(57)【要約】【課題】増幅効率および配列特異性の高い核酸増幅を可能とするプライマーセットの提供。【解決手段】標的核酸配列を増幅しうる少なくとも二種のプライマーを含んでなるプライマーセットであって、前記プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、（i）鋳型上における該プライマーの伸長反応によって得られるプライマー伸長鎖において、該プライマー伸長鎖の５’末端部分が同一鎖上にハイブリダイズすることを可能とし、かつ（ii）該プライマーの配列が核酸増幅反応における相補鎖合成により二本鎖の状態となったときに、エンドヌクレアーゼ認識部位を提供しうるものであり、前記エンドヌクレアーゼがニッキング活性を示すことのできるものである、プライマーセット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸配列を増幅しうる少なくとも二種のプライマーを含んでなるプライマーセットであって、
前記プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、（i）鋳型上における該プライマーの伸長反応によって得られる核酸鎖において、該核酸鎖の５’末端部分が同一鎖上にハイブリダイズすることを可能とし、かつ（ii）該プライマーの配列が核酸増幅反応における相補鎖合成により二本鎖の状態となったときに、エンドヌクレアーゼ認識部位を提供しうるものであり、
前記エンドヌクレアーゼがニッキング活性を示すことのできるものである、プライマーセット。
【請求項２】
前記エンドヌクレアーゼがニッキング酵素である、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
前記プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）の相補配列（Bc）にハイブリダイズする配列（B'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものである、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項４】
前記プライマーが、二本鎖の増幅産物中に前記エンドヌクレアーゼ認識部位またはその一部を与えるための配列を含んでなるものである、請求項３に記載のプライマーセット。
【請求項５】
前記プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（B-Bc'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものである、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項６】
前記プライマーが、二本鎖の増幅産物中に前記エンドヌクレアーゼ認識部位またはその一部を与えるための配列を含んでなるものである、請求項５に記載のプライマーセット。
【請求項７】
前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）の相補配列（Bc）にハイブリダイズする配列（B'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（C）にハイブリダイズする配列（Cc'）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（C）よりも５’側に存在する配列（D）の相補配列（Dc）にハイブリダイズする配列（D'）を前記配列（Cc'）の５’側に含んでなるものである、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項８】
前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（B-Bc'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（C）にハイブリダイズする配列（Cc'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（D-Dc'）を前記配列（Cc'）の５’側に含んでなるものである、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項９】
前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）の相補配列（Bc）にハイブリダイズする配列（B'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（C）にハイブリダイズする配列（Cc'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（D-Dc'）を前記配列（Cc'）の５’側に含んでなるものである、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項１０】
前記第一のプライマーおよび前記第二のプライマーの一方または両方が、二本鎖の増幅産物中に前記エンドヌクレアーゼ認識部位またはその一部を与えるための配列を含んでなるものである、請求項７〜９のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項１１】
前記標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズする１種以上の第三のプライマーを含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項１２】
鋳型核酸上の前記標的核酸配列よりも３’側の領域にハイブリダイズするアウタープライマーを含んでなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項１３】
試料中の標的核酸を増幅する方法であって、
（ａ）標的核酸を含む試料を用意する工程、
（ｂ）ニッキング活性を示すことのできるエンドヌクレアーゼを用意する工程、
（ｃ）請求項１〜１２のいずれか一項に記載のプライマーセットを用意する工程、および
（ｄ）前記試料および前記エンドヌクレアーゼの存在下、前記エンドヌクレアーゼがニッキング活性を示す条件下において前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行う工程
を含んでなる、方法。
【請求項１４】
前記エンドヌクレアーゼがニッキング酵素である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
核酸増幅反応が等温で行われる、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
鎖置換能を有するポリメラーゼが使用される、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
核酸増幅反応が融解温度調整剤の存在下で行われる、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
融解温度調整剤が、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの２種以上の混合物である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
試料中の標的核酸を増幅するためのキットであって、
（ａ）ニッキング活性を示すことのできるエンドヌクレアーゼ、および
（ｂ）請求項１〜１２のいずれか一項に記載のプライマーセット
を含んでなる、キット。
【請求項２０】
前記エンドヌクレアーゼがニッキング酵素である、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
鎖置換能を有するポリメラーゼをさらに含んでなる、請求項１９または２０に記載のキット。
【請求項２２】
融解温度調整剤をさらに含んでなる、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２３】
融解温度調整剤が、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの２種以上の混合物である、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
核酸試料中の核酸配列における変異の有無を判定する方法であって、
（ａ）核酸試料を用意する工程、
（ｂ）ニッキング活性を示すことのできるエンドヌクレアーゼを用意する工程、
（ｃ）請求項１〜１２のいずれか一項に記載のプライマーセットであって、該プライマーセットに含まれる少なくとも１種のプライマーが、前記変異の存在または不存在によって前記核酸試料中の標的配列との間で１以上のミスマッチを生じるように設計されたものである、プライマーセットを用意する工程、および
（ｄ）前記核酸試料および前記エンドヌクレアーゼの存在下、前記エンドヌクレアーゼがニッキング活性を示す条件下において前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行う工程
を含んでなる、方法。
【請求項２５】
前記エンドヌクレアーゼがニッキング酵素である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
核酸増幅反応が等温で行われる、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
鎖置換能を有するポリメラーゼが使用される、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
核酸増幅反応が融解温度調整剤の存在下で行われる、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
融解温度調整剤が、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの２種以上の混合物である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
核酸増幅反応がミスマッチ結合タンパク質の存在下で行われる、請求項２４〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
核酸試料中の核酸配列における変異の有無を判定するためのキットであって、
（ａ）ニッキング活性を示すことのできるエンドヌクレアーゼ、および
（ｂ）請求項１〜１２のいずれか一項に記載のプライマーセットであって、該プライマーセットに含まれる少なくとも１種のプライマーが、前記変異の存在または不存在によって前記核酸試料中の標的配列との間で１以上のミスマッチを生じるように設計されたものである、プライマーセット
を含んでなる、キット。
【請求項３２】
前記エンドヌクレアーゼがニッキング酵素である、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
鎖置換能を有するポリメラーゼをさらに含んでなる、請求項３１または３２に記載のキット。
【請求項３４】
融解温度調整剤をさらに含んでなる、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３５】
融解温度調整剤が、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの２種以上の混合物である、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
ミスマッチ結合タンパク質をさらに含んでなる、請求項３１〜３５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３７】
一本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸を増幅する方法であって、
（ａ）ニッキング活性を示すことのできるエンドヌクレアーゼを用意する工程、
（ｂ）前記エンドヌクレアーゼにより認識される二本鎖配列の少なくとも一方の鎖の配列を含んでなる一本鎖の鋳型核酸であって、その３’末端と５’末端において、それぞれ末端領域に相補的な塩基配列からなる領域を同一鎖上に備え、この互いに相補的な塩基配列がハイブリダイズすることによりループ構造または折り返し構造を形成しうる、鋳型核酸を用意する工程、
（ｃ）核酸増幅反応に用いられる、鎖置換能を有するポリメラーゼを用意する工程、および
（ｄ）前記エンドヌクレアーゼ、前記鋳型核酸および前記ポリメラーゼを含んでなる核酸増幅反応溶液を調製し、この溶液を、前記エンドヌクレアーゼがニッキング活性を示す条件下においてインキュベートする工程
を含んでなる、方法。
【請求項３８】
前記エンドヌクレアーゼがニッキング酵素である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記溶液が等温下でインキュベートされる、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記溶液が融解温度調整剤を含んでなる、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
融解温度調整剤が、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの２種以上の混合物である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
試料中の標的核酸を検出するための装置であって、
（ａ）請求項１３〜１８、２４〜３０および３７〜４１のいずれか一項に記載の方法を行うための反応室と、
（ｂ）前記反応室の内部の温度を調節するための温度調節手段と、
（ｃ）前記反応室中の反応混合物からの、増幅産物の生成を示すシグナルを検出するためのシグナル検出手段と
