(57)【要約】【課題】ピコルナウィルスファミリーに属するウィルスの感染に対するＩ型インターフェロンの応答が欠失した、ピコルナウィルス特異的Ｉ型インターフェロン不応答性非ヒトモデル動物や、このＩ型インターフェロン不応答性非ヒトモデル動物を利用した抗ピコルナウィルス剤の同定方法などを提供すること。【解決手段】ＭＤＡ５（Melanoma differentiation associated gene-5）をコードする内在性遺伝子の全部又は一部を破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化し、ＭＤＡ５を発現する機能を喪失させた非ヒト動物を、ピコルナウィルスファミリーに属するウィルスの感染に対するＩ型インターフェロンの応答が欠失したＩ型インターフェロン不応答性非ヒトモデル動物として使用する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＤＡ５（Melanoma differentiation associated gene-5）をコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部を破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化し、ＭＤＡ５を発現する機能を喪失させた非ヒト動物であって、ピコルナウィルスファミリーに属するウィルスの感染に対するＩ型インターフェロンの応答が欠失したＩ型インターフェロン不応答性非ヒトモデル動物。
【請求項２】
非ヒトモデル動物が、モデルマウスであることを特徴とする請求項１記載の非ヒトモデル動物。
【請求項３】
ＭＤＡ５（Melanoma differentiation associated gene-5）をコードする内在性遺伝子の全部又は一部を破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化し、ＭＤＡ５を発現する機能を喪失させた非ヒト動物を、ピコルナウィルスファミリーに属するウィルスの感染に対するＩ型インターフェロンの応答が欠失したＩ型インターフェロン不応答性非ヒトモデル動物として使用する方法。
【請求項４】
非ヒトモデル動物が、モデルマウスであることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
ＭＤＡ５（Melanoma differentiation associated gene-5）をコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部を破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化し、ＭＤＡ５を発現する機能を喪失させた非ヒト動物に、ピコルナウィルスファミリーに属するウィルスを感染させ、ウィルス感染の前後又は同時に被検物質を投与し、前記非ヒト動物におけるＩ型インターフェロン、ＲＡＮＴＥＳ又はＩＬ−６の産生量を測定し、Ｉ型インターフェロン、ＲＡＮＴＥＳ又はＩＬ−６の産生が認められた場合、前記被検物質を抗ピコルナウィルス剤と評価することを特徴とする抗ピコルナウィルス剤の同定方法。
【請求項６】
非ヒト動物と同種の野生型動物におけるＩ型インターフェロン、ＲＡＮＴＥＳ又はＩＬ−６の産生量と比較・評価することを特徴とする請求項５記載の同定方法。
【請求項７】
非ヒト動物が、マウスであることを特徴とする請求項５又は６記載の同定方法。
【請求項８】
ＭＤＡ５（Melanoma differentiation associated gene-5）をコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部を破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化し、ＭＤＡ５を発現する機能を喪失させた非ヒト動物に、ピコルナウィルスファミリーに属する心筋炎ウィルス（ＥＭＣＶ）を感染させ、ＥＭＣＶ感染の前後又は同時に被検物質を投与し、前記非ヒト動物の心臓の組織学的分析を行い、心筋細胞の病巣壊死の抑制が認められた場合、前記被検物質を抗ＥＭＣＶ剤と評価することを特徴とする抗ＥＭＣＶ剤の同定方法。
【請求項９】
非ヒト動物と同種の野生型動物における心筋細胞の病巣壊死の抑制の程度と比較・評価することを特徴とする請求項８記載の同定方法。
【請求項１０】
非ヒト動物が、マウスであることを特徴とする請求項８又は９記載の同定方法。
【請求項１１】
ＭＤＡ５（Melanoma differentiation associated gene-5）をコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部を破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化し、ＭＤＡ５を発現する機能を喪失させた非ヒト動物由来の細胞に、ピコルナウィルスファミリーに属するウィルスを感染させ、ウィルス感染の前後又は同時に被検物質を前記細胞に接触させ、前記非ヒト動物由来の細胞におけるＩ型インターフェロン、ＲＡＮＴＥＳ又はＩＬ−６の産生量を測定し、Ｉ型インターフェロン、ＲＡＮＴＥＳ又はＩＬ−６の産生が認められた場合、前記被検物質を抗ピコルナウィルス剤と評価することを特徴とする抗ピコルナウィルス剤の同定方法。
【請求項１２】
非ヒト動物と同種の野生型動物由来の細胞におけるＩ型インターフェロン、ＲＡＮＴＥＳ又はＩＬ−６の産生量と比較・評価することを特徴とする請求項１１記載の同定方法。
【請求項１３】
非ヒト動物が、マウスであることを特徴とする請求項１１又は１２記載の同定方法。
【請求項１４】
細胞が、胚線維芽細胞又は樹状細胞であることを特徴とする請求項１１〜１３のいずれか記載の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＤＡ５（Melanoma differentiation associated gene-5）を発現する機能を喪失させた非ヒト動物を、ピコルナウィルスファミリーに属するウィルスの感染に対するＩ型インターフェロンの応答が欠失したＩ型インターフェロン不応答性非ヒトモデル動物として使用する方法や、Ｉ型インターフェロン不応答性非ヒトモデル動物や、このＩ型インターフェロン不応答性非ヒトモデル動物を利用した抗ピコルナウィルス剤の同定方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
