(57)【要約】      （修正有）【課題】ジアホラーゼの活性やその耐熱性の程度が所定レベル以上の変異型タンパク質を提供する。【解決手段】特定の天然型アミノ酸配列において、少なくとも一つ以上のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、酵素活性値２４５以上のジアホラーゼ活性を有する変異型タンパク質、さらには、酵素活性値２４５以上であって、かつ、加熱処理後の残存酵素活性率が４１％以上のジアホラーゼ活性を有する耐熱性変異型タンパク質。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の天然型アミノ酸配列において、少なくとも一つ以上のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、
酵素活性値２４５以上のジアホラーゼ活性を有する変異型タンパク質。
【請求項２】
加熱処理後の残存酵素活性率が２７％以上であることを特徴とする請求項１記載の変異型タンパク質。
【請求項３】
加熱処理後の前記残存酵素活性率が４１％以上であることを特徴とする請求項２記載の変異型タンパク質。
【請求項４】
配列番号１の天然型アミノ酸配列において、少なくとも一つ以上のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、
酵素活性値１７０以上のジアホラーゼ活性を有し、かつ、加熱処理後の前記残存酵素活性率が４１％以上である変異型タンパク質。
【請求項５】
好熱性バチルス属細菌由来のジアホラーゼ活性を有するタンパク質の変異型である請求項１記載の変異型タンパク質。
【請求項６】
追加
好熱性バチルス属細菌由来のジアホラーゼ活性を有するタンパク質の変異型である請求項４記載の変異型タンパク質。
【請求項７】
バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来のジアホラーゼ活性を有するタンパク質の変異型である請求項５記載の変異型タンパク質。
【請求項８】
バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来のジアホラーゼ活性を有するタンパク質の変異型である請求項６記載の変異型タンパク質。
【請求項９】
配列番号２のアミノ酸配列を有する請求項３記載の変異型タンパク質。
【請求項１０】
配列番号３のアミノ酸配列を有する請求項３記載の変異型タンパク質。
【請求項１１】
配列番号４のアミノ酸配列を有する請求項２記載の変異型タンパク質。
【請求項１２】
配列番号５のアミノ酸配列を有する請求項２記載の変異型タンパク質。
【請求項１３】
配列番号６のアミノ酸配列を有する請求項１記載の変異型タンパク質。
【請求項１４】
配列番号７のアミノ酸配列を有する請求項１記載の変異型タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジアホラーゼ活性を有する変異型タンパク質に関する。より詳しくは、酵素活性、さらには耐熱性の程度が所定レベル以上のジアホラーゼ活性を有する変異型タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素は、生命の維持に係わる多くの反応を生体内の温和な条件下で円滑に進める生体内触媒である。この酵素は、生体内で代謝回転し、生体内で必要に応じて生産されて、その触媒機能を発揮する。
【０００３】
現在、この酵素を生体外で利用する技術が、既に実用化されたり、あるいは実用化に向けた検討が行われたりしている。例えば、有用物質の生産、エネルギー関連物質の生産、測定又は分析、環境保全、医療などの様々な技術分野において、酵素の利用技術が進展している。比較的近年では、燃料電池の一種である酵素電池（例えば、特許文献１参照）、酵素電極、酵素センサー（酵素反応を利用して化学物質を計測するセンサー）などの技術も提案されている。
【０００４】
この酵素の化学的本体はタンパク質であるので、酵素は、熱やｐＨの程度によって変性する性質を有する。このため、酵素は、金属触媒などの他の化学的触媒に比べて生体外での安定性が低い。従って、酵素を生体外で利用する場合は、環境の変化に対して酵素をより安定的に働かせて、その活性を持続させるようにすることが重要である。
【０００５】
酵素を生体外で利用する場合、酵素自体の性質や機能を人工的に改変させる方法や酵素の働く場所の環境を工夫する方法などのアプローチが採用されることになる。前者の方法では、タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を人工的に変化させ、この変化させた遺伝子を大腸菌等の生物の中で発現させることによって人工的に変異したタンパク質を作製し、そして、利用目的にあった機能や性質を備える変異型タンパク質を選別（スクリーニング）することが一般的に行われている（例えば、特許文献２参照）。
