(57)【要約】【課題】従来の１光子を使用した顕微鏡よりも高い解像限界を有する顕微鏡を提供する。【解決手段】対になった２光子の光子対を放出する２光子の波長より小さな物質で染色した、被観察物３を励起するための光源１と、光子対を２つのパスに分けるビームスプリッタ８と、ビームスプリッタ８により分けられた光子により形成された被観察物３の像を、それぞれ撮像面に拡大投影する投影光学系と、各撮像面に設けられた２つの２次元フォトン検出器アレイ９、１０と、２次元フォトン検出器アレイ９、１０のピクセルに対応した複数の計数器を備えた同時計数装置１１とを有し、計数器は、２つの２次元フォトン検出器９、１０のそれぞれの対応するピクセルにおいて、同時に光子が検出されたときのみ、計数を行うようにされており、所定撮像時間経過後の、同時計数装置１１の計数器の計数値に基づいて、被観察物３の像を形成するように構成されていることを特徴とする顕微鏡。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対になった２光子の光子対を放出する前記２光子の波長より小さな物質で染色した、被観察物を励起するための光源と、前記被観察物より光学的に後面に設けられ、前記光子対を２つのパスに分けるビームスプリッタと、前記ビームスプリッタにより分けられた光子により形成された前記被観察物の像を、それぞれ撮像面に拡大投影する投影光学系と、前記各撮像面に設けられた２つの２次元フォトン検出器アレイと、前記２次元フォトン検出器アレイのピクセルに対応した複数の計数器を備えた計数装置とを有し、前記計数器は、前記２つの２次元フォトン検出器のそれぞれの対応するピクセルにおいて、同時に光子が検出されたときのみ、計数を行うようにされており、所定撮像時間経過後の、前記計数装置の前記計数器の計数値に基づいて、前記被観察物の像を形成するように構成されていることを特徴とする顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一般に顕微鏡の解像限界を与える空間周波数は２×(開口数)/(波長)である。例えば、顕微鏡に用いる光の波長が400nm、開口数が１のとき、200nm程度の構造物体が解像限界となる。この制限を打破し、さらに高い解像限界を得るために、２光子吸収や２光子放出を利用する方法が提案されている。例えば、強いレーザ光を一点に絞った状態で物体面上を走査していき、像面上に２光子吸収物質を貼付しておくと、２光子吸収物質が感光し像が得られ、その像は解像限界を超えて超解像となる。（解像限界は従来の２倍まで高められる）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、２光子吸収や２光子放出を利用する方法では、２光子吸収物質が必要となり、現在有効な物質は見つかっていない。また物体上を光で点照射し、それを走査しなければならないので、撮像に時間がかかるという問題点がある。
【０００４】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、従来の１光子を使用した顕微鏡よりも高い解像限界を有する顕微鏡を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記課題は、対になった２光子の光子対を放出する前記２光子の波長より小さな物質で染色した、被観察物を励起するための光源と、前記被観察物より光学的に後面に設けられ、前記光子対を２つのパスに分けるビームスプリッタと、前記ビームスプリッタにより分けられた光子により形成された前記被観察物の像を、それぞれ撮像面に拡大投影する投影光学系と、前記各撮像面に設けられた２つの２次元フォトン検出器アレイと、前記２次元フォトン検出器アレイのピクセルに対応した複数の計数器を備えた計数装置とを有し、前記計数器は、前記２つの２次元フォトン検出器のそれぞれの対応するピクセルにおいて、同時に光子が検出されたときのみ、計数を行うようにされており、所定撮像時間経過後の、前記計数装置の前記計数器の計数値に基づいて、前記被観察物の像を形成するように構成されていることを特徴とする顕微鏡により解決される。