(57)【要約】【課題】安定性の面で優れた性質を有するが生産性に問題のあったサーモアスカス  オーランティアカス(Thermoascus aurantiacus)のカタラーゼＢを大量生産する方法を確立し、過酸化水素の分解除去が必要なさまざまな産業分野に利用可能な高性能カタラーゼを提供する。【解決手段】サーモアスカス  オーランティアカス(Thermoascus aurantiacus)のカタラーゼＢタンパク質をコードする遺伝子を単離して塩基配列を決定し、該遺伝子を微生物に導入発現させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カタラーゼ活性を有するカタラーゼＢタンパク質をコードする、配列番号１に示す塩基配列番号１〜２５０２で表される塩基配列、または該塩基配列から１個もしくは複数個の塩基が欠損、置換、または付加された塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項２】
カタラーゼ活性を有するカタラーゼＢタンパク質をコードする、配列番号２に示す塩基配列番号１〜２２２３で表される塩基配列、または該塩基配列から１個もしくは複数個の塩基が欠損、置換、または付加された塩基配列を有するｃＤＮＡ
【請求項３】
配列番号３に示すアミノ酸配列番号１〜７４０で表されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列から１個もしくは複数個のアミノ酸が欠損、置換、または付加されたアミノ酸配列を有する、カタラーゼ活性を有するカタラーゼＢタンパク質。
【請求項４】
配列番号４に示すアミノ酸配列番号１〜７０１で表されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列から１個もしくは複数個のアミノ酸が欠損、置換、または付加されたアミノ酸配列を有する、カタラーゼ活性を有するカタラーゼＢタンパク質。
【請求項５】
カタラーゼ活性を有するカタラーゼＢタンパク質をコードするＤＮＡが、サーモアスカス  オーランティアカス(Thermoascus aurantiacus)由来である、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項６】
カタラーゼ活性を有するカタラーゼＢタンパク質が、サーモアスカス  オーランティアカス(Thermoascus aurantiacus)由来である、請求項３または４に記載のカタラーゼ活性を有するカタラーゼＢタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はカタラーゼＢ遺伝子および該遺伝子の発現産物であるカタラーゼＢタンパク質（以下、単にカタラーゼＢと記すことがある）に関する。更に詳しくは、カタラーゼＢ遺伝子またはカタラーゼＢｃＤＮＡを宿主微生物に導入することによって、カタラーゼＢを大量に生産する方法に関する。カタラーゼＢは、構成的に分泌され、安定性にも優れていることから、その大量生産法を確立できれば、過酸化水素の分解剤として使用されているカタラーゼのより有利な供給手段となり、漂白剤や洗浄剤として過酸化水素を繁用している繊維産業や半導体産業の分野等で大いに役立つ。
【背景技術】
【０００２】
従来から、微生物由来のカタラーゼとして、アスペルギルス(Aspergillus)属、ペニシリウム(Penicillium)属、ノイロスポラ(Neurospora)属、サーモアスカス(Thermoascus)属、ハンセヌラ(Hansenula)属、サッカロマイセス(Saccharomyces)属、バチルス(Bacillus)属、ビブリオ(Vibrio)属等に属する微生物のカタラーゼが知られているが、特に糸状菌由来のカタラーゼは熱、ｐＨ、過酸化水素等に対する安定性に優れた性質を有しているものが多く、適用範囲が広い。
糸状菌由来のカタラーゼにはサブユニットのサイズにより２つのクラスに分けられているが、サブユニットのサイズが大きいクラスのカタラーゼは存在部位、発現時期等の違いにより２つのタイプ、即ち、カタラーゼＡまたはカタラーゼＢに分けられる。カタラーゼＡは胞子形成時に生産され、カタラーゼＢは生育を通じ定常的に生産される。カタラーゼＢは安定性に優れ、菌体外に分泌されることから、産業上の利用価値が高い。
【０００３】
糸状菌の生産するカタラーゼの中でも、サーモアスカス オーランティアカス(Thermoascus aurantiacus)のカタラーゼは、耐熱性、耐ｐＨ性が強い等優れた性能を有している（例えば、特許文献１参照）。本酵素はT.aurantiacusの液体培養および固体培養で生産されるが、その生産性は実用上十分ではない。
