(57)【要約】【課題】カロテノイド生産性微生物、好ましくは細菌、さらに好ましくはパラコッカス属細菌の培養において培養の途中に鉄塩の添加を行うことで、カロテノイド、特にＡｘを効率良く生産する方法を提供する。【解決の手段】微生物の培養によりカロテノイド類を生産する方法において、培養する微生物菌体に含まれる無機元素組成比に合わせた初期培地により微生物の培養を開始し、微生物の菌体密度が最大菌体密度の５０〜９０％に達したときに、初期培地に含まれた鉄塩量の１／１０〜５倍量（重量換算）の鉄塩を培養液に添加するカロテノイド類の生産方法を用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物の培養によりカロテノイド類を生産する方法において、培養する微生物菌体に含まれる無機元素組成比に合わせた初期培地により微生物の培養を開始し、微生物の菌体密度が最大菌体密度の５０〜９０％に達したときに、初期培地に含まれた鉄塩量の１／１０〜５倍量（重量換算）の鉄塩を培養液に添加することを特徴とするカロテノイド類の生産方法。
【請求項２】
最大菌体密度が、鉄塩として初期培地含有分のみで微生物を培養したときに到達する最大の菌体密度であることを特徴とする請求項１記載のカロテノイド類の生産方法。
【請求項３】
カロテノイド類が、アスタキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、アドニキサンチン、エキネノンおよびβ−カロテンからなる群より選ばれる１または複数種のカロテノイドであることを特徴とする請求項１または請求項２に記載のカロテノイド類の生産方法。
【請求項４】
微生物が、細菌であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のカロテノイド類の生産方法。
【請求項５】
微生物が、パラコッカス属細菌であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のカロテノイド類の生産方法。
【請求項６】
微生物が、パラコッカス属細菌Ｎ−８１１０６株の改変株であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のカロテノイド類の生産方法。
【請求項７】
改変株が、自然突然変異または変異原物質や紫外線等による人為的操作で誘発された変異株、または上記記載の微生物に遺伝子操作を施した組換え株であることを特徴とする請求項６に記載のカロテノイド類の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、養殖サケ・マス・マダイの色揚げ剤や鶏卵の色調改善剤、健康補助食品、医薬品として有用な化合物であり、脂溶性色素である天然アスタキサンチン（以下、「Ａｘ」という。）を微生物の培養により高収量に得る方法に関するものである。詳しくは、培養の途中に鉄塩の添加を行うことで、カロテノイド類、特にＡｘを効率良く生産する方法である。
【背景技術】
【０００２】
β‐カロチンやリコペンなどに代表されるカロテノイド類の化合物のうち、アスタキサンチン（Ａｘ）は、オキアミ、カニ、エビなどの甲殻類やマダイ、サケ、マスなどの魚類、フラミンゴなどの鳥類、藻類や微生物等に広く分布する天然の化合物である。近年はサケやマス、マダイ等の養殖魚の色揚げ剤や鶏卵の色調改善剤としてＡｘの需要が増加している。またＡｘには抗酸化活性や抗癌活性などの様々な生理的作用が確認され、医薬品や健康補助食品としての利用も注目されている。
【０００３】
Ａｘの製造方法としては、化学合成法、天然物からの抽出法、微生物による発酵生産法などがあるが、現在は主に価格等の要因から化学合成法による製品が広く流通している。しかし、化学合成法では原料に臭素および塩素を含むハロゲン系化合物や重金属類を使用するため安全性に懸念があり（例えば、特許文献１参照）、消費者の自然、天然志向にともない天然物由来のＡｘへの要求が強くなっている。
【０００４】
天然物からの抽出法としてはオキアミ等からの抽出法があるが、これらは含量が低く、採取、抽出、精製などに多大な労力を要し、コスト的に問題があった。
【０００５】
微生物を利用した製法としては、酵母ではファフィア・ロドチーマ（Ｐｈａｆｆｉａ  ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）（例えば、非特許文献１参照）、藻類ではヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）（例えば、非特許文献２参照）の報告がある。しかしながらファフィア酵母は増殖速度が遅いため培養日数が長く、細胞壁が強固なために抽出効率が低く、含量が少ないためコスト高である。またヘマトコッカス藻類は増殖速度が非常に遅いために培養日数が長く、光を必要とするため立地条件や設備などに制約がある他、クロロフィルなどの夾雑物の除去が必要になりコスト高である。
【０００６】