【特許文献１】特開２００４−７１５５９号公報。
【特許文献２】特開２００４−２９８１８５号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ジアホラーゼの生体外での広範な利用可能性を視野に入れ、ジアホラーゼの活性やその耐熱性の程度が所定レベル以上の変異型タンパク質を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明では、配列番号１の天然型アミノ酸配列（アミノ酸残基数２１１）おいて、少なくとも一つ以上のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、酵素活性値２４５以上のジアホラーゼ活性を有する変異型タンパク質を提供し、さらには、酵素活性値２４５以上であって、かつ、加熱処理後の残存酵素活性率２７％以上、さらに好適には、加熱処理後の残存酵素活性率４１％以上のジアホラーゼ活性を有する変異型タンパク質を提供する。
【０００８】
また、配列番号１の天然型アミノ酸配列において、少なくとも一つ以上のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、酵素活性値１７０以上のジアホラーゼ活性を有し、かつ、加熱処理後の前記残存酵素活性率が４１％以上である変異型タンパク質を提供する。
【０００９】
これらの変異型タンパク質は、例えば、好熱性バチルス属細菌、特にバチルスステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来のジアホラーゼ活性を有するタンパク質の変異型タンパク質であり、より具体的には、配列番号２〜７のアミノ酸配列を有する変異型タンパク質を挙げることができる。
【００１０】
なお、配列番号２のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１３９番位置のリシン（Lysine）がアスパラギン（Asparagine）に置換されているとともに、Ｎ末端から１８７番位置のアラニン(Alanine)がグルタミン酸(Glutamic asid)に置換されている（以下、略記号Ｋ１３９Ｎ／Ａ１８７Ｅ）。配列番号３のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１０５番目位置のフェニルアラニン(Phenylalanine)がロイシン(Luecine)に置換されている（以下、略記号Ｆ１０５Ｌ）。配列番号４のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１２２番位置のグリシン（Glycine）がアスパラギン酸（Aspartic acid）に置換されている（以下、略記号Ｇ１２２Ｄ）。配列番号５のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１３１番位置のグリシン（Glycine）がグルタミン酸（Glutamic asid ）に置換されている（以下、略記号Ｇ１３１Ｅ）。配列番号６のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１４６番位置のアラニン（Alanine）がグリシン（Glycine）に置換されている（以下、略記号Ａ１４６Ｇ）。配列番号７のアミノ酸配列は、配列番号１の天然型アミノ酸配列のＮ末端から１４７番位置のアルギニン（Arginine）がヒスチジン（Histidine）に置換されている（以下、略記号Ｒ１４７Ｈ）。
【００１１】
ここで、本発明に関連する主たる技術用語について説明する。
【００１２】
「ジアホラーゼ（Diaphorase）」は、NADH又はNADPHをフェリシアン化カリウム、メチレンブルー、2,6-ジクロルインドフェノール、テトラゾリウム塩等の色素で酸化する反応を触媒する活性（即ち、ジアホラーゼ活性）を持つ酵素であり、細菌、酵母等の微生物から哺乳類動物まで広く分布する。このジアホラーゼは、生体内の電子伝達系において重要な役割を果たし、このジアホラーゼによって、NAD+又はNADP+依存性の脱水素酵素類による基質からの脱水素反応により生成されるNADH又はNADPHは、電子受容体で酸化され、電子受容体は還元型となる。
【００１３】
「変異型タンパク質」とは、タンパク質を構成するアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基の並び順を人工的に変えることにより得られた遺伝子から発現させたタンパク質である。
【００１４】
