(57)【要約】      （修正有）【課題】肝細胞癌（hepatocellular carcinoma）（ＨＣＣ）のバイオマーカーを提供する。【解決手段】肝内小結節を有するか有すると思われる被験体、特に、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスの少なくとも１つに感染した者における肝細胞癌（ＨＣＣ）の素因を決定するための方法、ならびにＨＣＣを有するかまたは有すると思われる被験体の予後評価のための方法が開示され、ここで、Ｗｎｔ−１がＨＣＣのバイオマーカーとして使用される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における肝細胞癌の素因（predisposition）をインビトロで決定するための方法であって、
該被験体から採取した肝臓検体を腫瘍部分と非腫瘍部分へ分離すること；
該腫瘍部分と該非腫瘍部分におけるＷｎｔ−１発現のレベルをそれぞれ検出すること；
該腫瘍部分におけるＷｎｔ−１発現の検出レベルを該非腫瘍部分のそれと比較して、比率値を得ること；および
該被験体が、得られた該比率値に基づいて肝細胞癌に素因を有する（predisposed to）か否かを決定すること（ここで、該被験体は、得られた該比率値が１よりも大きい場合、肝細胞癌に素因を有すると決定される）
を包含する、方法。
【請求項２】
前記被験体が、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスの少なくとも１つに感染している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記肝臓検体が、肝内小結節（hepatic nodule）を含む前記被験体の肝臓の部分から採取される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記肝臓検体が、部分切除および右葉切除（right lobectomy）から選択される外科手術によって前記被験体から採取される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記肝臓検体が、肝生検、吸引（aspiration）または腹腔鏡検査によって前記被験体から採取される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記非腫瘍部分のそれと比較した場合の、前記腫瘍部分における前記Ｗｎｔ−１発現の検出レベルの増加が、ＮＦ−κＢ活性化と関連している、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｗｎｔ−１発現のレベルが、Ｗｎｔ−１遺伝子のｍＲＮＡ転写物を定量することによって検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
Ｗｎｔ−１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の定量が、以下の方法：ハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング、および定量的ポリメラーゼ連鎖反応の少なくとも１つを使用して行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｗｎｔ−１発現のレベルがＷｎｔ−１蛋白質を定量することによって検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
Ｗｎｔ−１蛋白質の定量が、以下の方法：ゲル電気泳動、ウェスタンブロッティング、酵素免疫検定法、例えば酵素結合イムノソルベント検定法、放射免疫測定法、免疫組織化学、およびプロテオミクスの少なくとも１つを使用して行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
Ｗｎｔ−１蛋白質の定量が、Ｗｎｔ−１蛋白質に特異的に結合する抗体ベースの結合部分を使用して行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体ベースの結合部分が検出可能なラベルで標識される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ラベルが、放射性ラベル、ハプテンラベル、蛍光ラベル、および酵素ラベルからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体ベースの結合部分が抗体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
肝細胞癌を有するかまたは有すると思われる被験体の予後（prognosis）をインビトロで評価するための方法であって、
該被験体から採取した肝臓検体を腫瘍部分と非腫瘍部分へ分離すること；
該腫瘍部分と該非腫瘍部分におけるＷｎｔ−１発現のレベルをそれぞれ検出すること；
該腫瘍部分におけるＷｎｔ−１発現の検出レベルを該非腫瘍部分のそれと比較して、比率値を得ること；および
得られた該比率値に基づいて該被験体の予後を評価すること（ここで、該被験体は、
（ｉ）得られた該比率値が２より大きい場合、６ヶ月以下の予後；
（ｉｉ）得られた該比率値が１〜２である場合、６〜１８ヶ月の予後；および
（ｉｉｉ）得られた該比率値が１未満である場合、少なくとも１８ヶ月の予後
を有すると評価される）
を包含する、方法。
【請求項１６】
前記被験体が、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスの少なくとも１つに感染している、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記肝臓検体が、肝内小結節（hepatic nodule）を含む前記被験体の肝臓の部分から採取される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記肝臓検体が、部分切除および右葉切除（right lobectomy）から選択される外科手術によって前記被験体から採取される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記肝臓検体が、肝生検、吸引（aspiration）または腹腔鏡検査によって前記被験体から採取される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記非腫瘍部分のそれと比較した場合の、前記腫瘍部分における前記Ｗｎｔ−１発現の検出レベルの増加が、ＮＦ−κＢ活性化と関連している、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｗｎｔ−１発現のレベルが、Ｗｎｔ−１遺伝子のｍＲＮＡ転写物を定量することによって検出される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
Ｗｎｔ−１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の定量が、以下の方法：ハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング、および定量的ポリメラーゼ連鎖反応の少なくとも１つを使用して行われる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｗｎｔ−１発現のレベルがＷｎｔ−１蛋白質を定量することによって検出される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
Ｗｎｔ−１蛋白質の定量が、以下の方法：ゲル電気泳動、ウェスタンブロッティング、酵素免疫検定法、例えば、酵素結合イムノソルベント検定法、放射免疫測定法、免疫組織化学、およびプロテオミクスの少なくとも１つを使用して行われる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
Ｗｎｔ−１蛋白質の定量が、Ｗｎｔ−１蛋白質に特異的に結合する抗体ベースの結合部分を使用して行われる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体ベースの結合部分が検出可能なラベルで標識されている、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ラベルが、放射性ラベル、ハプテンラベル、蛍光ラベル、および酵素ラベルからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体ベースの結合部分が抗体である、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、肝細胞癌（hepatocellular carcinoma）（ＨＣＣ）のバイオマーカーとしてのＷｎｔ−１の発見に関する。該発見に基づいて、本発明は、肝内小結節（hepatic nodule）を有するか有すると思われる被験体、特に、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスの少なくとも１つに感染した者におけるＨＣＣの素因（predisposition）を決定するための方法、ならびにＨＣＣを有するかまたは有すると思われる被験体の予後評価（prognostic evaluation）のための方法を提供し、ここで、Ｗｎｔ−１がＨＣＣのバイオマーカーとして使用される。
【背景技術】
【０００２】
２．関連技術の説明
癌からの生存において最も重要な因子の１つは、早期段階での検出である。癌の早期事象を検出する臨床検査は、癌進行に介入しこれを防止する機会を提供する。遺伝子プロファイリングおよびプロテオミクスの発展に伴って、特定の癌を診断および予後予測する（prognose）ために使用され得る分子マーカーまたは“バイオマーカー”の同定が顕著に進歩した。
【０００３】
例えば、Sanford D. Markowitzらに付与されたUS 5,866,323は、患者の細胞中のＴＧＦ−βについての機能タイプＩＩレセプター（functional type II receptor）（ＲＩＩ）の非存在の検出による、癌の診断または予後予測（prognosis）のための方法を開示している。
【０００４】
John Fruehaufらに付与されたUS 6,303,324 B1は、ヒト癌患者における疾患過程の予後予測を行うための方法を開示しており、該方法は以下の工程を包含する：（ａ）ヒト癌患者から腫瘍のサンプルを得る工程；（ｂ）該腫瘍サンプルにおけるｐ５３蛋白質の核局在のレベルを測定し、そして該腫瘍サンプル中のｐ５３蛋白質の核局在のレベルを比較し、そして該腫瘍サンプル中のｐ５３蛋白質の核局在のレベルと非侵襲性・非転移性腫瘍サンプル中のｐ５３蛋白質の核局在のレベルとを比較する工程；（ｃ）該腫瘍サンプル中のトロンボスポンジン１発現のレベルを測定し、そして非侵襲性・非転移性腫瘍サンプル中のトロンボスポンジン１発現のレベルを比較する工程；（ｄ）腫瘍サンプル中の微小血管新生の程度を免疫組織化学によって測定し、そして該腫瘍サンプル中の微小血管新生の程度と非侵襲性・非転移性腫瘍サンプル中の微小血管新生の程度とを比較する工程；ここで、該予後は、更なる新生物性疾患の可能性を考慮することから予想され、これは、腫瘍サンプルの核局在のレベルが、非侵襲性・非転移性腫瘍サンプル中のｐ５３蛋白質の核局在のレベルよりも大きく；腫瘍サンプル中のトロンボスポンジン１発現のレベルが、非侵襲性・非転移性腫瘍サンプル中のトロンボスポンジン１発現のレベルより低く；ならびに腫瘍サンプル中の微小血管新生の程度が、非侵襲性・非転移性腫瘍サンプル中の微小血管新生の程度よりも大きい場合になされ；そしてここで、該ヒト癌患者は、乳癌または前立腺癌を有する。
【０００５】
Alexander Lopataらに付与されたUS 6,607,894 B1は、子宮洗浄におけるマトリクスメタロプロテイナーゼ−２および／またはマトリクスメタロプロテイナーゼ−９のレベルの測定により、子宮内膜癌の存在および／または危険性を評価するための方法を開示している。該方法は、質的または量的であり得、そして大規模スクリーニングおよび臨床試験に適応可能である
