(57)【要約】      （修正有）【課題】新たな装置、試薬等を使用せずに、高品質のタンパク質が多く得られる無細胞タンパク質合成方法を提供する。【解決手段】従来から知られているコムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成方法の温度である約２６℃よりも低い温度である０℃〜２０℃にてバッチ法、透析法、不連続ゲルろ過法、繰り返しバッチ法、繰り返し供給バッチ法による合成反応において、混入する胚乳が実質的に除去されているコムギ胚芽抽出液を用いて無細胞タンパク質合成方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
０℃〜２０℃の温度条件下でコムギ胚芽抽出液を用いて翻訳反応を行うことを特徴とする、以下のいずれか１から選ばれる無細胞タンパク質合成方法。
１）バッチ法、２）透析法、３）不連続ゲルろ過法、４）繰り返しバッチ法、５）繰り返し供給バッチ法
【請求項２】
無細胞タンパク質合成方法が、透析法である請求項１の無細胞タンパク質合成方法。
【請求項３】
コムギ胚芽抽出液が、混入する胚乳が実質的に除去されている請求項１又は２に記載の無細胞タンパク質合成方法。
【請求項４】
コムギ胚芽抽出液が、低分子タンパク質合成阻害物質が実質的に除去されている請求項１〜３のいずれか１に記載の無細胞タンパク質合成方法。
【請求項５】
コムギ胚芽抽出液が、内因性グリコシダーゼが実質的に除去されている請求項１〜４のいずれか１に記載の無細胞タンパク質合成方法。
【請求項６】
コムギ胚芽抽出液から、以下のいずれか１から選ばれるATPを介する糖のリン酸化系の制御が行われている請求項１〜４のいずれか１に記載の無細胞タンパク質合成方法。
１）単糖類の除去、２）リン酸化糖の除去、３）多糖類から単糖類の生成の制御、４）単糖類からリン酸化糖の生成の制御
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低温条件下でのコムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質合成反応を生体外で行う方法として、細胞抽出液に翻訳鋳型、基質となるアミノ酸、エネルギー源、各種イオン、緩衝液、及びその他の有効因子を加えて試験管内でタンパク質を合成する、いわゆる無細胞タンパク質合成法等の研究が盛んに行われてきている（特許文献１〜５）。
この無細胞タンパク質合成系に用いるタンパク質合成用の細胞抽出液または生体組織抽出液は、大腸菌、コムギ胚芽、または家兎網状赤血球等を原料として調製される。無細胞タンパク質合成系は、"ペプチド合成速度"と"翻訳反応の正確性"の２点において、生細胞に匹敵する性能を保持している。そして、この系は複雑な化学反応工程や煩雑な細胞培養工程を必要としない。この利点を有するため、この系はその実用的なシステムの開発がなされてきた。しかしながら、一般的に、生物体の細胞から抽出した細胞抽出液は、そのタンパク質合成能が極めて不安定なためにタンパク質合成効率が低かった。さらに、保存中の細胞抽出液の品質低下も著しかった。そのため、無細胞タンパク質合成系によって得られる合成物の量は、放射性同位体標識等によって検出可能な程度の少量であった。その結果、この系は実用的なタンパク質の生産手段としては利用できなかった。
【０００３】
本発明者等は先に、従来の無細胞タンパク質合成系の欠点を解決する方法として、以下の方法を提供した。
（１）無細胞タンパク質合成用細胞抽出物製剤および無細胞タンパク質合成方法（特許文献６）、（２）汎用性および高効率機能を備えた鋳型分子並びにこれを利用する無細胞タンパク質合成方法（特許文献７）、（３）拡散連続バッチ法（重層法と呼ぶことがある）（特許文献８）、（４）繰り返しバッチ法（特許文献９）。
【０００４】
上記合成法は、従来の無細胞タンパク質合成方法と比較して、格段の合成効率を示したが、さらなる改良として、装置の改良、新たな試薬の添加等のコストをかけずに高品質のタンパク質を得るための無細胞タンパク質合成方法が必要である。
【非特許文献１】Ｓｐｉｒｉｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１７，１２３−１４２
【特許文献１】特開平６−９８７９０
【特許文献２】特開平６−２２５７８３
【特許文献３】特開平７−１９４
【特許文献４】特開平９−２９１
【特許文献５】特開平７−１４７９９２