ウィルスやバクテリア等の微生物病原体に対する自然免疫応答は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）及びヘリカーゼファミリーメンバーのような宿主パターン認識受容体（ＰＲＲ）が、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と呼ばれる侵入病原体の特異構造を認識することによって惹起される（例えば、非特許文献１及び非特許文献２参照）。宿主パターン認識受容体（ＰＲＲ）は、ＤＮＡ、一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡ、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ及び糖タンパク質を含むウィルスに特異的な分子パターンの認識に不可欠の役割を果たしている。エンドソーム膜に局在するＴＬＲ３は、合成ｄｓＲＮＡアナログであるポリイノシン−ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）に加えてウィルスのｄｓＲＮＡも認識することが知られている。また、細胞質タンパク質であるＲＩＧ−Ｉ（Retinoic acid-inducible protein-I）及びヘリカードとしても知られるＭＤＡ−５（Melanoma differentiation associated gene-5）は、ｄｓＲＮＡディテクターとして同定されている。ＲＩＧ−Ｉは、カスパーゼをリクルートするドメイン（ＣＡＲＤ）様モジュールを２個有するＤＥｘＤ／Ｈｂｏｘ型ＲＮＡヘリカーゼである。へリカーゼドメインは、ｄｓＲＮＡの認識に関与していると考えられ、ＣＡＲＤは、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７及びＮＦ−κＢの活性化を導くダウンストリームシグナル伝達の開始に必須であることが報告されている（例えば、非特許文献３参照）。また、ＲＩＧ−Ｉ欠損マウスは、水疱性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）、ニューカッスル病ウィルス（ＮＤＶ）及びセンダイウィルス（ＳｅＶ）の感染に対して、一貫してＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）を産生しないことが報告されている（例えば、非特許文献４参照）。さらに、ウィルス感染に応答したＩＲＦ３及びＮＦ−κＢの活性化は、ＲＩＧ−Ｉ欠損細胞で障害されていた。また、ＭＤＡ−５は、ＲＩＧ−Ｉに類似した構造を有し、抗ウィルス応答の媒介に関与していることが報告されている（例えば、非特許文献５及び非特許文献６参照）。
【０００３】
ＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ５は、ウィルスｄｓＲＮＡの認識に関与することが示唆されるものの、インビボでのこれらｄｓＲＮＡディテクター間の機能的関係に加え、ＭＤＡ５の機能的役割については知られていない。このようにｄｓＲＮＡディテクターの明確な機能が解明されていないため、哺乳動物において、これらの作用に基づくインターフェロン応答を抑えることはできなかった。
【０００４】
【非特許文献１】Annu Rev Immunol.20, 197-216, 2002
【非特許文献２】Annu Rev Immunol. 21,335-376, 2003
【非特許文献３】Nat Immunol. 5, 730-737, 2004参照
【非特許文献４】Immunity Vol.23 19-28 July 2005
【非特許文献５】Curr Biol. 12, 838-843, 2002
【非特許文献６】Proc Natl Acad Sci USA. 101, 17264-17269, 2004
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、ピコルナウィルスファミリーに属するウィルスの感染に対するＩ型インターフェロンの応答が欠失した、ピコルナウィルス特異的Ｉ型インターフェロン不応答性非ヒトモデル動物や、このＩ型インターフェロン不応答性非ヒトモデル動物を利用した抗ピコルナウィルス剤の同定方法などを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、まず、インビボでのＭＤＡ５の機能的役割を調べるため、ＭＤＡ５−／−マウスを確立した。このＭＤＡ５−／−マウス由来の線維芽細胞、及び樹状細胞はピコルナウィルスファミリーに属する脳心筋炎ウィルス（ＥＭＣＶ）や、タイラーウィルス（Theiler’s virus）の感染に対するＩ型インターフェロン応答が欠如していたが、他のＲＮＡウィルスに対する応答性は正常であった。このように、ＭＤＡ５がピコルナウィルス属のウィルスを特異的に認識し、Ｉ型インターフェロン産生を誘導する受容体であることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、（１）ＭＤＡ５（Melanoma differentiation associated gene-5）をコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部を破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化し、ＭＤＡ５を発現する機能を喪失させた非ヒト動物であって、ピコルナウィルスファミリーに属するウィルスの感染に対するＩ型インターフェロンの応答が欠失したＩ型インターフェロン不応答性非ヒトモデル動物や、（２）非ヒトモデル動物が、モデルマウスであることを特徴とする上記（１）記載の非ヒトモデル動物や、（３）ＭＤＡ５（Melanoma differentiation associated gene-5）をコードする内在性遺伝子の全部又は一部を破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化し、ＭＤＡ５を発現する機能を喪失させた非ヒト動物を、ピコルナウィルスファミリーに属するウィルスの感染に対するＩ型インターフェロンの応答が欠失したＩ型インターフェロン不応答性非ヒトモデル動物として使用する方法や、（４）非ヒトモデル動物が、モデルマウスであることを特徴とする上記（３）記載の方法に関する。
【０００８】
また本発明は、（５）ＭＤＡ５（Melanoma differentiation associated gene-5）をコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部を破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化し、ＭＤＡ５を発現する機能を喪失させた非ヒト動物に、ピコルナウィルスファミリーに属するウィルスを感染させ、ウィルス感染の前後又は同時に被検物質を投与し、前記非ヒト動物におけるＩ型インターフェロン、ＲＡＮＴＥＳ又はＩＬ−６の産生量を測定し、Ｉ型インターフェロン、ＲＡＮＴＥＳ又はＩＬ−６の産生が認められた場合、前記被検物質を抗ピコルナウィルス剤と評価することを特徴とする抗ピコルナウィルス剤の同定方法や、（６）非ヒト動物と同種の野生型動物におけるＩ型インターフェロン、ＲＡＮＴＥＳ又はＩＬ−６の産生量と比較・評価することを特徴とする上記（５）記載の同定方法や、（７）非ヒト動物が、マウスであることを特徴とする上記（５）又は（６）記載の同定方法に関する。
【０００９】
