(57)【要約】【課題】            Ｅ型ボツリヌス感染症、Ｅ型ボツリヌス神経毒素中毒症に関する疾患の診断あるいは治療に有用であるＥ型ボツリヌス神経毒素に特異的に結合する抗体を提供する。【解決手段】        Ｅ型ボツリヌス神経毒素を中和するマウスモノクローナル抗体を提供する。当該抗体産生細胞より抗体分子を構成するＶＨ領域及びＶＬ領域遺伝子をクローニングし、このＶ領域の遺伝情報を元にしてヒト化抗体及び二重特異性抗体などの各種抗体を作製することを特徴とする。本発明により得られる抗体は、Ｅ型ボツリヌス感染症、ボツリヌス神経毒素中毒症に関する疾患の診断あるいは治療に有用である。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｅ型ボツリヌス神経毒素に対する中和活性を有するモノクローナル抗体。
【請求項２】
当該抗体が、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０８５８を有するハイブリドーマによって産生される請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
当該抗体が、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０８５９を有するハイブリドーマによって産生される請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
当該抗体が、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０８６０を有するハイブリドーマによって産生される請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
請求項１に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項６】
当該ハイブリドーマが独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０８５８を有する請求項５に記載のハイブリドーマ。
【請求項７】
当該ハイブリドーマが独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０８５９を有する請求項５に記載のハイブリドーマ。
【請求項８】
当該ハイブリドーマが独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０８６０を有する請求項５に記載のハイブリドーマ。
【請求項９】
請求項１から４のいずれかに記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とするＥ型ボツリヌス神経毒素を免疫学的に検出する方法。
【請求項１０】
請求項１から４のいずれかに記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とするＥ型ボツリヌス神経毒素を免疫学的に定量する方法。
【請求項１１】
請求項１から４のいずれかに記載のモノクローナル抗体を有効成分として含有することを特徴とするＥ型ボツリヌス感染症またはＥ型ボツリヌス神経毒素中毒症の診断薬。
【請求項１２】
請求項１から４のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含むＥ型ボツリヌス神経毒素に対する中和活性を有するマウスモノクローナル抗体由来のアミノ酸配列とヒト抗体由来のアミノ酸配列からなる遺伝子組換え抗体であって、少なくとも定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列であることを特徴とし、かつＥ型ボツリヌス神経毒素に対する中和活性を有するヒト化組換え抗Ｅ型ボツリヌス神経毒素抗体または抗体フラグメント。
【請求項１３】
当該組換え抗体の可変領域重鎖（ＶＨ）のアミノ酸配列が配列番号６のアミノ酸配列の全部または一部であり、可変領域軽鎖（ＶＬ）のアミノ酸配列が配列番号８のアミノ酸配列の全部または一部であることを特徴とする請求項１２に記載の組換え抗体または抗体フラグメント。
【請求項１４】
当該抗体フラグメントが抗体機能分子であり、Fab、Fab'、F(ab')2、一本鎖抗体及びジスルフィド安定化抗体であるか、または二重特異性抗体及びその類似物であるか、またはチェインシャッフリングによって生成した抗体分子であることを特徴とする、請求項１２または１３に記載の組換え抗体または抗体フラグメント。
【請求項１５】
当該組換え抗体が、ヒト型キメラ抗体である請求項１２から１４のいずれかに記載の組換え抗体または抗体フラグメント。
【請求項１６】
当該組換え抗体が、ヒト型改変抗体である請求項１２から１４のいずれかに記載の組換え抗体または抗体フラグメント。
【請求項１７】
当該ＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列の一部が、Kabatらの文献（Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th. ed. U.S. Department of Health and Human Services (1987)）、またはChothiaらの文献（J. Mol. Biol., 196, 901, 1987）に基づき決定される、配列番号６及び配列番号８の可変領域内の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む請求項１２から１６のいずれかに記載の組換え抗体または抗体フラグメント
【請求項１８】
当該Kabatらの文献により決定される当該ＶＨのＣＤＲ１が配列番号９、ＣＤＲ２が配列番号１０、ＣＤＲ３が配列番号１１であり、当該ＶＬのＣＤＲ１が配列番号１２、ＣＤＲ２が配列番号１３、ＣＤＲ３が配列番号１４である請求項１２から１７のいずれかに記載の組換え抗体または抗体フラグメント。
【請求項１９】
当該組換え抗体のＶＨ及びＶＬがそれぞれ配列番号６及び配列番号８のアミノ酸配列であり、定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列であることを特徴とするヒト型キメラ抗体である請求項１２から１８のいずれかに記載の組換え抗体または抗体フラグメント。
【請求項２０】
当該組換え抗体のＶＨ及びＶＬ内のＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号９〜１０及び配列番号１２〜１４であり、フレームワーク領域（ＦＲ）の一部がマウス抗体由来であり、その他のＦＲ及び定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列であることを特徴とするヒト型改変抗体である請求項１２から１８のいずれかに記載の組換え抗体または抗体フラグメント。
