(57)【要約】【課題】  新規なストレスバイオマーカーを利用したストレス抑制物質又はストレス増強物質のスクリーニング方法や、ストレスの判定方法や、ストレス診断用キットを提供すること。【解決手段】  １０時間の水浸拘束によりストレスを負荷したラットの血清を二次元電気泳動に供試する。ストレス負荷前後の二次元電気泳動の泳動像を比較し、ストレス負荷後のｐＨ６．０〜７．０、分子量４０〜５５ｋＤに現れる４種のスポットとして検出されるクレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）等のタンパク質をマーカーとして使用する。採血後直ちに胃を摘出し、潰瘍部分の面積を計測し、胃全体に対する潰瘍部分の面積の占める割合を潰瘍指数（％）としたところ、水浸拘束試験によるストレス性胃潰瘍の潰瘍指数は約２０％だった。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト哺乳動物に、ストレスを負荷する前後又は同時に、被験物質を投与し、該被験物質を投与した非ヒト哺乳動物の血清を二次元電気泳動に供試して、ｐＨ６．０〜７．０、分子量４０〜５５ｋＤに現れる４種のスポットのうちのいずれか１種以上を検出し、被験物質を投与しない場合と比較・評価することを特徴とするストレス抑制物質又はストレス増強物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
ｐＨ６．０〜７．０、分子量４０〜５５ｋＤに現れる４種のスポットのうちのいずれか１種が、クレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）によるスポットであることを特徴とする請求項１に記載のストレス抑制物質又はストレス増強物質のスクリーニング方法。
【請求項３】
非ヒト哺乳動物に、ストレスを負荷する前後又は同時に、被験物質を投与し、該被験物質を投与した非ヒト哺乳動物の血清からクレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）又はクレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）に特異的に結合する抗体を検出し、被験物質を投与しない場合と比較・評価することを特徴とするストレス抑制物質又はストレス増強物質のスクリーニング方法。
【請求項４】
哺乳動物から採取した血清を二次元電気泳動に供試し、ｐＨ６．０〜７．０、分子量４０〜５５ｋＤに現れる４種のスポットのうちいずれか１種以上を検出することを特徴とするストレスの判定方法。
【請求項５】
ｐＨ６．０〜７．０、分子量４０〜５５ｋＤに現れる４種のスポットのうちのいずれか１種が、クレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）によるスポットであることを特徴とする請求項４に記載のストレスの判定方法。
【請求項６】
哺乳動物から採取した血清中のクレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）又はクレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）に特異的に結合する抗体を検出することを特徴とするストレスの判定方法。
【請求項７】
ストレスを負荷させた哺乳動物から採取した血清を二次元電気泳動法に供試し、ｐＨ６．０〜７．０、分子量４０〜５５ｋＤに現れる４種のスポットのうちいずれか１種を単離し、該単離したタンパク質、若しくは該単離したタンパク質に特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とするストレス診断用キット。
【請求項８】
単離したタンパク質が、クレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）であることを特徴とするストレス診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ストレスを負荷させた非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、該被験物質を投与した非ヒト哺乳動物の血清を二次元電気泳動に供試して、ｐＨ６．０〜７．０、分子量４０〜５５ｋＤに現れるスポットを指標としたストレス抑制物質又はストレス増強物質のスクリーニング方法や、前記指標を利用したストレスの判定方法やストレス診断薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
厚生労働省の平成１４年国民栄養調査結果によると、普段の生活でストレスを感じている人は、男性で７６．９％、女性で８４．２％にも上る。一般的にストレスの要因には、物理的（寒冷、放射線、騒音）、化学的（薬物、ビタミン不足、Ｏ２欠乏）、生物的（細菌感染）なもの以外に、環境やライフサイクルの変化、仕事・家庭の問題や複雑な人間関係なども含まれている。ストレスは様々な病気の原因となり、例えば、ストレスが原因で発症したと考えられる消化性潰瘍、すなわちストレス性潰瘍などは大きな社会問題となっている。
【０００３】
