(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｔ細胞免疫応答を原因とする疾患の治療および防止剤の提供。【解決手段】自己免疫疾患、アレルギー又はアトピー失調、及び移植片拒絶を治療又は防止するための方法であり、影響を受けていない集団における他のT リンパ球の大部分をそのままにしながら、T リンパ球の特定のサブ集団を殺すため、T リンパ球のサブ集団は、インターロイキン-4の投与と共にその免疫応答と関連する抗原を投与し、これにより免疫応答に関連するＴ細胞を取り除くことを含む方法。抗原として、ペプチドやミエリン塩基性タンパク質を用いることができる。【選択図】図３
2007077164.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト又は動物においてT 細胞免疫応答を阻害する方法であって、インターロイキン-4の投与と共に、その免疫応答と関連する抗原を反復して投与し、それにより、その免疫応答に関連するT 細胞を取り除くことを含んで成る方法。
【請求項２】
T 細胞免疫応答が自己免疫疾患に関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
自己免疫疾患が多発性硬化症である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
自己免疫疾患が自己免疫ブドウ膜炎である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
抗原が約24〜約72時間の間隔で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
抗原がペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
抗原がミエリン塩基性タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ペプチドが約10〜約100 μg の間の投与量において投与される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
インターロイキン-4が、抗原が投与された約12〜約72時間後に投与される、請求項1 に記載の方法。
【請求項１０】
インターロイキン-4が非経口的に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
インターロイキン-4が約48〜約72時間の間にわたり、連続注入を介して投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
サンプル中のT 細胞の前選択されたサブ集団を削除する方法であって、T 細胞により認識される抗原及びインターロイキン-4とそのサンプルとを接触させることを含んで成る方法。
【請求項１３】
抗原が自己免疫疾患に関連する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
自己免疫疾患が多発性硬化症である、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第一にT 細胞免疫応答を原因とする疾患の治療及び防止に関する。特に、本発明は、インターロイキン-4(IL-4)及び関連特異的抗原による治療により特定の自己免疫疾患、移植片拒絶、及びアレルギー性失調を抑制又は除去し、これにより、この特異的抗原を認識するT 細胞のサブ集団だけを殺すことを可能にすることに関する。このやり方において、IL-4前処理がT 細胞を感作し、T 細胞レセプタ結合後にプログラムされた細胞死を経験させる。
【背景技術】
【０００２】
アポプトシス(apoptosis) は、多数の生物学的系において生じるプログラムされた細胞死の形態である(非特許文献1-5) 。アポプトシス細胞は、それ自体の自己破壊に帰される活性代謝に依存する事件の特定のプログラムを経験する。明確な形態学的変化がこの過程、例えば、膜消滅(blobbing)並びに細胞質及び核の凝集の間に生じる。これらの変化は、1 〜数個のヌクレオソームを構成する片へのゲノムDNA の断片化により達成される。最終段階において、細胞は、隣の細胞により特異的に認識され且つ食菌(phagocytozed)されるアポプトシス体に崩壊される。
【０００３】
T リンパ球は、それらの寿命内の多数点において様々な刺激により誘導されるアポプトシス細胞死に感受性である。実験的証拠は、プログラムされた細胞死が正常にはそのT 細胞レパートリーを形作り且つ維持することにおいて多くの役割を演じるということを強く示唆している。このレパートリーは、その生物内のT リンパ球の完全プール内に含まれる個々の抗原レセプタの特異性の数により定められる。それぞれのT リンパ球は、その細胞上の同一構造の全てであり、そしてそれ故に単一の抗原特異性を提示すると言われる抗原のための表面レセプタを担持する。それぞれのT 細胞がユニークな特異性をもつため、生物内の抗原特異性の全コレクションは異なる個々のT 細胞の合計であり、これ故、T 細胞レパートリーが存在する。個々のT 細胞の数を削除し又は増加させることにより、特定の抗原への生物の応答性がそれぞれ削減されるか又は強化されるかのいずれかである。これらの変化が生じることは記載されており、そしてT 細胞レパートリーにおける変化として知られている。このT細胞レパートリーにおける変化は、胸腺細胞( 又は未成熟T 細胞)の小フラクションだけが、その発生T 細胞のその周辺循環への移動を許容する胸腺内発生及び選択事件から生き延びるようなT 細胞発生の間に自然に生じる(非特許文献6,7) 。胸腺細胞のほとんどは、それらが特定のレセプタを担持しているために、その胸腺内でアポプトシス細胞死を経験するようである。このT 細胞レパートリーのこの" 編集(editing)"は、2 つの過程の結果であると考えられる: 陽性選択の欠如、及び陰性選択又はクローンの欠失。後者は、自己耐性の確立に基本的なものである。なぜなら、潜在的に自己反応性のレセプタを発現する細胞が活性に削除されるからである。胎児胸腺臓器培養(非特許文献8) 、インビボにおける(非特許文献9) 、及びインビトロにおける(非特許文献10,11) 実験は、二重溶液(CD4＋  ,CD8＋  ) 胸腺細胞が、より成熟した単一陽性細胞よりもT 細胞レセプタ占有により誘導されたアポプトシス死により感受性であるようであるということを示している。これらの二重陽性細胞は、グルココルチコイドにより誘導されたプログラムされた細胞死にも感受性である(非特許文献12)。
【０００４】
形質転換されたT 細胞は、T 細胞について正常には分裂促進性 (mmitogenic)である刺激からの活性化- 誘導死を経験する(非特許文献13-19) 。これらは、抗原、抗-TCR又はCD3 mAb 結合、ホルボール・エステルとCa２＋イオン透過担体との組み合わせ、並びに他の活性化分子Thy-1及びLy-6のmAb 調節を、含む。これらの細胞は、グルココルチコイド- 誘導アポプトシスにも感受性である。活性化- 及びグルココルチコイド- 誘導プログラム細胞死の過程は、形質転換されたT 細胞において相互に拮抗的である(非特許文献20-22) 。
【０００５】
成熟T 細胞は、様々な刺激への応答におけるアポプトシス、例えば、生育能力のためにIL-2を必要とする細胞の場合におけるIL-2派生(非特許文献23)、及びこのAPO-1 mAb によるFas 抗原の調節(非特許文献24,25) を経験することが示されている。さらに、IL-2が、インビイトロ及びインビボの両方において抗原レセプタ刺激への応答におけるアポプトシスを経験するために成熟T リンパ球をプログラムしていることが最近証明された(非特許文献26)。T 細胞は、アポプトシスのためのT 細胞レセプタ刺激が生じる前にIL-2の影響下になければならず、そして細胞死の量は、IL-2の増加量により上昇する。この過程は、傍観細胞によらず、それらの特異的抗原レセプタにより引き金を引かれた刺激T細胞だけが細胞死を経験するように、選択的である。propriocidal調節と言われるこの見かけのフィードバック経路は、T 細胞応答が調節される機構を提示することができる(非特許文献26)。
【０００６】
インターロイキン-4(IL-4)がT リンパ球をプログラムされた細胞死、又はアポプトシスに傾かせるという発見は、IL-4- 応答性T 細胞の作用により第一に引き起こされるヒト及び動物における疾患過程における治療的妨害の新規の方法を与える(非特許文献27)。本質において、これは、実質的に影響を受けないT リンパ球の大部分を残しながら、疾患を引き起こすことができるT リンパ球のサブ集団の死を特異的に誘導することを含む。本妨害方法は、T リンパ球の一般的な抑制又は死を引き起こす最近使用されている治療方法とは対照的であり、そして潜在的にそれよりかなり優れている。広く使用される一般的な免疫抑制剤の例は、コルチコステロイド、例えば、プレドニゾンであって自己免疫疾患及びアレルギー症状の治療のために使用されるもの、及びシクロスポリンA であって移植片拒絶の治療のために使用されるものである(非特許文献28)。これらの治療は、全体ではなく大部分のT 細胞レパートリーを衰弱させることにより免疫防御をかなり無防備とする欠点に苦しんでいる。これは、患者を感染性疾患に無防備にする。本方法の2 つの主要要素は: i)疾患を引き起こす抗原と反応するT 細胞のサブセットだけがその治療により影響を受け; そしてii) その治療により影響を受けたT 細胞が殺される、すなわち、それらがそのレパートリーから永久に除去される、ことである。
