(57)【要約】      （修正有）【課題】乳酸菌を利用して、優れた抗菌活性と高い安全性を有する天然の抗菌物質を提供すること。【解決手段】特定なアミノ酸配列を有する新規な抗菌性ペプチドの生産能が高い乳酸菌のエンテロコッカス・フェカリスを選択した。この抗菌性ペプチドは、特許生物寄託センターの寄託番号がＦＥＲＭ Ｐ−２０３８８の乳酸菌のエンテロコッカス・フェカリス ＣＡＣＴ１０１を培養することによって得ることができる。  この抗菌性ペプチドは、非常に広い抗菌スペクトルを示し、特にバチルス属細菌に対してはほとんどの菌に対して抗菌活性を示す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１および配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する新規抗菌性ペプチド。    
【請求項２】
配列表の配列番号３で示される請求項１に記載の新規抗菌性ペプチドをコードする領域を含むＤＮＡ。    
【請求項３】
請求項１に記載の新規抗菌性ペプチドを含有する培養液混合物、その濃縮物、またはその乾燥物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品等の貯蔵、保存に有用な広い抗菌スペクトルを有する新規な抗菌性ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
食品として日常的に摂取しているもののなかには天然の抗菌物質を含むものが多数存在する。このような天然の抗菌物質を利用し、有害な微生物の増殖を抑える技術は、消費者の多くが合成抗菌剤を嫌うという事情もあって、近年になって重要視されている。天然の抗菌物質の中で実用化されているものの例としては、わさび、唐辛子をはじめとする香辛料抽出物、ホップ、ヒノキチオールなどが挙げられるが、これらの物質はそれらの持つ独特の味やにおいのため実用例がごく一部に限られており、また有効成分の水溶性が乏しいため、水溶液中で十分な効力を発揮させることができない。一方、乳酸菌は、古来より醤油、味噌、漬け物、日本酒等の様々な発酵食品や発酵飲料の生産に利用されている有用な微生物の1つである。乳酸菌を製品の製造過程で用いると、乳酸菌から産生される乳酸や抗菌性ペプチドの働きにより、製品の製造過程及び保管中において細菌が繁殖するのを抑え、製品の品質の低下を防ぐことが可能となることが知られている。このような技術を利用した実例としては、エンテロコッカス属微生物やラクトコッカス属微生物の培養生産物を利用する方法が知られている（例えば、特許文献１〜３、非特許文献１参照）。
【０００３】
【特許文献１】特開２００３−２３５５２９号公報
【特許文献２】特開２００３−１６４２７６号公報
【特許文献３】特開２００４−１０５１１８号公報
【非特許文献１】Journal of Bacteriology, 180, 1988-1994 (1998)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このような乳酸菌が産生する抗菌性ペプチドは、蛋白分解酵素で分解されることから安全な抗菌性物質として期待されているが、その抗菌活性などにおいて必ずしもまだ満足すべきものではなく、実用的な抗菌性物質として十分に利用できるものは少ない。
本発明は、古くから食品及び食品加工に利用されている乳酸菌を利用して、優れた抗菌活性と高い安全性を有する天然の抗菌物質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上述のような課題を解決すべく検討を行い、種々の発酵食品から乳酸菌を分離し、抗菌性ペプチドを生産する菌株のスクリーニングを行った。その結果、単純な組成の培地で容易に生育し、効率的に生産することができる乳酸菌の分離に成功し、この乳酸菌が産生する蛋白質のうちのある種のものが非常に広い抗菌スペクトルを示すことを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
即ち、本発明は、以下の内容をその要旨とするものである。
（１）配列表の配列番号１および配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する新規抗菌性ペプチド。
（２）配列表の配列番号３で示される前記（１）に記載の新規抗菌性ペプチドをコードする領域を含むＤＮＡ。
