(57)【要約】      （修正有）【課題】バイオチップに最適なガラス基材表面に存在する官能基の数の定量する手法を提供する。【解決手段】下記工程Ａ〜Ｅからなる、基材表面の官能基の定量方法。工程Ａ：基材（１１）上に平均厚さが５００μｍ以下で、該基材の面積が１００平方ｍｍ〜１００００平方ｍｍである微量容積の半密閉の空間を形成する工程、工程Ｂ：上記空間に上記基材上の官能基と反応する物質を含む液を満たす工程、工程Ｃ：上記基材上の官能基と上記物質を定量的に反応させる工程、工程Ｄ：上記反応後の液体を回収する工程、工程Ｅ：回収した上記液体中の上記物質を定量し、差分を求める工程。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程Ａ〜Ｅを含むことを特徴とする基材表面の官能基の定量方法。
工程Ａ：基材上に平均厚さが５００μｍ以下で、該基材の面積が１００〜１００００ｍｍ２である微量容積の空間を形成する工程。
工程Ｂ：上記空間に上記基材上の官能基と反応する官能基反応性物質を含む液体を満たす工程。
工程Ｃ：上記基材上の官能基と上記官能基反応性物質を定量的に反応させる工程。
工程Ｄ：上記反応後の液体を回収する工程。
工程Ｅ：回収した上記液体中の上記反応性物質を定量し、差分を求める工程。
【請求項２】
検出すべき官能基がアミノ基である請求項１記載の定量方法。
【請求項３】
アミノ基と反応する物質がイソチオシアネート基およびフェニル基を含む請求項２記載の定量方法。
【請求項４】
イソチオシアネート基およびフェニル基を含む物質がフェニレンイソチオシアネートである請求項３記載の定量方法。
【請求項５】
アミノ基と反応する物質の検出方法は高速液体クロマトグラフィーを用いることを特徴とする請求項３および４記載の定量方法。
【請求項６】
上記液体中の溶媒がジメチルホルムアルデヒドまたはＮ−メチルピロリドンである請求項２〜５のいずれかに記載の定量方法。
【請求項７】
上記液体中に３級アミンをさらに含む請求項２〜６のいずれかに記載の定量方法。
【請求項８】
定量すべき基材がアミノシランで表面処理された基材である請求項２〜７のいずれかに記載の定量方法。
【請求項９】
基材がバイオチップ基板である請求項８記載の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は基材表面の官能基の定量方法、より具体的にはバイオチップ基材表面の官能基の定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオチップなどに用いるガラス基材表面はその効果を発現するためには、種々の化学修飾を行う必要がある。しかしながら、従来はガラス基材表面の化学修飾によって付加された官能基の定量的な分析は行われてこなかった。これは、そのような測定が非常に困難であることが一つの要因である。さらに、二番目の要因としては、基材表面の化学修飾による基材表面全体の物性の変化が確認できれば、基材表面の分子レベルでの定量的な把握ができていなくても、基材材料の表面特性に関して大きな問題は生じず、バイオチップ用基材材料としては充分であったことが挙げられる。基材表面全体の物性の変化の確認には、例えば、水の接触角や透過率の変化、防汚性能などの評価試験が用いられる（非特許文献１）。
【０００３】
しかし、近年開発が盛んになっているバイオチップでは、低発現と呼ばれる発現濃度の低い遺伝子まで網羅的、定量的に測定できることが求められており（特許文献１）、そのための基材材料としては、基材材料表面に存在する官能基数を定量的に把握することが重要である。しかし、基材表面の物理化学的物性とバイオチップとしての性能を直接的に比較することは極めて困難であった。
【０００４】
そこでガラス基材表面の官能基量を測定することによりバイオチップの性能との相関を得ようとして種々の試みがなされていた。しかし、従来はガラス基材表面の官能基量を定性的に測定することしかできず、したがって、バイオチップなどに最適なガラス基材の官能基量を正確に制御することは行われていなかった。表面の官能基量の定性的な分析手法としては、ＦＴ−ＩＲ、ＥＳＣＡ、蛍光イメージ走査法などが用いられていたが、これらの手法では定性的に官能基量の多寡はわかるものの、定量的な官能基量の把握は困難であった。
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−２９９５３号公報
