(57)【要約】【課題】核酸認識体の濃度分布に起因する精度低下の排除された核酸検出を可能にする核酸検出用デバイスを提供する。【解決手段】核酸検出用デバイスの流路規定部材１０４は、核酸認識体を含む溶液を流すための流路１１０と、流路１１０に沿って流路１１０内に設けられた２０個の電極部とを有している。流路１１０の各直線状流路領域には同じ配列パターンで配置された四つの電極部が含まれている。各直線状流路領域において、最も上流側に位置する電極部ＧＥ１は、二つの核酸検出用プローブ（相補配列）固定化電極Ｅａを有し、二番目に上流側に位置する電極部ＧＥ２は、二つの核酸検出用プローブ（非相補配列）固定化電極Ｅｂを有し、三番目に上流側に位置する電極部ＧＥ０は、特別の機能を持たない二つの電極Ｅｎを有し、最も下流側に位置する電極部ＧＥ３は、二つの基準値測定用電極Ｅｒを有している。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気化学的核酸検出を行なうための核酸検出用デバイスであり、
核酸認識体を含む溶液を流すための流路と、
前記流路内に、前記流路に沿った列をなして設けられた四つ以上の電極部とを有し、
前記複数の電極部のうち、少なくとも二つは核酸検出用プローブ固定化電極を含んでおり、少なくとも二つは基準値測定用電極を含んでおり、
前記基準値測定用電極を含む電極部は、前記核酸検出用プローブ固定化電極を含む電極部と隣り合うことを特徴とする核酸検出用デバイス。
【請求項２】
前記基準値測定用電極を含む少なくとも二つの電極部の間に、前記核酸検出用プローブ固定化電極を含む電極部が位置していることを特徴とする請求項１に記載の核酸検出用デバイス。
【請求項３】
前記基準値測定用電極を含む電極部の両側に、前記核酸検出用プローブ固定化電極を含む電極部が位置することを特徴とする請求項１に記載の核酸検出用デバイス。
【請求項４】
前記電極部の核酸検出用プローブ固定化電極を含む少なくとも二つの電極部において、少なくとも１つの電極部の核酸検出用プローブ固定化電極は、他の電極部の核酸検出用プローブ固定化電極とプローブの核酸配列が異なることを特徴とする請求項１に記載の核酸検出用デバイス。
【請求項５】
前記流路は、複数の直線状流路領域と、前記複数の直線状流路領域間を接続する接続流路領域を含んでおり、前記基準値測定用電極を含む電極部の各々は異なる直線状流路領域に配置されており、前記核酸検出用プローブ固定化電極を含む電極部の各々は異なる直線状流路領域に配置され、前記基準値測定用電極を含む電極部と、前記プローブ固定化電極を含む電極部が共に配置されている直線状流路領域を２以上有することを特徴とする請求項１に記載の核酸検出用プローブ。
【請求項６】
前記複数の電極部が前記流路に沿って、各電極部に含まれる電極の相違に基づく一定の配列パターンに従って繰り返し配置されていることを特徴とする請求項１に記載の核酸検出用デバイス。
【請求項７】
前記基準値測定用電極が、基準値測定用核酸プローブが固定化された電極であることを特徴とする請求項１に記載の核酸検出用デバイス。
【請求項８】
電気化学的核酸検出を行なうための核酸検出用デバイスであり、
核酸認識体を含む溶液を流すための流路と、
前記流路内に、前記流路に沿った列をなして設けられた、基準値測定用電極と核酸検出用プローブ固定化電極とを含む電極部を複数有することを特徴とする核酸検出用デバイス。
【請求項９】
前記複数の電極部において、電極部の核酸検出用プローブ固定化電極は、他の電極部の核酸検出用プローブ固定化電極とプローブの核酸配列が異なる請求項８に記載の核酸検出用デバイス。
【請求項１０】
前記電極部が、前記流路に沿って、各電極部に含まれる電極の相違に基づく一定の配列パターンに従って繰り返し配置されていることを特徴とする請求項８に記載の核酸検出用デバイス。
【請求項１１】
前記流路は、複数の直線状流路領域と、前記複数の直線状流路領域間を接続する接続流路領域を含んでおり、異なる直線状流路領域の各々に複数の前記電極部が配置されていることを特徴とする請求項８に記載の核酸検出用デバイス。
【請求項１２】
前記複数の電極部は前記流路の入口及び出口付近に各々配置されていることを特徴とする請求項１１に記載の核酸検出用デバイス。
【請求項１３】
前記基準値測定用電極が、基準値測定用核酸プローブが固定化された電極であることを特徴とする請求項８に記載の核酸検出用デバイス。
【請求項１４】
電気化学的核酸検出を行なうための核酸検出用デバイスであり、
核酸認識体を含む溶液を流すための流路と、
前記流路内に、前記流路に沿った列をなして設けられ、少なくとも二つが核酸検出用プローブ固定化電極を含んでおり、少なくとも一つが基準値測定用電極を含んでいる三つ以上の電極部と、
前記流路内に設けられ、前記核酸認識体の前記流路内濃度分布の相対値を測定するための少なくとも二つの核酸認識体濃度測定用電極とを有していることを特徴とする核酸検出用デバイス。
【請求項１５】
前記少なくとも二つの核酸認識体濃度測定用電極の間に前記電極部が位置していることを特徴とする請求項１３に記載の核酸検出用デバイス。
【請求項１６】
前記電極部と前記核酸認識体濃度測定用電極が前記流路に沿って一定の配列パターンに従って繰り返し配置されていることを特徴とする請求項１３に記載の核酸検出用デバイス。
【請求項１７】
前記流路は複数の直線状流路領域と前記複数の直線状流路領域間を接続する接続流路領域を含んでおり、前記複数の電極部は前記複数の直線状流路領域に位置しており、各直線状流路領域内の電極部に対して少なくとも一つの核酸認識体濃度測定用電極を有していることを特徴とする請求項１３に記載の核酸検出用デバイス。
【請求項１８】
前記電極部と同数の核酸認識体濃度測定用電極を有し、前記核酸認識体濃度測定用電極はそれぞれ前記電極部の電極に隣接して位置していることを特徴とする請求項１３に記載の核酸検出用デバイス。