【請求項２１】
請求項１２から２０のいずれかに記載の組換え抗体または抗体フラグメントをコードするＤＮＡ。
【請求項２２】
請求項２１に記載のＤＮＡが組み込まれることを特徴とする組換えベクター。
【請求項２３】
請求項２２記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
【請求項２４】
請求項２３記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に請求項１２から２０のいずれかに記載の組換え抗体または抗体フラグメントを生成蓄積させ、該培養物から該抗体を採取することを特徴とする抗体の製造方法。
【請求項２５】
請求項１２から２０のいずれかに記載の組換え抗体または抗体フラグメントが、放射性同位元素、蛋白質または低分子の薬剤と化学的または遺伝子工学的に結合させることを特徴とする融合抗体。
【請求項２６】
請求項１２から２０及び２５のいずれかに記載の抗体または抗体フラグメントを有効成分として含有する、Ｅ型ボツリヌス感染症またはＥ型ボツリヌス神経毒素中毒症の治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＥ型ボツリヌス感染症及びＥ型ボツリヌス神経毒素中毒症に関する疾患の診断あるいは治療に有用であるボツリヌス神経毒素（BoNTと称すこともある）に対する中和活性を有するモノクローナル抗体、当該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、当該モノクローナル抗体由来のアミノ酸配列とヒト抗体由来のアミノ酸配列からなる遺伝子組換え抗体、当該組換え抗体を産生する細胞株、該抗体を用いた治療剤に関する。さらには、このような有用な遺伝子組換え抗体の作製に有効なＨ鎖及びＬ鎖の可変領域をコードするＤＮＡ断片に関する。
【背景技術】
【０００２】
ボツリヌス中毒は、グラム陽性有芽胞性のボツリヌス菌が産生する蛋白性毒素を経口的に接種することにより起こる食餌性中毒と、一歳未満の乳児の腸管内で芽胞が発芽、増殖し、その際産生される毒素により起こる乳児ボツリヌス症に大別される。いずれの中毒においても、毒素は末梢の興奮性シナプスに作用し、神経伝達物質の遊離を阻害することにより弛緩性麻痺を引き起こす。ボツリヌス中毒は他の細菌性食中毒と比べ発生例は稀であるが、致死率がきわめて高く、我が国ではヒトの食餌性中毒事例が報告されている。また、最近ではその高い致死性ゆえにバイオテロの手段として使用されることが懸念されている。現在、ボツリヌス中毒症の治療薬としてＡ、Ｂ、Ｅ、Ｆ型に対して治療用馬抗毒素が常備されている。ウマ血清を原材料としているこの製剤は、ヒトには異種蛋白であるため、アナフィラキシー等のアレルギー反応を引き起こす危険性がある。乳児ボツリヌス症においてはこのアレルギー反応を回避するために異種蛋白由来の抗体による治療はなされていないのが現状である。この危険性は成人の中毒における治療においても同様であり、ウマ抗毒素に代わるより安全で、高い中和力価を持つ抗毒素製剤の開発が望まれている。
【０００３】
上記のような抗BoNT中和抗体を、ボツリヌス中毒症の患者またはBoNTを不活化したトキソイドで免疫した人から抗ボツリヌスヒト免疫グロブリンを直接採取・調製するやり方があり、実際に「BabyBIG」という商品名で乳児ボツリヌス症を対象に市販されている。しかし、この製剤はボツリヌストキソイドで健常人を免疫して中和抗体価の高い血漿をプールして製造されるために、この方法では倫理的な問題や原材料入手、バイオハザードの問題など数多い問題点が予想され、乳児ボツリヌス症のような疾患に限定された疾患にしか使用できない。すなわち、このようなヒト免疫グロブリン製剤を現在のウマ抗毒素の代わりに広く普及させることはできない。そこで、このような高力価血清の代替品としてBoNT中和活性を有するモノクローナル抗体の使用が考えられる。
【０００４】
最近、ボツリヌストキソイドを免疫した人のBリンパ球をソースにしてファージ抗体を作製し、その中から所望の中和抗体を選ぶ方法が試みられているが、BoNT A型毒素に関してそのような人から得られたヒト型中和モノクローナル抗体はそれぞれ単独では中和活性が弱く実用的でなかった。そこで、そのような弱い中和活性を持ったモノクローナル抗体を数種類混合するオリゴクローナルにすることで活性を強化せざるを得なかった。しかしながら、数種類のモノクローナル抗体からなる混合製剤は、抗体の種類が増えるに従って医薬品としての開発・製造コストを上昇させることになり、現実的な価格で医薬品を提供することが難しくなる恐れがある。また、現在のウマ抗毒素についてはＡ、Ｂ、Ｅ、Ｆ型の毒素に対する抗体が含まれているので、最終的には少なくとも４種類のモノクローナル抗体を混合することになる。それぞれの型に数種類のモノクローナル抗体を混合して、さらにそれらを混合することになれば、開発・製造コストの問題はより厳しさを増すことになる。すなわち、できるだけ一つの毒素の型について一種類のモノクローナル抗体で対応できる方がコスト的に有利である。
【０００５】
一方、マウスモノクローナル抗体については、免疫原の選択やマウスへの免疫回数など免疫方法に関してトキソイドをヒトに免疫するよりは、技術的にも倫理的にも制限が少なく、結果的にヒト由来のモノクローナル抗体よりも高力価の抗体を得ることが出来る可能性がある。マウスモノクローナル抗体作製に関する基本的な技術はすでに確立されている。しかし、マウスモノクローナル抗体をヒトに投与すると異種タンパクとして認識され、アナフィラキシーショックや血清病などの副作用を引き起こしたり、はやく体外に排除されたりして、抗体の治療効果を低下させてしまうことから臨床応用が困難であった。
【０００６】
そこで、遺伝子組換え技術を利用してマウスなどの動物由来のモノクローナル抗体をキメラ抗体あるいは改変抗体（ＣＤＲ[complementarity determining region]移植抗体、再形成ヒト抗体と言う場合もある）のようなヒト化抗体にする試みが行われている。抗体は重鎖（Ｈ）鎖と軽（Ｌ）鎖からなり、各々、抗原結合活性を担う可変（Ｖ）領域と、補体やFc受容体への結合性を担う定常（Ｃ）領域から構成されている（以下、Ｈ鎖Ｖ領域はVH、Ｌ鎖Ｖ領域はＶＬ、Ｈ鎖Ｃ領域はＣＨ、Ｌ鎖Ｃ領域はＣＬと称することがある）。
【０００７】
キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体を産生するマウスハイブリドーマからクローニングしたＶ遺伝子と、ヒト抗体産生細胞等のヒト細胞からクローニングしたＣ遺伝子とを結合させたマウスV−ヒトＣキメラ抗体遺伝子を動物細胞あるいは微生物細胞等で発現させ、その培養上清中に得られるものである（非特許文献１）。改変抗体はマウスなど動物由来抗体のＣＤＲをヒト抗体のＣＤＲと置換した抗体であり（非特許文献２）、サルを用いた実験ではマウス抗体に比べ免疫原性が低下し、血中半減期が４〜５倍延長している（非特許文献３）。
