(57)【要約】【課題】構造色変化に基づく簡便な光学的手段によって高精度に標的物質を検出し得る方法とシステムを提供すること。【解決手段】本発明によって提供される検出方法では、基材（１０）と、標的物質（１）と特異的に結合し得る受容体（２）と、該受容体に結合した付加物質（６）であって構造色変化の度合いを高めるための付加物質と、前記基材上に固定され且つ前記受容体と結合した状態の捕捉物質（３）であって前記標的物質が存在する所定の条件下にあっては前記受容体が遊離し得る性状の捕捉物質とを備えた構造色評価用デバイス（２０）を使用する。そして、試料中の標的物質の存在に応じて前記デバイスから受容体及び付加物質が遊離し得る条件で該デバイスと試料をインキュベートし、受容体の遊離に基づく構造色の変化の度合いを光学的に調べる。【選択図】図２
2007093355.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含まれる特定の標的物質を検出する方法であって：
基材と、
前記標的物質と特異的に結合し得る受容体と、
前記基材上に固定され且つ前記受容体と結合した状態の捕捉物質であって前記標的物質が存在する所定の条件下にあっては前記受容体が遊離し得る性状の捕捉物質と、
前記受容体に結合した付加物質であって構造色変化の度合いを大きくするための付加物質とを備え、
前記基材上には、構造色を測定可能なように前記捕捉物質、受容体及び付加物質がそれぞれ配列して成る表面層が形成されていることを特徴とする構造色評価用デバイスを用意すること；
前記デバイスに試料を付与するとともに、該試料中の標的物質の存在に応じて前記表面層から前記付加物質及び受容体が遊離し得る条件で該デバイスと試料をインキュベートすること；および
前記インキュベートした後の前記基材の表面層について、前記付加物質及び受容体の遊離に基づく構造色変化の度合いを調べること；
を包含する、標的物質検出方法。
【請求項２】
前記受容体として、検出対象の標的物質よりも分子サイズの大きい物質が使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記付加物質として前記基材上に配置し得る球状物質が使用される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記試料として液体試料が使用され、該液体試料が前記基材表面層に接触した状態で前記インキュベートが行われる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記構造色の変化の度合いは、前記インキュベートの前後で測定した前記基材表面層における反射スペクトルの比較に基づいて決定される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
試料中に含まれる特定の標的物質を光学的に検出するデバイスであって、
基材と、
前記標的物質と特異的に結合し得る受容体と、
前記基材上に固定され且つ前記受容体と結合した状態の捕捉物質であって前記標的物質が存在する所定の条件下にあっては前記受容体が遊離し得る性状の捕捉物質と、
前記受容体に結合した付加物質であって構造色変化の度合いを高めるための付加物質とを備え、
前記基材上には、構造色を測定可能なように前記捕捉物質、付加物質及び受容体がそれぞれ配列して成る表面層が形成されていることを特徴とする、構造色評価用デバイス。
【請求項７】
前記受容体として検出対象の標的物質よりも分子サイズの大きい物質を備える、請求項６に記載のデバイス。
【請求項８】
前記付加物質は、前記基材上に配置し得る球状物質である、請求項６又は７に記載のデバイス。
【請求項９】
試料中に含まれる特定の標的物質を光学的に検出するデバイスを製造するのに用いられるキットであって、
基材と、
前記標的物質と特異的に結合し得る受容体と、
前記受容体に結合した付加物質であって構造色変化の度合いを高めるための付加物質と、
前記基材上に固定された状態の捕捉物質であって前記受容体と結合し且つ前記標的物質が存在する所定の条件下においては該結合した受容体が遊離し得る性状の捕捉物質と、
を備え、
ここで前記基材上には前記捕捉物質が構造色を測定可能なように配列して成る表面層が形成されており、前記付加物質及び受容体は該表面層が形成された基材とは独立に保存可能な形態で装備されている、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学的手段によって標的物質を検出する方法に関する。詳しくは、構造色の変化に基づく標的物質の検出方法に関し、そのような検出方法を実施し得る検出システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
ナノテクノロジーの進展に伴って、構造性発色即ち構造色の変化に基づいて標的物質を検出する方法が提案されている。構造色とは光の反射等により表現される発色であり、被処理物の微細構造（典型的にはナノオーダーの微細構造）による光の干渉（例えば、薄膜干渉や多層膜干渉による干渉色）、回折（回折格子）、光散乱等によるものが知られている。これら構造色変化に基づく迅速で簡単な標的物質検出方法ならびに簡素な構成の検出システムの実現が期待されている。