ＵＳ特許出願公開公報20050048542 A1は、癌患者における予後決定のための非侵襲性・量的試験を開示している。試験は、特定のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）または対応の遺伝子発現産物の腫瘍レベルの測定に頼る。これらｍＲＮＡまたは蛋白質レベルは、数的スコアを生じる多項式（アルゴリズム）へ入れられ、これは、再発危険性（再発スコア）または治療への患者応答の可能性（応答スコア）を示している。
【０００６】
WO 2005/071387 A1は、患者から得られる生物学的サンプル中のＡＤＡＭ１２のレベルを評価することによる、上皮起源の癌の診断および予後予測のための方法を開示している。
【０００７】
癌検出の分野において顕著な進歩があるにもかかわらず、臨床適用において容易に使用され得る種々の癌についての新規のバイオマーカーの同定についての必要性が当該分野において依然として存在している。
【０００８】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、それぞれ、世界中で３億５千万および１億７千万を超える人々に感染している（Purcell, R.H. (1993), Gastroenterology, 104:955-963）。両ウイルスは、慢性的に感染された被験体において共通の特徴を共有しており、肝臓における類似の組織病理学的変化、ならびに慢性肝炎から、肝硬変および最終的には肝細胞癌（ＨＣＣ）への共通の臨床的進展（clinical evolution）を含む（S.L. Tsai and Y.F. Liaw (1995), Digest. Surg., 12:7-15; K. Okuda (1992), Hepatology, 15:948-963; S.S. Thorgeirsson and J.W. Grisham (2002), Nature Genet., 31:339-346）。
【０００９】
慢性ウイルス性肝炎を有する患者について、初期ＨＣＣについてのスクリーニグは、治療処置ストラテジーの設定を可能に得、そして抗ウイルス治療は、ＨＣＣの引き続いての発生の危険性を減少させ得る。確立された肝細胞癌を有する患者について、同時の慢性ウイルス性肝炎または肝硬変の存在は、予後および生存に影響を与え得、そして損なわれた肝機能のために治療オプションを変化させ得る。
【００１０】
ＨＣＣについての診断方法における近年の進歩にもかかわらず、予後予測は、依然として、一般的に粗末である。転移性または局所的に進行したＨＣＣを有する患者は、通常、抗癌治療に対する反応性に乏しい。処置していない患者は通常３〜４ヶ月で死亡し、処置した患者は、彼らが治療に応答した場合は、６〜１８ヶ月生存し得る。長期の生存が、場合によっては、非侵襲性癌について、成功した部分的肝切除（successful subtotal hepatectomy）後に見られる。肝臓の正常な代謝および貯蔵機能は損なわれているので、患者は、栄養および出血合併症の危険性がある。進行した肝硬変を有する患者は、一般的に、腫瘍の程度とは無関係に、合併症、例えば、脳障害、静脈溜出血、および敗血症に倒れる。
【００１１】
肝臓切除（hepatic resection）は、この腫瘍の処置の中心のままであり、そして唯一の一貫した長期の生存を提供する（N. Nagasue et al. (2001), British Journal of Surgery, 88:515-522）。現在、肝臓切除は、患者の１０〜１５％についてのみ実行可能である。この低い切除可能率についての理由としては、肝臓切除の任意の形態を排除する、広範囲の局所疾患（extensive local disease）、肝外疾患（extrahepatic disease）の存在および乏しい機能的肝臓リザーブ（poor functional liver reserve）が挙げられる（T.K. Seow et al. (2001),Proteomics, 1:1249-1263）。
【００１２】
ＨＣＣは、それが臨床的に表れる前に、進行した段階に達し得るので、危険性のある個人について、６ヶ月間隔での定期的なスクリーニングが推奨される。これは、腫瘍小結節（tumor nodule(s)）の存在を検出するための肝臓の経腹超音波スキャンの実施および血清腫瘍マーカー  α−フェト−プロテイン（ＡＦＰ）の測定を必要とする（T.K. Seow et al. (2001), Proteomics, 1:1249-1263）。
【００１３】
いくつかの研究は、腫瘍組織（J. Kim et al. (2002), Electrophoresis. 23: 4142-4156; S.O. Lim et al. (2002), Biochem. Biophys. Res. Commun., 291: 1031-1037; K.S. Park et al. (2002), Int. J. Cancer, 97: 261-265）、または患者の血清（F.L. Naour et al. (2002), Mole. Cell. Proteomics., 1:197-203）のいずれかからの、ＨＣＣのプロテーム分析を報告している。全てが、肝細胞癌発生に関連する特異的因子またはＨＣＣの早期診断のための新規の腫瘍マーカーを同定するように試みたが、これらのゴールは到達には遠いようである（R.C.M.Y. Liang et al. (2002), J. Chromatogr. B., 771:303-328; T.K.Seow et al. (2001), Proteomics, 1:1249-1263）。
【００１４】
以前同定されたマーカー、例えば、ＡＦＰ、血清フェリチン、γ−グルタミルトランスペプチダーゼアイソエンザイム、アルカリホスファターゼ、デス−γ−カルボキシプロトロンビン、α−１−アンチトリプシン、アルドラーゼＡ、５’−ヌクレオチドホスホジエステラーゼ、組織ポリペプチド抗原、およびα−１−フコシダーゼ（T.K. Seow et al. (2001), Proteomics, 1:1249-1263）は、ＨＣＣを診断および治療するための努力を促進したが、この腫瘍の診断および治療を更に改善するために、ＨＣＣについての更なるマーカーおよび治療ターゲットの同定についての必要性が、依然として存在している。
【００１５】
Ｗｎｔ遺伝子は、Ｎ−結合グリコシル化（N-linked glycosylation）によって修飾されている、膜内外ドメイン（transmembrane domains）を欠いている、３８−４５ｋＤａの、分泌システインリッチ蛋白質のファミリーをコードする（K.M. Cardigan and R. Nusse (1997), Genes Dev., 11:3286-3305）。これらの分泌Ｗｎｔ蛋白質は、細胞表面上またはその付近の細胞外マトリクス蛋白質に結合し（associate with）、そしてオートクラインまたはパラクライン効果（autocrine or paracrine effects）を発し得る。１９の公知のヒトＷｎｔ遺伝子の第一メンバー、Ｗｎｔ−１は、その腫瘍形成特性のために初めて発見された（R. Nusse and H.E. Varmus (1982), Cell, 31:99-109）。ウイングレス（wingless）、Ｗｎｔ−１のハエ相同体（the fly homolog of Wnt-1）の引き続いての発見は、癌発生遺伝子を含有すると判ったシグナリング経路を組み立てることへの道を開いた（K.M. Cardigan and R. Nusse (1997), Genes Dev., 11:3286-3305; P. Polakis (2000), Genes Dev., 14:1837-1641）。
【００１６】
ヒト癌におけるＷｎｔ遺伝子の過剰発現（overexpression）、および特には過小発現（underexpression）について（K.M. Cardigan and R. Nusse (1997)（前述）; P. Polakis (2000)（前述）; J. Taipale, and P.A. Beachy (2001), Nature, 411: 349-354; D. Kalderon (2002), Trends Cell. Biol., 12: 523-531; Ariel Ruiz i Altaba et al. (2002), Nature Rev. Cancer, 2 (5): 361-370; J.R. Miller, et al. (1999), Oncogene. 18:7860-7872）、ならびに血液学的悪性疾患における無調節の（dysregulated）Ｗｎｔシグナリングについて（F.J.T. Staal and H.C. Clevers (2005), Nature Rev. Immunol., 5: 21-30）の多数の報告が存在する。Ｗｎｔリガンドまたはレセプターをコードする遺伝子の増幅、再配列または突然変異に対するより説得力のある証拠が、例えば、P. Polakis (2000)（前述）; J. Taipale, and P.A. Beachy (2001)（前述）; D. Kalderon (2002)（前述）; Ariel Ruiz i Altaba et al. (2002)（前述）; J.R. Miller, et al. (1999)（前述）において見られ得、ここで、Ｗｎｔ突然変異は、結腸直腸癌の８５％、類腱腫の７４％、およびヘパトブラストーマの６７％において生じると報告された。
【００１７】
核因子κＢ（nuclear factor κB）（ＮＦ−κＢ）は、多くの炎症性および免疫学的蛋白質、例えば、サイトカイン、インターフェロン、主要組織適合遺伝子複合体蛋白質、接着分子、および誘導性一酸化窒素シンテターゼ（inducible nitric oxide synthetase）を調節する、重要な転写因子（transcription factor）である。従って、ＮＦ−κＢは、細胞生理学およびアポトーシスの制御において重要な役割を果たす。ＮＦ−κＢは、Ｒｅｌ蛋白質のダイマーであり、そして通常、２つのサブユニット、ＲｅｌＡ（ｐ６５）およびＮＦκＢ１（ｐ５０）からなる。静止条件下で、ＮＦ−κＢダイマーは、ＮＦ−κＢダイマーが核へ入ることを阻止する阻害κＢ（ＩκＢ）蛋白質との相互作用により、細胞質中で隔離される。該細胞が刺激によって活性化されると、ＩκＢ蛋白質は、リン酸化され、そして迅速に分解する。遊離形態のＮＦ−κＢは、核へ輸送され、そして標的遺伝子のイントロニックエンハンサー（intronic enhancer）と結合し、遺伝子転写を誘発する。
【００１８】
蓄積された証拠は、ＨＢＶ（M. Doria et al. (1995), EMBO J., 14:4747-57; F. Su and R.J. Schneider (1996), J. Virol., 70: 4558-4566; R. Weil et al. (1999), Mol. Cell Biol., 19: 6345-6354; J. Diao et al. (2001), Cytokine Growth F. R., 12:189-205;H. Kim et al. (2001), Biochem. Biophys. Res. Commun., 286:886-894）およびＨＣＶ（D.I. Tai et al. (2000), Hepatology, 31: 656-664; H. Yoshida et al. (2001), J. Biol. Chem., 276: 16399-16405; P. Boya et al. (2001), Hepatology, 34: 1041-48; G. Gong et al. (2001), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98:9599-9604; H. Marusawa et al. (1999), J. Virol., 73: 4713-4720）の両方ともが、核因子−カッパＢ（ＮＦ−κＢ）を活性化し得ることを示している。ＮＦ−κＢの構成的および／または誘導性活性化が、ＨＢＶ陽性細胞系Ｈｅｐ３ＢおよびＨＣＶトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞、ならびにＨＢＶおよびＨＣＶ感染された肝臓組織において確立された（D.I. Tai et al. (2000), Hepatology, 31: 656-664; P.J. Chiao et al. (2002), Cancer, 95:1696-1705; D.I. Tai et al. (2000), Cancer, 89: 2274-2281）。活性化ＮＦ−κＢは、免疫組織学化学的染色、電気泳動移動度シフトアッセイ（electrophoretic mobility shift assay）（ＥＭＳＡ）、およびスーパーシフトアッセイ（supershift assay）によって実証され得る。免疫におけるＮＦ−κＢの重要性は議論の余地が無い（W.C. Sha (1998), J. Exp. Med., 187:143-146; Q. Li (2002), Nature Rev. Immunol., 2:725-734）。最近の証拠は、ＮＦ−κＢおよびその活性化経路はまた、腫瘍発生についても重要であることを示している（D. Hanahan and R.A. Weinberg (2000), Cell, 100:57-70; M. Karin et al. (2002), Nature Rev. Cancer, 2: 301-310; E. Pikarsky et al. (2004), Nature, 431: 461-466; A. Lin and M. Karin (2003), Semin. Cancer Biol., 13: 107-114）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
