(57)【要約】【課題】植物由来及び／又は微生物由来製造の現場や植物由来及び／又は微生物由来リパーゼを用いる臨床検査薬の品質管理において簡便で操作性に優れ正確性と再現性に優れた酵素法によるリパーゼ活性測定試薬の提供。【解決手段】非イオン性界面活性剤に溶解したジグリセリドを植物由来及び／又は微生物由来リパーゼの基質として用い、植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ反応によって生成されるモノグリセリドを酵素法により検出することで精度・再現性に優れた試薬液状で長期保存安定性を確保し、植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ反応で生成されるモノグリセリドを酵素的に検出する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも非イオン性界面活性剤に溶解したジグリセリドを基質として用いることを特徴とする植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定用組成物。
【請求項２】
少なくとも非イオン性界面活性剤に溶解したジグリセリド、モノグリセリドリパーゼ、ＡＴＰ、グリセロキナーゼ、還元型ＮＡＤ、ホスフォエノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ、及びラクテートデヒドロゲナーゼを含有する植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定用組成物。
【請求項３】
少なくとも非イオン性界面活性剤に溶解したジグリセリド、モノグリセリドリパーゼ、ＡＴＰ、グリセロキナーゼ、酸化型ＮＡＤ又は酸化型ＮＡＤＰ、グルコース、ＡＤＰ−ヘキソキナーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを含有する植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定用組成物。
【請求項４】
少なくとも非イオン性界面活性剤に溶解したジグリセリド、モノグリセリドリパーゼ、ＡＴＰ、グリセロキナーゼ、グリセロ−３−リン酸オキシダーゼ、及びペルオキシダーゼと過酸化水素発色試薬を含有する植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定用組成物。
【請求項５】
非イオン性界面活性剤の濃度が、植物由来及び／又は微生物由来リパーゼのリパーゼ活性が発現する濃度である請求項１〜４いずれか１項に記載の植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定用組成物。
【請求項６】
試薬１と試薬２との組み合わせキットとして用いる請求項２〜５のいずれか１項に記載の植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定用組成物。
【請求項７】
試薬１及び／又は試薬２が液状である、請求項６記載の植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定用組成物。
【請求項８】
１の試薬にグリセロールオキシダーゼを添加し、他のいずれかの試薬にグリセロールキナーゼ、アデノシン−３−リン酸のどちらか又は両方を添加することを特徴とする請求項７に記載の植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定用組成物。
【請求項９】
請求項１〜８に記載のリパーゼ活性測定用組成物の、植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定の為の使用。
【請求項１０】
非イオン性界面活性剤に溶解したジグリセリド、モノグリセリドリパーゼ、ＡＴＰ、グリセロキナーゼ、ホスフォエノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、及び低濃度ｐＨ緩衝剤を含有する試薬１と、還元型ＮＡＤ又は還元型ＮＡＤＰと高濃度ｐＨ緩衝剤を含有する試薬２とからなる植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定用キット。
【請求項１１】
非イオン性界面活性剤に溶解したジグリセリド、モノグリセリドリパーゼ、ＡＴＰ、グリセロキナーゼ、グルコース、ＡＤＰ−ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、及び低濃度ｐＨ緩衝剤を含有する試薬１と、酸化型ＮＡＤ又は酸化型ＮＡＤＰと高濃度ｐＨ緩衝剤を含有する試薬２とからなる植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定用キット。
【請求項１２】
非イオン性界面活性剤に溶解したジグリセリド、モノグリセリドリパーゼ、ＡＴＰ、グリセロキナーゼ、グリセロ−３−リン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、色原体、及び低濃度ｐＨ緩衝剤を含有する試薬１と、カップラーと高濃度ｐＨ緩衝剤とを含有する試薬２とからなる植物由来及び／又は微生物リパーゼ由来活性測定用キット。
【請求項１３】
少なくとも非イオン性界面活性剤に溶解したジグリセリドを基質に用いてリパーゼ反応により生成されるモノグリセリドを酵素的に測定する植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定方法。
【請求項１４】
請求項２項に記載のリパーゼ活性測定用組成物を用いた、リパーゼ反応でジグリセリドから遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりグリセロールに変換し、これをＡＴＰ存在下にグリセロールキナーゼによりＡＤＰに変換し、次いでホスフォエノールピルビン酸存在下にピルビン酸キナーゼでピルビン酸に変換し、更に還元型ＮＡＤ存在下にラクテートデヒドロゲナーゼを作用させ、還元型ＮＡＤの３４０ｎｍ付近の波長における吸光度の減少速度を測定する植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定方法。
【請求項１５】
請求項３項に記載のリパーゼ活性測定用組成物を用いた、リパーゼ反応でジグリセリドから遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりグリセロールに変換し、これをＡＴＰ存在下にグリセロールキナーゼによりＡＤＰに変換し、次いでグルコース存在下にＡＤＰ−へキソキナーゼでグルコース−６−リン酸に変換し、更に酸化型ＮＡＤ又はＮＡＤＰ存在下にグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、還元型ＮＡＤ又は還元型ＮＡＤＰの３４０ｎｍ付近の波長における吸光度の増加速度を測定する植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定方法。
【請求項１６】
請求項４項に記載のリパーゼ活性測定用組成物を用いた、リパーゼ反応でジグリセリドから遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりグリセロールに変換し、これをＡＴＰ存在下にグリセロールキナーゼによりグリセロール−３−リン酸に変換し、次いでグリセロール−３−リン酸オキシダーゼを作用させ過酸化水素に変換し、更に過酸化水素発色色素存在下にペルオキシダーゼを作用させ発色反応を行い、５４０〜７００ｎｍ付近の波長における吸光度の増加速度を測定する植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定方法。
【請求項１７】
