(57)【要約】      （修正有）【課題】肥満被検者の脂肪細胞のサイズを簡便に把握することができる手段、この手段を用いた肥満関連疾患診断方法、Mest発現調節因子検査方法及びMest発現調節因子のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】脂肪細胞中の中胚葉特異的転写物（Mest）の発現量を測定することにより肥満関連疾患を診断する方法。試験用動物に被試験物質を投与し、前記動物の脂肪細胞中のMestのmRNA量または血液中のMestタンパク質の量を測定し、上記被試験物質がMestのmRNA発現量を変化させる物質であるかを決定する、被試験物質がMest発現調節因子であるかの検査方法。２つ以上の被試験物質からなる群を用意し、各被試験物質を試験用動物に投与し、前記動物の脂肪細胞中のMestのmRNA量または血液中のMestタンパク質の量を測定し、上記群からMestのmRNA発現量を変化させる被試験物質を選択する、Mest発現調節因子のスクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪細胞中の中胚葉特異的転写物（以下、Mestという）の発現量を測定することにより肥満関連疾患を診断する方法。
【請求項２】
前記Mestの発現量の測定を、脂肪細胞中のMest mRNA量を測定することにより行う請求項1に記載の診断方法。
【請求項３】
前記Mestの発現量の測定を、血液中のMestタンパク質の量を測定することにより行う請求項1に記載の診断方法。
【請求項４】
肥満関連疾患が2型糖尿病である請求項1〜3のいずれか１項に記載の診断方法。
【請求項５】
肥満関連疾患が動脈硬化である請求項1〜3のいずれか１項に記載の診断方法。
【請求項６】
肥満関連疾患が高血圧である請求項1〜3のいずれか１項に記載の診断方法。
【請求項７】
肥満関連疾患が高脂血症である請求項1〜3のいずれか１項に記載の診断方法。
【請求項８】
試験用動物に被試験物質を投与し、
前記動物の脂肪細胞中の中胚葉特異的転写物（以下、Mestという）のmRNA量を測定し、
上記被試験物質がMestのmRNA発現量を変化させる物質であるかを決定する
ことを含む、被試験物質がMest発現調節因子であるかの検査方法。
【請求項９】
試験用動物に被試験物質を投与し、
前記動物の血液中の中胚葉特異的転写物（以下、Mestという）タンパク質の量を測定し、
上記被試験物質がMestのmRNA発現量を変化させる物質であるかを決定する
ことを含む、被試験物質がMest発現調節因子であるかの検査方法。
【請求項１０】
前記試験用動物が遺伝性肥満動物である請求項8または9に記載の検査方法。
【請求項１１】
２つ以上の被試験物質からなる群を用意し、
各被試験物質を試験用動物に投与し、
前記動物の脂肪細胞中の中胚葉特異的転写物（以下、Mestという）のmRNA量を測定し、
上記群からMestのmRNA発現量を変化させる被試験物質を選択する
ことを含む、Mest発現調節因子のスクリーニング方法。
【請求項１２】
２つ以上の被試験物質からなる群を用意し、
各被試験物質を試験用動物に投与し、
前記動物の血液中の中胚葉特異的転写物（以下、Mestという）タンパク質の量を測定し、
上記群からMestのmRNA発現量を変化させる被試験物質を選択する
ことを含む、Mest発現調節因子のスクリーニング方法。
【請求項１３】
前記試験用動物が遺伝性肥満動物である請求項11または12に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肥満関連疾患を診断する方法、被試験物質がMest発現調節因子であるかの検査方法及びMest発現調節因子のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、脂肪組織質量の増加と定義されるが、先進国で最も蔓延した栄養障害であり、現在は発展途上国で問題が高まりつつある。脂肪組織質量は、脂質生成の過程を通じた新しい脂肪細胞の産生および／または細胞当たりの細胞質トリグリセリドの貯蔵量増加に伴って増加する。脂肪組織の発達を調節する機構は盛んに研究されてきている (非特許文献1)。脂肪細胞分化はさまざまな因子によって調節される複雑な過程である(非特許文献2)。分化の誘導に際して、遺伝子転写現象のカスケードが生じ、脂肪細胞特異的遺伝子の発現に繋がる。 PPARγおよびC/EBPαは脂質形成カスケードに関与する必須の転写因子である。PPARγおよびC/EBPαは 脂肪細胞特異的遺伝子の発現をアップレギュレートし、脂肪分化を促進する (非特許文献3-6)。PPARγは核受容体ファミリーの一員であり (非特許文献7, 8)、たとえば、前駆脂肪細胞の分化を刺激することができるチアゾリジンジオン類(TZDs)といった抗糖尿病薬によって活性化される (非特許文献9)。脂肪細胞のin vitroの分化については多くのことが解ってきているが (非特許文献2)、脂質生成を in vivoで調節する機構の分子的基礎について解っていることはより少ない。
【０００３】
肥満に影響する遺伝子組み換えを有するマウスに関して多くの報告がなされている。ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(DGAT)-1は哺乳類のトリグリセリド合成の最終段階を触媒する。同型接合Dgat ノックアウト マウスは、食餌に誘導される肥満に耐性があり、飼料と高脂肪食の両方で野生型対照マウスより小さい脂肪細胞を有する(非特許文献10)。核受容体コアクチベーターである PGC-1βを過剰発現している遺伝子導入マウスは、エネルギー消費の増加とより小さい脂肪細胞を持つことのために、肥満に耐性がある (非特許文献11)。異型接合 PPARγ欠損マウスは脂肪細胞がより小さく脂肪がより少ない(非特許文献12)。上記の例では、脂肪質量の減少は、脂肪細胞の大きさの減少を伴う。より大きな脂肪細胞は、たとえばTNFαやレジスチンといったインシュリン耐性を引き起こす分子を分泌し(非特許文献13)、より小さな脂肪細胞は、たとえばアディポネクチンといったインシュリン感受性を増大させる分子を分泌する (非特許文献14)。このように、脂肪細胞の大きさは、肥満に関連する疾患の管理に極めて重要である。
【０００４】
in vivo およびin vitroでの脂肪組織形成中の遺伝子発現の調節をさらに特徴づけるために、マイクロアレイ分析が実施されている (非特許文献15-17)。マイクロアレイ分析では、本発明者らは、Mest (中胚葉特異的転写物) / Peg1 (父性発現遺伝子1) (以後、Mestと称する)ｍRNAの発現レベルが、肥満マウスの白色脂肪組織 (WAT)中で顕著に増加していたことを見いだした。Mest遺伝子は、発生中に父性対立遺伝子からだけ発現するインプリント遺伝子としてよく研究されている (非特許文献18-22)。しかし、生体組織中でのMestタンパク質の機能に関してはほとんど研究されていない。
【非特許文献１】Friedman, J. M. (2000) Nature 404, 632-634.
