(57)【要約】【課題】診断薬の分野において従来技術による解決し得ない問題を解決するために、例えば一つまたはそれ以上の化学的または微生物学的個体単位についてその捕捉、認識、検出、同定または定量化などを行うために幾つかの核酸類縁体を提供すること。 【解決手段】相補的配列の従来公知の核酸とハイブリッドを形成し、而もそのハイブリッドのＴｍ値における安定性を相当する配列を持つ従来公知の核酸が形成するハイブリッドよりも高くするような特性および／または相当する配列を持つ前記従来公知の相当する核酸よりも不適合の程度に関与する配列と比較した相補的配列に対する選択性をより大きくする特性といった、従来知られていない特性を有する新規な構造の核酸類縁体及びを診断薬または分析にかかる核酸類縁体を使用する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載されるような、核酸類縁体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
【数１−１】
2007306926.tif 000002
【背景技術】
【０００２】
【数１−２】
2007306926.tif 000003
【０００３】
【数２−１】
2007306926.tif 000004
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明によって以下が提供される：
【０００５】
【数９４】
2007306926.tif 000005
【０００６】
【数９５】
2007306926.tif 000006
【０００７】
【数９６】
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【０００８】
【数９７】
2007306926.tif 000008
【０００９】
【数９８】
2007306926.tif 000009
【００１０】
【数９９】
2007306926.tif 000010
【００１１】
【数２−２】
2007306926.tif 000011
【００１２】
【数３】
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【００１３】
【数４】
2007306926.tif 000013
【００１４】
【数５】
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【００１５】
【数６】
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【００１６】
【数７】
2007306926.tif 000016
【００１７】
【数８】
2007306926.tif 000017
【００１８】
【数９】
2007306926.tif 000018
【００１９】
【数１０】
2007306926.tif 000019
【００２０】
【数１１】
2007306926.tif 000020
【００２１】
【数１２】
2007306926.tif 000021
【００２２】
【数１３】
2007306926.tif 000022
【００２３】
【数１４】
2007306926.tif 000023
【００２４】
【数１５】
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【００２５】
【数１６】
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【００２６】
【数１７】
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【００２７】
【数１８】
2007306926.tif 000027
【００２８】
【数１９】
2007306926.tif 000028
【００２９】
【数２０】
2007306926.tif 000029
【００３０】
【数２１】
2007306926.tif 000030
【００３１】
【数２２】
2007306926.tif 000031
【００３２】
【数２３】
2007306926.tif 000032
【００３３】
【数２４】
2007306926.tif 000033
【００３４】
【数２５】
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【００３５】
【数２６】
2007306926.tif 000035
【００３６】
【数２７】
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【００３７】
【数２８】
2007306926.tif 000037
【００３８】
【数２９】
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【００３９】
【数３０】
2007306926.tif 000039
【００４０】
【数３１】
2007306926.tif 000040
【００４１】
【数３２】
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【００４２】
【数３３】
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【００４３】
【数３４】
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【００４４】
【数３５】
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【００４５】
【数３６】
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【００４６】
【数３７】