【非特許文献１】技術情報協会「“ぬれ性”と制御  〜表面改質・界面の制御，評価，接触角〜」２０００年１月発刊第３章「ぬれの測定と接触角」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、従来技術では困難であった基材表面の官能基を少量の液量であっても、定量的に評価することが可能な手法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は下記工程Ａ〜Ｅを含むことを特徴とする基材表面の官能基の定量方法を提供する。
工程Ａ：基材上に平均厚さが５００μｍ以下で、該基材の面積が１００平方ｍｍ〜１００００平方ｍｍである微量容積の半密閉の空間を形成する工程。
工程Ｂ：上記空間に上記基材上の官能基と反応する物質を含む液体を満たす工程。
工程Ｃ：上記基材上の官能基と上記物質を定量的に反応させる工程。
工程Ｄ：上記反応後の液体を回収する工程。
工程Ｅ：回収した上記液体中の上記物質を定量し、差分を求める工程。
【０００８】
さらに、本発明は検出すべき官能基がアミノ基である上記の基材表面の官能基の定量方法、アミノ基と反応する物質がイソチオシアネート基およびフェニル基を含む物質である定量方法、イソチオシアネート基およびフェニル基を含む物質がフェニレンイソチオシアネートである基材表面の官能基の定量方法、アミノ基と反応する物質の検出方法は高速液体クロマトグラフィーを用いることを特徴とする基材表面の官能基の定量方法、さらに上記液体中の溶媒がジメチルホルムアルデヒドまたはＮ−メチルピロリドンである基材表面の官能基の定量方法および上記液体中に不揮発性の３級アミンをさらに含む基材表面の官能基の定量方法、また、内部標準物質として、アミノ基と反応せず、高速液体クロマトグラフィーで定量できる基材表面の官能基の定量方法、その場合の内部標準物質がジメチルアニリンである基材表面の官能基の定量方法、定量すべき基材がアミノシランで表面処理された基材である基材表面の定量方法および基材がバイオチップ基板であり、定量すべき基材がアミノシランで表面処理された基材である基材表面の定量方法も提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の基材表面の官能基の定量方法を用いれば、基材表面の官能基を定量的に測定することが可能となり、バイオチップなどに用いられるガラス基材として最適な官能基量の基材を提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
工程Ａにおける基材上に平均厚さが５００μｍ以下で、該基材の面積が１００〜１００００平方ｍｍ２である微量容積の空間を形成する工程では、厚さは５００μｍ以下であればよいが、より厚さが薄いほど、工程Ｂにおける基材上の官能基と反応する物質と、基材上の官能基とが、拡散距離以内に接近する機会が増えることで、工程Ｃにおける定量的な反応を促進することが出来、また空間の容積が減ることで、工程Ｂにおける基材上の官能基と反応する物質を含む液体の濃度を濃く出来、工程Ｅにおいて定量するまでの、吸着などによる誤差を少なくすることが出来るためよいので、１００μｍ以下が好適である。さらに５０μｍ以下がより好適である。微量容積の空間の厚さが５μｍ未満になると、工程Ｄにおける液体の回収が困難になるため、また、高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣ）のサンプリングも困難になるため、厚さは５μｍ以上が好適である。さらに１０μｍ以上がより好適である。
【００１１】
上記微量容積の空間は上記空間に官能基と反応する液体を満たした場合に、官能基の反応時間中は液体を保持し、液体が揮散しないような空間であればよい。このような空間は、例えば、図１に示すようにスライドガラスなどの基材上に平均厚みが５００μｍ以下の凸部が両縁に形成されているカバーガラスを基材上に重ねることによって得ることが可能である。
【００１２】
工程Ｂにおける上記空間に上記基材上の官能基と反応する物質（以下官能基反応性物質）を含む液体を満たす工程はどのような方法を用いてもよいが、スポイトやシリンジなど通常の手段を用いて行ってもよい。
【００１３】
工程Ｃにおいては、上記基材上の官能基と官能基反応性物質を定量的に反応させる工程であるので、上記基材上の官能基と官能基反応性物質が充分に反応することが必要となるので、反応が充分進むための時間が工程Ｄの回収前に必要となる。この時間は上記基材上の官能基と上記官能基反応性物質に依存する。
【００１４】
