(57)【要約】      （修正有）【課題】個体の識別に有利な一塩基多型を選択することによって、簡便且つ迅速な個体識別を可能とする方法を提供する。【解決手段】（ｉ）２塩基置換型の一塩基多型において、アレル頻度をＸ及びＹとし、Ｘ＋Ｙ＝１、Ｙ≦Ｘとしたとき、0.5≦Ｘ≦0.7である；  （ii）３塩基置換型の一塩基多型において、アレル頻度をＸ、Ｙ及びＺとし、Ｘ＋Ｙ＋Ｚ＝１、Ｚ≦Ｙ≦Ｘとしたとき、1/3≦Ｘ  且つ  (1-Ｘ)／2≦Ｙ  且つ  Ｘ＋Ｙ＜１であって、（ａ）    Ｙ≦1/2・Ｘ  且つ  Ｘ＜2/3であるか又は（ｂ）    1/2・Ｘ＜Ｙ  且つ  ＸＹ＜2/9である；及び  （iii）４塩基置換型の一塩基多型において、アレル頻度をＸ、Ｙ、Ｚ及びＷとし、Ｘ＋Ｙ＋Ｚ＋Ｗ＝１、Ｗ≦Ｚ≦Ｙ≦Ｘとしたとき、1/4≦Ｘ  且つ  (1-Ｘ)／3≦Ｙ  且つ  Ｘ＋Ｙ＜１であって、（ａ）    Ｙ≦1/2・Ｘ  且つ  Ｘ＜2/3であるか又は（ｂ）    1/2・Ｘ＜Ｙ  且つ  ＸＹ＜2/9である；一塩基多型を選択し、個体識別検査に用いることからなる。【選択図】図１
2007006720.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体が有する核酸配列と、試料とする核酸配列との一致を判定する個体識別方法において、
識別されるべき対象個体が属する集団に存在する一塩基多型群から、複数の一塩基多型を選択する工程と、
前記対象個体が有する核酸配列、及び試料由来の核酸配列中の、前記選択された複数の一塩基多型における遺伝子型を決定して、それらを比較する工程とを具備し、
前記選択する工程においては、下記（ｉ）〜（iii）の条件の何れか一つを満たす一塩基多型を選択することを特徴とする、個体識別方法：
（ｉ）２塩基置換型の一塩基多型において、取り得る２つの塩基のそれぞれのアレル頻度をＸ及びＹとし、Ｘ＋Ｙ＝１、Ｙ≦Ｘとしたとき、
0.5≦Ｘ≦0.7  である；
（ii）３塩基置換型の一塩基多型において、取り得る３つの塩基のそれぞれのアレル頻度をＸ、Ｙ及びＺとし、Ｘ＋Ｙ＋Ｚ＝１、Ｚ≦Ｙ≦Ｘとしたとき、
1/3≦Ｘ  且つ  (1-Ｘ)／2≦Ｙ  且つ  Ｘ＋Ｙ＜１であって、
（ａ）    Ｙ≦1/2・Ｘ  且つ  Ｘ＜2/3
であるか又は
（ｂ）    1/2・Ｘ＜Ｙ  且つ  ＸＹ＜2/9である；及び
（iii）４塩基置換型の一塩基多型において、取り得る４つの塩基のそれぞれのアレル頻度をＸ、Ｙ、Ｚ及びＷとし、Ｘ＋Ｙ＋Ｚ＋Ｗ＝１、Ｗ≦Ｚ≦Ｙ≦Ｘとしたとき、
1/4≦Ｘ  且つ  (1-Ｘ)／3≦Ｙ  且つ  Ｘ＋Ｙ＜１であって、
（ａ）    Ｙ≦1/2・Ｘ  且つ  Ｘ＜2/3
であるか又は
（ｂ）    1/2・Ｘ＜Ｙ  且つ  ＸＹ＜2/9である。
【請求項２】
前記（ｉ）におけるアレル頻度が、
0.55≦Ｘ＜0.7  である、請求項１に記載の個体識別方法。
【請求項３】
前記（ｉ）におけるアレル頻度が、
0.6≦Ｘ＜0.7  である、請求項１に記載の個体識別方法。
【請求項４】
前記（ｉ）におけるアレル頻度が、
0.65≦Ｘ≦0.68  である、請求項１に記載の個体識別方法。
【請求項５】
前記対象個体が有する遺伝子型において、前記選択された全ての一塩基多型について、アレル頻度から算出される遺伝子型頻度を乗算して逆数をとることによって、該対象個体が有する遺伝子型の組み合わせが前記集団内に存在する確率を算出し、前記個体識別の結果の信頼度を判定する工程をさらに具備する、請求項１〜４の何れか一項に記載の個体識別方法。
【請求項６】
個体が有する核酸配列と、試料とする核酸配列との一致を判定する個体識別検査に用いるための、核酸プローブが基体に固定されたアレイにおいて、
該核酸プローブが、一塩基多型を含む標的配列と相補的な配列を有することを特徴とし、
該一塩基多型が、識別されるべき対象個体が属する集団に存在する一塩基多型群から、下記（ｉ）〜（iii）の条件の何れか一つを満たすものであることを特徴とするアレイ：
（ｉ）２塩基置換型の一塩基多型において、取り得る２つの塩基のそれぞれのアレル頻度をＸ及びＹとし、Ｘ＋Ｙ＝１、Ｙ≦Ｘとしたとき、
0.5≦Ｘ≦0.7  であること；
（ii）３塩基置換型の一塩基多型において、取り得る３つの塩基のそれぞれのアレル頻度をＸ、Ｙ及びＺとし、Ｘ＋Ｙ＋Ｚ＝１、Ｚ≦Ｙ≦Ｘとしたとき、
1/3≦Ｘ  且つ  (1-Ｘ)／2≦Ｙ  且つ  Ｘ＋Ｙ＜１であって、
（ａ）    Ｙ≦1/2・Ｘ  且つ  Ｘ＜2/3
であるか又は
（ｂ）    1/2・Ｘ＜Ｙ  且つ  ＸＹ＜2/9であること；及び
（iii）４塩基置換型の一塩基多型において、取り得る４つの塩基のそれぞれのアレル頻度をＸ、Ｙ、Ｚ及びＷとし、Ｘ＋Ｙ＋Ｚ＋Ｗ＝１、Ｗ≦Ｚ≦Ｙ≦Ｘとしたとき、
1/4≦Ｘ  且つ  (1-Ｘ)／3≦Ｙ  且つ  Ｘ＋Ｙ＜１であって、
（ａ）    Ｙ≦1/2・Ｘ  且つ  Ｘ＜2/3
であるか又は
（ｂ）    1/2・Ｘ＜Ｙ  且つ  ＸＹ＜2/9であること。
【請求項７】
請求項６に記載のアレイと、
該アレイの基体上に設けられ、薬液又はエアの流れる方向に沿って設けられた流路と、
前記基体上に前記流路に沿って複数設けられ、前記プローブが固定化される作用極と、
前記流路の内周面に前記作用極に対応して各々が配置され、前記作用極との間に電位差を与える対極と、
前記流路の内周面に前記作用極に対応して各々が配置され、前記作用極に検出電圧をフィードバックさせる参照極と、
前記流路に開口し、前記流路の上流側から前記流路内に薬液又はエアを送入する送入ポートと、
前記流路に開口し、前記流路の下流側から前記流路内の薬液又はエアを送出する送出ポートと、
前記流路内に試料を注入する試料注入口と
を具備してなる個体識別検査装置。
【請求項８】
請求項７に記載の個体識別検査装置と、
前記送入ポートに連通し、該送入ポートを介して前記流路内に薬液又はエアを供給する第１の配管と、前記第１の配管の薬液又はエアの流量を制御する第１の弁とを備えた供給系と、前記送出ポートに連通し、該送出ポートを介して前記流路内から薬液又はエアを排出する第２の配管と、前記第２の配管の薬液又はエアの流量を制御する第２の弁と、第２の配管に設けられ、前記流路内から薬液又はエアを吸い上げるポンプとを備えた排出系と、
前記作用極と対極との間に電位差を与える電圧印加部を備えた測定系と、
前記アレイの温度を制御する温度制御系と、
前記供給系の第１の弁と、前記排出系の第２の弁及びポンプと、前記測定系の前記電圧印加部と、前記温度制御系とを制御し、前記作用極又は前記対極から電気化学反応信号を検出し、この電気化学反応信号を測定データとして格納する制御機構と、
前記制御機構に制御条件パラメータを与えて前記制御機構を制御するとともに、前記測定データに基づいて塩基配列の解析処理を実行し、個体識別検査の判定を行うコンピュータとを具備してなる個体識別検査システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ配列情報を用いて個体を識別する方法に関し、さらに個体識別検査のためのアレイ、装置及びシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムの塩基配列がほぼ解読されたことによって、個人間、人種間で差異のある配列、またその頻度が明確になってきた。個人間での差異は、医療分野において薬物の効果又は副作用との関連を解明するための研究に利用されている。
【０００３】
ゲノム塩基配列の相違は、犯罪捜査等における個人認証にも利用されている。現在、個人認証に用いられている主な方法は、ＤＮＡ配列上のShort Tandem Repeat (STR), Variable Number of Tandem Repeat (VNTR)などに代表される繰り返し配列の繰り返し回数の相違に基づいた方法である。例えば、平成１５年から警察で採用されている方法は、ＳＴＲ９箇所、ＶＮＴＲ１箇所の領域をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、キャピラリ電気泳動法に供してその移動度から繰り返し回数を決定する方法である。
【０００４】
しかしながら、ＳＴＲ、ＶＮＴＲ等の配列は、数塩基単位の一定の配列が繰り返し表れるものであり、上記10箇所については、その繰り返し配列の全長が、３０〜６００bp程度となる。この繰り返し回数を測定するためには、検査対象の試料中に目的の領域が切断されることなく保存されている必要がある。しかしながら、犯罪捜査等の試料採取現場に残された体液や血痕等、または、火事、爆発、事故等の大惨事の現場に残された試料等は、劣化していることが容易に想定される。そのような場合、ＤＮＡ配列が断片化されて、目的の領域全てが保存されていない可能性がある。このように、比較的長い配列が必要である繰り返し配列による識別法では測定が困難な場合があるという課題があり、従って、検出に必要なＤＮＡ領域は可能な限り短い方が好ましい。
【０００５】
そこで、近年解明が進められている一塩基多型を個体識別に用いる方法が考えられる。例えば特許文献１には、個人識別のために、マイクロアレイのＤＮＡプローブに一塩基多型を用いることが可能であると記載されている。しかしながら、その具体的な方法については開示されていない。また、非特許文献１には、韓国人集団において個人の同定及び親子鑑定等に用いることが可能な２４個の一塩基多型について開示されている。  
しかしながら、現在判明している一塩基多型だけでも膨大な数に上り、その全てについて検査することは現実的ではない。しかし、何れの一塩基多型を検査すべきであるかについては、現在のところ有力な判断基準は存在していない。
【特許文献１】特開２００４−２３９７６６号公報
【非特許文献１】Lee HY, et. al. ; Selection of twenty-four highly informative SNP markers for human identification and paternity analysis in Koreans. ; Forensic Aci Int. 2005 Mar 10 ; 148(2-3):107-12.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記問題に鑑み、本発明は、個体の識別に有利な一塩基多型を選択することによって、簡便且つ迅速な個体識別を可能とする方法を提供することを目的とする。また、個体識別検査に用いるためのアレイ、検査装置、及びシステムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に拠れば、個体が有する核酸配列と、試料とする核酸配列との一致を判定する個体識別方法において、識別されるべき対象個体が属する集団に存在する一塩基多型群から、複数の一塩基多型を選択する工程と、前記対象個体が有する核酸配列、及び試料由来の核酸配列中の、前記選択された複数の一塩基多型における遺伝子型を決定して、それらを比較する工程とを具備し、前記選択する工程においては、下記（ｉ）〜（iii）の条件の何れか一つを満たす一塩基多型を選択することを特徴とする、個体識別方法が提供される：
（ｉ）２塩基置換型の一塩基多型において、取り得る２つの塩基のそれぞれのアレル頻度をＸ及びＹとし、Ｘ＋Ｙ＝１、Ｙ≦Ｘとしたとき、
0.5≦Ｘ≦0.7  である；
（ii）３塩基置換型の一塩基多型において、取り得る３つの塩基のそれぞれのアレル頻度をＸ、Ｙ及びＺとし、Ｘ＋Ｙ＋Ｚ＝１、Ｚ≦Ｙ≦Ｘとしたとき、
1/3≦Ｘ  且つ  (1-Ｘ)／2≦Ｙ  且つ  Ｘ＋Ｙ＜１であって、
（ａ）    Ｙ≦1/2・Ｘ  且つ  Ｘ＜2/3であるか又は（ｂ）    1/2・Ｘ＜Ｙ  且つ  ＸＹ＜2/9である；及び
（iii）４塩基置換型の一塩基多型において、取り得る４つの塩基のそれぞれのアレル頻度をＸ、Ｙ、Ｚ及びＷとし、Ｘ＋Ｙ＋Ｚ＋Ｗ＝１、Ｗ≦Ｚ≦Ｙ≦Ｘとしたとき、
1/4≦Ｘ  且つ  (1-Ｘ)／3≦Ｙ  且つ  Ｘ＋Ｙ＜１であって、
（ａ）    Ｙ≦1/2・Ｘ  且つ  Ｘ＜2/3であるか又は（ｂ）    1/2・Ｘ＜Ｙ  且つ  ＸＹ＜2/9である。
【０００８】
ここで、前記Ｘは、好ましくは0.55≦Ｘ＜0.7であり、より好ましくは0.6≦Ｘ＜0.7であり、さらに好ましくは0.65≦Ｘ≦0.68である。
【０００９】
また、本発明の他の側面に従えば、個体が有する核酸配列と、試料とする核酸配列との一致を判定する個体識別検査に用いるための、核酸プローブが基体に固定されたアレイにおいて、該核酸プローブが、一塩基多型を含む標的配列と相補的な配列を有することを特徴とし、該一塩基多型が、識別されるべき対象個体が属する集団に存在する一塩基多型群から、下記（ｉ）〜（iii）の条件の何れか一つを満たすものであることを特徴とするアレイが提供される：
（ｉ）２塩基置換型の一塩基多型において、取り得る２つの塩基のそれぞれのアレル頻度をＸ及びＹとし、Ｘ＋Ｙ＝１、Ｙ≦Ｘとしたとき、
0.5≦Ｘ≦0.7  であること；
（ii）３塩基置換型の一塩基多型において、取り得る３つの塩基のそれぞれのアレル頻度をＸ、Ｙ及びＺとし、Ｘ＋Ｙ＋Ｚ＝１、Ｚ≦Ｙ≦Ｘとしたとき、
1/3≦Ｘ  且つ  (1-Ｘ)／2≦Ｙ  且つ  Ｘ＋Ｙ＜１であって、
（ａ）    Ｙ≦1/2・Ｘ  且つ  Ｘ＜2/3
であるか又は
（ｂ）    1/2・Ｘ＜Ｙ  且つ  ＸＹ＜2/9であること；及び
（iii）４塩基置換型の一塩基多型において、取り得る４つの塩基のそれぞれのアレル頻度をＸ、Ｙ、Ｚ及びＷとし、Ｘ＋Ｙ＋Ｚ＋Ｗ＝１、Ｗ≦Ｚ≦Ｙ≦Ｘとしたとき、
1/4≦Ｘ  且つ  (1-Ｘ)／3≦Ｙ  且つ  Ｘ＋Ｙ＜１であって、
（ａ）    Ｙ≦1/2・Ｘ  且つ  Ｘ＜2/3
であるか又は
