(57)【要約】      （修正有）【課題】ウイルスを含有した試薬が、外部に拡散すること無く試料と混和、反応し、且つ反応後の試料を観察することが可能となるため、安全性が高く、簡便で、精度が高く、且つ定量的な癌細胞の検出が可能な癌細胞検出キット、及びそれを用いた癌の診断方法を提供する。【解決手段】癌細胞検出キットは、一端に被験者から採取した生体由来の試料を受け入れる入口を有する試験容器と、前記入口を塞ぐキャップ部とを備え、前記試験容器が、ウイルスを含有した試薬を封入する、仕切部によって密閉された試薬封入部を有し、前記キャップ部が、ウイルス非透過性の通気性フィルタを有する、前記入口を前記キャップ部により塞ぐ動作により前記仕切部を開封する開封部を備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
一端に被験者から採取した生体由来の試料を受け入れる開口を有し、シール部によってウイルスを含有した試薬が封入された試験容器と、
ウイルス非透過性の通気性フィルタを有する前記開口を塞ぐためのキャップ部と、
前記シール部を開封する開封部と、を備える癌細胞検出試料調製用キット。
【請求項２】
前記キャップ部が前記開口を塞ぐ動作に伴って前記開封部が前記シール部を開封する請求項１記載の癌細胞検出試料調製用キット。
【請求項３】
前記キャップ部が、前記開封部を有する請求項１または請求項２に記載の癌細胞検出試料調製用キット。
【請求項４】
前記シール部が前記開封部により開封される際に、前記試薬容器の内部のウイルスが外部から隔離されている請求項１〜３の何れか１項に記載の癌細胞検出試料調製用キット。
【請求項５】
前記シール部が前記開口から所定距離隔てた位置に設けられており、
前記挿入部の先端が前記開口を閉塞する第１位置から前記シール部が前記開封部により開封される第２位置まで前記キャップ部が前記試験容器に対して移動されることにより、前記試験容器に前記キャップ部が装着されるように構成されている請求項４に記載の癌細胞検出試料調製用キット。
【請求項６】
前記ウイルスのゲノムが、発癌遺伝子のプロモーター及び標識タンパク質をコードする遺伝子が組み込まれたものである請求項１〜５の何れか１項に記載の癌細胞検出試料調製用キット。
【請求項７】
前記ウイルスが、腫瘍溶解性ウイルスである請求項１〜６の何れか１項に記載の癌細胞検出試料調製用キット。
【請求項８】
前記ウイルスが、d12.CALP、d12.CALP delta RR、Telomelysin、Telomelysin-RGD、AxE1AdB-UPRT、AdSLPI.E1AdB、AxE1CAUP、AdE3-IAI.3B、Ad-MKAdMK、AdCEAp/Rep、AdAFPep/Rep、MMP-sub II SeV/delta M、又はCD-MMP-sub II-SeV/delta Mである請求項１〜７の何れか１項に記載の癌細胞検出試料調製用キット。
【請求項９】
前記試料が、血液、喀痰又は子宮から採取したものである請求項１〜８の何れか１項に記載の癌細胞検出試料調製用キット。
【請求項１０】
請求項１〜９の何れか１項に記載の癌細胞検出試料調製用キットと、
前記試験容器を挿入する挿入部、
前記試験容器を挿入する動作によって、前記試験容器の底面を開封する第２開封部、及び
前記第２開封部により底面が開封された試験容器から試料及び試薬の反応液を導入し、前記反応液を外部から観察可能に保持する保持部を有するスライドグラスと、を備えた癌細胞検出用キット。
【請求項１１】
前記試験容器の底面が、前記第２開封部により開封される際に、内部のウイルスが外部から隔離されている請求項１０記載の癌細胞検出用キット。
【請求項１２】
前記試験容器の底面が、前記第２開封部により開封される第２シール部を有する請求項９または請求項１１に記載の癌細胞検出用キット。
【請求項１３】
請求項１〜１２の何れか１項に記載のキットを用いた癌の診断方法。
【請求項１４】
前記癌が、血液癌、肺癌又は子宮頸癌である請求項１３に記載の診断方法。
【請求項１５】
一端に開口を有し、シール部によってウイルスを含有した試薬が封入された試験容器に、被験者から採取した試料を添加する工程と、
前記開口を、ウイルス非透過性の通気性フィルタを有したキャップ部により塞ぐ工程と、
前記シール部を開封部材により開封する工程を備えた癌細胞検出用試料の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌細胞検出試料調製用キット及びそれを用いた癌細胞検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は日本人の死亡率の第一位の要因であるが、早期診断による早期治療が可能であれば、その死亡率を著しく減少させることができると言われている。
現在、癌の診断は、一般的に細胞検査技師が、被験者から採取した被検試料中の細胞を検鏡により形態学的検査を行うことによって、正常細胞と癌細胞を見分けることによって行われている。しかしながら、この診断方法は、細胞検査技師による目視検査であるため、集団検診のように大量の被検試料を取り扱いには不向きであり、また、被検試料の状態等によっては検査結果にばらつきが生じ、且つ定量的に分析することができないという問題がある。
