(57)【要約】【課題】  抗血栓性に優れる人工血管を製造するための人工血管用材料を提供する。【解決手段】  ヒト血管内皮細胞により被覆されたマイナス電荷を有するハイドロゲルである人工血管用材料であって、前記ハイドロゲルがポリ（ｐ−スチレンスルホン酸ナトリウム）又はポリ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸ナトリウム）である、前記人工血管用材料。  本発明の生体適合材料は、血液適合性として重要な特性である抗血栓性に優れており、人工血管、特に口径が6mm以下の人工毛細血管の製造に好適に使用し得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト血管内皮細胞により被覆されたマイナス電荷を有するハイドロゲルである人工血管用材料であって、前記ハイドロゲルがポリ（ｐ−スチレンスルホン酸ナトリウム）又はポリ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸ナトリウム）である、前記人工血管用材料。
【請求項２】
コンフルエントに増殖したヒト血管内皮細胞に被覆されたハイドロゲルである、請求項１に記載の人工血管用材料。
【請求項３】
人工血管が口径６ｍｍ以下の人工毛細血管である、請求項１又は２に記載の人工血管用材料。
【請求項４】
ヒト血管内皮細胞により被覆されたマイナス電荷を有するハイドロゲルである人工血管用材料の製造方法であって、ポリ（ｐ−スチレンスルホン酸ナトリウム）又はポリ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸ナトリウム）からなる薄膜にヒト血管内皮細胞を播種する工程、播種したヒト血管内皮細胞を培養してハイドロゲルを被覆する工程を含む、前記製造方法。
【請求項５】
播種したヒト血管内皮細胞を培養する工程が、Transforming growth factor-b (TGF-β)を含む培地を用いて播種したヒト血管内皮細胞を培養する工程である、請求項４に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト血管内皮細胞によって被覆された、抗血栓性に優れた人工血管用材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、先端医療の分野において注目を集めている再生医療において利用される人工臓器に求められる基本特性の一つは、いわゆる血液適合性である。特に人工血管の血液適合性の向上は、施術後の人工血管内において血栓を発生させないために特に重要である。
【０００３】
主に高分子材料から構成される人工臓器の血液適合性を高める手段として、高分子材料の表面を高分子グラフト鎖またはantithrombogenic mediatorなどで修飾する方法が知られている（非特許文献１）。しかし、これらの修飾された高分子材料から構成される人工臓器の多くは、その血液適合性が時間に伴って低下するという問題を有している。また、人工血管、特に血管内径が６ｍｍ以下の人工血管への前記のような表面修飾の適用は、依然として血栓の発生という問題を解決できない。
【０００４】
血栓は、ポリエステル性の線維や伸展性の４塩化フッ素化合物などの代表的な原料から人工血管を、特に小口径（内径が約０．５ｍｍ〜約５ｍｍ）の人工血管を成形した場合によく認められる現象である。小口径人工血管では、口径が小さいために血流速度を十分に確保することが難しく、人工血管表面に形成される血栓による閉塞、或いは極端な組織の過形成による狭窄等による閉塞などの発生が報告されている。
【０００５】
生体組織に近い構造を持つ人工臓器を開発することにより、当該臓器の生体適合性、特に血液適合性の向上が期待されることから、人工血管用材料の表面を内皮細胞で被覆することによって、人工血管に抗血栓性を付与することが試みられている。
【０００６】
移植後の人工血管内壁の内皮化を促進する試みとして、合成ポリマーと生体適合性材料とを複合化させて人工血管を製造する方法が報告されている。例えば、ポリエステルとゼラチン又は低温不溶性グロブリンとからなる人工血管(非特許文献２)、ポリエステルとフィブロネクチンあるいはＥＣＧＦ(内皮細胞成長因子)とを複合化した人工血管(非特許文献３)等が提案されている。
【０００７】
