(57)【要約】【課題】免疫関連反応を誘導または検出する能力を保持しているパピローマウイルス様キメラ粒子を提供する。【解決手段】ヒト又はウシパピローマウイルス含み、パピローマウイルス粒子の融合パートナーがパピローマウイルスＥ６又はＥ７ペプチドである、パピローマウイルス粒子の形状エピトープを有するパピローマウイルス様粒子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
パピローマウイルスＬ１融合生成物を含み、パピローマウイルス粒子の形状エピトープを有するパピローマウイルス様粒子。
【請求項２】
前記パピローマウイルスＬ１融合生成物が、ヒトパピローマウイルスＬ１融合生成物またはウシパピローマウイルスＬ１融合生成物である請求項１に記載のパピローマウイルス様粒子。
【請求項３】
前記ヒトパピローマウイルスＬ１融合生成物が、ＨＰＶ１６Ｌ１融合生成物であり、前記ウシパピローマウイルスＬ１融合生成物が、ＢＰＶ１Ｌ１融合生成物である請求項２に記載のパピローマウイルス様粒子。
【請求項４】
前記ヒトパピローマウイルスＬ１融合生成物が、ペプチド若しくは全長蛋白である単一の融合パートナー、または、ペプチド、全長蛋白、若しくは縦並びに連結されたこれらの組み合わせである複数の融合パートナーを含む請求項１に記載のパピローマウイルス様粒子。
【請求項５】
前記融合パートナーがパピローマウイルスＥ６またはＥ７生成物である請求項４に記載のパピローマウイルス様粒子。
【請求項６】
前記パピローマウイルスＬ１融合生成物が、そのＮ末端またはＣ末端で融合パートナーに融合する請求項１に記載のパピローマウイルス様粒子。
【請求項７】
前記パピローマウイルスＬ１融合生成物が、Ｌ１アミノ酸の間に挿入された融合パートナーを有する請求項１に記載のパピローマウイルス様粒子。
【請求項８】
更にパピローマウイルスＬ２生成物を含む請求項１に記載のパピローマウイルス様粒子。
【請求項９】
前記パピローマウイルスＬ２生成物が、ＨＰＶ１６Ｌ２生成物またはＢＰＶ１Ｌ２生成物である請求項８に記載のパピローマウイルス様粒子。
【請求項１０】
請求項１に記載のパピローマウイルス様粒子を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パピローマウイルス様キメラ粒子および関連する合成ＤＮＡ分子、宿主細胞、方法並びにワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
パピローマウイルスはヒトおよび広範囲の動物の上皮に感染し、当該上皮の感染部位に一般に良性の増殖を誘導する。しかしながら、幾つかの事例ではある種のパピローマウイルスによって誘導された病巣は悪性に経過する。ヒトの性器病巣の悪性進行とヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のある種の型（例えばＨＰＶ１６）との間には密接な関係が存在する。これらのウイルス型による感染は、子宮頸癌（世界的に最も一般的な女性の癌の１つ）の進行における最も重要な危険因子であると考えられる（非特許文献１; 非特許文献２)。子宮頸癌の大半はＨＰＶ初期遺伝子（例えばＥ６およびＥ７）を含み、該遺伝子を発現している。さらに、これらの遺伝子は培養細胞において強力な形質転換活性および永代化（immortalizing)活性を有することが示された（非特許文献３)。
【０００３】
パピローマウイルスは、直径が約５５ｎｍのエンベロープを持たない二本鎖ＤＮＡウイルスで、ヌクレオヒストンのコアの中に約８ｋｂのゲノムを含む(非特許文献４)。キャプシドは、ウイルスによってコードされる２つの蛋白Ｌ１およびＬ２で構成され、これらはＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、それぞれ約５５ｋＤａおよび７５ｋＤａに移動する(非特許文献５)。Ｌ１（これは主要キャプシド蛋白である）は、Ｔ−７の二十面体対称と結合する７２ペンタメーターとして配列されている。Ｌ２の機能およびビリオン内の位置は不明である(非特許文献４)。
【０００４】
Ｌ１蛋白は自己集合組立能をもち、それによって、大量のウイルス様粒子（virus-like
particles, VLPs）が、多数のパピローマウイルス種に由来するＬ１蛋白の種々の組換え体（リコンビナント）発現系での発現により生成できる（非特許文献６; 非特許文献７; 非特許文献８; 非特許文献９)。集合組立には必要ではないが、Ｌ２は、細胞内でＬ１とともに同時に発現される場合（Ｌ１／Ｌ２ＶＬＰｓ）ＶＬＰｓに取り込まれる。
【０００５】
天然のビリオンまたはＬ１ＶＬＰｓでウサギを免疫することによって高力価の中和血清抗体が誘導されるが、大腸菌で発現させた集合組立されていないＬ１による免疫では誘導されなかった（非特許文献１０; 非特許文献７; 非特許文献１１; 非特許文献１２)。天然の粒子に対して作製した多クローン性および単クローン性抗体は形状依存性エピトープを認識する(非特許文献１３; 非特許文献１４; 非特許文献１５）。
【０００６】
ＶＬＰｓに対して作製した中和抗体もまた形状依存性エピトープを認識する。感染性ＢＰＶ１（これはウシの病巣から容易に得られ、インビトロＢＰＶ１感染性アッセーで定量できる(非特許文献１６）を用いて、ウシパピローマウイルスから得られたＶＬＰｓは高レベルの中和抗体を誘導することが示された(非特許文献７)。この中和抗体は形状依存性エピトープに対して誘導され、免疫の前に粒子を変性させると中和活性を誘導するこの調製物の能力は失われた（上掲書）。
【０００７】
昆虫細胞でリコンビナントバキュロウイルスによってＬ１主要キャプシド蛋白を発現させるために非進行性病巣から得られたＨＰＶ１６分離株のＬ１遺伝子を用いた場合、Ｌ１は、プロトタイプのＨＰＶ１６（癌病巣から最初に分離された）に由来するＬ１を用いて得られた収量より３乗高い収量で自己集合組立を行ない、天然のビリオンと形態学的に同様なＶＬＰｓを形成した(非特許文献８)。ＤＮＡ配列の比較によって、プロトタイプＬ１
の効率の悪い自己集合組立をもたらすただ１つの非保存的アミノ酸変化が明らかにされた（上掲書）。集合組立能をもつクローンのＬ１はしたがって野性型遺伝子と考えられ、集合組立不全クローンのプロトタイプＬ１は変異体と考えられる。
【０００８】
野性型Ｌ１蛋白をもつＨＰＶ１６ＶＬＰｓを抗原として用いて、ＨＰＶ１６に感染した患者における血清抗体を検出するＥＬＩＳＡを開発した(非特許文献１７）。対照的に、変性ＨＰＶ１６粒子もプロトタイプＬ１蛋白調製物もこれらの抗体を検出できなかった（上掲書）。これらの結果は、プロトタイプＬ１蛋白は形状エピトープをもたないことを明らかにした。
【０００９】
