(57)【要約】【課題】  医薬品合成の中間体として有用な光学活性プロパルギルアルコールを製造する方法を提供すること。【解決手段】  ２級アルコール脱水素酵素又はカルボニル還元酵素を用いて、プロパルギルケトンを不斉還元し、光学活性プロパルギルアルコールを製造する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）から（ｅ）；
（ａ）配列番号１に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸からなるタンパク質であって、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式２で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式２で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；又は
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式２で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド：
のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質、該タンパク質を機能的に発現する微生物もしくは形質転換株、またはその処理物を、式１：
【化１】
2007274901.tif 000010
（式中、Ｒは、Ｃ１−Ｃ１０の置換若しくは未置換の直鎖、分岐鎖又は環状のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基、あるいはＣ６−Ｃ２０のアリール基を表す）
で示されるプロパルギルケトン誘導体に作用させ、該ケトンを還元して式２：
【化２】
2007274901.tif 000011
（式中、Ｒは、式１の場合と同義である）
で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を製造することを含む、光学活性プロパルギルアルコール誘導体の製造方法。
【請求項２】
式１で示されるプロパルギルケトン誘導体が式３：
【化３】
2007274901.tif 000012
で示される１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オンであり、式２で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体が式４：
【化４】
2007274901.tif 000013
で示される（Ｓ）−１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールである、請求項１に記載の光学活性プロパルギルアルコール誘導体の製造方法。
【請求項３】
（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を、対応する補酵素、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)もしくは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)を再生する活性を有する脱水素酵素を共に発現する形質転換株、若しくは該形質転換株の処理物を用いて、式１で示されるプロパルギルケトンを還元し、式２で示される光学活性プロパルギルアルコールを製造する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
NADHもしくはNADPH再生活性を有する脱水素酵素がグルコース脱水素酵素若しくはギ酸脱水素酵素である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
下記（ａ）から（ｅ）；
（ａ）配列番号３、５又は７に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４、６又は８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４、６又は８に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸からなるタンパク質であって、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式５で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３、５又は７に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式５で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；又は
（ｅ）配列番号４、６又は８に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式５で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド：
のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質、該タンパク質を機能的に発現する微生物もしくは形質転換株、またはその処理物を、式１：
【化５】
2007274901.tif 000014
（式中、Ｒは、Ｃ１−Ｃ１０の置換若しくは未置換の直鎖、分岐鎖又は環状のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基、あるいはＣ６−Ｃ２０のアリール基を表す）
で示されるプロパルギルケトン誘導体に作用させ、該ケトンを還元して式５：
【化６】
2007274901.tif 000015
（式中、Ｒは、式１の場合と同義である）
で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を製造することを含む、光学活性プロパルギルアルコール誘導体の製造方法。
【請求項６】
式１で示されるプロパルギルケトン誘導体が式３：
【化７】
2007274901.tif 000016
で示される１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オンであり、式５で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体が式６：
【化８】
2007274901.tif 000017
で示される（Ｒ）−１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールである、請求項５に記載の光学活性プロパルギルアルコール誘導体の製造方法。
【請求項７】
（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を、対応する補酵素、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)もしくは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)を再生する活性を有する脱水素酵素を共に発現する形質転換株、若しくは該形質転換株の処理物を用いて、式１で示されるプロパルギルケトンを還元し、式５で示される光学活性プロパルギルアルコールを製造する、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
NADHもしくはNADPH再生活性を有する脱水素酵素がグルコース脱水素酵素若しくはギ酸脱水素酵素である、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、各種医薬品の光学活性原料として、特に、プロスタグランジン系化合物に必須なω側鎖の原料として有用な光学活性プロパルギルアルコールを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書に定義する式２もしくは式５で示される光学活性プロパルギルアルコールの製造方法としては、
（１）式２もしくは式５で示されるプロパルギルアルコールのラセミ体混合物をフタル酸モノエステルとして光学活性アミンを光学分割剤として分割する方法（J. Am. Chem. Soc., 94, 7827 (1972)）、
（２）式２もしくは式５で示されるプロパルギルアルコールのラセミ体混合物のエステルをリパーゼ又はパン酵母などを用いた加水分解反応により反応速度論的分割を行い、光学活性プロパルギルアルコールを得る方法（特開平３−２５９０９４号公報）、
（３）式２もしくは式５で示されるプロパルギルアルコールのラセミ体混合物を光学分割カラムにより分割し、光学活性プロパルギルアルコールを得る方法（特開２００３−６４００９号公報）、
（４）本明細書に定義する式１で示されるプロパルギルケトンを不斉還元触媒を用いて不斉還元する方法（J. Am. Chem. Soc., 101, 5843 (1979)）、
（５）式１で示されるプロパルギルケトンを微生物により不斉還元する方法 （J. Am. Chem. Soc., 97, 865 (1975)）、
（６）式１で示されるプロパルギルケトンのα-ハロゲン置換体をラクトバチルス (Lactobacillus) 由来のアルコール脱水素酵素を用いて不斉還元し、光学活性なα-ハロゲン置換されたプロパルギルアルコールを得る方法（ＷＯ０２／６４５７９号公報）、
（７）γ−ヨウ化アリルアルコールをシャープレス光学分割法によって光学活性γ−ヨウ化アリルアルコールを得、脱ヨウ化水素を経て光学活性プロパルギルアルコールを得る方法（Tetrahedron Lett., 30, 7083 (1989)）、
などが知られている。
【０００３】
