(57)【要約】【課題】培養表面に接着状態を維持したまま、培養容器内に培養された細胞を冷却する。【解決手段】冷却装置を構成する冷却用閉鎖空間の内部の気相温度を０℃に維持しておき、その中に培養状態にあった培養容器を移動させる。培養容器を移動させた後、所定の時間の経過後に、冷却用閉鎖空間の内部の気相温度を保存、輸送に必要とされる温度に設定し、気相温度をその温度に維持して、その温度に培地温度を維持する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
樹脂製の培養表面に温度により疎水性、親水性が変化する相転位温度を有する温度応答性高分子を設けた培養容器を収納するための冷却用閉鎖空間を実質的に０℃に維持すること、
実質的に０℃に維持されている前記冷却用閉鎖空間内に細胞が接着している前記培養容器を投入すること、
前記培養容器が投入された後、所定時間経過した後、あるいは、前記培養容器の培地の温度が所定の温度に達した後に前記冷却用閉鎖空間の温度を実質的に４℃に維持すること、
より、前記樹脂製の培養表面に接着している細胞を通常培養のなされる温度から実質的に４℃まで冷却する冷却方法。
【請求項２】
樹脂製の培養表面に温度により疎水性、親水性が変化する相転位温度を有する温度応答性高分子を設けた培養容器を収納可能とした冷却用閉鎖空間を備える冷却装置において、
前記冷却用閉鎖空間の気相温度を検出するための手段と、
前記冷却用閉鎖空間の気相温度を低下させるための手段と、
前記冷却用閉鎖空間の気相温度を上昇させるための手段と、
前記冷却用閉鎖空間に投入された培養容器の培地温度を推定または計測する手段と、
前記冷却用閉鎖空間の気相温度を制御するための手段とを備え、
前記気相温度を制御するための手段は、冷却用閉鎖空間に培養容器が投入される前は前記冷却用閉鎖空間の気相温度を実質的に０℃に維持し、培養容器が投入された後は所定時間が経過した後、あるいは、培養容器の培地温度が所定の値になった後、前記気相温度を細胞が接着状態を維持したまま実質的に４℃に維持する機能を備えるものであることを特徴とする冷却装置。
【請求項３】
前記冷却用閉鎖空間に投入された培養の培地温度を１分間あたりに６．６℃から８．３℃の範囲で温度降下させ、培地温度が実質的に４℃に到達する直前まで留置し、上記温度になった時点で、前記冷却用閉鎖空間内の温度を４℃に設定し、１分間あたりに１０℃以上の変化率で加温する請求項１記載の冷却方法。
【請求項４】
前記冷却用閉鎖空間に投入された培養の培地温度を１分間あたりに６．６℃から８．３℃の範囲で温度降下させ、培地温度が実質的に４℃に到達する直前まで留置し、上記温度になった時点で、前記冷却用閉鎖空間内の温度を４℃に設定し、１分間あたりに１０℃以上の変化率で加温する請求項２記載の冷却装置。
【請求項５】
前記培養容器の周辺を、高熱伝導性のゲル、金属等、或いは低熱伝導性を有する遮熱剤により、或いはそれらを組み合わせて被覆することにより、気相による温度制御を二次的に制御する請求項２記載の冷却装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は培養容器内の細胞の冷却方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞は培養のなされる温度から組織処理を行う温度４℃まで冷却する方法は、低温度一定条件を実現できる機器を用いて、その内部に実現された低温度気相下に晒されるか、或いは、あらかじめその温度に冷却された培地へ交換した後に低温保温機内へ移動される。その一例として特表平１１−５１０３６３がある。
【０００３】
