(57)【要約】      （修正有）【課題】  植物のリポ多糖に対する認識及び応答機構を明らかにし、リポ多糖を利用した新たな植物病害の防除手段を提供する。【解決手段】  シュードモナス属微生物由来のリポ多糖を有効成分として含有することを特徴とする単子葉植物の病害抵抗性誘導剤及び植物病害抵抗性誘導強化剤。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポ多糖を有効成分として含有することを特徴とする単子葉植物の病害抵抗性誘導剤。
【請求項２】
リポ多糖が、シュードモナス属の微生物由来のリポ多糖であることを特徴とする請求項１に記載の単子葉植物の病害抵抗性誘導剤。
【請求項３】
リポ多糖を有効成分として含有することを特徴とする植物病害抵抗性誘導強化剤。
【請求項４】
リポ多糖が、シュードモナス属の微生物由来のリポ多糖であることを特徴とする請求項３に記載の植物病害抵抗性誘導強化剤。
【請求項５】
植物が、単子葉植物であることを特徴とする請求項３又は４に記載の植物病害抵抗性誘導強化剤。
【請求項６】
植物にリポ多糖を散布した後、エリシターを散布することを特徴とする植物の病害防除方法。
【請求項７】
リポ多糖が、シュードモナス属の微生物由来のリポ多糖であることを特徴とする請求項６に記載の植物の病害防除方法。
【請求項８】
植物が、単子葉植物であることを特徴とする請求項６又は７に記載の植物の病害防除方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単子葉植物の病害抵抗性誘導剤、植物病害抵抗性誘導強化剤、及び植物の病害防除方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、動植物の防御応答を誘導する共通的な機構として、微生物固有の分子パターン（Pathogen-Associated Molecular Pattern; PAMPs）認識に基づく防御応答が注目されている。細菌鞭毛成分のフラジェリンや糸状菌細胞壁を構成するキチン、βグルカン断片などは代表的なPAMPsと考えられ、その認識・応答機構に関する研究が進められている。
【０００３】
一方、動物の先天性免疫において細菌由来のPAMPsとして役割が注目されているリポ多糖（LPS）に関しては、いくつかの双子葉植物において過敏感反応抑制その他の活性が報告されているものの（非特許文献１、非特許文献２）、単子葉植物に対する作用に関しては報告が無い。
【０００４】
【非特許文献１】Dow M, Newman M-A, von Roepenack E; Ann. Rev. Phytopathol., 38, 241-261 (2000)
【非特許文献２】Erbs G, Newman, M-A; Mol. Plant Pathol., 4, 421-425 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述したように、植物におけるリポ多糖の防御応答誘導に関する知見は非常に少ない。本発明は、このような技術的背景の下になされたものであり、植物のリポ多糖に対する認識及び応答機構を明らかにし、リポ多糖を利用した新たな植物病害の防除手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、（１）リポ多糖が単子葉植物に対して防御応答を誘導すること、（２）リポ多糖が細胞死を誘導すること、（３）リポ多糖で予め処理することにより、他のエリシターによる防御応答誘導が強化されること、を見出し、これらの知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（８）を提供するものである。
【０００８】
（１）リポ多糖を有効成分として含有することを特徴とする単子葉植物の病害抵抗性誘導剤。
【０００９】
（２）リポ多糖が、シュードモナス属の微生物由来のリポ多糖であることを特徴とする（１）に記載の単子葉植物の病害抵抗性誘導剤。
【００１０】
（３）リポ多糖を有効成分として含有することを特徴とする植物病害抵抗性誘導強化剤。
【００１１】
（４）リポ多糖が、シュードモナス属の微生物由来のリポ多糖であることを特徴とする（３）に記載の植物病害抵抗性誘導強化剤。
【００１２】
（５）植物が、単子葉植物であることを特徴とする（３）又は（４）に記載の植物病害抵抗性誘導強化剤。
【００１３】
（６）植物にリポ多糖を散布した後、エリシターを散布することを特徴とする植物の病害防除方法。
【００１４】
（７）リポ多糖が、シュードモナス属の微生物由来のリポ多糖であることを特徴とする（６）に記載の植物の病害防除方法。
【００１５】