非イオン性界面活性剤の濃度が、植物由来及び／又は微生物由来リパーゼのリパーゼ活性が発現する濃度である請求項１３〜１６いずれか１項に記載の植物及び／又は微生物リパーゼ活性測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はリパーゼ製造および工業用用途・臨床検査診断試薬等のリパーゼ応用分野における植物由来及び／又は微生物由来リパーゼの活性測定用組成物および活性測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
油脂分解酵素であるリパーゼは動植物や微生物等に広く存在している。例えば、微生物由来リパーゼとしては、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・フェニクス、アスペルギルス・ウサミ等のアスペルギルス属、ペニシリウム・キャメンベルティ、ペニシリウム・クリソゲナム、ペニシリウム・ロッキェフェルティ等のペニシリウム属、ムコール・ジャバニクス、ムコール・ミエハイ等のムコール属、リゾプス・デレマー、リゾプス・ジャバニクス、リゾプス・ミエハイ、リゾプス・ニベウス、リゾプス・オリゼー等のリゾプス属、リゾムコール・ミエハイなどの糸状菌、キャンディダ・ルゴサ等のキャンディダ属の酵母、ストレプトマイセス属の放線菌、アルカリゲネス属、シュドモナス・フラジ、シュドモナス・フルオレッセンス等のシュドモナス属、クロモバクテリウム・ビスコサム、セラチア・マセランス等に存在しているもの等が知られており、これらの微生物等の培養液から製造されている。また、動物由来のリパーゼとしては、動物の膵臓等から得られるものが知られている。そして、植物由来のリパーゼとしては、植物種子、米ぬか、小麦胚芽等から得られるものが知られている。これらのリパーゼは、工業用用途、診断薬原料酵素等として広範囲に利用されている。例えば、工業用用途としては、医薬品・農薬等の原料として使用する光学活性体アルコール、光学活性体エステル化合物の製造用途等に用いられており、又、診断薬原料酵素としては、血中の中性脂質（トリグリセリド）診断薬原料酵素として用いられている。
【０００３】
ところで、工業用用途、診断薬原料酵素等として広範囲に利用されているリパーゼは、品質、価格、安定供給等の面から、発酵法（微生物の培養物から抽出分離精製）により製造されており、実質的には、微生物由来リパーゼが用いられている。そして、リパーゼの製造プロセスの管理において、工程管理の観点からリパーゼ活性測定法は工程管理測定法として必須である。工程管理測定は、リパーゼを大量に製造する工程でも必要であるが、例えば、臨床検査薬などに使用する微量の試薬を製造する工程でも必要である。  
通常リパーゼの活性測定に用いる基質はオリーブ油、トリオレインなどのトリグリセリドが使用されるが水に不溶性であるために乳化剤存在下でホモゲナイザーを用いて強制的に攪拌した基質が用いられている。この基質にリパーゼが作用して生成された遊離脂肪酸を水酸化ナトリウム等のアルカリ溶液で滴定する方法が一般的に行われている（非特許文献１）。この方法においては基質エマルジョンの作製条件やリパーゼ反応後の滴定の個人差によりリパーゼ活性度測定の精度（同時測定再現性、日間測定再現性）の面で十分でない。特に中性脂肪測定検査薬に用いるリパーゼの原料管理、試薬の安定性等の品質管理においては前記方法では不十分であった。リパーゼを原料に用いた臨床検査薬は自動分析機器を用いて１検体あたり０．１ｍｌ程度の試薬量である。近年更なる試薬の微量化の要望があるが、このように微量の試薬を製造する品質管理においてリパーゼ活性を従来のトリグリセリドを基質にしてリパーゼ反応で生成した遊離の脂肪酸をアルカリで滴定するリパーゼ活性測定方法ではリパーゼ活性測定は現実的に不可能であった。
【０００４】
こうしたトリグリセリド基質を用いる方法の課題解決を目的としてジグリセリドを基質に用いる方法が開発されてきている（特許文献１、特許文献２）。しかしながら従来の膵リパーゼ活性を発現するために使用するジグリセリドを溶解する非イオン性界面活性剤濃度範囲では微生物由来リパーゼ活性発現が全く不十分であり正確に測定することはできなかった。
こうした状況下、品質、価格、供給等の面で優れている微生物由来リパーゼの酵素活性を正確、且つ高感度、さらに簡便に測定する技術開発、特に、微量の試薬を製造する工程の工程管理測定方法等を指向した十分に感度を有する新しい技術開発が望まれていた。
【特許文献１】特開昭５９−９１８９８号公報
【特許文献２】特開昭６３−２４５６７２号公報
【非特許文献１】ＪＩＳ  Ｋ０６０１（工業用リパーゼの活性度測定方法）１９８８年制定
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、簡便かつ正確に植物由来及び／又は微生物由来リパーゼの酵素活性を測定するための組成物を提供することを課題とする。さらには、簡便かつ正確な植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定用組成物、植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定用キット、及び植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定方法を提供することも課題とする。具体的にはリパーゼ製造および工業用用途・臨床検査診断試薬等のリパーゼ応用分野における従来の組成物よりも優れた精度及び簡便性を有する組成物を提供すること、及び該組成物を用いた植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定方法を提供すること、さらには長期保存安定性に優れたジグリセリドの水溶液を含有するキット、組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、先ず、リパーゼ活性を精度良く測定するという課題を解決するために、ジグリセリドおよびこれを溶解する界面活性剤に着目し鋭意検討した結果、ジグリセリドを非イオン性界面活性剤に溶解した基質を用いるとリパーゼの起源によらずに安定して正確なリパーゼ活性を測定することできることを見出した。次に、微生物由来リパーゼにおいて、非イオン性界面活性剤の濃度を高値にすることで安定して正確なリパーゼ活性を測定できることを見出し、さらには植物由来リパーゼについても、従来の膵リパーゼ活性を発現するために使用するジグリセリドを溶解する非イオン性界面活性剤濃度範囲では活性発現が全く不十分であるが、非イオン性界面活性剤の濃度を高値にすることで安定して正確に測定できることも合わせて見出した。その上、ジグリセリドの水溶液中における長期保存安定性の向上に着目して鋭意検討した結果、低濃度のｐＨ緩衝剤を共存させると長期保存安定性が向上することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下のような構成から成る。
１）少なくとも非イオン性界面活性剤に溶解したジグリセリドを基質として用いることを特徴とする植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定用組成物。
２）少なくとも非イオン性界面活性剤に溶解したジグリセリド、モノグリセリドリパーゼ、ＡＴＰ、グリセロキナーゼ、還元型ＮＡＤ、ホスフォエノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ、及びラクテートデヒドロゲナーゼを含有する植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定用組成物。
３）少なくとも非イオン性界面活性剤に溶解したジグリセリド、モノグリセリドリパーゼ、ＡＴＰ、グリセロキナーゼ、酸化型ＮＡＤ又は酸化型ＮＡＤＰ、グルコース、ＡＤＰ−ヘキソキナーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを含有する植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定用組成物。
４）少なくとも非イオン性界面活性剤に溶解したジグリセリド、モノグリセリドリパーゼ、ＡＴＰ、グリセロキナーゼ、グリセロ−３−リン酸オキシダーゼ、及びペルオキシダーゼと過酸化水素発色試薬を含有する植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定用組成物。
