(57)【要約】      （修正有）【課題】ストローマ細胞の産生する造血幹細胞増殖調節因子を解析し、ｃＤＮＡライブラリーを作成し、新規な造血関連遺伝子を単離し、提供する。【解決手段】以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質をコードする遺伝子：    （ａ）特定な配列から成る群から選択される一つのアミノ酸配列、    （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、造血幹細胞増殖調節活性を有する蛋白質。【選択図】図１１
2007143556.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質をコードする遺伝子：
（ａ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、造血幹細胞増殖調節活性を有する蛋白質。
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子：
（ａ）配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、造血幹細胞増殖調節活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質をコードする遺伝子：
（ａ）配列番号１２に示されるアミノ酸配列、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、造血幹細胞増殖調節活性を有する蛋白質。
【請求項４】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子：
（ａ）配列番号１１に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、造血幹細胞増殖調節活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質をコードする遺伝子：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、造血幹細胞増殖調節活性を有する蛋白質。
【請求項６】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、造血幹細胞増殖調節活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質をコードする遺伝子：
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、造血幹細胞増殖調節活性を有する蛋白質。
【請求項８】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子：
（ａ）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、造血幹細胞増殖調節活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項９】
以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質をコードする遺伝子：
（ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、造血幹細胞増殖調節活性を有する蛋白質。
【請求項１０】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子：
（ａ）配列番号５に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、造血幹細胞増殖調節活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の遺伝子にコードされる蛋白質。
【請求項１２】
請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の少なくとも一種の遺伝子を含有する組換え発現ビークル。
【請求項１３】
組換えプラスミドベクターである請求項１２に記載の組換え発現ビークル。
【請求項１４】
組換えレトロウィルスベクターである請求項１２に記載の組換え発現ビークル。
【請求項１５】
請求項１２、１３又は１４に記載の発現ビークルによって形質転換された形質転換体。
【請求項１６】
形質転換体がＣＯＳ−７細胞である請求項１５に記載の形質転換体。
【請求項１７】
形質転換体がストローマ細胞である請求項１５に記載の形質転換体。
【請求項１８】
請求項１５又は１６に記載の形質転換体を培養することを含む、請求項１１に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項１９】
請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の少なくとも一種の遺伝子によりストローマ細胞を形質転換することから成る、該ストローマ細胞の造血幹細胞増殖活性の調節方法。
【請求項２０】
造血幹細胞増殖活性を増幅することを特徴とする、請求項１９に記載の調節方法。
【請求項２１】
該ストローマ細胞がマウス・ストローマ細胞である、請求項１９又は２０に記載の造血幹細胞増殖活性の調節方法。
【請求項２２】
以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質をコードする遺伝子：
（ａ）配列番号１３に示されるアミノ酸配列、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、造血幹細胞増殖調節活性を有する蛋白質、