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【００４７】
【数３８】
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【００４８】
【数３９】
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【００４９】
【数４０】
2007306926.tif 000049
【００５０】
【数４１】
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【００５１】
【数４２】
2007306926.tif 000051
【００５２】
【数４３】
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【００５３】
【数４４】
2007306926.tif 000053
【００５４】
【数４５】
2007306926.tif 000054
【００５５】
【数４６】
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【００５６】
【数４７】
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【００５７】
【数４８】
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【００５８】
【数４９】
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【００５９】
【数５０】
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【００６０】
【数５１】
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【００６１】
【数５２】
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【００６２】
【数５３】
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【００６３】
【数５４】
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【００６４】
【数５５】
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【００６５】
【数５６】
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【００６６】
【数５７】
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【００６７】
【数５８】
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【００６８】
【数５９】
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【００６９】
【数６０】
2007306926.tif 000069
【００７０】
【数６１】
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【００７１】
【数６２】
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【００７２】
【数６３】
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【００７３】
【数６４】
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【００７４】
【数６５】
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【００７５】
【数６６】
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【００７６】
【数６７】
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【００７７】
【数６８】
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【００７８】
【数６９】
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【００７９】
【数７０】
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【００８０】
【数７１】
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【００８１】
【数７２】
2007306926.tif 000081
【００８２】
【数７３】
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【００８３】
【数７４】
2007306926.tif 000083
【００８４】
【数７５】
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【００８５】
【数７６】
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【００８６】
【数７７】
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【００８７】
【数７８】
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【００８８】
【数７９】
2007306926.tif 000088
【００８９】
【数８０】
