(57)【要約】      （修正有）【課題】操作が煩雑でなく、迅速かつ大量の試料を解析するための、多大な労力を要しない大規模なラボオートメーションシステム中で用いられ、明確にかつ再現性よく核酸配列中の多型を検出することができる方法及びそのための試薬を提供する。【解決手段】核酸と有機溶媒を含有する溶液の温度を変化させ、その温度変化に伴う核酸の形態変化に相関するシグナルを測定し、そのシグナルに基づいて核酸中の塩基配列を判断する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の核酸の塩基配列の変異の有無を判断する方法において、該核酸と有機溶媒を含有する溶液の温度を変化させ、その温度変化に伴う該核酸の形態変化に相関するシグナルを測定し、該シグナルに基づいて該核酸中の塩基配列を判断することを特徴とする塩基配列判別方法。
【請求項２】
温度変化が温度上昇であることを特徴とする請求項1記載の塩基配列判別方法。
【請求項３】
形態変化が、核酸の二重鎖構造から一重鎖構造への形態変化であることを特徴とする請求項1または２に記載の塩基配列判別方法。
【請求項４】
少なくとも１種類の二重鎖核酸選択的結合剤を用いて、温度変化に伴う該核酸の形態変化に相関するシグナルを得ることを特徴とする請求項1〜３のいずれかに記載の塩基配列判別方法。
【請求項５】
二重鎖核酸選択的結合剤がインターカーレータであることを特徴とする請求項４記載の塩基配列判別方法。
【請求項６】
有機溶媒が、ヘキサン、ベンゼン、トルエン、ジエチルエーテル、クロロホルム、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、塩化メチレン、アセトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ブタノール、プロパノール、エタノール、メタノール、高級アルコールアルコール類及びホルムアミドからなる群より選ばれたすくなくとも１種以上であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の塩基配列判別方法。
【請求項７】
使用される有機溶媒の終濃度が50％以下であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の塩基配列判別方法。
【請求項８】
試料中の核酸が遺伝子増幅産物であることを特徴とする請求項1〜７のいずれかに記載の塩基配列判別方法。
【請求項９】
遺伝子増幅産物が、特定核酸配列増幅用オリゴヌクレオチドを用いて増幅される核酸断片であり、塩基配列の有無に応じて増幅される核酸断片長が異なることを特徴とする請求項８記載の塩基配列判別方法。
【請求項１０】
遺伝子増幅産物を得る方法が、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＡ、ＴＭＡ、ＬＡＭＰ及びＩＣＡＮよりなる群から選ばれたいずれかの方法であることを特徴とする請求項８または９に記載の塩基配列判別方法。
【請求項１１】
鎖長がそれぞれ異なる一種以上の二重鎖構造を有する核酸を含有すると予想される試料と二重鎖核酸選択的結合剤と有機溶媒とを含む溶液の温度を変化させ、該二重鎖核酸選択的結合剤から得られるシグナルを測定して熱融解曲線を取得し、その熱融解曲線に基づいて該核酸の存在を決定する方法。
【請求項１２】
温度変化が温度上昇であることを特徴とする請求項1１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の塩基配列を判定する方法に関するものである。更に詳しくは、遺伝病の診断、塩基多型解析等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の塩基多型は、薬物に対する副作用および治療失敗の発生において個体間変動の原因として重要な役割を果たし、体質として知られる基礎代謝等の個人差の原因としても知られている。その上、これらは多数の疾患の遺伝マーカーとしての働きもする。それゆえ、これら突然変異の解明は臨床的に重要であり、ルーチンの表現型分類が臨床研究において特に推奨される（非特許文献１; 非特許文献２）。また、原因となる変異型遺伝子の同定に続くそれぞれの遺伝子型の検出用の核酸配列分析法が所望される。
【０００３】
従来の核酸配列分析技術としては、例えば核酸配列決定法（シークエンシング法）がある。核酸配列決定法は核酸配列中に含まれる塩基多型を検出、同定することができるが、鋳型核酸の調製、ＤＮＡポリメラーゼ反応、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、核酸配列の解析等を行うため多大な労力と時間が必要である。また近年の自動シークエンサーを用いることで省力化は行うことができるが、高価な装置が必要であるという問題がある。
