(57)【要約】【課題】  食中毒細菌をマルチプレックスＰＣＲ法で測定するときのプライマーセット及び食中毒菌の検出方法である。【解決手段】  腸管出血性大腸菌O157、サルモネラ属菌、カンピロバクター・ジェジュニ、リステリア・モノサイトゲネス及び黄色ブドウ球菌からなる群の２以上の食中毒細菌をＰＣＲ法で検出するためのプライマーセットであり、検出対象とする細菌に応じて、特定のプライマーセットの２つ以上を混合してなるマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットである。また、本発明の食中毒細菌の検出法は上記マルチプレックスＰＣＲ用プライマーを用いる検出方法である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸管出血性大腸菌O157、サルモネラ属菌、カンピロバクター・ジェジュニ、リステリア・モノサイトゲネス及び黄色ブドウ球菌からなる群の２以上の食中毒細菌をＰＣＲ法で検出するためのプライマーセットであり、検出対象とする細菌に応じて、下記(1)〜(5)に記載されるプライマーセットの２つ以上を混合してなるマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセット。
(1) 腸管出血性大腸菌O157に対して、
・配列番号１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４又は５に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４又は５に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１１又は１３に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１２又は１３に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号８に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１２又は１３に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１３に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１３に示される塩基配列からなるプライマー；
の組合せの１つ又はその相補的配列の組合せ。
(2) サルモネラ属菌に対して、
・配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１９又は２１に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号１５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１８、１９又は２０に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２１に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号１７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２２、２３又は２４に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号２５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２７，２９、３０又は３１に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号２６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２７，２８，２９，３０又は３１に示される塩基配列からなるプライマー；
の組合せの１つ又はその相補的配列の組合せ。
(3) カンピロバクター・ジェジュニに対して、
・配列番号３２に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３４又は３６に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号３３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３５又は３６に示される塩基配列からなるプライマー；
の組合せの１つ又はその相補的配列の組合せ。
(4) リステリア・モノサイトゲネスに対して、
・配列番号３７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４１、４２、４３、４４、４５又は４６に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号３８に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４１、４２、４３、４４又は４５に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号３９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４３、４４、４５又は４６に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号４０に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４４、４５又は４６に示される塩基配列からなるプライマー；
の組合せの１つ又はその相補的配列の組合せ。
(5) 黄色ブドウ球菌に対して、