（３）前記（１）に記載の新規抗菌性ペプチドを含有する培養液混合物、その濃縮物、またはその乾燥物。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の新規抗菌性ペプチドは、長年にわたり摂取されてきた発酵食品から分離された乳酸菌が産生するものであることから、安全性が高いと同時に、バチルス属細菌、乳酸菌、ブドウ球菌、リステリアに対して優れた抗菌活性を示し、これらの細菌の増殖を効果的に抑制することができる。従って、この抗菌性ペプチドは、食品類やその他の製品の製造過程及び保管中において細菌の繁殖による製品の品質の低下を防ぐことができるという効果を発揮する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明者らは、種々の発酵食品を分離源として多数の乳酸菌を分離し、それらのなかから耐熱性の強いバチルス属細菌に対する抗菌活性を指標として、菌株のスクリーニングを行った。その結果、漬物から分離したエンテロコッカス属に属する乳酸菌の１株に特に高い抗菌活性を見出し、その培養液から本発明の新規抗菌性ペプチドを得た。
【０００９】
まず、スクリーニングのための乳酸菌は、以下のようにして分離し、取得した。即ち、各種の発酵食品から採取した試料を、０．５％の炭酸カルシウムを含むＭＲＳ培地（メルク社製）を用いて培養し、必要に応じて数回の継代培養を行った。次いで、この培養液をＭＲＳ寒天培地に塗抹培養し、ここに生じたコロニーから乳酸菌を採取した。尚、ＭＲＳ培地の組成は表１に示すとおりである。
【００１０】
【表１】
2007274918.tif 000002
【００１１】
このようにして分離した乳酸菌から、耐熱性の強いバチルス属細菌に対す抗菌活性を指標として抗菌性物質の生産能が特に強い乳酸菌１株を選択した。この選択した乳酸菌について、その菌学的性質、塩基配列データベースに存在する乳酸菌の１６ＳリボソームＤＮＡの塩基配列相同性解析、および糖質の発酵試験を行った。その結果から、この乳酸菌がエンテロコッカス・フェカリスに属する新菌株であると判定され、この菌株をＣＡＣＴ１０１株と命名し、２００５年２月３日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）へ寄託した。その寄託番号はＦＥＲＭ Ｐ−２０３８８である。
【００１２】
このエンテロコッカス・フェカリスに属する新菌株（ＣＡＣＴ１０１株）は、標準条件で生育する連鎖球菌であり、グラム陽性、好気条件および嫌気条件で生育し、オキシダーゼ陰性、カタラーゼ陰性、非運動性、非胞子形成性という性質を有する。培養的性質としては、肉汁寒天平板培養で良く生育し、白色の光沢のある小コロニーを形成し、肉汁液体培養では、生育良、表面発育なし、リトマスミルクでは酸性化がみられる。
【００１３】
次に、本発明の新規抗菌性ペプチドについて説明する。
本発明の新規抗菌性ペプチドは、上記のエンテロコッカス・フェカリス（ＣＡＣＴ１０１株）を、ＭＲＳ培地を用いて所定の条件で培養し、その培養液から分離・精製することによって得ることができる。即ち、本発明の新規抗菌性ペプチドは、エンテロコッカス・フェカリス（ＣＡＣＴ１０１株）をＭＲＳ培地で３０℃前後の培養温度で培養することにより、２４時間程度の培養で十分な生産が認められる。抗菌性ペプチドの取得を目的として本菌を大量に培養する場合は、培地としてコーン培地（組成：1リットルあたりコーンスティープリカー（庄野澱粉社製）１０ｇ、酵母エキス（オリエンタル酵母社製）２ｇ、グルコース（和光純薬杜製）１０ｇ）を用いることが好ましく、この培地を用いて３０℃前後の培養温度で２４〜４８時間培養すればよい。
【００１４】
本発明の新規抗菌性ペプチドの分離、精製は常法によって行うことができる。例えば、培養液を遠心分離し、その上清を硫安分画を行い、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによる分取、逆相カラムクロマトグラフィーによる分取を行うことによって抗菌活性を示す画分を分画し、精製された本発明の抗菌性ペプチドを得ることができる。
【００１５】
得られた本発明の新規抗菌性ペプチドのアミノ酸配列の解析は次の方法によって行った。即ち、エドマン分解法によりこの抗菌性ペプチドのＮ−末端側から全アミノ酸配列の約７割を決定し、その結果を基にプライマーを設計し、このプライマーがハイブリダイズした近傍領域のＤＮＡ塩基配列を決定した。得られたＤＮＡ塩基配列は、配列表の配列番号３に示すとおりである。このＤＮＡ塩基配列のうちの抗菌活性を示すアミノ酸をコードする塩基配列から抗菌性ペプチドの全アミノ酸配列を決定した。これらの本発明の抗菌性ペプチドの全アミノ酸配列は、配列表の配列番号１および配列番号２に示すとおりであり、それぞれ４４個及び４３個のアミノ酸からなる。
