(57)【要約】【課題】本発明は、生体内に埋め込み可能であり、血管組織に類似した構造を有し、かつ弾性率、弾性回復率に優れた血管再生材料を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、（ｉ）同心円状の内層、中間層および外層からなり、外径が０．５〜５０ｍｍで、厚みが２００〜５，０００μｍの中空の円筒状であり、各層は、平均繊維径が０．０５〜１０μｍの脂肪族ポリエステルの繊維からなり、内層を構成する脂肪族ポリエステルは、ポリ乳酸（ＰＬＡ）と、５０〜９０モル％の乳酸由来の繰り返し単位および１０〜５０モル％のカプロラクトン由来の繰り返し単位からなる共重合体（ＰＬＣＡ）とを含有し、前者の含有量が４０〜１００重量％で、後者の含有量が０〜６０重量％である血管再生材料である。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
同心円状の内層、中間層および外層からなる中空の円筒状であり、各層は、平均繊維径が０．０５〜１０μｍの脂肪族ポリエステルの繊維からなり、内層を構成する脂肪族ポリエステルは、ポリ乳酸（ＰＬＡ）と、５０〜９０モル％の乳酸由来の繰り返し単位および１０〜５０モル％のカプロラクトン由来の繰り返し単位からなる共重合体（ＰＬＣＡ）とを含有し、前者の含有量が４０〜１００重量％で、後者の含有量が０〜６０重量％である血管再生材料。
【請求項２】
外層、中間層またはこれらの双方を構成する脂肪族ポリエステルは、乳酸、グリコール酸およびカプロラクトンからなる群より選ばれる少なくとも１種のモノマーの重合体である請求項１記載の血管再生材料。
【請求項３】
各層は、脂肪族ポリエステル繊維が円筒の軸を中心として、渦巻き状に巻き付けられたものである請求項１記載の血管再生材料。
【請求項４】
内層、中間層および外層の厚みがそれぞれ３０〜５００μｍである請求項１記載の血管再生材料。
【請求項５】
外層の、差圧１２５Ｐａにおける厚み１００μｍ換算した空気透過率が３０ｃｍ３／ｃｍ２・ｓ以上である請求項１記載の血管再生材料。
【請求項６】
引張弾性率が、０．１〜１０ＭＰａ、弾性回復率が７０〜１００％である請求項１記載の血管再生材料。
【請求項７】
さらに、血管細胞、血管前駆細胞および骨髄由来細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞を含有する請求項１記載の血管再生材料。
【請求項８】
血管細胞が、血管内皮細胞、平滑筋細胞および線維芽細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項７記載の血管再生材料。
【請求項９】
内層に含有された細胞の総数を１００％としたとき、少なくとも５０％の細胞が、内層表面から３０μｍまでに存在する請求項７記載の血管再生材料。
【請求項１０】
同心円状の内層、中間層および外層からなる中空の円筒状であり、各層は、平均繊維径が０．０５〜１０μｍの脂肪族ポリエステルの繊維からなる血管再生材料を製造する方法であって、
(i) ポリ乳酸（ＰＬＡ）と、５０〜９０モル％の乳酸由来の繰り返し単位および１０〜５０モル％のカプロラクトン由来の繰り返し単位からなる共重合体（ＰＬＣＡ）とを含有し、前者の含有量が４０〜１００重量％で、後者の含有量が０〜６０重量％である脂肪族ポリエステルおよび揮発性溶媒を含有するドープを静電紡糸法にて紡糸し、得られた繊維をコレクタ上に巻き取り内層を形成する工程、
(ii) 脂肪族ポリエステルおよび揮発性溶媒を含有するドープを静電紡糸法にて紡糸し、得られた繊維を内層上に巻き取り中間層を形成する工程、並びに
(iii) 脂肪族ポリエステルおよび揮発性溶媒を含有するドープを静電紡糸法にて紡糸し、得られた繊維を中間層上に巻き取り外層を形成する工程、
を含む血管再生材料の製造方法。
【請求項１１】
外層を形成した後、血管細胞、血管前駆細胞および骨髄由来細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種類の細胞を播種する工程を含む請求項１０記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管再生材料およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、大きく損傷したり失われた生体組織の治療法として、細胞の分化、増殖能を利用し元の生体組織を再構築する再生医療の研究が活発になってきている。血管再生もその１つであり、先天的もしくは病気によるダメージを受けた血管を切除し、欠損部に再生の足場となる材料あるいは足場材料に細胞を含有させた複合材料を架橋し、血管を再生する研究が行われている。
実際の血管組織は血管内面を被覆している内皮細胞を含む内膜、平滑筋細胞からなる中膜、繊維芽細胞からなる外膜の３層から構成されている。内膜は物質の選択的な透過をコントロールするため空間体積の小さい密な構造を有している。また中膜は血管特有の弾性機能を担っている。さらに外膜は血管の外から栄養分を取るため空間体積の大きい疎な構造を有している。血管治療用材料としては、このような血管組織の３層構造を模倣したものが好ましい。
【０００３】
