(57)【要約】【課題】本発明は、細胞内のグルタチオンレダクターゼの活性を増強させて、還元型のグルタチオンの生体濃度を高めるものであり、還元型のグルタチオンの欠乏により生じる過酸化物の皮膚障害を防止するグルタチオンレダクターゼ活性増強剤を提供することを目的とする。【解決手段】次の一般式（１）【化１】 2007051114.tif 000007 （式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、各々独立して水素原子、炭素原子数１〜１２のアルキル基、アルケニル基、環状アルキル基、環状アルケニル基、アルコキシアルキル基、アリール基、アルキルアリール基、アラルキル基、アシル基、またはグリコシル基から選択される基を示す。）の構造式で示されるフェルラ酸、イソフェルラ酸、又はそれらのエステル、グリコシド、ボルニル、およびそれらの塩の中から選ばれる一種又は二種以上の物質を含有することを特徴とするグルタチオンレダクターゼ活性増強剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の一般式（１）
【化１】
2007051114.tif 000006
（式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、各々独立して水素原子、炭素原子数１〜１２のアルキル基、アルケニル基、環状アルキル基、環状アルケニル基、アルコキシアルキル基、アリール基、アルキルアリール基、アラルキル基、アシル基、またはグリコシル基から選択される基を示す。）の構造式で示されるフェルラ酸、イソフェルラ酸、又はそれらのエステル、グリコシド、ボルニル、およびそれらの塩の中から選ばれる一種又は二種以上の物質を含有することを特徴とするグルタチオンレダクターゼの活性増強剤。
【請求項２】
一般式（１）の構造式で示されるフェルラ酸、イソフェルラ酸、又はそれらのエステル、グリコシド、ボルニル、およびそれらの塩の中から選ばれる一種又は二種以上の物質を含有することを特徴とする還元型グルタチオン生成促進剤。
【請求項３】
請求項１記載のグルタチオンレダクターゼの活性増強剤を含む還元型グルタチオンの生成促進による抗酸化剤。
【請求項４】
請求項１記載のグルタチオンレダクターゼの活性増強剤を含む還元型グルタチオンの生成促進による美白用組成物。
【請求項５】
請求項１記載のグルタチオンレダクターゼの活性増強剤を含む還元型グルタチオンの生成促進による老化防止用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルタチオンレダクターゼ活性増強剤に関し、特に食品、化粧品、医薬部外品または医薬品等に配合してグルタチオンレダクターゼの活性を増強し、還元型グルタチオンの生成を促進することにより皮膚の酸化傷害や皮膚老化にその有効性を発揮する生体の酸化防止または予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は生体の最外層に位置し、紫外線等の影響により活性酸素が発生しやすい臓器であり、絶えずその酸素ストレスに曝されている。一方、皮膚細胞内にはグルタチオンに代表される還元物質が存在しており、その能力を超える過酸化物が発生しないかぎり過酸化物の傷害から皮膚細胞を防衛している。グルタチオンは細胞内で酸化型と還元型の２種類の構造で存在し、グルタチオンレダクターゼにより酸化型のグルタチオンは還元型に変換され、細胞内の還元能力が保持されている。したがって、細胞の還元能力を保持するためには、還元型のグルタチオンの濃度を上げることが重要であり、還元型のグルタチオンの生成を促進するグルタチオンレダクターゼは、細胞の還元能力を保持する重要な酵素である。
【０００３】
ところが、紫外線などの酸化ストレスにより、皮膚中のグルタチオンレダクターゼ活性が低下することが知られている（非特許文献１参照）。グルタチオンレダクターゼ活性が低下すると、還元型グルタチオンの生成量が減少し、細胞の還元能力が低下する。したがって、過酸化物による傷害がその防御反応を凌駕したとき、皮膚は酸化され、細胞機能が劣化して老化してゆくと考えられる。
【非特許文献１】Ｊｕｒｇｅｎ  Ｆｕｃｈｓ  Ｍ．Ｄ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ，９３：７６９−７７３，１９８９．
【０００４】
そこで、過酸化物による傷害からの防御を目的として、特許文献１〜４などのように抗酸化剤や活性酸素消去剤が検討され、ＳＯＤやカタラーゼ等の活性酸素消去酵素、ＳＯＤ様活性物質などの活性酸素消去剤や抗酸化剤、細胞内のグルタチオン濃度を増強させる組成物を配合した食品、化粧品、医薬部外品または医薬品等が開発されている。
【特許文献１】特開平９−１１８６３０
【特許文献２】特開平９−２０８４８４
【特許文献３】特開平２００２−２７５０７９
【特許文献４】特開平２００３−３２１４６３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、ＳＯＤやカタラーゼ等の活性酸素消去酵素は安定性に問題があり、活性酸素消去剤や抗酸化剤は、その効果が充分ではない。また、細胞内のグルタチオン濃度を増強させる組成物も還元型グルタチオンの量が保持されなければ、十分な過酸化物による傷害からの防御効果が期待されないため、不充分である。
【０００６】
本発明は、細胞内のグルタチオンレダクターゼの活性を増強させて、還元型のグルタチオンの生体濃度を高めるものであり、還元型グルタチオンの欠乏により生じる過酸化物の皮膚障害を防止するグルタチオンレダクターゼ活性増強剤を提供することを目的とする。また、細胞機能の低下により生じる皮膚細胞へのメラニンの沈着およびしわやハリの低下などの老化症状の改善を目的とする。
【０００７】