【０００７】
幾つかの一般的な原理が本過程の下にある。T 細胞は、体全体にある抗原- 提示細胞の表面上の主要組織適合複合体(MHC) との非共有結合性複合体を形成する短いペプチドの形態における抗原を認識する(非特許文献29)。抗原は、多糖類、有機分子、又は核酸の形態を呈することもできる。それぞれのT 細胞は、特異的抗原-MHC複合体を認識することができるT 細胞レセプタ(TCR) といわれるユニーク抗原レセプタを担持する。このTCR タンパク質- コーディング・セグメントを含む遺伝子セグメントの再編成を通して、様々なTCRsの広大な列、おそらく事実上無限の数の組み合わせが生成される(非特許文献30)。" 対立遺伝子排除" といわれる機構により、それぞれのT 細胞は単一のユニークTCR を担持する。このT 細胞レパートリーは、それ故、特異的抗原-MHC複合体を認識する別個のTCR をそれぞれにもつ多数のT 細胞である。この広大な列のT 細胞は、微生物、腫瘍細胞、及び異種移植片の侵入に対する抗原構造の多様性に対する免疫学的応答を許容し、これ故その生物の完全性を保存する。
【０００８】
ほとんどの抗原は、T 細胞レパートリーの非常に小さなフラクションだけにおける応答を顕出することができる(非特許文献31)。例えば、タンパク質抗原への最初の応答は、1000中の1 〜10,000中の1 のT リンパ球と同程度の低さを含むことができる(非特許文献32)。この理由のために、T 細胞反応性により引き起こされた疾患は、T 細胞の大きなレパートリーの小さいサブセットだけにより仲介される(非特許文献33)。特に、それが直接的に測定される場合において、例えば、多発性硬化症においては、疾患を仲介物質するT 細胞レパートリーのフラクションはかなり小さい(非特許文献33)。疾患に参加するT 細胞サブセットの重要な特徴は、それが、その疾患を誘発する抗原を特異的に認識するT 細胞を含むということである。アレルギー症状においては、抗原は、炎症応答分子の放出を引き起こす。例えば、" ヘルパー"T細胞は、リンホカイン、例えば、B 細胞が炎症性抗体IgE を産生することを引き起こすIL-4を分泌する。自己免疫疾患においては、抗原は、その体内の特定の臓器から得られることができ、そしてT 細胞のサブセットにより認識されるとき、そのT 細胞を刺激してその臓器を攻撃させる。同様の効果が移植片拒絶の間に生じる。移植された臓器内の抗原タンパク質は、その移植された組織を攻撃するT 細胞のサブセットにおいて応答を喚起する。未知の理由のために、外来又は" アロ(allo)"組織を認識するT 細胞のフラクションは、典型的にはタンパク質抗原を認識するであろう数よりもかなり高い。しかしながら、応答T細胞の数は、未だ、そのT 細胞レパートリー全体の明確な少数(1-10%)である(非特許文献34)。
【０００９】
特異的抗原-MHC複合体に対する典型的なT 細胞応答においては、TCR の刺激(非特許文献35)は、遺伝子活性化事件のカスケードをもたらす。これらは、その分子レベルにおいて広く特徴付けされ、そして2 つのこのような活性化事件: i)成長リンホカイン、例えば、IL-4の生産及びii)IL4についての高- アフィニティー・レセプタを構成する細胞表面タンパク質の発現、が、特に、本発明に密接な関係がある。残りのT 細胞は少数の高アフィニティーIL-4レセプタを発現し; この数は活性化の後に増加する(非特許文献36)。IL-4は、適切な高アフィニティー・レセプタを担持するT 細胞の分裂を引き起こす15,000ダルトン・タンパク質である(非特許文献37,38) 。IL-4の生産、その後のそのレセプタとのその相互作用は、そのT 細胞をその細胞サイクルに駆動する自己分泌(autocrine) 機構を引き起こす。これは、抗原と特異的に反応性であるT 細胞の最初の増加を導く。現在、ヒト及びネズミの両方の免疫系において、CD4 ＋  T Ｈ  2 細胞といわれるT リンパ球のサブクラスが、IL-4を生産し且つ応答することにより抗原活性化後に増殖することができるという証拠が示されている(非特許文献39)。このサブセットは、B 細胞が、免疫グロブリン(Ig)を生産することを刺激することにおいて重要且つおそらくユニークな役割を演じている(非特許文献40)。この理由は、IL-4並びにT Ｈ  2 細胞により生産された他のリンホカイン、例えば、IL-5及びIL-6が、Ig生産に不可欠であるB 細胞の分化因子として作用するからである。それ故、Igが病原的役割を演じる自己免疫疾患においては、CD4 ＋  T Ｈ  2 リンパ球の削減は、疾患を停止させるための高く有効な方法を提示する。我々の結果及び他者の結果(非特許文献27,40-43)は、遅延型過敏症を仲介するCD4 ＋  T Ｈ  1 型リンパ球を含むT 細胞の他のクラス並びに細胞毒性を仲介するCD8 ＋  細胞も、IL-4に応答して増殖するであろうし、そしてTCR 誘導アポプトシスの素因となある。それ故、IL-4は、免疫応答の間T 細胞成長において潜在的に広い役割をもつ。従って、IL-4は、それらをアポプトシスに傾かせるためにT 細胞の様々なクラスにおいて広く活性であることができよう。本発明の発見は、IL-4が、ヒト又はマウスのいずれかのT 細胞の拡張プールをアポプトシスに又はそれらが再び刺激され又はTCR を通して再挑戦される場合にプログラムされた細胞死に傾かせる驚くべき効果をももつということを示す(非特許文献27)。前記の本研究において、T 細胞内で達成されたアポプトシスの程度は、IL-4のレベル。それらの最初の拡張の間の細胞経験、再挑戦の間のTCR 刺激の強さ、及びその再挑戦のタイミングの全てと、正の相関をもつ。リンホカイン- 素因アポプトシスにおいて、その効果は、リンホカインがもはや存在しなくなった2-3 日後に消滅し、これ故、再挑戦は、この期間内で起らなけらばならない(非特許文献44)。活性化合物及びアポプトシスの過程は、最終的に、そのT 細胞レパートリーの抗原- 反応性サブセットを消費する。
【００１０】
アポプトシスは、T 細胞の核が縮み、その遺伝子材料(DNA) が漸進的に分解し、そしてその細胞が崩壊するような、プログラムされた細胞死のタイプである(非特許文献1-5) 。細胞がアポプトシスから回復されることができず、そしてそれが不可逆的な殺しをもたらすという証拠が示唆されている(非特許文献1-5) 。アポプトシスを経験しないが、活性化されるようになったT 細胞は、細胞溶解を引き起こすことにより、又はB 細胞応答又は他の免疫効果を引き起こすリンホカインを分泌することにより、それらの" エフェクター(effector)" 作用を行うであろう(非特許文献45)。これらの" エフェクター" 作用は、自己免疫及びアレルギー性疾患又は移植片拒絶における組織損傷の原因である。疾患を回避するための強力なアプローチは、それ故、そのT 細胞レパートリーの大部分を無傷に残しながら、疾患刺激抗原と反応性であるこれらのT 細胞だけをアポプトシスにより永久的に削除することであろう。抗原刺激により引き起こされたアポプトシス及びT 細胞欠失は、モデル系において証明されているが、この現象についての機構が先に知られていないために、これを治療的に有効な方法で使用することが不可能であった(非特許文献46-50) 。
【００１１】
自己免疫疾患又は移植片拒絶を導く抗原( 単数又は複数) による免疫感作による適切なサイクルにおけるTCR 刺激によりT 細胞を死に傾かせる剤としてIL-4を使用することにより、疾患原因のT 細胞の死を呼び出すことができる。特定の方法を、i)同定されたタンパク質抗原及びIL-4による自己免疫又はアレルギー性疾患の治療、及びii) 血液細胞抗原及びIL-4による移植片拒絶の治療、のために、記載する。論理学的展開により、このような方法を、特異的抗原により活性化されたT 細胞の効果から生じたヒト又は動物の他の疾患のために、さらに発展させることができる。免疫応答の広大な大部分がT 細胞活性化に依存するため、この形態の治療を、特に抗体産生が関係する場合に多種多様な自己免疫及びアレルギー性症状に適用することができるであろう(非特許文献51,52) 。
【００１２】
幾つかのヒト自己免疫疾患において、抗原活性化T 細胞が疾患を作り出すことにおいて主要な役割を演じるというデータが示された。これらは、これに限定されないが: 1)多発性硬化症(非特許文献53-58); 2) ブドウ膜炎(非特許文献59,60); 3) 関節炎(非特許文献61-63); 4)I型( インシュリン依存性)糖尿病(非特許文献64,65); 5) 橋本及びGrave 甲状腺炎(非特許文献66-68);及び6)自己免疫心筋炎(非特許文献69)を含む。ヒト実験についての倫理的制限は、T 反応性がこれらの疾患の唯一の刺激剤であることを証明することを非常に困難にしている。しかしながら、動物モデルに対する実験的研究の大きな部分--とりわけ、多発性硬化症のためのモデルとしてのネズミの実験的アレルギー性脳炎(非特許文献70,71) 、ヒト糖尿病のためのBB糖尿病ラット(非特許文献72,73) 、リウマチ様関節炎のためのネズミ・コラーゲン-誘導関節炎(非特許文献74,75) 、及びヒト自己免疫ブドウ膜炎のためのラット及びギニア・ブタにおけるS 抗原疾患(非特許文献76,77) --は、T 細胞がこれらの疾患の決定的な剤であることを示唆している。最近の研究から、疾患を引き起こすタンパク質又はペプチド抗原の同定がされつつある: i)多発性硬化症: ミエリン塩基性タンパク質(MBP) 残基84-102及び143-168 のペプチド・エピトープ(非特許文献54,57,58,78); ii)自己免疫ブドウ膜炎: 最近分子クローニングされたヒトS 抗原(非特許文献59,79); iii)リウマチ様関節炎におけるII型コラーゲン(非特許文献80); 及びiv) 甲状腺炎におけるサイログロブリン(非特許文献81)。同様に、多種多様なタンパク質であって、一般的なアレルギーについての重要な免疫学的反応であるアレルギー性免疫グロブリンIgE の産生を刺激するもの、が同定された。IgE は、"T細胞ヘルプ" として知られる抗原- 活性化T 細胞により生産されたリンホカインを必要とする過程においてB リンパ球により産生される。B 細胞を刺激するCD4 ＋  " ヘルパー"T細胞(TＨ  2 細胞) のクラスは、典型的にIL-4を生産し且つこれに応答する(非特許文献39,40) 。