【請求項１９】
前記核酸認識体濃度測定用電極が、直鎖状有機分子からなるブロッキング分子の層を表面に有する電極で構成されていることを特徴とする請求項１３に記載の核酸検出用デバイス。
【請求項２０】
前記核酸認識体濃度測定用電極が、核酸認識体と相互作用する核酸分子からなる層を表面に有する電極で構成されていることを特徴とする請求項１３に記載の核酸検出用デバイス。
【請求項２１】
請求項１又は請求項５に記載の核酸検出用デバイスを使用して電気化学的核酸検出を行なう核酸検出装置であり、
複数の基準値測定用電極を介して測定される値を用いて算出した数値を基準として核酸検出を行なうことを特徴とする核酸検出装置。
【請求項２２】
請求項１３に記載の核酸検出用デバイスを使用して電気化学的核酸検出を行なう核酸検出装置であり、
前記核酸検出用プローブ固定化電極と前記基準値測定用電極のいずれかを介して測定される値を、前記核酸認識体濃度測定用電極のいずれかを介して測定される値によって補正した値を用いて核酸検出を行なうことを特徴とする核酸検出装置。
【請求項２３】
請求項１３に記載の核酸検出用デバイスを使用して電気化学的核酸検出を行なう核酸検出装置であり、
複数の核酸認識体濃度測定用電極を介して測定される値を用いて、核酸検出用プローブ固定化電極および基準値測定用電極を介して測定される値を補正して核酸検出を行なうことを特徴とする核酸検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸認識体を利用した電気化学応答による測定によって標的核酸を検出するための核酸検出用デバイスおよびこの核酸検出用デバイスを測定するための核酸検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の遺伝子工学の発展に伴い、医療分野では遺伝子による病気の診断や予防が可能となっている。これは遺伝子診断と呼ばれ、病気の原因となるヒトの遺伝子欠陥、変化を検出することで、病気の発症前もしくは極めて初期の段階で診断や予測ができる。また、ヒトゲノムの解読と共に、遺伝子型と疾病との関連に関する研究が進み、各個人の遺伝子型に合わせた治療（テーラーメイド医療）も現実化しつつある。従って、遺伝子の検出、遺伝子型の決定を簡便に行なうことは非常に重要である。
【０００３】
核酸検出法には、放射性同位体を使用するもの、蛍光色素ラベルを使用したものがある。前者は検出を行なう場所が限定され、また操作が煩雑である。後者は蛍光色素検出するための高価な装置が必要である。
【０００４】
これらの手法とは別に、電極の表面に固定化された核酸プローブに対して試料核酸をハイブリダイズさせた後、核酸認識体を添加し、電気化学的検出を行なう手法が確立されている。この核酸検出を電気化学的に行なう手法は、１枚のチップ上で複数の反応を行なう、「Lab-on-a-chip」に適していることから、様々な開発が進められている。
【０００５】
しかし、容積の大きなセルを用いての反応とは異なり、比較的微小な領域で行なうチップ上での反応において、核酸プローブ固定化領域内での核酸認識体の濃度分布を均一にすることは困難であり、これは精度の低下を招く。特に核酸プローブ固定化領域上に形成された流路に核酸認識体を流して供給するデバイスの場合、流路上流から流路下流にかけての核酸認識体の濃度分布に起因する精度の低下が課題となっている。
【０００６】
濃度分布を均一にするために、溶液の揺動や超音波による撹拌などの手法も開発されているが、これらの手法を採用すると装置構成が複雑になってしまう。
【特許文献１】USP5776672
【特許文献２】USP5972692
【特許文献３】USP6294670
【非特許文献１】E. Nebling, et.al, Anal. Chem. 2004 Feb 1; 76(3): 689-696
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前述の通り、チップ状での反応において、核酸プローブ固定化領域内での核酸認識体の濃度分布が存在することに起因する、精度の低下が問題となっている。核酸認識体には様々な種類が存在するが、例えば二本鎖核酸認識体の場合は、標的核酸と相補的な配列を持つ核酸プローブと、標的核酸とがハイブリダイゼーションし、二本鎖となった核酸を認識して強く吸着する。しかしながら、標的核酸と非相補的な配列を持ち、標的核酸とはハイブリダイゼーションせずに一本鎖の状態である核酸プローブには弱く吸着するという特徴を持つ。さらには核酸の存在しない電極表面にも吸着する。核酸認識体の電気化学応答を測定することによって標的核酸の有無を検出する場合には、吸着する場所が二本鎖なのか、一本鎖なのか、電極表面なのか、区別することはできないため、標的核酸のハイブリダイゼーションに起因する電気化学応答のほかに、一本鎖核酸や電極表面への吸着に起因するバックグラウンドの電気化学応答（基準値、ネガティブコントロール）が存在する。このことは、核酸を蛍光色素で検出する手法と比較して、核酸認識体の電気化学応答を利用して核酸を検出する手法の欠点であると言われている。核酸認識体の濃度が高ければ、バックグラウンドの電気化学応答（基準値）が増大し、核酸認識体の濃度が低ければ、ハイブリダイゼーションに起因する電気化学応答が減少する。従って、最適な濃度範囲になるように核酸認識体の濃度を設定する必要がある。しかし、核酸認識体は流路壁面や、支持基板上にも強く吸着するため、溶液中の核酸認識体濃度が減少し、流路上流側と流路下流側ではどうしても濃度分布が発生してしまう。さらには、核酸のハイブリダイゼーションは、温度や塩濃度、溶液のｐＨ、溶液の流速などに敏感であり、せっかく標的核酸と核酸プローブがハイブリダイゼーションした核酸の結合を解離させてしまわないような条件下で核酸認識体を反応させなくてはならないなど、流路構造を用いて供給された核酸認識体の電気化学応答を利用して核酸の検出を行なう手法に独特の課題がある。