例えば、特許文献１には、糖応答性高分子ゲルを糖含有溶液と接触させることによって該ゲルの構造色を変化させるとともにその変化の度合いを反射スペクトルの変化として観測することによって該供試溶液中の糖濃度を検出する方法が記載されている。
また、特許文献２には、光学的特性を与える表面を有する基質と、該基質表面によって支持されている薄膜状中間層と、当該中間層に固定された受容物質（標的物質即ち被検物と結合する物質）とを有する薄膜デバイスであって、標的物質が該受容物質に結合したときにその結果として薄膜状中間層または光学的厚みに生ずる変化から当該標的物質の存在又は量が検出できるように上記受容物質が濃密に上記薄膜状中間層に固定されていることを特徴とする薄膜デバイスが記載されている。
【０００３】
【特許文献１】特開２００４−２７１９５号公報
【特許文献２】特開２００４−４５４２１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１に記載の方法は、特殊な材料（糖応答性高分子ゲル）を使用する方法であって用途が限定されており、汎用性に欠ける。また、特許文献２に記載の方法は、基板上に形成された薄膜部分に濃密に受容物質（例えば抗体）を付着させる必要があり、これによってデバイスの製造コスト高となり得るとともにデバイス毎に受容物質の保持量が異なり得る。このことは標的物質の検出精度の低下の要因となり得るため好ましくない。
【０００５】
本発明は、構造色に基づく検出方法及び検出システムにおける上記従来の課題を解決すべく創出されたものであり、構造色変化に基づいて高精度に標的物質を検出し得る汎用的な方法を提供することを目的とする。また、そのような検出方法を好適に行い得る検出システム（検出方法に使用する物品を含む）を提供することを他の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、従来とは異なる手段・プロセスによって、試料中に含まれる特定の標的物質を光学的に検出する方法を提供する。
すなわち、ここで開示される一つの標的物質検出方法は、（１）基材と、前記標的物質と特異的に結合し得る受容体と、前記基材上に固定され且つ前記受容体と結合した状態の捕捉物質であって前記標的物質が存在する所定の条件下にあっては前記受容体が遊離し得る性状の捕捉物質と、前記受容体に結合した付加物質であって構造色変化の度合いを高めるための付加物質とを備え、前記基材上には、構造色を測定可能なように前記捕捉物質、受容体及び付加物質がそれぞれ配列して成る表面層が形成されていることを特徴とする構造色評価用デバイスを用意すること、（２）前記デバイスに試料を付与するとともに、該試料中の標的物質の存在に応じて前記表面層から前記付加物質及び受容体が遊離し得る条件で該デバイスと試料をインキュベートすること、および、（３）前記インキュベートした後の前記基材の表面層について、前記付加物質及び受容体の遊離に基づく構造色変化の度合いを調べること、を包含する。
【０００７】
本明細書において「受容体」とは、検出対象とする特定の標的物質に対して特異的（選択的）に結合し得る物質を指す用語であり、特定の形態のものに限定されない。標的物質との関係において高い結合定数を有する物質、例えば、特定の抗原抗体反応に関与する抗原（ネイティブな抗原物質の他に種々の断片を含む）と抗体（ネイティブな抗体物質の他に種々の修飾体や断片を含む）のいずれか一方（即ち他方は標的物質であり得る）は、ここでいう受容体に含まれる典型例である。
また、ここで「捕捉物質」とは、選定した受容体に対して種々の結合機構（例えば水素結合、疎水性結合）によってある程度の特異性（選択性）をもって可逆的な結合を起こすが、その結合力（典型的な指標として結合定数が挙げられる。）は目的とする標的物質と該受容体との間の結合力（結合定数）に及ばないものをいう。例えば、特定の抗原に対する抗体を受容体とした場合、該抗原のエピトープと構造上類似する部位を有する構造類似体（いわゆるアナログ）は、ここでいう捕捉物質に包含される一典型例であり得る。例えば、高い結合定数を有するアビジン−ビオチン複合体に関して、より低い結合定数の複合体をアビジンとの間で形成し得るビオチン類似体（例えば後述するデチオビオチン）は、ここでいう捕捉物質に該当する一典型例である。
また、ここで「付加物質」とは、上記受容体に結合可能な物質であって構造色変化の度合いを高めることができる性状の物質をいう。
また、ここで「構造色の変化」とは、種々の光学的手段によって測定可能な被処理物の微細構造の変化に基づく構造性発色の変化（典型的には構造変化に基づく光の波長変化）であればよく、その変化が直接的に視認し得るかし得ないかは問題とされない。
【０００８】
本発明の検出方法で使用されるデバイスは、構造色を測定する基材（デバイス）上に、上述したような内容の捕捉物質、目的の標的物質に対する受容体、及び該受容体に結合した状態の付加物質が配列した表面層を有する。
そして、本方法では、試料に含まれる標的物質との相互作用によってインキュベート中に付加物質結合受容体の基材表面からの遊離が行われる。かかる受容体の遊離により基材表面層の微細構造が変化し、その変化を光学的に構造色変化として捉え、評価する。
本方法では、標的物質が基材表面に付着（結合）することに基づいた構造色の変化を測定する上記公報に記載されるような従来の方法とは異なり、試料中の標的物質の量に応じた構造色の変化の度合いを受容体の遊離によって実現する。このため、標的物質自体の大きさや標的物質の基材への結合形態に影響を受け難い。