しかしながら、（１）の方法は低収率でかつ高価な分割剤が必要である、（２）の方法は光学純度が低い、未反応のエステルと加水分割されたアルコールの分離が困難である、（３）の方法は高価な光学分割カラムが必要であり、（４）の方法は高価な不斉還元触媒が必要、極低温が必要、（５）の方法は収率、光学純度共に低い、（６）の方法は生産性が低い、（７）の方法は高価な分割剤が必要かつ工程が複雑、など工業的な製造方法としては問題がある。
【０００４】
【非特許文献１】J. Am. Chem. Soc., 94, 7827 (1972)
【非特許文献２】J. Am. Chem. Soc., 101, 5843 (1979)
【非特許文献３】J. Am. Chem. Soc., 97, 865 (1975)
【非特許文献４】Tetrahedron Lett., 30, 7083 (1989)
【特許文献１】特開平３−２５９０９４号公報
【特許文献２】特開２００３−６４００９号公報
【特許文献３】ＷＯ０２／６４５７９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、式２もしくは式５で示される光学活性プロパルギルアルコール、とりわけ、式４で示される（Ｓ）−１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールもしくは式６で示される（Ｒ）−１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールの製造において、光学純度の高い生成物を収率良く与えることができる製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、理論収率が５０％を越えない分割手法ではなく、原料を１００％利用可能な、プロパルギルケトンを立体選択性の高い酵素を利用して不斉還元反応により高い光学純度の光学活性プロパルギルアルコールを製造する方法を検討した。
式１のＲがシクロヘキシル基である１−シクロヘキシルプロピノン(1-cyclohexylpropynone、以下CHPNと略す) を基質として多くのカルボニルを不斉還元する酵素を用い、１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オール(1-cyclohexyl-2-propyn-1-ol、以下 CHPOと略す) 合成を検討した結果、ピキア・フィンランディカ (Pichia finlandica) 由来の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素（配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）が (S)-CHPOを生成し、サッカロマイセス・セレビジエ (
Saccharomyces cerevisiae) 由来のカルボニル還元酵素ScGRE2 （配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）及びScYGD9（配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）、並びにトルラスポラ・デルブレッキー (Torulaspora delbrueckii) 由来のカルボニル還元酵素 TdCR1（配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）がいずれも (R)-CHPOを９９％ｅｅ以上の極めて高い立体選択性で生成することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００７】
（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素は、アセト酢酸エチルを不斉還元し、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸エチルを生成することが知られているが（ＷＯ０１／６１０１４号公報）、CHPNに対して活性を有するか否か、どの程度の立体選択性を持って還元するか、いずれの立体を生成するかは予測不可能であり、９９％ｅｅ以上の高い選択性で(S)-CHPOを生成したことは驚くべき結果であった。
【０００８】
同様に、ScGRE2（J. Org. Chem. 63, 4996-5000 (1998)）、ScYGD9及び TdCR1（いずれも特願２００３−１１３４０２号）は、アセト酢酸エチルを不斉還元し、（Ｓ）−３−ヒドロキシ酪酸エチルを生成することが報告されているが、（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の場合と同様、CHPNに対して活性を有するか否か、どの程度の立体選択性を持って還元するか、いずれの立体を生成するかは予測不可能であり、９９％ｅｅ以上の高い選択性で(R)-CHPOを生成したことは驚くべき結果であった。例えば、キャンディダ・パラプシロシス由来の（Ｓ）特異的２級アルコール脱水素酵素（特開平０７−２３１７８５号公報）は、アセト酢酸エチルを不斉還元し、（Ｓ）−３−ヒドロキシ酪酸エチルを生成することが報告されているが、CHPNに対して実質的に活性を示さなかった。また、TdCR1に対して６１％のホモロジーを有するScYDR1（特願２００３−１１３４０２号）もまた、CHPNに対して実質的に活性を有しなかった。
【０００９】
また、上記反応に付随してNADHから生成するNAD+のNADHへの再生、及び、NADPHから生成するNADPHのNADP+への再生は、例えばグルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素などによって行うことができるが、本発明者らは、これらの遺伝子を本発明で用いるアルコール脱水素酵素もしくはカルボニル還元酵素をコードするDNAと同時に宿主に導入することによって、アルコール脱水素酵素もしくはカルボニル酵素とNAD(P)H再生酵素を同時に発現し、該形質転換株またはその処理物を用いて還元反応を行うことにより、より効率的に光学活性プロパルギルアルコール誘導体を製造できることを見いだした。
【００１０】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  下記（ａ）から（ｅ）；
（ａ）配列番号１に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸からなるタンパク質であって、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式２で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式２で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；又は
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式２で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド：
のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質、該タンパク質を機能的に発現する微生物もしくは形質転換株、またはその処理物を、式１：
【化１】
2007274901.tif 000002
（式中、Ｒは、Ｃ１−Ｃ１０の置換若しくは未置換の直鎖、分岐鎖又は環状のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基、あるいはＣ６−Ｃ２０のアリール基を表す）
で示されるプロパルギルケトン誘導体に作用させ、該ケトンを還元して式２：
【化２】
2007274901.tif 000003
（式中、Ｒは、式１の場合と同義である）
で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を製造することを含む、光学活性プロパルギルアルコール誘導体の製造方法。
【００１１】
（２）  式１で示されるプロパルギルケトン誘導体が式３：
【化３】
2007274901.tif 000004
で示される１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オンであり、式２で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体が式４：
【化４】
2007274901.tif 000005
で示される（Ｓ）−１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールである、（１）に記載の光学活性プロパルギルアルコール誘導体の製造方法。
【００１２】
（３）  （ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を、対応する補酵素、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)もしくは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)を再生する活性を有する脱水素酵素を共に発現する形質転換株、若しくは該形質転換株の処理物を用いて、式１で示されるプロパルギルケトンを還元し、式２で示される光学活性プロパルギルアルコールを製造する、（１）又は（２）に記載の方法。
【００１３】
（４）  NADHもしくはNADPH再生活性を有する脱水素酵素がグルコース脱水素酵素若しくはギ酸脱水素酵素である、（３）に記載の方法。
【００１４】
（５）  下記（ａ）から（ｅ）；
