(57)【要約】【課題】高い蛍光強度及び良好な経時安定性を有する蛍光性重合体微粒子を提供する。【解決手段】疎水性コアと親水性シェルからなるコアシェル構造を有する重合体粒子と、前記重合体粒子に内蔵されると共にランタノイド陽イオンを含有する蛍光性ランタノイド色素と、を含む蛍光性樹脂微粒子であって、前記疎水性コアを形成する重合体が、前記ランタノイド陽イオンへ配位可能な官能基を有することを特徴とする蛍光性重合体微粒子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性コアと親水性シェルからなるコアシェル構造を有する重合体粒子と、該重合体粒子に内蔵されると共にランタノイド陽イオンを含有する蛍光性ランタノイド色素と、を含む蛍光性樹脂微粒子であって、前記疎水性コアを形成する重合体が、前記ランタノイド陽イオンへ配位可能な官能基を有することを特徴とする蛍光性重合体微粒子。
【請求項２】
前記疎水性コアを形成する重合体が、下記一般式（Ｉ）で表される繰り返し単位を少なくとも１種含有することを特徴とする蛍光性重合体微粒子。
【化１】
2007126551.tif 000027
［一般式（Ｉ）中、Ｌは、２または３価の連結基を表し、Ｘはランタノイド陽イオンへ配位可能な官能基であると共に含窒素芳香族複素環基、カルボキシル基、１，３−ジケトン基、ホスフィンオキシド基、リン酸エステル基、亜リン酸エステル基及びホスホン酸エステル基からなる群より選択された基を表す。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、互いに同じでも異なってもよく水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、アルキル基、−ＣＯＯＲ４または−ＣＨ２ＣＯＯ−Ｒ４（ここで、Ｒ４は脂肪族基を表す。）を表す。］
【請求項３】
前記蛍光性ランタノイド色素が、下記一般式（Ｌ−Ｉ）で表される含窒複素環配位子を少なくとも１個有することを特徴とする請求項１又は２記載の蛍光性重合体微粒子。
【化２】
2007126551.tif 000028
［一般式（Ｌ−Ｉ）において、Ａ１、Ａ２、Ａ３は、下記一般式（Ｌ−II）〜（Ｌ−Ｖ）で表される原子団、または水酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アリールアミノ基、ジアリールアミノ基を表し、互いに同一であってもよい。Ｂ１、Ｂ２は、それぞれ独立に、窒素原子または＝Ｃ(−Ｒ)−を表し、Ｒは水素原子または置換基を表す。
【化３】
2007126551.tif 000029
各式中Ｒ１１〜Ｒ１９は、それぞれ水素原子または置換基を表す。Ｒ１７とＲ１８、Ｒ１８とＲ１９およびＲ１７とＲ１９は可能な場合には互いに結合して環を形成してもよい。ｎは０、１又は２を表す。Ｇは置換基を有してもよい炭素原子又は窒素原子を表す。Ｑは５員環又は６員環の含窒素複素環を形成するのに必要な原子団を表し、さらに含窒素複素環は縮合環を形成してもよい。Ａｒ１は芳香族炭素環、芳香族複素環を表す。一般式（Ｌ−II）〜（Ｌ−Ｖ）において、＃は一般式（Ｌ−Ｉ）で表される含窒素複素環と結合する位置を表す。］
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の蛍光性重合体微粒子と、該蛍光性重合体微粒子及び検出対象物質を連結可能な連結物質と、で構成された蛍光検出用複合体。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項記載の蛍光性重合体微粒子と、該蛍光性重合体微粒子及び検出対象物質を連結可能な連結物質とを用いて、該検出対象物質を検出することを特徴とする蛍光検出方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項記載の蛍光性重合体微粒子を含む蛍光検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光性重合体微粒子、蛍光検出キット及び蛍光検出方法に関し、特に、蛍光性重合体微粒子並びに、蛍光性重合体微粒子を含む蛍光検出キット及び蛍光性重合体微粒子を用いた蛍光検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微量な物質を視覚化又は定量するために、種々の標識物が開発されてきた。特に高感度を必要とする分野では、ラジオアイソトープが代表的な標識物であり、トリチウムや放射性ヨウ素等が代表例として用いられている。しかし、放射性物質の使用には、使用後の廃棄や取り扱いに多くの課題があるため、放射性物質に代わる手法が開発された。このような手法としては、例えば酵素標識法（ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、又はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ等が利用）や、蛍光物質標識法（フルオレッセイン又はローダミン等が利用）が挙げられる。
しかしこれらの方法では、標識としての絶対的感度が不足するという欠点がある。
【０００３】
測定の精度及び感度を上昇させるために、蛍光物質標識法の一つの発展型として時間分解蛍光測定が開発された（例えば、特許文献１）。この方法は、ユーロピウムキレートに代表される蛍光消光時間の長い蛍光物質にパルスの励起光を照射し、直接の励起光や周辺物質に起因する短い蛍光が消光する一定時間の後に蛍光を測定して、ユーロピウム特異的蛍光を測定する方法である。
更に、感度を上げるために、このユーロピウムキレートや色素をポリスチレン粒子に閉じこめ、ポリスチレン粒子の表面に抗原又は抗体をコートして試薬とし、抗原抗体反応によって固定化されたポリスチレン粒子を視覚的に検出しようとする試みもなされている（例えば、特許文献２）。
【０００４】
しかし、色素や蛍光物質をポリスチレン粒子に閉じこめて標識物質とする公知の方法では、簡便な操作で或る程度の感度が得られるものであるが、感度的に満足できるものでなく、更なる高感度化が求められていた。
更に、表面が疎水性ポリスチレンであるという特質から、（１）コートしたい抗原又は抗体等の機能性分子を結合した後、非結合表面にタンパク質や種々の生体物質の類似物質をコートしてポリスチレンの疎水性を覆い隠す方法、あるいは、（２）反応時に液体中に界面活性剤を加えてポリスチレン粒子が相互に影響し合うのを防ぐ方法等といった種々の工夫をして用いてきた。しかし、それでも非特異的な反応による判定の誤りが生まれることがあった。
【０００５】
一方、ポリスチレン粒子に起因する非特異的反応を改良するために、水不溶性高分子化合物からなるコアと反応性基を有する水溶性シェル部分からなるコアシェル型微粒子を作成し、コア部分に蛍光色素を封入する技術及び、これによって得られた高い蛍光強度を安定して有する蛍光分析用組成物などが開発された（例えば、特許文献３及び４）。
【特許文献１】特開昭６１−１２８１６８号公報。
【特許文献２】特開２０００−３４５０５２号公報。
【特許文献３】国際公開第２００２／０９７４３６号パンフレット
【特許文献４】特開２００５−４９２０７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、このコアシェル型微粒子を利用した方法では、非特異的な反応によるノイズが抑制できるものの、蛍光強度的には満足できるものでない。また、経時安定性が低く、使用期間中に蛍光強度が減少することがある。
本発明の目的は、高い蛍光強度及び良好な経時安定性を有する蛍光性重合体微粒子と、このような蛍光性重合体微粒子を用いて検出対象物質を高感度に検出することができると共に良好な保存安定性を有する蛍光検出用複合体、蛍光検出キット及び蛍光検出方法とを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記の目的を達成すべく、特に微粒子のポリマーに関して、鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち、本発明は、以下の通りである。
【０００８】
（１）疎水性コアと親水性シェルからなるコアシェル構造を有する重合体粒子と、該重合体粒子に内蔵されると共にランタノイド陽イオンを含有する蛍光性ランタノイド色素と、を含む蛍光性樹脂微粒子であって、前記疎水性コアを形成する重合体が、前記ランタノイド陽イオンへ配位可能な官能基を有することを特徴とする蛍光性重合体微粒子。
（２）上記（１）において、前記疎水性コアを形成する重合体が、下記一般式（Ｉ）で表される繰り返し単位を少なくとも１種含有することを特徴とする蛍光性重合体微粒子。