・配列番号４７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４９又は５０に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号４８に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５０に示される塩基配列からなるプライマー；
の組合せの１つ又はその相補的配列の組合せ。
【請求項２】
請求項１の(1)〜(5)に記載されるプライマーセットの１つずつを全て含むマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセット。
【請求項３】
各ＰＣＲ増幅産物の塩基長が１０塩基以上の差が生じるように各プライマーセットが選択されている請求項１又は２記載のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセット。
【請求項４】
配列番号１〜５０に示される塩基配列又はその相補的配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
(a)検体からＤＮＡを抽出する工程、(b)当該ＤＮＡを鋳型として、請求項１〜３の何れかに記載のプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、(c)ＤＮＡの増幅の有無を検出する工程を含む、腸管出血性大腸菌O157、サルモネラ属菌、カンピロバクター・ジェジュニ、リステリア・モノサイトゲネス及び黄色ブドウ球菌からなる群の２以上の食中毒細菌を同時に検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はプライマーセット及び食中毒細菌の検出方法に関する。より詳細には、複数の食中毒細菌をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で同時に検出する際に使用されるマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセット及びそれを用いた食中毒細菌の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食中毒の発生や感染を防止するために、食品、食品原料、患者の嘔吐物や糞便、又は環境由来材料等から食中毒細菌を検出し、同定することが行われている。係る検出・同定をする場合、増菌培養、直接分離培養、一次確認培養、二次確認培養、抗血清による凝集反応などの確認試験を行わなければならない。これらの各試験の所要時間は、それぞれ１８〜２４時間であり、総所要時間として３〜６日を要し、多大な時間とコストを必要とする。更に複数の食中毒細菌を検査する場合には、それぞれの食中毒細菌を検査しなければならない。またそれぞれの菌の検査に至適な培地、培養方法や判定方法を適用しなければならない。このように現在の検査法は煩雑で迅速性や簡便性に欠けている。
【０００３】
そこで、最近ではオリゴヌクレオチドをプライマーとする遺伝子増幅反応（ＰＣＲ）による食中毒細菌の検出が可能になっている。しかし、標的遺伝子毎にそれぞれの反応液を調製する必要があり、複数の食中毒細菌を検査するためには、複数の反応液を調製しなければなず、操作が煩雑であるという問題点があった。
上記のＰＣＲの欠点を克服する手法として、一つの反応液中に複数の標的遺伝子のプライマーセットを混合し、同時に複数の異なった遺伝子を特異的に検出するマルチプレックスＰＣＲ法がある（非特許文献１及び２）。しかし、従来のマルチプレックスＰＣＲ法は、複数のプライマーセットを単純に混合しただけで、それぞれの特異的な遺伝子増幅産物が得られるとは限らなかった。
一般的には、ＰＣＲにより2つ以上の遺伝子を同時に増幅する場合は、目的以外の遺伝子が非特異的に増幅される頻度が高くなる。そこで、標的遺伝子に特異的に結合するのみならず、プライマー間の干渉力の少ないプライマーを設計する必要があった（非特許文献３）。
また、菌種又は菌属に特異性なプライマーを選択した後に競合の有無を調べ、競合する場合にはプライマーセットの濃度や反応温度の最適化が必要であった（特許文献１）。さらに、これらを十分考慮してプライマーを設計した場合でも、反応効率の予期せぬ低下や非特異的な増幅がみられることがあり、特異的なプライマーセットの設計は容易でなかった。
【非特許文献１】Jpn. J. Food Microbiol., 19: 47-55. 2002
【非特許文献２】J. Food Prot., 68: 551-556. 2005
【非特許文献３】Clin. Microbiol. Rev., 13: 559-570, 2000
【特許文献１】特開２００５−３４１２１公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述のように、従来のマルチプレックスＰＣＲ法では、複数のプライマーセットを単純に混合しただけで、それぞれの特異的な遺伝子増幅産物が得られるとは限らなかった。
本発明は、このような問題点を解消し、食中毒細菌を特異的に検出するためになされたもので、食品、食品原料、患者の嘔吐物や糞便、又は環境由来材料等に存在し、食中毒の原因となる腸管出血性大腸菌O157、サルモネラ属菌、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)及び／又は黄色ブドウ球菌をＰＣＲ法で同時に検出するためのマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセット及びそれを用いた上記食中毒細菌の検出方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記の課題を解決するためになされた本発明は、腸管出血性大腸菌O157、サルモネラ属菌、カンピロバクター・ジェジュニ、リステリア・モノサイトゲネス及び黄色ブドウ球菌からなる群の２以上の食中毒細菌をＰＣＲ法で検出するためのプライマーセットであり、検出対象とする細菌に応じて、下記(1)〜(5)に記載されるプライマーセットの２つ以上を混合してなるマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットである。