これまでA.niger、A.oryzae、A.nidulans、N.crassa等の糸状菌のカタラーゼ遺伝子がクローニングされている。また、T. aurantiacus に関しては、カタラーゼ遺伝子の１種が既にクローニングされている(例えば、特許文献２参照)。しかしながら、構成的に分泌生産され、より優れた性能を有し、広範な利用が期待されるカタラーゼＢをコードしているカタラーゼＢ遺伝子はクローニングされておらず、従って本遺伝子を利用したカタラーゼＢの大量発現は困難であった。
【０００４】
【特許文献１】特開平５−１５３９７５号公報
【特許文献２】特開２００４−２６１１３７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らが解決しようとする課題は、糸状菌により構成的に生産され、広範な利用が期待されるカタラーゼＢをコードしているカタラーゼＢ遺伝子を単離して塩基配列を決定し、該遺伝子を同種又は異種発現させ、過酸化水素の分解除去が必要なさまざまな産業分野に利用可能な高性能カタラーゼを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は上記課題を解決するためになされたものである。本発明者らは、鋭意研究の結果、T.aurantiacusのゲノムＤＮＡから単離したカタラーゼＢ遺伝子のクローニング、T.aurantiacusの培養菌体から単離したｍＲＮＡを基に作製したカタラーゼＢｃＤＮＡのクローニング、これらの塩基配列の決定、およびｃＤＮＡの宿主細胞への導入と発現に成功し、本発明を完成するに至ったものである。
即ち、本発明は以下の（１）〜（６）に示す、カタラーゼＢ遺伝子、およびカタラーゼＢｃＤＮＡ、ならびに該遺伝子またはｃＤＮＡを宿主微生物に導入することによって得られるカタラーゼＢを大量に生産する組換え微生物に関する。
（１）カタラーゼ活性を有するカタラーゼＢタンパク質をコードする、配列番号１に示す塩基配列番号１〜２５０２で表される塩基配列、または該塩基配列から１個もしくは複数個の塩基が欠損、置換、または付加された塩基配列を有するＤＮＡ。
（２）カタラーゼ活性を有するカタラーゼＢタンパク質をコードする、配列番号２に示す塩基配列番号１〜２２２３で表される塩基配列、または該塩基配列から１個もしくは複数個の塩基が欠損、置換、または付加された塩基配列を有するｃＤＮＡ
（３）配列番号３に示すアミノ酸配列番号１〜７４０で表されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列から１個もしくは複数個のアミノ酸が欠損、置換、または付加されたアミノ酸配列を有する、カタラーゼ活性を有するカタラーゼＢタンパク質。
（４）配列番号４に示すアミノ酸配列番号１〜７０１で表されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列から１個もしくは複数個のアミノ酸が欠損、置換、または付加されたアミノ酸配列を有する、カタラーゼ活性を有するカタラーゼＢタンパク質。
（５）カタラーゼ活性を有するカタラーゼＢタンパク質をコードするＤＮＡが、サーモアスカス  オーランティアカス(Thermoascus aurantiacus)由来である、（１）に記載のＤＮＡ。
（６）カタラーゼ活性を有するカタラーゼＢタンパク質が、サーモアスカス  オーランティアカス(Thermoascus aurantiacus)由来である、（３）または（４）に記載のカタラーゼ活性を有するカタラーゼＢタンパク質。
【０００７】
本発明によりT.aurantiacusのカタラーゼＢを大量に生産することが可能になり、過酸化水素の分解が必要な様々な産業分野への適用を可能にするものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
T.aurantiacusのゲノムＤＮＡは本菌の液体培養菌体から公知の方法で抽出する。本菌カタラーゼＢのＮ末端アミノ酸配列、およびこれまでに報告されている糸状菌のカタラーゼＢの保存領域を基にプライマーを作製し、このプライマーを用いてゲノムＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）を行い、カタラーゼＢ遺伝子の部分断片を得る。得られた断片の塩基配列を基に合成したプライマーを用い、ゲノムＤＮＡの各種制限酵素による消化断片を鋳型として順次ＰＣＲを行い、増幅した断片を公知の方法によりクローニングする。得られたカタラーゼＢ遺伝子断片の塩基配列の解析により、開始コドン、終止コドンを含むカタラーゼＢゲノム遺伝子の塩基配列を決定する。
【０００９】
