(57)【要約】【課題】高精度のアルツハイマー病診断を可能とする手段、方法を提供すること。【解決手段】被検体に含まれる、表1に記載のJSNP IDを有する44個の遺伝子の少なくとも１つに含まれるアルツハイマー病関連一塩基多型を検出することを含む、アルツハイマー病の予測または診断の方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体に含まれる、以下の表にJSNP IDを示す44個の遺伝子の少なくとも１つに含まれるアルツハイマー病関連一塩基多型を検出することを含む、アルツハイマー病の予測または診断の方法。
【表１】
2007166962.tif 000018
【請求項２】
被検体に含まれる、ApoE4の遺伝子型を検査し、その結果と組み合わせて行う、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記被検体が、被験者から採取した血液であり、かつ前記一塩基多型の検出をSNPタイピングにより行う、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記被検体が、被験者から採取した血液であり、かつ前記一塩基多型の検出を、遺伝子チップを用いて行う、請求項1または2に記載の方法。
【請求項５】
遺伝子チップが、前記44個の遺伝子及びApoE4の遺伝子型を判定できるプローブを固定化したものである請求項4に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病の予測または診断の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経変性疾患であるアルツハイマー病の遺伝的研究では、この病気の危険因子として、ＡｐｏＥ遺伝子の変異が確認されている。アルツハイマー病には早発性、遅発性、家族性、非家族性の痴呆が存在するが、ＡｐｏＥ遺伝子の変異体は、これらの区別にかかわらず、この病気の主要な危険因子である。しかしながら、このＡｐｏＥ遺伝子の変異体がアルツハイマー病の発生に必須ではなく、また充分ではないとの知見から、他の環境要素や他の遺伝子がＡｐｏＥ遺伝子と関連して、または単独で、アルツハイマー病発生の危険を増加させることに関与していると考えられている。
【０００３】
また、アルツハイマー病の診断は、現在、神経心理学的検査や画像診断によって行われており、さらに、3年から5年の追跡検査が必要である。これらの検査は高額であるばかりでなく、時間もかかり、何よりも、発症後にしか診断できないという欠点がある。アポリポタンパクE4（ApoE4）の遺伝子型がアルツハイマー病と高い相関を示す。（非特許文献１、２）
【非特許文献１】Strittmater, WJ et al. Binding of human apolipoprotein E to synthetic amyloid beta peptide:Isoform-specific effects and implications for late-onset Alzheimer disease.  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 8098-8102, 1993.
【非特許文献２】Corder EH. Et al.  Gene dose of apolipprotein E type 4 allele and the risk of Alzheimer's disease in late onset families.  Science 261, 921-923, 1993.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、ApoEの遺伝子型のみでは診断の精度が低いという欠点があった。
【０００５】
そこで本発明の目的は、高精度のアルツハイマー病診断を可能とする手段、方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ヒト遺伝子中の10万SNPをアルツハイマー病患者DNAと健常者DNAサンプルについてスクリーニングを行い、44個のアルツハイマー病関連SNPを同定した。この44個のSNPの少なくとも１つを検出することで、アルツハイマー病の予測または診断が可能であり、ApoE遺伝子型と組み合わせることにより、より高い精度でのアルツハイマー病診断が可能となることを見いだして本発明を完成させた。
【０００７】
上記課題を解決するための本発明は以下のとおりである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、高精度のアルツハイマー病診断が可能であり、かつ発症前からの早期診断ができ、画像診断等、患者への負担もなく、追跡検査の必要もない等、利点は多い。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、被検体に含まれる、以下の表1にJSNP IDを示す44個の遺伝子の少なくとも１つに含まれるアルツハイマー病関連一塩基多型を検出することを含む、アルツハイマー病の予測または診断の方法である。
【００１０】
【表１】
2007166962.tif 000002
【００１１】
上記表1にJSNP IDを示す44個の遺伝子のさらに詳細な情報は以下の表2に示す。JSNP ID以外にGene Name、染色体、位置、オッズ比、95％信頼区間及びP値が示されている。これら44個の遺伝子は、10万個のヒトSNPについてスクリーニング(実施例において詳述する)を行い、その中から、以下の基準により、選択されたものである。