(1) 腸管出血性大腸菌O157に対して、
・配列番号１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４又は５に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４又は５に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１１又は１３に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１２又は１３に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号８に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１２又は１３に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１３に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１３に示される塩基配列からなるプライマー；
の組合せの１つ又はその相補的配列の組合せ。
(2) サルモネラ属菌に対して、
・配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１９又は２１に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号１５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１８、１９又は２０に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２１に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号１７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２２、２３又は２４に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号２５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２７，２９、３０又は３１に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号２６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２７，２８，２９，３０又は３１に示される塩基配列からなるプライマー；
の組合せの１つ又はその相補的配列の組合せ。
(3) カンピロバクター・ジェジュニに対して、
・配列番号３２に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３４又は３６に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号３３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３５又は３６に示される塩基配列からなるプライマー；
の組合せの１つ又はその相補的配列の組合せ。
(4) リステリア・モノサイトゲネスに対して、
・配列番号３７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４１、４２、４３、４４、４５又は４６に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号３８に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４１、４２、４３、４４又は４５に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号３９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４３、４４、４５又は４６に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号４０に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４４、４５又は４６に示される塩基配列からなるプライマー；
の組合せの１つ又はその相補的配列の組合せ。
(5) 黄色ブドウ球菌に対して、
・配列番号４７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４９又は５０に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号４８に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５０に示される塩基配列からなるプライマー；
の組合せの１つ又はその相補的配列の組合せ。
特に、上記(1)〜(5)に記載されるプライマーセットの１つずつを全て含むマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットが好適に使用される。更に、各ＰＣＲ増幅産物の塩基長が１０塩基以上の差が生じるようにプライマーセットを選択するのが好ましい。
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、上記の配列番号１〜５０に示される塩基配列又はその相補的配列からなるオリゴヌクレオチドである。