「酵素活性値」とは、一般には、ある定まった条件におけるある反応の触媒反応速度のことを意味する。本発明においては、Nicotinamide dinucleotide, reduced form (NADH)による2-amino-1,4-naphthoquinone(ANQ)の還元反応により、Nicotinamide dinucleotide, oxidized form (NAD+)及び2-amino-1,4-dihidroxynaphtheneを生じる反応の触媒反応速度であり、具体的には、25℃、アルゴン雰囲気下ないしは窒素雰囲気下、0.1 M リン酸カリウム緩衝液中、0.3 mM ANQ、40 mM NADH存在下において単位時間当たり1 molの酵素が触媒する反応によって生じる生成物のmol数（したがって単位はsec-1）である。なお、酵素活性値２４５以上は、バチルスステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来のジアホラーゼ活性を有する天然型タンパク質の約１．５倍以上に相当する。
【００１５】
「加熱処理後の残存酵素活性率（residual activity）」は、「酵素活性残存率」、あるいは「酵素活性維持率」と称してもよく、酵素に対して所定の加熱処理を施したときに、その前後で活性がどのように変化するかを表した値である。すなわち、加熱処理の前後において、同一条件で酵素活性測定を行い、加熱処理後の活性値が処理前に比べてどれだけ存在するかを百分率で表した値である。本発明においては、前記「加熱処理」は、緩衝液中８０℃での１０分間静置処理であり、この加熱処理前後における、前記酵素活性値の比を百分率で表している。なお、加熱処理後の残存酵素活性率４１％以上は、バチルスステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来のジアホラーゼ活性を有する天然型タンパク質の約１．５倍以上に相当する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明に係る変異型タンパク質は、ジアホラーゼの活性又はその耐熱性、あるいはその両方の程度が所定レベル以上である。
【実施例】
【００１７】
（実施例１）。
バチルスステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来のジアホラーゼ（Diaphorase）のクローニングと発現及び精製。
【００１８】
（１-１）Bacillus stearothermophilusからゲノムDNAの単離・精製。
Bacillus stearothermophilusは、理化学研究所微生物系統保存施設（ＪＣＭ）から分譲を受けた（JCM No.2501,NCBIのdiaphorase geneのaccession number:AF112858）。Bacillus stearothermophilusの凍結乾燥体を寒天培地Ａ上、55℃で一晩培養した。
【００１９】
このようにして得られたコロニーを新しい寒天培地Ａ上にて同様に培養して、清浄なコロニーとして、ここから一部を取り出して液体培地Ａ中55℃で一晩培養した。遠心分離により集菌し、Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega社)を使用して、ゲノムDNAを単離した(方法の詳細は製品添付の取扱説明書)。なお、培地Ａの組成は次の「表１」のとおり(１Ｌ中、pH 7.0-7.2に調整)。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
（１-２）ジアホラーゼ（Diaphorase）遺伝子のクローニング。
前記（１-１）で得られたゲノムDNAからPCRによりジアホラーゼ遺伝子をクローニングした。DNA polymeraseにはPfu DNA polymerase (Stratagene社)を使用し、プライマーとしては、は以下の「表２」の配列のものを使用した。
【００２２】
【表２】
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【００２３】
次に、ＰＣＲ産物のジアホラーゼ遺伝子をPCR Cleanup Kit（Qiagen社）を使って精製し、アガロース電気泳動により確認した。また、ＤＮＡシーケンサーにより塩基配列の確認を行った。
【００２４】
（１-３）ジアホラーゼ遺伝子のベクターへの導入。
ジアホラーゼ遺伝子のクローニングした断片をBamH IとNde Iにより処理し、PCR Cleanup Kit（Qiagen社）を使って精製した。また、ベクターpET12a (Novagen社)をBamH IとNde Iにより処理し、同様に精製した。これら２種類の断片をT4 ligaseによりligationし、産物によってXL1-blue electrocompetent cell (Stratagene社)を形質転換してLB-amp培地で培養を行い、増産した。
【００２５】