でストローマ細胞を形質転換することから成る、該ストローマ細胞の造血幹細胞増殖調節活性の修飾方法。
【請求項２３】
造血幹細胞増殖活性を増幅することを特徴とする、請求項２２に記載の調節方法。
【請求項２４】
該ストローマ細胞がマウス・ストローマ細胞である、請求項２１、２２又は２３に記載の造血幹細胞増殖活性の調節方法。
【請求項２５】
請求項１３に記載の少なくとも一種の蛋白質、及び／又は、
（ａ）配列番号１３に示されるアミノ酸配列、若しくは
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、造血幹細胞増殖調節活性を有する蛋白質、
を有効成分として含有する、造血幹細胞増殖調節用組成物。
【請求項２６】
請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の遺伝子にコードされる蛋白質又はその部分ペプチドに対する抗体。
【請求項２７】
ポリクローナル抗体であることを特徴とする、請求項２６に記載の抗体。
【請求項２８】
請求項２６ないし２７のいずれ一項に記載の抗体を用いて、ストローマ細胞を単離する方法。
【請求項２９】
ストローマ細胞が骨髄造血支持細胞である、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、造血微小環境（niche）を形成し造血因子・接着因子を介して造血幹細胞又は造血前駆細胞の増殖・分化を制御していると考えられている骨髄ストローマ細胞が産生する、新規な造血幹細胞増殖調節因子及びそれをコードする遺伝子（ポリヌクレオチド）等に関する。
【０００２】
骨髄内に存在する造血幹細胞及び間葉系幹細胞は終生に渡り、それぞれ血球系細胞、骨・軟骨、脂肪細胞等に分化し、それらを供給し続けることで成体の生命を維持している。しかし近年、これら臓器特異的幹細胞がある条件下で多臓器の細胞（神経、肝臓、肺、腸管、心筋、筋肉等）にも分化し得ることが示され、その増殖機構の解明が、移植治療及び再生医療への応用という見地からも大変に重要であると考えられている。
【０００３】
これまで生体外にて造血幹細胞を増幅する試みが数多くなされ、一定の成果を挙げつつある。骨髄造血組織においては、骨髄ストローマ細胞が造血微小環境（niche）を形成し造血因子・接着因子を介して造血前駆細胞の増殖・分化を制御していると考えられている。ストローマ細胞の産生する造血因子として、ＩＬ−３，ＩＬ−６などのサイトカイン、ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３  ｌｉｇａｎｄなどの受容体型チロシンキナーゼリガンド(非特許文献１)、分化抑制因子であるＮｏｔｃｈリガンドのｊａｇｇｅｄ−１(非特許文献２)が報告されている。
【０００４】
しかしながら、上述の様に造血に重要な膜結合型因子・接着分子に関してはまだ多くが未同定であると考えられている。また、現時点では既知の因子の組み合わせだけで、造血幹細胞を長期に培養することは不可能といえ、一方、造血支持細胞であるストローマ細胞と共培養させることにより、それが一定期間可能となることから、ストローマ細胞には未だ同定されていない造血関連遺伝子を発現していることが期待される。
【非特許文献１】Gibson, F. M. et al., Br J Haematol 1995
【非特許文献２】Varnum-Finney, B. et.al., Blood 1998
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明は、上記課題を解決する為に、ストローマ細胞の産生する造血幹細胞増殖調節因子を解析し、ｃＤＮＡライブラリーを作成し、新規な造血関連遺伝子の単離を行うことによって、将来的には造血幹細胞の生体外増幅、造血器悪性腫瘍の移植治療、幹細胞による再生医学、遺伝子治療への応用を目的としたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記の目的を達成する為に、鋭意研究の結果、造血幹細胞増殖調節活性を有する蛋白質をコードする新規な遺伝子を骨髄ストローマ細胞で見出し、本発明を完成した。
【０００７】
即ち、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質をコードする遺伝子に係る：
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０及び１２から成る群から選択される一つの配列番号に示されるアミノ酸配列、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、造血幹細胞増殖調節活性を有する蛋白質。
【０００８】
本発明は更に、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子に係る：
（ａ）配列番号１、３、５、７、９及び１１から成る群から選択される一つの配列番号に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、造血幹細胞増殖調節活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【０００９】
本明細書において、「造血幹細胞増殖調節活性」とは、例えば、造血幹細胞の増殖を増幅又は増加する能力、及び、逆に造血幹細胞の増殖を抑制する能力を含み、造血幹細胞の増殖に対して何らかの影響を与える機能を意味する。更に、「造血幹細胞」とは、狭義の造血幹細胞のみならず、例えば、後述のCobblestone area forming cell (CAFC) で検出できるような、１段階分化した骨髄球系、赤芽球系、巨核球系、リンパ球系前駆細胞を含むものである。
【００１０】
