(57)【要約】【課題】インビボで生体適合性のポリマー性物質でなる合成バリアーを提供する。【解決手段】この方法は、血管、組織管腔または他の中空空間の内部表面のような組織または細胞表面への物質の適用を含む。この物質はまた、移植可能な医用デバイスの表面を含む組織へも適用され得る。このポリマー性物質は、組織管腔表面への適用（および、好ましくは接着）を可能にし、より流動性の少ない第２状態へとインサイチュで増加または変化し得る流動性状態；制御された透過性および分解性；ならびに、好適な実施態様においては、インビボでの組織管腔表面または管腔内部への放出のための生物活性物質（これは、細胞−細胞相互作用を変化させる）の組み入れにより特徴づけられる。テナシンが、細胞の特定のインテグリン要素との相互作用を介した平滑筋細胞の移動のメディエーターであることもまた見出されている。【選択図】図１
2007307429.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞または組織表面に適用され得る生体適合性ポリマー性物質を含む、細胞−細胞間の相互作用を変化させるための組成物であって、ここで、該ポリマー性物質は、第１の流動状態で適用され、そしてインサイチュで第２の非流動状態に変換される、温度による以外で固形化するポリマーであり、そして該第２の非流動状態の該物質が、巨大分子、微生物、および細胞の、該非流動状態の該ポリマー性物質中の通過を、分子量の関数として選択的に制限または制御するように規定される多孔性を有する、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、生物学的に活性な分子を含有するポリマー性ゲル物質を組織表面に投与し、かつ、特定のＥＣＭおよびＲＧＤペプチドを用いることによって、組織欠陥を処置し、細胞−細胞相互作用を変化させる方法の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
器官の中空あるいは管状の構造は、例えば、流体あるいは気体（血液、尿、リンパ液、酸素あるいは呼吸用の気体）の運搬あるいは細胞封じ込め（卵子、精子）の促進において、機能上重要である。疾病の過程は、中空あるいは管状の要素の断面を侵害したり、閉塞したり、あるいは小さくすることによって、器官組織あるいはその構成要素に影響を与え得る。さらに、他の疾病の過程は、中空の器官の本来の境界面を侵害し、それによってその遮断機能および／または封じ込め性に影響を与え得る。これらの疾病の過程は、年齢、食事、創傷、あるいは凝固、補体および他の炎症系の活性化、もしくは新形成あるいは悪性疾患の進行などによって誘発される疾病を含む。そして、器官あるいは構造体が適切に機能する能力は、非常に危うくなり得る。これは特に、最初は成功であった処置が、その後、再狭窄と呼ばれる内皮の過剰増殖もしくは血管拡張後の血管最狭窄あるいは血管閉塞によって合併症を生じ得る、冠状動脈疾病において顕著である。
【０００３】
細胞移動を防止するためのアジュバント処置から大きな恩恵を受ける特定の治療方策は、経皮経管腔冠状血管形成術（ＰＴＣＡ、バルーン血管形成術）である。バルーン血管形成術は、冠状血管および末梢血管の、進行した疾病の介在治療の主要な方法となっている。この処置によって、遮断が生じる罹病動脈管腔の拡張という治療の目的が達成されるが、治療自体は動脈壁に損傷を与え、動脈機能に変化を生じさせ得る。バルーン血管形成術の後に生じる再狭窄あるいは血管再閉塞は、この処置の一貫した長期的成功率を低迷させている主な制限要因である。実際に、現在は緩和不可能な、再狭窄による血管形成術後の欠損率は３０％から５０％である。
【０００４】
血管壁の内膜過形成あるいは肥厚もしくは再狭窄の基本的メカニズムは、壁内の平滑筋細胞の刺激によって生じ、それによってそれらの細胞が移動し、増殖し、細胞外マトリクスタンパク質を協同して分泌あるいは沈着させる。管腔に向かって進行し、結局は管腔を侵害する平滑筋細胞移動およびマトリクス沈着の組み合わせは、再狭窄の原因となる。損傷に対するこのＳＭＣ応答は、ＳＭＣ表現型が、静止した収縮状態から中間ＳＭＣの高い割合で合成の増殖状態へ変質することによって、特徴づけられる。損傷の後に生じる別の重要な事象は、ＳＭＣ（合成ＳＭＣおよび収縮ＳＭＣの両方）が移動体となり、中膜から内膜に移動することである。
【０００５】
血管形成と関連するタイプの問題は、例えば、前立腺外科手術または狭窄あるいはファロピオ管狭窄の腹腔鏡検査法およびバルーン拡張による処置および疾病、外科手術および外傷によって生じる開口部の処置の後に行われる、尿道および生殖経路障害の外科矯正術およびバルーン拡張を含む、別のタイプの自然管腔の同様の処置に特徴的である。さらに、これらの再閉塞の問題は、頚動脈肝臓内門脈体静脈シャント処置（transjugular intrahepatic portosystemic shunting procedure）（TIPS）において形成される肝臓内シャントの再狭窄などの、人工的にあるいは治療上製造された管腔あるいは経路においても生じ得る。
【０００６】
例えば、Slepianの米国特許第5,213,580号などの文献に記載されているように、前もって成形されたポリマー性物質が血管に挿入され、次いで血管の表面に適合するように変形
され、それによって血管を保護し、再狭窄を防止し得る。Henryらの米国特許第5,126,141号および第5,135,751号に記載されているように、ポリオキシアルキレンポリマー性およびイオン性多糖類から形成される水性で、熱可逆性のゲル組成物が、体の損傷領域に適用され、それによって接着が防止され得る。これらの同一タイプのポリオキシアルキレンポリマーは、RosenbergらのWO93/01286に記載されているように、再狭窄の治療のために、外科手術で露出された血管表面にオリゴヌクレオチド（アンチセンス）を局所的に送達するために用いられている。
【０００７】
しかし、これらの方法のいずれも、透過性を制御するバリアとしてあるいは生物学的に活性な物質を制御して送達するために用いられ得るポリマー性物質を、管腔の表面あるいは表面上に形成する手段を記載しておらず、これらの物質は特定の細胞タイプを標的とし得るものでもない。先行技術は損傷した管腔表面の有用な治療法を開示しているが、これらの付加的で有用な機能、特に、気体および養分の自由な交換を可能にする制御された透過性あるいは管腔表面に有益な高分子の制御された拡散および、例えは成長因子あるいは抗炎症の表面への制御された薬剤送達を行い得る物質を得ることが望ましい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明の目的は、最初は非晶性で生体適合性であり、インサイチュで形成され得るポリマー性物質を提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、管腔表面上で選択的なバリアとして用いられ得る、制御された透過性を有するポリマー性物質を提供することである。
【００１０】
本発明のさらに別の目的は、薬剤および他の生物学的に活性な物質の組織管腔表面あるいは管腔自体への制御された送達に用いられ得る物質を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
生組織においてインサイチュの特定の局所的相互作用あるいは細胞相互作用を生じさせる方法が開示される。これは、局所的かつ選択的に透過性のバリアを形成する流動性の物質を単独で、あるいは特定の生物学的に活性な分子と組み合わせて、治療部位に直接適用することによって達成される。適用の際には、流動性の物質は、組織と調和させられ、温度変化、イオン濃度変化、剪断力を加えること、または化学的あるいは物理的な重合あるいは架橋によって、流動性が少ない状態に変換される。ある実施態様においては、養分、気体およびその他の分子に対して選択的に透過性であることを可能にすると同時に、細胞および／または高分子の相互作用を物理的に阻止することによって、血栓、炎症あるいは接着の形成などの細胞の相互作用が抑制される。透過性は、物質の選択、製造方法、密度、架橋度、モノマーユニットの分子量、粒子あるいはその他の物質の組み入れおよびポリマー性物質の分解性あるいは非生体内分解性によって制御される。別の実施態様においては、ポリマー性ゲルは、生物学的に活性な分子、特に、細胞増殖、移動および炎症反応を改変するために用いられ得る、接触誘導、走化性活性あるいは走触性活性を提供する生物学的に活性な分子と組み合わせられて提供される。
【００１２】
実施例によって示されるように、生体適合性のポリマー性物質からなる合成バリアは、インビボで血管あるいは組織管腔の内側表面などの組織表面あるいは細胞表面に適用され得る。この物質は、移植可能な医用デバイスの組織接触表面にも適用され得る。ポリマー性物質は、第１の流動状態で、例えば、カテーテルあるいは外科手術時に噴霧あるいは灌流により処置され得る部位に適用される。
【００１３】
次いで、この物質は、被覆される表面と密接に適合して接触するように再構成され、次
いで、この物質を第２の非流動状態に変換する条件下で維持される。この変換は、化学物質あるいはエネルギーを付加あるいは除去することによってこの物質を取りまく状況を変える能動的方法か、あるいは、例えば、患者の体内平熱によって物質を維持することによって物質を非流動状態に変換する受動的方法かのいずれかによって達成され得る。流動状態から非流動状態への物質の転移は、物質がゲル化によって液体状態から固体状態に変化する相変化、あるいは実際には単一相のままである物質の粘度変化の結果として生じ得る。
【００１４】
これらの研究の一部として、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質テナシンが、罹病組織あるいは損傷組織の処置のためのインビボでの細胞移動を促進し、単独でも、あるいは局所的治療のためのポリマー性ゲルなどのキャリアと組み合わせても用いられ得ることが明らかにされている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本明細書で説明するように、ポリマー性物質は組織管腔の表面に適用されて、管腔内の物質、例えば血液に対して制御された透過性を有しおよび／または組み入れられた生物活性剤の制御された放出を有するバリアを提供する。
【００１６】
ポリマー性物質の選択 ポリマー性物質の基本要件は、生体適合性であること、および、流動状態で適用され次にインビボで達成され得る条件下で化学的または物理的に再構成され、透過性に関して規定された特徴を有する非流動性ポリマー性物質となって、組み入れられた物質を放出することが可能であることである。
【００１７】
ポリマー性物質は、モノマー、マクロマー、ポリマーまたはそれらの組み合わせとして適用され得、溶液、懸濁液、または分散液として維持され得るが、ここでは特に明記しない限り合わせて「溶液」と呼ぶ。その非流動状態には多くの形態があり得るが、オルガノゲルおよびヒドロゲルが好適な実施態様の代表例である。非分解性および生分解性物質が使用され得るが、生分解性物質が好ましい。
【００１８】
本明細書で使用されるように、「生分解性」とは、非永久的で、自然にまたは課せられた治療との生物学的および／または化学的プロセスによって除去される物質を説明することを意図している。血管形成術後の血管内に適用するには、実質的に移植の６ヶ月後に分解するポリマーを使用することが好ましい。損傷または外科手術処置後の、接着の防止または制御された放出のためには、劣化は回復に必要な時間、すなわち、一般に６日より多く６ヶ月未満という時間と相関関係にあらねばならない。
【００１９】
ポリマー性物質は、インビボで重合し得るかまたはその粘度が変化し得る材料から選択される。このような重合または粘度変化は、外生手段、例えば、光、超音波、放射線、または、キレート化を単独でまたは触媒を添加した状態で適用するか、または、内因性手段、例えば、生理的ｐＨへの変化、カルシウムイオン(calcium ions)（アルギン酸塩(alginate)）またはホウ酸塩イオン(borate ions)（ポリビニルアルコール(polyvinyl alcohol)）のポリマーへの拡散、または体温への温度変化（３７℃）によって行われる。
【００２０】
本明細書で使用されるように、ヒドロゲルは網目状の(interlaced)ポリマー性成分を有する水性相として定義され、その重量の内少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは８０％以上、そして具体例としては９０％が水分である。以下の定義はDictionary of Chemical Terms、第４版、McGraw Hills著(1989)からの引用である：ヒドロゲル：その内部において、分散相（コロイド）と連続相（水分）とが組み合わされて粘性のゼリー状の生成物、例えば、凝集ケイ酸が生成されるコロイド。
【００２１】
オルガノゲルは網目状ポリマー性成分を有する有機相として定義され、その重量の内少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは８０％以上、そして具体例としては、９０％が有機溶媒である。好適な溶媒は、ジメチル・スルホキシド（ＤＭＳＯ）(dimethyl sulfoxide)および鉱油および植物油（ただしこれらに限定されない）を含む非中毒性有機溶媒を包含する。
【００２２】
適切な物質は市販されているかまたは公知の方法によって当業者に容易に合成され得る。これらの物質の例としては、以下のものが挙げられる：
１．温度またはせん断力または他の物理的力の作用として重合するかまたは粘度が変化する物質 