ＮＦ−κＢ活性化と関連する以前の報告に基づいて、ＨＢＶおよびＨＣＶの両方に共通のＮＦ−κＢ関連肝細胞癌発生（NF-kB-related hepatocarcinogenesis）の可能な機構が存在することが、提案される。この仮説を試験するために、本発明者は、ＨＢＶおよび／またはＨＣＶに感染した患者から採取した対の腫瘍および非腫瘍組織におけるＮＦ−κＢ活性化をそれぞれ分析した。驚くべきことに、本発明者は、より高いレベルのＮＦ−κＢ結合Ｗｎｔ−１蛋白質（NF-kB-associated Wnt-1 protein）が、ＨＢＶおよびＨＣＶの少なくとも１つに感染した患者から採取した対の肝臓検体の非腫瘍部分においてよりも腫瘍部分において検出されるということを見出した。更に、Ｗｎｔ−１の増強された発現が、ＨＢＶおよびＨＣＶの少なくとも１つに感染した患者におけるＨＣＣの発生に臨床的に関連している。
【００２０】
本発明者の知る限りでは、Ｗｎｔ−１がＨＣＣの発生に密接に関連していることは、文献において報告されていない。本発明者の知見に基づいて、Ｗｎｔ−１をＨＣＣのバイオマーカーとして使用する、肝内小結節（hepatic nodule）を有するか有すると思われる被験体、特に、ＨＢＣとＨＣＶの少なくとも１つに感染した者におけるＨＣＣの素因を決定するための方法、ならびにＨＣＣを有するかまたは有すると思われる被験体の予後評価のための方法を開発することが可能である。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
発明の要旨
従って、第一の局面によれば、本発明は、
肝内小結節を有するか有すると思われる被験体における肝細胞癌の素因（predisposition）を決定するための方法であって、
該被験体から採取した肝臓検体を腫瘍部分と非腫瘍部分へ分離すること；
該腫瘍部分および該非腫瘍部分におけるＷｎｔ−１発現のレベルをそれぞれ検出すること；
該腫瘍部分におけるＷｎｔ−１発現の検出レベルを該非腫瘍部分のそれと比較して、比率値を得ること；および
該被験体が、得られた該比率値に基づいて肝細胞癌に素因を有する（predisposed to）か否かを決定すること（ここで、該被験体は、得られた該比率値が１よりも大きい場合、肝細胞癌に素因を有すると決定される）
を包含する方法を提供する。
【００２２】
第二の局面において、本発明は、
肝細胞癌を有するかまたは有すると思われる被験体の予後評価（prognostic evaluation）のための方法であって、
該被験体から採取した肝臓検体を腫瘍部分と非腫瘍部分へ分離すること；
該腫瘍部分および該非腫瘍部分におけるＷｎｔ−１発現のレベルをそれぞれ検出すること；
該腫瘍部分におけるＷｎｔ−１発現の検出レベルを該非腫瘍部分のそれと比較して、比率値を得ること；および
得られた該比率値に基づいて該被験体の予後を評価すること（ここで、該被験体は、
（ｉ）得られた該比率値が２より大きい場合、６ヶ月以下の予後（prognosis）；
（ｉｉ）得られた該比率値が１〜２である場合、６〜１８ヶ月の予後；または
（ｉｉｉ）得られた該比率値が１未満である場合、少なくとも１８ヶ月の予後
を有すると評価される）
を包含する方法を提供する。
【００２３】
本発明の上記および他の特徴および利点は、添付の図面を参照する好ましい実施形態の以下の詳細な説明において明らかとなる。
【００２４】
発明の詳細な説明
本明細書の目的のために、用語“含む（comprising）”は“含むが限定されない（including but not limited to）”を意味し、そして用語“含む（comprises）”は対応の意味を有すると明確に理解される。
【００２５】
先行技術刊行物が本明細書において参照しても、このような参照は、該刊行物が当該分野、台湾または他の国における共通の一般的知識の一部を形成するという承認を構成しないことが理解されるべきである。
【００２６】
別に規定されない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術の当業者によって一般的に理解される意味を有する。
【００２７】
種々の実質性肝臓疾患（parenchymal liver diseases）は、肝炎、線維症、および最終的には肝硬変に至り得る。硬変肝臓は、再生性小結節（regenerative nodules）を含み、そしてまた異形成小結節（dysplastic nodules）ならびに肝細胞癌（ＨＣＣ）を含み得る。１９９５年以来、改変された命名法は、２つのグループに肝内小結節を分類した：再生性病巣（regenerative lesions）および異形成または新生物性病巣（dysplastic or neoplastic lesions）。
【００２８】
異形成または新生物性病巣は、推定されるかまたは証明された遺伝的変性によって引き起こされる異常成長の組織学的特徴を示す肝細胞から構成される。異形成または新生物性小結節は、肝細胞腺腫、異形成病巣（dysplastic foci）、異形成小結節、およびＨＣＣを包含する。
【００２９】
異形成病巣（dysplastic focus）は、直径１ｍｍ未満の肝細胞のクラスターとして規定され、異形成を有するが悪性度について明確な組織学的判定基準を有さない。異形成（dysplasia）は、該病巣を構成する細胞のクラスター内の、核および細胞質変化の存在（例えば、重篤な核異型へ最小量のもの）および増加した量の細胞質脂肪またはグリコーゲンを示す。異形成病巣は、肝硬変において一般的であり、そして非肝硬変肝臓において一般的でない。異形成は、小さいまたは大きい細胞タイプのものであり得る。
【００３０】
異形成小結節（dysplastic nodule）は、少なくとも直径１ｍｍの肝細胞の小結節領域であり、異形成を有するが悪性度について明確な組織学的判定基準を有さない。これらの小結節は、通常、肝硬変肝臓において見られる。異形成小結節は、低グレードまたは高グレードであり得る。低グレード異形成を有する小結節は、変化した肝臓実質細胞構造ならびに増加した核−細胞質比を有する増加した数の細胞を示し得る。高グレード異形成を有する小結節は、サイズおよび形状が可変である核を含有する、肝細胞の層の増加した厚みを示す。
【００３１】
ＨＣＣは、肝細胞性分化（hepatocellular differentiation）を有する細胞から構成される悪性新生物である。小さなＨＣＣは、直径２ｃｍ以下と規定される。ＨＣＣと高グレード異形成小結節とを区別するために使用される判定基準は、明確には規定されていない。ほとんどの小さなＨＣＣは、確信をもって異形成小結節と組織学的に区別することが出来ない。更には、癌の病巣（foci of carcinoma）は、他に良性異形成小結節において見られ得る。
【００３２】
上記説明は、Shahid M. Hussain et al. (2002), RadioGraphics, 22:1023-1039から引用され、この開示は、その全てが、参照によって本明細書中に組み込まれる。
【００３３】
ＨＢＶおよびＨＣＶでの慢性感染は、肝炎、肝硬変、および肝細胞癌（ＨＣＣ）に病因学的に関連する。ウイルスは両方とも、肝細胞においてＮＦ−κＢ活性化を誘発すると報告されている。ＨＢＶおよびＨＣＶの両方に共通のＮＦ−κＢ関連肝細胞癌発生（NF-kB-related hepatocarcinogenesis）の可能な機構を探究するために、本発明者は、ＨＢＶおよびＨＣＶの少なくとも１つに感染した患者から採取した対の腫瘍および非腫瘍肝臓組織において、ＮＦ−κＢ結合蛋白質複合体（NF-kB associated protein complexes）を分析した。ＮＦ−κＢ結合蛋白質の量を、２−ＤＥゲルにおける蛋白質スポット強度（protein spot intensity）によって半定量的に測定した。ＮＦ−κＢシグナリング複合体と関連した蛋白質スポットを、機能的プロテオーム分析（functional proteomics analysis）によって研究した（R. Aebersold and M. Mann (2003), Nature, 422:198-207; E. Phizicky et al. (2003), Nature, 422:208-215）。
【００３４】
本発明の研究プロトコルを図１に図示する。手短に言えば、ＨＢＶおよびＨＣＶの少なくとも１つに感染した患者から採取した対の腫瘍／非腫瘍肝組織を、以下の分析に供した：ＥＭＳＡ／スーパーシフトアッセイ、免疫沈降（ＩＰ）、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２−ＤＥ）、銀染色および／またはＳＹＰＲＯ−Ｒｕｂｙ染色、ＩＰ蛋白質スポットのＭＡＬＤＩ−Ｑ−ＴＯＦ分析、および抗−Ｗｎｔ−１抗体を使用するウェスタンブロッティング。
【００３５】
図６を参照して、抗−ｐ５０および／または抗−ｐ６５を使用してＩＰで処理した２−ＤＥゲル上においてポジティブに染色されたものに等しい２０個の蛋白質スポットを、ImageMaster 2D Platinum Software, version 5.0 (Amersham Biosciences)を組み合わせたTyphoon 9200 ImageMaster (Amersham Biosciences)を使用して、任意に選択しそして共にマッピングした。
【００３６】
別の２−ＤＥゲルを、図６の銀染色した２−ＤＥゲルについて使用したものと同一の条件下で実行した。ＳＹＰＲＯ−Ｒｕｂｙ染色後、図６に示されるそれらのスポットに対応する２０個の蛋白質スポットを、イン−ゲルトリプシン消化（in-gel trypsin digestion）に供し、続いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計を使用して質量分析を行った。
【００３７】
これらの分析した２０個の蛋白質スポットのうち、“ＭＩ２０５４３４”と呼ばれる蛋白質スポットは、ＭＡＬＤＩ  ＰＭＦ分析によるデータベースサーチ結果（後述の表３を参照のこと）、抗−ヒトＷｎｔ−１を使用するＨＣＣ患者番号１および５の対の検体の２−ＤＥウェスタンブロット分析からの実験結果（図１１を参照のこと）、ならびに８個の更なるＨＣＣ患者からの検体の１−ＤＥウェスタンブロットにおけるデンシトメトリー分析からの実験結果（即ち、患者番号１０〜１７、図１２を参照のこと）に基づいて、Ｗｎｔ−１蛋白質（ＮＣＢＩアクセッションナンバーＰ０４６２８）であると示唆された。
【００３８】
