(57)【要約】【課題】一定の予備実験によりSNPs検出用DNAチップの性能、特に検出の定量性・信頼性を簡便かつ正確に評価することができる方法を提供する。【手段】本発明は、SNPs検出用DNAチップの性能を評価する方法であって、核酸プローブと核酸検体との複数の組合せを用意すること；各組合せでハイブリダイゼーション反応を行い、ハイブリダイゼーション反応により形成されたハイブリッド核酸の濃度を測定すること；および、各組合せでの測定シグナル強度と、各組合せで核酸プローブと核酸検体との間に理論上形成可能な水素結合対の総数との間の正の相関を調べることを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
SNPs検出用DNAチップの性能を評価する方法であって、
核酸プローブと核酸検体との複数の組合せを用意すること；
各組合せでハイブリダイゼーション反応を行い、ハイブリダイゼーション反応により形成されたハイブリッド核酸の濃度を測定すること；および、
各組合せでの測定シグナル強度と、各組合せで核酸プローブと核酸検体との間に理論上形成可能な水素結合対の総数との間の正の相関を調べること；
を含む方法。
【請求項２】
核酸プローブと核酸検体との複数の組合せは、塩基配列の異なる複数の核酸プローブを、該核酸プローブの少なくとも１つとマッチングする核酸検体とそれぞれ組み合わせることにより、理論上形成可能な水素結合対の総数が変動する複数の組合せとして構成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
水素結合対の総数の変動に依存する測定シグナル強度の変動について線形近似が成立するか否かを判断することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
１に近い正の相関係数が得られる否かを判断することを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
蛍光色素分子が付加された核酸検体を使用し、ハイブリダイゼーション反応により形成されたハイブリッド分子の蛍光色素分子から発生する蛍光の強度を検出することにより、前記シグナル強度を測定することを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
担体上に核酸プローブがin-situ合成されるSNPs検出用DNAチップの性能を評価する方法であって、前記担体への核酸プローブの合成収率を測定し、該合成収率を用いて前記シグナル強度を補正することを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
核酸プローブと核酸検体との複数の組合せを用意すること；
各組合せでハイブリダイゼーション反応を行い、ハイブリダイゼーション反応により形成されたハイブリッド核酸の濃度を測定すること；および、
各組合せでの測定シグナル強度と、各組合せで核酸プローブと核酸検体との間に理論上形成可能な水素結合対の総数との間の正の相関を調べること；
を実行させるためのSNPs検出用DNAチップの性能を評価するプログラムを記録したコンピュータに読み取り可能な記録媒体。
【請求項８】
核酸プローブと核酸検体との複数の組合せは、塩基配列の異なる複数の核酸プローブを、該核酸プローブの少なくとも１つとマッチングする核酸検体とそれぞれ組み合わせることにより、理論上形成可能な水素結合対の総数が変動する複数の組合せとして構成される、請求項７に記載のコンピュータに読み取り可能な記録媒体。
【請求項９】
水素結合対の総数の変動に依存する測定シグナル強度の変動について線形近似が成立するか否かを判断することを含む、請求項７又は８に記載のコンピュータに読み取り可能な記録媒体。
【請求項１０】
１に近い正の相関係数が得られる否かを判断することを含む、請求項７〜９のいずれか１項に記載のコンピュータに読み取り可能な記録媒体。
【請求項１１】
蛍光色素分子が付加された核酸検体を使用し、ハイブリダイゼーション反応により形成されたハイブリッド分子の蛍光色素分子から発生する蛍光の強度を検出することにより、前記シグナル強度を測定することを含む、請求項７〜１０のいずれか１項に記載のコンピュータに読み取り可能な記録媒体。
【請求項１２】
担体上に核酸プローブがin-situ合成されるSNPs検出用DNAチップの性能を評価するプログラムであって、前記担体への核酸プローブの合成収率を測定し、該合成収率を用いて前記シグナル強度を補正するプログラムを含む、請求項７〜１１のいずれか１項に記載のコンピュータに読み取り可能な記録媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、SNPs検出用DNAチップの性能、特に検出信頼性を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の変異、特にSNPs（一塩基多型）の検出は、突然変異等に起因する疾患、例えば、ガンの診断等に有効なだけでなく、多因子疾患の病因関連遺伝子の解析や予測医療にも貢献し、個々人の薬剤応答性や副作用の程度を調べる上にも非常に重要である。この遺伝子変異を速やかに検出する手段として、SNPs検出用DNAチップが有効であることが知られている。
【０００３】
DNAチップとは、被検DNA断片に対し、相補的な塩基配列を有する1本鎖のDNAあるいはオリゴヌクレオチド分子を核酸プローブとし、それぞれの核酸プローブごとに分けて、担体となる表面上のそれぞれの区画に対応させて配列し固定したものである。
【０００４】
SNPs検出用DNAチップには、SNPsの検査対象部位に相当するDNA断片（以下単に「核酸検体」又は「検体」ともいう）の相補鎖を核酸プローブとして固定する。SNPsの検査対象部位には、通常、1つの正常型と複数の変異型が存在し、それらのいずれかにマッチングする核酸プローブがスポット内に配列される。被検試料は、SNPsの検査対象部位に相当するDNA断片のみをPCR法により増幅させた検体液を用いる。
【０００５】
