らかとなった。そこで、硫化水素の生成が顕著に抑制されたＭｅｔ２０ｐｐｍ試験区の酵母で、対照区の酵母と比較して有意に発現量が変化した遺伝子を以下のようにして探索した。
【００５３】
２．遺伝子の発現解析
まず、Ｍｅｔ２０ｐｐｍ試験区及び対照区の浮遊酵母数がピークとなる発酵開始後１９時間目に酵母をそれぞれ回収し、Ｍｅｔ２０ｐｐｍ試験区の酵母で、対照区の酵母と比較して有意に発現量が変化する遺伝子をマイクロアレイで解析した。
【００５４】
１）トータルＲＮＡの抽出：
まず、それぞれの酵母（約１ｇ）を遠心チューブに入れ、遠心チューブごと液体窒素で凍結させた。その後、凍結した酵母をクライオプレス（マイクロテック・ニチオン社製）で磨砕し、そこに約１０ｍｌのＩｓｏｇｅｎＴＭ（ニッポンジーン社製）を加え、付属のマニュアルに従ってトータルＲＮＡを精製した。
【００５５】
こうして得られたトータルＲＮＡは、吸光度を測定して濃度を算出し、バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ）で、ＲＮＡの分解が生じていないことを確認した。
【００５６】
２）蛍光色素による標識：
次に、それぞれのトータルＲＮＡにオリゴｄＴプライマーをアニールさせ、ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＵＴＰ存在下で逆転写反応を行い、得られたｃＤＮＡにカップリング反応（間接標識法）でＣｙａｎｉｎｅ色素を結合させ、蛍光標識ｃＤＮＡを調製した。その際、Ｍｅｔ２０ｐｐｍ試験区のｃＤＮＡはＣｙ３で標識し、対照区のｃＤＮＡはＣｙ５で標識した。
【００５７】
３）マイクロアレイ：
マイクロアレイは、下面ビール酵母（Ｓ．  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）ゲノムライブラリーの約２０，０００個のプラスミドクローン（それぞれ約２．５ｋｂｐのゲノムＤＮＡ断片を含む）をガラス基板上に固定した下面ビール酵母マイクロアレイを用いた。下面ビール酵母ゲノムライブラリーは、「酵母遺伝子実験マニュアル」（大矢禎一監修、丸善株式会社、ｐ．１１３−１１９）に従って作成した。下面ビール酵母マイクロアレイは、得られた約２０，０００個のプラスミドクローンをアルカリ固定液に溶解し、ポリリジンで処理されたガラス基板上にスポッティングして作成した。
【００５８】
４）ハイブリダイゼーション：
それぞれの蛍光標識ｃＤＮＡは、上述した下面ビール酵母マイクロアレイと６２℃の恒温槽で１４時間ハイブリダイズさせた。その後、蛍光標識ｃＤＮＡがハイブリダイズした下面ビール酵母マイクロアレイを洗浄して、非特異的に吸着した蛍光標識ｃＤＮＡを取り除いた。ハイブリダイゼーション及びその後の洗浄方法については、「ＤＮＡアレイと最新ＰＣＲ法」（秀潤社）に記載された方法に従って行った。
【００５９】
５）蛍光強度の測定：
ハイブリダイゼーション後の下面ビール酵母マイクロアレイは、スライドスキャナー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｓｃａｎｎｅｒ；Ａｇｉｌｅｎｔ社）にセットし、そのマイクロアレイ上の下面ビール酵母のゲノムＤＮＡ（以下、プローブ）にハイブリダイズした蛍光標識ｃＤＮＡの蛍光シグナルを画像データとして取り込んだ。この画像データは、専用ソフトＦｅａｔｕｒｅＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）で数値データに変換して解析した。
【００６０】
６）プローブの塩基配列解析及び遺伝子の機能推定（アノテーション）：
上記の発酵試験及び遺伝子発現解析は繰り返して３回行い、下面ビール酵母マイクロアレイによる解析で得られた数値データに基づいてクラスタリングした。
【００６１】
表１は、対照区と比較してＭｅｔ２０ｐｐｍ試験区で遺伝子の発現が有意に変動したプローブの数を示した表である。
【００６２】
【表１】
2007319095.tif 000002
【００６３】
その結果、２０ｐｐｍのメチオニンの添加により遺伝子の発現が有意に上昇したプローブは８０個検出され、有意に減少したプローブは７個検出された。
【００６４】