本発明者の結果は、ＨＢＶおよび／またはＨＣＶに感染した患者から採取した対の肝臓検体の腫瘍および非腫瘍部分におけるＮＦ−κＢの構成的活性化（constitutive activation）を明らかにした。更に、驚くべきことに、より高いレベルのＮＦ−κＢ結合Ｗｎｔ−１蛋白質が、ＨＢＶおよびＨＣＶの少なくとも１つに感染した９人の患者（即ち、後述の表１に列挙されるＨＣＣ患者番号１〜９）から採取した対の肝臓検体の非腫瘍部分よりも腫瘍部分において検出されることが判明した。更に、Ｗｎｔ−１の増強された発現は、ＨＢＶおよびＨＣＶの少なくとも１つに感染したこれら９人の患者において、ＨＣＣの発生に臨床的に関連している。ＮＦ−κＢ結合Ｗｎｔ−１蛋白質（NF-kB-associated Wnt-1 protein）の観察された増強された発現は、更に、８個の更なる対のＨＣＣ検体（即ち、患者番号１０〜１７、図１２を参照のこと）のイムノブロット分析によって立証された。本発明者の研究は、ＮＦ−κＢ結合Ｗｎｔ−１蛋白質の増強された発現は、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎関連肝細胞癌発生の共通事項（common denominator）であり得ることを示唆している。従って、ＮＦ−κＢおよびＷｎｔ−１蛋白質は、ＨＣＣの処置および肝細胞癌発生の化学的予防のために非常に有効な治療剤を設計することにおける潜在的な標的として使用され得る。
【００３９】
更には、術後１年以内で検出された肝臓内拡散（intrahepatic spread）、早期の再発、門脈腫瘍血栓症（portal vein tumor thrombosis）、および遠位転移（distant metastases）を、悪い予後（poor prognosis）と分類した。今までのところ研究された４２人のＨＣＣ患者において、高レベルのＷｎｔ−１発現（腫瘍／非腫瘍≧２）は、外科手術治療を受けたこれらの患者において悪い予後に関連した。
【００４０】
従って、本発明によれば、肝内小結節を有するかまたは有すると思われる被験体における肝細胞癌の素因（predisposition）を決定するための方法であって、
該被験体から採取した肝臓検体を腫瘍部分と非腫瘍部分へ分離すること；
該腫瘍部分および該非腫瘍部分におけるＷｎｔ−１発現のレベルをそれぞれ検出すること；
該腫瘍部分におけるＷｎｔ−１発現の検出レベルを該非腫瘍部分におけるそれと比較して、比率値を得ること；および
該被験体が、得られた該比率値に基づいて肝細胞癌に素因を有する（predisposed to）か否かを決定すること（ここで、該被験体は、得られた該比率値が１よりも大きい場合、肝細胞癌に素因を有すると決定される）
を包含する方法が提供される。
【００４１】
本発明によれば、試験される被験体は、肝臓問題を有している患者、特にＢ型肝炎ウイルスとＣ型肝炎ウイルスの少なくとも１つに感染した者である。
【００４２】
本発明によれば、該被験体に存在する肝内小結節（hepatic nodule）は、臨床プラクティスにおいて広く使用される種々の身体検査、例えば、超音波、コンピュータ連動断層撮影（ＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）などによって検出され得る。肝内小結節はそれ自体臨床的に検出され得るが、肝内小結節が良性または前悪性または悪性であるかを決定することが依然として必要であり得る。
【００４３】
本発明によれば、肝臓検体は、好ましくは、肝内小結節を含有する被験体の肝臓の部分から採取される。
【００４４】
本発明によれば、該肝臓検体は、部分切除および右葉切除（right lobectomy）から選択される外科手術によって、あるいは肝生検（liver biopsy）、吸引（aspiration）または腹腔鏡検査によって、該被験体から採取される。次いで、該肝臓検体を、該検体に含まれる肝臓組織の全体的外観（gross appearances）に基づいて、腫瘍部分および非腫瘍部分に分離する。
【００４５】
本発明の研究によれば、該非腫瘍部分におけるそれと比較した場合の、該腫瘍部分における該Ｗｎｔ−１発現の検出レベルの増加が、ＮＦ−κＢ活性化と関連している。
【００４６】
Ｗｎｔ−１発現のレベルは、当業者に公知の手段によって測定され得る。本発明によれば、一般的に、抗体、または抗体等価物を使用して、肝臓検体におけるＷｎｔ−１発現のレベルを検出することが好ましい。しかし、ｍＲＮＡ転写物（mRNA transcripts）の分析によってＷｎｔ−１発現を測定することのような、Ｗｎｔ−１発現の検出のための他の方法もまた使用され得る。
【００４７】
ｍＲＮＡのレベルを評価するための方法は、当業者に周知である。例えば、Ｗｎｔ−１遺伝子のｍＲＮＡ転写物を定量することは、以下の方法の少なくとも１つを使用して行われ得る：ハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）など。
【００４８】
例として、ノーザンブロッティングと関連して、ＲＮＡの調製は、変性アガロースゲンル上において実行され、そして適切な支持体（例えば、活性化セルロース、ニトロセルロースまたはガラスまたはナイロン膜）へ移される。次いで、標識された（例えば、放射標識された）ｃＤＮＡまたはＲＮＡを、該調製物へハイブリダイズさせ、洗浄し、そしてオートラジオグラフィーのような方法によって分析する。ＲＮＡ転写物の検出のための別の一般的なアプローチは、ＲＴ−ＰＣＲであり、これは、ｃＤＮＡへｍＲＮＡを逆転写し、続いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことを包含する。あるいは、ｍＲＮＡ発現は、ＤＮＡアレイ、チップまたはマイクロアレイにおいて検出され得る。ＤＮＡアレイを作製する方法およびそれらの使用方法は、当該分野において周知である（例えば、US 6,618,679、US 6,379,897、US 6,664,377、US 6,451,536およびUS 6,548,257を参照のこと）。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態において、Ｗｎｔ−１発現のレベルは、以下の方法の少なくとも１つを使用して、Ｗｎｔ−１蛋白質を定量することによって測定される：ゲル電気泳動、ウェスタンブロッティング、酵素免疫検定法、例えば、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法、免疫組織化学、プロテオミクスなど。
【００５０】
本発明の好ましい実施形態において、Ｗｎｔ−１蛋白質の定量は、Ｗｎｔ−１蛋白質に特異的に結合する抗体ベースの結合部分（antibody-based binding moiety）を使用して行われる。本発明のより好ましい実施形態において、該抗体ベースの結合部分は、放射性ラベル、ハプテンラベル、蛍光ラベル、および酵素ラベルからなる群から選択される、検出可能なラベルで標識される。
【００５１】
用語“抗体ベースの結合部分”または“抗体”は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な決定基、例えば、Ｗｎｔ−１蛋白質に特異的に結合する（これと免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を包含する。用語“抗体ベースの結合部分”は、任意のアイソタイプの全ての抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥなど）を包含するように意図され、そしてまたＷｎｔ−１蛋白質と特異的に反応性であるそのフラグメントを包含する。
【００５２】
抗体は、従来の技術を使用してフラグメント化され得る。従って、用語“そのフラグメント”は、特定の蛋白質と選択的に反応し得る、蛋白質分解的に切断された（proteolytically-cleaved）または組換え的に調製された（recombinantly-prepared）抗体分子部分のセグメントを包含する。このような蛋白質分解および／または組換えフラグメントの非限定的な例は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｄａｂ（dabs）およびペプチドリンカーによって連結されたＶＬおよびＶＨドメインを含有する一本鎖抗体（single chain antibodies）（ｓｃＦｖ）を包含する。該ｓｃＦｖは、共有結合または非共有結合されて２以上の結合部位を有する抗体を形成し得る。
【００５３】
用語“抗体ベースの結合部分”は、ポリクローナル、モノクローナル、または抗体および組換え抗体の他の精製調製物を包含する。用語“抗体ベースの結合部分”は、更に、ヒト化抗体、二重特異的（bi-specific）抗体、および抗体分子から誘導される少なくとも１つの抗原結合決定基を有するキメラ分子を包含するように意図される。
【００５４】
好ましい実施形態において、該抗体ベースの結合部分は、検出可能に標識される。本明細書中で使用される場合、“標識された抗体（labeled antibody）”は、検出可能な手段によって標識されている抗体を含み、そして酵素的に、放射活性的に、蛍光的に、および化学発光的に標識されている抗体を含むが、これらに限定されない。抗体はまた、ｃ−Ｍｙｃ、ＨＡ、ＶＳＶ−Ｇ、ＨＳＶ、ＦＬＡＧ、Ｖ５、またはＨＩＳのような、検出可能なタグ（tag）で標識され得る。
【００５５】
Ｗｎｔ−１の検出のために抗体ベースの結合部分を使用する本発明の方法において、肝臓検体中に存在するＷｎｔ−１蛋白質のレベルは、検出可能に標識された抗体から発せられたシグナルの強度に相関する。
【００５６】
１つの好ましい実施形態において、抗体ベースの結合部分は、抗体を酵素へ連結することによって、検出可能に標識される。次いで、酵素は、その基質へ暴露されると、例えば、分光測光的、蛍光測定的または可視的手段によって、検出可能であり得る化学部分を生成する様式で、該基質と反応する。本発明の抗体を検出可能に標識するために使用され得る酵素としては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ（delta-V- steroid isomerase）、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホースラディシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アルパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−ＶＩ−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。化学発光は、抗体ベースの結合部分を検出するために使用され得る別の方法である。
【００５７】
検出はまた、種々の他の免疫測定法を使用して達成され得る。例えば、抗体を放射性標識することによって、放射免疫アッセイ（radioimmune assays）の使用により該抗体を検出することが可能である。放射性同位体は、ガンマカウンターまたはシンチレーションカウンターの使用のような手段によって、あるいはオートラジオグラフィーによって、検出され得る。本発明の目的のために特に有用である同位体は、３Ｈ、３１Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、および１２５Ｉである。
【００５８】
蛍光性化合物で抗体を標識することも可能である。蛍光的に標識された抗体を好適な波長の光へ暴露すると、その存在は、蛍光に起因して検出され得る。最も一般的に使用される蛍光標識化合物は、中でも、ＣＹＥ色素、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリセリン（phycoerytherin）、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタアルデヒド（o-phthaldehyde）およびフルオレスカミンである。抗体はまた、１５２Ｅｕ、またはランタニド系の他のもののような蛍光発光金属（fluorescence emitting metals）を使用して検出可能に標識され得る。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート基（metal-chelating groups）を使用して、抗体へ結合され得る。抗体はまた、それを化学発光化合物へカップリングすることによって、検出可能に標識され得る。次いで、化学発光−抗体の存在は、化学反応の過程の間に生じる発光の存在を検出することによって測定される。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、ルシフェリン、イソルミノール（isoluminol）、テロマティックアクリジニウムエステル（theromatic acridinium ester）、イミダゾール、アクリジニウム塩およびオキサレートエステルである。
