(57)【要約】【課題】溶液中の試料細胞に対しても、迅速かつ確実に細胞内への針部の接触、侵入を検知する。【解決手段】試料細胞Ａの外部に接触状態に配置される第１電極１１と、試料細胞Ａの内部に挿入される第２電極１２と、該第２電極１２の試料細胞Ａへの挿入前後において、第１電極１１と第２電極１２との間の電気的特性を測定する測定手段１５とを備える細胞操作装置１を提供する。【選択図】      図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料細胞の外部に接触状態に配置される第１電極と、
前記試料細胞の内部に挿入される第２電極と、
該第２電極の前記試料細胞への挿入前後において、前記第１電極と第２電極との間の電気的特性を測定する測定手段とを備える細胞操作装置。
【請求項２】
前記試料細胞を内部に保持する試料細胞保持手段を備え、
前記第１電極が前記試料細胞保持手段の底部に設けられている請求項１に記載の細胞操作装置。
【請求項３】
前記第１電極が、前記試料細胞の水平断面より広い電極である請求項２に記載の細胞操作装置。
【請求項４】
前記第１電極が、前記試料細胞を観察するための光の光路を避けて配置されている請求項２に記載の細胞操作装置。
【請求項５】
前記第１電極が、前記試料細胞を観察するための光の光路上に設けられた透明電極からなる請求項２に記載の細胞操作装置。
【請求項６】
前記試料保持手段が、該試料保持手段の内部の第１電極と試料保持手段の外部とを絶縁する請求項２に記載の細胞操作装置。
【請求項７】
前記第２電極が、前記試料細胞より細い先端部を有する針状の電極である請求項１に記載の細胞操作装置。
【請求項８】
前記第２電極が、半導体材料を含む請求項１に記載の細胞操作装置。
【請求項９】
前記第２電極は、前記試料細胞に挿入される先端部が露出され、他の部分が絶縁膜により被覆されている請求項１に記載の細胞操作装置。
【請求項１０】
前記試料細胞内に挿入される部位に、前記試料細胞に導入される物質を保持する保持部を備える請求項１に記載の細胞操作装置。
【請求項１１】
前記電気特性がインピーダンスである請求項１に記載の細胞操作装置。
【請求項１２】
前記測定手段が、前記第２電極の前記試料細胞への挿入前後において測定された前記電気的特性の変化に基づいて、前記試料細胞への前記第２電極の侵入成否を判断するための信号を出力する請求項１に記載の細胞操作装置。
【請求項１３】
試料細胞の外部に、第１電極を接触状態に配置する工程と、
該第１電極と該第１電極に対向する第２電極との間の電気的特性を、試料細胞の内部への第２電極の挿入前に測定する工程と、
前記試料細胞の内部に第２電極を挿入する工程と、
該第２電極の前記試料細胞への挿入後に、前記第１電極と第２電極との間の電気的特性を測定する工程とを備える細胞操作方法。
【請求項１４】
前記第２電極の前記試料細胞への挿入前後において測定された前記電気的特性の変化に基づいて、前記試料細胞への前記第２電極の侵入成否を判断するための信号を出力する工程を備える請求項１３に記載の細胞操作方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞操作装置および細胞操作方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞に導入する遺伝子等の導入物質を物理吸着により固定した原子間力顕微鏡のカンチレバー先端の針部を細胞内に侵入させることで遺伝子導入を行う技術が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
この技術においては、カンチレバーを変位させながら、カンチレバーに作用する力の変動を監視することにより、カンチレバー先端の針部が細胞の細胞膜に刺さったことあるいは細胞膜から引き抜かれたことを検出することとしている。
【特許文献１】特開２００３−３２５１６１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
原子間力顕微鏡のカンチレバーを利用する特許文献１の技術では、細胞膜に接触した際のカンチレバーの撓みにより接触を検出可能とするために、カンチレバーとして、バネ定数０．０１〜０．０３Ｎ／ｍ程度の非常に柔らかいものを採用する必要がある。このため、カンチレバーは極めて薄くしなければならない。
しかしながら、細胞操作は培養液やバッファ液等の溶液中で行われるため、液面への接触や液中での動作によって受ける外力によりカンチレバーが破損し易いという問題がある。その結果、細胞操作に際してカンチレバーを高速動作させることができず、個々の細胞へのアプローチに時間を要し、複数細胞に対して迅速に細胞操作を繰り返すことが困難であるという問題がある。
【０００４】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、溶液中の試料細胞に対しても、迅速かつ確実に細胞内への針部の接触、侵入を検知することができる細胞操作装置および細胞操作方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、試料細胞の外部に接触状態に配置される第１電極と、前記試料細胞の内部に挿入される第２電極と、該第２電極の前記試料細胞への挿入前後において、前記第１電極と第２電極との間の電気的特性を測定する測定手段とを備える細胞操作装置を提供する。