５）非イオン性界面活性剤の濃度が、植物由来及び／又は微生物由来リパーゼのリパーゼ活性が発現する濃度である上記１）〜４）いずれかに記載の植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定用組成物。
【０００８】
６）試薬１と試薬２との組み合わせキットとして用いる上記２）〜５）のいずれかに記載の植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定用組成物。
７）試薬１及び／又は試薬２が液状である、上記６）記載の植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定用組成物。
８）１の試薬にグリセロールオキシダーゼを添加し、他のいずれかの試薬にグリセロールキナーゼ、アデノシン−３−リン酸のどちらか又は両方を添加することを特徴とする上記７）に記載の植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定用組成物。
９）上記１）〜８）に記載のリパーゼ活性測定用組成物の、植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定の為の使用。
１０）非イオン性界面活性剤に溶解したジグリセリド、モノグリセリドリパーゼ、ＡＴＰ、グリセロキナーゼ、ホスフォエノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、及び低濃度ｐＨ緩衝剤を含有する試薬１と、還元型ＮＡＤ又は還元型ＮＡＤＰと高濃度ｐＨ緩衝剤を含有する試薬２とからなる植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定用キット。
【０００９】
１１）非イオン性界面活性剤に溶解したジグリセリド、モノグリセリドリパーゼ、ＡＴＰ、グリセロキナーゼ、グルコース、ＡＤＰ−ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、及び低濃度ｐＨ緩衝剤を含有する試薬１と、酸化型ＮＡＤ又は酸化型ＮＡＤＰと高濃度ｐＨ緩衝剤を含有する試薬２とからなる植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定用キット。
１２）非イオン性界面活性剤に溶解したジグリセリド、モノグリセリドリパーゼ、ＡＴＰ、グリセロキナーゼ、グリセロ−３−リン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、色原体、及び低濃度ｐＨ緩衝剤を含有する試薬１と、カップラーと高濃度ｐＨ緩衝剤とを含有する試薬２とからなる植物由来及び／又は微生物リパーゼ由来活性測定用キット。
１３）少なくとも非イオン性界面活性剤に溶解したジグリセリドを基質に用いてリパーゼ反応により生成されるモノグリセリドを酵素的に測定する植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定方法。
１４）上記２）に記載のリパーゼ活性測定用組成物を用いた、リパーゼ反応でジグリセリドから遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりグリセロールに変換し、これをＡＴＰ存在下にグリセロールキナーゼによりＡＤＰに変換し、次いでホスフォエノールピルビン酸存在下にピルビン酸キナーゼでピルビン酸に変換し、更に還元型ＮＡＤ存在下にラクテートデヒドロゲナーゼを作用させ、還元型ＮＡＤの３４０ｎｍ付近の波長における吸光度の減少速度を測定する植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定方法。
【００１０】
１５）上記３）に記載のリパーゼ活性測定用組成物を用いた、リパーゼ反応でジグリセリドから遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりグリセロールに変換し、これをＡＴＰ存在下にグリセロールキナーゼによりＡＤＰに変換し、次いでグルコース存在下にＡＤＰ−へキソキナーゼでグルコース−６−リン酸に変換し、更に酸化型ＮＡＤ又はＮＡＤＰ存在下にグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、還元型ＮＡＤ又は還元型ＮＡＤＰの３４０ｎｍ付近の波長における吸光度の増加速度を測定する植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定方法。
１６）上記４）に記載のリパーゼ活性測定用組成物を用いた、リパーゼ反応でジグリセリドから遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりグリセロールに変換し、これをＡＴＰ存在下にグリセロールキナーゼによりグリセロール−３−リン酸に変換し、次いでグリセロール−３−リン酸オキシダーゼを作用させ過酸化水素に変換し、更に過酸化水素発色色素存在下にペルオキシダーゼを作用させ発色反応を行い、５４０〜７００ｎｍ付近の波長における吸光度の増加速度を測定する植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定方法。
１７）非イオン性界面活性剤の濃度が、植物由来及び／又は微生物由来リパーゼのリパーゼ活性が発現する濃度である上記１３）〜１６）いずれかに記載の植物及び／又は微生物リパーゼ活性測定方法。
【発明の効果】
【００１１】
取り扱いが簡便であり再現性及び正確性に優れた植物由来及び／又は微生物リパーゼ活性測定キット、リパーゼ活性測定用組成物を提供すること、さらには長期保存安定性に優れたジグリセリドの水溶液を含有するキット、組成物の提供が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明について具体的に説明する。
本発明の植物及び／又は微生物リパーゼ活性測定用組成物、植物及び／又は微生物リパーゼ活性測定試薬、植物及び／又は微生物リパーゼ活性測定用キット、及び植物及び／又は微生物リパーゼ活性測定方法は、植物由来及び／又は微生物由来のリパーゼの活性を正確且つ簡便に行うために有用である。
本発明のリパーゼ活性測定用組成物は、非イオン性界面活性剤に溶解したジグリセリド基質を用いて植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性を測定することを特徴とする。
本発明のリパーゼ活性測定方法は、ジグリセリドに植物由来及び／又は微生物リパーゼが作用して遊離するモノグリセリドを酵素的に検出することを特徴とする。
【００１３】
本発明に用いることができるリパーゼの基質としてのジグリセリドとしては、例えば、１，２−ジオレオルグリセリルコリン、１−パルミトイル−２−オレイルグリセリルコリン、卵黄由来精製レシチン、又は大豆由来精製レシチン等のリン脂質を予め調製し、これらのリン脂質にホスフォリパーゼＣを作用して得ることができるが、レシチン等のリン脂質にホスフォリパーゼＣを反応させることによって得られる１，２−ジグリセリドが好ましい例として挙げられる。また、該１，２−ジグリセリドを、非イオン界面活性剤存在下でアルカリ処理を施して一部１，３−ジグリセリドに変換させたジグリセリド（１、２−ジグリセリドと１，３−ジグリセリドの混合物）も本発明のリパーゼ反応の基質として用いることができる。より安定したリパーゼ活性を得ることができる点で、該１，２−ジグリセリドと１，３−ジグリセリド混合物の方がリパーゼ基質として好ましく、１，２−ジグリセリドと１，３−ジグリセリド平衡状態付近の混合物であることが好ましい態様もある。このジグリセリド混合物は非イオン性界面活性剤を含有する緩衝液を用い温度と加温時間を変えてアルカリ処理を施すことで得ることができる。アルカリ処理温度とアルカリ処理時間は、１，２−ジグリセリドと１，３−ジグリセリドの比率を測定して適宜設定できる。