【０００９】
【化１】
2007126551.tif 000002
【００１０】
［一般式（Ｉ）中、Ｌは、２または３価の連結基を表し、Ｘはランタノイド陽イオンへ配位可能な官能基であると共に含窒素芳香族複素環基、カルボキシル基、１，３−ジケトン基、ホスフィンオキシド基、リン酸エステル基、亜リン酸エステル基及びホスホン酸エステル基からなる群より選択された基を表す。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、互いに同じでも異なってもよく水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、アルキル基、−ＣＯＯＲ４または−ＣＨ２ＣＯＯ−Ｒ４（ここで、Ｒ４は脂肪族基を表す。）を表す。］
（３）上記（１）又は（２）において、前記蛍光性ランタノイド色素が、下記一般式（Ｌ−Ｉ）で表される含窒複素環配位子を少なくとも１個有することを特徴とする蛍光性重合体微粒子。
【００１１】
【化２】
2007126551.tif 000003
【００１２】
一般式（Ｌ−Ｉ）において、Ａ１、Ａ２、Ａ３は、下記一般式（Ｌ−II）〜（Ｌ−Ｖ）で表される原子団、または水酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アリールアミノ基、ジアリールアミノ基を表し、互いに同一であってもよい。Ｂ１、Ｂ２は、それぞれ独立に、窒素原子または＝Ｃ(−Ｒ)−を表し、Ｒは水素原子または置換基を表す。
【００１３】
【化３】
2007126551.tif 000004
【００１４】
各式中Ｒ１１〜Ｒ１９は、それぞれ水素原子または置換基を表す。Ｒ１７とＲ１８、Ｒ１８とＲ１９およびＲ１７とＲ１９は可能な場合には互いに結合して環を形成してもよい。ｎは０、１又は２を表す。Ｇは置換基を有してもよい炭素原子又は窒素原子を表す。Ｑは５員環又は６員環の含窒素複素環を形成するのに必要な原子団を表し、さらに含窒素複素環は縮合環を形成してもよい。Ａｒ１は芳香族炭素環、芳香族複素環を表す。一般式（Ｌ−II）〜（Ｌ−Ｖ）において、＃は一般式（Ｌ−Ｉ）で表される含窒素複素環と結合する位置を表す。
【００１５】
（４）上記（１）〜（３）のいずれか１項記載の蛍光性重合体微粒子と、該蛍光性重合体微粒子及び検出対象物質を連結可能な連結物質と、で構成された蛍光検出用複合体。
（５）上記（１）〜（３）のいずれか１項記載の蛍光性重合体微粒子と、該蛍光性重合体微粒子及び検出対象物質を連結可能な連結物質とを用いて、該検出対象物質を検出することを特徴とする蛍光検出方法。
（６）  上記（１）〜（３）のいずれか１項記載の蛍光性重合体微粒子を含む蛍光検出キット。
【００１６】
本発明では、コアシェル型の蛍光重合体微粒子の疎水性コアを形成する重合体が、ランタノイド陽イオンへ配位可能な官能基を有するので、疎水性コアを形成する重合体とランタノイド色素の相互作用が強化されて、蛍光性重合体微粒子に蛍光性ランタノイド色素を安定的に内蔵することができる。これにより、ランタノイド色素が微粒子中からの遊離が抑制され、保存や使用によって時間が経過しても、蛍光性重合体微粒子の蛍光強度を維持することができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、高い蛍光強度及び良好な経時安定性を有する蛍光性重合体微粒子と、このような蛍光性重合体微粒子を用いて検出対象物質を高感度に検出することができると共に良好な保存安定性を有する蛍光検出用複合体、蛍光検出キット及び蛍光検出方法とを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の蛍光性重合体微粒子は、疎水性コアと親水性シェルからなるコアシェル構造を有する重合体粒子と、前記重合体粒子に内蔵されると共にランタノイド陽イオンを含有する蛍光性ランタノイド色素と、を含む蛍光性樹脂微粒子であって、前記疎水性コアを形成する重合体が、前記ランタノイド陽イオンへ配位可能な官能基を有することを特徴としている。
以下、本発明を更に詳細に説明する。
【００１９】
＜重合体粒子＞
本発明の重合体粒子は、疎水性コアと親水性シェルからなるコアシェル構造を有し、疎水性コアを形成する重合体に、ランタノイド陽イオンへ配位可能な官能基が含まれていることを特徴としている。これにより、後述する蛍光性ランタノイド色素を均一に高濃度で含有して非特異的反応を低くすることができると共に、疎水性コアを形成する重合体とランタノイド色素の相互作用が強化されて、蛍光性ランタノイド色素を安定的に内蔵することができる。
【００２０】
ここでランタノイド陽イオンへ配位可能な官能基とは、後述する蛍光性ランタノイド色素中のランタノイド陽イオンに対して配位可能な官能基であればよい。本発明において好ましい配位可能な官能基とは、官能基中に電子供与性非共有電子対を有する官能基または酸性官能基である。酸性官能基の場合にはアルカリ金属塩であってもよい。ランタノイド陽イオンへ配位可能な官能基とすることができるものとして、含窒素芳香族複素環基、カルボン酸基、１，３−ジケトン基、ホスフィンオキシド基、リン酸エステル基、亜リン酸エステル基、ホスホン酸エステル基、リン酸基、亜リン酸基、スルホン酸基、ボロン酸基、ポリエーテル基、３級アミノ基およびこれらの組み合わせにより形成できる官能基を挙げることができる。
【００２１】
このようなランタノイド陽イオンへ配位可能な官能基としては、下記一般式（Ｉ）で表される繰り返し単位を少なくとも１種含有するものが、ランタノイド陽イオンとの相互作用及び重合体微粒子形成容易性の観点から好ましい。
【００２２】
【化４】
2007126551.tif 000005
【００２３】
一般式（Ｉ）において、Ｌは、２または３価の連結基を表す。
Ｌが２価の連結基の場合、例として、単結合、炭素数１〜１０のアルキレン基、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−（ＣＨ２）ｎＣＯＯ−、−（ＣＨ２）ｎＯＣＯ−、−Ｏ−、−ＳＯ２−、−ＣＯＮＨＣＯＯ−、−ＣＯＮＨＣＯＮＨ−、−ＣＯＮ（Ｒ５）−、−ＣＯＮ（Ｒ５）ＣＨ２−、−ＣＯＮ（Ｒ５）−Ｃ６Ｈ４−、−ＳＯＮＲ５―（これらのうちＲ５は水素原子または炭素数１〜２２のアルキル基等の炭化水素基を示し、ｎは１〜４の整数を示す）、または
【００２４】
【化５】
2007126551.tif 000006
【００２５】
（ここでＬ１は単結合、−Ｏ−、−ＯＣＯ−、−ＣＯＯ−、又は−ＣＨ２Ｎ（Ｒ５）ＣＨ２−を表し、Ｒ５は前記と同意である）、およびこれらの組み合わせにより形成できる２価又は３価の原子団を挙げることができる。
Ｌが、３価の連結基の場合、好ましい例として、以下のものを挙げることができる。
【００２６】
【化６】
2007126551.tif 000007
【００２７】
一般式（Ｉ）中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、互いに同じでも異なってもよく、水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、アルキル基、−ＣＯＯＲ４または−ＣＨ２ＣＯＯ−Ｒ４（ここで、Ｒ４は脂肪族基を表す。）
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、好ましくは、互いに同じでも異なってもよく、各々水素原子、ハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子等）、シアノ基、アルキル基（好ましくは炭素数１〜３のアルキル基）、−ＣＯＯ−Ｒ４または−ＣＨ２ＣＯＯ−Ｒ４（ここで、Ｒ４は、好ましくは炭素数１〜２２の脂肪族基を表し、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ヘキシル基、オクチル基、デシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル基、オクタデシル基、ドコシル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、ヘプテニル基、オクテニル基、デセニル基、ドデセニル基、テトラデセニル基、ヘキサデセニル基、オクタデセニル基等）が挙げられる。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３またはＲ４が置換基を有する場合、置換基の例としてアリール基、アミノ基、複素環基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アミド基、ウレイド基およびハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）などが挙げられる。ここで挙げた置換基の例において、水素原子以外の原子数は１乃至５０が好ましく、より好ましくは１乃至３０であり、１乃至２０が最も好ましい。また、置換基がアルキル基を含む場合には環状であっても、鎖状であってもよく、鎖状の場合には直鎖でも分枝しているものであってもよく、飽和であっても不飽和結合を含むものであってもよい。