【００１６】
本発明の抗菌性ペプチドに類似したペプチドとして、前記非特許文献１には、エンテロコッカス・フェカリス Ｌ５０から産生されるエンテロシン（Enterocins）Ｌ５０ＡおよびＬ５０Ｂが記載されている。これらもそれぞれ４４個と４３個のアミノ酸からなるが、配列番号１および配列番号２の本発明の抗菌性ペプチドと比較すると、その構成アミノ酸が以下のように相違する。すなわち、配列番号１のペプチドの３８番目のアミノ酸がアスパラギン酸（Ｄ）であるのに対して、Ｌ５０Ａが「グルタミン酸（Ｅ）」である点で相違し、配列番号２のペプチドの９番目と１５番目のアミノ酸がそれぞれアラニン（Ａ）とフェニルアラニン（Ｆ）であるのに対して、Ｌ５０Ｂがそれぞれ「トレオニン（Ｔ）」と「ロイシン（Ｌ）」である点で相違している。そして、このように両者の構成アミノ酸が相違することの結果として、本発明の抗菌性ペプチドが非常に広い抗菌スペクトルを有し、特にバチルス属の細菌に対して優れた抗菌活性を示すのに対して、Ｌ５０ＡおよびＬ５０Ｂは食中毒の原因菌として知られるバチルス・セレウスに対し抗菌作用を示さず、両者は異なった特性を示す別異のたんぱく質であることがわかる。従って、配列番号１および配列番号２の本発明の抗菌性ペプチドは、前記非特許文献１においても公知となっていない新規なペプチドである。
【００１７】
このようにして得られた本発明の抗菌性ペプチドは、従来公知の抗菌性ペプチドに見られない次のような特徴ある性質を有する新規な抗菌性物質である。
本発明の抗菌性ペプチドは、１００℃で３０分間放置してもその活性を失わず、優れた熱安定性を有する。更に、バチルス属細菌、乳酸菌に対し広い抗菌スペクトルを有し、特にバチルス属細菌のほとんど全てに対し、従来知られている種々の抗菌性ペプチドには見られなかった極めて広い抗菌スペクトルを示す。また、消化酵素であるトリプシンまたはプロテナーゼを添加すると分解し、活性を失う。従って、本発明の抗菌性ペプチドは、摂取しても消化管内で容易に分解されアミノ酸となると考えられ、安全性に関しても極めて優れている。
【００１８】
本発明の抗菌性ペプチドは、熱安定性に優れ、安全性が高く、耐熱性が高く、バチルス属細菌や乳酸菌に対して抗菌作用を示すことから、細菌による加熱加工製品の品質劣化を防止する食品類その他の素材としての応用が期待できる。
【００１９】
また、実際に食品等に利用する場合には、必ずしも上述したような抗菌性ペプチドの精製を行う必要はなく、食品素材を原料とするエンテロコッカス・フェカリス（ＣＡＣＴ１０１株）の培養液そのもの、またはこの培養液を濃縮した濃縮物、乾燥した乾燥物を使用しても良い。
【００２０】
次に、以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。尚、各実施例中「％」は特に注記しない限り質量基準である。
【実施例１】
【００２１】
(1)抗菌性ペプチド粗粉末の調製
エンテロコッカス・フェカリス（ＣＡＣＴ１０１株）をＴＹＧ培地（トリプトン１％、酵母エキス  ０．５％、ブドウ糖１％、食塩０．５％）１００ｍＬに接種し、３０℃で２４時間培養して前培養液を得た。次いで、コーン培地（コーンスティープリカー（庄野澱粉社製）１％、酵母エキス（オリエンタル酵母社製）０．２％、ブドウ糖（和光純薬杜製）１％、食塩０．２％、硫酸マンガン０．０２％（ｐＨ６．５に調整））１０リットルに上記前培養液を加え、３０℃で下限ｐＨ５．５にコントロール下に３６時間培養し、抗菌性ペプチドを含む培養液を得た。この培養液から遠心分離（２００００Ｇ×１０分）により菌体を除去した後、培養上清液を８０℃で３０分間殺菌した後、噴霧乾燥して本発明の抗菌性ペプチド粗粉末約５００ｇを得た。
【００２２】
(2)抗菌性ペプチド粗粉末の精製
上記(1)で得た抗菌性ペプチド粗粉末の２％水溶液を調製し、次の手順で抗菌性ペプチドを精製した。
(i)  硫安分画
４０％飽和の硫安水溶液に溶解し、８０％飽和の硫安水溶液で沈殿した画分を取得し、その画分の水溶液をフナコシ社製の透析膜で脱塩した。
(ii)  陽イオン交換クロマトグラフィー
上記(i)で得た水溶液を、次の条件で陽イオン交換クロマトグラフィーにかけ、カラムに吸着しない成分を水洗により除去した後、溶離液を通液して流出した画分を抗菌性画分Ａとして分取した。
担  体：SP Sepharose Fast Flow (Amershum) 
