(57)【要約】      （修正有）【課題】染色体異常に起因するヒト疾患を治療するための候補薬剤のスクリーニングまたはかかるヒト疾患の発症メカニズム研究に精度よく用いることができる真のモデル動物を提供すること。【解決手段】ヒト第１５染色体ｑ１１−１３における重複であるヒト疾患に関連するヒト染色体異常に対応する染色体異常を有する非ヒト動物またはその子孫動物。マウス染色体シンテニー領域、特に、Ｍｋｒｎ遺伝子とＨｅｒｃ遺伝子との間に染色体重複を有するマウスまたはその子孫動物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト疾患に関連するヒト染色体異常に対応する染色体異常を有する非ヒト動物またはその子孫動物。
【請求項２】
ヒト疾患が精神疾患である請求項１記載の非ヒト動物またはその子孫動物。
【請求項３】
精神疾患が自閉症である請求項２記載の非ヒト動物またはその子孫動物。
【請求項４】
ヒト染色体異常がヒト第１５染色体ｑ１１−１３における重複である請求項３記載の非ヒト動物またはその子孫動物。
【請求項５】
非ヒト動物が哺乳動物である請求項１−４のいずれか１項に記載の非ヒト動物またはその子孫動物。
【請求項６】
非ヒト動物が齧歯類動物である請求項５記載の非ヒト動物またはその子孫動物。
【請求項７】
非ヒト動物が分化全能性細胞から個体までの再生系が確立されている非ヒト動物である請求項１−６のいずれか１項に記載の非ヒト動物またはその子孫動物。
【請求項８】
染色体異常をヒトの染色体領域のシンテニー領域に有する請求項１−７のいずれか１項に記載の非ヒト動物またはその子孫動物。
【請求項９】
非ヒト動物がマウスであって、染色体領域のシンテニー領域がマウス第７染色体ｃの相当領域である請求項８記載の非ヒト動物またはその子孫動物。
【請求項１０】
マウス第７染色体のMkrn3遺伝子とHerc2遺伝子との間に染色体重複を有する請求項９記載の非ヒト動物またはその子孫動物。
【請求項１１】
染色体異常を染色体外の染色体断片またはウイルスとして有する請求項１−７のいずれか１項に記載の非ヒト動物またはその子孫動物。
【請求項１２】
野生型動物と比較して社会性相互作用の障害、不安度の上昇または固執化傾向を示す、請求項１−１１のいずれか１項に記載の非ヒト動物またはその子孫動物。
【請求項１３】
疾患病態研究に用いるための請求項１−１２のいずれか１項に記載の非ヒト動物またはその子孫動物。
【請求項１４】
ヒト疾患に関連するヒト染色体異常に対応する染色体異常を作製することを含む該疾患の非ヒト動物を作製する方法。
【請求項１５】
ヒト疾患が精神疾患である請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
精神疾患が自閉症である請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ヒト染色体異常がヒト第１５染色体ｑ１１−１３における染色体重複である請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
非ヒト動物が哺乳動物である請求項１４−１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
非ヒト動物が齧歯類動物である請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
非ヒト動物が分化全能性細胞から個体までの再生系が確立されている非ヒト動物である請求項１４−１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
染色体異常をヒトの染色体領域のシンテニー領域に作製する請求項１４−２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
非ヒト動物がマウスであって、染色体領域のシンテニー領域がマウス第７染色体ｃの相当領域である請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
非ヒト動物がマウスであって、染色体領域のシンテニー領域に作製する染色体異常がマウス第７染色体上のMkrn3とHerc2との間の領域の染色体重複である請求項１４−２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
染色体異常を染色体外の染色体断片またはウイルスとして作製する請求項１４−２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
野生型動物と比較して社会性相互作用の障害、不安度の上昇または固執化傾向を示す、請求項１４−２４のいずれか１項に記載の非ヒト動物の作製方法。
【請求項２６】