工程Ｄの上記反応後の液体を回収する工程では、微量容積の液体を工程Ｅで回収した上記液体中の官能基反応性物質を定量し、差分を求められる程度の量が回収されればよい。回収の方法は種々存在するが、簡便には、上記微量容積の空間が基材とカバーガラスで構成されている場合には、カバーガラスを開きシリンジなどで回収することが可能ある。回収する量は下記の工程Ｅで上記液体中の上記官能基反応性物質を定量し、差分を求める工程で、差分を求められるような装置で検出できる量であればよい。
【００１５】
工程Ｅで回収した上記液体中の上記物質を定量し、反応前の反応性物質の定量結果との差分を求める工程では、差分を求められるような装置であればよく、ＨＰＬＣやガスクロマトグラフィー（以下ＧＣ）などが使用可能である。
【００１６】
上記基材の検出すべき官能基は、特に特定の官能基である必要はないが、バイオチップでは、基材表面にＤＮＡや蛋白質を固定化しやすいため、また、より強固にＤＮＡや蛋白質を固定化するための官能基を基材表面に構築するための反応点として用いられることも多いため、上記官能基にはアミノ基が好ましく使用できる。
【００１７】
上記官能基がアミノ基である場合には、アミノ基と反応する物質は少なくともアミノ基と特異的に反応することが知られている官能基、およびＨＰＬＣなどの光学検出による試験装置で検出が可能なように、フェニル基などの光（紫外線）吸収特性もしくは蛍光特性をもつ部位を含む物質（以下アミノ基反応物質）を用いるのが好ましい。具体的には、ニトロアリールハライド基を持つＮＢＤ−ＦやＮＢＤ−Ｃｌ、酸クロリド基を持つＤＭＥＱ−ＣＯＣｌやＳｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ１０１ＡｃｉｄＣｈｌｏｒｉｄｅ、スクシイミド部位を持つ５−ＦＡＭや６−ＴＡＭＲＡ、イソチオシアネート基を持つフルオレセインイソチオシアネートやフェニレンイソチオシアネート、その他、オルトフタルアルデヒドとＮ−アセチルシステインとの組み合わせや、ニンヒドリンなどが使用できるが、上記物質に限定されるものではない。
【００１８】
その中でも特にフェニレンイソチオシアネート（以下ＰＩＴＣ）を用いることが、アミノ基と特異的に反応する官能基と、紫外線を吸収するベンゼン環との、最小限の構成であるために、アミノ基が高密度で機材表面に存在している場合でも、アミノ基反応物質自身の体積によって、本発明による定量結果が飽和してしまうのを避けられるし、ＰＩＴＣはアミノ酸のラベル化や蛋白質分析において特性がよく知られていて、類似の分野で実績がある、などの点から好適である。この場合には、上記工程Ｃにおける反応が進むための時間は１〜８時間程度が必要となる。基板上のアミノ基とＰＩＴＣとが完全に反応するには、室温で４時間ないし８時間を要するが、反応時間が過大に延長されると、ＰＩＴＣの自己分解やＤＭＦの揮発などの誤差因子が拡大するため、実用的にはアミノ基とＰＩＴＣ反応が充分に進行し、かつ、測定上の定量性を向上させるには３時間程度の反応時間が好適である。
【００１９】
アミノ基と反応する物質の検出方法は、微量サンプルの測定の簡便さと、各化合物を分離し、定量することが可能であればよいので、ＧＣやＨＰＬＣを用いていることが可能である。検出感度の点ではＧＣが優れているが、ＨＰＬＣを用いるほうが、定量性の点で実績があり、波長２５４ｎｍにおける光吸収を検出することで、より特異的にＰＩＴＣを定量することができる。
【００２０】
上記液体中の溶媒は、アミノ基反応物質を均一に溶解し、かつアミノ基およびアミノ基反応物質との相互作用が少ないような溶媒であればよい。具体的には、ジメチルスルフォオキシド、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、メタノール、エタノール、ジメチルホルムアルデヒド、またはＮ−メチルピロリドンなどが使用できるが、これらに限定されるものではない。その中でもジメチルホルムアルデヒドまたはＮ−メチルピロリドンが、揮発性が低いため上記工程ＢおよびＤにおける正確な操作が容易であり、アミノ基反応物質の溶解性が高く、機材表面に対する濡れ性が適度であり、さらに、特にＰＩＴＣをアミノ基反応物質として用いる場合には、ＰＩＴＣの機材表面のアミノ基との結合以外による分解を最小限に抑える目的で、無水グレードの溶媒が入手しやすいこと、などから好適に用いられる。
【００２１】
さらに、上記液体中に３級アミンをさらに含ませることも可能である。上記液体中に３級アミンをさらに含ませると、アミノ基反応物質のアミノ基との反応性を向上させることが期待される。