2007306926.tif 000089
【００９０】
【数８１】
2007306926.tif 000090
【００９１】
【数８２】
2007306926.tif 000091
【００９２】
【数８３】
2007306926.tif 000092
【００９３】
【数８４】
2007306926.tif 000093
【００９４】
【数８５】
2007306926.tif 000094
【００９５】
【数８６】
2007306926.tif 000095
【００９６】
【数８７】
2007306926.tif 000096
【００９７】
【数８８】
2007306926.tif 000097
【００９８】
【数８９】
2007306926.tif 000098
【００９９】
【数９０】
2007306926.tif 000099
【０１００】
【数９１】
2007306926.tif 000100
【０１０１】
【数９２】
2007306926.tif 000101
【０１０２】
【数９３】
2007306926.tif 000102
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１Ａ】天然のデオキシリボヌクレオチド（Ａ）および本発明のペプチド核酸（ＰＮＡ）（Ｂ）を示す。
【図１Ｂ】天然のデオキシリボヌクレオチド（Ａ）および本発明のペプチド核酸（ＰＮＡ）（Ｂ）を示す。
【図２Ａ】ＤＮＡ認識のための天然および非天然の核酸塩基およびリポ−タ−基を示す。
【図２Ｂ】ＤＮＡ認識のための天然および非天然の核酸塩基およびリポ−タ−基を示す。
【図３】以下の概略図を示したものである：すなわち、（ａ）Ａｃｒ1−（Ｔａｅｇ）10−Ｌｙｓ−ＮＨ2（ＡｃｒＴ10Ｌｙｓ−ＮＨ2）による光開裂；Ａｃｒ1−（Ｔａｅｇ）10−Ｌｙｓ−ＮＨ2のジアゾ−結合アクリジンによるフォトフットプリントおよび好ましいＫＭｎＯ4−開裂；および（ｃ）Ｓ1−ヌクレア−ゼで増進せしめられた開裂と（ｄ）Ａｃｒ1−（Ｔａｅｇ）10−Ｌｙｓ−ＮＨ2結合部位のミクロコッカスヌクレア−ゼによる開裂。
【図４】ＰＮＡモノマ−シントンのいくつかの例を示す。
【図５】Ａｃｒ1リガンドおよび一つのＰＮＡであるＡｃｒ1−（Ｔａｅｇ）10−Ｌｙｓ−ＮＨ2を示す。
【図６】モノマ−シントンを調製する一般的な概略図である。
【図７】Ａｃｒ1リガンドを調製する一般的概略図である。
【図８】線状の未保護ＰＮＡアミドの調製を図示する固相ＰＮＡ合成の一般的概略図である。
【図９】以下の分析ＨＰＬＣクロマトグラムを示すものである：（Ａ）ＨＦ−開列後の粗製Ｈ−［Ｔａｅｇ］15−Ｌｙｓ−ＮＨ2（凍結乾燥前）；（Ｂ）ＨＦ開裂後の粗製Ａｃｒ1−［Ｔａｅｇ］15−Ｌｙｓ−ＮＨ2（凍結乾燥前）；および（Ｃ）精製Ａｃｒ1−［Ｔａｅｇ］15−Ｌｙｓ−ＮＨ2・緩衝液Ａ、５％ＣＨ3ＣＮ／９５％  Ｈ2Ｏ／０．０４４５％ＴＦＡ；緩衝液Ｂ、６０％ＣＨ3ＣＮ／４０％Ｈ2Ｏ／０．０３９０％ＴＦＡ；直線勾配、３０分でＢが０−１００％；流量、  １．２ｍｌ／分；カラム、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８  （５μｍ、０．４６  ｘ  ２５ｃｍ）。
【図１０】以下の分析ＨＰＬＣクロマトグラムを示す：すなわち、（Ａ）精製Ｈ−［Ｔａｅｇ］10−Ｌｙｓ−ＮＨ2および（Ｂ）Ｈ−［Ｔａｅｇ］5−Ｃａｅｇ−［Ｔａｅｇ］4−Ｌｙｓ−ＮＨ2−第９図におけると同一条件を使用。
【図１１Ａ】第１１ａ図および第１１ｂ図は、ＡｃｒＴ10−ＬｙｓのｄＡ10・５’−32Ｐで標識したオリゴヌクレオチドへの結合を示す；（１）（５’−ＧＡＴＣＣＡ10Ｇ）をＡｃｒＴ10−Ｌｙｓの存在下または不存在下およびオリゴヌクレオチドの存在下または不存在下で培養した。（２）（５’−ＧＡＴＣＣＡ10Ｇ）および試料を”自然の条件”下（第１１ａ図）または”変性条件”下（第１１ｂ図）でポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）およびオ−トラジオグラフィ−によって分析した。
【図１１Ｂ】第１１ａ図および第１１ｂ図は、ＡｃｒＴ10−ＬｙｓのｄＡ10・５’−32Ｐで標識したオリゴヌクレオチドへの結合を示す；（１）（５’−ＧＡＴＣＣＡ10Ｇ）をＡｃｒＴ10−Ｌｙｓの存在下または不存在下およびオリゴヌクレオチドの存在下または不存在下で培養した。（２）（５’−ＧＡＴＣＣＡ10Ｇ）および試料を”自然の条件”下（第１１ａ図）または”変性条件”下（第１１ｂ図）でポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）およびオ−トラジオグラフィ−によって分析した。
【図１２Ａ】第１２ａ−ｃ図は、ｄｓＤＮＡ−ＡｃｒＴ10−Ｌｙｓ−ＮＨ2錯体についての化学的、光化学的および酵素的プロ−ビングを示す。ｄｓＤＮＡ−ＡｃｒＴ10−Ｌｙｓ−ＮＨ2とｄＡ10／ｄＴ10標識配列を含む32Ｐ−ｅｎｄ標識化ＤＮＡフラグメントとの間の錯体を、アフィニティ−光開裂（第１２ａ図、レ−ン１−３；第１２ｂ図、レ−ン１−３）、過マンガン酸塩プロ−ビング（第１２ｂ図、レ−ン４−６）またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓヌクレア−ゼによるプロ−ビング（第１２ｂ図、レ−ン８−１０）もしくはヌクレア−ゼＳ１によるプロ−ビング（第１２ｃ図）によってプロ−ブした。Ａ鎖（第１２ａ図）またはＴ鎖（第１２ｂ図、第１２ｃ図）をプロ−ブした。（ＰＡＧＥ）およびオ−トラジオグラフィ−によって分析した。