さらに本発明は、（８）ＭＤＡ５（Melanoma differentiation associated gene-5）をコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部を破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化し、ＭＤＡ５を発現する機能を喪失させた非ヒト動物に、ピコルナウィルスファミリーに属する心筋炎ウィルス（ＥＭＣＶ）を感染させ、ＥＭＣＶ感染の前後又は同時に被検物質を投与し、前記非ヒト動物の心臓の組織学的分析を行い、心筋細胞の病巣壊死の抑制が認められた場合、前記被検物質を抗ＥＭＣＶ剤と評価することを特徴とする抗ＥＭＣＶ剤の同定方法や、（９）非ヒト動物と同種の野生型動物における心筋細胞の病巣壊死の抑制の程度と比較・評価することを特徴とする上記（８）記載の同定方法や、（１０）非ヒト動物が、マウスであることを特徴とする上記（８）又は（９）記載の同定方法や、（１１）ＭＤＡ５（Melanoma differentiation associated gene-5）をコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部を破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化し、ＭＤＡ５を発現する機能を喪失させた非ヒト動物由来の細胞に、ピコルナウィルスファミリーに属するウィルスを感染させ、ウィルス感染の前後又は同時に被検物質を前記細胞に接触させ、前記非ヒト動物由来の細胞におけるＩ型インターフェロン、ＲＡＮＴＥＳ又はＩＬ−６の産生量を測定し、Ｉ型インターフェロン、ＲＡＮＴＥＳ又はＩＬ−６の産生が認められた場合、前記被検物質を抗ピコルナウィルス剤と評価することを特徴とする抗ピコルナウィルス剤の同定方法や、（１２）非ヒト動物と同種の野生型動物由来の細胞におけるＩ型インターフェロン、ＲＡＮＴＥＳ又はＩＬ−６の産生量と比較・評価することを特徴とする上記（１１）記載の同定方法や、（１３）非ヒト動物が、マウスであることを特徴とする上記（１１）又は（１２）記載の同定方法や、（１４）細胞が、胚線維芽細胞又は樹状細胞であることを特徴とする上記（１１）〜（１３）のいずれか記載の同定方法に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明において、ＭＤＡ５がピコルナウィルスファミリーのウィルスを特異的に認識していることを明らかにした。ＭＤＡ５はヘリカーゼであり、この機能を調節することで、このグループに属するウィルス群、例えばポリオウィルス、コクサッキーウィルス、風邪症候群の原因であるライノウィルスなどの感染制御が可能になる可能性がある。また、ＭＤＡ５−／−マウスはヒトウィルス受容体を発現する遺伝子変異マウスと交配させることによりヒトウィルス感染症のモデルマウスとして利用されることが期待される。さらに、ＭＤＡ５の活性を制御する薬剤をＭＤＡ５欠損（ＭＤＡ５−／−）マウス、及びコントロール（野生型）マウスを用いてスクリーニングすることができ、例えばポリオウィルス受容体を発現するマウスと交配させ、ポリオウィルス感染感受性のモデル動物となりうる。このマウスを用いて新しい薬剤のスクリーニングに利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の非ヒトモデル動物としては、ＭＤＡ５をコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部を破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化し、ＭＤＡ５を発現する機能を喪失させた非ヒト動物であって、ピコルナウィルスファミリーに属するウィルスの感染に対するＩ型インターフェロンの応答が欠失したＩ型インターフェロン不応答性の非ヒト動物であれば特に制限されず、また、本発明の方法としては、ＭＤＡ５をコードする内在性遺伝子の全部又は一部を破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化し、ＭＤＡ５を発現する機能を喪失させた非ヒト動物を、ピコルナウィルスファミリーに属するウィルスの感染に対するＩ型インターフェロンの応答が欠失したＩ型インターフェロン不応答性非ヒトモデル動物として使用する方法であれば特に制限されず、上記Ｉ型インターフェロンとしては、ＩＦＮ−αやＩＦＮ−βを具体的に例示することができる。
【００１２】
本発明においてＩ型インターフェロン不応答性とは、ピコルナウィルスファミリーに属するウィルスによる感染（刺激）に対する生体又は生体を構成する細胞、組織若しくは器官のＩ型インターフェロン産生反応性が低下しているか、あるいはほぼ失われていることを意味する。したがって、本発明においてＩ型インターフェロン不応答性非ヒトモデル動物とは、ピコルナウィルスファミリーに属するウィルスによる感染に対して、生体又は生体を構成する細胞、組織若しくは器官のＩ型インターフェロン産生反応性が低下しているか、あるいはほぼ失われているマウス、ラット、ウサギ等のヒト以外の動物をいう。これらの中でも、Ｉ型インターフェロン不応答性モデルマウスを好適に例示することができる。本発明のＩ型インターフェロン不応答性非ヒトモデル動物は、Ｉ型インターフェロン不応答性に加えて、ＲＡＮＴＥＳやＩＬ−６に対しても不応答性であることが好ましい。
【００１３】
ピコルナウィルスファミリー（Picornaviridae）に属するウィルスは、一本のプラス鎖ＲＮＡをゲノムとしてもつＲＮＡウィルスで、エンベロープを持たず、正２０面体のカプシドを有し、小さなＲＮＡ（pico-rna）を持つという意味で名付けられたこのピコルナウィルスファミリーに属するウィルスとしては、ポリオウィルス、コクサッキーウィルス、エコーウィルスなどのエンテロウィルス属（Enterovirus）に属するウィルスや、ヒトライノウィルス、メンゴウィルスなどのライノウィルス属（Rhinovirus）に属するウィルスや、脳心筋炎ウィルス（ＥＭＣＶ）などのカーディオウィルス属（Cardiovirus）に属するウィルスや、口蹄疫ウィルスなどのアフトウィルス属（Aphthovirus）に属するウィルスや、Ａ型肝炎ウィルスなどのヘパトウィルス属（Hepatovirus）に属するウィルスや、Human parechovirusなどのParechovirus属に属するウィルスを挙げることができる。
【００１４】
本発明のＭＤＡ５を発現する機能を喪失した非ヒト動物として、ＭＤＡ５−／−マウスの他、例えばＭＤＡ５遺伝子の機能が欠損したＭＤＡ５−／−ラット等の齧歯目動物を例示することができる。これらＭＤＡ５遺伝子の機能が欠損した非ヒト動物としては、メンデルの法則に従い出生してくるＭＤＡ５−／−非ヒト動物が、正確な比較実験をすることができる同腹の野生型と共に得ることができる点で好ましい。かかるＭＤＡ５遺伝子の機能が欠損した動物の作製方法を、ＭＤＡ５−／−マウスを例にとって以下説明する。
【００１５】
ＭＤＡ５遺伝子は、マウス遺伝子ライブラリーをＰＣＲ法等により増幅し、得られた遺伝子断片をマウスＭＤＡ５遺伝子由来のプローブを用いてスクリーニングすることができる。スクリーニングされたＭＤＡ５遺伝子は、プラスミドベクター等を用いてサブクローンし、制限酵素マッピング及びＤＮＡシーケンシングにより特定することができる。次に、このＭＤＡ５をコードする遺伝子の全部又は一部をｐＭＣ１ネオ遺伝子カセット等に置換し、３'末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入することによって、ターゲットベクターを作製する。
【００１６】