【０００８】
本発明は、このような実状を考慮してなされたものであり、その主な目的は、核酸認識体の濃度分布に起因する精度低下の排除された核酸検出を可能にする核酸検出用デバイスを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明による核酸検出用デバイスは、核酸認識体を含む溶液を流すための流路と、前記流路内に、前記流路に沿った列をなして設けられた四つ以上の電極部とを有し、前記複数の電極部のうち、少なくとも二つは核酸検出用プローブ固定化電極を含んでおり、少なくとも二つは基準値測定用電極を含んでおり、前記基準値測定用電極を含む電極部は、前記核酸検出用プローブ固定化電極を含む電極部と隣り合うことを特徴とする。
【００１０】
本発明による別の核酸検出用デバイスは、核酸認識体を含む溶液を流すための流路と、前記流路内に、前記流路に沿った列をなして設けられ、少なくとも二つが核酸検出用プローブ固定化電極を含んでおり、少なくとも一つが基準値測定用電極を含んでいる三つ以上の電極部と、前記流路内に設けられ、前記核酸認識体の前記流路内濃度分布の相対値を測定するための少なくとも二つの核酸認識体濃度測定用電極とを有していることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、核酸認識体の濃度分布に起因する精度低下の排除された核酸検出を可能にする核酸検出用デバイス及び核酸検出装置が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。
【００１３】
図１は、電気化学的核酸検出を行なうための核酸検出用デバイスの平面図を示している。図１に示されるように、核酸検出用デバイス１００は支持基板１０２と流路規定部材１０４を有している。支持基板１０２は複数の信号入出力用パッド１０６を有している。流路規定部材１０４は、核酸認識体を含む溶液を流すための流路１１０と、流路１１０に沿って流路１１０内に互いに離間して、列をなして設けられた２０個の電極部ＧＥとを有している。
【００１４】
各電極部ＧＥは、例えば図１に示されるように二つの電極Ｅで構成されているが、これに限定されるものではなく、三つ以上の電極で構成されてもよく、また、一つの電極で構成されてもよい。また上限は例えば１０以下である。より好ましくは電極数が１以上４以下である。
【００１５】
電極部ＧＥの形状やサイズは特に限定されないが、電極部ＧＥの領域が例えば円形の場合、直径が０．００２ｍｍ以上１．６ｍｍ以下、より好ましくは０．０１ｍｍ以上０．８ｍｍ以下の範囲、矩形の場合、一辺が０．００２ｍｍ以上１．６ｍｍ以下、より好ましくは０．０１ｍｍ以上０．８ｍｍ以下の範囲のものが挙げられる。
【００１６】
また電極部ＧＥ内で流路に露出する各電極の形状やサイズは特に問わないが、例えば円形の場合、直径は０．００１ｍｍ以上０．８ｍｍ以下、より好ましくは０．００１ｍｍ以上０．４ｍｍ以下のものが挙げられる。また矩形の場合、一辺が０．００１以上０．８ｍｍ以下、より好ましくは０．００１ｍｍ以上０．４ｍｍ以下のものが挙げられる。
【００１７】
信号入出力用パッド１０６はそれぞれ流路１１０内の電極Ｅと電気的に接続されている。電極部ＧＥの個数は、これに何ら限定されるものではなく、任意の個数であってよい。各電極部ＧＥ間の間隔は、特に問わないが、例えば０．１ｍｍ以上３．０ｍｍ以下、より好ましくは０．５ｍｍ以上２．５ｍｍ以下の範囲が挙げられる。
【００１８】
図２は流路規定部材１０４の拡大図である。図２に示すように、一つの流路１１０は、流路の上流端に位置する流路入口部１１０ａと、流路の下流端に位置する流路出口部１１０ｄと、それらの間に位置し、複数の直線状流路領域１１０ｂと、直線状流路領域１１０ｂ同士を接続している半円状の接続領域１１０ｃとから構成されている。複数の直線状流路領域１１０ｂは列状に配列している。複数の直線状流路領域１１０ｂを連絡している接続領域１１０ｃは、半円状でなくとも曲線、あるいは直線が屈折した形状等であってもよい。
【００１９】
電極部ＧＥは直線状流路領域１１０ｂに配置されている。直線状流路領域１１０ｂにおいて電極部ＧＥは等間隔で配置されているが、必ずしもその必要はなく、不規則な間隔で配置されてもよい。
【００２０】
核酸検出用デバイス１００は公知の核酸検出装置に装着されて使用される。核酸検出装置は、流路１１０に対して核酸認識体を含む溶液を送液したり、信号入出力用パッド１０６を介して電極部ＧＥの電極Ｅに流れる電流を測定したりする。
【００２１】
核酸検出用デバイス１００は、図１に示される形態に何ら限定されるものではない。
【００２２】
流路１１０は流路規定部材１０４に溝を形成し、流路規定部材１０４上に平面状の部材を積層して流路を形成するか、あるいは平面状の部材の流路１１０に対応する部分に溝を形成し流路規定部材１０４上に積層するか、その両方に溝を形成することにより形成してもよい。また、流路規定部材１０４を用いずに支持基板１０２上に直接流路が形成されてもよい。流路１１０の断面構造は、四角形や三角形などの多角形、半円や半楕円など、任意の形状であってよい。
【００２３】
例えば直線状流路領域１１０ｂ、接続領域１１０ｃの流路の幅は、例えば０．０５ｍｍ以上３．０ｍｍ以下、より好ましくは０．２ｍｍ以上１．５ｍｍ以下の範囲、また高さは０．０２ｍｍ以上２．０ｍｍ以下、より望ましくは０．１ｍｍ以上１．２ｍｍ以下の範囲が具体例として挙げられる。この範囲の流路サイズであると、流路内での核酸認識体の濃度のばらつきが抑制できる。
【００２４】
流路１１０の幅は常に一定であるが、広→狭、狭→広、広→狭を繰り返すなど、変動してもよい。