【特許文献６】ＷＯ００／６８４１２号号公報
【特許文献７】ＷＯ０１／２７２６０号公報
【特許文献８】ＷＯ０２／２４９３９号公報
【特許文献９】ＷＯ２００４／０９７０１４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、従来の無細胞タンパク質合成方法に比べて、活性の高いタンパク質を効率よく得るための無細胞タンパク質合成方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するために、従来の無細胞タンパク質合成方法の各条件を一つ一つ検討した。
その結果、特定の無細胞タンパク質合成方法において、従来知られている好適な合成温度である約２６℃よりも低い温度である０℃〜２０℃、好ましくは５℃〜２０℃、最も好ましくは１５℃〜２０℃でタンパク質合成を行うことにより、比活性（合成量当りの活性のあるタンパク質の合成量の割合）の高いタンパク質を合成できること、また、従来方法よりも合成量が増加することを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
つまり、本発明は以下からなる；
（１）０℃〜２０℃の温度条件下でコムギ胚芽抽出液を用いて翻訳反応を行うことを特徴とする、以下のいずれか１から選ばれる無細胞タンパク質合成方法。
１）バッチ法、２）透析法、３）不連続ゲルろ過法、４）繰り返しバッチ法、５）繰り返し供給バッチ法
（２）無細胞タンパク質合成方法が、透析法である前項１の無細胞タンパク質合成方法。
（３）コムギ胚芽抽出液が、混入する胚乳が実質的に除去されている前項１又は２に記載の無細胞タンパク質合成方法。
（４）コムギ胚芽抽出液が、低分子タンパク質合成阻害物質が実質的に除去されている前項１〜３のいずれか１に記載の無細胞タンパク質合成方法。
（５）コムギ胚芽抽出液が、内因性グリコシダーゼが実質的に除去されている請求項１〜４のいずれか１に記載の無細胞タンパク質合成方法。
（６）コムギ胚芽抽出液から、以下のいずれか１から選ばれるATPを介する糖のリン酸化系の制御が行われている請求項１〜４のいずれか１に記載の無細胞タンパク質合成方法。
１）単糖類の除去、２）リン酸化糖の除去、３）多糖類から単糖類の生成の制御、４）単糖類からリン酸化糖の生成の制御
【発明の効果】
【０００８】
本発明の無細胞タンパク質合成方法は、従来の無細胞タンパク質合成方法に比べて、比活性の高いタンパク質を合成でき、効率よく品質のよいタンパク質を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、低温条件下でのコムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成方法である。本発明の低温条件下とは、少なくとも無細胞タンパク質合成方法の過程において、翻訳段階（いわゆるタンパク質合成段階）のコムギ胚芽抽出液の液温を、０℃〜２０℃、好ましくは５℃〜２０℃、最も好ましくは１５℃〜２０℃に設定し、翻訳を行うことを意味する。なお、本発明の温度条件とは、０℃〜２０℃を意味する。
【００１０】
上記のコムギ胚芽抽出液の液温の温度設定は、翻訳鋳型を添加する前段階又は添加後の段階に限らず、行うことができる。また、プレインキュベーションを低温条件下で実施してもよいが、特に限定されない。すなわち、翻訳鋳型を添加した後のコムギ胚芽抽出液の液温を自体公知の方法によって、本発明の温度条件に設定すれば良い。例えば、コムギ胚芽抽出液を含む容器を約０℃〜約２０℃に設定した浴槽に入れておけば、長時間のタンパク質合成において、一定温度に保つことができる。また、タンパク質合成環境自体の温度を下げることによって、結果としてコムギ胚芽抽出液の温度を本発明の温度条件に設定することもできる。
【００１１】
また、上記コムギ胚芽抽出液の液温の測定方法は、自体公知の測定方法を使用して測定することができる。具体的には、コムギ胚芽抽出液を含む容器を温度調節可能な浴槽に入れて、浴槽の温度を該抽出液の液温とほぼ同温として、浴槽の温度を測定することによって測定可能であるが、温度計を直接コムギ胚芽抽出液に入れて、測定することもできる。
【００１２】
