(57)【要約】【課題】遺伝子導入等の細胞操作にそのまま適用可能な状態で生理活性物質を採取でき、細胞等の生体試料からも直接的に生理活性物質を採取する。【解決手段】生理活性物質を内在する細胞を含む液体Ｌまたは生理活性物質を含む液体Ｌを保持する液体保持部１１に、液体に接触状態に設けられた第１電極１２と、液体保持部１１に対して相対的に移動可能に設けられる第２電極１３と、該第２電極１３を細胞または液体Ｌに接触する位置と、該液体Ｌから離間する位置との間で液体保持部１１に対して相対的に移動させる移動手段と、細胞または液体Ｌに挿入された第２電極１３に対して、第１電極１２の電位を相対的な基準として生理活性物質の電荷と逆極性にバイアスされた脈流電圧を加える電源１５とを備える生理活性物質採取装置１を提供する。【選択図】      図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性物質を内在する細胞を含む液体または生理活性物質を含む液体を保持する液体保持部に、前記液体に接触状態に設けられた第１電極と、
前記液体保持部に対して相対的に移動可能に設けられる第２電極と、
該第２電極を前記細胞または液体に接触する位置と、該液体から離間する位置との間で液体保持部に対して相対的に移動させる移動手段と、
前記細胞または液体に挿入された第２電極に対して、前記第１電極の電位を相対的な基準として前記生理活性物質の電荷と逆極性にバイアスされた脈流電圧を加える電源とを備える生理活性物質採取装置。
【請求項２】
前記生理活性物質が、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質である請求項１に記載の生理活性物質採取装置。
【請求項３】
前記生理活性物質が、負の電荷を有するＤＮＡである請求項２に記載の生理活性物質採取装置。
【請求項４】
前記電源が前記第２電極に脈流電圧を加えたままの状態で、前記移動手段が前記第２電極を液体保持部に対して相対的に移動させる請求項１に記載の生理活性物質採取装置。
【請求項５】
第１電極が接触状態に配された、生理活性物質を内在する細胞または生理活性物質を含む液体に、第２電極を挿入する工程と、
該第２電極に対し、前記第１電極の電位を相対的な基準として前記生理活性物質の電荷と逆極性にバイアスした脈流電圧を加える工程と、
該第２電極と前記液体とを離間する位置まで相対的に移動させる工程とを備える生理活性物質採取方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性物質採取装置および生理活性物質採取方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、電極間に電圧をかけて、ＤＮＡ（DeoxyriboNucleic Acid）を採取する装置としてＤＮＡピンセットが知られている（例えば、非特許文献１参照。）。
このＤＮＡピンセットは、電極となるＤＮＡピンセットの先端をＤＮＡ溶液に接触させ、高周波電圧を加えることにより、両電極間にＤＮＡを集めるものであり、電極先端にＤＮＡが付着するためＤＮＡ溶液内からＤＮＡを採取することができる。
【非特許文献１】Gen Hashiguchi, et al., “DNAManipulation and Retrieval from an Aqueous Solution with MicromachinedNanotweezers” Analytical Chemistry, vol. 75, No. 17,September 1, 2003, pp.4347-4350
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、ＤＮＡピンセットは電極間においてＤＮＡを採取するため、採取されたＤＮＡを遺伝子導入などの細胞操作に適用することが困難であるという問題がある。すなわち、遺伝子導入等の細胞操作を行うには、微細な針部にＤＮＡを保持させる必要があるので、ＤＮＡピンセットの先端の電極間に挟まれるようにして採取されたＤＮＡは、そのまま細胞に導入することはできない。
さらに、ＤＮＡピンセットは、ＤＮＡ溶液内のＤＮＡを採取することはできるものの、細胞のような生体試料内から直接採取することができないという不都合がある。
【０００４】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、遺伝子導入等の細胞操作にそのまま適用可能な状態で生理活性物質を採取でき、細胞等の生体試料からも直接的に生理活性物質を採取することができる生理活性物質採取装置および生理活性物質採取方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、生理活性物質を内在する細胞を含む液体または生理活性物質を含む液体を保持する液体保持部に、前記液体に接触状態に設けられた第１電極と、前記液体保持部に対して相対的に移動可能に設けられる第２電極と、該第２電極を前記細胞または液体に接触する位置と、該液体から離間する位置との間で液体保持部に対して相対的に移動させる移動手段と、前記細胞または液体に挿入された第２電極に対して、前記第１電極の電位を相対的な基準として前記生理活性物質の電荷と逆極性にバイアスされた脈流電圧を加える電源とを備える生理活性物質採取装置を提供する。
