(57)【要約】      （修正有）【課題】手術不可能な進行・再発肺癌等に対し、癌において特異的に発現する癌特異的抗原ペプチド及びそれを用いたワクチン療法を提供する。【解決手段】癌特異的抗原ペプチドは、特定の塩基配列を有する癌特異的抗原遺伝子の遺伝子配列にコードされ、特定のアミノ酸配列を有する癌特異的抗原蛋白に由来する特定のアミノ酸配列を有する。該ペプチドはＨＬＡ−Ｂ１５拘束性に癌特異的細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、および／または癌特異的細胞障害性Ｔ細胞によって認識されると共に抗腫瘍活性を有しかつ、癌細胞に発現する。さらに、上記癌特異的抗原ペプチドを含むワクチンを提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に記載するアミノ酸配列を有する癌特異的抗原ペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載の癌特異的抗原ペプチドにおいて、前記癌特異的抗原ペプチドが、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有する癌特異的抗原遺伝子の遺伝子配列にコードされていることを特徴とする癌特異的抗原ペプチド。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の癌特異的抗原ペプチドにおいて、前記癌特異的抗原ペプチドが、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する癌特異的抗原蛋白に由来することを特徴とする癌特異的抗原ペプチド。
【請求項４】
請求項１乃至請求項３何れかに記載の癌特異的抗原ペプチドにおいて、前記癌特異的抗原ペプチドが、ＨＬＡ−Ｂ１５拘束性に癌特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し、および／または癌特異的細胞傷害性Ｔ細胞によって認識されるとともに抗腫瘍活性を有しかつ、癌細胞に発現することを特徴とする癌特異的抗原ペプチド。
【請求項５】
請求項１乃至請求項４何れかに記載の癌特異的抗原ペプチドを含有してなる癌ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌特異的抗原に関し、さらに詳しくは、ＨＬＡ−Ｂ１５拘束性に癌特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し、および／または癌特異的細胞傷害性Ｔ細胞によって認識されるとともに抗腫瘍活性を有しかつ、癌細胞に高率に発現している癌特異的抗原に関する。また、前記癌特異的抗原ペプチドを含有してなる癌ワクチンに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、日本で死亡原因疾患の第一位である癌に対して、従来の、手術療法、抗癌剤による化学療法、放射線療法に加えて、新しい治療法として癌特異的抗原を用いた免疫療法（ペプチドワクチン療法）が考えられている。
【０００３】
生体内での癌拒絶には細胞性免疫に係る細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ：cytotoxic T lymphocyte）が重要な役割を果たすことが明らかになってきている。即ち、ＣＴＬが癌細胞上に提示される癌抗原を認識し、その癌細胞を殺傷することによって癌が排除される。
【０００４】
腫瘍抗原としては、１９９１年にベルギーのLudwig癌研究所のBoon,T.らが、自己腫瘍特異的ＣＴＬをプローブとしたｃＤＮＡ発現クローニング法を用いることにより、悪性黒色腫の癌拒絶抗原をコードするＭＡＧＥ遺伝子を初めて同定した。それ以来、癌抗原をコードする多くの遺伝子が同定されてきている。それらのうちの一部の癌抗原については、主要組織適合性抗原（ＭＨＣ：major histocompatibility complex）クラスＩ分子に提示されるペプチドエピトープも同定されており、そのような癌抗原ペプチドの刺激によってin vitroで癌細胞を傷害するＣＴＬを誘導できることも報告されている。さらに、それら癌抗原ペプチドを用いたワクチン療法についても、主に悪性黒色腫患者において、一部その臨床効果が報告されている。
【０００５】
一般に、癌拒絶においては、癌抗原は先ず癌細胞内で蛋白質として産生された後、細胞内で分解されて８箇〜１１箇のアミノ酸からなるペプチド（腫瘍抗原ペプチド）になり、主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）であるヒト白血球抗原（ＨＬＡ：human leukocyte antigen）クラスＩ分子と結合して腫瘍細胞上に提示される。細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）はＨＬＡクラスＩ分子と腫瘍抗原ペプチドとの複合体を認識して腫瘍細胞を傷害する。この現象は、ＨＬＡ拘束性と呼ばれている。而して、抗腫瘍効果を期待できる免疫療法を行うためには、癌細胞のみに発現する癌特異的抗原をターゲットとして用いることが必須である。