（ａ）疾患に関連するヒト染色体異常に対応する染色体異常を、非ヒト動物のＥＳ細胞の染色体領域のシンテニー領域に導入し；
（ｂ）該染色体異常が非ヒト動物のＥＳ細胞染色体に導入されたことをサザン法で確認し；
（ｃ）該ＥＳ細胞を非ヒト動物から採取した胚盤胞に導入し；
（ｄ）該胚盤胞をレシピエント非ヒト動物の卵管内に移植して妊娠させ；
（ｅ）該レシピエント非ヒト動物から仔非ヒト動物を得る
工程を含む、ヒト疾患に関連するヒト染色体異常に対応する染色体異常を有する非ヒト動物の作製方法。
【請求項２７】
（１）5'Hprt−loxPおよび3'Hprt−loxPを、マウス第７染色体上のMkrn3およびHerc3遺伝子外側のイントロンに相同組換えにより挿入するターゲティングベクターをそれぞれ構築し；
（２）5'Hprt−loxPを含むターゲティングベクターをエレクトロポレーションによりマウスＥＳ細胞に導入し、該5'Hprt−loxPがMkrn3遺伝子外側の領域に挿入されたことをサザン法で確認し；
（３）3'Hprt−loxPを含むターゲティングベクターをエレクトロポレーションにより（２）で調製したマウスＥＳ細胞に導入し、該3'Hprt−loxPがHerc3遺伝子外側の領域に挿入されたことをサザン法で確認し；
（４）該マウスＥＳ細胞をCreレコンビナーゼ処理して第７染色体ｃ領域が重複した染色体を有するマウスＥＳ細胞を得；
（５）得られたＥＳ細胞における該重複をサザン法で確認し；
（６）確認されたＥＳ細胞をマウス胚盤胞に導入し；
（７）該マウス胚盤胞をレシピエントマウスの卵管内に移植して妊娠させ；ついで
（８）該レシピエントマウスから仔マウスを得る
工程を含む、ヒト自閉症モデルマウスの作製方法。
【請求項２８】
請求項１−１３のいずれか１項に記載の染色体異常を有する非ヒト動物個体またはその子孫動物個体に、その染色体異常に起因するヒト疾患を治療するための候補薬剤を投与し、ついで、その動物の症状の改善の程度を評価する工程を含む該ヒト疾患を治療するための候補薬剤の薬効を評価する方法。
【請求項２９】
ヒト疾患が自閉症であって、症状の改善が社会性相互作用の改善、不安度の低下または固執化傾向の緩和である請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
症状の改善の程度を、社会性相互作用行動テスト、社会性コミュニケーションテストおよび常同行動テストよりなる群から選択される１またはそれを超える方法によって評価する請求項２９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、染色体異常に起因する疾患の非ヒトモデル動物に関する。詳細には、本発明は、ヒトにおける染色体異常を非ヒト動物に導入することにより作製した非ヒトモデル動物、遺伝子工学技術を用いたその作製方法、および、かかるモデル動物を用いた治療剤の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの疾患を治療する新規な薬剤を開発する過程では、候補となり得る広範囲の薬剤を合成したうえで、その膨大な数の候補薬剤の薬効を評価し、スクリーニングにかけて候補薬剤を選択することが必須の工程である。
【０００３】
かかる候補薬剤のスクリーニングは、通常、イン・ビトロ(in vitro)でのモデル組織または細胞を用いた一次スクリーニングにつづいて、マウスなどのモデル哺乳動物を用いた二次スクリーニングが行われ、最終的には目的とする疾患を有するヒトに投与してその薬効が確認される。したがって、優れたモデル哺乳動物を用いる評価系の構築は、効率的な候補薬剤のスクリーニングを行ううえで重要であるといえる。ましてや、ハイスループットスクリーニングなどによる薬剤開発期間の短縮が要求される昨今の薬剤開発事情に鑑みれば、優れたモデル哺乳動物の評価系の構築は極めて重要であるといえる。
【０００４】
しかしながら、ヒトとマウスなどのモデル哺乳動物とでは、同じ哺乳動物に属するとはいえ生物学的には異なる動物であり、同じ疾患を発症するとは限らず、同じ疾患を発症する場合でもその発症メカニズムが異なるなど、様々な相異点が存在する。
【０００５】
かかる両生物間の生物学的な相異を可能な限り埋めるために、薬剤投与によってヒトと同じ疾患を発症するモデル動物が作製されている（非特許文献１）。しかし、このような薬剤投与により作製したモデル動物では、投与した薬剤により動物に生じる障害が非特異的であり、目的とする疾患に特異的な障害を有するモデル動物を作製することは困難である。また、たとえ目的とするヒト疾患と同様の症状を有するモデル動物が得られたとしても、その症状がヒトの場合と同じ発症メカニズムによって発症しているかは不明であり、候補薬剤をスクリーニングするための真のモデル動物であるか否かの確信がもてない。
【０００６】
