(57)【要約】【課題】固相と標識抗体との非特異反応により生じるバックグラウンド（ノイズ）の影響を回避し、より正確な測定結果を得ることができる、被検物質の測定方法を提供することである。【解決手段】（ａ）固相上に捕捉体、第一の特異結合物質、被検物質および第二の特異結合物質を含む第一の複合体を形成させる工程、（ｂ）第一の複合体が形成された固相を洗浄する工程、（ｃ）捕捉体または第二部位に特異的に結合する遊離剤を含む溶液中で、第一の特異結合物質、被検物質および第二の特異結合物質を含む第二の複合体を固相から溶液に遊離させる工程、（ｄ）第二の複合体を含む溶液を固相から分離する工程、および（ｅ）分離された溶液中の標識を測定する工程を含む被検物質の測定方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）被検物質を含み得る試料に対して、固相に固定された捕捉体、被検物質に特異的に結合する第一部位と捕捉体に特異的に結合する第二部位とを有する第一の特異結合物質、および被検物質に特異的に結合し標識された第二の特異結合物質を用いて、固相上に捕捉体、第一の特異結合物質、被検物質および第二の特異結合物質を含む第一の複合体を形成させる工程、
（ｂ）第一の複合体が形成された固相を洗浄する工程、
（ｃ）捕捉体または第二部位に特異的に結合する遊離剤を含む溶液中で、遊離剤が第一の複合体中の捕捉体または第二部位に結合することにより、第一の特異結合物質、被検物質および第二の特異結合物質を含む第二の複合体を固相から溶液に遊離させる工程、
（ｄ）第二の複合体を含む溶液を固相から分離する工程、および
（ｅ）分離された溶液中の標識を測定する工程
を含む被検物質の測定方法。
【請求項２】
工程（ａ）が、被検物質を含み得る試料と第一の特異結合物質を混合して、被検物質と第一の特異結合物質とが結合した第一反応物を形成する工程、固相に固定された捕捉体と第一反応物中の第一の特異結合物質とが結合した第二反応物を形成する工程、および第二反応物中の被検物質と第二の特異結合物質とを結合させることにより第一の複合体を形成する工程からなる請求項１記載の方法。
【請求項３】
捕捉体がアビジン、第一の特異結合物質の第一部位が被検物質特異抗体、第一の特異結合物質の第二部位がデスチオビオチン、第二の特異結合物質が、標識された被検物質特異抗体、および遊離剤がビオチンである請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
請求項１、２または３記載の方法を実施するためのキットであって、固相に固定された捕捉体、被検物質と捕捉体とに結合する第一の特異結合物質、被検物質に結合する標識された第二の特異結合物質および／または遊離剤を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検物質の測定方法に関する。詳しくは、本発明は、抗原抗体反応などの被検物質に対する特異的結合を利用する被検物質の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ヒトの臨床検査をはじめとして、獣医検査、食品検査など多くの分野で、被検物質に対する特異結合物質を用いる被検物質の測定法が広く普及している。例えば、抗原、抗原に対して特異的に結合する抗体であって固相に固定された抗体、および抗原に対して特異的に結合する抗体であって標識された抗体の３つの因子からなる免疫複合体を固相上に形成させ、免疫複合体中の標識を測定する抗原の測定法が知られている。しかしながら、そのような方法においては、もともと固相自体に標識抗体が非特異的に結合しやすい場合、形成された免疫複合体の正確な量を図ることが困難となる。また非特異的なシグナルが大きいほど、測定感度が低下することになる。
【０００３】
固相上の複合体を測定する従来の測定法については、非特異結合の回避、測定感度の向上などを目的とする様々な試みがなされている。たとえば、特許文献１には、固相上に形成された複合体を別の固相に移し変えた後に、固相上の複合体を測定する測定法が開示されている。しかしながら、そのような方法では、固相上に複合体を形成する工程が２回必要であるため、操作が煩雑である。
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−１０７０８９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、固相と標識抗体との非特異反応により生じるバックグラウンド（ノイズ）の影響を回避し、より正確な測定結果を得ることができる、被検物質の測定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記課題を解決するための手段として、本発明は、
