(57)【要約】【課題】ＯＸ２と命名されたリガンドに対する新規なレセプターホモログを提供すること。【解決手段】哺乳動物（例えば、霊長類）のＯＸ２のレセプター、精製されたタンパク質およびそのフラグメントをコードする核酸、抗体（ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方）。診断的有用性および治療的有用性の両方のために組成物を使用する方法。本発明はまた、細胞または組織培養細胞の生理機能または発生を調節する方法を提供し、その方法は、細胞を哺乳動物ＯＸ２ＲＨのアゴニストまたはアンタゴニストと接触させる工程を包含する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載される、細胞または組織培養細胞の生理機能または発生を調節する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、免疫系機能を含む、哺乳動物生理学に影響を及ぼすための組成物および方法に関する。詳細には、それは、発生および／または免疫系を調節し得る試薬または方法を提供する。これらの物質の診断的使用および治療的使用もまた記載される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ＯＸ２抗原（ＯＸ２）は、胸腺細胞、Ｂリンパ球、活性化Ｔリンパ球、ニューロン、内皮細胞、および濾胞性樹状細胞を含む種々の細胞に関して同定された細胞表面タンパク質である。非特許文献１。配列分析は、それが２つの細胞外免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメインおよび短い細胞質ドメインを含む膜貫通タンパク質であるということを示す。非特許文献２。このドメイン構成は、多くの異なる白血球表面タンパク質において共通であり、そして見出される。非特許文献３。これらの型のタンパク質は、しばしば他の細胞の表面上の他のタンパク質と相互作用し、また、Ｉｇ様ドメインを有する。
【０００３】
ＯＸ２抗原の分布は、ＯＸ２は、結合パートナー（例えば、ＯＸ２レセプター（ＯＸ２Ｒ））を介してシグナルを、マクロファージ（そのレセプターを発現する（非特許文献４）を含む白血球系統内の細胞およびおそらく単球−マクロファージ系統の他の細胞にリレーするという仮説と一致する。また、ＯＸ２は、マクロファージの種々の機能の調節に関係していた。例えば、このシナリオにおいて、ニューロン上のＯＸ２の発現は、ＯＸ２Ｒを発現し得る小グリア細胞と呼ばれる、脳の常在性マクロファージへの情報伝達の直接の手段を確立し得る。なぜなら、それらは、単球−マクロファージ系統から発生するからである。非特許文献５。
【０００４】
一般的に、マクロファージの活性化の欠損または激化は、広い範囲の免疫学的疾患および他の疾患の病原性に寄与する。例えば、非特許文献６；非特許文献７；ならびに非特許文献８を参照のこと。
【０００５】
また、ＯＸ２相互作用タンパク質の同定（例えば、ＯＸ２抗原に対するＯＸ２Ｒ）は、難しい。なぜなら、その相互作用の親和性はしばしば非常に低いためである。このことは、細胞表面タンパク質（例えば、ＯＸ２）の組換え形態と、それらの結合パートナー（ｐａｒｔｎｅｒ）（相互作用タンパク質、例えば、ＯＸ２Ｒ）との結合は、通常の方法による検出が可能であるほど十分に安定ではないということを意味する。従って、ＣＤ４８とＣＤ２との間の相互作用（両方のパートナーが、それらの細胞外領域に２つのＩｇ様ドメインを含む）は、わずか１秒間の半減期を有する。非特許文献９；および非特許文献１０を参照のこと。
【０００６】
細胞表面タンパク質の組換え形態（例えば、ＯＸ２）は、多数の方法によってマルチバレント（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）が作製され得、そして新規なタンパク質を検出するために使用され得る。ＯＸ２は、ＣＤ４由来の２つのＩｇ様ドメインのタグを含むように操作される。組換え可溶性タンパク質は、真核生物細胞における従来の発現方法によって発現される。初期の研究において、蛍光ビーズ上のマルチバレント組換えＯＸ２タンパク質とマウスマクロファージとの間の相互作用を観察した。非特許文献４。
【０００７】
上記に関わらず、ブロッキング抗体ＯＸ８９の使用によるマウスマクロファージ上のＯＸ２Ｒを同定する試みは、成功しなかった。非特許文献４。
【０００８】
前述から、ＯＸ２様分子に対する新規なレセプターの発見、同定、および理解は非常に有利であることは明白である。本発明は、ＯＸ２リガンドおよび関連化合物に対する新たなレセプターホモログならびにそれらの使用のための方法を提供する。
【非特許文献１】Ｂａｒｃｌａｙ（１９８１）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４４：７２７〜７３６
【非特許文献２】Ｃｌａｒｋら、（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．４：１１３−１１８
【非特許文献３】Ｂａｒｃｌａｙら、（１９９７）Ｌｅｕｃｏｃｙｔｏ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ（第２版）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ
【非特許文献４】Ｐｒｅｓｔｏｎら、（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：１９１１−１９１８
【非特許文献５】ＰｅｒｒｙおよびＧｏｒｄｏｎ（１９８８）Ｔｒｅｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１：２７３−２７７
【非特許文献６】ＭｃＧｅｅら、（１９９２編）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ
【非特許文献７】ＬｅｗｉｓおよびＭｃＧｅｅ（１９９２編）Ｔｈｅ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ
【非特許文献８】ＢｏｃｋおよびＧｏｏｄｅ（１９９７編）Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｅｆｅｎｃｅ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ
【非特許文献９】Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｒｗｅら、（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２１：３４０Ｓ
【非特許文献１０】Ｖａｎ  ｄｅｒ  ｍｅｒｗｅおよびＢａｒｃｌｙ（１９９４）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９：３４５−３５８
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、例えば、げっし類および霊長類の実施形態において、ＯＸ２と命名されたリガンドに対する新規なレセプターホモログに関する。これらは、種々のげっし類種および霊長類種に由来する実施形態にあっては、一般的に、ＯＸ２レセプターホモログ（ＯＸ２ＲＨ）と命名されている。それぞれの種のＯＸ２に実際に結合するように、２つが確立されてきた。詳細には、それは、ＯＸ２ＲＨ１、ＯＸ２ＲＨ２、ＯＸ２ＲＨ３およびＯＸ２ＲＨ４と命名されるホモログの説明を提供する。それは、ポリペプチドそれ自身をコードする核酸ならびにそれらの産生および使用のための方法を含む。本発明の核酸は、本明細書に同封されるクローン化された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列に対するそれらの相同性によって、部分的に特徴付けられる。
【００１０】
本発明は、ＯＸ２とＯＸ２Ｒとの間の相互作用をブロックするラットマクロファージ上のＯＸ２Ｒに対する新たなモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（ＯＸ１０２と命名される）を産生した。それらはまた、単離されて、かつ特徴付けられたラットＯＸ２Ｒ遺伝子およびポリペプチドを有する。ラットＯＸ２Ｒ核酸分子およびポリペプチドについての配列（推定アミノ酸配列）が、本明細書中に提供される。類似タンパク質との類似性によって、本発明者らは、ヒトＯＸ２Ｒのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、対応するラットＯＸ２Ｒ配列と少なくとも５０％相同性であるということを教示する。ラットＯＸ２Ｒ  ｃＤＮＡおよび推定ＯＸ２Ｒポリペプチド配列の有用性は、公知のヒト配列のスクリーニングまたはハイブリダイゼーションもしくはＰＣＲ技術によるヒト核酸の単離のいずれかを介して、等価なヒトＯＸ２Ｒ配列の同定を可能にすることである。
【００１１】
ＯＸ２Ｒポリペプチドにおける大きな細胞質配列の存在は、ＯＸ２Ｒは、シグナル伝達においてか、または細胞質成分との相互作用を介してかのいずれかで、マクロファージ機能において役割を果たすということを示す。従って、本発明は、ＯＸ２Ｒポリペプチドまたは核酸配列（例えば、ＯＸ２Ｒ結合部位と反応するように設計される低分子実体、ＯＸ２Ｒに対して惹起されるｍＡｂもしくはアンチセンス配列）を模倣するか、または認識するＯＸ２Ｒに基づいた試薬を提供し、いずれかの試薬が、ＯＸ２および／またはＯＸ２Ｒ細胞表面タンパク質を保有する細胞の機能（例えば、マクロファージ、活性化リンパ球、ニューロン、内皮細胞、樹状細胞、胸腺細胞およびＢリンパ球のような細胞の機能）を、細胞活性を増強または阻害することのいずれかによって、改変するための治療的に有用な化合物を構成する。従って、ＯＸ２Ｒポリペプチドまたは核酸配列を模倣するか、認識するＯＸ２Ｒに基づく試薬は、広範な範囲のマクロファージの機能（細菌感染、自己免疫疾患などに対する応答を含む）を制御するための潜在的用途を有する。
【００１２】
ＯＸ２Ｒの細胞外ドメインは、ＯＸ２との相互作用に関する原因であると考えられているので、本発明者らは、ＯＸ２とＯＸ２Ｒとの間の結合に影響を及ぼす能力（陽性または陰性に）について、候補化合物をスクリーニングする手段を提供する。従って、本発明により提供されるようなＯＸ２Ｒを使用して、例えば、ＯＸ２とＯＸ２Ｒとの間の相互作用を阻害する化合物を検出し得、それゆえこれはおそらく、マクロファージと免疫系の他の細胞（例えば、リンパ球または濾胞性樹状細胞）との間の相互作用に影響を及ぼす。
【００１３】
ラットＯＸ２Ｒについての核酸およびアミノ酸配列は、表１に示される。本発明の種々の局面は、以下に述べられる。他の局面は、詳細な説明から明らかである。
【００１４】
従って、第１の局面において、本発明は、表１に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む物質を提供する。
【００１５】
さらなる局面において、本発明は、表１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含む物質を提供する。
【００１６】
さらなる局面において、本発明は、上記ポリペプチドの変異体、改変体、誘導体または対立遺伝子であるポリペプチドおよび全長ＯＸ２Ｒの特有の性質（例えば、ＯＸ２または全長ＯＸ２Ｒに対する抗体と結合する能力）を有するポリペプチドを提供する。
【００１７】
さらなる局面において、本発明は、上記ポリペプチドのフラグメント（例えば、表１に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメント）である物質を提供し、このフラグメントは、全長ＯＸ２Ｒタンパク質の特有の性質を示す。例えば、このフラグメントは、ＯＸ２タンパク質と結合し得るか、または全長ＯＸ２Ｒタンパク質に対する抗体と結合し得る。１つの実施形態において、このフラグメントは、ＯＸ２Ｒの細胞内ドメインの一部もしくは全てを含むか、またはそのドメインの活性部分を含む。別の実施形態において、このフラグメントは、ＯＸ２Ｒの細胞外ドメインの一部もしくは全てを含むか、またはそのドメインの活性部分を含む。その細胞外ドメインは、ＯＸ２と相互作用するための原因であると考えられるので、細胞外ドメインの一部もしくは全てを含む、本発明に従うそのようなフラグメントは、ＯＸ２とＯＸ２Ｒとの間の結合を妨害する能力について候補化合物をスクリーニングするために使用され得る。
【００１８】
従って、本発明は、マクロファージと他の細胞（胸腺細胞、Ｂリンパ球、活性化Ｔリンパ球、ニューロン、内皮細胞および濾胞性樹状細胞を含む）との間のＯＸ２／ＯＸ２Ｒ相互作用を妨害する能力をおそらく有する候補化合物をスクリーニングするための方法および材料を提供する。
【００１９】
ポリペプチドおよびフラグメントは、上記のように、組換え体および／または単離されたポリペプチドであり得る。
【００２０】
さらなる局面において、本発明は、表１のヌクレオチド配列を有する核酸を含む物質を提供する。本発明はまた、上記ポリペプチドまたはフラグメントをコードする核酸分子を含む物質を提供する。従って、表１は、ＯＸ２Ｒポリペプチドをコードする例示的な核酸分子のｃＤＮＡ配列を示す。この核酸分子は、表１の核酸配列と、少なくとも５０％の配列相同性を有し得る。
【００２１】
本発明はまた、表１のコードヌクレオチド配列の一部を有する核酸分子を含む物質を提供する。その物質が表１のコードヌクレオチド配列の一部を含む場合、それはＯＸ２Ｒ遺伝子を特徴付ける部分である。従って、その部分は、上記のようなポリペプチドフラグメントをコードし得、これはＯＸ２または全長ＯＸ２Ｒに対する抗体と結合する。あるいは、その部分は、表１のヌクレオチド配列の少なくとも４〜７個の連続コドン、しばしば少なくとも７〜９個の連続コドン、代表的には少なくとも９〜１３個の連続コドン、および最も好ましくは、少なくとも２０〜３０個の連続コドンを含み得る。あるいは、その部分は、表１のポリペプチド配列の少なくとも４〜７個の連続アミノ酸、しばしば少なくとも７〜９個の連続アミノ酸、代表的には少なくともおよそ９〜１３個の連続アミノ酸、および最も好ましくは、少なくともおよそ２０〜３０個の連続アミノ酸をコードし得る。
【００２２】
上記の核酸分子は、組換え体であり得、そして／または単離され得る。
【００２３】
さらなる局面において、本発明は、本明細書中に提供されるようなＯＸ２Ｒ核酸を含むベクター（例えば、ＯＸ２Ｒ核酸配列がその発現を方向付けるために制御配列と作動可能に連結される、発現ベクター）を提供する。また、そのようなベクターで形質転換された宿主細胞も提供される。本発明はさらに、ＯＸ２Ｒポリペプチドを産生する方法を含み、その方法は、そのような宿主細胞を培養する工程および産生されたＯＸ２Ｒポリペプチドを単離する工程を包含する。
【００２４】
さらなる局面において、本発明は、宿主細胞においてＯＸ２Ｒを発現させる方法を提供し、その方法は、上記の核酸分子を宿主細胞内へ挿入する工程を含み、そして宿主細胞においてその核酸分子を発現させるための条件を提供する。その方法は、発現ベクターを利用し得る。
【００２５】
さらなる局面において、本発明は、上記のＯＸ２Ｒポリペプチドまたはフラグメントの可溶性形態を含む組成物を提供し、その組成物はまた、必要に応じてアジュバント、薬学的キャリアまたは賦形剤を含む。その組成物を使用して、例えば、ＯＸ２Ｒポリペプチドに対して応答性の抗体を産生し得る。
【００２６】
さらなる局面において、本発明は、上記ＯＸ２Ｒポリペプチドおよび核酸分子を、おそらく治療薬として有用である候補化合物をスクリーニングする際の使用のために提供する。本発明は、おそらく細菌感染、自己免疫疾患などの処置のために有用である物質についてスクリーニングする際の上記ＯＸ２Ｒポリペプチドまたはフラグメントの使用を提供する。
【００２７】
本発明はまた、ＯＸ２以外のＯＸ２Ｒに対するリガンドの同定のためのＯＸ２Ｒポリペプチド、ポリペプチドフラグメントおよび核酸の使用を提供する。本発明はまた、ＯＸ２の模倣物の設計のためのＯＸ２Ｒポリペプチド、ポリペプチドフラグメントおよび核酸の使用を提供する。
【００２８】
さらなる局面において、本発明は、上記のＯＸ２Ｒポリペプチド、ポリペプチドフラグメントおよび核酸と特異的に結合し得る抗体、ならびにそのような抗体を含む組成物を提供する。これらの抗体を、アッセイにおいて使用してＯＸ２Ｒの存在を検出し、そして定量し得、ならびにＯＸ２Ｒを精製する方法において使用し得る。その抗体はポリクローナル抗体であり得る。好ましくは、その抗体は、ＩｇＧ抗体であり、より好ましくはモノクローナルＩｇＧ抗体である。
【００２９】
さらなる局面において、本発明は、結合分子（例えば、ＯＸ２とＯＸ２Ｒとの間の相互作用をブロックし得る１つ以上の抗体ドメインを有する物質）を産生するために、本明細書中で提供されるようなＯＸ２Ｒポリペプチド、ポリペプチドフラグメントおよび核酸分子の使用を提供する。これらは、細菌感染、自己免疫疾患などの処置のための医薬の調製においておそらく有用である組成物内に含まれ得る。その結合分子が抗体である場合、それらはＩｇＧ抗体であり得、好ましくはモノクローナルＩｇＧ抗体であり得る。
【００３０】
さらなる局面において、本発明は、マクロファージ細胞の集団において、ＯＸ２Ｒ発現を制限するために、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドの内部移行および安定化を促進させ得るホスホロチオレート化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｉｏｌａｔｅｄ）オリゴヌクレオチドまたはコレステロール結合オリゴヌクレオチド）の設計において、上記に定義されるようなＯＸ２Ｒ核酸の使用を提供する。
【００３１】
さらなる局面において、本発明は、核酸試験サンプルを増幅する方法を提供し、その方法は、本明細書中に提供される配列情報から入手可能なプライマーオリゴヌクレオチドを用いる核酸ポリメラーゼ反応をプライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）する工程を包含する。その核酸試験サンプルは、ヒトＯＸ２Ｒをコードする核酸がそのような方法を使用して増幅されるように、ヒト由来であり得る。
【００３２】
さらなる局面において、本発明は、ラット以外の種（例えば、ヒトＯＸ２Ｒ）に由来するＯＸ２Ｒの一部または全てをコードする核酸分子を入手する方法を提供し、その方法は、本明細書中に提供される配列情報から入手可能な核酸プローブを用いて目的の種由来の核酸試験サンプルを詳しく調査する工程を包含する。
【００３３】
さらなる局面において、本発明は、ラット以外の種（例えば、ヒトＯＸ２Ｒ）に由来するＯＸ２Ｒポリペプチド配列を入手するための方法を提供し、その方法は、本明細書中に提供されるようなＯＸ２Ｒアミノ酸配列（表１）と少なくとも５０％相同であるポリペプチド配列についてデータベースを検索する工程を包含する。同様に、ラット以外の種（例えば、ヒトＯＸ２Ｒ）に由来するＯＸ２Ｒ核酸配列は、本明細書中に提供されるようなＯＸ２Ｒヌクレオチド配列と少なくとも５０％相同であるヌクレオチド配列についてデータベースを検索することによって入手され得る。
【００３４】
本発明はまた、例えば、一本鎖構造多型（ＳＳＣＰ）のような技術を使用して、ＯＸ２Ｒ遺伝子内の変異についての検索において、本明細書中に提供される核酸配列情報の使用を提供する。
【００３５】
本発明は、以下から選択された組成物を提供する：配列番号２のセグメントと同一である少なくとも４つのアミノ酸からなる少なくとも３つの異なる非重複セグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチドまたは組換えポリペプチド；配列番号２のセグメントと同一である少なくとも５つのアミノ酸からなる少なくとも２つの異なる非重複セグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチドまたは組換えポリペプチド；成熟した配列番号２を含む天然配列げっし類ＯＸ２ＲＨ１ポリペプチド；ラットＯＸ２ＲＨ１配列を含む融合ポリペプチド；配列番号４のセグメントと同一である少なくとも４つのアミノ酸からなる少なくとも３つの異なる非重複セグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチドまたは組換えポリペプチド；配列番号４のセグメントと同一である少なくとも５つのアミノ酸からなる少なくとも２つの異なる非重複セグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチドまたは組換えポリペプチド；成熟した配列番号４を含む天然配列げっし類ＯＸ２ＲＨ１ポリペプチド；ヒトＯＸ２ＲＨ１配列を含む融合ポリペプチド；配列番号６のセグメントと同一である少なくとも４つのアミノ酸からなる少なくとも３つの異なる非重複セグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチドまたは組換えポリペプチド；配列番号６のセグメントと同一である少なくとも５つのアミノ酸からなる少なくとも２つの異なる非重複セグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチドまたは組換えポリペプチド；成熟した配列番号６を含む天然配列げっし類ＯＸ２ＲＨ１ポリペプチド；マウスＯＸ２ＲＨ１配列を含む融合ポリペプチド；配列番号８のセグメントと同一である少なくとも４つのアミノ酸からなる少なくとも３つの異なる非重複セグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチドまたは組換えポリペプチド；配列番号８のセグメントと同一である少なくとも５つのアミノ酸からなる少なくとも２つの異なる非重複セグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチドまたは組換えポリペプチド；成熟した配列番号８を含む天然配列げっし類ＯＸ２ＲＨ１ポリペプチド；ヒトＯＸ２ＲＨ２配列を含む融合ポリペプチド；配列番号１０のセグメントと同一である少なくとも４つのアミノ酸からなる少なくとも３つの異なる非重複セグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチドまたは組換えポリペプチド；配列番号１０のセグメントと同一である少なくとも５つのアミノ酸からなる少なくとも２つの異なる非重複セグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチドまたは組換えポリペプチド；成熟した配列番号１０を含む天然配列げっし類ＯＸ２ＲＨ２ポリペプチド；マウスＯＸ２ＲＨ２配列を含む融合ポリペプチド；配列番号１２のセグメントと同一である少なくとも４つのアミノ酸からなる少なくとも３つの異なる非重複セグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチドまたは組換えポリペプチド；配列番号１２のセグメントと同一である少なくとも５つのアミノ酸からなる少なくとも２つの異なる非重複セグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチドまたは組換えポリペプチド；成熟した配列番号１２を含む天然配列げっし類ＯＸ２ＲＨ３；マウスＯＸ２ＲＨ３配列を含む融合ポリペプチド；配列番号２０のセグメントと同一である少なくとも４つのアミノ酸からなる少なくとも３つの異なる非重複セグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチドまたは組換えポリペプチド；配列番号２０のセグメントと同一である少なくとも５つのアミノ酸からなる少なくとも２つの異なる非重複セグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチドまたは組換えポリペプチド；成熟した配列番号２０を含む天然配列霊長類ＯＸ２ＲＨ１．２ポリペプチド；霊長類ＯＸ２ＲＨ１．２配列を含む融合ポリペプチド；配列番号２３のセグメントと同一である少なくとも４つのアミノ酸からなる少なくとも３つの異なる非重複セグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチドまたは組換えポリペプチド；配列番号２３のセグメントと同一である少なくとも５つのアミノ酸からなる少なくとも２つの異なる非重複セグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチドまたは組換えポリペプチド；成熟した配列番号２３を含む天然配列げっし類ＯＸ２ＲＨ４ポリペプチド；またはマウスＯＸ２ＲＨ４配列を含む融合ポリペプチド。いくつかの好ましい実施形態は、異なる非重複セグメントの同一性が以下：少なくとも８つのアミノ酸のうちの１つを含むか；少なくとも４つのアミノ酸のうちの１つおよび少なくとも５つのアミノ酸のうちからもう１つのアミノ酸を含むか；少なくとも４つ、５つ、および６つのアミノ酸からなる少なくとも３つのセグメントを含むか、または少なくとも１２個のアミノ酸のうちの１つを含む、実施形態を含む。他の好ましい実施形態は、以下：ａ）ＯＸ２ＲＨ１ポリペプチドが、表１または２の成熟配列を含み；ＯＸ２ＲＨポリペプチドの非グリコシル化形態であり；霊長類（例えば、ヒト）由来であり；げっし類（例えば、ラットもしくはマウス）由来であり；配列番号２、４、６または２０の少なくとも１７個のアミノ酸を含み；配列番号２，４、６、または２０の少なくとも７つのアミノ酸からなる少なくとも４つの非重複セグメントを示し；ＯＸ２ＲＨ１の天然対立遺伝子改変体であるか；少なくともおよそ３０個のアミノ酸の長さを有するか；霊長類もしくはげっし類ＯＸ２ＲＨ１に特異的な少なくとも２つの非重複エピトープを示すか；グリコシル化され；天然のグリコシル化を有する少なくとも３０ｋＤの分子量を有するか；合成ポリペプチドであるか；固体基板に付着されているか；別の化学部分と結合体化されているか；天然配列から５倍以下で置換されているか；あるいは天然配列に由来する欠失改変体または挿入改変体であり；ｂ）ＯＸ２ＲＨ２ポリペプチドが以下：表２の成熟配列を含むか；ＯＸ２ＲＨ２ポリペプチドの非グリコシル化形態であるか；霊長類（例えば、ヒト）由来であるか；げっし類（例えば、マウス）由来であるか；配列番号８または１０の少なくとも１７個のアミノ酸を含むか；配列番号８または１０の少なくとも７つのアミノ酸からなる少なくとも４つの非重複セグメントを示すか；ＯＸ２ＲＨ２の天然対立遺伝子改変体であるか；少なくともおよそ３０個のアミノ酸の長さを有するか；霊長類もしくはげっし類ＯＸ２ＲＨ２に特異的な少なくとも２つの非重複エピトープを示すか；グリコシル化されているか；天然のグリコシル化を有する少なくとも３０ｋＤの分子量を有するか；合成ポリペプチドであるか；固体基板に付着されているか；別の化学部分と結合体化されているか；天然配列から５倍以下で置換されているか；あるいは天然配列に由来する欠失改変体または挿入改変体であり；ｃ）ＯＸ２ＲＨ３ポリペプチドが以下：表３の成熟配列を含むか；ＯＸ２ＲＨ３の非グリコシル化形態であるか；げっし類（例えば、マウス）由来であるか；配列番号１２の少なくとも１７個のアミノ酸を含むか；配列番号１２の少なくとも７つのアミノ酸からなる少なくとも４つの非重複セグメントを示すか；ＯＸ２ＲＨ３の天然対立遺伝子改変体であるか；少なくともおよそ３０個のアミノ酸の長さを有するか；げっし類ＯＸ２ＲＨ３に特異的な少なくとも２つの非重複エピトープを示すか；グリコシル化されているか；天然のグリコシル化を有する少なくとも３０ｋＤの分子量を有するか；合成ポリペプチドであるか；固体基板に付着されているか；別の化学部分と結合体化されているか；天然配列から５倍以下で置換されているか；または天然配列に由来する欠失改変体または挿入改変体であるか；あるいはｄ）ＯＸ２ＲＨ４ポリペプチドが以下：表２の成熟配列を含むか；ＯＸ２ＲＨ４の非グリコシル化形態であるか；げっし類（例えば、マウス）由来であるか；配列番号２３の少なくとも１７個のアミノ酸を含むか；配列番号２３の少なくとも７つのアミノ酸からなる少なくとも４つの非重複セグメントを示すか；ＯＸ２ＲＨ４の天然対立遺伝子改変体であるか；少なくともおよそ３０個のアミノ酸の長さを有すか；げっし類ＯＸ２ＲＨ４に特異的な少なくとも２つの非重複エピトープを示すか；グリコシル化されているか；天然のグリコシル化を有する少なくとも３０ｋＤの分子量を有するか；合成ポリペプチドであるか；固体基板に付着されているか；別の化学部分と結合体化されているか；天然配列から５倍以下で置換されているか；または天然配列に由来する欠失改変体または挿入改変体である。また他の実施形態において、本発明は組成物を提供し、その組成物は以下：ａ１）実質的に純粋なＯＸ２ＲＨ１および別のＩｇスーパーファミリーメンバー；ａ２）実質的に純粋なＯＸ２ＲＨ２および：別のＩｇスーパーファミリーメンバー、ＤＡＰ１２またはＤＡＰ１０；ａ３）実質的に純粋なＯＸ２ＲＨ３および；別のＩｇスーパーファミリーメンバー、ＤＡＰ１２またはＤＡＰ１０；ａ４）実質的に純粋なＯＸ２ＲＨ４および；別のＩｇスーパーファミリーメンバー、ＤＡＰ１２またはＤＡＰ１０；あるいは滅菌ＯＸ２ＲＨ１ポリペプチド；滅菌ＯＸ２ＲＨ２ポリペプチド；滅菌ＯＸ２ＲＨ３ポリペプチド；滅菌ＯＸ２ＲＨ４ポリペプチド；ＯＸ２ＲＨ１、ＯＸ２ＲＨ２、ＯＸ２ＲＨ３、またはＯＸ２ＲＨ４ポリペプチドおよびキャリアを含み、ここでそのキャリアは、水性化合物（水、生理食塩水、および／または緩衝液を含む）であり；そして／または経口投与、直腸投与、経鼻投与、局所投与または非経口投与のために処方される。
