(57)【要約】 【課題】  水に対する溶解度が低い酵素あるいは有機溶剤中では不安定で活性を失う酵素等を、有機溶剤を用いずに水溶液中から効率的に分離・精製する方法を提供する。【解決手段】  酵素含有液中で、酵素と包接化合物との包接複合体を形成し、該包接複合体を分離・精製する分離精製工程を有することを特徴とする酵素精製法。酵素としてクチナーゼ、包接化合物としてシクロデキストリンを好適に用いることができ、包接複合体の分離・精製には膜による分離・精製を好適に用いることができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素含有液中で、酵素と包接化合物との包接複合体を形成し、該包接複合体を分離・精製する分離精製工程を有することを特徴とする酵素精製法。
【請求項２】
前記分離精製工程が、膜を用いて前記包接複合体を分離・精製する工程である請求項１に記載の酵素の精製法。
【請求項３】
前記包接化合物が、シクロデキストリンである請求項１または２に記載の酵素の精製法。
【請求項４】
前記包接化合物が、メチル−β−シクロデキストリンである請求項３に記載の酵素の精製法。
【請求項５】
前記酵素が、クチナーゼである請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵素の精製法。
【請求項６】
前記酵素含有液が、クリプトコッカス属由来の酵母がクチナーゼを産出した培養液である請求項５に記載の酵素の精製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素含有液から、効率的に酵素を分離・精製する方法に関する。
さらに詳しくは、酵素含有液中の酵素を包接化合物を用いて包接複合体とし、該複合体を分離・精製する工程を有する酵素の精製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、酵素含有液から酵素を分離・精製する方法としては、分別沈殿法、二層分離法、カラムクロマトグラフィー法、膜分離法等が知られている。
これらの中でも膜分離法に関しては、近年の膜製造技術の発達により、種々の分画分子量に対応して、形状あるいは濾過口径等、目的に合わせた仕様の膜が開発され、利用されている。
【０００３】
また二層分離法に関しては、水に対する溶解度が低く、有機溶剤に可溶な酵素の精製法として、有機溶剤中において界面活性剤を用いて、酵素と界面活性剤との複合体を形成させて水に可溶とさせた後、水層に酵素を抽出することで、酵素を精製する方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【特許文献１】特開平６−７３０９０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１に記載の方法は、有機溶剤中では不安定で活性を失う酵素に対しては適用することができず、このような酵素に関しては、水溶液中で精製する方法が求められていた。
したがって、本発明の目的は、水に対する溶解度が低い酵素あるいは有機溶剤中では不安定で活性を失う酵素等を、有機溶剤を用いずに水溶液中から効率的に分離・精製する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、酵素含有液中から、該酵素を効率的に分離・精製する方法について鋭意検討した結果、酵素の水に対する溶解度の如何に関わらず、酵素と包接化合物とを用いて包接複合体を形成させ、得られた包接複合体を分離・精製し、分離・精製した包接複合体から酵素を分離することにより、前記目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、酵素含有液中で、酵素と包接化合物との包接複合体を形成し、該包接複合体を分離・精製する分離精製工程を有することを特徴とする酵素精製法である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、水に対する溶解度の如何に関わらず、膜分離などの定法を用いて、酵素含有液中から該酵素を効率的に分離・精製することができる。