さらに、受容体と同時に付加物質が基材上から遊離するため、当該受容体が基材から遊離する前後間における構造色の変化の度合いを比較的大きくすることができる。従って、本構成の検出方法によると、構造色測定によって、高精度且つ簡便に目的とする標的物質を定性的又は定量的に検出することができる。
【０００９】
好ましくは、前記基材に備えられる受容体として、検出対象の標的物質よりも分子サイズの大きい物質が使用される。この態様の方法によると、小さい分子サイズの標的物質であっても、それよりも大きい受容体及び付加物質が遊離してデバイス表面の構造色を大きく変化させ得ることから、より高感度、高精度に標的物質を検出することができる。
特に好ましくは、前記使用する受容体が鎖状分子構造を有するものであることを特徴とする。鎖状分子構造（棒状構造や螺旋状構造を含む。）を有する受容体であると、基材表面の捕捉物質に捕捉された状態では該受容体の鎖状分子構造が規則的に配列して成る膜構造が形成され得る。そして、標的物質の存在によって受容体が捕捉物質から遊離した状態では、そのような膜構造の変化によって顕著な構造色の変化が実現され得る。このため、本構成の方法によると、より高精度な標的物質検出を簡便な構造色測定によって行うことができる。
【００１０】
また、好ましくは、前記付加物質として前記基材上に配置し得る球状物質が使用される。付加物質が球状であると、当該付加物質が膜状に基材上に配列（整列）した場合でも当該球状物質間の隙間を介して受容体と標的物質とが容易に接触、結合することができる。このため、付加物質の存在によって標的物質の検出が阻害されない。
【００１１】
好ましくは、前記試料として目的の標的物質が含まれ得る液体試料が使用され、該液体試料が基材表面層に接触した状態で前記インキュベートが行われる。この態様によると、捕捉物質からの受容体及び付加物質の遊離が助長され、容易に構造色変化を生じさせることができる。
【００１２】
また、好ましくは、前記構造色の変化の度合いは、前記インキュベートの前後で測定した前記基材表面層における反射スペクトルの比較に基づいて決定される。この態様によると、構造色の変化を簡便に測定することができる。
【００１３】
また、本発明は、他の側面として、ここで開示される検出方法を実施するのに好適なシステム（測定装置）及び該システムを構成するのに用いられる器具を提供する。
本発明は、試料中に含まれる特定の標的物質を光学的に検出する構造色評価用デバイスを提供する。
このデバイスは、基材と、前記標的物質と特異的に結合し得る受容体と、前記基材上に固定され且つ前記受容体と結合した状態の捕捉物質であって前記標的物質が存在する所定の条件下にあっては前記受容体が遊離し得る性状の捕捉物質と、前記受容体に結合した付加物質であって構造色変化の度合いを高めるための付加物質とを備える。このデバイスでは、前記基材上に構造色を測定可能なように前記捕捉物質、付加物質及び受容体がそれぞれ配列して成る表面層が形成されていることを特徴とする。
上述のとおり、かかる構成のデバイスによると、ここで開示される検出方法を好適に実施することができる。
【００１４】
好ましくは前記受容体として検出対象の標的物質よりも分子サイズの大きい物質を備えている。例えば鎖状分子構造を有する受容体を備えている。このような構成のデバイスは、高精度且つ簡便に光学的に標的物質を検出することができる。
【００１５】
また、好ましくは、前記付加物質は前記基材上に配置し得る球状物質である。このような構成のデバイスは、付加物質の存在に拘わらず、当該球状物質間の隙間を介して受容体と標的物質とを容易に接触、結合させることができるため、高感度に標的物質の検出を行うことができる。
【００１６】
また、本発明は、試料中に含まれる特定の標的物質を光学的に検出するデバイスを製造するのに用いられるキット（即ち、いくつかの構成要素の組み合わせ品）を提供する。このキットは、基材と、前記標的物質と特異的に結合し得る受容体と、前記受容体に結合した付加物質であって構造色変化の度合いを高めるための付加物質と、前記基材上に固定された状態の捕捉物質であって前記受容体と結合し且つ前記標的物質が存在する所定の条件下においては該結合した受容体が遊離し得る性状の捕捉物質とを備える。また、このキットでは、前記基材上には前記捕捉物質が構造色を測定可能なように配列して成る表面層が形成されており、前記付加物質及び受容体は該表面層が形成された基材とは独立に保存可能な形態で装備されている。
かかる構成のキットによると、ここで開示される検出方法を行う前に上述のデバイスを容易に製造することができる。
【００１７】
好ましくは前記受容体として検出対象の標的物質よりも分子サイズの大きい物質を備える。特に好ましくは鎖状分子構造を有する受容体を備えている。また、好ましくは、付加物質として前記基材上に配置し得る球状物質を備える。
このような構成のキットは、高精度且つ簡便に光学的に標的物質を検出し得るデバイスを製造し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の好適な実施形態を説明する。なお、本明細書において特に言及している内容以外の技術的事項であって本発明の実施に必要な事項は、従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。本発明は、本明細書及び図面によって開示されている技術内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。