この検体液を、SNPs検出用DNAチップの核酸プローブが固定された面に接触させ、検体DNA断片と対応する核酸プローブ間で、対合する塩基間での水素結合、すなわち、ハイブリダイゼーションを起こさせる。そして、このハイブリダイゼーションによる結合を光学的、あるいは、電気化学的なシグナルとして検出することにより、核酸プローブと結合した検体DNA断片を同定し、かつ、定量することができる。
【０００６】
ここで、核酸プローブと検体の組合せが、正常型プローブと正常型検体、あるいは、変異型プローブとそれに対応する変異型検体のようなパーフェクトマッチングでは、ハイブリダイゼーションが完全であり強い。一方、核酸プローブと検体の組合せが、正常型プローブと変異型検体、あるいは、変異型プローブと正常型検体のようなミスマッチングでは、水素結合の出来ない部位を必然的に伴うので、ハイブリダイゼーションが不完全であり弱い。
【０００７】
このように、パーフェクトマッチングとミスマッチングとにおけるハイブリダイゼーションの結合力の差異に由来するシグナル強度の差異を検出することにより初めて、検体中のSNPsの型を識別し、確定することが可能になる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
パーフェクトマッチングとミスマッチングの差異は、ハイブリダイゼーションが可能な水素結合対の数で比較すると、後者は前者に対し数%程度しか少ないに過ぎない。例えば、核酸プローブが20mer塩基から成るとすれば、パーフェクトマッチングでは検体の核酸プローブに相補的な部分の塩基がすべて結合するが、ミスマッチングではその内の1塩基は対合関係が崩れているので、上述の差異は約5%（1/20）ということになる。SNPs識別とは、このようなわずかな差異を識別する高度な技術である。さらに、実際の測定においては、パーフェクトマッチングとミスマッチングのシグナルの差異を縮める要因が存在する。
【０００９】
その要因の1つが、測定されるシグナルに含まれる、本来のシグナルとは無関係な成分、すなわち、ノイズ成分である。このノイズ成分に関して、現在一般的に行われている、検体DNAに付加させた蛍光色素分子からの蛍光を検出する方式を例に説明する。
【００１０】
測定される蛍光には、核酸プローブとハイブリダイゼーションした検体DNAの蛍光色素分子からの測定すべき本来の蛍光、すなわち、シグナル成分だけではなく、ハイブリダイゼーション以外のメカニズムにより基板および核酸プローブに結合した検体DNAの蛍光色素分子からの蛍光、基板自体の蛍光、基板に付着したほこりや汚れ、または測定光学系内部の汚れなどから発せられる蛍光、さらには測定光学系が有する暗シグナルといった検出を阻害する蛍光成分、すなわちノイズ成分が存在する。
【００１１】
このノイズ成分は、一般に、シグナル成分に対し無視できるほど小さいことは稀であり、シグナル成分と同程度レベルの大きさである場合もある。また、このノイズ成分は、同一種類の核酸プローブの集合であるスポット間において、一定ではなく、ばらつきを有する。
【００１２】
したがって、パーフェクトマッチングとミスマッチングの間で、本来のシグナルに十分な大小関係があっても、測定されるシグナルにおいては、この本来のシグナルにノイズ成分が上乗せされるので、パーフェクトマッチングの測定シグナルをミスマッチングの測定シグナルで割った値、すなわち、識別比は期待される値よりはるかに小さくなり、かつ、安定せず信頼性を欠くことになる。
【００１３】
このような事情は、光学的ではなく電気化学的な検出を行う場合においても、ノイズ電流の影響があるため、同様に当てはまる。
上記のように、SNPs検出用DNAチップによるSNPsの検出は、定量性・信頼性の観点からは十分に確立されたとは一般的には言えない。また、非常に微妙な差異を扱う関係上、SNPsの検出結果は、その時々のハイブリダイゼーション条件、すなわち、検体液と核酸プローブの接触を行うインキュベーション、および完全なハイブリダイゼーションした核酸検体のみを相対的に残す後洗浄に関する条件に強く依存し、本質を定量的に見抜き難い傾向がある。
【００１４】
したがって、従来は、SNPs検出用DNAチップによるSNPs検出の定量性・信頼性に関しては、データ数を非常に多く積んで統計的に解釈する必要があった。また、検出信頼性を向上させるには、どのような形式のSNPs検出用DNAチップを用いて、どのような方式で検出を行うことがよいかを判断するための指標が存在しなかった。
【００１５】
本発明が解決しようとする課題は、様々な形式または方式のSNPs検出用DNAチップの性能、特に検出の定量性・信頼性の判断に、統一的、かつ、普遍的に適用できる性能指標を提供することにあり、そのような指標を得るための一定の予備実験を行うだけで、従来のような統計的解釈に依存することなくSNPs検出能力を評価することができる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記の課題を解決するために、本発明は、SNPs検出用DNAチップの性能を評価する方法であって、
核酸プローブと核酸検体との複数の組合せを用意すること；
各組合せでハイブリダイゼーション反応を行い、ハイブリダイゼーション反応により形成されたハイブリッド核酸の濃度を測定すること；および、
各組合せでの測定シグナル強度と、各組合せで核酸プローブと核酸検体との間に理論上形成可能な水素結合対の総数との間の正の相関を調べること；
を含む方法を提供する。
【００１７】
本発明の評価法の一態様では、核酸プローブと核酸検体との複数の組合せは、塩基配列の異なる複数の核酸プローブを、該核酸プローブの少なくとも1つとマッチングする核酸検体とそれぞれ組み合わせることにより、理論上形成可能な水素結合対の総数が変動する複数の組合せとして構成される。
【００１８】
本発明の評価法の他の態様は、水素結合対の総数の変動に依存する測定シグナル強度の変動に線形近似が成立するか否かを判断することを含む。
本法のさらに他の態様は、1に近い正の相関係数が得られる否かを判断することを含む。
【００１９】