【００３６】
融合ポリペプチドもまた提供され、例えば、その融合ポリペプチドは以下：表１〜３の成熟タンパク質配列；検出タグもしくは精製タグ（ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ６またはＩｇ配列を含む）；または別のＩｇスーパーファミリータンパク質の配列を含む。キットもまた提供され、例えば、そのキットは、ＯＸ２ＲＨポリペプチドおよび；そのタンパク質またはポリペプチドを含む区画（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）；あるいはそのキット内の試薬の使用または処分についての取扱説明書を含む。
【００３７】
本発明はまた、種々の抗体様試薬（異なる種に由来する抗体を含む）を含む。それは、例えば、天然ＯＸ２ＲＨポリペプチド（例えば、ＯＸ２ＲＨ１、ＯＸ２ＲＨ２、ＯＸ２ＲＨ３および／またはＯＸ２ＲＨ４）と特異的に結合する抗体に由来する抗原結合部位を含む結合化合物を提供し、ここで；その結合化合物が容器内にあるか；そのＯＸ２ＲＨポリペプチドが、げっし類または霊長類由来であるか；その結合化合物がＦｖフラグメント、ＦａｂフラグメントまたはＦａｂ２フラグメントであるか；その結合化合物が、別の化学部分と結合体化されているか；あるいはその抗体が表１〜３の成熟ポリペプチドのペプチド配列に対して惹起されるか；成熟ＯＸ２ＲＨに対して惹起されるか；精製された哺乳動物ＯＸ２ＲＨに対して惹起されるか；免疫選択されるか；ポリクローナル抗体であるか；変性ＯＸ２ＲＨと結合するか；抗原に対して少なくとも３０μＭのＫｄを示すか；ビーズまたはプラスチック膜を含む固体基板に付着されているか；滅菌組成物内にあるか；あるいは放射性標識または蛍光標識を含み検出可能に標識されている。それによりキットが提供され、例えば、そのキットは、そのような結合化合物および：その結合化合物を含む区画；あるいはそのキット内の試薬の使用または処分についての取扱説明書を含む。また、例えば、抗原：結合化合物または抗原：抗体複合体を産生する方法も提供され、その方法は、適切な条件下において、哺乳動物ＯＸ２ＲＨポリペプチドと抗体とを接触させる工程を包含し、それによって複合体が形成することを可能とする。好ましくは、この方法において、その複合体は、他のサイトカインまたはＩｇスーパーファミリーレセプターから精製されるか；その複合体は、他の抗体から精製されるか；その接触が、哺乳動物ＯＸ２を含むサンプルを伴うか；その接触が、抗原の定量的検出を可能にするか；その接触が抗体を含むサンプルを伴うか；あるいはその接触がその抗体の定量的検出を可能にする。関連する組成物（例えば、滅菌結合化合物または結合化合物およびキャリアを含む）が使用可能であり、ここでそのキャリアは、水、生理食塩水および／または緩衝液を含む水性化合物であり；そして／または経口投与、直腸投与、経鼻投与、局所投与または非経口投与のために処方される。
【００３８】
本発明は、核酸（例えば、ＯＸ２ＲＨポリペプチドをコードする、単離された核酸または組換え核酸）をさらに提供し、ここでＯＸ２ＲＨは、哺乳動物由来であるか；またはその核酸は、表１〜３の抗原性ペプチド配列をコードするか；表１〜３の複数の抗原性ペプチド配列をコードするか；天然ｃＤＮＡコードフラグメントに対して、少なくとも１３個のヌクレオチドに渡って同一性を示すか；発現ベクターであるか；複製起点をさらに含むか；天然の供給源に由来するか；検出標識を含むか；合成ヌクレオチド配列を含むか；６ｋｂ未満、好ましくは３ｋｂ未満であるか；霊長類またはげっし類に由来するか；天然全長コード配列を含むか；ＯＸ２ＲＨをコードする遺伝子に対するハイブリダイゼーションプローブであるか；ＤＡＰ１２またはＤＡＰ１０をさらにコードするか；あるいはＰＣＲプライマー、ＰＣＲ産物または変異誘発プライマーである。組換え核酸を含む細胞もまた提供され、例えば、ここでその細胞は、原核生物細胞であるか；真核生物細胞であるか；細菌細胞であるか；酵母細胞であるか；昆虫細胞であるか；哺乳動物細胞であるか；マウス細胞であるか；霊長類細胞であるか；またはヒト細胞である。その核酸を含むキットが提供され、例えば、そのキットは、核酸を含む区画；哺乳動物ＯＸ２ＲＨポリペプチドをさらに含む区画；あるいはそのキット内の試薬の使用または処分についての取扱説明書を含む。
【００３９】
あるいは、本発明は核酸を提供し、その核酸は、３０分間４０℃および２Ｍ未満の塩という洗浄条件下において、配列番号１、３、５、７、９、１１、１９、または２２のコード部分にハイブリダイズするか、または霊長類ＯＸ２ＲＨ  ｃＤＮＡまたはげっし類ＯＸ２ＲＨ  ｃＤＮＡに対して少なくともおよそ３０ヌクレオチドのストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）に渡って同一性を示す。好ましくは、その洗浄条件は、５０℃および／または５００ｍＭ塩；または６０℃および／または１５０ｍＭ塩であり；そのストレッチは、少なくとも５５ヌクレオチドまたは７５ヌクレオチドであり；あるいはその核酸は、ＤＡＰ１２ペプチドまたはＤＡＰ１０ペプチドをさらにコードする。
【００４０】
例えば、細胞または組織培養細胞の生理機能または発生を調節する方法といった、他の方法もさらに包含され、その方法は、その細胞を哺乳動物ＯＸ２ＲＨのアゴニストまたはアンタゴニストと接触させる工程を包含する。しばしば、その細胞は、ＯＸ２ＲＨをコードする核酸で形質転換される。
上記に加えて、本発明は、以下を提供する：
（項目１）  組成物であって、以下：
ａ１）配列番号２のセグメントと同一である少なくとも４つのアミノ酸からなる少なくとも３つの異なる非重複セグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチドまたは組換えポリペプチド；
ａ２）配列番号２のセグメントと同一である少なくとも５つのアミノ酸からなる少なくとも２つの異なる非重複セグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチドまたは組換えポリペプチド；
ａ３）成熟した配列番号２を含む、天然配列げっ歯類ＯＸ２ＲＨ１ポリペプチド；
ａ４）ラットＯＸ２ＲＨ１配列を含む、融合ポリペプチド；
ｂ１）配列番号４のセグメントと同一である少なくとも４つのアミノ酸からなる少なくとも３つの異なる非重複セグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチドまたは組換えポリペプチド；
ｂ２）配列番号４のセグメントと同一である少なくとも５つのアミノ酸からなる少なくとも２つの異なる非重複セグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチドまたは組換えポリペプチド；
ｂ３）成熟した配列番号４を含む、天然配列げっ歯類ＯＸ２ＲＨ１ポリペプチド；
ｂ４）ヒトＯＸ２ＲＨ１配列を含む、融合ポリペプチド；
ｃ１）配列番号６のセグメントと同一である少なくとも４つのアミノ酸からなる少なくとも３つの異なる非重複セグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチドまたは組換えポリペプチド；
ｃ２）配列番号６のセグメントと同一である少なくとも５つのアミノ酸からなる少なくとも２つの異なる非重複セグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチドまたは組換えポリペプチド；
ｃ３）成熟した配列番号６を含む、天然配列げっ歯類ＯＸ２ＲＨ１ポリペプチド；
ｃ４）マウスＯＸ２ＲＨ１配列を含む、融合ポリペプチド；
ｄ１）配列番号８のセグメントと同一である少なくとも４つのアミノ酸からなる少なくとも３つの異なる非重複セグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチドまたは組換えポリペプチド；
ｄ２）配列番号８のセグメントと同一である少なくとも５つのアミノ酸からなる少なくとも２つの異なる非重複セグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチドまたは組換えポリペプチド；
ｄ３）成熟した配列番号８を含む、天然配列げっ歯類ＯＸ２ＲＨ１ポリペプチド；
ｄ４）ヒトＯＸ２ＲＨ２配列を含む、融合ポリペプチド；
ｅ１）配列番号１０のセグメントと同一である少なくとも４つのアミノ酸からなる少なくとも３つの異なる非重複セグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチドまたは組換えポリペプチド；
ｅ２）配列番号１０のセグメントと同一である少なくとも５つのアミノ酸からなる少なくとも２つの異なる非重複セグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチドまたは組換えポリペプチド；
ｅ３）成熟した配列番号１０を含む、天然配列げっ歯類ＯＸ２ＲＨ２ポリペプチド；
ｅ４）マウスＯＸ２ＲＨ２配列を含む、融合ポリペプチド；
ｆ１）配列番号１２のセグメントと同一である少なくとも４つのアミノ酸からなる少なくとも３つの異なる非重複セグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチドまたは組換えポリペプチド；
ｆ２）配列番号１２のセグメントと同一である少なくとも５つのアミノ酸からなる少なくとも２つの異なる非重複セグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチドまたは組換えポリペプチド；
ｆ３）成熟した配列番号１２を含む、天然配列げっ歯類ＯＸ２ＲＨ３；
ｆ４）マウスＯＸ２ＲＨ３配列を含む、融合ポリペプチド；
ｇ１）配列番号２０のセグメントと同一である少なくとも４つのアミノ酸からなる少なくとも３つの異なる非重複セグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチドまたは組換えポリペプチド；
ｇ２）配列番号２０のセグメントと同一である少なくとも５つのアミノ酸からなる少なくとも２つの異なる非重複セグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチドまたは組換えポリペプチド；
ｇ３）成熟した配列番号２０を含む、天然配列霊長類ＯＸ２ＲＨ１．２ポリペプチド；
ｇ４）霊長類ＯＸ２ＲＨ１．２配列を含む、融合ポリペプチド；
ｈ１）配列番号２３のセグメントと同一である少なくとも４つのアミノ酸からなる少なくとも３つの異なる非重複セグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチドまたは組換えポリペプチド；
ｈ２）配列番号２３のセグメントと同一である少なくとも５つのアミノ酸からなる少なくとも２つの異なる非重複セグメントを含む、実質的に純粋なポリペプチドまたは組換えポリペプチド；
ｈ３）成熟した配列番号２３を含む、天然配列げっ歯類ＯＸ２ＲＨ４ポリペプチド；
ｈ４）マウスＯＸ２ＲＨ４配列を含む、融合ポリペプチド、
から選択される組成物。
（項目２）  抗体由来の抗原結合部位を含む結合化合物であって、該結合化合物は、項目１に記載の天然ＯＸ２ＲＨポリペプチドに特異的に結合し、ここで：
ａ）該結合化合物が容器内にあるか；
ｂ）該ＯＸ２ＲＨポリペプチドが、げっし類または霊長類由来であるか；
ｃ）該結合化合物がＦｖフラグメント、ＦａｂフラグメントまたはＦａｂ２フラグメントであるか；
ｄ）該結合化合物が、別の化学部分と結合体化されているか；あるいは
ｅ）該抗体が：
ｉ）表１〜３の成熟ポリペプチドのペプチド配列に対して惹起されるか；
ｉｉ）成熟ＯＸ２ＲＨに対して惹起されるか；
ｉｉｉ）精製された哺乳動物ＯＸ２ＲＨに対して惹起されるか；
ｉｖ）免疫選択されるか；
ｖ）ポリクローナル抗体であるか；
ｖｉ）変性ＯＸ２ＲＨと結合するか；
ｖｉｉ）抗原に対して少なくとも３０μＭのＫｄを示すか；
ｖｉｉｉ）ビーズまたはプラスチック膜を含む固体基板に付着されているか；
ｉｘ）滅菌組成物内にあるか；または
ｘ）蛍光標識を含み検出可能に標識されている、
結合化合物。
（項目３）  項目１に記載の前記ＯＸ２ＲＨポリペプチドをコードする、単離された核酸または組換え核酸であり、ここで：
ａ）該ＯＸ２ＲＨが、哺乳動物由来であるか；あるいは
ｂ）該核酸が以下：
ｉ）表１〜３の抗原性ペプチド配列をコードするか；
ｉｉ）表１〜３の複数の抗原性ペプチド配列をコードするか；
ｉｉｉ）前記セグメントをコードする天然ｃＤＮＡに対して少なくとも１３個のヌクレオチドにわたって同一性を示すか；
ｉｖ）発現ベクターであるか；
ｖ）複製起点をさらに含むか；
ｖｉ）天然の供給源に由来するか；
ｖｉｉ）検出標識を含むか；
ｖｉｉｉ）合成ヌクレオチド配列を含むか；
ｉｘ）６ｋｂ未満、好ましくは３ｋｂ未満であるか；
ｘ）霊長類またはげっし類に由来するか；
ｘｉ）天然の全長コード配列を含むか；
ｘｉｉ）該ＯＸ２ＲＨをコードする遺伝子に対するハイブリダイゼーションプローブであるか；
ｘｉｉｉ）ＤＡＰ１２もしくはＤＡＰ１０をさらにコードし；または
ｘｉｖ）ＰＣＲプライマー、ＰＣＲ産物、もしくは変異誘発プライマーである、
単離された核酸または組換え核酸。
（項目４）  核酸であって、該核酸は以下：
ａ）４０℃にて３０分間および２Ｍ未満の塩という洗浄条件下において、配列番号１，３，５，７、９、１１、１９、または２２のコード部分とハイブリダイズするか；あるいは
ｂ）霊長類またはげっし類のＯＸ２ＲＨ  ｃＤＮＡに対して、少なくとも約３０ヌクレオチドのストレッチにわたって同一性を示す、
核酸。
（項目５）  細胞または組織培養細胞の生理機能または発生を調節する方法であって、該方法は、該細胞を哺乳動物ＯＸ２ＲＨのアゴニストまたはアンタゴニストと接触させる工程を包含する、方法。
（項目６）  項目５に記載の方法であって、ここで：
ａ）該生理機能を調節することが、以下
ｉ）骨髄性機能を増強させることであるか；または
ｉｉ）免疫を増強させることであるか；
ｂ）該アゴニストまたは該アンタゴニストが該細胞へのＯＸ２媒介性シグナル伝達を減弱させるか；あるいは
ｃ）該アンタゴニストが、以下：
ｉ）該ＯＸ２ＲＨに対する抗体であるか；
ｉｉ）可溶性ＯＸ２ＲＨ構築物であるか；
ｉｉｉ）可溶性ＯＸ２ＲＨ−Ｉｇ融合物であるか；または
ｉｖ）ＯＸ２Ｒアンチセンス核酸である、
方法。
（項目７）  項目６に記載の方法であって、ここで：
ａ）前記生理機能の調節がインビトロにおける骨髄性細胞機能の増強であり、そして前記アンタゴニストがＯＸ２ムテインであるか；または
ｂ）該生理機能の調節が、該アンタゴニストで全身的に処置されている動物における免疫の増強である、
方法。
（項目８）  ＯＸ２Ｒに対する非ＯＸ２リガンドの同定のための方法であって、該方法はＯＸ２Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質との結合について、ＯＸ２ノックアウトマウス由来の遺伝子のライブラリーをスクリーニングする工程、および該融合タンパク質と結合する遺伝子を同定する工程を包含する、方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
（概要）
Ｉ．一般原理
ＩＩ．活性
ＩＩＩ．核酸
Ａ．コードフラグメント、配列、プローブ
Ｂ．変異、キメラ、融合体
Ｃ．核酸作製
Ｄ．ベクター、細胞含有
ＩＶ．タンパク質、ペプチド
Ａ．フラグメント、配列、免疫原、抗原
Ｂ．ムテイン
Ｃ．アゴニスト／アンタゴニスト、機能的等価物
Ｄ．タンパク質作製
Ｖ．核酸、タンパク質作製
Ａ．合成
Ｂ．組換え
Ｃ．天然供給源
ＶＩ．抗体
Ａ．ポリクローナル抗体
Ｂ．モノクローナル抗体
Ｃ．フラグメント；Ｋｄ
Ｄ．抗イディオタイプ抗体
Ｅ．ハイブリドーマ細胞株
ＶＩＩ．ＯＸ２ＲＨを定量するためのキットおよび方法
Ａ．ＥＬＩＳＡ
Ｂ．アッセイｍＲＮＡコード
Ｃ．質的／量的
Ｄ．キット
ＶＩＩＩ．治療組成物、方法
Ａ．組換え組成物
Ｂ．単位用量
Ｃ．投与
ＩＸ．スクリーニング
Ｘ．リガンド
（Ｉ．一般原理）
本発明は、哺乳動物（本明細書中の霊長類およびげっし類）のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列、レセプター様サブユニット分子、これらの命名されたＯＸ２レセプターホモログ（ＯＸ２ＲＨ）を提供する。これらの遺伝子は、構造的また生物学的のいずれかもしくはその両方において、特有の定義された特性を有する。これらの分子をコードする種々のｃＤＮＡを、哺乳動物（例えば、ヒトおよびげっし類）、ｃＤＮＡ配列ライブラリーから入手した。他の哺乳動物（例えば、霊長類、げっし類）または他の対応物もまた所望される。
【００４２】
ＯＸ２抗原を、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＭＲＣ  ＯＸ２を使用して、初めにラットにおいて特徴付けた。例えば、ＭｃＭａｓｔｅｒおよびＷｉｌｌｉａｍｓ（１９７９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４２６−４２３；Ｂａｒｃｌａｙ（１９８１）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４４：７２７−７３６；Ｂａｒｃｌａｙ（１９８１）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４２：５９３−６００；Ｂｕｋｏｖｓｋｙら、（１９８４）Ｉｍｍｕｎｏｌｇｙ  ５２：６３１−６４０；ならびにＷｅｂｂおよびＢａｒｃｌａｙ（１９８４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．４３：１０６１−１０６７を参照のこと。フローサイトメトリのために、組織切片または細胞懸濁物の免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色においてこの抗体を使用して、ＯＸ２抗原は、広範に種々の細胞（例えば、ニューロン、血管内皮、Ｂ細胞、活性化Ｔ細胞、濾胞性樹状細胞、平滑筋細胞およびトロホブラスト）によって発現されたということを明らかにした。さらに、ヒトＯＸ２は、正常な脳細胞およびＢ細胞において発現され得ることは公知である。ＭｃＣａｕｇｈａｎら、（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２５：３２９−３３５。ＭＲＣ  ＯＸ２（Ｃｌａｒｋら、（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．４：１１３−１１８）により認識されるラットタンパク質の特徴付けは、ＯＸ２は、２つの細胞外免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン、膜貫通ドメインおよび短いＣ末端細胞質テール（ｔａｉｌ）を含むおよそ２４８個のアミノ酸から構成されるということを明らかにした。その分子は、６Ｎ−結合グリコシル化部位を介してグリコシル化され、それらうちの３つがＮ末端Ｖ様Ｉｇドメインに存在し、そしてその他は膜近位Ｃ２様Ｉｇドメインに存在する。このことは、ＯＸ２をＩｇスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）に位置付け、そのＩｇスーパーファミリーは、ＣＤ２、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９０およびＣＤ１４７のような分子を有する小さなＩｇＳＦ分子のサブグループ（ｓｕｂ−ｇｒｏｕｐ）を形成し、これらは、例えば、Ｉｇ可変領域ドメインおよび定常領域ドメイン、膜貫通セグメント、細胞内ドメインならびに特徴的なシステイン残基およびトリプトファン残基間隔に対応する免疫グロブリン様ドメインの存在によって、構造的に特徴付けられる。例えば、Ｃａｍｂｅｌｌら、（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ  ２８２：３４１−３４２を参照のこと。興味深いことに、ＣＤ９０はまた、ニューロンによって大いに発現される。Ｗｉｌｌｉａｍｓら、（１９７７）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｓｖｍｐ．Ｏｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４１  Ｐｔ  １：５１−６１。さらに、ＯＸ２は、ＣＤ８０およびＣＤ８６の構造的ホモログであったということ（Ｂｏｒｒｉｅｌｌｏら、（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：４５４８−４５５４）ならびにＯＸ２遺伝子が、マウスの第１６染色体上のＣＤ８０およびＣＤ８６をコードするそれらに近接して連結されていたということを示した（Ｂｏｒｒｉｅｌｌｏら、（１９９８）Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ  ９：１１４−１１８）。ＣＤ８０およびＣＤ８６の両方は、同時刺激として公知のプロセスにおけるリガンドとして役に立ち、従って、おそらく、ＯＸ２は、同じようにリガンドとして作用する。ＯＸ���抗原は、本明細書中以後、ＯＸ２タンパク質またはリガンドＯＸ２として言及される。結合パートナーは、ＯＸ２レセプターとして言及される。
【００４３】
ＯＸ２に対するレセプター（ＯＸ２Ｒ）を同定するために、マルチバレント試薬を、蛍光ビーズと結合したラットＯＸ２ラットＣＤ４融合タンパク質を使用して、調製した。この試薬は、マウスおよびラットの腹膜マクロファージと結合することが示されており、そしてこの結合は、ｍＡｂ  ＭＲＣ  ＯＸ８８によってブロックされ得る。Ｐｒｅｓｔｏｎら、（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：１９１１−１９８１。このｍＡｂは、腹膜および脾臓の両方から単離されたマクロファージと結合することが示されており、そして脾臓切片に対するＩＨＣにおいて、染色は、マクロファージを高い割合で含むことが公知である領域において見出された。
【００４４】
ＯＸ１０２と命名された、Ｂａｒｃｌａｙのグループにより惹起された二次モノクローナル抗体は、ラット種のマクロファージと結合し、そしてラット腹膜マクロファージに対するＯＸ２分子の結合を特異的に妨げることも示された。ＯＸ１０２分子に結合する物質の単離およびＮ末端配列決定は、推定ＯＸ２レセプター（ＯＸ２Ｒ）が新規な分子であることを示した。これを、本明細書中に記載されるようにクローン化した。ＯＸ１０２抗体によって認識されるそのタンパク質が確かにレセプターであったということが、ＯＸ２分子それ自体（リガンド）に関してこの分子上のより長い細胞質テールの実証によって、支持された。Ｃｌａｒｋら、（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．４：１１３−１１８。ＯＸ２Ｒの予備分析は、公知のシグナル伝達分子と一致する明らかなモチーフを示さなかったが、このことはＯＸ２誘導シグナルを媒介する際のこの分子の潜在的役割を除外しない。
【００４５】
次いで、マウスホモログを同定し、ＯＸ２ＲＨ１と命名した。用語ＯＸ２Ｒを、ＯＸ２に実際に結合することが立証されたそれらのタンパク質のために留保するべきであるという理由のために、適用される最初の命名は、群１のレセプターホモログである。この分子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、本明細書中に記載される。
【００４６】
利用可能な配列データベースのさらなる分析は、ＯＸ２ＲＨの別の異なる形態の存在を明らかにした。その分子は、ＯＸ２ＲＨ１に対して、推定細胞外Ｉｇドメイン構造における有意な相同性を示したが、異なる膜貫通配列および細胞質配列を有していた。これらの形態は、本明細書中においてＯＸ２ＲＨ２と命名されており、そしてヒトおよびマウスの実施形態の両方が同定されている。分子の膜貫通部分にある２２４位（ヒト）および１７０位（マウス）のリジン（Ｋ）部分の存在は、特に注意する。そのような残基は、この分子が、細胞活性化のためにシグナル伝達し得るモチーフを発現することが公知である分子パートナー（例えば、ＤＡＰ１２）と関連するとうことを示唆する。例えば、Ｌａｎｉｅｒら、（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：７０３−７０７；Ｃｏｌｏｎｎａ（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：６４２−３；Ｃａｍｂｅｌｌら、（１９９９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３１：６３１−６３６；およびＬｏｐｅｚ−Ｂｏｔｅｔら、（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：３０１−３０７を参照のこと。さらに、そのようなことは、種々のシグナル伝達経路および関連する生化学を示唆する。例えば、Ｌａｎｉｅｒら、（１９９８）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ８：６９３−７０１；Ｓｍｉｔｈら、（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：７−１０；Ｇｏｓｓｅｌｉｎら、（１９９９）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６６：１６５−１７１；Ｔｏｍａｓｅｌｌｏら、（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３４１１５−３４１１９；およびＭｃＶｉｃａｒら、（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３２９３４−３２９４２を参照のこと。しかし、全長マウスまたはヒトＯＸ２ＲＨ２形態は、さらに単離されるべきである。
【００４７】
ＯＸ２ＲＨ１分子のマウス細胞外領域とラット細胞外領域との間には高い相同性が存在し、これらの両方は、それぞれの種のＯＸ２と結合することが確認されている。従って、ラットおよびマウスＯＸ２ＲＨ１実施形態は、機能的にＯＸ２ＲＨとしても適当に言及される。両者は、代表的な細胞外ドメイン構造、膜貫通ドメイン構造および細胞内ドメイン構造を含む。ヒトＯＸ２ＲＨ１実施形態を発見した。さらに、ラットおよびマウスＯＸ２ＲＨ１の可溶性形態が存在し得る。
【００４８】
関連ホモログ（ＯＸ２ＲＨ２およびＯＸ２ＲＨ４と命名されている）もまた、記載されており、マウスおよびヒトにおいて種々の実施形態をもたらす。ＯＸ２ＲＨ２、Ｈ３およびＨ４実施形態は、膜貫通セグメントにおいて荷電したリジン残基を示す。ヒトＯＸ２ＲＨ２実施形態は、シグナル配列を欠失しており、そして、いくつかのゲノム配列イヤマーク（ｅａｒｍａｒｋ）を示し、このことは、天然ヒトＯＸ２ＲＨ２の機能形態が、親密に関連しているはずであるが、提供される配列はわずかに異なることを示唆する。マウスおよびヒトホモログ２および４の機能的関連性には、確認すべきことが残されている。
【００４９】
さらなるＯＸ２Ｒホモログもまた、マウスにおいて見出した。その相同性は、かなり相違するが、それは配列においていくらかの類似性を示す。詳細には、それは、膜貫通領域内にリジン残基を有する。従って、他のＯＸ２ＲＨ２、Ｈ３、およびＨ４様分子は、この特徴を示し、それは、例えばＤＡＰ１２のような会合分子を介してシグナル伝達することが予期される。本実施形態を、本明細書中においてげっし類（例えば、マウス）由来のＯＸ２ＲＨ３と命名する。
【００５０】
ＯＸ２ＲＨ１の発現パターンの継続中の分析は、ラット、マウスおよびヒトの白血球において、ＯＸ２ＲＨ１（ＯＸ１０２抗体および／またはＰＣＲ技術によるｍＲＮＡ発現の分析を用いるフローサイトメトリ染色により決定されるように）は、単球、顆粒球、および肥満細胞によって最も強く発現され、Ｂ細胞によりわずかに発現され、そしてＴ細胞により微弱に発現されるということを示す。このことは、初期の研究における、マクロファージへのリガンドＯＸ２の優先的な結合と一致する。正常なラット中枢神経系において、ある割合の常在性マクロファージ（または小グリア細胞）もまたＯＸ２Ｒを発現するが、低いレベルである。
【００５１】
