(57)【要約】【課題】遺伝子導入作業等の細胞操作に要するコストを低減し、細胞内への遺伝子導入等の操作をより確実に行う。【解決手段】顕微鏡観察下において、細胞に対して操作を行う細胞操作装置１であって、細胞に挿入される針部１１と、該針部１１の先端を、生理活性物質が含まれる溶液中に存在する細胞内まで移動させる駆動手段１２とを備え、針部１１によって細胞の細胞膜に孔を形成し、溶液中に存在する生理活性物質を細胞内に導入する細胞操作装置１を提供する。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕微鏡観察下において、細胞に対して操作を行う細胞操作装置であって、
細胞に挿入される針部と、
該針部の先端を、生理活性物質が含まれる溶液中に存在する前記細胞内まで移動させる駆動手段とを備え、
前記針部によって前記細胞の細胞膜に孔を形成し、前記溶液中に存在する前記生理活性物質を前記細胞内に導入する細胞操作装置。
【請求項２】
前記針部を自由端側に備える片持ち梁を備え、
該片持ち梁の長手方向と前記針部の長手方向とが異なる請求項１に記載の細胞操作装置。
【請求項３】
前記片持ち梁に接続され、該片持ち梁を前記針部の長手方向とは異なる方向に加振する振動手段を備える請求項２に記載の細胞操作装置。
【請求項４】
前記針部の先端が、前記振動手段により、前記針部の長手方向とは異なる方向に振動させられる請求項３に記載の細胞操作装置。
【請求項５】
前記針部の先願が、前記振動手段により、少なくとも２次元方向に振動させられる請求項３に記載の細胞操作装置。
【請求項６】
前記振動手段は、前記針部の先端が前記細胞の細胞膜に接触するときに該針部の先端を加振する請求項３に記載の細胞操作装置。
【請求項７】
前記振動手段は、前記針部の先端が前記細胞に近接させられる際に、前記針部の先端を加振する請求項６に記載の細胞操作装置。
【請求項８】
顕微鏡観察下において、生理活性物質が含まれる溶液中に存在する細胞に対して操作を行う細胞操作方法であって、
細胞に挿入される針部を細胞に近接させる工程と、
前記針部によって前記細胞の細胞膜に孔を形成する工程と、
形成された孔を介して前記溶液中に存在する前記生理活性物質を前記細胞内に導入する工程とを備える細胞操作方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞操作装置および細胞操作方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞に導入する遺伝子等の導入物質を物理吸着により固定した原子間力顕微鏡のカンチレバー先端の針部を細胞内に侵入させることで遺伝子導入を行う技術が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
この技術においては、カンチレバーを変位させながら、カンチレバーに作用する力の変動を監視することにより、カンチレバー先端の針部が細胞の細胞膜に刺さったことあるいは細胞膜から引き抜かれたことを検出することとしている。
【０００３】
また、細胞の細胞膜に貫通孔を形成する方法として、例えば、特許文献２に開示されている方法がある。
この方法は、遺伝子等の導入物質を分散させた溶液中において、標的細胞に対してレーザ光を照射し、細胞膜上に修復可能な微小の孔を形成することにより遺伝子を導入し形質転換を行おうとするものである。
【特許文献１】特開２００３−３２５１６１号公報
【特許文献２】特開平５−２０７８２７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、カンチレバー先端の針部の細胞内への侵入容積は微小であり、また、細胞膜が流動性を有しているために、針部の先端が細胞内に侵入したと思われる位置までカンチレバーを移動させても、細胞膜が流動的に針部の表面を覆ってしまい、細胞膜を貫通させることができない場合がある。このため、遺伝子導入が安定せず、良好な導入率を得ることができないという不都合がある。