【非特許文献２】Smas, C. M., and Sul, H. S. (1995) Biochem. J. 309, 697-710.
【非特許文献３】Tontonoz, P., Hu, E., and Spiegelman, B. M. (1994) Cell 79, 1147-1156.
【非特許文献４】Loftus, T., and Lane, M. (1997) Curr. Opin. Genet. Dev. 7, 603-608.
【非特許文献５】Wu, Z., Rosen, E. D., Brun, R., Hauser, S., Adelmant, G., Troy, A. E., McKeon, C., Darlington, G. J., and Spiegelman, B. M. (1999) Mol. Cell. 3, 151-158.
【非特許文献６】Takahashi, N., Kawada, T., Yamamoto, T., Goto, T., Taimatsu, A., Aoki, N., Kawasaki, H., Taira, K., Yokoyama, K., Kamei, Y., and Fushiki, T. (2002) J. Biol. Chem. 277, 16906-16912.
【非特許文献７】Mangelsdorf, D. J., Thummel, C., Beato, M., Herrlich, P., Schutz, G., Umesono, K., Blumberg, B., Kastner, P., Mark, M., Chambon, P., and et al. (1995) Cell 83, 835-839.
【非特許文献８】Glass, C. K., and McDonnell, D. P. (2004) Mol. Cell 13, 459-467.
【非特許文献９】Lehmann, J. M., Moore, L. B., Smith-Oliver, T. A., Wilkison, W. O., Willson, T. M., and Kliewer, S. A. (1995) J. Biol. Chem. 270, 12953-12956.
【非特許文献１０】Chen, H., Smith, S., Ladha, Z., Jensen, D., Ferreira, L., Pulawa, L., McGuire, J., Pitas, R., Eckel, R., and Farese, R. J. (2002) J. Clin. Invest. 109, 1049-1055.
【非特許文献１１】Kamei, Y., Ohizumi, H., Fujitani, Y., Nemoto, T., Tanaka, T., Takahashi, N., Kawada, T., Miyoshi, M., Ezaki, O., and Kakizuka, A. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 100, 12378-12383.
【非特許文献１２】Kubota, N., Terauchi, Y., Miki, H., Tamemoto, H., Yamauchi, T., Komeda, K., Satoh, S., Nakano, R., Ishii, C., Sugiyama, T., et al. (1999) Mol. Cell 4, 597-609.
【非特許文献１３】Flier, J. (2001) Nature 409, 292-293.
【非特許文献１４】Yamauchi, T., Kamon, J., Waki, H., Terauchi, Y., Kubota, N., Hara, K., Mori, Y., Ide, T., Murakami, K., Tsuboyama-Kasaoka, N., et al. (2001) Nat. Med. 7, 941-946.
【非特許文献１５】Soukas, A., Cohen, P., Socci, N., and Friedman, J. (2000) Genes. Dev. 14, 963-980.
【非特許文献１６】Soukas, A., Socci, N., Saatkamp, B., Novelli, S., and Friedman, J. (2001) J. Biol. Chem. 276, 34167-34174.
【非特許文献１７】Gerhold, D., Liu, F., Jiang, G., Li, Z., Xu, J., Lu, M., Sachs, J., Bagchi, A., Fridman, A., Holder, D., et al. (2002) Endocrinology 143, 2106-2118.
【非特許文献１８】Kaneko-Ishino, T., Kuroiwa, Y., Miyoshi, N., Kohda, T., Suzuki, R., Yokoyama, M., Viville, S., Barton, S., Ishino, F., and Surani, M. (1995) Nat. Genet. 11, 52-59.
【非特許文献１９】Lefebvre, L., Viville, S., Barton, S., Ishino, F., and Surani, M. (1997) Hum. Mol. Genet. 6, 1907-1915.
【非特許文献２０】Lefebvre, L., Viville, S., Barton, S., Ishino, F., Keverne, E., and Surani, M. (1998) Nat. Genet. 20, 163-169.
【非特許文献２１】Reule, M., Krause, R., Hemberger, M., and Fundele, R. (1998) Dev. Genes Evol. 208, 161-163.