いくつかの適用可能な標準的方法が記載されるか、または、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、（第２版）、第１〜３巻、ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅ，Ｂｒｏｏｋｌｙｎ，ＮＹ；またはＡｕｓｕｂｅｌら、（１９８７および定期的補遺）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ／Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）において参照される。
【００５２】
げっし類（例えば、ラット）のＯＸ２レセプターホモログ１（ＯＸ２ＲＨ１）コードセグメントのヌクレオチド（配列番号１）および対応するアミノ酸配列（配列番号２）が表１に示される。同様に、さらなる実施形態において、霊長類（例えば、ヒト）およびげっし類（例えば、マウス）が記載されＯＸ２ＲＨ１、１．２、２、および４と命名される。この核酸配列は、配列番号３、１９、５、７、９、および２２であり；対応するアミノ酸配列は、配列番号４、２０、６、８、１０、および２３であり、これらは表２に示される。表３は、他のげっし類（例えば、マウス）のＯＸ２ＲＨ３の配列を提供する（配列番号１１および１２）。
【００５３】
逆翻訳（Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）核酸配列が、表４に提供される（配列番号：１３−１４、２１、１５−１７、２４、および１８）。表５は、ポリペプチド配列のアラインメントおよび数値比較を提供する。
【００５４】
表１：げっし類ＯＸ２（ホモログ１）のヌクレオチド配列およびポリペプチド配列
【００５５】
【表１】
2007319163.tif 000002
2007319163.tif 000003
表２：さらなるＯＸ２Ｒホモログのヌクレオチド配列およびポリペプチド配列
【００５６】
【表２】
2007319163.tif 000004
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2007319163.tif 000013
表３：げっし類（例えば、マウス）ＯＸ２ＲＨ３（配列番号１１および１２）
【００５７】
【表３】
2007319163.tif 000014
2007319163.tif 000015
表４：ＯＸ２Ｒホモログの逆翻訳
【００５８】
【表４】
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2007319163.tif 000018
表５：さまざまな種のＯＸ２Ｒホモログ１および２のアラインメント
【表５】
2007319163.tif 000019
2007319163.tif 000020
ＯＸ２ＲＨ１および２の実施形態は、互いに特定の類似性を示す（例えば、表５を参照のこと）。目的の特定の領域または位置は、以下である：ラットＨ１に関しては、ｃｙｓ２、ｌｅｕ３３、ｃｙｓ３５、ｉｌｅ４６、ｔｒｐ４８、ａｒｇ５３、ｐｒｏ５６、ｃｙｓ５８、ｔｙｒ６２、ｃｙｓ７４、ｔｈｒ８０、ｔｒｐ８１、ｌｅｕ９１、ｉｌｅ９３、ｈｉｓ１００、ｇｌｙ１０２、ｔｙｒ１０４、ｇｌｙ１１３、ｐｈｅ１１５、ｌｅｕ１２２、ｖａｌ１２３、ｐｒｏ１２７、ａｓｎ１３６、ａｌａ１３９、ｖａｌ１４０、ｃｙｓ１４１、ａｌａ１４３、ｌｙｓ１４７、ｐｒｏ１４８、ａｌａ１４９、ｉｌｅ１５２、ｔｒｐ１５４、ｐｒｏ１５６、ａｓｎ１６９、ｔｈｒ１７１、ｖａｌ１７４、ｓｅｒ１７６、ｃｙｓ１７８、ｇｌｕ１８１、ｓｅｒ１８６、ｖａｌ１８８、ｃｙｓ１９０、ｓｅｒ１９３、ｈｉｓ１９４、ｔｈｒ１９６、ａｓｎ１９８、ｌｅｕ２０２、ｇｌｙ２１５、ｔｙｒ２１７、ｌｅｕ２３７、ｌｙｓ２３８、およびｉｌｅ３０４に隣接する（その前、そこに、またはその後ろの）境界。残基の多くは、Ｈ１およびＨ２クラスにわたって保存されている。Ｈ２およびＨ４も同様である。表５を参照のこと。ラットＯＸ２ＲＨにおける目的の特定のドメインは、約ｃｙｓ２からｐｒｏ１２７までのＣ２ドメイン、約ｇｌｕ１２８からｇｌｙ２１５までのＣ２ドメイン、約ｔｙｒ２１７からｌｅｕ２３７までのＴＭセグメント、および約ｌｙｓ２３８からｉｌｅ３０４までの細胞内ドメインである。マウスＨ１の対応するセグメントは、約ｓｅｒ２４〜ｐｒｏ１５０、ｇｌｕ１５１〜ｇｌｙ２３１、ｔｙｒ２３９〜ｌｅｕ２５９、およびｌｙｓ２６０〜ｉｌｅ３２６である。マウスＨ２については、このセグメントは利用可能な配列において、約ａｒｇ１〜ｐｒｏ７４、ｇｌｕ７５〜ｇｌｙ１５５、ｐｒｏ１６１〜ｇｌｙ１８２、およびｐｈｅ１８３〜ｔｈｒ１９４に対応する。ヒトＨ２については、この膜貫通セグメントは、約ａｌａ２１４〜ｖａｌ２３３およびｔｈｒ２３４〜ｌｅｕ２５０であり、そしてマウスＨ３においては、約ｐｒｏ１１９〜ｇｌｙ２３７（膜間ｌｙｓ２２８を伴う）、およびｐｈｅ２３８〜ｇｌｙ２５２である。表５はまた、Ｈ２およびＨ４の実施形態のアラインメントを示す。さらなる目的の位置（例えば、フラグメントの境界）は、ラットＯＸ２ＲＨ１を有するホモログ群またはこのファミリーのメンバーの種々のサブセットにわたって保存されている位置である。
【００５９】
機能的には、ラットおよびマウスＨ１は、ＯＸ２に結合することが示された。このことは、ヒトＨ１については未だ確認されていないが、容易に試験され得る。Ｈ２、Ｈ４およびＨ３群に対して適合するリガンドは、以下に記載される。
【００６０】
げっ歯類Ｈ３は、予測されるように、ＤＡＰ１２と関連することが示された。組換え発現されたエピトープタグ化ＤＡＰ１２は、シャペロン（ｃｈａｐａｒｏｎｅ）パートナーの同時発現がない場合、膜結合型ではない。例えば、Ｂａｋｋｅｒら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：９７９２−９７９６を参照のこと。マウスＨ３は、シャペロンパートナーとして働き得る。しかし、ＤＡＰ１２を通じたシグナル経路は、Ｈ３リガンドに結合することを必要とする。このＨ３リガンドは、未だ同定されていないが、適切なスクリーニングストラテジー（例えば、生化学的または物理的方法）を用いて見出され得る。Ｈ２およびげっ歯類Ｈ４の配列類似性は、ＤＡＰ１２または（可能であれば）ＤＡＰ１０のいずれかとの類似の関連性を示唆する。
【００６１】
マウスＨ２およびＨ４およびヒトＨ２はまた、このような特性を有する可能性が高い（例えば、ＤＡＰ１２（活性化）またはＤＡＰ１０との関連性）。シグナル伝達経路は、ＮＫ細胞上の関連レセプターのいくつかを用いて決定された。例えば、Ｌａｎｉｅｒら（１９９８）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ８：６９３−７０１；Ｓｍｉｔｈら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：７−１０；Ｇｏｓｓｅｌｉｎら（１９９９）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６６：１６５−１７１；Ｔｏｍａｓｅｌｌｏら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３４１１５−３４１１９；およびＭｃＶｉｃａｒら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３２９３４−３２９４２を参照のこと。細胞外ドメインとＨ１メンバーとが類似しているので、ＯＸ２様遺伝子（特にＯＸ２）は、リガンドであるようである。
【００６２】
本明細書中で使用される場合、用語ＯＸ２ＲＨ１、ＯＸ２ＲＨ２またはＯＸ２ＲＨ４は、例えば表１〜２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を記載するために使用される。多くの場合、実質的なそのフラグメントは、機能的に等価であるか、または構造的に等価である（例えば、細胞外または細胞内ドメインを含む）。本発明はまた、配列が提供されているそれぞれのＯＸ２ＲＨ対立遺伝子のタンパク質改変体を含む（例えば、ムテインまたは可溶性細胞外構築物）。代表的には、このようなアゴニストまたはアンタゴニストは、約１０％未満の配列差を示し、従って、これはしばしば、１〜１１残基の置換（例えば、２、３、５、７など）を有する。これは、記載されたタンパク質の対立遺伝子改変体および他の改変体（例えば、天然の多型）を含み得る。代表的には、このレセプターは、例えば、少なくとも約１００ｎＭ、通常は約３０ｎＭより良好に、好ましくは約１０ｎＭより良好に、そしてより好ましくは約３ｎＭより良好に高親和性を有する対応するよう生物学的リガンドに結合する。この用語はまた、関連する天然に存在する形態（例えば、対立遺伝子、多型改変体、および哺乳動物タンパク質の代謝改変体）をいうために本明細書中で使用される。レセプター複合体の好ましい形態は、リガンド−レセプター相互作用について適切な親和性および選択性を有する適切なリガンドを結合する。
【００６３】
本発明はまた、表１〜３におけるアミノ酸配列と実質的なアミノ酸配列相同性を有するタンパク質またはペプチドの組合わせを包含する。これは、比較的少ない置換（例えば、好ましくは約３〜５未満）を有する配列改変体を含む。
【００６４】
実質的なポリペプチド「フラグメント」または「セグメント」は、少なくとも約８アミノ酸、一般には少なくとも１０アミノ酸、より一般には少なくとも１２アミノ酸、しばしば少なくとも１４アミン酸、よりしばしば少なくとも１６アミノ酸、代表的には少なくとも１８アミノ酸、より代表的には少なくとも２０アミノ酸、通常は少なくとも２２アミノ酸、より通常には少なくとも２４アミノ酸、好ましくは少なくとも２６アミノ酸、より好ましくは少なくとも２８アミノ酸、そして特に好ましい実施形態においては、少なくとも約３０以上のアミノ酸のアミノ酸残基のストレッチである。異なるタンパク質の配列またはセグメントは、適切な長さのストレッチにわたって互いに比較され得る。多くの状況において、フラグメントは、インタクトなサブユニットの機能的特性を示し得る。例えば、膜貫通レセプターの細胞外ドメインは、リガンド結合特徴を保持し得、そして可溶性レセプター様複合体を調製するために使用され得る。
【００６５】
アミノ酸配列相同性または配列同一性は、残基の適合を最適化することにより決定される。いくつかの比較において、必要であれば、ギャップが導入され得る。例えば、Ｎｅｅｄｌｅｈａｍら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３；Ｓａｎｋｏｆｆら（１９８３）Ｔｉｍｅ  Ｗａｒｐｓ，Ｓｔｒｉｎｇ  Ｅｄｉｔｓ，ａｎｄ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：Ｔｈｅ  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍａｐａｒｉｓｏｎの第１章，Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ，Ｒｅａｄｉｎｇ，ＭＡ；ならびにＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ；およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのソフトウェアパッケージを参照のこと；その各々は、本明細書中に参考として援用される。このギャップを、保存的置換を考慮する場合、適合するように変化させる。保存的置換は、代表的には、以下の群内の置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。相同性アミノ酸配列は、レセプターホモログ配列における天然の対立遺伝子改変体および種間改変体を含むことが意図される。代表的な相同性タンパク質またはペプチドは、表１〜３のアミノ酸配列セグメントと５０〜１００％相同性（ギャップが導入され得る場合）、６０〜１００％相同性（保存的置換が含まれる場合）を有する。相同性尺度は、少なくとも約７０％、一般には少なくとも７６％、より一般的には少なくとも８１％、しばしば少なくとも８５％、よりしばしば少なくとも８８％、代表的には少なくとも９０％、より代表的には少なくとも９２％、通常少なくとも９４％、より通常少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、そして特に好ましい実施形態において、少なくとも９８％以上である。相同性の程度は、比較されるセグメントの長さとともに変化する。相同性タンパク質またはペプチド（例えば、対立遺伝子改変体）は、表１〜３に記載の実施形態と大部分の生物学的活性を共有する。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、用語「生物学的活性」は、レセプター様タンパク質による炎症性応答、先天免疫、および／または形態形成発生に対する効果を限定することなく記載するために使用され得る。例えば、これらのレセプターは、ホスファターゼまたはホスホリラーゼ活性を通じたそれらの効果を媒介するようである。これらの活性は、標準的な手順により容易に測定される。例えば、Ｈａｒｄｉｅら（１９９５編）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  ＦａｃｔＢｏｏｋ第１巻および２巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｈａｎｋｓら（１９９１）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２００：３８−６２；Ｈｕｎｔｅｒら（１９９２）Ｃｅｌｌ  ７０：３７５−３８８；Ｌｅｗｉｎ（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６１：７４３−７５２；Ｐｉｎｅｓら（１９９１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｏｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５６：４４９−４６３；およびＰａｒｋｅｒら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：７３６−７３８を参照のこと。レセプターホモログまたはその部分は、一般的または特異的基質を標識するためにホスフェート標識酵素として有用であり得る。サブユニットはまた、認識抗体を誘発するための機能的免疫原または抗体を結合し得る抗原であり得る。
【００６７】
用語リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、およびアナログ（例えば、ＯＸ２ＲＨの）は、ＯＸ２タンパク質の結合に対する特徴的細胞応答を調節する分子、ならびにリガンド−レセプター相互作用（例えば、アンタゴニストがレセプターホモログまたは抗体の可溶性細胞外ドメインである場合）のより標準的な構造的結合競合特徴を有する分子を含む。細胞応答は、代表的には、レセプターチロシンキナーゼ経路を通じて媒介されるようである。
【００６８】
また、レセプターホモログは、このリガンドが結合する天然のレセプターもしくはそのアナログのいずれかとして働く分子、または天然のレセプターの機能的アナログである分子であり得る。機能的アナログは、構造的改変を有するレセプター分子であり得るか、または適切なリガンド結合決定基と相互作用する分子形状を有する全く関連しない分子であり得る。このリガンドはアゴニストまたはアンタゴニストとして働き得る。例えば、Ｇｏｏｄｍａｎら（１９９０編）Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。
【００６９】
合理的な薬物設計はまた、レセプターホモログ、抗体または他のエフェクターもしくはレセプターホモログ関連実体の分子形状の構造研究に基づき得る。例えば、Ｈｅｒｚら（１９９７）Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔ．Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．Ｒｅｓ．１７：６７１−７７６；およびＣｈａｉｋｅｎら（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：３６９−３７５を参照のこと。エフェクターは、リガンド結合に応答して他の機能を媒介する他のタンパク質、またはレセプターホモログと正常に相互作用する他のタンパク質であり得る。どの部位が特定の他のタンパク質と相互作用するかを決定するための１つの手段は、物理的構造決定（例えば、ｘ線結晶学または二次元ＮＭＲ技術）である。これらは、アミノ酸残基が分子接触領域を形成するような指針を提供する。タンパク質構造決定の詳細な説明については、例えば、ＢｌｕｎｄｅｌｌおよびＪｏｈｎｓｏｎ（１９７６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【００７０】
（ＩＩ．活性）
レセプター様タンパク質は、多くの異なる生物学的活性（例えば、細胞増殖を調節する（すなわち、リン酸代謝において）、特異的基質（代表的には、タンパク質）に付加されるか、あるいは除去される）を有する。このようなレセプター様タンパク質は、一般に、炎症性機能、他の先天免疫応答、または形態形成効果の調節を生じる。レセプターホモログは、記載されるように、おそらくリガンドに対する特異的低親和性結合を有する。
【００７１】
ＯＸ２ＲＨ１は、レセプターチロシンキナーゼ経路を通じたレセプターシグナル伝達系路を連想させるモチーフを有する。例えば、Ｉｈｌｅら（１９９７）：Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  １５（補遺１）：１０５−１１１；Ｓｉｌｖｅｎｎｏｉｎｅｎら（１９９７）ＡＰＭＩＳ  １０５：４９７−５０９；Ｌｅｖｙ（１９９７）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖｉｅｗ  ８：８１−９０；ＷｉｎｓｔｏｎおよびＨｕｎｔｅｒ（１９９６）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌ．６：６６８−６７１；Ｂａｒｒｅｔｔ（１９９６）Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ
Ｃｌｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１０：１−１５；およびＢｒｉｓｃｏｅら（１９９６）Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．３５１：１６７−１７１を参照のこと。
【００７２】
ＯＸ２Ｒホモログの生物学的活性は、代表的には、特異的様式であるが、ときおり非特異的様式で、基質に対するリン酸部分の付加または除去に関連するようである。基質が同定され得るか、または酵素活性についての条件が標準的方法（例えば、Ｈａｒｄｉｅら（１９９５編）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ
ＦａｃｔＢｏｏｋ  第１巻および２巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｈａｎｋｓら（１９９１）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２００：３８−６２；Ｈｕｎｔｅｒら（１９９２）Ｃｅｌｌ  ７０：３７５−３８８；Ｌｅｗｉｎ（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６１：７４３−７５２；Ｐｉｎｅｓら（１９９１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｏｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５６：４４９−４６３；およびＰａｒｋｅｒら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：７３６−７３８に記載）によりアッセイされ得る。
【００７３】
レセプターホモログは、１つ以上の他のタンパク質と組合わさって、機能的複合体を形成し得る（例えば、この複合体は、リガンドを結合するためまたは抗体を調製するために有用であり得る）。これらは、実質的診断用途（検出または定量を含む）を有する。
【００７４】
（ＩＩＩ．核酸）
本発明は、単離された核酸またはフラグメントの使用を含む。例えば、このフラグメントは、例えば、対応するポリペプチドをコードするように、これらの関連タンパク質または非常に関連するタンパク質あるいはそのフラグメントをコードする。好ましくは、これらのうちの１つは生物学的に活性である。さらに、本発明は、このようなタンパク質または特徴的配列を有するポリペプチドの（例えば、ホモログの）組合わせをコードする単離されたＤＮＡあるいは組換えＤＮＡを含む。代表的には、核酸は、適切な条件下で表１〜３に示される核酸配列セグメントとハイブリダイズし得るが、他の公知のＩｇスーパーファミリーレセプターの対応するセグメントとはハイブリダイズし得ない。この生物学的に活性なタンパク質またはポリペプチドは、全長タンパク質、またはフラグメントであり得、そして代表的には、非常に相同的な（例えば、表１〜３に示された１つに対して有意な同一性のストレッチを示す）アミノ酸配列のセグメントを有する。さらに、本発明は、ＯＸ２Ｒタンパク質に等価なフラグメントを有するタンパク質をコードする単離された核酸または組換え核酸あるいはそのフラグメントの使用を含む。単離された核酸は、５’および３’隣接においてそれぞれの調節配列を有し得る（例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ付加シグナル、および天然の遺伝子に由来する他のもの）。
【００７５】
単離された核酸分子は、天然にはネイティブな配列に付随する他の成分（例えば、由来している種からのリボソーム、ポリメラーゼ、および隣接ゲノム配列）から分離された、実質的に純粋な核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または混合ポリマー）である。この用語は、その天然に存在する環境から取り出された核酸配列を含み、そして組換えＤＮＡ単離物、もしくはクローニングされたＤＮＡ単離物（これらは、このことにより天然に存在する組成物とは区別可能である）および化学的に合成されたアナログまたは異種系により生物学的に合成されたアナログを含む。実質的に純粋な分子は、完全に純粋または実質的に純粋のいずれかでこの分子の単離された形態を含む。
【００７６】
単離された核酸は、一般に均質な組成の分子であり得るが、いくつかの実施形態においては、不均質性（好ましくはわずか）を含む。この不均質性は、代表的にはポリマー末端または所望の生物学的機能もしくは活性に重要ではない部分で見られる。
【００７７】
「組換え」核酸は、代表的には、その生成方法またはその構造のいずれかによって規定される。その生成方法に対する言及（例えば、プロセスにより生成された産物）において、このプロセスは、組換え核酸技術（例えば、ヌクレオチド配列におけるヒトの介入を含む）の使用である。
【００７８】
代表的には、この介入は、インビトロ操作を包含するが、特定の環境下で、これは、より古典的な動物育種技術を包含し得る。あるいは、これは、互いに天然には連続していない２つのフラグメントの融合物を含む配列を生成することによって生成された核酸であり得るが、天然の産物（例えば、それらの天然の状態で見出される天然に存在する変異体）を排除することが意味される。従って、例えば、天然には存在しないベクターで細胞を形質転換することにより生成された産物が含まれ、任意の大部分の合成オリゴヌクレオチドプロセスを用いて誘導された配列を含む核酸も同様である。このようなプロセスは、しばしば、コドンを、同じかまたは保存的アミノ酸をコードするげっ歯類コドンで置換する一方で、代表的には、制限酵素配列認識部位を導入するか、または除去するために行われる。あるいは、このプロセスは、所望の機能の核酸セグメントを共に連結して、一般には利用可能な天然の形態において見出されない機能の所望の組合わせを含む（例えば、融合タンパク質をコードする）１つの遺伝的実体を生成するために行われる。制限酵素認識部位は、しばしば、このような人工的操作の標的であるが、他の部位特異的標的（例えば、プロモーター、ＤＮＡ複製部位、調節配列、制御配列、または他の有用な特徴）は設計に組み込まれ得る。同様の概念は、組換え（例えば融合物）ポリペプチドについて意図される。これは、ダイマー反復を含む。特に、遺伝コード縮重による、ＯＸ２レセプターホモログのフラグメントおよび種々の異なる関連分子からの配列（例えば、他のＩｇスーパーファミリーメンバー）の融合物に等価なポリペプチドをコードする合成核酸が含まれる。
【００７９】
核酸の状況における「フラグメント」は、少なくとも約１７ヌクレオチド、一般には少なくとも２１ヌクレオチド、より一般には少なくとも２５ヌクレオチド、通常には少なくとも３０ヌクレオチド、より通常には少なくとも３５ヌクレオチド、しばしば少なくとも３９ヌクレオチド、よりしばしば少なくとも４５ヌクレオチド、代表的には少なくとも５０ヌクレオチド、より代表的には少なくとも５５ヌクレオチド、普通には少なくとも６０ヌクレオチド、より普通には少なくとも６６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも７２ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも７９ヌクレオチドの連続するセグメントであり、そして特に好ましい実施形態においては少なくとも８５ヌクレオチド以上の連続するセグメントである。代表的には、異なる遺伝子配列のフラグメントは、適切な長さのストレッチ、以下に記載のドメインのような特に規定されたセグメントにわたり互いに比較され得る。
【００８０】
ＯＸ２Ｒホモログをコードする核酸は、遺伝子、ｍＲＮＡ、およびｃＤＮＡ種（これらは、ＯＸ２Ｒホモログ自体、または密接に関連したタンパク質をコードする）、ならびに多型改変体、対立遺伝子改変体または他の遺伝的改変体（例えば、異なる個体または関連種に由来）をコードするＤＮＡを同定するために特に有用である。このようなスクリーニングのための好ましいプローブは、異なる多型改変体の間で保存されているか、または特異性を欠如したヌクレオチドを含むレセプターホモログの領域であり、そして好ましくは、全長またはほぼ全長である。他の状況において、多型改変体特異的配列は、より有用である。定量または特異的配列分析は、疾患または医学的状態についてのマーカーとして、あるいは特定の治療適所値を選択する際に有用であり得る。
【００８１】
本発明は、本明細書中で記載される単離されたＤＮＡセットに対して同一な核酸配列またはこのセットに対して非常に相同な核酸配列を有する組換え核酸分子およびフラグメントをさらに含む。特に、この配列は、しばしば、転写、翻訳および／またはＤＮＡ複製を制御するＤＮＡセグメントに作動可能に連結される。これらのさらなるセグメントは、代表的には、所望の核酸セグメントの発現を補助する。
【００８２】
相同な、または高度に同一性の核酸配列（例えば、ＯＸ２ＲＨ配列）は、互いに比較される場合、有意な類似性を示す。核酸における相同性についての標準は、配列比較により当該分野で一般に使用される相同性についての尺度、またはハイブリダイゼーション条件に基づくかのいずれかである。匹敵するハイブリダイゼーション条件は、以下により詳細に記載される。
【００８３】
核酸配列比較関係における実質的な同一性は、比較すると、適切なヌクレオチド挿入または欠失を有して必要に応じて整列される場合、セグメントまたはそれらの相補鎖が、少なくとも約６０％のヌクレオチド、一般には少なくとも６６％、通常少なくとも７１％、多くの場合少なくとも７６％、より多くの場合８０％、大抵８４％、より大抵８８％、典型的には９１％、より典型的には少なくとも約９３％、好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６〜９８％以上、そして特定の実施形態では約９９％以上程度のヌクレオチド（例えば、以下に記載されるセグメントのような構造ドメインをコードするセグメントが挙げられる）であることのいずれかを意味する。あるいは、典型的には表１〜３から導かれる配列を使用して、このセグメントが選択的なストリンジェントな条件下で鎖またはその相補鎖にハイブリダイズする場合、実質的な同一性が存在する。典型的には、選択的なハイブリダイゼーションは、少なくとも約１４ヌクレオチドの伸長にわたる少なくとも約５５％の相同性、より典型的には少なくとも約６５％、好ましくは少なくとも約７５％、そしてより好ましくは少なくとも約９０％である場合に生じる。Ｋａｎｅｈｉｓａ（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：２０３−２１３（これは、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。記載されるように、相同性比較の長さは、より長い伸長を超え得、そして特定の実施形態では、少なくとも約１７ヌクレオチド、一般には少なくとも約２０ヌクレオチド、通常少なくとも約２４ヌクレオチド、大抵少なくとも約２８ヌクレオチド、典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約４０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約５０ヌクレオチドそしてより好ましくは少なくとも約７５〜１００以上のヌクレオチドの伸長を超える。これは、例えば、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２４６、２７３、３００、３２５、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００および他の長さを含む。
