(57)【要約】【課題】  スリーフィンガー様スキャフォールドを利用して所望の標的に結合しうる新規な蛋白質を同定するための蛋白質ライブラリを提供すること。【解決手段】  スリーフィンガー様スキャフォールドを有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリであって，３つのループ中の特定の領域のアミノ酸残基がランダム化されていることを特徴とする蛋白質ライブラリが開示される。また，この蛋白質ライブラリを標的と接触させ，標的と結合した蛋白質を選択し，そのアミノ酸配列を決定することにより，標的と結合しうる新規蛋白質を同定する方法も提供される。【選択図】図２
2007306866.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スリーフィンガー様スキャフォールドを有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリであって，以下の領域：
（ｉ）Ｃ１−ＣｙｓのＣ末端側２番目のアミノ酸からＣ２−ＣｙｓのＮ末端側７番目のアミノ酸までの領域；
（ｉｉ）Ｃ３−ＣｙｓのＣ末端側２番目のアミノ酸からＣ４−ＣｙｓのＮ末端側４番目のアミノ酸までの領域；および
（ｉｉｉ）Ｃ５−ＣｙｓのＣ末端側４番目のアミノ酸からＣ６−ＣｙｓのＮ末端側１番目のアミノ酸までの領域
のアミノ酸残基がランダム化されていることを特徴とする蛋白質ライブラリ。
【請求項２】
前記蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質が，それぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在している，請求項１記載の蛋白質ライブラリ。
【請求項３】
前記蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質が，ピューロマイシンを介してそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと結合している，請求項２記載の蛋白質ライブラリ。
【請求項４】
前記蛋白質ライブラリが，以下のアミノ酸配列：
LVCY(X)6PGTLETCPDDFTCV(X)10TQYCSHACAIP(X)7CCQTDKCNG（配列番号１）
（式中，Ｘは任意のアミノ酸残基である）
を有する複数の蛋白質の群を含む，請求項１−３のいずれかに記載の蛋白質ライブラリ。
【請求項５】
請求項１−４のいずれかに記載の蛋白質ライブラリをコードするポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項６】
標的と結合しうる蛋白質を同定する方法であって，
（ａ）スリーフィンガー様スキャフォールドを有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリであって，以下の領域：
（ｉ）Ｃ１−ＣｙｓのＣ末端側２番目のアミノ酸からＣ２−ＣｙｓのＮ末端側７番目のアミノ酸までの領域；
（ｉｉ）Ｃ３−ＣｙｓのＣ末端側２番目のアミノ酸からＣ４−ＣｙｓのＮ末端側４番目のアミノ酸までの領域；および
（ｉｉｉ）Ｃ５−ＣｙｓのＣ末端側４番目のアミノ酸からＣ６−ＣｙｓのＮ末端側１番目のアミノ酸までの領域
のアミノ酸残基がランダム化されている蛋白質ライブラリを用意し；
（ｂ）前記蛋白質ライブラリを前記標的と接触させ；
（ｃ）前記標的と結合した蛋白質を選択し；そして
（ｄ）前記選択された蛋白質のアミノ酸配列を決定する，
の各工程を含む方法。
【請求項７】
工程（ａ）の蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質が，それぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在しており，蛋白質のアミノ酸配列を決定する工程（ｄ）が，その蛋白質に結合しているポリヌクレオチドの塩基配列を決定することにより行われる，請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質が，ピューロマイシンを介してそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと結合している，請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記蛋白質ライブラリが，以下のアミノ酸配列：
LVCY(X)6PGTLETCPDDFTCV(X)10TQYCSHACAIP(X)7CCQTDKCNG（配列番号１）
（式中，Ｘは任意のアミノ酸残基である）
を有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリである，請求項６−８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
標的と結合しうる蛋白質を同定する方法であって，
（ａ）スリーフィンガー様スキャフォールドを有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリであって，以下の領域：
（ｉ）Ｃ１−ＣｙｓのＣ末端側２番目のアミノ酸からＣ２−ＣｙｓのＮ末端側７番目のアミノ酸までの領域；
（ｉｉ）Ｃ３−ＣｙｓのＣ末端側２番目のアミノ酸からＣ４−ＣｙｓのＮ末端側４番目のアミノ酸までの領域；および
（ｉｉｉ）Ｃ５−ＣｙｓのＣ末端側４番目のアミノ酸からＣ６−ＣｙｓのＮ末端側１番目のアミノ酸までの領域
のアミノ酸残基がランダム化されている蛋白質ライブラリを用意し，ここで前記蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質はそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在しており；
（ｂ）前記蛋白質ライブラリを前記標的と接触させ；
（ｃ）前記標的と結合した蛋白質を選択し；
（ｄ）前記選択された蛋白質をコードするポリヌクレオチドを増幅し，転写し，および翻訳することにより，第２の蛋白質ライブラリを製造し，ここで前記第２の蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質はそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在しており；
（ｅ）前記第２の蛋白質ライブラリを前記標的と接触させ；
（ｆ）前記標的と結合した蛋白質を選択し；
（ｇ）必要により工程（ｄ）−（ｆ）を繰り返し；そして
（ｈ）選択された蛋白質のアミノ酸配列を決定する，
の各工程を含む方法。
【請求項１１】
前記蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質が，ピューロマイシンを介してそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと結合している，請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記蛋白質ライブラリが，以下のアミノ酸配列：
LVCY(X)6PGTLETCPDDFTCV(X)10TQYCSHACAIP(X)7CCQTDKCNG（配列番号１）
（式中，Ｘは任意のアミノ酸残基である）
を有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリである，請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
標的と結合しうる蛋白質を同定する方法であって，
（ａ）スリーフィンガー様スキャフォールドを有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリであって，以下の領域：
（ｉ）Ｃ１−ＣｙｓのＣ末端側２番目のアミノ酸からＣ２−ＣｙｓのＮ末端側７番目のアミノ酸までの領域；
（ｉｉ）Ｃ３−ＣｙｓのＣ末端側２番目のアミノ酸からＣ４−ＣｙｓのＮ末端側４番目のアミノ酸までの領域；および
（ｉｉｉ）Ｃ５−ＣｙｓのＣ末端側４番目のアミノ酸からＣ６−ＣｙｓのＮ末端側１番目のアミノ酸までの領域
のアミノ酸残基がランダム化されている蛋白質ライブラリを用意し，ここで前記蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質はそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在しており；
（ｂ）前記蛋白質ライブラリを前記標的と接触させ；
（ｃ）前記標的と結合した蛋白質を選択し；
（ｄ）前記選択された蛋白質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を決定し；
（ｅ）決定された塩基配列に基づいて，一部の配列が前記決定された塩基配列と同じであり残りの配列が前記決定された塩基配列と異なる塩基配列を有する複数のポリヌクレオチドの群を調製し，転写し，および翻訳することにより，第２の蛋白質ライブラリを製造し，ここで前記第２の蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質はそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在しており；
（ｆ）前記第２の蛋白質ライブラリを前記標的と接触させ；
（ｇ）前記標的と結合した蛋白質を選択し；
（ｈ）必要により工程（ｄ）−（ｇ）を繰り返し；そして
（ｉ）選択された蛋白質のアミノ酸配列を決定する，
の各工程を含む方法。
【請求項１４】
前記蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質が，ピューロマイシンを介してそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと結合している，請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記蛋白質ライブラリが，以下のアミノ酸配列：
LVCY(X)6PGTLETCPDDFTCV(X)10TQYCSHACAIP(X)7CCQTDKCNG（配列番号１）
（式中，Ｘは任意のアミノ酸残基である）
