(57)【要約】【課題】  メチル化リグナンを供給するために、リグナンにメチル基転移活性を有する酵素を提供する。【解決手段】  リグナンにメチル基を転移する活性を有する酵素を同定し、当該酵素ポリペプチドのアミノ酸配列および当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を同定し、これらの配列情報に基づいて、メチル化リグナンを産生する形質転換体を作製すること。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)〜(d)のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
(a)配列番号：１又は３の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２又は４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号：１又は３の塩基配列の一部又は全部と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリグナンにメチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
(d)配列番号：２又は４のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつリグナンにメチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号：２又は４のアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列に対して１又は数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換によって修飾されているアミノ酸配列を有し、かつリグナンにメチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする前記請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号：１又は３の塩基配列の一部又は全部と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリグナンにメチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号：１又は３の塩基配列の一部又は全部と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、５ｘＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつリグナンにメチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする前記請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号：１又は３の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する前記請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号：２又は４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する前記請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
DNAである、前記請求項１〜６のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
フロフラン型リグナンに対してメチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする前記請求項１〜７のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
ピノレジノール及び／又はピペリトールに対してメチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする前記請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記請求項1〜９のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
【請求項１１】
前記請求項1〜９のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１２に記載の宿主細胞を培養し又は生育させ、当該宿主細胞からリグナンにメチル基を転移する活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする該タンパク質の製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれかに記載のポリヌクレオチドが導入された植物体もしくは当該植物体と同一の性質を有する該植物体の子孫となる植物体、又はそれら植物体の組織。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれかに記載のポリヌクレオチドを用いてリグナンにメチル基を転移する方法。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれかに記載のポリヌクレオチドを植物体に導入し、発現させることによって、産生するリグナン組成が改変された当該植物体もしくは当該植物体と同一の性質を有する該植物体の子孫となる植物体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はリグナンにメチル基を転移する活性を有する酵素の遺伝子、当該メチル化酵素を利用してリグナン組成が変換された植物などに関する。更に詳しくは、本発明は、メチル化リグナンを合成する活性を有する酵素遺伝子、好ましくはゴマ由来のメチル化リグナンを合成する活性を有する酵素遺伝子、及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゴマ属ゴマ（Sesamum indicum）は、ゴマ科（Pedaliaceae）に属する１年生の草本植物である。ゴマの原産地は、中央アフリカといわれている。ゴマは、約６０００年の歴史を有する最古の栽培油糧植物とされ、世界中で栽培されてきた。ゴマは、古来から貴重な食品であり、健康に良い食品の代表として知られている。特に、ゴマ種子、ゴマ種子から得た油、ゴマ種子からの抽出物が利用されている（例えば、ゴマその科学と機能性、並木満夫編：丸善プラネット社（１９９８）参照）。ゴマ種子に含まれる成分は、その約５０％が脂質であり、約２０％が蛋白質である。ゴマに含まれる脂質の主要成分は、オレイン酸およびリノール酸を主体とするトリグリセリドである。ゴマはまた、ビタミンＢ１、Ｂ２、Ｅなどをさらに含む。リグナンと総称される植物の二次代謝物（例えば、セサミンおよびセサモリンなど）が、上記の成分以外にゴマに含まれており、これらは強い抗酸化性を有している（例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｅｃｏｌｏｇｙ １３，１３３−１３９（１９８５）参照）。
【０００３】
リグナンの生合成については、例えば、Ｌｉｇｎａｎｓ：ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１：６４０−７１３（１９９９）； Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅｖ． ２２５７−２８８  （２００３）などに記載されている。
例えば、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅｖ． ２２５７−２８８  （２００３）には、コニフェリルアルコールが重合して合成されるピノレジノールが生合成上の最初のリグナンであること、そしてピノレジノールから個々の植物種において特有な生合成経路を経由して多様なリグナンが合成されることが示されている。このピノレジノールの合成に寄与するデリジェントタンパク質がレンギョウなどにおいて報告されている（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５，  ３６２−３６６  （１９９７）等参照）。さらに、レンギョウのピノレジノール−ラリシレジノール還元酵素遺伝子（例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：２９４７３（１９９６）、特表２００１−５０７９３１号公報等参照）、Ｔｈｕｊａ  ｐｌｉｃａｔａのピノレジノール−ラリシレジノール還元酵素遺伝子（例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：６１８（１９９９）等参照）ならびに組換えセコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼおよびその使用方法（例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（１６）：１２６１４−２３（２００１）、特表２００２−５１２７９０号公報等参照）が報告されている。さらに、Ｌａｒｒｅａ  ｔｒｉｄｅｎｔａｔａから、ラレアトリシン水酸化酵素遺伝子がクローニングされている（例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：１０６４１（２００３）等参照）。
【０００４】
ゴマリグナンの生合成についてはピノレジノールにピペリトール合成酵素が作用することによってピペリトールが合成され、次いで、このピペリトールにセサミン合成酵素が作用することによってセサミンが合成されるとされていた。しかしながら、ゴマからクローニングされたチトクロームP450タンパク質であるCYP81Q1は単独でピノレジノールからピペリトールを経て、セサミンを合成することが明らかにされた（国際公開公報ＷＯ2005/030944；図1参照）。
【０００５】
近年、リグナンだけでなくリグナンの配糖体もまた注目されている。上記したリグナン分子のうちのいくつかは、配糖体として植物中に存在することが知られている。例えば、ゴマ種子中には、セサミノール配糖体（セサミノール２’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド；セサミノール２’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル（１−２）−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド；およびセサミノール２’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル（１−２）−Ｏ−（−β−Ｄ−グルコピラノシル（１−６））−β−Ｄ−グルコピラノシド））、およびピノレジノール配糖体（ピノレジノール４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル（１−６）−β−Ｄ−グルコピラノシド；ピノレジノール４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル（１−２）−β−Ｄ−グルコピラノシド；ピノレジノール４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル（１−６）−Ｏ−（β−Ｄ−グルコピラノシル（１−６））β−Ｄ−グルコピラノシド；およびピノレジノールジ−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド））などが存在し、レンギョウには、（＋）−ピノレジノール−４’−Ｏ−β−Ｄグルコシドおよび（−）−マタイレジノール−４−Ｏ−グルコシドが、アマには、セコラリシレジノールジグルコシドおよびピノレジノールジグルコシドなどが存在する（例えば、生薬学雑誌、第３２巻、第１９４頁（１９７８）； Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１４：６４９（２００３）；Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５８：５８７（２００１）等参照）。
【０００６】
ゴマに含まれるピノレジノール配糖体およびセサミノール配糖体（例えば、Ｋａｔｓｕｚａｋｉ，Ｈ．ら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６，２０８７−２０８８（１９９２）等参照）は、水溶性領域で強い抗酸化性を示すので、脂溶性抗酸化剤（例えば、トコフェロール）とは異なる応用が期待されている。また、リグナン配糖体について以下のような作用機構が提唱されている：リグナン配糖体は、抗酸化性を示す官能基であるフェノール性水酸基が自身の有する糖によって保護されているが、体内へ摂取された後に、腸内細菌の有するβ−グルコシダーゼの作用によって加水分解され、アグリコン部分である脂溶性のリグナンが生成される。このアグリコンが腸内に吸収されて血液を経由して各種臓器に運ばれて、臓器の生体膜などにおける酸化障害を防ぐ。このような作用機構に基づいて、リグナン配糖体は動脈硬化予防食品としての応用が期待されている（例えば、Ｔ．Ｏｓａｗａ：Ａｎｔｉｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ２：ｐ．３２７，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏ参照）。
