(57)【要約】【課題】生体分子の非特異的な影響を受けることなく、結合シグナルを増幅させることにある。特に表面プラズモン（ＳＰＲ）測定に用いてプロテインキナーゼによるリン酸化を検出する際に、信頼性の高いデータを得ることのできる解析方法を提供する。【解決手段】ＳＰＲにより基板上のポリペプチドのリン酸化を検出する方法であって、例えば式（Ｉ）に示すような構造を含むビオチン修飾された化合物及び抗ビオチン抗体を用いることを特徴とする基板上に固定化されたポリペプチドのリン酸化反応の検出方法。    【化１】2007248055.tif 000011【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸化が予想されるポリペプチド（ｉ）とビオチン標識された化合物（ｉｉ）と抗ビオチン抗体（ｉｉｉ）とを接触させ、（ｉ）と（ｉｉ）と（ｉｉｉ）を含む複合体の有無を調べることを特徴とするリン酸化検出方法。
【請求項２】
ビオチン標識された化合物がポリアミン亜鉛錯体であることを特徴とする請求項１に記載のリン酸化検出方法。
【請求項３】
ビオチン標識された化合物がポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体であることを特徴とする請求項１又は２に記載のリン酸化検出方法。
【請求項４】
ビオチン標識された化合物が式（Ｉ）に記載される構造を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のリン酸化検出方法。
【化１】
2007248055.tif 000010
【請求項５】
ポリペプチドが３０アミノ酸残基以下のペプチドであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のリン酸化検出方法。
【請求項６】
ポリペプチドの末端にシステイン残基が付加されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のリン酸化検出方法。
【請求項７】
アミノ酸配列の中に親水性化合物が挿入されてなるポリペプチドを用いることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のリン酸化検出方法。
【請求項８】
親水性化合物がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であることを特徴とする請求項７に記載のリン酸化検出方法。
【請求項９】
親水性化合物の分子量が１００〜１０００であることを特徴とする請求項７または８に記載のリン酸化検出方法。
【請求項１０】
親水性化合物の分子量が４００〜１０００であることを特徴とする請求項７〜９のいずれかに記載のリン酸化検出方法。
【請求項１１】
抗ビオチン抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載のリン酸化検出方法。
【請求項１２】
ポリペプチドが基板上に固定化されていることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載のリン酸化検出方法。
【請求項１３】
ポリペプチドが基板上にアレイ状に固定化されていることを特徴とする請求項１２に記載のリン酸化検出方法。
【請求項１４】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析を用いることを特徴とする請求項１〜１３のいずれかに記載のリン酸化検出方法。
【請求項１５】
ＳＰＲ解析がＳＰＲイメージングであることを特徴とする請求項１４に記載のリン酸化検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いることにより、チップ上におけるリン酸化の検出方法に関する。より詳細には、ポリペプチドが固定化されてなるチップ上で、プロテインキナーゼを含有するもしくは含有すると考えられる溶液を作用させることにより該固定化されたポリペプチドのリン酸化を検出する方法において、リン酸基との結合性を有する化合物でビオチン修飾された化合物と抗ビオチン抗体とを用いることを特徴とするリン酸化の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体分子の相互作用解析、発現分子のプロファイリング、もしくは診断に用いるバイオチップが注目を集めている。基板上に生体分子が固定化されることで操作が容易になり、場合によっては非常に多くの物質の相互作用を解析することができる。特に比較的分子量の小さなペプチドを基板上に固定化したペプチドアレイは、蛋白質のような変性の問題が比較的少なく、またコンビナトリアルケミストリーの側面が強いことから、近年酵素の基質探索や、あるいはインヒビターの探索などに広く用いられるようになってきている。なかでも、ポストゲノムの中にあっては、蛋白質の翻訳後修飾、特にリン酸化の解析は蛋白質の活性調節、機能調節を詳細に解明するうえで重要である。
【０００３】
既に報告されている関連技術として、例えばＳＰＯＴ技術によりセルロースメンブラン上で直接ペプチドを合成し、その後チップ上に固定化する技術が知られている。この技術を利用して、ｐ６０チロシンキナーゼの基質をチップ上に固定化し、蛍光物質もしくは放射性物質を用いてキナーゼ活性を評価したことが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。また、同様の技術で作製されたペプチドアレイを用いて、プロテインキナーゼＡ（以下、ＰＫＡと示すこともある。）やＮＩＭＡ−ｒｅｌａｔｅｄ キナーゼ６（ＮＥＫ６）などの活性を、放射性物質を用いてアッセイしたことについての報告（例えば、非特許文献２及び３参照）もある。その他、アビジンでコートした基板上にビオチン結合したペプチドを固定化し、ＰＫＡ活性を検討した例（例えば、非特許文献４参照）もある。しかしながら、上記いずれの方法においても、検出の際のバックグラウンドがスポットを観察する上で悪影響し、その低減が大きな課題となっている。更には、放射性物質を用いる方法が主流であり、安全性の問題はもとより専用施設を設置する必要性もあり、限られた研究機関でしか実施できないという問題がある。あるいは抗体を用いる方法の場合には、そのコストや要求特性が十分でないなどの課題があり、必ずしも満足なものであるとは言い難いのが実情である。
【０００４】
【非特許文献１】Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １３，３１５，２００２
【非特許文献２】Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．  ４３，２６７１，２００４
【非特許文献３】Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １，２７，２００４
【非特許文献４】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７７，２７８３９，２００２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、簡便で安全な方法による、創薬スクリーニングのためのハイスループット対応も可能であるＯｎ−ｃｈｉｐでのプロテインキナーゼ活性の検出のための評価系を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示すような手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