を有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリである，請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
以下のアミノ酸配列：
LVCY(X)6PGTLETCPDDFTCVATRHTLGHNLTQYCSHACAIP(X)7CCQTDKCNG（配列番号２）
（式中，Ｘは任意のアミノ酸残基である）
を有する蛋白質。
【請求項１７】
以下のいずれかのアミノ酸配列：
LVCYQLLACRPGTLETCPDDFTCVATRHTLGHNLTQYCSHACAIPACETPASCCQTDKCNG（配列番号３）；
LVCYQLLACRPGTLETCPDDFTCVATRHTLGHNLTQYCSHACAIPTPRARTGCCQTDKCNG（配列番号４）；または
LVCYAPLPYTPGTLETCPDDFTCVATRHTLGHNLTQYCSHACAIPACETPASCCQTDKCNG（配列番号５）
を有する請求項１６記載の蛋白質。
【請求項１８】
以下のアミノ酸配列：
LVCY(X)6PGTLETCPDDFTCVATRHTLGHNLTQYCSHACAIP(X)7CCQTDKCNG（配列番号２）
（式中，Ｘは任意のアミノ酸残基である）
を有する蛋白質を有効成分として含む，ＩＬ−６とＩＬ−６レセプターとの結合の阻害剤。
【請求項１９】
蛋白質が以下のいずれかのアミノ酸配列：
LVCYQLLACRPGTLETCPDDFTCVATRHTLGHNLTQYCSHACAIPACETPASCCQTDKCNG（配列番号３）；
LVCYQLLACRPGTLETCPDDFTCVATRHTLGHNLTQYCSHACAIPTPRARTGCCQTDKCNG（配列番号４）；または
LVCYAPLPYTPGTLETCPDDFTCVATRHTLGHNLTQYCSHACAIPACETPASCCQTDKCNG（配列番号５）
を有する請求項１８記載の阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，蛋白質ライブラリおよびこれを用いて新規な蛋白質を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
α型神経毒（α-neurotoxin）は，ｅｌａｐｉｄａｅ科をはじめとするヘビ毒に多く見いだされる蛋白質群であり，そのうちのいくつかは共通するスリーフィンガー様スキャフォールドを含む。このタイプの神経毒は，通常は６０−７０アミノ酸（ＭＷ：７−８ｋＤａ）を含む小さい蛋白質であり，４−５個のジスルフィド結合，３〜５個のアンチパラレルβシート，およびスリーフィンガー構造を形成する３つの突起ループを含む（Endo T, Tamiya N. (1987), Pharmacol Ther., 34, 403-451）。スリーフィンガー様スキャフォールドの分子は，温度に対して高い安定性を有し，６０−７０℃に耐えられる（Sivaraman T, Kumar TK, Hung KW, Yu C. Comparison of the structural stability of two homologous toxinsisolated from the Taiwan cobra (Naja naja atra) venom. Biochemistry. 2000 Aug 1;39(30):8705-10.）。ジスルフィド・フレームワークの形は，βシートを形成するアミノ酸残基の種類が異なっていても，これらの分子の間で高度に保存されている。天然のレセプターへの結合事象に関与するアミノ酸もまた非常に高い頻度で保存されている（Antil, S., Servent, D. and Menez, A. (1999). J. Biol. Chem., 274, 34851-34858; Teixeira-Clerc F, Menez A, Kessler P. (2002)  J. Biol. Chem., 277, 25741-25747）。神経毒はそれぞれのレセプターに対して非常に高い特異性を有しており，この特性はループの先端の残基により付与される。天然のレセプターとの相互作用にはループＩ，ループＩＩおよびテール領域が関与することが知られており，例えば，ヘビ神経毒の１つであるα-cobratoxin (Naja kaouthia 由来）では，Ｉ５−Ｄ８，Ｋ２３，Ｗ２５，Ｄ２７，Ａ２８，Ｆ２９，Ｒ３３，Ｒ３６，Ｋ４７およびＦ６５などの残基に点突然変異を導入することにより標的との結合特性が変化することが報告されており，これらの残基が相互作用に関与していることが示唆されている。一方，結晶学および変異実験を用いた最近の研究によれば，ループＩＩＩは標的との結合には関与していないようである（Antil, S., Servent, D. and Menez, A. (1999), J. Biol. Chem., 274, 34851-34858; Bourne Y, Talley TT, Hansen SB, Taylor P, Marchot P. (2005), EMBO J., 24, 1512-1522）。
【０００３】
蛋白質スキャフォールドを利用して蛋白質のコンビナトリアルライブラリを作製し，抗体に代わる新規な蛋白質を発見する試みが行われている（Nygren, P-A and Skerra, A. (2004), J. Immunol. Methods., 290, 3-28）。この方法においては，蛋白質のフレームワーク領域の構造を維持しながら，相互作用に関与する領域（例えばループ領域）のアミノ酸配列がランダムであるように設計された蛋白質ライブラリを作製し，所望の標的と接触させて，その標的に結合しうる蛋白質を選択し，その構造を決定することにより，所望の標的に結合しうる新規な蛋白質を同定することができる。
【０００４】
スリーフィンガー様スキャフォールドは，比較的サイズが小さく，安定性が高いため，このような蛋白質ライブラリを作製するのに適していると考えられる。これまでに複数の研究グループが，ループＩまたはループＩＩ，あるいはこれらの両方に部位特異的な突然変異を導入することにより結合特性に関わるアミノ酸残基を解析する試みは行われてきた。しかしながら，スリーフィンガーの親和性を向上させたり，認識特異性を変える試みはなされてきていない。
【０００５】
したがって，スリーフィンガー様スキャフォールドを利用して親和性を上げたり，認識特異性を変える方法が求められている。
【０００６】
【非特許文献１】Endo T, Tamiya N. (1987), Pharmacol Ther., 34, 403-451
【非特許文献２】Antil, S., Servent, D. and Menez, A. (1999). J. Biol. Chem., 274, 34851-34858
【非特許文献３】Teixeira-Clerc F, Menez A, Kessler P. (2002)  J. Biol. Chem., 277, 25741-25747
【非特許文献４】Bourne Y, Talley TT, Hansen SB, Taylor P, Marchot P. (2005), EMBO J., 24, 1512-1522
【非特許文献５】Nygren, P-A and Skerra, A. (2004), J. Immunol. Methods., 290, 3-28
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は，スリーフィンガー様スキャフォールドを利用して所望の標的に結合しうる新規な蛋白質を同定するための蛋白質ライブラリを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは，スリーフィンガー様スキャフォールドを有する蛋白質のアミノ酸配列の一部を改変して，天然のパートナーとは異なる標的と結合する蛋白質を作製するためには，βシートを形成すると予測される部分の一部のアミノ酸配列も含むループＩ，ループＩＩおよびループＩＩＩのアミノ酸配列をすべてを同時に変更する必要があることを見いだした。
【０００９】
本発明は，スリーフィンガー様スキャフォールドを有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリであって，以下の領域：
（ｉ）Ｃ１−ＣｙｓのＣ末端側２番目のアミノ酸からＣ２−ＣｙｓのＮ末端側７番目のアミノ酸までの領域；
（ｉｉ）Ｃ３−ＣｙｓのＣ末端側２番目のアミノ酸からＣ４−ＣｙｓのＮ末端側４番目のアミノ酸までの領域；および
（ｉｉｉ）Ｃ５−ＣｙｓのＣ末端側４番目のアミノ酸からＣ６−ＣｙｓのＮ末端側１番目のアミノ酸までの領域
のアミノ酸残基がランダム化されていることを特徴とする蛋白質ライブラリを提供する。
【００１０】
スリーフィンガー様スキャフォールドとは，α型神経毒に見いだされる，４（場合により５個）のジスルフィド結合，３〜５個のアンチパラレルβシート，およびスリーフィンガー構造を形成する３つの突起ループを含む構造をいう。図１５に，スリーフィンガー様スキャフォールドを有する代表的な蛋白質のアミノ酸配列のアライメントを示す。図の左端の数字はアミノ酸の長さである。このアライメントに示されるそれぞれの蛋白質の名称と起源生物を以下の表に示す。
【００１１】
【表１】
2007306866.tif 000003
【００１２】
本明細書においては，スリーフィンガー様スキャフォールドのアミノ酸配列において，ジスルフィド結合を形成する保存システインを，Ｎ末端側から順番にそれぞれＣ１〜Ｃ８と称する。また，Ｃ１とＣ２の間，Ｃ３とＣ４の間，およびＣ５とＣ６の間の領域を，それぞれループＩ，ループＩＩ，およびループＩＩＩと称する。例えば，図１５の第１列に示される蛋白質ＣＴｘ３のアミノ酸配列においては，Ｃ１−ＣｙｓはＮ末端側から３番目のシステインを，Ｃ２−ＣｙｓはＮ末端側から１７番目のシステインを示し，この間の領域，すなわちＮ末端側から４番目−１６番目のアミノ酸の領域はループＩと称される。
【００１３】
本発明においては，ループＩ，ループＩＩおよびループＩＩＩの特定の領域をランダム化することにより，スリーフィンガー様スキャフォールドのフレームワークを保ったまま，標的との結合特性の異なる種々の蛋白質からなるライブラリが得られることが見いだされた。すなわち，以下の領域：
（ｉ）Ｃ１−ＣｙｓのＣ末端側２番目のアミノ酸からＣ２−ＣｙｓのＮ末端側７番目のアミノ酸までの領域；