生体におけるストレスを測定する方法としては、例えば、新規ストレスタンパク質ｐ２０の抗体を用いたストレスタンパク質ｐ２０の測定方法や（例えば、特許文献１参照）、ヒト老化マーカー及びストレスマーカーを認識するＡｓｐ151がβＤ体であるαＡクリスタリンに対して特異的な抗体を提供し、この抗体を組織・細胞に適用して、人の老化又は人のストレスのマーカーを検出するための方法や（例えば、特許文献２参照）、哺乳動物の血液中に存在するトリプトファンの濃度の変化率を指標にストレスを測定することを特徴とする測定方法（例えば、特許文献３参照）や、一定の個体のストレス量の指示要素として遊離の唾液中の副腎皮質ホルモンの量を用いてその視床下部−副腎の系における活性を測定することにより一定の哺乳類動物におけるストレスの量を測定するための方法（例えば、特許文献４参照）等が知られている。
【０００４】
一方、Lohmanによって筋肉内に見出された酵素であるクレアチンキナーゼ（ＣＫ）は酵素の構成上２個のサブユニットからなる二量体で、細胞質上清分画に存在するＣＫアイソエンザイムは、一般的にＣＫ−ＢＢ，ＣＫ−ＭＢ，ＣＫ−ＭＭの３種が知られている。血清ＣＫ活性の上昇は進行性筋ジストロフィー、心筋梗塞で認められ、急性心筋梗塞の診断にはＣＫ−ＭＢの測定がきわめて重要であるとされている。また、このクレアチンキナーゼは、急性冠状動脈症候群の診断マーカーとしても利用できることが知られている（例えば、特許文献５及び６参照）。
【０００５】
【特許文献１】特開平７−１８１１８０号公報
【特許文献２】特開２００２−１０７３６３号公報
【特許文献３】特開２００４−１９８３２５号公報
【特許文献４】特表２００５−５０６５１６号公報
【特許文献５】特表２００４−５２０５９８号公報
【特許文献６】特開２００５−１２１６６４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、新規なストレスバイオマーカーを利用したストレス抑制物質又はストレス増強物質のスクリーニング方法や、ストレスの判定方法や、ストレス診断用キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ストレスに関与する有効なバイオマーカーを探索するため、ストレス発症前後において、二次元電気泳動（以下、２−Ｄともいう。）法により血液中の発現たんぱく質の解析を行ったところ、ストレス発症後の２−Ｄ像には、ストレス発症前の２−Ｄ像とは異なるスポット群の発現を確認した。このスポット群はｐＨ６．０〜７．０、分子量４０〜５５ｋＤａ付近に数種類見い出され、これらのスポットのうち２つをクレアチンキナーゼと同定して、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、（１）非ヒト哺乳動物に、ストレスを負荷する前後又は同時に、被験物質を投与し、該被験物質を投与した非ヒト哺乳動物の血清を二次元電気泳動に供試して、ｐＨ６．０〜７．０、分子量４０〜５５ｋＤに現れる４種のスポットのうちのいずれか１種以上を検出し、被験物質を投与しない場合と比較・評価することを特徴とするストレス抑制物質又はストレス増強物質のスクリーニング方法や、（２）ｐＨ６．０〜７．０、分子量４０〜５５ｋＤに現れる４種のスポットのうちのいずれか１種が、クレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）によるスポットであることを特徴とする上記（１）に記載のストレス抑制物質又はストレス増強物質のスクリーニング方法に関する。
【０００９】
また本発明は、（３）非ヒト哺乳動物に、ストレスを負荷する前後又は同時に、被験物質を投与し、該被験物質を投与した非ヒト哺乳動物の血清からクレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）又はクレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）に特異的に結合する抗体を検出し、被験物質を投与しない場合と比較・評価することを特徴とするストレス抑制物質又はストレス増強物質のスクリーニング方法や、（４）哺乳動物から採取した血清を二次元電気泳動に供試し、ｐＨ６．０〜７．０、分子量４０〜５５ｋＤに現れる４種のスポットのうちいずれか１種以上を検出することを特徴とするストレスの判定方法や、（５）ｐＨ６．０〜７．０、分子量４０〜５５ｋＤに現れる４種のスポットのうちのいずれか１種が、クレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）によるスポットであることを特徴とする上記（４）に記載のストレスの判定方法に関する。
【００１０】
