(57)【要約】【課題】本発明は、細胞低接着性の細胞培養基材を提供することを課題とする。【解決手段】細胞培養基材の表面に半球状のくぼみを有し、該半球状のくぼみの孔径が５０〜５００ｎｍであり、かつピッチ間距離が１００〜６００ｎｍからなる細胞培養基材による。【選択図】図１
2007306881.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養基材の表面に半球状のくぼみを有し、該半球状のくぼみの孔径が５０〜５００ｎｍであり、かつピッチ間距離が１００〜６００ｎｍからなる細胞培養基材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞低接着性の細胞培養基材に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養の技術は、細胞の生化学的現象や性質の解明、有用な物質の生産などの様々な目的で利用されている。遺伝工学を中心としてバイオテクノロジーの進展の中で細胞による物質生産技術の開発を中心とした技術が数多く報告されている。培養細胞は、物質生産だけでなく、細胞の働きや形態を任意に加工することで、人工臓器やバイオセンサ、バイオリアクター、再生医療などに利用しようという試みが盛んに行われている。例えば再生医療では、生体病変部や欠損部への補綴材、薬剤の評価などが挙げられる。この時、細胞を培養する基材が必要となり、材質は通常細胞接着性のものが選択される。
【０００３】
細胞培養基材として、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸（ＰＬＡ）やポリ乳酸-グリコール酸（ＰＬＧＡ）などに代表される生分解性材料が近年注目されている。再生医療の分野ではティッシュエンジニアリング（組織工学）により、生分解性高分子を細胞培養の基材（足場）とし、対象となる組織の細胞を播種して培養系または生体内で組織構造を再生させ、培養人工組織、例えば軟骨、骨、心臓弁、人工器官、培養人工膀胱などの人工臓器が作製された。
【０００４】
一方では、細胞低接着性基材の開発も望まれている。これらは、人工血管や癒着防止膜、カテーテルといった様々な用途に利用される。
これまでに検討されている細胞低接着性基材には、以下のようなものがある。これらは材質に特徴を有するといわれている。例えば、疎水性ポリマー基材（ＰＴＦＥやポリスチレン）が挙げられる。ＰＴＦＥは人工血管として利用されている（特許文献１）。
【０００５】
ポリスチレンを材質とする細胞低接着性シャーレが旭テクノグラス社から市販されている。また、ポリスチレンに超親水性ポリマーを基材表面に固定（共有結合）させた細胞低接着性シャーレ（商標名ハイドロセル、セルシード社）が販売されている。さらに、温度応答型分離材料により、標的物質（細胞）の機能を損なわないように分離および回収できる細胞培養用基材について開示がある（特許文献２）。ここで開示される基材は、酵素を使用せずに細胞を剥離できるという特徴を有する。
【０００６】
また、リン脂質類似構造ポリマーをコーティングした医療用材料について、開示がある（特許文献３）。
【特許文献１】特許第２９８６７２８号公報
【特許文献２】特許第３４４１５３０号公報
【特許文献３】特開２０００−２７９５１２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、細胞低接着性の細胞培養基材を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、材質のみならず、基材の構造に着目し、基材の表面構造を工夫することによって細胞の接着性を制御可能なことを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．細胞培養基材の表面に半球状のくぼみを有し、該半球状のくぼみの孔径が５０〜５００ｎｍであり、かつピッチ間距離が１００〜６００ｎｍからなる細胞培養基材。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の細胞培養基材上で培養した細胞は、付着細胞であっても特にトリプシン処理などの酵素処理を施さずとも、容易に細胞を剥がすことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の細胞培養基材は、表面に半球状のくぼみを有する。基材からの培養細胞の剥離性の観点から該半球状のくぼみの孔径は、５０〜５００ｎｍであり、好ましくは１００〜４００ｎｍである。
【００１２】
また、半球状くぼみの中心部から中心部までの距離、即ちピッチ間距離は、基材からの培養細胞の剥離性の観点から１００〜６００ｎｍであり、好ましくは１５０〜５００ｎｍである。
【００１３】