細胞を含有させた複合材料としては、ポリウレタン繊維等からなり血管組織の３層構造を模倣した足場材料に血管内皮細胞および平滑筋細胞を含有させたハイブリッド人工血管が提案されている（特許文献１）。しかし再生医療においては、生分解性材料であることが好ましい。
生分解性材料を用いた足場材料としては、生分解性材料からなる発泡体を生分解性材料からなる補強材によって強化した心血管系組織培養用基材が提案されている（特許文献２）。しかし、このような基材は発泡体であることから実際の血管組織とは構造が大きく相違する。また、生分解性材料からなる織編物およびコラーゲンを構成成分とする足場材料が提案されている（非特許文献１）。しかし、織編物を構成する繊維は繊維径が大きいため比表面積が小さく、高い細胞接着性を得ることは困難であると考えられる。
細胞接着性を向上させた材料として、数ナノメートルから数十マイクロメートルの外径を有するコラーゲン、ポリウレタンなどの医療用高分子の繊維を用いて作製された不織布を含む足場材料が提案されている（特許文献３）。しかし、合成生分解性ポリマーを使用した例は開示されていない。コラーゲン等の動物由来製品は未知のウイルスを有している危険性があるため、生体内に埋め込んで使用する血管治療用材料は、合成生分解性ポリマーからなるものが好ましい。
【特許文献１】特開２００３−２４３５１号公報
【特許文献２】特開２００１−０７８７５０号公報
【特許文献３】特開２００４−３２１４８４号公報
【非特許文献１】Ann Thorac Surg. 2005 Nov;80(5):1821-7
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、従来のかかる問題を解決し、生体内に埋め込み可能であり、血管組織に類似した構造を有し、かつ弾性率、弾性回復率に優れた血管再生材料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、血管組織に類似した内層、中間層および外層からなる３層構造を有し、かつ同程度の機械的強度を有する血管再生材料について検討した。その結果、内層にポリ乳酸（ＰＬＡ）と、５０〜９０モル％の乳酸由来の繰り返し単位および１０〜５０モル％のカプロラクトン由来の繰り返し単位からなる共重合体（ＰＬＣＡ）とを含有し、前者の含有量が４０〜１００重量％で、後者の含有量が０〜６０重量％であるの脂肪族ポリエステルの繊維を用いると、細胞浸潤性を適度に抑制することが出来、表面付近に細胞が局在し、血管内腔に類似の内皮細胞構造を構築できることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
即ち本発明は、同心円状の内層、中間層および外層からなる中空の円筒状であり、各層は、平均繊維径が０．０５〜１０μｍの脂肪族ポリエステルの繊維からなり、内層を構成する脂肪族ポリエステルは、ポリ乳酸（ＰＬＡ）と、５０〜９０モル％の乳酸由来の繰り返し単位および１０〜５０モル％のカプロラクトン由来の繰り返し単位からなる共重合体（ＰＬＣＡ）とを含有し、前者の含有量が４０〜１００重量％で、後者の含有量が０〜６０重量％である血管再生材料である。該血管再生材料は、細胞を含有することが好ましい。
【０００７】
また本発明は、同心円状の内層、中間層および外層からなる中空の円筒状であり、各層は、平均繊維径が０．０５〜１０μｍの脂肪族ポリエステルの繊維からなる血管再生材料を製造する方法であって、
(i) ポリ乳酸（ＰＬＡ）と、５０〜９０モル％の乳酸由来の繰り返し単位および１０〜５０モル％のカプロラクトン由来の繰り返し単位からなる共重合体（ＰＬＣＡ）とを含有し、前者の含有量が４０〜１００重量％で、後者の含有量が０〜６０重量％である脂肪族ポリエステルおよび揮発性溶媒を含有するドープを静電紡糸法にて紡糸し、得られた繊維をコレクタ上に巻き取り内層を形成する工程、
(ii) 脂肪族ポリエステルおよび揮発性溶媒を含有するドープを静電紡糸法にて紡糸し、得られた繊維を内層上に巻き取り中間層を形成する工程、並びに
(iii) 脂肪族ポリエステルおよび揮発性溶媒を含有するドープを静電紡糸法にて紡糸し、得られた繊維を中間層上に巻き取り外層を形成する工程、
を含む血管再生材料の製造方法である。該方法は、さらに細胞を播種する工程を含むことが好ましい。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の血管再生材料は、３層からなり、血管組織に類似した構造を有する。また本発明の血管再生材料は、弾性率、弾性回復率に優れ、血管組織と同程度の弾性率、弾性回復率を有する。よって、本発明の血管再生材料は血管再生用の足場材料に好適である。
また本発明の血管再生材料は、空気透過率の高い外層を有し、空間体積が大きい外膜を有する血管組織の構造に類似している。そのため該血管再生材料は、細胞の浸潤性に優れ血管組織の再生に適している。
また本発明の血管再生材料は、細胞浸潤性の低い内層を有するので、内層に播種した細胞は、血管組織の内皮細胞に類似した密な薄い層に覆われた構造を有する。従って本発明の血管再生材料は再生医療における血管治療用材料として好適である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明について詳述する。
＜血管再生材料＞
