(57)【要約】【課題】  本発明は、コラーゲンまたはエラスチンの分解抑制活性と合成増強活性を合わせ持ち、コラーゲンまたはエラスチンの病的代謝異常を合理的に改善する薬剤を提供することを目的とする。【解決手段】  本発明は、ＪＮＫ阻害活性を有する物質を有効成分とするコラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患の予防および治療剤を提供する。詳しくは、ＪＮＫの活性化によりコラーゲンまたはエラスチン線維の分解促進と再生阻害が生じ、組織構築の崩壊が引き起こされるという新知見に基づき、ＪＮＫ阻害剤により、コラーゲンまたはエラスチンの代謝バランスを合理的に是正し、組織の病的崩壊を防止すると同時に組織再構築を積極的に促すものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＪＮＫ阻害活性を有する物質を有効成分とするコラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患の予防剤または治療剤。
【請求項２】
コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患が、皮膚疾患または骨、軟骨もしくは関節疾患、心血管疾患または肺もしくは消化管の内臓疾患の少なくとも一種である請求項１に記載の予防剤または治療剤。
【請求項３】
コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患が皮膚老化である請求項１に記載の予防剤または治療剤。
【請求項４】
ＪＮＫ阻害活性を有する物質が、コラーゲンまたはエラスチンの合成能を回復させる物質である請求項１乃至３のいずれか１項に記載の予防剤または治療剤。
【請求項５】
コラーゲンまたはエラスチンの合成能を回復させる物質が、リジン酸化酵素を活性化させる物質である請求項４に記載の予防剤または治療剤。
【請求項６】
コラーゲンまたはエラスチンの合成能を回復させる物質が、プロリン水酸化酵素を活性化させる物質である請求項４に記載の予防剤または治療剤。
【請求項７】
コラーゲンまたはエラスチンの合成能を回復させる物質が、リジン水酸化酵素を活性化させる物質である請求項４に記載の予防剤または治療剤。
【請求項８】
ＪＮＫ阻害活性を有する物質が、ＪＮＫ阻害活性を有する化合物またはその薬学上許容される塩である請求項１乃至７のいずれか１項に記載の予防剤または治療剤。
【請求項９】
ＪＮＫ阻害活性を有する化合物が、ピラゾロアントロンまたはその誘導体である請求項８に記載の予防剤または治療剤。
【請求項１０】
ＪＮＫ阻害活性を有する物質が、ＪＮＫ阻害活性を有するペプチドまたは核酸である請求項１乃至７のいずれか１項に記載の予防剤または治療剤。
【請求項１１】
ＪＮＫ阻害活性を有する物質が、ペプチドであってＪＮＫペプチドインヒビター１Ｄ体（Ｄ−ＪＮＫＩ１）である請求項１０に記載の予防剤または治療剤。
【請求項１２】
注射剤の形態である請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の予防剤または治療剤。
【請求項１３】
経口剤の形態である請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の予防剤または治療剤。
【請求項１４】
外用薬の形態である請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の予防剤または治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲンまたはエラスチン代謝異常疾患の予防剤および治療剤に関する。詳しくはＣ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（以下ＪＮＫという）の活性を阻害し、コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常により発症する疾病を予防あるいは治療する薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンおよびエラスチンは、皮膚、骨・軟骨または関節、血管に主に分布し、その他、歯、腱、消化管、肺、子宮などにも広く分布している。そのため、コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常は分布する各臓器で種々の疾患を引き起こすことが知られている。特にコラーゲンは、その４０％が皮膚に、２０％は骨や軟骨に存在し、その他血管や内臓にも広く分布している。例えば、先天性疾患Ｅｈｌｅｒｓ−Ｄａｎｌｏｓ症候群に代表されるように、コラーゲン合成に必須の酵素の異常により、皮膚の過伸展と脆弱性、関節の過可動性と脱臼ならびに血管の脆弱性と出血などの症状を呈することがよく知られている。さらにコラーゲンまたはエラスチンの代謝異常は、心臓弁膜症、動脈解離、血管瘤（動脈瘤または静脈瘤）などの心血管系、変形性関節症、脊柱変形、ヘルニアなどの骨軟骨系、腸管破裂、子宮破裂、膀胱破裂、気胸、肺気腫などの内臓系、眼球破裂、網膜剥離などの眼系または歯牙欠損、歯根膜炎などの歯系でも合併症を併発することがある。一般によく知られているものでは、ビタミンＣ不足によりコラーゲン合成に異常をきたす壊血病がある。壊血病では、血管がもろくなって、皮下出血、歯肉出血や内臓出血をきたすとともに、骨や皮膚がもろくなるなど全身症状を伴う。
【０００３】
近年の研究で、骨や軟骨の形成に足場としてコラーゲンが必要なことが判明し、コラーゲンの代謝異常による骨軟骨症状の病態が裏づけされた。実際、コラーゲンまたはコラーゲンペプチドの投与により変形性関節症や慢性関節リウマチの症状が改善したとの臨床試験結果が報告されている他、動物実験ではコラーゲンペプチド投与が骨粗鬆症を改善することが報告されている。その他、創傷治癒においてもコラーゲンは必須の因子であり、コラーゲンの分解が合成を上回ると治癒過程に支障をきたし、潰瘍を生ずる原因となる。
【０００４】
また、コラーゲンおよびエラスチンは皮膚の特に真皮に多く分布し、それぞれ皮膚の柔軟性と弾力性の保持に必須と考えられている。コラーゲンおよびエラスチンの代謝異常、すなわち分解が合成を上回ることで総量が減少すると、その結果としてしわやたるみ、しみと言ったいわゆる皮膚の老化が発症する。日焼けなどの紫外線照射により皮膚の老化症状が増加するが、その病態においてもコラーゲンおよびエラスチンの代謝異常を伴っていることが近年明らかになった。
【０００５】
さらに、コラーゲンおよびエラスチンは、血管壁の強度と弾性を保つために重要である。コラーゲンおよびエラスチンやその合成に必要な酵素の遺伝子異常が原因の先天性疾患（Ｅｈｌｅｒｓ−Ｄａｎｌｏｓ症候群など）では、血管の瘤化、破裂をきたすことが知られている。また、急性冠症候群（急性心筋梗塞、不安定狭心症、突然死）の発症は、冠動脈粥状硬化巣（プラーク）の破綻が原因とされているが、破綻しやすい不安定なプラークの病態には、コラーゲンおよびエラスチンの分解亢進とそれによる線維性被膜の菲薄化、脆弱化が深く関わっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
