(57)【要約】【課題】  乳酸菌が存在する試料において、乳酸菌の影響を受けずに、乳酸菌以外の細菌の生菌数を測定する方法、特に、セレウス菌の生菌数を測定する方法を提供する。【解決手段】  乳酸菌含有試料中の乳酸菌以外の細菌の生菌数測定において、塩化リチウムを０．４％〜１．０％添加した寒天培地を使用する。寒天培地は、標準寒天培地が好ましい。細菌がセレウス菌である場合には、寒天培地はＮＧＫＧ寒天培地であることが好ましい。塩化リチウムの添加量は、０．４％〜０．６％であることが好ましい。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌含有試料中の乳酸菌以外の細菌の生菌数測定において、塩化リチウムを０．４％〜１．０％添加した寒天培地を使用することを特徴とする生菌数測定方法。
【請求項２】
寒天培地が、標準寒天培地であることを特徴とする請求項１記載の生菌数測定方法。
【請求項３】
乳酸菌含有試料中のセレウス菌の生菌数測定において、塩化リチウムを０．４％〜０．６％添加したＮＧＫＧ寒天培地を使用することを特徴とする生菌数測定方法。
【請求項４】
塩化リチウムを０．４％〜１．０％添加したことを特徴とする、乳酸菌含有試料中の乳酸菌以外の細菌の生菌数測定用寒天培地。
【請求項５】
塩化リチウムを０．４％〜０．６％添加したことを特徴とする、乳酸菌含有試料中のセレウス菌の生菌数測定用ＮＧＫＧ寒天培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌を含有する試料中における乳酸菌以外の細菌の生菌数測定方法及びその方法に用いる寒天培地に関する。本発明は、特に、寒天培地に塩化リチウムを一定量添加することにより、乳酸菌以外の細菌、特にセレウス菌の生菌数を有効に測定し得る測定方法及びその方法に用いる寒天培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
チーズやヨーグルト等の乳製品は、殺菌した原料乳に大量の乳酸菌を接種して製造されるため、乳酸菌以外の汚染細菌が共存していても、乳酸菌の影響で増殖できず、死滅すると考えられている。そのため、乳酸菌を接種した乳製品の製造過程における汚染細菌の生菌数測定は無意味なものと考えられてきた。
しかし、ナチュラルチーズ等を原料とした乳製品の製造過程では、汚染細菌の生菌数を測定することが必要な場合がある。このような場合に、汚染細菌の生菌数が乳酸菌数より少ないと、共存する乳酸菌の影響を受けて、汚染細菌数を正確に測定することが不可能である。そのため、乳酸菌が共存する乳製品の製造過程において、汚染細菌の生菌数測定検査はほとんど実施されていない。
【０００３】
なお、食品衛生法には、成分規格の項目の一つとして、一般細菌数が規定されており、その測定法として標準寒天培地を使用する方法が記載されている。食品衛生法に掲載されている乳酸菌含有粉末清涼飲料の成分規格の生菌数は、乳酸菌を除いた生菌数と規定しており、乳酸菌を除く方法として、ペニシリンＧを１μｇ／ｍｌ添加した標準寒天培地を用いて測定する検査法が掲載されている（平成１７年９月２２日、新日本法規出版発行、食品衛生研究会編集、食品衛生小六法平成１８年版、食品の規格基準（Ｄ−各条）粉末清涼飲料、５６５〜５６７頁）。
ところが、本発明者らが、この検査法を実施したところ、チーズ製造等に利用されるスターター乳酸菌の発育が抑制されると同時に、食品由来の黄色ブドウ球菌、セレウス菌、リステリア菌、大腸菌、大腸菌群等の発育も抑制されてしまい、乳酸菌以外の細菌の生菌数を正しく測定することができなかった（参考例１参照）。
そのため、食品衛生法に規定されているペニシリンＧを添加する方法は、乳酸菌が存在する試料における汚染細菌の測定に利用することができない。
【非特許文献１】平成１７年９月２２日、新日本法規出版発行、食品衛生研究会編集、食品衛生小六法平成１８年版、食品の規格基準（Ｄ−各条）粉末清涼飲料、５６５〜５６７頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そのため、乳酸菌が存在する試料において、乳酸菌の影響を受けずに、乳酸菌以外の細菌の生菌数を測定する新規な方法が求められる。特に、セレウス菌の生菌数を測定する方法が特に望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、寒天培地中に、塩化リチウムを特定量添加することにより、乳酸菌以外の細菌の生菌数を有効に測定できることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、乳酸菌含有試料中の乳酸菌以外の細菌の生菌数測定において、塩化リチウムを０．４％〜１．０％添加した寒天培地を使用することを特徴とする生菌数測定方法である。
