(57)【要約】      （修正有）【課題】毛包誘導能を持つ毛乳頭細胞の長期にわたり増殖性を維持させ、しかも毛包誘導能を維持させながら培養できる培養方法、及びこの毛乳頭細胞を移植し、毛包を再生する方法の提供。【解決手段】毛乳頭細胞の培養方法であって、毛乳頭細胞を塩基性繊維芽細胞増因子（ｂＦＧＦ）の存在下で培養し、継代する、及び毛乳頭細胞をスフェア化させる、ことを特徴とする、毛乳頭培養方法。レシピエント動物に、この毛乳頭細胞を移植し、毛包を再生する方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
毛乳頭細胞の培養方法であって、
毛乳頭細胞を塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の存在下で培養し、継代する、及び
毛乳頭細胞をスフェア化させる、
ことを特徴とする、毛乳頭培養方法。
【請求項２】
前記毛乳頭細胞を少なくとも１０代にわたって継代することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ｂＦＧＦが培養液１ｍｌ当たり０．０１ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法により調製された毛乳頭細胞。
【請求項５】
レシピエント動物に請求項４に記載の毛乳頭細胞を移植し、毛包を再生する方法。
【請求項６】
ヒトに請求項４に記載の毛乳頭細胞を移植し、毛包を再生する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は毛乳頭細胞の長期培養方法及びそのような方法により調製された毛乳頭細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
毛包は成熟した生体で自己再生をほぼ一生涯を通じて繰り返す器官である。その自己再生の仕組みを解明することは、組織や細胞移植による脱毛治療、毛包や皮脂腺を含有する自然に近い機能的にも優れた皮膚シートの構築など、ニーズの高い臨床応用に繋がるものと期待される。近年、幹細胞研究への関心の高まりと共に毛包上皮系幹細胞（上皮系細胞）の研究が急速に進展し、また毛包特異的な間葉系細胞たる毛乳頭細胞についてもその性質が少しずつ判ってきた。毛乳頭細胞は毛包の自己再生のために毛包上皮系幹細胞に活性化シグナルを送るいわば司令塔の役割を担い、毛包再構成評価系においては毛包上皮系幹細胞と共に欠くことのできない細胞であることが判っている（Kishimoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), pp. 7336-7341；非特許文献１）。
【０００３】
そこで、毛包誘導能をもつ毛乳頭細胞は大量に入手できれば下記のような利点が見出せる。（１）毛包誘導能は毛乳頭細胞の最重要形質なので、毛包誘導能を維持した培養毛乳頭細胞を用いたin vitro実験にこれまで以上に意味が出てくる。（２）植毛等の毛の再生医療を考えた場合、患者自身の毛から採取した毛乳頭細胞を単離・培養し、再び患者自身に戻せるので、拒絶反応もなく、また感染症の危険性もなくなる。しかしながら、毛乳頭細胞はヒトから採取しなければならないため、外科手術や抜き毛などを行なう必要があり、大量に入手するのは困難である。また、これまでの毛乳頭細胞単離方法では、活性毛乳頭細胞を、例えば移植のために十分な量で獲得することが困難であり、毛包再生における活性毛乳頭細胞の役割を完全に解明することができなかった。
【０００４】
細胞の大量入手のためには、それをin vitroで何代にもわたって継代培養できることが一般に望ましいが、毛乳頭細胞の継代培養を行なった場合、増殖性の極端な低下や毛包誘導能の喪失が認められることから、実際には困難であることが知られている。具体的には、毛乳頭細胞の増殖性は継代５代以上で極端に低下し、その毛包誘導能も継代５代以上で失われるとの報告がある（Jahoda CAB et al. (1984) Nature 311 : 560-562）。したがって、毛乳頭細胞の継代培養では、実験や移植に必要とされるのに十分な量の活性毛乳頭細胞を獲得することはできなかった。
【０００５】
従って、毛乳頭細胞に関して、in vitroで長期にわたり増殖性を維持させ、しかも毛包誘導能を維持させながら培養できる、あるいは一度毛包誘導能を失っても再度その形質を獲できるようにする培養方法の開発が必要とされる。
【０００６】
【特許文献１】特開平７−２７４９５９号公報
【特許文献２】特開平２００３−７０４６６号公報
【非特許文献１】Kishimoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), vol. 96, pp. 7336-7341
【非特許文献２】Jahoda CAB et al., Nature (1984). vol. 311, pp. 560-562