【０００７】
リグナン配糖体以外のリグナン派生体としてメチル化リグナンが知られている。メチル化リグナンもリグナン配糖体同様に抗酸化性を示す官能基であるフェノール性水酸基がメチル基によって保護されており、それによりメトキシ構造を有するリグナンである。フロフラン型のゴマリグナンの中にはピペリトールの4位の水酸基がメチル化されたコブシンおよびセサミノールの2‘位の水酸基がメチル化されたセサンゴリンが報告されている（非特許文献１：Ｐｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４７， ５８３−５９１ （１９９８）；および非特許文献２：Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ． ２７， ３２３２−３２３５ （１９６２）参照）（図1）。しかしながらこれらの合成反応を触媒する酵素は不明であり、フロフラン型リグナンをメチル化する酵素およびそれをコードする遺伝子はこれまでに精製されたり単離された報告はない。
なお、メチル基転移反応を触媒するという特定の機能を有するタンパク質は、異なる植物種においてもそのアミノ酸配列が類似しているということが知られている（例えば、非特許文献３：Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １４， ５０５−５１９ （２００２）参照）。
【非特許文献１】Ｐｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４７， ５８３−５９１ （１９９８）
【非特許文献２】Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ． ２７， ３２３２−３２３５ （１９６２）
【非特許文献３】Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １４， ５０５−５１９ （２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
植物の二次代謝物などの生合成経路を改変することによって、有用な物質の生成および／または有用な植物の育種が行われている。このような技術は、代謝工学と呼ばれている。このような技術を用いれば、任意の化合物を大量生産すること、および／または不要な物質の生産を抑制することが可能になる。従って、リグナン代謝経路に関与する遺伝子を用いてリグナンおよびその代謝物の合成を遺伝子工学的に行うことは、上述したようなこれらの物質の有用性に鑑みて産業上有用である。しかし、リグナン、特にゴマリグナンに代表されるフロフラン型リグナンの生合成に関与する遺伝子に関する知見は、前述のように限られており、さらに、メチル化フロフラン型リグナンの生成を触媒するメチル化酵素は見出されていないので、さらなる遺伝子の取得が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、上記状況に鑑みてなされたもので、下記に示す、リグナンメチル基転移活性を有する酵素、それをコードするポリヌクレオチド、それを含有するベクター・細胞・形質転換体などを提供する。
【００１０】
（１）以下の(a)〜(d)のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
(a)配列番号：１又は３の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２又は４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号：１又は３の塩基配列の一部又は全部と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリグナンにメチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
(d)配列番号：２又は４のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつリグナンにメチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
（２）配列番号：２又は４のアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列に対して１又は数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換によって修飾されているアミノ酸配列を有し、かつリグナンにメチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（３）配列番号：１又は３の塩基配列の一部又は全部と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリグナンにメチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（４）配列番号：１又は３の塩基配列の一部又は全部と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、５ｘＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつリグナンにメチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（５）配列番号：１又は３の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（６）配列番号：２又は４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する上記（1）に記載のポリヌクレオチド。
（７）DNAである、上記（１）〜（６）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（８）フロフラン型リグナンに対してメチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする上記（１）〜（７）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（９）ピノレジノール及び／又はピペリトールに対してメチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする上記（８に記載のポリヌクレオチド。
（１０）上記（1）〜（９）のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
（１１）上記（1）〜（９）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
（１２）上記（１１）に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
（１３）上記（１２に記載の宿主細胞を培養し又は生育させ、当該宿主細胞からリグナンにメチル基を転移する活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする該タンパク質の製造方法。
（１４）上記（１）〜（９）のいずれかに記載のポリヌクレオチドが導入された植物体（例えば、ゴマ、レンギョウ又はアマ）もしくは当該植物体と同一の性質を有する該植物体の子孫となる植物体、又はそれら植物体の組織。
（１５）上記（１）〜（９）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを用いてリグナンにメチル基を転移する方法。
（１６）上記（１）〜（９）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを植物体に導入し、発現させることによって、産生するリグナン組成が改変された当該植物体もしくは当該植物体と同一の性質を有する該植物体の子孫となる植物体。
（１７）上記（１）〜（９）に記載のポリヌクレオチドのフラグメントまたはその相補配列からなるポリヌクレオチド。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のポリペプチド（リグナンメチル化酵素）を利用すれば、例えば、生物（特に、植物）においてリグナンおよびメチル化リグナンの量を人為的に調節することができるという効果を奏する。また、これらの組換え酵素を用いてリグナンをメチル化することによって、インビトロおよびインビボにおいて物性（溶解度、動物の吸収効率など）を改変することもできる。また、本発明のポリヌクレオチドを利用することによって、これまでに自然界において未同定であったメチル化リグナンを人工的に生産することも可能となる。また、本発明のポリペプチドを利用して合成されるメチル化リグナンは、新規生理機能物質の出発物質又は中間体として有効に利用することができる。
【００１２】
本発明のリグナンメチル化酵素を遺伝子組換え技術を用いて所望の生物に発現させることによって、ピノレジノールからモノメチル化ピノレジノールを、および／またはピペリトールからコブシンを人工的に生産することが可能となる。また、本発明のリグナンメチル化酵素を遺伝子組換え技術を用いて所望の生物に発現させることによって、リグナンとメチル化リグナンとの量を人為的に制御した植物および／または微生物を作出することができる。
また、コブシンまたはメチル化ピノレジノールを生産する植物において、本発明のリグナンメチル化酵素の発現を抑制することによって、アグリコンを遊離させて、リグナン（特に、ピペリトールおよび／またはピノレジノール）の量を増加させることもできる。
さらに、本発明のリグナンメチル化酵素を用いれば、新規メチル化リグナンであるモノメチル化ピノレジノールをピノレジノールから人工的に生産することができる。
【発明を実施するための最良の形式】
【００１３】
本発明者らは、リグナン、特に、ピノレジノールおよび／またはピペリトールを主な基質にする新規メチル化酵素を見出すとともに、そのメチル化酵素がピノレジノールをメチル化することを見出した。これまでに、ジメチル化ピノレジノールであるユデスミンは同定されているがモノメチル化ピノレジノールは見出されていない。
本発明者らは、ゴマ種子由来の5000クローンからなるＥＳＴデータベースから相同性検索によりゴマメチル化酵素様遺伝子の部分配列を探索し、その結果2種類のメチル化酵素様遺伝子（以下ＳｉＯＭＴ1およびＳｉＯＭＴ2）を得た。これらのＳｉＯＭＴ遺伝子は種子において強く発現していた。これらの完全長塩基配列をＲＡＣＥ法で取得し、大腸菌において発現させた。得られた組換えタンパク質をセサミノールまたはピノレジノールと反応させた後、ＨＰＬＣ分析、ＬＣ−ＭＳ分析、およびＴＯＦ−ＭＳ／ＭＳ分析を用いて酵素活性を測定した。その結果、ＳｉＯＭＴ1がピペリトールをメチル化しコブシンを生成する反応を触媒する活性を有することが明らかとなった。さらにＳｉＯＭＴ1はピノレジノールをメチル化しモノメチル化ピノレジノールを生成する反応を触媒する活性を有することが明らかとなった。このメチル化リグナンはピノレジノール派生体であるユデスミンの中間体であると考えられる。アフリカゴマであるSesamum radiatumからＰＣＲによりＳｉＯＭＴ1ホモログであるＳｒＯＭＴ1遺伝子をクローニングし、ＳｒＯＭＴ1はＳｉＯＭＴ1と同様のメチル化活性を有することを確認した。
【００１４】
なお、「リグナン」は、Ｃ6Ｃ3骨格を有するフェニルプロパノイド化合物２分子が、主としてこれらの８−８’位を介して重合（８，８’−結合）した化合物である。リグナンは、植物における生体防御機構に寄与していると考えられている（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅｖ． ２， ３７１−３９０ （２，００３）参照）。
代表的なリグナンとしては、ゴマに含まれる（+）−セサミン、（+）−セサミノール、（+）−セサモリン、（＋）−ピノレジノール、（+）−ピペリトールおよび（+）−セサモリノール；レンギョウ（Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）に含まれる（＋）−ピノレジノール、（−）−アルクチゲニンおよび（−）−マタイレジノール；ソシマ（Ｄａｐｈｎｅ  ｔａｎｇｕｔｉｃａ）に含まれる（−）−ピノレジノールおよび（−）−ラリシレジノール；アマ（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）に含まれる（＋）−セコイソラリシレジノールなどが挙げられる。これらのリグナンの分子構造は多様である（Ｗｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９０， ２７−１１０ （２，００３）等参照）。（+）−ピノレジノールに代表されるゴマリグナン類は最も幅広い植物種で同定されているフロフラン型のリグナン類に分類される。ゴマリグナンの１つであるセサミンは、多彩な生理活性作用を有しており、コレステロール代謝、肝機能および免疫機能の改善に有効である（例えば、ゴマその科学と機能性、並木満夫編：丸善プラネット社（1998）参照）。セサミンをゴマ種子またはゴマの絞り粕から分離精製する方法がすでに実用化されており（例えば、特開２００１−１３９５７９公報、特開平１０−７６７６号公報等）、セサミンを主成分とするアルコール分解促進作用を有する肝機能改善／増強剤が市販されている（商品名：セサミン、発売元：サントリー株式会社）。またセサミン以外の他のリグナン（例えば、セサミノール、セサモリンなど）もまた生理活性作用を有することが報告されている（例えば、日本農芸化学会誌、７６：８０５−８１３（２００２）参照）。このように、リグナン又はその誘導体は、種々の生理活性を有する生理活性物質あるいはその中間体として有用である。