更に、本発明の食中毒細菌の検出方法は、(a)検体からＤＮＡを抽出する工程、(b)当該ＤＮＡを鋳型として、請求項１〜３の何れかに記載のプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、(c)ＤＮＡの増幅の有無を検出する工程を含む、腸管出血性大腸菌O157、サルモネラ属菌、カンピロバクター・ジェジュニ、リステリア・モノサイトゲネス及び黄色ブドウ球菌からなる群の２以上の食中毒細菌を同時に検出する方法である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットによれば、腸管出血性大腸菌O157、サルモネラ属菌、カンピロバクター・ジェジュニ、リステリア・モノサイトゲネス及び／又は黄色ブドウ球菌の標的遺伝子を単一のＰＣＲチューブ内で特異的にかつ干渉反応を生じさせないで増幅させ得る。従って、増幅産物を電気泳動した場合には、電気泳動用ゲルの単一のレーン上に肉眼的に識別可能な腸管出血性大腸菌O157、サルモネラ属菌、カンピロバクター・ジェジュニ、リステリア・モノサイトゲネス及び／又は黄色ブドウ球菌に特異的なＰＣＲ増幅産物のバンドを形成することができる。
また、本発明の食中毒細菌の検出方法は、上記のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットを用いる方法であり、腸管出血性大腸菌O157、サルモネラ属菌、リステリア・モノサイトゲネス、カンピロバクター・ジェジュニ及び黄色ブドウ球菌の２種類以上の食中毒細菌を迅速、簡便に特異的かつ同時検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明者らは、食中毒の原因となる腸管出血性大腸菌O157、サルモネラ属菌、カンピロバクター・ジェジュニ、リステリア・モノサイトゲネス及び／又は黄色ブドウ球菌をＰＣＲ法で同時に且つ干渉することなく検出するためのマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットを検討した結果、腸管出血性大腸菌O157の病原因子の一つであるインチミン(intimin)の遺伝子又はO157抗原合成領域遺伝子、サルモネラ属菌の侵入性因子のinvA遺伝子又はサルモネラ属菌のoriC遺伝子、カンピロバクター・ジェジュニの生存に必要なスーパーオキシドジスムターゼのsodB遺伝子、リステリア・モノサイトゲネスの膜障害毒素hlyA遺伝子及び黄色ブドウ球菌のコアグラーゼ遺伝子をそれぞれ特異的に検出するプライマーの組合せのうち、後記する表１、表２、表３、表４及び表５に記載の組合せからそれぞれ選択される１つを２以上を組合わせることにより、腸管出血性大腸菌O157、サルモネラ属菌、カンピロバクター・ジェジュニ、リステリア・モノサイトゲネス及び黄色ブドウ球菌からなる群の２以上の食中毒細菌を同時に及び正確に検出することができることを見出した。
【０００８】
上記の同時に検出するとは、(1)表１、表２、表３、表４及び表５に記載の組合せからそれぞれ選択される１つを２以上を組合わせたプライマー群を用いて、１本のＰＣＲチューブ内で、熱変性、アニーリング、重合反応を単一のＰＣＲ条件で増幅し、ＰＣＲ増幅産物を調製し、(2)当該ＰＣＲ増幅産物を単一のレーン上で電気泳動して、腸管出血性大腸菌O157、サルモネラ属菌、カンピロバクター・ジェジュニ、リステリア・モノサイトゲネス及び黄色ブドウ球菌からなる群の２以上の選択したプライマーに対応する食中毒細菌を正確に検出でき、供試プライマー特異的なＰＣＲ増幅産物の全てが、肉眼的に識別可能なバンドを形成することをいう。
肉眼的に識別可能なバンドを形成させるためには、近接する増幅産物のサイズの差の最小値は10bp以上、好ましくは20bp以上であるのが好ましい。
また、正確に検出できるとは、擬陰性又は擬陽性の出現頻度がそれぞれ10％未満であることをいう。
【０００９】
本発明でプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、選択性や検出感度及び再現性から考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さを持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天然のどちらでもよく、プライマーが標識されているか否かは問わない。また、プライマーとしての機能を果たす限り、プライマー（オリゴヌクレオチド）の５’末端側に１又は２以上の塩基が付加していてもよく、また１又は２以上の塩基が置換、欠失していてもよい。
【００１０】
ＰＣＲ増幅産物の塩基長は選択したプライマーセットにより規定されるが、本発明のプライマーセットにより規定される、食中毒細菌のヌクレオチド配列における増幅領域は５０塩基から２,０００塩基、望ましくは１００塩基から１,０００塩基となるように選択する。
【００１１】
以下、本発明のプライマーセットを具体的に説明する。
腸管出血性大腸菌(Escherichia
coli O157)を検出するためのプライマーセットは以下のとおりである。
腸管出血性大腸菌O157のインチミン遺伝子を検出するための配列；
(5’)-CTGAACACAGTACGCAGAAG-(3’)・・・(Ia:配列番号１)
(5’)-GCACAAGACTACCAGGCTAT-(3’)・・・(Ib:配列番号2)
(5’)-GTCGTGTCTGCTAAAAC-(3’)・・・(Ic:配列番号3)
(5’)-GTAAAGTCCGTTACCCCAAC-(3’)・・・(Id:配列番号4)
(5’)-ACTGGCTGACCGTTTTTCA-(3’)・・・(Ie:配列番号5)
又は
腸管出血性大腸菌O157のO157抗原合成領域遺伝子を検出するための配列；
(5’）-GGCGTATTACATGCGTTC-(3’）・・・(IIa:配列番号6）
(5’）-TAGTCTCCAGTTGTATGGGG-(3’）・・・(IIb:配列番号7）
(5’）-GTAGGGGTTGTATGCTCGT-(3’）・・・(IIc:配列番号8）
(5’）-CTTTCCGACACCAGAGTTAG-(3’）・・・(IId:配列番号9）
