(57)【要約】      （修正有）【課題】免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する安定なポリペプチドを提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有し、免疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘導するポリペプチド、そのポリペプチドをコードするＤＮＡと、適宜宿主内に当該ポリペプチドをコードするＤＮＡを導入してなる形質転換体を培養する工程と、生成したポリペプチドを培養物から採取する工程を含んでなるポリペプチドの製造方法及び有効成分として当該ポリペプチドを含んでなる感受性疾患剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表における配列番号４に示すアミノ酸配列において少なくともそのN末端から第３８番目、第６８番目、及び第７６番目のシステインがセリン又はアラニンに、又は、配列表における配列番号５に示すアミノ酸配列において少なくともそのN末端から第７番目のシステインがアラニンに置換されたアミノ酸配列を含有し、かつ、免疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘導するポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は新規な生理活性ポリペプチドに関するものであり、詳細には、免疫担当細胞においてインターフェロン−γ（以下、「ＩＦＮ−γ」と略記する。）の産生を誘導する人為的に創製されたポリペプチドに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
本発明者らは、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチド（以下、「野生型ポリペプチド」と言う。）の単離と、その野生型ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのクローニングに成功し、関連する発明を特許文献１、特許文献２及び特許文献３に開示した。この野生型ポリペプチドは、通常、部分アミノ酸配列として配列表における配列番号１乃至３に示すアミノ酸配列を共通して含有し、有用な生理活性蛋白質であるＩＦＮ−γの産生を誘導する性質と、キラー細胞による細胞障害性を増強したり、キラー細胞の生成を誘導する性質を兼備している。上記の生理活性故に、野生型ポリペプチドは、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗腫瘍剤、免疫疾患剤などとして広範な用途が期待されている。
【０００３】
ところが、同じ特許出願人による特許文献３にも記載されているように、天然の細胞は一般に野生型ポリペプチドの産生量が少ないという問題がある。本発明者らが鋭意研究したところ、その原因の一つは、天然の細胞において、野生型ポリペプチドが生理活性を有しない前駆体として存在していることが判明した。本発明者らは、この前駆体が、例えば、インターロイキン−１β変換酵素などの変換酵素を作用させると活性型に変換されることを見出し、特許文献４及び特許文献５に開示した。
【０００４】
天然の細胞において野生型ポリペプチドの産生量が少ない別の原因として、野生型ポリペプチドが不安定である可能性がある。組換えＤＮＡ技術の進歩により、昨今では、生理活性蛋白質を構成するアミノ酸の１個又は２個以上を欠失せしめたり、あるいは、他のアミノ酸で置換する改変ポリペプチドの開発が盛んである。しかしながら、組換えＤＮＡ技術が進歩した今日でも、個々の生理活性蛋白質においては、元の生理活性を実質的に変えることなく安定性を高めるには、依然として試行錯誤を繰返さなければならない状況にある。
【０００５】
【特許文献１】特開平８−２７１８９号公報
【特許文献２】特開平８−１９３０９８号公報
【特許文献３】特開平９−２８９８９６号公報
【特許文献４】特開平１０−８０２７０号公報
【特許文献５】特開平１０−２７１９９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
斯かる状況に鑑み、この発明の第一の課題は、野生型ポリペプチドの生理活性を実質的に変えることなく、安定性を有意に高めたポリペプチドを提供することにある。
【０００７】
さらに、この発明の第二の課題は、斯かるポリペプチドの製造方法を提供することにある。
【０００８】
加えて、この発明の第三の課題は、斯かるポリペプチドの医薬品としての用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者がこれらの課題を解決すべく鋭意研究したところ、部分アミノ酸配列として、配列表における配列番号１乃至３に示すアミノ酸配列を含有する野生型ポリペプチドにおけるシステインの１若しくは複数が他のアミノ酸により置換されたアミノ酸配列、又は、その置換されたアミノ酸配列において、前記置換部位以外の部位で、１若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されたアミノ酸配列を含有するポリペプチドは、野生型ポリペプチドと比較して、安定性が有意に高く、置換する他のアミノ酸の種類によっては、免疫担当細胞におけるＩＦＮ−γ誘導能も有意に高いことが判明した。そして、斯かるポリペプチドは組換えＤＮＡ技術を応用することによって所望量を容易に製造することができ、また、毒性が低いことから、ＩＦＮ−γ誘導剤としてのみならず、医薬品としても極めて有利に用い得ることを確認した。
【００１０】
すなわち、この発明は、前記第一の課題を、部分アミノ酸配列として、配列表における配列番号１乃至３に示すアミノ酸配列を含有するポリペプチドにおいて、そのポリペプチドにおけるシステインの１若しくは複数が他のアミノ酸により置換されたアミノ酸配列、又は、その置換されたアミノ酸配列において、前記置換部位以外の部位で、１若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されたアミノ酸配列を含有し、免疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘導するポリペプチドにより解決するものである。
【００１１】
さらに、この発明は、前記第二の課題を、斯かるポリペプチドをコードするＤＮＡを適宜宿主内に導入してなる形質転換体を培養する工程と、生成したポリペプチドを培養物から採取する工程を含んでなるポリペプチドの製造方法により解決するものである。
【００１２】
加えて、この発明は、前記第三の課題を、有効成分として斯かるポリペプチドを含んでなる感受性疾患剤により解決するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
この発明でいうポリペプチドとは、部分アミノ酸配列として、配列表における配列番号１乃至３に示すアミノ酸配列を含有するポリペプチドにおいて、そのポリペプチドにおけるシステインの１若しくは複数が他のアミノ酸により置換されたアミノ酸配列、又は、その置換されたアミノ酸配列において、前記置換部位以外の部位で、１若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されたアミノ酸配列を含有し、免疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘導する性質を有するすべてのポリペプチドを包含する。システインを置換する他のアミノ酸としては、そのアミノ酸によって置換されたアミノ酸配列を含有するポリペプチドが、部分アミノ酸配列として配列表における配列番号１乃至３に示すアミノ酸配列を含有する野生型ポリペプチドと同様、単独又は適宜補因子の存在下において、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導し且つ野生型ポリペプチドと比較して有意に高い安定性を示すかぎりにおいて、その種類は問わない。システインを置換する他のアミノ酸の具体例としては、例えば、セリン、トレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが挙げられ、このうちで最も望ましいアミノ酸はセリン及びアラニンである。配列表における配列番号１乃至３に示すアミノ酸配列を含有するポリペプチドの具体例としては、例えば、配列表における配列番号４又は５に示すアミノ酸配列を含有する野生型ポリペプチドを挙げることができる。因みに、配列番号４に示すアミノ酸配列は、そのＮ末端から第３８番目、第６８番目、第７６番目及び第１２７番目にシステインを有し、配列番号５に示すアミノ酸配列は、そのＮ末端から第７番目、第７５番目及び第１２５番目にシステインを有している。
【００１４】
この発明のポリペプチドの具体例としては、例えば、配列表における配列番号４に示すアミノ酸配列を含有する野生型ポリペプチドにおけるシステインを他のアミノ酸で置換した配列表における配列番号６乃至１２に示すアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列表における配列番号５に示すアミノ酸配列を含有する野生型ポリペプチドにおけるシステインを他のアミノ酸で置換した配列表における配列番号１３及び１４に示すアミノ酸配列を含有するポリペプチド、さらには、所期の生理活性と安定性が失われない範囲で、それらのアミノ酸配列において、前記特定の置換部位以外の部位で、１若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されたアミノ酸配列を含有するポリペプチドが挙げられる。なお、アミノ酸の付加、欠失若しくは置換に関し、１若しくは複数のアミノ酸とは、部位特定変異誘発法などの公知の手法によって付加、欠失若しくは置換できる程度の数のアミノ酸を意味する。配列番号６乃至１４に示すアミノ酸配列を含有するポリペプチドは、野生型ポリペプチドと比較して、いずれも安定性と生理活性が有意に高い。
【００１５】
この発明のポリペプチドは、通常、組換えＤＮＡ技術を応用して製造される。すなわち、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡを適宜宿主内に導入して形質転換し、得られた形質転換体を培養し、生成した当該ポリペプチドを培養物から採取する。この発明は、組換えＤＮＡ技術を用いる当該ポリペプチドの製造方法を提供するものでもあり、この発明の製造方法によるときには、所望量の当該ポリペプチドを容易に得ることができる。
【００１６】
この発明の製造方法で用いるＤＮＡとしては、それが当該ポリペプチドをコードするかぎり、天然の給源から得られたＤＮＡを人為的に改変したものであっても、化学合成したものであってもよい。前者の方法の具体例としては、例えば、天然の細胞を給源にして、配列表における配列番号４又は５に示すアミノ酸配列をコードする、配列番号２５又は２８に示す塩基配列のＤＮＡを調製し、このＤＮＡに対して、ロバート・エム・ホートンらが『メソッズ・イン・エンザイモロジー』、第２１７巻、２７０乃至２７９頁（１９９３年）に報告している『オーバーラップ・エクステンションＰＣＲ法』を適用し、配列番号４又は５に示すアミノ酸配列におけるシステインに相当するコドンを他のアミノ酸のコドンにより置換した塩基配列のＤＮＡを調製する。斯かるＤＮＡの具体例としては、例えば、配列番号２５に示す塩基配列有におけるコドンが置換された配列番号１５乃至２１に示す塩基配列、配列番号２８におけるコドンが置換された配列番号２２及び２３に示す塩基配列及び、それらの塩基配列に相補的な塩基配列、さらには、その配列表における配列番号１５乃至２３に示す塩基配列及びそれらの塩基配列に相補的な塩基配列において、それらの塩基配列がコードするアミノ酸配列を変更することなく、塩基の１若しくは複数を他の塩基で置換した塩基配列を含んでなるものが挙げられる。後者の方法の具体例としては、例えば、化学合成が挙げられ、配列表における配列番号１５乃至２３に示す塩基配列に基づき、常法にしたがって、前者の方法の場合と同様の塩基配列を含有するＤＮＡを得ることができる。いずれにしても、一旦ＤＮＡが入手されれば、これにＰＣＲ法を適用することによって、所望のレベルに容易に増幅することができる。