【００１２】
表２中のSNPは、P値の小さいものから順に並んでいる。表２中のオッズ比とは要因と疾患の関連の強さを示す指標であり，0から無限大に分布し、1は無相関、1より小さければその要因に曝露された者ではその疾患のリスクが低いことを、1より大きければ曝露者にリスクが高いことを意味する。表に示されているオッズ比は推定値であり、その真の値はその近傍にあると考えられる。95%信頼区間とは、95%の確率で真の値が存在する範囲である。95%信頼区間の下限値が1を越えていたり、上限が1を下回っておれば5%水準で有意であると言える。P値は各SNPが疾患に関連なしと仮定した場合にそのオッズ比が観察される確率である。SNPが疾患に関連があるという事を直接証明するのは難しいため、逆にSNPが疾患に関連なしという仮説を立ててそれを否定する事により疾患との関連をいう。つまりSNPが疾患に関連していなければオッズ比は1が期待されるので、オッズ比が1より大きかったり小さかったりするのは稀な事象が起こったと考え、どのくらい稀であるかをP値で表す。P値が小さい程より稀な事象である事を示し、とても稀な事が起こったというよりは仮定が間違っていると考える。つまりSNPが疾患に関連なしという仮定を間違いであるとし、SNPが疾患に関連すると考える。
【００１３】
【表２】
2007166962.tif 000003
2007166962.tif 000004
2007166962.tif 000005
【００１４】
さらに表3には、各SNPを含む配列の５'側の配列とSNPを示し、表4に各SNPを含む配列の３'側の配列とこれらSNPの配列番号を示す。さらに、表3には、疾患において高頻度である塩基を示す。また、表5に、これらSNPを検出するために用いるPCRプライマー(フォワード及びバックワード)の配列と配列番号を示す。
【００１５】
【表３】
2007166962.tif 000006
2007166962.tif 000007
2007166962.tif 000008
【００１６】
【表４】
2007166962.tif 000009
2007166962.tif 000010
2007166962.tif 000011
【００１７】
【表５】
2007166962.tif 000012
2007166962.tif 000013
2007166962.tif 000014
【００１８】
本発明は、被検体に含まれる、上記表に示される44個の遺伝子の少なくとも１つに含まれるアルツハイマー病関連一塩基多型を検出することを含み、さらに、これら44個の遺伝子についての一塩基多型を検出することに加えて、被検体に含まれる、ApoE4の遺伝子型を検査し、その結果と組み合わせて、アルツハイマー病の発病のしやすさに影響する遺伝性素因の検査を行うことができる。ApoE4の遺伝子型を検査方法は、公知であり、例えば、Journal of Lipid Research Vol. 31, 1990, pp545-548に記載の方法を参照して実施することができる。
【００１９】
各一塩基多型の検出は、上記配列情報に基づいて、それ自身公知の方法を用いて行うことができる。例えば、被検体として被験者から採取した血液を用い、一塩基多型の検出をSNPタイピング(例えば、タックマン)により行うことができる。SNPタイピングに用いるプローブは、上記配列情報に基づいて、適宜合成することができる。タックマン法の一般的なプローブの作成法としては、SNPのそれぞれを含んだ塩基配列にそれぞれ異なる色を発する蛍光物質（FAMもしくはVIC）とクエンチャーをつけたプローブを作製し、５'及び３'プライマーとともにPCRをかければそれぞれのSNPに対応した色で識別することができる。
【００２０】
あるいは、被検体として被験者から採取した血液を用い、一塩基多型の検出を、遺伝子チップを用いて行うことができる。遺伝子チップは、前記44個の遺伝子及びApoE4の遺伝子型を判定できるプローブを固定化したものであることができる。各プローブは、上記配列情報に基づいて、適宜合成することができる。また、遺伝子チップは、これらプローブを用いて公知の方法により製造することができる。
【００２１】
ApoE４をホモで持っている場合は、アルツハイマー病の危険性が、ApoEの２や ３の場合よりも１５倍あがり、ヘテロの場合でも３倍に上がると言われている。ただ、ApoEで検出できるのは約５０％で残りは他の遺伝子あるいはSNPの影響と考えられている。今回の表1のNo.１(96584)のpoliovirus receptor-related2はApoEとともに変動するが、他のSNPは独立して動く。このことから、上記44個のSNP少なくとも1つ、好ましくは44個全部について検査することで、ApoE４をもっていないが、アルツハイマーになりやすい人を検出することができる。具体的には、表3に示した、各SNPについてのアルツハイマー病の危険性が高い塩基を有するか否かで、アルツハイマー病を発病する危険性を、予測または診断することができる。
【００２２】
本発明によれば、例えば、患者血液から調整したDNAを使って44個のSNPのタイピングを行い、ApoEのタイピング結果を加味して、アルツハイマー病の早期診断、予測を行うことができ、生活習慣等について早期介入が可能となる。
【実施例】
【００２３】
