(57)【要約】      （修正有）【課題】内的ストレスにより誘発される過剰な色素沈着に対して有効な化粧料組成物の提供。【解決手段】シソ科植物の抽出物、特に、ウォーターミント（Mentha aquatica）、クールミント（Mentha arvensis）、ホースミント（Mentha longifolia）、セイヨウハッカ（Mentha piperita）、ペニーロイヤルミント（Mentha pulegium）及びスペアミント（Mentha spicata）から選択された属のハッカに由来する抽出物を含有する化粧料組成物。さらに、美白剤（アスコルビン酸誘導体及び／又はカンゾウの抽出物）、角質溶解剤（フェノール誘導体、特にサリチル酸又はその誘導体の１つ、又はブナノキの芽の抽出物）、キレート剤（エデト酸４ナトリウム及び／又はクエン酸）、抗−ＮＯ剤（イチョウの抽出物）の少なくとも１つを含有する化粧料組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
情動タイプのストレスにより誘発されるメラニンの合成及び／又は放出を予防する及び／又は減少させるための非治療的処置の方法において、シソ科(Menthae family)の少なくとも１つの植物の細胞の少なくとも１つの抽出物を活性剤として含む化粧料組成物が使用される方法。
【請求項２】
情動タイプのストレスにより誘発される過剰な皮膚の色素沈着を予防する及び／又は処置するための非治療的処置の方法において、シソ科の少なくとも１つの植物の細胞の少なくとも１つの抽出物を活性剤として含む組成物が使用される方法。
【請求項３】
情動タイプのストレスにより誘発される過剰なメラニン生成に関連する皮膚疾患を予防する及び／又は処置するための非治療的処置の方法において、シソ科の少なくとも１つの植物の細胞の少なくとも１つの抽出物を活性剤として含む組成物が使用される方法。
【請求項４】
抽出物が、ウォーターミント（Mentha aquatica）、クールミント（Mentha arvensis）、ホースミント（Mentha longifolia）、セイヨウハッカ（Mentha piperita）、ペニーロイヤルミント（Mentha pulegium）及びスペアミント(Mentha spicata)から選択された属のハッカから由来する細胞に由来するところの、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
抽出物が、セイヨウハッカ（Mentha piperita）属のハッカから由来する細胞から由来するところの、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
抽出物が、組成物の合計重量に対して０．００１重量％〜０．４重量％の範囲の乾燥活性物質の量で使用される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
生理学的に許容される媒体中に、シソ科の少なくとも１つの植物の細胞の少なくとも１つの抽出物を、チロシナーゼの阻害のメカニズム、又は間接的にメラニン生成を刺激する第二のメッセンジャーの阻害のメカニズムに従って作用する少なくとも１つの脱色素剤と組み合わせて含む化粧料組成物。
【請求項８】
角質溶解落屑剤、抗−ＮＯ剤、抗ＵＶ剤、美白剤、抗炎症剤、キレート剤、及び／又は抗酸化剤の少なくとも１つをもまた含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
生理学的に許容される媒体中に、セイヨウハッカ（Mentha piperita）属の少なくとも１つの植物の細胞の少なくとも１つの抽出物を、少なくともアスコルビン酸（ビタミンＣ）又はその少なくとも１つの誘導体、例えばリン酸アスコルビルマグネシウム（ビタミンＣ  ＰＭｇ）、アスコルビン酸グリコシル（ビタミンＣＧ）、リン酸アスコルビルナトリウム（ビタミンＣ  ＰＮａ）、及び３−Ｏ−エチルアスコルビン酸、と組み合わせて含む化粧料組成物。
【請求項１０】
生理学的に許容される媒体中に、シソ科の少なくとも１つの植物の細胞の少なくとも１つの抽出物を、角質溶解落屑剤、抗−ＮＯ剤、及び／又はキレート剤の少なくとも１つと組み合わせて含む化粧料組成物。
【請求項１１】
生理学的に許容される媒体中に、シソ科の少なくとも１つの植物の細胞の少なくとも１つの抽出物及び少なくとも１つの脱色素剤を、角質溶解落屑剤、抗−ＮＯ剤、抗ＵＶ剤、美白剤、抗炎症剤、キレート剤、及び／又は抗酸化剤の少なくとも１つと組み合わせて含む化粧料組成物。
【請求項１２】
角質溶解剤が、フェノール誘導体、特にサリチル酸又はその誘導体の一つ、又はブナノキの芽の抽出物である、請求項８及び１０〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
抗−ＮＯ剤がイチョウ（gingko biloba）の抽出物である、請求項８及び１０〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
キレート剤がエデト酸 ４ナトリウム及び／又はクエン酸である、請求項８及び１０〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
美白剤がビタミンＣＧ及び／又はカンゾウの抽出物である、請求項８及び１０〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
セイヨウハッカ（Mentha piperita）の抽出物、イチョウ（gingko biloba）の抽出物、ビタミンＣＧ、カンゾウの抽出物、サリチル酸、及びブナノキの芽の抽出物の少なくとも１つを含む、請求項７〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シソ科（Menthae family）の少なくとも１つの植物の細胞の抽出物を、情動タイプのストレスにより特に誘発されるメラニン生成の阻害剤、及び／又は脱色素剤として使用する方法に関する。
【０００２】
メラニン生成はメラニンを合成する過程であり、メラニンは細胞の色素沈着の原因である。それは、Ｌ−チロシンアミノ酸のヒドロキシル化により開始される複雑な生化学的な過程であり、Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）の形成をもたらす。Ｌ−ＤＯＰＡは、今度は、特定のメラニン生成細胞関連酵素、すなわちチロシナーゼの作用によりＤＯＰＡクロームへ転換され、次の還元及び酸化反応によりＤＯＰＡクロームのメラニンへの転換がもたらされる。チロシナーゼの生産及びその活性は、生成されるメラニンの量を部分的に決定する。ケラチン生成細胞へ移動されるメラニンの量及びタイプがヒトの皮膚の視認される色素沈着の程度を部分的に決定する。