本法のさらに他の態様は、蛍光色素分子が付加された核酸検体を使用し、ハイブリダイゼーション反応により形成されたハイブリッド分子の蛍光色素分子から発生する蛍光の強度を検出することにより、前記シグナル強度を測定することを含む。
【００２０】
本法のさらに他の態様は、担体上に核酸プローブがin-situ合成されるSNPs検出用DNAチップの性能を評価する方法であって、前記担体への核酸プローブの合成収率を測定し、該合成収率を用いて前記シグナル強度を補正することを含む。
【００２１】
また、１つの態様において、本発明は、
核酸プローブと核酸検体との複数の組合せを用意すること；
各組合せでハイブリダイゼーション反応を行い、ハイブリダイゼーション反応により形成されたハイブリッド核酸の濃度を測定すること；および、
各組合せでの測定シグナル強度と、各組合せで核酸プローブと核酸検体との間に理論上形成可能な水素結合対の総数との間の正の相関を調べること；
を実行させるためのSNPs検出用DNAチップの性能を評価するプログラムを記録したコンピュータに読み取り可能な記録媒体である。
【００２２】
本発明の記録媒体の１つの態様において、核酸プローブと核酸検体との複数の組合せは、塩基配列の異なる複数の核酸プローブを、該核酸プローブの少なくとも１つとマッチングする核酸検体とそれぞれ組み合わせることにより、理論上形成可能な水素結合対の総数が変動する複数の組合せとして構成される。
【００２３】
１つの態様において、本発明の記録媒体は、水素結合対の総数の変動に依存する測定シグナル強度の変動について線形近似が成立するか否かを判断することを実行させるためのプログラム含む。
【００２４】
１つの態様において、本発明の記録媒体は、１に近い正の相関係数が得られる否かを判断することを実行させるためのプログラムを含む。
１つの態様において、本発明の記録媒体は、蛍光色素分子が付加された核酸検体を使用し、ハイブリダイゼーション反応により形成されたハイブリッド分子の蛍光色素分子から発生する蛍光の強度を検出することにより、前記シグナル強度を測定することを実行させるためのプログラムを含む。
【００２５】
１つの態様において、本発明の記録媒体は、担体上に核酸プローブがin-situ合成されるSNPs検出用DNAチップの性能を評価する方法であって、前記担体への核酸プローブの合成収率を測定し、該合成収率を用いて前記シグナル強度を補正することを含む方法を実行するためのプログラムを含む。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の評価法では、使用される核酸プローブと、それらに対応する核酸検体との任意の組合せについてハイブリダイゼーション反応させ、各組でのハイブリダイゼーションの度合いと水素結合対の総数との間の正の相関を調べる。この相関関係は、様々なSNPs検出用DNAチップについて検出性能を判断するための普遍的な指標となる。したがって、その指標を得る一定の予備実験を行うことにより、SNPs検出用DNAチップの性能、特に検出の定量性・信頼性を簡便かつ正確に評価することができる。
【発明の実施の形態】
【００２７】
核酸プローブと核酸検体のハイブリダイゼーションの度合いは、ハイブリダイゼーションに寄与した水素結合対の総数が多いほど強くなる。また、シグナル強度は、このハイブリダイゼーションの度合いが強いほど大きくなる。よって、シグナル強度は、ハイブリダイゼーションに寄与した水素結合対の総数と正の相関を持つ。
【００２８】
このシグナル強度と水素結合対の総数の正確な関係は、非常に複雑であろう。しかし、水素結合対の総数の変化範囲が小さければ、この範囲内では両者の間に線形近似が成立する、すなわち、両者の間での正の相関係数は1に近づくと考えてよい。本発明においては、相関係数があらかじめ定めた値以上の場合、線形近似が成立すると判断すればよい。あらかじめ定めた値とは、求める精度により定めれば良いが、例えば、０．８５、より好ましくは０．９、さらに好ましくは０．９５である。この線形性に関しては、後記の実施例1の後半部において詳細に述べる。
【００２９】
通常のSNPs検出用DNAチップにおいては、正常型プローブと複数の変異型プローブが存在し、そこに検体として、正常型検体かあるいは変異型検体が滴下される。各核酸プローブの集団であるスポットにおいては、核酸プローブと検体の組合せにより、パーフェクトマッチングとミスマッチングの場合があり、ミスマッチングにはミスマッチングの度合いの異なる複数の組合せがある。
【００３０】
本発明の一態様
本発明の一態様として、正常型プローブと2種類の変異型プローブの合計3種類の核酸プローブを搭載したSNPs検出用DNAチップに、それぞれの核酸プローブの相補鎖に相当する3種類の核酸検体によりハイブリダイゼーション試験を行う方法を説明する。例えば、3種類の核酸プローブを担持させたSNPs検出用DNAチップを3枚用意し、3種類の核酸検体のいずれか1種を含む検体液を3枚のチップにそれぞれ1種類ずつ滴下する。その結果、DNAチップの各スポットでは、特定の核酸プローブと特定の核酸検体とのハイブリダイゼーション反応が別個に行われる。こうして考え得る全ての組合せで、ハイブリダイゼーションの度合いを表すスポットシグナル強度、すなわち、形成されたハイブリッド核酸の濃度が測定される。
【００３１】
核酸プローブと検体の組合せは全部で3×3 = 9通り存在する。これらにはパーフェクトマッチングおよびタイプの異なるミスマッチングに関するすべての組合せが含まれている。各々の組合せにおいて理論上形成可能な水素結合対の総数は、核酸プローブと核酸検体との間で塩基配列を対比し、マッチングする塩基対のうちA-T対に2本、G-G対に3本を加算して合計することにより計算することができる。
【００３２】
前記9通りの形成可能な水素結合対の総数は、全部が互いに異なるとは限らず、一部重なっている場合もある。水素結合対の総数の違いは、それが最小の組合せと最大の組合せとの間で比較しても10%程度以内の小さい値であるのが一般的である。本態様では、そのような範囲で変動する異なる水素結合対の総数に影響されるであろうそれぞれのスポットシグナル強度を調べ、水素結合対の総数とシグナル強度との相関を求める。