また、上述した問題点は、ヒト疾患の病態研究においても同様に存在する。すなわち、通常、かかる研究では、薬物投与によってヒト疾患と同様の症状を有するモデル動物を作製し、その動物に生じた障害を調べて疾患との因果関係を明らかにする作業が行われるが、薬剤投与によって動物に生じる障害は非特異的であるため、疾患の病態研究の真のモデル動物となり得ない。
【０００７】
一方、近年の分子遺伝学の発展により、ヒト疾患の中には、染色体異常に起因して発症する疾患が存在することが明らかにされてきており、かかる疾患を治療する薬剤を評価し、また、かかる疾患の病態を研究するための真のモデル動物に対する要望が存在していた。
【非特許文献１】Reproductive toxicology, Vol. 11(2-3): pp.417-422, 1997年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、ヒトにおける染色体異常に起因する疾患を治療する薬剤のスクリーニングおよびかかる疾患の病態研究に用いる非ヒト動物を提供することにある。
また、本発明の目的は、かかる非ヒト動物の作製方法およびかかる非ヒト動物を用いた薬剤の評価方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題に鑑みて鋭意検討した結果、ヒト染色体異常に起因して発症する疾患について、そのヒト染色体異常に相当する染色体異常を非ヒト動物に導入することにより当該疾患の真の動物モデルを作製できることを見出し、本願発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、
［１］  ヒト疾患に関連するヒト染色体異常に対応する染色体異常を有する非ヒト動物またはその子孫動物；
［２］  ヒト疾患が精神疾患である［１］記載の非ヒト動物またはその子孫動物；
［３］  精神疾患が自閉症である［２］記載の非ヒト動物またはその子孫動物；
［４］  ヒト染色体異常がヒト第１５染色体ｑ１１−１３における重複である［３］記載の非ヒト動物またはその子孫動物；
［５］  非ヒト動物が哺乳動物である［１］−［４］のいずれか１に記載の非ヒト動物またはその子孫動物；
［６］  非ヒト動物が齧歯類動物である［５］記載の非ヒト動物またはその子孫動物；
［７］  非ヒト動物が分化全能性細胞から個体までの再生系が確立されている非ヒト動物である［１］−［６］のいずれか１に記載の非ヒト動物またはその子孫動物；
［８］  染色体異常をヒトの染色体領域のシンテニー領域に有する［１］−［７］のいずれか１に記載の非ヒト動物またはその子孫動物；
［９］  非ヒト動物がマウスであって、染色体領域のシンテニー領域がマウス第７染色体ｃの相当領域である［８］記載の非ヒト動物またはその子孫動物；
［１０］  マウス第７染色体のMkrn3遺伝子とHerc2遺伝子との間に染色体重複を有する［９］記載の非ヒト動物またはその子孫動物；
［１１］  染色体異常を染色体外の染色体断片またはウイルスとして有する［１］−［７］のいずれか１に記載の非ヒト動物またはその子孫動物；
［１２］  野生型動物と比較して社会性相互作用の障害、不安度の上昇または固執化傾向を示す、［１］−［１１］のいずれか１に記載の非ヒト動物またはその子孫動物；
［１３］  疾患病態研究に用いるための［１］−［１２］のいずれか１に記載の非ヒト動物またはその子孫動物；
［１４］  ヒト疾患に関連するヒト染色体異常に対応する染色体異常を作製することを含む該疾患の非ヒト動物を作製する方法；
［１５］  ヒト疾患が精神疾患である［１４］記載の方法；
［１６］  精神疾患が自閉症である［１５］記載の方法；
［１７］  ヒト染色体異常がヒト第１５染色体ｑ１１−１３における染色体重複である［１６］記載の方法；
［１８］  非ヒト動物が哺乳動物である［１４］−［１７］のいずれか１に記載の方法；
［１９］  非ヒト動物が齧歯類動物である［１８］記載の方法；
［２０］  非ヒト動物が分化全能性細胞から個体までの再生系が確立されている非ヒト動物である［１４］−［１９］のいずれか１に記載の方法；
［２１］  染色体異常をヒトの染色体領域のシンテニー領域に作製する［１４］−［２０］のいずれか１に記載の方法；
［２２］  非ヒト動物がマウスであって、染色体領域のシンテニー領域がマウス第７染色体ｃの相当領域である［２１］記載の方法；
［２３］  非ヒト動物がマウスであって、染色体領域のシンテニー領域に作製する染色体異常がマウス第７染色体上のMkrn3とHerc2との間の領域の染色体重複である［１４］−［２２］のいずれか１に記載の方法；
［２４］  染色体異常を染色体外の染色体断片またはウイルスとして作製する［１４］−［２０］のいずれか１に記載の方法；
［２５］  野生型動物と比較して社会性相互作用の障害、不安度の上昇または固執化傾向を示す、［１４］−［２４］のいずれか１に記載の非ヒト動物の作製方法；