【０００３】
メラニンは、主として皮膚に関しては、太陽、より一般的には、紫外線に対する保護機能を提供することが公知である。メラニンはこれらの線を吸収し、照射の間に発生した遊離基により起こされ得る損傷の顕在化のリスクを著しく減少させる。
【０００４】
しかし、メラニンは、外因的な刺激、例えば汚染又は紫外線、及び／又は内因的な刺激、例えば老化又は内的ストレスによる刺激、への応答において、ケラチン生成細胞、内皮細胞、繊維母細胞、及びランゲルハンス細胞で過剰に又は異常にさえ、合成され得る。
【０００５】
実際、これらの２つの刺激方法のいくつかは共存することができる。
【０００６】
すなわち、ＵＶ照射は第一に、メラニン生成細胞を直接刺激することによりメラニン合成を刺激し、第二に、仲介物を介して、ケラチン生成細胞、内皮細胞、及び繊維細胞によるメッセージを開始する、及び／又はメッセージの通過を促進することにより、メラニン生成を間接的に刺激する。特に、ケラチン生成細胞は、合成仲介物、例えばアルファ−ＭＳＨ（アルファ−メラニン生成細胞刺激ホルモン）、エンドセリン、Ｅ２プロスタグランジン及びＮＯ、を介してメラニン生成細胞と伝達しているようである。
【０００７】
特に外因的刺激により誘発される過剰な色素沈着の発現を阻むために、特に皮膚の正常な色を回復するために活性剤が既に提案されてきた。これらの活性剤の例として、特にＬ−アルコルビン酸、コージ酸、ハイドロキノンなどが挙げられ得る。しかしこれらの活性剤はより特に内的ストレスにより誘発される過剰な色素沈着を治療することを可能にしない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、後者の刺激方法により誘発される過剰な色素沈着を治療することを可能にする活性剤を有する需要が残っている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、新しく記載される活性を示すところの、シソ科の植物の細胞の抽出物がメラニン生成過程、特に内的ストレスによる誘発される過程を阻害することのできる活性剤として使用されることができることを正確に、全く意外にも示した。
【００１０】
セイヨウハッカ（Mentha piperita）の由来物は、皮膚に鎮静効果を有する活性剤として、既に国際公開第２００４／０５８２８２号パンフレットにおいて提案されている。しかし、該パンフレットは内的ストレスにより誘発されるメラニン生成過程に関してこの同じタイプの抽出物の性質について何も言及しておらず、情動タイプのストレスにより誘発されるメラニン生成の過剰に関する皮膚疾患を予防する及び／又は治療することにおけるその有効性についてずっと少なく言及している。
【００１１】
本発明者らにより発見された新規な活性は、メラニンの合成及び／又は放出を防ぐ及び／又は減少させ、内的ストレスに続いて起きる皮膚の色素沈着の過剰又は皮膚疾患と戦うのに有利である。
【００１２】
本発明の文脈において、「内的ストレス」及び「情動タイプのストレス」という表現は等価であり、どちらも、心理的ストレス又は疲労により誘発された、すなわち引き起こされた又は増幅された内因性の変化を意味することを目的とする。
【００１３】
情動タイプのストレスは特に、ホルモン、及び／又は神経ホルモン、例えばカテコールアミンの血液及び周辺組織への放出を通して、はっきり現れることができる。
【００１４】
それはカテコールアミン、その中にはノルアドレナリンがある、の量の増加により特に反映され得る。ノルアドレナリンタイプのストレスを参照されたい。
【００１５】
内的ストレスにより誘発されたメラニン生成に対するハッカの抽出物の効果を示すために、本発明者らは、インビトロの多細胞のケラチン生成細胞／メラニン生成細胞／神経細胞モデルを使用してきた。このノルアドレナリンで刺激されるインビトロのモデルは、情動タイプのストレスにより誘発されるメラニン生成に対する潜在的に活性剤の効果を評価するのに適することが見出されている。
【００１６】
すなわち本発明者らは、このモデルにおけるハッカの抽出物の活性は、メラニン生成の別の間接的なパートナー、すなわちポリペプチドの化学要素であるカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）放出の阻害により反映されることに注目した。
【００１７】
ケラチン生成細胞は、成長、メラニン合成及びメラニン生成細胞の樹状性（dendricity）を調節するメラニン親和性の因子を、ＣＧＲＰによる刺激に応答して生産することが今、公知である（マサヒコトヨダら「研究皮膚科学会（The society for investigate dermatology）」第４巻、第２号、１９９９年、９月）。
【００１８】
ＣＧＲＰは、カルシトニン遺伝子から製造される３７のアミノ酸のペプチドであり、最も広く分布されており、最も豊富な感覚神経ペプチドである。外因性の刺激例えばＵＶ照射に反応して、神経末端により分泌されること（Scholzenら、研究皮膚科学シンポジウム予稿集（Journal of investigative dermatology symposium proceedings）、１９９９年、第４巻、第１号、５５〜６０ページ）、及びその分泌は外部の攻撃、例えば汚染により刺激されることもまた示された。
【００１９】
より最近、ＣＧＲＰの生産は、情動タイプのストレスへに対する応答において、刺激され得ることもまた注目されてきた。すなわち、ＣＧＲＰ分泌は、ストレスホルモン、例えばノルアドレナリン及びアドレナリンにより刺激されることができることが示されてきた。
【００２０】
結果的に、本発明者らは、ハッカの抽出物がＣＧＲＰの放出を阻害する性質を有し、その結果、メラニン生成を調節する、特に後者が情動タイプのストレスにより誘発される場合阻害することを可能にすることを見出した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
この理由から、本発明の特徴の一つに従うと、本発明は、特に情動タイプのストレスにより誘発されるメラニンの合成及び／又は放出を予防する及び／又は減少させるための治療的又は非治療的処置、特に化粧的処置の方法において、シソ科の少なくとも１つの植物の細胞の少なくとも１つの抽出物を活性剤として含む化粧料組成物が使用される方法に関する。
【００２２】
本発明の別の特徴に従うと、本発明は、治療的又は非治療的処置の方法、特に化粧的処置の方法、特に情動タイプのストレスにより誘発される、過剰な皮膚色素沈着を予防する及び／又は処置するための方法において、上記で定義された組成物が使用される方法に関する。
【００２３】
