(57)【要約】【課題】非還元マンノース残基を認識する抗体を提供すること。【解決手段】マンノトリオースとジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンとの還元アミノ化反応で合成した人工糖脂質であるMan3-DPPEを抗原として用いてヒトscFvを提示するファージ提示型ライブラリーをスクリーニングによって得られる、非還元マンノース残基を認識する抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）から（１４）の何れかに記載の抗体。
（１）重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列又は配列番号４に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
（２）重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列又は配列番号８に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
（３）重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号１０に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号１０に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
（４）重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号１４に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号１４に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列又は配列番号１６に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
（５）重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号２０に記載のアミノ酸配列又は配列番号２０に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
（６）重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号２２に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号２２に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号２４に記載のアミノ酸配列又は配列番号２４に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
（７）重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号２６に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号２６に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号２８に記載のアミノ酸配列又は配列番号２８に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
（８）重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号３０に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号３０に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号３２に記載のアミノ酸配列又は配列番号３２に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
（９）重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号３４に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号３４に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号３６に記載のアミノ酸配列又は配列番号３６に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
（１０）重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号３８に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号３８に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号４０に記載のアミノ酸配列又は配列番号４０に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
（１１）重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号４２に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号４２に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号４４に記載のアミノ酸配列又は配列番号４４に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
（１２）重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号４６に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号４６に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号４８に記載のアミノ酸配列又は配列番号４８に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
【請求項２】
請求項１に記載の抗体をコードする核酸。
【請求項３】
以下の何れかの核酸。
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号３に記載の塩基配列を含む核酸；
（２）配列表の配列番号５に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号７に記載の塩基配列を含む核酸；
（３）配列表の配列番号９に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号１１に記載の塩基配列を含む核酸；
（４）配列表の配列番号１３に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号１５に記載の塩基配列を含む核酸；
（５）配列表の配列番号１７に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号１９に記載の塩基配列を含む核酸；
（６）配列表の配列番号２１に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号２３に記載の塩基配列を含む核酸；
（７）配列表の配列番号２５に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号２７に記載の塩基配列を含む核酸；
（８）配列表の配列番号２９に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号３１に記載の塩基配列を含む核酸；
（９）配列表の配列番号３３に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号３５に記載の塩基配列を含む核酸；
（１０）配列表の配列番号３７に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号３９に記載の塩基配列を含む核酸；
（１１）配列表の配列番号４１に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号４３に記載の塩基配列を含む核酸；及び
（１２）配列表の配列番号４５に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号４７に記載の塩基配列を含む核酸；
【請求項４】
請求項３に記載の核酸を用いた抗体の生産方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法によって得ることができる、非還元マンノース残基を認識する組換え抗体。
【請求項６】
抗体が１本鎖抗体である請求項５に記載の組換え抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非還元マンノース残基を認識するファージ提示型単鎖抗体に関する。より詳細には、本発明は、ファージ提示型抗体ライブラリーのスクリーニングによって得られる非還元マンノース残基を認識する単鎖抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖類で免疫するとIgMの一次応答が誘発されることが多いことは広く知られているが、糖類の多くは自己抗原であるので応答が見られない場合もある（非特許文献１及び２）。ファージディスプレイ法は自己抗原に対する抗体を産生できるので、糖鎖部分に対する抗体を産生するための最適な方法であると考えられる。各種の糖鎖部分に対するモノクローナル抗体を産生する際、ハイブリドーマによる従来の手法は有効ではないことが既に証明されていることから、糖鎖に対する高い特異性と親和性を有する抗体フラグメントを、ファージディスプレイ法により単離できる可能性が注目を集めている。ファージディスプレイ法はタンパク質に対する抗体を産生するために主に用いられてきたが、糖鎖抗原にはほとんど利用されたことがない。プラスチックプレート上に糖鎖抗原を固定化することは困難なので、タンパク質抗原で一般的に用いられる方法を糖鎖抗原にそのまま適用することはできない。既報の研究では、糖タンパク質、ヘテログリカン、BSA結合糖鎖を抗原として用いて、ファージディスプレイ法により抗糖鎖単鎖抗体（scFv）を作製している（非特許文献１及び３〜７）。現在までに作製された抗糖鎖抗体の大部分は、モノクローナル抗体の場合はIgMクラスであり、scFvの場合であっても低親和性であったので、これらの抗体はin vivoの診断法や治療法には適さない。こ糖鎖抗原に対する低親和性は、糖鎖自体が持つ性質である可能性が最も高いので、これを克服するのは容易ではない可能性がある。抗体価を高めることによって抗糖鎖抗体の低い親和性を向上させる試みがなされてきた（非特許文献７〜１０）。多価のscFvでは糖鎖部分に対する親和性が高まることが示されている（非特許文献９〜１０）。
【０００３】
【非特許文献１】Deng, S., MacKenzie, C.R., Sadowaka, J., Michniewicz, J., Young, N.M., Bundle, D.R., and Narang, S.A. (1994) J. Biol. Chem. 269, 9533-9538.
【非特許文献２】MacKenzie, C.R., Hirama. T., Deng, S., Bundle, D.R., Narang, S.A., and Young, N.M. (1996) J. Biol. Chem. 271, 1527-1533.
【非特許文献３】Babino, A., Pritsch, O., Oppezzo, P., Du Pasquier, R., Roseto, A., Osinaga, E., and Alzari, P.M. (1997) Hybridoma 16, 317-324.
【非特許文献４】van Kuppevelt, T.H., Dennissen, M.A.B.A., van Venrooij, W.J., Hoet, R.M.A., and Veerkamp, J.H. (1998) J. Biol. Chem. 273, 12960-12966.
【非特許文献５】Mao, S., Gao, C., Lo, C.-H. L., Wirsching, P., Wong, C.-H., and Janda K.D. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 6953-6958.
【非特許文献６】Lee, K.J., Mao. S., Sun, C., Gao, C., Blixt, O., Arrues, S., Hom. L.G., Kaufmann, G.F., Hoffman, T.Z., Coyle, A.R., Paulson, J., Felding-Habermann, B., and Janda, K.D. (2002) J. Am. Chem. Soc. 124, 12439-12446.
【非特許文献７】Ravn, P., Danielczyk, A., Jensen, K.B., Kristensen, P., Christensen, P.A., Larsen, M., Karsten, U., and Goletz, S. (2004) J. Mol. Biol. 343, 985-996
【非特許文献８】Deng, S., MacKenzie, C.R., Hirama, T., Brousseau, R., Lowary, T.L., Young, N.M., Bundle, D.R., and Narang, S.A. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 4992-4996.
【非特許文献９】MacKenzie, R. and To, R. (1998) J. Immunol. Mothods 220, 39-49.
【非特許文献１０】Zhang, J., Tanha, J., Hirama, T., To, N.H.K.R., Tong-Sevinc, H., Stone, E., Brisson, J.-R., and MacKenzie, C.R. (2004) J. Mol. Biol. 345, 49-56.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、非還元マンノース残基を認識する抗体、並びに当該抗体をコードする核酸を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らはファージディスプレイ法を改良し、人工糖脂質（Stoll, M. S., Mizuochi, T., Childs, R. A., and Feizi, T. (1988) J. Biochem. 256, 661-665；Kenjo, A., Takahashi, M., Matsushita, M., Endo, Y., Nakata, M., Mizuochi, T., and Fujita, T. (2001) J. Biol. Chem. 276, 19959-19965；及びShimizu, Y., Nakata, M., Matsunuma, J., and Mizuochi, T. (2001) J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 754, 127-133）を抗原として用いてヒトscFvを作製した。脂質アンカーを介して可溶性糖鎖抗原をプラスチック製タイタープレート上に固定化し、パニングとELISA法でのスクリーニングによって各糖鎖抗原に対する有望なファージ抗体を単離することが可能である。本発明は、上記目的を達成するために、30種類以上の人工糖脂質を合成した。
【０００６】
本発明者らは、各種糖鎖部分に対する一群のscFvを作製する方法を確立するために、1011種類以上のヒトscFvを提示するファージ提示型ライブラリー（Sblattero, D. and Bradbury, A. (2000) Nat. Biotechnol. 18, 76-80）のスクリーニングを行った。本発明では、マンノトリオース（Man3）とジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（DPPE）から既報の還元アミノ化反応（Stoll, M. S., Mizuochi, T., Childs, R. A., and Feizi, T. (1988) J. Biochem. 256, 661-665；Kenjo, A., Takahashi, M., Matsushita, M., Endo, Y., Nakata, M., Mizuochi, T., and Fujita, T. (2001) J. Biol. Chem. 276, 19959-19965；及びShimizu, Y., Nakata, M., Matsunuma, J., and Mizuochi, T. (2001) J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 754, 127-133）に従って合成した人工糖脂質であるMan3-DPPEをモデル抗原として用いた。TLC-overlay法と表面プラズモン共鳴法による陽性ファージクローンの解析から、非還元末端にマンノース残基を持つ人工糖脂質にこれらのファージ抗体クローンが結合することが明らかになった。また、ファージ抗体は高マンノース型オリゴ糖を持つRNase Bには結合したが、複合型オリゴ糖とO-結合型オリゴ糖を持つフェツインには結合しなかった。さらに、各ファージが産生するscFvの１回目の解析では、非還元マンノース残基に対して高い親和性と特異性を有することも示された。従って、各種糖鎖抗原に対するヒトscFvの作製においては、ファージディスプレイ法が有効であることが示された。
【０００７】
即ち、本発明によれば、以下の（１）から（１４）の何れかに記載の抗体が提供される。
（１）重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列又は配列番号４に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
（２）重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列又は配列番号８に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
（３）重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号１０に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号１０に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
（４）重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号１４に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号１４に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列又は配列番号１６に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
（５）重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号２０に記載のアミノ酸配列又は配列番号２０に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
（６）重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号２２に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号２２に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号２４に記載のアミノ酸配列又は配列番号２４に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
（７）重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号２６に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号２６に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号２８に記載のアミノ酸配列又は配列番号２８に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
（８）重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号３０に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号３０に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号３２に記載のアミノ酸配列又は配列番号３２に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
（９）重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号３４に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号３４に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号３６に記載のアミノ酸配列又は配列番号３６に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
（１０）重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号３８に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号３８に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号４０に記載のアミノ酸配列又は配列番号４０に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
（１１）重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号４２に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号４２に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号４４に記載のアミノ酸配列又は配列番号４４に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
（１２）重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号４６に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号４６に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号４８に記載のアミノ酸配列又は配列番号４８に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含む、非還元マンノース残基を認識する抗体。
【０００８】
本発明の別の側面によれば、上記した本発明の抗体をコードする核酸が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、以下の何れかの核酸が提供される。
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号３に記載の塩基配列を含む核酸；
（２）配列表の配列番号５に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号７に記載の塩基配列を含む核酸；
（３）配列表の配列番号９に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号１１に記載の塩基配列を含む核酸；
（４）配列表の配列番号１３に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号１５に記載の塩基配列を含む核酸；
（５）配列表の配列番号１７に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号１９に記載の塩基配列を含む核酸；
（６）配列表の配列番号２１に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号２３に記載の塩基配列を含む核酸；
（７）配列表の配列番号２５に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号２７に記載の塩基配列を含む核酸；
（８）配列表の配列番号２９に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号３１に記載の塩基配列を含む核酸；
（９）配列表の配列番号３３に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号３５に記載の塩基配列を含む核酸；
（１０）配列表の配列番号３７に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号３９に記載の塩基配列を含む核酸；
（１１）配列表の配列番号４１に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号４３に記載の塩基配列を含む核酸；及び
（１２）配列表の配列番号４５に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号４７に記載の塩基配列を含む核酸；
【０００９】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の核酸を用いた抗体の生産方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記方法によって得ることができる、非還元マンノース残基を認識する組換え抗体が提供される。好ましくは、抗体は１本鎖抗体である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、非還元マンノース残基を認識する抗体、並びに該抗体をコードする核酸が提供される。本発明の抗体は、個体が認識できない糖鎖抗原を含む各種糖鎖に特異的かつ高親和性で結合することができる。さらに本発明の単鎖抗体を遺伝子操作することにより、改良型の単鎖抗体を作製することも可能であり、単鎖抗体の量産も容易である。また、本発明で得られた抗体の遺伝子操作によりトキシンや酵素などのタンパク質の糖鎖特異的デリバリーも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態についてより具体的に説明する。