【００１３】
本治療的アプローチの基本的概念は、非常に単純である。疾患を引き起こすT 細胞を免疫感作により最初に挑戦させて、その活性化されたT 細胞が高アフィニティーIL-4レセプタを発現することを、そしてT Ｈ  2 細胞がIL-4を生産且つ分泌開始することを引き起す。細胞が高レベルのIL-4レセプタを発現しているとき、追加のヒトIL-4を輸注し、活性化細胞のすべてをその細胞サイクルに非常に効率的に駆動する。次に、IL-4の影響下の細胞を、抗原性ペプチド又はタンパク質による再免疫感作によりアポプロシスを経験せしめる。さらに、抗原が十分なIL-4生産を刺激することができる場合に、外因性IL-4を投与することは必要でないかもしれない。いずれの場合においても、再挑戦のタイミングは重要であり--それは、短い間隔、例えば、細胞が高レベルのIL-4レセプタを担持し、そして外因性又は内因性IL-4に応答するとき、最初の刺激の2-3 日後に、起こらなければならない。
【００１４】
本方法の下にある進歩的発見により提供される概念的利点は、T細胞の免疫性が抗原- 特異的T リンパ球の生産と破壊の間のバランスとして働くということである。先に、研究者は、T リンパ球の増殖及び応答性を増加させるためのリンホカイン成長因子、例えば、IL-4の使用に焦点を当てた(非特許文献38,43,82-86) 。反対のT 細胞機構が治療的に使用されるとができることが目下提案されている。IL-4がT細胞を死に傾かせるという発見は、IL-4の先に理解された特性に反し、そしてT 細胞反応性により引き起こされる疾患の治療への全く新しいアプローチを提供する。本発明の発見の基礎を内科医及び医学研究者に提供することにより、T 細胞破壊を導く免疫自己調節の方法を疾患との戦いにおいて開拓することができる。
【００１５】
従来の活性化及びリンホカインの生産がインビボ及びインビトロの両方において免疫応答性を減少させることができたということがときどき従来にも知られていた(非特許文献46-48) 。これらの効果の下にある機構は理解されていない。IL-4がT リンパ球を抗原- 依存性アポプロシスに傾かせるという知識がないため、この現象を医学又は治療目的のために操作することができなかった。現在、本明細書中に提供されたガイダンスに従って所定の疾患のための治療サイクルを日常的に最適化するために、疾病素因期におけるIL-4の、及びアポプロシス期における抗原の動態及び投与量要求について熱心に研究することができる。
【００１６】
本法がIL-4の新規の特性の発見に基くということ、特に、めでたいことである。IL-4は1982年におけるその発見以降十分に研究されてきた(非特許文献84,85) 。それは、遺伝子的によく理解されていおり、そのcDNA及び遺伝子が分子クローニグされ、そして免疫検定のためのそのタンパク質に対する抗体が調製されてきた(非特許文献86,87) 。IL-4はヒトにおける使用のための形態において医薬として既に入手可能であり、そしてヒト癌犠牲者における研究がIL-4が様々な投与量においてヒトの生理学にどのように影響を与えるかについて洞察を与えた(非特許文献88-91) 。これらの特徴のすべてが、ヒト及び他の哺乳類における多種多様な疾患の治療のために、疾患により引き起こされるT リンパ球の自己破壊を引き起こすためのその新規の用途の実行可能性をかなり強化する。
【００１７】
【非特許文献１】Kerr, J.F.R, and B.V. Harmon. 1991. アポプトシスの定義及び発生：歴史的展望。In Apoptosis:the molecular basis of cell death, L.D. Tomei and F.O. Cope, ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York, p. 5.
【非特許文献２】Lockshin, R.A., and Z. Zakeri. 1991. プログラムされた細胞死及びアポプトシス。In Apoptosis:the molecular basis of cell death, L.D. Tomei and F.O. Cope, ed., Cold Spring Harbor Press, Plainview, New York, p. 47.
【非特許文献３】Cohen, J.J., R.C. Duke, V.A. Fadok, and K.S. Sellins. 1992. 免疫におけるアポプトシス及びプログラムされた細胞死。 Ann. Rev. Immunol. 10:267.
【非特許文献４】Duvall, E. and A.H. Wyllie. 1986. 死及び細胞死。 Immunology Today 7:115.
【非特許文献５】Cotter, T.G., S.V. Lennon, J.G. Glynn, and S.J. Martin. 1990. アポプトシスを介しての細胞死及び生長に対するその関係。腫瘍及び正常細胞の両方の発達及び分化。Anticancer Research 10:1153.
【非特許文献６】von Boehmer, H. 1988. Ｔリンパ球の発展的生物学。Ann. Rev. Immunol. 6:309.
【非特許文献７】Marrack, P., and J. Kappler, 1987. Ｔ細胞レセプタ。 Science 238:1073.
【非特許文献８】Smith, C.A., G.T. Williams, R. Kingston, E.J. Jenkinson,and J.J.T. Owen. 1989. Nature 337:181.
【非特許文献９】Shi, Y., R.P. Bissonnette, N. Parfrey, M. Szalay, R.T. Kubo, and D.R. Green. 1991. CD3 T細胞レセプタに対するモノクロナール抗体のインビボにおける投与は、未成熟胸腺細胞において細胞死（アポプトシス）を引き起こす。J. Immunol. 146:3340.
【非特許文献１０】McConkey, D.J., P. Hartzell, J.F. Amador-Perez, S. Orrenius, and M. Jondal. 1989. CD3/T細胞を介しての刺激による未成熟胸腺細胞のカルシウム依存性殺し。J. Immunol. 143:1801.
【非特許文献１１】Nieto, M.A., A. Gonzalez, A. Lopez-Rivas, F. Diaz-Espada, and F. Gambon. 1990. IL-2が、ヒト骨髄胸腺細胞における抗-CD3- 誘導細胞死に対して保護する。J. Immunol. 145:1364.
【非特許文献１２】Wyllie, A.H. 1980. グルココルチコイド誘導胸腺アポプトシスは、内因性エンドヌクレアーゼ活性に関係する。Nature 284:555.
【非特許文献１３】Ashwell, J.D., R.E. Cunningham, P.D. Noguchi, and D. Hernandez. 1987. 抗原による活性化に対するＴ細胞ハイブリドーマの細胞生長サイクル・ブロック。J. Exp. Med. 165:173.
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【非特許文献１５】Ucker, D.S., J.D. Ashwell, and G. Nickas. 1989, 活性化駆動Ｔ細胞死。1.新たな転写及び翻訳についての要求及びゲノム断片化との関係。J. Immunol. 143:3461.
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【非特許文献２２】Iwata, M., S. Hanaoka, and K. Sato. 1991. Ｔ細胞レセプタ/CD3複合体を介する刺激によるグルココルチコイド誘導アポプトシスからの胸腺細胞及びＴ細胞ハイブリドーマの救済：Ｔ細胞レパートリーの陽性選択についての可能性のあるインビトロ・モデル。 Eur. J. Immunol. 21:643.
【非特許文献２３】Duke, R.C. and J.J. Cohen. 1986. IL-2 傾倒：生長因子の取下げが、独立Ｔ細胞における自殺プログラムを活性化する。 Lymphokine Research 5:289.