これらの問題を解決する方法として海洋性アグロバクテリウム属細菌Ｎ−８１１０６（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１４０２３）の培養により得る方法が開示されている（例えば、特許文献２参照）。当該発明によれば、藻類や酵母に比べて細菌は増殖が速く、また細胞壁が脆弱であり、藻類と異なりクロロフィルなどのカロテノイド以外の色素を含まず、酵母のように副生成物の多糖類を生産しないという利点がある。当該発明によればＡｘを含有した菌体が迅速に得られ、さらに菌体を回収した後、アセトンなどの有機溶媒と菌体を混和・攪拌するだけで容易にＡｘを抽出できるという利点がある。なお、この微生物は後に１６ＳリボゾーマルＲＮＡ遺伝子の配列解析が行われた結果、パラコッカス属細菌と再同定された。海洋バイオテクノロジー研究所においてＭＢＩＣ０１１４３としても管理され、その諸性質に関する情報の概略は国立遺伝学研究所日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）や米国ＮＩＨのデーターベース（ＮＣＢＩ）に公開されている（例えば、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５参照）。また該微生物を用いて変異育種を行ない、Ａｘの生産能が向上したＴＳＵＧ１Ｃ１１株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４１６）やＴＳＮ１８Ｅ７株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４６）の取得例が報告されている（例えば、特許文献３参照）。
【０００７】
Ｎ−８１１０６株は細胞中にＡｘを主なカロテノイドとして蓄積するが、その他にβ−カロテン、エキネノン、β−クリプトキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、カンタキサンチン、３’−ヒドロキシエキネノン、シス−アドニキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチンなどの多様なカロテノイドを蓄積し、これらの生成比率は培養条件により変化することも知られている（例えば、非特許文献６参照）。
【０００８】
当該微生物のＡｘの生合成経路はＦｒａｓｅｒらにより解明されている（例えば、非特許文献７参照）。彼らはβ−カロテンからＡｘを合成する酵素の遺伝子であるｃｒｔＷおよびｃｒｔＺを見出し、大腸菌にクローニングして製造した両酵素の性質を解析した。その結果によれば、これらはそれぞれβ−カロテンの３および３’位にケト基を導入する酵素、および４および４’位に水酸基を導入する酵素である。この発見に基づき、Ａｘの生合成経路として（１）β−カロテンにｃｒｔＺが優先して作用してβ−クリプトキサンチンを経てゼアキサンチンが第一に生産され、次いでｃｒｔＷが作用してアドニキサンチン（４−ケトゼアキサンチンとも称される）を経てＡｘが生産される経路と、（２）ｃｒｔＷが優先して作用してエキネノンを経てカンタキサンチンが第一に生産され、次いでｃｒｔＺが作用してフェニコキサンチンを経てＡｘに至る経路の、二つの経路が存在することが解明された。
【０００９】
両酵素は機能発現のために鉄イオンを必要とすることも明らかにされている。すなわち、本微生物の培養によりＡｘを得るためには鉄イオンが需要な因子であることが知られていた。しかしながら本微生物の培養方法において、反応の初期に鉄塩を添加することが行われてきたのみであり、培養途中に鉄塩を添加することなどの添加方法等の培養方法の改善については全く知られていなかった。
【００１０】
【特許文献１】米国特許第４２８３５５９号明細書
【特許文献２】特許第３５７０７４１号公報
【特許文献３】特開２００５−５８２１６号公報
【非特許文献１】Ａｎｄｒｅｗｅｓ，Ａ．Ｇ．ら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１５，１００３，１９７６年
【非特許文献２】Ｒｅｎｓｔｒｏｍ，Ｂら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０，２５６１，１９８１年
【非特許文献３】インターネット（海洋バイオテクノロジー研究所ホームページ）、株式会社  海洋バイオテクノロジー研究所、ＭＢＩＣ（菌株コレクションデータベース）、［ｏｎｌｉｎｅ］、掲載年月日不明、９ページ目の「ｃａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ」、「ｓｔｒａｉｎ  ｎａｍｅ」及び「１６ｓ」の項、  ［平成１７年６月８日検索］、インターネット：＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｃｏｄ．ｍｂｉｏ．ｃｏ．ｊｐ／ｍｂｉｈｐ／ｊ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ＞
【非特許文献４】インターネット（国立遺伝学研究所ホームページ）大学共同利用機関法人  情報・システム研究機構  国立遺伝学研究所  日本ＤＮＡデータバンク、「ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ」、［ｏｎｌｉｎｅ］、２００２年１０月８日、３ページ目の「ＯＲＩＧＩＮ」の項、［平成１７年６月８日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ＞
【非特許文献５】インターネット（米国Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈホームページ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、［ｏｎｌｉｎｅ］、２００２年１０月８日、４頁目の「Ｓｏｕｒｃｅ  ｏｒｉｇｉｎｅ」および「Ｆｅａｔｕｒｅｓ」の項、［２００５年１０月１８日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／＞