本発明の無細胞タンパク質合成方法で合成できるタンパク質（ペプチドも含む）は、特に限定されない。すなわち、低温条件下でタンパク質合成を行うことによって、従来の温度条件下で合成できるタンパク質が合成できなくなることはない。さらに、本発明の無細胞タンパク質合成方法では、従来の温度条件下では合成が困難であった、低温菌などの低温に適応した生物種由来のタンパク質（Gerday et al., Trends in Biotechnol. 18 103-107 [2000]）の合成に適している。
【００１３】
本発明の低温条件下でのコムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成方法としては、バッチ法、透析法、不連続ゲルろ過法、繰り返しバッチ法、繰り返し供給法が挙げられるが、特に好適なのは、透析法である。
【００１４】
バッチ法
合成用容器に入った細胞抽出液に無細胞タンパク質合成に必要なエネルギー源やアミノ酸、あるいはｔＲＮＡを添加して行う方法（Ｐｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ，１７９−２０９，Ｂ．Ｄ．＆Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８４））である。
合成用容器を浴槽等で本発明の温度条件にして翻訳反応を行う。
【００１５】
透析法
合成反応液を透析内液とし、透析外液と物質移動が可能な透析膜によって隔離される装置を用いて、タンパク質合成を行う方法である（木川等、第２１回日本分子生物学会、ＷＩＤ６）。
透析容器を浴槽等で本発明の温度条件にして翻訳反応を行う。
【００１６】
不連続ゲルろ過法
不連続ゲルろ過法とは、合成反応系に、鋳型のＲＮＡ、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成物や分解物を必要時に排出する方法（特開２０００−３３３６７３公報）である。
合成用容器を浴槽等で本発明の温度条件にして翻訳反応を行う。なお、ゲルろ過の操作時の温度も本発明の温度にするのが好ましい。
【００１７】
繰り返しバッチ法
繰り返しバッチ法とは、鋳型物質を原料にする一般的なバッチ式もしくは拡散連続バッチ式の、反応速度の高い合成反応初期相の特性を最大限に利用することを特徴とする合成法である（ＷＯ２００４／０９７０１４号公報）。
その手段は、合成速度の略低下前後又は合成反応の略停止前後、又はそれらの途上に、反応溶液の希釈処理又は濃縮処理を行い、ついで、希釈された場合は濃縮処理、濃縮処理された場合は希釈処理を行い、これら希釈及び濃縮処理は、不連続に繰り返しおこなうことで、大量のタンパク質を合成可能とする。
合成用容器を浴槽等で本発明の温度条件にして翻訳反応を行う。なお、濃縮処理及び／又は希釈処理においても、本発明の温度条件で行うのが好ましいが、特に限定されない。
【００１８】
繰り返し供給バッチ法
合成用容器に入った反応液である反応相に供給液を連続又は不連続に供給して合成反応に導き、合成速度の略低下前後、合成反応の略停止前後、又はそれらの途上に、供給液の供給を停止する。続いて、反応溶液（反応相）の濃縮処理及び供給液の連続又は不連続の供給による、希釈処理を行う。そして、この希釈及び濃縮処理は、不連続に繰り返しおこなうことで、大量のタンパク質の合成を可能とする方法である（PCT/JP2005/020727）。
合成用容器を浴槽等で本発明の温度条件に設定して翻訳反応を行う。なお、濃縮処理及び／又は希釈処理においても、本発明の温度条件で行うのが好ましいが、特に限定されない。
【００１９】
本発明では、植物種子の胚芽であるコムギ胚芽抽出液を対象とする。コムギ胚芽抽出液ではPROTEIOSTM（TOYOBO社製）に添付のもの等が挙げられる。さらに混入する胚乳成分、低分子タンパク質合成阻害剤物質が実質的に除去されたコムギ種子胚芽抽出液、さらには、内因性グリコシダーゼの除去、糖分解酵素等の除去、単糖類の除去、リン酸化糖の除去、多糖類から単糖類の生成の制御、単糖類からリン酸化糖の生成の制御が行われているコムギ種子胚芽抽出液抽出液がより好適である。これらは従来のコムギ種子胚芽抽出液と比較して、抽出液中のタンパク質合成阻害に関与する成分及び物質が低減されているからである。
ここで、混入する胚乳が実質的に除去されているとは、コムギ種子胚芽抽出液のリボソームが実質的に脱アデニン化されていない程度を意味し、リボソームの脱アデニン化率が７％以下、好ましくは１％以下になっていることをいう（ＷＯ００／６８４１２号公報参照）。