また、内皮化を促進する因子を人工血管自身から供給させる技術も報告されている。例えば、多孔質高分子化合物の管壁の孔内、内面および外面の全体もしくは一部分に、血管内皮細胞を刺激誘引する物質を、生体分解性ポリマーに分散して複合化した人工血管（特許文献１）などがある。
【０００８】
しかしながらこの試みは、移植後の人工血管と生体血管との吻合部から伸展してくる内皮を対象としているため、人工血管が長くなるに従い内皮化が遅れる、吻合部からの内皮伸展には限界があり途中で内皮化が止まってしまう等の問題も指摘されている。また、内皮化を促進させる因子の供給は初期血栓を重篤にし、結果として内皮化以前に人工血管が閉塞するという問題も指摘されている。
【０００９】
これらの移植後の内皮化を促進させるという試みとは別の血栓防止技術として、移植に先立っての人工血管内壁の内皮化（endothelialization）がある。これは、移植前の人工血管内壁に血管内皮細胞を予め増殖させ、同細胞の単層からなる内皮を形成させることで人工血管に抗血栓性を持たせようとする試みである。
【００１０】
例えば、平滑筋を含有し、血管内皮細胞の層を内腔面上に形成できるような平滑な内腔面を有する人工的な筒状物質を形成したハイブリッド型人工血管モデル（非特許文献４、非特許文献５）などが提唱されている。しかしこの人工血管は機械的強度が非常に低く、移植時の取り扱い操作で容易に壊れたり、移植後も血圧によって破裂したりするなどの問題を有している。
【００１１】
また、生分解性又は非生分解性の筒状の構造体に平滑筋細胞を含有させた培養溶液を直接播種させ、これによって内腔面が平滑になるまで培養させた後に血管内皮細胞を播種させるモデルも提唱されている（非特許文献６、特許文献２）。
【００１２】
この人工血管は機械的強度に優れるという特徴を有するが、生分解性又は非生分解性の筒状構造体は疎水性が強く、細胞の接着および増殖が著しく悪いため、平滑筋細胞を培養させるのに数ヶ月という長時間を要する上に、その増殖密度が不十分で筒状構造体の隙間から血液が漏れるおそれのあるものであった。
【００１３】
また、ポリエステルとコラーゲンの複合化人工血管に血管内皮細胞を播種した人工血管(特許文献３)などがあるが、移植後の血管内皮細胞の定着性について問題が指摘されている。
【００１４】
水に対する界面張力が１〜３dyn/cm以下であるハイドロゲルのような親水性ポリマー表面が抗血栓性に優れていることは、既に報告されている（非特許文献７）。しかしながら一方で、親水性ポリマーのみでは必ず抗血栓性の向上には役立たず、適度に疎水性ポリマーが共存した親水―疎水の２親性ポリマーが抗血栓性を示すなど、ハイドロゲルの表面特性と抗血栓性との相関関係に関しては、まだ不明な点が多い。
【００１５】
以上の様に、血管内皮細胞で覆われた材料からなる人工血管の開発が盛んに行われている。しかしながら、血管内皮細胞による被覆が必ずしも抗血栓性を獲得するとは限らないのが現状である。
【００１６】
血管内皮細胞は、種々の生理活性物質や細胞外基質を生産して、血小板の活性化反応を制御する役割を果たしている。例えば、内皮細胞表面に発現したproteoclycan（heparin sulfate proteoclycan）が血液中の抗トロンビンantithrombin III (AT III)と結合して、トロンビンを不活性化させる。また、内皮細胞が生産されたendothelium derived relaxing factor (EDRF)は血小板凝集抑制作用があると報告された。一方、内皮細胞はvon Willebrand 因子、fibronectinなどの細胞外基質を生産して、血小板の粘着足場として提供し、そして、内皮細胞より放出されるADPは血小板凝集を引き起すものと考えられる。内皮細胞は、これらの物質の生産をコントロールしながら、結果的に抗血栓性を示しており、正常な内皮細胞表面では、血小板は粘着、凝集を起さない。しかし、血液中の様々な化学物質、あるいは物理的なストレスに内皮細胞の機能に障害をきたすようになると、血小板機能制御のバランスが崩れ、血小板を活性化され、血栓を形成、さらに動脈硬化の原因となりうる。このように血管内皮細胞と血小板の相互作用が一連の複雑な生化学反応に関連するため、血管内皮細胞による人工的な材料表面の被覆によって常に抗血栓性が獲得されるとは限らないのである。よって、依然として、血液適合性に優れる人工血管の開発は必要である。
【非特許文献１】片岡一則編  生命材料工学  １９９１年、３８項、裳華房