具体的には１，２−ジグリセリドと１，３−ジグリセリドの比率が２：１〜２：３の範囲になるようにするのが好ましく、１：１〜２：３の範囲になるようにするのも好ましい。また、２：１〜１：１の範囲になるようにするのが好ましい別の態様もある。さらに、１，２−ジグリセリドと１，３−ジグリセリドの比率が７０：３０〜３０：７０の範囲になるようにするのが好ましく、５０：５０〜３０：７０の範囲になるようにするのも好ましい。また、１，２−ジグリセリドと１，３−ジグリセリドの比率が７０：３０〜５０：５０の範囲になるようにするのが好ましい別の態様もある。さらに１，２−ジグリセリドと１，３−ジグリセリドの比率が５０：５０〜３５：６５の範囲になるようにするのが好ましい別の態様もある。１，２−ジグリセリドと１，３−ジグリセリドの平衡状態を達成する条件としては、例えばｐＨ８〜ｐＨ９の場合には３７℃で５〜８時間、３０℃で１０〜２０時間程度加温する方法、又、ｐＨ９〜ｐＨ１１の場合には３７℃で１時間程度加温する等の方法が挙げられる。ｐＨ９〜ｐＨ１１の場合に３７℃で１時間程度加温する方法がより好ましい。また、ｐＨ８〜ｐＨ９の場合に３７℃で５〜８時間、３０℃で１０〜２０時間程度加温する方法がより好ましい別の態様もある。ｐＨ８〜ｐＨ９の場合においては、ｐＨの上限としてはｐＨ９．０未満であることが好ましく、ｐＨ８．７以下であることがより好ましく、ｐＨ８．５以下であることがさらに好ましく、またｐＨの下限としてはｐＨ８．０以上であることが好ましく、ｐＨ８．１以上であることがより好ましく、ｐＨ８．３以上であることがさらに好ましく、ｐＨ８．４以上であることが特に好ましい。又、ｐＨ９〜ｐＨ１１の場合においてはｐＨの上限としてはｐＨ１１．０以下であることが好ましく、ｐＨ１０．７以下であることがより好ましく、ｐＨ１０．５以下であることがさらに好ましく、ｐＨ１０．３以下であることが特に好ましく、ｐＨ１０．２５以下であることが最も好ましく、またｐＨの下限としてはｐＨ９．０以上であることが好ましく、ｐＨ９．４以上であることがより好ましく、ｐＨ９．５以上であることがさらに好ましく、ｐＨ９．７以上であることが特に好ましく、ｐＨ９．８以上であることが最も好ましい。このようにして調製した基質溶液は長期保存するために冷蔵保存することが好ましい。この基質を後述するリパーゼ反応液に供する。
【００１４】
また、本発明により、低濃度のｐＨ緩衝液、及び非イオン性界面活性剤存在下で実質的に１，２−ジグリセリドと１，３−ジグリセリドの平衡状態の濃度分布となっているジグリセリドを含有した液状であるリパーゼ活性測定用基質が提供される。平衡状態の濃度分布とは、１，２−ジグリセリドと１，３−ジグリセリドの比率が一定温度条件下変化しない時点での１，２−ジグリセリドと１，３−ジグリセリドの割合であれば特に限定されないが、具体的にはジグリセリド混合物に対して上記アルカリ処理を行い、その後４℃〜８℃で保存した状態が挙げられる。４〜８℃で保存した場合、１，２−ジグリセリドと１，３−ジグリセリドの比率は変化しない。冷蔵保存する時のｐＨは５〜９．５範囲で使用することができるが、上限としてはｐＨ９．５以下であることが好ましく、ｐＨ９．０以下であることがより好ましく、ｐＨ８．５以下であることがさらに好ましく、ｐＨ８．３以下であることが特に好ましく、ｐＨ８．１以下であることが最も好ましく、下限としてはｐＨ５．０以上であることが好ましく、ｐＨ６．０以上であることがより好ましく、ｐＨ７．０以上であることがさらに好ましく、ｐＨ７．５以上であることが特に好ましく、ｐＨ７．８以上であることが最も好ましい。また冷蔵保存時のｐＨとして、ｐＨ８付近が好ましい別の態様もある。
【００１５】
なお、１，２−ジグリセリドと１，３−ジグリセリドの割合を測定する方法としては、薄層クロマトにより展開（展開溶媒；クロロホルム９５：アセトン５）した後ヤトロスキャン法（検出はＦＩＤ；フレームイオナイズスキャン法による）を用いて分析を行った。
リパーゼ反応に最適な基質濃度は０．２５ｍＭ〜２ｍＭの範囲であるが０．５ｍＭ程度が安定性およびリパーゼに対する特異性を考慮した場合特に好ましい。本発明で用いる原料ジグリセリドの濃度としては、下限値は０．２５ｍＭ以上が好ましく、０．３０ｍＭ以上がさらに好ましく、０．３２ｍＭ以上が特に好ましく、０．３４ｍＭ以上が最も好ましい。また、上限値は２ｍＭ以下が好ましく、１ｍＭ以下がさらに好ましく、０．８ｍＭ以下が特に好ましく、０．６ｍＭ以下が最も好ましい。
特に、０．５ｍＭ程度が安定性を考慮した場合に好ましい。
【００１６】
ジグリセリドを構成する高級脂肪酸残基としての脂肪酸としては炭素数１２以上の高級脂肪酸であればよく、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸等の飽和高級脂肪酸やパルミトオレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸等の不飽和高級脂肪酸が挙げられる。これらの高級脂肪酸は１種類だけでもよく２種類の異なる高級脂肪酸の組み合わせであってもよいが、不飽和高級脂肪酸を含有するジグリセリドが基質として調製した際の溶液の澄明度が高くより好ましい。特に好ましいジグリセリドとしては１，２−ジオレイルグリセロール、１−パルミトイル−２−オレイルグリセロールを挙げることができる。これらのジグリセリドを得るには１，２−ジオレオルグリセリルコリン、１−パルミトイル−２−オレイルグリセリルコリン、卵黄由来精製レシチン、大豆由来精製レシチン等のリン脂質を予め調製し、これらのリン脂質にホスフォリパーゼＣを作用させて調製すればよい。
【００１７】
本発明において、植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性を測定するための非イオン性界面活性剤としては、各種の非イオン性界面活性剤を使用することができる。例えば、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）高級アルコールエーテル、ＰＯＥ第２級アルコールエトキシレート、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル、ＰＯＥ脂肪酸エステル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル等から選択することができるが、溶解性、安定性の面でＰＯＥアルキルフェニルエーテル系非イオン性界面活性剤が好ましい。ＰＯＥアルキルフェニルエーテル系非イオン性界面活性剤としては、例えば、ＰＯＥノニルフェニルエーテル等が挙げられる。
非イオン性界面活性剤の使用濃度は、植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性を最大に発現させ且つ阻害しない濃度範囲、具体的には、ジグリセリドに対して１．５倍モル比以上であればよい。基質溶解の点では２．５倍モル以上が好ましく、３倍モル以上がより好ましく、４倍モル以上がさらに好ましく、５倍モル以上が特に好ましい。実作業の観点からの具体的な下限値としては、０．０８％（重量％）以上が好ましく、０．１０％以上がより好ましく、０．１５％以上がさらに好ましく、０．２０％以上が特に好ましい。また、実作業の観点からの具体的な上限値としては、２％（重量％）以下が好ましく、１％以下がより好ましく、０．５％以下がさらに好ましく、０．３％以下が特に好ましい。好適な範囲の一例としては、０．１５％〜２％、特に０．２〜０．３％が挙げられる。
【００１８】
本質的には、ジグリセリドと非イオン性界面活性剤のモル比によって形成される水に可溶性のミセル構造に着目し、ジグリセリド：非イオン性界面活性剤＝１：２付近で形成されるミセル構造と異なるミセル構造を形成するのに必要な量以上の非イオン性界面活性剤濃度を、植物由来及び／又は微生物由来リパーゼのリパーゼ活性が発現する濃度として用いればよい。ジグリセリドとの濃度比としての非イオン性界面活性剤の濃度としては、活性を発現する１０〜３０倍モル比の範囲で使用することができるが、特に１５〜２０倍モル比で使用することが好ましい。