自己集合組み立てさせた野性型ＨＰＶ１６Ｌ１／Ｌ２に対して作製したウサギ血清は、ＨＰＶ１６ＶＬＰが細胞表面分子に結合するのを妨げることが分かった(Rodenら、J. Virol. （印刷中、1994年、10月))。対照的に、ＨＰＶ１６Ｌ１／Ｌ２のプロトタイプ株に対して作製された血清はそのような結合を阻止しなかった（上掲書）。このデータは、プロトタイプＨＰＶ株は形状エピトープを欠いていることを示している。
【００１０】
完全なワタオウサギパピローマウイルス（ＣＲＰＶ）のＬ１またはＬ１／Ｌ２から構成されたウイルス様粒子で免疫したウサギは、その後の感染性ＣＲＰＶによる実験的感染から防御された(Breitburdら、第12回国際パピローマウイルスワークショップ（於：アムステルダム）、印刷中（1994年、10月))。対照的に、変性粒子で免疫した動物は防御されなかった（上掲書）。これらの発見は、形状エピトープをもつＶＬＰは防御免疫を誘導できるという結論と一致する。
【００１１】
キャプシド蛋白で構成されたＶＬＰは、パピローマウイルス感染を防止する予防ワクチンとして魅力的な候補物である。しかしながら、これらＶＬＰワクチンがすでに成立したパピローマウイルス感染に対して治療的効果を有することはおそらくないであろう。Ｅ６およびＥ７と異なり、このキャプシド蛋白は進行性病巣または基底上皮感染細胞（これらはパピローマの免疫退行の推定標的である）での発現は検出されない。
【００１２】
Ｌ１およびＬ２以外のパピローマウイルス蛋白に対する免疫はパピローマウイルス感染の制御を助けるかもしれないということが実験モデルによって証明される。Ｅ６およびＥ７は腫瘍発生過程で選択的に維持されるので、これらの腫瘍蛋白に由来するペプチドは、ＨＰＶ含有腫瘍細胞に対する細胞性免疫反応のための標的として役立つ可能性がある。動物モデル実験によってＨＰＶ１６のＥ７蛋白は腫瘍拒絶抗原として作用することが示唆された（非特許文献１８; 非特許文献１９）。のみならず、ＨＰＶ感染頻度、ＨＰＶ感染の持続、並びに子宮頸癌および他のＨＰＶ関連癌のリスクは細胞性免疫の抑制をもつ患者で高まる（非特許文献２０; 非特許文献２１）。これらの観察によって、細胞性免疫は、ＨＰＶ感染およびそれに付随する腫瘍の発達を防御するために重要であることが示唆される。そのような免疫の誘導は予防的であるとともに治療的であるかもしれない。
【００１３】
外来ペプチドがウイルスキャプシド様構造物に取り込まれ得ること、さらにこれらキメラ粒子を用いて外来抗原を免疫系に呈示することが可能なことが明らかになった。報告された実施例には、ヒトライノウイルス２型エピトープ(非特許文献２２)、ＨＩＶのｇｐ４１（非特許文献２３）のＢ型肝炎コア抗原粒子の表示、並びに単純ヘルペスウイルス１型およびネズミ肝炎ウイルス由来ペプチドのＢ１９パルボウイルス粒子の表示(非特許文献２４）が含まれる。パルボウイルスキメラは、対応するウイルスによる実験的感染攻撃からマウスを防御した。上記の系の全てで、外来配列はキャプシド構造に必須の蛋白内に挿入され、２０アミノ酸未満に限定されていた。しかしながら、最近の実験（非特許文献２５)は、パルボウイルスＬ１マイナーキャプシド蛋白に融合させた場合、完全な１４７アミノ酸のニワトリ卵白リゾチーム蛋白がＢ１９パルボウイルス粒子に取り込まれ得ること
を明らかにした。このリゾチームは生物的活性を保持し、ウサギに注射したとき免疫反応を誘導した。別の関連性が低い実験でも、ＨＩＶ−１エンベロープ糖蛋白の８４アミノ酸を含むＢ型肝炎ウイルス表面抗原粒子（これは脂質膜構造である）（非特許文献２６)およびＨＩＶ−１Ｖ３ループの一部分を含む酵母Ｔｙウイルス様粒子(非特許文献２７）もまた、動物に接種したとき挿入したペプチドに対して免疫反応を起こさせることが示された。パピローマウイルスに関しては、ＨＰＶ１６Ｅ７ペプチド（全て２０アミノ酸未満）を含むＢ型肝炎ウイルスコア抗原粒子は、マウスでペプチド特異的抗体およびＴヘルパー応答を誘導することが報告された（非特許文献２８）。
【００１４】
【非特許文献１】H. zur Hausen, Science 254:1167(1991)
【非特許文献２】M.H. Schiffman, J. Natl. Cancer Inst. 84:394(1992)
【非特許文献３】B.A. Wemess, K. Munger & P.M. Howley(1991)、「腫瘍学の進歩」(Advances in Oncology)、V.T. DeVita, S. Hellman & S.A.Rosenberg編、（Lipponcott、フィラデルフィア）pp.3-18
【非特許文献４】Bakerら、Biophys. J. 60:1445(1991)
【非特許文献５】Mose Larsonら、J. Virol.61:3596(1987)
【非特許文献６】Hagenseeら、J. Virol. 67:315(1993)
【非特許文献７】Kirnbauerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89:12180(1992)
【非特許文献８】Kirnbauerら、J. Virol. 67:6929(1993)
【非特許文献９】Roseら、J. Virol. 67:1936(1993)
【非特許文献１０】N.D. Christensen & J.W. Kreider, J. Virol.64:3151(1990)
【非特許文献１１】Pilacinskiら、Bio/Technology 2:356(1984)
【非特許文献１２】Segreら、Am. J. Vet. Res. 16:517(1955)
【非特許文献１３】N.D. Christensen & J.W. Kreider, Virus Res.28:195(1993)
【非特許文献１４】Christensenら、J. Virol. 64:5678(1990)
【非特許文献１５】Christensenら、Virology 181:572(1991)
【非特許文献１６】Dvoretzkyら、Virology 103:369(1980)
【非特許文献１７】Kirnbauerら、L. Natl. Cancer Inst. 86:494(1994)
【非特許文献１８】Chenら、Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 88:110(1981)
【非特許文献１９】Feltkempら、Eur. J. Immunol. 23:2242(1993)
【非特許文献２０】Alloutら、Br. Med.J. 298:153(1989)
【非特許文献２１】Lagaら、Int. J. Cancer 50:45(1992)
【非特許文献２２】Francisら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2545(1990)
【非特許文献２３】Borisovaら、FEBS Lett. 259:121(1989)
【非特許文献２４】Brownら、Virology 198:477(1994)