【００１９】
本発明の検出方法は、構造色の測定によって所定の標的物質（検査対象物質）を検出する方法であればよく、定性的であると定量的であるとを問わない。検出対象の試料は、種々の形態（例えば、液体、蒸気、固体、粉体、ゲル）であり得るが、好ましくは液体試料である。例えば、人又は他の生物、自然界或いは人工物から採取した液体試料（血液その他の体液、樹液、海水、陸水、食品又は化学品に含まれる液体、天然又は人工の油脂類、等）、或いは非液状試料を適当な溶媒に溶解又は分散して調製した液体試料を必要に応じて適宜希釈又は濃縮して利用することができる。例えば、本発明の検出方法は、ヒト又は他の哺乳類の体液中に含まれる有害物質（例えばウイルスや細菌等の微生物を起源とするタンパク質、核酸、毒素）或いは自然界に含まれる有害物質（例えば内分泌攪乱物質即ち環境ホルモンとして疑われる種々の有機塩素化合物や高分子化合物）を簡便な光学的手段によって検出することができる。
【００２０】
本発明の検出方法に使用するデバイスは、構造色の変化を測定し得る構成のデバイスであればよく、基材の材質や形状に特に制限はない。限定はしないが、基材表面層における薄膜干渉又は多層膜干渉による構造色の変化を利用する場合には、基材表面層において干渉光を生じさせ易く光反射性のよい基材、例えば表面に酸化シリコン膜を備えたシリコン基板が好適な一例として挙げられる。或いは、基材を透過した光の回折による構造色の変化を利用する場合には、光透過性のよい基材、例えば石英基板が例示される。
基材の表面（測定する構造色を発現させる部位）の形状は構造色の測定に適当であれば特に制限はないが、スペクトル観測の観点からフラットな表面形状が好ましい。従って、ここで開示されるデバイスの好適な一態様は、平板形状の基材（基板）を含むことを特徴とする。
【００２１】
構造色は、いずれの原理によるものでもよい。例えば、基材上に形成された薄膜又は多層膜においての当該膜に照射され反射された光の干渉に基づく構造色が典型例として挙げられる。或いは、基材上に規則的に配列された物質群においての波長に依存した方向性のある光の回折に基づく構造色が他の典型例として挙げられる。これら構造色の発生機構や他の構造色の発生機構（例えば光の散乱に基づく構造色）は、技術常識であり、本発明の開示に特に必要がないため、構造色自体についてのこれ以上の詳細な説明を省略する。
【００２２】
構造色の測定手段は特に限定されない。基材上の構造変化を的確に検知し得る手段が好ましい。ここで開示される方法では、典型的には基材（デバイス）表面層の構造変化、即ち反射する光の干渉及び／又は回折による構造色の変化を測定する。この場合における好適な測定手段の一つは、反射スペクトルの測定である。この種の反射スペクトルは、種々の光源、分光器、光検出器等を備えた反射率測定装置を使用することによって容易に測定することができる。
【００２３】
構造色を発現させるため、好ましくは、所望する捕捉物質を使用して基材の表面に該捕捉物質が配列した表面層を構成する。例えば、捕捉物質から成る単分子層を形成することが好ましい。この目的には、鎖状分子構造を有する捕捉物質（後述する実施例参照）の採用が好ましい。捕捉物質は、基材表面に種々の結合機構（例えば、疎水性結合、水素結合、共有結合、イオン結合）で結合（固定）させることができる。
例えば、Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔ法（ＬＢ法）に基づいて、比較的長いアルキル（或いはアルケニル又はアルキニル）鎖を有する高分子化合物を基材表面に規則的に配列し、それら鎖間のファンデルワールス力によって高密度及び高配向の単分子層（即ち自己組織化単分子層；self-assembled monolayer)を形成することができる。
【００２４】
好ましくはカップリング剤（典型的にはシランカップリング剤）等を使用して捕捉物質を基材表面に化学結合することができる。例えば、シリコン基板の表面に形成された酸化シリコン膜のような、基材の無機酸化物表面に適当な表面処理を施して該表面に反応性基（例えばシラノール基（Ｓｉ−ＯＨ）、水酸基、その他の親水性基）を導入し、例えば一般式：Ｘ−Ｒ−Ｓｉ−Ｚ３（式中のＸは有機材料と結合可能なアミノ基、ビニル基、エポキシ基、メタクリロキシ基等の官能基、Ｒはアルキル基、Ｚは各々独立してアルコキシル基又はハロゲン）で表されるような適当なシランカップリング剤（例えば、ビニルトリエトキシシラン（ＶＴＥＳ）、３−グリシドキシプロピルトリエトキシシラン（ＧＰＴＥＳ）、３−メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン（ＭＰＴＥＳ）、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ））の水溶液を用いることによって、有機物である捕捉物質を当該無機酸化物表面上に強固に化学結合させることができる。この場合、反応性基の量が無機酸化物表面に十分に存在すれば、該シランカップリング剤のアルキル鎖によって一方向に規則的に配列する単分子層が形成される。
【００２５】