を少なくとも備えてなる、装置。
【請求項４３】
前記シグナルが検出された場合に試料中の標的核酸が検出されたことを表示するための表示手段をさらに含んでなる、請求項４２に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、遺伝子工学分野において有用な核酸配列の増幅法に関するものであり、より詳細には、鎖置換反応を利用した核酸配列の増幅法、ならびにこれらの方法を利用した変異検出法に関するものである。
【０００２】
背景技術
遺伝子工学分野においては、遺伝的な特徴を直接的に分析しうる方法として、核酸配列の相補性に基づく分析が知られている。このような分析では、試料中に存在する目的遺伝子量が少ない場合には、一般にその検出が容易ではないため、目的遺伝子そのものを予め増幅することが必要となる。
【０００３】
近年、等温状態で実施可能な核酸増幅法が開発されている。このような方法としては、例えば、特公平７−１１４７１８号公報に記載の鎖置換型増幅（ＳＤＡ；strand displacement amplification）法、自立複製（３ＳＲ；self-sustained sequence replication）法、日本国特許第２６５０１５９号公報に記載の核酸配列増幅（ＮＡＳＢＡ；nucleic acid sequence based amplification）法、ＴＭＡ(transcription-mediated amplification)法、日本国特許第２７１０１５９号公報に記載のＱベータレプリカーゼ法、米国特許第５８２４５１７号明細書、国際公開第９９／０９２１１号パンフレットまたは国際公開第９５／２５１８０号パンフレットに記載の種々の改良ＳＤＡ法、国際公開第００／２８０８２号パンフレットに記載のＬＡＭＰ法（Loop-Mediated Isothermal Amplification）、国際公開第０２／１６６３９号パンフレットに記載のＩＣＡＮ法（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）、国際公開第２００４／０４００１９号パンフレットに記載の方法、国際公開第２００５／０６３９７７号パンフレットに記載のＳＭＡＰ法等が挙げられる。これらの等温核酸増幅法に関与する全段階の反応は一定の温度に保たれた反応混合物中で同時に進行する。
【０００４】
特公平７−１１４７１８号公報（特許文献１）に記載のＳＤＡ法では、最終的にＤＮＡが増幅される系において、ＤＮＡポリメラーゼと制限エンドヌクレアーゼが介する二本鎖の置換により、試料中の目的核酸（およびその相補鎖）の増幅が可能となる。該方法では、４種類のプライマーが必要とされ、その内の２種類は、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含むように設計する必要がある。また、該方法では、核酸合成のための基質として、修飾されたデオキシリボヌクレオシド三リン酸、例えば三リン酸部分のα位のリン酸基の酸素原子が硫黄原子（Ｓ）に置換されたデオキシリボヌクレオシド三リン酸が必要とされる。さらに該方法では、増幅された核酸断片中にαＳ置換デオキシヌクレオチド等の修飾ヌクレオチドが含まれるため、例えば、増幅断片を制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ；restriction enzyme fragment length polymorphism）解析に供しようとする場合に、該増幅断片が制限酵素で切断できないことがあり、よって、そのような解析を実施できない場合がある。
【０００５】
米国特許第５８２４５１７号明細書（特許文献２）に記載の改良ＳＤＡ法は、ＲＮＡとＤＮＡから構成され、３’末端側がＤＮＡであるキメラプライマーを必要とする。そのようなＲＮＡとＤＮＡから構成されるキメラプライマーはその合成が困難であり、また、ＲＮＡを含むプライマーはその取り扱いに専門的な知識を必要とする。また、国際公開第９９／０９２１１号パンフレット（特許文献３）に記載の改良ＳＤＡ法は、５’突出末端を生じさせる制限酵素を必要とし、さらに、国際公開第９５／２５１８０号パンフレット（特許文献４）に記載の改良ＳＤＡ法は、少なくとも２組のプライマー対を必要とするため、これらの方法は高いランニングコストを必要とする。
【０００６】
国際公開第００／２８０８２号パンフレット（特許文献５）に記載のＬＡＭＰ法では、４種類のプライマーが必要とされ、それらが６個所の領域を認識することにより、目的遺伝子の増幅が可能となる。すなわち、この方法では、まず、第一のプライマーが鋳型鎖にアニーリングして伸長反応が起こり、次に、第一のプライマーよりも上流側に設計された第二のプライマーによる鎖置換反応により第一のプライマーによる伸長鎖が鋳型鎖から分離する。この時に、剥ぎ取られた第一のプライマー伸長産物の構成に起因して伸長鎖の５’末端部分でステムループ構造が形成される。これと同様の反応が二本鎖核酸のもう一方の鎖、もしくは、剥ぎ取られた第一のプライマー伸長産物の３’末端側についても行なわれ、これらの反応が繰り返されることにより、標的核酸が増幅される。この方法では、プライマー伸長鎖に対する相補鎖合成により３’末端においてステムループ構造を形成する増幅産物が得られ、その３’末端を合成起点とする相補鎖合成が連続して生じるため、多くの標的核酸配列がプライマー配列を介して連結された長い増幅産物が得られる。
【０００７】
国際公開第２００４／０４００１９号パンフレット（特許文献６）に記載の方法では、プライマー伸長鎖の５’末端部分においてステムループ構造を形成しうるループ形成プライマーのペアが用いられる。このループ形成プライマーは、鋳型にアニーリングしてプライマー伸長反応を経た後、その伸長鎖の５’末端において自動的に同伸長鎖に折り返してループを形成し、これにより一本鎖の状態となった鋳型上の領域に同じプライマーがアニーリングすることを可能とする。この方法でも、プライマー伸長鎖に対する相補鎖合成により３’末端においてステムループ構造を形成する増幅産物が得られ、その３’末端を合成起点とする相補鎖合成が連続して生じるため、多くの標的核酸配列がプライマー配列を介して連結された長い増幅産物が得られる。
【０００８】
国際公開第２００５／０６３９７７号パンフレット（特許文献７）に記載のＳＭＡＰ法では、国際公開第２００４／０４００１９号パンフレットに記載のループ形成プライマーと、相互に相補的な配列を一本鎖上に連結した折り畳み配列を５’末端部分に含む折り畳みプライマーとからなるプライマーペアが用いられる。この方法では、プライマー伸長鎖に対する相補鎖合成により３’末端においてステムループ構造または折り畳み構造を形成する増幅産物が得られ、その３’末端を合成起点とする相補鎖合成が連続して生じるため、多くの標的核酸配列がプライマー配列を介して連結された長い増幅産物が得られる。
【０００９】
近年、遺伝子の挿入、欠失などの遺伝子情報を迅速に検出する診断技術は非常に重要視されており、例えば、癌細胞などに特異的に発現されるｍＲＮＡや遺伝子マーカーの迅速かつ特異的な検出などに利用可能な技術が重要視されている。よって、配列特異性が高く、増幅効率の高い核酸増幅法が依然として求められている。
【００１０】
【特許文献１】特公平７−１１４７１８号公報
【特許文献２】米国特許第５８２４５１７号明細書
【特許文献３】国際公開第９９／０９２１１号パンフレット
【特許文献４】国際公開第９５／２５１８０号パンフレット
【特許文献５】国際公開第００／２８０８２号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２００４／０４００１９号パンフレット
【特許文献７】国際公開第２００５／０６３９７７号パンフレット
【発明の概要】
【００１１】
本発明者らは、プライマー伸長鎖の５’末端部分が同一鎖上に折り返すことを可能とする折り返しプライマー中に、ニッキング活性を有するエンドヌクレアーゼの認識配列を組み込み、該プライマーを用いた核酸増幅反応を前記エンドヌクレアーゼの存在下で行うことにより、該プライマーによって増幅産物中に新たに生じる認識部位の片方の鎖が前記エンドヌクレアーゼによって切断され、これにより新たな相補鎖合成の起点が生成し、増幅効率が顕著に向上することを見出した。さらに、本発明者らは、このようなプライマーおよびエンドヌクレアーゼを用いる核酸増幅法が高い配列特異性を有し、例えば、標的核酸配列中の一塩基変異の検出を可能とすることを見出した。本発明はこれら知見に基づくものである。
【００１２】
従って、本発明の目的は、増幅効率および配列特異性の高い核酸増幅を可能とするプライマーセットおよび核酸増幅法を提供することにある。
【００１３】
そして、本発明によるプライマーセットは、標的核酸配列を増幅しうる少なくとも二種のプライマーを含んでなるプライマーセットであって、前記プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、（i）鋳型上における該プライマーの伸長反応によって得られる核酸鎖において、該核酸鎖の５’末端部分が同一鎖上にハイブリダイズすることを可能とし、かつ（ii）該プライマーの配列が核酸増幅反応における相補鎖合成により二本鎖の状態となったときに、エンドヌクレアーゼ認識部位を提供しうるものであり、前記エンドヌクレアーゼがニッキング活性を示すことのできるものである、プライマーセットである。
【００１４】
さらに、本発明による核酸増幅法は、試料中の標的核酸を増幅する方法であって、（ａ）標的核酸を含む試料を用意する工程、（ｂ）ニッキング活性を示すことのできるエンドヌクレアーゼを用意する工程、（ｃ）本発明によるプライマーセットを用意する工程、および（ｄ）前記試料および前記エンドヌクレアーゼの存在下、前記エンドヌクレアーゼがニッキング活性を示す条件下において前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行う工程を含んでなるものである。
【００１５】
本発明によれば、鋳型に含まれる標的核酸配列を迅速かつ正確に増幅することが可能となる。本発明による核酸増幅法は、等温下で行うこともできる。これらのことから、本発明によれば、核酸試料における標的核酸の検出、遺伝子中の変異、特に一塩基変異の検出などを、迅速、簡便かつ正確に行うことが可能となる。
【発明の具体的説明】
【００１６】
本発明によるプライマーセットは、標的核酸配列を増幅しうる少なくとも二種のプライマーを含んでなるものである。該プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーは、鋳型上における該プライマーの伸長反応によって得られる核酸鎖において、該核酸鎖の５’末端部分が同一鎖上にハイブリダイズすることを可能とするもの（以下「折り返しプライマー」という）である。ここで、「核酸鎖」とは、ＤＮＡ鎖、ＲＮＡ鎖およびＤＮＡ／ＲＮＡ鎖のいずれをも意味し、好ましくはＤＮＡ鎖を意味する。本発明によるプライマーセットは複数種の折り返しプライマーを含んでいてもよいが、その場合には、少なくとも一種の折り返しプライマーは、該プライマーの配列が核酸増幅反応における相補鎖合成により二本鎖の状態となったときに、エンドヌクレアーゼ認識部位を提供しうるものとされる。こうして提供されるエンドヌクレアーゼ認識部位は、鋳型となる二本鎖核酸中に存在していなかった新たな認識部位であることが好ましい。前記エンドヌクレアーゼはニッキング活性を示すことのできるものとされる。
【００１７】
本発明において「標的核酸」または「標的核酸配列」とは、増幅しようとする核酸またはその配列そのものだけでなく、これに相補的な配列または該配列を有する核酸をも意味する。
【００１８】
本発明において「ハイブリダイズする」とは、本発明によるプライマーの一部がストリンジェントな条件下で標的核酸にハイブリダイズし、標的核酸以外の核酸分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、本発明によるプライマーとその相補鎖との二重鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などに依存して決定することができ、例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)等を参照することができる。例えば、使用するプライマーの融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行なうと、プライマーを標的核酸に特異的にハイブリダイズさせることができる。このようなプライマーは、市販のプライマー構築ソフト、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ３（Whitehead Institute for Biomedical Research社製）などを用いて設計することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、ある標的核酸にハイブリダイズするプライマーは、その標的核酸に相補的な核酸分子の全部または一部の配列を含んでなるものである。
【００１９】
本発明において「ニッキング活性」とは、二本鎖核酸のいずれか一方の鎖のみを切断する酵素活性をいう。
【００２０】
本発明に用いられるエンドヌクレアーゼは、特定のヌクレオチド配列を有する二本鎖核酸部分においてニッキング活性を示すことのできるものである。このような活性を示す多くのエンドヌクレアーゼがその認識配列とともに知られており、当業者であれば、これらのエンドヌクレアーゼの中から適宜選択して使用することができる。このようなエンドヌクレアーゼとしては、例えば、ニッキング酵素、制限酵素、ホーミング酵素、ＲＮアーゼ、リボザイム、配列特異的にギャップを形成できるヌクレアーゼ等が挙げられ、好ましくはニッキング酵素、制限酵素、およびホーミング酵素とされる。
【００２１】
