(57)【要約】【課題】  発電所等の海水利用プラントの取水口や、漁業施設に、クラゲが襲来して大量の難処理廃棄物となった場合に、これを効率よく分解又は減容する新たな手法が求められており、また、クラゲの襲来を未然に防ぐことを可能とするクラゲの駆除方法も求められている。【解決手段】  難処理廃棄物となったクラゲを、EC 3.4に分類されるペプチダーゼ、好ましくは、Bacillus sp. 97001株が産生するペプチダーゼ若しくはその類似酵素で処理することにより分解又は減容を図り、該難処理廃棄物となったクラゲの最終処分を容易にならしむるペプチダーゼとその利用法を提供する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
EC 3.4 に分類され、かつ、クラゲを分解しえるペプチダーゼ。
【請求項２】
Bacillus sp. 97001株由来である請求項１に記載のペプチダーゼ。
【請求項３】
ペプチダーゼの性質および／または実質的に同等な性質を有するタンパク質またはその塩について、該タンパク質をコードするアミノ酸配列あるいは当該配列に１またはそれ以上のアミノ酸残基の欠失、置換もしくは付加による変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的に活性で安定なタンパク質である請求項１ないし２に記載のペプチダーゼ。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載のペプチダーゼの生産能を有する微生物。
【請求項５】
請求項４に記載の微生物を培養し、ペプチダーゼを生産せしめ、これを採取してなるペプチダーゼの製造方法。
【請求項６】
請求項１〜３の何れか１項に記載のペプチダーゼを使用してなるクラゲの分解方法。
【請求項７】
請求項１〜３の何れか１項に記載のペプチダーゼを使用してなるクラゲ分解装置。
【請求項８】
請求項１〜３の何れか１項に記載のペプチダーゼを含有してなるクラゲ分解用製剤。
【請求項９】
請求項１〜３の何れか１項に記載のペプチダーゼを使用してなるクラゲ分解産物。
【請求項１０】
請求項１〜３の何れか１項に記載のペプチダーゼを使用してなるクラゲの駆除方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチダーゼについて、クラゲを分解しえるペプチダーゼに関し、該ペプチダーゼの製造方法に関する。
また、本発明は、該ペプチダーゼを使用したクラゲの分解方法及び駆除方法に関する。
さらに、本発明は、該ペプチダーゼを含有するクラゲの分解用製剤及び該ペプチダーゼを使用したクラゲ分解装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
クラゲは、腔腸動物（刺胞動物）門のヒドロ虫綱とハチクラゲ綱の自由遊泳型と有侯動物の個体の総称である。クラゲは、日本だけでも数百種が分布しており、海生の最大のプランクトンである。
沿岸近くに位置している火力・原子力発電所では、通常、タービンを回転させた蒸気の冷却用として、海水を取水している。この取水管にムラサキイガイ（ムール貝）やフジツボ等が大量に付着すると、取水ポンプの負荷が増す等の問題が発生する。また、クラゲが大量流入すると復水器冷却水の取水が困難になり、発電出力の制限を余儀なくされる。イガイやフジツボ等の付着生物、大量に出現し取水口を詰まらせる。
【０００３】
クラゲは、火力・原子力発電所等の海水利用プラントの取水口付近に屡々大量に襲来し、海水利用プラントの取水を妨害する。かかるクラゲの大量襲来による海水の取水障害は、発電出力の低下、機器の性能低下、取水及び発電停止等の極めて深刻な被害をもたらす。また、クラゲは漁業施設にも屡々大量に襲来し、定置網等の漁網に入り込み、漁網中の魚類の窒息、死亡、品質低下及び漁網破損等の被害を発生させる。尚、この様な問題の原因となるクラゲとしては、例えば、ミズクラゲやエチゼンクラゲが挙げられる。かかる被害を未然に防ぐ為、古くから対策技術が検討実施されて来たが、完全な流入防止ができていない現状であり、大量襲来した結果陸揚げされたクラゲはその運搬・処理が追いつかず大きな問題となっている。陸揚げされたクラゲの処理法としては、例えば、焼却や、一般廃棄物としての埋め立てが有るが、焼却処理に際して悪臭等の問題が発生し、また廃棄物処理法等の改正によって埋め立て地へのクラゲの廃棄は困難になりつつある。
【０００４】
発電所等の海水利用プラントの取水口や、漁業施設に、クラゲが襲来して大量の難処理廃棄物となった場合に、これを効率よく分解又は減容する新たな手法が求められており、また、クラゲの襲来を未然に防ぐことを可能とするクラゲの駆除方法も求められている。
従来、クラゲの分解又は減容の為の手段としては、微生物法、酵素法、化学法、物理法、またこれらの内何れかの方法の組み合わせ（特許文献１〜５を参照）等が提案されている。しかしこれらは、速度、効率、初期費用、運転費用、等を鑑みれば、必ずしも満足できるものではない。
【０００５】
また、クラゲから有用物質を抽出することを目的として、クラゲの分解にクラゲ自身の内因性のアルカリプロテアーゼや外部から添加されたアルカリプロテアーゼを使用する方法（特許文献６を参照）があるが、該内因性のアルカリプロテアーゼは、本発明の難処理廃棄物であるクラゲを短時間で効率よく分解又は減容するには活性が不足している。さらに、外部から添加するプロテアーゼの例としてペプシンを挙げているが、ペプシンは現状ブタやウシから取られる高価な酵素であり、本発明の難処理廃棄物としてのクラゲを短時間で効率よく分解又は減容する為の触媒には適さない。
クラゲの駆除方法としては、有効であり且つ自然環境への悪影響が軽微なものが、望まれている。
【０００６】
【特許文献１】特開平05-185065号公報
【特許文献２】特開平07-292646号公報
【特許文献３】特開平11-138146号公報
【特許文献４】特開平11-316008号公報
【特許文献５】特開2004-255313号公報