（ｂ）    1/2・Ｘ＜Ｙ  且つ  ＸＹ＜2/9であること。
【００１０】
ここで、前記Ｘは、好ましくは0.55≦Ｘ＜0.7であり、より好ましくは0.6≦Ｘ＜0.7であり、さらに好ましくは0.65≦Ｘ≦0.68である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に従えば、個体の識別に有利な複数の一塩基多型を選択することができ、個体識別に要する一塩基多型を最小限の数にすることができる。これによって、簡便、迅速且つ経済的な個体識別方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の一つの側面に従えば、個体識別方法が提供される。本明細書において個体識別とは、個体が有する核酸配列と、試料とする核酸配列との一致を判定することを意味する。例えば、犯罪捜査において残留血痕や毛髪などの遺留品が、被疑者や被害者等のものであるかを特定するために用いられることができる。したがって、試料とする核酸配列は、それらの残留物等に含まれる核酸であってよいが、これに限定されない。  
ここで使用される「核酸」という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、メチルフォスホネート核酸、Ｓ−オリゴ、ｃＤＮＡ及びｃＲＮＡ等、並びに何れのオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド等、核酸及び核酸類似体を総括的に示す語である。また、そのような核酸は、天然に存在するものであっても、人工的に合成されたものであってもよい。  
ここで核酸配列は、ゲノムＤＮＡ配列であることが好ましいが、ゲノム全体が確保されない断片的な配列であってもよい。また、本発明の個体識別は、本人であることを確認するための本人認証や、親子鑑定等に用いることもできるが、これらに限定されない。
【００１３】
本発明の方法では、個体識別に一塩基多型（ＳＮＰ）を用い、特に、個体識別に有利なＳＮＰを選択して用いる。このＳＮＰの選択は、そのアレル頻度を参照して行う。  
ここでＳＮＰとは、ゲノムＤＮＡ配列の一塩基の違いのことを指し、これは特定の集団において通常１％以上の頻度で認められる。ほとんどの場合、一ヶ所のＳＮＰでは２つの塩基の間で置換が起こり、例えばある個体ではＡ（アデニン）が、他の個体ではＧ（グアニン）が取られる。このようなＳＮＰを２塩基置換型と称し、この場合には一ヶ所のＳＮＰにおいて３通りの遺伝子型が存在する。上の例でいえば、Ａ／Ａのホモ、Ｇ／Ｇのホモ、及びＡ／Ｇのヘテロである。
【００１４】
しかしながら、稀に３塩基置換型或いは４塩基置換型のＳＮＰも存在する。これらのＳＮＰでは、それぞれ６通り又は１０通りの遺伝子型が存在し、一つのＳＮＰ部位だけでも多数の遺伝子型が存在し得ることになる。
【００１５】
これらの遺伝子型の出現頻度は、それぞれの塩基のアレル頻度から求めることができる。アレル頻度とは、ある集団内において、あるＳＮＰが取る塩基のそれぞれの割合を指す。即ち、ある集団内におけるあるＳＮＰがＡとＴの何れかの塩基をとり、その集団内でＳＮＰがＡである場合が７０％、Ｔである場合が３０％の割合であるとき、Ａのアレル頻度Ｘは0.7であり、Ｔのアレル頻度Ｙは0.3と表す。ここで、Ｘ＋Ｙ＝１であり、２塩基置換であることから０＜Ｘ、０＜Ｙである。
【００１６】
このアレル頻度は、ある集団に含まれる相当数の個体の遺伝子型を検査し、その分布によって決定される。現在、複数のデータベースによって種々の集団におけるアレル頻度が公開されており、それぞれ、人種や民族など各種の分類による集団について調査されている。ＳＮＰの位置、頻度などを掲載したデータベースには、例えばＨＡＰＭＡＰ、ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ  ＳＮＰ、ＪＳＮＰ、ＴＳＣ等がある。
【００１７】
なお、本明細書においては、これらの分類、例えば人種、民族、国家、居住領域、性別、年齢等によって分けられた個体群を集団と称する。アレル頻度を決定するために調査した個体数が適切であり、信頼性が高ければ、何れのデータベースで公開されているアレル頻度を用いてもよく、或いはアレル頻度の調査を独自に行ってもよい。
【００１８】
上述したように、遺伝子型頻度はアレル頻度から求められる。上の例のＳＮＰで言えば、その遺伝子型は、ＡＡホモ、ＡＴへテロ、及びＴＴホモが存在し、それぞれの遺伝子型の頻度は、（Ｘ＋Ｙ）2＝ＸＸ＋２ＸＹ＋ＹＹから求められる。即ち、ＡＡ：ＡＴ：ＴＴ＝0.49：0.42：0.09である。
【００１９】
本発明の方法では、これらアレル頻度及び遺伝子型頻度によって適切なＳＮＰを選択する。そして、個体の核酸配列と試料の核酸配列において、該選択されたＳＮＰにおける遺伝子型を決定し、それらを比較する。両者の遺伝子型が全て一致すれば、該試料はその個体に由来するものであると判定することができる。
【００２０】
なお、本明細書において個体とは、ヒトの他に、動物及び植物等のゲノムＤＮＡ配列によって識別し得るものであれば何れのものでもよい。好ましくはヒトを対象とするが、その他に家畜やペット等、或いは栽培植物や野生植物を含んでもよい。
【００２１】
ところで、ヒトのゲノムＤＮＡには、１０００万個程度のＳＮＰが存在すると言われている。可能な限り多くのＳＮＰを検査した方が、検査精度が上昇することは明らかであるが、簡便性、迅速性、及び経済性を考慮すると、検査するＳＮＰは少ない方がよいことも明らかである。
【００２２】
そこで本発明者らは、下記のような条件に従うことによって、個体の識別に有利なＳＮＰを選択することができることを見出し、個体識別に要するＳＮＰを最小限の数にすることを可能にした。以下、ＳＮＰを選択するための条件（ｉ）〜（iii）を順に説明する。
【００２３】
（ｉ）まず、２塩基置換型の場合のＳＮＰの選択方法を説明する。置換する塩基をＡ及びＢとし、そのアレル頻度と遺伝子型頻度との関係を図１ａに示した。図１ａでは、Ａの頻度が上昇するに従って、遺伝子型ＡＡの頻度が上昇する。反対に、Ａの頻度が上昇するに従って、Ｂの頻度は減少し、遺伝子型ＢＢの頻度も減少する。Ａの頻度が0.5の時、即ち、ＡとＢの頻度が等しいとき、遺伝子型ＡＢの頻度は最大になる。
【００２４】
この図１ａにおいて、最大の遺伝子型頻度と最小の遺伝子型頻度を抜き出したものが図１ｂである。この図の通り、２塩基置換型のＳＮＰでは、最も遺伝子型頻度が高い遺伝子型（ＭＡＸ）は、Ａの頻度が0.66のときに最も低い遺伝子型頻度4/9をとり、これ以下にはならない。また、最も遺伝子型頻度が低い遺伝子型（ＭＩＮ）は、Ａの頻度が0.5のとき最大の遺伝子型頻度になり、その前後では減少する。
【００２５】
ここで、個体識別にはどのような遺伝子型頻度を有するＳＮＰが望ましいかを考える。あるＳＮＰにおいて、最大の遺伝子型頻度を有する遺伝子型の頻度は、可能な限り低い方が望ましい。これは、最大の遺伝子型頻度が高ければ、その集団においてその遺伝子型を有する個体が多く存在することになり、そのＳＮＰの個体を識別する能力が低くなるためである。従って、最低限の識別能力を確保するために、最大の遺伝子型頻度を有する遺伝子型の頻度は、0.5以下であることが好ましい。
【００２６】
また、最小の遺伝子型頻度を有する遺伝子型は、可能な限り低い方が望ましい。この遺伝子型頻度が低ければ、その遺伝子型は稀少であると言え、そのＳＮＰは極めて識別能力が高く有用なＳＮＰであると言える。
【００２７】
ここで、塩基Ａ及びＢのそれぞれのアレル頻度をＸ及びＹとして表す。Ｘ＋Ｙ＝１とし、Ｙ≦Ｘとする。また、定義から０＜Ｘ、０＜Ｙであり、条件から0.5≦Ｘである。このとき、図１ｂにおいて、最大の遺伝子型頻度（ＭＡＸ）が0.5以下であるＸは、0.5≦Ｘ≦0.7である。よって、アレル頻度が0.5≦Ｘ≦0.7であるＳＮＰが好適に用いられる。
【００２８】
ここで、上述したように、最大の遺伝子型頻度を小さくするためには、Ｘの値が0.66に近づくことが望ましい。しかし、最小の遺伝子型頻度を小さくするためには、Ｘの値がより大きい方が好ましい。これらの条件を考慮し、さらに好ましい範囲は0.55≦Ｘ＜0.7であり、より好ましくは0.6≦Ｘ＜0.7であり、最も好ましくは0.65≦Ｘ≦0.68の範囲である。
【００２９】
以上のような範囲のＸ（アレル頻度）を有するＳＮＰは、識別能力のバランスがよく、このようなＳＮＰは本発明の方法において好適に用いられることができる。
【００３０】
（ii）次に、３塩基置換型の場合のＳＮＰの選択方法を説明する。３塩基置換型のＳＮＰは、上述したように遺伝子型が６通りある。従って、一つのＳＮＰによる識別能力が向上し、個体の識別に用いるのに有利である。
【００３１】
さらに、２塩基置換型では、最大の遺伝子型頻度がとり得る最小の遺伝子型頻度は4/9であるため、３塩基置換型ではこれより小さい遺伝子型頻度のＳＮＰを選択することにより、個体識別により効果的なＳＮＰを選択することが可能である。
【００３２】
ここでは、置換する塩基をＡ、Ｂ及びＣとし、アレル頻度をそれぞれＸ、Ｙ及びＺとする。ここで、Ｘ＋Ｙ＋Ｚ＝１、Ｚ≦Ｙ≦Ｘとする。このとき、1/3≦Ｘ、(1-Ｘ)／2≦Ｙ、Ｘ＋Ｙ＜１である。
【００３３】
ところで、３塩基置換型における遺伝子型は、Ｘ2、Ｙ2、Ｚ2、２ＸＹ、２ＹＺ、２ＺＸである。この中で、遺伝子型頻度が最大に成り得るものは、Ｘ2又は２ＸＹである。
【００３４】
（ａ）２ＸＹ≦Ｘ2である場合、即ち、Ｙ≦1/2・Ｘであるとき、最大の遺伝子型はＸ2である。ここで、上記したように、4/9より小さい遺伝子型頻度が望ましいため、Ｘ2＜4/9とする。従って、望ましいアレル頻度はＹ≦1/2・Ｘ  且つ  Ｘ＜2/3であり、このようなＳＮＰを選択する。
【００３５】
（ｂ）或いは、２ＸＹ＞Ｘ2である場合、即ち、1/2・Ｘ＜Ｙであるとき、最大の遺伝子型は２ＸＹである。ここで、上記したように、4/9より小さい遺伝子型頻度が望ましいため、２ＸＹ＜4/9とする。従って、望ましいアレル頻度は1/2・Ｘ＜Ｙ  且つ  ＸＹ＜2/9であり、このようなＳＮＰを選択する。
【００３６】
以上の（ａ）及び（ｂ）に適合するＸ及びＹの範囲を、図２の斜線の領域として示した。この範囲のアレル頻度を有する３塩基置換型ＳＮＰは、２塩基置換型のＳＮＰよりも個体識別により貢献し得るＳＮＰであり、有効性の高いＳＮＰであるといえる。
【００３７】
（iii）次に、４塩基置換型の場合のＳＮＰの選択方法を説明する。４塩基置換型のＳＮＰは、上述したように遺伝子型が１０通りある。従って、一つのＳＮＰによる識別能力が最も大きく、個体の識別に用いるのに有利である。４塩基置換型のＳＮＰは、３塩基置換型のＳＮＰと同様に、最大の遺伝子型頻度が4/9より小さい遺伝子型頻度のＳＮＰを選択することにより、個体識別により効果的なＳＮＰを選択することが可能である。
【００３８】
ここでは、置換する塩基をＡ、Ｂ、Ｃ及びＤとし、アレル頻度をそれぞれＸ、Ｙ、Ｚ及びＷとする。ここで、Ｘ＋Ｙ＋Ｚ＋Ｗ＝１、Ｗ≦Ｚ≦Ｙ≦Ｘとする。このとき、1/4≦Ｘ、(1-Ｘ)／3≦Ｙ、Ｘ＋Ｙ＜１である。
【００３９】
この４塩基置換型における遺伝子型も、遺伝子型頻度が最大に成り得るものは、Ｘ2又は２ＸＹである。
【００４０】
（ａ）２ＸＹ≦Ｘ2である場合、即ち、Ｙ≦1/2・Ｘであるとき、最大の遺伝子型はＸ2である。ここで、上記したように、4/9より小さい遺伝子型頻度が望ましいため、Ｘ2＜4/9とする。従って、望ましいアレル頻度はＹ≦1/2・Ｘ  且つ  Ｘ＜2/3であり、このようなＳＮＰを選択する。
【００４１】
（ｂ）或いは、２ＸＹ＞Ｘ2である場合、即ち、1/2・Ｘ＜Ｙであるとき、最大の遺伝子型は２ＸＹである。ここで、上記したように、4/9より小さい遺伝子型頻度が望ましいため、２ＸＹ＜4/9とする。従って、望ましいアレル頻度は1/2・Ｘ＜Ｙ  且つ  ＸＹ＜2/9であり、このようなＳＮＰを選択する。
【００４２】
以上の（ａ）及び（ｂ）に適合するＸ及びＹの範囲を、図３の斜線の領域として示した。この範囲のアレル頻度を有する４塩基置換型ＳＮＰは、２塩基置換型のＳＮＰよりも個体識別により貢献し得るＳＮＰであり、有効性の高いＳＮＰであるといえる。
【００４３】
以上の（ii）及び（iii）に示したＳＮＰは、例えば、National Center for Biological Information (NCBI)のＳＮＰデータベースに登録されているＳＮＰから検索することができる。
【００４４】
上記（ｉ）〜（iii）の条件を満たすように選択されるＳＮＰは、ゲノム中で、異なる染色体から選択することが望ましい。同一染色体上に存在するＳＮＰは、互いに連鎖していないことが明らかであるか、又はその確率が低いＳＮＰを用いることが望ましい。
【００４５】
なお、上記の条件に従って選択された複数のＳＮＰの組み合わせは、選択されたｉ個の一塩基多型のそれぞれの、アレル頻度から算出された遺伝子型頻度において、ｎ番目の一塩基多型における最も高い遺伝子型頻度を(Max）nとし、最も低い遺伝子型頻度を（Min）nとしたとき、1／Π（Max）i及び1／Π（Min）iがそれぞれ適切な値になるように選択されることが望ましい。
【００４６】
例えば、前記集団を構成する個体数をＵとしたとき、１／Π（Max）i  及び１／Π（Min）i  のそれぞれが、Ｕに対する割合で表したときに適切な範囲であるように選択することもできる。
【００４７】
１／Π（Max）iは、選択されたＳＮＰの組み合わせにおいて、最も確率の高い組み合わせを有する個体が、１／Π（Max）i人に一人の割合で存在することを表す。１／Π（Max）iの値が低ければ、そのＳＮＰの組み合わせを有する個人が、集団内に多く存在し、そのＳＮＰの組み合わせは個人の識別能力が低いものであるといえる。
【００４８】