本発明のさらに別の特徴に従うと、本発明は、治療的又は非治療的処置の方法、特に化粧的処置の方法、特に情動タイプのストレスにより誘発される過剰なメラニン生成に関連する皮膚疾患を予防する及び／又は処置するための方法において、上記で定義された組成物が使用される方法に関する。
【００２４】
本発明の別の特徴に従うと、本発明は、ハッカの抽出物が作用するメカニズムとは異なるメカニズムに従って、すなわちＣＧＲＰの阻害により、メラニン生成に作用する追加の脱色素剤と共にハッカの抽出物が有利に組み合わされることのできる新規な組成物にもまた関する。追加の脱色素剤は、例えばチロシナーゼの阻害又は第二のメッセンジャー、例えば間接的にメラニン生成を刺激するＮＯ又はプロスタグランジン、の阻害のメカニズムに従って作用し得る。種々の作用の方法に従って同時に作用するそのような組み合わせは、色素の点又は欠点に、改善された総合的な効果を得ることを可能にする。
【００２５】
すなわち、本発明の課題は、化粧料組成物及び／又は皮膚科学組成物において、生理学的に許容される媒体中に、シソ科の少なくとも１つの植物の細胞の少なくとも１つの抽出物を、チロシナーゼの阻害又は間接的にメラニン生成を刺激する第二メッセンジャー、例えばＮＯ又はプロスタグランジンの阻害のメカニズムに従って作用する少なくとも１つの脱色素剤と組み合わせて含むことを特徴とする組成物でもある。
【００２６】
特定の実施態様に従うと、本発明は、皮膚科学的及び／又は化粧料組成物において、生理学的に許容される媒体中に、シソ科の少なくとも１つの植物の細胞の少なくとも１つの抽出物を、角質溶解落屑剤、抗−ＮＯ剤及び／又はキレート剤の少なくとも１つと組み合わせて含むことを特徴とする組成物に関する。
前記の剤はアスコルビン酸及びその誘導体とは異なる。
【００２７】
別の特定の実施態様に従うと、本発明は、皮膚科学的及び／又は化粧料組成物において、生理学的に許容される媒体中に、シソ科の少なくとも１つの植物の細胞の少なくとも１つの抽出物、及び少なくとも１つの脱色素剤を、角質溶解落屑剤、抗−ＮＯ剤、抗−ＵＶ剤、美白剤、抗炎症剤、キレート剤、及び／又は抗酸化剤の少なくとも１つと組み合わせて含むことを特徴とする組成物に関する。
【００２８】
別の特定の実施態様に従うと、本発明は、皮膚科学的及び／又は化粧料組成物において、生理学的に許容される媒体中に、セイヨウハッカ属（Mentha piperita genus）の少なくとも１つの植物の細胞の少なくとも１つの抽出物を、少なくとも１つのアスコルビン酸又はその少なくとも１つの誘導体、例えばリン酸アスコルビルマグネシウム（ビタミンＣ  ＰＭｇ）、アスコルビン酸グリコシル（ビタミンＣＧ）、リン酸アスコルビルナトリウム（ビタミンＣＰＮａ）、及び３−Ｏ−エチルアスコルビン酸と組み合わせて含むことを特徴とする組成物に関する。
【００２９】
すなわち、本発明の目的は、皮膚の色素沈着、例えばホクロ、（単純型又は太陽型又は老年期型）、ＰＵＶＡホクロ、サンベッドホクロ、網目状ホクロ、太陽などにより引き起こされるソバカス又は肝斑症（melasmae）（シミ）を予防する及び処置する、より特にメラニン生成過程を阻害するために特に効果的であるところのハッカの抽出物及び／又は新規な組成物を提案することでもある。
【００３０】
本発明者らは、ハッカの抽出物、特にシソ科の植物の細胞の抽出物及び以降に記載される追加の脱色素剤の組み合わせがそのような効果を提供するのに特に有用であることが分かったことを特に発見した。
【００３１】
本発明は、皮膚科学的及び／又は化粧料組成物において、生理学的に許容される媒体中にシソ科の少なくとも１つの植物の細胞の少なくとも１つの抽出物を、組成物の合計重量に対して０．４重量％未満の乾燥活性物質の割合でを含むことを特徴とする組成物にもまた関する。
【００３２】
本発明に従う組成物は、局所的経口投与のために配合されることができる。
【００３３】
本発明は、シソ科の少なくとも１つの植物の細胞の抽出物及び／又は本発明に従う組成物を脱色素剤としてインビボ又はインビトロで使用する方法にもまた向けられる。
【００３４】
本発明は、シソ科の少なくとも１つの植物の細胞の抽出物及び／又は本発明に従う組成物を、メラニン生成、特に情動タイプのストレスにより誘発されるメラニン生成を阻害するための剤としてインビボ又はインビトロで使用する方法にもまた関する。
【００３５】
本発明は、シソ科の少なくとも１つの植物の細胞の抽出物及び／又は本発明に従う組成物を美白剤として使用する方法にもまた関する。
【００３６】
本発明の目的のために、用語「メラニン生成」は、例えばメラニンの化学的前駆体を合成する方法に関するすべての酵素反応及び／又は非酵素反応、その中間体の一つ又は副生物を含む、メラニン合成の過程を意味する。
【００３７】
本発明の目的のために、用語「阻害する」は、過程の作用又は機能を低下させる、制限する、又はブロックすることを意味する。
【００３８】
本発明の目的のために、もし物質が、メラニン生成が起きる表皮のメラニン生成細胞の活性（vitality）に直接作用する、及び／又は、もし物質が、メラニン生成に含まれる酵素の一つを阻害することによるか、又はメラニン合成鎖の化学物質の一つの構造類似体としてインターカレートし、次に該鎖はブロックされることができ、このようにして脱色素を確保することにより、メラニン生合成の段階の一つを阻むならば、該物質は脱色素していると認識される。
【００３９】
抽出物の定義
用語「少なくとも１つのハッカの抽出物」は、「ハッカ細胞の抽出物」、従って「シソ科の少なくとも１つの植物の抽出物」としてとして理解されるべきである。
【００４０】
少なくとも１つのハッカの抽出物は、シソ科から由来する任意の植物物質から製造された抽出物であることができ、該物質はインビトロ又はインビボでの培養により得られてきた。
【００４１】
用語「インビトロにおける培養」は、植物又は植物の一部を人工的に得ることを可能にする、当業者に公知のすべての技術を意味する。
【００４２】
すなわち、例えば本発明に従うと、抽出物は、インビトロでの培養により得られた少なくとも１つのハッカの器官（根、茎、葉）、又は器官の細胞の抽出物、又はさもなければ少なくとも１つのハッカの未分化の細胞の抽出物であり得る。好ましくはインビトロでの培養に得られた未分化の細胞から得られた抽出物が使用される。
【００４３】
用語「未分化の植物細胞」は、特異的な分化の特徴をなんら示さず、かつそれ自身で生きることができ、他の細胞との依存の状態にない任意の植物細胞を意味することが意図される。これらの未分化の植物細胞は、誘起の効果下で、そのゲノムに従って任意の分化が可能であり得る。
【００４４】
シソ科は、いくつかの種類（species）を含む。
【００４５】
本発明に従って使用されることができるシソ科の属の中では、例えばウォーターミント（Mentha aquatica）、クールミント（Mentha arvensis）、ホースミント（Mentha longifolia）、セイヨウハッカ（Mentha piperita）、ペニーロイヤルミント（Mentha pulegium）及びスペアミント(Mentha spicata)の属が挙げられ得る。