本発明の抗体は、非還元マンノース残基を認識する抗体である。以下の実施例に記載した通り本発明の抗体は、マンノトリオース（Man3）とジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（DPPE）から還元アミノ化反応で合成した人工糖脂質であるMan3-DPPEをモデル抗原として用いて、ヒトscFvのファージ提示型ライブラリーのスクリーニングすることによって取得されたものである。陽性ファージクローンをTLC-overlay法と表面プラズモン共鳴法で解析した結果、本発明の抗体は、非還元末端にマンノース残基を持つ人工糖脂質に結合することが実証された。
【００１２】
本発明でスクリーニングの際に抗原として用いる糖脂質としては、非還元末端にマンノース残基を持つ人工糖脂質であれば特に限定されないが、オリゴ糖が好ましい。
【００１３】
オリゴ糖中で、各構成糖は、α１→２結合、α１→３結合、α１→４結合、α１→６結合またはβ１→４結合等あるいはこれらの組み合わせにより結合したものである。例えば、マンノースは上記の結合により直鎖を構成してもよく、又はα１→３結合、α１→６結合との組み合わせにより分岐構造をとってもよい。オリゴ糖中の単糖の数は、好ましくは２から１１個である。
【００１４】
具体的なオリゴ糖として、例えばマンノビオース（Ｍan２）、マンノトリオース（Ｍan３）、マンノテトラオース（Ｍan４）、マンノペンタオース（Ｍan５）、マンノヘキサオース（Ｍan６）、マンノヘプタオース（Ｍan７）などを挙げることができる。
【００１５】
これらのオリゴ糖は、還元末端アルデヒド基を有する。そこで、このアルデヒド基を、オリゴ糖を固定化するための手段として使用することができる。すなわち、このアルデヒド基とアミノ基を有する脂質との間に反応によりシッフ塩基を形成し、次にこのシッフ塩基を常法に従って還元、好ましくは化学還元、例えばＮａＢＨ3ＣＮによりオリゴ糖と脂質とを結合することができる。
【００１６】
上記のアミノ基を有する脂質は、好ましくはアミノ基を有するリン脂質であり、例えばジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）等を使用することができる。上記のようにして得られたオリゴ糖と脂質との結合物を本発明においては人工糖脂質と称する場合がある。本発明で用いる糖脂質は、上記したような人工糖脂質が好ましい。
【００１７】
抗原となる人工糖脂質を溶解する溶剤は特に限定しないが、クロロホルム／メタノール／水（１０：１０：３、体積比）に溶解後、さらにメタノールで、例えば４０μｇ／ｍｌに希釈することが望ましい。この溶液を、例えば９６ウェルプラスチックプレート（平底）に加えて風乾させ、人工糖脂質をウェルに固定化させる。このウェルをブロッキングし、洗浄する。かかる操作で人工糖脂質をコートしたプレートを、抗原コートプレートとして用いることができる。
【００１８】
緩衝液にはトリス緩衝生理食塩水（以下、ＴＢＳという）を用いることが望ましい。また、ブロッキング用溶液としては例えば３％ウシ血清アルブミンを含むＴＢＳ（以下、３％ＢＳＡ／ＴＢＳという）が、洗浄溶液としては例えば０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（以下、ＴＢＳ−Ｔという）が望ましい。
【００１９】
ファージ提示型抗体は、公知の方法により作製することができる（Ｍａｒｋｓ  ＪＤほか、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２巻５８１−５９７頁、１９９１年；Ｎｉｓｓｉｍ  Ａほか、ＥＭＢＯ  Ｊ．１３巻６９２−６９８頁、１９９４年；高柳淳・奥井理予・清水信義、超レパートリー人工抗体ライブラリ、出願番号  特願２００１−３５８６０２（国際公開番号ＷＯ０３／０４４１９号））。
【００２０】
ファージ提示型抗体ライブラリーは、繊維状ファージのコートタンパク質に抗体を融合させることにより、ファージの表面上に抗体を提示（ディスプレイ）するシステムを応用したものである。具体的には、抗体遺伝子をＰＣＲで増幅して多種類の抗体遺伝子を含むライブラリーを作製し、これをファージ上に提示させることによってファージディスプレイライブラリーとすることができる。以下に、ファージ提示型単鎖抗体の作製方法の具体例を示すが、これに限定されるものではない。
【００２１】
ヒト末梢血および脾臓ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてイムノグロブリン遺伝子のＶＨ又はＶＬ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをそれぞれＰＣＲ法により増幅する。それらを混合し鋳型として、ＰＣＲ法によりＶＨ又はＶＬ領域を増幅する。増幅したこれらのＤＮＡ断片をそれぞれ非発現型ファージミドベクターに組込み、ＶＨライブラリーとＶＬライブラリーを作製する。これらの大腸菌ＶＨライブラリーとＶＬライブラリーに、ヘルパーファージを感染させ、ファージライブラリーに変換する。これらファージ型ＶＨおよびＶＬライブラリーをＣｒｅ組換え酵素を発現する大腸菌に共感染させ、大腸菌内でＶＨ・ＶＬベクター間で組換え反応を行う。この大腸菌にＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージを感染させ、完全長一本鎖抗体を発現するファージを生成させることができる。これらのファージに混入している非組換え体を取り除くため、このファージを多重感染が起こらないように大腸菌に感染させ、さらにヘルパーファージを重感染させ、アンピシリン・カナマシン・クロラムフェニコールを含みグルコースを含まない培地で２５℃で培養する。これにより上清中に組換え一本鎖抗体を発現するファージを得ることができる。上清中のファージをポリエチレングリコールで沈殿し、再懸濁し、１０の１１乗以上のレパートリーを有する人工抗体ライブラリーを得ることができる。
【００２２】
さらに目的の糖結合性を有するファージ提示型抗体は、上記方法により作製したヒト型一本鎖ファージライブラリーから、当該糖鎖構造を有する人工糖脂質に対する結合能を指標にして選択的に回収することができる。この操作をパニングと称する場合がある。
【００２３】
パニングを繰り返して得られたファージ提示型抗体の糖結合性を解析する方法としては、例えば以下に述べるＥＬＩＳＡ法を応用して解析することが、多数のファージクローン試料について同時解析できる上で望ましい。すなわち、９６ウェルプラスチックプレートに糖鎖を固定化し、ファージ提示型抗体の非特異的吸着をなくすため、例えば３％ＢＳＡを含む緩衝液でブロッキングする。これに、緩衝液で適切な濃度に調製したファージ提示型抗体の懸濁液を加え、十分に反応させた後（例えば、３７℃で２時間）、緩衝液で洗浄する。
【００２４】
糖鎖に結合したファージ提示型抗体を検出・定量するため、検出に適切な物質で標識されている抗ファージ抗体の水溶液を反応させ、緩衝液で洗浄後、標識物質の検出に最適な手法で検出・定量する。このとき、抗ファージ抗体の標識物質は特に制限されないが、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼでの標識が、簡便さの点で望ましい。また、検出に用いる検出器も特に制限されないが、例えばＥＬＩＳＡに適したプレートリーダーを用いることが望ましい。
【００２５】
本発明でいう抗体とは、通常生体内に存在する形の抗体の他に、抗体のH鎖もしくはL鎖の可変領域もしくはその組み合わせで形成される抗原結合部位を少なくとも1つ含むペプチド、1組のH鎖断片とL鎖断片からなるFab、2組のH鎖断片とL鎖断片からなるF(ab')2、H鎖断片とL鎖断片が同一ペプチドに直列に結合した一本鎖抗体（以下「scFv」ということもある）なども含まれる。本発明の抗体は、全長Ｈ鎖と全長Ｌ鎖の2対の組み合わせから構成される、通常生体内に存在する形の全長抗体でもよい。
【００２６】
なお、本発明におけるＦ（ａｂ'）2及びＦａｂとは、イムノグロブリンを、蛋白分解酵素であるペプシンあるいはパパイン等で処理することにより製造され、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の前後で消化されて生成される抗体フラグメントを意味する。例えば、ＩｇＧ１をパパインで処理すると、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の上流で切断されてＶL（Ｌ鎖可変領域）とＣL（Ｌ鎖定常領域）からなるＬ鎖、及びＶH（Ｈ鎖可変領域）とＣHγ1（Ｈ鎖定常領域中のγ1領域）とからなるＨ鎖フラグメントがＣ末端領域でジスルフィド結合により結合した相同な２つの抗体フラグメントを製造することができる。これら２つの相同な抗体フラグメントを各々Ｆａｂ'という。またＩｇＧをペプシンで処理すると、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の下流で切断されて前記２つのＦａｂ'がヒンジ領域でつながったものよりやや大きい抗体フラグメントを製造することができる。この抗体フラグメントをＦ（ａｂ'）2という。
【００２７】
通常の抗体は大小二種類のポリペプチドからなり、大きい方のサブユニットを「H鎖」（重鎖）、小さい方のサブユニットを「L鎖」（軽鎖）という。また、それぞれのペプチドはN末端側に存在して抗原結合部位を形成する「可変領域」と抗体のクラス別に一定の「定常領域」から構成されている。可変領域はさらに特に抗原結合部位の形成に密接に関与している相補性決定領域「CDR」とその間に存在する「フレームワーク」に分けられる。CDRにはH鎖とL鎖のそれぞれについてN末端側から「CDR1」、「CDR2」、「CDR3」と呼ばれる3つの領域があることが知られている。
【００２８】
本発明の一本鎖抗体は、pSE380プラスミド（インビトロジェン社）やpET24d(+)プラスミド（ノバジェン社）などの誘導性のベクターと宿主となる菌体を適宜選択することによって調製することができる。また、本発明の抗体の生産においては、上述の方法の他、動物細胞発現系、昆虫細胞発現系、酵母細胞発現系を用いることもできる。H鎖およびL鎖を結合するリンカーも当業者であれば適宜選択することができる。
【００２９】
配列表の配列番号１から４８には、以下に示す通り、本発明の抗体の重鎖と軽鎖の塩基配列とアミノ酸配列を示した。これらのアミノ酸配列において、糖脂質の非還元マンノース残基を認識する抗体が得られる限りは、１もしくは数個（好ましくは１〜８個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個程度）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含むものも本発明の範囲に含まれる。下記の配列表に示す塩基配列を有する核酸は、本明細書の実施例に記載した手法により取得してもよいし、あるいはＤＮＡ合成装置を用いて化学的に合成することもできる。また、下記の配列表に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列についても、ＰＣＲなどを含む通常の遺伝子組み換え技術、又はＤＮＡ合成装置を用いた化学合成により当業者であれば容易に取得することができる。
【００３０】
配列番号１：抗体Ｍ３−２の重鎖の可変領域の塩基配列
配列番号２：抗体Ｍ３−２の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号３：抗体Ｍ３−２の軽鎖の可変領域の塩基配列
配列番号４：抗体Ｍ３−２の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
【００３１】
配列番号５：抗体Ｍ３−４の重鎖の可変領域の塩基配列
配列番号６：抗体Ｍ３−４の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号７：抗体Ｍ３−４の軽鎖の可変領域の塩基配列
配列番号８：抗体Ｍ３−４の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
【００３２】
配列番号９：抗体Ｍ３−５の重鎖の可変領域の塩基配列
配列番号１０：抗体Ｍ３−５の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号１１：抗体Ｍ３−５の軽鎖の可変領域の塩基配列
配列番号１２：抗体Ｍ３−５の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
【００３３】
配列番号１３：抗体Ｍ３−６の重鎖の可変領域の塩基配列
配列番号１４：抗体Ｍ３−６の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号１５：抗体Ｍ３−６の軽鎖の可変領域の塩基配列
配列番号１６：抗体Ｍ３−６の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
【００３４】
配列番号１７：抗体Ｍ３−７の重鎖の可変領域の塩基配列
配列番号１８：抗体Ｍ３−７の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号１９：抗体Ｍ３−７の軽鎖の可変領域の塩基配列
配列番号２０：抗体Ｍ３−７の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
【００３５】
配列番号２１：抗体Ｍ３−８の重鎖の可変領域の塩基配列
配列番号２２：抗体Ｍ３−８の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２３：抗体Ｍ３−８の軽鎖の可変領域の塩基配列
配列番号２４：抗体Ｍ３−８の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
【００３６】
配列番号２５：抗体Ｍ３−９の重鎖の可変領域の塩基配列
配列番号２６：抗体Ｍ３−９の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２７：抗体Ｍ３−９の軽鎖の可変領域の塩基配列
配列番号２８：抗体Ｍ３−９の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
【００３７】
配列番号２９：抗体Ｍ３−１０の重鎖の可変領域の塩基配列
配列番号３０：抗体Ｍ３−１０の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号３１：抗体Ｍ３−１０の軽鎖の可変領域の塩基配列
配列番号３２：抗体Ｍ３−１０の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
【００３８】
配列番号３３：抗体Ｍ３−１１の重鎖の可変領域の塩基配列
配列番号３４：抗体Ｍ３−１１の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号３５：抗体Ｍ３−１１の軽鎖の可変領域の塩基配列
配列番号３６：抗体Ｍ３−１１の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
【００３９】
配列番号３７：抗体Ｍ３−１２の重鎖の可変領域の塩基配列
配列番号３８：抗体Ｍ３−１２の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号３９：抗体Ｍ３−１２の軽鎖の可変領域の塩基配列
配列番号４０：抗体Ｍ３−１２の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
【００４０】
配列番号４１：抗体Ｍ３−１３の重鎖の可変領域の塩基配列
配列番号４２：抗体Ｍ３−１３の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号４３：抗体Ｍ３−１３の軽鎖の可変領域の塩基配列
配列番号４４：抗体Ｍ３−１３の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
【００４１】
配列番号４５：抗体Ｍ３−１４の重鎖の可変領域の塩基配列
配列番号４６：抗体Ｍ３−１４の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号４７：抗体Ｍ３−１４の軽鎖の可変領域の塩基配列
配列番号４８：抗体Ｍ３−１４の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
【００４２】
さらに、scFvから通常生体内にある形の抗体を作製することが可能である。一例を挙げると、scFvのプラスミドからH鎖およびL鎖の可変領域部分のみをPCR法にて増幅する。それぞれの断片は、例えば、ヒトの抗体のH鎖遺伝子及び/またはL鎖遺伝子を有するプラスミドに組み換えて、上記scFv上にある可変領域を持つ通常生体内にある形の抗体にすることが可能である。具体的には、例えば、プラスミドからH鎖およびL鎖の可変領域を増幅するとき得られる遺伝子断片の両端に、適当な制限酵素切断部位を入れておいて、ヒト抗体のH鎖及び/またはL鎖を有するプラスミド上の適当な制限酵素切断部位と組み合わせて、フレームシフトが起こらないように可変領域の遺伝子を入れ替える。このような方法によりプラスミド上にあった可変領域の配列をそのまま持つ通常生体内にある形の抗体を作ることは可能である。この抗体からさらに、抗体のH鎖もしくはL鎖の可変領域もしくはその組み合わせで形成される抗原結合部位を少なくとも1つ含むペプチド、1組のH鎖断片とL鎖断片からなるFab、2組のH鎖断片とL鎖断片からなる(Fab'2)を作ることも可能である。
【００４３】
本発明の抗体の発現には、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等を用いることができる。例えば、COS細胞やCHO細胞にて抗体を発現させるときにはpCDNA3.1(+)やpMAMneo（CLONETECH社）等を使用することが可能である。例えば、上記の手法で取得した抗体のH鎖の遺伝子をpCDNA3.1(+)のマルチクローニングサイトに、L鎖の遺伝子をpMAMneoにそれぞれ組み込む。その上でH鎖の組み込まれたベクターの適当なサイトにプロモーターとpolyAの間にL鎖の遺伝子がある発現ユニットを組み込む。このベクターをCOS細胞やCHO-K1、またはCHO DG44に遺伝子工学の定法にて導入することにより目的の抗体の生産を行うことができる。さらに、上記作製したベクターに例えばpSV2/DHFR(Nature,1981.Vol.294,Lee F. et al.,)からDHFR遺伝子の発現ユニットを切り出し、H鎖とL鎖を発現するベクターに組み込む。このベクターをCHO DG44に遺伝子工学の定法にて遺伝子導入する。これにより選択した細胞はMTXを用いたDHFR遺伝子増幅系を使用することにより抗体の生産性を大幅に上昇させることが可能である。
【００４４】
COS細胞やCHO細胞などの動物細胞は、通常10%ウシ胎児血清(FBS)を加えたDulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)を用い、5%CO2存在下37℃で培養することができる。COS細胞への遺伝子導入法は電気穿孔法の他、DEAEデキストラン法、lipofectin等のトランスフェクション試薬を用いた方法で行うことができる。
【００４５】
本発明の抗体の生産時には、血清由来のウシ抗体の混入を避けるために、無血清の培地にて培養することが望ましい。無血清培地に馴化していないCOSおよびCHOの血清培地で培養している細胞については、血清を入れていないDMEMによって培養することが望ましい。こうして培養上清中に得られた本発明の抗体は、例えばプロテインAカラムやプロテインGカラムを用いる一般的なIgG抗体の精製法によって容易に精製することが可能である。
【００４６】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。本明細書で使用する略号は次の通りである：Fv、抗体可変領域；scFv、単鎖抗体可変領域；Ab、抗体；mAb、モノクローナル抗体；BSA、ウシ血清アルブミン；IGF、インスリン様増殖因子；Man1、マンノース；Man2、マンノビオース（Manα1-6Man）；Man3、マンノトリオース［Manα1-6（Manα1-3）Man］；Man5、マンノペンタオース［Manα1-6（Manα1-3）Manα1-6（Manα1-3）Man］；GN2Man3、GlcNAcβ1-2Manα1-6（GlcNAcβ1-2Manα1-3）Man；GN2、ジ-N-アセチルキトビオース（GlcNAcβ1-4GlcNAc）；FG、Fucα1-2Gal；LNT、ラクト-N-テトラオース（Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc）；HRP、西洋ワサビペルオキシダーゼ
【実施例】
【００４７】
（Ａ）材料と方法
（１）材料
Escherichia coli株は、Invitrogen社（カリフォルニア州、カールズバッド）のサプレッサー変異株TG1と非サプレッサー変異株TOP10F'を使用した。ヘルパーファージM13KO7はAmersham Biotech社（英国）から入手した。ウシ血清アルブミン（BSA）、フェツイン、アシアロフェツイン、RNase A、RNase B、DPPE、およびジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）は、Sigma-Aldrich社（ミズーリ州、セントルイス）から購入した。マンノース（Man1）、マンノビオース（Man2；Manα1-6Man）、マンノトリオース（Man3；Manα1-6（Manα1-3）Man）、マンノペンタオース（Man5；Manα1-6（Manα1-3）Manα1-6（Manα1-3）Man）、ジ-N-アセチルキトビオース（GN2；GlcNAcβ1-4GlcNAc）、ラクト−N−テトラオース（LNT；Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc）、Fucα1-2Gal（FG）、GlcNAcβ1-2Manα1-6（GlcNAcβ1-2Manα1-3）Man（GN2Man3）、Man1-BSA、およびMan3-BSAは、Dextra Laboratories社（英国、レディング）から入手した。Glucose-sp-Biotin、Man3-sp-Biotin、Lewis b-sp-Biotinは、GlycoTech社（メリーランド州、ゲイサーズバーグ）から入手した。ABTS/H2O2はRoche Diagnostics社（ドイツ、マンハイム）から入手した。酒石酸は和光純薬（日本、大阪）から入手した。抗M13抗体はAmersham Biosciences社（ニュージャージー州、ピスカタウェイ）とExhalpha Biologicals社（マサチューセッツ州、ウォータータウン）から購入した。抗インスリン様増殖因子-I（IGF-I）受容体scFvファージ抗体は、1H7 mAb由来のscFv（Li, S.-L., Liang, S.-J., Guo, N., Wu, A. M., Fujita-Yamaguchi, Y. (2000) Cancer Immunol. Immunother. 49, 243-252）から、Amersham Bioscience社のExpression Module/Recombinant Phage Antibody Systemを用いて調製した。
【００４８】
（２）人工糖脂質の調製
人工糖脂質は、糖類（Man1、Man2、Man3、Man5、GN2、LNT、FG、またはGN2Man3）とDPPEから、既報の方法（Stoll, M. S., Mizuochi, T., Childs, R. A., and Feizi, T. (1988) J. Biochem. 256, 661-665；Kenjo, A., Takahashi, M., Matsushita, M., Endo, Y., Nakata, M., Mizuochi, T., and Fujita, T. (2001) J. Biol. Chem. 276, 19959-19965；及びShimizu, Y., Nakata, M., Matsunuma, J., and Mizuochi, T. (2001) J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 754, 127-133）に従って還元アミノ化反応により合成した。反応図を図１Ａに示す。各糖類（1〜2mg）を含む水溶液60μlにDPPE 9.4mgを含むクロロホルム／メタノール（1：1、体積比）溶液940μl、水素化シアノホウ素ナトリウム4mgを含むメタノール溶液200μlを加えて混合した。時々超音波を当てながら80℃で5時間反応させた。反応混合物中の人工糖脂質は、既報の方法（Shimizu, Y., Nakata, M., Matsunuma, J., and Mizuochi, T. (2001) J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 754, 127-133）に従って、シリカゲルカラムShim-pack PREP-SIL（島津製作所製、日本、京都）を用いたHPLCと、カートリッジカラムBond Elut C18（Varian社製、カリフォルニア州、ハーバーシティ）を用いた逆相クロマトグラフィーにより精製した。各人工糖脂質の純度と構造は、TLCとMALDI-TOF質量分析法で確認した。
【００４９】
（３）ファージライブラリーの構築
一次ファージライブラリーの構築に使用したcDNA、PCR増幅、並びにVH及びVL遺伝子レパートリーのクローニング
PCRの鋳型としては、BioChain社（カリフォルニア州、ヘイワード）のヒト脾臓cDNAとBD Biosciences社（カリフォルニア州、パロアルト）のヒト白血球cDNAを購入して使用した。既に発表されている情報に基づいて（Sbalattero, D. & Bradbury, A. (1998) Immunotechnology 3, 271-278）、この遺伝子ファミリーに共通の配列を有する適切なリバースプライマーとフォワードプライマーの等モル混合物を用いて、ヒト免疫グロブリン可変領域をPCRで増幅した。
【００５０】
5'-プライマー：
VHf1   AGCGCGGCCtctagaCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCSG（配列番号４９）
VHf2   AGCGCGGCCtctagaCAGGTACAGCTGCAGCAGTCA（配列番号５０）
VHf3   AGCGCGGCCtctagaCAGGTGCAGCTACAGCAGTGGG（配列番号５１）
VHf4   AGCGCGGCCtctagaGAGGTGCAGCTGKTGGAGWCY（配列番号５２）
VHf5   AGCGCGGCCtctagaCAGGTCCAGCTKGTRGAGTCTGG（配列番号５３）
VHf6   AGCGCGGCCtctagaCAGRTCACCTTGAAGGAGTCTG（配列番号５４）
VHf7   AGCGCGGCCtctagaCAGGTGCAGCTGGTGSARTCTGG（配列番号５５）
Vkf1   GACATCCRGDTGACCCAGTCTCC（配列番号５６）
Vkf2   GAAATTGTRWTGACRCAGTCTCC（配列番号５７）
Vkf3   GATATTGTGMTGACBCAGWCTCC（配列番号５８）
Vkf4   GAAACGACACTCACGCAGTCTC（配列番号５９）
Vlf1   CAGTCTGTSBTGACGCAGCCGCC（配列番号６０）
Vlf2   TCCTATGWGCTGACWCAGCCAC（配列番号６１）
Vlf3   TCCTATGAGCTGAYRCAGCYACC（配列番号６２）