制限酵素は、通常、二本鎖核酸の両方の鎖を切断するが、特定の組成を有する反応溶液を核酸増幅反応に用いることにより、ニッキング活性を示すことができる（例えば、Barany et al., Gene 65(2), 149, 1988を参照のこと）。また、制限酵素によって切断されない修飾塩基を二本鎖核酸の一方の鎖に導入することにより、他方の鎖のみを切断するニッキング活性を示すことができる（特公平７−１１４７１８号公報を参照のこと）。
【００２２】
ホーミング酵素は、一般的に、制限酵素やニッキング酵素よりも長い配列を認識してＤＮＡを切断する。多くのホーミング酵素は二本鎖核酸の両方の鎖を切断するが、片方の鎖のみを切断する例も報告されている（Goodrch-Blair H. and Shub D.A., Cell 84(2), 211, 1996）。また、二本鎖核酸の両方の鎖を切断するホーミング酵素のアミノ酸配列を置換することにより、片方の鎖のみの切断が優位となるように該酵素を改変する方法も報告されている（Silva G.H. and Belfort M., Nucleic Acids Research 32(10), 3156, 2004）。さらに、特定の組成からなる反応液中では、ホーミング酵素がニッキング活性を示すことも報告されている（Belfort M. and Roberts R.J., Nucleic Acids Research 25(17), 3379,1997）。
【００２３】
本発明の特に好ましい実施態様によれば、エンドヌクレアーゼとしてニッキング酵素が用いられる。ニッキング酵素は、特定の配列を有する二本鎖ＤＮＡの片方の鎖のみを切断するエンドヌクレアーゼである。このニッキング酵素により、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖のホスホジエステル結合が開裂して、開裂部位の５’側にリン酸基が生じ、３'側にヒドロキシル基が生じる。天然のニッキング酵素としては、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩが報告されている（Morgan R.D. et al., Biol. Chem. 381(11), 1123, 2000）。また、制限酵素のアミノ酸配列を改変してニッキング酵素を作製する方法として、ホモダイマーとして機能する制限酵素のダイマー化ドメインを改変してダイマーの形成を妨げる方法（Xu Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98(23), 12990, 2001）、ヘテロダイマーとして機能する制限酵素の一方のサブニユットの切断活性を破壊する方法（Heiter D.F. et al., J. Mol. Biol. 348(3), 631, 2005）などがある。ニッキング酵素の例としては、Ｎ．ＭｌｙＩ（5'-/NNNNNGAGTC-3'；Caroline E. et al., EMBO Rep. 2(9), 782, 2001）、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ（5'-/CCR-3'；Chan S.H. et al., Nucleic Acids Res. 32(21), 6187, 2004）、Ｎ．ＡｌｗＩ（5'-GGATCNNN/NN-3'；New England Biolabs社）、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ（5'-GAGTCNNNN/N-3'；New England Biolabs社）、Ｎ．ＢｂｖＣＩＡ（5'-GC/TGAGG-3'；New England Biolabs社）、Ｎ．ＢｂｖＣＩＢ（5'-CC/TCAGC-3'；New England Biolabs社）、Ｎｂ．ＢｓｍＩ（5'-NG/CATTC-3'；New England Biolabs社）、Ｎｂ．Ｂｐｕ１０Ｉ（5'-GC/TNAGG-3'；Fermentas社）などが挙げられる。ここで、括弧内の配列はそれぞれの酵素の認識配列を示し、「/」は切断部位を示す。また、この配列中の「N」はA、T、CおよびGのいずれかのヌクレオチドを表し、「R」はAまたはGを表す。
【００２４】
本発明によるプライマーセットに含まれる折り返しプライマーは、当業者であれば適宜設計することができる。折り返しプライマーは、典型的には、鋳型にハイブリダイズする配列をその３’末端部分に含んでなり、該プライマーの伸長鎖上のいずれかの領域にハイブリダイズする配列を５’側に含んでなるものとすることができる。このような折り返しプライマーは、例えば、国際公開第００／２８０８２号パンフレット、国際公開第２００４／０４００１９号パンフレット、国際公開第２００５／０６３９７７号パンフレット等の記載に従って、適切に設計することができる。
【００２５】
折り返しプライマーは、当業者に公知の手段によって、該プライマーの配列が核酸増幅反応における相補鎖合成により二本鎖の状態となったときに、エンドヌクレアーゼ認識部位を提供しうるように設計することができる。典型的には、折り返しプライマーの配列中に、エンドヌクレアーゼによって認識される二本鎖配列のうちの少なくとも一方の鎖を組み込むことにより、上述のような折り返しプライマーを設計することができる。プライマー中に導入される配列は、二本鎖の認識配列のうちのセンス鎖およびアンチセンス鎖のいずれであってもよい。その際、折り返しプライマー中の鋳型に由来する配列に、二本鎖認識配列の片方の鎖の全てが含まれることは避けることが好ましい。
【００２６】
本発明の好ましい実施態様によれば、本発明によるプライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）の相補配列（Bc）にハイブリダイズする配列（B'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものとされる。このプライマーは前記折り返しプライマーの一例であり、以下「ループ形成プライマー」という。
【００２７】
ループ形成プライマーによる核酸合成の作用機序を図１に模式的に示す。まず、鋳型となる核酸中の標的核酸配列を決定し、その標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）、および配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）を決定する。ループ形成プライマーは、配列（Ac'）を含んでなり、さらにその５’側に配列（B'）を含んでなる。配列（Ac'）は、配列（A）にハイブリダイズするものであり、配列（B'）は、配列（B）の相補配列（Bc）にハイブリダイズするものである。ここで、ループ形成プライマーは、前記配列（Ac'）と前記配列（B'）の間に、反応に影響を与えない介在配列を含んでいてもよい。このようなプライマーを鋳型核酸にアニーリングさせると、プライマー中の配列（Ac'）が標的核酸配列の配列（A）にハイブリダイズした状態となる（図１(a)）。この状態でプライマー伸長反応が起こると、標的核酸配列の相補配列を含む核酸が合成される。そして、合成された核酸の５’末端側に存在する配列（B'）が、同核酸中に存在する配列（Bc）にハイブリダイズし、これにより、合成された核酸の５’末端部分においてステムループ構造が形成される。その結果、鋳型核酸上の配列（A）が一本鎖となり、この部分に先のループ形成プライマーと同一の配列を有する他のプライマーがハイブリダイズする（図１(b)）。その後、鎖置換反応により、新たにハイブリダイズしたループ形成プライマーからの伸長反応が起こると同時に、先に合成された核酸が鋳型核酸から分離される（図１(c)）。
【００２８】
上記の作用機序において、配列（B'）が配列（Bc）にハイブリダイズする現象は、典型的には、同一鎖上に相補領域が存在することにより起こる。一般に、二本鎖核酸が一本鎖に解離するときは、その末端あるいはそれ以外の比較的不安定な部分から部分的な解離が始まる。上記ループ形成プライマーによる伸長反応で生成した二本鎖核酸は、比較的高温では末端部分の塩基対は解離と結合の平衡状態にあり、全体としては二本鎖を保っている。そのような状態で末端の解離した部分に相補的な配列が同一鎖上に存在すると、準安定な状態としてステムループ構造を形成することができる。このステムループ構造は安定的には存在しないが、その構造の形成により剥き出しとなった相補鎖部分（鋳型核酸上の配列（A））に同一の他のプライマーが結合し、すぐさまポリメラーゼが伸長反応を行うことにより、先に合成された鎖が置換されて遊離すると同時に、新たな二本鎖核酸を生成することができる。
【００２９】
本発明のさらに好ましい実施態様におけるループ形成プライマーの設計基準は次のとおりである。まず、プライマーの伸長により鋳型核酸の相補鎖が合成された後に新たなプライマーが効率よく同鋳型核酸にアニーリングするためには、合成された相補鎖の５’末端におけるステムループ構造形成により、鋳型核酸上の前記配列（A）の部分を一本鎖とする必要がある。そのためには、配列（Ac'）の塩基数Ｘと標的核酸配列中における前記配列（A）と前記配列（B）に挟まれた領域の塩基数Ｙとの差（Ｘ−Ｙ）の、Ｘに対する割合（Ｘ−Ｙ）／Ｘが重要となる。ただし、鋳型核酸上において配列（A）よりも５’側に存在する、プライマーのハイブリダイズとは関係無い部分まで一本鎖とする必要はない。また、新たなプライマーが効率よく鋳型核酸にアニーリングするためには、上述のステムループ構造形成を効率よく行なうことも必要となる。そして、効率の良いステムループ構造形成、すなわち、効率の良い配列（B'）と配列（Bc）とのハイブリダイゼーションには、前記配列（B'）と前記配列（Bc）との間の距離（Ｘ＋Ｙ）が重要となる。一般に、プライマー伸長反応のための最適温度は最高でも７２℃付近であり、そのような低い温度では、伸長鎖が長い領域にわたって解離することは困難である。従って、配列（B'）が配列（Bc）に効率よくハイブリダイズするためには、両配列の間の塩基数は少ないほうが好ましいと考えられる。一方で、配列（B'）が配列（Bc）にハイブリダイズして鋳型核酸上の前記配列（A）の部分を一本鎖とするためには、配列（B'）と配列（Bc）との間の塩基数は多い方が好ましいと考えられる。
【００３０】
以上のような観点から、本発明のさらに好ましい実施態様による前記ループ形成プライマーは、プライマーを構成する配列（Ac'）と配列（B'）の間に介在配列が存在しない場合において、（Ｘ−Ｙ）／Ｘが−１．００以上、好ましくは０．００以上、さらに好ましくは０．０５以上、さらに好ましくは０．１０以上となり、また、１．００以下、好ましくは０．７５以下、さらに好ましくは０．５０以下、さらに好ましくは０．２５以下となるように設計される。さらに、（Ｘ＋Ｙ）は、好ましくは１５以上、さらに好ましくは２０以上、さらに好ましくは３０以上とされ、また、好ましくは５０以下、さらに好ましくは４８以下、さらに好ましくは４２以下とされる。
【００３１】
また、プライマーを構成する配列（Ac'）と配列（B'）の間に介在配列（塩基数はＹ’）が存在する場合には、本発明のさらに好ましい実施態様による前記ループ形成プライマーは、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）｝／Ｘが−１．００以上、好ましくは０．００以上、さらに好ましくは０．０５以上、さらに好ましくは０．１０以上となり、また、１．００以下、好ましくは０．７５以下、さらに好ましくは０．５０以下、さらに好ましくは０．２５以下となるように設計される。さらに、（Ｘ＋Ｙ＋Ｙ’）は、好ましくは１５以上、さらに好ましくは２０以上、さらに好ましくは３０以上とされ、また、好ましくは１００以下、さらに好ましくは７５以下、さらに好ましくは５０以下とされる。
【００３２】
前記ループ形成プライマーは、与えられた条件下で必要な特異性を維持しながら標的核酸との塩基対結合を行うことができる程度の鎖長を有するものである。このプライマーの鎖長は、好ましくは１５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは２０〜６０ヌクレオチドとする。また、前記第一のプライマーを構成する配列（Ac'）と配列（B'）の長さは、それぞれ、好ましくは５〜５０ヌクレオチド、より好ましくは７〜３０ヌクレオチドである。また、必要に応じて、配列（Ac'）と配列（B'）の間に、反応に影響を与えない介在配列を挿入してもよい。
【００３３】
本発明の一つの実施態様によれば、ループ形成プライマーは、二本鎖の増幅産物中に前記エンドヌクレアーゼ認識部位またはその一部を与えるための配列を含んでなるものとされ、例えば、このループ形成プライマー中にエンドヌクレアーゼの認識配列またはその一部が組み込まれる。プライマー中に導入される配列は、二本鎖の認識配列のうちのセンス鎖およびアンチセンス鎖のいずれであってもよい。この実施態様では、このループ形成プライマーは、配列（Ac'）と配列（B'）との間に、前記エンドヌクレアーゼによって認識される二本鎖核酸のうちの少なくとも一本鎖の配列（塩基数はＹ'）を含んでなるものとすることが好ましい。その場合には、前記ループ形成プライマーは、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ'）｝／Ｘが−１．００以上、好ましくは０．００以上、さらに好ましくは０．０５以上、さらに好ましくは０．１０以上となり、また、１．００以下、好ましくは０．７５以下、さらに好ましくは０．５０以下、さらに好ましくは０．２５以下となるように設計することが好ましい。さらに、（Ｘ＋Ｙ＋Ｙ'）は、好ましくは１５以上、さらに好ましくは２０以上、さらに好ましくは３０以上とされ、また、好ましくは１００以下、さらに好ましくは７５以下、さらに好ましくは５０以下とされる。また、この実施態様によるループ形成プライマーの鎖長は、好ましくは１５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは３０〜６０ヌクレオチドとする。さらに、この実施態様によるループ形成プライマーを構成する配列（Ac'）と配列（B'）の長さは、それぞれ、好ましくは５〜５０ヌクレオチド、より好ましくは１０〜３０ヌクレオチドである。あるいは、このループ形成プライマーは、配列（Ac'）の３’末端部分に前記エンドヌクレアーゼによって認識される二本鎖核酸のうちの一本鎖の部分配列を含んでなるか、または配列（Ac'）の５’末端部分と前記介在配列の３’末端部分とからなる部分もしくは前記介在配列の５’末端部分と配列（B'）の３’末端部分とからなる部分に前記エンドヌクレアーゼによって認識される二本鎖核酸のうちの一本鎖の全配列を含んでなるものとしてもよい。