この作製されたターゲティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質により相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を選択する。また、この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。その確認されたＥＳ細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型マウスと交雑させると、ヘテロ接合体マウス（Ｆ１マウス；ＭＤＡ５＋／−）を得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスを交雑させることによって、本発明のＭＤＡ５−／−マウスを作製することができる。また、ＭＤＡ５−／−マウスにおいて、ＭＤＡ５が生起しているかどうかを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスからＲＮＡを単離してノーザンブロット法等により調べたり、またこのマウスにおけるＭＤＡ５の発現をウエスタンブロット法等により調べる方法がある。
【００１７】
また、作出されたＭＤＡ５−／−マウスがＩ型インターフェロン不応答性であることは、例えば、ピコルナウィルスファミリーに属するウィルスをＭＤＡ５−／−マウスのマクロファージ、単核細胞、樹状細胞などの免疫細胞や胚線維芽細胞にインビトロ又はインビボで感染せしめ、かかる細胞におけるＩ型インターフェロン、ＩＬ−６、ＲＡＮＴＥＳ等の産生量を測定することにより確認することができる。
【００１８】
本発明の抗ピコルナウィルス剤の同定方法としては、ＭＤＡ５をコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部を破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化し、ＭＤＡ５を発現する機能を喪失させた非ヒト動物に、ピコルナウィルスファミリーに属するウィルスを感染させ、ウィルス感染の前後又は同時に被検物質を投与し、前記非ヒト動物におけるＩ型インターフェロン、ＲＡＮＴＥＳ又はＩＬ−６の産生量を測定し、Ｉ型インターフェロン、ＲＡＮＴＥＳ又はＩＬ−６の産生が認められた場合、前記被検物質を抗ピコルナウィルス剤と評価する方法や、ＭＤＡ５をコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部を破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化し、ＭＤＡ５を発現する機能を喪失させた非ヒト動物由来の細胞に、ピコルナウィルスファミリーに属するウィルスを感染させ、ウィルス感染の前後又は同時に被検物質を前記細胞に接触させ、前記非ヒト動物由来の細胞におけるＩ型インターフェロン、ＲＡＮＴＥＳ又はＩＬ−６の産生量を測定し、Ｉ型インターフェロン、ＲＡＮＴＥＳ又はＩＬ−６の産生が認められた場合、前記被検物質を抗ピコルナウィルス剤と評価する方法であれば特に制限されず、本発明の抗ピコルナウィルス剤の同定方法を利用すると、抗ピコルナウィルス剤をスクリーニングすることもできる。かかる本発明の同定方法の実施の形態を以下に例を挙げて説明する。
【００１９】
本発明のＩ型インターフェロン不応答性非ヒトモデル動物から得られる樹状細胞等の免疫細胞や胚線維芽細胞と、被検物質と、ピコルナウィルスファミリーに属するウィルスとを共に培養し、前記細胞におけるＩ型インターフェロン産生の程度を測定・評価する同定方法や、本発明のＩ型インターフェロン不応答性非ヒトモデル動物に被検物質をあらかじめ投与した後、該非ヒト動物から得られる免疫細胞にピコルナウィルスファミリーに属するウィルスを感染させ、該免疫細胞におけるＩ型インターフェロン産生の程度を測定・評価する同定方法や、本発明のＩ型インターフェロン不応答性非ヒトモデル動物にピコルナウィルスファミリーに属するウィルスをあらかじめ感染した後、該非ヒト動物から得られる免疫細胞を被検物質の存在下で培養し、該免疫細胞におけるＩ型インターフェロン産生の程度を測定・評価する同定方法や、本発明のＩ型インターフェロン不応答性非ヒトモデル動物にピコルナウィルスファミリーに属するウィルスを感染させ、感染と同時又は前後して被検物質を投与し、該非ヒトモデル動物から得られる免疫細胞におけるＩ型インターフェロン産生の程度を測定・評価する同定方法や、本発明のＩ型インターフェロン不応答性非ヒトモデル動物にピコルナウィルスファミリーに属するウィルスを感染させ、感染と同時又は前後して被検物質を投与し、該非ヒトモデル動物から得られる血清中のＩ型インターフェロン産生の程度を測定・評価する同定方法を挙げることができる。上記Ｉ型インターフェロン産生の程度を測定する代わりに、ＲＡＮＴＥＳ又はＩＬ−６の産生の程度を測定することもでき、また、評価に際しては、非ヒト動物と同種の野生型動物、中でも同腹の仔におけるＩ型インターフェロン、ＲＡＮＴＥＳ又はＩＬ−６の産生量と比較・評価することが好ましい。
【００２０】
本発明の抗ＥＭＣＶ剤の同定方法としては、ＭＤＡ５（Melanoma differentiation associated gene-5）をコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部を破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化し、ＭＤＡ５を発現する機能を喪失させた非ヒト動物に、ピコルナウィルスファミリーに属する心筋炎ウィルス（ＥＭＣＶ）を感染させ、ＥＭＣＶ感染の前後又は同時に被検物質を投与し、前記非ヒト動物の心臓の組織学的分析を行い、心筋細胞の病巣壊死の抑制が認められた場合、前記被検物質を抗ＥＭＣＶ剤と評価する同定方法であれば特に制限されず、本発明の抗ＥＭＣＶ剤の同定方法を利用すると、抗ＥＭＣＶ剤をスクリーニングすることもできる。また、評価に際しては、非ヒト動物と同種の野生型動物、中でも同腹の仔における心筋細胞の病巣壊死の抑制の程度を比較・評価することが好ましい。
【００２１】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例】
【００２２】
［材料と方法］
（１）ＭＤＡ５−／−マウスの作製
ＰＣＲにより、ＥＳ細胞（ＧＳＩ−Ｉ）から抽出したゲノムＤＮＡからＭＤＡ５遺伝子を単離した。ＭＤＡ５ＯＲＦ（ＤＥｘＨ  ｂｏｘを含む）をコードする４．３−ｋｂの断片をネオマイシン耐性遺伝子カセット（neo）で置換することによりターゲティングベクターを構築し、ＰＧＫプロモーターにより動かされた単純ペルペスウィルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）を、ネガティブ選択のため、ゲノム断片に挿入した。ターゲティングベクターをＥＳ細胞にトランスフェクトした後、Ｇ４１８とガンシクロビアの二重耐性コロニーを選択し、ＰＣＲによりスクリーニングし、さらにサザンブロットによって確認した。相同組換体を雌のＣ５７ＢＬ／６マウスにマイクロインジェクションし、ＭＤＡ５−／−マウスを得るために、ヘテロ接合体のＦ１子孫をインタークロスした。
【００２３】
