(57)【要約】【課題】高価な装置及び複雑な解析を必要とせず、簡便に判断結果が得られるような、判定対象種判定用のＤＮＡチップなどのプローブ固定担体及びそれを用いた判定方法を提供すること。【解決手段】判定対象生物種の検出のための複数のプローブを、判定対象生物種の所定の基準による分類に基づく平面上の位置関係で担体に固定して検体中に含まれる生物種判定用のプローブ固定担体を作製する。【選択図】図４
2007333694.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物種を特定するためのプローブ固定担体の製造方法において、
生物の判定対象種の複数を所定の基準に基づいて分類して得られる各判定対象種間の関係を平面上の位置関係で表す工程と、
各判定対象種毎に特徴的な標的物質と特異的に結合し得るプローブを、前記平面上の位置関係に基づいて担体上に配置する工程と、
を有することを特徴とするプローブ固定担体の製造方法。
【請求項２】
前記分類における所定の基準が、系統樹である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記分類における所定の基準に遺伝的距離が更に含まれる請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記分類における所定の基準が、各判定対象種に対して投与される抗生物質である請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
前記分類における所定の基準が、各判定対象種に特徴的な標的核酸と該標的核酸と特異的に結合し得るプローブとのハイブリダイゼーション強度である請求項１に記載の製造方法。
【請求項６】
ハイブリダイゼーション強度の強いプローブを中央に配置し、該プローブよりもハイブリダイゼーション強度の弱いプローブを周囲に配置する請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
ハイブリダイゼーション強度の弱いプローブを中央に配置し、該プローブよりもハイブリダイゼーション強度の強いプローブを周囲に配置する請求項５に記載の製造方法。
【請求項８】
ハイブリダイゼーション強度の強いプローブで、該プローブよりもハイブリダイゼーション強度の弱いプローブを背景として、絵、文字及び模様の少なくとも１を描画するようにプローブを配置する請求項５に記載の製造方法。
【請求項９】
生物種を特定するためのプローブ固定担体であって、
担体と、
該担体の表面上に結合している、生物の判定対象種の複数のそれぞれに特徴的な標的物質と特異的に結合し得る複数のプローブと、を有し、
該複数のプローブが、前記複数の判定対象種を所定の基準に基づいて分類して得られる各判定対象種間の関係を表した平面上の位置関係に基づいて該担体表面に配置されている
ことを特徴とするプローブ固定担体。
【請求項１０】
前記分類における所定の基準が、系統樹である請求項９に記載のプローブ固定担体。
【請求項１１】
前記分類における所定の基準に遺伝的距離が更に含まれる請求項１０に記載のプローブ固定担体。
【請求項１２】
前記分類における所定の基準が、各判定対象種に対して投与される抗生物質である請求項９に記載のプローブ固体担体。
【請求項１３】
前記分類における所定の基準が、各判定対象種に特徴的な標的核酸と該標的核酸と特異的に結合し得るプローブとのハイブリダイゼーション強度である請求項９に記載のプローブ固定担体。
【請求項１４】
ハイブリダイゼーション強度の強いプローブを中央に配置し、該プローブよりもハイブリダイゼーション強度の弱いプローブを周囲に配置する請求項１３に記載のプローブ固定担体。
【請求項１５】
ハイブリダイゼーション強度の弱いプローブを中央に配置し、該プローブよりもハイブリダイゼーション強度の強いプローブを周囲に配置する請求項１３に記載のプローブ固定担体。
【請求項１６】
ハイブリダイゼーション強度の強いプローブで、該プローブよりもハイブリダイゼーション強度の強いプローブを背景として、絵、文字及び模様の少なくとも１を描画するようにプローブを配置する請求項１３に記載のプローブ固定担体。
【請求項１７】
検体中に含まれる生物種を判定する方法において、
前記検体由来の試料を、請求項９乃至１６のいずれかに記載のプローブ固定担体と反応させる工程と、
前記試料中に前記判定対象種に特徴的な標的物質が存在する場合における該標的物質と該標的物質に特異的に結合し得るプローブとの結合を検出し、前記検体中に含まれる生物種を判定する工程と、
を有することを特徴とする生物種の判定方法。
【請求項１８】
検体中に含まれる生物種を判定するためのキットにおいて、
請求項９乃至１６のいずれかに記載のプローブ担体と、試料を該プローブ固定担体と反応させ、該プローブ固定担体上でのプローブと試料中の標的物質との反応を検出可能とするための試薬と、を有することを特徴とする生物種判定用のキット。
【請求項１９】
生物種を特定するためのプローブが担体に固定されているプローブ固定担体の製造方法であって、生物の判定対象種の複数を所定の基準に基づいて分類して得られる各判定対象種間の平面上の位置関係に基づいて、前記判定対象種の複数の各々に特徴的な標的物質と特異的に結合し得るプローブを担体上に配置する工程を有することを特徴とするプローブ固定担体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体に含まれる生物種を判定するための生物種判定用のプローブ固定担体及びその製造方法、並びに、このプローブ固定担体を含む生物種判定用のキットに関する。プローブ固定担体の具体例として、ＤＮＡチップ（またはＤＮＡマイクロアレイともいう。以下同じ）がある。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＤＮＡチップを用いた遺伝子発現解析が創薬を始め、種々の領域で行なわれている。例えば、各種遺伝子セット（プローブ）が配置されたＤＮＡマイクロアレイに、異なる検体ＤＮＡを個々に反応させ、各検体に存在するそれぞれの遺伝子量を比較する。比較した結果に基づいて、検体が置かれた種々のステージで大量に存在する（発現量の高い）遺伝子、或いは逆に不活性化している（発現量の低い）遺伝子を分類し、各遺伝子を機能と関連付けて解析する。
【０００３】
ＤＮＡチップを用いて検体中における解析対象遺伝子の発現量の検出とその分析を機械的に行なうために、管理番号順などの所定の順序で格子状に多数種のプローブを機械的に担体上に配置するのが、従来は一般的な方法であった。一方、特許文献１には、ストレスの程度を調べるために、ストレス関連の遺伝子セットを、ストレス受容時の疾病の種類やその致死性の程度や傾向に着目して分類した上で、これらの程度や傾向に準じて多数種のプローブをチップ上に配置することが記載されている。この特許文献１では、遺伝子分類に国際オントロジーコンソーシアムによるオントロジーデータベースで行なわれている分類方法を流用することで、ＤＮＡチップ上のプローブ位置の決定を行なっている。
【０００４】
また、ＤＮＡチップを用いた臨床的な応用としては、特許文献２にあるように、対象とする個体に特有の遺伝子の核酸配列を持つプローブを用いて、個体判別を行なうというものがある。
【特許文献１】特開２００２−３４０９１７号公報
【特許文献２】特許第３４９５７５２号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来のＤＮＡチップにおいては、遺伝子ごとのプローブ配置位置について、その位置をアドレス情報として管理した上で、ハイブリダイゼーション結果と照らし合わせて数値化することで、分析を行なうのが一般的であった。しかし、現実的にはＤＮＡチップに設定するプローブの種類・量は多岐に渡っている。そのため、実際にハイブリダイゼーション強度の情報を数値化したものを得ても、その数値化情報を分析するのには、専用の分析ソフトウェアが動作するハードウェアを必要とする場合が多く、このような場合は分析コストが高くなる傾向にある。また、そのようなソフトウェア・ハードウェアを使用しない場合でも、その分野での経験が必要とされてしまう。
【０００６】
感染症の起炎菌の判定用ＤＮＡチップを臨床上で使用する際に、膨大なデータ量をアドレス情報を参照しながら分析することが必要となる場合がある。このような場合では、反応データの分析処理に長時間を要するため、臨床の現場で診断を行なう際などの迅速性が必要とされる状況に対応できず、ＤＮＡチップの有用性を活かすことができないことがある。
【０００７】
また、実験用のＤＮＡチップを用いた実験によっては膨大なデータ量を処理する必要はなく、おおまかな発現量の傾向を把握できれば良いこともある。
【０００８】
また、特許文献１に開示されるプローブの配置方法は、同一の生物種（この場合ヒト）における異なる遺伝子ごとの臨床的な症状の程度や傾向で分類して配置する方法である。そのため、この配置方法は、特許文献２におけるような異なる生物種を単一の遺伝子を用いることで一括して分類を行なうことを目的とする生物種個体分類に利用することは困難である。
【０００９】