１．リン酸化が予想されるポリペプチド（ｉ）とビオチン標識された化合物（ｉｉ）と抗ビオチン抗体（ｉｉｉ）とを接触させ、（ｉ）と（ｉｉ）と（ｉｉｉ）を含む複合体の有無を調べることを特徴とするリン酸化検出方法。
２．ビオチン標識された化合物がポリアミン亜鉛錯体であることを特徴とする１のリン酸化検出方法。
３．ビオチン標識された化合物がポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体であることを特徴とする１又は２のリン酸化検出方法。
４．ビオチン標識された化合物が式（Ｉ）に記載される構造を含むことを特徴とする１〜３のいずれかのリン酸化検出方法。
【化１】
2007248055.tif 000002
５．ポリペプチドが３０アミノ酸残基以下のペプチドであることを特徴とする１〜４のいずれかのリン酸化検出方法。
６．ポリペプチドの末端にシステイン残基が付加されていることを特徴とする１〜５のいずれかのリン酸化検出方法。
７．アミノ酸配列の中に親水性化合物が挿入されてなるポリペプチドを用いることを特徴とする１〜６のいずれかのリン酸化検出方法。
８．親水性化合物がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であることを特徴とする７のリン酸化検出方法。
９．親水性化合物の分子量が１００〜１０００であることを特徴とする７または８に記載のリン酸化検出方法。
１０．親水性化合物の分子量が４００〜１０００であることを特徴とする７〜９のいずれかのリン酸化検出方法。
１１．抗ビオチン抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする１〜９のいずれかのリン酸化検出方法。
１２．ポリペプチドが基板上に固定化されていることを特徴とする１〜１１のいずれかのリン酸化検出方法。
１３．ポリペプチドが基板上にアレイ状に固定化されていることを特徴とする１２のリン酸化検出方法。
１４．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析を用いることを特徴とする１〜１３のいずれかのリン酸化検出方法。
１５．ＳＰＲ解析がＳＰＲイメージングであることを特徴とする１４のリン酸化検出方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明におけるアレイを用いた特にＳＰＲによる相互作用解析により、Ｏｎ−ｃｈｉｐでのプロテインキナーゼの活性検出のための測定系を得ることができる。アレイでの解析を行うことにより、ハイスループット化への対応も可能である点も有用である。特に製薬業界に対して、リン酸化阻害剤などの新規な創薬スクリーニングのための評価系として非常に有用なものとして期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、ＳＰＲによる相互作用解析により、Ｏｎ−ｃｈｉｐでのプロテインキナーゼによるリン酸化の網羅的な検出を行うことを特徴とする。特に、ＳＰＲを用いることにより、ラベルフリーに解析できる長所があり、一般的なチップ、アレイにおいては、放射線同位体等によるラベル手段による検出が必要なことに比べて、簡便性のみならず安全性の点でも優位である。この場合、最終的に物質が結合したかどうかだけを検出することができ、相互作用に関係のない物質が非特異的に吸着しても、誤って検出されることはない。従って、相互作用する対象物質がネガティブコントロールに対して非特異的に吸着してなければ、正確に測定できているものと判断することができる。
【０００９】
本発明において用いられる基板の素材は、特に限定されるものではないが、金、銀などの金属が好適に用いられる。なかでも、酸・アルカリ・有機溶媒などに非常に安定な金が好ましい。実際、金は上記光学的検出方法で多用される物質である。また、金を支持する物質は透明である方が好ましく、透明なガラスであることがより好ましい。透明なガラスは容易に入手できるだけでなく、ＳＰＲ測定に極めて適しているからである。
【００１０】
金属基板を形成する方法としては、金属薄層をコーティングする方法が好ましい。金属をコーティングする方法は特に限定されるものではないが、一般的に蒸着法、スパッタリング法、イオンコーティング法などが選択される。光学的な検出方法に供するために、金属薄層の厚みをナノレベルでコントロールする必要がある。金属薄層の厚みも特に限定されるものではないが、一般的には３０ｎｍから８０ｎｍの範囲で選択される。金属薄層の剥離を抑制するため、０．５ｎｍから１０ｎｍのクロム層やチタン層を予め基板にコーティングしておくことが好ましい。
【００１１】
このＳＰＲをアレイ解析技術に応用したＳＰＲイメージング法は、広範囲に偏光光束を照射し、その反射像を解析することで、物質間の相互作用の様子を、画像処理技術等を駆使することによりモニター化する方法であり、複数の物質を固定化したチップをスクリーニングすることや、表面に吸着する物体のモルホロジーを高感度に観察することが可能である。ＳＰＲイメージング法においては、反射像を解析するためにチップに広範囲で偏光光束を照射し、かつ光束の照度を十分に確保するための手段が必要である。図１においてその一例を示した。偏光光束の照度は明るいほどセンサーの感度が上昇してより好ましい。
【００１２】
光源の種類は特に限定されるものではないが、ＳＰＲ共鳴角の変化が特に敏感になる近赤外光を含む光を用いるのが好ましい。具体的には、メタルハライドランプ、水銀ランプ、キセノンランプ、ハロゲンランプ、蛍光灯、白熱灯などの広範囲に光を照射することのできる白色光源を用いることができるが、なかでも得られる光の強度が十分に高く、光の電源装置が簡易で安価なハロゲンランプが特に好ましい。
【００１３】
通常の白色光源はフィラメント部に光の明暗ムラが生じる欠点がある。光源の光をそのまま照射すると、反射して得られる像に明暗ムラが生じ、スクリーニングやモルホロジー変化を評価するのが困難となる。したがって、チップに均一に光を照射する手段として、光をピンホールに通してから平行光にする方法が好ましい。ピンホールを通す手段は、明るさの均一な光束を得る手段としては好ましいが、そのままピンホールに光を通すと照度が低下する欠点がある。そこで、十分な照度を確保する手段として、ピンホールと光源の間に凸レンズを設置し、集光してピンホールを通す方法を用いることが好ましい。
【００１４】
白色光源は放射光であるため、集光する前に凸レンズを用いて平行光にする必要がある。凸レンズの焦点距離近傍に光源を設置することで、平行光を得ることができる。もう一枚凸レンズを設置し、そのレンズの焦点距離近傍にピンホールを設置することで集光した光をピンホールに通すことが可能である。ピンホール内で交差し、通過した光はカメラ用のＣＣＴＶレンズで平行光とするが、その際に得られる平行光束の断面面積は１０〜１０００ｍｍ２に調節するのが好ましい。この方法によって広範囲にわたるスクリーニングやモルホロジー観察が可能となる。
【００１５】
相互作用をモニターする際に、上記偏光光束は物質あるいは物質の集合体が固定化されている金属薄膜の反対面に照射される。上記偏光光束は物質もしくは物質の集合体が固定化されている金属薄膜の反対面に照射され、その反射光束が得られる。金属薄膜からの反射光束は近赤外波長の光干渉フィルターを通し、ある波長付近の光のみを透過させてからＣＣＤカメラにより撮影される。