（ａ）被検物質を含み得る試料に対して、固相に固定された捕捉体、被検物質に特異的に結合する第一部位と捕捉体に特異的に結合する第二部位とを有する第一の特異結合物質、および被検物質に特異的に結合し標識された第二の特異結合物質を用いて、固相上に捕捉体、第一の特異結合物質、被検物質および第二の特異結合物質を含む第一の複合体を形成させる工程、
（ｂ）第一の複合体が形成された固相を洗浄する工程、
（ｃ）捕捉体または第二部位に特異的に結合する遊離剤を含む溶液中で、遊離剤が第一の複合体中の捕捉体または第二部位に結合することにより、第一の特異結合物質、被検物質および第二の特異結合物質を含む第二の複合体を固相から溶液に遊離させる工程、
（ｄ）第二の複合体を含む溶液を固相から分離する工程、および
（ｅ）分離された溶液中の標識を測定する工程
を含む被検物質の測定方法を提供する。
【０００７】
前記方法において、工程（ａ）は、被検物質を含み得る試料と第一の特異結合物質を混合して、被検物質と第一の特異結合物質とが結合した第一反応物を形成する工程、固相に固定された捕捉体と第一反応物中の第一の特異結合物質とが結合した第二反応物を形成する工程、および第二反応物中の被検物質と第二の特異結合物質とを結合させることにより第一の複合体を形成する工程からなることが好ましい。
【０００８】
さらに、前記方法において、捕捉体はアビジン、第一の特異結合物質の第一部位は被検物質特異抗体、第一の特異結合物質の第二部位はデスチオビオチン、第二の特異結合物質は、標識された被検物質特異抗体、および遊離剤はビオチンであることが好ましい。
【０００９】
また、本発明は、前記方法を実施するためのキットであって、固相に固定された捕捉体、被検物質と捕捉体とに結合する第一の特異結合物質、被検物質に結合する標識された第二の特異結合物質および／または遊離剤を含むキットを提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明を用いれば、バックグラウンドの影響を回避することができ、たとえ被検物質が微量であっても十分に測定することができる。
【００１１】
また本発明によれば、たとえば、被検物質、第一の特異結合物質および標識された第二の特異結合物質を含む複合体のみを分離して被検物質を測定するため、測定の際、非特異的に固相に結合した第二の特異結合物質からのシグナルの影響を受けない。したがって、より高いS/N比を得ることが可能となり、感度の上昇を実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の被検物質の測定方法は、
（ａ）被検物質を含み得る試料に対して、固相に固定された捕捉体、被検物質に特異的に結合する第一部位と捕捉体に特異的に結合する第二部位とを有する第一の特異結合物質、および被検物質に特異的に結合し標識された第二の特異結合物質を用いて、固相上に捕捉体、第一の特異結合物質、被検物質および第二の特異結合物質を含む第一の複合体を形成させる工程、
（ｂ）第一の複合体が形成された固相を洗浄する工程、
（ｃ）捕捉体または第二部位に特異的に結合する遊離剤を含む溶液中で、遊離剤が第一の複合体中の捕捉体または第二部位に結合することにより、第一の特異結合物質、被検物質および第二の特異結合物質を含む第二の複合体を固相から溶液に遊離させる工程、
（ｄ）第二の複合体を含む溶液を固相から分離する工程、および
（ｅ）分離された溶液中の標識を測定する工程
を含む。
【００１３】
本明細書において、「被検物質」は、検出または定量すべき対象の物質を意味する。被検物質としては、糖、脂質、核酸、ペプチド、タンパク質、細胞などが例示されるが、これらに限定されるものではない。
【００１４】
「試料」は、被検物質を含む疑いのある溶液、懸濁液、抽出液などの液体試料であれば特に限定されない。たとえば、尿、血清、血漿、血液、胆汁、胃腸分泌物、リンパ液、骨髄液、唾液、組織抽出液、組織ホモジネート、細胞抽出液、細胞ホモジネートなどを試料として用いることができる。
【００１５】
「固相」は、捕捉体を固定することができる限り、その形状、サイズおよび材質などに特に制限はない。たとえば、マイクロタイタープレート、チューブ、またはゼラチン粒子、ラテックス粒子、磁性粒子などの粒子など本分野において常用されている固相を適宜使用することができる。溶液と固相との分離を容易に行うことができるという観点から、固相としては、磁性粒子を用いることが好ましい。磁性粒子としては、たとえば、フェライト粒子を用いることができる。
【００１６】
「捕捉体」は、第一の特異結合物質の一部（以下、「第一の特異結合物質の第二部位」または「第二部位」と称する）に特異的に結合する物質である。
【００１７】
固相上に捕捉体を固定させるための方法は、たとえば、吸着法、共有結合法、イオン結合法、架橋法などの常法を適宜使用することができる。
【００１８】
