(57)【要約】【課題】  局所的骨成長促進剤および局所的骨成長促進用キットの提供。【解決手段】  骨への局所投与局所的、好ましくは継続投与を特徴とする、脚を伸ばすための、細胞栄養因子を有効成分とする局所的骨成長促進剤。骨端へ直接注射することにより連続局所注入される。四肢長異常および側彎症よりなる群より選ばれる脚の長さの違う病気を治療するべく脚を伸ばすための薬剤である。四肢長異常は、小児期における四肢長異常である。美容整形で脚を伸ばすための薬剤である。針の先端を骨端に固定可能な骨端へ直接注射するための注射針および持続注入するためのポンプからなる、注射剤の骨端への投与キット。注射針は、針の先端に骨端に固定する形状を有する。ポンプは、体内または体外で用いるポンプである。細胞栄養因子は、成長ホルモン、ソマトメジンC、および繊維芽細胞増殖因子からなる群から選ばれる骨成長因子である。【選択図】  図１
2007182396.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨への局所投与を特徴とする、脚を伸ばすための、細胞栄養因子を有効成分とする局所的骨成長促進剤。
【請求項２】
骨への局所投与が、局所的継続投与である請求項１の局所的骨成長促進剤。
【請求項３】
骨端へ直接注射することにより連続局所注入される請求項１または２の局所的骨成長促進剤。
【請求項４】
細胞栄養因子が、GH（成長ホルモン）、IGF-1（ソマトメジンC）、およびFGF（繊維芽細胞増殖因子）からなる群から選ばれる骨成長因子である請求項１、２または３の局所的骨成長促進剤。
【請求項５】
脚の長さの違う病気を治療するべく脚を伸ばすための薬剤である請求項４の局所的骨成長促進剤。
【請求項６】
脚長差が生じる疾病が、四肢長異常（LLD）および側彎症（足の長さの違いにより骨盤のズレが生じる。そのことにより背骨が曲がる症状）よりなる群より選ばれる疾病である請求項５の局所的骨成長促進剤。
【請求項７】
四肢長異常（LLD）が、小児期における四肢長異常（LLD）である請求項６の局所的骨成長促進剤。
【請求項８】
美容整形で脚を伸ばすための薬剤である請求項４の局所的骨成長促進剤。
【請求項９】
針の先端を骨端に固定可能な骨端へ直接注射するための注射針および持続注入するためのポンプからなる、注射剤の骨端への投与キット。
【請求項１０】
注射針が、針の先端に骨端に固定する形状を有する請求項９の注射剤の骨端への投与キット。
【請求項１１】
ポンプが、体内または体外で用いるポンプである請求項９または１０の注射剤の骨端への投与キット。
【請求項１２】
注射剤が細胞栄養因子を有効成分とする注射剤である請求項９、１０または１１の注射剤の骨端への投与キット。
【請求項１３】
細胞栄養因子が、ＧＨ、IGF-1、FGHからなる群から選ばれる骨成長因子である請求項１２の注射剤の骨端への投与キット。
【請求項１４】
局所的骨成長促進用キットである請求項９ないし１３のいずれかの注射剤の骨端への投与キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、局所的骨成長促進に関する。詳しくは本発明は、骨への局所投与を特徴とする局所的骨成長促進剤、より具体的には例えば小児期における四肢長異常（LLD）を治療するための局所的骨成長促進剤、および局所的骨成長促進用キットに関する。
なお、本発明において、局所的骨成長促進剤とは、骨への局所投与で骨成長を促進する効果を発揮する薬剤を意味する。
【背景技術】
【０００２】
小児期における四肢長異常（LLD）は、先天性、外傷性、腫瘍性および特発性のものを含む様々な病気により引き起こされ得る（非特許文献１〜３）。
【０００３】
脚長異常を示す骨格的に未成熟な患者の評価と治療は一般的な問題である。脚長異常を扱うための治療的代替方法としては、例えば、靴中におけるリフトの使用（非特許文献４）、長い方の脚の手術による短縮化（非特許文献５）、エピフィセオデシス（epiphyseodesis）による長い方の脚の成長減速もしくは停止（非特許文献６）、または、仮骨延長法と呼ばれる技法による短い脚の伸長化（非特許文献７）挙げることができる。
【０００４】
骨を伸ばすことにより、疾患を治療する方法として創外固定器による仮骨延長法が存在した。仮骨延長法について説明すると、骨折を起こすとその部分には新しい骨（仮骨）ができる。骨折部の隙間をゆっくり引き伸ばすと更にその隙間に仮骨が形成される。手術的に骨折と同じ状態を作り（骨切り）、創外固定器で骨を固定して固定器を操作することによって骨切り部分を引き伸ばし、その部分に隙間を作る。これを繰り返すことによって（仮骨延長法）新しい骨を作り、骨延長・変形矯正・骨移動術が可能になった。
【０００５】
創外固定器について説明すると、一般に骨折の手術治療に用いられているプレートや髄内釘などの内固定は体内中で骨折部を固定する方法である。体外からスクリューやピンによって骨を固定するものを創外固定器という。つまり治療期間中は体の外側に機械を装着することになるので、治療期間中はある程度日常生活が制限されるが、これまで治療が困難であった疾患が治るようになった。創外固定器にはロシアで開発されたリング型のイリザロフ創外固定器や片側型創外固定器などがある。また、脊椎や手足の指に装着する特別な創外固定器もある（非特許文献８）。  