コラーゲンまたはエラスチンの代謝バランスに異常をきたす原因は、コラーゲンまたはエラスチンの分解能が亢進し、それらの正常な合成能を上回ることにより、結果としてコラーゲンまたはエラスチンの存在量が減少するか、或いはコラーゲンまたはエラスチンの合成能力が低下し、正常な分解能に対して、それを補い得なくなり、結果としてコラーゲンまたはエラスチンの総量が減少する場合がある。更に最悪の場合には、コラーゲンまたはエラスチンの分解が亢進し、同時に合成能力の低下を生ずることにより、急速にコラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患を生ずるものと考えられる。
【０００７】
従って、コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常による疾患に対する薬剤としては、それぞれ分解能の亢進に抑制する必要がある場合と、合成能力を回復させる薬剤を必要とする場合とがあるのであるが、コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患が、そのいずれの原因に基づいて発症したのかを知ることは容易ではない。そこで、そのいずれに対しても有効である薬剤、すなわちコラーゲンまたはエラスチンの分解を抑制する効果と合成能力を高める効果とを併せ持つ薬剤の開発が望まれていた。
【０００８】
そこで、本発明は、コラーゲンまたはエラスチンの分解抑制活性と合成増強活性を合わせ持ち、コラーゲンまたはエラスチンの病的代謝異常を改善する薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、培養実験系においてＪＮＫ依存性遺伝子群を網羅的に検索した結果、コラーゲンまたはエラスチンをはじめとする細胞外基質分解に関わる遺伝子群がＪＮＫ依存的に発現亢進すること、ならびにコラーゲンまたはエラスチンの合成に必須の酵素群（プロリン水酸化酵素（Ｐ４Ｈ）、リジン水酸化酵素（ＰＬＯＤ）およびリジン酸化酵素（ＬＯＸ））がＪＮＫ依存的に発現低下することを見出した。さらに本発明者らは、ＪＮＫの活性化によりコラーゲンまたはエラスチンの分解促進と再生阻害が同時に生ずるというこの病態機序に基づき、ＪＮＫ阻害剤がコラーゲンまたはエラスチン代謝に及ぼす効果を培養実験系において検討した。その結果本発明者らは、ＪＮＫ阻害活性を有する物質が、コラーゲンまたはエラスチンの分解抑制活性と合成増強活性を合わせ持ち、総合的に病的代謝バランスを是正することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
【００１１】
（１）ＪＮＫ阻害活性を有する物質を有効成分とするコラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患の予防および／または治療剤。
【００１２】
（２）コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患が、皮膚疾患、骨、軟骨もしくは関節疾患、心血管疾患または肺もしくは消化管の内臓疾患の少なくとも一種である（１）に記載の予防および／または治療剤。
【００１３】
（３）コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患が皮膚老化である（１）に記載の予防および／または治療剤。
【００１４】
ここで、皮膚の老化、すなわち皮膚のしわやたるみ、或いはシミなど老化により生ずる現象もコラーゲンやエラスチンの減少による症状であり、コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患の一種に包含されるものとする。
【００１５】
（４）ＪＮＫ阻害活性を有する物質が、コラーゲンまたはエラスチンの合成能を回復させる物質である（１）または（３）に記載の予防および／または治療剤。
【００１６】
（５）コラーゲンまたはエラスチンの合成能を回復させる物質が、リジン酸化酵素を活性化させる物質である（４）に記載の予防および／または治療剤。
【００１７】
（６）コラーゲンまたはエラスチンの合成能を回復させる物質が、プロリン水酸化酵素を活性化させる物質である（４）に記載の予防および／または治療剤。
【００１８】
（７）コラーゲンまたはエラスチンの合成能を回復させる物質が、リジン水酸化酵素を活性化させる物質である（４）に記載の予防および／または治療剤。
【００１９】
（８）ＪＮＫ阻害活性を有する物質が、ＪＮＫ阻害活性を有する化合物またはその薬学上許容される塩である（１）〜（７）のいずれかに記載の予防および／または治療剤。
【００２０】
（９）ＪＮＫ阻害活性を有する化合物が、ピラゾロアントロンまたはその誘導体である（８）に記載の予防および／または治療剤。
【００２１】
（１０）ＪＮＫ阻害活性を有する物質が、ＪＮＫ阻害活性を有するペプチドまたは核酸である（１）〜（７）のいずれかに記載の予防および／または治療剤。
【００２２】
（１１）ＪＮＫ阻害活性を有する物質が、ペプチドであってｃ−Ｊｕｎ  Ｎ−末端キナーゼ（ＪＮＫ）ペプチドインヒビター１  Ｄ体（Ｄ−ＪＮＫＩ１）である（１０）に記載の予防および／または治療剤。
【００２３】
（１２）注射剤の形態である（１）〜（１１）のいずれかに記載の予防および／または治療剤。
【００２４】
（１３）経口剤の形態である（１）〜（１１）のいずれかに記載の予防および／または治療剤。
【００２５】
（１４）外用薬の形態である（１）〜（１１）のいずれかに記載の予防および／または治療剤。
【発明の効果】
【００２６】
本発明は、基本的にはＪＮＫ阻害活性を有する物質よりなるコラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患の予防および／または治療剤を提供することにある。ＪＮＫ阻害剤は、コラーゲンまたはエラスチンの分解抑制活性と合成増強活性を合わせ持ち、疾患の直接的な病因であるコラーゲンまたはエラスチンの代謝異常を総合的に是正しうる。すなわちＪＮＫ阻害剤により、コラーゲン線維またはエラスチン線維の病的崩壊を防止し、組織再構築を積極的に促し、ついには疾患を合理的かつ有効に予防および／または治療することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
ＪＮＫは、ｃ−Ｊｕｎのアミノ末端をリン酸化する酵素で、ＭＡＰキナーゼの一種であり、インターロイキン１（ＩＬ−１）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）等のサイトカインや紫外線照射、熱ショック、高浸透圧等の物理化学的なストレス刺激で活性化される酵素の一種である。ＪＮＫはまた、ｃ−Ｊｕｎを構成遺伝子とする転写因子ＡＰ−１をリン酸化し、炎症に関与する遺伝子Ｃｏｘ−２等の発現をも誘導することが知られ、またアポトーシスに関与するとも考えられていた。しかしながら、ＪＮＫの細胞外基質代謝バランスにおける役割とコラーゲンまたはエラスチン代謝異常疾患の病態における役割については不明であった。