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、毛乳頭細胞の長期培養方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、驚くべきことに、毛乳頭細胞を培養する際に塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、別名ＦＧＦ−２）を添加し、さらに毛乳頭細胞をスフェア化させることにより、少なくとも継代１０代にわたり増殖速度及び増殖性を維持し、しかも毛包誘導能を維持したまま、毛乳頭細胞を培養することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
従って、本願は以下の発明を提供する。
（１）毛乳頭細胞の培養方法であって、
毛乳頭細胞を塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の存在下で培養し、継代培養する、及び
毛乳頭細胞をスフェア化させる、ことを特徴とする、毛乳頭培養方法。
（２）前記毛乳頭細胞を少なくとも１０代にわたって継代することを特徴とする、（１）の方法。
（３）前記ｂＦＧＦが培養液１ｍｌ当たり０．０１ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの濃度で存在する、（１）〜（３）のいずれかの方法。
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載の方法により調製された毛乳頭細胞。
（５）レシピエント動物に（４）の本方法で調製した毛乳頭細胞を移植し、毛包を再生する方法。
（６）ヒトに（４）の本方法で調製した毛乳頭細胞を移植し、毛包を再生する方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、毛包誘導能を維持した毛乳頭細胞を大量にかつ短時間で入手することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、毛包を再生するための毛乳頭細胞及び上皮系細胞を含有する組成物、それを用いて毛包を再生する方法、さらにはそのような再生された毛包を担持する動物を提供する。
【００１２】
「毛乳頭細胞」とは、間葉系細胞として毛包最底部に位置し、毛包の自己再生のために毛包上皮幹細胞に活性化シグナルを送る、いわば司令塔の役割を担っていると考えられている細胞をいう。
【００１３】
本発明で使用する毛乳頭細胞、その生理機能に悪影響を及ぼさないような態様で皮膚から調製する。好ましくは、毛乳頭細胞はヒト毛乳頭細胞であり、頭皮から採取する。しかしながら、毛乳頭細胞はヒト由来に限定されることはなく、ヒト以外のあらゆる哺乳動物、例えばヒト、チンパンジー、その他の霊長類、家畜動物、例えばイヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、他に実験用動物、例えばラット、マウス、モルモット、より好ましくはヌードマウス、スキッドマウス、ヌードラットの皮膚やひげに由来してもよい。ヒト頭皮は、外科手術の副産物として生じたものを使用することができる。頭皮は、本発明の目的に照らし、成人男性由来のものを使用することが望しいが、それに限定されることはなく、子供由来でも女性由来であってもよい。使用する皮膚は、毛乳頭が正常な生理機能を保持している限り、頭髪に限らず体毛等に属するものを選んでもよい。通常、好ましくは、頭皮のうち、側頭部や後頭部に由来するものがよい。
【００１４】
培養に供する単離毛乳頭細胞は、上記頭皮から、それ自体既知の操作により調製することができる。例えば、上述の Messenger, A. G., Br. J. Dermatol. 110,685-689（1984）に記載の方法に従うことができる。例えば、頭皮を５ｍｍほどの短冊状に切り、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等で洗浄した後、必要によりタンパク質分解酵素等を用いまたは外科的に処理し、表皮層および真皮層を除き、皮下脂肪層のみにし、次いで毛包を物理的手段、例えばピンセツト等で単離する。毛包から毛球部を切り取り、この毛球部下部から毛乳頭を露出させて毛乳頭（細胞）を単離する。
【００１５】
こうして得られる単離毛乳頭の培養は、動物細胞の培養に用いられる市販の栄養培地をそのまま、または改性したもので培養（初代培養および継代培養）することができる。毛乳頭細胞の培養に使用できる代表的な培地としては、ウシ胎児血清を含むダルベッコ変性イーグル培地［Dulbecco′s Modefied Eagle Medium、Gibco ＢＲＬより入手可］、チャン培地(Chang′s medium)［Irvine Scientific より入手可］が挙げられる。培地には、さらに必要に応じて細胞増殖因子、ホルモンやその他の微量栄養素を加えることができる。これらの具体的なものとしては、トランスフエリン、インスリン、トリヨードチロニン、グルカゴン、ハイドロコーチゾン、テストステロン、エストラジオール、プロゲステロン、セレン等が挙げられる。
【００１６】