Vlf4   CAGCCTGTGCTGACTCARYC（配列番号６３）
Vlf5   CAGDCTGTGGTGACYCAGGAGCC（配列番号６４）
Vlf6   CAGCCWGKGCTGACTCAGCCMCC（配列番号６５）
Vlf7   TCCTCTGAGCTGASTCAGGASCC（配列番号６６）
Vlf8   CAGTCTGYYCTGAYTCAGCCT（配列番号６７）
Vlf9   AATTTTATGCTGACTCAGCCCC（配列番号６８）
3'-プライマー：
VHr1   CATTGAGGAGACRGTGACCAGGGTG（配列番号６９）
VHr2   CATTGAGGAGACGGTGACCAGGGTT（配列番号７０）
VHr3   CATTGAAGAGACGGTGACCATTGT（配列番号７１）
VHr4   CATTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCC（配列番号７２）
VHr5   CATGGTTGGGGCGGATGCACTCC（配列番号７３）
VHr6   CATSGATGGGCCCTTGGTGGARGC（配列番号７４）
VKr1   TTTGATTTCCACCTTGGTCC（配列番号７５）
VKr2   TTTGATCTCCASCTTGGTCC（配列番号７６）
VKr3   TTGATATCCACTTTGGTCC（配列番号７７）
VKr4   TTTAATCTCCAGTCGTGTCC（配列番号７８）
Vlr1   TAGGACGGTSASCTTGGTCC（配列番号７９）
Vlr2   GAGGACGGTCAGCTGGGTGC（配列番号８０）
ＣＤＲシャッフリング用プライマー
VH(FWR)f1     GGACACGGCCGTRTATTACTGT（配列番号８１）
VH(FWR)f2     GGACAYGGCCATGTATTACTGT（配列番号８２）
Vk(FWR)f1     ATCAGYWGNSTGSARSCTGARGAT（配列番号８３）
Vk(FWR)f2     ATCAATWGNSTGSARSCTGARGAT（配列番号８４）
Vl(FWR)f1     GAYGAGGCTGACTATTACTGT（配列番号８５）
Vl(FWR)f2     GATGAATCTGATTATTACTGT（配列番号８６）
Vl(FWR)f3     GATGAGGCTGAGTATCATTGT（配列番号８７）
Vl(FWR)f4     GATGAGAGTGACTACCACTGT（配列番号８８）
VH(FWR)r1     ACAGTAATAYACGGCCGTGTCC（配列番号８９）
VH(FWR)r2     ACAGTAATACATGGCCRTGTCC（配列番号９０）
Vk(FWR)r1     ATCYTCAGSYTSCASNCWRCTGAT（配列番号９１）
Vk(FWR)r2     ATCYTCAGSYTSCASNCWATTGAT（配列番号９２）
Vl(FWR)r1     ACAGTAATAGTCAGCCTCRTC（配列番号９３）
Vl(FWR)r2     ACAGTAATAATCAGATTCATC（配列番号９４）
Vl(FWR)r3     ACAATGATACTCAGCCTCATC（配列番号９５）
Vl(FWR)r4     ACAGTGGTAGTCACTCTCATC（配列番号９６）
【００５１】
反応混合物（50μl）には、cDNA溶液0.5μl、リバースプライマーおよびフォワードプライマー各25pmol、200μM dNTP、10mM KCl、10mM（NH4）2SO4、20mM Tris-HCl（pH 8.8）、2mM MgCl2、100μg/ml BSA、およびKOD plus DNA polymerase（東洋紡、日本、大阪）1unitを含む。プライマーセットごとに、PCR条件を最適化した。アガロースゲル電気泳動により精製した1回目のPCR産物は、次回のPCRで免疫グロブリン可変領域を増幅する際の鋳型として、1回目と同量で混合した。得られた可変領域のDNA断片を精製して適切な制限酵素で切断した後、ベクター（pVH-HygまたはpVL-Amp）に挿入した。ライゲーション後、E. coli XL1-Blue由来F'プラスミドを持つE. coli DH10B株にこれらのファージミドDNAをエレクトロポレーションにより導入し、1％グルコースとハイグロマイシン（50μg/ml）またはアンピシリン（50μg/ml）を含む寒天プレート上にて30℃でコロニーを培養した。コロニーを採取し、1％グルコースを含む2×YT培地にて30℃で一晩ヘルパーファージM13KO7を重感染させることにより、VH遺伝子またはVL遺伝子を持つファージを形成させた。標準プロトコールに従い遠心分離とポリエチレングリコール（PEG）沈殿によりファージを回収した。
【００５２】
組み換え及び二次ファージscFvライブラリーの作製
E. coli XL1−Blue株由来F'プラスミドをCre-リコンビナーゼを構成的に発現しているE. coli NS3529株に導入して、E. coli NS3529/F'株を作製した。VHファージとVLファージをMOI = 50でNS3529/F'に感染させ、攪拌せずに37℃で1時間静置した。その後、M13KO7ヘルパーファージをMOI = 20で重感染させた。37℃で1時間インキュベーションした後、アンピシリンとカナマイシンをそれぞれ50μg/mlと25μg/mlになるように添加した。37℃で一晩培養する間に、Cre/loxの組み換えによってVHフラグメントがNS3529/F'細胞内のベクターpVL-Ampに移動し、scFv遺伝子を形成させた。培養した菌から得られた組み換えファージを培養中のXL1-Blue株にMOI < 0.1で感染させ、37℃で1時間静置した。20μg/mlクロラムフェニコール、50μg/mlアンピシリン、25μg/mlカナマイシンを含む2×YT培地（グルコース無添加）中において25℃で一晩培養した菌から、コートタンパク質g3pと融合したscFv提示ファージが得られた。PEG沈殿により濃縮したファージを1％ゼラチンと6％DMSOを含むSMバッファーで懸濁し、-80℃で保存した。
【００５３】
（４）ファージの選別方法
パニング法
ライブラリーは、パニング操作を４回行った。96ウェルプレートの50ウェルと16ウェルをMan3-DPPE（2μg/ウェル）でコーティングし、それぞれ1回目と2回目のパニングで使用した。5ウェルと2ウェルをMan3-DPPE（2μg/ウェル）でコーティングし、それぞれ3回目と4回目のパニングで使用した。ファージの選別は既報の方法（Marks, J.D., Hoogenboom, H.R., Bonnet, T.P., McCafferty, J., Griffiths, A.D., and Winter, G. (1991) J. Mol. Biol. 222, 581-597）を一部改良して行った。Man3-DPPEによるウェルのコーティングを簡単に説明する。ウェルにMan3-DPPE（40μg/mlメタノール溶液）50μlを加えて37℃で溶媒を蒸発させた後、0.15M NaClと3％BSA（ブロッキング液）を含むTris-HClバッファー（pH7.4）150μlを加えて4℃で一晩インキュベーションした。ウェルの洗浄は、0.2％Tween 20/TBS（TBS-T）50μlで2回、TBS200μlで1回行った。0.1％Tween 20と1.4％BSAを含むファージ懸濁TBS溶液50μlをウェルに加え、攪拌しながら37℃で60分間インキュベーションした。ウェルをTBS-T 200μlで3回、TBS 200μlで2回洗浄した後、100mMトリエチルアミン50μlを添加して25℃で10分間インキュベーションして、結合したファージを溶出させた。その後、ブロッキング液で処理済みのコントロール用プレートのウェル中で中和液（1M Tris-HCl[pH7.4]：3％BSA/TBS=2:1、体積比）100μlと混合して中和した。100mMトリエチルアミン50μlを添加して25℃で20分間インキュベーションすることによって結合したファージをさらに溶出させ、上記の方法に従って中和液中に回収した。溶出させたファージは、対数増殖期のE. coli TG1株100μlに37℃で1時間感染させた。感染した大腸菌は1mM NaOH、0.1％グルコース、カルベニシリン(50μg/ml)を含むLB寒天プレート（培地）（直径10cm）にて25℃で16時間培養し、プレート1枚当たり2mlのLB-10mM Tris-HCl（pH7.5）（SBS）を加えた後、スプレッダーを使ってプレートから回収した。この懸濁液38mlのうち1mlをカルベニシリンを含むSBS 40mlに植菌し、37℃で2時間攪拌しながら培養した。ヘルパーファージ40μl（3.5 × 109pfu.）を添加して37℃で1時間、攪拌せずに37℃で1時間インキュベーションした後、カナマイシン(25μg/ml)／クロラムフェニコール(10μg/ml)を添加して旋回攪拌しながら25℃で40時間インキュベーションし、ファージを採取した。PEG沈殿によりファージ粒子を濃縮し、TBS 400μl、3％BSA/TBS 400μl、10％Tween 20/TBS 40mlを加えて37℃で1時間インキュベーションして溶解させた。遠心分離（18,000g、4℃、5分間）後、ファージ懸濁液800μlを回収し、2回目のパニングに用いた。2、3、4回目のパニングは、洗浄条件以外は1回目のパンニングと同様の方法で行った。4回目のパニング後の単一コロニーから採取した菌を、SBS／カルベニシリン50μlを入れた96ウェルプレート中で旋回攪拌しながら37℃で１時間培養した。ヘルパーファージ50μlをさらに添加し、旋回攪拌しながら37℃で1時間インキュベーションした。SBS／カナマイシン／クロラムフェニコール混合物を50μl/ウェルずつ添加した後、旋回攪拌しながら25℃で16時間インキュベーションし、遠心分離（200g、4℃、15分間）してファージ懸濁液を回収した。3％BSA/TBS 100μlを入れたウェルに上清50μlを移し、37℃で1時間インキュベーションして4℃で保存した。
【００５４】
Man3-DPPEに対する抗体を発現するファージクローンのスクリーニング（ELISA法）
Man3-DPPEへのファージの結合を、ファージを含む細菌の上清を用いてELISA法で解析した。96ウェルプレートを上記方法に従ってMan3-DPPE（1μg/ウェル）でコーティングし、3％BSA/TBS 150μlを加えて4℃で一晩インキュベーションしてブロッキングした。コントロール用プレートは、抗原なしで上記方法で調製した。ファージ懸濁液75μlをウェルに添加し、37℃で1時間インキュベーションした。ウェルの洗浄は200μlのTBS-Tで5回行った。西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識抗M13抗体を加えて37℃で1時間インキュベーションした後、TBS-T 200μlで10回、TBS 200μlで1回洗浄し、結合したファージ抗体を検出した。ペルオキシダーゼ活性はABTS/H2O2と30分間反応させ、1％シュウ酸で反応を停止させて検出した。その後、BIO-RAD社のプレートリーダーで415nmの吸光度を測定した。
【００５５】
（５）ファージ抗体の解析
コロニーPCRとDNA配列の決定
ファージを感染させたE.coli TG1株の各コロニーからscFv遺伝子は、プライマーセット（フォワードプライマーCm-f：5'-TGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCT-3'（配列番号９７）、リバースプライマーg3-r：5'-GCTAAACAACTTTCAACAGTCTATGCGGCAC-3'（配列番号９８））を使用してPCRで増幅した。94℃で2分間プレヒートした後、熱変性が94℃で20秒間、アニーリングが53℃で20秒間、伸長反応が68℃で1分間という条件で35サイクルのPCRを行った。精製して2％アガロースゲル電気泳動でPCR産物の長さを確認した後、得られたscFv遺伝子のDNA配列を決定した。scFvのDNA配列は、3730 DNA Analyzer（Applied Biosystem社製、カリフォルニア州、フォスターシティ）を用いて決定した。
【００５６】
TLCプレート上での結合実験
クロロホルム／メタノール／水（50：55：18、体積比）に溶解した人工糖脂質400pmolをTLCプレート上にドットブロットした。または、アルミニウム製シリカゲル60高速TLCプレート（長さ10cm；Merck社製、ドイツ、ダルムシュタット）に、人工糖脂質各1μgを含む混合物をスポットし、クロロホルム／メタノール／水（60：35：8、体積比）溶媒で展開した。これらのプレートは乾燥後、0.1％（重量体積比）Plexigum P28（Sigma-Aldrich社製）を含むn-ヘキサンに30秒間浸し、3％BSA/TBSで室温で1時間ブロッキングし、その後、TBSで洗浄した。次に、プレートを4℃で一晩ファージ抗体（1013 cfu/ml）でオーバーレイし、その後、室温で1時間、マウス抗M13ファージコートタンパク質（p8）IgG（5,000倍希釈）でオーバーレイした。人工糖脂質へのファージ抗体の結合は、HRP標識抗マウスIgG（MBL社製、日本、名古屋）と化学発光試薬（ECLTMウエスタンブロット検出試薬、Amersham Biosciences社製、英国、バッキンガムシャー）の両方を使い、メーカーの説明書に従って検出した。
【００５７】
天然の糖タンパク質との反応性の検討による、ファージ抗体糖鎖特異性の決定
フェツイン、アシアロフェツイン、RNase A、およびRNase B（5μg/レーン）をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（10％ゲル）により分離し、PVDFメンブレンにブロットした。SDS-PAGEゲルはクマシーブリリアントブルーで染色した。上記の方法に従い、天然の糖タンパク質に対するファージ抗体の反応性を、ファージ抗体M3-7とHRP標識抗M13ファージ抗体を用いて、ウエスタンブロット法により検討した。
【００５８】
scFvタンパク質の発現と部分精製
単離した各ファージクローンを、シャペロン／リプレッサーベクターを持つE.coli TOP10F'株に感染させた。M3-7またはコントロールの抗FLAGファージを感染させたTOP10F'細胞を、50μg/mlアンピシリン、50μg/mlスペクチノマイシン、1mMイソプロピル-チオβ-D-ガラクトピラノシド（IPTG）を含む2×YT培地200ml中にて30℃で3時間培養した。TOP10F'細胞の上清、ペリプラズム画分、全細胞抽出物を、分画遠心法により回収した。培養液40mlから回収した全細胞抽出物は、6M塩酸グアニジン、5％グリセロール、0.5mM PMSF及び0.1mM DTTを含む50mM Tris-HCl（pH 8）1mlに入れ、氷上に1時間放置して可溶化した。遠心分離（18,800g、30分間）後、上清を150mM NaClを含む10mM HEPES（pH 7.4）で透析した。遠心分離して沈殿を除去した後、上清をSDS-PAGE／ウエスタンブロット法で解析した。還元条件のSDS-PAGE（4〜20％アクリルアミドゲル）（第一化学薬品、日本、東京）で総タンパク量18μg/レーンを分離した後、PVDFメンブレンに転写した。3％ BSA/PBSでブロッキングした後、発現したscFvタンパク質をHRP標識抗E-tag抗体（Amersham Bioscience社製、日本）で検出した。このscFvタンパク質サンプルをSPR解析に使用した。
【００５９】
合成糖タンパク質へのscFvタンパク質の結合（ELISA法）
scFvタンパク質を以下の方法で作製し、各種BSA結合オリゴ糖に対する特異性の検討に用いた。TOP10F'-FS2細胞にMan3特異的ファージを感染させ、1％グルコース、50μg/mlカルベニシリン、50μg/mlスペクチノマイシンを含むSBS 5mlにて25℃で16時間培養した。次に、感染させた細胞を遠心分離により回収し、懸濁し、カルベニシリンとスペクチノマイシンを含むSBS 40mlにて30℃で3時間培養した。1mM IPTGを添加後、30℃で16時間培養してscFvタンパク質を誘導し、上清を回収した。ニトロセルロース上にドットブロット後に、HRP標識抗E-tag抗体を添加して、scFvタンパク質の発現を確認した。
【００６０】
ELISAプレートは、4℃、16時間の条件のもと、BSA結合オリゴ糖（10μl/ml）50μlでコーティングした。培養液の上清（50μl/ウェル）をこのウェルに移し、37℃で2時間放置した。オリゴ糖へのscFvタンパク質の結合は、上記の方法に従い、HRP標識抗E-tag抗体を用いて測定した。
【００６１】
ファージ抗体とscFvタンパク質の解析（表面プラズモン共鳴法、SPR）
SPR解析は25℃で行った。溶液は新しく調製し、脱気して孔サイズ0.22μmのフィルターで濾過した。BIAcore X（Pharmacia Biosensor社製）を用いたSPRにより、ファージ抗体の結合特性を決定した。この解析では、金膜表面に脂肪族鎖を共有結合させたHPAセンサーチップと、泳動バッファーとして150mM NaClを含む10mM HEPES（pH7.4）（HBS）を用いた。HPAセンサーチップ表面への人工糖脂質の固定化は、メーカーのプロトコールに従って行った。人工糖脂質被覆リポソームを添加し、糖鎖を表面に提示している脂質単分子膜をHPAセンサーチップ上に形成させた。固定化する前に、非イオン性界面活性剤である40mM MEGA9（同仁化学、日本、熊本）と50％エタノールを流速5μl/分で注入して表面を洗浄した。その後、DPPCまたはMan3-DPPE/DPPC（1：10、モル比）を流速2μl/分でセンサーチップ表面に注入した。脂質表面から多重膜構造を除去するため、10 mM NaOH 5μlを流速5μl/分で注入した。HBSで透析したファージ抗体のサンプルを流速5μl/分でチップ表面に10分間注入した。SPRでの競合的阻害作用を検討するため、ファージ抗体サンプルを10mMまたは100mMのD-マンノース、あるいはα-メチル-D-マンノピラノシド（ナカライテスク、日本、京都）と混合した後、4℃で1時間インキュベーションした。
【００６２】
HPAセンサーチップまたはSA（ストレプトアビジン）センサーチップを用いて、scFvタンパク質サンプルのSPR解析を流速5μl/分でBIAcore 3000により行った。DPPC、Man3-DPPE/DPPC（1：10、モル比）、Man2-DPPE/DPPC（1：10、モル比）、Man5-DPPE/DPPC（1：10、モル比）は、上記の方法に従ってHPAセンサーチップに固定化した。脂質膜に含まれるDPPE結合体のモル比を基に固定化リガンド量を算出したところ、DPPC、Man2-DPPE、Man3-DPPE、Man5-DPPEがそれぞれ0.43pmol、0.31pmol、0.48pmol、0.30pmol含まれていた。SAセンサーチップを使用する場合は、0.01％ Tween 20を含むHBS（HBS-T）を泳動バッファーとして用いた。ビオチン化リガンド固定化の前に、活性化バッファー（50mM NaOHを含む1M NaCl）を1分間ずつ計3回連続して注入し、SAセンサーチップ表面を活性化した。Glucose-sp-Biotin、Man3-sp-Biotin、Lewis b-sp-Biotin（0.1mM）をHBS-Tで希釈して0.05μMとし、そのうち10μlを100〜150 RUとなるまで流速1μl/分で手動で注入した。先に用いた人工糖脂質とは異なり、これらのリガンドにはO（CH2）3NHCO（CH2）5NHという構造からなるスペーサー（sp）が含まれる。固定化されたビオチン化糖鎖の量はそれぞれ0.25pmol、0.23pmol、0.13pmolであると推定された。HBS-Tで透析したscFvサンプルを流速1μl/分で4分間チップ表面に注入した。1サンプルの測定が終了したらセンサーチップの表面を10mM塩酸グリシン（pH1.5）で1分間処理して再生し、その後、次のサンプルを注入する前に一定流速のHBS-Tで洗浄した。
【００６３】
（Ｂ）結果
（１）Man3-DPPEに対するscFv提示ファージのスクリーニング
ファージ提示型ヒトscFvライブラリーには、Man3-DPPEに対するパニングを4回行った。Man3-DPPEの構造を図1Bに示す。上記した方法に従い、Man3-DPPE（2μg/ウェル）を用いてパニングを行った。Man3-DPPE（1μg/ウェル）を抗原としてELISA法でスクリーニングした672クローン中、40クローン以上でS/N比が2を上回り、ELISA陽性を示した。その中から、scFvをコードしている25個の陽性クローンをMan3構造に対するファージ抗体の有力候補として選択した。これらのファージクローンのscFv領域のDNA配列を決定したところ、解析したクローン全てで配列が異なっていた。１２クローンの特徴を表１に記す。
【００６４】
【表１】
2007306828.tif 000002
【００６５】
（２）ファージクローンの糖鎖特異性
使用した抗原に対する特異性と高親和性を有するファージ抗体を迅速に識別するためには、ファージ抗体としてのscFv提示ファージ解析に適した方法を確立することが必要である。最終的にはscFvタンパク質の発現、単離および解析が必要となるが、scFvタンパク質の発現と単離には手間と時間を要するので、詳細な解析に使用する有望なクローンを選択するためには、ファージクローンに関する基礎的な情報が不可欠であろう。この目的のために、一群の人工糖脂質をTLCプレート上に個別にスポットし（図２Ａ）、その後、ファージ抗体をプレートにオーバーレイして人工糖脂質と結合させた。この実験から、ファージ抗体は、Man3に対して特異性を有しているだけでなく、Man3ほどではないもののMan2とMan5に対しても特異性を有していることが示された（図２Ａ）。また、GN2Man3とDPPEへの結合は観察されなかったので、検討したファージ抗体は人工糖脂質の脂質部分ではなく、非還元マンノース残基に結合していることが示された。この実験で使用した人工糖脂質の構造を図２Ｂに示す。
【００６６】
（３）天然の糖タンパク質へのファージ抗体の結合
Man3-DPPEを標的抗原として単離したファージ抗体は、人工糖脂質の非還元マンノース残基に対する特異性を有することが示された。そこで、これらのファージ抗体における糖タンパク質の非還元マンノース残基への結合能を検討した。ファージ抗体M3-7は高マンノース型オリゴ糖を持つRNase Bには結合するが、糖鎖を持たないRNase Aや複合型オリゴ糖とO-結合型オリゴ糖を持つフェツインには結合しなかったことが明確に示された（図３）。
【００６７】
（４）Man3特異的scFv提示ファージ抗体のSPR解析
ファージ抗体のMan3に対する特異性をELISA法とTLC-overlay法で確認した後、SPRによりファージ抗体の結合速度を解析した。ファージM3-7のMan3-DPPEへの結合を示すセンサーグラム（Man3-DPPEへのファージ抗体の結合から、DPPEのみへの結合を差し引いたセンサーグラム）より、検討したファージ抗体のMan3に対する結合性を確認した（図4；センサーグラムＡ）。この結果は、（i）ファージ抗体の結合がマンノース（センサーグラムＣ）またはα-メチル-D-マンノシドによって競合的に阻害されたこと、（ii）ヒトIGF-I受容体特異的scFvを提示しているコントロールのファージ抗体がMan3-DPPEに結合しなかった（センサーグラムＢ）ことからも裏付けられる。
【００６８】
（５）可溶性タンパク質としてのMan3特異的scFvの発現と解析
scFvタンパク質を可溶性タンパク質として発現させ、その糖鎖特異性について解析した。SDS-PAGE後に抗E-tag抗体を用いたイムノブロット解析を行い、上清、ペリプラズム画分、全細胞抽出物でのscFvタンパク質の含有量を比較した。その結果、発現したscFvタンパク質の大部分は、全細胞抽出物の画分に含まれることが明らかとなった。そこで、ELISA法とSPR解析は全細胞抽出物の画分を用いて行った（図５）。使用した画分は未精製であったが（図５左）、E-tag反応性のscFvタンパク質が含まれていた（図５右）。この実験と同様の条件下でファージ感染させたE. coli細胞で発現したscFvタンパク質量も、これと類似の範囲であると考えられる（図５右）。scFvタンパク質M3-7およびM3-8のマンノース残基への結合能は、合成糖タンパク質を用いてELISA法で確認した（図６）。
【００６９】
（６）可溶性タンパク質としてのMan3特異的scFvのSPR解析
scFvタンパク質サンプル（図５）を用いて、Man3特異的scFvタンパク質の結合速度を固定化した人工糖脂質を用いたSPRにより解析した（図７）。その結果、ファージクローンM3-7由来のscFvタンパク質では、Man3-DPPEおよびMan5-DPPEに対する相対的結合速度は同等であり、DPPEに対する同速度を上回ることが示された。一方、Man2-DPPEに対する結合速度はDPPEに対する同速度よりも小さかった（図７）。
【００７０】
ビオチン化糖鎖のSPR解析も行った。Man3-sp-biotin、Lewis b-sp-biotin、およびglucose-sp-biotinへのscFvタンパク質サンプルの結合速度から、scFvタンパク質M3-7は、構造的に無関連なLewis b（Lewis bへのscFvタンパク質M3-7の親和性は、非常に低いが有意である）よりもMan3とははるかに高い親和性で結合した（図８）。一方、コントロールとして用いたグルコースには、これらのscFvタンパク質は結合しないと考えられた。抗FLAG scFvタンパク質のセンサーグラムは、コントロールとみなすべきである。
【００７１】
Man3-DPPE（図７）とMan3-biotinへの（図８）へのscFvタンパク質の結合のセンサーグラムから、DPPE（図９Ａ）とglucose-biotin（図９Ｂ）のセンサーグラムをそれぞれ差し引き、Man3に対する特異的結合をこれら２種類の方法での結果により比較した（図９）。検討したscFvタンパク質間での相対的親和性に関して、このデータが示すことがいくつかある。例えば、M3-7から得たscFvタンパク質は、Man3構造に親和性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図1は、人工糖脂質（A）とMan3-DPPE（B）の合成を示す。Man1、Man2、Man3、Man5、GN2、LNT、FG、およびGN2Man3などのオリゴ糖（構造式は図２Ｃを参照）とジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（DPPE）から、還元アミノ化反応により人工糖脂質を合成した。
【図２】図２は、Man3-DPPEを用いたパニングとELISA法によりスクリーニングした、ファージ抗体の糖鎖特異性を示す。（A）TLCプレート上に各種人工糖脂質をドットブロットし、各プレートを抗Man3ファージ抗体M3-7、またはM3-8をオーバーレイした後、ファージを検出した。（B）この実験で用いた人工糖脂質を示す。Man1、マンノース；Man2、マンノビオース（Manα1-6Man）；Man3、マンノトリオース［Manα1-6（Manα1-3）Man］；Man5、マンノペンタオース［Manα1-6（Manα1-3）Manα1-6（Manα1-3）Man］；GN2Man3、GlcNAcβ1-2Manα1-6（GlcNAcβ1-2Manα1-3）Man；GN2、ジ-N-アセチルキトビオース（GlcNAcβ1-4GlcNAc）；FG、Fucα1-2Gal ；LNT、ラクト-N-テトラオース（Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc）