【０００６】
仮骨の形成される速度は人によって違うが１日１ｍｍ程度の速さが目安となり、新しく形成された仮骨は時間が経つと正常で丈夫な骨になる。仮骨延長法を行うことによってこれまで治療が困難であった疾患に対しても、治療が可能となりつつある。この方法では手術の後でピンやフレームの位置を調整することによって骨の位置や向きをコントロールしより正確な治療を行うことが可能である。また、骨組織だけでなく筋・腱・靱帯も延長することもできるので関節拘縮の治療などにも応用している。
【０００７】
より良い治療法の探索において、成長因子はその重要性を大きく高めている。インスリン様増殖因子（IGF-1）は、ヒトにおいて20〜80nMの濃度で血漿中を循環する約7.5kDaの一本鎖ポリペプチドである（非特許文献９）。ソマトメジンCとも呼ばれるIGF-1は、縦方向の骨成長に対する成長ホルモン（GH）効果の重要なメディエイターであり、その作用様式については依然として議論の余地がある（非特許文献10）。
【０００８】
初期の「ソマトメジン仮説」において、GHの主な効果は、肝細胞によるIGF-1の産生を刺激することであり、次いでIGF-1により内分泌様式にて成長板の縦方向の伸長を刺激するものであると提案されていた（非特許文献11）。より最近の研究では、GHは、胚領域前駆体からの軟骨細胞の産生を増幅させるために成長板に直接作用し、その結果、局所的IGF-1合成（自己分泌／傍分泌様式で軟骨細胞柱のクローン性増殖を刺激すると考えられる）を誘導し得ることが示唆されている（非特許文献12）。
【０００９】
IGF-1の全身的および局所的投与は、ヒトおよび実験動物において骨代謝回転および骨ミネラル密度（BMD）を増加させることも示されている（非特許文献13〜16）。骨成長に対するその同化作用、in vivoにおけるIGF-1分子の半減期は５分未満と推定されているにもかかわらず（非特許文献17）、全身的IGF-1注入で報告されている。
また、特許文献１には、仮骨伸延と同時の、動物における骨形成の促進のための成長ホルモン又は成長ホルモン分泌促進薬の使用が提案されている。上記成長ホルモン又は成長ホルモン分泌促進薬は、伸延期間の間に投与されなければならず、そしてさらに、骨の品質が満足ゆくまで、（伸延期間の後）治癒期間のいくつか又は全ての間、投与されることができる。投与期間は、通常、約５週〜約200週、好ましくは、約20週〜約100週の範囲内にある。投与経路は、適当な又は所望の作用部位に上記活性化合物を有効に輸送するいずれかの経路、例えば、経口、鼻内、経膣、直腸、舌下、経皮又は非経口（例えば、筋中、腹膜内、静脈内又は皮下注射、又はインプラント）並びに肺吸入であることができる。成長ホルモン又は成長ホルモン分泌促進薬は、各投与経路のために適当な剤形に配合されることができる。上記組成物又は剤形は、慣用の形態、例えば、カプセル、錠剤、エアロゾル、溶液、懸濁液又は表在局所的適用で現われることができる。
しかし、これらはいずれも副作用（非特許文献18）も懸案事項である。
【００１０】
また、注射により治療対象部位への局所注入などについて、特許文献２には、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）またはＰＴＨ誘導体を有効成分として含有する骨癒合促進剤が提案されている。ここで骨癒合促進剤とは、骨延長、骨切り、骨折、骨移植後などの骨修復過程を促進することなどで治療期間を短縮、あるいは骨強度を増すことなどにより再骨折を予防することなどで治療効果を発揮する薬剤を意味し、詳しくは骨癒合を促進する薬剤、再骨折を予防する薬剤または骨欠損部の修復を促進する薬剤を意味する。薬剤の剤形としてはペプチドの通常の製剤方法により製造される注射剤の他に、例えばマイクロカプセルへの封入あるいはゲル状のシートに含ませるなど局所化および遅効性を期待した剤形も可能である。液剤の場合には、適当な蛋白質を添加したり、あるいは適当な付着防止剤を添加することが好ましい。薬剤の投与方法は、全身投与でも局所投与でも行い得るが、好ましい例として、皮下投与、静脈内投与あるいは鼻腔内投与などによる全身投与や、注射により治療対象部位への局所注入などがあげられる。投与期間は、たとえば骨折の場合には、通常骨折直後からリモデリングの過程を経て骨折治癒が完了するまでの期間であり、好ましくは骨折直後から骨癒合に至る骨折治癒期間である。投与頻度は、月１回投与から連日投与が可能であり、好ましくは１回／２週から５回／週程度もしくは連日投与である。  
【００１１】
【特許文献１】特表2001-503416号公報
【特許文献２】特開平08-310965号公報
【非特許文献１】J Pediatr Orthop 15(5):561-5
【非特許文献２】Klin Padiatr 199(2):111-4