ポリオキシアルキレンポリマー(poly(oxyalkylene)polymer)およびポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド(poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide)(PEO-PPO)またはポリエチレンオキシド−ポリブチレンオキシド(poly(ethylene oxide)−poly(butylene oxide)(PEO-PBO)コポリマーのようなコポリマー、ならびに、これらのポリマーと、限定されるわけではないが乳酸(lactic acid)、グリコール酸(glycolic acid)およびヒドロキシ酪酸(hydroxybutyric acid)を含むポリ（α−ヒドロキシ酸）(poly(alpha-hydroxy acids)、ポリカプロラクトン(polycaprolactones)、およびポリバレロラクトン(polyvalerolactones)などのポリマーとのコポリマーおよびブレンドが合成または市販されている。例えば、ポリオキシアルキレンコポリマーが米国特許第3,829,506号、第3,535,307号、第3,036,118号、第2,979,578号、第2,677,700号、および第2,675,619号に記載されており、それらの教示が本明細書に援用される。
【００２３】
ポリオキシアルキレンコポリマーはＢＡＳＦ社によって販売されており、それ以外のものはPluronicsTMの商品名で販売されている。好適な物質としてはＦ−１２７、Ｆ−１０８などがあり、その他のゲル物質との混合物用としてはＦ−６８がある。これらの物質は室温以下の温度で粘性溶液として適用されるが、より高い体温では凝固する。
【００２４】
このような挙動を示す他の物質は当該分野において公知であり、本明細書に記載されるように使用され得る。これらの物質としては、KlucelTM（ヒドロキシプロピルセルロース(hydroxypropyl cellulose)）、および精製コンニャクグルコマンナンゴム(konjac glucomannan gum)などがある。
【００２５】
高温では液体であるが体温では固体またはゲル状となるポリマー溶液もまた利用され得る。様々な熱可逆性ポリマーが公知であり、その例としては、アガロース(agarose)、寒天(agar)、ファーセレラン(furcellaran)、β−カラギーナン(beta-carrageenan)のような天然ゲル形成物質、および、カードラン(curdlan)、ゼラチン(gelatin)などのβ−１,３−グルカン(beta-1,3-glucans)、または上記のようなポリオキシアルキレン含有化合物がある。具体例としては、Dunnらによる米国特許第4,938,763号に記載される、インビボでの使用のための熱硬化性生分解性ポリマーがあり、その教示が本明細書に援用される。
【００２６】
チキソトロピー性および擬塑性ポリマーは、せん断力による低粘調化を示すので、このポリマーはせん断力下ではより流動的となり、そしてせん断力が停止すると高粘度またはゲル状に戻る。せん断力または他の物理的力にさらされると粘度が液状からゲル状へと変化する物質の好適な例としては、天然に産出するヒアルロン酸(hyaluronic acid)があるが、最も好ましくは、300,000ダルトン以上の範囲の高分子量で濃度が約１％以上のものである。ヒアルロン酸はつなぎ目に存在して、衝撃を吸収し移動表面を潤滑にする働きをする。ヒアルロン酸はまた、以下に説明するように、イオン的に架橋し得る。
【００２７】
２．イオン存在下またはイオン除去下で重合する物質 
組織および血液は、ｐＨ、イオン強度および浸透圧(osmolarity)の規制された条件で多
数のアニオンおよびカチオンを含有し、ポリマーのゲル化および局所的な沈殿を引き起こし得る。カルシウム(calcium)、バリウム(barium)、マグネシウム(magnesium)、銅(copper)、および鉄(iron)などいくつかの二価イオンは、体内組織および血液の通常の構成要素である。これらのイオンはポリマーをイオン的に架橋させるために使用され得、例えばアルギン酸塩(alginates)、誘導体化アルギン酸塩(derivatized alginates)、κ、λ、ιカラギーナン(carrageenans)などはカルシウムイオンの存在下でゲル化する。ヒアルロン酸、ヘパリン(heparin)、カルボキシルメチルセルロース(carboxymethyl cellulose)、硫酸セルロース(cellulose sulfate)、キサンタンゴム(xanthan gum)、およびペクチン(pectin)などの他のカルボキシル化および硫酸化ポリマー、およびトラガンス(traganth)のようなさまざまな天然ゴムの粘度は、二価カチオンの存在下で実質的に高められ得る。一価イオンはゲラン(gellan)をゲル化し得、カリウム(potassium)はκ−カラギーナンをゲル化し得る。キトサン(chitosan)は弱酸性状態で可溶であり、生理的ｐＨでまたはリン酸イオンまたは硫酸イオンによってゲル化する。オルガノゲルもまたこれらの手順を使用することによって形成され得る。典型的には、ゲル化ポリマーは組織と適合性で非水性の溶媒に溶解して組織に適用される。ここで、有機溶媒が拡散により除去されると、ポリマーはゲル化または沈殿する。
【００２８】
イオンの除去時にポリマーを形成する物質、例えば、特定のモノマーまたはポリマーの塩などの物質もまた使用され得る。ここで、塩は、処置される組織への適用時に、またはエチレンジアミン四酢酸(ethylenediaminetetraacetic acid、EDTA)、抗凝結剤として使用されるキレート化剤などのキレーター(chelators)を添加することによって、モノマー溶液外に拡散するかまたは拡散される。
【００２９】
３．化学的に、または光、超音波または放射線によって架橋され得る物質 
光、超音波または放射線を使用することによって架橋され得る物質は、一般に、二価（エチレン性）結合または三価（アセチレン性）結合を含有し、好ましくは二価または三価結合に結合し電子吸引性置換基を有する物質であり、本明細書においては包括的に「不飽和」と呼ぶ。適切な物質の具体例は、アクリル酸(acrylic acid)、ビニルアセテート(vinyl acetate)、ビニルピロリドン(vinyl pyrrolidone)、アリルアルコール(allyl alcohol)などのアクリル(acrylic)、アリル(allylic)またはビニル(vinyl)基を含有する小分子物質、ならびにメチレンビスアクリルアミド(bisacrylamide)のようなこれらの化合物のダイマーまたはオリゴマー形形態を含む。好適なモノマーは分子量が十分に大きく典型的には４００分子量であるため、細胞を透過しない。これにより、中毒性が最小限となる。
【００３０】
これら好適なモノマーの例としては、タンパク質(proteins)、多糖類(polysaccharides)、または合成ポリマーの不飽和誘導体がある。生分解性または非生分解性モノマーがポリマーを形成するために使用され得る。適切な物質の例はHubbellらによるWO93/17669号、およびDunnらによる米国特許第4,938,763号に記載されており、それらの教示は本明細書に援用される。好適な物質の例としては、ポリアクリル酸(poly(acrylic acids))(すなわち、CarbopolsTM)、ポリアクリレート(poly(acrylates))、ポリアクリルアミド(polyacrylamides)、ポリビニルアルコール(polyvinyl alcohols)、ポリエチレングリコール(polyethylene glycol)、およびエチレンビニルアセテート(ethlene vinyl acetates)に重合するモノマーが挙げられる。
【００３１】
光重合は、例えば紫外線、Ｘ線、またはガンマ線照射などによって供給される高エネルギー光子によって直接達成され得る。しかしながら、細胞を損傷させる物質、典型的には３５０ｎｍ未満の紫外線やガンマ線照射は避けるべきである。
【００３２】
可視光線による光重合は通常、光増感剤の存在を必要とする。光増感剤は光開始重合速度を早めるか、または重合が起こる波長に波長をシフトさせたりする。光開始は、光重合
によって形成されるゲルの厚みを薄膜に制限するよう利用し得るため、有利である。
【００３３】
４．グルタルアルデヒドのような共有結合性架橋剤の添加によって架橋し得る物質 
いかなるアミノ含有ポリマーも、グルタルアルデヒド(glutaraldehyde)、スクシンジアルデヒド(succindialdehyde)、またはカルボジイミド(carbodiimide)(CDI)などのジアルデヒド(dialdehyde)を使用することによって共有結合的に架橋され得る。有効なアミノ含有ポリマーの例としては、ポリペプチド(porypeptides)および、アルブミン(albumin)、エラスチン(elastin)、およびコラーゲン(collagen)などのタンパク質(protein)、およびポリエチレンイミン(polyethyleneimine)などのポリマーが挙げられる。以下に述べるように、特別な官能基(function)を有するペプチドもまた、例えば、重合中に架橋剤を使用することによって、これらの物質に共有結合し得る。
【００３４】
上記の物質はいずれも、その生理的適合性を向上させるために他の物質と混合され得る。これらの物質は、物質が適用される特定の組織に応じて、緩衝液、生理学的塩、従来の増粘剤または粘度改変剤、シリカまたはセルロース(cellulosic)などのフィラー、およびその他公知の同様の機能を有する添加剤などを包含する。
【００３５】
ポリマー性物質の透過性測定 
ポリマー性物質は、管腔内の物質を制御するために、または組み入れられた物質を放出するために、透過性が制御されるように設計されている。管腔内に存在する物質に関してポリマー性物質が達成するよう意図されている状況は基本的に３つある：本質的には、管腔からポリマー性物質を介して組織管腔表面へ向かうかまたはその逆方向の栄養分（小分子量化合物）および気体のみの通過がある場合；栄養分、気体、およびタンパク質およびペプチドを含む選択された高分子の通過がある場合；栄養分、気体、高分子、および細胞の通過がある場合；および、ポリマー性物質が通路に対するバリヤとしての役割を果たす場合。本明細書において使用するように、「制御された多孔性」は、特定の意図された分子のみを通過させるかまたはいかなる分子の通過をも防止するよう規定された多孔性を意味する。これらの物質の分子量の範囲は公知であるため、所望の多孔性を算出するのに利用され得る。例えば、高分子は1000ダルトンより大きい分子量を有するとして定義され得、また細胞は一般に600〜700ｎｍから１０ミクロンの範囲であり、凝集体は全体で３０〜４０ミクロンの大きさである。
【００３６】
ポリマー性物質の制御された透過性機能は、１つの位置における直接的運搬のみならず、組織管腔下流における液だめ(trapping)または選択的透過性のためにも有用であり得る。例えば、器官または組織管腔がポリマー性物質の上流で内分泌因子を分泌する場合、ポリマー性物質は選択的液だめとして機能し得、因子を濃縮するか、因子の制御された放出を引き起こすか、またはポリマー性物質によって覆われた部位を因子が通過することを防止する。
【００３７】
ゲル化、粘度変化、相変化、または重合によるポリマー性物質の同化は、一般に、「固化」とよばれ、「固化物質」を生成する。固化物質における多孔性制御を達成する方法は、当該分野において公知である。制御された放出システムおよび製造技術についての卓越した考察が、「Controlled Release Systems：Fabrication Technology」第II巻、Dean Hsieh編集、第３章「Gels for Drug Delivery」、David W．WoodfordおよびDean S.T．Hsieh執筆４２〜５７頁(CRCプレス、フロリダ)に見ることができ、その教示は本明細書に援用される。
【００３８】
典型的には、多孔性制御は固化される物質を選択することによって達成される。すなわち、化学組成、分子量、架橋のための基の利用可能性；ポリマーの架橋度：ポリマー溶液のイオン強度、浸透圧、およびｐＨ；ソルビトール(sorbitol)、グリセリン(glycerin)ま
たはスクロース(sucrose)のような粘度改変剤の添加；細胞およびタンパク質への表面結合を変化させるための脂質または高荷電ポリマーの添加；および水溶性有機物質または粒子の組み入れである。後者はより高い強度を有する複合体を形成するかまたは勾配ふるいを形成するために使用され得る。
【００３９】
ポリマー性物質はまた、異なる多孔性または勾配多孔性の層、あるいは周期的放出のための同様のまたはスタガード層の封入生体活性物質に適用され得る。組み入れられた生物学的に活性な物質は、以下により詳細に説明する。
【００４０】
生物活性薬剤の組み入れ
１．生物活性薬剤の選択 
さまざまな種類の生物活性薬剤がポリマー性物質に組み入れられ得る。これらは物理的または化学的にポリマー性物質に組み入れられ得る。物理的に組み入れられた物質の放出は拡散および／またはポリマー性物質の分解によって達成される；化学的に組み入れられた物質の放出は、ポリマーまたは生物活性薬剤をポリマーに結合している化学結合（例えば、トリプシン(trypsin)、トロンビン(thrombin)、またはコラゲナーゼ(collagenase)のような酵素によってインビボで切断されるペプチド）の分解によって達成される。場合によっては、生物活性薬剤はポリマー性物質と永久にまたは長時間、ポリマー性物質が分解して部位から除去されたあとまで結合したままであるのが望ましい。
【００４１】
広義では、生体活性物質はタンパク質（本明細書において定義されるように、特に指定の無い限りペプチドを含む）、糖類(saccharides)、多糖類および炭水化物(carbohydrates)、核酸(nucleic acids)、脂質、ガングリオシド(gangliosides)、および合成有機および無機物質を包含し得る。
【００４２】