本発明の培養方法は、上記培養をｂＦＧＦの存在下で行なうことを特徴とする。ｂＦＧＦはヒト由来でも、その他の哺乳動物、例えばウシ、マウス、ラット由来であってもよく、組換体であってもよい。培養液に存在させるべきｂＦＧＦの濃度は特に限定されるものではないが、例えば０．０１ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、好ましくは０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ程度とする。
【００１７】
これらの培地での単離毛乳頭細胞の培養は、通常、培養皿を用い、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃のインキユベーター内に静置して行い、アウトグロースが確認されたら、(初代培養)培地を交換してさらに培養を続けることに(継代培養)より実施する。こうして得られる培養細胞はさらに必要な継代数にわたって、継代培養を行う。継代は乳頭細胞の所望する量が達成されるまで行なうことができ、たとえば10回以上の継代、所望量が多い場合は好ましくは15回以上、さらに好ましくは20回以上まで継代を行なうことができる。
【００１８】
スフェア形成は、飽和状態になるまで細胞を増殖させ、細胞を剥離した後、培地で懸濁させ、この細胞懸濁物を非接着処理した培養皿中の培地上に捲き、数日放置することにより丸い細胞塊(スフェロイド)の細胞集合体を形成することで行う。好ましくは、スフェア形成はｂＦＧＦの非存在下で行うが、ｂＦＧＦ存在下でも十分にスフェア形成は達成される。なお、スフェア形成を行う時期は特に制限されるものではなく、最後の継代を終えた培養細胞に対し行ってよい。
【００１９】
このようにして調製したスフェア化した毛乳頭細胞は、毛包誘導能を維持しており、したがって、毛包の再構成のメカニズムの解明のために研究のin vitro実験や、毛再生医療などのために利用できる。
【００２０】
本発明に係る方法で調製した毛乳頭細胞をヒトやレシピエント動物に移殖する方法は、それ自体公知の移殖方法によることができる。例えば、Weinberg et al, J. Invest. Dermatol. Vol.100(1993), pp.229-236及びZheng et al. J. Invest. Dermatol. Vol.124(2005), pp.867-876を参照のこと。例えばヌードマウスに移植を行う場合、用意されたスフェア化した毛乳頭細胞と別途調製した上皮系細胞を移植直前〜１時間前に混合し、遠心（9000×ｇ，10 min．）により培養液を取り除き、50〜100μＬ程度の細胞塊にした後、すみやかにヌードマウス背部皮膚に埋め込んだシリコン製のドーム型チャンバー内に流し込む。１週間後にチャンバーを注意深く取りはずし、さらに２週間目以降に移植部位の毛髪形成の有無の肉眼観察を行うことができる。ヒトを含む動物に発毛を目的に移植を行う場合も似たようにして行うことができ、適切な方法は医師や獣医により適宜決定されるであろう。
移植は、例えば直径約１ｃｍの円に対し、毛乳頭細胞が１×106〜108個相当／ｃｍ2、好ましくは1.0〜1.5×107個相当／ｃｍ2の移植量、より好ましくは1.27×107個相当／ｃｍ2の移植量で移植されるように行うのが好ましい。
さらに、より少ない細胞量で移植する方法としては、前述と同様に５×105細胞相当の毛乳頭細胞のスフェロイドと別途調製した５×105細胞相当の上皮系細胞を移植間に混合し、レシピエントの背部に注射針でつけた切込み部位に注入移植する方法である。
【００２１】
上記毛乳頭細胞をレシピエント動物に移植する場合、その移植は同種移植、即ち自己移植、同種同系移植もしくは同種異系移植であっても、異種移植であってもよい。レシピエント動物としてはあらゆる哺乳動物、例えばヒト、チンパンジー、その他の霊長類、家畜動物、例えばイヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、他に実験用動物、例えばラット、マウス、モルモット、より好ましくはヌードマウス、スキッドマウス、ヌードラットが挙げられる。
【００２２】
また、本発明に係る方法により調製された毛乳頭細胞を適当なレシピエント動物に移植することで、再生毛包を担持するキメラ動物を提供することができる。かかるキメラ動物は、例えば毛包の再生の機構を研究・解明するため、あるいは毛包再生又は発毛もしくは脱毛に有効な薬剤・生薬のスクリーニングを行うための有力な動物モデルを担うことができるであろう。レシピエント動物は、該動物に移植される系に含まれる各細胞の起源に拘わりなく、免疫系が抑制された動物であることが好ましい。また動物種としては、実験動物として使用しうるものであり、本発明の目的に沿うものである限り、いかなる動物であってもよいが、好ましくは、マウス、ラット等を挙げることができる。このような動物のうち、免疫系が抑制されているものとしては、マウスを例にすれば、ヌードマウスのように、胸腺欠損のごとき形質をもつものが挙げられる。なお、本発明の目的を考慮すれば、特に好ましいレシピエント動物としては、市販のヌードマウス（例えば、Ｂａｌｂ−ｃ  ｎｕ／ｎｕ系統）、スキッドマウス（例えば、Ｂａｌｂ／ｃ−ＳＣＩＤ）、ヌードラット（例えば、Ｆ３４４／Ｎ  Ｊｃｌ−ｒｎｕ）を挙げることができる。
