(57)【要約】【課題】β−ヘキソサミニダーゼのサブユニットαとサブユニットβを同時に大量生産するための新しい手段を提供する。【解決手段】(i)  蛍光タンパク質Xとサブユニットαとを発現する発現ベクターXαを構築する工程；(ii)  蛍光タンパク質Yとサブユニットβとを発現する発現ベクターYβを構築する工程；(iii)  発現ベクターXαと発現ベクターYβを動物細胞にトランスフェクションする工程；(iv)  フローサイトメトリー法によって、蛍光タンパク質Xと蛍光タンパク質Yとを発現する細胞集団を単離する工程；(v)  単離した細胞集団の培養物からサブユニットαとサブユニットβを回収する工程、を含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−ヘキソサミニダーゼのサブユニットαとサブユニットβを同時に大量製造する方法であって、
(i)  蛍光タンパク質Xとサブユニットαとを発現する発現ベクターXαを構築する工程；
(ii)  蛍光タンパク質Yとサブユニットβとを発現する発現ベクターYβを構築する工程；
(iii)  発現ベクターXαと発現ベクターYβを動物細胞にトランスフェクションする工程；
(iv)  フローサイトメトリー法によって、蛍光タンパク質Xと蛍光タンパク質Yとを発現する細胞集団を単離する工程；
(v)  単離した細胞集団の培養物からサブユニットαとサブユニットβを回収する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
蛍光タンパク質Xとβ−ヘキソサミニダーゼのサブユニットαとを発現する発現ベクターXαと、蛍光タンパク質Yとβ−ヘキソサミニダーゼのサブユニットβとを発現する発現ベクターYβとからなるベクターセット。
【請求項３】
請求項２のベクターセットを細胞内に保有し、β−ヘキソサミニダーゼのサブユニットαとサブユニットβを同時に大量産生する哺乳動物細胞。
【請求項４】
請求項１の方法により製造された組換え体サブユニットαと組換え体サブユニットβとからなるβ−ヘキサミニダーゼ（αβ）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、β−ヘキソサミニダーゼとその量産方法に関するものである。さらに詳しくは、本願発明は、ヒトβ−ヘキソサミニダーゼ（β-Hex）の欠損に基づき、脳内での糖脂質GM2ガングリオシドの過剰蓄積と中枢神経障害を伴って発症するGM2ガングリオシドーシスの組換え酵素補充療法の開発、該補充療法に用いる酵素ヒトβ−Hexとその量産方法、この酵素を量産するための発現ベクターとその構築方法などの提供に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、遺伝性リソソーム酵素欠損症は不治の病とされ有効な治療法が無かったが、近年、ゴーシェ病やファブリー病などのリソソーム病患者に対し、哺乳単離培養細胞で大量発現した組換え酵素の補充療法が有効性を示すことが明らかになり、組換え酵素製剤として実用化されるに至っている。
【０００３】
GM2ガングリオシドーシスは、リソソーム酵素の一種であるβ−ヘキソサミニダーゼ(β-Hex)の欠損により、脳内での糖脂質GM2ガンダリオシドの過剰蓄積と中枢神経障害を伴って発症する疾患であり、また単一遺伝病の代表例でもある。
【０００４】
β-Hexは異なる２種の遺伝子にコードされたサブユニットα（β-Hexα）およびβ（β-Hexβ）から構成され、両者の組み合わせによりHexA(αβ)、HexB(ββ)およびHexS(αα)の3種のアイソザイムが存在するが、この内HexA(αβ)のみがGM2ガングリオシドを基質として分解することができる。従ってGM2ガングリオシドーシスの酵素補充療法を開発するためには、各々αおよびβをコードする両遺伝子を同時に発現する培養細胞株の樹立が必要になる。通常、複数の遺伝子の同時発現株の樹立は、異なる薬剤耐性遺伝子の導入を利用して二重に選別する方法が取られるが、自然耐性株の出現や導入遺伝子の脱落等の問題が生じる。
【０００５】
なお、ヒトβ-Hex遺伝子の発現ベクターとしては、lentivirus（FIV）系ベクターにヒトβ-Hex遺伝子を挿入した発現ベクター（特許文献1）が知られている。しかしながら、この特許文献１の発現ベクターは遺伝子治療用ベクターであり、β-Hexαサブユニットおよびβ-Hexβサブユニットを同時に大量生産するための宿主−ベクター系は従来知られていない。
【特許文献１】国際公報WO 03/092612号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本願発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、β-Hexαサブユニットおよびβ-Hexβサブユニットを同時に大量生産するための新しい手段を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第1の発明は、β-Hexαサブユニットとβ-Hexβサブユニットを同時に大量製造する方法であって、
(i)  蛍光タンパク質Xとβ-Hexαサブユニットとを発現する発現ベクターXαを構築する工程；
(ii)  蛍光タンパク質Yとβ-Hexβサブユニットとを発現する発現ベクターYβを構築する工程；