特に、水に対する溶解度が低い酵素、あるいは有機溶媒中では不安定で活性を失う酵素を、効率的に分離・精製することができる。すなわち、酵素含有液中から、該酵素を分離しようとする場合、特に、酵素の水に対する溶解度が低い場合には、酵素同士が凝集して沈殿したり、酵素が、酵素含有液中に夾雑物として含まれる他の化合物に吸着したり、分離膜やろ過器などの精製装置に吸着したりしやすい。特に、酵素含有液が培養液である場合には、夾雑物として含まれる糖や目的とする酵素以外のタンパク質等に吸着しやすく、この傾向は、酵素の精製が進むほど強くなる。したがって、酵素を精製すればするほど、酵素含有液中からの酵素の回収率は低くなってしまう。しかしながら、本発明の酵素の精製法においては、このような酵素を包接化合物と包接複合体を形成させることにより、水に対する溶解度を向上させることができ、目的物である酵素の回収率悪化を防ぐことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明について詳しく説明する。
（酵素含有液）
本発明で用いる酵素含有液とは、酵素を産生する微生物を培養した培養液、該培養液から菌体を除いた遠心上清、あるいは該遠心上清からさらに夾雑物の一部を除去したもののいずれでもよい。
【０００８】
（酵素）
本発明の酵素の精製法で精製できる酵素としては、種々のものを挙げることができ、例えば、クチナーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、インベルターゼ、ぺクチナーゼ、リパーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼおよびラクターゼ等を挙げることができる。これらの中でも、クチナーゼが好ましい。
【０００９】
前記酵素は、種々の微生物に由来するものが例示できる。
例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ；ＩＦＯ  ３００７、ＩＦＯ  １２１１２等、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ；ＩＦＯ  ４０７５、ＩＦＯ  ３０１０２等が産生するアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ；ＩＦＯ  ４０６７、３１１２５等、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ；ＩＦＯ  ４７７６、ＩＦＯ４７８０等が産生するグルコアミラーゼ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ；ＩＦＯ  ５７２０、ＩＦＯ  ５８３６等が産生するセルラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ；ＩＦＯ  ３００７、ＩＦＯ  １２１１２等、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ；ＩＦＯ  ３１０２、ＩＦＯ  ３３５５等、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ；ＩＦＯ  ４０７５、ＩＦＯ  ３０１０２等が産生するプロテアーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ；ＩＦＯ  １０４９、ＩＦＯ  ２３５９等、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ；ＩＦＯ  ３００７、ＩＦＯ  １２１１２等が産生するインベルターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ；ＩＦＯ  ４０７５、ＩＦＯ  ３０１０２等、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ；ＩＦＯ  ４０６７、３１１２５等が産生するぺクチナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ；ＩＦＯ  ４０６７、３１１２５等、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ；ＩＦＯ  ４７７６、ＩＦＯ４７８０等が産生するリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ；ＩＦＯ  ４０６７、３１１２５等が産生するカタラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ；ＩＦＯ  ４０６７、３１１２５等が産生するグルコースオキシダーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ；ＩＦＯ  ０６１６、ＩＦＯ  ０２８８等が産生するラクターゼ、等が挙げられる。
【００１０】
（クチナーゼ）