具体的な物質としては、抗生物質、抗ウィルス物質、抗炎症物質、ステロイドおよび非ステロイド物質、抗腫瘍物質、チャネル遮断剤を含む抗痙攣物質、細胞成長インヒビターおよび非接着分子を含む細胞−細胞外マトリックス相互作用のモジュレーター、酵素および酵素インヒビター、抗凝血物質および／または抗血栓剤、成長因子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質合成インヒビター、細胞移動、増殖、および／または成長をモジュレートする化合物、血管拡張剤、ならびにその他組織損傷治療に通常使用される薬剤が挙げられる。これら化合物の具体例としては、酵素インヒビターを変換するアンギオテンシン(angiotensin)、プロスタサイクリン(prostacyclin)、ヘパリン(heparin)、サリチル酸塩(salicylates)、硝酸塩(nitrates)、カルシウムチャネル遮断薬、ストレプトキナーゼ(streptokinase)、ウロキナーゼ(urokinase)、組織プラスミノーゲン活性剤（ＴＰＡ）、アニソイレート化(anisoylated)プラスミノーゲン活性剤（ＴＰＡ）およびアニソイレート化プラスミノーゲン−ストレプトキナーゼ活性剤複合体（ＡＰＳＡＣ）、コルヒチン(colchichine)およびアルキル化剤、およびアプトマー(aptomer)がある。細胞相互作用のモジュレータの具体例としては、インターロイキン(interleukins)、血小板誘導成長因子、酸性または塩基性線維等細胞成長因子（ＦＧＦ）、形態転換成長因子β（ＴＧＦβ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子、およびそれらに対する抗体がある。核酸の具体例としては、アンチセンス(antisenses)およびリボザイムが挙げられる。
【００４３】
その他の生物活性薬剤の具体例としては、改変細胞外マトリックス要素(midified extracellular matrix components)またはそれらのレセプター、および脂質およびコレステロールイオン封鎖剤(cholesterol sequestrants)などがある。
【００４４】
好適な実施態様においては、生体活性物質は細胞に走化性活性、走触性活性、または接触ガイダンスを提供するよう選択される。走化性は可溶性誘導体の濃度勾配に対応して、
すなわち、ゲル内における指向性移動として定義される。定義は「The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair」、R.A.F.ClarkおよびP.M．Henson編，(Plenum press，NY，1988)、第１３章、J.B．McCarthy、Sas、およびFurcht著に記載されており、その教示は本明細書に援用される。走触性は、接着勾配に沿った指向性移動として定義される。本明細書において記載されるように、細胞の挙動を導く分子のポリマー性物質への組み入れにより、情報は下層より供給される。その例としては、ラミニン(laminin)、フィブロネクチン(fibronectin)、ビトロネクチン(vitronectin)またはコラーゲン(collagen)のような細胞外マトリックスタンパク質、またはそれらから誘導されるかまたはタンパク質に結合する効果を有する、以下の実施例に記載されるＲＧＤペプチドのようなペプチドがある。接触ガイダンスは、ポリマー性物質の溝、裂溝、または孔を介してか、または細胞成長を導く粒子、帯、または繊維のポリマー性物質への組み入れによる細胞の物理的方向を指す。その例としては鞘形状の神経繊維の再生があり、これは物理的誘導の存在しない状態では起こらない。
【００４５】
複数のポリマー層が使用される適用においては、特定の効果を達成するために異なる薬理学的物質が異なるポリマー層に使用され得る。
【００４６】
Ｘ線放射線不透過性のバリウム(barium)、ヨウ素(iodine)またはタンタル塩(tantalum salts)などをポリマー性物質に対して任意に添加することにより、コーティングを可視化およびモニターすることが可能となる。
【００４７】
細胞もまた懸濁液としてポリマー性物質に組み入れられ得、組織表面にゲルを形成し、これにより細胞が成長し得場合によっては増殖し得る。（天然に存在するかまたは組換ＤＮＡ技術によって生成される）細胞、例えば、人工細胞、幽霊細胞（すなわち、ＲＢＣまたは血小板ゴースト）、または擬ビリオン(pseudovirions)存続し得、いくつかの目的のいずれかに役立ち得る。例えば、細胞は局所的組織位置における成長因子のような特定の薬剤を生成するように選択され得る。
【００４８】
物質に組み入れられる細胞はまた，処置位置における組織のタイプに対応した前駆細胞かまたは治療に有利な他の細胞であり得る。例えば、肝臓細胞はポリマー性物質に組み入れられ得、患者の肝臓内に形成される管腔内に移植され得、その管腔の再生および閉鎖を促進する。これは、疾病（例えば、肝硬変、線維症、嚢胞性疾病または悪性疾患）によって組織が機能しなくなったり、かさぶたが形成されたり、または組織が癌性細胞に取って代わったりする場合に、適切な処置法となり得る。同様の方法が他の器官にも適用され得る。
【００４９】
２．生物活性薬剤の物理的組み入れ 
ほとんどの場合において、生物活性薬剤は、組織表面への適用および重合の前に、物質と混合することにより物理的に組み入れることが可能である。物質はモノマー溶液中に混合され、溶液、懸濁液、または分散液を形成し得る。ある実施態様においては、生物活性薬剤は、ミクロスフェア、マイクロカプセル、リポソーム、幽霊細胞、または擬ビリオンのような送達デバイス内に封入され得、これら送達デバイスはそれ自体で放出速度を生じさせ、食作用細胞のような細胞による摂取を行わせる。
【００５０】
３．生物活性薬剤の化学組み入れ 
生物活性薬剤は、重合前または重合中に化学的にポリマー性物質と結合し得る。好適な実施態様においては、生物活性薬剤は、ポリマー性物質の投与前に化学的に組織表面に結合する。いくつかのポリマー生体適合性物質は表面改変を受ける。表面改変においては、表面結合生物活性分子／リガンドは細胞結合特性を示す。これらの方法は、Tay、Merrill、Salzman、およびLindonにより「Biomaterials」10、11-15、(1989)に記載されており、
その教示は参考のため本明細書に援用される。
【００５１】
共有結合的架橋は、Ｎ−保護アミノ酸、ポリアミノ酸(poly(amido acid))（２から１０のアミノ酸）、ペプチド（１０以上〜１００のアミノ酸）、またはタンパク質の酸無水物酸ハロゲン化物形態を、ヒドロキシル(hydroxyl)、チオール(thiol)、またはポリマーのアミン基と反応させることによって形成され得る。アミノ酸またはペプチドのアミン基は、自己縮合を避けるために、酸ハロゲン化物または酸無水物を形成する前に保護されなければならない。Ｎ−保護は当業者にとって周知であり、カルボベンゾキシ(carbobenzoxy)（ＣＢＺ）基のようなさまざまな保護基を使用することによって達成され得る。
【００５２】
本明細書で使用される「保護基」という用語は、反応から官能基を防御し官能基を保護する必要が無くなったときに切断され得る部分を意味する。官能基の例としては、アミノ、ヒドロキシ、チオ(thio)、およびカルボキシル基(carboxylate groups)が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。保護基の例は当業者にとって周知である。
【００５３】
カルボキシレート含有化合物は、ヒドロキシ、チオ、アミノ基など酸ハロゲン化物または酸無水物と反応し得る様々な官能基を含有し得る。これらの官能基は、自己縮合を避けるために、酸塩化物または酸無水物を形成する前に保護されなければならない。酸塩化物または酸無水物の形成、およびそれに引き続くヒドロキシ、チオール、または他の分子のアミノ基（複数）との反応後、保護基は「脱保護」工程において除去され得る。Ｎ−保護アミノ基は当業者にとって公知の手段によって脱保護され得る。これらの化合物におけるいかなるヒドロキシまたはチオ基も酸塩化物または酸無水物と反応しないように保護されなければならない。アルコール用の適切な保護基の例としては、トリアルキルシリル基(trialkyl silyl groups)、ベンジルエーテル(benzyl ethers)、およびテトラヒドロピラニルエーテル(tetrahydropyranyl ethers)が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。これらの基は当業者によって公知の手段によって保護され得、エステル化完了後引き続いて脱保護され得る。保護基の例はGreene，T.W．およびWuts.，P;.G.M．「Protective
Groups in Organic Synthesis」第２版、John Willey & Sons,Inc．317〜318頁(1991)に見いだされ得、本明細書に参考として援用される。
【００５４】
酸ハロゲン化物誘導体の調製の非限定的方法は、好ましくは触媒量のＤＭＦを有するベンゼン(benzene)またはトルエン(toluene)内で、カルボン酸(carboxylic acid)を酸化チオニル(thionyl chloride)と反応させる。酸無水物を生成する公知の方法は、カルボン酸を無水酢酸と反応させる。この反応においては、酢酸が形成されると反応容器外に留去される。例えば、ポリマー性物質がポリ乳酸(poly(lactic acid))のようなα−ヒドロキシ酸(alpha hydroxy acid)のポリマーである場合、ペプチドのアミン官能基を保護し、ポリマーの酸部分の酸ハロゲン化物または酸無水物を形成し、酸ハロゲン化物または酸無水物を遊離ヒドロキシ、チオール、またはポリマーのアミン基と反応させ、次いで、ペプチド上のアミン基を脱保護して、エステル化、チオエステル化、またはアミド化によるペプチド結合を有するポリマーを生成することによって、ペプチドはポリマー性物質に共有結合し得る。ペプチドはまた、グルタルアルデヒド(glutaraldehyde)のようなジアルデヒド(dialdehyde)による還元性アミノ化を用いて、遊離アミンを介してポリマーに結合し得る。
【００５５】
ポリエステル表面のエステル基は、加水分解されて活性ヒドロキシおよびカルボキシ基を生成し得る。これらの基は生物活性分子を結合するために使用され得る。好ましくは、活性カルボキシレート基を酸ハロゲン化物または酸無水物形態に変換する前に、活性ヒドロキシ基を保護して得られる酸ハロゲン化物または酸無水物との反応を避けなければならない。非限定的な例として、活性ヒドロキシ基はベンジルエーテルとして保護され得る。次に活性カルボキシル基は、酸ハロゲン化物または酸無水物に変換され得、第２の化合物のヒドロキシまたはアミノ基と反応してエステルまたはアミド結合を形成する。その後、
Ｏ−保護ヒドロキシ基が脱保護され得る。
【００５６】
ポリ酸無水物は、部分的に加水分解されてカルボキシ基を生成し得る。得られるカルボキシ基は、酸ハロゲン化物に変換され得る。酸ハロゲン化物は、アミノ酸、ペプチド、または結合特性を有する他のアミン含有化合物と反応し得てアミド結合を形成し得る。
【００５７】
ポリエステル(polyesters)およびポリラクトン(polylactones)は、部分的に遊離ヒドロキシおよびカルボキシ基に加水分解され得る。ヒドロキシ基は当業者に公知の手段によって保護され得、カルボキシ基は酸ハロゲン化物に変換される。
【００５８】
酸ハロゲン化物は、アミノ酸、ペプチド、または結合特性を有するその他のアミン含有化合物と反応し得てアミド結合を形成し得る。
【００５９】
あるいは、ヒドロキシ基が１級または２級ヒドロキシ基である場合、それらはアルデヒド(aldehydes)またはケトン(ketones)に酸化され得、還元性アミノ化によりアミンと反応して共有結合を形成し得る。
【００６０】
ポリアミドは、部分的に加水分解して、遊離アミンおよびカルボキシ基を生成し得る。次いで、アミン基は、アミノ酸またはペプチドと反応され得るが、この場合アミン基は保護されており、カルボキシル基は酸ハロゲン化物に変換されている。あるいは、ポリアミドのアミン基が保護され得、カルボキシ基が酸ハロゲン化物に変換され得る。次いで、得られる酸ハロゲン化物はアミノ基またはペプチドのアミン基と直接反応し得る。
【００６１】
末端ヒドロキシ基を有するポリアルコールには、アミノ酸またはペプチドが付加し得る。まず１つがアミン基を保護し、次にアミノ酸またはペプチドのカルボキシル基を酸ハロゲン化物に変換する。酸ハロゲン化物はヒドロキシ基と直接反応してエステル結合を生成し得る。
【００６２】
上記の酸ハロゲン化物はまた、チオール基と反応してチオエステルを形成し得る。
ポリマー性物質の適用 
１．組織表面へのポリマー性物質の投与 
一般に、ポリマー性物質は生体適合性ポリマー性物質であり、上に述べたように、刺激に応じた種々の度合いの流動性を有している。この物質は、コーティング工程完了時にはインビボで実質的に非流動性であるような物質である。流動的な形態の物質は、被覆される組織または細胞表面に接触して配置され、そして上に述べたように、非流動性となるように刺激される。ポリマー性物質の流動相は、ポリマー性物質が適用される組織管腔表面に応じて、カテーテル、内視鏡、注射器、または噴霧器を使用して適用される。このようなデバイスは当業者にとって公知である。
【００６３】
コーティングは、典型的には、改変ＰＴＣＡカテーテルのようなあるタイプのカテーテルを使用することによって適用され得る。物質は、好ましくは単一または複数のバルーンおよび管腔を有する単一のカテーテルを使用して適用される。
【００６４】
カテーテルの断面積は比較的小さくなければならない。器官または血管領域の内部に接近するためには、Ｘ線透視ガイダンス(fluoroscopic guidance)を使用して操作される細長い管状カテーテルが好ましい。
【００６５】
処置される組織は、中空または管状の形状を有する器官または構造であり得る。この場合、ポリマー生成物は天然に産出する管腔内に沈着される。あるいは、組織は、その内部に外科処置、経皮関与、不慮の外傷、または疾病の結果、空洞が形成されている、通常の
中実の器官であり得る。中空脈管の例としては、大動脈、冠状動脈、静脈、およびリンパ管がある。
【００６６】
中空の器官の例としては、心臓、目、腸、卵管、子宮、腎臓、または膀胱がある。さらに、気管（肺）、胆管（胆嚢）、または膵管（膵臓）など、多くの器官が中空構造の要素を有している。中空を囲む器官に加えて、多くの中実の器官が空洞、海綿静脈洞または管腔などの内部の「真の」空間、または壊死腫瘍の内部にあたる空間を形成する疾病過程に伴う「潜在的」空間を有する。
【００６７】
