(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞培養基材としての用途以外の新たなビトリゲルの用途を開発すること。【解決手段】ビトリゲル上で細胞を培養し、接着、伸展、または増殖した状態の細胞培養物を形成する工程；およびビトリゲルごと接着、伸展、または増殖した状態の細胞培養物を保存する工程；を含む、細胞の凍結保存方法。また、ビトリゲルおよびビトリゲル上に付着した細胞を含む、凍結細胞。このような凍結細胞は、上述した様に、ビトリゲル上で細胞を培養し、接着、伸展、または増殖した状態の細胞培養物を形成する工程；およびビトリゲルごと接着、伸展、または増殖した状態の細胞培養物を保存する工程；を含む、細胞の凍結保存方法により作製することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビトリゲル上で細胞を培養し、接着、伸展、または増殖した状態の細胞培養物を形成する工程；
ビトリゲルごと接着、伸展、または増殖した状態の細胞培養物を保存する工程；
を含む、細胞の凍結保存方法。
【請求項２】
ビトリゲルが、薄膜状のビトリゲルである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
細胞が、初代肝細胞、胚性幹細胞または線維芽細胞である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
ビトリゲルおよびビトリゲル上に付着した細胞を含む、凍結細胞。
【請求項５】
ビトリゲルが、薄膜状のビトリゲルである、請求項4に記載の凍結細胞。
【請求項６】
細胞が、初代肝細胞、胚性幹細胞または線維芽細胞である、請求項4または5に記載の凍結細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビトリゲルを利用した種々の細胞の凍結物を製造する方法およびこれにより得られる凍結細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
培養皿内にコラーゲンのゾルを注入して至適な塩濃度とpHと温度を与えてゲル化（gelation）した後、低温で十分に乾燥してガラス化（vitrification）し、さらに再水和（rehydration）することで、コラーゲンゲルの物性を、強度と透明性に優れた薄膜に再現性良く変換する技術が確立された（特許文献1）。
【０００３】
ここで、熱変性タンパク質のガラス化は、乾燥工程で自由水が除去された後に結合水が徐々に減少する過程で進行することが報告されている（非特許文献1）。ハイドロゲルであればコラーゲン以外の成分のゲルでも、ガラス化した後に再水和することで、ゲルを安定した新しい物性状態に変換することができるので、このガラス化工程を経て作製された新しい物性状態のゲルを意味する用語として、ビトリゲル（vitrigel）という学術用語を設定した（非特許文献2）。
【０００４】
しかしながら、この様なビトリゲルの用途は、現時点では細胞培養基材としての用途に限定されており、新たな用途の開発が待たれている。
【０００５】
動物細胞の凍結保存は、一般的には、細胞を保存液中に懸濁した状態で凍結して液体窒素中に保存することが従来から行われてきた。しかしながら、例えば初代培養した肝細胞の場合、従来からの凍結保存は極めて困難であり、細胞生理機能の指標となる接着率で評価すると、極めて不良であることが多かった。そのため、このような従来からの凍結方法では凍結が困難である細胞を凍結保存する方法として、担体と共に凍結保存する方法が検討されてきた。例えば、生体より分離した直後の初代肝細胞（350細胞）を直径1 mmのアルギン酸ゲルビーズの中に包埋して1バイアル中に約3,000個のビーズを入れて液体窒素中で凍結した製品（約1×106細胞／バイアル）がある（LIVERBEADSTM；Biopredic Int.（Rennes France）／（株）ケー・エー・シー）。しかしながら、これまでの凍結保存方法を利用した場合には、解凍後に肝細胞をビーズより分離して単層状態で培養することはできなかった。
【特許文献１】特開平8-228768
【非特許文献１】Takushi E, et al., Nature 345: 298-299, 1990