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、従来の１光子を使用した顕微鏡よりも高い解像限界を有する顕微鏡を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明の実施の形態の例を図を用いて説明する。図１は、本発明の実施の形態の１例である２光子顕微鏡の光学系の概要を示す図である。インコヒーレント光源１から放出された光は、コリメートレンズ２を介して、生体試料である被観察物３をケーラー照明する。光源としてインコヒーレントのものを使用するのは、コヒーレント性を有する光源を使用すると、被観察物３をケーラー照明したときに被観察物３上に集光点ができてしまい、一様照明性が失われ、かつ、被観察物３から放出される２次光源がインコヒーレントとならないからである。
【０００８】
生体試料である被観察物３は、対になった２光子の光子対を放出する前記２光子の波長より小さな物質である量子ドット（ビーズ）１２により染色されている。この染色は、蛍光顕微鏡を使用するときに、被観察物を蛍光色素で染色するのと同じ方法で行うことができる。よって、被観察物３が照明光を受けると、これらのビーズ１２より対になった２光子が放出される。
【０００９】
ビーズ１２としては、波長変換に使用される非線形結晶のいくつかが使用可能であり、例えば、ＢＢＯ、ＬＢＯ、ＣＬＢＯを使用することができる。また、非線形結晶以外にも、CuCl等の半導体結晶又は誘電体を使用することができる。CuCl等の半導体結晶を用いると、変換効率が高いので強い２次光源を得ることができ、撮像のスループットを高めることができる。これらの役割は、インコヒーレント光源１から放出される光源を受け、２光子を含む光を放出することであるので、このような性質を有するものであれば、適宜選択して使用することができる。
【００１０】
インコヒーレント光源１としては、例えば、レーザ光を拡散板で拡散させたり、フライアイミラーを通したりすることにより、もともとコヒーレントであった強力な光を、インコヒーレント光に変換したような光源を使用することができる。
【００１１】
被観察物３中のビーズ１２から放出された、２光子を含む光は、レンズ４、５、６、及び波長板７、偏光ビームスプリッタ８を有する光学系に入射する。この実施の形態は、２光子の偏光の振動面が互いに９０度異なっている光を使用するときに用いられる光学系である。
【００１２】
レンズ４を透過した光は、波長板７により、２光子のうち１つがＳ偏光、他の１つがＰ偏光となるように変換される。このうち、Ｐ偏光（一点鎖線）は偏光ビームスプリッタ８を透過し、レンズ５の作用により、結像面に設けられた２次元フォトン検出器アレイ９上に結像する。Ｓ偏光（破線）は偏光ビームスプリッタ８で反射され、レンズ６の作用により、結像面に設けられた２次元フォトン検出器アレイ１０上に結像する。
【００１３】
２次元フォトン検出器アレイ９、１０は、ＩＣＣＤ等、微小で高感度のフォトン検出器が２次元アレイ状に配列されたものであり、各、フォトン検出器に光子が入射する毎に、そのフォトン検出器からパルス出力を出すようになっている。
【００１４】
２次元フォトン検出器アレイ９のフォトン検出器の配列をＡ（ｉ，ｊ）とし、２次元フォトン検出器アレイ１０のフォトン検出器の配列をＢ（ｉ，ｊ）とすると、被観察物３の同じ点から放出されて分離された２光子は、１光子ずつに分かれて２次元フォトン検出器アレイ９，１０の同じ（ｉ，ｊ）のフォトン検出器（幾何光学対応位置）に入射するようになっている。但し、回折効果により、各光子が同じ（ｉ，ｊ）へ入射しない場合もある。
【００１５】
同時計数装置１１は、２次元フォトン検出器アレイ９，１０の各ピクセルに対応したカウンタ（計数器）を有する。このカウンタを前記フォトン検出器の配列に対応させてＣ（ｉ，ｊ）とする。そして、同時計数装置１１のカウンタＣ（ｉ，ｊ）は、２次元フォトン検出器アレイ９のフォトン検出器Ａ（ｉ，ｊ）と２次元フォトン検出器アレイ１０のフォトン検出器Ｂ（ｉ，ｊ）（同じ位置）から同時に出力があったとき、カウント値をインクリメントするようにされている。
【００１６】