本発明の検出方法で用いられる受容体は、検出対象である標的物質の内容に応じて適宜選択される。例えば、標的物質が試料中に含まれる抗原物質（例えば種々の毒素や菌体を構成するタンパク質）である場合は、抗体又は抗体の断片（例えばＦａｂフラグメント）であり得る。また、標的物質が試料中に含まれるポリヌクレオチド（例えば種々の病原ウイルスが有するＤＮＡ又はＲＮＡ）である場合は、該ポリヌクレオチド（二本鎖の場合はいずれか一方のヌクレオチド鎖）の少なくとも一部の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドであり得る。これらの他、特定のタンパク質を標的物質とする場合、該タンパク質と特異的に結合する（即ち高い結合定数を示す）物質（リガンド）を受容体とすることができる。例えば、種々の酵素とその基質（又は該基質と拮抗するアナログ化合物）の関係、種々のホルモンとそのレセプターの関係、種々の核酸結合性タンパク質とその標的核酸との関係において、いずれかが標的物質となり、いずれかが受容体であり得る。一典型例としてアビジンとビオチンの関係が挙げられる。
【００２６】
本発明の検出方法で用いられる捕捉物質は、所定の条件下において、所定の受容体に対して可逆的に結合し得る一方で、該条件下において標的物質が存在する場合には該受容体の該捕捉物質からの遊離が容易に行われる（活発化され得る）物質である。捕捉物質は、標的物質及び受容体の種類や性質に応じて適宜選択すればよく、特に制限はない。
この種の捕捉物質として、典型的には、目的とする標的物質と化学構造が類似する物質（アナログ）であって該物質の受容体との結合定数が標的物質と受容体との結合定数よりも低いものが採用され得る。酵素、ホルモン等のタンパク質を標的物質とし、それに対する補酵素基質、レセプター等を受容体とする場合には、それら標的物質タンパク質よりも結合定数の低い構造のアナログタンパク質を用いるとよい。
例えば、図１に示すように、ビオチン(biotin)１を標的物質とし、アビジン(avidin)２を受容体とする系において、ビオチン１と構造類似の化合物であって該化合物とアビジン２との結合定数がビオチン／アビジンの結合定数よりも低い物質、例えば図示するようなデチオビオチン(dethiobiotin)３は、本発明の実施においての捕捉物質として使用され得る一好適例である。
【００２７】
あるいは、特定の塩基配列を有する核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を標的物質とし、それと相補する塩基配列のポリヌクレオチドを受容体とする系において、塩基配列の受容体に対する相同性が標的物質たる核酸よりも低いポリヌクレオチド（即ち標的物質の核酸よりも受容体に対してハイブリダイズし難いポリヌクレオチド）を捕捉物質として使用し得る。
捕捉物質からの受容体の遊離のされ易さは、インキュベート条件を適宜調節することによって容易に決定することができる。例えば、試料が液体であり、受容体及び捕捉物質がタンパク質、核酸である場合（典型的には、これらの結合がファンデルワールス力や水素結合によるもの）には、塩濃度や処理温度を変化させることによって、捕捉物質からの受容体の遊離の程度（速度）を調整することができる。
【００２８】
また、本発明の検出方法で用いられる付加物質は、構造色の変化の度合いを大きくする（典型的には波長の変化即ちΔλが増幅される）ために受容体に結合される物質であり、この目的に適う物質であれば特に制限はない。構造色変化の度合いが大きくなる比較的大きいサイズの分子或いは微粒子が好適である。また、標的物質に対して反応性を有さない安定した物質（例えば標的物質及び基材表面と非特異的吸着を起こさない物質）が好適である。特に球状微粒子（又は巨大分子）が上述の理由により好ましい。例えば、種々の高分子物質（ポリスチレン、シリカ、ラテックス等）から成る球状微粒子（好ましくは平均直径０．０５μｍ〜１μｍ）が特に好ましい。このような形態の付加物質を受容体に結合することによって、従来の構造色変化（即ち基材上への標的物質吸着に基づく構造色変化）を採用する検出方法とは異なり、検出対象とする標的物質の分子（又は粒子）サイズが小さい場合であっても、それに代替して標的物質よりも格段に大きい付加物質結合受容体の遊離による構造色変化によって当該小さいサイズの標的物質の存在を高感度（高精度）に検出することができる。
【００２９】
ここで開示される検出方法の大まかな手順と機構を図２に示す。本発明の検出方法では、先ず図２の（Ａ）に示すように、構造色評価を行い得る適当な基材（例えば表面に酸化シリコン膜を備えたシリコン基板）１０の表面の少なくとも構造色測定に関わる部分に配列した状態で捕捉物質（図では上述のデチオビオチン）３を結合させる。典型的にはシランカップリング剤等を利用して基材１０表面に結合したスペーサー（架橋分子）４を介して捕捉物質（デチオビオチン）３を結合（固着）させる。これにより、基材１０表面に捕捉物質３から成る（好ましくはスペーサー４によって一方向に配向した）表面層（好ましくは単分子層）が形成される。かかる単分子層は、所定のスペクトル（可視光波長域に反射光強度の最大値又は最小値又はその両者を有するスペクトル）を呈する。
【００３０】