【非特許文献３】UnfallCHirurgie 18(3):162-7〕
【非特許文献４】J South Orthop Assoc 10(2):73-85; discussion 85
【非特許文献５】J R Coll Surg Edinb 44(1):46-54
【非特許文献１】Orthopade 29(1):2-8
【非特許文献７】J Bone Joint Surg Br 70(4):543-9
【非特許文献８】http://web.kanazawa-u.ac.jp/~med27/treatment_bottom6.htm
【非特許文献９】Clin Chem 45(8 Pt 2):1384-90
【非特許文献１０】FasebJ 13(14):1985-90
【非特許文献１１】Nature235(5333):107
【非特許文献１２】EndocrRev 19(1):55-79
【非特許文献１３】AmJ Physiol 267(1 Pt 1):E1-6
【非特許文献１４】Bone12(1):21-6
【非特許文献１５】JBone Miner Res 13(1):13-9
【非特許文献１６】Endocrinology141(7):2674-82
【非特許文献１７】Neuroendocrinology72(3):171-8
【非特許文献１８】Endocrinology141(4):1493-9〕
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
細胞栄養因子であるGH、IGF-1、FGHは骨成長因子であることは知られていたが、今まで骨髄への継続的な薬剤投与方法はなかったため、局所的な骨の治療に細胞栄養因子を用いることはなかった。例えば先天的な遺伝子の欠損（軟骨無形成症−第４番染色体の短腕の１６．４番目−繊維芽細胞成長因子受容体３遺伝子の変異）や事故などにより片足の骨の成長が止まっている（脚長差を生じている）ヒトの患部（局所）への細胞栄養因子の継続的な投与方法はなかった。現在は前記の通り創外固定器による仮骨延長が用いられている。骨を伸ばすことにより、疾患を治療する方法としての創外固定器による仮骨延長法は、有益な方法であるが、広く一般的に行われているわけではない。治療期間が長いこともあるが、ピンやスクリューが体外と骨につながっているために細菌が入り込みやすい状態であることや、リハビリが不十分だと関節拘縮を起こしやすいなどの合併症を生じやすいことも原因である。合併症の発生頻度は経験値と関係があると考えられる。  
【００１３】
本発明は、骨の成長を局所的に促す局所的骨成長促進剤、より具体的には例えば小児期における四肢長異常（LLD）を治療するための局所的骨成長促進剤の提供、およびこの薬剤により全身投与ではなく、局所的に投与可能となり、骨の成長を局所的に促すための局所的骨成長促進用キットの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは骨端へ直接注射することにより局所の薬剤投与が可能になることを発見した。このことにより、全身投与ではなく、局所的に栄養因子を与えることで、骨の形成に良い影響を与えられることができ、骨の成長を局所的に促すことができる。
【００１５】
本発明は、以下の（１）〜（８）の局所的骨成長促進剤を要旨とする。
（１）骨への局所投与を特徴とする、脚を伸ばすための、細胞栄養因子を有効成分とする局所的骨成長促進剤。
（２）骨への局所投与が、局所的継続投与である（１）の局所的骨成長促進剤。
（３）骨端へ直接注射することにより連続局所注入される（１）または（２）の局所的骨成長促進剤。
（４）細胞栄養因子が、GH（成長ホルモン）、IGF-1（ソマトメジンC）、およびFGF（繊維芽細胞増殖因子）からなる群から選ばれる骨成長因子である（１）、（２）または（３）の局所的骨成長促進剤。
（５）脚の長さの違う病気を治療するべく脚を伸ばすための薬剤である（４）の局所的骨成長促進剤。
（６）脚長差が生じる疾病が、四肢長異常（LLD）および側彎症（足の長さの違いにより骨盤のズレが生じる。そのことにより背骨が曲がる症状）よりなる群より選ばれる疾病である（５）の局所的骨成長促進剤。
（７）四肢長異常（LLD）が、小児期における四肢長異常（LLD）である（６）の局所的骨成長促進剤。
（８）美容整形で脚を伸ばすための薬剤である（４）の局所的骨成長促進剤。
【００１６】
本発明は、以下の（９）〜（１４）の局所的骨成長促進剤を要旨とする。
（９）針の先端を骨端に固定可能な骨端へ直接注射するための注射針および持続注入するためのポンプからなる、注射剤の骨端への投与キット。
（１０）注射針が、針の先端に骨端に固定する形状を有する（９）の注射剤の骨端への投与キット。
（１１）ポンプが、体内または体外で用いるポンプである（９）または（１０）の注射剤の骨端への投与キット。
（１２）注射剤が細胞栄養因子を有効成分とする注射剤である（９）、（１０）または（１１）の注射剤の骨端への投与キット。
