(57)【要約】【課題】イヌホタルイにおけるスルホニルウレア系除草剤抵抗性能力（本能力）の評価方法等を提供すること。【解決手段】イヌホタルイの本能力評価方法で、イヌホタルイ含有の２種のアセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）遺伝子において、ＡＬＳドメインＡ（本領域）の第７アミノ酸の塩基配列がプロリンコドンであるかを検定する第一工程、及び、第一工程により得られる検定結果に基づきイヌホタルイの本能力有無を判定する第二工程を有し、且つ、第一工程が前記遺伝子を鋳型とするように選択的にアニールし且つＡＬＳ遺伝子のイントロン領域の塩基配列と本領域の第７アミノ酸の塩基配列とを含む領域からなるＤＮＡ断片を増幅し得るプライマーセットを用いたＰＣＲを行う工程、及び、制限酵素を用いたＲＦＬＰ等に基づき本領域の第７アミノ酸の塩基配列を解析する工程を含む方法等。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イヌホタルイ由来のアセト乳酸合成酵素遺伝子の一部であり、アセト乳酸合成酵素におけるドメインＡの第５番目のアミノ酸をコードする塩基配列と第６番目のアミノ酸をコードする塩基配列との間に存在するイントロン領域からなるポリヌクレオチド。
【請求項２】
イントロン領域が、下記のいずれかのイントロン領域であることを特徴とする請求項１記載のポリヌクレオチド若しくはその一部。
（１）配列番号１で示される塩基配列における第２００番目の塩基から第１３４３番目の塩基までのイントロン領域。
（２）配列番号２で示される塩基配列における第２００番目の塩基から第１２９６番目の塩基までのイントロン領域。
【請求項３】
イヌホタルイにおけるスルホニルウレア系除草剤抵抗性能力の評価方法であって、
（１）供試されるイヌホタルイに含まれる２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子の各々において、アセト乳酸合成酵素のドメインＡにおける第７番目のアミノ酸をコードする塩基配列がプロリンをコードする塩基配列であるか否かを、前記遺伝子の各々について検定する第一工程、及び、
（２）第一工程により得られる検定結果が、前記遺伝子の各々において、いずれもアセト乳酸合成酵素のドメインＡにおける第７番目のアミノ酸をコードする塩基配列がプロリンをコードする塩基配列である場合には、供試されるイヌホタルイはスルホニルウレア系除草剤抵抗性能力を有さないと判定し、一方、前記遺伝子の各々において、いずれか若しくはいずれもアセト乳酸合成酵素のドメインＡにおける第７番目のアミノ酸をコードする塩基配列がプロリンをコードする塩基配列でない場合には、供試されるイヌホタルイはスルホニルウレア系除草剤抵抗性能力を有すると判定する第二工程、
を有し、且つ、第一工程が、
（ａ）供試されるイヌホタルイに含まれる２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子の両者又はいずれか一方を鋳型とするように選択的にアニールし、且つ、請求項１若しくは２記載のポリヌクレオチドが有する塩基配列の一部若しくは全部と、アセト乳酸合成酵素のドメインＡにおける第７番目のアミノ酸をコードする塩基配列とを含む領域からなるＤＮＡ断片を増幅し得るプライマーセットを用いたＰＣＲを行う第Ａ工程、及び、
（ｂ）電気泳動、制限酵素を用いたＲＦＬＰ又はダイレクトシーケンスに基づき、アセト乳酸合成酵素のドメインＡにおける第７番目のアミノ酸をコードする塩基配列を解析する第Ｂ工程を含むことを特徴とする評価方法。
【請求項４】
イヌホタルイに含まれる２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子の各々において、アセト乳酸合成酵素のドメインＡにおける第７番目のアミノ酸をコードする塩基配列がプロリンをコードする塩基配列であるか否かを、前記遺伝子の各々について検定する方法であって、
（ａ）供試されるイヌホタルイに含まれる２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子の両者又はいずれか一方を鋳型とするように選択的にアニールし、且つ、請求項１若しくは２記載のポリヌクレオチドが有する塩基配列の一部若しくは全部と、アセト乳酸合成酵素のドメインＡにおける第７番目のアミノ酸をコードする塩基配列とを含む領域からなるＤＮＡ断片を増幅し得るプライマーセットを用いたＰＣＲを行う第Ａ工程、及び、
（ｂ）電気泳動、制限酵素を用いたＲＦＬＰ又はダイレクトシーケンスに基づき、アセト乳酸合成酵素のドメインＡにおける第７番目のアミノ酸をコードする塩基配列を解析する第Ｂ工程
を含むことを特徴とする検定方法。
【請求項５】
第Ｂ工程がダイレクトシーケンスに基づき塩基配列を解析する工程であり、且つ、第Ａ工程において用いられるプライマーセットが供試されるイヌホタルイに含まれる２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子の両者を鋳型とするように選択的にアニールし得るプライマーセットである場合には、前記ダイレクトシーケンスにおいて用いられるシーケンシングプライマーが、第Ａ工程において増幅されるＤＮＡ断片のいずれか一方を鋳型とするように選択的にアニールし得るプライマーであることを特徴とする請求項３又は４記載の方法。
【請求項６】
第Ｂ工程がダイレクトシーケンスに基づき塩基配列を解析する工程であり、且つ、第Ａ工程において用いられるプライマーセットが供試されるイヌホタルイに含まれる２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子のいずれか一方を鋳型とするように選択的にアニールし得るプライマーセットである場合には、前記ダイレクトシーケンスにおいて用いられるシーケンシングプライマーが、第Ａ工程において増幅されるＤＮＡ断片を鋳型とするように選択的にアニールし得るプライマーであることを特徴とする請求項３又は４記載の方法。
【請求項７】
第Ｂ工程が制限酵素を用いたＲＦＬＰに基づき塩基配列を解析する工程であり、且つ、ＲＦＬＰにおいて用いられる制限酵素が、アセト乳酸合成酵素のドメインＡにおける第７番目のアミノ酸をコードする塩基配列の全部若しくは一部を制限酵素認識部位として含む制限酵素であることを特徴とする請求項３又は４記載の方法。
【請求項８】
第Ｂ工程が制限酵素を用いたＲＦＬＰに基づき塩基配列を解析する工程であり、且つ、ＰＣＲにおいて用いられるプライマーセットが、ミスマッチ塩基を導入し得るアンチセンスプライマーを含むプライマーセットであり、且つ、ＲＦＬＰにおいて用いられる制限酵素が、前記ミスマッチ塩基の導入により増幅されるＤＮＡ断片に付与された塩基配列の全部若しくは一部を制限酵素認識部位として含む制限酵素であることを特徴とする請求項３又は４記載の方法。
【請求項９】
スルホニルウレア系除草剤抵抗性能力を有するイヌホタルイの分布状況を、請求項３記載の評価方法に基づいて調査する工程を有することを特徴とするモニタリング方法。
【請求項１０】
請求項３記載の評価方法により評価されたスルホニルウレア系除草剤抵抗性能力に基づきスルホニルウレア系除草剤抵抗性能力を有するイヌホタルイを選抜することを特徴とするスルホニルウレア系除草剤抵抗性イヌホタルイの探索方法。
【請求項１１】
イヌホタルイにおけるスルホニルウレア系除草剤抵抗性能力を評価するための試薬が有する塩基配列を提供する塩基配列情報源としての、請求項１若しくは２記載のポリヌクレオチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イヌホタルイ由来のアセト乳酸合成酵素遺伝子の一部であり、アセト乳酸合成酵素におけるドメインＡの第５番目のアミノ酸をコードする塩基配列と第６番目のアミノ酸をコードする塩基配列との間に存在するイントロン領域からなるポリヌクレオチド、及び、イヌホタルイにおけるスルホニルウレア系除草剤抵抗性能力の評価方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
アセト乳酸合成酵素は、バリン、ロイシン、イソロイシン等の分岐鎖アミノ酸の生合成経路における律速酵素である。アセト乳酸合成酵素の阻害剤としては、スルホニルウレア系除草剤、イミダゾリノン系除草剤、ピリミジニルカルボキシル系除草剤、トリアゾロピリミジン系除草剤及びスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン系除草剤が知られている。
日本の水田においては、アセト乳酸合成酵素の阻害剤として、スルホニルウレア系除草剤であるベンスルフロンメチル、ピラゾスルフロンエチル、イマゾスルフロン等が広く利用されてきたが、近年、これらのスルホニルウレア系除草剤に対して抵抗性を有するイヌホタルイが出現し、問題となっている。
【０００３】
植物由来のアセト乳酸合成酵素には、ドメインＡ（アミノ酸配列：Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ）と呼ばれる高度に保存された領域が存在している。当該ドメインの第７番目のプロリン（Ｐｒｏ）は、シロイヌナズナ由来のアセト乳酸合成酵素では上流から第１９７番目に存在していたことから、通常「Ｐｒｏ１９７」と呼ばれている。
Ｐｒｏ１９７は、アセト乳酸合成酵素の阻害剤であるスルホニルウレア系除草剤が当該酵素へ結合する際に相互作用するアミノ酸残基の１つである。Ｐｒｏ１９７部位が別のアミノ酸によって置換されると、当該酵素とスルホニルウレア系除草剤との結合性は大幅に低下することが知られている。例えば、スルホニルウレア系除草剤に抵抗性を示す植物及び酵母のアセト乳酸合成酵素から、Ｐｒｏ１９７部位におけるＳｅｒ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ及びＴｙｒへの置換突然変異が見出されている。以下、それぞれの変異を、Ｐ１９７Ｓ、Ｐ１９７Ｌ、Ｐ１９７Ａ、Ｐ１９７Ｈ、Ｐ１９７Ｒ、Ｐ１９７Ｔ、Ｐ１９７Ｑ、Ｐ１９７Ｉ、Ｐ１９７Ｅ、Ｐ１９７Ｖ、Ｐ１９７Ｗ及びＰ１９７Ｙと表記することもある（例えば、非特許文献１、２及び３参照）。
【０００４】
以上の知見から、植物におけるスルホニルウレア系除草剤抵抗性能力を評価するには、アセト乳酸合成酵素のＰｒｏ１９７部位における他のアミノ酸への置換突然変異（以下、Ｐ１９７Ｘと表記することもある）が存在するか否かを調査することが重要であり、このために、Ｐ１９７Ｘをより簡便に検出する方法の開発が望まれていた。
これまでに、Ｐ１９７Ｘを検出する方法としては、例えば、セイヨウノダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｒａｐｈａｎｉｓｔｒｕｍ）においてＰＣＲ−ＲＦＬＰを適用した事例が知られている（例えば、非特許文献４参照）。当該事例では、セイヨウノダイコン由来のアセト乳酸合成酵素遺伝子においてＰｒｏ１９７部位をコードする領域を含むＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅し、増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｌａＩＶにより消化することにより得られる消化産物の断片長多型を解析することで、Ｐ１９７Ｘの存在有無を検出している。
【０００５】