本発明は更に、これら遺伝子又はＤＮＡにコードされる蛋白質に係る。本発明で初めて見出されたこれら６種類の蛋白質は、ストローマ細胞に由来し、後述する実施例で示されるように造血幹細胞増殖調節活性を有するものであることから、夫々、ＳＤＨＦ（Stromal cell Derived Hematopoietic Factor）−１、ＳＤＨＦ−２、ＳＤＨＦ−３、ＳＤＨＦ−４、ＳＤＨＦ−５及びＳＤＨＦ−６と命名される。これら各蛋白質をコードする塩基配列及び対応するアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１及び２、配列番号３及び４、配列番号５及び６、配列番号７及び８、配列番号９及び１０、並びに、配列番号１１及び１２で示されている。
【００１１】
本発明は更に、少なくとも一種の上記のいずれかの遺伝子を含有する組換え発現ビークル、該発現ビークルによって形質転換された形質転換体、及び、該形質転換体を培養することを含む、上記のいずれかの蛋白質の製造方法に係る。
【００１２】
本発明は更に、少なくとも一種の上記のいずれかの遺伝子によりストローマ細胞を形質転換することから成る、該ストローマ細胞の造血幹細胞増殖活性の調節方法に係る。形質転換した該ストローマ細胞において、本発明の遺伝子が発現し、その造血幹細胞増殖調節活性によって、該ストローマ細胞の造血幹細胞増殖活性が増幅又は増加したり、抑制されたりするのである。尚、形質転換は、例えば、上記の組換え発現ビークルを使用して、当業者に公知の方法で行なうことが出来る。
【００１３】
又、配列番号１３に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列は既に報告されており(1999 Genomics 61 (1), pp37-43)、ＩＳＬＲと呼ばれているものであるが、その機能がこれまで全くわかっておらず、今回、本発明者によって、以下の実施例に示されるように、造血幹細胞増殖調節活性を有していることが初めて実証されたものである。
【００１４】
従って、本発明は、又、以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質をコードする遺伝子：
（ａ）配列番号１３に示されるアミノ酸配列、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、造血幹細胞増殖調節活性を有する蛋白質、
でストローマ細胞を形質転換することから成る、該ストローマ細胞の造血幹細胞増殖活性の調節方法に係る。尚、形質転換は、例えば、上記の組換え発現ビークルを使用して、当業者に公知の方法で行なうことが出来る。
【００１５】
本発明は更に、上記ＳＤＨＦ−１ないしＳＤＨＦ−６及びＩＳＬＲから選択される少なくとも一種の蛋白質を有効成分として含有する造血幹細胞増殖調節用組成物に係る。
【００１６】
本明細書中で、「造血幹細胞増殖活性」とは、造血幹細胞の増殖に対して何らかの影響を与える機能を意味し、「調節」とは、該活性を増幅又は増加すること、及び、逆に抑制すること等の何らかの変化を意味する。
【００１７】
本発明は、更に、上記ＳＤＨＦ−１、−２、−３、−４、−５及び−６等の本発明の各蛋白質に対するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体等の各種抗体に係る。
尚、図２３に、本発明のＳＤＨＦ−１からＳＤＨＦ−６の分子構造を模式的に示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明遺伝子又はＤＮＡは、以下の実施例に示すように、例えば、培養中に白血病阻害因子（ＬＩＦ）で刺激された、マウス・ストローマ細胞株ＯＰ９細胞のようなストローマ細胞由来のｍＲＮＡから、ｃＤＮＡライブラリーを作成して、これに基づき、例えば、以下の実施例に示された方法で調製することが出来る。
【００１９】
或いは、本明細書で開示された配列情報に基づいて、当該技術分野における周知手段を用いた化学合成等によっても調製することが可能である。当業者であれば、特定のアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸を欠失、置換若しくは付加することも、当該技術分野における周知手段を用いて容易に実施することができる。
【００２０】
本発明において、特定の遺伝子又はＤＮＡは、当業者に周知の緩衝液中で、適当な温度及び塩濃度等の諸条件下のストリンジェントな条件でハイブリダイズさせることができる。
【００２１】
このようなストリンジェントな条件下で本発明の遺伝子又はＤＮＡとハイブリダイズし、且つ、造血幹細胞増殖調節活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの例として、例えば、かかる遺伝子と相同性が７０％以上、好ましくは９０％以上であるようなＤＮＡを挙げることができる。
【００２２】
本発明の遺伝子又はＤＮＡに、遺伝子組換え操作において当業者に公知である様々な配列、例えば、プロモーター及びエンハンサーなどの調節因子、制限酵素部位、並びに選択マーカー（マーカー酵素等）遺伝子等が適宜結合されたＤＮＡ分子も本発明の範囲である。
【００２３】
更に、本発明の遺伝子、ＤＮＡ又は上記ＤＮＡ分子を含有する組換えプラスミドベクター又はレトロウイルス等を使用する組換えウイルスベクター等の発現ビークル、及び該発現ビークルを含みそれによって形質転換された大腸菌等の細菌、マウスＣＯＳ−７細胞又はマウス・ストローマ細胞ＯＰ９等の真核細胞等の形質転換体も本発明に含まれる。これらのＤＮＡ分子、発現ビークル及び形質転換体は、当該技術分野における公知の手段によって、容易に調製することができる。更に、本発明の蛋白質は、当業者であれば、上記の形質転換体を当該技術分野における公知手段によって培養し、得られた培養物から精製することにより、容易に製造することができる。