【０００６】
上記発明においては、前記試料細胞を内部に保持する試料細胞保持手段を備え、前記第１電極が前記試料細胞保持手段の底部に設けられていることとしてもよい。
また、上記発明においては、前記第１電極が、前記試料細胞の水平断面より広い電極であることとしてもよい。
【０００７】
また、上記発明においては、前記第１電極が、前記試料細胞を観察するための光の光路を避けて配置されていることとしてもよい。
また、上記発明においては、前記第１電極が、前記試料細胞を観察するための光の光路上に設けられた透明電極からなることとしてもよい。
【０００８】
また、上記発明においては、前記試料保持手段が、該試料保持手段の内部の第１電極と試料保持手段の外部とを絶縁することとしてもよい。
また、上記発明においては、前記第２電極が、前記試料細胞より細い先端部を有する針状の電極であることとしてもよい。
【０００９】
また、上記発明においては、前記第２電極が、半導体材料を含むこととしてもよい。
また、上記発明においては、前記第２電極は、前記試料細胞に挿入される先端部が露出され、他の部分が絶縁膜により被覆されていることとしてもよい。
【００１０】
また、上記発明においては、前記試料細胞内に挿入される部位に、前記試料細胞に導入される物質を保持する保持部を備えることとしてもよい。
また、上記発明においては、前記電気特性がインピーダンスであることとしてもよい。
【００１１】
また、上記発明においては、前記測定手段が、前記第２電極の前記試料細胞への挿入前後において測定された前記電気的特性の変化に基づいて、前記試料細胞への前記第２電極の侵入成否を判断するための信号を出力することとしてもよい。
【００１２】
また、本発明は、試料細胞の外部に、第１電極を接触状態に配置する工程と、該第１電極と該第１電極に対向する第２電極との間の電気的特性を、試料細胞の内部への第２電極の挿入前に測定する工程と、前記試料細胞の内部に第２電極を挿入する工程と、該第２電極の前記試料細胞への挿入後に、前記第１電極と第２電極との間の電気的特性を測定する工程とを備える細胞操作方法を提供する。
【００１３】
上記発明においては、前記第２電極の前記試料細胞への挿入前後において測定された前記電気的特性の変化に基づいて、前記試料細胞への前記第２電極の侵入成否を判断するための信号を出力する工程を備えることとしてもよい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、溶液中の試料細胞に対しても、迅速かつ確実に細胞内への針部の接触、侵入を検知することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の第１の実施形態に係る細胞操作装置１および細胞操作方法について、図１〜図４を参照して説明する。
本実施形態に係る細胞操作装置１は、図１に示されるように、細胞を観察するための顕微鏡装置２に備えられる。
【００１６】
顕微鏡装置２は、細胞を収容した容器３を載置するステージ４と、該ステージ４上の細胞を照明する照明装置５と、細胞において反射あるいは透過した光、あるいは細胞から発生した蛍光を観察する観察装置６と、ステージ４を駆動制御するステージコントローラ７と、照明装置５および観察装置６を制御する顕微鏡コントローラ８と、観察装置６により得られた画像を処理する画像処理装置９と、該画像処理装置９により処理された画像を表示する表示装置１０とを備えている。
【００１７】
前記照明装置５には、細胞に対して、観察装置６とは反対側から照明光を照射する透過照明光源５Ａおよび、該透過照明光源５Ａから発せられた照明光を細胞に集光するコンデンサレンズ５Ｃと、細胞に対して観察装置６と同一方向から照明光を照射する落射照明光源５Ｂとが備えられている。
また、観察装置６には、図示しない対物レンズを含む観察光学系６と、該観察光学系６を介した細胞からの光を撮像して画像を取得するＣＣＤ素子６Ａと、細胞からの光を直接観察する接眼レンズ６Ｂとが備えられている。
【００１８】
本実施形態に係る細胞操作装置１は、図２に示されるように、前記顕微鏡装置２のステージ４上に載置され、バッファ液あるいは培養液Ｌを貯留する容器３の底面に設けられた平板状の第１電極１１と、該第１電極１１上において培養される細胞Ａに対して上方から近接させられる第２電極１２と、該第２電極１２を移動させる駆動ユニット１３と、該駆動ユニット１３を制御する駆動ユニット制御回路１４とを備えている。
【００１９】
前記第２電極１３は、図２および図３に示されるように、先端に尖鋭な針部１２Ａを有するカンチレバー状に形成されている。第２電極１３は、シリコン基板１２Ｂの表面に導電膜１２Ｃを成膜することにより形成されている。シリコン基板１２Ｂ上に形成された導電膜１２Ｃは、先端の針部１２Ａにおいて細胞Ａの核Ｃ内に完全に収容される程度の寸法だけ露出させられ、それ以外の部分は絶縁膜１２Ｄによって被覆されている。第２電極１２は、取付部材１６により駆動ユニット１３に取り付けられている。