（１３）細胞栄養因子が、ＧＨ、IGF-1、FGHからなる群から選ばれる骨成長因子である（１２）の注射剤の骨端への投与キット。
（１４）局所的骨成長促進用キットである（９）ないし（１３）のいずれかの注射剤の骨端への投与キット。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により骨端へ直接注射することにより局所の薬剤投与が可能になる。全身投与ではなく、局所的に栄養因子を与えることで、骨の形成に良い影響を与えられることができ、骨の成長を局所的に促すことができる。
【００１８】
実施例に記述するとおり、幼ウサギ脛骨近位骨端中への１、２および４週間にわたるインスリン様増殖因子-1（IGF-1）の連続的局所注入の影響について調べた結果、対照と比較して、２および４週間のIGF-1処置群において縦方向の骨成長の有意な促進ならびに骨幹端のＢＭＤの増大を観察した。
四肢長異常（LLD）を示す骨格的に未成熟な患者の治療は一般的な問題であり、より良い治療の探索において、IGF-1はその重要性を大きく高めている。IGF-1がどれほど効率的に骨に送達されうるのかを知るために、IGF-1の連続的局所注入の効果を分析した。
材料および方法：２４匹のオスウサギを、IGF-1を１週間処置したグループ（ｎ＝５）、IGF-1を２週間処置したグループ（ｎ＝５）、およびIGF-1を４週間処置したグループ（ｎ＝１４）の３つのグループに分けた。１５０μg／kg／日のIGF-1を、浸透圧小型ポンプを用いて、左脛骨の近位骨端に連続的に注入した。対照としては、右脛骨骨端に生理食塩水を注入した。ソフトＸ線写真画像、ヘマトキシリンおよびエオシン、ならびにpＱＣＴを用いて脛骨を調べた。試験の一部において、IGF-1の代わりに墨汁を注入した。
結果：対照と比較して、２週間のIGF-1連続的局所注入群におけるＸ線写真上の左脛骨の骨長は１ｍｍ促進され（p＜０．０１）、４週間のIGF-1連続的局所注入群におけるＸ線写真上の左脛骨の骨長は２ｍｍ促進された（p＜０．００４）。骨成長の促進に伴い、増殖領域および過形成領域の軟骨細胞数の増加が見られた。２週間および４週間のＩＧＦ処置群における脛骨近位骨幹端における骨ミネラル濃度（ＢＭＤ）は、対照の濃度よりも有意に高かった（それぞれ、p＜０．００９、Ｐ＜０．００４）。最終的に、骨端へ注入した墨汁は成長板および骨幹端を染色した。
結論：長骨骨端へのIGF-1の連続的局所注入は骨成長およびＢＭＤの増大を促進し、LLD治療のための優れた選択肢となり得る。
【００１９】
本発明により、骨への局所投与を特徴とする、脚を伸ばすための、細胞栄養因子を有効成分とする局所的骨成長促進剤、より具体的には例えば小児期における四肢長異常（LLD）を治療するための局所的骨成長促進剤、および局所的骨成長促進用キットを提供することができる。
本発明により、骨の成長を局所的に促す局所的骨成長促進剤を提供することができ、また、この薬剤により全身投与ではなく、局所的に投与可能となり、骨の成長を局所的に促すことができる。従来の全身的IGF-1注入で報告されている副作用〔Endocrinology
141(4):1493-9〕も懸案事項であるところ、本発明は、全身投与ではなく、局所的に栄養因子を与えることで、骨の形成に良い影響を与えられることができ、骨の成長を局所的に促すことができ、すなわち局所的投与は低濃度での投与となり副作用の問題がない。様々な成長因子、GH、IGF-1、FGHで試験して、最適の物質（すでに販売されているもの）を見つけることができる。  
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
局所的骨成長促進剤としては、GH（成長ホルモン）、IGF-1（ソマトメジンC）、FGF（繊維芽細胞増殖因子）が挙げられる。脳下垂体でGHは作られて肝臓に届き、肝臓でIGF-1が作られ、そのIGF-1が骨に届き、骨の伸長作用が起きる。FGFは局所因子と言われ、IGF-1からシグナルを受けて、成長帯で作られる。普通であれば、成長帯（成長軟骨）にFGFを局所投与することで骨の成長が促されると考えられるが、IGF-1の局所投与が良く効く。GHは直接成長軟骨に直接働くとは考えられていないが、実際は骨成長作用が存在する。
【００２１】
IGF-1は骨成長のための周知の自己分泌および傍分泌因子である〔Annu
Rev Med 42:17-24〕。IGF-1の半減期がin vivoにおいて非常に短いことが報告されていることから、本発明者らはIGF-1を連続的に注入した。IGF-1の局所注入がラットの縦方向の骨成長に大きな影響を有することが示されている〔Am J Physiol 250(4 Pt 1):E367-72〕。本発明の実施例において、本発明者らは、in vivoでの局所処置の２週間後、IGF-1によって骨成長が促進されたことを示した。IGF-1の全身的投与は他の臓器に望ましくない副作用を示し得るので、本発明者らはIGF-1を局所的に注入した。例えば、高濃度の血清中IGF-1は、乳癌、前立腺癌および結腸癌の主要な危険因子である〔New Perspectives for a New Century. Trends Endocrinol Metab