【図１２Ｂ】第１２ａ−ｃ図は、ｄｓＤＮＡ−ＡｃｒＴ10−Ｌｙｓ−ＮＨ2錯体についての化学的、光化学的および酵素的プロ−ビングを示す。ｄｓＤＮＡ−ＡｃｒＴ10−Ｌｙｓ−ＮＨ2とｄＡ10／ｄＴ10標識配列を含む32Ｐ−ｅｎｄ標識化ＤＮＡフラグメントとの間の錯体を、アフィニティ−光開裂（第１２ａ図、レ−ン１−３；第１２ｂ図、レ−ン１−３）、過マンガン酸塩プロ−ビング（第１２ｂ図、レ−ン４−６）またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓヌクレア−ゼによるプロ−ビング（第１２ｂ図、レ−ン８−１０）もしくはヌクレア−ゼＳ１によるプロ−ビング（第１２ｃ図）によってプロ−ブした。Ａ鎖（第１２ａ図）またはＴ鎖（第１２ｂ図、第１２ｃ図）をプロ−ブした。（ＰＡＧＥ）およびオ−トラジオグラフィ−によって分析した。
【図１２Ｃ】第１２ａ−ｃ図は、ｄｓＤＮＡ−ＡｃｒＴ10−Ｌｙｓ−ＮＨ2錯体についての化学的、光化学的および酵素的プロ−ビングを示す。ｄｓＤＮＡ−ＡｃｒＴ10−Ｌｙｓ−ＮＨ2とｄＡ10／ｄＴ10標識配列を含む32Ｐ−ｅｎｄ標識化ＤＮＡフラグメントとの間の錯体を、アフィニティ−光開裂（第１２ａ図、レ−ン１−３；第１２ｂ図、レ−ン１−３）、過マンガン酸塩プロ−ビング（第１２ｂ図、レ−ン４−６）またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓヌクレア−ゼによるプロ−ビング（第１２ｂ図、レ−ン８−１０）もしくはヌクレア−ゼＳ１によるプロ−ビング（第１２ｃ図）によってプロ−ブした。Ａ鎖（第１２ａ図）またはＴ鎖（第１２ｂ図、第１２ｃ図）をプロ−ブした。
【図１３】保護ＰＮＡシントンを合成する手法を示す。
【図１４】保護アデニンモノマ−シントンを合成する手法を示す。
【図１５】保護グアニンモノマ−シントンを合成する手法を示す。
【図１６】ＰＮＡ主鎖改変のいくつかの例を示す。
【図１７】通常のアミノ酸に相当する側鎖を有するチミンモノマ−シントンを合成する手法を示す。
【図１８Ａ】第１８ａ図および第１８図ｂはそれぞれ、チミンモノマ−シントンのアミノプロピル類縁体およびプロピオニル類縁体を合成する手法を示す。
【図１８Ｂ】第１８ａ図および第１８図ｂはそれぞれ、チミンモノマ−シントンのアミノプロピル類縁体およびプロピオニル類縁体を合成する手法を示す。
【図１９】チミンモノマ−シントンのアミノエチル−β−アラニン類縁体を合成する手法を示す。
【図２０】ＰＮＡｓ−Ｔ10、−Ｔ9Ｃおよび−Ｔ8Ｃ2が、高い配列特異性をもって二本鎖ＤＮＡに結合することを実証するＰＡＧＥラジオオ−トグラフを示す。
【図２１】Ａ10／Ｔ10二本鎖ＤＮＡ標的に結合した長さの異なるＰＮＡ類の熱安定性を示すＰＡＧＥオ−トラジオグラフのデンシトメ−タ−走査に基づくグラフである。
【図２２】Ａ１０／Ｔ１０二重鎖ＤＮＡ標的に結合させた、長さの異なるＰＮＡの熱安定性を示す、ＰＡＧＥオートラジオグラフのデンシトメトリ走査に基くグラフである。
【図２３】ＤＮＡに対する制限酵素活性が、ＰＮＡを制限酵素認識部位の近位に結合させた場合抑制されることを実証する電気泳動ゲル染色を示す。
【図２４】125Ｉで標識したＰＮＡ−Ｔ10が相補的ｄＡ10オリゴヌクレオチドに結合することを実証するＰＡＧＥオ−トラジオグラフを示す。
【図２５】第２５ａ図から第２５ｃ図は、固定化したＰＮＡとマッチするまたは塩基一つがミスマッチしたオリゴ−ＤＮＡ類との間で異なる温度において実現される結合の百分率を示す。
【図２６】第２６図は、転写された鎖へのＴ10によるＲＮＡポリメラ−ゼ転写抑制を示すオ−トラジオグラフである。
【図２７】標識化プラスミドｄｓＤＮＡ類の一つに相補的である固定化されたＤＮＡに捕捉されかつ異なる温度において洗浄された標識化プラスミドｄｓＤＮＡ類の混合物のオ−トラジオグラフである。
【図２８】第２８図は、ＰＮＡによる鎖置換を用いたプラスミドｄｓＤＮＡの定量を実証する臭化エチジウムゲルとそのオ−トラジオグラフとを組合せたものである。
【図１Ａ】
2007306926.tif 000103
【図１Ｂ】
2007306926.tif 000104
【図２Ａ】
2007306926.tif 000105
【図２Ｂ】
2007306926.tif 000106
【図３】
2007306926.tif 000107
【図４】
2007306926.tif 000108
【図５】
2007306926.tif 000109
【図６】
2007306926.tif 000110
【図７】
2007306926.tif 000111
【図８】
2007306926.tif 000112
【図９】
2007306926.tif 000113
【図１０】
2007306926.tif 000114
【図１１Ａ】
2007306926.tif 000115
【図１１Ｂ】
2007306926.tif 000116
【図１２Ａ】
2007306926.tif 000117
【図１２Ｂ】
2007306926.tif 000118
【図１２Ｃ】
2007306926.tif 000119
【図１３】
2007306926.tif 000120
【図１４】
2007306926.tif 000121
【図１５】
2007306926.tif 000122
【図１６】
2007306926.tif 000123
【図１７】
2007306926.tif 000124
【図１８Ａ】
2007306926.tif 000125
【図１８Ｂ】
2007306926.tif 000126
【図１９】
2007306926.tif 000127
【図２０】
2007306926.tif 000128
【図２１】
2007306926.tif 000129
【図２２】
2007306926.tif 000130
【図２３】
2007306926.tif 000131
【図２４】
2007306926.tif 000132
【図２５】
2007306926.tif 000133
【図２６】
2007306926.tif 000134
【図２７】
2007306926.tif 000135
【図２８】
2007306926.tif 000136