(57)【要約】【課題】  従来のゲル拡散法における不具合を改善し、蛋白質など生体高分子の単結晶を大型で良質な状態で均一に生成する結晶成長方法及び装置を提供すること。【解決手段】  生体高分子を含有する溶液から、その生体高分子を結晶成長させる方法において、生体高分子溶液と、半透過性物質と、生体高分子の結晶化を促進する溶液とを、この順に各界面を接触させて並列させると共に、略水平に配置し、結晶化促進溶液を、半透過性物質を通過させ生体高分子溶液中に拡散させることで過飽和状態とし、生体高分子の結晶を析出させる。生体高分子溶液の下面に、生体高分子溶液より比重が大きな不活性液体を接触させて配置して、生体高分子溶液中における結晶化促進溶液の分散の均一化に寄与させてもよい。【選択図】  図３
2007051044.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体高分子を含有する溶液から、その生体高分子を結晶成長させる方法であって、
生体高分子溶液と、半透過性物質と、生体高分子の結晶化を促進する溶液とを、この順に各界面を接触させて並列させると共に、略水平に配置し、
結晶化促進溶液を、半透過性物質を通過させ生体高分子溶液中に拡散させることで過飽和状態とし、生体高分子の結晶を析出させる
ことを特徴とする生体高分子の結晶成長方法。
【請求項２】
生体高分子溶液の下面に、生体高分子溶液より比重が大きな不活性液体を接触させて配置することで、生体高分子溶液中における結晶化促進溶液の分散を均一化する
請求項１に記載の生体高分子の結晶成長方法。
【請求項３】
生体高分子を含有する溶液から、その生体高分子を結晶成長させる装置であって、
生体高分子溶液を充填保持する器部と、半透過性物質を充填保持する器部と、生体高分子の結晶化を促進する溶液を充填保持する器部とが、この順に連設されると共に、略同一平面に配置される
ことを特徴とする生体高分子の結晶成長装置。
【請求項４】
生体高分子溶液を充填保持する器部の下面に、生体高分子溶液より比重が大きな不活性液体を充填保持する器部が配設される
請求項３に記載の生体高分子の結晶成長装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛋白質をはじめとする生体高分子を、凝集、吸着、分離する方法、より詳細には生体高分子を結晶成長させる方法、並びに、その方法を実施する装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質に代表される生体高分子の三次元立体構造を明らかにすることは、その分子の生体中における生理機能を明らかにできるばかりでなく、合理的な医薬品の開発（ドラッッグデザイン）を進める上でも極めて有用であると考えられている。この生体高分子の三次元立体構造を解析する実用的な手法には、ＮＭＲ（核磁気共鳴）法とＸ線結晶構造解析法とがあるが、解析上分子量に制限が無いＸ線結晶構造解析法が、今後特に有効であると考えられている。
Ｘ線結晶構造解析法では、多結晶や双晶などでは解析が困難なので単結晶を作製しなければならない。更に、結晶構造解析の分解能などの精度を向上させるために、良質な結晶性の良い単結晶を作製する必要がある。
しかし、この結晶化がボトルネックとなっていて、迅速で高精度の結晶構造解析を妨げているのが実状である。
【０００３】
生体高分子の単結晶作製法としては、図１に示すような従来公知の方法が現在主に採用されている。図１（ａ）は、ハンギングドロップ蒸気拡散法を示す正面断面説明図、図１（ｂ）は、シッティングドロップ蒸気拡散法を示す正面断面説明図、図１（ｃ）は、マイクロバッチ法を示す正面断面説明図、図１（ｄ）は、ゲル拡散法を示す正面断面説明図である。
図１（ａ）（ｂ）に示す蒸気拡散法では、少量の蛋白質を含む水溶液（１１）を、結晶化プレート（２１）を閉蓋するカバーガラス（２２）の下面、或いは結晶化プレート（２１）内の支持台部（２３）上に滴下すると共に、底部のリザーバー（２４）に沈殿剤（１２）を充填して、容器を密閉する。これにより蛋白質溶液（１１）はやがて過飽和状態となり、この蛋白質溶液（１１）中で結晶が析出する。