【００１５】
以下、本発明のリグナンメチル化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドにコードされるタンパク質、およびこれらの利用について詳述する。
【００１６】
（１）ポリヌクレオチド
まず、本発明は、以下の(a)〜(d)のいずれかに記載のポリヌクレオチドを提供する。
(a)配列番号：１又は３の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２又は４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号：１又は３の塩基配列の一部又は全部と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリグナンにメチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
(d)配列番号：２又は４のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつリグナンにメチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【００１７】
本明細書中、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。
本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、またはそれは、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
【００１８】
本明細書中、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個（例えば、２〜６０個）結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）といわれ、長いものは３０マーまたは１００マーというように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、化合合成されてもよい。
本明細書中、用語「ポリヌクレオチドの一部」は、そのポリヌクレオチドのフラグメントを意味し、例えば、少なくとも１２ｎｔ（ヌクレオチド）、好ましくは約１５ｎｔ、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは少なくとも約４０ｎｔの長さのフラグメントが意図される。「少なくとも１２ｎｔの長さのフラグメント」は、例えば、配列番号１に示される塩基配列からの１２以上の連続した塩基を含むフラグメントが意図される。本明細書を参照すれば配列番号１に示される塩基配列が提供されるので、当業者は，配列番号１に基づくＤＮＡフラグメントを容易に作製することができる。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波による剪断は、種々のサイズのフラグメントを作製するために容易に使用され得る。あるいは、このようなフラグメントは、合成的に作製され得る。適切なフラグメント（オリゴヌクレオチド）が、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ＡＢＩ，８５０  Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｄｒ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ  ９４４０４）３９２型シンセサイザーなどによって合成される。
【００１９】
本発明のポリヌクレオチドは、リグナンメチル化活性を有するポリペプチドをコードする。そのようなポリヌクレオチドは、典型的には、配列番号：１又は３の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；あるいは配列番号：２又は４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドである。本発明の好ましいポリヌクレオチドは、配列番号：１又は３の塩基配列を有するポリヌクレオチド、あるいは配列番号：２又は４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
本発明のポリヌクレオチドは、それがコードするポリペプチドがリグナンメチル化活性を有する限り、配列番号：１又は３の塩基配列において１または複数個（例えば、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個、１〜数個（例えば、６個）、１〜５個、１〜３個、１〜２個など）の塩基が欠失、挿入、置換、及び／または付加された変異体であってもよい。変異体は、コードもしくは非コード領域、またはその両方において変異され得る。コード領域における変異は、保存的または非保存的なアミノ酸の欠失、挿入、置換、または付加を生成し得る。
【００２０】
本発明のポリヌクレオチドは、リグナンメチル化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号：１または３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。
【００２１】
ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。
【００２２】
本明細書中、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照ポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは約３０〜７０ｎｔにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。
さらに、本発明は、配列番号：１または３の塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチドを提供する。
【００２３】
任意の特定の核酸分子が、例えば、配列番号：１または３に示される塩基配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラム（例えば、Ｂｅｓｔｆｉｔ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１）を使用して決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列間の最も良好な相同性セグメントを見出す（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２〜４８９（１９８１））。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列整列プログラムを用いて、特定の配列が、本発明に従う参照配列に対して、例えば、９５％同一であるか否かを決定する場合は、同一性のパーセントが参照塩基配列の全長にわたって計算され、そして参照配列におけるヌクレオチド数全体の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように、パラメーターが設定される。
【００２４】
特定の実施形態では、参照（ＱＵＥＲＹ）配列（本発明に係る配列）と対象配列との間の同一性（全体的な配列整列ともいわれる）は、Ｂｒｕｔｌａｇらのアルゴリズム（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７〜２４５（１９９０））に基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定される。％同一性を計算するために、ＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列において使用される好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ＝５００または対象塩基配列の長さ（どちらかより短い方）である。
【００２５】
また、本発明は、上記ポリヌクレオチドのフラグメントまたはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを包含する。本発明のオリゴヌクレオチドがリグナンメチル化ポリペプチドをコードしない場合でさえ、当業者は、本発明のポリヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとして本発明のポリペプチドを作製するために使用され得ることを容易に理解する。リグナンメチル化ポリペプチドをコードしない本発明のオリゴヌクレオチドの他の用途としては、以下が挙げられる：（１）ｃＤＮＡライブラリー中のリグナンメチル化酵素遺伝子またはその対立遺伝子もしくはスプライシング改変体の単離；（２）リグナンメチル化酵素遺伝子の正確な染色体位置を提供するための、分裂中期染色体スプレッドへのインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、「ＦＩＳＨ」）（Ｖｅｒｍａら，Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載される）；および（３）特定の組織におけるリグナンメチル化酵素ｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット分析。
【００２６】
本発明のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡメカニズムによる遺伝子発現操作のためのツールとして使用することができる。アンチセンスＲＮＡ技術によって、内因性遺伝子に由来する遺伝子産物の減少が観察される。本発明のオリゴヌクレオチドを導入することによって、リグナンメチル化活性を有するポリペプチドの含量を低下させ得、その結果、植物中のメチル化リグナン含量または含量比を制御（増加または減少）させることができる。本発明のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを取得する方法としては、本発明のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離する種々の公知の方法が挙げられる。例えば、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製して、ゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすれば、本発明のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを取得することができる。このようなプローブとしては、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）であればよい。
【００２８】
このようなハイブリダイゼーションによって選択されるポリヌクレオチドとしては、天然のポリヌクレオチド（例えば、ゴマ科植物やコケ科植物などの植物由来のポリヌクレオチド）が挙げられるが、植物以外に由来するポリヌクレオチドであってもよい。
本発明のポリヌクレオチドを取得する別の方法として、ＰＣＲを用いる方法が挙げられる。このＰＣＲ増幅方法は、例えば、本発明のポリヌクレオチドのｃＤＮＡの５’側および／または３’側の配列（またはその相補配列）を利用してプライマーを調製する工程、これらのプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等をテンプレートにしてＰＣＲ増幅する工程を包含することを特徴としており、本方法を使用すれば、本発明のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得することができる。
【００２９】
本発明のポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、特に限定されないが、ピペリトールまたはピノレジノールを含む生物材料であることが好ましい。本明細書中、用語「生物材料」は、生物学的サンプル（生物体から得られた組織サンプルまたは細胞サンプル）が意図される。後述する実施例においては、ゴマを用いているが、これに限定されない。
【００３０】
本発明のポリヌクレオチドを使用すれば、形質転換体または細胞においてリグナンメチル化活性を有するポリペプチドを合成することができる。本発明のポリヌクレオチドを用いれば、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを検出することによって、リグナンメチル化活性を有するポリペプチドを発現する生物を容易に検出することができる。
【００３１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、リグナンメチル化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出するハイブリダイゼーションプローブまたは当該ポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして利用することによって、リグナンメチル化活性を有するポリペプチドを発現する生物または組織を容易に検出することができる。なおさらに、上記オリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用して、上記生物体またはその組織もしくは細胞におけるリグナンメチル化活性を有するポリペプチドの発現を抑制することができる。
