(57)【要約】【課題】ポリ酸を効率よく分解可能なポリ酸分解方法及びこれに利用可能な微生物を提供する。【解決手段】ポリ酸分解能を有する微生物バチルス・リケニフォルミス、特にバチルス・リケニフォルミスＴ７−２（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０９２０）、又はその破砕物を用いて、生分解性プラスチックであるポリ乳酸を分解する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ乳酸分解能を有する微生物バチルス・リケニフォルミス又はその破砕物を用いて、ポリ乳酸を分解することを特徴とするポリ乳酸の分解方法。
【請求項２】
前記バチルス・リケニフォルミスが、バチルス・リケニフォルミスＴ７−２（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０９２０）であることを特徴とする請求項１項記載のポリ乳酸の分解方法。
【請求項３】
バチルス・リケニフォルミスＴ７−２（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０９２０）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリ乳酸の分解方法及び微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、プラスチックの使用量が増加するにつれて、環境への配慮から天然環境下で分解可能な生分解性プラスチックの開発が進められている。例えばポリ乳酸は、水系環境下で加水分解可能な高分子であり、その分解には酵素が用いられることもある。またポリ乳酸を直接分解する微生物についてもいくつか同定されている。
ポリ乳酸分解能を有する微生物としては、例えば、土中から３０℃で分離されたアミコラトプシス属放線菌、サッカロスリクス属放線菌、ストレプトマイセス属放線菌が知られている（例えば、特許文献１〜４）。また分子構造中にエステル結合を有するプラスチックの分解能を有するペニバチルス属細菌も、土中から３０℃で分離されている（特許文献５）。これらの菌は、３０℃４時間程度の処理でポリ乳酸を分解する。また、特許文献６〜７には、土中から５０℃で分離されたバチルス・ズブチリス、バチルス・サーキュランス、バチルス・ステロサーモフィラス、アクチノマデュラ属放線菌、スタフィロコッカス属細菌が記載されている。これらの菌は、５０℃における２週間程度の処理でポリ乳酸を分解する。
【特許文献１】特開平９−３７７７６号公報
【特許文献２】特開２０００−６０５４０号公報
【特許文献３】特開２００１−１２８６９３号公報
【特許文献４】特開平１０−１０８６６９号公報
【特許文献５】特開２００４−１６６５４２号公報
【特許文献６】特開平１１−４６８０号公報
【特許文献７】特開平１１−４６７５５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、プラスチックの分解処理速度は一般に温度に依存して速くなるが、微生物の生育適温を超えると微生物による分解活性が低下する。一方、微生物のポリ乳酸の分解能は、その微生物種によって異なる。
従って、本発明は、ポリ乳酸を効率よく分解可能なポリ乳酸分解方法及びこれに利用可能な微生物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明のポリ乳酸の分解方法は、ポリ乳酸分解能を有する微生物バチルス・リケニフォルミス又はその破砕物を用いて、ポリ乳酸を分解することを特徴としている。
また前記バチルス・リケニフォルミスが、バチルス・リケニフォルミスＴ７−２（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０９２０）であることが好ましい。
本発明の微生物は、バチルス・リケニフォルミスＴ７−２（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０９２０）である。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によれば、ポリ乳酸を効率よく分解可能なポリ乳酸分解方法及びこれに利用可能な微生物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明のポリ乳酸の分解方法は、ポリ乳酸分解能を有する微生物バチルス・リケニフォルミス又はその破砕物を用いて、ポリ乳酸を分解することを特徴としている。
【０００７】
ポリ乳酸としては、乳酸を主成分とする重合体であればよく、ポリＬ−乳酸及びポリＤ−乳酸のようなホモポリマー、ポリＬ／Ｄ−乳酸、これらと他の成分から構成される共重合を挙げることができる。共重合体である場合には、乳酸成分は重量比率が１０％以上のものであることが好ましい。また共重合体を構成する他の成分としては、ε−カプロラクトン、グリコリド、デプシペプチド等を挙げることができる。これらの他の成分は１種であっても、２種以上であってもよい。
本発明によって分解可能ポリ乳酸の分子量には特に制限はないが、例えば数平均分子量１０，０００〜１００，０００、分解速度の観点から好ましくは５０，０００〜３００，０００とすることができる。
【０００８】
本発明のポリ乳酸の分解方法に用いられる微生物は、バチルス・リケニフォルミスである。バチルス・リケニフォルミスであれば、いずれの菌株であってもよいが、特に、バチルス・リケニフォルミスＴ７−２株（茨城県つくば市東１−１−１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０９２０、２００６年５月２２日付受領にて寄託）であることが分解活性の高さから好ましい。