【０００８】
さらに、最近の抗体工学の進歩により、一本鎖抗体（single chain Fv; 以下、scFvと称することもある：非特許文献４）あるいはジスルフィド安定化抗体（disulfide stabilized Fv; 以下、dsFvと称することもある：非特許文献５）といった、より小さな抗体分子の作製が行われている。一本鎖抗体やジスルフィド安定化抗体は完全分子型の抗体に比べ、その分子量が小さいことから組織移行性、血中クリアランスに優れ、完全分子型の抗体とは異なった治療効果も期待されている。
【０００９】
【非特許文献１】Morrison, S. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 81, 6851-5 (1984)
【非特許文献２】Riechmann, L. et al., Nature, 332, 323-7 (1988)
【非特許文献３】Hakimi, J. et al., J. Immunol., 147, 1352-9 (1991)
【非特許文献４】Bird, R. E. et al., Science, 242, 423-6 (1988)
【非特許文献５】Webber, K. O. et al., Molecular Immunology, 32, 249-58 (1995)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
以上述べてきたように、現在のウマ抗毒素は副作用の点で問題がある。その解決策として現在報告されているヒト型モノクローナル抗体では一種類のみで治療効果の優れた抗体はなく、数種類のモノクローナル抗体を混合する製剤となっている。このため、医薬品の開発や製造のコストアップを招き、必然的に高価な医薬品とならざるを得ない。すなわち、治療効果や安全性に優れ、開発や製造コストの面でも実用化が容易なBoNT抗体の開発が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
このような状況において、本発明者らは抗毒素製剤のターゲットである４つの血清型のうちＥ型のBoNTに対して高力価に中和活性を有するマウスモノクローナル抗体を産生する細胞（ハイブリドーマ）の作製に成功し、キメラ化及びヒト化抗体、あるいは抗体フラグメントの材料となるＶ領域遺伝子を提供することを可能にし、本発明を完成するに至った。実際、当該細胞から該抗体のＶ領域をコードする遺伝子を分離することに成功し、このＶ領域を用いてマウス−ヒト組換え抗体の発現を試みた結果、神経毒素に対して中和活性を有する組換え抗BoNT抗体の作製に成功した。すなわち本発明は、これまでに一切報告されていないＥ型BoNTに対するマウス中和モノクローナル抗体とその産生細胞を提供し、さらにはそのＶ領域をコードする遺伝子情報を提供し、これを用いた組換え抗BoNT抗体を提供する。遺伝子情報とは、遺伝子をコードする核酸塩基配列やその配列から決定されるアミノ酸配列、さらには当該遺伝子断片そのものなど、組換え抗BoNT抗体の作製に必要な遺伝子情報である。また、当該組換え抗BoNT抗体の形態は、一般的な抗体分子の形態から一つの抗体分子で２つの特異性をもった二重特異性抗体やＶ領域とＣ領域の一部からなる様々な形態までの抗体機能分子を提供することが可能である。従って、本願発明は、抗Ｅ型BoNTマウス中和モノクローナル抗体とその産生細胞だけでなく、そのＶ領域をコードする遺伝子情報からもたらされる様々な形態の組換え抗BoNT抗体遺伝子の作製工程、及びその遺伝子を含有する発現ベクター、さらにはそのベクターを用いて動物細胞及び微生物を形質転換する工程及びその結果もたらされた組換え抗BoNT抗体及び抗体機能分子高産生形質転換体の作製方法をも包含する。
【００１２】
本発明は、下記１）〜２６）の発明を含むものである。
【００１３】
１）Ｅ型ボツリヌス神経毒素に対する中和活性を有するモノクローナル抗体。
【００１４】
２）当該抗体が、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０８５８を有するハイブリドーマによって産生される上記１）に記載のモノクローナル抗体。
【００１５】
３）当該抗体が、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０８５９を有するハイブリドーマによって産生される上記１）に記載のモノクローナル抗体。
【００１６】
４）当該抗体が、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０８６０を有するハイブリドーマによって産生される上記１）に記載のモノクローナル抗体。
【００１７】
５）上記１）に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【００１８】
６）当該ハイブリドーマが独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０８５８を有する上記５）に記載のハイブリドーマ。
【００１９】
７）当該ハイブリドーマが独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０８５９を有する上記５）に記載のハイブリドーマ。
【００２０】
８）当該ハイブリドーマが独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０８６０を有する上記５）に記載のハイブリドーマ。
【００２１】
９）上記１）から４）のいずれかに記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とするＥ型ボツリヌス神経毒素を免疫学的に検出する方法。
【００２２】
１０）上記１）から４）のいずれかに記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とするＥ型ボツリヌス神経毒素を免疫学的に定量する方法。
【００２３】
１１）上記１）から４）のいずれかに記載のモノクローナル抗体を有効成分として含有することを特徴とするＥ型ボツリヌス感染症またはＥ型ボツリヌス神経毒素中毒症の診断薬。
【００２４】
１２）上記１）から４）のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含むＥ型ボツリヌス神経毒素に対する中和活性を有するマウスモノクローナル抗体由来のアミノ酸配列とヒト抗体由来のアミノ酸配列からなる遺伝子組換え抗体であって、少なくとも定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列であることを特徴とし、かつＥ型ボツリヌス神経毒素に対する中和活性を有するヒト化組換え抗Ｅ型ボツリヌス神経毒素抗体または抗体フラグメント。