(iii)  発現ベクターXαと発現ベクターYβを動物細胞にトランスフェクションする工程；
(iv)  フローサイトメトリー法によって、蛍光タンパク質Xと蛍光タンパク質Yとを発現する細胞集団を単離する工程；
(v)  単離した細胞集団の培養物からβ-Hexαサブユニットとβ-Hexβサブユニットを回収する工程、
を含むことを特徴とする方法である。
【０００８】
第２の発明は、蛍光タンパク質Xとβ-Hexαサブユニットとを発現する発現ベクターXαと、蛍光タンパク質Yとβ-Hexαβサブユニットとを発現する発現ベクターYβとからなるベクターセットである。
【０００９】
第３の発明は、前記第２発明のベクターセットを細胞内に保有し、β-Hexαサブユニットとβ-Hexβサブユニットを同時に大量産生する哺乳動物細胞である。
【００１０】
第４の発明は、前記第１発明の方法により製造された組換え体β-Hexαサブユニットと組換え体β-Hexβサブユニットとかなるβ-Hexαβである。
【００１１】
なお、本願発明において、「ポリヌクレオチド」とは、プリンまたはピリミジンが糖にβ-N-グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ATP、GTP、CTP、UTP；またはdATP、dGTP、dCTP、dTTP）が複数個結合した分子を言う。「タンパク質」とは、アミド結合（ペプチド結合）または非天然の残基連結によって互いに結合した複数個のアミノ酸残基から構成され、特定の機能を有する分子を意味する。また、「遺伝子」とは、タンパク質を発現するポリヌクレオチド分子を意味する。
【００１２】
この出願の各発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。また本願発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はSambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等に記載されている。さらに、この発明における用語は基本的にはIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。
【発明の効果】
【００１３】
従来の薬剤耐性遺伝子を利用する遺伝子同時発現株の単離法では、自然耐性を示す細胞の出現や継代中の遺伝子の脱落により、効率よくβ-Hexを恒常高発現する細胞株の単離と維持が困難であった。これに対して、本願発明方法では、目的遺伝子の非発現細胞の混入を避けることができ、また遺伝子脱落によって酵素発現量の低下が起こった場合にも、遺伝子導入細胞群を対象としたフローサイトメトリー工程によってβ-Hexを恒常高発現する細胞株を選別することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
発現ベクターXαは、蛍光タンパク質Xとβ-Hexαサブユニットとを同時に発現する発現ベクターである。例えば、蛍光タンパク質Xをコードするポリヌクレオチドと、その発現制御配列（プロモーター）とからなる発現カセットXと、β-Hexαサブユニットをコードするポリヌクレオチドとそのプロモーターとからなる発現カセットαとを、動物細胞発現用のベクターに組込むことによって構築することができる。また、実施例に例示したようなIRESバイシストロン性発現ベクターに蛍光タンパク質Xをコードするポリヌクレオチドとβ-Hexαサブユニットをコードするポリヌクレオチドとを組込めば、ベクターに備わっている同一のプロモーターから蛍光タンパク質Xとβ-Hexαサブユニットとを同時発現させることもできる。
【００１５】
蛍光タンパク質Xとしては、緑色蛍光タンパク質（GFP）、赤色蛍光タンパク質（RFP）、黄色蛍光タンパク質（YFP）等であり、それぞれ市販の蛍光タンパク質発現ベクターから各蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域を切出して使用することができる。
【００１６】
β-Hexαサブユニットをコードするポリヌクレオチドは、そのcDNA配列が公知（例えばヒトβ-HexαサブユニットcDNA：GenBank/NM_000520）であり、これら公知のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプローブを用いてcDNAライブラリーをスクリーニングすることによって取得することができる。また、公知の配列に基づいて設計したプライマーセットを用い、ゲノムDNAやトータルRNAを鋳型とするPCR（Polymerase Chain Reaction）法によって取得することもできる。
【００１７】
動物細胞用の発現ベクターは、プロモーター、スプラインシング領域、ポリ（A）付加部位等を有するベクターであり、pKA1、pCDM8、pSVK3、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBVベクター、pRS、pYE82、実施例で使用したIRESバイシストロン性発現ベクターpIRES等を例示することができる。
【００１８】
発現ベクターYβは、蛍光タンパク質Yとβ-Hexβサブユニットとを同時に発現する発現ベクターである。
【００１９】