【００３４】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、本発明によるプライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（B-Bc'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものとされる。このプライマーは前記折り返しプライマーの一例であり、以下「折り畳みプライマー」という。
【００３５】
このような折り畳みプライマーの構造は、例えば、図２に示すようなものであるが、図２に示される配列やヌクレオチド数に限定されるものではない。折り畳みプライマーを構成する配列（Ac'）の長さは、好ましくは５〜５０ヌクレオチド、より好ましくは１０〜３０ヌクレオチドである。また、前記折返し配列（B-Bc'）の長さは、好ましくは２〜１０００ヌクレオチド、より好ましくは２〜１００ヌクレオチド、さらに好ましくは４〜６０ヌクレオチド、さらに好ましくは６〜４０ヌクレオチドであり、折返し配列の内部におけるハイブリダイゼーションによって形成される塩基対のヌクレオチド数は、好ましくは２〜５００ｂｐ、より好ましくは２〜５０ｂｐ、さらに好ましくは２〜３０ｂｐ、さらに好ましくは３〜２０ｂｐである。折返し配列（B-Bc'）のヌクレオチド配列はいかなる配列であってもよく、特に限定されるものではないが、好ましくは標的核酸配列にハイブリダイズしない配列とされる。また、必要に応じて、配列（Ac'）と折返し配列（B-Bc'）の間に、反応に影響を与えない介在配列を挿入してもよい。
【００３６】
折り畳みプライマーは、ループ形成プライマーについて説明した作用機序と同様に作用することが可能である。一般に、二本鎖核酸が一本鎖に解離するときは、その末端あるいはそれ以外の比較的不安定な部分から部分的な解離が始まる。折り畳みプライマーによる伸長反応で生成した二本鎖核酸は、比較的高温では末端部分の塩基対は解離と結合の平衡状態にあり、全体としては二本鎖を保っている。このように解離した末端部分において、新たな折り畳みプライマーが鋳型にアニーリングし、そこから鎖置換を伴う相補鎖合成が進行する。
【００３７】
本発明の一つの実施態様によれば、折り畳みプライマーは、二本鎖の増幅産物中に前記エンドヌクレアーゼ認識部位またはその一部を与えるための配列を含んでなるものとされ、例えば、この折り畳みプライマー中にエンドヌクレアーゼの認識配列またはその一部が組み込まれる。プライマー中に導入される配列は、二本鎖の認識配列のうちのセンス鎖およびアンチセンス鎖のいずれであってもよい。この実施態様では、折り畳みプライマーは、配列（Ac'）以外の部分に、前記エンドヌクレアーゼによって認識される二本鎖核酸のうちの少なくとも一本鎖の配列を含んでなるものとすることが好ましい。このような一本鎖の認識配列は、例えば、配列（Ac'）と配列（B-Bc'）との間、配列（B-Bc'）の内部、配列（B）と配列（Bc'）との間、配列（Ac'）の５’末端部分と配列（B-Bc'）の３’末端部分とからなる部分、配列（Ac'）の５’末端部分と前記介在配列の３’末端部分とからなる部分、前記介在配列の５’末端部分と配列（B-Bc'）の３’末端部分とからなる部分などに導入することができる。あるいは、この折り畳みプライマーは、配列（Ac'）の３’末端部分または配列（B-Bc'）の５’末端部分に、前記エンドヌクレアーゼによって認識される二本鎖核酸のうちの一本鎖の部分配列を含んでなるものとしてもよい。この実施態様では、折り畳みプライマーを構成する配列（Ac'）の長さは、好ましくは５〜５０ヌクレオチド、より好ましくは１０〜３０ヌクレオチドである。また、前記折返し配列（B-Bc'）の長さは、好ましくは２〜１０００ヌクレオチド、より好ましくは２〜１００ヌクレオチド、さらに好ましくは４〜６０ヌクレオチド、さらに好ましくは６〜４０ヌクレオチドであり、折返し配列の内部におけるハイブリダイゼーションによって形成される塩基対のヌクレオチド数は、好ましくは２〜５００ｂｐ、より好ましくは２〜５０ｂｐ、さらに好ましくは２〜３０ｂｐ、さらに好ましくは３〜２０ｂｐである。折返し配列（B-Bc'）のヌクレオチド配列はいかなる配列であってもよく、特に限定されるものではないが、好ましくは標的核酸配列にハイブリダイズしない配列とされる。また、必要に応じて、配列（Ac'）と折返し配列（B-Bc'）の間に、反応に影響を与えない前記認識配列以外の介在配列を挿入してもよい。
【００３８】
本発明の一つの具体的な実施態様によれば、折り畳みプライマーは、折返し配列（B-Bc'）中にエンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含むように設計される。この場合、増幅産物が十分に長く伸長されるまでエンドヌクレアーゼのニッキング活性が機能しないように、折り畳みプライマーを設計することができる。例えば、前記センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかを折り畳みプライマーの５’末端部分に配置し、その末端の塩基を欠失させることができる。さらに、折返し配列（B-Bc'）の３’末端部分に配置された他方の鎖の配列中に、本来の認識配列とは異なるミスマッチ塩基を導入することができる。このような折り畳みプライマーを用いて核酸増幅反応を行った場合の作用機序を、図３を用いて説明する。図３に記載されている１０塩基以上のヌクレオチド配列（二本鎖核酸の配列については、いずれか一方の鎖）は、配列表中の配列番号１０〜１３にも示されている。
【００３９】
図３には、エンドヌクレアーゼの認識配列およびこれを組み込んだ折り畳みプライマーの配列が示されている。ここでは、エンドヌクレアーゼとしてＮｂ．ＢｓｍＩが用いられている。図３に示される認識配列は、矢印の位置でＮｂ．ＢｓｍＩにより切断される。また、プライマー配列中の下線部は前記認識配列に由来する配列を示し、囲み線を付した部分は鋳型にハイブリダイズする配列を示す。まず、この折り畳みプライマーが鋳型にアニールしてプライマー伸長鎖が形成され（図３ａ、上側の配列）、その後、一本鎖となった該伸長鎖に他方のプライマーがアニールして相補鎖が合成される（図３ａ、下側の配列）。こうして得られる二本鎖核酸の一方の末端部分には、前記折り畳みプライマーの配列が二本鎖の状態で存在するが、この段階でＮｂ．ＢｓｍＩが機能することはない。すなわち、この二本鎖の折り畳みプライマー配列は、その末端部分と折返し配列（B-Bc'）の３’末端に対応する部分とにＮｂ．ＢｓｍＩ認識配列に由来する配列を含んでいるが（図３ａ、下線部）、これらの配列は、上述の末端塩基の欠失またはミスマッチ塩基の存在により完全な認識配列を形成しておらず、よって、Ｎｂ．ＢｓｍＩは作用しない。次に、得られた二本鎖核酸の末端に存在する折返し配列（B-Bc'）の相補鎖が折り返して図２に示す構造を形成する。折り返した該相補鎖の末端は３’末端であるため、その後、これが起点となって相補鎖合成が進行する（図３ｂ）。この相補鎖合成により、欠失していた認識配列の塩基が補完されるために認識配列の一方の鎖は完全なものとなるが（図３ｃ、下側の下線部）、これにハイブリダイズしている他方の鎖に依然としてミスマッチ塩基が含まれるため（図３ｃ、上側の下線部）、ここでもＮｂ．ＢｓｍＩは作用しない。次いで、図３ｃに示される二本鎖の状態の一本鎖核酸を鋳型とする相補鎖合成がなされる（図３ｄ）。これにより得られる二本鎖の状態の核酸は、図３ｅに示すとおり、上述のように補完された完全な認識配列を二本鎖の状態で含んでいるため（囲み線）、矢印の位置でＮｂ．ＢｓｍＩにより切断される。このように、折り畳みプライマーは、増幅産物が十分に長く伸長されるまでエンドヌクレアーゼのニッキング活性が機能しないように設計することができる。
【００４０】
これらのループ形成プライマーおよび折り畳みプライマーは、任意の組み合わせで用いることができる。すなわち、２種類のループ形成プライマーをフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして用いてもよいし、２種類の折り畳みプライマーをフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして用いてもよいし、あるいは、ループ形成プライマーと折り畳みプライマーとをフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして用いてもよい。
【００４１】
本発明の一つの実施態様によれば、本発明によるプライマーセットは、２種類のループ形成プライマーをフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして含むものとされる。すなわち、この実施態様では、本発明によるプライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）の相補配列（Bc）にハイブリダイズする配列（B'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものとされ、前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（C）にハイブリダイズする配列（Cc'）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（C）よりも５’側に存在する配列（D）の相補配列（Dc）にハイブリダイズする配列（D'）を前記配列（Cc'）の５’側に含んでなるものとされる。
【００４２】
本発明の他の実施態様によれば、本発明によるプライマーセットは、２種類の折り畳みプライマーをフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして含むものとされる。すなわち、この実施態様では、本発明によるプライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（B-Bc'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものとされ、前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（C）にハイブリダイズする配列（Cc'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（D-Dc'）を前記配列（Cc'）の５’側に含んでなるものとされる。
【００４３】
本発明の好ましい実施態様によれば、本発明によるプライマーセットは、ループ形成プライマーと折り畳みプライマーとの組み合わせをプライマーペアとして含むものとされる。すなわち、この実施態様では、本発明によるプライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）の相補配列（Bc）にハイブリダイズする配列（B'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものとされ、前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（C）にハイブリダイズする配列（Cc'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（D-Dc'）を前記配列（Cc'）の５’側に含んでなるものとされる。
【００４４】
これらループ形成プライマー（第一のプライマー）および折り畳みプライマー（第二のプライマー）による核酸増幅反応について考えられる作用機序を、図４（図４ａおよび図４ｂ）を用いて説明する。ここでは、エンドヌクレアーゼを用いない核酸増幅反応について説明する。なお、図４では、説明を簡略化するため、ハイブリダイズする２つの配列を相互に相補的な配列としているが、これにより本発明が限定されるものではない。まず、第一のプライマーが標的核酸のセンス鎖にハイブリダイズし、該プライマーの伸長反応が起きる（図４(a)）。次いで、伸長鎖（−）上においてステムループ構造が形成され、これにより一本鎖となった標的核酸センス鎖上の配列（A）に新たな第一のプライマーがハイブリダイズし（図４(b)）、該プライマーの伸長反応が起きて、先に合成された伸長鎖（−）が脱離する。次に、脱離した伸長鎖（−）上の配列（C）に第二のプライマーがハイブリダイズし（図４(c)）、該プライマーの伸長反応が起き、伸長鎖（＋）が合成される（図４(d)）。生成した伸長鎖（＋）の３’末端と伸長鎖（−）の５’末端ではステムループ構造が形成され（図４(e)）、遊離型の３’末端である伸長鎖（＋）のループ先端から伸長反応が起こると同時に、前記伸長鎖（−）が脱離する（図４(f)）。ループ先端からの前記伸長反応により、伸長鎖（＋）の３’側に配列（A）および配列（Bc）を介して伸長鎖（−）が結合したヘアピン型の二本鎖核酸が生成し、その配列（A）および配列（Bc）に第一のプライマーがハイブリダイズし（図４(g)）、その伸長反応により伸長鎖（−）が生成する（図４(h)および(i)）。また、前記ヘアピン型二本鎖核酸の３’末端に存在する折返し配列によって遊離型の３’末端が提供され（図４(h)）、そこからの伸長反応により（図４(i)）、両端に折返し配列を有し、第一および第二のプライマーに由来する配列を介して伸長鎖（＋）と伸長鎖（−）とを交互に含む一本鎖核酸が生成する（図４(j)）。この一本鎖核酸では、その３’末端に存在する折返し配列により遊離型の３’末端（相補鎖合成起点）が提供されるため（図４(k)）、同様の伸長反応が繰り返され、１回の伸長反応あたり２倍の鎖長となる（図４(l)および(m)）。また、図４(i)において脱離した第一のプライマーからの伸長鎖（−）では、その３’末端に存在する折返し配列により遊離型の３’末端（相補鎖合成起点）が提供されるため（図４(n)）、そこからの伸長反応により、両端にステムループ構造が形成され、プライマーに由来する配列を介して伸長鎖（＋）と伸長鎖（−）とを交互に含む一本鎖核酸が生成する（図４(o)）。この一本鎖核酸においても、３’末端におけるループ形成によって相補鎖合成起点が順次提供されるため、そこからの伸長反応が次々に起こる。このようにして自動的に延長される一本鎖核酸には、第一のプライマーおよび第二のプライマーに由来する配列が伸長鎖（＋）と伸長鎖（−）との間に含まれているため、各プライマーがハイブリダイズして伸長反応を起こすことが可能であり、これにより標的核酸のセンス鎖およびアンチセンス鎖が顕著に増幅される。