また、１／Π（Min）iは、選択されたＳＮＰの組み合わせにおいて、最も確率の低い組み合わせを有する個体が、１／Π（Min）i人に一人の割合で存在することを表す。１／Π（Min）iの値が低ければ、そのＳＮＰの組み合わせを有する個体は稀にしか存在せず、個人の識別能力が高いＳＮＰの組み合わせであるといえる。
【００４９】
なお、本発明において個体識別に用いるために選択されるＳＮＰの数ｉは、必要とする識別能力に応じて適宜決定すればよく、簡便性、迅速性、経済性、及び判定の信頼度を考慮して決定してよい。
【００５０】
以上に述べた条件に従って選択したＳＮＰを用いた個体識別方法では、さらに、対象個体が有する遺伝子型の頻度をアレル頻度から算出して、選択されたＳＮＰの全てについての遺伝子型頻度を乗算し、その逆数を取ることによって、対象個体が有する遺伝子型の組み合わせが、集団内に存在する確率を算出することができる。図４を用いて説明すると、対象個体の遺伝子型が１：ＣＣ、２：ＣＣ、３：ＣＴ、４：ＣＣ、５：ＴＴである場合、それぞれの遺伝子型頻度を乗算すると、0.078×0.518×0.3942×0.314×0.2916＝0.001458であり、その逆数は685.7である。よって、このサンプルの遺伝子型は686人に一人存在する遺伝子型である。
【００５１】
例えば、１億人の集団内で１０人に一人が有する遺伝子型であれば、対象個体と試料の遺伝子型が一致しても、それらが同一のものであるという信頼度が低くなる。反対に、対象個体が有する遺伝子型が稀にしか存在しない遺伝子型であれば、判定の信頼度が高くなる。従って、集団内における存在確率を決定し、判定の信頼度を明らかにすることも、個体識別の際には重要である。本工程により存在確率を算出することで個体識別の検査結果の信頼度を判定することができる。
【００５２】
以上詳細に述べた本発明の個体識別方法をまとめると、まず、識別されるべき対象個体が属する集団に存在するＳＮＰ群から、上記（ｉ）〜（iii）の何れかの条件を満たすＳＮＰを複数選択する。ここで選択された複数の一塩基多型における遺伝子型を、対象個体が有する核酸配列、及び試料由来の核酸配列中それぞれで決定する。次いで、両者の決定された遺伝子型を比較し、対象個体の核酸配列と試料の核酸配列が一致するか否かを判定する。
【００５３】
ここで、対象個体及び試料の核酸配列中の遺伝子型を決定する方法は、周知の方法で行えばよく、例えば当該ＳＮＰ部位をポリメラーゼ増幅反応で増幅させて調べる方法、ＤＮＡ配列解析方法等の適切な方法によって行ってもよい。
【００５４】
本発明に従って選択されたＳＮＰを用いることにより、要求される信頼度の中で最小数のＳＮＰ数で個体識別することが可能であり、簡便、迅速に検査でき、且つコストを抑制することができる。
【００５５】
次に、本発明の他の側面から、個体識別検査に用いるためのアレイが提供される。本発明におけるアレイは、標的核酸と相補的な配列を有する核酸プローブが基体に固定されたものである。ここで標的核酸とは、識別されるべき対象個体が属する集団に存在するＳＮＰ群から、上記（ｉ）〜（iii）の条件の何れか一つを満たすように選択されたＳＮＰを含む標的配列を有する核酸鎖を意味する。基体に固定された核酸プローブは、適切な条件下において標的核酸とハイブリダイズし得るものである。  
ここで使用される「相補」、「相補的」および「相補性」の語は、５０％〜１００％の範囲で相補的であればよく、好ましくは１００％で相補的であることを言う。
【００５６】
基体に固定された核酸プローブは、単一の核酸プローブであってもよいが、複数の異なる核酸プローブであってもよい。即ち、それぞれ異なるＳＮＰを含む標的配列を有する標的核酸と、それぞれ相補的な配列を有する核酸プローブを固定してもよい。
【００５７】
また、例えばＡとＴの２塩基置換型のＳＮＰにおいて、Ａである場合の配列に相補的な核酸プローブと、Ｔである場合の配列に相補的な核酸プローブの双方のプローブをアレイに固定してもよく、或いは、一方の配列のためのプローブのみを固定してもよい。同様に、３塩基置換型及び４塩基置換型のＳＮＰでも、各塩基の場合の配列に対応するプローブを用いてもよく、検出したい配列に対応するプローブのみを用いてもよい。核酸プローブの長さは、基体に固定し、ハイブリダイズするのに適切な長さを適宜選択してよく、標的核酸より短くても良い。例えば、約３〜約１０００bpであってよく、好ましくは約１０〜約２００bpであってよい。
【００５８】
標的核酸は、ＳＮＰが存在する部位の上流及び下流の配列から成る配列を有する核酸である。アレイ上で核酸プローブとのハイブリダイゼーションに供する標的核酸は、核酸が含まれる試料溶液をそのまま用いてもよいが、例えばＰＣＲなどによって、標的配列部位を予め増幅切り出しして用いてもよい。このとき、標的核酸の長さは任意に決定すればよいが、プライマーの設計によって、例えば３０〜５００bp程度の長さにしてもよい。標的核酸の長さを適度にすることにより、ハイブリダイゼーションの効率を上昇させることができる。
【００５９】
本発明において使用され得る基体は、核酸プローブが固定可能な基体であればよく、例えば非多孔性、硬質及び半硬質な材質による、ウェル、溝または平らな表面を有する板状形体、又は、球体などの立体形状を有するものであってよい。基体は、これに限定されるものではないが、シリコン、ガラス、石英ガラス、石英などのシリカ含有基材、およびポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリカーボネート、等のプラスチックおよびポリマーなどで製造され得る。
【００６０】
本発明のアレイは、基体に固定化された核酸プローブと標的核酸がハイブリダイズした結果生じた二本鎖の存在を検知するための手段として、電気化学的方法を用いることができるが、これに限定されない。
【００６１】
電気化学的方法による二本鎖核酸の検出は、例えば、公知の二本鎖認識物質を用いて行えばよい。二本鎖認識物質は特に限定されるものではないが、例えば、ヘキスト３３２５８、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーターおよびポリインターカレーター等を用いることが可能である。更に、これらのインターカレーターを電気化学的に活性な金属錯体、例えば、フェロセン、ビオロゲン等で修飾しておくことも可能である。また、その他の公知の二本鎖認識物質も使用可能である。
【００６２】
電気化学的方法により二本鎖核酸を検出する方法では、基体に電極を設け、核酸プローブはこの電極に固定される。電極は、特に限定されるものではないが、例えば、グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カーボンペースト、カーボンファイバーのような炭素電極、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウムのような貴金属電極、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛のような酸化物電極、Ｓｉ、Ｇｅ、ＺｎＯ、ＣｄＳ、ＴｉＯ2、ＧａＡｓのような半導体電極、チタン等によって形成されることができる。これらの電極は導電性高分子によって被覆しても、単分子膜によって被覆してもよく、所望に応じてその他の表面処理剤を処理してもよい。
【００６３】
核酸プローブの固定は、公知の手段によって行えばよい。例えば、スペーサーを電極に固定し、該スペーサーに核酸プローブを固定することによって、核酸プローブをスペーサーを介して電極に固定してもよい。または、予め核酸プローブにスペーサーを結合させ、そのスペーサーを介して電極に固定してもよい。或いは、電極上でスペーサーと核酸プローブを公知の手段によって合成してもよい。また、スペーサーを介しての核酸プローブの固定は、処理又は無処理の電極表面に対して当該スペーサーを、共有結合、イオン結合又は物理吸着などによって直接固定化してもよい。或いは、スペーサーを介した核酸プローブの固定を助けるリンカー剤を用いても良い。また、電極に対する被検核酸の非特異的な結合を防止するためのブロッキング剤をリンカー剤と共に電極に処理しても良い。また、ここで使用されるリンカー剤及びブロッキング剤は、例えば、電気化学的検出を有利に行うための物質であってもよい。
【００６４】
なお、異なる塩基配列を有する核酸プローブは、それぞれ、異なる電極に対してスペーサーを介して固定化されてもよい。
【００６５】
さらに、他の一般的な電気化学的検出法と同じように、対極および／または参照極をアレイに備えてもよい。参照極を設置する場合、例えば、銀／塩化銀電極や水銀／塩化水銀電極などの一般的な参照極を使用することができる。
【００６６】
アレイによる標的核酸の検出は、例えば以下のように行うことができる。ヒトを含む動物などの個体、組織または細胞などの対象から採取した試料より、核酸成分を試料核酸として抽出する。得られた試料核酸は、必要に応じて、逆転写、伸長、増幅および／または酵素処理などの処理をしてもよい。必要に応じて前処理された試料核酸を、核酸プローブ固定化基体に固定化された核酸プローブと接触させ、適切なハイブリダイゼーションが可能な条件下で反応を行う。そのような適切な条件は、標的配列に含まれる塩基の種類、核酸プローブ固定化基体に具備されるスペーサーおよび核酸プローブの種類、試料核酸の種類およびそれらの状態などの諸条件に応じて、当業者であれば適宜選択することが可能である。
【００６７】
ハイブリダイゼーション反応は、例えば次のような条件下で行ってもよい。ハイブリダイゼーション反応溶液は、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液中を用いる。この溶液中にはハイブリダイゼーション促進剤である硫酸デキストラン、並びに、サケ精子ＤＮＡ、牛胸腺ＤＮＡ、ＥＤＴＡおよび界面活性剤などを添加してもよい。ここに得られた試料核酸を添加し、９０℃以上で熱変性させる。この溶液中に、核酸の変性直後、あるいは０℃に急冷後に核酸プローブ固定化基体を挿入する。或いは、基体上に液を滴下することでハイブリダイゼーション反応を行うことも可能である。
【００６８】
反応中は、撹拌、あるいは振盪などの操作で反応速度を高めてもよい。反応温度は、例えば、１０℃〜９０℃の範囲で、反応時間は１分以上１晩程度で行えばよい。ハイブリダイゼーション反応後、電極を洗浄する。洗浄液は、例えば、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いる。試料核酸中に標的配列を含む標的核酸が存在した場合、核酸プローブとハイブリダイズし、基体上に二本鎖核酸が生じる。
【００６９】
続いて、電気化学的手段により二本鎖核酸の検出を行う。検出手順は一般に、ハイブリダイゼーション反応後に基体を洗浄し、電極表面に形成された二本鎖部分に二本鎖認識体を作用させて、それにより生じる信号を電気化学的に測定する。
【００７０】
二本鎖認識体の濃度は、その種類によって異なるが、一般的には１ｎｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの範囲で使用する。この際は、イオン強度０．００１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いればよい。
【００７１】
電気化学的測定は、例えば、二本鎖認識体が電気化学的に反応する電位以上の電位を印加し、二本鎖認識体に由来する反応電流値を測定することによって可能である。この際、電位は定速で掃引するか、あるいはパルスで印加するか、あるいは、定電位を印加してもよい。測定の際に、例えば、ポテンショスタット、デジタルマルチメーターおよびファンクションジェネレーター等の装置を用いて電流、電圧を制御してもよい。さらに、得られた電流値を基に、検量線から標的核酸の濃度を算出してもよい。
【００７２】
以上記載したアレイを用いたハイブリダイゼーション反応によって、検出された標的核酸の配列は、検査対象の個体、及び試料が有する核酸配列である。これによって、それぞれの試料に含まれる核酸配列における、選択されたＳＮＰの遺伝子型を決定することができる。
【００７３】
識別されるべき個体と試料のそれぞれの遺伝子型が決定された後、それらを比較し、両者が一致するか否かを判定する。さらに、用いたＳＮＰの遺伝子型頻度を基に、その個体又は試料の遺伝子型の存在割合を算出し、判定の信頼度を決定してもよい。
【００７４】
本発明の他の側面から、上記アレイを備えた個体識別検査装置が提供される。該装置では、基板状のアレイが好適に用いられ、ここではチップとも称する。さらに、本発明の他の側面から、該個体識別検査装置によって個体識別検査を実行するシステムが提供される。
【００７５】
本発明による個体識別検査装置は、上記の本発明に従ったアレイと、該アレイの基体上に設けられ、薬液又はエアの流れる方向に沿って設けられた流路と、前記基体上に前記流路に沿って複数設けられ、前記プローブが固定化される作用極と、前記流路の内周面に前記作用極に対応して設けられ、各々が前記基体表面に対向する第１の面に位置するように配置され、前記作用極との間に電位差を与える対極と、前記流路の内周面に前記作用極に対応して設けられ、各々が前記基板表面に対向する第２の面に位置するように配置され、前記作用極に検出電圧をフィードバックさせる参照極と、前記流路に開口し、前記流路の上流側から前記流路内に薬液又はエアを送入する送入ポートと、前記流路に開口し、前記流路の下流側から前記流路内の薬液又はエアを送出する送出ポートと、前記流路内に試料を注入する試料注入口とを具備する。
【００７６】