バチルス・リケニフォルミスＴ７−２は、後述するように、森林土壌から、５０℃の温度条件下でポリ乳酸を分解可能な微生物として分離された菌であり、グラム陽性を示し、ＴＳＢ（Trypticase Soy Broth, Becton Dickinson）寒天培地、５０℃で培養した栄養細胞は０．８×２〜３ μｍの桿菌であり、楕円形の内生胞子を有する。Ｒ型のコロニーを形成し、その表面にはしわがあり、光沢はなく、ポリ乳酸の分解について優れた能力を有する。
【０００９】
本発明に用いられる微生物は、通常用いられる条件下で培養して、維持・増殖させることができる。このような培養条件としては、ｐＨ４〜１０、生育速度の観点から好ましくはｐＨ６．０〜８．０のｐＨ，４０〜６０℃、生育速度の観点から好ましくは４５〜５５℃の培養温度とすることができる。
本発明に係る微生物を維持可能な培養用の基本培地（以下、単に「培地」という）としては、窒素源として例えば硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムなど、その他無機塩類としては、例えばリン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、硫酸第一鉄、モリブデン酸ナトリウム、塩化マンガンなどを、それぞれ含むものであって、通常利用される固体又は液体培地であればいずれも好ましく使用できる。なお、培地には、上記成分の他、微生物の成育を促進させるための各種ビタミン、ミネラル、その他の栄養成分を含ませてもよい。
【００１０】
本微生物は、種々の形態でポリ乳酸の分解に用いられる。このような形態としては、微生物菌体、菌体の破砕物及び微生物の培養上清などの各形態から適宜選択することができる。菌体の場合には、その培養物から遠心分離等の集菌操作によって得られる生菌体、菌体を凍結乾燥した乾燥粉末、微生物を含む培養液のいずれであってもよい。破砕物としては、物理的手段又は化学的手段によって破砕されたものであればよく、物理的手段としては、物理的手段としては、超音波粉砕機、グラスビーズを用いた細胞破砕機などを挙げることができ、化学的手段としては、リゾチームなどの容菌酵素を挙げることができる。物理的手段又は化学的手段を用いて菌体を破砕する場合には、それぞれ破砕物の分解活性を損なわない穏和な条件下で行うことが好ましい。培養上清としては、前述した液体培地中で微生物を培養したものであればよく、培養上清における分解活性の強さから、好ましくは培養２日目以降、更に好ましくは培養３日以降の培養上清を使用することができる。
【００１１】
ポリ乳酸の分解処理は、適当な形態に調製された上記微生物を、好気条件下、処理されるべきポリ乳酸と接触させることによって行われる。分解処理時のｐＨは、ｐＨ４〜１０、分解速度の観点から好ましくはｐＨ６．０〜８．０とすることができる。また分解処理時の温度は、４０℃〜６０℃、ポリ乳酸の処理速度の観点から好ましくは４５〜５５℃とすることができる。処理時間は、５日間〜１５日間、処理効率の観点から好ましくは７日間〜１０日間とすることができる。
また、ポリ乳酸の分解処理を行う際のポリ乳酸の形態は、フィルム（シート）、成型体、破砕物、粉末、懸濁液などを挙げることができ、これらのいずれであってもよい。また分解処理時のポリ乳酸は、上述したようなポリ乳酸単独であってもよく、他のプラスチックとの混合物であってもよい。
【００１２】
分解処理におけるポリ乳酸の量は、対象となるポリ乳酸の形態及び処理に用いる微生物の形態によって異なるが、本菌培養液に１００ｍｌに対して、０．１〜５．０グラムとすることができ、分解速度の観点から０．５〜１．０グラムとすることができる。
処理は、培養槽に、基本培地、処理対象のポリ乳酸、分解能を有する微生物又はその破砕物を配合した粉末、錠剤、培養液を添加することによって行ってもよく、微生物を活性汚泥及びコンポストに組み込むことによって行ってもよい。
この他、ポリ乳酸の分解に適用可能な条件としては、本発明にかかる微生物の活性を損なわない限り、既知の条件をそのまま適用可能である。
【実施例】
【００１３】
以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。
［実施例１］
１．  ポリ乳酸（ＰＬＡ）を分解する微生物の分離
（１）  表１に示す組成のポリ乳酸（ＰＬＡ）含有基本培地を４００ｍｌ調製し、それを等量に分け、一つには寒天を６ｇ添加し加熱滅菌（１２０℃、２０分間）する。加熱滅菌後、寒天を添加していない培地に１６ｍｌのジククロロメタンで溶解したＰＬＡ（レイシアＨ４００、住友化学）を加え、超音波破砕機を用いて十分に乳化（１０分間）させた。この乳化したＰＬＡを、寒天を添加した培地に加え十分攪拌後、シャーレに分注し、ＰＬＡ乳化寒天培地を作製した。
【００１４】
【表１】
2007319078.tif 000002
【００１５】
（２）  森林土壌から、マイクロスパーテルを用いて少量の土壌サンプルを採取し、試験管に分注してある３ｍｌの滅菌水に懸濁する。次に超音波洗浄機で試験管を３０秒間処理して、さらに攪拌機を用いて十分（３分間）に懸濁する。この懸濁液０．１ｍｌを、上記ＰＬＡ乳化寒天培地に塗抹し、５０℃で培養した。この結果、寒天培地上にＰＬＡ分解によるクリアゾーンを形成する微生物Ｔ７−２株を得た。
【００１６】
２．微生物の同定
分離菌株（Ｔ７−２）をＴＳＢ（Becton Dickinson）平板培地に画線し、５０℃にて２４時間培養した。コロニーを楊枝でピックアップし、２０μｌの滅菌蒸留水に懸濁した。楊枝の先で、押しつぶしながら混ぜ、１８０μｌのInstaGene Matrix（BIO-RAD社製）を加えた。手で軽く攪拌し、１００℃で１５分間加熱した。加熱後、１０秒間以上攪拌し、１２，０００ｒｐｍ（１３，０００×ｇ）で２〜３分間遠心した。上澄み２０μｌを５０μｌスケールのＰＣＲテンプレートとして用いた。