溶離液：1M NaCl in 20nMリン酸Na (pH 5.9)
(iii)  疎水性相互作用クロマトグラフィー
上記(ii)で得た抗菌性画分Ａを、次の条件で疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけ、カラムに吸着しない成分を水洗により除去した後、溶離液を通液して流出した画分を抗菌性画分Ｂとして分取した。
担  体：Octyl Sepharose (Amershum)
溶離液：EtOH／20mM リン酸Na (pH 5.9)（７／３）
(iv)  逆相ＨＰＬＣ
上記(iii)で得た抗菌性画分Ｂを、次の条件で逆相ＨＰＬＣにかけ、カラムに吸着しない成分を水洗により除去した後、溶離液を通液して流出液から抗菌性画分Ｄ及びＥを分取した。
カラム  ：  Capcell Pak C18MG 4.6mm×150mm  (Shiseido)
溶離液Ａ：  0.1 % トリフルオロ酢酸水溶液
溶離液Ｂ：  0.1 % トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液
溶離液Ｂは２０％→４０％の１２０分リニアグラディエント
検  出  ：  ２２０ｎｍ
注入量  ：  ０．５ｍｌ（1回あたり）
こうして得られた抗菌性ペプチドを含む画分Ｄ及びＥは、トリシン−ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、それぞれ単一バンドを示した。
【００２３】
(3)  抗菌性ペプチドのアミノ酸配列の決定
上記(1)において、培養液から遠心分離で菌体を除去する際に、遠沈物として得られた菌体からＤＮＡを抽出した。抽出方法は、Appl. Environ. Microbiol. 1983 September, 46(3), 549-552 に従った。
次に、上記(2)で得られた抗菌性ペプチドを含む画分Ｄ及びＥ中に含まれるペプチドのＮ末端からおよそ３０〜４０個のアミノ酸配列をエドマン分解法により決定した。その結果を以下に示すとともに、配列表に配列番号４および５として示す。
画分Ｄ：
Met Gly Ala Ile Ala Lys Leu Val Ala Lys Phe Gly Trp Pro Ile Val Lys Lys Tyr Tyr Lys Gln Ile Met Gln Phe Ile Gly Glu Gly Trp Ala Ile Asn Lys Ile Ile 
画分Ｅ：
Met Gly Ala Ile Ala Lys Leu Val Ala Lys Phe Gly Trp Pro Phe Ile Lys Lys Phe Tyr Lys Gln Ile Met Gln Phe Ile Gly Gln Gly 
上記のペプチドのアミノ酸配列を基に、プライマーＡＢ−１、Ａ−２、Ｂ−２を設計した。そのＤＮＡ塩基配列を以下に示す。
ＡＢ−１:  AA YTT NGC NAC NAR YTT NGC DAT
Ａ−２  :  TGG CCN ATH GTN AAR AAR TAY TA
Ｂ−２  :  TGG CCN TTY ATH AAR AAR TTY TA
ここで、ＲはＡとＧ、ＹはＣとＴ、ＤはＡとＧとＴ、ＨはＡとＣとＴ、そしてＮはＡとＣとＧとＴの混合物を表す。
【００２４】
これらのプライマーを用いて、菌体から抽出したＤＮＡを鋳型として直接ＰＣＲ反応を行い、増幅されたＤＮＡフラグメントの塩基配列をＤＮＡシーケンサーで決定した。ここで決定されたＤＮＡ塩基配列を基に下記プライマーを合成し、上記のペプチドをコードする領域の前後１８６３塩基のＤＮＡ塩基配列を決定した。
Ｎ−１Ｆ：  GATGGGCAATTAACAAAATTATTG
Ｎ−１Ｃ：  AATATGTTTTTTGATCCAATCAAT
Ｎ−２Ｆ：  TGATGAAAAAGACCAACAGGGTATAC
Ｎ−２Ｃ：  GCTATTTCTGGAAATAGAATATCCTC
決定されたＤＮＡ塩基配列の結果は配列番号３に示す通りである。配列番号３のＤＮＡ塩基配列より画分Ｄ及びＥ中に含まれる抗菌性ペプチドをコードする部分の全アミノ酸配列を決定した。画分Ｄのペプチドは全部で４４個のアミノ酸からなり、配列表の配列番号１に示すとおりであり、画分Ｅのペプチドは全部で４３個のアミノ酸からなり、配列表の配列番号２に示すとおりである。
・ペプチド１（画分Ｄのペプチド）