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【発明の開示】
【００１８】
発明の要約
本発明は、IL-4が抗原- 駆動死について成熟T 細胞をプログラムするという発見から生じた。IL-4によりその後の抗原刺激により引き起こされるT 細胞の死は、" プログラムされた細胞死" 又はアポプロシスの、顕著な特徴(hallmarks) 、例えば、DNA 断片化をもつ。従って、IL-4は、それらの抗原レセプタを通して特異的に刺激されたT 細胞だけの消滅の引き金を引く死サイトカイン(death cytokine)として作用する。それ故、本発明は、胸腺内の陰性選択が特定の抗原特異性をもつT 細胞を削減するのとほとんど同一の方法でT 細胞レパートリーを変更する能力を与える。IL-4の先に発見されていない特性のこの新規の使用は、抗原レセプタ担持T 細胞の特定のクラスの特異的削減を許容し、IL-4の新たな臨床的用途のための基礎を形成するであろう。
【００１９】
IL-4は、B リンパ球の成長を引き起こすことを元来発見されたTリンパ球により生産されるリンホカインである(85)。その後、この分子が、B 細胞に対する多面的(pleiotropic) 活性、例えば、MHCクラスII分子の増加表面発現、上昇免疫グロブリン分泌並びにクラス・スイッチング及びFcεレセプタの存在の誘導をもつことが発見された(93)。最も重要なことは、IL-4がCD4 ＋  及びCD8 ＋  T 細胞の両方に対して強力な効果をもっていた(37-43) 。IL-4は、移植片拒絶に関連する細胞溶解性T 細胞の活性を強く増強した(42)。また、IL-4は、有効なT 細胞成長因子である(37,38,43)。ヘルパーT リンパ球の中で、IL-4は、抗原刺激に応答してIL-4を生産し、そして抗体応答に載せられたB 細胞をヘルプするT Ｈ  2 細胞の成長を促進する(40)。
【００２０】
T リンパ球増殖又はプログラムされた細胞死の間の選択の臨界的な決定要素は、IL-4へのこれらの細胞のを前もって晒すことである。IL-4に晒されないT 細胞における抗原レセプタ刺激は、正常の活性化を引き起こし、リンホカイン生産及び成長を導く。これに反し、IL-4に前もって晒されたT 細胞は、抗原レセプタ刺激の後にアポプトシスを経験する。それ故、IL-4の直後の影響下にある抗原- 活性化T 細胞は、アポプトシスの経験により抗原による再挑戦に応答するであろう。このタイミングは重要である。なぜなら、その細胞がIL-4の影響下にもはやない場合、例えば、IL-4が除去され、そしてそのT 細胞がそれらの休止状態に戻される場合、その後の抗原刺激が、アポプトシスよりもむしろ成長を引き起こすからである。
【００２１】
IL-4の新規の特性についての少なくとも3 の用途が具体化されることができる。
第一に、自己免疫疾患に関係する抗原から得られたペプチドの注入がこのような疾患の重度の軽減を導くということを示す発見の出現セットが存在する(94 参照) 。自己免疫疾患の実験的アレルギー性脳炎(EAE) の様々な研究は、それがミエリン塩基性タンパク質(MBP) による免疫感作によるT 細胞の活性化により引き起こされるということを示す。興味深いことに、その疾患を生成するT 細胞を刺激するMBP 配列から得られたペプチドの注入がその疾患のブロッキングにおいて有効である(71)。本明細書中に開示する発見は、これらの一見して矛盾する観察についての説明を提供する。これは、T 細胞が活性化され、そしてペプチド注入の間にIL-4により潜在的に刺激され、そして次にそれらがMBP 抗原により再刺激されるときアポプトシスを経験するということである。ペプチド抗原により活性化されたT 細胞と関連してきたヒト疾患は、多発性硬化症及び自己免疫ブドウ膜炎を含む(78,80) 。これらの疾患、及び、例えば、全身性紅斑性狼瘡、全身性血管炎、多発性筋炎- 皮膚筋炎、全身性硬化症( 硬皮症) 、ショーグレン(Sjogren's) 症候群、硬直性脊椎炎及び関連脊椎関節症、リウマチ様熱、過敏性肺炎、アレルギー性気管支肺炎アスペルギルス症、無機ダストじん肺症、類肉腫症、自己免疫性溶血性貧血、免疫学的血小板失調、寒冷症、例えば、寒冷フィブリノーゲン血症、自己免疫多内分泌障害、及び重症筋無力症が、その疾患の原因であるT 細胞のアポプトシスを引き起こすためのIL-4及びその関連ペプチドを使用して原理的方法において潜在的に調節されることが目下可能である治療によりアプローチされることができる。すべてのT 細胞がIL-4を生産し且つこれに応答する傾向をもちはしない。しかしながら、IL-4を生産し且つこれに応答するT リンパ球のT Ｈ  2 クラスは、抗体の産生に関係する免疫学的応答のための" ヘルパー" 細胞として決定的である。先に述べた自己免疫疾患の多くは、( 重症筋無力症におけるように) 病因に直接的に通ずる又は( 全身性狼瘡におけるように) 免疫複合体により病因に間接的に通ずる抗体成分をもつ(51)。それ故、T Ｈ  2"ヘルパー"細胞は、これらの疾患のかなりの改善又は治癒を提供することができる。アポプトシスのためにIL-4に応答するT 細胞の集団を標的とすることにより、本発明は、IL-2がT 細胞をアポプトシスに傾かせるという先の発見をかなり進展させる(26)。IL-4注入に適当な時間又は反復免疫感作スケジュールは、その注入されたペプチドの保護効果を実質的に増大させる。
【００２２】
第二に、外来組織による移植に先立って動物又はヒトの前免疫感作がその移植片の生存時間を延長することを示唆する文献のかなりの体が存在する(95 参照) 。この現象の1 例は、臓器ドナーから血液を含む臓器移植物を受容する患者を輸注することがその移植物の拒絶を減少させるような" ドナー- 輸注効果" である。研究は、CD8 ＋  細胞がIL-4に応答して成長し(42,43) それ故、CD8 ＋  細胞がIL-4仲介アポプトシスに対する感受性を潜在的に与えるということを示した。これは、移植片拒絶に関係するT 細胞の一次クラスである。IL-4のこの新たな特性の発見に基づき、CD8 ＋  T 細胞がIL-4-仲介アポプトシスを経験するように誘導されることができ; 前- 免疫感作/ 輸注期の間及び直後にIL-4を投与すること、又は適当な短い間隔でMHC 抗原による繰り返しの免疫感作が、T 細胞の死を増大させ、移植片のより大きな抵抗性を導くことができるであろう。
【００２３】
第三に、喘息又はアレルギーとして一般的に知られた多種多様のアトピー又はアレルギー失調は、有害なリンホカインの放出及びB細胞によるIgE の産生の両方を引き起こす活性化T 細胞の効果から生じる(96,97,98)。過去数十年間にわたり、臨床医は、アレルギーを顕出させた同一抗原への反復暴露から成る" 脱感作(desensiti-zation)"方法によりこれらの疾患を治療する原始的な試みを行ってきた(97)。この手順による演技において設定された機構についてほとんど知られていないにもかかわらず、幾つかのケースにおいて、このような治療が高く成功した(97)。臨床的アレルギーにおけるこの研究の重要な化学的副産物は、かなりの努力が、アレルギー応答を引き起こすタンパク質及び他の分子を同定することに向けられたということである(98)。これは、抗原のためのタンパク質配列、例えば、花粉症(hay fever) を引き起こすブタクサ(ragweed) アレルゲンであるAmb a V 及びAmb t V 、タラ(codfish) に対するアレルギーを引き起こすアレルゲンM からの抗原ペプチドのタンパク質配列及び特徴の同定(99)、及びスズメバチの刺し(hornet stings) に対するアレルギーに関係する、白頭スズメバチ毒(white-face hornet venom)の抗原5 のためのcDNAの分子クローニング(100) を導いた。アレルギーを引き起こすことができる薬物は、典型的には、宿主タンパク質との共有結合性複合体を形成することにより免疫原性となることができる小さな有機分子である。さらに、広い種類のアレルゲンが、食品医薬品局の監督下でヒトに臨床的に投与されるべきタンパク質として調製され、そしてPanel on Review of Allergenic Extractsにより評価された(97)。これらの及び他のアレルギー誘発抗原の分子同定により、アレルギー性失調、例えば、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、アナフィラキシー症候群、じん麻疹、血管性浮腫、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触性皮膚炎、結核性紅斑、多形性紅斑、スチーブン- ジョンソン症候群、皮膚壊死性静脈炎(cutaneous necrotizing venulitis) 、及び水泡性皮膚疾患に関係するT 細胞のアポプトシスを誘導するためにIL-4によりサイクルにおいて免疫感作することができるであろう(12 ページ及び図3)。
【００２４】
このアレルギー応答の主要な成分はIL-4に応答する" ヘルパー"T細胞に依存する生産IgE 抗体でああるので(96)、T 細胞のIL-4仲介物質アポプトシスはアレルギー疾患過程に対してかなりの効果をもつことができるであろう。