【００２５】
１３）当該組換え抗体の可変領域重鎖（ＶＨ）のアミノ酸配列が配列番号６のアミノ酸配列の全部または一部であり、可変領域軽鎖（ＶＬ）のアミノ酸配列が配列番号８のアミノ酸配列の全部または一部であることを特徴とする上記１２）に記載の組換え抗体または抗体フラグメント。
【００２６】
１４）当該抗体フラグメントが抗体機能分子であり、Fab、Fab'、F(ab')2、一本鎖抗体及びジスルフィド安定化抗体であるか、または二重特異性抗体及びその類似物であるか、またはチェインシャッフリングによって生成した抗体分子であることを特徴とする、上記１２）または１３）に記載の組換え抗体または抗体フラグメント。
【００２７】
１５）当該組換え抗体が、ヒト型キメラ抗体である上記１２）から１４）のいずれかに記載の組換え抗体または抗体フラグメント。
【００２８】
１６）当該組換え抗体が、ヒト型改変抗体である上記１２）から１４）のいずれかに記載の組換え抗体または抗体フラグメント。
【００２９】
１７）当該ＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列の一部が、Kabatらの文献（Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th. ed. U.S. Department of Health and Human Services (1987)）、またはChothiaらの文献（J. Mol. Biol., 196, 901, 1987）に基づき決定される、配列番号６及び配列番号８の可変領域内の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む上記１２）から１６）のいずれかに記載の組換え抗体または抗体フラグメント
【００３０】
１８）当該Kabatらの文献により決定される当該ＶＨのＣＤＲ１が配列番号９、ＣＤＲ２が配列番号１０、ＣＤＲ３が配列番号１１であり、当該ＶＬのＣＤＲ１が配列番号１２、ＣＤＲ２が配列番号１３、ＣＤＲ３が配列番号１４である上記１２）から１７）のいずれかに記載の組換え抗体または抗体フラグメント。
【００３１】
１９）当該組換え抗体のＶＨ及びＶＬがそれぞれ配列番号６及び配列番号８のアミノ酸配列であり、定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列であることを特徴とするヒト型キメラ抗体である上記１２）から１８）のいずれかに記載の組換え抗体または抗体フラグメント。
【００３２】
２０）当該組換え抗体のＶＨ及びＶＬ内のＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号９〜１０及び配列番号１２〜１４であり、フレームワーク領域（ＦＲ）の一部がマウス抗体由来であり、その他のＦＲ及び定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列であることを特徴とするヒト型改変抗体である上記１２）から１８）のいずれかに記載の組換え抗体または抗体フラグメント。
【００３３】
２１）上記１２）から２０）のいずれかに記載の組換え抗体または抗体フラグメントをコードするＤＮＡ。
【００３４】
２２）上記２１）に記載のＤＮＡが組み込まれることを特徴とする組換えベクター。
【００３５】
２３）上記２２）に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
【００３６】
２４）上記２３）記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に上記１２）から２０）のいずれかに記載の組換え抗体または抗体フラグメントを生成蓄積させ、該培養物から該抗体を採取することを特徴とする抗体の製造方法。
【００３７】
２５）上記１２）から２０）のいずれかに記載の組換え抗体または抗体フラグメントが、放射性同位元素、蛋白質または低分子の薬剤と化学的または遺伝子工学的に結合させることを特徴とする融合抗体。
【００３８】
２６）上記１２）から２０）及び２５）のいずれかに記載の抗体または抗体フラグメントを有効成分として含有する、Ｅ型ボツリヌス感染症またはＥ型ボツリヌス神経毒素中毒症の治療薬。
【発明の効果】
【００３９】
このような本願発明の新規抗BoNTマウスモノクローナル抗体及びその産生細胞、そのＶ領域遺伝子情報からもたらされる各種組換え抗体及び抗体フラグメントによって、開発や製造コストの面で優れ、効果が高く副作用の少ないボツリヌス中毒症の診断薬・治療薬・予防薬の開発が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
本発明である抗BoNTマウスモノクローナル抗体及びその産生細胞は、これまでに確立されているマウスモノクローナル抗体の作製技術を用いて作製される。免疫原としては、例えば、ボツリヌス菌の産生する神経毒、もしくはその毒素活性をホルマリン処理等により失活させたトキソイド、もしくは遺伝子組換え技術を用いて調製される組換え毒素Ｈ鎖、Ｌ鎖、あるいは毒素のペプチド、もしくは該毒素蛋白のアミノ酸配列に基づいて調製される好適な合成ペプチド等があげられる。使用可能なボツリヌス菌株の一例として、C. botulinum type E であればいかなる株でも構わないが、望ましくは35396株、Iwanai株、Biwako株、5545株、164-1株などがあげられる。
【００４１】
マウスを上記のような適当な株の神経毒素を免疫原で免疫し、得られた脾臓細胞をマウスのミエローマ細胞と融合させ、得られたハイブリドーマから、前記の免疫原に反応する細胞を選択し、該細胞を培養することによって抗BoNTマウスモノクローナル抗体を調製することができる。
【００４２】
更に、このようにして得られた抗BoNTマウスモノクローナル抗体産生細胞の中からＥ型BoNTに対して中和活性を有するモノクローナル抗体を産生している細胞を選択することができる。そのような細胞株として本発明者等はBoNTに対して中和活性を有する抗体を産生する１６種のハイブリドーマの確立に成功した。中でも１０種、更に好ましくはm3-4、m9-4、m9-7、m9-8の４種が、これらが本発明に用いる最も好ましい細胞株としてあげられる。
これらのうち、m3-4、m9-7及びm9-8については、平成１８年３月２９日付、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにそれぞれ受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０８５８、ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０８５９及びＦＥＲＭ  ＡＰ−２０８６０として寄託されている。