一方、イヌホタルイにおいては、２種類のアセト乳酸合成酵素が存在しており、各々をコードする遺伝子が存在するとされている（例えば、非特許文献５参照）。しかしながら、各々のアセト乳酸合成酵素遺伝子の塩基配列は未だ知られておらず、例えば、両アセト乳酸合成酵素遺伝子の全長は如何なのか、どのようなエキソン−イントロン構造を有しているのか、塩基配列にはどのような差異が存在しているのか等々は不明である。勿論、各々のアセト乳酸合成酵素遺伝子におけるＰｒｏ１９７部位とイントロンとの位置関係も同様に不明である。さらにまた、イントロンの塩基配列を利用することにより、各々のアセト乳酸合成酵素遺伝子を区別してＰｒｏ１９７部位の塩基配列を解析する方法については何ら開示されていない。
【０００６】
【非特許文献１】Ｄｕｇｇｌｅｂｙ ＆ Ｐａｎｇ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３３，１−３６，２０００
【非特許文献２】Ｐａｔｒｉｃ ＆ Ｗｒｉｇｈｔ，Ｗｅｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，５０，７００−７１２，２００２
【非特許文献３】Ｄｕｇｇｌｅｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７０，２８９５−２９０４，２００３
【非特許文献４】Ｔａｎ ＆ Ｍｅｄｄ，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６３，１９５−２０５，２００２
【非特許文献５】内野ら，雑草研究，４９（別），５８−５９，２００４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、イヌホタルイ由来の２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子においてＰ１９７Ｘをより簡便に検出する方法の一つとなり得るような、イヌホタルイにおけるスルホニルウレア系除草剤抵抗性能力の評価方法等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、このような状況下で鋭意検討した結果、イヌホタルイ由来の２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子の各々におけるＰｒｏ１９７部位とイントロンとが近接した位置関係を有すること、当該遺伝子の各々におけるＰｒｏ１９７部位と近接するイントロンは異なる長さを有しその差異は４７ｂｐであること等を見出し、さらに当該イントロンの塩基配列を利用してイヌホタルイ由来の２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子の各々を区別しながらＰｒｏ１９７部位の塩基配列を解析することにより、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は、
１．イヌホタルイ由来のアセト乳酸合成酵素遺伝子の一部であり、アセト乳酸合成酵素におけるドメインＡの第５番目のアミノ酸をコードする塩基配列と第６番目のアミノ酸をコードする塩基配列との間に存在するイントロン領域からなるポリヌクレオチド（以下、本発明ポリヌクレオチドと記す。）；
２．イントロン領域が、下記のいずれかのイントロン領域であることを特徴とする請求項１記載のポリヌクレオチド若しくはその一部
（１）配列番号１で示される塩基配列における第２００番目の塩基から第１３４３番目の塩基までのイントロン領域
（２）配列番号２で示される塩基配列における第２００番目の塩基から第１２９６番目の塩基までのイントロン領域；
２．イヌホタルイにおけるスルホニルウレア系除草剤抵抗性能力の評価方法であって、
（１）供試されるイヌホタルイに含まれる２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子の各々において、アセト乳酸合成酵素のドメインＡにおける第７番目のアミノ酸をコードする塩基配列がプロリンをコードする塩基配列であるか否かを、前記遺伝子の各々について検定する第一工程、及び、
（２）第一工程により得られる検定結果が、前記遺伝子の各々において、いずれもアセト乳酸合成酵素のドメインＡにおける第７番目のアミノ酸をコードする塩基配列がプロリンをコードする塩基配列である場合には、供試されるイヌホタルイはスルホニルウレア系除草剤抵抗性能力を有さないと判定し、一方、前記遺伝子の各々において、いずれか若しくはいずれもアセト乳酸合成酵素のドメインＡにおける第７番目のアミノ酸をコードする塩基配列がプロリンをコードする塩基配列でない場合には、供試されるイヌホタルイはスルホニルウレア系除草剤抵抗性能力を有すると判定する第二工程、
を有し、且つ、第一工程が、
（ａ）供試されるイヌホタルイに含まれる２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子の両者又はいずれか一方を鋳型とするように選択的にアニールし、且つ、前項１若しくは２記載のポリヌクレオチドが有する塩基配列の一部若しくは全部と、アセト乳酸合成酵素のドメインＡにおける第７番目のアミノ酸をコードする塩基配列とを含む領域からなるＤＮＡ断片を増幅し得るプライマーセットを用いたＰＣＲを行う第Ａ工程、及び、
（ｂ）電気泳動、制限酵素を用いたＲＦＬＰ又はダイレクトシーケンスに基づき、アセト乳酸合成酵素のドメインＡにおける第７番目のアミノ酸をコードする塩基配列を解析する第Ｂ工程を含むことを特徴とする評価方法（以下、本発明評価方法と記す。）；
３．イヌホタルイに含まれる２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子の各々において、アセト乳酸合成酵素のドメインＡにおける第７番目のアミノ酸をコードする塩基配列がプロリンをコードする塩基配列であるか否かを、前記遺伝子の各々について検定する方法であって、
（ａ）供試されるイヌホタルイに含まれる２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子の両者又はいずれか一方を鋳型とするように選択的にアニールし、且つ、前項１若しくは２記載のポリヌクレオチドが有する塩基配列の一部若しくは全部と、アセト乳酸合成酵素のドメインＡにおける第７番目のアミノ酸をコードする塩基配列とを含む領域からなるＤＮＡ断片を増幅し得るプライマーセットを用いたＰＣＲを行う第Ａ工程、及び、
（ｂ）電気泳動、制限酵素を用いたＲＦＬＰ又はダイレクトシーケンスに基づき、アセト乳酸合成酵素のドメインＡにおける第７番目のアミノ酸をコードする塩基配列を解析する第Ｂ工程
を含むことを特徴とする検定方法（以下、本発明検定方法と記す。）；
４．第Ｂ工程がダイレクトシーケンスに基づき塩基配列を解析する工程であり、且つ、第Ａ工程において用いられるプライマーセットが供試されるイヌホタルイに含まれる２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子の両者を鋳型とするように選択的にアニールし得るプライマーセットである場合には、前記ダイレクトシーケンスにおいて用いられるシーケンシングプライマーが、第Ａ工程において増幅されるＤＮＡ断片のいずれか一方を鋳型とするように選択的にアニールし得るプライマーであることを特徴とする前項３又は４記載の方法；
５．第Ｂ工程がダイレクトシーケンスに基づき塩基配列を解析する工程であり、且つ、第Ａ工程において用いられるプライマーセットが供試されるイヌホタルイに含まれる２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子のいずれか一方を鋳型とするように選択的にアニールし得るプライマーセットである場合には、前記ダイレクトシーケンスにおいて用いられるシーケンシングプライマーが、第Ａ工程において増幅されるＤＮＡ断片を鋳型とするように選択的にアニールし得るプライマーであることを特徴とする前項３又は４記載の方法；
６．第Ｂ工程が制限酵素を用いたＲＦＬＰに基づき塩基配列を解析する工程であり、且つ、ＲＦＬＰにおいて用いられる制限酵素が、アセト乳酸合成酵素のドメインＡにおける第７番目のアミノ酸をコードする塩基配列の全部若しくは一部を制限酵素認識部位として含む制限酵素であることを特徴とする前項３又は４記載の方法；
７．第Ｂ工程が制限酵素を用いたＲＦＬＰに基づき塩基配列を解析する工程であり、且つ、ＰＣＲにおいて用いられるプライマーセットが、ミスマッチ塩基を導入し得るアンチセンスプライマーを含むプライマーセットであり、且つ、ＲＦＬＰにおいて用いられる制限酵素が、前記ミスマッチ塩基の導入により増幅されるＤＮＡ断片に付与された塩基配列の全部若しくは一部を制限酵素認識部位として含む制限酵素であることを特徴とする前項３又は４記載の方法；
８．スルホニルウレア系除草剤抵抗性能力を有するイヌホタルイの分布状況を、前項３記載の評価方法に基づいて調査する工程を有することを特徴とするモニタリング方法（以下、本発明モニタリング方法と記す。）；
９．前項３記載の評価方法により評価されたスルホニルウレア系除草剤抵抗性能力に基づきスルホニルウレア系除草剤抵抗性能力を有するイヌホタルイを選抜することを特徴とするスルホニルウレア系除草剤抵抗性イヌホタルイの探索方法（以下、本発明探索方法と記す。）；
１０．イヌホタルイにおけるスルホニルウレア系除草剤抵抗性能力を評価するための試薬が有する塩基配列を提供する塩基配列情報源としての、前項１若しくは２記載のポリヌクレオチドの使用（以下、本発明使用と記す。）；
等を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、イヌホタルイ由来の２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子においてＰ１９７Ｘをより簡便に検出する方法の一つとなり得るような、イヌホタルイにおけるスルホニルウレア系除草剤抵抗性能力の評価方法等を提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、イヌホタルイ（Ｓｃｉｒｐｕｓ ｊｕｎｃｏｉｄｅｓ ｖａｒ． ｏｈｗｉａｎｕｓ）由来のアセト乳酸合成酵素遺伝子に関連する技術である。高等植物由来のアセト乳酸合成酵素のアミノ酸配列には互いに相同性が存在しているが、アミノ酸数においては差異がある。しかしながら、任意の高等植物由来のアセト乳酸合成酵素における特定のアミノ酸について言及する際には、シロイヌナズナ由来のアセト乳酸合成酵素におけるアミノ酸順位に置き換えて呼ぶことがある。例えば、前記ドメインＡのプロリンは、各植物種における実際のアミノ酸順位に拠らず、共通して「Ｐｒｏ１９７」と呼ばれている。本発明でもこのような呼び方を採用する。
【００１３】
本発明におけるスルホニルウレア系除草剤の具体例としては、例えば、ベンスルフロンメチル、ピラゾスルフロンエチル、イマゾスルフロン、アジムスルフロン、シクロスルファムロン、エトキシスルフロン、ハロスルフロンメチル、シノスルフロン、フルセトスルフロン、オルトスルファムロン及びクロリムロンエチル等を挙げることができる。
【００１４】