【００４５】
本発明によるプライマーセットは、第一のプライマーおよび第二のプライマー以外に、１種以上の第三のプライマーを含むものとすることができる。第三のプライマーは、前記標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズするものであればよいが、好ましくは、標的核酸配列またはその相補配列へのハイブリダイゼーションについて他のプライマーと競合しないものとされる。
【００４６】
本発明において「競合しない」とは、そのプライマーが標的核酸にハイブリダイズすることによって他のプライマーによる相補鎖合成起点の付与が妨げられないことを意味する。
【００４７】
折り返しプライマーにより標的核酸が増幅された場合には、図４に例示されるように、増幅産物は標的核酸配列とその相補配列とを交互に有するものとなる。その増幅産物の３’末端には折り返し配列またはループ構造が存在し、これにより提供される相補鎖合成起点から次々に伸長反応が起こっている。第三のプライマーは、このような増幅産物が部分的に一本鎖の状態になった時に、その一本鎖部分に存在する標的配列にアニ−リングすることができる。これにより、増幅産物中の標的核酸配列内に新たな相補鎖合成起点が提供され、そこからの伸長反応が起こるため、核酸増幅反応がより迅速に行われるようになる。
【００４８】
第三のプライマーは必ずしも１種類に限定されるわけではなく、核酸増幅反応の迅速性および特異性を向上させるためには２種類以上の第三のプライマーを同時に用いてもよい。これら第三のプライマーは、典型的には折り返しプライマーとは異なる配列からなるが、これらのプライマーと競合しない限りにおいて、部分的に重なる領域にハイブリダイズするものとしてもよい。第三のプライマーの鎖長は、好ましくは２〜１００ヌクレオチド、より好ましくは５〜５０ヌクレオチド、さらに好ましくは７〜３０ヌクレオチドとされる。
【００４９】
第三のプライマーは、折り返しプライマーによる核酸増幅反応をより迅速に進めるための補助的な働きをその主目的とするものである。従って、第三のプライマーは、折り返しプライマーの各３’末端のＴｍよりも低いＴｍを有するものとすることが好ましい。また、第三のプライマーの増幅反応液への添加量は、折り返しプライマーのそれぞれの添加量よりも少ない方が好ましい。
【００５０】
第三のプライマーとしては、国際公開第０２／２４９０２号パンフレットに記載のような、ループを形成できる構造をもつものを鋳型として、そのループ部分に相補鎖合成の起点を与えるものを挙げることができるが、これに限定されるものではない。すなわち、標的核酸配列内であれば、いかなる部位に相補鎖合成起点を提供するものであってもよい。
【００５１】
本発明によるプライマーセットは、さらに、鋳型核酸上の前記標的核酸配列よりも３’側の領域にハイブリダイズするアウタープライマーを含んでなるものとしてもよい。
【００５２】
本発明によるプライマーセットに含まれるプライマーは、デオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドにより構成される。本発明において、「リボヌクレオチド」（単に「Ｎ」ということもある）とは、リボヌクレオシド三リン酸をいい、例えば、ＡＴＰ，ＵＴＰ，ＣＴＰ，ＧＴＰ等がある。さらに、リボヌクレオチドにはこれらの誘導体が含まれ、例えば、α位のリン酸基の酸素原子を硫黄原子に置き換えたリボヌクレオチド（α−チオ−リボヌクレオチド）等がある。
【００５３】
また、前記プライマーには、未修飾デオキシリボヌクレオチドおよび／または修飾デオキシリボヌクレオチドで構成されたオリゴヌクレオチドプライマー、および未修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドで構成されたオリゴヌクレオチドプライマー、未修飾デオキシリボヌクレオチドおよび／または修飾デオキシリボヌクレオチドおよび未修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマー等も含まれる。
【００５４】
本発明によるプライマーセットに含まれるプライマーは、オリゴヌクレオチドの合成に用いることのできる任意の方法、例えば、リン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等により合成できる。前記プライマーは、例えば、ＡＢＩ社（Applied Biosystem Inc.）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いてホスホアミダイト法により合成すれば、容易に取得することができる。
【００５５】
本発明による核酸増幅法では、標的核酸を含む試料を鋳型として、本発明によるプライマーセットを用いた核酸増幅反応が行なわれる。この核酸増幅反応は、ニッキング活性を示すことのできるエンドヌクレアーゼの存在下、前記エンドヌクレアーゼがニッキング活性を示す条件下において行われる。このような反応条件は、当業者であれば適宜決定することができる。
【００５６】
核酸増幅反応において鋳型となる、試料中の標的核酸配列を含む核酸分子（鋳型核酸）は、ＤＮＡまたはＲＮＡのどちらでもよい。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。ＲＮＡには、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡおよび合成ＲＮＡのいずれもが含まれる。核酸増幅反応に用いられる試料は、例えば、血液、組織、細胞、動物および植物などの生体に由来する試料、ならびに生体由来試料、食品、土壌、排水等から分離された微生物由来試料などであってよいが、これらの試料を精製して得られる精製試料であってもよく、さらには、これらの試料から単離された鋳型核酸とすることもできる。
【００５７】
鋳型核酸の単離は任意の方法で行うことができ、例えば、界面活性剤による溶解処理、音波処理、ガラスビーズを用いた振盪撹拌およびフレンチプレス等を用いる方法が挙げられる。また、内在性ヌクレアーゼが存在する場合には、単離された核酸を精製することが好ましい。核酸の精製は、例えば、フェノール抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動、密度に依存した遠心分離などにより実施することが可能である。
【００５８】
より具体的には、前記鋳型核酸としては、上記方法により単離したゲノムＤＮＡやＰＣＲフラグメントのような二本鎖核酸、全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡから逆転写反応で調製されたｃＤＮＡのような一本鎖核酸のいずれも使用可能である。上記二本鎖核酸の場合は、変性工程（denaturing）を行なって一本鎖とすることにより、より最適に利用することができる。
【００５９】
上記の逆転写反応に用いられる酵素は、ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成活性を有するものであれば特に限定されず、例えば、トリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ ＲＴａｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ−２ ＲＴａｓｅ）、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴａｓｅ）等、種々の起源の逆転写酵素が挙げられる。このほか、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼを使用することも可能である。また、本発明の目的のためには、高温で逆転写活性を有する酵素が最適であり、例えばサーマス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ等）、バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ等を使用できる。特に好ましい酵素を例示すれば、例えば、好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼとして、Ｂ．ｓｔ由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ）、およびＢ．ｃａ由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ）、例えばＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。例えば、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼは、反応にマンガンイオンを必要とせず、高温条件下で鋳型ＲＮＡの二次構造形成を抑制しながらｃＤＮＡを合成することが可能である。
【００６０】
核酸増幅反応では、鋳型核酸が二本鎖核酸の場合でも、これをそのまま反応に用いることができるが、必要に応じてそれらを変性して一本鎖にすることにより、鋳型核酸へのプライマーのアニーリングを効率よく行なうこともできる。温度を約９５℃に上昇させることは、好ましい核酸変性法である。他の方法として、ｐＨを上昇させることにより変性させることも可能であるが、この場合には、プライマーを標的核酸にハイブリダイズさせるためにｐＨを低下させる必要がある。
【００６１】
核酸増幅反応に用いられるエンドヌクレアーゼは、折り返しプライマー中に組み込まれた認識配列に対応するものとされる。反応溶液中におけるエンドヌクレアーゼの濃度は、酵素の種類に応じて当業者により適宜決定されるが、好ましくは０．０００１単位／μｌ〜１００単位／μｌ、さらに好ましくは０．００１単位／μｌ〜１０単位／μｌ、さらに好ましくは０．０１単位／μｌ〜１単位／μｌとされる。
【００６２】
本発明によるプライマーセットが等温下での反応によって標的核酸の増幅を可能とするものとされる場合には、核酸増幅反応は等温下で行なうことが好ましい。ここで、「等温」とは、酵素およびプライマーが実質的に機能しうるような、ほぼ一定の温度条件下に保つことをいう。さらに、「ほぼ一定の温度条件」とは、設定された温度を正確に保持することのみならず、酵素およびプライマーの実質的な機能を損なわない程度の温度変化であれば許容されることを意味する。一定の温度条件下での核酸増幅反応は、使用する酵素の活性を維持できる温度に保つことにより実施することができる。また、この核酸増幅反応において、プライマーが標的核酸にアニーリングするためには、例えば、反応温度を、そのプライマーの融解温度（Ｔｍ）付近の温度、もしくはそれ以下に設定することが好ましく、さらには、プライマーの融解温度（Ｔｍ）を考慮し、ストリンジェンシーのレベルを設定することが好ましい。従って、この温度は、好ましくは、約２０℃〜約７５℃であり、さらに好ましくは、約３５℃〜約６５℃とする。
【００６３】
核酸増幅反応に用いられるポリメラーゼは、鎖置換（strand displacement）活性（鎖置換能）を有するものであることが好ましく、常温性、中温性、もしくは耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。また、このポリメラーゼは、天然体もしくは人工的に変異を加えた変異体のいずれであってもよい。このようなポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。さらに、このＤＮＡポリメラーゼは、実質的に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有しないものであることが好ましい。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus、以下「Ｂ．ｓｔ」という）、バチルス・カルドテナックス（Bacillus caldotenax、以下「Ｂ．ｃａ」という）等の好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント等が挙げられる。核酸増幅反応において使用するＤＮＡポリメラーゼとしては、さらに、Vent DNAポリメラーゼ、Vent (Exo-) DNAポリメラーゼ、DeepVent DNAポリメラーゼ、DeepVent (Exo-) DNAポリメラーゼ、Φ２９ファージＤＮＡポリメラーゼ、ＭＳ−２ファージＤＮＡポリメラーゼ、Z-Taq DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、Pfu turbo DNAポリメラーゼ、KOD DNAポリメラーゼ、9°Nm DNAポリメラーゼ、Therminator DNAポリメラーゼ等が挙げられる。
【００６４】