本発明の目的は、プローブ固定担体上のプローブと、検体由来の試料中の標的物質との反応に基づく検体に含まれる生物種の判定を、視覚等により簡便に行うことを可能とするプローブ固定担体及びその製造方法を提供することにある。本発明の他の目的は、かかるプローブ固定担体を含む生物種判定用のキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明のプローブ固定担体の製造方法は、生物種を特定するためのプローブ固定担体の製造方法において、
生物の判定対象種の複数を所定の基準に基づいて分類して得られる各判定対象種間の関係を平面上の位置関係で表す工程と、
各判定対象種毎に特徴的な標的物質と特異的に結合し得るプローブを、前記平面上の位置関係に基づいて担体上に配置する工程と、
を有することを特徴とするプローブ固定担体の製造方法である。
【００１１】
本発明のプローブ固定担体は、  生物種を特定するためのプローブ固定担体であって、
担体と、
該担体の表面上に結合している、生物の判定対象種の複数のそれぞれに特徴的な標的物質と特異的に結合し得る複数のプローブと、を有し、
該複数のプローブが、前記複数の判定対象種を所定の基準に基づいて分類して得られる各判定対象種間の関係を表した平面上の位置関係に基づいて該担体表面に配置されている
ことを特徴とするプローブ固定担体である。
【００１２】
本発明の検体に含まれる生物種の判定方法は、
前記検体由来の試料を、上記の構成のプローブ固定担体と反応させる工程と、
前記試料中に前記判定対象種に特徴的な標的物質が存在する場合における該標的物質と該標的物質に特異的に結合し得るプローブとの結合を検出し、前記検体中に含まれる生物種を判定する工程と、
を有することを特徴とする生物種の判定方法である。
【００１３】
本発明の検体に含まれる生物種判定用のキットは、検体中に含まれる生物種を判定するためのキットにおいて、
上記の構成のプローブ担体と、試料を該プローブ固定担体と反応させ、該プローブ固定担体上でのプローブと試料中の標的物質との反応を検出可能とするための試薬と、を有することを特徴とする生物種判定用のキットである。
【００１４】
本発明に係るプローブ固定担体の製造方法の他の態様は、
生物種を特定するためのプローブが担体に固定されているプローブ固定担体の製造方法であって、
生物の判定対象種の複数を所定の基準に基づいて分類して得られる各判定対象種間の平面上の位置関係に基づいて、前記判定対象種の複数の各々に特徴的な標的物質と特異的に結合し得るプローブを担体上に配置する工程を有することを特徴とするプローブ固定担体の製造方法である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明にかかるプローブ固定担体では、判定対象種の所定の基準での分類に基づいて、判定対象種判定用の多数のプローブが、目視等の簡単な方法によりプローブ固定担体上での反応結果から検体中の生物種の判定が可能となるように配置される。その結果、本発明にかかるプローブ固定担体を用いた生物種の判定では、目視等の簡単な方法で、プローブ担体上のプローブと試料の反応結果から検体に含まれる生物種の判定が可能となる。この判定操作では判定用のデータ処理ソフト等の使用を省略できるので、迅速かつ簡便な判定操作が要求される場合に対して本発明のプローブ固定担体及びそれを用いた生物種判定方法は極めて好適に利用可能である。
【００１６】
すなわち、本発明によれば、高価な装置及び複雑な解析を必要とせず、簡便に判断結果が得られるような、判定対象種判定用のＤＮＡチップなどのプローブ固定担体及びそれを用いた判定方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明にかかるプローブ固定担体の有するプローブは、判定対象として予め選択した生物種（以下、判定対象種という）に特徴的な標的物質に対して特異的に結合し得るものである。プローブを担体に固定するに際して、まず、判定対象種を所定の基準に基づいて分類する。この分類のための基準は、プローブ固定担体と試料との反応を可視化して、特別な光学系やデータ処理ソフトを用いなくても、これを目視などの簡便な方法により認識することで検体中の生物種の判定を簡単に行ために設定される。分類された複数の判定対象種の関係を平面上の位置に置き代えて、各判定対象種の平面上の位置にそれに対応するプローブを配置する。分類の基準と分類された判定対象種間の関係の具体例としては以下のものを挙げることができる。
（１）生物種の系統樹を分類基準とし、系統樹上の各判定対象種の位置関係を平面上の位置関係に写し取って各判定対象種の位置に対応する担体上にプローブを配置する。
（２）上記の生物種の系統樹に更に各判定対象種間の遺伝的距離を加味してプローブを配置する。
（３）生物種が抗生物質投与による治療対象感染症の感染源である場合に、投与される抗生物質の種類を分類基準とし、抗生物質の種類毎に位置決めした平面上の所定位置にその抗生物質投与対象の判定対象種検出用のプローブを配置する。
（４）各判定対象種に特徴的な標的核酸と、この標的核酸と特異的に結合し得るプローブとのハイブリダイゼーション強度を分類基準とし、ハイブリダイゼーション強度に応じた所定位置に判定対象種検出用のプローブを配置する。
【００１８】
以上の（１）〜（４）の分類基準及びプローブの配置方法は、それぞれ単独で、あるいは必要に応じて２以上を組み合わせて用いることができる。
【００１９】
上記の（４）のハイブリダイゼーション強度を分類の基準とする場合には、強度の程度により以下のような配置が可能である。
（４−１）ハイブリダイゼーション強度の強いプローブを中央に配置し、このプローブよりもハイブリダイゼーション強度の弱いプローブを周囲に配置する。
（４−２）ハイブリダイゼーション強度の弱いプローブを中央に配置し、このプローブよりもハイブリダイゼーション強度の強いプローブを周囲に配置する。
（４−３）ハイブリダイゼーション強度の強いプローブで、このプローブよりもハイブリダイゼーション強度の弱いプローブを背景として、絵、文字及び模様の少なくとも１を描画するようにプローブを配置する。
（４−４）ハイブリダイゼーション強度の弱いプローブで、このプローブよりもハイブリダイゼーション強度の強いプローブを背景として、絵、文字及び模様の少なくとも１を描画するようにプローブを配置する。
【００２０】
上記のようにして分類され、かつ平面上の位置関係が設定された判定対象種に応じたプローブの担体への固定は、担体とプローブ種類に応じて選択された方法により行うことができる。
【００２１】
プローブは判定対象種の種類に応じて選択することができる。判定対象種に特徴的な塩基配列（例えば遺伝子中の特徴的配列）を有する核酸（例えばＤＮＡ）を標的物質とする場合は、核酸（例えばＤＮＡ）からなるプローブを用いる。
【００２２】
本発明のプローブ固定担体はおおまかな判定を行う際に特に効果的である。感染症起炎菌の種の判定に用いるプローブ固定担体は、判定対象種に特徴的な塩基配列からなる標的核酸を標的物質としてこの塩基配列を認識し得るプローブを選択して担体の上記分類に所定の位置に固定することで作製可能である。プローブ固定担体の形態としては、ＤＮＡアレイ、ＤＮＡチップあるいはＤＮＡマイクロアレイなどを挙げることができる。
【００２３】
本発明にかかるプローブ固定担体を用いた検体中に含まれる判定対象種の判定は、以下のようにして行うことができる。
【００２４】
まず、検体からプローブ固定担体と反応させるための試料を調製する。この試料の調製は、プローブで認識し得る標的物質の種類に応じた各種方法により行うことができる。標的物質が核酸である場合は、常法により核酸を検体から抽出し、プローブ固定担体との反応に適した状態に試料を整える。試料中の核酸をＰＣＲ法などを用いて増幅しておいてもよい。検体としては、ヒト、家畜等の動物由来の血液、喀痰、胃液、各種分泌物、口腔内粘液等の体液、尿および糞便のような排出物等、判定対象種が存在すると思われるあらゆるものが検体となり得る。また、食中毒、汚染の対象となる食品、飲料水及び温泉水のような環境中の水等、細菌による汚染が引き起こされる可能性のある媒体が検体として用いられることもある。さらに、輸出入時における検疫等の動植物も検体としてその対象となる。検体そのものを直接試料として利用できる場合は、検体をプローブ固定担体と反応させる。試料をプローブ固定担体と反応させると、プローブが特異的に結合し得る標的物質が試料に含まれていれば、担体上のプローブに標的物質が結合する。この担体上のプローブへの標的物質の結合を可視化して目視等の簡単な手段でも認識できるようにする。担体上のプローブと標的物質との結合反応を可視化する手段としては、当該分野で用いられている各種の手段を利用することができる。例えば、試料中の標的物質が核酸であれば、試料中の核酸に可視化のための各種標識を施しておく。この標識を施すための標識物質としては、Cy3、Cy5、Rodaminなどの蛍光物質を用いることができる。試料中の核酸をＰＣＲで増幅する場合には、増幅される核酸に標識物質が取り込まれるように反応系を調製することで、増幅された核酸への標識を行うことができる。また、標的物質とプローブとが結合した状態を特異的に可視化できる色素を用いて、これらが結合している状態を可視化してもよい。
【００２５】