【００２８】
より好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、各々、水素原子、炭素数１〜３のアルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基等）を表す。
【００２９】
一般式（Ｉ）中Ｘは、ランタノイド陽イオンへ配位可能な官能基である含窒素芳香族複素環基、カルボン酸基、１，３−ジケトン基、ホスフィンオキシド基、リン酸エステル基、亜リン酸エステル基、ホスホン酸エステル基及びボロン酸基を表す。
含窒素芳香族複素環としては、重合体微粒子形成容易性および、微粒子中へのランタノイド色素の保持性の観点より炭素数３〜２０のものが好ましく、具体例として、ピロール、イミダゾール、トリアゾール、ピリジン、ピラジン、トリアジン、オキサゾール、チアゾール、インドール、ベンゾイミダゾール、ベンゾオキサゾール、キノリン、カルバゾール、ジピリジン、ターピリジン、フェナントロリンを挙げることができる。
カルボン酸基、１，３−ジケトン基、リン酸基、亜リン酸基、スルホン酸基、ボロン酸基は、アルカリ金属（リチウム、ナトリウム、カリウム等）の塩であってもよい。
１，３−ジケトン基は、下記一般式（II）で表される構造を表す。
【００３０】
【化７】
2007126551.tif 000008
【００３１】
ここで、Ｒ６は炭素数１〜６のアルキル基（メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基）、炭素数１〜６のフッ化アルキル基（トリフルオロメチル基、テトラフルオロエチル基等）、炭素数６〜１０の芳香族炭素環基（フェニル基、ナフチル基）、炭素数３〜１０の芳香族複素環基（ピリジル基、トリアジノ基、ピラジノ基、キノキサリノ基）を挙げることができ、これらのうち、メチル基、トリフルオロメチル基が重合体微粒子形成容易性および、微粒子中へのランタノイド色素の保持性の観点より好ましい。
ホスフィンオキシド、リン酸エステル、亜リン酸エステル、ホスホン酸エステル基は、それぞれ下記一般式（III）、（IV）、（Ｖ）、（VI）で表される構造を表す。
【００３２】
【化８】
2007126551.tif 000009
【００３３】
上記一般式（III）〜（VI）において、Ｒ７は、アルキレン基、アリーレン基を表し、Ｒ８、Ｒ９は、互いに同じでも異なってもよく、アルキル基、フルオロアルキル基、芳香族炭素環基を表す。好適なＲ７としては、炭素数１〜１０のアルキレン基（例えばメチレン基、エチレン基、プロピレン基、キシリレン基等）、炭素数６〜１２のアリーレン基（例えばフェニレン基、ナフチレン基等）を挙げることができる。Ｒ８、Ｒ９としては、炭素数１〜１０の直鎖、環状または分岐のアルキル基（例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ヘキシル基、オクチル基、イソプロピル基、イソブチル基、シクロヘキシル基）、炭素数１〜１０のフルオロアルキル基（例えばトリフルオロメチル基、ペンタフルオロメチル基、ヘプタフルオロプロピル基、ノナフルオロブチル基、ヘプタフルオロイソプロピル基、ノナフルオロイソブチル基）、炭素数６〜２０の芳香族炭素環基（例えばフェニル基、ナフチル基、アントラセニル基、ピレニル基）を挙げることができる。
【００３４】
一般式（Ｉ）で表される繰り返し単位は、下記一般式（VII）で表される、エチレン性不飽和結合を有する化合物を、後述のラジカル発生剤の存在下ラジカル重合することによってポリマー中に導入することができる。
【００３５】
【化９】
2007126551.tif 000010
【００３６】
上記一般式（VII）において、Ｌ、Ｘ及びＲ１、Ｒ２、Ｒ３は、前記一般式（Ｉ）のＬ、Ｘ及びＲ１、Ｒ２、Ｒ３と同じ意味を表す。
以下、本発明の重合体粒子に用いる一般式（VII）で表される化合物の好ましい具体的を挙げるが、これにより本発明は限定されるものではない。
【００３７】
【化１０】
2007126551.tif 000011
【００３８】
【化１１】
2007126551.tif 000012
【００３９】
【化１２】
2007126551.tif 000013
【００４０】
【化１３】
2007126551.tif 000014
【００４１】
上記の例示化合物は、市販されているものは、必要に応じ精製を行い使用することができる。市販されていない場合は、入手できる化合物を、公知の反応条件において反応させることにより合成することができる。
例えば、前記Ｍ−８、Ｍ−１９は下記の反応により合成することができる。
【００４２】
【化１４】
2007126551.tif 000015
【００４３】
他の例示化合物も、それぞれに対応した原材料を選択することにより同様な反応経路にて合成することができる。
【００４４】
疎水性コア部分を形成する重合体は、上記のランタノイド陽イオンへ配位可能な官能基を含む水不溶性高分子化合物であって、しかも、コア部分を形成した際に、その内部に蛍光性ランタノイド色素を封入することができる高分子化合物である限り、特に限定されるものではない。
疎水性コアを形成する水不溶性高分子化合物としては、後述するスチレン系樹脂または（メタ）アクリル系樹脂が好ましく、特に紫外線を光源として用いる場合には、透明性の点からは（メタ）アクリル系樹脂が更に好ましい。
【００４５】
前記水不溶性高分子化合物としては、例えば、疎水性ポリマー［例えば、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）、ポリイソプレン、ポリ塩化ビニル、ポリ乳酸、ポリラクトン、又はポリラクタムなどを挙げることができる。前記のコア部分は、前記の水不溶性高分子化合物１種類のみから実質的に形成されているか、又は前記の水不溶性高分子化合物２種類以上の組み合わせから実質的に形成されていることができる。
【００４６】
また水不溶性高分子化合物としては、粒子形成容易性の観点から、上記一般式（VII）で表される化合物に加えて、公知のラジカル重合性モノマーを併用することが好ましい。公知のラジカル重合性モノマーとしては、例えば、スチレン、メチルスチレン、クロロメチルスチレン、４−メトキシスチレン、４−アセトキシスチレン等のスチレン系モノマー、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸ヘキシル、（メタ）アクリル酸オクチル、（メタ）アクリル酸２−エチルヘキシル、（メタ）アクリル酸シクロヘキシル、（メタ）アクリル酸ドデシル、（メタ）アクリル酸ステアリル、（メタ）アクリル酸フェニル、（メタ）アクリル酸ベンジル、（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチル等の（メタ）アクリル酸エステル類を挙げることができる。
【００４７】
また、粒子の強度向上の観点から、粒子ポリマーに架橋構造を導入することが可能である。このためには、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメタクリレート等の２価のラジカル重合性モノマーを使用することが好ましい。２価のラジカル重合性モノマーは、粒子を形成する全ラジカル重合性モノマーに対し、１〜２０モル％の範囲で使用することができ、２〜１０モル％が更に好ましい。
【００４８】
本重合体粒子において、前記一般式（VII）で表されるエチレン性不飽和結合を有する化合物は、疎水性コア部として使用する全モノマー中、１〜１００モル％の範囲で使用することができ、重合体微粒子形成容易性及び微粒子中へのランタノイド色素の保持性の観点から好ましくは２〜８０モル％であり、更に好ましくは、５〜５０モル％である。
【００４９】
前記コア部分の形状は特に限定されるものではないが、一般的には大略球状あるいは大略楕球状である。また、前記コア部分の寸法も特に限定されるものではなく、用途に応じて適宜変化させることができるが、大略球状のコア部分の直径は、一般的には５ｎｍ〜５００ｎｍ程度である。
【００５０】