【特許文献６】特許第3696018号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、かかる従来技術の現状を鑑み創案されたものであり、その目的は、発電所等の海水利用プラントの取水口や、漁業施設に、クラゲが襲来して大量の難処理廃棄物となった場合に、これを効率よく分解又は減容する為に使用することができ、またクラゲの駆除にも応用できる、ペプチダーゼとその利用法を提供することにある。
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、EC 3.4に分類される酵素であってクラゲを分解しえるペプチダーゼ、少なくともBacillus sp. 97001株由来のペプチダーゼ若しくはその類似酵素を提供し、またその利用法を提供している。本発明は、発電所等の海水利用プラントの取水口、漁業施設等に、クラゲが襲来し、該クラゲが難処理廃棄物となった場合に、これを効率よく、極めて短時間の内に、分解若しくは減容することができ、産業上極めて有用なペプチダーゼとその利用法を提供することが可能である。難処理廃棄物となったクラゲを、EC 3.4に分類されかつクラゲを分解しえるペプチダーゼ、好ましくは、Bacillus sp. 97001株が産生するペプチダーゼ若しくはその類似酵素で処理することにより分解又は減容を図り、該難処理廃棄物となったクラゲの最終処分を容易にならしむるものである。本発明の分解方法により、該クラゲの最終処分が、従来の焼却等と比較して、極めて容易であり、クラゲの襲来による海水利用プラントや漁業施設の運営への悪影響を最小限にすることができる。
【０００９】
クラゲ成体の約９５％は水分であり、約２％がコラーゲンであるとされる。クラゲを効果的に減容するには、このコラーゲン画分を分解することで、その形態を速やかに消失させることが必要であると考えられる。しかし、クラゲ由来コラーゲンを効率よく加水分解できるペプチダーゼは従来知られておらず、また、コラーゲンを分解する酵素としてコラゲナーゼが一般的に知られていたが、非常に高価であるため、研究用試薬等に用途が限られており、廃棄物の処理に使用できるようなものとは言いがたい。
【００１０】
本発明において注目すべきことは、本発明のペプチダーゼが、化学的、物理的手法と比較して、反応を穏和な条件の下で進行させる働きを持つことである。従って、クラゲを、EC 3.4に分類されるペプチダーゼ、好ましくは、Bacillus sp. 97001株が産生するペプチダーゼ若しくはその類似酵素で処理することにより、常温、常圧で、強酸や強塩基を加えたりすること無く加水分解反応を進行させ、目的を達することができる。これは、加熱したり、強酸や強塩基を加えたり、圧力を掛けたりすることが必要な化学的な方法と比較して、エネルギーコストが低く環境への負荷も少ないという点で圧倒的に有利である。
【００１１】
さらに、EC 3.4に分類されるペプチダーゼ、好ましくは、Bacillus sp. 97001株が産生するペプチダーゼ若しくはその類似酵素で、クラゲを処理することは、化学的な方法と比較して速度と効率の面で勝っており、また加熱処理、強酸や強塩基処理、圧力処理することが必要な化学的処理に使用する設備に比べ、本発明のペプチダーゼ処理に必要な設備は、初期費用と運転費用を低く抑えることができ、有利である。
また、EC 3.4に分類されかつクラゲを分解しえるペプチダーゼ、好ましくは、Bacillus sp. 97001株が産生するペプチダーゼ若しくはその類似酵素は、従来知られていたコラーゲンを分解する酵素と比較して、圧倒的にその生産量と分解活性が高いため、本発明のペプチダーゼを使用することで、難処理廃棄物であるクラゲを分解又は減容することが、産業利用として十分可能である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
そこで本発明者らは、上記課題を解決する為にクラゲ由来コラーゲンを効率よく加水分解できるペプチダーゼに着目し、クラゲを効率よく分解又は減容し得る酵素に関し鋭意研究した。その結果、クラゲは、EC 3.4に分類されるペプチダーゼで処理することにより、その形態を消失させることが可能であることが判明した。更に研究を進め、Bacillus sp. 97001株由来のペプチダーゼ若しくはその類似酵素を使用することで、クラゲを効率よく分解又は減容することを見出した。
【００１３】
かかる知見に基づき、本発明者らは、発電所等の海水利用プラントの取水口や漁業施設に襲来して大量の難処理廃棄物となった、クラゲの処理工程に、該酵素を使用すれば、従来困難であったその分解又は減容を容易に行えることに想到し、遂に本発明を完成するに至った。
【００１４】
即ち、発電所等の海水利用プラントの取水口や漁業施設に襲来して大量の難処理廃棄物となったクラゲの分解又は減容の方法は、以下のステップ（１）〜（３）を含んでなる。
【００１５】
(1)  前記海水利用プラントの取水口又は漁業施設に襲来し、取水路に流入したクラゲを、適当な手段で分別採取する。
(2)  該クラゲを必要に応じて適当な手段で、裁断及び／又は破砕等の前処理を行う。
(3)  前記の前処理済みクラゲを、適当な容器内で所定の時間、Bacillus sp. 97001株由来のペプチダーゼ若しくはその類似酵素と反応させる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の対象となるクラゲは如何なるクラゲであってもよく、例えば、ミズクラゲ及びエチゼンクラゲであることができる。尚、本発明において、「クラゲ」という用語は、成熟クラゲ個体と未成熟クラゲ個体の何れも挙げることができる。
【００１７】
本発明のペプチダーゼは、少なくともクラゲを分解又は減容可能な酵素であればよく、EC 3.4に分類されるペプチダーゼであり、好ましくは、EC 3.4.21に分類されるペプチダーゼであり、更に好ましくは、EC 3.4.21.62に分類されるペプチダーゼである。例えば、Bacillus sp. 97001株由来のペプチダーゼ、Bacillus sp. 97001株が産生するペプチダーゼ若しくはその類似酵素であればよい。また、ペプチダーゼの性質および／または実質的に同等な性質を有するタンパク質またはその塩について、該タンパク質をコードするアミノ酸配列あるいは当該配列に１またはそれ以上のアミノ酸残基の欠失、置換もしくは付加による変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的に活性で安定なタンパク質であればよい。本発明のペプチダーゼは、少なくともクラゲを分解又は減容可能な酵素であればよく、クラゲを分解しえる活性を有していることが望ましく、本発明のペプチダーゼをクラゲに接触させた瞬間から起算して12時間後にクラゲ体積が接触直後の体積の、好ましくは3分の2以下、より好ましくは2分の1以下、望ましくは3分の1以下になっていればよい。