プローブ固定担体上で、標的物質と反応しているプローブを上記の可視化手段で可視化し、先に述べた分類に従ったプローブの配置中での可視化されたプローブの位置を目視や簡単な光学系で観察することで、検体由来の試料中における判定対象種の有無を判定できる。
【００２６】
本発明のプローブ固定担体と、試料とプローブ固定担体との反応及びその可視化に必要な試薬とを組み合わせて、判定対象種の検体由来使用中での存在を判定するためのキットを提供することができる。
【００２７】
以下、添付の図面に基づいて、細菌を同定するためのプローブを例に、本発明の実施形態の一例を説明する。図１は、ＤＮＡチップにおけるハイブリダイゼーションの模式図である。１０１はＤＮＡチップを示す。ＤＮＡチップ１０１上には複数のプローブ１０２が固定化されている。プローブ１０２と、試料中に存在するプローブ１０２の塩基配列と相補的な塩基配列を持つターゲット（標的物質）１０３と、を水素結合させることをハイブリダイゼーションと呼ぶ。プローブ１０２を構成する塩基はＤＮＡの場合はアデニン(＝Ａ)、シトシン(＝Ｃ)、グアニン(＝Ｇ)、チミン(＝Ｔ)の４種類であり、それぞれが水素結合できる（相補的である）塩基は「Ａ−Ｔ」「Ｃ−Ｇ」のペアとなっている。生体内においては、ＤＮＡは二本の核酸鎖が水素結合をして二重螺旋構造を取っているが、これに温度変化を与えることで、二重螺旋をほどいたり、再び結合させたりする事が可能である。
【００２８】
一般にターゲット１０３は標識されており、ＤＮＡチップ１０１上で、各プローブ１０２の位置ごとに、ターゲット１０３の標識が検出されるかどうかを評価することで、ハイブリダイゼーションが起きているかどうかを検出する。
【００２９】
図２は、上述のＤＮＡチップにおけるハイブリダイゼーションを利用した、細菌を同定する方法を説明する模式図である。２０１は、未知の細菌の核酸２０２を含む試料である。２０３は細菌の同定を目的として作成されたＤＮＡチップである。このＤＮＡチップには、菌Ａの核酸に特有の塩基配列に相補的な塩基配列を持つプローブ２０４と、菌Ｂの核酸に特有の塩基配列に相補的な塩基配列を持つプローブ２０５と、が固定されている。試料２０１にＤＮＡチップ２０２を適用しハイブリダイゼーション反応を起こさせた後に、どちらのプローブとハイブリダイズしたかを評価することで、未知の細菌の同定が可能である。図２の例では、未知の細菌の核酸２０２はプローブ２０５と結合している（２０６に示す破線は、核酸の水素結合を意味するものとする）ため、この細菌は菌Ｂであると判断できる。
【００３０】
図２の例ではプローブは２つしか設定されていないが、実際のＤＮＡチップにおていは、プローブの数は例えば、数百から数千に渡って設定することが可能である。また、図２の例では、一つの菌について一つのプローブを設定しているが、一つの菌について複数のプローブを設定することも可能である。本発明のプローブ固定担体の作製に当たっては、判定対象種の所定の基準による分類に応じた担体平面の位置にプローブを配置するので、本発明にかかるプローブ固定担体は多数のプローブを固定して判定を行う場合にも好適に利用可能である。
【００３１】
このようにＤＮＡチップ上には、それぞれに意味のあるプローブが複数種類設定されていて、通常はどの位置にどのプローブが配置されているのかが管理された状態になっている。この配置は遺伝子名順、プローブの管理番号順などになっているのが通常である。またＤＮＡチップ上には数百から数千のプローブを設定するのが通常であるため、ハイブリダイゼーション強度の高いプローブがあった場合に、実際の配置位置から、当該プローブの意味についてはアドレス情報を参照することで判断する必要がある。このように、通常、アドレス情報はプローブの配置を行なう装置と、発現量あるいはハイブリダイゼーション強度の評価を行なう検出装置と、検出装置から得られた情報を判断する実験者により利用されることになる。
【００３２】
本発明によれば、判定対象種の所定の基準による分類に応じた担体平面の位置にプローブが予め配置されており、この分類基準を把握しておくことで、上記のようなアドレス情報を詳細に参照することなく、ハイブリダイゼーション反応が可視化された状態から検体に含まれる判定対象種の判別を簡便に行なうことができる。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。なお、各実施例に先立ち、プローブ配列とターゲット配列の塩基の違いから、ハイブリダイゼーション輝度を予測する方法について、まず説明する。本発明の実施例は、このハイブリダイゼーション輝度予測に基づき説明する。
【００３４】
以下の表１に示すのは、実施例１に後述する方法で作成したＤＮＡチップを用いて、大腸菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子と下記の条件でハイブリダイゼーションを行なった際の、プローブの塩基配列と各プローブ由来のハイブリッド体が示す輝度である。各プローブは、大腸菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の３箇所に対してミスマッチの無いプローブ、１塩基ミスマッチのプローブ、２塩基ミスマッチのプローブをそれぞれ設計した。
ハイブリダイゼーション条件：
・液組成：6xSSPE / 10% Formamide / 0.05wt% SDS / Target
・操作：65℃(3分)→92℃(2分)→50℃(4時間)→ Wash 2xSSC/0.1wt% 25℃ → Wash 2xSSC/0.1wt% 20℃
【００３５】
【表１】
2007333694.tif 000003
【００３６】
上記表１より、プローブの塩基配列とターゲットの塩基配列との間にミスマッチが有る場合には、フルマッチの場合と比較して蛍光輝度が著しく下がる傾向が有ることが分かる。以下の実施例は、このように、プローブの塩基配列とターゲットの塩基配列の間にミスマッチがある場合にはフルマッチの場合と比較してハイブリダイゼーション強度が低下する現象を利用したものである。
【００３７】
（実施例１）[近縁の菌を近くに並べる]
（１）プローブの配置位置の決定
表２に示す６菌を同定するためのプローブを設定するＤＮＡチップを作成する場合を例に上げて説明する。また、表２に示す菌を同定するために、表３に示すようなプローブを作成するものとする。本プローブが標的とするのは、それぞれ想定している菌種の１６Ｓ  ｒＲＮＡをコーディングする遺伝子である。
【００３８】
【表２】
2007333694.tif 000004
【００３９】
【表３】
2007333694.tif 000005
【００４０】
表３に示すプローブにおいて、Ａ−１、Ａ−２、Ａ−３は表２の「Ａ菌」ことＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに特有の配列と結合し得るプローブとする。以下同様に、Ｂ−１、Ｂ−２、Ｂ−３はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓに特有の配列と結合し得るプローブである。Ｃ−１、Ｃ−２、Ｃ−３は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉと結合し得るプローブである。Ｄ−１、Ｄ−２、Ｄ−３はＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅと結合し得るプローブである。Ｅ−１、Ｅ−２、Ｅ−３はＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅと結合し得るプローブである。Ｆ−１、Ｆ−２、Ｆ−３はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａにそれぞれ特有の配列と結合し得るプローブである。また、ＡＢ−１、ＡＢ−２、ＡＢ−３は、表２の「Ａ菌」ことＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｒｅｕｓｕと「Ｂ菌」ことＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓにのみ共通する配列と結合し得るプローブとする。以下同様に、ＣＤＥ−１、ＣＤＥ−２、ＣＤＥ−３はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉとＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅとＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅにのみ共通する配列と結合し得るプローブとする。ＡＢＣＤＥＦ−１、ＡＢＣＤＥＦ−２、ＡＢＣＤＥＦ−３は、表２に示す６菌全てに共通する配列と結合し得るプローブである。
【００４１】
この時、上記の６菌の塩基配列を国立遺伝学研究所の以下のサイトにて公開されている配列解析サービスであるＣｌｕｓｔａｌＷを用いてマルチプルアライメントを行なうと、以下の結果を得た。
・ＷＷＷサイト(http://www.ddbj.nig.ac.jp/)
・ＣｌｕｓｔａｌＷ（http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/clustalw-j.html）