【非特許文献２】ゴブレビッチ(Ｇovrebitich)ら、バイオマテリアル(Ｂiomaterials)、１９８８年、第９巻、第９号、第９７頁
【非特許文献３】グライスラー(Ｇreisler)ら、１９８７年、ジャーナル・オブ・バスキュラー・サージュリー(Ｊ．Ｖasc．Ｓurg)、第５２巻、第３９３頁
【非特許文献４】ワインバーグら（Weinberg et al.）、サイエンス（ Science）、１９８６年、第２３１巻、第３９７−４００頁
【非特許文献５】ヒライら（Hirai et al.）、ASAIO journal、１９９４年、３８３−３８８頁
【非特許文献６】ニクラソンら（Niklason et al.）、１９９９年、サイエンス（ Science）、 第２８４巻、 第４８９−４９３頁
【非特許文献７】片岡一則編  生命材料工学  １９９１年、３２項、裳華房
【特許文献１】特開平５−７６５８８
【特許文献２】特開２００１-７８７５０号公報
【特許文献３】特開平１−１７０４６７号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、特に毛細血管として利用可能な抗血栓性に優れる人工血管を形成し得る生体適合材料を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、マイナス電荷を持つハイドロゲルであるポリ（ｐ−スチレンスルホン酸ナトリウム）又はポリ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸ナトリウム）を選択し、これをヒト血管内皮細胞、好ましくはさい帯静脈血管内皮細胞(HUVECs)で被覆することによって、高い抗血栓性を有する人工血管、特に口径の小さい人工血管を製造するための生体適合材料を提供し得ることを見いだし、以下の各発明を完成した。
【００１９】
（１）ヒト血管内皮細胞により被覆されたマイナス電荷を有するハイドロゲルである人工血管用材料であって、前記ハイドロゲルがポリ（ｐ−スチレンスルホン酸ナトリウム）又はポリ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸ナトリウム）である、前記人工血管用材料。
【００２０】
（２）コンフルエントに増殖したヒト血管内皮細胞に被覆されたハイドロゲルである、（１）に記載の人工血管用材料。
【００２１】
（３）人工血管が口径６ｍｍ以下の人工毛細血管である、（１）又は（２）に記載の人工血管用材料。
【００２２】
（４）ヒト血管内皮細胞により被覆されたマイナス電荷を有するハイドロゲルである人工血管用材料の製造方法であって、ポリ（ｐ−スチレンスルホン酸ナトリウム）又はポリ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸ナトリウム）からなる薄膜にヒト血管内皮細胞を播種する工程、播種したヒト血管内皮細胞を培養してハイドロゲルを被覆する工程を含む前記製造方法。
【００２３】
（５）播種したヒト血管内皮細胞を培養する工程が、Transforming growth factor-b (TGF-β)を含む培地を用いて播種したヒト血管内皮細胞を培養する工程である、（４）に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の生体適合材料は、血液適合性として重要な特性である抗血栓性に優れており、人工血管、特に口径が6mm以下の人工毛細血管の製造に好適に使用し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明の生体適合材料は、マイナス電荷を有するハイドロゲルであるポリ（ｐ−スチレンスルホン酸ナトリウム）又はポリ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸ナトリウム）の表面がヒト血管内皮細胞により、特にコンフルエントにまで増殖させたヒト血管内皮細胞により被覆されたものである。
【００２６】
ポリ（ｐ−スチレンスルホン酸ナトリウム）（poly (sodium p-styrene sulfonate)、以下PNaSSと表す）又はポリ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸ナトリウム）（poly (2-acrylamido-2-methyl-1-propanesulfonic sodium)、以下PNaAMPSと表す）は、それぞれ以下の構造式Ｉ（PNaSS）、ＩＩ（PNaAMPs）で示すことが出来る、マイナス電荷を有するハイドロゲルである。
