(57)【要約】      （修正有）【課題】オピエートリガンド−レセプター相互作用の研究のための調査を含む、生物医学的調査における使用のための多数の個々のペプチドの提供。【解決手段】以下の構造を有するペプチド：Ac-A1-B2-C3-Arg-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg-NH２。ここで、A1はTyrまたはArgであり；B2はArgまたはPheであり；そして、C3はThr、Phe、またはMetである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多くの種々のペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般的に、ペプチド化学の分野に関し、そしてより詳細には、オピオイドレセプターへのリガンド結合を阻害し得る新規オピオイドペプチドに関する。
【０００２】
背景情報
オピオイドレセプターの少なくとも３つの公知のサブタイプ、ミュー（μ）、デルタ（δ）、およびカッパ（κ）があり、これらは、モルヒネ、エンケファリン、およびダイノルフィンを結合する。３つのレセプターサブタイプは鎮痛特性を有する。しかし、阻害される疼痛のタイプおよび二次的機能は、各レセプタータイプで異なる。κレセプターは、化学的刺激を含む疼痛に応じて鎮痛に影響を与える点で効力がある。κレセプターはまた、利尿および鎮静を誘導し、そして不快および精神心理学的効果、ならびに薬物または他の身体的依存に関連する。μレセプターは、一般的に、鎮痛、呼吸抑制、腸管運動性、抗利尿、免疫応答、および薬物または他の身体的依存に関連するものとみなされる。一方、δレセプターは、熱鎮痛、およびより小さい程度では、呼吸および嗜癖に関連する。オピオイドレセプター機能におけるこれらの差は、有害な副作用なしに鎮痛を生じる薬物の調査を促進する。
【０００３】
合成ペプチドの使用は、これらのサブタイプの描写(delineation)、およびインビトロ
およびインビボの両方の系でのこれらのレセプター系に特異的なリガンドの相互作用を研究するために使用され得るアナログを提供することにおける手段になる。あるオピオイド化合物は（レセプターに結合して効果を生じる）アゴニストであるが、他のオピオイド化合物は（レセプターに結合するが効果を生じない）アンタゴニストである。オピオイドレセプターのほとんどの以前から公知のアゴニストおよびアンタゴニストは、エンケファリンおよび関連ペプチド（ダイノルフィン、デルムエンケファリン(dermenkephalin)、およびカソモルフィン(casomorphin)を含む）のアナログである。本発明の化合物は、これら
の公知のオピオイドペプチドのいずれとも配列相同性をほとんどから全く有さない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
多数の個々のペプチドの調製およびスクリーニングのための方法における最近の進歩は、オピエートレセプターへのリガンドの相互作用に関する調査を含む、生物医学的調査のすべての領域に有用な多くのペプチドの同定を導いている。レセプター特異的アゴニストおよびアンタゴニストの両方とも、薬理学的ツールとしておよび治療薬剤として必要とされる。しかし、これらの進歩でさえも、基本的調査および薬物の発見は、特定のオピエートレセプターサブタイプに対するリガンド間の関係を確かめるために必要とされる、必要な多数の異なるオピエートアゴニストおよびアンタゴニストの利用可能性によって限定されている。したがって、オピエートリガンド−レセプター相互作用の研究のための調査を含む、生物医学的調査における使用のための多数の個々のペプチドについての必要性が存在する。さらに、治療価値を有するオピオイドペプチドが必要とされる。本発明は、これらの必要性を満たし、そしてさらに関連する利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（項目  １）以下の構造を有するペプチド：
Ac-A1-B2-C3-Arg-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg-NH２、
（配列番号28）
ここで、A1はTyrまたはArgであり；
B2はArgまたはPheであり；そして
C3はThr、Phe、またはMetである。
（項目  ２）以下からなる群より選択される配列を有する、請求項１に記載のペプチド：
Ac-Tyr-Arg-Thr-Arg-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg-NH２（配列番号１）；
Ac-Tyr-Arg-Phe-Arg-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg-NH２（配列番号２）；