本発明において、界面活性剤に溶解したジグリセリドの長期保存安定性を得るために用いるｐＨ緩衝液としては、例えばトリス−塩酸、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ等のグッドの緩衝液やグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を使用することができるが、中でも、試薬ブランクが低いＴｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅがより好ましく、Ｂｉｃｉｎｅが特に好ましい。使用する濃度はジグリセリド濃度と同倍モル〜２倍モル程度でよい。
【００１９】
界面活性剤に溶解したジグリセリドの長期保存安定性は、共存するｐＨ緩衝液の濃度に依存するためｐＨ緩衝液濃度の選択は極めて重要である。非イオン性界面活性剤に溶解したジグリセリドに添加するｐＨ緩衝液の濃度が、例えば１０ｍＭ以上の高濃度条件では、ジグリセリドは室温において不安定であり冷蔵保存を行ったときですら長期保存により加水分解を受ける。ジグリセリドの長期保存安定性を維持するためには０．５〜９ｍＭの範囲で使用することが好ましい。より好ましくは２〜７ｍＭ、特に好ましくは３〜５ｍＭである。従って、リパーゼ測定用組成物においては、ジグリセリド、界面活性剤を含有する溶液の長期安定性や、測定対象リパーゼの種類等を考慮して、必要に応じて試薬を分割する等の工夫を施すことが大変に好ましい。
【００２０】
植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定に用いる上記のジグリセリド濃度は０．１〜２ｍＭの範囲で使用できるが、好ましくは０．２〜０．８ｍＭ、特に好ましくは０．３〜０．７ｍＭである。ジグリセリドを基質にした際のリパーゼ反応の生成物は遊離脂肪酸とモノグリセリドである。遊離脂肪酸もしくはモノグリセリドを、酵素反応を共役させて分光学的手法でこれらの生成速度を測定することによりリパーゼ活性を測定することができるが、遊離脂肪酸は粗酵素抽出液中に存在している。このためモノグリセリドを酵素法により測定する方が好ましい。該モノグリセリドを定量する際は、関与する共役酵素を用いた酵素法を用いて測定するのが好ましい。
【００２１】
モノグリセリドを酵素法により定量する方法として下記反応式に示す３つの方法がある。
下記反応式中ＭＧＬＰはモノグリセリドリパーゼ、ＧＫはグリセロールキナーゼ、ＡＴＰはアデノシン−３−リン酸、ＡＤＰはアデノシン−２−リン酸、ＰＥＰはホスフォエノールピルビン酸、ＰＫはピルビン酸キナーゼ、ＮＡＤＨは還元型βジホスフォピリジンヌクレオチド、ＮＡＤは酸化型βジホスフォピリジンヌクレオチド、ＡＤＰ−ＨＫはＡＤＰ依存性のヘキソキナーゼ、Ｇ６ＰＤＨはグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼである。ＧＰＯはグリセロ−３−リン酸オキシダーゼ、ＰＯＤはペルオキシダーゼ、４−ＡＡは４−アミノアンチピリン、ＴＯＯＳはエチル−Ｎ−(２−ヒドロオキシ−３−スルフォプロピル）−ｍ−ルイジンナトリウムである。
【００２２】
【化１】
2007306821.tif 000002
【００２３】
【化２】
2007306821.tif 000003
【００２４】
【化３】
2007306821.tif 000004
【００２５】
まず反応式１の場合について述べる。
本発明で用いるモノグリセリドリパーゼとしては、ジグリセリドに作用せずモノグリセリドに特異的に作用する酵素であれば特に起源は問わないが、安定供給の点で微生物由来酵素が好ましい。中でもバチルス属由来酵素が好ましい。リパーゼ反応における共役酵素として使用する濃度の下限値としては、０．５Ｕ／ｍｌ以上が好ましく、０．６Ｕ／ｍｌ以上がより好ましく、０．７Ｕ／ｍｌ以上がさらに好ましく、０．７２Ｕ／ｍｌ以上が特に好ましく、０．７４Ｕ／ｍｌ以上が大変に好ましい。上限値としては、５Ｕ／ｍｌ程度あれば充分であり、３Ｕ／ｍｌ以下が好ましく、１．１３Ｕ／ｍｌ以下がより好ましく、１Ｕ／ｍｌ以下がさらに好ましく、０．８Ｕ／ｍｌ以下が特に好ましく、０．７８Ｕ／ｍｌ以下が大変に好ましく、０．７６Ｕ／ｍｌ以下が特に大変に好ましい。最も好ましいのは０．７５Ｕ／ｍｌ付近である。
【００２６】
本発明で用いるグリセロキナーゼは特にその起源は問わないが安定性に優れた酵素の使用が好ましい。中でもフラボバクテリウム属由来酵素が好ましい。植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ反応における共役酵素として使用する濃度は、下限値としては０．１Ｕ／ｍｌ以上が好ましく、０．１５Ｕ／ｍｌ以上がより好ましく、０．１８Ｕ／ｍｌ以上がさらに好ましく、０．２Ｕ／ｍｌ以上が特に好ましい。また、上限値としては２Ｕ／ｍｌ程度あれば充分であり、１Ｕ／ｍｌ以下が好ましく、０．５Ｕ／ｍｌ以下がより好ましく、０．３Ｕ／ｍｌ以下がさらに好ましく、０．２２Ｕ／ｍｌ以下が特に好ましい。最も好ましいのは０．２Ｕ／ｍｌ付近である。
本発明で用いるピルビン酸キナーゼは、臨床検査試薬の原料として汎用される動物筋肉由来酵素を使用することができる。植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ反応における共役酵素としてのピルビン酸キナーゼは０．５〜１０Ｕ／ｍｌ程度あればよく、１〜２Ｕ／ｍｌの範囲が好ましく、０．８〜１．２Ｕ／ｍｌの範囲が特に好ましい。最も好ましいのは１Ｕ／ｍｌ付近である。
【００２７】
ピルビン酸キナーゼの基質である、本発明で用いるホスフォエノールピルビン酸は０．３〜２ｍＭの範囲、好ましくは０．３〜０．４ｍＭ、或いは０．４８〜０．５２ｍＭで使用することができるが好ましくは０．５ｍＭ付近である。
本発明で用いるラクテートデヒドロゲナーゼは、その起源は特に問わないが安定性に優れたトリ心臓由来酵素の使用がより好ましい。植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ反応における共役酵素としての本酵素は０．１５〜１．５Ｕ／ｍｌ程度あればよく、好ましくは０．３〜０．４Ｕ／ｍｌ、或いは０．２８〜０．３２Ｕ／ｍｌの範囲が挙げられる。好ましくは０．３Ｕ／ｍｌ付近である。
ラクテートデヒドロゲナーゼの基質である、本発明で用いる還元型ＮＡＤは０．２〜０．４ ｍＭの範囲が好ましく、０．２〜０．３５ｍＭの範囲がさらに好ましく、０．２８〜０．３２ｍＭの範囲が特に好ましい。好ましくは０．３ｍＭ付近である。０．３〜０．４ ｍＭの範囲が好ましい態様もある。
【００２８】
グリセロキナーゼおよびピルビン酸キナーゼの活性化剤であるマグネシウムイオンを、本発明の組成物にさらに添加した組成物も大変に好ましい。該マグネシウムイオンは１．５〜４ｍＭの範囲、好ましくは１．８〜２．２ｍＭの範囲で使用することができるが、特に好ましくは２ｍＭ付近である。マグネシウムイオンは塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム等の塩を使用することができるが中でも硫酸マグネシウムが特に好ましい。
リパーゼ反応のｐＨを一定に保つために緩衝液を使用することは大変に好ましい。ＨＴＧＬ、ＬＰＬ共に活性の最適ｐＨは７．７〜８．３であり、このｐＨ範囲に緩衝能のある緩衝液、例えばトリス−塩酸、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ，ＥＰＰＳ，Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ，ｃＨＥＳ等のグッドの緩衝液を使用することができるが、中でも、試薬ブランクが低いＴｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅがより好ましく、トリス−塩酸緩衝液が特に好ましい。使用する濃度の下限値としては、５０ｍＭ以上が好ましく、１００ｍＭ以上がより好ましく、１５０ｍＭ以上が更に好ましく、１８０ｍＭ以上が特に好ましい。また上限値としては、５００ｍＭ以下が好ましく、３００ｍＭ以下がより好ましく、２５０ｍＭ以下が更に好ましく、２２０ｍＭ以下が特に好ましい。２００ｍＭ付近が最も好ましい。