【００１７】
ところで、斯界においては、一般に、あるポリペプチドをコードするＤＮＡを宿主中で発現させるに際し、そのＤＮＡの発現効率を改善したり、あるいは、ポリペプチドそのものの生理活性を改善する目的で、ＤＮＡにおける塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置換したり、ＤＮＡに適宜のプロモーターやエンハンサーを連結することがある。この発明のＤＮＡにおいても斯かる変更は当然可能であり、具体的には、最終的に得られるポリペプチドが所期の生理活性と安定性を失わない範囲で、例えば、配列表における配列番号１５乃至２３に示す塩基配列の５´末端及び／又は３´末端に適宜の制限酵素による認識部位、開始コドン、終止コドン、さらには、例えば、配列表における配列番号２４に示すヒトインターフェロン−αにおけるサブタイプα２ｂのシグナルペプチドに代表されるような、適宜のシグナルペプチドをコードする塩基配列を連結し得ることは言うまでもない。
【００１８】
斯かるＤＮＡは微生物及び動植物由来の適宜の宿主、とりわけ、哺乳類由来の宿主細胞に導入すると、安定性と生理活性の高いポリペプチドを発現する。この発明のＤＮＡは、通常、組換えＤＮＡの形態で宿主に導入される。組換えＤＮＡはこの発明のＤＮＡと自律
複製可能なベクターを含んでなり、ＤＮＡさえ入手できれば、通常一般の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製することができる。この発明のＤＮＡを挿入し得るベクターとしては、例えば、ｐｃＤ、ｐｃＤＬ−ＳＲα、ｐＫＹ４、ｐＣＤＭ８、ｐＣＥＶ４、ｐＭＥ１８Ｓなどのプラスミドベクターが挙げられる。自律複製可能なベクターは、通常、プロモーター、エンハンサー、複製起点、転写終結部位、スプライシング配列及び／又は選択配列などの、この発明のＤＮＡが個々の宿主において発現するための適宜塩基配列を含んでなる。なお、プロモーターとして、例えば、熱ショック蛋白質プロモーターや、あるいは、同じ特許出願人が特開平７−１６３３６８号公報に開示したインターフェロン−αプロモーターを用いるときには、形質転換体における当該ＤＮＡの発現を外部刺激により人為的に制御できることとなる。
【００１９】
斯かるベクターにこの発明のＤＮＡを挿入するには、斯界において慣用の方法が用いられる。具体的には、先ず、この発明のＤＮＡを含む遺伝子と自律複製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片を連結する。遺伝子及びベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用する制限酵素、とりわけ、ＡｃｃＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩなどを用いれば、ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するのが容易となる。ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するには、必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られる組換えＤＮＡは、微生物や動物由来の宿主において無限に複製可能である。
【００２０】
斯かる組換えＤＮＡは、適宜宿主内に導入して当該ポリペプチドの製造に用いられる。宿主としては、斯界において慣用される微生物及び動植物由来のものを用いることができるが、ポリペプチドの最終用途が医薬品である場合には、酵母や哺乳類由来の宿主が望ましい。哺乳類由来の宿主細胞の具体例としては、例えば、３Ｔ３細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＯＰ細胞及びそれらの変異株を始めとする、ヒト、サル、マウス及びハムスター由来の上皮系細胞、間質系細胞及び造血系細胞が挙げられる。斯かる宿主にこの発明のＤＮＡを導入するには、例えば、公知のＤＥＡＥ−デキストラン法、燐酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、さらには、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスなどによるウイルス感染法などを用いればよい。形質転換体から当該ポリペプチドを産生するクローンを選択するには、形質転換体を培養培地で培養し、当該ポリペプチドの産生が観察されたクローンを選択すればよい。なお、哺乳類由来の宿主細胞を用いる組換えＤＮＡ技術については、例えば、黒木登志夫、谷口克、押村光雄編集、『実験医学別冊細胞工学ハンドブック』、１９９２年、羊土社発行や横田崇、新井賢一編集、『実験医学別冊バイオマニュアルシリーズ３  遺伝子クローニング実験法』、１９９３年、羊土社発行などにも詳述されている。
【００２１】
斯くして得られる形質転換体は、培養培地で培養すると、宿主内外に当該ポリペプチドを産生する。培養培地として、形質転換体を培養するための慣用の培養培地を用いればよく、斯かる培養培地は、通常、緩衝水を基材とし、これにナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、燐イオン、塩素イオンなどの無機イオンと、宿主の代謝能力に応じた微量元素、炭素源、窒素源、アミノ酸、ビタミンなどを加え、必要に応じて、さらに血清、ホルモン、細胞成長因子、細胞接着因子などを含有せしめて構成される。個々の培養培地としては、例えば、１９９培地、ＤＭＥＭ培地、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ培地、ＭＣＤＢ１０４培地、ＭＣＤＢ１５３培地、ＭＥＭ培地、ＲＤ培地、ＲＩＴＣ８０−７培地、ＲＰＭＩ−１６３０培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＷＡＪＣ４０４培地などが挙げられる。斯かる培養培地に形質転換体を約１×１０４乃至１×１０７個／ｍｌ、望ましくは、約１×１０５乃至１×１０６個／ｍｌ接種し、必要に応じて新鮮な培養培地と取替えながら、温度３７℃前後で１日乃至１週間、望ましくは、２乃至４日間浮遊培養又は単層培養すると、当該ポリペプチドを含む培養物が得られる。形質転換体の種類や培養条件にもよるが、斯くして得られる培養物は、通常、１ｌ当り、当該ポリペプチドを約１μｇ乃至１ｍｇ含む。
【００２２】
このようにして得られた培養物はＩＦＮ−γ誘導剤としてそのまま用いられることもあるが、通常は使用に先立ち、必要に応じて、超音波、細胞溶解酵素及び／又は界面活性剤により菌体又は細胞を破砕した後、濾過、遠心分離などにより当該ポリペプチドを菌体若しくは細胞又はそれらの破砕物から分離し、精製する。精製には菌体若しくは細胞又はそれらの破砕物を除去した培養物に、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、分別沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの生理活性蛋白質を精製するための斯界における慣用の方法が適用され、必要に応じて、これらは適宜組合せて適用される。そして、最終使用形態に応じて、精製ポリペプチドを濃縮・凍結乾燥して液状又は固状にすればよい。なお、同じ特許出願人による特開平８−２３１５９８号公報に開示されたモノクローナル抗体は当該ポリペプチドの精製に極めて有用であり、このモノクローナル抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィーによるときには、高純度の当該ポリペプチドが最少のコストと労力で得られる。
【００２３】
この発明のポリペプチドは、通常、免疫担当細胞を培養してＩＦＮ−γを製造するための培養培地に共存させるか、ＩＦＮ−γ感受性疾患の治療・予防のためにヒトを含む哺乳動物に投与される。すなわち、前者の用途においては、哺乳類の末梢血から分離される白血球や、例えば、ＨＢＬ−３８細胞、Ｍｏ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ８０６６）、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ８１６３）、ＨｕＴ７８細胞（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ１６１）、ＥＬ４細胞（ＡＴＣＣ  ＴＵＢ３９）、Ｌ１２−Ｒ４細胞などの培養株化した免疫担当細胞又はその変異株をこの発明のポリペプチドを１ｍｌ当り約０．１ｎｇ乃至１μｇ、望ましくは、約１乃至１００ｎｇ含む適宜の培養培地に浮遊させる。必要に応じて、培養培地にマイトジェンやインターロイキン２、抗ＣＤ３抗体などのＴ細胞刺激物質を加え、培養培地を適宜新鮮なものと取換えながら、通常一般の方法により約１乃至１００時間培養する。斯くして得られる培養物にＩＦＮ−γを精製するための慣用の方法、すなわち、塩析、透析、濾過、濃縮、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などを適宜組合せて適用することにより、ＩＦＮ−γを採取することができる。
【００２４】
さらに、この発明のポリペプチドは免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導することから、有効成分として当該ポリペプチドを含んでなる感受性疾患剤は、ヒトを含む哺乳動物に投与すると、体内の免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生が促され、ＩＦＮ−γ感受性疾患の治療・予防に効果を発揮する。また、後記実施例に例示する本発明のポリペプチドのように、ポリペプチドが免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する性質に加えて、ＮＫ細胞やＬＡＫ細胞（リンホカイン活性化キラー細胞）、細胞障害性Ｔ細胞などのキラー細胞による細胞障害性の増強又はキラー細胞の生成を誘導する性質を兼備するときには、キラー細胞も感受性疾患の治療・予防に関与することとなる。したがって、この発明でいう感受性疾患とは、ＩＦＮ−γ感受性疾患を含む、ＩＦＮ−γ及び／又はキラー細胞が直接又は間接に関与して治療及び／又は予防し得る疾患全般を意味するものであり、具体的には、例えば、肝炎、ヘルペス症、尖圭コンジロム、ＡＩＤＳなどのウイルス性疾患、カンジダ症、マラリア症、クリプトコックス症、エルシニア症、結核などの感染症、悪性腎腫瘍、菌状息肉症、慢性肉芽腫などの固形悪性腫瘍、成人Ｔ細胞白血病、慢性骨髄性白血病、悪性リンパ種などの血球系悪性腫瘍、さらには、アレルギー症、リウマチ、膠原病などの免疫疾患や骨粗鬆症を挙げることができる。また、インターロイキン３と併用するときには、白血病、骨髄腫、さらには、悪性腫瘍を治療する際の放射線照射や化学療法剤の投与に伴う白血球減少症や血小板減少症の完治又は緩解にも効果を発揮する。
【００２５】
斯くして、この発明の感受性疾患剤は、上記のごとき感受性疾患を治療・予防するための抗腫瘍剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、免疫疾患剤、血小板増多剤、白血球増多剤などとして多種多様な用途を含有することとなる。剤型並びに感受性疾患の種類及び症状にもよるが、この発明の感受性疾患剤は、通常、液状、ペースト状又は固状に調製され、当該ポリペプチドを０．０００００１乃至１００％（ｗ／ｗ）、望ましくは、０．０００１乃至０．１％（ｗ／ｗ）含んでなる。