【非特許文献２２】Nishita, Y., Sado, T., Yoshida, I., and Takagi, N. (1999) Gene 226, 199-209.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
肥満は先進諸国においては最も多い障害であると報告されている。肥満はしばしば２型糖尿病、動脈硬化、高血圧及び高脂血症のような医学的に重要な疾患を引き起こすため、公衆衛生上大きな問題である。しかし、肥満は脂肪細胞のサイズが増大する肥満と数が増加する肥満の2つのタイプに分けられ、サイズの増大が糖尿病などの関連疾患発症の主な原因となっている。即ち、肥満では脂肪細胞のサイズの増大が2型糖尿病、動脈硬化、高血圧及び高脂血症の主な原因となっていることから、肥満被検者の脂肪細胞のサイズを把握することが肥満に関連しておこる疾患に対して有効な対策が期待できる。しかし簡便に脂肪細胞のサイズを把握するマーカーは報告されていない。
【０００６】
そこで本発明は、脂肪細胞のサイズを実際に測定することなく肥満被検者の脂肪細胞のサイズを簡便に把握することができる手段を提供することを目的とする。
【０００７】
さらに本発明は、肥満被検者の脂肪細胞のサイズを簡便に把握することができる手段を用いて、肥満関連疾患診断方法、Mest発現調節因子検査方法及びMest発現調節因子のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明では、in vitroおよびin vivo手法を用いて、脂肪組織の形成におけるMest発現の機能を特徴づけることで、肥満被検者の脂肪細胞のサイズを簡便に把握する方法を見いだした。より具体的には、中胚葉特異的転写物Mest（mesoderm specific transcripts）/Peg1は高脂肪食、遺伝性肥満マウスの肥大化した脂肪細胞で発現し、抗糖尿病薬であるピオグリタゾンによる脂肪細胞のサイズ減少に伴い発現量が減少すること、即ち、Mestが脂肪細胞のサイズと非常によく相関することを見出した。またMest は血液中に分泌される蛋白であることが予想され、被検者の血液中のMest量を測定することにより脂肪細胞のサイズの把握ができ、肥満被検者の糖尿病や動脈硬化などの易罹患性を的確かつ簡便に予測することが可能となる。
【０００９】
上記課題を解決するための本発明は以下の通りである。
[請求項1]脂肪細胞中の中胚葉特異的転写物（Mest）の発現量を測定することにより肥満関連疾患を診断する方法。
[請求項2]前記Mestの発現量の測定を、脂肪細胞中のMest mRNA量を測定することにより行う請求項1に記載の診断方法。
[請求項3]前記Mestの発現量の測定を、血液中のMestタンパク質の量を測定することにより行う請求項1に記載の診断方法。
[請求項4]肥満関連疾患が2型糖尿病である請求項1〜3のいずれか１項に記載の診断方法。
[請求項5]肥満関連疾患が動脈硬化である請求項1〜3のいずれか１項に記載の診断方法。
[請求項6]肥満関連疾患が高血圧である請求項1〜3のいずれか１項に記載の診断方法。
[請求項7]肥満関連疾患が高脂血症である請求項1〜3のいずれか１項に記載の診断方法。
[請求項8]試験用動物に被試験物質を投与し、
前記動物の脂肪細胞中の中胚葉特異的転写物（Mest）のmRNA量を測定し、
上記被試験物質がMestのmRNA発現量を変化させる物質であるかを決定する
ことを含む、被試験物質がMest発現調節因子であるかの検査方法。
[請求項9]試験用動物に被試験物質を投与し、
前記動物の血液中の中胚葉特異的転写物（Mest）タンパク質の量を測定し、
上記被試験物質がMestのmRNA発現量を変化させる物質であるかを決定する
ことを含む、被試験物質がMest発現調節因子であるかの検査方法。
[請求項10]
前記試験用動物が遺伝性肥満動物である請求項8または9に記載の検査方法。
[請求項11]２つ以上の被試験物質からなる群を用意し、
各被試験物質を試験用動物に投与し、
前記動物の脂肪細胞中の中胚葉特異的転写物（Mest）のmRNA量を測定し、
上記群からMestのmRNA発現量を変化させる被試験物質を選択する
ことを含む、Mest発現調節因子のスクリーニング方法。
[請求項12]２つ以上の被試験物質からなる群を用意し、
各被試験物質を試験用動物に投与し、
前記動物の血液中の中胚葉特異的転写物（Mest）タンパク質の量を測定し、
上記群からMestのmRNA発現量を変化させる被試験物質を選択する
ことを含む、Mest発現調節因子のスクリーニング方法。
[請求項13]前記試験用動物が遺伝性肥満動物である請求項11または12に記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、肥満では脂肪細胞のサイズの増大が2型糖尿病、動脈硬化、高血圧及び高脂血症の主な原因となっていることから、肥満被検者の脂肪細胞のサイズを把握することが肥満に関連しておこる疾患に対して有効な対策が期待できる。しかし、脂肪細胞のサイズ測定は脂肪組織を採取し非常に煩雑な処理を必要とする方法以外に、簡便に脂肪細胞のサイズを把握するマーカーは報告されていない。本発明者らは、Mestが脂肪細胞の肥大化に伴って増加することを明らかにしたことに加え、さらに分泌蛋白である可能性もあることから、本発明により、脂肪細胞のサイズを実際に測定することなく肥満被検者の脂肪細胞のサイズを簡便に把握する方法を提供することができることは、臨床における肥満機能診断に有効なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
［肥満関連疾患診断方法］
本発明の肥満関連疾患診断方法は、脂肪細胞中の中胚葉特異的転写物（Mest）の発現量を測定することにより行う。
Mestの発現量の測定は、例えば、脂肪細胞中のMest mRNA量を測定することにより行うことができる。脂肪細胞中のMest mRNA量の測定は、例えば、以下のように行うことができる。