（ｉｉ）Ｃ３−ＣｙｓのＣ末端側２番目のアミノ酸からＣ４−ＣｙｓのＮ末端側４番目のアミノ酸までの領域；および
（ｉｉｉ）Ｃ５−ＣｙｓのＣ末端側４番目のアミノ酸からＣ６−ＣｙｓのＮ末端側１番目のアミノ酸までの領域
をランダム化することができる。ここで，Ｃ１−ＣｙｓのＣ末端側２番目のアミノ酸からＣ２−ＣｙｓのＮ末端側７番目のアミノ酸までの領域とは，例えば，図１５の第１列に示される蛋白質ＣＴｘ３のアミノ酸配列において，５番目のトレオニンから１０番目のプロリンまでの領域をいう。同様に，Ｃ３−ＣｙｓのＣ末端側２番目のアミノ酸からＣ４−ＣｙｓのＮ末端側４番目のアミノ酸までの領域とは，ＣＴｘ３のアミノ酸配列において，２５番目のリジンから３４番目のバリンまでの領域をいい，Ｃ５−ＣｙｓのＣ末端側４番目のアミノ酸からＣ６−ＣｙｓのＮ末端側１番目のアミノ酸までの領域とは，ＣＴｘ３のアミノ酸配列において，４６番目のアラニンから５３番目のヒスチジンまでの領域をいう。
【００１４】
好ましくは，本発明の蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質は，それぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在している。特に好ましくは，本発明の蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質は，ピューロマイシンを介してそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと結合している。
【００１５】
本明細書において，「対応づけられた形で存在する」とは，蛋白質とそれをコードするポリヌクレオチドとが，これらを１対１で対応づけることが可能な様式で存在することを意味する。このような対応付け技術はディスプレイ技術とも称され，多くの技術が当該技術分野において知られている。例えば，ライブラリの各メンバー蛋白質は，ピューロマイシン等の化学物質を介してそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと結合していてもよい（インビトロウイルス法）。このような無細胞翻訳系を利用した対応付け技術には，リボソームディスプレイ，ＳＴＡＢＬＥ（非共有結合ＤＮＡディスプレイ），マイクロビーズドロップレット法，共有結合ＤＮＡディスプレイなどがある。あるいは，ファージディスプレイ，イーストディスプレイ，バクテリアディスプレイ等のディスプレイ技術におけるように，個々のファージや細胞中に，ライブラリの各メンバー蛋白質とそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドの対が含まれていてもよい。
【００１６】
特に好ましくは，本発明の蛋白質ライブラリは，以下のアミノ酸配列：
LVCY(X)6PGTLETCPDDFTCV(X)10TQYCSHACAIP(X)7CCQTDKCNG（配列番号１）
（式中，Ｘは任意のアミノ酸残基である）
を有する複数の蛋白質の群を含む。
【００１７】
別の観点においては，本発明は，上述の本発明の蛋白質ライブラリをコードするポリヌクレオチドライブラリを提供する。
【００１８】
別の観点においては，本発明は，以下の各工程を含む，標的と結合しうる蛋白質を同定する方法を提供する：
（ａ）スリーフィンガー様スキャフォールドを有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリであって，以下の領域：
（ｉ）Ｃ１−ＣｙｓのＣ末端側２番目のアミノ酸からＣ２−ＣｙｓのＮ末端側７番目のアミノ酸までの領域；
（ｉｉ）Ｃ３−ＣｙｓのＣ末端側２番目のアミノ酸からＣ４−ＣｙｓのＮ末端側４番目のアミノ酸までの領域；および
（ｉｉｉ）Ｃ５−ＣｙｓのＣ末端側４番目のアミノ酸からＣ６−ＣｙｓのＮ末端側１番目のアミノ酸までの領域
のアミノ酸残基がランダム化されている蛋白質ライブラリを用意し；
（ｂ）前記蛋白質ライブラリを前記標的と接触させ；
（ｃ）前記標的と結合した蛋白質を選択し；そして
（ｄ）前記選択された蛋白質のアミノ酸配列を決定する。
【００１９】
好ましい態様においては，上述の工程（ａ）の蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質は，それぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在しており，蛋白質のアミノ酸配列を決定する工程（ｄ）は，その蛋白質に結合しているポリヌクレオチドの塩基配列を決定することにより行われる。
【００２０】
また別の観点においては，本発明は，以下の各工程を含む，標的と結合しうる蛋白質を同定する方法を提供する：
（ａ）スリーフィンガー様スキャフォールドを有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリであって，以下の領域：
（ｉ）Ｃ１−ＣｙｓのＣ末端側２番目のアミノ酸からＣ２−ＣｙｓのＮ末端側７番目のアミノ酸までの領域；
（ｉｉ）Ｃ３−ＣｙｓのＣ末端側２番目のアミノ酸からＣ４−ＣｙｓのＮ末端側４番目のアミノ酸までの領域；および
（ｉｉｉ）Ｃ５−ＣｙｓのＣ末端側４番目のアミノ酸からＣ６−ＣｙｓのＮ末端側１番目のアミノ酸までの領域
のアミノ酸残基がランダム化されている蛋白質ライブラリを用意し，ここで前記蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質はそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在しており；
（ｂ）前記蛋白質ライブラリを前記標的と接触させ；
（ｃ）前記標的と結合した蛋白質を選択し；
（ｄ）前記選択された蛋白質をコードするポリヌクレオチドを増幅し，転写し，および翻訳することにより，第２の蛋白質ライブラリを製造し，ここで前記第２の蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質はそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在しており；
（ｅ）前記第２の蛋白質ライブラリを前記標的と接触させ；
（ｆ）前記標的と結合した蛋白質を選択し；
（ｇ）必要により工程（ｄ）−（ｆ）を繰り返し；そして
（ｈ）選択された蛋白質のアミノ酸配列を決定する。
【００２１】
さらに別の観点においては，本発明は，以下の各工程を含む，標的と結合しうる蛋白質を同定する方法を提供する：
（ａ）スリーフィンガー様スキャフォールドを有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリであって，以下の領域：
（ｉ）Ｃ１−ＣｙｓのＣ末端側２番目のアミノ酸からＣ２−ＣｙｓのＮ末端側７番目のアミノ酸までの領域；
（ｉｉ）Ｃ３−ＣｙｓのＣ末端側２番目のアミノ酸からＣ４−ＣｙｓのＮ末端側４番目のアミノ酸までの領域；および
（ｉｉｉ）Ｃ５−ＣｙｓのＣ末端側４番目のアミノ酸からＣ６−ＣｙｓのＮ末端側１番目のアミノ酸までの領域
のアミノ酸残基がランダム化されている蛋白質ライブラリを用意し，ここで前記蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質はそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在しており；
（ｂ）前記蛋白質ライブラリを前記標的と接触させ；
（ｃ）前記標的と結合した蛋白質を選択し；
（ｄ）前記選択された蛋白質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を決定し；
（ｅ）決定された塩基配列に基づい，一部の配列が前記決定された塩基配列と同じであり残りの配列が前記決定された塩基配列と異なる塩基配列を有する複数のポリヌクレオチドの群を調製し，転写し，および翻訳することにより，第２の蛋白質ライブラリを製造し，ここで前記第２の蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質はそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在しており；
（ｆ）前記第２の蛋白質ライブラリを前記標的と接触させ；
（ｇ）前記標的と結合した蛋白質を選択し；
（ｈ）必要により工程（ｄ）−（ｇ）を繰り返し；そして
（ｉ）選択された蛋白質のアミノ酸配列を決定する。
【００２２】
別の観点においては，本発明は，以下のアミノ酸配列：
LVCY(X)6PGTLETCPDDFTCVATRHTLGHNLTQYCSHACAIP(X)7CCQTDKCNG（配列番号２）
（式中，Ｘは任意のアミノ酸残基である）
を有する蛋白質，ならびにこの蛋白質を有効成分として含む，ＩＬ−６とＩＬ−６レセプターとの結合の阻害剤を提供する。好ましくは，本発明の蛋白質は，以下のいずれかのアミノ酸配列：
LVCYQLLACRPGTLETCPDDFTCVATRHTLGHNLTQYCSHACAIPACETPASCCQTDKCNG（配列番号３）；
LVCYQLLACRPGTLETCPDDFTCVATRHTLGHNLTQYCSHACAIPTPRARTGCCQTDKCNG（配列番号４）；または
LVCYAPLPYTPGTLETCPDDFTCVATRHTLGHNLTQYCSHACAIPACETPASCCQTDKCNG（配列番号５）
を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の蛋白質ライブラリにおいては，スリーフィンガー様スキャフォールドのループＩ，ＩＩおよびＩＩＩの領域の一部のアミノ酸配列がランダム化されており，このライブラリから，天然の標的，例えば，ｎＡＣｈＲやＡＣｈＢＰとは異なる任意の標的と結合する蛋白質を選択することができる。本明細書において，蛋白質ライブラリとは，アミノ酸配列の異なる複数の蛋白質の集合を意味する。また，本明細書においては，蛋白質ライブラリのそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドの集合をポリヌクレオチドライブラリと称する。ランダム化とは，蛋白質の任意の所与の位置に２種類以上のアミノ酸残基が存在するような蛋白質の集合を用意することをいう。ランダム化された蛋白質においては，所与の位置に全ての可能なアミノ酸残基が同様の確率でまたは異なる確率で存在してもよく，所与の位置に選択された特定の２種類以上のアミノ酸残基が存在してもよい。例えば，配列中の特定の位置において２０種類のアミノ酸残基が各５％の確率で存在することができるが，各アミノ酸残基の存在の確率は５％に限定されず，様々でありうる。また，後述する子孫ライブラリの場合に見られるように，前回のラウンドで得られた配列情報に基づいてアミノ酸配列の特定の位置のみをランダム化し，残りの位置の配列が固定されているようにライブラリを作製してもよい。標的とは，本発明の方法により選択される蛋白質が結合しうる任意の物質であり，例えば，蛋白質，糖類，糖蛋白質，核酸，低分子化合物などが含まれる。例としては，レセプター，細胞表面抗原，抗体，ホルモン，ＤＮＡ，ＲＮＡ，ウイルス表面抗原等が挙げられる。蛋白質と標的との結合は，共有結合，疎水性結合，静電的結合，水素結合，ファンデルワールス結合のいずれでもよい。