【００２８】
本発明者らは、ＪＮＫが活性化すると、複数の細胞外基質分解酵素、特にマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）群、リポカリン２、誘導性一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）あるいはＩＬ−１等の発現が亢進され、その結果、主たる細胞外基質分解酵素ＭＭＰ−９の活性が著しく亢進し、ＭＭＰ抑制因子（ＴＩＭＰ−３）が減少することを培養実験系の検討から発見した。さらに本発明者らは、細胞または組織培養実験系において、ＪＮＫ阻害活性を有する物質がコラーゲンまたはエラスチンを分解する蛋白分解酵素群ＭＭＰの活性を統合的に阻害するだけでなく、同時にコラーゲンまたはエラスチンの合成増強活性を有することを証明した。すなわちＪＮＫ阻害剤はコラーゲンまたはエラスチンの代謝改善効果を細胞レベルまたは組織レベルで発揮するものであり、コラーゲンまたはエラスチン代謝異常疾患に対する合理的な予防薬ならびに治療薬と考えられる。
【００２９】
本発明は、ＪＮＫの活性阻害により、前記のとおりリポカリン２、ｉＮＯＳ、ＩＬ‐１あるいはＭＭＰ‐９など組織を構成するコラーゲンまたはエラスチンの崩壊を助長する因子の働きを統合的に阻害し、且つプロコラーゲン（コラーゲン前駆体）の発現およびコラーゲンまたはエラスチンの合成に必須な酵素群（リジン水酸化酵素、プロリン水酸化酵素およびリジン酸化酵素）の発現の是正により細胞外基質合成能を回復させ、組織の構築を再生治癒するものである。
【００３０】
したがって本発明においては、ＪＮＫの活性を阻害することが直接的に組織中のコラーゲンまたはエラスチン代謝バランスを改善し、コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患の予防のみならず治療に有効であり、注射投与、経口投与または外用等により、生体内で有効にＪＮＫの活性を阻害する物質を用いるかぎり、薬物的なＪＮＫ阻害手段は特に制限されない。
【００３１】
本発明でいうＪＮＫは、ＪＮＫ１、ＪＮＫ２およびＪＮＫ３を含み、これらＪＮＫ１、ＪＮＫ２およびＪＮＫ３の３種類の遺伝子には、それぞれコードされたいくつかのアイソフォームが存在することが知られている。本発明におけるＪＮＫ阻害とは、これらアイソフォームに特異的な阻害と非特異的な阻害の両方を含むものである。
【００３２】
コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患は、その代表的なＥｈｌｅｒｓ−Ｄａｎｌｏｓ症候群でみられるように皮膚の過伸展と脆弱性、関節の過可動性と脱臼ならびに血管の脆弱性と出血など、コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常によって引き起こされた組織の脆弱化あるいは組織構築の崩壊に伴う諸症状を特徴とする疾患群である。より具体的には、心臓弁膜症、動脈解離、血管瘤、急性冠症候群などの心血管系疾患、変形性関節症、脊柱変形、ヘルニアなどの骨軟骨系疾患、腸管破裂、子宮破裂、膀胱破裂、気胸、肺気腫などの内臓系疾患、眼球破裂、網膜剥離などの眼系疾患、歯牙欠損、歯根膜炎などの歯系疾患、ビタミンＣ不足によりコラーゲン合成に異常をきたす壊血病、ならびに皮膚の老化などが挙げられる。
【００３３】
ＪＮＫ阻害剤は、コラーゲンまたはエラスチンの病的代謝を細胞レベルおよび組織レベルで改善し正常化する効果を持つので、これらのコラーゲンまたはエラスチン代謝異常疾患に対して合理的な予防剤または治療剤であると考えられる。
【００３４】
本発明は、コラーゲンまたはエラスチンの分解抑制活性と合成増強活性を合わせ持つ、コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患の予防剤および治療剤を提供するものであるが、同時に本発明からはコラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患の予防剤および治療剤に相応しい化合物を選択または同定（スクリーニング）する時の有用な評価指標が提供される。第一の指標は、ＪＮＫ活性の阻害能である。より具体的には、ＪＮＫ１、ＪＮＫ２またはＪＮＫ３による基質ｃ−Ｊｕｎリン酸化の抑制効果を検出する無細胞キナーゼアッセイ等でテストされうる。第二の指標は、コラーゲンまたはエラスチンの分解抑制能である。より具体的には、培養細胞系でコラーゲンまたはエラスチンの代表的分解酵素であるＭＭＰ活性の抑制効果を免疫アッセイ法やザイモグラフィー法等でテストされうる。第三の指標は、コラーゲンまたはエラスチンの合成促進能である。より具体的には、培養細胞系でコラーゲンまたはエラスチンの必須合成酵素であるプロリン水酸化酵素（Ｐ４Ｈ），リジン水酸化酵素（ＰＬＯＤ）およびリジン酸化酵素（ＬＯＸ）の増強または回復効果を、特異的基質を用いたアッセイにより活性レベルで検出する方法またはＰＣＲにより発現レベルで検出する方法等でテストされうる。これらの指標により段階的に化合物が選択され、その結果、コラーゲンまたはエラスチンの代謝異常疾患の予防剤および治療剤として最も相応しいものが同定されることを期待できる。
【００３５】
本発明において、ＪＮＫ阻害活性（ＪＮＫ阻害剤と称する場合もある）を有する物質としては、既知のＪＮＫ阻害活性を有する化合物（それらは種々の文献、例えばＮａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ２：５５４−５６５（２００３），Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ＣＮＳ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｄｉｓｏｒｄ  １：３１−４９（２００２），Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ  ２３：４０−４５（２００２），Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０９：１１９６−１２０５（２００４），Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３：４２０−４２５（２００３），Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １６９７：８９−１０１（２００４），Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  ９：９３２−９３９（２００４）などに示されている。）またはその薬学上許容される塩、或いは既知のＪＮＫ活性を阻害するペプチドまたは核酸が例示される。