【００２６】
この発明の感受性疾患剤は当該ポリペプチド単独の形態はもとより、当該ポリペプチドとそれ以外の生理的に許容される、例えば、担体、賦形剤、希釈剤、免疫助成剤、安定剤、さらには、必要に応じて、他の生理活性物質の１種又は２種以上との組成物としての形態をも包含する。安定剤としては、例えば、血清アルブミン、ゼラチンなどの蛋白質や、グルコース、果糖、蔗糖、マルトース、ラクトース、トレハロース、ソルビトール、マンニトール、マルチトール、ラクチトールなどの糖質、さらには、燐酸、クエン酸を主体とする緩衝剤が、また、併用し得る他の生理活性物質としては、例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン１２、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージ刺激因子、カルボコン、シクロホスファミド、アクラルビシン、チオテパ、ブスルファン、アンシタビン、シタラビン、フルオロウラシル、テトラヒドロフリルフルオロウラシル、メトトレキセート、アクチノマイシンＤ、クロモマイシンＡ3 、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、Ｌ−アスパラギナーゼ、金コロイド、クレスチン、ピシバニール、レンチナン及び丸山ワクチンなどが挙げられる。このうち、インターロイキン２との併用は、インターロイキン２がこの発明のポリペプチドが免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する際の補因子として機能するので特に有利である。天然型又は組換え型インターロイキン２を併用することにより、当該ポリペプチド単独ではＩＦＮ−γを産生し難い免疫担当細胞においても所期のＩＦＮ−γ産生を誘導することができる。また、インターロイキン１２と併用するときには、当該ポリペプチド又はインターロイキン１２単独では容易に達成し得ない、極めて高レベルのＩＦＮ−γ産生を誘導することができる。しかも、当該ポリペプチドは体内におけるインターロイキン１２によるイムノグロブリンＥ抗体の産生阻害を高めるので、イムノグロブリンＥ抗体の産生を主因とする、例えば、アトピー性喘息、アトピー性気管支喘息、枯草熱、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、血管性浮腫、アトピー性消化器異常を始めとするアトピー性疾患を治療するための免疫疾患剤においても極めて有用である。なお、ヒトを含む哺乳動物の体内においては、微量ではあるが、インターロイキン１２が存在することがあるので、斯かる場合には、当該ポリペプチドのみを投与すれば所期の治療効果が達成できる。
【００２７】
さらに、この発明の感受性疾患剤は、投薬単位形態の薬剤をも包含し、その投与単位形態の薬剤とは、当該ポリペプチドを、例えば、１回当りの用量又はその整数倍（４倍まで）若しくはその約数（１／４０まで）に相当する量を含んでなり、投薬に適する物理的に
一体の剤型にある薬剤を意味する。このような投薬単位形態の薬剤としては、注射剤、液剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、舌下剤、点眼剤、点鼻剤、坐剤などが挙げられる。
【００２８】
この発明の感受性疾患剤は経口的に投与しても非経口的に投与しても、また、以下に述べるように抗腫瘍細胞を体外で活性化させる場合に用いてもよく、いずれの場合にも、感受性疾患の治療・予防に効果を発揮する。感受性疾患の種類や症状にもよるが、具体的には、患者の症状や投与後の経過を観察しながら、成人当り約０．１μｇ乃至５０ｍｇ／回、望ましくは、約１μｇ乃至１ｍｇ／回のポリペプチドを１乃至４回／日又は１乃至５回／週の用量で１日乃至１年間に亙って経口投与するか、皮内、皮下、筋肉内又は静脈内に非経口投与すればよい。
【００２９】
この発明の感受性疾患剤は、インターロイキン２を用いる、いわゆる「抗腫瘍免疫療法」にも有用である。抗腫瘍免疫療法は、一般に、（ｉ）悪性腫瘍患者の体内に直接インターロイキン２を投与する方法と、（ｉｉ）インターロイキン２により生体外で活性化させた抗腫瘍細胞を患者の体内に移入する方法（養子免疫療法）に大別されるが、当該ポリペプチドを併用するときには、その効果を有意に高めることができる。具体的には、前記（ｉ）の方法の場合、患者にインターロイキン２を投与するのと同時又は事前に当該ポリペプチドを成人当り約０．１μｇ乃至１ｍｇ／回の用量で１乃至１０回投与する。インターロイキン２の投与量は、悪性腫瘍の種類、患者の症状及びポリペプチドの用量にもよるが、通常、成人当り約１０，０００乃至１，０００，０００単位／回とする。一方、前記（ｉｉ）の方法の場合には、悪性腫瘍患者から採取した単核球又はリンパ球をインターロイキン２の存在下で培養するに当り、それら血球１×１０６個当り当該ポリペプチドを約０．１ｎｇ
乃至１μｇ共存させておく。そして、一定時間培養した後、培養物からＮＫ細胞又はＬＡＫ細胞を採取し、これを元の患者に移入するのである。この発明による抗腫瘍免疫療法の対象となり得る疾患としては、例えば、結腸癌、直腸癌、大腸癌、胃癌、甲状腺癌、舌癌、膀胱癌、絨毛癌、肝癌、前立腺癌、子宮癌、喉頭癌、肺癌、乳癌、悪性黒色腫、カポジ肉腫、脳腫瘍、神経芽細胞腫、卵巣腫瘍、睾丸腫瘍、骨肉腫、膵臓癌、悪性腎腫瘍、副腎腫、血管内皮腫などの固形悪性腫瘍や白血病、悪性リンパ腫などの血球系悪性腫瘍が挙げられる。
【００３０】
ところで、当該ポリペプチドをコードするこの発明のＤＮＡは、いわゆる、「遺伝子療法」にも有用である。すなわち、通常の遺伝子療法においては、この発明のＤＮＡを、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどのウイルス由来のベクターに挿入するか、カチオニックポリマーや膜融合型リポソームなどのリポソームに包埋し、この状態でＩＦＮ−γ及び／又はキラー細胞に感受性を含有する疾患に罹患した患者に直接注入するか、あるいは、患者からリンパ球を採取し、生体外で導入した後、患者に自家移植するのである。また、養子免疫遺伝子療法においては、効果細胞にこの発明のＤＮＡを通常の遺伝子療法の場合と同様にして導入すると、腫瘍細胞に対する効果細胞の細胞障害性が高まり、養子免疫療法を強化することができる。さらに、腫瘍ワクチン遺伝子療法においては、患者から摘出した腫瘍細胞にこの発明のＤＮＡを通常の遺伝子療法の場合と同様にして導入し、生体外で一定数に達するまで増殖させた後、患者に自家移植するのである。移植された腫瘍細胞は患者体内においてワクチンとして作用し、強力且つ抗原特異的な抗腫瘍免疫を発揮する。斯くして、この発明のＤＮＡは、ウイルス疾患、感染症、悪性腫瘍及び免疫疾患を始めとする各種疾患の遺伝子療法に著効を発揮することとなる。なお、これらの遺伝子療法を実施するための一般的手順は、例えば、島田隆、斎藤泉、小澤敏也編集、『実験医学別冊バイオマニュアルＵＰシリーズ  遺伝子治療の基礎技術』、１９９６年、羊土社発行に詳述されている。
【００３１】
以下、この発明の実施の形態につき、実施例を挙げて説明する。実施例Ａ−１乃至Ａ−９にはこの発明によるポリペプチドの製造方法の実施例が、また、実施例Ｂ−１乃至Ｂ−５にはこの発明の感受性疾患剤の実施例がそれぞれ例示されている。なお、実施例Ａ−１乃至Ａ−９において用いられる手法は斯界において慣用のものであり、例えば、黒木登志夫、谷口克、押村光雄編集、『実験医学別冊細胞工学ハンドブック』、１９９２年、羊土社発行や横田崇、新井賢一編集、『実験医学別冊バイオマニュアルシリーズ３  遺伝子クローニング実験法』、１９９３年、羊土社発行などにも詳述されている。
【００３２】
＜実施例Ａ−１：ポリペプチドの製造＞
【００３３】
＜実施例Ａ−１（ａ）：組換えＤＮＡの構築＞
ヒト急性リンパ性白血病に由来する株化細胞の一種であるＢＡＬＬ−１細胞（ＲＣＢ０２５６）から常法にしたがって染色体ＤＮＡを採取する一方、カーステン・ヘンコらが『ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー』、第１８５巻、２２７乃至２６０頁（１９８５年）に報告しているヒトインターフェロン−αにおけるサブタイプα２ｂのシグナルペプチドをコードする配列表における配列番号２４に示す塩基配列に基づき、センスプライマー１及びアンチセンスプライマー１として５´−ＡＣＡＣＣＴＣＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＣＣＴＴＴＧＣＴＴＴＡＡＣ−３´及び５´−ＴＴＧＣＣＡＡＡＧＴＡＧＣＣＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＣＴＴＧ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをそれぞれ化学合成した。次いで、０．５ｍｌ容反応管に染色体ＤＮＡを１μｇ、１０×ＰＣＲ緩衝液を１０μｌ、そして、２５ｍＭ  ｄＮＴＰミックスを１μｌそれぞれとり、さらに、センスプライマー１及びアンチセンスプライマー１をそれぞれ適量加え、滅菌蒸留水を加えて全量を９９μｌとし、２．５単位／μｌ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを１μｌ加えた後、９４℃、６０℃及び７２℃の順序でそれぞれ１分間インキュベートするサイクルを３０回繰返してＰＣＲ反応させたところ、配列表における配列番号２４に示す塩基配列と、その塩基配列の５´末端に連結された制限酵素ＸｈｏＩによる認識部位及び３´末端に連結された配列番号２５に示す塩基配列の第１乃至１１番目の塩基配列をそれぞれ含んでなるＤＮＡ断片１を得た。
【００３４】
別途、同じ特許出願人による特開平８−１９３０９８号公報に記載された方法にしたがって、配列表における配列番号４に示すアミノ酸配列を有する野生型ポリペプチドをコードする、配列表における配列番号２５に示す塩基配列を含む組換えＤＮＡ『ｐＨＩＧＩＦ』を調製した。配列表における配列番号４のアミノ酸配列の野生型ポリペプチドは、その第１６乃至２１番目、第３０乃至３５番目及び、第５１乃至５５番目のアミノ酸よりなる部分に、それぞれ、部分アミノ酸配列としての、配列番号１、２及び３に示すアミノ酸配列を含んでいる。一方、配列表における配列番号２５及び２６に示す塩基配列に基づき、常法にしたがって、センスプライマー２及びアンチセンスプライマー２として５´−ＣＴＧＣＴＣＴＧＴＧＧＧＣＴＡＣＴＴＴＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＣ−３´及び５´−ＡＣＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＧＴＣＴＴＣＧＴＴＴＴＧＡＡＣＡＧ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをそれぞれ化学合成した。０．５ｍｌ容反応管に組換えＤＮＡ『ｐＨＩＧＩＦ』を１ｎｇ、１０×ＰＣＲ緩衝液を１０μｌ、そして、２５ｍＭ  ｄＮＴＰミックスを１μｌをとり、さらに、センスプライマー２及びアンチセンスプライマー２をそれぞれ適量加え、滅菌蒸留水を加えて全量を９９μｌとし、２．５単位／μｌ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを１μｌ加えた後、９４℃、６０℃及び７２℃の順序でそれぞれ１分間インキュベートするサイクルを３０回繰返してＰＣＲ反応させたところ、配列表における配列番号２５に示す塩基配列と、その塩基配列の３´末端に連結された終止コドンＴＡＧ及び制限酵素ＮｏｔＩによる認識部位並びに５´末端に連結された配列番号２４に示す塩基配列の第５７乃至６９番目の塩基配列をそれぞれ含んでなるＤＮＡ断片２を得た。