イヌホタルイ由来のアセト乳酸合成酵素遺伝子を取得する方法としては、例えば、ディジェネレートＰＣＲ法を挙げることができる。当該方法において用いられるディジェネレートプライマーとしては、例えば、シロイヌナズナ（ＧｅｎｅＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：Ｘ５１５１４）、トウモロコシ（ＧｅｎｅＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：Ｘ６３５５４）、コムギ（ＧｅｎｅＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＡＹ２１０４０８）、タバコ（ＧｅｎｅＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：Ｘ０７６４４.）、ナタネ（ＧｅｎｅＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：Ｚ１１５２４）、ワタ（ＧｅｎｅＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：Ｚ４６９６０）等の高等植物由来のアセト乳酸合成酵素遺伝子に共通する比較的保存された領域に基づいて、混合塩基を含みながら設計することができる。具体的には例えば、センスプライマーとしては、tcmatggagatycaycargc（プライマー１：配列番号５）及びggncarcaycaratgtgggc（プライマー２：配列番号６）等が挙げられる。。アンチセンスプライマーとしては、gcyttrtaraacckrtcytc（プライマー３：配列番号７）及びayatccarcargtanggycc（プライマー４：配列番号８）等が挙げられる。
【００１５】
ディジェネレートＰＣＲ法により得られるＰＣＲ産物は、通常の遺伝子工学的手法によりシーケンスすることができる。例えば、まず当該ＰＣＲ産物をそのまま、ＴＯＰＯ Ｂｌｕｎｔ Ｃｌｏｎｉｎｇキットや、ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）におけるクローニングベクターに組み込む。または、制限酵素の認識部位（クローニングサイト）を設けたディジェネレートプライマーを用いたディジェネレートＰＣＲ法により得られるＰＣＲ産物を当該制限酵素で処理することにより付着末端を付与し、これを当該付着末端に対して相補的な付着末端を有するクローニングベクターにライゲーションさせることにより組み込む。次いで、このようにして得られた組み換えプラスミドを大腸菌等の宿主生物に導入しクローニングした後、当該プラスミドに特異的なプライマーを用いてシーケンスする。または、前記ＰＣＲ産物を、当該ＰＣＲ産物の増幅に使用されたディジェネレートプライマー若しくは断片内部にアニールする別のプライマーを用いてダイレクトシーケンスしてもよい。
【００１６】
供試されるイヌホタルイに含まれる２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子の各々は、以下のようにして調製すればよい。
まず供試されるイヌホタルイからゲノムＤＮＡを通常の方法に従い抽出する。ゲノムＤＮＡの抽出法としては、例えば、ＣＴＡＢ法、Ｉｓｏｐｌａｎｔキット（ニッポンジーン社製）、Ｐｒｅｐｍａｎ Ｕｌｔｒａキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等を挙げることができる。また、ＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡに基づき逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを作製してもよい。尚、ＲＮＡの抽出法としては、例えば、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ社製）等を挙げることができる。
ＤＮＡを抽出する器官としては、特に限定されず、例えば、種子、葉、花茎、小穂等を挙げることができる。ＲＮＡを抽出する好ましい器官としては、例えば、葉、花茎等が挙げられる。
【００１７】
このようにして調製されたイヌホタルイ由来の２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子のうち、より長いものを「ＡＬＳａ遺伝子」（尚、その塩基配列は、（１）配列番号１で示される塩基配列、（２）配列番号２１で示される塩基配列（全長）、及び（３）図１〜３中の「StrainG ALSa」で示される行に記載される塩基配列に相当する。）、より短いものを「ＡＬＳｂ遺伝子」（尚、その塩基配列は、（１）配列番号２で示される塩基配列、（２）配列番号２２で示される塩基配列（全長）、及び（３）図１〜３中の「StrainG ALSb」で示される行に記載される塩基配列に相当する。）と記すが、特に両者の遺伝子を限定しない場合には、単に「ＡＬＳ遺伝子」と呼ぶこともある。
両者の遺伝子が有する塩基配列を比較解析するには、例えば、ＡＬＳａ遺伝子とＡＬＳｂ遺伝子との塩基配列における相同性に基づいて、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフト社製）を用いて整列化（アラインメント）すればよい。図１〜３には、当該整列化による塩基配列の比較解析結果を示す。ここで図１〜３中に記載されるハイフン「−」は、一方のＡＬＳ遺伝子における特定の塩基について、もう一方のＡＬＳ遺伝子において相当する特定の塩基が存在しないことを意味する。
【００１８】
イヌホタルイ由来の２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子におけるイントロンは、ＡＬＳ遺伝子の各々において、そのゲノムＤＮＡの塩基配列とそのｃＤＮＡの塩基配列とを比較することにより見出すことができる。例えば、図４に示されたＡＬＳａ遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列は、図１〜３に示されたＡＬＳａ遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列における第１番目の塩基から第１３９６番目の塩基までの領域から、第２００番目の塩基から第１３５０番目の塩基までの領域を削除した塩基配列に相当する。また、図４に示されたＡＬＳｂ遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列は、図１〜３に示されたＡＬＳｂ遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列における第１番目の塩基から第１３９６番目の塩基までの領域から、第２００番目の塩基から第１３５０番目の塩基までの領域を削除した塩基配列（但し、後述するＰｒｏ１９７部位となる１塩基を除く。）に相当する。従って、図１〜３に示されたＡＬＳａ遺伝子又はＡＬＳｂ遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列における第２００番目の塩基から第１３５０番目の塩基までの領域が、イヌホタルイ由来の２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子におけるイントロンと判明する。
尚、ここで「図４に示されたＡＬＳａ遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列」又は「図４に示されたＡＬＳｂ遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列」とは、図１〜３に示されたＡＬＳａ遺伝子又はＡＬＳｂ遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列が解析されたゲノムＤＮＡを提供する個体とは別個体から調製されたＡＬＳａ遺伝子又はＡＬＳｂ遺伝子のｃＤＮＡを解析して得られた塩基配列である。
【００１９】
イヌホタルイ由来の２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列、及び、イヌホタルイ由来の２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子のイントロンを除くゲノムＤＮＡの塩基配列は、アミノ酸配列へ翻訳することができる。３種類の想定フレームのうちどれがオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であるかは、公知のアセト乳酸合成酵素のアミノ酸配列との相同性を確保できるもの、という基準で容易に選択することができる。このようにして確定されたＯＲＦを翻訳して得られるアミノ酸配列におけるＰｒｏ１９７部位は、アセト乳酸合成酵素のドメインＡを検索することにより、特定することができる。アセト乳酸合成酵素のドメインＡにおける第７番目のアミノ酸がＰｒｏ１９７部位であるが、スルホニルウレア系除草剤に抵抗性を示すイヌホタルイ由来のアセト乳酸合成酵素遺伝子を解析した際には、Ｐｒｏ１９７部位がプロリン（Ｐｒｏ）ではない別のアミノ酸により置換されている可能性がある。従って、アセト乳酸合成酵素のドメインＡの検索は、アミノ酸配列：Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｘｘｘ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒを検索するのがよい。ここで、「Ｘｘｘ」は任意のアミノ酸を意味する。そのようにして検索されるイヌホタルイのＰｒｏ１９７部位は、図１〜３に示されるＡＬＳ遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列における第１３５４番目の塩基から第１３５６番目の塩基までの領域、又は、図４に示されるＡＬＳ遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列における第２０３番目の塩基から第２０５番目の塩基までの領域に相当する。
そしてまた、イヌホタルイ由来の２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子のイントロン（図１〜３に示されたＡＬＳ遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列における第２００番目の塩基から第１３５０番目の塩基までの領域）とＰｒｏ１９７部位（図１〜３に示されるＡＬＳ遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列における第１３５４番目の塩基から第１３５６番目の塩基までの領域）は極めて近接して存在する。
因みに、本発明は、本来、イヌホタルイにおけるスルホニルウレア系除草剤抵抗性能力の発現の主要因となっている（２種類の）アセト乳酸合成酵素のアミノ酸配列における置換突然変異とは全く直接的な関係が無いアセト乳酸合成酵素遺伝子のイントロンと、前記置換突然変異との遺伝子上での特異的な位置関係（「極めて近接して存在する」）等に注目し、当該知見を利用することを本願発明者が鋭意検討することにより、初めて成し遂げられたものである。
【００２０】
本発明ポリヌクレオチドは、イヌホタルイ由来のアセト乳酸合成酵素遺伝子の一部であり、アセト乳酸合成酵素におけるドメインＡの第５番目のアミノ酸をコードする塩基配列と第６番目のアミノ酸をコードする塩基配列との間に存在するイントロン領域からなるポリヌクレオチドである。より具体的には、イントロン領域が、下記のいずれかのイントロン領域であることを特徴とする。