このようにすると、被観察物３のある点から２光子である光子が飛び出したときのみ、ある点に対応する同時計数装置１１のカウンタＣ（ｉ，ｊ）のカウンタがインクリメントされる。１光子の光は、２次元フォトン検出器アレイ９、１０の片方にしか入力しないのでカウントされず、無視される。
【００１７】
このようにして、所定時間、インコヒーレント光源１により被観察物３を照射すると、同時計数装置１１のカウンタのカウント値が累算されるが、その累算値は、そのカウンタに対応する位置から放出される２光子からなる光子の累算カウント値となり、これを画像変換して２次元画像として観察すれば、２光子のみを使用して、被観察物３の面を観察していることとなる。よって、解像限界は、従来の１光子を使用した場合の２倍となり、解像限界を高めることができる。又、走査型でなく、２次元検出方式であるので、スループットを高めることができる。
【００１８】
以上の実施の形態は、２光子の光子同士の偏光状態が異なる場合の例であったが、２光子の光子同士の波長が異なる場合は、２光子を分離するのに、ダイクロイックミラー等を使用すればよい。分離した後、別々の２次元フォトン検出器で検出し、対応する位置の検出器からの出力を同時計数することにより、２光子以外の光の影響を除去する方法は、図１に示したものと本質的に変わらず、当業者は、容易にその構成を推考できるであろう。
【００１９】
また、２光子の偏光状態や波長が同じであり、通常の手段では分離が困難である場合には、図１において、波長板７を除去し、偏光ビームスプリッタ８をハーフミラーに変えたものを使用する。２光子は、ハーフミラーを２光子のまま通過する第１の場合、ハーフミラーで２光子のまま反射される第２の場合、１光子が反射され１光子が透過する第３の場合があるが、第３の場合にのみ、同時係数が行われる。１光子の場合は、反射するか透過するかであるので同時係数は行われない。よって、偏光ビームスプリッタを使用した場合に比べて測定時間が長くなるが、本方法でも、解像限界を高めることができる。
【００２０】
特許請求の範囲及び明細書においてビームスプリッタと称しているものは、単にビームを分割する機能を有すればよく、このようなダイクロイックミラーやハーフミラーを含むものである。
【００２１】
本実施の形態の顕微鏡における同時係数の間隔は、異なるビーズ１２からの光子が同時係数されないように、同時係数のタイミング（時間の長さ）を調整する必要がある。又、被観察物３は、４Ｋ程度の低温に保ち、測定を行う。これにより、２光子対の発生確率を上げることができる。
【００２２】
又、試料ステージを光軸方向に走査することで３次元分解能が得られ、画像処理により、３次元像を観察することができる。これは、焦点面からずれた面内のビーズ１２の像は各像面でぼやけるため、対応するピクセル対で同時計数される確率が極端に落ちカウントされないためである。
【００２３】
なお、以上の実施の形態の例は、被観察物３を透過する光を結像させていたが、被観察物３で反射する光を結像させるような光学系にしても良く、このような光学系は、実質的に図１に示したものと同じ光学系で実現できる。
【００２４】
図２に、本発明の実施例である顕微鏡の分解可能な空間周波数領域と、従来の透過型共焦点顕微鏡の分解可能な空間周波数領域を比較して示す。Ｘ成分は、光軸方向の成分であり、Ｘ成分は光軸に垂直な方向の成分である。従来の透過型共焦点顕微鏡では、分解能可能な空間周波数は200nm程度であったのに、本発明の実施例の場合は、100nmまで向上している。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の実施の形態の１例である２光子顕微鏡の光学系の概要を示す図である。
【図２】本発明の実施例である顕微鏡の分解可能な空間周波数領域と、従来の透過型共焦点顕微鏡の分解可能な空間周波数領域を比較して示す図である。
【符号の説明】
【００２６】
１…インコヒーレント光源、２…コリメートレンズ、３…被観察物、４…レンズ、５…レンズ、６…レンズ、７…波長板、８…偏光ビームスプリッタ、９…２次元フォトン検出器アレイ、１０…２次元フォトン検出器アレイ、１１…同時計数装置、１２…量子ドット（ビーズ）
【図１】
2007248554.tif 000003
【図２】
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