【００２４】
上記蛋白質を有効成分として含有する、本発明の造血幹細胞増殖調節活性化組成物には、造血因子として公知のその他のサイトカイン、並びに当該技術分野で公知の適当なキャリア及び助剤等を目的に応じて適宜含有させることが出来る。蛋白質を有効成分としての本発明蛋白質及びその他の成分の含有量及び含有割合等は、使用目的などに応じて当業者が適宜選択することが出来る。
【００２５】
上記ＳＤＨＦ−１、−２、−３、−４、−５及び−６等の本発明の各蛋白質に対する、本発明のポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体等の各種抗体は、当業者に公知の任意の方法で製造することができる。例えば、ポリクローナル抗体の場合には、上記各蛋白質又はその部分ペプチドを免疫源としてウサギ等の各種実験動物に接種することによって容易に製造することができる。又、モノクローナル抗体の場合には、このような免疫源を使用して同様に調製した抗体産生細胞を適当な親細胞（不死化細胞株）と当業者に周知の各種方法によって細胞融合させてハイブリドーマを作成し、この中から各蛋白質と特異的に反応するクローンを選択することによって容易に得ることができる。尚、部分ペプチドは各蛋白質の任意の部分のアミノ酸配列に相当するものであり、そのアミノ酸数に特に制限はないが、少なくとも１０個以上のアミノ酸を有するものが好ましく、通常、１０〜２０個の範囲のものが適当である。又、各蛋白質との反応性を考慮すると、免疫源として使用する部分ペプチドは各蛋白質の細胞外領域から選択することが好ましい。
【００２６】
このような抗体は、骨髄幹細胞、間葉系幹細胞、及び神経幹細胞等の各種成体細胞、並びに骨髄造血支持細胞等の幹細胞支持細胞（ストローマ細胞）を単離又は純化する方法に使用することができる。これらの単離又は純化方法は、具体的には、当業者に公知の任意の各種手段、例えば、アフィニティカラムによる精製、及びＦＡＣＳによるソーティング等により実施することができる。
【００２７】
実施例
以下に実施例に即して本発明を詳述するが、これら実施例は本発明の技術的範囲を如何なる意味でも何ら限定するものではない。
【００２８】
ｃＤＮＡライブラリーの構築とSignal Sequence Trap (SST) 法
マウス・ストローマ細胞株ＯＰ９細胞はＡｌｐｈａ−ＭＥＭ培地に２０％の胎児牛血清を添加して培養する。ＰＬＡＴ−Ｅ細胞（2000 森田らGene Therapy vol7 1063-6）はＤＭＥＭに１０％の胎児牛血清を添加した培地にて培養した。ＯＰ９細胞よりのｐｏｌｙＡ  ＲＮＡの抽出はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のFAST TRACK2.0mRNA Isolation Kitを用い、その添付プロトコールに従い行った。ｃＤＮＡライブラリーの材料としmouse Leukemia Inhibitory Factor (LIF) １０ｎｇ／ｍｌ３７℃６０分にて刺激したＯＰ９細胞１ｘ１０８個から抽出したｐｏｌｙＡＲＮＡ５μｇを用いた。ｃＤＮＡライブラリーの構築はＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  ＩＩ (Invitrogen社)を用い、ランダムヘキサマーをプライマーとして行った。得られたｃＤＮＡライブラリーにＢｓｔＸＩアダプタープライマー（Invitrogen社）を付加し、レトロウィルスベクターであるｐＭＸ−ＳＳＴベクター（1999 小嶋らNat Biotech vol 17 p487）のＢｓｔＸＩ部位に組み込みプラスミド・ライブラリーを構築した。
【００２９】
作製したｃＤＮＡライブラリーをＰＬＡＴ−Ｅ細胞にＦｕＧｅｎｅ６（Roche社）を用いて遺伝子導入して上清にレトロウィルスの形で回収した。得られたレトロウィルスｃＤＮＡライブラリーをインターロイキン３(IL-3)依存性のマウスプロＢ細胞であるＢａ／Ｆ３細胞に感染させた。ｐＭＸ−ＳＳＴベクターはシグナルペプチドを欠損した恒常的活性化型ｃ−Ｍｐｌ遺伝子を有しており、ライブラリー由来の遺伝子がシグナルペプチドを有している場合にｃＭｐｌ遺伝子が活性化し、Ｂａ／Ｆ３細胞がＩＬ−３非存在下において不死化する（1999 小嶋らNat Biotech vol 17 p487-90）。レトロウィルス・ライブラリーを感染させたＢａ／Ｆ３細胞からＩＬ−３を除去し９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００００個ずつ分けて培養、細胞が増殖してきたものを単離し、ゲノムＤＮＡを抽出した。シグナルペプチドを有した遺伝子はレトロウィルスにてＢａ／Ｆ３細胞のゲノムＤＮＡに挿入されているのでｐＭＸ−ＳＳＴベクターの配列をもとにして設計したプライマー(GGGGGTGGACCATCCTCTA, CGCGCAGCTGTAAACGGTAG)にてゲノムＤＮＡ  ＰＣＲ反応（LA-Taq, TAKARA 98℃ 20 sec 68℃ 300 sec; 35 cycles）を行い回収した。
【００３０】
遺伝子配列の決定
シグナルペプチドを有したクローンは上記ＰＣＲ反応にてＤＮＡ断片として得られるのでこの塩基配列をＡＢＩ社３７３Ａ  シーケンサーにて決定した。得られたＰＣＲ断片をPCR purification kit (Quiagen社)にて精製しプライマーを除去した後、ＡＢＩ社のプロトコールに従いdye terminator法にて配列を決定した。得られた配列情報はＮＣＢＩのＢＬＡＳＴプログラム（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）にて解析し、既知配列、未知配列の判定を行った。未知配列の一部は得られた配列を元に設計したプライマーを用いて３’ＲＡＣＥ法にて決定した。３’ＲＡＣＥ法は、上記ＰＣＲクローンの配列をもとにして設計したプライマーとオリゴｄＴプライマーを用いたＰＣＲ法にて未知遺伝子のｐｏｌｙＡ領域までを同定する方法である。得られたＰＣＲ断片は上記と同様にＡＢＩ社３７３Ａシーケンサーにて塩基配列を決定した。