【００３２】
（２）ポリペプチド
本発明は、上記した本発明のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質（ポリペプチド）をも提供する。そのようなポリペプチドは、典型的には、配列番号：２又は４のアミノ酸配列からなるタンパク質である。
本明細書中、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片が意図される。本発明のポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよい。
【００３３】
本発明のポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。さらに、本発明のポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。
また、本発明は、リグナンメチル化活性を有するポリペプチドを提供する。本明細書中、「リグナンメチル化活性」は、リグナンをメチル化する活性、すなわち、リグナンにメチル基を転移する活性が意図される。すなわち、本明細書中、「メチル化酵素」と「メチル基転移酵素」とは、相互交換可能に使用される。「リグナンメチル化活性」は、メチル基供与体であるSAMと基質であるリグナンとをリグナンメチル化酵素と反応させ、その反応生成物をHPLCまたはLC-MS分析することで測定又は確認することができる。一般的なメチル化酵素活性測定法は公知文献に記載のとおりである（公知文献：Toquin, V., et al. (2003) Plant Mol. Biol. 52, 495-509.,Gang, D. R., et al. (2002) Plant Cell 14, 505-519.)。
【００３４】
また、本発明のポリペプチドは、配列番号：２または4のアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体であって、かつリグナンメチル化活性を有するポリペプチドを含む。
このような変異体は、配列番号：２又は４のアミノ酸配列において、1もしくは複数個（例えば、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個、１〜数個（６個）、１〜３個、１〜２個など）のアミノ酸（アミノ酸残基）が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつリグナンにメチル基を転移する活性を有するタンパク質を含む。「欠失、置換、挿入及び／又は付加」には、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性の残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）が含まれる。特に、ポリペプチドにおける「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのポリペプチドの活性にほとんど影響しない。
【００３５】
ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が所望の活性を有するか否かを容易に決定し得る。
好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加を有する。好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明のポリペプチド活性を変化させない。
【００３６】
代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。
上記に詳細に示されるように、どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントでありそうか（すなわち、機能に対して有意に有害な効果を有しそうにないか）に関するさらなるガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ，  Ｊ．Ｕ．ら「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｅｓｓａｇｅ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０  （１９９０）に記載されている。
【００３７】
このような変異ポリペプチドは、上述したように、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在するポリペプチドを単離精製したものであってもよい。
本発明のポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖やイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されない。
また、本発明のポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。
【００３８】
また、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入して、そのポリペプチドを細胞内発現させた状態であってもよいし、細胞、組織などから単離精製されてもよい。
本発明のポリペプチドは、下記で詳述されるように組換え生成されても、化学合成されてもよい（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５１３１−５１３５（１９８５）；米国特許第４，６３１，２１１号等参照）。
【００３９】
本発明のポリペプチドは、リグナン（特に、ピノレジノールまたはピペリトール）のメチル化反応を触媒することができる。
【００４０】
（３）本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの利用
本発明はさらに、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを用いることによって生物（好ましくは、植物）中のリグナンおよびメチル化リグナンの量を制御（増加または減少）するための方法および当該制御された生物（好ましくは、植物）を提供する。
【００４１】
（Ａ）ベクター
本発明は、リグナンメチル化活性を有するポリペプチドを生成するために使用されるベクターを提供する。本発明のベクターは、インビトロ翻訳に用いるベクターであっても組換え発現に用いるベクターであってもよい。
本発明のベクターは、上述した本発明のポリヌクレオチドを含むものであれば、特に限定されない。例えば、リグナンメチル化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターなどが挙げられる。組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
【００４２】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明のポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明のポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
本発明の発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーター、および／または複製起点等）を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター（例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等）が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、ｔｒｐＣ等が挙げられる。また動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）が挙げられる。植物体の形質転換に用いられる組換え発現ベクターは、当該植物内で本発明のポリヌクレオチドを発現させることが可能なベクターであれば特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター）を有するベクター、または外的な刺激によって誘導性に活性化されるプロモーターを有するベクターが挙げられる。
【００４３】
発現ベクターの作製は、制限酵素および／またはリガーゼ等を用いる慣用的な手法に従って行うことができる。発現ベクターによる宿主の形質転換もまた、慣用的な手法に従って行うことができる。
上記発現ベクターを用いて形質転換された宿主を、培養、栽培または飼育した後、培養物等から慣用的な手法（例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等）に従えば、目的タンパク質を回収、精製することができる。
【００４４】
発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子またはネオマイシン耐性遺伝子、およびＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
上記選択マーカーを用いれば、本発明のポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。あるいは、本発明のポリペプチドを融合ポリペプチド（例えば、ＧＦＰとの融合ポリペプチド）として発現させ、ＧＦＰの蛍光をマーカーとして用いてもよい。
【００４５】
（Ｂ）形質転換体または細胞
本発明は、上述したリグナンメチル化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換体または細胞を提供する。本明細書中、用語「形質転換体」は、組織または器官だけでなく、生物個体を含むことが意図される。
形質転換体または細胞の作製方法（生産方法）は特に限定されないが、例えば、上述した組換えベクターを宿主に導入して形質転換する方法が挙げられる。ここで用いられる宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞等を挙げることができる。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知である。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種微生物、植物または動物が挙げられる。
【００４６】
本発明の形質転換体または細胞は、これらの形質転換体または細胞が天然に有するリグナンおよび／またはメチル化リグナンの組成が改変されていることを特徴とする。本発明の形質転換体または細胞は、植物もしくはその子孫、またはこれら由来の組織であることが好ましく、ゴマ、レンギョウまたはアマであることが特に好ましい。このような形質転換体または細胞は、本発明のメチル化リグナン含有量を制御する方法を用いることによって、リグナンを産生する生物中のメチル化リグナンの含有量を増加または減少させることができる。
【００４７】
本発明の形質転換体は、植物形質転換体であり得る。本実施形態の植物形質転換体は、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが発現され得るように植物中に導入することによって取得される。
【００４８】
組換え発現ベクターを用いる場合、植物体の形質転換に用いられる組換え発現ベクターは、当該植物内で本発明のポリヌクレオチドを発現させることが可能なベクターであれば特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター）を有するベクター、または外的な刺激によって誘導性に活性化されるプロモーターを有するベクターが挙げられる。
【００４９】
本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）または植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどのいずれをも意味する。形質転換に用いられる植物としては、特に限定されず、単子葉植物綱または双子葉植物綱に属する植物のいずれでもよい。
【００５０】
植物への遺伝子の導入には、当業者に公知の形質転換方法（例えば、アグロバクテリウム法、遺伝子銃、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法など）が用いられる。例えば、アグロバクテリウムを介する方法と直接植物細胞に導入する方法が周知である。アグロバクテリウム法を用いる場合は、構築した植物用発現ベクターを適当なアグロバクテリウム（例えば、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ））に導入し、この株をリーフディスク法（内宮博文著、植物遺伝子操作マニュアル（１９９０）２７〜３１頁、講談社サイエンティフィック、東京）などに従って無菌培養葉片に感染させ、形質転換植物を得ることができる。また、Ｎａｇｅｌらの方法（Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、６７、３２５（１９９０））が用いられ得る。この方法は、まず、例えば発現ベクターをアグロバクテリウムに導入し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓ．Ｂ．Ｇｅｌｖｉｎら、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載の方法で植物細胞または植物組織に導入する方法である。ここで、「植物組織」とは、植物細胞の培養によって得られるカルスを含む。アグロバクテリウム法を用いて形質転換を行う場合には、バイナリーベクター（ｐＢＩ１２１またはｐＰＺＰ２０２など）を使用することができる。