［２６］  （ａ）疾患に関連するヒト染色体異常に対応する染色体異常を、非ヒト動物のＥＳ細胞の染色体領域のシンテニー領域に導入し；
（ｂ）該染色体異常が非ヒト動物のＥＳ細胞染色体に導入されたことをサザン法で確認し；
（ｃ）該ＥＳ細胞を非ヒト動物から採取した胚盤胞に導入し；
（ｄ）該胚盤胞をレシピエント非ヒト動物の卵管内に移植して妊娠させ；
（ｅ）該レシピエント非ヒト動物から仔非ヒト動物を得る
工程を含む、ヒト疾患に関連するヒト染色体異常に対応する染色体異常を有する非ヒト動物の作製方法；
［２７］  （１）5'Hprt−loxPおよび3'Hprt−loxPを、マウス第７染色体上のMkrn3およびHerc3遺伝子外側のイントロンに相同組換えにより挿入するターゲティングベクターをそれぞれ構築し；
（２）5'Hprt−loxPを含むターゲティングベクターをエレクトロポレーションによりマウスＥＳ細胞に導入し、該5'Hprt−loxPがMkrn3遺伝子外側の領域に挿入されたことをサザン法で確認し；
（３）3'Hprt−loxPを含むターゲティングベクターをエレクトロポレーションにより（２）で調製したマウスＥＳ細胞に導入し、該3'Hprt−loxPがHerc3遺伝子外側の領域に挿入されたことをサザン法で確認し；
（４）該マウスＥＳ細胞をCreレコンビナーゼ処理して第７染色体ｃ領域が重複した染色体を有するマウスＥＳ細胞を得；
（５）得られたＥＳ細胞における該重複をサザン法で確認し；
（６）確認されたＥＳ細胞をマウス胚盤胞に導入し；
（７）該マウス胚盤胞をレシピエントマウスの卵管内に移植して妊娠させ；ついで
（８）該レシピエントマウスから仔マウスを得る
工程を含む、ヒト自閉症モデルマウスの作製方法；
［２８］  ［１］−［１３］のいずれか１に記載の染色体異常を有する非ヒト動物個体またはその子孫動物個体に、その染色体異常に起因するヒト疾患を治療するための候補薬剤を投与し、ついで、その動物の症状の改善の程度を評価する工程を含む該ヒト疾患を治療するための候補薬剤の薬効を評価する方法；
［２９］  ヒト疾患が自閉症であって、症状の改善が社会性相互作用の改善、不安度の低下または固執化傾向の緩和である［２８］記載の方法；および
［３０］  症状の改善の程度を、社会性相互作用行動テスト、社会性コミュニケーションテストおよび常同行動テストよりなる群から選択される１またはそれを超える方法によって評価する［２９］記載の方法
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、染色体異常に起因して発症するヒトの疾患を治療する候補薬剤のスクリーニングを行うことができ、また、かかる疾患の病態や発症メカニズムを真のヒトのモデル動物において研究することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、第１の態様において、ヒト疾患に関連するヒト染色体異常に対応する染色体異常を有する非ヒト動物またはその子孫動物を提供する。
【００１３】
本発明の非ヒト動物に作製し得るヒト疾患は、ヒトにおいて染色体の異常に起因して発症する疾患であり、例えば、自閉症、統合失調症、精神遅滞などの精神疾患や、先天性異常、癌などの疾患が挙げられる。
【００１４】
また、本発明の非ヒト動物が有するヒト染色体異常に対応する染色体異常は、上記ヒトの疾患を発症する染色体異常と同じ形態の異常を非ヒト動物に導入することにより得ることができ、この染色体異常の形態としては、例えば染色体領域の欠失、重複、逆位、挿入、転座などがある。例えば、自閉症の非ヒト動物を作製する場合には、自閉症と関連するヒト第１５染色体ｑ１１−１３領域に相当する染色体領域の重複を野生型の非ヒト動物において作製する。また、統合失調症の非ヒト動物を作製する場合には、統合失調症と関連するヒト第２２染色体ｑ１１領域に相当する染色体領域の欠失を非ヒト動物において作製する。また、精神遅延の非ヒト動物を作製する場合には、精神遅延と関連するヒト第５染色体ｑ１５.３に相当する染色体領域の欠失を非ヒト動物において作製する。
【００１５】
上記の染色体異常を導入する領域は、非ヒト動物の染色体のいずれの領域であってもよいが、他の染色体領域の機能に与える影響をできるだけ抑制するという観点から、その異常を有するヒトの染色体領域に相当する非ヒト動物のシンテニー領域が好ましい。例えば、自閉症のマウスを作製する場合には、ヒト第１５染色体ｑ１１−１３に相当するシンテニー領域であるマウス第７染色体ｃの相当領域、例えばMkrn3遺伝子とHerc2遺伝子との間の領域に導入するのが好ましい。