【特許文献１】特表平１１−５１０３６３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ある温度を境に疎水性、親水性が変化する温度応答性高分子を培養表面に被覆された培養容器（以下、温度応答性培養皿と称する）がある。この容器によれば、培養表面が疎水性である温度帯において培養表面に付着している培養により得られた細胞に対し、培地温度を培養表面が親水性になる温度にまで低下させることで、細胞自身の代謝活動により細胞を剥離、回収することができる。すなわち、タンパク質分解酵素等を用いることなく、培養表面から剥離、回収することができる。細胞の回収にタンパク質分解酵素等を用いないため、回収された細胞の細胞外タンパク質、細胞の生活性の維持にすぐれる。この方法により回収、移植された組織は生着性に優れ、移植後も細胞自身の機能が十分保たれるので、既存の培養容器と回収方法を組み合わせた場合より優れる。
【０００５】
特表平１１−５１０３６３を例とする従来方法を用いて、培養中あるいは培養後の細胞を保存及び輸送を目的として組織処理を行う４℃まで冷却する場合、その温度帯において保存、輸送に関わる工程を実施することについては示されているが、４℃まで冷却する方法、その装置においては示されていない。これは、従来用いられる既存の培養容器では細胞が自発的に剥離することはないためである。
【０００６】
しかし、培養容器として温度応答性培養皿を使用する場合、これを用いて培養された細胞を４℃まで従来法に従い冷却すると、温度応答性培養皿の有する性質により細胞は培養表面から剥離する。剥離した状態のまま保存、輸送を実施すると、細胞は培地内での位置が不規則に変化させられる等を原因として、細胞壊死の頻度が高くなるという問題が生じる。
【０００７】
よって、温度応答性培養皿を使用する場合、細胞の安全な保存、輸送を実施するには、従来法で冷却する場合よりも細胞の接着性を向上させることが課題となる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を解決するために、本発明は以下の手段を提案する。
【０００９】
特殊な培養容器である温度応答性培養皿を含む培養表面上に細胞が接着状態を維持したまま組織処理を行う４℃まで冷却する工程、その温度を維持した状態で、保存を行う際には凍結保護剤の浸透工程、輸送を行う際には運搬工程を行うことができる、培養容器を収納、冷却することのできる冷却用閉鎖空間を備え、培養容器内の培地温度の変化率を前記冷却用閉鎖空間内の気相により制御する機構を有する冷却装置を用いる。すなわち、本発明の冷却装置により、急速に培地温度を低下させて、細胞を保存及び輸送がなされる温度にまで到達させる。また、培養容器の周辺を、高熱伝導性のゲル、金属等、或いは低熱伝導性を有する遮熱剤により、或いはそれらを組み合わせて被覆することにより、気相による温度制御を二次的に制御し、培地温度の変化率を、細胞の接着性が増す条件へ修正する方法を用いる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、温度応答性培養皿の培養表面における細胞の接着性を、従来法で冷却した場合に比較し、向上させることができる。よって冷却後の保存或いは輸送過程において、細胞壊死の頻度を抑えるという効果を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明の実施例について図面を用いて説明する。図１は冷却装置の全体システム構成を示す図である。
【００１２】
本発明の実施例においては、少なくとも１つの温度応答性高分子がポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）であり相転位温度は３２℃であるものを樹脂性の培養表面に被覆した特殊な培養容器上に、細胞が接着状態を維持したまま組織処理を行う４℃まで冷却することを可能とし、その温度を維持した状態で、培養容器を収納、冷却することのできる冷却用閉鎖空間を備える。培養容器内の培地温度の変化率を冷却用閉鎖空間内の気相により制御する機構を有し、細胞培養培地の凍結する限界温度である０℃に冷却用閉鎖空間の温度を設定後、庫内へ培地温度が３７℃である培養容器を投入する。その培地温度を１分間あたりに６．６℃から８．３℃の範囲で低下させる機能を有し、培地温度が４℃に到達、或いは４℃に到達する直前の温度にあることを計測又は推定する機能を持ち、これにより上記温度に達するまで留置する。上記温度に到達した時点で組織処理を行う温度である４℃に庫内の温度を設定し、冷却用閉鎖空間の温度を１分あたりの温度上昇率を１０℃以上とする変化率で上昇させる。