シェル部分を形成するのに用いることのできる化合物は、直鎖状の水溶性高分子化合物（即ち、水溶性マクロモノマー）であり、その一方の末端（結合末端）でコア部分の表面と結合することができると共に、もう一方の末端（自由末端）に反応性官能基を有するか、あるいは、反応性官能基を導入することができ、しかも、前記コア部分の表面にブラシ状に配置することが可能である限り、特に限定されるものではない。
【００５１】
本発明において、「コア部分の表面をブラシ状に覆うシェル部」とは、シェル部が多数の直鎖状水溶性高分子化合物からなり、それら直鎖状水溶性高分子化合物の各々が一方の結合末端でコア部分の表面と結合し、しかも、もう一方の自由末端が、少なくとも水溶性高分子化合物と連結物質（例えば、抗原又は抗体）とを反応させる反応液中において、その反応液の系中に糸状又は棒状に表面から突出していることを意味する。また、これらのブラシ状の水溶性高分子化合物鎖の自由末端には、それぞれ連結物質［例えば、生理活性物質（例えば、抗体、酵素、又はＤＮＡ）］と結合可能な反応性官能基が存在するので、シェル部分の最外殻は、多数の反応性官能基で覆われている。
【００５２】
前記水溶性高分子化合物としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸ジメチルアミノエチル、又はポリアリルアミンなどを挙げることができ、ＰＥＧ又はポリビニルアルコールが好ましい。これらの分子量として特に制限されないが、重合体粒子の粒径制御、分散安定性の観点から数平均分子量５００〜２００，０００であることが好ましく、１０００〜１００，０００であることが更に好ましい。
本発明において、シェル部を構成する水溶性高分子化合物鎖は、各水溶性高分子化合物鎖が前記の水溶性高分子化合物１種類のみから実質的に形成されているか、又は各水溶性高分子化合物鎖が相互に異なる前記の水不溶性高分子化合物２種類以上の組み合わせから実質的に形成されていることができる。
【００５３】
前記水溶性高分子化合物鎖の自由末端に存在する反応性官能基は、前記水溶性高分子化合物の一方の末端（結合末端）をコア部分表面に結合させる前からもう一方の末端（自由末端）に存在するか、あるいは、前記水溶性高分子化合物の一方の末端（結合末端）をコア部分表面に結合させた後からもう一方の末端（自由末端）に導入することができる。
【００５４】
これらの反応性官能基は、いずれも水（又は水系溶媒）中で安定であり、しかも、本発明の蛍光性重合体粒子を標識物質として使用する際の連結物質［例えば、生理活性物質（例えば、抗体、酵素、又はＤＮＡ）］と反応可能な官能基である限り、特に限定されるものではない。重合体微粒子表面に設ける官能基として好適なのは、アルデヒド基、カルボキシル基、メルカプト基、酸塩化物基等の酸ハロゲン化物基、酸無水物基、エステル基、アミド基、マレイミド基、ビニルスルホン基、メタンスルホニル基、チオール基、水酸基、およびアミノ基等で、中でもアルデヒド基、カルボキシル基、酸塩化物基、酸無水物基、マレイミド基、チオール基、アミノ基等が更に好適で、アルデヒド基、マレイミド基、チオール基及びアミノ基が最も好適である。なお、エステル基は加水分解により容易にカルボキシル基に変換できるので、エステル基を表面に有する重合体微粒子は有用な中間体である。
これらの連結物質を結合するための官能基量は、本発明の重合体微粒子の単位質量当たりの官能基当量として表現すると、通常、０．００１〜１０ミリ当量／グラム、好ましくは０．００５〜５ミリ当量／グラム、より好ましくは０．０１〜１ミリ当量／グラムとする。
【００５５】
重合体微粒子の粒径には特に制限はないが、通常、体積平均粒径として０．０１〜２０μｍの範囲とする。特に蛍光検出用複合体として用いる場合には、体積平均粒径が０．０５〜２μｍであることが好ましい。この値が大きすぎると沈降性等の理由で好ましくなく、逆に小さすぎると発光特性の点で好ましくない。こうした理由で、本発明の重合体微粒子の体積平均粒径はより好ましくは０．０５〜１μｍ、更に好ましくは０．０５〜０．５μｍ、最も好ましくは０．０５〜０．３μｍとする。
このような重合体微粒子において前記コア部分の直径と前記シェル部分の厚さとの比率は、用途に応じて適宜変化させることができる。例えば、コア部分の直径を、例えば、５ｎｍ〜５００ｎｍとすることができ、また、シェル部分の厚さを、例えば、５ｎｍ〜５００ｎｍとすることができる。
上記疎水性コアを形成する重合体に関する事項については、特開平７−３１６２４４号公報、特開平８−１８３７６０号公報、ＷＯ２００２／０９７４３６号公報に記載のコアシェル型粒子に関する記載を適宜適用することもできる。
【００５６】
＜重合体微粒子の製造方法＞
本発明にかかる重合体微粒子は、これまで報告されている様々なコア−シェル型粒子を調製する方法が適用可能である。前記公知方法としては、例えば、反応性官能基を有する水溶性高分子化合物、即ち水溶性マクロモノマーを分散剤として、水不溶性高分子化合物、即ちラジカル重合性モノマーをラジカル重合させる分散重合法を挙げることができる。この場合、ラジカル発生剤としては、前述のラジカル発生剤を用いることができる。
【００５７】
重合においては、水溶性マクロモノマーとラジカル重合性モノマーとを全量、水又は含水有機溶媒中に混合溶解し、ラジカル発生剤を添加する方法が可能であるが、反応温度及び粒子径を制御するために、水溶性マクロモノマーを予め溶解した水又は含水有機溶媒中に、ラジカル重合性モノマー及びラジカル発生剤を徐々に添加する方法も好ましい。
水溶性マクロモノマーは、重合体粒子の分散安定性の観点からラジカル重合性モノマーの全モルに対し、０．１〜３００モル％の範囲で使用することができ、１〜２００モル％がより好ましく、２〜１００モル％が更に好ましい。
【００５８】
好適な含水有機溶媒としては、例えば、水とメタノール、エタノール、アセトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルフォルムアミド、テトラヒドロフラン等との混合物が挙げられるが、水が分散媒として最適である。
上述した水溶性マクロモノマーに加えて使用可能な好適な分散安定剤としては、例えば、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム等のスルホン酸塩、パルミチン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム等のカルボン酸塩等の陽イオン性界面活性剤、テトラエチルアンモニウム等の４級オニウム塩を結合した陰イオン性界面活性剤、ポリエチレングリコール鎖等の水溶性構造を結合した非イオン性界面活性剤、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルピリジン、ポリビニルアルコール等の水溶性高分子等が挙げられる。
【００５９】
ラジカル発生剤としては、水溶性のラジカル発生剤、例えば過硫酸ナトリウム、過硫酸カリウム、過硫酸リチウム、過硫酸アンモニウム等の過硫酸塩等、ラジカル重合性モノマーまたは含水有機溶媒に溶解性のもの、例えば、Ｎ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、Ｎ，Ｎ−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）等のアゾ化合物、過酸化ベンゾイル等の過酸化物等を使用することができ、異種のラジカル開始剤を併用しても構わない。
ラジカル発生剤は、ラジカル重合性モノマーの全モル量に対して、０．０１〜５モル％の範囲で使用することが好ましく、０．１〜３モル％がより好ましい。
【００６０】
反応温度は、使用する開始剤の分解温度に応じて適宜設定できるが、４０℃〜１００℃が好ましく、６０〜８０℃がより好ましい。
なお、本発明の蛍光性重合体微粒子において、本発明の趣旨を著しく損なわない限り、任意の添加剤、例えばトリオクチルホスフィンオキシドやトリブチルホスフィンオキシド等の有機リン化合物のように、ランタノイド陽イオンに配位することで水和等による蛍光強度の低下を抑制することができる添加剤を使用することも可能であり、かかる添加剤は重合時のモノマー溶液に予め添加しておくことが好適である。
【００６１】
＜蛍光性ランタノイド色素＞
本発明に用いられる蛍光性ランタノイド色素とは、ランタノイド陽イオンと有機配位子からなる蛍光色素である。この蛍光色素は、配位子の増感作用（配位子を励起する光のエネルギーによりランタノイド陽イオンが発光する現象）を示す錯体である。