【００５１】
また、遺伝子を直接植物細胞または植物組織に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法が知られている。遺伝子銃を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばＰＤＳ−１０００（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）など）を用いて処理することができる。処理条件は植物または試料によって異なるが、通常は４５０〜２０００ｐｓｉ程度の圧力、４〜１２ｃｍ程度の距離で行う。
【００５２】
遺伝子が導入された細胞または植物組織は、まずハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性で選択され、次いで定法によって植物体に再生される。形質転換細胞から植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。
植物培養細胞を宿主として用いる場合は、形質転換は、組換えベクターを遺伝子銃、エレクトロポレーション法などで培養細胞に導入する。形質転換の結果得られるカルスやシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養または器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライドなど）の投与などによって植物体に再生させることができる。
【００５３】
遺伝子が植物に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。例えば、形質転換植物からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。
【００５４】
本発明のポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれた形質転換植物体が一旦取得されれば、当該植物体の有性生殖または無性生殖によって子孫を得ることができる。また、当該植物体またはその子孫、あるいはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該植物体を量産することができる。したがって、本発明には、本発明のポリヌクレオチドが発現可能に導入された植物体、もしくは、当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫、またはこれら由来の組織も含まれる。
【００５５】
また、種々の植物に対する形質転換方法が既に報告されている。本発明の形質転換体植物としては、例えば、ゴマ、イネ、タバコ、オオムギ、コムギ、ナタネ、ポテト、トマト、ポプラ、バナナ、ユーカリ、サツマイモ、タイズ、アルファルファ、ルーピン、トウモロコシ、カリフラワー、バラ、キク、カーネーション、キンギョソウ、シクラメン、ラン、トルコギキョウ、フリージア、ガーベラ、グラジオラス、カスミソウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウム、ゼラニウム、ペチュニア、トレニア、チューリップ、レンギョウ、シロイヌナズナ、アマ、およびミヤコグサなどが挙げられるがこれらに限定されない。
好ましい実施形態において、ゴマを使用して、本発明の形質転換体を作製することができる。ゴマの形質転換体の作製方法としては、例えば、Ｔ．Ａｓａｍｉｚｕ：Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｓａｍｅ  ｐｌａｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ＭＡＴ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ：ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ  ｇｅｎｅｓ．Ｓｅｓａｍｅ  Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ  １６：２２〜２５（２００２）に記載されるような公知の方法が挙げられる。
このようにして得た形質転換ゴマを用いれば、当該ゴマ内でメチル化リグナンを生産するため、低コストかつ環境に低負荷な生産プロセスでメチル化リグナン（ピペリトール、および／またはピノレジノール）を生産することができる。
【００５６】
他の好ましい実施形態において、本発明の形質転換体として、タバコを好適に用いることができる。タバコは、ペチュニアなどとともに、形質転換が容易な代表的植物であり、細胞壁を取り除いた細胞の１個（プロトプラスト）から、植物１個体への再生が可能である。この再生された植物１個体は、多細胞に由来する１個体とは異なりキメラ状に陥らないため、形質転換体の作製を効率よく行うことができる。
タバコの形質転換に好ましい方法としては、リーフディスク法が挙げられる。この方法は、操作が容易であり、かつ１枚の葉切片からいくつもの独立した形質転換体を得ることができる方法である。形質転換の方法はたとえば「新生物化学実験の手引き３  核酸の分離・分析と遺伝子実験法  化学同人  １９９６年」に記載されている。
このようにして得た形質転換タバコを用いれば、低コストかつ環境に低負荷な生産プロセスでリグナンメチル化酵素を生産することができる。
別の好ましい実施形態において、本発明の形質転換体として、イネを好適に用いることもできる。形質転換イネを用いれば、当該イネ内で低コストかつ環境に低負荷な生産プロセスでリグナンメチル化酵素を生産することができる。
【００５７】
本発明の形質転換体は、リグナン（特に、ピノレジノールまたはピペリトール）を含む生物であれば、生物種を問わず、上記ポリヌクレオチドを導入することで当該メチル化リグナンを生産することができる。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターが導入された形質転換体を用いれば、植物などの生物に内在するリグナンをメチル化する反応を触媒することができるので、低コストかつ環境に対して低負荷な生産プロセスでメチル化リグナンの大量調製が可能になる。さらに本発明は、メチル化リグナンを大量調製することによって安価な食品または工業製品を提供することができる。
本発明の形質転換体を用いれば、リグナンメチル化反応を触媒するポリペプチドを低コストでありかつ環境に低負荷な条件下で提供することができる。
一実施形態において、本発明に係る細胞は、種々の細菌宿主であり得る。本実施形態に係る細胞は、本発明に係るポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが発現され得るように細胞中に導入することによって取得される。
【００５８】
当業者は、本明細書中の記載に従えば、リグナンメチル化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターが導入されれば、細菌から高等植物までの広範な生物にリグナンメチル化能を付与することができるということを容易に理解する。
本発明の細胞は、リグナン（特に、ピノレジノールまたはピペリトール）を含む生物であれば、生物種を問わず、上記ポリヌクレオチドを導入することで当該メチル化リグナンを生産することができる。
【００５９】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターが導入された細胞を用いれば、当該細胞内でリグナンメチル化反応を触媒することができるので、低コストかつ環境に対して低負荷な生産プロセスでメチル化リグナンの大量調製が可能になる。さらに本発明は、メチル化リグナンを大量調製することによって安価な食品または工業製品を提供することができる。
本発明に係る細胞を用いれば、リグナンメチル化反応を触媒するポリペプチドを低コストでありかつ環境に低負荷な条件下で提供することができる。
【００６０】
（Ｃ）ポリペプチドの生産方法
本発明は、本発明のポリペプチドを生産する方法を提供する。本発明のポリペプチドの生産方法を用いれば、リグナンメチル化反応を触媒するポリペプチドを低コストでありかつ環境に低負荷な条件下で提供することが可能となる。また、本発明のポリペプチドの生産方法を用いれば、リグナンメチル化反応を触媒するポリペプチドを容易に生産することが可能となる。
【００６１】
本発明のポリペプチドの生産方法では、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いることができる。
本発明のポリペプチドの生産方法は、上記ベクターを無細胞タンパク質合成系に用いることが好ましい。無細胞タンパク質合成系を用いる場合、種々の市販のキットを用いればよい。好ましくは、本実施形態のポリペプチドの生産方法は、上記ベクターと無細胞タンパク質合成液とをインキュベートする工程を包含する。
【００６２】
また、本実施形態のポリペプチドの生産方法は、組換え発現系を用いることもできる。組換え発現系を用いる場合、本発明のポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能に宿主に導入し、宿主内で翻訳されて得られる上記ポリペプチドを精製するという方法などを採用することができる。組換え発現ベクターは、プラスミドであってもなくてもよく、宿主に目的ポリヌクレオチドを導入することができればよい。好ましくは、本実施形態のポリペプチドの生産方法は、上記ベクターを宿主に導入する工程を包含する。
【００６３】
宿主としては、原核生物または真核生物を用いることができる。原核生物宿主としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する細菌（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）など）、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓなどを用いることができる。真核生物宿主としては、下等真核生物（例えば、酵母または糸状菌などの真核生物微生物）を用いることができる。酵母としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属微生物（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなど）が挙げられ、糸状菌としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属微生物（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒなど）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属微生物が挙げられる。また、動物細胞または植物細胞が宿主として使用され得る。動物細胞としては、マウス、ハムスター、サル、ヒト等の細胞が挙げられる。さらに、昆虫細胞（例えば、カイコ細胞、またはカイコの成虫）もまた宿主として使用され得る。
上記の宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞等を挙げることができるが、特に限定されない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知である。
【００６４】
このように宿主に外来ポリヌクレオチドを導入する場合、発現ベクターは、外来ポリヌクレオチドを発現するように宿主内で機能するプロモーターを組み込んであることが好ましい。組換え的に産生されたポリペプチドを精製する方法は、用いた宿主、ポリペプチドの性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のポリペプチドを精製することが可能である。
【００６５】
本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、本発明のポリペプチドを含む細胞または組織の抽出液から当該ポリペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。ポリペプチドを精製する工程は、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。
【００６６】
本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドを天然に発現する細胞または組織から当該ポリペプチドを精製することもできるし、化学合成によって調製することもできる。
【００６７】
変異ポリペプチドを作製する方法についても、特に限定されない。例えば、部位特異的変異誘発法（例えば、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｇｅｎｅ  １５２，２７１−２７５（１９９５）参照）、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し変異ポリペプチドを作製する方法、またはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異ポリペプチド作製法を用いることによって、変異ポリペプチドを作製することができる。変異ポリペプチドの作製には市販のキットを利用してもよい。