【００１３】
１は装置本体である。１０は液体窒素貯蔵タンクであり、冷却するための熱源である。１１はポンプであり、タンク１０の液体窒素を気化させ冷却用閉鎖空間１４へ気体状態の窒素を送る。１２はチューブであり、ポンプ１１と冷却用閉鎖空間１４とをつなぐ。２６は開閉装置付きの冷却ガス弁である。１３は温度制御操作部であり、気化した窒素を用いて冷却用閉鎖空間１４の気相温度を制御する。１５は温度制御コントロール部であり、温度制御操作部１３に冷却用閉鎖空間１４の温度を制御するための信号をコード１６を介して送る。２３は培養容器であり、冷却用閉鎖空間１４内に保持される。本発明の実施例では、培養容器２３は疎水性、親水性が変化する相転位温度を有する温度応答性高分子、少なくとも１つの温度応答性高分子がポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）であり相転位温度は３２℃であるものを樹脂性の培養表面に被覆した特殊な培養容器を使用する。
【００１４】
ポンプ１１により気化された液体窒素は液体窒素貯蔵タンク１０からチューブ１２を介して温度制御操作部１３へ移動する。それを用いて冷却用閉鎖空間１４内部の気相温度を、温度制御部１５からの信号で設定された状態を実現する。また、冷却用閉鎖空間１４内部は冷却のみでなく加熱による温度制御も内部で併せて行うが、これは温度制御操作部１３により冷却用閉鎖空間１４の内部に組み込まれた加熱板２２による加熱による。温度センサ２０は冷却用閉鎖空間１４内部の気相の温度をモニタリングする。温度センサ２１は培養容器２３の内部の培地の温度をモニタリングする。温度制御部１５は一連の冷却過程における温度、温度変化率をあらかじめ設定しておき、冷却用閉鎖空間１４の内部にある気相用温度センサ２０、培地用温度センサ２１により得られる時間ごとの気相温度測定結果に基づき、冷却或いは加熱の指示を温度制御操作部１３に送り、指定の温度を実現させる。また、温度制御操作部１３により、サンプル（細胞）を一定時間０℃に晒すことによる時間ごとの培地温度の値を把握し、培地温度が４℃に達し次第、加熱板２２による加熱機能を用い急速に温度を上昇させる。
【００１５】
冷却用閉鎖空間１４の内部の温度は、温度制御操作部１３による液体窒素を利用した冷却による温度制御と、冷却用閉鎖空間１４の内壁に設置された加熱板２２の加熱による温度制御とにより制御される。二つの温度センサ２０、２１により得られた温度の実測値はコード１６を介して、温度制御部１５に送られる。温度制御部１５においてあらかじめ設定された経時的温度を実現させるため、冷却による温度制御操作部１３と加熱板２２とで冷却用閉鎖空間１４の内部の温度を制御する。また、高熱伝導性のゲル、金属等、或いは低熱伝導性を有する遮熱剤により、或いはそれらを組み合わせて被覆材２５により培養容器２３を被覆することにより、気相による二次的な温度制御を可能とする。２４は冷却用閉鎖空間１４の内部へ細胞を入れるための扉である。これはネジなどの連結手段により固定されており、扉２４が閉じられている状態では冷却用閉鎖空間１４の内部の熱的密封性が維持される。
【００１６】
図２（Ａ），（Ｂ）は、一連の冷却過程についてのアルゴリズムを示す図である。細胞の培養される培養容器に対する操作、培地温度の変化等についての一例を示したものである。
【００１７】
図２（Ａ）は庫内（冷却用閉鎖空間１４）にサンプル（細胞）投入に備えて内部の目標温度を０℃に維持する過程である。庫内（冷却用閉鎖空間１４）の内部の目標温度を０℃に設定する（ステップ３１）。庫内（冷却用閉鎖空間１４）の内部の温度が０℃より下がったか否かを計測する（ステップ３２）。庫内（冷却用閉鎖空間１４）の内部の温度が０℃より下がっていなければ冷却ガス弁を開とし（ステップ３３）、下がっていれば冷却ガス弁を閉とする（ステップ３４）。庫内（冷却用閉鎖空間１４）の内部の温度が０℃よりプラス側になったか否かを計測する（ステップ３５）。庫内（冷却用閉鎖空間１４）の内部の温度が０℃よりプラス側になっていれば、冷却ガス弁を開とする（ステップ３６）。ステップ３５で、庫内（冷却用閉鎖空間１４）の内部の温度が０℃よりマイナス側にあることが確認されれば、サンプルが投入可能の状態である（ステップ３７）。
