(57)【要約】      （修正有）【課題】CYP2C9（ヒトチトクロームＰ４５０  ２Ｃ９遺伝子）の一塩基変異遺伝的多型を簡便に検出し、患者の薬物代謝副作用の予測に役立てる方法を提供する。【解決手段】被験体に存在するヒトチトクロームP450 2C9 遺伝多型を検出する方法であって、連続する１８〜２８塩基を有する特定の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、あるいは別の連続する１８〜２９塩基を有する特定の塩基配列オリゴヌクレオチドの、少なくとも一つをプライマーとして用いて、チトクロームＰ４５０2C9 遺伝多型の検査をする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示される塩基配列の連続する１８〜２８塩基を有する配列を含んだオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、配列番号２で示される塩基配列の連続する１８〜２９塩基を有する配列を含んだオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、少なくともいずれか一つを含むことを特徴とする新規なヒトチトクロームP450 2C9 遺伝多型検査用オリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項２】
請求項１記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットと、遺伝多型部位に実質的に相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いて解析する工程を含む、ヒトチトクロームP450 2C9 遺伝多型の検査方法。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドプローブが標識または水不溶性担体に固定されていることを特徴とする請求項２記載のヒトチトクロームP450 2C9 遺伝多型の検査方法。
【請求項４】
標識が蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質よりなる群から選ばれたいずれかである請求項２または３に記載のヒトチトクロームP450 2C9 遺伝多型の検査方法。
【請求項５】
配列番号１で示される塩基配列の連続する１８〜２８塩基を有する配列を含んだオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、その３´末端または３´末端から２番目の塩基が多型部位と相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして用いて解析する工程を含む、ヒトチトクロームP450 2C9 遺伝多型の検査方法。
【請求項６】
配列番号２で示される塩基配列の連続する１８〜２９塩基を有する配列を含んだオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとし、その３´末端または３´末端から２番目の塩基が多型部位と相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして用いて解析する工程を含む、ヒトチトクロームP450 2C9 遺伝多型の検査方法。
【請求項７】
３´末端または３´末端から２番目の塩基が多型部位と相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドの３´末端から３〜５番目の少なくとも１つの塩基が相補的あるいは相同的でない塩基に置換されていることを特徴とする請求項５または６記載のヒトチトクロームP450 2C9 遺伝多型の検査方法。
【請求項８】
請求項５〜７記載のオリゴヌクレオチドが標識されていることを特徴とする
ヒトチトクロームP450 2C9 遺伝多型の検査方法。
【請求項９】
標識が蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質よりなる群から選ばれたいずれかである請求項５〜８のいずれかに記載のヒトチトクロームP450 2C9 遺伝多型の検査方法
【請求項１０】
請求項１記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットと、遺伝多型部位に実質的に相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いて解析する工程を含む、ヒトチトクロームP450 2C9 遺伝多型の検査キット。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドプローブが標識または水不溶性担体に固定されていることを特徴とする請求項１０記載のヒトチトクロームP450 2C9 遺伝多型の検査キット。
【請求項１２】
標識が蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質よりなる群から選ばれたいずれかである請求項１０または１１に記載のヒトチトクロームP450 2C9 遺伝多型の検査キット。
【請求項１３】