一旦、ポリマー性物質の流動相が適用されると、物質の流動状態が再構成されて、コーティングされたまたは「舗装」された層を表面に密接に適合した状態に形成する。得られる舗装層は封止機能を有し得る、すなわち、この舗装層は、高分子（すなわち、小タンパク質の５３オングストローム未満からミオシン(myosin)のような棹状体の2000オングストロームまで）および細胞（血小板の600ｎｍから大きな細胞の３０〜４０ミクロンまで）を排除するのに十分低い多孔性のコーティングを形成する。コーティングは、好ましくは組織表面において0.001〜１．０mmの厚さを有するが、この範囲外の厚みを有するコーティングもまた使用され得る。市販の物質を用いて使用される物質を適切に選択し、そして、特定のパーセント架橋および多孔性を生じさせる公知の架橋方法を選択することにより、さらに舗装物質の構造を適切に選択することにより、このプロセスは広範囲に渡る生物学的または臨床的状況を満足させるように適合され得る。
【００６８】
ポリマー性物質は、さまざまな厚さ、長さ、および３次元形状（例えば、点状、星状、直線状、円筒状、弓状、らせん状）を有する特定用途向けの形状で適用され得、様々な最終形状を達成し得る。さらに、このプロセスは、（天然のまたは人工的に形成された）単一または多層形状の、中空、海綿状、または管状の生物学的構造の内部表面に物質を適用するために使用され得る。このプロセスはまた、適切な場合、完全に組織管腔を閉塞するために使用され得る。
【００６９】
２．単離された細胞および細胞凝集体へのポリマー性物質の適用 
ポリマー性物質はまた細胞表面にも適用され得、例えば、血液成分、平滑筋細胞、内皮細胞、および万一誤って分離して患者の体内に取り残された場合に除去されて付着しないように処置されなければならない腫瘍細胞などの個々のまたは複数の細胞を被覆または封入し得る。一般に、この方法論は処置された細胞を単離するために使用され得る。
【００７０】
第２の実施態様においては、ポリマー性物質は、単離された細胞または細胞凝集体を保護し、細胞の付着、成長および／または増殖が必要とされる体内の領域に付着させるために使用される。１つのプロセスにおいては、まず第１にカテーテルを疾病器官セグメント内の管腔内に挿入する。管腔は天然の脈管かまたは人造管腔であり得る。次にポリマープラグが管腔内に導入される。そしてカテーテルは除去されて、プラグが所定の位置に取り残され、ポリマープラグとともに移植された細胞から新しい成長が行われるための中心としての役割を果たす。より管状の構造が所望の場合は、プラグは適切に再構成し得る。
【００７１】
３．ポリマー性物質適用のための代表的デバイス
図１は組織管腔にポリマー性物質を適用するためのプロセスの概略図である。
【００７２】
工程１において、管腔内の損傷が識別されて隔離される。工程２において、カテーテル、任意には１つ以上のバルーンを有する管状シャフトからなるバルーンカテーテルが管腔内に挿入される。血管処置の好適な実施態様においては、遠位閉塞バルーンが処置部位の遠位端を閉塞するために使用され得る。例えば末端動脈、胃腸経路、または肺において管腔がきれいに洗浄され得る実施態様においては、バルーンを膨張させる必要はない。いず
れの場合も、工程３に示されるように、処置部位は血液、粘液、または他の異物を除去する。次に部位は、工程４に示すように、例えば機械的刺激に対する応答または細胞増殖を阻害する薬品によって処置される。工程５において、適切であれば、動脈血小板の場合、損傷自体がバルーンの膨張によって処置され、あるいは他の機械的、熱的、光学的、光化学的、超音波、または放射線手段によって処置される。工程６に示されるように、部位は再び薬品によって処置され、および／または洗浄され、あるいは接着性を向上させるための化合物が適用される。工程７において、組織表面にポリマー性物質を形成するための溶液が適用され重合されるかまたは固化される。ある実施態様においては、カテーテルは、ポリマー性物質が薄層内の処置領域のみを覆うようにポリマー性物質を形成する「鋳型コア」を備える。中心鋳型コア部材は大きさが調整可能である、すなわち、最大限の空間を占領しないようバルーンが不十分に膨張し得るようになっているため、ポリマー性物質のための場所が残される。ポリマー性物質は均一の層として形成され得、または所望のようにパターン化またはセグメント化され得る。工程８において、カテーテルは除去されてポリマーで被覆された管腔を通過する物質の流れが回復する。
【００７３】
ポリマー性物質を適用するために使用され得る送達カテーテルの他の２つの実施態様が、図２Ａ、図２Ｂ、および図２Ｃに示されている。図２Ａは組織管腔内に入り、区域を隔離し、洗浄し、薬品、接着剤および／またはポリマー性物質およびコア形成部材および／または拡張部材を適用する手段を有する単一物体である。カテーテル１１は２つの隔離バルーン１０、１４および中心拡張または鋳型バルーン１２を備えて構成され、さらに複数の管腔および洗浄流体、薬品、接着剤および／またはポリマーを送達するために取り付けられたレザバー１６を備える。適用デバイスの先端の詳細な拡大断面図が図２Ａに示されている。２つの隔離バルーン１８および２２は弾性物質、すなわちラテックス、クライトン(krayton)またはＣフレックス、またはポリエチレン(polyethylene)、ポリオレフィンコポリマー(polyolefin co-polymer)、ポリエチレンテレフタレート(polyethylene telepthalate)、またはナイロン(nylon)のような熱可塑性ポリマーによって構成され得る。バルーン１８および２２は、デバイスの長手に沿って延びる中心管腔４２を含む複数管腔シャフト４３に取り付けられ、ガイドワイヤ（図示せず）の向こうまで流動または通過することを可能とする。中心鋳型コアバルーン２０は隔離バルーン１８および２２と同様の材料かまたはより柔軟でない(less compliant)材料から製造されるため、バルーン材料のクリープにより連続的に伸長または拡張することなく所望の寸法に開く。さらに管腔は、隔離バルーン２４および２６を充填し、流体を点滴し、充填するか、あるいは拡張または鋳型コアバルーン３２および３４から除去するために存在する。さらに、流体を隔離区域内に点滴するために管腔３０および３６が存在する。管腔３８および４０は流体を点滴するかまたは隔離区域から流体を除去するために使用される。このデバイスによって、区域の点滴、潅流、および超融合(superfuse)の手段が提供される。
【００７４】
図２Ｃは２つのテレスコープ部材４４およびその中にある４６を取り囲む他のカテーテル４５を示す。区域隔離バルーン５０および５２と、中心鋳型コアおよび／または拡張バルーン５４は、点滴または吸入ポート５６とともにポリマー性物質を適用する別の手段を提供する。
【００７５】
物質はまた噴霧、押出、またはその他単一または複数管腔を有する送達デバイスを介して流動状態の物質を内部に送達することによって、被覆されるべき表面に適用され得る。
【００７６】
コーティング物質の適用は、モノマー、ポリマー、マクロマー、またはそれらの組み合わせの溶液、分散液、または懸濁液を、カテーテルを介して押出し、組織または細胞表面、組織管腔、または中空の空間を被覆または充填することによって行われる。コーティングの形成は、架橋剤、ゲル化剤、または架橋触媒を流動性物質と共に導入し、次に架橋および／またはゲル化が発生するように状態を変化させることによって制御され得る。従っ
て、バルーンカテーテルが使用される場合、加熱または冷却された流体のバルーンへの流入によって、局所温度は導入された物質のゲル化または架橋が誘導されるレベルにまで変化し得、それにより物質が非流動性となる。局所的な加熱または冷却は、加熱または冷却された液体を直接処置部位に供給することによって強化され得る。しかしながら、温度制御はまた、バルーンを通過するかまたはバルーンに流入する流体を使用することにより、または、バルーンを介して温度制御流体を管腔内に流入させるよう部分的に穿孔されたバルーンを使用することにより行われ得る。温度制御はまた、抵抗加熱素子に接触してカテーテル本体の長手に沿って延びるワイヤを介した電気抵抗加熱を使用することによってもまた行われ得る。このタイプの加熱素子は、直流電流（ＤＣ）、無線周波（ＲＦ）電流、外部無線周波またはマイクロ波照射を利用し得る。温度制御を達成するためのその他の方法もまた利用し得、その例としては、内部光ファイバ（裸またはレンズ付き）を使用する光誘導加熱がある。光、超音波、または放射線を印加するために、同様のデバイスが利用され得る。
【００７７】
カテーテル本体は、外科用鋼および熱可塑性ポリマーなど通常の材料から製造される。閉塞バルーンはラテックス(latex)またはシリコーン(silicone)のような柔軟な(compliant)材料またはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）(polyethylene terephthalate)のような非柔軟性(non-compliant)材料から製造され得る。拡張可能な部材は好ましくは、ＰＥＴ、（ＰＶＣ）、ポリエチレン(polyethylene)またはナイロン(nylon)のような非柔軟性材料から製造される。使用される場合、バルーンカテーテルの膨張部分は、シリコーン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）(polytetrafluoroethylene)のような材料、水和ヒドロゲル(hydrated hydrogels)などの親水性材料、および他の潤滑物質によって任意に被覆され得、ポリマーコーティングの分離を補助する。
【００７８】
処置のための医療適応症
１．管腔表面の処置 動脈の処置に加えて、本明細書に記載の方法は、静脈、尿管、尿道、気管支、胆管および膵臓管系、消化管、鼻涙管、洞腔、眼、および耳管、精液管ならびにファロピウス管の内面の修復(paving)ような他の用途に利用され得る。このプロセスは、経頚肝内門脈体静脈吻合手順(TIPS)、透析移植片、動静脈フィステル、および大動脈および他の動脈の動脈瘤の関係において、ならびにPCTA後の剥離血管隔離、顕著な血管解離の「つぎあて」、カテーテル損傷に対し２次的であるかまたは自発性のいずれかで起こる血管壁「フラップ」の密封、および種々の動脈炎に関連する動脈瘤の冠状拡張の密封の処置において修復層を提供するために使用され得る。
【００７９】
材料の最終的なインビボ形状(geometry)は、コーティングの最終機能を指定する。より薄い適用は、ポリマーフィルムを、コーティング、シーラント、隔壁バリア、バンデージ、および/または薬物デポー剤として機能させる。
【００８０】
多くの身体成分に存在する中空または海綿性の形状は、機能的重要性を有する。そのような形状は、流体（血液、尿、リンパ液、胆汁）中のガス、細胞(卵巣、脾臓)の封入または輸送を促進する。これらの中空の脈管、器官、および器官成分は、代表的には、いくつかの組織層を含む。一般的に、これらの器官は、代表的にはバリア層として機能する内側細胞層、筋層、腺または他の機能的組織を含む１つまたはいくつかの中間機能層、および外部支持または支質被覆層を含む。
【００８１】
疾患により、これらの中空器官の最も内側の層が影響を受け、そしてそれによってそれらのバリア機能が犯される。疾患は、(1)全体拡散の構成的症状を伴う全身性、(2)局在化した特定の器官内の病巣を含む全身性、または(3)限定的な領域の器官内のみを含む局在性のいずれかであり得る。そのような疾患の例は、自発性プラーク破裂、不安定アンギナ、非心原性肺水腫、敗血症、およびびらん性/浸潤腫瘍を含む。
【００８２】
２．細胞−細胞相互作用の操作 
本明細書に記載される方法はバリア機能を回復し、および/または制御薬物送達が提供される場合は、それによってこれらの疾患を処置するための方法を提供する。ポリマー性物質はまた、栄養層、接着層として、他の治療管腔内デバイスのコーティングとして、吸収層として、金属イオン封鎖剤、またはキレート剤として作用し得る。
【００８３】
上記のように、特に好適な実施態様では、ポリマー性物質は、有効量の生物活性分子(走化性分子、走触性(haptotactic)分子または生物活性分子がそうでなければ有効な用量で到達しないであろう部位への接触ガイダンスを提供する分子等)を適用するために用いられる。細胞−細胞相互作用の場合、ポリマー性物質は、これら分子が通常見出される細胞表面に類似である基質を提供し、そしてそれ故ポリマー性物質の非存在下で同一の用量で投与されるより顕著に有効であるように見える。
【００８４】
付着ペプチド、セレクチンレセプター、および炭水化物(例えば、シアリル(Siaryl)LeX)のような材料が使用され得、それは白血球細胞および血小板のような特定の細胞型を誘因し、そして結合するために供する。フィブロネクチン、ビトロネクチン、およびコラーゲンのような材料は、細胞型を非特異的に結合するため、細胞移動を促進し、そしてそれによって治癒を促進するために用いられ得る。細胞成長、細胞増殖、および細胞移動の成長因子およびモジュレーターが特に有用である。例えば、ポリマー性物質にPDGFのような細胞に対する化学的誘引因子、あるいは次いで創傷修復または疾患から生じるギャップまたは裂け目のための細胞の内成長を促進するマトリックスタンパク質(すなわち、フィブロネクチン、ラミニン、フィブリン、またはIV型コラーゲン)を取り込み得る。
【００８５】
細胞外マトリックス成分 過去20年の間、細胞外マトリックス(ECM)における細胞接着および細胞移動の基礎知識が、分子レベルで急速に拡大した。この領域の研究における初期の努力は、接着促進ECMタンパク質フィブロネクチン(FN)に集中した。FNの限定タンパク質分解を用いた研究は、分子全体と同様の方法で細胞接着を支持するFNの120KDポリペプチド断片を示した。この断片は、FN分子中に包埋されたドメインとして存在し、そして細胞結合ドメインと呼ばれた。FN細胞結合ドメインのさらなる配列分析およびペプチドマッピングは、細胞結合活性をテトラペプチドArg-Gly-Asp-Ser(RGDS)中に維持する最小の配列を生じた。
【００８６】
RGDS配列の細胞表面フィブロネクチンレセプターとの生物学的相互作用は、溶液中の合成RGDSを含むペプチドが、フィブロネクチンで被覆された基質上で、繊維芽細胞の細胞拡散を競合的に阻害し得たことを示すことにより証明された。可溶性RGDSはまた、懸濁液中で放射性標識フィブロネクチンの繊維芽細胞への直接結合を阻害した。これらの競合研究は、RGD配列が親分子の細胞接着機能にとって重要であることを示した。