また、被験者の血漿および血清中の腫瘍由来ＤＮＡを検出することで、癌の診断を行う方法の研究も行われている。具体的には、被検者から採取した血中に含まれる細胞を濃縮し、当該濃縮された細胞中の血中遊離癌細胞に係るＤＮＡ等を生化学的に分析することで癌の診断を行うというものである。この方法は、大量の被検試料を比較的安全に処理することができるが、血中遊離癌細胞の濃縮工程が困難であり、簡便性に欠けるという問題がある。
一方、近年癌細胞において特異的に増殖する腫瘍溶解性ウイルスを用いた抗癌剤（特許文献２）や癌細胞検出試薬が報告されている（特許文献３）。腫瘍溶解性ウイルスとは、癌細胞中で特異的に増殖するウイルスのことで、該ウイルスを癌細胞に感染させることにより、癌細胞を直接的に破壊・死滅させることができ、そのゲノムに標識タンパク質の遺伝子を組み込むことで癌細胞を簡便に検出することが可能となる。しかしながら、癌細胞の検出は簡便であっても、腫瘍溶解性ウイルスは正常細胞にも感染性を有するため、該検出を行うにはＰ２レベルの設備が必要となる。従って、現実的に集団検診等での使用は困難であるという問題があった。
【特許文献１】ＷＯ２００４／００５５１１号公報
【特許文献２】ＷＯ２００６／０３６００４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、癌細胞検出試料調製用キット及びそれを用いた癌細胞検出用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
かかる実情に鑑み、本発明者らは鋭意研究を行った結果、ウイルス、特に腫瘍溶解性ウイルス、を含有した試薬による癌細胞の検出において、前記ウイルスの外部への拡散による汚染を伴うことのない癌細胞検出試料調製用キットを見出し、本発明を完成した。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）一端に被験者から採取した生体由来の試料を受け入れる開口を有し、シール部によってウイルスを含有した試薬が封入された試験容器と、ウイルス非透過性の通気性フィルタを有する前記開口を塞ぐためのキャップ部と、前記シール部を開封する開封部と、を備える癌細胞検出試料調製用キット；
（２）前記キャップ部が前記開口を塞ぐ動作に伴って前記開封部が前記シール部を開封する（１）記載の癌細胞検出試料調製用キット；
（３）前記キャップ部が、前記開封部を有する（１）または（２）に記載の癌細胞検出試料調製用キット；
（４）前記シール部が前記開封部により開封される際に、前記試薬容器の内部のウイルスが外部から隔離されている（１）〜（３）の何れか１つに記載の癌細胞検出試料調製用キット；            
（５）前記シール部が前記開口から所定距離隔てた位置に設けられており、前記挿入部の先端が前記開口を閉塞する第１位置から前記シール部が前記開封部により開封される第２位置まで前記キャップ部が前記試験容器に対して移動されることにより、前記試験容器に前記キャップ部が装着されるように構成されている（４）に記載の癌細胞検出試料調製用キット；
（６）前記ウイルスのゲノムが、発癌遺伝子のプロモーター及び標識タンパク質をコードする遺伝子が組み込まれたものである（１）〜（５）の何れか（１）つに記載の癌細胞検出試料調製用キット；
（７）前記ウイルスが、腫瘍溶解性ウイルスである（１）〜（６）の何れか１つに記載の癌細胞検出試料調製用キット；
（８）前記ウイルスが、d12.CALP、d12.CALP delta RR、Telomelysin、Telomelysin-RGD、AxE1AdB-UPRT、AdSLPI.E1AdB、AxE1CAUP、AdE3-IAI.3B、Ad-MKAdMK、AdCEAp/Rep、AdAFPep/Rep、MMP-sub II SeV/delta M、又はCD-MMP-sub II-SeV/delta Mである（１）〜（７）の何れか１つに記載の癌細胞検出試料調製用キット；
（９）前記試料が、血液、喀痰又は子宮から採取したものである（１）〜（８）の何れか１つに記載の癌細胞検出試料調製用キット；
（１０）（１）〜（９）の何れか１つに記載の癌細胞検出試料調製用キットと、
前記試験容器を挿入する挿入部、前記試験容器を挿入する動作によって、前記試験容器の底面を開封する第２開封部、及び前記第２開封部により底面が開封された試験容器から試料及び試薬の反応液を導入し、前記反応液を外部から観察可能に保持する保持部を有するスライドグラスと、を備えた癌細胞検出用キット；
（１１）前記試験容器の底面が、前記第２開封部により開封される際に、内部のウイルスが外部から隔離されている（１０）記載の癌細胞検出用キット；
（１２）前記試験容器の底面が、前記第２開封部により開封される第２シール部を有する（９）または（１１）に記載の癌細胞検出用キット；