配列番号１で示される塩基配列の連続する１８〜２８塩基を有する配列を含んだオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、その３´末端または３´末端から２番目の塩基が多型部位と相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして用いて解析する工程を含む、ヒトチトクロームP450 2C9 遺伝多型の検査キット。
【請求項１４】
配列番号２で示される塩基配列の連続する１８〜２９塩基を有する配列を含んだオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとし、その３´末端または３´末端から２番目の塩基が多型部位と相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして用いて解析する工程を含む、ヒトチトクロームP450 2C9 遺伝多型の検査キット。
【請求項１５】
３´末端または３´末端から２番目の塩基が多型部位と相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドの３´末端から３〜５番目の少なくとも１つの塩基が相補的あるいは相同的でない塩基に置換されていることを特徴とする請求項１３または１４記載のヒトチトクロームP450 2C9 遺伝多型の検査キット。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドが標識されていることを特徴とするヒトチトクロームP450 2C9 遺伝多型の検査キット。
【請求項１７】
標識が蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質よりなる群から選ばれたいずれかである請求項１３〜１６のいずれかに記載のヒトチトクロームP450 2C9 遺伝多型の検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトチトクロームP450 2C9 遺伝子（以下、「CYP2C9」ということがある）の一塩基変異多型の検査に用いられるオリゴヌクレオチドプライマー及びそれを用いたヒトチトクロームP450 2C9 遺伝子の一塩基変異多型の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムとは遺伝情報が記されている設計図であるが、その情報全体はヒトの場合、３−４万個の遺伝子で構成されている。これらの遺伝子の塩基配列を比較すると、個人毎に異なっている箇所が存在することが明らかになってきた。このことは遺伝子の多型と呼ばれ、既に１４０万個以上の一塩基多型(Single Nucleotide Polymorphism ;SNP)が同定されている。これらの塩基多型は薬物代謝において副作用および治療失敗の発生において個体間変動の原因として重要な役割を果たし、体質として知られる基礎代謝等の個人差の原因としても知られている。その上、多数の疾患の遺伝マーカーとしての働きもするといわれており、それゆえこれら塩基多型の解明は臨床的に重要であると考えられている。
【０００３】
チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）は肝臓に存在する薬物代謝酵素で、CYP 1ファミリー、CYP 2ファミリー、およびCYP 3ファミリー等が同定されている。CYP1ファミリーは、2つのサブファミリー：CYP 1Aサブファミリー(CYP 1A1およびCYP 1A2のアイソフォームを有する)およびCYP 1Bサブファミリー(CYP 1B1アイソフォームを有する)を含むことが知られている。CYP 2ファミリーは、主に5つのサブファミリー：CYP 2Aサブファミリー(CYP 2A6アイソフォーム、CYP 2A7アイソフォーム、CYP 2A13アイソフォームを有する)、CYP 2Bサブファミリー(CYP 2B6アイソフォームを有する)、CYP 2Cサブファミリー(CYP 2C8アイソフォーム、CYP 2C9アイソフォーム、CYP 2C18アイソフォーム、CYP 2C19アイソフォームを有する)、CYP 2Dサブファミリー(CYP 2D6アイソフォームを有する)、およびCYP 2Eサブファミリー(CYP 2E1アイソフォームを有する)、を含むことが知られている。ファミリー 3は、CYP 3A4アイソフォーム、CYP 3A5アイソフォーム、CYP 3A7アイソフォーム、およびCYP3A43アイソフォームを有するCYP 3Aサブファミリーを含む。
【０００４】
薬の効き易さや副作用の出方など薬剤に対する反応性の個人差は、これらＣＹＰファミリー群の遺伝子多型が原因の一つであると考えられている。チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）をはじめ多数の薬物代謝酵素において一塩基多型（Single  Nucleotide  Polymorphism;SNP）の解析が進められている。特にCYP2C9は、種々の薬物の代謝を触媒する酵素であり、CYP2C9のアミノ酸配列に異常があるか否かを調べることは、患者における各種薬剤に対する副作用の有無を予測する上で重要である。
【０００５】