【０００４】
一方、遺伝子の点突然変異により引き起こされる遺伝病が種々知られており、それらの中には、遺伝子のどの部位がどのように点突然変異することにより遺伝病が引き起こされるかわかっているものも少なくない。
【０００５】
このような予想される点突然変異を検出する方法として、従来、ＰＣＲ（polymerase chain reaction)法（特許文献１、特許文献２）などの遺伝子増幅法を利用した遺伝子の点突然変異の検出方法が知られている。増幅された遺伝子断片に対し、特定の核酸配列を切断する制限酵素により処理し、生じるフラグメントの大きさで判断する方法(PCR-RFLP)法が用いられている。同じくPCR法を用いた検出方法としては、使用するprimerの特異性を利用した Alelle specific amplification法が用いられる。この方法では、遺伝子増幅法に用いる一対のオリゴヌクレオチドのうちの一方のオリゴヌクレオチドとして、野生型遺伝子の増幅領域の端部領域に完全に相補的な野生型用オリゴヌクレオチドと、変異型遺伝子の増幅領域の端部領域に完全に相補的な変異型用オリゴヌクレオチドとを用いる。変異型のオリゴヌクレオチドは、その３’末端が予想される点突然変異を起こしたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドになっている。このような野生型及び変異型用オリゴヌクレオチドをそれぞれ別個に用いて試料遺伝子を遺伝子増幅法に供する。試料遺伝子が野生型であれば、野生型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には核酸の増幅が起きるが、変異型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には、オリゴヌクレオチドの３’末端が試料遺伝子の対応ヌクレオチドと相補的ではない（ミスマッチ）ので伸長反応が起きず、核酸の増幅は起きない。一方、試料遺伝子が変異型であれば、逆に、野生型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には増幅が起きず、変異型用オリゴヌクレオチドを用いた場合に増幅が起きる。従って、各オリゴヌクレオチドを用いた場合に増幅が起きるか否かを調べることにより、試料遺伝子が野生型か変異型かを判別することができ、それによって試料遺伝子中の点突然変異を同定することができる。この時増幅がおきたか否かを調べる方法として、増幅産物をアガロースゲル電気泳動した後、エチジウムブロマイド等の核酸特異的結合蛍光試薬を用いて染色の後、UV照射して増幅核酸の有無を検出できる。またほかの様式として、ナイロン膜上に増幅核酸を固定し、標識プローブを用いて検出するサザンブロット法、個体担体上に固定した補足プローブで捕捉した後検出プローブを作用させて検出するサンドイッチハイブリダイゼーション法などが開発されてきた。
【０００６】
また近年、核酸の増幅反応をリアルタイムに検出できる装置が開発されたことに伴い、検出したい核酸配列にプローブを結合させた後、一定時間温度上昇を行い、検出したい核酸配列とプローブとの結合の乖離していく状態を検出する方法を用いて塩基配列を判定する融解曲線解析法が開発された。本方法は核酸増幅の後、プローブを添加することで核酸配列を検出する方法である（特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８）。また蛍光標識されたprimerを用い、その蛍光強度の変化を検出する方法（特許文献９）既知の配列を有する核酸を添加することによって、試料の核酸配列を検出する方法（特許文献１０）など報告されている。
【０００７】
上記のような方法により増幅核酸を検出し、容易に多型を同定が行えるように思われるが、実際には、操作は煩雑であり、迅速かつ大量の試料を解析するためには、多大な労力を要するか大規模なラボオートメーションシステムを構築する必要がある。
【０００８】
たとえば電気泳動法によれば野生型及び多型型を別々に検出する必要があり、また泳動像から核酸量を正確に数値化することは困難である。またサザンブロット法やサンドイッチハイブリダイゼーション法ではプローブとのハイブリダイゼーション反応が必要であり、その条件を厳密に整える必要がある。更には過剰なプローブを除去する工程が必要であり、操作は非常に煩雑である。融解曲線解析法は電気泳動法、ハイブリ法の問題点を解決する方法であるが、プローブの添加、蛍光標識オリゴヌクレオチドの使用、既知配列のオリゴヌクレオチドの添加などが必要なため、操作性、経済性に問題があった。
【特許文献１】特公平４−６７９６０号公報
【特許文献２】特公平４−６７９５７号公報
【特許文献３】特開2005-110502