（１）配列番号１で示される塩基配列における第２００番目の塩基から第１３４３番目の塩基までのイントロン領域（尚、図１〜３に示されたＡＬＳａ遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列における第２００番目の塩基から第１３５０番目の塩基までの領域からなる塩基配列に相当する。また、配列番号２１で示される塩基配列における第５１０番目の塩基から第１６５４番目の塩基までの領域からなる塩基配列にも相当する。）
（２）配列番号２で示される塩基配列における第２００番目の塩基から第１２９６番目の塩基までのイントロン領域（尚、図１〜３に示されたＡＬＳｂ遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列における第２００番目の塩基から第１３５０番目の塩基までの領域からなる塩基配列に相当する。また、配列番号２２で示される塩基配列における第５０２番目の塩基から第１５９８番目の塩基までの領域からなる塩基配列にも相当する。）
【００２１】
イヌホタルイ由来の２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子の塩基配列には、個体の産地や来歴の差異によって一部の塩基にバリエーションが存在する部位が含まれることがある。例えば、本発明ポリヌクレオチドにおいて「アセト乳酸合成酵素におけるドメインＡの第５番目のアミノ酸をコードする塩基配列と第６番目のアミノ酸をコードする塩基配列との間に存在するイントロン領域」とは、任意のイヌホタルイ個体由来の２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子の塩基配列が、配列番号１で示される塩基配列における第２００番目の塩基から第１３４３番目の塩基までのイントロン領域からなる塩基配列、又は、配列番号２で示される塩基配列における第２００番目の塩基から第１２９６番目の塩基までのイントロン領域からなる塩基配列と完全一致するものだけを意味するものではなく、例えば、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフト社製）、Ｇｅｎｅｔｙｘ（ゼネティックス社製）及びＶｅｃｔｏｒＮＴＩ（ワールドフュージョン社製）等の配列解析ソフトの相同性検索機能を用いて、ＡＬＳａ遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列若しくはＡＬＳｂ遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列のいずれかの塩基配列を相手に整列化（アラインメント）した際に、図１〜３に示されたＡＬＳ遺伝子の塩基配列における第２００番目の塩基から第１３５０番目の塩基までの領域として特定される領域からなる塩基配列（即ち、配列番号１で示される塩基配列における第２００番目の塩基から第１３４３番目の塩基までのイントロン領域からなる塩基配列、又は、配列番号２で示される塩基配列における第２００番目の塩基から第１２９６番目の塩基までのイントロン領域からなる塩基配列と実質的に同一であって、当該塩基配列との最適な整列化において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されてもよい塩基配列に相当する。）も含み意味するものである。好ましくは、配列番号１で示される塩基配列における第２００番目の塩基から第１３４３番目の塩基までのイントロン領域からなる塩基配列、又は、配列番号２で示される塩基配列における第２００番目の塩基から第１２９６番目の塩基までのイントロン領域からなる塩基配列と完全一致するものが挙げられる。
【００２２】
本発明評価方法は、イヌホタルイにおけるスルホニルウレア系除草剤抵抗性能力の評価方法であって、
（１）供試されるイヌホタルイに含まれる２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子の各々において、アセト乳酸合成酵素のドメインＡにおける第７番目のアミノ酸をコードする塩基配列がプロリンをコードする塩基配列であるか否かを、前記遺伝子の各々について検定する第一工程、及び、
（２）第一工程により得られる検定結果が、前記遺伝子の各々において、いずれもアセト乳酸合成酵素のドメインＡにおける第７番目のアミノ酸をコードする塩基配列がプロリンをコードする塩基配列である場合には、供試されるイヌホタルイはスルホニルウレア系除草剤抵抗性能力を有さないと判定し、一方、前記遺伝子の各々において、いずれか若しくはいずれもアセト乳酸合成酵素のドメインＡにおける第７番目のアミノ酸をコードする塩基配列がプロリンをコードする塩基配列でない場合には、供試されるイヌホタルイはスルホニルウレア系除草剤抵抗性能力を有すると判定する第二工程、
を有し、且つ、第一工程が、
（ａ）供試されるイヌホタルイに含まれる２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子の両者又はいずれか一方を鋳型とするように選択的にアニールし、且つ、本発明ポリヌクレオチドが有する塩基配列の一部若しくは全部と、アセト乳酸合成酵素のドメインＡにおける第７番目のアミノ酸をコードする塩基配列とを含む領域からなるＤＮＡ断片を増幅し得るプライマーセットを用いたＰＣＲを行う第Ａ工程、及び、
（ｂ）電気泳動、制限酵素を用いたＲＦＬＰ又はダイレクトシーケンスに基づき、アセト乳酸合成酵素のドメインＡにおける第７番目のアミノ酸をコードする塩基配列を解析する第Ｂ工程を含むことを特徴とする。
【００２３】
本発明評価方法の第一工程では、供試されるイヌホタルイに含まれる２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子の各々において、アセト乳酸合成酵素のドメインＡにおける第７番目のアミノ酸をコードする塩基配列がプロリンをコードする塩基配列であるか否かを、前記遺伝子の各々について検定する。そして当該検定のための工程には、（ａ）供試されるイヌホタルイに含まれる２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子の両者又はいずれか一方を鋳型とするように選択的にアニールし、且つ、本発明ポリヌクレオチドが有する塩基配列の一部若しくは全部と、アセト乳酸合成酵素のドメインＡにおける第７番目のアミノ酸をコードする塩基配列とを含む領域からなるＤＮＡ断片を増幅し得るプライマーセットを用いたＰＣＲを行う第Ａ工程、及び、（ｂ）電気泳動、制限酵素を用いたＲＦＬＰ又はダイレクトシーケンスに基づき、アセト乳酸合成酵素のドメインＡにおける第７番目のアミノ酸をコードする塩基配列を解析する第Ｂ工程を含む。尚、当該第一工程は、後述する本発明検出方法に実質的に相当するものである。以下、必要に応じて本発明評価方法の第一工程、後述する本発明評価方法とを合わせて説明することもある。
【００２４】
本発明評価方法（及び後述する本発明検定方法）の第Ａ工程において用いられる、「供試されるイヌホタルイに含まれる２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子の両者を鋳型とするように選択的にアニールし得るプライマーセット」における「両者を鋳型とするように選択的にアニールし得る」とは、当該プライマーセットをなす２つのプライマーの各々の塩基配列が、配列番号１で示される塩基配列と、配列番号２で示される塩基配列との間で完全一致する領域に含まれる塩基配列に相当するように調製することが最も好ましいが、必ずしもそれに限られない。
例えば、配列番号１で示される塩基配列と、配列番号２で示される塩基配列との間で一致しない塩基を含む領域に含まれる塩基配列に相当するように調製する場合には、一致しない塩基が当該プライマーセットをなす２つのプライマーの各々において、１若しくは２個程度であれば、所望のＤＮＡ断片を増幅し得るプライマーセットとして用いることもできる。その際には、一致しない塩基が当該プライマーの、３´末端の３塩基に含まれないようにすればよい。また、塩基が一致しない部位については、２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子の両者が有する塩基（２種類の塩基）を混合塩基として有するプライマーを設計してもよい。
【００２５】
本発明評価方法（及び後述する本発明検定方法）の第Ａ工程において用いられる、「供試されるイヌホタルイに含まれる２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子の両者を鋳型とするように選択的にアニールし得るプライマーセット」における一方をなすセンスプライマーとしては、当該センスプライマーの３´末端が、図１〜３に示されたＡＬＳ遺伝子の塩基配列における第１２０１番目の塩基よりも上流部位にアニールし得るような塩基配列からなることが好ましい。より好ましくは、当該センスプライマーの３´末端が、図１〜３に示されたＡＬＳ遺伝子の塩基配列における第１２０１番目の塩基よりも上流部位であって且つ第７５０番目の塩基よりも下流部位にアニールし得るような塩基配列からなることがよい。具体的には例えば、当該センスプライマーとしては、ttatgtcatcttaatcgaaggt（プライマー５：配列番号９：図１〜３に示されたＡＬＳ遺伝子の塩基配列における第１１５１番目の塩基から第１１７２番目の塩基までの領域に相当する。）及びcattgcttgattctgtgccta（プライマー６：配列番号１０：図１〜３に示されたＡＬＳ遺伝子の塩基配列における第１５９番目の塩基から第１７９番目の塩基までの領域に相当する。）等を挙げることができる。
【００２６】
これに対して本発明評価方法（及び後述する本発明検定方法）の第Ａ工程において用いられる、「供試されるイヌホタルイに含まれる２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子の両者を鋳型とするように選択的にアニールし得るプライマーセット」における一方をなすアンチセンスプライマーとしては、当該アンチセンスプライマーの３´末端が、Ｐｒｏ１９７部位（図１〜３に示されたＡＬＳ遺伝子の塩基配列における第１３５４番目の塩基から第１３５６番目の塩基までの領域に相当する。）よりも下流部位にアニールし得るような塩基配列からなることが必要である。具体的には例えば、当該アンチセンスプライマーとしては、ctatgtcaagtacaagatagttgtg（プライマー７：配列番号１１：図１〜３に示されたＡＬＳ遺伝子の塩基配列における第１４２５番目の塩基から第１４５０番目の塩基までの領域に相当する。）及びggtgtctccaacattttcctcactgcctcc（プライマー８：配列番号１２：図１〜３に示されたＡＬＳ遺伝子の塩基配列における第２６３１番目の塩基から第２６６０番目の塩基までの領域に相当する。）等を挙げることができる。
【００２７】