【００４３】
本発明のマウスモノクローナル抗体及び当該抗体産生細胞より、ボツリヌス中毒症の診断薬・治療薬・予防薬になる各種組換え抗体及び抗体フラグメントを作製することができる。当該モノクローナル抗体のＶ領域をコードする遺伝子断片は、前述のような抗BoNT中和モノクローナル抗体産生細胞より分離され、解析された遺伝子配列である。Ｖ領域遺伝子は通常の遺伝子操作技術により単離することができる。例えば、その細胞の染色体ＤＮＡから常法［例えば、T. Maniatis "Molecular Cloning" Cold Spring Harbor Lab.(1982)参照]に従ってＶ領域遺伝子をクローニングする方法、あるいは、その細胞のｍＲＮＡを材料として常法［例えば、D.M.Glover編集 " DNA cloning Vol.I" IRL press (1985)］によりｃＤＮＡを合成しＶ領域遺伝子をクローニングする方法である。いずれの方法も、Ｖ領域遺伝子クローニングの為のプローブとして、すでに報告されているマウス免疫グロブリン遺伝子の核酸塩基配列［例えば、 坂野ら、Nature, 286,p676,(1980); E.E.Max ら、J. Biol. Chem., 256,p5116,(1981)］を参照して合成したＤＮＡプローブ等を利用することが出来る。
【００４４】
また、ＰＣＲ（ポリメレース連鎖反応）を利用したクローニングも可能である［R. Orlandi, et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 86, 3833 (1989); W. D. Huse, et al., Science, 246, 1275 (1989)］。例えば、前述のようにハイブリドーマから調製されたｃＤＮＡを鋳型に、Kabatら[Sequences of Proteins of Immunological Interest 4th ed., Public Health Service, NIH, Washington DC, 1987]の分類したＶ領域とＪ領域の核酸塩基配列をもとにして合成したＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲを行なうことが可能である。Ｖ領域とＪ領域のＰＣＲ用プライマーは、ＤＮＡ合成受託機関（例えばQIAGEN社）などに依頼すれば容易に入手可能である。この時、5'側にKOZAK配列（Kozak M, J.Mol.Biol., 196, 947 (1987)）及び適切な制限酵素切断部位(例えばHindIIIやBamHI)の配列を付加することが望ましい。これらのプライマーは抗体の種類によって使用可能なプライマーの種類が異なるが、本願発明の４種のハイブリドーマのうちm9-4抗体の場合には、好ましくは、配列番号１から４に記載の合成ＤＮＡがプライマーとして用いられる。ＰＣＲ反応は、例えばAdvantage HF-2 PCR Kit（BC Bioscience）を用い、添付のプロトコールに従って行えばよい。ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の塩基配列は、ＴＡクローニングキット（インビトロジェン社）等を用いてクローニングした後、ＤＮＡシークエンサー、例えば、ABI PRISM310 Genetic Analyzer（PEバイオシステムズ社）により決定することが出来る。
【００４５】
このようにして得られたBoNT中和活性を有する抗体分子の可変領域をコードする遺伝子として、Ｈ鎖、Ｌ鎖それぞれ配列番号６及び８のアミノ酸配列をコードする遺伝子断片がその好ましい一例として挙げられる。また、そのような遺伝子の具体的核酸塩基配列の一例としては、Ｈ鎖、Ｌ鎖それぞれ配列番号５及び７に示された核酸塩基配列が挙げられる。また、Kabatら（Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th. ed. U.S. Department of Health and Human Services (1987)）あるいは／及び、Chothia and Lesk（J.Mol.Biol., 196, 901, 1987）を参照することにより、本発明の抗BoNT抗体の抗体活性を決定する可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）の配列を同定することが出来る。
【００４６】
例えば、Kabatらの定義に従えば、本発明により得られたｍ９−４抗体のＣＤＲは下記の通り同定される。
【００４７】
ＶＨ：（配列番号６）
ＶＨ−ＣＤＲ１：Asp Tyr Ala Met Ser（配列番号９）
ＶＨ−ＣＤＲ２：Thr Ser Ile Ser Thr Asp Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Val（配列番号１０）
ＶＨ−ＣＤＲ３：Gly Gly Ser His Phe Tyr（配列番号１１）
ＶＬ：（配列番号８）
ＶＬ−ＣＤＲ１：Lys Ala Ser Gln Ala Ile Asn Ser Tyr Leu Ser（配列番号１２）
ＶＬ−ＣＤＲ２：Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp（配列番号１３）
ＶＬ−ＣＤＲ３：Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu Thr（配列番号１４）
【００４８】
これらの配列がＣＤＲペプチド、さらには抗体活性の改良を行う際の重要な領域となる。後述の抗体機能分子を作製する際にも、このようなアミノ酸配列が最も重要な情報となりうる。具体的にはそのようなアミノ酸配列をコードした核酸塩基配列を含む遺伝子を用いてそのような抗体機能分子は作製される。そのようなアミノ酸配列をコードした核酸塩基配列であればいかなるコドンからなっても構わないが、その望ましい核酸塩基配列として、配列番号１５〜２０に示される配列があげられる。
【００４９】
このようにしてクローニングされた本願発明のＶ領域遺伝子断片あるいはアミノ酸配列を元にして、ヒト化抗体（マウスヒトキメラ抗体及び改変抗体）が作成可能である。例えば、キメラ抗体についてはM. Bruggemann（Waldmann H (ed) Monoclonal Antibody Therapy. Prog Allergy. Basel, Karger, 1988, vol 45, pp91）やS. L. Morrison（Advances in Immunology, 44, 65, (1989)）などの文献が、改変抗体については、G. Winter and C. Milstein（Nature 349, 293 (1991)）やM.M.Bendig（Methods, 8, 83 (1995)）などの文献に紹介されている方法に準じて行うことが出来る。