（１３）（１）〜（１２）の何れか１つに記載のキットを用いた癌の診断方法；
（１４）前記癌が、血液癌、肺癌又は子宮頸癌である（１３）に記載の診断方法；
（１５）一端に開口を有し、シール部によってウイルスを含有した試薬が封入された試験容器に、被験者から採取した試料を添加する工程と、前記開口を、ウイルス非透過性の通気性フィルタを有したキャップ部により塞ぐ工程と、前記シール部を開封部材により開封する工程を備えた癌細胞検出用試料の調製方法；
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、ウイルスを含有した試薬が、外部に拡散すること無く試料と混和し反応さ、且つ反応後の試料を観察することが可能となるため、安全性が高く、簡便で、精度が高く、且つ定量的な癌細胞の検出が可能な癌細胞検出試料調製用キット及びそれを用いた癌細胞検出用キット、並びにそれらのキットを用いた癌の診断方法及び癌細胞検出用試料の調製方法が提供される。
【０００７】
また、本発明のキット及び方法を用いれば、Ｐ２レベルの大規模な検査施設を設ける必要が無いため、簡便で、且つ精度の高い癌の集団検診が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明の実施形態を、図面を用いて説明する。図面は、説明の便宜のために用いられるものであり、本発明の範囲は、図面に示す実施形態に限定されない。
【０００９】
まず、本実施形態に係る癌細胞検出試料調製用キットの構成について説明する。図１は、一実施形態に係る癌細胞検出試料調製用キットを示した側面図である。本実施形態に係る癌細胞検出試料調製用キットは、キャップ部１と試験容器３とを備えている。試験容器３は、実質的に円筒状に形成されており、その上面には、図２で示されるように、被験者から採取した生体由来の試料を受け入れるための開口４が設けられている。開口４より挿入されるキャップ部１は、実質的に円筒状の開封部２と、開封部２の上端に設けられた円盤状の鍔部１ａを備えている。更に、鍔部１ａは、キャップ部1が試験容器３に当接されたときに、試験容器３の上端縁の全周を嵌合する嵌合部１ｂを有している（図５参照）。開封部２は、試験容器３の上面内側、即ち開口４の直径と実質的に同一の直径を有している。従って、かかる開封部２は、試験容器３の開口４の全周にわたって密着した状態で、鍔部１ａが試験容器３の上端と当接するまで挿入されることになる。また、円柱状の開封部２の下側、即ちキャップ部１の鍔の反対側には、２つの突起２ａが設けられており、この突起２ａにより後述する第１アルミシート５を開封することが可能である。また、キャップ部１の中央部分には、前記開封部２の空洞を閉塞するようにウイルス吸着性のチャコールフィルタ１０が備えられている。これにより、キャップ部１により試薬容器３を閉塞した際にも、試薬容器３の内部空間に外気からの通気を確保することができる（図５参照）。
【００１０】
図３は、試験容器３の図２に示されるＡ−Ａ断面矢視図である。本実施形態では、試験容器３には、その容器内部を仕切る第１アルミシート５が、容器内部のほぼ中央に設けられている。更に試験容器３の底面には第２アルミシート８が設けられており、第１アルミシート５と第２アルミシート８とで挟まれた空間は、外部から隔離された試薬封入部６となっている。この試薬封入部６には、ウイルスを含有した試薬７が封入されている。このように、第１アルミシート５と第２アルミシート６とで隔離された空間である試薬封入部６に試薬７が封入されているため、ウイルスが外部に拡散されること無く、安全に試験容器３を持ち運ぶことができる。
【００１１】
次に、本実施形態に係る癌細胞検出試料調製用キットを使用して癌細胞検出用試料を調製するときの動作について説明する。まず、ユーザは試料を試験容器３に注入する。試料が注入された状態の試験容器３の断面図を図４に示す。上述したような構成により、試験容器３の開口４（上端）から第１アルミシート５で仕切られた試験容器３の略中央位置までの部分（即ち試験容器３の上側部分）は、凹状となっており、試料１０を収容することが可能である。ユーザは、例えばピペットを用いることによって、試料を試験容器３の凹状部分に注入する。試験容器３の開口４から注入された試料１０は、試験容器中央部に設けられた第１アルミシート５により容器内部の中央で堰き止められる。そのため、試薬注入時に、上述の試薬封入部６に封入されたウイルスを含有する試薬７と混和されることは無い。即ち、試料注入時において、ウイルスを含有する試薬７は外部から隔離された密封状態にあり、外部へのウイルスの拡散が起こることは無い。
【００１２】