これらの治療のプロトコールのそれぞれの主要な特徴は、患者のT 細胞レパートリーの小さな成分だけを含んで成る抗原特異的T 細胞だけが削減されるであろうということである。この治療は、患者の免疫系を広く無傷に残すであろう。これは、宿主の免疫機能をひどく無能力にする一般的な免疫抑制に頼る現在の治療とは対照的である(101参照) 。その上、本治療はT 細胞リンパ球の死を引き起こすため、それは、T 細胞を殺さないがむしろ典型的には可逆的である機能的不活性化又はアネルギーを引き起こす他の最近発見された機構よりも優れている(102-104) 。以下に記載する実験結果は、それ故、ヒト免疫学的疾患への適用において広い臨床的重要性をもつ。
【００２５】
ヒト及び動物疾患への免疫学のアプローチの歴史を通して。1798年にEdward Jenner により行われた天然痘に対する最初の種痘に始まり、陽性及び保護的抗原- 特異的免疫応答の刺激について強調されてきた。最近の免疫学においては、これは、リンパ球の活性化によるものであることが知られている。これ故、抗原- 特異的免疫細胞、特にT リンパ球の活性化及び増殖を引き起こすことが、免疫学の臨床的適用のほとんどの基礎を形成している。特に、分子クローニングされたサイトカイン、特に免疫細胞の増殖を引き起こす能力をもつものの最近の出現は、免疫学の臨床的適用を促進した。このような分子クローニングされたサイトカインは、薬理学的に容易に生産されることができ、そしてリンパ球の成長及び分裂を刺激するための強力な剤である。本明細書中に開示する発見により提供される概念的及び実行的進歩は、十分な量で与えられるとき、サイトカイン、例えば、IL-4が、陰性調節効果、例えば、T 細胞アポプトシスをも引き起こすということである。これらの調節効果は、その免疫応答を限定又は抑制するためのビルト- イン機構を提示する。これ故、これらの機構が存在するという認識、及び抗原- 特異的T 細胞の死を潜在的に引き起こす生物学的IL-4の同定は、疾患の治療のために免疫応答の陰性調節を発揮する機会を提供する。
【００２６】
従って、本発明の目的は、抗原- 活性化T 細胞により引き起こされるヒト又は動物における疾患を治療又は防止するための方法を提供することである。本法は、他のT リンパ球のものよりも大きな程度まで上記疾患を引き起こすことができるT リンパ球のサブ集団のアポプトシスによりその死を誘導する。この疾患は、自己免疫疾患、移植片拒絶、又はアレルギー又はアトピー性失調を含むことができ、そしてそのアトプトシスは、内因性IL-4を開拓するか又はこの物質を外因的に投与するかのいずれかにより、達成されることができる。IL-4が外因的に投与されるとき、アポプトシスは、抗原、ペプチド、タンパク質、多糖類、有機分子、及び核酸から成る群から選ばれた物質による免疫感作を介して特異的T 細胞を挑戦させること、その後に、そのT 細胞が高レベルのIL-4レセプタを発現しているとき、そのT 細胞がその物質による免疫感作の間にアポプトシスを経験することを生じさせるように、高投与量のIL-4を投与すること、から成るサイクルにより、達成されることができる。内因性IL-4がアポプトシスを達成するために使用されるとき、そのサイクルは、高投与量のIL-4のその後の投与によらず、その代わりIL-4の内因レベルに頼って、アポプトシスを引き起こすのに適当な間隔における上記物質の反復投与による免疫感作を介して、そのT 細胞を挑戦させることを含んで成る。
【００２７】
さらに本発明の利用可能性の範囲は、以下の提供する詳細な説明及び図面から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明及び特定の実施例は、本発明の好ましい態様を示しながら、説明だけの方法で与えられると理解されるべきである。なぜなら、様々な変更及び修正が本発明の本質及び範囲内でこの詳細な説明から当業者に明らかになるであろうからである。
【００２８】
発明の詳細な説明
本発明の以下の詳細な説明は、その実施において当業者を助けるために提供される。たとえそうでも、以下の詳細な説明は、本発明を不当に限定すると解釈されてなならない。なぜなら、本明細書中で討議する態様における変更及び修正が本発明の発見の範囲の本質又は範囲から外れることなく当業者により行われることができるからである。
本明細書中に引用する文献のそれぞれの開示をそれらの全体として引用により本明細書中に取り込む。
【００２９】
材料及び一般的方法
材料。雌B10.A 及びBALB/cマウスをCharles River から購入した。ハトのチトクロームc 、及びヨウ化プロピジウムをSigma Chemical Co.(St. Louis, MO)から購入した。精製ネズミrIL-4 は親切にもDr.W. Paul(National Institute of Allergy and Infectious Diseases,NIH)により提供された。抗- ネズミIL-2モノクロナール抗体(mAb)S4B6.1は親切にもDr. Zueniga-Pfluecker(National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH) により提供された。実験において使用した抗- ネズミCD3 ε mAb 145-2C11(105)は、37℃において120 分間又は一夜燐酸塩バッファー生理食塩水(PBS) 中1 μg/ml 又は10μg/mlのいずれかの濃度において12- ウェル又は96- ウェルのいずれかの培養プレート( それぞれ、500 μl 又は100 μl )(Costar, Cambridge MA)をコーティングすることにより固定化された。このプレートを使用前に培地(Click's又はEagle's Hank'sアミノ酸、EHAA、及び10% FCS 、2mM グルタミン、50μM β- メルカプトエタノール、ペニシリン及びストレプトマイシン; Biofluids, Inc., Rockville, MD)により3 回洗浄した。MHC クラスII分子に特異的なmAbs(Aｋ  , 10.2.16;及びE ｋ  , Y17)は、Dr. R. Schwartz (National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH)からの贈り物であった。
【００３０】
細胞培養。ネズミの非形質転換T 細胞クローンA.E7を先に記載されているように行った(106) 。実験のために、休止細胞( 抗原刺激後>2週間) 又は抗原刺激細胞のいずれかを使用した。抗原刺激は、1 x 10６  休止T 細胞を1 x 10７  B10.A 照射(3000R) 脾臓細胞及び5 μM のハト・チトクロームc と共に2ml の全容量において培養することから成っていた。48時間後、抗原提示細胞(APCs)をMHC クラスII mAb仲介補体溶解( 低毒-Mウサギ補体、Cedarlane Laboratories, Westbury, NY) により除去し、そして細胞を先に記載されているように(41,104)、リンパ球密度遠心分離(Cedar Lane Laboratories) により回収した。次に、T 細胞を収穫し、そして洗浄し、そして検定を48時間200 μl の全容量により2 連で96ウェルの平底プレート内で行った。5 x 10４  細胞/ ウェル( 表1 の例外として、実験1 は1 x 10５  細胞/ ウェルであった。) をT 細胞レセプタ刺激の非存在又は存在のいずれかにおいて、特定リンホカインにより添加した。次に生きた細胞数を以下に記載するように測定した。
【００３１】
T 細胞増殖検定。T 細胞レセプタ(TCR) 刺激によらない5 x 10４  細胞の並行カルチャーを、16-24 時間1 μCiの[ ３  H]チミジン( ３  H-TdR)(6.7μCi/mmol, New England Nuclear) の添加によりパルスした。細胞をその後ガラス・フィルター紙上に収穫し、そしてサンプルをLKB カウンター上の液体シンチレーションによりカウントした。データを3 連の平均cpm として表した。
【００３２】
細胞生育活性。生きた細胞数をヨウ化プロピジウム染色細胞によるフロー・サイトメトリー(FACS)による血球計を使用してトリパン・ブルー排除細胞のマニュアル計数により測定した。フロー・サイトメトリー定量のために、細胞をピペットにより収穫し、燐酸塩バッファー生理食塩水(PBS) 中で1 回洗浄し、そしてそれぞれのサンプルをヨウ化プロピジウムを含む一定容量のPBS(2 μg/ml) 中に懸濁させた。一定量の時間(100秒) の間に集めたサンプルの蛍光強度をLysis IIソフトウェアー(Becton Dickenson, Mountain View, CA)をもつFACSCAN IIアナライザーを使用して測定した。
この手順のために、それぞれのサンプルを一定容量中に保持し、そしてその細胞を事件の数にかかわらず、一定量の時間に間集めた。フォワード・スキャター(forward scatter) 及びヨウ化プロピジウムにより断言されたような生きた細胞数だけを定量する。トリパン・ブルー排除又はフロー・サイトメトリー分析により生きた細胞数について分析された2 連カルチャー間の比較は、これらの2 つの定量法の間の関係がR 値>0.97 により証明されるように線形であることを現した。
【００３３】
アガロース・ゲル中のDNA 断片化の分析。