【００２４】
本発明の蛋白質ライブラリの１つの好ましい態様は，Micrurus corallinusから単離された新規なヘビ神経毒であるＣＴｘ３（Kubo, T., et al., (2002), Program No. 137.16., 32nd Annual Meeting of Society for Neuroscience, Washington, DC, 3rd November, 2002）に基づく蛋白質ライブラリである。ＣＴｘ３は，６１アミノ酸を含むスリーフィンガー型の毒素であり，ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）やアセチルコリン結合蛋白質（ＡＣｈＢＰ）（神経毒の天然の標的）に結合してこれらを阻害することが見いだされている。図１Ａに，ＣＴｘ３と，既知のヘビ神経毒であるα−ブンガロトキシン（α−Ｂｇｔｘ）およびコブラトキシン（Ｃｂｔｘ）の一次アミノ酸配列のマルチプルアラインメントを示す。相同な配列はブロックで示されている。ＢＩＡＣＯＲＥ Ｊ装置（Ｂｉａｃｏｒｅ）により測定して，ＣＴｘ３とＡＣｈＢＰとの解離定数（Ｋｄ）は２９．５±７．９ｎＭである。
【００２５】
本発明者らは，Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ６．０（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）のＰｒｏｔｅａｎソフトウエア部品を用いてＣＴｘ３の二構造を予測し，既知のα−ブンガロトキシン（α−Ｂｇｔｘ）の構造と比較して，ループおよびβシートの形成に関与する残基を推定した（図１Ｂ）。図１Ｃは，予測二次構造の情報から得られる，βシートおよびループの概略図を示す。数字はループを形成するターンの開始および停止位置を示し，１番目のアミノ酸を１として表す。
【００２６】
次に，このような構造の情報に基づいて，各ループ部分をランダム化して，天然の標的とは異なる蛋白質に対して結合しうる蛋白質を取得しようと試みた結果，ループ部分のアミノ酸配列のみならずその周辺のアミノ酸配列も変更する必要があること，ならびに，３つのループのアミノ酸配列をすべてを同時に変更する必要があることがわかった。本発明の蛋白質ライブラリは，図２に示すように，ＣＴｘ３のＴ５−Ｐ１０（６アミノ酸）（以下ループＩと称する），Ｋ２５−Ｖ３４（１０アミノ酸）（以下ループＩＩと称する）およびＡ４６−Ｈ５２（７アミノ酸）（以下ループＩＩＩと称する）がランダム化されている。それ以外の位置のアミノ酸配列は固定されており，この部分がスリーフィンガー様スキャフォールドのフレームワークを決定する。すなわち，本発明のＣＴｘ３に基づく蛋白質ライブラリのアミノ酸配列は以下のように表すことができる：
LVCY(X)6PGTLETCPDDFTCV(X)10TQYCSHACAIP(X)7CCQTDKCNG（配列番号１）
（式中，Ｘは任意のアミノ酸残基である）。
【００２７】
さらに当業者は，図１５に示されるアライメントを参照することにより，スリーフィンガー様スキャフォールドを有する他の蛋白質についても，ＣＴｘ３に基づく蛋白質ライブラリ同様にして蛋白質ライブラリを製造し，使用することができる。
【００２８】
本発明の蛋白質ライブラリは，通常のペプチド合成の技術を用いて，手動または自動により製造することができる。あるいは，蛋白質ライブラリの各メンバー蛋白質をコードするポリヌクレオチドのライブラリを製造し，無細胞系で，または細菌や動物細胞中で蛋白質を発現させることにより製造してもよい。すなわち，本発明は，上述の本発明の蛋白質ライブラリをコードするポリヌクレオチドライブラリを提供する。このようなポリヌクレオチドライブラリの製造方法および発現（転写および翻訳）方法は，当該技術分野においてよく知られている。
【００２９】
本発明の蛋白質ライブラリは，標的と結合しうる蛋白質を同定する目的のために，インビトロまたはインビボで種々の方法において，例えば，無細胞翻訳系やファージディスプレイ技術を用いる方法において用いることができる。
【００３０】
別の観点においては，本発明は，本発明の蛋白質ライブラリを用いて標的と結合しうる蛋白質を同定する方法を提供する。この方法においては，まず本発明の蛋白質ライブラリを標的と接触させる。蛋白質ライブラリと標的との接触は，適当な緩衝液中に蛋白質ライブラリと標的とを加えて所定の時間インキュベートすることにより行うことができる。接触の条件は，標的との親和性の高い蛋白質が標的と結合したまま残り，親和性の低い蛋白質が結合しないように設定することができる。また，標的の特性，本発明にしたがって選択されるべき蛋白質の用途，予測される非特異的結合の程度などを考慮することができる。さらに，下記に詳細に説明するように，複数のラウンドの選択を行う場合にはラウンドごとに接触の条件を変更してもよい。次に，蛋白質ライブラリのうち，標的と結合していない蛋白質を除去し，標的と結合した蛋白質を選択する。この選択工程を容易にするためには，蛋白質ライブラリおよび標的のいずれかを固相に固定化しておくことが便利である。固相としては，ガラスまたはプラスチックのプレート，ビーズ，多孔性粒子，膜，磁気粒子などの，当該技術分野において知られる任意のものを用いることができる。このようにして選択された蛋白質を回収して，そのアミノ酸配列を決定することにより，標的と結合する蛋白質を同定することができる。
【００３１】
あるいは，蛋白質ライブラリをマイクロアレイのフォーマットで，各コンパートメントにどのような配列の蛋白質が存在するかがわかるように製造して，標的と接触させてもよい。マイクロアレイに標識した標的を加えてインキュベートした後，未結合蛋白質を洗い流し，マイクロアレイ上に残存する標識を検出する。標的が結合しているコンパートメントの位置から，標的と結合しうる蛋白質の配列を知ることができる。
【００３２】
本発明の１つの好ましい態様においては，本発明の蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質が，それぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在するように，蛋白質ライブラリを製造する。このような蛋白質−ポリヌクレオチドライブラリを用いると，ポリヌクレオチドの塩基配列を決定することにより，標的と結合した蛋白質のアミノ酸配列の決定を容易に行うことができる。
【００３３】
さらに，ポリヌクレオチドと対応づけられた形の蛋白質ライブラリを用いると，標的に結合した蛋白質の群を選択した後，この蛋白質をコードするポリヌクレオチドの群を回収して，これを増幅し，転写し，および翻訳することにより，第２の蛋白質ライブラリを製造することができる。この第２の蛋白質ライブラリは，個々の蛋白質は元の蛋白質ライブラリと同じランダム化領域およびフレームワーク領域を有するが，ライブラリ全体として標的との親和性が増加しており，ランダム化領域の配列の多様性が減少しているはずである。本明細書においてはこの多様性の減少を「濃縮」と称する。次に，この第２の蛋白質ライブラリを用いて，最初の工程と同様に標的と結合する蛋白質を選択し，この蛋白質をコードするポリヌクレオチドから第３の蛋白質ライブラリを製造する。このようにして，多数ラウンドの選択およびライブラリの生成を行うことにより，標的との親和性がより高い蛋白質の集合を得ることができる。
【００３４】
さらに別の態様においては，上述のように第２の蛋白質ライブラリを製造する際に，分子進化の手法を適用することができる。すなわち，標的に結合するとして選択された蛋白質の配列を決定した後，その配列の一部をさらにランダム化したいわゆる子孫ライブラリを作製する。配列の一部のランダム化とは，例えば，選択された蛋白質のランダム化領域のアミノ酸配列に１個あるいは複数の変異を導入し，残りのアミノ酸配列は固定化したアミノ酸配列を設計する，ある領域（例えばループＩ）のアミノ酸配列は固定して別の領域（例えばループＩＩ）のアミノ酸配列に１個あるいは複数の変異を導入したアミノ酸配列を設計する，選択された複数の蛋白質のランダム化領域に現れたアミノ酸残基をシャッフリングしてこれらを混成させた新たなアミノ酸配列を設計する，などの方法により行うことができる。このようにして，一部のアミノ酸配列が前ラウンドで選択された蛋白質のアミノ酸配列と同じであり残りのアミノ酸が異なる複数の蛋白質の群からなる第２の蛋白質ライブラリを製造することができる。次に，この第２の蛋白質ライブラリを用いて標的と結合する蛋白質を選択し，以下同様にして，複数のラウンドの選択およびライブラリのさらなるランダム化を行うことができる。このようにして，標的に結合しうる蛋白質にさらに変異を導入して人工的な分子進化を促進することが可能となる。
【００３５】