【０００４】
また、図１（ｃ）に示すバッチ法では、蛋白質溶液と沈殿剤との等量の混合液（１３）をウエル（２５）内に分注し、その上部にパラフイン等のオイル（１４）を注入して封入する。これにより、混合液（１３）中で蛋白質溶液成分が過飽和状態となり晶出する。
図１（ｄ）に示すゲル拡散法では、容器（２６）内に予め濃度1%程度のアガロース等のゲル（１５）を充填しておき、その上部に沈殿剤（１２）を注入する。その後、直径1mm程度、長さ数cm〜10cm程度で、蛋白質溶液（１１）が充填された縦型ガラスキャピラリー（２７）を、ゲル（１５）に突き立てて倒立させ、蓋（２８）で密閉する。これにより、沈殿剤（１２）がゲル（１５）を通過してガラスキャピラリー（２７）中の蛋白質溶液（１１）に拡散していくことで過飽和状態となり、蛋白質溶液（１１）中で結晶が析出する。
【０００５】
蛋白質の結晶化においては、結晶化条件が、個々の蛋白質の特性や発現・精製条件等によって異なり多様である。
そのため、その初期段階においては結晶化条件の探索（結晶化スクリーニング）を行うことによって、おおよその条件を見つける必要がある。この結晶化スクリーニングのための方法としては、図１に示した上記従来法のうち、ハンギングドロップ蒸気拡散法（図１（ａ））、シッティングドロップ蒸気拡散法（図１（ｂ））、マイクロバッチ法（図１（ｃ））が主に用いられている。
しかし、結晶化スクリーニングで得られる結晶化条件は、一般に、おおよそ好適である条件に過ぎないため、その条件下では良質な単結晶が得られない場合が多い。そのため、更に結晶化条件を最適化する必要がある。
【０００６】
最適な結晶化条件を得るためには、図１に示した前記従来法が、個々の蛋白質や精製後の蛋白質量に応じて使い分けられて用いられている。しかし、結晶性の良好な単結晶を得ようとする場合、通常は結晶の成長速度すなわち過飽和度をより厳密に制御することが最も有効であると考えられる。よって、図１に示した前記従来法のなかでは、ゲル拡散法（図１（ｄ））が最も好ましい方法であると考えられる。
【０００７】
更には、結晶化スクリーニングと結晶化条件の最適化過程では、それぞれ異なった結晶化法を用いるのが効果的であると考えられている。これに関しては、非特許文献１に詳細な記述がある。
【非特許文献１】佐崎元、中嶋一雄、“タンパク質の結晶化：結晶成長学からの提言”、構造生物、8（2003）34−48．およびNaomi Chayen, "Protein Crystallization for Genomics: High Throughput Optimization Techniques", ICCBM9, O-A2.11, March 23-28, 2002, Jena, Germany
【０００８】
以上のように、結晶性の良好な蛋白質単結晶を得るためには、過飽和度をより厳密に制御することが可能な結晶化法を適用することが重要となる。この目的に適したゲル拡散法については、非特許文献２及び３に詳細な記述がある。
【非特許文献２】Alexander McPherson, "Crystallization of Biological Macromolecules", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999)
【非特許文献３】J.M. Garcia-Ruiz, et al, "Granada Crystallization Box: a new device for protein crystallization by counter-diffusion technique", Acta Cryst. D58, (2002) 1638
【０００９】
しかしながら、ゲル拡散法を適用する上では、以下のような問題点が挙げられる。
１；装置が大型になってしまう。しかも、ガラスキャピラリー（２７）を用いているため、蛋白質溶液（１１）の消費量が多くなってしまう。
２；縦型のガラスキャピラリー（２７）の中で結晶が成長するため、結晶化の様子を実体顕微鏡で観察するのが困難である。