【化１】
2007307300.tif 000002
【化２】
2007307300.tif 000003
【００２７】
かかるハイドロゲルは、Chen Y M らの方法（文献Chen Y M, Shiraishi N, Satokawa H, Kakugo K, Narita T, Gong J P, Osada Y, Yamamoto K, Ando J. Biomaterials 2005；26：4588-4596）に従い、それぞれのモノマー溶液、すなわちｐ−スチレンスルホン酸ナトリウム溶液又は２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸ナトリウム溶液に適当なＵＶ開始剤と架橋剤とを加え、ラジカル重合させることによって調製することが出来る。
【００２８】
ＵＶ開始剤は、2-Oxoglutaric acidを利用可能することができる。また架橋剤はN, N’- methylenebis(acrylamide) (MBAA)を利用することが出来る。
【００２９】
上記モノマーのラジカル重合反応自体は格別な反応条件を必要とするものではなく、前記Chen Y Mらの方法における反応条件に従えばよい。例えば、反応温度は20℃〜30℃、反応時間は6〜10時間、前記ＵＶ開始剤の添加量は0.1mol%、架橋剤の添加量は2mol%〜10mol%の各範囲から、使用するモノマー、ＵＶ開始剤や架橋剤の種類などに応じて適宜決定すればよい。また、ラジカル反応を行うに際して、不活性化ガスを用いたバブリングなどによってモノマー溶液の溶存酸素を不活性化ガスに置換することが望ましい。
【００３０】
本発明の材料を用いて人工血管を製造するためには、調製するハイドロゲルの形態を平板状又は円盤状の薄膜とすることが好ましい。その様な形態のハイドロゲルは、例えば、適当な間隔を空けた２枚のガラス板の間にモノマー溶液を充填してラジカル重合を行わせるなどの方法によって、容易に調製することが出来る。また薄膜の厚みは、0.1mm〜10mm、好ましくは0.2mm〜5mm、より好ましくは0.5mm〜3mmとすればよい。
【００３１】
さらに、上記の様に調製したハイドロゲルは、そのまま後に説明するヒト血管内皮細胞による被覆を行っても良いが、ヒト血管内皮細胞による被覆操作に好適な適当な緩衝液中又は培養液中でハイドロゲルを膨潤させ、ゲル中の溶媒を交換することが好ましい。この溶媒交換によって、ヒト血管内皮細胞を用いた被覆をより密に行うことが出来る。好適な緩衝液としては、実施例で使用されるHEPES緩衝液の他、PBS等を挙げることができる。また培地としては、ヒト血管内皮細胞の培養に好適な培地であればよく、Humedia-EB2 medium(KURSBO Biomed. Bus., Tokyo, Japan),  Medium-199 (GIBCO BRL Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD), Modified Eagle's Medium （MEM）(GIBCO BRL Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD), Dulbecco’s  Modified Eagle’s Medium（DMEM）(GIBCO BRL Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD), 等を挙げることができる。なお、ヒト血管内皮細胞を用いた被覆に先立って、ＵＶ滅菌、オートクレーブ滅菌その他の方法によってハイドロゲルを滅菌しておくことが望ましい。
【００３２】
上記のようにして調製したハイドロゲルのヒト血管内皮細胞による被覆は、適当な容器に置いた該ハイドロゲルに適当な個数のヒト血管内皮細胞を含む細胞懸濁液を加え、該細胞を培養する、特にヒト血管内皮細胞をコンフルエントにまで培養することによって達成することが出来る。
【００３３】
本発明で使用するヒト血管内皮細胞は、ヒト由来であればいずれの血管内皮細胞であってもよいが、特にヒトのさい帯静脈から回収される血管内皮細胞であるHUVECsを用いることが好ましい。
【００３４】