【００４６】
本発明に従ってより特に考慮される種類は、セイヨウハッカ属から由来する。
【００４７】
従来技術において当業者に公知である任意の抽出方法が本発明に従って使用されることができる。特にアルコール抽出、特にエタノール抽出、及び水性アルコール抽出が挙げられ得る。国際公開第０４／０５８２８２号パンフレットに記載された方法によって製造された抽出物もまた使用され得る。そのような抽出物は、１０〜１１０ ｇ／ｌ、又は４５〜７５ ｇ／ｌさえの乾燥活性物質を含み得る。例えば、この抽出物は２〜３０ｇ／ｌの糖（M. Duboisらの方法により測定された、分析化学（Analytical Chemistry）、第２８巻、第３号、３５０〜３５６ページ、１９５６年）及び０．２〜２．７ ｇ／ｌのポリフェノール（フェリシアン化カリウムを用いる比色分析により測定された）を含み、ヒドロキシ桂皮化合物、フラボン、フラバノン、及びクマリンを含む。
【００４８】
ハッカの抽出物は、市販入手もまた可能である。すなわち、GREENTECH社により販売されているカナディアンハッカの葉の水−グリコール抽出物、ALBANMULLER社により販売されているプロピレングリコールによるセイヨウハッカの葉の抽出物、及びSILAB社によりCALMISKIN（商標）の名前で販売されているセイヨウハッカの葉の抽出物が本発明に従って使用されることができる。
【００４９】
ハッカの抽出物は、それが配合される組成物に本発明に従って必要とされる性質を与えるのに有効である量において存在する。
【００５０】
他に述べられない限り、ハッカ抽出物の量は、乾燥活性物質として示される。用語「乾燥活性物質」は、従来技術において当業者に公知である任意の方法により測定されることができる、抽出物の乾燥後に残った物質の量を意味する。測定は、例えば国際公開第２００４／０５８２８２号パンフレットに記載されたプロトコルに従って行われることができる。
【００５１】
すなわち、本発明の化粧料組成物又は皮膚科学組成物は、組成物の合計重量に対して０．４重量％未満、特に０．１重量％未満、０．０５重量％〜０．００１重量％の範囲でさえのハッカの抽出物の乾燥活性物質を含む。
【００５２】
明白な理由から、ハッカの抽出物のこの量は、かなりの程度まで変化することができ、特に所望されるＣＧＲＰ阻害活性、及び／又は投与の方法、すなわち対応する組成物のために選択された局所投与又は経口投与に依存することができる。
【００５３】
例えば、ハッカの抽出物は、０．００１重量％〜０．４重量％の範囲、特に０．００２重量％〜０．３５重量％の範囲、特に０．００３重量％〜０．１重量％の範囲の乾燥活性物質の量で本発明に従う組成物中において、より特に局所施与を意図されたものにおいて使用されることができる。
【００５４】
脱色素剤とハッカの抽出物の組み合わせ
上で記載されたように、本発明は、ＣＧＲＰ阻害のメカニズムとは異なるメカニズムに従ってメラニン生成に作用する少なくとも１つの脱色素剤と組み合わされた少なくとも１つのハッカ抽出物を含む組成物に関する。特にチロシナーゼの阻害、又は間接的にメラニン生成を刺激する第二のメッセンジャーの阻害のメカニズムに従って作用する脱色素剤を含んでいてもよい。
【００５５】
本発明に従って使用され得る脱色素剤の非制限的な例示として、コージ酸、アルブチン、エラグ酸、ルシノール、Ｓリノレン酸、トラネキサム酸、４−メトキシサリチル酸カルシウム、アデノシンモノリン酸二ナトリウムＯＴ、又はジヒドロキシジプロピルビフェニル（ＤＤＢ）が挙げられ得る。
【００５６】
特定の実施態様に従うと、本発明は、セイヨウハッカ属の少なくとも１つの植物の細胞の少なくとも１つの抽出物を、アスコルビン酸（ビタミンＣ）又はその一つの誘導体、例えばアスコルビルリン酸マグネシウム（ビタミンＣＰＭｇ）、アスコルビン酸グリコシル（ビタミンＣＧ）、アスコルビルリン酸ナトリウム（ビタミンＣＰＭａ）、及び３−Ｏエチルアスコルビン酸、少なくとも１つと組み合わせて含む組成物にもまた関する。
【００５７】
本発明に従う組成物が、ハッカの少なくとも１つの抽出物を、チロシナーゼの阻害又は間接的にメラニン生成を刺激する第二メッセンジャーの阻害のメカニズムに従って作用する少なくとも１つの脱色素剤、特に上に列挙された脱色素剤と組み合わせて含むとき、それらは以降に記載される角質溶解落屑剤、抗−ＮＯ剤、抗−ＵＶ剤、美白剤、抗炎症剤、キレート剤、及び／又は抗酸化剤の少なくとも１つを追加的に含み得る。
【００５８】
本発明の化粧料組成物及び／又は皮膚科学組成物は、組成物の合計重量に対して０．１重量％〜７重量％、好ましくは０．５重量％〜７重量％の脱色素剤を含むことができる。
【００５９】
もちろん、この量自身は特に使用される脱色素剤の性質に依存して、かなりの程度まで変化することができ、所望される脱色素活性及び／又は対応する組成物のために選択される投与の方法にもまた依存し得る。
【００６０】
皮膚疾患
上に記載されたように、ハッカの抽出物及び／又は本発明に従う組成物は、過剰の皮膚色素沈着を予防する及び／又は処置するために、特に情動タイプのストレスにより誘発される過剰のメラニン生成に特に関連する皮膚の疾患に特に有利であることがわかる。
【００６１】
さらに、ハッカの抽出物及び／又は本発明に従う組成物は、色素沈着症（hypermelanoses）を予防する及び／又は処置するために使用されることができる。
【００６２】
色素沈着症は、過負担のメラニン又は皮膚におけるメラニンの 異常な分布に対応する。
【００６３】
色素沈着症、褐色性色素沈着症（melanoderma）、真皮に関係する異常は、青色性色素沈着症、皮膚異常とは区別されることができる。
【００６４】
褐色性色素沈着は、真皮の基底層中の活性なメラニン生成細胞の数の増加から生じるか、又はメラニン生成細胞の数の変化なしに真皮中のメラニンの量の増加から生じる。後者の場合がほとんどの皮膚の高色素沈着を構成する。
【００６５】
チロシナーゼの増加された合成、メラノソームのメラニン化の増加、ケラチン生成細胞への移動の増加、及び／又はケラチン生成細胞のメラノゾームの残存の増加により誘発されることができる。
【００６６】
色素沈着症の例として、ホクロ、ＰＵＶＡホクロ、サンベッドホクロ、網目状ホクロ、ソバカス、及び黒皮症（又はシミ）が挙げられ得る。
【００６７】
ホクロは、表皮の高色素沈着症（hypermelanocytoses）である。ホクロは、もしその色が太陽光によって変化されないならば単純型であり、又は太陽型、又は老年期型である。後者は、一般的にサイズが大きい。それらは光が過剰な地域において観察される。それらは日焼けした後の若い人、及び太陽への暴露を追う高齢の人において現れる。７０歳以上の人の９０％超が、特に手の裏側、顔、腕、背中の上方部、及び首及び肩に太陽ホクロを呈する。いくつかの太陽ホクロは合併し、広い被覆を形成することができる。