【００１６】
光干渉フィルターの中心波長は、ＳＰＲの感度が高い６００〜１０００ｎｍが好ましい。光干渉フィルターの透過率が極大時の半分になる波長の波長幅を半値巾と呼ぶが、半値巾は小さい方が波長の分布がシャープとなり好ましく、具体的には半値巾１００ｎｍ以下が好ましい。光干渉フィルターを通してＣＣＤカメラで撮影された像はコンピュータに取り込まれ、ある部分の明るさの変化をリアルタイムで評価することや、画像処理により全体像の評価が可能である。こうして複数の物質を固定化したチップをスクリーニングすることや、表面に吸着する物体のモルホロジーを高感度に観察することができる。
【００１７】
本発明において用いるＳＰＲ用のチップは好ましくは透明な基板上に金属薄膜が形成された金属基板からなり、上記金属薄膜上に直接的もしくは間接的に、化学的もしくは物理的に、物質もしくは物質の集合体が固定化されているスライドが用いられる。基板の素材としては特に限定されるものではないが、透明なものを用いるのが好ましい。具体的にはガラス、あるいはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、アクリルなどのプラスチック類が挙げられるが、中でもガラスが特に好ましい。
【００１８】
基板の厚さは０．１〜２０ｍｍ程度が好ましく１〜２ｍｍ程度がより好ましい。金属薄膜からの反射像を評価する目的を達成するために、ＳＰＲ共鳴角はできるだけ小さい方が撮影される画像がひしゃげる恐れがなく解析がしやすい。したがって、透明基板あるいは透明基板とそれに接触するプリズムの屈折率ｎＤは１．５以上、好ましくは１．６以上であることが好ましい。
【００１９】
本発明においては、ポリペプチドが上述したような基板上に固定化されたアレイを用いる。ポリペプチドは、プロテインキナーゼの基質として機能しうるようなアミノ酸配列を含有するものを少なくとも１つ、好ましくは異なる種類のプロテインキナーゼによりリン酸化を受けるアミノ酸配列のものを複数種が用いられる。更には、測定に関する信頼性を確認するために、予めリン酸化されたアミノ酸残基を含むもの（ポジティブコントロール）、あるいはネガティブコントロールも同じ基板上に固定化されているのが好ましい。ネガティブコントロールを用いる場合は、リン酸化部位がセリン残基、スレオニン残基の場合はアラニン残基に、リン酸化部位がチロシン残基の場合はフェニルアラニン残基に置換されたものが好ましい。ポリペプチドの大きさは特に限定されるものではなく、高分子量の蛋白質を用いることも可能であるが、合成のしやすさ、取り扱いやすさ、保存安定性などの点では、比較的低分子量のペプチドを用いる方が好ましい。ここでペプチドとは一般的に用いられる意味のものを指し、アミノ酸が２個以上ペプチド結合により連結されたものである。そのアミノ酸残基の数は特に限定されないが、通常は５〜６０残基程度であり、７〜３０残基程度が好ましく、１０〜２５残基程度がより好ましい。
【００２０】
本発明のペプチドアレイにおけるポリペプチドの固定化方法は特に限定されるものではなく、ペプチド配列におけるアミノ基やチオール基のような官能基を介した方法、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグなどのアフィニティ結合を利用する方法などが挙げられる。この中では、特にチオール基を介してポリペプチドを固定化する方法が、特異性、感度の両面から特に好ましい。
【００２１】
固定化されるポリペプチドのアミノ酸配列において少なくとも１箇所以上のシステイン残基が存在することが好ましい。システイン残基は固定化されるペプチドが本来の機能を奏するために必要なアミノ酸配列として必須な残基として存在している場合であっても、あるいはポリペプチドが本来の機能を奏するために必要なアミノ酸配列に対してさらに付加された場合であってもよい。固定化されるポリペプチドにおけるシステイン残基の存在位置は特に限定されないが、好ましくは少なくとも一方の末端に、より好ましくは一方の末端のみに付加されてなる方がよい。一方の末端にシステイン残基を付加させる場合、システイン残基のみを付加してもよいが、固定化されたポリペプチドの自由度を上げることにより作用させる物質との相互作用の効率を高めるためにスペーサーとして１乃至数残基のアミノ酸配列をさらに付加させてもよい。スペーサー部分のアミノ酸配列は特に限定されないが、なかでもグリシン残基及び／又はアラニン残基もしくはセリン残基が１乃至数個の配列を付加させることが特に好ましい。
【００２２】
本発明においては、上記基板に固定化される部位と基質配列部位との間にスペーサーとして親水性化合物が挿入されているものを用いるのが特に好ましい。親水性化合物の分子量は特に限定されないが、１００〜１０００が好ましく、４００〜１０００がより好ましい。また、上記親水性化合物とともに、アミノ酸残基数が２〜１０個、より好ましくは２〜６個からなるスペーサー配列を更に付加させてもよい。スペーサー配列を構成するアミノ酸残基の種類は特に限定されるものではないが、高次構造の形成を起こしにくいアミノ酸を含むことが好ましい。具体的には、少なくとも１つはグリシン残基を含むことが好ましい。より好ましくは、１残基のグリシン（Ｇ）、２残基のグリシン（ＧＧ）、グリシンとアラニン（ＧＡもしくはＡＧ）、あるいはグリシンとセリン（ＧＳもしくはＳＧ）残基の繰り返しを１回以上、更に好ましくは２回以上含んでなる。
【００２３】
ここで、親水性化合物とは水に可溶もしくは水に膨潤する性質をもつ、繰り返し単位をもつ化合物のことをいうものであり、合成物であっても天然物であってもよい。具体的に例示すると、親水性高分子としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）アクリル酸塩、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリエチレンイミン、ポリビニルピロリドン、カルボン酸もしくはその塩やスルホン酸もしくはその塩を含有するモノマーまたはポリエチレングリコール等の親水性部分を共重合させたポリエステルやポリウレタン、カルボキシメチルセルロース、さらにはキトサン、カラギーナン、グルコマンナンなどの多糖類が挙げられる。なかでも、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が特に好ましい。こうしたスペーサーを付加させることにより、固定化された基質ペプチドの自由度を大きく向上させることができ、その結果としてプロテインキナーゼの固定化ポリペプチドへのアクセスが容易になることより、受けるリン酸化作用の効率をより高めることが可能となる。
【００２４】
また、固定化されるポリペプチドに対して、チオール基を有する化合物が１箇所以上のいずれかのアミノ酸残基において化学結合されている状態のものを用いてもよい。該化合物の結合箇所も特に限定はされないが、いずれかの末端のアミノ酸残基に結合されていることが好ましい。また、親水性化合物の挿入される位置に関しても、固定化部位とリン酸化を受ける部位との間であれば、特には制限されるものではないが、固定化部位に近接している方がより好ましい。親水性化合物の挿入されたペプチドの合成方法も特に限定されるものではなく、例えば市販されているペプチド合成用の保護基で修飾されている化合物を用いることにより容易に得ることが可能である。保護基の種類も特に限定されるものではなく、Ｆｍｏｃ基、ｔＢｏｃ基などの一般的なものが用いられる。
【００２５】