皮下脂肪組織からニードルバイオプシーにより脂肪組織を得る。この脂肪組織からRNAを抽出し、RT-PCRやノーザンブロット法によりMest mRNA量を定量する。
【００１２】
あるいはMestの発現量の測定は、血液中のMestタンパク質の量を測定することにより行うこともできる。血液中のMestタンパク質の量の測定は、例えば、以下のように行うことができる。
Mestタンパク質の抗体が得られれば血漿から、ELISA法、RIA(radio immuno assay)法によりMestタンパク質の定量をすることができる。
【００１３】
本発明の肥満関連疾患診断方法により、脂肪細胞中の中胚葉特異的転写物（Mest）の発現量を測定することで、2型糖尿病、動脈硬化、高血圧、及び高脂血症のなりやすさを推定できる。より具体的には、肥満関連疾患が2型糖尿病である場合、脂肪組織でのMest mRNA量が高い値の場合、またはMestタンパク質量が多い場合、脂肪のサイズが大きいことが分かり、糖尿病になりやすいタイプの肥満であることが推定できる。
【００１４】
肥満関連疾患が動脈硬化である場合、脂肪組織でのMest mRNA量が高い値の場合、または血中のMestタンパク質量が多い場合、脂肪のサイズが大きいことが分かり、動脈硬化になりやすいタイプの肥満であることが推定できる。
【００１５】
肥満関連疾患が高血圧である場合、脂肪組織でのMest mRNA量が高い値の場合、または血中のMestタンパク質量が多い場合、脂肪のサイズが大きいことが分かり、高血圧になりやすいタイプの肥満であることが推定できる。
【００１６】
肥満関連疾患が高脂血症である場合、脂肪組織でのMest mRNA量が高い値の場合、または血中のMestタンパク質量が多い場合、脂肪のサイズが大きいことが分かり、高脂血症になりやすいタイプの肥満であることが推定できる。
【００１７】
［被試験物質がMest発現調節因子であるかの検査方法］
本発明は、被試験物質がMest発現調節因子であるかの検査方法を包含する。この方法は、(1)試験用動物に被試験物質を投与し、(2a) 被試験物質を投与した動物の脂肪細胞中の中胚葉特異的転写物（Mest）のmRNA量を測定し、(3)上記被試験物質がMestのmRNA発現量を変化させる物質であるかを決定することを含む。あるいは、上記検査方法は、(1)試験用動物に被試験物質を投与し、(2b) 被試験物質を投与した動物の血液中の中胚葉特異的転写物（Mest）タンパク質の量を測定し、(3)上記被試験物質がMestのmRNA発現量を変化させる物質であるかを決定する。
【００１８】
(1)において、被試験物質を投与する試験用動物は、再現性、操作性、利便性に優れ、人間のモデルになりうる動物という観点から適宜選択され、マウス、ラット、モルモット等であることが適当であり、特にマウスを好ましく用いることができる。マウスとしては、C57Bl/6マウス、BALBCマウス、KKAyマウス、ob/obマウス、db/dbマウス等を用いることができる。Mestの発現量が低下すれば、この被試験物質に脂肪細胞を小さくする抗肥満作用があることが推定される。
【００１９】
被試験物質は、公知の物質であっても、本発明完成時に未知の物質であっても良く、合成物質、半合成物質、天然物質のいずれであっても良い。
【００２０】
被試験物質の投与形態は、被試験物質の種類及び試験用動物の種類等を考慮して適宜選択できるが、例えば、経口投与、混餌投与、皮下投与、腹腔投与、静脈投与等であることができる。
【００２１】
被試験物質の投与量及び投与スケジュールは、被試験物質の溶解性、物理的性質、特性等を考慮して適宜選択できるが、例えば、以下の用にすることができる。
1)被試験物質を餌に5％の割合で混合し（重量%）、毎日新しい餌を与え、1週間摂取させる。
2)被試験物質を生理食塩水に20mg/ml濃度に溶解し、ゾンデで経口的に胃内に挿入する。
3)被試験物質を生理食塩水に50μg/ml濃度に溶解し、腹腔注射を一日2回（朝、夕）の反復投与を3日間行なう。
【００２２】
また、複数の被試験物質の併用効果を本発明の方法を用いて検査することもできる。複数の被試験物質を用いる場合、各被試験物質の投与量及び投与スケジュールは、併用の狙い等を考慮して適宜決定できる。
【００２３】
(2a)における、被試験物質を投与した動物の脂肪細胞中の中胚葉特異的転写物（Mest）mRNA量の測定は、前記本発明の肥満関連疾患診断方法において用いた方法をそのまま用いることができる。
【００２４】
(2b)における、被試験物質を投与した動物の血液中の中胚葉特異的転写物（Mest）タンパク質の量の測定は、前記本発明の肥満関連疾患診断方法において用いた方法をそのまま用いることができる。
【００２５】
(3)において、上記被試験物質がMestのmRNA発現量を変化させる物質であるかを決定する。この決定は、例えば、脂肪細胞中のMest mRNA量を測定するか、Mestタンパク質の量を測定することで行うことができる。脂肪細胞中のMest mRNA量の測定は、例えば、皮下脂肪組織からニードルバイオプシーにより脂肪組織を得、この脂肪組織からRNAを抽出し、RT-PCRやノーザンブロット法によりMest mRNA量を定量することで行うことができる。また、Mestタンパク質量の測定は、Mestタンパク質の抗体が得られれば血漿から、ELISA法、RIA(radio immuno assay)法によりMestタンパク質の定量をすることで行うことができる。
【００２６】
[Mest発現調節因子のスクリーニング方法]
本発明は、Mest発現調節因子のスクリーニング方法を包含する。この方法は、(10)２つ以上の被試験物質からなる群を用意し、(11)各被試験物質を試験用動物に投与し、(12a) 被試験物質を投与した動物の脂肪細胞中の中胚葉特異的転写物（Mest）のmRNA量を測定し、(13)上記群からMestのmRNA発現量を変化させる被試験物質を選択することを含む。あるいは、上記方法は、(10)２つ以上の被試験物質からなる群を用意し、(11)各被試験物質を試験用動物に投与し、(12b) 被試験物質を投与した動物の血液中の中胚葉特異的転写物（Mest）タンパク質の量を測定し、(13)上記群からMestのmRNA発現量を変化させる被試験物質を選択することを含む。