本発明評価方法（及び後述する本発明検定方法）の第Ａ工程において用いられる、「供試されるイヌホタルイに含まれる２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子のいずれか一方を鋳型とするように選択的にアニールし得るプライマーセット」における「いずれか一方を鋳型とするように選択的にアニールし得る」は、例えば、下記（３）のような設計においては、当該プライマーセットをなす２つのプライマーのいずれかまたは双方の塩基配列が、配列番号１で示される塩基配列における第２００番目の塩基から第１３４３番目の塩基までのイントロン領域からなる塩基配列、又は、配列番号２で示される塩基配列における第２００番目の塩基から第１２９６番目の塩基までのイントロン領域からなる塩基配列との間で完全一致しない領域に含まれる塩基配列に相当するように調製すればよい。そして、配列番号１で示される塩基配列における第２００番目の塩基から第１３４３番目の塩基までのイントロン領域からなる塩基配列、又は、配列番号２で示される塩基配列における第２００番目の塩基から第１２９６番目の塩基までのイントロン領域からなる塩基配列との間で一致しない塩基を含む領域に含まれる塩基配列に相当するように調製する場合には、一致しない塩基が当該プライマーセットをなす２つのプライマーのいずれかまたは双方において少なくとも２個程度以上であれば、所望のＤＮＡ断片を増幅し得るプライマーセットとして用いることもできる。その際には、一致しない塩基の少なくとも１つを当該プライマーの３´末端の３塩基のいずれかに相当させることがよい。また、必ずしも上記の調製方法には限られず、前記イントロン領域以外の領域からなる塩基配列を情報源として適宜選択することもできる。一方、下記（１）又は（２）のような設計においては、２つのＡＬＳ遺伝子間における塩基の一致／不一致ではなく、一方のＡＬＳ遺伝子における挿入配列または欠損配列を利用すればよい（後述参照）。
【００２８】
本発明評価方法（及び後述する本発明検定方法）の第Ａ工程において用いられる、「供試されるイヌホタルイに含まれる２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子のいずれか一方を鋳型とするように選択的にアニールし得るプライマーセット」における一方をなすセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとしては、当該センスプライマーと当該アンチセンスプライマーとの少なくとも一方が、２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子のいずれか一方に対して優先的にアニールし得るような塩基配列からなることが必要である。ここで「選択的に」とは、結果として増幅されるＤＮＡ断片のうち、一方のＤＮＡ断片の割合が７０％以上、望ましくは９０％以上である場合を意味する。
このようなセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとしては、例えば、下記の（１）、（２）又は（３）のようにして設計すればよい。
【００２９】
（１）２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子のいずれか一方のみにしか存在していない挿入配列（図１〜３に示されたＡＬＳ遺伝子の塩基配列における第２００番目の塩基から第１３５０番目の塩基までの領域からなる塩基配列において、アラインする対象塩基がなく、連続したハイフンがアライン相手として示されている部分）に相当するセンスプライマーを設計する。具体的には例えば、当該挿入配列としては、図１〜３に示されたＡＬＳａ遺伝子の塩基配列における第１２０１番目の塩基から第１２４１番目の塩基までの領域、図１〜３に示されたＡＬＳｂ遺伝子の塩基配列における第６４４番目の塩基から第６４６番目の塩基までの領域、図１〜３に示されたＡＬＳａ遺伝子の塩基配列における第５４６番目の塩基から第５５５番目の塩基までの領域等を挙げることができる。その中でも、プライマーの全長すべてを当該挿入配列から設計することが好ましく、例えば、図１〜３に示されたＡＬＳａ遺伝子の塩基配列における第１２０１番目の塩基から第１２４１番目の塩基までの領域が挙げられる。もっとも、必ずしも当該領域にプライマーの全長すべてが収まる必要はなく、プライマーの一部が当該領域に相当するものでもよい。また、挿入配列が、プライマーの全長よりも短い場合にもプライマーの一部が当該領域に相当するように設計すればよい。
具体的には例えば、当該センスプライマーとしては、cagaaaaatatgtagatcataagaggaa（プライマー９：配列番号１３：図１〜３に示されたＡＬＳａ遺伝子の塩基配列における第１２０１番目の塩基から第１２２８番目の塩基までの領域に相当する。）及びcattcgcagcagcaatta（プライマー１０：配列番号１４：図１〜３に示されたＡＬＳｂ遺伝子の塩基配列における塩基配列における第６３５番目の塩基から第６５２番目の塩基までの領域に相当する。）等を挙げることができる。
【００３０】
（２）上記（１）の各挿入配列部位に対応し、配列欠損（連続したハイフンに相当する。）を有する側の遺伝子に注目し、図１〜３に示されたＡＬＳａ遺伝子若しくはＡＬＳｂ遺伝子の塩基配列において連続したハイフンを挟む形でプライマーを設計すれば、当該配列欠損を有する側の遺伝子に対して優先的にアニールし得るような塩基配列からなるセンスプライマーが得られる。
具体的には例えば、当該センスプライマーとしては、tatatttgtttataacatcttatacttaag（プライマー１１：配列番号１５：図１〜３に示されたＡＬＳｂ遺伝子の塩基配列における第１１８８番目の塩基から第１２５８番目の塩基までの領域に相当する。）等を挙げることができる。
【００３１】
（３）上記（１）又は（２）のように、両者の遺伝子で３塩基以上長さの異なる領域以外においても、連続若しくは近接する２またはそれ以上の塩基において両者の遺伝子で塩基配列が異なる領域に、プライマーが相当するように設計すれば、一方の遺伝子に対して優先的にアニールし得るような塩基配列からなるプライマーが得られる。この際には、両者の遺伝子の間で一致しない少なくとも１つの塩基を当該プライマーの３´末端の３塩基のいずれかに相当させるとよい。
具体的には例えば、当該センスプライマーとして、aagtcaaattcagaatatactttacc（プライマー１２：配列番号１６：図１〜３に示されたＡＬＳａ遺伝子の塩基配列における第３６０番目の塩基から第３８５番目の塩基までの領域に相当する。）及びcgctcaaattttacattcttg（プライマー１３：配列番号１７：図１〜３に示されたＡＬＳｂ遺伝子の塩基配列における第７０１番目の塩基から第７２２番目の塩基までの領域に相当する。）等を挙げることができる。一方、当該アンチセンスプライマーとしては、tcccgtacctcactcctc（プライマー１４：配列番号１８：図１〜３に示されたＡＬＳａ遺伝子の塩基配列における第２６１６番目の塩基から第２６３３番目の塩基までの領域に相当する。）及びtcccgtacctcactccgt（プライマー１５：配列番号１９：図１〜３に示されたＡＬＳｂ遺伝子の塩基配列における第２６１６番目の塩基から第２６３３番目の塩基までの領域に相当する。）等を挙げることができる。
【００３２】
上記（１）、（２）及び（３）から選ばれるセンスプライマーと対をなしてプライマーセットとなるアンチセンスプライマーとしては、例えば、プライマー７、プライマー８等を挙げることができる。また上記（３）から選ばれるアンチセンスプライマーと対をなしてプライマーセットとなるセンスプライマーとしては、例えば、プライマー５、プライマー６等を挙げることができる。また場合により、（１）、（２）及び（３）から選ばれるセンスプライマーと、（３）から選ばれるアンチセンスプライマーとをプライマーセットとして用いることもできる。
【００３３】
本発明評価方法（及び後述する本発明検定方法）の第Ｂ工程が、ダイレクトシーケンスに基づき塩基配列を解析する工程である場合には、第Ａ工程において用いられるプライマーセットの種類に応じて、当該ダイレクトシーケンスにおいて用いられるシーケンシングプライマーを適切に選択する必要がある。
【００３４】
具体的には、第Ａ工程において用いられるプライマーセットが供試されるイヌホタルイに含まれる２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子の両者を鋳型とするように選択的にアニールし得るプライマーセットである場合には、第Ａ工程において増幅されるＤＮＡ断片が２種類生じるために、前記ダイレクトシーケンスにおいて用いられるシーケンシングプライマーが、第Ａ工程において増幅されるＤＮＡ断片のいずれか一方を鋳型とするように選択的にアニールし得るプライマーを選択する必要がある。
【００３５】
上記のようなシーケンシングプライマーとしては、例えば、プライマー９、プライマー１０、プライマー１１、プライマー１２、プライマー１３等を挙げることができる。尚、ダイレクトシーケンスを実施する際には、ＰＣＲによる反応物中に含まれる未反応のｄＮＴＰ及び未反応のＰＣＲプライマーを、ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（ＵＳＢ社）等を用いて予め除去しておくことが好ましい。
【００３６】
また、第Ａ工程において用いられるプライマーセットが供試されるイヌホタルイに含まれる２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子のいずれか一方を鋳型とするように選択的にアニールし得るプライマーセットである場合には、第Ａ工程において増幅されるＤＮＡ断片が１種類のみ生じるために、前記ダイレクトシーケンスにおいて用いられるシーケンシングプライマーが、第Ａ工程において増幅されるＤＮＡ断片を鋳型とするように選択的にアニールし得るプライマーであればよい。
【００３７】
上記のようなシーケンシングプライマーとしては、例えば、例えば、プライマー５、プライマー６、プライマー７、プライマー８等を挙げることができる。勿論、第Ａ工程において増幅されたＤＮＡ断片に対応する「一方の遺伝子」に特異的なシーケンシングプライマーであってもよい。例えば、プライマー９、プライマー１０、プライマー１１、プライマー１２、プライマー１３等が挙げられる。
【００３８】
本発明評価方法（及び後述する本発明検定方法）の第Ｂ工程は、電気泳動、制限酵素を用いたＲＦＬＰ又はダイレクトシーケンスに基づき、アセト乳酸合成酵素のドメインＡにおける第７番目のアミノ酸をコードする塩基配列を解析する工程である。
第Ａ工程で増幅されたＤＮＡ断片を２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子のいずれかに由来するＤＮＡ断片であるかを判定するには、通常、ＡＬＳａ遺伝子に由来するＤＮＡ断片の方がＡＬＳｂ遺伝子に由来するＤＮＡ断片に比較して長いことにより、区別すればよい。また塩基数が同じ場合には塩基配列の違いを利用して、第Ａ工程で増幅されたＤＮＡ断片を、一方の遺伝子に由来するＤＮＡ断片のみを選択的に切断する制限酵素を用いて、消化処理した後、当該消化物のサイズを比較することにより、区別すればよい。また第Ａ工程において増幅されるＤＮＡ断片のいずれか一方を鋳型とするように選択的にアニールし得るシーケンシングプライマーを用いてダイレクトシーケンスすることにより、区別してもよい。
このような方法により、２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子の両者に由来するＤＮＡ断片が混在していても、クローニング等による両者の区別を行うことなく、イヌホタルイ由来の２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子においてＰ１９７Ｘをより簡便に検出することが可能となる。