【図３】図３は、天然の糖タンパク質へのファージ抗体の結合を示す。天然の糖タンパク質（フェツイン、アシアロフェツイン、RNase A、およびRNase B）に対するファージ抗体M3-7の反応性をウエスタンブロット法により検討した。タンパク質のバンドはクマシーブリリアントブルーで染色した。ファージ抗体M3-7とHRP標識抗M13ファージ抗体を用いたウエスタンブロットを行い、ファージ抗体が結合しているバンドを同定した。
【図４】図４は、Man3特異的scFv提示ファージ抗体のSPR解析を示す。ファージ抗体M3-7（A）のSPR解析をMan3-DPPEを用いて行った。抗IGF-I受容体scFvファージを陰性コントロールとして用いた（B）。100mMマンノースの存在下、ファージ抗体M3-7を用いて競合阻害実験を行った（C）。これはMan3に対する特異的結合に関するセンサーグラムである。特異的なMan3-DPPEに関するセンサーグラムから、DPPEに関するセンサーグラムを差し引いて求めた。
【図５】図５は、可溶性タンパク質としてのMan3特異的scFvの発現を示す。左：E. coli TOP10F'株で発現させたscFvタンパク質（M3-7）と、コントロールである抗FLAG scFvタンパク質のSDS-PAGEを行った。ゲルはクマシーブリリアントブルーで染色した。右：抗E-tag抗体を用いてscFvタンパク質のウエスタンブロットを行った。
【図６】図６は、Man3-BSAへのscFvタンパク質の結合を示す（ELISA法で検討）。scFvタンパク質（M3-7、およびM3-8）をELISA法で解析した。BSA（a）、Man1-BSA（b）、Man3-BSA（c）、およびscFvタンパク質を含まないBSA（d）に対する各scFvタンパク質の反応性を決定した。
【図７】図７は、Man2-DPPE、Man3-DPPE、またはMan5-DPPE固定化チップを用いた、Man3特異的scFvタンパク質のSPR解析を示す。
【図８】図８は、Man3-sp-biotin、Lewis b-sp-biotin、またはglucose-sp-biotinを結合させたチップを用いた、Man3特異的scFvタンパク質のSPR解析を示す。太線はMan3-sp-biotinを示し；点線はLewis b-sp-biotinを示し、細線はglucose-sp-biotinを示す。
【図９】図９は、Man3部分に対するscFvタンパク質の特異的結合の比較を示す。Man3-DPPE（図７）とMan3-biotin（図８）とに対する、2種類のscFvタンパク質センサーグラム間で比較した。特異的結合は、それぞれのセンサーグラムからDPPE（図９Ａ）またはGlucose-biotin（図９Ｂ）に対するセンサーグラムを差し引くことにより求めた。
【配列表フリーテキスト】
【００７３】
［配列表］
SEQUENCE LISTING
<110>  Tokai University
<120>  Phage-displayed single chain antibodies recognizing non-reducing mannose residues
<130>  A61375A
<160>  58
<170>  PatentIn version 3.1
<210>  1
<211>  354
<212>  DNA
<213>  human
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(354)
<223> 
<400>  1
cag gtg acc ttg aag gag tct ggt cct gcg ctg gtg aaa ccc aca cag       48
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 
1               5                   10                  15
acc ctc aca ctg acc tgc acc ttc tct gac ttc tca ctc acc act agt       96
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Asp Phe Ser Leu Thr Thr Ser 
20                  25                  30
gga atg cgt gtc agc tgg atc cgt cag ccc cca ggg aag gcc ctg gag      144
Gly Met Arg Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 
35                  40                  45
tgg ctt gca cgc att gat tgg gat gat gat aag ttc tac agc acc tct      192
Trp Leu Ala Arg Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Phe Tyr Ser Thr Ser 
50                  55                  60
ctg aag acc agg ctc acc atc tcc aag gac acc tcc aaa aac cag gtg      240
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 
65                  70                  75                  80
gtc ctt aca ctg acc aac atg gac cct gtg gac aca gcc acg tat tac      288
Val Leu Thr Leu Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 
85                  90                  95
tgt gca cgg gat att tcg aaa gca cat gac tac tgg ggc cag gga acc      336
Cys Ala Arg Asp Ile Ser Lys Ala His Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 
100                 105                 110 
ctg gtc act gtc tcc tca                                              354
Leu Val Thr Val Ser Ser 
115 
<210>  2
<211>  118
<212>  PRT
<213>  human
<400>  2
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Asp Phe Ser Leu Thr Thr Ser 
20                  25                  30
Gly Met Arg Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 
35                  40                  45
Trp Leu Ala Arg Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Phe Tyr Ser Thr Ser 
50                  55                  60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Leu Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 
85                  90                  95
Cys Ala Arg Asp Ile Ser Lys Ala His Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 
100                 105                 110 
Leu Val Thr Val Ser Ser 
115 
<210>  3
<211>  324
<212>  DNA
<213>  human
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(324)
<223> 
<400>  3
gaa acg aca ctc acg cag tct cca gcc acc ctg tct gtg tct cta ggg       48
Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Leu Gly 
1               5                   10                  15
gac aga gcc tcc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtg ggc acc aag       96
Asp Arg Ala Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Thr Lys 
20                  25                  30
tta gcc tgg tac cag cac aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc ttc      144
Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Phe 
35                  40                  45
tat ggt gca tcc acc agg gcc cct agt gtc ccg gcc agg ttc agt ggc      192
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Pro Ser Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly 
50                  55                  60
agt ggg tct ggg aca gaa ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag tct      240
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 
65                  70                  75                  80
gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt cag caa tat ata aac tgg cct cgg      288
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ile Asn Trp Pro Arg 
85                  90                  95
acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa ggc                      324
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly 
100                 105 
<210>  4
<211>  108
<212>  PRT
<213>  human
<400>  4
Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Leu Gly 
1               5                   10                  15
Asp Arg Ala Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Thr Lys 
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Phe 
35                  40                  45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Pro Ser Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly 
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ile Asn Trp Pro Arg 
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly 
100                 105 
<210>  5
<211>  390
<212>  DNA
<213>  human
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(390)
<223> 
<400>  5
cag gtg cag cta cag cag tgg ggc gcg gga ata ttg aag cct tcg gag       48
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Ile Leu Lys Pro Ser Glu 
1               5                   10                  15
acc ctg tct cta acc tgc gct atc tac ggc aca tat atc ggt ggt tat       96
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Tyr Gly Thr Tyr Ile Gly Gly Tyr 
20                  25                  30
cac tgg acg tgg atc cga cgg ccc cca ggg ggg gga ctg gag tgg att      144
His Trp Thr Trp Ile Arg Arg Pro Pro Gly Gly Gly Leu Glu Trp Ile 
35                  40                  45
gga gaa atc gaa aat act ggt aac atc aaa tat aat ccg tcc ctc agg      192
Gly Glu Ile Glu Asn Thr Gly Asn Ile Lys Tyr Asn Pro Ser Leu Arg 
50                  55                  60
aat cga gtc acc att tcc tca gac acg tcc aaa aga caa gtc ttc ttg      240
Asn Arg Val Thr Ile Ser Ser Asp Thr Ser Lys Arg Gln Val Phe Leu 
65                  70                  75                  80
agt ctg act tct ctg acc act gcg gac acg gct gta tat tat tgt gcg      288
Ser Leu Thr Ser Leu Thr Thr Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 
85                  90                  95
aag ggg ggg ggt aaa gag gtc acg gtt ctc ggc ctg cct gtg ggg tgg      336
Lys Gly Gly Gly Lys Glu Val Thr Val Leu Gly Leu Pro Val Gly Trp 
100                 105                 110 
gac tac tac ggc atg gac ata tgg ggc cca ggg acc acg gtc acc gtc      384
Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Ile Trp Gly Pro Gly Thr Thr Val Thr Val 
115                 120                 125 
tcc tca                                                              390
Ser Ser 
130 
<210>  6
<211>  130
<212>  PRT
<213>  human
<400>  6
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Ile Leu Lys Pro Ser Glu 
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Tyr Gly Thr Tyr Ile Gly Gly Tyr 
20                  25                  30
His Trp Thr Trp Ile Arg Arg Pro Pro Gly Gly Gly Leu Glu Trp Ile 
35                  40                  45
Gly Glu Ile Glu Asn Thr Gly Asn Ile Lys Tyr Asn Pro Ser Leu Arg 
50                  55                  60
Asn Arg Val Thr Ile Ser Ser Asp Thr Ser Lys Arg Gln Val Phe Leu 
65                  70                  75                  80
Ser Leu Thr Ser Leu Thr Thr Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 
85                  90                  95
Lys Gly Gly Gly Lys Glu Val Thr Val Leu Gly Leu Pro Val Gly Trp 
100                 105                 110 
Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Ile Trp Gly Pro Gly Thr Thr Val Thr Val 
115                 120                 125 
Ser Ser 
130 
<210>  7
<211>  324
<212>  DNA
<213>  human
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(324)
<223> 
<400>  7
gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gtg gga       48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
1               5                   10                  15
gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag acc ctt acc acc tat       96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Leu Thr Thr Tyr 
20                  25                  30
tta aat tgg tat caa cag aga cca ggg aaa gcc cca aaa ctc ctc atc      144
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
35                  40                  45
tat ctt gca tcc act ttg gac agt ggg gtc cca tca aga ttc agt ggc      192
Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
50                  55                  60
agt gca tct ggc aca act ttc acc ctc acc atc acc agt cta caa cct      240
Ser Ala Ser Gly Thr Thr Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro 
65                  70                  75                  80
gac gat gtt gca act tat tac tgt caa cag agt tac aat att cct cgg      288
Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Ile Pro Arg 
85                  90                  95
acg ttc ggc cag ggg acc aag gtg gag atc aaa ggc                      324
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly 
100                 105 
<210>  8
<211>  108
<212>  PRT
<213>  human
<400>  8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Leu Thr Thr Tyr 
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
35                  40                  45
Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
50                  55                  60
Ser Ala Ser Gly Thr Thr Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro 
65                  70                  75                  80
Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Ile Pro Arg 
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly 
100                 105 
<210>  9
<211>  354
<212>  DNA
<213>  human
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(354)
<223> 
<400>  9
cag gtg acc ttg aag gag tct ggt cct acg ctg gtg aaa ccc aca cag       48
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln 
1               5                   10                  15
acc ctc acg ctg acc tgc acc ttc tct gga ttc tca ctc agc act agt       96
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 
20                  25                  30
gga atg ggt gtg ggc tgg atc cgt cag ccc cca gga aag gcc ctg gag      144
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 
35                  40                  45
tgg ctt gca gtc att tat tgg gat gat gat aag cgc tac agc cca tct      192
Trp Leu Ala Val Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser 
50                  55                  60
ctg aag acc agg ctc acc atc acc aag gac acc tcc aaa aac cag gtt      240
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 
65                  70                  75                  80
gtc ctt aca atg acc aac atg gac cct gtg gac aca gcc aca tat tac      288
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 
85                  90                  95
tgt gca cag caa cgg tgg tcc aac ttt gac tac tgg ggc cag gga atc      336
Cys Ala Gln Gln Arg Trp Ser Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ile 
100                 105                 110 
ctg gtc acc gtc tcc tca                                              354
Leu Val Thr Val Ser Ser 
115 
<210>  10
<211>  118
<212>  PRT
<213>  human
<400>  10
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln 
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 