【非特許文献６】Ａ．Ｙｏｋｏｙａｍａ  ＆  Ｗ．Ｍｉｋｉ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｏｒｉｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２８，１３９，１９９５）。
【００１１】
【非特許文献７】Ｆｒａｓｅｒ  Ｐ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，６１２８，１９９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、カロテノイド生産性微生物、好ましくは細菌、さらに好ましくはパラコッカス属細菌の培養において培養の途中に鉄塩の添加を行うことで、カロテノイド、特にＡｘを効率良く生産する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは上記課題に関し鋭意検討した結果、本微生物の培養においては培養初期と中期では菌体収量やＡｘの生産に好適な鉄塩の濃度が異なり、初期に鉄塩濃度が高い場合には微生物の増殖には好ましく作用するがカロテノイド生産を阻害し、一方、培養途中に鉄塩を追加することでカロテノイド生産量が向上することを見出した。さらに検討を行った結果、特定の培養条件で培養を開始し、その条件で得られる菌体密度の５０％から９０％、好ましくは５０％から８５％に到達した段階で、初期濃度の１／１０倍〜５倍量以上、好ましくは１／５倍〜３倍量の鉄塩を添加することによりＡｘの生産量が向上することを見出し、本発明の完成に至った。
【００１４】
すなわち本発明は、微生物の培養によりカロテノイド類を生産する方法において、培養する微生物菌体に含まれる無機元素組成比に合わせた初期培地により微生物の培養を開始し、微生物の菌体密度が最大菌体密度の５０〜９０％に達したときに、初期培地に含まれた鉄塩量の１／１０〜５倍量（重量換算）の鉄塩を培養液に添加するカロテノイド類の生産方法であり、さらに最大菌体密度とは、鉄塩として初期培地含有分のみで微生物を培養したときに到達する最大の菌体密度であるカロテノイド類の生産方法である。
【００１５】
また本発明は、生産対象のカロテノイド類が、アスタキサンチン（Ａｘ）、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、アドニキサンチン、エキネノンおよびβ−カロテンからなる群より選ばれる１または複数種のカロテノイドである、カロテノイド類の生産方法であり、この内でもＡｘの生産性を向上させることができる。
【００１６】
また本発明は、培養に用いる微生物が、細菌、さらにパラコッカス属細菌、特にパラコッカス属細菌Ｎ−８１１０６株またはその改変株であることが好ましく、また改変株が、自然突然変異または変異原物質や紫外線等による人為的操作で誘発された変異株、または上記記載の微生物に遺伝子操作を施した組換え株であるカロテノイド類の生産方法である。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明に用いる微生物としては、カロテノイドを生産する能力があるものであれば特に限定はないが、培養に用いる微生物が、細菌、さらにパラコッカス属細菌、特にパラコッカス属細菌Ｎ−８１１０６株またはその改変株であることが好ましく、また改変株が、自然突然変異または変異原物質や紫外線等による人為的操作で誘発された変異株、または上記記載の微生物に遺伝子操作を施した組換え株であることが好ましい。
【００１８】
さらに具体的には、例えばパラコッカス属細菌を用いることができ、中でもパラコッカス属細菌Ｎ−８１１０６株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１４０２３）やその改変株が好ましい。そのような改変株としてＴＳＵＧ１Ｃ１１株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４１６）やＴＳＮ１８Ｅ７株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４６）またはＴＳＴＴ０３１株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６８９）のような変異株やこれらの遺伝子組換え株をあげることができる。
【００１９】
組換え株としては上記Ｎ−８１１０６株やＴＳＮ１８Ｅ７株を、Ｎ−８１１０６株由来のβ−イオノン環の４位のメチレン基をケト基に変換する酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、同株由来の４−ケト−β−イオノン環の３位および／またはβ−イオノン環の３位の炭素に一つの水酸基を付加する酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、同株由来のリコペンをβ−カロテンに転換する酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、同株由来のフィトエンをリコペンに転換する酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、同株由来のプレフィトエン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、同株由来のゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子等で形質転換した菌株が知られている（例えば、特願２００５−３１５０７０号参照）。なお、本明細書中では変異株と遺伝子組換え株を総称して改変株と称する。