本発明の血管再生材料は、同心円状の内層、中間層および外層の３層からなる。各層の厚みは、好ましくは３０〜５００μｍであり、より好ましくは５０〜２５０μｍである。各層は、脂肪族ポリエステル繊維が血管再生材料の軸を中心として、渦巻き状に巻き付けられたものが好ましい。
血管再生材料を構成する脂肪族ポリエステル繊維の平均繊維径は、０．０５〜１０μｍ、好ましくは０．２〜１０μｍである。平均繊維径が、０．０５μｍよりも小さいと血管再生材料の強度が保てないため好ましくない。また平均繊維径が１０μｍを超えると繊維の比表面積が小さく生着する細胞数が少なくなるため好ましくない。平均繊維径は、光学顕微鏡による画像から２０箇所の繊維径の測定値の平均である。
本発明の血管再生材料の断面の一例を図２に示す。図２は説明のための略図であり、本発明の血管再生材料の外面、内面には不規則な凹凸が存在する。本発明の血管再生材料は外径（１１）が、０．５〜５０ｍｍ、好ましくは１〜３０ｍｍである。外径はマイクロメーターにより１０箇所測定を行い、測定値の最小値と最大値の範囲で表す。血管再生材料の内部は中空であり、中空部の内径（１５）は、好ましくは０．１〜４５ｍｍ、より好ましくは０．５〜２５ｍｍである。内径は、測定された外径の値と厚みの値との差である。
【００１０】
本発明の血管再生材料は、厚み（１４）が２００〜５，０００μｍ、好ましくは２００〜２，０００μｍである。厚みが２００μｍより薄いと機械強度が低く、血管など負荷の高い組織の再生材料としては好ましくない。厚みは血管再生材料を切り開き、長さ５ｃｍ、幅１ｃｍの試料を調製し、マイクロメーターにより１０箇所測定を行った際の、測定値の最小値と最大値の範囲で表す。
血管再生材料の引張弾性率は、好ましくは０．１〜１０ＭＰａ、より好ましくは０．２〜２．５ＭＰａの範囲である。実際の人体の動脈血管の引張り弾性率は２ＭＰａであるためである（臨床工学ライブラリーシリーズ２，Ｐ５４（秀潤社）、生体物性／医用機械工学  池田研二、嶋津秀照著）。０．１ＭＰａより低いと血液による負荷に耐えられず、破損する場合がある。また引張り弾性率が１０ＭＰａより高いと、移植した際、コンプライアンスミスマッチが起こる場合がある。引張弾性率は、血管再生材料を切り開き、軸方向に５ｃｍ、円周方向に１ｃｍの試料を作製し、軸方向に引張試験を行うことにより求める。
【００１１】
また本発明の血管再生材料の弾性回復率は、７０〜１００％であることが好ましい。７０％未満であると血液による負荷に耐えられず、破損する可能性がある。よって、引張弾性率が０．１〜１０ＭＰａ、弾性回復率が７０〜１００％である血管再生材料が好ましい。弾性回復率は、以下の式により算出した値である。
［Ｌ０−（Ｌ３０−Ｌ０）］／Ｌ０×１００（％）
Ｌ０：血管再生材料の長さ（ｍｍ）
Ｌ３０：血管再生材料の長さに対し１０％変位の引張り処理を３０回行った後の血管再生材料の長さ（ｍｍ）
【００１２】
また血管再生材料は、外層の空気透過率が３０ｃｍ３／ｃｍ２・ｓ以上、好ましくは７０〜２５０ｃｍ３／ｃｍ２・ｓ、より好ましくは７０〜２００ｃｍ３／ｃｍ２・ｓである。外層の空気透過率が３０ｃｍ３／ｃｍ２・ｓ以上であると細胞の浸潤性が高く血管再生用の足場材料として好ましい。外層の空気透過率の上限は実質２５０ｃｍ３／ｃｍ２・ｓである。外層の空気透過率は、差圧１２５Ｐａ、厚み１００μｍに換算した空気透過量で表され、ＪＩＳ−Ｌ１０９６、ＪＩＳ−Ｒ３４２０に従い測定した値である。
血管再生材料は、軸方向に連続する山部（９）および谷部（１０）を有する蛇腹状の血管再生材料であり、山部の間隔（１２）が２ｍｍ以下であり、谷部の深さ（１３）が０．１〜１０ｍｍであることが好ましい。蛇腹状の血管再生材料の断面略図を図３に示す。山部の間隔（１２）が２ｍｍより長いと血管再生材料の伸縮性が十分でない。山部、および谷部の間隔は、光学顕微鏡により１０箇所測定を行い、測定値の最大値と最小値との範囲で表す。図３は説明のための略図である。血管再生材料の蛇腹部の構造は規則的であっても不規則であっても良い。製法によっては血管再生材料の蛇腹部の構造は不規則であり、山部の高さ、谷部の深さ、およびこれらの間隔は一定ではない。
【００１３】
血管再生材料の各層を構成する脂肪族ポリエステルの組成により、細胞浸潤性を制御することが可能である。例えば、グリコール酸由来の繰り返し単位を含有する重合体では細胞との親和性が高く細胞浸潤性が高まる。一方、乳酸単独の重合体では細胞が表面に接着するものの、血管再生材料内部への細胞の浸潤性は低くなる。従って、高い細胞生着が求められる外層ではグリコール酸由来の繰り返し単位を含有するものが好ましく、内層では一層の内皮細胞層を形成することが望まれるため、乳酸由来の繰り返し単位を含有するものが好ましい。従って、内層、中間層、外層の脂肪族ポリエステルは以下のものが好ましい。
【００１４】
血管の内膜は、一層の内皮細胞層に覆われた密な構造を有し、物質の選択的な透過をコントロールしている。よって、血管再生材料の内層は、血管組織と同様に一層の内皮細胞層に覆われた構造を有することが好ましい。血管再生材料の最内層にグリコール酸由来の繰り返し単位が含まれると、細胞浸潤性が高まるため一層の内皮細胞構造が構築され難く好ましくない。