【００５９】
上述されるように、Ｗｎｔ−１蛋白質の量またはレベルは、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、イムノラジオメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ）、ウェスタンブロッティング、または免疫組織化学のような、免疫アッセイによって検出され得る。抗体アレイまたはプロテインチップもまた使用され得る（例えば、米国特許第6,329,209号および第6,365,418号；ならびに米国特許出願公開公報第20030013208A1号、第20020155493A1号および第20030017515A1号を参照のこと）。
【００６０】
プロテオミクスは、典型的に、以下の工程を包含する：（１）２−Ｄゲル電気泳動（２−Ｄ  ＰＡＧＥ）によるサンプル中の個々の蛋白質の分離；（２）例えば質量分析またはＮ末端配列決定（N-terminal sequencing）による該ゲルから回収された個々の蛋白質の同定；ならびに（３）バイオインフォマティックスを使用する該データの分析。プロテオミクス方法は、遺伝子発現プロファイリングの他の方法の有用な補足であり、そして本発明に従うＨＣＣのバイオマーカーのプロダクトを検出するために、単独でまたは他の方法と組み合わせて使用され得る。
【００６１】
質量分析法は、当該分野において周知であり、そして生体分子（例えば、蛋白質）を定量および／または同定するために使用されている。従って、本発明の方法において、Ｗｎｔ−１蛋白質はまた、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ（飛行時間型（time-of-flight））、ＳＥＬＤＩ／ＴＯＦ、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）、高速液体クロマトグラフィー−質量分析（ＨＰＬＣ−ＭＳ）、キャピラリー電気泳動−質量分析、核磁気共鳴分光測定、またはタンデム質量分析（tandem mass spectrometry）（例えば、ＭＳ／ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＴ−ＭＳ／ＭＳなど）のような質量分析法を使用して検出され得る。例えば、米国特許出願公開公報第20030199001号、20030134304号、20030077616号を参照のこと（これらは、参照により本明細書中に組み込まれる）。
【００６２】
本発明によれば、肝細胞癌を有するかまたは有すると思われる被験体の予後評価（prognostic evaluation）のための方法であって、
該被験体から採取した肝臓検体を腫瘍部分と非腫瘍部分へ分離すること；
該腫瘍部分および該非腫瘍部分におけるＷｎｔ−１発現のレベルをそれぞれ検出すること；
該腫瘍部分におけるＷｎｔ−１発現の検出レベルを該非腫瘍部分におけるそれと比較して、比率値を得ること；および
得られた該比率値に基づいて該被験体の予後を評価すること（ここで、該被験体は、
（ｉ）得られた該比率値が２より大きい場合、６ヶ月以下の予後（prognosis）；
（ｉｉ）得られた該比率値が１〜２である場合、６〜１８ヶ月の予後；または
（ｉｉｉ）得られた該比率値が１未満である場合、少なくとも１８ヶ月の予後
を有すると評価される）
を包含する方法もまた提供される。
【００６３】
肝細胞癌を有するかまたは有すると思われる被験体の予後を評価するための方法の局面に関する詳細および細部は、上記で議論される被験体における肝細胞癌の素因を決定するための方法の局面のそれらと実質的に同一であると理解され、そしてこれは、適切である場合は、肝臓検体、分析などに関する上記の記載は、肝細胞癌を有するかまたは有すると思われる被験体の予後を評価するための方法の局面に必要な変更を加えて適用されることを意味する。
【００６４】
本発明の予後予測方法（prognostic method）は、ＨＣＣを有するかまたは有すると思われる患者についての処置の適切なコースを決定するために有用である。処置のコースは、癌についての診断後または処置後に患者について採用される治療手段（therapeutic measures）をいう。例えば、癌再発、拡散、または患者生存についての可能性の決定は、治療へのより保存的なまたはより根治的なアプローチが採用されるべきかどうか、あるいは処置モダリティ（treatment modalities）を組み合わせるべきかどうかを決定するに役立ち得る。例えば、癌再発の可能性がある場合、化学療法、放射線、免疫療法、生物学的修飾物質治療（biological modifier therapy）、遺伝子治療、ワクチンなどでの外科的処理を先行するかまたは追随すること、あるいは患者が処置される期間を調節することが、有利であり得る。
【００６５】
本発明はまた、肝内小結節を有するかまたは有すると思われる被験体におけるＨＣＣの診断（素因）および／または予後予測（prognosis）のための診断キットの製造を考え、ここで、Ｗｎｔ−１発現のレベルを定量し得る試薬が含まれる。
【００６６】
本発明は、以下の実施例によって更に説明される。しかし、以下の実施例は、例示目的のためのみに意図され、そして実際に本発明を限定すると解釈されるべきではないことが理解される。
【実施例】
【００６７】
実施例
材料および方法：
１．肝臓組織サンプルの収集：
インフォームドコンセントを、本発明において研究される被験体の各々から、彼らの肝臓組織の寄贈について得、そして本発明の研究プロトコルは、1975 Declaration of Helsinkiの倫理指針に適合した。
【００６８】
Chi-Mei Medical Center（台南、台湾）およびChang-Gung Memorial Hospital（タオエン（Taoyen）、台湾）において肝臓腫瘍の外科的処理を受けた９人のＨＣＣ患者（患者番号１〜９）の新鮮な切除検体を、手術直後、腫瘍および非腫瘍部分に分離した。表１は、これら９人の患者の臨床的特徴（clinical features）を要約している。The Tumor and Serum Bank of Chi-Mei Medical Centerから得た８個の更なる対のＨＣＣ検体（患者番号１０〜１７）を、同様に、腫瘍および非腫瘍部分へ分離し、そして検証のために研究した。全てのＨＣＣ検体を、実験前、−７０℃で保存した。
【００６９】
【表１】
2007139742.tif 000002
【００７０】
２．肝臓組織からの蛋白質サンプルの調製：
蛋白質を、研究下のＨＣＣ検体から抽出した。２つのグループの実験を並行して行い、一方は、腫瘍および非腫瘍部分に予め分割された各々の対のＨＣＣ検体について個々に実行し、そして他方は、９個の対のＨＣＣ検体の腫瘍および非腫瘍部分のプールされた総蛋白質についてそれぞれ行った。
【００７１】
サンプルは、実験の間中ずっと氷上で維持した。腫瘍および非腫瘍部分に分離された個々のＨＣＣ検体の各々について、０．０６〜０．０８ｇの凍結肝臓組織を、液体窒素と共に冷却されたステンレススチール乳鉢および乳棒を使用して粉末に砕いた。得られた組織粉末を、５ｍＬの溶解緩衝液（lysis buffer）（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％ＣＨＡＰＳ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、および１ｍＭ ＰＭＳＦ）と混合し、そしてこのようにして得られた混合物を、４℃で１時間、Ｐｏｔｔｅｒタイプホモジナイザーを使用してホモナイゼーションに供した。破壊されていない細胞および結合組織を、４℃で３時間、２１，０００×ｇでの遠心分離によって、該ホモジネートから除去した。上澄みを回収し、そして使用まで−７０℃で保存した。
【００７２】
回収した上澄みの蛋白質濃度を、ＰｌｕｓＯｎｅＴＭ２−Ｄ  Ｑｕａｎｔ  Ｋｉｔ（Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ, USA）を使用して定量した。５ｍＬ溶解緩衝液中の０．２ｇの凍結肝臓組織は、５〜１０ｍｇ／ｍＬの最終蛋白質濃度を与えた。このようにして調製された蛋白質サンプルを、免疫沈降および２−ＤＥ電気泳動実験において使用した。
【００７３】
他方で、引き続いての１−ＤＥ電気泳動実験において使用した蛋白質サンプルを、以前に記載されたＢｒａｄｆｏｒｄ蛋白質アッセイ（Bradford protein assay）によって定量した。
【００７４】
３．ＥＭＳＡおよびスーパーシフトアッセイ：
核および細胞質蛋白質抽出物を、標準プロトコルに従って調製した（S.M. Abmayr and J.L. Workman (1991), Preparation of nuclear and cytoplasmic extracts from mammalian cells. In: Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman J.G., Smith, J.A., and Struhl, K. eds., Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley & Sons; 12.1.1-12.1.9）。
【００７５】
該ＨＣＣ検体の腫瘍および非腫瘍部分についてのＮＦ−κＢの電気泳動移動度シフトアッセイ（Electrophoretic mobility shift assay）（ＥＭＳＡ）およびスーパーシフトアッセイ（supershift assay）を、以前に記載された手順（D.I. Tai et al. (2000), Hepatology, 31:656-664; および D.I. Tai et al. (2000), Cancer, 89:2274-2281）に従って行った。
【００７６】
４．ＮＦ−κＢ結合蛋白質複合体の免疫沈降：
上述の９個の対のＨＣＣ検体の腫瘍および非腫瘍部分から調製した該蛋白質サンプルの各々（５００μｇ）を、１ｍＬの再水和緩衝液（rehydration buffer）（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％ＣＨＡＰＳ、０．５％ＩＰＧ緩衝液および数滴のブロモフェノールブルー）に溶解し、続いて、４℃で１．５時間、抗−ＮＦ−κＢ  ｐ５０抗体（抗−ｐ５０）または抗−ＮＦ−κＢ  ｐ６５抗体（抗−ｐ６５）（Biogenesis, Poole, UK）のいずれか１０μＬと混合した。得られた免疫複合体、即ち、ＮＦ−κＢ結合蛋白質複合体（NF-kB-associated protein complexes）を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭＣＬ−４Ｂビーズ（Amersham Biosciences）により製造業者の使用説明書に従って回収した。
【００７７】
５．二次元電気泳動（２−ＤＥ）：
表１（前述）に列挙される９人のＨＣＣ患者の検体の腫瘍部分から回収された免疫複合体を、プールし、次いで、標準プロトコル（P.H. O’Farrell (1975), J. Biol. Chem., 250:4007-4021）および以前に記載される詳細な手順（C.L. Lee et al. (2003), Proteomics, 3:2472-2486）に従って、変性条件下、１２．５％ポリアクリルアミドゲルを使用して二次元電気泳動（２−ＤＥ）分析に供した。
【００７８】
本発明の実験において、免疫沈降から回収された該ＮＦ−κＢ結合蛋白質複合体に加えて、表１（前述）に列挙される９人のＨＣＣ患者の検体の腫瘍および非腫瘍部分からの総蛋白質を、並行して実験した。
【００７９】
６．銀染色：