【００１８】
本発明のEC 3.4に分類されるペプチダーゼとしては、EC 3.4.1 a-Amino-Acyl-Peptide Hydrolases、EC 3.4.2 Peptidyl-Amino-Acid Hydrolases、EC 3.4.3 Dipeptide Hydrolases、EC 3.4.4 Peptidyl Peptide Hydrolases、EC 3.4.11 Aminopeptidases、EC 3.4.12 Peptidylamino-Acid Hydrolases or Acylamino-Acid Hydrolases、EC 3.4.13 Dipeptidases、EC 3.4.14 Dipeptidyl-peptidases and tripeptidyl-peptidases、EC 3.4.15 Peptidyl-dipeptidases、EC 3.4.16 Serine-type carboxypeptidases、EC 3.4.17 Metallocarboxypeptidases、EC 3.4.18 Cysteine-type carboxypeptidases、EC 3.4.19 Omega peptidases、EC 3.4.21 Serine endopeptidases、EC 3.4.22 Cysteine endopeptidases、EC 3.4.23 Aspartic endopeptidases、EC 3.4.24 Metalloendopeptidases、EC 3.4.25 Threonine endopeptidases、EC 3.4.99 Endopeptidases of unknown catalytic mechanism等が挙げられる。この中で、好ましくは、EC 3.4.21 Serine endopeptidases、EC 3.4.22 Cysteine endopeptidases、EC 3.4.23 Aspartic endopeptidases、EC 3.4.24 Metalloendopeptidasesが挙げられる。
【００１９】
さらに、EC 3.4.21.1 chymotrypsin、EC 3.4.21.2 chymotrypsin C、EC 3.4.21.3 metridin、EC 3.4.21.4 trypsin、EC 3.4.21.5 thrombin、EC 3.4.21.6 coagulation factor Xa、EC 3.4.21.7 plasmin、EC 3.4.21.9 enteropeptidase、EC 3.4.21.10 acrosin、EC 3.4.21.12 a-Lytic endopeptidase、EC 3.4.21.19 glutamyl endopeptidase、EC 3.4.21.20 cathepsin G、EC 3.4.21.21 coagulation factor VIIa、EC 3.4.21.22 coagulation factor IXa、EC 3.4.21.25 cucumisin、EC 3.4.21.26 prolyl oligopeptidase、EC 3.4.21.27 coagulation factor XIa、EC 3.4.21.32 brachyurin、EC 3.4.21.34 plasma kallikrein、EC 3.4.21.35 tissue kallikrein、EC 3.4.21.36 pancreatic elastase、EC 3.4.21.37 leukocyte elastase、EC 3.4.21.38 coagulation factor XIIa、EC 3.4.21.39 chymase、EC 3.4.21.41 complement subcomponent C、EC 3.4.21.42 complement subcomponent C、EC 3.4.21.43 classical-complement-pathway C3/C5 convertase、EC 3.4.21.45 complement factor I、EC 3.4.21.46 complement factor D、EC 3.4.21.47 alternative-complement-pathway C3/C5 convertase、EC 3.4.21.48 cerevisin、EC 3.4.21.49 hypodermin C、EC 3.4.21.50 lysyl endopeptidase、EC 3.4.21.53 endopeptidase La、EC 3.4.21.54 g-renin、EC 3.4.21.55 venombin AB、EC 3.4.21.57 leucyl endopeptidase、EC 3.4.21.59 tryptase、EC 3.4.21.60 scutelarin、EC 3.4.21.61 kexin、EC 3.4.21.62 subtilisin、EC 3.4.21.63 oryzin、EC 3.4.21.64 endopeptidase K、EC 3.4.21.65 thermomycolin、EC 3.4.21.66 thermitase、EC 3.4.21.67 endopeptidase So、EC 3.4.21.68 t-plasminogen activator、EC 3.4.21.69 protein C (activated)、EC 3.4.21.70 pancreatic endopeptidase E、EC 3.4.21.71 pancreatic elastase II、EC 3.4.21.72 IgA-specific