【００２９】
次に反応式２について述べる。
反応式２を用いるリパーゼの測定試薬組成の中で、ジグリセリド、緩衝液、モノグリセリドリパーゼ、グリセロキナーゼおよびＡＴＰは前記反応式１の内容と同一である。グリセロキナーゼの生成物のひとつであるＡＤＰはグルコース存在下ＡＤＰ依存性へキソキナーゼによりグルコース−６−リン酸に変換できる。
ＡＤＰ−ＨＫは特にその起源は問わないが、安定供給の点で微生物由来が好ましい。中でも保存安定性に優れたパイロコッカス属やサーモコッカス属等の高度好温菌由来酵素が特に好ましい。
【００３０】
ＡＤＰ−ＨＫの基質であるグルコースは２〜５０ｍＭの範囲で使用することができるが中でも１０〜３０ｍＭ特に１５〜２５ｍＭが特に好ましい。リパーゼ反応の共役酵素としての本酵素の濃度は０．２〜３Ｕ／ｍｌの範囲で使用できるが０．４〜１Ｕ／ｍｌが特に好ましい。
本酵素の生成物であるグルコース−６−リン酸は酸化型ＮＡＤまたはＮＡＤＰ存在下でグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼによって還元型ＮＡＤまたはＮＡＤＰに変換できる。グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼは特にその起源は問わないが安定供給の点で微生物由来酵素が好ましい。なかでもロイコノストック属由来酵素が特に好ましい。リパーゼ反応の共役酵素としての本酵素の濃度は０．２〜３Ｕ／ｍｌの範囲で使用できるが０．４〜１Ｕ／ｍｌが特に好ましい。
【００３１】
次に反応式３について述べる。
反応式１を用いるリパーゼの測定試薬組成の中で、ジグリセリド、緩衝液、モノグリセリドリパーゼ、グリセロキナーゼおよびＡＴＰは前記反応式１の内容と同一である。グリセロキナーゼの生成物のひとつであるグリセロール−３−リン酸はこれを特異的に酸化するグリセロ−３−リン酸オキシダーゼにより過酸化水素に変換することができる。
グリセロ−３−リン酸オキシダーゼは特にその起源は問わないが、安定供給の点で微生物由来が好ましい。中でも乳酸菌由来酵素が特に好ましい。膵臓由来リパーゼ反応の共役酵素としての本酵素の濃度は２〜５０Ｕ／ｍｌの範囲で使用できるが５〜２０Ｕ／ｍｌが特に好ましい。
【００３２】
グリセロ−３−リン酸オキシダーゼ反応で生成される過酸化水素はペルオキシダーゼとトリンダー試薬の色原体とカップラーとの酸化縮合により色素を生成する。
トリンダー型試薬の色原体としては、フェノール誘導体、アニリン誘導体、トルイジン誘導体等が使用可能であり、具体例としてＮ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ,Ｎ−ジエチルアニリン、２，４−ジクロロフェノール、Ｎ−エチル−Ｎ−(２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル) −３，５−ジメトキシアニリン(ＤＡＯＳ)、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン(ＭＡＰＳ)、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＰＳ）、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＯＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−スルホプロピル−アニリン（ＨＡＬＰＳ）（以上同人化学研究所社製）等が挙げられる。
【００３３】
植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定試薬中での濃度は０．０２〜０．５％の範囲で使用することができるが０．０５〜０．１％の範囲が特に好ましい。
カップラーとしては４−アミノアンチピリン若しくは３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン(ＭＢＴＨ)等のカップラーを使用することができる。植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定試薬中での濃度は０．０２〜０．５％の範囲で使用することができるが０．０５〜０．１％の範囲が特に好ましい。
また過酸化水素はパーオキシダーゼ存在下ロイコ型試薬を用いて発色することができる。この試薬の具体例としては、ｏ−ジアニシジン、ｏ−トリジン、３，３−ジアミノベンジジン、３，３，５，５−テトラメチルベンジジン；以上同人化学研究所社製、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４−ビス（ジメチルアミノ）ビフェニルアミン（ＤＡ６４）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（ＤＡ６７）；以上和光純薬社製等が挙げられる。
【００３４】
本発明で使用するペルオキシダーゼはその起源は特に問わないが、既に安定供給されている西洋わさび大根由来の酵素が特に好ましい。リパーゼ反応の共役酵素としては２〜５０Ｕ／ｍｌの範囲で使用できるが５〜２０Ｕ／ｍｌが特に好ましい。
また過酸化水素は蛍光法、化学発光を利用した分析法、アルコールから生じたアルデヒドを定量する方法、又は電極法でも定量することができる。蛍光法には、酸化によって蛍光を発する化合物、例えばホモバニリン酸、４−ヒドロキシフェニル酢酸、チラミン、パラクレゾール、ジアセチルフルオレスシン誘導体等を、化学発光法には、触媒としてルミノール、ルシゲニン、イソルミノール、ピロガロール等を用いることが出来る。カタラーゼ等を用いてアルコールからアルデヒドを生成せしめて、生じたアルデヒドを定量する方法としては、ハンチ反応を用いる方法や、ＭＢＴＨとの縮合反応により発色させる方法、若しくはアルデヒドデヒドロゲナーゼを用いる方法等が挙げられる。
【００３５】
また過酸化水素を電極を用いて測定する場合、電極には、過酸化水素との間で電子を授受する事の出来る材料である限り特に制限されないが、例えば白金、金若しくは銀等が挙げられ電極測定方法としてはアンペロメトリー、ポテンショメトリー、クーロメトリー等の、公知の方法を用いることが出来、さらにオキシダーゼまたは基質と電極との間の反応に電子伝達体を介在させ、得られる酸化、還元電流或いはその電気量を測定しても良い。電子伝達体としては電子伝達機能を有する任意の物質が使用可能であり、例えばフェロセン誘導体、キノン誘導体等の物質が挙げられる。またオキシダーゼ反応により生成する過酸化水素と電極の間に電子伝達体を介在させ得られる酸化、還元電流またはその電気量を測定しても良い。
【００３６】
本発明で測定することができるリパーゼとしては、植物由来及び／又は微生物リパーゼが挙げられる。
植物由来リパーゼとしては、植物種子由来、米ぬか由来、小麦胚芽由来リパーゼ等が挙げられ、小麦胚芽由来リパーゼが好ましい。
微生物由来リパーゼとしては、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・フェニクス、アスペルギルス・ウサミ等のアスペルギルス属由来、ペニシリウム・キャメンベルティ、ペニシリウム・クリソゲナム、ペニシリウム・ロッキェフェルティ等のペニシリウム属由来、ムコール・ジャバニクス、ムコール・ミエハイ等のムコール属由来、リゾプス・デレマー、リゾプス・ジャバニクス、リゾプス・ミエハイ、リゾプス・ニベウス、リゾプス・オリゼー等のリゾプス属由来、リゾムコール・ミエハイなどの糸状菌由来、キャンディダ・ルゴサ等のキャンディダ属の酵母由来、ストレプトマイセス属の放線菌由来、アルカリゲネス属由来、シュドモナス・フラジ、シュドモナス・フルオレッセンス等のシュドモナス属由来、クロモバクテリウム・ビスコサム、セラチア・マセランス等の細菌由来等が挙げられる。中でも、ムコール・ミエハイ等のムコール属由来、キャンディダ・ルゴサ等のキャンディダ属の酵母由来、クロモバクテリウム・ビスコサム等の細菌由来が好ましく、ムコール・ミエハイ由来、キャンディダ・ルゴサ由来、クロモバクテリウム・ビスコサム由来が特に好ましい。
【００３７】