Ac-Arg-Phe-Phe-Arg-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg-NH２（配列番号３）；
Ac-Tyr-Arg-Met-Arg-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg-NH２（配列番号４）；および
Ac-Arg-Arg-Phe-Arg-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg-NH２（配列番号５）。
（項目  ３）以下の構造を有するペプチド：
(D)Phe-D4-E5-F6（配列番号29）、
ここで、D4は(D)NapAlaまたは(D)Pheであり；
E5は(D)Nle、Trp、または(D)Ileであり；そして
F6は(D)Argまたは(D)ChAlaである。
（項目  ４）以下からなる群より選択される配列を有する、請求項３に記載のペプチド：
(D)Phe-(D)NapAla-(D)Nle-(D)Arg（配列番号６）；
(D)Phe-(D)NapAla-(D)Nle-(D)ChAla（配列番号７）；
(D)Phe-(D)NapAla-Trp-(D)Arg（配列番号８）；
(D)Phe-(D)NapAla-Trp-(D)ChAla（配列番号９）；
(D)Phe-(D)NapAla-(D)Ile-(D)Arg（配列番号10）；
(D)Phe-(D)NapAla-(D)Ile-(D)ChAla（配列番号11）；
(D)Phe-(D)Phe-(D)Nle-(D)Arg（配列番号12）；
(D)Phe-(D)Phe-(D)Nle-(D)ChAla（配列番号13）；
(D)Phe-(D)Phe-Trp-(D)Arg（配列番号14）；
(D)Phe-(D)Phe-Trp-(D)ChAla（配列番号15）；
(D)Phe-(D)Phe-(D)Ile-(D)Arg（配列番号16）；および
(D)Phe-(D)Phe-(D)Ile-(D)ChAla（配列番号17）。
（項目  ５）以下の構造を有するペプチド：
(D)Nle-D4-E5-F6（配列番号30）、
ここで、D4は(D)NapAlaまたは(D)Pheであり；
E5は(D)Nle、Trp、または(D)Ileであり；そして
F6は(D)Argまたは(D)ChAlaである。
（項目  ６）以下からなる群より選択される配列を有する、請求項５に記載のペプチド：
(D)Nle-(D)NapAla-(D)Nle-(D)Arg（配列番号18）；
(D)Nle-(D)NapAla-(D)Nle-(D)ChAla（配列番号19）；
(D)Nle-(D)NapAla-Trp-(D)Arg（配列番号20）；
(D)Nle-(D)NapAla-(D)Ile-(D)Arg（配列番号21）；
(D)Nle-(D)NapAla-(D)Ile-(D)ChAla（配列番号22）；
(D)Nle-(D)Phe-(D)Nle-(D)Arg（配列番号23）；
(D)Nle-(D)Phe-Trp-(D)Arg（配列番号24）；
(D)Nle-(D)Phe-Trp-(D)ChAla（配列番号25）；
(D)Nle-(D)Phe-(D)Ile-(D)Arg（配列番号26）；および
(D)Nle-(D)Phe-(D)Ile-(D)ChAla（配列番号27）。
発明の要旨
本発明は、κオピエートレセプターについて選択的である新規オピオイドペプチドを提供する。１つの実施態様では、オピオイドペプチドは、一般構造Ac-A1-B2-C3-Arg-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg-NH２（配列番号28）を有し、ここでA1はTyrまたはArgであり、B2はArgまたはPheであり、そしてC3はThr、Phe、またはMetである。さらに他の実施態様では、
オピオイドペプチドは、一般構造(D)Phe-D4-E5-F6（配列番号29）または(D)Nle-D4-E5-F6（配列番号30）を有し、ここでこれらの式の両方において、D4は(D)NapAlaまたは(D)Phe
であり、E5は(D)Nle、Trp、または(D)Ileであり、そしてF6は(D)Argまたは(D)ChAlaであ
る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
発明の詳細な説明
本発明は、κ選択的オピオイドリガンド[３H]-U69,593の結合を阻害し得る新規オピオ