そこで、２０ｐｐｍのメチオニンの添加により遺伝子の発現が有意に減少した７個のプローブ（クローン番号：ＳＢｃ３５Ｄ１４、ＳＢｃ１３Ｊ０８、ＳＢｃ１９Ｈ１４、ＳＢｃ２０Ｃ１５、ＳＢｃ４９Ｋ０７、ＳＢｃ３６Ｏ０４、ＳＢｃ３８Ｊ２４）について塩基配列の決定を行い、この塩基配列に基づいて遺伝子の機能推定（アノテーション）を行った。アノテーションは、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＳ．  ｂａｙａｎｕｓのゲノムデータベースを用い、７つのプローブの塩基配列とホモロジーを有する遺伝子をＤＮＡＳＩＳ  Ｐｒｏで検索して行った。Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＳ．  ｂａｙａｎｕｓのゲノムデータベースは、ＮＣＢＩのｗｅｂ  ｓｉｔｅからダウンロードして用いた。尚、下面ビール酵母（Ｓ．  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）遺伝子の塩基配列情報はほとんど報告がなく、利用できる下面ビール酵母ゲノムデータベースはなかった。
【００６５】
表２は、対照区と比較してＭｅｔ２０ｐｐｍ試験区で遺伝子の発現が有意に減少した７プローブのアノテーション結果を示した表である。
【００６６】
【表２】
2007319095.tif 000003
【００６７】
その結果、７プローブ中３プローブの下面ビール酵母ゲノムクローン（ＳＢｃ１３Ｊ０８、ＳＢｃ１３Ｊ０８及びＳＢｃ１９Ｈ１４）の塩基配列は同一遺伝子由来のゲノムクローンであった。これにより、今回見出した２０ｐｐｍのメチオニンの添加で有意に発現が抑制される遺伝子は５種類であった。
【００６８】
アノテーションの結果からは、ＳＢｃ３６Ｏ０４及びＳＢｃ３８Ｊ２４は、それぞれＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＭＥＴ６遺伝子及びＣＹＳ４（ＳＴＲ４）遺伝子と１００％の相同性があることが明らかとなり、下面ビール酵母のＭＥＴ６遺伝子及びＣＹＳ４（ＳＴＲ４）遺伝子は、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＭＥＴ６遺伝子及びＣＹＳ４（ＳＴＲ４）遺伝子と同一であることが判明した。
【００６９】
一方、ＳＢｃ３５Ｄ１４、ＳＢｃ１３Ｊ０８（ＳＢｃ１９Ｈ１４、ＳＢｃ２０Ｃ１５）及びＳＢｃ４９Ｋ０７は、それぞれＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＭＥＴ３遺伝子、ＭＥＴ５（ＥＣＭ１７）遺伝子及びＭＥＴ１０遺伝子と８５％、８４％及び８２％の相同性があり、Ｓ．  ｂａｙａｎｕｓのＭＥＴ３遺伝子、ＭＥＴ５（ＥＣＭ１７）遺伝子及びＭＥＴ１０遺伝子と９４％、９３％及び９３％の相同性があるものの、下面ビール酵母（Ｓ．  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）特有の塩基配列を有する新規遺伝子（以下、下面ビール酵母型ＭＥＴ３遺伝子、下面ビール酵母型ＭＥＴ５遺伝子及び下面ビール酵母型ＭＥＴ１０遺伝子）であることが判明した。下面ビール酵母型ＭＥＴ３遺伝子の一部の塩基配列は、配列表の配列番号１に、下面ビール酵母型ＭＥＴ５遺伝子の一部の塩基配列は、配列表の配列番号２に、下面ビール酵母型ＭＥＴ１０遺伝子の一部の塩基配列は、配列表の配列番号３に示した。
【００７０】
以上より、２０ｐｐｍのメチオニンを麦汁に添加して下面ビール酵母を発酵させることにより、新規遺伝子である下面ビール酵母型ＭＥＴ３遺伝子、ＭＥＴ５遺伝子及びＭＥＴ１０遺伝子の発現が有意に減少することが判明し、これらの遺伝子の発現量を指標にすれば、硫化水素生産能の低い下面ビール酵母（Ｓ．  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）株を選抜できることが示唆された。
【００７１】
３．硫化水素生産能の低い下面ビール酵母株の選抜
そこで、硫化水素生産能が異なる２種類の下面ビール酵母株、ＳＢＣ０６０１株及びＳＢＣ０８４４株を用いて、下面ビール酵母型ＭＥＴ３遺伝子、ＭＥＴ５遺伝子又はＭＥＴ１０遺伝子の発現量を比較し、硫化水素生産能の低い下面ビール酵母株を選抜できるか否かについて試験した。各遺伝子の発現量の比較は、各遺伝子の特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲで行った。
【００７２】
まず、２種類の下面ビール酵母株、ＳＢＣ０６０１株及びＳＢＣ０８４４株を、以下の条件下で発酵させた。
・麦汁エキス濃度：  約１１％
・麦汁容量：  ２．５Ｌ
・麦汁溶存酸素濃度：  約５〜１０ｐｐｍ
・発酵温度：  １５℃