得られたプラスミドをBss Iで処理し、アガロース電気泳動でジアホラーゼ遺伝子の挿入を確認し、塩基配列を測定・解析した。すると、データベース(ＮＣＢＩ)の塩基配列との間に若干の際があった。これは、理化学研究所の微生物系統保存施設より取得した株とデータベースの株に若干の違いがあったために、クローニングしたDIとデータベースのDIの遺伝子配列に不一致があったためと思われる。遺伝型（塩基配列）については１１箇所、そのうち表現型（アミノ酸配列）において２残基にて不一致があった（表３参照）。
【００２６】
【表３】
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【００２７】
そこで、この２箇所のアミノ酸残基をデータベースのもの同様に修正した遺伝子を、Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene社)を使って作成した。なお、この遺伝子を「pET12a-BsDI」と命名した。
【００２８】
（１-４）大腸菌の形質転換。
前記pET12a-BsDIをE. coli BL21 (DE3) (Novagen社)にヒートショック法により導入、形質転換を行った。SOC中で１hr、37℃で前培養後、LB-amp寒天培地に展開、コロニーの一部を液体培養し、ジアホラーゼの発現をSDS-pageで確認した。
【００２９】
（１-５）形質転換体の凍結保存サンプル。
前記（１-４）で得られた形質転換体培養液３ｍＬを遠心分離し、大腸菌ペレットに2XYT培地を加えて分散させて-80℃で保存した。
【００３０】
（１-６）大量培養とタンパク質精製。
BL21 (DE3)/pET12a-BsDIの凍結サンプルから、LB-amp agar培地に展開し、コロニーをピックアップして100mL LB-ampでOD600が１程度になるまで前培養し、これを18 LのLB-ampに展開して、37℃でOD600が２程度で飽和するまでしんとう培養した。この培養液から菌体を遠心分離(5 kG)により回収した（ウェットで収量20 g）。菌体ペレットを-80℃で凍結した後溶解し、0℃で200mLの50mM Tris-HCl, pH 7.8, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF溶液中で超音波処理して溶菌し、遠心分離(9.5 kG)により溶液画分を回収した。
【００３１】
次に、硫安沈殿法による精製を行った。35%飽和溶液になるまで撹拌しながら徐々に粉状の硫酸アンモニウムを添加し、一晩静置した。沈殿物を遠心分離(9.5 kG)により取り除き、透析膜チューブを使って脱塩処理した（最終溶液：5 mM Tris-HCl, pH 7.8）。限外濾過法で濃縮したサンプル50 mLを陰イオン交換カラム(Sepharose Q FastFlow, Amersham Bioscience)にかけ、diaphorase含有画分を回収して限外濾過法で濃縮した(溶液量20 mL、Centriplus 遠心式フィルターユニット YM-30、Millipore)。次いで、このサンプルをゲル濾過カラム(Sephacryl S-200, Amersham Bioscience)にかけ、diaphorase含有画分を集めた。
【００３２】
（実施例２）。
Bacillus stearothermophilus由来のジアホラーゼのランダムミューテーションによる変異体ライブラリーの作成と耐熱性変異体のスクリーニング。
【００３３】
まず、本実施例２で行った実験の流れを図１に示す。Error-prone PCRによるdiaphoraseミュータントの遺伝子ライブラリー作成を行い、この遺伝子をベクターDNAに導入して大腸菌中で発現させた。このライブラリーを耐熱性スクリーニングにかけ、目的とする耐熱性diaphorase変異体を抽出した。
【００３４】
（２-１）GeneMorph（登録商標）によるError-Prone PCR。
「Error-prone PCR法」とは、PCRによるDNA断片複製反応の際に、DNA polymeraseが塩基配列の読み間違いを起こすことを利用して、複製されたDNA断片に変異をランダムに起こす方法である。種々の方法が報告されているが、ここでは製品化されているものの中から、Stratagene社のGeneMorph（登録商標）を選択した。Template DNAは、Bacillus stearothermophilusのジアホラーゼ遺伝子を組み込んだ上記pET12a-BsDIを用いた。プライマーもこの遺伝子のクローニングに用いたものを使用した。
【００３５】
プライマーの配列は、以下の「表４」に示すとおりであり、codingの5’端にNde I配列を、complementaryの5’端にBamH I配列をそれぞれ有している(下線部)ため、error-prone PCR産物をこれら制限酵素処理によりpET12aのマルチクローニングサイトに挿入することができる(天然型ジアホラーゼのクローニングと同様)。
【００３６】
【表４】
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【００３７】