「特異的に結合する」または「特異結合」とは、抗原と抗体との結合、ホルモンとホルモンレセプターとの結合、ＤＮＡハイブリダイゼーション反応におけるＤＮＡ配列とその相補配列との結合、アビジンとビオチンとの結合、アビジンとデスチオビオチンとの結合などに例示されるような、特定の物質が結合することを意味する。
【００１９】
「第一の特異結合物質」は、少なくとも被検物質に特異的に結合する部位（以下、「第一の特異結合物質の第一部位」または「第一部位」と称する）および捕捉体に特異的に結合する第二部位を有する。第一の特異結合物質としては、たとえば、捕捉体に特異的に結合する物質と被検物質に特異的に結合する物質とを化学的に結合したものを用いることができる。捕捉体に特異的に結合する物質および被検物質に特異的に結合する物質の双方がタンパク質である場合は、遺伝子組み換え技術を用いて製造した双方の融合タンパク質を、第一の特異結合物質として使用することもできる。
【００２０】
「第二の特異結合物質」は、少なくとも、被検物質に特異的に結合し、被検物質との結合を検出することができるよう標識されている。たとえば、被検物質がタンパク質である場合には、そのタンパク質に対する抗体に標識を結合させた複合体を第二の特異結合物質として使用することができる。ここで、第二の特異結合物質が結合する被検物質中の領域は、第一部位が結合する領域と異なるものでなければならない。
【００２１】
「標識」としては、本技術分野において通常用いられる標識を適宜用いることができる。標識としては、たとえば、α−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼもしくはペルオキシダーゼなどの酵素、フルオレセイン、クマリン、エオシン、フェナントロリン、ピレンもしくはローダミンなどの蛍光物質、ＤＮＡもしくはＲＮＡなどの核酸、またはラジオアイソトープなどを使用することができる。これらの標識を用いることにより、第二の特異結合物質と被検物質とが結合した場合には被検物質を検出することができる。標識が酵素の場合には、酵素と基質との反応により生じる発色によって、被検物質を検出することができる。標識が蛍光物質の場合には、所定の波長を照射することにより生じる蛍光によって、被検物質を検出することができる。
【００２２】
「第一の複合体」は、少なくとも捕捉体、第一の特異結合物質、被検物質および第二の特異結合物質を含む。第一の複合体において、捕捉体は第一の特異結合物質の第二部位に結合し、第一の特異結合物質の第一部位は被検物質に結合し、被検物質は第二の特異結合物質に結合している。第一の複合体を固相上に形成させる方法としては、たとえば、第一の特異結合物質と被検物質を含み得る試料とを混合することにより第一反応物を製造し、次に第一反応物と固相に固定された捕捉体とを混合することにより第二反応物を製造し、ついで第二反応物と第二の特異結合物質とを混合する方法が挙げられる。あるいは、固相に固定された捕捉体と第一の特異結合物質とを混合することにより第一反応物を製造し、次に第一反応物と被検物質を含み得る試料とを混合することにより第二反応物を製造し、ついで第二反応物と第二の特異結合物質とを混合することにより、第一の複合体を製造してもよい。さらにたとえば、固相に固定された捕捉体、第一の特異結合物質、被検物質を含み得る試料および第二の特異結合物質を混合することにより、第一の複合体を製造してもよい。
【００２３】
「固相の洗浄」は、測定に不要な物質を固相から除去する目的で行う作業であり、常法に基づき適宜実施することができる。たとえば、固相がマイクロタイタープレートまたはチューブの場合、固相の洗浄は、マイクロタイタープレートまたはチューブから液相を吸引除去し、洗浄液を添加し、ついで、洗浄液を吸引除去することにより実施することができる。固相が磁性粒子の場合、磁石を用いて粒子を容器の壁面に固定しながら液相を吸引除去し、洗浄液を添加して粒子を懸濁させ、ついで磁石を用いて粒子を固定しながら洗浄液を吸引除去することにより、固相の洗浄を実施してもよい。固相がゼラチン粒子またはラテックス粒子の場合、粒子が沈殿することができる程度の遠心力により粒子を沈降させ、上清を吸引除去し、洗浄液を添加して粒子を懸濁させ、ついで遠心により再度粒子を沈降させて洗浄液を吸引除去することにより、固相の洗浄を行うことができる。
【００２４】
洗浄液としては、被検物質と第一の特異結合物質との結合を解離させるなど、固相上に形成された第一の複合体に影響を及ぼすものでなければ、特に限定されない。洗浄液としては、たとえば、ＴＢＳ−Ｔ（0.02M Tris-HCl (pH7.6), 0.137M NaCl, 0.1% Tween 20）などの緩衝液を用いることができる。
【００２５】