((S.aureus:0.00632,S.epidermidis:0.00885):0.50060, P.aeruginosa:0.08719):0.04164,
E.coli:0.01364,(K.pneumoniae:0.01328,E.cloacae:0.01057):0.00587);
この結果を得て、各菌の関係を図示したものが、図３である。図３を描画するにあたり、系統解析ソフトウェアであるＭＥＧＡ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．１（ＭｅｇａＳｏｆｔ社製）を使用した。図３においては、菌間の距離がすなわち類縁性を示していると考えることができる。そこで、この菌間の関係を維持するようにプローブを配置したＤＮＡチップを図４のように設計した。図４において、６０１はＤＮＡチップである。６０２はＡ−１、Ａ−２、Ａ−３のプローブが配置されている箇所である。６０３はＢ−１、Ｂ−２、Ｂ−３のプローブが配置されている箇所である。６０４はＣ−１、Ｃ−２、Ｃ−３のプローブが配置されている箇所である。６０５はＤ−１、Ｄ−２、Ｄ−３のプローブが配置されている箇所である。６０６はＥ−１、Ｅ−２、Ｅ−３のプローブが配置されている箇所である。６０７はＦ−１、Ｆ−２、Ｆ−３のプローブが配置されている箇所である。６０８はＡＢ−１、ＡＢ−２、ＡＢ−３のプローブが配置されている箇所である。６０９は、ＣＤＥ−１、ＣＤＥ−２、ＣＤＥ−３のプローブが配置されている箇所である。６１０はＡＢＣＤＥＦ−１、ＡＢＣＤＥＦ−２、ＡＢＣＤＥＦ−３のプローブが配置されている箇所である。
【００４２】
図４に示すＤＮＡチップでは、従来のＤＮＡチップのように「プローブをそれぞれ等距離になるように均等に配置」することにはこだわらず、系統樹におけるそれぞれの距離を重視して配置しても良い。
【００４３】
（２）マレイミド基導入基板の作成
（基板洗浄）
１インチ角のガラス板をラックに入れ、超音波洗浄用洗剤に一晩浸した。その後、洗剤中で２０分間超音波洗浄を行ない、その後、水洗により洗剤を除去する。蒸留水ですすいだ後、蒸留水の入った容器中でさらに超音波処理を２０分間行なう。次に、あらかじめ加温してあった１Ｎ水酸化ナトリウム溶液に１０分間浸す。引き続き水洗、蒸留水洗浄を行なう。
（表面処理）
上記の洗浄処理を行った基板を、１重量％シランカップリング剤水溶液（信越化学工業社製、商品名ＫＢＭ６０３）に室温で２０分浸し、その後、窒素ガスを両面に吹き付けて、水分を飛ばし、乾燥させる。乾燥処理された基板を、１２０℃に加熱したオーブンで１時間ベークしシランカップリング処理を完結させる。続いて、ＥＭＣＳ（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ：  Ｄｏｊｉｎ社製）を２．７ｍｇ秤量し、ＤＭＳＯ／エタノールの１：１溶液に溶解する（最終濃度０．３ｍｇ／ｍｌ）。シランカップリング剤処理を行なったガラス基板をこのＥＭＣＳ溶液に２時間浸し、シランカップリング剤のアミノ基とＥＭＣＳ溶液のカルボキシル基を反応させる。この状態でガラス表面にはＥＭＣＳ由来のマレイミド基が表面に存在することになる。ＥＭＣＳ溶液と反応させたガラス板は蒸留水で洗浄後、窒素ガスで乾燥させ、ＤＮＡとの結合反応に用いられる。
（３）ＤＮＡの基板への結合反応
（２７種ＤＮＡプローブの合成）
上述の（１）にて用意した２７種類のプローブについて、５’末端にＳＨ基（チオール基）を有する２７種類のプローブ一本鎖ＤＮＡを定法により合成する。
（ＤＮＡプローブの吐出）
各プローブＤＮＡをそれぞれ水に溶解し、以下の組成のＳＧクリアを用いて最終濃度8μＭになるよう希釈する。
ＳＧクリア組成：
グリセリン７．５重量％、尿素７．５重量％、チオジグリコール７．５重量％、アセチレノールＥＨ（商品名：川研ファインケミカル株式会社）１重量％を含む水溶液。
【００４４】
少量のサンプルを吐出できるように改造したＢＪプリンター用ヘッドＢＣ６２（キヤノン社製）のノズルにプローブＤＮＡの溶液を１００μｌ充填する。各ヘッドあたり６種のＤＮＡを吐出できるようにして、２７種のＤＮＡのそれぞれのスポットが独立して形成されるように吐出させる。こうして所定の位置に所定のプローブが配置されたＤＮＡプローブアレイを得ることができる。その後、基板を３０分加湿チャンバー中に放置し、プローブＤＮＡを基板に結合させて固定する反応を行なうと、図４に示す基板平面へのプローブ配置を有するＤＮＡアレイ基板を得ることができる。
（４）ハイブリダイゼーション反応
（ブロッキング反応）
１Ｍ  ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）溶液にてＤＮＡアレイ基板を洗い、ガラス表面の固定されてないＤＮＡ溶液を完全に洗い流す。その後、２重量％ウシ血清アルブミン水溶液中に浸し、２時間放置し、ブロッキング反応を行なう。
（ハイブリダイゼーション）
表４に示す生物種から個々に１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域を増幅する公知のＰＣＲプライマを用いて、ハイブリダイゼーション用のＤＮＡ試料を調製し、標識を施してからそれぞれ上記の方法で作製したプローブ固定担体を反応させる。
【００４５】
【表４】
2007333694.tif 000006
【００４６】
今回は、実際にハイブリダイゼーションを行なった結果ではなく、シグナル強度を予測し、その値を図５〜図１１に示す。すなわち、上記の表４に示す生物種の核酸配列を公共データベースから取得する。当該データベースから得られた核酸配列と、表３に示す各プローブとの相同性の評価結果を用いてハイブリダイゼーション結果として得られるシグナル強度を予測し、図５〜図１１に示す。
【００４７】
なお、このシグナル強度の予測には、前述の表１に示す実験結果を踏まえて、ターゲットである各生物種の核酸配列と、プローブ配列との間で、最も相同性の高い領域において、一致しない塩基数と一致する塩基数との比を、指標として用いる。具体的には、３塩基以上のミスマッチがある場合には、プローブとターゲットとの間でハイブリダイゼーションは起こらない。また、２塩基以内のミスマッチであっても、ミスマッチの数が多ければハイブリダイゼーション強度は弱く、ミスマッチの数が少なければハイブリダイゼーション強度は強くなるものとする。
【００４８】
ハイブリダイゼーションシグナルの予測に用いる各生物種の配列は、表４に示す株(ＮＣＢＩのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ)の１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域を用いた。またハイブリダイゼーションシグナルの予測に際して、相同性検索には、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ２を用いた。
【００４９】
ＤＮＡ試料とプローブ固定担体上のプローブとのハイブリダイゼーションにより、図５〜図１１のような結果が得られると期待される。なお、図８〜図１１では「+」表示がハイブリダイゼーション強度が高いことを示す。「-」表示は、ハイブリダイゼーション強度が低いことを意味する。「+-」表示は両者の中間程度のハイブリダイゼーション強度があると期待されることを意味する。
【００５０】
表４に示すＡ〜Ｆは、それぞれ表２に示す菌に対応する株である。
【００５１】
図５は、公共データベースから取得した遺伝子配列と同等の配列を持つ試料と、ＤＮＡチップとのハイブリダイゼーション反応を行なった場合に結果として得られることが期待されるシグナルを予測した模式図である。すなわち、公共データベースからＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのＭｕ５０株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列（NC_002758 REGION: 530475..532029）を取得する。この取得したものと同等の配列を持つ試料を、図４に示すＤＮＡチップとハイブリダイゼーション反応を行なった場合に結果として得られることが期待されるシグナルを予測する。予測した結果を示した模式図が図５である。図５に示すように、「Ａ−１、Ａ−２、Ａ−３、ＡＢ−１、ＡＢ−２、ＡＢ−３、ＡＢＣＤＥＦ−１、ＡＢＣＤＥＦ−２、ＡＢＣＤＥＦ−３」で高いハイブリダイゼーション強度が得られることが期待される。以下の表５−１及び表５−２には、図５の根拠となる、各プローブ配列とＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのＭｕ５０株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列（NC_002758 REGION: 530475..532029）の配列とのミスマッチ数を示す。更に、表５−１及び表５−２にターゲット配列とプローブ配列との一致度と、それを元に予測したハイブリダイゼーション強度をそれぞれ示す。アライメントの欄は、ターゲットとプローブの、それぞれの塩基配列の一致度を表現している。ターゲットの行の数字は、16S rRNAにおける位置を示しており、プローブの行の数字は、プローブ塩基配列における位置を示している。ターゲットの行とプローブの行の間の「|」の記号は、ターゲットの16S rRNAにおける塩基配列とプローブの塩基配列の一致している箇所を示す。この欄が空欄の場合は、ターゲット塩基配列とプローブ塩基配列の間で、ほとんど塩基配列が一致していないことを示す。輝度予測の欄の「+++」「-」などの記号は、「+++」が非常に強いハイブリダイゼーション強度を示し、「-」はハイブリダイゼーション強度が弱いことを示す。「++」と「+」はそれぞれの中間を示し、1塩基のミスマッチがある場合が「++」で2塩基のミスマッチがある場合が「+」となると予測している。