【００２０】
Ｎ−８１１０６株は当初その菌学的性質よりアグロバクテリウム  アウランティアカス  ｓｐ．  Ｎｏｖ．として同定されて特許出願されたが、後に１６ＳリボゾーマルＲＮＡ遺伝子の配列解析により、パラコッカス属に再同定された。この情報の概略は国立遺伝学研究所日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）や米国ＮＩＨのデーターベース（ＮＣＢＩ）に公開されている（前記、非特許文献４、非特許文献５を参照）
本発明に用いる培地としては、細菌が増殖しカロテノイドを生産し得るものであればいずれを使用してもよく、たとえば炭素源にはグルコース、フルクトース、マンノース、ショ糖、デンプン、乳糖、グリセロール、酢酸、またはこれらを主成分として含む天然物（例えば糖蜜）などが、窒素源にはコーンスティープリカー、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粕等の天然成分や、アンモニア水、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム等のアンモニア及び、アンモニア塩や、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン等のアミノ酸類が、無機塩にはリン酸２ナトリウム、リン酸１ナトリウム、リン酸２カリウム、リン酸１カリウム等のリン酸塩等が、金属塩には硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、クエン酸鉄、塩化第一鉄、塩化第二鉄、硫酸アンモニウム鉄、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、塩化マンガン、塩化銅などが、ビタミン源として酵母エキス、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、チアミン、リボフラビン、イノシトール、ピリドキシン、ビオチン、葉酸、コリン等が使用できる。
【００２１】
本発明のカロテノイド類の生産方法における培養条件については、培養温度およびｐＨは上記菌株が生育する条件でよく、たとえば１０〜４０℃、ｐＨ６〜８とするのが好ましい。培養時間は任意に設定できるが、カロテノイドが十分に生産される時間であることが好ましく、通常は数時間〜２００時間のいずれかの時間に設定される。
【００２２】
本発明の核心部分となる培養条件下での鉄塩の使用法は、培養開始時に所定量の鉄塩を添加しておき、培養に用いた微生物が所定量増殖した後に、一定範囲内の鉄塩を添加することにある。すなわち、培養する微生物菌体に含まれる無機元素組成比に合わせた初期培地により微生物の培養を開始し、微生物の菌体密度が最大菌体密度の５０〜９０％に達したときに、初期培地に含まれた鉄塩量の１／１０〜５倍量（重量換算）の鉄塩を培養液に添加するものである。
【００２３】
培養に用いられる初期培地に含まれる鉄塩量は、通常の微生物の培養において用いられる量であれば何れの量にも設定することが出来るが、他の培地成分との存在比率が比較的重要な因子となる。そのような組成比は通常は実験的に設定することされる。例えば様々な組成比で培養を繰り返し、最も良い増殖やカロテノイド生産が得られる培地組成に設定されることが好ましいが、特に好ましい方法として、菌体と培地の構成元素の組成比を一致するように設定することが行われる。
【００２４】
このように培地組成を決定した例としては例えばＰＨＢ（Ｐｏｌｙ  ｈｙｄｒｏｘｙ  ｂｕｔｙｒａｔｅ）生産菌のアルカリゲネス  ラテゥス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ）細菌による報告例がある（例えば、Ｔ．Ｙａｍａｎｅら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．ｂｉｏｅｎｇ．，５０，１９７．１９９６年、参照）。この場合は微生物菌体の元素組成を予め任意の方法で分析しておき、培地成分の配合比を決定する。培地成分に酵母エキス、ペプトン、糖蜜、コーンスチープリカーなどの天然原料を利用する場合にはそれらの元素組成も測定し、それらを加味した上で配合比が決定される。
【００２５】
元素組成の分析方法に特に限定はなく、既存の任意の方法で分析して得られた値が用いられる。例えば、炭素、窒素、水素は元素分析計による分析法が知られ、硫黄、塩素は酸素フラスコ燃焼にて分解後イオンクロマトグラフィーによる分析が知られている。リンやマグネシウム、鉄などの金属類は硫酸や硝酸で菌体や天然原料を分解した後にＩＣＰ発光法（Ｉｎｄｕｃｔｉｃｅｌｙ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｐｌａｓｍａ  Ａｔｏｍｉｃ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）で分析する方法が知られている。また、分解した後にイオンクロマト法やマススペクトロメトリーで分析することも可能である。酸素濃度は上記の方法では定量的に知ることはできないが、測定した全元素重量の合計値と試料重量との差異を酸素濃度とすることで推定される。
【００２６】