【００５０】
また、これらのＶ領域の情報を元にBoNTに特異的に反応する低分子の抗体機能分子を作製することが可能である。低分子の抗体機能分子として、例えば、Fragment of antigen binding（Fabと略記する）、Fab'、F(ab')2、一本鎖抗体及びジスルフィド安定化抗体を作製することも可能である。この場合、本願発明のマウス抗体そのものの遺伝情報を利用することもできるが、望ましくは本願発明のマウス抗体の遺伝情報をベースにして作製されたキメラ抗体あるいは改変抗体をベースにすることによって、よりヒトに対して安全性の高い低分子抗体を作製することが出来る。
【００５１】
一方、組換え抗BoNT抗体作製に用いられるヒト免疫グロブリンＨ鎖遺伝子並びにＬ鎖遺伝子のＣ領域遺伝子は、例えば ヒト抗体産生細胞から同様の方法により単離することが出来る。また、Ｃ領域遺伝子はその遺伝子内で再配列を行わないので特にヒトＣ領域遺伝子を単離するために抗体産生細胞を使う必要はなく、その他の組織の細胞でも構わない。単離する方法としては、前述のマウスV領域遺伝子の単離の場合と同様にして行なうことができる。また、Ｃ領域遺伝子の種類としては、特にγ1 鎖、κ鎖に限ったものではなく、μ鎖、α鎖、γ2鎖、γ3鎖、γ4鎖、ε鎖、λ鎖の各鎖の遺伝子でも可能である。しかし、補体活性化能、抗体依存性細胞傷害活性を期待するならば、γ1鎖が望ましい。
【００５２】
さらに、抗体機能分子として二重特異性抗体（bispecific抗体あるいはbifunctional抗体と呼ぶことがある）が挙げられる。抗体１分子は２個の抗原結合部位を有するが、それぞれの抗原結合部位が異なる抗原に結合する抗体、すなわち２つの特異性を持った抗体のことを二重特異性抗体という。通常、二重特異性抗体は細胞融合法と化学合成法の２つの方法で作製される。細胞融合法では、２つの異なるモノクローナル抗体産生細胞をさらに融合することによって作製する事が出来る。化学合成法は、２つの抗体分子を一旦還元してＨ鎖間のＳＳ結合を解離させ、これらを混合して再び酸化することによって作製するものである。本願発明では、得られたＨ鎖、Ｌ鎖を適宜組み合わせることによって二重特異性抗体を作製することができる。さらに、本願発明で得られたＨ鎖及びＬ鎖のみならず、Ｅ型以外のボツリヌス神経毒素を中和可能な抗体由来のＨ鎖及びＬ鎖とを適宜組み合わせることにより、タイプの異なる二種以上のボツリヌス神経毒素に対して中和可能な二重特異性抗体を作製することも可能となる。
【００５３】
また本願発明は、抗体機能分子として前述の二重特異性抗体だけを示すものではなく、二重特異性抗体の類似物として、例えば、ヒンジ領域のCys残基による自発的な２量体化、両親媒性ペプチドの導入によるＦabの２量体化や、２つの１本鎖抗体（scFv）をペプチドリンカーで結合させるscFvの２量体化（BiscFv）、特異性の異なる２つの抗体におけるお互いのドメインを入れ替えて、非共有結合的に２量体化（diabody）なども、本願発明のＶ領域を用いることにより作製することが可能である。
【００５４】
また本願発明は、抗体機能分子として前述の二重特異性抗体だけを示すものではなく、二重特異性抗体の類似物として、例えば、ヒンジ領域のCys残基による自発的な２量体化、両親媒性ペプチドの導入によるＦabの２量体化や、２つの１本鎖抗体（scFv）をペプチドリンカーで結合させるscFvの２量体化（BiscFv）、特異性の異なる２つの抗体におけるお互いのドメインを入れ替えて、非共有結合的に２量体化（diabody）なども、本願発明のＶ領域を用いることにより作製することが可能である。
【００５５】
さらに、抗体機能分子として、本願発明の抗BoNT抗体可変領域をコードする遺伝子断片を用いて、結合活性を強化した新しい抗体が作製可能である。すなわち、本発明により提供される抗BoNT抗体可変領域をコードする遺伝子断片は、BoNTに対して中和活性を有する抗体分子の可変領域の特異的アミノ酸配列もしくは核酸塩基配列を開示するものであり、この領域、ドメインを用いて新しい抗体作製の可能性をも提供する物である。例えば、エクソンシャフリング（exon shuffling）やチェインシャフリング（chain shuffling）と言われているファージディスプレイライブラリーを応用する方法があげられる。すなわち、ファージ上に発現さる際に、抗体可変領域のＶＨあるいはＶＬ遺伝子の一方を固定化し、他方をＶ遺伝子ライブラリーと結合させたファージライブラリーを構築し、もとの抗体より抗原に対する特異性が高い抗体可変領域の組み合わせをスクリーニングする方法が考えられる。あるいは、ＣＤＲのみを人工的に入れ替えるＣＤＲシャフリングや単純にＣＤＲにランダム変異を導入して、親和性や特異性を向上させる方法が考えられる。
【００５６】
以上のようにして得られるＶ領域を利用して作製された抗BoNT抗体分子をコードする遺伝子を発現させる場合は通常の組換えタンパク質が発現される産生系ならどの様なものでも利用可能であるが、抗体の通常形態である完全分子なら動物細胞での発現が望ましい。また、前述の一本鎖抗体のような低分子抗体の形態なら、動物細胞以外に大腸菌、酵母などの微生物の中から適切なものを選択することができるが、その場合の発現用ベクターとしては、それぞれの宿主に適切なものを選択する必要がある。また、適切なシグナルペプチドをコードするｃＤＮＡを発現用ベクターに挿入することで一本鎖抗体を細胞外に分泌させ、ペリプラズマ領域に輸送させ、あるいは細胞内に留まらせることができる。
【００５７】
ここでは最も一般的な、動物細胞での発現について述べる。動物細胞を宿主とする発現ベクターには特段の制約はないが、プラスミド、ウイルスベクター等を用いることができる。当該発現ベクターに含まれるプロモーターは、宿主として用いる動物細胞との組み合わせにより、SV40初期、SV40後期、サイトメガロウイルスプロモーター、ニワトリβアクチンなど、最終的にアッセンブルした抗体及び抗体機能分子が得られるのであれば如何なるものでも良い。好ましくは、ニワトリβ−アクチンプロモーター系発現プラスミドpCAGG（特許第２８２４４３４号）が使用される。選択や遺伝子増幅のマーカー遺伝子として、アミノグリコシド3'ホスホトランスフェラーゼ(neo)遺伝子やジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)遺伝子、ピューロマイシン耐性酵素遺伝子、グルタミン合成酵素(GS)遺伝子など一般に知られる選択や遺伝子増幅用のマーカー遺伝子（Kriegler M著、加藤郁之進 監訳、ラボマニュアル動物細胞の遺伝子工学、宝酒造(1994)）が利用できる。