ここで、低分子タンパク質合成阻害物質は、分子量１４，０００ダルトン以下であり、コムギ胚芽抽出液を排除分子量１２，０００〜１４，０００ダルトン程度の再生セルロース膜を用い、透析を行うことによって除去することができる（ＷＯ２００３／０６４６７２号公報参照）。
ここで、内因性グリコシダーゼが実質的に除去されている、糖分解酵素等が実質的に除去されている、単糖類が実質的に除去されている、リン酸化糖が実質的に除去されている、多糖類から単糖類の生成の制御が実行されている、単糖類からリン酸化糖の生成の制御が実行されているとは、細胞抽出液の糖、リン酸化糖が10mM以下、好ましくは6mM以下まで低減されている（２６０nmにおける吸光度２００ OD/mlの抽出液中のグルコース濃度として）ことを意味する（ＷＯ２００５／０６３９７９号公報参照）。
【００２０】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００２１】
コムギ胚芽抽出液の調製
（１）コムギ胚芽の調製
北海道産チホクコムギ種子または愛媛産チクゴイズミ種子を１分間に１００ｇの割合でミル（Fritsch社製：Rotor Speed Millpulverisette14型）に添加し、回転数８，０００rpmで種子を温和に粉砕した。篩いで発芽能を有する胚芽を含む画分（メッシュサイズ０．７〜１．００mm）を回収した後、四塩化炭素とシクロヘキサンの混合液（容量比＝四塩化炭素：シクロヘキサン＝２．４：１）を用いた浮選によって、発芽能を有する胚芽を含む浮上画分を回収し、室温乾燥によって有機溶媒を除去した後、室温送風によって混在する種皮等の不純物を除去して粗胚芽画分を得た。
次に、ベルト式色彩選別機BLM−300K（製造元：株式会社安西製作所、発売元：株式会社安西総業）を用いて、次の通り、色彩の違いを利用して粗胚芽画分から胚芽を選別した。この色彩選別機は、粗胚芽画分に光を照射する手段、粗胚芽画分からの反射光及び／又は透過光を検出する手段、検出値と基準値とを比較する手段、基準値より外れたもの又は基準値内のものを選別除去する手段を有する装置である。
色彩選別機のベージュ色のベルト上に粗胚芽画分を１０００乃至５０００粒／cm2となるように供給し、ベルト上の粗胚芽画分に蛍光灯で光を照射して反射光を検出した。ベルトの搬送速度は、５０m／分とした。受光センサーとして、モノクロのCCDラインセンサー（2048画素）を用いた。
まず、胚芽より色の黒い成分（種皮等）を除去するために、胚芽の輝度と種皮の輝度の間に基準値を設定し、基準値から外れるものを吸引により取り除いた。次いで、胚乳を選別するために、胚芽の輝度と胚乳の輝度の間に基準値を設定し、基準値から外れるものを吸引により取り除いた。吸引は、搬送ベルト上方約１cm位置に設置した吸引ノズル３０個（長さ１cm当たり吸引ノズル１個並べたもの）を用いて行った。
この方法を繰り返すことにより胚芽の純度（任意のサンプル１ｇ当たりに含まれる胚芽の重量割合）が９８％以上になるまで胚芽を選別した。
得られたコムギ胚芽画分を４℃の蒸留水に懸濁し、超音波洗浄機を用いて洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄した。次いで、ノニデットP40（Nonidet P40：ナカライ・テスク社製）の０．５容量％溶液に懸濁し、超音波洗浄機を用いて洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄してコムギ胚芽を得た。回収した胚芽湿重量に対して２倍容量の抽出溶媒（８０mM HEPES-KOH(pH7.8)、２００mM酢酸カリウム、１０mM酢酸マグネシウム、８mMジチオスレイトール、４mM塩化カルシウム、各０．６mM２０種類のＬ型アミノ酸、さらに２．５mM ＡＴＰ）を加え、ワーリングブレンダーを用い、５，０００〜２０，０００rpmで３０秒間ずつ３回の胚芽の限定破砕を行った。
【００２２】
（２）沈殿助剤を用いたS-30画分の調製
上記得られたホモゲネート（破砕物）に、２０％重量の海砂あるいは膨潤させたセファデックスG25粒子を加え、混合した。海砂は、ホモゲネート添加前にあらかじめ以下の処理を行った：水洗→５容の０．１規定のNaOH又はKOH洗浄→水洗→０．１規定のHCl洗浄→水洗→１００〜１２０℃の加熱によりRNase失活処理後、乾燥処理。
海砂を混合したホモゲネートを３万ｘｇ、３０分で２回遠心、続いて１２分間１回の遠心で、半透明な遠心上清を得た（S-30画分）。得られたS-30画分を、溶出溶液（40mM HEPES-KOH(pH7.8)、200mM酢酸カリウム、10mM酢酸マグネシウム、4mM DTT）で平衡化したセファデックスＧ２５にかけ、ゲルろ過し、分子量1000ダルトン以下の低分子物質を排除した胚芽抽出液を調製した。