また、糸状菌のカタラーゼＢｃＤＮＡの単離は以下のように行う。カタラーゼＢを生産している菌体よりＲＮＡを抽出し、先に決定したカタラーゼ遺伝子塩基配列の５'−および３'−末端部配列を基にプライマーを合成し、逆転写酵素等を用いるＲＴ−ＰＣＲ法によりｃＤＮＡを合成・増幅する。これを大腸菌ベクターに繋ぎ、大腸菌にクローニングした後、塩基配列を決定する。本カタラーゼＢ遺伝子及び本ｃＤＮＡは、これを同種及び異種宿主に導入して高発現せしめ、カタラーゼＢを製造することが可能である。
【００１０】
宿主としては各種真核微生物が利用可能である。異種発現の宿主としてアスペルギルス ニガー(A.niger)、アスペルギルス オリゼ(A.oryzae)、アスペルギルス ニドランス(A.nidulans)、アスペルギルス アワモリ（A.awamori）トリコデルマ ビリデ(Trichoderma viride)、トリコデルマ リーセイ(T.reesei)、リゾプス ニヴェウス(Rhizopus niveus)等を例示できるが、宿主-ベクター系が確立されているものであればよく、これらに限定されるものではない。同種発現宿主として、サーモアスカス オーランティアカスも利用可能である。カタラーゼＢｃＤＮＡに関しては、大腸菌、枯草菌を始めとする細菌類も宿主として使用可能である。
【００１１】
上記により単離したカタラーゼＢ遺伝子は宿主における公知の高発現プロモーターを利用し発現させることが可能である。プロモーターとしては宿主のグルコアミラーゼ遺伝子、タカアミラーゼ遺伝子、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素遺伝子、グルタミン酸脱水素酵素遺伝子等のプロモーターが使用できるがこれらに限定されるものではない。
本カタラーゼＢ遺伝子は上記プロモーターの下流に挿入され、プラスミドに組み込まれて公知の方法により宿主に導入される。この形質転換体を培養することによりカタラーゼＢの高発現が達成される。
【実施例】
【００１２】
以下、実施例をもって本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。
実施例１
カタラーゼＢ遺伝子のクローニングおよび塩基配列の決定
（１）カタラーゼＢの精製およびＮ末端アミノ酸配列の決定
表1に示す組成のA培地で培養したT.aurantiacusの7日目の培養液300mlを用いて公知の精製方法を組み合わせてカタラーゼBの精製を行った。エタノール沈殿により得られたカタラーゼBを含む沈殿をバッファーに溶解した後、DEAE-Toyopearl 640M、(東ソー社製)、Mono Q HR5/5(Amersham Bioscience社製)によるカラムクロマトグラフィー、硫安分画、Phenylsuperpose 5/5及びSuperdex200HR 10/30(Amersham Bioscience社製)によるゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより精製し、SDS-PAGEで単一バンドを示す分画を得た。SDS-PAGEの単一バンド部分をPVDF膜にエレクトロブロッティング法により転写し、プロテインシークエンサーModel491-1(Perkin Elmer社製)により、N末端アミノ酸配列の決定を行った。N末端アミノ酸配列はA-E-G-G-G-G-A-A-A-E-T-E-K-Fであった。
表１.Ａ培地組成                              
NaNO3          0.5%    FeSO4・7H2O     0.002%
K2HPO4         0.1%    酵母エキス      0.2%
KCl            0.05%   麦芽エキス      0.2%
MgSO4・7H2O    0.1%    ブドウ糖        5.0%  
（２）カタラーゼＢ遺伝子の部分断片の調製
N末端アミノ酸配列の情報を基にPCRに使用するミックスプライマー1および2を公知の方法により合成した。
プライマー1    GCI-GAR-GGI-GGN-GGN-GGN-GC
プライマー2    GGI-GGI-GCN-GCN-GCN-GAR-AC
逆向きのプライマー3は、これまでに報告されている真菌類のカタラーゼのアミノ酸配列アラインメントを基に保存領域から作成した。
プライマー3   5’-GATGAATTCYTGRATRAARAA-3’