一方、本発明の酵素の精製法で精製できる酵素としては、好ましいものとしてクチナーゼを挙げることができ、種々のクチナーゼ産生微生物に由来するものが例示できる。例えば、クリプトコッカス  エスピー  エス−２（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ  Ｓ−２；ＦＥＲＭ  Ｐ−１５１５５）、フサリウム  ソラニ  ピシ（Ｆｕｓａｒｉｕｍｕ  ｓｏｌａｎｉ  ｐｉｓｉ；ＩＦＯ  ９４２５、ＩＦＯ  ９９７５等）、ボトリチス  シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ；ＡＴＣＣ  １１５４２等）、グロメレラ  シングラータ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｃｉｎｇｕｌａｔａ；ＩＦＯ  ５２５７、ＩＦＯ  ５９０７、ＩＦＯ  ５９１０等）、ファイトフソーラ  ブラシカエ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ；ＣＢＳ  １７８．８７、ＣＢＳ  １７９．８７等）、ファイトフソーラ  カプシシ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃａｐｓｉｃｉ；ＣＢＳ  １２８．８３、ＣＢＳ  １７８．２６等）、ネクトリア  ハエマトコッカ（Ｎｅｃｔｒｉａ  ｈａｅｍａｔｏｃｃｏｃａ；ＡＴＣＣ  １６２３９等）、モニリニア  フルクチコラ（Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ  ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ；ＩＦＯ  ９０６８、ＩＦＯ  ３０４５１等）、ブルメリア  グラミニス（Ｂｌｕｍｅｒｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、アスペルギルス  オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ；ＩＦＯ  ４０７５、ＩＦＯ  ３０１０２等）、ピレノペジザ  ブラシカエ（Ｐｙｒｅｎｏｐｅｚｉｚａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ；ＡＴＣＣ  ２００７０９、ＡＴＣＣ  ２００７１０、ＡＴＣＣ  ４８３４６、ＡＴＣＣ  ６４６８０等）、アルテルナリア  ブラシシコラ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ；ＩＦＯ  ３１２２６、ＩＦＯ  ３１２２７等）、アスコチタ  ラビエイ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ  ｒａｂｉｅｉ；ＡＴＣＣ  ２４８９１等）、等の微生物に由来するクチナーゼを、好適な例として挙げることができる。
特に、水への溶解度が低いことが知られているクリプトコッカス  エスピー  エス−２（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ  Ｓ−２；ＦＥＲＭ  Ｐ−１５１５５、以下、クリプトコッカス  エスピー  エス−２と略記）由来のクチナーゼが、好ましいものとして挙げられる。
また、上記のクチナーゼは単独で用いても良く、２種以上のものを組み合わせて用いても良い。
なお、クチナーゼ産生微生物に由来するクチナーゼは、クチナーゼ産生微生物自体がタンパク質として産生したものであってもよいし、クチナーゼ産生微生物に由来する遺伝子を導入された他の微生物等が産生したものであってもよい。
【００１１】
（クリプトコッカス属由来の酵母からのクチナーゼの産出）
クリプトコッカス属由来の酵母が産出したクチナーゼを含有する培養液は、例えば、下記の方法により得られる。
すなわち、ラクトース  ０．５％、酵母エキス  ０．５％、ＫＨ２ＰＯ４  １％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．１％、トリオレイン  １％からなるクチナーゼ産生培地の上に、前培養したクリプトコッカス  エスピー  エス−２を１％接種したものを、初期ｐＨ５．６、２５℃、１００ｒｐｍで１２０時間振とう培養して、クチナーゼを含有する培養液が得られる。
【００１２】
（包接化合物）