【０００６】
上記発明においては、前記生理活性物質が、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質であることが好ましい。
また、上記発明においては、前記生理活性物質が、負の電荷を有するＤＮＡであることとしてもよい。
【０００７】
また、上記発明においては、前記電源が前記第２電極に脈流電圧を加えたままの状態で、前記移動手段が前記第２電極を液体保持部に対して相対的に移動させることとしてもよい。
また、本発明は、第１電極が接触状態に配された、生理活性物質を内在する細胞または生理活性物質を含む液体に、第２電極を挿入する工程と、該第２電極に対し、前記第１電極の電位を相対的な基準として前記生理活性物質の電荷と逆極性にバイアスした脈流電圧を加える工程と、該第２電極と前記液体とを離間する位置まで相対的に移動させる工程とを備える生理活性物質採取方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、遺伝子導入等の細胞操作にそのまま適用可能な状態で生理活性物質を採取でき、細胞等の生体試料からも直接的に生理活性物質を採取することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明の第１の実施形態に係る生理活性物質採取装置１および生理活性物質採取方法について、図１〜図８を参照して説明する。
本実施形態に係る生理活性物質採取装置１は、例えば、図１に示されるように、細胞を観察するための顕微鏡装置２に備えられる。
【００１０】
顕微鏡装置２は、図１に示されるように、遺伝子等の生理活性物質を分散させた培養液内に細胞を収容した容器３を載置するステージ４と、該ステージ４上の細胞を照明する照明装置５と、細胞において反射あるいは透過した光、あるいは細胞から発生した蛍光を観察する観察装置６と、ステージ４を駆動制御するステージコントローラ７と、照明装置５および観察装置６を制御する顕微鏡コントローラ８と、観察装置６により得られた画像を処理する画像処理装置９と、該画像処理装置９により処理された画像を表示する表示装置１０とを備えている。
【００１１】
前記照明装置５には、細胞に対して、観察装置６とは反対側から照明光を照射する透過照明光源５Ａおよび、該透過照明光源５Ａから発せられた照明光を細胞に集光するコンデンサレンズ５Ｃと、細胞に対して観察装置６と同一方向から照明光を照射する落射照明光源５Ｂとが備えられている。
また、観察装置６には、図示しない対物レンズを含む観察光学系と、該観察光学系を介した細胞からの光を撮像して画像を取得するＣＣＤ素子６Ａと、細胞からの光を直接観察する接眼レンズ６Ｂとが備えられている。
【００１２】
本実施形態に係る生理活性物質採取装置１は、図２に示されるように、ステージ４上の容器３近傍に配置されるＤＮＡ溶液保持部１１に設けられた第１電極１２と、該第１電極１２の上方に対向して設けられた第２電極１３と、該第２電極１３を駆動する駆動ユニット（移動手段）１４と、第２電極１３に脈流電圧を加える電気信号発生回路（電源）１５とを備えている。
【００１３】
ＤＮＡ溶液保持部１１は、図２に示されるように、プレート１１Ａと、該プレート１１Ａ表面に敷設されたＰｔ膜からなる第１電極１２と、ＤＮＡ溶液Ｌの保持される保持領域以外の領域のＰｔ膜を被覆するように設けられた撥水膜１１Ｂとを備えている。これにより、ＤＮＡ溶液保持部１１にＤＮＡ溶液Ｌを載せると、撥水膜１１Ｂが設けられていない保持領域に露出する第１電極１２に接触状態にＤＮＡ溶液Ｌが保持されるようになっている。
【００１４】
前記第２電極１３は、例えば、シリコン基板１６の表面に導電膜１３Ａを製膜することにより構成されている。第２電極１３は、カンチレバー状に形成されたシリコン基板１６の自由端に突出状態に設けられ、ＤＮＡ溶液Ｌ内に進入可能な針部１７を備えている。該針部１７にも導電膜１３Ａが設けられている。
【００１５】
前記駆動ユニット１４は、Ｘ，Ｙ，Ｚ方向に針部１７を移動させる、例えば、３軸の直線移動機構を備えている。駆動ユニット１４には、該駆動ユニット１４を制御する駆動制御装置１８が接続されている。駆動制御装置１８は、駆動ユニット１４を制御する駆動ユニット制御回路１８Ａおよび前記電気信号発生回路１５を備えている。
電気信号発生回路１５は、前記第１電極１２と第２電極１３との間に、図３に示されるような正のバイアスを有する高周波電圧を加えるようになっている。
【００１６】
このように構成された本実施形態に係る生理活性物質採取装置１を用いた生理活性物質採取方法について以下に説明する。