GeneMorph（登録商標）のマニュアルにしたがって、以下の「表５」に示すような反応液の調製、温調サイクルに基づいてPCRを行った。
【００３８】
【表５】
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【００３９】
【表６】
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【００４０】
（２-２）ベクターへのジアホラーゼ遺伝子の導入。
Error-prone PCR産物はアガロースゲル電気泳動に用いた分以外全量をNde IとBamH Iによる制限酵素処理に用いた。37℃で2時間反応を行ったのち、反応生成物をQiaquick PCR purification Kit（Qiagen社）により精製した。一方、ベクターはpET12aをPCR産物同様、Nde IとBamH Iによる制限酵素処理した（37℃で2時間）。
【００４１】
これら制限酵素処理反応産物を低融点アガロースゲル電気泳動により分離し、対応する開環状態のベクターDNAをQiaquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。次いで、精製したベクターの制限酵素処理産物をアルカリフォスファターゼで処理することにより、5’末端を脱リン酸化した。反応生成物をQiaquick PCR purification Kit（Qiagen社）により精製した。このようにして得られたerror-prone PCR産物（即ち、ジアホラーゼ変異体遺伝子ライブラリー）を制限酵素・脱リン酸化処理されたベクターにライゲーションした。ライゲーション反応はLigation Kit Mighty Mix(タカラバイオ社)を使用した。反応生成物は、エタノール沈殿法により精製した。
【００４２】
（２-３）Competent Cellの作成と形質転換。
Competent Cellは自前で調製したBL21(DE3)のelectrocompetent cell (competency 〜108/ng)を用いた。40 μLのcompetent cell凍結サンプルを氷上にて融解し、1 μg/μL程度の濃度のDNAサンプルを0.5μL混合し、0.1 cmギャップのelelctroporation cuvetteに全量をセットし、1800 kVの電圧を印加することにより形質転換した。これに960μLのSOC培地を加え、１時間37℃でしんとうして前培養を行い、この培養液を5〜50 μL LB-amp寒天培地へ植菌し、37℃で一晩インキュベーションを行った。
【００４３】
（２-４）スクリーニング方法。
前記（２-３）で得られた寒天培地上のシングルコロニーをそれぞれ96ウェルプレートのLB-amp液体培地（150 μL）に爪楊枝を使って植菌した。２ウェルを、野生型を産生する大腸菌株に当てた。ウェルプレート上面をガスパーマブル粘着シート(ABgene)でシールし、さらに付属のふたをして37℃で一晩（〜14時間）しんとう培養を行った。この培養液25μLずつを新しいウェルプレートで同量の0.2N NaOH aq(あらかじめ分注)とピペッティングによりよく混合した後プレートにふたをし、37℃で15分インキュベーション（インキュベーター）することにより溶菌した。
【００４４】
次に室温で100 μLの0.1 M K-pi, pH 6.8を加え、液を中和した。このとき非加熱のコントロールサンプルとして野生型のサンプル２つのうち１つをマイクロチューブに取り分けて室温でとりおいた。プレートを市販のOPPテープでシールし、80℃で75分加熱処理を行い（恒温器）、室温に静置して冷まして取り分けておいた野生型のサンプルをプレートに戻した。各サンプルに10μLの20mM anthraquinone sulfonic acid(AQS) 20% DMSO溶液、直前に調製した80 mM NADH水溶液を50 μLを順次加え、プレートをOPPテープでシールしてvortex mixerで5秒攪拌した。顕色する様子をカメラで記録し、野生型サンプルと比較して前記AQSの還元による発色が強いものを耐熱性候補として選択した。
【００４５】
（２-５）サンプル保存。
スクリーニングをくぐり抜けた検体については、96ウェルプレートに残っている培養液の一部を4.5mLのLB培地に植菌して１晩培養しプラスミドを精製し冷凍庫で保存した。また、別途4mLのLB培地に植菌してO.D.600が0.4程度にまで培養し、遠心分離により集菌し、2 mLの2xYT培地に懸濁させて液体窒素により凍結して-80℃で保存した。
【００４６】
（２-６）ジアホラーゼ変異体の大量発現と精製。
ジアホラーゼ変異体の大量発現と精製は以前に報告した方法により行った。ただし、大量発現におけるE.coliの培養は1 L LB-ampで行い、培養スケールに合わせて、その後の精製の各段階における容積等を調整した。