ランタノイド陽イオンとしては、２〜４価の陽イオンをあげることができ、具体例として、Ｃｅ３＋，Ｐｒ３＋，Ｎｄ３＋，Ｎｄ４＋，Ｓｍ２＋，Ｓｍ３＋，Ｅｕ２＋，Ｅｕ３＋，Ｔｂ３＋，Ｄｙ３＋，Ｄｙ４＋，Ｈｏ３＋，Ｅｒ３＋，Ｔｍ２＋，Ｔｍ３＋，Ｙｂ２＋，Ｙｂ３＋等が挙げられ、中でも、Ｐｒ３＋，Ｎｄ３＋，Ｓｍ３＋，Ｅｕ３＋，Ｔｂ３＋，Ｄｙ３＋，Ｈｏ３＋，Ｅｒ３＋，Ｔｍ３＋，Ｙｂ３＋等の３価陽イオンは、紫外〜近赤外領域、長い寿命、狭い波長幅等の特徴を持つ蛍光を発することから好適であり、中でもＮｄ３＋，Ｓｍ３＋，Ｅｕ３＋，Ｔｂ３＋，Ｄｙ３＋，およびＴｍ３＋が更に好適であり、Ｅｕ３＋およびＴｂ３＋が発光強度の点で最も好適である。
【００６２】
有機配位子としては、公知のランタノイド陽イオンの有機配位子を用いることができる。
有機配位子としては、ランタノイド陽イオンへの増感作用を示す限りにおいて特に制限はないが、芳香族アミン類（Helv.Chim.Acta, Vol.79, P.789,1966）、β―ジケトン類（Anal.Chem. Vol.70, P.596-601,1998）、芳香族基含有カルボン酸類（Chem.Mater., Vol.10, 286-296）、特開２０００−３４５０５２号公報）を挙げることができる。具体例として、４，４，４−トリフルオロ−１−（２−チエニル）−１，３−ブタンジオン、４，４，４−トリフルオロ−１−フェニル−１，３−ブタンジオン、４，４，４−トリフルオロ−１−（２−ナフチル）−１，３−ブタンジオンを挙げることができる。芳香族カルボン酸としては、フォーカルポイントにカルボキシレート基を有しかつ繰り返し単位に芳香環を有するデンドロンを挙げることができる。
また、これらの配位子とともに、ランタノイド色素の蛍光強度低下を抑制する目的で、ホスフィンオキシド類、リン酸エステル類、スルホキシド類、亜リン酸エステル類、ホスフィン類、スルフィド類、アミン類、窒素含有芳香族複素環化合物を同時に用いることができる。
【００６３】
更に配位子として、高蛍光強度及び長い蛍光寿命を有する一般式（Ｌ−Ｉ）で表される含窒複素環配位子を用いることが好ましい。
【００６４】
【化１５】
2007126551.tif 000016
【００６５】
一般式（Ｌ−Ｉ）において、Ａ１、Ａ２、Ａ３は、下記一般式（Ｌ−II）〜（Ｌ−Ｖ）で表される原子団、または水酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アリールアミノ基、ジアリールアミノ基を表し、互いに同一であってもよい。アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アリールアミノ基、ジアリールアミノ基である場合には、それぞれ重合体微粒子への取り込まれやすさ、溶剤溶解性の観点から炭素数１乃至１２であることが好ましい。
Ａ１、Ａ２、Ａ３は、蛍光強度、励起波長の調節、ランタノイドイオンとの親和性調節、重合体微粒子への取り込まれやすさ、溶剤溶解性の観点から下記一般式（Ｌ−II）〜（Ｌ−Ｖ）で表される原子団であることが好ましい。
【００６６】
【化１６】
2007126551.tif 000017
【００６７】
各式中Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ水素原子または置換基を表すが、置換基の例としてアルキル基、アリール基、アミノ基、複素環基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アミド基、ウレイド基およびハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）などが挙げられる。ここで挙げた置換基の例において、水素原子以外の原子数は１乃至５０が好ましく、より好ましくは１乃至３０であり、１乃至２０が最も好ましい。また、置換基がアルキル基を含む場合には環状であっても、鎖状であってもよく、鎖状の場合には直鎖でも分枝しているものであってもよく、飽和であっても不飽和結合を含むものであってもよい。アルキル基やアリール基が置換基を有している場合、好ましい置換基の例としてはアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロ環基、シリル基、アルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アシルアミノ基、スルホニルアミノ基、アシル基、スルホニル基、ホルミル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、スルファモイル基、ハロゲン原子、シアノ基、スルホ基またはカルボキシル基などが挙げられる。
【００６８】
Ｒ１３〜Ｒ１６はそれぞれ独立に水素原子または置換基を表す。Ｒ１３〜Ｒ１６が置換基を表す場合、好ましい例としては置換されてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、複素環基、シリル基、アルコキシ基、アミノ基、アシルアミノ基、スルホニルアミノ基、アシル基、スルホニル基、ホルミル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、スルファモイル基、ハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、シアノ基、スルホ基またはカルボキシル基であり、より好ましくは置換されてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アシルアミノ基、スルホニルアミノ基またはハロゲン原子またはシアノ基である。
Ｒ１３〜Ｒ１６に関して、水素を除いた原子数は１〜６０が好ましく、１〜４５がより好ましく、１〜３５が最も好ましい。
【００６９】
Ｒ１７、Ｒ１８及びＲ１９は水素原子または置換基を表し、Ｒ１７とＲ１８、Ｒ１８とＲ１９及びＲ１７とＲ１９は互いに結合して環を形成してもよい。ここで、置換基とは、アルキル基、アリール基、カルボアミド基、スルホンアミド基、アルキオチオ基、複素環基、アルコキシ基、アリールオキシ基及びこれらの組合からなる群から選択される置換基を示す。ｎは０、１又は２を表す。  Ｒ１７〜Ｒ１９に関して、水素を除いた原子数は１〜６０が好ましく、１〜４５がより好ましく、１〜３５が最も好ましい。
Ｇは、炭素原子又は窒素原子を表すが、炭素原子の場合には置換基を有していてもよく、この場合の置換基としてはＲ１１およびＲ１２の例で挙げたものが使用できる。
Ｑは５又は６員の含窒素複素環を形成するのに必要な原子群を表し、さらに該含窒素複素環は縮合環を形成していてもよい。また、Ｒ１７、Ｒ１８又はＲ１９と結合して環を形成してもよい。
【００７０】
以下にＱとして好ましい複素環の例を挙げる。以下の例においては複素環の骨格を表すものであり、部分的に飽和された骨格として用いられてもよく、ヘテロ原子の位置はそれぞれの環系で適宜選択が可能であり、縮合環については任意の位置で縮合してもよい。また、これらの環の組み合わせで表される環であってもよい。
ピロール、ピラゾール、イミダゾール、トリアゾール、テトラゾール、チオフェン、フラン、オキサゾール、チアゾール、オキサジアゾール、チアジアゾール、セレナゾール、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、トリアジン、テトラジン、オキサジン、チアジン、オキサジアジン、チアジアジン、ピロロピロール、インドール、ピロロピラゾール、ピロロイミダゾール、ピロロトリアゾール、ピロロテトラゾール、チエノピロール、ピロロオキサゾール、チエノピロール、ピロロオキサゾール、ピロロチアゾール、ピロロピリジン、ピロロピリミジン、ピロロピラジン、ピロロピリダジン、ピロロトリアジン、ピロロテトラジン、ピロロオキサジン、ピロロチアジン、ピロロオキサジン、ピロロチアジアジン、インダゾール、ベンズイミダゾール、ベンゾトリアゾール、ベンゾチオフェン、ベンゾフラン、ベンゾオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾオキサジアゾール、ベンゾチアジアゾール、ベンゾセレナゾール、キノリン、キナゾリン、キノキサリン、フタラジン、ベンゾトリアジン、ベンゾオキサジン、ベンゾチアジン、ピラゾロピラゾール、ピラゾロオキサゾール、ピラゾロチアジアゾール、ピラゾロピリジン、ピラゾロピリミジン、ピラゾロピラジン、ピラゾロピリダジン、ピラゾロトリアジン、ピラゾロオキサジン、ピラゾロチアジン、ピラゾロチアジアジン、イミダゾロピラゾール、ピラゾロトリアゾール、ピラゾロテトラゾール、チエノピラゾール、フロピラゾール、ピラゾロオキサゾール、イミダゾロイミダゾール、イミダゾロトリアゾール、イミダゾロテトラゾール、チエノイミダゾール、フロイミダゾール、イミダゾロオキサゾール、チエノイミダゾール、イミダゾロオキサジアゾール、イミダゾロチアジアゾール、イミダゾロセレナゾール、イミダゾロピリジン、イミダゾロピリミジン、イミダゾロピラジン、イミダゾロピリダジン、イミダゾロトリアジン、イミダゾロオキサジン、イミダゾロチアジン、イミダゾロオキサジアジン、イミダゾロチアジアジン、トリアゾロトリアゾール、チエノトリアゾール、フロトリアゾール、トリアゾロオキサゾール、トリアゾロチアゾール、トリアゾロオキサジアゾール、トリアゾロチアジアゾール、トリアゾロピリジン、トリアゾロピリミジン、トリアゾロピラジン、トリアゾロピリダジン、トリアゾロトリアジン、トリアゾロオキサジン、トリアゾロチアジン、トリアゾロオキサジアジン、トリアゾロチアジアジン、テトラゾロオキサゾール、テトラゾロチアゾール、テトラゾロピリジン、テトラゾロピリミジン、テトラゾロピラジン、テトラゾロピリダジン、テトラゾロオキサジン、テトラゾロチアジン、チエノチオフェン、チエノフラン、チエノオキサゾール、チエノチアゾール、チエノオキサジアゾール、チエノチアジアゾール、チエノセレナゾール、チエノピリジン、チエノピリミジン、チエノピラジン、チエノピリダジン、チエノトリアジン、チエノテトラゾール、チエノオキサジン、チエノチアジン、チエノオキサジアジン、チエノチアジアジン、フロオキサゾール、フロチアゾール、フロオキサジアゾール、フロチアジアゾール、フロピリジン、フロピリミジン、フロピラジン、フロピリダジン、フロトリアジン、フロオキサジン、フロチアジン、オキサゾロオキサゾール、チアゾロオキサゾール、オキサゾロオキサジアゾール、オキサゾロチアジアゾール、オキサゾロピリジン、オキサゾロピリミジン、オキサゾロピラジン、オキサゾロピリダジン、オキサゾロトリアジン、オキサゾロオキサジン、オキサゾロチアジン、オキサゾロオキサジアジン、オキサゾロチアジアジン、チアゾロチアゾール、チアゾロオキサジアゾール、チアゾロオキサジアゾール、チアゾロセレナゾール、チアゾロピリジン、チアゾロピリミジン、チアゾロピラジン、チアゾロピリダジン、チアゾロトリアジン、チアゾロオキサジン、チアゾロチアジン、チアゾロオキサジアジン、チアゾロチアジアジン、ジチオール、ジオキソール、ベンゾジチオール、ベンゾジオキソール。
Ｑに関して、水素を除いた原子数は４〜７０が好ましく、５〜５５がより好ましく、６〜４５が最も好ましい。
【００７１】
Ｂ１、Ｂ２は、それぞれ独立に、窒素原子または＝Ｃ（−Ｒ）−を表し、Ｒは水素原子または置換基を表す。Ｂ１及びＢ２のうち少なくとも一方が窒素原子を表すことが好ましい。
Ｒは水素原子または置換基を表す。Ｒが置換基を表す場合、好ましくは置換されてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、複素環基、シリル基、アルコキシ基、アミノ基、アシルアミノ基、スルホニルアミノ基、アシル基、スルホニル基、ホルミル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、スルファモイル基、ハロゲン原子、シアノ基、スルホ基またはカルボキシル基であり、より好ましくは置換されてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アシル基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ハロゲン原子またはシアノ基である。Ｒに関して、水素原子以外の原子数は１〜３０が好ましく、１〜２０がより好ましく、１〜１０が最も好ましい。
【００７２】
Ａｒ１は炭素数６〜３０の芳香族炭素環、芳香族複素環を表す。芳香族炭素環の例としては、ベンゼン環、チオフェン環、フラン環、ピロール環、ピラゾール環、トリアゾール環、チアゾール環、イミダゾール環、オキサゾール環、オキサジアゾール環、チアジアゾール環などが好ましく、これらの環に対してさらに環が縮合していてもよい。Ａｒ１は置換基を有する場合、置換基の例としては、前述のＲ１１、Ｒ１２の置換基の例と同じ基を挙げることができる。
一般式（Ｌ−II）〜（Ｌ−Ｖ）において、＃は一般式（Ｌ−Ｉ）で表される含窒素複素環と結合する位置を表す。
本発明にかかる含窒素複素環配位子としては、蛍光強度、吸収波長および重合体微粒子への取り込まれやすさの観点から一般式（Ｌ−VI）で表されるものが好ましく、更に好ましくは一般式（Ｌ−VII）で表されるものが好ましい。
【００７３】
【化１７】
2007126551.tif 000018
【００７４】
［式中Ａ１は前記一般式（Ｌ−Ｉ）のＡ１と同じ意味を表す。Ｒ１１、Ｒ１２及びＧは、前記一般式（Ｌ−II）のＲ１１、Ｒ１２及びＧと同じ意味を表す。］
【００７５】
【化１８】
2007126551.tif 000019
【００７６】
［式中、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１７、Ｇ及びＱは、前記一般式（Ｌ−II）及び（Ｌ−IV）のＲ１１、Ｒ１２、Ｒ１７、Ｇ及びＱと同じ意味を表す。］
以下に、本発明にかかる含窒素複素環配位子の具体例を示す。
【００７７】
【化１９】
2007126551.tif 000020
【００７８】
【化２０】
2007126551.tif 000021
【００７９】
【化２１】
2007126551.tif 000022
【００８０】
上記例示化合物は公知の化合物を用い、公知の反応条件において反応することにより合成することができる。一般式（Ｌ−Ｉ）で表される化合物は、好ましくは、シアヌル酸クロリドへの、Ａ１〜Ａ３原子団の求核置換反応により合成できる。
例えば、下記一般式（ＬＰ−Ｉ）で表される化合物と一般式（ＬＰ−III）で表される化合物を反応させることにより合成することができる。
【００８１】
【化２２】
2007126551.tif 000023
【００８２】
一般式（ＬＰ−Ｉ）中、Ａは前記Ａ１、Ａ２、Ａ３で記述したものと同様であり、Ｅは、離脱性の基またはＡを表し、一般式（ＬＰ−III）中、Ｒ１７は前述したものと同様であり、Ｒ２０は、置換されてもよいアルキル基、置換されてもよいアリール基（ヘテロアリール基を含む）を表すが、好ましくは炭素数１乃至３０のものであり、１乃至２０がより好ましく、１乃至１２がさらに好ましい。
Ｒ２１およびＲ２２は、それぞれ水素原子または置換基を表し、Ｒ２０とＲ２１およびＲ２１とＲ２２は可能な場合には互いに結合して環を形成してもよい。Ｒ２１およびＲ２２が置換基を表す場合、好ましい置換基としてはアルキル基、アリール基、アミノ基、複素環基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アミド基、ウレイド基およびハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）などが好ましい。ここで挙げた置換基の例において、水素を除いた原子数は１乃至６０が好ましく、より好ましくは１乃至４５であり、１乃至３５が最も好ましい。
Ｄは、一般式（ＬＰ−III）中のアンモニウムイオンの対イオンを表す。Ｚは、酸素原子、−ＣＲ２３Ｒ２４−、ＮＲ２５、硫黄原子を表し、可能な場合にはＲ１７と互いに結合して環を形成してもよい。ここでＲ２３、Ｒ２４、Ｒ２５は、置換されてもよいアルキル基またはアリール基を表すが、アルキル基の例としては炭素数１乃至３０が好ましく、１乃至２０がより好ましく、１乃至１０が最も好ましく、環状であっても、鎖状であってもよく、鎖状の場合には直鎖でも分枝しているものであってもよく、飽和であっても不飽和結合を含むものであってもよい。
【００８３】
一般式（ＬＰ−Ｉ）におけるＥとしての離脱性の基の例には、ハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、アリールオキシ基（フェノキシ基、４−ニトロフェノキシ基など）、アリールチオ基（フェニルチオ基、４−ブロモフェニルチオ基など）、スルホニルオキシ基（ｐ−トルエンスルホニルオキシ基、トリフルオロメタンスルホニルオキシ基など）、カルバモイルオキシ基（ジメチルカルバモイルオキシ基、モルホリノカルボニルオキシ基など）が好ましく、ハロゲン原子が最も好ましい。
【００８４】
一般式（ＬＰ−III）におけるＤとしての対イオンには、好ましくは、ハライドイオン（フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン）、硫酸イオン、過塩素酸イオン、硝酸イオン、硫酸水素イオン、スルホン酸イオン（ｐ−トルエンスルホン酸イオン、ｐ−クロルベンゼンスルホン酸イオンなど）、硫酸エステルイオン（モノメチル硫酸イオンなど）、テトラフルオロボレートイオン、ヘキサフルオロホスフェートイオンなどが挙げられる。