また、本発明による個体識別検査システムは、前記個体識別検査装置と、前記送入ポートに連通し、該送入ポートを介して前記流路内に薬液又はエアを供給する第１の配管と、前記第１の配管の薬液又はエアの流量を制御する第１の弁とを備えた供給系と、前記送出ポートに連通し、該送出ポートを介して前記流路内から薬液又はエアを排出する第２の配管と、前記第２の配管の薬液又はエアの流量を制御する第２の弁と、第２の配管に設けられ、前記流路内から薬液又はエアを吸い上げるポンプとを備えた排出系と、前記作用極と対極との間に電位差を与える電圧印加部を備えた測定系と、前記アレイの温度を制御する温度制御系と、前記供給系の第１の弁と、前記排出系の第２の弁及びポンプと、前記測定系の前記電圧印加部と、前記温度制御系とを制御し、前記作用極又は前記対極から電気化学反応信号を検出し、この電気化学反応信号を測定データとして格納する制御機構と、前記制御機構に制御条件パラメータを与えて前記制御機構を制御するとともに、前記測定データに基づいて塩基配列の解析処理を実行し、固体識別検査の判定を行うコンピュータとを具備する。
【００７７】
以下、図面を参照しながら本発明の個体識別検査装置及びシステムの一実施形態を説明する。
【００７８】
図５は本発明の一つの態様における個体識別検査システムの全体構成を示す概念図である。図５に示すように、個体識別検査システム１は、チップカートリッジ１１（個体識別検査装置）と、このチップカートリッジ１１と電気的に接続される測定系１２、チップカートリッジ１１に設けられた流路とインタフェース部を介して物理的に接続される送液系１３及びチップカートリッジ１１の温度制御を行う温度制御系１４から構成される。
【００７９】
これら測定系１２、送液系１３及び温度制御系１４は制御機構１５により制御される。制御機構１５は、コンピュータ１６に電気的に接続されており、このコンピュータ１６に備えられたプログラムにより、制御機構１５が制御される。本実施形態では、チップカートリッジ１１、測定系１２、送液系１３及び温度制御系１４を測定ユニット１０と称する。
【００８０】
チップカートリッジ１１には、核酸プローブが固定化されたチップ２１が実装されたプリント基板２２が取り付けられて用いられる。核酸プローブはチップ２１の作用極に固定化される。チップ２１のセル内に導入される試料（検体溶液）には、検査の対象となる核酸が含まれている。この実施形態の個体識別検査装置は、標的核酸を核酸プローブとハイブリダイゼーションさせ、その反応の有無をバッファ、挿入剤導入後にモニタリングすることにより、試料中に標的核酸が含まれているか否かを判別する。
【００８１】
図６はチップカートリッジ１１の詳細な構成を示す図であり、（ａ）は上面から見た図、（ｂ）はＡ−Ａ方向から見た図、（ｃ）はＢ−Ｂ方向から見た部分透視断面図、（ｄ）はチップカートリッジ１１の一構成要素である支持体１１１を裏面から見た図を示している。
【００８２】
チップカートリッジ本体１１０は、プリント基板２２を下部側から支持する支持体１１１と、この支持体１１１とともにプリント基板２２を上部側から挟み込み固定支持するためのチップカートリッジ上蓋１１２からなる。
【００８３】
チップカートリッジ上蓋１１２の側部には２つの開口が設けられ、その開口のうちの１つにはインタフェース部１１３ａが、他の１つにはインタフェース部１１３ｂが接続されている。これらインタフェース部１１３ａ及び１１３ｂは、送液系１３とチップカートリッジ１１のインタフェースとして機能する。これらインタフェース部１１３ａ及び１１３ｂの内部にはそれぞれ流路１１４ａ及び１１４ｂが設けられている。流路１１４ａを介して、送液系１３上流側からの薬液やエアをチップカートリッジ１１内部に送入する。流路１１４ｂを介して、チップカートリッジ１１内の試料、薬液及びエアを送液系１３下流側に送出する。
【００８４】
図６（ａ）〜（ｃ）では、流路１１４ａ及び１１４ｂは破線で示されている。これら流路１１４ａ及び１１４ｂは、インタフェース部１１３ａ及び１１３ｂからチップカートリッジ上蓋１１２内まで連通しており、さらにはセル１１５に通じている。セル１１５は、チップ２１とこのチップ２１に導入される各種溶液との電気化学反応を生じさせるために設けられる領域である。このセル１１５は、チップ２１が実装されたプリント基板２２の四隅がこのチップカートリッジ１１のチップカートリッジ上蓋１１２に基板固定ねじ２５により固定化されている場合に、チップ２１とシール材２４ａ、チップカートリッジ上蓋１１２に囲まれた閉空間領域で定められる。チップ２１を実装したプリント基板２２がチップカートリッジ上蓋１１２に固定化された状態で、支持体１１１とチップカートリッジ上蓋１１２によりプリント基板２２がシール材２４ａを挟んで保持される。さらに、上蓋固定ねじ１１７によりチップカートリッジ上蓋１１２が固定される。これにより、流路１１４ａからセル１１５を介して流路１１４ｂまで連通した各種薬液やエアの注入・吐出経路が定められる。なお、チップ２１は、プリント基板２２に封止樹脂２３により封止されている。
【００８５】
セル１１５の上面に位置するチップカートリッジ上蓋１１２には、送入ポート１１６ａ及び送出ポート１１６ｂが設けられている。送入ポート１１６ａは、チップカートリッジ上蓋１１２の側面から底面まで貫通し、セル孔部１１５ａでチップカートリッジ上蓋１１２の底面に開口している。送出ポート１１６ｂは、チップカートリッジ上蓋１１２の別の側面から底面まで貫通し、セル孔部１１５ｂでチップカートリッジ上蓋１１２の底面に開口している。送入ポート１１６ａが流路１１４ａに、送出ポート１１６ｂが流路１１４ｂに接続されることにより、流路１１４ａとセル１１５，流路１１４ｂとセル１１５が連通する。
【００８６】
プリント基板２２表面であってセル１１５から離間した位置に、電気コネクタ２２ａが設定されている。電気コネクタ２２ａは、プリント基板２２の基板本体のリードフレームと電気的に接続されている。また、この基板本体のリードフレームは、チップ２１の各種電極とリードなどにより電気的に接続されている。この電気コネクタ２２ａに測定系１２の端子を接続することにより、チップ２１で得られる電気信号を、プリント基板２２の所定の位置に設けられた所定の端子を介して、さらには電気コネクタ２２ａを介して測定系１２に出力することができる。
【００８７】
図６（ｄ）に示すように、支持体１１１はコの字型をしており、中央に切り込み部１１１ａが設けられている。この切り込み部１１１ａはプリント基板２２よりも小さく、チップ２１よりも大きな形状となっている。これにより、支持体１１１によるプリント基板２２の支持機能を保ちつつ、チップ２１に支持体１１１を介さずに温度制御系１４を接して配置することができる。１１７ａはねじ孔であり、上蓋固定ネジ１１７が固定される。
【００８８】
チップ２１の温度を調節する温度制御系１４としては、例えばペルティエ素子が用いられる。これにより、±０．５℃の温度制御が可能である。核酸の反応は、室温に比較的近い温度範囲において行うのが一般的である。従って、ヒーターのみでの温度制御は安定性に乏しい。また、温度プロファイルにより、核酸の反応を制御する必要があるため、別に冷却機構が必要になってきてしまう。その点、ペルティエ素子は、電流の向きを変えることにより、加熱・冷却いずれも可能であるため、最適である。
【００８９】
図７は上蓋固定ねじ１１７で固定する前の支持体１１１とチップカートリッジ上蓋１１２を示す図である。図７に示すように、チップカートリッジ上蓋１１２に、チップ２１が実装されたプリント基板２２の四隅が基板固定ねじ２５で固定されている。チップカートリッジ上蓋１１２には、シール材２４ａが一体化されている。従って、チップ２１上に、シール材２４ａとチップカートリッジ上蓋１１２で囲まれたセル１１５が定められる。さらに、上蓋固定ねじ１１７で支持体１１１にチップカートリッジ上蓋１１２が固定されて用いられる。なお、基板固定ねじ２５は、プリント基板２２の裏面側から固定しても、表面側から固定してもよい。このように、チップカートリッジ上蓋１１２にプリント基板２２を固定化することにより、チップ２１、シール材２４ａ及びチップカートリッジ上蓋１１２の間の密着性を確実に保持することができる。
【００９０】
図８はチップ２１を実装したプリント基板２２の詳細な構成を示す図である。図８に示すように、プリント基板２２上には、チップ２１が封止樹脂２３により封止されている。チップ２１上には、作用極５０１が設けられている。この作用極５０１は、図８の矢印で示される薬液及びエアの流れる方向に沿って１つずつ設けられている。薬液及びエアの流れる方向は、チップカートリッジ上蓋１１２及びシール材２４ａによりチップ２１上の作用極５０１の周囲に矢印で示す方向に沿った空間を残して密閉することにより定められる。破線で示された領域は、シール材２４ａが配置される領域である。複数の作用極５０１は、この破線で示された領域に収まるように配置される。
【００９１】
プリント基板２２の端部には電気コネクタ２２ａが設置されている。チップ２１の作用極５０１と電気コネクタ２２ａは、プリント基板２２表面に設けられたリードフレームなどにより電気的に接続されている。電気コネクタ２２ａには、測定系１２の信号インタフェースを接続することにより、チップ２１の各電極と測定系１２とを電気的に接続することができる。
【００９２】
図９（ａ）は図６（ａ）に示すセル１１５及びセル１１５に通じる薬液供給系統をＣ−Ｃ方向から見た断面図、図９（ｂ）はセル１１５近傍の上面図である。図９（ａ）に示すように、チップカートリッジ上蓋１１２の底面には、高さｄ４２の流路状凸部１１２ａが設けられている。そして、この流路状凸部１１２ａには例えばスクリーン印刷などにより予めシール材２４ａが印刷され、シール材２４ａと一体的に形成されている。これにより、シール材２４ａとチップカートリッジ上蓋１１２との位置決めを行うことなくセル１１５を定めることができ、セル１１５の組み立て工程が簡便になる。シール材２４ａは、流路状凸部１１２ａとチップ２１との間に固定される。これにより、チップカートリッジ上蓋１１２とチップ２１の間に閉空間が定められる。この閉空間が試料や薬液とプローブとの電気化学反応を生じさせる反応室としてのセル１１５である。セル１１５の底面はチップ２１により定められる。セル１１５の側面はチップカートリッジ１１２に設けられた流路状凸部１１２ａ及びシール材２４ａの側部により定められる。セル１１５の上面はチップカートリッジ１１２のうち流路状凸部１１２ａが設けられていない部位により定められる。これにより、セル孔部１１５ａ及び１１５ｂ以外は密閉された閉空間が定められ、チップ２１と蓋１２０との液密が保持される。このセル１１５の高さは約０．５ｍｍ程度に設定される。ここでは０．５ｍｍ程度に設定しているがこの限りではなく、０．１ｍｍ〜３ｍｍの範囲で設定するのが望ましい。
【００９３】
セル１１５は、上面から見ると図９（ｂ）に示すように細長の流路６０１が配置された形状をなす。図９（ｂ）では、送入ポート１１６ａ側のセル孔部１１５ａからセル孔部１１５ｂに向けて同じ路幅の１本の流路６０１が設けられている。この１本の流路６０１は、検出用流路６０１ａと、ポート接続流路６０１ｂ及び６０１ｃ、流路接続流路６０１ｄからなる。検出用流路６０１ａは、作用極５０１が配置される複数本の流路である。ポート接続流路６０１ｂは、セル孔部１１５ａに最も近い検出用流路６０１ａをセル孔部１１５ａに接続する。ポート接続流路６０１ｃは、セル孔部１１５ｂに最も近い検出用流路６０１ａをセル孔部１５ｂに接続する。流路接続用流路６０１ｄは隣りあう検出用流路６０１ａの端部同士を接続して複数の検出用流路６０１ａに薬液又はエアが流れる方向を一方向に定める。これにより、ある検出用流路６０１ａを流れた薬液又はエアは、流路接続用流路６０１ｄに流れ込み、さらに同じ方向に隣りあう別の検出用流路６０１ａに流れる。また、流路６０１ａ〜６０１ｄのいずれも、同じ路幅及び断面を有しており、その路幅は０．５ｍｍ〜１０ｍｍが望ましい。
【００９４】
図９（ｂ）において、破線で囲まれ流路６０１が形成されていない領域は、流路状凸部１１２ａ及びシール材２４ａが設けられておりチップ２１とシール材２４ａが接する領域である。流路６０１が形成されている領域は、流路状凸部１１２ａ及びシール材２４ａが設けられない領域である。送入ポート１１６ａ及び送出ポート１１６ｂは各々セル１１５の上面から上方に、セル底面に対してほぼ垂直な方向に所定の高さまで延びている。送入ポート１１６ａ及び送出ポート１１６ｂはさらにセル１１５の中心から互いに遠ざかる方向にその流路が折れており、流路１１４ａ及び１１４ｂにそれぞれ接続される。
【００９５】
送出ポート１１６ｂは、セル底面に対してほぼ垂直な方向に所定の高さまで延び、さらにセル１１５の中心から遠ざかる方向にほぼ直角に折れているが、その折れ曲がり位置で２つの経路に分岐する。その一つの経路は、チップカートリッジ上蓋１１２の表面まで貫通し、試料注入口１１９に通じている。これにより、試料注入口１１９から注入された試料は、送出ポート１１６ｂを通ってセル１１５に導入される。試料注入口１１９と送出ポート１１６ｂの中心軸はほぼ一致しており、試料注入口１１９の口径は、送液ポート１１６ｂの口径よりも大きく設定されている。また、試料注入口１１９近傍に設けられ、蓋１２０により試料注入口１１９を塞ぐことができる。これにより、試料注入口１１９を利用せず、薬液を流路１１４ａからセル１１５を介して流路１１４ｂに循環させる場合に薬液が試料注入口１１９から流出するのを防止することができ、薬液の経路を確保することができる。また、蓋１２０にはシール材１２１が設けられており、試料注入口１１９を密閉することにより、薬液のわずかな漏出を防止できる。図９（ａ）の例では特に示していないが、送出ポート１１６ｂから流路１１４ｂに接続される経路のみを残して試料注入口１１９への経路を完全に塞ぐような深さのシール材１２１を用いれば、試料注入口１１９側への薬液やエアの滞留を低減することができる。