次いで、基材１０に、目的とする標的物質に対する受容体（図では上述のアビジン）２であって適当な付加物質６が予め結合した状態の受容体２を添加し、適当な条件下でインキュベートすることによって基材１０上の捕捉物質３から成る層（好ましくは単分子層）に付加物質６結合タイプの受容体２を捕捉させる。ここで、捕捉物質３が単分子層のように規則的に配列している場合は、典型的には、そこに捕捉される付加物質６結合タイプ受容体２についても、構造色評価を行い得るように配列した状態で基材表面に配置され得る。従って、この状態の基材１０表面は、所定のスペクトル（可視光波長域に反射光強度の最大値又は最小値又はその両者を有するスペクトル）を呈する。
なお、図示するように、受容体３に対して付加物質６を結合するために行われる方法は特に限定されず、従来周知の方法によって結合することができる。例えば物理的吸着作用によって受容体２に付加物質６を直接結合してもよいが、図示されるようにシランカップリング剤等を利用して付加物質６の表面に結合したスペーサー（架橋分子）５を介して受容体２を共有結合させることが好ましい。
【００３１】
なお、基材１０上には、上記の付加物質６（架橋分子５を含む）、受容体３及び捕捉物質４（架橋分子４を含む）の他、種々の目的で種々の物質を装備することができる。例えば、非特異的吸着等を回避すべく、ＢＳＡ等の化合物によって基材表面をコーティングしておくことが好ましい。
【００３２】
このようにして本発明のデバイス２０が製造される。本発明により提供されるキットには、典型的にはこのようなデバイスを検出方法実施前に構築し得るように、上記捕捉物質３結合済みの基材１０と、該基材１０とは独立して保存可能な形態（例えば、付加物質が結合した受容体が好適な分子構造（形状）を維持し得るように好適な塩を含む溶液状態或いは凍結乾燥された粉末状態）でストックされた受容体２を含む。
【００３３】
そして、かかる構成のデバイス２０に標的物質（図では上述のビオチン）１を含み得る試料を付与し、図２の（Ｂ）に示すように、該試料中の標的物質１の存在に応じて基材１０の表面層から付加物質６及び受容体２が遊離し得る適当な条件で該デバイス２０と試料をインキュベート（即ち、反応状態を保持）するとよい。かかるインキュベーション（所定時間の処理継続）によって、図示するように、標的物質１との高い結合定数を有する受容体２が標的物質１の存在に応じて基材表面層の捕捉物質３から付加物質６とともに遊離し、典型的には試料中の標的物質１と結合する。これにより、図示されるように、基材１０表面の微細構造が大きく変化し、該変化（即ち図２（Ａ）に示す状態から図２（Ｂ）に示す状態への変化）は構造色の変化として光学的に検知することができる。
なお、かかる構造色の変化は、従来公知の種々の光学的技法によって検知することができる。例えば、反射スペクトルの測定、吸収スペクトルの測定等は市販の光学機器（分光光度計等）を使用することで容易に実現することができる（後述の実施例参照）。
【００３４】
従って、本発明によって提供され得る検出システムは、ここで開示される構造色評価用デバイスを使用するとともに、該デバイスの構造色の変化を光学的に測定し得る種々の装置を包含し得る。例えば、種々の光源、分光器（分光光度計）、該分光器によって得られたデータを解析する解析装置（コンピュータ）を備えることができる。例えば、図３に示すような構成の装置１００によってデバイスの構造色の変化を光学的に測定することができる。即ち、本装置１００は、大まかにいって、光源１０２と分光器１０４と解析装置（ＰＣ部）１０１とを備える。光源１０２と分光器１０４は、光ファイバ１０３，１０５によってそれぞれ計測部１０６と光学的に接続される。計測部１０６には測定容器１０８が付設され、その容器１０８内に標的物質を含む所定の試料即ち被処理物（検体）と本発明に係るデバイス１１０が配置される。そして、所定時間のインキュベート後、光源１０２より光ファイバ１０３を介して出力された測定用光をデバイス１１０表面に投射し、その反射光を光ファイバ１０５を介して分光器１０４において受光する。そして、解析装置（ＰＣ部）１０１は、計測された反射光スペクトル等に基づいて標的物質の定性又は定量を行う。なお、このような装置構成自体は、既存の装置と同様であるので、これ以上の詳細な説明は省略する。
また、このような装置１００は、構造色評価用デバイス１１０をインキュベートし得る種々のインキュベーター（例えば恒温器）を備えることができる。これらシステムの構成要素は、標的物質及び／又は試料の性状に応じて好適なものを採用すればよい。
【００３５】
ここで開示される方法によると、試料中に標的物質が存在することに基づくデバイス（基材表面層）における構造色の変化を簡便な光学的手段によって容易に検知することができる。即ち、ここで開示される検出方法によると、構造色の変化の度合いを調べることによって、試料中に含まれる標的物質を容易に定性的に検出することができる。
また、例えば、予め相互に異なる既知量の標的物質を含むいくつかの標準試料を用いて各標準試料における構造色変化の度合いを調べておき、それらデータより検量線を作成しておくことによって、測定対象の試料中の標的物質を定量的に測定することができる。
【００３６】