【０００６】
ＨＬＡ−Ｂ５２分子および／またはＨＬＡ−Ｂ６２分子との複合体を認識する腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させる腫瘍抗原に関しては、既に提案されている（たとえば、特許文献１参照）。この先行技術は、ＨＬＡ−Ｂ５２拘束性および／またはＨＬＡ−Ｂ６２拘束性に腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導しおよび／または腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）によって認識される腫瘍抗原（テスティン関連遺伝子（GenBankアクセション番号ＡＹ１４３１７１））のエピトープを有するペプチドに関している。
【特許文献１】特開２００４−１４１１５４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記先行技術は、ＨＬＡ−Ｂ５２拘束性および／またはＨＬＡ−Ｂ６２拘束性に腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導しおよび／または腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）によって認識される腫瘍抗原のエピトープを有するペプチドを開示するに止まり、抗癌剤による化学療法や放射線療法に感受性が低い肺癌等に対し、手術療法以外の新たな治療法を確立するという課題に必ずしも十分な解決手段を与えるものではない。本発明は、手術不可能な進行・再発肺癌等に対し、癌において特異的に発現する抗原ペプチドを用いたワクチン療法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するための、請求項１に記載の発明は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する癌特異的抗原ペプチドである。
【０００９】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の癌特異的抗原ペプチドにおいて、前記癌特異的抗原ペプチドが、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有する癌特異的抗原遺伝子の遺伝子配列にコードされている癌特異的抗原ペプチドである。
【００１０】
請求項３に記載の発明は、請求項１または請求項２に記載の癌特異的抗原ペプチドにおいて、前記癌特異的抗原ペプチドが、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する癌特異的抗原蛋白に由来する癌特異的抗原ペプチドである。
【００１１】
請求項４に記載の発明は、請求項１乃至請求項３何れかに記載の癌特異的抗原ペプチドにおいて、前記癌特異的抗原ペプチドが、ＨＬＡ−Ｂ１５拘束性に癌特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し、および／または癌特異的細胞傷害性Ｔ細胞によって認識されるとともに抗腫瘍活性を有しかつ、癌細胞に発現することを特徴とする癌特異的抗原ペプチドである。
【００１２】
請求項５に記載の発明は、請求項１乃至請求項４何れかに記載の癌特異的抗原ペプチドを含有してなる癌ワクチンである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、抗癌剤による化学療法や放射線療法に感受性が低い肺癌等に対し、手術療法以外の新たな治療法である免疫療法（ペプチドワクチン療法）の確立に大きく資することができる。本発明は、手術不可能な進行・再発肺癌等に対し、癌において特異的に発現する抗原ペプチドを用いたワクチン療法を提供するものであり、患者の体力的負担からも有用と考えられる。
【００１４】