【００２７】
(10)における被試験物質の群を構成する被試験物質は特に制限されることはなく、前述の検査方法において挙げた被試験物質を適宜含むことができる。また、被試験物質の群は、別の検査方法またはスクリーニング方法により選択された物質を含み、または選択された物質からなることもできる。
【００２８】
(11)における、被試験物質の試験用動物への投与は、前述の検査方法において説明したと同様に行うことができる。
【００２９】
(12a)における、被試験物質を投与した動物の脂肪細胞中の中胚葉特異的転写物（Mest）mRNA量の測定は、前記本発明の肥満関連疾患診断方法において用いた方法をそのまま用いることができる。
【００３０】
(12b)における、被試験物質を投与した動物の血液中の中胚葉特異的転写物（Mest）タンパク質の量の測定は、前記本発明の肥満関連疾患診断方法において用いた方法をそのまま用いることができる。
【００３１】
(13)における、被試験物質がMestのmRNA発現量を変化させる物質であるかの決定は、前述の検査方法において説明したと同様に行うことができる。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
［材料および方法］
動物
C57BL/6J マウスはTokyo Laboratory Animals Science (Tokyo, Japan)から入手した。飼料の組成は記載の通りであった(文献23)。db/-およびdb/db マウスはClea Japan (Tokyo, Japan)から入手した。マウスは12時間明／暗周期に曝露し、22℃の一定温度で飼育した。動物に関するすべての手順は施設内ガイドラインに従った。
【００３３】
RNA調製およびノーザンブロット分析  
総RNAは、TRIzol (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) を用いて取扱説明書に従って組織から調製した。プローブ用cDNAフラグメントはRT-PCRで得られ、配列決定して確認した。ラットCEBP/( およびマウスGlut 4のcDNAはDr. Lane MD (ジョンホプキンス(Johns Hopkins)大学)より提供を受けた。マウスPPARγのcDNAはDr. Glass CK (University California, San Diego)より提供を受けた。ノーザンブロッティングは記載に従って実施した(文献24)。
【００３４】
脂肪組織からの脂肪細胞および非−脂肪細胞の単離
脂肪細胞および非−脂肪細胞はマウス12〜18個体の子宮周囲部脂肪組織からコラゲナーゼ法(文献25)によって調製した。組織ホモジネートは、ウシ血清アルブミン(画分V)20mg/mLおよびグルコース2mmol/Lを添加したKrebs-Henseleit 4-(2-ヒドロキシエチル)-2-ピペラジンエタンスルホン酸緩衝液pH7.4中で、短時間の遠心分離(350gにて20秒間)によって分画した。浮遊細胞は脂肪細胞であり、一方、沈澱した細胞は非−脂肪細胞であった。
【００３５】
組織学的分析および形態計測
痩身(db/-)および肥満(db/db)マウス由来の子宮付近の脂肪組織を、4%パラホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝生理食塩水で固定し、次いでパラフィン包埋、切断、ヘマトキシリンとエオシンで染色の処理を行った。脂肪細胞の数と大きさの定量には、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した標本中のWATの断面積を分析した。
【００３６】
レトロウイルス媒介発現
Mestウイルス発現ベクターは完全長cDNAをpMx-puroにライゲーションすることによって作製した(文献26)(pMX-Mest)。Phoenix293パッケージング細胞(文献27)にpMX-Mestをトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後にウイルス上清を回収した。ウイルス上清を、10%ウシ胎児血清およびポリブレン5(g/(Lを含むDulbecco改変Eagle培地(DMEM)中で3T3-L1細胞に加えた。非感染細胞を除去するために、培地を10%ウシ胎児血清およびピューロマイシン10(g/(Lを含むDMEMに交換した。
【００３７】
細胞培養と分化の誘導
ウイルス感染細胞は分化培地である10%ウシ胎児血清を含むDMEM中で密集状態まで培養した。密集状態に達したら、細胞を1(Mデキサメタゾンおよびインシュリン10(g/mLで42時間処理した。細胞は2日毎に培地を交換した(3)。
【００３８】
遺伝子導入マウスの作製
完全長Mest cDNAはpcDNA3.1(()(Invitrogen Life Technologies)のApaI部位に挿入された(pcDNA3.1(()-Mest)。6-kbのaP2プロモーター(文献28)をマウスゲノムからPCRで増幅した。使用したPCRプライマーは下記の通りであった：5'プライマー5'-TAGCTGGAGAATCGCACAGA-3'、および3'プライマー5'-ACAGCACTCACCCACTTCTT-3'。pcDNA3.1(()-aP2-Mestベクターは、aP2プロモーターを、pcDNA3.1(()-MestのNotI部位にライゲーションして作製した。aP2プロモーターを含む最終構造は(図5A)Kpn(/Sph(フラグメントとして回収され、マイクロインジェクション(2ng/μL)用に精製された。受精卵をC57BL/6の雄と交配したC57BL/6から採取し、Japan SLC Inc.(Hamamatsu, Japan)にてマイクロインジェクションを行った。
【００３９】
統計分析