serine endopeptidase、EC 3.4.21.73 u-plasminogen activator、EC 3.4.21.74 venombin A、EC 3.4.21.75 furin、EC 3.4.21.76 myeloblastin、EC 3.4.21.77 semenogelase、EC 3.4.21.78 granzyme A、EC 3.4.21.79 granzyme B、EC 3.4.21.80 streptogrisin A、EC 3.4.21.81 streptogrisin B、EC 3.4.21.82 glutamyl endopeptidase II、EC 3.4.21.83 oligopeptidase B、EC 3.4.21.84 limulus clotting factor 、EC 3.4.21.85 limulus clotting factor 、EC 3.4.21.86 limulus clotting enzyme、EC 3.4.21.87 omptin、EC 3.4.21.88 repressor LexA、EC 3.4.21.89 signal peptidase I、EC 3.4.21.90 togavirin、EC 3.4.21.91 flavivirin、EC 3.4.21.92 endopeptidase Clp、EC 3.4.21.93 proprotein convertase 1、EC 3.4.21.94 proprotein convertase 2、EC 3.4.21.95 snake venom factor V activator、EC 3.4.21.96 lactocepin、EC 3.4.21.97 assemblin、EC 3.4.21.98 hepacivirin、EC 3.4.21.99 spermosin 、EC 3.4.21.100 pseudomonalisin、EC 3.4.21.101 xanthomonalisin、EC 3.4.21.102 C-terminal processing peptidase、EC 3.4.21.103 physarolisin、EC 3.4.21.104 mannan-binding lectin-associated serine protease-2、EC 3.4.22.1 cathepsin B、EC 3.4.22.2 papain、EC 3.4.22.3 ficain、EC 3.4.22.6 chymopapain、EC 3.4.22.7 asclepain、EC 3.4.22.8 clostripain、EC 3.4.22.10 streptopain、EC 3.4.22.14 actinidain、EC 3.4.22.15 cathepsin L、EC 3.4.22.16 cathepsin H、EC 3.4.22.24 cathepsin T、EC 3.4.22.25 glycyl endopeptidase、EC 3.4.22.26 cancer procoagulant、EC 3.4.22.27 cathepsin S、EC 3.4.22.28 picornain 3C、EC 3.4.22.29 picornain 2A、EC 3.4.22.30 caricain、EC 3.4.22.31 ananain、EC 3.4.22.32 stem bromelain、EC 3.4.22.33 fruit bromelain、EC 3.4.22.34 legumain、EC 3.4.22.35 histolysain、EC 3.4.22.36 caspase-1、EC 3.4.22.37 gingipain R、EC 3.4.22.38 cathepsin K、EC 3.4.22.39 adenain、EC 3.4.22.40 bleomycin hydrolase、EC 3.4.22.41 cathepsin F 、EC 3.4.22.42 cathepsin O 、EC 3.4.22.43 cathepsin V 、EC 3.4.22.44 nuclear-inclusion-a endopeptidase 、EC 3.4.22.45 helper-component proteinase、EC 3.4.22.46 L-peptidase、EC 3.4.22.47 gingipain K、EC 3.4.22.48 staphopain、EC 3.4.22.49 separase、EC 3.4.22.50 V-cath endopeptidase、EC 3.4.22.51 cruzipain、EC 3.4.22.52 calpain-1、EC 3.4.22.53 calpain-2 、EC 3.4.23.1 pepsin A、EC 3.4.23.2 pepsin B、EC 3.4.23.3 gastricsin、EC 3.4.23.4 chymosin、EC 3.4.23.5 cathepsin D、EC 3.4.23.12 nepenthesin、EC 3.4.23.15 renin、EC 3.4.23.16 HIV-1 retropepsin、EC 3.4.23.17 Pro-opiomelanocortin converting enzyme、EC 3.4.23.18 aspergillopepsin I、EC 3.4.23.19 aspergillopepsin II、EC 3.4.23.20 penicillopepsin、EC 3.4.23.21 rhizopuspepsin、EC 3.4.23.22 endothiapepsin、EC 3.4.23.23 mucorpepsin、EC 3.4.23.24 candidapepsin、EC 3.4.23.25 saccharopepsin、EC 3.4.23.26 rhodotorulapepsin、EC 3.4.23.28 acrocylindropepsin、EC 3.4.23.29 polyporopepsin、EC 3.4.23.30 pycnoporopepsin、EC 3.4.23.31 scytalidopepsin A、EC 3.4.23.32 scytalidopepsin B、EC 3.4.23.34 