【００２２】
さらに３級アミンの置換基がアルキル基である場合は、光吸収が少ないため、上記工程ＥにおけるＨＰＬＣ分析において分析を妨げにくい。このような物質としては、例えばトリエチルアミンなどが好適に使用できる。その使用量としては上記溶液中にフェニレンイソチオシアネートを用いた場合には、上記溶液中の０．０１〜１体積％が好ましい。０．０１体積％以下ではその効果が見られず、１体積％超の使用ではＰＩＴＣの自己分解を促進する問題が生じるので、１体積％以下の使用が望ましい。
【００２３】
定量すべき基材の検出すべき官能基がアミノ基である場合は、アミノ基を有するシランカップリング剤（アミノシラン）で表面処理された基材を用いることが望ましい。使用可能なアミノシランとしては、有機性官能基をＲ、無機材料と反応する加水分解性基をＸとすると、ＲＳｉＸ３化学構造を有するもので、有機性官能基Ｒの末端のうち少なくとも一つがアミノ基であり、Ｘは塩素とアルコキシ基などが好ましく挙げられる。アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、などが例示される。
【００２４】
アミノシランの例としては、Ｎ−（２−アミノエチル）−３アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシランなどがあげられるがこれらに限定されるものではない。中でも特に３−アミノプロピルトリメトキシシランが、構造がシンプルで、取り扱いが容易なため、好適に用いられる。
【００２５】
基材に用いるガラスは、シランカップリング剤を表面に結合させられるものであればどのような種類のガラスでも使用可能である。入手の容易さの点と、バイオチップ用途における実績の点で、合成石英、ホウ珪酸ガラス、ソーダライムガラスのようなガラスが好ましいが、金属または金属酸化物あるいは金属窒化物からなる、または、これらをスパッタや蒸着などにより表面にコーティングさせた、基材であってもよい。本基材は本発明の定量方法により、表面のアミノ基などの官能基量が定量されているので、バイオチップの用途に応じた品質の高いバイオチップ基板を作製することが可能となる。
【００２６】
また、本発明の液体中には内部標準物質としては、アミノ基と反応せず、基材表面への吸着が少なく、高速液体クロマトグラフィーで定量できる物質を含有していてもよい。内部標準物質が上記液体中に含有すると、基材上のアミノ基の定量性を向上させることが可能となる場合もあるからである。内部標準物質としては、例えば、トルエン、ピリジン、アセトアミノフェン、Ｎ−フェニルアセトアミン、ジメチルアニリンなどの物質を用いることが可能であるが、これらに限定されるものではない。
【実施例】
【００２７】
２５ｍｍ×７６ｍｍ×厚さ１ｍｍのソーダライムガラス基板を１０％ＮａＣｌ水溶液中で１０分間超音波処理し、純水で３回リンスし、サンプル０を得た。さらにこの基板を、３−アミノプロピルトリメトキシシラン（以下アミノシラン）１％（ｖ／ｖ）のＨ２Ｏ：ＭｅＯＨ＝１：１溶液に浸漬し、室温で一晩置いた。その後ＭｅＯＨで３回リンスした後乾燥させ、１２０℃のオーブンで２時間焼成し、サンプル１を得た。
【００２８】
２５ｍｍ×７６ｍｍ×厚さ１ｍｍの合成石英ガラス基板を１％塩酸中で１０分間超音波処理し、純水で３回リンスした。この基板を、３−アミノプロピルトリメトキシシランの１％（ｖ／ｖ）ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ溶液に浸漬し、室温で一晩置いた。その後ＭｅＯＨで３回リンスした後乾燥させ、１２０℃のオーブンで２時間焼成し、サンプル２を得た。
【００２９】
このサンプルの測定に用いる高速液体クロマトグラフ装置（以下ＨＰＬＣ）を次の条件で準備した。（１）検出波長：２５４ｎｍ、（２）カラム：Ｉｍｔａｋｔ社製ＣａｄｅｎｚａＣＤ−Ｃ１８、（３）流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、（４）溶媒：Ｈ２Ｏ：アセトニトリル＝４：６。これらの条件のもとで０．１％トリエチルアミン（ｖ／ｖ）を含むジメチルホルムアミド溶液（以下ＤＭＦ溶液）を用意し、ＰＩＴＣをＤＭＦ溶液で１２５０００倍希釈し、テスト液１を得た。このテスト液１の１００μＬには、およそ６．７５×１０−９ｍｏｌ（以下テスト液濃度とする）のＰＩＴＣが含まれていることになる。
【００３０】