【００３６】
上記のＪＮＫ阻害活性を有する化合物の具体例としては、次の一般式（１）〜（１３）で示される化合物からなる群から選択される少なくとも一の化合物が示される。
一般式（１）
【００３７】
【化１】
2007051086.tif 000002
［但し、上記式中、Ｒ１とＲ２は、それぞれ同一または異なり、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、ニトロ基、三フッ化メチル基、スルホニル基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アルコキシ基、アリール基、アリールオキシ基、アリールアルキルオキシ基、アリールアルキル基、シクロアルキルアルキルオキシ基、シクロアルキルオキシ基、アルコキシアルキル基、アルコキシアルコキシ基、アミノアルコキシ基、モノまたはジアルキルアミノアルコキシ基、または次の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）の式で示されるグループのいずれかである。
【００３８】
【化２】
2007051086.tif 000003
（上記Ｒはアルキレン基、Ｒ３とＲ４は末端が連結したアルキレンまたはヘテロ原子を含むアルキレン、或いは、それぞれ同一または異なり、水素原子、アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、アリールアルキル基、シクロアルキルアルキル基、アリールオキシアルキル基、アルコキシアルキル基、アルコキシアミノ基、またはアルコキシ（モノまたはジーアルキルアミノ）基を表し、Ｒ５は、水素原子、アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、アリールアルキル基、シクロアルキルアルキル基、アルコキシ基、アミノ基、モノまたはジーアルキルアミノ基、アリールアミノ基、アリールアルキルアミノ基、シクロアルキルアミノ基、またはシクロアルキルアルキルアミノ基を表す。）］
一般式（２）
【００３９】
【化３】
2007051086.tif 000004
［但し、上記式中、Ｒ１は非置換または置換化アリール基またはヘテロアリール基であり、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ同一または異なり、水素原子または、低級アルキル基であり、Ｒ４は、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、低級アルキル基および低級アルコキシ基であり、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ同一または異なり、水素原子または、アルキル基、非置換または置換化アリール基である。］
一般式（３）
【００４０】
【化４】
2007051086.tif 000005
［但し、上記式中、Ｒ１、Ｒ２は水素原子、低級アルキル基および低級アルコキシ基、Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＮＨであり、Ｇは、非置換または置換化ピリミジニル基である。］
一般式（４）
【００４１】
【化５】
2007051086.tif 000006
［但し、上記式中、Ａｒ１およびＡｒ２は、互いに独立して、非置換または置換化アリール基またはヘテロアリール基であり、Ｒ１は水素原子または低級アルキル基であり、ｎは、０から５の整数であり、Ｘ１はＯまたはＳであり、Ｙは、少なくとも一のヘテロ原子を含む非置換もしくは置換化４〜８員ヘテロ環、非置換または置換化アリール基またはヘテロアリール基である。］
一般式（５）
【００４２】
【化６】
2007051086.tif 000007
［但し、上記式中、Ｒ１、Ｒ２は互いに独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、低級アルキル基および低級アルコキシ基である。］
一般式（６）
【００４３】
【化７】
2007051086.tif 000008
［但し、上記式中、Ｘ−Ｙ−Ｚは以下の式のいずれかから選択される；
【００４４】
【化８】
2007051086.tif 000009
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、互いに独立して、水素原子、低級アルキル基、シクロアルキル基、非置換または置換化アリール基、アリールアルキル基であり、Ｇは非置換または置換化アリール基、ヘテロアリール基であり、Ｑ−ＮＨは下記の式である；
【００４５】
【化９】
2007051086.tif 000010
（上記式中、ＡはＮであり、ＵはＯ、Ｓ、またはＮＨである）］
式（７）
【００４６】
【化１０】
2007051086.tif 000011
一般式（８）
【００４７】
【化１１】
2007051086.tif 000012
［但し、上記式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立に、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、非置換または置換化アリール基またはヘテロアリール基であり、ＸはＮまたはＣＨである。］
一般式（９）
【００４８】
【化１２】
2007051086.tif 000013
［但し、上記式中、Ｒ１は、非置換または置換化アリール基、アリールオキシ基、ヘテロアリール基、ヘテロアリールオキシ基、または置換されたヘテロアリールオキシで置換された低級アルキルであり、Ｒ２およびＲ３は、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、非置換または置換化アリール基またはヘテロアリール基であり、Ｘは、ＮまたはＣＨであり、ｚで示した点線の結合は随意である。］
一般式（１０）
【００４９】
【化１３】
2007051086.tif 000014
［但し、上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５は独立に、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、非置換または置換化アリール基またはヘテロアリール基であり、Ｌ−Ｘ−ＹはＮＨ−ＣＯ−Ｒであり、Ｒは、非置換または置換化アリールアルキル基またはヘテロアリールアルキル基である。］
一般式（１１）
【００５０】
【化１４】
2007051086.tif 000015
［但し、上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５は、互いに独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、非置換または置換化アリール基またはヘテロアリール基であり、Ｒ３は、Ｘと一緒になって、完全に飽和した５〜７員環を形成しており、前記環中の各飽和炭素は、＝Ｏまたは＝Ｓで任意に、且つそれぞれ別個にさらに置換されている。Ｙは、ＣＨまたはＮであり、ｎは１である。］