cathepsin E、EC 3.4.23.35 barrierpepsin、EC 3.4.23.36 signal peptidase II、EC 3.4.23.38 plasmepsin I、EC 3.4.23.39 plasmepsin II、EC 3.4.23.40 phytepsin、EC 3.4.23.41 yapsin 1、EC 3.4.23.42 thermopsin、EC 3.4.23.43 prepilin peptidase、EC 3.4.23.44 nodavirus endopeptidase、EC 3.4.23.45 memapsin 1、EC 3.4.23.46 memapsin 2、EC 3.4.23.47 HIV-2 retropepsin、EC 3.4.23.48 plasminogen activator Pla、EC 3.4.24.1 atrolysin A、EC 3.4.24.3 microbial collagenase、EC 3.4.24.6 leucolysin、EC 3.4.24.7 interstitial collagenase、EC 3.4.24.11 neprilysin、EC 3.4.24.12 envelysin、EC 3.4.24.13 IgA-specific metalloendopeptidase、EC 3.4.24.14 procollagen N-endopeptidase、EC 3.4.24.15 thimet oligopeptidase、EC 3.4.24.16 neurolysin、EC 3.4.24.17 stromelysin 1、EC 3.4.24.18 meprin A、EC 3.4.24.19 procollagen C-endopeptidase、EC 3.4.24.20 peptidyl-Lys metalloendopeptidase、EC 3.4.24.21 astacin、EC 3.4.24.22 stromelysin 2、EC 3.4.24.23 matrilysin、EC 3.4.24.24 gelatinase A、EC 3.4.24.25 vibriolysin、EC 3.4.24.26 pseudolysin、EC 3.4.24.27 thermolysin、EC 3.4.24.28 bacillolysin、EC 3.4.24.29 aureolysin、EC 3.4.24.30 coccolysin、EC 3.4.24.31 mycolysin、EC 3.4.24.32 b-lytic metalloendopeptidase、EC 3.4.24.33 peptidyl-Asp metalloendopeptidase、EC 3.4.24.34 neutrophil collagenase、EC 3.4.24.35 gelatinase B、EC 3.4.24.36 leishmanolysin、EC 3.4.24.37 saccharolysin、EC 3.4.24.38 gametolysin、EC 3.4.24.39 deuterolysin、EC 3.4.24.40 serralysin、EC 3.4.24.41 atrolysin B、EC 3.4.24.42 atrolysin C、EC 3.4.24.43 atroxase、EC 3.4.24.44 atrolysin E、EC 3.4.24.45 atrolysin F、EC 3.4.24.46 adamalysin、EC 3.4.24.47 horrilysin、EC 3.4.24.48 ruberlysin、EC 3.4.24.49 bothropasin、EC 3.4.24.50 bothrolysin、EC 3.4.24.51 ophiolysin、EC 3.4.24.52 trimerelysin I、EC 3.4.24.53 trimerelysin II、EC 3.4.24.54 mucrolysin、EC 3.4.24.55 pitrilysin、EC 3.4.24.56 insulysin、EC 3.4.24.57 O-sialoglycoprotein endopeptidase、EC 3.4.24.58 russellysin、EC 3.4.24.59 mitochondrial intermediate peptidase、EC 3.4.24.60 dactylysin、EC 3.4.24.61 nardilysin、EC 3.4.24.62 magnolysin、EC 3.4.24.63 meprin B、EC 3.4.24.64 mitochondrial processing peptidase、EC 3.4.24.65 macrophage elastase、EC 3.4.24.66 choriolysin L、EC 3.4.24.67 choriolysin H、EC 3.4.24.68 tentoxilysin、EC 3.4.24.69 bontoxilysin、EC 3.4.24.70 oligopeptidase A、EC 3.4.24.71 endothelin-converting enzyme、EC 3.4.24.72 fibrolase、EC 3.4.24.73 jararhagin、EC 3.4.24.74 fragilysin、EC 3.4.24.75 lysostaphin、EC 3.4.24.76 flavastacin、EC 3.4.24.77 snapalysin、EC 3.4.24.78 gpr endopeptidase、EC 3.4.24.79 pappalysin-1、EC 3.4.24.80 membrane-type matrix metalloproteinase-1、EC 3.4.24.81 ADAM10 endopeptidase、EC 3.4.24.82 ADAMTS-4 endopeptidase、EC 3.4.24.83 anthrax lethal factor endopeptidase、EC 3.4.24.84 Ste24 endopeptidase、EC 3.4.24.85 S2P endopeptidase、EC 3.4.24.86 ADAM 17 endopeptidase等が挙げられる。