【特許文献４】特開2005-58114
【特許文献５】特開2005-58107
【特許文献６】特開2004-313121
【特許文献７】特開2004-313119
【特許文献８】特開2004-313120
【特許文献９】特開2004-33216
【特許文献１０】特開2001-299393
【非特許文献１】European Consensus Conference on Pharmacogenetics. Commission of the European Communities, Luxembourg、第８７〜９６頁、1990年,
【非特許文献２】Eur. J. Clin. Pharmacol、第３６巻、第５５１〜５５４頁、1989年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、上記のような課題を解決して、明確にかつ再現性よく核酸配列中の多型を検出することができる方法及びそのための試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究の結果、上記の従来法に対して、特定の核酸配列を含む試料溶液に該特定核酸配列増幅用オリゴヌクレオチドを用いて、増幅反応と同時およびまたは増幅反応後、その溶液の温度を上昇させながらその溶液の核酸濃度と相関するシグナルを測定して熱融解曲線を取得し、その熱融解曲線に基づいて前記二重鎖核酸の塩基配列の変異の有無を判断する方法において、有機溶媒を含有することにより簡便に塩基配列を判定することが可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。  
１．試料中の核酸の塩基配列の変異の有無を判断する方法において、該核酸と有機溶媒を含有する溶液の温度を変化させ、その温度変化に伴う該核酸の形態変化に相関するシグナルを測定し、該シグナルに基づいて該核酸中の塩基配列を判断することを特徴とする塩基配列判別方法。
２．温度変化が温度上昇であることを特徴とする1の塩基配列判別方法。
３．形態変化が、核酸の二重鎖構造から一重鎖構造への形態変化であることを特徴とする1または２の塩基配列判別方法。
４．少なくとも１種類の二重鎖核酸選択的結合剤を用いて、温度変化に伴う該核酸の形態変化に相関するシグナルを得ることを特徴とする1〜３のいずれかの塩基配列判別方法。
５．二重鎖核酸選択的結合剤がインターカーレータであることを特徴とする４の塩基配列判別方法。
６．有機溶媒が、ヘキサン、ベンゼン、トルエン、ジエチルエーテル、クロロホルム、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、塩化メチレン、アセトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ブタノール、プロパノール、エタノール、メタノール、高級アルコールアルコール類及びホルムアミドからなる群より選ばれたすくなくとも１種以上であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の塩基配列判別方法。
７．使用される有機溶媒の終濃度が50％以下であることを特徴とする１〜６のいずれかの塩基配列判別方法。
８．試料中の核酸が遺伝子増幅産物であることを特徴とする1〜７のいずれかの塩基配列判別方法。
９．遺伝子増幅産物が、特定核酸配列増幅用オリゴヌクレオチドを用いて増幅される核酸断片であり、塩基配列の有無に応じて増幅される核酸断片長が異なることを特徴とする８の塩基配列判別方法。
１０．遺伝子増幅産物を得る方法が、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＡ、ＴＭＡ、ＬＡＭＰ及びＩＣＡＮよりなる群から選ばれたいずれかの方法であることを特徴とする８または９の塩基配列判別方法。
１１．鎖長がそれぞれ異なる一種以上の二重鎖構造を有する核酸を含有すると予想される試料と二重鎖核酸選択的結合剤と有機溶媒とを含む溶液の温度を変化させ、該二重鎖核酸選択的結合剤から得られるシグナルを測定して熱融解曲線を取得し、その熱融解曲線に基づいて該核酸の存在を決定する方法。
１２．温度変化が温度上昇であることを特徴とする1１の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、試料核酸中の塩基多型を明確にまた簡便に検出できる方法が提供される。本発明の方法では、これまでの方法のように煩雑な操作を必要としないので、迅速で容易に再現性の良い結果を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。試料中に含まれる特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片は、目的の遺伝子の情報を担う塩基多型部位を含む標的核酸であれば、特に制限されない。該標的核酸の例としては、Alu配列、蛋白質をコードする遺伝子のエキソンやイントロン、プロモーターなどが例示できる。より具体的には、遺伝病を含む各種疾患、薬物代謝、生活習慣病（高血圧、糖尿病等）、薬物代謝酵素に関連する遺伝子が挙げられる。例えば、高血圧としてＡＣＥ(Angiotensin I Converting Enzyme)遺伝子、薬物代謝酵素としてCYP2C19（Cytochrome P450 2C19）が挙げられる。