【００９６】
以上のような構成により、薬液は図９（ａ）の矢印で示される方向に、流路１１４ａ、送入ポート１１６ａ、セル１１５（流路６０１），送出ポート１１６ｂ、流路１１４ｂの順に流れることができる。また、試料は、試料注入口１１９から注入され、矢印の方向に送出ポート１１６ｂを通ってセル１１５内に導入される。従って、試料は送出側から注入されることとなり、薬液の供給の流れと試料の注入経路が逆に設定されている。これにより、洗浄工程において、試料の洗浄効率を高めることができる。
【００９７】
図９（ｃ）は送入ポート１１６ａと送出ポート１１６ｂと流路６０１との最適な位置関係を示す図である。送入ポート１１６ａの外周はポート接続流路６０１ｂの外周と接している。また、送出ポート１１６ｂの外周はポート接続流路６０１ｃの外周と離れている。これにより、薬液やエア送入の際に送入ポート１１６ａのポート隅近傍に生じやすい薬液残りやエア残りを低減することができるとともに、薬液や送出の際に送出ポート１１６ｂのポート隅で生じる送液速度のばらつきを低減することができ、エア残りなどを低減することができる。なお、同図の破線で示すように、ポート接続流と６０１ｂの外周に送入ポート１１６ａの外周が重なることによりポート接続流路６０１ｂから送入ポート１１６ａがはみ出した形状で形成されていても同様の効果を得られる。もちろん、送入ポート１１６ａと送出ポート１１６ｂの流路６０１との位置関係は図９（ｃ）に示したものに限定されない。送入ポート１１６ａ側は、ポート接続流路６０１ｂとの接続で、両者の外周が重なりを有する場合、離れる場合の３通りが考えられ、送出ポート１１６ｂ側も、ポート接続流路６０１ｃの接続で、両者の外周が接する場合、重なりを有する場合、離れる場合の３通りが考えられる。
【００９８】
図１０及び図１１は、セル１１５の詳細な構成を示す図である。図１０（ａ）はセル孔部１１５ａと１１５ｂを結んだ直線で切断された断面図、図１０（ｂ）はチップ２１にチップカートリッジ上蓋１１２が固定される様子を示す図、図１１はセル１１５の上面図である。図１０（ａ）に示すように、検出用流路６０１ａがほぼ等間隔に複数形成されている。図１０（ａ）の左側に示される検出用流路６０１ａの断面を奥側から手前側に薬液又はエアが流れる場合、中央の検出用流路６０１ａはこれとは逆の方向、すなわち手前側から奥側に流れ、左側に示される検出用流路６０１ａはさらにこれとは逆の方向、すなわち奥側から手前側の方向に流れる。このように、隣り合う検出用流路６０１ａの薬液又はエアの流れる方向は逆向きとなる。これら検出用流路６０１ａを薬液又はエアの流れる方向に対して垂直な断面で切断すると、すべて同じ長方形の断面形状をなし、かつ電極配置も同一である。
【００９９】
検出用流路６０１ａの底面はチップ２１により定められる。検出用流路６０１ａの各々の底面には作用極５０１がそれぞれ１つ形成されている。検出用流路６０１ａの側面はチップカートリッジ上蓋１１２から凸設された流路状凸部１１２ａ及びシール材２４ａにより定められる。この流路側面、すなわち流路状凸部１１２ａの側部には、流路底面から所定の高さにそれぞれ参照極５０３が固定されている。このように、複数の参照極５０３はチップ表面と平行な平面上であってチップ表面と対向する面に位置し、かつその平面は作用極５０１が設けられている平面よりも高い平面に位置する。検出用流路６０１ａの上面は流路状凸部１１２ａが設けられていないチップカートリッジ上蓋１１２底面により定められる。この流路上面にはそれぞれ対極５０２が固定されている。このように、複数の対極５０２はチップ底面と平行な平面上であってチップ表面と対向する面に位置し、かつその平面は作用極５０２や参照極５０３が設けられている平面よりも高い平面に位置する。このように、作用極５０１、対極５０２及び参照極５０３は、それぞれ異なる平面に三次元配置されている。
【０１００】
シール材２４ａはチップカートリッジ上蓋１１２の流路状凸部１１２ａに予め印刷等により固定化されている。従って、セル１１５を組み立てる際には、シール材２４ａが一体化したチップカートリッジ上蓋１１２をチップ２１に対して図１０（ｂ）の矢印に示す方向に押圧する。これにより、シール材２４ａを介してチップカートリッジ上蓋１１２とチップ２１の間に図１０（ａ）に示すような周囲が密閉された流路６０１が定められる。
【０１０１】
図１１に示すように、作用極５０１，対極５０２及び参照極５０３からなる３電極が各検出用流路６０１ａに、薬液又はエアの流れる方向に等間隔に配置されている。この３電極は、それぞれ薬液又はエアの流れる方向に対して垂直な平面に配置されている。
【０１０２】
なお、図１１の例では、上面から見て作用極５０１，対極５０２及び参照極５０３の位置関係が流路の方向にかかわらず同じマトリクス状の配置を示したがこれに限定されない。図１２に示すように、隣り合う検出用流路６０１ａにおける流路断面の構造を薬液又はエアの流れる方向に沿って左右逆転させてもよい。この場合、いずれの検出用流路６０１ａでも対極５０２は流れる方向に向かって流路の右側の側面に配置される。これにより、薬液又はエアの流れる方向にすべて同一形状の３電極配置が実現できる。作用極５０１及び対極５０２についても、断面で左右対称の位置に配置しない場合には、この参照極５０３と同じように隣り合う検出用流路６０１ａにおいて左右逆転させた位置に配置されるようにできる。
【０１０３】
このように、同じ断面形状流路に薬液又はエアの流れる方向に沿ってそれぞれ１つずつ作用極５０１、対極５０２及び参照極５０３が３電極１組として設けられ、かつこれら３電極の位置関係が同じで流路形状も同じ構成となっている。作用極５０１から見れば、作用極５０１に対する流路底面、側面及び上面への距離、作用極５０１から対応する対極５０２、参照極５０３に対する位置関係が同じになっている。これにより、各３電極で検出される電気化学信号特性の均一性が向上する。その結果、検出の信頼性が向上する。
【０１０４】
ここでは、対極５０２、参照極５０３がそれぞれ対応する作用極５０１に対して分離された配置しているが、これに限定されるものではない。対極５０２もしくは参照極５０３が、あるいはそれらのいずれもが複数電極連結された構成となっていてもよい。その場合、それぞれの電極における各作用極から最も近傍の領域が対極や参照極として機能する。また、流路の断面形状は上述した図１０（ａ）の構成に限定されない。
【０１０５】
次に、前述したチップ２１及びプリント基板２２の製造方法について図１３の工程断面図に沿って説明する。シリコン基板２１１を洗浄した後、シリコン基板２１１を加熱し、シリコン基板２１１表面に熱酸化膜２１２を形成する。シリコン基板２１１の代わりにガラス基板を用いてもよい。次に、基板全面にＴｉ膜２１３を例えば５０ｎｍの膜厚で、次いでＡｕ膜２１４を例えば２００ｎｍの膜厚でスパッタリングにより形成する。ここで、Ａｕ膜２１４はその結晶面方位が＜１１１＞配向になっていることが好ましい。次に、後に電極や配線となる領域を保護するようにフォトレジスト膜２１０をパターニングし（図１３（ａ））、Ａｕ膜２１４及びＴｉ膜２１３膜をエッチングする（図１３（ｂ））。本実施形態ではＡｕ膜２１４のエッチングにはＫＩ／Ｉ２混合溶液を、ＴｉのエッチングにはＮＨ４ＯＨ／Ｈ２Ｏ２混合溶液を用いた。Ａｕ膜２１４のエッチングには、希釈した王水を用いる方法や、イオンミリングで除去する方法もある。Ｔｉ膜２１３のエッチングも、同様に、弗酸や、バッファード弗酸を用いてウェットエッチング処理する方法や、例えば、ＣＦ４／Ｏ２混合ガスによるプラズマを用いたドライエッチングによる方法も適用可能である。
【０１０６】
次に、フォトレジスト膜２１０を酸素アッシングにより除去する（図１３（ｃ））。フォトレジスト膜２１０の除去工程は、溶剤を用いたり、レジストストリッパを用いたり、また、これらと酸素アッシング工程を併用したりして行うことも可能である。
【０１０７】
次に、全面にフォトレジスト２１５を塗布し、電極部及びボンディングパッドを開口するようにパターニングする（図１３（ｄ））。その後、クリーンオーブン内で、例えば、２００℃において、３０分間ハードベイクを行う。ハードベイクの方法は、熱板を用いたり、また、処理条件も適宜変更可能である。ここでは、フォトレジスト膜２１５を保護膜として選択したが、フォトレジスト以外に、ポリイミド、ＢＣＢ（ベンゾシクロブテン）等の有機膜を用いることも可能である。また、ＳｉＯ、ＳｉＯ２やＳｉＮのような無機膜を保護膜に用いても良い。その場合、電極部を保護するようにフォトレジストを開口してＳｉＯ等を堆積し、リフトオフ法により、電極部以外の領域を保護したり、もしくは、全面にＳｉＮ等を形成した後、電極部のみを開口するようにフォトレジスト膜２１５をパターン形成し、エッチングにより電極上のＳｉＮ膜等を除去し、最後にフォトレジスト膜２１５を剥離することにより形成してもよい。
【０１０８】
次に、ダイシングを行うことによりチップ化する。最後に、電極部表面を清浄化するため、ＣＦ４／Ｏ２混合プラズマによる処理を行う。これにより、チップ２１が得られる。そして、このチップ２１を電気コネクタ２２ａが実装されたプリント基板２２上にマウントする。そして、チップ２１のボンディングパッドとプリント基板２２上のリード配線とをワイヤボンディングにより接続する。その後、封止樹脂２３を用いてワイヤボンディング部分を保護する。以上の工程により、チップ２１を実装したプリント基板２２を作製することができる。
【０１０９】
作製されたチップ２１の上面図を図１４に示す。図１４に示すように、チップ表面の中央近傍には、作用極５０１が複数設けられている。また、作用極５０１が形成される領域は、破線で示されるシール材２４ａの形成領域に収まるようにして用いられる。また、チップ周辺部にはボンディングパッド２２１が配置される。そして、作用極５０１の各々は、ボンディングパッド２２１に配線２２２で接続される。なお、この図１４では示していないが、ボンディングパッド２２１の形成された周辺部分は前述の封止樹脂２３により封止される。
【０１１０】
次に、送液系１３の具体的な構成の一例を図１５を用いて説明する。この送液系１３は、チップカートリッジ１１の流路１１４ａ側に設けられた供給系統と、流路１１４ｂ側に設けられた排出系統に大別される。配管４０４の最上流には、エア供給源４０１が接続されている。このエア供給源４０１の下流側には、エア以外の薬液などが配管４０４を介してエア供給源４０１に逆流するのを防止する逆止弁４０２が設けられ、さらに下流側には２方電磁弁４０３（Ｖａ）が設けられている。これにより配管４０４からチップカートリッジ１１の方へ流れ込むエアの流量が制御される。
【０１１１】
配管４１４には、薬液の一つとしてのミリＱ水を収容したミリＱ水供給源４１１が接続されている。このミリＱ水供給源４１１の下流側には、ミリＱ水以外の薬液やエアなどがミリＱ水供給源４１１に逆流するのを防止する逆止弁４１２が設けられ、さらに下流側には３方電磁弁４１３（Ｖｗａ）が設けられている。この３方電磁弁４１３により、配管４０４と配管４１５の連通と、配管４１４と配管４１５の連通の切替が行われる。すなわち、３方電磁弁４１３の非通電時には配管４０４を配管４１５に連通させ、通電時には配管４１４を配管４１５に連通させる。これにより、配管４１５へのエアとミリＱ水の供給切替が行える。
【０１１２】
配管４２４には、薬液の一つとしてのバッファ（緩衝液）を収容したバッファ供給源４２１が接続されている。このバッファ供給源４２１の下流側には、バッファ以外の薬液やエアなどがバッファ供給源４２１に逆流するのを防止する逆止弁４２２が設けられ、さらに下流側には３方電磁弁４２３（Ｖｂａ）が設けられている。この３方電磁弁４２３により、配管４２４と配管４２５の連通と、配管４１５と配管４２５の連通の切替が行われる。すなわち、３方電磁弁４２３の非通電時には配管４１５を配管４２５に連通させ、通電時には配管４２４を配管４２５に連通させる。これにより、配管４２５へのバッファの供給と、エアあるいはミリＱ水の供給の切替が行える。
【０１１３】
配管４３４には、薬液の一つとしての挿入剤を収容した挿入剤供給源４３１が接続されている。この挿入剤供給源４３１の下流側には、挿入剤以外の薬液やエアなどが挿入剤供給源４３１に逆流するのを防止する逆止弁４３２が設けられ、さらに下流側には３方電磁弁４３３（Ｖｉｎ）が設けられている。この３方電磁弁４３３により、配管４３４と配管４３５の連通と、配管４２５と配管４３５の連通の切替が行われる。すなわち、３方電磁弁４３３の非通電時には配管４２５を配管４３５に連通させ、通電時には配管４３４を配管４３５に連通させる。これにより、配管４３５への挿入剤の供給と、エア、ミリＱ水あるいはバッファの供給の切替が行える。
【０１１４】
以上、エアや薬液の供給系統において、２方電磁弁４０３及び３方電磁弁４１３，４２３及び４３３を制御することにより、配管４３５を介してチップカートリッジ１１に供給されるエアや、ミリＱ水、バッファ及び挿入剤などの薬液の供給の切替を行い、また供給されるエアやこれら薬液の流量を制御することができる。
【０１１５】
配管４３５の上流側は前述した３方電磁弁４３３が連通し、その下流側は３方電磁弁４４１（Ｖｃｂｉｎ）が連通している。３方電磁弁４４１により、配管４３５が配管４４０及びバイパス配管４４６に分岐させることができる。３方電磁弁４４１は、非通電時には配管４３５をバイパス配管４４６に連通させ、通電時には配管４３５を配管４４０に連通させる切替を行う。また、３方電磁弁４４５は、非通電時にはバイパス配管４４６を配管４５０に連通させ、通電時には配管４４０を配管４５０に連通させる切替を行う。これら３方電磁弁４４１及び４４５により、各種薬液やエアなどの供給をバイパス配管４４６及び配管４４０に切替えることができる。
【０１１６】