この中で、好ましくは、EC 3.4.21.62 subtilisinが挙げられる。該EC 3.4.21.62は、alcalase、alcalase 0.6L、alcalase 2.5L、ALK-enzyme、bacillopeptidase A、bacillopeptidase B、Bacillus subtilis alkaline proteinase、Bacillus subtilis alkaline proteinase bioprase、Bacillus subtilis carlsberg、bioprase、bioprase AL 15、bioprase APL 30、colistinase、esperase、genenase I、kazusase、maxatase、nagarase、nagarse、opticlean、orientase 10B、protease S、protease VIII、protease XXVII、protin A 3L、savinase、savinase 16.0L、savinase 32.0 L EX、savinase 4.0T、savinase 8.0L、SP 266、subtilisin、subtilisin A、subtilisin BL、subtilisin bpn'、subtilisin carlsberg、subtilisin DY、subtilisin E、subtilisin GX、subtilisin J、subtilisin NOVO、subtilisin S41、subtilisin Sendai、subtilopeptidase、subtilopeptidase A、subtilopeptidase B、subtilopeptidase bpn'、subtilopeptidase C、superase、thermoase、thermoase PC-10、Bacillus sp. 97001株が産生するペプチダーゼ等が含まれる。
【００２０】
本発明のペプチダーゼを産生する微生物は、クラゲを分解又は減容するペプチダーゼの生産能を有していればよく、好ましくは、Bacillus sp. 97001株であり、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにFERM P-20726として寄託している。本菌株の形態観察や、生理的性状試験等の結果を下記に示す。
【００２１】
【表１】
2007189906.tif 000002
【００２２】
表１の結果と、文献（「バージーズ・マニュアル・オブ・システマティク・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology）」 Vol.2 (1986) Williams & Wilkins及び「ザ・ジーナス・バチルス（The Genus Bacillus）」 (1973) U. S. Department of Agriculture」を参考にして、本菌株はBacillus sp. 97001株と命名した。
本発明の微生物は、天然又は人為的変異法等の育種によって得られた微生物菌株であってもよい。
【００２３】
本発明のペプチダーゼの製造方法は、培地に上記微生物を接種し、常法に従って培養すればよい。該培養に使用する培地中には、微生物が資化し得る炭素源及び窒素源を適当量含有せしめておくことが望ましい。この炭素源及び窒素源は特に制限されないが、例えば炭素源として可溶性澱粉、ガラクトース、グルコース、シュクロース、フラクトース、マルトース、マンニトール、マンノース、ラフィノースや資化し得る有機酸、例えばクエン酸等が挙げられる。また、窒素源としては、カザミノ酸、コーングルテンミール、コーンスティープリカー、ソイトン、ソイビーンミール、トリプトン、フーマメディア、ポリペプトン、酵母エキス、大豆粉、肉エキス、綿実油粕やカルチベータ等の有機窒素源が有効である。更に、カリウム塩、カルシウム塩、コバルト塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、リン酸塩等の無機塩や、必要であれば、無機又は有機微量栄養素やビタミン類を培地中に適宜添加することができる。培養温度は１０〜４５℃、特に３０℃前後が好ましく、ｐＨは６〜８、特に７前後が好ましく、この条件下において通常１〜５日間で培養が完了する。
【００２４】
本発明のペプチダーゼは、少なくともクラゲを分解又は減容可能な酵素であればよく、EC 3.4に分類されるペプチダーゼである。本発明のペプチダーゼは、菌体を含む培養液をそのまま用いてもよいし、培養液の濃縮物であってもよい。また、菌体の破砕物であってもよく、自己消化や界面活性剤による可溶化で得られる菌体抽出液であってもよい。本発明のペプチダーゼは、培養液及び／又は菌体抽出液から精製し、純化されたものであってもよい。当該純化の度合いは特に制限されるものではなく、適宜選択し用いればよい。本発明のペプチダーゼを純化するには、一般の酵素採取の手段に準じて行えばよい。例えば、本発明の微生物の培養完了後、該微生物を遠心分離又は濾過等の通常の分離手段により培養液から微生物を除去して粗酵素液を得る。さらに、該粗酵素液を本必要に応じて限外濾過若しくは塩析若しくは溶媒沈澱等の手段により回収し、本発明のペプチダーゼを取得すればよい。本発明のペプチダーゼは粉末化して使用してもよい。また、一般的な酵素精製の手段、例えば、陰イオン交換樹脂、陽イオン交換樹脂、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトによるクロマトグラフィー及びゲル濾過等を適宜組み合せることによって精製してもよい。
本発明のBacillus sp. 97001株由来のペプチダーゼは、エンドペプチダーゼに分類され、活性中心はセリン残基、分子量は約26,000、至適温度は55〜70度であり、至適温度は60℃付近で最大活性を示した。至適pHはpH7〜9であり、pH6〜9の範囲で安定である。阻害作用は、ジイソプロピルフルオロリン酸(DEP)、フェニルメタンスルホニルフルオリド(PMSF)、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、大豆トリプシンインヒビターである。