また、ここで開示される方法では、受容体の分子構造を大きくすることによって、標的物質の検出感度を向上させることができる。即ち、所定の条件下で遊離される受容体のサイズが大きいほど、当該受容体の遊離前と比べて構造色発現に関与する基材の表面構造の変化が大きくなる。換言すれば、僅かな量の受容体の遊離であっても、構造色の変化（例えば反射スペクトルの変化率）の度合いが大きくなり、そのことを光学的手段によって検知し易くなる。例えば、上述のアビジンのような受容体分子を鎖状分子（例えば長鎖脂肪酸、或いはパラフィン系、オレフィン系及びアセチレン系炭化水素のような脂肪族化合物）で修飾することによって、基材上での規則的な配列を維持しつつ分子サイズの大きい修飾受容体を得ることができる。なお、受容体の修飾方法は、使用する受容体（標的物質との結合に関与するコア部分）の性状に応じて異なるため、特に制限されない。受容体の種類に応じて従来公知の種々の修飾技法を採用すればよい。例えば、従来技法によって、タンパク質受容体を長鎖脂肪酸で修飾（結合）することができる。
【００３７】
以下に説明する実施例によって、本発明を更に詳細に説明するが、本発明をかかる実施例に示すものに限定することを意図したものではない。
【００３８】
＜構造色プレートの作製＞
本実施例では、シリコン及び酸化シリコン表面膜から成る構造色プレートを基材とし、構造色変化に基づくビオチン検出用デバイスを製造した。
即ち、シリコンウェハ（面方位(100)、ｎ−タイプ、厚さ０．５ｍｍ、片面研磨、株式会社ニラコ製品）をガラス切りで適当なサイズに切断し、アセトン及び硝酸に２４時間浸漬して洗浄した。続いて、電気炉を用いて一定温度（９５０〜１１２０℃）で３時間アニールを行うことにより、シリコン表面の酸化層の膜厚を増大させ、表面にシラノール基（反応性水酸基：−ＯＨ）を有するプレート３０を得た（図４（Ａ））。
次に、１質量％の３−グリシドキシプロピルトリエトキシシラン（ＧＰＴＥＳ）エタノール溶液中に上記プレートを室温で２４時間浸漬した。これにより、図４（Ｂ）に示すように、プレート３０表面にシランカップリング剤（ＧＰＴＥＳ）を固定し、プレート表面にエポキシ基を導入した。
次に、０．０５質量％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）中に上記プレートを室温で２４時間浸漬した。これにより、図４（Ｃ）に示すように、上記エポキシ基とＢＳＡのアミノ基とが反応・結合し、プレート３０表面の架橋分子にＢＳＡ分子が導入された。また、プレート３０表面の空白部分にもＢＳＡ分子が固定化（コーティング）された。
【００３９】
＜構造色プレートへのデチオビオチンの結合＞
次に、プレート３０の表面に形成したスペーサー先端のＢＳＡの末端カルボキシル基に、ビオチンのアナログであるデチオビオチンヒドラジド（ＤＳＢ−Ｈ）を結合させた。
即ち、２．９ｍＭのＤＳＢ−Ｈと、５vol％のＤＭＳＯ（dimethyl sulfoxide）と、６．２ｍＭのＥＤＣ（1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide）と、０．１ＭのＭＥＳ（4-morpholineethanesulfonic acid）を含む水溶液（ｐＨ５．５）中に上記プレートを０℃で１時間、その後室温で５０時間浸漬した。これにより、図４（Ｄ）に示すように、プレート３０表面に、ＢＳＡを含む長鎖状のスペーサーを介して本実施例に係る捕捉物質であるＤＳＢ−Ｈが表面に結合したプレート３０を得た。
【００４０】
＜構造色プレート表面のＤＳＢ−Ｈへのアビジンの結合＞
上記のようにして得られたプレート（構造色評価用基材）３０の表面に、本実施例に係る受容体であるアビジンを結合させた。即ち、１×１０−５Ｍのアビジンを含むリン酸バッファー（ｐＨ＝７．４）を調製した。このバッファーにプレート３０を室温で２４時間浸漬した。その後、プレート３０をバッファーから引き上げ、超純水で洗浄した。これにより、図５（Ａ）に示すように、プレート３０表面のＤＳＢ−Ｈ（符号３３）にアビジン３２が結合したプレート３０を得た。
【００４１】
＜構造色プレート表面のアビジンへの付加物質の結合＞
次に、上記のようにして得られたプレート（構造色評価用基材）３０の表面に、本実施例に係る付加物質であるポリスチレン（ＰＳ）微粒子（平均粒径１００ｎｍ、屈折率１．５９：Duke Scientific Corporation製品）を結合させた。
即ち、１．３ｍｇ／ｍＬのＰＳ微粒子を含むｐＨ７．４のＰＢＳ−Ｍ溶液（１ｍｇ／ｍＬの非イオン性界面活性剤（n-Octanoyl-N-methylglucamide：商品名ＭＥＧＡ−８）を含む）中にプレート３０を室温で１時間浸漬した。その後、プレート３０をバッファーから引き上げ、超純水で洗浄した。これにより、図５（Ｂ）に示すように、プレート３０表面のアビジン３２に結合したＰＳ微粒子３６が断面からみて規則的に配列したプレート３０を得た。得られたプレート３０の表面層を原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）で観察した。結果（ＡＦＭ画像）を図６に示す。この画像からも明らかなように、得られたプレート（構造色評価用デバイス）の表面には、ＰＳ微粒子が密に配列していた。
【００４２】
＜ビオチン添加によるアビジンの遊離＞
標的物質として４．１×１０−３Ｍのビオチン（東京化成工業（株）製品）を含むリン酸バッファー（ｐＨ＝７．４）を調製した。このバッファーに上記得られたプレート３０を室温で２０時間浸漬することによりインキュベートした。その後、プレート３０をバッファーから引き上げ、超純水で洗浄した。なお、アビジンの変性を防ぐため、この作業はプレートを常に乾燥させることなく行った。
【００４３】
＜反射スペクトルの測定＞