本発明において、チオール基を介してポリペプチドを固定化する場合、予めアミノ基を表面に導入した後、スクシンイミド（ＮＨＳ）基もしくは硫酸スクシンイミド基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するヘテロ二官能型架橋剤を用いることが特に好ましい。このようなヘテロ二官能型架橋剤としては、ＰＥＧのような親水性高分子の両端がＮＨＳ基とＭＡＬ基で修飾されたものを用いることも可能であるが、ペプチドの固定化収率を向上させるためには、より低分子量のものを用いてもよい。具体的には、式（ＩＩ）に示す化合物Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（以下、ＳＭＣＣと示す。）もしくは式（ＩＩＩ）に示す化合物Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（以下、ＳＳＭＣＣと示す。）が挙げられる。なお、式（ＩＩ）もしくは式（ＩＩＩ）に示す化合物と完全に同一構造のものだけを指すのではなく、その機能を損なわない範囲でアナログ化された化合物をも包含する。また、本発明においてはＳＭＣＣ及びＳＳＭＣＣのいずれも適用することが可能であるが、水に対する溶解性の点からは、緩衝液のような水系で反応させる場合においてはＳＳＭＣＣを用いる方がより好ましい。ペプチドの溶解性に応じて、両方を使い分けることが可能である。
【００２６】
【化２】
2007248055.tif 000003
【００２７】
【化３】
2007248055.tif 000004
【００２８】
上述したような低分子量化合物を適用することにより、特に高分子量の物質を架橋剤として用いる場合と比べて、ポリペプチドのチップへの固定化効率が格段に高くなるため標的物質との結合効率も向上して、結合によるシグナルがより鮮明になるという効果を奏するものである。また、非特異的な影響に関してもほとんど問題とならず、いわゆるＳ／Ｎ比を大きくすることができる点で有利である。しかしながら、本発明において架橋剤の種類は、特にこれらに限定されるものではない。
【００２９】
上記ＳＭＣＣもしくはＳＳＭＣＣをチップ上に導入させてマレイミド表面を形成させるためには、ＳＭＣＣにおけるもう一方の端に有するスクシンイミド基あるいはＳＳＭＣＣにおけるもう一方の端に有する硫酸スクシンイミド基と反応性を有する官能基、具体的にはアミノ基を予めチップ上に導入させておく必要がある。チップ上にアミノ基を導入する手段は特に限定されるものではない。基板表面に分子を整列させる自己組織化表面の手法、反応試薬を用いて導入する方法、官能基を有する物質をチップ上にコーティングする手段などが挙げられる。また、表面に導入しておいた官能基を起点として、架橋剤を用いてアミノ基を導入する手段なども含まれる。
【００３０】
本発明において用いられるアレイは、ポリペプチドの固定化されていない部分（バックグラウンド部）が、式（ＩＶ）に示すような化合物によりコーティングされていることが好ましい。式（ＩＶ）においてｍは１〜２０の整数、ｎは１〜１０の整数を示す。ｍの値は、２〜１０の範囲がより好ましく、４〜８の範囲が更に好ましい。ｎの値は、２〜８の範囲がより好ましく、３〜６の範囲が更に好ましい。この化合物によりバックグラウンド部をコーティングすることにより、バックグラウンド部における非特異的吸着を非常に効果的に抑制することが実現される。また、本発明に用いられるアレイは、基板の製造ロットや処理条件などの様々な変動要因に依存されるデータの再現性も向上し、非常に安定な測定データを得ることが可能である。
【００３１】
【化４】
2007248055.tif 000005
【００３２】
しかし、ラベルフリーな光学的検出方法においては、どのような物質がチップ上に吸着してもシグナルとして検出される。すなわち、測定対象ではない物質が非特異的に吸着するのと、特異的な吸着を区別することが難しい。よって、よりシビアに非特異的な吸着を抑制する手段が求められるため、上記の固定化方法は非常に効果的である。
【００３３】
ＥＬＩＳＡ法やラベル物質を用いる相互作用解析方法においてはブロッキング方法として牛血清アルブミンやカゼインなどによる物理吸着が一般的に選択されている。物理吸着の方法は容易ではあるが、安定しておらず、経時的にチップ表面から脱離する場合がある。上記の光学的検出方法にはブロッキング剤の脱離さえも検出するため、共有結合によるブロッキングを行うことが好ましい。特に未反応のマレイミド基表面をブロッキングする場合は、チオール基を有する化合物を用いるのが好ましく、特にＰＥＧ（ポリエチレングリコール）の誘導体が好適に用いられる。
【００３４】
本発明は、アレイ上におけるリン酸化の検出を目的とする。したがって、上述のようにして得られたアレイ上で、プロテインキナーゼを含有するもしくは含有すると考えられる溶液を作用させるに際しては、該プロテインキナーゼ活性を阻害するもしくは阻害すると考えられる化合物を該溶液中に共存させることになる。プロファイリングの対象となるプロテインキナーゼは市販されているような試薬であってもよいが、細胞由来の抽出液中に既に含まれる、もしくは含まれると推定されるものを用いることも可能である。例えば、バッファーもしくは細胞抽出液または両者混合液中にプロテインキナーゼ試薬もしくは細胞抽出液中にすでに含まれるプロテインキナーゼとヌクレオシド三リン酸（ＡＴＰ）を加えたものを直接アレイに作用させることにより固定化基質のリン酸化を行うことができる。リン酸化の条件はプロテインキナーゼの種類により変動するが、通常は１０〜４０℃程度、好ましくは２０〜４０℃程度の温度で５分〜８時間程度、好ましくは１０分〜５時間程度反応させることで、固定化されたペプチドをリン酸化することができる。また、必要に応じて反応液中には、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋などのリン酸化を補助、促進する物質を共存させてもよい。
【００３５】
また、本発明は、アレイ上でのリン酸化阻害活性の検出を目的とすることも可能である。この場合は、プロテインキナーゼを含有するもしくは含有すると考えられる溶液を作用させるに際しては、該プロテインキナーゼ活性を阻害するもしくは阻害すると考えられる化合物を該溶液中に共存させることになる。共存される阻害剤は特に限定されるものではないが、ペプチドもしくは蛋白質であってもよいし、その他の低分子化合物であってもよい。低分子化合物としては、分子量２，０００以下のものが挙げられるが特に制約されない。
【００３６】
ところで、ポリペプチドのリン酸化に際しては、分子量としては僅かに８０の増大しか伴わないため、ＳＰＲによる検出を試みる場合には、直接的な検出シグナルを得ることは困難である。そこで、間接的にリン酸基もしくはリン酸化されたアミノ酸に特異的に結合しうる物質もしくは化合物を検出プローブとして用いる必要がある。本発明においては、ビオチン修飾された化合物と抗ビオチン抗体を組み合わせて用いることを特徴とする。
【００３７】
リン酸基もしくはリン酸化されたアミノ酸に特異的に結合しうる物質もしくは化合物としては、特に限定されるものではないが、リン酸化を特異的に感度よくモニターするためにキレート化合物を用いる。キレート化合物とは一般に多座配位子ないしキレート試薬が金属イオンに配位して生じた錯体をいうものを指すが、特にリン酸に選択的かつ可逆的に結合する性質を有する化合物が好ましい。具体的には、例えばポリアミン亜鉛錯体が好適に用いられる。ポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体が特に好ましく、更に、二核亜鉛（ＩＩ）錯体を基本構造にもつヘキサアミン二核亜鉛（ＩＩ）錯体を用いることがより好ましい。