しかし、染色体異常の形態のうち、重複、逆位、挿入、転座を導入する場合には、その染色体が担う遺伝子の発現レベルで同様の効果が現れ、かつ、他の染色体領域への影響をできるだけ抑制するという観点から、染色体以外の核内の部位に、その染色体異常の形態を有する染色体断片を導入することもできる。その染色体外への染色体断片の導入は、上述したシンテニー領域への導入に加えて、または、シンテニー領域への導入なしに行うことができる。染色体外への染色体断片の導入には、ＹＡＣベクター、ウイルスベクターなどを用いることができる。
【００１６】
本発明の非ヒト動物として使用する動物は、ヒト以外のいずれの動物であってもよいが、ヒト疾患のモデル動物という観点から哺乳動物が好ましく、系統が確立されている齧歯類動物がさらに好ましく、また、上記の染色体変異が導入された動物モデルを容易に作製し得るという観点から、分化全能性細胞から個体までの再生系が確立されている動物がさらに好ましい。これらの非ヒト動物としては、例えば、前記したマウスのほか、ラット、モルモット、ハムスター、ヒツジ、サル、ヤギ、ブタ、ウマ、ウシ、サル、ウサギ、イヌ、ネコなどが挙げられる。
【００１７】
さらに、かかる染色体異常が生殖系列細胞に導入された場合には、導入した非ヒト動物の子孫動物にもその形質が遺伝される。したがって、本発明は、かかる非ヒト動物の子孫動物も包含する。
【００１８】
上述したように染色体異常が導入された非ヒト動物またはその子孫動物は、ヒトにおける染色体異常と関連する疾患と同様な表現型を示す。例えば、自閉症に関連する染色体異常を導入した非ヒト動物では、かかる染色体異常を導入していない同じ非ヒト動物、すなわち野生型非ヒト動物と比較して社会性相互作用の障害、不安度の上昇または固執化傾向を示す。
【００１９】
本発明の非ヒト動物は、非ヒト動物が導入された染色体異常に基づいてヒトの疾患と同様な表現型を示すことから、かかるヒトの疾患を治療するための薬剤の薬効評価の優れたモデル動物として用いることができる。また、ヒト疾患の病態研究の優れた非ヒトモデル動物としても用いることができる。さらに、本発明の非ヒト動物は、対応する染色体異常を非ヒト動物のシンテニー領域に導入する場合には他の染色体領域への影響が最小限に抑えられるため、非常に厳密な薬剤評価または病態研究に用いることができる。
【００２０】
また、本発明は、第２の態様において、ヒト疾患に関連するヒト染色体異常に対応する染色体異常を有する非ヒト動物を作製する方法を提供する。
【００２１】
本発明の方法により作製する非ヒト動物がモデルとするヒト疾患は、ヒトにおいて染色体の異常に起因して発症する疾患であり、例えば、自閉症、統合失調症、精神遅延などの精神疾患や、先天性異常や癌などの疾患が挙げられる。
【００２２】
また、本発明の方法により作製する非ヒト動物が有するヒト染色体異常に対応する染色体異常は、上記ヒトの疾患を発症する染色体異常と同じ形態の異常を非ヒト動物に導入することにより得ることができ、この染色体異常の形態としては、例えば染色体領域の欠失、重複、逆位、挿入、転座などがある。例えば、自閉症の非ヒト動物を作製する方法の場合には、自閉症と関連するヒト第１５染色体ｑ１１−１３領域に相当する染色体領域の重複を野生型の非ヒト動物において作製する。また、また、統合失調症の非ヒト動物を作製する場合には、統合失調症と関連するヒト第２２染色体ｑ１１領域に相当する染色体領域の欠失を非ヒト動物において作製する。また、精神遅延の非ヒト動物を作製する場合には、精神遅延と関連するヒト第５染色体ｑ１５.３に相当する染色体領域の欠失を非ヒト動物において作製する。
【００２３】
本発明の方法により上記の染色体異常を導入する領域は、非ヒト動物の染色体のいずれの領域であってもよいが、他の染色体領域の機能に与える影響を最小限に抑制するという観点から、その異常を有するヒトの染色体領域に相当する非ヒト動物のシンテニー領域が好ましい。例えば、自閉症のマウスを作製する方法の場合には、ヒト第１５染色体ｑ１１−１３に相当するシンテニー領域であるマウス第７染色体ｃの相当領域、例えばMkrn3遺伝子とHerc2遺伝子との間の領域に導入するのが好ましい。染色体異常を導入する方法には、例えばＣｒｅ−ｌｏｘＰ組換えシステムを用いた重複または欠失など公知の遺伝子組換え技術が含まれる。
【００２４】
詳細には、非ヒト動物細胞中の染色体の目的領域の両端にダブルターゲティングすることによってｌｏｘＰ配列（Ｃｒｅレコンビナーゼの認識部位）を挿入し、ついでＣｒｅレコンビナーゼによってこの目的領域の相同組換えを引き起こしてこの染色体領域の重複を作製することができる。
【００２５】
しかし、染色体異常の形態のうち、重複、逆位、挿入、転座を導入する方法の場合には、その染色体が担う遺伝子の発現レベルで同様の効果が現れ、かつ、他の染色体領域への影響をできるだけ抑制するという観点から、染色体以外の核内の部位に、その染色体異常の形態を有する染色体断片を導入することもできる。その染色体外への染色体断片の導入は、上述したシンテニー領域への導入に加えて、または、シンテニー領域への導入なしに行うことができる。染色体外への染色体断片の導入には、ＹＡＣベクター、ウイルスベクターなどを用いることができる。