次に、ユーザは、キャップ部１により試験容器３の開口を閉塞する。図５にキャップ部１により開口４が塞がれたときの試験容器３の断面図を示す。上述したように、キャップ部１の開封部２は、その先端に突起が設けられており、且つキャップ部１を試験容器３に挿入した際、開封部２が試験容器３の開口４と密着した状態で挿入できるようになっている。つまり、開封部２の先端部分が開口４に挿入された位置において、既に試薬容器３の開口は閉塞されており、試薬容器３の内部空間は外部から隔離した状態となっている。なお、ここでいう隔離した状態とは、試薬容器３に収容されたウイルスが外部に拡散されることなく、しかも試薬容器３の内部空間が試料中の細胞を生存させるために外気を導入するための微細孔によって通気されている状態をいう。更に、開封部２の全長は、試験容器３の上端から試験容器３中央部の第１アルミシート５までの長さより長く構成されている。これにより、キャップ部１を鍔部１ａが試薬容器３の上端面と当接するまで試験容器３に挿入することにより、開封部２の突起が第１アルミシート５を突き破り、第１アルミシート５を開封することができる。更に、開封部２の胴部分、即ち突起以外の部分の挿入開始から、開封部２の突起が第１アルミシート５に到達するまでの間においては、開封部２の胴部分が、既に開口４と円周方向の全周にわたって密着した状態を維持するため、試験容器３の内部が外部から隔離された状態となっている。従って、試料９と試薬７が混合される際は、試験容器３の内部は外部から隔離された状態となっており、ウイルスが外部に拡散されることが無い。また、キャップ部１の上面に設けられたチャコールフィルタ１０により、ウイルスが外部に拡散することなく試験容器３内部の通気性が確保され、十分に試料９に含まれる細胞と試薬７に含まれるウイルスを反応させることができる。このようにして試薬容器３の内部で試料９と試薬７とを混和することによって、測定試料（反応液）が調製される。
【００１３】
上述のようにして試薬容器３により調製された反応液は、以下に説明するスライドグラス１１に供給されて検鏡により検査される。スライドグラス１１の構成について以下に説明する。
図６は、一実施形態に係る検鏡用のスライドグラス１１の斜視図である。本実施形態のスライドグラス１１は平坦な直方体の板状をなしており、その長方形の平面の中央部分から短辺寄りの位置に、試験容器３を挿入する挿入部１２を有している。挿入部１２は、試験容器３の外径と実質的に同一サイズの内径を有する円筒状をなしており、上部の開口から試験容器３と全周にわたり密着した状態で挿入することが可能となっている。この挿入部１２には、試験容器３が、第２アルミシート８を有する底面側から挿入される。
【００１４】
図７（ａ）にスライドグラス１１の平面図を示し、図７（ｂ）にその側面断面図を示す。２枚のスライドグラス、第１スライドグラス１７と第２スライドグラス１８とが溶着されて構成されている。なお、この第１スライドグラス１７と第２スライドグラス１８とは、水密を保つように溶着されている。また、第１スライドグラスと第２スライドグラスとが水密を保つように接合されていればその接合形態は限定されず、例えば接着剤により接合されていてもよい。第１スライドグラス１７には、開口が設けられており、当該開口の周囲から立ち上がるように上記の挿入部１２が設けられている（図７（ｂ）参照）。また、第２スライドグラス１８の挿入部１２に対応する箇所には、第２開封部１６が設けられている。この第２開封部１６は、挿入部１２の実質的に中央位置に、上方へ突出するように設けられており、上端が尖った略円錐状をなしている。これにより、挿入部１２に挿入された試験容器３の底部に設けられた第２アルミシート８が第２開封部１６により突き破られ、内容物である反応液がスライドグラス１１内に導入される。
【００１５】
スライドグラス１１の第１スライドグラス１７及び第２スライドグラス１８に挟まれる部分には、検鏡対象である反応液を保持する保持部１３が設けられている。スライドグラス１１の保持部１３は、反応液を検鏡する検鏡部１４と、挿入部１２に流出した反応液を検鏡部１４へ誘導する反応試料流路部１５により構成されている。検鏡部１４は、供給された反応液を検鏡により観察することが可能であるように、扁平な空間として形成されている。
【００１６】
次に、本発明の実施形態に係る癌細胞検査用キットを使用した動作について説明する。まず、ユーザは、試料を注入して、キャップ部１により開口を閉塞した状態の試験容器３をスライドグラス１１の挿入部１２に挿入する。これにより、第２開封部１６により第２アルミシートが開封され、試験容器３に収容されていた反応液が挿入部へと供給される。このとき、図７（ａ）の矢印に示すように、反応液は反応試料流路部１５を通流して検鏡部１４へと到達する。また、上述したように、挿入部１２と試験容器３は過不足無く密着した状態で挿入可能なようになっているため、試験容器３の挿入部１２への挿入により、保持部１３は外部から隔離された状態になる。更に、第２開封部１６の先端は、挿入部１２の入口上面よりも下方に位置しているため、第２開封部１６で第２アルミシート８が開封される際には、既に保持部１３は外部から隔離された状態、即ちウイルスを含む反応液が外部から隔離された状態となっている。この構成により、検鏡時においても反応液中のウイルスが外部に拡散することはなく、安全に診断を行うことができる。
【００１７】
ここまで、特定の実施形態を例にとって説明してきたが、本発明は、この実施形態に限定されるものではなく、種々の変形が可能である。