そのため、内層を構成する脂肪族ポリエステルは、ポリ乳酸（ＰＬＡ）と、５０〜９０モル％の乳酸由来の繰り返し単位および１０〜５０モル％のカプロラクトン由来の繰り返し単位からなる共重合体（ＰＬＣＡ）とを含有し、前者の含有量が４０〜１００重量％で、後者の含有量が０〜６０重量％である。ＰＬＣＡは、６０〜９０モル％の乳酸由来の繰り返し単位および１０〜４０モル％のカプロラクトン由来の繰り返し単位からなることが好ましい。ＰＬＡとＰＬＣＡとは、前者の含有量が５０〜９０重量％で、後者の含有量が１０〜５０重量％であることが好ましい。
【００１５】
中間層を構成する脂肪族ポリエステルは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、トリメチレンカーボネート、ポリブチレンサクシネート、ポリエチレンサクシネートおよびこれらを構成するモノマーの共重合体などであることが好ましい。これらのうち、乳酸、グリコール酸およびカプロラクトンからなる群より選ばれる少なくとも一種のモノマーの重合体であることが好ましい。血管の中膜は、弾性機能を担っている。そのため血管再生材料の中間層は、弾性を有する５０〜９０モル％の乳酸と１０〜５０モル％のカプロラクトンとの共重合体（ＰＬＣＡ）であることが特に好ましい。
【００１６】
外層を構成する脂肪族ポリエステルは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、ポリトリメチレンカーボネート、ポリブチレンサクシネート、ポリエチレンサクシネートおよびこれらを構成するモノマーの共重合体などであることが好ましい。これらのうち、乳酸、グリコール酸およびカプロラクトンからなる群より選ばれる少なくとも一種のモノマーの重合体であることが好ましい。
【００１７】
血管の外膜は、血管の外から栄養分を取るため疎な構造を有し、高い空気透過率を有し、胞浸潤性に優れている。よって、血管再生材料の外層は、細胞の生着性を向上させるため、グリコール酸由来の繰り返し単位を含むことが好ましい。グリコール酸由来の繰り返し単位を含む共重合体としては、乳酸とグリコール酸との共重合体（ＰＬＧＡ）が挙げられる。該共重合体は、好ましくは２０〜８０モル％、より好ましくは４０〜８０モル％の乳酸由来の繰り返し単位および好ましくは２０〜８０モル％、より好ましくは２０〜６０モル％のグリコール酸由来の繰り返し単位からなる。外層には、乳酸とカプロラクトンとの共重合体を含有していてもよい。該共重合体は、５０〜９０モル％の乳酸由来の繰り返し単位および１０〜５０モル％のカプロラクトン由来の繰り返し単位からなることが好ましい。
また外層は、乳酸とグリコール酸との共重合体、および乳酸とカプロラクトンとの共重合体からなる組成物であることが好ましい。組成物中の前者の含有量は好ましくは５０〜９０重量％、後者の含有量は好ましくは１０〜５０重量％である。前者は、２０〜８０モル％の乳酸由来の繰り返し単位および２０〜８０モル％のグリコール酸由来の繰り返し単位からなることが好ましい。後者は、５０〜９０モル％の乳酸由来の繰り返し単位および１０〜５０モル％のカプロラクトン由来の繰り返し単位からなることが好ましい。
【００１８】
本発明の血管再生材料には、脂肪族ポリエステル中に他の成分をさらに含有しても良い。該成分としては、リン脂質類、糖質類、糖脂質類、ステロイド類、ポリアミノ酸類、タンパク質類、およびポリオキシアルキレン類からなる群から選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。具体的な第２成分としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロールなどのリン脂質類および／またはポリガラクチュロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン、デキストラン硫酸、硫酸化セルロース、アルギン酸、デキストラン、カルボキシメチルキチン、ガラクトマンナン、アラビアガム、トラガントガム、ジェランガム、硫酸化ジェラン、カラヤガム、カラギーナン、寒天、キサンタンガム、カードラン、プルラン、セルロース、デンプン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、グルコマンナン、キチン、キトサン、キシログルカン、レンチナンなどの糖質類および／またはガラクトセレブロシド、グルコセレブロシド、グロボシド、ラクトシルセラミド、トリヘキソシルセラミド、パラグロボシド、ガラクトシルジアシルグリセロール、スルホキノボシルジアシルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、グリコシルポリプレノールリン酸などの糖脂質類および／またはコレステロール、コール酸、サポゲニン、ジギトキシンなどのステロイド類および／またはポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ポリリジンなどのポリアミノ酸類および／またはコラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、フィブリン、ラミニン、カゼイン、ケラチン、セリシン、トロンビンなどのタンパク質類および／またはポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンエーテルなどのポリオキシアルキレン類、ＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）、ＴＧＦ−β（β型形質転換増殖因子）、ＮＧＦ（神経増殖因子）、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、ＢＭＰ（骨形成因子）などの細胞増殖因子などが挙げられる。