【００５８】
Ｈ鎖Ｌ鎖の遺伝子を動物細胞に導入する際の組み合わせや形態、比率に特段の制約はない。Ｈ鎖Ｌ鎖の遺伝子を同じベクター内に組み込み同時に動物細胞内に導入する方法でも良いし、Ｈ鎖Ｌ鎖の遺伝子を別々のベクターに組み込み、同時期に、あるいは別々の時期に選択マーカーを変えて動物細胞に順次導入してもよい。また、その構成比もＨ鎖Ｌ鎖が１：１になるようにする必要はなく、どの様な比率でも構わない。
【００５９】
発現ベクターを導入する宿主細胞として、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞やSP2/0等マウスミエローマ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、ＣＯＳ細胞など様々な動物細胞が利用可能であるが、発現ベクターに使用されるプロモーター、選択及び遺伝子増幅用マーカー遺伝子に合わせて適当な細胞を選択すれば良い。例えば、ニワトリβ−アクチンプロモーター系発現プラスミドを用いて構築した発現ベクターには、ＣＨＯ細胞などが使用される。
【００６０】
宿主細胞の形質転換するときには公知の方法を利用すればよい。例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、リポフェクチン系のリポソームを用いる方法、プロトプラストポリエチレングリコール融合法、エレクトロポレーション法などが利用でき、使用する宿主細胞により適当な方法を選択すればよい（Molecular Cloning (3rd Ed.), Vol 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)）。
【００６１】
形質転換細胞の選択・増殖には、一般に動物細胞を形質転換する時に行われる方法を使用すればよい。例えば、形質転換後の細胞は、CHO-S-SFMII培地（GIBCO-BRL）、IS CHO-V培地(アイエスジャパン)、YMM培地等無血清培地やMEMアルファ培地、RPMI培地、ダルベッコMEM培地（いずれもGIBCO-BRL）に５〜10％程度のウシ胎児血清を添加した血清培地などの一般的に動物細胞培養に用いられる培地に、使用する選択マーカーに合わせてメトトレキサート、G418等を添加した選択培地を用いて、適宜培地交換をしながら、37℃前後で10〜14日間程度培養される。この培養により、形質転換されていない細胞は死滅し、形質転換した細胞のみが増殖してくる。更に、形質転換細胞に対して、限界希釈法などの方法により、目的とする抗体産生細胞株の選択及びクローン化が行われる。
【００６２】
このようにして得られる本発明の組換え抗体は、Ｅ型BoNTに対して中和活性を有していることが確認され、本発明によりこれまでになかった組換え抗BoNT抗体を調製することが可能となった。このような組換え抗BoNT抗体は、Ｅ型ボツリヌス中毒症の臨床において、これまでになかった有効な治療剤となりうるものである。さらに、本発明により提供される抗BoNT抗体可変領域をコードする遺伝子断片は、Ｅ型BoNTに対して中和活性を有する抗体分子の可変領域の特異的アミノ酸配列もしくは核酸塩基配列を開示するものであり、今後、さらに進んだ遺伝子組換え技術を応用して目的の抗体分子を修飾、または一部置換等することにより、より優れた組換え抗BoNT抗体分子の開発を可能にするものである。
【００６３】
以下に、実施例を挙げて本願発明をさらに具体的に説明するが、この例示に限定されるものではない。
【実施例】
【００６４】
以下に示す実施例では、特に断りのない限り、和光純薬、宝酒造、東洋紡及びNew England BioLabs社、アマシャムバイオサイエンス社、バイオラド社、シグマ社、ギブコ社製の試薬を使用した。
【００６５】
《実施例１：マウスハイブリドーマの調製》
現在治療用毒素として使用されているC. botulinum type E 35396株より精製したE型神経毒素をＢ型神経毒素で行われた方法に準拠して（Infect. Immun. 18: 761-766, 1977）ホルマリンで不活化したトキソイドを免疫抗原に用いた。上記のトキソイドとFreund’s Complete Adjuvant（Difco）を等量混合しBALB/cマウス１匹当たり毒素蛋白量で0.25mgを腹腔内に接種した。初回免疫後、４及び８週目にFreund’s Incomplete Adjuvant（Difco）を用いて同量を追加免疫した。１０日後、部分採血を行い、ELISAにより抗原結合抗体価を測定した。ELISAには、E型神経毒素（0.5μg/well）をコートしたプレート（FALCON, Flexible Plate）を用い、ブロッキングには0.2％BSA、２次抗体にはペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG(H+L)（1：5000，BioRad）、基質はオルソフェニレンジアミン（Nacalai Tesque）を使用した。反応は基質反応以外全て37℃２時間で行った。基質の発色反応は37℃30分で行った。
【００６６】
５匹のBalb/cマウスにおいて３回のトキソイド免疫後の血中の抗ボツリヌスE型神経毒素のELISA抗体価はいずれのマウスにおいても500,000倍以上に上昇していた。ELISA抗体価が500,000倍以上のマウスにおいて順次、神経毒素（10μg／マウス；106LD50/マウス）を腹腔内に投与した。３〜４日後に脾細胞を調製し、ポリエチレングリコール法によりミエローマ細胞（P3U1）と細胞融合を行った。脾細胞とP3U1を10：3の割合で混合し、50% PEG4000(MERCK) /10% DMSO(SIGMA)を用いて細胞融合を行った。DMEM (DIFCO)/15% FCS (GIBCO)/HAT (SIGMA)を用いて細胞を選択した。得られたハイブリドーマの培養上清中のELISA抗体価を測定し、限界希釈法により中和活性のある抗体を産生しているハイブリドーマのクローニングを２〜３回行った結果、E型神経毒素に対する抗体陽性ハイブリドーマが46クローン得られた。
【００６７】
《実施例２．マウス抗体の中和活性》
これら46クローンの内、比較的抗体価の高いクローンを20クローン選別し、産生する抗体の毒素中和活性を調べた。中和活性は、BoNT（200ipLD50/ml）とハイブリドーマ培養上清を等量混合し、室温で３０分反応させた後、マウスの腹腔内へ0.5ml接種し、毒素を培地のみと混合したサンプルをコントロールとし、コントロールが死亡した時点における、試験群の臨床症状（麻痺の程度）により判定した。その結果、E型神経毒素を完全中和する抗体を産生するハイブリド−マが10クローン、神経毒素のみを接種した対照マウスと比較して延命あるいは症状の緩和が見られたクローンが6クローン得られた（表１）。