【００６８】
ＰＵＶＡホクロは、太陽ホクロとは少し異なるシミであり、長い間ＰＵＶＡ治療を受けている患者に現れる。それらはＵＶＡ照射に暴露されている領域に見出される。
【００６９】
サンベッドホクロは、ソラレンなしにサンベッドを使用する明るいフォトタイプ（light phototype）を有する患者に、一回の強い暴露の後に、又は習慣的かつ規則的な暴露の後に現れる。
【００７０】
網目状ホクロは、太陽ホクロの変形であり、非常に色が濃く、ほとんど黒である。
【００７１】
夏日斑、すなわちソバカスは、光に暴露される領域（顔、手の甲、前腕）、最も特に、非常に明るい皮膚を有する人に現れる。それらの着色は太陽への暴露の後、目立つ。
【００７２】
肝斑症（melasma）又は肝斑症（chloasma）に関して、光に暴露される領域にもっぱら存在する高色素沈着である。妊娠又はホルモン治療中に、又はある種の医薬を飲んでいるときに現れる。
【００７３】
ハッカの抽出物及び／又は本発明に従って考慮される組成物は、すべてのこれらの表皮の高色素沈着症を予防する及び／又は処置するために有効であることが見出された。本発明の有利な実施態様に従って、ハッカの抽出物は、皮膚上で活性であり、特に所望される脱色素効果と一緒に協力することのできる別の剤と混合されることもまたできる。
【００７４】
この活性剤は特に、角質を溶解する落屑剤、抗−ＮＯ剤、抗−ＵＶ剤、美白剤、抗炎症剤、キレート剤及び／又は酸化剤から選択されることができ、同じ化合物がこれらの性質のいくつかを有することができることが理解される。
【００７５】
本発明の目的のために、角質を溶解する剤又は落屑剤は、表皮の上層を剥離し、かつメラニンが入っている、死んだ細胞を除く剤である。
【００７６】
この点において、フェノール誘導体、より特にサリチル酸又はその誘導体の一つ、及び／又はブナノキの芽の抽出物が最も特に適する。
【００７７】
すなわち、フェノール誘導体は好ましくは、Ｎ−（４−ヒドロキシフェノール）アセトアミド又はアセトアミノフェノンと呼ばれるパラセタモール、サリチル酸、及びサリチル酸誘導体から選択される。
【００７８】
フェノール誘導体がサリチル酸誘導体であるとき、５−ｎ−オクタノイルサリチル酸、５−ｎ−デカノイルサリチル酸及び５−ｎ−ドデカノイルサリチル酸、又はそれらの塩の一つから好ましく選択される。
【００７９】
ＡＨＡ、ＢＨＡ、及び誘導体、アミノ酸及び酸誘導体もまた挙げられ得る。
【００８０】
ＵＶ線吸収剤（すなわち抗ＵＶ剤）の非制限的な例として、ｐ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、ｐ−アミノ安息香酸グリセリル、ｐ−アミノ安息香酸エチルジヒドロキシプロピル、桂皮酸オクチルメトキシ、ｐ−メトキシ桂皮酸２−エトキシエチル、２，４−ジヒドロキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシ−４−メチルベンジンベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシ−４−メチルベンゾフェノン−５−スルホネート、エチルウロカネート、２−フェニル−５−メチルベンゾオキサゾール、４−メトキシ−４−ｔ−ブチルジベンゾイルメタン及びｐ−メトキシ桂皮酸エチルヘキシル、及び類縁体が挙げられ得る。
【００８１】
抗酸化剤として、特にポリフェノール誘導体が挙げられ得る。
【００８２】
本発明の組成物において使用されることのできるポリフェノール化合物は、例えば
ａ）フラボノイド、
ｂ）カルノシン酸又はカルノソール、
ｃ）場合により置換されていてもよい（２，５−ジヒドロキシフェニル）カルボン酸及び（２，５−ジヒドロキシフェニル）アルキレンカルボン酸、及びその誘導体、特にその塩、エステル、又はアミド、
ｄ）カフェイン酸エステル又はアミド、
ｅ）タンニン酸及びそれらの混合物、
から選択されることができる。
【００８３】
本発明に従って使用されることのできるフラボノイドの中で、タクシフォリン、カテキン、エピカテキン、エリオジクチオール、ナリンゲニン、ルチン、トロキセルチン、クリシン、タンゲレチン、ルテオリン、エピガロカテキン、エピガロカテキンガレート、クェルセチン、フィセチン、ケンフェロール、ガランギン、ガロカテキン、及びエピカテキンガレートが特に挙げられ得る。
【００８４】
使用されることができるポリフェノールのあるものは、公知の方法で抽出されることのできる植物の形態で存在する。茶葉の抽出物（チャノキ（Camellia sinensis又はCamellia japonica）が使用されることができる。ニッコー社によりSunphenonの名前で販売されている特にフラボノイドを含む緑茶の抽出物が特に挙げられ得る。
【００８５】
上で定義されたポリフェノールは組成物の合計重量に対して０．１〜１重量％の割合で存在してもよい。
【００８６】
抗−ＮＯ剤はより特に、イチョウ、サンザシ、オリーブの木、葡萄、バジル、ショウガ、ニンニク、及び緑茶及びそれらの混合物の抽出物から選択される。
【００８７】
イチョウの抽出物は最も特に有利であることが見出される。そのような抽出物は、特に市販の形態で流通されている。本発明に従う化粧料組成物又は皮膚科学組成物においてイチョウの抽出物は固体ベースで組成物の合計重量に対して０．０１重量％〜１０重量％の濃度で一般的に存在する。
【００８８】
本発明に従って使用されることのできるキレート剤の非制限的な例示として、特にエデト酸４ナトリウム（tetrasodium hedetate）、及び／又はクエン酸が挙げられ得る。
【００８９】
本発明に従って使用されることのできる美白剤の非制限的な例として、特にアスコルビン酸（ビタミンＣ）及び誘導体、例えばリン酸アスコルビルマグネシウム（ビタミンＣ  ＰＭｇ）、アスコルビン酸グリコシル（ビタミンＣＧ）、リン酸アスコルビルナトリウム（ビタミンＣＰＮａ）、及び３−Ｏ−エチルアスコルビン酸、カモミール、ポリフェノール例えばエラグ酸、コージ酸、又はカンゾウの抽出物が挙げられ得る。
特に少なくともビタミンＣＧ及び／又はカンゾウの抽出物を含み得る。
【００９０】
ビタミンＣＧはビタミンＣから由来し、このビタミンからバイオテクノロジーにより、及びシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）酵素を用いて澱粉から得られる。それは美白剤、遊離基捕捉剤及びケラチンを溶解させる剤としてもまた同時に作用する。
【００９１】