(5’）-GCAATACTTAGTGGCTGGG-(3’）・・・(IIe:配列番号10）
(5’）-CCCCATACAACTGGAGACTA-(3’）・・・(IIf:配列番号11）
(5’）-CTAACTCTGGTGTCGGAAAG-(3’）・・・(IIg:配列番号12）
(5’）-GTAGAGCCGCCATCAACTAT-(3’）・・・(IIh:配列番号13）
の中から表１に示す組合せの1つ又はその相補的配列の組合せである。
なお、プライマーセットの相補的配列からなるオリゴヌクレオチドセットがプライマーセットとしての機能を果たすことは当業者にとって自明である。
【００１２】
【表１】
2007274934.tif 000002
【００１３】
上記の腸管出血性大腸菌を検出するためのプライマーセットを具体的に示すと以下のとおりである。
・配列番号１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４又は５に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４又は５に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１１又は１３に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１２又は１３に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号８に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１２又は１３に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１３に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１３に示される塩基配列からなるプライマー；
の組合せの１つ又はその相補的配列の組合せ。
【００１４】
サルモネラ属菌(Salmonella)を検出するためのプライマーセットは以下のとおりである。
サルモネラ属菌のinvA遺伝子を検出するための配列；
(5’）-GCGTCTACGTAGTCAGTTC-(3’）・・・(IIIa:配列番号14）
(5’）-ATCAGCAAGGTAGCAGTCAGT-(3’）・・・(IIIb:配列番号15）
(5’）-GGTATCTGCTGAAGTTGAGG-(3’）・・・(IIIc:配列番号16）
(5’）-GTGCTCGTTTACGACCTG-(3’）・・・(IIId:配列番号17）
(5’）-GATATACGTTGTACCGTGGC-(3’）・・・(IIIe:配列番号18）
(5’）-GCTCCACGAATATGCTCTAC-(3’）・・・(IIIf:配列番号19）
(5’）-CCTCAACTTCAGCAGATACC-(3’）・・・(IIIg:配列番号20）
(5’）-GACAGACGTAAGGAGGACAA-(3’）・・・(IIIh:配列番号21）
(5’）-CCACGGTGACAATAGAGAAG-(3’）・・・(IIIi:配列番号22）
(5’）-GTTCAACAGCTGCGTCAT-(3’）・・・(IIIj:配列番号23）
(5’）-ATCGAGATCGCCAATCAGTC-(3’）・・・(IIIk:配列番号24）
又は
サルモネラ属菌oriC
遺伝子を検出するための配列；
(5’）-CAACTTTAGCCGATGGAG-(3’）・・・(IVa:配列番号25）
(5’）-GGATAACCCGGATCCTGTA-(3’）・・・(IVb:配列番号26）
(5’）-CACAGCTAGTGATCCTTTCC-(3’）・・・(IVc:配列番号27）
(5’）-AGATTCCGGAAGATCCAG-(3’）・・・(IVd:配列番号28）
(5’）-ACAGGTTGGGGAAACACT-(3’）・・・(IVe:配列番号29）
(5’）-GTTGGGGAAACACTGAAG-(3’）・・・(IVf:配列番号30）
(5’）-AGAAGCGGAACTGAAAGG-(3’）・・・(IVg:配列番号31）
の中から表２に示す組合せの1つ又はその相補的配列の組合せである。
【００１５】
【表２】
2007274934.tif 000003
【００１６】
上記のサルモネラ属菌を検出するためのプライマーセットを具体的に示すと以下のとおりである。
・配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１９又は２１に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号１５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１８、１９又は２０に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２１に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号１７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２２、２３又は２４に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号２５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２７，２９、３０又は３１に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号２６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２７，２８，２９，３０又は３１に示される塩基配列からなるプライマー；
の組合せの１つ又はその相補的配列の組合せ。
【００１７】
カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter
jejuni)を検出するためのプライマーセットは以下のとおりである。
カンピロバクター・ジェジュニのスーパーオキシドジスムターゼ(sodB）遺伝子を検出すための配列；
(5’）-CTTCAAATGGGGGCGTAT-(3’）・・・(Va:配列番号32）
(5’）-GGCGGTTCATGTCAAAGT-(3’）・・・(Vb:配列番号33）
(5’）-CTAAATAAGCAGGGCGTG-(3’）・・・(Vc:配列番号34）
(5’）-CTAACTGATCCCATGCCTTC-(3’）・・・(Vd:配列番号35）
(5’）-AGCTAACTGATCCCATGC-(3’）・・・(Ve:配列番号36）
の中から表３に示す組合せの1つ又はその相補的配列の組合せである。
【００１８】
【表３】
2007274934.tif 000004
【００１９】
上記のカンピロバクター・ジェジュニを検出するためのプライマーセットを具体的に示すと以下のとおりである。
・配列番号３２に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３４又は３６に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号３３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３５又は３６に示される塩基配列からなるプライマー；
の組合せの１つ又はその相補的配列の組合せ。
【００２０】
リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)を検出するためのプライマーセットは以下のとおりである。
リステリア・モノサイトゲネスのhlyA遺伝子を検出するための配列；
(5’）-CAAGTCCTAAGACGCCAATC-(3’）・・・(VIa:配列番号37）
(5’）-GTATACCACGGAGATGCAGT-(3’）・・・(VIb:配列番号38）
(5’）-CAAACGTTAACAACGCAGTA-(3’）・・・(VIc:配列番号39）
(5’）-GGATACGTTGCTCAATTC-(3’）・・・(VId:配列番号40）
(5’）-GAGAGCACCTGGATAGGTTA-(3’）・・・(VIe:配列番号41）
(5’）-GTCATACCTGGCAAATCAAT-(3’）・・・(VIf:配列番号42）
(5’）-GCAACGTATCCTCCAGAGT-(3’）・・・(VIg:配列番号43）
(5’）-GGACGATGTGAAATGAGC-(3’）・・・(VIh:配列番号44）
(5’）-AAACCAGTGCATTCTTTAGC-(3’）・・・(VIi:配列番号45）
(5’）-GCCCCAGATGGAGATATTTCTATT-(3’）・・・(VIj:配列番号46）
の中から表４に示す組合せの1つ又はその相補的配列の組合せである。
【００２１】
【表４】
2007274934.tif 000005
【００２２】
上記のリステリア・モノサイトゲネスを検出するためのプライマーセットを具体的に示すと以下のとおりである。
・配列番号３７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４１、４２、４３、４４、４５又は４６に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号３８に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４１、４２、４３、４４又は４５に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号３９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４３、４４、４５又は４６に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号４０に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４４、４５又は４６に示される塩基配列からなるプライマー；
の組合せの１つ又はその相補的配列の組合せ。
【００２３】
黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus）を検出するためのプライマーセットは以下のとおりである。
黄色ブドウ球菌のコアグラーゼ遺伝子を検出するための配列、
(5’）-CGACATATGGGCCTAGAGTA-(3’）・・・(VIIa:配列番号47）
(5’）-CGTACCGAACTGGAACTTAC-(3’）・・・(VIIb:配列番号48）
(5’）-GTAAGTTCCAGTTCGGTACG-(3’）・・・(VIIc:配列番号49）
(5’）-GGTCATCCATTAGGTGCTAC-(3’）・・・(VIId:配列番号50）
の中から表５に示す組合せの1つ又はその相補的配列の組合せである。
【００２４】
【表５】
2007274934.tif 000006
【００２５】
上記の黄色ブドウ球菌を検出するためのプライマーセットを具体的に示すと以下のとおりである。
・配列番号４７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４９又は５０に示される塩基配列からなるプライマー；
・配列番号４８に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５０に示される塩基配列からなるプライマー；
の組合せの１つ又はその相補的配列の組合せ。
【００２６】