（８）植物が、単子葉植物であることを特徴とする（６）又は（７）に記載の植物の病害防除方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の単子葉植物の病害抵抗性誘導剤又は植物病害抵抗性誘導強化剤により、イネなどの植物の病害の効率的な防除が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明の単子葉植物の病害抵抗性誘導剤は、リポ多糖を有効成分として含有することを特徴とするものである。本発明において「単子葉植物の病害抵抗性誘導剤」とは、単子葉植物の病害に対する抵抗性を誘導し、単子葉植物の病害を防除するための薬剤をいう。本発明の単子葉植物の病害抵抗性誘導剤の具体的な使用方法としては、病害が発生している圃場又は発生するおそれのある圃場に散布する方法を例示できる。
【００１９】
使用するリポ多糖は、単子葉植物の病害に対する抵抗性を誘導できるものであれば特に限定されないが、シュードモナス（Pseudomonas）属の微生物由来のリポ多糖を使用するのが好ましく、シュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginossa）由来のリポ多糖を使用するのが更に好ましい。シュードモナス属以外の微生物由来のリポ多糖としては、例えば、シゲラ（Shigella）属、サルモネラ（Salmonella）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、エシェリキア（Escherichia）属の微生物由来のリポ多糖などを使用することができる。
【００２０】
対象とする植物は、単子葉植物とし、単子葉植物の中でもイネ科の植物が好ましく、イネが特に好ましい。
【００２１】
本発明の単子葉植物の病害抵抗性誘導剤を実際の圃場で使用する場合、その使用量は特に限定されないが、例えば、10aの水田に散布する場合、有効成分であるリポ多糖の量が0.5〜50g程度になるように散布するのが好ましく、0.5〜1g程度になるように散布するのが更に好ましい。
【００２２】
本発明の植物病害抵抗性誘導強化剤も、リポ多糖を有効成分として含有することを特徴とするものである。本発明において「植物病害抵抗性誘導強化剤」とは、植物の病害に対する抵抗性を誘導する物質（エリシター）あるいは感染時の抵抗性誘導作用を強化し、植物の病害を防除するための薬剤をいう。本発明の植物病害抵抗性誘導強化剤の具体的な使用方法としては、病害が発生している圃場又は発生するおそれのある圃場に、エリシターの散布と同時に又はそれに先立ち、散布する方法を例示できる。
【００２３】
使用するリポ多糖は、単子葉植物の病害抵抗性誘導剤と同様でよい。対象とする植物は、単子葉植物だけでなく、双子葉植物も対象とすることができる。
【００２４】
エリシターとしては、キチンオリゴ糖（重合度は６〜８程度が好ましい。）、βグルカンオリゴ糖、などを例示できる。
【００２５】
本発明の植物病害抵抗性誘導強化剤を実際の圃場で使用する場合、その使用量は特に限定されないが、単子葉植物の病害抵抗性誘導剤の場合よりも少量でよい。例えば、10aの水田に散布する場合、有効成分であるリポ多糖の量が10mg〜10g程度になるように散布するのが好ましく、10〜20mg程度になるように散布するのが更に好ましい。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
【００２７】
最初に、本実施例において使用した実験材料及び実験方法について説明する。
【００２８】
（１）培養細胞
300mlの三角フラスコに90mlのL培地を入れ、イネ培養細胞（日本晴）を暗黒下、25℃、120 rpmで培養した。１週間ごとに新しい培地に植え継ぎ、植え継ぎ後4,5日目の細胞を実験に用いた。
【００２９】
（２）エリシター
リポ多糖は、シュードモナス・エルギノーザ（シグマ社製）、シゲラ・フレキシネル（Shigella flexneri、シグマ社製）、サルモネラ・アボルツス（Salmonella abortus、シグマ社製）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae、シグマ社製）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli、和光純薬製）を用いた。それぞれ水に1mg/mlで溶かし、遠心分離した後の上清を用いた。キチンオリゴ糖はキトサンオリゴ糖（8量体、焼津水産化学製）を再N-アセチル化したものを0.5mg/mlとなるように水に溶かし、必要濃度に希釈したものを用いた。
【００３０】
（３）ポリミキシンアガロースゲルによるリポ多糖の吸着除去
Detoxi-GelTM（PIERCE社製）3mlをカラムにつめ300μgのリポ多糖を含む溶液を添加、吸着させた。素通り画分およびデオキシコール酸溶出画分中の糖はフェノール硫酸法により測定した。
【００３１】
（４）活性酸素誘導の測定
培養４ないし５日目の培養細胞を、2mlエッペンドルフチューブ中、新鮮培地1mlに対して細胞40mgとなるように添加した。これをサーモミキサーで25℃、750rpmで30分間（実施例６では2時間）プレインキュベートし、その後エリシター処理を行なった。処理後、計時的に上清10μlずつを化学発光測定用の96穴マイクロタイタープレートに取り、1.1mMルミノール溶液50μlと14ｍMフェリシアン化カリウム溶液100μlを加えて反応させ、ルミノメーターにて発光量を測定した。