【００１３】
本発明において、核酸配列を単に核酸ということがある。変異型核酸とは、野生型核酸のうち少なくとも１つ、好ましくは１つのヌクレオチドが点突然変異して他のヌクレオチドに置換されているものや、野生型核酸の一部に挿入、欠失配列等を含む核酸のことであり、どの部位のヌクレオチドが変異しているかが解明されているものである。このような塩基多型により体質等が異なっていることが解明されてきており、本発明の方法は試料中の核酸がこのような予想される変異を有しているか否かを検査する方法である。
【００１４】
本願発明の「二重鎖構造を有する核酸」とは、二重鎖の核酸を示すが、一重鎖の核酸であっても高次構造を形成し二重鎖部分を形成できる核酸であってもよい。
【００１５】
本発明に供される核酸は、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、ペプチド核酸(ＰＮＡ)、ロックド核酸（LNA）が用いられ、これらを組み合わせた核酸配列の検出にも応用できる。
【００１６】
本発明において、核酸配列増幅用オリゴヌクレオチドとは、検出対象としている核酸配列を既知の増幅方法であるＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＡ、ＴＭＡ、ＬＡＭＰおよびＩＣＡＮ法を用いて増幅するために使用するためのものであれば特に限定されない。
【００１７】
本発明において、特定核酸配列増幅用オリゴヌクレオチドとは、対象となる塩基多型部位を含む染色体又はその断片に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであって、既知の増幅方法であるＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＡ、ＴＭＡ、ＬＡＭＰおよびＩＣＡＮ法に使用できるものであれば特に限定されるものではない。
【００１８】
本発明に用いられる核酸配列増幅用オリゴヌクレオチドと特定核酸配列増幅用オリゴヌクレオチドの長さとしては通常使用される長さであれば構わない。10〜３５塩基であればよく、好ましくは、１1〜３０塩基である。さらに好ましくは15〜30塩基である。
【００１９】
本発明において、特定核酸配列増幅用オリゴヌクレオチドの伸長方法は、基本的には、従来の方法を用いて行うことができる。通常、一本鎖に変性させた特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼを共に、作用させることで、標的核酸を鋳型としてオリゴヌクレオチドが伸長する。
【００２０】
該伸長反応は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrookら、１９８９)に記載の方法に従って行うことができる。また、該オリゴヌクレオチドが伸長されたか否かによって塩基多型を検出する方法において、標的核酸が検出するのに十分な量が含まれていない場合、予め前記多型配列を含む核酸断片を以下に示す増幅反応によって、増幅しておくことも可能である。
【００２１】
本発明において、特定の塩基多型部位を含む染色体又は断片の増幅方法も、基本的には、従来の方法を用いて行うことができ、通常、一本鎖に変性させた特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼ及び特定核酸配列増幅用オリゴヌクレオチドを作用させることで、標的核酸を鋳型として用いたオリゴヌクレオチド間の配列が増幅される。
【００２２】
核酸増幅方法としては、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence-basedamplification method；Ｎａｔｕｒｅ 第３５０巻、第９１頁(1991)）、ＬＣＲ（国際公開８９／１２６９６号公報、特開平２−２９３４号公報）、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification：Nucleic acid research 第２０巻、第１６９１頁(1992)）、ＲＣＲ（国際公開９０／１０６９号公報）、ＴＭＡ（Transcription mediated amplification method；J.Clin.Microbiol. 第３１巻、第３２７０頁(1993)）ＬＡＭＰ（loop-mediated isothermal amplification method :J Clin Microbiol. 2004 第42巻:第1,956頁）、ＩＣＡＮ（isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids: Kekkaku. 2003 第78巻、第５３３頁）などが挙げられる。