【０００５】
また、遺伝子を保持した針部の細胞膜内への侵入を原子間力顕微鏡により測定しながら行うこととしているが、原子間力顕微鏡は極めて高価であるため、遺伝子導入作業のコストが増大する不都合がある。
【０００６】
さらに、特許文献２に開示されている方法では、細胞膜の正確な位置が顕微鏡観察下では得られにくく、細胞膜上にレーザ光を集光することが困難である。また、レーザ光による方法では、細胞膜にしか孔が形成されないため、核内まで遺伝子を到達させることができず、良好な発現効率を得ることができないという不都合がある。
【０００７】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、遺伝子導入作業等の細胞操作に要するコストを低減し、細胞内への遺伝子導入等の操作をより確実に行うことを可能とする細胞操作装置および細胞操作方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、顕微鏡観察下において、細胞に対して操作を行う細胞操作装置であって、細胞に挿入される針部と、該針部の先端を、生理活性物質が含まれる溶液中に存在する前記細胞内まで移動させる駆動手段とを備え、前記針部によって前記細胞の細胞膜に孔を形成し、前記溶液中に存在する前記生理活性物質を前記細胞内に導入する細胞操作装置を提供する。
【０００９】
上記発明においては、前記針部を自由端側に備える片持ち梁を備え、該片持ち梁の長手方向と前記針部の長手方向とが異なることとしてもよい。
また、上記発明においては、前記片持ち梁に接続され、該片持ち梁を前記針部の長手方向とは異なる方向に加振する振動手段を備えることとしてもよい。
【００１０】
また、上記発明においては、前記針部の先端が、前記振動手段により、前記針部の長手方向とは異なる方向に振動させられることとしてもよい。
また、上記発明においては、前記針部の先願が、前記振動手段により、少なくとも２次元方向に振動させられることとしてもよい。
【００１１】
また、上記発明においては、前記振動手段は、前記針部の先端が前記細胞の細胞膜に接触するときに該針部の先端を加振することとしてもよい。
また、上記発明においては、前記振動手段は、前記針部の先端が前記細胞に近接させられる際に、前記針部の先端を加振することとしてもよい。
【００１２】
また、本発明は、顕微鏡観察下において、生理活性物質が含まれる溶液中に存在する細胞に対して操作を行う細胞操作方法であって、細胞に挿入される針部を細胞に近接させる工程と、前記針部によって前記細胞の細胞膜に孔を形成する工程と、形成された孔を介して前記溶液中に存在する前記生理活性物質を前記細胞内に導入する工程とを備える細胞操作方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、遺伝子導入作業等の細胞操作に要するコストを低減し、細胞内への遺伝子導入等の操作をより確実に行うことができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の第１の実施形態に係る細胞操作装置１および細胞操作方法について、図１〜図５を参照して説明する。
本実施形態に係る細胞操作装置１は、図１に示されるように、細胞を観察するための顕微鏡装置２に備えられる。
【００１５】
顕微鏡装置２は、遺伝子等の生理活性物質を分散させた培養液内に細胞を収容した容器３を載置するステージ４と、該ステージ４上の細胞を照明する照明装置５と、細胞において反射あるいは透過した光、あるいは細胞から発生した蛍光を観察する観察装置６と、ステージ４を駆動制御するステージコントローラ７と、照明装置５および観察装置６を制御する顕微鏡コントローラ８と、観察装置６により得られた画像を処理する画像処理装置９と、該画像処理装置８により処理された画像を表示する表示装置１０とを備えている。
【００１６】