10(4):136-141〕。
【００２２】
また、近位骨幹端のBMDおよび骨膜周が幼ウサギの脛骨で増大したことが結果から示された。骨内でのIGF-1の局所的影響についてはマウスで研究が行われている。本発明者らは、マウスの思春期にBMDを増加させるためにIGF-1が重要であることを述べた〔Endocrinology 144(3):929-36〕。このように、IGF-1は骨幹端に作用し得る可能性がある。このことを支持するために、骨端に注入した墨汁が成長板および骨幹端を染色することが実験結果から明らかであることが示された。したがって、骨端に注入されたIGF-1は成長板から骨幹端へと通ることができ、これにより直接、骨形成を活性化し得る。
結論として、長骨骨端へのIGF-1の連続的注入はLLD治療の優れた選択肢となり得る。しかしながら、LLD患者の治療において本方法の実行可能性は確立されていない。
【００２３】
有効成分（細胞栄養因子）は公知である。特にIGF-1はインスリン受容体異常症Ａ型、インスリン受容体異常症Ｂ型、脂肪萎縮性糖尿病、妖精症、ラブソン・メンデンホール症候群における高血糖、高インスリン血症、黒色表皮腫、多毛の改善、または成長ホルモン抵抗性の成長ホルモン単独欠損症Type 1Aラロン型小人症などにおける成長障害の改善に用いられている。しかしながら、いずれも皮下注射をしており、今回のような骨への局所投与による脚の伸長を目的とした用途としては用いられていない。
【００２４】
インスリン様増殖因子-1（IGF-1）の連続的局所注入が、幼ウサギにおいて縦方向の骨成長を促進し、骨ミネラル密度を増大させる。
より良い治療法の探索において、成長因子はその重要性を大きく高めている。インスリン様増殖因子（IGF-1）は、ヒトにおいて２０〜８０nMの濃度で血漿中を循環する約７．５kDaの一本鎖ポリペプチドである。ソマトメジンCとも呼ばれるIGF-1は、縦方向の骨成長に対する成長ホルモン（GH）効果の重要なメディエイターであり、その作用様式については依然として議論の余地がある〔Faseb J 13(14):1985-90〕。初期の「ソマトメジン仮説」において、GHの主な効果は、肝細胞によるIGF-1の産生を刺激することであり、次いでIGF-1により内分泌様式にて成長板の縦方向の伸長を刺激するものであると提案されていた〔Nature 235(5333):107〕。より最近の研究では、GHは、胚領域前駆体からの軟骨細胞の産生を増幅させるために成長板に直接作用し、その結果、局所的IGF-1合成（自己分泌／傍分泌様式で軟骨細胞柱のクローン性増殖を刺激すると考えられる）を誘導し得ることが示唆されている〔Endocr Rev 19(1):55-79〕。IGF-1の全身的および局所的投与は、ヒトおよび実験動物において骨代謝回転および骨ミネラル密度（BMD）を増加させることも示されている〔Am J Physiol 267(1 Pt 1):E1-6, Bone 12(1):21-6, J Bone Miner Res
13(1):13-9, Endocrinology 141(7):2674-82〕。骨成長に対するその同化作用、in vivoにおけるIGF-1分子の半減期は５分未満と推定されているにもかかわらず〔Neuroendocrinology 72(3):171-8〕、全身的IGF-1注入で報告されている。副作用〔Endocrinology 141(4):1493-9〕も懸案事項である。
したがって本発明の実施例において、本発明者らは、幼ウサギの脛骨近位骨端中にIGF-1を局所的に注入した。その結果から、IGF-1の連続的局所注入が、成長板中の軟骨細胞のクローン性増殖を刺激することにより骨長を増大させることが示される。
【００２５】
特定の投与間隔（連続的局所注入）、以下に示す特定の投与量の採用により特定の患者群に顕著な効果が奏されるものである。
全身投与の量の１０分の１〜１０００分の１（通常の投与・投与日数に対して）の量を２４時間持続的に投与することにより、骨の成長を促すことができる。
【００２６】
特定の患者群について、小児期における四肢長異常（LLD）は、先天性、外傷性、腫瘍性および特発性のものを含む様々な病気により引き起こされ得る〔J Pediatr Orthop 15(5):561-5, Klin Padiatr 199(2):111-4, UnfallCHirurgie
18(3):162-7〕。脚長異常を示す骨格的に未成熟な患者の評価と治療は一般的な問題である。脚長異常を扱うための治療的代替方法としては、例えば、靴中におけるリフトの使用〔J South Orthop Assoc 10(2):73-85; discussion 85〕、長い方の脚の手術による短縮化〔J R Coll Surg