本発明はまた、寒天培地が、標準寒天培地であることを特徴とする前記生菌数測定方法である。
本発明はまた、乳酸菌含有試料中のセレウス菌の生菌数測定において、塩化リチウムを０．４％〜０．６％添加したNGKG寒天培地を使用することを特徴とする生菌数測定方法である。
本発明はまた、塩化リチウムを０．４％〜１．０％添加したことを特徴とする、乳酸菌含有試料中の乳酸菌以外の細菌の生菌数測定用寒天培地である。
本発明はまた、塩化リチウムを０．４％〜０．６％添加したことを特徴とする、乳酸菌含有試料中のセレウス菌の生菌数測定用NGKG寒天培地である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、乳酸菌が存在するナチュラルチーズ、ヨーグルト、それらを原料とする食品、あるいは漬物等の試料中において、乳酸菌以外の細菌の生菌数を、乳酸菌の影響を受けずに、有効に測定することができる。特に、本発明は、セレウス菌数を測定する場合に、非常に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、具体例を示しながら、本発明を詳しく説明する。
本発明において対象となる乳酸菌含有試料としては、特に限定されないが、各種ナチュラルチーズ、ヨーグルト類、それらを原料とする食品や飲料、漬物類等が例として挙げられる。
【０００８】
本発明においては、乳酸菌以外の細菌数を測定するために、一定量の塩化リチウムを添加した寒天培地を使用することを特徴とするが、寒天培地としては、標準寒天培地等が例として挙げられる。
なお、標準寒天培地とは、アメリカ公衆衛生協会の「乳および乳製品の標準試験法」が採用するプレートカウント寒天培地を、食品衛生法が生菌数測定用標準寒天培地として採用したものである。
セレウス菌の測定の場合には、ＮＧＫＧ寒天培地を用いることが好ましい。ＮＧＫＧ寒天培地は、乳酸菌の発育を積極的に抑制しないため、乳酸菌が増殖し、酸を産生しセレウス菌の発育を抑制する。そのため、乳酸菌の発育を抑制するために、塩化リチウムをＮＧＫＧ寒天培地に対して添加し、選択的に乳酸菌の発育を抑制して、セレウス菌数を測定することができる。
なお、ＮＧＫＧ寒天培地とは、セレウス菌を他の細菌から選択的に分離するためにポリミキシンとグリシンが添加され、さらにセレウス菌の一つの特徴であるレシチナーゼによる卵黄反応陽性を確認するために卵黄が添加されたセレウス菌の分離・鑑別培地である。
【０００９】
塩化リチウムの添加量は、寒天培地に対して、０．４％〜１．０％であり、特に、０．４％〜０．６％とすることが好ましい。塩化リチウムの量が０．４％未満となると、乳酸菌の発育抑制はなく、乳酸菌以外の細菌と乳酸菌が共に発育するので、正しい生菌数の測定が不可能となる。また、１．０％超えると、乳酸菌の発育が抑制されるが、乳酸菌以外の細菌の発育も抑制されるので、正しい生菌数の測定が不可能となる。
特に、セレウス菌の測定の場合には、塩化リチウムの添加量の上限を０．６％とすることが好ましいが、０．６％を超えると、セレウス菌の発育の抑制が見られ、正しいセレウス菌数の測定が不可能となる。
【実施例】
【００１０】
以下、本発明の実施例を、実験例や参考例とともに示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
（参考例１）
【００１１】
（スターター乳酸菌を含む各種細菌に対するペニシリンGの薬剤感受性試験）
表１に示すチーズ製造等に利用されるスターター乳酸菌（Ｎｏ．１〜３）、食品由来黄色ブドウ球菌（Ｎｏ．４〜１７）、腸球菌（Ｎｏ．１８）、セレウス菌（Ｎｏ．１９〜２１）、リステリア菌（Ｎｏ．２２〜２７）、大腸菌（Ｎｏ．２８）、大腸菌群（Ｎｏ．２９、３０）等の３０菌株、及び日本化学療法学会標準菌株Staphylococcus aureusＪＣ−１（Ｎｏ．３１）、Escherichia coliＪＣ−２（Ｎｏ．３２）を用いて、寒天平板希釈法による薬剤感受性試験を実施し、最小発育阻止濃度（minimum inhibitory concentration：ＭＩＣ）を測定した。
ペニシリンＧ１００μg／ml溶液を２倍に連続希釈して、表１に示すペニシリンＧを０〜０．００３９μｇ／ｍｌ含有する１５希釈段階のペニシリンG含有標準寒天平板培地を調製した。これらのペニシリンG含有標準寒天平板培地に、トリプトソイブイヨンで２０〜４８時間培養した各種供試菌を接種し、３５℃、２４時間培養後の発育の有無を観察した。結果を表１に示す。