【００８４】
ストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーションの関係における相同性に関して、塩、温度、有機溶媒およびハイブリダイゼーション反応において典型的に制御される他のパラメーターの、ストリンジェントな組み合わせ条件である。ストリンジェントな温度条件は、大抵約３０℃を超え、より大抵は約３７℃を超え、典型的には約４５℃を超え、より典型的には約５０℃を超え（例えば、５５℃または６０℃）、好ましくは約６５℃を超え、そしてより好ましくは約７０℃を超える温度を含む。ストリンジェントな塩条件は、通常約１Ｍ未満、より通常は約５００ｍＭ未満、大抵約４００ｍＭ未満、より大抵は約３００ｍＭ未満、典型的には約２００ｍＭ未満、好ましくは約１００ｍＭ未満、そしてより好ましくは、約８０ｍＭ未満（例えば、５０ｍＭ未満、約２０ｍＭ未満にもなお下がる）である。しかし、パラメーターの組み合わせは、任意の１つのパラメーターの測定よりも非常に重要である。例えば、ＷｅｔｍｕｒおよびＤａｖｉｄｓｏｎ（１９６８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１：３４９−３７０（これは本明細書中で参考として本明細書により援用される）を参照のこと。
【００８５】
単離されたＤＮＡは、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入およびヌクレオチド伸長の逆転により容易に改変され得る。これらの改変は、一般には、このタンパク質またはその誘導体をコードする新規ＤＮＡ配列を生じる。これらの改変された配列は、変異体タンパク質（ムテイン）を産生するため、または変種の発現を増強するために使用され得る。タンパク質またはそのフラグメントの所定の変異または部位特異的変異を含むこのような変異体ＯＸ２Ｒホモログ誘導体としては、遺伝コードの縮重を使用するサイレントな変異体が挙げられる。本明細書中で使用される場合、「変異体ＯＸ２レセプターホモログ」は、上記のようなＯＸ２レセプターホモログの定義とは別に分類されるポリペプチドを意図するが、欠失、置換または挿入の様式に関わらず、天然に見出されるような他のＩｇスーパーファミリーのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する。特に「部位特異的変異体ＯＸ２レセプターホモログ」は、表１〜３のタンパク質との実質的な配列同一性を有するタンパク質を意図し、そして典型的には、本明細書中で開示される形態の生物学的活性または生物学的効果（例えば、免疫原性）のいくつかまたはそのほとんどを共有する。
【００８６】
部位特異的変異部位は、予め決定されるが、変異が部位特異的である必要はない。哺乳動物ＯＸ２レセプターホモログ変異誘発は、発現と合わされた、遺伝子におけるアミノ酸挿入または欠失を作製することにより達成され得る。置換、欠失、挿入または多くの組み合わせが生成され得、最終構築物に達し得る。挿入は、アミノ末端融合またはカルボキシ末端融合を含む。次いで、無作為な変異誘発は、標的コドンにおいて誘導され得、そして発現された哺乳動物ＯＸ２ＲＨ変異体は、次いで所望の活性についてスクリーニングされ得、構造−活性の関係のいくつかの局面を提供し得る。既知の配列を有するＤＮＡにおける所定の部位において置換変異を作製するための方法（例えば、Ｍ１３一次変異原性による）は、当該分野で周知である。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９８７および定期的な補遺）をも参照のこと。
【００８７】
ＤＮＡにおける変異は、正常には、リーディングフレームの外のコード配列に位置すべきではなく、そして好ましくは、ハイブリダイズしてループまたはヘアピンのような二次的なｍＲＮＡ構造を作製する相補領域を作成しない。
【００８８】
ホスホラミダイト法（ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１）Ｔｅｒｔａ．Ｌｅｔｔｓ．２２：１８５９−１８６２により記載される）は、適切な合成ＤＮＡフラグメントを作製する。二本鎖フラグメントは、しばしば、相補鎖を合成しそして適切な条件下で一緒に鎖をアニーリングすることによるか、または適切なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖を添加することのいずれかにより得られる。
【００８９】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術は、しばしば、変異誘発において適用され得る。あるいは、変異誘発プライマーは、所定の部位において規定された変異を生成するための方法に通常使用される。例えば、Ｉｎｎｉｓら（１９９０，編）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；ならびにＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ（１９９５；編）ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＣＳＨ，ＮＹ．を参照のこと。
【００９０】
本発明の特定の実施形態は、記載されるレセプターホモログまたはリガンド配列を含む組み合わせ化合物に関する。他の実施形態では、配列の機能部分は、融合タンパク質をコードするように接続され得る。他の形態では、記載する配列の変異体が、置換され得る。
【００９１】
（ＩＶ．タンパク質、ペプチド）
上記のように、本発明は、哺乳動物ＯＸ２ＲＨポリペプチド（例えば、その配列は、表１〜３に開示されかつ上に記載される）を含む。対立遺伝子変異体および他の改変体ポリペプチドもまた意図され、これらとしては、例えば、他の配列（例えば、エピトープタグ、機能ドメインおよびＤＡＰ１２またはＤＡＰ１０の配列を含む配列）を有するこのような配列の部分と結合される、融合タンパク質が挙げられる。
【００９２】
本発明はまた、組換えタンパク質（例えば、これらの霊長類またはげっ歯類のタンパク質由来のセグメントを使用する異種融合タンパク質）を提供する。異種融合タンパク質は、天然においては同じ様式では正常に融合しないタンパク質またはセグメントの融合物である。従って、２つのＯＸ２ＲＨの融合産物は、代表的なペプチド連結において融合される配列を有する連続するタンパク質分子であり、代表的には、単一の翻訳産物として作成され、そして特性（例えば、各供給源ペプチドに由来する配列または抗原性）を示す。同様の概念が異種核酸配列に適用される。種々の、複合体へと設計されたタンパク質の組み合わせもまた提供され得る。
【００９３】
さらに、新規の構築物は、他の関連するタンパク質（例えば、種の改変体を含むレセプターを含む他のＩＴＩＭ、ＩＴＡＭ、またはＹｘｘＭモチーフ）由来の同様の機能または構造ドメインを組み合わせることから作製され得る。例えば、リガンド結合セグメントまたは他のセグメントは、異なる新規の融合ポリペプチドまたはフラグメントの間で「交換（ｓｗａｐｐｅｄ）」され得る。例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１３３０−１３３６；およびＯ’Ｄｏｗｎら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５９８５−１５９９２（これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。従って、特異性の新規の組み合わせを示す新規のキメラポリペプチドは、レセプター−結合特異性の機能的連結から生じ得る。例えば、他の関連するレセプターホモログ分子由来のリガンド結合ドメインは、このタンパク質または関連するタンパク質のほかのドメインについて付加されてもよいしまたは置換されてもよい。得られるタンパク質は、しばしばハイブリッド機能および特性を有する。例えば、融合タンパク質は、標的ドメインを含み得、このドメインは、特定の細胞下のオルガネラに融合タンパク質の隔絶を提供するように機能し得る。
【００９４】
候補融合パートナーおよび配列は、種々の配列データベース（例えば、ＧｅｎｅＢａｎｋ，ｃ／ｏ  ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ；およびＢＣＧ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｈｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ（これらは、各々、本明細書中で参考として援用される））から選択され得る。特に、表１〜３において提供されるポリペプチド配列の組み合わせは、特に好ましい。特性の種々の形態は、記載される組み合わせにおいて置換され得る。
【００９５】
本発明は、特にムテインを提供する。このムテインは、ＯＸ２様リガンドに結合し、そして／またはシグナル伝達に影響する。ＯＸ２レセプターホモログファミリーの種々のメンバーの構造アラインメントは、保存された特色／残基を示す。例えば、表５を参照のこと。ＯＸ２Ｒホモログ配列のアライメントは、種々の構造の特色および機能的に共有された特色を示す。Ｂａｚａｎら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３７９：５９１；Ｌｏｄｉら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：１７６２−１７６６；ＳａｙｌｅおよびＭｉｌｎｅｒ−Ｗｈｉｔｅ（１９９５）ＴＩＢＳ  ２０：３７４−３７６；ならびにＧｒｏｎｅｎｂｅｒｇら（１９９１）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４：２６３−２６９もまた参照のこと。
【００９６】
マウス配列またはヒト配列を伴う置換が特に好ましい。逆に、リガンド結合相互作用領域から離れた保存的置換は、恐らくほとんどのシグナル伝達活性を保存し；そして細胞内ドメインから離れた保存的置換は、恐らくほとんどのリガンド結合特性を保存する。
【００９７】
哺乳動物ＯＸ２ＲＨの「誘導体」としては、アミノ酸配列変異体、グリコシル化改変体、代謝誘導体および他の化学部分との共有結合体または凝集接合体が挙げられる。共有結合誘導体は、例えば、当該分野で周知の手段により、ＯＸ２ＲＨアミノ酸側鎖かまたはＮ末端もしくはＣ末端において見出される基への官能基の連結により調製され得る。これらの誘導体は、限定することなく、脂肪族エステルまたはカルボキシル末端のアミドもしくはカルボキシル側鎖を含む残基のアミド、水酸基含有残基のＯ−アシル誘導体、ならびにアミノ末端のアミノ酸またはアミノ基含有残基（例えば、リジンまたはアルギニン）のＮ−アシル誘導体が挙げられる。アシル基は、Ｃ３〜Ｃ１８の通常のアルキルを含むアルキル部分の基から選択され、これによりアルカノイルアロイル種を形成する。
【００９８】
特に、グリコシル化変更が含まれ、例えば、その合成およびプロセシングの間、またはさらなるプロセシング工程においてポリペプチドのグリコシル化パターンを改変することにより為される。このことを達成するための特に好ましい手段は、このようなプロセシングを正常に提供する細胞由来のグリコシル化酵素（例えば、哺乳動物グリコシル化酵素）にポリペプチドを曝すことによる。脱グリコシル化酵素もまた、意図される。同じ初期のアミノ酸配列のバージョンもまた含まれる。このアミノ酸配列は、他の少数の改変（リン酸化アミノ酸残基（例えば、リン酸チロシン、リン酸セリンまたはリン酸スレオニン）が挙げられる）を有する。
【００９９】
誘導体の主な群は、レセプターホモログまたはポリペプチドの他のタンパク質を有するそれらのフラグメントの共有結合接合体である。これらの誘導体は、Ｎ末端融合またはＣ末端融合のような組換え培養物中または当該分野で公知の薬剤（反応性側鎖を介する架橋タンパク質におけるそれらの有用性のために）の使用により合成され得る。架橋剤との好ましい誘導体化部位は、遊離アミノ基、炭化水素部分およびシステイン残基に存在する。
【０１００】
レセプターホモログと他のホモログまたは同種タンパク質との間の融合ポリペプチドもまた提供される。同種ポリペプチドは、異なるレセプター間で融合され得、例えば、複数の異なるＯＸ２関連リガンドについての結合特異性を示すハイブリッドタンパク質または基質効果の幅広化されたか弱められた特異性を有し得るレセプターを生じ得る。同様に、異種融合物が構築され得、これは、誘導体タンパク質の特性または活性の組み合わせを示す。典型的な例は、レセプターポリペプチドの融合（例えば、レセプターのセグメントまたはドメイン（例えば、リガンド結合セグメント）を有するルシフェラーゼ）であり、その結果、所望のリガンドの存在または位置が容易に決定され得る。例えば、Ｄｕｌｌら、米国特許代４，８５９，６０９号を参照のこと（これは本明細書により参考として本明細書中で援用される）。他の遺伝子融合パートナーとしては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＴＳ）、細菌性β−ガラクトシダーゼ、ｔｒｐＥ、プロテインＡ、β−ラクタマーゼ、αアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼおよび酵母α接合因子が挙げられる。例えば、Ｇｏｄｏｗｓｋｉら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：８１２−８１６を参照のこと。標識タンパク質はしばしば、タンパク質の記載される組み合わせにおいて置換される。
【０１０１】
ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．２２：１８５９−１８６２により記載されるホスホロアミダイド方法は、適切な合成ＤＮＡフラグメントを生成する。二本鎖フラグメントは、しばしば、相補鎖を合成しそして適切な条件下で鎖を一緒にアニーリングするか、または適切なプライマー配列を有するＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖を添加するかのいずれかにより得られる。
【０１０２】
このようなポリペプチドはまた、リン酸化、硫酸化、ビオチン化、または他の部分の付加もしくは除去により化学的に改変されたアミノ酸残基（特に、リン酸基に類似する分子の形を有する部分を有するアミノ酸残基）を有し得る。いくつかの実施形態では、この改変は、有用な常識試薬であるか、または精製標的（例えば、アフィニティーリガンド）として機能する。
【０１０３】
融合タンパク質は、典型的には組換え核酸法かまたは合成ポリペプチド法のいずれかにより作成され得る。核酸操作および発現のための技術は、一般的には例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）第１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙおよびＡｕｓｕｂｅｌら（１９８７編、および定期的な補遺）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ／Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（これらは、各々、本明細書中で参考として援用される）に記載される。ポリペプチドの合成のための技術は、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５６；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３４１−３４７；およびＡｔｈｅｒｔｏｎら（１９８９）Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）に記載される。より大きいポリペプチドを作成するための方法については、Ｄａｗｓｏｎら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７７６−７７９もまた参照のこと。
【０１０４】
本発明はまた、アミノ酸配列における改変またはグリコシル化ではなく、ＯＸ２ＲＨの誘導体の使用を意図する。このような誘導体は、化学部分との共有結合的な会合または凝集会合を含み得る。これらの誘導体は、一般に以下の３つのクラスに分類される；（１）塩、（２）側鎖および末端残基の共有結合改変体、ならびに（３）吸着複合体（例えば、細胞膜との吸着複合体）。このような共有結合誘導体または凝集誘導体は、免疫原として、免疫アッセイにける試薬としてまたは免疫アッセイまたは精製方法（例えば、レセプターまたは他の結合分子（例えば、抗体）のアフィニティー精製）において有用である。例えば、ＯＸ２リガンドは、ＯＸ２ＲＨ、抗体または他の類似の分子のアッセイまたは精製における使用のために、当該分野で周知の方法により、固体支持体（例えば、臭化シアン活性化セファロース）に共有結合により固定され得るか、またはポリオレフィン表面上にグルタルアルデヒド架橋を伴ってかまたは伴わずに吸着され得る。リガンドはまた、診断アッセイにおける使用のために、検出可能な基（例えば、クロラミンＴ手順により放射性標識された基、希土類キレートに共有結合された基、または他の蛍光部分と結合体化された基）で標識され得る。
【０１０５】
本発明の組み合わせ（例えば、ＯＸ２ＲＨが挙げられる）は、例えば、他のＯＸ２レセプターホモログ間を識別し得る抗血清または抗体特異性の産生のための免疫原としてか、または所望の組み合わせ特異性についての免疫原として使用され得る。このＯＸ２ＲＨを使用して、タンパク質を含む種々の形態の不純な調製物での免疫により調製されるモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントをスクリーニングし得る。特に、用語「抗体」はまた、天然の抗体のフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆｖなど）に結合する抗原を意図する。精製されたＯＸ２ＲＨはまた、内在性レセプターホモログに対する抗体の産生を生じる上昇したレベルの発現または免疫学的障害の存在に対する応答において生成する抗体を検出する試薬として使用され得る。さらに、ＯＸ２ＲＨフラグメントはまた、直下に記載されるように本発明の抗体を産生するための免疫原として機能し、。例えば、本発明は、表１〜３において示されるアミノ酸配列、それらのフラグメントまたは種々の相同ペプチドもしくはサブセットに対する結合親和性を有する抗体、あるいはそれらに対して誘起された抗体を意図する。特に、本発明は、特定のフラグメントに対する結合親和性を有するか、または特定のフラグメントに対して誘起された抗体を意図し、この特定のフラグメントは、ネイティブなＯＸ２ＲＨのタンパク質の外側表面において曝されたことが推定されるか、実際に曝される。タンパク質の組み合わせの複合体はまた有用であり、そしてそれらに対する抗体調製物が作成され得る。
【０１０６】
レセプターリガンドに対する生理学的応答のブロッキングは、恐らくは競合阻害を介してか、または多分、抗体結合に起因するレセプター発現の下方制御を介して、レセプターへのリガンドの結合の阻害から生じ得る。従って、本発明のインビトロアッセイは、しばしば、これらの抗体もしくはこれらの抗体の抗原結合セグメントまたは固相基質に付着されたフラグメントを使用する。これらのアッセイはまた、リガンド結合領域の変異および改変、または他の変異および改変（例えば、シグナル伝達もしくは酵素機能に影響する変異および改変）のいずれかの効果の診断的決定を可能にする。
【０１０７】
本発明はまた、競合的薬物スクリーニングアッセイ（例えば、リガンドまたは他の抗体への結合について、試験化合物と競合するレセプター複合体またはフラグメントに対する抗体を中和するアッセイ）の使用を意図する。この様式で、中和抗体またはフラグメントを使用して、レセプターに対する１以上の結合部位を共有するポリペプチドの存在を検出し得る。そしてまたこれを使用して、リガンドとそれ以外に結合し得るレセプター上の結合部位を占有する。
【０１０８】
（Ｖ．核酸およびタンパク質の作製）
タンパク質コードするＤＮＡまたはそのフラグメントは、化学合成、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、または幅広い種々の細胞株または組織サンプルから調製されるゲノムライブラリーのスクリーニングによって得られ得る。天然の配列は、標準的な方法を使用して単離され得、そしてその配列は、本明細書中において、例えば、表１〜３に提供され得る。逆翻訳配列は、表４に提供される。他の種の対の部分は、ハイブリダイゼーション技術、または種々のＰＣＲ技術によって、配列データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）と組み合わせて、またはこれらのデータベースから探すことによって同定され得る。抗体は、種の対応部分に対する発現クローニングの試みにおいて使用され得る。
【０１０９】
このＤＮＡは、全長レセプターまたはフラグメント（これは、例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を生成するために使用され得る）の合成のため；結合研究のため；改変リガンド結合ドメインまたはキナーゼ／ホスファターゼドメインの構築および発現のため；および構造／機能研究のために幅広い種々の宿主細胞において発現され得る。改変体またはフラグメントは、適切な発現ベクターを用いて形質転換されるかまたはトランスフェクトされる宿主細胞において発現され得る。これらの分子は、タンパク質または細胞性混入物、組換え宿主から誘導されるもの以外のものを実質的に含み得ず、従って、薬学的に受容可能なキャリアおよび／または希釈剤と組み合わせた場合、薬学的組成物において特に有用である。タンパク質、またはその部分は、他のタンパク質の融合物として発現され得る。記載のタンパク質、またはそれらをコードする核酸の組み合わせは、特に興味深い。
【０１１０】
発現ベクターは、典型的には、所望のレセプターホモログ遺伝子またはそのフラグメントを含む自己複製ＤＮＡまたはＲＮＡ構築物であり、通常、適切な宿主細胞において認識される適切な遺伝子制御エレメントに作動可能に連結される。これらの制御エレメントは、適切な宿主内で発現を行い得る。複数の遺伝子が協調的に発現され得、ポリシストロニックメッセージ上に存在し得る。発現を行うのに必要な特定のタイプの制御エレメントは、使用される最終的な宿主細胞に依存する。一般的に、遺伝子制御エレメントは、原核生物プロモーター系または真核生物プロモーター発現制御系を含み得、典型的には、転写プロモーター、転写の開始を制御するための任意のオペレータ、ｍＲＮＡ発現のレベルを高めるための転写エンハンサー、適切なリボソーム結合部位をコードする配列、および転写および翻訳を終結する配列を含む。発現ベクターはまた、通常、複製起点を含み、この複製起点によってベクターが宿主細胞に独立して複製し得る。
【０１１１】
本発明のベクターは、上記のようなタンパク質の組み合わせ、または生物学的に活性な等価なポリペプチドをコードするＤＮＡを含むベクターである。ＤＮＡは、ウイルスプロモーターの制御下であり得、選択マーカーをコードし得る。本発明は、さらに原核生物宿主または真核生物宿主においてこのようなタンパク質をコードする原核生物ｃＤＮＡを発現し得るような発現ベクターの使用を意図し、ここで、このベクターは、宿主と適合性であり、そして真核生物ｃＤＮＡは、ベクターを含む宿主の増殖が問題のｃＤＮＡを発現するようにベクターに挿入される。通常、発現ベクターは、それらの宿主細胞における安定な複製のため、または細胞当たりの所望の遺伝子の総コピー数を大きく増加させるための増幅のために設計される。発現ベクターが宿主細胞において複製されることは、必ずしも必要ではない。例えば、宿主細胞によって認識される複製起点を含まないベクターを使用して種々の宿主においてタンパク質またはそのフラグメントの一過性発現を行うことが可能である。タンパク質をコードするタンパク質を宿主ＤＮＡに組換えによって組み込ませるベクターを使用することもまた可能である。
【０１１２】
ベクターは、本明細書で使用される場合、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組込み可能ＤＮＡフラグメント、およびＤＮＡフラグメントを宿主のゲノムに組込み得る他のビヒクルを含む。発現ベクターは、作動可能に連結された遺伝子の発現を行う遺伝子制御エレメントを含む特殊化されたベクターである。プラスミドは、最も通常使用される形態のベクターであるが、等価な機能に役立ち、当該分野において公知であるか、公知になる他の形態のベクターの全てが本明細書中での使用に適切である。例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら、（１９８５  ａｎｄ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，およびＲｏｄｒｉｇｕｅｚら、（編、１９８８）Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎを参照のこと。これらは本明細書中において参考として援用される。
【０１１３】
形質転換された細胞は、組換えＤＮＡ技術を使用して構築されたベクターを用いて形質転換されたかまたはトランスフェクトされた細胞（好ましくは、哺乳動物）である。形質転換された宿主細胞は、通常、所望のタンパク質を発現するが、そのＤＮＡをクローニング、増幅、および操作するために、対象のタンパク質を発現する必要はない。本発明は、さらに、形質転換された細胞を栄養性培地において培養する工程、従って、タンパク質を蓄積させる工程を包含する。タンパク質は、培養物から、または特定の場合には、培養培地からのいずれかから回収され得る。
【０１１４】
本発明の目的のために、核酸配列は、それらが互いに機能的に関連する場合、作動可能に連結する。例えば、プレシークエンス（ｐｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）または分泌リーダーに対するＤＮＡは、ポリペプチドを細胞膜に指向させる際またはポリペプチドの分泌の際に、プレタンパク質として発現されるかまたは関与する場合、ポリペプチドに作動可能に連結される。プロモーターは、ポリペプチドの転写を制御する場合、コード配列に作動可能に連結され；リボソーム結合部位は、翻訳を可能にするように位置付けられる場合、コード配列に作動可能に連結される。通常、作動可能に連結されるとは、連続し、リーディングフレーム内にであることを意味するが、抑制遺伝子のような特定の遺伝子エレメントは、連続的に連結されないが、オペレータ配列に結合し、次いで、これは発現を制御する。  適切な宿主細胞には、原核生物細胞、下等真核生物細胞、および高等真核生物細胞が挙げられる。原核生物には、グラム陰性生物およびグラム陽性生物の両方、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ．およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓが挙げられる。下等真核生物には、酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｎｃｈｉａ）ならびにＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ属の種が挙げられる。高等真核生物には、非哺乳動物起源（例えば、昆虫細胞、および鳥類）と哺乳動物起源（例えば、ヒト、霊長類、およびげっ歯類）との両方の動物細胞由来の、樹立組織培養細胞株が挙げられる。
【０１１５】