一つの実施態様に従うと、特に局所施与を意図された化粧料組成物及び／又は皮膚科学組成物は、ハッカの抽出物に加えて、少なくとも１の抗−ＮＯ剤、例えばイチョウの抽出物及び美白剤、例えばビタミンＣＧを含むことができる。
【００９２】
例えば本発明に従う組成物は、少なくとも１のセイヨウハッカの抽出物、イチョウの抽出物、ビタミンＣＧ、カンゾウの抽出物、サリチル酸、及びブナノキの芽の抽出物を含み得る。
【００９３】
もちろん、本発明に従う組成物は、ハッカの抽出物に加えて、適切であれば、１以上の他の活性剤と組み合わせて、組成物の考慮下の投与方法に関してより特に選択された配合物のための添加剤及び／又は担体を含み得る。
【００９４】
特に、本発明に従う組成物は、選択された施与の方法又は投与の方法に従って、通常使用される任意の剤形であり得る。
【００９５】
より具体的には、本発明に従う組成物は局所的施与又は経口投与のために配合され得る。
【００９６】
より特に局所施与を意図されている組成物に関して、該組成物は、水性溶液、水性アルコール溶液、又は油性溶液、溶液タイプの分散物、又はローション又は美溶液タイプの分散物、ミルクタイプの液体、又は半液体の凋度を有するエマルジョン、クリーム又は水性又は無水のゲルタイプの懸濁物又はエマルジョン、ミクロエマルジョン、ミクロカプセル、ミクロ粒子、又はイオン及び／又はノニオンタイプのベシクルの分散物であり得る。
【００９７】
それらは、例えばケアクリーム、ケアゲル、支持体上のマスク、ファンデーション、カモフラージュ製品、コンシーラー、アイシャドウ、アイペンシル、コール、マスカラ、又はメイクアップ除去製品であり得る。
【００９８】
本発明の組成物がエマルジョンであるとき、脂肪相の割合は、組成物の合計重量に対して５重量％〜８０重量％、好ましくは５重量％〜５０重量％の範囲であり得る。エマルジョンの形態の組成物において使用されるオイル、乳化剤、及び共乳化剤は、化粧料及び／又は皮膚科学の分野で慣用的に使用されるものから選択される。乳化剤及び共乳化剤は、組成物の合計重量に対して０．３重量％〜３０重量％、好ましくは０．５重量％〜２０重量％の範囲の割合で存在し得る。
【００９９】
本発明の組成物が油性溶液又はゲルであるとき、脂肪相は組成物の合計重量の９０重量％超を占めうる。
【０１００】
これらの組成物は通常の方法に従って製造される。
【０１０１】
公知の方法で、本発明の化粧料組成物又は皮膚科学組成物は、化粧料又は皮膚科学の分野で通常の助剤、例えば脂肪物質、乳化剤、親水性又は親油性ゲル化剤、親水性又は親油性活性剤、保存剤、抗酸化剤、香料、フィラー、スクリーニング剤、及び染料を含み得る。
【０１０２】
本発明において使用されることができる脂肪物質として、鉱物オイル、例えば水素化されたポリイソブテン及び液状石油ゼリー、植物オイル、例えばシアバターの液状フラクション、ヒマワリオイル、及びアプリコット核オイル、動物性オイル、例えばパーヒドロスクワレン、合成オイル、特にプルセリンオイル、ミリスチン酸イソプロピル及びパルミチン酸エチルヘキシル、及びフルオロオイル例えばパーフルオロポリエーテルが挙げられ得る。脂肪族アルコール、脂肪酸、例えばステアリン酸、例えばワックス、例えばパラフィンワックス、カルナウバ蝋、及び蜜蝋もまた使用され得る。シリコーン化合物、例えばシリコーンオイル、例えばシクロメチコーン、及びジメチコーン及びシリコーンガム、樹脂及びワックスが使用され得る。
【０１０３】
本発明において使用され得る乳化剤として、例えばステアリン酸グリセリル、ポリソルベート６０、ＨＥＮＫＥＬ社によりＳｉｎｎｏｗａｘ  ＡＯ（商標）の名前で販売されているセチルステアリルアルコール／３３モルのエチレンオキシドを含むオキシエチレン化セチルステアリルアルコール、ＧＡＴＴＥＦＯＳＳＥ社によりＴｅｆｏｓｅ（商標）６３の名前で販売されているＰＥＧ−６／ＰＥＧ−３２／ステアリン酸グリコールの混合物、ＰＰＧ−３ミリスチルエーテル、シリコーン乳化剤、例えばセチルジメチコーンコポリオール、及びソルビタンモノ又はトリステアレート、ＰＥＧ−４０ステアレート、又はオキシエチレン化ソルビタンモノステアレート（２０ＥＯ）が挙げられ得る。
【０１０４】
本発明において使用され得る溶媒として、低級アルコール、特にエタノール及びイソプロパノール、及びプロピレングリコールが挙げられ得る。
【０１０５】
親水性ゲル化剤として、カルボキシルポリマー、例えばＣＡＲＢＯＭＥＲ（商標）、アクリルコポリマー、例えばアクリレート／アルキルアクリレートコポリマー、ポリアクリルアミド、特にＳＥＰＰＩＣ社によりＳｅｐｉｇｅｌ  ３０５（商標）の名前で販売されているポリアクリルアミド、Ｃ１３〜１４イソパラフィン、及びＬａｕｒｅｔｈ−７の混合物、多糖類、例えばセルロースの誘導体、例えばヒドロキシアルキルセルロース、特にヒドロキシプロピルセルロース、及びヒドロキシエチルセルロース、天然のガム、例えばグアーガム、キャロブガム、キサンタンガム、及び粘土が挙げられ得る。
【０１０６】
親水油性ゲル化剤として、変性された粘土、例えばベントン、脂肪酸の金属塩、例えばステアリン酸アルミニウム、及び疎水性シリカ、又はエチルセルロース、及びポリエチレンが挙げられ得る。
【０１０７】
これらの種々の助剤の量は、化粧料及び／又は皮膚科学の分野において慣用的に使用されている量であり、例えば組成物の合計重量に対して０．０１〜２０重量％である。その性質に依存して、これらの助剤は脂肪相、水性相、及び脂質ベシクルに導入され得る。
【０１０８】
本発明に従う化粧方法は、例えばゲル、ローション、又はエマルジョンの形で配合されていてもよいところの本発明に従う組成物の例えば毎日の局所施与により、実施され得る。
【０１０９】
すなわち、本発明に従う方法は単純な施与を含み得る。
【０１１０】
別の実施態様に従うと、施与は例えば、１以上の日に毎日２〜３回、かつ一般的に少なくとも４週間、又はさらに４〜１５週間の持続期間に渡って、かつ適切であれば１以上の停止期間とともに繰り返される。
【０１１１】
本発明に従う組成物の経口投与の場合、摂取可能な支持体の使用が好まれる。
【０１１２】
摂取のために、経口組成物の数多くの実施態様、特に栄養補助食品、が可能である。それらの配合はドラジェ、ゼラチンカプセル、ゲル、エマルジョン、タブレット又はカプセルの製造のための通常の方法により行われる。粉末は、経口的に投与される前に、摂取可能な液体、例えば水に希釈されることができる。
【０１１３】
以降に記載の実施例は、本発明の分野の非制限的な例として提示されている。
【実施例】
【０１１４】
実施例１
活着状況(survival conditions)下に保たれたヒトの皮膚のモデルにおける色素沈着及び、ＣＧＲＰ（カルシトニン遺伝子関連ペプチド）に誘発されるメラニン生成の、本発明に従う抽出物による変化の評価。
【０１１５】
物質及び方法
