(57)【要約】【課題】測定試料中に含まれるタンパク質などの被測定物質の荷電を分析する方法を提供すること。【解決手段】スルホン酸基で修飾された表面を有する基板からなるバイオセンサーに、異なるｐＨを有する複数の被測定物質含有溶液を接触させ、該バイオセンサー表面への被測定物質の濃縮の程度を測定することを含む、被測定物質の荷電を分析する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スルホン酸基で修飾された表面を有する基板からなるバイオセンサーに、異なるｐＨを有する複数の被測定物質含有溶液を接触させ、該バイオセンサー表面への被測定物質の濃縮の程度を測定することを含む、被測定物質の荷電を分析する方法。
【請求項２】
基板が、金属表面又は金属膜から成る基板である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項３】
金属表面あるいは金属膜が、金、銀、銅、白金、及びアルミニウムからなる群より選ばれる自由電子金属からなるものである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
基板が、疎水性高分子化合物又は水溶性高分子化合物でコーティングした金属表面又は金属膜であるか、あるいは自己組織化膜を有する金属表面又は金属膜である、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
バイオセンサーが、スルホン酸基を有する高分子化合物を基板の表面にコートすることによって作成されるものである、請求項１から４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
表面プラズモン共鳴分析によりバイオセンサー表面への被測定物質の濃縮の程度を測定する、請求項１から５の何れかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スルホン酸基を導入した表面を有するバイオセンサーとｐＨを変化させた溶媒に被測定物質を溶解した溶液とを用いて被測定物質の荷電を分析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーの開発において、センシング部の金属薄膜に修飾を施すことが必要となり、ＳＰＲセンサーをバイオセンサーに応用するためには、金属薄膜を官能基を有するポリマーで修飾することが行われている。金属薄膜として金の薄膜を使用する場合、金へのチオール又はスルフィド類の自己吸着性（Self-Assembly）を利用する修飾法が知られている。例えば、ＳＰＲバイオセンサーにおけるセンサー表面へのリガンドの固定化のためには、金薄膜上に自己吸着したアルカンチオールをリンカー層として、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）層を導入し、そのＣＭＤ層にリガンドを固定化する方法が報告されている。ここで用いるＣＭＤ層の役割は、固定化するリガンド量の増加、金薄膜への生体分子の非特異的結合の防止などである。チオール、スルフィド類による修飾方法は、Claire E. Jordanらの論文（非特許文献１）では１ｍＭのチオールのエタノール溶液に１時間、金薄膜を浸すだけで９０％の吸着率を示すという簡単なものであり、吸着の評価は、Ｘ線電子分光法やＳＰＲ角変化を見ることにより行うことができる。
【０００３】
また、特許文献１には、金属表面に結合する層の上にヒドロゲルなどの生体適合性多孔質マトリックス層を設けてなる検出表面が記載されている。特許文献２には、二官能性又は多官能性分子を用いたセンサーユニットが記載されている。特許文献３には、センサー表面にリガンドが結合したセンサーを用いる巨大分子の特性の決定方法が記載されている。特許文献４には、可逆的結合受容体を含む固定化された結合パートナーを含む固体支持体を用いて試料中の関心のある分析対象物を検出する方法及び装置が記載されている。さらに、特許文献５には、自己吸着性単層膜（Self-Assembled Monolayer）上に膜形成蛋白質又は脂質を結合させた基質表面の製造方法が記載されている。
【０００４】
また、特許文献６には、生体分子もしくは生物分子集合体を固定化する部分（固定化部位）と固定化部位以外のバックグラウンド部を有する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定用バイオチップであり、分子量が２０００以上２００００以下のポリ−Ｌ−グルタミン酸を１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解しているｐＨ７．４のリン酸緩衝液が３０℃にてチップ表面に１０分間接触させた後に、リン酸緩衝液で１０分間洗浄した場合において、固定化部位に結合するポリ−Ｌ−グルタミン酸によって得られるＳＰＲによるシグナルと、固定化部位以外のバックグラウンド部への非特異吸着によるシグナルのシグナル比が２以上であるＳＰＲ測定用バイオチップが記載されている。このＳＰＲ測定用バイオチップは、バックグラウンド部には非特異的吸着がほとんどなく、結合部位に生体分子もしくは生物分子集合体の活性を保ったまま固定化できることを特徴とするものである。
【０００５】
しかしながら、上記した何れの文献にも、バイオセンサーを用いて分子の荷電を分析することについては記載がない。
【０００６】
【非特許文献１】Jordan, C.E. et al., Langmuir, 1994, 10, 3642-3648
【特許文献１】特表平４−５０１６０５号公報
【特許文献２】特表平４−５０１６０６号公報
【特許文献３】特表平４−５０１６０７号公報