表１に示すように、供試した３株のスターター乳酸菌のＭＩＣは０．０５〜０．２μｇ／ｍｌで、ペニシリンＧを１μｇ／ｍｌ添加した標準寒天培地では発育が抑制された。
しかし、乳酸菌以外の一部の黄色ブドウ球菌やその他ブドウ球菌、リステリア菌のＭＩＣは０．７８μｇ／ｍｌ以下であり、ペニシリンＧを１μｇ／ｍｌ添加した標準寒天培地では、発育が抑制されることが予想される。また、供試した大腸菌及び大腸菌群、セレウス菌、黄色ブドウ球菌及びブドウ球菌の一部のＭＩＣは０．７８以上であり、ペニシリンＧを１μｇ／ｍｌ添加した標準寒天培地でも発育することが推測される。
すなわち、ペニシリンＧを１μｇ／ｍｌ添加した標準寒天培地を使用した場合、乳酸菌以外のいくつかの汚染細菌の発育が抑制されることが明らかになった。
したがって、乳酸菌が存在する乳製品中の汚染細菌数の測定には、食品衛生法に規定するペニシリンＧを１μｇ／ｍｌ添加した標準寒天培地を用いても、生菌数の測定は不可能であることが確認された。
【００１２】
【表１】
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【００１３】
（実験例１）
（スターター乳酸菌を含む３４菌株の発育に及ぼす塩化リチウムの影響）
塩化リチウムを０、０．１、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０％添加した標準寒天平板培地を調製した。この塩化リチウム含有標準寒天平板培地に、トリプトソイブイヨンで２０〜４８時間培養した、表２に示すスターター乳酸菌：４株（Ｎｏ．１〜４）、黄色ブドウ球菌：１０株（Ｎｏ．５〜１４）、黄色ブドウ球菌以外のブドウ球菌：５株（Ｎｏ．１５〜１９）、リステリア菌：６株（Ｎｏ．２５〜３０）、セレウス菌：３株（Ｎｏ．２２〜２４）、大腸菌：２株（Ｎｏ．３１、３２）、大腸菌群（Ｎｏ．３３〜３４）：２株、腸球菌：１株（Ｎｏ．２１）、ミクロコックス属菌：１株（Ｎｏ．２０）の計３４株を接種し、３５℃、２４〜４８時間培養し、集落の形成を観察した。結果を表２に示す。
表２に示すように、供試した４株のスターター乳酸菌は、塩化リチウムを０．４％以上添加した標準寒天平板培地で発育が抑制された。これに対して、その他の細菌（黄色ブドウ球菌および黄色ブドウ球菌以外のブドウ球菌：１５株、リステリア菌：６株、セレウス菌：３株、大腸菌および大腸菌群：４株、腸球菌：１株、ミクロコックス属菌：１株）の３０菌株は、０．１％〜１．０％塩化リチウム含有標準寒天平板培地で発育し、塩化リチウムによる発育の抑制はほとんど見られなかった。
一方、乳製品の製造に利用されているスターター乳酸菌は塩化リチウム０．４％〜１．０％含有標準寒天平板培地で発育の抑制がみられ、実験に供試したスターター乳酸菌以外の種々の細菌は塩化リチウムを０．４％〜１．０％添加した標準寒天平板培地で発育することを確認した。
これらの結果から、塩化リチウムを０．４％〜１．０％添加した標準寒天培地を用いると、乳酸菌の影響を受けずに、各種細菌の生菌数を測定し得ることが明らかとなった。
【００１４】
【表２】
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【００１５】
（実験例２）
（腸球菌（Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium）の発育に及ぼす塩化リチウムの影響）
塩化リチウムは腸球菌の発育に影響を及ぼすことが知られているので、表３に示す由来の異なるEnterococcus faecalis１０株（Ｎｏ．１〜１０）、Enterococcus faecium１０株（Ｎｏ．１１〜２０）の計２０株の腸球菌に対する影響を検討した。
２０株の腸球菌をトリプトソイブイヨンで、３５℃、２４時間培養した。その培養液を塩化リチウム０、０．１、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０％添加した標準寒天平板培地に接種し、３５℃、４８時間培養後の標準寒天平板培地上の集落の有無を観察した。結果を表３に示す。
表３に示すように、供試したEnterococcus faecali１０株中８株は、１．０％塩化リチウム添加標準寒天平板培地で発育し、残る２株は０．８％塩化リチウム添加標準寒天平板培地で発育したが、１．０％塩化リチウム添加標準寒天平板培地では発育できなかった．