３；結晶を取り出すためにはガラスキャピラリー（２７）を破壊しなければならないので、その際に結晶を破損してしまうことがある。
４；ガラスキャピラリー（２７）下部に位置する蛋白質溶液（１１）とゲル（１５）とが接触する界面近傍が、沈殿剤（１２）の濃度の最も高い領域であり、この領域で多量の微結晶が析出してしまう。すなわち、ガラスキャピラリー（２７）中に沈殿剤（１２）の濃度勾配が形成されることにより、結晶成長が不均一になってしまう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで、本発明は、ゲル拡散法において、従来の不具合点を改善するためになされたものであり、蛋白質など生体高分子の良質な単結晶を、均一に大型成長させる結晶成長方法及び装置を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するため、本発明の生体高分子の結晶成長方法は、生体高分子を含有する溶液から、その生体高分子を結晶成長させる方法において、生体高分子溶液と、半透過性物質と、生体高分子の結晶化を促進する溶液とを、この順に各界面を接触させて並列させると共に、略水平に配置し、結晶化促進溶液を、半透過性物質を通過させ生体高分子溶液中に拡散させることで過飽和状態とし、生体高分子の結晶を析出させることを特徴とする。
【００１２】
ここで、生体高分子溶液の下面に、生体高分子溶液より比重が大きな不活性液体を接触させて配置して、生体高分子溶液中における結晶化促進溶液の分散の均一化に寄与させてもよい。
【００１３】
このような方法を実施する生体高分子の結晶成長装置は、生体高分子を含有する溶液から、その生体高分子を結晶成長させる装置において、生体高分子溶液を充填保持する器部と、半透過性物質を充填保持する器部と、生体高分子の結晶化を促進する溶液を充填保持する器部とを、この順に連設すると共に、略同一平面に配置することを特徴とする。
【００１４】
ここで、生体高分子溶液を充填保持する器部の下面に、生体高分子溶液より比重が大きな不活性液体を充填保持する器部を配設して、均一で大型の単結晶の成長に寄与させてもよい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によると、簡易な装置でありながら、従来は多数の不均一な微結晶が成長してしまう結晶化条件下でも、良質で均一な単結晶を成長させることができる。
また、結晶性良く成長した結晶を安全に取り出すこともできる。そのため、高精度の結晶構造解析に使用できる単結晶を生産性良く製造可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下に、図面を基に本発明の実施形態を説明する。
本発明の結晶化法は、従来のゲル拡散法の装置を横型に改変し、生体高分子溶液としての蛋白質溶液（１１）と、その蛋白質の結晶化を促進する溶液としての沈殿剤（１２）とを略水平に配置させて、その境界に、半透過性の物質としてゲル（１５）を介在させる構造を基本とする。
【００１７】
図２（ａ）（ｂ）は、本発明による結晶化装置の要部を示す平面図及び正面断面図である。
プレート（２１）の上面は、略水平に配置され、蛋白質溶液（１１）、ゲル（１５）、沈殿剤（１２）が、順に各境界面で隣接した状態で略同一平面内に保持される。
蛋白質溶液（１１）は、上部が開口した管路状の凹部（３１）に充填される。図示の例では、凹部（３１）は、屈曲した折線状に形成されている。
凹部（３１）は、従来の結晶化法におけるガラスキャピラリー（２７）の役割を果たすものであるため、ガラスキャピラリー（２７）と同程度のサイズであることが望ましい。凹部（３１）の好適なサイズは、幅は数mm程度、長さは数十mm程度である。
また、ゲル（１５）を保持する層の上面に、ゲル（１５）を注入するための注入孔（３２）が設けられている。
【００１８】
これにより、沈殿剤（１２）がゲル（１５）の層を通過して蛋白質溶液（１１）に到達することで、蛋白質溶液（１１）内が過飽和状態となって結晶化が促進される。