【００８７】
フィブロネクチンにおけるRGD細胞接着認識部位が同定された後、他の細胞接着タンパク質の配列が関連シグナルについて調べられた。機能的RGD配列を保持することが知られている他のタンパク質は、血小板接着タンパク質フィブリノーゲン、ビトロネクチンおよびフォンウィレブランド因子、オステオポンチン、およびラミニンを含む。これらの知見は、RGDが偏在性の細胞接着シグナルであることを示す。
【００８８】
特定のRGDペプチドは、Ruoslahtiらによる米国特許第4,517,686号、Pierschbacherらによる第4,589,881号、Ruoslahtiらによる第5,169,930号、Plowらによる第5,149,780号、Ruoslahtiらによる第4,578,079号、Ruoslahtiらによる第5,041,380号、ならびに、PierschbacherおよびRuoslahti、J.Biol.Chem.262(36)、17294-17298(1987)、Mohriら、Amer.J.Hem. 37：14-19(1991)、Aumailleyら、FEBS291(1)、50-54(1991)、Gurrathら、Eur.J.Bioch
em.210、911-921(1992)、およびScarboroughら、J.Biol.Chem. 268(2)、1066-1073(1993)に記載され、これらの教示は本明細書に援用される。
【００８９】
ラミニンは、細胞の接着、移動、分化、および成長を促進する、基底膜中に見出される大きな接着糖タンパク質である(Kleinmanら、J.Cell.Biochem. 27:317-325(1985)；Kleinmanら、Biochem.25:312-318(1986)；Beckら、FASEB J. 4:148-160(1990))。LNは、Ａ(Mr=400 kD)、B1(Mr=210 kD)、およびB2(Mr=200 kD)と称される３つの鎖からなる。ネズミタンパク質の３つの鎖のすべてが、クローン化および配列決定されており(SasakiおよびYamada、J.Biol.Chem．262：17111-17117（1987）；Sasakiら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：935-939(1987)；Sasakiら、J.Biol.Chem. 263:16536-16544(1988))、そしていくつかの接着促進部位が分子上で同定された。配列に基づくいくつかの合成ペプチドが、完全なラミニン分子の生物学的活性と類似の生物学的活性を有するとして記載されている。B1鎖由来のノナペプチドCDPYIGSRおよびペンタペプチドYIGSRが、細胞の付着および移動を促進することが示された(Grafら、Cell48:989-996(1987)、Biochem. 26：6896-6900(1987))。さらなる研究は、YIGSRを含むペプチドが血管形成および腫瘍転移を阻害し得ることを示している(Grantら、Cell58：933-943(1989)、Iwamotoら、Science 238：1132-1134(1987)、Sakamotoら、Cancer Res. 51：903-906(1991))。他のペプチドは、PDSGRおよびIKVAVを含む。
【００９０】
接着リガンドのYIGSRペプチドのクラスは、影響を受けた組織中で細胞の増殖および移動が起こる疾患の処置に利用され得る化合物のクラスの良好な例である。YIGSRペプチドは、特異的細胞-ECM相互作用を選択的に阻害することが示されているが、それらは、治療上有効であるためには、それらの予め選択された、かつ特異的な標的組織に到達しなければならない。YIGSRの全身投与は、代表的には、満足できる治療戦略ではあり得ない。何故なら、正常細胞-ECM相互作用および標的細胞のそれを顕著に妨害するからである。より適切な治療が、YIGSRを局所的に標的部位へ送達し得る。
【００９１】
ECMのためのインテグリンレセプター 多くの細胞型由来の種々の細胞接着タンパク質に対するRGD指向細胞表面レセプターの単離は、適切な共有結合接着タンパク質を保持するSepharoseTM上のアフィニティークロマトグラフィーを用いて実施されている。細胞抽出物からの細胞表面接着レセプターは、これらのカラムに特異的に結合することが観察され、そしてRGDを含むペプチド溶液で溶出された。アフィニティリガンドとしてのフィブロネクチンの使用により、160kDαサブユニットおよび140kDβサブユニットを有するヘテロダイマーであるレセプターを得た。同様のアフィニティークロマトグラフィー実験により、ビトロネクチンに対して特異的な別個のヘテロダイマー性RGD指向レセプター、およびフィブリノーゲンおよびフィブロネクチンに対して親和性を有する血小板レセプターを得た。ヘテロダイマー性構造は、140と160kDとの間の範囲のαサブユニットおよび90と140kDとの間の範囲のβサブユニットを有し、RGD指向レセプターの特徴であったことが認識された。これらのRGDレセプターは、インテグリンとして知られ、細胞表面接着タンパク質のインテグリンスーパーファミリーを形成する。
【００９２】
インテグリンのスーパーファミリーは、重要な、そして細胞-基質および細胞-細胞接着の両方に対する細胞-表面レセプターの良く特徴付けられた群である。
【００９３】
インテグリンは、特徴的に膜を貫通する、αサブユニットおよびβサブユニットからなるヘテロダイマー性タンパク質複合体である。14個の別個のαサブユニットおよび11個のβサブユニットが現在単離されそして同定されており、そしていくつかのαβの組み合わせが観察されている。β1およびβ3サブユニットを含むインテグリン複合体は、一般に、細胞外マトリックスに対する細胞接着に関係しており、その一方、β2インテグリンは、細胞-細胞接着に関係している。
【００９４】
インテグリンは、代表的には、むしろ高度に保存された配列Arg-Gly-Asp X(RGDX)(ここでXは特定の細胞接着タンパク質に依存する改変体である)により、細胞接着タンパク質に結合する。これに隣接する残基を変化させることにより、特定のインテグリンに対するRGDXリガンドの親和性が改変されるが、特定のインテグリンに対する選択性は達成されなかった。さらなる研究は、RGDXを含むペプチドの環状化は、ビトロネクチンレセプターであるインテグリンαvβ3に対して高度に選択的であったリガンドを作成したことを示した。他の研究は、環状ペプチド内で立体配置に束縛されているRGD配列が、直線状RGD配列よりインテグリンαvβ3に対して高い親和性および選択性で結合したことを確認した。環状RGDペプチドの細胞外投与が、インビトロでビトロネクチン被覆基質に対して細胞の接着および移動を阻害することが示されている。
【００９５】
最近のインビトロ研究により、フィブロネクチン(FN)、ラミニン(LN)、ビトロネクチン(VN)、I型コラーゲン(I)、およびIV型コラーゲン(IV)で被覆された基質に対するSMCの接着および移動の促進におけるβ1およびvβ3インテグリンレセプターの役割を調べた。特定のインテグリン複合体に対する機能的ブロック性抗体を用いて、Clymanら、Exp.Cell Res. 200：272-284(1992)は、FN-、LN-、VN-、I-、またはIV被覆基質に対するSMC接着は、機能的β1インテグリンに専ら依存し、しかもこれら基質に対するSMC移動はαvβ3インテグリンに大きな程度まで依存したことを見い出した。
【００９６】
リガンドアフィニティークロマトグラフィーおよび免疫沈降分析は、各マトリックス成分：FN α5β1 α3β1 αvβ1)、LN(α1β1、α7β1)、VN(αvβ1)、I(α1β1、α2β1)、およびIV(α1β1)に対する、独特な一連のβ1インテグリン結合を同定した。β3インテグリン、αvβ3は、試験された接着タンパク質のすべて(FN、LN、VN、I、およびIV)に結合することが観察された。これらの研究は、SMC移動の誘導が、ECMとの安定なβ1インテグリン相互作用からなる固定状態から、細胞がインテグリンαvβ3によるECMとの一時的な相互作用を形成する移動状態へのスイッチを必要とし、しかも環状RGDが、それがECMとのインテグリンαvβ3相互作用を特異的にブロックし得ることから、SMC移動の強力なインヒビターであることを示唆した。このことは、今や、以下の実施例により示されるように証明されている。
【００９７】
テナシン 
テナシンは、ダイマー性でありそして400kDaであるフィブロネクチンのような他のECMタンパク質と比較した場合、分子量が1000kDaを超える異常に大きなヘキサマーECMタンパク質である。テナシン分子の電子顕微鏡写真は、Chiquet-Ehrismann、FASEB J. 4:2598-2604(1990)により報告されているように、中央の球形ドメインを有する特徴的な６つのアーム構造を明らかにしている。組織中のテナシンの分布は、ラミニンおよびフィブロネクチンのそれよりもかなり限定されている。Mackieら、J.Cell Biol. 107:2757-2767(1988)、ChuongおよびChen、Am.J.Path. 138:427-440(1991)により報告されているように、最近の証拠は、器官発生の間に発達する多くの器官において、特定の腫瘍の支質において、および創傷治癒の間の成人組織において、テナシンが一時的に発現されていることを明らかにしている。これらの知見により、これらのプロセスの間におけるテナシンの機能的役割を検討するに至っている。
【００９８】
テナシン機能の最も初期の研究は、Chiquet-Ehrismann(1990;1991)に記載されているように、主に、テナシンの機能的ドメイン、および細胞マトリックス接着またはテナシンのECM成分との相互作用に対するそれらの影響に注目した。テナシンの主要な細胞結合性機能的ドメインが、Chiquet-Ehrismanら、Cell53:383-390(1988)により、モノクローナル抗体mAb Tn68を用いてマップされた。Tn68エピトープペプチドは、Prietoら、J.Cell Biol.
119:663-678(1992)により、それが培養基質に吸着されたとき、線維芽細胞接着を促進す
ることが示されている。
【００９９】
Tn68エピトープペプチドの接着促進活性とは対照的に、完全なテナシン分子は、インピトロで、フィブロネクチンまたはテナシン仲介細胞接着を阻害する。Prietoらによるさらなる研究は、Tn68エピトープに対して惹起されたモノクローナル抗体mAb Tn68が、フィブロネクチン基質に対するテナシン仲介細胞接着の阻害をブロックすることを示した。これらの研究は、TN68エピトープが完全なテナシン分子内でそのネイティブな状態では抗接着性であるが、ペプチド断片として細胞接着を促進し得ることを示している。
【０１００】
テナシンのより最近の機能的マッピング研究は、以下に図示するように、テナシン分子のアームに沿って４つの独立した細胞結合ドメインを明らかにした。アームのＣ末端の節にあるフィブリノーゲン様ドメイン、およびフィブロネクチンIII型反復II-VIを含むドメインは、Prietoらに記載されるように、細胞接着を促進する。EGF様反復および最後の２つのフィブロネクチンIII型反復は細胞接着を阻害することが観察された。Aukhilら、J.Biol.Chem.268:2542-2553(1993)により報告された他の研究は、フィブロネクチンIII型反復IV-Vを含むドメイン、およびフィブリノーゲンドメインが、ヘパリン結合および細胞結合活性を有することを明らかにした。これらの研究は、ECMにおけるテナシンの多機能の役割に対しておよびテナシンに対する種々の細胞応答を仲介するレセプターを単離するための指針に対して基礎を提供する。
【０１０１】
【表１】
2007307429.tif 000003
【０１０２】
その他の研究は、テナシンのECM成分との相互作用を調査している。テナシンがプロテオグリカン、コラーゲン、およびフィブロネクチンに結合するという証拠(すべて一致するわけではない)が増加している。他のECM成分に対するテナシンの結合を報告している研究では、テナシンのこれら成分との相互作用は、Faissnerら、J.Neurochem.43:1004-1015(1990); LightnerおよびErickson、J.Cell Sci. 95:263-277(1990)により概説されているように、一般に、弱い。これら研究の生理学的関連性は、テナシンがECMから容易に除去され得、そしてそれが細胞表面レセプターに結合するとき、細胞表面と会合するようになることである。
【０１０３】
テナシンが仲介するヒトのグリオーマ細胞株U251MGの付着の機構に関するBourdonおよびRuoslahtiら、J.Cell.Biol.108:1149-1155(1989)による詳細なインビボ研究は、インテグリン型の接着レセプターが関係していたことを示した。細胞膜抽出物のリガンド親和性クロマトグラフィーおよび引き続くゲル電気泳動は、テナシン親和性カラムマトリックスに結合したヘテロダイマー性細胞表面タンパク質を明らかにした。このタンパク質複合体は、インテグリンにより認識されるRGD配列を含むペプチドにより特異的に溶出された。ウェスタンブロット分析により、ダイマー複合体中の１つのサブユニットがインテグリンβ1として同定された。Sriramaroら、J.Cell.Sci.105:1001-1012(1993)およびJoshiら、J.Cell.Sci．106:389-400(1993)によるより最近の研究は、内皮細胞接着および拡散が、インテグリンα2β1およびαvβ3によりそれぞれ仲介されることを示した。インテグリンαvβ3に対するテナシン結合部位は、第３番目のフィブロネクチンIII型ドメイン内の配列S
RRGDMSであった。インテグリンα2β1の相互作用は、RGD依存性ではなく、そしてこのレセプターに対する結合配列は決定されなかった。
【０１０４】
テナシンアームのフィブリノーゲンドメインに対する細胞接着がAukhilらにより観察されたがインテグリン依存性ではなかった。何故なら、このドメインを介する細胞接着は２価カチオン依存性ではなく、または可溶性RGDペプチドにより阻害されなかったからである。フィブリノーゲンドメインに対する細胞付着の阻害が、細胞を可溶性ヘパリンまたはヘパリチナーゼで処理したときに観察された。これらの結果は、テナシンのフィブリノーゲンドメインに対する細胞付着が細胞表面プロテオグリカンにより仲介されることを示唆した。