【００１７】
Ｔ７−２株の１６ＳｒＤＮＡ遺伝子の増幅は、後述する表４に記載した９Ｆ（配列番号１）及び１５４１Ｒ（配列番号２）をプライマーとして行った。サーマルサイクラーは、TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Standard（タカラバイオ株式会社）を使用した。ポリメラーゼには、Hot Star Taq DNA polymerase（株式会社キアゲン）を使用した。反応液の組成は以下のとおりとし、ＰＣＲ反応を、９６℃５分間を１サイクル、９７℃４５秒間、５０℃３０秒間、７４℃１分間の一連の処理を５サイクル、９６℃４５秒間、５０℃３０秒間、７４℃１分間の一連の処理を２５サイクルとして行い、ＰＣＲ産物は、PCR Purification Kit -Spin Type- （BIONEX社製）を用いて精製した。
【００１８】
【表２】
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【００１９】
ＤＮＡシークエンスはダイターミネーター法により行った。塩基配列の決定には、ABI PRISM 3100 DNA Sequencer（Applied Biosystems社）を使用した。サイクルシークエンス、シークエンシング産物の精製、シークエンス条件についてはマニュアルの方法に従い、以下の方法で行った。
（１）シーケンスサンプルの調製
シーケンスサンプルの調製は、専用キットBigGye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems社製）を使用し、シーケンスには、表４に記載した９Ｆ、７８５Ｆ（配列番号３）、８０２Ｒ（配列番号４）を使用した。サイクルシークエンス条件及びサンプル調製方法はマニュアルの方法を一部改変し、表３に示す反応液を用いて、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ条件は、９６℃１分間を１サイクル、９６℃１０秒間、５０℃５秒間、６０℃４分間の一連の処理を２５サイクルとした。
【００２０】
【表３】
2007319078.tif 000004
【００２１】
【表４】
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【００２２】
（２）シークエンシングサンプルの精製
上記で得られたサンプルに、Clean SEQ（Agencourt社製）１０μｌを混ぜながら添加した。６２μｌの８５％エタノールを添加して、ピペッティング後、磁気プレート上に置き、３分間静止した。透明になっていることを確認して溶液を廃棄した。８５％エタノールを１００μｌ添加し、３０秒静置した。溶液を廃棄し、同操作を繰り返した。３７℃で１０分間インキュベートし、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を４０μｌ加えて、５分間静置した。
【００２３】
１６Ｓ ｒＤＮＡ部分塩基配列の決定および系統解析は以下のとおりに行った。各プライマーから得られた塩基配列は、Genetix-ATGC ver.10.1（Software development 社製）で編集し、１６Ｓ ｒＤＮＡ部分塩基配列を決定した（図１）。決定された塩基配列を、大学共同利用機関法人  情報・システム研究機構  国立遺伝学研究所  日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ：http://www.ddbj.nig.ac.jp/）よりＢＬＡＳＴ検索を行った。ＢＬＡＳＴ検索の結果から、Ｔ７−２株はバチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）と推定した。
【００２４】
３．Ｔ７−２株によるＰＬＡ分解
上記で得られたＴ７−２株のＰＬＡ分解能を調べた。上記１で使用したＰＬＡ乳化寒天培地に、Ｔ７−２株を移植し、５０℃で５日間培養した。結果を図２に示す。５０℃５日間後の培地には、Ｔ７−２株による直径約３．１センチのクリアゾーンが形成された。
また、５０℃３日間の培養では、Ｔ７−２株はＰＬＡ乳化寒天培地上に直径約２センチのクリアゾーンが形成した。従来のＰＬＡ分解活性性微生物（ストレプトアロテイカス・ヒンズスタヌス、サッカロモノスポラ・アズレア、キブデロスポランギウム・アリズム、サッカロポリスポラ・エリスラエ、サッカロポリスポラ・ホルデイ、ストレプトアロテイカス・ヒンズスタヌス、レントゼア・アルビドカピラタ、アクチノキネオスポラ・リパリア、アクチノポリスポラ・ハロフィラ、アクチノポリスポラ・モルチバリス、アクチノマデュラ・ビィリディス、ストレプトマイセス・ビオァセウスニガー、ストレプトマイセス・シアネス、アミコラトプシス・メディテラネイ）が同程度のクリアゾーンを形成するのに２週間かかることから、Ｔ７−２株によるＰＬＡ分解活性は従来の菌株よりも優れていることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明のＴ７−２株の１６Ｓ ｒＤＮＡ部分塩基配列である。
【図２】本発明のＴ７−２株によるＰＬＡ分解活性を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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