このように、本発明のポリペプチドの生産方法は、少なくとも、リグナンメチル化活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列、またはリグナンメチル化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて公知慣用技術を用いればよいといえる。
【００６８】
（Ｄ）メチル化リグナン生産方法
これまで、リグナンおよびメチル化リグナンの生産はゴマからの抽出により行われているので、大量生産ができない等の問題点を有していたが、本発明に従えば、リグナンおよびメチル化リグナンを低コストで大量生産できる。
本発明は、本発明のポリペプチドを発現する生物体または細胞を用いてメチル化リグナンを生産する方法を提供する。上記生物体は、天然の未改変生物体であっても組換え発現系を用いた形質転換体であってもよい。本発明のメチル化リグナン生産方法は、リグナン（特に、ピノレジノールまたはピペリトール）を効率よく生産することができる。
一実施形態において、本発明のメチル化リグナン生産方法は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換された生物体またはその組織を用いてメチル化リグナンを生産することを特徴とする。好ましくは、上記生物体は、上述した形質転換体植物または細菌であり、特に好ましくは、大腸菌、ゴマ、レンギョウまたはアマである。
【００６９】
本発明のメチル化リグナン生産方法は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを上記生物体に導入する工程を包含する。ポリヌクレオチドを上記生物体に導入する工程としては、上述した種々の遺伝子導入方法を用いればよい。本実施形態のこの局面において、上記生物体は形質転換される前に産生したメチル化リグナンと形質転換後に産生するメチル化リグナンとの間でその組成が異なる。具体的には、上記生物体から得られるリグナンおよびメチル化リグナンは、その含有率が増加する。本実施形態のこの局面に係るメチル化リグナン生産方法は、上記生物体からメチル化リグナンを抽出する工程をさらに包含することが好ましい。
【００７０】
また、本発明のメチル化リグナン生産方法は、本発明のポリペプチドを天然に発現する生物体に、本発明のオリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドとして導入する工程を包含する。オリゴヌクレオチドを上記生物体に導入する工程としては、上述したアンチセンスＲＮＡ技術を用いればよい。本実施形態に係るメチル化リグナン生産方法は、上述した抗体またはオリゴヌクレオチドを用いて本発明のポリペプチドを天然に発現する生物体を同定する工程をさらに包含することが好ましい。本実施形態のこの局面に係るメチル化リグナン生産方法は、上記生物体からメチル化リグナンを抽出する工程をさらに包含することが好ましい。
本実施形態において、上記生物体は上記オリゴヌクレオチドを導入される前に産生したメチル化リグナンと導入後に産生するメチル化リグナンとの間でその組成が異なる。具体的には、上記生物体から得られるリグナンおよびメチル化リグナンは、その含有率が減少する。
【００７１】
（Ｅ）食品および工業製品
本発明は、上述のメチル化リグナン生産方法により得られたメチル化リグナンを用いて製造される食品および工業製品を提供する。本項で記載する食品は、上述した形質転換植物体の種子、果実、切穂、塊茎、および／または塊根であっても、上述した形質転換植物体から抽出されたメチル化リグナンを用いて製造された食品（例えば、ゴマ、レンギョウまたはアマ、あるいはこれらの加工食品）であってもよい。本発明に係る食品または工業製品は、所望する量のリグナン（特に、ピノレジノールまたはピペリトール）を含有することができる。
例えば、上述のようにメチル化リグナンの含量が増加した本発明の形質転換植物から抽出されたメチル化リグナン抽出液は、メチル化リグナンの含量が高い食品として提供される。また、抽出したメチル化リグナンに限らず、上記形質転換植物体の種子、果実、切穂、塊茎、および／または塊根等もまた、メチル化リグナンを多く含む食品として提供される。メチル化リグナン組成を改変する対象は特に限定されるものではなく、植物以外にも動物、細菌、または酵母等のあらゆる生物を対象とすることが可能である。
また、リグナンおよびメチル化リグナンの独特な物性に基づいて、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、工業製品（例えば、フィルム、生分解性プラスティック、機能性繊維、潤滑油、または洗剤のような工業製品）の原料に利用され得る。
【００７２】
本明細書において、ゴマのリグナンメチル化ポリペプチドを一例として記載されているが、本発明は、ゴマ由来のポリペプチドまたはポリヌクレオチドにのみ限定されるべきではなく、リグナンメチル化活性を有する全てのポリペプチド、およびその利用に関するものであることが、当業者には明白である。リグナンメチル化酵素は、植物、動物または微生物のいずれ由来でもよく、リグナンメチル化酵素活性を有していればリグナン量を制御することができる。さらに本発明は、リグナンメチル化酵素をコードするポリヌクレオチドを導入することによって作製されたリグナン量が調節された植物、その子孫またはこれらの組織に関し、その形態は切り花であってもよい。本発明のリグナンメチル化ポリペプチドを用いれば、メチル化リグナンの生成を促進または抑制することができる。また、慣用的な手法を用いれば、植物に上記ポリヌクレオチドを導入して当該ポリヌクレオチドを構成的あるいは組織特異的に発現させて、目的のポリペプチドの発現を増加させること、ならびに、アンチセンス法、同時サプレッション法およびＲＮＡｉ法などを用いることによって目的のポリペプチドの発現を抑制することができるということを、当業者は容易に理解する。
本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、これに限定されるべきではない。
【実施例】
【００７３】
実施例において用いる分子生物学的手法は、他で詳述しない限り、国際公開ＷＯ２００４／０１８６８２号公報（ＰＣＴ／ＪＰ０３／１０５００）またはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法に従った。
【００７４】
〔実施例１：ゴマ種子のEST解析〕
公知文献（国際公開公報ＷＯ2005/030944）に記載のゴマ種子由来のｃＤＮＡファージライブラリーをRapid Excisionキット（Stratagene社）を用いて製造業者が推奨する方法に従って大腸菌内にpBK-CMV(Stratagene社)に切り出した。このゴマ種子由来ＥＳＴを含む大腸菌コロニーをランダムに5000クローンをピックアップし、Ｍ13ＲＶプライマー（配列番号5）およびＭ4（-20）プライマー（配列番号6）を用いて以下の条件でコロニーＰＣＲを行った。
１×Ｅｘ−Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（ＴａｋａＲａ）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、プライマー各０．２ｐｍｏｌ／μｌ、Ｅｘ−Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  １．２５Ｕからなる混合液に大腸菌コロニーをけん濁し、９４℃で５分間の後、９４℃で１分間、５５℃で1分間、７２℃で２分間の反応を３０サイクル行ってＰＣＲ増幅した後、７２℃で７分間保持した。
配列番号5：Ｍ13ＲＶ：5'-CAGGAAACAGCATTGAC
配列番号6：Ｍ4-20：5'-GTAAAACGACGGCCAGT
【００７５】
これらのＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、ｐＢＫ−ＣＭＶに含まれるＥＳＴが特異的に増幅されていることをエチジウムブロマイド染色により確認した。これら5000種のＰＣＲ産物４μｌを10unitのExonucleaseI（ＵＳＢ社）と2unitのShrimp Alkaline phosphatase（ＵＳＢ社）と混合し、37℃で30分保持し、80℃で20分保持し酵素反応を終了させた。この酵素反応液1μｌを用いて以下の条件でダイレクトシークエンス反応を行った。シークエンス反応液は酵素反応液1μｌ、5ｘＢｉｇＤｙｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＢｕｆｆｅｒ ver.3.1（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）3μｌ、ＢｉｇＤｙｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲＲ ver.3.1（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ） 2μｌ、1.6ｐmol/μｌＭ13ＲＶプライマー1μｌ、滅菌水13μｌからなる。シークエンス反応は96℃1分間に続いて96℃10秒間、50℃5秒間、60℃4分間の反応を25サイクル行った。シークエンス反応液はＤｙｅＥｘ９６(ＱIAGEN社)を用いて業者が推奨する方法で生成し、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ｍｏｄｅｌ  ３１００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて塩基配列を決定した。
【００７６】
得られた5000種の塩基配列はＢｌａｓｔｘを用いて相同検索を行い、その中からメチル化酵素遺伝子と相同性を有する2種類のゴマメチル化酵素(Sesamum indicum O-methyltransferase; 以下SiOMT)の部分配列を同定した。Ｂｌａｓｔｘ解析の条件は以下のとおりである。プログラム：Ｂｌａｓｔｘ  ｖｅｒ．２．２．９、データベース：ｎｒ、遺伝コード：ｓｔａｎｄａｒｄ（１）、フィルタ：ＬＯＷ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ、Ｅｘｐｅｃｔ：１０、Ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ：３、マトリクス：ＢＬＯＳＵＭ６２、Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ：Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  １１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  １。
【００７７】
〔実施例2：ゴマメチル化酵素遺伝子の発現解析〕
ＥＳＴ解析により得られた二種類のＳｉＯＭＴ1およびＳｉＯＭＴ2の遺伝子発現パターンを解析するために、公知文献（国際公開公報ＷＯ2005/030944）に記載のゴマの器官別ｃＤＮＡに対して以下の条件でＲＴ−ＰＣＲを行った。
ｃＤＮＡ  １μｌ、１×Ｅｘ−Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（ＴａｋａＲａ）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、プライマー各０．２ｐｍｏｌ／μｌ、Ｅｘ−Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  １．２５Ｕからなる。９４℃で５分間の後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の反応を３2サイクル行ってＰＣＲ増幅した後、７２℃で5分間保持した。ＳｉＯＭＴ1およびＳｉＯＭＴ2特異的プライマーとしてＳｉＯＭＴ1-ＦＷ（配列番号７）とＳｉＯＭＴ1-ＲＶ（配列番号８）およびＳｉＯＭＴ2-ＦＷ（配列番号9）とＳｉＯＭＴ2-ＲＶ（配列番号10）を用いた。ＳｉＯＭＴ遺伝子の発現量と内在性遺伝子の発現量とを比較するために、内部標準となる遺伝子のＰＣＲ反応を同時に行った。具体的には、Ｓｉ１８ＳｒＲＮＡ−Ｆプライマー（配列番号11）およびＳｉ１８ＳｒＲＮＡ−Ｒプライマ−（配列番号12）を用いてゴマの１８Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ遺伝子（アクセッション番号：ＡＦ１６９８５３）のＰＣＲ反応を行った。
配列番号7：ＳｉＯＭＴ1-ＦＷ：5‘-ＴＴＧＣＣＣＣＡＴＧＴＣＡＴＴＣＡＡＧＡＴ
配列番号8：ＳｉＯＭＴ1-ＲＶ：5‘-ＡＡＡＡＴＴＣＡＧＡＣＴＴＡＴＡＡＣＧＡＴＡＣＣＡＡＡ
配列番号9：ＳｉＯＭＴ2-ＦＷ：5‘-ＴＴＡＧＡＡＡＡＡＣＴＣＡＡＴＴＣＧＴＣＴＡＡＴ
配列番号10：ＳｉＯＭＴ2-ＲＶ：5‘-ＣＣＴＡＣＡＴＣＣＡＣＧＡＣＧＧＡＡＴＣＣＡＡＡ
配列番号11：Ｓｉ１８ＳｒＲＮＡ−ＦＷ：５’−ｔａｔｇｃｔｔｇｔｃｔｃａａａｇａｔｔａａ
配列番号12：Ｓｉ１８ＳｒＲＮＡ？ＲＶ：５’−ａａｃａｔｃｔａａｇｇｇｃａｔｃａｃａｇａ
【００７８】
ＰＣＲ産物を電気泳動し、エチジウムブロマイド染色を行った結果、両ＳｉＯＭＴ遺伝子ともに種子において強い発現が確認された（図２の2Ａ）。すなわち、両ＳｉＯＭＴ遺伝子発現領域とメチル化リグナンが蓄積する領域が一致することを確認した。
【００７９】
〔実施例3：ゴマメチル化酵素遺伝子のクローニング〕