実験群からのデータの比較は、一元配置分散分析(ANOVA)を用いて行った。有意である場合、各群を互いにFisherの最小有意差(PLSD)検定(Statview 4.0, Abacus Concepts, Piscataway, NJ)を用いて比較した。2群からのデータの統計的比較は、対応の無いStudentのt検定によって行った。統計的有意性はP<0.05と定義した。数値は平均±標準誤差である。
【００４０】
［結果］
高脂肪食誘導肥満のマウスのWATにおけるMest発現
マイクロアレイ分析は、Mest mRNAのレベルが高脂肪食を与えた肥満マウスのWAT中で顕著に増加していたことを示した(データ記載せず)。この増加を確認するため、本発明者らは高脂肪食を与えた肥満マウスのWATからの試料を用いてノーザンブロット分析を行った。マウスに炭水化物食と高脂肪食を与えた。これらのマウスの体重は：4週間炭水化物食18.6±0.7g；4週間高脂肪食19.0±0.4g；10週間高脂肪食24.0±0.5gであった。高脂肪食で10週間後、マウスのWATは4週間高脂肪食のマウスのものよりずっと重かった(平均して、10週間で0.6gと4週間で0.2g)(図1A)。高脂肪食で4週間後、Mest mRNAレベルは、対照炭水化物食を与えたマウスのレベルよりわずかに高かった(図1B)。Mest mRNAレベルは高脂肪食10週間後の肥満マウスではずっと高かった(図1B)。
【００４１】
脂肪組織は脂肪細胞と非−脂肪細胞から成っているため、本発明者らは次いで、Mest mRNAの発現の増加が脂肪細胞または非−脂肪細胞のどちらで起こっているのか調べた。10週間高脂肪食を与えたマウスと実験用試料を与えた同年齢のマウスの脂肪組織をコラゲナーゼ消化し、その後短時間遠心分離によって脂肪細胞と非−脂肪細胞に分離し、RNAを抽出した。図1Cに示す通り、非−脂肪細胞はUCP-2の発現が脂肪細胞より5倍高かった。Glut4は脂肪細胞で顕著に発現されていたが非−脂肪細胞ではそうでなく、非−脂肪細胞画分と脂肪細胞画分の間の有意なクロスコンタミネーションは無かったことを示唆した。Mest mRNAレベルの上昇は、肥満マウスの脂肪細胞画分でだけ観察された。
【００４２】
以上の結果から、Mestは、脂肪組織の中の脂肪細胞のみに発現し、しかも肥大化したとき、顕著な発現量の増大が認められることがわかった。
【００４３】
遺伝的肥満db/dbマウスのWATにおけるMest発現
食餌に誘導された肥満に加えて、本発明者らは遺伝に基づく肥満におけるMest mRNA発現を分析した。本発明者らは、レプチン受容体突然変異を有するdb/db肥満マウス(文献29)、および対照痩身マウス(db/-)におけるMest mRNAレベルを分析した。db/dbマウスでは、Mest mRNAの発現増加が観察された(図2A)。db/dbマウスにおけるMest mRNAの組織分布が示されている。雌雄両方のdb/dbマウスの脳、心臓、肝臓、腎臓、およびＢＡＴにおけるMest mRNA発現レベルは非常に弱く、その一方、雌雄両方のdb/dbマウスのWATにおいてMest mRNAは高度に発現していた(図2B)。
【００４４】
ストレプトゾトシン誘導糖尿病マウスのWATにおけるMest mRNA発現
高脂肪食誘導肥満およびdb/dbマウスは、肥満の表現型を示すと同時に糖尿病であった。ゆえに、本発明者らはMest mRNA増加が肥満または糖尿病のどちらに関連するのかを、Mest mRNA発現を別の糖尿病モデル;ストレプトゾトシン(STZ)誘導糖尿病(文献30)で検討することによって試験した。STZ誘導糖尿病マウスでは、血中グルコース濃度が高く(STZ処理マウスについて524.7±7.3mg/dL、対照マウスについて182.7±6.4mg/dL)体重減少を伴った(STZ処理マウスについて16.6±0.2g、対照マウスについて19.6±0.4g)。STZ糖尿病マウスの脂肪組織では、Mest mRNAは増加しておらずむしろ減少していた(図2C)。従って、脂肪組織におけるMest mRNA増加はすべての糖尿病状態に伴うものではない。
【００４５】
以上の結果から、Mestは、遺伝性肥満マウスにおいても発現量が亢進していて白色脂肪組織のみに発現し、血糖値による制御は受けていなかったことが分かる。
【００４６】
ピオグリタゾン処理db/dbマウスのWATにおけるMest発現
本発明者らはdb/dbマウスをII型糖尿病の治療薬であるピオグリタゾン(31, 32)で処理し、Mest mRNA発現を調べた。ピオグリタゾン(試料g当たり200μg)を試料添加物として5週間投与した。ピオグリタゾンはdb/dbマウスの体重増加を引き起こした。最終体重は、ピオグリタゾンを与えない痩身で25.1±0.2g(n=5)；ピオグリタゾンを与えた痩身で26.7±0.5g(n=5)；ピオグリタゾンを与えないdb/dbで42.0±0.6g(n=5)；ピオグリタゾンを与えたdb/dbで53.2±1.7g(n=4)であった(ピオグリタゾン有りと無しのdb/db間のP<0.001)。ピオグリタゾンはdb/dbマウスの血中グルコース濃度を正常濃度へ低下させた：ピオグリタゾンを与えない痩身で126.8±2.8mg/dL;ピオグリタゾンを与えた痩身で109.8±15.2mg/dL;ピオグリタゾンを与えないdb/dbで600mg/dL超(グルコース分析器の最大レベルを超えた)およびピオグリタゾンを与えたdb/dbで197.3±51.6mg/dLであった。同時に、WATの組織学的分析は、ピオグリタゾンが脂肪細胞の大きさを減少させたことを示し(図3A,B)、これはTZDがfa/faラットで脂肪細胞の大きさを減少させた結果と合致する(33)。ピオグリタゾン処理肥満db/dbマウスのWATで、Mest mRNAレベルは、未処理db/db肥満マウスにおけるレベルと比較して顕著に低下していた(図3C)。ピオグリタゾンはdb/dbマウスの体重を増加させるため、Mest mRNAは肥満において発現されている必要は無いが、脂肪細胞の大きさを反映しうる。
【００４７】