【００３２】
（５）RT-PCR
活性酸素測定同様にエリシター処理を行い、処理後0分、30分、360分にピペット操作により培地とエリシターを除去後、RNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN社製）を用い、細胞からRNAを抽出した。対象とする遺伝子ごとに設計したプライマーを用い、One-step RT-PCRキット（QIAGEN社製）を用いてcDNAを増幅し、アガロース電気泳動により確認した。
【００３３】
（６）TUNEL/DAPI法によるDNAの蛍光染色
活性酸素測定と同様にエリシター処理を行い、12時間処理後、ピペット操作により培地とエリシターを除去した。細胞を水で洗浄し、暗黒下、室温で4%パラホルムアルデヒドにより固定した。PBS（pＨ7.4）で洗浄後、Proteinase Kを加え37℃、30分間処理した。これをPBSで洗浄し、TUNEL reaction mix（In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein：Roche社製）を50μl加えて37℃、1時間処理した。細胞をスライドガラスに移しDAPI solution（同仁化学研究所製）にてマウントし共焦点レーザー顕微鏡（LSM510：ZEISS）で観察した。DAPI染色は364nm励起、BP435-485フィルターで検出し、TUNEL試薬による染色は488nm励起、LP530フィルターで検出した。
【００３４】
（７）DNA断片化の検出
活性酸素測定同様にエリシター処理を行い、24時間処理後、ピペット操作により培地とエリシターを除去した。2%CTAB溶液（100mM Tris-HCl、1.4M NaCL、 20mM EDTA、pH5.8）200μlを加え65℃、30分加熱した。クロロホルム：イソアミルアルコール（24：1）混合液を200μl加えよく攪拌した後遠心し、上清に1%CTAB溶液（50mM Tris-HCl、10mM EDTA、pH5.8）1mlを加え混合した。これを遠心し、エタノールで沈殿を洗浄後TEバッファー100μlに溶解、さらに37℃、1時間、RNase処理を行った。イソプロパノール沈殿によりDNAを濃縮後6%アクリルアミドゲルにて泳動、エチルブロマイドでDNAを染色し検出した。
【００３５】
（８）エバンスブルー染色
活性酸素測定同様にエリシター処理を行い、12時間処理後、遠心により培地とエリシターを除去し、細胞を水で洗浄した。0.05%エバンスブルー溶液（50ｍM HEPS-KOH、pH7.2）で15分間染色後、水でよく洗浄した。細胞を24穴プレートに移し、抽出液（50%メタノール、1% SDS）を加え3時間静置後、上清の吸光度（595nm）を測定した。
【００３６】
（９）リポ多糖による防御応答誘導強化の評価
プレインキュベート（2時間）終了後、リポ多糖（0.1μg/ml）により2時間処理を行った。その後キチンオリゴ糖エリシター（0.08ng/ml）処理を行い、誘導される活性酸素量あるいはエリシター応答性遺伝子の発現量を測定した。
【００３７】
（１０）リアルタイムPCR
エリシター処理後2時間の細胞からRNAを抽出し、塩化リチウム沈殿法にて精製した。これを鋳型としてcDNAを合成し、遺伝子ごとに設計したTaqmanプローブとプライマーを用いて対象とする遺伝子を増幅、検出した。反応チューブごとの逆転写効率の差異は内部標準として一定量のリボソームRNAを用いることにより校正した。
【００３８】
〔実施例１〕  リポ多糖によるイネ培養細胞の活性酸素生成誘導−１
リポ多糖による病害抵抗性誘導効果を調べるため、病害抵抗性誘導の指標である活性酸素生成の誘導を調べた。
【００３９】
実験には、シュードモナス・エルギノーサ由来のリポ多糖（50μg/ml）を用いた（以下、特に記載がない場合は、シュードモナス・エルギノーサ由来のリポ多糖を用いている。）。また、比較のため、既知のエリシターであるキチンオリゴ糖（1.6ng/ml）も用いた。結果を図１に示す。
【００４０】
図１に示すように、リポ多糖は、キチンオリゴ糖と同様にイネ培養細胞に対し活性酸素生成を誘導した。
【００４１】
〔実施例２〕  リポ多糖によるイネ培養細胞の活性酸素生成誘導−２
実施例１で使用したリポ多糖標品による活性酸素生成誘導が夾雑物によるものではなく、リポ多糖によるものであることを確認するため、ポリミキシン（リポ多糖中のリピドAと特異的に結合する）固定化カラムを通過させた画分（画分２及び画分３）の活性酸素生成誘導を調べた。結果を図２に示す。
【００４２】
図２に示すように、ポリミキシン固定化カラム通過後の画分は、活性酸素生成を誘導しなかった。このことから、リポ多糖標品による活性酸素生成誘導は、リポ多糖に基づくことが確認された。
【００４３】
〔実施例３〕  リポ多糖による病害抵抗性関連遺伝子の発現誘導