【００１９】
細胞は、血管細胞、血管前駆細胞および骨髄由来細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。血管細胞は、血管内皮細胞、平滑筋細胞および線維芽細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。細胞の継代数は、好ましくは５以下である。継代数が５を越えた細胞は脱分化が進んでいる可能性があるため好ましくない。
細胞は、繊維表面に付着し、血管再生材料中に包含される。播種密度は、好ましくは１０４〜１０７個／ｃｍ２、より好ましくは１０５〜１０６個／ｃｍ２である。本発明の血管再生材料は、内層に含有された細胞の総数を１００％としたとき、少なくとも５０％の細胞が、内層表面から３０μｍまでに存在することが好ましい。
【００２０】
＜血管再生材料の製造＞
本発明の血管再生材料は、(i) ポリ乳酸（ＰＬＡ）と、５０〜９０モル％の乳酸由来の繰り返し単位および１０〜５０モル％のカプロラクトン由来の繰り返し単位からなる共重合体（ＰＬＣＡ）とを含有し、前者の含有量が４０〜１００重量％で、後者の含有量が０〜６０重量％である脂肪族ポリエステルおよび揮発性溶媒を含有するドープを静電紡糸法にて紡糸し、得られた繊維をコレクタ上に巻き取り内層を形成する工程、
(ii) 脂肪族ポリエステルおよび揮発性溶媒を含有するドープを静電紡糸法にて紡糸し、得られた繊維を内層上に巻き取り中間層を形成する工程、並びに
(iii) 脂肪族ポリエステルおよび揮発性溶媒を含有するドープを静電紡糸法にて紡糸し、得られた繊維を中間層上に巻き取り外層を形成する工程、
により製造することができる。
【００２１】
工程(i)は、脂肪族ポリエステルおよび揮発性溶媒を含有するドープを静電紡糸法にて紡糸し、得られた繊維をコレクタ上に巻き取り内層を形成する工程である。
【００２２】
脂肪族ポリエステルは血管再生材料の項で説明した通りである。揮発性溶媒は、脂肪族ポリエステルを溶解し、常圧で沸点が２００℃以下であり、室温で液体である物質である。具体的には、塩化メチレン、クロロホルム、アセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、トルエン、テトラヒドロフラン、１，１，３，３−ヘキサフルオロイソプロパノール、水、１，４−ジオキサン、四塩化炭素、シクロヘキサン、シクロヘキサノン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトニトリルなどが挙げられる。これらのうち、脂肪族ポリエステルの溶解性等から、塩化メチレン、クロロホルム、アセトンが特に好ましい。これらの溶媒は単独で用いても良く、複数の溶媒を組み合わせても良い。また本発明においては、本目的を損なわない範囲で他の溶媒を併用しても良い。
【００２３】
ドープ中の脂肪族ポリエステルの濃度は、好ましくは１〜３０重量％、より好ましくは２〜２０重量％である。脂肪族ポリエステルの濃度が１重量％より低いと、濃度が低すぎるため繊維を形成することが困難となり好ましくない。また、３０重量％より高いと得られる繊維の繊維径が大きくなり好ましくない。
【００２４】
静電紡糸法とは、脂肪族ポリエステルおよび揮発性溶媒を含有するドープを電極間で形成された静電場中に吐出し、ドープを電極に向けて曵糸することにより、繊維状物質をコレクタに巻き付け、血管再生材料を製造する方法である。繊維状物質とは既に溶液の溶媒が留去され、繊維状物質となっている状態のみならず、いまだ溶液の溶媒を含んでいる状態も含む。
静電紡糸法は、例えば図１に示す装置を用いて行うことができる。図１は、ノズル（１）を有する保持槽（３）中に吐出側電極（４）を挿入した装置である。この装置はさらに捕集側電極（５）、高電圧発生器（６）、コレクタ（７）および静電除去器（８）を有する。吐出側電極（４）と捕集側電極（５）との間には、高電圧発生器（６）により所定の電圧が付与される。図１に示す装置において、ドープ（２）を保持槽（３）に充填し、ノズル（１）を通じて静電場中に吐出させ、電界によって曳糸して繊維化させ、コレクタ（７）に集めることにより血管再生材料を得ることができる。静電気除去器（８）を用いることにより外層の空気透過率を高めることができる。
【００２５】
電極は、吐出側電極（４）と捕集側電極（５）とからなる。これらの電極は、金属、無機物または有機物のいかなるものでも導電性を示しさえすれば良い。また、絶縁物上に導電性を示す金属、無機物または有機物の薄膜を持つものであっても良い。静電場は一対または複数の電極間で形成されており、いずれの電極に高電圧を印加しても良い。これは例えば電圧値が異なる高電圧の電極が２つ（例えば１５ｋVと１０ｋV）と、アースにつながった電極の合計３つの電極を用いる場合も含み、または３本を超える数の電極を使う場合も含む。