両ＥＳＴクローンが推定ＯＲＦの５’領域を含んでいなかったため、５’Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄ（以下、５’ＲＡＣＥ）法を使用して、それぞれのＳｉＯＭＴ遺伝子の５’領域を増幅した。具体的には、Ｇｅｎｅ  Ｒａｃｅｒ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を製造業者の推奨する方法に従って使用して、以下のプライマー（配列番号13〜16）を用いて、各々の５’領域を増幅した。
配列番号13：GR-ＳｉＯＭＴ1-ＲＶ：5'-ccggcccactgttcgggtcctaacgggaaa
配列番号14：ＳｉＯＭＴ1-ＮＥＳＴ−ＲＶ：5'-gcaaatccacttcataaaaat
配列番号15：GR-ＳｉＯＭＴ２-ＲＶ：5'-cctcgggttccgctctttctgctcccagaa
配列番号16：ＳｉＯＭＴ２-ＮＥＳＴ−ＲＶ：5'-atcaatttgggaaattacaaa
【００８０】
ＳｉＯＭＴ2に関してはＥＳＴクローンが推定ＯＲＦの3‘末端を含んでいなかったため、配列番号17および18のプライマーを用いて3’ＲＡＣＥを行った。
配列番号1７：GR-ＳｉＯＭＴ２-ＦＷ：5'-gaagatcgccccatgagcatgaaacccttt
配列番号1８：ＳｉＯＭＴ２-ＮＥＳＴ−ＦＷ：5'-aacgtcgttctgggagcagaaaga
【００８１】
ＲＡＣＥ法によって得られた増幅断片の塩基配列を、プライマーウォーキング法によって決定し、ＳｉＯＭＴ1およびＳｉＯＭＴ2遺伝子の完全長オープンリーディングフレームを含む塩基配列情報を得た（配列番号１および配列番号19）。
ＳｉＯＭＴ1とＳｉＯＭＴ２はお互いにアミノ酸配列で29％の配列同一性を示した。配列同一性について、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔプログラム（Ｍａｃ  Ｖｅｃｔｏｒ  ｖｅｒ．７．２．２（Ｓｙｍａｎｔｅｃｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））をデフォルト設定で使用した。
【００８２】
得られたＳｉＯＭＴ遺伝子の完全長ｃＤＮＡ配列をＢｌａｓｔｘ解析（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）によって相同性を有する既知タンパク質を検索した。Ｂｌａｓｔｘ解析の条件は以下のとおりである。
プログラム：Ｂｌａｓｔｘ  ｖｅｒ．２．２．９、データベース：ｎｒ、遺伝コード：ｓｔａｎｄａｒｄ（１）、フィルタ：ＬＯＷ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ、Ｅｘｐｅｃｔ：１０、Ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ：３、マトリクス：ＢＬＯＳＵＭ６２、Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ：Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  １１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  １。
Ｂｌａｓｔｘ解析の結果、ＳｉＯＭＴ１は、Catharanthsus roseus Caffeic acid-O-methyltransferase（ＣＯＭＴ）（AAK20170）と74％の配列同一性を示し、ＳｉＯＭＴ2は、Rosa hybrida（AAM23004）のOrcinol-O-methyltransferase（OＯＭＴ）と５7％の配列同一性を示した。このように、両ＳｉOMTと既知のメチル化酵素との配列同一性はいずれも高いとは言えない。従って、得られた両ＳｉＯＭＴ遺伝子の機能を推定することはできなかった。すなわち、得られた両ＳｉＯＭＴ遺伝子は、これまでに単離されていないリグナンメチル化酵素である可能性が非常に高い。
【００８３】
〔実施例4：大腸菌発現ベクターの構築〕
ＳｉＯＭＴ１に対して配列番号20および21のプライマー対を使用して、ｃＤＮＡの開始メチオニンコドン（ＡＴＧ）の上流にＢｇｌＩＩ部位を、終始コドンの下流にＳａｌＩ部位を有するフラグメントをＰＣＲ増幅した。
一方、ＳｉＯＭＴ2に対して配列番号22および23のプライマー対を使用して、ｃＤＮＡの開始メチオニンコドン（ＡＴＧ）の上流にＢａｍＨＩ部位を、終始コドンの下流にＸｈｏＩ部位を有するフラグメントをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲに用いたプライマーを以下に示す。
配列番号20：Bgl2-SiOMT1-FW：5'-aaaacatgtatggcggatcagtccgaggaagaagaggcttt
配列番号21：SalI-SiOMT1-RV：5'-attgtcgacttatgaaattccatgatccaaatatt
配列番号22：BamHI-SiOMT2-FW：5'-aaaggatccatggcgatggttaaccaaaagcaaaatctt
配列番号23：XhoI-SiOMT2-RV：5'-aaactcgagttaaggatatatctcgatgatagatctcaa
【００８４】
ＰＣＲ反応液（２５μｌ）は、テンプレートとしてのゴマ種子ｃＤＮＡ、各プライマー０．２ｐｍｏｌ／μｌ、１×ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ｂｕｆｆｅｒ  （ＴＯＹＯＢＯ）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ4、１Ｕ  ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅからなる。９４℃で５分間反応させた後、９４℃１分間、５５℃１分間、７２℃２分間の反応を３０サイクル行ってＰＣＲ増幅した後、７２℃で３分間保持した。得られた各ＰＣＲ産物を、製造者が推奨する方法に従ってｐＣＲ4  Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のマルチクローニング部位に挿入して、ＳｉＯＭＴ１／ｐＣＲ4  Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（ｐＳＰＢ2678と称する）、ＳｉＯＭＴ2／ｐＣＲ4  Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（ｐＳＰＢ2679と称する）を得た。
ｐＳＰＢ2678および、ｐＳＰＢ2679に含まれるＳｉＯＭＴ塩基配列を解析して、正しくＰＣＲが行われたことを確認した。これらのプラスミドをPCRプライマーに付加した制限酵素サイトで消化して得られる完全長ＳｉＯＭＴを含む約１．1ｋｂのＤＮＡ断片を、大腸菌発現ベクターであるｐＱＥ30ベクター（ＱＩＡＧＥＮ）のＢａｍＨＩ／ＳａｌＩサイトに挿入して、ＳｉＯＭＴ１／ｐＱＥ30（ｐＳＰＢ2690と称する）、ＳｉＯＭＴ2／ｐＱＥ30（ｐＳＰＢ2686と称する）を得た。
【００８５】
〔実施例５：組換えタンパク質の調製〕
上記において作製した大腸菌発現ベクターｐＳＰＢ2690およびｐＳＰＢ2686を用いて大腸菌株ＪＭ１０９（ＴＯＹＯＢＯ）を形質転換し、最終濃度２０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地中にて３７℃で一晩前培養した。前培養液の一部をアンピシリン５０μｇ／ｍｌ、カザミノ酸０．５％を含むＭ９培地（１０ｍｌ）に添加して、Ａ600＝０．６〜１．０に達するまで振盪培養した。次いで、培養液に最終濃度０．５ｍＭのＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を加え、さらに３０℃で一晩振盪培養した後、３０００ｒｐｍにて４℃で１０分間遠心分離を行って集菌した。菌体を１０ｍｌの緩衝液（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、2ｍＭ  ＭｇＣｌ2、0.5ｍＭ  ＥＤＴＡ，50μM APSMF）に懸濁した後に超音波処理を行って大腸菌を破砕し、次いで、１５，０００ｒｐｍにて４℃で１０分間遠心分離を行い、得られた上清を粗酵素液として以下の活性測定に用いた。
【００８６】
〔実施例6：ゴマリグナンメチル化酵素による生成物の分析〕
酵素反応の基質に用いるゴマリグナンは少量のＤＭＳＯに溶解した後に７０％エタノールに溶解して基質溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を調製した。ゴマリグナンは、例えば、公知の方法（日本農芸化学会誌  ６７：１６９３（１９９３））に従ってゴマから抽出および精製して得ることができる。基質溶液１０μｌ、大腸菌で発現させたＳｉＯＭＴの上記粗酵素液２００μｌおよび１０ｍＭ  Ｓ−Ａｄｅｎｏｓｙｌ-L-Mathianine（ＳＡＭ）  １０μｌを反応チューブ中で混合した後、３０℃で2時間反応させた。
０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む１００％アセトニトリル（２５０μｌ）を反応チューブに添加することによって、酵素反応を停止させた。反応チューブをボルテックスミキサーで激しく攪拌した後、１５，０００ｒｐｍにて４℃で５分間遠心分離し、得られた上清をフィルタ（ポアサイズ０．４５ｍｍ、４ｍｍ  Ｍｉｌｌｅｘ−ＬＨ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて清浄化した後、液体高速クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣ）を用いてこの上清を分析した。リグナンおよびそのメチル化リグナンの分析条件は以下の通りである。
【００８７】
Ｃ−３０カラム（野村化学Ｃ３０−ＵＧ−５、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）を用いて液体クロマトグラフィー（Ｌｃ−２０１０ｃ（島津製作所））を行った。移動相には、Ａ液として、０．１％ＴＦＡ、Ｂ液として、０．１％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリルを用いた。Ａ液８０％：Ｂ液２０％の混合液を用いてカラムを平衡化した（２０分間）後、直線濃度勾配（Ａ液８０％：Ｂ液２０％→Ａ液１０％：Ｂ液９０％）を用いて20分間にわたって溶出（流速０．６ｍｌ／分）し、さらにＡ液１０％：Ｂ液９０％を用いて7分間溶出した。２８0ｎｍの吸収を測定して、サンプル中に含有される化合物を検出した。化合物の各ピークを、ＳＰＤ−１０ＡＶ（島津製作所）を用いて１９０ｎｍ〜４００ｎｍのスペクトルを測定し、リグナンに特徴的な２つの吸収極大（２３０ｎｍおよび２８０ｎｍ）を有する物質を探索した。この条件下で、ピノレジノール標準品は約11.8分、ピペリトール標準品は約15.5分、セサミノール標準品は約16.8分に検出される。
ＳｉＯＭＴ1組換えタンパク質とピノレジノールとの反応液中において、リグナンのスペクトルを有する保持時間14.0分のピークＡが新たに得られた（図3の３Ａ）。また、ＳｉＯＭＴ1組換えタンパク質とピペリトールとの反応液中において、リグナンのスペクトルを有する保持時間約17.7分のピークＢが新たに得られた（図3の３Ｂ）。
【００８８】
ＳｉＯＭＴ2組換えタンパク質とピノレジノールまたはピペリトールとの反応液中において、新たな生成物は認められなかった（図４の3Ｃ、3Ｄ）。また、ＳｉＯＭＴ1およびＳｉＯＭＴ２のセサミノールに対するリグナンメチル化活性は認められなかった。
【００８９】
次に、ＬＣ−ＭＳ分析によって、ＳｉＯＭＴ1により生成した新規リグナンの分子量を決定した（液体クロマトグラフィー（ＬＣ）：Ｗａｔｅｒｓ  ２７９５（ウォーターズ社）、質量分析器：ＱＵＡＴＲＯ  ｍｉｃｒｏ（マイクロマス社））。ダイアイオンＨＰ−２０樹脂（三菱化学）を１ｍｌ充填したカラムを５０％アセトン５ｍｌで洗浄した後、水１０ｍｌを用いて平衡化した。ＳｉＯＭＴ1により生成したメチル化リグナンを含む酵素反応液をカラムにロードし、５ｍｌの水を用いて不純物を洗浄した後、８０％アセトン２ｍｌを用いて溶出した。エバポレーターを用いて溶出液を乾固させた後、１％ギ酸を含む９０％アセトニトリル（１００μｌ）中に溶解させてＬＣ−ＭＳ分析試料とした。ＬＣ条件を以下に示す。
【００９０】
Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ３０−ＵＧ−３カラム（野村化学、３．０×１５０ｍｍ）を用い、移動相は、Ａ液として水を、Ｂ液として１００％アセトニトリルを、Ｃ液として１％ギ酸を、Ｄ液として１００ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液を用いた。１０分間にわたる直線濃度勾配（Ａ液６０％：Ｂ液３０％：Ｃ液５％：Ｄ液５％→Ａ液１０％：Ｂ液８０％：Ｃ液５％：Ｄ液５％）を用いて溶出し、その後、Ａ液１０％：Ｂ液８０％：Ｃ液５％：Ｄ液５％を用いて５分間溶出した（流速：常時０．２ｍｌ／分）。アンモニウム付加イオンとしてシグナルを検出した。
この条件下で、ピークＡは約8.3分、ピークＢは約11.3分に検出される（図3〜５）。イオンモードＥＳ＋、Ｃｏｎｅ  ｖｏｌｔａｇｅ  １５Ｖ、Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  ２eＶのＭＳ条件を用いて、１００〜８００（ｍ／ｚ，３０分）の範囲でＭＳスキャンし、２１０〜４００ｎｍ（３０分）の範囲のＰＤＡを測定した。