【非特許文献２】Takezawa T, et al., Cell Transplant. 13: 463-473, 2004
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、細胞培養基材としての用途以外の新たなビトリゲルの用途を開発することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ビトリゲル上で培養することで接着、伸展、または増殖させた種々の細胞を、液体窒素中にて凍結保存した場合、解凍した際の細胞の生存率を向上させることに成功した。
【０００８】
すなわち、本発明は、ビトリゲル上で細胞を培養し、接着、伸展、または増殖した状態の細胞培養物を形成する工程；およびビトリゲルごと接着、伸展、または増殖した状態の細胞培養物を保存する工程；を含む、細胞の凍結保存方法を提供する。
【０００９】
本発明はまた、ビトリゲルおよびビトリゲル上に付着した細胞を含む、凍結細胞を提供する。このような凍結細胞は、上述した様に、ビトリゲル上で細胞を培養し、接着、伸展、または増殖した状態の細胞培養物を形成する工程；およびビトリゲルごと接着、伸展、または増殖した状態の細胞培養物を保存する工程；を含む、細胞の凍結保存方法により作製することができる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明を利用することにより、例えば接着、伸展、または増殖した状態の細胞など、培養条件下にある細胞の培養形態のまま細胞を凍結することが可能になる。このような細胞の凍結保存方法はこれまでの当該技術分野においては実用化されておらず、新たな細胞の凍結保存方法を提供する。
【００１１】
また、本発明の方法において作製した接着、伸展、または増殖した状態の細胞は、ビトリゲル薄膜を培養支持体として使用しているため、接着、伸展、または増殖した細胞を凍結時ならびに解凍後においても、接着、伸展、または増殖した状態にある細胞のままで保存・運搬等するために十分な強度を有している。
【００１２】
例えば、初代培養肝細胞は、新薬開発の薬物動態試験には極めて重要であり、異なる複数の研究機関で同じ個体（特にヒト）由来の培養肝細胞を利用できる普遍的なシステムを構築することが急がれている。初代培養肝細胞を本発明の方法により凍結保存した場合、この目的を達成する有効な手段となる。
【発明の実施の形態】
【００１３】
本発明は、ビトリゲル上で細胞を培養し、接着、伸展、または増殖した状態の細胞培養物を形成する工程；およびビトリゲルごと接着、伸展、または増殖した状態の細胞培養物を保存する工程；を含む、細胞の凍結保存方法を提供することができることを明らかにした。
【００１４】
本発明において使用することができるビトリゲルは、従来から知られているビトリゲルの作製方法（例えば、特開平8-228768または特願2006-25682を参照）に従って作製することができる。本発明において使用することができるビトリゲルの形状は、どのような形状であってもよく、例えば薄膜状、糸状、管状、または棒状などの形状をとることができる。
【００１５】
例えば薄膜状のビトリゲルを作製する場合、具体的には、培養皿にゾル状態のハイドロゲル溶液を注入し、これを保存してプレート内でゲル化させる。プレート内でゲル化が完了した後、プレートごと恒温恒湿条件下でゲル内の水分（自由水）を除去し（乾燥）、さらに時間をかけて結合水の乾燥（ガラス化）を行った。乾燥を行う際の温度および時間は、当業者が適宜選択することができるものであり、例えば温度10℃、湿度40％中で行うことができる。自由水を完全に除去した後の乾燥ゲル薄膜は、室温で保管しながらゆっくりと結合水を除去するガラス化工程をかけて進行させる（非特許文献2を参照）。その後、必要に応じて8000 J/m2のUV照射を行う。このようにして作製したビトリゲル薄膜は、その後、PBSで再水和した後使用する。
【００１６】