1 x 10６  細胞を48時間抗-CD3ε mAbによりコートした12ウェル内でインキュベートした。このとき、細胞を穏やかにスプレープすることにより収穫し、そして先に手順(8) の修正により調製した。簡単に言えば、細胞をPBS 中で1 回洗浄し、そして50℃において1 時間20μl の溶解バッファー(50mM Tris, pH 8.0, 10mM EDTA, 500μg/ml プロテイナーゼK 、及び0.5%サルコジル・ナトリウム) 中でインキュベートした、RNase A (50 μg/ml)(Boehringer Mannheim)を添加し、そしてその細胞を50℃において追加の1 時間の間インキュベートした。染色バッファー(10mM EDTA、1% (w/v)低融点アガロース、0.25% (w/v) ブロムフェノール・ブルー、及び40% (w/v) シュクロース) を添加し、そのサンプルを5 分間70℃において加熱し、氷上でクエンチし、2% Nusieveアガロース、臭化エチジウムを含む1%超純粋アガロース・ゲル中で電気泳動にかけた。
【００３４】
実施例I 
IL-4はT 細胞を抗原- 誘導アポプトシスに傾ける。
我々は先に、IL-2が、T リンパ球を抗原- 誘導アポプトシスに傾けることにより、propriocidal調節といわれる見かけのフィードバック経路に参加することを、示した(26)。それ故、我々は、IL-4、別のT 細胞成長因子、がこの経路を誘導するかどうかを測定した。我々は、最初にE ｋ  MHC クラスII分子のコンテクスト中のハト・チトクロームc に応答する非形質転換CD4 ＋  T Ｈ  1 クローンA.E7について研究した。このクローンは、抗原刺激に応答してそのIL-4レセプタをアップレギュレートし、そしてIL-4に応答して増殖することが示された(41)。表1 中に示すように、抗原は、トリチル化チミジン( ３  H-TdR)取り込みにより示されるように( 実験1)、投与量に依存したやり方でIL4 に対するA.E7細胞増殖を刺激した。その上、その増殖細胞がその後抗-CD3ε- コート・プレート上に48時間置かれたとき、非コート・プレート対照に比較して、劇的な細胞の損失が存在した。細胞数における減少は、成長リンホカインの添加がないとき最小であり、そしてリンホカインの量の増加により達成される増殖の程度におおよそ比例して増加した。1000 U/ml IL-4により処理した細胞は、TCR 刺激の後細胞数における84% の減少を示した。IL-4により見つかった全体細胞損失は、IL-2刺激により得られたものと同様に大きかった( それぞれ、85% 対87%)。
【００３５】
我々は、リンホカイン- 依存性T 細胞系、CR.4R 及びCT.4S により同様の現象を観察した。我々は、いずれの細胞系においてもいずれのT 細胞レセプタ表面発現を検出することができず、そして抗-CD3ε刺激は、これらの細胞に対して全く効果をもたなかった(S.B.及びM.L.、非公開結果) 。それにもかかわらず、TCR 占有が、ホルボール・ミリスチック・アセテート(PMA) とイオノマイシンとの組み合わせによりまねられたとき、大きな細胞損失が48時間後に観察された( 表1 、実験2)。90% 細胞損失よりも大きなものが、IL-2又はIL-4のいずれかに晒したCT.4R 細胞について観察され、そして87% 細胞損失がIL-4とインキュベートされたCT.4S 細胞について見られた。
【００３６】
これらの実験における細胞損失の幾つかの特徴は、細胞死が生じていることを示唆していた。第一に、すべてのケースにおいて顕微鏡検査は、細胞がアポプトシスを経験しているようであることを現した。図1 中に示されるように、トリパン・ブルー染色は、非処理サンプルにおけるよりも抗-CD3ε抗体により刺激された細胞内の非-生存細胞( 暗い色) を検出することができる。第二に、1000 U/ml IL-4及び抗-CD3ε刺激後のA.E7細胞の数は、増殖におけるいずれかの有効なブロックの添加における細胞損失を含意するウェルへ入れられた細胞数よりも少なかった( 表1 、実験1)。第三に、ヌクレオソーム長DNA のラダーは、A.E7細胞のIL-4及び抗-CD3ε処理後に得られ、これは、アポプトシスの発生を示している。図2 中に示すように、DNA 断片化が、プレート結合抗-CD3ε mAbと共に培養された細胞内で観察され( レーン3 及び4)、そして培地単独により培養された細胞内では観察されなかった( レーン1 及び2)。また、我々は、IL-4処理A.E7細胞が照射脾臓細胞及び抗原と同時培養されたとき細胞死を観察した( 表1 、実験3)。IL-4が特定の条件下でIL-2の放出を刺激することができるため(107) 、IL-2に結合することができるmAb(S4B6.1) は、このIL-4刺激に含まれていた。これは、その後のT 細胞刺激- 誘導アポプトシスを阻害せず( 表1 、実験4)、IL-4処理単独がT 細胞をアポプトシスに傾けることを示唆している。
【００３７】
これらの実験は長い時間にわたりインビトロにおいて行われたT細胞クローンにおいて行われたため、我々は、IL-4がリンパ節細胞がアポプトシスに傾くことができるかどうかについて調査した。IL-2又はIL-4のいずれかに応答してリンホカインを生産させ、そして増殖させるためにリンパ節T (LNT) 細胞を刺激するための条件が最近決定された(108) 。TCR 刺激及びIL-2による処理は、IL-2を生産し且つこれに応答する優勢なT Ｈ  1 表現型を示すカルチャーを作り出し、一方、IL-4を含むものは、IL-4を生産し且つこれに応答するT Ｈ  2 表現型の細胞を導く(108) 。新たに単離したリンパ節細胞を可溶性抗-CD3ε mAb又はコンカバリンA のいずれか、及びIL-2又はIL-4により、72時間処理した。LNT 細胞は、すべてのサンプルにおいてリンホカインに応答して有意に増殖した( 表2 、CPM)。テストされたすべての条件においてプラスチック対照に比べて抗-CD3ε-コート・プレート上の48時間のインキュベーション後に回収された生きた細胞の数において大きな減少があった( 表2)。これらの結果は、IL-4がLNT 細胞をアポプトシスに傾かせる能力をもつことを示している。さらに、我々が先にIL-2により観察したように(26)、IL-4それ自体が、抗原レセプタ刺激の後にアポプトシスに導くpropriocidal経路を引き起こすことができる。
【００３８】
【表１】
2007077164.tif 000003
１  48時間の抗原刺激後のA.E7細胞の処理を示す。CT.4R 及びCT.4S細胞系は、抗原刺激を経験しなかったが、記載したように前処理された。上に示したリンホカインの濃度は、48時間の前処理実験の48時間の経過時間の間それぞれのサンプルについて一定に維持した。
２  これらの細胞は、その細胞表面上にTCR を発現せず、そしてPMA (10ng/ml) 及びイオン透過担体(2μM)と共に培養された。
３  ホワード・スキャター・プロフィール、ヨウ化プロピジウム染料排除及び抗- マウスV α11 mAb(Pharmingen)による表面染色により測定されるような生きたA.E7細胞数を示す( 材料及び方法を参照のこと。) 実験条件は、10倍過剰のB10 から成っていた。照射脾臓細胞、1 μM ハト・チトクロームc (+Ag) 及び30μg の抗- マウスIL-2 mAb S4B6.1 。
【００３９】
【表２】
2007077164.tif 000004
【００４０】
BALB/cリンパ節細胞を、可溶性抗CD3 ε(3μg/ml) 又はConcavarin A(3 μg/ml) と共にIL-2(14U/ml)又はIL-4(1000U/ml)の存在中72時間1 x 10６  細胞/ml の濃度において培養した。細胞(5 x 10 ４  細胞/ ウェル) を十分に洗浄し、そしてリンホカインの存在中さらに48時間の間培地又は抗-CD3- コート・プレートと共にインキュベートした。次にこの細胞を収穫し、そして生きた細胞の数をFACS分析により測定した。
我々は先に、IL-2によりその細胞サイクル内に導入された成熟Tリンパ球の抗原レセプタ-刺激アポプトシスについて用語propriocidal調節を提案した(26)。この機構は、刺激抗原について十分なアフィニティーをもついずれかのT リンパ球の削減をもたらすであろう。我々の先に結果は、そのT リンパ球にpropriocidal細胞死を経験させるために、それがIL-2処理に応答しなければならないが、必ずしもそのリンホカインを生産しないということを、示唆する。現在、我々は、これらの結果を延長し、A.E7、IL-4に応答することができるがそれを生産しないT Ｈ  1 クローンが、IL-4処理に応答して活性にサイクル化する場合にTCR 刺激によりアポプトシスを経験するであろうということを示す。また、我々は、抗原レセプタ刺激及びIL-2又はIL-4処理のいずれかにより細胞サイクルに駆動された正常リンパ節細胞がその後のTCR 刺激にわたり細胞死を経験することを示した。細胞サイクル化(cycling) それ自体は必要ではない。なぜなら、我々は、特定のブロッキング剤がTCR-仲介アポプトシスを防止しないということを発見したからである(27)。にもかかわらず、後期G1の先の進行を防ぎ、そしてS 期における増殖をブロックしない剤がアポプトシスを阻害することができることが発見された(27)。従って、我々は、成長リンホカイン、例えば、IL-2又はIL-4により刺激される後期G1の先の細胞サイクル進行が、T リンパ球におけるTCR-仲介死について寛大であるという仮定を好む。T 細胞ハイブリドーマ及びリンパ腫の形質転換表現型のために後期G1段階の先の細胞サイクル進行がリンホカイン処理によらないTCR-仲介アポプトシスに対するそれらの感受性によるらしい(13-18) 。我々の結果は、成長リンホカイン、例えば、IL-4に対するT リンパ球応答の内因特性がさらなるTCR 刺激にわたるアポプトシスへの感受性であるということを示唆する。その上、この応答は、特異的抗原に対する免疫応答が自然に抑制されることができる機構を描写する。