原核生物宿主−ベクター系は、多くの異なる種に対する幅広い種々のベクターを含む。Ｅ．ｃｏｌｉおよびそのベクターが記載されるが、等価なベクターおよび宿主が、一般的に置換され得る。ＤＮＡを増幅するための代表的なベクターは、ｐＢＲ３２２またはその誘導体の多くである。レセプターホモログまたはそのフラグメントを発現するために使用され得るベクターには、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ｌａｃプロモーター（ｐＵＣシリーズ）；ｔｒｐプロモーター（ｐＢＲ３２２−ｔｒｐ）；Ｉｐｐプロモーター（ｐＩＮシリーズ）；λ−ｐＰまたはｐＲプロモーター（ｐＯＴＳ）；またはｐｔａｃ（ｐＤＲ５４０）のようなハイブリッドプロモーターを含むようなベクター。Ｂｒｏｓｉｕｓら、（１９９８）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  Ｌａｍｂｄａ−、ｔｒｐ−、ｌａｃ−、ａｎｄ  Ｉｐｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｐｒｏｍｏｔｏｒｓ」、Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ（編、ＲｏｄｒｉｇｕｅｚおよびＤｅｎｈａｒｄｔ）、Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １０、２０５−２３６頁を参照のこと。これは、本明細書中に参考として援用される。
【０１１６】
下等真核生物（例えば、酵母およびＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）は、ベクターを含むＯＸ２ＲＨ配列によって形質転換され得る。最も一般的な下等真核生物は、パン酵母、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。多くの他の菌株および種がまた利用可能であるが、これは、下等真核生物を例示するために使用される。酵母ベクターは、典型的に、複製起源（組込み型でない場合）、選択遺伝子、プロモーター、レセプターホモログまたはそのフラグメントをコードするＤＮＡ、ならびに翻訳終結、ポリアデニル化および転写終結のための配列からなる。酵母についての適切な発現ベクターには、３−ホスホグリセレートキナーゼのような構成性プロモーター、および種々の他の解糖酵素遺伝子プロモーターまたはアルコールデヒドロゲナーゼ２プロモーターまたはメタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーターのような誘導性プロモーターが挙げられる。適切なベクターには、以下のタイプの誘導体が挙げられる：自己複製低コピー数（例えば、ＹＲｐシリーズ）、自己複製高コピー数（例えば、ＹＥｐシリーズ）；組込みタイプ（例えば、ＹＩｐシリーズ）またはミニ染色体（例えば、ＹＣｐシリーズ）。
【０１１７】
高等真核組織培養細胞は、通常、機能的に活性なＯＸ２ＲＨタンパク質の発現について好ましい宿主細胞である。特に、多くの高等真核生物組織培養細胞株（例えば、昆虫バキュロウイルス発現系）は、無脊椎供給源か脊椎動物供給源かに関わらず、操作可能である。しかし、哺乳動物細胞が好ましい。このような細胞の形質転換またはトランスフェクションおよび増殖は、慣用的な手順である。有用な細胞株の例には、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、乳児ラット腎臓（ＢＲＫ）細胞株、昆虫細胞株、トリ細胞株、およびサル（ＣＯＳ）細胞株が挙げられる。このような細胞株についての発現ベクターは、通常、複製起源、プロモーター、翻訳開始部位、ＲＮＡスプライス部位（ゲノムＤＮＡが使用される場合）、ポリアデニル化部位、および転写終結部位が挙げられる。これらのベクターはまた、通常、選択遺伝子または増幅遺伝子を含む。適切な発現ベクターは、例えば、アデノウイルス、ＳＶ４０、パルボウイルス、ワクシニア、ウイルス、またはサイトメガロウイルスからのような供給源から誘導されるプロモーターを保有するプラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスであり得る。適切な発現ベクターの代表的な例としては、ｐＣＤＮＡ１；ｐＣＤ（Ｏｋａｙａｍａら、（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：１１３６−１１４２；ｐＭＣ１ｎｅｏ  ＰｏｌｙＡ（Ｔｈｏｍａｓら、（１９８７）Ｃｅｌｌ  ５１：５０３−５１２；およびｐＡＣ３７３またはｐＡＣ６１０のようなバキュロウイルスベクターが挙げられる。
【０１１８】
分泌されたタンパク質およびいくつかの膜タンパク質について、オープンリーディングフレームは、通常、そのＮ末端において単一のペプチドに共有結合的に連結される成熟産物または分泌産物からなるポリペプチドをコードする。シグナルペプチドは、成熟、または活性なポリペプチドの分泌の前に切断される。切断部位は、経験則から高い程度の正確性でもって予測され得る。例えば、ｖｏｎ−Ｈｅｉｊｎｅ（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １４：４６８３−４６９０、およびＮｉｅｌｓｅｎら、（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１０：１−１２。単一のペプチドの正確なアミノ酸組成は、しばしば、その機能に対して決定的であるようではない。例えば、Ｒａｎｄａｌｌら、（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４３：１１５６−１１５９；Ｋａｉｓｅｒら、（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：３１２−３１７。本発明の成熟タンパク質は、標準的な方法を使用して容易に決定され得る。
【０１１９】
特定または規定のグリコシル化パターンを提供する系においてこれらのペプチドを発現することが、しばしば望ましい。この場合、通常のパターンは、発現系によって天然に提供されるパターンである。しかし、このパターンは、ポリペプチド（例えば、グリコシル化されていない形態）を、異種発現系に導入された適切なグリコシル化タンパク質に曝露することによって改変可能である。例えば、ＯＸ２ＲＨ遺伝子は、哺乳動物または他のグリコシル化酵素をコードする１つ以上の遺伝子を用いて同時形質転換され得る。このアプローチを使用して、特定の哺乳動物グリコシル化パターンが、原核生物細胞または他の細胞において達成可能である。原核生物細胞における発現は、典型的に、タンパク質の非グリコシル化形態を導く。
【０１２０】
ＯＸ２ＲＨの供給源は、例えば上記のように、組換えポリペプチドを発現する原核生物宿主または真核生物宿主であり得る。供給源はまた、細胞株であり得るが、他の哺乳動物細胞株もまた、本発明に意図され、好ましい細胞株はヒト由来である。
【０１２１】
配列が公知である以上は、霊長類ＯＸ２ＲＨ、そのフラグメント、または誘導体は、ペプチドを合成するための従来のプロセスによって調製され得る。これらには、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ（１９８４）Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ；ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＢｏｄａｎｓｚｋｙ（１９８４）Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；およびＢｏｄａｎｓｚｋｙ（１９８４）Ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されるようなプロセスが挙げられる。それぞれは全て本明細書中において参考として援用される。例えば、アジドプロセス、酸塩化物プロセス、酸無水物プロセス、混合無水物プロセス、活性エステルプロセス（例えば、ｐ−ニトロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、またはシアノメチルエステル）、カルボジイミダゾールプロセス、酸化−還元プロセス、またはジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣＤ）／添加物プロセスが使用され得る。固相合成および液相合成は、ともに、前記プロセスに適用可能である。同様な技術は、部分的なＯＸ２ＲＨ配列とともに使用され得る。
【０１２２】
ＯＸ２ＲＨタンパク質、フラグメントまたは誘導体は、典型的にはペプチド合成に使用されるような上記プロセスに従って適切に調製され、一般的には、いわゆる逐次プロセス（アミノ酸を末端アミノ酸に１つずつ順に縮合する工程を包含する）によってか、または末端アミノ酸にペプチドフラグメントを結合することによるかのいずれかによる。カップリング反応に使用されないアミノ基は、典型的に、間違った位置でのカップリング反応を防ぐように保護されなければならない。
【０１２３】
固相合成が適合する場合、Ｃ末端アミノ酸は、そのカルボキシル基を介して不溶性のキャリアまたは支持体に結合される。不溶性のキャリアは、反応性カルボキシル基に結合する能力を有するべきであり、例えば、ハロメチル樹脂（例えば、クロロメチル樹脂またはブロモメチル樹脂）、ヒドロキシメチル樹脂、フェノール樹脂、ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボニルヒドラジデート樹脂などである。
【０１２４】
アミノ基保護アミノ酸は、ペプチドを逐次的に合成するために、その活性化されたカルボキシル基および以前に形成されたペプチドまたは鎖の反応性アミノ基の縮合によって、順に結合する。完全な配列を合成した後に、ペプチドは、ペプチドを作製するために不溶性キャリアから分離される。この固相アプローチは、一般的に、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、（１９６３）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５６によって記載され、これは本明細書中において参考として援用される。
【０１２５】
調製されたタンパク質およびそのフラグメントは、例えば、抽出、沈澱、電気泳動、種々の形態のクロマトグラフィーなどによって、ペプチド分離によって反応混合物から単離および精製され得る。本発明のレセプターアナログは、所望の用途に依存して種々の程度の純度で得られ得る。精製は、標準的なタンパク質精製技術または本明細書中で免疫吸収剤アフィニティークロマトグラフィー方法で記載される抗体を使用して達成され得る。典型的には、アフィニティークロマトグラフィーは、最初に抗体を固体支持体に連結し、次いで、連結された抗体を、適切な細胞の可溶化された溶解物、ＯＸ２ＲＨを発現する他の細胞の溶解物、あるいはＤＮＡ技術の結果としてタンパク質を産生する細胞の溶解物または上清（以下を参照のこと）と接触させることによって、実施され得る。
【０１２６】
一般的に、精製されたタンパク質は、少なくとも４０％純粋、普通少なくとも約５０％純粋、通常少なくとも約６０純粋、典型的には少なくとも７０％純粋、より典型的には少なくとも約８０％純粋、好ましくは少なくとも９０％純粋、そしてより好ましくは少なくとも９５％純粋、そして特定の実施形態においては、９７％−９９％またはそれ以上である。純度は、通常、重量基準であるが、モル基準でもあってもよい。異なるアッセイは、適切に適用される。個々のタンパク質は、精製され得、その後合わせられ得る。
【０１２７】
（ＶＩ．抗体）
抗体は、種々の哺乳動物（例えば霊長類）において、ＯＸ２ＲＨタンパク質およびそのフラグメントを、天然のネイティブな形態とそれらの変性した形態の両方で惹起され得る。ネイティブなＯＸ２ＲＨに対して惹起された抗体は、ネイティブなコンフォメーションでのみ存在するエピトープを認識する傾向が強い。変性された抗原検出はまた、例えば、ウェスタン分析において有用であり得る。抗イディオタイプ抗体がまた意図され、これは、例えば、診断試薬として有用である。
【０１２８】
タンパク質の所定のフラグメントに対する抗体（結合フラグメントおよび一本の鎖の場合を含む）は、免疫原タンパク質とフラグメントの結合体を用いて動物を免疫することによって惹起され得る。モノクローナル抗体は、所望の抗体を分泌する細胞から調製される。これらの抗体は、正常または欠損したタンパク質に結合するためにスクリーニングされ得るか、またはアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性についてスクリーニングされ得る。これらのモノクローナル抗体は、通常、少なくとも約１ｍＭ、より通常では少なくとも約３００μＭ、典型的には少なくとも約１００μＭ、より典型的には少なくとも約３０μＭ、好ましくは少なくとも約１０μＭ、そしてより好ましくは少なくとも約３μＭまたはそれより良いＫDで結合する。
【０１２９】
本発明の抗体（抗原結合フラグメントを含む）は、有意な診断的または治療的価値を有し得る。これらは、レセプターホモログに結合する強力なアンタゴニストであり得、リガンドに対する結合を阻害し得るかまたは生物学的応答を誘発するレセプターホモログの能力を阻害し得る（例えば、その基質に作用する）。これらはまた、非中和抗体として有用であり得、そしてＯＸ２ＲＨ産生細胞に結合するために毒素または放射性核種に結合され得る。さらに、これらの抗体は、例えば、直接的または間接的（例えば、リンカーによって）のいずれかで、薬物または他の治療剤に結合し得る。
【０１３０】
本発明の抗体はまた、診断的用途に有用であり得る。捕捉または非中和抗体として、これらは、リガンドまたは基質結合を阻害することなく、ＯＸ２ＲＨに結合し得る。抗体を中和する場合、これらは、競合結合アッセイにおいて有用であり得る。これらはまた、リガンドを検出または定量する際に有用である。これらは、ウェスタンブロット分析、あるいは免疫沈降またはそれぞれのタンパク質の免疫精製のための試薬として使用され得る。同様に、核酸およびタンパク質は、アフィニティー精製または検出方法のために固体基板に固定化され得る。この基板は、例えば、固体樹脂ビーズ、プラスチックのシート、または誘導体ガラスであり得る。
【０１３１】
タンパク質フラグメントは、他の物質、特にポリペプチドに融合ポリペプチドまたは共有結合ポリペプチドとして結合され得、免疫原として使用される。哺乳動物ＯＸ２ＲＨポリペプチドおよびフラグメントは、種々の免疫原、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、ウシ血清アルブミン、破傷風トキソイドなどのような種々の免疫原に融合または共有結合され得る。Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｏｅｂｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，ＨａｒｐｅｒおよびＲｏｗ，１９６９；Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ（１９６２）Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｖ  ｏｆ  Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｄｏｖｅｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ならびにＷｉｌｌｉａｍｓら、（１９６７）Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．１，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。これらのそれぞれは、本明細書中に参考として援用される。典型的な方法は、抗原を用いる動物の超免疫化を含む。次いで、動物の血液は、繰り返される免疫化のすぐ後に回収され、血清またはガンマグロブリンが単離される。
【０１３２】
いくつかの場合において、マウス、げっ歯類、霊長類、ヒトなどのような種々の哺乳動物宿主からモノクローナル抗体を調製することが望ましい。このようなモノクローナル抗体を調製するための技術の説明は、例えば、Ｓｔｉｔｅｓら（編）Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４版）Ｌａｎｇｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ  Ａｌｔｏｓ，ＣＡ、Ｌａｎｇｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ  Ａｌｔｏｓ，ＣＡ、およびそれに引用される参考文献；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ
ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；ならびに特にＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７を参照のこと（これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）。簡単には、免疫原を、免疫応答を引き起こすために、動物に注射する。次いで、動物を屠殺し、そして細胞をその脾臓から採取し、ミエローマ細胞と融合し、ハイブリドーマを生成させる。次いで、ハイブリドーマの集団をスクリーニングして、個々のクローンを単離し、これらは免疫原に結合する抗体を分泌する。
【０１３３】
他の適切な技術には、抗原性ポリペプチドに対するリンパ球のインビトロでの曝露、またはファージまたは類似のベクターにおいて抗体のライブラリーの選択を伴う。Ｈｕｓｅら（１９８９）「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｌａｒｇｅ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｉｎ  Ｐｈａｇｅ  Ｌａｍｂｄａ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；およびＷａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６を参照のこと（これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）。キメラ抗体またはヒト化抗体が、産生され得るか（米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）；またはマウスにおいて作製され得る（Ｍｅｎｄｅｚら、（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１５：１４６−１５６を参照のこと）。これらの参考文献は、本明細書中で参考として援用される。
【０１３４】
ポリペプチドおよび抗体は、頻繁に標識される。広範な種々の標識および結合技術が公知であり、そして科学および特許文献の両方に広く報告される。適切な標識としては、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光部分、化学発光部分、磁性粒子などが挙げられる。このような標識の使用を教示する特許には、例えば、米国特許第３，８１７，８３７号；第３，８５０，７５２号；第３，９３９，３５０号；第３，９９６，３４５号：第４，２７７，４３７号；第４，２７５，１４９号；および第４，３６６，２４１号が挙げられる。
【０１３５】
本発明の抗体はまた、ＯＸ２ＲＨタンパク質またはペプチドを単離する際のアフィニティークロマトグラフィーのために使用され得る。カラムが調製され得、ここで、抗体は、固体支持体、例えば、粒子（例えば、アガロース、Ｓｅｐｈａｄｅｘなど）に連結され、ここで、細胞溶解物がカラムを通過し得、カラムが洗浄され、次いで穏和な変性剤の濃度を上昇させ、それによって精製したタンパク質が放出される。あるいは、タンパク質を用いて抗体を生成し得る。適切な交叉吸着または枯渇が適用され得る。
【０１３６】
抗体はまた、特定の発現産物について発現ライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。通常、このような手順で使用される抗体を部分で標識し、抗体結合による抗原の存在の検出を容易にし得る。
【０１３７】
ＯＸ２ＲＨタンパク質に対する抗体はまた、抗イディオタイプ抗体を惹起するために用いられる。これらは、このタンパク質の発現またはこのタンパク質を発現する細胞に関する種々の免疫学的状態を検出または診断するために有用である。これらはまたリガンドのアゴニストまたはアンタゴニストとして有用である。これらは、インヒビターと競合し得るか、または天然に存在するリガンドに置換される。
【０１３８】
配列番号２のアミノ酸配列からなる免疫原のような、規定された免疫原に対して産生された抗体に特異的に結合するか、または特異的に免疫反応性であるレセプターホモログタンパク質は、代表的には、イムノアッセイで決定される。イムノアッセイは、代表的には、例えば、配列番号２のタンパク質に対して惹起されたポリクローナル抗血清を使用する。この抗血清を、他のＩｇスーパーファミリーレセプターメンバー（例えば、ＮＫＧ２Ｄ、好ましくは、同じ種由来）に対する低い交差反応性を有するように選択し、そして任意のこのような交差反応性を、イムノアッセイでの使用前に免疫吸着によって取り出す。
【０１３９】
イムノアッセイにおける使用のための抗血清を産生するために、例えば、配列番号２のタンパク質を、本明細書に記載のように単離する。例えば、組換えタンパク質は、哺乳動物細胞株で産生され得る。ＢＡＬＢ／ｃのような近交系のマウスに、代表的には、フロイントアジュバントのような標準的アジュバント、および標準的マウス免疫プロトコル（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出を参照のこと）を使用して、選択されたタンパク質で免疫接種する。あるいは、本明細書に開示された配列に由来しそしてキャリアタンパク質に結合した合成ペプチドを、免疫原に使用し得る。ポリクローナル血清を回収し、そしてイムノアッセイ、例えば、固体支持体に固定した免疫原との固相イムノアッセイにおいて、免疫原タンパク質に対して滴定する。１０4以上の力価のポリクローナル抗血清を選択し、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，前出の５７０〜５７３頁に記載のような競合結合イムノアッセイを使用して、Ｉｇスーパーファミリーレセプターメンバーに対する交差反応性についてテストする。好ましくは、少なくとも２つのレセプターファミリーメンバーをこの決定に使用する。これらのレセプターファミリーメンバーを、組換えタンパク質として産生し、そして本明細書に記載のように標準的分子生物学技術およびタンパク質化学技術を使用して単離し得る。
【０１４０】
競合結合形式におけるイムノアッセイを、交差反応性決定について使用し得る。例えば、配列番号２のタンパク質を、固体支持体に固定し得る。アッセイに添加されるタンパク質は、固定された抗原への抗血清の結合と競合する。固定されたタンパク質への抗血清の結合と競合する上記タンパク質の能力を、このタンパク質と比較する。上記タンパク質のパーセント交差反応性を、標準的計算を使用して計算する。上記に列挙したタンパク質のそれぞれと１０％未満の交差反応性を有する抗血清を選択しそしてプールする。次いで、交差反応する抗体を、上記のタンパク質との免疫吸着によって、プールした抗血清から取り出す。
【０１４１】
次いで、免疫吸着しそしてプールした抗血清を、免疫原タンパク質（例えば、配列番号２のＯＸ２ＲＨ１様タンパク質）に対して第２のタンパク質を比較するために、上記のように競合結合イムノアッセイで使用する。この比較を作成するために、２つのタンパク質を、広範な濃度でそれぞれアッセイし、そして固定されたタンパク質への抗血清の結合の５０％を阻害するために必要とされる各タンパク質の量を決定する。必要とされる第２のタンパク質の量が、必要とされる選択されたタンパク質のタンパク質の量の２倍未満である場合、第２のタンパク質は、免疫原に対して産生された抗体に特異的に結合するといわれる。
【０１４２】
これらのＯＸ２レセプターホモログタンパク質は、少なくとも６のこれまで同定された遺伝子を含むホモログタンパク質のファミリーのメンバーであることが理解される。特定のＯＸ２ＲＨ１のような遺伝子産物について、この用語は、本明細書中に開示されるアミノ酸配列をいうのみならず、対立遺伝子改変体、非対立遺伝子改変体、または種改変体である他のタンパク質もまたいう。この用語は、単一の部位の変異のような従来の組換え技術を用いる故意の変異より、あるいはそれぞれのタンパク質をコードするＤＮＡの短いセクションを切除することにより、あるいは新規のアミノ酸を置換すること、または新規のアミノ酸を付加することにより、導入された非天然のタンパク質を含む。このようなマイナーな変化は、代表的には、本来の分子の免疫原性および／またはその生物学的活性を実質的に維持する。従って、これらの変化は、設計された天然に存在するＯＸ２ＲＨタンパク質に特異的に免疫反応性であるタンパク質を含む。変化したタンパク質の生物学的活性は、適切な細胞株においてタンパク質を発現させ、そして例えば、トランスフェクトさせたタンパク質に対する適切な効果を測定することによって、決定され得る。マイナーとみなされる特定のタンパク質修飾は、全体としてレセプターホモログファミリーについて上記に記載されるような、アミノ酸の類似の化学特性での保存的置換を含む。必要に応じて、レセプターホモログのタンパク質とあるタンパク質を整列させることにより、および免疫同一性を決定するために本明細書中に記載される従来のイムノアッセイを用いることにより、本発明のタンパク質組成物を決定し得る。
【０１４３】
（ＶＩＩ．キットおよび定量）
本発明のレセプター様分子の天然に存在するおよび組換えの両方の形態とも、キットおよびアッセイ方法に、特に有用である。例えば、これらの方法はまた、結合活性（例えば、これらのタンパク質に対するリガンド）についてスクリーニングするために適用される。自動化アッセイのいくつかの方法は、年間、数万の化合物のスクリーニングを可能にするように、近年開発されている。例えば、ＢＩＯＭＥＫ自動化ワークステーション、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、およびＦｏｄｏｒら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７６７−７７３を参照のことこれらは本明細書中で参考として援用される）。後者は、固体基材上で合成された複数の規定されたポリマーにより結合を試験するための手段を記載する。アゴニスト／アンタゴニストホモログタンパク質をスクリーニングするための適切なアッセイの開発は、本発明によって提供されるような大量の精製された、活性状態での可溶性レセプターの利用可能性によって、非常に容易にされ得る。
【０１４４】
精製されたＯＸ２ＲＨは、上記のリガンドスクリーニング技術における使用のためにプレート上に直接コーティングされ得る。しかし、これらのタンパク質に対する非中和抗体は、例えば、診断用途において有用である、固体支持体上のそれぞれのレセプターホモログを固定するための捕捉抗体として用いられ得る。
【０１４５】
本発明はまた、タンパク質またはそのリガンドの存在を検出するための種々の診断キットおよび方法における、これらのＯＸ２ＲＨ、そのフラグメント、ペプチド、およびそれらの融合産物の使用を意図する。あるいは、この分子に対する抗体は、キットおよび方法に取り込まれ得、ＯＸ２ＲＨまたはそれを発現する細胞を定量する際に用いられ得る。代表的には、キットは、ＯＸ２ＲＨペプチドまたは遺伝子セグメントまたは１つもしくは他を認識する試薬のいずれかを含むコンパートメントを有する。代表的には、認識試薬は、ペプチドの場合、レセプターホモログまたは抗体であるか、あるいは、遺伝子セグメントの場合、通常、ハイブリダイゼーションプローブである。
【０１４６】
サンプルにおけるＯＸ２ＲＨの濃度を決定するための好ましいキットは、代表的には、標識化合物（例えば、リガンドまたは抗体（これらは、ＯＸ２ＲＨに対する公知の結合アフィニティーを有する））、陽性コントロールとしてのＯＸ２ＲＨの供給源（天然または組換え）、および遊離の標識リガンドから結合体を分離する手段（例えば、試験サンプル中のＯＸ２ＲＨを固定するための固相）を備える。試薬および指示書を含むコンパートメントは、通常提供される。適切な核酸またはタンパク質を含むキットもまた提供される。
【０１４７】