一方、フェルラ酸の生理活性については、抗酸化作用（非特許文献２参照）、化学的発癌抑制作用（非特許文献３参照）、βアミロイド蛋白毒性抑制作用（非特許文献４参照）、子宮運動抑制作用（非特許文献５参照）などが知られている。しかし、フェルラ酸がグルタチオンレダクターゼの活性を増強する作用については全く知られていない。
【非特許文献２】Ｇｕｐｔａ Ｓ， Ｓｕｋｈｉｊａ ＰＳ， ＢｈａｔｉａＩＳ，Ｍｉｌｃｈｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ，３４：２０５−２０６，１９７９．
【非特許文献３】Ｍｏｒｉ Ｈ， Ｋａｗａｂａｔａ Ｋ， ＹｏｓｈｉｍｉＮ， Ｔａｎａｋａ Ｔ， Ｍｕｒａｋａｍｉ Ｔ， Ｏｋａｄａ Ｔ， Ｍｕｒａｉ Ｈ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９：３７７５−３７７８，１９９９．
【非特許文献４】Ｙａｎ ＪＪ， Ｃｈｏ ＪＹ， Ｋｉｍ ＨＳ， ＫｉｍＫＬ， Ｊｕｎｇ ＪＳ， Ｈｕｈ ＳＯ， Ｓｕｈ ＨＷ， Ｋｉｍ ＹＨ， Ｓｏｎｇ ＤＫ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１３３：８９−９６，２００１
【非特許文献５】Ｏｚａｋｉ Ｙ， Ｍａ ＪＰ， Ｈｕ ＧＱ， ＬｉＹＫ， Ｈａｒａｄａ Ｍ，Ｓｈｏｙａｋｕｇａｋｕｇａｋｕ Ｚａｓｓｈｉ，４５：２９９−３０５，１９９１
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、過酸化物による傷害からの防御作用に優れた外用剤を得るために鋭意検討した結果、次の一般式（１）
【化２】
2007051114.tif 000002
（式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、各々独立して水素原子、炭素原子数１〜１２のアルキル基、アルケニル基、環状アルキル基、環状アルケニル基、アルコキシアルキル基、アリール基、アルキルアリール基、アラルキル基、アシル基、またはグリコシル基から選択される基を示す。）の構造式で示されるフェルラ酸、イソフェルラ酸、又はそれらのエステル、グリコシド、ボルニル、およびそれらの塩の中から選ばれる一種または二種以上の物質が安定で、皮膚細胞のグルタチオンレダクターゼの活性を増強させて、還元型のグルタチオンの生体濃度を高めることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明で用いられる一般式（１）の構造式で示されるフェルラ酸、イソフェルラ酸、又はそれらのエステル、グリコシド、ボルニル、およびそれらの塩は、これを含有する天然物、特に植物から抽出することもでき、化学合成により工業的に製造することもできる。抽出によって得ても、合成によって得てもよい。
【００１０】
一般式（１）の構造式で示されるフェルラ酸、イソフェルラ酸、又はそれらのエステル、グリコシド、ボルニルは、塩にすることにより水溶性を向上させ、生理学的有効性を増大させることができる。塩形成用の塩基物質としては、例えば、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属の水酸化物；水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム等のアルカリ土類金属の水酸化物；水酸化アンモニウム等の無機塩基、アルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン等の塩基性アミノ酸；モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等の有機塩基が用いられる。本発明においては、これらの塩を調製してから、その他の成分からなる組成物中に添加したものでもよいし、別々に該組成物中に添加して、この中で塩を形成せしめたものでもよい。
【００１１】
植物から抽出する方法としては、例えば、コメの糠より得られた米糠油を、室温時弱アルカリ性下で含水エタノール及びヘキサンで分配した後、含水エタノール画分に得られたフェルラ酸エステルを、加圧下熱時硫酸で加水分解し、精製して得る方法があげられる。また、細菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）を、フトモモ科チョウジノキ（Ｓｙｚｙｇｉｕｍ
ａｒｏｍａｔｉｃｕｍ ＭＥＲＲＩＬＬ ｅｔ ＰＥＲＲＹ）のつぼみおよび葉より水蒸気蒸留で得られた丁子油、又は丁子油から精製して得られたオイゲノールを含む培養液で培養し、その培養液を、分離、精製して得ることもできる。
【００１２】
またフェルラ酸は、化学合成、例えば、バニリンとマロン酸との縮合反応によって製造することができる。なお、一般式（１）の構造式で示されるフェルラ酸、イソフェルラ酸、又はそれらのエステル、グリコシド、ボルニル、およびそれらの塩には、立体異性体が存在するが、本発明では、純粋な立体異性体またはそれらの混合物を用いることができる。
【００１３】
本発明の一般式（１）の構造式で示されるフェルラ酸、イソフェルラ酸、又はそれらのエステル、グリコシド、ボルニル、およびそれらの塩は、効果を損なわない範囲内で、通常の外用剤に用いられる成分である油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、金属石鹸、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、保湿剤、粉体、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、酸化防止剤、美白剤、キレート剤等の成分を配合することもできる。
【００１４】