Met Gly Ala Ile Ala Lys Leu Val Ala Lys Phe Gly Trp Pro Ile Val Lys Lys Tyr Tyr Lys Gln Ile Met Gln Phe Ile Gly Glu Gly Trp Ala Ile Asn Lys Ile Ile Asp Trp Ile Lys Lys His Ile
・ペプチド２（画分Ｅのペプチド）
Met Gly Ala Ile Ala Lys Leu Val Ala Lys Phe Gly Trp Pro Phe Ile Lys Lys Phe Tyr Lys Gln Ile Met Gln Phe Ile Gly Gln Gly Trp Thr Ile Asp Gln Ile Glu Lys Trp Leu Lys Arg His
【実施例２】
【００２５】
抗菌性ペプチド抗菌スペクトル
実施例１で得られた抗菌性ペプチド粗粉末を添加したＴＹＧ寒天培地（トリプトン１％、酵母エキス０．５％、ブドウ糖１％、食塩０．５％、寒天１．５％）に、次の表２〜表４に示す各種の被検菌を接種し、３０℃で２日間培養した後、菌の生育の状況を観察した。その結果を表２、表３および表４に示す。
【００２６】
【表２】
2007274918.tif 000003
【００２７】
【表３】
2007274918.tif 000004
【００２８】
【表４】
2007274918.tif 000005
【００２９】
表２の結果からわかるように、本発明の抗菌性ペプチドは、試験したすべてのバチルス属の細菌に対して優れた抗菌活性を示し、非常に幅広い抗菌スペクトルを示すものである。また、表３の結果からわかるように、本発明の抗菌性ペプチドは、乳酸菌のうちのいくつかのものに対して抗菌活性があり、表４の結果からわかるように、これ以外にもブドウ球菌（Staphylococcus aureus）およびリステリア菌（Listeria monocytogenes）に対しても抗菌活性を示した。このように広い抗菌スペクトルを有するものは従来のものにはまったく見られなかったもので、本発明の抗菌性ペプチドの著しい特徴的な性質である。
【実施例３】
【００３０】
(1)抗菌性ペプチドの熱安定性
実施例１で得た抗菌性ペプチド粗粉末の１％水溶液を調製し、塩酸または水酸化ナトリウムでｐＨを５および６に調整し、９０℃、および１００℃に３０分間放置した。これらのサンプルをあらかじめラクトバチルス・プランタラム（ＪＣＭ１０５７）を混釈したＭＲＳ寒天培地上に０．０２ｍＬスポットし、３０℃で２日間培養し、生育阻止円の直径を測定した。加熱前の抗菌性ペプチド水溶液による生育阻止円と、上記温度で放置後の各サンプルによる生育阻止円を比較したところ、この間に差はほとんどみられなかった。この結果からわかるように、本発明の抗菌性ペプチドは、ｐＨ５〜６においては１００℃で３０分の加熱においても安定であり、優れた耐熱性を有する。
【００３１】
(2)  抗菌性ペプチドのｐＨ安定性
実施例１で得た抗菌性ペプチド粗粉末の１％水溶液を調製し、塩酸または水酸化ナトリウムでそのｐＨ値を、３、４、５、６、７、８、および９に調整した。これらの各試料を室温で１日放置した後、そのｐＨを約６に調整し、あらかじめラクトバチルス・プランタラム（ＪＣＭ１０５７）を混釈したＭＲＳ寒天培地上に０．０２ｍＬスポットし、３０℃で２日間培養し、生育阻止円の直径を測定した。処理前の抗菌性ペプチド粉末溶液による生育阻止円と、上記の各ｐＨで処理した試料による生育阻止円を比較したところ、ｐＨ３からｐＨ９のすべてのｐＨにおいて、各試料の間に差はほとんどみられず、処理前の試料のものともその差はほとんど見られなかった。この結果からわかるように、本発明の抗菌性ペプチドは、ｐＨが３〜９の範囲で、抗菌活性が低下することなく安定である。
【００３２】
(3)  抗菌性ペプチドの消化酵素による分解
実施例１で得た抗菌性ペプチド粗粉末の１％水溶液を調製し、プロナーゼ（Ｒｏｃｈｅ社製）０．０１％を加え、３７℃で１時間インキュベートした。この試料について、上記(1)、(2)と同様の方法によってＭＲＳ寒天培地上の生育阻止円を観察することによって、その抗菌活性を測定した。その結果、プロナーゼを添加した場合には、生育阻止円がまったく観察されず、抗菌性ペプチドはプロナーゼ処理により抗菌活性を失ったことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明の抗菌性ペプチドを使用することにより、バチルス属細菌をはじめ広い範囲の細菌に対して優れた抗菌作用を示し、多くの食品類その他の製品の腐敗防止に有用であり、食品産業、その他多くの産業において有用である。
【配列表】
2007274918000001.app