ヒト血管内皮細胞は、Humedia-EB2 medium(KURSBO Biomed. Bus., Tokyo, Japan),  Medium-199 (GIBCO BRL Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD), Modified Eagle's Medium （MEM）(GIBCO BRL Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD), Dulbecco’s  Modified Eagle’s Medium（DMEM）(GIBCO BRL Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD),などの、ヒト血管内皮細胞の増殖に好適な培地に懸濁して使用すればよい。特に、人工血管の移植を必要としている患者自身の血管から回収されるヒト血管内皮細胞を利用してハイドロゲルを被覆することによって、当該患者に対して自家移植的な人工血管を提供することが可能となる。
【００３５】
上記のようにして調製したヒト血管内皮細胞のハイドロゲル上での培養は、ハイドロゲル単位面積（ｃｍ２）当たり1×１０４〜1×１０６  個のヒト血管内皮細胞を播種し、標準的なヒト血管内皮細胞の培養条件下にハイドロゲルを置くことで行うことが出来る。典型的な培養条件は、培養温度が20℃〜40℃、1% 〜10%のＣＯ２雰囲気、培養時間は6時間〜168時間である。
【００３６】
上記の方法で製造されるヒト血管内皮細胞によって被覆されたハイドロゲルは、後に詳細に説明する試験例に示されるとおりの優れた抗血栓性を有しており、人工血管、特にこれまでヒト血管内皮細胞による被覆だけでは抗血栓性を獲得することのできなかった孔径6mm以下の微細な人工血管を製造するための材料として利用することができる。
【００３７】
さらに本発明は、上記に説明した人工血管用材料の製造方法、特に高い抗血栓性を有する人工血管用材料を製造する方法を提供する。具体的には、本発明の方法は、ヒト血管内皮細胞により被覆されたマイナス電荷を有するハイドロゲルである人工血管用材料の製造方法であって、ポリ（ｐ−スチレンスルホン酸ナトリウム）又はポリ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸ナトリウム）からなる薄膜にヒト血管内皮細胞を播種する工程、播種したヒト血管内皮細胞を培養する工程を含む前記製造方法である、特に本発明は、前記播種したヒト血管内皮細胞を培養する工程が、Transforming growth factor-b (TGF-β)を含む培地を用いて播種したヒト血管内皮細胞を培養する工程である、人工血管用材料の製造方法に関する。
【００３８】
TGF-βは、細胞増殖や分化、アポトーシス、遊走、細胞外マトリックスの産生と分解などを調節することが知られているサイトカイン（細胞の働きを調節する分泌性蛋白の一種）であり、内皮細胞表面のプロテオグリカン（proteoglycans、PGs）の合成を促進させることが報告されている(Kaji Tら、J. Biol. Chem.、２０００年、第２７５巻、第１４６３−１４７０頁)。本発明の方法はこのTGF-βの生理活性を利用するものである。さらに本発明は、上記に説明した人工血管用材料の製造方法、特に高い抗血栓性を有する人工血管用材料を製造する方法を提供する。推論ではあるが、TGF-βの作用によって内皮細胞表面に発現したPGｓであるheparin sulfate proteoclycanが、血液中の抗トロンビン（antithrombin III）と結合してトロンビンを不活性化させ、抗血栓性が向上すると思われる。
【００３９】
よって本発明においては、上記のプロテオグリカン合成促進能を有するTGF-βであればいずれも利用可能である。かかるTGF-βは、試薬として市販されている他、TGF-βをコードする公知の遺伝子を用いた遺伝子工学的手法によって、組み換え蛋白質として調製されるTGF-β等であってもよい。ヒト血管内皮細胞の増殖に使用する培地へのTGF-βの添加量は、1ng/ml〜50ng/mlの範囲で適宜調節すればよい。また、前記培地はHumedia-EB2 medium(KURSBO Biomed. Bus., Tokyo, Japan),  Medium-199 (GIBCO BRL Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD), Modified Eagle's Medium （MEM）(GIBCO BRL Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD), Dulbecco’s  Modified Eagle’s Medium（DMEM）(GIBCO BRL Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) などのヒト血管内皮細胞の増殖に好適な培地であればよい。