【００８５】
本発明における含窒複素環配位子は、一般式（ＬＰ−Ｉ）で表される化合物と一般式（ＬＰ−III）で表される化合物とを、好ましくは溶媒を用いて混合し、好ましくは塩基の存在下、適切な温度にて反応を行うことにより得ることができる。
【００８６】
この場合、塩基としては、通常有機合成で用いられる塩基であればほとんどのものが使用できるが、好ましくはピリジン類（ピリジン、２，６−ルチジンなど）、３級アミン類（トリエチルアミン、Ｎ−エチルジイソプロピルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、トリブチルアミンなど）、グアニジン類（トリフェニルグアニジン、１，１，３，３−テトラメチルグアニジンなど）、アミジン類（１，８−ジアザビシクロ〔５．４．０〕−７−ウンデセン、１，５−ジアザビシクロ〔４．３．０〕−５−ノネンなど）、アニリン類（Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリンなど）、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水素化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキンド、ナトリウム−ｔ−ブトキシド、カリウム−ｔ−ブトキシド、酢酸カリウム、酢酸ナトリウムなどを好ましく用いることができるが、ピリジン類、３級アミン類、グアニジン類、アミジン類がより好ましい。
【００８７】
用いる溶媒に関してはプロトン性溶媒、非プロトン性溶媒のいずれも用いることができるが、非プロトン性溶媒が好ましく、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノンなどが好ましい。
反応温度は反応によってそれぞれ適当な温度が設定されるべきであるが、本発明においては一般に−２０℃乃至１５０℃が好ましく、０℃乃至１２０℃がより好ましく、０℃乃至１００℃が最も好ましい。
反応の仕込み順はどの順に仕込んでもよいが、一般式（ＬＰ−Ｉ）で表される化合物と一般式（ＬＰ−III）で表される化合物を溶媒に溶解または懸濁し、撹拌しながら塩基を添加するのが好ましい。
【００８８】
（合成例）例示化合物４の合成
例えば、上記化合物４は、下記の方法により合成することができる。
１８．４ｇの塩化シアヌルを１００ｍＬのジメチルアセトアミドに溶解し、室温で６９．２ｇの３，５−ジメチルピラゾールを添加した。ついで反応温度を８０℃として２時間反応した。
冷却後、反応液を水に注ぎ、析出した結晶を濾取し、ジメチルホルムアミドから再結晶して、下記（ＬＰ−Ｉ−１）を得た。収量２１．０ｇ、収率５７．９％
ｎｍｒスペクトルデータ（重クロロホルム）：６．１１（３Ｈ，ｓ）、２．８１（９Ｈ，ｓ）、２．３３（９Ｈ，ｓ）
【００８９】
【化２３】
2007126551.tif 000024
【００９０】
４１９ｍｇの６−クロロ−５−シアノ−１，３−ジエチル−２−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾリウムｐ−トルエンスルホナートと３６３ｍｇの上記化合物（ＬＰ−Ｉ−１）を８ｍＬのジメチルスルホキシドに懸濁し、０．５ｍＬのテトラメチルグアニジンを加えて、８０℃で３０分間反応した。
冷却後、水を加えて析出した結晶に減圧ろ過を施して、得られた結晶をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製を行った。さらに、メタノールと酢酸エチルの混合溶媒から再結晶を行い、目的物を得た。収量２８７ｍｇ、収率５５．７％。
ｎｍｒスペクトルデータ（重クロロホルム）：７．３４（１Ｈ，ｓ）、７．２１（１Ｈ，ｓ）、６．０４（２Ｈ，ｓ）、５．３１（１Ｈ，ｓ）、４．５３（２Ｈ，ｑ）、４．３９（２Ｈ，ｑ）、２．７０（６Ｈ，ｓ）、２．３３（６Ｈ，ｓ）、１．３１（３Ｈ，ｔ）、１．２８（３Ｈ，ｔ）
他の例示化合物も、Ａ１〜Ａ３に相当する部分を、対応する化合物に変更することにより、化合物４と同様に合成することができる。
【００９１】
本発明において、重合体微粒子中の蛍光性ランタノイド色素の濃度に制限はないが、通常、重合体微粒子の質量に対して０．０１〜５０質量％、輝度の点で好ましくは０．０５〜２０質量％、より好ましくは０．１〜１０質量である。
【００９２】
＜重合体微粒子の蛍光色素導入方法＞
本発明の蛍光性重合体微粒子は、先に説明した種々の公知方法により調製した微粒子に、蛍光性ランタノイド色素が導入（内蔵）されている。色素の導入は次のように行うことができる。微粒子の疎水性部を形成する水不溶性高分子化合物を膨潤させる有機溶媒（例えば、アセトン又はトルエン等）が一定比率で含まれる溶液中に、微粒子及び蛍光性ランタノイド色素を浸漬させる。前記浸漬により、前記水不溶性高分子化合物は膨潤し、その膨潤に伴って蛍光性ランタノイド色素が微粒子に取り込まれる。続いて、この混合物から、有機溶媒を除去すると、前記水不溶性高分子化合物は収縮するが、疎水的な蛍光性ランタノイド色素は微粒子から外に出ることができず、微粒子に封入される。所望により、微粒子に取り込まれなかった蛍光性ランタノイド色素を除去することにより、本発明の蛍光性重合体微粒子を得ることができる。
【００９３】
上記製造方法において、前記混合物から有機溶媒を除去する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、エバポレートなどにより有機溶媒を蒸発乾固する方法、あるいは、非溶媒中で収縮させる方法（例えば、有機溶媒を含有する溶液を、前記有機溶媒を含有しない溶液に置換する方法）などを挙げることができる。
また、微粒子を膨潤するのに用いる前記有機溶媒含有溶液における有機溶媒の割合は、蛍光性ランタノイド色素が水不溶性高分子化合物に取り込まれる程度まで、前記水不溶性高分子化合物を膨潤させることができる割合である限り、特に限定されるものではないが、例えば、４０〜６０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）％であることができる。
上記の方法の他に、重合性モノマー、マクロモノマーを含有する液体に蛍光性ランタノイド色素を溶解し、次いで重合することにより、微粒子形成と同時に蛍光性ランタノイド色素を導入する方法をとることも可能である。
【００９４】
＜蛍光検出用複合体＞
本発明の蛍光検出用複合体は、本発明の蛍光性重合体微粒子と、蛍光性重合体微粒子及び検出対象物質を連結可能な連結物質とから構成されている。これにより、標的物質の検出を、連結物質を介した蛍光性重合体微粒子の蛍光発光に基づいて効率よく且つ高感度に行うことができる。
【００９５】
＜蛍光検出用複合体の調整＞
連結物質としては、抗原又は抗体を挙げることができる。このような抗体としては、ウサギ、ヤギ等のポリクローナル抗体、マウスのモノクローナル抗体のＩｇＧ、ＩｇＭ、またはこれらを酵素処理又は還元剤処理して得るＦ（ａｂ’)２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’分画等が挙げられる。一方、抗原としては、タンパク質、ポリペプチド、ステロイド、多糖類、脂質、薬物、花粉など種々のものが挙げられる。
かかる抗体又は抗原の結合方法としては、重合体微粒子のカルボキシル基に対して抗体又は抗原のアミノ基をカルボジイミド等の縮合剤を使用して結合する方法、重合体微粒子のアミノ基に対して抗体又は抗原の糖鎖を、過ヨウ素酸を使用して結合する方法、重合体微粒子のアミノ基に対して抗体又は抗原のアミノ基を、グルタルアルデヒドを使用して結合する方法、重合体微粒子のマレイミド基に対して抗体又は抗原のチオール基を反応させる方法等が挙げられ、その結合量としては、重合体微粒子１ミリグラム当たりの質量として、通常５０ナノグラム〜５００マイクログラム、好ましくは５００ナノグラム〜２００マイクログラムとする。これにより、蛍光能を有する免疫分析試薬（蛍光免疫分析試薬）として使用可能である
【００９６】