哺乳動物ＯＸ２ＲＨまたはフラグメント、あるいはレセプターホモログフラグメントに特異的な、抗原結合フラグメントを含む、抗体は、ホモログおよび／またはフラグメントの上昇したレベルの存在を検出するための診断適用において有用である。診断アッセイは、均質（遊離の試薬と抗原−抗体複合体との間の分離工程を伴わない）または不均質（分離工程を伴う）であり得る。種々の市販のアッセイが存在し、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫検定法（ＥＩＡ）、多元酵素免疫検定法（ＥＭＩＴ）、基質標識蛍光イムノアッセイ（ＳＬＦＩＡ）などである。例えば、非標識抗体を、標識され、そしてレセプターホモログまたはその特定のフラグメントに対する抗体を認識する、第二の抗体を使用することによって、用い得る。これらのアッセイはまた、文献で広く議論されている。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ．、およびＣｏｌｉｇａｎ（１９９１編および定期的補遺）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｅｅｎｅ／Ｗｉｌｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。
【０１４８】
抗イディオタイプ抗体は、レセプターホモログのアゴニストまたはアンタゴニストとしての役割を果たすための類似の用途を有し得る。これらは、適切な環境下での治療薬として有用である。
【０１４９】
頻繁に、診断アッセイのための試薬は、そのアッセイの感度を最適にするように、キット中に供給される。本発明については、アッセイの性質に依存して、プロトコル、および標識、標識されたまたは標識されていない抗体のいずれか、あるいは標識されたリガンドが提供される。これは、通常、緩衝剤、安定化剤、酵素に対する基質のようなシグナル産生に必要な物質などのような、他の添加物とともに存在する。好ましくは、このキットはまた、適切な使用および使用後の内容物の処理のついての指示書を含む。代表的には、このキットは、各有用な試薬のためのコンパートメントを有し、そして試薬の適切な使用および使用後の内容物の処理のついての指示書を含む。望ましくは、この試薬が、アッセイを行うための試薬の適切な濃度を有する水性媒体中で再構成され得る場合、試薬は、凍結乾燥した粉末として提供される。
【０１５０】
薬物スクリーニングの上記の構成成分は、改変なしで使用され得るか、あるいは種々の方法で改変され得る。例えば、標識することは、検出可能なシグナルを直接または間接的に提供する部分を共有結合または非共有結合によって達成され得る。これらのアッセイの多くでは、試験化合物、レセプターホモログ、またはそれに対する抗体は、直接にまたは間接的にのいずれかで標識され得る。直接的に標識するための可能性は、以下の標識群を包含する：125Ｉのような放射性標識、ペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼのような酵素（米国特許第３，６４５，０９０号）、および蛍光強度、波長シフト、または蛍光極性化の変化をモニタリングし得る蛍光標識（米国特許第３，９４０，４７５号）。これらの特許の両方は、本明細書中に参考として援用される。間接的に標識するための可能性は、１つの構成成分のビオチン化、次いで上記の標識群の１つにカップリングしたアビジンに結合することを包含する。
【０１５１】
また、遊離のリガンドから結合したものを、あるいは遊離の試験化合物から結合したものを分離する多くの方法がある。レセプターホモログは、種々のマトリクス上に固定され得、続いて洗浄され得る。適切なマトリクスには、ＥＬＩＳＡプレートのようなプラスチック、フィルター、およびビーズが挙げられる。マトリクスにレセプターホモログを固定する方法には、限定することなく、プラスチックへの直接付着、捕獲抗体の使用、化学的カップリング、およびビオチン−アビジンが挙げられる。このアプローチの最後の工程は、例えば、ポリエチレングリコールのような有機溶媒、または硫酸アンモニウムのような塩を利用する方法を含む、いくつかの方法のいずれかによって、抗体／抗原複合体の沈降を包含する。他の適切な分離技術には、限定することなく、Ｒａｔｔｌｅら（１９８４）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３０：１４５７−１４６１に記載のフルオレセイン抗体磁化粒子方法、および米国特許第４，６５９，６７８号に記載のような二重抗体磁性粒子分離方法が挙げられる（これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）。
【０１５２】
種々の標識へタンパク質またはそのフラグメントを連結する方法は、文献に広く報告されており、そして本明細書での詳細な議論の必要はない。その技術の多くは、ペプチド結合を形成するためにカルボジイミドまたは活性エステルのいずれかの使用により活性化されたカルボキシル基の使用、連結のためのクロロアセチルのような活性化ハロゲンまたはマレイミドのような活性化オレフィンとメルカプト基の反応によるチオエーテルの形成などを包含する。融合タンパク質はまた、これらの適用における使用を見い出す。
【０１５３】
本発明の別の診断局面は、レセプターホモログの配列から得たオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列の使用を包含する。これらの配列は、免疫学的障害を有する疑いのある患者においてそれぞれのレセプターホモログのレベルを検出するためのプローブとして使用され得る。ＲＮＡおよびＤＮＡの両方のヌクレオチド配列の調製、配列の標識化、およびその配列の好ましいサイズは、文献において広い説明および議論を受け入れている。通常は、オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも約１４ヌクレオチド、通常は少なくとも約１８ヌクレオチドを有するべきであり、そしてポリヌクレオチドプローブは、数キロ塩基までであり得る。種々の標識は、最も普通には、放射性核種、特に32Ｐを用い得る。しかし、他の技術もまた、例えば、ポリヌクレオチドへの導入のためのビオチン改変ヌクレオチドを使用して、用いられ得る。次いで、そのビオチンは、アビジンまたは抗体に結合するための部位として作用し、これは、放射性核種、蛍光団、酵素などのような広範な種々の標識で標識され得る。あるいは、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖、またはＤＮＡ−タンパク質二重鎖を含む、特定の二重鎖を認識し得る抗体が用いられ得る。次いで、その抗体が標識され得、そして二重鎖が表面に結合される場合、その結果、表面上の二重鎖の形成の際に、二重鎖へ結合した抗体の存在が検出され得るアッセイを行い得る。新規のアンチセンスＲＮＡに対するプローブの使用は、核酸ハイブリダイゼーション、プラスおよびマイナススクリーニング、組換えプロービング、ハイブリッド放出翻訳（ＨＲＴ）、およびハイブリッド停止翻訳（ＨＡＲＴ）のような従来の任意の技術において行われ得る。これはまた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅技術を包含する。
【０１５４】
他のマーカーの定性的または定量的な存在についてもテストする診断キットも意図される。診断または予後は、マーカーとして使用される多数の指標の組み合わせに依存し得る。したがって、キットは、マーカーの組み合わせについてテストし得る。例えば、Ｖｉａｌｌｅｔら（１９８９）Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｓ．１：８９−９７を参照のこと。
【０１５５】
（ＶＩＩＩ。治療的有用性）
本発明は、有意な治療的価値を有する試薬を提供する。例えば、Ｌｅｖｉｔｚｋｉ（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８：２３９−２４４を参照のこと。レセプターホモログ（天然に存在するまたは組換え）、そのフラグメント、ムテインレセプター、および抗体は、レセプターホモログまたは抗体に結合親和性を有すると同定された化合物と共に、骨髄系統細胞の機能の調節が所望される状態の処置において有用である。このような異常は、代表的には、免疫学的障害により、また骨髄細胞活性が生理学的プロセス（例えば、ＣＮＳ成熟または発達など）に影響する状態によりまた明かとなる。さらに、本発明は、異常な発現またはリガンドに対する応答の異常な誘発と関連する種々の疾患または障害において、治療的価値を提供する。
【０１５６】
マクロファージ／骨髄系統細胞を含み、ＯＸ２Ｒを発現する白血球が症状に関与し、かつ疾患プロセスに寄与する場合では、これらの細胞の機能を阻害することが所望され得る。これは、レセプターシグナル伝達の細胞阻害活性が動員されるような、ＯＸ２Ｒの適切な刺激により達成され得る。このことは、例えば、リガンドＯＸ２アゴニストまたはレセプターに対するアゴニスト活性を有するＯＸ２Ｒに対する抗体を用いて達成され得る。適切な状態は、動物が炎症、白血球増殖、または外傷後の状態の兆候または症状である。好ましい実施形態では、この兆候または症状は、天然の組織；リンパ組織；骨髄組織；膵臓；胃腸組織；甲状腺組織；筋組織；または皮膚もしくはコラーゲン組織においてである。特定の実施形態は、動物が自己免疫；炎症状態；組織特異的自己免疫；変性性自己免疫；慢性関節リウマチ；アテローム性動脈硬化症；多発性硬化症；脈管炎；遅延型過敏症；皮膚移植；移植；脊椎損傷；発作；神経変性；または虚血の兆候または症状を経験している。投与する薬剤は、抗炎症性サイトカインアゴニストまたはアンタゴニスト；鎮痛薬；抗炎症剤；またはステロイドとの組合わせであり得る。
【０１５７】
対照的に、白血球（マクロファージ／骨髄系列細胞を含む）の場合、ＯＸ２Ｒを発現することは、免疫化およびワクチン化、修復機構、病理特定、または感染制御（特に細菌感染）のプロセスに関与する。これらの細胞の機能を増強することが望まれ得る。これは、ＯＸ２Ｒの適切な刺激により治療上獲得され得、その結果、レセプターシグナル伝達の細胞活性化活性が動員されるか、またはＯＸ２−ＯＸ２Ｒの相互作用を完全にブロックすることにより細胞活性化を進行させ得る。後者はリガンドＯＸ２遺伝子ノックアウトマウスにおいて生じる。このマウスではリガンドＯＸ２を欠き、骨髄細胞活性化が導かれる。これは、例えば以下を用いて獲得され得る：リガンドＯＸ２アンタゴニスト（例えば、リガンドＯＸ２に対する抗体）ＯＸ２−ＯＸ２Ｒ相互作用を阻害するＯＸ２Ｒに対する抗体、ＯＸ２Ｒ発現を阻害し得るアンチセンス核酸、細胞結合ＯＸ２が細胞結合ＯＸ２Ｒと相互作用する能力を（例えば、競合結合により）ブロックするＩｇ−ＯＸ２Ｒ融合タンパク質、または低分子アンタゴニスト。この様式が骨髄細胞機能の促進においてインビボで適用を有するということは、実験により実証されている。この実験とは、例えば、ヒトＩｇＧマウスＯＸ２ＲＨ１融合タンパク質（マウスＯＸ２に結合することが公知）を産生するアデノウイルス構築物のマウスへの静脈注射が、これらのマウスにおいて自己免疫疾患実験の自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の発現を、ヒトＩｇＧ融合タンパク質骨格のみを産生するアデノウイルス構築物を投与されたマウスを比べて、加速することである。疾患加速の程度は、ＯＸ２Ｒ（ＯＸ２と名付けられる）のリガンドを遺伝子標的化により不活性化したマウスにおいてみられる加速の程度に匹敵した。
【０１５８】
あるいは、本明細書において記載される種々のＯＸ２Ｒ分子が、活性化対阻害の機能を有する場合、細胞活性化を誘導するＯＸ２Ｒの特異的活性化が適切であり得る。これは、例えば、所与のＯＸ２Ｒのアゴニスト活性を有する特異的抗体の使用により達成され得る。種々の実施形態において、動物が創傷治癒または血餅形成の兆候または症状（ここでは、マクロファージ活性化の増強が所望され得る）を経験する方法、または動物が細菌感染（ここでは、顆粒球および／またはマクロファージによる食細胞活性の増強が好ましい）を経験する方法が適用される。投与は、しばしば以下と組み合わせられる：脈管形成因子；増殖因子（ＦＧＦまたはＰＤＧＦを含む）；抗生物質；または凝固因子。組換えレセプター、ムテイン、それに対するアゴニストまたはアンタゴニストの抗体、または抗体が精製され得、次いで患者に投与される。これらの試薬は、治療用途のためにさらなる活性成分とともに組み合わせられ得る（例えば、生理学的に無害の安定化剤および賦形剤とともに、従来の受容可能なキャリアまたは希釈剤中で）。これらの組み合わせは、例えば、濾過により滅菌され得、そして投与バイアル中の凍結乾燥により投薬形態に入れられ得、または安定化水性調製物中に貯蔵され得る。本発明はまた、抗体またはその結合フラグメント（補体結合ではない）の使用を意図する。
【０１５９】
レセプターまたはそのフラグメントを用いるリガンドスクリーニングを実行して、レセプターに対する結合親和性を有する分子を同定し得る。次いで、引き続く生物学的アッセイを利用して、推定リガンドが競合結合（内因性刺激活性をブロックし得る）を提供し得るか否かを決定し得る。レセプターフラグメントは、ブロッカーまたはアンタゴニストとして用いられ得る。すなわち、レセプターフラグメントは、リガンドの活性をブロックする。同様に、内因性刺激活性を有する化合物は、レセプターを活性化し得、従って、アゴニストである。すなわち、この化合物はリガンドの活性を刺激する（例えば、シグナル伝達を誘導する）。本発明はさらに、アンタゴニストとして、レセプターに対する抗体の治療的使用を意図する。
【０１６０】
効果的な治療に必要な試薬の量は、多くの異なる因子に依存する。この因子としては、投与手段、標的部位、試薬の生理学的寿命、薬理学的寿命、患者の生理学的状態、および投与される他の医薬が挙げられる。従って、処置投薬量を滴定して、安全性および効率を最適化すべきである。代表的には、インビトロで用いられる投薬量は、これらの試薬のインサイチュ投与に有用な量で、有用なガイダンスを提供し得る。特定の障害の処置のために有効な用量の動物試験により、ヒト投薬量のさらなる予想的指標を提供する。例えば、Ｇｉｌｍａｎら（１９９０編）Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ‘ｓ：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第８版．，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１７版（１９９０），Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎ．；（これらそれぞれは、本明細書において参考として援用されている）において、種々の考察が記載されている。投与の方法は、それらおよび以下において考察されている（例えば、経口投与、静脈投与、腹腔内投与、または筋肉内投与、経皮拡散、などについて）。薬学的に受容可能なキャリアとしては、水、生理食塩水、緩衝液、および他の化合物（例えば、Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙが挙げられる。投薬範囲は、適切なキャリアとともに、濃度１００ｍＭ未満、代表的には約１ｍＭ濃度未満、通常、約１００μＭ未満、好ましくは、約１μＭ未満、そして最も好ましくは、約１０ｎＭ未満の量であることが通常、期待される。徐放性処方物または徐放性装置は、しばしば持続投与のために利用される。
【０１６１】
レセプターホモログ、そのフラグメント、および抗体またはそのフラグメント、アンタゴニスト、およびアゴニストが、処置されるべき宿主に直接投与され得る、または化合物のサイズに依存して、それらを、投与の前に、オボアルブミンまたは血清アルブミンのようなキャリアタンパク質と結合体化することが所望され得る。治療的処方物は、多くの従来の投薬処方物中で投与され得る。活性成分が単独で投与されることは可能であるが、薬学的処方物として存在することが好ましい。処方物は、１つ以上のその受容可能なキャリアとともに、上記で規定されたように、少なくとも１つの活性成分を含む。各々のキャリアは、他の成分と適合するという意味で薬学的に受容可能かつ生理学的に受容可能の両方であり、そして患者に無害でなければならない。処方物は、経口投与、直腸投与、経鼻投与、または非経口投与（皮下、筋肉内、静脈および皮内を含む）に適切な処方物を含む。処方物は、単位投薬形態中に都合よく存在し得、そして製薬の当業者に周知の方法により調製され得る。例えば、Ｇｉｌｍａｎら（１９９０編）Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第８版、Ｐｅｒｇａｍｏｎ
Ｐｒｅｓｓ；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１７版（１９９０）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎ．；Ａｖｉｓら、（１９９３編）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編、１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ  Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ；およびＬｉｅｂｅｒｍａｎら（１９９０編）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ；Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹを参照のこと。本発明の治療は、他の治療剤と組み合わせられ得るか、または他の治療剤（特に他のレセプターファミリーメンバーのアゴニストまたはアンタゴニスト）と関連して用いられ得る。
【０１６２】
（ＩＸ．スクリーニング）
ＯＸ２ＲＨまたはそのフラグメントを用いる薬物スクリーニングを実行して、レセプターホモログに対する結合親和性を有する化合物を同定し得る。この工程には関連コンポーネントの単離を含む。次いで引き続く生物学的活性を利用して、この化合物が固有の刺激活性を有するか否か、従ってブロッカーまたはアンタゴニスト（すなわち、この化合物がリガンドの活性をブロックする）であるか否かを決定し得る。同様に、固有の刺激活性を有する化合物は、レセプターを活性化合物し得、従ってアゴニストである。すなわち、この化合物はリガンド（例えば、ＯＸ２）の活性を刺激する。本発明はさらに、アゴニストまたはアンタゴニストとして、レセプターに対する抗体の治療的使用を意図する。
【０１６３】
同様に、複数のタンパク質を含む複合体を用いて、この複合体を認識し得るリガンドまたは試薬をスクリーニングし得る。いくつかのレセプターは、少なくとも２つのサブユニット（同じであっても異なっても良い）を含む。あるいは、膜貫通レセプターは、別の可溶性タンパク質（例えば、第二のレセプターサブユニットとして働く）に会合するリガンドを含む複合体に結合し得る。
【０１６４】
薬物スクリーニングの１つの方法には、別のレセプターサブユニットと組み合わせて、ＯＸ２ＲＨを発現する組換えＤＮＡ分子で安定に形質転換されている、真核生物宿主細胞または原核生物宿主細胞を利用する。他の機能的レセプターからの単離物中にレセプターを発現する細胞を単離し得る。このような細胞（生存に適した形態または固定形態のいずれか）を、標準的抗体／抗原、またはリガンド／レセプター結合アッセイに用い得る。また、Ｐａｒｃｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：２４３〜２４７；およびＯｗｉｃｋｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：４００７〜４０１１（細胞性応答を検出する敏感な方法を記載する）を参照のこと。競合アッセイは、特に有用である。競合アッセイでは、細胞（推定リガンドの供給源）を、リガンドに対する既知の結合親和性を有する、標識したレセプターまたは抗体（例えば、125Ｉ抗体）、ならびに試験サンプル（結合組成物に対するその結合親和性が測定されている）と接触させ、一緒にインキュベートする。次いで、結合された標識化結合組成物および遊離の標識化結合組成物を分離して、リガンド結合の程度を評価する。試験化合物結合の量は、公知の供給源への標識化レセプター結合の量に対して逆比例する。多くの技術を用いて遊離のリガンドからの結合を分離し、リガンド結合の程度を評価する。この分離工程は代表的に、フィルターへの結合、その後の洗浄、プラスチックに対する結合その後の洗浄、または細胞膜の遠心分離のような手順を包含する。生存細胞はまた、ＯＸ２媒介機能への薬物の効果（例えば、セカンドメッセンジャーレベル、すなわち、Ｃａ＋＋；細胞増殖；イノシトールリン酸プール変化；など）についてスクリーニングするために用いられ得る。いくつかの検出方法により、分離工程（例えば、近接鋭敏検出システム）の排除が可能になる。カルシウム感受性色素は、蛍光定量計または蛍光発光細胞ソーティング装置を用いてＣａ＋＋レベルを検出するのに有用である。
【０１６５】
（Ｘ．リガンド）
本明細書のＯＸ２Ｒの記載により、上記のようにリガンド同定のための手段を提供する。このようなリガンドは、かなり高い親和性を有するそれぞれのレセプターに対して特異的に結合するはずである。種々の利用可能な構築物が作製される。これは、リガンドを検出するためのレセプターのいずれかの標識化を可能にする。例えば、二次標識化のためのマーカー（例えば、ＦＬＡＧまたは他のエピトープタグなど）に融合する、直接標的化レセプターは、レセプターの検出を可能にする。この工程は、発現クローニングアプローチにおける、組織学的（生化学的アフィニティー精製方法）、または標識化もしくは選択であり得る。ツーハイブリッド選択システムもまた、利用可能なレセプター配列を有する適切な構築物を作製するのに適用され得る。例えば、ＦｉｅｌｄおよびＳｏｎｇ（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５〜２４６を参照のこと。
【０１６６】
本発明の広範な範囲は以下の実施例を参考して最も理解される。以下の実施形態は、特定の実施形態に対して本発明が限定されることを意図しない。
【０１６７】
（実施例）
（Ｉ．一般的方法）
いくつかの標準的方法が、以下において記載されるかまたは参照される：Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（第２版）、第１〜３巻、ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；またはＡｕｓｂｅｌら、（１９８７および補遺）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｒｅｎｅ／Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。タンパク質精製の方法としては、硫酸アンモニウム沈殿、カラムクロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、結晶化などのような方法が挙げられる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９８７および定期補遺）；Ｃｏｌｉｇａｎら（１９９６編）および定期補遺、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」Ｇｒｅｅｎｅ／Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ（１９９０）「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８２巻およびこのシリーズの他の巻；およびタンパク質精製産物の使用における製造業者の文献、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．、またはＢｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡを参照のこと。組み換え技術との組み合わせにより、適切なセグメント（例えば、プロテアーゼ切り取り可能配列を介して融合され得る、ＦＬＡＧ配列または等価物）に対する融合が可能になる。例えば、Ｈｉｃｈｕｌｉ（１９９０）「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｍｅｔａｌ  Ｃｈｅｌａｔｅ  Ａｂｓｏｒｂｅｎｔ」Ｓｅｔｌｏｗ（編）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２：８７〜９８、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；ａｎｄ  Ｃｒｏｗｅら（１９９２）ＯＩＡｅｘｐｒｅｓｓ：Ｔｈｅ  Ｈｉｇｈ  Ｌｅｖｅｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ＆Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＱＵＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡを参照のこと。
【０１６８】
コンピューター配列分析を、例えば、利用可能なソフトウェアプログラム（ＧＣＧ（Ｕ．Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を含む）およびＧｅｎＢａｎｋ供給源を用いて実行する。公的な配列データベースをまた、ＧｅｎＢａｎｋなどから用いる。
【０１６９】
ＩＬ−１０レセプターに対して適用可能な多くの技術を、例えば、参考として本明細書に援用されるＵＳＳＮ  ０８／１１０，６８３（ＩＬ−１０レセプター）に記載のように、ＯＸ２ＲＨに適用し得る。
【０１７０】
（ＩＩ．マクロファージへのラットＯＸ２／ＯＸ２ＲＨの相互作用をブロックするモノクローナル抗体）
組換えＯＸ２−ＣＤ４タンパク質およびラット腹膜マクロファージを用いてビーズアッセイをセットアップする。Ｐｒｅｓｔｏｎら（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：１９１１〜１９１８を参照のこと。マクロファージは、組換えＯＸ２−ＣＤ４タンパク質で被覆された蛍光ビーズに結合した。６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、０．１〜０．２５ｍｇの粗膜画分（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＢａｒｃｌａｙ（１９８６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ第１巻、２２．１−２２．２４，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）かまたは常在ラット腹膜滲出細胞（５百万）のいずれかで、６回免疫した。間接的免疫蛍光およびフローサイトメトリーによって、マクロファージの標識化について種々の稀釈の血清を試験することにより、マクロファージを認識する高力価の抗体について、マウスをスクリーニングした。ラットマクロファージに対する良好な免疫反応を生じるマウスを、腹膜滲出細胞の注射により最終的にブーストした。４日後、脾臓を取り出し、そしてＮＳ−１骨髄細胞に融合してハイブリドーマを生成した。スクリーニング前の最終注射は、脾臓内に行った。ハイブリドーマ上清を、ラットマクロファージに対する標識化能について、およびマクロファージとのラットＯＸ２相互作用をブロックする能力について、スクリーニングした。１つの抗体（ＯＸ１０２と命名された）を獲得して、クローニングした。この抗体は、明白なブロッキングを付与した。このハイブリドーマをバルク中で増殖させ、そして標準的手順を用いて抗体を精製した。
【０１７１】
（ＩＩＩ．ＯＸ１０２  ｍＡｂについての抗原の精製）
精製したＯＸ１０２  ｍＡｂを、製造業者により推薦されたように、ＣＮＢｒ活性化セファロース−４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に共有結合する。Ｔｗｅｅｎ４０およびデオキシコール酸ナトリウムを用いて、膜タンパク質を可溶化し、そしてＯＸ１０２ｍＡｂに結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅビーズとともに７０時間インキュベートした。ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＢａｒｃｌａｙ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ
ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍａｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ第１巻、２２．１〜２２．２４、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ＯＸ１０２  ｍＡｂ結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズを遠心分離により沈殿させ、そして０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中で洗浄し、そして最終的に０．５％ＳＤＳ中で５５℃で１５分間溶出した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、この溶出した画分を分析した。