【００３３】
後記の実施例で示される通り、形成可能な水素結合対の総数の変動に対し、スポットシグナル強度の変動が線形近似の成立する範囲内に収まっており、SNPs検出が良好に行われていれば、正の相関係数は1に近い値を示すことになる。
【００３４】
上記のように求められた相関係数は、使用したSNPs検出用DNAチップの検出性能を判定するために有用な指標として使用することができる。また、この相関係数は、わずか数枚のチップのハイブリダイゼーション結果から得ることができる。よって、少ないデータ数から、SNPs検出用DNAチップのSNPs検出の信頼性を確認することができる。
【００３５】
本発明の他の態様
本発明に従い、水素結合対の総数とシグナル強度との相関係数を求める上で留意すべきことは、正常型と複数の変異型の全スポットにおける核酸プローブ密度のばらつきである。本発明では、形成し得る水素結合対の総数がスポットシグナル強度に対し有意な影響を及ぼすことを前提とするが、核酸プローブ密度もスポットシグナル強度に影響を及ぼし得るからである。スポット間での核酸プローブ密度の変動が、スポット間での水素結合対の総数の差違に基づくスポットシグナル強度の変動を相殺してしまうことがある。
【００３６】
すべてのスポットで核酸プローブ密度が等しくなるように核酸プローブを合成すべきであるが、核酸プローブ・スポット形成法によってはこのばらつきが大きくなる場合がある。典型的には、核酸プローブをin-situ合成する場合である。一般に、核酸プローブのin-situ合成は、SNPs検出用DNAチップ上で、直接あるいはSNPs検出用DNAチップの一部を構成する担体上で行われる。核酸プローブは、固相合成を利用したホスホアミダイト法による縮合反応により形成されるが、この縮合反応の合成収率は95%程度と100%より低く、かつ、わずかな反応環境の差異により95%の前後でばらつく傾向にある。すべてのスポットの合成収率が95%で統一されていれば問題ないが、あるスポットの合成収率が97%で別のスポットの合成収率が93%とばらつけば、水素結合対の総数とは無関係に、この合成収率の差がシグナル強度差を生んでしまう。したがって、各スポットでの合成収率がある程度以上ばらつく場合は、合成収率を用いて補正することが必要である。
【００３７】
本態様は、担体上に核酸プローブがin-situ合成されるSNPs検出用DNAチップの性能を評価する方法に関し、前記担体への核酸プローブの合成収率を測定し、該合成収率を用いて、測定されたシグナル強度を補正することを含む。
【００３８】
一般に合成収率は、随時正確にモニターできるので、この結果を利用して合成収率のばらつきの影響を巧妙に排除することができる。例えば、シグナル強度の実測値を、合成収率が100%であるならば得られたとみなされるシグナル強度に換算して、この補正されたシグナル強度を用いて、水素結合対の総数とシグナル強度の相関係数を求めればよい。
【００３９】
本発明による評価手順の一例
SNPs検出用DNAチップの作製時に各スポットへの核酸プローブの合成収率が一致していることが確認されている場合は、各スポットでのハイブリダイゼーションにより得られたシグナル強度をそのまま評価に用いることができる。
【００４０】
ハイブリダイゼーション試験のために、評価対象のSNPs検出用DNAチップと、これに使用されている核酸プローブによる検査対象の核酸検体とを用意する。用意すべき核酸検体の種類は、核酸プローブの種類に依存する。好ましい組合せの条件は、核酸プローブと核酸検体との間で形成可能な水素結合対の総数が適度に変動することである。そのような条件は、SNPs検出用DNAチップに使用される核酸プローブの少なくとも1つにマッチングする核酸検体を使用することで得られる。例えば、3種類の核酸プローブがあれば、核酸プローブと核酸検体のとの組合せ数は、好ましくは3つ以上、より好ましくは9つである。
【００４１】
核酸プローブの少なくとも1つにマッチングする核酸検体を、すべての核酸プローブに対応させることにより一連の組合せが得られ、さらに、このような一連の組合せを複数の変異型プローブのそれぞれに用意することにより、考え得るすべての組合せを網羅することもできる。最も好ましい組合せは、正常型および変異型の核酸プローブの各々にパーフェクトマッチングする複数種の核酸検体を用意し、すべての核酸プローブと、すべての核酸検体とが総当たりとなる組合せである。一般的なSNPs検出では、全長２０塩基程度の核酸プローブに核酸検体からみて０〜３塩基、好ましくは０〜２塩基のミスマッチがあるので、全水素結合対の総数にして０〜１５％、典型的には０〜１０％のミスマッチ範囲内にある複数の組み合わせが構成されるであろう。
【００４２】
ハイブリダイゼーション試験では、1種類の核酸検体を、SNPs検出用DNAチップに使用し、1枚のDNAチップで核酸プローブの種類の数に対応する複数組のハイブリダイゼーション反応を行う。ハイブリダイゼーション反応には、当該SNPs検出に適した条件、通常、パーフェクトマッチングの組合せが有意に検出されるのに充分にストリンジェントな条件が選択されるであろう。別の核酸検体を同種のSNPs検出用DNAチップに使用することで、別の複数組のハイブリダイゼーション反応を行うことができる。
【００４３】
各組のハイブリダイゼーション反応で形成されるハイブリッド分子の濃度は、蛍光色素分子が付加された核酸検体を使用することにより各スポットから発せられる蛍光のシグナル強度として検出される。
【００４４】
本発明に使用し得るハイブリダイゼーション条件は、一般的なSNPs検出に使用される条件であり、それらの選定および実施方法の詳細は、例えば、「ＤＮＡマイクロアレイ」（Mark Schena編、加藤郁之進監訳、タカラバイオ発行）に記載されているように、当業者によく知られている。
【００４５】
複数組のハイブリダイゼーションについて、測定されたシグナル強度と、理論上形成可能な水素結合対の総数との相関係数を求める。例えば、横軸に水素結合対の総数をとり、縦軸に測定シグナル強度をとり、各組毎のデータをグラフ上にプロットする。複数組のデータに基づくプロットの並びを線形近似することにより相関係数を求める。