「遊離剤」は、捕捉体または第一の特異結合物質中の第二部位に結合することができ、かつ、捕捉体または第二部位に結合することによって捕捉体と第二部位との結合を分離または解離することができる物質である。固相上に形成された第一の複合体に遊離剤を混合すれば、遊離剤が捕捉体または第二部位に結合、すなわち、遊離剤が捕捉体または第二部位と置換される。その結果、第一の特異結合物質、被検物質および第二の特異結合物質を含む複合体、または遊離剤、第一の特異結合物質、被検物質および第二の特異結合物質を含む複合体（これらを「第二の複合体」と称する）が固相から溶液に遊離する。たとえば、捕捉体がアビジン、第二部位がデスチオビオチンである場合には、遊離剤としてビオチンを用いることができる。また、捕捉体がデスチオビオチン、第二部位がアビジンである場合にも、遊離剤としてビオチンを用いることができる。しかしながら、ビオチンとアビジンとの結合は、デスチオビオチンとアビジンとの結合よりも強力であるため、たとえば、ビオチンを第一部位として使用し、遊離剤としてデスチオビオチンを使用することはできない。
【００２６】
たとえば、ある物質Ａを遊離剤として使用し得るか否かは、次のようにして確認することができる。捕捉体が固定されたマイクロタイタープレートに、標識された第二部位を混合することにより、プレート上に捕捉体と標識された第二部位との反応物を形成させる。プレートを洗浄した後、物質Ａの溶液をプレートに添加し、捕捉体または第二部位との反応に十分な時間プレートを静置する。そのプレートから溶液を分離し、溶液に含まれる標識量を測定する。溶液中に標識が含まれている場合、物質Ａは遊離剤として使用することができる。遊離剤としては、捕捉体を介してプレート上に固定された第二部位の３０％以上を溶液中に遊離させることができる物質を使用することが好ましい。さらに好ましくは、プレート上に固定された第二部位の５０％以上を溶液中に遊離させることができる物質を遊離剤として使用する。
【００２７】
「測定」は、被検物質を検出すること、または被検物質の量もしくは濃度を測定することを意味する。検出または測定は、常法に基づき適宜実施することができる。たとえば発光を測定する場合、市販のフォトンカウンタを用いて実施することができる。
【００２８】
捕捉体、第一の特異結合物質の第一部位および第二部位、第二の特異結合物質ならびに遊離剤の組み合わせとしては、たとえば以下のものを例示することができる。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
表１において、「アビジン類」とは、たとえばアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンなど、ビオチンおよびビオチン類似体と特異的に結合し得るものを意味する。
【００３１】
表１において、「ビオチン類」は、たとえばビオチン、またはビオチン誘導体を含む。ビオチン誘導体としては、具体的には、デスチオビオチンなどが例示される。デスチオビオチンを第一の特異結合物質の第一部位として使用する場合、遊離剤としては、デスチオビオチンとアビジン類との結合を解離することができる物質、たとえばビオチンを用いることができる。
【００３２】
「ハプテン類似体」としては、ハプテン誘導体などが挙げられる。具体的には、ハプテンとして２，４−ジニトロフェニル基が例示され、ジニトロフェニル基の類似体としてはε−Ｎ−２，４−ジニトロフェニル−Ｌ−リジンが例示される。
【００３３】
「ホルモン類似体」としては、ホルモン誘導体などが挙げられる。
【００３４】
抗被検物質抗体、抗ハプテン抗体などの抗体は、常法に基づき製造することができる。たとえば、被検物質に対する抗体は、マウス、ラット、ウマ、ヤギおよびウサギなどの適当な動物を被検物質で免疫することによって製造することができる。また、抗体を産生するハイブリドーマの培養液からモノクローナル抗体を得ることができる。ハイブリドーマを投与したマウスの腹水から、モノクローナル抗体を得ることもできる。なお、ハプテンは遊離の状態では抗体の産生を誘導することができない。抗ハプテン抗体を製造する際には、免疫原として、ハプテンと異種由来の生体高分子（担体）とを共有結合して得られるハプテン−担体複合体を使用する。担体としては、たとえば、オボアルブミン、ニワトリγグロブリン、スカシガイのヘモシアニンなどのタンパク質が用いられる。
【００３５】
ハイブリドーマは、通常の方法、たとえば以下の手順により得ることができる。すなわち、感作抗原として、被検物質をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）等の適当な緩衝液中に溶解あるいは懸濁した抗原液を用いる。抗原液において、抗原濃度は、たとえば50〜500μg/mLとすることができる。免疫の際には、免疫原と、たとえば不完全フロイントアジュバントなどのアジュバントとの混合物を動物に投与することが好ましい。また、キャリアータンパク質としてアルブミンやキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等を用いてもよい。Ｂａｌｂ／ｃマウスに免疫を行う場合、アジュバント混合抗原液０．０５〜１ｍＬ（抗原物質１０〜２００μｇ）を腹腔内、皮下または筋肉内に注射する。さらに、初回の免疫から約４〜２１日毎に１〜４回免疫を行う。最終免疫より約３〜５日後、免疫動物から脾細胞を分離してリンパ球を得る。得られたリンパ球は、常法に基づき、たとえばマウスのミエローマ細胞と融合する。ハイブリドーマを適当な方法を用いてスクリーニングし、限界希釈法などにより、所望のハイブリドーマを単一クローンとして分離する。