【非特許文献２５】Miyamuraら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:8507(1994)
【非特許文献２６】Michelら、J. Virol. 64:2452(1990)
【非特許文献２７】Griffithsら、J. Virol. 65:450(1991)
【非特許文献２８】Tindleら、Virology 200:547(1994)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
自己集合組立パピローマウイルスＬ１を基材にしたキメラ粒子はこれまで報告がなく、またキメラＶＬＰを作製する目的でウイルス性融合パートナーとして使用したという報告もない。上記に記載したキメラ粒子実験は、パピローマウイルスと無関係のウイルスを含み、したがってパピローマウイルスを含むキメラ粒子実験の結果を予測することはできない。実際、カーンバウエルらによるパピローマウイルスの研究(Kirnbauerら、J. Virol. 67:6929(1993）上掲書）では、Ｌ１のただ１つの非保存的アミノ酸変化が、ＶＬＰｓへの効果的な自己集合組立および形状エピトープの表示（これらは臨床的に関連する免疫反応の誘導および検出に必須であるらしい）をもたらすことが明らかにされた。したがって、パピローマウイルスに無関係のウイルスを用いた研究は、Ｌ１のただ１つのアミノ酸置換によって効果的な自己集合組立が失われると仮定した場合、外来ペプチドまたは蛋白を含むパピローマウイルスＬ２がパピローマウイルスＬ１との同時集合組立によって粒子を形成することができるか否かを予測することは不可能である。さらにまた、これらの実験は、Ｌ１のただ１つのアミノ酸置換が形状エピトープの表示を妨げることができると仮定した場合、生じたキメラ粒子のいずれかが中和抗体もしくは他の免疫関連反応を誘導または検出する能力を保持しているか否かを予測することも不可能である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
前記課題を解決するため、パピローマウイルス様キメラ粒子を提供することが本発明の目的である。これらのキメラ粒子は多価抗原を表示するための土台として機能することができる。またこれらのキメラ粒子は、蛋白を細胞内に運び、ペプチドに加工し続いてＭＨＣ分子の中にこれらのペプチドを表示させて細胞性免疫反応を誘導させるために役立てることができる。このキメラ粒子は、有効スペクトルの広い効果的なパピローマウイルスワクチンを作製する費用効率の良い方法を提供する。また別に、このパピローマウイルス用キメラ粒子はＶＬＰおよび／または融合パートナーの精製にも利用できる。またこのキメラ粒子は、活性を有する無傷の蛋白（例えば酵素、毒素または薬剤）を細胞内に運ぶために機能することができる。
【００１７】
前記目的を達成するため、本発明は、パピローマウイルスＬ１融合生成物を含み、パピローマウイルス粒子の形状エピトープを有することを特徴とするパピローマウイルス様粒子を提供する。
【００１８】
当該パピローマウイルス様粒子において、前記パピローマウイルスＬ１融合生成物は、ヒトパピローマウイルスＬ１融合生成物またはウシパピローマウイルスＬ１融合生成物であることを特徴としていてもよい。
【００１９】
前記ヒトパピローマウイルスＬ１融合生成物は、ＨＰＶ１６Ｌ１融合生成物であり、前記ウシパピローマウイルスＬ１融合生成物が、ＢＰＶ１Ｌ１融合生成物であることを特徴としていてもよい。
【００２０】
前記ヒトパピローマウイルスＬ１融合生成物が、ペプチド若しくは全長蛋白である単一の融合パートナー、または、ペプチド、全長蛋白、若しくは縦並びに連結されたこれらの組み合わせである複数の融合パートナーを含むことを特徴としていてもよい。
【００２１】
前記融合パートナーがパピローマウイルスＥ６またはＥ７生成物であることを特徴としていてもよい。
【００２２】
前記パピローマウイルスＬ１融合生成物が、そのＮ末端またはＣ末端で融合パートナーに融合することを特徴としていてもよい。
【００２３】
前記パピローマウイルスＬ１融合生成物が、Ｌ１アミノ酸の間に挿入された融合パートナーを有することを特徴としていてもよい。
【００２４】
更にパピローマウイルスＬ２生成物を含むことを特徴としていてもよい。
【００２５】
前記パピローマウイルスＬ２生成物が、ＨＰＶ１６Ｌ２生成物またはＢＰＶ１Ｌ２生成物であることを特徴としていてもよい。
【００２６】
本発明の別の態様として、上記パピローマウイルス様粒子を含む組成物も含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明は、パピローマウイルスＬ２融合生成物が、パピローマウイルスＬ１生成物を基材とする、形状エピトープを表示するパピローマウイルス様粒子に取り込まれるという結果から得られた。これらの結果は予期せぬものであった。
【００２８】
パピローマウイルスの研究(Kirnbauerら、J. Virol. 67:6929(1993）上掲書）において、Ｌ１のただ１つの非保存的アミノ酸変化がＶＬＰｓへのＬ１の効果的な自己集合組立および形状エピトープの表示をもたらすことが示された。この形状エピトープの表示は、臨床的に関連のある免疫反応の誘導および検出に必要なように思える。したがって、Ｌ１内のただ１つのアミノ酸置換が効果的な自己集合組立を失わせると仮定した場合、外来ペプチドまたは蛋白を含むパピローマウイルスＬ２がパピローマウイルスＬ１とともに集合組み立てされて粒子を形成するか否かは予測不可能であった。Ｌ１内のただ１つのアミノ酸置換が形状エピトープの表示を妨げることができると仮定した場合、生成されるどのようなキメラ粒子が中和抗体もしくは他の免役関連反応の誘導または検出能を保持しているかを予測することもまた不可能であった。
【００２９】
パピローマウイルスＬ２融合生成物は一連のアミノ酸の鎖を意味し、この場合該鎖の一部分はＬ２の蛋白配列に由来し、さらに該鎖の一部分は別の１つ蛋白配列（または複数の蛋白配列）に由来する。
【００３０】
Ｌ２融合生成物は、１つの蛋白（または多数の蛋白）のための読み取り枠をＬ２のため
の読み取り枠の隣にまたはその中に（枠内で）スプライシングすることによって製造される。
【００３１】
蛋白工学を用いてＬ２融合生成物の構造を決定する。蛋白工学分野の従事者にとって日常的な作業で天然蛋白Ｌ２の変種が作製される。作製されるこのような変形はＬ２の構造を詳細に知った上での経験に基づいて予測されるものでもよく、また完全に任意のものであってもよい。構造情報とランダム変異および選別との組合せによってもまた劇的な結果を得ることができる。
【００３２】
例えば、融合ペプチドまたは蛋白がその間に挿入されるＬ２アミノ酸の選別はこの基準によって実施することができる。アミノ酸の配列と長さがパピローマウイルス間で変化する領域が存在することは、この領域がＬ２の組み込みおよび／または粒子への取り込みに必須ではない構造を表していることを示唆する。融合ペプチドまたは蛋白をＬ２内へ挿入するこの観察された能力は、そのような領域が存在することを暗示させる。