蛋白質溶液（１１）の層が、その上面を露出した状態で水平に保持されるため、成長した結晶を上方から容易に観察でき、Ｘ線回折実験に供する結晶を損傷させることなく上方から容易に取り出すことができる。
なお、本装置の材質は、耐薬品性及び加工性に優れるものであれば、任意のものが使用できる。例えば、ガラスやポリカーボネート、ポリプロピレン等のプラスチックが利用できる。
【００１９】
図３（ａ）（ｂ）は、別実施例の要部を示す平面図及び正面断面図である。
図２（ａ）（ｂ）に示した結晶化装置とは、蛋白質溶液（１１）の層の下面に不活性液体（１６）の層が埋設されている点が異なる。不活性液体（１６）は、蛋白質溶液（１１）より比重が大きく、プレート（２１）上面に連通する注入孔（３３）から充填される。
不活性液体（１６）としてはフッ素系のフロリナート（登録商標）等が利用でき、その液体層の深さは数mm程度であれば十分である。
【００２０】
図４は、図２に相当する装置による結晶化の過程を模式的に示すものであり、装置の正面断面図とグラフとを記載する。
沈殿剤（１２）はゲル（１５）中を拡散した後に蛋白質溶液（１１）の層に到達するが、初期にはこのゲル（１５）と蛋白質溶液（１１）との界面近傍での沈殿剤濃度が最も高くなるため、この部分で多量に微結晶（１７）が析出する。
沈殿剤（１２）は、離隔した位置の蛋白質溶液（１１）にまで徐々に拡散していくため、沈殿剤（１２）の蛋白質溶液（１１）中での濃度はグラフのように漸減していく。この場合、ゲル（１５）から離隔した位置の蛋白質溶液（１１）中で、大型の結晶（１７）が成長することが期待される。
【００２１】
図５は、図３に相当する装置による結晶化の過程を模式的に示すものであり、装置の正面断面図とグラフとを記載する。
本装置では、蛋白質溶液（１１）の下面に不活性液体（１６）の層が埋設されているので、蛋白質溶液（１１）と不活性液体（１６）との界面には、界面張力（比重の低い蛋白質溶液を上に押し上げようとする揚力）に起因する対流が発生する。
この対流により、蛋白質溶液（１１）中に拡散してきた沈殿剤（１２）は混合され均一化されるため濃度勾配は発生せず、蛋白質溶液（１１）中のどの位置でも沈殿剤濃度はほぼ一定となる。そのため、蛋白質溶液（１１）の過飽和度もほぼ一定となるため、均一なサイズの結晶（１７）を成長させることが可能になる。
通常は結晶化スクリーニングによって、ある蛋白質の結晶化条件を見出した後には、その結晶化条件を最適化して更に高品質で大型の結晶を作製する必要がある。このような場合に、本発明の結晶化方法及び装置を適用することは非常に効果的である。
【００２２】
図６及び７は、本発明による装置の平面図であり、それぞれ、図２及び３に示した装置を多数集積化したものである。いずれも２４個のユニットセルが同一平面内に並列されている。このような構造にすることによって、多数の実験を同時に実施することが可能となり、また、装置の製造コスト低減にもつながる。
【実施例】
【００２３】
図２及び３に示した２つの装置を作製した。
厚み15mm、幅20mm、長さ100mmのポリカーボネート性樹脂を用い、機械切削によって、沈殿剤用器部（WXDXH=15X5X7）、ゲル用器部（WXDXH=15X2X7）、蛋白質溶液用器部（WXDXH=1.5X1.5X80）を形成し連接させた。同様に、蛋白質溶液用器部の下部に、不活性液体の層（厚み5mm）を形成するための器部を付設したものも作成した。
実験は不活性液体層のある場合と無い場合について行った。
【００２４】
結晶化用として以下の蛋白質を準備した。また、各蛋白質について既知の結晶化条件（沈殿剤濃度）を用いて結晶成長の様子を観察した。蛋白質濃度は２種類の濃度について結晶化を実施した。
【００２５】
蛋白質１；ニワトリ卵白由来リゾチーム（分子量：14KDa）
標準的な結晶化条件：0.1M 酢酸Na pH4.6、2.0M NaCl
蛋白質濃度：30, 60mg/mL (0.1M 酢酸Na pH4.6 で溶解)
【００２６】
蛋白質２；ブタ膵臓由来エラスターゼ（分子量：26KDa）