【００３８】
このような化合物の典型としては、式（Ｉ）に示されるような、１，３−ビス［ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］−２−ハイドロキシプロパノラート（ＩＵＰＡＣ名：１，３−ｂｉｓ［ｂｉｓ（２−ｐｙｒｉｄｙｌｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］−２−ｐｒｏｐａｎｏｌａｔｏｄｉｚｉｎｃ（ＩＩ） ｃｏｍｐｌｅｘ）を基本骨格とするポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体（ただし、プロパノール骨格の水酸基はアルコラートとして二つの亜鉛２価イオンの架橋配位子になっている）が挙げられるが、本発明は特にこの化合物に限定されるものではない。
【００３９】
【化５】
2007248055.tif 000006
【００４０】
本発明で用いられる錯体は、一般的な化学合成技術を利用して合成することが可能であるが、市販の化合物を原料としても合成することができる。例えば、上記式（Ｉ）で示される化合物（Ｚｎ２Ｌ）は、市販の１，３−ビス［ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］−２−ハイドロキシプロパンと酢酸亜鉛を原料として次の方法により合成することができる。１，３−ビス［ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］−２−ハイドロキシプロパン４．４ｍｍｏｌのエタノール溶液（１００ｍｌ）に１０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（０．４４ｍｌ）を加え、次いで酢酸亜鉛二水和物（９．７ｍｍｏｌ）を加える。溶媒を減圧留去することにより褐色のオイルを得ることができる。この残渣に水１０ｍｌを加えて溶解後、１Ｍ過塩素酸ナトリウム水溶液（３当量）を７０℃に加温しながら滴下して加え、析出する無色の結晶を濾取し、加熱乾燥することにより式（Ｉ）の構造式で表される酢酸イオン付加体の二過塩素酸塩（Ｚｎ２Ｌ−ＣＨ３ＣＯＯ−・２ＣｌＯ４−・Ｈ２Ｏ）を高収率で得ることができる。この結晶は一分子の結晶水を含んでいる。
【００４１】
元素分析、核磁気共鳴分析、および赤外線分析により上記化学構造を確認することができる。下記にそのデータの事例を示す。
元素分析の理論値・・・Ｃ２９Ｈ３４Ｃｌ２Ｎ６Ｏ１２Ｚｎ２： Ｃ， ４０．４９； Ｈ， ３．９８；Ｎ， ９．７７
元素分析の実測値・・・Ｃ， ４０．４３； Ｈ，３．８６； Ｎ， ９．８５
１Ｈ ＮＭＲ （５００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）の結果
δ２．０４ （２Ｈ， ｄｄ， Ｊ ＝ １２．１ ａｎｄ １２．３ Ｈｚ， ＣＣＨＮ）， ２．５３（３Ｈ， ｓ， ＣＨ３）， ３．０６ （２Ｈ， ｄｄ， Ｊ ＝ １２．１ ａｎｄ １２．３ Ｈｚ，ＣＣＨＮ）， ３．７４ （１Ｈ， ｔ， Ｊ ＝ １０．４ Ｈｚ， ＣＣＨＣ）， ４．０２ − ４．３４ （８Ｈ， ｍ， ＡｒＣＨ２）， ７．５４ −７．６５ （８Ｈ， ｍ， ＡｒＨ）， ８．０６ −８．１２ （４Ｈ， ｍ， ＡｒＨ）， ８．５８（４Ｈ， ｍ， ＡｒＨ）１３Ｃ ＮＭＲ （１２５ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）の結果
δ５８．０， ６０．１， ６２．０， ６４．６，１２２．７， １２４．３， １２４．４， １２４．４， １３９．９， １４０．４， １４７．０， １４７．２， １５４．７， １５５．１
赤外線分析の結果
１６０９， １５７６， １５５６（Ｃ＝Ｏ）， １４８５， １４３９， １２６６， １１０８（ＣｌＯ４−）， １０９０（ＣｌＯ４−）， ７７０， ６２５ｃｍ−１
上記のデータは、式（Ｉ）の化合物に対して酢酸イオンが１当量と過塩素酸イオンが２当量をカウンターイオンとしてもつ物質であることを示している。
【００４２】
本発明においては、上述したような化合物にビオチンが修飾、結合されたものを用いることを特徴とする。例えば式（Ｖ）に示されるようなものが例示されるが、これに限定されるものではない。
【００４３】
【化６】
2007248055.tif 000007
【００４４】
作用されるビオチン修飾化合物の溶液濃度は特に限定されないが、通常は１μＭ〜１０Ｍ、好ましくは１０μＭ〜１Ｍ、より好ましくは１０μＭ〜１０ｍＭの範囲である。またアレイへの作用様式に関しても特に限定されないが、ビオチン修飾化合物溶液をアレイ表面全体に広がるのに必要な液量をドロップしてもよいし、溶液中にアレイを浸漬させてもよい。あるいはポンプを用いて溶液を送液しながら、アレイ表面上に溶液を接触させることにより作用させてもよい。作用温度は室温でもよいし、２０〜４０℃程度の一定温度でインキュベートさせてもよい。作用時間は１０分から２時間程度が好ましく、３０分から１時間程度がより好ましい。
【００４５】
抗ビオチン抗体に関しても、特に制約されるものではなく、ビオチンを特異的に認識する抗体であれば広く適用することが可能である。抗ビオチン抗体を作用させることにより、リン酸化されているポリペプチドに結合した上記ビオチン修飾化合物に対して抗体が結合することにより、ＳＰＲにより結合シグナルとして捉えることが可能である。抗体としてはモノクロナール抗体、ポリクロナール抗体のいずれも適用できるが、特異性の点でモノクロナール抗体の方が好ましい。抗体を作用させる際の濃度は特に限定されないが、好ましくは０．０１〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１〜５μｇ／ｍｌ、更に好ましくは０．５〜２μｇ／ｍｌ程度である。
【００４６】
抗ビオチン抗体は市販のモノクローナル抗体を購入して使用してもよいし、免疫原となるビオチン化抗原を使って免疫、細胞融合によりハイブリドーマ作製し、細胞から分泌される抗体を精製して使用してもよい。ビオチン化抗原は公知のキャリア蛋白質に公知のビオチン化試薬を作用させて作製する。キャリア蛋白としてビオチン化試薬が反応できる官能基を有していて免疫原性があれば特に限定しないが、高純度品か精製により高純度化できるものが望ましく、例えば牛血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｍｉｎ）、キーホールリンペットヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、ヤギイムノグロブリンＧを用いることができる。ビオチン化試薬は市販のビオチン化試薬が使用でき、例えばキャリア蛋白のアミノ基と反応する活性エステルタイプのＮ−シスクシイミジルＤ−ビオチン（Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  Ｄ−ＢＩＯＴＩＮ）、その水溶性を高めたスルホスクシイミジルＤ−ビオチン（Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  Ｄ−Ｂｉｏｔｉｎ）、さらに活性基とビオチン間に適当なスペーサーでのリンカー部分を挿入したものを使用してもよい。抗原ビオチン化手順は公知の方法でビオチン化することができ、例えば予め５０ｍＭ炭酸緩衝液ｐＨ８で透析したキャリア蛋白を用意し、ビオチン化試薬を適当な溶媒で溶解後、キャリア蛋白モル比として過剰となる量、例えば２０倍量をキャリア蛋白溶液に添加・攪拌の後２５℃２時間反応させ、その後未反応のビオチン化試薬を１０ｍＭ燐酸生理緩衝液で透析することにより除去し、ビオチン化抗原を得ることができる。