【００６８】
【表１】
2007274924.tif 000002
【００６９】
《実施例２：V領域遺伝子クローニング》
マウスモノクローナル抗体のＶ領域遺伝子は、RT-PCR法によって単離した。m9-4ハイブリドーマよりQuickPrep micro mRNA Purification Kit (Amersham Bioscience)を用いてmRNAを抽出し、Superscript II 逆転写酵素(Invitrogen)によるｃＤＮＡ合成を行った。これをテンプレートとし、プライマーとしてKozak配列及び必要なスプライシングシグナル、酵素サイト（HindIII、BamHI）を持ったオリゴマーをVH、VL領域遺伝子用にそれぞれのV領域及びJ領域のサブグループ毎に作製し（配列番号１〜４）、Advantage HF-2 PCR Kit（BD Bioscience）を用いて当該キットのプロトコールに従ってＰＣＲ反応を行った。その結果、ＶＨ、ＶＬ領域それぞれにＰＣＲ増幅バンドが複数検出された。その中からサイズ的に既知のＶＨ、ＶＬ領域のｃＤＮＡ遺伝子と一致しているバンドを選び、ＴＡクローニングキット（Invitrogen）を用いてクローニングし、ABI PRISM310 Genetic Analyzer（PEバイオシステムズ）を用いてその核酸塩基配列の決定を行った。これらの複数のバンドから、開始コドンからＪ領域までＶ領域内で正しいオープンリーディングフレームを取る遺伝子を選んだ結果、一対のＶＨ、ＶＬ領域遺伝子の組み合わせが得られた。その核酸塩基及びアミノ酸配列を配列番号５〜８にそれぞれ示す。
【００７０】
《実施例３：キメラ抗体産生細胞の作製》
このようにして得たＶＨ、ＶＬ領域遺伝子をHindIIIとBamHI（TAKARA）で消化し、それぞれを、発現ベクターであるCAG-γ１、CAG-1κ（J. Immnol., 167, 3266, 2001）の同サイトに組み込み、キメラ抗体発現ベクターを構築した。CAG-γ１は、ヒト抗体C領域γ１鎖の遺伝子及び選択マーカーとしてのネオマイシン耐性遺伝子（neor）を持ち、CAG-κはヒト抗体C領域κ鎖の遺伝子及び選択マーカーとしてのジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（dhfr）を持っている。構築したキメラ抗体発現プラスミドを用い以下に述べる方法にてCHO DG44（Urlaub Gら, Somatic cell. Mol. Genet., 12, 555 (1986)、以下CHO）細胞を形質転換した。形質転換の前日にCHO細胞を6 well プレートに1-0.5×105cells/２ml/wellの細胞密度で10％ウシ胎児血清（FCS、GIBCO-BRL社製）を含むYMM培地（インシュリン・トランスフェリン・エタノールアミン・亜セレン酸ナトリウムを含むアミノ酸・ビタミンを強化した核酸不含MEMアルファ培地）を用い播種した。37℃、５％CO2培養装置で一夜培養の後、リポソーム系形質転換試薬、TransIT-LT1（宝）あるいはリポフェクトアミン2000（インビトロジェン）を用いて、あらかじめキメラ抗体Ｈ鎖及びＬ鎖遺伝子発現プラスミドを等量混合し、PvuIで消化・線状化しておいたものを導入DNAとして、それぞれのプロトコールに従いトランスフェクションを行った。37℃、５％CO2培養装置で一夜培養した後、選択培地、10%透析FCS(d-FCS：GIBCO-BRL社製)、0.5 mg/ml Geneticin（G418：GIBCO-BRL社製）、300nM メトトレキサート（MTX：和光純薬工業製）を含むYMM培地に培地交換した。３〜４日毎に培地を交換しながら37℃、５％CO2培養装置で培養を続けることで選択を行い、形質転換体を得た。得られた形質転換細胞の培養上清中に含まれるキメラ抗体の濃度は、ヤギ由来抗ヒトIgG Fc抗体（CAPPEL）とプロテインA-HRP（ZYMED社）を用いたサンドイッチELISA法により測定した。この際、市販のヒトIgG1抗体（Biogenesis）の希釈系列を作製し、それを標準試料とした。このELISA法により得られた形質転換細胞の中から抗体産生量の高い細胞をスクリーニングし、次いで限界希釈法によるクローニングを行って。最終的に得られた9-4由来のキメラ抗体産生細胞はAE94と名付けた。
【００７１】
《実施例４：キメラ抗体の活性》
得られたキメラ抗体の神経毒素に対する結合活性をE型神経毒素（0.5μg/well）をコートしたプレート（FALCON, Flexible Plate）を用いて測定した。ブロッキングには0.2％BSA、２次抗体にはペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG(H+L)（1：5000，BioRad）、基質はオルソフェニレンジアミン（Nacalai Tesque）を使用した。反応は基質反応以外全て37℃２時間で行った。基質の発色反応は37℃30分で行った。細胞の培養上清中の抗BoNTキメラモノクローナル抗体はELISAによって期待通りに毒素と結合することが示された。
【００７２】
また、キメラ抗体の培養上清中の毒素中和活性を調べた。前述の中和活性測定と同様に、BoNTと培養上清を等量混合し、室温で30分反応させた後、マウスの腹腔内へ0.5ml接種した。毒素を培地のみと混合したコントロールが死亡した時点における、試験群の臨床症状を調べた結果、表１で示したものと同様の結果になった。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本願発明によって得られる抗BoNTマウスモノクローナル抗体及びそのV領域遺伝子情報からもたらされる組換え抗体はBoNTに対して高力価の中和活性を有している。このような組換え抗BoNT抗体は、ボツリヌス中毒症の臨床において、これまでになかった有効な治療剤となりうるものである。さらに、本発明により提供される抗BoNTマウスモノクローナル抗体及びその可変領域をコードする遺伝子断片は、BoNTに対して中和活性を有する抗体分子の可変領域の特異的アミノ酸配列もしくは核酸塩基配列を開示するものであり、今後、さらに進んだ遺伝子組換え技術を応用して目的の抗体分子を修飾、または一部置換等することにより、より優れた抗BoNT換え抗体分子の開発を可能にするものである。
【００７４】
このように、本願発明の方法により得られる抗BoNTマウスモノクローナル抗体産生細胞及び当該細胞により得られる抗BoNTマウスモノクローナル抗体、そのV領域遺伝子情報を元にて得られる組換え抗BoNT抗体産生細胞及び当該細胞により得られる組換え抗BoNT抗体は、医療及び研究分野において多大なる貢献をするものである。
【配列表】
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