【００３５】
０．５ｍｌ容反応管にこのようにして得たＤＮＡ断片１及び２をそれぞれ１ｎｇ、１０×ＰＣＲ緩衝液を１０μｌ、さらに、２５ｍＭ  ｄＮＴＰミックスを１μｌとり、滅菌蒸留水で９９μｌとし、９４℃で３分間インキュベートし、３７℃まで徐々に冷却し、１５分間インキュベートした後、２．５単位／μｌ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを１μｌ加え、７２℃まで徐々に昇温し、２分間インキュベートし、センスプライマー１及びアンチセンスプライマー２をそれぞれ適量加え、９４℃で１分間、６０℃で１分間及び７２℃で１分３０秒間の順序でインキュベートするサイクルを３０回繰返してさらにＰＣＲ反応させたところ、配列表における配列番号２６に示す塩基配列を含んでなるＤＮＡ断片３が得られた。
【００３６】
次に、常法にしたがって、配列表における配列番号２６に示す塩基配列の第２８７番目のグアニンをシトシンに置換するための変異センスプライマーとしての５´−ＣＴＣＴＧＴＧＡＡＧＴＣＴＧＡＧＡＡＡＡＴＴＴＣＡＡＣＴＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを化学合成した。そして、ＤＮＡ断片３を鋳型とし、センスプライマー２に代えてこの変異センスプライマーを用いた以外はＤＮＡ断片２の場合と同様にＰＣＲ反応させたところ、配列表における配列番号２６に示す塩基配列の第２８７番目の塩基がシトシンであること以外は配列番号２６の塩基配列における第２７６乃至５７０番目と同一の塩基配列を含有するＤＮＡ断片４が得られた。
【００３７】
別途、常法にしたがって、配列表における配列番号２６に示す塩基配列の第２８７番目のグアニンをシトシンに置換するための変異アンチセンスプライマーとしての５´−ＧＡＧＴＴＧＡＡＡＴＴＴＴＣＴＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＡＧＡＧ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを化学合成した。そして、ＤＮＡ断片３を鋳型とし、アンチセンスプライマー１に代えてこの変異アンチセンスプライマーを用いた以外はＤＮＡ断片１の場合と同様にＰＣＲ反応させたところ、配列表における配列番号２６に示す塩基配列の第２８７番目の塩基がシトシンであること以外は配列番号２６の塩基配列における第１乃至３０４番目と同一の塩基配列を含有するＤＮＡ断片５が得られた。
【００３８】
このようにして得たＤＮＡ断片４及び５を鋳型にした以外は、ＤＮＡ断片３の場合と同様にＰＣＲ反応させたところ、配列表における配列番号６に示すアミノ酸をコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片６を得た。このＤＮＡ断片６は、配列表における配列番号１５に示す塩基配列と、その塩基配列の５´末端に連結された配列番号２４に示す塩基配列及び制限酵素ＸｈｏＩによる認識部位と、３´末端に連結された終止コドンＴＡＧ及び制限酵素ＮｏｔＩによる認識部位からなっていた。
【００３９】
その後、常法にしたがって、このＤＮＡ断片６を制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩにより切断し、得られた５５５塩基対からなるＤＮＡ断片を２５ｎｇとり、予め制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩにより同様に切断しておいたインビトロジェン製プラスミドベクター『ｐＣＤＭ８』を１０ｎｇ加え、宝酒造製ライゲーション・キット『ライゲーション・キット・バージョン２』を用いて１６℃で３０分間インキュベートした後、クローニングしたところ、４，４９４塩基対からなる自律複製可能な組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ１２』が得られた。図１に示したように、この組換えＤＮＡにおいては、配列表における配列番号１５に示す塩基配列を含むｃＤＮＡ『ＩＧＩＦ／ＭＵＴ１２』がヒトインターフェロン−αにおけるサブタイプα２ｂのシグナルペプチドをコードする塩基配列ＩＦＮｓｓの下流に連結されていた。配列表における配列番号１５に示す塩基配列は、そこに併記したアミノ酸配列に見られるように、配列番号４に示すアミノ酸配列の野生型ポリペプチドにおける第６８番目のシステインがセリンに置換された、配列番号６に示すアミノ酸配列をコードするものである。
【００４０】
対照として、ＤＮＡ断片６に代えてＤＮＡ断片３を用いた以外は上記と同様に処置して、４，４９４塩基対からなる自律複製可能な組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＷＴ』を得た。図２に見られるように、この組換えＤＮＡにおいては、野生型ポリペプチドをコードする配列表における配列番号２５に示す塩基配列を有するｃＤＮＡ『ＩＧＩＦ／ＷＴ』がヒトインターフェロン−αにおけるサブタイプα２ｂのシグナルペプチドをコードする塩基配列ＩＦＮｓｓの下流に連結されていた。
【００４１】
＜実施例Ａ−１（ｂ）：形質転換体によるポリペプチドの製造＞
実施例Ａ−１（ａ）の方法により得た組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ１２』を通常のコンピテントセル法によりインビトロジェン製大腸菌ＭＣ１０６１／Ｐ３株に導入し、得られた形質転換体を２０μｇ／ｍｌアンピシリン及び１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンをそれぞれ含むＬ培地（ｐＨ７．２）に接種し、３７℃で１８時間振盪培養した。培養物を遠心分離して菌体を分離し、これに通常のアルカリ−ＳＤＳ法を適用して組換えＤＮＡを抽出した。
【００４２】
６ウェルマイクロプレートに１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＤＭＥ培地（ｐＨ７．４）を２．５ｍｌ／ウェルずつ分注し、アフリカミドリザルの腎臓に由来する株化細胞の一種であるＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５０）を１．８×１０５個／ウェルの割合で接種した後、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。培養物から上清を除き、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）により平衡化したＤＭＥ培地により洗浄した後、２．８μｇ／ｍｌの上記で抽出した組換えＤＮＡ、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、０．４ｍｇ／ｍｌ  ＤＥＡＥ−デキストラン及び０．１ｍＭクロロキンをそれぞれ含むＤＭＥ培地を１．８ｍｌ／ウェルずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４時間培養した。上清を除き、１０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルフォキシド及び１４０ｍＭ  ＮａＣｌをそれぞれ含む１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．４）を２．５ｍｌ／ウェルずつ加え、室温下で２分間静置し、再度上清を除き、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を含むＤＭＥ培地により細胞を洗浄した後、コスモバイオ製培養培地『ＣＯＳ培地』を２．５ｍｌ／ウェル加え、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で３日間培養した。培養物を同じ特許出願人による特開平８−２３１５９８号公報に記載されたモノクローナル抗体を用いるウェスタンブロッティング法により分析したところ、配列表における配列番号４に示すアミノ酸配列の第６８番目のシステインがセリンに置換されたアミノ酸配列を有し、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するこの発明のポリペプチドが培養物１ｍｌ当り約２０ｎｇ産生していた。
【００４３】
対照として、実施例Ａ−１（ａ）の方法により得た組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＷＴ』を組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ１２』と同様に処置したところ、培養物１ｍｌ当り、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する野生型ポリペプチドが約１ｎｇ産生していた。このポリペプチド産生量は、組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ１２』を用いた場合の約５％に過ぎないものである。このことは、本実施例で得たこの発明のポリペプチドが、野生型ポリペプチドと比較して、安定性及び生理活性が高いことを示している。
【００４４】
＜実施例Ａ−１（ｃ）：ポリペプチドの精製＞
実施例Ａ−１（ｂ）の方法により得たこの発明のポリペプチドを含む培養物を遠心分離し、上清を採取した。別途、同じ特許出願人による特開平８−２３１５９８号公報に記載された方法にしたがってモノクローナル抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィー用ゲルを調製し、プラスチック製円筒管にカラム状に充填し、燐酸緩衝生理食塩水（以下、「ＰＢＳ」と言う。）で洗浄した後、上記上清を負荷した。カラムを新鮮なＰＢＳで洗浄した後、１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）を通液し、溶出画分から免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドを含む画分を採取し、ＰＢＳに対して４℃で１８時間透析し、膜濾過により濃縮した後、凍結乾燥して、純度約９５％のポリペプチド固状物を得た。収量は原料培養物当り約５０％であった。並行して、組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＷＴ』を用いて得た野生型ポリペプチドを含む培養物を同様にして精製し、後記理化学的性質の解明において対照として用いた。
【００４５】
＜実施例Ａ−１（ｄ）：分子量＞
実施例Ａ−１（ｃ）の方法により得たこの発明のポリペプチドをユー・ケー・レムリが『ネイチャー』、第２２７巻、６８０乃至６８５頁（１９７０年）に報告している方法に準じ、還元剤として２％（ｗ／ｖ）ジチオトレイトールの存在下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動したところ、分子量１８，０００乃至１９，５００ダルトンに相当する位置にＩＦＮ−γ誘導能あるポリペプチドの主バンドが観察された。なお、このときの分子量マーカーは、ウシ血清アルブミン（６７，０００ダルトン）、オボアルブミン（４５，０００ダルトン）、カーボニックアンヒドロラーゼ（３０，０００ダルトン）、大豆トリプシンインヒビター（２０，１００ダルトン）及びα−ラクトアルブミン（１４，４００ダルトン）であった。
【００４６】
＜実施例Ａ−１（ｅ）：Ｎ末端アミノ酸配列＞
パーキン・エルマー製プロテイン・シーケンサー『４７３Ａ型』を使用し、常法にしたがって分析したところ、実施例Ａ−１（ｃ）の方法により得たこの発明のポリペプチドは、Ｎ末端に配列表における配列番号２７に示すアミノ酸配列を有していた。
【００４７】