【００３９】
本発明評価方法（及び後述する本発明検定方法）の第Ｂ工程が、制限酵素を用いたＲＦＬＰに基づき塩基配列を解析する工程である場合には、ＲＦＬＰにおいて用いられる制限酵素が、アセト乳酸合成酵素のドメインＡにおける第７番目のアミノ酸をコードする塩基配列の全部若しくは一部を制限酵素認識部位として含む制限酵素であればよい。
この場合には、２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子の両者又はいずれか一方を鋳型として増幅されるＤＮＡ断片が、Ｐｒｏ１９７部位において前記制限酵素で切断されるか否かで、Ｐｒｏ１９７部位における置換突然変異の有無を検出することが可能となる。前述のように、２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子を鋳型として、本発明ポリヌクレオチドが有する塩基配列の特定な一部若しくは全部（即ち、イントロンの特定な一部若しくは全部）及びＰｒｏ１９７部位を含んで増幅しＤＮＡ断片を得ると、ＡＬＳａ遺伝子に由来するＤＮＡ断片の方がＡＬＳｂ遺伝子に由来するＤＮＡ断片よりも長い。そのため、長いＤＮＡ断片におけるＰｒｏ１９７部位での切断の成否、短いＤＮＡ断片におけるＰｒｏ１９７部位での切断の成否、の各々により、ＡＬＳａ遺伝子及びＡＬＳｂ遺伝子の各々におけるＰ１９７Ｘの存在を独立且つ同時に検出することが可能となる。当該ＲＦＬＰに用いられる制限酵素としては、例えばＢｓｐＬＩ又はそのアイソシゾマー（例えば、ＮｌａＩＶ）が挙げられる。
また、第Ａ工程において用いられるプライマーセットの種類に応じては、具体的には、ＰＣＲにおいて用いられるプライマーセットが、ミスマッチ塩基を導入し得るアンチセンスプライマーを含むプライマーセットである場合には、ＲＦＬＰにおいて用いられる制限酵素が、前記ミスマッチ塩基の導入により増幅されるＤＮＡ断片に付与された塩基配列の全部若しくは一部を制限酵素認識部位として含む制限酵素を選択する必要がある。
この場合には、アンチセンスプライマーにミスマッチ塩基を導入することにより、増幅されるＤＮＡ断片に、本来鋳型となる遺伝子には存在していない制限酵素認識部位を付与する。当該ＲＦＬＰに用いられる制限酵素は、前記ミスマッチ塩基の導入により増幅ＤＮＡ断片に付与された塩基配列の全部若しくは一部を制限酵素認識部位として含む制限酵素であればよいが、例えば、ＢｓｅＤＩ又はそのアイソシゾマー（例えば、ＳｅｃＩ）、ＢｓｅＬＩ又はそのアイソシゾマー（例えば、ＢｓｉＹＩ）、ＸａｇＩ又はそのアイソシゾマー（例えば、ＥｃｏＮＩ）等を挙げることができる。好ましくは、ＢｓｅＬＩ又はそのアイソシゾマー（例えば、ＢｓｉＹＩ）が挙げられる。
ＲＦＬＰにおいてＤＮＡ断片長の多型を検出する方法としては、例えば、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、各種クロマトグラフィー等を挙げることができる。
【００４０】
本発明評価方法の第二工程では、第一工程により得られる検定結果が、前記遺伝子の各々において、いずれもアセト乳酸合成酵素のドメインＡにおける第７番目のアミノ酸をコードする塩基配列がプロリンをコードする塩基配列である場合には、供試されるイヌホタルイはスルホニルウレア系除草剤抵抗性能力を有さないと判定し、一方、前記遺伝子の各々において、いずれか若しくはいずれもアセト乳酸合成酵素のドメインＡにおける第７番目のアミノ酸をコードする塩基配列がプロリンをコードする塩基配列でない場合には、供試されるイヌホタルイはスルホニルウレア系除草剤抵抗性能力を有すると判定する。
【００４１】
本発明検定方法は、イヌホタルイに含まれる２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子の各々において、アセト乳酸合成酵素のドメインＡにおける第７番目のアミノ酸をコードする塩基配列がプロリンをコードする塩基配列であるか否かを、前記遺伝子の各々について検定する方法であって、
（ａ）供試されるイヌホタルイに含まれる２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子の両者又はいずれか一方を鋳型とするように選択的にアニールし、且つ、本発明ポリヌクレオチドが有する塩基配列の一部若しくは全部と、アセト乳酸合成酵素のドメインＡにおける第７番目のアミノ酸をコードする塩基配列とを含む領域からなるＤＮＡ断片を増幅し得るプライマーセットを用いたＰＣＲを行う第Ａ工程、及び、
（ｂ）電気泳動、制限酵素を用いたＲＦＬＰ又はダイレクトシーケンスに基づき、アセト乳酸合成酵素のドメインＡにおける第７番目のアミノ酸をコードする塩基配列を解析する第Ｂ工程
を含むことを特徴とする。
尚、本発明検定方法は、前述する本発明評価方法の第一工程に実質的に相当するものであり、詳細な説明は前述する本発明評価方法の第一工程における詳細な説明と同様である。
【００４２】
本発明は、本発明ポリヌクレオチド、本発明評価方法、本発明検定方法の他に、例えば、本発明モニタリング方法、本発明探索方法、本発明使用、ＡＬＳ遺伝子等のイヌホタルイ由来の２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子に関連する技術を含む。
本発明モニタリング方法は、スルホニルウレア系除草剤抵抗性能力を有するイヌホタルイの分布状況を、本発明評価方法に基づいて調査する工程を有することを特徴とする。
本発明探索方法は、本発明評価方法により評価されたスルホニルウレア系除草剤抵抗性能力に基づきスルホニルウレア系除草剤抵抗性能力を有するイヌホタルイを選抜することを特徴とする。
本発明使用は、イヌホタルイにおけるスルホニルウレア系除草剤抵抗性能力を評価するための試薬が有する塩基配列を提供する塩基配列情報源としての、本発明ポリヌクレオチドの使用である。
【実施例】
【００４３】
以下に、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４４】
参考例１  （供試されるイヌホタルイ系統におけるスルホニルウレア系除草剤抵抗性能力の従来法に基づく評価（その１））
遺伝子解析に供試されるイヌホタルイ５系統におけるスルホニルウレア系除草剤抵抗性能力を評価した。表１に示されるイヌホタルイ系統を、予め水田土壌が詰められた１／５０００アールワグネルポットに播種した。当該植物を湛水条件下で本葉が２枚になるまで温室内で育成した後、ベンスルフロンメチル、イマゾスルフロン又はピラゾスルフロンエチル（有効成分）がＴｗｅｅｎ２０含有（２％(w/v)）アセトンに溶解してなる薬剤を、表１に示される有効成分量が施用されるように、田面水に滴下処理した。薬剤処理後、前記供試植物を３５日間温室内で育成したのち、除草効力を後述の評価基準に従い目視で評価した。評価基準は、前記供試植物の生育状態が無処理区における生育状態と比較して全く乃至殆ど差異が無いものを「０」とし、前記供試植物が完全枯死又は生育が完全に抑制されているものを「５」として、０〜５の６段階に区分し、０、１、２、３、４、５で判定した。結果を表１に示した。
系統Ａは実用的な有効成分量のスルホニルウレア系除草剤に対して感受性であり、系統Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは同有効成分量のスルホニルウレア系除草剤に対して抵抗性であった。
【００４５】
【表１】
2007319052.tif 000002
【００４６】
参考例２  （供試されるイヌホタルイ系統におけるスルホニルウレア系除草剤抵抗性能力の従来法に基づく評価（その２））
参考例１で供試されたイヌホタルイ５系統とは異なるイヌホタルイ２系統におけるスルホニルウレア系除草剤抵抗性能力を評価した。表２に示されるイヌホタルイ系統を、予め水田土壌が詰められた１／５０００アールワグネルポットに播種した。当該植物を湛水条件下で本葉が１枚になるまで温室内で育成した後、ベンスルフロンメチルの顆粒水和剤（商品名Ｌｏｎｄａｘ、ＤｕＰｏｎｔ社製）又はイマゾスルフロンの粒剤（商品名テイクオフ、住化武田農薬社製）を、表２に示される有効成分量が施用されるように、水面処理した。薬剤処理後、前記供試植物を２６日間温室内で育成したのち、除草効力を参考例１に記載される評価基準に従い目視で評価した。結果を表２に示す。
系統Ｆは実用的な有効成分量のスルホニルウレア系除草剤に対して感受性であり、系統Ｇは同有効成分量のスルホニルウレア系除草剤に対して抵抗性であった。
【００４７】
【表２】
2007319052.tif 000003
【００４８】
実施例１  （イヌホタルイ由来のアセト乳酸合成酵素遺伝子の取得）
ワグネルポットで栽培された系統Ｇ（スルホニルウレア系除草剤抵抗性系統）の花茎を５ｍｍ長に刻み、当該植物器官片からＩｓｏｐｌａｎｔキット(ニッポンジーン社製)を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型とし、且つ、プライマー１（センスプライマー）及びプライマー４（アンチセンスプライマー）をプライマーセットとし、ＥｘＴａｑキット（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。当該ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片をＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のプラスミドｐＣＲ２．１のクローニング部位に連結することにより、組換えプラスミドを得た。
次いで、当該プラスミドを大腸菌（コンピテントセル（タカラバイオ社製））に導入し、アンピシリン耐性になった大腸菌（アンピシリン耐性株）を１１株選抜した。次いで、選抜されたアンピシリン耐性株に含まれるプラスミドの塩基配列を、ＢｉgＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ及びＤＮＡシークエンサー３１００(Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)を用いて決定した。
その結果、シロイヌナズナ由来のアセト乳酸合成酵素遺伝子の塩基配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：Ｘ５１５１４）に対して高い相同性を有する塩基配列（具体的には、配列番号１で示される塩基配列）を有する遺伝子を保持する８株と、シロイヌナズナ由来のアセト乳酸合成酵素遺伝子の塩基配列に対して高い相同性を有する塩基配列であって前者８株が有する遺伝子の塩基配列とは一部異なる塩基配列（具体的には、配列番号２で示される塩基配列）を有する遺伝子を保持する３株との２つのグループを見出した。
上記の「配列番号１で示される塩基配列」と「配列番号２で示される塩基配列」とは、イヌホタルイ由来の２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子の部分塩基配列と考えられ、各々の遺伝子を「ＡＬＳａ遺伝子」及び「ＡＬＳｂ遺伝子」と命名した。尚、配列番号１で示される塩基配列（因みに、当該配列は、後述で明らかなように、図１〜３に示されたＡＬＳａ遺伝子の塩基配列に対応している。）を有する遺伝子を保持する８株、又は、配列番号２で示される塩基配列（因みに、当該配列は、後述で明らかなように、図１〜３に示されたＡＬＳｂ遺伝子の塩基配列に対応している。）を有する遺伝子を保持する３株の各々のグループ内で、まれに１株における特定の１塩基が他７株（ＡＬＳａ遺伝子の場合）又は他２株（ＡＬＳｂ遺伝子の場合）と一致しないことがあったが、これはＥｘＴａｑポリメラーゼのＰＣＲエラーによるものであると判断されることから、その部分については各グループにおける多数決で塩基を確定し、一義的な塩基配列として配列番号１又は配列番号２に示した。