【０１７２】
（ＩＶ．ＯＸ１０２ｍＡｂについての抗原のＮ末端配列）
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｏｃｉｓｅ  ４９４Ａタンパク質シーケンサー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｔｄ．，ＵＫ）での、自動化Ｅｄｍａｎ分解を用いて、アミノ末端配列決定を行った。Ｎ末端配列を、表１に示すように確認した。ブランクサイクルは、Ｎ連結グリコシル化により改変されたアスパラギンの存在に起因して、アスパラギンであると推定された。精製したポリペプチドは、ＯＸ１０２ｍＡｂについての抗原のＮ末端の２０アミノ酸を用いて公知のタンパク質データベースをスクリーニングすることにより、新規であると確認された。このタンパク質はラットＯＸ２ＲＨ１である。
【０１７３】
（Ｖ．ＯＸ１０２  ｍＡｂの抗原をコードするｃＤＮＡクローンの単離）
総ＲＮＡを、製造業者によって推奨されるようにＲＮＡｚｏｌ  Ｂ（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を使用して、ラット腹膜滲出液細胞から抽出し、次いで、製造業者によって推奨されるようにオリゴｄＴビーズ（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ、ＧＩＡＧＥＮ）と使用して、ポリ−Ａ画分を精製した。約５０ｎｇのポリＡ＋精製ｍＲＮＡを、選択された１μＭのセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド、１ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、および２ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ2の存在下で、２００ＵのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）で処理し、そして４２℃で１時間インキュベートした。
【０１７４】
次いで、このｃＤＮＡを、ＰＣＲ反応物（例えば、供給された４０μｌの１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｔａｑ好熱性ＰＣＲ緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈより供給）；８μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ；８μｌのＡｄｖａｎｔａｇｅ  Ｔａｑ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；２μｌのｃＤＮＡ（上記のように調製）；３１８μｌの蒸留水；Ｎ末端ペプチドに対応する、１６μｌのアンチセンス縮重オリゴヌクレオチド（１０μＭ）；および８μｌの１０μＭのセンスオリゴヌクレオチド）中におけるテンプレートとして使用した。両方のオリゴヌクレオチドプライマーを、クローニングを容易にするために、５’末端ホスフェートを付けて合成した（Ｇｅｎｏｓｙｓ）。
【０１７５】
このＰＣＲ混合物を、８×５０μｌのサンプルに等分し、そしてＲｏｂｏｃｙｃｌｅｒＰＣＲ機器（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において、ＰＣＲ条件に供した。このＲｏｂｏｃｙｃｌｅｒＰＣＲ機器（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）は、同時に、個々のサンプルにおけるアニーリング温度を変動させるように操作することが可能である。例示的なパラメーターは、以下の通りである：９３℃で３０秒間：次いで、以下の３５サイクル：９３℃で３０秒間；４２〜５６℃で１分間；７２℃で３０秒間：そして、最終サイクルの７２℃で８分間。
【０１７６】
１０μｌのＰＣＲ産物を、標準的な手順によって、アガロースゲル電気泳動により分析した。約４２℃、４４℃、および４６℃のアニーリング温度を有した３つのサンプル中の１００塩基対と３００塩基対との間の範囲の長さのＰＣＲ産物をゲルから摘出し、そしてＱＩＡｑｕｉｃｋ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、その核酸を精製した。これらの精製産物を、標準的な手順を使用して、約１６℃にて４８時間で、ＰＣＲＳｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（これは、ＳｍａＩで消化され、そしてホスファターゼ処理されている）中に連結した。
【０１７７】
形質転換体を、最初にコロニーＰＣＲによってスクリーニングし、そして適切なサイズの挿入物を含む２０個のコロニーを、５０μｇ／ｍｌアンピシリンの存在下でＬＢブロス中において増殖し、そしてプラスミドをＱＩＡＧＥＮロボットによって精製した。ＢＩＧＤＹＥ蛍光ジデオキシターミネーション技術およびＡＢＩ−ＰＲＩＳＭモデル３７７（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｔｄ．、ＵＫ）を使用して、挿入物を配列決定した。ＯＸ１０２  ｍＡｂに対する抗原のＮ末端配列をコードするヌクレオチド配列を含む挿入物を使用して、３’ＲＡＣＥ反応のためのオリゴヌクレオチドを設計した。
【０１７８】
ＯＸ１０２に対する抗原の完全ｃＤＮＡ配列を、３’ＲＡＣＥ  ＰＣＲ（上記と同じプロトコールを使用）（ただし、各々０．２μＭの最終濃度で、適切なオリゴヌクレオチドを使用することによって改変された）によって得た。ＰＣＲ条件は、例えば、以下の通りであった：９３℃で３０秒間：次いで、以下の３０サイクル：９３℃で３０秒間；５１〜６５℃で１分間；７２℃で３．５分間：そして最終サイクルの７２℃で１２分間。
【０１７９】
約２．３Ｋｂのバンドを、標準的な手順を使用して、６５℃でのＰＣＲ反応から摘出し、ゲル精製し、ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩで消化し、そしてＮｏｔＩ／ＸｈｏＩ消化ベクター（ＰＣＲＳｃｒｉｐｔ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に連結した。挿入物を、上記のように配列決定した。
【０１８０】
ＯＸ１０２タンパク質（本明細書中で、ラットＯＸ２ＲＨ１としても言及される）のｃＤＮＡ配列を、表１に示す。他のホモログの実施形態の全長単離物を、同様に、クローン化し、そして配列を確認した。標準的な方法が、容易に適用可能である。
【０１８１】
（ＶＩ．他のＯＸ２ＲＨ  ｃＤＮＡの獲得）
ラットＯＸ２ＲＨ１ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列の見識により、配列類似性に基づき、そしてラットＯＸ２ＲＨ１はこのような等価物の単離のためのツールを提供することが理由で、他の種由来の相同な機能的等価物（マウスまたはヒトのＯＸ２ＲＨ１を含む）を得ることが可能である。
【０１８２】
従って、ヒトＯＸ２ＲＨ１を同定するために、正体未定のポリペプチドについてのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の既存のデータベース（例えば、ヒトゲノムプロジェクトから得られた配列を蓄えたデータベース）を、本明細書中に提供されたラットＯＸ２ＲＨ１の核酸配列およびアミノ酸配列に対して相同性を有する配列について検索し得る。多くのサイトで蓄えられ、そしてアップデートされているデータベース（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｃｅｎｔｒｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／）およびＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を含む）が、汎用性プログラム（例えば、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴ）によってアクセスされ得る。これらのデータベースは、発現配列タグ（ＥＳＴ）の配列を含み、このＥＳＴは、無作為なｃＤＮＡクローンから配列決定されたヌクレオチド配列の短い領域である。これは、本明細書中に提供されるラットＯＸ２ＲＨ配列情報と比較することによって、マウスまたはヒトのＯＸ２ＲＨについての部分的ｃＤＮＡクローンを単離することを可能にする。次いで、マクロファージｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノムライブラリーをスクリーニングすることによってか、またはプライマー伸長技術（例えば、全長ラットＯＸ２ＲＨ１クローンを得るために本明細書中に記載された技術）によって、全長クローンを単離し得る。
【０１８３】
ラットＯＸ２ＲＨ１に関連したマウス配列およびヒト配列を、例えば、ＢＬＡＳＴサーバー（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．６：１１９−１２９）を使用して、ゲノム配列データベースから同定した。標準的な分析プログラム（例えば、ＰＨＤ（ＲｏｓｔおよびＳａｎｄｅｒ（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １９：５５−７２）およびＤＳＣ（ＫｉｎｇおよびＳｔｅｒｎｂｅｒｇ（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．５：２２９８−２３１０））を使用して、構造を評価し得る。標準的な比較ソフトウェアは、例えば、以下を含む：Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０；Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９９５）Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｍａｐｓ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ  Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；ＬａｎｄｅｒおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９９５版）Ｃａｌｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓｅｃｒｅｔｓ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｐｒｅｓｓ；ならびに、ＳｐｅｅｄおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９９６版）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｐｐｉｎｇ  ａｎｄ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＩＭＡ  Ｖｏｌｕｍｅｓ  ｉｎ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、第８１巻）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ。
【０１８４】
ラットおよびヒトのＯＸ２ＲＨ１の核酸配列は、例えば、表５で見られ得るように、５０〜９８％の相同性を有する。他のホモログについては、特にホモログ３とは、類似性は低くあり得る。
【０１８５】
データベーススクリーニングに対する代替として、本明細書中に提供されるラットＯＸ２ＲＨ１核酸配列を使用して、マクロファージｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーをスクリーニングし、適切なストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするに十分に相同なヒト配列を同定し得る。このアプローチを使用し、プローブとしてラットＯＸ２核酸を用いてヒトＯＸ２遺伝子を単離した。ＭｃＣａｕｇｈａｎら（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２５：３２９−３３５。テンプレートとして、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡクローン、またはゲノムクローンのテンプレートを使用するＰＣＲに基づく方法もまた広範に使用されており、一般的なアプローチが、ｃＤＮＡからのマウスＯＸ２の単離によって例示される。Ｐｒｅｓｔｏｎら（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：１９１１−１９１８を参照のこと。
【０１８６】
提供されたＯＸ２ＲＨ配列に由来するＰＣＲプライマーを使用して、ヒトまたは他の種もしくは組織のｃＤＮＡライブラリーを探索する。配列は、例えば、表１〜４から導き出され得る（好ましくは、配列の末端に隣接する配列）。霊長類、げっ歯類または他の種のＯＸ２ＲＨの全長ｃＤＮＡを、例えば、λｇｔ１０ファージのＤＮＡハイブリダイゼーションスクリーニングによってクローン化する。ＰＣＲ反応を、適切な条件下で、Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ  Ｔａｑｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して実施する。
【０１８７】
さらに、ラットＯＸ２ＲＨ１配列を使用して、対応するマウスＯＸ２ＲＨ１配列を単離し得、そしてそれらの間で保存された領域を同定し得る。特に、一群のホモログの発見によって、類似性の領域を同定し得る。保存された領域の配列は、一定範囲の種において所定の遺伝子を同定するための有用な試薬を提供する。例えば、マウスおよびラットのＯＸ２のドメイン１は、同じヒトドメインとラットドメインとの間の７７％同一性と比較して、アミノ酸レベルで９０％同一である。Ｐｒｅｓｔｏｎら（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：１９１１−１９１８。
【０１８８】
さらに別の方法は、発現クローンに対する抗体を使用するか、または適切な細胞型（例えば、マクロファージ）由来もしくは他の種由来のｃＤＮＡライブラリーにおいて発現される交差反応するタンパク質を同定する。
【０１８９】
（ＶＩＩ．染色体位置付け）
遺伝子をマッピングする。例えば、染色体スプレッド（ｓｐｒｅａｄ）を調製する。インサイチュハイブリダイゼーションを、例えば、７２時間培養されたヒト由来のフィトヘマグルチニン刺激を与えたリンパ球から得られる染色体調製物において実施する。５−ブロモデオキシウリジンを、培養の最後の７時間に添加して（６０μｇ／ｍｌの培地）、良好な質のハイブリダイゼーション後染色体バンディングを確実にする。
【０１９０】
プライマーの補助により増幅されたＰＣＲフラグメントを、適切なベクター中にクローン化する。ベクターを、3Ｈでのニックトランスレーションによって標識する。放射性標識化プローブを、Ｍａｔｔｅｉら（１９８５）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６９：３２７−３３１に記載されるように、最終濃度２００ｎｇ／ｍｌのハイブリダイゼーション溶液で、中期スプレッドに対してハイブリダイズさせる。
【０１９１】
核追跡（ｔｒａｃｋ）エマルジョン（ＫＯＤＡＫ  ＮＴＢ2）でのコーティングの後、スライドを露光する。バンディング手順の間の銀粒子のいかなるスリップをも回避するために、最初に染色体スプレッドを緩衝化ギームザ溶液で染色し、そして中期写真撮影した。次いで、Ｒ−バンディングを、蛍光色素−光分解−ギームザ（ＦＰＧ）法によって実施し、分析前に中期を再撮影する。
【０１９２】
類似のアプローチ方法が、他の種に使用される。
【０１９３】
（ＶＩＩＩ．種々のＯＸ２ＲＨ  ｍＲＮＡの位置付け）
ＯＸ２ＲＨ１の予期される発現パターンは、主にマクロファージ、顆粒球、および肥満細胞であるが、ホモログＨ２、Ｈ３、および／またはＨ４は、機能的にそれほど密接に関連していない可能性がある。従って、これらの分布は、特に興味深い。分布は、例えば、ハイブリダイゼーション方法もしくはＰＣＲ方法によって、核酸レベルで評価され得るか、または例えば、組織学的方法もしくは免疫化学的方法によって、タンパク質レベルで評価され得る。
【０１９４】
ヒト複数組織（カタログ番号１、２）および癌細胞株ブロット（カタログ番号７７５７−１）（１レーンあたり約２μｇのポリ（Ａ）+ＲＮＡを含む）を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）から購入する。プローブを、例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅランダムプライマー標識化キット（ＲＰＮ１６３３）を用いて、［α−32Ｐ］ｄＡＴＰで放射性標識する。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを、例えば、０．５Ｍ  Ｎａ2ＨＰＯ4、７％ＳＤＳ、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中で６５℃にて実施する。高ストリンジェンシーの洗浄は、例えば、６５℃で、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで４０分間の最初の２回の洗浄、次いで、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２０分間の引き続く洗浄で実施される。次いで、メンブランを、増感スクリーンの存在下で、Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ）に−７０℃で露光する。ｃＤＮＡライブラリーサザンによるより詳細な研究を、選択した適切な哺乳動物ＯＸ２ＲＨ１クローンで実施して、造血細胞サブセットまたは他の細胞サブセットにおけるそれらの発現を試験する。
【０１９５】
あるいは、２つの適切なプライマーを、例えば、表１〜４から選択する。ＲＴ−ＰＣＲを、メッセージの存在について選択された適切なｍＲＮＡサンプル（例えば、この遺伝子を発現するサンプル）において実施して、ｃＤＮＡを産生する。
【０１９６】
全長クローンを、ＰＣＲシグナルによって予め選択された適切な組織から、ｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションによって単離し得る。ノーザンブロットを、実施し得る。
【０１９７】
ＯＸ２ＲＨをコードする遺伝子についてのメッセージを、適切な技術（例えば、ＰＣＲ、イムノアッセイ、ハイブリダイゼーション、または他の技術）によってアッセイする。組織および器官のｃＤＮＡ調製物は、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡから入手可能である。天然に発現する供給源の同定は、記載されるように有用である。
【０１９８】
マウスでの分布について、例えば、サザン分析は、以下の通りに実施し得る：一次増幅されたｃＤＮＡライブラリー由来のＤＮＡ（５μｇ）を、適切な制限酵素で消化して、挿入物を放出し、１％アガロースゲルにおいて泳動し、そしてナイロンメンブラン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）に転写する。
【０１９９】
マウスｍＲＮＡ単離のためのサンプルとしては、以下が挙げられ得る：休止マウス線維芽細胞Ｌ細胞株（Ｃ２００）；Ｂｒａｆ：ＥＲ（エストロゲンレセプターへのＢｒａｆ融合物）でトランスフェクトされた細胞；コントロール（Ｃ２０１）；Ｔ細胞、ＴＨ１偏光化（Ｍｅｌ１４光明、脾臓由来ＣＤ４＋細胞、ＩＦＮ−γおよび抗ＩＬ−４で７日間偏光化；Ｔ２００）；Ｔ細胞、ＴＨ２偏光化（ＭＥｌｌ４光明、脾臓由来ＣＤ４＋細胞、ＩＬ−４および抗ＩＦＮ−γで７日間偏光化；Ｔ２０１）；Ｔ細胞、高度にＴＨ１偏光化（Ｏｐｅｎｓｈａｗら（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：１３５７−１３６７を参照のこと；２、６、１６時間プールについて抗ＣＤ３で活性化；Ｔ２０２）；Ｔ細胞、高度にＴＨ２偏光化（Ｏｐｅｎｓｈａｗら（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：１３５７−１３６７を参照のこと；２、６、１６時間プールについて抗ＣＤ３で活性化；Ｔ２０３）；胸腺から選別される、ＣＤ４４−  ＣＤ２５＋プレＴ細胞（Ｔ２０４）；抗原での最後の刺激後３週間休止中、ＴＨ１  Ｔ細胞クローンＤ１．１（Ｔ２０５）；１０μｇ／ｍｌのＣｏｎ  Ａで１５時間刺激された、ＴＨ１  Ｔ細胞クローンＤ１．１（Ｔ２０６）；抗原での最後の刺激後３週間休止中、ＴＨ２  Ｔ細胞クローンＣＤＣ３５（Ｔ２０７）；１０μｇ／ｍｌのＣｏｎ  Ａで１５時間刺激された、ＴＨ２  Ｔ細胞クローンＣＤＣ３５（Ｔ２０８）；休止中、脾臓由来Ｍｅｌ１４＋ネイティブＴ細胞（Ｔ２０９）；６、１２、２４時間プールについてＩＦＮ−γ／ＩＬ−１２／抗ＩＬ−４でＴｈ１に偏光化された、Ｍｅｌ１４＋  Ｔ細胞（Ｔ２１０）；６、１３、２４時間プールについてＩＬ−４／抗ＩＦＮ−γでＴｈ２に偏光化された、Ｍｅｌ１４＋  Ｔ細胞（Ｔ２１１）；刺激されていない成熟Ｂ細胞白血病細胞株Ａ２０（Ｂ２００）；刺激されていないＢ細胞株ＣＨ１２（Ｂ２０１）；刺激されていない、脾臓細胞由来ラージＢ細胞（Ｂ２０２）；ＬＰＳで活性化された、全脾臓由来Ｂ細胞（Ｂ２０３）；休止中、脾臓由来メトリザマイド富化樹状細胞（Ｄ２００）；休止中、骨髄由来樹状細胞（Ｄ２０１）；；ＬＰＳで４時間活性化された、単球細胞株ＲＡＷ２６４．７（Ｍ２００）；ＧＭおよびＭ−ＣＳＦで誘導された、骨髄マクロファージ（Ｍ２０１）；休止中、マクロファージ細胞株Ｊ７７４（Ｍ２０２）；０．５、１、３、６、１２時間プールでのマクロファージ細胞株Ｊ７７４＋ＬＰＳ＋抗ＩＬ−１０（Ｍ２０３）；０．５、１、３、５、１２時間プールでのマクロファージ細胞株Ｊ７７４＋ＬＰＳ＋ＩＬ−１０（Ｍ２０４）；エアロゾルチャレンジしたマウス肺組織、Ｔｈ２プライマー、エアロゾルＯＶＡチャレンジ７、１４、２３時間プール（Ｇａｒｌｉｓｉら（１９９５）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ７５：７５−８３を参照のこと；Ｘ２０６）；ブラジル鉤虫（Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｕｌｕｓ）感染肺組織（Ｃｏｆｆｍａｎら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５：３０８−３１０を参照のこと；Ｘ２００）；全成人肺、正常（Ｏ２００）；全肺、ｒａｇ−１（Ｓｃｈｗａｒｚら（１９９３）Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ４：２４９−２５２を参照のこと；Ｏ２０５）；ＩＬ−１０  Ｋ．Ｏ．脾臓（Ｋｕｈｎら、（１９９１）Ｃｅｌｌ  ７５：２６３−２７４を参照のこと；Ｘ２０１）；全成人脾臓、正常（Ｏ２０１）；全脾臓、ｒａｇ−１（Ｏ２０７）；ＩＬ−１０  Ｋ．Ｏ．パイアー斑（Ｏ２０２）；全パイアー斑、正常（Ｏ２１０）；ＩＬ−１０  Ｋ．Ｏ．腸間膜リンパ節（Ｘ２０３）；全腸間膜リンパ節、正常（Ｏ２１１）；ＩＬ−１０  Ｋ．Ｏ．結腸（Ｘ２０３）；全結腸、正常（Ｏ２１２）；ＮＯＤマウス膵臓（Ｍａｋｉｎｏら（１９８０）Ｊｉｋｋｅｎ  Ｄｏｂｕｔｓｕ  ２９：１−１３を参照のこと；Ｘ２０５）；全胸腺、ｒａｇ−１（Ｏ２０８）；全腎、ｒａｇ−１（Ｏ２０９）；全心臓、ｒａｇ−１（Ｏ２０２）；全脳、ｒａｇ−１（Ｏ２０３）；精巣、ｒａｇ−１（Ｏ２０４）；全肝臓、ｒａｇ−１（Ｏ２０６）；ラット正常結合組織（Ｏ３００）；およびラット関節炎結合組織（Ｘ３００）。
【０２００】
ヒトｍＲＮＡ単離のためのサンプルとしては、以下が挙げられ得る：末梢血単核細胞（単球、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、顆粒球、Ｂ細胞）、休止中（Ｔ１００）；末梢血単核細胞、２、６、１２時間プールについて抗ＣＤ３で活性化（Ｔ１０１）；Ｔ細胞、ＴＨ０クローンＭｏｔ７２、休止中（Ｔ１０２）；３、６、１２時間プールについて抗ＣＤ２８および抗ＣＤ３で活性化されたＴ細胞、ＴＨ０クローンＭｏｔ７２（Ｔ１０３）；２、７、１２時間プールについて特異的ポリペプチドでアネルギー処理されたＴ細胞、ＴＨ０クローンＭｏｔ７２（Ｔ１０４）；Ｔ細胞、ＴＨ１クローンＨＹ０６、休止中（Ｔ１０７）；３、６、１２時間プールについて抗ＣＤ２８および抗ＣＤ３で活性化されたＴ細胞、ＴＨ１クローンＨＹ０６（Ｔ１０８）；２、６、１２時間プールについて特異的ポリペプチドでアネルギー処理されたＴ細胞、ＴＨ１クローンＨＹ０６（Ｔ１０９）；Ｔ細胞、ＴＨ２クローンＨＹ９３５、休止中（Ｔ１１０）；２、７、１２時間プールについて抗ＣＤ２８および抗ＣＤ３で活性化されたＴ細胞、ＴＨ２クローンＨＹ９３５（Ｔ１１１）；Ｔ細胞ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ−  Ｔ細胞（抗ＣＤ２８、ＩＬ−４、および抗ＩＦＮ−γにおいて２７日間偏光化）、ＴＨ２偏光化、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で４時間活性化（Ｔ１１６）；Ｔ細胞腫瘍株ＪｕｒｋａｔおよびＨｕｔ７８、休止中（Ｔ１１７）；Ｔ細胞クローン、プールされたＡＤ１３０．２、Ｔｃ７８３．１２、Ｔｃ７８３．１３、Ｔｃ７８３．５８、Ｔｃ７８２．６９、休止中（Ｔ１１８）；Ｔ細胞無作為（ｒａｎｄｏｍ）γδＴ細胞クローン、休止中（Ｔ１１９）；脾細胞、休止中（Ｂ１００）；抗ＣＤ４０およびＩＬ−４で活性化された脾細胞（Ｂ１０１）；プールされたＢ細胞ＥＢＶ株ＷＴ４９、ＲＳＢ、ＪＹ、ＣＶＩＲ、７２１．２２１、ＲＭ３、ＨＳＹ、休止中（Ｂ１０２）；１、６時間プールについてＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化されたＢ細胞株ＪＹ（Ｂ１０３）；プールされたＮＫ２０クローン、休止中（Ｋ１００）；プールされたＮＫ２０クローン、ＰＭＡおよびイオノマイシンで６時間活性化（Ｋ１０１）；ＮＫＬクローン、ＬＧＬ白血病患者の末梢血由来、ＩＬ−２処理（Ｋ１０６）；ＮＫ細胞傷害性クローン６４０−Ａ３０−１、休止中（Ｋ１０７）；１、６時間プールについてＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化された造血前駆体株ＴＦ１（Ｃ１００）；Ｕ９３７前単球株、休止中（Ｍ１００）；Ｕ９３７前単球株、１、６時間プールについてＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化（Ｍ１０１）；溶出単球、１、２、６、１２、２４時間プールについてＬＰＳ、ＩＦＮγ、抗ＩＬ−１０で活性化（Ｍ１０２）；溶出単球、１、２、６、１２、２４時間プールについてＬＰＳ、ＩＦＮγ、抗ＩＬ−１０で活性化（Ｍ１０３）；溶出単球、４、１６時間プールについてＬＰＳ、ＩＦＮγ、抗ＩＬ−１０で活性化（Ｍ１０６）；溶出単球、４、１６時間プールについてＬＰＳ、ＩＦＮγ、抗ＩＬ−１０で活性化（Ｍ１０７）；溶出単球、１時間ＬＰＳで活性化（Ｍ１０８）；溶出単球、６時間ＬＰＳで活性化（Ｍ１０９）；ＤＣ７０％ＣＤ１ａ＋、ＣＤ３４＋