【００３１】
その結果、上記のＳＳＴ法により既知・未知合わせて２３４クローンの遺伝子を単離した。その内訳は、既知遺伝子１８１、及び未知遺伝子４２、解析できなかったもの１１であった。既知遺伝子の内訳としては、増殖因子４９、受容体２３、接着因子７１、及びその他３８であった。
【００３２】
未知遺伝子の中に、本発明の遺伝子である、６種類のＳＤＨＦ（Stromal cell derived hematopoietic factor）遺伝子、及びＩＳＬＲが含まれていた。尚、第１図〜第６図及び配列１３に示されるように、６種類のＳＤＨＦ及びＩＳＬＲ遺伝子がコードするアミノ酸配列のＮ末端には、シグナルペプチド（四角の枠部で示された部分）が含まれていることが判明した。以上の結果を表１及び表２に示す。
【００３３】
【表１】
2007143556.tif 000003
【００３４】
【表２】
2007143556.tif 000004
2007143556.tif 000005
【００３５】
マイクロアレイ法
Signal Sequence Trap法にて得られたＰＣＲ断片は全てスライドグラス上にスポットし（以上の操作は北海道システムサイエンス社に委託した。）ＯＰ９細胞をＬＩＦ１０ｎｇ／ｍｌ  ３７℃６０分による刺激前後の条件にて調整した細胞より作製した蛍光標識ｃＤＮＡプローブにて発現の変化を検出した。プローブは上記と同様に抽出したｐｏｌｙＡ  ＲＮＡよりオリゴｄＴプライマーにてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩにて逆転写反応を行い、Fluorolink Cy-dUTPを取り込ませることにより標識した後Ｍｉｃｒｏｃｏｎ３０（Millipore社）にて精製し用いた。得られた結果を第７図に示した。
【００３６】
ノーザンブロッティング
ＯＰ９細胞をＬＩＦ  １０ｎｇ／ｍｌ  ３７℃６０分にて刺激後、０分、３０分、１時間、３時間、８時間、２４時間後にそれぞれｔｏｔａｌ  ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ液（Invitrogen社）を用い、そのプロトコールに従い抽出した。抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡは濃度測定後１０μｇずつ１％アガロースゲル上に電気泳動後、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ(Amersham社)上に転写し、それぞれの遺伝子のＤＮＡ断片をプローブにして標準的な方法にてノーザンブロッティングを行った。その結果、第８図に示されるように、ＳＤＨＦ−１、ＳＤＨＦ−２、及びＳＤＨＦ−５遺伝子について発現の増加が観察された。一方、対照的に、ＳＤＨＦ−６遺伝子について発現の減少が観察された。
【００３７】
ウェスタン解析法
得られた遺伝子の全長配列よりアミノ酸をコードしている領域（Open Reading Frame: ORF）を決定し、そのカルボキシル末端にＦＬＡＧタグ配列（DYKDDDDK）をＰＣＲ法にて付加した。これらのｃＤＮＡを発現ベクターｐＵＣ−ＣＡＧＧＳに挿入して作製したプラスミドをＦｕＧｅｎｅ６（ロシュ社）にてＣＯＳ−７細胞に一過性に発現した。ウェスタン解析は過去に報告した方法（1995 Ueno, JBC vol 270pp20135-42）にて行った。細胞はTriton lysis buffer (0.5% (v/v) Triton X-100, 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 2 mM PMSF, 10 U/ml aprotinin 1mM EDTA)  にて可溶化した後、５０μｇをSDS-polyacrylamide gel elestrophoresis (PAGE)にて展開し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐメンブレインに転写後抗ＦＬＡＧ抗体、Ｍ２（SIGMA社）にて検出した。その結果、第９図に示されるように、本発明のいずれの遺伝子もＣＯＳ７細胞にて発現されウェスタン解析にてバンドが検出された。
【００３８】
免疫染色法
上記と同条件にてＦＬＡＧタグ配列を付加した遺伝子をＣＯＳ−７細胞にＦｕＧｅｎｅ試薬を用いて一過性に発現させ（上記参照）、３．７％ホルムアルデヒドにて固定後１％ＮＰ４０にてｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎを行い、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて染色した（二次抗体はTexas Red標識抗マウス抗体、Jackson社）。核はＤＡＰＩ（フナコシ社）染色を行った。その結果を第１０図に示す。
【００３９】
Cobblestone Area Forming Cell Assay : CAFC（敷石状領域形成細胞アッセイ）
ＯＰ９細胞に上記にて得られた遺伝子をレトロウィルスベクター(pMX-puro) にて遺伝子導入し６ｗｅｌｌディッシュに２．５ｘ１０５ずつ蒔き、一晩培養した後、５−８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス大腿骨より採取した骨髄細胞１ｘ１０５まき、６日後に形成されたＣＡＦＣ数を測定した。