本発明に用いるグルタチオンレダクターゼ活性増強剤は、食品、化粧品、医薬部外品または医薬品のいずれにも用いることができ、その剤型としては、例えば、錠菓、飲料、化粧水、クリーム、乳液、ゲル剤、エアゾール剤、軟膏、パップ剤、ペースト剤、プラスター剤、エッセンス、パック、洗浄剤、浴用剤、ファンデーション、打粉、口紅、散剤、丸剤、錠剤、注射剤、坐剤、乳剤、カプセル剤、顆粒剤、液剤（チンキ剤、流エキス剤、酒精剤、懸濁剤、リモナーデ剤などを含む）等が挙げられる。
【００１５】
本発明に用いる一般式（１）の構造式で示されるフェルラ酸、イソフェルラ酸、又はそれらのエステル、グリコシド、ボルニル、およびそれらの塩の中から選ばれる一種または二種以上の物質の配合量は特に限定されないが、０．００００１〜２０重量％の範囲が好ましく、さらに好ましくは０．０００１〜１０重量％である。０．００００１重量％以下では効果が低く、また２０重量％を超えても効果に大きな増強はみられにくく、効率的でない。また、添加の方法については、予め加えておいても製造途中で添加しても良く、作業性を考えて適宜選択すれば良い。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の一般式（１）の構造式で示されるフェルラ酸、イソフェルラ酸、又はそれらのエステル、グリコシド、ボルニル、およびそれらの塩の中から選ばれる一種または二種以上の物質を含有することを特徴とするグルタチオンレダクターゼ活性増強剤は、グルタチオンレダクターゼの活性を増強させて、還元型のグルタチオンの生体濃度を高める作用を有する。詳しくは、細胞機能の低下により生じる皮膚細胞へのメラニンの沈着およびしわやハリの低下などの老化症状の改善に有効なグルタチオンレダクターゼ活性増強剤に関するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
次に本発明を詳細に説明するため、実施例として処方例及び実験例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。実施例に示す配合量は重量％を示す。
【実施例１】
【００１８】
本発明に係る実施例の処方を示す。
【００１９】
処方例１  クリーム
処方                                                配合量（重量％）
１．フェルラ酸                                        ０．１
２．スクワラン                                        ５．５
３．オリーブ油                                        ３．０
４．ステアリン酸                                      ２．０
５．ミツロウ                                          ２．０
６．ミリスチン酸オクチルドデシル                      ３．５
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）  ３．０
８．ベヘニルアルコール                                １．５
９．モノステアリン酸グリセリン                        ２．５
１０．香料                                              ０．１
１１．１，３−ブチレングリコール                        ８．５
１２．パラオキシ安息香酸エチル                          ０．０５
１３．パラオキシ安息香酸メチル                          ０．２
１４．精製水                                          ６８．０５
［製造方法］成分１〜９を加熱して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１１〜１４を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。
【００２０】
処方例２  クリーム２
処方例１において、フェルラ酸をイソフェルラ酸に置き換えたものをクリーム２とした。
【００２１】
処方例３  クリーム３
処方例１において、フェルラ酸をフェルラ酸メチルに置き換えたものをクリーム３とした。
【００２２】
処方例４  クリーム４
処方例１において、フェルラ酸をフェルラ酸７−Ｏ−グルコシドに置き換えたものをクリーム４とした。
【００２３】
処方例５  クリーム５
処方例１において、フェルラ酸をフェルラ酸ボルニルに置き換えたものをクリーム５とした。
【００２４】
処方例６  クリーム６
処方例１において、フェルラ酸をフェルラ酸４−Ｏ−β−グルコピラノシドに置き換えたものをクリーム６とした。
【００２５】
処方例７  クリーム７
処方例１において、フェルラ酸を４−メトキシフェルラ酸に置き換えたものをクリーム７とした。
【００２６】
処方例８  クリーム８
処方例１において、フェルラ酸をフェルラ酸ナトリウムに置き換えたものをクリーム８とした。
【００２７】
比較例１  従来のクリーム
処方例１において、フェルラ酸を精製水に置き換えたものを従来のクリームとした。
【００２８】
処方例９  化粧水
処方                                                配合量（重量％）
１．フェルラ酸７−Ｏ−グルコシド                      ０．０５
２．１，３−ブチレングリコール                        ８．０
３．グリセリン                                        ２．０
４．キサンタンガム                                    ０．０２