【００５２】
【表５】
2007333694.tif 000007
【００５３】
【表６】
2007333694.tif 000008
【００５４】
図６は、公共データベースから取得した配列に基づく試料と、図４に示すＤＮＡチップと、のハイブリダイゼーション反応を行なった場合に結果として得られることが期待されるシグナルを予測した模式図である。すなわち、公共データベースからＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓのＡＴＣＣ１２２２８株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列（NC_004461 REGION: complement(1598006..1599559)）を取得する。取得された遺伝子配列からの試料を図４に示すＤＮＡチップとハイブリダイゼーション反応を行なった場合に結果として得られることが期待されるシグナルを予測する。予測されたシグナルを図６に模式図として示す。図６に示すように、「Ｂ−１、Ｂ−２、Ｂ−３、ＡＢ−１、ＡＢ−２、ＡＢ−３、ＡＢＣＤＥＦ−１、ＡＢＣＤＥＦ−２、ＡＢＣＤＥＦ−３」で高いハイブリダイゼーション強度が得られることが期待される。以下の表６−１及び表６−２には、図６の根拠となる、各プローブ配列とＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓのＡＴＣＣ１２２２８株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列（NC_004461 REGION: complement(1598006..1599559)）の配列とのミスマッチ数を示す。更に、表６−１及び表６−２に、図６の根拠となる、ターゲット配列とプローブ配列との一致度と、それを元に予測したハイブリダイゼーション強度をそれぞれ示す。アライメントの欄は、ターゲットとプローブの、それぞれの塩基配列の一致度を表現している。ターゲットの行の数字は、16S rRNAにおける位置を示しており、プローブの行の数字は、プローブ塩基配列における位置を示している。ターゲットの行とプローブの行の間の「|」の記号は、ターゲットの16S rRNAにおける塩基配列とプローブの塩基配列の一致している箇所を示す。この欄が空欄の場合は、ターゲット塩基配列とプローブ塩基配列の間で、ほとんど塩基配列が一致していないことを示す。輝度予測の欄の「+++」「-」などの記号は、「+++」が非常に強いハイブリダイゼーション強度を示し、「-」はハイブリダイゼーション強度が弱いことを示す。「++」と「+」はそれぞれの中間を示し、1塩基のミスマッチがある場合が「++」で2塩基のミスマッチがある場合が「+」となると予測している。
【００５５】
【表７】
2007333694.tif 000009
【００５６】
【表８】
2007333694.tif 000010
【００５７】
図７は、公共データベースから取得した配列と同等の配列を持つ試料を図４に示すＤＮＡチップとハイブリダイゼーション反応を行なった場合に結果として得られることが期待されるシグナルを予測した模式図である。すなわち、公共データベースからＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＫ１２株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列(NC_000913 REGION: 223771..225312)を取得する。取得した配列と同等の配列を持つ試料を図４に示すＤＮＡチップとハイブリダイゼーション反応を行なった場合に結果として得られることが期待されるシグナルを予測する。予測した値を模式図として図７に示す。図７に示すように、「Ｃ−１、Ｃ−２、Ｃ−３、ＣＤＥ−１、ＣＤＥ−２、ＣＤＥ−３、ＡＢＣＤＥＦ−１、ＡＢＣＤＥＦ−２、ＡＢＣＤＥＦ−３」で高いハイブリダイゼーション強度が得られることが期待される。以下の表７−１から表７−３には、図７の根拠となる、各プローブ配列とＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＫ１２株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列(NC_000913 REGION: 223771..225312)の配列とのミスマッチ数を示す。更に、表７−１から表７−３には、図７の根拠となる、とターゲット配列とプローブ配列との一致度と、それを元に予測したハイブリダイゼーション強度をそれぞれ示す。アライメントの欄は、ターゲットとプローブの、それぞれの塩基配列の一致度を表現している。ターゲットの行の数字は、16S rRNAにおける位置を示しており、プローブの行の数字は、プローブ塩基配列における位置を示している。ターゲットの行とプローブの行の間の「|」の記号は、ターゲットの16S rRNAにおける塩基配列とプローブの塩基配列の一致している箇所を示す。この欄が空欄の場合は、ターゲット塩基配列とプローブ塩基配列の間で、ほとんど塩基配列が一致していないことを示す。輝度予測の欄の「+++」「-」などの記号は、「+++」が非常に強いハイブリダイゼーション強度を示し、「-」はハイブリダイゼーション強度が弱いことを示す。「++」と「+」はそれぞれの中間を示し、1塩基のミスマッチがある場合が「++」で2塩基のミスマッチがある場合が「+」となると予測している。
【００５８】
【表９】
2007333694.tif 000011
【００５９】
【表１０】
2007333694.tif 000012
【００６０】
【表１１】
2007333694.tif 000013
【００６１】
図８は、公共データベースから取得した配列と同等の配列を持つ試料を図４に示すＤＮＡチップとハイブリダイゼーション反応を行なった場合に結果として得られることが期待されるシグナルを予測した模式図である。すなわち、公共データベースからＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＡｃ０１株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列（DQ185604）を取得する。取得した配列と同等の配列を持つ試料を図４に示すＤＮＡチップとハイブリダイゼーション反応を行なった場合に結果として得られることが期待されるシグナルを予測する。予測した値を模式図として図８に示す。図８に示すように、「Ｄ−１、Ｄ−２、Ｄ−３、ＣＤＥ−１、ＣＤＥ−２、ＣＤＥ−３、ＡＢＣＤＥＦ−１、ＡＢＣＤＥＦ−２、ＡＢＣＤＥＦ−３」で高いハイブリダイゼーション強度が得られることが期待される。以下の表８−１から表８−３には、図８の根拠となる、各プローブ配列とＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＡｃ０１株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列（DQ185604）の配列とのミスマッチ数を示す。更に、表８−１から表８−３に、図８の根拠となる、ターゲット配列とプローブ配列との一致度と、それを元に予測したハイブリダイゼーション強度をそれぞれ示す。アライメントの欄は、ターゲットとプローブの、それぞれの塩基配列の一致度を表現している。ターゲットの行の数字は、16S rRNAにおける位置を示しており、プローブの行の数字は、プローブ塩基配列における位置を示している。ターゲットの行とプローブの行の間の「|」の記号は、ターゲットの16S rRNAにおける塩基配列とプローブの塩基配列の一致している箇所を示す。この欄が空欄の場合は、ターゲット塩基配列とプローブ塩基配列の間で、ほとんど塩基配列が一致していないことを示す。輝度予測の欄の「+++」「-」などの記号は、「+++」が非常に強いハイブリダイゼーション強度を示し、「-」はハイブリダイゼーション強度が弱いことを示す。「++」と「+」はそれぞれの中間を示し、1塩基のミスマッチがある場合が「++」で2塩基のミスマッチがある場合が「+」となると予測している。
【００６２】
【表１２】
2007333694.tif 000014
【００６３】
【表１３】
2007333694.tif 000015
【００６４】
【表１４】
2007333694.tif 000016
【００６５】