【００２５】
支持基板１０２上の信号入出力用パッド１０６は必要に応じて省略されてもよい。また核酸検出用デバイス１００が、核酸抽出反応、核酸増幅反応、濾過工程、撹拌工程など、様々な反応工程や他の検出を行なう領域を備えていてもよい。
【００２６】
以下の従来例及び実施形態の説明に用いる図３、図５、図７、図９、図１１、図１３、図１５、図１７、図１９は電極のレイアウトを示すが、説明の便宜上、図２に示す電極番号を各図の流路上の電極部の電極に割り当てる。流路入口側から、１行目の直線状流路領域内の電極を１〜８番電極、２行目の直線状流路領域内の電極を９〜１６番電極、・・・とする。
【００２７】
［従来例］
従来例の核酸検出用デバイスにおける電極レイアウトを図３に示す。従来例の核酸検出用デバイスでは、図３に示されるように、１行目の直線状流路領域において、１，２番電極には、標的核酸と相補的な配列を持つ核酸検出用プローブが固定化され、３，４番電極には、標的核酸と非相補的な配列を持つ核酸検出用プローブが固定化されている。２行目以降の直線状流路領域についても同様である。また、流路１１０の末端に位置する３９，４０番電極が基準値測定用電極とされている。  言い換えれば、各直線状流路領域において、最も上流側に位置する電極部ＧＥ１は、二つの核酸検出用プローブ（相補配列）固定化電極Ｅａを有し、その次に位置する電極部ＧＥ２は、二つの核酸検出用プローブ（非相補配列）固定化電極Ｅｂを有している。また、流路１１０の全体において、最も下流側に位置する電極部ＧＥ３は、二つの基準値測定用電極Ｅｒを有している。
【００２８】
図３の核酸検出用デバイスにおいて、３９，４０番電極の基準値測定用電極を介して測定された値が、１−４，９−１２，・・・に配置された核酸検出用プローブに対する基準値として適用され、この基準値と核酸検出用プローブ固定化電極を介して得られる電流値を比較することによって、標的核酸の有無の判断や標的核酸の定量が行われる。
【００２９】
図４は、図３の核酸検出用デバイスに対して核酸検出装置によって得られた核酸認識体の電気化学応答を示している。図４から分かるように、１行目から５行目にいくにつれ、電気化学応答が徐々に低下している。本来なら、５行目の結果のように、基準値測定用電極Ｅｒと核酸検出用プローブ（非相補配列）固定化電極Ｅｂは同程度の値を示すはずだが、他の行での結果では、核酸検出用プローブ（非相補配列）固定化電極Ｅｂでの電気化学応答が大きく得られてしまい、精度の高い核酸検出ができていない。
【００３０】
［第一実施形態］
第一実施形態の核酸検出用デバイスにおける電極レイアウトを図５に示す。第一実施形態の核酸検出用デバイスでは、図５に示されるように、１行目の直線状流路領域において、１，２番電極には、標的核酸と相補的な配列を持つ核酸検出用プローブが固定化され、３，４番電極には、標的核酸と非相補的な配列を持つ核酸検出用プローブが固定化されており、また、７，８番電極は、基準値測定用電極Ｅｒとされている。２行目以降の直線状流路領域についても同様である。
【００３１】
基準値測定用電極Ｅｒは、例えば基準値測定用核酸プローブを固定化して構成される。基準値測定用核酸プローブは、サンプルの核酸に中に含まれない配列またはその相補配列を有する。また、基準値測定用電極Ｅｒは、基準値測定用核酸プローブを固定化したものに限定されるものではなく、核酸プローブが固定化されていない電極で構成されてもよい。例えば、直鎖状有機分子、あるいは、複数の環状構造からなる有機分子、合成核酸、酵素、が固定化されていてもよい。基準値測定用核酸プローブを固定化する工程としては、場合によっては、基準値測定用核酸プローブを含む微量な溶液を電極上に滴下するという工程が必要である。そのため、滴下する液滴の直径よりも電極間距離を縮めることができず、デバイス面積の縮小ができない、必要サンプル量が低減できないという難点があるが、上記のように核酸プローブを固定しない場合は、デバイス全体を各種分子を含む溶液中に浸漬するという工程によって基準値測定用電極を形成することができるため、電極間距離を縮めることができ、低コスト化につながる。核酸検出用プローブ固定化電極に、標的核酸がハイブリダイゼーションしない場合に示す電流値と、基準値測定用電極の示す電流値は同等あるいは容易に比較できる値でなくてはならない。
【００３２】
各直線状流路領域には同じ配列パターンで配置された四つの電極部が含まれている。各直線状流路領域において、最も上流側に位置する電極部ＧＥ１は、二つの核酸検出用プローブ（相補配列）固定化電極Ｅａを有し、二番目に上流側に位置する電極部ＧＥ２は、二つの核酸検出用プローブ（非相補配列）固定化電極Ｅｂを有し、三番目に上流側に位置する電極部ＧＥ０は、特別の機能を持たない二つの電極Ｅｎを有し、最も下流側に位置する電極部ＧＥ３は、二つの基準値測定用電極Ｅｒを有している。従って、流路１１０の全体では、電極部は、流路１１０に沿って、ＧＥ１，ＧＥ２，ＧＥ０，ＧＥ３の配列パターンで繰り返し配置されている。また、ＧＥ１と、ＧＥ３の関係について見ると、それらは互いに隣り合っており、交互に配列されている。なお、これらの電極部ＧＥ１，ＧＥ２，ＧＥ０，ＧＥ３の区別は、それらに含まれる電極Ｅａ，Ｅｂ，Ｅｎ，Ｅｒの機能の相違に基づいている。なお、Ｅａ、Ｅｂは固定化された核酸検出用プローブ電極という点では機能が同一であるが、核酸検出用プローブの核酸配列が異なり、異なる配列の核酸を検出できるという機能において異なっている。
【００３３】