一方、供試したEnterococcus faecium１０株中７株は１．０％塩化リチウム添加標準寒天平板培地で発育したが、3株は発育できなかった。発育できない３株中２株は０．８％、１株は０．６％塩化リチウム添加標準寒天培地で発育できなかったが、０．４％塩化リチウム添加標準寒天平板培地で発育した。
腸球菌の多くの菌株は０．６％以上の塩化リチウム添加標準寒天培地で発育するが、Enterococcus faeciumの１株は０．６％、０．８％および１．０％塩化リチウム添加標準寒天平板培地で発育の抑制がみられ、０．４％塩化リチウム添加標準寒天平板培地で発育した。
これらの結果から、塩化リチウムを標準寒天培地に対して０．６％未満添加した場合には、２０株中１９株の腸球菌は発育することが明らかとなった。
【００１６】
【表３】
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【００１７】
（実験例３）
（種々の乳酸菌の発育に及ぼす塩化リチウムの影響）
表４に示す乳酸菌１４株（Lactococcus lactis subsp. lactis：５株（Ｎｏ．１〜５）；Lactococcus lactis subsp. ceremoris：２株（Ｎｏ．６、７）；Streptococcus thermophilus：３株（Ｎｏ．８〜１０）；Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus：１株（Ｎｏ．１１）、Lactobacillus paracasei：１株（Ｎｏ．１２）、Lactobacillus casei subsp. casei：1株（Ｎｏ．１３）、Lactobacillus pantrum：１株（Ｎｏ．１４））の発育に及ぼす塩化リチウムの影響について検討した。
Lactococcus lactisは、GAM培地で３０℃、７２時間培養し、Streptococcus thermophilusはST培地、LactobacillusはMRS培地で３５℃、７２時間培養後、塩化リチウム０，０．１，０．２，０．４，０．６，０．８，１．０％添加した標準寒天平板培地に接種し、３５℃，４８時間培養後の集落の形成を観察した。結果を表４に示す。
表４に示すように、供試した乳酸菌１４株は１．０％塩化リチウム添加標準寒天培地で発育が全て抑制された。０．８％塩化リチウム添加標準寒天培地ではLactococcus lactis subsp. lactisの１株以外の発育が抑制された。０．６％塩化リチウム添加標準寒天培地ではLactococcus lactis subsp. lactisの１株、Lactobacillus pantrumの１株の計２株以外は発育が抑制された。
さらに、０．４％塩化リチウム添加標準寒天培地ではLactococcus lactis subsp. lactisの２株、Lactococcus lactis subsp. ceremorisの１株、Lactobacillus pantrumの１株の計４株以外の発育は抑制された。０．２％塩化リチウム添加標準寒天培地ではLactococcus lactis subsp. lactisの１株、Lactococcus lactis  subsp. ceremorisの１株、Streptococcus thermophilusの２株、Lactobacillus paracaseiの１株、Lactobacillus casei subsp. Caseiの１株の計５株の発育は抑制された。また、０．１％塩化リチウム添加標準寒天培地ではLactococcus lactis  subsp. ceremorisの１株、Streptococcus thermophilusの２株の計３株の発育は抑制された。しかし、塩化リチウム無添加標準寒天培地では供試した乳酸菌14株は全て発育した。
これらの結果から、標準寒天培地に塩化リチウムを添加することにより、乳酸菌の発育が抑制されることが明らかとなった。
【００１８】
【表４】
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【００１９】
（実施例１）
（乳酸菌が共存する乳製品の生菌数測定における０．５％塩化リチウム添加標準寒天培地による生菌数測定）
乳酸菌が共存している市販の「発酵バター」と「ナチュラルチーズ」（雪印乳業社製）の２検体について、塩化リチウム無添加と０．５％添加標準寒天培地の２種類の培地を用いて生菌数を測定した。