図９は、公共データベースから取得した配列と同等の配列を持つ試料を図４に示すＤＮＡチップとハイブリダイゼーション反応を行なった場合に結果として得られることが期待されるシグナルを予測した模式図である。すなわち、公共データベースからＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅのＣＰ１株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列（DQ089673）を取得する。取得した配列と同等の配列を持つ試料を図４に示すＤＮＡチップとハイブリダイゼーション反応を行なった場合に結果として得られることが期待されるシグナルを予測する。予測した値を模式図として図９に示す。
【００６６】
図９に示すように、「Ｅ−１、Ｅ−２、Ｅ−３、ＣＤＥ−１、ＣＤＥ−２、ＣＤＥ−３、ＡＢＣＤＥＦ−１、ＡＢＣＤＥＦ−２、ＡＢＣＤＥＦ−３」で高いハイブリダイゼーション強度が得られることが期待される。以下の表９−１から表９−３には、図９の根拠となる、各プローブ配列とＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅのＣＰ１株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列（DQ089673）の配列とのミスマッチ数を示す。更に、表９−１から表９−３に、図９の根拠となる、ターゲット配列とプローブ配列との一致度と、それを元に予測したハイブリダイゼーション強度をそれぞれ示す。アライメントの欄は、ターゲットとプローブの、それぞれの塩基配列の一致度を表現している。ターゲットの行の数字は、16S rRNAにおける位置を示しており、プローブの行の数字は、プローブ塩基配列における位置を示している。ターゲットの行とプローブの行の間の「|」の記号は、ターゲットの16S rRNAにおける塩基配列とプローブの塩基配列の一致している箇所を示す。この欄が空欄の場合は、ターゲット塩基配列とプローブ塩基配列の間で、ほとんど塩基配列が一致していないことを示す。輝度予測の欄の「+++」「-」などの記号は、「+++」が非常に強いハイブリダイゼーション強度を示し、「-」はハイブリダイゼーション強度が弱いことを示す。「++」と「+」はそれぞれの中間を示し、1塩基のミスマッチがある場合が「++」で2塩基のミスマッチがある場合が「+」となると予測している。
【００６７】
【表１５】
2007333694.tif 000017
【００６８】
【表１６】
2007333694.tif 000018
【００６９】
【表１７】
2007333694.tif 000019
【００７０】
図１０は、公共データベースから取得した配列と同等の配列を持つ試料を図４に示すＤＮＡチップとハイブリダイゼーション反応を行なった場合に結果として得られることが期待されるシグナルを予測した模式図である。すなわち、公共データベースからＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＰＡ０１株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列（NC_002516 REGION: 722096..723631）を取得する。取得した配列と同等の配列を持つ試料を図４に示すＤＮＡチップとハイブリダイゼーション反応を行なった場合に結果として得られることが期待されるシグナルを予測する。予測した値を模式図として図１０に示す。
【００７１】
図１０に示すように、「Ｆ−１、Ｆ−２、Ｆ−３、ＡＢＣＤＥＦ−１、ＡＢＣＤＥＦ−２、ＡＢＣＤＥＦ−３」で高いハイブリダイゼーション強度が得られることが期待される。以下の表１０−１及び表１０−２には、図１０の根拠となる、各プローブ配列とＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＰＡ０１株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列（NC_002516 REGION: 722096..723631）の配列とのミスマッチ数を示す。更に、表１０−１及び表１０−２に、図１０の根拠となる、とターゲット配列とプローブ配列との一致度と、それを元に予測したハイブリダイゼーション強度をそれぞれ示す。アライメントの欄は、ターゲットとプローブの、それぞれの塩基配列の一致度を表現している。ターゲットの行の数字は、16S rRNAにおける位置を示しており、プローブの行の数字は、プローブ塩基配列における位置を示している。ターゲットの行とプローブの行の間の「|」の記号は、ターゲットの16S rRNAにおける塩基配列とプローブの塩基配列の一致している箇所を示す。この欄が空欄の場合は、ターゲット塩基配列とプローブ塩基配列の間で、ほとんど塩基配列が一致していないことを示す。輝度予測の欄の「+++」「-」などの記号は、「+++」が非常に強いハイブリダイゼーション強度を示し、「-」はハイブリダイゼーション強度が弱いことを示す。「++」と「+」はそれぞれの中間を示し、1塩基のミスマッチがある場合が「++」で2塩基のミスマッチがある場合が「+」となると予測している。
【００７２】
【表１８】
2007333694.tif 000020
【００７３】
【表１９】
2007333694.tif 000021
【００７４】
図１１は、公共データベースより取得した配列と、図４に示すＤＮＡチップとハイブダイリゼーション反応を行なった場合に結果として得られることが期待されるシグナル強度を予測して図示した模式図である。すなわち、公共データベースから、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｍｉｎｉｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の配列（ＮＣＢＩのＡＣＣＳＥＳＳＩＯＮ：AM157418）を取得する。この菌は、遺伝的にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓやＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓに近い菌である。取得した配列と、図４に示すＤＮＡチップとハイブダイリゼーション反応を行なった場合に結果として得られることが期待されるシグナル強度を予測して模式図として図１１に示す。今回、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｍｉｎｉｓは検体中に何らかの未知の菌が存在した場合を想定している。図１１に示すように、Ａ−２、Ｂ−３、ＡＢ−２、ＡＢ−３付近のプローブでハイブダイゼーション強度が高くなることが期待され、結果的にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓに近縁の菌が試料中に存在することが、十分推測される。以下の表１１−１及び表１１−２には、図１１の根拠となる、各プローブの配列とＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｍｉｎｉｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の配列（ＮＣＢＩのＡＣＣＳＥＳＳＩＯＮ：AM157418）とのミスマッチ数を示す。更に、表１１−１及び表１１−２に、図１１の根拠となる、とターゲット配列とプローブ配列との一致度と、それを元に予測したハイブリダイゼーション強度をそれぞれ示す。アライメントの欄は、ターゲットとプローブの、それぞれの塩基配列の一致度を表現している。ターゲットの行の数字は、16S rRNAにおける位置を示しており、プローブの行の数字は、プローブ塩基配列における位置を示している。ターゲットの行とプローブの行の間の「|」の記号は、ターゲットの16S rRNAにおける塩基配列とプローブの塩基配列の一致している箇所を示す。この欄が空欄の場合は、ターゲット塩基配列とプローブ塩基配列の間で、ほとんど塩基配列が一致していないことを示す。輝度予測の欄の「+++」「-」などの記号は、「+++」が非常に強いハイブリダイゼーション強度を示し、「-」はハイブリダイゼーション強度が弱いことを示す。「++」と「+」はそれぞれの中間を示し、1塩基のミスマッチがある場合が「++」で2塩基のミスマッチがある場合が「+」となると予測している。
【００７５】
【表２０】
2007333694.tif 000022
【００７６】
【表２１】
2007333694.tif 000023
【００７７】
図５〜図１１に示すとおり、菌種ごとに強いハイブリダイゼーション強度が得られる位置について、判定対象種の分類に使用した系統樹に対応したプローブの基板上での配置を予め把握しておく。このことにより、ハイブリダイゼーション強度の高いプローブの位置ごとに近縁の菌種であれば、おおまかに判断することが可能となる。本実施例にかかるプローブ固定担体は、菌の同定に関して正確さよりもおおまかな判断が迅速に必要な際に有用であるといえる。
【００７８】
（実施例２）
［薬効ごとに分類した上で配置を行なう］
前述の実施例１においては、系統樹を作成することで、プローブの配置の調整を行ない、結果として個体種別のおおまかな判定を簡便に得る方法について例示した。本実施例においては、プローブの分類の指標として、薬効を用いることで、個体種別の同定を簡便に行なう方法を例に挙げて説明する。
【００７９】