【００４７】
本発明のモノクローナル抗体およびハイブリドーマは、公知のモノクローナル抗体作成法例えば単クローン抗体実験マニュアル 富田朔ニ・安東民衛／編 講談社サイエンティフィク １９８７年、免疫研究法ハンドブック 藤原大美・淀井淳司／編 中外医学社 １９９６年、組織培養の技術［第３版］応用編 日本組織培養学会／編 朝倉書店 １９９９年記載内容に従い、作製することができる。
【００４８】
動物の免疫に使用する被免疫動物としては、公知のハイブリドーマ作製法に用いられる哺乳動物を使用することができる。具体的には、例えばマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマなどである。ただし摘出した抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞の入手容易性などの観点からは、マウスおよびラットを被免疫動物とするのが好ましい。また、実際に使用するマウスおよびラットの系統は特に制限はないが、マウスの場合には、例えばＢＡＬＢ／ｃ  メス  ４〜１２週令を用いることができる。
【００４９】
動物の免疫は、ビオチン化蛋白を動物の皮内、腹腔内または投与することによって行うことができる。投与スケジュールは被免疫動物の種類、個体差により異なるが、一般には、抗原投与回数２〜６回、投与間隔１〜２週間が好ましい。また抗原の投与量は動物の種類、個体差等により異なる。一般には１０―１００μｇ／匹・回程度といわれているが、投与量を変えて免疫を実施し血清中や血漿中抗体価の最も高い被免疫動物を選択することもできる。投与する際はアジュバントとよばれる免疫活性化物質と共に投与してもよい。たとえばアジュバントとして、フロイント完全アジュバンド、フロイント不完全アジュバント、ＣｐＧ ＤＮＡ，ムラミルジペプジド、リポポリサッカライドなどが挙げられる。
【００５０】
細胞融合に際して、生体内免疫の場合では上記の抗原投与スケジュールの最終免疫日から１〜５日後に被免疫動物から抗体産生細胞を含む脾臓細胞またはリンパ細胞を無菌的に取り出す。これらの脾臓細胞またはリンパ細胞からの抗体産生細胞の分離は、公知の方法に従って行うことができる。
【００５１】
細胞融合には上記の抗体産生細胞とミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞には特段の制限はなく、公知の細胞株から適宜に選択して用いることができる。ただし、融合細胞からハイブリドーマを選択する際の利便性を考慮して、その選択手続きが確立しているＨＧＰＲＴ（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ−ｇｕａｎｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）欠損株を用いるのが好ましい。すなわち、マウス由来のＸ６３−Ａｇ８（Ｘ６３），ＮＳ１−Ａｇ４／１（ＮＳ−１），Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１），Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（Ｘ６３．６５３），ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ２／０），Ｆ０等などである。
【００５２】
抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、公知の方法に従い、細胞の生存率を極度に低下させない程度の条件で適宜実施することができる。そのような方法は、例えば、ポリエチレングリコールなどの高濃度ポリマー溶液中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合する化学的方法、電気的刺激を利用する物理的方法などを用いることができる。
【００５３】
融合細胞と非融合細胞の選択は、例えば、公知のＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン）選択法により行うのが好ましい。ＨＡＴ培地や後述のクローニングなど細胞培養に使用する培地は、公知のものを使用すればよく、例えばＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、ｅＲＤＦ、ＩＭＤＭなどが使用できる。同時に動物血清や増殖因子、コンディションドメディウム、抗生物質等、蛋白質などを添加してもよいが、限界希釈などでクローニングを行う場合はこれらを組み合わせて添加することが好ましい。動物血清であれば例えばウシ胎児血清を１乃至２０％添加してもよいし、増殖因子であれば例えばＩＬ−６、インシュリン、エタノールアミン、セレン、２メルカプトエタノール、ピルビン酸、非必須アミノ酸類を添加してもよいし、コンデションメディウムであれば例えば胸腺細胞培養後の培養上清５％乃至２０％を添加してもよいし、抗生物質であれば例えばゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、ペニシリンを添加してもよいし、蛋白であれば例えばウシ血清アルブミン、カゼイン、トランスフェリンを添加してもよい。細胞を培養する温度は細胞が増殖する温度であればよいが例えば３７℃で行うことができる。培地中に炭酸水素ナトリウムを加える場合には炭酸ガス存在下例えば培地中のｐＨが中性となる炭酸ガス５％乃至１０％で培養するのが好ましい。
【００５４】
目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞のスクリーニングは、公知の酵素免疫検定法（ＥＩＡ：Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射線免疫検定法（ＲＩＡ：Ｒａｄｉｏ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、蛍光抗体法、免疫染色法などにより行うことができる。
【００５５】
スクリーニングにより選択されたハイブリドーマ細胞は、メチルセルロース法、軟アガロース法、限界希釈法などの公知の方法によりクローニングし、抗体産生に用いる。
【００５６】
以上の通りの方法によって得たハイブリドーマ細胞は、液体窒素中または−８０℃以下の冷凍庫中に凍結状態で保存することができる。細胞凍結時の細胞濃度は１ｘ１０６／ｍｌ乃至１ｘ１０７／ｍｌの範囲が好ましく、凍結時安定化剤として培地に５乃至１０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシドを添加してもよい。
【００５７】
本発明の抗体生産方法は上記の方法で作製したハイブリドーマ細胞を公知の方法で培養することによって所望のモノクローナル抗体を得ることができる。例えばマウスに免疫して作成したハイブリドーマであれば、あらかじめプリスタン等の鉱物油を投与したマウスの腹腔に該細胞を移植すると１乃至３週間でモノクローナル抗体を含んだ腹水が得られる。また例えばハイブリドーマを培地中で培養するとハイブリドーマからモノクローナル抗体が分泌され、該抗体を含んだ培養上清が得られる。必要に応じて該抗体を含んだ腹水や培養上清は公知の抗体精製手法でより純度の高いモノクローナル抗体を得ることができる。培養時に市販の無血清培地、無血清無蛋白培地を使用するとさらに純度の高いモノクローナル抗体を得ることができる。