【００４６】
他方、各スポットまたは担体への核酸プローブの合成時に、縮合反応の合成収率が2%程度以上ばらついている場合は、測定して得られるシグナル強度を合成収率が100%であるとした時のシグナル強度に換算することにより補正シグナル強度を求める。補正シグナル強度と水素結合対の総数との組をプロットすることにより相関係数を求める。こうして合成収率のばらつきを考慮して補正された相関係数が得られる。
【００４７】
次に、測定シグナル強度の補正シグナル強度への換算の仕方の一例を示す。
全段でn段、すなわち、n merのオリゴヌクレオチドの、ヌクレオチド間における縮合反応の合成収率をx%とすると、1段目の付加総数をaとすれば、n merまで伸長したオリゴヌクレオチドの本数はa・(x/100)n-1 本であり、長さがk mer（k=1,2,…,n-1）の不完全なものはa｛(x/100)k-1−(x/100)k｝本である。
【００４８】
このうちハイブリダイゼーションしてシグナルに寄与する核酸プローブは、n merの完全なオリゴヌクレオチドと、寄与が少し落ちて(n-1)merの不完全なオリゴヌクレオチドと、さらに寄与が少し落ちて(n-2)merのさらに不完全なオリゴヌクレオチド程度である。(n-1)merと(n-2)merのオリゴヌクレオチドの本数はn merのオリゴヌクレオチドの本数に対し、それぞれの割合が、(100/x)−1、(100/x)｛(100/x)−1｝であり、xが95程度以上100未満であるので、これらの割合は1より十分小さいことがわかる。
【００４９】
つまり、シグナルへの寄与は近似的に、n merの完全なオリゴヌクレオチドの本数a・(x/100)n-1に比例するとみなしてよい。
よって、合成収率が100%であれば、n merの完全なオリゴヌクレオチド本数はaであるから、合成収率が100%であるとした時の補正シグナル強度は、合成収率x%における測定シグナル強度から、次式：
【００５０】
【数１】
2007093403.tif 000002
【００５１】
で示されるように、換算することができる。
【実施例】
【００５２】
以下、20merのオリゴヌクレオチドプローブを用いたSNPs検出用DNAチップの場合を例にとり、さらに詳細に説明する。ただし、本発明はそれら実施例のみに限定されるものではない。
【００５３】
実施例1
最初に、本実施例において相関係数を求める際に使用したSNPs検出用DNAチップの形式を説明する。
【００５４】
使用されるSNPs検出用DNAチップは、特開2005-249429号に開示されたもので、細孔にオリゴヌクレオチドプローブをin-situ合成し担持させた多孔質ガラス粒子を、スライドガラス上に配列・固定してスポットを形成したものである。
【００５５】
使用される多孔質ガラス粒子は、粒径7μm、細孔径50nm、細孔容積1.3ml/gである。この多孔質ガラス粒子を、厚さ3μmのガラス用の接着層を介して、単層状態でスライドガラス上に配列・固定することによりスポットは形成され、スポット径は1mmである。
【００５６】
多孔質ガラス粒子の体積の半分以上は接着層の外に露出することになり、この露出部が検体液に直接接触することができる。そして、検体液は、細孔を経由して多孔質ガラス粒子の内部に染み渡るようにして、多孔質ガラス粒子の細孔内に3次元的に配置するオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーションする。
【００５７】
検体には予め蛍光標識分子としてFITC（フルオレセインイソチオシアネート）を付加させてある。ハイブリダイゼーションの検出は、波長494nmの励起光を照射し、前記の蛍光標識分子から発生する波長518nmの蛍光を測定することにより行われる。
【００５８】
使用される多孔質ガラス粒子は、波長494nmの励起光、波長518nmの蛍光に対し十分に透明である。よって、多孔質ガラス粒子の内部からの蛍光シグナルをすべて3次元的に集めることが可能である。したがって、本実施例のSNPs検出用DNAチップは、シグナル強度が非常に大きいという特長を有する。
【００５９】
本実施例のSNPs検出用DNAチップは、ガン抑制遺伝子p53のコドン248での点変異を検出するためのものであり、オリゴヌクレオチドプローブとして、下記の1種類の正常型プローブと2種類の変異型プローブを搭載した。
【００６０】
【化１】
2007093403.tif 000003
【００６１】
A、C、G、Tは糖残基に結合する4種類の塩基：アデニン、シトシン、グアニン、チミンを、PGは多孔質ガラス粒子を表す。
前記核酸プローブの相補鎖に対応する、3’末端にFITC標識を付加した下記の3種類の検体を用意した。
【００６２】
【化２】
2007093403.tif 000004
【００６３】
上記SNPs検出用DNAチップに搭載された核酸プローブに対して上記の検体を組合せたハイブリダイゼーション試験を行い、各組の水素結合対の総数とスポット蛍光強度の間の相関係数を求めた。
【００６４】
SNPs検出用DNAチップ上のスポット領域には、上記の正常型プローブに対応するスポット、変異型1プローブに対応するスポット、変異型2プローブに対応するスポットの3種類を、それぞれ5つずつ配置した。
【００６５】
次いで、上記の検体3種類をハイブリダイゼーションバッファ液でそれぞれ希釈した検体液3種類を調製し、各検体液をSNPs検出用DNAチップ3枚のスポット領域にそれぞれ１種類ずつ滴下した。その上にカバーガラスをかぶせて検体液を均等に行き渡らせ、ハイブリダイゼーションさせるため45℃×12時間のインキュベーションを行った。
【００６６】
インキュベーション後、SSC溶液による通常の洗浄を行い、一連のハイブリダイゼーション操作を終了させた。次いで、SNPs検出用DNAチップのスポットを通常の蛍光顕微鏡にて観察し、各スポットの蛍光強度を測定した。
【００６７】