以上の結果から、糖尿病治療薬ピオグリタゾンで脂肪組織を小さくするとMestの発現量が減少し、糖尿病が改善したことから、Mestの発現量を少なくすると、糖尿病状態が改善されることが分かる。
【００４８】
3T3-L1脂肪細胞におけるMestの外因性発現
脂肪組織におけるMestの発現増加について洞察を得るために、本発明者らはMestを3T3-L1脂肪細胞で安定して発現させた。本発明者らはMest cDNAをレトロウイルスベクター中にクローニングし、そのウイルスを用いて細胞を感染させた。3T3-L1細胞では、内因性Mest mRNAは分化中に発現されなかった(データ記載せず)。密集に達した時点でMestまたはベクターのみを感染させた3T3-L1細胞を、1(Mデキサメタゾンおよびインシュリン10(g/mLを含む分化培地で培養した。42時間後、培地を10%FCSを含むDMEMに交換した。表示の時間に、脂肪細胞マーカーのmRNAレベルを調べた。脂肪細胞マーカーのmRNAレベルの上昇が、Mest mRNAを発現している3T3-L1細胞で観察された(図4)。油滴の増加がMestを発現している3T3-L1細胞で観察された(データ記載せず)。この結果は、Mestが脂質生成活性を増大させることを示唆する。
【００４９】
以上の結果から、Mestは脂肪細胞への分化を促進する作用があることが分かる。
【００５０】
Mestマウスの作製
Mestのin vivoにおける発現増加を調べるために、次に本発明者らは、Mest遺伝子を脂肪組織で過剰発現している遺伝子導入マウスを確立した。導入遺伝子の脂肪特異的発現を促進するために一般に用いられるaP2プロモーター(文献28, 34)を、Mest cDNAの発現を促進するために使用した(図5A)。マウスの独立した3系統を得た。マウスの尾部DNAのサザンブロット分析により推定した各個体の導入遺伝子コピー数はそれぞれ、3(系統C)、10(系統D)および12(系統E)であった。Mest導入遺伝子の発現はノーザンブロット分析で評価した。図5Bは、Mest遺伝子導入マウス雌(系統C、D、E)および対照非−遺伝子導入マウス雌の組織から単離した総RNAへのMestプローブのハイブリダイゼーション強度を示す。aP2プロモーターを使用した結果、脂肪組織においてMest導入遺伝子の非常に高い発現レベルが得られた(約1.8kb)(図5B)。CおよびE系統は脂肪組織におけるMest導入遺伝子の発現レベルがD系統のレベルより高かった。同様の選択的なMest導入遺伝子発現が、雄の遺伝子導入マウスで観察された(データ記載せず)。系統CおよびEのWAT中のMest導入遺伝子のmRNAレベルはdb/dbマウスのWAT中で観察されたレベルと同程度であったため(データ記載せず)、増加は生理的レベルで起こった。
【００５１】
MestマウスのWAT
Mestを発現している3T3-L1細胞で観察された遺伝子発現の増加はMestマウスのWATでも観察されるかどうか調べるため、本発明者らはノーザンブロット分析を実施した。図6Aに示す通り、たとえばaP2、レプチン、CD36およびレジスチンといった脂肪遺伝子の発現は、同じ性別の野生型同腹仔と比較して、MestマウスのWAT中で顕著に促進されている(系統C雄、および系統E雌)。さらに、組織学的分析では、これらのMestマウスの脂肪細胞は対照マウスの物より顕著に大きいことが示された(図6B、C)。
【００５２】
以上の結果から、生体においてもMestには脂肪細胞肥大化作用があることが示された。
【００５３】
以上の実験結果において、本発明者らは、Mest mRNAレベルが、高脂肪食誘導した肥満および遺伝的に生じた肥満のマウスのWAT中で顕著に増加したことを見出した。STZ誘導糖尿病マウスおよびピオグリタゾン処理db/dbマウスを用いた実験は、糖尿病または増加した体重でなく、脂肪細胞の大きさが、Mest発現を反映することを示唆する。Mestの異所性発現は、in vitroおよびin vivoの両方で脂肪遺伝子発現を増加させた。さらに、脂肪細胞は遺伝子導入マウスで顕著に大きくなった。これまでMestタンパク質の機能にはほとんど注意が払われてきていないが、上記実験で示された観察結果は、Mestが脂肪細胞の大きさの決定を含む脂肪組織形成に関わることを示した。
【００５４】
Mestは最初、マウス胎児性がん細胞系統(MC12)からクローニングされ、胚性および胚外性中胚葉で発現するが生体組織では発現していない(文献35)。正常および単為発生胚(母性ゲノムのみ)由来のｃＤＮＡ間の差分化ハイブリダイゼーションを用いたインプリント遺伝子の系統的スクリーニング過程で、Mestは父性発現遺伝子(pegs)の1つと同定された(文献18)。以後の研究で、Mest遺伝子の母性対立遺伝子は5'領域で完全にメチル化されていて胚で発現しないこと、一方、父性対立遺伝子は5'領域でメチル化されておらず実際発現したことが見出された(文献19)。成体組織では、Mest発現は非常に低かったが、Mest発現のインプリントはまだ残っていた(文献21)。最近のMestプロモーターのルシフェラーゼプロモーター分析で、組織でMest発現がより低いのは、Mestプロモーターのメチル化状態とは無関係であることが明らかになった(文献22)。これらのデータは、肥満脂肪組織におけるMestの顕著なアップレギュレーションは母性対立遺伝子のMestプロモーターの脱メチル化、または／およびメチル化とは独立した機構によるMestプロモーターの促進または抑制解除によることを示唆した。インプリント遺伝子の発現調節ならびに脂肪細胞の拡大の機構についてさらに洞察を得るためには、肥満脂肪細胞におけるMestの顕著な発現の機構を解明することが非常に重要である。
【００５５】