【０１０５】
Mackieら、Am.J.Path. 141:377-388(1992)による研究は、正常血圧Wistar-Kyoto(WKY)ラットからの大動脈および小動脈におけるテナシン発現が、中膜を通じて低レベルであり、そして分岐部位でのみより高いレベルであったことを示した。正常血圧ラットにおけるこの発現パターンに対して、高レベルのテナシンが自発性高血圧WKYラット由来の動脈中膜全体に巣状に散在していることが観察された。さらに、MackieおよびScott-Burden、Am.J.Path.142:659(1993)によるインビトロ研究は、WKYラット大動脈SMC培養を用いて、テナシンmRNAおよびタンパク質の増加発現が、アンジオテンシンII、形質転換成長因子β1および血小板由来成長因子により誘導可能であったことを示した。Sharifiら、J.Biol.Chem.25:23910-23915(1992)による別のインビトロ研究は、SMCテナシンmRNA発現に対するアンジオテンシンIIの刺激効果を確認した。これらの研究は、血管性SMCによるテナシンの増大した局部発現が慢性高血圧に関連し、そして慢性高血圧に関連する血管構造におけるアンジオテンシンIIが誘導される変化を仲介し得ることを示唆する。
【０１０６】
Hedinら、Am.J.Path. 139:649-656(1991)は、バルーン障害ラット頚動脈の新脈管内膜(neointima)における増殖性の合成表現型SMCが検出可能なレベルのテナシンを分泌したことを観察した。対照的に、彼らは、正常およびバルーン障害ラット頚動脈の媒質中では検出可能なレベルのテナシンを見い出さなかった。このグループによるさらなる研究は、培養中のSMCが、それらが、新たに単離された細胞の縮小表現型から合成状態に形質転換するとき、マトリックス中にテナシンを沈着し得ることを示した。この研究から、インビボおよびインビトロにおけるテナシン生産が、SMC表現型の縮小から合成状態への遷移と相伴い誘導されたと結論された。これらの研究は、慢性高血圧に伴うまたは血管損傷に応答する血管壁中の増大したテナシン発現と相関連した。しかし、現在まで、血管壁疾患または損傷に対するテナシンの機能的役割については先行技術に記載されていない。
【０１０７】
以下の実施例に示されるように、今や、テナシンが、インビトロで損傷誘導SMC移動を刺激することが示されている。初期の結果は、インテグリンαvβ3がテナシン刺激SMC移動に重要であることを示す。引き続く結果は、SMC移動の有力なインテグリンメディエーターであるインテグリンαvβ3が、テナシンに有効に結合するSMC表面成分であることを示す。
【０１０８】
従って、テナシンと、SMC上のインテグリン特にαvβ3との間の相互作用の阻害によりSMC移動を阻害することが可能である。
【０１０９】
接着リガンドの局所送達 
接着リガンドの環状RGDペプチドのクラスは、影響を受けた組織中で細胞の増殖および移動が起こる疾患の処置に利用され得る化合物のクラスの良好な例である。環状RGDペプチドが特異的な細胞-ECM相互作用を選択的に阻害することが示されているが、それらは、治療上有効であるためには、それらの予め選択されおよび特異的な標的組織に到達しなければならない。環状RGDの全身投与は、代表的には、不満足な治療戦略である。何故なら
、正常細胞-ECM相互作用および標的細胞のそれらに対する顕著な妨害が生じ得るからである。効力に対して要求され得るペプチド量はまた、著量であり得る。より適切な治療は、上記のポリマーゲルを用いて、環状RGDを標的部位に局所的に送達することである。
【０１１０】
走化性因子および成長因子 内皮細胞に対する好適な例では、ヘパリン、マクロファージ走化性因子(Bandaら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:7773-7777(1982))、塩基性FGFまたは腫瘍血管形成因子が、血管形成術、アテローム除去術(atherectomy)、ステントまたは血管手術後の修復を促進するために用いられ得る。BCGのような化学治療剤投与後の膀胱癌の処置に対する好適な例では、膀胱を被覆するためのゲル中で、EGFが適用される。EGFは、同様に、頚の冷凍療法(crysotherapy)後、ポリマー性ゲル中で適用されて、再上皮形成を促進する。
【０１１１】
器官修復を補助するために、成長因子を取り込んだゲルのペーストまたは層が損傷器官付近に適用され得、疾患または手術後の器官再成長を促進する。成長因子に加えて胚心筋細胞が、病的な、例えば、心不全または梗塞後の心筋における減少した細胞再集団、および縮小機能の「ミニ器官」の作成のために、人工管腔中のポリマー性ゲル中に接種され得る。隔膜の破裂に至る薄膜化およびVSDの生成から、心室と急性心不全の発症との間に、有意な関連死亡率で関連性のあることが導き出される。現在、DacronTMパッチが、血流および血圧を安定化するために挿入されているが、それらは非機能的である隔膜中の大きなゾーンを残す。生物活性分子と組み合わせた複合物に適用されるポリマー性物質を用いて修復および再成長を促進し得る。
【０１１２】
因子を生産するための細胞の取り込み 副甲状腺の主細胞を、ポリマーゲル中に取り込み得、そして局所的に移植し、副甲状腺破壊後または甲状腺除去に伴う除去(カルシウムおよびリン酸代謝の変化を招き特に重大な問題である)後、局所副甲状腺ホルモン産生の島を形成し得る。
【０１１３】
管状器官における機能的改変および疾患プロセスに加えて、多くの非管状器官および組織表面がまた、老化、疾患または損傷に起因する機能または構造のいずれかにおける変化を起こし得る。例えば、内部器官で組織表面上で腫瘍が見い出される場合、現在の治療は、局所手術切除を含み疾患のない周縁を生成する。正常ゾーン中へのさらなる疾患の進行を防ぐために、しばしば細胞障害性の外部化学療法が投与されるか、または患者は放射線照射療法を受けるかのいずれかである。これらの治療は、多くの副作用を生じ、有効性が限られることがしばしばである。本明細書に記載される方法を用いて、ポリマー性物質のコーティングを組織表面に局所的に適用し得、それ単独、または取り込まれた抗増殖性化学療法剤または生物活性物質により腫瘍細胞の内成長を制限する。また、正常な実質細胞の内成長または上皮細胞の過剰増殖を選択的に促進する生物活性な分子もまた利用し得る。
【０１１４】
ポリマー性物質は、創傷が縫合またはステープルを用いて閉じられる通常の手術手順後の治癒の増強として特に有効である。
【０１１５】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照してさらに理解される。
【実施例１】
【０１１６】
偽中空器官に対するポリマーのインビトロ適用。
カテーテルが、透明なプラスチックTygonTMチューブから構築された偽血管導管中に挿入された。遠位閉塞バルーンが膨張され、処置部位を規定し、そして流動形態のPluronicTMF127がカテーテルを通じて脈管中に注入された。鋳型のコアバルーンを膨張し、そしてPluronicTMゲル材料を加温しゲル化させた。最後にバルーンをしぼませ、そしてカテーテ
ルを引き抜き、「脈管」管腔の内面にゲルコーティングを残した。
【０１１７】
図3A-3Gに詳細に示すように、、図3は、厚い中空の管状構造中の流動可能なゲルポリマーの適用について上記図2Cに概説したバルーン適用カテーテルの使用の実際の例を示す。入れ子式のゲル修復カテーテルを図3Aに示す。このカテーテルは、末端の環状閉塞バルーン58(即ち、近位閉塞バルーン)を有する近位中空シャフト64からなる。近位シャフト内にはまり込んでいるものは、遠位閉塞バルーン60および鋳型コアまたはゲル修復バルーン66が取り付けられたより小さな第２シャフト62である。図3Bでは、カテーテルアセンブリが、偽中空管状器官(この場合透明なTygonTM管材)の管腔68内に配置される。
【０１１８】
図3Cでは、近位および遠位閉塞バルーンが膨張されている状態が示されており、中空の管状器官のゾーン70を単離している。
【０１１９】
図3Dでは、流動可能なポリマー性溶液72が、単離ゾーン内に点滴注入されている。この実施例では、４℃でPluronicTMF127(25%v/v)が、可視化のための溶解されたトルイジンブルーを含む着色溶液とともに利用された。図3Eでは、ポリマーが加温されそしてゲル化され、それによって点滴注入流体をゲル化する。近位および遠位閉塞バルーンがしぼんでも、なお着色ポリマー74がゾーン内に含まれたまま残り、そのゲル化された特徴を示していることに注意。
【０１２０】
図3Fでは、適用カテーテルが除去されて、中央中空管腔78を有するゾーン中にゲルコーティング76を残している。
【０１２１】
図3Gでは、ポリマー80のより薄いコーティングが見られ、それは遠位閉塞バルーン60のコートされたゾーンの第２回目の逆行通過により達成されるが、さらにゲルをなめらかにしそして薄いコーティングを生成する。
【実施例２】
【０１２２】
単離された血液導管セグメントへのポリマーのインビトロ適用。
血管のセグメントを切除した。カテーテルを、この脈管の内面中に挿入した。
【０１２３】
流動形態にある冷却PluronicゲルF127を、カテーテルを通じて、カテーテルと管壁との間の空間に注入し、そして鋳型コアバルーンを膨張させた。一旦ポリマーがゲル化を引き起こすに十分な温度に加温されると、鋳型コアバルーンをしぼませそしてカテーテルを除去した。
【０１２４】
図4A-4Fは、「鋳型コア」中央カテーテルを用いる単離されたウシ冠状動脈へのゲルコーティングの適用を示す顕微鏡写真である。図4aでは、単離されたウシ冠状動脈82のセグメントの断面が観察される。図4Bでは、鋳型コアカテーテル84が管腔内で中央に配置されている。図4Cでは、流動可能な着色ポリマー性溶液86(PluronicTMF127 25%(w/v)＋トルイジンブルー)が、鋳型コアバルーンおよび管腔内表面により規定された空間を占める管腔中への注入により点滴注入された。
【０１２５】
図4Dおよび4Eでは、ポリマーのゲル化およびカテーテルの除去の際の、ポリマーゲル88、90の薄い環状コーティングが、脈管管腔内表面上の緊密な接触状態で観察される。図4Fでは、ゲルて被覆されたまたは修復された動脈が拡大下(６×)で観察され、そして薄い管腔内ゲル層92が同定され、基底の動脈壁94に接着および適合している。
【０１２６】
得られる組織表面は、Pluronicゲルで、表面を被覆し、そして表面上の不規則性を充填しそして適合する様式で修復される。さらに、ゲルの配置された内表面はなめらかであり
、それによって改善された血流をともなうレオロジー的に有利な表面を有するバリア層を提供する。
【０１２７】
図５は、ゲルで被覆したウシ冠状動脈の凍結断面(250×)の顕微鏡写真である。上記のようにして形成されたゲル96の薄い層が血管の基底管腔内(緊密な)表面98と緊密な適合接触で観察される。
【実施例３】
【０１２８】
熱可逆的ポリエーテルヒドロゲルは、インビトロおよびエクスビボで損傷動脈緊密表面の血栓形成性を減少する。
【０１２９】
ポリマー管腔内修復は、中空体構造の管腔内表面に生体適合性ポリマーの薄層を適用する一般的方法である。適用されたポリマー層は、一時的な壁支持体、バリアまたは局在化した持続性薬剤送達ビヒクルとして機能し得る。血管系において構造的ポリエステルを利用する現在までの研究は、管腔内修復層が、構造的に安定で、壁を支持し、そして血液適合性の、局在化されたカテーテルを基礎にした熱形成により、インサイチュで効果的に適用され得ることを証明した。
【０１３０】
修復方法の拡張として、最近の研究は、動脈管腔内への非構造的ポリマーヒドロゲルの層の適用が、損傷した動脈表面血栓形成原性を局所的に減少させる短期間のバリアとして作用する実行可能性を調べた。生分解性および腐食性ポリエーテル(PE)を用いる研究が、インビトロでPEゲルの血液適合性、インビトロでPEゲルが急性損傷動脈表面表面の血栓形成原性を減少する能力、およびエクスビボで管腔内PEゲルが損傷動脈表面を血栓保護する能力を測定するために実施された。
【０１３１】
材料および方法： 
ガラス上のPEのスピン−ケース(spin-case)ゲルフィルム、および、内膜を剥離され、新たに外植されたラット大動脈の小片(エクスビボ)(Ao)(この上にPEゲルが形成された)を、パラレルプレートフローチェンバー内に置いて、過剰な(overflowing)、ヘパリン処理し(２U/ml)、メパクリン(mepacrine)標識した(10mM)、新鮮なヒト血液(剪断速度100/秒、37℃)に曝した。５分後、表面をエピ蛍光ビデオ顕微鏡観察(epi-fluorescence videomicroscopy)により検査し、そして1000×の視野あたりの接着性血小板(pl)、３〜10個のplの凝集体(pa)、および血栓(t)の数を計測した。ガラス上のGelatinのフィルムおよびコートされていない剥離されたラット大動脈をコントロールとした。
【０１３２】
結果：
【０１３３】
【表２】
2007307429.tif 000004
【０１３４】
中和されたポリ(アクリル酸)(poly(acrylic acid)),pH 7.4(CarbopolTM 934および940
、B.F．Goodrich)を含む他のポリマー性物質を用いて同様な結果を得た。
【実施例４】
【０１３５】
熱可逆性ポリエーテルヒドロゲルは、損傷した動脈内膜表面のトロンボゲン形成性を低下させ、そしてその後のインビボでの最終的な新内膜過形成進展を制限する。
【０１３６】
損傷した動脈内膜表面の急性血栓症は、血管形成術、血栓溶解治療およびステント設置後の潜在的に重篤な合併症である。損傷した動脈内膜下表面への直接の熱可逆性ポリエーテルヒドロゲル(thermoreversible polyether hydrogel)の形成が、引き続くインビボでの血小板沈着および血栓形成を制限するかどうかを決定するための研究を行った。
【０１３７】
材料および方法