【００１８】
本発明における試料は、被験者から採取した生体由来の細胞を含むものであれば、特に制限されることは無いが、例えば、血液、喀痰、子宮由来の資料等が挙げられ、特に血液、喀痰及び子宮の試料が好ましい。
【００１９】
本発明において用いられるウイルスは、試料中の細胞に感染能を有するものであれば、特に制限されないが、例えば腫瘍溶解性ウイルスが挙げられ、具体的にはd12.CALP、d12.CALP delta RR、Telomelysin、Telomelysin-RGD、AxE1AdB-UPRT、AdSLPI.E1AdB、AxE1CAUP、AdE3-IAI.3B、Ad-MKAdMK、AdCEAp/Rep、AdAFPep/Rep、MMP-sub II SeV/delta M、又はCD-MMP-sub II-SeV/delta Mが好ましい。
【００２０】
本発明におけるシール部及び第２シール部は、ウイルスを含有する試薬が外部に流出せず、且つ該ウイルスが外部に拡散しないものであれば、特に制限されないが、例えばアルミシート等が挙げられる。
【００２１】
本発明において用いられるウイルス非透過性の通気性フィルタは、反応液中のウイルスが外部に拡散されず、且つ通気性を有するものであれば、特に制限されるものではないが、例えば通気性の抗ウイルス性フィルタやウイルス吸着性フィルタ等が挙げられ、具体的にはチャコールフィルタが好ましい。
【００２２】
本発明において隔離とは、ウイルスが外部に拡散しない状態であれば特に制限されないが、完全な密閉状態ではなく通気性を有するほうが、十分に試料中の細胞と試薬中のウイルスを反応させることができるため好ましい。
【００２３】
本発明における癌細胞検出試料調製用キットは、癌細胞を確認できる検査であれば、特にその使用が限定されるものではないが、例えば、検鏡検査及びフローサイトメータによる検査等が挙げられる。
【００２４】
以上の実施形態で示した種々の特徴は、互いに組み合わせることができる。１つの実施形態中に複数の特徴が含まれている場合、そのうちの１又は複数個の特徴を適宜抜き出して、単独で又は組み合わせて、本発明の癌細胞検出試料調製用キット及びそれを用いた癌細胞検出用キットに採用することができる。
【００２５】
以下に、本発明の癌細胞検出用キットを実際に用いた癌の検出方法による結果を、実施例を用いて、本発明を具体的に説明する。
【実施例１】
【００２６】
肺癌細胞の検出
（サンプルの調整）
健常人より採取した喀痰を１．５  ｍｌ の細胞培養液 （Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ  ；  ＤＭＥＭ）に回収し、６０分間、３７℃、５％ＣＯ２の条件で前培養を行った。前培養した細胞培養液を１．０  ｘ  １０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ  となるようにＤＭＥＭで希釈したものに、ヒト肺癌細胞株であるＡ４３１細胞溶液（ＡＰＣＣ社より購入）を１０００ｃｅｌｌｓ／３００ｕｌとなるように加え、肺癌サンプルとした。
またコントロールとして、Ａ４３１細胞溶液添加前の細胞培養液（１．０  ｘ  １０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）及びＡ４３１細胞溶液を１０００ｃｅｌｌｓ／３００ｕｌとなるようにＤＭＥＭで希釈したものを用意した。
（試薬の調整）
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする腫瘍溶解性ウイルスであるＯＢＰ−３０１を含有する試薬は、ＣＡＮＣＥＲ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ ６４，６２５９−６２６５，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １，２００４に記載されている公知の方法で調整した。調整された試薬は、上述した試験容器３の試薬封入部６に封入した。
（サンプルへのウイルス感染）
上述した癌細胞検出試料調製用キットの試薬封入部６にＯＢＰ−３０１を含有する試薬を封入した試験容器３に、コントロール又は癌サンプルをそれぞれ２５０ｕｌ注入した。その後、キャップ部１を、鍔部１ａが試験容器３の上端と当接するまで挿入し、２４時間、３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養を行うことで、サンプルにウイルスを感染させた。
（サンプルの観察）
ウイルス感染後の試薬容器３を、上述したスライドガラス１１の挿入部１２に挿入し、検鏡部１４に保持された反応液を蛍光顕微鏡により観察した結果を表１及び図８に示す。
【００２７】
【表１】
2007319042.tif 000003
ＳｐｕｔｕｍはＡ４３１細胞添加前の細胞培養液（１．０  ｘ  １０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を示し、Ｓｐｕｔｕｍ／Ａ４３１は肺癌サンプルを示し、Ａ４３１はＡ４３１細胞溶液を１０００ｃｅｌｌｓ／３００ｕｌとなるようにＤＭＥＭで希釈したものを示す。