（２）ＭｙＤ８８−／−マウス、ＴＲＩＦ−／−マウス、ＴＬＲ３−／−、ＴＲＩＦ−／−マウス及びＲＩＧ−Ｉ−／−マウスの作製
ＭｙＤ８８−／−マウス、ＴＬＲ３−／−マウス、ＴＲＩＦ−／−マウスについては、文献Sceience 301, 640-3 （2003）に記載の方法により作製した。また、ＩＦＮα／βＲ−／−マウスは、Int Immunol 14 1225-31（2002）に記載の方法により作製した。さらに、ＩＣＲマウスとの交配により、ＲＩＧ−Ｉ−／−成体マウスを作製した。
【００２４】
（３）ＲＩＧ−Ｉ−／−ＭＤＡ５−／−マウスの作製
ＲＩＧ−Ｉヘテロ接合体（ＲＩＧ−Ｉ＋／−）マウスとＭＤＡ５ヘテロ接合体（ＭＤＡ５＋／−）マウスとを交配すると、その子はＲＩＧ−Ｉ＋／＋ＭＤＡ５＋／＋、ＲＩＧ−Ｉ＋／−ＭＤＡ５＋／＋、ＲＩＧ−Ｉ＋／＋ＭＤＡ５＋／−、ＲＩＧ−Ｉ＋／−ＭＤＡ５＋／−のどれかとなる。この遺伝子型はマウス尾より抽出したゲノムＤＮＡを用い、ＰＣＲ法もしくはサザンブロット法を用いることにより同定することが出来る。このうち、ＲＩＧ−Ｉ＋／−ＭＤＡ５＋／−の遺伝子型のマウス間同士で交配させることにより、ＲＩＧ−Ｉ＋／＋ＭＤＡ５＋／＋、ＲＩＧ−Ｉ＋／−ＭＤＡ５＋／＋、ＲＩＧ−Ｉ＋／＋ＭＤＡ５＋／−、ＲＩＧ−Ｉ＋／−ＭＤＡ５＋／−、ＲＩＧ−Ｉ−／−ＭＤＡ５＋／＋、ＲＩＧ−Ｉ−／−ＭＤＡ５＋／−、ＲＩＧ−Ｉ＋／＋ＭＤＡ５−／−、ＲＩＧ−Ｉ＋／−ＭＤＡ５−／−、ＲＩＧ−Ｉ−／−ＭＤＡ５−／−、のどれかとなる。このうち、ＲＩＧ−Ｉ−／−ＭＤＡ５−／−マウスをＰＣＲ法もしくはサザンブロット法により同定した。
【００２５】
（４）細胞、試薬及びウィルス
ＲＩＧ−Ｉ−／−ＭＥＦ及び骨髄由来ＧＭＣＳＦ又はＦｌｔ３Ｌ−ＤＣの作製については、文献Immunity 23, 19-28 （2005）記載のとおり作製した。Miltenyi Biotech社製の抗Ｂ２２０及びＣＤ１１ｃマイクロビーズを用いたＭＡＣＳにより、Ｆｌｔ３Ｌ−ＤＣからｐＤＣ及びｃＤＣを前述のとおり単離した。ポリ（Ｉ：Ｃ）は、Amersham Biosciences社から購入した。抗ＭＤＡ５ポリクローナル抗体は、マウスＭＤＡ５のアミノ酸１００５−１０１９に対応して作製された。ＮＣＶ、ＶＳＶ、インフルエンザウィルス、ΔＮＳ１、ＪＥＶ、ＥＭＣＶ、タイラーウィルス、及びメンゴウィルスは、それぞれ文献に記載されている方法で作製した。ＳｅＶ（Ｖ−）及び（Ｃｍ）変異体は、Dr. A. Katoから供与されたものを使用した。
【００２６】
（５）ノーザンブロット
１０００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−βを用いて又は用いずに、ＰＥＣを８時間処理し、TRIzol試薬（Invitrogen社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを電気泳動にかけ、ナイロン膜に転写した後、表示のｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。ＭＤＡ５  ｍＲＮＡの発現を検出するため、３０８ｂｐの断片（７７７−１０８４）をプローブとして使用した。同じ膜をβアクチンプローブと再度ハイブリダイズさせた。
【００２７】
（６）ウェスタンブロット
１０００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−βでＭＥＦを８時間処理した。その後、１．０％のNonidet-P40、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche社製）を含む溶解緩衝液中で細胞を溶解した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで細胞溶解物を溶解し、ＰＶＤＦ膜に転写した。かかる膜をＭＤＡ５タンパク質の特異抗体でブロットし、増強した化学発光システム（Perkinermer社製）により視覚化した。
【００２８】
（７）組織学的分析
ＥＭＣＶ感染マウスから心臓を採取し、３．７％のホルムアルデヒドで固定した。心臓全体にわたって横断面の切片（５μｍ）を切り出し、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。
【００２９】
（８）プラークアッセイ
ＥＭＣＶ感染マウスの心臓をＰＢＳ中でホモジナイズした。ＰＢＳ含有ウィルスにおけるウィルス滴定を、前述のとおりに標準プラークアッセイで確認した。調製したＨｅＬａ細胞を連続希釈物に感染させた。１％の低融点アガロースを含むＤＭＥＭを細胞に重ね、４８時間インキュベーションした。その後、プラークを計数した。
【００３０】
（９）ルシフェラーゼアッセイ
胎生１１．５日で野生型又はＲＩＧ−Ｉ−／−ＭＤＡ５−／−胚から得たＭＥＦを、空のベクター（コントロール）、ＲＩＧ−Ｉ又はＭＤＡ５発現ベクターと共にＩＦＮ−βプロモーターを含むレポーターコンストラクトで一時的にトランスフェクトした。内部コントロールとして、ウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼコンストラクトをトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞には模擬処理（Mock）を行うか、又はｍｏｉを次第に増大させたＥＭＣＶに、若しくはＳＶｃ−（ｍｏｉ＝２０）に２４時間感染させた。細胞を溶解させて、二重ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Promega社製）を用いたルシフェラーゼアッセイにかけた。
【００３１】
（１０）ＩＦＮ−α、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−６及びＲａｎｔｅｓ生成の測定
培養上清液を回収し、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）でＩＦＮ−α、ＩＬ−６又はＩＬ−１２ｐ４０の生成を分析した。マウスＩＦＮ−α用のＥＬＩＳＡキットはPBL Biomedical Laboratories社から購入し、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、及びＲａｎｔｅｓ用のＥＬＩＳＡキットは、R & D Systems社から入手した。
【００３２】
（１１）フローサイトメトリー
マウスの静脈内に２００μｇのポリＩ：Ｃを注入し、注入から２４時間後にマウスを処分した。前述のとおり、コラゲナーゼ及びＤＮａｓｅＩを用いてマウスから脾細胞を調製した。ＣＤ８６−ＦＩＴＣ（BD Biosciences Pharmingen社製）、Ｂ２２０−ＰＥ、及びＣＤ１１ｃ−ＡＰＣで脾細胞を染色し、FACS Calibur（BD Bioscience社製）で分析した。
【００３３】
（１２）インビトロ転写ｄｓＲＮＡの調製
マウスLamin A/CのｃＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅し、ｐＴ７ブルーＴベクター（Novagen社製）にてクローン化し、配列決定した。以下のＴ７配列でタグしたプライマーを用いた別のＰＣＲ反応により、マウスLamin A/Cに対応する２００及び４００ｂｐのＤＮＡ配列の末端に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターをタグした；