１９８７年頃より様々な研究者達によってCYP2C9のｃＤＮＡやアミノ酸の配列解析がさかんに行われ、アミノ酸の変異箇所についても報告されてきた。それらの報告を受け、１９９５年にWangらが中国人を対象として、今まで報告のあった箇所全て（exon3(Arg144-Cys)、exon7(Tyr358-Cys)、exon7(Ile359-Leu) 及びexon8(Gly417-Asp) 変異）についてＰＣＲ−ＲＦＬＰ法にて遺伝子多型解析を行なっている（非特許文献１) 。その結果、中国人については、exon7(Ile359-Leu) 変異（すなわち、CYP2C9の第３５９番目のイソロイシンがロイシンになる変異で、第７エクソン中の点突然変異による）のみを検出している。exon7(Ile359-Leu) 変異の有無をＰＣＲ−ＲＦＬＰ法により調べる場合には、先ず、第７エクソン中の上記点突然変異（第７エクソンの第１番目の塩基を１ｎｔとして１８３ｎｔのＡがＣになる）部位を包含する領域をＰＣＲで増幅する必要があり、そのためのプライマーの具体的な配列もWangらの文献（非特許文献１）に記載されている。しかしながら、Wangらの文献に記載されたプライマーを用いてCYP2C9遺伝子を増幅すると、CYP2C9遺伝子のみならず、CYP2C17 遺伝子及びCYP2C19 遺伝子も増幅されてくることがわかった。もし、CYP2C17 遺伝子又はCYP2C19 遺伝子が増幅されると、ＲＦＬＰにおいてこれらのバンドが検出されてしまうため、診断を誤る可能性がある。
【０００６】
上記の問題点を解決する方法として、CYP2C9遺伝子のみを特異的に増幅させるreverseプライマーを用いたＰＣＲ−ＲＦＬＰ法により遺伝的多型を検出する方法（特許文献１）も考案されたが、非特異的増幅を解消しかつ制限酵素処理前後の核酸断片を電気泳動で明瞭に分離解析するためには、特別な条件設定が必要であり、多検体の処理には不向きである。
【特許文献１】特開平１０−６６６００
【非特許文献１】Su-Lan Wang et al., Pharmacogenetics (1995) 5, 37-42
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記既報によるとＰＣＲ増幅後、制限酵素処理を行い電気泳動することによって特別な検出装置を用いることなく遺伝多型の検出が可能である。しかしながら多数の検体について限られた時間内に検査をする場合、効率良く行うことが重要である。これまで報告されている方法では、非特異増幅を解消しかつ、制限酵素処理前後の核酸断片を電気泳動で明瞭に分離解析するためには、特別な条件設定が必要であった。従って、本発明の目的は、CYP2C9 の一塩基変異遺伝的多型を、迅速・簡便に検出する手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、上記文献に記載されたものとは異なる新規なプライマーを用いることにより、CYP2C17 、CYP2C18 及びCYP2C19 遺伝子を増幅させることなく、CYP2C9遺伝子多型のみを特異的に増幅させることができることを見出し、本発明を完成した。本発明は、配列表の配列番号１で示される塩基配列の連続する１８〜２８塩基を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号２で示される塩基配列の連続する１８〜２９塩基を有するオリゴヌクレオチドを、ヒトチトクロームP450 2C19 遺伝子一塩基変異検査用オリゴヌクレオチドプライマーとして提供する。すなわち、本発明は、ヒトチトクロームP450 2C19 遺伝子一塩基変異検査用オリゴヌクレオチドプライマーセット、ヒトチトクロームP450 2C9 遺伝多型の検査方法およびヒトチトクロームP450 2C9 遺伝多型の検査キットに関する。
１．配列番号１で示される塩基配列の連続する１８〜２８塩基を有する配列を含んだオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、配列番号２で示される塩基配列の連続する１８〜２９塩基を有する配列を含んだオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、少なくともいずれか一つを含むことを特徴とする新規なヒトチトクロームP450 2C9 遺伝多型検査用オリゴヌクレオチドプライマーセット。
２．１のオリゴヌクレオチドプライマーセットと、遺伝多型部位に実質的に相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いて解析する工程を含む、ヒトチトクロームP450 2C9 遺伝多型の検査方法。
３．オリゴヌクレオチドプローブが標識または水不溶性担体に固定されていることを特徴とする２のヒトチトクロームP450 2C9 遺伝多型の検査方法。
４．標識が蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質よりなる群から選ばれたいずれかである２または３のヒトチトクロームP450 2C9 遺伝多型の検査方法。
５．配列番号１で示される塩基配列の連続する１８〜２８塩基を有する配列を含んだオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、その３´末端または３´末端から２番目の塩基が多型部位と相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして用いて解析する工程を含む、ヒトチトクロームP450 2C9 遺伝多型の検査方法。