培地組成の決定において、菌体の主要構成元素となる炭素、窒素、水素、および酸素については上記の基準で培地に配合することも可能だが、これらが過剰に存在すると生育阻害を引き起こすことがある。例えばグルコースなどの炭素源が高濃度に存在するとクラブトリー効果に代表される成育阻害や生産阻害を示すことがある。そこで、無機塩、金属塩および酵母エキスやビタミン類のみを上記の基準で配合した培地も好ましく用いられが、この場合も過剰に存在すると同様に生育阻害が生じる。そのため予め最適濃度および上限濃度を調べておくことが好ましい。過剰濃度で増殖原因となる栄養源、例えば、炭素源、窒素源、無機塩および金属塩等は任意の、しかしできるだけ低い濃度の初期濃度で培養を開始し、微生物に消費された量を補給していく方法が好ましく行われる。この方法は流加培養と呼ばれる。
【００２７】
流加培養を行う場合には炭素と窒素の初期濃度に特に制限はなく、生育阻害や生産阻害を起こさない濃度で任意に設定することができる。例えば微生物が良好な増殖を示すために十分な量を添加すれば良い。或いは培養開始後、一定期間経過後に流加を行う場合には、流加を開始する前に目的の栄養源が消費しつくされない程度の量に設定される。この様な培養法が行われる場合は培養液のｐＨ変化や排ガス組成の変化などの物理量からのフィードバックにより厳密に流加を制御することができる。フィードバックを行う場合は培養初期には微生物菌体が少量であるため、これらの物理量の変化が小さく炭素源や窒素源の消費量の変動が予測困難であるため、菌体が増加して物理量の変化が大きくなった後に流加が開始される。
【００２８】
炭素の供給源、すなわち炭素源としては糖質、炭化水素、アルコール、または有機酸およびその塩が用いられる。なお、炭素源は菌体の成分のみならず、菌体内で燃焼して微生物が生命活動を行うためのエネルギー源として利用される分も加味してその量を決定する必要がある。エネルギー源として利用された炭素源は炭酸ガスとして排出されるので、醗酵の排ガス中の炭酸ガス量を定量することでその量を知ることができる。
【００２９】
窒素源についてはアンモニア、硫安や塩安などのアンモニウム塩、硝酸や硝酸塩、蛋白質、アミノ酸類またはアミン類などが利用できるが、窒素および水素以外の元素を含まないアンモニアがより好ましい。
【００３０】
菌体の主構成成分のうち水素と酸素に関しては、炭素源や窒素源、供給ガスや培地中の水分から補給されるために特に考慮する必要はない。
【００３１】
その様に設定した培地の一例として表５に示す組成が上げられる。この培地はＮ−８１１０６株またはその改変株を用いる場合に好ましく用いられるものである。この培地では炭素源としては糖質類、好ましくは単糖類や二糖類、さらに好ましくはグルコースの流加を行うことを、窒素源としてはアンモニウム塩、好ましくはアンモニアの流加を行うことを前提に設定されている。表５の成分の組成比が維持されていれば、任意の倍率に濃度に変更することもできる。例えば表５に示す濃度の１／１０倍から３倍程度に各成分を一様に増減して使用することも可能である。また、培地を構成する元素組成比が維持されていれば、塩類を構成するアニオンやカチオンの種類を任意にかえることもできる。
【００３２】
なお、菌体の元素組成比に基づいて培地成分の組成比を設定する場合、菌体と培地の組成比を厳密に一致させることは極めて困難であり、また厳密に一致させる必要もないが、すべての元素の不足がないように設定する必要がある。例えば菌体と酵母エキスの元素組成の例を表４に示すが、これに基づいて設定した表５の培地組成には表６に示す菌体組成との乖離がある。しかしこの乖離は許容範囲内にあり、さらに大きく乖離しても大きな問題とはならない。乖離の原因は炭素や酸素、水素を除く元素（流加に使用する糖類などから供給されるため初期濃度の設定では無視できる）が、２種類以上ある培地成分において、すべての元素が不足しないように最も必要量の多い元素にあわせるために起きる。例えばリンを例にとると、表５の培地におけるリンの供給源は酵母エキス、リン酸１ナトリウム、リン酸２ナトリウムである。ここで、酵母エキスはビタミン類の供給源として用いられ、また原料として高価であるため、その必要量はビタミンを十分に供給し得、かつ経済的に問題の生じない範囲で第一に設定される。次いでリン酸の必要量をリン酸１ナトリウムとリン酸２ナトリウムの量の調整で設定される。しかしリン酸１ナトリウム、リン酸２ナトリウムはリン以外にナトリウムの供給源でもあり、リン酸の必要量に調製した場合はナトリウムが不足することになり、ナトリウム量を十分量に調製した場合にはリンが過剰になる。硫黄（硫酸）とカリウムについても同じ関係があり、このような調整を炭素、窒素、水素、酸素を除く全ての無機元素に対して行ったものが表５に示した組成である。
【００３３】
なお、本発明では菌体と培地の元素組成比の乖離の指標として下式（１）で定義される余剰度（「ｉ」と表記）を使用した。
余剰度ｉ  ＝  （Ｍｉｍ  −  Ｍｉｘ）／Ｍｉｘ      （１）
式（１）中、余剰度ｉは培地中の任意の元素ｉの余剰度（単位は重量％）を、Ｍｉｍは培地中の元素ｉの含有量（単位はｍｇ／Ｌ）を、Ｍｉｘは培地中の菌体密度がＸ（単位はｇ／Ｌ）の場合に菌体内に存在する元素ｉの培地中における含有量（単位はｍｇ／Ｌ）を示す。
【００３４】
表５の培地は、予め本願発明の微生物を任意の培地で培養し、得られた菌体の元素組成を分析し（表４）、次いで菌体が１５０ｇ／Ｌの密度で存在する状況を想定して、各元素についてＭｉｘを求め、余剰度ｉが各元素について最小になるように上記のように無機塩の組成比を調整して設定したものである。なお、ここで１５０ｇ／Ｌの菌体密度は、微生物菌体の生産目標値として暫定的に設定した数値である。