（ａ）配列番号３、５又は７に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４、６又は８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４、６又は８に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸からなるタンパク質であって、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式５で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３、５又は７に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式５で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；又は
（ｅ）配列番号４、６又は８に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式５で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド：
のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質、該タンパク質を機能的に発現する微生物もしくは形質転換株、またはその処理物を、式１：
【化５】
2007274901.tif 000006
（式中、Ｒは、Ｃ１−Ｃ１０の置換若しくは未置換の直鎖、分岐鎖又は環状のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基、あるいはＣ６−Ｃ２０のアリール基を表す）
で示されるプロパルギルケトン誘導体に作用させ、該ケトンを還元して式５：
【化６】
2007274901.tif 000007
（式中、Ｒは、式１の場合と同義である）
で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を製造することを含む、光学活性プロパルギルアルコール誘導体の製造方法。
【００１５】
（６）  式１で示されるプロパルギルケトン誘導体が式３：
【化７】
2007274901.tif 000008
で示される１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オンであり、式５で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体が式６：
【化８】
2007274901.tif 000009
で示される（Ｒ）−１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールである、（５）に記載の光学活性プロパルギルアルコール誘導体の製造方法。
【００１６】
（７）  （ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を、対応する補酵素、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)もしくは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)を再生する活性を有する脱水素酵素を共に発現する形質転換株、若しくは該形質転換株の処理物を用いて、式１で示されるプロパルギルケトンを還元し、式５で示される光学活性プロパルギルアルコールを製造する、（５）又は（６）に記載の方法。
【００１７】
（８）  NADHもしくはNADPH再生活性を有する脱水素酵素がグルコース脱水素酵素若しくはギ酸脱水素酵素である、（７）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、高い光学純度を有する光学活性プロパルギルアルコールを効率よく製造する方法を提供することが可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、下記（ａ）から（ｅ）；
（ａ）配列番号１に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸からなるタンパク質であって、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式２で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式２で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；又は
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式２で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド：
のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質、該タンパク質を機能的に発現する微生物もしくは形質転換株、またはその処理物を用いて、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式２で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を製造する方法に関するものである。
【００２０】
配列番号２に記載の蛋白質としては、例えば、ピキア・フィンランディカ由来の (R)-２-オクタノール脱水素酵素が挙げられる。該酵素は、ＷＯ０１／６１０１４号公報に記載の方法により、ピキア・フィンランディカの菌体より調製することができる。ピキア・フィンランディカとしては、特に、ピキア・フィンランディカDSM 70280株が好適に利用できる。また、ピキア・フィンランディカDSM 70280株由来の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素のアミノ酸配列である配列番号２に記載のタンパク質をコードするＤＮＡを、ピキア・フィンランディカDSM 70280株などからクローニングし、若しくは配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを化学合成し、大腸菌など異種の宿主に発現可能な形態において導入した組換え体を用いて、（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素を発現し、組換え体より該酵素を得ることもできる。
【００２１】
本発明で用いる（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の酵素活性の測定は次のように確認することができる。100 mM トリス−塩酸緩衝液（pH 9.0）、2.5 mM 酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、5 mM （Ｒ）−２−オクタノール及び酵素を含む反応液中、30℃で反応させ、NADHの増加に由来する３４０ｎｍの吸光度の増加を測定する。１Ｕは、1分間に1μmolのNADH の生成を触媒する酵素量とした。
【００２２】
さらに本発明は、下記（ａ）から（ｅ）；
（ａ）配列番号３、５又は７に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４、６又は８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４、６又は８に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸からなるタンパク質であって、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式５で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３、５又は７に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式５で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；又は
（ｅ）配列番号４、６又は８に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式５で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド：
のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質、該タンパク質を機能的に発現する微生物もしくは形質転換株、またはその処理物を用いて、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式５で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を製造するする方法に関するものである。
【００２３】
本発明で利用されるカルボニル還元酵素ScGRE2は、J. Org. Chem. 63, 4996-5000 (1998) に記載の方法によりパン酵母より調製することができる。また、サッカロマイセス・セレビジエ由来のScGRE2をコードする配列番号３に記載のDNAを、サッカロマイセス・セレビジエ（例えば X2180-1B株） (Yeast Genetic Stock Center)などからPCRなどによりクローニングし、大腸菌など異種の宿主に発現可能な形態において導入した組換え体を用いてScGRE2を発現し、組換え体より該酵素を得ることもできる。
【００２４】