蛍光タンパク質Yは、前記発現ベクターXαにおける蛍光タンパク質Xとは蛍光波長の異なる蛍光タンパク質である。例えば、蛍光タンパク質Xが赤色蛍光タンパク質である場合には、蛍光タンパク質Yは緑色蛍光タンパク質または黄色蛍光タンパク質とする。
【００２０】
β-Hexβサブユニットをコードするポリヌクレオチドも配列情報は公知であり（例えばヒトβ-HexβサブユニットcDNA：GenBank/NM_000521）、これらの配列情報を用いて、前記β-Hexαサブユニットの場合と同様にポリヌクレオチドを取得することができる。
【００２１】
以上のとおりの発現ベクターXαと発現ベクターYβをトランスフェクションする動物細胞としては、例えばサル腎臓細胞COS-7、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHOなどの哺乳動物培養細胞を例示することができる。また発現ベクターを真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポゾーム法、DEAEデキストラン法など公知の方法を用いることができる。
【００２２】
両発現ベクターをトランスフェクションした細胞群は、次いで、フローサイトメトリー法によって解析し、蛍光タンパク質Xと蛍光タンパク質Yをそれぞれ発現する細胞のみが単離される。フローサイトメトリー法は、市販のフローサイトメトリー装置（Fluorescence-activated cell sorter：FACS）を用いて実施することができる。
【００２３】
このフローサイトメトリー法によって単離された細胞は、蛍光タンパク質Xと蛍光タンパク質Yをそれぞれ発現する形質転換細胞であり、すなわち、β-Hexαサブユニットとβ-Hexβサブユニットをも安定に発現する細胞である。
【００２４】
この形質転換細胞を公知の方法によって一定期間培養することによって、培養物からβ-Hexαサブユニットとβ-Hexβサブユニットを得ることができる。培養物からβ-Hexαサブユニットとβ-Hexβサブユニットを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、SDS−PAGE、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（β-Hexαサブユニットとβ-Hexβサブユニットにそれぞれ特異的なポリクローナル抗体、モノクローナル抗体を用いる方法も含む）、などである。
【００２５】
以下、実施例を示して本願発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、本願発明は以下の例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
β-Hexサブユニットと蛍光タンパク質を同時に発現するベクタープラスミドDNAの構築：
(1)  ヒトおよびマウスのそれぞれのβ-Hexαサブユニットをコードする遺伝子（hHEXAおよびmHexa）、赤色蛍光タンパク質（DsRed-Express）遺伝子およびNeomycin耐性遺伝子（Neor）の同時発現ベクターpIRES-hHEXA-DsRed-NeorおよびpIRES-mHexa-DsRed-Neorを次の通り作製した。
【００２７】
Neorを含むIRESバイシストロン性遺伝子発現ベクターpIRES（BD Bioscience Clontech社631605）のIRES配列の5’上流側のクローニングサイトに、hHEXA cDNAまたはmHexa cDNA（Dr. R.L. Proia, NIH, MD, USAから供与）を、また赤色蛍光タンパク質（DsRed-Express）発現ベクターpDsRed-Express-N1（BD Bioscience Clontech社632429）由来のDsRed-ExpressのORF（open reading frame）をIRES配列の3’下流側のクローニングサイトに組み込んで作製した（図１AおよびB）。
(2)  ヒトおよびマウスのそれぞれのβ-Hexβサブユニットをコードする遺伝子（hHEXBおよびmHexb）、緑色蛍光タンパク質（EGFP）遺伝子およびNeomycin耐性遺伝子（Neor）の同時発現ベクターpIRES-hHEXB-EGFP-NeorおよびpIRES-mHexb-EGFP-Neorを次の通り作製した。
【００２８】
IRESバイシストロン性遺伝子発現ベクターpIRES（BD Bioscience Clontech社631605）のIRES配列の5’上流側のクローニングサイトに、hHEXB cDNAまたはmHexb cDNA（Dr.R.L. Proia, NIH, MD, USAから供与）を、また緑色蛍光タンパク質（EGFP）発現ベクターpEGFP-N1（BD Bioscience Clontech社632318）由来のEGFPのORF（open reading frame）をIRES配列の3’下流側のクローニングサイトに組み込んで作製した。
(3)  ヒトおよびマウスのそれぞれのβ-Hexβサブユニットをコードする遺伝子（hHEXBおよびmHexb）、緑色蛍光タンパク質（EGFP）遺伝子およびHygromycin耐性遺伝子（Hygror）の同時発現ベクターpIRES-hHEXB-EGFP-HygrorおよびpIRES-mHexb-EGFP-Hygrorを次の通り作製した。
【００２９】