【００２３】
なかでもＰＣＲ法は、試料核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のオリゴヌクレオチド及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより、上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれる試料核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である。すなわち、変性工程で試料の核酸を変性し、続くアニーリング工程において各オリゴヌクレオチドと、それぞれに相補的な一本鎖試料核酸上の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、各オリゴヌクレオチドを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各一本鎖試料核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ、二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２n倍に増幅される。増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在するので、電気泳動等の方法により容易に検出できる。よって、遺伝子増幅法を用いれば、従来では検出不可能であった、極めて微量（１分子でも可）の試料核酸をも検出することが可能であり、最近非常に広く用いられている技術である。
【００２４】
上記のような核酸増幅法を利用した方法では、反応後に多型部位を含む遺伝子断片が形成される。本発明に用いられる増幅された２本鎖の核酸の長さは特に限定はされないが、50ｂｐ以上500ｂｐ以下が好ましく用いられる。さらに好ましくは、50ｂｐ以上400ｂｐ以下、特に好ましくは100ｂｐ以上400ｂｐ以下がよい。
【００２５】
Allele specific primerは特定の核酸配列を特異的に増幅することが可能である。この性質を利用して、試料中に標的となる配列が存在する場合、Allele specific primerと対をなすprimerを用いた増幅産物を得ることができる。一方試料中に標的となる配列が存在しない場合、他のprimer対を用い、異なる増幅長を有する核酸断片を得ることも可能である。
【００２６】
本発明の重要な開示のひとつは、上記の方法により得られた核酸断片を、有機溶媒を含む溶液と混和後、その溶液の温度を上昇させながらその溶液の核酸濃度と相関するシグナルを測定して熱融解曲線を取得し、その熱融解曲線に基づいて前記二重鎖核酸の塩基配列を判断する方法である。あるいは、核酸断片を有機溶媒を含む溶液と混和後、その溶液の温度を95℃以上に上昇させた後、その温度を下降させながらその溶液の核酸濃度と相関するシグナルを測定して熱融解曲線を取得し、その熱融解曲線に基づいて前記二重鎖核酸の塩基配列を判断する方法である。
【００２７】
さらに、本発明の重要な開示のひとつは、鎖長がそれぞれことなる一種以上の二重鎖構造を有する核酸の存在を判別する方法である。具体的には、一種以上の二重鎖構造を有する核酸の混合物を、有機溶媒を含む溶液と混和後、その溶液の温度を上昇させながらその溶液の核酸濃度と相関するシグナルを測定して熱融解曲線を取得し、その熱融解曲線に基づいて前記二重鎖核酸の塩基配列を判断する方法である。あるいは、一種以上の二重鎖構造を有する核酸の混合物を、有機溶媒を含む溶液と混和後、その溶液の温度を95℃以上に上昇させた後、その温度を下降させながらその溶液の核酸濃度と相関するシグナルを測定して熱融解曲線を取得し、その熱融解曲線に基づいて前記二重鎖核酸の塩基配列を判断する方法である。本願発明によれば、二重鎖構造を有する核酸の鎖長により、得られるシグナルが得られる温度が異なるので、容易に二重鎖構造を有する核酸の存在を判別することが出来る。
【００２８】
ついで、本発明の重要な開示のひとつは、鎖長がそれぞれことなる一種以上の二重鎖構造を有する核酸の存在比を判別する方法である。上記に記載のように、本発明により得られる熱融解曲線は核酸濃度と相関する。従って、それぞれの二重鎖構造を有する核酸の存在比率をも判断できる。スタンダードカーブをあらかじめ用意するか、標準物質を試料中に内在させておけば、一度に複数の核酸量を決定することもできる。