【００３３】
Ｌ２融合生成物のための構造の決定は、形状エピトープを表示するパピローマウイルスＬ１生成物を基材にしたパピローマウイルス様粒子への取り込みが生じるＬ２融合生成物の能力をもとに実施される。
【００３４】
構造決定の好ましい手段は、パピローマウイルスＬ１生成物を基材とするパピローマウイルス様粒子へのＬ２融合生成物の取り込み効率および／または純正度を測定するアッセーを含む。
【００３５】
Ｌ１／Ｌ２ＶＬＰｓ形成の効率および／または純正度は形状エピトープの表示と関連がある（上掲書）。
【００３６】
キメラＬ２は、したがって野性型Ｌ２の取り込みのそれと同じような効率および／または純正度でＬ１基材ＶＬＰｓへ取り込まれるようになるであろう。
【００３７】
Ｌ２融合生成物のための構造を決定する他の好ましい手段は、中和抗体の誘発および／または検出を測定するアッセーを含む。
【００３８】
中和抗体は形状依存性エピトープに対して誘導される（上掲書）ので、中和抗体の誘導および／または検出は形状エピトープの表示と関連がある。
【００３９】
したがって、キメラＬ２の取り込みは、Ｌ１またはＬ１／Ｌ２ＶＬＰｓと比較したときパピローマウイルス様キメラ粒子による中和抗体の誘導および／または検出を抑制しない。
【００４０】
本発明の目的のために、キメラＬ２融合生成物は、形状エピトープ（上記の手段または当技術分野で既知の他のいずれかの手段で特定されたか否かにかかわらず）を表示するパピローマウイルスＬ１生成物基材パピローマウイルス様粒子へ取り込まれることができる能力をもつ。
【００４１】
Ｌ２およびその融合パートナー（およびＬ１）の構造は、完全な長さのＬ２蛋白（およびＬ１蛋白）並びに完全な長さの融合パートナー蛋白およびそのフラグメント（５'フラグメントであれ、３'フラグメントであれまたは内部フラグメントであれ）を含むことが意図される。前記フラグメントは、少なくとも約２０アミノ酸残基、有利には少なくとも約１０アミノ酸残基、さらに好ましくは少なくとも約５アミノ酸残基である。Ｌ２（およびＬ１）のタイプ、サブグループおよび株間変動並びに、融合パートナー蛋白のヒト対立
遺伝子および種間変動も明らかに本発明の範囲内に含まれると解される。本発明はまた、完全な長さのＬ２蛋白（およびＬ１蛋白）並びに完全な長さの融合パートナー蛋白およびそのペプチドフラグメントの保存的変種を含むが、この場合、保存的アミノ酸が野性型Ｌ２（およびＬ１）および融合パートナー蛋白のアミノ酸残基に代わって置換される。遺伝暗号の縮退のために、本発明はまた、Ｌ２（およびＬ１）および融合パートナー遺伝子のＤＮＡがコードするのと同じアミノ酸残基をコードするＤＮＡを含む。
【００４２】
このパピローマウイルス様キメラ粒子自体は、どのようなパピローマウイルスに由来するどのようなＬ２融合生成物もいずれのＬ１生成物と一緒に（該ゲノムが密接に関係しようと、関係が薄かろうと粒子への取り込みが生じるかぎり）取り込むと予想される。したがって、例えばＢＰＶ−１、ＢＰＶ−２、ＢＰＶ−４、ＣＲＰＶ、ＤＰＶ、ＥＥＰＶ、ＨＰＶ−１、ＨＰＶ−５、ＨＰＶ−６、ＨＰＶ８、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１またはＨＰＶ−３３の何れかと関係があるＬ２融合生成物は、例えば上記のウイルスの何れか、またはパピローマウイルスのいずれかのタイプ、サブグループもしくは株間変種に由来する何れのＬ１生成物とも粒子内に取り込まれ得る。
【００４３】
ＶＬＰｓは高力価の中和血清抗体の誘導に必要な形状依存性エピトープを表示するので、Ｌ２融合生成物を含むＶＬＰキメラは、液性免役の刺激のために最適化されたサブユニットワクチンとして機能し、パピローマウイルス感染を予防し、したがってパピローマウイルス関連癌およびパピローマウイルスに付随する他の病的状態の発生を排除する。
【００４４】
先に考察したように、ＶＬＰｓが既に存在する増殖性病巣の退縮を誘導する治療用ワクチンとして有効であるということはありそうもないので、キメラＶＬＰｓは、治療用ワクチンを開発しようと長い間熱望され、これまで果たされなかった要請を達成するために機能することができる。
【００４５】
おそらくキメラＶＬＰｓは、特異的な細胞表面レセプターに結合して内在化されて細胞質中に遊離され、したがって細胞性免疫を惹起させる細胞毒性Ｔ細胞に向けて呈示されるＭＨＣクラスＩ分子と組み合わされたペプチドの表示を促進するであろう。これは、特異的に細胞に進入したり、細胞毒性Ｔ細胞反応を誘導するためにＭＨＣクラスＩ分子と一体となってペプチドの表示を促進することが期待されない非複合体化蛋白と対照的な点である（この場合は、ＭＨＣクラスＩＩ分子と結合してヘルパーＴ細胞に呈示され、ペプチドの表示が促進される可能性の方が高い）。
【００４６】
Ｌ２融合生成物として１つまたは２つ以上のパートナーを包含することは、（臨床的病巣の治療および予防の改善を含む）広い利用スペクトルをもつ効果的なパピローマウイルスワクチンを作製するために明らかに経費効率が良い方法である。
【００４７】
融合パートナーは、ＶＬＰ基材ワクチンの潜在的標的を広げる方法を提供するような融合パートナー（例えばＥ６もしくはＥ７ペプチドまたは完全な長さのＥ６もしくはＥ７、他のパピローマウイルスペプチドもしくは蛋白、または他のＳＴＤもしくは感染性病原体（例えば単純ヘルペス、ＨＩＶ、トラコーマクラミジア、淋菌、梅毒トレポネーマ）のペプチドもしくは蛋白）から成る群から選択できる。
【００４８】
Ｌ２融合生成物はＬ２分子につきただ１つの融合パートナーとは限らず、また別の融合パートナー、例えば縦並びに連結したまた別のペプチドまたは完全な長さの蛋白、または同じかもしくは異なる蛋白に由来するそれらの組合せを含むことができる。さらにまた、１つ以上のＬ２融合生成物をただ１つのＶＬＰ中に同時に集合組み立てさせることができる。例えば、補助刺激蛋白の結合ドメインまたは免疫反応に必要な補助レセプターもしくはリガンドを含むように操作して、ウイルス標的エピトープを含むＬ２融合生成物または
キメラＶＬＰをまた作製できる。これらは、例えばＢ７（これはＴ細胞上でＣＤ２８と相互作用する）、細胞内粘着分子（ＩＣＡＭ）、リンパ球機能抗原（ＬＦＡ）、血管細胞粘着分子（ＶＣＡＭ−１）および熱耐性抗原（ＨＳＡ）（補助刺激物質またはリガンドをＶＬＰ表面に誘導するため、実施例１４参照）である。
【００４９】
疾患の予防および／または治療においてワクチンとして実際に好ましいパピローマウイルス様キメラ粒子の量は、製剤化された具体的な組成物、適用態様、処置される具体的な部位および器官によって変動することは理解されよう。ある宿主の投与量は通常の方法によって、例えば適切な慣用的免疫付与プロトコルによって決定できる。
【００５０】