本発明で用いるScGRE2の酵素活性の測定は次のように確認することができる。100 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 6.5）、0.2 mM 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、NADPH と略す）、20 mM アセト酢酸エチル及び酵素を含む反応液中で30℃で反応させ、NADPHの減少に由来する340nmの吸光度の減少を測定する。1Uは、1分間に1μmolのNADPH の減少を触媒する酵素量とした。
【００２５】
本発明で利用されるカルボニル還元酵素ScYGD9は、サッカロマイセス・セレビジエ由来のScYGD9をコードする配列番号５に記載のＤＮＡを、例えば、特願２００３−１１３４０２号に記載の方法などにより、サッカロマイセス・セレビジエ（例えば X2180-1B株）(Yeast Genetic Stock Center) などからPCRなどによりクローニングし、大腸菌など異種の宿主に発現可能な形態において導入した組換え体を用いてScYGD9を発現し、組換え体より該酵素を得ることにより調製できる。本発明で用いるScYGD9の酵素活性は、ScGRE2と同じ方法により確認することができる。
【００２６】
本発明で利用されるカルボニル還元酵素TdCR1は、特願２００３−１１３４０２に記載の方法によりトルラスポラ・デルブレッキー (Torulaspora delbrueckii) より調製することができる。また、トルラスポラ・デルブレッキー由来のTdCR1をコードする配列番号７に記載のDNAを、トルラスポラ・デルブレッキー（例えば IFO 0381株）などからPCRなどによりクローニングし、大腸菌など異種の宿主に発現可能な形態において導入した組換え体を用いてTdCR1を発現し、組換え体より該酵素を得ることもできる。
【００２７】
本発明によるTdCR1の酵素活性の測定は次のように確認することができる。100 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 6.5）、0.2 mM NADPH、5 mM 3,4-ジメトキシフェニルアセトン及び酵素を含む反応液中で30℃で反応させ、NADPHの減少に由来する３４０ｎｍの吸光度の減少を測定する。１Ｕは、1分間に1μmolのNADPH の減少を触媒する酵素量とした。
【００２８】
上記酵母（サッカロマイセス・セレビジエ、トルラスポラ・デルブレッキー）は、YM培地等の酵母の培養に用いられる一般的な培地で培養される。十分に増殖させた後に菌体を回収し、２−メルカプトエタノールやフェニルメタンフルホニルフルオリド等の還元剤やプロテアーゼ阻害剤を加えた緩衝液中で破砕して無細胞抽出液とする。無細胞抽出液から、タンパク質の溶解度による分画（有機溶媒による沈澱や硫安などによる塩析など）や、陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィーや、キレート、色素、抗体などを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせることにより精製することができる。例えば、フェニル−セファロースを用いた疎水クロマトグラフィー、ＭｏｎｏＱを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、ブチル−セファロースを用いた疎水クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトを用いた吸着クロマトグラフィー等を経て電気泳動的に単一バンドにまで精製することができる。
【００２９】
本発明における1もしくは複数（好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列は、配列番号１、３、５又は７に記載のポリヌクレオチドに部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487 (1982) , Methods in Enzymol.100,pp.448 (1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) , PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991) ）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加などの変異を導入することにより得ることが可能である。
【００３０】
本発明におけるポリヌクレオチドのホモログとは、配列番号２、４、６又は８に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、より好ましくは９０%以上のホモロジーを有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。タンパク質のホモロジー検索は、例えばSWISS-PROT, PIR,DADなどのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベースや DDBJ、EMBL、あるいはGene-BankなどのDNA配列に関するデータベース、DNA配列を元にした予想アミノ酸配列に関するデータベースなどを対象に、BLAST, FASTAなどのプログラムを利用して、例えば、インターネットを通じて行うことができる。本発明のホモロジーとは、例えば、BLASTプログラムを用いてidentity で示される数値を指す。
【００３１】
本発明における配列番号１、３、５又は７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、いずれかのポリヌクレオチド配列番号に記載中の任意の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば４０、６０または１００個の連続した配列を一つまたは複数選択したＤＮＡをプローブＤＮＡとし、例えばECL direct nucleic acid labeling and detection system (Amersham Pharmaica Biotech社製)を用いて、マニュアルに記載の条件（例えば、wash：42℃、0.5x SSCを含むprimary wash buffer）において、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを示す。より具体的な「ストリンジェントな条件」とは、例えば、通常、42℃、2×SSC、0.1％SDSの条件であり、好ましくは50℃、2×SSC 、0.1％SDSの条件であり、さらに好ましくは、65℃、0.1×SSCおよび0.1％SDSの条件であるが、これらの条件に特に制限されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００３２】
本発明において利用可能なアルコール脱水素酵素又はカルボニル還元酵素をコードするポリヌクレオチドを、公知の発現ベクターに挿入することにより、各酵素の発現ベクターが提供される。また、この発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、本発明において利用可能なアルコール脱水素酵素、カルボニル還元酵素を組換え体から得ることができる。本発明においてアルコール脱水素酵素、カルボニル還元酵素を発現させるために、形質転換の対象となる微生物は、それぞれの酵素をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換され、それぞれの酵素活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。利用可能な微生物としては、例えば以下のような微生物を示すことができる。
【００３３】
エシェリヒア(Escherichia)属、バチルス(Bacillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、セラチア(Serratia)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、コリネバクテリイウム(Corynebacterium)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、及びラクトバチルス(Lactobacillus)属など宿主ベクター系の開発されている細菌；
ロドコッカス(Rhodococcus)属、及びストレプトマイセス(Streptomyces)属など宿主ベクター系の開発されている放線菌；
サッカロマイセス(Saccharomyces)属、クライベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属、ピキア(Pichia)属、及びキャンディダ(Candida)属などの宿主ベクター系の開発されている酵母；
ノイロスポラ(Neurospora)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、セファロスポリウム(Cephalosporium)属、及びトリコデルマ(Trichoderma)属などの宿主ベクター系の開発されているカビ：
【００３４】
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laboratories）。微生物中などにおいて、本発明で用いるNADPHを電子供与体とするカルボニル還元酵素遺伝子を発現させるためには、まず微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中にこのDNAを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のDNA鎖の5'-側上流に、より好ましくはターミネーターを3'-側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター、ターミネーターを用いる必要がある。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターなどに関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 (1990)、Yeast 8, 423-488 (1992)、などに詳細に記述されている。
【００３５】
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Nature 315, 592-594 (1985)）や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。
【００３６】
本明細書に記載の式２もしくは式５に示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体の製造の好ましい態様においては、酵素分子、その処理物、酵素分子を含む培養物、あるいは酵素を生成する微生物等の形質転換体を反応溶液と接触させることにより、目的とする酵素反応を行わせることによって、光学活性プロパルギルアルコール誘導体の製造を行うことができる。なお、酵素と反応溶液の接触形態はこれらの具体例に限定されるものではない。
【００３７】
本発明におけるアルコール脱水素酵素もしくはカルボニル還元酵素を含む微生物の処理物には、具体的には界面活性剤やトルエンなどの有機溶媒処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生物、あるいはガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液やそれを部分精製したものなどが含まれる。
【００３８】
本発明における式１で示されるプロパルギルケトン誘導体において、Ｒは、Ｃ１−Ｃ１０の置換若しくは未置換の直鎖、分岐鎖又は環状のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基、あるいはＣ６−Ｃ２０のアリール基を表す。Ｒとしては例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、イソプロピル、イソブチル、t-ブチル、２−メチルペンチル、３−メチルヘキシル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、フェニルなどが挙げられ、これらの置換基は更に、塩素、臭素、ヨウ素、トリアルキルシリル、トリアルキル錫などにより置換されていてもよい。
【００３９】
本発明の好ましい態様においては、（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素活性を有するタンパク質、該酵素またはタンパク質を産生する微生物、もしくは該微生物の処理物を式３に示される１−シクロヘキシルプロピノン (CHPN) に作用させ、式４に示される（Ｓ）−１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オール ((S)-CHPO)を製造することを特徴とする、（Ｓ）−１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールの製造方法が提供される。また、ScGRE2, ScYGD9、TdCR1又はそれらの変異体から選択されるカルボニル還元酵素活性を有するタンパク質、該酵素またはタンパク質を産生する微生物、もしくは該微生物の処理物を式３に示される１−シクロヘキシルプロピノン (CHPN) に作用させ、式６に示される（Ｒ）−１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オール ((R)-CHPO)を製造することを特徴とする、（Ｒ）−１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールの製造方法が提供される。
【００４０】
上記還元反応に付随してNADH もしくはNADPHから生成するNAD+ もしくはNADP+の、NADH もしくはNADPHへの再生は、微生物の持つNAD+, NADP+還元能（解糖系、メチロトローフのＣ１化合物資化経路など）を用いて行うことができる。これらNAD+, NADP+還元能は、反応系にグルコースやエタノールなどを添加することにより増強することが可能である。また、NAD+, NADP+からNADH, NADPHを生成する能力を有する微生物やその処理物、酵素を反応系に添加することによっても行うことができる。例えば、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などを含む微生物、その処理物、ならびに部分精製もしくは精製酵素を用いてNADHもしくはNADPHの再生を行うことができる。これらのNADH, NADPH再生に必要な反応を構成する成分は、本発明による光学活性アルコールの製造のための反応系に添加する、固定化したものを添加する、あるいはNADH、NADPHの交換が可能な膜を介して接触させることができる。
【００４１】
また本発明は、本発明に利用可能なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換された形質転換体を培養する工程を含むことができる。本方法において、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターで形質転換した微生物の生菌体を前記光学活性アルコールの製造方法に利用する場合には、NADH, NADPH再生のための付加的な反応系を不要とできる場合がある。すなわち、NADH, NADPH再生活性の高い微生物を宿主として用いることにより、形質転換体を用いた還元反応において、NADH, NADPH再生用の酵素を添加することなく効率的な反応が行える。さらに、NADH、NADPH再生に利用可能なグルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などの遺伝子を、本発明のNADH もしくはNADPH依存性アルコール脱水素酵素もしくはカルボニル還元酵素をコードするDNAと同時に宿主に導入することによって、より効率的なNADH, NADPH再生酵素とNADPH依存性カルボニル還元酵素の発現、還元反応を行うことも可能である。これらの２つもしくはそれ以上の遺伝子の宿主への導入には、不和合性を避けるために複製起源のことなる複数のベクターに別々に遺伝子を導入した組換えベクターにより宿主を形質転換する方法や、単一のベクターに両遺伝子を導入する方法、両方、もしくは、片方の遺伝子を染色体中に導入する方法などを利用することができる。
【００４２】
単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター、ターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
【００４３】
例えば、NADH及びNADPH再生用酵素として、バシラス・サブチルス（Bacillus subtilis）やサーモプラズマ・アシドフィラム（Thermoplasma acidophilum）に由来するグルコース脱水素酵素が利用可能である。また、NADH再生用酵素として、マイコバクテリウム・バッカエ由来のギ酸脱水素酵素およびその変異体が好適に利用可能である。
【００４４】
具体的には、(S)-CHPO合成には、ピキア・フィンランディカ由来の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の遺伝子とマイコバクテリウム・バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の遺伝子を共に導入した共発現プラスミド、pSF-PFO2（ＷＯ０１／６１０１４号公報）や、バシラス・サブチルス由来グルコース脱水素酵素遺伝子を共に導入した共発現プラスミド pSG-PFO1（ＷＯ０１／６１０１４号公報）、pSG-PFO2（ＷＯ  ０１／６１０１４号公報）が挙げられる。また、(R)-CHPO合成には、ScGRE2、ScYGD9、TdCR1のいずれかのカルボニル還元酵素の遺伝子とバシラス・サブチルス由来グルコース脱水素酵素遺伝子を共に導入した共発現プラスミド（それぞれ、pSG-YOL1 (本発明実施例に記載), pSG-YGD9 (特願2003-113402), pSG-TDR1(特願2003-113402)）が挙げられる。
【００４５】
本発明の酵素を用いた還元反応は、水中もしくは水に溶解しにくい有機溶媒、例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン、メチルイソブチルケトン、メチルターシャリーブチルエステルなどの有機溶媒中、もしくは、水性媒体との2相系、もしくは水に溶解する有機溶媒、例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、アセトン、ジメチルスルホキシドなどとの混合系により行うことができる。本発明の反応は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。
【００４６】
本発明の反応は、反応温度４−６０℃、好ましくは１０−４０℃、ｐＨ３−９、好ましくはｐＨ５−７、基質濃度０．０１−５０%、好ましくは０．１−１０%、さらに好ましくは０．１−５％で行うことができる。本発明の反応の基質である式1に示されるプロパルギルケトンは一般に水中、特に、アルカリ側で不安定なため、反応は弱酸性領域で低い温度で実施することが望ましい。また、反応系には必要に応じて補酵素NAD+, NADH, NADP+もしくはNADPHが０．００１mM−１００mM、好ましくは、０．０１−１０mM添加できる。また、基質は反応開始時に一括して添加することも可能であるが、反応液中の基質濃度が高くなりすぎないように連続的、もしくは非連続的に添加することが望ましい。