【００２０】
駆動ユニット１３は、Ｘ，Ｙ，Ｚ方向に針部１２を移動させる、例えば、３軸の直線移動機構を備えている。容器３は、絶縁材料により構成され、内部の第１電極１１を外部に対して電気的に絶縁するようになっている。また、第１電極１１は接地されている。
【００２１】
第１電極１１と第２電極１２との間には、周波数特性解析装置１５が接続されている。周波数特性解析装置１６は、容器３底面の第１電極１１と、第２電極１２の針部１２Ａに露出している導電膜１２Ｃとの間の電気化学系のインピーダンスを測定することができる。
また、第２電極１２を構成する針部１２Ａは、ＤＮＡ、ＲＮＡあるいはタンパク質を化学的あるいは電気的に保持する保持部を構成している。
【００２２】
このように構成された本実施形態に係る細胞操作装置１を用いた細胞操作方法について、以下に説明する。
本実施形態に係る細胞操作装置１を用いて、遺伝子等の導入物質を細胞Ａ内に導入するには、ステージコントローラ７および顕微鏡コントローラ８を作動させ、ステージ４の作動により観察したい細胞Ａを顕微鏡観察下に配置する。そして、駆動ユニット１３を作動させ、ＤＮＡ等の導入物質を保持させた第２電極１２の針部１２Ａを細胞Ａの上方から細胞Ａに近接させる。
【００２３】
そして、このとき、第１電極１１と第２電極１２との間に接続された周波数特性解析装置１５を作動させ、針部１２Ａの導電膜１２Ｃと第１電極１１との間の電気化学系のインピーダンスを測定する。
容器３の底面に設けられた第１電極１１が細胞Ａに接触することにより、細胞膜Ｂの電位が第１電極１１の電位（接地電位）に固定されている。そして、第２電極１２の針部１２Ａに設けた導電膜１２Ｃが細胞膜Ｂに接触するまでの間においては、図３に符号Ｐで示されるように、第２電極１２と細胞膜Ｂとの距離が変化しても、両者間のインピーダンスに変化はない。
【００２４】
さらに、第２電極１２を下降させて、針部１２Ａに露出した導電膜１２Ｃが細胞膜Ｂに接触すると、図３に符号Ｑで示されるように、第２電極１２と細胞膜Ｂとの間のインピーダンスが急激に変化する。そして、第２電極１２をさらに下降させて、針部１２Ａに露出した導電膜１２Ｃが細胞Ａの核Ｃ内に侵入すると、導電膜１２Ｃが細胞内電位となることにより、インピーダンスが所定値になる。したがって、細胞Ａ内への針部１２Ａの挿入作業中に第１電極１１と第２電極１２との間のインピーダンスを測定して、電解液抵抗の変化を検出することにより、針部１２Ａに露出する導電膜１２Ｃの細胞Ａへの接触および侵入を精度よく検知することができる。
【００２５】
この場合において、本実施形態に係る細胞操作装置１によれば、従来の原子間力顕微鏡のカンチレバーのような剛性の低いカンチレバーを使用するのではなく、インピーダンスのような電気的特性の変化を検出するものであるため、構造的に剛性の高いカンチレバー状のシリコン基板１２Ｂを使用できる。したがって、液面への接触や液中における高速動作においても第２電極１２が破損することを防止できる。その結果、個々の細胞Ａへのアプローチに際しても迅速かつ精度よく第２電極１２を移動させることができ、針部１２Ａに構成された保持部に保持したＤＮＡ等の生理活性物質を細胞Ａ内に迅速かつ効率よく導入することができるという利点がある。
【００２６】
なお、本実施形態においては、シリコン基板１２Ｂに形成された導電膜１２Ｃを被覆する絶縁膜１２Ｄを設けたが、これに代えて、第２電極１２のＤＮＡ溶液Ｌに接触する部分全体を絶縁膜１２Ｄで被覆することにより、リーク電流の発生を防ぎ、測定の精度を向上することとしてもよい。
【００２７】
また、第１電極１１として、その表面上で細胞Ａを培養する透明電極を採用した。これにより、第１電極１１および容器３底面を介した落射照明および透過照明が可能となる。これに代えて、第１電極１１としては不透明な電極を採用し、照明光が通過する光路を避けて配置することとしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る細胞操作装置を示す全体構成図である。
【図２】図１の細胞操作装置のカンチレバー近傍の構造を示す拡大図である。
【図３】図１の細胞操作装置のカンチレバーに設けた針部の細胞への挿入動作を説明する図であり、（ａ）は接触前、（ｂ）は接触時、（ｃ）は侵入後の状態をそれぞれ示している。
【図４】図１の挿入動作に伴う第１電極と第２電極間のインピーダンス変化を示すグラフである。
【符号の説明】
【００２９】
Ａ  試料細胞
１  細胞操作装置
３  容器（試料細胞保持手段）
１１  第１電極（透明電極）
１２  第２電極
１２Ａ  針部（針状の電極）
１２Ｂ  シリコン基板（半導体材料）
１２Ｄ  絶縁膜
１５  周波数特性解析装置（測定手段）
【図１】
2007319034.tif 000003
【図２】
2007319034.tif 000004
【図３】
2007319034.tif 000005
【図４】
2007319034.tif 000006