使用された抽出物は、ＣＡＬＭＩＳＫＩＮ（商標）の商品名でＳＩＬＡＢ社により販売されている製品である。それは水中の１００％（体積／体積）におけるハッカ（セイヨウハッカ）の葉の抽出物の溶液である。それは２重量％の割合で使用される。
【０１１６】
皮膚の色素沈着は、フォンタナ−マッソン染色による暴露後に光学顕微鏡の下で、メラニン生成細胞及び隣接するケラチン生成細胞のレベルにおいて組織学的に評価される。活性メラニン生成細胞の数は、表皮全体上でのドーパ反応後にもまた数えられる。
【０１１７】
脱色素する生成物又は色素化を進める生成物（propigmenting product）の客観化は、該生成物で処置された皮膚のメラニン生成細胞、及び隣接するケラチン生成細胞中に存在するメラニン色素の量を、処置されていない皮膚と比較して評価することから成る。
【０１１８】
試験プロトコル
６人の異なるドナーからの正常なヒトの皮膚の断片がインサートに入れられ、該インサート自身は培養ウェル中に置かれる。活着状況下の維持に特異的に適する培養培地（抗生物質、ＦＣＳ）が、ウェルの底に添加され、多孔質の膜（３μｍ）を通して２つの区画の間の遅い拡散により通過が行われる。
【０１１９】
ＣＧＲＰが１０−７ Ｍの濃度においてＤ０に培養培地に添加される。本発明に従う生成物が２％において局所的に施与される（Ｄ０、Ｄ１及びＤ２）。
【０１２０】
以下の比較が行われた：
対照の（未処置の）皮膚
皮膚＋１０−７ Ｍ  ＣＧＲＰ
皮膚＋１０−７ Ｍ  ＣＧＲＰ＋２％ハッカの抽出物
【０１２１】
全体が７２時間、活着状況下に保たれる。
【０１２２】
フォンタナ−マッソン染色による組織学的暴露
皮膚断片は、上記のプロトコルの終わりに、ブアン液中に固定され、フォンタナ−マッソン染色の後に組織学的研究のためにパラフィンに埋め込まれる。メラニン粒子を含む細胞の数の定量的評価が、基底層の３００〜４００細胞上で顕微鏡下行われる。３つカテゴリーの細胞が数えられる。
スコアー１：色素沈着のない細胞又はいくつかの粒子を示す細胞、小胞の外観を有する細胞；
スコアー２：中程度のメラニン量を示す細胞（分散されており、非均一であるメラニンの粒子）；
スコアー３：かなりのメラニン量を示す細胞（細胞の細胞質の半分超を覆う均一な黒い沈着物）。
【０１２３】
ドーパ反応によるメラニン生成細胞の組織学的暴露
活性なメラニン生成細胞の数は、０．５ Ｍ、ｐＨ７．５において（９０秒、６０℃において）ＥＤＴＡ２Ｎａの溶液によりはがされた新鮮な表皮を使用して評価される。
【０１２４】
メラニン生成細胞は０．１％のドーパ溶液で暴露される（３７℃における終夜インキュベーション）。
【０１２５】
ドーパに陽性な細胞の数が光学顕微鏡下の視域の単位（unit of  field）ごとに評価される（４０倍において１０〜１２の視域）。視域ごとに存在する活性なメラニン生成細胞の平均の数が各条件に対して計算される。
【０１２６】
統計的分析
６つの皮膚について得られた結果に基づいて各パラメーターに対して平均が出される。統計的分析は、５％の危険率で、Ｚスコアと呼ばれるスチューデント検定、又は対応のある標本試験により行われる。
【０１２７】
結果
フォンタナ−マッソン染色による組織学的暴露
【０１２８】
表１は、各色素沈着スコアーに対する上皮細胞の百分率を示す。
【表１】
2007182444.tif 000002
表１：フォンタナ−マッソン染色後の組織学的分析。結果は分析された総数に対する細胞の百分率として表されている（ｎ＝６の異なる皮膚）。
＊：対照の皮膚と比較された統計的に有意な差（対応のあるスチューデントの検定、ｐ＜０．０５）。
＊＊：皮膚＋ＣＧＲＰと比較された統計的に有意な差（対応のあるスチューデントの検定、ｐ＜０．０５）。
【０１２９】
活着状況下に維持されたＣＧＲＰで刺激されたヒトの皮膚のモデルにおいて、メラニン生成細胞から隣接するケラチン生成細胞へのメラニン粒子の移動の増加が注目される。特異的に、非常に顔料の多い細胞（スコアー３）の割合が、１０−７ Ｍ  ＣＧＲＰによる刺激後、かなり増加する：対照皮膚における１９．７％に対して３０．３％のフォンタナ陽性細胞。同時に、顔料が全くない、又はほとんどない細胞（スコアー１）の百分率はＣＧＲＰの施与後、対照皮膚に比較されてかなり減少する（２４．９％対３９．８％、ｐ＝０．０３）。スコアー２の細胞の百分率は、ＣＧＲＰの施与後変化しない。
【０１３０】
その結果、２％において試験されたハッカの抽出物は、ＣＧＲＰに誘発される色素沈着をかなり阻害する（スコアー１の細胞の５０．１％対ＣＧＲＰありの２４．９％、ｐ＝０．００４）。平行して、非常に色素の沈着した細胞（スコアー３）の数はかなり減少する（１７．３％対ＣＧＲＰによる３０．３％）。
【０１３１】
２のスコアーを有する細胞の百分率における統計的に有意な減少もまた見出される（３２．６％対ＣＧＲＰのみの４５％）。
【０１３２】
【表２】
2007182444.tif 000003
表２：表皮層上のメラニン生成細胞の数（Ｄｏｐａ反応後）（ｎ＝８）。
＊：対照皮膚と比較された統計的に有意な差（対応のあるスチューデントの検定、ｐ＜０．０５）。
＊＊：皮膚＋ＣＧＲＰと比較された統計的に有意な差（対応のあるスチューデントの検定、ｐ＜０．０５）。
【０１３３】
Ｄｏｐａ反応により示されたメラニン生成細胞の数は、ＣＧＲＰにより著しく誘発されたメラニン生成を明らかにする：Ｄｏｐａ陽性細胞５６に対して対照皮膚３１（ｐ＝０．０１）。
【０１３４】
２％において試験されたハッカの抽出物はこのＣＧＲＰに誘発されるメラニン生成を著しく阻害する（それぞれ３８の陽性細胞）。
【０１３５】
実施例２
多細胞のインビトロでのケラチン生成細胞／メラニン生成細胞／神経細胞モデルにおける、情動的ストレスの状況におおける皮膚の色素沈着及びＣＧＲＰ（カルシトニン遺伝子関連ペプチド）に誘発されるメラニン生成のハッカの抽出物を用いての変化の評価。
【０１３６】
使用された抽出物はＳＩＬＡＢ社によりＣＡＬＭＩＳＫＩＮ（商標）の商品名で販売されている製品である。それはハッカ（セイヨウハッカ）の葉の抽出物の１００％（体積／体積）における水中の溶液である。それは０．０３重量％の割合で使用される。
【０１３７】
多細胞ケラチン生成細胞／メラニン生成細胞／神経細胞モデル
第一の培養物は、２ｍＭのＬ−グルタミン（インビトロジェン社、２５０３００２４）、５０ ＩＵ／ｍｌのペニシリン−５０ μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（インビトロジェン社、１５０７００６３）、Ｎ２サプルメント（１７５０２−０４８）、神経成長因子（神経成長因子、ＮＧＦ、インビトロジェン社、１３２９０．０１０）及びニューロトロフィン３（ＮＴ−３、テブ社、４５０−０３−ｂ）を補強されたＤＭＥＭ−ＨＡＭ  Ｆ１２培養培地（インビトロジェン社、２１３３１−０２０）中で、デポジット（ＴｈｉｎＣｅｒｔ（商標）、グライナーバイオワン、参照６６２ ６１０）ごとに２００００細胞の割合で、２４ウェルプレートについて、培養インサート中で培養された神経細胞から調製され、そして３７℃及び水蒸気で飽和された５％ＣＯ２のインキュベーター中で５日間維持された。