蛋白質スポット可視化を提供するために質量分析と適合性である、改変した銀染色法（modified silver staining method）を、本発明の研究プロトコルにおいて使用した（C.L. Lee et al., (2003), Proteomics, 3:2472-2486）。簡単に言えば、２−ＤＥ後のポリアクリルアミドゲルを、３０分間、水中５０％メタノール／１０％酢酸において固定し、続いて１５分間５％メタノール中でインキュベートした。その後、２−ＤＥゲルを、各々５分間、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で３回洗浄し、次いで、正確に２分間、新たに調製した０．０２％チオ硫酸ナトリウムで敏感にし、続いて、各々３０秒間、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で３回洗浄した。その後、該２−ＤＥゲルを、２５分間、０．２％硝酸銀で処理し、そして各々１分間、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で３回リンスした。該２−ＤＥゲルを次いで、３％炭酸ナトリウム、０．０１８％ホルムアルデヒドおよび０．０２％チオ硫酸ナトリウムを含む発色溶液（developer solution）に浸漬した。染色の所望の強度は、３〜４分間発色溶液中に２−ＤＥゲルを浸漬後に達成された。発色（development）を、１０分間の１．４％ＥＤＴＡナトリウムの添加によって停止し、そして次いで該２−ＤＥゲルを、各々２分間、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で２回リンスした。
【００８０】
７．ＳＹＰＲＯ−Ｒｕｂｙ染色：
２−ＤＥ電気泳動を、上記のものと同一の条件下、別の１２．５％ポリアクリルアミドゲル上において実行した。その後、該ゲルを、３０分間、水中１０％メタノール／７％酢酸において固定し、続いて５分間水で各々３回洗浄した。最大感度を得るために、該ゲルを、少なくとも３時間、製造業者の使用説明書に従って、ＳＹＰＲＯ−Ｒｕｂｙ溶液（Molecular Probes, Eugene, OR, USA）と共にインキュベートした。バックグラウンド蛍光を減少させそして感度を増加させるために、該染色されたゲルを、３０分間、水中１０％メタノール／７％酢酸で洗浄した。
【００８１】
８．画像記録および分析：
銀染色後、２−ＤＥゲルを、各々５分間水で２回リンスし、その後、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ９２００  ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ（Amersham Biosciences）においてスキャンした。画像分析および２−ＤＥゲルプロテオームデータベースマネージメントを、ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ  ２Ｄ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０（Amersham Biosciences）を使用して行った。２−ＤＥマーカーの理論的ＭｒおよびｐＩ値を使用して、２−ＤＥゲルにおける蛋白質スポットのＭｒおよびｐＩ値を較正した。強度レベルを、全ゲルについて検出された総蛋白質強度の割合として、ゲル間で標準化し、そして各スポットの蛋白質量を、スポット領域上の密度を積分するによって算出した（C.L. Lee et al. (2003), Proteomics, 3: 2472-2486; M.J. Hubbard and N.J. McHugh (2000), Electrophoresis, 21: 3785-3796）。
【００８２】
９．質量分析：
ＳＹＰＲＯ−Ｒｕｂｙ染色された２−ＤＥゲルを、イン−ゲルトリプシン消化（in-gel trypsin digestion）に供した。その後、トリプシン消化ペプチド（Tryptic peptides）を、該染色された２−ＤＥゲル上の選択された蛋白質スポットから得、次いで、以前に記載されたリフレクトロンポジティブイオンモード（reflectron positive ion mode）（C.L. Lee et al. (2003), Proteomics, 3:2472-2486;J. Kim et al. (2002), Electrophoresis, 23:4142-4156）において操作される、マトリクス支援レーザー脱離／イオン化  四重極−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−Ｑ−ＴＯＦ）（matrix-assisted laser desorption/ionization quadrupole-time of flight）質量分析計（M@LDITM; Micromass, Manchester, UK）を使用して、ＭＡＬＤＩペプチドマスフィンガープリンティング（MALDI peptide mass fingerprinting）（ＰＭＦ）に供した。簡単に言えば、サンプルを、６０％ＡＣＮ／１％ＴＦＡ中α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）の飽和マトリクス溶液を使用して、９６ウエルフォーマットＭＡＬＤＩターゲットプレート上へスポットした。器機を、標準ペプチド混合物で外部から較正し、そして更に、近点較正物質（near-point calibrant）として副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）を使用してロックマスフィーチャー（lock mass feature）で調節した。質量スペクトルを、９００〜３０００Ｄａの質量範囲について獲得し、そしてＭＡＳＣＯＴプログラムを使用してＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベースに対するＰＭＦサーチのためにＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘＴＭソフトウェアによって自動で処理した（A.I. Nesvizhskii and R. Aebersold (2004), Drug Disc. Today, 9:173-181）。サーチパラメータは、１つの失われた切断（one missed cleavage）、メチオニンの酸化、Ｎ末端アセチル化、およびシステインのカルボキサミド−メチル化を考慮に入れた。蛋白質のポジティブ同定は、５０ｐｐｍまたはそれより良好な質量精度での少なくとも５つのマッチングペプチド質量を必要とした。
【００８３】
１０．Ｗｎｔ−１蛋白質の１−ＤＥおよび２−ＤＥウェスタンブロット分析：
分析１−ＤＥおよび２−ＤＥゲルを、標準手順に従って、Ｗｎｔ−１蛋白質のウェスタンブロット分析のためにＰＶＤＦ膜（Hybond P, Amersham Biosciences）上に電気移動させ（electrotransferred）、ここで、使用した一次抗体は、ビオチン結合ウサギ抗−ヒトＷｎｔ−１抗体（ZYMED Lab. Inc., CA）であり、そして使用した二次抗体は、ＨＲＰ結合マウス抗−ウサギＩｇＧ（Amersham Pharmacia Biotech, NJ, USA）であった。その後、ＰＶＤＦ膜を、増強された化学発光検出システム（ECLplus, Amersham Biosciences）で処理し、続いて３〜１５分間オートラジオグラフィーフィルムへ暴露した。Ｗｎｔ−１蛋白質の発現レベルを、ImageMaster TotalLab, Version 2.01（Amersham Pharmacia Biotech, NJ, USA）を使用して、該フィルム上で半定量的に評価した。
【００８４】
結果：
１．ＨＢＶ−およびＨＣＶ−関連ＨＣＣ腫瘍および非腫瘍組織におけるＮＦ−κＢの構成的活性化：
ＨＶＢおよびＨＣＶ関連ＨＣＣ肝臓検体の腫瘍および非腫瘍部分におけるＮＦ−κＢの活性化を、ＥＭＳＡによって、単独でまたはスーパーシフトアッセイと組み合わせて、分析した。詳細には、表１に列挙されるＨＣＣ患者番号１〜９の検体の腫瘍および非腫瘍部分からの核蛋白質サンプルを、ＮＦ−κＢについてのプローブとして抗−ｐ５０を使用して、ＥＭＳＡへ、単独でまたはスーパーシフトアッセイと組み合わせて供した。図２は、抗−ｐ５０でプローブした場合の、ＨＣＣ患者番号１〜７の検体の腫瘍および非腫瘍部分からの核蛋白質サンプルのＥＭＳＡおよびスーパーシフトアッセイ結果を示しており、一方、図３は、ＨＣＣ患者番号８および９の検体の腫瘍および非腫瘍部分からの核蛋白質サンプルのＥＭＳＡ結果を示している。別のＥＭＳＡ実験を、本発明の研究の更なる検証のために、１つの対のＨＣＣ腫瘍および非腫瘍組織、胆石の胆嚢切除の間の肝生検からの１つの正常な肝臓コントロール、ならびに患者番号１０〜１７の８個の更なる検体のうち５つからの腫瘍組織を使用して行った（データは示さず）。
【００８５】
シフトしたバンドの特異性を、D.I. Tai et al. (2000), Hepatology, 31:656-664に記載される手順に従って行われたＥＭＳＡ実験において使用した変異プローブ（mutant probe）および５０倍過剰量の野生型コールドプローブ（wild-type cold probe）との競合研究によって確かめた。スーパーシフト研究は、ＨＢＶおよびＨＣＶ感染した肝臓における活性化ＮＦ−κＢバンドは、抗−ｐ５０でのスーパーシフトを受けることを示した（図２を参照のこと）。抗−ｐ６５でのスーパーシフト実験は、同様の結果を示した（データは示さず）。ＨＢＶおよびＨＣＶの両方に感染した肝臓のシフトバンドは、過剰量野生型コールドプローブによってほとんど完全に無効にされたが（データは示さず）、変異プローブとの競合時に変化されなかった（データは示さず）。
【００８６】
文献において、多数の因子または蛋白質がＮＦ−κＢ活性化に関連していると報告されている（W.C. Sha (1998), J. Exp. Med., 187:143-146; Q. Li and I.M. Verma (2002), Nature Rev. Immunol., 2:725-734; D. Hanahan and R.A. Weinberg (2000), Cell, 100:57-70; M. Karin et al. (2002), Nature Rev. Cancer, 2:301-310; E. Pikarsky et al. (2004), Nature, 431: 461-466; A. Lin and M. Karin (2003), Semin. Cancer Biol., 13: 107-114）。従って、腫瘍部分におけるＮＦ−κＢ活性化は、同一患者の非腫瘍部分におけるそれよりも必ずしも顕著であるとは限らない。図２および３において示されるＥＭＳＡおよびスーパーシフトアッセイ結果は、ＮＦ−κＢの構成的活性化が、表１に列挙されるＨＢＶおよび／またはＨＣＶに感染した患者番号１〜９の対の検体の腫瘍および非腫瘍部分中に存在することを明らかにしている。
【００８７】
２．免疫沈降（ＩＰ）無しまたは有りでのＮＦ−κＢ結合蛋白質複合体の２−ＤＥ：
表１に列挙される９人のＨＣＣ患者の検体の腫瘍部分から抽出された蛋白質を、それぞれ、抗−ｐ５０または抗−ｐ６５のいずれかを使用する免疫沈降（ＩＰ）へ供し、そして該９人のＨＣＣ患者の蛋白質サンプル中の得られたＮＦ−κＢ結合蛋白質複合体を、回収しそして共にプールし、２−ＤＥ分析を実行し、続いて銀染色を行った。図４は、抗−ｐ５０によってプローブされたＮＦ−κＢ結合蛋白質複合体のプロテオームプロフィールを示しており、一方、図５は、抗−ｐ６５によってプローブされたＮＦ−κＢ結合蛋白質複合体のプロテオームプロフィールを示している。
【００８８】
別の実験を、表１に列挙される９人のＨＣＣ患者の検体の腫瘍部分からのプールされた総蛋白質をＩＰ無しで直接２−ＤＥ分析に供し、続いて銀染色を行うことによって、並行して行った。結果を図６に示す。
【００８９】
図６を参照して、抗−ｐ５０および／または抗−ｐ６５を使用するＩＰで処理された２−ＤＥゲル上においてポジティブに銀染色されたものに等しい２０個のスポットを、任意に選択しそして共にマッピングした。これら２０個のスポットを、引き続いての実験における分析のために選択した。