本発明のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットにおいては、検出対象とする食中毒細菌種に応じて、上記のプライマーセットを適宜組合わせて混合し、マルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットを構成して使用する。検体に含まれる食中毒細菌の種類が不明な場合が多いので、５種類のプライマーセットを混合して使用すると、検体に含まれる食中毒細菌を確実に検出できるので好ましい。
なお、マルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットを構成する際には、表１から表５に記載の各ＰＣＲ増幅産物の塩基長が１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の差を生じるように選択し、マルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットを構成し使用する。このようにすることにより、供試プライマー特異的なＰＣＲ増幅産物の全てを肉眼的に識別可能なバンドを形成することができる。
【００２７】
本発明の食中毒細菌の検出方法は、(a)検体からＤＮＡを抽出する工程、(b)当該ＤＮＡを鋳型として、前述のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、(c)ＤＮＡの増幅の有無を検出する工程を含む、腸管出血性大腸菌O157、サルモネラ属菌、カンピロバクター・ジェジュニ、リステリア・モノサイトゲネス及び黄色ブドウ球菌からなる群の２以上の食中毒細菌を同時に検出する方法である。
【００２８】
上記の検体としては、食品、食品の原料に限らず、患者の吐物や糞便、下水やスワブなどの環境由来材料でもよい。これら材料をＰＣＲの試料として用いるには、材料中に存在する菌体からＤＮＡ成分を遊離させる操作が前処理として必要となる。しかし、プライマーがハイブリダイズできるＤＮＡが数分子から数十分子以上存在すればＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界面活性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを進行させるに十分なＤＮＡ量を持った試料液が調製できる。なお、必要に応じて、検査材料を適当な培地中で培養して食中毒細菌を増殖させてからＤＮＡ試料を調製してもよい。
【００２９】
次いで、上記で調製した試料中のＤＮＡを鋳型として、本発明のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットを用いてＰＣＲを行う。
係るＰＣＲ工程は常法に準じて行うことができ、既に市販されているＰＣＲ装置などを用いて行うことができる。
より詳細には、例えば、ＰＣＲ反応に使用される反応液は、市販のＰＣＲ測定キットなどに添付されている反応液を使用すればよい。
また、ＰＣＲ反応に用いる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは９０〜９５℃の温度で活性を保持していれば、何れの生物種由来でもよい。使用される耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えばGene Taq、TaKaRa Taq、ExTaq HSなどが例示できる。
ＰＣＲ条件としては、熱変性の温度は９０〜９５℃、プライマーをハイブリダイズさせるアニーリング操作の温度は３７〜６５℃、重合反応は５０〜７５℃で、これを１サイクルとしたＰＣＲを２０から４２サイクル行って増幅させる。特に本発明は一回のＰＣＲ反応で複数の食中毒細菌の遺伝子の同時検出を可能にするために、熱変性の温度は９４℃、全てのプライマーのTm値及びGC含量がそれぞれ４５〜５５℃、５０〜５５％の範囲内となるように設計を行なった。
プライマーセットの使用量は、特に制限されないが、一般的に約20μＭで使用することが好ましい。
【００３０】
ＰＣＲによる増幅が終了した後、反応液中の増幅ＤＮＡを検出する。ＤＮＡの検出は常法に準じて行えばよく、例えば、ＰＣＲを終えた反応液をそのままアガロースなどを使用した慣用のゲル電気泳動に付し、泳動後のＤＮＡ断片を臭化エチジウム染色、蛍光試薬などで検出する方法が例示され、増幅されたＤＮＡ断片の存在及びその長さを確認できる。前記の表１〜５に示されるように、使用したプライマーセットにより増幅ＤＮＡの塩基長が規定されるので、増幅ＤＮＡの塩基長に基づいて、検査対象である食中毒細菌の有無を判定することができる。
増幅されたヌクレオチド断片の検出には、アガロースゲル以外の支持体を使用する電気泳動法やクロマトグラフィーを適用することもできる。また、上記プライマーセットを膜、ＥＬＩＳＡ用プレート、スライドグラス等の支持体に固定しておき、サザンブロッテイング用プローブとして使用することもできる。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は係る例に限定されるものではない。
【００３２】
実施例１
検体調製
表６及び表７に示す腸管出血性大腸菌O157株、表８及び表９に示すサルモネラ属菌株、表１０に示すカンピロバクター・ジェジュニ株、表１１に示すリステリア属菌株と表１２に示す表皮ブドウ球菌及び黄色ブドウ球菌株のそれぞれを常用されている増菌培地及び培養条件で培養した。培養液１ｍｌを6000rpmで2分間遠心し、集菌後，滅菌精製水 100μｌに懸濁し、5分間、96℃で加熱し、その後に15000rpm、10分間遠心し、その上清を検体とした。
【００３３】
【表６】
2007274934.tif 000007
【００３４】
【表７】
2007274934.tif 000008
【００３５】
【表８】
2007274934.tif 000009
【００３６】
【表９】
2007274934.tif 000010
【００３７】
【表１０】
2007274934.tif 000011
【００３８】
【表１１】
2007274934.tif 000012
【００３９】
【表１２】
2007274934.tif 000013
【００４０】
ＰＣＲプライマー