サンプル０、１および２（以下各サンプル）の上に、面積が１０平方ｃｍのカバーガラスで厚さ２０μｍのスペーサを持つ松浪硝子社製「ギャップカバーガラス（商品名）」を置き、各サンプルとカバーガラスとの間に挟まれる空間１の体積が２０μＬになるようにした。この空間１に２０μＬのテスト液１を、２０μＬ用のマイクロピペットを用い、カバーガラスの平面の端部にピペットチップの先端を接触させながら毛管現象を利用してゆっくりと満たし（以下満たした容積を投入容積とする）、この時を時間０とし、各サンプルとカバーガラスとからなる全体を、それぞれ個別にポリプロピレン製の密閉容器に入れた。
【００３１】
テスト液１は、調製後自然放置によってもＰＩＴＣが分解していくため、これに起因する誤差を以下の手順によって差し引くことで、定量精度を確保する。すなわち、テスト液１の一部は調製後速やかに、空間１と同体積（２０μＬ）ずつ、ＨＰＬＣ用サンプル瓶４〜５本に小分けし（以下無操作テスト液）、できるだけ速やかにＨＰＬＣ分析する。また、後述する各サンプルの空間１から回収するテスト液の直前あるいは直後、もしくは直前直後などの、時間０から適当な時間（１時間、２時間など）が経過したときにも、ＨＰＬＣ分析する。すべてのＨＰＬＣ分析が終了後、無操作テスト液のＰＩＴＣピークエリアを、時間０からのＨＰＬＣ分析時間までの経過時間を横軸に取り指数関数で近似し予測曲線とする。各サンプルのＰＩＴＣピークエリアについては、予測曲線上の、各サンプルの分析時刻（時間０からの経過時間）における予想エリアとの差を算出し、この差を予想エリアで除した数を、各サンプルの表面においてアミノシランのアミノ基とＰＩＴＣとが反応した正味量（以下正味減少率）とした。
【００３２】
時間０から３時間が経過したとき、各サンプルの空間１からそれぞれテスト液１を次の方法で回収した。すなわち、カバーガラスの一辺にピンセットを当てて持ち上げ、持ち上げた辺と反対側の辺がガラス基板に接触したままの状態にすると、空間１中にあったテスト液１は、表面張力により、ガラス基板とカバーガラスとが接触している辺の周囲に集まるので、ここに２０μＬ用のマイクロピペットの先端を当て慎重に吸いとった。吸いとったテスト液１をＨＰＬＣ用サンプル瓶に移し、ＨＰＬＣ分析してＰＩＴＣのピークエリアを求め、上記の計算方法により正味減少率を評価した。さらに、次の計算によって、ガラス基板の表面積を、アミノシランがどれだけ覆っているか（以下アミノ基密度）を評価した。すなわち、アミノシランの分子模型から、アミノシランのアルキル鎖部位がガラス基板表面の平面に対して垂直に存在していると仮定し、それをガラス基板表面の平面に垂直な上方から見た場合の、最も広い幅を０．５ｎｍと見なし、これを１辺とする正方形の面積を、本定量法における、アミノシラン１分子がガラス基板表面を被覆する面積、と定義した。左記の状態を仮定した正方形が単層を成して理論密度で１０ｃｍ２のガラス基板表面に敷き詰められた場合、正方形の数は６．６４×１０−９ｍｏｌと推定された。
【００３３】
式：アミノ基密度＝テスト液濃度×投入容積×正味減少率／細密アミノ基密度、によって、各サンプルのアミノ基密度を求めた。その結果を表１に示す。サンプル０においてもアミノ基密度が１．９９％を示しており、アミノ基が存在しないはずの基材でも定量操作によりこのように減少する。しかしアミノシランで処理したサンプル１およびサンプル２では、サンプル０と比較して明らかに有意にアミノ基密度が示されていることから、本反応法および器具により、ガラス基板上にコーティングされた化学的に有効であったアミノ基に対してＰＩＴＣを反応させることが出来たといえる。
【００３４】
サンプル        アミノ基密度（ｍｏｌ／１０ｃｍ２）    アミノ基密度（％）
サンプル０      １．３２×１０−１０                    １．９９
サンプル１      ６．６３×１０−１０                    ９．９８
サンプル２      ９．７８×１０−１０                    １４．７
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明の基材材料表面の官能基の定量方法を用いれば、バイオチップなどに必要な官能基量が定量できるため、高品質な基材を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明での空間の形成方法の一例を示す図
【符号の説明】
【００３７】
１１：スライドガラス
１２：ギャップカバーガラス
１３：ギャップカバーガラスに付属のスペーサー
【図１】
2007248206.tif 000003