ドープをコレクタ（７）に向けて曳糸する間に、条件に応じて溶媒が蒸発して繊維状物質が形成される。通常の室温であればコレクタ（７）に捕集されるまでの間に溶媒は完全に蒸発するが、もし溶媒蒸発が不十分な場合は減圧条件下で曳糸しても良い。
コレクタ（７）として鏡面仕上げされていない心棒を用いると、血管再生材料を簡便に製造することが出来る。静電紡糸法により心棒上に血管再生材料を形成する際、心棒を円周方向に回転させることが好ましい。コレクタ（７）を回転させることにより、均質な厚さの円筒体を形成することができる。回転の速度は好ましくは１〜１，０００ｒｐｍ、より好ましくは５〜２００ｒｐｍである。
電極間の距離は、帯電量、ノズル寸法、ドープ吐出量、ドープ濃度等に依存するが、１０ｋＶ程度のときには５〜２０ｃｍの距離が適当である。また、印加される静電気電位は、好ましくは３〜１００ｋＶ、より好ましくは５〜５０ｋＶ、さらに好ましくは５〜３０ｋＶである。
ドープをノズルから静電場中に供給する場合、数個のノズルを用いて繊維状物質の生産速度を上げることもできる。ノズルの内径は好ましくは０．１〜５ｍｍ、より好ましくは０．１〜２ｍｍである。曳糸する温度は溶媒の蒸発挙動や紡糸液の粘度に依存するが、通常は、０〜５０℃である。
【００２６】
工程(ii)は、工程（ｉ）で形成された内層の上に、工程（ｉ）と相違する脂肪族ポリエステルを積層する以外は、工程（ｉ）と同じである。工程(iii)は、工程(ii)で形成された中間層の上に、工程(ii)と相違する脂肪族ポリエステルを積層する以外は、工程(ii)と同じである。
外層を形成した後、血管細胞、血管前駆細胞および骨髄由来細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種類の細胞を播種することが好ましい。播種密度は、好ましくは１０４〜１０７個／ｃｍ２、より好ましくは１０５〜１０６個／ｃｍ２である。細胞の播種は、細胞を含有する培養液中で、血管再生材料を回転させることにより行うことができる。
【００２７】
（蛇腹構造）
本発明によれば、血管再生材料を伸長させることにより弾性回復率を損なわずに蛇腹構造を有する血管再生材料を得ることができる。伸長率としては５０〜３００％が好ましい。ここで５０％伸長とは、１０ｃｍのものを１５ｃｍに伸長させることをいう。十分な弾性回復率を有する血管再生材料を得るために５０％以上伸長させることが好ましい。また３００％を超えて伸長させると血管再生材料自体が破断する場合がある。心棒から血管再生材料を取り外し、血管再生材料の両端を固定し伸長させることで、山部の間隔が２ｍｍ以下であり谷部の深さが０．１〜１０ｍｍの蛇腹構造を有する血管再生材料を得ることができる。蛇腹構造を有する血管再生材料の断面略図を図３に示す。
コレクタ（７）から血管再生材料を取り外すとき、血管再生材料の一端のみに応力をかけ蛇腹構造を得ることができる。即ち、血管再生材料の一端を固定しておき、コレクタ（７）をその固定端の方向に引き抜くことで、一端のみに応力をかけ、蛇腹構造を得ることができる。山部の間隔および谷部の深さは、例えば、デジタルマイクロスコープ(株式会社KEYENCE、VHX DIGITAL MICROSCOPE)により、それぞれ図３の（１２）および（１３）で示す長さを１０箇所程度測定し、範囲を求めることができる。
【実施例】
【００２８】
以下の実施例により本発明を具体的に説明する。しかし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（１）実施例に使用した材料は以下の通りである。
【００２９】
(i)ＰＬＧＡ（５０／５０、ＩＶ＝０．６）：乳酸（５０モル％）−グリコール酸（５０モル％）共重合体、固有粘度（以下ＩＶ）＝０．６ｄＬ／ｇ（ＨＦＩＰ中、３０℃）、Birmingham Polymers社製、
(ii)ＰＬＧＡ（５０／５０、ＩＶ＝１．０８）：乳酸（５０モル％）−グリコール酸（５０モル％）共重合体、ＩＶ＝１．０８ｄＬ／ｇ（ＨＦＩＰ中、３０℃）、Absorbable Polymers International社製、
(iii)ＰＬＡ：乳酸重合体、島津製作所（株）製、
(iv)ＰＬＣＡ（７７／２３）：乳酸（７７モル％）−カプロラクトン（２３モル％）共重合体、Ｍｗ＝２．５×１０５、多木化学（株）製、
(v)塩化メチレン、エタノール、マイヤーヘマトキシリン溶液：和光純薬工業（株）製、
(vi)正常ブタ大動脈内皮細胞：APPLICATIONS社製、
(vii)ＦＢＳ（ウシ胎児血清）：HYCLONE社製、
(viii)DMEM、PBS:Invitrogen社製、
(ix)Tissue-Tek OCT compound、エオジン溶液：サクラファインテックジャパン（株）製、
(x)７．５％中性ホルムアルデヒド溶液(pH7.2)：シグマアルドリッチジャパン（株）製、
(xi)AQUATEX:Merck社製
【００３０】
（２）血管再生材料の物性は以下の方法により測定した。
(i)平均繊維径：デジタルマイクロスコープ（株式会社KEYENCE、VHX DIGITAL MICROSCOPE)により２０箇所測定を行い、その平均値を平均繊維径とした。
(ii)外径：マイクロメーター（株式会社ミツトヨ）により１０箇所測定を行い、測定値の最小値と最大値との範囲を外径とした。
(iii)厚み：血管再生材料を切り開き、長さ５ｃｍ、幅１ｃｍの試料を調製し、マイクロメーターにより１０箇所測定を行い、測定値の最小値と最大値との範囲を厚みとした。