【００２５】
本発明のクラゲの分解用製剤は、少なくとも本発明のペプチダーゼを含有していればよく、例えば、本発明のペプチダーゼの製造工程中に得られる該粗酵素液をそのまま含有してもよいし、本発明のペプチダーゼを生産する微生物を含む培養液を含有してもよく、本発明のペプチダーゼの産生微生物を含有していてもよい。本発明のクラゲの分解用製剤は、少なくとも本発明のペプチダーゼを含有し、その他の配合、形状は特に制限されるものではない。例えば、安定化の目的でグリセロールなど多価アルコールを含有させたり、腐敗防止の目的で安息香酸ナトリウムを任意の割合で配合することが出来る。形状は、液状であっても、粉末であってもよく、粉末を顆粒状にすることも可能であるし、その他の基材を用いてペースト状にすることも可能である。
【００２６】
本発明のクラゲの分解方法は、本発明のペプチダーゼを使用しクラゲに作用させることで、該クラゲを分解又は減容すればよい。また、本発明のクラゲの分解方法は、クラゲの分解に際して、上記した培養液、培養液の上清、培養液の上清の濃縮物、培養液の上清から適当な程度精製して得た酵素、培養によって得られた本発明の微生物の菌体、培養によって得られた該微生物の菌体処理物等のいずれかを使用することが好ましく、該クラゲを分解又は減容する為の条件等に応じて適宜選択し使用することができる。例えば、以下のステップ(1)〜(3)を実行することによって行われる。
【００２７】
(1)  海水利用プラントの取水口又は漁業施設に襲来し、取水路に流入したクラゲを、適当な手段で分別採取し、
(2)  該クラゲを、必要に応じて、適当な手段で裁断及び／又は破砕等の前処理を行い、
(3)  該前処理済みクラゲを、適当な容器内で所定の時間、本発明の微生物が産生するペプチダーゼ若しくはその類似酵素と反応させ、クラゲの分解又は減容する。
【００２８】
本発明の分解方法のステップ(1)は、海水利用プラントの取水口又は漁業施設に襲来し、取水路に流入したクラゲが、適当な手段により分別採取される。このクラゲの分別採取の手段は常法により行えばよく、例えば襲来したクラゲを網、金属メッシュ若しくはスクリーンでトラップするなどが挙げられる。また、分別採取されたクラゲ自体が微生物により変敗することを防ぐ為にステップ(3)までの工程は、低温下での保存や作業することが好ましい。さらに、ステップ(3)までの経過時間はなるべく短くすることが好ましい。本発明の方法のステップ(1)において分別採取されたクラゲは、ステップ(2)において、必要に応じ、適当な手段により裁断及び／又は破砕等の前処理を施される。これは、ステップ(3)での反応の効率をより高くすることを目的としている。このクラゲの裁断及び／又は破砕等に使用する装置は、前記目的を達成でき、本発明のクラゲの分解を可能とする装置を使用すればよく、産業的に利用している裁断機、粉砕機等を適宜選択し使用すればよい。本発明の方法のステップ(2)において、必要に応じ、また、適当な裁断及び／又は破砕等の手段により、裁断及び／又は破砕等の処理をしたクラゲは、ステップ(3)において、適当な容器内で所定の時間、本発明のEC 3.4に分類されかつクラゲを分解しえるペプチダーゼ、好ましくは、Bacillus sp. 97001株が産生するペプチダーゼ若しくはその類似酵素と反応する。ステップ(3)においては、反応の効率を高く保つ為、反応系のｐＨ及び／又は温度を適切に制御することが好ましく、さらに、撹拌混合を行うことが望ましい。該撹拌混合に使用する装置は、本発明のクラゲの分解を可能とする装置を使用すればよく、産業的に利用している撹拌装置、反応タンク、ニーダー等を適宜選択して使用すればよい。本発明の分解方法のステップ(2)とステップ(3)を行う順序は特に限定されるものではなく、例えば、ステップ(2)とステップ(3)を同時に行ってもよい。上記するステップ(1)〜(3)を組み合わせることにより、分解又は減容したクラゲは、固形分が大幅に減少し、一般的な汚水と同様の形態となる。分解又は減容した該クラゲは、通常の生物的及び／又は化学的な汚水処理法によって処理することで、ＢＯＤ（生物化学的酸素要求量）及び／又はＣＯＤ（化学的酸素要求量）を低減させることができ、効率よく廃棄することが可能である。発電所等の海水利用プラントの取水口や、漁業施設に、襲来して大量の難処理廃棄物となったクラゲは、適切な手法が無く、該クラゲの最終処分が困難であったが、本発明の分解方法によることでこの課題を容易ならしむるものである。
【００２９】
本発明のクラゲの分解方法に際して、本発明のペプチダーゼは、１Kgの生きたクラゲを処理するのに際して、好ましくは、0.3〜72AUであり、より好ましくは10〜55AUであり、最適には25〜40AUであればよい。本発明で単位とするAUとはアンソン単位であり、ジメチルカゼイン法を用いて測定した蛋白質分解活性の単位を示す。
【００３０】
本発明のクラゲ分解装置は、本発明のクラゲの分解方法に関連し、処理すべきクラゲの量に応じた容器であって、ｐＨ及び／又は温度を適切に制御することが好ましく、さらに好ましくは接触効率を高め、分解速度を高く保つために攪拌装置が設置されていればよい。該ｐＨ及び／又は温度の適切な制御は、自動制御手段であっても、手動制御手段であってもよく、該制御装置としては制御手段に応じて適宜選択し設置できる。例えば、産業的に利用している各種の反応タンク、ニーダー等を使用し応用すればよい。
【００３１】
また、上記した本発明の分解方法は、そのまま、本発明のクラゲ分解産物の製造方法としても応用することができる。クラゲの固形分はコラーゲンを含むことから、本発明を応用することで、クラゲ由来コラーゲン及び／又はその分解物を含有するクラゲ分解産物を、効率よく製造できる。該クラゲ由来コラーゲン及び／又はその分解物を含有するクラゲ分解産物は、食品素材や化粧品素材等への応用が可能である。
【００３２】