【０１３８】
第二の培養物は、ＰＭＡなしのＨＭＧＳ−２（テブ０５８Ｓ−０１６−５）と、５０ ＩＵ／ｍｌのペニシリンと５０ μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（インビトロジェン社、１５０７００６３）との混合物で補強された培地（Ｍｅｄｉｕｍ  ２５４（テブ社０５８Ｍ−２５４−５００））中で、２４ウェルプレートにおいて、１０００００細胞／ウェルの割合で接種されたケラチン細胞（Ｋ）（形成外科手術から単離され、第三代継代において使用される正常なヒトケラチン生成細胞（ＮＨＥＫ）（Ｒ３  Ｋ０１５））及びケラチン生成細胞培養において５００００細胞／ウェルの割合で接種されたメラニン生成細胞（Ｍ）（第六代継代において使用される正常なヒト表皮メラニン生成細胞（ＮＨＥＭ−２））を用いて調製された。
【０１３９】
４日の培養の後、神経細胞を含むインサートがケラチン生成細胞／メラニン生成細胞共培養物を含むウェルの中に入れられて（共培養物の培養の１日後）、Ｎ／Ｋ／Ｍ培養培地の存在下、多細胞の神経細胞−ケラチン生成細胞−メラニン生成細胞（Ｎ／Ｋ／Ｍ）モデルを得た。
【０１４０】
Ｎ／Ｋ／Ｍ培養培地は、２ｍＭのＬ−グルタミン（インビトロジェン社、２５０３００２４）、５０ ＩＵ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（インビトロジェン社、１５０７００６３）、Ｎ２サプリメント（１７５０２−０４８）、神経成長因子（ＮＧＦ、インビトロジェン社）、及びニューロトロフィン３（ＮＴ−３）で補強された５０％ＤＭＥＭ−ＨＡＭ  Ｆ１２（インビトロジェン社、２１３３１−０２０）、０．２ ｍＭのＣａＣｌ２（テブ社、Ｓ−０１３−１５４）及びケラチン細胞成長因子（ヒトケラチン細胞成長サプリメント（ＨＫＧＳ）テブ社、Ｓ−００１−５）で補強された３３％のＭ １５４培地（テブ社Ｍ １５４  ＣＦ／ＰＲＦ）、及び１７％のＭ １５４培地（テブ社、Ｍ １５４  ＣＦ／ＰＲＦ）を含む。
【０１４１】
このようにして得られた多細胞モデルは少なくとも１０日間培養液中で維持された。
【０１４２】
ウェル及びインサートの培養培地は毎日５０％更新された。
【０１４３】
メラニン生成へのノルアドレナリンタイプの情動的ストレスの効果
【０１４４】
上記のようにして得られた多細胞モデルの細胞は、上記のプロトコルに類似するプロトコルに従って、０．０３％のＣＡＬＭＩＳＫＩＮ（商標）又は１０−６ ＭのＣＧＲＰ８−３７が添加されている、又は添加されていないところの１０−５ Ｍのノルアドレナリンの不存在下又は存在下で１０日間維持された。
【０１４５】
ＣＧＲＰ８−３７は、参照のＣＧＲＰ−レセプターアンタゴニストである。
【０１４６】
インキュベーションの終わりに、メラニンは０．５ ＮのＮａＯＨ溶液でケラチン生成細胞／メラニン生成細胞の共培養物から抽出され、それから光学密度４０５ｎｍ）を測定することにより分析されて、外因的なメラニン（０．３９−１００μｇ／ｍｌのメラニン、Ｓｉｇｍａ  Ｍ８６３１）の標準曲線と比較された。
【０１４７】
実験データは、ＰＲＩＳＭ（商標）ソフトウェア（グラフパッドソフトウェア）により解析された。
【０１４８】
集団間の比較は、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用いる分散の解析（ＡＮＯＶＡ）により行われた。
【０１４９】
２つの試料の間の比較は、Ｔ検定を用る分析により行われた。
【０１５０】
得られた結果は下の表に与えられる。結果は４つの独立した実験の平均を表す。それらはメラニンのμｇ／ｍｌで表される。
【０１５１】
【表３】
2007182444.tif 000004
【０１５２】
１０−５ Ｍのノルアドレナリンの存在は、共培養において合成されたメラニンの量を有意に（＃；ｐ＜０．０１）刺激する（＋１５％）。
【０１５３】
０．０３％の濃度におけるＣＡＬＭＩＳＫＩＮ（商標）製品、及びＣＧＲＰ−レセプターアンタゴニストＣＧＲＰ８−３７は、ノルアドレナリンの存在下、メラニンの量を有意に（＊；ｐ＜０．０５及び＃；ｐ＜０．０１）減少させる（それぞれ−７．３％及び−１７．２％）。
【０１５４】
ＣＧＲＰ放出の測定
【０１５５】
上記の実験の最後において、ウェルから、及びインサートからの上澄みが別々に集められ、ＣＧＲＰ濃度を分析するために、−８０℃において直ちに凍結された。
【０１５６】
ＣＧＲＰ濃度は、培養物の上澄み液においてＥＬＩＳＡ分析により、供給元により推薦されたプロトコルに従って測定された（ラットのＣＧＲＰ酵素免疫分析キット、Ｓｐｉ  Ｂｉｏ  Ａ０５４８２）。
【０１５７】
結果は、培地１ｍｌ当たりのＣＧＲＰのｐｇで表わされる。
【０１５８】
結果の分析は、上記のように行われた。
【０１５９】
【表４】
2007182444.tif 000005
【０１６０】
ノルアドレナリンの存在下、対照の培養インサート中に放出されたＣＧＲＰの量は、非常に多い。ＣＡＬＭＩＳＫＩＮ（商標）生成物はＣＧＲＰ放出を少し変化させた。
【０１６１】
（ケラチン生成細胞／メラニン生成細胞共培養物と接触している）ウェルの培養培地中で分析されたＣＧＲＰの量は、ＣＧＲＰが分散した、又は多孔質のインサートを横断した神経末端により放出されたことを示す。このレベルにおいて、ＣＡＬＭＩＳＫＩＮ製品はＣＧＲＰの放出を有意に減少させた（対照の−２１％；ｐ＜０．０５）。
【０１６２】
結論
本発明に従う多細胞モデルへのノルアドレナリンの添加は、培養培地中へ神経細胞により放出されるＣＧＲＰの量の増加を招く。
【０１６３】
この量は神経細胞のレベルにおいてより高いが、ケラチン生成細胞／メラニン生成細胞共培養の近くでも測定されることができる。
【０１６４】
すなわち、ノルアドレナリンはＣＧＲＰ放出によるケラチン生成細胞／メラニン生成細胞共培養において、測定可能な態様でメラニン生成を増加させるようである（＋１５％）。
【０１６５】
この刺激は０．０３％の濃度におけるＣＡＬＭＩＳＫＩＮ製品の施与により減少された。
【０１６６】
実施例３
すべてのタイプの皮膚に対する美白美溶液の配合の例。
【０１６７】
それは、当業者にとって慣用である方法で製造された水中油型エマルジョンであり、以下の組成を有する。
【０１６８】
2007182444.tif 000006
【外国語明細書】
2007182444000001.pdf
2007182444000002.pdf
2007182444000003.pdf