５匹のラットの両側の頸動脈を露出させ、１対の動脈の部分を、非外傷性クリップにより隔絶し、正常生理食塩水で血液を洗い流し、そしてバルーン剥離した(２fr Fogarty×３)。動物あたり１つの頸動脈をコントロール血管として選び、次いで血流を回復させた。対応する実験側の頸動脈では、次いでポリエーテルヒドロゲルの層を内腔表面に適用し、その後血流を回復させた。注意：実験側の血管では、ポリマーが適用された後まで損傷した表面を血液に再び曝さないよう注意した。血液再還流の１時間後、動物をヘパリン処理し(200U/kg)、過剰用量の麻酔で屠殺し、両側の頸動脈を生理食塩水で洗浄し、そしてインサイチュで圧固定した(90mmHg、２％グルタルアルデヒド(glutaraldehyde))。次いで、血管を摘出し、全体的ならびに立体顕微鏡観察および走査型電子顕微鏡観察で検査した。
【０１３８】
結果：
【０１３９】
【表３】
2007307429.tif 000005
【０１４０】
図6A(コントロール)および6Bに示された結果は、無処置コントロールとは対照的に、処置血管には血小板、白血球およびフィブリンの沈着がほとんどないことを示す。
【０１４１】
解析は、コントロールの大動脈には７±１個の血栓が検出されたことを示した。ゲルコートした、損傷した動脈表面には血栓は見られなかった。205±44個の単一血小板がコントロールの表面で検出されたのに対し、コートされた動脈では２±１個の血小板が検出された(p<0.05)。
【０１４２】
図7Aおよび7Bは、バルーン剥離による損傷14日後に採取したラット頸動脈の組織学的切片の代表例である。図7Bにおける動脈102は、バルーン剥離され、14日間治癒させた、損傷後のゲルコートを受けていないコントロールの動脈の例である。顕著な新内膜の肥厚110がみられ、下の中膜106と比較して厚さがほぼ２倍である。
【０１４３】
これに対して、図7Aのゲル処置した動脈100は、新内膜108の著しい減少を有する。この動脈はPluronicTM F127(25％ W/V)ゲルでコートされ、次いで過剰の血液に再び曝し、そして14日間治癒させた。
【０１４４】
結論： 
ポリエーテルゲルは血液適合性であり、最小の血小板活性化作用を有する表面を提供する。損傷した動脈の表面に直接形成された熱可逆性ポリエーテルヒドロゲル層は、インビトロまたはインビボのいずれでも、内膜表面のトロンボゲン形成性を全体的に減少させることで、血小板沈着および血栓形成を制限する効果的な物理的バリア層を形成する。
【実施例５】
【０１４５】
疾患の処置としてのインビボの選択された局所部位への接着レセプターリガンドまたは他の接着レセプターモジュレーターの送達 環状RGDペプチドの局所送達がバルーン損傷後の新内膜過形成を阻害することを示す研究は以下のように行われ、インビボでの血管壁の損傷部位、すなわちPTCAが実行された部位への環状RGDの局所送達の方法が提供されて、内膜過形成を効果的に減少させ得る内膜SMC移動の局所化された阻害が生じるか否かを評価した。詳細には、環状インテグリンアンタゴニストペプチドの局所化された送達による、動脈壁におけるインテグリン−マトリックス相互作用の干渉が、ラットバルーン損傷モデルにおいて14日目で新内膜過形成進展の程度を改変するか否かを決定する研究を行った。
【０１４６】
10匹のラット(雄性、350g)の左頸動脈をバルーン剥離した(2Fr fogarty×３)。10匹のラットうちの５匹では、インテグリンアンタゴニストである環状ペプチドGPenGRGDSPCA(cRGD)を１mM Pluronicゲル(500μl)の濃度に混合しそして損傷した動脈の外膜に局所的に適用した。５匹の無処置ラットをコントロールとした。
【０１４７】
14日目にラットを屠殺し、頸動脈を圧固定しそして平均内膜厚および平均中膜厚を測定した。コントロールの、バルーン剥離した動脈の平均内膜/中膜比(I/M)は、2.09±0.54であった。剥離した、cRGD処置動脈における平均内膜/中膜比は、0.17±0.10であった(p<0.001)。
【０１４８】
これらの結果により、cRGDペプチドの局所適用は過形成の程度の92％減少を導くことが示される。群間で中膜厚に有意な変化はなかった。バルーン損傷後の動脈壁へのインテグリンアンタゴニストの局所化された適用は、正常な治癒応答を改変し、結果的に新内膜過形成の進展を有意に減少させる。
【実施例６】
【０１４９】
損傷後の新内膜過形成を制限することにおける局所的に送達された線状RGDペプチドと環状RGDペプチドとの効力の比較。
【０１５０】
細胞表面インテグリンおよび細胞外マトリックスタンパク質リガンドによって媒介される細胞−マトリックス相互作用は、細胞表現型および機能を調節することが示されている。前記実施例に記載されるように、環状インテグリンアンタゴニストペプチドGPenGRGDSPCA(cRGD)の局所化された送達による、動脈壁におけるインテグリン−マトリックス相互作用の干渉は、ラットバルーン損傷モデルにおいて、14日目で新内膜過形成進展の92％阻害を生じた。SMCインテグリンαvβ3のECMとの相互作用が損傷後のSMC移動および新内膜過形成の進展の支配的なメカニズムであるか、あるいはβ1インテグリンもまた損傷後のSMC応答に重要であるかは、不明のままである。
【０１５１】
この研究は、損傷後14日目の新内膜過形成を制限することにおいて、局所的に送達した線状ペプチドGRGDSPCA(これは、β3インテグリンよりβ1インテグリンを強く阻害する)の効力をcRGD(β3インテグリンを標的にする環状ペプチド(GPenGRGDSPCA))に対して比較することによってこの問題に取り組む。
【０１５２】
材料および方法
14匹のラット(雄性、350g)において、左頸動脈をバルーン剥離した(2fr Fogarty×３)。線状RGD(4/14ラット)または環状RGD(5/14)を、外膜に適用されたPluronicTMゲル(500μl)中において、１mMで損傷した動脈に局所的に適用した。無処置ラット(5/14)をコントロールとした。14日目、ラットを屠殺し、頸動脈を圧固定しそして平均内膜厚および中膜厚を測定した。
【０１５３】
結果
バルーン剥離した、環状および線状RGD処置動脈における平均内膜/中膜比(I/M)は、それぞれ0.17±0.10(p<0.001)および1.95±0.32(p<0.007)であった。コントロールの剥離された動脈では、I/Mは2.09±0.54であった。cRGDペプチドの局所適用は、過形成の程度の92％減少を導いた。一方、線状RGD処置は有意な減少を生じなかった。同様の条件下で研究した、３種の線状ペプチド、２種の既知のβ1インテグリンインヒビター、１種のナンセンスペプチド、および環状RGDペプチドについての結果を図８に示す。
【０１５４】
考察
cRGDのようなβ3インテグリンインヒビターは、新内膜過形成の進展を効果的に減少させ得る。一方、β1インテグリンインヒビター、すなわち、線状RGDは、過形成を制限することができない。従って、SMCβ3インテグリンの血管壁ECMとの相互作用は、損傷後の移動およびその後の新内膜過形成の進展に関して、β1インテグリン相互作用より重要であるにちがいない。細胞インテグリン−マトリックス相互作用は、損傷誘発再狭窄の制限を目的とする薬理学的操作のための別の実行可能な標的であり得る。
【実施例７】
【０１５５】
非インテグリン細胞マトリックスレセプター結合ペプチドの局所送達は、バルーン損傷後の新内膜過形成を阻害する。
【０１５６】
細胞外マトリックスタンパク質であるラミニンとの細胞の相互作用は、細胞関連69kD非インテグリンレセプターにより部分的に媒介されるが、これは、細胞表現型および機能を調節することが示されている。ラミニンペプチドフラグメントを介してのこの相互作用の干渉は、神経冠細胞の移動および実験的転移を制限することが示された。
【０１５７】
材料および方法
この研究では、ラミニンβ1鎖ペプチドフラグメントの局所化された送達を通じての、動脈壁におけるラミニン−69kDレセプター相互作用の干渉が、ラットバルーン損傷モデルにおいて、14日目で新内膜過形成進展の程度を変化させ得るか否かを決定した。10匹のラット(雄性、350g)において、左頸動脈をバルーン剥離した(2fr．Fogarty×３)。5/10のラットにおいて、線状ノナペプチドCDPGYIGSRアミド(YIGSRアミド)を、外膜に適用したPluronicTMゲル(500μl)中で、１mMで損傷した動脈に局所的に適用した。無処置ラット(5/10)をコントロールとした。
【０１５８】
14日目、ラットを屠殺し、頸動脈を圧固定しそして平均内膜厚および中膜厚を測定した。
【０１５９】
結果
コントロールのバルーン剥離された動脈の平均内膜/中膜比(I/M)は2.09±0.54であった。剥離した、YIGSRアミド処置動脈では、I/M比は0.22±0.16(p<0.001)てあった。ノナペプチドであるYIGSRアミドの局所適用は、過形成の程度の89％減少を導いた。群間の中膜厚には有意な変化はなかった。
【０１６０】
考察
バルーン損傷後の動脈壁への、ラミニンβ1鎖のノナペプチドフラグメントであるCDPGYIGSRアミドの局所化された適用は、正常な治癒応答を改変し、結果的に新内膜過形成進展の有意な減少を生じる。平滑筋細胞の非インテグリンラミニンレセプター−ラミニン相互作用は、血管損傷後の再狭窄の制限を目的とする薬理学的操作のための別の実行可能な標的であり得る。
【実施例８】
【０１６１】
テナシンを用いる細胞移動の改変 ECM(細胞外マトリックスタンパク質)であるテナシン(tenascin)の増加したレベルは、最近、バルーン損傷後の動脈新内膜中で検出された。従って、動脈損傷におけるテナシンの役割をさらに理解するために、損傷誘発平滑筋細胞(SCM)移動に対する外来テナシンの効果を検討した。ラット大動脈のSMC(２〜４継代)の集密培養物を木製アプリケーター(applicator)で１度引っかくことにより損傷し、新鮮な培地(DMEM＋10%FCS)で洗浄し、そして培地＋テナシン(１μg/ml)中でインキュベートした。コントロールは、テナシンなしでインキュベートしたことを除いて同様に処置した。24時間で、細胞が傷の縁から移動した平均距離を測定することによって細胞移動を測定した。また移動を、インテグリンαvβ3およびα5β1のそれぞれに対する遮断抗体、抗VNRおよび抗FNRの存在下で評価して、テナシンが媒介する損傷後の移動を促進する際のこれらのインテグリンの役割を決定した。抗体を損傷直後に、最大の阻害性であることが知られている濃度で添加した。
【０１６２】
６つのサンプルにおいて、無処置コントロール(100％)に対するテナシン処置サンプルの平均パーセント移動は、182.6±20.1％であった。これは、p<0.01の水準で有意である。インテグリンブロック研究において、テナシン処置コントロール(100％)に対するパーセント移動は、抗αVβ3については33.6±7.2％(p<0.01、n=5)であり、そして抗α5β1については94.7±4.1％(p=有意差なし、n=5)であった。これらの研究を、コントロール、および２種の抗体で処置した細胞への同一濃度のテナシンの結合を測定することによって確かめた。コントロールの結合は53±１fM/106細胞であった；抗VNRは結合を29.7±3.8に減少させたが、抗FNRは効果を有さなかった(50.3±2.8)。
【０１６３】
これらの結果は、可溶性テナシンでの処置が引っかき損傷された平滑筋細胞の移動を有意に増加させることを示す。抗αVβ3抗体は、テナシン刺激性移動に対して効果を有さないが、抗α5β1は移動を有意に減少させて、テナシンの効果を本質的にブロックする。これらの結果は、損傷後のSMC移動の刺激におけるテナシンの役割を示唆し、そして移動応答が少なくとも部分的にインテグリンαVβ3によって媒介されることをさらに示唆する。
【実施例９】
【０１６４】
平滑筋細胞移動の阻害のためのcRGDペプチドのヒドロゲルを基礎にした局所送達 cRGDペプチドのヒドロゲルを基礎にした局所送達が、直接的な短期間のペプチド曝露に比べて、平滑筋細胞の移動のより強い阻害を導くことを示す研究を行った。この研究では、局所インビボ送達のモデルのように、インビトロでの引っかき傷損傷後の平滑筋細胞(SMC)移動に対する抗移動ペプチドのヒドロゲルを基礎にした送達の効果を直接的な短期間送達と比較した。
【０１６５】
材料： 
16個のSMC単層(ラット大動脈)を引っかき創傷し、そして環状RGDペプチド(１mM)を含有するポリ(エチレングリコール)乳酸(poly(ethylene glycol)lactic acid)ブロックコポリマーからなるヒドロゲルの薄層を、16個の単層のうちの４個に直接光重合させ、次いでこれを培地で覆った。別の４個の単層では、培地(MEM)中の１mM cRGDを、ヒドロゲルなしで
直接適用した。薬物を含まないヒドロゲル単独を16個の単層のうちの４個に適用し、または培地単独を16個の単層のうちの４個にコントロールとして適用した。10分間のインキュベーション(37℃)後、全ての単層の培地を棄て、培養物を洗浄し、そして薬物を含まない培地中で24時間インキュベートした。培養物を固定、染色し、そしてSMCが創傷の線から移動した面積を、ゲル処置群と直接処置群の両群について測定し、そしてゲル単独コントロールに対する移動指数(移動指数＝面積処置/面積コントロール)として報告した。
【０１６６】
結果： 
cRGDをヒドロゲルで処置した単層の移動指数は、0.27＋0.09であり、これに対して、10分間の直接的なcRGD曝露については0.93＋0.08であった(p<0.01)。ヒドロゲルを基礎にした送達により、SMC移動の程度は、10分間の直接的なペプチド曝露に比べさらに66％減少させるに至った。ゲル単独では、培地単独コントロールに比べ、移動を制限しなかった。
【０１６７】
結論： 
抗SMC移動ペプチドのヒドロゲルを基礎にした送達は、増強された局所的な効力を導き、直接的な短期間のペプチド曝露単独に比べてSMC移動をより強く減少させる。ポリマー性ヒドロゲル送達ビヒクルを介する有望な抗再狭窄剤の送達は、カテーテルベースの直接曝露単独によりなされ得る以上に局所的な薬物効力を増強する方法を提供するに違いない。
【実施例１０】
【０１６８】