【００３６】
抗体は、たとえば、ハイブリドーマを適当な培地にて培養することにより、培養液中に分泌される。したがって、たとえば、ハイブリドーマの培養液または培養液からの精製物を、本発明の方法に用いることができる。あるいは、ハイブリドーマを投与したマウスの腹水またはその精製物を、本発明の方法に用いることができる。抗体の精製は、たとえば沈殿分画法、イオン交換樹脂カラムによるIgG精製および／または抗原固定化カラムによる精製などの常法により、適宜実施することができる。
【００３７】
本発明のキットは、本発明の方法を実施する目的のキットである限り、特に限定されない。固相に固定された捕捉体、被検物質と捕捉体とに結合する第一の特異結合物質、被検物質に結合する標識された第二の特異結合物質および遊離剤のうち、少なくとも１つの試薬を含むものであればよい。たとえば、固相に固定された捕捉体、被検物質と捕捉体とに結合する第一の特異結合物質、被検物質に結合する標識された第二の特異結合物質および遊離剤が１つの箱に納められているものを、本発明のキットとすることができる。あるいは、個別に包装される各試薬を本発明のキットとしてもよい。たとえば、標識としてラジオアイソトープを用いた場合など、保管条件が異なる試薬を使用する場合は、第二の特異結合物質のみを個別に包装してもよい。また、本発明のキットは、希釈液、洗浄液または標準液を備えていてもよい。
【００３８】
本発明の方法の実施態様として、たとえば、次の方法を例示することができる。第一の特異結合物質と被検物質を含み得る試料とを混合し、反応に十分な時間静置することにより、第一の特異結合物質と被検物質とからなる第一反応物を得る。次に、第一反応物と固相に固定された捕捉体とを混合し、反応に十分な時間静置することにより、第一反応物と捕捉体とからなる第二反応物、すなわち、固相に固定された捕捉体、第一の特異結合物質および被検物質からなる第二反応物を得る。ここで、第二反応物が固定された固相を洗浄してもよい。固相の洗浄は、上述した方法により実施することができる。ついで、第二反応物と第二の特異結合物質とを混合し、反応に十分な時間静置することにより、第一の複合体、すなわち固相に固定された捕捉体、第一の特異結合物質、被検物質および第二の特異結合物質からなる第一の複合体を得る。第一の複合体が固定されている固相を洗浄した後、第一の複合体と遊離剤とを混合する。混合手順は特に限定されない。第一の複合体と遊離剤とを混合し、反応に十分な時間静置することにより、第二の複合体、すなわち第一の特異結合物質、第二の特異結合物質、被検物質および第二の特異結合物質からなる第二の複合体が、固相から溶液に遊離する。ついで、遊離した第二の複合体を含む溶液を固相から分離する。第二の複合体を含む溶液を固相から分離する際には、常法を用いることができる。たとえば、固相がマイクロタイタープレートまたはチューブの場合、シリンジおよびピペット等を用いて溶液を吸引することにより、第二の複合体を含む溶液を固相から分離してもよい。固相が磁性粒子の場合、磁石を用いて粒子を容器の壁面に固定しながらシリンジおよびピペット等を用いて溶液を吸引することにより、第二の複合体を含む溶液を固相から分離してもよい。あるいは、固相がゼラチン粒子またはラテックス粒子の場合、粒子が沈殿することができる程度の遠心力により粒子を沈降させ、シリンジおよびピペット等を用いて溶液を吸引することにより、第二の複合体を含む溶液を固相から分離してもよい。次に、第二の複合体を含む溶液中に含まれる標識を測定する。測定は、常法に基づき適宜実施することができる。
【００３９】
本発明の方法の他の実施態様として、たとえば、次の方法を例示することができる。固相に固定された捕捉体と第一の特異結合物質とを混合し、反応に十分な時間静置することにより、固相に固定された捕捉体と第一の特異結合物質とからなる第一反応物を得る。ここで、第一反応物が固定された固相を洗浄してもよい。固相の洗浄は、上述の方法により実施することができる。次に、第一反応物と被検物質を含み得る試料とを混合し、反応に十分な時間静置することにより、第一反応物と被検物質とからなる第二反応物、すなわち、固相に固定された捕捉体、第一の特異結合物質および被検物質からなる第二反応物を得る。ここで、第二反応物が固定された固相を、たとえば上述の方法にしたがって洗浄してもよい。ついで、第二反応物と第二の特異結合物質とを混合し、反応に十分な時間静置することにより、第一の複合体を得る。第一の複合体が固定されている固相を洗浄した後、第一の複合体と遊離剤とを混合する。混合手順は特に限定されない。第一の複合体と遊離剤とを混合し、反応に十分な時間静置することにより、第二の複合体が固相から溶液に遊離する。ついで、遊離した第二の複合体を含む溶液を固相から分離する。第二の複合体を含む溶液を固相から分離する方法としては、上述したように常法を用いることができ、特に限定されない。次に、第二の複合体を含む溶液中に含まれる標識を測定する。測定は、常法に基づき適宜実施することができる。