配管４４０には、３方電磁弁４４１から見て下流側に向かって順に２方電磁弁４４２（Ｖ１ｉｎ）、チップカートリッジ１１、液センサ４４３、２方電磁弁４４４（Ｖ１ｏｕｔ）、３方電磁弁４４５（Ｖｃｂｏｕｔ）が設けられている。２方電磁弁４４２側には、チップカートリッジ１１の送入系統に相当する流路１１４ａが連通し、２方電磁弁４４４側には、チップカートリッジ１１の送出系統に相当する流路１１４ｂが連通している。これにより、チップカートリッジ１１の送入系統に配管４４０を介して薬液やエアなどが供給され、チップカートリッジ１１の送出系統からこれら薬液やエアなどを排出することができる。また、２方電磁弁４４２及び４４４により、この送液及び吐液の経路における薬液やエアなどの流量を制御することができる。また、液センサ４４３により、チップカートリッジ１１に流れ込み、あるいはチップカートリッジ１１から排出される薬液の流量をモニタすることができる。
【０１１７】
配管４５０には、３方電磁弁４４５から見て下流側に向かって順に２方電磁弁４５１（Ｖｖｉｎ）、減圧領域４５２、２方電磁弁４５３（Ｖｏｕｔ）、送液ポンプ４５４、３方電磁弁４５５（Ｖｗｗ）が設けられている。２方電磁弁４５１及び４５３は、減圧領域４５２前後の経路における薬液やエアの逆流を防止する。また、送液ポンプ４５４はチューブポンプからなり、チップカートリッジ１１から見て送出側（下流側）の排出系統に設けられている点が特徴である。すなわち、チューブポンプを用いることにより、薬液がチューブ壁以外の機構に接しないため、汚染防止の観点から好ましい。また、チップカートリッジ１１への薬液やエアの供給及び排出を吸引動作により行うことにより、チップカートリッジ１１内部での薬液とエアの置換が潤滑に行うことができるのみならず、万一の場合として配管に緩みが生じたり、もしくはチップカートリッジ１１が配管４４０から外れたりした場合にも、液漏れが生じない。これにより、装置設置の安全性が向上する。
【０１１８】
もちろん、ポンプをチップカートリッジ１１上流側の配管に設け、このポンプによりチップカートリッジ１１にエアや薬液を押し出す構成としてもよい。また、ポンプは、チューブポンプに限ることなく、シリンジポンプ、プランジャポンプ、ダイアフラムポンプ、マグネットポンプ等を用いることもできる。
【０１１９】
３方電磁弁４５５は、非通電時には配管４５０を配管４６１に連通させ、通電時には配管４５０を配管４６３に連通させるように切替を行う。配管４６１には廃液タンク４６２が設けられ、配管４６３には挿入剤廃液タンク４６４が設けられている。これにより、挿入剤以外のミリＱ水、バッファなどの薬液を３方電磁弁４５５の切替により廃液タンク４６２に導き、挿入剤を挿入剤廃液タンク４６４に導くことができる。これにより、挿入剤を分別回収することが可能となる。
【０１２０】
なお、各電磁弁の間は、テフロンチューブ等の配管で接続してもよいが本実施形態では、チップカートリッジ１１に対してその上流側と下流側でそれぞれ電磁弁と流路を一体型構造としたマニフォールド構造で構成している。これにより、配管内の容量が少なくなることから、必要な薬液量を大幅に削減できる。また、配管内における薬液流れが安定するため、検出結果の再現性や安定性が向上する。
【０１２１】
この図１５に示す送液系１３を用いた送液工程を図１６のフローチャートを用いて説明する。まず、作用極５０１上に固定化された核酸プローブと試料とのハイブリダイゼーション反応をセル１１５内で実行させる（ｓ２１）。このハイブリダイゼーション反応の実行では、例えばチップカートリッジ１１の底面、すなわちプリント基板２２の底面が４５℃程度となるように温度制御系１４を制御し、例えば６０分間保持する。
【０１２２】
このハイブリダイゼーション反応と並行して、薬液ラインの立ち上げを行う（ｓ２２）。具体的には、３方電磁弁４４１及び４４５を制御することによりバイパス配管４４６側を利用し、３方電磁弁４３３を通電させることで挿入剤供給源４３１から挿入剤を例えば１０秒程度供給する。３方電磁弁４５５は通電させ、配管４５０からの挿入剤は挿入剤廃液タンク４６４に収容される。次いで、挿入剤とエアを交互に例えば５秒ずつ程度繰り返し配管４３５からバイパス配管４４６に導入する。次いで、エアのみを配管４３５からバイパス配管４４６に導入する。この段階で廃液タンク４６２に廃液切替を行う。そして、バッファをバッファ供給源４２１からバイパス配管４４６に導入する。その後、ミリＱ水とエアを交互に例えば５秒ずつ程度繰り返し配管４３５からバイパス配管４４６に導入する。
【０１２３】
この薬液ラインの立ち上げが終了し、ハイブリダイゼーション反応が終了すると、配管内洗浄が行われる（ｓ２３）。配管内洗浄は、例えば温度制御系１４によりプリント基板２２の温度を２５℃程度とした上で、ミリＱ水でバイパス配管４４６をパージした後、エアとミリＱ水を交互に例えば５秒ずつ程度繰り返し導入する。次に、チップカートリッジ内洗浄が行われる（ｓ２４）。チップカートリッジ内洗浄は、薬液導入経路をバイパス配管４４６から配管４４０に切り替え、エアとミリＱ水を交互に例えば５秒ずつ程度繰り返し配管４４０に導入する。そして、液センサ４４３によりチップカートリッジ１１内に水が充填されたことを確認した上で、導入経路をバイパス配管４４６に切り替える。
【０１２４】
次に、配管内バッファパージが行われる（ｓ２５）。配管内バッファパージでは、バッファとミリＱ水が混合しないようにまずエアをバイパス配管４４６に導入する。次に、エアとバッファを交互に例えば５秒ずつ程度繰り返しバイパス配管４４６に導入する。そして、バイパス配管４４６に設けられた液センサ４４７によりバイパス配管４４６がバッファで置換されたことを確認する。次に、チップカートリッジ内バッファ注入が行われる（ｓ２６）。チップカートリッジ内バッファ注入では、まずバイパス配管４４６から配管４４０に切り替え、エアとバッファを交互に例えば５秒ずつ程度繰り返しチップカートリッジ１１内に導入する。次に、チップカートリッジ１１へのバッファ充填が行われる（ｓ２７）。バッファ充填では、液センサ４４３でチップカートリッジ１１内の状態を監視しながらバッファをチップカートリッジ１１に導入し、例えば６０℃で３０分間放置することにより、不要な試料の洗浄を行う（ｓ２８）。不要な試料の洗浄工程後、配管４４０からバイパス配管４４６に切り替え、ミリＱ水を導入することにより配管内洗浄が行われる（ｓ２９）。この配管内洗浄では、さらにエアとミリＱ水が交互に例えば５秒程度ずつ繰り返し導入される。
【０１２５】
次に、チップカートリッジ内洗浄が行われる（ｓ３０）。チップカートリッジ内洗浄では、バイパス配管４４６からチップカートリッジ１１に切り替えられ、エアと水が交互に例えば５秒程度ずつ繰り返し導入される。その後、液センサ４４３によりチップカートリッジ１１内にミリＱ水が充填されたことを確認した上でバイパス配管４４６に切り替えられる。次に、測定が開始される。測定では、まず配管内挿入剤パージが行われる（ｓ３１）。この配管内挿入剤パージでは、バイパス配管４４６にエアを導入しながら廃液を挿入剤廃液タンク４６４に切り替える。次に、エアと挿入剤を交互に例えば５秒程度ずつ繰り返しバイパス配管４４６に供給した後、バイパス配管４４６が挿入剤で置換されたかを液センサ４４７を用いて検出する。
【０１２６】
次に、チップカートリッジ１１内挿入剤注入が行われる（ｓ３２）。この工程では、先ずバイパス配管４４６からチップカートリッジ１１側に切り替えられた後、エアと挿入剤が交互に例えば５秒ずつ程度繰り返し導入される。次に、液センサ４４３での監視の下、チップカートリッジ１１への挿入剤充填が行われる（ｓ３３）。その後測定が行われる（ｓ３４）。測定が終了すると、バイパス配管４４６にミリＱ水を導入し、次いでエアとミリＱ水を交互に例えば５秒程度ずつ導入した後エアで置換して配管内洗浄が行われる（ｓ３５）。
【０１２７】
最後に、バイパス配管４４６からチップカートリッジ１１に置換してエアとミリＱ水を交互に例えば５秒程度ずつ導入し、チップカートリッジ１１内をさらにエアで置換してチップカートリッジ内洗浄が行われ（ｓ３６）、一連の送液工程が終了する。
【０１２８】
このように、図１５の送液系１３を用いた図１６に示した工程によれば、薬液の置換を効率的に行うため、薬液／エア／薬液／エアというように、配管内をエアと薬液が交互に流れるシーケンスを作って送液することができる。このような送液方法とすることにより、薬液交換において、古い薬液と新しい薬液の混合を最小限にすることが可能である。その結果、液交換の遷移状態が減り、最終的な電気化学特性の再現性を向上することができる。更に、薬液交換の効率化による、送液時間の短縮・薬液量の削減を実現することが出来る。また、このような薬液／エアシーケンス送液により、反応セル１１５内の薬液濃度を常に一定に保つことが出来るので、電流特性の面内均一性が向上、即ち検出の信頼性が向上する。
【０１２９】
また、セル１１５内への薬液充填の方法として、チップカートリッジ出口バルブとしての２方電磁弁４４４を閉じた状態で、チップカートリッジ下流側の配管４４０内を減圧状態にして（ポンプ４５４を動作させた状態で、２方電磁弁４５１を制御することにより、減圧領域４５２を減圧してから２方電磁弁４５３を制御して、減圧領域４５２の減圧状態を保つ）から、２方電磁弁４４４を開けることにより、チップカートリッジ反応セル１１５内に薬液を導入することができる。なお、この図１６に示した送液のタイミングはほんの一例にすぎず、測定の目的、対象、条件などに応じて種々変更することができる。
【０１３０】
図１７は、測定系１２の具体的な構成を示す図である。この図１７に示す測定系１２は、対極５０２の入力に対して参照極５０３の電圧をフィードバック（負帰還）させることにより、セル１１５内の電極や溶液などの各種条件の変動によらずに溶液中に所望の電圧を印加する３電極方式のポテンシオ・スタット１２ａである。より具体的には、ポテンシオ・スタット１２ａは、作用極５０１に対する参照極５０３の電圧をある所定の特性に設定されるように対極５０２の電圧を変化させ、挿入剤の酸化電流を電気化学的に測定する。作用極５０１は、標的核酸とは相補的な標的核酸を有する核酸プローブが固定化される電極であり、セル１１５内の反応電流を検出する電極である。対極５０２は、作用極５０１との間に所定の電圧を印加してセル１１５内に電流を供給する電極である。参照極５０３は、参照極５０３と作用極５０１との間の電圧を所定の電圧特性に制御すべく、その電極電圧を対極５０２にフィードバックさせる電極であり、これにより対極５０２による電圧が制御され、セル１１５内の各種検出条件に左右されない精度の高い酸化電流検出が行える。電極間を流れる電流を検出するための電圧パターンを発生させる電圧パターン発生回路５１０が配線５１２ｂを介して参照極５０３の参照電圧制御用の反転増幅器５１２（ＯＰｃ）の反転入力端子に接続されている。
【０１３１】
電圧パターン発生回路５１０は、制御機構１５から入力されるデジタル信号をアナログ信号に変換して電圧パターンを発生させる回路であり、ＤＡ変換器を備える。配線５１２ｂには抵抗Ｒｓが接続されている。反転増幅器５１２の非反転入力端子は接地され、出力端子には配線５０２ａが接続されている。反転増幅器５１２の反転入力端子側の配線５１２ｂと出力端子側の配線５０２ａは配線５１２ａで接続されている。この配線５１２ａには、フィードバック抵抗Ｒｆｆ及びスイッチＳＷｆからなる保護回路５００が設けられている。配線５０２ａは端子Ｃに接続されている。端子Ｃは、チップ２１上の対極５０２に接続されている。対極５０２が複数設けられている場合には、各々に対して並列に端子Ｃが接続される。これにより、１つの電圧パターンにより複数の対極５０２に同時に電圧を印加することができる。配線５０２ａには、端子Ｃへの電圧印加のオンオフ制御を行うスイッチＳＷ０が設けられている。
【０１３２】
反転増幅器５１２に設けられた保護回路５００により、対極５０２に過剰な電圧がかからないような構成となっている。従って、測定時に過剰な電圧が印加され、溶液が電気分解されてしまうことにより、所望の挿入剤の酸化電流検出に影響を及ぼすことが無く、安定した測定が可能となる。端子Ｒは配線５０３ａにより電圧フォロア増幅器５１３（ＯＰｒ）の非反転入力端子に接続されている。電圧フォロア増幅器の反転入力端子は、その出力端子に接続された配線５１３ｂと配線５１３ａにより短絡している。配線５１３ｂには抵抗Ｒｆが設けられており、配線５１２ｂの抵抗と、配線５１２ａと配線５１２ｂの交点との間に接続されている。これにより、電圧パターン発生回路５１０により生成される電圧パターンに、参照極５０３の電圧をフィードバックさせた電圧を反転増幅器５１２に入力させ、そのような電圧を反転増幅した出力に基づき対極５０２の電圧を制御する。
【０１３３】
端子Ｗは配線５０１ａによりトランス・インピーダンス増幅器５１１（ＯＰｗ）の反転入力端子に接続されている。トランス・インピーダンス増幅器５１１の非反転入力端子は接地され、その出力端子に接続された配線５１１ｂと配線５０１ａとは配線５１１ａにより接続されている。配線５１１ａには抵抗Ｒｗが設けられている。このトランス・インピーダンス増幅器５１１の出力側の端子Ｏの電圧をＶｗ、電流をＩｗとすると、Ｖｗ＝Ｉｗ・Ｒｗとなる。この端子Ｏから得られる電気化学信号は制御機構１５に出力される。作用極５０１は複数あるため、端子Ｗ及び端子Ｏは作用極５０１のそれぞれに対応して複数設けられる。複数の端子Ｏからの出力は後述する信号切替部により切り替えられ、ＡＤ変換されることにより各作用極５０１からの電気化学信号をデジタル値としてほぼ同時に取得することができる。なお、端子Ｗ及び端子Ｏの間のトランス・インピーダンス増幅器５１１などの回路は、複数の作用極５０１で共有してもよい。この場合、配線５０１ａに複数の端子Ｗからの配線を切り替えるための信号切替部を備えればよい。