ポリヌクレオチドと結合した蛋白質から構成される蛋白質ライブラリの好適な１つの例は，ピューロマイシンを利用したインビトロウイルス（ＩＶＶ）である。本明細書においてインビトロウイルス（ＩＶＶ）とは，蛋白質とこれをコードするポリヌクレオチドがピューロマイシンを介して結合している複合体をいい，ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−蛋白質，ＤＮＡ／ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−蛋白質，およびＤＮＡ−ピューロマイシン−蛋白質が含まれる。ピューロマイシンは，アミノアシル−ｔＲＮＡの３’末端と類似する構造を有する蛋白質合成阻害剤であり，所定の条件下ではリボソーム上の伸張中の蛋白質の３’末端に特異的に結合する性質を有する。適当なリンカーを介してｍＲＮＡとピューロマイシンとを結合させておき，無細胞翻訳系でｍＲＮＡから蛋白質を合成すると，合成された蛋白質とこれをコードするｍＲＮＡとがピューロマイシンを介して結合している複合体が生ずる（Nemoto et al, FEBS Lett., 414, 405-408, 1997）。次に，この複合体のライブラリから所望の機能をもつ蛋白質を選択する。ｍＲＮＡと蛋白質の複合体を用いて選択した後に逆転写によりＤＮＡを合成してもよく，あるいはｍＲＮＡから逆転写によりＤＮＡを合成して，ＤＮＡ／ｍＲＮＡハイブリッドと蛋白質の複合体の形とした後に，蛋白質を選択してもよい。所望の機能をもつ蛋白質を選択した後，ＤＮＡの配列を分析することにより，蛋白質を同定することができる。ピューロマイシンとしては，伸張中の蛋白質の３’末端に特異的に結合する機能を有する限り，任意のピューロマイシン誘導体を用いることができる。ピューロマイシンの安定性を高めるための修飾，複合体の検出のための標識，精製を容易にするためのアフィニティー部位，他の分子への結合を容易にするためのリンカー部位などを含むよう設計された種々の誘導体が市販されているか，または容易に製造することができる。
【００３６】
以下に，実施例で作成し使用したＣＴｘ３に基づくライブラリを例として，本発明のスリーフィンガー−インビトロウイルス（３Ｆ−ＩＶＶ）ライブラリの構造および作製方法，ならびにこれを用いた標的結合蛋白質の同定方法を説明する。ＣＴｘ３は単なる例示のためにのみ用いられ，本発明の範囲はこの特定の蛋白質に基づくライブラリに限定されるものではない。
【００３７】
本発明の蛋白質ライブラリは，ＣＴｘ３のスリーフィンガー様スキャフォールドに基づいて，アセチルコリンレセプターへの結合に関与すると推定されているアミノ酸を含む３つのループ領域がランダム化されている構造を有する。図２に示されるように，ループを形成していると予測される領域およびその周辺のアミノ酸残基をランダム化した。ベータシートを形成しているアミノ酸は変更していない。
【００３８】
ＣＴｘ３遺伝子を含む３Ｆ−ＩＶＶライブラリ用の全長コンストラクトは，ループ部分のアミノ酸配列をランダム化したＣＴｘ３遺伝子の５’側にＳＰ６プロモーター，キャップ部位，Ｘｅｎｏｐｕｓグロブリン非翻訳配列（ＵＴＲ）および翻訳開始部位を含むＳＰ６−ＵＴＲフラグメントを付加し，３’側にスペーサー（ＧＧＧＳ）２，Ｃ−末端Ｈｉｓ６−タグ，スペーサー（ＧＧＧＳ）およびＹ−タグ配列を付加するよう設計した（図３）。ＳＰ６−ＵＴＲはＣＴ３ｘ遺伝子のインビトロ転写および翻訳に，Ｈｉｓ６−タグ配列はライブラリの精製に，Ｙ−タグ配列はｍＲＮＡとピューロマイシンリンカーへのライゲーションに用いるための配列である。スペーサーは，合成したタンパク質のフォールディングをスムーズにするために導入した。得られた全長コンストラクトを直接配列決定してループ領域のランダム化の程度を評価したところ，図５に示されるように，ループ領域がランダム化されていることが確認された。
【００３９】
ＩＶＶは，リボソーム上の伸張中のペプチドと，これをコードするｍＲＮＡとがピューロマイシンを介して結合している複合体である。下記の実施例においてＩＶＶを形成するために用いたピューロマイシン・ビオチン・リンカーの構造を図６に示す。
【００４０】
ピューロマイシン・ビオチン・リンカーは，Ｐｕｒｏ−Ｆ−Ｓとビオチン・ループとの２つの修飾オリゴヌクレオチドを二官能性試薬（ＥＭＣＳ）を用いて架橋させることにより合成する。Ｐｕｒｏ−Ｆ−Ｓは，スペーサーの一方の端にピューロマイシンが結合しており，他方の端にチオール基を有しており，フルオレセインで標識されている。
【００４１】
ビオチン・ループは，ステムループ構造をとることができる塩基配列を有し，ループ部分にビオチンが結合している。ステム部分は制限酵素ＰｖｕＩＩの認識部位を形成する。ビオチンはＩＶＶの精製のために用いることができ，制限酵素部位におけるＤＮＡの切断によりＩＶＶを回収することができる。ビオチン・ループのステムから３’側の配列は，上述のＣＴｘ３全長コンストラクト中のＹ−タグ配列と対応しており，ＣＴｘ３コンストラクトから生成したｍＲＮＡの３’側の配列とアニーリングすることができる。ｍＲＮＡとのライゲーションはビオチン・ループの５’末端で生ずる。ビオチン・ループの３’末端近傍のｄＴは１級アミノ基を有するよう誘導化されており，このアミノ基を介して二官能性試薬によりＰｕｒｏ−Ｆ−Ｓと結合させる。さらに，ビオチン・ループの３’末端は，ライゲーションしたｍＲＮＡからの逆転写を行う際のプライマーとして機能する。
【００４２】
Ｐｕｒｏ−Ｆ−Ｓのチオール基を還元し，ビオチン・ループとＥＭＣＳとのコンジュゲートを加え，Ｐｕｒｏ−Ｆ−Ｓの末端チオール基とビオチン・ループ上のアミノ基とを結合させて，ピューロマイシン・ビオチン・リンカーを得る。
【００４３】
ランダム化ＣＴｘ３遺伝子の全長コンストラクトからＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼによりｍＲＮＡを生成する。次に，ｍＲＮＡのＹタグ配列をピューロマイシン・ビオチン・リンカーにアニーリングさせ，ライゲーション部位でＴ４  ＲＮＡリガーゼによりライゲーションさせて，ｍＲＮＡとピューロマイシン・ビオチン・リンカーとを結合させる。
【００４４】
次に，ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・ビオチン・リンカーを無細胞翻訳系で翻訳させて蛋白質を生成し，ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・ビオチン・リンカー−蛋白質の複合体を形成させる。この複合体をビオチンを介してストレプトアビジンと結合させた後，逆転写酵素反応によりＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを形成し，得られたＤＮＡ／ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・ビオチン・リンカー−蛋白質を制限酵素ＰｖｕＩＩで消化することにより，ストレプトアビジンから切り離す。得られたＤＮＡ／ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−蛋白質を，Ｃ−末端Ｈｉｓ６−タグを利用してＮｉ−ＮＴＡ磁気ビーズにより精製する。以上のようにして，本発明の３Ｆ−ＩＶＶライブラリを形成することができる。
【００４５】
本発明において製造したＣＴｘ３に基づくスリーフィンガー様スキャフォールドの蛋白質ライブラリの有用性を確認するために，インターロイキン６レセプターに特異的かつ高い親和性を有する結合／阻害蛋白質の同定を行った。インターロイキン−６（ＩＬ−６）は，細胞増殖，分化，および細胞機能を制御する多機能性サイトカインであり，種々の疾患，例えば慢性関節リウマチやキャッスルマン病の病因に関連する。ＩＬ−６の活性は，ＩＬ−６レセプター（ＩＬ−６Ｒ）を介して発揮される。ＩＬ−６はＩＬ−６Ｒと相互作用して低アフィニティー複合体を形成し，これは次にｇｐ１３０とともにシグナリングに必須の高アフィニティー複合体を形成する。ＩＬ−６Ｒの阻害剤は，ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒとの結合を妨害し，その結果，（ＩＬ−６）−（ＩＬ−６Ｒ）−ｇｐ１３０複合体の形成を阻害し，このことによりシグナリングカスケードを阻害すると考えられている（Nishimoto, N., Kishimoto, T. and Yoshizaki, K. (2000), Ann Rheum Dis, 59 (suppl 1), i21-i27）。
【００４６】
本発明の３Ｆ−ＩＶＶライブラリをＩＬ−６Ｒ誘導化セファロースビーズとともにインキュベートし，数回洗浄した後に，ＩＬ−６Ｒに結合した蛋白質を含むＩＶＶを溶出する。溶出した生成物をＰＣＲ増幅し，さらにＳＰ６−ＵＴＲの配列を付加する。上述のようにして転写させ，得られたｍＲＮＡをピューロマイシンリンカーにライゲーションさせ，翻訳させ，逆転写させて，ＤＮＡ／ｍＲＮＡ−ピューロマイシンリンカー−蛋白質複合体を得る。この複合体は，第２の３Ｆ−ＩＶＶライブラリとして，次のラウンドで使用することができる。このようにして，複数ラウンドの選択および蛋白質ライブラリ生成を行うことができる。第２ラウンド以降の選択のラウンドにおいては，標的の濃度やインキュベーション時間を減少させ，洗浄の回数を増加させることにより，選択圧を順次高くして，より結合親和性の高い蛋白質を濃縮することができる。
【００４７】
以下の実施例に示されるように，本発明においては，１０ラウンドの選択およびライブラリの生成により，ＩＬ−６Ｒと結合しうる複数の蛋白質を得ることができた。これらの蛋白質のうち，以下のアミノ酸配列：
LVCYQLLACRPGTLETCPDDFTCVATRHTLGHNLTQYCSHACAIPACETPASCCQTDKCNG（配列番号３）；
LVCYQLLACRPGTLETCPDDFTCVATRHTLGHNLTQYCSHACAIPTPRARTGCCQTDKCNG（配列番号４）；または
LVCYAPLPYTPGTLETCPDDFTCVATRHTLGHNLTQYCSHACAIPACETPASCCQTDKCNG（配列番号５）
を有する蛋白質がＩＬ−６Ｒに対して高い親和性を示した。したがって，これら蛋白質は，ＩＬ−６とＩＬ−６レセプターとの結合の阻害剤として，種々の疾患の治療に有用であると考えられる。
【００４８】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが，本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００４９】
実施例１．スリーフィンガー様スキャフォールドの蛋白質ライブラリの作製
インビトロウイルス（ＩＶＶ）法による進化分子工学を用いて，標的と結合しうるスリーフィンガー型のポリペプチドを取得するために，３つのループ領域をランダム化した蛋白質ライブラリ（３Ｆ−ＩＶＶライブラリ）を作製した。スリーフィンガー様スキャフォールドのシステインのフレームワークは，いくつかの短い神経毒の間で保存されていることが知られている。アセチルコリンレセプターへの結合に関与すると推定されているアミノ酸を含む部分およびその周辺のアミノ酸残基をランダム化した。ループＩのＴ５−Ｐ１０（６アミノ酸），ループＩＩのＫ２５−Ｖ３４（１０アミノ酸）およびループＩＩＩのＡ４６−Ｈ５２（７アミノ酸）をランダム化した（図２）。ベータシートを形成しているアミノ酸は変更しなかった。