核酸増幅反応に用いられるその他の試薬としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム等の触媒、ｄＮＴＰミックス等の基質、トリス塩酸バッファー、トライシンバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、リン酸カリウムバッファー等の緩衝液を使用することができる。さらに、ジメチルスルホキシド(dimethyl sulfoxide)やベタイン（N,N,N-trimethylglycine）等の添加物、国際公開第９９／５４４５５号パンフレットに記載の酸性物質、陽イオン錯体等を使用してもよい。
【００６５】
核酸増幅反応において、核酸の増幅効率を高めるために、融解温度調整剤を反応溶液中に添加することができる。核酸の融解温度（Tm）は、一般的に、核酸中の二本鎖形成部分の具体的なヌクレオチド配列によって決定される。反応溶液中に融解温度調整剤を添加することにより、この融解温度を変化させることができ、従って、一定の温度下では、核酸における二本鎖形成の強度を調整することが可能となる。一般的な融解温度調整剤は、融解温度を下げる効果を有する。このような融解温度調整剤を添加することにより、２本の核酸の間の二本鎖形成部分の融解温度を下げることができ、換言すれば、その二本鎖形成の強度を下げることが可能となる。従って、前記核酸増幅反応においてこのような融解温度調整剤を反応溶液中に添加すると、強固な二本鎖を形成するＧＣの豊富な核酸領域や複雑な二次構造を形成する領域において効率的に二本鎖部分を一本鎖とすることが可能となり、これにより、プライマーによる伸長反応が終わった後に次のプライマーが目的領域にハイブリダイズしやすくなるため、核酸の増幅効率を上げることができる。本発明において用いられる融解温度調整剤およびその反応溶液中での濃度は、ハイブリダイゼーション条件に影響を与える他の反応条件、例えば塩濃度、反応温度等を考慮して、当業者により適切に選択される。従って、融解温度調整剤は特に制限されるものではないが、好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの任意の組み合わせとされ、より好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）とされる。
【００６６】
さらに、核酸増幅反応において、酵素安定化剤を反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の増幅効率を高めることが可能となる。本発明において用いられる酵素安定化剤は、グリセロール、ウシ血清アルブミン、糖類などの、当技術分野において知られているいかなるものであってもよく、特に制限されない。
【００６７】
さらに、核酸増幅反応において、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、エンドヌクレアーゼなどの酵素の耐熱性を増強するための試薬を、酵素安定化剤として反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の合成効率および増幅効率を高めることが可能となる。このような試薬は当技術分野において知られているいかなるものであってもよく、特に制限されないが、好ましくは糖類、より好ましくは単糖またはオリゴ糖、さらに好ましくはトレハロース、ソルビトールもしくはマンニトール、またはこれらの２種以上の混合物とされる。
【００６８】
核酸増幅反応によって得られた増幅産物の存在は、多くのあらゆる方法により検出することができる。一つの方法は、一般的なゲル電気泳動による特定のサイズの増幅産物の検出である。この方法では、例えば、エチジウムブロマイドやサイバーグリーン等の蛍光物質により検出できる。他の方法としては、ビオチンのような標識を有する標識プローブを用い、これを増幅産物にハイブリダイズさせることにより検出することもできる。ビオチンは、蛍光標識されたアビジン、ペルオキシダーゼのような酵素に結合したアビジン等との結合により検出可能である。さらに別の方法としては、免疫クロマトグラフを用いる方法がある。この方法では、肉眼で検出可能な標識を利用したクロマトグラフ媒体を用いることが考案されている（イムノクロマトグラフィー法）。上記増幅断片と標識プローブとをハイブリダイズさせ、該増幅断片のさらに異なる配列とハイブリダイズ可能な捕捉用プローブをクロマト媒体に固定しておけば、その固定した部分でトラップすることができ、クロマト媒体での検出が可能となる。その結果、肉眼的にシンプルな検出が可能となる。さらに、本発明者らによる核酸増幅法では、核酸増幅反応における増幅効率が非常に高いため、増幅の副産物としてピロリン酸が生じることを利用して、増幅産物を間接的に検出することもできる。このような方法としては、例えば、ピロリン酸が反応溶液中のマグネシウムと結合することによりピロリン酸マグネシウムの白色沈澱が生じることを利用して、反応溶液の白濁を目視で観察する方法がある。また、他の方法としては、ピロリン酸がマグネシウムなどの金属イオンと強く結合して不溶性塩を形成することにより、反応溶液中のマグネシウムイオン濃度が著しく減少することを利用する方法がある。この方法では、マグネシウムイオン濃度に応じて色調が変化する金属指示薬（例えば、Eriochrome Black T、Hydroxy Naphthol Blue等）を反応溶液に添加しておくことにより、反応溶液の色の変化を目視で観察することにより、増幅の有無を検出することが可能となる。さらに、Calceinなどを利用することにより、増幅反応に伴う蛍光の増大を目視で観察することができるため、リアルタイムでの増幅産物の検出が可能となる。
【００６９】
本発明による核酸増幅法は、高い配列特異性を有し、なおかつ顕著に高い増幅効率を有するものである。このような増幅効率が実現される理由は、特定の理論に拘束されるものではないが、次のように考えられる。まず、折り返しプライマーが鋳型にアニーリングしてプライマー伸長反応が生じると、５’末端部分が同一鎖上に折り返すことのできる鋳型の相補鎖が合成される。次に、このような相補鎖に対して何らかのプライマーがアニーリングし、さらにその相補鎖が合成されると、３’末端部分が同一鎖上に折り返すことのできる鎖が得られる。こうして得られた鎖においては、折り返した３’末端が相補鎖合成の起点となって、次々に相補鎖合成が進行し、図４に例示したような長鎖の増幅産物が形成される。この増幅産物は、多くの標的核酸配列のセンス鎖とアンチセンス鎖とが交互に並んだ二本鎖の構造を有し、そのセンス鎖とアンチセンス鎖との間には、折り返しプライマーの配列が二本鎖の状態で存在する。よって、この折り返しプライマーの配列中にエンドヌクレアーゼの認識配列が存在し、そのエンドヌクレアーゼのニッキング活性によって片方の鎖が切断されれば、その切断部位が起点となって３’方向に相補鎖合成が進行する。さらに、このような切断部位が増幅産物の内部に数多く存在することが利点であると考えられる。
【００７０】
本発明による高い配列特異性および高い増幅効率を有する核酸増幅法は、核酸試料中の核酸配列における変異の有無を判定するのに適している。よって、本発明によれば、核酸試料中の核酸配列における変異の有無を判定する方法であって、（ａ）核酸試料を用意する工程、（ｂ）ニッキング活性を示すことのできるエンドヌクレアーゼを用意する工程、（ｃ）本発明によるプライマーセットであって、該プライマーセットに含まれる少なくとも１種のプライマーが、前記変異の存在または不存在によって前記核酸試料中の標的配列との間で１以上のミスマッチを生じるように設計されたものである、プライマーセットを用意する工程、および（ｄ）前記核酸試料および前記エンドヌクレアーゼの存在下、前記エンドヌクレアーゼがニッキング活性を示す条件下において前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行う工程、を含んでなる方法が提供される。ここで、「変異」という用語は、１以上のヌクレオチドの置換、欠失および挿入のいずれをも包含する。
【００７１】
本発明において「ミスマッチ」とは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびチミン（Ｔ）（ＲＮＡの場合はウラシル（Ｕ））から選択される一組の塩基対が正常な塩基対（ＡとＴの組み合わせ、またはＧとＣの組み合わせ）ではないことを意味する。ミスマッチには、１つのミスマッチのみならず、複数の連続したミスマッチ、１または複数の塩基の挿入および／または欠失により生じるミスマッチ、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。
【００７２】
上記の１以上のミスマッチは、１塩基のミスマッチ、連続した複数のミスマッチ、または非連続的な複数のミスマッチとすることができる。
【００７３】
変異の存在または不存在によってミスマッチを生じる上記のプライマーは、検出の対象とする変異を有する標的核酸配列と該変異を有さない標的核酸配列とを比較することにより、当業者であれば適宜設計することができる。すなわち、これら２つの標的核酸配列の間で異なるヌクレオチドを含む領域にハイブリダイズするように、前記プライマーを設計すればよい。その際、前記プライマーは、変異を有する標的核酸配列に相補的な配列を含むように設計すれば、変異の不存在によってミスマッチを生じるものとなり、一方で、変異を有さない標的核酸配列に相補的な配列を含むように設計すれば、変異の存在によってミスマッチを生じるものとなる。
【００７４】
ループ形成プライマーが用いられる場合には、このプライマーは、前記変異の存在または不存在によって、前記配列（A）と前記配列（Ac'）との間で１以上のミスマッチを生じるように設計することができる。あるいは、このプライマーは、前記変異の存在または不存在によって、前記配列（Bc）と前記配列（B'）との間で１以上のミスマッチを生じるように設計することもできる。
【００７５】
折り畳みプライマーが用いられる場合には、このプライマーは、前記変異の存在または不存在によって、前記配列（C）と前記配列（Cc'）との間で１以上のミスマッチを生じるように設計することができる。
【００７６】
第三のプライマーが用いられる場合には、このプライマーは、前記変異の存在または不存在によって前記核酸配列またはその相補配列との間で１以上のミスマッチを生じるように設計することができる。
【００７７】
本発明の一つの実施態様によれば、本発明による変異検出法における核酸増幅反応は、ミスマッチ認識タンパク質の存在下で行なわれ、これにより、より正確に変異を検出することが可能となる。
【００７８】
ＤＮＡの二本鎖において部分的に対合できない（ミスマッチ）塩基対が生じたときに、細菌や酵母等には、これを修復するための機構があることが既に知られている。この修復は「ミスマッチ結合タンパク質」（「ミスマッチ認識タンパク質」とも称される）と呼ばれるタンパク質によって行なわれるものであり、ＭｕｔＳタンパク質（特表平９−５０４６９９号公報）、ＭｕｔＭタンパク質（特開２０００−３００２６５号公報）、ＧＦＰ（Green Fluorescence Protein）に結合したＭｕｔＳタンパク質（国際公開第９９／０６５９１号パンフレット）などの様々なミスマッチ結合タンパクの使用が報告されている。さらに、近年、ミスマッチ結合タンパク質を利用してミスマッチを検出する遺伝子診断法が開発されている（M. Gotoh et al., Genet. Anal., 14, 47-50, 1997）。核酸中における特定のヌクレオチドにおける多型および突然変異の検出法としては、例えば、変異のない対照核酸と、変異が存在することが疑われる被検核酸とをハイブリダイズさせ、そこにミスマッチ認識タンパク質を導入することによりミスマッチを検出する方法が知られている。
【００７９】
本発明による変異検出法においても、これらのミスマッチ結合タンパク質を利用することにより、その特異性（正確さ）を向上させることができる。本発明による変異検出法では、核酸試料に含まれる被検核酸が、変異部位において標的核酸配列と異なるヌクレオチドを有する場合には、プライマーに含まれる配列の被検核酸へのハイブリダイゼーションが妨げられるため、増幅産物が得られないか、または増幅産物の量が減少することとなる。しかしながら、これらのハイブリダイゼーションが完全には妨げられない場合もあり、その場合には、これらの配列において少量のヘテロ二本鎖構造が生ずる。本発明において「ヘテロ二本鎖構造」とは、実質的には相補的な二本鎖構造であるが、１または複数のミスマッチを有することにより非相補的な領域を含む二本鎖構造を意味する。このようなヘテロ二本鎖構造により、本来的には生成しないはずの誤った増幅産物がもたらされる。そこで、核酸増幅反応に用いられる反応液中にミスマッチ結合タンパク質を添加しておけば、上記のようなヘテロ二本鎖構造にこのミスマッチ結合タンパク質が結合し、その後の増幅反応が妨げられる。従って、ミスマッチ結合タンパク質を利用することにより、誤った増幅産物の生成を防ぐことが可能となる。
【００８０】