Edinb 44(1):46-54〕、エピフィセオデシス（epiphyseodesis）による長い方の脚の成長減速もしくは停止〔Orthopade 29(1):2-8〕、または、仮骨延長法と呼ばれる技法による短い脚の伸長化〔J Bone Joint Surg Br 70(4):543-9〕を挙げることができる。ヒトにおいて、身長がのびるのは男１８歳、女１６歳といわれている。小児期における四肢長異常（LLD）は成長可能な年齢までの間にを治療する必要がある。
また、脚長差が生じる疾患は、先天性片側肥大症、先天性疾患、先天性片側萎縮症、先天性股関節脱臼、先天性内反股近位大腿骨巣状欠損症（PFFD）、先天性脛骨低形成症、先天性腓骨無（低）形成症、先天性脛骨偽関節症、先天性脛骨後弯症、腫瘍性疾患、線維性異形成症、多発性外骨腫内軟骨腫症、Mafucci症候群、神経線維腫症（Von Recklinghausen病）、感染症化膿性骨髄炎、化膿性関節炎、骨・関節結核、外傷、骨折、骨端線損傷、麻痺性疾患、ポリオ、脊髄髄膜瘤、Perthes病、大腿骨頭辷り症、放射線障害、若年性関節リウマチと、多くのものがある。患者数は不明であるが、社会的に意義深い研究成果である。
【００２７】
局所的骨成長促進用キットについて、図を使って説明する。図１に注射剤を骨端へ注入する装置のイメージ図を示す。連続的局所注入は、注射針（１）および持続注入するためのポンプ（２）の組み合わせを用いる。注射針（１）は、骨端へ直接注射するための注射針である。注射針は連続的かつ継続的注入のため針の先端を骨端に固定して使用する。注射針の先端を骨端に開けた小さい穴に挿入したとき、穴から抜けがたい形状をもたせる、および／または周辺組織を縫合して、その位置を安定させる必要がある。骨端に固定する手段を針の先端（３）にをもつ形状のものが好ましいがその形状は特に限定されない。ポンプは、体内、体外で用いるポンプのいずれでもよい。注射剤から細胞栄養因子を有効成分とする注射剤を注入する。細胞栄養因子は、ＧＨ、IGF-1、FGHからなる群から選ばれる骨成長因子である。実施例では、連続的局所注入モデル動物実験動物にはオスニホンシロウサギ（4週齢、体重650〜800ｇ）を用いた。塩酸ケタミンおよびキシラジンをそれぞれ体重1kgあたり20mgおよび5mgの用量での静脈注射による麻酔下に近位脛骨骨端にドリルで小さい穴をあけ、27ゲージの針から作製したＬ型カニューレをその穴に挿入した。カニューレの位置を安定させるために周辺組織を縫合し、組換えヒトインスリン様成長因子-1溶液を含むAlzet浸透圧小型ポンプをウサギの背中の皮下に移植した。IGF-1は、カニューレに連結させたポリエチレンカテーテルを通して、150μg／kg／日の用量で注入した。  
【００２８】
本発明の詳細を実施例で説明する。本発明はこれらの実施例によって何ら限定されることはない。
【実施例１】
【００２９】
幼ウサギ脛骨近位骨端中への１、２および４週間にわたるインスリン様増殖因子−Ｉ（IGF-1）の連続的局所注入の影響について調べた。対照と比較して、２および４週間のIGF-1処置群において縦方向の骨成長の有意な促進ならびに骨幹端のBMDの増大を観察した。
［材料および方法］
〈動物〉
24匹のオスニホンシロウサギ（4週齢、体重650〜800ｇ）をオリエンタル酵母社（東京、日本）から購入した。これらのウサギを、IGF-1を1週間処置したグループ（n＝5）、IGF-1を2週間処置したグループ（n＝5）、およびIGF-1を4週間処置したグループ（n＝14）の3グループに分けた。
塩酸ケタミンおよびキシラジンをそれぞれ体重1kgあたり20mgおよび5mgの用量で静脈注射することにより、すべてのウサギを麻酔した。近位脛骨骨端にドリルで小さい穴をあけ、27ゲージの針から作製したＬ型カニューレをその穴に挿入した。カニューレの位置を安定させるために周辺組織を縫合し、組換えヒトインスリン様成長因子-1溶液を含むAlzet浸透圧小型ポンプをウサギの背中の皮下に移植した（図２）。
IGF-1は、カニューレに連結させたポリエチレンカテーテルを通して、150μg／kg／日の用量で注入した。左脛骨にはその対照となる生理食塩水（N/S）を注入した。組み換えヒトIGF-1は、藤沢化学社（大阪、日本）から寛大に贈られたものである。
【００３０】
動物達は、１２時間の明暗周期、華氏70度、標準的ウサギ用飼料（RC4、オリエンタル酵母、東京、日本）を自由摂取できる標準的環境条件下で飼育した。ペントバルビトンナトリウム注（体重1kgあたり60mg）により全てのウサギを犠牲にし、BMD測定ならびに放射線学的分析および組織学的分析のために脛骨を採取した。本プロトコールは徳島大学地域動物保護倫理委員会により認可されている。
試験の一部において、注入した物質の分布を分析するために、4匹の動物に、脛骨近位骨端中へ1時間あたり2.5μlの量で墨汁を連続的に局所注入した。48時間後に全てのウサギを犠牲にし、採取した脛骨を、10％中性ホルマリンを用いて5日間固定し、20％EDTA水溶液中で４週間脱灰した。巨視的写真を撮るために試料を5mm厚の冠状に切断し、次いで、パラフィン中に包埋した。切片は顕微鏡観察のために3μm厚の冠状に切断した。
【００３１】