【００４９】
実施例２  （ｃＤＮＡにおけるＡＬＳａ遺伝子及びＡＬＳｂ遺伝子の取得、並びに、イントロンの特定）
系統Ａの花茎から、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した。抽出されたｔｏｔａｌＲＮＡに含まれる完全長ｍＲＮＡからＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｃＤＮＡを得た。当該キットに添付されるプライマーとプライマー１４とのプライマーセット、及び、当該キットに添付されるプライマーとプライマー１５とのプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより、ＡＬＳａ遺伝子に由来するＤＮＡ断片及びＡＬＳｂ遺伝子に由来するＤＮＡ断片を得た。
得られた各々のＤＮＡ断片がＥｘｏＳＡＰ ＩＴ（ＵＳＢ社製）を用いて精製されたものを鋳型にし、且つ、「gagaggtgtaccctggaaga」（配列番号２０）という塩基配列からなるプライマー（配列番号１に示された塩基配列における第１５７４番目の塩基から第１５９３番目の塩基までの領域、配列番号２に示された塩基配列における第１５２７番目の塩基から第１５４６番目の塩基までの領域に相当する。）を用いてダイレクトシーケンスすることにより、ＡＬＳａ遺伝子のｃＤＮＡの部分塩基配列とＡＬＳｂ遺伝子のｃＤＮＡの部分塩基配列とを決定した。
その結果、ＡＬＳａ遺伝子のｃＤＮＡの部分塩基配列は、配列番号１に示された塩基配列における第１番目の塩基から第１３８９番目の塩基までの領域からなる塩基配列（即ち、配列番号３）に相当するものであり、また、ＡＬＳｂ遺伝子のｃＤＮＡの部分塩基配列は、配列番号２に示された塩基配列における第１番目の塩基から第１３４２番目の塩基までの領域からなる塩基配列（即ち、配列番号４）に相当するものであった。因みに、配列番号３で示される塩基配列は、配列番号１に示された塩基配列から当該塩基配列における第２００番目の塩基から第１３４３番目の塩基までの領域を除いてなる塩基配列に一致しており、また、配列番号４で示される塩基配列は、配列番号２に示された塩基配列から当該塩基配列における第２００番目の塩基から第１２９６番目の塩基までの領域を除いてなる塩基配列において、さらに１塩基（配列番号２に示された塩基配列における第１３００番目の「Ｔ」、配列番号４で示される塩基配列における第２０３番目の「Ｃ」）を除き一致していた。
次に、ＡＬＳａ遺伝子及びＡＬＳｂ遺伝子の各々において、ゲノムＤＮＡが有する塩基配列とｃＤＮＡが有する塩基配列とを比較することにより、イヌホタルイ由来のＡＬＳａ遺伝子中に存在しているイントロン及びイヌホタルイ由来のＡＬＳｂ遺伝子中に存在しているイントロンを特定した。
その結果、イヌホタルイ由来のＡＬＳａ遺伝子中に存在しているイントロンは、配列番号１に示された塩基配列における第２００番目の塩基から第１３４３番目の塩基までの領域であり、また、イヌホタルイ由来のＡＬＳｂ遺伝子中に存在しているイントロンは、配列番号２に示された塩基配列における第２００番目の塩基から第１２９６番目の塩基までの領域であることが判明した。
【００５０】
次いで、ＡＬＳａ遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列とＡＬＳｂ遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列とを、両者の相同性に基づき、ＤＮＡ配列解析ソフトウエアＤＮＡＳＩＳ（日立ソフト社製）を用いて整列化（アラインメント）することにより、両者の塩基配列を比較解析した。その結果を図１〜３に示した。また、ＡＬＳａ遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列とＡＬＳｂのｃＤＮＡの塩基配列とを、両者の相同性に基づき、同様に整列化した結果を図４に示した。
図１〜３においてハイフン「−」は、一方のＡＬＳ遺伝子における特定の塩基について、もう一方のＡＬＳ遺伝子においては相当する塩基が存在しないことを意味している。図１〜３においてイントロンは、第２００番目の塩基から第１３５０番目の塩基までの領域に相当しているが、２つのイントロンにおいて長さを相違させる要因は、ほぼ、一方のＡＬＳ遺伝子に特異的な挿入配列（図１〜３における、ＡＬＳａ遺伝子の塩基配列における第１２０１番目の塩基から第１２４１番目の塩基までの領域からなる塩基配列、ＡＬＳｂ遺伝子の塩基配列における第６４４番目の塩基から第６４６番目の塩基までの領域からなる塩基配列、及び、ＡＬＳａ遺伝子の塩基配列における第５４６番目の塩基から第５５５番目の塩基までの領域からなる塩基配列のような、アラインする相手が連続したハイフンとなる領域からなる塩基配列）に拠っていた。即ち、２つのイントロンにおいて長さを相違させる部位は、特定の箇所に局在して存在していた。
このようにして特定されたイントロンを、図１〜３に示されたＡＬＳａ遺伝子の塩基配列及び図１〜３に示されたＡＬＳｂ遺伝子の塩基配列から除くことにより、図１〜３に示されたＡＬＳａ遺伝子の塩基配列及び図１〜３に示されたＡＬＳｂ遺伝子の塩基配列をアミノ酸配列に翻訳することが可能になる。
系統Ｇ（スルホニルウレア系除草剤抵抗性系統）のＰｒｏ１９７部位は、図１〜３に示されたＡＬＳａ遺伝子の塩基配列における第１３５４番目の塩基から第１３５６番目の塩基までの領域に相当していた。より具体的には、ＡＬＳａ遺伝子の塩基配列の場合にはＣＣＴ（Ｐｒｏ）であり、またＡＬＳｂ遺伝子の塩基配列の場合にはＴＣＴ（Ｓｅｒ）であった。以上より、系統Ｇ由来のＡＬＳｂ遺伝子は、Ｐ１９７Ｓ変異体であると判明した。
一方、系統Ａ（スルホニルウレア系除草剤感受性系統）のＰｒｏ１９７部位は、図４に示されたＡＬＳ遺伝子の塩基配列における第２０３番目の塩基から第２０５番目の塩基までの領域に相当していた。より具体的には、ＡＬＳａ遺伝子の塩基配列及びＡＬＳｂ遺伝子の塩基配列のいずれの場合にもＣＣＴ（Ｐｒｏ）であった。以上より、系統Ａ由来のＡＬＳａ遺伝子及びＡＬＳｂ遺伝子は、Ｐｒｏ１９７部位の置換突然変異体ではないと判明した。
【００５１】
実施例３  （本発明評価方法（その１）：ＡＬＳａ遺伝子選択的ダイレクトシーケンス及びＡＬＳｂ遺伝子選択的なダイレクトシーケンス）
系統Ａ、系統Ｂ、系統Ｃ、系統Ｄ又は系統ＥのゲノムＤＮＡを鋳型とし且つプライマー５及びプライマー８のプライマーセットを用いて、ＡＬＳ遺伝子の両者を由来とするＤＮＡ断片を増幅するためのＰＣＲを行った。当該ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片をＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（ＵＳＢ社製）を用いて精製した後、当該精製物について、プライマー９又はプライマー１１がシーケンシングプライマーとして用いられるダイレクトシーケンスを実施した。尚、ダイレクトシーケンスを実施する際には、ＢｉgＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ及びＤＮＡシークエンサー３１００(Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)を用いた。
解読した領域（図１〜３に示されたＡＬＳ遺伝子の塩基配列における第１３２１番目の塩基から第１５５０番目の塩基までの領域）の塩基配列は、いずれの系統でも、プライマー９がシーケンシングプライマーとして用いられるダイレクトシーケンスの場合には、Ｐｒｏ１９７部位を除き、図１〜３に示されたＡＬＳａ遺伝子の塩基配列と完全一致していることが判明した。一方、プライマー１１がシーケンシングプライマーとして用いられるダイレクトシーケンスの場合には、Ｐｒｏ１９７部位を除き、図１〜３に示されたＡＬＳｂ遺伝子の塩基配列で示される塩基配列と完全一致していることが判明した。
以上より、ＡＬＳ遺伝子の両者の各々に由来するＤＮＡ断片が混在する試料であっても、プライマー９がシーケンシングプライマーとして用いられるダイレクトシーケンスの場合には、ＡＬＳａ遺伝子を選択的にダイレクトシーケンスすることができ、またプライマー１１がシーケンシングプライマーとして用いられるダイレクトシーケンスの場合には、ＡＬＳｂ遺伝子を選択的にダイレクトシーケンスすることができることが確認された。
尚、上記の試験により確認された、各系統の２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子の両者におけるＰｒｏ１９７部位の塩基配列と当該塩基配列がコードするアミノ酸とを表３に示した。
系統ＡのＡＬＳ遺伝子の両者の各々におけるＰｒｏ１９７部位には、置換突然変異が存在していないことが実施例２と同様に確認された。また系統ＢのＡＬＳａ遺伝子におけるＰｒｏ１９７部位には、Ｐ１９７Ｈという置換突然変異が存在していることが確認された。また系統ＣのＡＬＳｂ遺伝子におけるＰｒｏ１９７部位には、Ｐ１９７Ｓという置換突然変異が存在していることが確認された。また系統ＤのＡＬＳａ遺伝子におけるＰｒｏ１９７部位には、Ｐ１９７Ｌという置換突然変異が存在していることが確認された。また系統ＥのＡＬＳａ遺伝子におけるＰｒｏ１９７部位には、Ｐ１９７Ａという置換突然変異が存在していることが確認された。
【００５２】
【表３】
2007319052.tif 000004
【００５３】
実施例４  （本発明評価方法（その２）：ＡＬＳａ遺伝子選択的ダイレクトシーケンス又はＡＬＳｂ遺伝子選択的なダイレクトシーケンス）
系統ＤのゲノムＤＮＡを鋳型とし、且つ、プライマー１２及びプライマー８のプライマーセット或いはプライマー１３及びプライマー８のプライマーセットを用いて、ＡＬＳ遺伝子の両者の各々を由来とするＤＮＡ断片を別々に増幅するためのＰＣＲを行った。当該ＰＣＲにより増幅された各々のＤＮＡ断片をＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（ＵＳＢ社製）を用いて精製した後、当該精製物について、プライマー５がシーケンシングプライマーとして用いられるダイレクトシーケンスを実施した。尚、ダイレクトシーケンスを実施する際には、ＢｉgＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ及びＤＮＡシークエンサー３１００(Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)を用いた。
解読した領域（図１〜３に示されたＡＬＳ遺伝子の塩基配列における第１３２１番目の塩基から第１５５０番目の塩基までの領域）の塩基配列は、プライマー１２及びプライマー８のプライマーセットとして用いられるＰＣＲの場合には、Ｐｒｏ１９７部位を除き、図１〜３に示されたＡＬＳａ遺伝子の塩基配列と完全一致していることが判明した。一方、プライマー１３及びプライマー８のプライマーセットとして用いられるＰＣＲの場合には、Ｐｒｏ１９７部位を除き、図１〜３に示されたＡＬＳｂ遺伝子の塩基配列と完全一致していることが判明した。