表１２は、本実施例に示すＤＮＡチップで同定を行なう対象の生物種、すなわち判定対象種である。
【００８０】
【表２２】
2007333694.tif 000024
【００８１】
表１２に示す微生物による感染症を治療するために使用する抗生物質は、それぞれ異なるものとする。図１２は、表１２に示す生物種を同定するためにプローブを配置したＤＮＡチップである。１７０１はＤＮＡチップであり、このチップ上には、表１２に示した微生物をそれぞれ判別するためのプローブを配置する。１７０２はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを判別するプローブを配置する位置であるとする。１７０３はメスチリン耐性を持つＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを判別するプローブを配置する位置であるとする。１７０４はＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓを判別するプローブを配置する位置であるとする。１７０５はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒを判別するプローブを配置する位置であるとする。１７０６はＨｕｍａｎ  Ｈｅｒｐｓｅ  Ｖｉｒｕｓ  １を判別するプローブを配置する位置であるとする。１７０７はＨｕｍａｎ  Ｈｅｒｐｓｅ  Ｖｉｒｕｓ  ２を判別するプローブを配置する位置であるとする。
【００８２】
このようなプローブ配置を持つＤＮＡチップを用いて、実施例１と同様に未知の微生物からのハイブリダイゼーション用のＤＮＡ試料とＤＮＡチップ上のプローブとのハイブリダイゼーションを行なう。結果として、投与抗生物質が既知である１７０２〜１７０７のどの領域でのハイブリダイゼーション強度が高くなるか？ということから、どの抗生物質による治療対象の判定対象種が検体に含まれているかを判定できる。更に、検体を提供した患者の治療に用いる抗生物質の決定を迅速、かつ簡便に判断することもできる。
【００８３】
本実施例においては、対象は６微生物と仮定して例示したが、薬効ごとに分類して配置するのであれば、微生物グループは６種に限定されるものではない。
【００８４】
（実施例３）
［プローブの予想されるハイブリ強度を基準にして、分離の良いプローブとあまり分離の良くないプローブを効果的に並べる］
１６Ｓ  ｒＲＮＡを用いて細菌の判別を行なう場合、１６Ｓ  ｒＲＮＡ菌種ごとに保存されている領域と、菌種ごとに特異的な領域とが存在することが知られている。例えばＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓとＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡの配列は非常に類似している。そのため、それぞれの菌について図１３に示すように６箇所ずつの領域を選択して判別用プローブを作成した場合、それぞれの菌に対して完全に特異的な領域からなるプローブと相同性の高い領域からなるプローブができることになる。
【００８５】
１８０１はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡである。同様に、１８０８はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡである。１８０２〜１８０７はそれぞれＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡに対応するプローブである。１８０９〜１８１４はそれぞれＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡに対応するプローブである。１８０２〜１８０７と１８０９〜１８１４をそれぞれ表にしたものが、表１３である。
【００８６】
【表２３】
2007333694.tif 000025
【００８７】
先述したように、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓとＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓとの１６Ｓ  ｒＲＮＡは、それぞれ互いに相同性が高い。その結果、比較的特異的と思われる領域をプローブとして選択しても、ハイブリダイゼーションを行なうと、表１４に見られるようにクロスハイブリダイゼーションが見られることが経験的に分かっている。表１４中「クロスハイブリ」の列に「＋」と表示されているプローブは互いの菌に対して若干のハイブリッドを形成する場合があることが経験的に分かっているプローブである。例えば１８０９のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ用プローブは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡとも若干のハイブリッドを形成しうることを示している。逆に１８１０のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ用のプローブは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓとのみハイブリッドを形成するプローブであり、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓとのクロスハイブリが起こらないことを意味する。
【００８８】
このような関係になっている時に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓを検出するためのＤＮＡチップを作成する際には、未知の試料中に存在するＤＮＡがＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓであることを簡便に判別することを可能にするようにプローブを配置する。
【００８９】
図１４は、本実施例におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ判別用のＤＮＡチップにおけるプローブ配置の例である。
【００９０】
２１０１はＤＮＡチップであり、ＤＮＡチップ２１０１上の１８０２〜１８０７、１８０９〜１８１４は、それぞれのプローブ名に対応したプローブのスポット位置を示す。図１４に示すように、表１４を元にして、特にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの分離性の良いプローブである１８１０、１８１１、１８１２、１８１４を中心に配置し、１８０９、１８１３のような、若干Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの分離に劣るプローブや１８０２〜１８０７のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ  ａｕｒｅｓｕのプローブを外側に配置する。
【００９１】
【表２４】
2007333694.tif 000026
【００９２】
実施例１と同様に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域をコーディングする遺伝子配列とそれぞれハイブリダイゼーション反応を行なった結果を、図１５に示す。
【００９３】
図１５は、ハイブリダイゼーションの検出を蛍光標識にて行ない、ハイブリダイゼーション強度を蛍光輝度の強弱として検出し、その結果を色の濃淡で表したものである。図１５において、色の濃いプローブは輝度の高かったプローブであり、すなわちハイブリッドを形成しているプローブである。図１５のａ．はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの遺伝子配列とのハイブリダイゼーション結果であり、ｂ．はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの遺伝子配列とのハイブリダイゼーション結果である。また、ｃは、ヒトゲノムとのハイブリダイゼーション結果である。
【００９４】
図１５のａ、ｂ、ｃ図に示すように、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓが検出された場合には、中央部の蛍光輝度が強くなる結果が得られる。このように、ハイブリダイゼーション強度を考慮した配列とし、判定対象種に応じた蛍光輝度のコントラストパターンを予め設置しておくことにより、高度な検出装置・判定ソフトウェアを用いることなく、簡便に菌の同定が可能になる。
【００９５】
（実施例４）
［文字や絵が表示される］
実施例３にて説明するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ用のプローブとＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ用のプローブとを、それぞれ図１６に示すように文字の形に配置する。
【００９６】