〈放射線学的分析〉
脛骨のソフトＸ線画像はSoftex X線装置、モデルCMB-2T（Softex社、神奈川、日本）を使用した。骨長はScion Imageソフトウエアを用いて計測した。
【００３２】
〈末梢骨定量コンピュータ断層撮影（pQCT）〉
コンピュータ断層撮影はStratec pQCT（XCT-960A；  Norland／Stratec， Fort Atkinson Pforzheim，USA／Germany）を用いて行った。BMD、骨膜周および骨内膜周を測定するため、脛骨近位骨幹端についてpQCTスキャンを行った。BMD（mg／cm３）および骨面積（mm２）は、全骨、海綿骨および皮質骨において測定した。脛骨近位部成長板に対して5mmの位置の1mm厚切片を用いて測定を行った。
【００３３】
〈組織学的分析〉
採取した脛骨試料はすべて、10％中性ホルマリンを用いて5日間固定し、20％EDTA水溶液中で4日間脱灰し、次いで、パラフィン中に包埋した。切片は3μm厚に冠状に切断し、ヘマトキシリンとエオシンを用いて染色した。増殖および過形成領域の成長板における骨柱あたりの軟骨の数は、倍率20倍の顕微鏡を用いて計数した。良く配向されている「全または無傷の」全ての細胞柱（すなわち、平面上で区分され、各領域の厚み全体に拡がる連続した細胞群を呈する柱）を分析に含め、これらの柱内の各領域に存在する細胞数を計測し、柱あたりの細胞数として表し、動物ごとに各領域について平均した〔Bone 35(3):739-49〕。成長板（GP）の全長は2つの軟骨結合部間の距離を測定した。増殖および過形成領域（PZおよびHZ）の高さを測定するために、形態学的基準に基づいてそれらの境界を線引きした〔Dev Biol 229(1):141-62〕。
【００３４】
〈統計学的分析〉
データの統計学的分析はスチューデント対応のあるt-検定を使用して行った。結果は平均±標準偏差（SD）として示した。p＜0.05の値を有意であるとみなした。
【００３５】
［結果］
〈骨成長〉
対照および4週間IGF-1処置した脛骨のＸ線写真を図３に示す。２週間IGF-1処置した脛骨の骨長は、対照の脛骨の長さよりも約1mm長かった（p＜0.01）。4週間IGF-1処置した群においては、脛骨の長さは、対照の脛骨の長さよりも約2mm長かった（p＜0.00000004）。2週間および4週間IGF-1処置した左脛骨の骨長は、それぞれ1mmおよび2mm増加した〔表１（脛骨長におけるIGF-1連続的局所注入の効果）〕。
【００３６】
〈ＰＱＣＴデータ〉
IGF-1処置した近位骨幹端の小柱容積BMDは、2週間処置群（p＜0.01）および4週間処置群（p＜0.0001）の対照のBMDよりも有意に高かった（図４Ａ）。１週間処置群におけるIGF-1処置した箇所のBMDと対照のBMDとでは有意差が見られなかった。
IGF-1処置した近位骨幹端の皮質BMDは、2週間処置群（p＜0.029）および4週間処置群（p＜0.0002）の対照のBMDよりも有意に高かった（図４Ｂ）。1週間処置群におけるIGF-1処置した箇所のBMDと対照のBMDとでは有意差が見られなかった。
IGF-1処置した近位骨幹端の全ＢＭＤは、２週間処置群（p＜0.009）および4週間処置群（p＜0.004）の対照のBMDよりも有意に高かった（図５）。1週間処置群におけるIGF-1処置した箇所のBMDと対照のBMDとでは有意差が見られなかった。
IGF-1処置した近位骨幹端の骨膜周は、１週間処置群（p＜0.006）、2週間処置群（p＜0.001）および4週間処置群（p＜0.001）の対照の骨膜周よりも有意に高かった（図６Ａ）。IGF-1処置した近位骨幹端の骨内膜周は、２週間処置群（p＜0.004）および4週間処置群（p＜0.0006）の対照の骨内膜周よりも有意に高かった（図６Ｂ）。1週間処置群におけるIGF-1処置した箇所と対照箇所とでは有意差が見られなかった。
【００３７】
【表１】
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【００３８】
脛骨長は2つの骨端間の距離を表す。測定はＸ線画像からのscionイメージによりmmで測定した。全てのデータは平均±SD値で示した。IGF-1の連続的直接的注入の2週間処置群におけるp＜0.01および4週間処置群におけるp＜0.00000004はN／Sと比較して有意であった。1週間処置群のp値は（p＜0.21）有意でなかった。
【００３９】
〈組織学的知見〉
IGF-1を注入したウサギにおける骨成長増大の原因を判断するために、IGF-1を注入した左脛骨近位骨端と生理食塩水を注入した右脛骨近位骨端との間で、脛骨成長板における軟骨の増殖および過形成を比較した〔図７、表２（．脛骨近位部の成長板におけるIGF-1連続的局所注入の効果）〕。生理食塩水とIGF-1の１週間の投与後、成長板の長さは有意差を示さなかった。柱あたりの増殖領域（ＰＺ）中の細胞の大きさおよび数は、対照群と比較して、2週間IGF-1を連続的局所注入した群（それぞれ、p＜0.01、p＜0.005）および4週間IGF-1を連続的局所注入した群（それぞれ、p＜0.03、p＜0.009）で増加した。過形成領域（ＨＺ）中の細胞の大きさおよび数は、対照群と比較して、2週間IGF-1を連続的局所注入した群（それぞれ、p＜0.02、p＜0.04）および4週間IGF-1を連続的局所注入した群（それぞれ、p＜0.003、p＜0.03）で増加した。休止領域（ＲＺ）中の細胞の大きさおよび数は、IGF-1群と対照群とで有意差は無かった。