図６は、図５の核酸検出用デバイスに対して核酸検出装置によって得られた核酸認識体の電気化学応答を示している。図６に示される電気化学応答において、１行目の直線状流路領域については、７，８番の基準値測定用電極を介して測定された値が、１−４番の核酸検出用プローブ固定化電極に対して、基準値として適用される。また２行目の直線状流路領域については、１５，１６番の基準値測定用電極を介して測定された値が、９−１２番の核酸検出用プローブ固定化電極に対して、基準値として適用される。３行目以降の直線状流路領域についても同様である。各行の直線状流路領域において、核酸検出用プローブ固定化電極を介して得られる電流値をその行の直線状流路領域内の基準値測定用電極に基づく基準値と比較することによって、標的核酸の有無の判断や標的核酸の定量が行われる。
【００３４】
このような構成により、各行における核酸認識体の濃度分布を反映した精度の高い基準値が測定でき、その値を基にして核酸検出用プローブの値を比較することによって、精度の高い検出が可能となる。
【００３５】
［第二実施形態］
第二実施形態の核酸検出用デバイスにおける電極レイアウトを図７に示す。第二実施形態の核酸検出用デバイスでは、図７に示されるように、１行目の直線状流路領域において、１番電極には、標的核酸と相補的な配列を持つ核酸検出用プローブが固定化され、３番電極には、標的核酸と非相補的な配列を持つ核酸検出用プローブが固定化されており、２，４番電極は、基準値測定用電極とされている。２行目以降の直線状流路領域についても同様である。
【００３６】
言い換えれば、各直線状流路領域には同じ配列パターンで配置された四つの電極部が含まれている。各直線状流路領域において、最も上流側に位置する電極部ＧＥ４は、一つの核酸検出用プローブ（相補配列）固定化電極Ｅａと一つの基準値測定用電極Ｅｒとを有し、その次に位置する電極部ＧＥ５は、一つの核酸検出用プローブ（非相補配列）固定化電極Ｅｂと一つの基準値測定用電極Ｅｒとを有し、そのほかの電極部ＧＥ０は、特別の機能を持たない二つの電極Ｅｎを有している。従って、流路１１０の全体では、電極部は、流路１１０に沿って、ＧＥ４，ＧＥ５，ＧＥ０，ＧＥ０の配列パターンで繰り返し配置されている。
【００３７】
図８は、図７の核酸検出用デバイスに対して核酸検出装置によって得られた核酸認識体の電気化学応答を示している。図８に示される電気化学応答において、１行目の直線状流路領域については、２番の基準値測定用電極を介して測定された値が、１番の核酸検出用プローブ固定化電極に対して、基準値として適用され、３番の基準値測定用電極を介して測定された値が、４番の核酸検出用プローブ固定化電極に対して、基準値として適用され、基準値と核酸検出用プローブ固定化電極を介して得られる電流値を比較することによって、標的核酸の有無の判断や標的核酸の定量が行われる。２行目以降の直線状流路領域についても同様である。
【００３８】
つまり本実施形態では、核酸検出用プローブ固定化電極を介して得られる電流値は、その核酸検出用プローブ固定化電極を含む電極部に含まれる基準値測定用電極を介して測定された値に基づく基準値と比較される。
【００３９】
このような構成により、各核酸検出用電極の位置における核酸認識体の濃度分布を反映した精度の高い基準値が測定でき、その値を基にして核酸検出用プローブの値を比較することによって、精度の高い検出が可能となる。
【００４０】
［第三実施形態］
第三実施形態の核酸検出用デバイスにおける電極レイアウトを図９に示す。第三実施形態の核酸検出用デバイスでは、図９に示されるように、１行目の直線状流路領域において、１，５番電極には、標的核酸と相補的な配列を持つ核酸検出用プローブが固定化され、３，７番電極には、標的核酸と非相補的な配列を持つ核酸検出用プローブが固定化されており、４，８番電極は、基準値測定用電極とされている。２行目以降の直線状流路領域についても同様である。
【００４１】
言い換えれば、各直線状流路領域には同じ配列パターンで配置された四つの電極部が含まれている。各直線状流路領域において、上流側から一番目と三番目に位置する電極部ＧＥ７は、一つの核酸検出用プローブ（相補配列）固定化電極Ｅａと一つの基準値測定用電極Ｅｒとを有し、上流側から二番目と四番目に位置する電極部ＧＥ５は、一つの核酸検出用プローブ（非相補配列）固定化電極Ｅｂと一つの基準値測定用電極Ｅｒとを有している。従って、流路１１０の全体では、電極部は、流路１１０に沿って、ＧＥ７，ＧＥ５，ＧＥ７，ＧＥ５の配列パターンで繰り返し配置されている。
【００４２】
図１０は、図９の核酸検出用デバイスに対して核酸検出装置によって得られた核酸認識体の電気化学応答を示している。図１０に示される電気化学応答において、１行目の直線状流路領域については、４番の基準値測定用電極を介して測定された値が、１，３番の核酸検出用プローブ固定化電極に対して、基準値として適用され、８番の基準値測定用電極を介して測定された値が、５，７番の核酸検出用プローブ固定化電極に対して、基準値として適用され、基準値と核酸検出用プローブ固定化電極を介して得られる電流値を比較することによって、標的核酸の有無の判断や標的核酸の定量が行われる。２行目以降の直線状流路領域についても同様である。
【００４３】
つまり本実施形態では、核酸検出用プローブ固定化電極を介して得られる電流値は、その核酸検出用プローブ固定化電極を含む電極部かその隣の電極部に含まれる基準値測定用電極を介して測定された値に基づく基準値と比較される。
【００４４】
このような構成により、各行において、中間と末端の２点における核酸認識体の濃度分布を反映した精度の高い基準値が測定でき、その値を基にして核酸検出用プローブの値を比較することによって、精度の高い検出が可能となる。
【００４５】
［第四実施形態］
第四実施形態の核酸検出用デバイスにおける電極レイアウトを図１１に示す。第四実施形態の核酸検出用デバイスでは、図１１に示されるように、１行目の直線状流路領域において、３，４番電極には、標的核酸と相補的な配列を持つ核酸検出用プローブが固定化され、５，６番電極には、標的核酸と非相補的な配列を持つ核酸検出用プローブが固定化されている。２行目以降の直線状流路領域についても同様である。また、１，２，３９，４０番電極は、基準値測定用電極とされている。