６．配列番号２で示される塩基配列の連続する１８〜２９塩基を有する配列を含んだオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとし、その３´末端または３´末端から２番目の塩基が多型部位と相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして用いて解析する工程を含む、ヒトチトクロームP450 2C9 遺伝多型の検査方法。
７．３´末端または３´末端から２番目の塩基が多型部位と相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドの３´末端から３〜５番目の少なくとも１つの塩基が相補的あるいは相同的でない塩基に置換されていることを特徴とする請求項５または６記載のヒトチトクロームP450 2C9 遺伝多型の検査方法。
８．５〜７のオリゴヌクレオチドが標識されていることを特徴とするヒトチトクロームP450 2C9 遺伝多型の検査方法。
９．標識が蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質よりなる群から選ばれたいずれかである５〜８のいずれかのヒトチトクロームP450 2C9 遺伝多型の検査方法
１０．１のオリゴヌクレオチドプライマーセットと、遺伝多型部位に実質的に相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いて解析する工程を含む、ヒトチトクロームP450 2C9 遺伝多型の検査キット。
１１．オリゴヌクレオチドプローブが標識または水不溶性担体に固定されていることを特徴とする１０のヒトチトクロームP450 2C9 遺伝多型の検査キット。
１２．標識が蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質よりなる群から選ばれたいずれかである１０または１１のヒトチトクロームP450 2C9 遺伝多型の検査キット。
１３．配列番号１で示される塩基配列の連続する１８〜２８塩基を有する配列を含んだオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、その３´末端または３´末端から２番目の塩基が多型部位と相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして用いて解析する工程を含む、ヒトチトクロームP450 2C9 遺伝多型の検査キット。
１４．配列番号２で示される塩基配列の連続する１８〜２９塩基を有する配列を含んだオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとし、その３´末端または３´末端から２番目の塩基が多型部位と相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして用いて解析する工程を含む、ヒトチトクロームP450 2C9 遺伝多型の検査キット。
１５．３´末端または３´末端から２番目の塩基が多型部位と相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドの３´末端から３〜５番目の少なくとも１つの塩基が相補的あるいは相同的でない塩基に置換されていることを特徴とする１３または１４のヒトチトクロームP450 2C9 遺伝多型の検査キット。
１６．１３〜１５のいずれかのオリゴヌクレオチドが標識されていることを特徴とするヒトチトクロームP450 2C9 遺伝多型の検査キット。
１７．標識が蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質よりなる群から選ばれたいずれかである１３〜１６のいずれかのヒトチトクロームP450 2C9 遺伝多型の検査キット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、被験体から核酸試料を得、前記試料中で、チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）の遺伝子多型を簡便でかつ再現性が高い結果が得られるようになり、これらの多型に関連のある薬物使用の際に重要な情報を迅速に提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明で、被験体から核酸試料を得、前記試料中で、チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）の遺伝子多型を検出することによって、薬の効き易さや副作用の出方など薬剤に対する反応性の個人差の指標および代謝能の変化を示すことで薬物治療の用量調整に関する重要な情報の一つを提供することができる。
【００１１】