イドペプチドを提供する。１つの実施態様では、このペプチドは、一般構造Ac-A1-B2-C3-Arg-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg-NH２（配列番号28）を有し、ここでA1はTyrまたはArgであり、B2はArgまたはPheであり、そしてC3はThr、Phe、またはMetである。この式に包含さ
れるペプチドの例としては、以下のものが挙げられる：Ac-Tyr-Arg-Thr-Arg-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg-NH２（配列番号１）；Ac-Tyr-Arg-Phe-Arg-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg-NH２（配列番号２）；Ac-Arg-Phe-Phe-Arg-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg-NH２（配列番号３）；Ac-Tyr-Arg-Met-Arg-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg-NH２（配列番号４）；およびAc-Arg-Arg-Phe-Arg-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg-NH２（配列番号５）。
【０００７】
別の実施態様では、新規ペプチドは、式(D)Phe-D4-E5-F6（配列番号29）に包含される
ものであり、ここでD4は(D)NapAlaまたは(D)Pheであり、E5は(D)Nle、Trp、または(D)Ileであり、そしてF6は(D)Argまたは(D)ChAlaである。この実施態様の範囲内のペプチドの例は以下の配列のいずれか１つを有する：(D)Phe-(D)NapAla-(D)Nle-(D)Arg（配列番号６）；(D)Phe-(D)NapAla-(D)Nle-(D)ChAla（配列番号７）；(D)Phe-(D)NapAla-Trp-(D)Arg（
配列番号８）；(D)Phe-(D)NapAla-Trp-(D)ChAla（配列番号９）；(D)Phe-(D)NapAla-(D)Ile-(D)Arg（配列番号10）；(D)Phe-(D)NapAla-(D)Ile-(D)ChAla（配列番号11）；(D)Phe-(D)Phe-(D)Nle-(D)Arg（配列番号12）；(D)Phe-(D)Phe-(D)Nle-(D)ChAla（配列番号13）
；(D)Phe-(D)Phe-Trp-(D)Arg（配列番号14）；(D)Phe-(D)Phe-Trp-(D)ChAla（配列番号15）；(D)Phe-(D)Phe-(D)Ile-(D)Arg（配列番号16）；および(D)Phe-(D)Phe-(D)Ile-(D)ChAla（配列番号17）。
【０００８】
本発明のさらに別の実施態様では、ペプチドは、構造(D)Nle-D4-E5-F6（配列番号30）
を有し、ここでD4は(D)NapAlaまたは(D)Pheであり、E5は(D)Nle、Trp、または(D)Ileであり、そしてF6は(D)Argまたは(D)ChAlaである。この式の範囲内にあるペプチドの例は、以下の配列を有する：(D)Nle-(D)NapAla-(D)Nle-(D)Arg（配列番号18）；(D)Nle-(D)NapAla-(D)Nle-(D)ChAla（配列番号19）；(D)Nle-(D)NapAla-Trp-(D)Arg（配列番号20）；(D)Nle-(D)NapAla-(D)Ile-(D)Arg（配列番号21）；(D)Nle-(D)NapAla-(D)Ile-(D)ChAla（配列
番号22）；(D)Nle-(D)Phe-(D)Nle-(D)Arg（配列番号23）；(D)Nle-(D)Phe-Trp-(D)Arg（
配列番号24）；(D)Nle-(D)Phe-Trp-(D)ChAla（配列番号25）；(D)Nle-(D)Phe-(D)Ile-(D)Arg（配列番号26）；および(D)Nle-(D)Phe-(D)Ile-(D)ChAla（配列番号27）。
【０００９】
（以下の標準的略語が、本明細書でアミノ酸残基を同定するために使用される。）
【００１０】
【表１Ａ】
2007077163.tif 000002
【００１１】
アミノ酸は、上に提供されるようなこれらの一般に知られているコードによって示され、そして(D)は、天然に存在するL-アミノ酸に対するものとして「D」配置を有するアミノ酸を示す。特定の配置が示されない場合、当業者はアミノ酸が(L)-アミノ酸であると理解する。
【００１２】
例示したペプチド内の１つ以上のアミノ酸が、例えば、例示されたペプチドに示される１つ以上の特定のアミノ酸の保存的アミノ酸置換によって、改変または置換され得ることは、当業者には公知である。保存的アミノ酸置換変化には、例えば、１つの塩基性アミノ酸の他の塩基性アミノ酸への置換、１つの疎水性アミノ酸の別の疎水性アミノ酸への置換、または、Argに対するオルニチン（Orn）またはホモアルギニン（homoArg）のような天