【特許文献４】特表平７−５０７８６５号公報
【特許文献５】国際公開ＷＯ９６／１０１７８号公報
【特許文献６】特開２００４−１２５６２５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、測定試料中に含まれるタンパク質などの被測定物質の荷電を分析する方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、スルホン酸基で修飾された表面を有する基板からなるバイオセンサーとｐＨを変化させた溶媒に被測定物質を溶解した溶液を作製し、上記バイオセンサーの表面に上記溶液を接触させ、バイオセンサー表面への被測定物質の濃縮の程度を測定することによって、被測定物質の荷電を評価できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【０００９】
即ち、本発明によれば、スルホン酸基で修飾された表面を有する基板からなるバイオセンサーに、異なるｐＨを有する複数の被測定物質含有溶液を接触させ、該バイオセンサー表面への被測定物質の濃縮の程度を測定することを含む、被測定物質の荷電を分析する方法が提供される。
【００１０】
好ましくは、基板は、金属表面又は金属膜から成る基板である。
好ましくは、金属表面あるいは金属膜は、金、銀、銅、白金、及びアルミニウムからなる群より選ばれる自由電子金属からなるものである。
【００１１】
好ましくは、基板は、疎水性高分子化合物又は水溶性高分子化合物でコーティングした金属表面又は金属膜であるか、あるいは自己組織化膜を有する金属表面又は金属膜である。
【００１２】
好ましくは、バイオセンサーは、スルホン酸基を有する高分子化合物を基板の表面にコートすることによって作成されるものである。
好ましくは、表面プラズモン共鳴分析によりバイオセンサー表面への被測定物質の濃縮の程度を測定する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法によれば、測定試料中に含まれるタンパク質などの分子の荷電を評価することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明による被測定物質の荷電を分析する方法は、スルホン酸基で修飾された表面を有する基板からなるバイオセンサーに、異なるｐＨを有する複数の被測定物質含有溶液（即ち、被測定物質の溶液であってｐＨを変化させた溶液、好ましくは、ｐＨを変化させた溶媒に被測定物質を溶解した溶液）を接触させ、該バイオセンサー表面への被測定物質の濃縮の程度を測定することを特徴とする。
【００１５】
生理活性物質をその等電点よりも低いｐＨを有する緩衝液に溶解した場合は＋荷電となる。これに対して、同時に同じ緩衝液中で−荷電を持つポリマーを用意した場合、静電引力によって生理活性物質がポリマー上に濃縮され、種別することができる。生理活性物質はそれぞれ固有の等電点を有するため、より多種の生理活性物質を上記原理で種別するためには、緩衝液のｐＨによらず常に−荷電を持つポリマーを用意する必要がある。このような性質をもつポリマーとして、スルホン酸を導入したポリマーが適している。スルホン酸を導入したポリマーとしては、疎水性高分子化合物でもよいし、水溶性高分子化合物でもよい。ここで用いる疎水性高分子化合物及び水溶性高分子化合物については、本明細書中で後記する。なお、生理活性物質として蛋白質を考えた場合、その蛋白質がもつ電荷により種別する方法として等電点電気泳動があるが、本発明では、まったく新しい原理で蛋白がもつ電荷によって種別できる。
【００１６】
本発明では、スルホン酸基で修飾された表面を有する基板からなるバイオセンサーに、異なるｐＨを有する複数の被測定物質含有溶液（即ち、ｐＨを変化させた溶媒に被測定物質を溶解した溶液）を接触させる。即ち、本発明では、被測定物質を様々なｐＨの溶媒に溶解して溶液を作製し、得られた様々なｐＨを有する溶液をバイオセンサーに接触させ、バイオセンサー表面への被測定物質の濃縮の程度を測定する。なお、被測定物質を溶解するための溶媒のｐＨの範囲としては、被測定物質の等電点以下のｐＨから等電点以上のｐＨまでの範囲とすることができる。
【００１７】
被測定物質を溶解するための溶媒のｐＨは緩衝液を用いて調整することができ、緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液などを用いることができる。
【００１８】
本発明で言うバイオセンサーとは最も広義に解釈され、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどがある。バイオセンサーでは、これら互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。
【００１９】
本発明で用いるバイオセンサーでは、金属表面又は金属膜を基板として用いることができる。金属表面あるいは金属膜を構成する金属としては、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００２０】
金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上１０ｎｍ以下であるのが好ましい。
【００２１】
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。
【００２２】
金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
【００２３】
上記のようにして得られたバイオセンサー表面に、スルホン酸を導入したポリマーを配置し、被測定物質を緩衝液ともに接触させ、緩衝液のｐＨを変化させることにより被測定物質の荷電に対応したセンサー表面への結合をモニターすることが可能となる。