【００３５】
またここで示す余剰度は少なければ少ないほど好ましいが、上記に記載したように全ての元素が過不足なく設定することは困難である。余剰度は１．０以下が好ましく、より好ましくは０．５以下である。余剰度が上記のごとく一定範囲に収まる範囲とした培地、すなわち、培養する微生物菌体に含まれる無機元素組成比に合わせた初期培地により微生物の培養を開始することとなる。
【００３６】
上記の条件で培養を行って菌体密度が最大値の５０〜９０％となった時点、より好ましくは５５〜８５％となった時点で、初期培地に含まれた鉄塩量の１／１０〜５倍量（重量換算）、好ましくは１／５倍〜３倍量の鉄塩を培養液に添加する。
【００３７】
追加を行う時間は以下のように設定される。まず培養途中の鉄塩の添加操作を行わずに上記のような条件で微生物を培養して、その条件における最大菌体密度、すなわち、鉄塩として初期培地含有分のみで微生物を培養したときに到達する最大の菌体密度を調べる。菌体密度の測定の仕方に限定はなく、一定量の培養液を遠心分離やろ過などの方法で回収したのちに回収した菌体を任意の方法で乾燥させて重量を測定する方法、培養液の濁度から推定する方法、微生物の呼吸による酸素の消費量や炭酸ガスの発生量から推定する方法などが上げられる。このうち乾燥重量を測定する方法は正確に菌体密度が測定できるが、測定に時間がかかる。濁度を測定する方法は微生物の種類に依存するため予め検量線の作製が必要であるが、簡便である。炭酸ガスの発生量から推定する方法は、培養中にオンラインで測定できる利点があるが、濁度と同様に予め検量線を作製する必要があり、さらに微生物菌体の密度が低い場合にはガスの発生量が少なく測定困難である。従って一般的には予め乾燥重量と濁度の相関式を得ておき、濁度から菌体密度を推定する方法で調べられる。
【００３８】
次いで同様に培養を行い、培養液中の微生物の菌体密度が最大菌体密度の５０〜９０％に達したとき、より好ましくは５５〜８５％となった時点で鉄塩を添加する。５０％に達する前に添加を行うとＡｘの生産が阻害されるため好ましくない。また最大値となった後では微生物の活性が低下しており、もはや添加を行っても十分な生産性の向上は望めない。鉄塩の添加は一回行われるだけでなく、上記の期間内であれば複数回行うこともできる。
【００３９】
鉄塩の添加方法に特に限定はなく、鉄塩を粉末として添加することもできるが、添加した後に鉄塩を速やかに培養液中に分散させるために、水溶液として添加することが好ましい。利用できる鉄塩としては硫酸第一鉄、硫酸第ニ鉄、塩化第一鉄、塩化第ニ鉄、クエン酸鉄、リン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄等、一般的に使用される鉄塩であれば特に限定はない。
【００４０】
本発明におけるカロテノイドの定量方法は、菌体または培養液から安定に効率よく抽出し定量できれば特に限定はなく、例えば抽出溶媒としてメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジクロロメタン、クロロフォルム、ジメチルフォルムアミド、ジメチルスルフォキシド、酢酸エチル等が用いられる。抽出されたカロテノイドの定量には、各種カロテノイドが分離され、定量性に優れる高速液体クロマトグラフィーにより行うことが好ましいが、比色定量などで行うこともできる。
【００４１】
カロテノイドの回収方法にも特に限定はないが、菌体を回収してそのまま、或いは乾燥して使用することができるし、定量の方法として述べたものと同様の方法で抽出して使用することもできる。抽出液をそのまま用いることも可能であり、さらに精製して使用することもできる。またこれらの菌体、抽出物或いは精製物を、それぞれ単独で用いることもでき、これらを任意の割合で混合して用いることもでき、また他の任意の物質と混合して用いることもできる。
【発明の効果】
【００４２】
本発明により、カロテノイド、特にＡｘの生産に対する鉄塩の供給が効果的に行うことができるようになり、生産の効率を向上せしめることが可能となった。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお本発明は、これらの実施例のみに限定されるものではなく、発明の要旨を逸脱しない範囲で、任意に変更が可能であることは言うまでもない。
【００４４】
（カロテノイドの抽出と定量法）
適量な培養液を１．５ｍＬ容エッペンドルフチューブを用いて、１５，０００回転、５分間遠心分離を行ない菌体を得た。この菌体に２０μＬの純水に懸濁し、次いで２４０μＬのジメチルホルムアミドおよび２４０μＬのアセトンを加え約１時間振とうし、カロテノイドを抽出した。この抽出液を１５，０００回転、５分間遠心分離により残渣を除去後、ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０ＴＭカラム（東ソー社製）を用いた高速液体クロマトグラフィー（以下、「ＨＰＬＣ」と略記する。）でアスタキサンチンを定量した。なおＡｘの分離はＡ液として純水とメチルアルコールの５対９５の混合溶媒、Ｂ液としてメチルアルコールとテトラヒドロフランの７対３（容積比）の混合溶媒を用い、１ｍＬ／ｍｉｎの流速でＡ液を５分間カラムに通過させた後、同じ流速Ａ液からＢ液へ５分間の直線濃度勾配を行ない、さらにＢ液を５分間通過させることにより行なった。Ａｘ濃度は４７０ｎｍの吸光度をモニターし、既知濃度のＡｘ試薬（シグマ製）で作成した検量線より濃度を算出した。