アッセイに用いる試料溶液は、患者の血液、組織から、既知の方法により調製してもよい。代表的なものとして、フェノール／クロロホルム抽出法（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  ａｃｔａ 第７２巻、第６１９〜６２９頁、１９６３年）、アルカリＳＤＳ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ 第７巻、第１５１３〜１５２３頁、１９７９年）等の液相で行う方法がある。また、核酸の単離に核酸結合用担体を用いる系としては、ガラス粒子とヨウ化ナトリウム溶液を使用する方法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．  ＵＳＡ 第７６−２巻、第６１５〜６１９頁、１９７９年）、ハイドロキシアパタイトを用いる方法（特開昭６３−２６３０９３号公報）等がある。その他の方法としてはシリカ粒子とカオトロピックイオンを用いた方法（Ｊ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ 第２８−３巻、第４９５〜５０３頁、１９９０年、特開平２−２８９５９６号公報）が挙げられる。
【００１２】
本発明は、チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）の遺伝子に存在する多型の中でCYP２C9のアミノ酸配列において１番目のMetから数えて３５９番目に存在するIleのLeuへの多型を検出するための方法、プライマーセットおよびそのキットである。遺伝子レベルで説明すると、翻訳開始点から1077番目、又はエキソン７の先頭位置から１８３番目の塩基であるアデニン(以下、183Aと表記することがある)からシトシン(以下、183Cと表記することがある)への多型(以下、183A→Cと表記することがある)を検出するための方法、プライマーセットおよびそのキットである。このCYP2C9の183A→Cの多型部位は、GenBankの ACCESSION  M61857に基づいて説明するならば、1075番目に位置する。183Aは野生型であり、183Cは多型を示す。ここで、多型または多型核酸とは、野生または野生型核酸のうちの１つのヌクレオチドのみが点変異して他のヌクレオチドに置換されているもののことである
【００１３】
核酸増幅方法としては、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence-basedamplification method；Ｎａｔｕｒｅ 第３５０巻、第９１頁(1991)）、ＬＣＲ（国際公開８９／１２６９６号公報、特開平２−２９３４号公報）、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification：Nucleic acid research 第２０巻、第１６９１頁(1992)）、ＲＣＲ（国際公開９０／１０６９号公報）、ＴＭＡ（Transcription mediated amplification method；J.Clin.Microbiol. 第３１巻、第３２７０頁(1993)）ＬＡＭＰ（loop-mediated isothermal amplification method :J Clin Microbiol. 2004 第42巻:第1,956頁）、ＩＣＡＮ（isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids: Kekkaku. 2003 第78巻、第５３３頁）などが挙げられる。
【００１４】
なかでもＰＣＲ法は、試料核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のオリゴヌクレオチド及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより、上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれる試料核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である。すなわち、変性工程で試料の核酸を変性し、続くアニーリング工程において各オリゴヌクレオチドと、それぞれに相補的な一本鎖試料核酸上の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、各オリゴヌクレオチドを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各一本鎖試料核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ、二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２n倍に増幅される。増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在するので、電気泳動等の方法により容易に検出できる。よって、遺伝子増幅法を用いれば、従来では検出不可能であった、極めて微量（１分子でも可）の試料核酸をも検出することが可能であり、最近非常に広く用いられている技術である。
【００１５】
更に詳しくは、一塩基変異検出には、配列番号３，４で示されるオリゴヌクレオチドを利用しても良い。
配列番号３は、ＣＹＰ２Ｃ９の１８３番目の塩基がＡであることを認識するreverseプライマーであり、配列表の配列番号１で示される塩基配列の連続する１８〜２８塩基を有する配列を含んだオリゴヌクレオチドと組み合わせて用いることができる。