【００５８】
抗体精製方法として例えば、硫安塩析、カラムクロマトが挙げられる。カラムクロマトに使用できる樹脂担体として例えば陰イオン交換樹脂やプロテインＡやプロテインＧ、ＰｒｏｔｅｉｎＬ、などのアフィニティクロマト樹脂、ハイドロキシアパタイト樹脂、疎水クロマト樹脂などの抗体吸着性のあるものや、架橋デキストラン樹脂やアガロース樹脂など分子量で樹脂内移動度の異なることを利用したゲルろ過担体が挙げられる。これら精製操作を行う前にモノクローナル抗体のサブタイプを調べておき適切な精製手段を選択することが望ましい。精製後の抗体は透析などの方法でｐＨ中性の緩衝液にバッファー交換を行うことが好ましく、ｐＨ中性の緩衝液として例えば生理的食塩濃度のリン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））や生理的食塩濃度のトリス緩衝液（ＴＢＳ）を用いることができる。本緩衝液のｐＨは５．５〜８．５の間が好ましい。
【００５９】
このようにして得られたモノクローナル抗体は溶液状態や凍結状態で保存することができる。液状で保存する場合は防腐剤を添加したり、０．２２μｍメッシュの滅菌フィルターなどで無菌ろ過後滅菌容器中に保存することが好ましい。防腐剤として例えば０．０５％アジ化ナトリウムを添加することができる。容器の滅菌方法は公知の方法で実施すればよく、例えばγ線照射滅菌、ＵＶ照射滅菌、オートクレーブ滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌などが挙げられる。保存容器は保存中抗体と反応しない不活性な素材を使用したものが使用でき、例えば、ガラス、ポリエチレン、ポリプロピレンである。抗体の結合活性を損なわない方法であれば保存容器表面に吸着しないよう表面加工を行った容器を使用してもよい。液状での保存温度は凍結しない温度であればよいが、蛋白変性を抑えるためできるだけ低温であることが好ましく、より好ましくは２乃至１０℃である。また凍結を防止することのできる濃度で凍結防止剤を添加するとさらに低温で保存することもでき、例えば終濃度５０％のグリセロールを添加すると−２０℃でも凍結することなく液状で保存することができる。凍結状態で保存する場合は−２０℃以下、より好ましくは−３０℃以下で保存することが好ましい。保存時の抗体濃度は沈殿を生じない濃度で設定することができるが、好ましくは０．１乃至５ｍｇ／ｍｌである。また安定化剤として蛋白質、水溶性ポリマー高分子、界面活性剤、糖類、糖アルコールを添加することもできる。安定化蛋白質の例としてウシ血清アルブミンやゼラチンなどが挙げられ、保存中沈殿が生じない濃度で添加することができる。濃度範囲としてより好ましくは０．１乃至５ｍｇ／ｍｌである。
【００６０】
上記プロテインキナーゼとしては、種々のチロシンキナーゼあるいはセリン／スレオニンキナーゼが挙げられる。これらプロテインキナーゼの種類については特に限定されるものではなく、基本的にはあらゆる種類のプロテインキナーゼに対して適用することが可能である。
【００６１】
上述したような本発明の方法により、Ｏｎ−ｃｈｉｐでリン酸化反応を行うことにより、プロテインキナーゼ活性のプロファイリングによる網羅的な解析を実現することができる。特にリン酸化の阻害活性をモニターすることにより、創薬のスクリーニングに有用な技術を提供することが実現される。
【実施例】
【００６２】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に特に限定されるものではない。
【００６３】
［実施例１］
（ＳＰＲアレイの作製）
式（ＶＩ）に示すような、末端官能基がチオール基である直鎖型チオールＰＥＧ試薬（ＳｅｎｓｏＰａｔｈ製ＳＰＳＰＴ−００１１）を１ｍＭの濃度でエタノール７ｍｌに溶解させた。直鎖型チオールＰＥＧの分子量は３３６．５４である。特に、金に対する金属結合性を示す。
【００６４】
【化７】
2007248055.tif 000008
【００６５】
１８ｍｍ四方、２ｍｍ厚のＳＦ１５ガラススライドにクロムを３ｎｍ蒸着し、金を４５ｎｍ蒸着した金蒸着スライドを、上記直鎖型ＰＥＧチオール溶液に３時間浸漬させ、金基板全体にＰＥＧチオールを結合させた。
【００６６】
このスライドの上にフォトマスクを載せ、５００Ｗ超高圧水銀ランプ（ウシオ電機製）で２時間照射し、ＵＶ照射部のＰＥＧチオールを除去した。フォトマスクは５００μｍ四方の正方形の穴が９６個有し（８個×１２個のパターンからなる。）、穴の中心間のピッチは１ｍｍに設計されている。フォトマスクの穴があいている部分はＵＶ光が透過し、スライドに照射されてパターン化される。照射されなかった部分はＰＥＧが残り、チップのバックグラウンド（Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）部分としてレファレンス部として機能する。
【００６７】
８−Ａｍｉｎｏ−１−Ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ， Ｈｙｄｒｏｃｈｒｏｌｉｄｅ（８−ＡＯＴ，同仁化学研究所製）の１ｍＭエタノール溶液に１時間浸漬し、ＵＶ照射部に８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させた。ＳＳＭＣＣ（ピアス製）を２０ｍＭ    リン酸緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に０．４ｍｇ／ｍｌで溶解し、金表面の８−ＡＯＴに１５分間反応させた。８−ＡＯＴのアミノ基とＳＳＭＣＣのＮＨＳ基とが反応し、ＭＡＬ基は未反応のまま残るため、ＰＥＧを介してマレイミド基を表面に導入することができた。
【００６８】
上記のようにして得られた表面に、ｃＳｒｃキナーゼの基質となるアミノ酸配列からなるペプチド（チロシン型；配列番号１）、そのポジティブコントロール（リン酸化チロシン型；配列番号２）、ＰＫＡの基質となるアミノ酸配列からなるペプチド（セリン型；配列番号３）、そのネガティブコントロール（アラニン型；配列番号４）、そのポジティブコントロール（リン酸化セリン型；配列番号５）を、いずれもリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に１ｍｇ／ｍｌで溶解して、ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ（登録商標）自動スポッター（東洋紡績製）を用いて１０ｎｌずつスポッティングを行った。いずれのペプチドにおいても、基質としてのアミノ酸配列においてＣ末端のシステイン残基が固定化のために付加されており、かつ２残基のグリシン残基がスペーサーとして挿入されてなる。その後、ウェットな環境下で室温、１６時間静置させて固定化反応を行った。チップの表面に形成させたマレイミド基と基質ペプチド末端のシステイン残基が有するチオール基とが反応し、基質ペプチドを共有結合的に表面に固定化することができた。
【００６９】
（未反応マレイミド基のブロッキング）