【実施例２】
【００２３】
ルシフェラーゼ（Luc）の翻訳鋳型の作成
Lucをコードする塩基配列（pSP-luc+:プロメガ社製、カタログ番号：E1781）およびE01配列を導入したpEUベクターを作成した。続いて、pEUベクターを鋳型にPCRを用いて転写鋳型を作成した。該転写鋳型を転写反応溶液〔最終濃度、８０mM HEPES-KOH（pH7.8）、１６mM酢酸マグネシウム、１０mMジチオスレイトール、２mMスペルミジン、２．５mM ４NTPs（４種類のヌクレオチド三リン酸）、０．８u／μｌ RNase阻害剤、１．６u／μｌ SP6 RNAポリメラーゼ〕に添加して、３７℃で３時間転写を行い、翻訳鋳型を作成した（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2002,vol99,p14652-14657:Sawasaki,T et al.に記載の方法と同様に翻訳鋳型を作成した）。
【実施例３】
【００２４】
透析法を用いた各温度条件下によるルシフェラーゼ（Luc）の合成
実施例１で調製した胚芽抽出液２５μlを含むタンパク質合成用反応液６２．６μl（それぞれ最終濃度で、２９mM HEPES-KOH(pH7.8)、９５mM酢酸カリウム、２．７mM酢酸マグネシウム、０．４mMスペルミジン（ナカライテスク社製）、各０．２３mM  L型アミノ酸２０種類、２．９mMジチオスレイトール、１．２mM ATP（和光純薬社製）、０．２５mM GTP（和光純薬社製）、１５mMクレアチンリン酸（和光純薬社製）、０．４６μg／lクレアチンカイネース（ロシュ社製））を作製した。この反応液に実施例２で作成したLucの翻訳鋳型を１６μg／５０μl加えたものを透析膜を有する容器に加え、当該容器を、胚芽抽出液を含まない以外は前記タンパク質合成用反応液と同様の組成である液中に透析可能なように浸し、次の各温度条件にてそれぞれ２４時間インキュベートした。
温度条件は、０℃、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２６℃とし、各温度条件下で合成したLucの活性を検出した。また、Lucの合成量は、ポリアクリルアミド未変性ゲル電気泳動上のCBB染色Lucバンドの染色強度を標準Lucバンドの染色強度と比較して算出した。これらをあわせてLucの比活性を算出した。
【００２５】
図１より、本発明の温度条件である０℃、５℃、１０℃、１５℃、２０℃の何れの温度においても、温度条件２６℃と比較して、約２倍〜７倍のLuc活性を示した。
また、図２より０℃、５℃、１０℃、１５℃、２０℃の何れの温度においてもタンパク質の比活性値は２６℃の場合よりも約３倍〜３０倍もの比活性を示した。これは、本発明が活性の高いタンパク質を従来方法に比べて格段に高い割合で合成できることを証明している。
さらに、図３より、１５℃でタンパク質合成を行うことにより、従来の２６℃で合成を行う場合よりもタンパク質の合成量が有意に増加し、本発明がタンパク質の合成量の増加に寄与していることも証明された。
以上により、本発明の無細胞タンパク質合成方法は、従来の一般的な温度条件下での無細胞タンパク質合成方法と比較して、比活性の高いタンパク質を合成でき、また合成量も従来方法以上に確保することができると言える。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明の無細胞タンパク質合成方法は、新たな装置、試薬等を使用せずに、比活性の高いタンパク質を合成できる無細胞タンパク質合成方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】低温条件下で合成したLucの活性の結果
【図２】低温条件下で合成したLucの比活性の結果
【図３】低温条件下で合成したLucの合成量の結果
【図１】
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【図２】
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【図３】
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