前記（2）で作製したpIRES-hHEXB-EGFP-NeorおよびpIRES-mHexb-EGFP-NeorのNeor領域を、plox2-Hygro（Prof. P. Chambon, CNRS/INSERM/ULP, Franceから供与）に含まれるHygromycin耐性遺伝子（Hygror）領域と交換することにより作製した（図１CおよびD）。
【実施例２】
【００３０】
β-Hexαおよびβ両サブユニットを同時に恒常発現するChinese-Hamster-Ovary（CHO）細胞株の樹立：
(1)  実施例１(1)で作製したpIRES-hHEXA-DsRed-Neorおよび実施例１(3)で作製したpIRES-hHEXB-EGFP-Hygror発現ベクターをLipofection法により同時にCHO細胞（RIKEN Cell Bank）に導入し、neomycinおよびhygromycin共存下で両遺伝子の同時恒常発現株を選別し、継代維持培養した。
(2)  得られた細胞株（1 x 107cells）をFluorescence-activated cell sorter(FACS)にかけ、DsRed-Express（励起波長557nm; 蛍光波長579nm）およびEGFP（励起波長488nm; 蛍光波長517nm）の同時蛍光陽性領域の細胞株を分取し、neomycinおよびhygromycin共存下で増殖させた。
(3)  上記(2)で得られたDsRed-ExpressおよびEGFP同時陽性の細胞集団（1 x 107cells）を再度FACSにかけ、同時蛍光陽性領域の細胞株を分取し、さらにneomycinおよびhygromycin共存下で増殖させた。この操作を合計３回行った（図２）。
(4)  分取後の細胞集団におけるDsRed-ExpressおよびEGFPの発現細胞の割合を、蛍光顕微鏡観察により評価した。その結果を図３に示す。
【００３１】
FACS操作を経るごとに、赤色蛍光タンパク質と緑色蛍光タンパク質とを同時発現する細胞集団が濃縮されることが確認された。
(5)  上記(3)で得られた細胞集団を継代培養し、β-Hexの基質である4-MUG（4-メチルウンベリフェリル-β-Dグルコサミニド）および4-MUGS（4-メチルウンベリフェリル-β-DN-アセチルグルコサミン-6-サルフェート）分解活性の細胞内発現を、細胞抽出液および培養上清を用いて測定し、非遺伝子導入のCHO親株およびFACSによる分離後の各細胞集団について比較検討した。その結果を図４に示す。
【００３２】
CHO親株やFACS前の細胞に比較して、FACS後の細胞は、培養上清および細胞抽出液の4-MUGおよび4-MUGS分解活性が著しく上昇することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
高純度のβ-Hexαサブユニットとβ-Hexβサブユニットが安定かつ大量に製造可能となるため、GM2ガングリオシドーシスの酵素補充療法が実現可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】実施例で構築した発現ベクターの模式図である。Aはヒトβ-Hexαサブユニット遺伝子（hHEXA）、赤色蛍光タンパク質（DsRed-Express）遺伝子およびNeomycin耐性遺伝子（Neor）の同時発現ベクターpIRES-hHEXA-DsRed-Neor、Bはマウスβ-Hexαサブユニット遺伝子（mHexa）、赤色蛍光タンパク質（DsRed-Express）遺伝子およびNeomycin耐性遺伝子（Neor）の同時発現ベクターpIRES-mHexa-DsRed-Neor、Cはヒトβ-Hexβサブユニット遺伝子（hHEXB）、緑色蛍光タンパク質（EGFP）遺伝子およびHygromycin耐性遺伝子（Hygror）の同時発現ベクターpIRES-hHEXB-EGFP-Hygror、Dはマウスβ-Hexβサブユニット遺伝子（mHexb）、緑色蛍光タンパク質（EGFP）遺伝子およびHygromycin耐性遺伝子（Hygror）の同時発現ベクターpIRES-mHexb-EGFP-Hygrorである。
【図２】CHO親株（A）、FACS２回後の形質転換CHO細胞（B）、FACS３回後の形質転換CHO細胞（C）のそれぞれのフローサイトメトリー解析画像である。FGFP/DsRed同時発現領域に回収された細胞の割合は、CHO親株（0.00％）、FACS２回後の形質転換CHO細胞（9.12％）、FACS３回後の形質転換CHO細胞（66.04％）であった。
【図３】FACSによって分離した細胞（CHO hHEXA/DsRed-hHEXB/EGFP）を径60mm培養皿で培養し、蛍光顕微鏡（EGFP；励起波長488nm、蛍光波長517nm、DsRed；励起波長557nm、蛍光波長579nm）で観察した結果である。約50％の細胞が両蛍光に対して同時陽性であった。Aは蛍光像（EGFP）、Bは蛍光像（DsRed）、Cは重ね合わせ像、Dは微分干渉像である。
【図４】細胞の培養上清と細胞抽出液の4-MUGおよび4-MUGS分解活性を測定した結果である。各グラフにおいて、カラム１はCHO親株、カラム２はFACSによる分離前の細胞集団、カラム３はFACSによる分離後の細胞集団である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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