【００２６】
本発明の方法により作製する非ヒト動物は、ヒト以外のいずれの動物であってもよいが、ヒト疾患のモデル動物という観点から哺乳動物が好ましく、系統が確立されている齧歯類動物がさらに好ましく、また、上記の染色体変異が導入された動物モデルを容易に作製し得るという観点から、分化全能性細胞から個体までの再生系が確立されている動物がさらに好ましい。これらの非ヒト動物としては、例えば、前記したマウスのほか、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウシ、イヌ、ネコなどが挙げられる。
【００２７】
さらに、かかる染色体異常が生殖系列細胞に導入された場合には、導入した非ヒト動物の子孫動物にもその形質が遺伝される。したがって、本発明は、かかる非ヒト動物の子孫動物の作製方法も包含する。
【００２８】
上述したように染色体異常が導入された非ヒト動物またはその子孫動物は、ヒトにおける染色体異常と関連する疾患と同様な表現型を示す。例えば、自閉症に関連する染色体異常を導入した非ヒト動物では、かかる染色体異常を導入していない同種の非ヒト動物、すなわち野生型非ヒト動物と比較して社会性相互作用の障害、不安度の上昇または固執化傾向を示す。
【００２９】
本発明の非ヒト動物の作製方法は、非ヒト動物が導入された染色体異常に基づいてヒトの疾患と同様な表現型を示すことから、かかるヒトの疾患を治療するための薬剤の薬効評価に優れたモデル動物を作製するのに用いることができる。また、対応する染色体異常を非ヒト動物のシンテニー領域に導入する場合には、他の染色体領域への影響を最小限に抑える本発明の非ヒト動物は、ヒト疾患の病態研究の優れたモデル動物としても用いることができる。
【００３０】
例えば、ヒト自閉症のモデルマウスは以下のようにして作製することができる。
１．  5'Hprt-loxPおよび3'Hprt-loxPを、ヒト第１５染色体ｑ１１−１３領域のシンテニーにあたるマウス第７染色体ｃ領域に存在するそれぞれMkrn3およびHerc2遺伝子の外側のイントロンに配置するターゲティングベクターを構築する。
２．  構築した5'Hprt-loxPを含むターゲティングベクターをエレクトロポレーション法によりマウスＥＳ細胞に導入し、導入された細胞を薬剤耐性によって選抜する。さらに、相同組換えにより所望の位置に挿入されたことはSouthern法によって確認する。
３．  構築した3'Hprt-loxPを含むターゲティングベクターを工程２で選抜したマウスＥＳ細胞に導入し、3'Hprt-loxPについても同様にして薬剤耐性およびSouthern法によって確認する。
４．  工程３で選抜したマウスＥＳ細胞をＣｒｅレコンビナーゼ処理して７ｃ領域の重複を引き起こし、標的領域が重複したＥＳ細胞をSouthern法によって確認する。
５．  重複が確認されたＥＳ細胞をマウス胚盤胞に導入し、レシピエントマウス（仮親）へ移植し、一定期間後帝王切開により仔マウスを得る。仔マウスの生殖系列細胞への染色体重複の導入を確認する（Southern、RT-PCR、FISH、BAC-CGH）。
６．  得られた染色体重複を有するモデルマウスがヒトにおける自閉症の症状を示すか否かを、社会性相互作用行動テスト、社会性コミュニケーションテスト、常同運動テストなどによって評価する。
【００３１】
本発明の非ヒト動物の作製方法は、非ヒト動物が導入された染色体異常に基づいてヒトの疾患と同様な表現型を示すことから、かかるヒトの疾患を治療するための薬剤の薬効評価の優れたモデル動物の作製方法として用いることができる。また、ヒト疾患の病態研究の優れた非ヒトモデル動物の作製方法としても用いることができる。さらに、本発明の非ヒト動物の作製方法は、対応する染色体異常を非ヒト動物のシンテニー領域に導入する場合には他の染色体領域への影響が最小限に抑えられるため、非常に厳密な薬剤評価または病態研究に用いる非ヒト動物の作製方法として用いることができる。
【００３２】
また、本発明は、第３の態様において、染色体異常に起因して発症するヒト疾患を治療するための候補薬剤の薬効を評価する方法を提供する。
この評価方法には、染色体異常に起因して発症するヒト疾患を治療するための候補薬剤を、前記したそのヒトの染色体異常に対応する染色体異常を有する非ヒト動物に種々の用量で投与し、その後、その非ヒト動物の症状の改善の程度を種々評価することが含まれる。
【００３３】
候補薬剤の非ヒト動物への投与は経口的または非経口的に行うことができ、非経口的な投与方法としては、例えば静脈内投与、局所投与、筋肉内、腹膜内投与、膣内投与、経皮投与、点眼などが含まれる。
ここで、症状とは、ヒトにおいてその染色体異常に起因して臨床学的に認められる外観的または生理学的現象をいい、その改善とは野生型健常動物の外観的または生理学的現象により近くなった状態をいい、改善の程度とはかかる改善の外観的または生理学的な度合いをいう。