本発明で用いる包接化合物としては、各種天然型シクロデキストリンおよび各種化学修飾型シクロデキストリン、各種クラウンエーテル、各種シクロファン、各種カリックスアレーン等を挙げることができ、なかでも好ましいものとして、α―シクロデキストリン、β―シクロデキストリン、γ―シクロデキストリン、δ―シクロデキストリンおよびこれらを化学修飾したもの等を挙げることができる。ここで言う化学修飾とは、各種シクロデキストリン中の水酸基をアルキル化したもの等を指す。この時のアルキル基としては、直鎖状、分枝状のいずれでも良く、その構造中に不飽和結合を含むものでも良いが、好ましいものとしてメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基等を挙げることができ、このような各種化学修飾型シクロデキストリンのなかでも、メチル−β−シクロデキストリンを、特に好ましいものとして挙げることができる。
また、これら包接化合物は、一種のみを用いても良く、また２種以上を併用しても良い。
【００１３】
（包接複合体の形成）
本発明における包接複合体とは、酵素含有液中の酵素と包接化合物とから形成されるものであり、酵素含有液に包接化合物を添加し、撹拌することにより得られる。
用いる包接化合物の量は、酵素と等モル以上飽和溶解度以下とすることが好ましい。
また、包接化合物添加後の液の撹拌条件については、温度は０℃以上３０℃以下とすることが好ましく、０℃以上１５℃以下とすることがより好ましい。さらに、時間は３０分以上２４時間以下とすることが好ましく、３０分以上２時間以下とすることがより好ましい。
包接化合物添加後の液は、完全溶解状態および懸濁状態のいずれでもかまわないが、完全溶解状態であることが好ましい。
【００１４】
目的物である酵素が、特に水に対する溶解度が低い酵素の場合には、包接化合物と包接複合体を形成させずに前記分離・精製を行うと、該酵素が、夾雑物として前記酵素含有液に含まれる糖あるいは目的とする酵素以外のタンパク質等に吸着されたり、分離膜に吸着されたりしやすくなる。その結果、酵素の回収率が著しく低下するという問題点がある。
しかし、本発明の酵素の精製法において、このような酵素を包接化合物と包接複合体を形成させることにより、水に対する溶解度を向上させることができ、目的物である酵素の回収率悪化を防ぐことができる。
【００１５】
（包接複合体の分離・精製）
本発明は、前記包接複合体を分離・精製する分離精製工程を有することを特徴とする。すなわち、前記包接複合体は、該包接複合体と比較して超大分子および／または微小分子の夾雑物を分離し、除去することによって精製する。分離方法は、分子量または物理的な大きさの差異に基づいて分離する方法であれば特に限定されるものではないが、膜を用いて夾雑物を除去することが好ましい。これら夾雑物の除去は、作業性の観点から、超大分子の除去を行ってから、微小分子の除去を行うことが好ましい。
【００１６】
（超大分子の除去）
培養液あるいは培養液から菌体を除いた遠心上清には、目的物である酵素以外にも様々な夾雑物が含まれている。これら夾雑物のうち超大分子は、分子量または物理的な大きさの差異に基づいて超大分子を分離し除去する方法であれば特に限定されるものではないが、分画分子量が酵素の分子量よりも大きい膜（例えば、ＭＦ膜等）を用いて除去することが好ましく、分画分子量が１．０×１０６ダルトン以上の膜を用いて濾過することが特に好ましい。
【００１７】
（微小分子の除去）
培養液あるいは培養液から菌体を除いた遠心上清に含まれる夾雑物のうち、微小分子は、分子量または物理的な大きさの差異に基づいて微小分子を分離し除去する方法であれば特に限定されるものではないが、分画分子量が酵素の分子量よりも小さい膜（例えば、ＵＦ膜等）を用いて除去することが好ましく、分画分子量が１．０×１０４ダルトン以下の膜を用いて濾過することがより好ましく、分画分子量が６．０×１０３ダルトン以下の膜を用いて濾過することが特に好ましい。
【００１８】
（酵素精製の実施形態）
前記分離精製工程を含む酵素の精製法としては、種々の実施形態を採用することができる。具体的には、例えば、以下に示すものを挙げることができる。
第一の実施形態：
酵素含有液に包接化合物を添加して包接複合体を形成し、遠心上清を分離して、該遠心上清から超大分子を除去した後、微小分子を除去する実施形態である。
第二の実施形態：
酵素含有液に包接化合物を添加して包接複合体を形成し、遠心上清を分離して、該遠心上清から微小分子を除去した後、超大分子を除去する実施形態である。
第三の実施形態：
酵素含有液から遠心上清を分離して、該遠心上清に包接化合物を添加して包接複合体を形成し、超大分子を除去した後、微小分子を除去する実施形態である。
第四の実施形態：