＜実施例Ａ−１（ｆ）：安定性＞
実施例Ａ−１（ｃ）の方法により得たこの発明のポリペプチド及び野生型ポリペプチドをＣＯＳ培地にポリペプチド固形物として約１０ｎｇ／ｍｌになるようにそれぞれ別々に溶解し、溶液を４０℃で２４時間インキュベートした。インキュベート開始から０時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間及び２４時間後にそれぞれの溶液からサンプリングし、そのＩＦＮ−γ誘導能を後記実施例Ａ−１（ｇ）の方法により測定することにより活性経時変化を調べた。そして、インキュベート開始から０時間後のＩＦＮ−γ誘導能を基準にして、各個のインキュベーション時間における残存活性の百分率（％）を計算した。結果を図３に示す。
【００４８】
図３の結果に見られるように、本実施例のポリペプチドは野生型ポリペプチドと比較して安定性が有意に高く、生理活性がより長時間持続した。このことは、本実施例におけるアミノ酸の置換が、野生型ポリペプチドの生理活性を損なうことなく安定性を高めるのに有効であることを物語っている。
【００４９】
＜実施例Ａ−１（ｇ）：免疫担当細胞におけるＩＦＮ−γの産生＞
ヒト急性骨髄性白血病に由来する株化細胞の一種であるＫＧ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２４６）を血清無含有のＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．４）に細胞密度３×１０５個／ｍｌになるように接種し、１０％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４日間培養した後、細胞を採取し、１０％仔牛血清アルブミンを補足したＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．４）に細胞密度３×１０６個／ｍｌになるように浮遊させた。この浮遊液を９６ウェルマイクロプレートに０．１ｍｌ／ウェルずつ分注し、実施例Ａ−１（ｃ）の方法により得たこの発明のポリペプチドか野生型ポリペプチドのいずれかを適宜希釈して０．１ｍｌ／ウェル加えた後、１０％ＣＯ2 インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した後、各ウェルから培養上清を０．１ｍｌずつ採取し、通常の酵素免疫測定法によりＩＦＮ−γを測定した。並行して、ポリペプチドを一切省略した系を設け、上記と同様に処置して対照とした。結果を表１に示す。なお、表１中のＩＦＮ−γ含量は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）から入手したＩＦＮ−γ標品（Ｇｇ２３−９０１−５３０）に基づき国際単位（ＩＵ）に換算している。
【００５０】
【表１】
2007143555.tif 000002
【００５１】
表１の結果は、この発明のポリペプチドを作用させると、免疫担当細胞としてのＫＧ−１細胞においてＩＦＮ−γの産生が誘導されたことを示している。そして、このときのＩＦＮ−γ産生は野生型ポリペプチドの場合と同等以上であった。
【００５２】
＜実施例Ａ−１（ｈ）：ＮＫ細胞による細胞障害性の増強＞
ヘパリン加注射器により健常者から血液を採取し、ＰＢＳにより２倍希釈した後、フィコール上に重層し、遠心分離して高密度リンパ球を得た。このリンパ球を細胞密度１×１０６個／ｍｌになるように１０μｇ／ｍｌカナマイシン、５×１０−５Ｍ  ２−メルカプトエタノール及び１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清をそれぞれ含むＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．２）に浮遊させ、１２ウェルマイクロプレートに０．５ｍｌ／ウェルずつ分注した。そして、実施例Ａ−１（ｃ）の方法により得たこの発明のポリペプチドか野生型ポリペプチドのいずれかを上記と同一の新鮮な培地に適宜希釈してマイクロプレートに１．５ｍｌ／ウェルずつ加え、さらに、５０単位／ｍｌ組換え型ヒトインターロイキン２を含むか含まない上記と同一の新鮮な培地を０．５ｍｌ／ウェル加えた後、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養し、ＰＢＳで洗浄して効果細胞としてのＮＫ細胞を含む培養リンパ球を得た。
【００５３】
次いで、常法により51Ｃｒ標識したＮＫ細胞感受性標的細胞としてのヒト慢性骨髄性白血病に由来する株化細胞の一種であるＫ−５６２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２４３）を９６ウェルマイクロプレートに１×１０４個／ウェルずつとり、上記で調製した培養リンパ球を効果細胞／標的細胞比で２．５：１、５：１又は１０：１の割合となるように加え、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４時間培養した後、常法にしたがって培養上清の放射能を測定して死滅標的細胞数を求めた。そして、各々の系につき、細胞障害性の目安とすべく、試験に供した標的細胞数に対する死滅標的細胞数の百分率（％）を計算した。結果を表２に示す。
【００５４】
【表２】
2007143555.tif 000003
【００５５】
表２の結果は、この発明のポリペプチドにＮＫ細胞による細胞障害性を増強する性質があり、しかも、この性質は野生型ポリペプチドと同等以上であることを示している。表２の結果に見られるように、この細胞障害性の増強は、インターロイキン２が共存すると、一段と増強される。
【００５６】
＜実施例Ａ−１（ｉ）：ＬＡＫ細胞の生成誘導＞
常法により５１Ｃｒ標識したＮＫ細胞非感受性標的細胞としてのヒトバーキットリンパ腫に由来する株化細胞の一種であるＲａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８６）を９６ウェルマイクロプレートに１×１０４個／ウェルずつとり、７２時間培養した以外は実施例Ａ−１（ｇ）と同様にして調製した効果細胞としてのＬＡＫ細胞を含む培養リンパ球を効果細胞／標的細胞比で５：１、１０：１又は２０：１の割合で加え、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４時間培養した後、常法にしたがって培養上清の放射能を測定し、実施例Ａ−１（ｈ）と同様にして細胞障害性（％）を計算した。結果を表３に示す。
【００５７】
【表３】
2007143555.tif 000004
【００５８】
表３の結果は、この発明のポリペプチドにＬＡＫ細胞の生成を誘導する性質があり、しかも、この性質は野生型ポリペプチドと同等以上であることを示している。表３の結果に見られるように、この誘導は、インターロイキン２が共存すると、一段と増強される。
【００５９】
＜実施例Ａ−１（ｊ）：急性毒性試験＞
常法にしたがって、８週齢のマウスに実施例Ａ−１（ｃ）の方法により得たこの発明のポリペプチドを経皮、経口又は腹腔内に注射投与した。その結果、この発明のポリペプチドのＬＤ５０は、いずれの投与経路によっても約１ｍｇ／ｋｇマウス体重以上であることが判明した。このことは、この発明のポリペプチドがヒトに対する医薬品に配合して安全であることを裏付けている。
【００６０】
＜実施例Ａ−２：ポリペプチドの製造＞
実施例Ａ−１（ａ）の方法により得たＤＮＡ断片６を鋳型に用い、配列表における配列番号４に示すアミノ酸配列の第３８番目のシステインをセリンに置換するための変異センスプライマー及び変異アンチセンスプライマーとして、それぞれ５´−ＣＴＧＡＴＴＣＴＧＡＣＴＣＴＡＧＡＴＡＡＴＧＣ−３´及び５´−ＧＣＡＴＴＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＡＧＡＡＴＣＡＧ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた以外は実施例Ａ−１（ａ）と同様にして、配列表における配列番号１６に示す塩基配列を含む自律複製可能な組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ２１』を得た。図４に示すように、この組換えＤＮＡにおいては、配列表における配列番号７に示すアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ『ＩＧＩＦ／ＭＵＴ２１』がヒトインターフェロン−αにおけるサブタイプα２ｂのシグナルペプチドをコードする塩基配列ＩＦＮｓｓの下流に連結されていた。
【００６１】
この組換えＤＮＡを実施例Ａ−１（ｂ）と同様にしてＣＯＳ−１細胞に導入し、得られた形質転換体を培養したところ、配列表における配列番号７に示すアミノ酸配列を含有するポリペプチドが培養培地１ｍｌ当り約５０ｎｇ産生していた。この培養物を実施例Ａ−１の方法により精製し、理化学的性質を調べたところ、本実施例のポリペプチドは実施例Ａ−１の方法により得たこの発明のポリペプチドと同様の分子量とＮ末端アミノ酸配列を有し、同様に毒性が低かった。さらに、実施例Ａ−１（ｆ）の方法により安定性を調べたところ、図３に見られるように、本実施例のポリペプチドは野生型ポリペプチドと比較して安定性が有意に高かった。これらの事実は、本実施例におけるアミノ酸の置換が、野生型ポリペプチドの生理活性を損なうことなく安定性を高めるのに有効であることを物語っている。
【００６２】
＜実施例Ａ−３：ポリペプチドの製造＞
実施例Ａ−１（ａ）の方法により得たＤＮＡ断片６を鋳型に用い、配列表における配列番号４に示すアミノ酸配列の第１２７番目のシステインをセリンに置換するための変異センスプライマー及び変異アンチセンスプライマーとして、それぞれ５´−ＣＴＴＴＣＴＡＧＣＴＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧ−３´及び５´−ＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＴＴＣＡＧＡＡＧＣＴＡＧＡＡＡＧ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた以外は実施例Ａ−１（ａ）と同様にして、配列表における配列番号１７に示す塩基配列を含む自律複製可能な組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ２５』を得た。図５に示すように、この組換えＤＮＡにおいては、配列表における配列番号８に示すアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ『ＩＧＩＦ／ＭＵＴ２５』がヒトインターフェロン−αにおけるサブタイプα２ｂのシグナルペプチドをコードする塩基配列ＩＦＮｓｓの下流に連結されていた。
【００６３】
この組換えＤＮＡを実施例Ａ−１（ｂ）と同様にしてＣＯＳ−１細胞に導入し、得られた形質転換体を培養したところ、配列表における配列番号８に示すアミノ酸配列を含有するポリペプチドが培養培地１ｍｌ当り約３０ｎｇ産生していた。この培養物を実施例Ａ−１の方法により精製し、理化学的性質を調べたところ、本実施例のポリペプチドは実施例Ａ−１の方法により得たこの発明のポリペプチドと同様の分子量とＮ末端アミノ酸配列を有し、同様に毒性が低かった。さらに、実施例Ａ−１（ｆ）の方法により安定性を調べたところ、図３に見られるように、本実施例のポリペプチドは野生型ポリペプチドと比較して安定性が有意に高かった。これらの事実は、本実施例におけるアミノ酸の置換が、野生型ポリペプチドの生理活性を損なうことなく安定性を高めるのに有効であることを物語っている。
【００６４】
＜実施例Ａ−４：ポリペプチドの製造＞