【００４７】
NADH, NADPHの再生のために、例えば、グルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコース、アルコール脱水素酵素を利用する場合のエタノールもしくはイソプロパノール、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、アミノ酸脱水素酵素を利用する場合のアミノ酸、リンゴ酸脱水素酵素を利用する場合のリンゴ酸、グリセロール脱水素酵素を利用する場合のグリセロールなどが反応系に添加される。これらの化合物は、基質ケトンに対してモル比で０．１〜２０、好ましくは１〜５倍過剰に添加することができる。一方、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、グリセロール脱水素酵素などの、NADH, NADPH再生用の酵素は、本発明のNADH, NADPH依存性酵素に比較して酵素活性で０．１〜１００倍、好ましくは０．５〜２０倍程度添加することができる。
【００４８】
基質であるプロパルギルケトンは、例えば文献（J. Org. Chem., 52, 2860 (1987).）に記載の方法などで合成することができる。
【００４９】
本発明のプロパルギルケトンの還元により生成する光学活性プロパルギルアルコールの精製は、菌体、タンパク質の遠心分離、膜処理などによる分離、溶媒抽出、蒸留などを適当に組み合わせることにより行うことができる。
【００５０】
例えば、(S)-CHPO合成では、微生物菌体を含む反応液に直接有機溶媒、例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、ヘキサン、ベンゼン、メチルイソブチルケトン、メチルターシャリーブチルエーテル、ブタノール、ヘキサン、ヘプタンなどを添加して抽出後、これを減圧濃縮することにより、光学活性プロパルギルアルコールとして、採取することができる。さらに反応生成物の純度を上げるには、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、蒸留、結晶化などを行うことにより、さらに高度に精製することができる。
以下の実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００５１】
[実施例１]ピキア・フィンランディカ由来（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素とバチルス・サブチルス由来グルコース脱水素酵素の同時発現
特許文献（ＷＯ０１／６１０１４号公報）に示された方法で得たピキア・フィンランディカ由来の(R)−オクタノール脱水素酵素とバチルス・サブチリス由来のグルコース脱水素酵素を共発現するプラスミドpSG-PFO1を保持する大腸菌HB101株（HB101 (pSG-PFO1)）を2×YT培地（Difco-Tryptone 20g/L、Difco-Yeast extract 10g/L、 NaCl 10g/L、 pH 7.2）50mLで培養し、0.1mM IPTGで遺伝子の発現を誘導した。得られた菌体を集菌後、密閉式超音波破砕装置UCD-200TM（コスモバイオ）で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。
【００５２】
[実施例２]ピキア・フィンランディカ由来（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素とバチルス・サブチルス由来グルコース脱水素酵素の酵素活性
実施例１で得られた無細胞抽出液を用い、酵素活性を測定した。（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素活性の測定は、50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.5）、2.5 mM NAD+、5 mM （Ｒ）−２−オクタノール及び酵素を含む反応液中、30 ℃で反応させ、NADHの増加に由来する340 nmの吸光度の増加を測定した。1Uは、1分間に1μmolのNADHの生成を触媒する酵素量とした。組換え大腸菌から得た無細胞抽出液では、NAD+依存的に（Ｒ）−２−オクタノール酸化活性を示し、その比活性は、35.9 U/mg−タンパク質であった。また、CHPN還元活性の測定は、100 mMリン酸カリウム緩衝液（pH 6.5）、0.2 mM NADH、1% ジメチルスルホキシド、2 mM CHPN及び酵素を含む反応液中で30 ℃で反応させ、NADHの減少に由来する340 nmの吸光度の減少を測定した。1Uは、1分間に1μmolのNADHの生成を触媒する酵素量とした。組換え大腸菌から得た無細胞抽出液では、NADH依存的にCHPN還元活性を示し、その比活性は、8.01 U/ mg−タンパク質であった。
【００５３】
グルコース脱水素酵素活性の測定は、100 mMリン酸カリウム緩衝液（pH 6.5）、2.5 mM NAD+、100 mM D−グルコース及び酵素を含む反応液中で30 ℃で反応させ、NADHの増加に由来する340 nmの吸光度の増加を測定した。1Uは、1分間に1μmolのNADHの生成を触媒する酵素量とした。組換え大腸菌から得た無細胞抽出液では、その比活性は、1.18 U/ mg−タンパク質であった。
【００５４】
[実施例３]ピキア・フィンランディカ由来（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素とバチルス・サブチルス由来グルコース脱水素酵素による(S)-CHPOの合成
実施例１で得られた形質転換した大腸菌を2×YT培地（Difco-Tryptone 20 g/L、Difco-Yeast extract 10 g/L、 NaCl 10 g/L、 pH 7.2）50mLで培養し、0.1mM IPTGで遺伝子の発現を誘導した後、集菌した。得られた菌体の半量を400 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 6.5）、1% CHPN（73 mM）、1% ジメチルスルホキシド、1.6% グルコース（88mM）を含む50 mLの反応液に加えて、振盪下20 ℃で反応を開始した。反応開始から1時間後に集菌体の半量を更に添加し、一晩反応を継続した。
【００５５】
[実施例４]反応液からの(S)-CHPOの単離
実施例３で調製した反応液に対し、150 mLのヘキサンを用いて3回抽出を行った。このヘキサン抽出液の一部を取り、ガスクロマトグラフィーで変換率の測定を行った。分析には、FFAP 20％ Chromosorb W (AW)、80−100メッシュ（直径0.32×210cm、信和化工）を用いた。カラム室温度と注入口温度は200 ℃、検出器温度は230 ℃、キャリアガスには窒素、検出には水素炎イオン化検出器を用いた。各化合物の保持時間は、CHPNで5.0分、CHPOで8.5分であった。定量の結果、変換率は100％であった。有機層をろ過して不溶成分を除去した後、減圧下に溶媒を留去した。得られた油状物を冷却することにより、結晶が析出した。析出した結晶をろ過によって回収し、目的物である(S)-CHPOの結晶380 mgを得た。収率は75%であった。
【００５６】
[実施例５]合成した(S)-CHPOの光学純度
実施例４記載のヘキサン抽出液を用い、光学分割カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーを用いて光学純度の測定を行った。分析には、CHIRALCEL OD（φ0.46×25cm、ダイセル化学工業）を用いた。カラム室温度は40 ℃、溶出はヘキサン／2−プロパノール（97/3、流速1 mL／分）、検出波長は220 nmとした。各対掌体の保持時間は、(S)体で13.0分、(R)体で14.9分であった。その結果、生成物の光学純度は100％ee (S)であった。
【００５７】
[実施例６]ピキア・フィンランディカ由来（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素とマイコバクテリウム・バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の同時発現
特許文献（ＷＯ０１／６１０１４号公報）に示された方法で得たピキア・フィンランディカ由来の(R)−オクタノール脱水素酵素とマイコバクテリウム・バッカエ由来のギ酸脱水素酵素を共発現するプラスミドpSF-PFO3を保持する大腸菌HB101株（HB101 (pSF-PFO3)）を2×YT培地（Difco-Tryptone 20 g/L、Difco-Yeast extract 10 g/L、 NaCl 10 g/L、pH 7.2）50 mLで培養し、0.1 mM IPTGで遺伝子の発現を誘導した。得られた菌体を集菌後、密閉式超音波破砕装置UCD-200TM（コスモバイオ）で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。
【００５８】
[実施例７]ピキア・フィンランディカ由来（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素とマイコバクテリウム・バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の酵素活性
実施例６で得られた無細胞抽出液を用い、酵素活性を測定した。組換え大腸菌から得た無細胞抽出液では、NAD+依存的に（Ｒ）−２−オクタノール酸化活性を示し、その比活性は、18.2 U/ mg−タンパク質であった。
【００５９】