Mestはどのようにして、遺伝子発現の刺激と脂肪細胞の拡大を含め、脂肪組織に影響を与えるのか、Mestタンパク質の機能は全く調べられていない。Mestタンパク質のアミノ酸配列を考慮すると、Mestは転写因子ではない。タンパク質ホモロジー検索(文献36)は、Mestは魚類Danio rerioのα／βヒドロキシラーゼ(genbank AB042295, 344アミノ酸中の74%同一)および菌類Pseudomonas aeruginosaのエポキシドヒドラーゼ(genbank AE004764, 292アミノ酸中の41%)と高いアミノ酸類似性を有することを示し(データ記載せず)、Mestタンパク質が酵素活性を有することを示唆した。Mestは、PPARγやC/EBPαのような脂肪生成転写因子の活性化分子を産生する反応を触媒する可能性がある。この案を支持して、異型接合PPARγ欠損マウスはより小さい脂肪細胞を有した(文献12)。この可能性はまだ明らかになっていない。
【００５６】
ヒトMEST遺伝子は7q32.2にマッピングされている(http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/)。興味深いことに、独立した研究が、肥満度指数(BMI)に影響する遺伝子座が7q32.3にマッピングされることを示した(文献37)。この遺伝子座はヒトLEPTIN(7q32.1)の位置に近い(文献38)(http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/)。LEPTIN遺伝子に加えて、MESTはこの領域の新遺伝子候補である。一方で、コンピュータ予測配列解析(http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/)は、Mestタンパク質はＮ末端にシグナルペプチド配列を有することを示し(データ記載せず)、このタンパク質が肥満した対象の脂肪細胞外へ分泌される可能性があることを示唆した。すなわち、血中Mestタンパク質濃度の検査が、肥満および／または脂肪細胞の大きさの新たな生物学的マーカーを提供することを示す。
【００５７】
さらに、本発明によれば、肥満およびそれに関連する代謝疾患の治療薬を含む、Mestを標的とする薬物候補を開発するのに有用なスクリーニング方法を提供することができる。
【００５８】
実施例で示された文献（２２以前は非特許文献として前出）
23. Takahashi, M., Tsuboyama-Kasaoka, N., Nakatani, T., Ishii, M., Tsutsumi, S., Aburatani, H., and Ezaki, O. (2002) Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver. Physiol. 282, G338-348.
24. Sambrook, J., Fritsch, E. E., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning (New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
25. Tsuboyama-Kasaoka, N., Takahashi, M., Tanemura, K., Kim, H., Tange, T., Okuyama, H., Kasai, M., Ikemoto, S., and Ezaki, O. (2000) Diabetes 49, 1534-1542.
26. Misawa, K., Nosaka, T., Morita, S., Kaneko, A., Nakahata, T., Asano, S., and Kitamura, T. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 97, 3062-3066.
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【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明の肥満関連疾患を診断する方法、被試験物質がMest発現調節因子であるかの検査方法及びMest発現調節因子のスクリーニング方法は、肥満関連疾患の診断や、Mest発現調節因子の検査及びスクリーニングに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】高脂肪食誘導肥満のマウスのWATにおけるMest発現試験結果。1A:脂肪組織重量、1B: Mest及び28Sの発現量、1C: Mest、Glut4、UCP2及び28Sの発現量
【図２】遺伝的肥満db/dbマウスのWATにおけるMest発現試験結果。2A: db/db肥満マウスおよび対照痩身マウス(db/-)におけるMest mRNAレベル、2B: db/dbマウスにおけるMest mRNAの組織分布、2C: STZ糖尿病マウスの脂肪組織でのMest mRNA発現量
【図３Ａ】ピオグリタゾン処理db/dbマウスのWATにおけるMest発現試験におけるWATの組織学的分析結果。
【図３Ｂ】ピオグリタゾン処理db/dbマウスのWATにおけるMest発現試験におけるWATの組織学的分析結果。
【図３Ｃ】ピオグリタゾン処理db/dbマウスのWATにおけるMest発現試験におけるMest mRNAの発現レベルの結果。
【図４】分化処理後の脂肪細胞マーカーのmRNAレベル試験結果。
【図５】Mestマウスの作製に用いたaP2プロモーター(5A)及び各系統における総RNA についてのMestプローブのハイブリダイゼーション強度を示す(5B)。
【図６Ａ】Mestマウス及び性別が符合する対照同腹仔(8週齢)の生殖腺WATにおける脂肪遺伝子発現結果。
【図６Ｂ】Mestマウスの生殖腺WATの組織学的分析結果。
【図６Ｃ】Mestマウスの生殖腺WATにおける脂肪細胞サイズの分布。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2007306801.tif 000010
【図６Ｃ】
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【配列表】
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