然に存在しないアミノ酸の使用を包含する当該分野で周知の他の保存的置換が挙げられ得る。このような置換には、(L)配置のアミノ酸が記載されている場合の対応する(D)-アミ
ノ酸、およびその反対（visa-versa）が含まれる。
【００１３】
上記のタイプの改変または置換の他に、１つ以上のアミノ酸の模倣物、さもなければペプチド模倣物（peptide mimeticまたはpeptidomimetic）として公知であるものもまた使
用され得る。本明細書で使用される場合、用語「模倣物」とは、同一または同様のアミノ酸の機能的特徴を有するアミノ酸またはアミノ酸アナログを意味する。したがって、例えば、(D)アルギニンアナログは、このアナログが、アルギニンのグアニジニウム側鎖反応
性基の特徴である生理学的pHで正の電荷を有する側鎖を含む場合、(D)アルギニンの模倣
物であり得る。ペプチド模倣物は、対応するペプチドに存在するような同様のペプチド鎖ファルマコフォア(pharmacophore)基を保持する有機分子である。
【００１４】
アミノ酸の天然に存在しないアミノ酸および上記のようなペプチド模倣物による置換は、側鎖の機能性に対する改変に基づいて、個々のペプチドの全体の活性または他の特性を増強し得る。例えば、例示されたペプチドのこれらのタイプの変更は、酵素的分解に対するペプチドの安定性を増強し得るか、または生物学的活性を増加し得るか、または免疫原性を低下させ得る。
【００１５】
上記の式を使用して、当業者は、本発明のペプチドを容易に合成し得る。合成ペプチドを調製するための標準的手順は当該分野で周知である。新規オピオイドペプチドは、Merrifield（J.Am. Chem. Soc., 85:2149 (1964)、これは参考として本明細書に援用される
）の固相ペプチド合成（SPPS）方法、またはSPPSの改変を使用して合成され得、あるいはこのペプチドは、当該分野で周知の標準的溶液方法（例えば、Bodanzsky,M.,Principles
of Peptide Synthesis, 第２改訂版 (Springer-Verlag, 1988および1993)を参照のこと
、これは参考として本明細書に援用される）を使用して合成され得る。あるいは、当該分野で周知の同時多数ペプチド合成（SMPS）技法が使用され得る。Merrifieldの方法によって調製されるペプチドは、AppliedBiosystems431A-01 Peptide Synthesizer (Mountain View, CA)のような自動化ペプチド合成機を使用して、またはHoughten,Proc.Natl. Acad. Sci., USA 82:5131 (1985)（これは参考として本明細書に援用される）に記載される手動のペプチド合成技法を使用して、合成され得る。
【００１６】
ペプチドは、アミノ酸またはアミノ酸アナログを使用して合成され得、その活性基は、必要に応じて、例えば、t-ブチルジカルボネート（t-BOC）基またはフルオレニルメトキ
シカルボニル（FMOC）基を使用して保護される。アミノ酸およびアミノ酸アナログは、市販用を購入するか（SigmaChemical Co.; AdvancedChemtec）または当該分野で公知の方
法を使用して合成され得る。固相法を使用して合成されるペプチドは、4-メチルベンズヒドリルアミン（MBHA）、4-(オキシメチル)-フェニルアセトアミドメチル、および4-(ヒドロキシメチル)フェノキシメチル-コポリ(スチレン-１％ジビニルベンゼン)（Wang樹脂）
（これらの全ては市販されている）を含む樹脂に、またはp-ニトロベンゾフェノンオキシムポリマー（オキシム樹脂）（これは、DeGradoおよびKaiser, J.Org. Chem. 47:3258 (1982)に記載されるように合成され得、これは参考として本明細書に援用される）に付着
され得る。
【００１７】
例示したペプチドにおいて、「Ac」はアミノ末端でのアセチル基を示し、そして「NH２」はアミド基がカルボキシ末端にあることを意味する。ペプチドは、例えば、まだ樹脂に付着されている間に、アセチル化したペプチドのようなN-末端改変した化合物を得るために操作され得るか、あるいはフッ化水素または等価の切断試薬を使用して樹脂から除去され、次いで改変され得る。C-末端カルボキシ基（Wang樹脂）を含む合成された化合物は、樹脂からの切断後、またはいくつかの場合には液相合成前に改変され得る。N-末端のアセチル化の方法またはC-末端のアミド化の方法のような、N-末端またはC-末端を改変する方法は、当該分野で周知である。
【００１８】