例えば糸状、管状、または棒状などの形状のビトリゲルを作製する場合、糸状、管状、または棒状などの形状の鋳型にハイドロゲルを流し込んでゲル化させ、糸状、管状、または棒状などの形状のゲルを作製する。このようなハイドロゲルの形状の長軸方向を水平に対して60〜90度の角度をつけて立て、恒温恒湿条件下で脱水・乾燥してガラス化することにより、糸状、管状、または棒状などの形状のビトリゲルを作製することができる。このようにして作製したビトリゲル薄膜は、その後、PBSで再水和した後使用する（特願2006-25682を参照）。
【００１７】
本発明のビトリゲルを作製する際に原料として使用するハイドロゲルの組成は、脱水・乾燥することによりガラス化するものであれば、特に限定されない。ビトリゲルを形成しうるハイドロゲルの組成としては、I型コラーゲン、III型コラーゲンなどのコラーゲン、あるいはマトリゲル（EHS腫瘍より抽出される基底膜成分で主にIV型コラーゲン、ラミニン、およびヘパラン硫酸プロテオグリカンを含む）などの細胞外マトリックス成分、その他、寒天、アガロース、アクリルアミドなどが知られている。本発明においては、I型コラーゲン、III型コラーゲン、またはこれらの組み合わせなどの、コラーゲンを使用することが好ましい。
【００１８】
上述したビトリゲル上で、目的とする細胞を培養し、細胞がビトリゲルに接着、伸展、または増殖した状態の細胞培養物を作製する。このような細胞培養を行う際の条件は、細胞ごとに既知の培養条件をそのまま利用することができる。本発明において使用することができる細胞としては、どのような細胞を使用してもよく、例えば初代肝細胞、胚性幹細胞または線維芽細胞を使用することができる。
【００１９】
本発明において、ビトリゲル上で細胞が「接着」、「伸展」、または「増殖」する、という場合、ビトリゲルと、培養する細胞との関係を示すものであり、ある細胞が「接着」、「伸展」、または「増殖」のいずれかの状態であること、またはこれらの組み合わせの状態にあることのいずれをも包含する。例えば、接着依存性の細胞は、ビトリゲルに接着するが、接着した後、伸展する細胞（「接着」し「伸展」する細胞）もあれば接着したままで伸展しない細胞（「接着」のみする細胞）も存在する。また、伸展した細胞の場合、伸展した後、増殖する細胞（「接着」し、「伸展」し、「増殖」する細胞）もあれば増殖しない細胞（「接着」し「伸展」する細胞）も存在する。細胞の種類に依存して、ビトリゲル上での細胞の形態は種々に変化するが、具体的には、ラット初代培養肝細胞（例えば成熟肝細胞）とマイトマイシンC処理した繊維芽細胞は、「接着」した後に「伸展」するが「増殖」はしない。また、マウスES細胞は、「接着」した後に少しだけ「伸展」して凝集しながら島状に「増殖」する。
【００２０】
このようにしてビトリゲル上に接着、伸展または増殖した細胞培養物を、ビトリゲルごと凍結することができる。細胞培養物を凍結する際に使用することができる凍結保存液は、通常細胞懸濁液を凍結する際に使用する培養液と同様のものを使用することができる。例えば、凍結保存液としては、細胞を培養する際に使用する培養液に対して10％のジメチルスルホキシド（DMSO）を添加したものなどを例としてあげることができる。このような凍結保存液に入れた細胞培養物を、通常の細胞懸濁液を凍結する際と同様の温度および時間の条件で、凍結する。例えば、バイセル凍結処理容器等に入れて-80℃のフリーザー中で1日〜7日間凍結させ、その後液体窒素中に移動させて凍結保存する方法の他、プログラムフリーザーを用いて所望の温度および時間の条件で凍結させ、最終的に液体窒素中に移動させて凍結保存する方法などが知られているが、これらには限定されない。
【００２１】
液体窒素中で凍結保存された細胞培養物は、解凍してから使用する。細胞培養物を解凍する際には、細胞培養物の温度を急速に37℃にまで上昇させ、次いで凍結保存液を通常の培養液に変換して37℃、5％CO2インキュベータ内で培養を継続する。
【００２２】
本発明はまた、ビトリゲルおよびビトリゲル上に付着した細胞を含む、凍結細胞を提供することができることを明らかにした。このような凍結細胞は、上述した様に、ビトリゲル上で細胞を培養し、接着、伸展、または増殖した状態の細胞培養物を形成する工程；およびビトリゲルごと接着、伸展、または増殖した状態の細胞培養物を保存する工程；を含む、細胞の凍結保存方法により作製することができる。
【実施例】
【００２３】
実施例1：ラット初代肝細胞の凍結