【００４０】
本発明の方法のさらなる実施態様として、たとえば、次の方法を例示することができる。固相に固定された捕捉体、第一の特異結合物質、被検物質および第二の特異結合物質を含み得る試料を混合し、反応に十分な時間静置することにより、固相に固定された捕捉体、第一の特異結合物質、被検物質および第二の特異結合物質からなる第一の複合体を得る。第一の複合体が固定されている固相を洗浄した後、第一の複合体と遊離剤とを混合する。混合手順は特に限定されない。第一の複合体と遊離剤とを混合し、反応に十分な時間静置することにより、第二の複合体が固相から溶液に遊離する。ついで、遊離した第二の複合体を含む溶液を固相から分離する。第二の複合体を含む溶液を固相から分離する方法としては、前述したように常法を用いることができ、特に限定されない。次に、第二の複合体を含む溶液中に含まれる標識を測定する。測定は、常法に基づき適宜実施することができる。
【００４１】
以下に、実施例および比較例を示すことにより、本発明をさらに詳細に説明する。ただし、以下の実施例により、本発明が限定されるものではない。
【００４２】
（実施例１）
TBS-T-BSA（0.1% Tween 20、1% BSA、0.02% NaN3；調製後、0.2μmメッシュのフィルターでろ過）で4μg/mLに希釈したDSB-X Biotin-1053を、50μLずつ8連チューブに分注した。そのチューブに、TBS-T-BSAに溶解した0.01、0.1、1 ng/mLのリコンビナントHBsAg（BIODESIGN International製、0.48mg/mL、Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原サブタイプadr、 カタログ番号R86783、Lot 4A01303）を20μLずつ添加し、チューブを室温で1分間静置した。なお、TBS-T-BSAのみを20μL添加したものをコントロールとし、HBsAgを添加したものと同様に以下の処理を行った。ここで使用したDSB-X Biotin-1053は、Ｂ型肝炎表面抗原（HBsAG）に対するモノクローナル抗体1053とデスチオビオチンとのコンジュゲートであり、DSB-X Biotin Protein Labeling Kit（Molecular Probes製、カタログ番号D20655）を用いて調製された。DSB-X Biotin-1053はTBS-T-BSA中に溶解しており、その濃度は2.22 mg/mLであった。
【００４３】
前記チューブに、TBS-T-BSAに懸濁した磁性粒子（0.5% M-PVA SAV1；Chemagen製）を30μlずつ添加し、チューブを室温で5分間静置した。なお、0.5% M-PVA SAV1はストレプトアビジンが表面に固定された磁性粒子である。
【００４４】
次に、磁性粒子を３回洗浄した。なお、粒子の洗浄は次のようにして行った。磁性粒子を集磁し、上清を吸引除去した。チューブに200μLのTBS-T（0.02M Tris-HCl (pH7.6), 0.137M NaCl, 0.1% Tween 20）を添加し、磁性粒子を懸濁したのち、再び粒子を集磁して反応液を吸引除去した。
【００４５】
チューブにTBS-T-BSAで1,000倍希釈したALP-Fab′(149)を100μLずつ添加し、磁性粒子を懸濁させた。ついで、チューブを室温で5分間静置したのち、磁性粒子を前述の方法で３回洗浄した。ALP-Fab′(149)は、Alkaline Phosphatase Labeling Kit-SH（同仁化学製）を用い、149抗体のFab′断片をアルカリホスファターゼで標識することにより作製した。なお、149抗体はHBsAGに対するモノクローナル抗体であり、1053抗体の認識部位とは異なるHBsAGの部位を認識する。
【００４６】
チューブに50μLのビオチン溶液(pH8.0)を添加して、磁性粒子を懸濁させた。ついで、磁性粒子を5分毎に懸濁させながら、懸濁液を室温で15分間静置した。なお、ビオチン溶液は、10mM sodium carbonate buffer (pH10.0)に溶解された50mM D-ビオチン溶液（Molecular Probes製、カタログ番号B20656）に1/50量の1M Tris-HCl (pH7.5)を添加することによりD-ビオチン溶液のpHを8.0に調整したものを使用した。
【００４７】