【００１８】
図２（Ｂ）は目標温度の０℃に維持されている庫内（冷却用閉鎖空間１４）にサンプル（細胞）を投入して庫内（冷却用閉鎖空間１４）を目標温度の４℃に維持する過程である。温度が０℃よりマイナス側にある庫内（冷却用閉鎖空間１４）にサンプルが投入される（ステップ３８）。保持時間７分を設定する（ステップ３９）。設定された保持時間７分が経過したか否か判定する（ステップ４０）。経過していなければ、保持時間７分が経過するまで、これを繰り返す。保持時間７分が経過したら庫内（冷却用閉鎖空間１４）の内部の温度を４℃に設定する（ステップ４１）。以後、設定温度４℃を維持する温度制御ルーチンを実行する。これは、温度センサ２０の信号に応じて、温度制御部１５が与える信号に応じて温度制御操作部１３が気化した窒素による冷却と加熱板２２とで冷却用閉鎖空間１４の内部の温度を制御する操作である。なお、ステップ４０が保持時間の経過で培地温度を推定するものとしているのに対して、温度センサ２１の信号に応じて培地温度が、目標温度の４℃に達したか否かを判定するものとしても良い。
【００１９】
図３は、本発明の実施例による冷却用閉鎖空間の内部の経時的な気相、及び培地の温度の変化の一例を示す図である。図２で説明したように、サンプル（細胞）投入前に庫内（冷却用閉鎖空間１４）の内部の温度を０℃に維持しておき、サンプル（細胞）投入してから７分間の経過時間を待って、庫内（冷却用閉鎖空間１４）の内部の目標温度を４℃に維持する。したがって、培養容器２３の培地の温度は急速に目標温度を４℃に向かって変化するとともに、目標温度を４℃に維持される。これにより温度応答性培養皿上に培養された細胞の冷却後の接着性を向上させることを実現させる。最終的に到達する組織処理を行う温度は０℃〜１０℃の範囲とするが、４℃が好ましい。
【００２０】
この例において、冷却用閉鎖空間１４の内部の気相温度を０℃にし、培養容器２３をその内部に移すと、０℃の気相温度下に晒された培地温度の１分あたりの変化率は６．６℃から８．３℃であり、発明者による実験では７分後に培地温度は４℃に到達する。その時点で気相温度を４℃まで上昇させ、培地温度を４℃一定のまま維持する。
【００２１】
図４は培養容器２３の周辺の気相温度を制御して培地温度の１分あたりの変化率を実際に計測した結果の一例を示すデータである。ここでは例として、（Ａ）気相温度を１分あたり０．５℃の変化率で低下させた場合、（Ｂ）気相温度を１分あたり２℃の変化率で低下させた場合、（Ｃ）従来用いられる方法である４℃気相下に置く場合、（Ｄ）本発明による場合、及び、（Ｅ）−５℃気相下に置く場合のそれぞれの冷却方法に対して実際の培地温度の１分間あたりの変化率について調べた。
【００２２】
本発明による方法（Ｄ）では、４℃気相下に晒された方法（Ｃ）と比較すると変化率は大きい。−５℃気相下に晒された方法（Ｅ）は、本発明による方法よりも、さらに変化率が大きくなる。しかし、−５℃気相下に晒す方法では、氷結晶が生じる０℃よりも気相温度が低いため、氷結晶が生じ、細胞への障害の一因となる可能性がある。よって、本発明では、培地温度の１分あたりの変化率を、気相４℃下と−５℃下に晒した場合の変化率を参考にして、６．６℃から８．３℃と決定した。
【００２３】
特殊な培養容器である温度応答性培養皿から細胞が剥離するメカニズムは、培養表面を被覆する温度応答性高分子の性質が、培養がなされる温度においては疎水性であり、それよりも低い温度に晒されると相転位を起こし親水性に切り替わり、培養表面に接着していた細胞はその変化を受け、自身の代謝機能を用いて形態を変化させることにより、培養表面から剥離する。本発明は、細胞の晒される培地の温度を急速に低下させて細胞自身の有する代謝機能を速やかに消失させることにより、温度応答性培養皿の培養表面から細胞の剥離を抑制することとした。すなわち、培地の温度を急速に低下させることにより、培養表面に接着していた細胞が自身の代謝機能を用いて形態を変化させる時間を与えないで細胞の剥離を防止するものである。