本実施例においては、ラットから肝細胞を採取し、初代培養を行って接着・伸展した状態の細胞を調製した後、接着・伸展した状態のまま細胞を凍結する方法について検討を行った。
【００２４】
ラットの肝細胞は、コラゲナーゼ灌流法を適用して採取した。このようにして採取した肝細胞（生存率80.1％）を、10％非動化ウシ胎仔血清（FBS）、10 mM ニコチンアミド、20 mM HEPES、100 u/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培養液（DMEM）中に細胞密度2×105 細胞/mlとなるように懸濁した。ポリスチレン製培養皿（FALCON 3001；対照群）、あるいはポリスチレン製培養皿内に作製した環状ナイロン膜支持体付きのI型コラーゲンビトリゲル薄膜担体上（ゲル薄膜群）に、それぞれ細胞懸濁液を2.0 mlずつ播種することで培養を開始して、37℃、5％CO2インキュベータ内で培養を行い、培養3時間目に培養液を交換することで死細胞を除去した。ゲル薄膜群はさらに、培養6時間目に培養皿よりゲル薄膜担体を剥離して培養を続けた。
【００２５】
本発明において使用するビトリゲル薄膜は、非特許文献2に記載の方法に従って作製した。すなわち、4℃で、等量の0.5％I型コラーゲン水溶液（CELLGEN I-AC,（株）高研製）と培養液（10％非動化ウシ胎仔血清（FBS）、20 mM HEPES、100 u/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培養液（DMEM））とを混合して、0.25％I型コラーゲンのゾルを作製した。ポリスチレン製培養皿（FALCON 3001）に上記の0.25％I型コラーゲンのゾルを約2.0 ml注入し、これを37℃で2時間保温して、培養皿内でゲル化させた。培養皿内でゲル化が完了した後、培養皿ごと温度10℃、湿度40％の恒温恒湿機内でゲル内の水分（自由水）を2日間かけて除去し（乾燥）、さらに時間をかけて結合水の乾燥（ガラス化）をおよそ2週間かけて行った。自由水を完全に除去した後の乾燥ゲル薄膜は、室温で保管しながらゆっくりと結合水を除去するガラス化工程をおよそ2週間かけて進行させる。その後、ビトリゲル薄膜は、PBSで再水和して本実施例において使用した。
【００２６】
対照群およびゲル薄膜群のいずれの群も、37℃、5％CO2インキュベータ内で培養を24時間継続し、培養24時間目（位相差顕微鏡写真を図1Aおよび1Bに示す）に培養液を凍結保存液（10％ジメチルスルホキシド（DMSO）、10％非動化ウシ胎仔血清（FBS）、10 mM ニコチンアミド、20 mM HEPES、100 u/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培養液（DMEM））に交換して、プログラムフリーザーで凍結保存を開始した。対照群は、ポリスチレン製培養皿（FALCON 3001）に付着した初代肝細胞をポリスチレン製培養皿ごと凍結保存し、またゲル薄膜群はビトリゲル薄膜担体に付着した初代肝細胞をビトリゲル薄膜担体ごと凍結保存することにより、接着・伸展した状態のラット初代肝細胞を凍結保存した。
【００２７】
凍結保存の際の温度および時間のプログラムは、
20.0℃から0.0℃まで-1.00℃／分の速度で20分かけて冷却し、
その後0.0℃にて2分間おいた後、
0.0℃から-8.0℃まで-2.00℃／分の速度で4分かけてさらに冷却し、
-8.0℃から-28.0℃まで-50.00℃／分の速度で24秒かけてさらに急冷し、
-28.0℃から-33.0℃まで-2.50℃／分の速度で2分かけてさらに冷却し、
その後-33.0℃から-28.0℃まで+2.50℃／分の速度で2分かけて一旦温度を上昇させ、
その後-28.0℃から-60.0℃まで-2.00℃／分の速度で16分かけてさらに冷却し、
次いで-60.0℃から-100.0℃まで-10.00℃／分の速度で4分かけてさらに冷却し、
-100℃にて30分おいた後、液体窒素中で凍結保存する
ことにより行い、最終的には接着・伸展した状態の細胞を液体窒素内にて凍結保存した。
【００２８】