ギ酸脱水素酵素活性の測定は、100 mMリン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）、2.5 mM NAD+、100 mM ギ酸ナトリウム及び酵素を含む反応液中で30℃で反応させた。1Uは、1分間に1μmolのNADHの生成を触媒する酵素量とした。組換え大腸菌から得た無細胞抽出液では、その比活性は、1.11 U/ mg−タンパク質であった。
【００６０】
[実施例８] ピキア・フィンランディカ由来（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素とマイコバクテリウム・バッカエ由来ギ酸脱水素酵素による(S)-CHPOの合成
実施例６で得られた形質転換した大腸菌を2×YT培地（Difco-Tryptone 2 0g/L、Difco-Yeast extract 10 g/L、 NaCl 10 g/L、 pH 7.2）50mLで培養し、0.1 mM IPTGで遺伝子の発現を誘導した後、集菌した。得られた菌体の半量を400 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 6.5）、1％CHPN（73 mM）、１％ジメチルスルホキシド、1.6% グルコース（88 mM）、1 mM NAD+を含む25 mLの反応液に加えて、振盪下20 ℃で一晩反応を継続した。反応液に対し、75 mLの酢酸エチルを用いて2回抽出を行い、ガスクロマトグラフィーで定量した結果、変換率は84％であった。
【００６１】
［実施例９］サッカロマイセス・セレビジエからの染色体DNAの精製
サッカロマイセス・セレビジエ X2180-1B (Yeast Genetic Stock Center) をYM培地で培養し、菌体を調製した。菌体からの染色体DNAの精製は、Meth. Cell Biol. 29, 39-44 (1975) に記載の方法により行った。
【００６２】
［実施例１０］カルボニル還元酵素のScGRE2 のクローニング
DDBJに登録されている予想タンパク質YOL151w (SWISS-PROT Accession No. Z74893-1) に対応するDNA配列 (DDBJ Accession No. Z74893) を基にPCR用プライマーYOL1-ATG1（配列番号：9）、YOL-XbaIR（配列番号：10）、YOL-XbaIF（配列番号：11）、YOL1-TAA1 （配列番号：12）を合成した。
配列番号９：
YOL-ATG1: GACACATGTCAGTTTTTGTTTCAGGTGCTAAC
配列番号１０：
YOL-XbaIR: TCCTCTAGAAATTCCCAAGCTG
配列番号１１：
YOL-XbaIF：CTGTCTAGAGGAGAATCGTGACTCTGTAAAATTC
配列番号１２：
YOL-TAA1: GTCGAATTCCTCTATTAAATACGGCCCTCAAATTTTAAAATTTGGGAG
【００６３】
プライマーYOL-ATG1, YOL-XbaIRを各２５ｐｍｏｌ、dNTP１０ｎｍｏｌ、サッカロマイセス・セレビジエ由来染色体DNA５０ｎｇ、Pfu DNA polymerase用緩衝液 (STRATAGENE製)、Pfu DNA polymerase 2Ｕ (STRATAGENE製)を含む５０μLの反応液を用い、変性（９５℃、４５秒）、アニール（５５℃、３０秒）、伸長（７２℃、１分２０秒）を30サイクル、GeneAmp PCR System 2400 (パーキンエルマー製)を用いてPCRを行った結果、特異的な増幅産物が得られた。
【００６４】
増幅産物をフェノール処理後、制限酵素BspLU11I, XbaIで2重消化し、得られた断片を精製した。
【００６５】
次に、プライマーYOL-Xba1F, YOL-TAA1を各２５ｐｍｏｌ、dNTP１０ｎｍｏｌ、サッカロマイセス・セレビジエ由来染色体DNA５０ｎｇ、Pfu DNA polymerase用緩衝液 (STRATAGENE製)、Pfu DNA polymerase 2Ｕ (STRATAGENE製)を含む５０μLの反応液を用い、変性（９５℃、４５秒）、アニール（５５℃、３０秒）、伸長（７２℃、１分２０秒）を30サイクル、GeneAmp PCR System 2400 (パーキンエルマー製)を用いてPCRを行った結果、特異的な増幅産物が得られた。
【００６６】
得られた増幅産物をフェノール処理後、制限酵素XbaI, EcoRIで2重消化し、得られた断片を精製した。
【００６７】
得られた2種類の制限酵素消化済みＰＣＲ増幅DNA断片を、制限酵素NcoI, EcoRIで2重消化したベクターpSE420D（特開2000-189170号公報）とTAKARA Ligation Kitによりライゲーションした。ライゲーションしたDNAにより大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリン（５０ｍｇ／Ｌ）を含むLB培地で生育し、得られた形質転換株よりプラスミドをFlexiPrepにより精製した。得られたプラスミドの挿入DNA部分の塩基配列を解析した結果、プライマー部分を除き、DDBJに登録されている塩基配列と完全に一致した。得られたプラスミドをpSE-YOL1とした。プラスミド構築の過程を図1に示した。
【００６８】
［実施例１１］カルボニル還元酵素ScGRE2と枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を共発現するプラスミドpSG-SCR1の構築
pSE-YOL1をNheI, Csp45Iで2重消化し、719 bpからなるDNA断片を精製した。更に、同プラスミドをCsp45I, EcoRIで2重消化し、469 bpからなるDNA断片を精製した。枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を含むプラスミドpSE-BSG1（特願2000-374593号）をNheI、EcoRIの2つの制限酵素で二重消化し、pSE-YOL1から切り出した上記２DNA断片とTakara Ligation Kitを用いてライゲーションした。ライゲーションしたDNAにより大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリン（５０ｍｇ／Ｌ）を含むLB培地で生育し、得られた形質転換株よりプラスミドをFlexiPrepにより精製し、グルコース脱水素酵素とScGRE2を同時に発現可能なプラスミドであるpSG-SCR1を得た。プラスミド構築の過程を図２に示した。
【００６９】
[実施例１２]カルボニル還元酵素ScGRE2と枯草菌由来グルコース脱水素酵素の同時発現
実施例１１で得られたpSG-SCR1で形質転換した大腸菌 HB101株（E.coli HB101 (pSG-SCR1)） をアンピシリン50 mg/Lを含むLB培地で終夜培養後、IPTGを0.1 mM添加して遺伝子の発現を誘導し、更に４時間培養した。得られた菌体を集菌後、密閉式超音波破砕装置UCD-200TM（コスモバイオ製）で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。
【００７０】
[実施例１３]カルボニル還元酵素ScGRE2の酵素活性
実施例１２で得られた無細胞抽出液を用い、酵素活性を測定した。CHPN還元活性の測定は、100 mMリン酸カリウム緩衝液（pH 6.5）、0.2 mM NADPH、2 mM CHPN、1% ジメチルスルホキシド及び酵素を含む反応液中で、25 ℃で反応させた。1Uは、1分間に1 μmolのNADHの生成を触媒する酵素量とした。組換え大腸菌から得た無細胞抽出液では、NADPH依存的にCHPN還元活性を示し、その比活性は、10.8 U/mg-抽出液であった。
【００７１】
[実施例１４]カルボニル還元酵素ScGRE2を用いた(R)-CHPOの合成
200 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 6.5）、1 mM NADP+、CHPN 50 mM、D-グルコース 250 mM、BSA 0.1%、グルコース脱水素酵素（アマノ製）2 U、及びScGRE2酵素溶液 1 Uを含む反応液を振盪下、25 ℃で一晩反応させた。
【００７２】
［実施例１５］(R)-CHPOの光学純度
実施例１４で調整した反応液に対し、２倍容の酢酸エチルで抽出を行った。減圧下に溶媒を留去し、残渣を1倍容のヘキサン／２−プロパノール（97/3）に溶解した。このサンプルの光学分割カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーを用いた光学純度の測定を行った。分析は、実施例５に記載の方法により行った。その結果、生成物の光学純度は99.8％ee (R)であった。
【００７３】
［実施例１６］(R)-CHPOの変換率
実施例１４で調整したサンプルを用い、実施例４に記載の方法によりガスクロマトグラフィーで変換率の測定を行った。ピーク面積から算出した変換率は28.4％であった。
【００７４】
［実施例１７］カルボニル還元酵素ScYGD9のクローニング及びカルボニル還元酵素ScYGD9と枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を共発現するプラスミドpSG-YGD9の構築
特願2003-113402号の記載の方法に従って、以下の通り行った。
（１）カルボニル還元酵素のホモログ YGL039w のクローニング