７Ｔ Lamin. フォワード、ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧａｃｔｔｇｔｔｇｇｃｔｇｃｇｃａｇｇｃ
７Ｔ Lamin. ２００リバース、ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧｃｃａｃｔｃｇｃｃｔｃａｇｃａｔｃｔｃａｔ
７Ｔ Lamin. ４００リバース、ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧｃｔｇｔｔｃｃａｃｃｔｇｇｔｃｃｔｃａｔｇ
ＰＣＴ産物をゲル精製し、T7 RiboMAXTMExpress RNAi System（Promega社製）を製造者の説明書どおりに用いてのｄｓＲＮＡのインビトロ転写及び作製に使用した。
【００３４】
（１３）心エコー検査
２．５％のアベルチン（８μｌ／ｇ）で麻酔をかけたマウスに対し、超音波検査（SONOS-5500、１５−ＭＨｚの線形変換器を装備、Philips Medical Systems社製）を用いて心エコー検査を行った。心臓は、二次元胸骨傍短軸像で映し出され、心室中央部（midventricle）のＭモードによる心エコー図を乳頭筋のレベルで記録した。ＬＶの心拍数、前壁及び後壁の厚さ、並びに拡張終期及び収縮末期の内径をＭモードによる画像から得た。
【００３５】
［結果］
インビボでのＭＤＡ５の機能的役割を調べるため、ＭＤＡ５−／−マウスを確立し、ウィルス認識に対するＭＤＡ５の寄与を分析した（図１ａ及び１ｂ参照）。ＭＤＡ５のｍＲＮＡの発現は、ＭＤＡ５タンパク質の場合と同様に、ＭＤＡ５−／−細胞では検出されなかった（図１ｃ及び１ｄ参照）。その多くが胚期に死亡するＲＩＧ−Ｉ−／−マウスとは対照的に、ＭＤＡ５−／−マウスはメンデル比にしたがって誕生して健康に成長し、２４週齢まで巨視的な発達異常は認められなかった。脾臓及びリンパ節におけるＣＤ３、Ｂ２２０、ＣＤ１１ｃのフローサイトメトリー分析により、野生型とＭＤＡ５−／−マウスとの間には、リンパ球及び樹状細胞の数において変化がないことを確認した。
【００３６】
ＴＬＲ３、ＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ５は、ポリＩ：Ｃの認識及びその後の抗ウィルス応答の誘導に関与しているとされている。しかし、ｄｓＲＮＡ刺激に対する応答におけるこれらの分子のインビボでの寄与については、まだ明らかにされていない。したがって、本発明者らは次に、ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ−５、ＴＲＩＦ、又はＭＤＡ−５とＴＲＩＦの両方を欠損したマウスにおけるポリＩ：Ｃへのインビボでの応答について調べた。意外にも、ポリＩ：Ｃを投与すると野生型及びＲＩＧ−Ｉ−／−マウスのいずれの血清中でも、ＩＦＮ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１２が急速に誘導され、ＲＩＧ−ＩがインビボにおけるポリＩ：Ｃを介した応答に不可欠ではないことが示された（図２ａ参照）。これとは際立って対照的に、ＭＤＡ５−／−マウスがポリＩ：Ｃに応答してＩＦＮ−αを生成することはなく、ＩＬ−６及びＩＬ−１２ｐ４０の生成も、かなり減少していた。また、ＴＲＩＦ−／−マウスは通常量のＩＦＮ−αを生成していたが、ＩＬ−１２ｐ４０の生成は著しく減少しており、ＩＬ−６の生成もかなり減少していた。さらに、ＭＤＡ５−／−ＴＲＩＦ−／−マウスがポリＩ：Ｃに応答してＩＦＮ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１２ｐ４０を誘導することはなかった（図２ｂ参照）。これらの結果は、ＭＤＡ５はポリＩ：Ｃ誘導性のＩＦＮ−α生成に不可欠であり、ＴＬＲ３シグナリングはＩＬ−１２の生成に重要である一方で、ＭＤＡ５及びＴＬＲ３の両方がＩＬ−６の生成を調節することを示している。サイトカインの誘導に加え、野生型マウスのポリＩ：Ｃ処理によっても、従来の脾臓ＤＣにおけるＣＤ８６などの共刺激分子の表面発現が増加した（図２ｃ参照）。ＭＤＡ５又はＴＲＩＦの一方が欠損していてもＣＤ８６発現に影響はなかったが、二重欠損では結果的にＣＤ８６のアップレギュレーションが阻害された。このことは、ＭＤＡ５シグナリング及びＴＬＲ３シグナリングの両方が、インビボにおけるポリＩ：Ｃ応答性のｃＤＣ活性化に関与していることを示している。ＧＭ−ＣＳＦを用いて作製した骨髄由来ＤＣ（ＧＭＣＳＦ−ＤＣ）をポリＩ：Ｃで刺激すると、野生型又はＲＩＧ−Ｉ−／−マウスのいずれかの細胞は、ポリＩ：Ｃに応答して投与量依存的にＩＦＮ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１２ｐ４０を生成する。これとは対照的に、ＭＤＡ５−／−ＧＭＣＳＦ−ＤＣでは、これらのサイトカインの生成がひどく減少していた（図２ｄ参照）。したがって、細胞質中では、ＲＩＧ−ＩではなくＭＤＡ５がポリＩ：Ｃを主に認識していることを確認した。
【００３７】
しかし、イノシン酸は自然状態でのウィルス複製過程では利用されないため、本発明者らはインビトロ転写により長鎖ｄｓＲＮＡを合成し、ＭＤＡ５又はＲＩＧ−Ｉを欠損しているマウスの胚線維芽細胞（ＭＥＦ）におけるＩＦＮ応答を調べてみた。リポフェクション試薬との錯体を形成するマウスラミン（Lamin）Ａ／Ｃの配列に対応する、長さの異なる２つのｄｓＲＮＡ（２００ｂｐ及び４００ｂｐ）で、ＭＥＦを刺激した。ポリＩ：Ｃの場合とは異なり、野生型及びＭＤＡ５−／−ＭＥＦは同等量のＩＦＮ−βを生成した（図２ｅ参照）。ＲＩＧ−Ｉ−／−ＭＥＦは、検出可能量のＩＦＮ−βをまったく生成しなかった。これは、ＲＩＧ−Ｉがインビトロ転写ｄｓＲＮＡの検出に不可欠であることを示している。また、他のいくつかの配列に対応するインビトロ転写ｄｓＲＮＡは、ＭＤＡ５ではなくＲＩＧ−Ｉを介してＩ型ＩＦＮを誘導していた。総合的に考えて、これはＭＤＡ５とＲＩＧ−ＩがポリＩ：Ｃ及びインビトロ転写ｄｓＲＮＡの検出にそれぞれ差別的に関与している証拠となる。
【００３８】
これらの知見から、本発明者らは、ＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ５が異なるＲＮＡウィルスの検出に関与しているとの仮説を立てた。ＲＮＡウィルスは、ゲノム構造に基づいて、マイナス鎖ｓｓＲＮＡウィルス、プラス鎖ｓｓＲＮＡウィルス、及びｄｓＲＮＡウィルスに分類される。本発明者らは以前に一連のマイナス鎖ＲＮＡウィルスがＲＩＧ−Ｉに認識されることを示している。本発明者らはまず、ＮＤＶ、Ｓｅｖ、ＶＳＶ、及びインフルエンザウィルスを含む一連のマイナス鎖ｓｓＲＮＡウィルスに応答した、ＭＤＡ５−／−ＭＥＦにおけるＩＦＮ−αの生成について調べた。ＮＤＶ以外の大半の野生型ウィルスの感染は、ウィルス性タンパク質によりＩＦＮ応答が抑制されるためにＭＥＦ中でＩＦＮ−αを誘導しないことから（データは図示せず）、本発明者らはウィルス阻害タンパク質を欠損した変異ウィルスも使用した。かかるウィルスには、Ｖタンパク質を欠損した（Ｖ−）又は変異したＣタンパク質を有する（Ｃｍ）ＳｅＶ、Ｍタンパク質の変異体を欠損したＶＳＶ（ＮＣＰ）、及びＮＳ１タンパク質を欠損したインフルエンザウィルス（ΔＮＳ１）が含まれる。図３ａに示されるように、野生型細胞に比べてＲＩＧ−Ｉ−／−ＭＥＦではＩＦＮ−αの生成がひどく損なわれているが、ＭＤＡ５はこれらのウィルスに応答したＩＦＮ−αの生成には不可欠ではなかった。ＳｅｖなどのパラミクソウィスルのＶタンパク質は、ＭＤＡ５と協同してｄｓＲＮＡ誘導性のＩＦＮ生成を抑制することが示されている。野生型及びＳｅＶＶ（−）は共に、コントロール及びＭＤＡ５−／−ＭＥＦにおいてＩＰ−１０遺伝子及びＩ型ＩＦＮの発現を誘導した（図２ａ及び図６）。また、ＲＩＧ−Ｉ−／−ＭＥＦは、野生型及びＳｅＶＶ（−）のいずれにも応答しなかった。このことは、ウィルス阻害タンパク質の存在とは関係なく、ＭＤＡ５がＳｅＶ認識に寄与していないことを示している。フラビウィルスに属するプラス鎖ｓｓＲＮＡウィルスである日本脳炎ウィルス（ＪＥＶ）も、ＩＦＮ−βの生成にＲＩＧ−Ｉを必要としたが、ＭＤＡ５を必要とすることはなかった（図３ｂ）。