さらに本発明は、（６）哺乳動物から採取した血清中のクレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）又はクレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）に特異的に結合する抗体を検出することを特徴とするストレスの判定方法や、（７）ストレスを負荷させた哺乳動物から採取した血清を二次元電気泳動法に供試し、ｐＨ６．０〜７．０、分子量４０〜５５ｋＤに現れる４種のスポットのうちいずれか１種を単離し、該単離したタンパク質、若しくは該単離したタンパク質に特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とするストレス診断用キットや、（８）単離したタンパク質が、クレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）であることを特徴とするストレス診断用キットに関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のストレス抑制物質又はストレス増強物質のスクリーニング方法によれば、ストレスを負荷させて被験物質を投与した非ヒト哺乳動物の血清を二次元電気泳動に供試して、ｐＨ６．０〜７．０、分子量４０〜５５ｋＤに現れるスポットを検出することにより行うため、従来のように試験動物を殺すことなく、ストレス抑制物質又はストレス増強物質をスクリーニングすることができる。上記ストレス抑制物質はストレス治療剤として有用であり、ストレス増強物質はストレス発症の機構を解明する上で有用である可能性がある。
【００１２】
また、本発明の判定方法によれば、ストレスを発症した際に血液中に発現する新規ストレスバイオマーカー又はそれに対する抗体を検出することで、非侵襲的にストレスの判定が可能であるため、簡便かつ迅速に実験動物やペット、ヒト等のストレスを検出することができ、前記新規ストレスバイオマーカーを含有するストレス診断用キットは、汎用性に富み、高精度かつ高感度でストレスを判定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のストレス抑制物質又はストレス増強物質のスクリーニング方法としては、非ヒト哺乳動物に、ストレスを負荷する前後又は同時に、被験物質を投与し、該被験物質を投与した非ヒト哺乳動物の血清を二次元電気泳動に供試して、ｐＨ６．０〜７．０、分子量４０〜５５ｋＤに現れる４種のスポットのうちのいずれか１種以上を検出し、被験物質を投与しない場合と比較・評価する方法（以下、スクリーニング方法［１］ともいう。）や、非ヒト哺乳動物に、ストレスを負荷する前後又は同時に、被験物質を投与し、該被験物質を投与した非ヒト哺乳動物の血清からクレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）又はクレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）に特異的に結合する抗体を検出し、被験物質を投与しない場合と比較・評価する方法（以下、スクリーニング方法［２］ともいう。）であれば特に制限されず、上記非ヒト哺乳動物としては、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、サル等を挙げることができる。上記ストレスを負荷する方法としては、水浸法、拘束法、水浸拘束法、床電撃法等の公知のストレス負荷方法を挙げることができる。また、上記被検物質としては、ペプチド、タンパク質、核酸、合成化合物、微生物発酵物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞紬出物、真核単細胞抽出物、動物細胞抽出物等を挙げることができる。なお、本発明において、血清には、便宜上血漿も含まれる。
【００１４】
本発明における二次元電気泳動法としては、例えば等電点と分子量というタンパク質の有する２つの物性面から分離を行う方法であれば特に制限されるものではなく、一般的には、まずキャピラリーゲルや市販のストリップゲルなどを分離媒体として等電点電気泳動を行い、泳動を終了したゲルを第２の平面状のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル(slab gel)に載せ、等電点電気泳動の展開方向に対して直角の方向に電気泳動することにより行うことができ、より好適には文献（J.Korean Med. Sci.,18(4) 505 2003；Electrophoresis,23(15),2513 2002）記載の方法や、下記実施例による方法を挙げることができる。また、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから、血清中のタンパク質を分離する方法としては、「プロテオーム解析のための２次元電気泳動ガイド（バイオ・ラッド株式会社）」記載の方法に準じて行うことができる。
【００１５】
上記スクリーニング方法［１］において、被験物質を投与しない場合と比較して、ｐＨ６．０〜７．０、分子量４０〜５５ｋＤに現れるスポットの種類が減少したり、検出量が減少した場合、被験物質はストレス抑制物質と評価され、他方、前記スポットの検出量が増大した場合、ストレス増強物質と評価される。なお、スポットの種類の減少やスポットの検出量の減少及び増大の判定は、例えばクマシーブルー等の染色液にてスポットを視覚化することで容易に行うことができ、また前記スポットを切り出し、トリプシン等のプロテアーゼで消化し抽出された成分を質量分析等により直接定量し、その増減を判定することにより行うこともできる。この場合、ｐＨ６．０〜７．０、分子量４０〜５５ｋＤに現れる４種のスポットのうちのいずれか１種が、クレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）によるスポットであることが好ましい。