配列番号１〜５０に示した各配列のオリゴヌクレオチドを化学合成した。化学合成は、β−シアノエチルフォスホアミダイト法により行った。合成したオリゴヌクレオチドの精製は、Ｃ18逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで行った。
【００４１】
ＰＣＲの方法
前記検体液１μｌを用い、滅菌蒸留水３７．７μｌ、１０ｘ反応用緩衝液(500mM
KCl, 100mM Tris-HCl pH8.3, 17.5mM 塩化マグネシウム）５μｌ，ｄＮＴＰ溶液４μｌ(dATP, dCTP, dGTP, dTTPの混合物；最終濃度2.5ｍＭ）、表１から表５に示すプライマーセットからそれぞれ１つを選択したプライマーセット各１.０μｌ（２０μＭ）、及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（TaqDNAポリメラーゼ（5 unit/μl; Roche社製））０.３μｌを加えて、全量５０μｌの反応液を調製した。反応条件：（熱変性）９４℃、１分、（アニーリング）５５℃、１分、（重合反応）
６８℃、１分。熱変性からアニーリングを経て、重合反応に至る過程を１サイクルとし、これを３５サイクル（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、ＰＣＲ装置（Applied Biosystems社製 Gene AmpTM ＰＣＲ System 9700、Bio-Rad社製 iCyclerTM、 MJ Japan社製 PTC-200 DNA Engine）に上記反応条件をプログラムして行った。
【００４２】
増幅ＤＮＡの検出
反応液から増幅されたヌクレオチド断片を検出するため、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。アガロースゲルはゲル濃度１％(W/V）とし、臭化エチジウム（濃度0.5μｇ/ml）を含むものを用いた。泳動の条件は定電圧１００Ｖ、２５分で行った。操作方法ならびに他の条件は、Sambrook et. al著 Molecular Cloning 第３版(2001）に記載されている技法で行った。反応液の他に分子量マーカーの泳動も同時に行い、相対移動度の比較によりヌクレオチド断片のサイズを算出した。
【００４３】
結果
上記の結果を表６から表１２に示した。表６から表１２が示す通り、当該遺伝子陽性の菌株のＤＮＡのみを増幅し、当該遺伝子陰性の菌株のＤＮＡとは全く反応しなかった。すなわち、本発明のプライマーセット（オリゴヌクレオチドセット）は、標的遺伝子を正しく増幅し、標的遺伝子を有する菌のみを選択的に増幅することが明らかになった。即ち、表１から表５に記載の「○」印で示すプライマーセットは、各食中毒細菌の検出に適用可能なことが明らかになった。
【００４４】
実施例２
方法
実施例１に記載の各培養液を混合して実験に供したこと及び表１３に記載のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセット（プライマーセット１〜４）を用いたこと以外は実施例１と同様に操作した。なお、ここで使用したプライマーセットは、５種類の食中毒細菌を検出できるように設定されたプライマーセットである。
【００４５】
【表１３】
2007274934.tif 000014
【００４６】
結果
上記の結果を図１に示した。図中の（１）、（２）、（３）と（４）はそれぞれプライマーセット１、プライマーセット２、プライマーセット３とプライマーセット４による遺伝子増幅産物の電気泳動像を示す。また図中のＭは分子量マーカーの電気泳動像を示す。図１が示す通り、表１３に記載のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットを用いると、腸管出血性大腸菌O157、サルモネラ属菌、リステリア・モノサイトゲネス、カンピロバクター・ジェジュニ及び黄色ブドウ球菌の５種類の食中毒細菌を同時に検出することができた。また、ＰＣＲ増幅産物を電気泳動した際、同一のレーン上に肉眼的に識別可能な独立した５つのバンドを形成することができた。
【００４７】
比較例
方法
表１４に記載のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセット（プライマーセット５及び６）を用いたこと以外は実施例２と同様に操作した。
【００４８】
【表１４】
2007274934.tif 000015
【００４９】
結果
上記の結果を図２に示した。図中の（５）と（６）はそれぞれプライマーセット５とプライマーセット６による遺伝子増幅産物の電気泳動像を示す。図２が示す通り、表１４に記載のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットを用いると、腸管出血性大腸菌O157、サルモネラ属菌、リステリア・モノサイトゲネス、カンピロバクター・ジェジュニ及び黄色ブドウ球菌の５種類の食中毒細菌のうち、プライマーセット５では腸管出血性大腸菌O157のゲノムの塩基配列に基づくプライマーセット（IIaとIIg）を用いたにも関わらず腸管出血性大腸菌O157を検出できないことが判明した。またプライマーセット６ではリステリア・モノサイトゲネスのゲノムの塩基配列に基づくプライマーセット（VIｂとVIｊ）を用いたにも関わらずリステリア・モノサイトゲネスを検出できないことが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】表１３に示されるプライマーセットを用いて５種類の食中毒細菌が検出され得ることを示す電気泳動像である。
【図２】表１４に示されるプライマーセットを用いれば４種類の食中毒細菌しか検出されないことを示す電気泳動像である。
【図１】
2007274934.tif 000016
【図２】
2007274934.tif 000017
【配列表】
2007274934000001.xml