実施例Ａ−２の方法により得た組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ２１』における配列表の配列番号７に示すアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ『ＩＧＩＦ／ＭＵＴ２１』を鋳型に用い、配列表における配列番号４に示すアミノ酸配列の第１２７番目のシステインをセリンに置換するための変異センスプライマー及び変異アンチセンスプライマーとして、それぞれ５´−ＣＴＴＴＣＴＡＧＣＴＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧ−３´及び５´−ＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＴＴＣＡＧＡＡＧＣＴＡＧＡＡＡＧ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた以外は実施例Ａ−１（ａ）と同様にして、配列表における配列番号１８に示す塩基配列を含む自律複製可能な組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ３２』を得た。図６に示すように、この組換えＤＮＡにおいては、配列表における配列番号９に示すアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ『ＩＧＩＦ／ＭＵＴ３２』がヒトインターフェロン−αにおけるサブタイプα２ｂのシグナルペプチドをコードする塩基配列ＩＦＮｓｓの下流に連結されていた。
【００６５】
この組換えＤＮＡを実施例Ａ−１（ｂ）と同様にしてＣＯＳ−１細胞に導入し、得られた形質転換体を培養したところ、配列表における配列番号９に示すアミノ酸配列を含有するポリペプチドが培養培地１ｍｌ当り約８０ｎｇ産生していた。この培養物を実施例Ａ−１の方法により精製し、理化学的性質を調べたところ、本実施例のポリペプチドは実施例Ａ−１の方法により得たこの発明のポリペプチドと同様の分子量とＮ末端アミノ酸配列を有し、同様に毒性が低かった。さらに、実施例Ａ−１（ｆ）の方法により安定性を調べたところ、図３に見られるように、本実施例のポリペプチドは野生型ポリペプチドと比較して安定性が有意に高かった。これらの事実は、本実施例におけるアミノ酸の置換が、野生型ポリペプチドの生理活性を損なうことなく安定性を高めるのに有効であることを物語っている。
【００６６】
＜実施例Ａ−５：ポリペプチドの製造＞
実施例Ａ−４の方法により得た組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ３２』における配列表の配列番号１８に示す塩基配列のｃＤＮＡ『ＩＧＩＦ／ＭＵＴ３２』を鋳型に用い、配列表における配列番号４に示すアミノ酸配列の第７６番目のシステインをセリンに置換するための変異センスプライマー及び変異アンチセンスプライマーとして、それぞれ５´−ＣＡＡＣＴＣＴＣＴＣＣＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡＡ−３´及び５´−ＴＴＧＴＴＣＴＣＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＧＴＴＧ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた以外は実施例Ａ−１（ａ）と同様にして、配列表における配列番号１９に示す塩基配列を含む自律複製可能な組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ４１』を得た。図７に示すように、この組換えＤＮＡにおいては、配列表における配列番号１０に示すアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ『ＩＧＩＦ／ＭＵＴ４１』がヒトインターフェロン−αにおけるサブタイプα２ｂのシグナルペプチドをコードする塩基配列ＩＦＮｓｓの下流に連結されていた。
【００６７】
この組換えＤＮＡを実施例Ａ−１（ｂ）と同様にしてＣＯＳ−１細胞に導入し、得られた形質転換体を培養したところ、配列表における配列番号１０に示すアミノ酸配列を含有するポリペプチドが培養培地１ｍｌ当り約６ｎｇ産生していた。この培養物を実施例Ａ−１の方法により精製し、理化学的性質を調べたところ、本実施例のポリペプチドは実施例Ａ−１の方法により得たポリペプチドと同様の分子量とＮ末端アミノ酸配列を有し、同様に毒性が低かった。さらに、実施例Ａ−１（ｆ）の方法により安定性を調べたところ、図３に見られるように、本実施例のポリペプチドは野生型ポリペプチドと比較して安定性が著しく高かった。これらの事実は、本実施例におけるアミノ酸の置換が、野生型ポリペプチドの生理活性を損なうことなく安定性を高めるのに極めて有効であることを物語っている。
【００６８】
＜実施例Ａ−６：ポリペプチドの製造＞
実施例Ａ−２の方法により得た組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ２１』における配列表の配列番号７に示すアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ『ＩＧＩＦ／ＭＵＴ２１』を鋳型に用い、配列表における配列番号４に示すアミノ酸配列における第７６番目のシステインをアラニンに変換するための変異センスプライマー及び変異アンチセンスプライマーとして、それぞれ、５´−ＣＴＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＡＡＣＡＡＡＡＴＴＡＴＴＴＣＣ−３´及び５´−ＴＴＴＧＴＴＣＴＣＡＧＣＧＧＡＧＡＧＡＧＴＴＧ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた以外は実施例Ａ−１（ａ）と同様にして、配列表における配列番号２０に示す塩基配列を含む自律複製可能な組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ３５』を得た。図８に示すように、この組換えＤＮＡにおいては、配列表における配列番号１１に示すアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ『ＩＧＩＦ／ＭＵＴ３５』がヒトインターフェロン−αにおけるサブタイプα２ｂのシグナルペプチドをコードする塩基配列ＩＦＮｓｓの下流に連結されていた。
【００６９】
この組換えＤＮＡを実施例Ａ−１（ｂ）と同様にしてＣＯＳ−１細胞に導入し、得られた形質転換体を培養したところ、配列表における配列番号１１に示すアミノ酸配列を含有するポリペプチドが培養培地１ｍｌ当り約６０ｎｇ産生していた。この培養物を実施例Ａ−１の方法により精製し、理化学的性質を調べたところ、本実施例ポリペプチドは実施例Ａ−１の方法により得たこの発明のポリペプチドと同様の分子量とＮ末端アミノ酸配列を有し、同様に毒性が低かった。さらに、実施例Ａ−１（ｆ）の方法により安定性を調べたところ、図３に見られるように、本実施例のポリペプチドは野生型ポリペプチドと比較して安定性が著しく高かった。これらの事実は、本実施例におけるアミノ酸の置換が、野生型ポリペプチドの生理活性を損なうことなく安定性を高めるのに極めて有効であることを物語っている。
【００７０】
＜実施例Ａ−７：ポリペプチドの製造＞
実施例Ａ−４の方法により得た組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ３２』における配列表の配列番号１８に示すアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ『ＩＧＩＦ／ＭＵＴ３２』を鋳型に用い、配列表における配列番号４に示すアミノ酸配列の第７６番目のシステインをアラニンに置換するための変異センスプライマー及びアンチセンスプライマーとして、それぞれ、５´−ＣＴＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＡＡＣＡＡＡＡＴＴＡＴＴＴＣＣ−３´及び５´−ＴＴＴＧＴＴＣＴＣＡＧＣＧＧＡＧＡＧＡＧＴＴＧ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた以外は実施例Ａ−１（ａ）と同様にして、配列表における配列番号２１に示す塩基配列を含む自律複製可能な組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ４２』を得た。図９に示すように、この組換えＤＮＡにおいては、配列表における配列番号１２に示すアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ『ＩＧＩＦ／ＭＵＴ４２』がヒトインターフェロン−αにおけるサブタイプα２ｂをシグナルペプチドをコードする塩基配列ＩＦＮｓｓの下流に連結されていた。
【００７１】
この組換えＤＮＡを実施例Ａ−１（ｂ）と同様にしてＣＯＳ−１細胞に導入し、得られた形質転換体を培養したところ、配列表における配列番号１２に示すアミノ酸配列を含有するポリペプチドが培養培地１ｍｌ当り約３０ｎｇ産生していた。この培養物を実施例Ａ−１の方法により精製し、理化学的性質を調べたところ、本実施例ポリペプチドは実施例Ａ−１の方法により得たこの発明のポリペプチドと同様の分子量とＮ末端アミノ酸配列を有し、同様に毒性が低かった。さらに、実施例Ａ−１（ｆ）の方法により安定性を調べたところ、図３に見られるように、本実施例のポリペプチドは野生型ポリペプチドと比較して安定性が著しく高かった。これらの事実は、本実施例におけるアミノ酸の置換が、野生型ポリペプチドの生理活性を損なうことなく安定性を高めるのに極めて有効であることを物語っている。
【００７２】
＜実施例Ａ−８：ポリペプチドの製造＞
【００７３】
＜実施例Ａ−８（ａ）：組換えＤＮＡの構築＞
実施例Ａ−１（ａ）に記載のＤＮＡ断片１を得るためのＰＣＲ反応において、アンチセンスプライマー１に代えて、５′−ＣＧＧＣＣＡＡＡＧＴＴＧＣＣＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＣＴＴＧ−３′で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた以外は同様にしてＰＣＲ反応を行った。その結果、配列表における配列番号２４に示す塩基配列と、その塩基配列の５´末端に連結された制限酵素ＸｈｏＩによる認識部位及び３´末端に連結された配列番号２８に示す塩基配列の第１乃至１１番目の塩基配列をそれぞれ含んでなるＤＮＡ断片７を得た。
【００７４】
同じ特許出願人による特開平８−２７１８９号公報に記載された方法にしたがって、配列表における配列番号５に示すアミノ酸配列を有する野生型ポリペプチドをコードする配列表における配列番号２８に示す塩基配列を含む組換えＤＮＡ『ｐＭＧＴＧ−１』を調製した。配列表における配列番号５に示すアミノ酸配列の野生型ポリペプチドは、その第１６乃至２１番目、第２９乃至３４番目及び、第５０乃至５４番目のアミノ酸よりなる部分に、それぞれ、部分アミノ酸配列として、配列表における配列番号１、２及び３に示すアミノ酸配列を含んでいる。一方、センスプライマー３及びアンチセンスプライマー３として、５′−ＣＴＧＣＴＣＴＧＴＧＧＧＣＡＡＣＴＴＴＧＧＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＴＧ−３′及び５′−ＡＣＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＡＣＴＴＴＧＡＴＧＴＡＡＧＴＴＡＧ−３′で表されるオリゴヌクレオチドを化学合成した。実施例Ａ−１（ａ）に記載のＤＮＡ断片２を得るためのＰＣＲ反応において、組換えＤＮＡ『ｐＨＩＧＩＦ』、センスプライマー２及びアンチセンスプライマー２に代えて、ここで得た組換えＤＮＡ『ｐＭＧＴＧ−１』、センスプライマー３及びアンチセンスプライマー３をそれぞれ用いた以外は同様にしてＰＣＲ反応を行った。その結果、配列表における配列番号２８に示す塩基配列と、その塩基配列の３´末端に連結された終止コドンＴＡＧ及び制限酵素ＮｏｔＩによる認識部位並びに５´末端に連結された配列番号２４に示す塩基配列の第５７乃至６９番目の塩基配列をそれぞれ含んでなるＤＮＡ断片８を得た。