デジタル化したスポット画像のピクセルの明るさを平均して各スポットの蛍光強度を算出した。同一種類のプローブからなる5つのスポットの値を平均して、各検体に対する各プローブの蛍光強度をまとめた結果を表1に示す。
【００６８】
【表１】
2007093403.tif 000005
【００６９】
各検体に対し、パーフェクトマッチングの蛍光強度とミスマッチングの蛍光強度の比、すなわち識別比を括弧の中に記述してある。正常型検体に対しては、正常型プローブがパーフェクトマッチングであり、変異型1プローブと変異型2プローブがミスマッチングである。変異型1検体に対しては、変異型1プローブがパーフェクトマッチングであり、正常型プローブと変異型2プローブがミスマッチングである。変異型2検体に対しては、変異型2プローブがパーフェクトマッチングであり、正常型プローブと変異型1プローブがミスマッチングである。パーフェクトマッチングに相当する枠内は網掛けを施してある。
【００７０】
表1を見ると6つの識別比がすべて1を超えており、これらのSNPsの識別が可能であることがわかる。
次に、この検出の信頼度を、本発明に従って相関係数を求めることにより評価する。
【００７１】
表2は、核酸プローブと検体の各組合せにおける、ハイブリダイゼーションに寄与する水素結合対の総数をまとめたものである。
【００７２】
【表２】
2007093403.tif 000006
【００７３】
A-T結合部では2本、C-G結合部では3本、そして、ミスマッチ部位では0本と勘定した値である。
表2と表1を見比べることにより、スポット蛍光強度と水素結合対の総数の関係として、表の上列、中列、下列の順番に、（53, 180.1）、（50, 109.3）、（50, 121.9）、（50, 118.7）、（52, 150.3）、（47, 82.2）、（50, 127.1）、（47, 91.2）、（52, 183.6）の9ポイントが得られる。
【００７４】
横軸に水素結合対の総数、縦軸にスポット蛍光強度をとったグラフに、これらのポイントをプロットし、両者の間の相関係数を求めた結果を図1にまとめた。
相関係数は、0.94と1にかなり近い値になっている。これは、多孔質ガラス粒子の細孔内に3次元的に核酸プローブを有する上記のSNPs検出用DNAチップの検出信頼性が非常に高いことを現している。
【００７５】
この相関係数は、検出信頼性を示す指標として非常に重要であり、識別比よりも普遍性の高い指標であることを以下に示す。
スポット蛍光強度に対し線形的な変形を施した場合、すなわち、（53, a(180.1−b)）、（50, a(109.3−b)）、（50, a(121.9−b)）、（50, a(118.7−b)）、（52, a(150.3−b)）、（47, a(82.2−b)）、（50, a(127.1−b)）、（47, a(91.2−b)）、（52, a(183.6−b)）の9ポイントに対し、相関係数を上述した方法と同様に求めると、定数a、bの大きさには無関係に（ただしa≠0）、線形的な変形を施す前の値0.94になる。
【００７６】
一方、相関係数ではなく識別比であれば、このような変形を行うと、bが大きいほど大きい値になる。
このbの値は、一般に、ハイブリダイゼーション条件に大きく依存する。
【００７７】
パーフェクトマッチングとミスマッチングの差異が強く反映される温度と時間でインキュベーションを行えば、bは大きくなる。また、パーフェクトマッチングとミスマッチングの差異が強く反映される洗浄条件でインキュベーション後の洗浄を行えば、bは大きくなる。ハイブリダイゼーションとは別の機構で結合している検体、すなわち、非特異吸着した検体の洗浄時の除去効率が上がってもbは大きくなる。
【００７８】
このように、より好ましいハイブリダイゼーション条件を採用すれば、識別比は大きくなる。一方、相関係数は、上述の検討によりハイブリダイゼーション条件依存は小さいことがわかる。
【００７９】
つまり、SNPs検出用DNAチップそのものの検出信頼性、すなわち、SNPs検出用DNAチップの真の検出能力を把握する目的では、ハイブリダイゼーション条件に大きく左右される要素を含まない指標である相関係数を用いることが好適である。
【００８０】
この相関係数が1に近づくということは、スポットのシグナル強度そのものが、ばらつきなく正確に安定して測定できたことに依拠する。
実際に測定されるシグナルには、シグナル強度にノイズ強度が加算されている。したがって、相関係数が1に近づくためには、
(1)シグナル強度がノイズ強度に比し十分大きいこと；および
(2)同一種スポット間でのシグナル強度、あるいはノイズ強度のばらつきが十分小さいこと；
が挙げられる。
【００８１】
これらはSNPs検出用DNAチップの性能の高さを保証する条件そのものである。
本実施例のSNPs検出用DNAチップの相関係数が0.94と1に近い理由は、主に(1)に起因すると考えられる。なぜなら、核酸プローブが3次元的に配置するため、シグナルは3次元的に増強されるが、ノイズの方は、それの多くを占めるスライドガラス表面の汚れから来るノイズ成分が2次元的なままだからである。
【００８２】
このように、相関係数はSNPs検出用DNAチップの性能指標として、統一的、かつ、普遍的な意義を有する。検出原理が異なるSNPs検出用DNAチップ間においても、例えば、光学的検出型と電気化学的検出型においても、共通の指標として採用できる。
【００８３】
たとえ識別比が十分高くても、この相関係数が、例えば、0.6以下と低ければ、そのSNPs検出用DNAチップは検出信頼性の観点から問題ありと判断すべきである。
また、（シグナル強度、水素結合対の総数）として得られるプロットの関係上、相関係数が求められない場合は、新たな組合せのプロットができるように工夫して、相関係数が求められるようにすることが好ましい。
【００８４】
参考として、図１に相当する相関係数を理論的に求めた結果を以下に示す。