【００４７】
（２-７）活性評価試験。
ジアホラーゼ変異体の活性評価を以下の条件で行った。反応溶液は100mM K-pi, pH 8.0で、[ANQ] = 0.3 mM、[NADH] = 40 mM、[diaphorase] = 48 nMである。測定前にアルゴンバブリングにより十分除酸素を行い、反応はアルゴン雰囲気で行った。ジアホラーゼの添加により反応を開始し、反応進行を520ｎｍにおけるANQの吸光度(モル吸光係数680M-1cm-1)の減少によりモニターし、反応速度を算出した。
【００４８】
（２-８）耐熱性試験。
精製したジアホラーゼ変異体サンプルの5 0mM Tris-HCl, pH 7.8, 300 mM NaCl溶液を限外濾過法による濃縮／バッファー交換を行って、0.1 M K-pi, pH 8.0溶液とした。この溶液を適宜薄めてジアホラーゼの460 nm の吸光度が0.1となるように調製した(酵素濃度8.3μMの溶液となる)。この溶液をアルミブロックヒーター等で、80℃・10分インキュベートし、すぐに氷上で冷却し、十分冷ましてから活性測定を行った。また、前記インキュベーションを行わなかったサンプルで対照実験を行った。
【００４９】
（２−９）結果。
総計約8000コロニーを上記の方法にそってスクリーニングにかけた。結果43検体が陽性として抽出された。実際例としてウェルプレートの写真の一部を図２に示す。なお、図２には、スクリーニングにおける活性を維持しているジアホラーゼの検出例が示されており、矢印(Ａ、Ａ)がこのプレートで検出された耐熱性変異体候補の検体、対照実験として矢印(Ｂ)が野生型検体、矢印(Ｃ)が加熱処理を行っていない野生型検体をそれぞれ示している。
【００５０】
プレート間の誤差、株間のジアホラーゼ発現量の違いなど、可能性のある誤差を考慮して、選択された検体を一度にまとめて再スクリーニングを行った。即ち、凍結保存した大腸菌サンプルをLB寒天培地上に画線培養し、得られたコロニーを96ウェルプレートに植菌して同様に加熱実験を行った。但し、誤差を極力小さくするために、一つの検体につき、８つのコロニーを取り上げスクリーニングにかけた。
【００５１】
このダブルチェック実験の結果の写真の一部を図３に示す。この図３は、縦列に同一の変異体サンプルを配置し、参照として、列番号１１及び２４の上４ウェルが熱処理後の野生型、列番号１２及び２４の下４ウェルが熱処理を加えていない野生型サンプルである。この図３に示す写真の例では、列番号７、１４、１７、１９、２０、２１を陽性として、耐熱性変異体候補として選出した。
【００５２】
このようにして再現性を確保した１４サンプルを抽出された耐熱性ジアホラーゼ変異体候補とした。これら１４変異体の遺伝子配列を解析すると、添付した図４（図面代用表）に示すとおりの結果になった。１４のサンプルのうち３つが同じ変異体G149Dと重複しており、また一つのサンプルについては野生型であった。従って最終的に抽出された耐熱性変異体候補は１０個になった。
【００５３】
上で得た耐熱性ジアホラーゼ変異体候補について耐熱性試験を行った結果を図５（図面代用グラフ）に示す。なお、図５においては、耐熱性ジアホラーゼ変異体候補の熱処理前後の活性（反応速度、左）および熱処理による残存酵素活性率（右）、グラフ中の点線はそれぞれの値における野生型の値を示している。図５中の「Amano」は、天野エンザイム製のジアホラーゼであり、ＷＴと同じ配列のものである。
【００５４】
その結果、変異型タンパク質の加熱処理後の酵素残存活性率は、Ｆ１０５Ｌ(47.7%)、Ｋ１３９Ｎ／Ａ１８７Ｅ(53.3%)が野生型（ＷＴ）よりも特に優れており、Ｇ１３１Ｅ（28.1％）、Ｇ１２２Ｄ（２７．７％）は野生型（ＷＴ、２５．３％）よりもやや優れていた（図５参照）。その他は野生型と同等かそれ以下であった。従って、スクリーニングでは、耐熱性の向上した変異体だけでなく、残存酵素活性率がそれほど向上しなくても通常の活性が向上した変異体も選択されていたことがわかる。しかしながら、これら多くの変異体において活性の向上が確認され、特に、Ｋ１３９Ｎ／Ａ１８７Ｅは野生型の２倍以上の活性を示した。いずれにしても、本実験系では、目的とする耐熱性の向上したジアホラーゼ変異体を得ることに成功した。よって、今回用いたerror-prone PCRによるランダムミューテーションで生じさせた変異体ライブラリーの作成と熱処理によるスクリーニングのための方法が実際に有効であるということが確認できた。
【００５５】
（実施例３）。
ジアホラーゼ耐熱性変異体に関する詳細な検討。
【００５６】
（３-１）。上記実施例によって得られた変異体のうち、野生型に比べて耐熱性が特に向上した変異型タンパク質Ｋ１３９Ｎ／Ａ１８７Ｅに関する熱耐性について、さらに詳細な検討を行った。図６には、熱処理の温度をさまざまに変化させたときの残存酵素活性率を測定してプロットしたグラフを示した。
【００５７】