標準的な結晶化条件：0.1M 酢酸Na pH4.6、2.0M NaCl
蛋白質濃度：15, 30mg/mL (0.1M 酢酸Na pH4.6 で溶解)
【００２７】
蛋白質３；ウシ肝臓由来カタラーゼ（分子量:240KDa）
標準的な結晶化条件：0.1M Tris-HCl pH7.5、10% PEG6,000、5% MPD
蛋白質濃度：13, 25mg/mL (0.1M リン酸Na  pH8.0で溶解)
【００２８】
ゲル層に用いたアガロースゲルは1.2％のものを用いた。各ウエルに沈殿剤を0.5mL、蛋白質溶液は20mLを分注した。
結晶化はすべて20℃で行った。結晶の観察は、結晶開始後10日間経過してから行った。
各結晶化実験の条件と結果を図８〜１０の表に示す。
【００２９】
図８〜１０は、それぞれ、蛋白質を、ニワトリ卵白由来リゾチーム、ブタ膵臓由来エラスターゼ、ウシ肝臓由来カタラーゼとした場合における結晶化条件と結果を示す表である。
これらから、通常の蒸気拡散法においては蛋白質濃度が高く結晶が多数成長してしまう条件下でも、本発明によると、均一に大型の単結晶が成長することが判明した。これは、ゲル層を介して起こる沈殿剤の拡散効果、並びに不活性液体層に起因する撹拌効果により、通常は多数の単結晶や微結晶が成長してしまう条件下でも、結晶核の形成と成長が適度に抑制され、均一な成長が起こるためであると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明によると、従来のゲル拡散法における問題点を解消し、良質で均一な単結晶を成長させ、損傷させる危惧なく取り出すことができる。そのため、大量の蛋白質等の生体高分子を迅速に結晶化して構造解析を行う場合や、高精度の構造解析に使用できる良質な単結晶を作製する場合などに有効であり、用途が広く産業上非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１（ａ）】従来の生体高分子の単結晶作製法を示す正面断面説明図
【図１（ｂ）】従来の生体高分子の単結晶作製法を示す正面断面説明図
【図１（ｃ）】従来の生体高分子の単結晶作製法を示す正面断面説明図
【図１（ｄ）】従来の生体高分子の単結晶作製法を示す正面断面説明図
【図２】結晶化装置要部を示す平面図及び正面断面図
【図３】同、別実施例図
【図４】図２に相当する装置による結晶化過程を示す正面断面模式図及びグラフ
【図５】同、図３に相当する装置による結晶化過程を示す正面断面模式図及びグラフ
【図６】図２に示した装置を多数集積化した装置の平面図
【図７】同、図３に示した装置を多数集積化した装置の平面図
【図８】ニワトリ卵白由来リゾチームの結晶化条件と結果を示す表
【図９】ブタ膵臓由来エラスターゼの結晶化条件と結果を示す表
【図１０】ウシ肝臓由来カタラーゼの結晶化条件と結果を示す表
【符号の説明】
【００３２】
１１  蛋白質溶液
１２  沈殿剤
１３  蛋白質溶液と沈殿剤の混合液
１４  オイル
１５  ゲル
１６  不活性液体
１７  結晶
２１  結晶化プレート
２２  ガラス
２３  支持台部
２４  リザーバー
２５  ウエル
２６  容器
２７  ガラスキャピラリー
２８  蓋
３１  凹部
３２、３３  注入孔
【図１（ａ）】
2007051044.tif 000003
【図１（ｂ）】
2007051044.tif 000004
【図１（ｃ）】
2007051044.tif 000005
【図１（ｄ）】
2007051044.tif 000006
【図２】
2007051044.tif 000007
【図３】
2007051044.tif 000008
【図４】
2007051044.tif 000009
【図５】
2007051044.tif 000010
【図６】
2007051044.tif 000011
【図７】
2007051044.tif 000012
【図８】
2007051044.tif 000013
【図９】
2007051044.tif 000014
【図１０】
2007051044.tif 000015