本発明に用いられるミスマッチ結合タンパク質は、二本鎖核酸におけるミスマッチを認識し、そのミスマッチの部位に結合することが可能なタンパク質であればよく、例えば、当業者に公知のいずれのものであってもよい。また、本発明に用いられるミスマッチ結合タンパク質は、二本鎖核酸中のミスマッチを認識しうる限り、野生型タンパク質のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質（変異体）であってもよい。このような変異体は、自然界において生じることもあるが、人為的に作製することも可能である。タンパク質にアミノ酸変異を導入する方法としては、多くの方法が知られている。例えば、部位特異的変異導入法としては、 W.P. DengとJ.A. Nickoloffの方法（Anal. Biochem., 200, 81, 1992）、K.L. MakamayeとF. Ecksteinの方法（Nucleic Adids Res., 14, 9679-9698, 1986）などが知られており、ランダム変異導入法としては、基本的な修復系を欠損した大腸菌 XL1-Red 株（Stratagene社）を用いる方法、亜硝酸ナトリウム等を用いて化学的に塩基を修飾する方法（J.-J. Diaz et al., BioTechnique, 11, 204-211, 1991）などが知られている。このようなミスマッチ結合タンパク質としては、ＭｕｔＭ、ＭｕｔＳおよびそれらの類似体など、多くのものが知られている（Radman,M.et al.,Annu.Rev.Genet.20:523-538(1986);Radaman,M.etal.,Sci.Amer.,August 1988,pp40-46;Modrich,P.,J.Biol.Chem.264:6597-6600(1989)； Lahue,R.S. et al.,Science 245:160-164(1988);Jiricny,J.et al,.Nucl.Acids Res.16:7843-7853(1988);Su,S.S.et al.,J.Biol.Chem.263;6829-6835(1988);Lahue,R.S.et al.,Mutat.Res.198:37-43(1988);Dohet,C.et al.,Mol.Gen.Gent.206:181-184(1987); Jones,M.et al.,Gentics 115:605-610(1987)； Salmonella typhimuriumのＭｕｔｓ（Lu,A.L.,Genetics 118:593-600(1988);HaberL.T. et al.,J.Bacteriol.170:197-202(1988);Pang,P.P.et al.,J.Bacteriol.163:1007-1015(1985)）；およびPriebe S.D.et al.,J.Bacterilo.170:190-196(1988)）。本発明に用いられるミスマッチ結合タンパク質は、好ましくはＭｕｔＳ、ＭｕｔＨ、ＭｕｔＬ、または酵母に由来するものとされ、より好ましくはＭｕｔＳ、ＭｕｔＨ、またはＭｕｔＬとされる。
【００８１】
ミスマッチ結合タンパク質は、一本鎖核酸にも結合することがあり、このようなミスマッチ結合タンパク質の一本鎖核酸への結合は、一本鎖結合タンパク質により阻害されることが知られている。従って、本発明による変異検出法においてミスマッチ結合タンパク質を用いる場合には、一本鎖結合タンパク質を併用することが好ましい。また、ミスマッチ結合タンパク質は、ミスマッチを含まない二本鎖核酸にも結合することがあり、このようなミスマッチ結合タンパク質の誤った結合は、あらかじめ活性剤を用いてミスマッチ結合タンパク質を活性化しておくことにより阻害されることが知られている。従って、本発明による変異検出法においてミスマッチ結合タンパク質を用いる場合には、活性剤によりあらかじめ活性化されたものを用いることが好ましい。
【００８２】
一本鎖核酸にミスマッチ結合タンパク質が結合するのを阻害するために使用する一本鎖結合タンパク質(ＳＳＢ)は、当技術分野において公知の任意のＳＳＢとすることができる。好ましいＳＳＢとしては、エシェリキア・コリ、ショウジョウバエ、およびアフリカツメガエルに由来する一本鎖結合タンパク質、およびＴ４バクテリオファージ由来の遺伝子３２タンパク質、ならびに他の種に由来するこれらの相当物が挙げられる。この場合に使用されるミスマッチ結合タンパク質としては、ＭｕｔＳ、ＭｕｔＨ、ＭｕｔＬ、ＨｅｘＡ、ＭＳＨ１〜６、Ｒｅｐ３、ＲＮａｓｅＡ、ウラシル−ＤＮＡグリコシダーゼ、Ｔ４エンドヌクレアーゼVII、レゾルバーゼなどが挙げられ、好ましくはＭｕｔＳ、ＭＳＨ２もしくはＭＳＨ６、またはこれらの２種以上の混合物とされ、より好ましくはＭｕｔＳとされる。
【００８３】
ミスマッチ結合タンパク質を活性化するための活性剤は、当業者であれば適宜選択することができるため、特に限定されないが、好ましくは、ＡＴＰ(アデノシン５'−三リン酸)、ＡＤＰ(アデノシン５'−二リン酸)、ＡＴＰ−γ−Ｓ(アデノシン５'−Ｏ−(３−チオ三リン酸))、ＡＭＰ−ＰＮＰ(アデノシン５'−[β,γ−イミド]三リン酸)などの化合物とされ、あるいは、ミスマッチ結合タンパク質に結合できるヌクレオチドの一つとされる。ミスマッチ結合タンパク質の活性化は、ミスマッチ結合タンパク質と活性剤とを、室温で数秒間から数分間インキュベートすることにより行うことができる。
【００８４】
上記核酸増幅反応の他の条件は、本発明による核酸増幅法と同様に設定することができる。例えば、上記核酸増幅反応では、好ましくは上述の鎖置換能を有するポリメラーゼが使用される。また、必要に応じて、上述の融解温度調整剤、上述の酵素安定化剤などを用いてもよい。
【００８５】
本発明による変異検出法を行なった結果、変異の存在によりミスマッチを生じるプライマーを用いて増幅産物が得られた場合には核酸試料中に前記変異が存在しないものと判定することができ、逆に、増幅産物が得られなかった場合には前記変異が存在するものと判定することができる。一方で、変異の不存在によりミスマッチを生じるプライマーを用いて増幅産物が得られた場合には核酸試料中に前記変異が存在するものと判定することができ、逆に、増幅産物が得られなかった場合には前記変異が存在しないものと判定することができる。
【００８６】
本発明による核酸増幅法または変異検出法を実施するために、必要な試薬をまとめてキットとすることができる。従って、本発明によれば、鋳型核酸中の標的核酸配列を増幅するためのキットであって、（ａ）ニッキング活性を示すことのできるエンドヌクレアーゼ、および（ｂ）本発明によるプライマーセットを含んでなるキットが提供される。さらに、本発明によれば、核酸試料中の核酸配列における変異の有無を判定するためのキットであって、（ａ）ニッキング活性を示すことのできるエンドヌクレアーゼ、および（ｂ）本発明によるプライマーセットであって、該プライマーセットに含まれる少なくとも１種のプライマーが、前記変異の存在または不存在によって前記核酸試料中の標的配列との間で１以上のミスマッチを生じるように設計されたものであるプライマーセット、を含んでなるキットが提供される。本発明によるキットはさらに、鎖置換能を有するポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、緩衝液などの上述の試薬類、反応容器、説明書等を含んでいてもよい。
【００８７】
以上に説明してきたように、本発明による核酸増幅法の主要な特徴の一つは、本発明によるプライマーセットを用いた核酸増幅反応において、エンドヌクレアーゼの認識部位を含み、かつ、両端にループ構造または折り返し構造を有する一本鎖核酸が形成される点にある。このような一本鎖核酸にエンドヌクレアーゼと鎖置換能を有するポリメラーゼとを作用させると、一本鎖核酸の３’末端側のループ部分を合成起点とする相補鎖合成が生じて、一本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸が次々に伸長される。これと同時に、前記エンドヌクレアーゼのニッキング活性によって二本鎖のうちの一方だけが切断された部分を合成起点とする相補鎖合成が生じて、標的核酸の増幅が顕著に促進される。上述の核酸増幅法の説明では、一本鎖核酸上のエンドヌクレアーゼ認識部位の位置はプライマーに由来する配列の近辺に限定されているが、該認識部位が一本鎖核酸上のいずれの位置にあっても同様の反応が生じることは、当業者には明らかであろう。
【００８８】
従って、本発明の他の態様によれば、一本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸を増幅する方法が提供され、該方法は、（ａ）ニッキング活性を示すことのできるエンドヌクレアーゼを用意する工程、（ｂ）前記エンドヌクレアーゼにより認識される二本鎖配列の少なくとも一方の鎖の配列を含んでなる一本鎖の鋳型核酸であって、その３’末端と５’末端において、それぞれ末端領域に相補的な塩基配列からなる領域を同一鎖上に備え、この互いに相補的な塩基配列がハイブリダイズすることによりループ構造または折り返し構造を形成しうる、鋳型核酸を用意する工程、（ｃ）核酸増幅反応に用いられる、鎖置換能を有するポリメラーゼを用意する工程、および（ｄ）前記エンドヌクレアーゼ、前記鋳型核酸および前記ポリメラーゼを含んでなる核酸増幅反応溶液を調製し、この溶液を、前記エンドヌクレアーゼがニッキング活性を示す条件下においてインキュベートする工程を含んでなる。エンドヌクレアーゼについては、既に説明したとおりである。また、核酸増幅反応溶液は、融解温度調整剤など、上述したような様々な試薬を含んでいてもよい。さらに、前記溶液のインキュベートは、等温下で行われることが好ましい。
【００８９】
さらに、本発明による核酸増幅法または変異検出法を用いることにより、試料中の標的核酸を特異的に検出することが可能となるが、これは、専用の装置を用いて行うことができる。従って、本発明の他の態様によれば、試料中の標的核酸を検出するための装置が提供され、該装置は、（ａ）本発明による核酸増幅法または変異検出法を行うための反応室と、（ｂ）前記反応室の内部の温度を調節するための温度調節手段と、（ｃ）前記反応室中の反応混合物からの、増幅産物の生成を示すシグナルを検出するためのシグナル検出手段とを少なくとも備えてなるものである。さらに、この装置は、前記シグナルが検出された場合に試料中の標的核酸が検出されたことを表示するための表示手段をさらに含んでいてもよい。
【００９０】
前記シグナルとしては、蛍光、電気化学的発光、色素など、核酸増幅反応における増幅産物の検出に利用可能な公知のシグナルを用いることができ、選択されたシグナルに応じてその検出手段を選択することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、前記シグナル検出手段は、前記反応混合物からの発光量を測定するための発光量測定手段を含んでなるものとされる。この実施態様では、前記反応混合物は、増幅産物の生成により発光する物質を予め含んでいるものとされ、このような物質としては、インターカレーターなどの公知の物質を用いることができる。発光量測定手段は、発光強度を測定しうる手段であればよく、例えば、当技術分野において周知の様々な発光量測定装置（例えば、フォトンカウンター）を挙げることができる。
【００９１】
前記反応室は、その内部に反応混合物を保持することのできるものであればよく、その形状等は特に制限されないが、好ましくはその外部からのシグナル検出、例えば発光量の測定を可能とする透明部分または開口部を有するものとされる。このような透明部分または開口部により、反応混合物からのシグナルの検出が容易となる。
【００９２】
前記反応混合物は、薄型のチップ上に担持された状態で前記反応室中に投入することができる。この場合、反応混合物を調製した後にこれをチップ上に配置してもよいし、あるいは、ニッキング活性を示すことのできるエンドヌクレアーゼ、および本発明によるプライマーセットなどの反応に必要な試薬群を予めチップ上に固定化しておき、そこに液体の試料を滴下してもよい。あるいは、前記反応混合物は、反応溶液として前記反応室中に投入してもよく、この場合、前記反応室は、その内部に液体を保持することができる容器とすることができる。このような容器としては、反応溶液に溶解しない素材からなるものであれば、いかなる容器を用いてもよい。
【００９３】
前記温度調節手段は、反応室内部の温度を予め設定された温度に保つことのできる装置を含むことができる。このような装置は当技術分野において周知であり、当業者であれば適宜選択して使用することができる。
【００９４】
前記表示手段は、検出結果を表示できるものであればいかなる手段であってもよく、例えば、文字情報を表示するためのパネル等であってよい。この表示手段により表示される情報は、標的核酸が検出されたことだけでなく、該標的核酸の遺伝子配列、該標的核酸に関連する他の情報も含むことができる。例えば、標的核酸が疾患に関連する配列を有するものである場合には、その疾患に関する情報を表示することができる。また、標的核酸がその個体における治療薬の有効性に関連する場合には、その個体にとって最適な治療薬の情報を表示することができる。
【００９５】
さらに、本発明による装置は、標的核酸およびシグナル検出の情報を携帯用端末、コンピュータ等の通信機器に入力するためのインターフェイスを含んでいてもよい。これにより、標的核酸およびシグナル検出の情報を、医療機関の検査センター、中央検査部、薬剤部などに送信することが可能となる。
【００９６】
本発明の好ましい実施態様による装置およびチップを図５に示す。図５に示される核酸検出装置１は反応室２を備えており、そこに反応混合物４を担持したチップ３が挿入される。反応室２の周囲には温度調節手段５が備えられており、これにより反応室の内部温度が調節され、反応混合物４による核酸増幅反応が進行する。この核酸増幅反応により増幅産物が得られた場合には、反応混合物４から増幅産物の生成を示すシグナルが発生し、このシグナルはシグナル検出器６により検出される。そして、シグナル検出の信号がシグナル検出器６から表示部７に送られ、表示部７において標的核酸に関する情報が表示される。
【実施例】
【００９７】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００９８】
例１：プライマーの設計および合成
本例では、ヒトＣＹＰ２Ｄ６遺伝子（ＣＹＰ２Ｄ６＊１）の特定の領域を増幅するためのプライマーを設計し、合成した。また、その領域において一塩基変異を有する同遺伝子のアレル（ＣＹＰ２Ｄ６＊４４）についても、同様のプライマーを設計し、合成した。ＣＹＰ２Ｄ６＊１中の増幅領域周辺の配列（配列番号１）と各プライマーとの位置関係は、図６に示すとおりである。また、ループ形成プライマーおよび折り畳みプライマーについては、ニッキング酵素であるNb.BsmIの認識配列：NG/CATTC（「/」が切断部位。「N」はA、T、CおよびGのいずれか一つを意味する。）を組み込んだものも用意した。具体的には、以下の配列を有するプライマーを設計した。