上記条件下でのＬＣ−ＭＳ分析の結果、ピークＡはアンモニウムイオン付加分子量373（ｍ／ｚ）、ピークＢはアンモニウムイオン付加分子量371（ｍ／ｚ）であった（図６の4Ａ、図７の4Ｂ）。従って、これらのピークは、それぞれピノレジノール（アンモニウムイオン付加分子量３５９）のモノメチル化されたもの、およびピペリトール（アンモニウムイオン付加分子量３７４）のモノメチル化されたものであると同定した。
以上の結果からＳｉＯＭＴ1はゴマリグナンであるピノレジノールおよびピペリトールに対してモノメチル化する活性を有する酵素であることが明らかになった。
【００９１】
〔実施例7：ゴマリグナンメチル化酵素ホモログ遺伝子の単離〕
リグナンメチル化活性を有する酵素遺伝子がゴマ種間において機能的および構造的に保存されているかどうかを明らかにするために、栽培ゴマ品種であるＳｅｓａｍｕｍ  ｉｎｄｉｃｕｍとは細胞遺伝学的に異なるアフリカゴマ（Ｓｅｓａｍｕｍ  ｒａｄｉａｔｕｍ）から、ＳｉＯＭＴ1のカウンターパート遺伝子（ＳｒＯＭＴ1）を単離することを試みた。
Ｓ．ｒａｄｉａｔｕｍはアフリカに現存するゴマ植物であり、細胞遺伝学解析によれば染色体数は２ｎ＝６４とされており、栽培ゴマ品種であるＳ．ｉｎｄｉｃｕｍ（２ｎ＝２６）とは遺伝的に異なる系統である（参考文献、並木満夫、小林貞作「ゴマの科学」朝倉書店）。しかし、Ｓ．ｒａｄｉａｔｕｍ種子においても多様なリグナンが蓄積していることが知られている（参考文献、Ｂｅｄｉｇｉａｎ，Ｄ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｅｃｏｌｏｇｙ  １３：１３３−１３９（１９８５））。従って、Ｓ．ｒａｄｉａｔｕｍのゲノム中にはＳ．ｉｎｄｉｃｕｍのＳｉＯＭＴ1に対応する遺伝子が含まれていることが期待される。
【００９２】
Ｓ．ｒａｄｉａｔｕｍ種子のｃＤＮＡを用いてBgl2-ＳｉＯＭＴ1-FW（配列番号20および）SalI-ＳｉＯＭＴ1−RV（配列番号21）のプライマー対を用いて、ＰＣＲによりＳｒＯＭＴ1の増幅を試みた。
Ｓ．ｒａｄｉａｔｕｍ種子のｃＤＮＡ 1μｌ、１×Ｅｘ−Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（ＴａｋａＲａ）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、プライマー各０．２ｐｍｏｌ／μｌ、Ｅｘ−Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  １．２５Ｕからなる。９４℃で５分間の後、９４℃で１分間、５５℃で1分間、７２℃で２分間の反応を３０サイクル行ってＰＣＲ増幅した後、７２℃で5分間保持した。得られた約１．1ｋｂのＰＣＲ産物を、製造者が推奨する方法に従ってｐＣＲ２−ＴＯＰＯ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のマルチクローニングサイトに挿入し、ＳｒＳｉＯＭＴ1／ｐＣＲ２−ＴＯＰＯ（ｐＳＰＢ2910）を得た。
プライマーウォーキング法によって、ｐＳＰＢ2910に含まれるＳｒＯＭＴ1の塩基配列（およびアミノ酸配列）を決定した（配列番号3および4）。ＳｒＯＭＴ1は、ＳｉＯＭＴ1に対してアミノ酸配列で89％の配列同一性を示した。配列同一性について、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔプログラム（Ｍａｃ  Ｖｅｃｔｏｒ  ｖｅｒ．７．２．２（Ｓｙｍａｎｔｅｃｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））をデフォルト設定で使用した。この高い配列同一性はＳｒＯＭＴ１がＳｉＯＭＴ1のカウンターパート遺伝子であることを強く支持する。
【００９３】
実施例2と同様の方法でＲＴ−ＰＣＲを行い、ＳｒＯＭＴ1の種子に特異的な遺伝子発現を確認した（図1）。
実施例４と同様にＳｒＯＭＴ1の大腸菌発現ベクターであるＳｒＯＭＴ1/ｐＱＥ３０（ｐＳＰＢ2911）を構築し、実施例５と同様に組換えタンパク質を調整し、実施例６と同様にその活性および生成物の分析を行った。
ＳｒＯＭＴ1はＳｉＯＭＴ1と同様に、ピノレジノールおよびピペリトールに対してメチル化活性を示した（図２）。また、ＳｉＯＭＴ1はセサミノールに対してメチル化活性を示さなかった。以上の結果より、ＳｒＯＭＴ1はＳｉＯＭＴ1のカウンターパート遺伝子であり、本酵素遺伝子がゴマ種間で保存されていることが示された。
【００９４】
〔実施例８：ＳｉＯＭＴ1のゲノミックサザン解析〕
ゴマゲノム内におけるＳｉＯＭＴ1遺伝子のコピー数を明らかにするために、ゲノミックサザン解析を実施した。Ｎｕｃｌｅｏｎ  Ｐｈｙｔｏｐｕｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アマシャム社）を製造業者が推奨する方法に従って用いて、Ｓ．ｉｎｄｉｃｕｍ（真瀬金品種）の葉からゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡ２０μｇを、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ，ＸｈｏＩまたはＸｂａＩで消化した後、アガロースゲルを用いた電気泳動にて分離した。このアガロースゲルを０．２５Ｍ  ＨＣｌを用いて１５分間加水分解した後、１．５Ｍ  ＮａＣｌ／０．５Ｍ  ＮａＯＨの溶液を用いて変性させ（３０分間）、１．５Ｍ  ＮａＣｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を添加することによって変性溶液で中和した（２０分間）。次いで、アガロースゲル内のゲノムＤＮＡを、２０×ＳＳＣ溶液中にてメンブレン（Ｈｙｂｒｉｂｏｎｄ−Ｎ、アマシャム社）に転写した。メンブレンに転写したゲノムＤＮＡをＵＶ照射によりメンブレンに結合させ、７％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、２％ブロッキング試薬、０．１％ラウロイルサルコシン、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）からなるハイブリダイゼーション緩衝液（高ＳＤＳ緩衝液：ロシュ社）を用いて、４２℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った。
【００９５】
ｐＳＰＢ2678をテンプレートとして、それぞれ配列番号20（Ｂｇｌ2-ＳｉＯＭＴ1−ＦＷ）および配列番号21（ＳａｌＩ−ＳｉＯＭＴ1−ＲＶ）のプライマー対を用いるＰＣＲによって、ＤＩＧ標識化ハイブリダイゼーションプローブを作製した。ＰＣＲ反応液は、ｐＳＰＢ2678プラスミド１ｎｇ、１×ＰＣＲ緩衝液（タカラバイオ社）、２．５ｍＭ  ＤＩＧ−ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ（ＰＣＲ  ＤＩＧ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｍｉｘ、ロシュ社）、０．２ｐｍｏｌの各プライマー、１Ｕ  ｒＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）からなる。ＰＣＲ反応を、９５℃で３０秒間、５３℃で３０秒間、７２℃で２分間の反応を３０サイクル行った。Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０カラム−Ｆｉｎｅ（ベーリンガー社）を用いて精製したＰＣＲ産物をハイブリダイゼーションプローブとして用いた。このプローブを熱変性した後、プレハイブリダイゼーション液に１５μｌ添加して、４２℃で一晩インキュベートした。
【００９６】
ハイブリダイゼーション後、高ストリンジェントな条件（０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液を用いて６５℃で３０分間を２回）によってメンブレンを洗浄した。ＤＩＧラベリング＆デテクションキット（ロシュ社）を製造業者の指示書に従って用いて、ハイブリダイゼーションシグナルを検出した。
サザン解析の結果、いずれの制限酵素消化画分においても二本以上のバンドが検出されたので、ＳｉＯＭＴ1と極めて相同性の高い遺伝子が少なくとも１つ以上ゴマゲノム内にコードされていることが示された（図８）。さらに言えば、ゴマゲノム中にはＳｉＯＭＴ1と機能的に重複もしくは類似した酵素遺伝子が複数存在することが期待される。
【００９７】
〔実施例9：ゴマリグナンメチル化酵素のＣＯＭＴ活性の測定〕
実施例3に示すようにデータベース検索によりＳｉＯＭＴ1およびＳｒＯＭＴ1は既知のタンパク質の中ではＣＯＭＴと最も高い配列同一性を示す。このことはゴマメチル化酵素がＣＯＭＴ活性をも有していることを示唆する。
実施例５および実施例７で発現させたＳｉＯＭＴ1およびＳｒＯＭＴ1のカフェ酸に対するメチル化活性を検討した。0.4ｍｇ/ｍｌカフェ酸１０μｌ、大腸菌で発現させたＳｉＯＭＴの粗酵素液２００μｌおよび１０ｍＭ  ＳＡＭ  １０μｌを反応チューブ中で混合した後、３０℃で１時間反応させた後、実施例6と同様の方法でＨＰＬＣ分析に供した。
その結果、ＳｉＯＭＴ1およびＳｒＯＭＴ1共にカフェ酸との反応液中に標準品フェルラー酸と保持時間が一致するピークＣ（保持時間約7.3分）が生成した（図９の6Ａ〜６Ｃ））。本ＨＰＬＣ分析条件下ではカフェ酸は保持時間約3.9分に溶出される。
実施例６と同様の条件でＬＣ−ＭＳ分析を行ったところピークＣはアンモニウムイオン付加分子量195（ｍ／ｚ）であった（図１０の6Ｄ）。従って、ピークＣは、カフェ酸（アンモニウムイオン付加分子量181（ｍ/ｚ））がモノメチル化されて生成するフェルラー酸であることが確認された。これにより二種のリグナンメチル化酵素は共にＣＯＭＴ活性をも有していることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
以上のように、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、メチル化リグナンの生産に有用である。また、本発明のポリヌクレオチドを発現可能に導入した形質転換体または細胞は、食品分野、各種工業分野において、メチル化リグナン、またはこれを用いる製品を生産する上で、極めて有用である。上記形質転換体が植物体である場合、植物体自体を食品として用いることができるので農業分野等において非常に有用である。
さらに、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを、本発明者らが見出した他の酵素（ピペリトールおよびセサミンを合成する酵素であるＳｉＰ１８９）と組み合わせることによって、ゴマに限ることなく、特定のリグナン分子種の生産系の確立が可能となり、その結果、特定のリグナンおよびメチル化リグナンの生産量を拡大することができる。従って、本発明は、農業、食品産業、医薬品産業およびこれらの関連産業にわたる広範な利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】図1はゴマリグナンの構造と代謝経路図である。
【図２】２Ａは、ＳｉＯＭＴ1およびＳｉＯＭＴ2のゴマ(S.indicum cv. 真瀬金)器官別のＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現解析の結果である。２Ｂは、ＳｒＯＭＴ1のゴマ(S.radiatum)器官別のＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現解析の結果である。
【図３】3Ａは、大腸菌で発現させたＳｉＯＭＴ1とピノレジノールとの酵素反応液のA280nmのクロマトグラムである。3Ｂは、大腸菌で発現させたＳｉＯＭＴ1とピペリトールとの酵素反応液のA280nmのクロマトグラムである。
【図４】3Ｃは、大腸菌で発現させたＳｉＯＭＴ2とピノレジノールとの酵素反応液のA280nmのクロマトグラムである。3Ｄは、大腸菌で発現させたＳｉＯＭＴ2とピペリトールとの酵素反応液のA280nmのクロマトグラムである。
【図５】3Ｅは、大腸菌で発現させたＳｒＯＭＴ1とピノレジノールとの酵素反応液のA280nmのクロマトグラムである。3Ｆは、大腸菌で発現させたＳｒＯＭＴ1とピペリトールとの酵素反応液のA280nmのクロマトグラムである。
【図６】4ＡはＳｉＯＭＴ1により生成されたメチル化ピノレジノールのＬＣ−ＭＳのクロマトグラムである。
【図７】4ＢはＳｉＯＭＴ1により生成されたメチル化ピペリトール（コブシン）のＬＣ−ＭＳのクロマトグラムである。
【図８】図８はＳｉＯＭＴ1遺伝子の完全長プローブを用いたゲノミックサザンハイブリダイゼーションの結果である。
【図９】6Ａは、標準品のカフェ酸のA280nmのクロマトグラムである。6Ｂは、大腸菌で発現させたＳｉＯＭＴ1とカフェ酸との酵素反応液のA280nmのクロマトグラムである。6Ｃは、大腸菌で発現させたＳｒＯＭＴ1とピノレジノールとの酵素反応液のA280nmのクロマトグラムである。
【図１０】6ＤはＳｉＯＭＴ1により生成されたメチル化カフェ酸（フェルラー酸）のＬＣ−ＭＳのクロマトグラムである。
【図１】
2007259789.tif 000002
【図２】
2007259789.tif 000003
【図３】
2007259789.tif 000004
【図４】
2007259789.tif 000005
【図５】
2007259789.tif 000006
【図６】
2007259789.tif 000007
【図７】
2007259789.tif 000008
【図８】
2007259789.tif 000009
【図９】
2007259789.tif 000010
【図１０】
2007259789.tif 000011
【配列表】
2007259789000001.app