【００１６】
また、ｐＨ６．０〜７．０、分子量４０〜５５ｋＤに現れる４種のスポットのうち２つはクレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）として同定されていることから、上記スクリーニング方法［２］のように、例えばストレスを負荷させた非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、該被験物質を投与した非ヒト哺乳動物から、クレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）又はクレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）に特異的に結合する抗体を検出することにより、ストレス抑制物質又はストレス増強物質のスクリーニングすることも可能であり、スクリーニング方法［２］において、被験物質を投与しない場合と比較して、クレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）又はクレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）に特異的に結合する抗体の検出量が減少した場合、被験物質はストレス抑制物質と評価され、クレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）又はクレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）に特異的に結合する抗体の検出量が増大した場合、被験物質はストレス増強物質と評価される。クレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＭ−ＭＭ）又はクレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）に特異的に結合する抗体の検出方法としては特に制限されないが、具体的には、抗原と抗体の結合反応を利用した免疫学的検出法等を好適に挙げることができる。例えば、クレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＭ−ＭＭ）の検出方法としては、標識した抗クレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）モノクローナル抗体を用い、また、クレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）に特異的に結合する抗体の検出方法としては、標識又はペプチドタグ化したクレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＭ−ＭＭ）を用いて、例えばイムノクロマト法、ＥＬＩＳＡ法等の免疫学的検出法を挙げることができる。標識物質としては、アルカリフォスファターゼ、ＨＲＰ等の酵素、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰ等の蛍光物質などを具体的に挙げることができ、またペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。
【００１７】
本発明のストレスの判定方法としては、哺乳動物から採取した血清を二次元電気泳動に供試し、ｐＨ６．０〜７．０、分子量４０〜５５ｋＤに現れる４種のスポットのうちいずれか１種以上を検出する方法（以下、ストレス検出方法［１］ともいう。）や、哺乳動物から採取した血清中のクレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）又はクレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）に特異的に結合する抗体を検出する方法（以下、ストレス検出方法［２］ともいう。）であれば特に制限されず、上記哺乳動物としては、ヒト、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、サル等を挙げることができる。また、ストレス検出方法［１］やストレス検出方法［２］において、二次元電気泳動を実施したり、クレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）又はクレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）に特異的に結合する抗体を検出するには、上述した方法を用いることができる。ストレス検出方法［１］を行う場合、ｐＨ６．０〜７．０、分子量４０〜５５ｋＤに現れる４種のスポットのうちのいずれか１種が、クレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）によるスポットであることが好ましい。本発明のストレスの判定方法を用いると、例えばストレスに起因する、胃潰瘍、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎等の消化器系疾患、高血圧症、狭心症、心筋梗塞、不整脈等の心血管系の疾患、筋肉疲労、慢性関節リウマチ、腰痛症、片頭痛、緊張性頭痛等の筋骨格系の疾患、気管支喘息、過呼吸症候群等の呼吸器系の疾患、種々の糖尿病合併症、脳神経疾患などを早期に発見することができる。