酵素含有液から遠心上清を分離して、該遠心上清に包接化合物を添加して包接複合体を形成し、微小分子を除去した後、超大分子を除去する実施形態である。
第五の実施形態：
酵素含有液から遠心上清を分離して、該遠心上清から超大分子を除去した後、包接化合物を添加して包接複合体を形成し、微小分子を除去する実施形態である。
第六の実施形態：
酵素含有液から遠心上清を分離して、該遠心上清から微小分子を除去した後、包接化合物を添加して包接複合体を形成し、超大分子を除去する実施形態である。
【００１９】
上述の通り、包接化合物を添加して包接複合体を形成する工程は、種々のタイミングで行うことが可能である。
上記実施形態の中では、第一、第三および第五の実施形態が特に有効である。
【００２０】
（酵素の固定化）
本発明の酵素の精製法により得られた、酵素と包接化合物との包接複合体を含有する液に、酵素固定化担体を添加することにより、該包接複合体のまま酵素を固定化することができる。また、従来公知の方法で酵素と包接化合物とを分離してから、上記酵素固定化担体を添加することにより、酵素を固定化することもできる。
その結果得られた固定化酵素を用いて各種酵素反応を行うことで、各種化学工業材料を製造することができる。
【実施例】
【００２１】
以下、具体的な実施例により、本発明をさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下の実施例に何ら限定されるものではない。
[実施例１]
（培養液の作製）
ラクトース  ０．５％、酵母エキス  ０．５％、ＫＨ２ＰＯ４  １％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．１％、トリオレイン  １％からなるクチナーゼ産生培地の上に、前培養したクリプトコッカス  エスピー  エス−２を１％接種したものを、初期ｐＨ５．６、２５℃、１００ｒｐｍで１２０時間振とう培養し、酵素としてクチナーゼを含有する培養液（Ａ）を得た。さらに培養液（Ａ）に対して、１０，０００ｒｐｍで２０分間、冷却遠心装置による遠心分離を行い、遠心上清（Ｂ）を得た。
【００２２】
（超大分子の除去）
カセットタイプの膜であるＣＥＮＴＲＡＭＡＴＥ  ＴＭ（ＰＡＬＬ  ＦＩＬＴＲＯＮ社製、カタログナンバー：ＯＳ９９０Ｆ０６、分画分子量１．０×１０６ダルトン）を用いて、上記遠心上清（Ｂ）を１５℃にてろ過し、超大分子が除去された粗精製酵素含有液（Ｃ）を得た。
【００２３】
（包接複合体の形成）
粗精製酵素含有液（Ｃ）５Ｌに、メチル−β−シクロデキストリン（ワッカー社製）を、濃度が３％となるように加えて、１５℃にて３０分間撹拌し、溶解させることにより、メチル−β−シクロデキストリンとクチナーゼとからなる包接複合体（Ｄ）を作製し、該包接複合体（Ｄ）を含有する酵素水溶液（Ｅ）を調製した。
【００２４】
（微小分子の除去）
マイクローザＵＦラボモジュール（旭化成株式会社製、形式：ＡＩＰ−１０１３、分画分子量６，０００ダルトン）を用いて、上記酵素水溶液（Ｅ）３Ｌ（クチナーゼ  ９．０ｍｇ含有）を１５℃にてろ過することにより、クチナーゼの精製を行った。ろ液中には、微小分子が含まれ、包接複合体（Ｄ）は含まれなかった。ろ過処理の進行に伴い、酵素水溶液の液量は減少し、その結果、包接複合体（Ｄ）が濃縮された。またこの時、微小分子の除去をより進行させるため、酵素水溶液の電気伝導度が０．１ｍＳ／ｃｍ以下となるまで適宜蒸留水を添加しながらろ過処理を行い、酵素水溶液の液量が２００ｍＬになるまでろ過処理を継続した。その結果、クチナーゼの回収量は７．８ｍｇ、回収率は８４％であった。
【００２５】
（クチナーゼの定量）
クチナーゼの定量は高速液体クロマトグラフ分析（株式会社日立製作所製ＬａＣｈｒｏｍ  Ｅｌｉｔｅ）により行った。疎水性相互カラム  Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷ（東ソー株式会社製）を用い、Ａ液：２Ｍ硫酸アンモニウム溶液（ｐＨ７．０  ０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解）、およびＢ液：エチレングリコール／ｐＨ７．０  ０．１Ｍリン酸緩衝液＝５０／５０（ｖ／ｖ）によるグラジエント溶出を行い、ＵＶ２８０ｎｍでクチナーゼを検出した。より詳細な定量条件は以下の通りである。なお、これは以下の実施例および比較例についても同様である。
定量条件；
カラム Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷ
溶離液 