【００７５】
実施例Ａ−１（ａ）に記載のＤＮＡ断片３を得るためのＰＣＲにおいて、ＤＮＡ断片１、ＤＮＡ断片２及びアンチセンスプライマー２に代えて、上記で得たＤＮＡ断片７、ＤＮＡ断片８及びアンチセンスプライマー３をそれぞれ用いたこと以外は同様にしてＰＣＲ反応を行った。その結果、配列表における配列番号２９に示す塩基配列を含んでなるＤＮＡ断片９を得た。
【００７６】
実施例Ａ−１（ａ）に記載のＤＮＡ断片４を得るためのＰＣＲ反応において、ＤＮＡ断片３に代えて上記で得たＤＮＡ断片９を用いるとともに、変異センスプライマーとして配列表における配列番号２９に示す塩基配列の第１０３番目のチミンをグアニンに、第１０４番目のグアニンをシトシンに置換するための５′−ＧＧＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＧＣＴＡＣＡＡＣＣ−３′で表されるオリゴヌクレオチドを化学合成して用い、そしてアンチセンスプライマー２に代えて上記のアンチセンスプライマー３を用いたこと以外は同様にしてＰＣＲ反応を行った。その結果、配列表における配列番号２９に示す塩基配列の第１０３番目及び第１０４番目の塩基がそれぞれグアニン及びシトシンであること以外は配列番号２９の塩基配列における第９１乃至５７０番目の塩基からなる配列と同一の塩基配列を含有するＤＮＡ断片１０を得た。
【００７７】
実施例Ａ−１（ａ）に記載のＤＮＡ断片５を得るためのＰＣＲ反応において、ＤＮＡ断片３に代えて上記で得たＤＮＡ断片９を用いるとともに、変異アンチセンスプライマーとして配列表における配列番号２９に示す塩基配列の第１０３番目のチミンをグアニンに、第１０４番目のグアニンをシトシンに置換するための５′−ＧＧＴＴＧＴＡＧＣＧＴＧＡＡＧＴＣＧＧＣＣ−３′で表されるオリゴヌクレオチドを化学合成して用いたこと以外は同様にしてＰＣＲ反応を行った。その結果、配列表における配列番号２９に示す塩基配列の第１０３番目及び第１０４番目の塩基がそれぞれグアニン及びシトシンであること以外は配列番号２９の塩基配列における第１乃至１１１番目の塩基からなる配列と同一の塩基配列を含有するＤＮＡ断片１１を得た。
【００７８】
実施例Ａ−１（ａ）に記載のＤＮＡ断片３を得るためのＰＣＲ反応において、ＤＮＡ断片１、ＤＮＡ断片２及びアンチセンスプライマー２に代えて、上記で得たＤＮＡ断片１０、ＤＮＡ断片１１及びアンチセンスプライマー３をそれぞれ用いた以外はすべて同様にしてＰＣＲ反応を行った。その結果、配列表における配列番号１３に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片１２を得た。このＤＮＡ断片１２は、配列表における配列番号２２に示す塩基配列と、その塩基配列の５′末端に連結された配列番号２４に示す塩基配列及び制限酵素ＸｈｏＩによる認識部位と、３′末端に連結された終止コドンＴＡＧ及び制限酵素ＮｏｔＩによる認識部位からなっていた。
【００７９】
実施例Ａ−１（ａ）に記載の組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ１２』を得るための一連の処理において、ＤＮＡ断片６に代えて上記で得たＤＮＡ断片１２を用いた以外は同様にして処理したところ、自律複製可能な組換えＤＮＡ『ｐＣＳＭＩＧＩＦ／ＭＵＴ１１』が得られた。図１０に示すように、この組換えＤＮＡにおいては、配列表における配列番号２２に示す塩基配列を含むｃＤＮＡ『ｍＩＧＩＦ／ＭＵＴ１１』がヒトインターフェロン−αにおけるサブタイプα２ｂのシグナルペプチドをコードする塩基配列ＩＦＮｓｓの下流に連結されていた。配列表における配列番号２２に示す塩基配列は、そこに併記したアミノ酸配列に見られるように、配列番号５に示すアミノ酸配列の野生型ポリペプチドにおける第７番目のシステインがアラニンに置換されたアミノ酸配列をコードするものである。
【００８０】
対照として、実施例（ａ）に記載の組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ１２』を得た一連の処理において、ＤＮＡ断片６に代えて上記で得たＤＮＡ断片９を用いた以外は同様にして処理したところ、自律複製可能な組換えＤＮＡ『ｐＣＳＭＩＧＩＦ／ＷＴ』が得られた。図１１に示すようにこの組換えＤＮＡにおいては、野生型ポリペプチドをコードする配列表における配列番号２８に示す塩基配列を含有するｃＤＮＡ『ｍＩＧＩＦ／ＷＴ』がヒトインターフェロン−αにおけるサブタイプα２ｂのシグナルペプチドをコードする塩基配列『ＩＦＮｓｓ』の下流に連結されていた。
【００８１】
＜実施例Ａ−８（ｂ）：形質転換体によるポリペプチドの製造＞
実施例Ａ−１（ｂ）に記載のポリペプチドの製造において、組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ１２』に代えて実施例Ａ−８（ａ）で得た組換えＤＮＡ『ｐＣＳＭＩＧＩＦ／ＭＵＴ１１』を用いた以外は同様にして、組換えＤＮＡを抽出し、組換えＤＮＡをＣＯＳ−１細胞に導入し、組換えＤＮＡの導入されたＣＯＳ−１細胞を培養して培養物を得た。培養物を、同じ特許出願人による特開平８−２１７７９８号公報に記載されたモノクローナル抗体を用いるウェスタンブロッティング法により分析したところ、配列表における配列番号５に示すアミノ酸配列の第７番目のシステインがアラニンに置換されたアミノ酸配列を有し、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するこの発明のポリペプチドが培養物１ｍｌ当り約２０ｎｇ産生していた。
【００８２】
対照として、実施例Ａ−８（ａ）の方法により得た組換えＤＮＡ『ｐＣＳＭＩＧＩＦ／ＷＴ』を、組換えＤＮＡ『ｐＣＳＭＩＧＩＦ／ＭＵＴ１１』と同様に処理したところ、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドが産生された。このポリペプチド産生量は、『ｐＣＳＭＩＧＩＦ／ＭＵＴ１１』を用いた場合と比較して有意に低かった。このことは、本実施例で得たこの発明のポリペプチドが、野生型ポリペプチドと比較して、安定性及び生理活性が高いことを示している。
【００８３】
＜実施例Ａ−８（ｃ）：ポリペプチドの精製＞
実施例Ａ−８（ｂ）の方法により得たこの発明のポリペプチドを含む培養液を遠心分離し、上清を採取した。別途、同じ特許出願人による特開平８−２１７７９８号公報に記載された方法にしたがってモノクローナル抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィー用ゲルを調製し、プラスチック製円筒管にカラム状に充填し、ＰＢＳで洗浄した後、上記上清を負荷した。カラムを新鮮なＰＢＳで洗浄した後、３５ｍＭエチルアミン水溶液（ｐＨ１０．８）を通液し、溶出画分から免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドを含む画分を採取し、ＰＢＳに対して透析し、膜濾過により濃縮し、凍結乾燥して純度約９５％のポリペプチド固状物を得た。並行して、組換えＤＮＡ『ｐＣＳＭＩＧＩＦ／ＷＴ』を用いて得た野生型ポリペプチドを含む培養物を同様にして精製し、後記理化学的性質の解明における対照として用いた。
【００８４】
＜実施例Ａ−８（ｄ）：分子量＞
実施例Ａ−８（ｃ）での方法により得たこの発明のポリペプチドを、実施例Ａ−１（ｄ）に準じてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、分子量１８，５００乃至１９，５００ダルトンに相当する位置にＩＦＮ−γ産生能あるポリペプチドの主バンドが観察された。
【００８５】
＜実施例Ａ−８（ｅ）：Ｎ末端アミノ酸配列＞
実施例Ａ−１（ｅ）に準じて分析したところ、実施例Ａ−８（ｃ）の方法により得たこの発明のポリペプチドは、Ｎ末端に配列表における配列番号３０に示すアミノ酸配列を有していた。
【００８６】
＜実施例Ａ−８（ｆ）：安定性＞
実施例Ａ−８（ｃ）の方法により得たこの発明のポリペプチド及び野生型ポリペプチドを、０．２ｇ／ｍｌマルトースを含むＰＢＳにポリペプチド固形物として約１００ｎｇ／ｍｌになるようにそれぞれ別々に溶解し、溶液を４０℃で２４時間インキュベートした。インキュベート開始から０時間、３時間、９時間及び２４時間にそれぞれの溶液から一部をサンプリングしてそのＩＦＮ−γ産生の誘導能の経時変化を調べた。ＩＦＮ−γ産生の誘導能は、後記実施例Ａ−８（ｇ）に詳述した方法により求め、インキュベート開始後０時間の値を基準にして、各インキュベーション時間における残存活性の百分率（％）を計算した。結果を図１２に示す。
【００８７】
図１２の結果に見られるように、本発明のポリペプチドは野生型ポリペプチドと比較して安定性が有意に高く、生理活性がより長時間持続した。このことは、本実施例におけるアミノ酸の置換が、野生型ポリペプチドの生理活性を損なうことなく安定性を高めるのに有効であることを物語っている。
【００８８】
＜実施例Ａ−８（ｇ）：免疫担当細胞におけるＩＦＮ−γの産生＞
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスより免疫担当細胞として脾細胞を採取し、細胞を１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を補足したＲＰＭＩ−１６４０培地に浮遊させ、細胞浮遊液に実施例Ａ−８（ａ）の方法で得たこの発明のポリペプチド又は野生型ポリペプチドを、コンカナバリンＡ又はインターロイキン２の存在するか又はしない条件下で添加し、培養した後、産生したＩＦＮ−γを酵素免疫測定法により測定することにより、ＩＦＮ−γの産生の誘導能を調べた。その結果、この発明のポリペプチドは、免疫担当細胞としてのマウス脾細胞におけるＩＦＮ−γの産生を誘導し、その誘導能は、野生型ポリペプチドの場合と同等以上であることが確認された。
【００８９】
＜実施例Ａ−８（ｈ）：急性毒性試験＞
実施例Ａ−１（ｊ）に記載の方法にしたがって、実施例Ａ−８（ａ）の方法で得たこの発明のポリペプチドの急性毒性試験を実施した。その結果、当該ポリペプチドのＬＤ５０は、いずれの投与経路によっても約１ｍｇ／ｋｇマウス体重以上であり、哺乳動物に対する医薬品に配合して安全であることが確認された。
【００９０】
＜実施例Ａ−９：ポリペプチドの製造＞
実施例Ａ−８（ａ）の方法により得たＤＮＡ断片９を鋳型に用い、配列表における配列番号５に示すアミノ酸配列の１２５番目のシステインをセリンに置換するための変異センスプライマー及び変異アンチセンスプライマーとして、それぞれ、５′−ＧＧＡＣＡＣＴＴＴＣＴＴＧＣＴＡＧＣＣＡＡＡＡＧＧ−３′及び５′−ＣＣＴＴＴＴＧＧＣＴＡＧＣＡＡＧＡＡＡＧＴＧＴＣＣ−３′で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた以外は実施例Ａ−８（ａ）と同様にして処理し、配列表における配列番号２３に示す塩基配列を含む自律複製可能な組換えＤＮＡ『ｐＣＳＭＩＧＩＦ／ＭＵＴ１２』を得た。図１３に示すように、この組換えＤＮＡにおいては、配列表における配列番号１４に示すアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ『ｍＩＧＩＦ／ＭＵＴ１２』がヒトインターフェロン−αにおけるサブタイプα２ｂのシグナルペプチドをコードする塩基配列ＩＦＮｓｓの下流に連結されていた。
【００９１】