【００４６】
言い換えれば、各直線状流路領域において、上流側から二番目に位置する電極部ＧＥ１は、二つの核酸検出用プローブ（相補配列）固定化電極Ｅａを有し、上流側から三番目に位置する電極部ＧＥ２は、二つの核酸検出用プローブ（非相補配列）固定化電極Ｅｂを有している。また、流路１１０の全体において、最も上流側に位置する電極部ＧＥ３と最も下流側に位置する電極部ＧＥ３は、二つの基準値測定用電極Ｅｒを有している。すなわち、核酸検出用プローブ固定化電極ＥａおよびＥｂを含む電極部ＧＥ１およびＧＥ２は、基準値測定用電極Ｅｒを含む電極部ＧＥ３の間に位置している。
【００４７】
図１２は、図１１の核酸検出用デバイスに対して核酸検出装置によって得られた核酸認識体の電気化学応答を示している。図１２に示される電気化学応答において、１，２，３９，４０番の基準値測定用電極を介して測定された値を基に算出した値が、全ての核酸検出用プローブ固定化電極に対して基準値として適用され、基準値と核酸検出用プローブ固定化電極を介して得られる電流値を比較することによって、標的核酸の有無の判断や標的核酸の定量が行われる。基準値の算出方法はデバイスの構成によって様々な算出式がありうる。例えば、基準値測定用電極と核酸検出用プローブの距離を基にして算出する方法や、予め用意した検量線に沿って算出する方法などがあげられる。そのほか、公知の妥当な任意の算出方法が適用されてよい。
【００４８】
このような構成により、各行中において、各電極位置における核酸認識体の濃度分布を反映した精度の高い基準値が算出でき、その値を基にして核酸検出用プローブの値を比較することによって、精度の高い検出が可能となる。
【００４９】
［第五実施形態］
第五実施形態の核酸検出用デバイスにおける電極レイアウトを図１３に示す。第五実施形態の核酸検出用デバイスでは、図１３に示されるように、１行目の直線状流路領域において、３，４番電極には、標的核酸と相補的な配列を持つ核酸検出用プローブが固定化され、５，６番電極には、標的核酸と非相補的な配列を持つ核酸検出用プローブが固定化されており、１，２，７，８番電極は、基準値測定用電極とされている。２行目以降の直線状流路領域についても同様である。
【００５０】
言い換えれば、各直線状流路領域には同じ配列パターンで配置された四つの電極部が含まれている。各直線状流路領域において、上流側から一番目と四番目に位置する電極部ＧＥ３は、二つの基準値測定用電極Ｅｒを有し、上流側から二番目に位置する電極部ＧＥ１は、二つの核酸検出用プローブ（相補配列）固定化電極Ｅａを有し、上流側から三番目に位置する電極部ＧＥ２は、二つの核酸検出用プローブ（非相補配列）固定化電極Ｅｂを有している。従って、流路１１０の全体では、電極部は、流路１１０に沿って、ＧＥ３，ＧＥ１，ＧＥ２，ＧＥ３の配列パターンで繰り返し配置されている。
【００５１】
図１４は、図１３の核酸検出用デバイスに対して核酸検出装置によって得られた核酸認識体の電気化学応答を示している。図１４に示される電気化学応答において、１行目の直線状流路領域については、１，２，７，８番の基準値測定用電極を介して測定された値を基に算出した値が、３−６番の核酸検出用プローブ固定化電極に対して基準値として適用される。また２行目の直線状流路領域については、９，１０，１５，１６番の基準値測定用電極を介して測定された値が、１１−１４番の核酸検出用プローブ固定化電極に対して基準値として適用される。３行目以降の直線状流路領域についても同様である。このように各行の直線状流路領域において、核酸検出用プローブ固定化電極を介して得られる電流値をその行の直線状流路領域内の基準値測定用電極に基づく基準値と比較することによって、標的核酸の有無の判断や標的核酸の定量が行われる。基準値の算出には、第四実施形態で述べたように、公知の妥当な任意の算出方法が適用されてよい。
【００５２】
このような構成により、各行中において、各電極位置における核酸認識体の濃度分布を反映した精度の高い基準値が算出でき、その値を基にして核酸検出用プローブの値を比較することによって、精度の高い検出が可能となる。
【００５３】
［第六実施形態］
第六実施形態の核酸検出用デバイスにおける電極レイアウトを図１５に示す。第六実施形態の核酸検出用デバイスでは、図１５に示されるように、１行目の直線状流路領域において、１，２番電極には、標的核酸と相補的な配列を持つ核酸検出用プローブが固定化され、３，４番電極には、標的核酸と非相補的な配列を持つ核酸検出用プローブが固定化されている。２行目以降の直線状流路領域についても同様である。また、流路１１０の末端の３９，４０番電極は、基準値測定用電極とされている。さらに、１，２番電極の流路上流側と３９，４０番電極の流路下流側に、核酸認識体濃度測定用電極Ｅｄが配置されている。何も吸着していない清浄な表面でもよいし、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ等のハロゲン原子が吸着している表面でもよい。さらに、直鎖状有機分子、例えば末端にチオール基が修飾されているメルカプトエタノール、メルカプトヘキサノール、メルカプトオクタノール等の分子や、末端にアミノ基が修飾されている分子でもよい。核酸認識体濃度測定用電極は、核酸認識体の濃度に依存する信号を示す構成であれば特に限定されない。例えば、直鎖状有機分子、あるいは、複数の環状構造からなる有機分子、合成核酸、酵素、が固定化されていてもよい。核酸認識体と相互作用する分子、あるいは核酸認識体が相互作用する官能基で修飾されている分子が固定化されていればなおよい。核酸認識体濃度測定用電極を形成する工程としては、デバイス全体を各種分子を含む溶液中に浸漬するという工程によって核酸認識体濃度測定用電極を形成することができるため、電極間距離を縮めることができ、低コスト化につながる。また、基準値測定用電極とは異なり、核酸検出用プローブ固定化電極に、標的核酸がハイブリダイゼーションしない場合に示す電流値と、核酸認識体濃度測定用電極の示す電流値は同等あるいは容易に比較できる値でなくてもよいため、電極面積や、配置位置に限定が少なくなるというメリットもある。例えば、核酸検出用プローブ固定化電極の直径が２００μｍ、電極の間隔が２ｍｍである場合に、核酸認識体濃度測定用電極の直径は５０μｍで、核酸検出用プローブ固定化電極同士の２ｍｍの間隔の隙間に配置することができるため、余計な領域を占有せず、コストをかけずに構成することができる。