【００９０】
３．蛋白質スポットの質量分析：
別の２−ＤＥゲルを、銀染色した２−ＤＥゲルのために使用したものと同一の条件下で実行した。ＳＹＰＲＯ−Ｒｕｂｙ染色後、図６に記載のスポットに対応する２０個の蛋白質スポットを、イン−ゲルトリプシン消化に供し、続いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計を使用して質量分析を行った。
【００９１】
図７は、これら２０個の選択されたスポットの質量分析結果を示している。更には、これら２０個の蛋白質スポットの質量分析後に得られたデータベースサーチ結果は、ＩＰ蛋白質の２−ＤＥプロフィールにおけるいくつかのスポットが、抗−ＮＦ−κＢ抗体の重鎖または軽鎖の誘導体であり得るという可能性を排除した（ruled out）（データは示さず）。
【００９２】
４．ＨＢＶおよび／またはＨＣＶ関連ＨＣＣ患者からの肝臓検体の腫瘍および非腫瘍部分におけるスポットＭＩ２０５４３４の量比較およびイムノブロット分析：
図６の銀染色された２−ＤＥゲルから選択された２０個の蛋白質スポットを、半質量的に測定した。該９個の対のＨＣＣ検体の腫瘍部分と非腫瘍部分との間に、該蛋白質スポットの発現レベルの点で、差異があるということは、驚くべきことであった。特に、スポットＭＩ２０５４３４について、その測定された値は、該９個の対のＨＣＣ検体のうち７個で、少なくとも２倍、非腫瘍部分においてよりも腫瘍部分において有意に高かった。図８〜１０はそれぞれ、前述の表１に列挙したＨＣＣ患者番号１、５および９の検体の腫瘍部分および非腫瘍部分間のスポットＭＩ２０５４３４の量比較結果を示している。
【００９３】
表２は、該９個の対のＨＣＣ検体の各々の非腫瘍部分におけるそれに対する腫瘍部分におけるスポットＭＩ２０５４３４の測定量の比率を示している。非腫瘍部分におけるそれに対する腫瘍部分におけるスポットＭＩ２０５４３４（即ち、Ｗｎｔ−１蛋白質）の発現の最大増加（１１．４倍）は、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎に罹患したＨＣＣ患者番号９において観察された。
【００９４】
【表２】
2007139742.tif 000003
【００９５】
ＭＡＬＤＩペプチドマスフィンガープリント（MALDI peptide mass fingerprint）（ＰＭＦ）分析によるスポットＭＩ２０５４３４のデータベースサーチ結果は、スポットＭＩ２０５４３４についていくつかの蛋白質候補が存在することを示した（データは示さず）。しかし、ＭＡＬＤＩ  ＰＭＦ分析によるデータベース結果（図３を参照のこと）、抗−ヒトＷｎｔ−１を使用するＨＣＣ患者番号１および５の対の検体の２−ＤＥウェスタンブロット分析からの実験結果（図１１を参照のこと）、ならびに８個の更なるＨＣＣ患者（患者番号１０〜１７）からの検体の１−ＤＥウェスタンブロットについてのデンシトメトリー分析からの実験結果（図１２を参照のこと）の統合は、スポットＭＩ２０５４３４の最も可能性ある候補蛋白質がＷｎｔ−１蛋白質であることを示唆した。
【００９６】
【表３】
2007139742.tif 000004
【００９７】
更に、図１２から、Ｗｎｔ−１の発現レベルが、該更なる８個の対のＨＣＣ検体（患者番号１０〜１７）のうち６個で、非腫瘍部分におけるそれよりも腫瘍部分において少なくとも２倍増強されたことが理解され得る。
【００９８】
得られた結果、特に、表２および図１２に示されるものに基づいて、Ｗｎｔ−１蛋白質は、被験体におけるＨＣＣの素因を検出するため、またはＨＣＣを有する被験体の予後を予測するための、バイオマーカーとして使用され得る。
【００９９】
詳細には、今までのところ研究された患者から回収された結果によれば、肝細胞癌を有するかまたは有すると思われる被験体の予後が、該被験体から採取した対の肝臓検体の非腫瘍部分におけるそれと腫瘍部分におけるＷｎｔ−１発現のレベルとを比較することから得られる比率値に基づいて評価され得、ここで、該被験体は、以下を有すると評価される：
（ｉ）得られた該比率値が２より大きい場合、６ヶ月以下の予後（prognosis）；
（ｉｉ）得られた該比率値が１〜２である場合、６〜１８ヶ月の予後；および
（ｉｉｉ）得られた該比率値が１未満である場合、少なくとも１８ヶ月の予後。
【０１００】
議論：
本発明の研究は、機能的プロテオームアプローチによって、ＨＣＣ腫瘍および非腫瘍組織におけるＮＦ−κＢ結合シグナリング蛋白質複合体（NF-kB-associated signaling protein complexes）を分析した。Ｗｎｔ−１蛋白質の発現レベルは、ＨＢＶおよびＨＣＶの少なくとも１つに感染した患者から採取した対の肝臓検体の非腫瘍部分におけるよりも腫瘍部分においてより高いことが偶然に見出された。
【０１０１】
初めて、本発明者は、Ｗｎｔ−１発現のレベルが、ＨＢＶおよびＨＣＶの少なくとも１つに感染した患者から採取した対の肝臓検体の非腫瘍部分においてよりも腫瘍部分において増強されることを実証した。この増強は、ＨＣＣの肝細胞癌発生に臨床的に関連している。最も重要なことに、Ｗｎｔ−１蛋白質の過剰発現は、ＮＦ−κＢシグナリングに関連している。これは、ＮＦ−κＢが、炎症関連癌（inflammation-associated cancer）における腫瘍プロモータとして機能するというＰｉｋａｒｓｋｙらによって報告されるデータと一致している（E. Pikarsky et al. (2004), Nature, 431:461-466）。
【０１０２】
ＨＢＶおよびＨＣＶ感染の共通の症状発現は、肝臓における共通の組織病理学的変化、慢性肝炎から、肝硬変および最終的にはＨＣＣへの共通の臨床的進展を包含する（Brechot, C. 2001. In: Arias, I.M. editor-in-chief. The Liver: Biology and Pathobiology. 4th ed. Philadelphia (PA): Lippincott: P.801-830）。臨床的には、マルチモダリティー処置プロトコル（multimodality treatment protocols）がＨＣＣ患者を処置するために適用されているが、この癌の予後は依然として非常に悪い（A. Sangiovanni et al. (2004), Gastroenterology, 126:1005-1014; S. Ueno et al. (2001), Hepatology, 34:529-534; T.W.T. Leung et al. (2002), Cancer, 94:1760-1769; J. Bruix and J.M. Llovert (2002), Hepatology, 35:519-524）。
【０１０３】
プロト発癌性（proto-oncogenic）蛋白質Ｗｎｔ−１とＮＦ−κＢ活性との関連は、BournatらによってJ. Neurosci. Res., 61:21-32, 2000において初めて報告された。彼らの研究は、ＰＣ１２細胞、神経堤直系のラット褐色細胞腫細胞（rat pheochromocytoma cell line of neural crest lineage）のＷｎｔ−１介在生存は、ＮＦ−κＢ活性化に依存すること、ならびにＷｎｔ−１の安定発現はＮＦ−κＢ活性を増加させることを示した。ＷｎｔシグナリングとＮＦ−κＢ経路との関連は、以前、プロテアソームによるユビキチン依存性蛋白質分解を研究する際に気付かれた。その経路のキーメディエーターは、β−カテニンである（K. Willer and R. Nusse (1998), Curr. Opin. Genet. Dev., 8: 95-102）。その上、ＨＢＶのＸ−蛋白質（ＨＢｘ）がβ−カテニンの安定化を増強させ得、そして活性化Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングのために必須であるという、ＨＢＶとＷｎｔシグナリングとの関連が、肝癌細胞において最近報告された（M.Y. Cha et al. (2004), Hepatology, 39:1683-1693）。
【０１０４】
ＨＣＶ感染とＷｎｔ／β−カテニンシグナリングとの関連は未だ報告されていない。しかし、熱ショック蛋白質２７（heat-shock protein 27）（ＨＳＰ２７）が、ＨＣＶの非構造蛋白質５Ａ（nonstructural protein 5A）（ＮＳ５Ａ）と相互作用すると、プロテオームアプローチによって確認された（Y.W. Choi et al. (2004), Biochem. Biophys. Res. Commun., 318: 514-519）。同様に、ＨＳＰ７０は、ＨＣＶ関連ＨＣＣ腫瘍組織において過剰発現への傾向を示した（M. Takashima et al. (2003), Proteomics, 3: 2487-2493）。誘導される熱ショック蛋白質は、変性細胞蛋白質を安定化および部分的に修復することを助けるものを含み、そしてユビキチン依存性蛋白質分解経路に密接に関連しており（H. Shimura et al. (2004), J. Biol. Chem., 279: 4869-4876）、そしてまた、ＮＦ−κＢシグナリングおよび細胞生存に関連している（R. Ran et al. (2004), Genes Dev., 18:1466-1481）。従って、ＨＣＶ感染とＷｎｔ／β−カテニンシグナリングとの間接的な関連のみが、今回、共に連結され得る。この考察は、更なる研究を必要とする。
【０１０５】
累積的証拠が、ＮＦ−κＢの活性化がアポトーシスを阻害すること、およびＮＦ−κＢの阻害が増加されたアポトーシスにより抗腫瘍治療を増強することを示している（A.A. Berg, and D. Baltimore (1996), Science, 274:782-784; D.J. Van Antwerp et al. (1996), Science, 274:787-789; C.Y. Wang et al. (1999), Nat. Med., 5:421-427）。ＩＥＸ−１Ｌ遺伝子、アポトーシスインヒビターの活性化およびアポトーシス蛋白質（ｃ−ＩＡＰ１およびｃ−ＩＡＰ２）のインヒビターの誘導が、ＮＦ−κＢ介在細胞生存に関与し得ることも報告された（M.X. Wu et al. (1998), Science, 281: 998-1001; C.Y. Wang et al. (1998), Science, 281:680-1683）。ＨＢＶおよびＨＣＶが感染したＨＣＣ腫瘍および非腫瘍組織におけるＮＦ−κＢ関連Ｗｎｔ−１蛋白質発現がこれら抗−アポトーシス因子に関連しているか否かは、依然として不明のままである。
【０１０６】
累積的証拠は、進化的に保存された（evolutionarily conserved）Ｗｎｔ−シグナリング経路は、多くの器官の発生の間に重要な役割を有し得（K.M. Cardigan and R. Nusse (1997), Genes Dev., 11:3286-3305; A. Ruiz i Altaba et al. (2002), Nature Rev. Cancer, 2:361-370; F.J.T. Staal et al. (2005), Nature Rev. Immunol., 5: 21-30）、そして調節異常の（dysregulated）Ｗｎｔ−シグナリングは、種々の腫瘍の開始および疾患の発生において重要な因子であることを示唆している（P. Polakis, (2000), Genes Dev., 14:1837-1641; J. Taipale and P.A. Beachy (2001), Nature, 411: 349-354; D. Kalderon (2002), Trends Cell. Biol., 12: 523-531; A. Ruiz i Altaba et al. (2002), Nature Rev. Cancer, 2:361-370; J.R. Miller (1999), Oncogene, 18:7860-7872; W.J. Nelson and R. Nusse (2004), Science, 303: 1483-1487）。
【０１０７】