５．クエン酸                                          ０．０１
６．クエン酸ナトリウム                                ０．１
７．エタノール                                        ５．０
８．パラオキシ安息香酸メチル                          ０．１
９．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（４０Ｅ．Ｏ．）    ０．１
１０．香料                                              ０．１
１１．精製水                                          ８４．５２
［製造方法］成分２〜６及び１１と、成分１及び７〜１０をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合し濾過して製品とする。
【００２９】
処方例１０  乳液
処方                                                配合量（重量％）
１．４−メトキシフェルラ酸エチル                      ０．００５
２．スクワラン                                        ５．０
３．オリーブ油                                        ５．０
４．ホホバ油                                          ５．０
５．セタノール                                        １．５
６．モノステアリン酸グリセリン                        ２．０
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）  ３．０
８．ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート        ２．０
９．香料                                              ０．１
１０．プロピレングリコール                              １．０
１１．グリセリン                                        ２．０
１２．パラオキシ安息香酸メチル                          ０．２
１３．精製水                                          ７３．１９５
［製造方法］成分２〜８を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１０〜１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分９を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。
【００３０】
処方例１１  軟膏
処方                                                配合量（重量％）
１．フェルラ酸ブチル                                  １．０
２．ポリオキシエチレンセチルエーテル（３０Ｅ．Ｏ．）  ２．０
３．モノステアリン酸グリセリン                      １０．０
４．流動パラフィン                                    ５．０
５．セタノール                                        ６．０
６．パラオキシ安息香酸メチル                          ０．１
７．プロピレングリコール                            １０．０
８．精製水                                          ６５．９
［製造方法］成分２〜５を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び６〜８を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。
【００３１】
処方例１２  ファンデーション
処方                                                配合量（重量％）
１．４−メトキシフェルラ酸イソプロピル                ０．５
２．ステアリン酸                                      ２．４
３．ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート      １．０
（２０Ｅ．Ｏ．）
４．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）  ２．０
５．セタノール                                        １．０
６．液状ラノリン                                      ２．０
７．流動パラフィン                                    ３．０
８．ミリスチン酸イソプロピル                          ６．５
９．パラオキシ安息香酸ブチル                          ０．１
１０．カルボキシメチルセルロースナトリウム              ０．１