また別にキメラＶＬＰはＶＬＰ精製方法でも用いることができる。ＶＬＰｓはそれ自体予防用ワクチンとして、さらに免疫診断として有用である（上掲書）。簡単に記せば、融合パートナーに対する抗体は標準的な免疫学的技術によって作製され、アフィニティークロマトグラフィーカラムはこの抗体を用いて構築される。続いてＶＬＰｓはアフィニティークロマトグラフィー工程で精製される。また、キメラＶＬＰｓは融合パートナーの精製方法で用いることができる。例えば、Ｌ２−Ｅ７融合生成物を含むＶＬＰｓは、正しく折り畳まれたＥ７を得る手段として有用である。子宮頸癌患者の血清は、細菌から分離されたような変性Ｅ７に対するよりも高い割合で形状的に正確なＥ７に対して陽性であることが報告された(Viscidiら、Int. J. Cancer 55:780(1993))。この報告でＥ７を生成させるために用いられたインビトロ転写−翻訳系は困難かつ高価で、しかも放射能標識Ｅ７を用いる。キメラＥ７ＶＬＰｓを精製し、この材料をＥ７ＥＬＩＳＡで用いることが有利であろう。ヒトＬ１またはＬ２との血清反応性の複雑さを避けるために、ＢＶＰ基材粒子を用いることができるであろう。Ｅ７の血清反応性（これは前癌病変とは対照的に癌と相関する）をモニターすることは、子宮頸癌患者で疾患の進行を追跡するために、さらに再発をスクリーニングするために有用であると提唱された（上掲書）。
【００５１】
場合によっては、キメラＶＬＰｓは活性を有する完全な蛋白を細胞に輸送させる方法で用いることができる。この蛋白は、例えば酵素または毒素または薬剤であろう。このキメラＶＬＰｓは細胞にインビトロ、インビボ、そのままの場所でまたは生体外のいずれかで投与され、この蛋白はその後細胞に輸送され、該細胞でその意図された目的（例えば酵素または毒素または薬剤として）のために機能する。
【００５２】
本発明者らは、Ｌ２に融合させたＥ７蛋白またはペプチドを取り込んだパピローマウイルス様キメラ粒子の作製に成功した。
【００５３】
パピローマウイルスＥ７遺伝子は、Ｌ２遺伝子の３'末端に枠内で融合させた場合、またはＬ２読み取り枠部分内で融合させた場合、ウイルス様粒子に取り込んだＬ２−Ｅ７融合蛋白をＬ１蛋白の存在下で発現させた。ＶＬＰｓへのＬ２−Ｅ７の取り込み効率と純正度は野性型Ｌ２蛋白のそれと同様であった。ＢＰＶＬ１／Ｌ２−Ｅ７ウイルス様粒子は、ＢＰＶＬ１／Ｌ２粒子と同じ効率で中和抗体を誘導させることが分かった。キメラ粒子は、Ｌ２−Ｅ７キメラ粒子で免疫したウサギで融合パートナーエピトープに特異的な液性免疫を誘導し、Ｅ７に対する抗体を生じることが観察された。
【００５４】
パピローマウイルス様キメラ粒子を作製することが可能になったことによって、実際上どのような蛋白またはペプチドもＬ２生成物に融合させ、パピローマウイルス様キメラ粒子に取り込ませることが可能になる。
【００５５】
本発明者らは、Ｌ２−Ｅ７融合蛋白を作製し、これらの蛋白を昆虫細胞でリコンビナントバキュロウイルスを介してＬ１とともに発現させることによってキメラＶＬＰｓを製造することに成功した。我々は３つのキメラＶＬＰｓを作製した：ＨＰＶ１６Ｌ１＋ＨＰＶ
１６Ｌ２−ＨＰＶ１６Ｅ７（完全な長さ）、ＢＰＶＬ１＋ＢＰＶＬ２−ＨＰＶ１６Ｅ７（完全な長さ）およびＢＰＶＬ１＋ＢＰＶＬ２−ＨＰＶ１６Ｅ７（アミノ酸１〜３０）。ＢＰＶＬ２はＨＰＶ１６Ｅ７にその３'末端で融合させた。ＨＰＶ１６Ｌ２はＨＰＶ１６Ｅ７にその３'末端で融合させた。さらにＨＰＶ１６Ｅ７の最初の３０コドンはＢＰＶＬ２のコドン２７４と２７５との間に挿入させた。
【００５６】
Ｌ１およびＬ２−Ｅ７の蔗糖濃度勾配による同時沈降並びに免疫沈澱によって、キメラ蛋白がＶＬＰｓに取り込まれていることが示された。
【００５７】
透過型電子顕微鏡によって、Ｌ２−Ｅ７融合蛋白を含む粒子はＬ１またはＬ１／Ｌ２ＶＬＰｓと同じ効率で集合組立が行なわれ、形態学的に区別できないことが明らかになった。
【００５８】
インビトロＢＰＶ１中和アッセーによって、ＢＰＶＬ１含有キメラＶＬＰｓは中和抗血清を誘導できることが示された。力価はＢＰＶＬ１／Ｌ２を用いて得られるものに匹敵した。３００００に匹敵する中和力価がＢＰＶＬ１／Ｌ２ＶＬＰｓおよびＢＰＶＬ１／Ｌ２−ＨＰＶ１６Ｅ７（完全な長さ）キメラＶＬＰｓの両方に対して得られた。
【００５９】
Ｌ２−Ｅ７キメラ粒子で免疫したウサギはＥ７に対する抗体を生じたが、このことは、キメラＶＬＰｓによる融合パートナーエピトープに対して特異的な液性免疫が誘導されることを示し、さらにＥ７の存在部位がＶＬＰｓの外部であることを確認させた。
【００６０】
実施例１で説明するように、キメラリコンビナントバキュロウイルスを作製することができる。キメラの遺伝子は、ゲノム源またはｃＤＮＡから直接的合成またはそのいずれかの組合せによって得ることができる。Ｌ２およびその融合パートナー遺伝子はリコンビナントＰＣＲ技術によって増幅できる。このＰＣＲ技術は、例えば融合を促進し、さらに発現、移転および／またはクローニングのためのベクター（例えばプラスミド）へのクローニングを促進する制限酵素部位を含むオリゴヌクレオチドを用いる。
【００６１】
融合遺伝子はバキュロウイルス発現ベクターでクローニングできる。Ｌ１を含む別のバキュロウイルス発現ベクターを作製できる。または、融合遺伝子は、既にＬ１を含むバキュロウイルス二重発現ベクターでクローニングできる。
【００６２】
実施例２では、リコンビナントバキュロウイルス選別の典型的な方法が説明される。ＣｓＣｌ精製（またはそれに匹敵する）リコンビナントプラスミドをバキュロウイルスＤＮＡとＳｆ９昆虫細胞にリポフェクチン（またはそれと同等なもの）を用いて同時トランスフェクションさせることができる。続いて、通常のバキュロウイルスベクターおよび昆虫細胞培養方法を用いて、リコンビナントバキュロウイルスを（例えば）プラーク精製することができる。
【００６３】
二重発現バキュロウイルスベクターの代わりに２種の単一発現バキュロウイルスを用いる方が有利であるかもしれない。この場合には、キメラＶＬＰｓはＳｆ９細胞を２つのリコンビナントバキュロウイルス（１つはＬ１生成物を他方はＬ２融合生成物をコードする）で感染させることによって生成できる。該遺伝子を異なるベクターに配置することによって、産生されるＬ１生成物およびＬ２融合生成物量を操作することができる。このアプローチは、ＶＬＰにおけるＬ２融合生成物のＬ１生成物に対する比を変化させることを可能にする。天然のビリオンではＬ２はＬ１に比べて少ない成分であるが、２種の単一発現ベクターを用いてＶＬＰへのＬ２融合生成物のより大量の取り込みを達成することができる。
【００６４】