一般式（１２）
【００５１】
【化１５】
2007051086.tif 000016
［但し、上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、互いに独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、非置換または置換化アリール基、シクロアルカン基またはヘテロアリール基であり、Ｘは１から３個の炭素を有する結合またはアルキル架橋であるか、ＨＥＴＣｙと一緒になって、完全に飽和した５〜７員環を形成しており、Ｙは−ＮＨであり、ＨＥＴＣｙは、少なくとも１個のＮ原子を含有している４〜６員のヘテロアリール基である］
一般式（１３）
【００５２】
【化１６】
2007051086.tif 000017
［但し、上記式中、Ｒ７はアルキレンチオアルキル基またはアルキレンアルキルエーテル基、Ｒ８、Ｒ９はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、低級アルキル基、低級アルコキシ基またはアルコキシアルキル基である。］
上記に例示される一般式で示される化合物の内、特に有効なＪＮＫ阻害剤となる具体的化合物の例を、それぞれ対応する番号を付して、次の式（１）〜（１３）で示す。
【００５３】
【化１７】
2007051086.tif 000018
【００５４】
【化１８】
2007051086.tif 000019
【００５５】
【化１９】
2007051086.tif 000020
【００５６】
【化２０】
2007051086.tif 000021
【００５７】
【化２１】
2007051086.tif 000022
【００５８】
【化２２】
2007051086.tif 000023
【００５９】
【化２３】
2007051086.tif 000024
これらの化合物のうち、一般式（１）で示される化合物は特に効果が優れており、特に予防または治療剤として注射剤の形態とすることが望ましい。前記式（２）で示されるアニリノピリミジン誘導体は注射剤としても使用可能であるが、特に経口剤として有効に使用できるため、本発明において治療用は勿論、予防剤として優れた有用性が期待できる。前記式（３）および式（４）で示される化合物は、特に経口剤として有効である。
【００６０】
式（１）で表されるピラゾロアントロン骨格を有するアントラピラゾール−６−オンは、製品名ＳＰ６００１２５として市販されており、ＡＴＰに対する競合的な阻害作用により、ＩＬ‐１で刺激された細胞で、ＡＰ‐１の転写活性の抑制、ヒト末梢血単核細胞で、Ｃｏｘ‐２、ＩＬ‐２、ＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐αの炎症性遺伝子の発現を阻害する目的やＬＰＳで誘導されるＴＮＦ‐αの発現を抑制し、アポトーシス抑制のために使用されている。
【００６１】
本発明で使用される化合物は、その薬学上許容される塩であってもよく、塩基性化合物の場合は例えばカルボン酸、スルホン酸等の有機酸、硫酸、塩酸、鉱酸等との塩が、酸性化合物の場合は例えばアルカリ金属、アルカリ土類金属、有機塩基等との塩が挙げられる。カルボン酸、スルホン酸等の有機酸としては、例えば酢酸、アジピン酸、安息香酸、クエン酸、フマール酸、アスパラギン酸、乳酸、リンゴ酸、パルミチン酸、サリチル酸、酒石酸、ベンゼンスルホン酸、カンファースルホン酸、トルエンスルホン酸が、鉱酸としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸等が挙げられる。アルカリ金属、アルカリ土類金属、有機塩基等としては、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、テトラメチルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム等が挙げられる。
【００６２】
本発明で使用される化合物は光学活性体、またはラセミ体、ジアステレオマー、またはジアステレオマーの混合物、個々のエナンチオマーからエナンチオマーの混合物までを全て包含するものである。また、置換基の結合位置等は特に限定しない限り、結合可能な位置異性体すべてを含む。更に、水和物等の溶媒和物、溶媒和物の互変異性体等のように様々な多形も本発明で使用される化合物に含まれる。
【００６３】
本発明における上記一般式で表される一連の化合物群は、それぞれ公開公報、国際公表公報等において開示された製造法によって製造されるが、それらの方法に限定されるものではない。
【００６４】
本発明においてＪＮＫ阻害活性を有する物質として上記一般式で表される一連の化合物が用いられる場合は、単独または溶解剤、増量剤、賦形剤または担体と混合して注射剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル剤、貼付剤、軟膏剤、スプレー剤、溶液剤、徐放剤等の製剤とし、賦形剤または担体等の添加剤としては薬学的に許容されるものが選ばれ、その種類および組成は投与経路や投与方法によって決まる。例えば注射剤の場合、一般に食塩、グルコース、マンニトール等の糖類が望ましい。経口剤の場合、でんぷん、乳糖、結晶セルロース、ステアリン酸マグネシウム等が望ましい。
【００６５】
投与経路は、経口もしくは注射により、または外用剤等により非経口により全身に投与する方法の他、軟膏剤、溶液剤、貼付剤やスプレー剤等により病変部または病変部近傍局所に直接投与する方法、カテーテル等により病変部または病変部近傍に遠隔的に投与する方法等が選ばれる。予防剤としては、特に経口あるいは外用が好ましい。治療剤としては、その重症度によって、経口剤のみならず注射剤または局所投与等も望ましい。また、皮膚、骨・軟骨または関節におけるコラーゲンまたはエラスチン代謝異常疾患に対する治療剤としては、経口剤または注射剤のみならず貼付剤、軟膏剤、スプレー剤等の外用剤も望ましい。
【００６６】
本発明の予防剤および治療剤中における本化合物の含量は製剤により種々異なるが通常０．００１〜１００重量％、好ましくは０．０１〜９８重量％である。例えば注射剤の場合には、通常０．００１〜３０重量％、好ましくは０．０１〜１０重量％の有効成分を含むようにすることがよい。経口剤の場合には、添加剤とともに錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤、ドライシロップ剤等の形態で用いられる。カプセル剤、錠剤、顆粒、散剤は一般に０．１〜１００重量％、好ましくは１〜９８重量％の有効成分を含む。投与量は、患者の年令、体重、症状等により決定されるが、治療量は一般に、非経口投与で０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、経口投与で０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日である。溶液で用いる場合は、１〜１０００ｎＭの濃度で用いる。