20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 
35                  40                  45
Trp Leu Ala Val Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser 
50                  55                  60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 
85                  90                  95
Cys Ala Gln Gln Arg Trp Ser Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ile 
100                 105                 110 
Leu Val Thr Val Ser Ser 
115 
<210>  11
<211>  327
<212>  DNA
<213>  human
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(327)
<223> 
<400>  11
gaa att gta ttg acg cag tct cca gcc acc ctg tct ttg tct cca ggg       48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
1               5                   10                  15
gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt agc ggc aac       96
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Gly Asn 
20                  25                  30
tta gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc      144
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 
35                  40                  45
ttt gct aca tcc acc agg gcc act ggt atc cca gtc agg ttt agt ggc      192
Phe Ala Thr Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Val Arg Phe Ser Gly 
50                  55                  60
cgt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc aga ctg gag cct      240
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro 
65                  70                  75                  80
gaa gat ttt gca gtg tat tac tgt cag cag tat ggt ggc tca cct cgg      288
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Gly Ser Pro Arg 
85                  90                  95
ctc act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gaa atc aaa ggc                  327
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly 
100                 105 
<210>  12
<211>  109
<212>  PRT
<213>  human
<400>  12
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Gly Asn 
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 
35                  40                  45
Phe Ala Thr Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Val Arg Phe Ser Gly 
50                  55                  60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro 
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Gly Ser Pro Arg 
85                  90                  95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly 
100                 105 
<210>  13
<211>  366
<212>  DNA
<213>  human
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(366)
<223> 
<400>  13
cag gtg cag cta cag cag tgg ggc gca gga ctg ttg aag cct tcg gag       48
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 
1               5                   10                  15
acc ctg tcc ctc acc tgc gct gtt tct ggt tat ggg tcc ctc agt ggt       96
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Gly Ser Leu Ser Gly 
20                  25                  30
tac tac tgg agc tgg atc cgc cag ccc cca ggg aag ggg ctg gag tgg      144
Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 
35                  40                  45
att ggg gaa atc aat cgt ggc gga agc acc aaa tac aac ccg tcc ctc      192
Ile Gly Glu Ile Asn Arg Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Leu 
50                  55                  60
aag agt cga atc acc ata tca gta gac acg tcc aag aac cag ttc tcc      240
Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 
65                  70                  75                  80
ctg aat ctg aac tct gtg acc gcc gcg gac acg gct gtg tat tac tgt      288
Leu Asn Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
85                  90                  95
gcg aga agt ggc ctg tat ggc acc act ccg tca acc ttt gac cac tgg      336
Ala Arg Ser Gly Leu Tyr Gly Thr Thr Pro Ser Thr Phe Asp His Trp 
100                 105                 110 
ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca                              366
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
115                 120 
<210>  14
<211>  122
<212>  PRT
<213>  human
<400>  14
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Gly Ser Leu Ser Gly 
20                  25                  30
Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 
35                  40                  45
Ile Gly Glu Ile Asn Arg Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Leu 
50                  55                  60
Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 
65                  70                  75                  80
Leu Asn Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
85                  90                  95
Ala Arg Ser Gly Leu Tyr Gly Thr Thr Pro Ser Thr Phe Asp His Trp 
100                 105                 110 
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
115                 120 
<210>  15
<211>  336
<212>  DNA
<213>  human
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(336)
<223> 
<400>  15
cag tct gtg gtg acg cag ccg ccc tca gtg tct ggg acc cca gga tcg       48
Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Ser 
1               5                   10                  15
tgg gtc acc atc tcc tgc act ggg acc agg tcc aac atc ggg gca cct       96
Trp Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Arg Ser Asn Ile Gly Ala Pro 
20                  25                  30
aag ggt gtc cac tgg tac caa cac gtc cca ggg aca gcc cct aaa ctc      144
Lys Gly Val His Trp Tyr Gln His Val Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 
35                  40                  45
ctc atc tat gat agt aat agt cgg tcc tcg ggg gtc cct gcc cgc ttc      192
Leu Ile Tyr Asp Ser Asn Ser Arg Ser Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe 
50                  55                  60
tct ggg tcc aag tct ggc act tca ggc agc ctg gcc atc gct gga ctg      240
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Gly Ser Leu Ala Ile Ala Gly Leu 
65                  70                  75                  80
caa cct gag gat gag gct gat tat tat tgc cag tct ctt gat acc aac      288
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Leu Asp Thr Asn 
85                  90                  95
ttg aat gct tgg gtg ttc ggc ggg ggg acc aag ctg acc gtc cta ggc      336
Leu Asn Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 
100                 105                 110 
<210>  16
<211>  112
<212>  PRT
<213>  human
<400>  16
Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Ser 
1               5                   10                  15
Trp Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Arg Ser Asn Ile Gly Ala Pro 
20                  25                  30
Lys Gly Val His Trp Tyr Gln His Val Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 
35                  40                  45
Leu Ile Tyr Asp Ser Asn Ser Arg Ser Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe 
50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Gly Ser Leu Ala Ile Ala Gly Leu 
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Leu Asp Thr Asn 
85                  90                  95
Leu Asn Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 
100                 105                 110 
<210>  17
<211>  366
<212>  DNA
<213>  human
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(366)
<223> 
<400>  17
cag gtg cag ctg cag cag tcg ggc cca gga ctg gtg aag gct tcg gag       48
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Ala Ser Glu 
1               5                   10                  15
acc ctg tcc ctc acc tgc gct gtc tct ggt tac tcc atc agc agc ggt       96
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly 
20                  25                  30
tac tac tgg ggc tgg atc cgg cag ccc cca ggg aag gga ctg gag tgg      144
Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 
35                  40                  45
att gga aat atc tat cat agt ggg aac acc tac tac aac ccg tcc ctc      192
Ile Gly Asn Ile Tyr His Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu 
50                  55                  60
aag agt cga gtt acc att tca cga gac acg tcc aag aat cac ttc tcc      240
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn His Phe Ser 
65                  70                  75                  80
ctg aag ctg aag tct gtg acc gcc gca gac acg gcc gtg tat tac tgt      288
Leu Lys Leu Lys Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
85                  90                  95
gcg aga gcc gac ccc ggc tat atg atc ttt aac tgg ttc gac ccc tgg      336
Ala Arg Ala Asp Pro Gly Tyr Met Ile Phe Asn Trp Phe Asp Pro Trp 
100                 105                 110 
ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca                              366
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
115                 120 
<210>  18
<211>  122
<212>  PRT
<213>  human
<400>  18
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Ala Ser Glu 
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly 
20                  25                  30
Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 
35                  40                  45
Ile Gly Asn Ile Tyr His Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu 
50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn His Phe Ser 
65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Lys Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
85                  90                  95
Ala Arg Ala Asp Pro Gly Tyr Met Ile Phe Asn Trp Phe Asp Pro Trp 
100                 105                 110 
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
115                 120 
<210>  19
<211>  324
<212>  DNA
<213>  human
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(324)
<223> 
<400>  19
aat ttt atg ctg act cag cca ccc tca gcg tct ggg acc ccc ggg cag       48
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 
1               5                   10                  15
agg gtc acc atc tct tgt tct gga agc agc tcc aac atc gga aat aat       96
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 
20                  25                  30
gat gta tac tgg tac cag caa ttc cca gga acg gcc ccc aaa ctc ctc      144
Asp Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 
35                  40                  45
atc tat agg aat aat cag cgg ccc tca ggg gtc cct gac cga ttc tct      192
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 
50                  55                  60
ggc tcc aag tct ggc acc tca gcc tcc ctg gcc atc agt ggg ctc cgg      240
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 
65                  70                  75                  80
tcc gag gat gag gct gat tat tac tgt gca gca tgg gat gac agc ctg      288
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 
85                  90                  95
ata ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta ggc                      324
Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 
100                 105 
<210>  20
<211>  108
<212>  PRT
<213>  human
<400>  20
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 
20                  25                  30
Asp Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 
35                  40                  45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 
50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 
85                  90                  95
Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 
100                 105 
<210>  21
<211>  369
<212>  DNA
<213>  human
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(369)
<223> 
<400>  21
cag gtg cag ctg gtg gag tct ggg tct gag gtg aag aag cct ggg gcc       48
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ser Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
1               5                   10                  15
tca gtg aag gtc tcc tgt aag gct tct gga tac acc ttc acc gac tac       96
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 
20                  25                  30
tat atc cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gaa tgg atg      144
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
35                  40                  45
gga tgg ctc aac ccc aat ggt gga agt aca aac tat cca cag aag ttt      192