T.aurantiacus)のゲノムＤＮＡは液体培養した菌体から公知の方法(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al.,1987 )により調製した。得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記プライマーを用いてnested PCRを行った。1回目PCRはプライマー1および3の組み合わせで行い、次にこのPCR液の一部を鋳型とし、プライマー2および3を用いて２回目PCRを行った。その結果、約600bpの増幅断片が確認された。公知の方法により増幅断片を大腸菌にクローニングし、その塩基配列を決定した。本断片は、A.nidulans及び A.fumigatusのカタラーゼB遺伝子とそれぞれ、70.7%および71.2%の相同性を示した。
（３）５’末端側及び３’末端側ＤＮＡの取得
ゲノムDNAウオーキング法により各種カセットを用いて5’末端側及び3’末端側の未取得DNAを得た．即ち、5’末端側DNAを取得するため、既に取得した部分遺伝子の塩基配列からプライマー4および5を作製した。
プライマー4    5’-GATGAATTCTAGACTGTTCTGATCCTCAA-3’
プライマー5    5’-ATCTTTTGACGGAGGATGAAGTCCTC-3’
これらのプライマーとカセットプライマーを用いてnested PCRを行った結果、ゲノムDNAのHin dIII消化断片を鋳型とした反応で約1.4kb断片、PstI消化断片からは約800bp断片、Xba I消化断片からは約500bp断片が増幅された。それぞれの断片をクローニングし、プライマー4から約440bp上流までの塩基配列を決定した。この中にカタラーゼ遺伝子の5’末端と考えられる開始コドンが含まれていた．
同様に3’末端側DNAを取得するために4段のPCRを行った．先の部分遺伝子の塩基配列を基に作製したプライマー6および7を用い、Hin dIII消化断片を鋳型として約500bpの増幅断片を得、塩基配列を決定した。
プライマー6    5’-GATTCTAGAATTCTCGATCTGACAGCCAGC
プライマー7    5’-GAACTTCGGTAGGCAACTATCATGCTCT
この塩基配列を基に作製したプライマー8および9を用い、PstI消化断片から約1kbの増幅断片を得、塩基配列を決定した。
プライマー8    5’-AATCGAGGCTGGAAGGTACCCTGAGTG-3’
プライマー9    5’-GATTCTAGAATTCTCCCTGCTATGTATGGA-3’
更にこの配列を基に作製したプライマー10及び11を用い、SalI消化断片から約300bpの断片を得、この塩基配列を決定した。
プライマー10  5’-CCAGACCCAACCTTCTACCACAACAAC-3’
プライマー11  5’-CGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3’
この塩基配列を基にプライマー12および13を作製し、NheI消化断片を鋳型とするXbaIカセットPCRにより約1.4kbpの断片を得、塩基配列を決定した。この配列中にはカタラーゼ遺伝子の3’末端と考えられる終止コドンが認められた。
プライマー12  5’-GTCCTCGCCACCGTCAACAAGCCCGACTCG-3’
プライマー13  5’-TCAAGCAGGCCGCCAGCCTGAAGGCCAGCT-3’
（４）カタラーゼＢ遺伝子のクローニングと全塩基配列
得られた各断片の塩基配列を結合することによりカタラーゼ遺伝子全長の塩基配列2502bp（配列１）が決定された。また、5’末端及び3’末端塩基配列を基に作製したプライマーを用い、ゲノムDNAを鋳型にしたPCRを行い、カタラーゼ遺伝子全長を含むDNAを増幅させ、大腸菌にクローニングした。
【００１３】
実施例２
カタラーゼＢｃＤＮＡのクローニング及び塩基配列の決定
カタラーゼを生産しているT.aurantiacusの菌体から公知の方法によりRNAを抽出した。1st cDNAの合成はアマシャム製のcDNA合成キットを用い、そのマニュアルに従って行った。目的cDNAの増幅、単離は次のように行った。先に決定したゲノム遺伝子の5'-および3'-末端の塩基配列を基にプライマーを合成した。それぞれのプライマーには制限酵素認識配列のタグが付けてある。1st cDNA mixtureを鋳型にしてPCRを行い、特異的増幅断片をベクターpBluescriptIISKにつなぎ大腸菌にクローニングした。この断片の塩基配列を決定し、カタラーゼcDNAであることを確認した。本cDNA は、配列2に示した、開始コドン及び終止コドンを含む222Obpの塩基配列から成り、740アミノ酸残基からなるカタラーゼのアミノ酸配列(配列3)が判明した。このアミノ酸配列にはKEX2型エンドペプチダーゼ切断サイトと考えられる(Arg37-Arg38)が存在することから、シグナルペプチド配列部分が切断された成熟タンパク質は、701アミノ酸残基(配列４)からなると予想された。
【配列表】
2007143405000001.app