前記照明装置５には、細胞に対して、観察装置６とは反対側から照明光を照射する透過照明光源５Ａおよび、該透過照明光源５Ａから発せられた照明光を細胞に集光するコンデンサレンズ５Ｃと、細胞に対して観察装置６と同一方向から照明光を照射する落射照明光源５Ｂとが備えられている。
また、観察装置６には、図示しない対物レンズを含む観察光学系と、該観察光学系を介した細胞からの光を撮像して画像を取得するＣＣＤ素子６Ａと、細胞からの光を直接観察する接眼レンズ６Ｂとが備えられている。
【００１７】
本実施形態に係る細胞操作装置１は、前記顕微鏡装置２のステージ４近傍に配置され、細胞に対して挿入される針部１１と、該針部１１を移動させる駆動ユニット１２と、該駆動ユニット１２を制御する駆動制御装置１３とを備えている。駆動ユニット１２は、Ｘ，Ｙ，Ｚ方向に針部１１を移動させる、例えば、３軸の直線移動機構を備えている。
【００１８】
前記針部１１は、図２に示されるように、カンチレバー１４の自由端側に、カンチレバー１４の長手方向に対して交差する方向に延びるように設けられている。カンチレバー１４は取付部材１５に固定され、該取付部材１５は、振動ユニット１６を介して導入針保持具１７に固定されている。これにより、カンチレバー１４は斜め下向きに保持され、針部１１はカンチレバー１４の自由端において、先端を鉛直下方に向けて保持されている。
【００１９】
取付部材１５と導入針保治具１７との間に配置された振動ユニット１６は、例えば、積層された圧電素子（以下、圧電素子１６とも言う。）により構成され、所定の周波数の交流電圧を加えることにより、所定の周波数および振幅の振動を生じさせることができるようになっている。図２に示されるように圧電素子１６は取付部材１５と導入針保治具１７との間に水平方向に配置されているので、電圧を加えることにより導入針保治具１７に対して取付部材１５を水平方向に振動させ、該取付部材１５に鉛直下向きに取り付けられている針部１１の先端を水平方向に振動させることができるようになっている。
駆動制御装置１３は、駆動ユニット１２を制御する駆動ユニット制御回路１３Ａと、振動ユニット１６を制御する振動ユニット制御回路１３Ｂとを備えている。
【００２０】
このように構成された本実施形態に係る細胞操作装置１を用いた細胞操作方法について以下に説明する。
本実施形態に係る細胞操作装置１を用いて、遺伝子等の導入物質を細胞Ａ内に導入するには、容器３内に、遺伝子等の生理活性物質を分散させた培養液Ｌを貯留するとともに、該培養液Ｌ内に細胞Ａを収容した状態でステージ４に載置する。ステージコントローラ７および顕微鏡コントローラ８を作動させ、ステージ４の作動により観察したい細胞Ａを顕微鏡観察下に配置する。そして、駆動ユニット制御回路１３Ａの作動により駆動ユニット１２を作動させ、カンチレバー１４の針部１１を細胞Ａの上方から細胞Ａに近接させる。
【００２１】
このとき、振動ユニット１６を作動させることにより、図３に示されるように、針部１１の先端を水平方向に振動させながら針部１１を下降させていく（図３（ａ））。これにより、針部１１の先端が下降していく途中において、細胞Ａに接触すると（図３（ｂ））、針部１１の振動によって細胞膜Ｂに切り込みが形成される。すなわち、細胞膜Ｂは流動性を有し、針部１１を単に長さ方向に移動させて刺す場合には、細胞膜Ｂが針部１１に倣って変形するため細胞膜Ｂを貫通することができないが、本実施形態のように針部１１をその長手方向に交差する方向に振動させながら長さ方向に移動させることで、細胞膜Ｂに切り込みを形成し、容易に細胞膜Ｂを貫通することが可能となる。
【００２２】
その結果、針部１１を細胞膜Ｂ内の核Ｃに確実に刺し入れることが可能となる（図３（ｃ））。そして、針部１１を細胞Ａから引き抜き、所定時間にわたって培養することにより、核Ｃ内まで形成された孔に培養液Ｌ内の生理活性物質がより確実に導入されることになる。
図４に、本実施形態に係る細胞操作装置１を用いて針部１１を細胞膜Ｂ内に侵入させた実施例を示す。また、図５に、比較例として、単に針部１１を長手方向に押して針部１１の先端を細胞Ａ内の核Ｃ内の位置まで移動させた例を示す。