【００２３】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例１】
【００２４】
「毛乳頭細胞の単離と培養」
4週令のヴァーシカン-GFPトランスジェニックマウス [Kishimoto et al. (1999) Proc Natl Acad Sci 96:7336]の頬ヒゲ毛包から顕微鏡下でヒゲ毛乳頭を注意深く単離した。ヴァーシカン-GFPトランスジェニックマウスとは、成長期の毛乳頭細胞がヴァーシカン（コンドロイチン硫酸プロテオグリカン類）を特異的に発現する性質を有することを利用し、ヴァーシカン遺伝子のプロモーターにリポーター遺伝子（ＧＦＰ）を繋げたＤＮＡを用いて作製したトランスジェニックマウスであり、ヴァーシカン発現を指標とした毛乳頭細胞の同定を可能にする。単離した毛乳頭細胞を培養皿の底面に静置し、10%血清を含むDulbecco’s modified essential medium (以下10％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ)で37℃、５％  ＣＯ2条件下で10〜14日間培養した。培養に際し、必要に応じて塩基性繊維芽細胞増殖因子(別名ｂａｓｉｃ  ＦＧＦ、ｂＦＧＦまたはＦＧＦ−２、以下ｂＦＧＦ)を10 ng/ml添加した。培養期間中、増殖した毛乳頭細胞は0.25％trypsin-EDTA処理を行い、細胞を回収した後、２×105 cells/100mm培養皿の条件で継代し更に培養を継続した。培地交換は４日に１回行い、ｂＦＧＦ添加は培地交換・継代の時に行った。培養皿に細胞がコンフルエント状態になる前に細胞を回収して、培養皿あたりの総細胞数を計測した。最終的に培養後回収した細胞を１×105個/ml濃度に分散し、スフェア形成のために本細胞分散液0.1mlを低細胞接着性の丸底96穴プレート(Nunc社)に播種・静置培養した。なお、スフェア形成の培養はｂＦＧＦを含まない10％ＦＢＳ−ＤＭＥＭで37℃、５％ ＣＯ2で行い、培養後、２〜４日後にスフェアを回収し、ヌードマウスへの移植実験に用いた。
【００２５】
図１にｂＦＧＦの存在下及び非存在下における毛乳頭細胞の増殖能の比較を示す。この図から明らかとおり、ｂＦＧＦの非存在下では毛乳頭細胞の継代は５回程度が限界とされているのに対し、ｂＦＧＦを添加することで継代回数を２０回以上と飛躍的に増大させることが可能である。
【００２６】
「ヌードマウスへの移植細胞の調製と移植実験」
上記方法で作成した毛乳頭細胞のスフェロイドおよび平板培養の毛乳頭細胞の毛包誘導能を比較するため、これら毛乳頭細胞と上皮系細胞を用いたヌードマウスへの移植毛包誘導実験を行った。スフェア化した毛乳頭細胞および平板培養のままの毛乳頭細胞は前述の方法で調製した。上皮系細胞は胎児期(Ｅ17.5〜Ｅ18.5)または生後数日(Ｐ０〜Ｐ１)のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス皮膚から以下の方法で調製した。採取した背部皮膚を５〜10mm2片に切り1000U/mlディスパーゼ溶液に37℃で1時間処理した。その後、表皮のみを剥離し、表皮細胞を得るため、更に0.2mg/mlコラゲナーゼ-500U/mlディスパーゼで37℃-１時間処理した。処理して得られた表皮細胞は更に40μm径のセルストレーナーでろ過後、10%FBS-DMEMに分散し細胞数を計測し、上皮系細胞とした。
ヌードマウスをペントバルビタールナトリウムで麻酔後、注射針で背部に切り込みをつけた。そして、50万個の上皮細胞と50万個のスフェア化したまたは50万個の平板培養した毛乳頭細胞を混合し、マイクロピペットチップを用いて、前述の切り込み部に移植した。移植２〜３週間後に、移植部位での毛包誘導を組織学的に観察した。
【００２７】
以下に、毛乳頭細胞のスフェア形成の有無と、継代数との関係を示す。
【表１】
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【００２８】
また、図２には毛乳頭細胞を移植することにより毛包誘導が認められた場合と認められなかった場合の写真を示す。本発明に係る方法で培養した毛乳頭細胞を移植した場合、顕著な毛包の誘導が認められた。
以上の結果から明らかなとおり、ｂＦＧＦの添加とスフェア形成とを組み合わせることで、毛包誘導能を維持させたまま、毛乳頭細胞の長期培養が可能であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明に係る毛乳頭細胞培養方法は毛包を再生するための毛包移植や、毛包再構成についての研究・開発、さらには脱毛症の治療に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ｂＦＧＦの存在下及び非存在下におけるヴァーシカン−ＧＦＰマウスのヒゲ毛乳頭細胞の長期継代における増殖性の比較を示す。
【図２】毛乳頭細胞の移植による毛包誘導を示す。
【図１】
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【図２】
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