リポ多糖又はキチンオリゴ糖で処理したイネ培養細胞におけるβグルカナーゼ遺伝子（rBG）、キチナーゼ遺伝子（RCC）、エリシター応答性遺伝子（EL2）、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ遺伝子（PAL）、ファイトアレキシン合成系遺伝子（OsDTC2）の５種類の病害抵抗性関連遺伝子の発現誘導を調べた。また、比較のため、病害抵抗性とは関係のないアクチン遺伝子（ACTIN）の発現誘導も調べた。結果を図３に示す。
【００４４】
図３に示すように、リポ多糖で処理したイネ培養細胞では、キチンオリゴ糖で処理した場合と同様に、４種類すべての病害抵抗性関連遺伝子の発現が誘導されていた。
【００４５】
〔実施例４〕  リポ多糖による細胞死の誘導−１
リポ多糖又はキチンオリゴ糖で処理したイネ培養細胞における核DNAの断片化をTUNEL/DAPI染色により調べた。TUNEL染色の結果を図４左に、DAPI染色の結果を図４右に示す。
【００４６】
図４に示すように、リポ多糖で処理したイネ培養細胞では、核DNAの顕著な断片化が検出された。一方、キチンオリゴ糖で処理したイネ培養細胞における核DNAの断片化は、コントロールとほぼ同様であった。このことから、リポ多糖には細胞死を誘導する作用があると考えられる。
【００４７】
〔実施例５〕  リポ多糖による細胞死の誘導−２
リポ多糖又はキチンオリゴ糖で処理したイネ培養細胞から単離されたDNAについて、アガロース電気泳動を行い、DNAの断片化を検出した。また、リポ多糖又はキチンオリゴ糖で処理したイネ培養細胞に対してエバンスブルー染色（死細胞を染色）を行い、リポ多糖による細胞死を評価した。リポ多糖は、シュードモナス・エルギノーサ由来のものとエシェリキア・コリ由来のものとを使用した。アガロース電気泳動の結果を図５aに、エバンスブルー染色の結果を図５bに示す。
【００４８】
図５に示すように、リポ多糖で処理することにより、DNAが断片化し、また、死細胞が顕著に増加した。キチンオリゴ糖による処理によっても、DNAの断片化や死細胞の増加は観察されたが、リポ多糖の場合ほど顕著ではなかった。
【００４９】
〔実施例６〕  リポ多糖による病害抵抗性誘導の強化
イネ培養細胞を低濃度（0.1μg/ml）のリポ多糖で２時間処理した後、キチンオリゴ糖（0.08ng/ml）で処理し、活性酸素生成の誘導を調べた。結果を図６に示す。
【００５０】
図６に示すように、キチンオリゴ糖処理前にリポ多糖で処理した細胞では、処理しなかったものよりも、活性酸素生成が強く誘導された。このことから、リポ多糖には、病害抵抗性誘導を強化するはたらきがあると考えられる。
【００５１】
〔実施例７〕  リアルタイムPCRによる病害抵抗性関連遺伝子発現誘導の定量的評価
イネ培養細胞を低濃度（0.1μg/ml）のリポ多糖で２時間処理した後、キチンオリゴ糖（0.08ng/ml）で処理し、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ遺伝子（PAL）、キチナーゼ遺伝子（RCC）、βグルカナーゼ遺伝子（rBG）、ファイトアレキシン合成系遺伝子（OsDTC2）の４種類の病害抵抗性関連遺伝子の発現をリアルタイムPCRによって調べた。結果を図７に示す。
【００５２】
図７に示すように、キチンオリゴ糖処理前にリポ多糖で処理した細胞では、処理しなかったものよりも、４種類すべての病害抵抗性関連遺伝子の発現量が増大していた。このことから、リポ多糖には、病害抵抗性誘導を強化するはたらきがあると考えられる。
【００５３】
〔実施例８〕  種々の細菌由来のリポ多糖によるイネ培養細胞の活性酸素生成誘導
シュードモナス・エルギノーザ（P.aeruginosa）、エシェリキア・コリ（E.coli）、クレブシエラ・ニューモニエ（K.pneumoniae）、サルモネラ・アボルツス（S.abortus）、シゲラ・フレキシネル（S.flexneri）の５種類の細菌由来のリポ多糖のイネ培養細胞に対する活性酸素生成誘導を実施例１と同様の方法で調べた。結果を図８に示す。
【００５４】
図８に示すように、いずれのリポ多糖にも活性酸素誘導活性がみられたが、シュードモナス・エルギノーザ由来のリポ多糖が最も活性が高かった。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】実施例１の実験結果を示す図。
【図２】実施例２の実験結果を示す図。
【図３】実施例３の実験結果を示す図（図中のCはコントロール、LPSはリポ多糖、GN8はキチンオリゴ糖を示す）。
【図４】実施例４の実験結果を示す図。
【図５】実施例５の実験結果を示す図（図中のCはコントロール、GN8はキチンオリゴ糖、LPSはリポ多糖を示す）。
【図６】実施例６の実験結果を示す図。
【図７】実施例７の実験結果を示す図。
【図８】実施例８の実験結果を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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