対照群およびゲル薄膜群共に、接着・伸展した状態の細胞を液体窒素内に保存して4日目に、急速解凍した後に凍結保存液を培養液（10％非動化ウシ胎仔血清（FBS）、10 mM ニコチンアミド、20 mM HEPES、100 u/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培養液（DMEM））に交換して培養を再開して、培養1時間目に、解凍した接着・伸展した状態のラット初代肝細胞の外観を位相差顕微鏡で観察すると共に（図1Cおよび1D）、生細胞では緑色蛍光を、死細胞では明るい赤色蛍光を発生する、市販のLIVE/DEAD（商標）生存率アッセイキット（Invitrogen）を使用して細胞を染色した（図1Eおよび1F）。
【００２９】
この結果、凍結直前である播種後培養24時間目には、位相差顕微鏡下において、ポリスチレン製培養皿（FALCON 3001）上の初代肝細胞（対照群）およびビトリゲル薄膜担体上の初代肝細胞（ゲル薄膜群）とも、良好な接着・伸展形態を示していた（図1Aおよび1B）。しかしながら、4日間の凍結後解凍した場合、解凍1時間目には、位相差顕微鏡写真を見る限り（図1Cおよび1D）、対照群ではほとんどの細胞が培養皿から脱落しているが、ゲル薄膜群ではおおむね60％程度の細胞が解凍後も接着していることが形態的に明らかになった。さらに、市販のLIVE/DEAD（商標）生存率アッセイキットを用いた際の蛍光顕微鏡写真（図1Eおよび1F）では、ビトリゲル薄膜上に接着する細胞の約33％は、生存していることが明らかになった。
【００３０】
また、凍結前および凍結解凍後の細胞接着率と生存率を、それぞれ単位面積当たりの接着細胞および生存接着細胞の面積占有率より算出して数値化した（図2）。その結果、対照群では凍結前の接着細胞に対して凍結解凍後にはわずか0.5％しか培養皿に接着している生細胞が残存していなかったが、ゲル薄膜群ではおよそ20％の細胞がビトリゲル薄膜担体上に生細胞として接着していることが明らかになった。
【００３１】
この結果から、ビトリゲル薄膜担体上に接着した初代肝細胞は、そのまま凍結・解凍しても、接着細胞の生存率を維持できることが明らかになった。
【００３２】
実施例2：マウス胚性幹細胞（ES細胞）の凍結
本実施例においては、マウスES細胞培養を行って接着、伸展、または増殖した状態の細胞を調製した後、接着、伸展、または増殖した状態のまま細胞を凍結する方法について検討を行った。
【００３３】
マウスES細胞として、129SV系のマウス由来のES細胞（大日本住友製薬株式会社）、継代数13を、使用した。ポリスチレン製培養皿（FALCON 3001；対照群）、あるいはポリスチレン製培養皿内でUV照射（8,000 J/m2）して作製したI型コラーゲンビトリゲル薄膜担体上（ゲル薄膜群）に、ES細胞用培養液中に1×105細胞/mlの細胞密度で懸濁したフィーダー細胞としてのマイトマイシンC処理済の初代マウス胚線維芽細胞を2.0 mlずつ播種し、8時間、37℃、5％CO2インキュベータ内で培養を行い、フィーダーレイヤーを作製した。その後、それぞれの群のフィーダーレイヤー上に、ES細胞用培養液中に5×105細胞/mlの細胞密度で懸濁した上述のES細胞を2.0 mlずつ播種し、37℃、5％CO2インキュベータ内で培養を行った。ES細胞用培養液は、DMEM（GIBCO BRL # 11995-065）400 mlにAntimyobic-Antimycotic（GIBCO BRL # 15240-062）5.0 ml、3.5μl β-メルカプトエタノール（SIGMA # M-6250）含有PBS 5.0 ml、MEM非-必須アミノ酸（GIBCO BRL # 11140-050）5.0 ml、ヌクレオシド（アデノシン4 mg、グアノシン4.25 mg、シチジン3.65 mg、ウリジン3.65 mg、チミジン1.2 mgを溶解したPBS）5.0 ml、ESGRO（CHEMICON # ESG1107；10e7 U/ml）50μl、およびFBS（GIBCO BRL # 16141-079）100 mlを添加して調製した。
【００３４】