【００４０】
本発明の人工血管用材料は、ヒト血管内皮細胞によって被覆した面と反対側の面を血管平滑筋細胞で被覆することによって細胞外マトリックスを産生させ、さらに生体適合性に優れる人工血管用材料とすることもできる。
【００４１】
本発明の人工血管材料を用いて人工血管を製造するには、薄膜状の本発明の人工血管用材料を所望の内径を有する筒状に成形すればよい。このとき、網目構造を有する筒状構造体、例えばステンレスメッシュチューブあるいはテフロン（登録商標）やポリウレタンなどからなるポリマーメッシュチューブなどの外側を覆うようにして薄膜状の本発明の材料を巻くことで、筒状に成形してもよい。あるいは本発明の材料を例えばステンレスメッシュシートあるいはテフロン（登録商標）やポリウレタンなどからなるポリマーメッシュシートなどに密着させたシートを丸めて筒状に成形してもよい。
【００４２】
前記網目構造を有する筒状構造体は、上述のステンレスメッシュチューブやシートに代表されるような、例えば1μｍ 〜 5mmの大きさの細孔を有する構造体であって筒状に成形されているものであればよい。その材質、チューブ径や長さあるいは筒状の成形する前のシートの大きさは人工血管として利用可能なものであれば特に制限はないが、本発明では孔径6mm以下のサイズを選択することができる。
【００４３】
以下、非限定的な実施例により、さらに詳細に本発明を説明する。
【実施例】
【００４４】
＜実施例１＞
１）ハイドロゲルの調製
ｐ−スチレンスルホン酸ナトリウム、0.1mol%の2-Oxoglutaric acid（ＵＶ開始剤）及び4mol%〜10mol%のN, N’- methylenebisacrylamide（MBAA、架橋剤）を含む水溶液、並びに２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸ナトリウム、0.1mol%の2-Oxoglutaric acid（ＵＶ開始剤）及び2mol%〜10mol%のN, N’- methylenebisacrylamide（MBAA、架橋剤）を含む水溶液  20ｍＬを各モノマーについて調製し、窒素バブリングによって溶存酸素を窒素置換した。モノマー濃度（架橋密度）は、PNaSSは4mol%と10mol%の２種類、PNaAMPSは10mol%の１種類を用意した。
【００４５】
窒素置換後の各モノマー溶液を、10×10mm四方の２枚のガラス基板で1.5mmのシリコンスペーサーを挟んでなる鋳型に流し込んだ後、室温で６時間重合させて、架橋密度が4mol%のPNaSSゲル、架橋密度が10mol%のPNaSSゲル、架橋密度が10mol%のPNaAMPsゲルをそれぞれ得た。
【００４６】
ガラス基板から各ゲルを取り出し、1Ｌの蒸留水に一日ごと蒸留水を交換し、一週間膨潤させた後、ゲルを15.5mMのNaHCO3、140mMのNaClを含む5mMの4-(-2-hydroxyethyl)-piperazine-1- ethansulfonic acid (HEPES) 緩衝液（pH7.4）にさらに一週間置いて、ゲルの溶媒交換を行った。
【００４７】
２）HUVECsによるハイドロゲルの被覆
上記１）で溶媒交換した各ゲルをシャーレに移し、121℃、20分オートクレーブ滅菌後、各ゲルから直径15mm、厚さ1〜3mmのディスク（4mol%PNaSSディスク、10mol%PNaSSディスク、10mol%PNaAMPsディスク）を切り出した。
【００４８】
各ディスクを２４穴ＰＳディッシュに置き、その上から4×10４cell/mlのHUVECs（Human Umbilical Vein Endothelial Cells、HUVECs）懸濁液を１ml／ウェル加えた。この２４穴ＰＳディッシュを37℃、5%ＣＯ２雰囲気のインキュベータ内に置き、HUVECsを培養し、人工血管用材料を製造した。