Gly Trp Leu Asn Pro Asn Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Pro Gln Lys Phe 
50                  55                  60
cag ggc tgc gtc acc atg acc cgg gac acg gcc acc agt aca gcc ttc      240
Gln Gly Cys Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ala Thr Ser Thr Ala Phe 
65                  70                  75                  80
atg gag ctg agc ggc ctc aag tct gac gac acg gcc tta tat tac tgt      288
Met Glu Leu Ser Gly Leu Lys Ser Asp Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 
85                  90                  95
gcg aga gcg ata aaa gcc gat tcg ggc ttc tcc tac ctt ctg gac gtc      336
Ala Arg Ala Ile Lys Ala Asp Ser Gly Phe Ser Tyr Leu Leu Asp Val 
100                 105                 110 
tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca                          369
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
115                 120 
<210>  22
<211>  123
<212>  PRT
<213>  human
<400>  22
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ser Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 
20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
35                  40                  45
Gly Trp Leu Asn Pro Asn Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Pro Gln Lys Phe 
50                  55                  60
Gln Gly Cys Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ala Thr Ser Thr Ala Phe 
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Gly Leu Lys Ser Asp Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 
85                  90                  95
Ala Arg Ala Ile Lys Ala Asp Ser Gly Phe Ser Tyr Leu Leu Asp Val 
100                 105                 110 
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
115                 120 
<210>  23
<211>  333
<212>  DNA
<213>  human
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(333)
<223> 
<400>  23
cag cct gtg ctg act cag cca ccc tca gcg tct ggg acc ccc ggg cag       48
Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 
1               5                   10                  15
agg gtc acc atc tct tgt tct gga agc agc tct aac atc gga agt aat       96
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 
20                  25                  30
tat gta tac tgg tac cag cag ctc cca gga acg gcc ccc aaa ctc ctc      144
Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 
35                  40                  45
atc tat agg att aat cag cgg ccc tca ggg gtc cgt gac cga ttc tct      192
Ile Tyr Arg Ile Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Arg Asp Arg Phe Ser 
50                  55                  60
ggc tcc aag tct ggc acc tca gcc tcc ctg gcc atc agt ggg ctc cgg      240
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 
65                  70                  75                  80
tcc gag gat gag gct gat tat tac tgt tca gca tgg gat gac agc ctg      288
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ala Trp Asp Asp Ser Leu 
85                  90                  95
agt ggt tgg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta ggc          333
Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 
100                 105                 110 
<210>  24
<211>  111
<212>  PRT
<213>  human
<400>  24
Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 
20                  25                  30
Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 
35                  40                  45
Ile Tyr Arg Ile Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Arg Asp Arg Phe Ser 
50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ala Trp Asp Asp Ser Leu 
85                  90                  95
Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 
100                 105                 110 
<210>  25
<211>  360
<212>  DNA
<213>  human
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(360)
<223> 
<400>  25
cag gtg cag ctg cag gag tcc ggg gga ggc tta gtt cag ccc gga ggg       48
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
1               5                   10                  15
tcc ctg aga ctc tcc tgt aca gcc tca gga ttc act ttc agt aat cac       96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn His 
20                  25                  30
tgg atg cac tgg gtc cgc caa act cca ggg aag ggg ctg gtg tgg gtc      144
Trp Met His Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val 
35                  40                  45
tca cgt atc aga ggt gat gcg ggc gac aga aac tac gcg gac tct gtg      192
Ser Arg Ile Arg Gly Asp Ala Gly Asp Arg Asn Tyr Ala Asp Ser Val 
50                  55                  60
aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac tcc cag aac acc ctg ttt      240
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn Thr Leu Phe 
65                  70                  75                  80
ctg caa atg aac agt ctg aca gcc gag gac acg gct gtc tat tac tgt      288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
85                  90                  95
gca aga gat gtg gtc ctt ggt tcg ggc agt act gac cag tgg ggc cag      336
Ala Arg Asp Val Val Leu Gly Ser Gly Ser Thr Asp Gln Trp Gly Gln 
100                 105                 110 
gga gcc ctg gtc acc gtc tcc tca                                      360
Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser 
115                 120 
<210>  26
<211>  120
<212>  PRT
<213>  human
<400>  26
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn His 
20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val 
35                  40                  45
Ser Arg Ile Arg Gly Asp Ala Gly Asp Arg Asn Tyr Ala Asp Ser Val 
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn Thr Leu Phe 
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
85                  90                  95
Ala Arg Asp Val Val Leu Gly Ser Gly Ser Thr Asp Gln Trp Gly Gln 
100                 105                 110 
Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser 
115                 120 
<210>  27
<211>  342
<212>  DNA
<213>  human
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(342)
<223> 
<400>  27
gat att gtg atg acc cag act cca gac tcc ctg gct gtg tct ctg ggc       48
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
1               5                   10                  15
gag agg gcc acc atc aac tgc aag tcc agc cag agt gtt tta tac agc       96
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 
20                  25                  30
tcc aac agt aag aac tac tta gct tgg tac cag cag aaa cca gga cag      144
Ser Asn Ser Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 
35                  40                  45
cct cct aag ctg ctc att tac tgg gca tct acc cgg gaa tcc ggg gtc      192
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 
50                  55                  60
cct gac cga ttc agt ggc agc ggg tct ggg aca gat ttc act ctc acc      240
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 
65                  70                  75                  80
atc agc agc ctg cag gct gaa gat gtg gca gct tat tac tgt cag caa      288
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln Gln 
85                  90                  95
tat tct act act ccg ttc act ttc ggc gga ggg acc aag ctg gag atc      336
Tyr Ser Thr Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 
100                 105                 110 
aaa ggc                                                              342
Lys Gly 
<210>  28
<211>  114
<212>  PRT
<213>  human
<400>  28
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 
20                  25                  30
Ser Asn Ser Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 
35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 
50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln Gln 
85                  90                  95
Tyr Ser Thr Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 
100                 105                 110 
Lys Gly 
<210>  29
<211>  362
<212>  DNA
<213>  human
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(360)
<223> 
<400>  29
cag gtg cag ctg gtg gag tcc ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg agg       48
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 
1               5                   10                  15
tcc ctg agc ctc tcc tgt aca acc tct gga ttc acc ttc agt gac tat       96
Ser Leu Ser Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 
20                  25                  30
tac atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg      144
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
35                  40                  45
gca ttt att tca tct gat gga ggt aat aag tat tat tta gac tcc gtg      192
Ala Phe Ile Ser Ser Asp Gly Gly Asn Lys Tyr Tyr Leu Asp Ser Val 
50                  55                  60
aag ggc cga ttc acc gtc tcc aga gac aat tcc aag aac aca cta tct      240
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Ser 
65                  70                  75                  80
ctg caa atg aac agc ctg aag act gag gac acg gct ctg tat tac tgt      288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 
85                  90                  95
gcg ggg gtg cca gct gtt acg tca gcc tgg tac ttc gat ctc tgg ggc      336
Ala Gly Val Pro Ala Val Thr Ser Ala Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly 
100                 105                 110 
cgt ggc acc ctg gtc acc gtc tct ca                                   362
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 
115                 120 
<210>  30
<211>  120
<212>  PRT
<213>  human
<400>  30
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 
1               5                   10                  15
Ser Leu Ser Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
35                  40                  45
Ala Phe Ile Ser Ser Asp Gly Gly Asn Lys Tyr Tyr Leu Asp Ser Val 
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Ser 
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 
85                  90                  95
Ala Gly Val Pro Ala Val Thr Ser Ala Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly 
100                 105                 110 
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 
115                 120 
<210>  31
<211>  342
<212>  DNA
<213>  human
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(342)
<223> 
<400>  31
gac atc cag ttg acc cag tct cca gac tcc ctg gct gtg tct ctg ggc       48
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
1               5                   10                  15
gag agg gcc acc atc aac tgc aag tcc agc cag agt gtt tta tac agc       96
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 
20                  25                  30
tcc aac aat aag aac tac tta gct tgg tac cag cag aaa cca gga cag      144
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 
35                  40                  45
cct cct aag ctg ctc att tac tgg gca tct acc cga gaa tct ggg gtc      192
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 
50                  55                  60
cct gac cgg ttc agt ggc agc ggg tct ggg aca gat ttc act ctc acc      240
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 
65                  70                  75                  80
atc agc agc ctg cag gtt gaa gat gtg gca gtg tat tat tgt cag caa      288
Ile Ser Ser Leu Gln Val Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 
85                  90                  95
tat tat act tat tcc ctc act ttc ggc gga ggg acc aag ctg gag atc      336
Tyr Tyr Thr Tyr Ser Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 
100                 105                 110 
aaa ggc                                                              342
Lys Gly 
<210>  32
<211>  114
<212>  PRT
<213>  human
<400>  32
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 
20                  25                  30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 
35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 
50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Val Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 
85                  90                  95
Tyr Tyr Thr Tyr Ser Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 
100                 105                 110 
Lys Gly 
<210>  33
<211>  357
<212>  DNA
<213>  human