【００５０】
３Ｆ−ＩＶＶライブラリ用の全長コンストラクトの調製：
３Ｆ−ＩＶＶライブラリ用の全長コンストラクトは，ループ部分のアミノ酸配列をランダム化したＣＴｘ３遺伝子の５’側にＳＰ６プロモーター，キャップ部位，Ｘｅｎｏｐｕｓグロブリン非翻訳配列（ＵＴＲ）および翻訳開始部位を含むＳＰ６−ＵＴＲフラグメントを付加し，３’側にスペーサー（ＧＧＧＳ）２，Ｃ−末端Ｈｉｓ６−タグ，スペーサー（ＧＧＧＳ）およびＹ−タグ配列を付加するよう設計した（図３）。ＳＰ６−ＵＴＲはＣＴ３ｘ遺伝子のインビトロ転写および翻訳のために，Ｈｉｓ６−タグ配列はライブラリの精製のために，Ｙ−タグ配列はｍＲＮＡとピューロマイシンリンカーへのライゲーションのために，それぞれ付加されている。
【００５１】
ＣＴｘ３のヌクレオチド配列を４つのフラグメントに分割し，各フラグメントに対応するオリゴヌクレオチドを慣用のホスホルアミダイト化学により合成した。最初の３つのフラグメントはそれぞれ，３Ｆ遺伝子のループ配列に対応するランダム化ヌクレオチドおよび非ランダム化ベータシート配列に対応するヌクレオチドを含む。第１のフラグメントの５’末端にはＳＰ６−ＵＴＲの一部が含まれている。第４のフラグメントは，Ｙ−タグ，スペーサー（ＧＧＧＳ）２，Ｃ−末端Ｈｉｓ6−タグ，スペーサー（ＧＧＧＳ）を含む。これらの４つのフラグメントは，それぞれ３’側にオーバーラップ配列を含む。この実験に用いたオリゴヌクレオチドの一覧を以下に示す。ＮはＡ，Ｇ，ＣまたはＴを表し，ＳはＣまたはＧを表す。
Ｆ１：  5'-CGCTCAACTTTGGCAGATCTACCATGGGAGGTTCACTTGTATGTTACACA(NNS)6CCTCCTG GAACCTTAGAGACTTG-3' （配列番号３２）
Ｆ２：  5'-ACGCATGAGAACAATACTGGGTAAC(SNN)10TTTTTTAACACATGTGAAATCATCTGGACAA GTCTCTAAGGTTCCAGG-3' （配列番号３３）
Ｆ３：  5'-TCCGTTGCATTTGTCTGTTTGGCAACA(SNN)7AAACTCATAGGACGCCGGTATCGCACACGC ATGAGAACAATACTGGGT-3' （配列番号３４）
Ｆ４：  5'-tttccccgccgccccccgtcctTGAGCCACCTCCAGAACCACCGCCATGGTGGTGATGATGGTGAGACCCTCCGCCTGAGCCTCCACCTCCGTTGCATTTGTCTGTTTGG- 3' （配列番号３５）
ＳＰ６−ＵＴＲ：  5'-ATTTAGGTGACACTATAGAATACAAGCTTGCTTGTTCTTTTTGCAGAAGCTCAGAATAAACG CTCAACTTTGGCAGATCTACCATGG-3' （配列番号３６）
【００５２】
下線を付した配列はＰＣＲ用のオーバーラップ配列を示す。Ｆ−４において，小文字で示される配列はＹ−タグ配列を示し，これは転写されたｍＲＮＡをピューロマイシン−リンカーにライゲーションさせるための配列である。
【００５３】
ライブラリ生成のためにＰＣＲを３工程で行った（図４を参照）：
工程１  最初の３つのフラグメント（ランダム化配列を含む）のＰＣＲによりＦ１−Ｆ２−Ｆ３を生成する。
工程２  Ｆ１−Ｆ２−Ｆ３とＦ４とのＰＣＲによりＦ１−Ｆ２−Ｆ３−Ｆ４を生成する。
工程３  ＳＰ６−ＵＴＲとＦ１−Ｆ２−Ｆ３−Ｆ４とのＰＣＲにより全長コンストラクトを生成する。
【００５４】
ＰＣＲは，２５ユニットのＫＯＤポリメラーゼ（Ｔｏｙｏｂｏ，Ｊａｐａｎ）および１００ｐｍｏｌｅの各フラグメントを用いて製造元から供給されたバッファ中で行った。９４℃を１５秒間，６４℃を１０秒間および７４℃を３０秒間を２５サイクル行い，生成物を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分析し，全長コンストラクト（ＳＰ６−ＵＴＲ）−Ｆ１−Ｆ２−Ｆ３−Ｆ４（約３７０塩基対）を含む対応するバンドを切り出した。標準的な方法によりＤＮＡを抽出し，分光高度計で２６０ｎｍで測定した。１００ピコモルの各フラグメントから出発して，出発物質からの最終収率２４％が得られた。
【００５５】
配列決定による初期ライブラリの質の評価：
次に，上述で得られた全長コンストラクトを直接配列決定してループ領域のランダム化の程度を評価した。図５に示されるように，ランダム化ヌクレオチド（ループに対応）は，非ランダム化ピークと比較して短いピークを有していた。ランダム化部分における短いピークは，種々のヌクレオチドが種々のＤＮＡコピーの同じ位置に存在するための不適切なシグナルによるものであり，一方非ランダム化部分においてはＤＮＡのすべてのコピーに単一のヌクレオチドが存在して，鋭い明確なピークを与える。このことは，コンストラクト中にランダム化部分が首尾良く挿入されたことを示す。
【００５６】
さらに，ライブラリをクローニングして，２０個の単一コロニーを無作為に取り出し，配列決定した。２０個のクローンのすべてにおいて，ランダム化ヌクレオチドは異なっており，ライブラリが適切な多様性からなることが確認された。ヌクレオチドの組成についても，ＳについてはＣまたはＧのいずれか，Ｎについては４つのヌクレオチドのいずれかを含むことが確認された。したがって，上述の方法により作製したライブラリは，多様性および質の点で満足しうるものであった。
【００５７】
ピューロマイシン・ビオチン・リンカーの合成：
ＩＶＶは，リボソーム上の発生しつつあるペプチドと，これをコードするｍＲＮＡとがピューロマイシンを介して結合している複合体である。ＩＶＶを形成するためのピューロマイシン・ビオチン・リンカーの構造を図６に示す。ビオチン・ループの３’末端は，ライゲーションしたｍＲＮＡからの逆転写の際のプライマーとして機能する。ビオチンは，ＩＶＶの精製のために用い，制限酵素部位におけるＤＮＡの切断により，ＩＶＶを回収することができる。
【００５８】
ピューロマイシン・ビオチン・リンカーは，ヘテロ二官能性試薬（ＥＭＣＳ）を用いて以下の２つの修飾オリゴヌクレオチドを架橋させることにより合成した。
Puro-F-S：5’-(S)-TC(F)-(Spc18)-(Spc18)-(Spc18)-(Spc18)-CC-(Puro)-3’
ビオチン・ループ：5’-CCCGGTGCAGCTGTTTCATC(T-B)CGGAAACAGCTGCACCCCCCGCCGCCCCCCG(T)CCT-3’（配列番号３７）
（Ｓ）は５’−チオール−モディフィアーＣ６，（Ｆ）はフルオレセイン−ｄＴ，（Ｐｕｒｏ）はピューロマイシンＣＰＧ，（Ｓｐｃ１８）はスペーサーホスホルアミダイト１８，（Ｔ）はアミノ−モディフィアーＣ６ｄＴ，（Ｔ−Ｂ）はビオチン−ｄＴを表す。すべての修飾ホスホルアミダイト試薬はＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ，ＵＳＡ）から購入した。
【００５９】
Ｐｕｒｏ−Ｆ−Ｓのチオール基の還元反応は室温で６時間行った。反応液は総量１００μｌ中に１０ｎｍｏｌのＰｕｒｏ−Ｆ−Ｓ，１ｍＭ  ＴＣＥＰ，５０ｍＭリン酸バッファ（ｐＨ７）を含む。架橋反応の前に，ＮＡＰ５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により５０ｍＭリン酸バッファ（ｐＨ７）を用いて生成物を精製した。
【００６０】
１０ｎｍｏｌのビオチン・ループおよび２０μｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２μｍｏｌのＥＭＣＳを０．２Ｍリン酸バッファ（ｐＨ７）に加えて総量１００μｌとした。反応混合物を室温で３０分間撹拌し，ＮＡＰ５カラムにより１ｍＭリン酸バッファ（ｐＨ７）を用いて精製して，過剰のＥＭＣＳを除去した。ビオチン・ループとＥＭＣＳとのコンジュゲートを含む画分を回収し，沈殿により濃縮した後，スピードバキュームで乾燥した。生成物を１０μｌの０．２Ｍリン酸バッファ（ｐＨ７）に溶解し，上述のように還元したＰｕｒｏ−Ｆ−Ｓを加え，反応混合物を４℃で一晩撹拌することにより，Ｐｕｒｏ−Ｆ−Ｓとビオチン・ループとを結合させて，ピューロマイシン・ビオチン・リンカーを得た。この溶液にＴＣＥＰを最終濃度４ｍＭで加え，室温で１５分間インキュベートした。ピューロマイシン・ビオチン・リンカーおよびビオチン・ループをエタノール沈殿により濃縮して，過剰のＰｕｒｏ−Ｆ−Ｓを除去した。さらに，これを０．１Ｍ  ＴＥＡＡで平衡化したＣ１８調製用カラム（５ｍｍ内径；２５０ｍｍ長さ；ＡＲ−３００，Ｗａｔｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）に負荷し，８０％アセトニトリル（１５から３５％）の直線勾配で０．５ｍｌ／分間で合計３３分間の溶出を行うことにより，過剰のビオチン・ループを除去した。各画分を変性尿素ＰＡＧＥで分析した。このようにして精製したピューロマイシン・ビオチン・リンカーはスピードバキュームで乾燥し，ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理水で１０μＭの最終濃度に希釈した。
【００６１】
ライブラリＤＮＡの転写：
ランダム化ＣＴｘ３遺伝子の全長コンストラクトＤＮＡを９４℃に加熱し，ゆっくり冷却することによりアニーリングさせて，適切に塩基対形成した二本鎖ＤＮＡを形成した。テンプレートＤＮＡを，Ｒｉｂｏ  ＭＡＸ大量合成システム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）を用いて，ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼにより転写させて，ｍＲＮＡを生成した。ＤＮａｓｅＩを加えることにより反応を停止させ，フェノール／クロロホルム法により精製した。ＲＮＡ濃度は分光光度計により２６０ｎｍで測定した。
【００６２】
ピューロマイシン−リンカーのｍＲＮＡへのライゲーション：