【０１３４】
この図１７のポテンシオ・スタット１２ａを用いた測定系１２の効果を従来のポテンシオ・スタットを用いた場合と比較して説明する。従来のポテンシオ・スタットを図１８に示す。図１８に示すように、従来のポテンシオ・スタット１２ａ’の構成は、図１７の示すポテンシオ・スタット１２ａとほぼ共通する。異なるのは、反転増幅器５１２に保護回路５００が設けられていない点である。電圧パターン発生回路５１０の出力端子Ｉにおける電圧をＶｒｅｆｉｎ、端子Ｃにおける電圧をＶｃ、端子Ｒの電圧をＶｒｅｆｏｕｔとする。参照極５０３のフィードバックにより、Ｖｒｅｆｏｕｔ＝Ｒｆ／Ｒｓ・Ｖｒｅｆｉｎが成立する。
【０１３５】
次に、測定データに基づきコンピュータ１６により信号解析を行う測定データ解析手法の一例を説明する。ここでは、標的核酸のＳＮＰ位置の塩基がＧ型（ホモ型）か、Ｔ型（ホモ型）か、あるいはＧＴ型（ヘテロ型）かを判定する遺伝子型判定の解析手法を図１９のフローチャートを用いて説明する。なお、図５では特に示していないが、コンピュータ１６のメインプロセッサ１６ａは、遺伝子型判定フィルタリング、遺伝子型判定処理、判定結果出力などを行うための複数の指令からなる解析プログラムを実行することにより、型判定フィルタリング、型判定処理、判定結果出力を実行する。また、前述した制御機構１５の制御は、別途制御プログラムが設けられている。これら解析プログラムや制御プログラムは、コンピュータ１６に設けられた記録媒体読取装置が記録媒体に格納された解析プログラムを読み取ることにより実行されてもよいし、コンピュータ１６に設けられた磁気ディスクなどの記憶装置から読み出されて実行されてもよい。
【０１３６】
この測定データ解析を行う前提として、４塩基置換型のＳＮＰを例として説明すると、まず、検出の目的とされる標的核酸をＳＮＰ位置の塩基をＡ，Ｇ，Ｃ，Ｔとして４種類用意し、その標的核酸と相補的な塩基配列を有する核酸プローブを各種類について複数ずつ各作用極５０１に固定化させる。また、これら４種類の核酸プローブとは異なる塩基配列を有する核酸プローブ（以下、ネガティブコントロールと称する）を別の作用極５０１に複数固定化させる（ｓ６１）。なお、一つの作用極５０１に固定化される核酸プローブの種類は原則１つである。
【０１３７】
次に、上述した核酸プローブが固定化されたチップに検体標的核酸を含む試料を注入してハイブリダイゼーション反応などを生じさせ（ｓ６２）、バッファによる洗浄、挿入剤の導入による電気化学反応を経て測定系１２を用いて代表電流値を算出する（ｓ６３）。代表電流値とは、各核酸プローブのハイブリダイゼーション反応の発生を定量的に把握するために有効な数値を指し、一例としては、検出される信号の電流値の最大値（ピーク電流値）などが該当する。ピーク電流値の算出は、各作用極５０１上に固定化された核酸プローブにハイブリダイゼーションした２本鎖核酸に結合した挿入剤からの酸化電流信号を測定し、その電流値のピークを得ることで導出される。ピーク電流値の検出には、挿入剤からの酸化電流信号以外のバックグラウンド電流を差し引くことにより行うのが望ましい。もちろん、信号処理の精度や目的に応じていかなる値を代表電流値と定めてもよいが、例えば酸化電流信号の積分値などが該当する。もちろん、電流値に限らず、電圧値、これら電流や電圧に対して数値解析処理を行った値などを代表値と定めることもできる。
【０１３８】
ＳＮＰ位置の塩基をＡ，Ｇ，Ｃ，Ｔ型とした標的核酸に関する測定データ、すなわち代表電流値をそれぞれＸａ、Ｘｇ、Ｘｃ、Ｘｔと定義し、ネガティブコントロールの核酸プローブの代表電流値をＸｎと定義する。また、代表電流値は、各種別に応じて複数得られるので、それぞれを互いに識別すべく、１番目のＸａをＸａ１、２番目のＸａをＸａ２、…というように定義する。また、ＳＮＰ位置の塩基をＡ，Ｇ，Ｃ，Ｔ型とした標的核酸の得られる代表電流値の個数をｎａ、ｎｇ、ｎｃ、ｎｔ個、ネガティブコントロールについて得られる代表電流値の個数をｎｎ個と定義する。
【０１３９】
次に、得られた代表電流値Ｘａ、Ｘｇ、Ｘｃ、Ｘｔ、Ｘｎのうち、明らかに異常なデータを除去すべく、型判定フィルタリング処理を実行する（ｓ６４）。この型判定フィルタリング処理のフローチャートを図２０に示す。この図２０の型判定フィルタリング処理は、Ｘａ、Ｘｇ、Ｘｃ、Ｘｔ、Ｘｎについてそれぞれ別個に行われる。例えばＸａを例にとると、Ｘａについて得られたｎａ個の代表電流値のうち、明らかに異常なデータと思われる代表電流値をこの型判定フィルタリングで排除する。Ｘｇ、Ｘｃ、Ｘｔ、Ｘｎについても同様に行われる。なお、この図２０の説明では、データ種別に応じて同様の処理が行われるため、Ｘａのフィルタリングを例に説明する。具体的には、図２０に示すように、まず測定グループまず測定グループの全測定データの設定、すなわちデータセットの設定を行う（ｓ８１）。例えばＸａであれば、Ｘａ１、Ｘａ２、…、Ｘａｎａをデータセットとして設定する。
【０１４０】
次に、これら測定データＸａ１、Ｘａ２、…、ＸａｎａについてのＣＶ値（以下、ＣＶ０）を算出する（ｓ８２）。このＣＶ０は、測定データＸａ１、Ｘａ２、…、Ｘａｎａの標準偏差を平均値で除算することにより得られる。そして、得られた値ＣＶ０が１０％、すなわち０．１以上か否かを判定する（ｓ８３）。１０％以上であれば、測定データのうち最小値を除いたｎａ−１個のデータセットのＣＶ値（以下、ＣＶ１）を算出する（ｓ８４）。１０％未満であれば、明らかに異常なデータは無いと判定し、後述する型判定に進む。ＣＶ１を算出した後、ＣＶ０≧２×ＣＶ１か否かを判定する（ｓ８５）。この不等式が成立すれば、（ｓ８６）に進み、さらに測定データのうち最小値を除いたｎａ−２個のデータセットを新たにデータセットと定義し、（ｓ８２）に戻り、異常データのフィルタリングを繰り返し行う。不等式が成立しなければ、最小値側ではなく最大値側に異常なデータがあると判定し、測定データのうち最大値を除いたｎａ−２個のデータセットのＣＶ値（以下、ＣＶ２）を算出する（ｓ８７）。そして、ＣＶ０≧２×ＣＶ２が成立するか否かを判定する（ｓ８８）。成立すれば、さらに測定データのうち最大値を除いたｎａ−３個のデータセットを新たにデータセットと定義し、（ｓ８２）に戻り、異常データのフィルタリングを繰り返し行う。成立しなければ、明らかに異常なデータは無いと判定し、後述する型判定に進む。以上に示した型判定フィルタリングをＸｇ、Ｘｃ、Ｘｔ、Ｘｎについても行う。
【０１４１】
次に、得られた型判定フィルタリング結果を用いて型判定処理を実行する（ｓ６５）。この型判定処理の一例を図２１のフローチャートを用いて説明する。なお、図２１の例では、標的核酸のＳＮＰ位置の塩基がＧ型か、Ｔ型か、あるいはＧＴ型かを判定する型判定の場合を示している。また、この型判定処理は、大別して最大グループ判定アルゴリズム、２標本ｔ検定アルゴリズムからなる。図２１に示すように、まず各グループ毎の代表電流値の平均値を抽出する（ｓ９１）。グループとは、Ｘａ、Ｘｇ、Ｘｃ、Ｘｔ、Ｘｎなど、標的核酸が異なるものは別グループ、標的核酸が一致するものは同一グループとする。（ｓ６４）で型判定フィルタリングにより明らかに異常なデータが排除された測定データが抽出される。もちろん、（ｓ６４）の型判定フィルタリング以外のフィルタリングにより以上データを排除した測定データを抽出してもよいし、何らフィルタリングを行わない測定データを抽出してもよい。なお、代表電流値の平均値ではなく、これら統計値から統計処理して得られた別の統計処理値を求めてもよい。標的核酸のＳＮＰ位置の塩基がＡ，Ｇ，Ｃ，Ｔの場合をそれぞれグループＡ〜Ｔ、ネガティブコントロールをグループＮとして説明する。また、得られた平均値をＸａ、Ｘｇ、Ｘｃ、Ｘｔ、Ｘｎそれぞれのグループについて、Ｍａ、Ｍｇ、Ｍｃ、Ｍｔ、Ｍｎとする。
【０１４２】
次に、得られた平均値Ｍａ、Ｍｇ、Ｍｃ、Ｍｔ、Ｍｎについて、最大はグループＧの平均値Ｍｇか否かを判定する（ｓ９２）。最大であれば（ｓ９３）へ、最大でなければ（ｓ９７）に進む。（ｓ９７）では、平均値Ｍａ、Ｍｇ、Ｍｃ、Ｍｔ、Ｍｎについて、最大はグループＴの平均値Ｍｔか否かを判定する。最大であれば（ｓ９８）へ、最大でなければグループＧ、Ｔともに最大でないこととなり、判定不能として再検査が行われる。（ｓ９３）では、グループＧの測定データＸｇ１、Ｘｇ２、…と、グループＮの測定データＸｎ１、Ｘｎ２、…との間に差があるか否かを判定する。差があるか否かは、例えば２標本ｔ検定が用いられる。具体的には、２標本Ｔ検定で求めた確率Ｐと有意水準αとの代表関係を比較し、
Ｈ０：Ｐ≧αならば、有意差無し（帰無仮説）
Ｈ１：Ｐ＜αならば、有意差あり（対立仮説）
と判定する。有意水準αは、コンピュータ１６を用いてユーザが設定できる。この（ｓ９３）の例では、グループＧの測定データとグループＮの測定データの値に差があるかというＨ１の設問を提起し、この設問に対し、これら２つのグループの間に差が無いと仮定するＨ０という仮説を設定する。そして、グループＧの測定データの平均値ＭｇとグループＮの測定データの平均値Ｍｎに２つのグループの差が要約されているとして、確率を求める。確率の算出は、グループＧの統計値Ｘｇ１、Ｘｇ２、…とグループＮの統計値Ｘｎ１，Ｘｎ２、…に基づき統計定数ｔ、自由度φを算出し、ｔ分布の確率密度変数の積分値から確率Ｐを求める。得られた確率Ｐについて、Ｐ≧αなら、Ｈ０を棄却できず、判定を保留する。すなわち、差が無いと判定する。Ｐ＜αならＨ０を棄却し仮説Ｈ１を採用し、差があると判定する。このようにして判定結果が「差がある」と判定された場合には（ｓ９４）に進み、「差が無い」と判定された場合には判定不能として再検査される。
【０１４３】
（ｓ９４）では、グループＧとグループＡについて（ｓ９３）と同様の２標本ｔ検定を用いて２つのグループに差があるか否かを判定する。差があれば（ｓ９５）に進み、差が無ければ判定不能として再検査される。（ｓ９５）では、グループＧとグループＣについて（ｓ９３）と同様の２標本ｔ検定を用いて２つのグループに差があるか否かを判定する。差があれば（ｓ９６）に進み、差が無ければ判定不能として再検査される。（ｓ９６）では、グループＧとグループＴについて（ｓ９３）と同様の２標本ｔ検定を用いて２つのグループに差があるか否かを判定する。差があればグループＧ型と決定する。グループＧ型が平均値最大、かつ他の測定グループと差があるためである。差が無ければグループＧＴ型と決定する。グループＧ型が平均値最大であるが、グループＧ型とグループＴ型に測定結果に差が無いからである。（ｓ９８）では、グループＴとグループＮについて（ｓ９３）と同様の２標本ｔ検定を用いて２つのグループに差があるか否かを判定する。差があれば（ｓ９９）に進み、差が無ければ判定不能として再検査される。（ｓ９９）では、グループＴとグループＡについて（ｓ９３）と同様の２標本ｔ検定を用いて２つのグループに差があるか否かを判定する。差があれば（ｓ１００）に進み、差が無ければ判定不能として再検査される。（ｓ１００）では、グループＴとグループＣについて（ｓ９３）と同様の２標本ｔ検定を用いて２つのグループに差があるか否かを判定する。差があれば（ｓ１０１）に進み、差が無ければ判定不能として再検査される。（ｓ１０１）では、グループＴとグループＧについて（ｓ９３）と同様の２標本ｔ検定を用いて２つのグループに差があるか否かを判定する。差があればグループＴ型と決定する。グループＴ型が平均値最大、かつ他の測定グループと差があるためである。差が無ければグループＧＴ型と決定する。グループＴ型が平均値最大であるが、グループＴ型とグループＧ型に測定結果に差が無いからである。
【０１４４】
以上の判定結果はコンピュータ１６に設けられた図示しない表示装置に表示される（ｓ６６）。このような型判定アルゴリズムを用いることにより、ヘテロ型の判定をすることが可能となる。
【０１４５】
なお、図１９〜図２１では、Ｇ型、Ｔ型あるいはＧＴ型のいずれに該当するかを判定する手法を示したが、Ａ型，Ｇ型，Ｃ型，Ｔ型のうちのいずれか２つの型、あるいはそれらのヘテロの判定に適用できることはもちろんである。また、必ずしもＡ型，Ｇ型，Ｃ型，Ｔ型のグループの４種類について測定データを取得する必要は無く、ＳＮＰの考えられ得る２つの塩基に関する２グループのみについて取得するのみでもよいし、その２グループにネガティブコントロールの１グループを加えてもよい。
【０１４６】
前述した個体識別検査装置を用いた個体識別の自動解析手法について図２２のシーケンス図を用いて説明する。図２２に示すように、まずコンピュータ１６を用いて自動解析のための自動解析条件パラメータの設定を行い、設定された自動解析条件パラメータに基づく自動解析の実行をコンピュータ１６にユーザが指示する（ｓ３０１）。自動解析条件パラメータは、制御機構１５を制御するための制御パラメータである。制御機構１５で用いられる制御パラメータは、測定系１２を制御するための測定系制御パラメータ、送液系１３を制御するための送液系制御パラメータ、温度制御系１４を制御するための温度制御系制御パラメータからなる。測定系制御パラメータは入力設定パラメータであり、初期値、刻み値、終了値、測定時間間隔、動作モードからなる。
【０１４７】
送液系制御パラメータは、図１５に示す電磁弁４０３，４１３，４２３，４３３，４４１，４４２，４４４，４４５，４５１，４５３，４６３を制御する電磁弁制御パラメータ、液センサ４４３，４４７を制御するセンサ制御パラメータ、ポンプ４５４を制御するポンプ制御パラメータを有する。これら電磁弁制御パラメータ、センサ制御パラメータ、ポンプ制御パラメータは、図１６の（ｓ２２）〜（ｓ３６）に示すような一連の工程をシーケンシャルに実行するための条件として、制御対象の制御量、制御対象の制御タイミング、制御対象を制御する制御条件などをパラメータの詳細として含む。