本発明により、日本人の約２０％の癌患者に、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する抗原ペプチドを用いた癌ペプチドワクチン療法を施すことが可能である。しかも、対象患者の生検或いは切除された癌組織を極少量使用してＲＴ−ＰＣＲ（reverse transcription-polymerase chain reaction：逆転写複製連鎖反応）法で解析するため、患者の大きな負担になることなく本発明による治療の有効性を検討できる。また、本発明の抗原ペプチドを用いた癌予防ワクチンの開発は、今後さらなる増加が予想される癌発生の予防に繋がる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明に係る癌特異的抗原ペプチドは、ＨＬＡ−Ｂ１５拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しおよび／または前記細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるとともに、抗腫瘍活性を有しかつ、癌細胞に発現する癌特異的抗原ペプチド（配列表の配列番号１）である。本発明の抗原ペプチドは、癌特異的遺伝子の配列表の配列番号２に記載の塩基配列にコードされ、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する抗原蛋白に由来している。
【００１６】
本発明の抗原ペプチドは、肺癌細胞由来のｃＤＮＡライブラリーからＨＬＡ−Ｂ１５拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導し、および／または細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）によって認識される抗腫瘍活性を有しかつ、癌細胞に高率に発現している癌特異的抗原として同定された。さらに、本発明の抗原ペプチドは、肺癌細胞の他に、乳癌などの癌細胞においても発現することが認められた。
【００１７】
本発明のペプチドは、当該技術分野で慣用されているペプチド合成法、たとえば固相法または液相法などにより容易に調製することができる（たとえば、社団法人日本生化学会編「新生化学実験講座」、第１巻、「タンパク質ＶＩ」、第３〜４４頁、１９９２年、東京化学同人）。これらのペプチド合成法のうちでも、たとえば、ペプチド合成機を用い、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）固相合成法を使用するのがよい。
【００１８】
また、本発明のペプチドは、上記ペプチド合成法に加えて、当該技術分野で慣用されている組換えＤＮＡ技術により調製することもできる。組換えＤＮＡ技術は、たとえば、上記ペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを調製し、得られたＤＮＡを自立増殖可能なベクターに挿入して得られた産物を大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母等の宿主に適宜導入して形質転換体を得、その形質転換体を培養することからなっている。本発明のペプチドは、得られた培養物から採取することによって得ることができる。
【００１９】
上記のようにして得られたペプチドは、ヒトなどの動物に対して抗原となる蛋白質（抗原蛋白質）を含むワクチンとして使用することができ、動物に投与したときにその血中に抗原蛋白質に対する抗体や細胞性免疫が誘導されることによって、ワクチンを投与された動物は疫病から予防され、治療することができることが期待できる。
【００２０】
本発明に係るワクチンは、本発明のペプチドを０．０１％〜１００％（ｗ／ｗ）、好ましくは０．０５％〜５０％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは０．５％〜５．０％（ｗ／ｗ）の割合で含んでいるのがよい。本発明のワクチンは、当該ペプチド単独の形態であってもまた、生理的に許容される、たとえば、血清アルブミン、ゼラチン、マンニトールなどの担体、賦形剤、免疫助成剤、安定剤などを含む組成物の形態であってもよい。また、本発明のワクチンは、たとえば、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、シロップ剤、乳剤、点眼剤、点鼻剤、注射剤などの剤形で、一般に、経皮、経口、点眼、点鼻、注射によって投与することができる。さらに、たとえば、ヒトに対する投薬量は、投与の目的や症状などによっても変わるが、通常、対象者の症状や投与後の経過を観察しながら、成人１回当たり０．０１ｇ〜１．０ｇ、好ましくは０．０１ｇ〜０．１ｇを通常１回〜数回投与するのがよい。
【００２１】
本発明においては、ＨＬＡ−Ｂ１５陽性患者の生検或いは切除された癌組織を用いて逆転写複製連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法で本抗原のメッセンジャーＲＮＡの発現を検出することによって、治療対象者を選定する。
【００２２】
本発明は、本抗原ペプチドを用いて細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導し大量増殖させた後に、治療対象者へ戻す養子免疫療法にも適用することができる。
【実施例１】
【００２３】