IGF-1の骨端部への注入がどのように成長板に影響し得るかを分析するために、著者らは、IGF-1の代わりに近位骨端に墨汁を注入し、その分布を評価した。巨視的および顕微鏡的切片は、墨汁が成長板および骨端中に局在していることを示した（図８）。
【００４０】
【表２】
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【００４１】
測定は脛骨の長軸と平行な構造の縦方向にμｍで表した。成長板（ＧＰ）の総長は、２つの軟骨結合部間の距離を表す。休止領域（ＲＺ）は、ＲＺ＝ＧＰ−（ＰＺ＋ＨＺ）により測定した．各成長板の数値の平均を求めるために、各群につき５匹の動物を測定した。切片あたり５測定を行い、１匹の動物につき２切片を使用した（１匹あたり１０測定）。
ＮＳ  有意性なし。
【００４２】
［考察］
本研究の主要な結果は、対照と比較して、脛骨近位骨端中への２週間にわたるIGF-1の連続的局所注入が縦方向の骨成長を１mm促進し、４週間にわたるIGF-1の連続的局所注入が縦方向の骨成長を２mm促進したということである。骨成長の促進は、増殖領域および過形成領域の軟骨細胞数の増加と関連している。
IGF-1を注入した骨端は内軟骨性骨成長が促進されることが結果から示された。IGF-1は軟骨形成において重要な役割を果たすが、その作用機構は十分に明らかにされていない〔Endocrinol Metab Clin North Am 25(3):615-31〕。著者らは、IGF-1が、骨端中の軟骨前駆細胞を集合させるか、または、成長板中の軟骨細胞の分化を促進する、と推測した。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】注射剤を骨端へ注入する装置のイメージ図である。
【図２】幼オスウサギにインスリン様増殖因子−Ｉ（IGF-1）の連続的局所注入実験を説明する図面に代わる写真である。（Ａ）幼オスウサギおよび背中の浸透圧ポンプ。（Ｂ）背中への浸透圧小型ポンプ埋め込みと、脛骨骨端近位部へのカニューレ挿入を示すウサギのレントゲン写真。（Ｃ）浸透圧小型ポンプ。（Ｄ）カニューレおよびカテーテル。
【図３】対照および４週間IGF-1処置した脛骨のＸ線写真を示す。（Ａ）対照脛骨の前後方向のレントゲン写真。Ｎ／Ｓを右に注入した（対照）。および（Ｂ）IGF-1処置を行った脛骨の前後方向のレントゲン写真。IGF-1を幼オスウサギの左脛骨骨端に注入した。IGF-1は４週間の注入後、Ｎ／Ｓを注入したものに比べて脛骨が２ｍｍ長く伸長した。
【図４】オスウサギにおけるＰＱＣＴにより測定した脛骨骨幹端の（Ａ）海綿骨ＢＭＤおよび（Ｂ）皮質骨ＢＭＤ。数値は平均値±ＳＤ値で表した（ｎ＝４〜１４）。左脛骨へのIGF-1注入と右脛骨へのＮ／Ｓ注入を、対応のあるスチューデントt-検定により比較した（Ａ：*ｐ＜０．１８，**p＜0.012，***p＜0.0001，およびＢ：*p＜0.19，**p＜0.02，***p＜0.0002）。
【図５】オスウサギにおけるＰＱＣＴにより測定した脛骨骨幹端の全ＢＭＤ。数値は平均値±ＳＤ値で表した（ｎ＝４〜１４）。左脛骨へのIGF-1注入と右脛骨へのＮ／Ｓ注入を、対応のあるスチューデントt-検定により比較した（*p＜0.29，**p＜0.009，***p＜0.0004）。
【図６】オスウサギにおけるＰＱＣＴにより測定した脛骨骨幹端の（Ａ）骨膜周および（Ｂ）骨内膜周。数値は平均値±ＳＤ値で表した（ｎ＝４〜１４）。左脛骨へのIGF-1注入と右脛骨へのＮ／Ｓ注入を、対応のあるスチューデントt-検定により比較した（Ａ：*p＜0.006，**p＜0.001，***p＜0.001，およびＢ：*p＜0.05，**p＜0.004，***p＜0.0006）。
【図７】脛骨骨端近位部におけるIGF-1の連続的局所的注入の効果を示す、ヘマトキシリンおよびエオシン染色した冠状切断面。休止領域（ＲＺ）が対照群では拡大しているが（Ａ）、IGF-1注入したウサギの成長板においては減少している。IGF-1における増殖領域（ＰＺ）および過形成領域（ＨＺ）の長さは、4週間処置後の対照群よりも長い（Ｂ）。
【図８】骨端から成長板へと拡散した墨汁がはっきりと示されている、脛骨近位部の巨視的写真（Ａ）。炭素が浸透した脛骨の組織学的冠状切断面。骨端（Ｂ）および成長板（Ｃ）へ黒色が拡散している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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