配列番号４は、ＣＹＰ２Ｃ９の１８３番目の塩基がＣであることを認識するforwardプライマーであり、配列番号２で示される塩基配列の連続する１８〜２９塩基を有する配列を含んだオリゴヌクレオチドと組み合わせて用いることができる。
【００１６】
本発明の一つの実施形態として、一つの試料を二つに分け、一方は配列表の配列番号１で示される塩基配列の連続する１８〜２８塩基を有する配列を含んだオリゴヌクレオチドおよび配列番号３で示されるオリゴヌクレオチドを用いて反応を行い、他方は配列番号２で示される塩基配列の連続する１８〜２９塩基を有する配列を含んだオリゴヌクレオチドおよび配列番号４で示されるオリゴヌクレオチドを用いて反応を行ってもよい。これにより、試料核酸が野生型であるか多型であるかを明確に知ることができる。
【００１７】
なお、配列番号１〜４で示されるオリゴヌクレオチド全てを組み合わせて用いることも可能である。
【００１８】
本発明のプライマーと既知のプライマーを組み合わせ、CYP2C9 の一塩基多型の検出をおこなってもよい。例えば、一塩基変異の検出のためのリバースプライマーは、特許文献１に記載されているものを使用することも可能である。
【００１９】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行う場合、アニーリングは５０〜６５℃で5〜120秒間、伸長は６８〜７２℃で15〜120秒間行う。変性条件は変性が行われればよいので特に限定されないが、通常、９４℃で5〜120秒間行う。サイクル数は特に限定されないが、２０〜４０サイクルが好ましい。また、ＰＣＲバッファー中の塩化マグネシウムの濃度は、1.0 ないし2.0 mMが好ましい。なお、ＰＣＲ法自体はこの分野において周知であり、必要な試薬類のキット及び装置も市販されているので、これらを用いて容易に行うことができる。
【００２０】
なお、プライマーが予め標識されていてもよい。該標識としては、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、放射線物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質などを用いればよい。例えば、標識が蛍光化学物質または蛍光蛋白質の場合、特定波長の光を照射し蛍光化学物質または蛍光蛋白質を励起させ、基底状態に変換される際に生じる特定波長の蛍光量を測定することが可能である。これらに用いられる蛍光化学物質としては、FITC、FAM、TAMRA、TexasRed、VIC、Cy3、Cy5、HEX等が挙げられ、蛍光蛋白質としては、GFP、YFP、RFP等を挙げることができる。標識が酵素である場合、酵素の基質を添加することによって生成される反応生成物を検出することによって測定が可能である。これらに用いられる酵素と基質の組み合わせとしては、アルカリフォスファターゼとパラニトロフェニルリン酸、CDP-star、AMPPD、DDAOphospate、BCIP-NBT等の組み合わせ、パーオキシダーゼとTMB、Lumi-Light（ロッシュ・ダイアグノスティックス）、SAT-1（同仁化学）等の組み合わせ、ジアホラーゼとNTB等の組み合わせ、各種オキシダーゼと基質、各種デヒドロゲナーゼと基質の組み合わせ等、反応生成物が検出されるものであれば、これらに限定されることはなく用いることが可能である。標識が磁性体の場合、磁気を検出することによって測定が可能である。標識が導電性物質の場合、電流値を検出することによって測定が可能である。
【００２１】
本発明よって得られた増幅産物は、電気泳動や、増幅産物の核酸配列と相同あるいは相補的な塩基配列を備えたなプローブとのハイブリダイゼーションによって検出可能であるが、これに限定されるものではない。また、ＴａｑＭａｎプローブ法のような５´ヌクレアーゼ活性を利用した蛍光標識プローブアッセイへの適用も可能である。
【００２２】
本発明のプライマーおよび一塩基変異箇所と相補的あるいは相同的な配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって、ＰＣＲ後、得られたＰＣＲ産物についてハイブリダイゼーションを行ってもよい。ハイブリダイゼーション法自体は周知の方法でよい。すなわち、水不溶性担体に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブに予め1本鎖にされたPCR産物を添加することにより、担体上にPCR産物が結合される。結合されたPCR産物が予め標識されていれば、その標識を検出することによって、PCR産物の配列を特定することが可能である
【００２３】
本発明よって得られた増幅産物をプローブで検出する場合には、標識プローブが好ましく使用される。標識プローブは新たに生成した配列に対してハイブリダイズするように設計されているので、既に存在している核酸の影響を受けることなく、伸長反応により新たに生成した伸長生成物を、効率よく検出することができる。プローブの標識としては、オリゴヌクレオチドプライマーの標識と同様のものが使用され、プライマーとプローブの両方を標識する場合には、異なる標識を好ましく使用できる。
【００２４】