【００４５】
（実施例１）  元素組成の分析
表１に示した組成の培地３００ｍＬを５００ｍＬ容のバッフル付き三角フラスコに入れ１２１℃、２０分間で滅菌後、Ｎ−８１１０６株の変異株の一つであるＴＳＮ１８Ｅ７（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４６）を植菌し、２５℃で１日間、毎分１００回転の振とう速度で前々培養を行なった。
【００４６】
【表１】
2007143492.tif 000002
次いで表２に示した組成の培地１００ｍＬを５００ｍＬ容のバッフル付き三角フラスコに入れ１２１℃、２０分間で滅菌し、上記培養液５ｍＬを植菌して２５℃で約１８時間、毎分１００回転の振とう速度で前培養した。
【００４７】
【表２】
2007143492.tif 000003
さらに、表３に示す組成の培地約１．４Ｌを３Ｌの発酵槽に入れ、１２１℃、２０分間で滅菌後、得られた上記培養液９０ｍＬと金属塩を添加し本培養を開始した。培養装置は千代田製作所社のＴＦＬ−３を使用し、排ガス分析装置はエイブル社のＤＥＸ−２５６２を使用した。培養温度は２２℃、ｐＨは７．０〜７．４とした。培養時のｐＨ調整はアルカリに２Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を、酸には２Ｎの塩酸水溶液を用いて制御した。また通気は１．５Ｌ／ｍｉｎの速度で空気を供給し、毎分４００回転の回転速度で撹拌した。
【００４８】
【表３】
2007143492.tif 000004
約１１６時間培養を行ったのち、遠心分離により菌体を回収した。１００℃の乾燥機中で恒量になるまで乾燥し、元素分析、ＩＣＰ発光分析、イオンクロマトグラフィー等の常法により分析した。また同様にディフコ社の酵母エキスの元素組成を分析した。それらの結果を菌体と酵母エキスの構成元素組成として表４に示した。
【００４９】
【表４】
2007143492.tif 000005
さらに酵母エキス、グルコース、および硫酸アンモニウム等の濃度を一般的な細菌培養用の培地成分を参考に、１５０ｇ／Ｌの菌体収量を想定した表５に示す組成および濃度の培地を設定した。表５の培地および菌体１５０ｇ／Ｌ中の各元素量について比較した結果を表５の培地における各元素量と１５０ｇの菌体の各元素量の比較として表６に示したが、余剰度は約０．３に収まり良好だった。なお、余剰度の計算法は、（表５培地中の各元素量−菌体１５０ｇ中の各元素量）／（菌体１５０ｇ中の各元素量）として、求めた。
【００５０】
【表５】
2007143492.tif 000006
【００５１】
【表６】
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（実施例２）  最大菌体密度の測定
表１に示した組成の培地３００ｍＬを５００ｍＬ容のバッフル付き三角フラスコに入れ１２１℃、２０分間で滅菌後、Ｎ−８１１０６株の変異株の一つであるＴＳＴＴ０３１株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６８９）を植菌し、２５℃で１日間、毎分１００回転の振とう速度で前々培養を行なった。
【００５２】
次いで表２に示した組成の培地１００ｍＬを５００ｍＬ容のバッフル付き三角フラスコに入れ１２１℃、２０分間で滅菌し、上記培養液５ｍＬを植菌して２５℃で約１８時間、毎分１００回転の振とう速度で前培養した。
【００５３】
さらに、表５に示す組成の培地約１．４Ｌを３Ｌの発酵槽に入れ、１２１℃、２０分間で滅菌後、得られた上記培養液９０ｍＬと金属塩を添加し本培養を開始した。培養装置は千代田製作所社のＴＦＬ−３を使用し、排ガス分析装置はエイブル社のＤＥＸ−２５６２を使用した。培養温度は２２℃、ｐＨは７．０〜７．４とした。培養時ｐＨは微生物の増殖に伴って低下するので１０％アンモニア水の添加により所定範囲に制御した。空気を１．８Ｌ／ｍｉｎの速度で通気し、毎分５１０回転の回転速度で撹拌した。また、回転速度を２４時間ごとに溶存酸素濃度が０．１ｐｐｍを超えない範囲で上昇させることで、微生物の増殖により酸素供給量が不足することをおぎなった。培地中のグルコース濃度が５ｇ／Ｌ以内を維持されるように、７００ｇ／Ｌのグルコースを用いて流加した。送液にはワトソン・モーロー社の定量ポンプ１０１Ｕ（低速型）を使用し、培養中はグルコース分析計（装置名；ＹＳＩ社２７００）を用いて定期的にグルコース濃度を測定した。
【００５４】
この培養の結果を図１に示した。菌体密度をあらわす６６０ｎｍの濁度は培養開始後、約１４０時間で最大値に達した（濁度４３０、単位は任意単位）。また、本発明の鉄塩の添加を行うべき最大値の５０〜９０％の菌体密度には培養開始後約６０時間から１２０時間の間に達することが判明した。
【００５５】
表７には鉄塩の初期濃度と追加量および培養終了後の培養液濁度（菌体密度を表わす）とカロテノイド生産量を示すが、この培養によりＡｘ（２５５ｍｇ／Ｌ）、アドニキサンチン（１０５ｍｇ／Ｌ）、フェニコキサンチン（２５６ｍｇ／Ｌ）、カンタキサンチン（１７４ｍｇ／Ｌ）、エキネノン（３８６ｍｇ／Ｌ）そしてβ−カロテン（５４ｍｇ／Ｌ）が生産された。なお、表中、Ａｘはアスタキサンチンを、Ａｄはアドニキサンチンを、Ｐｘはフェニコキサンチンを、Ｃｘはカンタキサンチンを、Ｅｑはエキネノンを、βＣはβ−カロテンを、ＴＣは総カロテノイドを、それぞれ示す。
【００５６】
【表７】