新しく合成されたペプチドは、逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）、等電点
クロマトグラフィーのような方法、またはペプチドのサイズもしくは電荷に基づく分離の他の方法を使用して、あるいは免疫精製技法によって、精製され得る。さらに、精製したペプチドは、アミノ酸分析および質量分析のようなこれらのおよび他の周知の方法を使用して特徴づけられ得る。
【００１９】
製造後、ペプチドは、実施例Ｉに提供されるようなκ放射性レセプターアッセイを使用して、κレセプター結合活性についてアッセイされ得る。ペプチドの特異性のさらなるデータについて、κ放射性レセプターアッセイの結果は、実施例IIで提供されるようなμおよびδ放射性レセプターアッセイの結果と比較され得る。ペプチドのインビトロアゴニストまたはアンタゴニスト活性を試験するために、実施例IIIに記載のモルモット回腸アッ
セイのような、周知のインビボアッセイが、ルーチンに行われ得る。さらに、いくつかの他の確実なインビボ試験が当該分野で公知であり、これらは本発明のオピオイドペプチドおよび組成物を試験するために有用である。試験の例としては、マウスの尾打（tail-flick）、尾はさみ（tail-pinch）、およびHCl苦悶（writhing）試験、ならびにラット温暖
プレートおよびホットプレートアッセイ、およびラット尾浸水（tail-immersion）、尾打
、および空気苦悶アッセイが挙げられ、これらはすべて、Vonvoigtlanderら、Journalof Pharmacology andExperimental Therapeutics, 224(1):7-12 (1983)に記載されており、これは参考として本明細書に援用される。上記のより通常に使用されるアッセイの１つである、マウス尾打インビボ動物モデルはまた、Dixonら、DrugRes.,27:1968 (1977)、Jiangら、J. Pharmacol. Exp. Ther., 262:526 (1992)、およびDooleyら、Science,266:2019
(1994)に記載され、これらはすべて、参考として本明細書に援用される。
【００２０】
本発明のペプチドはκレセプターに結合するので、これらはオピエートレセプターサブタイプを研究するためにインビトロアッセイで使用され得る。例えば、未知のタイプまたは起源の試料レセプターにおいて、ペプチドは、放射性同位元素のような検出可能なマーカーで標識された後、κサブタイプのような特定のレセプターサブタイプへの結合を特異的に助ける条件下で、レセプター試料と接触され得る。結合していないレセプターおよびペプチドは、例えば、生理的食塩溶液での洗浄によって除去され得、次いで、結合したレセプターは、当業者に周知の方法を使用して検出され得る。したがって、本発明のペプチドは、脳および他の組織試料中の、関連したオピオイドレセプターサブタイプ、特にκタイプの診断に、インビトロで有用である。
【００２１】
インビトロスクリーニング方法での有用性の他に、ペプチドはまたインビボで有用である。例えば、オピオイドペプチドは、オピオイドレセプターサブタイプを局在化するためにインビボで診断的に使用され得る。ペプチドはまた、薬物として、すなわち鎮痛薬として、あるいはオピオイドレセプター系と相互作用する他の化合物と関連する病状を処置するために有用である。したがって、本発明のペプチドは、κレセプターに関連する病状を処置するための医薬品に、および鎮痛薬として使用され得る。例えば、これらのペプチドが、中枢で作用する疼痛抑制剤(killer)の末梢効果をブロックするための治療的目的で使用され得ることが、考えられ得る。例えば、モルヒネは中枢に作用する疼痛抑制剤である。しかし、モルヒネは、所望の鎮痛効果に必要とされない、末梢において多くの有害な効果（例えば、便秘およびそう痒症（そう痒））を有する。多くのペプチドが血液脳関門を容易に横切せず、したがって中枢効果を誘起しないことは公知であるが、本発明のペプチドは、便秘およびそう痒のようなモルヒネの末梢効果をブロックする点で価値を有し得る。
【００２２】
本発明の新規ペプチドは薬学的組成物に組み込まれ得る。薬学的に受容可能なキャリアは当該分野で周知であり、そして、水溶液（例えば、生理学的に緩衝化された生理的食塩水または他の緩衝液）、あるいは溶媒またはビヒクル（例えば、グリコール、グリセロール、油（例えば、オリーブ油）、もしくは注入可能な有機エステル）を含む。薬学的に受容可能なキャリアは、例えば、オピオイドペプチドを安定化するか、またはペプチドの吸収を増加させるように作用する、生理学的に受容可能な化合物を含み得る。このような生理学的に受容可能な化合物としては、例えば、炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、またはデキストラン）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸またはグルタチオン）、キレート剤、低分子量タンパク質、または他の安定化剤もしくは賦形剤が挙げられる。生理学的に受容可能な化合物を含む薬学的に受容可能なキャリアの選択が、例えば、投与経路、および特定のオピオイドペプチドの特定の生理化学的特徴に依存することは、当業者に公知である。