ｍＲＮＡのＹタグ配列をリンカーにアニーリングさせ，ライゲーション部位でＴ４  ＲＮＡリガーゼによりライゲーションさせて，ｍＲＮＡとピューロマイシン・ビオチン・リンカーとを結合させた。ｍＲＮＡは，１ｘリガーゼバッファ（Ｔａｋａｒａ，Ｊａｐａｎ）中で９４℃に加熱し，ゆっくり冷却することにより，Ｙ−タグ配列を介してピューロマイシン・ビオチン・リンカー（１：１比）とアニーリングさせた。Ｔ４キナーゼおよびＴ４ＲＮＡリガーゼ（Ｔａｋａｒａ，Ｊａｐａｎ）を加え，２５℃で１時間反応させることにより，ｍＲＮＡとピューロマイシン・ビオチン・リンカーとをライゲーションさせた（図６Ｂ）。生成したｍＲＮＡ−ピューロマイシン・ビオチン・リンカーは，ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ライゲーション効率および生成物の純度はポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認した。
【００６３】
インビトロウイルス形成：
ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・ビオチン・リンカーを，Ｒｅｃｔｉｃ  Ｌｙｓａｔｅ  ＩＶＴ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ）を用いて３０℃で１０分間翻訳させた。翻訳後，６５ｍＭ  ＭｇＣｌ2および７５０ｍＭ  ＫＣｌの存在下で３７℃で２時間インキュベートすることにより，ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・ビオチン・リンカー−蛋白質の複合体を形成させた。この複合体をビオチン−ストレプトアビジン相互作用を利用して精製し，続いてＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｔａｋａｒａ，Ｊａｐａｎ）反応により，ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを形成した。次に，ＤＮＡ／ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・ビオチン・リンカー−蛋白質を制限酵素ＰｖｕＩＩで消化することにより，ビオチン−ストレプトアビジン複合体から切断した。得られたＤＮＡ／ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−蛋白質を，Ｃ−末端Ｈｉｓ６−タグを利用してＮｉ−ＮＴＡ磁気ビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製し，Ｂｅａｃｏｎ２０００（Ｐａｎｖｅｒａ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）により定量した。以上のようにして，３Ｆ−ＩＶＶライブラリを形成した。推計サイズ１×１０11の分子が得られ，これを以後の実験においてＩＬ−６Ｒ結合蛋白質の選択の出発物質として用いた。
【００６４】
ライブラリの質の評価：
初代３Ｆ−ＩＶＶライブラリのアフィニティーを固定化ＩＬ−６ＲおよびＣＴｘ３の天然のリガンドであるＡＣｈＢＰに対する結合アッセイにより調べて，ライブラリの質を評価した。等量の３Ｆ−ＩＶＶライブラリを２５０ｎＭの固定化ＩＬ−６ＲまたはＡＣｈＢＰとともにＰＢＳ中で室温で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで数回洗浄した後，結合した物質を溶出し，ＰＣＲ増幅し，ゲル電気泳動により分析した。ＰＣＲプライマーの配列は以下のとおりである：
PCR-フォワード：  5'-GAAGCTCAGAATAAACGCTCAACTTTGGCAGATCT-3' （配列番号３８）
PCR-リバース：  5'-TTTCCCCGCCGCCCCCCGTCCTGCTTCCGCCGTGATGAT-3' （配列番号３９）
３Ｆ−ＩＶＶライブラリの出発量の１／５０および１／２５０の希釈物を用いたＰＣＲ産物も同様にゲル電気泳動して，シグナル強度の比較により，ＩＬ−６に結合した３Ｆ−ＩＶＶライブラリのパーセントを求めた。
【００６５】
結果を図７に示す。ライブラリのＩＬ−６ＲおよびＡＣｈＢＰに対する結合は，それぞれ約０．３％および０．２％であることがわかった。このことは，初代３Ｆ−ＩＶＶライブラリの両方のレセプターへの結合は無視しうる程度であることを示す。
【実施例２】
【００６６】
３Ｆ−ＩＶＶライブラリからのＩＬ−６Ｒ結合蛋白質の選択：
上述のようにして構築した３Ｆ−ＩＶＶライブラリを用いて，新規なＩＬ−６Ｒの結合分子および／または阻害分子の発見を試みた。選択圧を順次高くする条件下で，３Ｆ−ＩＶＶライブラリの生成と選択との一連のラウンドを繰り返すことにより，ＩＬ−６Ｒに結合する蛋白質を選択した。
【００６７】
ＩＬ−６Ｒ（−）誘導化および（ＩＬ−６Ｒ）誘導化セファロースの調製：
ＩＬ−６ＲをアミンカップリングによりＮＨＳ活性化セファロース４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に固定化した。同様にして，ＩＬ−６ＲなしのＩＬ−６Ｒ（−）誘導化セファロース４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗビーズを同時に調製した。カップリング効率は，初期および未結合レセプターの吸光度を２８０ｎｍで測定することにより評価した。
【００６８】
ＩＬ−６Ｒ結合蛋白質の選択：
３Ｆ−ＩＶＶライブラリからＩＬ−６Ｒに結合する分子を選択した。選択の各ラウンドは，ＩＬ−６Ｒ（−）誘導化およびＩＬ−６Ｒ誘導化セファロースビーズを用いて，１００ｍＭＮａＣｌおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中でバッチ選択モードで行った。
【００６９】
ＩＬ−６Ｒ結合蛋白質を選択する前に，ライブラリをＩＬ−６Ｒ（−）誘導化セファロースと２時間プレインキュベートすることにより，非特異的セファロース結合蛋白質を除去した。次に，このライブラリをＩＬ−６Ｒセファロースと１時間インキュベートした。インキュベート後，ＩＬ−６Ｒセファロースを同じバッファで数回洗浄し，５０ｍＭＤＴＴ（ジチオスレイトール）を含む同じバッファで溶出した。溶出した生成物をＰＣＲフォワードおよびリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。
【００７０】
増幅産物を精製し，これをテンプレートとして用いて，さらにＳＰ６−ＵＴＲを用いてＰＣＲ増幅した。得られた増幅産物をゲル精製し，上述のようにして転写させ，得られたｍＲＮＡをピューロマイシンリンカーにライゲーションさせ，翻訳させ，逆転写した。得られたＩＶＶを精製し，Ｂｅａｃｏｎ２０００により定量して，次のラウンドで用いた。以降の選択のラウンドにおいては，ＩＬ−６Ｒの濃度を３００ｎＭから３０ｎＭに，インキュベーション時間を１時間から１５分間にそれぞれ徐々に減少させ，洗浄の回数を３から１５に徐々に増加させることにより，選択圧を順次高くした。このようにして１０ラウンドの選択を行った後，溶出したプールをＰＣＲで増幅し，ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ）にクローニングした。
【００７１】
３Ｆ−ＩＶＶライブラリからのＩＬ−６Ｒ結合蛋白質の選択の進行をモニターするために，ラウンド５および１０のＤＮＡプールを直接配列決定した。結果を図８に示す。ランダム化部分のピークの長さは選択の進行とともに増加していた。このことは，ＩＬ−６Ｒ結合蛋白質の選択にしたがってライブラリの多様性が低下したことを示す。
【００７２】
ＩＬ−６Ｒ結合蛋白質の評価：
ラウンド１０のＩＶＶプール（Ｒ１０プール）のＩＬ−６Ｒに対する結合能力および特異性を評価するために，種々の条件下で結合分析を行った。結果を図９に示す。図中，１／５０は出発量の５０倍希釈を示し，１／２５０は２５０倍希釈を示し，１／１は希釈なしを示す。Ｒ１０プールは，非誘導化セファロース（ダミービーズ）について無視しうるアフィニティー（〜０．２％）を示したが，ＩＬ−６Ｒセファロースには有意に結合した（〜２％）。このことは，このプールがＲ１０プールとＩＬ−６Ｒとの間のアフィニティーにより濃縮されたことを示す（図９−１，２）。
【００７３】
ＩＬ−６Ｒとのアフィニティーが蛋白質部分とＤＮＡ／ｍＲＮＡハイブリッド部分とのいずれで生じているかを確認するために，Ｒ１０プールをプロテイナーゼＫで消化して蛋白質部分を除去した。この条件下では，プールは無視しうる程度（〜０．２％）にしかＩＬ−６Ｒセファロースに結合しなかった（図９−３）。このことは，Ｒ１０プールが蛋白質−ＤＮＡ／ｍＲＮＡハイブリッドではなく蛋白質−蛋白質相互作用を介してＩＬ−６Ｒに結合したことを示す。
【００７４】
さらに，８倍過剰の可溶性ＩＬ−６Ｒを加えて，２５０ｎＭのＩＬ−６Ｒセファロースとの間の競合実験を行った。溶出物は無視しうる量（〜０．２％）のＩＶＶを含んでおり，ＩＬ−６ＲセファロースがＲ１０プールに対して可溶性ＩＬ−６Ｒと競合したことが確認された（図９−４）。以上のことから，Ｒ１０プールはＩＬ−６Ｒに結合し，この結合はＩＶＶの蛋白質部分を介して生じていることが示された。
【００７５】
ＩＬ−６Ｒ結合蛋白質の配列の確認：
Ｒ１０プールをクローン化し，無作為に選択した２０個のクローンの一次配列を決定してアライメントにより分析した。３つのループ配列は異なるが，残りの配列はほぼ同一であった。Ｒはラウンドを示し，１０は１０番目のラウンドを示し，続く数字はクローン番号を示す。配列の分析により，プールはループ配列の類似性に基づいて５つのグループに分けることができた（図１０）。ほぼ同一の配列を含むクローンの組をグループＩとしてグループ化し，これは配列決定されたクローンの７０％を占めた。グループＩＩおよびＩＩＩがこれに続き，それぞれ約１０％を含み，グループＩＶおよびＶはそれぞれ約５％を含んでいた。非ランダム化配列は数個の変異を除いてほとんど変化していなかった。わずかの変異の存在は，おそらくはライブラリが６５０サイクルのＰＣＲに供されたためにポリメラーゼのプルーフリーディングに失敗があったためであろう。
【００７６】
蛋白質の調製：
得られたＩＬ−６Ｒ結合蛋白質についてさらに詳細に調べるために，クローンＲ１０−１５から蛋白質を調製した。蛋白質は，ｐＢＡＤ／ＴＯＰＯＴｈｉｏ融合発現キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ）を用いてチオレドキシン融合蛋白質として調製した。また，対照実験において用いるためにチオレドキシンも調製した。プールのクローン化ＤＮＡをＰＣＲ増幅し（Ｃ−末端Ｈｉｓ６−タグをコード），ｐＢＡＤ／ＴＯＰＯＴｈｉｏ融合発現ベクター中にクローニングし，大腸菌をトランスフォームした。配列決定によりフレームの確認を行った。