【００４０】
ＣＡＦＣ解析の結果
ストローマ細胞と骨髄細胞を共培養した際、骨髄細胞がストローマ細胞の下部に潜り込み増殖する現象をCobblestone area forming cell (CAFC) という。ＣＡＦＣ形成数が多い場合、ストローマ細胞が未熟な造血支持細胞を増幅していることを意味している。ただしＣＡＦＣを形成している細胞は造血幹細胞だけでなく、１段階分化した骨髄球系、赤芽球系、巨核球系、リンパ球系前駆細胞を含んでいるため、厳密にはＣＡＦＣの増加=造血幹細胞の増幅ではない。造血支持能を有するマウス骨髄ストローマ細胞株のＯＰ９細胞に上記遺伝子をレトロウィルスｐＭＸ−ｐｕｒｏにて導入し、ピューロマイシン５μｇ／ｍｌにて薬剤耐性となった細胞についてＣＡＦＣ形成能を解析した。その結果、第１１図に示されるように、ISLRが最も高値を示しＳＤＨＦ−１、ＳＤＨＦ−２、ＳＤＨＦ−４、及びＳＤＨＦ−５についても軽度の高値を示した。これらの遺伝子の造血前駆細胞増幅能力が示唆された。逆にＳＤＨＦ−３ではＣＡＦＣ形成が抑制され、造血幹細胞増殖抑制機能を有すると考えられた。
【００４１】
細胞培養上清の分泌蛋白質のメチオニン標識による検出
ＣＯＳ−７細胞を６ｃｍディッシュに１ｘ１０５個まき、一晩培養した。ＦｕＧｅｎｅ法（Roche社）を用いて遺伝子導入した。これらの遺伝子のカルボキシル末端にはＦＬＡＧタグが付加されており、前述したように、抗ＦＬＡＧ抗体によるウェスタン解析にて発現した蛋白質を検出することが出来る。３６時間の培養後、上清を除去し、ＰＢＳにて２回洗浄後、０．５  ｍｌ  ＤＭＥＭ(Methionine−, SIGMA社)中の０．５ｍＣｉ［３５Ｓ］ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ(ICN社TRAN-S)を加え、４時間培養した。培養上清から遠心にて細胞成分を除去し、Ｍｉｃｒｏｎ  １０（ミリポア社）にて蛋白質を濃縮した。１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動後、標識された蛋白質をＢＡＳ２０００（富士フィルム社）にて検出した。
【００４２】
その結果、第１２図及び第１３図に示されるように、ＳＤＨＦ−１及びＳＤＨＦ−５にて、培養上清への蛋白質分泌が検出された。これらの遺伝子は構造的に膜型蛋白質であること、分泌蛋白質の分子量がウェスタン解析で検出された成熟型蛋白質よりも約２０ｋＤａ小さくなっていることから、これらの分泌蛋白質はカルボキシル末端の膜貫通領域が切断されたものと考えられる。カルボキシル末端の膜貫通領域が切断されて分泌されるタイプの増殖因子としてＳＣＦが知られており、一方、接着蛋白質ではこうした例は認められないことから、本発明の遺伝子がコードする蛋白質は、液性因子として他の細胞に情報を伝達するタイプの蛋白質であることを強く示唆するものと考えられる。
【００４３】
ＲＴ−ＰＣＲ法による発現部位の検定
各ＳＤＨＦ遺伝子の塩基配列に基づきプライマーを設定、Multiple Tissue cDNA (MTC) Panels (クロンテック社)をｔｅｍｐｌａｔｅとしてＰＣＲ反応（LA-Taq, TAKARA）を行った。また、骨髄内の細胞は蛍光標識したモノクローナル抗体（抗B220, 抗CD3, 抗Gr1, 抗MAC1, 抗Sca1抗体、Phamingen社）を用い、FACS Vantage(BectonDickinson社)にてソーティングしたＴｒｉｚｏｌ試薬（Invitrogen社）にてＲＮＡを抽出し、ランダムヘキサマーを用いてＲＴ反応を行った上で、同様にＰＣＲ反応を行った。
【００４４】
その結果、第１４図に示される様に全てのＳＤＨＦ遺伝子はＯＰ９細胞での発現が確認された。特にＳＤＨＦ−４は発現が脳と骨髄に限局して発現しており、また骨髄内においてはストローマ細胞に限局して発現しているなど興味深い。
【００４５】
Long Term Culture-Initiating Cells Assay（ＬＴＣ−ＩＣ法）による幹細胞支持機能の検定
上記のＣＡＦＣ法では比較的短期間の造血支持機能を反映しているにすぎないため、より長期の幹細胞支持機能評価法としてＬＴＣ−ＩＣ法を行った。上記と同様に単離した遺伝子をレトロウィルス発現ベクターｐＭＸ−ｐｕｒｏを用いてＯＰ９細胞に高発現させＬＴＣ−ＩＣ法を行った。
【００４６】
まず造血幹細胞を純化する。６週齢から８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの大腿骨より骨髄細胞を採取し、Ｆｉｃｏｌｌ法(比重1.100) にて単核細胞を遠心分離した。ＰＢＳにて洗浄後、ビオチン標識した１次抗体（抗Lineage抗体カクテル：抗CD3, 抗CD4, 抗CD8, 抗B220, 抗Ter119, 抗Gr1,抗 MAC1抗体、以上Phamingen社）およびストレプトアビジン標識磁気ビーズにそれぞれ４℃１５分間反応させた。ＭＡＣＳ法にてカラムを通過する分画（LIN(-)細胞）を回収し、遠心洗浄後、さらにＰＥ標識抗Ｓｃａ１抗体、ＦＩＴＣ標識抗ｃ−ｋｉｔ抗体、Ｐｅｒ−ＣＰ−Ｃｙ５．５標識ストレプトアビジン（以上Phamingen社）にて４℃１５分間反応させ、ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（Becton Dickinson社）にてＬＩＮ（−），Ｓｃａ１（＋），ｃ−ｋｉｔ（＋）分画（以上にて得られた細胞をKSL細胞と定義する。）ＳＤＨＦ−１−６のカルボキシル末端にＦＬＡＧペプチドを付加したｃＤＮＡをレトロウィルスベクター(pMX-puro) にてＯＰ９細胞に遺伝子導入して樹立した安定発現株を６穴ディッシュに２．５ｘ１０５ずつ蒔き、一晩培養した後、KSL細胞を１００個ずつまき、３週間培養した。その後細胞を回収し、γ線を２０Ｇｙ照射したＯＰ９細胞を１穴に３０００個ずつまいておいた９６穴ディッシュに、８穴ずつペアで２分の１ずつ薄めて蒔いた。５週間後、各穴から細胞を回収しそれぞれメチルセルロース培地（IMDM, メチルセルロース1%、牛胎児血清15%、牛血清アルブミン 1%、ヒトエリスロポイエチン3U/ml、ヒトIL-6 10ng/ml、マウスIL-3 10ng/ml、マウスSCF 100ng/ml牛インスリン10μg/ml）に蒔いて１２日後に血球コロニー（CFU-C）の有無で判定した。幹細胞の頻度はＬ−Ｃａｌｃソフトウェア（Stemcell社）にて行った。