この組換えＤＮＡを実施例Ａ−１（ｂ）と同様にしてＣＯＳ−１細胞に導入し、得られた形質転換体を培養したところ、配列表における配列番号１４に示すアミノ酸配列を含有するポリペプチドが培養培地１ｍｌ当り約５０ｎｇ産生していた。この培養物を実施例Ａ−８の方法により精製し、理化学的性質を調べたところ、本実施例のポリペプチドは実施例Ａ−８の方法により得たこの発明のポリペプチドと同様の分子量とＮ末端アミノ酸配列を有し、同様に毒性が低かった。さらに、実施例Ａ−８（ｆ）の方法により安定性を調べたところ、図１２に見られるように、本実施例のポリペプチドは野生型ポリペプチドと比較して安定性が有意に高かった。これらの事実は、本実施例におけるアミノ酸の置換が野生型ポリペプチドの生理活性を損なうことなく安定性を高めるのに有効であることを物語っている。
【００９２】
＜実施例Ｂ−１：液剤＞
安定剤として１％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミンを含む生理食塩水に実施例Ａ−１乃至Ａ−９の方法により得たこの発明の精製ポリペプチドのいずれかを１ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、常法にしたがって精密濾過により滅菌して７種類の液剤を得た。
【００９３】
安定性に優れた本品は、ヒトを含む哺乳動物の、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、感染症及び免疫疾患を含む感受性疾患を治療・予防するための注射剤、点眼剤及び点鼻剤として有用である。
【００９４】
＜実施例Ｂ−２：乾燥注射剤＞
安定剤として１％（ｗ／ｖ）精製ゼラチンを含む生理食塩水１００ｍｌに実施例Ａ−１乃至Ａ−９の方法により得たこの発明の精製ポリペプチドのいずれかを１００ｍｇ溶解し、常法にしたがって精密濾過により除菌し、バイアル瓶に１ｍｌずつ分注し、凍結乾燥した後、密栓して７種類の乾燥製剤を得た。
【００９５】
安定性に優れた本品は、ヒトを含む哺乳動物の、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、感染症及び免疫疾患を含む感受性疾患を治療・予防するための乾燥注射剤として有用である。
【００９６】
＜実施例Ｂ−３：軟膏剤＞
滅菌蒸留水に和光純薬工業製カルボキシビニルポリマー『ハイビスワコー１０４』と林原製結晶トレハロース粉末『トレハロース』をそれぞれ濃度１．４％（ｗ／ｗ）及び２．０％（ｗ／ｗ）になるように溶解し、実施例Ａ−１乃至Ａ−９の方法により得たこの発明の精製ポリペプチドのいずれかを均一に混合した後、ｐＨ７．２に調整して、１ｇ当り精製ポリペプチドを約１ｍｇ含む７種類のペースト状物を得た。
【００９７】
延展性と安定性に優れた本品は、ヒトを含む哺乳動物の、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、感染症及び免疫疾患を含む感受性疾患の治療・予防するための軟膏剤として有用である。
【００９８】
＜実施例Ｂ−４：錠剤＞
林原製無水結晶α−マルトース粉末『ファイントース』に実施例Ａ−１乃至Ａ−９の方法により得たこの発明の精製ポリペプチドのいずれかと細胞賦活剤としてのルミンを均一に混合し、得られる混合物を常法により打錠して製品１錠（約２００ｍｇ）当り精製ポリペプチド及びルミンをそれぞれ約１ｍｇ含む７種類の錠剤を得た。
【００９９】
摂取性、安定性に優れ、細胞賦活作用も含有する本品は、ヒトを含む哺乳動物の、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、感染症及び免疫疾患を含む感受性疾患を治療・予防するための錠剤として有用である。
【０１００】
＜実施例Ｂ−５：養子免疫療法剤＞
悪性リンパ腫患者の末梢血から単核球を単離し、３７℃に予温した１０％（ｖ／ｖ）ヒトＡＢ血清を補足したＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．２）に細胞密度約１×１０6 個／ｍｌになるように浮遊させ、養子免疫療法剤として実施例Ａ−１乃至Ａ−７の方法により得たこの発明の精製ポリペプチドのいずれかを約１０ｎｇ／ｍｌと組換え型ヒトインターロイキン２を約１００単位／ｍｌ加え、５％ＣＯ2
インキュベーター中、３７℃で１週間培養した後、遠心分離したＬＡＫ細胞を採取した。
【０１０１】
このＬＡＫ細胞は、元の悪性リンパ腫患者の体内に移入すると、リンパ腫細胞に顕著な細胞障害性を示し、インターロイキン２のみ用いる養子免疫療法と比較して有意に高い治療効果を発揮する。なお、ヒト単核球に代えて腫瘍組織浸潤リンパ球を同様に処置して得られる細胞障害性Ｔ細胞も、元の患者の体内に移入すると、ＬＡＫ細胞と同様の効果を発揮する。本実施例の養子免疫療法剤は、悪性リンパ腫以外に、例えば、悪性腎腫瘍、悪性黒色腫、大腸癌、肺癌などの固形悪性腫瘍にも有利に適用できる。
【０１０２】
ＩＦＮ−γはウイルス、細菌などに対する感染防御、悪性腫瘍の増殖抑制、免疫機能の調節作用を通じてヒトの生体防御、さらには、イムノグロブリンＥ抗体の産生阻害に多大の関与をすることが知られている。しかも、前述のとおり、ＩＦＮ−γはヒトの感受性疾患剤としてすでに実用化されており、その対象疾患、用量、用法及び安全性はほぼ確立した状況にある。一方、フランセス・アール・バークウィル著、渡部好彦訳、『サイトカインとがん治療』、１９９１年、東京化学同人発行などにも記載されているように、ＮＫ細胞及びＬＡＫ細胞などのキラー細胞を利用する療法は、抗腫瘍免疫療法を始めとして、多種多様のヒト疾患に対して試みられ、総じて良好な成果が報告されている。最近では、サイトカインを用いるキラー細胞による細胞障害性の増強又はキラー細胞の精製の誘導と治療効果との関連性が注目されており、例えば、ティー・フジオカら『ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ユーロロジー』、第７３巻、第１号、２３乃至３１頁（１９９４年）には、ＬＡＫ細胞とインターロイキン２を併用する抗腫瘍免疫療法において、インターロイキン２がＬＡＫ細胞の生成を顕著に誘導し、重篤な毒性や副作用を惹起することなく、ヒトの転移癌に格別の効果を発揮したことが報告されている。
【０１０３】
このように、多種多様のヒト疾患の治療・予防にＩＦＮ−γやキラー細胞が深く係わり、その完治又は緩解への多大の寄与が明らかになっている。斯かる状況において、実施例Ａ−１乃至Ａ−９の結果に見られるように、当該ポリペプチドが顕著な毒性を示すことなく、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するとともに、ＮＫ細胞による細胞障害性の増強又はＬＡＫ細胞の生成を誘導したことは、この発明の感受性疾患剤が重篤な副作用を惹起することなくヒトを含む哺乳動物に長期間連用でき、ＩＦＮ−γ及び／又はキラー細胞が関与する疾患の治療・予防に効果を発揮することを示している。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
以上説明したごとく、この発明は免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する安定なポリペプチドの創製に基づくものである。この発明のポリペプチドはアミノ酸配列までが解明された物質であり、しかも、野生型ポリペプチドと比較して安定性が高いので、実用に際して生理活性がより長時間持続する特徴がある。これにより、この発明のポリペプチドは細胞培養によりＩＦＮ−γを製造するためのＩＦＮ−γ誘導剤として、さらには、ヒトを含む哺乳動物における、ＩＦＮ−γ感受性を有するウイルス疾患、感染症、悪性腫瘍、免疫疾患一般に対する治療剤・予防剤として多種多様の用途を有することとなる。また、キラー細胞による細胞障害性の増強又はキラー細胞の生成を誘導する性質を兼備するこの発明のポリペプチドを有効成分とする感受性疾患剤は、悪性腫瘍などの難治性疾患の治療に格別の効果を発揮する。
【０１０５】
さらに、この発明のポリペプチドは強力なＩＦＮ−γ誘導能を有することから、一般に少量で所期のＩＦＮ−γ産生を誘導でき、また、毒性が極めて低いことから、多量投与しても重篤な副作用を惹起することがない。したがって、この発明のポリペプチドは、使用に際して用量を厳密に管理しなくても、所望のＩＦＮ−γを迅速に誘導できる利点がある。斯くも有用なるポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術を利用するこの発明の製造方法により、所望量を容易に製造することができる。
【０１０６】
この発明は斯くも顕著な作用効果を奏するものであり、斯界に貢献すること誠に多大な意義のある発明であると言える。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】この発明のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ１２』の構造を示す図である。
【図２】野生型ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＷＴ』の構造を示す図である。
【図３】この発明のポリペプチド及び野生型ポリペプチドの活性経時変化を示す図である。
【図４】この発明のポリペプチドをコードするさらに別の組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ２１』の構造を示す図である。
【図５】この発明のポリペプチドをコードするさらに別の組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ２５』の構造を示す図である。
【図６】この発明のポリペプチドをコードするさらに別の組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ３２』の構造を示す図である。
【図７】この発明のポリペプチドをコードするさらに別の組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ４１』の構造を示す図である。
【図８】この発明のポリペプチドをコードするさらに別の組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ３５』の構造を示す図である。
【図９】この発明のポリペプチドをコードするさらに別の組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ４２』の構造を示す図である。
【図１０】この発明のポリペプチドをコードするさらに別の組換えＤＮＡ『ｐＣＳＭＩＧＩＦ／ＭＵＴ１１』の構造を示す図である。
【図１１】野生型ポリペプチドをコードする別の組換えＤＮＡ『ｐＣＳＭＩＧＩＦ／ＷＴ』の構造を示す図である。
【図１２】この発明のポリペプチド及び野生型ポリペプチドの活性経時変化を示す図である。
【図１３】この発明のポリペプチドをコードするさらに別の組換えＤＮＡ『ｐＣＳＭＩＧＩＦ／ＭＵＴ１２』の構造を示す図である。
【符号の説明】
【０１０８】
ＣＭＶ：サイトメガロウイルス・プロモーター
ＩＦＮｓｓ：ヒトインターフェロン−αにおけるサブタイプα２ｂのシグナルペプチドをコードする配列
ＩＧＩＦ／ＷＴ：野生型ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ
ＩＧＩＦ／ＭＵＴ１２乃至ＩＧＩＦ／ＭＵＴ４２：この発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡ
ｍＩＧＩＦ／ＷＴ：別の野生型ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ
ｍＩＧＩＦ／ＭＵＴ１１及びｍＩＧＩＦ／ＭＵＴ１２：この発明の別のポリペプチドをコードするｃＤＮＡ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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