(iv)内径：測定された外径の値と厚みの値との差より求めた。
(v)引張弾性率：血管再生材料を切り開き、血管再生材料の軸方向に５ｃｍ、円周方向に１ｃｍの試料を作製し、血管再生材料の軸方向に張力をかけテンシロン（EZ TEST：島津製作所）により引張試験を行った。
(vi)弾性回復率：血管再生材料を切り開き、血管再生材料の軸方向に５ｃｍ、円周方向に１ｃｍの試料を作製し、血管再生材料の軸方向に張力をかけ、Ｌ０およびＬ３０を求め、以下の式により算出した。
［Ｌ０−（Ｌ３０−Ｌ０）］／Ｌ０×１００（％）
Ｌ０：血管再生材料の長さ（ｍｍ）
Ｌ３０：血管再生材料の長さに対し１０％変位の引張り処理を３０回行った後の血管再生材料の長さ（ｍｍ）
【００３１】
(vii)外層の空気透過率：血管再生材料を切り開き外層のみを剥がし、５ｃｍ×５ｃｍになるように形状を整え、フラジール・パーミヤメータ（（株）東洋精機製作所）を用いて、JIS-L1096、JIS-R3420に従い空気透過率（ｃｍ３／ｃｍ２・ｓ）を測定し、厚み１００μｍにおける空気透過率に換算した。
【００３２】
＜参考例１＞（ドープの調製）
（ドープＡの調製）
ＰＬＧＡ（５０／５０、ＩＶ＝０．６）０．８ｇ、ＰＬＣＡ（７７／２３）０．２ｇ、塩化メチレン／エタノール＝８／１（重量部／重量部）９ｇを室温（２５℃）で混合し濃度１０重量％のドープＡを調製した。
（ドープＢの調製）
ＰＬＣＡ（７７／２３）１ｇ、塩化メチレン／エタノール＝８／１（重量部／重量部）９ｇを室温（２５℃）で混合し濃度１０重量％のドープＢを調製した。
（ドープＣの調製）
ＰＬＧＡ（５０／５０、ＩＶ＝１．０８）０．８ｇ、ＰＬＣＡ（７７／２３）０．２ｇ、塩化メチレン／エタノール＝８／１（重量部／重量部）９ｇを室温（２５℃）で混合し濃度１０重量％のドープＣを調製した。
（ドープＤの調製）
ＰＬＡ０．８ｇ、ＰＬＣＡ（７７／２３）０．２ｇ、塩化メチレン／エタノール＝８／１（重量部／重量部）９ｇを室温（２５℃）で混合し濃度１０重量％のドープＤを調製した。
（ドープＥの調製）
ＰＬＡ０．５ｇ、ＰＬＣＡ（７７／２３）０．５ｇ、塩化メチレン／エタノール＝８／１（重量部／重量部）９ｇを室温（２５℃）で混合し濃度１０重量％のドープＥを調製した。表１にドープＡ〜Ｅに含有された脂肪族ポリエステルの組成を示す。
【００３３】
【表１】
2007307132.tif 000003
【００３４】
＜実施例１＞（Ｄ／Ｂ／Ａ）
（血管再生材料の製造）
図１に示す装置を組み立てた。ノズル（１）の内径は０．８ｍｍとした。ノズル（１）から捕集電極（５）までの距離は１０ｃｍに設定した。捕集側電極（５）として、外径４ｍｍ、長さ２０ｃｍのステンレス棒を用いた。ノズル（１）と捕集側電極（５）との間に、コレクタ（７）および静電除去器（８）を設置した。
（内層の形成）
ドープＤを保持槽（３）に入れ、ドープＤを捕集側電極（５）に向けて５分間吐出し、内層を形成した。吐出側電極（４）と捕集側電極（５）との電圧は１４ｋＶに設定した。コレクタ（７）は１００ｒｐｍで回転させながら捕集した。このとき、静電除去器（８）は使用しなかった。内層の厚みは６０〜８０μｍであった。内層を構成する繊維の平均繊維径は６μｍであった。
（中間層の形成）
さらに、ドープＤの代わりにドープＢを保持槽（３）に入れ、５分間吐出し、中間層を形成した。このとき、静電除去器（８）は使用しなかった。中間層の厚みは６０〜８０μｍであった。中間層を構成する繊維の平均繊維径は４μｍであった。
（外層の形成）
次に、ドープＢの代わりにドープＡを保持槽（３）に入れ、５分間吐出し、外層を形成し血管再生材料を得た。このとき、静電除去器（８）を使用した。外層の厚みは６０〜８０μｍであった。外層を構成する繊維の平均繊維径は６μｍであった。得られた血管再生材料は、長さ１０ｃｍ、外径４．４〜４．５ｍｍ、厚み２００〜２４０μｍであった。血管再生材料の引張弾性率は、１．１７ＭＰａ、弾性回復率は９７．３％、空気透過率は１４９cm3/cm2・sであった。
【００３５】
（ヒト臍帯静脈内皮細胞の播種）
得られた円柱状の血管再生材料の内部に一方の端部から細胞懸濁液を注入し、細胞を播種した。細胞懸濁液は、血管再生材料の内径と長さから播種密度が１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２となるように細胞数を調整しておいた。注入は、血管再生材料を垂直にし、下から上に向かって注入することにより行った。上側まで細胞懸濁液面が上がってきた時点で注入を止めた。
注入後、血管再生材料の両端（注入側、反対側）に一方向弁付きの栓を取り付けた後、培地入りの円筒状の培養容器内に固定した。培養容器をウェーブローター（株式会社サーモニクス）に置き３７℃で約３−６回／分で、約４−６時間回転させながら培養を行った。その後、栓は開放し静地で培養を継続した。培養後の担体断面のＨＥ染色像を図４に示す。なお、ＨＥ染色法は実施例３に示す通りである。図４によれば、血管再生材料の内層の中空部側に細胞層が形成されているのが分かる。
【００３６】
＜実施例２＞（Ｅ／Ｂ／Ａ）
内層をドープＥを用いて形成する以外は実施例１と同じ方法で血管再生材料を得た。血管再生材料の物性を表２に示す。その後、実施例１と同じ方法で細胞を播種した。