【００５４】
言い換えれば、各直線状流路領域において、最も上流側に位置する電極部ＧＥ１は、二つの核酸検出用プローブ（相補配列）固定化電極Ｅａを有し、二番目に上流側に位置する電極部ＧＥ２は、二つの核酸検出用プローブ（非相補配列）固定化電極Ｅｂを有している。また、流路１１０の全体において、最も下流側に位置する電極部ＧＥ３は、二つの基準値測定用電極Ｅｒを有している。さらに、これらの電極部ＧＥ１，ＧＥ２，ＧＥ３は、核酸認識体濃度測定用電極Ｅｄの間に位置している。
【００５５】
図１６は、図１５の核酸検出用デバイスに対して核酸検出装置によって得られた核酸認識体の電気化学応答を示している。図１６に示される電気化学応答において、核酸認識体濃度測定用電極Ｅｄを介して測定された値を基に算出した値を用いて、全てあるいは部分的な核酸検出用プローブ固定化電極、全てあるいは部分的な基準値測定用電極を介して得られる電流値に対して、電流値の補正を行い、補正後の電流値を用いて、標的核酸の有無の判断や標的核酸の定量が行われる。補正方法はデバイスの構成によって様々な算出式がありうる。例えば核酸認識体濃度測定用電極と核酸検出用プローブあるいは基準値測定用電極の距離を基にして補正する方法や、予め用意した検量線に沿って補正する方法などがあげられる。そのほか、公知の妥当な任意の算出方法が適用されてよい。
【００５６】
このような構成により、流路中において、各電極位置における核酸認識体の濃度分布を反映した電流値に補正することができ、その値を基にして核酸検出用プローブの値を比較することによって、精度の高い検出が可能となる。
【００５７】
［第七実施形態］
第七実施形態の核酸検出用デバイスにおける電極レイアウトを図１７に示す。第七実施形態の核酸検出用デバイスでは、図１７に示されるように、１行目の直線状流路領域において、１，２番電極には、標的核酸と相補的な配列を持つ核酸検出用プローブが固定化され、３，４番電極には、標的核酸と非相補的な配列を持つ核酸検出用プローブが固定化されている。さらに、１，２番電極の流路上流側と７，８番電極の流路下流側に、核酸認識体濃度測定用電極が配置されている。２行目以降の直線状流路領域についても同様である。流路１１０の末端の３９，４０番電極は、基準値測定用電極とされている。
【００５８】
言い換えれば、各直線状流路領域において、最も上流側に位置する電極部ＧＥ１は、二つの核酸検出用プローブ（相補配列）固定化電極Ｅａを有し、二番目に上流側に位置する電極部ＧＥ２は、二つの核酸検出用プローブ（非相補配列）固定化電極Ｅｂを有している。これらの電極部ＧＥ１，ＧＥ２は、核酸認識体濃度測定用電極Ｅｄの間に位置している。また、流路１１０の全体において、最も下流側に位置する電極部ＧＥ３は、二つの基準値測定用電極Ｅｒを有している。
【００５９】
図１８は、図１７の核酸検出用デバイスに対して核酸検出装置によって得られた核酸認識体の電気化学応答を示している。図１８に示される電気化学応答において、１行目の直線状流路領域については、１，２番電極の流路上流側と７，８番電極の流路下流側に配置した核酸認識体濃度測定用電極を介して測定された値を基に算出した値を用いて、１−４番電極を介して得られる電流値に対して電流値の補正を行い、補正後の電流値を用いて、標的核酸の有無の判断や標的核酸の定量が行われる。２行目以降の直線状流路領域についても同様である。
【００６０】
このような構成により、各行の直線状流路領域において、各電極位置における核酸認識体の濃度分布を反映した電流値に補正することができ、その値を基にして核酸検出用プローブの値を比較することによって、精度の高い検出が可能となる。
【００６１】
［第八実施形態］
第八実施形態の核酸検出用デバイスにおける電極レイアウトを図１９に示す。第八実施形態の核酸検出用デバイスでは、図１９に示されるように、１行目の直線状流路領域において、１番電極には、標的核酸と相補的な配列を持つ核酸検出用プローブが固定化され、３番電極には、標的核酸と非相補的な配列を持つ核酸検出用プローブが固定化されており、５，７番電極は、基準値測定用電極とされている。２行目以降の直線状流路領域についても同様である。さらに、核酸認識体濃度測定用電極Ｅｄは、各電極の近傍に配置されている。
【００６２】
言い換えれば、各直線状流路領域には同じ配列パターンで配置された四つの電極部が含まれている。各直線状流路領域において、最も上流側に位置する電極部ＧＥ７は、一つの核酸検出用プローブ（相補配列）固定化電極Ｅａと一つの特別の機能を持たない電極Ｅｎとを有し、二番目に上流側に位置する電極部ＧＥ８は、一つの核酸検出用プローブ（非相補配列）固定化電極Ｅｂと一つの特別の機能を持たない電極Ｅｎとを有し、そのほかの電極部ＧＥ９は、一つの基準値測定用電極Ｅｒと一つの特別の機能を持たない電極Ｅｎとを有している。従って、流路１１０の全体では、電極部は、流路１１０に沿って、ＧＥ７，ＧＥ８，ＧＥ９，ＧＥ９の配列パターンで繰り返し配置されている。核酸認識体濃度測定用電極Ｅｄは、各電極部内の電極の近くに配置されている。
【００６３】