基質ペプチドを固定化した表面をリン酸緩衝液で洗浄した後、未反応のマレイミド基をブロッキングするために、片末端の官能基がチオール基、もう一方の官能基がメトキシ基であるＰＥＧチオール（日本油脂製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）  ＭＥＳＨ−５０Ｈ）を１ｍＭ濃度になるようにリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に溶解して、２５０μｌをチップ上に注出し、室温で１時間反応させた。ここで用いたＰＥＧチオールの分子量は５，０００である。
【００７０】
［実施例２］
（ＳＰＲ解析によるリン酸化ペプチドの検出）
上記処理を施されたアレイをＰＢＳ及び水でアレイの洗浄を行い、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体を作用させた。ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体としては、以下の式（Ｖ）に示されるＰｈｏｓ−ｔａｇ（登録商標）ＢＴＬ−１０４（株式会社ナード研究所）を用いた。Ｐｈｏｓ−ｔａｇ（登録商標）ＢＴＬ−１０４は４μｇ／ｍｌ濃度とし、溶解液には０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０，１０％（ｖ／ｖ）エタノール、０．２Ｍ  硝酸ナトリウム、１ｍＭ  硝酸亜鉛を含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた。インキュベーションは室温で３０分間行った。
【００７１】
【化８】
2007248055.tif 000009
【００７２】
その後、ＰＢＳ及び水で３回ずつアレイの洗浄を行い、アレイ表面を乾燥した後、ＳＰＲイメージング機器（ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ（登録商標）：東洋紡績製）にセットし、ランニングバッファーとして１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．４；３００ｍＭ  ＮａＯＨ）を１００μｌ／ｍｉｎの速度でフローセル内に流した。ＳＰＲからのシグナルが安定したのを確認した後に、４μｇ／ｍｌ濃度の抗ビオチン抗体（ロシュ・ダイアグノスティックス製Ａｎｔｉ−Ｂｉｏｔｉｎ）溶液をＳＰＲ装置内のセルへ注入して作用させた。その際のＳＰＲシグナルの変化を観察して、シグナル上昇がプラトー状態になった時点で再度ランニングバッファーを送液して洗浄を行った。シグナル変化の観察は、各基質のスポット部位に加え、Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄにおいても実施した。
【００７３】
（観察の結果と考察）
ＳＰＲイメージングを行った結果を図１に示した。ＳＰＲ解析に際して、ＣＣＤカメラによる画像の取り込みを５秒ごとに行い、抗体反応後における時点で取り込まれた画像から、反応前の時点での画像を画像演算処理ソフトウエアＳｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ  Ｃｏｒｐ．製）を用いて引き算処理を行った結果である。
【００７４】
図１に示したように、リン酸化されているセリン残基もしくはチロシン残基を有するペプチド(Ｎｏ．２及び６)においてのみ抗体の結合シグナルを確認することができている。この手法がリン酸化の検出に有用であることが示されている。
【００７５】
［実施例３］
（ＳＰＲ解析によるＰＫＡによるリン酸化の検出）
ＰＥＧを介してマレイミド基を金表面に導入するところまでは実施例１と同様に行い、実施例１で用いたのと同じＰＫＡ基質ペプチド３種（配列番号３，４，５）と、グリシン２残基の替わりにＰＥＧが挿入されたものでセリン型、リン酸化セリン型を固定化した。ＰＥＧ挿入ペプチドは、ペプチド合成に際して、Ｆｍｏｃ修飾されたＰＥＧ誘導体として、Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ製Ｎ−Ｆｍｏｃ−ａｍｉｎｏ−ｄＰＥＧ−ａｃｉｄを用いて、そのＰＥＧ鎖長（単鎖の繰り返し数）が１２のものを用いて得ることができた。これらペプチドを実施例１と同様にして、いずれもリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に１ｍｇ／ｍｌで溶解して、スポッティングを行い、ウェットな環境下で室温、１６時間静置させて固定化反応を行った。得られたペプチドアレイにおける未反応マレイミド基のブロッキングも、実施例１と同様にして行った。
【００７６】
上記のようにブロッキングを行ったアレイ上を用いてＰＫＡによるリン酸化を行った。ＰＫＡ溶液４００μｌをアレイ上にドロップして、３０℃で２時間の反応を行った。ＰＫＡ溶液（０．２ｕｎｉｔ／μｌ濃度）の組成は、ｃＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｃａｔａｔｙｔｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ（８０ｕｎｉｔ／μｌ；濃度プロメガ製）１μｌ、５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）３７５μｌ、１Ｍ  塩化マグネシウム溶液２０μｌ、１ｍＭ  ＡＴＰ４μｌとした。
【００７７】
上記リン酸化を行ったアレイをＰＢＳ及び水でアレイの洗浄を行い、実施例２と同じ方法、条件によりＳＰＲイメージングによる観察を行った。結果を図２に示した。
【００７８】
（観察の結果と考察）
予めリン酸化されているペプチド（Ｎｏ．４及び６）においては強い結合シグナルが見られ、それと対比して妥当なレベルでセリン型基質ペプチド（Ｎｏ．３及び５）においてもＳＰＲシグナルの上昇を確認することができる。ＰＥＧ挿入のセリン型ペプチドにおいて、特に強い結合シグナルが確認されている。これは、ＰＥＧの挿入によりスペーサー効果により固定化ペプチドのモビリティが増大することにより、ＰＫＡ酵素の固定化された基質ペプチドへのアクセスもしくは抗体のリン酸化された固定化ペプチドへのアクセスが容易になった影響であると考えられる。上記のように、ビオチン修飾された化合物と抗ビオチン抗体とを組合せてＳＰＲ解析に適用することにより、Ｏｎ−ｃｈｉｐでのリン酸化の検出に有用であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明を利用することにより、多種類のプロテインキナーゼシグナルを網羅的に解析することができ、機能未知な遺伝子の導入、あるいは薬物投与に伴う細胞内のプロテインキナーゼ動態を効果的にプロファイリングすることができる。これにより新規な遺伝子からの機能解析、新薬探索へのアプローチといったゲノム創薬への展開が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】実施例２において、抗ビオチン抗体を作用させた際のＳＰＲイメージングを行った結果を示す図である。リン酸化されているペプチドへの特異的な抗体の結合が示される。
【図２】実施例３において、ＰＫＡによる固定化ペプチドのＯｎ−ｃｈｉｐでのリン酸化の様子をＳＰＲイメージングにより観察した結果を示す図である。ＰＫＡ基質ペプチドにおいてのみ、抗体の結合シグナルが確認されている。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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