パーフェクトマッチングの方がミスマッチングより、ハイブリダイゼーションに寄与する水素結合対の総数の多い分だけハイブリダイゼーションが強く、インキュベーション後の洗浄において、核酸プローブとハイブリダイゼーションした核酸検体の除去の速さに関して、パーフェクトマッチングの方がミスマッチングより遅いため、両者の間に識別が生じるという立場から計算を進める。計算の都合上、インキュベーション直後でのハイブリダイゼーションの度合いには差がなく、洗浄の段階でのみパーフェクトマッチングとミスマッチングの間に差が出ることにより識別比が1を超えるとする。
【００８５】
核酸プローブとハイブリダイゼーションした20merの核酸検体の重心は、運動エネルギーEを伴って、振動数νで核酸プローブに近づいたり遠ざかったりしているとみなせる。この運動エネルギーEは、Maxwellの速度分布に基づき、図4に示すように分布していると考えられる。ここでfは、20merの核酸検体の並進運動に関わる自由度であり、具体的には、f=3×20-19=41である。
【００８６】
この運動エネルギーEがハイブリダイゼーションを解離させるのに必要なエネルギーDを上回る時に、核酸検体は核酸プローブから除去されることになる。
核酸プローブと核酸検体の間では互いの負に帯電したリン酸基同士の反発作用があり、この作用がDを目減りさせる。この帯電は洗浄液中の電解質で中和されるので、洗浄液の塩濃度が低いほど、Dの目減りは大きくなる。また、洗浄時における攪拌等の物理作用は、洗浄液分子の核酸検体への衝突が核酸検体の核酸プローブからの解離を導くので、Dの目減りをもたらす。
【００８７】
よってDは、核酸プローブと核酸検体の間での水素結合エネルギーHと、0から1の間をとる目減り因子αを用いて、次式(1)：
【００８８】
【数２】
2007093403.tif 000007
【００８９】
と表せる。
パーフェクトマッチングにおけるHであるHPMとミスマッチングにおけるHであるHMMでは、HMMの方が水素結合対のミスマッチングの分だけ小さくなる。よって、図４における、除去される核酸検体の割合を示す面積比率Rにおいて、パーフェクトマッチングにおけるRであるRPMとミスマッチングにおけるRであるRMMでは、RPMの方がRMMより小さくなる。したがって、パーフェクトマッチングではミスマッチングより、ハイブリダイゼーションした核酸検体が除去され難いため、核酸プローブとハイブリダイゼーションした状態で残存する核酸検体数Nが多くなり、シグナル（蛍光強度）が大きくなる。
【００９０】
このNは、洗浄開始時のNをN0とすれば、洗浄時間tに対し、次式(2)：
【００９１】
【数３】
2007093403.tif 000008
【００９２】
と表せる。ここでは、一度除去された核酸検体は、大過剰な洗浄液中に溶け込むので、核酸プローブと再結合することはないとしている。
よってスポット蛍光強度Bは、次式(3)：
【００９３】
【数４】
2007093403.tif 000009
【００９４】
と表せる。B2はハイブリダイゼーションする前に元々存在するスポット蛍光強度である。これからパーフェクトマッチングとミスマッチングのスポット蛍光強度の比、すなわち、識別比yは、次式(4)：
【００９５】
【数５】
2007093403.tif 000010
【００９６】
と、洗浄時間tの関数として表せる。
パーフェクトマッチングとミスマッチングでのハイブリダイゼーションに関するバネ定数の平方根の差は非常に小さい。よって、パーフェクトマッチングとミスマッチングでのνの差は非常に小さいので、計算の都合上、νは両者に共通であるとみなしている。
【００９７】
また、上述のように、パーフェクトマッチングとミスマッチングでのN0が変わらないと仮定したので、B1は両者に共通であるとしている。
ここで、次式(5)：
【００９８】
【数６】
2007093403.tif 000011
【００９９】
と近似的に変形できる。ここで、αHMM >> fkT/3 を満足していることが前提であるが、実際にこの関係は、ほぼ満足している。
いままで、便宜上、パーフェクトマッチングとミスマッチングという関係で説明してきたが、これは、ハイブリダイゼーションに寄与する水素結合対の総数がn本のものと(n-x)本（x << n）のものという関係に置き直すことができる。
【０１００】
よってΔHは、水素結合対1本当りの結合エネルギーをhとすると、この不足する水素結合対の本数xにより、次式(6)：
【０１０１】
【数７】
2007093403.tif 000012
【０１０２】
と表せる。よって、式(6)を式(5)に代入することにより、次式(7)：
【０１０３】
【数８】
2007093403.tif 000013
【０１０４】
と変形でき、h=1.6kcal/mol、f=41、T=293K（室温洗浄）を代入すれば、次式(8)：
【０１０５】
【数９】
2007093403.tif 000014
【０１０６】
となる。
式(8)を式(4)に代入し、この時のkの実験値0.2も合わせて式(4)に代入すると、次式(9)：
【０１０７】
【数１０】
2007093403.tif 000015
【０１０８】
となる。
図１より水素結合対の総数が47本におけるスポット蛍光強度は、2プロットを平均して86.7であり、この値を基準にしてスポット蛍光強度Bを、式(9)の計算式を用いて表すことにすれば、次式(11)：
【０１０９】
【数１１】
2007093403.tif 000016
【０１１０】
となる。
スポット蛍光強度Bは、τ=RPMνt、すなわち、洗浄時間tに依存するが、ここでは、x=3の時に式(11)の右辺が最大になるτ=τ*に対してスポット蛍光強度Bを定義することにする。このτ*は、水素結合対の総数が50本と47本での識別比が最大になる値であるとも言える。式(11)の右辺は、τの0からの増加につれて、86.7から増加して最大値をとった後に減少するτの関数である。したがって、例えばτを0.1刻みに増加させて、どこで最大になるかを数値計算により調べることでτ*を求めることができる。
【０１１１】
図1に相当する、α=1の時のグラフを図５に示す。図1に比べると、スポット蛍光強度が大きく、近似直線の傾きが約2倍になっている。そこで、α=0.5とすると、図6のように、図1の実験データとほぼ一致する。
【０１１２】