・下面ビール酵母投入量：２０〜２４ｇ湿酵母菌体
【００７３】
次に、発酵開始後１９時間目にそれぞれの酵母株を回収し、そこからトータルＲＮＡを抽出し、これを鋳型に各遺伝子の特異的なプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。トータルＲＮＡの抽出及び精製は、上記した方法に従い、ＲＴ−ＰＣＲは、Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（ＡＭＶ）（タカラバイオ株式会社）を用いて、付属のマニュアルに従って行った。具体的には、０．３μｇのトータルＲＮＡを、上記のキットに付属のＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ＸＬでｃＤＮＡに逆転写し、以下のプライマーセットとＡＭＶ−Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  Ｔａｑとを用いて、サーマルサイクラーＤＩＣＥ  ｍｉｎｉ（タカラバイオ株式会社）でＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、５０℃で３０分、９４℃で２分間処理した後に、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分３０秒のサイクルを２２サイクルとした。
【００７４】
下面ビール酵母型ＭＥＴ３遺伝子（ＭＥＴ３ｓ．ｐ．）を特異的に増幅できるプライマーセットは、MET3s.p.F：5'-ACAATGGCGAACCCCTGCTT-3'（配列番号４）及びMET3s.p.R：5'-CATCTCAGTCCAGGACGTTT-3'（配列番号５）、
下面ビール酵母型ＭＥＴ５遺伝子（ＭＥＴ５ｓ．ｐ．）を特異的に増幅できるプライマーセットは、MET5s.p.F：5'-GTTCCTACGAGATGACAGAAC-3'（配列番号６）及びMET5s.p.R：5'-GCCAATCTGTTCTTGGGTAAAC-3'（配列番号７）、
下面ビール酵母型ＭＥＴ１０遺伝子（ＭＥＴ１０ｓ．ｐ．）を特異的に増幅できるプライマーセットは、MET10s.p.F5'-TGGCGAACAGGTTACCACTT-3'（配列番号８）及びMET10s.p.R5'-GGCAGTTGATGGAACTTCCT-3'（配列番号９）であり、
Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ型ＭＥＴ３遺伝子（ＭＥＴ３ｓ．ｃ．）を特異的に増幅できるプライマーセットは、MET3s.c.F：5'-ACTTACTGTCCAGGATGTTTAC-3'（配列番号１０）及びMET3s.c.R：5'-AGGTTCATCCGCTGACTCTA-3'（配列番号１１）、
Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ型ＭＥＴ５遺伝子（ＭＥＴ５ｓ．ｃ．）を特異的に増幅できるプライマーセットは、MET5s.c.F：5'-CAAGTTCTCTGACCCCAGTT-3'（配列番号１２）及びMET5s.c.R：5'-CGTTGCCATAATCATTCACATTACC-3'（配列番号１３）、
Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ型ＭＥＴ１０遺伝子（ＭＥＴ１０ｓ．ｃ．）を特異的に増幅できるプライマーセットは、MET10s.c.F：5'-CCTCGAAAGAACAGATACCTG-3'（配列番号１４）及びMET10s.c.R：5'-AGCGGAACCTCACTGAGGAA-3'（配列番号１５）である。
【００７５】
図６は、上記の各プライマーセットが目的とする遺伝子を特異的に増幅できることを示したゲル写真である。下面ビール酵母型の各遺伝子の増幅に用いるプライマーセットは、下面ビール酵母（Ｓ．  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）のゲノムＤＮＡを鋳型に用いたＰＣＲで目的サイズのＤＮＡ断片を増幅し、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ型の各遺伝子の増幅に用いるプライマーセットは、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡを鋳型に用いたＰＣＲで目的サイズのＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲで増幅された各ＤＮＡ断片は、電気泳動したゲルから抽出して塩基配列を調べ、目的とする遺伝子の対応部位が増幅されたことを確認した。これにより、上記の各プライマーセットは、目的とする遺伝子を特異的に増幅できることが証明された。