本実施形態に係る生理活性物質採取装置１を用いてＤＮＡ溶液Ｌ内のＤＮＡを採取するには、ＤＮＡ溶液保持部１１の保持領域にＤＮＡ溶液Ｌを保持して、ステージ４近傍に配置し、駆動ユニット制御回路１８Ａの作動により駆動ユニット１４を作動させて第２電極１３を移動させる。そして、第２電極１３先端の針部１７がＤＮＡ溶液Ｌ内に挿入された状態で駆動ユニット１４を停止し、駆動制御装置１８に設けられた電気信号発生回路１８Ｂを作動させる。
【００１７】
電気信号発生回路１８Ｂの作動により、第１電極１２と第２電極１３との間に正のバイアスの高周波電圧が加えられる。ＤＮＡ溶液Ｌ内のＤＮＡは、負の電荷を有しているので、これにより、ＤＮＡはＤＮＡ溶液Ｌ内に挿入されている第２電極１３の針部１７のみに集められる。
【００１８】
ＤＮＡ溶液Ｌ内に２つの電極からなるＤＮＡピンセットを刺し入れて、両電極間にＤＮＡを回収する従来の方法と比較すると、ＤＮＡを一方の第２電極１３のみに回収して、その後の操作を容易にすることができる。すなわち、第２電極１３を構成する針部１７の先端に付着した状態にＤＮＡを回収できる。したがって、ステージ４上に載置して顕微鏡観察下に配した細胞に、ＤＮＡが保持された針部１７をそのまま刺し入れて、核内に導入することができる。
【００１９】
また、本実施形態に係る生理活性物質採取装置１によれば、第１電極１２と第２電極１３との間に加える電圧を高周波電圧とすることにより、電流の実効値を抑制し、第２電極１３の表面における反応や、ＤＮＡ溶液Ｌ中の対流を防止して、効果的に第２電極１３の表面にＤＮＡを回収することができる。
【００２０】
ここで、図４に、本実施形態に係る生理活性物質採取装置１を用いて、ＤＮＡ溶液Ｌ中のＤＮＡを第２電極１３に回収した実施例を示す。予め蛍光標識したＤＮＡを分散させたＤＮＡ溶液Ｌ内に第２電極１３を差し込んで高周波電圧（１ＭＨｚ、２．５Ｖ、バイアス２．５Ｖ）を加え、蛍光顕微鏡により観察した結果、図４に示されるように、第２電極１３を差し込んだ右端部分の輝度が大きくなり、ＤＮＡが回収されていることがわかる。
【００２１】
また、このようにして電圧を加えた第２電極１３をＤＮＡ溶液Ｌから引き上げた後に、第２電極１３を蛍光観察した結果の輝度値は、図５に示されるように、電圧をかけずにＤＮＡ溶液Ｌに刺し入れて引き上げた第２電極１３と比較して２倍以上の値を示していることがわかる。
そして、このようにしてＤＮＡを付着させた第２電極１３を、そのまま、図６に矢印で示す細胞Ａに刺し入れて遺伝子導入を行い、２４時間培養した結果、図７に位相差観察像により示されるように細胞分裂した細胞Ａのうち、遺伝子導入を行った細胞Ａの遺伝子が発現したことが、図８に蛍光観察像により示されるように確認された。
【００２２】
なお、本実施形態に係る生理活性物質採取装置１においては、ＤＮＡを分散させたＤＮＡ溶液Ｌ内に第２電極１３を挿入してＤＮＡを回収する例を説明したが、これに代えて、第２電極１３を細胞Ａ内に挿入して細胞Ａ内の生理活性物質を採取することとしてもよい。
【００２３】
この場合、顕微鏡観察下において細胞Ａの位置を確認しながら第２電極１３を挿入する必要があるため、プレート１１Ａとしてガラス基板、第１電極１２として透明電極（ＩＴＯ電極）を用いた細胞保持部１１上において細胞Ａを培養しておくことが好ましい。そして、上記と同様にして、細胞Ａ内に第２電極１３を挿入して、正のバイアスをかけた高周波電圧を加えることにより、細胞Ａ内の生理活性物質を効率的に回収することができる。
また、透明電極に代えて、第１電極１２として不透明な電極を採用し、照明光が通過する光路を避けて配置することとしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る生理活性物質採取装置を示す全体構成図である。
【図２】図１の生理活性物質採取装置の電極近傍の構造を示す拡大図である。
【図３】図１の生理活性物質採取装置の電極に加える電圧波形例を示す図である。
【図４】図１の生理活性物質採取装置の電極の周囲にＤＮＡが集まっている様子を示す顕微鏡写真である。
【図５】図４の電極に高周波電圧をかけた場合とかけない場合とのＤＮＡの回収量を比較して示すグラフである。
【図６】図４のように電極に回収されたＤＮＡを導入した細胞を示す顕微鏡写真である。
【図７】図６の細胞を２４時間培養した結果の位相差観察像を示す顕微鏡写真である。
【図８】図６の細胞を２４時間培養した結果の蛍光観察像を示す顕微鏡写真である。
【符号の説明】
【００２５】
Ａ  細胞
Ｌ  ＤＮＡ溶液（液体）
１  生理活性物質採取装置
１１  ＤＮＡ溶液保持部（液体保持部）
１２  第１電極
１３  第２電極
１４  駆動ユニット（移動手段）
１５  電気信号発生回路（電源）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2007319035.tif 000008
【図７】
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【図８】
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