「発酵バター」は５℃に保存し、「ナチュラルチーズ」は２５℃、２４時間放置後５℃に保存したものを実験に供試した。生菌数の測定はフィルター付ストマッカー袋に各検体１０ｇを秤量し、それに滅菌生理的食塩水９０ｍｌを添加し、約５分間ストマックして２種類の検体の乳剤を調製した。各検体は中試験管に９ｍｌ入りの滅菌生理的食塩水を用いて１０−７まで１０倍連続希釈した。
各希釈段階の試料１ｍｌをそれぞれ４枚の滅菌ポリシャーレに注加し、その２枚に加熱溶解後約５０℃に保温した塩化リチウム無添加標準寒天培地、残りの２枚に同様に加熱溶解後約５０℃に保温した０．５％塩化リチウム添加標準寒天培地を注加後、十分混釈し、固形後に倒置して３５℃、４８時間培養後、発育した集落数を測定した。表５に結果を示す。
表５に示されるように、「発酵バター」中の生菌数は、塩化リチウム無添加標準寒天培地においては、希釈倍数１０−１、１０−２、１０−３、１０−４、１０−５の培地では、それぞれ１ｇ当たり５６０個、７２個、１１個、３個、０個であった。これに対して、０．５％塩化リチウム添加標準寒天培地では１０−１から１０−７まで、全て１ｇ当たり０個であった。
これらの結果から、「発酵バター」には１ｇ当たり５６００個の乳酸菌の存在が確認され、さらに乳酸菌以外の汚染菌は存在していないことが示唆された。
また、「ナチュラルチーズ」では、塩化リチウム無添加標準寒天培地で１０−１および１０−２の平板には非常に小さい集落がびっしり発育しており、その上に大きい集落がそれぞれ２４個および６個見られた。１０−３の平板には１個の集落の形成が見られた。一方、０．５％塩化リチウム添加標準寒天培地では、１０−１、１０−２、１０−３に、それぞれ２５個、５個、１個の集落の形成が見られた。
これらの結果から、「ナチュラルチーズ」には乳酸菌が存在し、その上、汚染菌は１ｇ当たり約２５０個共存していたことが測定できた。
これらの結果から、「発酵バター」中の生菌数を標準寒天培地で測定すると、１ｇ当たり約１０，０００個の生菌が存在すると判断できるが、０．５％塩化リチウム添加標準寒天培地で測定すると、集落の形成が全く見られず、全ての生菌は乳酸菌であることが示唆された。
一方、「ナチュラルチーズ」では、１ｇ当たり約１，０００個の乳酸菌と乳酸菌以外の細菌が存在していることが示唆された。
【００２０】
【表５】
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【００２１】
（実施例２）
（塩化リチウム添加ＮＧＫＧ寒天培地のセレウス菌の選択性への影響）
セレウス菌の選択培地であるＮＧＫＧ寒天培地（日水製薬社製）に、表６に示すように、塩化リチウムを０、０．１、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０％添加したNGKG寒天平板培地を調製した。次に、Lactococcus lactis subsp. lactis IFH５７６株の培養液とセレウス菌IFH１３７株の培養液の混合液（１ｍｌ当たりLactococcus lactis subsp. lactis：約10３個、セレウス菌：約10個）を調製した。その混合液の０．１ｍｌを各濃度の塩化リチウム含有NGKG寒天平板培地の表面に塗布し、３５℃、２４時間培養後、平板培地上の集落を観察した。結果を表６に示す。
塩化リチウム無添加および０．１％塩化リチウム添加ＮＧＫＧ寒天平板培地では、平板全体に小さい集落が密集し、平板全体が黄色に変化し、セレウス菌の集落は観察できなかった。塩化リチウム０．２、０．４、０．６、０．８％添加ＮＧＫＧ寒天平板培地では、大きなセレウス菌の集落がそれぞれ１、２、３および１個観察された。しかし、１．０％塩化リチウム添加ＮＧＫＧ平板培地ではセレウス菌の集落は観察されなかった。
この試料を塩化リチウム無添加の従来のＮＧＫＧ寒天平板培地で検査すると、乳酸菌の影響で平板全体が黄色に変化し、セレウス菌の存在が確認されるにもかかわらず、セレウス菌陰性というような判定になる可能性が示唆された。
これらの結果から、乳酸菌が存在又は共存している検体からのセレウス菌の検査には０．４％〜０．６％の塩化リチウム添加ＮＧＫＧ寒天培地が有効であることが判明した。
【００２２】
【表６】
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【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明の生菌数測定方法は、乳酸菌が存在する試料中の乳酸菌以外の細菌、特にセレウス菌の生菌数を、乳酸菌の影響を受けずに測定することができる。本発明の測定方法を利用すれば、乳酸菌含有食品や飲料中の有害細菌による食中毒を、有効に防ぐことが可能となる。