磁性粒子を集磁し、上清をNuncローバインディングプレート（Nunc製、カタログ番号245395、ホワイト）に移した。プレートに37℃で保温しておいたCDP-Starを100μL添加し、基質反応を実施した。フォトンカウントはMTP-700CL（コロナ電気製）を用いて行った（感度x 1）。なお、CDP-Starはアルカリホスファターゼの基質であり、CDP-Star Ready-to-Use with Sapphire II（ABI製、カタログ番号T2214）に含まれる。
【００４８】
フォトンカウントの値およびシグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）を下記表２に示す。
【００４９】
（比較例１）
TBS-T-BSAで4μg/mLに希釈したDSB-X Biotin-1053を50μLずつ8連チューブに分注した。そのチューブに、TBS-T-BSAに溶解したリコンビナントHBsAg（0.01、0.1、1 ng/mL）を20μLずつ添加し、チューブを室温で1分間静置した。なお、TBS-T-BSAのみを20μL添加したものをコントロールとし、HBsAgを添加したものと同様に以下の処理を行った。
【００５０】
前記チューブに、TBS-T-BSAに懸濁した磁性粒子（0.5% M-PVA SAV1）を30μlずつ添加し、チューブを室温で5分間静置した。
【００５１】
次に、磁性粒子を３回洗浄した。なお、粒子の洗浄は、実施例１に記載した方法により実施した。
【００５２】
チューブにTBS-T-BSAで1,000倍希釈したALP-Fab′(149)を100μLずつ添加し、磁性粒子を懸濁させた。ついで、チューブを室温で5分間静置したのち、磁性粒子を前述の方法で３回洗浄した。
【００５３】
チューブに37℃で保温しておいたCDP-Starを100μL添加し、磁性粒子を懸濁させた。得られた懸濁液をNuncローバインディングプレートに移し、そのプレートをマグネティックプレート上に置いて磁性粒子を底面に集磁した。フォトンカウントはMTP-700CLを用いて行った（感度x 1）。
【００５４】
フォトンカウントの値およびＳ／Ｎ比を下記表２に示す。
【００５５】
【表２】
2007093336.tif 000003
【００５６】
（抗体の製造例）
実施例１および比較例１で使用した抗体（１４９抗体、１０５３抗体）は、以下に示す方法で製造し、選択した。
【００５７】
（１）モノクローナル抗体の作製
１−１． マウスの免疫
ヒト血清から精製された不活性化ａｄｒ型ＨＢｓＡｇ（ＴＲＩＮＡ製）を５０μｇ含有するＰＢＳ１００μｌにフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）１００μｌを添加し、ボルテクスで混合して乳化させ、ＦＣＡ混合ＨＢｓＡｇ溶液２００μｌを作製した。また、ＦＣＡではなくフロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）を用いること以外は同様にしてＦＩＡ混合ＨＢｓＡｇ溶液２００μｌを作製した。
【００５８】
ＦＣＡ混合ＨＢｓＡｇ溶液２００μｌを８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内投与により初回免疫した。初回免疫後、二週間毎にＦＩＡ混合ＨＢｓＡｇ溶液２００μｌを用いて追加免疫を五回行った。最後の追加免疫から四日後に脾細胞を分離し、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８・６５３マウス骨髄腫細胞とＰＥＧ法により融合させ、ハイブリドーマを作製した。
【００５９】
１−２． ハイブリドーマの培養
ハイブリドーマを２．５×１０６cells/mlとなるようにヒポキサンチン−チミジン培地（ＨＴ培地）に懸濁させ、９６穴プレート（コーニング製；以下、培養用プレートとする）の各ウェルに２．５×１０５cells/wellとなるように分注した。培養用プレートを３７度、５％ＣＯ２の恒温槽内に静置し、ハイブリドーマの培養を開始した。翌日、ＨＡＴ培地を２５μｌずつ培養用プレートの各ウェルに添加し、さらに培養を継続した。１０日間培養してハイブリドーマのコロニーを出現させたところで、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングを行なった。
【００６０】
１−３． ハイブリドーマのスクリーニング
０．１ｗ／ｖ％ＮａＮ３を含む０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．５）に、ａｄｒ型ＨＢｓＡｇ（ＴＲＩＮＡ製）の濃度が０．５μｇ／ｍｌとなるようａｄｒ型ＨＢｓＡｇを添加し、固定用ＨＢｓＡｇ溶液を調整した。固定用ＨＢｓＡｇ溶液１００μｌを９６穴プレート（Nunc製；以下、抗原固定プレートとする）の各ウェルに分注した。４度で一晩静置した後、０．０５％の濃度でＴｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ緩衝液（以下、第一緩衝液とする）で三回洗浄した。洗浄後、抗原固定プレートの各ウェルに２ｗ／ｖ％の濃度でＢＳＡを含むＴＢＳ緩衝液（以下、第二緩衝液とする）３００μｌを添加し、室温で二時間静置した。