【０１４８】
温度制御パラメータは、原則として送液系制御パラメータに付随して与えられるものである。すなわち、送液系制御パラメータを設定することにより、送液系１３の動作に対応して温度制御パラメータが設定される。これにより、送液系１３と連動した温度制御系１４の温度制御が可能になる。
【０１４９】
自動解析の実行により、自動解析条件パラメータは、制御機構１５に送信される（ｓ３０２）。制御機構１５は、受信した自動解析条件パラメータのうち、測定系制御パラメータに基づき測定系１２を制御し、送液系制御パラメータに基づき送液系１３を制御し、温度制御系制御パラメータに基づき温度制御系１４を制御する。また、制御機構１５はこれら測定系１２，送液系１３及び温度制御系１４を制御するタイミングを各制御パラメータに含まれる制御タイミングや制御条件に基づき管理する。従って、制御のシーケンスはユーザにより設定された自動解析条件パラメータにより自由に定められるが、この図２２では代表的な一例について説明する。
【０１５０】
なお、この自動解析とは別に、ユーザはチップカートリッジ１１を用意する。これはまず所望の核酸プローブが作用極５０１に固定化された個体識別チップ２１が封止されたプリント基板２２を基板固定ねじ２５によりチップカートリッジ１１の支持体１１１に固定化し、チップカートリッジ１１への取り付けを行っている（ｓ４０１）。そして、上蓋固定ねじ１１７によりシール材２４ａが一体化されたチップカートリッジ上蓋１１２と支持体１１１を固定化し、セル１１５が形成された状態で準備されている（ｓ４０２）。チップカートリッジ１１に対して、試料注入口１１９から試料を注入する（ｓ４０３）。チップカートリッジ１１を装置本体に装着して、開始操作を行うことにより、ハイブリダイゼーション反応（ｓ２１）が開始される。なお、注入する試料の容量は、セル１１５の容積よりも若干多い量にするのが望ましい。これにより、セル１１５内をエア残り無く試料で完全に充填することができる。
【０１５１】
制御機構１５は、コンピュータ１６から受信した測定系制御パラメータに基づき測定系のタイミングの制御を開始する（ｓ３０３）。また、制御機構１５は、コンピュータ１６から受信した送液系制御パラメータに基づき送液系１３の各構成要素を順次制御する（ｓ３０４）。また、図２２では特に図示しないが、この送液系１３の制御と連動して、温度制御系制御パラメータに基づき温度制御系１４の温度制御を行う。この制御により、送液系１３は図１６の（ｓ２１）〜（ｓ３６）（ｓ３４を除く）に示したハイブリダイゼーション反応を含む送液工程を自動実行する（ｓ３０５）とともに、その送液工程で指定された温度に個体識別チップ２１が設定されるように温度制御系１４を自動制御する。制御機構１５は、この送液工程の中途の（ｓ３４）の測定工程のタイミングに同期して測定系１２に測定指令を行う（ｓ３０５）。すなわち、送液工程の（ｓ３４）の測定工程のタイミングで、制御機構１５の初期値レジスタ１５１、刻み値レジスタ１５２、終了値レジスタ１５３、インターバルレジスタ１５４及び動作設定レジスタ１５５に初期値、刻み値、終了値、測定時間間隔、動作設定モードを格納する。なお、前述の（ｓ３０３）の測定系タイミング制御をこの（ｓ３０５）と同時に行わせてもよい。
【０１５２】
測定系１２は、この測定指令に基づき例えば電圧パターンを発生させて測定を行い（ｓ３０６）、得られた測定信号は端子Ｏから制御機構１５に出力される（ｓ３０７）。制御機構１５は、受信した測定信号を信号処理し、測定データとしてデータメモリ１５ｂに格納する（ｓ３０８）。この測定データは、コンピュータ１６にローカルバス１７を介して出力される（ｓ３０９）。コンピュータ１６はこの測定データを受信する（ｓ３１０）。
【０１５３】
このようにして必要な測定データが得られると、コンピュータ１６は測定データに基づき図２０で示される（ｓ６４）の型判定フィルタリングを実行する。型判定フィルタリングが終了すると、フィルタリングされたデータに基づき図２１に示される型判定処理を実行する（ｓ６５）。そして、得られた判定処理結果をコンピュータ１６に備え付けの表示装置に表示する（ｓ６６）。
【０１５４】
以上の型判定を、識別されるべき個体と、試料のそれぞれについて行い、その結果のデータがコンピュータ１６に保存される。コンピュータ１６は、それらの結果を比較し、一致するか否かを判定する。また、予め入力されたアレル頻度、遺伝子型頻度のデータから、判定結果の信頼度を決定し、判定結果とともに表示してもよい。
【０１５５】
なお、コンピュータ１６と制御機構１５の処理の分担は上述したものに限定されない。例えば、測定系１２、送液系１３、温度制御系１４がコンピュータ１６からの指令を解釈し各構成要素を実行するプロセッサを有していれば、制御機構１５は省略されてもよい。
【０１５６】
測定系１２、送液系１３、温度制御系１４のタイミングの管理は、これら測定系１２、送液系１３、温度制御系１４がタイミングを管理するプロセッサを有していれば、そのプロセッサの管理するタイミングに基づき各処理を実行する。この場合、コンピュータ１６はこれら測定系１２、送液系１３，温度制御系１４に自動解析条件パラメータを送信すれば、タイミングを管理する必要が無い。また、コンピュータ１６が測定系１２、送液系１３，温度制御系１４、制御機構１５のタイミング制御を行ってもよい。
【０１５７】
また、試料注入口１１９は送出ポート１１６ｂに連通させる例を示したが、送入ポート１１６ａに連通させるようにしてもよい。また、個体識別チップ２１上の作用極５０１やボンディングパッド２２１はＴｉやＡｕの積層構造で示したが、他の材料を用いた電極やパッドを用いてもよい。また、作用極５０１の配置は図１４に示したものに限定されない。作用極５０１、対極５０２、参照極５０３の各々の電極数も図示したものに限定されない。
【０１５８】
また、送液系１３は図１５に示したものに限定されない。例えば、反応の種類に応じてエア、ミリＱ水、バッファ、挿入剤以外の薬液や気体を供給する供給系を付加することにより、セル１１５内におけるより複雑な反応を実行させることができる。また、各配管同士の薬液やエアの供給経路、供給量の制御は、電磁弁以外で行ってもよい。図１６に示した送液系１３の動作はほんの一例にすぎず、反応の目的などに応じて種々変更することができる。
【０１５９】
また、流路６０１ａ〜６０１ｄは図９（ｂ）に示したような配置に限定されない。例えば検出用流路６０１ａがセル孔部１１５ａと１１５ｂを結んだ直線に平行に配列されるようにしてもよいし、各流路６０１ａ〜６０１ｄは直線ではなく曲線状の流路であってもよい。更に、送入ポート１１６ａ及び送出ポート１１６ｂが、セル底面に対して垂直に伸びている例を示したが、これに限定されるものではなく、セル底面に対して平行に伸びる構成になっていてもよい。
【０１６０】
以上記載した本発明の実施態様に拠れば個体識別検査とその結果の判定を自動で実行することができる。
【実施例】
【０１６１】
表１に、選択された1塩基多型の例を表す。それぞれの1塩基多型に対して、アジア人（中国人または日本人）をサンプルとした場合における、各塩基の頻度(Allele frequency)及び、遺伝子型頻度(Genotype frequency)が記載されている。
【０１６２】
また、表２に、表１の各遺伝子型頻度から算出されたヘテロ型頻度(estimated heterozygosity)と、各遺伝子型（C/C、T/T、C/T）の中で最も大きい頻度（Max value）、最も小さい頻度（Minimum value）、及び、それらの逆数による識別能(power of identification)（何人に一人と言うことができるか）を表した。それぞれの識別能の最下段は、各識別能を乗算したものである。従って、表１の22個のＳＮＰについては、最も頻度の高い組み合わせであっても約8.38×106人（約838万人）に一人、最も頻度の低い組み合わせであれば、5.22×1019人に一人が同じ遺伝子型を有するということが分かる。
【表１】
2007006720.tif 000003
【０１６３】
【表２】
2007006720.tif 000004
【０１６４】
なお、本発明の詳細な説明において、遺伝子型の組み合わせが存在する確率を算出する方法として、遺伝子型の頻度を乗算した後に逆数を取ると記載した。しかし、本実施例のように各ＳＮＰについて遺伝子型の逆数を識別能として予め算出しておき、後から乗算してもよい。
【０１６５】
次に、上記の表に示したSNPのうち、任意のSNPを５つ選択し、該ＳＮＰを検出するための核酸プローブを電極に固定したアレイを作製した。表３に用いた核酸プローブの配列を示す。
【表３】
2007006720.tif 000005
【０１６６】
各核酸プローブ(30ug/mL)、NaCl (400mM)を含む溶液をアレイの電極上にスポットし、1時間静置した。その後、蒸留水で洗浄し、風乾させ、核酸固定化チップとした。
【０１６７】
標的核酸はPCRで増幅される領域を合成し、それをモデルサンプルとして使用した。表４に、標的核酸として用いた合成オリゴの配列を示す。
【表４−１】
2007006720.tif 000006
【０１６８】
【表４−２】
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表４に示す各合成核酸を1×1014copy/mL となるように2×SSC溶液に溶解し、標的核酸溶液とした。表４に示した合成核酸のうち、多型部位においてＧを含む核酸をサンプル１とし、多型部位においてＡを含む核酸をサンプル２として調製した。調製した標的核酸溶液50μLに作製したアレイを浸漬し、アレイ上の核酸プローブと標的核酸溶液中の標的核酸とをハイブリダイズさせた。0.2×SSC溶液（35℃）に40分間浸漬し、非特異的に結合している標的核酸を洗浄した。超純水で水洗後に風乾した。Hoechst 33258 (50uM) を20mMリン酸緩衝液（100mM NaCl）に溶解し、この溶液に風乾したチップを浸漬し、5分後に電気化学的測定を行った。Hoechst33258の酸化ピークの高さを検出し、ピーク電流値とした。
【０１６９】
各電極から得られたピーク電流値を図２３に示した。図２３（ａ）は、サンプル１の試験結果である。サンプル1は明らかに全てC/Cホモ型を示した。よって、表１の値から、この遺伝子型を有する個体は６９６人に一人存在するという判定が可能となる。
【０１７０】
一方、図２３（ｂ）に示したサンプル2は、全てT/Tホモを示しており、表１の値から５９７９人に一人という判定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１】２塩基置換型のＳＮＰのアレル頻度と遺伝子型頻度との関係図。
【図２】３塩基置換型のＳＮＰのアレル頻度と遺伝子型頻度との関係図。
【図３】４塩基置換型のＳＮＰのアレル頻度と遺伝子型頻度との関係図。
【図４】存在確率算出の例を示した図。
【図５】本発明の第１実施形態に係る個体識別検査システムの全体構成を示す概念図。
【図６】同実施形態に係るチップカートリッジの構成の詳細を示す図。
【図７】同実施形態に係る上蓋固定ねじで固定する前の支持体とチップカートリッジ上蓋を示す図。
【図８】同実施形態に係る個体識別チップを実装したプリント基板の詳細な構成を示す図。
【図９】同実施形態に係るセル及びセルに通じる薬液供給系統を示す図。
【図１０】同実施形態に係るセル近傍の各構成要素のより詳細な構成を示す図。
【図１１】同実施形態に係るセルの上面図。
【図１２】同実施形態に係るセルの変形例の上面図。
【図１３】同実施形態に係る個体識別チップ及びプリント基板の製造方法の工程断面図。
【図１４】同実施形態に係る個体識別チップの上面図。
【図１５】同実施形態に係る送液系の具体的な構成の一例を示す図。
【図１６】同実施形態に係る送液系を用いた個体識別検査のための送液工程のフローチャートを示す図。
【図１７】同実施形態に係る測定系の具体的な構成を示す図。
【図１８】従来のポテンシオ・スタットの構成を示す図。
【図１９】同実施形態に係る測定データ解析手法の一例を示す図。
【図２０】同実施形態に係る型判定フィルタリング処理のフローチャートを示す図。
【図２１】同実施形態に係る型判定処理の一例を示す図。
【図２２】同実施形態に係る個体識別検査装置を用いた個体識別の自動解析手法のシーケンス図。
【図２３】遺伝子型の検出例の測定結果を示すグラフ。
【符号の説明】
【０１７２】
１…個体識別検査システム、１０…測定ユニット、１１…チップカートリッジ、１２…測定系、１２ａ，１２ｂ，１２ｃ，１２ｄ，１２ｅ…ポテンシオ・スタット、１３…送液系、１４…温度制御系、１５…制御機構、１６…コンピュータ、１７…ローカルバス、２１…個体識別検査チップ、２２…プリント基板、２２ａ…電気コネクタ、２３…封止樹脂、２４ａ，２４ｂ…シール材、２５…基板固定ねじ、１１０…チップカートリッジ本体、１１１…支持体、１１２…チップカートリッジ上蓋、１１２ａ…流路状凸部、１１３ａ，１１３ｂ…インタフェース部、１１４ａ，１１４ｂ…流路、１１５…セル、１１５ａ，１１５ｂ…セル孔部、１１５ｃ，１１５ｅ，１１５ｆ，１１５ｇ，１１５ｈ…直線、１１５ｄ…ザグリ孔、１１６ａ…送入ポート、１１６ｂ…送出ポート、１１７…上蓋固定ねじ、１１７ａ…ねじ孔、１１９…試料注入口、１２０…蓋、１２１…シール材、５００…保護回路、５０１…作用極、５０２…対極、５０３…参照、５１０…電圧パターン発生回路、６０１…流路、６０１ａ…検出用流路、６０１ｂ，６０１ｃ…ポート接続流路、６０１ｄ…流路接続流路。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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