この図１６に示すＤＮＡチップに対して、実施例３と同様にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓからのハイブリダイゼーション用のＤＮＡ試料をそれぞれ個々に用いてハイブリダイゼーションを行なうことで、結果が図１７に示されるように文字で表示される。この文字を読み取ることで、簡便に菌の同定が可能になる。
【００９７】
２３０１はＤＮＡチップである。２３０２の領域には、表６の表の１８０３、１８０５、１８０９、１８１３のような、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓでもＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓからの試料でもハイブリッドを形成しうるプローブを、実施例１に示す方法で吐出してスポットした領域である。２３０３の領域は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに強いハイブリダイゼーション強度を持つプローブを吐出してスポットした領域である。２３０４はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓからの試料に対して強いハイブリダイゼーション強度を示すプローブを吐出してスポットした領域である。２３０２〜２３０４に示すそれぞれのスポット領域は、２３０５に示すように実施例１に示すようなＢＪプリンタによって吐出されたＤＮＡインクにより文字の形を示している。
【００９８】
実施例３と同様に、図１７の（ａ）は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの遺伝子配列とのハイブリダイゼーション結果を示している。この場合、第３行目の「ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ」を形成するプローブでのハイブリダイゼーション強度が低く、全体として「Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ」の文字が認識可能となる。図１７の（ｂ）はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの遺伝子配列とのハイブリダイゼーション結果を示している。この場合は、第２行目の「ａｕｒｅｕｓ」の文字を形成するプローブでのハイブリダイゼーション強度が低く、全体として「Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ」の文字が認識可能となる。図１７の（ｃ）ヒトゲノムとのハイブリダイゼーション結果を示している。この場合、全てのプローブでのハイブリダイゼーション強度が低く、菌種名をＤＮＡチップ上に認識することはできない。
【００９９】
実施例１に示すように、本発明においてはＢＪプリンタを用いたスポットを行なっているため、図１６に示す文字や、あるいは絵をプローブが溶解されたＤＮＡインクにより描画できる。これにより、簡便に菌の同定が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】ハイブリダイゼーションの模式図である。
【図２】ＤＮＡチップによる細菌同定方法の模式図である。
【図３】系統樹を示す図である。
【図４】ＤＮＡチップの模式図である。
【図５】Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの予測されるハイブリダイゼーション結果を示す図である。
【図６】Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの予測されるハイブリダイゼーション結果を示す図である。
【図７】Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの予測されるハイブリダイゼーション結果を示す図である。
【図８】Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの予測されるハイブリダイゼーション結果を示す図である。
【図９】Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅの予測されるハイブリダイゼーション結果を示す図である。
【図１０】Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの予測されるハイブリダイゼーション結果を示す図である。
【図１１】Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｍｉｎｉｓの予測されるハイブリダイゼーション結果を示す図である。
【図１２】ＤＮＡチップの模式図である。
【図１３】１６Ｓ  ｒＲＮＡとプローブを示す図である。
【図１４】ＤＮＡチップの模式図である。
【図１５】ハイブリダイゼーション結果を示すである。
【図１６】ＤＮＡチップの模式図である。
【図１７】ハイブリダイゼーション結果を示す図である。
【符号の説明】
【０１０１】
１０１．ＤＮＡチップ
１０２．プローブ
１０３．ターゲット
２０１．試料
２０２．ターゲット塩基配列
２０３．ＤＮＡチップ
２０４．菌Ａ用プローブ
２０５．菌Ｂ用プローブ
６０１．ＤＮＡチップ
６０２．Ａ菌用プローブ位置
６０３．Ｂ菌用プローブ位置
６０４．Ｃ菌用プローブ位置
６０５．Ｄ菌用プローブ位置
６０６．Ｅ菌用プローブ位置
６０７．Ｆ菌用プローブ位置
６０８．Ａ、Ｂ菌用プローブ位置
６０９．Ｃ、Ｄ、Ｅ菌用プローブ位置
６１０．Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ菌用プローブ位置
１７０１．ＤＮＡチップ
１７０２．Ａ用プローブ位置
１７０３．Ｂ用プローブ位置
１７０４．Ｃ用プローブ位置
１７０５．Ｄ用プローブ位置
１７０６．Ｅ用プローブ位置
１７０７．Ｆ用プローブ位置
１８０１．Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡ
１８０２．Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｓｕ用のプローブ
１８０３．Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｓｕ用のプローブ
１８０４．Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｓｕ用のプローブ
１８０５．Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｓｕ用のプローブ
１８０６．Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｓｕ用のプローブ
１８０７．Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡ
１８０８．Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ用のプローブ
１８０９．Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ用のプローブ
１８１０．Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ用のプローブ
１８１１．Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ用のプローブ
１８１２．Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ用のプローブ
２１０１．ＤＮＡチップ
２３０１．ＤＮＡチップ
２３０２．Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属に共通するプローブ
２３０３．Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに特異的なプローブ
２３０４．Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓに特異的なプローブ
２３０５．プローブのスポット位置
【図１】
2007333694.tif 000027
【図２】
2007333694.tif 000028
【図３】
2007333694.tif 000029
【図４】
2007333694.tif 000030
【図５】
2007333694.tif 000031
【図６】
2007333694.tif 000032
【図７】
2007333694.tif 000033
【図８】
2007333694.tif 000034
【図９】
2007333694.tif 000035
【図１０】
2007333694.tif 000036
【図１１】
2007333694.tif 000037
【図１２】
2007333694.tif 000038
【図１３】
2007333694.tif 000039
【図１４】
2007333694.tif 000040
【図１５】
2007333694.tif 000041
【図１６】
2007333694.tif 000042
【図１７】
2007333694.tif 000043
【配列表】
2007333694000001.app