肺癌患者Ｆ１１２１の手術切除標本から肺癌細胞株Ｆ１１２１Ｌを樹立し、手術後に採取・凍結保存していた自己所属リンパ節リンパ球を週１回、放射線照射で不活性化した肺癌細胞株Ｆ１１２１Ｌで刺激することによって、図１に示すように、自己腫瘍細胞を殺傷し自己正常細胞を殺傷しない自己腫瘍特異的ＣＴＬクローン（Ｈ１／１０）を誘導した。図１は、ＣＴＬ  Ｈ１／１０による自己腫瘍細胞特異的細胞傷害活性を、４時間の５１Ｃｒ放出試験によって様々なエフェクタ／ターゲット比（Ｅ／Ｔ比）で調べた結果を示すものである。図１から明らかなように、ＣＴＬ  Ｈ１／１０は自己腫瘍細胞株Ｆ１１２１Ｌを傷害し、自己正常細胞の代用である自己ＥＢウィルス形質導入細胞（Ｆ１１２１ＥＢＶ）やＫ５６２を傷害しない。
【００２４】
この自己腫瘍特異的ＣＴＬクローン（Ｈ１／１０）は、図２に示すように、ＨＬＡ−Ｂ１５拘束性に他家肺癌細胞株（Ｂ２０３Ｌ、Ｂ１２０３Ｌ）も認識した。従って、肺癌における共通抗原を認識していると考えられる。
【００２５】
図２（ａ）、（ｂ）は、他家肺癌細胞株に対するＣＴＬ  Ｈ１／１０の認識を示す状況を示すものである。図２（ａ）は、ＨＬＡ−Ｂ１５陽性肺癌細胞株に対するＣＴＬ  Ｈ１／１０の反応を示す図であり、図２（ａ）から明らかなように、ＣＴＬ  Ｈ１／１０は、自己腫瘍細胞株Ｆ１１２１ＬとともにＨＬＡ−Ｂ１５陽性他家肺癌細胞株２株も認識し、ＴＮＦ（tumor necrosis factor：腫瘍壊死因子）を産生する。図２（ｂ）は、ＨＬＡ−Ｂ１５陰性肺癌細胞株に対するＣＴＬ  Ｈ１／１０の反応を示す図であり、図２（ｂ）から明らかなように、ＣＴＬ  Ｈ１／１０は、ＨＬＡ−Ｂ１５遺伝子を導入することで他家肺癌細胞株４株中２株も認識し、ＴＮＦを産生する。
【００２６】
（ＨＬＡ−Ｂ１５拘束性腫瘍抗原をコードする遺伝子の同定および抗原ペプチドの同定）
そこで発明者は、肺癌細胞株Ｂ２０３Ｌ由来のｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡ発現クローニング法を用いることによって、このＣＴＬクローンに認識される３４２ｂｐ（base pair）の抗原遺伝子（ＫＫ−ＬＣ−１）を単離しさらに、この遺伝子の抗原提示部位（エピトープ）として９アミノ酸からなる、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する抗原ペプチドを同定した。図３に、ＣＴＬ  Ｈ１／１０に認識される抗原ペプチドの同定（ＩＦＮ−γ産生）を行った結果を示す。図３から明らかなように、ＣＴＬ  Ｈ１／１０は、この実施例において同定したペプチドを認識するが、irrelevant peptide（変異型ｐ５３ペプチド；negative control）は認識しない。
【００２７】
上記遺伝子（配列表の配列番号２に記載の塩基配列）は、GenBankに登録されている精巣由来の５５２ｂｐの遺伝子（Accession Ｎｏ．ＢＣ０６２２２３）と蛋白翻訳領域（open reading frame）が一致していた。なお、この遺伝子の生体内での詳細な機能は未だ判っていない。この抗原遺伝子の他家肺癌細胞株における発現をＲＴ−ＰＣＲ法によって解析した処、図４に示すように、１８細胞株中９株（５０％）と高頻度に発現を認めた。図４から明らかなように、同定した抗原遺伝子ＫＫ−ＬＣ−１のｍＲＮＡは、自己腫瘍細胞株Ｆ１１２１Ｌに発現し、Ｆ１１２１ＥＢＶには発現しない。また、他家肺癌細胞株１８細胞株中９株に発現を認める。
【００２８】
さらに、図２に示すように、そのうち４例には実際にこのＣＴＬ  Ｈ１／１０によるサイトカイン（ＴＮＦ）を認めたため、図５に示すように、この抗原ペプチドは、癌ペプチドワクチン療法に用いることが可能であると考えられる。因みに、日本人において、ＨＬＡ−Ｂ１５陽性の割合は約２０％である。
図５は、他家肺癌細胞株における抗原遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ法によって解析した結果を示すものであるが、同定した遺伝子のｍＲＮＡは、この実施例において解析した肺癌１８症例の正常組織では発現しなかった。一方、同じ肺癌１８症例の腫瘍組織においては、７症例（３８．９％）に発現を認めた。図中、矢印は発現を示している。
【実施例２】
【００２９】
実施例１において同定した抗原遺伝子ＫＫ−ＬＣ−１の、各種癌腫における発現をＲＴ−ＰＣＲ法によって調べた。その結果を、表−１に示す。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
表１から明らかなように、各種癌組織において、実施例１において同定した抗原遺伝子ＫＫ−ＬＣ−１は、肺癌３３．４％、乳癌２３％、食道癌２８．６％、胃癌５７．６％、および大腸癌４１．７％と高頻度に発現している。
【実施例３】
【００３２】
（ペプチド合成）