実施例３で説明するように、キメラ粒子は塩化セシウム（または同等物）中でのバンド形成によって精製することができる。Ｓｆ９昆虫細胞にバキュロウイルスを例えば感染価１０で感染させることができる。７２時間後（またはその辺りで）、細胞を採取し燐酸緩衝食塩水中で６０秒（またはその辺りで）音波破砕できる。低速（または同等な処理）で清澄にした後、溶解物を４０％（重量／容積）の蔗糖／ＰＢＳクッション中で例えば１１００００×ｇ、２５時間遠心する（ＳＷ−２８ローター）。再懸濁させた沈殿物を、例えば１０−４０％（重量／重量）のＣｓＣｌ／ＰＢＳ勾配中で室温で２０時間１４１０００×ｇで平衡に達するまで遠心する。目に見えるバンドを採取し、同一条件を用いて再び平衡となるまで遠心し、ＰＢＳに対して十分に透析して（例えば）４℃で保存する。
【００６５】
実施例４に説明するように、キメラ複合体の同時沈降を、例えば分析用濃度勾配遠心で実施できる。例えば、１２から４５％蔗糖の段階勾配は４℃で一晩で直線化して透析したサンプルを最上部に重層し、この濃度勾配を４１０００ｒｐｍ（２８８０００×ｇ）で２時間ＳＷ−４１ローターで遠心する。分画を採集し、同時沈降について例えばウェスタンブロット分析または同時免疫沈澱によって分析する。
【００６６】
実施例５で説明するように、同時沈降は例えば免疫沈澱によって達成される。
【００６７】
実施例６で説明するように抗血清を作製できる。これは、文献に記載されたように(Dvoretskyら、Virology 103:369(1980)）、ＢＰＶ１中和アッセー（または同等なもの）を実施するために行なわれる。抗血清は例えば以下のように作製される。ＰＢＳ中のＣｓＣｌ勾配精製粒子３３０μｌ（濃度１ｍｇ／ｍｌ）を皮下注射してウサギを免疫する。続いて、最初の注射から２週間後および４週間後に同じ量の粒子でウサギを追加免疫する。
【００６８】
実施例７で説明するようにＢＰＶ１中和アッセー（または同等なもの）を実施し、ＢＰＶキメラ粒子が形状エピトープを表示しているか否かを調べる。例えば２回目の追加免疫注射後３週間して得られた血清の段階希釈を＝５００フォーカス形成単位のＢＰＶ１ウイルスと３０分保温し、このウイルスをＣ１２７細胞に１時間吸着させ、この細胞を３週間培養する。続いてフォーカスをメタノール中の０．５％メチレンブルー／０．２５％石炭酸フクシンで染色する。キメラＶＬＰｓおよびコントロールＢＰＶＬ１−Ｌ２ＶＬＰｓについて中和力価を得る。匹敵する中和力価は、キメラ粒子が適切に折り畳まれて有効に形状エピトープが表示されていることを示す。
【００６９】
実施例８に説明するように、キメラ粒子は例えば透過型電子顕微鏡で調べることができる。例えば、精製粒子を炭素被覆グリッドに吸着させ、１％酢酸ウラニルで染色し、フィリップス電子顕微鏡モデルＥＭ４００Ｔで３６０００倍で調べる。キメラ粒子およびＬ１またはＬ１／Ｌ２ＶＬＰｓの取り込み効率並びに形態を比較する。取り込みおよび形態が区別不可能であるということは、キメラ粒子の適切な自己集合組立を示唆する。
【００７０】
実施例９で説明するように、キメラ粒子は、例えば融合パートナーエピトープに対して特異的な液性免疫誘導について調べられる。例えば、ウサギにキメラＶＬＰｓを接種する。例えば融合パートナー抗原サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに、続いてウェスタンブロッテイング分析に付してこの血清を抗体について調べる。免疫血清および免疫前血清（コントロール）を適切に希釈して用いることができる。免疫ウサギから得た血清によってウェスタンブロットで融合パートナーのバンドが検出されれば、融合パートナーエピトープに対して特異的な抗体が誘導されたことが示唆される。
【００７１】
実施例１０で説明するように、例えばキメラＶＬＰｓをマウスに注射し抗原特異的Ｔ細胞増殖を測定することによって、融合ペプチドについて特異的な細胞性免疫の誘導についてキメラ粒子を調べる。
【００７２】
実施例１１で説明するように、Ｌ２融合は予防免疫を失わせないことを明らかにするために、例えばウサギをキメラＣＲＰＶＶＬＰｓおよび非キメラＣＲＰＶＶＬＰｓ（コントロール）で免疫し、続いて感染性ＣＲＰＶで試験感染させることによって、または、ＳＴＤ病原体を含むキメラＶＬＰｓで実験動物を免疫し、続いてＳＴＤで試験感染させてから致死的感染に対する生存の向上もしくは致死量以下の試験感染後の感染の減少を測定することによって、キメラ粒子を試験感染に対する予防免疫の誘導について調べることができる。
【００７３】
実施例１２で説明するように、例えばキメラＣＲＰＶＶＬＰｓおよび非キメラＣＲＰＶＶＬＰｓ（コントロール）を用いて（既にパピローマをもつ）ウサギを免疫し、存在するパピローマの退縮を測定することによって、既に存在するパピローマに対する治療的免疫誘導についてキメラ粒子を調べることができる。
【００７４】
実施例１３で説明するように、例えば腫瘍の免疫療法および免疫的予防についてキメラ粒子を調べることができる。
【００７５】
本発明の具体的な特徴は、特定の実施形態に本発明の範囲を限定することなく本発明の例示を目的とする以下の実施例を参考にいっそう容易に理解されよう。
【実施例】
【００７６】
以下に、本発明の実施例を説明するが、本発明は以下の実施例になんら限定されるものではない。
（実施例１）
［キメラリコンビナントバキュロウイルスの作製］
３種のキメラを作製した：ＨＰＶ１６Ｌ２−ＨＰＶ１６Ｅ７、ＢＰＶＬ２−ＨＰＶ１６Ｅ７およびＢＰＶＬ２−ＨＰＶ１６Ｅ７（アミノ酸１〜３０）。ＨＰＶ１６Ｌ２−ＨＰＶ１６Ｅ７は、ＨＰＶ１６Ｌ２のＣ−末端（アミノ酸４７３）に融合させた完全な長さのＨＰＶ１６Ｅ７を含んでいた。ＢＰＶＬ２−ＨＰＶ１６Ｅ７は、ＢＰＶＬ２のＣ−末端（アミノ酸４６９）に融合した完全な長さのＨＰＶ１６Ｅ７を含んでいた。ＢＰＶＬ２−ＨＰＶ１６Ｅ７（アミノ酸１〜３０）は、アミノ酸２７４と２７５の間でＢＰＶＬ２の中央に融合させたＨＰＶ１６Ｅ７の最初の３０アミノ酸を含んでいた。
【００７７】
Ｌ２−Ｅ７キメラ遺伝子はリコンビナントＰＣＲ技術（R. Higuchi(1990)、「ＰＣＲプロトコル：方法と応用の手引」(PCR Protocols: A Guide toMethods and Applications）より、M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky & T.J. White編、(Academic, NY), pp.177-180))によって作製した。完全な長さのＨＰＶ１６Ｅ７を含むキメラについては、制限酵素部位を含む５'オリゴおよび、Ｅ７の５'オリゴと相補的な３'オリゴを用いてＬ２を増幅させた。それぞれ別個の反応で、Ｌ２の３'オリゴと相補的な５'オリゴ、および制限酵素部位を含む３'オリゴを用いてＥ７を増幅させた。続いて、外側（Ｌ２の５'およびＥ７の３'）オリゴのみを用いて、Ｌ２およびＥ７遺伝子を第二のプライマー伸長反応で融合させた。ＨＰＶ１６Ｅ７のアミノ酸１〜３０のみを含むキメラについては、"内部"プライマーはＨＰＶ１６Ｅ７の最初の３０アミノ酸をコードした。
【００７８】
続いて、融合遺伝子をバキュロウイルス二重発現ベクターｐＳｙｎｗｔＶ１−（これはポリヘドロンプロモーター下でクローニングされたＬ１を既に含む(Kirnbauerら、Virol.