【００２３】
医薬品を投与する方法は、当業者に周知であり、そして経口、静脈内、筋肉内、または腹腔内投与を含むが、これらに限定されない。投与は、連続的にまたは断続的に行われ得、そして被験体で変化し、そして処置のタイプおよび使用されるペプチドの効力に依存する。
【００２４】
以下の実施例は例証を意図するが、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００２５】
実施例Ｉ
放射性レセプターアッセイによるカッパ選択的オピオイドペプチドの同定
この実施例は、κ選択的リガンド[３H]-U69,593のインヒビターとしての個々のペプチ
ドの同定を記載する。個々のペプチドを、放射性レセプターアッセイによって、[３H]-U69,593を阻害し得るものとして同定した。
【００２６】
多数の種々のペプチドの10の混合物から作成した合成組合せライブラリー(synthetic combinatorial library)（SCL）は、個々の活性化合物を迅速に同定するために使用され得る。ライブラリーが溶液中にある（すなわち、ビーズ、ピン、ファージ、ガラスなどに付着していない）ので、これらは実質的に任意のアッセイ系でスクリーニングされ得る。すべてのオピオイドペプチドを、最初に調製し、そして位置スキャンニング(positionalscanning)合成組合せライブラリー（PS-SCL）内に含んだ。ライブラリーを反復選択プロセスとともに使用して、放射性レセプターアッセイにおいて[３H]-U69,593を阻害し得る個々
のペプチドを同定した。
【００２７】
以下に詳述するように、ペプチドライブラリーを、ラット脳ホモジネートおよび放射性リガンドとして[３H]-U69,593を使用してスクリーニングし、そして[３H]-U69,593の結合を著しく阻害したペプチドについて、IC５０値を決定した。
【００２８】
カッパレセプターについて選択的な放射性レセプターアッセイ
液体窒素で凍結したモルモット脳を、Harlan Bioproducts for Science (Indianapolis, IN)から得た。凍結した脳を解凍し、小脳および皮質を取り出して秤量した。合わせた
皮質および小脳を、100μMフェニルメチルスルホニルフルオライド（PMSF）、５mM MgCl
２、および１mg/mlウシ血清アルブミンを含む40mlTris-HCl緩衝液（50mM、pH7.4、４℃）中でホモジナイズし、そして４℃にて10分間遠心分離した（39000×g）（ModelJ2-HC;Beckman Instruments, Fullerton, CA)。ペレットを新鮮なTris-HCl緩衝液に再懸濁し、そ
して37℃にて40分間インキュベートした。インキュベーション後、懸濁液を上記のように遠心分離し、得られたペレットを100容量のTris緩衝液で再懸濁し、そして懸濁液を合わ
せた。膜懸濁液を調製し、そして同日中に使用した。粗ホモジネートのタンパク質含有量は、Bradford、Anal.Biochem.72:248-254 (1976)（参考として本明細書に援用される）
に記載される方法を使用して決定したように、0.1〜0.3mg/mlの範囲であった。
【００２９】
結合アッセイをポリプロピレンチューブで行った。各チューブは、３nMのκ選択的リガンド[３H]-U69,593（比活性62Ci/mmol）（Amersham;ArlingtonHeights, IL）、ペプチド混合物（混合物中の個々のペプチドについて３×10４〜３×10５M濃度の範囲）、ならび
に100μMPMSF、５mM MgCl２、および１mg/ml BSA、pH7.4を含むTris緩衝液を使用してモ
ルモット脳（皮質および小脳）から調製された組織ホモジネートを含んだ。アッセイチューブを、25℃にて2.5時間インキュベートした。反応を、GF-Bフィルター（Wallac,Gaithesburg,MD）による濾過によって停止した。続いて、フィルターを６ml Tris-HCl緩衝液で４℃にて洗浄した。結合した放射能をBeta-plateLiquidScintillation Counter (Life Technologies, Gaithersburg, MD）で計数し、そしてカウント／分（cpm）で表した。標準曲線を、0.05〜6300nMナロキソン（Sigma,St. Louis, MO）を使用して調製した。競合阻害アッセイを、ペプチド混合物の連続希釈を使用して上記のように行った。次いで、IC５０値を、ソフトウエアGRAPHPAD（ISI,SanDiego, CA）を使用して算出した。 IC５０値についての平均標準偏差は±20％であった。