また、連結物質としては、抗原及び抗体の他に、アレルゲン、酵素、酵素基質、補酵素、酵素阻害剤、ホスト化合物、ホルモン、ホルモンレセプター、タンパク質、血液タンパク質、組織タンパク質、細胞、細胞破砕物、核物質、ウイルス、ウイルス粒子、代謝産物、神経伝達物質、ハプテン、薬物、核酸、金属、金属錯体、微生物、寄生虫、細菌、ビオチン、アビジン、レクチン、糖、生理活性物質、生理活性物質受容体、環境物質、化学種又はこれらの誘導体などから、検出対象物質に応じて適宜選択してもよい。例えば、予め検出対象物質をアビジン化処理することが可能である場合には、ビオチンを連結物質とすることができる。検出対象物質が所定のリガンドである場合、該リガンドに特異的に結合するレセプター及びその断片であってもよい。また、標的物質が核酸である場合、該核酸に特異的に結合するタンパク質やペプチド（アプタマー）であってもよい。
これらの連結物質との結合方法は、前述と同様に行ってもよく、その他の既知の結合方法によって結合してもよい。
このような連結物質は、検出対象物質そのものであってもよく、また蛍光性重合体微粒子と同様に検出対象物質に対して結合処理することにより、本蛍光検出用複合体によって検出可能としてもよい。
【００９７】
＜蛍光検出方法＞
本発明の蛍光検出方法は、上記蛍光性重合体微粒子と、蛍光性重合体微粒子及び検出対象物質を連結可能な連結物質、即ち、蛍光検出用複合体を用いて検出対象物質を検出することを含む。これにより、蛍光強度が高く高感度に検出可能な本発明の蛍光性重合体微粒子を用いて、高感度に検出対象物質を検出することができる。
蛍光検出用複合体については、上記事項をそのまま適用することができる。
【００９８】
蛍光検出方法は、蛍光物質を利用した公知の蛍光検出方法における手順及び条件をそのまま適用することができ、測定対象物質と、蛍光検出用複合体とを接触させて検出試料を調製すること、蛍光検出用複合体を励起する励起光を照射すること、該照射による蛍光発光を測定することを含む。
本発明の蛍光性重合体微粒子にはランタノイド色素が内蔵されているので、可視光、例えば４００ｎｍ程度の光による励起が可能である。このため、ＵＶのような高エネルギーの励起光を使用する必要がなく、励起光源の選択の幅を広くすることができる。
これにより、低エネルギーの励起光源による蛍光検出を高感度に行うことができる。
本蛍光検出方法は、時間分解蛍光測定によるものであることが、測定の精度及び感度の観点から更に好ましい。時間分解蛍光測定における条件は、選択された金属イオンに応じて適宜選択することができる。
【００９９】
＜蛍光検出キット＞
本発明の蛍光検出キットは、本発明の蛍光性重合体微粒子を含むものである。
これにより、標的物質の検出を、連結物質を介した蛍光性重合体微粒子の蛍光発光に基づいて効率よく且つ高感度に行うことができる。
本蛍光検出キットにおける蛍光性重合体微粒子は、連結物質と共に含まれるものであってもよく、また蛍光検出用複合体として含まれるものであってもよい。
また連結物質の種類に応じて、検出対象物質を蛍光検出用複合体によって検出可能にするための試薬を含むものであってもよい。このような試薬としては、例えば、蛍光検出用複合体中の連結物質としてビオチンを選択した場合では、検出対象物質をアビジン化するための試薬が挙げられる。
【実施例】
【０１００】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これにより本発明は限定されるものではない。
実施例１
＜蛍光微粒子の合成＞
Anal.Chem. 2003, 75, 6124-6132に記載の方法に従い、下記式で表される末端にアミノ基を有するラジカル重合性マクロモノマーを合成した。ＧＰＣ測定から数平均分子量は７０００であった。
【０１０１】
【化２４】
2007126551.tif 000025
【０１０２】
前記化合物例のＭ−２（３０当量［モル当量、以下同じ］）、スチレン（７０当量）と前記マクロモノマー（５当量）及び１，４−ジビニルベンゼン（２当量）を、ラジカル発生剤Ｖ−６５（２当量、和光純薬（株）製）の共存下、エタノール／蒸留水＝４／１（体積比）中で７０℃に６時間加熱し、ラジカル重合を行った。反応物中のポリマー固形物をろ過し、ろ液を、蒸留水を用いて一日透析（分画分子量＝１２０００〜１４０００）を行い精製し、表面にアミノ基を有する微粒子の分散物を得た。粒度分布測定装置（コールターＮ４Ｐｌｕｓ、ベックマン・コールター株式会社製）を用いて粒径を測定したところ平均粒径が１３０ｎｍであった。蒸留水を用いて希釈し、粒子濃度を５０ｍｇ／ｍＬとした。
【０１０３】
次に、トリス（４，４，４−トリフルオロ−１−（２−チエノイル）−１，３−ブタンジオノ）ユーロピウム（III）と、化合物例１の含窒複素環配位子を等モル量混合した後、メタノールで溶解し、ユーロピウム色素の０．２質量％溶液を作成した。
前記で合成した表面にアミノ基を有する微粒子の分散液５０ｍＬに３８０ｍｇのユーロピウム色素溶液を加え、室温で３時間攪拌した。その後、アスピレータを用いて分散液中のメタノールを減圧留去した。不溶物をフィルターろ過し、ユーロピウム色素染色蛍光微粒子の分散液を得た。
【０１０４】
＜抗体連結微粒子の合成＞
次に、通常のヒンジ法（「酵素免疫測定法第３版」；石川栄治等編、医学書院）により上記で合成した蛍光微粒子へ抗体Ｆａｂ’の導入を行った。
上記で合成した表面にアミノ基を有するユーロピウム色素染色粒子を、濃度１４ｍｇ／ｍｌで０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）緩衝液に分散した。微粒子分散液１ｍｌにSulfo−ＧＭＢＳ（同仁化学）０．６ｍｇを添加し室温で1時間反応させ、ＰＤ−１０カラム（ファルマシアバイオサイエンス）で精製し表面にマレイミド基を有する蛍光微粒子溶液を得た。
次に、抗テオフィリン抗体７．２ｍｇからペプシン処理、メルカプトエチルアミン還元により精製したＦａｂ’分画３．９ｍｇを、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）緩衝液に溶解し濃度を１ｍｇ／ｍｌとした。表面にマレイミド基を有する蛍光微粒子溶液（１ｍｇ／ｍｌ ０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））と等容量混合し、４℃で一晩攪拌した後、ゲルろ過により精製、抗体連結蛍光微粒子を得た。
【０１０５】
＜テオフィリン結合ポリ−Ｌ−リジンの調製と石英基板への結合と検出＞
０．１％ポリ−Ｌ−リジン（Sigma）４０ｍｌと０．１Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）を１０ｍｌ混合し、Theophylline-8-Butanoic Acid（Sigma）３５ｍｇ、ＷＳＣ（同仁化学）３０ｍｇ、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ（Pierce）３４ｍｇを添加し室温で６時間反応させた。反応液をセファデックスＧ−２５でゲルろ過し、テオフィリン結合ポリ−Ｌ−リジンを精製した。表面をアルカリ処理した合成石英基板を精製水で十分に洗浄した後、テオフィリン結合ポリ−Ｌ−リジン溶液に室温で２時間浸漬した。精製水で洗浄、風乾し以下の実験に用いた。
抗体連結蛍光微粒子（微粒子濃度３．０×１０−６Ｍ）溶液と、その希釈液（×１０、×１００）をそれぞれ１μｌ石英基板上にスポットし、室温で２時間静置後、精製水で洗浄した。表面の水滴を除き、基板の時間分解蛍光量を時間分解蛍光光度計（ワラック社製）で測定した（励起光：４３０ｎｍ、蛍光発光：６１５ｎｍ）。その結果、蛍光微粒子濃度に依存した遅延蛍光が観察された。また、蛍光微粒子分散液を４０℃の環境下で２週間放置した後、再び石英基板上にスポットし、前記と同様に蛍光測定を行った。石英基板上の蛍光強度はほとんど変化せず、保存性に優れた蛍光検出試薬であることを確認した。
【０１０６】
実施例２〜５
実施例１において、前記化合物例のＭ−２（３０当量）、スチレン（７０当量）の変わりに、それぞれ第１表に示すラジカル重合性モノマーを用いた他は、実施例１と同様に蛍光微粒子を作成し、更に実施例１と同様にして抗体を結合した粒子を作成し、化合物に応じた蛍光測定を行った。蛍光粒子濃度に依存した遅延蛍光が観測され、４０℃の環境下で２週間放置した後、再び蛍光測定を行った場合も、蛍光強度はいずれもほとんど変化せず、保存性に優れた蛍光検出試薬であることを確認した。
【０１０７】
比較例
実施例１において、前記化合物例のＭ−２を用いずスチレン単独で、実施例１と同様に蛍光微粒子を作成し、更に実施例１と同様にして抗体を結合した粒子を作成し蛍光測定を行った。蛍光粒子濃度に依存した遅延蛍光が観測されたが、蛍光強度は実施例１〜５に比べ５０％であった。４０℃の環境下で２週間放置した後、再び蛍光測定を行ったところ、蛍光強度は保存前の５０％に減少し、本発明の蛍光微粒子に比べ保存性に劣っていた。
【０１０８】
【表１】
2007126551.tif 000026