【００３９】
次いで、ピコルナウィルスファミリーに属するプラス鎖ｓｓＲＮＡウィルスである脳心筋炎ウィルス（ＥＭＣＶ）に対するＭＥＦのＩＦＮ応答を調べた。意外にも、ＥＭＣＶ誘導性のＩＦＮ−βの生成は、ＭＤＡ５−／−ＭＥＦにおいては阻害されていた（図３ｃ）。これに対し、野生型及びＲＩＧ−Ｉ−／−ＭＥＦでは同等量のＩＦＮ−βが生成されており、これは、ＥＭＣＶがＭＤＡ５に特異的に認識されていることを示している（図３ｃ）。また、ＥＭＣＶに応答したＩＦＮ−α及びＩＬ−６の生成は、ＭＤＡ５−／−ＧＭＣＳＦ−ＤＣでは阻害されており、このことは、ＲＩＧ−Ｉではなく、ＭＤＡ５が、ＭＥＦ及び従来のＤＣにおけるＥＭＣＶの認識に不可欠であることを示している（図３ｄ及び３ｅ）。さらに、ピコルナウィルスファミリーに属するその他のウィルスであるタイラーウィルス及びメンゴウィルスも、ＭＤＡ５を介してＩＦＮ−αを誘導していた（図７）。
【００４０】
次に、ＳｅＶＣｍ又はＥＭＣＶへの暴露に応答したＩＦＮ−βの誘導が完全に阻害された、ＲＩＧ−Ｉ−／−ＭＤＡ５−／−二重欠損ＭＥＦにＲＩＧ−Ｉ又はＭＤＡ５発現ベクターをトランスフェクトすることにより、再構成実験を行った（図３ｆ）。ＭＤＡ５ではなくヒトＲＩＧ−Ｉの局所的発現によって、ＳｅＶＣｍ応答性のＩＦＮ−βプロモーター活性化が生じた。逆に、ＲＩＧ−ＩではなくヒトＭＤＡ５を発現する細胞は、投与量依存的にＥＭＣＶに応答してＩＦＮ−βプロモーターを活性化させた（図３ｆ）。これらの結果はヒトＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ５が異なるＲＮＡウィルスを認識していることを示している。
【００４１】
これまでの研究で、ｐＤＣが、数種のＲＮＡウィルスの認識において、ＲＩＧ−Ｉの代わりにＴＬＲシステムを主に利用していることが示されている。ＭｙＤ８８は、ＴＬＲ３を除く各種ＴＬＲのシグナリングに関与するアダプタータンパク質である。ｐＤＣはＴＬＲ７及びＴＬＲ９を高発現し、ウィルスへの暴露によりＩ型ＩＦＮをＭｙＤ８８依存的に生成する。ｐＤＣにおけるウィルス検出にＭＤＡ５が関与しているのかどうかに取り組むため、本発明者らはＦｌｔ３Ｌ構築ＢＭ由来（Ｆｌｔ３Ｌ−ＤＣ）ＤＣから精製したＢ２２０+ｐＤＣをＥＭＣＶに暴露し、ＩＦＮ−αの生成を測定した。ＭＤＡ５−／−マウス由来ではなくＭｙＤ８８−／−マウス由来のｐＤＣは、ＩＦＮ−αの生成に深刻な欠陥を示した。これは、ＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ５のいずれもがｐＤＣ中で重要な役割を果たしていないことを示している（図８）。逆に、Ｆｌｔ３Ｌ−ＤＣから精製されたＢ２２０−の従来のＤＣにおけるＩＦＮ−αの生成には、ＭｙＤ８８ではなくＭＤＡ５が必要である（図８）。これらの結果は、ＭＤＡ５とＲＩＧ−Ｉはいずれも、ｐＤＣ中のＩＦＮ−αのウィルス性誘導には不可欠ではないことを示している。
【００４２】
また、ウィルス感染に対する宿主の防御におけるＭＤＡ５又はＲＩＧ−Ｉのインビボでの役割について調べた。ＲＩＧ−Ｉ−／−マウスは、ほとんどが胚期に死亡するが、ＩＣＲマウスと交配させることにより、本発明者らは生存成体マウスを効率的に得ることができた。成体ＲＩＧ−Ｉ−／−マウスは巨視的な発達異常を全く示さず、２０週齢を過ぎても生存していた。マウスをＪＥＶに感染させると、ＲＩＧ−Ｉ−／−マウスでは同腹子のコントロールマウスと比較して、血清中のＩＦＮ−αレベルが顕著に低下した。これに対し、ＭＤＡ５−／−マウスは、ＪＥＶ誘導性の全身性ＩＦＮ−α生成については大きな欠陥を示さなかった（図４ａ）。コントロールマウスと比較してよりＪＥＶに感染しやすかったのはＭＤＡ５−／−マウスではなくＲＩＧ−Ｉ−／−マウスであったが、これは、上記知見に一致している（図４ｂ）。また、ＶＳＶ感染により死亡したのはＭＤＡ５−／−マウスではなくＲＩＧ−Ｉ−／−マウスであったが、これはＩＦＮ応答が阻害されたことと一致する（図４ｃ）。このように、ＲＩＧ−Ｉを介した一連のウィルスの認識は、インビボでの抗ウィルス宿主防御において重要な役割を果たしている。
【００４３】
さらに、ＭＤＡ５に認識されるウィルスモデルとしてのＥＭＣＶに感染したマウスを検証した。ＭＤＡ５−／−マウスの血清では、ＩＦＮ−α、ＲＡＮＴＥＳ及びＩＬ−６の誘導がひどく減少していた。これは、ＥＭＣＶ感染時のインビボでの体液性応答の誘導にはＭＤＡ５が不可欠であることを示している（図５ａ）。そのため、さらにＥＭＣＶ感染に対するＭＤＡ５−／−マウスの感受性を調べ、それをＩＦＮ−α／βＲ−／−、ＭＤＡ５−／−、ＲＩＧ−／−、及びＴＬＲ３−／−マウスの場合と比較した。図５ｂに示すように、ＭＤＡ５−／−及びＩＦＮ−α／βＲ−／−マウスは、コントロールである同腹子のマウスと比較して、ＥＭＣＶ感染に対する感受性が高かった。これに対し、ＲＩＧ−Ｉ又はＴＬＲ３の欠損はいずれも、ＥＭＣＶ感染マウスの生存には影響しなかった。ＥＭＣＶは心筋細胞に選択的に感染し、心筋炎を引き起こすことが知られている。コントロールマウスと比較してＭＤＡ５−／−マウスでは心臓内のウィルス価が際立って高く、これは、ＥＭＣＶへの感受性が増大していることと一致していた（図５ｃ）。ＥＭＣＶ感染２日後の心臓の組織学的分析により、心筋細胞の病巣壊死がＭＤＡ５−／−マウスで発達していたことが明らかになったが、野生型マウスの心臓は、その時点では組織学的な異常を全く示していなかった（図５ｄ）。注目すべきは、この時点で免疫細胞の浸潤が野生型又はＭＤＡ５−／−のいずれの心臓切片にも認められなかったことである。ＥＭＣＶ感染に応答した心臓機能の変化を評価するため、感染の２日後に心エコー検査で心仕事量を分析した（図５ｅ）。短縮率（ＦＳ）で判断した心臓収縮能は、ＭＤＡ５−／−マウスではひどく低下していた（野生型４８．２±４．９％対ＭＤＡ５−／−２１．２±５．８％）。このことは、ＭＤＡ５−／−マウスがウィルス誘導性心筋症による重篤な心不全を起こしたことを示唆している（図５ｆ）。このように、ＭＤＡ５を介したＥＭＣＶの認識は、心筋機能障害を予防するためだけではなく抗ウィルス応答を引き起こすための前提条件である。