【００４９】
＜比較例＞
架橋密度が4mol%のポリ（N',N-ジメチルアクリルアミド）（PDMAAｍ）ゲル並びに架橋密度が1mol%と架橋密度が2mol%の２種類のポリ（アクリル酸アミド）（PAA）ゲルからなる直径15mm、厚さ1〜3mmのディスク（4mol%PDMAAmディスク、1mol%PAAディスク、2mol%PAAディスク）を実施例１に記載の方法に従ってそれぞれ調製した。また、ポリエチレンテレフタレート（PET)、ポリスチレン（PS）からなる直径15mm、厚さ0.19mm, 0.78mmのディスク（PETディスクとPSディスク）を調製した。PDMAAｍは下記式３で、PAAは下記式４でそれぞれ表される構造を有するポリマーである。
【化３】
2007307300.tif 000004
【化４】
2007307300.tif 000005
【００５０】
PDMAAmディスクとPAAディスクは実施例１と同様にオートクレーブ滅菌し、PETディスクとPSディスクは75mol%アルコールに浸して滅菌した後、実施例１の２）に記載の条件下で２４穴ＰＳディッシュ内においた上記各ディスクに加えたHUVECsの培養を行って、比較サンプルを調製した。また、直接ガラス板にHUVECsを播種して増殖させたガラスディスクも用意した。
【００５１】
＜試験例１＞  HUVECsの増殖
本発明である4mol%PNaSSディスク、10mol%PNaSSディスク、10mol%PNaAMPsディスク、比較例である4mol%PDMAAmディスク、1mol%PAAディスク、2mol%PAAディスク、PETディスク、PSディスク並びにガラスディスクそれぞれにおけるHUVECsの増殖曲線を図１に示す。
【００５２】
1mol%PAAディスクならびに2mol%PAAディスクにおいて、播種したHUVECsは良好に増殖し、120時間培養後には細胞密度がサブコンフルエント（約4.5×10４ cells /cm２）にまで達した。4mol%PNaSSディスク、10mol%PNaSSディスクならびに10mol%PNaAMPsディスク上でのHUVECsの増殖は、ガラスディスクとPSディスクとほぼ同程度であった。一方、4mol%PDMAAmディスク上では、HUVECsをディスク上に播種した６時間後にHUVECsの伸展が観察され、伸展した細胞の密度はPNaAMPSディスクあるいはPNaSSディスク上で伸展した細胞の密度とほぼ同じ値を示したが、その後、HUVECsはPDMAAmディスク上では増殖できず、培養時間に伴って死滅した。
【００５３】
また、144時間培養後の各ディスク上のHUVECsを位相差顕微鏡で観察した。その結果（写真）を図２に示す。
【００５４】
＜試験例２＞  血小板粘着試験
１）ヒト血小板の調製
ヒト肘静脈より採血した血液に1/9容の3.8 mol%クエン酸ナトリウム溶液を加えて攪拌後、1200 rpmで５分間遠心して上澄に分画される血小板（多血小板血漿）を回収した。また、前記血液の一部を3500 rpmで10分間遠心し、上澄（乏血小板血漿）を分離し、両者を混合して血小板血漿を用意した。
【００５５】
２）各ディスクの溶媒交換と血小板の添加
実施例１並びに比較例で製造した、それぞれHUVECsを増殖させた4mol%PNaSSディスク、10mol%PNaSSディスク、10mol%PNaAMPsディスク、PDMAAmディスク、1mol%PAAディスク、2mol%PAAディスク、PETディスク並びにPSディスクに、１）で調製した血小板血漿を150 mlずつキャストし、37℃で２時間インキュベートした。
【００５６】
２時間後、各ウェルに加えた血小板血漿を除去してから、各ディスクを適当量のPBS溶液で２回洗浄した。さらに各ディスクを2.5%(v/v)グルタルアルデヒド溶液3mLに浸漬し、37℃で２時間静置した。グルタルアルデヒド溶液を除去した後、PBS溶液で１回、Milli-Q水で50mol%に希釈したPBS溶液で１回、続いてMilli-Q水で１回、各ディスクを洗浄した。
【００５７】
３）顕微鏡観察
２）で得た各ディスクを凍結乾燥機に入れ、−４０℃で５時間、次いで−２５℃で４時間保ち、各ディスクを凍結乾燥した。
【００５８】
各ゲルについて、倍率1000倍で５視野撮影し、粘着している血小板を、I型：球状を保っているもの、II型：球状を保っているが偽足を出しているもの、III型：伸展しているもの、に分類し、それぞれの個数をカウントした。