対照群およびゲル薄膜群のいずれの群も、37℃、5％CO2インキュベータ内で培養を48時間継続し、培養48時間目（位相差顕微鏡写真を図3Aおよび3Bに示す）に培養液を凍結保存液（10％DMSO含有のES細胞用培養液）に交換した後、バイセル凍結処理容器（日本フリーザー（株））に移し入れ−80℃フリーザーで5時間凍結してから液体窒素内で凍結保存した。対照群は、ポリスチレン製培養皿（FALCON 3001）に付着した細胞をポリスチレン製培養皿ごと凍結保存し、またゲル薄膜群はビトリゲル薄膜担体に付着した細胞をビトリゲル薄膜担体ごと凍結保存することにより、接着・伸展して島状に増殖した状態のマウスES細胞を凍結保存した。凍結保存は、液体窒素中で6日間継続した。
【００３５】
この結果、凍結直前である播種後培養48時間目には、位相差顕微鏡下において、ポリスチレン製培養皿（FALCON 3001）上のES細胞（対照群）およびビトリゲル薄膜担体上のES細胞（ゲル薄膜群）とも、島状に増殖した良好な形態を示していた（図3Aおよび3B）。しかしながら、6日間の凍結後解凍した場合、解凍1時間目には、位相差顕微鏡写真を見る限り（図3Cおよび3D）、対照群ではフィーダー細胞を含めすべての細胞がプレート上から脱落しているが、ゲル薄膜群ではおおむね80％程度の細胞が解凍後も接着していることが形態的に明らかになった。さらに、市販のLIVE/DEAD（商標）生存率アッセイキットを用いた際の蛍光顕微鏡写真（図3Eおよび3F）では、ビトリゲル薄膜上に残存した接着細胞はほぼすべて、生存していることが明らかになった。
【００３６】
また、凍結前および凍結解凍後の細胞接着率と生存率を、それぞれ単位面積当たりの接着細胞および生存接着細胞の面積占有率より算出して数値化した（図4）。その結果、対照群では凍結前の接着細胞に対して凍結解凍後にはわずか0.2％しか培養皿に接着している生細胞が残存していなかったが、ゲル薄膜群では82％もの細胞がビトリゲル薄膜担体上に生細胞として接着していることが明らかになった。
【００３７】
この結果から、ビトリゲル薄膜担体上に接着・伸展して島状に増殖したES細胞は、そのまま凍結・解凍しても、増殖細胞の生存率を十分に維持することができることが明らかになった。
【００３８】
実施例3：マウス線維芽細胞の凍結
本実施例においては、マウス線維芽細胞の培養を行って接着・伸展した状態の細胞を調製した後、接着・伸展した状態のまま細胞を凍結する方法について検討を行った。
【００３９】
マウス線維芽細胞として、マイトマイシンC処理済の初代マウス線維芽細胞（大日本住友製薬株式会社）を使用した。ポリスチレン製培養皿（FALCON 3001；対照群）、あるいはポリスチレン製培養皿内でUV照射（8,000 J/m2）して作製したI型コラーゲンビトリゲル薄膜担体上（ゲル薄膜群）に、ES細胞用培養液中に1×105細胞/mlの細胞密度で懸濁したマイトマイシンC処理済の初代マウス線維芽細胞を2.0 mlずつ播種し、24時間、37℃、5％CO2インキュベータ内で培養を行い、フィーダーレイヤーとなる細胞を作製した。
【００４０】
対照群およびゲル薄膜群のいずれの群も、37℃、5％CO2インキュベータ内で培養を24時間継続し、培養24時間目（位相差顕微鏡写真を図5Aおよび5Bに示す）に培養液を凍結保存液（10％DMSO含有のES細胞用培養液）に交換した後、バイセル凍結処理容器（日本フリーザー（株））に移し入れ−80℃フリーザーで5時間凍結してから液体窒素内で凍結保存した。対照群は、ポリスチレン製培養皿（FALCON 3001）に付着した細胞をポリスチレン製培養皿ごと凍結保存し、またゲル薄膜群はビトリゲル薄膜担体に付着した細胞をビトリゲル薄膜担体ごと凍結保存することにより、接着・伸展した状態のマイトマイシンC処理済のマウス線維芽細胞を凍結保存した。凍結保存は、液体窒素中で10日間継続した。
【００４１】
この結果、凍結直前である播種後培養24時間目には、位相差顕微鏡下において、ポリスチレン製培養皿（FALCON 3001）上の線維芽細胞（対照群）およびビトリゲル薄膜担体上の線維芽細胞（ゲル薄膜群）とも、接着・伸展した良好な形態を示していた（図5Aおよび5B）。しかしながら、10日間の凍結後解凍した場合、解凍1時間目には、位相差顕微鏡写真を見る限り（図5Cおよび5D）、対照群ではすべての細胞が培養皿から脱落しているが、ゲル薄膜群ではおおむね50％程度の細胞が解凍後も接着していることが形態的に明らかになった。さらに、市販のLIVE/DEAD（商標）生存率アッセイキットを用いた際の蛍光顕微鏡写真（図5Eおよび5F）では、ビトリゲル薄膜上に残存する接着細胞はほぼすべて、生存していることが明らかになった。