本発明のペプチドは、ペプチド合成機を用いて、ペプチドの合成樹脂に固定したアミノ酸誘導体に、１箇ずつアミノ酸をカルボキシル末端側から結合させていくペプチド固相合成法（Ｆｍｏｃ法）でペプチドを化学合成した。本発明のペプチドのＣ末端残基に相当するアミノ酸（Ｌｙｓ）が導入されているＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−レジン樹脂（０．４４ｍｍｏｌ／ｇ）：島津製作所（株）社製）の３０ｍｇを上記ペプチド合成機の反応容器にセットし、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で１回洗浄した。次に、デプロテクション溶液（３０％（ｖ／ｖ）ピペリジン／ＤＭＦ）を５分間、３分間と２回反応させ、樹脂に結合しているアミノ酸のＦｍｏｃを除き、ＤＭＦで５回洗浄した。Ｃ末端側から２番目のアミノ酸に相当する１５０μｍｏｌのＦｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ／ＰｙＢＯＰ
に、アクチベータ溶液を加えて活性化したものと、先のＦｍｏｃ基を除いた樹脂に結合しているアミノ酸を３０分間、室温で反応させた。ここで生成したＦｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−レジン樹脂をＤＭＦで４回洗浄後、活性化Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ／ＰｙＢＯＰ溶液と反応させた。同様の操作を繰り返すことにより、目的とする保護ペプチド樹脂を合成した。
【００３３】
次に、上記で得られた保護ペプチド樹脂にデプロテクション溶液を５分間と、３分間と２回反応させて、Ｎ末端Ｆｍｏｃ基を脱保護した後、ＤＦＭにて５回、メタノールで２回、ｔ−ブチルメチルエーテルにて１回洗浄した。その後、窒素ガスを吹きつけ１０分間乾燥させて樹脂を取り出した。さらに、クリページ溶液を０．５ｍｌ加え、室温で２時間反応させることにより樹脂からペプチドを切断し、アミノ酸側鎖保護基の除去を行ってペプチド溶液を得た。このペプチド溶液に、１０ｍｌの冷エーテルを加え、ペプチドを沈澱させ、２０００×ｇで１０分間遠心して沈澱物を得、再び冷エーテルを加えて分散させては回収した。この回収操作を４回繰り返し、得られたペプチドを洗浄し、凍結乾燥して目的とするペプチドを得た。
【実施例４】
【００３４】
（製剤例）
実施例３で得たペプチドを、安定剤として１％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミンを含む生理食塩水に最終濃度が０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌまたは１ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、濾過滅菌した後、滅菌バイアル瓶に２ｍｌずつ分注し、凍結乾燥し、密栓する。投与に際しては、バイアル瓶内に注射用蒸留水を１ｍｌ加え、次いで内容物を均一に溶解して使用する。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明によって個々の癌細胞において本抗原の発現を検出することで、従来の癌治療に加え、本発明の抗原を用いた癌特異的免疫療法を検討することが可能となった。治療抵抗性の再発癌または手術不能進行癌に対し、本発明の抗原ペプチドを用いた癌特異的免疫療法が有効な治療法となる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明の一実施例に係る、ＣＴＬ  Ｈ１／１０による自己腫瘍細胞特異的細胞傷害活性を、４時間の５１Ｃｒ放出試験によって様々なエフェクタ／ターゲット比（Ｅ／Ｔ比）で調べた結果を示すグラフ
【図２】本発明の一実施例に係る、他家肺癌細胞株に対するＣＴＬ  Ｈ１／１０の認識を示す状況を示すグラフであり、（ａ）はＨＬＡ−Ｂ１５陽性肺癌細胞株に対するＣＴＬ  Ｈ１／１０の反応を示すグラフ、（ｂ）はＨＬＡ−Ｂ１５陰性肺癌細胞株に対するＣＴＬ  Ｈ１／１０の反応を示すグラフ
【図３】本発明の一実施例に係る、Ｈ１／１０に認識される抗原ペプチドＲＱＫＲＩＬＶＮＬの同定（ＩＦＮ−γ産生）を行った結果を示すグラフ
【図４】本発明の一実施例に係る、抗原の抗原遺伝子の他家肺癌細胞株における発現を、ＲＴ−ＰＣＲ法によって解析した結果を示す図
【図５】本発明の一実施例に係る、同一肺癌症例の正常肺および腫瘍組織における抗原遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ法によって解析した結果を示す図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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