市販の紫外可視分光光度計（日本分光（株）製品、型式：Ｖ−５５０）と絶対反射率測定装置（日本分光（株）製品、型式：ＡＲＳ−４７４）とを用いた可視光反射スペクトル測定によって、本実施例に係るデバイスの性能を評価した。比較対照としてビオチン含有バッファーに浸漬する前のプレートについても同様に反射スペクトルを測定した。具体的には、プレート（デバイス）を絶対反射率測定用ホルダに入射角１０°で固定し、室温で測定した。この測定で得られたスペクトルから未処理のシリコンのスペクトルを除算することによって、構造色のみに起因するスペクトルを得た。
図７は、その結果を示すスペクトル・ダイアグラムである。横軸は波長（wavelength：ｎｍ）であり、縦軸は反射率（reflectivity：％）である。
かかるスペクトル図から明らかなように、ビオチン含有バッファーに浸漬する前（without
biotinとしてプロットされた曲線参照）と比較してビオチン含有バッファーに浸漬した後（with biotinとしてプロットされた曲線参照）では、受容体であるＰＳ微粒子付きアビジンが遊離してプレート表面層の構造が変化し、該変化を構造色の変化（典型的には光干渉の変化に基づく。）として検知することができた。即ち、可視光反射スペクトルの波長シフト（色変化）が確認された。具体的には、ビオチン含有試料とのインキュベートによって、おおよそ−４０ｎｍの波長シフト（Δλ）が確認された。このことを裏付けるＡＦＭ画像を図８に示す。この画像から明らかなように、ビオチン含有バッファーに浸漬した後のプレート表面では多数のＰＳ微粒子が遊離していることが認められた。また、図９に示すように、この色変化は肉眼でも確認されるレベルである。
【００４４】
次に、リン酸バッファー（ｐＨ＝７．４）中に含まれるビオチン濃度を、０Ｍ、２．０×１０−４Ｍ、４．１×１０−４Ｍ、２．０×１０−３Ｍ及び４．１×１０−３Ｍと変更しつつ同様の処理を行って可視光反射スペクトル測定を行った。結果を図１０に示す。横軸はビオチン濃度（Ｍ）であり、縦軸は最小波長シフト（Δλmin／ｎｍ）である。この図にプロットされた各ビオチン濃度に対する波長シフト（色変化）から明らかなように、本実施例に係るデバイスでは、ビオチン（標的物質）の濃度が２．０×１０−４Ｍのように低い場合でも、大きな値の波長シフト（−１５〜−２０）が認められた。
【００４５】
以上、本発明の具体例を詳細に説明したが、これらは例示にすぎず、特許請求の範囲を限定するものではない。特許請求の範囲に記載の技術には、以上に例示した具体例を様々に変形、変更したものが含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明の検出方法の測定原理を模式的に示す説明図である。
【図２】本発明の検出方法に用いる構造色評価用デバイスの微視的状態を模式的に示す説明図であり、（Ａ）は基材表面に捕捉物質、受容体及び付加物質が配置された状態、（Ｂ）は標的物質の存在によって受容体及び付加物質が捕捉物質から遊離した状態を示している。
【図３】標的物質の光学的検出装置の好適な一実施形態を模式的に示すブロック図である。
【図４】一実施例に係る構造色評価用デバイスの製造手順を模式的に説明するフロー図であり、（Ａ）は基材表面にシラノール基を導入した状態を示し、（Ｂ）はシランカップリング剤によって架橋分子（スペーサー）を基材表面に固定化した状態を示し、（Ｃ）は当該架橋分子の先端にＢＳＡ分子を導入した状態を示し、（Ｄ）は当該ＢＳＡ分子表面のカルボキシル基を利用してデチオビオチンヒドラジドを結合（固定）した状態を示している。
【図５】図４に続く構造色評価用デバイスの製造手順を模式的に説明するフロー図であり、（Ａ）は基材に固定したデチオビオチンヒドラジドにアビジンを結合した状態を示し、（Ｂ）は当該アビジンに付加物質である球状ポリスチレン微粒子を結合した状態を示している。
【図６】一実施例において製造された構造色評価用デバイスの表面の原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）観察で得られた画像（ＡＦＭ像）である。
【図７】一実施例において得られた検出結果を示す反射スペクトルのダイアグラムであり、横軸は波長（ｎｍ）、縦軸は反射率（％）を示す。
【図８】一実施例において使用したビオチン溶液浸漬後のデバイスの表面の原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）観察で得られた画像（ＡＦＭ像）である。
【図９】一実施例において視認されたデバイス（基材）表面の色変化を示すカラー写真である。
【図１０】一実施例において製造された構造色評価用デバイスを使用したときのビオチン濃度と波長シフトとの関係を示すダイアグラムであり、横軸はビオチン濃度（Ｍ）、縦軸は最小波長シフト（Δλmin／ｎｍ）を示す。
【符号の説明】
【００４７】
１  標的物質（ビオチン）
２，３２  受容体（アビジン）
３，３３  捕捉物質（デチオビオチンアナログ）
４，５  スペーサー（架橋分子）
６  付加物質
３６  付加物質（ポリスチレン微粒子）
１０，３０  基材
２０，１１０  構造色評価用デバイス
１００  光学的検出装置
【図１】
2007093355.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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