【００４２】
また、凍結前および凍結解凍後の細胞接着率と生存率を、それぞれ単位面積当たりの接着細胞および生存接着細胞の面積占有率より算出して数値化した（図6）。その結果、対照群では凍結前の接着細胞に対して凍結解凍後にはわずか0.04％しか培養皿に接着している生細胞が残存していなかったが、ゲル薄膜群では53％もの細胞がビトリゲル薄膜担体上に生細胞として接着していることが明らかになった。
【００４３】
この結果から、ビトリゲル薄膜担体上に接着させて形成したマイトマイシンC処理済のマウス線維芽細胞のフィーダーレイヤーは、そのまま凍結・解凍しても、フィーダーレイヤー細胞の生存率を維持できることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明を利用することにより、例えば接着、伸展、または増殖した状態の細胞など、培養条件下にある細胞の培養形態のまま細胞を凍結することが可能になる。このような細胞の凍結保存方法はこれまでの当該技術分野においては実用化されておらず、新たな細胞の凍結保存方法を提供する。
【００４５】
また、本発明の方法において作製した接着、伸展、または増殖した状態の細胞は、ビトリゲル薄膜を培養支持体として使用しているため、接着、伸展、または増殖した細胞を凍結時ならびに解凍後においても、接着、伸展、または増殖した状態にある細胞のままで保存・運搬等するために十分な強度を有している。
【００４６】
例えば、初代培養肝細胞は、新薬開発の薬物動態試験には極めて重要であり、異なる複数の研究機関で同じ個体（特にヒト）由来の培養肝細胞を利用できる普遍的なシステムを構築することが急がれている。初代培養肝細胞を本発明の方法により凍結保存した場合、この目的を達成する有効な手段となる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図1は、ポリスチレン製培養皿（FALCON 3001）上の初代肝細胞（対照群）およびビトリゲル薄膜担体上の初代肝細胞（ゲル薄膜群）の、凍結前および凍結解凍後の外観を示す図である。ここで、図1Aおよび1Bは凍結前の培養開始24時間目の状態についての位相差顕微鏡写真を、図1Cおよび1Dは凍結解凍後1時間目の位相差顕微鏡写真を、そして図1Eおよび1Fは市販のLIVE/DEAD（商標）生存率アッセイキットを用いて染色した凍結解凍後1時間目の蛍光顕微鏡写真を、それぞれ示す。
【図２】図2は、ラット初代肝細胞の凍結前および凍結解凍後の細胞接着率と生存率を示す図である。
【図３】図3は、ポリスチレン製培養皿（FALCON 3001）上のマウスES細胞（対照群）およびビトリゲル薄膜担体上のマウスES細胞（ゲル薄膜群）の、凍結前および凍結解凍後の外観を示す図である。ここで、図3Aおよび3Bは凍結前の培養開始48時間目の状態についての位相差顕微鏡写真を、図3Cおよび3Dは凍結解凍後1時間目の位相差顕微鏡写真を、そして図3Eおよび3Fは市販のLIVE/DEAD（商標）生存率アッセイキットを用いて染色した凍結解凍後1時間目の蛍光顕微鏡写真を、それぞれ示す。
【図４】図4は、マウスES細胞の凍結前および凍結解凍後の細胞接着率と生存率を示す図である。
【図５】図5は、ポリスチレン製培養皿（FALCON 3001）上のマイトマイシンC処理済のマウス線維芽細胞（対照群）およびビトリゲル薄膜担体上のマイトマイシンC処理済のマウス線維芽細胞（ゲル薄膜群）の、凍結前および凍結解凍後の外観を示す図である。ここで、図5Aおよび5Bは凍結前の培養開始24時間目の状態についての位相差顕微鏡写真を、図5Cおよび5Dは凍結解凍後1時間目の位相差顕微鏡写真を、そして図5Eおよび5Fは市販のLIVE/DEAD（商標）生存率アッセイキット用いて染色した凍結解凍後1時間目の蛍光顕微鏡写真を、それぞれ示す。
【図６】図6は、マイトマイシンC処理済のマウス線維芽細胞の凍結前および凍結解凍後の細胞接着率と生存率を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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