【００１８】
本発明のストレス診断用キットとしては、ストレスを負荷させた哺乳動物から採取した血清を二次元電気泳動法に供試し、ｐＨ６．０〜７．０、分子量４０〜５５ｋＤに現れる４種のスポットのうちいずれか１種を単離し、該単離したタンパク質、若しくは該単離したタンパク質に特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたキットであれば特に制限されず、上記単離したタンパク質としてはクレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）を好適に例示することができる。本発明のストレス診断用キットは、ヒト、ペット等のストレス性疾患、例えばストレスに起因する、胃潰瘍、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎等の消化器系疾患、高血圧症、狭心症、心筋梗塞、不整脈等の心血管系の疾患、筋肉疲労、慢性関節リウマチ、腰痛症、片頭痛、緊張性頭痛等の筋骨格系の疾患、気管支喘息、過呼吸症候群等の呼吸器系の疾患、種々の糖尿病合併症、脳神経疾患などの早期発見用検査キットとして有用である。
【００１９】
本発明に使用するクレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）等に特異的に結合する抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記クレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）を抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。
【００２０】
クレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）に対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に該クレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）若しくはエピトープを含む断片、又は該タンパク質を膜表面に発現した細胞を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリ
オーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）など任意の方法を用いることができる。
【００２１】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２２】
（試験動物の調製）
[水浸拘束試験]
１週間の予備飼育を行った７週齢のＳＤ（Sprague-Dawley）雄性ラット（体重１５０ｇ〜１８０ｇ）を用い、１日１回７日間連続で生理食塩水を経口投与した。２４時間の絶食後、ストレスケージに動物を入れ、剣状突起の高さまで水に浸し、１０時間の水浸拘束を行った。
【００２３】
［採血］
水浸拘束前後に採血を行った。得られた血液は室温で１時間静置した後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５分）し、その上清を血清として−４０℃で保管した。なお、胃潰瘍が発症する前のストレス負荷前血清は、２４時間の絶食をする前にエーテル麻酔し、負荷のかからない尾静脈より採取した。また、胃潰瘍発症後のストレス負荷後血清は、１０時間の水浸拘束後にエーテル麻酔し、血液をなるべく全量採取できる心臓より採取し、二次元電気泳動に供試した。また、採血後直ちに胃を摘出し、潰瘍部分の面積を計測し、胃全体に対する潰瘍部分の面積の占める割合を潰瘍指数（％）とした。水浸拘束試験によるストレス性胃潰瘍の潰瘍指数は約２０％だった。
【実施例２】
【００２４】
（ストレスバイオマーカーの同定）
[二次元電気泳動法（２−Ｄ）]
二次元電気泳動は、「プロテオーム解析のための２次元電気泳動ガイド（バイオ・ラッド株式会社）」記載の方法に準じて行った。水浸拘束試験によって得られた血清をMontage Albumin Deplete Kit（Millipore Corporation社製）で処理し、風乾したものを膨潤バッファーで約３ｍｇ／ｍｌに調製しサンプルとした。一次元目はｐＨ３〜１０の範囲のImmobilineドライストリップ（Immobiline DryStrip）（GE Healthcare社製）７ｃｍを膨潤バッファー［８Ｍ尿素、２％ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭＤＴＴ、０．２％Ｂｉｏ−Ｌｙｔｅ３／１０アンフォライト、０．００１％ＢＰＢ］で膨潤した後、ゲル１枚あたり１５０μｇのサンプルをアプライした。Immobilineドライストリップは乾燥防止のためにミネラルオイルを重層し、プロティアンＩＥＦセル（バイオ・ラッドラボラトリーズ株式会社製）により等電点電気泳動を行った。等電点電気泳動が完了したImmobilineドライストリップは平衡化した後、ゲル濃度１２％で調製したアクリルアミドゲルにアプライし、二次元目の電気泳動を行った。電気泳動が完了したゲルは染色液（０．１％クマシーブルーＲ−２５０、４０％メタノール、７．５％酢酸溶液）で約３０分間染色した後、脱色液（１０％メタノール、７．５％酢酸溶液）で約３時間脱色した。