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表７において、実施例２は鉄塩を追加添加せず培養して最大菌体密度を測定するものであり、以下の鉄塩添加時期を設定するための基準となる。
【００５７】
（実施例３）  鉄塩の追加実験１
実施例２と同様に培養を開始したが、培養開始後７２時間目に１００ｍＭの硫酸第一鉄水溶液を１２．６ｍＬ（終濃度０．７ｍＭ）加え、その後は再度実施例２と同様に培養を継続した。鉄塩の添加時の培養液の濁度は約２５０であり、菌体密度は最大値の５８％だった。この培養の結果を図２に示した。この培養で得られた最終的な培養液の濁度は３７０であった。また、カロテノイドの生産パターンを図３に示した。鉄塩の添加を行った７２時間目以降、Ａｘの生産は急速に加速された。この培養によりＡｘ（５２４ｍｇ／Ｌ）、アドニキサンチン（８７ｍｇ／Ｌ）、フェニコキサンチン（２５５ｍｇ／Ｌ）、カンタキサンチン（１６７ｍｇ／Ｌ）、エキネノン（１５８ｍｇ／Ｌ）そしてβ−カロテン（１０ｍｇ／Ｌ）が生産された。
【００５８】
この培養により、菌体密度が最大値の５８％に達した時点で初期濃度の１／３量の鉄塩を添加することにより微生物の増殖は抑制されるもののＡｘの生産量が大きく向上することが確認された。
【００５９】
（実施例４）  鉄塩の追加実験２
追加する硫酸第一鉄水溶液の量を２５．２ｍＬ（終濃度１．４ｍＭ）としたことを除き、実施例３と同様に培養を行った。１４０時間培養した後の濁度は４１０であり、Ａｘ（５１４ｍｇ／Ｌ）、アドニキサンチン（７４ｍｇ／Ｌ）、フェニコキサンチン（３６０ｍｇ／Ｌ）、カンタキサンチン（２６５ｍｇ／Ｌ）、エキネノン（２５２ｍｇ／Ｌ）そしてβ−カロテン（２５ｍｇ／Ｌ）が生産された。実施例３と比較して菌体密度とＡｘ収量は同等だったが、前躯体カロテノイドの生産量が向上した。初期量の２／３量の鉄塩の添加でカロテノイド生産量がさらに向上することが確認された。
【００６０】
（比較例１）  培養初期での鉄塩増量
表３に示す硫酸第一鉄の濃度を２．１  ｍＭから２．８ｍＭに変更したことを除き、実施例２と同様に培養を行った。１３０時間培養した後の濁度は４４０であり、菌体収量は実施例１と同等だった。しかしながら、生産されたカロテノイドはＡｘ（３２８ｍｇ／Ｌ）、アドニキサンチン（２１９ｍｇ／Ｌ）、フェニコキサンチン（７１ｍｇ／Ｌ）、カンタキサンチン（５５ｍｇ／Ｌ）、エキネノン（９１ｍｇ／Ｌ）、β−カロテン（６ｍｇ／Ｌ）であり、実施例１に比較するとＡｘ収量が向上したものの全体的なカロテノイド収量は低下した。また、実施例３および４と比較するとＡｘの収量も低いものだった。以上のことから培養開始時に鉄塩を３０％過剰に加えるとカロテノイド収量が低下することが確認された。
【００６１】
（実施例５）  鉄塩の２回追加実験
実施例３と同様に培養したが、さらに８０時間目（最大菌体密度の約８０％に達した時期）において、２回目の鉄塩追加を行った。追加量は１回目の追加と同量とした。即ち、終濃度０．７ｍＭを２回、合計１．４ｍＭを追加した。
【００６２】
２回目の追加により微生物の増殖は急激に抑制され、１４０時間培養後の濁度は３３０に留まった。しかしながらＡｘの生産量が著しく向上した（６０３ｍｇ／Ｌ）。この他にアドニキサンチン（２１４ｍｇ／Ｌ）、フェニコキサンチン（１１９ｍｇ／Ｌ）、カンタキサンチン（７５ｍｇ／Ｌ）、エキネノン（８９ｍｇ／Ｌ）、β−カロテン（１ｍｇ／Ｌ）が検出された。以上の結果より、初期量の２／３量の鉄塩を当該発明の対象となる期間内に２回に分けて添加することで、微生物の増殖には好ましくない影響があるものの、カロテノイド、特にＡｘの生産量が向上することが確認された。
【００６３】
（比較例２）
実施例５と同様に培養を行ったが、鉄塩の添加を６０時間目（菌体密度は最大値の４７％）及び７２時間目（同じく５５％）とした。１４０時間培養した後の濁度は４３０であり、またＡｘ収量は４１５ｍｇ／Ｌであり、実施例２に比較すると菌体収量はほぼ同等であり、Ａｘ収量は向上した。しかしながら実施例３、４および５に比較してＡｘ収量は低いものだった。また全体的なカロテノイド生産量はいずれの実施例に比較しても低いものだった。以上のことから当該発明の期間に達する前に初期濃度の１／３量の鉄塩を追加することでカロテノイドの生産が抑制されることがさらに確認された。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】本発明による培養においての最大菌体密度を調べるための菌体密度の推移を示す図であり、図中、Ｘ軸（横軸）は培養時間（単位は時間）を示し、Ｙ軸（縦軸）は６６０ｎｍの濁度（単位は任意単位）を示し、●は濁度の測定値を示す。
【図２】本発明による培養においての、培養途中の鉄塩の添加を行った場合の菌体密度の推移を示す図であり、図中、Ｘ軸（横軸）は培養時間（単位は時間）を示し、Ｙ軸（縦軸）は６６０ｎｍの濁度（単位は任意単位）を示し、●は濁度の測定値を示す。図中の矢印は硫酸第一鉄の添加を行った時点を示す。
【図３】本発明による培養においての、培養途中の鉄塩の添加を行った場合のカロテノイド生産量の推移を示す図であり、図中、Ｘ軸（横軸）は培養時間（単位は時間）を示し、Ｙ軸（縦軸）はカロテノイド濃度（単位はｍｇ／Ｌ）を示し、●はアスタキサンチン、○はアドニキサンチン、◆はフェニコキサンチン、▲はカンタキサンチン、＊はエキネノンを、それぞれ示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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