ＧＭ−ＣＳＦ由来、ＴＮＦα１２日間、休止中（Ｄ１０１）；ＤＣ７０％ＣＤ１ａ＋、ＣＤ３４＋  ＧＭ−ＣＳＦ由来、ＴＮＦα１２日間、１時間ＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化（Ｄ１０２）；ＤＣ７０％ＣＤ１ａ＋、ＣＤ３４＋  ＧＭ−ＣＳＦ由来、ＴＮＦα１２日間、６時間ＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化（Ｄ１０３）；ＤＣ９５％  ＣＤ１ａ＋、ＣＤ３４＋  ＧＭ−ＣＳＦ由来、ＴＮＦα１２日間ＦＡＣＳ分類、１、６時間プールについてＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化（Ｄ１０４）；ＤＣ９５％  ＣＤ１４＋、ｅｘ  ＣＤ３４＋  ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦα１２日間ＦＡＣＳ分類、１、６時間プールについてＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化（Ｄ１０５）；ＤＣ  ＣＤ１ａ＋  ＣＤ８６＋、ＣＤ３４＋  ＧＭ−ＣＳＦ由来、ＴＮＦα１２日間ＦＡＣＳ分類、１、６時間プールについてＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化（Ｄ１０６）；単球ＧＭ−ＣＳＦ由来ＤＣ、ＩＬ−４  ５日間、休止中（Ｄ１０７）；単球ＧＭ−ＣＳＦ由来ＤＣ、ＩＬ−４  ５日間、休止中（Ｄ１０８）；単球ＧＭ−ＣＳＦ由来ＤＣ、ＩＬ−４  ５日間、４、６時間プールにＬＰＳ活性化（Ｄ１０９）；単球ＧＭ−ＣＳＦ由来ＤＣ、ＩＬ−４  ５日間、ＴＮＦα活性化、４、１６時間プールについて単球上清（ｓｕｐｅ）（Ｄ１１０）；平滑筋腫Ｌ１１良性腫瘍（Ｘ１０１）；正常子宮筋層Ｍ５（Ｏ１１５）；悪性平滑筋肉腫ＧＳ１（Ｘ１０３）；１、６時間プールについてＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化された肺線維芽細胞肉腫株ＭＲＣ５（Ｃ１０１）；腎臓上皮癌細胞株、ＣＨＡ、１、６時間プールについてＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化（Ｃ１０２）；腎臓胎児２８週目雄（Ｏ１００）；肺胎児２８週目雄（Ｏ１０１）；肝臓胎児２８週目雄（Ｏ１０２）；心臓胎児２８週目雄（Ｏ１０３）；脳胎児２８週目雄（Ｏ１０４）；胆嚢胎児２８週目雄（Ｏ１０６）；小腸胎児２８週目雄（Ｏ１０７）；脂肪組織胎児２８週目雄（Ｏ１０８）；卵巣胎児２５週目雌（Ｏ１０９）；子宮胎児２５週目雌（Ｏ１１０）；精巣胎児２８週目雄（Ｏ１１１）；脾臓胎児２８週目雄（Ｏ１１２）；成体胎盤２８週目（Ｏ１１３）；および炎症扁桃、１２歳齢から（Ｘ１００）。
【０２０１】
類似のサンプルが、評価のために他の種から単離され得る。組織学もまた、実施し得る。
【０２０２】
（ＩＸ．哺乳動物ＯＸ２ＲＨタンパク質の産生）
適切な、例えば、ＧＳＴの融合タンパク質を、発現のために、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて操作する。例えば、マウスＯＸ２ＲＨ  ｐＧｅｘプラスミドを構築し、そしてＥ．ｃｏｌｉに形質転換する。新鮮な形質転換細胞を、例えば、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地中で増殖し、そしてＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で誘導する。一晩のインキュベーションの後、細菌を回収し、そしてＯＸ２ＲＨタンパク質を含むペレットを単離する。このペレットを、例えば、ＴＥ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび２ｍＭ  ペファボロック（ｐｅｆａｂｌｏｃ））２リットル中でモジネートする。この物質を、３回ミクロフィリューダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）を通過させる。この流動体化した上清を、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＧＳ−３ローターにおいて、１時間１３，０００ｒｐｍにてスピンダウンする。結果として生じたＯＸ２ＲＨタンパク質を含む上清を、濾過し、そして５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基（ｐＨ８．０）で平衡化したグルタチオン−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥカラムに対して通過させる。ＯＸ２ＲＨ−ＧＳＴ融合タンパク質を含む画分をプールし、そしてトロンビン（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｂｅｎｄ、ＩＮ）で切断する。次いで、切断されたプールを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基で平衡化したＱ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥカラムに対して通過させる。ＯＸ２ＲＨを含む画分をプールし、そして冷却蒸留水において、より低い伝導率まで希釈し、そして新鮮なＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（単独、または免疫親和性抗体カラムに続いて）に対して通過させる。ＯＸ２ＲＨタンパク質を含む画分をプールし、等分し、そして−７０℃のフリーザーにおいて保存する。
【０２０３】
種々の融合構築物が、ＯＸ２ＲＨを用いて作製される。従って、例えば、ＯＸ２ＲＨ２、Ｈ３、またはＨ４の細胞外部分の融合は、ＤＡＰ１２の細胞内部分またはＩｇＧドメイン、あるいは他の標識ドメインまたは機能的ドメインに融合され得る。適切な遺伝子の部分は、エピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧタグ）またはツーハイブリッド系構築物に融合される。例えば、ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−２４６を参照のこと。
【０２０４】
抗ＦＬＡＧ抗体での検出を用いる発現クローニング手順において、このエピトープタグは使用され得、結合パートナー（例えば、それぞれのレセプター相同体についてのリガンド）を検出する。ツーハイブリッド系はまた、ＯＸ２ＲＨに特異的に結合するタンパク質を単離するために使用され得る。
【０２０５】
類似のＩｇスーパーファミリーレセプタータンパク質でのＣＤスペクトルの比較は、タンパク質が正確にフォールディングされたことを示唆し得る。Ｈａｚｕｄａら、（１９６９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６８９−１６９３；およびＣａｍｂｅｌｌら（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ  ２８２：３４１−３４２を参照のこと。
【０２０６】
結合特性（例えば、速度論および機能的効果）についてのＯＸ２／ＯＸ２Ｒの反応性が研究され得る。優れて確立された免疫沈降法または遺伝的方法（例えば、酵母ツーハイブリッド系）を使用してＯＸ２Ｒ細胞質ドメインの相互作用が決定され得る。タンパク質を通常発現しない細胞へのＯＸ２ＲＨのトランスフェクションは、生理学的研究およびシグナル伝達研究において有用であり得る。
【０２０７】
（Ｘ．ＯＸ２ＨＲに特異的な抗体の調製）
適切な種または株（例えば、近交系のＢａｌｂ／ｃマウス）を、組換え形態のタンパク質（例えば、精製ＯＸ２ＲＨまたは安定にトランスフェクトされたＮＩＨ−３Ｔ３細胞）を用いて腹腔内で免疫した。タンパク質（付加的なアジュバントを有するか有さない）を用いて適切な時点に、動物をブーストし、さらに抗体産生を刺激する。血清を収集するか、または収集された脾臓を用いてハイブリドーマが産生される。
【０２０８】
あるいは、遺伝子またはそのフラグメントで形質転換された細胞、または内因性細胞あるいは外因性細胞のいずれか、または抗原の発現のために濃縮された単離された膜で、動物（例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウス）が免疫される。適切な時点（代表的には、多数のさらなる投与後）に、血清を収集する。種々の遺伝子療法技術が有用であり得る（例えば、インサイチュでタンパク質を産生する際に、免疫応答を産生するために）。血清または抗体調製物は、交差吸着または免疫選択され得、定義された特異性および高親和性の実質的に精製された抗体を調整する。従って、種々の種の対応物を認識する抗体、または特異的な種の部分集合または群（例えば、げっ歯類、エンボディメント（ｅｎｂｏｄｉｍｅｎｔ））を認識する抗体、が調製され得る。
【０２０９】
モノクローナル抗体が作製され得る。例えば、適切な融合パートナーと脾細胞は融合され、そしてハイブリドーマは、標準手順によって増殖培地中で選択される。ラットＯＸ２ＲＨ１に結合する抗体の存在について、ハイブリドーマ上清はスクリーニングされる（例えば、ＥＬＩＳＡまたは他のアッセイによって）。特定のＯＸ２ＲＨエンボディメントを特異的に認識する抗体はまた、選択され得るか、または調整され得る。
【０２１０】
別の方法において、合成ペプチドまたは精製タンパク質は、免疫系に提示され、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が産生される。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ（編、１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ；およびＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと。適切な状況において、結合試薬は、上記のように（例えば、蛍光または他で）標識されるか、パンニング方法のために基板に固定化されるかのいずれかである。核酸はまた、動物内の細胞に導入され得、抗原を産生する。その抗原は、免疫応答を惹起するために役立つ。例えば、Ｗａｎｇら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：４１４５−４１６０；Ｂａｒｒｙら、（１９９４）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １６：６１６−６１９；およびＸｉａｎｇら、（１９９５）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２：１２９−１３５を参照のこと。
【０２１１】
（ＸＩ．リガンドの結合およびパートナーの特異性）
結合選択性および親和性の試験のための手段は、容易に入手可能である。表面プラスモン共鳴（製造者のプロトコル；ＢＩＡｃｏｒｅマニュアル、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒを参照のこと）または他の方法が、ＯＸ２ＲＨに対するリガンドを決定するために使用され得る。ラットおよびマウスＨ１は、それらの種の対照物のリガンド、ＯＸ２に結合する；ヒトＨ１は、同様に試験される。類似の潜在的なリガンドに対して、Ｈ２は同様に試験されるが、既知のレセプター（ラットおよびマウスＨ１）に対するＨ２の細胞外ドメインの類似性は、同じリガンドまたは密接に関連したリガンドを示唆する。
【０２１２】
レセプターは、特異的な結合試薬として使用され得、その結合の特異性を利用することによって、その結合パートナーを同定する（抗体が使用されるのと同様に）。結合レセプターは、ＯＸ２ＲＨであり得るか、または、例えば別のサブユニットを有するＯＸ２ＲＨの複合体を含み得る。結合試薬は、上記のように標識されるか（例えば、蛍光または他で）、またはパンニング方法のために基板に固定化される。
【０２１３】
この結合組成物は、発現ライブラリーのスクリーニングに使用される。このライブラリーは、結合パートナー（例えば、リガンド）、好ましくは膜に結合した結合パートナーを発現する細胞株から作製される。標準染色手順は、表面で発現されたリガンドを検出または分類するために使用されるか、または、表面で発現された形質転換された細胞が、パンニングによってスクリーニングされる。細胞内発現のスクリーニングは、種々の染色または免疫蛍光手順によって行われる。ＭｃＭａｈａｎら、（１９９１）ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：２１８１−２８３２を参照のこと。
【０２１４】
あるいは、レセプター試薬は、アフィニティー精製、または推定リガンドを発現する細胞の選別に使用される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、またはＡｕｓｕｂｅｌらを参照のこと。
【０２１５】
別のストラテジーは、リガンドが結合した膜について、パンニングによってスクリーニングすることである。レセプターｃＤＮＡは、上記のように構築される。適切な抗体（例えば、ＯＸ２ＲＨ融合構築物上のＦＬＡＧ配列を認識する）の使用、または第１抗体に対して惹起された抗体の使用によって、固定化は達成され得る。選択および増幅の反復サイクルは、適切なクローンの濃縮およびクローンを発現するレセプターの結果的な単離を導く。
【０２１６】
ファージ発現ライブラリーは、哺乳動物ＯＸ２ＲＨ（例えば、標識された形態）によってスクリーニングされ得る。適切な標識技術（例えば、抗ＦＬＡＧ抗体）は、適切なファージクローンの特異的な標識を可能にする。
【０２１７】
ＯＸ２−ＯＸ２ＲＨ結合の確認の際、または他の相同体についての代替のリガンドの同定の際、シグナル伝達経路が試験される。例えば、Ｐｒｅｓｔｏｎら、（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：１９１１−１９１８を参照のこと。ＤＡＰ１２の関与の暗示はまた、明白である。例えば、Ｂａｋｋｅｒら（２０００）Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６１：１８−２７；Ｌａｎｉｅｒら、（１９９８）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ８：６９３−７０１；Ｓｍｉｔｈら、（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：７−１０；Ｇｏｓｓｅｌｉｎら、（１９９９）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６６：１６５−１７１；Ｔｏｍａｓｅｌｌｏら、（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３４１１５−３４１１９；およびＭｃＶｉｃａｒら、（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３２９３４−３２９４２を参照のこと。同様に、またはあるいは、ＤＡＰ１０は含まれ得る。例えば、Ｗｕ  Ｊら、（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：７３０−７３２；およびＢａｕｅｒら、（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：７２７−７２９を参照のこと。
【０２１８】
特に、ＤＡＰ１２補助受容体（ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ）のパートナーは、Ｔ細胞レセプターサブユニットζおよびＦｃεＲγと同じファミリーであり、ＩＴＩＭモチーフを保持し、そしてｓｙｋ／ｚａｐ７０タンパク質チロシンキナーゼに関与する経路を通じてシグナル伝達する。ＤＡＰ１０は、ＹｘｘＭモチーフを有し、ＰＩ３キナーゼ経路を通じてか、またはＰＩ３キナーゼ経路に類似して、シグナル伝達する。
【０２１９】
ＮＫ細胞のＭＨＣクラスＩレセプターの特定のアイソフォームは、細胞質のドメインにＩＴＩＭ配列を欠き、そしてこれらのアイソフォームは、ＮＫ細胞を阻害するよりむしろ活性化すると提案されている。これらの活性化レセプターは、非常に短い細胞内領域（シグナル伝達モチーフを欠く）を有し、そしてそれらはすべて膜貫通ドメイン内の正に荷電した残基を共有する。このことは、シグナル伝達可能なアダプタ分子との結合を示唆する。ＤＡＰ１２、ＩＴＡＭを含むタイプＩジスルフィド結合ホモダイマーは、ヒトＫＩＲ２ＤＳレセプターと非共有結合的に結合する。ＤＡＰ１２は、膜貫通領域に負に荷電されたアスパラギン酸残基を有し、そしてＫＩＲ２ＤＳと共免疫沈降することが見出された、報告された１２〜１３ｋＤのリンタンパク質に一致する。
【０２２０】
レセプターの係合の際に、ＤＡＰ１２はリン酸化され、そしてＳｙｋキナーゼを補充し、従って、Ｔ細胞レセプターに類似のシグナル伝達カスケードを誘導する。ＫＩＲ２ＤＳと結合されることに加えて、ＨＬＡ−Ｃについてのレセプター、ＤＡＰ１２はまた、ＮＫ細胞の細胞表面で発現される。ＮＫ細胞は、Ｈ−２を認識する活性化マウスＬｙ４９ＤおよびＬｙ４９Ｈレセプターと結合し、そしてＨＬＡ−Ｅを認識するヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃヘテロダイマーレセプター複合体に結合する。
【０２２１】
ＥＳＴデータベースを検索することによって潜在的な膜シグナル伝達タンパク質を同定するための最近の努力は、ＤＡＰ１０、新規の１０−ｋＤの表面アダプタ（主に、造血細胞で発現される）の同定を導いた。ＤＡＰ１０は、ＤＡＰ１２との限定された相同性を有するのみであるが、その膜貫通ドメインは、ＤＡＰ１２の膜貫通領域およびＴＣＲのＣＤ３サブユニットのすべてに保存される領域負に荷電された残基を含む。さらに、ＤＡＰ１２およびＣＤ３鎖の細胞外ドメイン内に保存されたシステイン残基はまた、ＤＡＰ１０に存在する。興味深いことに、ヒトＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２遺伝子は、転写方向の反対に染色体１９ｑ１３．１に隣接し、そしておそらく遺伝子複製の結果として約１３０塩基対のみ離れる。ＤＡＰ１０の１つの独特の特徴は、その短いが保存された細胞質尾部であり、ＹｘｘＭシグナル伝達モチーフ、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ  ３−キナーゼ）のｐ８５制御サブユニットについての潜在的なｓｒｃ相同性２（ＳＨ２）ドメイン結合部位を含む。種々のＯＸ２ＲＨの、ＤＡＰ１２またはＤＡＰ１０との物理的および機能的結合が決定され得る。
【０２２２】
（ＸＩＩ．遺伝子分析、動物研究）
配列は、染色体マッピングの決定、疾患マーカー相関関係、およびそれぞれの遺伝子の遺伝的な構造の単離および決定のために、利用可能な情報および試薬を有用にする。イントロン／エキソン構造が決定され、そしてトランスジェニックおよび欠損動物が調製される。例えば、Ｇｏｏｄｎｏｗ（１９９２）「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌｓ」Ｒｏｉｔｔ（編）Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、第１５０２〜１５０４頁；Ｔｒａｖｉｓ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１３９２−１３９４；Ｋｕｈｎら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：７０７−７１０；Ｃａｐｅｃｃｈｉ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８８；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ（編、１９８７）Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ；Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １０：１８０−１９９；およびＣｏｕｒｎｏｙｅｒおよびＣａｓｋｅｙ（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：２９７−３２９を参照のこと。
【０２２３】
インビトロおよびインビボでのＯＸ２−ＯＸ２Ｒの相互作用の機能を決定するために、可溶性形態で産生されるアデノウイルス構築物を調整し、ＯＸ２ＲＨ１の細胞外領域は、ヒトＩｇＧに融合された。ヒトＩｇＧバックボーンのみが可溶性形態で産生されるように、コントロール構築物を調製した。第１の例において、インビトロでの細胞性感染によって、これらの融合タンパク質を含む上清を産生し、正常に発現されたマウスＯＸ２に対する結合に基づいて、ＯＸ２Ｒ融合タンパク質が生物学的機能を有するかどうか試験した。第１の研究において、正常マウスならびにＯＸ２遺伝子ノックアウト（ＫＯ）マウスからのマウスの脾臓の組織断片を調製し、そしてＯＸ２Ｒまたはコントロール融合タンパク質を添加し、そして融合タンパク質のヒトＦｃ部分に結合する抗体の添加によって、これらの試薬を検出し、そして結合を明らかにするために、引き続いて免疫ペルオキシダーゼ染色手順を行った。ＯＸ２Ｒ融合タンパク質の弱い結合のみが、かつＯＸ２  ＫＯマウスではなく、正常マウスにおいてのみ、濾胞性樹状細胞および内皮細胞上で検出された。両方の細胞型は、非常に高レベルのリガンドＯＸ２を発現することが既知である。従って、試薬は、ＯＸ２の生理学的な形態に結合し、そして脾臓（リガンドＯＸ２は、遺伝子標的化に起因して存在しない）における結合は観察されなかった。
【０２２４】
Ｂ細胞は、リガンドＯＸ２を発現するが、濾胞性樹状細胞および内皮細胞よりも、より低いレベルで発現することが既知である。免疫組織化学は、特に感受性の技術ではない。従って、第２の研究において、同じ融合タンパク質は、正常マウスおよびＯＸ２  ＫＯマウスから単離された脾臓白血球に適用され、そしてＢ細胞のＢ２２０分子に対して特異的なｍＡｂを使用するフローサイトメトリー分析によってＢ細胞への結合が決定され、そして融合タンパク質は、フィコエリトリンに結合したヒトＩｇＧに対する第２抗体によって、より感受性に検出される。この場合、正常マウスにおけるすべてのＢ細胞は、ＯＸ２Ｒ融合タンパク質で標識されるが、コントロール融合タンパク質ではされない。ＯＸ２Ｒ融合タンパク質とＢ細胞との相互作用は、ｍＡｂ（ＯＸ９０と呼ばれ、ＯＸ２Ｒと相互作用するマウスＯＸ２分子の一部に結合することが既知である）の添加によってブロックされた。さらに、ＯＸ２Ｒ融合タンパク質をＯＸ２  ＫＯマウス由来のＢ細胞に添加した際には、コントロール融合タンパク質で見られたバックグラウンドレベル以上の結合は、観察されなかった。
【０２２５】
これらの研究の結果は以下である：（１）ＯＸ２Ｒ融合タンパク質は、生物学的に活性であり、そして造血細胞および非造血細胞のＯＸ２に結合する；および（２）ＯＸ２Ｒに結合される主要なリガンドは、リガンドＯＸ２と実際に同定される（抗ＯＸ２（ＯＸ９０）結合阻害およびＯＸ  ＫＯマウス由来のＢ細胞への検出可能な結合の欠如に基づく）。これらのデータは、以下の可能性を排除し得ない。既知のリガンドＯＸ２に加えて、ＯＸ２Ｒに結合される他のリガンドが存在する可能性。なぜなら、フローサイトメトリーでさえも、非常に低レベルで発現される細胞表面分子を検出しないからである。
【０２２６】
トランスジェニックマウスは、標準方法によって作製され得る。このような動物は、特定の組織においてか、または器官の全体にわたって遺伝子の欠失の影響を決定するのに有用である。このようなものは、種々の段階の動物の発生または特定の組織の発生における興味深い洞察を提供し得る。さらに、生物学的ストレスに対する種々の応答への影響が評価され得る。例えば、Ｈｏｇａｎら、（１９９５）Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２編）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと。同様に、欠失マウス（例えば、ノックアウトマウス）が作製され得る。
【０２２７】
これらの動物は、インビボでの遺伝子の機能を研究するために、動物モデルに供される。例えば、Ｇｏｒｃｚｙｎｓｋｉら、（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：１６５４−１６００；Ｍａｎｋｏｏら、（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ４００：６９−７３；Ｇｏｒｃｚｙｎｓｋｉら、（１９９９）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．３１：５７７−５７８；およびＧｏｒｃｚｙｎｓｋｉ  Ｌら、（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：７７４−７８１を参照のこと。特に興味深いのは、マクロファージまたは他の骨髄性細胞集団の、例えば、血液中、リンパ組織または固体器官（神経系における小神経膠細胞を含む）における役割である。感染、自己免疫炎症および神経変性の感受性の試験が示される。アンタゴニストおよびアゴニストの両方は、記載されるか、または利用可能にされるインビトロモデルまたはインビボモデルでの有用な試薬である。
【０２２８】
（ＸＩＩＩ．治療価値を有しそうな物質のスクリーニング）
ＯＸ２Ｒ／ＯＸ２Ｒ相互作用の生物学的な効果は、ＯＸ２Ｒ（ＯＸについての実験的な置換体）に反応性の抗体の使用によって研究され得る。ＯＸ２Ｒは、マクロファージ細胞表面膜のＯＸ２Ｒ分子を架橋し、そして例えば、一酸化窒素の産生またはシグナル伝達タンパク質のリン酸化における変化を捜すことによって研究され得る。
【０２２９】
ＯＸ２Ｒ／ＯＸ２相互作用を乱す効果は、ＯＸ２Ｒを保持するマクロファージを使用して試験され得る。マクロファージを架橋結合パートナー（例えば、ＯＸ２Ｒ（例えば、ＯＸ１０２）についてのｍＡｂ）、または組換え多価バージョンのＯＸ２に曝露することによって（候補物質の存在下または非存在下で）試験され得る。候補化合物の存在下または非存在下でのマクロファージの活性（例えば、一酸化窒素の産生またはシグナル伝達タンパク質のリン酸化）の比較は、候補物質が調節効果（例えば、阻害または増強）を有するかどうかを示す。
【０２３０】
候補物質はまた、マクロファージが関連する疾患（例えば、自己免疫）の病理学の疾患の優れて確立されたモデルにおいて試験され得る。例えば、先に記載され、かつ例示されたように、確立されたモデル（例えば、実験的アレルギー脳脊髄炎）（例えば、マウスにおける自己免疫疾患の実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）の促進された発症を示すモデル）が使用され得る。ＯＸ２Ｒ擬症は、慢性条件（例えば、慢性肉芽腫症）下で有利であり得る。ＯＸ２／ＯＸＲ２シグナル伝達のアゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、このような条件に対する存在する療法と組み合わされ得る。Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪを参照のこと。
【０２３１】
例えば、上記のような分析は、ＯＸ２Ｒ／ＯＸ２相互作用の摂動が治療的に有益であり得る方法を示す。例えば、本発明は、ＯＸ２ＲＨの組換えバージョンの作製手段を提供する。ＯＸ２ＲＸは、利用可能なＯＸ２タンパク質と関連して使用され得、相互作用をブロックする可能な薬理学的な試薬をスクリーニングする。相互作用するタンパク質の有効性は、薬理学的産業で使用されるようなハイスループットな低分子スクリーニングプログラムの手段を提供する。例えば、Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇについての会議，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ  ０１７７２−１７４９を参照のこと。ＯＸ２ＲＨの細胞質領域を介した相互作用は、治療標的でありそうであり、そして配列の知識およびその相互作用は、類似のスクリーニング方法を通じた薬理学的試薬を発達するための手段を提供する。
【０２３２】
（ＸＩＶ．構造活性関連性）
特定の残基の臨界に関する情報は、標準手順および分析を使用して決定され得る。標準変異導入分析は、例えば、決定された位置（例えば、上記で同定された位置）で多くの異なる変異体を産生することによって行われ、そして変異体の生物学的活性を評価することによって行われる。これは、活性を変化する位置を決定する程度まで行われ得るか、または生物学的活性を保持、ブロックまたは調節する、のいずれかのために置換され得る残基を決定するために特定の位置に注目するまで行われる。
【０２３３】
あるいは、天然の変異体の分析は、天然の変異に耐性である位置を示し得る。これは、個体の間、または株あるいは集団にわたる変異の集団分析より生じる。個体から選択されたサンプルは、例えば、ＰＣＲ分析および配列決定によって分析される。これは、集団の多形の評価を可能にする。
【０２３４】
本明細書中のすべての引用は、本明細書中で参考として援用される。各個々の刊行物または特許出願が、具体的にかつ個別に参考として援用されるように示される場合と同程度まで援用される。
【０２３５】
本発明の多くの修飾および改変が、その精神および範囲から逸脱することなくなされ得る。なぜなら、当業者には明らかであるので。本明細書中に記載される特定の実施形態は、例の目的のみで提供され、そして本発明は、添付の請求項（このような請求項が表題を付けられた等価物の全体の範囲内に沿って）に関して限定される。；そして本発明は、例示のために本明細書中に提示された特定の実施形態によって限定されない。
【配列表】
2007319163000001.app