総合的に考えて、これらの結果は、異なるグループのＲＮＡウィルスの認識、及びその後のＩ型ＩＦＮ及び炎症性サイトカインの生成において、ＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ５が不可欠な役割を果たしていることを明白に示している。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１のａは、マウスＭＤＡ５遺伝子、ターゲティングベクター及び予測された破壊遺伝子の構造を示す図である。■はコーディングエクソンを示す。Ｂ；ＢａｍＨＩを示す。図１のｂは、ヘテロ接合体のインタークロスによる子孫のサザンブロット分析結果を示す図である。ゲノムＤＮＡをマウスの尾から抽出し、ＢａｍＨＩで分解し、電気泳動で分離して、ａに示した放射性標識プローブとハイブリダイズした。サザンブロットにより、野生型（+／+）マウスには９．４ｋｂのシングルバンド、ホモ接合体（−／−）マウスには４．６ｋｂのバンド、ヘテロ接合体（+／−）マウスには両方のバンドが得られた。図１のｃは、腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）のノーザンブロット分析結果を示す図ある。１０００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−βで８時間処理した野生型（ＷＴ）及びＭＤＡ５−／−ＰＥＣの全ＲＮＡを抽出し、ＭＤＡ５のｍＲＮＡの発現について、ノーザンブロット分析を行った。同じ膜をβアクチンプローブと再度ハイブリダイズした。図１のｄは、ＭＤＡ５発現のウェスタンブロット分析結果を示す図ある。ＷＴ及びＭＤＡ５−／−ＭＥＦを１０００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−βで８時間処理し、全細胞溶解液をＭＤＡ５の抗体でイムノブロットした。
【図２】図２のａ及びｂは、表示のマウスの静脈内に、２００μｇのポリＩ：Ｃを表示した時間注入しておき、血清中のＩＦＮ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１２ｐ４０の生成をＥＬＩＳＡで測定した結果を示す図である。データは、血清試料の平均値±Ｓ．Ｄ．である。図２のｃは、ＰＢＳ又はポリＩ：Ｃを注入されたマウスの脾臓ＣＤ１１ｃ+Ｂ２２０−ｃＤＣについて、ＣＤ８６の表面発現をフローサイトメトリーで分析した結果を示す図である。図２のｄは、ＷＴ、ＲＩＧ−Ｉ−／−、及びＭＤＡ５−／−ＧＭＣＳＦ−ＤＣを、濃度を次第に増大させたポリＩ：Ｃで２４時間刺激した結果を示す図である。培養上清中のＩＦＮ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１２ｐ４０の生成をＥＬＩＳＡで測定した。図２のｅは、ＷＴ、ＲＩＧ−Ｉ−／−、及びＭＤＡ５−／−ＭＥＦを、リポフェクトアミン２０００と錯体を形成する、表示した長さのインビトロ転写ｄｓＲＮＡで２４時間処理した結果を示す図である。培養上清中のＩＦＮ−βの生成をＥＬＩＳＡで測定した。ｄ及びｅのエラーバーは、３回の±Ｓ．Ｄ．を示す。
【図３】図３のａは、ＷＴ、ＲＩＧ−Ｉ−／−、及びＭＤＡ５−／−ＭＥＦを、表示したマイナス鎖ｓｓＲＮＡウィルスに感染させた結果を示す図である。培養上清中のＩＦＮ−αの生成をＥＬＩＳＡで測定した。図３のｂ及びｃは、ＷＴ、ＲＩＧ−Ｉ−／−、及びＭＤＡ５−／−ＭＥＦを、表示したプラス鎖ｓｓＲＮＡウィルス、ＪＥＶ（ｂ）及びＥＭＣＶ（ｃ）に感染させた結果を示す図である。培養上清中のＩＦＮ−βの生成をＥＬＩＳＡで測定した。図３のｄ及びｅは、ＷＴ、ＲＩＧ−Ｉ−／−、及びＭＤＡ５−／−ＧＭＣＳＦ−ＤＣを、ｍｏｉを次第に増大させたＥＭＣＶに感染させた結果を示す図である。培養上清中のＩＦＮ−α（ｄ）及びＩＬ−６（ｅ）の生成をＥＬＩＳＡで測定した。図３のｆ及びｇは、ＷＴ及びＲＩＧ−Ｉ−／−ＭＤＡ５−／−ＭＥＦを、ＩＦＮ−βプロモーターを含み、さらに表示した発現ベクターを含む又は含まないレポーターコンストラクトで一時的にトランスフェクトし、その後、細胞をＥＭＣＶ又はＳｅＶＣｍに感染させ、ルシフェラーゼアッセイにかけた結果を示す図である。ａ、ｂ、ｃ、ｄ、及びｅのエラーバーは、３回の間の±Ｓ．Ｄ．を示す。
【図４】図４のａは、２×１０７ｐｆｕのＪＥＶを、ＲＩＧ−Ｉ+／−、ＲＩＧ−Ｉ−／−、ＭＤＡ５+／−及びＭＤＡ５−／−マウスの静脈内に注入し、注入の２４時間後、マウスから血清を採取し、ＩＦＮ−αの生成レベルをＥＬＩＳＡで測定結果を示す図である。バーは、平均値を示す。図４のｂは、静脈経由で２×１０７ｐｆｕのＪＥＶに感染させた表示マウス（６週齢）の生存を１５日間にわたってモニターした結果を示す図である。図４のｃは、４×１０６ｐｆｕのＶＳＶに鼻内感染させたマウス（３週齢）の生存を９日間にわたってモニターした結果を示す図である。
【図５】図５のａは、１０７ｐｆｕのＥＭＣＶを、ＭＤＡ５+／−及びＭＤＡ５−／−マウス（ｎ＝５）に静脈接種し、注入の４時間後に血清を採取し、ＩＦＮ−α、Ｒａｎｔｅｓ及びＩＬ−６の生成レベルをＥＬＩＳＡで確認した結果を示す図である。図５のｂは、１０２ｐｆｕのＥＭＣＶに腹腔内感染させた表示マウス（６週齢）の生存を、１２時間ごとに６日間にわたってモニターした結果を示す図である。図５のｃは、ＭＤＡ５＋／−マウス及びＭＤＡ５−／−マウスを、１０２ｐｆｕのＥＭＣＶに腹腔内感染させた、４８時間後、マウスを処分し、心臓内のウィルス価をプラークアッセイで確認した結果を示す図である。図５のｄは、感染から２日後のＭＤＡ５+／−及びＭＤＡ５−／−マウスの心臓について、ヘマトキシリン及びエオシン染色によって組織学的変化を評価した結果を示す図である。矢印は、心筋細胞の病巣壊死を示す。図５のｅ及びｆは、ＥＭＣＶ感染から４８時間後の心機能を心エコー検査により評価した結果を示す図である。図５のｅは、ＥＭＣＶ感染から４８時間後のＭＤＡ５+／−及びＭＤＡ５−／−マウスのＭモードによる経胸壁心エコー検査の透写図である。図５のｆは、心エコー検査により確認した感染後の短縮率（ＦＳ）を示す図である。
【図６】図６は、ＭＥＦｓのノーザンブロット分析結果を示す図である。ＷＴ（野生型）、ＲＩＧ−Ｉ−／−、及びＭＤＡ５−／−ＭＥＦｓをｍｏｉ＝１０のＳｅＶ V（−）で感染させ、抽出した全ＲＮＡをノーザンブロット分析に供し、ＩＦＮ−βとＩＰ１０のｍＲＮＡの発現を調べた。エチジウムブロマイドで染色されたゲル上の２８Ｓ及び１８ＳリボソームＲＮＡのバンドをRNA loadingコントロールとして使用した。
【図７】図７は、ＷＴ（野生型）及びＭＤＡ５−／−ＧＭＣＳＦ−ＤＣｓをｍｏｉの増加したタイラーウィルス（Theiler’s virus）又はメンゴウィルス(Mengovirus)に２４時間感染させ、培養物の上澄み中のＩＦＮ−αの産生量をＥＬＩＳＡで測定した結果を示す図である。
【図８】図８は、ＭＡＣＳによってＭｙＤ８８−／−、ＭＤＡ５−／−、及びＭＤＡ５−／−Ｆｌｔ３Ｌ−ＤＣｓから分離されたＢ２２０＋及びＢ２２０−ＣＤ１１ｃ＋細胞をｍｏｉ＝１のＥＭＣＶで２４時間感染させ、培養物の上澄み中のＩＦＮ−αの産生量をＥＬＩＳＡで測定した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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