67:6929(1993)）でｐＳｙｎプロモーターの直ぐ下流でクローニングした。
【００７９】
ＢＰＶＬ２−ＨＰＶ１６Ｅ７キメラは５'ＢｇＩＩＩから３'ＢｇＩＩＩフラグメントとしてクローニングした。ＨＰＶ１６Ｌ２−ＨＰＶ１６Ｅ７キメラは５'ＳｓｔＩＩから３'
ＳｓｔＩＩフラグメントとしてクローニングした。ＢＰＶＬ２−ＨＰＶ１６Ｅ７（完全な長さ）のために用いたプライマーは以下の通りであった：ＢＰＶＬ２のセンス（鎖）は、5'GCGGTAGATCTACCTATAAATATGAGTGCACGAAAAAGAGTAAAACGT3' （配列番号：１）、アンチセンス（鎖）は、5'GCAATGTAGGTGTATCTCCATGCATGGCATGTTTCCGTTTTTTTCGTTTCCTCAACAAGGAGGG3'（配列番号：２）ＨＰＶ１６Ｅ７、センスは、5'CCCTCCTTGTTGAGGAAACGAAAAAAACGGAAACATGCCATGCATGGAGATACACCTACATTGC3'（配列番号：３）およびアンチセンスは5'CCGCTAGATCTGGTACCTGCAGGATCAGCCATGG3' （配列番号：４）ＢＰＶＬ２−ＨＰＶ１６Ｅ７（アミノ酸１〜３０）のために用いたプライマーは以下の通りであった：ＢＰＶＬ２、センスは上記と同じで、内部プライマーのアンチセンスは5'CAGTTGTCTCTGGTTGCAAATCTAACATATATTCATGCAATGTAGGTGTATCTCCATGCATGGATGAAAACACTTCAGGATCTTCCGTGGGC3' （配列番号：５）、内部プライマーのセンスは5'GCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGAGACAACTGATCTCTACTGTTATGAGCAATTAAATGACCAAACATTTGCAAACCCACTGTATGAAGCAGAACC3' （配列番号：６）、ＢＰＶＬ２、アンチセンスは5'CCGCTAGATCTAGGGAGATACAGCTTCTGGCCTTGTTGCCACAACGC3'（配列番号：７）。ＨＰＶ１６Ｌ２−ＨＰＶ１６Ｅ７キメラのために用いたプライマーは以下の通りであった：ＨＰＶ１６Ｌ２、センスは5'GCGGTCCGCGGAATATGCGACACAAACGTTCTGCAAAACGCACAAAACGT3'(配列番号：８）、およびアンチセンスは5'ATCTCCATGCATGGCAGCCAAAGAGAC3'（配列番号：９）、ＨＰＶ１６Ｅ７、センスは5'GTCTCTTTGGCTGCCATGCATGGAGAT3'（配列番号：１０）、およびアンチセンスは5'GCTCCGCGGGGTACCTGCAGGATCAGCC3' （配列番号：１１）。
【００８０】
（実施例２）
［リコンビナントバキュロウイルスの選別］
リポフェクチン(GIBCO/BRL製、ガイザースバーグ、メリーランド）を用いて、ＣｓＣｌ精製リコンビナントプラスミドをＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ１７１１）にバキュロウイルスＤＮＡ（Baculo-Gold;PharMingen製、サンディエゴ、カリフォルニア）と同時トランスフェクションさせた（P.C. Harting, Biotechniques 11:310(1991)）。リコンビナントバキュロウイルスは、記載（M.D. Summers & G.E. Smith (1987)、「バキュロウイルスベクターと昆虫細胞培養手順の手引」(A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures)、Texas Agricultural Experiment Station Bulletin(Tex. Agric. Exp. Stn., College Station, TX)、1555巻）にしたがってプラーク精製した。
【００８１】
（実施例３）
［キメラ粒子の精製］
Ｓｆ９昆虫細胞は、感染価１０でリコンビナントバキュロウイルスで感染させられた。７２時間後、採取細胞を燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で６０秒間音波で破砕した。低速で清澄にした後、溶解物を４０％（重量／容積）の蔗糖／ＰＢＳクッション中で１１００００×ｇ、２５時間遠心した（ＳＷ−２８ローター）。再懸濁させた沈殿物を、１０〜４０％（重量／重量）のＣｓＣｌ／ＰＢＳ勾配中で室温で２０時間１４１０００×ｇで平衡に達するまで遠心した。目に見えるバンドを採取し、同一条件を用いて再び平衡となるまで遠心し、ＰＢＳに対して十分に透析して４℃で保存した。
【００８２】
（実施例４）
［Ｌ１／Ｌ２−Ｅ７複合体の同時沈降］
Ｌ２−Ｅ７融合蛋白が粒子内に取り込まれているか否かを決定するために、分析用濃度勾配遠心を、Ｌ１およびＬ２の同時集合組立について調べるために先に報告されたように実施した(Kirnbauerら、Virol. 67:6929(1993)）。
【００８３】
簡単に記せば、１２から４５％の蔗糖段階濃度勾配を４℃で一晩直線化させて透析サンプルを最上部に重層し、この濃度勾配をＳＷ−４１ローターで４１０００ｒｐｍ（２８８０００×ｇ）で２時間遠心した。分画を採取し、これら分画をクーマシー染色ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ（Ｌ１）またはウェスタンブロット分析（抗ＢＰＶＬ２ポリクローナル抗体または抗ＨＰＶ１６Ｅ７ポリクローナル抗体および125Ｉ標識抗ウサギＩｇＧを用いる）で調べた。
【００８４】
キメラＬ２−Ｅ７とウイルス様粒子との結合は同時沈降分析によって確認された。
【００８５】
（実施例５）
［Ｌ１／Ｌ２−Ｅ７複合体の同時免疫沈澱］
Ｌ２−Ｅ７融合蛋白はＬ１と安定な複合体を形成するという証拠を得るために、同時免疫沈澱実験を実施した。
【００８６】
簡単に記せば、ＢＰＶＬ１／Ｌ２−ＨＰＶ１６Ｅ７（完全な長さ）およびＢＰＶＬ１／Ｌ２−ＨＰＶ１６Ｅ７（アミノ酸１〜３０）ＶＬＰ調製物を、ＰＢＳ、１％トリトンＲＸ−１００中で抗Ｌ１モノクローナル抗体５Ｂ６(Rodenら、J. Virol. 印刷中（1994年11月))、抗Ｌ１ポリクローナル抗体、免疫前血清または無関係抗体（抗Ｅ１Ａモノクローナル抗体）および蛋白Ａセファロースを用いて免疫沈澱させ、さらにＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。蛋白を免疫ブロッティングに付し、抗ＢＰＶＬ２もしくは抗ＨＰＶ１６Ｅ７血清または抗ＨＰＶ１６Ｅ７モノクローナル抗体（Triton Diagnostics製、アラメダ、カリフォルニア）をプローブとして調べた。
【００８７】
キメラＬ２−Ｅ７とウイルス様粒子との結合は同時免疫沈澱によって確認された。
【００８８】
（実施例６）
［抗血清の作製］