図２０は、図１９の核酸検出用デバイスに対して核酸検出装置によって得られた核酸認識体の電気化学応答を示している。図２０に示される電気化学応答において、各電極近傍に配置した核酸認識体濃度測定用電極を介して測定された値を基に算出した値を用いて、各番電極を介して得られる電流値に対して電流値の補正を行い、補正後の電流値を用いて、標的核酸の有無の判断や標的核酸の定量が行われる。以下同様である。
【００６４】
このような構成により、各行中において、各電極位置における核酸認識体の濃度分布を反映した電流値に補正することができ、その値を基にして核酸検出用プローブの値を比較することによって、精度の高い検出が可能となる。
【実施例１】
【００６５】
以下に、第一実施形態の全自動核酸検出カセットの使用例を具体的に説明する。
【００６６】
１．核酸検出用デバイスの準備
１行目の直線状流路領域には、１，２番電極に、核酸検出用プローブ（Ａ）を固定化し、３，４番電極には、核酸検出用プローブ（Ｂ）を固定化し、７，８番電極には、基準値測定用核酸プローブ（Ｃ）を固定化した。２行目以降についても同様の処理を行なった。プローブの固定化は、一本鎖核酸プローブ溶液に核酸検出用デバイス上のＡｕ電極表面を１時間浸漬することによって行った。ここで用いた一本鎖核酸プローブの配列は以下の通りである。
【００６７】
Ａ：gtttctgcac ccgga
Ｂ：gtttctgcgc ccgga
Ｃ：gacctgcttc tgact
２．標的核酸の検出
標的核酸は、ＰＣＲ産物を用いた。配列は、一本鎖核酸プローブ（Ａ）と相補的な配列を持つ。配列は以下の通りである。
【００６８】
標的核酸：ggcctccgct ctcgcttcgc ctctttcacc ccgcgcccag ccccgccccg cgccgcgaag aaatgaaact cacagaccct gtgctgaggg cggctccggg cgcagaaacg aaacctagct
標的核酸を、終濃度で１×１０１４ｃｏｐｙ／ｍＬ含む２×ＳＳＣ溶液である試料を調整し、それぞれに、準備工程で作製した核酸プローブ固定化Ａｕ電極を浸漬し、ハイブリダイゼーション反応を行った。その後、０．２×ＳＳＣ溶液で洗浄を行った。その後、核酸認識体であるヘキスト３３２５８溶液を５０μＭ含む溶液中に１５分間浸漬した後、ヘキスト３３２５８分子の酸化電流応答を測定した。電気化学測定の結果を図（補充ねがいます）に示す。核酸検出用プローブ（Ａ）を固定化した電極は、基準電極と比較して大きな信号増加が見られ、核酸検出用プローブ（Ｂ）を固定化した電極は、基準電極の電流値と比較して、ほぼ同程度であった。このことから、標的核酸は、核酸検出用プローブ（Ｂ）への非特異吸着が無く、核酸検出用プローブ（Ａ）と相補的な配列を持つことが分かった。
【００６９】
これまで、図面を参照しながら本発明の実施形態を述べたが、本発明は、これらの実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において様々な変形や変更が施されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】電気化学的核酸検出を行なうための核酸検出用デバイスを示している。
【図２】図１に示された流路を拡大して示している。
【図３】従来例の核酸検出用デバイスにおける電極レイアウトを示している。
【図４】図３の核酸検出用デバイスに対して得られた核酸認識体の電気化学応答を示している。
【図５】本発明の第一実施形態の核酸検出用デバイスにおける電極レイアウトを示している。
【図６】図５の核酸検出用デバイスに対して得られた核酸認識体の電気化学応答を示している。
【図７】本発明の第二実施形態の核酸検出用デバイスにおける電極レイアウトを示している。
【図８】図７の核酸検出用デバイスに対して得られた核酸認識体の電気化学応答を示している。
【図９】本発明の第三実施形態の核酸検出用デバイスにおける電極レイアウトを示している。
【図１０】図９の核酸検出用デバイスに対して得られた核酸認識体の電気化学応答を示している。
【図１１】本発明の第四実施形態の核酸検出用デバイスにおける電極レイアウトを示している。
【図１２】図１１の核酸検出用デバイスに対して得られた核酸認識体の電気化学応答を示している。
【図１３】本発明の第五実施形態の核酸検出用デバイスにおける電極レイアウトを示している。
【図１４】図１３の核酸検出用デバイスに対して得られた核酸認識体の電気化学応答を示している。
【図１５】本発明の第六実施形態の核酸検出用デバイスにおける電極レイアウトを示している。
【図１６】図１５の核酸検出用デバイスに対して得られた核酸認識体の電気化学応答を示している。
【図１７】本発明の第七実施形態の核酸検出用デバイスにおける電極レイアウトを示している。
【図１８】図１７の核酸検出用デバイスに対して得られた核酸認識体の電気化学応答を示している。
【図１９】本発明の第八実施形態の核酸検出用デバイスにおける電極レイアウトを示している。
【図２０】図１９の核酸検出用デバイスに対して得られた核酸認識体の電気化学応答を示している。
【符号の説明】
【００７１】
１００…核酸検出用デバイス、１０２…支持基板、１０４…流路規定部材、１０６…信号入出力用パッド、１１０…流路、１１０ａ…流路入口部、１１０ｂ…直線状流路領域、１１０ｃ…半円状接続領域、１１０ｄ…流路出口部、ＧＥ，ＧＥ０〜ＧＥ９…電極部、Ｅ…電極、Ｅａ…核酸検出用プローブ（相補配列）固定化電極、Ｅｂ…核酸検出用プローブ（非相補配列）固定化電極、Ｅｒ…基準値測定用電極、Ｅｎ…特別の機能を持たない電極。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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