DDBJに登録されている予想タンパク質YGL039w (SWISS-PROT Accession No.P53183) に対応するDNA配列 (DDBJ Accession No. Z72561) を基にPCR用プライマーYGL2-ATG2（配列番号１３）、YGL2-TAA2（配列番号１４）を合成した。プライマーを各２５ｐｍｏｌ、dNTP１０ｎｍｏｌ、サッカロマイセス・セレビジエ由来染色体DNA５０ｎｇ、Pfu DNA polymerase用緩衝液 (STRATAGENE製)、Pfu DNApolymerase 2Ｕ (STRATAGENE製)を含む５０μLの反応液を用い、変性（９５℃、４５秒）、アニール（５０℃、３０秒）、伸長（７２℃、１分１５秒）を30サイクル、GeneAmp PCR System 2400 (パーキンエルマー製)を用いてPCRを行った結果、特異的な増幅産物が得られた。
増幅産物をフェノール処理後、制限酵素BspHI, NheIで2重消化し、制限酵素NcoI,XbaIで2重消化したベクターpSE420DとTAKARA Ligation Kit によりライゲーションした。ライゲーションしたDNAにより大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリン（５０ｍｇ／Ｌ）を含むLB培地で生育し、得られた形質転換株よりプラスミドをFlexiPrepにより精製した。プラスミドの挿入DNA部分の塩基配列を解析し、その結果を配列番号１５に示した。得られた塩基配列は、DDBJに登録されている塩基配列と完全に一致した。得られたプラスミドをpSE-YGD9とした。
【００７５】
（２）カルボニル還元酵素のホモログYGL039wと枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を共発現するプラスミドpSG-YGD9の構築
pSE-YGD9をEcoRI、HindIIIの2つの制限酵素で二重消化し、枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を含むプラスミドpSE-BSG1（特開2000-189170）から同酵素で切り出したグルコース脱水素遺伝子を含むDNA断片とTakara Ligation Kitを用いてライゲーションした。ライゲーションしたDNAにより大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリン（５０ｍｇ／Ｌ）を含むLB培地で生育し、得られた形質転換株よりプラスミドをFlexiPrepにより精製し、グルコース脱水素酵素とYGL039wを同時に発現可能なプラスミドであるpSG-YGD9を得た。
【００７６】
［実施例１８］カルボニル還元酵素ScYGD9の発現
実施例１７で得られたpSG-YGD9で形質転換した大腸菌 HB101株（E.coli HB101 (pSG-YGD9)） をアンピシリン50 mg/Lを含むLB培地で終夜培養後、IPTGを0.1 mM添加して遺伝子の発現を誘導し、更に４時間培養した。得られた菌体を集菌後、密閉式超音波破砕装置UCD-200TM（コスモバイオ製）で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。
【００７７】
［実施例１９］カルボニル還元酵素ScYGD9の酵素活性
実施例１８で得られた無細胞抽出液を用い、実施例１３の方法に従って酵素活性を測定した。組換え大腸菌から得た無細胞抽出液では、NADPH依存的にCHPN還元活性を示し、その比活性は、22.7 U/mg-抽出液であった。
【００７８】
[実施例２０]カルボニル還元酵素ScYGD9を用いた(R)-CHPOの合成
200 mMリン酸カリウム緩衝液（pH 6.5）、1 mM NADP+、CHPN 50 mM、D-グルコース 250 mM、BSA 0.1%、グルコース脱水素酵素（アマノ製）2U、及びScYGD9酵素溶液 1Uを含む反応液を振盪下、25℃で一晩反応させた。
【００７９】
［実施例２１］(R)-CHPOの光学純度
実施例２０で調整した反応液に対し、実施例５と同様の方法で光学純度の測定を行った。その結果、生成物の光学純度は99.3％ee (R)であった。
【００８０】
［実施例２２］(R)-CHPOの変換率
実施例２０で調整したサンプルを用い、実施例４と同様の方法で変換率の測定を行った。その結果、ピーク面積から算出した変換率は11.6%であった。
【００８１】
［実施例２３］カルボニル還元酵素TdCR1のクローニング及びカルボニル還元酵素TdCR1と枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を共発現するプラスミドpSG-TDR1の構築
文献（特願2003-113402）記載の方法に従って、以下の通り行った。
【００８２】
（１）カルボニル還元酵素遺伝子TdCR1の一部を含むプラスミドpUC-TDXの構築
カルボニル還元酵素遺伝子のORFのXbaI部位から3'末端までをクローニングするために、プライマーTd-XbaF（配列番号１６）、Td-TAA1（配列番号１７）を合成した。
プライマーTd-XbaFとTd-TAA1を各50 pmol、dNTP10 nmol、トルラスポラ・デルブレッキー由来染色体DNA 50ng、Pfu Turbo DNA polymerase用緩衝液 (STRATAGENE製)、Pfu Turbo DNA polymerase 3.75 U (STRATAGENE製)を含む50μLの反応液を用い、変性（95℃、2分30秒）、アニール（55℃、1分）、伸長（72℃、1分）を30サイクル、GeneAmp PCR System 2400 (パーキンエルマー製)を用いて行った。得られたPCR産物をTd-PCR2とした。
【００８３】
得られたPCR産物を、フェノール-クロロホルム抽出後、エタノール沈殿として回収した。Td-PCR2をXbaIで消化した後、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、Sephaglas BandPrep Kit(ファルマシア製)により精製した。
制限酵素消化されたTd-PCR2は、XbaIで消化したpUC18（宝酒造製）とTakaraLigation Kitを用いてライゲーションし、大腸菌JM109株を形質転換した。形質転換株をアンピシリンを含むLB培地で生育させ、挿入断片の塩基配列を解析した。ここで得られたプラスミドをpUC-TDXとした。
【００８４】
（２）カルボニル還元酵素遺伝子TdCR1と枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を共発現するプラスミドpSG-TDR1の構築
プラスミドpUC-TDXを制限酵素XbaIで消化し、エタノール沈殿後、アガロース電気泳動を行い、TdCR1遺伝子の一部を含む約0.8 bpのバンドを切り出し、SephaglasBandPrep (Amersham Pharmacia Biotech製)により精製、回収した。得られたDNA断片と、同制限酵素で消化し、アルカリフォスファターゼ処理後、フェノール抽出、フェノール-クロロホルム抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿したプラスミドpSG-TDXを、TaKaRa Ligation Kitを用いてライゲーションした。ライゲーションしたDNAによって大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリン(50 mg/L)を含むLB培地で生育させ、得られた形質転換株よりプラスミドをFlexiPrepにより精製した。その結果、グルコース脱水素酵素とTdCR1を同時に発現可能なプラスミドであるpSG-TDR1を得た。
【００８５】
［実施例２４］カルボニル還元酵素TdCR1と枯草菌由来のグルコース脱水素酵素の同時発現
実施例２３で得られたpSG-TDR1で形質転換した大腸菌 HB101株（E.coli HB101 (pSG-TDR1)） をアンピシリン50 mg/Lを含むLB培地で終夜培養後、IPTGを0.1 mM添加して遺伝子の発現を誘導し、更に４時間培養した。得られた菌体を集菌後、密閉式超音波破砕装置UCD-200TM（コスモバイオ製）で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。
【００８６】
［実施例２５］カルボニル還元酵素TdCR1の酵素活性
実施例２４で得られた無細胞抽出液を用い、実施例１３の方法に従って酵素活性を測定した。組換え大腸菌から得た無細胞抽出液では、NADPH依存的にCHPN還元活性を示し、その比活性は、5.7 U/mg-蛋白質であった。
【００８７】
[実施例２６]カルボニル還元酵素TdCR1を用いた(R)-CHPOの合成
200 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 6.5）、1 mM NADP+、CHPN 50 mM、D-グルコース 250 mM、BSA 0.1%、グルコース脱水素酵素（アマノ製）1U、及びTdCR1酵素溶液 0.5Uを含む反応液を振盪下、25℃で一晩反応させた。
【００８８】
［実施例２７］(R)-CHPOの光学純度
実施例２６で調整した反応液に対し、実施例５と同様の方法で光学純度の測定を行った。その結果、生成物の光学純度は99.7％ee (R)であった。
【００８９】
［実施例２８］(R)-CHPOの変換率
実施例２６で調整したサンプルを用い、実施例４と同様の方法で変換率の測定を行った。その結果、ピーク面積から算出した変換率は9.0％であった。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】図１は、ScGRE2発現プラスミドpSE-YOL1の構築を示す。
【図２】図２は、ScGRE2及びバチルス・サブチリス由来のグルコース脱水素酵素との共発現プラスミドpSG-SCR1の構築を示す。
【図１】
2007274901.tif 000018
【図２】
2007274901.tif 000019
【配列表】
2007274901000001.app