標的組織部位でのcRGDの保持、およびインビボ効力 放射性標識したcRGDを使用して、動脈におけるゲル中のcRGDの保持を研究した。雄性Sprague-Dawleyラット(375g)の頸動脈を、上記のように、2fr Fogartyカテーテルを３回通して剥離した。右頸動脈をクランプ隔絶し、そして洗浄して血液を取り除いた。本質的にはHill-Westらに従い、0.02mg/mlのエオシンＹ(Eosin Y)へのこの動脈の曝露によって、薄ゲル層をこれら動脈内に沈積させ、その後洗浄して過剰なエオシンを除去した。等張緩衝液中10％W/Vのアクリル化ポリエチレングリコール乳酸エステル(acrylated polyethyleneglycol lactate ester)からなるゲル形成マクロマーを、動脈中に徐々に染み込ませた。マクロマー溶液を添加物なし(ゲルコントロール)、または35Ｓで約５Ci/モルに標識した５mM cRGDを含有させて投与した。このゲルを514nmで30秒間光重合させた。
【０１６９】
いくつかの動脈を２時間クランプしたままにし、次いで放射能の量をコントロールと比較した。２時間で保持されていた放射性RGDのパーセントは、100％であった。このことは、ゲルが領域外に漏れ出さなかったことを示す。35Ｓ cRGDを含有するゲルを、正常血液循環に２、24および72時間曝した場合、保持されていたcRGDの相対的な量は、それぞれ約４％、４％、および１％であった。このことは、低分子量の物質の顕著な保持であり、動脈壁中への拡散を示す。
【０１７０】
cRGD適用の効力を、動脈を切片にして14日目の中膜：内膜比の測定により評価した。ゲルがない場合、この比は2.5であり、中膜の過形成を示した。ゲル単独コントロールでは、この比は0.28であった。cRGDを処置した動脈では、この比は、0.14にまでさらに減少した。従って、ポリマー単独は、動脈中膜の過形成を抑制することにおいて効果的であり、ポリマーとの組合せでcRGDは、動脈中膜の過形成を抑制することにおいて、ポリマーよりさらに効果的である。
【実施例１１】
【０１７１】
細胞−細胞外マトリックス相互作用のための局所化された治療 ラミニンβ1鎖ペプチドフラグメントの局所化された送達による、動脈壁におけるラミニン−69kDレセプター相互作用の干渉が、ラットバルーン損傷モデルにおいて14日目の新内膜過形成進展の程度を改
変し得るかどうかを検討するために研究を行った。
【０１７２】
方法： 
10匹のラット(雄性、350g)において、左頸動脈をバルーン剥離した(2fr Fogarty×３)。10匹のラットのうち５匹で、線状ノナペプチドCDPGYIGSRアミド(YIGSRアミド)を、外膜に適用したPluronicTM(ポリエチレンオキシドポリプロピレングリコール(polyethylene oxide polypropylene glycol))ゲル(400μl)中で、１mMで損傷した動脈に局所的に適用した。５匹の無処置ラット(５/10)をコントロールとして用いた。14日目に、ラットを屠殺し、頸動脈を圧固定し、平均内膜厚および平均中膜厚を測定した。
【０１７３】
結果： 
コントロールのバルーン剥離された動脈の平均内膜/中膜比(I/M)は、2.09±0.54であった。剥離された、YIGSRアミド処置された動脈では、I/Mは0.22±0.16であった(p<0.001)。ノナペプチドであるYIGSRアミドの局所適用は、過形成の程度の89％減少を導いた。群間には中膜厚の有意な変化はなかった。
【０１７４】
結論： 
バルーン損傷後の動脈壁への、ラミニンβ1鎖のノナペプチドフラグメントであるCDPGYIGSRアミドの局所化された適用は、正常な治癒応答を改変し、その結果、新内膜過形成の進展の有意な減少を生じる。平滑筋細胞の非インテグリンラミニンレセプター−ラミニン相互作用は、血管損傷後の再狭窄の制限を目的とする薬理学的操作のための別の実行可能な標的であり得る。
【実施例１２】
【０１７５】
治療的適用のためのプロ移動薬剤(pro-migratory agent)としてのテナシン テナシンは、現在、インビトロで損傷により誘発されるSMC移動を刺激することが示されている。
【０１７６】
最初の段階として、インビトロにおける損傷により誘発されるSMC移動に対する可溶性テナシンの効果を研究した。SMC移動を、インビトロでStewartら(Br.J.Exp.Path.60:582-588(1979))と同様に細胞単層を創傷することによって誘発した。ラット大動脈SMCを、タイプＩコラーゲンでコートした24ウェル培養皿に高密度で播種し、そして24時間インキュベートした。細胞移動を誘発するために、単層を、木製アプリケータースティックを用いて引っかき創傷した。創傷区域への細胞移動の進行を容易に測定し得た。なぜなら、元の創傷の線は、移動中の細胞の先端(leading edge)とは明らかに区別されたからである。引っかき損傷直後、可溶性テナシン(１μg/ml)を、各実験培養ウェルに添加した。コントロールウェルは創傷されたが、可溶性テナシンを与えられなかった。創傷後、細胞を24時間インキュベートし、細胞移動を創傷部位から測定可能な距離に前進させた。創傷後24時間の時点で、細胞を４％パラホルムアルデヒド(paraformaldehyde)中(２時間、室温)で固定し、そして１％トルイジンブルー(toluidine blue)を用いて染色した(２分間)。各培養ウェルを明視野顕微鏡観察(Zeiss、Axiovert)により倍率100×で検査した。ビデオカメラにより作成した画像をディジタル化し、そして画面取り込みボード(frame-grabber board)および画像処理ソフトウェア(NIH ImageTM)を装備したMacintoshTMIIciホストコンピュータで処理した。創傷部位における移動中の細胞の区域を囲む周辺(closed perimeter)を、検査された各視野について、ディジタル化タブレット(SummagraphicsTM)を用いてトレースし、そして移動中の細胞により取り囲まれた面積を、画像化ソフトウェアパッケージの積分ルーチン(integration routine)を用いて定量した。創傷部位からの５つの視野を各サンプルについて検査し、そして実験群およびコントロール群について３つのサンプルを検査した。各実験群のSMC移動をコントロールの移動のパーセントととして表した。
【０１７７】
可溶性テナシン(１μg/ml)が存在した場合、図9Aに示すように、SMC移動速度が80％増
加したことが観察された。さらなる研究により、2.0μg/mlを超える可溶性テナシンのレベルが細胞の接着を分断することを示した。このことは、テナシンの特徴的な抗接着特性を示す。
【０１７８】
第２の研究では、インビトロ創傷モデルを使用して、テナシンにより刺激されるSMC移動の促進における、インテグリンαVβ3(伝統的に、ビトロネクチンレセプター(VNR)として知られる)およびインテグリンα5β1(伝統的に、フィブロネクチンレセプター(FNR)として知られる)の役割を決定した。この研究のために、細胞を24ウェル培養皿に播種し、そして上記のように創傷した。実験サンプルを創傷の30分前に、インテグリンαVβ3(VNR)またはインテグリンα5β1(FNR)のいずれかに対する機能的遮断ウサギ抗血清(GIBCO/BRL)100μg/mlと共にプレインキュベートした。100μg/mlという濃度は、以前に、インテグリン機能を最大にブロックすることがMassiaおよびHubbell(J.Cell Bio. 114:1089-1100(1991))より決定されている。非免疫反応性免疫前疑似(sham)コントロールとして、選択されたサンプルを正常な免疫前ウサギ血清と共にプレインキュベートした。全てのサンプルを、可溶性テナシン(１μg/ml)の存在下で、創傷直後から創傷後24時間の実験終了時点までインキュベートした。24時間の終了時点で、サンプルを固定し、染色し、そして上記のように解析した。
【０１７９】
この第２の研究では、VNRに対する抗血清(抗VNR抗血清；100μg/ml、最大阻害濃度)は、SMC移動速度を、コントロールの移動の33.3±1.7％に減少させることが観察された。このことは、図9Bに示されるように、この血清の最大阻害能力を示す。これに対して、最大阻害濃度の抗FNRは、SMC移動速度をコントロール移動の83.3±3.3％に減少させたにすぎない。ただし、この値はこの抗血清の阻害能力よりはずっと低い。これらの結果は、インテグリンαVβ3がテナシン刺激SMC移動に重要であることを示唆する。
【０１８０】
全細胞(whole cell)放射性リガンド結合アッセイを利用して、テナシンがSMCの表面に特異的に結合するか否かを決定した。簡潔には、テナシンを、t-ブトキシカルボニル-L[35S]メチオニン-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル(t-butoxy carbonyl-L[35S]methionine-N-hydroxysuccinimidyl ester)を用いて放射性標識し、そして標識された生成物の比活性を測定した。SMCを回収し、そして無血清培地中に106細胞/mlの濃度で懸濁した。50μlアリコートの細胞懸濁液を、0.2μg/mlから4.0μg/mlまでの連続濃度の可溶性テナシンと共に１時間室温でインキュベートした。次いで、細胞懸濁液を洗浄し、そして各サンプル中の放射能を液体シンチレーション計数により測定した。各サンプル中の結合したテナシンの量を、放射性標識したテナシンの比活性に基づいて計算した。
【０１８１】
図10に示すように、可溶性テナシンレベルが0.4μg/mlから4.0μg/mlに増加するにつれ、特異的結合は増加することが観察された。可溶性外来テナシンの1.0μg/mlにのレベルはSMCに対してプロ移動性(promigratory)である)では、特異的に結合したテナシンのレベルは、53±１fmol/106細胞、すなわち１細胞あたり約３×104個の結合したテナシン分子であった。
【０１８２】
第２の全細胞放射性リガンド結合研究により、１μg/mlのテナシンと共にインキュベートした場合の、インテグリンαVβ3およびα5β1に対する抗体とのプレインキュベーション(15分間、室温)の、テナシンのSMCへの特異的結合に対する効果を調べた。こられらの抗体は、上記移動アッセイパイロット研究で使用した抗体と同一の遮断抗体であった。抗体濃度は、培養ラット大動脈SMCにおいて、これらのインテグリンの機能を最大に阻害することが観察されているレベルであった。SMCの抗αVβ3とのプレインキュベーションは、テナシンの特異的結合の顕著な減少(無処置細胞における53.0±1.0fmol/106細胞から抗αVβ3処置細胞における29.7±3.8fmol/106細胞への減少)を生じた。抗α5β1処置は、テナシン結合を著しく減少させなかった。なぜなら、特異的結合は、この処置群において50
.3±2.8fmol/106細胞であったからである(図10)。これらの結果は、インテグリンαVβ3(SMC移動の有力なインテグリンメディエーター)が、テナシンと能動的に結合するSMC表面成分であることを示す。
【０１８３】
本発明の改変および変形は、前記の詳細な説明から当業者に明らかである。このような改変および変形は以下の請求項の範囲内にあると意図する。
【図面の簡単な説明】
【０１８４】
【図１】本発明の方法の概略図である。
【図２】図２Ａは、図２Ｂに示されるカテーテルの多管腔機能の断面図である。図２Ｂおよび２Ｃはポリマー性物質を組織管腔表面に適用するための、本明細書に記載の方法に有用なカテーテルの拡大図である。
【図３】図３Ａから３Ｇは、模擬中空管状器官内における、本明細書に記載のポリマー性物質の写真の概略図である。図３Ａおよび３Ｂは、カテーテルおよび管内に挿入されたカテーテルの概略図である；図３Ｃは、カテーテル内の２つのバルーンが膨張して血管を封止する様子を示す概略図である；図３Ｄは、管内に注入されたポリマー性物質を示す概略図である；図３Ｅは、ポリマー性物質がゲル化しバルーンがしぼんだ管を示す概略図である；図３Ｆは、カテーテルが除去され、内部管腔または環状空間を有する血管壁にゲルコーティングが取り残される様子を示す概略図である；および、図３Ｇはバルーンがしぼんで被覆された血管から除去され、遠位閉塞バルーンを再度適用することによって物質が平滑に薄くされる様子を示す概略図である。
【図４】図４Ａから４Ｆは、単離したウシ冠状動脈内にポリマー性物質が注入される顕微鏡写真の概略図である。
【図５】薄膜ゲルコーティングでゲル被覆された動脈の断面の顕微鏡写真（２５０倍）の概略図である（左下隅）。
【図６Ａ】図６Ａは、損傷後の出血に６０秒間再度曝された後の、ラット頚動脈の内膜表面の走査電子顕微鏡写真である。大量の血小板、白血球、およびフィブリンが沈着している、コントロールのバルーンで摩耗したラット内膜（管腔内）表面である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、損傷後の出血に６０秒間再度曝された後の、ラット頚動脈の内膜表面の走査電子顕微鏡写真である。ゲル被覆された（Pluronic F127、２５％ｗ／ｖ）動脈表面であり、血小板、白血球、およびフィブリン沈着および接着が大幅に減少している様子を示す。
【図７】損傷１４日後の動脈新内膜過形成の発生を制限する効果を有するゲルコーティングの写真の概略図である。
【図８】環状ＲＧＤ（黒四角）、ＧＲＧＤｄＳＰ（β1インテグリンのより強力なインヒビター）（白四角）、ＧＲＧＤＳＰ（β1インテグリンを阻害する線状ＲＧＤペプチド）（黒丸）、およびＧＲＡＤＳＰ（ナンセンスペプチド）（白丸）についての、コントロールに対する移動パーセント対ペプチド濃度（ｍＭ）のグラフである。
【図９Ａ】図９Ａは、無処置コントロールに対するテナシン（１．０μｇ／ｍｌ）のパーセント移動のグラフである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、抗ビトロネクチンレセプターまたは抗フィブロネクチンレセプターと組み合わされた１μｇ／ｍｌテナシンのパーセント移動を、コントロールのテナシン単独の場合と比較するグラフである。
【図１０】ＳＭＣ表面結合テナシン（１モル／１０-6細胞）対培地中の可溶性テナシン（μｇ／ｍｌ）のグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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