本発明のリパーゼ活性測定用組成物は、全てを含有する１つの試薬として用いてもよいが、試薬１（Ｒ１）と試薬２（Ｒ２）の２つに分けて使用することが好ましい。
反応式１の場合、Ｒ１としては、例えば、ＡＴＰ、ホスフォエノールピルビン酸、モノグリセリドリパーゼ、グリセロキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、非イオン性界面活性剤に溶解したジグリセリド、マグネシウムイオンなどを含有する試薬が好ましく、さらにカルシウムイオン、アンモニウムイオン、グッドのｐＨ緩衝液等を含有してもよい。Ｒ２としては、例えばｐＨ緩衝液、還元型ＮＡＤまたはＮＡＤＰなどを含有させる。Ｒ１,Ｒ２共に必要に応じて防腐剤や酵素の安定化剤などを含有させてもいい。
【００３８】
反応式２の場合、Ｒ１としては、例えば、ＡＴＰ、グルコース、酸化型ＮＡＤまたはＮＡＤＰモノグリセリドリパーゼ、グリセロキナーゼ、ＡＤＰヘキソキナーゼ、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ、非イオン性界面活性剤に溶解したジグリセリドなどを含有する試薬が好ましく、さらにカルシウムイオン、アンモニウムイオン、グッドのｐＨ緩衝液等を含有してもよい。Ｒ２としては、例えばｐＨ緩衝液、非イオン性界面活性剤に溶解したジグリセリド、マグネシウムイオンなどを含有させる。Ｒ１,Ｒ２共に必要に応じて防腐剤や酵素の安定化剤などを含有させてもいい。
反応式３の場合、Ｒ１としては、例えば、ＡＴＰ、パーオキシダーゼ、ＴＯＤＢ、モノグリセリドリパーゼ、グリセロキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ、非イオン性界面活性剤に溶解したジグリセリド、マグネシウムイオンなどを含有する試薬が好ましく、さらにカルシウムイオン、アンモニウムイオン、グッドのｐＨ緩衝液等を含有してもよい。Ｒ２としては、例えばｐＨ緩衝液、４−アミノアンチピリンなどを含有させる。Ｒ１,Ｒ２共に必要に応じて防腐剤や酵素の安定化剤などを含有させてもいい。
【００３９】
植物由来及び／又は微生物由来リパーゼの粗酵素液（抽出液）には遊離のグリセロールが存在することがあり正誤差を生じる危険性が考えられるため被験液中の遊離のグリセロールを消去することが好ましい。消去する方法は反応式１、２と反応式３とでは異なる。
反応式１、２を利用する場合Ｒ１に遊離のグリセロールを消去する目的でグリセロールに作用する酸化酵素（グリセロールオキシダーゼ）を添加し遊離のグリセロールをアルデヒドに変換することで遊離のグリセロールの影響を回避することができる。この際にはグリセロールキナーゼ、ＡＴＰのどちらかまたは両方をＲ２に添加すればよい。該グリセロールオキシダーゼとしては、アスペルギルス属、ノイロスポラ属、ペニシリウム属由来のグリセロールオキシダーゼ等、の公知のグリセロールオキシダーゼを使用することができる（アグリカルチャル・バイオロジカル・ケミストリー  ４４巻、２号、３９９〜４０６頁、１９８０年を参照）。
【００４０】
反応式３を利用する場合のグリセロールは、グリセロキナーゼ、グリセロ−３−リン酸オキシダーゼ、カタラーゼあるいはパーオキシダーゼとフェノール誘導体、アニリン誘導体、トルイジン誘導体等のトリンダー試薬の色原体とを含有する試薬１（Ｒ１）に被験液を添加し予め加温することでこの成分を消去することができる。トリンダー型試薬の色原体としては、反応式３で説明した色原体が挙げられる。
試薬２（Ｒ２）は４−アミノアンチピリン若しくは３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン(ＭＢＴＨ)等のカップラーからなる成分で構成される。Ｒ１とＲ２が混合されると同時にグリセロ−３−リン酸オキシダーゼ反応で生成される過酸化水素はトリンダー試薬の色原体とカップラーとの酸化縮合により色素を生成する。この色素の吸光度を分光学的に測定することができる。
【００４１】
反応式１、２および反応式３を使用してリパーゼ活性測定試薬を調製する際には必要に応じて酵素の安定化剤、例えばシュクロース、マンニトール、ソルビトール、マルトース、ラクトース、サイクロデキストリン、トレハロース等の糖類、ＥＤＴＡ等のキレート剤を適宜添加してもよい。添加する糖類の濃度は１〜２０％の範囲で使用できるが好ましくは３〜１５％特に好ましくは４〜８％である。キレート剤を使用する場合にはその濃度範囲は０．０２ｍＭ〜１ｍＭであり、好ましくは０．０５ｍＭ〜０．５ｍＭ、特に好ましくは０．１〜０．３ｍＭである。更に各種の防腐剤、例えばアジ化ナトリウムの０．０１〜１０％、好適には０．０５〜１％を適宜添加してもよい。
【００４２】
さらに必要に応じて、３つ以上の試薬に分割して使用することも可能である。
また、これらのリパーゼ活性測定方法は、正確さや再現性に優れている。具体的には、反応式１の場合にはリパーゼ反応でジグリセリドから遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりグリセロールに変換し、これをＡＴＰ存在下にグリセロキナーゼによりＡＤＰに変換し、次いでホスフォエノールピルビン酸存在下にピルビン酸キナーゼでピルビン酸に変換し、更に還元型ＮＡＤ存在下にラクテートデヒドロゲナーゼを作用させ還元型ＮＡＤの吸光度の減少速度を測定する、リパーゼ活性の測定方法である。
還元型ＮＡＤの吸光度を測定する際の波長としては、試料中の膵臓由来リパーゼ活性を正確に測定できる波長であれば何を用いてもよい（ある１波長でもよいし、ある範囲の波長の積算でもよい）が、例えば、３００〜４００ｎｍから選択することが好ましく、３２０〜３６０ｎｍから選択することがより好ましく、３３０〜３５０ｎｍから選択することがさらに好ましく、３４０ｎｍ付近を選択することが大変に好ましい。３４０ｎｍ付近とは例えば、３４０ｎｍに設定し、その誤差範囲が１０ｎｍ以下であることが好適な例として挙げられ、その誤差範囲が５ｎｍ以下であることがより好適な例として挙げられ、その誤差範囲が３ｎｍ以下であることがさらに好適な例として挙げられ、その誤差範囲が１ｎｍ以下であることが大変に好適な例として挙げられる。
【００４３】
反応式２の場合にはリパーゼ反応でジグリセリドから遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりグリセロールに変換し、これをＡＴＰ存在下にグリセロキナーゼによりＡＤＰに変換し、次いでグルコース存在下にＡＤＰ依存性へキソキナーゼでグルコース−６−リン酸に変換し、更に酸化型ＮＡＤまたは酸化型ＮＡＤＰ存在下にグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ還元型ＮＡＤまたは還元型ＮＡＤＰの吸光度の増加速度を測定する、リパーゼ活性の測定方法である。
還元型ＮＡＤの吸光度を測定する際の波長としては、試料中の膵臓由来リパーゼ活性を正確に測定できる波長であれば何を用いてもよい（ある１波長でもよいし、ある範囲の波長の積算でもよい）が、例えば、３００〜４００ｎｍから選択することが好ましく、３２０〜３６０ｎｍから選択することがより好ましく、３３０〜３５０ｎｍから選択することがさらに好ましく、３４０ｎｍ付近を選択することが大変に好ましい。３４０ｎｍ付近とは例えば、３４０ｎｍに設定し、その誤差範囲が１０ｎｍ以下であることが好適な例として挙げられ、その誤差範囲が５ｎｍ以下であることがより好適な例として挙げられ、その誤差範囲が３ｎｍ以下であることがさらに好適な例として挙げられ、その誤差範囲が１ｎｍ以下であることが大変に好適な例として挙げられる。
【００４４】