１１．ベントナイト                                      ０．５
１２．プロピレングリコール                              ４．０
１３．トリエタノールアミン                              １．１
１４．パラオキシ安息香酸メチル                          ０．２
１５．二酸化チタン                                      ８．０
１６．タルク                                            ４．０
１７．ベンガラ                                          １．０
１８．黄酸化鉄                                          ２．０
１９．香料                                              ０．１
２０．精製水                                          ６０．５
［製造方法］成分２〜９を加熱溶解し、８０℃に保ち油相とする。成分２０に成分１０をよく膨潤させ、続いて、成分１及び１１〜１４を加えて均一に混合する。これに粉砕機で粉砕混合した成分１５〜１８を加え、ホモミキサーで撹拌し７５℃に保ち水相とする。この水相に油相をかき混ぜながら加え、冷却し、４５℃で成分１９を加え、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。
【００３２】
処方例１３  錠菓
処方                                                配合量（重量％）
１．フェルラ酸                                        １．０
２．フェルラ酸ブチル                                  １．０
３．乾燥コーンスターチ                              ５０．０
４．エリスリトール                                  ４０．０
５．クエン酸                                          ４．０
６．ショ糖脂肪酸エステル                              ３．０
７．香料                                              ０．１
８．水                                                ０．９
［製造方法］成分１〜５及び８を混合し、顆粒成形する。成形した顆粒に成分６及び７を加えて打錠する。１粒１．０ｇとする。
【００３３】
処方例１４  錠剤
処方                                                配合量（重量％）
１．フェルラ酸７−Ｏ−グルコシド                    １０．０
２．トウモロコシデンプン                            １０．０
３．精製白糖                                        ２０．０
４．カルボキシメチルセルロース                      １０．０
５．微結晶セルロース                                ３５．０
６．ポリビニルピロリドン                              ５．０
７．タルク                                          １０．０
［製造方法］成分１〜５を混合し、次いで成分６の水溶液を結合剤として加えて常法により顆粒化した。これに滑沢剤として成分７を加えて配合した後、１錠１００ｍｇの錠剤に打錠した。
【００３４】
処方例１５  注射剤
処方                                                配合量（重量％）
１．フェルラ酸４−Ｏ−β−グルコピラノシド            ０．０００1
２．ポリオキシエチレン（６０）硬化ヒマシ油            ３．７
３．ゴマ油                                            ０．２
４．塩化ナトリウム                                    ０．９
５．プロピレングリコール                              ４．０
６．リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ６．０）            １０．０
７．蒸留水                                          ８１．1９９９
［製造方法］成分１、２、３および成分５の半量を混合して約８０℃で加温溶解し、これに成分４、６と成分５を予め溶解した成分７を約８０℃に加温して加え全量を１０００ｍＬの水溶液とした。この水溶液を１ｍＬのアンプルに分注して熔閉した後、加熱滅菌した。
【実施例２】
【００３５】
次に、本発明の効果を詳細に説明するため、実験例をあげる。
【００３６】
実験例１  細胞内グルタチオンレダクターゼの活性化試験
細胞内グルタチオンレダクターゼの活性化効果を下記の条件にて測定した。
【００３７】