図6より、相関係数は、理論的には0.98と1に十分近づくことがわかった。よって、水素結合対の総数が50本±3本の範囲内において、すなわち、100%±6%の範囲内において、水素結合対の総数とスポット蛍光強度の間には線形関係がほぼ成立することが確認された。
【０１１３】
実施例2
本実施例では、核酸プローブ種類は実施例1と同じであるが、核酸プローブ配置が2次元的なSNPs検出用DNAチップにおける相関係数を示す。
【０１１４】
本実施例のSNPs検出用DNAチップは、スライドガラスの表面上に核酸プローブを直接固定する方式で作製された。通常のスポッティング法を用いて、活性エステル処理したスライドガラス上に、末端をアミノ化修飾した上記の合成オリゴヌクレオチドプローブを共有結合により固定した。スポット径、スポット配置は、実施例1と共通である。
【０１１５】
実施例1と同様のハイブリダイゼーションを行い、各スポットの蛍光強度の数値化を行った。その結果を表３に示す。
【０１１６】
【表３】
2007093403.tif 000017
【０１１７】
6つの識別比はいずれも1を超えてはいるが、実施例1に比べると、全体的にかなり小さい。
これは、核酸プローブ配置が実施例1と異なり2次元的であるため、シグナル成分が小さくなったからである。
【０１１８】
次に、実施例1と同様に相関係数を求めた結果を図2に示す。相関係数は0.58と1から大きく隔たっている。この結果から、本実施例のSNPs検出用DNAチップの検出信頼性は低いことが判明した。
【０１１９】
ちなみに、識別比が小さいというだけでは、検出信頼性が低いと断言するのは危険である。シグナル成分は小さくても、ばらつきなく正確に測定できており、かつ、ノイズ成分のばらつきが小さい場合があるからである。この場合は、測定されるシグナルから一定量のノイズ成分相当量を差し引いた値を真のシグナルとみなすことができて、真の識別比は十分大きくなるからである。
【０１２０】
一方、相関係数が小さいということは、検出信頼性が低いことと完全に同値である。この点からも、相関係数がSNPs検出用DNAチップの実力を示す重要な指標であることが理解できる。
【０１２１】
実施例3
本実施例では、実施例1のSNPs検出用DNAチップに関して、in-situ合成されたオリゴヌクレオチドプローブにおける縮合反応の合成収率にばらつきが生じたため、正常型プローブ、変異型1プローブ、変異型2プローブの合成収率にずれがある場合の、補正された相関係数の出し方を提示する。
【０１２２】
本実施例のSNPs検出用DNAチップでは、正常型プローブと変異型１プローブの合成収率は95%と一致しているが、変異型2プローブの合成収率は92%とかけ離れて低くなっている。
【０１２３】
合成収率は、原料であるホスホアミダイトのトリチル基の、脱トリチル反応時における脱離量を吸光度測定により計測する、いわゆるトリチルモニターによって正確に把握することが可能である。したがって、このように核酸プローブ種間で合成収率に差異が生じても、その差異が定量的に把握できているので、この影響を排除した、補正された相関係数を求めることが可能になる。
【０１２４】
本実施例における測定されたスポット蛍光強度を表4にまとめた。
【０１２５】
【表４】
2007093403.tif 000018
【０１２６】
変異型2プローブのみ合成収率が低く20mer揃った完全長の核酸プローブ密度が低いため、対応するスポット蛍光強度が低くなっている。そのため、変異型2検体に関しては、パーフェクトマッチングの方がミスマッチングよりスポット蛍光強度が低いという、識別に関する逆転が生じてしまっている。また、正常型検体、変異型1検体に関しては、変異型2プローブに対する識別比が異常に高くなってしまっている。
【０１２７】
この表4の結果をそのまま使って相関係数を求めると、当然のことながら、0.57と低い値になってしまう。
そこで、各核酸プローブ間の合成収率の違いを考慮して、補正された相関係数を算出する。
【０１２８】
まず、各核酸プローブがすべて合成収率100%であるとした時の、補正されたスポット蛍光強度に換算する。具体的には、既述の算出式：（補正シグナル強度）=（測定シグナル強度）×(100/x)n-1を適応すればよい。すなわち、正常型プローブと変異型1プローブに対しては、(100/95)20-1を、変異型2プローブに対しては、(100/92)20-1を、表4のそれぞれの測定されたスポット蛍光強度の値に掛ければよい。
【０１２９】
このようにして、表5のように、補正されたスポット蛍光強度が得られる。
【０１３０】
【表５】
2007093403.tif 000019
【０１３１】
表2と表5から、実施例1と同様の方法により、補正された相関係数が0.94と求められる（図3）。
このように、各核酸プローブ間での合成収率が異なる場合でも、この違いを上述の方法で補正することにより、この違いに左右されない相関係数を得ることができる。つまり、本実施例のSNPs検出用DNAチップにおいて、各核酸プローブ間の合成収率が一致した時に期待される、そのチップの本来の実力に相当する相関係数を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】図１は、実施例１のSNPs検出用DNAチップの相関係数を示すグラフである。
【図２】図２は、実施例２のSNPs検出用DNAチップの相関係数を示すグラフである。
【図３】図３は、実施例３のSNPs検出用DNAチップの相関係数を示すグラフである。
【図４】図４は、核酸検体の並進運動エネルギーEの分布図である。
【図５】図５は、図１に相当する相関係数を理論的に求めたグラフ(α＝１)である。
【図６】図６は、図１に相当する相関係数を理論的に求めたグラフ(α＝0.5)である。
【図１】
2007093403.tif 000020
【図２】
2007093403.tif 000021
【図３】
2007093403.tif 000022
【図４】
2007093403.tif 000023
【図５】
2007093403.tif 000024
【図６】
2007093403.tif 000025
【配列表】
2007093403000001.app