反応式３の場合にはリパーゼ反応でジグリセリドから遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりグリセロールに変換し、次いでこれをＡＴＰ存在下にグリセロキナーゼによりグリセロール−３−リン酸に変換し、次いで生成される過酸化水素をペルオキシダーゼとトリンダー試薬、カップラー試薬とにより可視部の波長をもつキノン色素に変換できる。波長は使用するトリンダー試薬によって異なるが５４０〜７００ｎｍ付近の波長を選択（ある１波長でもよいし、ある範囲の波長の積算でもよい）すればよい。例えば、５５０ｎｍ付近とは例えば、５５０ｎｍに設定し、その誤差範囲が１０ｎｍ以下であることが好適な例として挙げられ、その誤差範囲が５ｎｍ以下であることがより好適な例として挙げられ、その誤差範囲が３ｎｍ以下であることがさらに好適な例として挙げられ、その誤差範囲が１ｎｍ以下であることが大変に好適な例として挙げられる。生成される色素の増加速度をレート法によって測定してもよく、または一定時間反応を行った後ラウリル硫酸ナトリウムのような酵素変性剤で反応を停止した後５４０〜７００ｎｍ付近の波長でその吸光度を測定してもよい。
【実施例】
【００４５】
以下に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の例によって限定されるものではない。
［実施例１；植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ基質ジグリセリドの調製］
【００４６】
卵黄レシチン由来ホスファチジルコリン（旭化成ファーマ社製）１．５ｇを１０ｍｌのクロロホルムに溶解した。４００ＵｎitのホスフォリパーゼC（旭化成ファーマ社製）を溶解した５ｍｌの０．５ＭＰIＰES−ＮaOＨ緩衝液（ｐＨ７．５）を加え３７℃で攪拌しながら加水分解反応を行った。２時間後溶媒層と水槽とを分離しクロロホルム層を集め、予めクロロホルムに懸濁したシリカゲルカラム（３ｍｌ）に通しクロロホルムで展開しジグリセリド画分を得た。
ロータリーエバポレーターでクロロホルムを完全に留去しオイル状のジグリセリド１．１gを得た。
［実施例２；前記反応式１における植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定用試薬の調製］
１）試薬１（Ｒ１）の調製
２００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０），２ｍＭ塩化カルシウム、２ｍＭ硫酸マグネシウム、３ｍＭアデノシン−３−リン酸、０．３ｍＭ還元型ＮＡＤ、２ｍＭホスフォエノールピルビン酸、モノグリセリドリパーゼ（旭化成ファーマ社製）１１２５Ｕ／Ｌ、グリセロキナーゼ（旭化成ファーマ社製）６００Ｕ／Ｌ、ピルビン酸キナーゼ（シグマ社製）６００Ｕ／Ｌ、乳酸デヒドロゲナーゼ（オリエンタル酵母社製）９００Ｕ／Ｌから成る試薬を調製した。
２）Ｒ２の調製
実施例１で得たジグリセリドを一定量秤量し、２．４ｍＭになるように１．２％ＰＯＥノニルフェニルエーテル（１．５ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ５．５）を一定量加え、３７℃で１時間攪拌して完全に澄明な基質溶液を得た。
［実施例３；前記反応式２における植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定用試薬の調製］
１）試薬１（Ｒ１）の調製
２００ｍＭＢｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ塩化カルシウム、２ｍＭ硫酸マグネシウム、３ｍＭアデノシン−３−リン酸、３０ｍＭグルコース、３ｍＭＮＡＤＰ、モノグリセリドリパーゼ（旭化成ファーマ社製）１１２５Ｕ／Ｌ、グリセロキナーゼ（旭化成ファーマ社製）６００Ｕ／Ｌ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（東洋紡社製）６００Ｕ／Ｌ、ＡＤＰ−ＨＫ（旭化成ファーマ社製）９００Ｕ／Ｌから成る試薬を調製した。
２）Ｒ２の調製
実施例１で得たジグリセリドを一定量秤量し、１．２ｍＭになるように０．６％ＰＯＥノニルフェニルエーテル（１．５ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ５．５）を一定量加え、３７℃で１時間攪拌して完全に澄明な基質溶液を得た。
［実施例４；前記反応式３における植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定用試薬の調製］
１）試薬１（Ｒ１）の調製
３００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２ｍＭ塩化カルシウム、３ｍＭ硫酸マグネシウム、アデノシン−３−リン酸３ｍＭ、モノグリセリドリパーゼ（旭化成ファーマ社製）１１２５Ｕ／Ｌ、グリセロキナーゼ（旭化成ファーマ社製）６００Ｕ／Ｌ、グリセロリン酸オキシダーゼ（旭化成ファーマ社製）３００００Ｕ／Ｌ、ペルオキシダーゼ（シグマ社）５０００Ｕ／Ｌ、０．２％ＴＯＯＳから構成される試薬を調製した。
２）試薬２（Ｒ２）の調製
実施例１で得たジグリセリドを一定量秤量し、２．４ｍＭになるように１．２％ＰＯＥノニルフェニルエーテル（１．５ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ５．５）、０．２％４−アミノアンチピリンを加え、３７℃で１時間攪拌して完全に澄明な基質溶液を得た。
［実施例５］
【００４７】
実施例２に示した組成の試薬１（Ｒ１）１０００マイクロリットルにクロモバクテリウム・ビスコサム由来のリパーゼ（旭化成社製）を含有する検体０〜５０マイクロリットルの酵素液を加え、３７℃で３分間反応を行った後、実施例２に示した組成の試薬２（Ｒ２）５００マイクロリットルを添加し３７℃で反応をスタートさせた。３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度を連続的に測定した。
酵素量に対する吸光度変化量の直線性を図１に示した。
［図１］
2007306821.tif 000005
［実施例６］
【００４８】
実施例４に示した組成の試薬１（Ｒ１）１０００マイクロリットルにキャンディダ・ルゴサ由来リパーゼ（シグマ社製）を含有する検体０〜５０マイクロリットルの酵素液を加え、３７℃で３分間反応を行った後、実施例２に示した組成の試薬２（Ｒ２）５００マイクロリットルを添加し３７℃で反応をスタートさせた。５５０ｎｍにおける吸光度の増加速度を連続的に測定した。
酵素量に対する吸光度変化量の直線性を図２に示した。
0007
［図２］
2007306821.tif 000006
［実施例７］
【００４９】
実施例４に示した組成の試薬１（Ｒ１）１０００マイクロリットルにムコール・ミエハイ（シグマ社製）由来リパーゼを含有する検体０〜５０マイクロリットルの酵素液を加え、３７℃で３分間反応を行った後、実施例２に示した組成の試薬２（Ｒ２）５００マイクロリットルを添加し３７℃で反応をスタートさせた。５５０ｎｍにおける吸光度の増加速度を連続的に測定した。
【００５０】
酵素量に対する吸光度変化量の直線性を図３に示した。
［図３］
2007306821.tif 000007
［実施例８］
【００５１】
実施例４に示した組成の試薬１（Ｒ１）１０００マイクロリットルに小麦胚芽由来リパーゼ（シグマ社製）を含有する検体０〜５０マイクロリットルの酵素液を加え、３７℃で３分間反応を行った後、実施例２に示した組成の試薬２（Ｒ２）５００マイクロリットルを添加し３７℃で反応をスタートさせた。５５０ｎｍにおける吸光度の増加速度を連続的に測定した。
酵素量に対する吸光度変化量の直線性を図４に示した。
［図４］
2007306821.tif 000008
［実施例９］
【００５２】
実施例３に示した組成の試薬１（Ｒ１）１０００マイクロリットルにクロモバクテリウム・ビスコサム由来リパーゼ（旭化成社製）を含有する検体０〜５０マイクロリットルの酵素液を加え、３７℃で３分間反応を行った後、実施例３に示した組成の試薬２（Ｒ２）５００マイクロリットルを添加し３７℃で反応をスタートさせた。３４０ｎｍにおける吸光度の増加速度を連続的に測定した。
酵素量に対する吸光度変化量の直線性を図５に示した。
［図５］
2007306821.tif 000009
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明のリパーゼ活性測定用組成物は、正確なリパーゼ活性を測定することができ、植物由来及び／又は微生物由来リパーゼ活性測定に好適である。