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(357)
<223> 
<400>  33
cag gtg acc ttg aag gag tct ggt cct gcg ctg gtg aaa tcc aca cag       48
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Ser Thr Gln 
1               5                   10                  15
acc ctc acg ctg acc tgc aac ttg tct ggt ttc tct gtt aac act aga       96
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Asn Leu Ser Gly Phe Ser Val Asn Thr Arg 
20                  25                  30
gga gtg ggt gtg ggc tgg ctc cgt cag ccc cca gga aag gcc ctg gag      144
Gly Val Gly Val Gly Trp Leu Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 
35                  40                  45
tgg ctt gct atg att tat tgg gat gat gat agg cgc tac agt cca tac      192
Trp Leu Ala Met Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Arg Arg Tyr Ser Pro Tyr 
50                  55                  60
gtg aaa gac agg atc tcc ctc acc agg gac atc tcc aaa acc cag gtg      240
Val Lys Asp Arg Ile Ser Leu Thr Arg Asp Ile Ser Lys Thr Gln Val 
65                  70                  75                  80
gtc ctt aca atg acc aac atg gag cct gcc gac aca ggc aca tat tac      288
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Glu Pro Ala Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr 
85                  90                  95
tgt gca cgc gac tac aat cct cgg tct ttt gat cac tgg ggc cag gga      336
Cys Ala Arg Asp Tyr Asn Pro Arg Ser Phe Asp His Trp Gly Gln Gly 
100                 105                 110 
acc ctg gtc acc gtc tcc tca                                          357
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
115 
<210>  34
<211>  119
<212>  PRT
<213>  human
<400>  34
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Ser Thr Gln 
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Asn Leu Ser Gly Phe Ser Val Asn Thr Arg 
20                  25                  30
Gly Val Gly Val Gly Trp Leu Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 
35                  40                  45
Trp Leu Ala Met Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Arg Arg Tyr Ser Pro Tyr 
50                  55                  60
Val Lys Asp Arg Ile Ser Leu Thr Arg Asp Ile Ser Lys Thr Gln Val 
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Glu Pro Ala Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr 
85                  90                  95
Cys Ala Arg Asp Tyr Asn Pro Arg Ser Phe Asp His Trp Gly Gln Gly 
100                 105                 110 
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
115 
<210>  35
<211>  336
<212>  DNA
<213>  human
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(336)
<223> 
<400>  35
aat ttt atg ctg act cag ccc ccc tcg gcg tct ggg acc ccc ggg cag       48
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 
1               5                   10                  15
acg gtc tcc atc tct tgt tct gga agc gac tcc aac atc gga act tat       96
Thr Val Ser Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asp Ser Asn Ile Gly Thr Tyr 
20                  25                  30
act gtt aac tgg tac cag caa ctc cca gga acg gcc ccc aaa ctc ctc      144
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 
35                  40                  45
atc tat agc aat gat cag cgg ccc tca ggg gtc cct gac cga ttc tct      192
Ile Tyr Ser Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 
50                  55                  60
ggc tcc aag tct ggc acc tca gcc tcc ctg gcc atc agt ggg ctg cag      240
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln 
65                  70                  75                  80
tcc gag gat gag gct gat tat cac tgt gca gca tgg gat gcc aat ttg      288
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr His Cys Ala Ala Trp Asp Ala Asn Leu 
85                  90                  95
tat ggc cat gtg gta ttc ggc gga ggg acc aag gtg gaa atc aaa ggc      336
Tyr Gly His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly 
100                 105                 110 
<210>  36
<211>  112
<212>  PRT
<213>  human
<400>  36
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 
1               5                   10                  15
Thr Val Ser Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asp Ser Asn Ile Gly Thr Tyr 
20                  25                  30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 
35                  40                  45
Ile Tyr Ser Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 
50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln 
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr His Cys Ala Ala Trp Asp Ala Asn Leu 
85                  90                  95
Tyr Gly His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly 
100                 105                 110 
<210>  37
<211>  357
<212>  DNA
<213>  human
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(357)
<223> 
<400>  37
cag gtg cag ctg gtg gag act ggg gga ggc ttg gtc cag cct ggg ggg       48
Gln Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
1               5                   10                  15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tca gga ctc agc ttt agt aac tat       96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Ser Phe Ser Asn Tyr 
20                  25                  30
gcg atg agc tgg gtc cgc cag gct cca gga aag ggg ctg gag tgg gtc      144
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
35                  40                  45
tca act atc agt aat agt ggt gat aac aca ctc tac cca gac tcc gtg      192
Ser Thr Ile Ser Asn Ser Gly Asp Asn Thr Leu Tyr Pro Asp Ser Val 
50                  55                  60
aag ggc cgg ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aga gac aca cta tat      240
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asp Thr Leu Tyr 
65                  70                  75                  80
ctg cac ttg agt ggc ctg gga gcc gag gac acg gcc att tac tac tgt      288
Leu His Leu Ser Gly Leu Gly Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 
85                  90                  95
gcg aac gcc cca cca tac act cac tac ttt gac cag tgg ggc cag gga      336
Ala Asn Ala Pro Pro Tyr Thr His Tyr Phe Asp Gln Trp Gly Gln Gly 
100                 105                 110 
acc ctg gtc acc gtc tcc tca                                          357
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
115 
<210>  38
<211>  119
<212>  PRT
<213>  human
<400>  38
Gln Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Ser Phe Ser Asn Tyr 
20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
35                  40                  45
Ser Thr Ile Ser Asn Ser Gly Asp Asn Thr Leu Tyr Pro Asp Ser Val 
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asp Thr Leu Tyr 
65                  70                  75                  80
Leu His Leu Ser Gly Leu Gly Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 
85                  90                  95
Ala Asn Ala Pro Pro Tyr Thr His Tyr Phe Asp Gln Trp Gly Gln Gly 
100                 105                 110 
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
115 
<210>  39
<211>  342
<212>  DNA
<213>  human
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(342)
<223> 
<400>  39
gac atc cgg ttg acc cag tct cca gac tcc ctg gct gtg tct ctg ggc       48
Asp Ile Arg Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
1               5                   10                  15
gag agg gcc acc atc aac tgc aag tcc agt cag agt att tta tac aga       96
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Arg 
20                  25                  30
tac aac agt aac aac tac tta gct tgg tac cag cag aaa cca gga cag      144
Tyr Asn Ser Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 
35                  40                  45
cct cct aag ttg ctc att tac tgg gca tct acc cgg gaa tcc ggg gtc      192
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 
50                  55                  60
cct gac cga ttc agt ggc agc ggg tct ggg aca gat ttc act ctc acc      240
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 
65                  70                  75                  80
atc agc agt ctg cag gct gaa gat gtg gca gtt tat tac tgt cag caa      288
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 
85                  90                  95
tat tac agt act cct cag acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc      336
Tyr Tyr Ser Thr Pro Gln Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 
100                 105                 110 
aaa ggc                                                              342
Lys Gly 
<210>  40
<211>  114
<212>  PRT
<213>  human
<400>  40
Asp Ile Arg Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Arg 
20                  25                  30
Tyr Asn Ser Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 
35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 
50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 
85                  90                  95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Gln Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 
100                 105                 110 
Lys Gly 
<210>  41
<211>  366
<212>  DNA
<213>  human
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(366)
<223> 
<400>  41
cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc ctg gtc aag cct ggg ggg       48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 
1               5                   10                  15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc act ggg ttc agt ttc aga cat tat       96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Thr Gly Phe Ser Phe Arg His Tyr 
20                  25                  30
ggc atg aac tgg gtc cgc cag gcc cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtc      144
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
35                  40                  45
tcg tac att agt gat agt agc agc cac atc tac tac gca gac tcc gtg      192
Ser Tyr Ile Ser Asp Ser Ser Ser His Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
50                  55                  60
agg ggc cga ttc agc atc tcc aga gac aac gcc aag gac tca ctg ttt      240
Arg Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Ser Leu Phe 
65                  70                  75                  80
ctg gaa gtg aac agc ctg aga ccc ggg gac acg gct gct tat tac tgt      288
Leu Glu Val Asn Ser Leu Arg Pro Gly Asp Thr Ala Ala Tyr Tyr Cys 
85                  90                  95
gcg aga gat acg ggc acc tat gcc cgc atg tcc ggt atg gac gtc tgg      336
Ala Arg Asp Thr Gly Thr Tyr Ala Arg Met Ser Gly Met Asp Val Trp 
100                 105                 110 
ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca                              366
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
115                 120 
<210>  42
<211>  122
<212>  PRT
<213>  human
<400>  42
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Thr Gly Phe Ser Phe Arg His Tyr 
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
35                  40                  45
Ser Tyr Ile Ser Asp Ser Ser Ser His Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
50                  55                  60
Arg Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Ser Leu Phe 
65                  70                  75                  80
Leu Glu Val Asn Ser Leu Arg Pro Gly Asp Thr Ala Ala Tyr Tyr Cys 
85                  90                  95
Ala Arg Asp Thr Gly Thr Tyr Ala Arg Met Ser Gly Met Asp Val Trp 
100                 105                 110 
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
115                 120 
<210>  43
<211>  321
<212>  DNA
<213>  human
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(321)
<223> 
<400>  43
gat att gtg ctg acg cag act cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga       48
Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
1               5                   10                  15
gac aga gtc acc atc act tgc cgg gcc agt cag agt att agt gac tgg       96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Trp 
20                  25                  30
ttg gcc tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc      144
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
35                  40                  45