【実施例２】
【００２８】
子宮頸部・卵巣癌細胞の検出
（サンプルの調整）
滅菌した綿棒を用いて口腔粘膜細胞を回収し、１０ｍｌの細胞培養液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ  ；  ＤＭＥＭ）に回収し、６０分間、３７℃、５％ＣＯ２の条件で前培養を行った。前培養した細胞培養液を１．０  ｘ  １０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ  となるようにＤＭＥＭで希釈したものに、ヒト肺癌細胞株であるＨｅｌａ細胞溶液（ＡＰＣＣ社より購入）を１０００ｃｅｌｌｓ／３００ｕｌとなるように加え、子宮頸部・卵巣癌サンプルとした。
またコントロールとして、Ｈｅｌａ細胞溶液添加前の細胞培養液（１．０  ｘ  １０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）及びＨｅｌａ細胞溶液を１０００ｃｅｌｌｓ／３００ｕｌとなるようにＤＭＥＭで希釈したものを用意した。
その他は、実施例１と同様の操作でサンプル観察を行った。その結果を表２及び図９に示す。
【００２９】
【表２】
2007319042.tif 000004
ＯｒａｌはＨｅｌａ細胞添加前の細胞培養液（１．０  ｘ  １０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を示し、Ｏｒａｌ／Ｈｅｌａは子宮頸部・卵巣癌サンプルを示し、ＨｅｌａはＨｅｌａ細胞溶液を１０００ｃｅｌｌｓ／３００ｕｌとなるようにＤＭＥＭで希釈したものを示す。
【００３０】
実施例から明らかなように、本発明の癌細胞検出試料調製用キット及びそれを用いた癌細胞検出用キットを用い、実際に癌細胞の検出を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明の一実施形態である試験容器及びキャップ部を示す側面図である。
【図２】図１に示す試験容器の上面図である。
【図３】図１に示す試験容器における、図２のＡ−Ａ断面図である。
【図４】試料が注入された状態における図１の試験容器を示す側面断面図である。
【図５】キャップ部により入口が塞がれた図１の試験容器の側面断面図である。
【図６】本発明の一実施形態である検鏡用のスライドグラスを示す斜視図である。
【図７】図６に示す検鏡用のスライドグラスの上面図（ａ）及び断面図（ｂ）を示す。
【図８】肺癌細胞の蛍光顕微鏡による観察結果を示す図である。
【図９】子宮頸部・卵巣癌細胞の蛍光顕微鏡による観察結果を示す図である。
【符号の説明】
【００３２】
１：キャップ部  １ａ：鍔部  １ｂ：嵌合部  ２：開封部  ２ａ：突起  ３：試験容器  ４：試験容器の上面  ５：第１アルミシート  ６：試薬封入部  ７：試薬  ８：第２アルミシート  ９：試料  １０：チャコールフィルタ  １１：スライドグラス  １２：挿入部  １３：保持部  １４：検鏡部  １５：反応試料流路部  １６：第２開封部  １７：第１スライドグラス  １８：第２スライドグラス
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年3月6日(2007.3.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一端に被験者から採取した生体由来の試料を受け入れる開口を有し、シール部によって
ウイルスを含有した試薬が封入された試験容器と、
前記開口を塞ぐためのキャップ部と、
前記シール部を開封する開封部と、を備える癌細胞検出試料調製用キット。
【請求項２】
前記キャップ部がウイルス非透過性の通気性フィルタを有する、請求項１記載の癌細胞検出試料調製用キット。
【請求項３】
前記キャップ部が前記開口を塞ぐ動作に伴って前記開封部が前記シール部を開封する請求
項１又は２に記載の癌細胞検出試料調製用キット。
【請求項４】
前記キャップ部が、前記開封部を有する請求項１〜３の何れか１項に記載の癌細胞検出試料
調製用キット。
【請求項５】
前記シール部が前記開封部により開封される際に、前記試薬容器の内部のウイルスが外部
から隔離されている請求項１〜４の何れか１項に記載の癌細胞検出試料調製用キット。
【請求項６】
前記シール部が前記開口から所定距離隔てた位置に設けられており、
前記挿入部の先端が前記開口を閉塞する第１位置から前記シール部が前記開封部により開
封される第２位置まで前記キャップ部が前記試験容器に対して移動されることにより、前
記試験容器に前記キャップ部が装着されるように構成されている請求項５に記載の癌細胞
検出試料調製用キット。
【請求項７】
前記ウイルスのゲノムが、発癌遺伝子のプロモーター及び標識タンパク質をコードする遺
伝子が組み込まれたものである請求項１〜６の何れか１項に記載の癌細胞検出試料調製用
キット。
【請求項８】