【００６７】
本発明において、ＪＮＫ阻害剤を有効成分とするコラーゲンまたはエラスチン代謝異常疾患の予防剤または治療剤を注射剤とする場合には、人体に無害な溶液として用いればよいが、好ましい一態様は、ポリエチレングリコール（分子量３００〜５００程度）３０％、プロピレングリコール２０％、１５％クレモフォルイーエル、５％エタノール、３０％生理食塩水のエマルジョン化溶液として用いることができる。
【００６８】
また、本発明は、ＪＮＫ阻害剤として、ＪＮＫ活性を阻害するペプチドまたは核酸等を用いることができる。
【００６９】
治療剤としては、以下が挙げられる：例えば、（ｉ）ＪＮＫインヒビターペプチドならびにその誘導体、フラグメント、アナログおよびホモログの任意の１つ以上；（ｉｉ）ＪＮＫインヒビターペプチドならびにその誘導体、フラグメント、アナログおよびホモログをコードする核酸；（ｉｉｉ）ＪＮＫに対して指向される抗体のすべてまたは抗原認識部位を含むフラグメントまたはこれらをコードする核酸、（ｉｖ）ＪＮＫをコードする配列に対するアンチセンス核酸または干渉ＲＮＡおよびこれらをコードする核酸、ならびに（ｖ）モジュレーター（すなわち、インヒビター、アゴニストおよびアンタゴニスト）。
【００７０】
上記ＪＮＫ活性を阻害するペプチドまたは核酸の具体例として、例えば、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  １，Ｌ−ｓｔｅｒｅｏｉｓｏｍｅｒ（Ｌ−ＪＮＫＩ  １，  ＡＬＥＸＩＳ社，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１１８０−１１８６（２００３））、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  １，Ｄ−ｓｔｅｒｅｏｉｓｏｍｅｒ（Ｄ−ＪＮＫＩ  １，ＡＬＥＸＩＳ社，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１１８０−１１８６（２００３））ＪＮＫアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３３４２２−３３４２９（１９９７））、ＪＮＫ干渉ＲＮＡ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：４０１１２−４０１２１（２００４））、ドミナントネガティブＪＮＫ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３２５８０−３２５８７（１９９９））およびＪＮＫｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１（ＪＩＰ−１，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７７：６９３−６９６（１９９７））等を挙げることができる。
【００７１】
本発明のＪＮＫインヒビター、ペプチド、融合ペプチドおよび核酸は、薬学的組成物中で処方され得る。これらの組成物は、上記の物質のひとつに加えて、薬学的に受容可能な賦型剤、キャリア、緩衝剤、安定化剤または当業者に周知の他の材料を含み得る。そのような材料は、非毒性であるべきであり、そして活性成分の効力に干渉すべきではない。キャリアまたは他の材料の正確な性質は、投与経路に依存し得る（例えば、経口、静脈内、皮膚または皮下、経鼻、筋肉内、腹腔内経路等）。
【００７２】
経口投与のための薬学的組成物は、錠剤、カプセル、散剤または液体形態であり得る。錠剤は、固形キャリア（例えば、ゼラチンまたはアジュバント）を含み得る。液状薬学的組成物は、概して、液体キャリア（例えば、水、動物油、植物油または合成油）を含む。生理食塩水溶液、デキストロースまたは他の糖溶液もしくはグリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール）もまた含まれ得る。
【００７３】
静脈内、皮膚または皮下の注射、または罹患部位への注射のために、活性成分は、非経口的に受容可能な水溶液またはエマルジョン液の形態であり、これは、発熱物質を含まず、そして適切なｐＨ、等張性および安定性を有する。関連分野の当業者は、例えば、等張性ビヒクル（例えば、生理食塩注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液）を用いて適切な溶液を調製し得る。保存剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤および／または他の添加物もまた、必要に応じて含まれ得る。
【００７４】
本発明においてはＪＮＫ阻害活性を有する物質を有効成分とする薬剤を用いることにより、コラーゲンまたはエラスチン代謝異常疾患の予防または治療が可能になる。該薬剤はＪＮＫ阻害活性を有する物質を、製薬的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせてなる組成物、またはより多くの他の作用剤をさらに含む組成物の形態であってよく、その使用の態様は特に問題とはならず、該薬剤は注射や内服など体内に取り込む手段は特に制限されない。
【００７５】
以下に、前記式（１）で表されるピラゾロアントロン骨格を有するアントラピラゾール−６−オン化合物（ＳＰ６００１２５（トクリス社製：ピラゾールアントロン））等についての実施例を示す。
【実施例１】
【００７６】
培養細胞におけるＪＮＫ阻害ペプチドの効果
［方法］ＪＮＫ阻害ペプチドの効果を検証するため、主なコラーゲンまたはエラスチン分解酵素の一つであるＭＭＰ‐９を指標とした培養細胞系実験を行った。細胞は、種々のコラーゲンまたはエラスチン代謝異常疾患で主にＭＭＰ‐９を発現するマクロファージ細胞（ＴＨＰ‐１）を用いた。即ち、培養ＴＨＰ‐１細胞にあらかじめ異なる濃度（０、１、２、５μＭ）のＪＮＫ阻害ペプチドＤ‐ＪＮＫＩ１（ＡＬＥＸＩＳ社）を投与した。コントロールペプチドとしてＤ‐ＴＡＴ（ＡＬＥＸＩＳ社）を用いた。ペプチド投与後２４時間目に炎症性サイトカインであるＴＮＦ‐α（５０ｎｇ／ｍｌ）で刺激し、さらに４８時間後に培養液を回収して、培養液中に分泌されたＭＭＰ‐９量をゼラチンザイモグラフィー法で定量解析した。
【００７７】
［結果］培養ＴＨＰ‐１細胞は、ＴＮＦ刺激によって顕著なＭＭＰ‐９分泌を示した。Ｄ‐ＪＮＫＩ１は、ＴＮＦによるＭＭＰ‐９分泌を濃度依存性に抑制した。同濃度のコントロールペプチドＤ‐ＴＡＴでは、ＭＭＰ‐９の抑制効果は認められなかった。この結果から、ＪＮＫ阻害ペプチドＤ‐ＪＮＫＩ１がコラーゲンまたはエラスチンの分解抑制効果を持つことが示された。（図１参照）
【実施例２】
【００７８】
コラーゲン合成能に対するＪＮＫ阻害ペプチドの効果