【００６１】
第二緩衝液を抗原固定プレートの各ウェルに７５μｌずつ添加した。さらに、１−２．で作製したハイブリドーマ培養上清を培養用プレートの各ウェルから取り出し、抗原固定プレートの各ウェルに２５μｌずつ添加した。第二緩衝液及び培養上清添加後、３７度で一時間インキュベートした。インキュベート後、３００μｌの第一緩衝液で抗原固定プレートの各ウェルを洗浄した。洗浄後、第二緩衝液で１００００倍希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ製；Code No. P0447）を抗原固定プレートの各ウェルに１００μｌずつ添加した。室温で３０分間反応させ、３００μｌの第一緩衝液で抗原固定プレートの各ウェルを洗浄してTMB peroxidase EIA Substrate Kit (Bio-Rad製)を用いて陽性を示すウェルを検出した。その結果、２６８８ウェル中、約３００ウェルにおいて抗ＨＢｓモノクローナル抗体が産生されていることが確認された。
【００６２】
（２）変異型ＨＢｓＡｇの作製
野生型ＨＢｓＡｇ（サブタイプ：ａｄｒ型）を有するＨＢＶに感染した患者の血液試料からＨＢＶのＤＮＡを調製し、ＰＣＲ法を用いて野生型ＨＢｓＡｇをコードする領域を含むＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片がコードする野生型ＨＢｓＡｇのアミノ酸配列を配列表の配列番号１に記載する。このＤＮＡ断片を真核細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Invitrogen）に組み込み、野生型ＨＢｓＡｇ発現プラスミドを作製した。次にこの発現プラスミドをテンプレートとして、QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)を用いて部位特異的変異導入を行い、下記表３に示す２０種類の変異型ＨＢｓＡｇ発現プラスミドを構築した。野生型ＨＢｓＡｇ発現プラスミド及び変異型ＨＢｓＡｇ発現プラスミドをEndoFree Plasmid Maxi Kit (QIAGEN)を用いて精製した。精製後の発現プラスミドをそれぞれPolyMagII (OZ Bioscience)を用いてサル腎臓由来のＣＯＳ７細胞に導入し、５％  ＣＯ２インキュベーター中で２４時間培養した。また、ネガティブコントロールとしてＨＢｓＡｇをコードするＤＮＡを組み込まずに、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）のみを導入したＣＯＳ７細胞を作製し、同様に培養した。
【００６３】
【表３】
2007093336.tif 000004
【００６４】
（３）ＨＢｓＡｇに反応する抗体の選択
（２）で調製したＣＯＳ７細胞を、Trypsin-EDTA溶液（Sigma製）によりシャーレから剥がし、細胞をＰＢＳで洗浄した。洗浄後の細胞を適量のＰＢＳ中に懸濁させ、細胞浮遊液を調製した。細胞浮遊液をスライドグラスに適量スポットし、風乾後アセトン(和光純薬工業社製)で固定した。アセトン固定後のスライドグラスに（１）で作製した、抗ＨＢｓモノクローナル抗体を含む約３００クローンの培養上清をそれぞれ反応させた。各モノクローナル抗体の野生型ＨＢｓＡｇ及び２０種類の変異型ＨＢｓＡｇに対する反応性を、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇ抗体を用いて蛍光顕微鏡観察により判定した。その結果、表４に示されるようにハイブリドーマＨＢｓ−１０５３が産生する１０５３抗体及びハイブリドーマＨＢｓ−１４９が産生する１４９抗体に広範な反応性が認められた。ハイブリドーマＨＢｓ−１０５３およびハイブリドーマＨＢｓ−１４９は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０４９３およびＦＥＲＭ  Ｐ−２０４９４として受託された。
【００６５】
【表４】
2007093336.tif 000005
【００６６】
表４中の「＋」は抗体が抗原を認識して結合したことを示し、「−」は抗体と抗原との反応が起こらなかったことを示す。
【００６７】
表４より、１４９抗体は表３に示す１４５位のアミノ酸変異を有する変異型ＨＢｓＡｇを除く全ての変異型ＨＢｓＡｇ及び野生型ＨＢｓＡｇと結合した。また、１０５３抗体は表３に示す全ての変異型ＨＢｓＡｇ及び野生型ＨＢｓＡｇと結合した。
【配列表】
2007093336000001.app