Ａ液：２Ｍ硫酸アンモニウム溶液（ｐＨ７．０  ０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解）     
Ｂ液：エチレングリコール／ｐＨ７．０  ０．１Ｍリン酸緩衝液＝５０／５０（ｖ／ｖ）グラジエント        
０ｍｉｎ（Ｂ：０％)→１５ｍｉｎ（Ｂ：０％) →４５ｍｉｎ（Ｂ：１００％)→６０ｍｉｎ（Ｂ：１００％)→６０．１ｍｉｎ（Ｂ：０％)
流量   １．０ｍｌ／ｍｉｎ
温度   ５０℃
検出   ＵＶ２８０ｎｍ
注入量 ５０μｌ
【００２６】
[実施例２]
（包接複合体の形成）
前記粗精製酵素含有液（Ｃ）５００ｍＬに、メチル−β−シクロデキストリン（ワッカー社製）を、濃度が３％となるように加えて、１５℃にて３０分間撹拌し、溶解させることにより、メチル−β−シクロデキストリンとクチナーゼとからなる包接複合体（Ｄ）を作製し、該包接複合体（Ｄ）を含有する酵素水溶液（Ｅ）を調製した。
【００２７】
（微小分子の除去）
前記酵素水溶液（Ｅ）１５ｍＬ（クチナーゼ  ４５μｍｇ含有）を、ペンシル型中空糸ろ過膜ユニットＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製、カタログナンバー：ＵＦＣ９０１０９６、分画分子量１０，０００ダルトン）を用いて１５℃にてろ過し、微小分子を除去して、クチナーゼの精製を行った。この時、微小分子の除去をより進行させるため、酵素水溶液の電気伝導度が０．５ｍＳ／ｃｍ以下となるまで適宜蒸留水を添加しながらろ過処理を行い、酵素水溶液の液量が１ｍＬになるまでろ過処理を継続した。その結果、クチナーゼの回収量は４０μｇ、回収率は８９％であった。
【００２８】
[比較例１]
粗精製酵素含有液（Ｃ）中で、包接複合体（Ｄ）を作製しないこと以外は、実施例１と同様の方法でクチナーゼの精製を行った。包接複合体（Ｄ）を作製しなかった結果、クチナーゼは、前記粗精製酵素含有液に含まれていた夾雑物に吸着されたり、分離膜に吸着されたりして、全く回収できず、回収率０％であった。
【００２９】
[比較例２]
粗精製酵素含有液（Ｃ）中で、包接複合体（Ｄ）を作製しないこと以外は、実施例２と同様の方法でクチナーゼの精製を行った。包接複合体（Ｄ）を作製しなかった結果、クチナーゼは、前記粗精製酵素含有液に含まれていた夾雑物に吸着されたり、分離膜に吸着されたりして、クチナーゼの回収量は２２μｇ、回収率は４９％にとどまった。
【００３０】
[比較例３]
比較例２と同様に、粗精製酵素含有液（Ｃ）１５ｍＬ（クチナーゼ  ４５μｍｇ含有）を、ペンシル型中空糸ろ過膜ユニットＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製、カタログナンバー：ＵＦＣ９０１０９６、分画分子量１０，０００ダルトン）を用いて１５℃にてろ過し、微小分子を除去して、クチナーゼの精製を行った。この時、微小分子の除去をより進行させるため、電気伝導度が０．１ｍＳ／ｃｍ以下となるまで適宜蒸留水を添加しながらろ過処理を行い、酵素水溶液の液量が１ｍＬになるまでろ過処理を継続して濃縮した。しかし、包接複合体（Ｄ）を作製しなかった結果、クチナーゼは、前記粗精製酵素含有液に含まれていた夾雑物に吸着されたり、分離膜に吸着されたりして、全く回収できず、回収率０％であった。
【００３１】
すなわち、粗精製酵素含有液中のクチナーゼを、包接化合物と包接複合体を形成させずに分離・精製することを試みた比較例１〜３では、クチナーゼが全く得られないか、得られてもその回収率が低く、包接複合体を形成させてからクチナーゼの分離・精製をおこなった実施例１および２のクチナーゼ回収率が高いのとは、対照的な結果となった。
【００３２】
以上述べた通り、本発明の酵素の精製法により、酵素と包接化合物とから包接複合体を形成させることで、該酵素の水に対する溶解度の如何に関わらず、膜分離などの定法を用いて、酵素含有液中から該酵素を効率的に分離・精製することができ、特に、水に対する溶解度が低い酵素を効率的に分離・精製できることが確認された。
また、本発明の酵素の精製法は、有機溶媒中では不安定で活性を失う酵素にも、好適に適用することができる。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明の酵素の精製法は、水に対する溶解度が低い酵素、あるいは有機溶媒中では不安定で活性を失う酵素等を、膜分離などの定法を用いて効率的に精製できるため、各種酵素製造産業、あるいはこれら酵素を用いる各種化学工業材料製造産業に対して、有用なものである。また、酵素の精製にあたり、特殊な設備等を必要としないので、コスト面でも優れたものである。