Ｗｎｔ−１蛋白質の発現が、非腫瘍組織においてよりもＨＢＶおよび／またはＨＣＶの両方に関連するＨＣＣ腫瘍組織において増強されるという本発明者の知見は、癌形成に関連している。ＮＦ−κＢ結合Ｗｎｔ−１蛋白質は、ＨＢＶおよびＨＣＶ関連肝細胞発生の共通事項（common denominator）として役立ち得ることが提案される。ＮＦ−κＢ結合Ｗｎｔ−１蛋白質の増強された発現に関してのこの提案のシナリオを、図１３に示す。この提案についての可能な科学的基礎は、Ｗｎｔ蛋白質（Ｗｎｔ）が、典型的なＧ蛋白結合レセプター（G protein-coupled receptors）に似ている、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）レセプターについてのリガンドであるということである（K.M. Cardigan and R. Nusse (1997), Genes Dev., 11:3286-3305;J.R. Miller et al. (1999), Oncogene, 18:7860-7872）。従って、Ｗｎｔ蛋白質は膜Ｆｚレセプターに対して細胞外的に作用するが、Ｗｎｔ−シグナリングは、レセプター介在エンドサイトーシスの機構によって細胞内的に、ＮＦ−κＢを含むマルチプロテインコンプレックス（multiprotein complex）の調節に関与し得る。ＨＢＶおよびＨＣＶ感染によって活性化されたＮＦ−κＢは、更に、Ｗｎｔおよび細胞成長を制御する他の調節因子と相互作用し得ると考えられる。ＮＦ−κＢシグナリングがＷｎｔ−１蛋白質発現をどのように増強するか、およびこれらの複合体（complexes）が、ＨＢＶおよびＨＣＶ関連肝細胞癌発生においてＷｎｔ−１蛋白質とどのように関連するかについての問題は、依然として明確にされる必要がある。より複雑な病態生理学的コンテクストでの、ＨＢＶおよび／またはＨＣＶ、ＮＦ−κＢ、Ｗｎｔ−１、β−カテニン経路およびＨＣＣ間のコネクションを探究するために、更なる研究が必要とされる。
【０１０８】
Ｗｎｔシグナリング経路が、髄芽腫を有する子供における（R.J. Gilbertson (2004), Lancet Oncol., 5:209-218）、そして頭および首扁平上皮細胞癌（head and neck squamous cell carcinomas）を有する人における（C.S. Rhee (2002), Oncogene, 21:6598-6605）、新規の処置レジメを設計するための治療標的として使用され得ることが提案されている。理論的に、それは、ＨＣＣの処置における非常に有効な治療剤を設計するためおよび肝細胞癌発生の化学的予防のために（W.K. Hong and M.B. Sporn (1997), Science, 278:1073-1077; W.J. Nelson and R. Nusse (2004), Science, 303:1483-1487）、ＮＦ−κＢシグナリング（A. Lin and M. Karin (2003), Semin. Cancer Biol., 13:107-114; C.Y. Wang et al. (1999), Nat. Med., 5:421-427）と共に、Ｗｎｔシグナリング経路（J. Taipale and P. A. Beachy (2001), Nature, 411:349-354; Kalderon, D. (2002), Trends Cell. Biol., 12:523-531; A. Ruiz i Altaba et al. (2002), Nature Rev. Cancer, 2:361-370; R.J. Gilbertson (2004), Lancet Oncol., 5:209-218; C.S. Rhee et al. (2002), Oncogene, 21:6598-6605）を標的化することによって、実現可能である。
【０１０９】
最後に、本発明者の研究は、ＮＦ−κＢ結合Ｗｎｔ−１蛋白質の増強された発現が、ＨＢＶおよびＨＣＶ関連肝細胞癌発生の共通の機構を構成し得ることを示唆している。
【０１１０】
本明細書において引用された全ての特許および文献は、参照により、それらの全体が本明細書中に組み込まれる。コンフリクトの場合、規定を含む本明細書が優勢である。
【０１１１】
本発明は、上記特定の実施形態を参照して説明されたが、多数の修飾および改変が、本発明の範囲および精神を逸脱することなく成され得ることが明らかである。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲によって示されるようにのみ限定されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】図１は、本発明の研究プロトコルを図示しており、ここで、腫瘍および非腫瘍部分に分離された各々の対のＨＣＣ検体の肝臓組織から抽出された蛋白質が、種々の実験に供されている；略語：ＥＭＳＡ、電気泳動移動度シフトアッセイ；ＩＰ、免疫沈降；２−ＤＥ、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動；およびＭＡＬＤＩ−Ｑ−ＴＯＦ、マトリクス支援レーザー脱離／イオン化−四重極−飛行時間（matrix-assisted laser desorption/ionization-quadrupole-time-of-flight）。
【図２】図２は、抗−ＮＦ−κＢ  ｐ５０抗体（抗−ｐ５０）でプローブされる場合の、抽出された核蛋白質のＥＭＳＡおよびスーパーシフトアッセイ結果を示しており、該抽出された核蛋白質は、前述の表１に列挙されるＨＣＣ患者番号１〜７の検体の腫瘍および非腫瘍部分からそれぞれ得られ、ここで、略語：Ｔ、ＨＣＣ検体の腫瘍部分から抽出された核蛋白質、そしてＮＴ、ＨＣＣ検体の非腫瘍部分から抽出された核蛋白質。
【図３】図３は、前述の表１に列挙されるＨＣＣ患者番号８〜９の検体の腫瘍および非腫瘍部分からそれぞれ得られた、抽出された核蛋白質のＥＭＳＡ結果を示しており、ここで、略語：Ｔ、ＨＣＣ検体の腫瘍部分から抽出された核蛋白質、そしてＮＴ、ＨＣＣ検体の非腫瘍部分から抽出された核蛋白質。
【図４】図４は、２−ＤＥゲルの銀染色結果を示しており、ここで、前述の表１に列挙される９人のＨＣＣ患者の検体の腫瘍部分から抽出された蛋白質（５００μｇ）が、それぞれ、抗−ｐ５０を使用する免疫沈降（ＩＰ）へ供され、そして該９人のＨＣＣ患者の蛋白質サンプルにおいて得られる免疫複合体が、回収されそして共にプールされ、１２．５％ポリアクリルアミドゲルを使用する二次元電気泳動（２−ＤＥ）分析を実行し、続いてこのように得られた２−ＤＥゲルが銀染色され、この上においてスポットＭＩ２０５４３４の位置がマークされた。
【図５】図５は、２−ＤＥゲルの銀染色結果を示しており、ここで、前述の表１に列挙される９人のＨＣＣ患者の検体の腫瘍部分から抽出された蛋白質（５００μｇ）が、それぞれ、抗−ＮＦ−κＢ  ｐ６５抗体（抗−ｐ６５）を使用する免疫沈降（ＩＰ）へ供され、そして該９人のＨＣＣ患者の蛋白質サンプルにおいて得られる免疫複合体が、回収されそして共にプールされ、１２．５％ポリアクリルアミドゲルを使用する２−ＤＥ分析を実行し、続いてこのように得られた２−ＤＥゲルが銀染色され、この上においてスポットＭＩ２０５４３４の位置がマークされた。
【図６】図６は、２−ＤＥゲルの銀染色結果を示しており、ここで、前述の表１に列挙される９人のＨＣＣ患者の検体の腫瘍部分からのプールされた総蛋白質が、１２．５％ポリアクリルアミドゲルを使用する２−ＤＥ分析に供され、続いて、このように得られた２−ＤＥゲルが銀染色され、この上において、抗−ｐ５０および／または抗−ｐ６５を使用するＩＰで処理された２−ＤＥゲルにおいてポジティブに染色されたものに等しい２０個のスポットの位置が、ImageMaster 2D Platinum Software, version 5.0 (Amersham Biosciences)と組み合わせて、Typhoon 9200 ImageMaster (Amersham Biosciences)を使用して、任意に選択されそして共にマッピングされた（Hubbard, M.J., and McHugh, N.J. (2000), Electrophoresis, 21:3785-3796）。
【図７】図７は、図６の銀染色された２−ＤＥゲルについて使用したものと同一の条件下で実行された、ＳＹＰＲＯ−Ｒｕｂｙ染色された２−ＤＥゲルから得られた２０個のスポットの質量分析結果を示しており、そして図６に記載のスポットに対応している。
【図８】図８〜１０は、ぞれぞれ、前述の表１に列挙されるＨＣＣ患者番号１、５および９の検体の腫瘍部分および非腫瘍部分との間での、図６において同定されたスポットＭＩ２０５４３４の量比較結果を示しており、ここで、腫瘍肝臓組織と非腫瘍肝臓組織との間でのスポットＭＩ２０５４３４の量比較は、ImageMaster（Amersham Biosciences）によってなされており、そして参照値は、非腫瘍肝臓組織における対応のスポットから得られた量であり、これは、比較のためのベースライン値として機能する。
【図９】図８〜１０は、ぞれぞれ、前述の表１に列挙されるＨＣＣ患者番号１、５および９の検体の腫瘍部分および非腫瘍部分との間での、図６において同定されたスポットＭＩ２０５４３４の量比較結果を示しており、ここで、腫瘍肝臓組織と非腫瘍肝臓組織との間でのスポットＭＩ２０５４３４の量比較は、ImageMaster（Amersham Biosciences）によってなされており、そして参照値は、非腫瘍肝臓組織における対応のスポットから得られた量であり、これは、比較のためのベースライン値として機能する。
【図１０】図８〜１０は、ぞれぞれ、前述の表１に列挙されるＨＣＣ患者番号１、５および９の検体の腫瘍部分および非腫瘍部分との間での、図６において同定されたスポットＭＩ２０５４３４の量比較結果を示しており、ここで、腫瘍肝臓組織と非腫瘍肝臓組織との間でのスポットＭＩ２０５４３４の量比較は、ImageMaster（Amersham Biosciences）によってなされており、そして参照値は、非腫瘍肝臓組織における対応のスポットから得られた量であり、これは、比較のためのベースライン値として機能する。
【図１１】図１１は、前述の表１に列挙されるＨＣＣ患者番号１および５の検体の腫瘍部分および非腫瘍部分の２−ＤＥウェスタンブロット結果を示しており、ここで、表１に列挙されるＨＣＣ患者番号１および５の検体の腫瘍および非腫瘍部分から抽出された蛋白質は、それぞれ、２−ＤＥへ供され、続いて、抗−ヒトＷｎｔ−１抗体でプローブされるウェスタンブロッティングが行われた；略語：Ｔ、ＨＣＣ腫瘍部分；およびＮ、ＨＣＣ非腫瘍部分。
【図１２】図１２は、the Tumor and Serum Bank of Chi-Mei Medical Centerから得られた更なる８個の対のＨＣＣ検体（患者番号１０〜１７）の腫瘍および非腫瘍部分の一次元電気泳動（１−ＤＥ）−ウェスタンブロットについてのデンシトメトリー分析結果を示しており、ここで、該更なる８個の対のＨＣＣ検体の腫瘍および非腫瘍部分から抽出された蛋白質は、１２．５％ポリアクリルアミドゲルを使用する１−ＤＥ分析に供され、続いて、抗−ヒトＷｎｔ−１抗体でプローブされたウェスタンブロッティングが行われ、そして該更なる８個の対のＨＣＣ検体の腫瘍および非腫瘍部分の各々におけるＷｎｔ−１蛋白質の発現レベルが、the ImageMaster (Amersham Biosciences)を使用する半定量的分析によって測定され；参照値１００は、患者番号１７の腫瘍組織のＷｎｔ−１蛋白質バンドから得られた総カウントであり、これは比較のためのベースライン値として機能し；患者番号１０〜１３は、ＨＣＶ感染した被験体であり、一方、患者番号１４〜１７はＨＢＶ感染した被験体であり；略語：Ｔ、腫瘍組織；ＮＴ、非腫瘍組織；および矢印は、Ｗｎｔ−１の位置を示している。
【図１３】図１３は、ＨＣＣの発生の仮定される経路を示しており、ここで、ＮＦ−κＢシグナリング経路によるＷｎｔ−１蛋白質の活性化は、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎関連肝細胞癌発生に対して因果関係を有している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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