【００３４】
候補薬剤による症状の改善の程度を評価する方法としては、例えば染色体異常に起因する疾患が自閉症の場合には、社会性相互作用行動テスト、社会性コミュニケーションテスト、常同運動テストなどがあり、候補薬剤を投与し、これらの方法により外観的または生理学的な非ヒト動物の症状の改善の程度を評価し、候補薬剤非投与またはプラセボ投与の場合と比較して症状の改善が認められる場合には、疾患の治療薬剤として有力であると評価することができる。候補薬剤として有力な薬剤が選択された場合は、種々の用量および経路で本発明の非ヒト動物に投与した場合の症状の改善の程度を評価して、かかる薬剤の最適用量および投与経路を決定する。この非ヒト動物の最適用量のヒトにおける用量の算出は従来公知の方法によって行うことができる。
【００３５】
本発明の候補薬剤の薬効を評価する方法は、当該方法に用いる非ヒト動物がヒトの疾患と同様な表現型を示すことから、候補薬剤の薬効をヒトでない動物において評価することができる。また、本発明の評価方法は、使用する非ヒト動物において、対応する染色体異常がシンテニー領域に導入されている場合には他の染色体領域への影響が最小限に抑えられるため、非常に厳密な薬効評価を行うことができる。
【００３６】
つぎに、本発明を実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３７】
第７染色体ｃ領域重複マウスの作製・確立
染色体改変マウスを作製するにあたり、5'Hprt−loxP、3'Hprt−loxPをヒト第１５染色体ｑ１１−１３のシンテニーにあたるマウス第７染色体ｃ上のそれぞれMkrn3、Herc2遺伝子の外側のイントロンに配置するようなターゲティングベクターを構築した。結果的には、Herc2側にはそののちのアノテーションによりloxP挿入部位に新たな遺伝子（NIPA1）が存在することがわかったが、用いたベクター単独のノックインマウスでは正常なNIPA1遺伝子も一部発現し、少なくとも表現型に異常のないことが確認された（図１）。
【００３８】
5'Hprt−loxPをマウスＥＳ細胞でターゲティングし、マウス染色体Southernで確認後、さらに3'Hprt−loxPをターゲティングし、Creレコンビナーゼを処理して、７ｃの重複したものをSouthern法で確認した（図２）。Cisの重複例はHAT選択後組換え率１０−４の割合でとれたが、キメラ率は悪く、生殖系列細胞に入ったものは得られなかった。一方、Transの重複例は１０−６と組換え効率は悪かったが、そのうち生殖系列細胞に入ったものが得られた。また、このマウスのＦＩＳＨ解析により確かに第７染色体に重複が認められることを確認した（図３）。このマウスのＢ６系統への交配を続け、行動解析（同世代８０匹）などに必要な染色体重複マウスを確保、確立した。
【実施例２】
【００３９】
モデルマウスの形態学的解析
得られた染色体重複マウスの脳のマクロ的および組織学的解析の結果、著明な形態学的変化はみられなかった。
【実施例３】
【００４０】
ターゲット遺伝子の発現解析
ターゲット７ｃ領域内の１３個の遺伝子（図１）に関して、その発現をQuantitative  ＰＣＲ法により解析した。野生型マウス、あるいは父性重複マウス（ＰａｔＤｐ／＋）および母性重複マウス（ＭａｔＤｐ／＋）の各組織での発現をQuantitative  ＰＣＲ法で体系的に解析した。一般的に、重複マウスでは、野生型マウスに比べて発現量の上昇が観察された。一方、脳に発現する遺伝子群に関しては、それぞれのアダルトマウス脳組織での発現をin situ hybridization法により解析した。その結果、Ndn、Snrpn、Ube3a、Gabra5、Gabrb3はそれぞれ脳内での発現がみられ、やはり父性および母性遺伝子に関しては、そのインプリンティングに相応した発現量が観察された（図４）。
【実施例４】
【００４１】
モデルマウスの行動学的解析
上述のようにして得た染色体重複マウス（自閉症モデルマウス）の行動学的解析を、社会的行動測定テスト（strangerマウスへの社会的アプローチ）、明暗選択テストおよびローターロッドテストを用いて行った。これらの方法の詳細な説明は、Crawley JN: "What's wrong with may house?; Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice", Wiley-Liss, New York, 2000に記載されている。
【００４２】
社会的行動測定テスト（strangerマウスへの社会的アプローチ）
自閉症モデルマウスの社会的行動を測定するために社会的行動測定テスト（Social approach to a stranger mouse）を行った（図５）。