【００４１】
実施例II
T リンパ球のIL-4/ ペプチド- 仲介アポプトシスのための方法
図3 中に示すように、特異的ペプチド又はタンパク質による免疫感作を1 日目に行う。例えば、多発性硬化症の場合においては、ミエリン塩基性タンパク質(MBP) からの2 つの免疫優勢ペプチドのいずれかがヒトにおいて脳炎誘発性である: MBP 84-102( 好ましいペプチド) 、又はMBP 143-168 (78, 79)。破傷風変性毒素に結合したこれらのペプチドのいずれか又は両方を、約10〜約1000μg の間の投与量において、ミョウバン・アジュバント中で筋中(IM)に与えることができる。タンパク質又はペプチドを使用した初期免疫感作経験は、筋中投与が最適であるということを示唆した(109-113) 。より最新のデータは、経口投与も有効であることができるということを示唆している(94)。いずれかの医薬物質、生物製剤に関して、免疫感作のために使用されたいずれかのペプチド及びタンパク質についてのテストが、1)これらの物質の薬理動態挙動; 2)それらの免疫原性; 及び3)いずれかの有害効果の安全性及び同定、を決定するために投与量のレンジにわたり、日常的に行われることが必要であろう。従って、このプロトコールにおいて使用される特定のタンパク質又はペプチド( 例えば、多発性硬化症における、MBP 84-102、又はMBP 143-168;ブドウ膜炎における、S 抗原; 又はリウマチ様関節炎におけるII型コラーゲン) は、個々の日常的な最適化を必要とするであろう。同様の介入がアレルギー- 誘導タンパク質の調製に伴って使用されることができよう。これらは、目下臨床的に使用される様々なアレルゲン・タンパク質抽出物から得られるであろうし、又はそのためのクローン化DNA が入手可能なスズメバチ毒抗原5 のようなものについての組換えDNA 技術により生成されることができるであろう(100) 。ワクチンの開発からの多くの証拠は、合成ペプチド又は組換えDNA-誘導タンパク質のいずれかがヒトにおける免疫応答を顕出することにおいて有効であるということを示唆する(109-112)。これらの研究は、免疫感作に有効な投与量にレンジに関してのガイダンスをも提供する。
【００４２】
タンパク質:
1)酵母内での組換えタンパク質として生産されたB 型肝炎表面抗原。
大人2.5 〜20μg;子供1.25〜5 μg 筋中(IM)。ワクチンの90-96%が免疫応答を示し、10-20 μg に最良応答をもっていた(109) 。さらなる研究は、10μg 投与量の硬化を示し、皮下よりもIMにおいて与えられたときよりよい結果となった(110) 。IMにおいて与えられたミョウバン・アジュバント中の20μg の投与量は臨床試験において感染の防止に有効であることが発見された(111) 。
2)天然又は組換え分子のいずれかの、HIV gp 120。50-1000 μg間のチンパンジーにおける投与量はT 細胞応答を顕出させる(115) 。
【００４３】
ペプチド:
1)絨毛膜ゴナドトロピン。幾つかの研究は、コレラ又は破傷風変性毒素に結合し、そしてミョウバン・アジュバンント中の50-1000 μg の投与量において与えられたヒト絨毛膜ゴナドトロピン- βサブユニット・ペプチド( 残基109-145)に対する成功した免疫応答を示した(112) 。
【００４４】
2)マラリア・スポロゾイト抗原。破傷風変性毒素に結合したプラスモディウム・ファルシパラム(Plasmodium falciparum) ペプチド(NANP)３  の研究は、IMにおいて与えられたペプチド結合体の20-160μg の投与量に対する免疫応答を示し、160 μg において最良の応答をもっていた(113) 。
次に、その間に抗原が反応性TCRsを担持するT 細胞のサブセットを活性化し、それらがIL-4レセプタ及びたぶんIL-4を発現することを引き起こす、待ち時間が、免疫感作の後に続いた。この過程は、抗原により刺激された細胞上のIL-4レセプタだけをアップレギュレートするであろう(36)。インビトロにおけるヒト及びマウスの両方のT 細胞の研究に基づき、抗原暴露後の約12〜約24時間の間が、IL-4レセプタの数における有意な増加を発現するために必要であり、そして約72時間程の長さが、T 細胞の大部分の上にリンホカイン・レセプタの最適数を発現するために必要である(36)。従って、この待ち時間は、約12時間程短かく又は約72時間程長くあることができ、このレンジの上限の方に向かって増加して最適になる。
【００４５】
次に、この後に、高投与量のIL-4の注入が続く。非常に限定されたデータだけがIL-4の臨床的使用について存在するけれども(89-92)、大量の情報がIL-2を使用した臨床研究から得られた。高投与量の関連T 細胞成長リンホカインIL-2のヒトへの投与は、癌患者においてよく研究されており、様々な投与量が評価された(116-120) 。データは、IL-2が頻繁なボーラス投与量又は連続注入のいずれかとして静脈内(I.V.)に与えられなければならないということを示している(116-118) 。先に確立された投与量は、約300 〜約3000ユニット/kg/ 時の間の連続注入、又は10４  〜10６  ユニット/kg I.V.ボーラスのレンジにある(117) 。ユニットは、National Institutes of HealthにおけるBiological Response Modifiers Program から入手可能な標準により定められ、そして標準条件下そのバイオアッセイにおける50% 最大チミジン取り込みを与えるIL-2又はIL-4の量として定義される。これらの投与量の副作用は、悪寒、熱、倦怠感、頭痛、むかつき及び嘔吐、液体保持による体重増加、下痢、発疹、並びにかゆみであって、このすべてがアセトアミノフェン又はインドメタシンにより治療されることができるものを含んでおり; 重度の罹患率又は死亡率は全く観察されなかった。ヒトへのIL-4投与の研究は、10-20 μg/kg体重、3 回/ 日の投与量において与えられた比活性1.5x 10７  ユニット/μgのヒト組換えIL-4を使用した(89-91, 120,121)。IL-4による副作用は、IL-2により観察されたものと類似しており、そして水保持による体重増加及びむかつきを含んでいた。IL-4治療後、患者は、直ちに、当量投与量の抗原により再免疫感作されることができる。例えば、多発性硬化症のためには、治療は、破傷風変性毒素に結合し且つミョウバン・アジュバント中IMにおいて与えられた約10〜約1000μg のペプチドMBP 84-102により行われることができる。好ましい投与量は、このレンジも上限近くにあるようである。なぜなら、より大きなTCR 刺激がより大きなレベルのアポプトシスを作り出すからである(26,27) 。IL-4治療は、IL-4レセプタを担持するT 細胞--優勢には疾患を引き起こすT 細胞--を刺激するであろうし、そしてこれらの細胞は、次に、それらのTCR を通して再刺激されるであろう。これらの細胞は、次に、アポプトシスを経験するであろう。約12〜約72時間の免疫感作時間の後、このサイクルは、IL-4の再注入により再び始まるであろう。以下に説明するように、増加した効果は、おそらく、治療の多数のサイクルから生じるようである。この治療の終点は: i)適切には、様々に混合されたリンパ球により又は末梢血液リンパ球を使用した増殖検定により容易に測定されることができる、抗原に対するインビトロにおける反応性の削除; ii) 臨床的徴候の軽減; 又はiii)毒性、であろう。アレルギー疾患についての治療の終点は: i)臨床的徴候の改善; ii) アレルギーの皮膚テストの正常化; iii)血清IgE レベルにおける減少;及びiv) 測定が可能な場合、アレルギー性タンパク質に対する減少したT 細胞応答、であろう。
【００４６】
本治療の幾つかの特徴は、さらなる説明を必要とする。第一に、抗原により刺激されたものを除くT 細胞が高いアフィニティーのIL-4レセプタを発現することができるということが予想される。しかしながら、これは、治療の特異性を減少させてならない。なぜなら、そのTCRsが抗原による再挑戦により刺激される細胞だけが前記に記載したようにアポプトシスを経験するであろうからである。治療の効果は、使用した抗原の性質及びまさにそのプロトコールに依存して変化可能であることができるであろう。広範なインビトロにおける研究は、抗原- 特異的IL-4刺激T 細胞の50-80%の間が、TCR刺激により再挑戦されたときアポプトシスを経験するであろうということを示している( 前記、27) 。第二に、抗原- 特異的T 細胞の数における減少が、その治療の総合的な効果を決定する。それ故、繰り返されたサイクルは実質的に効果を増加させることができる。但し、それぞれのサイクルにおける殺しのレベルはたった50-70%である( 表3)。マウスの研究、前記において示されたように、抗原-反応性T 細胞のレベルは、反復免疫感作による最初の免疫感作の前のこのような細胞の数よりも下に減少するであろう。さらに、中程度の投与量又はリンホカインにおけるこのプロトコールの予測された毒性は微小でなければならず、そしてヒトにおける成長リンホカイン、例えば、IL-2又はIL-4の治療的使用における先に研究は、すべての副作用がリンホカイン治療の中断の後速やかに消失することを示している(89-91,116,117) 。最も重度の副作用、液体保持は、IL-4治療の間欠的な性質により最小化されなければならない。投与量の間の2-3 日間の休止期間がIL-4投与の間に作られる液体の利尿を許容するであろう。最後に、抗原の反復投与は、幾つかの細胞をアポプトシスに傾かせるであろう幾つかの内因性IL-4の生産を引き起こすであろう。内因性レベルが薬理学的に投与されることができる非常に高レベルのIL-4に到達することができるということはかなり起こりそうもないけれども、IL-4投与量における経験的に測定された減少が内因性IL-4の効果のために達成されることができるであろうという可能性がある。殺しのレベルは、T 細胞が晒されるIL-4の全体のレベルに依存し、そしてこれは、内因及び外因源の組み合わせを反映するであろう( 前記、26,27)。