【００２４】
本発明において好ましくは、基板は、疎水性高分子化合物又は水溶性高分子化合物でコーティングした金属表面又は金属膜であるか、あるいは自己組織化膜を有する金属表面又は金属膜である。以下、疎水性高分子化合物、水溶性高分子化合物及び自己組織化膜について説明する。
【００２５】
本発明で用いることができる疎水性高分子化合物は、一般的には吸水性を有しないか吸水性が低い高分子化合物であり、水への溶解度（２５℃）は好ましくは１０％以下であり、より好ましくは１％以下であり、最も好ましくは０．１％以下である。
【００２６】
疎水性高分子としては、具体的には、ポリアクリル酸誘導体、ポリメタクリル酸誘導体、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリブタジエン、ポリメチルペンテン、シクロオレフィンポリマー、ポリスチレン（ＰＳ）、アクリロニトリル／ブタジエン／スチレン共重合体（ＡＢＳ）、スチレン／無水マレイン酸共重合体・ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）、ナイロン６、ナイロン６６、酢酸セルロース（ＴＡＣ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、変性ポリフェニレンエーテル（ｍ−ＰＰＥ）、ポリフェニレンサルファイド（ＰＰＳ）、ポリエーテルケトン（ＰＥＫ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリスルホン（ＰＳＦ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリフェニレンサルファイド（ＰＰＳ）、液晶ポリマー（ＬＣＰ）などを挙げることができる。これら疎水性高分子表面に、スルホン酸を導入導入した場合も、生理活性物質を２次元表面にその物質がもつ荷電により種別することが可能となる。また、本発明で用いる疎水性高分子化合物は、合成高分子化合物でもよいし、天然高分子又はその誘導体でもよい。
【００２７】
疎水性高分子化合物の基板へのコーティングは常法によって行うことができ、例えば、スピン塗布、エアナイフ塗布、バー塗布、ブレード塗布、スライド塗布、カーテン塗布、さらにはスプレー法、蒸着法、キャスト法、浸漬法等によって行うことができる。
【００２８】
本発明で用いることができる水溶性高分子化合物としては、デキストラン誘導体、デンプン誘導体、セルロース誘導体、ゼラチン等の天然高分子、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド誘導体、ポリメチルビニルエーテル等の合成高分子等が挙げられる。先に記載した疎水性高分子も、スルホン酸の導入率が高い場合は水溶性高分子となる。バイオセンサーへの応用との観点からは、水溶性天然高分子が好ましく、デキストラン誘導体が特に好ましい。
【００２９】
自己組織化単分子膜について説明する。チオールやジスルフィド類などの硫黄化合物は金等の貴金属基板上に自発的に吸着し単分子サイズの超薄膜を与える。またその集合体は基板の結晶格子や吸着分子の分子構造に依存した配列を示すことから自己組織化膜と呼ばれている。自己組織化単分子膜としては、金表面のアルカンチオール類、ガラス表面のアルキルシラン類、シリコン表面のアルコール類等が挙げられる。アルカンチオール類の具体例としては、7−カルボキシ−１−ヘプタンチオール、10-カルボキシ-1-デカンチオール、4,4'-ジチオジブチリックアシッド、11-ヒドロキシ-1-ウンデカンチオール、11-アミノ-1-ウンデカンチオールなどを使用することができる。これら自己組織化単分子膜が、スルホン酸を有する化合物から形成される場合、生理活性物質を２次元表面にその物質がもつ荷電により種別することが可能となる。
【００３０】
本発明に用いられる、スルホン酸を導入したポリマーを製造するに当たり、重合方法については特に制約はないが、例えば縮重合法によって製造されていてもよく、またエチレン性不飽和結合を有する化合物を用いてラジカル重合、アニオン重合等の方法によって製造されていてもよい。さらには天然高分子（例えば、デキストラン、セルロースがごとき天然多糖類、ゼラチンがごときポリアミノ酸等）、又はその誘導体から合成されてもよい。
【００３１】
本発明に用いられるポリマーに対するスルホン酸の導入方法についても特に制約はなく、通常のモノマー分子とスルホン酸を有するモノマーとの共重合反応を行って重合体（ポリマー）を製造してもよいし、予め重合体を製造した後にいわゆる高分子反応により、前記のスルホン酸を導入してもよい。本発明に用いられるポリマーは、スルホン酸を有するモノマー成分以外に、他のモノマー成分が共重合されていてもよい。
【００３２】
本発明に用いられる、スルホン酸を有するモノマー成分以外の、他のモノマー成分としては、以下のモノマーが挙げられる。
【００３３】
アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、エチレン性不飽和カルボン酸のアミド類：アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−アクリロイルモルホリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（もしくはその塩）等、芳香族単量体：スチレン、ビニルトルエン、ｐ−ｔ−ブチルスチレン、ビニルナフタレン等、その他のビニル単量体：エチレン、プロピレン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、トリフロロエチレン、トリフロロクロロエチレン、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ビニルアルコール、Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ−ビニルアセトアミド、アクリロニトリル、メタクリロニトリル等。ノニオン性基を有するモノマー：２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、２−ヒドロキシ−３−クロロプロピルアクリレート、β−ヒドロキシエチル−β′−アクリロイルオキシエチルフタレート、１，４−ブチレングリコールモノアクリレート、ヒドロキシスチレン、アリルアルコール、メタアリルアルコール、イソプロペニルアルコール、１−ブテニルアルコール等。両性イオン基を有するモノマー： [２−(メタクリロイルオキシ)エチル] ジメチル−（３−スルホプロピル）アンモニウムヒドロキシド 、［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］ホスホリルコリン等。
【００３４】
本発明に用いられる合成高分子化合物の具体例としては、例えば化合物１が挙げられる。化合物１は銀塩写真用の高分子硬膜剤として公知であり、その使用法については、例えば特開２００１−２６４９４８号に開示されている。このような高分子硬膜剤が結合された表面は、本発明として好ましく用いることが可能である。化合物１は、特開昭６０−６１７４２号に記載の方法で合成される。特開昭６０−６１７４２号に記載のＰ−１、Ｐ−４、Ｐ−６、Ｐ−１０、Ｐ−１５、Ｐ−１６、Ｐ−２１もまた、好ましく用いることが出来る。
【００３５】
【化１】
2007093225.tif 000002
【００３６】
本発明に用いることができる特に好ましい天然高分子又はその誘導体として、デキストラン、セルロース、グアーガム、スターチ、ヒドロキシエチルデキストラン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルグアーガム、ヒドロキシエチルスターチ、メチルデキストラン、メチルセルロース、メチルグアーガム、メチルスターチ、エチルデキストラン、エチルセルロース、エチルグアーガム、エチルスターチ、ヒドロキシプロピルデキストラン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルグアーガム、ヒドロキシプロピルスターチ、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルグアーガム、ヒドロキシエチルメチルスターチ、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルグアーガム及びヒドロキシプロピルメチルスターチ等が挙げられ、なかでもデキストラン、ヒドロキシエチルデキストラン、ヒドロキシプロピルデキストラン、セルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースが好ましい。また、これらの多糖類のヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基等の置換基は、単一の置換基で置換されたものでもよいし、複数の置換基で置換されたものでもよく、その構成単糖残基当たりの置換度は０．１〜３．０、特に０．５〜１．５が好ましい。また、これら多糖類又はその誘導体の重量平均分子量は、１万〜1000万、特に10万〜100万の範囲のものが好ましい。
【００３７】
天然高分子又はその誘導体に対しスルホン酸を導入する方法は、公知の方法を利用することができる。例えば多糖類にスルホン酸を導入する場合、アルカリ条件下でスルホン酸を反応させることで、スルホン酸を導入することが可能となる。
【００３８】
本発明における被測定物質としては、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。
【００３９】
本発明では、被測定物質と該表面との相互作用を、非電気化学的方法により検出及び／又は測定することが好ましい。非電気化学的方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。
【００４０】
本発明の好ましい態様によれば、本発明で用いるバイオセンサーは、例えば、透明基板上に配置される金属膜を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとして用いることができる。
【００４１】
表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。
【００４２】
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。
【００４３】
表面プラズモン共鳴測定装置とは、表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析するための装置である。本発明で用いられる表面プラズモン共鳴測定装置は、金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備える。
【００４４】
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００４５】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。
【００４６】
上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【００４７】