【００４７】
その結果、第１５図に示されるようにＳＤＨＦ−４遺伝子に著明な造血支持能が観察された。この遺伝子の造血支持機能が示された。
【００４８】
ＳＤＨＦ−４細胞外領域・リコンビナントタンパク質によるマウス造血幹細胞の増幅効果
ＳＤＨＦ−４の細胞膜貫通領域をＰＳＯＲＴ  ＩＩプログラム（http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/form2.html）で予測し（アミノ酸524-540）、細胞外領域（アミノ酸1-523）にヒト免疫グロブリンFc領域と融合タンパク質（SDHF-4-ΔTM-Fc）を作製、発現ベクターｐＳＳＲａに組み込み、ＣＨＯ−ｋ１細胞に安定的に遺伝子導入した。無血清培地ＣＤ−ＣＨＯ（Invitrogen社）にて培養することで、上清から融合リコンビナントタンパク質をＰｒｏｔｅｉｎＡカラムにて精製した（第１６図）。マウス幹細胞はＬＴＣ−ＩＣ法の項に記載した様にマウス骨髄ＬＩＮ（−），Ｓｃａ１（＋），ｃ−ｋｉｔ（＋）分画（KSL細胞）１００個ずつ、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ），ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍｌ），ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＳＤＨＦ−４−ΔＴＭ−Ｆｃ（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加したＳｔｅｍ  Ｓｐａｎ培地（StemCell社）にて培養した。７日後、細胞を回収し、ＦＡＣＳ  ＣａｌｉｂｕｒにてＬＩＮ，Ｓｃａ１，ｃ−ｋｉｔの発現を解析した。
【００４９】
その結果、第１７図に示されるように、ＳＣＦ，ＩＬ−３，ＩＬ−６を添加したＳｔｅｍＳｐａｎ培地にて培養したＬＳＫ細胞はＳＤＨＦ−４−ΔＴＭ−Ｆｃ１００ｎｇ／ｍｌの存在下において非存在下と比較してＬＩＮ（−）細胞の割合が増加するだけでなく、ＬＩＮ（−），Ｓｃａ１（＋），ｃ−ｋｉｔ（＋）分画の割合も増加することが判明した。この結果は、ＳＤＨＦ−４細胞外領域・リコンビナントタンパク質にマウス造血幹細胞の未分化状態を維持する作用があることを示している。
【００５０】
脂肪細胞分化の検定とオイルレッドＯ染色法
ＳＤＨＦ−６遺伝子をレトロウィルスベクター(pMX-puro)導入した細胞とベクターのみを導入した細胞をそれぞれＡｌｐｈａ−ＭＥＭ＋２０％牛胎児血清の条件にて４週間以上継代せずにＣｏｎｆｌｕｅｎｔの状態で培養し続けた。細胞は１０％ホルマリンにて固定後オイルレッドＯにて染色した。
その結果、第１８図に示されるように、ＳＤＨＦ−６をレトロウィルス発現ベクターｐＭＸ−ｐｕｒｏを用いてＯＰ９細胞に高発現させると約４週間の培養の後、効率に脂肪細胞に分化させる効果があることが判明した。この遺伝子が、造血幹細胞よりもむしろ間葉系の細胞に作用して脂肪細胞への分化に関与していると考えられた。
【００５１】
ＳＤＨＦ−４に対するポリクローナル抗体の作製及びそれによる骨髄内造血支持細胞の単離
ＳＤＨＦ−４のアミノ酸配列をもとに、合成ペプチド（GYMAKDKFRRMNEGQVY（第32-48番目のアミノ酸に相当する））を設計しラビットに免疫してポリクローナル抗体を作製した。
このペプチドを Epoxy-activated Sepharose 6B（ファルマシア社）に結合させ、抗原カラムを作製、これにより、得られたポリクローナル抗体をアフィニティー精製した。この抗体を用い、ＣＨＯ−ｋ１細胞にｐＳＳＲα−ｂｓｒベクターを用いてＳＤＨＦ−４を発現させた細胞（SDHF4-cl12）とベクターだけ導入した細胞（ｍｏｃｋ）を比較してウェスタン解析を施行したところ、非常に特異的にＳＤＨＦ−４遺伝子産物を認識できることがわかった（第１９図）。また、得られた精製抗体１ｍｇを LinKit Fluoro-Link (ISL社) によりＦＩＴＣ標識し、同じ細胞をＦＡＣＳ  ｃａｌｉｂｕｒ（Becton Dickinson社）にて解析したところ、この抗体はFlowcytemetryにも使用可能であることがわかった（第２０図; ○線がmock、■線がSDHF4-cl12）。この抗体を用いてＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの骨髄細胞を染色し、ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（Becton Dickinson社）によりＳＤＨＦ４を発現している細胞をソーティングして回収したところ（第２１図）、これらの細胞は培養ディッシュに付着し、形態学的にも骨髄造血支持細胞に相当する間葉系の細胞であった（第２２図）。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明によって、ストローマ細胞に由来する、新規な造血関連遺伝子の単離を行うことに成功し、それらが造血幹細胞増殖調節活性を有することが実証された。これによって、造血幹細胞の生体外増幅、造血器悪性腫瘍の移植治療、幹細胞による再生医学、遺伝子治療、免疫療法、細胞移植、遺伝子治療、神経疾患（アルツハイマー病、脳梗塞、変性神経疾患等）、肝疾患（肝硬変等）、肺疾患、心筋疾患、糖尿病、骨疾患、及び慢性腎疾患等の広範囲な応用を可能としたものである。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】第１図は、ＳＤＨＦ−１のアミノ酸配列を示す。