［方法］ラット大動脈より分離した平滑筋細胞初代培養系を用いて、実験を行った。Ｋｉｄｗｅｌｌらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．１４７：４０７−４１４（１９８７））に準じ、３Ｈ標識プロリンが取込まれる新規合成蛋白の内、コラーゲン分解酵素によって特異的に分解を受ける分画を定量解析した。無血清培地に３Ｈ標識プロリン（３μＣｉ／ｍｌ）を添加し、培養を開始した。培養開始直後にＪＮＫ阻害ペプチド（Ｄ‐ＪＮＫＩ１、０,１,２,５ｍＭ、ＡＬＥＸＩＳ社）を投与した。ペプチド投与後７２時間目に培養上清中の蛋白を回収した。さらに、コラーゲン分解酵素で可溶化した分画のみ回収し、コラーゲン新規合成のために取込まれた３Ｈ標識プロリンをシンチレーションカウンターで計測した。
［結果］ＪＮＫ阻害ペプチドＤ‐ＪＮＫＩ１は、培養平滑筋細胞におけるコラーゲン合成能を濃度依存性に促進した（５ｍＭで０ｍＭの１．６±０．１倍、ｐ＜０．０１）。（図２参照）
【実施例３】
【００７９】
プロリン水酸化酵素に対するＪＮＫ阻害薬の効果
［方法］ラット大動脈より分離した平滑筋細胞初代培養系を用いて、実験を行った。無血清培地にＪＮＫ阻害薬ＳＰ６００１２５（トクリス社：ピラゾールアントロン、５０ｍＭ）添加し、ＳＰ添加後１時間目に、TＮＦ‐α（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。ＴＮＦ‐α刺激後２４時間目に、細胞を回収し、ノーザンブロット法を用いてプロリン水酸化酵素の発現をｍＲＮＡレベルで定量解析した。プロリン水酸化酵素（Ｐ４Ｈ）は、コラーゲン合成に必須な重要な酵素の一つであり、その低下はコラーゲン合成能の低下を意味する。
［結果］培養平滑筋細胞におけるプロリン水酸化酵素の発現は、ＴＮＦ‐αによる炎症性サイトカイン刺激によって減少するが、ＪＮＫ阻害薬ＳＰ６００１２５は、このプロリン水酸化酵素発現低下を阻止し、コラーゲン合成能を回復した（ｐ＜０．０５）。（図３参照）
【実施例４】
【００８０】
リジン酸化酵素に対するＪＮＫ阻害ペプチドの効果
［方法］ラット大動脈より分離した血管平滑筋細胞初代培養系を用いて、実験を行った。実験開始時に血清欠乏状態とし、血清欠乏ストレスにより培養細胞のＪＮＫを活性化した。実験開始直後にＪＮＫ阻害ペプチド（Ｄ‐ＪＮＫＩ１、５ｍＭ、ＡＬＥＸＩＳ社）を投与し、対照ペプチドとして、Ｄ‐TＡT（５ｍＭ、ＡＬＥＸＩＳ社）を用いた。ペプチド投与後６日目に細胞を回収し、ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法を用いてリジン酸化酵素の発現をｍＲＮＡレベルで定量解析した。リジン酸化酵素（ＬＯＸ）は、コラーゲン線維あるいはエラスチン線維の成熟に必須な酵素であり、その低下はコラーゲンまたはエラスチンの合成能低下を意味する。
［結果］培養平滑筋細胞におけるリジン酸化酵素の発現は、血清欠乏ストレス刺激によって減少するが、ＪＮＫ阻害ペプチドＤ‐ＪＮＫＩ１は、このリジン酸化酵素発現低下を阻止し、コラーゲンまたはエラスチンの合成能を回復した（ｐ＜０．０１）。（図４参照）
【実施例５】
【００８１】
ＪＮＫ２遺伝子欠損細胞における細胞外基質合成能の解析
［方法］ＪＮＫ２遺伝子欠損マウス（ＪＮＫ２−／−）の大動脈より分離した平滑筋細胞初代培養系を用いて、実験を行った。対照としては、同じ遺伝的背景を持つ野生型マウスから分離した細胞を用いた。それぞれの細胞を無刺激の状態で回収し、ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法を用いてリジン酸化酵素（ＬＯＸ）の発現をｍＲＮＡレベルで定量解析した。または、リジン酸化酵素の酵素活性を測定した。リジン酸化酵素は、コラーゲン線維あるいはエラスチン線維の成熟に必須な酵素であり、その低下はこれらコラーゲンまたはエラスチンの合成能低下を意味する。さらに、細胞外基質合成を統合的に促進するとされるサイトカインＴＧＦ−βを、ＥＬＩＳＡ法を用いて、蛋白発現レベルで定量解析した。
［結果］リジン酸化酵素の発現とその酵素活性は、ＪＮＫ２欠損細胞において有意に増加していた（ｐ＜０．０１）。さらにＴＧＦ−βもまたＪＮＫ２欠損細胞において有意に増加していた（ｐ＜０．０１）。すなわち、ＪＮＫ２特異的阻害によりコラーゲンまたはエラスチンの合成能が促進した。（図５参照）
【実施例６】
【００８２】
コラーゲン合成系に対する抑制型ＪＮＫ変異体の効果
［方法］ラット大動脈より分離した血管平滑筋細胞初代培養系を用いて、実験を行った。ＪＮＫを活性化するために、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２,２００ｍＭ）による酸化ストレス刺激を用いた。また、ＪＮＫを特異的に抑制するために抑制型（ドミナントネガティブ）ＪＮＫ変異体を発現する組換えアデノウイルス（Ａｄ−ＪＮＫ（ＡＰＦ））を作製し、対照としてはＧＦＰを発現する組換えアデノウイルス（Ａｄ−ＧＦＰ）を使用した。まず培養細胞をＨ２Ｏ２で刺激し、２４時間後に細胞を回収した（Ｈ２Ｏ２群）。Ｈ２Ｏ２刺激なしを比較対照とした（コントロール群）。次に、あらかじめＡｄ−ＪＮＫ（ＡＰＦ）またはＡｄ−ＧＦＰを感染させた培養細胞をＨ２Ｏ２で刺激し、２４時間後の細胞を回収した（それぞれＨ２Ｏ２＋ＡＰＦ群、Ｈ２Ｏ２＋ＧＦＰ群）。Ｈ２Ｏ２刺激で発現が変化する遺伝子群ならびに抑制型ＪＮＫ変異体の効果で発現が変化する遺伝子群を、オリゴＤＮＡマイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社ＲＧ−Ｕ３４）によって網羅的に解析した。
［結果］網羅的解析結果の中から、コラーゲン線維合成に必須な酵素であるプロリン水酸化酵素（Ｐ４Ｈ）、リジン水酸化酵素（ＰＬＯＤ）とリジン酸化酵素（ＬＯＸ）が、Ｈ２Ｏ２刺激によるＪＮＫ活性化で発現が低下し、かつＪＮＫ変異体によるＪＮＫ抑制効果によってその発現が増加するものとして同定された。すなわち、プロリン水酸化酵素発現レベルは、Ｈ２Ｏ２刺激により０．６２倍（Ｈ２Ｏ２群のコントロール群に対する比）に低下したが、Ａｄ−ＪＮＫ（ＡＰＦ）によるＪＮＫ抑制により１．３２倍（Ｈ２Ｏ２＋ＡＰＦ群のＨ２Ｏ２＋ＧＦＰ群に対する比）に増加した。またリジン水酸化酵素発現レベルは、Ｈ２Ｏ２刺激により０．７６倍（Ｈ２Ｏ２群のコントロール群に対する比）に低下したが、Ａｄ−ＪＮＫ（ＡＰＦ）により１．４１倍（Ｈ２Ｏ２＋ＡＰＦ群のＨ２Ｏ２＋ＧＦＰ群に対する比）に増加した。さらに、リジン酸化酵素発現レベルは、Ｈ２Ｏ２刺激により０．８７倍（Ｈ２Ｏ２群のコントロール群に対する比）に低下したが、Ａｄ−ＪＮＫ（ＡＰＦ）により１．２３倍（Ｈ２Ｏ２＋ＡＰＦ群のＨ２Ｏ２＋ＧＦＰ群に対する比）に増加した。これらの結果から、抑制型ＪＮＫ変異体が、コラーゲン線維合成に必須なプロリン水酸化酵素、リジン水酸化酵素ならびにリジン酸化酵素の発現を増強することが明らかになった。特に、リジン酸化酵素はエラスチン線維合成にも必須である。すなわち、抑制型ＪＮＫ変異体は、コラーゲンならびにエラスチン線維の合成系を増強することが示された。