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。
【００４８】
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。
【００４９】
また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００５０】
上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。
【００５１】
なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。
【００５２】
さらに、ターンテーブル等に搭載された複数個の測定チップの測定を順次行うことにより、多数の試料についての測定を短時間で行うことができる全反射減衰を利用した測定装置が、特開２００１−３３０５６０号公報に記載されている。
【００５３】
本発明で用いるバイオセンサーを表面プラズモン共鳴分析に使用する場合、上記したような各種の表面プラズモン測定装置の一部として適用することができる。
【００５４】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００５５】
実施例１：
本実施例は、タンパク質の等電点により種別するためのセンサーチップの作製に関するものである。
（１）試料１（実施例）の作成
スルホン酸を導入したポリマーを併せ持つ表面として、Biacore社センサーチップCM-5（research  grade）のカルボキシル基を、タウリンで置換した表面を用いた。
【００５６】
CM-5を Biacore社製の表面プラズモン共鳴装置であるBiacore3000にセットし、0.4MのEDC（1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide：同仁化学製）および2.8mMのHODhbt （3,4-Dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine：東京化成）を含む水溶液と３０分接触させ、さらにタウリン（2-アミノエタン-1-スルホン酸：和光純薬製）の1.0M溶液（NaOHにてpH10.0に調整）と３０分接触させることで、カルボキシメチルデキストランのカルボキシル基がスルホン酸基に置換された表面が作製される。EDC/HODhbtによる活性化時間、タウリンの反応時間、さらにこの操作の繰り返し回数により、スルホン酸基への置換率を制御することが可能である。
【００５７】
実施例２
本実施例は、実施例１で得られたセンサーチップに対し、タンパク質の等電点（ｐＩ）の違いによる、センサーチップ表面への蛋白濃縮をモニターすることによるタンパク質の種別に関するものである。  タンパク質としては、ｐ５３（Calbiochem製）とｐ３８（Upstate製）を用いた。二つの蛋白の等電点（ｐＩ）は、ATTO社のAE-8150を用いた電気泳動実験で、同時測定したマーカー（Broad pI Kit, pH 3.5-9.3：Amersham Biosciences社製）との比較から、ｐ５３はｐＩ=４．０程度であり、ｐ３８はｐＩ=５．６程度であることを確認した。
【００５８】
1mgのｐ５３を1mlのHBS-EPバッファー（ビアコア社製、pH7.4）に溶解した溶液を10μl秤量し、90μlの酢酸バッファー（pH3.5）を加えることで、0.1mg/mlのｐ５３溶液（pH3.5, 0.1mg/ml）を調整した。（試料１）
【００５９】
1mgのｐ５３を1mlのHBS-EPバッファー（ビアコア社製、pH7.4）に溶解した溶液を10μl秤量し、90μlの酢酸バッファー（pH5.5）を加えることで、0.1mg/mlのｐ５３溶液（pH5.5, 0.1mg/ml）を調整した。（試料２）
【００６０】
1mgのｐ３８を1mlのHBS-EPバッファー（ビアコア社製、pH7.4）に溶解した溶液を10μl秤量し、90μlの酢酸バッファー（pH5.5）を加えることで、0.1mg/mlのｐ３８溶液（pH5.5, 0.1mg/ml）を調整した。（試料３）
【００６１】
実施例２
実施例１で作製したセンサーチップをBiacore社製の表面プラズモン共鳴装置であるBiacore3000にセットし、上記試料１、２、３を、各々９０秒流したところのセンサーチップ表面への蛋白濃縮について検討した。結果を図１に示す。
【００６２】
ｐＨ５．５の試料３では、濃縮効果がみられたが、同じｐＨ５．５の酢酸バッファーに溶解されているｐ５３（試料２）では濃縮がみられなかった。この結果から、ｐ３８でｐＨ５．５中ではプラス荷電となり、マイナス荷電であるスルホン酸導入ポリマーをもつセンサー表面に濃縮されたが、ｐ５３はｐＨ５．５中ではマイナス荷電であるため濃縮されないということを表している。
【００６３】
しかし、試料１ではｐ５３はセンサー表面に濃縮された。これはｐＨ３．５中では、ｐ５３もプラス荷電となるからである。
【００６４】
上記の結果は、ｐ５３とｐ３８を荷電の相違に基づいて種別できたということを意味している。従って、スルホン酸を導入したポリマーで被覆されたバイオセンサーを用いて、蛋白質溶液のｐＨを変化させることにより、蛋白質を荷電によって種別することが可能であることが実証された。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１は、実施例１で作製したセンサーチップに試料１、２及び３を流した場合のセンサーチップ表面への蛋白濃縮について検討した結果を示す。
【図１】
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