互いに自由に往来可能な３のチャンバーに仕切った箱を準備し、その中央チャンバーに自閉症モデルマウス（ｐａｔＤＰ／＋）または野生型マウス（ＷＴ）を１匹入れ、１の片側のチャンバーにstrangerマウス（野生型マウス）を１匹入れ、自閉症モデルマウス（ｐａｔＤＰ／＋）または野生型マウス（ＷＴ）の各チャンバー内の滞在時間を測定した。その結果、本発明の自閉症モデルマウスは野生型マウスと比較して、strangerマウス側のチャンバーに滞在する時間が短い一方、それとは反対側のチャンバー（不存在側）に滞在する時間も短く、strangerマウスを意識しつつもアプローチしない状態で中央のチャンバーに滞在する時間が長かった（ＡおよびＢ）。
【００４３】
また、同じ構造の箱の中央チャンバーに自閉症モデルマウス（ｐａｔＤＰ／＋）または野生型マウス（ＷＴ）を１匹、両側のチャンバーにstrangerマウスをそれぞれ１匹ずつ入れ、自閉症モデルマウス（ｐａｔＤＰ／＋）および野生型マウス（ＷＴ）の各チャンバー内の滞在時間を測定した。この条件においても、本発明の自閉症モデルマウスは野生型マウス（ＷＴ）と比較して、strangerマウス側のチャンバーに滞在する時間が短かった（ＣおよびＤ）。
これらの結果より、本発明の自閉症モデルマウスは社会的相互作用に障害が生じ、ヒトの自閉症と同様の症状を示すことが確認された。
【００４４】
明暗選択テスト
自閉症モデルマウスの不安様行動を測定するために明暗選択テストを行った（図６）。
自閉症モデルマウスを迷路の暗箱の中に置き、１０分間の移動距離（Ａ）、明箱に滞在していた時間（Ｂ）、明箱と暗箱を行き来した回数（Ｃ）および最初に明箱に入るまでの潜時（Ｄ）を測定した。本発明の自閉症モデルマウス（ｍａｔＤｐ／＋）は野生型マウス（対照区）と比較して、明箱の滞在時間が短く（ＡおよびＢ）、行き来した回数が少なく（Ｃ）、最初に明箱に入るまでの潜時が長い（Ｄ）など不安様行動が亢進しており、ヒトの自閉症と同様の症状を示した。
【００４５】
ローターロッドテスト
自閉症モデルマウスの固執化傾向（協調運動・運動学習）を測定するためにローターロッドテストを行った（図７）。
自閉症モデルマウスまたは野生型マウスを回転するロッドにのせると、マウスは落ちないようにロッドの上を歩く。ロッドの回転スピードを徐々に上げてゆき、１試行をマウスが落ちるか、５分が経過するまで行う。このテストを１日３試行、２日間行った。テストを行うにつれ、マウスはロッドからなかなか落ちなくなる。本発明の自閉症モデルマウス（ｍａｔＤｐ／＋）は野生型マウス（対照区）と比較して落ちるまでの時間が長く、懸命に運動しようとしており、固執化傾向が亢進しており、ヒトの自閉症と同様の症状を示した。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明のヒトにおける染色体異常を導入したトランスジェニック非ヒト動物は、ヒトにおける染色体異常に起因する疾患を治療するための候補薬剤の薬効の評価やスクリーニングに用いることができ、また、ヒトにおける染色体異常に起因する疾患の発症メカニズム研究の精度のよいモデル動物として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】マウス第７染色体ｃ上の遺伝子群を示す図である。Mkrn3、Magel2、NdnおよびSnrpnは父性発現遺伝子であり、Ube3aおよびAtp10aは母性発現遺伝子であり、Gabrb3、Gabra5、Gabrg3、P、Herc2およびNipa1は非インプリント遺伝子である。
【図２】マウス第７染色体ｃ領域の重複を導入したマウスＥＳ細胞から調製したＤＮＡのサザンブロットを示す図である。
【図３】自閉症モデルマウス染色体のＦＩＳＨを示す図である。
【図４】野生型マウスと自閉症モデルマウスにおける遺伝子発現量の比較（quantitative  ＰＣＲ法）を示す図である。
【図５】自閉症モデルマウスの社会性相互作用の障害を示す図である（社会的行動測定テスト（strangerマウスへの社会的アプローチ））。３区画チャンバーの中央チャンバーに１匹の自閉症モデルマウス（Ａ）または野生型マウス（Ｂ）を入れ、一方の側のチャンバーに野生型マウスを入れた場合、および３区画チャンバーの中央チャンバーに１匹の自閉症モデルマウス（Ｃ）または野生型マウス（Ｄ）を入れ、両方の側のチャンバーに野生型マウスを入れた場合。
【図６】自閉症モデルマウスの不安度の上昇を示す図である（明暗選択テスト）。
【図７】自閉症モデルマウスの固執化傾向を示す図である（ローターロッドテスト）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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