【００７７】
ポジティブクローンを５０μｇ／ｍｌのアンピリシンを含むＬＢ培地で１６時間前培養した。少量の前培養物を新たなＬＢ−アンピリシン培地に移し，ＯＤ600が０．５に達するまで増殖させた。培養物を０．０２％アラビノースで３７℃で４時間誘導した。３０００ｒｐｍで２０分間で細胞を回収し，１μｇ／ｍｌＤＮａｓｅ，１μｇ／ｍｌＲＮａｓｅおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）の存在下でＢｕｇｂｕｓｔｅｒ蛋白質抽出試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）で溶解した。短時間インキュベーションした後，溶解物を遠心分離し，上清（可溶性画分）およびペレット（不溶性画分）に分離し，ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。可溶性画分は発現したペプチドのＨｉｓ６−タグについてＮｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）アフィニティーで非変性条件下でほぼ均一にまで精製した。不溶性画分は精製してインクルージョンボディーとし，５０ｍＭＣＡＰＳ，ｐＨ１１．０，０．３％Ｎ−ラウロイルサルコシン（Ｎｏｖａｇｅｎ）および０．１％β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）を含むバッファに溶解し，Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティーカラムで変性条件下でほぼ均一にまで精製した。精製後，変性した蛋白質を酸化還元条件下で再フォールディングさせた。蛋白質は，抗Ｈｉｓ抗体（Ｐｅｎｔａ．．ＨｉｓＨＲＰ，Ｑｉａｇｅｎ）によりＨｉｓ６−タグについてのウエスタンブロッティングにより確認した。蛋白質濃度は，ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準物質としてＢｉｏ−ｒａｄ蛋白質アッセイキット（Ｂｉｏ−ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＵＳＡ）により，およびＢＳＡ等の既知の蛋白質の濃度を標準としてＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の蛋白質バンドのデンシトメトリにより測定した。
【００７８】
直接結合アッセイ：
精製した蛋白質を７，７０および７００ｎＭの濃度で，１ｘＰＢＳ中で１μＭビオチン化ＩＬ−６Ｒとともに室温で１時間インキュベートした。ストレプトアビジン磁気ビーズを混合物に加え，さらに１５分間インキュベートした。ビーズをＰＢＳ−Ｔ（Ｔｗｅｅｎ０．１％）で数回洗浄し，溶出し，抗Ｈｉｓ抗体（Ｐｅｎｔａ．．ＨｉｓＨＲＰ，Ｑｉａｇｅｎ）およびＥＣＬ検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて，ウエスタンブロッティングによりペプチドのＨｉｓ６−タグについて分析した。バックグラウンドをモニターするために，蛋白質のＳＡビーズに対するアフィニティーも測定した。
【００７９】
ペプチドＲ１０−１５のＩＬ−６Ｒに対する結合は，１０倍増加濃度の蛋白質および一定量の１μＭのＩＬ−６Ｒで試験した。ペプチドは濃度依存的様式でＩＬ−６Ｒに結合することが明らかになった（図１１）。最も高い濃度のペプチド（７００ｎＭ）で無視しうる程度のバックグラウンドが観察された。
【００８０】
間接的結合アッセイ：
融合ペプチドの結合アフィニティー（Ｋｄ）は，Ｆｒｉｇｕｅｔら（Friguet, B., Chaffotte, A. F., Djavadi-Ohaniance, L. and Goldberg M. E. (1985), J. Immunol. Methods., 77, 305-319)に記載の方法にしたがい，いくつかの改変を加えて測定した。ＰＢＳ中の一定量のペプチド（５０ｎＭ）を種々の量のＩＬ−６Ｒ（１ｎＭ−１μＭ）とともに，平衡に達するまでインキュベートした。また，チオレドキシンもアッセイしてバックグラウンドをモニターした。混合物を一定量の固定化ＩＬ−６Ｒ（２００ｎＭ）に加え，さらに３０分間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで数回洗浄した後，固定化ＩＬ−６Ｒに結合したペプチド（すなわち，可溶性ＩＬ−６Ｒに結合しない）を溶出し，抗Ｈｉｓ抗体（Ｐｅｎｔａ．．ＨｉｓＨＲＰ，Ｑｉａｇｅｎ）およびＢｉｏ−ｒａｄ  Ｃｈｅｍｉｃｄｏｃ（Ｂｉｏ−ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＵＳＡ）のＥＣＬ検出システムを用いて，ウエスタンブロッティングによりペプチドのＨｉｓ６−タグについて分析した。シグナルはデンシトメトリによりＢｉｏ−ｒａｄ  Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウエアを用いて定量した。結果を図１２に示す。検出シグナルは，可溶性レセプター濃度の増加にともなって減少し，このことは，ペプチドの可溶性レセプターへの結合は濃度依存的であることを示す。Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４（ＧｒａｐｈＰａｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＵＳＡ）を用いてシグナル強度（Ｙ−軸）を可溶性ＩＬ−６Ｒ濃度（Ｘ−軸）に対してプロットし，非線形回帰曲線への当てはめにより解離定数を計算した。その結果，Ｒ１０−１５について解離定数１１５ｎＭを得た。この範囲の解離定数での相互作用は非常に強く，イムノグロブリンに匹敵する。このことは，本発明にしたがう３Ｆ−ＩＶＶライブラリから未知の高分子標的に対して強く結合する分子を取得することが可能であることを実証する。同様にして、ペプチドＲ１０−１３およびＲ１０−１４の解離定数を求めたところ、それぞれ１００ｎＭおよび５５ｎＭであった。
【００８１】
阻害アッセイ：
競合阻害実験によりペプチドＲ１０−１５によるＩＬ−６とＩＬ−６Ｒとの相互作用の阻害をアッセイした。一定量のビオチン化ＩＬ−６（４５ｎＭ）および種々の量のペプチド（１ｎＭ−２μＭ）を一定量の固定化ＩＬ−６Ｒ（３５０ｎＭ）とともにインキュベーションして，ＩＬ−６Ｒについて競合させた。ＩＬ−６の濃度は，予め間接結合法により決定したＩＬ−６Ｒの解離定数（２０ｎＭ）の約２倍高い４５ｎＭと設定した。数回の洗浄の後，生成物を溶出してビオチン化ＩＬ−６（阻害分析用）およびＨｉｓ６−タグペプチド（結合分析用）について，ウエスタンブロッティングおよびＥＣＬ検出システムにより分析した。グラフは上述のようにしてプロットした。
【００８２】
結果を図１３に示す。Ｒ１０−１５は濃度（用量）依存的に相互作用を阻害した。同様の条件下では，チオレドキシンは結合せず，（ＩＬ−６）−（ＩＬ−６Ｒ）相互作用を阻害しなかった。さらに，阻害は競合するペプチドのＩＬ−６Ｒへの結合により生じたことが確認された（図１３Ａ２）。シグナル強度対ペプチドの濃度のプロットから，ＩＣ５０を計算したところ，１０２ｎＭの値が得られた（図１３Ｂ）。同様にして、ペプチドＲ１０−１３およびＲ１０−１４についてＩＣ５０の値を求めたところ、それぞれ２５０ｎＭおよび１６３ｎＭであった。
【００８３】
特異性アッセイ：
１００ｎＭのペプチドＲ１０−１５を１μＭの種々の可溶性蛋白質（ＩＬ−６Ｒ，ＡＣｈＢＰおよびＩｇＧ）とともに室温で１時間インキュベーションした。混合物をさらに３００ｎＭのＩＬ−６Ｒセファロースとともに１時間インキュベーションして，未結合蛋白質を捕捉した。よく洗浄した後に溶出し，ウエスタンブロッティングによりペプチドのＨｉｓ６−タグについて分析した。結果を図１４に示す。ＩＬ−６Ｒのレーンは弱いバンドを含むが，ＡＣｈＢＰおよびＩｇＧは強いバンドを含み，このことは，Ｒ１０−１５がＩＬ−６Ｒに特異的に結合するがＡＣｈＢＰおよびＩｇＧには結合しないことを示す。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明の蛋白質ライブラリおよび方法は，所望の標的に結合する新規な蛋白質を同定するのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図１は，スリーフィンガー様スキャフォールド蛋白質ＣＴｘ３とα−ブンガロトキシン（α−Ｂｇｔｘ）およびコブラトキシン（Ｃｂｔｘ）との一次構造および二次構造の比較を示す。
【図２】図２は，ＣＴｘ３のアミノ酸配列を示す。
【図３】図３は，３Ｆ−ＩＶＶライブラリ作製用の全長コンストラクトの構造を示す。
【図４】図４は，３Ｆ−ＩＶＶライブラリ作製用の全長コンストラクトの製造工程を示す。
【図５】図５は，初代ライブラリの塩基配列を示す。
【図６】図６は，３Ｆ−ＩＶＶライブラリ作製用のピューロマイシン・ビオチン・リンカーの構造を示す。
【図７】図７は，結合分析による初期ライブラリの質の評価を示す。
【図８】図８は，３Ｆ−ＩＶＶライブラリからのＩＬ−６Ｒ結合蛋白質の濃縮の進行を示す。
【図９】図９は，ラウンド１０の３Ｆ−ＩＶＶプールのＩＬ−６Ｒへの結合を示す。
【図１０】図１０は，ＣＴｘ３遺伝子とラウンド１０の３Ｆ−ＩＶＶプールとのアミノ酸配列の比較を示す。
【図１１】図１１は，クローンＲ１０−１５のＩＬ−６Ｒへの結合を示す。
【図１２】図１２は，クローンＲ１０−１５のＩＬ−６Ｒに対するアフィニティーの測定結果を示す。
【図１３】図１３は，クローンＲ１０−１５による（ＩＬ−６）−（ＩＬ６−Ｒ）相互作用の阻害アッセイの結果を示す。
【図１４】図１４は，クローンＲ１０−１５のＩＬ−６Ｒに対する特異性を示す。
【図１５】図１５は，スリーフィンガー様スキャフォールドを有する種々の蛋白質のアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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