【００２９】
本発明の「温度変化に伴う核酸の形態変化」とは、二重鎖から一重鎖への変化、又は一重鎖核酸の自己ハイブリダイズ状態から非自己ハイブリダイズ状態への変化である。若しくは、その逆の、一重鎖から二重鎖への変化、又は一重鎖核酸の非自己ハイブリダイズ状態から自己ハイブリダイズ状態への変化などを示す。自己ハイブリダイズ状態とは、一重鎖の核酸が高次構造を形成し、二重鎖部分を形成する状態をいう。非自己ハイブリダイズ状態とは、その高次構造がほどけて、二重鎖部分を形成しない状態をいう。
【００３０】
本発明における「温度変化」の様式は特に限定されないが、温度を一方的に上昇させる変化が好ましい。温度上昇速度は特に限定されるものではないが、０．００１℃／sec．以上１℃／sec．以下、好ましくは０．０１℃／sec．以上０．５℃／sec．以下、特に好ましくは０．０３℃／sec．以上０．０５℃／sec．以下がよい。
【００３１】
従来は、このような熱融解曲線を用いた解析方法において、標識されたオリゴヌクレオチドプローブを用いる必要があった。このオリゴヌクレオチドプローブの塩基配列を設計するためには多大な労力と試行錯誤が必要であるが、本発明記載の方法では、有機溶媒を添加するという極めて簡易な方法で目的を達成しうるものであり、これまでの知見からは容易に類推されるものではなかった。
【００３２】
上記で使用される有機溶媒は、無極性有機溶媒（ヘキサン、ベンゼン、トルエン、ジエチルエーテル、クロロホルム、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、塩化メチレン）非プロトン性極性有機溶媒（アセトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド）プロトン性極性有機溶媒（ブタノール、プロパノール、エタノール、メタノール、高級アルコール）等を用いることが可能である。好ましくはジメチルスルホキシド、メタノール、エタノール、プロパノール、ホルムアミドがよく、特に好ましくはジメチルスルホキシド、ホルムアミドがよい。
【００３３】
有機溶媒を反応系に添加した時の終濃度は、例えば、ジメチルスルホキシドを用いるならば、５０％以下であればよい。好ましくは5％以上50％以下、より好ましくは10％以上30％以下、特に好ましくは15％以上25%以下がよい。ここでは、例として、ジメチルスルホキシドを取り上げたが、特に限定されるものではない。
【００３４】
「温度変化に伴う該核酸の形態変化に相関するシグナル」を得るには、二重鎖核酸選択的結合剤をもちいるのがよい。これらの二重鎖核酸選択的結合剤であれば二重鎖を形成している核酸が存在すれば結合し、ある波長の光を照射することによって蛍光を発し、その蛍光シグナルを検出することによって、温度変化に伴う該核酸の形態変化に相関するシグナルを得やすくなる。
【００３５】
本発明の二重鎖核酸選択的結合剤とは、二重鎖核酸にインターカーレートする物質であれば特に限定されるものではないが、好適には、二重鎖核酸に選択的に結合し、蛍光を発するインターカーレータを用いることができる。前述のようなインターカーレータとしては、エチレンブロマイド、SYBR（商標出願中）GreenI、ＡＯ（アクリジンオレンジ）、ＹＯＹＯ−１、ＴＯＴＯ−１等を用いることができる。好ましくはＳＹＢＲ（商標出願中）ＧｒｅｅｎＩが用いられる。
【００３６】
核酸中の塩基配列を判断する方法としては、塩基配列の違いによって増幅される領域が変化するように、特定の塩基配列特異的なオリゴヌクレオチドが用いられる。具体的には一塩基の違いを識別できる塩基特異的なオリゴヌクレオチドＡとそれと対をなして増幅反応に用いられるオリゴヌクレオチドＢおよび塩基特異的なオリゴヌクレオチドと別の領域に相補的でかつオリゴヌクレオチドＢと対をなして増幅反応に用いられるオリゴヌクレオチドＣ、また必要に応じてオリゴヌクレオチドＣと対をなし塩基特異的なオリゴヌクレオチドＡと異なる塩基特異的なオリゴヌクレオチドＤを用いてもよい。これらのオリゴヌクレオチドＡとＢとＣ、またはＡとＢとＣとＤを用いて核酸配列を増幅した場合、オリゴヌクレオチドＡおよびＢを用いて得られる増幅断片長とオリゴヌクレオチドＣおよびＢ、またはオリゴヌクレオチドＣおよびＤを用いて得られる増幅断片長が異なるように、用いるオリゴヌクレオチドの位置を設定する。
【００３７】