【００９９】
（１）ループ形成プライマー
2D6*44-F1：5'-CGCTGCACATGGCCTGGGGCCTCCTGCTCA-3'（配列番号２）
2D6*44-F1m：5'-GGCTGCACATGGCCTGGGGCCTCCTGCTCA-3'（配列番号３）
2D6*44-F1m-BsmT01：5'-GGCTGCACATGAATGCGGCCTGGGGCCTCCTGCTCA-3'（配列番号４）
【０１００】
2D6*44-F1はＣＹＰ２Ｄ６＊１に特異的なプライマーである。2D6*44-F1は、その３’末端側にある配列（２０ｍｅｒ：下線部以外）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’末端側にある配列（１０ｍｅｒ：下線部）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、該プライマーの３’末端塩基の１６塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするように設計されている。2D6*44-F1mはＣＹＰ２Ｄ６＊４４に特異的なプライマーであり、ＣＹＰ２Ｄ６＊１に対する一塩基変異に対応する塩基をその５’末端部分に含んでいる（下線部）。2D6*44-F1m-BsmT01はＣＹＰ２Ｄ６＊４４に特異的で、かつ、Nb.BsmI認識配列（下線部）を組み込んだプライマーである。
【０１０１】
（２）折り畳みプライマー
2D6*44-SR2-Bsm17b：5'-TACGGTATATACCGTATCCCCCTGCACTGTTTCCCAGA-3'（配列番号５）
2D6*44-SR2-Bsm17：5'-ATGCGTATATACGCATTCCCCCTGCACTGTTTCCCAGA-3'（配列番号６）
【０１０２】
2D6*44-SR2-Bsm17bは、ＣＹＰ２Ｄ６＊１とＣＹＰ２Ｄ６＊４４の双方に特異的なプライマーである。2D6*44-SR2-Bsm17bは、その３’末端側にある配列（２０ｍｅｒ）が鋳型にアニーリングし、５’末端側にある配列（１６ｍｅｒ：下線部）がその領域内で折り畳まれて図２に示す構造をとるように設計されている。2D6*44-SR2-Bsm17は、2D6*44-SR2-Bsm17bと同様に設計されているが、このプライマーは、増幅産物にNb.BsmI認識配列を導入するための配列（下線部）が組み込まれている。
【０１０３】
（３）インナープライマーおよびアウタープライマー
2D6*44-LF4：5'-ATCCGGATGTAGGATC-3'（配列番号７）
2D6*44OF4：5'-GATGGTGACCACCTCGAC-3'（配列番号８）
2D6*44OR4：5'-TGTACCCTTCCTCCCTCG-3'（配列番号９）
【０１０４】
2D6*44-LF4（インナープライマー）、2D6*44OF4（上流アウタープライマー）および2D6*44OR4（下流アウタープライマー）は、図６に示される領域において鋳型にハイブリダイズする配列のみからなっている。
【０１０５】
例２：ニッキング酵素およびその認識配列を含む折り畳みプライマーを利用した標的核酸配列の増幅
本例では、ニッキング酵素であるＮｂ．ＢｓｍＩおよびその認識配列を含む折り畳みプライマーを用いて、ヒトゲノム中の標的核酸配列を増幅するための核酸増幅反応を行った。
【０１０６】
具体的には、次の組成を有する反応液：１×NEBuffer3（New England BioLabs）、Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）、ｄＮＴＰ（各１．４ｍＭ）、ベタイン（０．８Ｍ）、ループ形成プライマー2D6*44-F1（２．４μＭ）、折り畳みプライマー2D6*44-SR2-Bsm17（２．４μＭ）、インナープライマー2D6*44-LF4（１．２μＭ）、上流アウタープライマー2D6*44OF4（０．３μＭ）、下流アウタープライマー2D6*44OR4（０．３μＭ）、ヒトゲノムＤＮＡ（１０ｎｇ／μｌ）、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（１０万倍希釈）、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（０．３２ｕｎｉｔ／μｌ、New England BioLabs）およびＮｂ．ＢｓｍＩ（０．０８ｕｎｉｔ／μｌ）を含有；を調製し、これを６０℃で７０分間インキュベートした。これらの反応は、リアルタイムＰＣＲ装置Ｍｘ３０００Ｐ（Stratagene）を用いて行った。
【０１０７】
核酸増幅反応における増幅量の経時変化を図７に示す。図７において、四角は鋳型（ヒトゲノムＤＮＡ）およびニッキング酵素（Ｎｂ．ＢｓｍＩ）をともに含有するサンプルを示し、丸は鋳型を含有し、ニッキング酵素を含有しないサンプルを示し、菱形は鋳型を含有せず、ニッキング酵素を含有するサンプルを示し、三角は鋳型とニッキング酵素をともに含有しないサンプルを示す。
【０１０８】
図７によれば、鋳型を含有するサンプルでは増幅産物が得られたが（四角および丸）、ニッキング酵素をさらに含有するサンプルにおいて増幅効率が顕著に高いことが示された（四角）。鋳型を含有しないサンプルでは、ニッキング酵素の有無にかかわらず増幅産物は得られなかった（菱形および三角）。
【０１０９】
上記の折り畳みプライマー2D6*44-SR2-Bsm17に代えて、Ｎｂ．ＢｓｍＩの認識配列を含まない折り畳みプライマー2D6*44-SR2-Bsm17bを用いて同様に行った核酸増幅反応の結果を図８に示す。図８において、四角は鋳型（ヒトゲノムＤＮＡ）およびニッキング酵素（Ｎｂ．ＢｓｍＩ）をともに含有するサンプルを示し、丸は鋳型を含有し、ニッキング酵素を含有しないサンプルを示し、菱形は鋳型を含有せず、ニッキング酵素を含有するサンプルを示し、三角は鋳型とニッキング酵素をともに含有しないサンプルを示す。
【０１１０】
図８によれば、ニッキング酵素の認識配列を含むプライマーが存在しない場合には、ニッキング酵素の有無による増幅効率の相違は見られないことが示された（四角および丸）。よって、図７において見られるニッキング酵素による増幅効率の顕著な上昇は、プライマーに含まれる該酵素の認識配列に起因することが示された。
【０１１１】
例３：ニッキング酵素およびその認識配列を含むループ形成プライマーを利用した標的核酸配列の増幅
本例では、ニッキング酵素であるＮｂ．ＢｓｍＩおよびその認識配列を含むループ形成プライマーを用いて、ＣＹＰ２Ｄ６＊４４中の標的核酸配列を増幅するための核酸増幅反応を行った。
【０１１２】
具体的には、次の組成を有する反応液：１×NEBuffer3（New England BioLabs）、Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）、ｄＮＴＰ（各１．４ｍＭ）、ベタイン（０．８Ｍ）、ループ形成プライマー2D6*44-F1m-BsmT01（２．４μＭ）、折り畳みプライマー2D6*44-SR2-Bsm17b（２．４μＭ）、インナープライマー2D6*44-LF4（１．２μＭ）、上流アウタープライマー2D6*44OF4（０．３μＭ）、下流アウタープライマー2D6*44OR4（０．３μＭ）、ＣＹＰ２Ｄ６＊４４断片を含むプラスミド（５０００コピー／μｌ）、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（１０万倍希釈）、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（０．３２ｕｎｉｔ／μｌ、New England BioLabs）およびＮｂ．ＢｓｍＩ（０．０６７ｕｎｉｔ／μｌ）を含有；を調製し、これを６０℃で１２０分間インキュベートした。これらの反応は、リアルタイムＰＣＲ装置Ｍｘ３０００Ｐ（Stratagene）を用いて行った。
【０１１３】
核酸増幅反応における増幅量の経時変化を図９に示す。図９において、四角は鋳型（プラスミド）およびニッキング酵素（Ｎｂ．ＢｓｍＩ）をともに含有するサンプルを示し、丸は鋳型を含有し、ニッキング酵素を含有しないサンプルを示す。
【０１１４】
図９によれば、ニッキング酵素の有無にかかわらず増幅産物が得られたが、ニッキング酵素を含有するサンプルにおいて増幅効率が顕著に高いことが示された（四角）。
【０１１５】
例４：ニッキング酵素およびその認識配列を含むプライマーを用いた標的核酸配列の増幅における一塩基変異の影響
本例では、本発明による核酸増幅反応の特異性を確認するため、標的核酸配列に対して一塩基変異を有する配列を鋳型としたときの増幅効率を調べた。この目的で、ＣＹＰ２Ｄ６＊４４断片を含むプラスミドおよびＣＹＰ２Ｄ６＊１断片を含むプラスミドのいずれか一方を鋳型とし、ＣＹＰ２Ｄ６＊４４に特異的なプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行った。
【０１１６】
具体的には、次の組成を有する反応液：１×NEBuffer3（New England BioLabs）、Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）、ｄＮＴＰ（各１．４ｍＭ）、ベタイン（０．８Ｍ）、ループ形成プライマー2D6*44-F1m（２．４μＭ）、折り畳みプライマー2D6*44-SR2-Bsm17（２．４μＭ）、インナープライマー2D6*44-LF4（１．２μＭ）、上流アウタープライマー2D6*44OF4（０．３μＭ）、下流アウタープライマー2D6*44OR4（０．３μＭ）、鋳型プラスミド（５０００コピー／μｌ）、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（１０万倍希釈）、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（０．３２ｕｎｉｔ／μｌ、New England BioLabs）およびＮｂ．ＢｓｍＩ（０．１ｕｎｉｔ／μｌ）を含有；を調製し、これを６０℃で８０分間インキュベートした。これらの反応は、リアルタイムＰＣＲ装置Ｍｘ３０００Ｐ（Stratagene）を用いて行った。
【０１１７】
核酸増幅反応における増幅量の経時変化を図１０に示す。図１０において、菱形は鋳型としてのＣＹＰ２Ｄ６＊４４プラスミドおよびニッキング酵素（Ｎｂ．ＢｓｍＩ）を含有するサンプルを示し、四角は鋳型としてＣＹＰ２Ｄ６＊４４プラスミドを含有し、ニッキング酵素を含有しないサンプルを示し、三角は鋳型としてのＣＹＰ２Ｄ６＊１プラスミドおよびニッキング酵素（Ｎｂ．ＢｓｍＩ）を含有するサンプルを示し、丸は鋳型としてＣＹＰ２Ｄ６＊１プラスミドを含有し、ニッキング酵素を含有しないサンプルを示す。
【０１１８】
図１０によれば、標的核酸であるＣＹＰ２Ｄ６＊４４プラスミドを鋳型として用いた場合には増幅産物が得られ（菱形および四角）、特にニッキング酵素を添加した場合に増幅効率が顕著に高くなることが示された（菱形）。一方で、標的核酸配列との間で一塩基のミスマッチを有するＣＹＰ２Ｄ６＊１プラスミドを鋳型として用いた場合には、ニッキング酵素の有無にかかわらず増幅産物がほとんど得られなかった（三角および丸）。これらの結果から、本発明による核酸増幅法は顕著に高い配列特異性を示し、例えば、鋳型における一塩基のミスマッチをも識別できることが示された。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】図１は、ループ形成プライマーを用いた核酸増幅反応の作用機序を模式的に示した図である。
【図２】図２は、折り畳みプライマーの構造を例示した図である。
【図３】図３は、エンドヌクレアーゼとしてＮｂ．ＢｓｍＩを用いた一つの実施態様における、核酸増幅反応の部分的作用機序を示す図である。
【図４ａ】図４ａは、ループ形成プライマーおよび折り畳みプライマーを用いた核酸増幅反応の作用機序を模式的に示した図である。
【図４ｂ】図４ｂは、ループ形成プライマーおよび折り畳みプライマーを用いた核酸増幅反応の作用機序を模式的に示した図である。
【図５】図５は、本発明の好ましい実施態様による核酸検出装置の概略図である。
【図６】図６は、ヒトＣＹＰ２Ｄ６遺伝子に含まれるヌクレオチド配列（配列番号１）、ならびにプライマーの設計に用いられた領域を示す図である。
【図７】図７は、ニッキング酵素および該ニッキング酵素の認識配列を含む折り畳みプライマーを用いた核酸増幅反応の経時変化を示すグラフである。
【図８】図８は、ニッキング酵素および該ニッキング酵素の認識配列を含まないプライマーセットを用いた核酸増幅反応の経時変化を示すグラフである。
【図９】図９は、ニッキング酵素および該ニッキング酵素の認識配列を含むループ形成プライマーを用いた核酸増幅反応の経時変化を示すグラフである。
【図１０】図１０は、ニッキング酵素および該ニッキング酵素の認識配列を含むプライマーを用いた核酸増幅反応における、鋳型中の一塩基ミスマッチの影響を示すグラフである。
【符号の説明】
【０１２０】
１  核酸検出装置
２  反応室
３  チップ
４  反応混合物
５  温度調節手段
６  シグナル検出器
７  表示部
【図１】
2007319096.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
2007319096.tif 000005
【図４ｂ】
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【図５】
2007319096.tif 000007
【図６】
2007319096.tif 000008
【図７】
2007319096.tif 000009
【図８】
2007319096.tif 000010
【図９】
2007319096.tif 000011
【図１０】
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【配列表】
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