【実施例７】
【００８３】
塩化カルシウム処置マウス動脈瘤モデルにおけるＪＮＫ阻害薬による動脈瘤治療・退縮実験
［方法］Ｌｏｎｇｏらの方法（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１０：６２５−６３２（２００２））に準じて塩化カルシウム刺激誘発性のマウス腹部大動脈瘤モデルを作製した。即ち、７週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウスを開腹し、腎動脈下腹部大動脈を０．５Ｍ塩化カルシウムで１５分間浸透処理した後に閉腹した。シャム手術（Ｎａ群）は、生理食塩水で処置した。処置後６週目まで飼育した後、Ｎａ群（８匹）とカルシウム処置マウスの一部（Ｃａ群、９匹）は、直ちに犠牲死させて腹部大動脈の最大径を計測した。他のカルシウム処置マウスは無作為に２群に分け、カルシウム処置後６週目からＪＮＫ阻害薬ＳＰ６００１２５（トクリス社：ピラゾールアントロン、ＳＰ群、９匹）または溶解液のみ（対照群、９匹）を連日皮下注射した。ＳＰ６００１２５は、Ｂｅｎｎｅｔｔらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１３６８１−１３６８６（２００１））に準じて、溶解液（３０％ポリエチレングリコール‐４００、２０％ポリプロピレングリコール、１５％クレモフォルイーエル、５％エタノール、３０％生理食塩水）で最終濃度４．２ｍｇ／ｍｌに用事調整し、６０ｍｇ／ｋｇ／日の投与量を一日二回連日皮下注射した。ＳＰ群と対照群はカルシウム処置後１２週目（注射開始後６週目）に犠牲死させ、腹部大動脈の最大径を計測した。さらに大動脈を摘出し、組織学的に解析した。
［結果］処置後６周目の大動脈径は、Ｎａ群；０．６９±０．０４ｍｍ、Ｃａ群；１．２９±０．０６ｍｍであり、カルシウム処理により有意な径拡大を呈した動脈瘤が形成された。Ｃａ群の大動脈壁では、中膜の菲薄化、弾性線維の破壊、炎症細胞浸潤といったヒトの腹部動脈瘤に特徴的な所見が組織学的に観察された。投薬後６週間経過したカルシウム処置後１２週目の対照群とＳＰ群の大動脈最大径は、それぞれ１．１８±０．０６ｍｍ、０．８５±０．０６ｍｍであった。ＳＰ群では、対照群と比べて有意に大動脈径が小さかった（ｔ検定によりｐ＜０．０１）。さらに、ＳＰ群の径は、カルシウム処置後６週目で注射開始直前のＣａ群よりも有意に小さかった（ｔ検定によりｐ＜０．０１）。すなわち、ＳＰ６００１２５は、一旦瘤が形成された後の投与開始で、明らかな瘤径の縮小効果を示した。さらに、対照群の組織所見はカルシウム処置後６週目（Ｃａ群）と同等であったが、ＳＰ群では対照群やＣａ群に比べ明らかに炎症細胞浸潤に乏しく、弾性線維等の組織構築が再生されていた。これらのことから、カルシウム処置動脈瘤モデルにおけるＪＮＫ阻害薬ＳＰ６００１２５の瘤退縮効果が証明された。（図６参照）
【実施例８】
【００８４】
アポＥノックアウトマウス動脈瘤モデルにおけるＪＮＫ阻害薬による動脈瘤治療・退縮実験
［方法］Ｄａｕｇｈｅｒｔｙらの方法（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５：１６０５−１６１２（２０００））に準じてアポＥノックアウトマウスにアンジオテンシンＩＩを持続投与して腹部大動脈瘤モデルを作製した。即ち、２４週齢のアポＥノックアウト雄マウスにミニ浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ社）を植え込み、アンジオテンシンＩＩ（１μｇ／ｍｉｎ／ｋｇ）を４週間持続注入した。アポＥノックアウトマウスは高脂血症、高血圧と動脈硬化を伴っており、アンジオテンシンＩＩ注入によりヒトの動脈瘤に類似の動脈硬化性大動脈瘤を発症する。４週間のアンジオテンシンＩＩ注入終了後に超音波診断装置を用いて腹部大動脈瘤の径を計測し、この計測値から均等に２群に分けた。群分け後直ちに、ＪＮＫ阻害薬ＳＰ６００１２５（ＳＰ群）または溶解液のみ（対照群）の連日皮下注射を開始した。ＳＰ６００１２５および溶解液の投与方法は上記実施例７と同様とした。注射開始後８週間目に、超音波診断装置を用いて腹部大動脈瘤の瘤径を再計測した。
【００８５】
［結果］アンジオテンシンＩＩ注入終了後、注射開始前に計測した大動脈瘤径は、対照群（８匹）；１．２３±０．０６ｍｍ、ＳＰ群；１．２３±０．０５ｍｍであり、２群に均等な瘤が存在していた。ＪＮＫ阻害薬ＳＰ６００１２５を連日投与したＳＰ群では、８週間の注射後の瘤径が１．００±０．０５ｍｍとなり、注射開始前に比べて有意に縮小していた（ｔ検定によりｐ＜０．０５）。注射前後での縮小率は、ＳＰ群で１８．４±４．４％であったが、対照群では−１．５±６．３％であり、２群間に有意差が確認された（ｔ検定によりｐ＜０．０５）。以上の結果から、ヒトの動脈瘤に類似のアポＥノックアウトマウス動脈瘤モデルにおいてもＪＮＫ阻害薬ＳＰ６００１２５の瘤治療・退縮効果が証明された。これは、コラーゲンおよびエラスチンの分解促進と再生阻害が同時に生ずるという動脈瘤の病態がＪＮＫ阻害剤により改善された結果と考えられる。すなわち、ＪＮＫ阻害剤によってコラーゲンまたはエラスチンの崩壊を防止するとともに組織再構築能を積極的に回復させることが、生体内おいても可能であることが証明された。（図７参照）
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明により、コラーゲンまたはエラスチン代謝異常疾患の予防および治療が可能になる。本発明の薬剤は、コラーゲンまたはエラスチン代謝異常疾患のための予防用薬剤、または治療用薬剤として内服または注射等の全身的投薬または外用等の局所投与に用いる薬剤として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】培養細胞においてＪＮＫ阻害ペプチドによるコラーゲンまたはエラスチンの分解酵素ＭＭＰ−９の抑制効果を示すグラフである。
【図２】培養細胞においてＪＮＫ阻害ペプチドによるコラーゲン合成能の促進効果を示すグラフである。
【図３】培養細胞においてＪＮＫ阻害薬によるプロリン水酸化酵素の発現増強効果を示すグラフである。
【図４】培養細胞においてＪＮＫ阻害ペプチドによるリジン酸化酵素の発現増強効果を示すグラフである。
【図５】培養細胞においてＪＮＫ２特異的阻害によるコラーゲンまたはエラスチンの合成促進効果を示すグラフである。
【図６】塩化カルシウム処置マウス動脈瘤モデルにおいてＪＮＫ阻害薬による動脈瘤治療・退縮実験の結果を示すグラフである。
【図７】アポＥノックアウトマウス動脈瘤モデルにおいてＪＮＫ阻害薬による動脈瘤治療・退縮実験の結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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