一例をあげるならば、測定したい塩基配列が遺伝子増幅反応により得られる増幅産物の内部に含まれるように、オリゴヌクレオチドＢ（アンチセンスプライマー）とＣ（センスプライマー）を設計する。つづいて、測定したい塩基配列に対して一塩基の違いを識別できる塩基特異的なオリゴヌクレオチドＡ（センスプライマー）を設計する。オリゴヌクレオチドＡは、オリゴヌクレオチドＢとＣに挟まれるよう設計してもよい。オリゴヌクレオチドＡが伸張できるならばオリゴヌクレオチドＢと対をなし増幅産物を産生する。オリゴヌクレオチドＡとＢによる増幅産物が得られるか、オリゴヌクレオチドＢとＣによる増幅産物が得られるかにより塩基配列の違いを判別できる。オリゴヌクレオチドＡとＢによる増幅産物と、オリゴヌクレオチドＢとＣによる増幅産物の長さが異なるように設計してもよい。
必要であれば、塩基特異的なオリゴヌクレオチドＡと異なる塩基特異的なオリゴヌクレオチドＤ（アンチセンスプライマー）を測定したい塩基配列部位に設計してもよい。オリゴヌクレオチドＤは、オリゴヌクレオチドＢとＣに挟まれるよう設計してもよい。オリゴヌクレオチドＡとオリゴヌクレオチドＤの関係は、センスとアンチセンスの関係ではあるが、その全域にわたって相補的な関係である必要はない。それぞれの３’末端領域に測定したい塩基配列の位置が設定されていればよい。オリゴヌクレオチドＡとオリゴヌクレオチドＤは、測定したい塩基配列の位置において、異なる塩基への変異を測定できるように設計してもよい。オリゴヌクレオチドＡとＢによる増幅産物が得られるか、オリゴヌクレオチドＣとＤによる増幅産物が得られるか、オリゴヌクレオチドＢとＣによる増幅産物が得られるかにより塩基配列の違いを判別できる。オリゴヌクレオチドＡとＢによる増幅産物と、オリゴヌクレオチドＣとＤによる増幅産物、およびオリゴヌクレオチドＢとＣによる増幅産物の長さが異なるように設計してもよい。
【００３８】
このように得られる増幅産物の長さが核酸配列によって異なる場合、二重鎖核酸特異的に結合するインターカーレータと有機溶媒を添加し、融解曲線解析することによって、核酸配列を判断することが可能となる。このことは、これまでには報告されていなかったことであり、全く予想だにできないことであった。
【００３９】
キット
本発明において、キットとしては、少なくとも有機溶媒、および二重鎖核酸選択的結合剤を含んでいればよい。
有機溶媒は、無極性有機溶媒（ヘキサン、ベンゼン、トルエン、ジエチルエーテル、クロロホルム、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、塩化メチレン）非プロトン性極性有機溶媒（アセトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド）プロトン性極性有機溶媒（ブタノール、プロパノール、エタノール、メタノール、高級アルコール）等を用いることが可能である。
【００４０】
二重鎖核酸選択的結合剤は、エチレンブロマイド、SYBR（商標出願中）Green I、ＡＯ（アクリジンオレンジ）、ＹＯＹＯ−１、ＴＯＴＯ−１等を用いることができる。好ましくはＳＹＢＲ（商標出願中）ＧｒｅｅｎＩが用いられる。
【００４１】
増幅された核酸断片長が配列によって異なる場合、有機溶媒および二重鎖核酸選択的結合剤を含有する試薬と混合し、温度を上昇あるいは下降させながら二重鎖核酸の溶液中での形態と相関するシグナルを継続的に検出し融解曲線解析を行なう。好ましくは、温度を一方的に上昇させるのがよい。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００４３】
実施例１  CytochromeP450 2C19遺伝子の塩基多型 (681G→A)の検出
（１）CytochromeP450 2C19遺伝子の681番目の多型を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号1〜4に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ1〜4と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社OPCカラムにて実施した。もしくはDNA合成受託会社（（株）日本バイオサービス、オペロン、プロリゴ KK、アマシャムファルマシア バイオテク（株）等）に依頼した。オリゴ１とオリゴ2と組み合わせ、６８１Ａ検出用のオリゴヌクレオチドとして使用され、オリゴ3とオリゴ4と組み合わせて、６８１Ｇ検出用のオリゴヌクレオチドとして使用される。
【００４４】
（２）PCR法によるCytochromeP450遺伝子多型の解析
PCR法による増幅反応ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトCytochromeP4502C19遺伝子の塩基多型 (681G→A)を解析した。
【００４５】
（３）試薬の調製
以下の試薬を含む25μｌ溶液を調製した。