本発明の細胞培養基材の形態は、表面に半球状のくぼみ構造を有するものであれば良く、特に限定されない。例えば細胞培養用シャーレや細胞培養用フラスコにおける細胞培養面に、上記構造を有する細胞培養基材を設けても良い。また、上記構造を有する細胞培養基材をシャーレの底面部やフラスコ内に設置することができるように、プレート状のような形態であっても良い。
【００１４】
本発明の細胞培養基材において、半球状のくぼみの作製方法は、特に限定されない。具体的には、金型転写法やレーザー加工、フォトレジスト加工、レーザー干渉といった製造方法を適用することができる。
【００１５】
本発明の細胞培養基材の材質は、細胞低接着性を発揮しうる材質であれば特に限定されない。このような材質のものとして、エンジニアリングプラスチックや生体由来材料を利用することができる。エンジニアリングプラスチックとしては、具体的にはポリスチレン、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸−グリコール酸の共重合体、ポリスルホン、ポリアミド、ポリエチレンテレフタレート、リン酸カルシウムなどが挙げられる。また、生体由来材料としては、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、アルギン酸などが挙げられる。
【００１６】
本発明の細胞培養基材を用いて培養される細胞は、付着性細胞であり、例えば市販されている、または独自に株化された付着性の各種腫瘍細胞、骨格筋芽細胞、繊維芽細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、神経細胞、ＥＳ細胞、脂肪細胞、骨髄幹細胞、骨細胞、肝細胞などが挙げられる。特に好適には骨格筋芽細胞が挙げられ、具体的にはＬ６細胞が挙げられる。
【実施例】
【００１７】
以下に実施例を示して説明するが、本実施例は発明の内容をより理解するためのものであって、本発明は本実施例に限定されるものではないことはいうまでもない。
【００１８】
（実施例）細胞培養基材（図１）
材質  ポリスチレン
構造  半球状のくぼみ  孔径  ２００ｎｍ、ピッチ間距離  ２５０ｎｍ
製法  金型転写法
形状  １５ｍｍΦのプレート状
【００１９】
上記細胞培養基材を調製し、あらかじめエチレンオキサイドガスにて滅菌しておいた。滅菌した各基材を、１６ｍｍФのシャーレ（一般に２４穴プレートとよばれるもの）内に置き、Ｌ６細胞（ラット骨格筋芽細胞株化細胞、ＡＴＣＣより入手）を４０cells/ｍｍ２となるように各基材上に播種した（各ｎ＝４）。培養液はＤＭＥＭ培地（１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１０％ウシ胎児血清を含む）を用い、ＣＯ２インキュベータ内で培養した。
【００２０】
培養１日目と４日目の細胞観察像を図２に示した。本発明の細胞培養基材上で、培養１日目でＬ６細胞は伸展形状を成し、さらに培養４日目で増殖していることが観察された。
続いて、培養４日目の細胞にピペッティングを施した後の形態観察像を図３に示した。Ｌ６細胞は付着細胞であるが、特にトリプシン処理などの薬剤処理を施さずとも、ピペッティング操作にて細胞が簡単に剥がれることが確認された。
【００２１】
（比較例）
市販のポリスチレン製培養皿（IWAKI社製）（２４穴プレート）上に、実施例と同様にＬ６細胞を４０cells/ｍｍ２となるように播種し（各ｎ＝４）、同様の培養液を用いてＣＯ２インキュベータ内で培養した。
【００２２】
培養１日目と４日目の細胞観察像を図４に示した。培養状況は、実施例と同様に伸展形状を成し、細胞の増殖も観察された。しかし、ピペッティング操作のみでは細胞が剥がれることはなかった。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
以上説明したように、本発明により細胞の接着性が低く、付着細胞であっても特にトリプシン処理などの酵素処理を施さずとも細胞が剥がれ易い細胞培養基材を提供することができた。本発明の細胞培養基材は、上記性質を利用して、抗血栓性部材（人工血管や癒着防止膜、カテーテルなど）や、酵素を使わずに細胞を剥離できるという特徴を有する熱応答性培養皿（製品名リプセル、セルシード社）の代替として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の細胞培養基材（２００ｎｍ金型転写体）表面の拡大図である。（実施例）
【図２】培養１日目および４日目のＬ６細胞観察像を示す図である。（実施例）
【図３】ピペッティング前後のＬ６細胞観察像を示す図である。（実施例）
【図４】培養１日目および４日目のＬ６観察細胞像を示す図である。（比較例）
【図１】
2007306881.tif 000003
【図２】
2007306881.tif 000004
【図３】
2007306881.tif 000005
【図４】
2007306881.tif 000006