【図２】第２図は、ＳＤＨＦ−２のアミノ酸配列を示す。
【図３】第３図は、ＳＤＨＦ−３のアミノ酸配列を示す。
【図４】第４図は、ＳＤＨＦ−４のアミノ酸配列を示す。
【図５】第５図は、ＳＤＨＦ−５のアミノ酸配列を示す。
【図６】第６図は、ＳＤＨＦ−６のアミノ酸配列を示す。
【図７】第７図は、マイクロアレイ法により得られた結果を示す。
【図８−１】第８図は、ノーザンブロッティングにより得られた結果を示す。
【図８−２】第８図は、ノーザンブロッティングにより得られた結果を示す。
【図９】第９図は、ウェスタン解析により得られた結果を示す。
【図１０】第１０図は、免疫染色法により得られた結果を示す。
【図１１】第１１図は、ＣＡＦＣ解析の結果を示す。
【図１２】第１２図は、ウェスタン解析により検出された本発明遺伝子ＳＤＨＦ−１、ＳＤＨＦ−５の蛋白質翻訳後修飾の結果を示す。★は糖鎖が付加されて分子量が大きくなった成熟型の蛋白質を示し、▲は糖鎖の付加される以前の生成過程の蛋白質を示し、▼は切断後の残存蛋白質を示し、●は分泌型蛋白質を示す。
【図１３】第１３図は、細胞培養上清の分泌蛋白質のメチオニン標識による検出の結果を示す。●は分泌型蛋白質を示し、→は切断後培養上清に分泌された蛋白質を示す。
【図１４−１】第１４図は、ＲＴ−ＰＣＲ法による本発明遺伝子の発現部位の検定の結果を示す、電気泳動の写真である。
【図１４−２】第１４図は、ＲＴ−ＰＣＲ法による本発明遺伝子の発現部位の検定の結果を示す、電気泳動の写真である。
【図１５】第１５図は、ＬＴＣ−ＩＣ法による本発明遺伝子の幹細胞支持機能の検定の結果を示す。
【図１６】第１６図は、ＳＤＨＦ−４細胞外領域・リコンビナントタンパク質をＰｒｏｔｅｉｎＡカラムにて精製した様子を示す、電気泳動の写真である。
【図１７】第１７図は、ＳＤＨＦ−４細胞外領域・リコンビナントタンパク質がマウス造血幹細胞の未分化状態を維持する作用を有することを示すグラフである。
【図１８−１】第１８図は、ＳＤＨＦ−６をレトロウィルス発現ベクターｐＭＸ−ｐｕｒｏを用いてＯＰ９細胞に高発現させると約４週間の培養の後、効率に脂肪細胞に分化させる効果があることを示す、顕微鏡写真（倍率：×４０）である。
【図１８−２】第１８図は、ＳＤＨＦ−６をレトロウィルス発現ベクターｐＭＸ−ｐｕｒｏを用いてＯＰ９細胞に高発現させると約４週間の培養の後、効率に脂肪細胞に分化させる効果があることを示す、顕微鏡写真（倍率：×４０）である。
【図１９】第１９図は、ＳＤＨＦ−４の部分ペプチドに対する抗体を用い、ＣＨＯ−ｋ１細胞にｐＳＳＲα−ｂｓｒベクターを用いてＳＤＨＦ−４を発現させた結果を示す、ウェスタン解析による写真である。
【図２０】第２０図は、上記の精製抗体をＦＩＴＣ標識し、ＳＤＨＦ−４を発現させたＣＨＯ−ｋ１細胞をＦＡＣＳ  ｃａｌｉｂｕｒ (BectonDickinson社)にて解析した結果を示す。
【図２１】第２１図は、同抗体を用いてＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの骨髄細胞を染色し、ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ (BectonDickinson社) によりＳＤＨＦ４を発現している細胞をソーティングした結果を示す。
【図２２】第２２図は、ソーティングにより選択された上記細胞の顕微鏡写真（倍率：×２００倍）である。
【図２３】第２３図は、ＳＤＨＦ−１からＳＤＨＦ−６の分子構造を模式的に表したものである。
【図１】
2007143556.tif 000006
【図２】
2007143556.tif 000007
【図３】
2007143556.tif 000008
【図４】
2007143556.tif 000009
【図５】
2007143556.tif 000010
【図６】
2007143556.tif 000011
【図７】
2007143556.tif 000012
【図１１】
2007143556.tif 000013
【図１５】
2007143556.tif 000014
【図１６】
2007143556.tif 000015
【図１７】
2007143556.tif 000016
【図１９】
2007143556.tif 000017
【図２０】
2007143556.tif 000018
【図２１】
2007143556.tif 000019
【図８−１】
2007143556.tif 000020
【図８−２】
2007143556.tif 000021
【図９】
2007143556.tif 000022
【図１０】
2007143556.tif 000023
【図１２】
2007143556.tif 000024
【図１３】
2007143556.tif 000025
【図１４−１】
2007143556.tif 000026
【図１４−２】
2007143556.tif 000027
【図１８−１】
2007143556.tif 000028
【図１８−２】
2007143556.tif 000029
【図２２】
2007143556.tif 000030
【図２３】
2007143556.tif 000031
【配列表】
2007143556000001.app