コンフルエントな状態のヒト表皮角化細胞を、１μｇ／ｍＬの試料を含むＤＭＥＭ培地でさらに２４時間培養した後、細胞を剥離し、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍＬを加えて超音波破砕し、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行い、上澄を試料溶液とした。試料溶液９００μＬに、９．５ｍＭ酸化型グルタチオン／リン酸緩衝溶液１００μＬ及び２ｍＭ  ＮＡＤＰＨ／リン酸緩衝溶液１２０μＬを加え、３４０ｎｍの吸光度の時間変化（φＡ３４０ｎｍ／ｍｉｎ、３分間）を測定し、標準のグルタチオンレダクターゼ０，５，１０および２０ｍＵ／ｍＬから作成した検量線より試料溶液のグルタチオンレダクターゼ活性を算出した。同時に、試料溶液のタンパク濃度を測定し、単位タンパク当りのグルタチオンレダクターゼ活性を算出した。試料未添加の細胞のグルタチオンレダクターゼ活性をコントロールとし、コントロールを１００としたときの試料添加のグルタチオンレダクターゼ活性の値を細胞内グルタチオンレダクターゼ活性として算出した。
【００３８】
これらの試験結果を表１に示した。その結果、フェルラ酸、イソフェルラ酸、フェルラ酸メチル、フェルラ酸７−Ｏ−グルコシド、フェルラ酸ボルニル、フェルラ酸４−Ｏ−β−グルコピラノシド、および４−メトキシフェルラ酸は優れた細胞内グルタチオンレダクターゼの活性化作用が認められた。
【００３９】
【表１】
2007051114.tif 000003
【００４０】
実験例２  細胞内還元型グルタチオン比の増加作用の評価
細胞内還元型グルタチオン比の増加作用を下記の条件にて測定した。
【００４１】
コンフルエントな状態になった表皮角化細胞を１μｇ／ｍＬ濃度の試料を添加したＥａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭ培地にてさらに２４時間培養した後、細胞を剥離し、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）０．５ｍＬを加えて超音波破砕し、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行い、上清を試料溶液とした。９６ｗｅｌｌプレートを用い試料溶液１００μＬに０．５ｍＭ  ＮＡＤＰＨ／リン酸緩衝溶液と１Ｕ／ｍＬグルタチオンレダクターゼ／リン酸緩衝溶液の１：１混合液２５μＬを添加し、室温で１０分間反応させた。さらに１０ｍＭ５，５’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ−２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ／リン酸緩衝溶液２５μＬを添加し、室温で１０分間反応させた後、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。標準の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）から作成した検量線より試料溶液の総グルタチオン量を算出した。また、試料溶液１５０μＬに１Ｍ２−ｖｉｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ２．５μＬを添加し、室温で１時間反応させＧＳＨを除いた後、同様な反応により酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）量を求めた。同時に、試料溶液のタンパク濃度を測定し、単位タンパク当りの総グルタチオン量とＧＳＳＧ量からＧＳＨ量を算出し、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比を求めた。試料未添加の細胞のＧＳＨ／ＧＳＳＧ比をコントロールとし、コントロールを１００としたときの試料添加のＧＳＨ／ＧＳＳＧ比の値を細胞内還元型グルタチオン比として算出した。
【００４２】
これらの試験結果を表２に示した。その結果、フェルラ酸、イソフェルラ酸、フェルラ酸メチル、フェルラ酸７−Ｏ−グルコシド、フェルラ酸ボルニル、フェルラ酸４−Ｏ−β−グルコピラノシド、および４−メトキシフェルラ酸は優れた細胞内還元型グルタチオン比の増加作用が認められ、細胞の還元型グルタチオン割合を増加させる作用が認められた。
【００４３】
【表２】
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【００４４】
実験例３  使用試験
処方例１〜８のクリーム及び比較例１の従来のクリームを用いて、しわ、シミに悩む女性３０人（２０〜４５才）を対象に６ヶ月間の使用試験を行った。使用後、しわ、シミの改善についてのアンケート調査を行って、皮膚性状の改善効果を判定した。アンケートの評価基準は、有効なものを「優」、やや有効なものを「良」、わずかに有効なものを「可」、無効なものを「不可」として評価した。
【００４５】
これらの結果を表３に示した。処方例１〜８のグルタチオンレダクターゼ活性増強剤を含む皮膚外用剤は優れたしわ、シミの改善効果を示した。なお、試験期間中皮膚トラブルは一人もなく、安全性においても問題なかった。
【００４６】
【表３】
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【００４７】
処方例９〜１４の化粧水、乳液、軟膏、ファンデーション、錠菓、および錠剤の使用試験を行ったところ、いずれも安全で優れたしわ、シミの改善効果を示した。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明の活用例として、食品、化粧品、医薬部外品または医薬品のいずれにも用いることができる。その剤型としては、錠菓、飲料、化粧水、クリーム、乳液、ゲル剤、エアゾール剤、軟膏、パップ剤、ペースト剤、プラスター剤、エッセンス、パック、洗浄剤、浴用剤、ファンデーション、打粉、口紅、散剤、丸剤、錠剤、注射剤、坐剤、乳剤、カプセル剤、顆粒剤、液剤（チンキ剤、流エキス剤、酒精剤、懸濁剤、リモナーデ剤などを含む）等が挙げられ、皮膚細胞の還元能力の低下に由来する皮膚のしわ、シミの防止等の改善効果が得られる。