tat aag gcg tct agt tta gaa agt ggg gtc ccg tca agg ttc agc ggc      192
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
50                  55                  60
agt gga tct ggg aca gag ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag cct      240
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
65                  70                  75                  80
gat gat ttt gca act tat tac tgc caa caa tat aat agt tac ttc act      288
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Phe Thr 
85                  90                  95
ttc ggc cct ggg acc aaa gtg gat atc aaa ggc                          321
Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Gly 
100                 105 
<210>  44
<211>  107
<212>  PRT
<213>  human
<400>  44
Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Trp 
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
35                  40                  45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
65                  70                  75                  80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Phe Thr 
85                  90                  95
Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Gly 
100                 105 
<210>  45
<211>  363
<212>  DNA
<213>  human
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(363)
<223> 
<400>  45
cag gtg cag ctg cag cag tgg ggc gca ggg ctg gtg aag cct tcg gag       48
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 
1               5                   10                  15
acc ctg tcc ctc acc tgc gct atc tat ggt ggg tcc ttc agt tct tac       96
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Tyr 
20                  25                  30
tac tgg aac tgg atc cgc cag ccc cca ggg aag gga ctg gag tgg att      144
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 
35                  40                  45
ggg gaa atc aat cat agt gga ggc acc aac tac aac ccg tcc ctc aag      192
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 
50                  55                  60
agt cga gtc acc ata tca ctt gac atg tcc aag aac cac ttc tcc ctg      240
Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Met Ser Lys Asn His Phe Ser Leu 
65                  70                  75                  80
aac ctg aac tct gtg acc gcc gcg gac acg gct gtc tat tat tgt gcg      288
Asn Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 
85                  90                  95
aga gat gct ggt aac cgg ggg tct acg gac tgg ttc gac ccc tgg ggc      336
Arg Asp Ala Gly Asn Arg Gly Ser Thr Asp Trp Phe Asp Pro Trp Gly 
100                 105                 110 
cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca                                  363
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
115                 120 
<210>  46
<211>  121
<212>  PRT
<213>  human
<400>  46
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Tyr 
20                  25                  30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 
35                  40                  45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 
50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Met Ser Lys Asn His Phe Ser Leu 
65                  70                  75                  80
Asn Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 
85                  90                  95
Arg Asp Ala Gly Asn Arg Gly Ser Thr Asp Trp Phe Asp Pro Trp Gly 
100                 105                 110 
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
115                 120 
<210>  47
<211>  324
<212>  DNA
<213>  human
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(324)
<223> 
<400>  47
gac atc cgg atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga       48
Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
1               5                   10                  15
gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag ggc att aga aat gat       96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 
20                  25                  30
tta ggc tgg tat cag cag aga cca ggg aaa gcc ccg aat ctc ctg atc      144
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile 
35                  40                  45
tat gct gca tcc act tta caa agt ggg gtc cca tca aga ttc agc ggc      192
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
50                  55                  60
agt gga tcc ggc aca gat ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag cct      240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
65                  70                  75                  80
gaa gat tct gca act tat tac tgt cta caa gat tac gct tac cca cgg      288
Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Ala Tyr Pro Arg 
85                  90                  95
acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa ggc                      324
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly 
100                 105 
<210>  48
<211>  108
<212>  PRT
<213>  human
<400>  48
Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 
20                  25                  30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile 
35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Ala Tyr Pro Arg 
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly 
100                 105 
<210>  49
<211>  37
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  49
agcgcggcct ctagacaggt gcagctgcag gagtcsg                    37
<210>  50
<211>  36
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  50
agcgcggcct ctagacaggt acagctgcag cagtca                     36
<210>  51
<211>  37
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  51
agcgcggcct ctagacaggt gcagctacag cagtggg                    37
<210>  52
<211>  36
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  52
agcgcggcct ctagagaggt gcagctgktg gagwcy                     36
<210>  53
<211>  38
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  53
agcgcggcct ctagacaggt ccagctkgtr gagtctgg                   38
<210>  54
<211>  37
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  54
agcgcggcct ctagacagrt caccttgaag gagtctg                    37
<210>  55
<211>  38
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  55
agcgcggcct ctagacaggt gcagctggtg sartctgg                   38
<210>  56
<211>  23
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  56
gacatccrgd tgacccagtc tcc                                   23
<210>  57
<211>  23
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  57
gaaattgtrw tgacrcagtc tcc                                   23
<210>  58
<211>  23
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  58
gatattgtgm tgacbcagwc tcc                                   23
<210>  59
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  59
gaaacgacac tcacgcagtc tc                                    22
<210>  60
<211>  23
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  60
cagtctgtsb tgacgcagcc gcc                                   23
<210>  61
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  61
tcctatgwgc tgacwcagcc ac                                    22
<210>  62
<211>  23
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  62
tcctatgagc tgayrcagcy acc                                   23
<210>  63
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  63
cagcctgtgc tgactcaryc                                       20
<210>  64
<211>  23
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  64
cagdctgtgg tgacycagga gcc                                   23
<210>  65
<211>  23
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  65
cagccwgkgc tgactcagcc mcc                                   23
<210>  66
<211>  23
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  66
tcctctgagc tgastcagga scc                                   23
<210>  67
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  67
cagtctgyyc tgaytcagcc t                                     21
<210>  68
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  68
aattttatgc tgactcagcc cc                                    22
<210>  69
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  69
cattgaggag acrgtgacca gggtg                                 25
<210>  70
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  70
cattgaggag acggtgacca gggtt                                 25
<210>  71
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  71
cattgaagag acggtgacca ttgt                                  24
<210>  72
<211>  26
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  72
cattgaggag acggtgaccg tggtcc                                26
<210>  73
<211>  23
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  73
catggttggg gcggatgcac tcc                                   23
<210>  74
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  74
catsgatggg cccttggtgg argc                                  24
<210>  75
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  75
tttgatttcc accttggtcc                                       20
<210>  76
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  76
tttgatctcc ascttggtcc                                       20
<210>  77
<211>  19
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  77
ttgatatcca ctttggtcc                                        19
<210>  78
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  78
tttaatctcc agtcgtgtcc                                       20
<210>  79
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  79
taggacggts ascttggtcc                                       20
<210>  80
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  80
gaggacggtc agctgggtgc                                       20
<210>  81
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  81
ggacacggcc gtrtattact gt                                    22
<210>  82
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  82
ggacayggcc atgtattact gt                                    22
<210>  83
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  83
atcagywgns tgsarsctga rgat                                  24
<210>  84
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  84
atcaatwgns tgsarsctga rgat                                  24
<210>  85
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  85
gaygaggctg actattactg t                                     21
<210>  86
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  86
gatgaatctg attattactg t                                     21
<210>  87
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  87
gatgaggctg agtatcattg t                                     21
<210>  88
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  88
gatgagagtg actaccactg t                                     21
<210>  89
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  89
acagtaatay acggccgtgt cc                                    22
<210>  90
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  90
acagtaatac atggccrtgt cc                                    22
<210>  91
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  91
atcytcagsy tscasncwrc tgat                                  24
<210>  92
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  92
atcytcagsy tscasncwat tgat                                  24
<210>  93
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  93
acagtaatag tcagcctcrt c                                     21
<210>  94
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  94
acagtaataa tcagattcat c                                     21
<210>  95
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  95
acaatgatac tcagcctcat c                                     21
<210>  96
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  96
acagtggtag tcactctcat c                                     21
<210>  97
<211>  29
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  97
tgtgatggct tccatgtcgg cagaatgct            29
<210>  98
<211>  31
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer
<400>  98
gctaaacaac tttcaacagt ctatgcggca c         31
【図１】
2007306828.tif 000003
【図４】
2007306828.tif 000004
【図６】
2007306828.tif 000005
【図７】
2007306828.tif 000006
【図８】
2007306828.tif 000007
【図９】
2007306828.tif 000008
【図２】
2007306828.tif 000009
【図３】
2007306828.tif 000010
【図５】
2007306828.tif 000011