以下本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例1
44個の遺伝子の10万個のヒトSNPからのスクリーニング方法
ヒトDNAを先ず表５に示すフォワードプライマー及びバックワードプライマーを使って、PCRで増幅した。次に、表３と表4に示す配列の約２４塩基を使ってプライマーを作製し、SNPを含んだタックマンプローブを作製し、PCRを行い、スクリーニングを行った。
【００２４】
実施例2
44個の遺伝子のSNP検出
タイピングによるSNP検出について以下に説明する。
DNA及び反応混合物(2X Universal Master Mix、プライマー、プローブ)の組成を以下に示す。
4ng/μL DNA             2.5μL
2X Universal Master Mix 6.2μL
50μM sense-primer      0.2μL (final 900nM)
50μM antisense-primer  0.2μL (final 900nM)
Fam-probe               XμL (final 200nM)
Vic-probe               YμL (final 200nM)
H2O                     ZμL                 
Total                 18.5μL
【００２５】
各プローブは終濃度が約200nMになるように計算し、H2Oの量もそれに応じて決定する。DNA及び反応混合物を96ウエルプレートに分注し、スピンダウンし、カバーをプレートにし、サーマルサイクラーにて以下の表6に示す条件で反応をスタートさせる。反応終了後、各ウエルの蛍光を測定することで、各SNPについて、いずれの塩基を有するか判定する。
【００２６】
【表６】
2007166962.tif 000015
【００２７】
実施例3
ApoE ゲノタイピング
原法   (Journal of Lipid Research, 31:545-8, 1990)を一部改変して行う。
F6: forward primer   taagcttggcacggctgtccaagga (配列番号177)
(7-bp クローン化用切断配列 + 18-bp apoE配列)
F4: reverse primer   acagaattcgccccggcctggtacac (配列番号178)
(9-bp クローン化用切断配列 + 17-bp apoE配列)
【００２８】
1)PCR
Genomic DNA  200 ng
Primers     1 μM (p mol/μl) each
dNTPs 0.2 mM each
DMSO  10%
AmpliTaq（予め、AntiTaq (東洋紡)と1:1混合したもの*）   0.025 unit/μl
PCR buffer   1x (10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2)
Total volume 20 μl
【００２９】
AntiTaqにより、50〜60 bpに現われることのある非特異増幅物の生成をかなり抑えることができる。ジェノタイプ・マーカー兼コントロールとして、2/2, 3/3, 4/4, 2/3, 2/4, 3/4のすべてのジェノタイプの既知サンプルを入れておく
【００３０】
95℃, 4分
30 cycles of:
95℃, 1分
63℃, 1分
70℃, 2分
70℃, 6分
15℃, soak
【００３１】
4 μl を制限酵素処理後の分離方法と同じ条件での分離をおこない、増幅産物のチェックをおこなう。
【００３２】
2)制限酵素処理
PCR産物 15 μl
+ 0.25 μl of 10 unit/μl Hha I (Takara)
+ 4.75 μl of 1x PCR buffer
（PCR buffer中でも酵素が十分働くため、制限酵素用のbufferを  加える必要はなく、酵素を直接添加するだけで良い。ただし、多検体をこな  すため、1x PCR bufferで希釈して１検体につき5 μlを８連  ピペットで添加している）
37℃, ２時間以上インキュベート
【００３３】
3)分離
(1)8% ポリアクリルアミドゲル（非変性）・・・原法
(2)アガロースゲル電気泳動でおこなう方法
5％ Nusieve 3:1（TBE）のミニゲルにサンプル10μl  を添加、BPB（約20 bp）が3/4まで泳動すると、少なくと  も48 bp 以上のバンドは明確に分離でき、その結果からジェノタイピン  グできる。
サイズマーカーには (pUC18-Msp I (Sigma)) や20 bp DNA ladder (  Takara)など。
(3)WAVEでおこなう方法
WAVE DNA fragment analysis system 3500 (Transgenomic, Inc.)
分離条件は、二重鎖DNAのsizing用のモードでおこなう。
その溶出プログラムは、必ずしも同一のものである必要はないが、我々がも  っともよく使用したプログラムは以下の通り。
サンプル添加量は通常７〜８μl
【００３４】
【表７】
2007166962.tif 000016
【００３５】
【表８】
2007166962.tif 000017
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明は、アルツハイマー病の遺伝子診断の分野に有用である。
【配列表】
2007166962000001.app