【００３７】
＜比較例１＞（Ａ／Ｂ／Ａ）
内層をドープＡを用いて形成する以外は実施例１と同じ方法で血管再生材料を得た。血管再生材料の物性を表２に示す。その後、実施例１と同じ方法で細胞を播種した。
【００３８】
＜比較例２＞（Ｃ／Ｂ／Ａ）
内層をドープＣを用いて形成する以外は実施例１と同じ方法で血管再生材料を得た。血管再生材料の物性を表２に示す。その後、実施例１と同じ方法で細胞を播種した。
【００３９】
＜実施例３＞（細胞浸潤性の評価）
実施例１の血管再生材料の細胞浸潤性を以下の方法で評価した。
（血管内皮細胞培養）
実施例１で外層を形成する前の内層（ａ）および中間層（ｂ）からなる血管再生材料をシート状に切り開き、直径１７ｍｍの円形に切り取った。内層上に正常ブタ大動脈内皮細胞を１×１０６個／ｃｍ２の密度で播種し、１０％ＦＢＳを含む培養液（ＤＭＥＭ）を用いて５％ＣＯ２、３７℃の環境下で７日間培養した。
（凍結切片作製）
培養後のシートをＰＢＳを用いて洗浄後、Tissue-Tek OCT compound内に包埋し、液体窒素を用いて凍結した。この試料からクライオスタット（ライカマイクロシステムズ（株）社製、ＣＭ１８００）を用いて厚さ５μｍの凍結縦切片を作製し、スライドグラス(Polyscience社製、Tissue Tack Microscope Slides)に貼り付け、室温で一晩静置することにより自然乾燥させた。
（ＨＥ染色）
上記手順により作製した標本を７．５％中性ホルムアルデヒド溶液に１０分間浸すことにより固定した。水道水で洗浄後、マイヤーヘマトキシリン溶液に５分間浸すことにより核を染色した。水道水に１５分間浸した後、エオジン溶液に３分間浸すことにより細胞質を染色した。水道水で洗浄後、余分な水分を取り除き乾燥後、封入剤ＡＱＵＡＴＥＸを用いてカバーグラス（松浪硝子工業（株）製）内に封入した。
（評価）
染色後の標本を光学顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ（株）製、ＢＸ５１）を用いて観察し、細胞が内層表面に接着している様子および内層内部に浸潤している様子を確認した。その結果、内層（ａ）の無作為に抽出した幅１ｍｍ範囲内に存在する全細胞のうち、６７％の細胞が内層表面（ｃ）から３０μｍまでに分布していた。その顕微鏡写真を図５に示す。
【００４０】
＜実施例４＞（細胞浸潤性の評価）
実施例２の血管再生材料の細胞浸潤性を実施例３と同じ方法で評価した。その結果、内層の（ａ）無作為に抽出した幅１ｍｍ範囲内に存在する全細胞のうち、６８％の細胞が内層表面（ｃ）から３０μｍまでに分布していた。
【００４１】
＜比較例３＞（細胞浸潤性の評価）
比較例１の血管再生材料の細胞浸潤性を実施例３と同じ方法で評価した。その結果、内層（ａ）の無作為に抽出した幅１ｍｍ範囲内に存在する全細胞のうち、３９％の細胞が内層表面（ｃ）から３０μｍまでに分布していた。その顕微鏡写真を図６に示す。
【００４２】
＜比較例４＞（細胞浸潤性の評価）
比較例２の血管再生材料の細胞浸潤性を実施例３と同じ方法で評価した。その結果、内層（ａ）の無作為に抽出した幅１ｍｍ範囲内に存在する全細胞のうち、４１％の細胞が内層表面（ｃ）から３０μｍまでに分布していた。
【００４３】
細胞浸潤性の評価から分かるように、内層（ａ）の組成により細胞浸潤性に差が認められる。即ち、グリコール酸由来の繰り返し単位を含有しない内層（ａ）を有する実施例１および２の血管再生材料は、グリコール酸由来の繰り返し単位を含有する内層（ａ）を有する比較例１および２の血管再生材料に比べ、細胞浸潤性が有意に抑えられ、表面付近に細胞が局在し、血管内腔に類似の内皮細胞構造を構築することができる。
【００４４】
【表２】
2007307132.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明の血管再生材料は血管組織に類似した構造および物理特性を示すため、再生医療における血管治療用材料として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】静電紡糸法で用いる装置の一例である。
【図２】本発明の血管再生材料の断面の説明図である。
【図３】蛇腹状の血管再生材料の断面の説明図である。
【図４】実施例１で得られた血管再生材料にヒト臍帯静脈内皮細胞を播種し培養後のＨＥ染色像である。
【図５】実施例３において細胞浸潤性を評価した顕微鏡写真である。
【図６】比較例３において細胞浸潤性を評価した顕微鏡写真である。
【符号の説明】
【００４７】
１．  ノズル
２．  ドープ
３．  保持槽
４．  吐出側電極
５．  捕集側電極
６．  高電圧発生器
７．  コレクタ
８．  静電除去器
９．  山部
１０．  谷部
１１．  外径
１２．  山部の間隔
１３．  谷部の深さ
１４．  厚み
１５．  内径
ａ．  内層
ｂ．  中間層
ｃ．  内層表面
【図１】
2007307132.tif 000005
【図２】
2007307132.tif 000006
【図３】
2007307132.tif 000007
【図４】
2007307132.tif 000008
【図５】
2007307132.tif 000009
【図６】
2007307132.tif 000010