【００５９】
PETディスク、PSディスク、ガラスディスク上では、それぞれ271cells /10４μm２、320 cells /10４μm２、181 cells /10４μm２個の血小板の吸着が確認された。PSディスクとガラスディスク上に吸着した血小板が直径２〜４μｍの正常の球状を示しているのに対して、PETディスク上に吸着した血小板が活性化されていることが認められた。PETディスク上に吸着した血小板のうち、約53.9%がIII型、43.1%がII型、3%がI型であった。この様に、PETディスク、PSディスク並びにガラスディスクには大量の血小板が吸着し、特にPETディスクでは血小板が活性化され易いことが明らかとなった。
【００６０】
4mol%PDMAAmディスクについては、その上でHUVECsが十分には増殖しないことから、血小板の吸着も認められなかった。
【００６１】
1mol%PAAディスクについては、無血清培地で溶媒交換した1mol%PAAディスク上に70cells /10４μm２個のI型血小板(２〜４μｍ)の吸着が観察された。
【００６２】
2mol%PAAディスクについては、無血清培地で溶媒交換した2mol%PAAディスクに、密度329cells /10４μm２の血小板の吸着が観察され、それぞれ約15%がII型血小板であった。
【００６３】
無血清培地で溶媒交換した10mol%PNaAMPSディスクについては、36cells /10４μm２個のI型血小板(２〜４μｍ）の吸着が観察された。
【００６４】
各PNaSSディスクには、殆ど血小板の吸着は観察されなかった。一方、HUVECsによる被覆を行っていない4mol%PNaSSディスク、10mol%PNaSSディスクを用意し、これらを血清培地で溶媒交換してから上記と同様の血小板吸着試験を行ったところ、4mol%PNaSSディスク、10mol%PNaSSディスク上にそれぞれ68 cells /10４μm２、172cells /10４μm２個のI型血小板の吸着が観察された。
【００６５】
以上より、PNaSSディスクならびにPNaAMPsディスクは、その上でのHUVECsの良好な増殖を許容し、かつ増殖したHUVECsによって被覆されることで、優れた抗血栓性を獲得することが分かる。
【００６６】
＜実施例２＞
実施例１の１）２）と同様の条件で、架橋密度が2mol%のPNaAMPsディスクと架橋密度が4mol%のPNaAMPsディスクを２組切り出した。
【００６７】
２組のディスクをそれぞれ２４穴ＰＳディッシュに置き、その上から4×10４cell/ml個のHUVECs懸濁液を１ml／ウェル加え、37℃、5mol%ＣＯ２雰囲気でHUVECsをコンフルエントまで培養した。その後、１組のディスクに対して20ng/mlのTGF-β1を含む  Humedia-EB2 medium (KURSBO Biomed. Bus., Tokyo, Japan) 培地中でHUVECsをさらに48時間培養した。
【００６８】
このTGF-β処理を行ったディスクと行わなかったディスクそれぞれについて、前記試験例２と同様に血小板吸着試験を行った。その結果、TGF-β処理を行わなかった2mol%PNaAMPsディスクと4mol%PNaAMPSディスク上に吸着した血小板の個数はそれぞれ183 cells /10４μm２、34 cells /10４μm２であったのに対して、TGF-β処理を行った2mol%PNaAMPsディスク、4mol%PNaAMPSディスク上に吸着した血小板の個数はそれぞれ15 cells /10４μm２、17 cells /10４μm２まで減少した。当該血小板はいずれもI型血小板であった。
【００６９】
これらの結果から、TGF-β1処理を行うことにより、HUVECsによって被覆されたハイドロゲルの抗血栓性を増大させることが可能であることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】本発明で使用するハイドロゲルならびに比較例におけるHUVECsの増殖曲線を示す。
【図２】本発明並びに比較例の各ディスク上のHUVECsの位相差顕微鏡で観察した写真を示す。
【図１】
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【図２】
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