本発明のクラゲ駆除方法は、海中に浮遊している及び／又は海中の物体に固着しているクラゲに対し、本発明のEC 3.4に分類されかつクラゲを分解しえるペプチダーゼ、好ましくは、Bacillus sp. 97001株が産生するペプチダーゼ若しくはその類似酵素を、海中に散布し、該クラゲと接触せしめればよい。本発明のクラゲ駆除方法は、本発明のペプチダーゼを使用することにより、クラゲの死体のみならず、生きたクラゲに対しても分解及び減容の効果が見られることから、海中にあっても実施可能である。本発明のペプチダーゼの使用量や形態等は、散布範囲、駆除するクラゲ量、散布方法、海水の流入量、海水温、塩分濃度等に応じて、適宜選択し使用すればよく、特に制限されず、実際に生きたクラゲを分解しさらには駆除することが可能である。
【００３３】
本発明の方法において、クラゲの分解及び減容の対象となる施設は、海水利用プラントである。海水利用プラントは、取水口から海水を取水してそれを利用するプラントであれば特に限定されないが、例えば、火力発電所、原子力発電所、液化天然ガスの再気化施設、漁業施設等が挙げられる。
【実施例】
【００３４】
以下に実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３５】
［実施例１．  Bacillus sp. 97001株の培養］
バチルス培地（酵母エキス（０．４％）、ポリペプトン（０．８％）、塩化ナトリウム（０．２％）：水酸化ナトリウム溶液にてｐＨ７．２に調整）をそれぞれ試験管４本に分注し、１２１℃で２０分間殺菌して冷却したのち、Bacillus sp. 97001株を一白金耳ずつ接種し、３０℃で１８時間振盪培養して、種培養液を調製した。２Ｌ容量の培養フラスコ４本に、上記バチルス培地４００ｍｌをそれぞれ分注し、これを１２１℃で２０分間殺菌して冷却したのち、上記の種培養液１６ｍｌ（試験管４本分）を各フラスコに４ｍｌずつ接種し、３０℃で１８時間振とう培養して、前培養液とした。ついで、上記と同様の組成からなる培地に消泡剤０．０１％（Ｗ／Ｖ）を添加した培地１６０Ｌを２００Ｌ容量のジャーファーメンターに入れ、１２１℃で２０分間殺菌して冷却したのち、上記の前培養液１．６Ｌを接種し、３０℃で１８時間、通気攪拌培養した。培養終了後、菌体と培養上清を分別した。
【００３６】
[実施例２．  Bacillus sp. 97001株由来ペプチダーゼの調製]
実施例１で得た培養上清を、膜ろ過装置（分画分子量10,000）を用いて４℃で濃縮し、次に同装置で液組成をリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７）に置換し、ペプチダーゼ溶液４Ｌを得た。得られたペプチダーゼの分子量は約26,000であった。定法に従い至適温度を測定したところ、60℃付近で最大活性を示した。また、pH6-9の範囲で安定であった。
【００３７】
[実施例３．  Bacillus sp. 97001株由来ペプチダーゼによるミズクラゲの分解]
実施例２で得たペプチダーゼ溶液１００ｍＬと、リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７）１００ｍＬとを混和し、これに生きたミズクラゲ（傘の直径  約４．５ｃｍ）１匹を入れ、３０℃で静置し、目視観察した。その結果、約６時間でミズクラゲは完全に分解され、形態が消失し減容した。
また、前記方法のミズクラゲ生体の代りに、ミズクラゲを約２ｃｍ角に裁断したものを使用した以外は前記方法と同一条件で実験を行ったところ、約２時間で裁断したミズクラゲは完全に分解され、形態が消失した結果減容した。
【００３８】
なお、対照区として、実施例２で得たペプチダーゼ溶液とリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７）とを混和した溶液を１２１℃、３０分のオートクレーブ処理による酵素失活させた混和溶液を使用した以外は同一条件で行った。該対照区では、ミズクラゲは分解されなかった。
【００３９】
[実施例４．  Bacillus sp. 97001株由来ペプチダーゼによるエチゼンクラゲの分解]
実施例２で得たペプチダーゼ溶液１００ｍＬと、リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７）１００ｍＬとを混和し、これをエチゼンクラゲ生体の切り身（２０ｃｍ×１５ｃｍ×３ｃｍ）に掛け、４５℃で静置し、目視観察した。その結果、約５時間でエチゼンクラゲは完全に分解され、形態が消失した結果減容した。
また、前記方法のエチゼンクラゲの切り身の代りに、エチゼンクラゲを約２ｃｍ角に裁断したもものを使用した以外は前記方法と同一条件で実験を行ったところ、約０．５時間でエチゼンクラゲは完全に分解され、形態が消失した結果減容した。
【００４０】
なお、対照区は、実施例２で得たペプチダーゼ溶液とリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７）とを混和した溶液を１２１℃、３０分のオートクレーブ処理による酵素失活させた混和溶液を使用した以外は前述の方法と同一条件で行った。該対照区では、エチゼンクラゲは分解されなかった。
【００４１】
[実施例５．  Bacillus sp. 97001株由来ペプチダーゼと他の酵素の比較]
クラゲ分解酵素として、実施例２で得たペプチダーゼ溶液、市販酵素10種類（市販品A, B, C, D, E, F, G, H, I ,J）を使用し、ミズクラゲ及びエチゼンクラゲの生体の切り身を各々２ｃｍ角に裁断した以外は、実施例4と同一の条件で行った。この際に、各酵素の使用量は、該酵素のタンパク量に基づいて揃え、50mgで行った。その表方法を表３に、その結果を表２に示した。
【００４２】
その結果、実施例2で得た、本発明のBacillus sp. 97001株由来ペプチダーゼによるミズクラゲ及びエチゼンクラゲの反応結果は、ミズクラゲを約２時間、エチゼンクラゲを約０．５時間で完全に分解した。他の市販酵素を使用した場合は、全く分解されないか若しくは１２時間以上かけて分解した。本発明のペプチダーゼを使用することで、クラゲをより効率に分解し及び減容できることが示された。
【００４３】
【表２】
2007189906.tif 000003
【００４４】
【表３】
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