前記ウイルスが、腫瘍溶解性ウイルスである請求項１〜７の何れか１項に記載の癌細胞検
出試料調製用キット。
【請求項９】
前記ウイルスが、d12.CALP、d12.CALP delta RR、Telomelysin、Telomelysin-RGD、AxE1A
dB-UPRT、AdSLPI.E1AdB、AxE1CAUP、AdE3-IAI.3B、Ad-MKAdMK、AdCEAp/Rep、AdAFPep/Rep
、MMP-sub II SeV/delta M、又はCD-MMP-sub II-SeV/delta Mである請求項１〜８の何れ
か１項に記載の癌細胞検出試料調製用キット。
【請求項１０】
前記試料が、血液、喀痰又は子宮から採取したものである請求項１〜９の何れか１項に記
載の癌細胞検出試料調製用キット。
【請求項１１】
請求項１〜１０の何れか１項に記載の癌細胞検出試料調製用キットと、
前記試験容器を挿入する挿入部、
前記試験容器を挿入する動作によって、前記試験容器の底面を開封する第２開封部、及び
前記第２開封部により底面が開封された試験容器から試料及び試薬の反応液を導入し、前
記反応液を外部から観察可能に保持する保持部を有するスライドグラスと、を備えた癌細
胞検出用キット。
【請求項１２】
前記試験容器の底面が、前記第２開封部により開封される際に、内部のウイルスが外部か
ら隔離されている請求項１１に記載の癌細胞検出用キット。
【請求項１３】
前記試験容器の底面が、前記第２開封部により開封される第２シール部を有する請求項１１又は１２に記載の癌細胞検出用キット。
【請求項１４】
請求項１〜１３の何れか１項に記載のキットを用いた癌の診断方法。
【請求項１５】
前記癌が、血液癌、肺癌又は子宮頸癌である請求項１４に記載の診断方法。
【請求項１６】
一端に開口を有し、シール部によってウイルスを含有した試薬が封入された試験容器に、
被験者から採取した試料を添加する工程と、
前記開口を、キャップ部により塞ぐ工程と、
前記シール部を開封部材により開封する工程を備えた癌細胞検出用試料の調製方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
癌は日本人の死亡率の第一位の要因であるが、早期診断による早期治療が可能であれば、その死亡率を著しく減少させることができると言われている。
現在、癌の診断は、一般的に細胞検査技師が、被験者から採取した被検試料中の細胞を検鏡により形態学的検査を行うことによって、正常細胞と癌細胞を見分けることによって行われている。しかしながら、この診断方法は、細胞検査技師による目視検査であるため、集団検診のように大量の被検試料を取り扱いには不向きであり、また、被検試料の状態等によっては検査結果にばらつきが生じ、且つ定量的に分析することができないという問題がある。
また、被験者の血漿および血清中の腫瘍由来ＤＮＡを検出することで、癌の診断を行う方法の研究も行われている。具体的には、被検者から採取した血中に含まれる細胞を濃縮し、当該濃縮された細胞中の血中遊離癌細胞に係るＤＮＡ等を生化学的に分析することで癌の診断を行うというものである。この方法は、大量の被検試料を比較的安全に処理することができるが、血中遊離癌細胞の濃縮工程が困難であり、簡便性に欠けるという問題がある。
一方、近年癌細胞において特異的に増殖する腫瘍溶解性ウイルスを用いた抗癌剤（特許文献１）や癌細胞検出試薬が報告されている（特許文献２）。腫瘍溶解性ウイルスとは、癌細胞中で特異的に増殖するウイルスのことで、該ウイルスを癌細胞に感染させることにより、癌細胞を直接的に破壊・死滅させることができ、そのゲノムに標識タンパク質の遺伝子を組み込むことで癌細胞を簡便に検出することが可能となる。しかしながら、癌細胞の検出は簡便であっても、腫瘍溶解性ウイルスは正常細胞にも感染性を有するため、該検出を行うにはＰ２レベルの設備が必要となる。従って、現実的に集団検診等での使用は困難であるという問題があった。
【特許文献１】ＷＯ２００４／００５５１１号公報
【特許文献２】ＷＯ２００６／０３６００４号公報
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
図３は、試験容器３の図２に示されるＡ−Ａ断面矢視図である。本実施形態では、試験容器３には、その容器内部を仕切る第１アルミシート５が、容器内部のほぼ中央に設けられている。更に試験容器３の底面には第２アルミシート８が設けられており、第１アルミシート５と第２アルミシート８とで挟まれた空間は、外部から隔離された試薬封入部６となっている。この試薬封入部６には、ウイルスを含有した試薬７が封入されている。このように、第１アルミシート５と第２アルミシート８とで隔離された空間である試薬封入部６に試薬７が封入されているため、ウイルスが外部に拡散されること無く、安全に試験容器３を持ち運ぶことができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
肺癌細胞の検出
（サンプルの調整）