また、蛍光色素で予め標識されたオリゴヌクレオチドプローブと、５´ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを利用したいわゆるTaqmanアッセイであれば、ＰＣＲ反応と共に一塩基変異の検出が可能な試料を解析する上では極めて有効な方法である。あるいは、オリゴヌクレオチドプローブを用いた融解曲線解析を行なうことによっても、配列を特定することができる。他の方法としては、配列番号1または２のオリゴヌクレオチドと、一塩基変異配列を特異的に増幅させるオリゴヌクレオチドとを組み合わせて用いることによって、アレル特異的に核酸断片を増幅させることも可能である。得られた核酸断片をＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩやエチレンブロマイドなどのインターカレーターを用いて蛍光検出することも可能であり、電気泳動にて増幅断片を検出しても良い。
【００２５】
増幅産物を検出するためのプローブは、水不溶性担体に固定されていてもよい。水不溶性担体としては、合成高分子、生体高分子、金属、ガラスなどが例示される。すなわち、水不溶性担体に固定化されたプローブに予め1本鎖にされたPCR産物を添加することにより、担体上にPCR産物が結合される。結合されたPCR産物が予め標識されていれば、その標識を検出することによって、PCR産物の配列を特定することが可能である。
【００２６】
増幅産物を検出するためのプローブは、これらの水不溶性担体にアレイ状に配置し、ＤＮＡアレイとして用いてもよい。チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）の２C9遺伝子の多型を調べるためのプローブ単独のDNAアレイを作成しても良い。また、他のＣＹＰファミリー、サブファミリー、アイソフォームの多型を調べるためのプローブを含んでいても良い。これらのＤＮＡアレイを用いることで、チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）の多型と薬物代謝の関係を網羅的に解析することが可能となる。
【００２７】
本発明の方法、プライマーセット、およびキットによって、被験体から核酸試料を得、前記試料中で、CYP2C9の遺伝子多型を簡便かつ再現性よく検出することが可能となり、薬の効き易さや副作用の出方など薬物に対する反応性の個人差および代謝能の変化を示す指標を提供することが出来る。これにより薬物治療の用量調整に関する重要な情報を迅速に提供することができる。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２９】
［実施例１］
・  CYP2C9遺伝子の183番目の多型を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１〜４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ１〜４と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社OPCカラムにて実施した。もしくはDNA合成受託会社（（株）日本バイオサービス、北海道システム・サイエンス（株）、プロリゴ（株）、イルミナ（株）等）に依頼した。
【００３０】
(2)  PCR法によるCYP2C9遺伝子多型の解析
PCR法による増幅反応
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液、およびヒトCYP2C9(C/C)遺伝子をクローニングしたプラスミドDNA溶液をサンプルとして、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトCYP2C9遺伝子の塩基多型 (183A→C)を解析した。
【００３１】
以下の試薬を含む25μl溶液を調製した。
KOD-plus -DNAポリメラーゼ反応液
オリゴ１および3（また2および4）  5 pmol、×10緩衝液 2.5 μl、2mM dNTP 2.5 μl、25 mM MgCl2 1 μl、KOD-plus- DNAポリメラーゼ0.4 Ｕ、抽出DNA溶液 20 ng（A/A、A/C）、抽出DNA溶液と等コピー数のプラスミドDNA溶液(C/C)
増幅条件
94℃・2分94℃・15秒、60℃・30秒、68℃、30秒（35サイクル）68℃・2分。
【００３２】
(3)  電気泳動を用いた検出
増幅反応液5μｌを3％アガロースを用いて電気泳動を行なった（図１）。その結果、塩基多型に応じた特異的な増幅産物が得られることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明により、被験体から核酸試料を得、前記試料中で、チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）の遺伝子多型を簡便でかつ再現性が高い結果が得られるようになり、これらの多型に関連のある薬物使用の際に重要な情報を迅速に提供することができることからも産業界に大きく寄与することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】Cytochrome P450 2C9(CYP2C19)遺伝子の塩基多型 (183A→C)の検出結果
【図１】
2007006863.tif 000002
【配列表】
2007006863000001.app