【００２３】
図５に示す比較例によれば、単に針部１１を長手方向に押すだけの方法では、針部１１の輪郭に倣って細胞膜Ｂが変形しただけで、細胞膜Ｂに孔が形成されていないことがわかる。これに対して、図４に示す実施例によれば、細胞膜Ｂに孔が形成されていることを明確に見ることができる。
【００２４】
なお、本実施形態に係る細胞操作装置１においては、カンチレバー１４の自由端に、カンチレバー１４の長手方向に対して交差する方向に延びる針部１１の先端を、振動ユニット１６により、針部１１の長手方向（鉛直方向）に交差する方向（水平方向）に振動させつつ、細胞Ａに近接させていくこととした。これにより、針部１１の先端と細胞膜Ｂとの接触を厳密に検出しなくても、移動途中に細胞膜Ｂと接触することにより細胞膜Ｂに切り込みが形成されるので、より簡易に導入物質を導入することができる。また、細胞Ａへの接触を検出する検出装置が不要となり、細胞Ａの操作作業に要するコストを低減することができる。
【００２５】
これに代えて、針部１１の先端と細胞Ａとの接触を検出できる場合には、図６に示されるように、針部１１の先端が細胞Ａと接触する直前までは振動させることなく近接させ（図６（ａ））、接触が検知されたときに振動ユニット１６の作動により針部１１の先端を振動させることとしてもよい（図６（ｂ））。
【００２６】
また、本実施形態においては、針部１１の先端を単一方向に振動させる場合について説明したが、これに代えて、図７に示されるように、圧電素子１６Ａ，１６Ｂを相互に交差する２方向に配置し、振動の位相を異ならせることにより、図８に示されるように針部１１の先端が略円運動を行うように振動させることとしてもよい。
このようにすることで、比較的大きなダメージに対して耐性のある細胞Ａに対しては、細胞膜Ｂをくりぬくようにして、より確実に開口させることができ、導入物質の細胞Ａ内への導入率をさらに向上することができる。
【００２７】
また、２方向に配置される圧電素子１６Ａ，１６Ｂにより、針部１１の先端を２次元的に振動させることとしたが、これに代えて、各部の機械的な共振周波数や加えられる振動周波数を適宜選択し、カンチレバー１４を針部１１の方向とは異なる方向に加振することにより、単一の圧電素子１６による一方向への加振によっても針部１１の先端を２次元的に振動させることができる。
【００２８】
また、本実施の形態では、プラスミドＤＮＡなどの核内にて作用する生理活性物質を導入しているため、針部１１を核Ｃ内の位置まで移動し、細胞膜および核膜を貫通する。例えば、細胞質内にて作用するｓｉＲＮＡ、細胞質を染色する蛍光色素等を導入する場合には、必ずしも針部１１を核Ｃまで移動する必要はなく、細胞膜Ｂに切り込みを形成するだけでよい。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る細胞操作装置を示す全体構成図である。
【図２】図１の細胞操作装置のカンチレバー近傍の構造を示す拡大図である。
【図３】図１の細胞操作装置のカンチレバーに設けた針部の細胞への挿入動作を説明する図である。
【図４】図１の細胞操作装置により針部の先端を細胞膜内に挿入した状態を示す顕微鏡写真である。
【図５】図４の比較例を示す顕微鏡写真である。
【図６】図３の挿入動作の変形例を示す説明図である。
【図７】図１の細胞操作装置の変形例を示すカンチレバー近傍の斜視図である。
【図８】図７の細胞操作装置による針部の先端の振動形態を示す図である。
【符号の説明】
【００３０】
Ａ  細胞
Ｂ  細胞膜
１  細胞操作装置
２  顕微鏡装置
１１  針部
１２  駆動ユニット（駆動手段）
１４  カンチレバー（片持ち梁）
１６，１６Ａ，１６Ｂ  振動ユニット（振動手段）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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