この図６（図面代用グラフ）に示されているように、温度７０℃で酵素活性が落ち始めるが、変異型タンパク質Ｋ１３９Ｎ／Ａ１８７Ｅは、７５〜８５℃の温度領域において天然型タンパク質の残存酵素活性率の１．５倍以上（の耐熱性）を維持できることがわかった。
【００５８】
（３-２）。上記の研究によって得られた変異体のうち、野生型に比べて酵素活性が向上したＧ１２２ＤとＫ１３９Ｎ／Ａ１８７Ｅを代表例として、さらに酵素反応速度論な検討を行った。
【００５９】
まず、図７（図面代用グラフ）には、NADH 40mM という条件においてANQの濃度をさまざまに変化させたときの酵素反応速度をプロットした。この図７から、変異型タンパク質であるＧ１２２ＤとＫ１３９Ｎ／Ａ１８７Ｅは、野生型（天然型）と同様にANQ濃度依存性を示し、これらの変異型タンパク質は、野生型（天然型）と比較して基質ANQに対するより大きな親和性を獲得していることがわかる。
【００６０】
また、図８（図面代用グラフ）には、ANQ 2.2 mMという条件においてNADHの濃度をさまざまに変化させたときの酵素反応速度をプロットした。変異型タンパク質Ｇ１２２Ｄは、野生型（天然型）と同様のANQ濃度依存性カーブを描き、変異型タンパク質Ｋ１３９Ｎ／Ａ１８７Ｅは、野生型（天然型）と比較して基質NADHに対する親和性はむしろ低下している。
【００６１】
酵素反応は、いずれもMichaelis-Mentenの式によく一致し、kcatおよびKM(NADH)、KM(ANQ)を求めた。比較として野生型（天然型）ジアホラーゼ（ＤＩ（ＤＨ“Ａｍａｎｏ”３）のkcatおよびKM(NADH)、KM(ANQ)をあわせて示す。ジアホラーゼは、いわゆるping-pong型の反応形式をとる。ここで、kcatは触媒反応の単位時間当たりのターンオーバー数、KM(NADH)、KM(ANQ)はそれぞれの基質に対するMichaelis定数であり、酵素のそれぞれの基質に対する活性部位への基質の結合のし易さを反映するファクターである。以上をまとめると、添付した図９（図面代用表）のようになる。
【００６２】
この結果から、これら変異体のミディエーターANQの結合部位が野生型（天然型）に比べてより結合し易い性質を有することがわかり（図９のANQ関連表参照）、一方、NADHの結合サイトに関しては野生型（天然型）と比較して特に変化がないか、むしろ低下していると考えられる（図９のNADH関連表参照）。したがって、これら変異体（変異型タンパク質）に置けるより高い触媒能は、基質ANQに対する親和性の獲得によるものと予測できる。
【００６３】
このことは、高濃度におけるより高い触媒活性を示さないが、低濃度において優位性を示すことを意味しており、例えば、酵素電池においてミディエーターANQの濃度をおさえることができるというメリットにつながると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明に係るジアホラーゼ活性を有する変異型タンパク質は、例えば、NADHあるいはNADPHのアッセイキット、NADHあるいはNADPHのセンサー、NADHあるいはNADPHの測定方法、酵素を固定化して電極に用いた燃料電池、キノン類などの色素の還元反応触媒などの分野において利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】実施例２に係わる実験の流れ（ランダムミューテーションによるライブラリー作成とスクリーニング）を示す模式図である。
【図２】総計約8000コロニーをスクリーニングにかけたときのウェルプレートの写真（図面代用写真）の一部である。
【図３】ダブルチェック実験の結果のウェルプレート写真の一部である。
【図４】耐熱性ジアホラーゼ変異体候補である１４変異体の遺伝子配列を解析した結果を示す図面代用表である。
【図５】耐熱性ジアホラーゼ変異体候補（変異型タンパク質）について耐熱性試験を行った結果を示す図面代用グラフである。
【図６】野生型に比べて耐熱性の向上した変異型タンパク質Ｋ１３９Ｎ／Ａ１８７Ｅに関する熱耐性に関し、加熱処理の温度をさまざまに変化させたときの残存酵素活性率を測定してプロットしたグラフである。
【図７】NADH 40mM という条件においてANQの濃度をさまざまに変化させたときの酵素反応速度をプロットした図面代用グラフである。
【図８】ANQ 2.2 mMという条件においてNADHの濃度をさまざまに変化させたときの酵素反応速度をプロットした図面代用グラフである。
【図９】野生型と、変異型の代表例であるＧ１２２Ｄ及びＫ１３９Ｎ／Ａ１８７Ｅのジアホラーゼ酵素のそれぞれの基質に対する活性部位への基質の結合のしやすさを反映するファクターをまとめた図面代用表である。
【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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