【００２５】
また、ストレス負荷前の血清も同様にして２―Ｄに供試した。ストレス負荷前後の２―Ｄの泳動像を比較し、ストレス負荷後のｐＨ６．０〜７．０、分子量４０〜５５ｋＤにのみ現れた４種の発現たんぱく質を以下の方法で解析した。
【００２６】
ストレス負荷後の血清を二次元電気泳動に供試して、ストレス負荷後にのみ現れたスポットを切り出し、トリプシンでペプチドに分解して、MALDI-TOF/MAS（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight/MassSpectrometry；マトリックス支援レーザ脱離イオン化−飛行時間型質量分析法）により分解成分の分子量を測定した。次に、分解成分の分子量を基に、Mascotデータベースで、Database1：NCBInr、Peptide Mass Tolerance：±０．１〜１．０Ｄａ、Fragment Mass Tolerance：±０．５〜１．０Ｄａ、Max Missed Clevages：１の検索条件によりコンビネーションサーチを行い、切り出したスポ
ットの成分を同定したところ、ｐＨ６．０〜７．０、分子量４０〜５５ｋＤに現れた４種のスポットのうち２つは（図２中の３及び４）クレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）であることがわかった。なお、スポット３はクレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）の修飾体と考えられる。
【実施例３】
【００２７】
（ＥＬＩＳＡによるＣＫ−ＭＭの測定）
[水浸拘束試験]
１週間の予備飼育を行った７週齢のＳＤ（Sprague-Dawley）雄性ラット（体重１５０ｇ〜１８０ｇ）を用い、１日１回７日間連続で生理食塩水を経口投与した。２４時間の絶食後、ストレスケージに動物を入れ、剣状突起の高さまで水に浸した。０．５時間、１時間、５時間、および１０時間の水浸拘束後、動物をエーテル致死させた。また、絶食後に水浸拘束せずケージに入れ、水浸拘束と同じ時間を経過させたものを対照とした。
【００２８】
[採血]
生理食塩水投与前はエーテル麻酔し尾静脈より、ストレス負荷前は２４時間の絶食前にエーテル麻酔し尾静脈より、また、ストレス負荷後は各時間の水浸拘束後にエーテル麻酔し心臓より、それぞれ採血を行った。得られた血液を室温で１時間静置した後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５分）し、その上清を血清として−４０℃で保管した。また、対照の血清は、生理食塩水投与前、ストレス負荷前（２４時間の絶食前）、および水浸拘束と同じ時間をケージ内で経過させエーテルで致死後、採血した。
【００２９】
[ＥＬＩＳＡによるＣＫ−ＭＭの検出]
市販抗ＣＫ−ＭＭモノクローナル抗体ＣＲ３０１４Ｍ１およびＣＲ３０１４Ｍ３（Cortex Biochem Inc.）を用い、固相化抗体をＣＲ３０１４Ｍ１に、ビオチン標識抗体をＣＲ３０１４Ｍ３としたサンドイッチＥＬＩＳＡにより、各血清中のＣＫ−ＭＭの相対量を測定した。その結果、ストレス負荷後の値からストレス負荷前の値を引いたＣＫ−ＭＭは、０．５時間、１時間であまり変わらず、５時間、１０時間で顕著に高い値を示した（図３）。また、対照でのＣＫ−ＭＭの値にはほとんど変化は認められなかった。これらのことから、水浸拘束個体でＣＫ−ＭＭ量が高い値を示したのは、試験における２４時間以降の絶食、あるいは採血操作などによるものではなく、水浸拘束ストレスに起因するものと考えられた。また、抗ＣＫ−ＭＭ抗体を用いることにより、ＥＬＩＳＡ、あるいはさらに簡易なイムノクロマト法などによるストレス負荷個体の血清から容易にＣＫ−ＭＭを測定できることから、ＣＫ−ＭＭのストレスマーカーとしての有効性と、測定方法を示すことができた。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明のストレス負荷前後の血清を二次元電気泳動に供試した結果を示す図である。左図はストレス負荷前の結果であり、右図がストレス負荷後の結果である。
【図２】本発明のストレス負荷後の血清を二次元電気泳動に供試した結果の拡大図である。
【図３】ストレス負荷によるラット血清中のクレアチンキナーゼの変化を示す図である。
【図１】
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【図２】
2007093597.tif 000003
【図３】
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