以上より、ＡＬＳ遺伝子の両者の各々に由来するＤＮＡ断片が混在して存在するゲノムＤＮＡの試料であっても、プライマー１２及びプライマー８のプライマーセットとして用いられるＰＣＲの場合には、ＡＬＳａ遺伝子を選択的にダイレクトシーケンスすることができ、またプライマー１３及びプライマー８のプライマーセットとして用いられるＰＣＲの場合には、ＡＬＳｂ遺伝子を選択的にダイレクトシーケンスすることができることが確認された。
尚、上記の試験により確認された、Ｄ系統の２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子の両者におけるＰｒｏ１９７部位の塩基配列と当該塩基配列がコードするアミノ酸とを表４に示した。
系統ＤのＡＬＳａ遺伝子におけるＰｒｏ１９７部位には、Ｐ１９７Ｌという置換突然変異が存在していることが実施例３と同様に確認された。
【００５４】
【表４】
2007319052.tif 000005
【００５５】
実施例５  （本発明評価方法（その３）：ＡＬＳａ遺伝子及びＡＬＳｂ遺伝子の両者を一括で増幅するＰＣＲ−ＲＦＬＰ）
系統Ａ、系統Ｂ、系統Ｃ、系統Ｄ、系統Ｅ又は系統ＧのゲノムＤＮＡを鋳型とし且つプライマー５及びプライマー７のプライマーセットを用いて、ＡＬＳ遺伝子の両者を由来とするＤＮＡ断片を増幅するためのＰＣＲを行った。当該ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離し、２つのＤＮＡ断片バンド（約３００塩基対付近及び約２６０塩基対付近）を得た。
因みに、理論的な計算結果に基づけば、上記プライマーセットにより挟まれた塩基配列からなる領域（図１〜３に示されたＡＬＳ遺伝子の塩基配列における第１１５１番目の塩基から第１４５０番目の塩基までの領域に相当する。）が増幅されたとすると、ＡＬＳａ遺伝子に由来するＤＮＡ断片は３００塩基対となり、またＡＬＳｂ遺伝子に由来するＤＮＡ断片は２５８塩基対となる。
上記のように得られた泳動結果と理論的な計算結果とが略一致することから、ＡＬＳ遺伝子の両者の各々に由来するＤＮＡ断片が混在する試料であっても、プライマー５及びプライマー７のプライマーセットとして用いられるＰＣＲの場合には、当該ＰＣＲにより増幅されるＤＮＡ断片は長さの異なる２つのＤＮＡ断片となることができることが確認された。
次に、前記の各々の系統に由来するＤＮＡ断片を、制限酵素ＢｓｐＬＩ（フェルメンタス社製：認識配列はＧＧＮ｜ＮＣＣ）を用いて消化した後、消化されたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動に供した。その結果、系統Ａに由来するＤＮＡ断片の場合には、前記の双方（３００塩基対及び２５８塩基対）のバンドが消滅した。また系統Ｂに由来するＤＮＡ断片の場合には、３００塩基対のバンドが残存し且つ２５８塩基対のバンドが消滅した。また系統Ｃに由来するＤＮＡ断片の場合には、３００塩基対のバンドが消滅し且つ２５８塩基対のバンドが残存した。また系統Ｄに由来する３００塩基対のバンドが残存し且つ２５８塩基対のバンドが消滅した。また系統Ｅに由来するＤＮＡ断片の場合には、３００塩基対のバンドが残存し且つ２５８塩基対のバンドが消滅した。また系統Ｇに由来するＤＮＡ断片の場合には、３００塩基対のバンドが消滅し且つ２５８塩基対のバンドが残存した。
以上より、供試された全ての系統において、ＢｓｐＬＩ（フェルメンタス社製：認識配列はＧＧＮ｜ＮＣＣ）が制限酵素として用いられる場合には、Ｐｒｏ１９７部位がＰ１９７ＸであるＤＮＡ断片は切断されず、Ｐｒｏ１９７部位がＰ１９７Ｘでない（プロリンでである）ＤＮＡ断片は切断された。よって、Ｐｒｏ１９７部位での制限酵素による切断の可否を検定することにより、ＡＬＳ遺伝子の両者の各々におけるＰｒｏ１９７Ｘの存在を検出でき、その結果として、アセト乳酸合成酵素のドメインＡにおける第７番目のアミノ酸をコードする塩基配列を解析することが可能であった。
【００５６】
実施例６  （本発明評価方法（その４）：ＡＬＳａ遺伝子又はＡＬＳｂ遺伝子のいずれか一方を選択的に増幅するＰＣＲ−ＲＦＬＰ）
系統Ｂ又は系統ＧのゲノムＤＮＡを鋳型とし且つプライマー９及びプライマー７のプライマーセット、及び、プライマー１１及びプライマー７のプライマーセットを用いて、ＡＬＳ遺伝子のいずれか一方を由来とするＤＮＡ断片を増幅するためのＰＣＲを行った。当該ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離し、１つのＤＮＡ断片バンド（２００数十塩基対付近）を得た。
次に、前記の各々の系統に由来するＤＮＡ断片を、制限酵素ＢｓｐＬＩ（フェルメンタス社製：認識配列はＧＧＮ｜ＮＣＣ）を用いて消化した後、消化されたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動に供した。その結果、
（１）プライマー９及びプライマー７のプライマーセットを用いて増幅されたＤＮＡ断片の場合には、系統Ｂに由来するＤＮＡ断片のバンドは残存した。また系統Ｇに由来するＤＮＡ断片のバンドは消滅した。また、
（２）プライマー１１及びプライマー７のプライマーセットを用いて増幅されたＤＮＡ断片の場合には、系統Ｂに由来するＤＮＡ断片のバンドは消滅した。また系統Ｇに由来するＤＮＡ断片のバンドは残存した。
以上より、プライマー９とプライマー１１とは、各々がプライマー７を相手に、ＡＬＳａ遺伝子又はＡＬＳｂ遺伝子のいずれか一方を選択的に増幅することが可能であり、このようにして増幅されたＤＮＡ断片をＢｓｐＬＩ（フェルメンタス社製：認識配列はＧＧＮ｜ＮＣＣ）で消化することにより、Ｐｒｏ１９７部位での制限酵素による切断の可否を検定することが可能となり、ＡＬＳ遺伝子の両者の各々におけるＰｒｏ１９７Ｘの存在を検出できる。その結果として、アセト乳酸合成酵素のドメインＡにおける第７番目のアミノ酸をコードする塩基配列を解析することが可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明により、イヌホタルイ由来の２種類のアセト乳酸合成酵素遺伝子においてＰ１９７Ｘをより簡便に検出する方法の一つとなり得るような、イヌホタルイにおけるスルホニルウレア系除草剤抵抗性能力の評価方法等を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１は、ＡＬＳａ遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列とＡＬＳｂ遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列とを、両者の相同性に基づき、ＤＮＡ配列解析ソフトウエアＤＮＡＳＩＳ（日立ソフト社製）を用いて整列化（アラインメント）することにより、両者の塩基配列を比較解析した結果を示す図であり、第１番目の塩基から第１１４０番目の塩基までの領域からなる塩基配列を対象にした図である。尚、これ以降の塩基配列については、順次、図２及び図３に示されている。  図中の「StrainG ALSa」で示される行に記載される塩基配列は、ＡＬＳａ遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列に相当し、且つ、「StrainG ALSb」で示される行に記載される塩基配列は、ＡＬＳｂ遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列に相当する。また図中に記載されるハイフン「−」は、一方のＡＬＳ遺伝子における特定の塩基について、もう一方のＡＬＳ遺伝子において相当する特定の塩基が存在しないことを意味している。  図中の大きな枠（図１〜２に跨る枠）は、アセト乳酸合成酵素におけるドメインＡの第５番目のアミノ酸をコードする塩基配列と第６番目のアミノ酸をコードする塩基配列との間に存在するイントロン領域を示している。また図中の小さな枠（前記の大きな枠に近接して存在する（図２中の）枠）は、アセト乳酸合成酵素遺伝子においてＰｒｏ１９７部位をコードする領域を示している。
【図２】図２は、図１の続きの図であり、第１１４１番目の塩基から第２２２０番目の塩基までの領域からなる塩基配列を対象にした図である。
【図３】図３は、図２の続きの図であり、第２２２１番目の塩基から第２６６１番目の塩基までの領域からなる塩基配列を対象にした図である。
【図４】図４は、ＡＬＳａ遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列とＡＬＳｂ遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列とを、両者の相同性に基づき、ＤＮＡ配列解析ソフトウエアＤＮＡＳＩＳ（日立ソフト社製）を用いて整列化（アラインメント）することにより、両者の塩基配列を比較解析した結果を示す図である。尚、図４に示されたＡＬＳａ遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列又はＡＬＳｂ遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列は、図１〜３に示されたＡＬＳａ遺伝子又はＡＬＳｂ遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列が解析されたゲノムＤＮＡを提供する個体とは別個体から調製されたＡＬＳａ遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列又はＡＬＳｂ遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列である。  図中の仕切り記号は、アセト乳酸合成酵素におけるドメインＡの第５番目のアミノ酸をコードする塩基配列と第６番目のアミノ酸をコードする塩基配列との間に存在するイントロン領域が挿入される位置を示している。また図中の小さな枠は、アセト乳酸合成酵素遺伝子においてＰｒｏ１９７部位をコードする領域を示している。
【００５９】
［配列表フリーテキスト］
配列番号５
ＰＣＲのために設計されたプライマー
配列番号６
ＰＣＲのために設計されたプライマー
配列番号７
ＰＣＲのために設計されたプライマー
配列番号８
ＰＣＲのために設計されたプライマー
配列番号９
ＰＣＲのために設計されたプライマー
配列番号１０
ＰＣＲのために設計されたプライマー
配列番号１１
ＰＣＲのために設計されたプライマー
配列番号１２
ＰＣＲのために設計されたプライマー
配列番号１３
ＰＣＲのために設計されたプライマー
配列番号１４
ＰＣＲのために設計されたプライマー
配列番号１５
ＰＣＲのために設計されたプライマー
配列番号１６
ＰＣＲのために設計されたプライマー
配列番号１７
ＰＣＲのために設計されたプライマー
配列番号１８
ＰＣＲのために設計されたプライマー
配列番号１９
ＰＣＲのために設計されたプライマー
配列番号２０
ＰＣＲのために設計されたプライマー
【図１】
2007319052.tif 000006
【図２】
2007319052.tif 000007
【図３】
2007319052.tif 000008
【図４】
2007319052.tif 000009
【配列表】
2007319052000001.app