【００４７】
特定の抗体により、細胞のアポプトシスへの傾きがIL-4の内因性生産により有意に誘導されることができる。これらの場合において、外因的に投与されたIL-4の非存在中、抗原による適当な免疫感作がT 細胞アポプトシス及び保護的効果を作り出すであろう。前記に開示されたアポプトシスへの感受性のタイミングの研究に基づき、特定の間隔において繰り返された免疫感作は有効な療法に不可欠であろう。IL-4- 仲介アポプトシスを行うために、免疫感作は、約24〜約120 時間の間隔において、好ましくは約24〜約72時間の間隔において、繰り返され、そして先に討議したレンジのほぼ上限における抗原投与量を使用して多数回繰り返されるであろう。次に、特異的抗原についてのT 細胞反応性又は細胞仲介免疫性を、T 細胞がアポプトシスを経験したかどうかを決定するためにインビトロにおける検定によりモニターすることができるであろう。本明細書中に開示する発見により提供される知識の欠如により、反復免疫感作により免疫応答性を減少させる先の試みは最適ではなかった。例えば、移植片拒絶を弱めるドナー輸注プロトコールは、2 週間間隔において与えられた3 の輸注を含んでいた(122,123) 。アレルギー・ショット、すなわち、脱過敏症治療は、典型的には、最初に4-7 日間の間隔において与えられ、その後間隔が2 〜4 週間にだんだん増加される(97)。T 細胞アポプトシスの本新規の理解に基づき、最も有効な免疫感作プロトコールは、約24〜72時間の間隔における抗原の反復投与を含むであろう。
【００４８】
【表３】
2007077164.tif 000005
【００４９】
理論的値は、100,000 細胞からの出発、及び70% の一定殺し効率に基づく。100 倍を超える減少が4 サイクルにおいて見られ、そして1000- 倍を超えるものが6 サイクルにおいて見られる。50% のフラクション殺しにおいて、ほとんど100-倍の減少が6 サイクルにおいて見られるであろう。一次速度式がここに表される。なぜなら、アポプトシスの過程は、抗代謝物により誘導されるアポプトシスのために示されているような単一の致死性ヒット・デリバリーを含むからである(1-5) 。
【００５０】
実施例III 
移植抗原/IL-4-仲介アポプトシスのための方法
組織がそれらの関連組織適合性抗原座において遺伝的に非同一である個体間に移植される医療手順、本明細書中異種移植片移植といい、そして移植された組織は異種移植片(allograft) という、においては、遭遇する主要な問題は、宿主によるドナー異種移植片の拒絶である。用語" 宿主" とは、異種移植片の受容者である個体をいい、そして用語" ドナー" とは、異種移植片を取り出される個体をいう。移植片拒絶の過程の研究は、それが、T リンパ球、特にCD8表面分子を担持するものの抗原- 特異的活性化によることが示されている(124) 。より重要には、T 細胞がヒトにおける免疫応答に載る能力をブロックする剤が移植片拒絶を有効に防止又は軽減する(125) 。CD8 ＋  T 細胞がIL-4によるアポプトシスに感受性であることが示されているので、前記、この現象は、反応性T 細胞を削除し、それにより移植片拒絶を回避するための特定の手段として使用されるとができる。
【００５１】
本質的には、タイミング及びIL-4投与量に関する同様のプロトコールが、自己免疫疾患の療法について前記に記載されたように上記療法について使用されることができる。上記の療法と先に記載されたものとの間の主要な差異は抗原の源である。主要組織適合複合体(MHC) 抗原は、個体の中で非常に多形性である細胞表面タンパク質である。それぞれの個体の細胞は、遺伝的に定められたセット、又はハプロタイプのこのような抗原であってそれぞれの細胞に対して免疫学的" 指紋" として役立つものを担持している。これは、特にT 細胞により作り出される応答において、個体の免疫系が、個体自体の細胞を認識し、そして自己の" 指紋" を担持しない細胞だけを攻撃することを可能にする(127) 。2 クラスのMHC-- 体内の全細胞上にある、クラスI 抗原; 及び単球、マクロファージ、B リンパ球、樹状突起細胞、及び活性化T 細胞上に優勢にある、クラスII抗原、が存在する(126) 。クラスI MHC 抗原は、異種移植片拒絶において優勢な影響力をもつCD8 ＋  T 細胞により認識される(124,1127)。MHC抗原のこの複雑性のために、最も単純な源は、異種移植片ドナーからの細胞である。この効果の機構は知られていないけれども、ドナー血液による移植片受容者の輸注が移植片拒絶を抑制するということ、そして多くのケースにおける臨床的な有効性が大きくないとうことが経験的に観察されている(123) 。これらのプロトコールは、ドナーからの200ml の全血又は当量の充填細胞の3 輸注が最小副作用をもつ受容者により容易に耐えられるという証拠を提供する(122) 。幾つかのケースにおけるドナー- 輸注が移植片宿主における感受性抗体応答を顕出させるという証拠が存在し、そしてこれらの患者は異種移植片を与えられなかった(122) 。これらの研究は、ドナー抗原へ晒されることがT 細胞応答を抑制するという経験的観察をおそらく表している。但し、これは議論のあるところである(124) 。本方法は、図4 中に示すように、IL-4によるサイクルにおける患者への約50〜約200ml の投与量におけるMHC 抗原の源としての血液の投与を含む。腎臓移植の場合においては、血液の量は、最終段階の腎臓疾患患者の液体抵抗性により測定されることができるであろう。血液は、全血、充填細胞、又は洗浄された充填細胞輸注のいずれかとして与えられることができる(123) 。治療の成功は: i)一般的な免疫抑制医薬の減少された要求; ii) 移植片の生存: 及びiii)異種移植片の適当な機能、により評価されることができる。例えば、移植された腎臓の機能は、クレアチニン及び血液尿窒素の血清レベルを測定することにより確立されることができる(125) 。これに、図3 中に示すように、その後、IL-4注入及び抗原としての血液細胞による再挑戦が続くことができる。
【００５２】
本発明をこれまで記載してきたが、同一のことが多くの方法で変更されることができることは、自明であろう。このような変更は、本発明の本質及び範囲から外れることとは認められず、そして当業者に自明であるであろう全ての修正は、クレームの範囲内に含まれることを意図されている。
【００５３】
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【図面の簡単な説明】
【００５４】
本発明の上記及び他の目的、構成、及び効果は、添付図面と共に以下の詳細な説明からよりよく理解されるであろう。それらのすべは、説明だけの方法で与えられ、そして本発明を限定するものではない。ここで:
【図１】T 細胞レセプタ刺激の存在又は非存在中でのIL-4処理A.E7細胞の顕微鏡写真。IL-4応答性A.E7細胞を培地中で48時間、単独で又はプレート結合抗-CD3ε mAb(145-2C11)と共に培養した。光学顕微鏡にために、培地を燐酸塩バッファー生理食塩水(PBS, 0.8M燐酸カリウム、154mM 塩化ナトリウム、及び2.9mM 燐酸ナトリウム、pH7.4)中の0.4%トリパン・ブルーにより置換した。このトリパン・ブルー染料を取り除き、そしてそのウェルをPBS だけにより3 回穏やかに洗浄した。顕微鏡写真をHoffman 調節コントラスト光学装置を使用してZeiss Axiovert 405 M顕微鏡上で撮影した。
【図２】IL-2(14 U/ml) 又はIL-4(1000 U/ml) により処理したA.E7細胞は、抗-CD3ε mAb(145-2C11)と共に培養したときアポプトシスを経験した。培地中単独で培養された( レーン1 及び2)、又は抗-CD3ε mAbによりプレート結合された( レーン3 及び4)、IL-2刺激( レーン1 及び3)、及びIL-4刺激( レーン2 及び4)A.E7細胞のアガロース・ゲル電気泳動によるDNA 完全性の分析。
【図３】処理の時間順配列( 線の上) 及び予想結果( 線の下) を示す。抗原接種及びIL-4注入のための時間を示す。抗原は、自己免疫疾患の治療について討議したようなタンパク質又はペプチド又は移植片拒絶のための赤血球から成ることができる。ヨコ線のボックスは、IL-4処理のための最も早い時間枠を示し; 影ボックスは、IL-4処理のための最適な時間を示す。
【図３】
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【図１】
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【図２】
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