KOD DNAポリメラーゼ反応液：オリゴ１、２ 、3、４ 各5 pmol、×10緩衝液 2.5 μl、2mM dNTP 2.5μl、25 mM MgSO４ 1.0 μl、KOD DNAポリメラーゼ 0.4 Ｕ、抽出DNA溶液 100 ng
【００４６】
（４）増幅条件
94℃・2分、94℃・15秒、60℃・30秒、68℃30秒（35サイクル）68℃・2分。
【００４７】
（５）融解曲線解析
反応後のPCR溶液15μlにSYBR（商標出願中） GreenI(250倍希釈)2.5μlとDMSO2.5μl（またはホルムアミド、プロパノール）を添加しiCycler（BioRad社）を用いて融解曲線解析を行なった。比較例として、有機溶媒を使用しないで融解曲線解析を行なった。
解析条件  95℃・1min−55℃・1min−（0.5℃/10sec.）−95℃
【００４８】
DMSO(図１)、ホルムアミド（図２）、プロパノール（図３）を用いた場合、塩基配列がＧ/Ｇ、Ｇ/Ａ、A/Aと異なる試料によって、融解曲線解析グラフのピークの温度が異なることがわかる。このピークの温度によって塩基配列を判断できる。比較例として、有機溶媒を使用せず融解曲線解析を行なった場合（図４）、塩基配列が異なる試料によって得られる融解曲線解析グラフのピークの温度は同じであり、塩基配列を判断することはできなかった。
【００４９】
実施例2  CytochromeP450 2C19遺伝子の塩基多型 (636G→A)の検出
（1）CytochromeP450 2C19遺伝子の636番目の多型を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号5〜8に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ5〜8と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社OPCカラムにて実施した。もしくはDNA合成受託会社（（株）日本バイオサービス、オペロン、プロリゴ KK、アマシャムファルマシア バイオテク（株）等）に依頼した。オリゴ5とオリゴ6と組み合わせ、６３６Ａ検出用のオリゴヌクレオチドとして使用され、オリゴ7とオリゴ8と組み合わせて、６３６G検出用のオリゴヌクレオチドとして使用される。
【００５０】
（２）PCR法によるCytochromeP450遺伝子多型の解析
PCR法による増幅反応ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトCytochromeP4502C19遺伝子の塩基多型 (636G→A)を解析した。
【００５１】
（３）試薬の調製
以下の試薬を含む25μｌ溶液を調製した。
KOD DNAポリメラーゼ反応液：オリゴ5,8 2.5 pmoles、オリゴ6,7 5pmoles,×10緩衝液 2.5 μl、2mM dNTP 2.5μl、25 mM MgSO４ 1.0 μl、KOD DNAポリメラーゼ 0.4 Ｕ、抽出DNA溶液 100 ng
【００５２】
（４）増幅条件
94℃・2分、94℃・15秒、60℃・30秒、68℃30秒（35サイクル）68℃・2分。
【００５３】
（５）融解曲線解析
反応後のPCR溶液15μlにSYBR（商標出願中） GreenI(250倍希釈)2.5μlとDMSO2.5μl（またはホルムアミド、プロパノール）を添加しiCycler（BioRad社）を用いて融解曲線解析を行なった。
解析条件  95℃・1min−55℃・1min−（0.5℃/10sec.）−95℃
【００５４】
DMSO(図5)、を用いた場合、塩基配列がＧ/Ｇ、Ｇ/Ａ、A/Aと異なる試料によって、融解曲線解析グラフのピークの温度が異なることがわかる。このピークの温度によって塩基配列を判断できる。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明により、試料核酸中の塩基多型を明確にまた簡便に検出できる方法が提供される。本発明の方法では、これまでの方法のように煩雑な操作を必要としないので、迅速で容易に再現性の良い結果を得ることができることからも、産業界に大きく寄与することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】DMSOを用いたＣＹＰ２Ｃ１９*2の融解曲線解析
【図２】ホルムアミドを用いたＣＹＰ２Ｃ１９*２の融解曲線解析
【図３】プロパノールを用いたＣＹＰ２Ｃ１９*２の融解曲線解析
【図４】有機溶媒を用いないＣＹＰ２Ｃ１９*２融解曲線解析（比較例）
【図５】DMSOを用いたＣＹＰ２Ｃ１９*３の融解曲線解析
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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