健常人より採取した喀痰を１．５  ｍｌ の細胞培養液 （Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ  ；  ＤＭＥＭ）に回収し、６０分間、３７℃、５％ＣＯ２の条件で前培養を行った。前培養した細胞培養液を１．０  ｘ  １０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ  となるようにＤＭＥＭで希釈したものに、ヒト肺癌細胞株であるＡ４３１細胞溶液（ＡＴＣＣ社より購入）を１０００ｃｅｌｌｓ／３００ｕｌとなるように加え、肺癌サンプルとした。
またコントロールとして、Ａ４３１細胞溶液添加前の細胞培養液（１．０  ｘ  １０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）及びＡ４３１細胞溶液を１０００ｃｅｌｌｓ／３００ｕｌとなるようにＤＭＥＭで希釈したものを用意した。
（試薬の調整）
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする腫瘍溶解性ウイルスであるＯＢＰ−３０１を含有する試薬は、ＣＡＮＣＥＲ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ ６４，６２５９−６２６５，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １，２００４に記載されている公知の方法で調整した。調整された試薬は、上述した試験容器３の試薬封入部６に封入した。
（サンプルへのウイルス感染）
上述した癌細胞検出試料調製用キットの試薬封入部６にＯＢＰ−３０１を含有する試薬を封入した試験容器３に、コントロール又は癌サンプルをそれぞれ２５０ｕｌ注入した。その後、キャップ部１を、鍔部１ａが試験容器３の上端と当接するまで挿入し、２４時間、３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養を行うことで、サンプルにウイルスを感染させた。（サンプルの観察）
ウイルス感染後の試薬容器３を、上述したスライドガラス１１の挿入部１２に挿入し、検鏡部１４に保持された反応液を蛍光顕微鏡により観察した結果を表１及び図８に示す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
子宮頸部細胞の検出
（サンプルの調整）
滅菌した綿棒を用いて口腔粘膜細胞を回収し、１０ｍｌの細胞培養液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ  ；  ＤＭＥＭ）に回収し、６０分間、３７℃、５％ＣＯ２の条件で前培養を行った。前培養した細胞培養液を１．０  ｘ
１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ  となるようにＤＭＥＭで希釈したものに、ヒト肺癌細胞株であるＨｅｌａ細胞溶液（ＡＴＣＣ社より購入）を１０００ｃｅｌｌｓ／３００ｕｌとなるように加え、子宮頸部サンプルとした。
またコントロールとして、Ｈｅｌａ細胞溶液添加前の細胞培養液（１．０  ｘ  １０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）及びＨｅｌａ細胞溶液を１０００ｃｅｌｌｓ／３００ｕｌとなるようにＤＭＥＭで希釈したものを用意した。
その他は、実施例１と同様の操作でサンプル観察を行った。その結果を表２及び図９に示す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
ＯｒａｌはＨｅｌａ細胞添加前の細胞培養液（１．０  ｘ  １０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を
示し、Ｏｒａｌ／Ｈｅｌａは子宮頸部サンプルを示し、ＨｅｌａはＨｅｌａ細胞
溶液を１０００ｃｅｌｌｓ／３００ｕｌとなるようにＤＭＥＭで希釈したものを示す。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
【図１】本発明の一実施形態である試験容器及びキャップ部を示す側面図である。
【図２】図１に示す試験容器の上面図である。
【図３】図１に示す試験容器における、図２のＡ−Ａ断面図である。
【図４】試料が注入された状態における図１の試験容器を示す側面断面図である。
【図５】キャップ部により入口が塞がれた図１の試験容器の側面断面図である。
【図６】本発明の一実施形態である検鏡用のスライドグラスを示す斜視図である。
【図７】図６に示す検鏡用のスライドグラスの上面図（ａ）及び断面図（ｂ）を示す。
【図８】肺癌細胞の蛍光顕微鏡による観察結果を示す図である。
【図９】子宮頸部細胞の蛍光顕微鏡による観察結果を示す図である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
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