ＰＢＳ中で１ｍｇ／ｍｌの濃度の３３０μｌのＣｓＣｌ濃度勾配精製粒子を皮下注射してウサギを免疫した。最初の注射から２週間および４週間後で同じ量の粒子でウサギを追加免疫した。
【００８９】
（実施例７）
［ＢＰＶ１中和アッセー］
報告(Kirnbauerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:12180(1992)）にしたがってフォーカス形成アッセーを実施した。
【００９０】
簡単に記せば、２回目の追加免疫注射の３週間後に得たウサギの血清の段階希釈を、＝５００フォーカス形成単位のＢＰＶ１ウイルスと３０分保温し、このウイルスをＣ１２７細胞に１時間吸着させ、さらにこの細胞を３週間培養した(Dvoretzkyら、Virology 103:369(1990)）。フォーカスをメタノール中の０．５％メチレンブルー／０．２５％石炭酸フクシンで染色した。
【００９１】
３００００に匹敵する中和力価がＢＰＶＬ１／Ｌ２ＶＬＰｓおよびＢＰＶＬ１／Ｌ２−ＨＰＶ１６Ｅ７（完全な長さ）キメラＶＬＰｓについて得られた。
【００９２】
（実施例８）
［電子顕微鏡］
透過型電子顕微鏡観察を報告(Kirnbauerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:12180(1992)）にしたがって実施した。
【００９３】
簡単に記せば、精製粒子を炭素被覆グリッドに吸着させ、１％酢酸ウラニルで染色し、フィリップス電子顕微鏡モデルＥＭ４００Ｔで３６０００倍で調べた。
【００９４】
Ｌ２−Ｅ７融合蛋白を含む粒子は、形態および取り込み効率に関してＬ１ＶＬＰｓまたはＬ１／Ｌ２ＶＬＰｓと区別できないことが分かった。
【００９５】
（実施例９）
［抗体の誘導］
ＢＰＶＬ１／Ｌ２−ＨＰＶ１６Ｅ７パピローマウイルス様粒子を接種したウサギはＥ７を認識する抗血清を産生した。
【００９６】
Ｅ７特異性について血清を調べるために、２．５μｇのＨＰＶ１６Ｅ７および２．５μｇのＢＳＡ（コントロール）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、続いてウェスタンブロッティングで調べた。免疫血清および免疫前血清（コントロール）を１：１０の希釈で用いた。
【００９７】
免疫ウサギから得た血清はウェスタンブロットでＨＰＶ１６Ｅ７蛋白バンドを特異的に検出し、Ｅ７エピトープに特異的な抗体の誘導を示唆した。
【００９８】
（実施例１０）
［細胞性免疫の誘導］
Ｅ７ペプチドに特異的な細胞性免疫の誘導について、例えばキメラＶＬＰｓをマウスに注射し、抗原特異的Ｔ細胞増殖を測定することによって、キメラ粒子を調べた。
【００９９】
（実施例１１）
［予防的免疫］
キメラ粒子を、試験感染に対する予防的免疫の誘導について調べる。例えばＥ７キメラＣＲＰＶＶＬＰｓおよび非キメラＣＲＰＶＶＬＰｓ（コントロール）でウサギを免疫し、続いて感染性ＣＲＰＶで試験感染させて、Ｌ２−Ｅ７融合が予防的免疫を失わせないことを示すか、またはＳＴＤ病原体を含むキメラＶＬＰｓで実験動物を免疫し、続いてＳＴＤ病原体で試験感染させ、致死的感染に対する生存度の向上または致死量以下の試験感染後の感染の減少を測定する。
【０１００】
（実施例１２）
［治療的免疫］
例えば、ウサギ（既にパピローマをもつ）をＥ７キメラＣＲＰＶＶＬＰｓおよび非キメラＣＲＰＶＶＬＰｓ（コントロール）で免疫し、既に存在するパピローマの退縮を測定することによって、既に存在するパピローマに対する治療的免疫の誘導についてキメラ粒子を調べる。
【０１０１】
（実施例１３）
［腫瘍の免疫療法および免疫予防］
例えば、実験動物（例えばマウス）で既に存在する腫瘍を治療する能力、または腫瘍の発達を予防する能力について、例えばＥ７を発現している腫瘍細胞を用いてキメラ粒子を調べる。動物を、例えばＬ２−Ｅ７キメラＶＬＰｓで免疫し、例えばＥ７を発現している接種腫瘍原性細胞の増殖について調べる。このアプローチは、非複合Ｅ７および補助刺激蛋白で免疫した動物で機能することが示された（Chenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:110(1991))。
【０１０２】
（実施例１４）
［キメラＶＬＰｓの表面への誘導］
細胞表面に結合する例えば補助刺激物質またはリガンドのようなある種の分子は、キメラＶＬＰｓの表面に存在することが望ましいかもしれない。ローデンら(Rodenら、J. Virol. 印刷中（1994年、11月))は、Ｌ２の領域はＶＬＰｓの表面存在することを見出した。
ＢＰＶＬ２アミノ酸４４〜１７３を含むペプチドは、ウサギに接種されたとき、１：１０００の血清希釈で活性を有する中和抗体を誘導した。これらの結果は，Ｌ２の領域は中和エピトープを明示し、さらにこれらの領域は天然のビリオン表面に接近できることを示唆している。したがって、非Ｌ２ポリペプチドをこれらの領域の１つに融合させることによって、おそらくこのペプチドをキメラＶＬＰ表面に誘導することができるであろう。
【配列表】
2007143560000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年2月27日(2007.2.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パピローマウイルスの形状エピトープを有し、パピローマウイルスＬ１融合生成物を含むパピローマウイルス様粒子を生成させる方法であって、宿主細胞が合成ＤＮＡ分子を発現させる条件を提供し、前記パピローマウイルス様粒子を生成させる工程を含み、
前記宿主細胞は合成ＤＮＡ分子により形質転換された宿主細胞であって、
前記合成ＤＮＡ分子は、パピローマウイルスＬ１融合生成物をコードし、前記形質転換された宿主細胞において、発現を誘導可能な遺伝子発現系をさらに含み、
前記パピローマウイルスＬ１融合生成物は、Ｌ１蛋白質配列由来のアミノ酸鎖、およびＬ１蛋白質以外の蛋白質由来のアミノ酸鎖からなる融合パートナーを含む、
パピローマウイルス様粒子を生成させる方法。
【請求項２】
前記パピローマウイルス様粒子を、前記宿主細胞から回収する方法をさらに含む、請求項１に記載のパピローマウイルス様粒子を生成させる方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡ分子が昆虫形質転換宿主細胞において発現を誘導可能な遺伝子発現系をさらに含み、前記ＤＮＡ分子がさらに昆虫細胞ベクターを含む、又は、前記ＤＮＡ分子が哺乳類形質転換宿主細胞において発現を誘導可能な遺伝子発現系をさらに含み、前記ＤＮＡ分子がさらに哺乳類細胞ベクターを含む、又は、前記ＤＮＡ分子が酵母形質転換宿主細胞において発現を誘導可能な遺伝子発現系をさらに含み、前記ＤＮＡ分子がさらに酵母細胞ベクターを含む、請求項１に記載のパピローマウイルス様粒子を生成させる方法。