【００７６】
図７は、発酵開始後１９時間目のＳＢＣ０６０１株及びＳＢＣ０８４４株から抽出したトータルＲＮＡを用いて、下面ビール酵母型ＭＥＴ３遺伝子及びＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ型ＭＥＴ３遺伝子の発現量をＲＴ−ＰＣＲで比較したゲル写真である。
【００７７】
その結果、ＳＢＣ０６０１株では、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ型ＭＥＴ３遺伝子（ＭＥＴ３ｓ．ｃ．）は増幅されるものの（レーン２）、下面ビール酵母型ＭＥＴ３遺伝子（ＭＥＴ３ｓ．ｐ．）はほとんど増幅されなかった（レーン３）。一方、ＳＢＣ０８４４株では、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ型ＭＥＴ３遺伝子（ＭＥＴ３ｓ．ｃ．；レーン４）及び下面ビール酵母型ＭＥＴ３遺伝子（ＭＥＴ３ｓ．ｐ．；レーン５）のいずれもが増幅された。よって、ＳＢＣ０６０１株は、ＳＢＣ０８４４株と比較して、硫化水素産生能が低い下面ビール酵母株であることが示唆された。
【００７８】
そこで、ＳＢＣ０６０１株及びＳＢＣ０８４４株の貯酒終了時（発酵開始後２６日目）における亜硫酸と硫化水素の生成量について調べた。表３は、ＳＢＣ０６０１株及びＳＢＣ０８４４株の貯酒終了時における亜硫酸と硫化水素の生成量について調べた結果である。
【００７９】
【表３】
2007319095.tif 000004
【００８０】
その結果、ＳＢＣ０８４４株の亜硫酸生成量及び硫化水素生成量は、それぞれ１５ｐｐｍ及び２ｐｐｂであった。一方、ＳＢＣ０６０１株の亜硫酸生成量及び硫化水素生成量は、それぞれ８ｐｐｍ及び１ｐｐｂであった。
【００８１】
以上の結果より、ＳＢＣ０６０１株は、ＳＢＣ０８４４株と比較して、亜硫酸及び硫化水素生産能が低い下面ビール酵母株であることが判明し、亜硫酸及び硫化水素生産能は、下面ビール酵母型ＭＥＴ３遺伝子の発現量に依存することが明らかとなった。これらの結果は、下面ビール酵母型ＭＥＴ５遺伝子及び下面ビール酵母型ＭＥＴ１０遺伝子を指標に解析した場合であっても同様であり、今回新たに見つけた下面ビール酵母型ＭＥＴ３遺伝子、下面ビール酵母型ＭＥＴ５遺伝子及び下面ビール酵母型ＭＥＴ１０遺伝子は、硫化水素産生能が低い下面ビール酵母株の選抜のためのマーカー遺伝子として使えることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】図１は、Ｍｅｔ２０ｐｐｍ試験区及び対照区の発酵過程における仮性エキスの量を経時的に示したグラフである。
【図２】図２は、Ｍｅｔ２０ｐｐｍ試験区及び対照区の発酵過程における浮遊酵母数を経時的に示したグラフである。
【図３】図３は、Ｍｅｔ２０ｐｐｍ試験区及び対照区の発酵過程における硫酸イオンの消費量を経時的に示したグラフである。
【図４】図４は、Ｍｅｔ２０ｐｐｍ試験区及び対照区の発酵過程における亜硫酸の生成量を経時的に示したグラフである
【図５】図５は、Ｍｅｔ２０ｐｐｍ試験区及び対照区の発酵過程及び貯酒終了時の硫化水素の生成量を経時的に示したグラフである。
【図６】図６は、配列表の配列番号４及び５、６及び７、並びに６及び７の塩基配列からなるプライマーセットが目的とする遺伝子を特異的に増幅できることを示したゲル写真である。
【図７】図７は、発酵開始後１９時間目のＳＢＣ０６０１株及びＳＢＣ０８４４株に発現する下面ビール酵母型ＭＥＴ３遺伝子及びＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ型ＭＥＴ３遺伝子の発現量をＲＴ−ＰＣＲで比較したゲル写真である。
【図１】
2007319095.tif 000005
【図２】
2007319095.tif 000006
【図３】
2007319095.tif 000007
【図４】
2007319095.tif 000008
【図５】
2007319095.tif 000009
【図６】
2007319095.tif 000010
【図７】
2007319095.tif 000011
【配列表】
2007319095000001.app