【００２４】
図５は各種の冷却条件に従い細胞を冷却したときの細胞の接着率について評価を行った結果を示す一例である。ここでは例として、（Ａ）気相温度を１分あたり０．５℃の変化率で低下させた場合、（Ｂ）気相温度を１分あたり２℃の変化率で低下させた場合、（Ｃ）従来用いられる方法である４℃気相下に置く場合、（Ｄ）本発明による場合、及び、（Ｅ）培地交換による冷却の場合のそれぞれの冷却方法に対して実際の細胞定着率を調べた。細胞接着率は培養容器内の培地温度の変化率が大きくなるほどに、細胞の持つ代謝活性は冷却過程においてより速やかに消失し、結果として細胞接着率は向上した。一方、あらかじめ冷却しておいた培地へ交換する方法（培地交換冷却）は、培地温度の変化率は最も大きいが、培地交換に伴う不連続な冷却が細胞に生物学的影響を与え、細胞接着率は低いという結果であった。
【００２５】
図５において、従来用いられる方法である４℃気相下に置く場合（Ｃ）と（Ｄ）本発明による場合（Ｄ）とでは、細胞接着率の最大値はほぼ同じ程度であったが、従来用いられる方法である４℃気相下に置く場合（Ｃ）では、定着率に大きなばらつきがあった。
【００２６】
本発明では、最初培養のなされる温度である培地温度と、冷却用閉鎖空間内の温度差が最大となるような温度下に制御しておき、冷却用閉鎖空間内に培養容器を移動させて培地の冷却効率を上昇させる方法を採用した。その際、冷却用閉鎖空間内の温度を０℃とすることとしたので、冷却用閉鎖空間内に移動された培養容器に氷結晶が生じることは無く、冷却に伴う細胞への障害は排除できる。したがって、培地交換を実施することなく培養温度をより早く冷却することができる。また、組織処理がなされる温度へ培地温度が達し次第、速やかに気相温度を組織処理がなされる温度に戻し、培地温度が不必要に冷却されないようにした。
【００２７】
培地の温度の変化率を二次的に制御するため、培養容器周辺を高熱伝導性のゲル、金属等、或いは低熱伝導性を有する遮熱剤により、或いはそれらを組み合わせて被覆する方法を併用することとする。発明者による実験では、１分間あたりの温度変化率を、イ）０〜６．６℃、ロ）６．６℃〜８．３℃、ハ）８．３℃以上（あらかじめ冷却した培地への交換による冷却）とし、マウス由来３Ｔ３細胞を用いて培養表面における細胞接着率の評価を行った。これによると、イ）６５％以下、ロ）７２％、ハ）４３％となった。よって本方式は細胞の接着率の向上に寄与しており、冷却後においても７割以上の接着性が期待できるものである。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の一実施例を示すもので、冷却装置の全体システム構成を示す図である。
【図２】（Ａ），（Ｂ）は、一連の冷却過程についてのアルゴリズムを示す図である。
【図３】本発明の実施例による冷却用閉鎖空間の内部の経時的な気相、及び培地の温度の変化の一例を示す図である。
【図４】培養容器の周辺の気相温度を制御して培地温度の１分あたりの変化率を実際に計測した結果の一例を示すデータである。
【図５】各種の冷却条件に従い細胞を冷却したときの細胞の接着率について評価を行った結果を示す一例である。
【符号の説明】
【００２９】
１０…液体窒素貯蔵タンク、１１…ポンプ、１２…チューブ、１３…温度制御部、１４…冷却用閉鎖空間、１５…温度制御部、１６…コード、２０…気相用温度センサ、２１…培地用温度センサ、２２…加熱板、２３…培養容器、２４…扉、２５…被覆材、２６…開閉装置付きの冷却ガス弁。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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