【００３０】
1000nMより低いIC５０値は、κレセプターに結合する非常に活性なオピオイドペプチドを示し、特に活性な化合物は100nMまたはそれより低いIC５０値を有し、そして最も活性
な化合物は10nMより低い値を有する。
【００３１】
１つのSCLのアッセイスクリーニングから同定したオピオイドペプチドは、一般構造Ac-A1-B2-C3-Arg-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg-NH２（配列番号28）を有し、ここでA1はTyrまたはArgであり、B2はArgまたはPheであり、そしてC3はThr、Phe、またはMetである。この式の範囲内にあるペプチドのIC５０値を、表１に提供する。
【００３２】
【表１】
2007077163.tif 000003
【００３３】
また、κ選択的ペプチドとして同定されるものは、一般式(D)Phe-D4-E5-F6（配列番号29）であり、ここでD4は(D)NapAlaまたは(D)Pheであり、E5は(D)Nle、Trp、または(D)Ile
であり、そしてF6は(D)Argまたは(D)ChAlaである。表２は、この式の範囲内の各ペプチドについてのそれぞれのIC５０値を提供する。
【００３４】
【表２】
2007077163.tif 000004
【００３５】
一般式(D)Nle-D4-E5-F6（配列番号30）（ここで、D4は(D)NapAlaまたは(D)Pheであり、E5は(D)Nle、Trp、または(D)Ileであり、そしてF6は(D)Argまたは(D)ChAlaである）のペ
プチドもまた、[３H]-U69,593のインヒビターとして同定した。この式の範囲内のペプチ
ドのIC５０値を、以下の表３に提供する。
【００３６】
【表３】
2007077163.tif 000005
【００３７】
上記の表１から３の結果は、κオピオイドレセプターについて全て選択的であるオピオイドペプチドの３つの構造的に独特の系列を提供する。
【００３８】
実施例II
オピオイドペプチドのカッパレセプター特異性
この実施例は、μおよびδオピエートレセプターと比較して、κレセプターに対する新規オピオイドペプチドの特異性についてのさらなるデータを得る方法を示す。
【００３９】
個々のペプチドは、上記のように当該分野で周知の手順によって合成され得る。以下に詳述される、μおよびδレセプターについて選択的な放射性レセプターアッセイにおける、個々の合成されたペプチドの活性は、実施例Ｉからのκレセプターについて選択的な放射性レセプターアッセイの結果と比較され得る。
【００４０】
μレセプターについて選択的な放射性レセプターアッセイを、上記のようにラット脳ホモジネートを使用して行い得る。試料ポリプロピレンチューブを、全容量0.65ml中に、約0.5mlの膜懸濁液、３nMのμ選択的オピオイドペプチド[３H]-DAMGO（比活性36Ci/mmol）
、0.08mg/mlペプチド混合物、およびTris-HCl緩衝液を含むように調製する。アッセイチ
ューブを、一般的に25℃にて60分間インキュベートし、そして反応を、例えば、GF-Bフィルターによる濾過によって停止した。続いて、フィルターを４℃にて６mlのTris-HCl緩衝液で洗浄する。次いで、結合した放射能を、例えば、Beta-plateLiquidScintillation Counter (Life Technologies, Gaithersburg, MD)で計数し、そしてカウント／分（cpm）
で表す。標準曲線を、0.13〜3900nMの標識されていないDAMGOの存在下での[３H]-DAMGOのインキュベーションによって決定し得る。
【００４１】
δレセプターについて選択的な放射性レセプターアッセイを、100μMフェニルメチルスルホニルフルオライド(PMSF）、５mM MgCl２、および１mg/mlウシ血清アルブミン（BSA）、pH7.4を含むTris緩衝液中で、上記のようにラット脳ホモジネートおよび放射性リガン
ドとして[３H]-ナルトリンドール(naltrindole)（0.5nM、比活性34.7ci/mmol）を使用し
て行い得る。試料を、一般的に、2.5時間インキュベートする。標準曲線を、0.10〜3200nM[３H]-D-Pen２、Pen５]-エンケファリン（[３H]-DPDPE）を使用して調製する。全ての他の工程は、上記と同様である。
【００４２】
トリチウム標識したリガンド、[３H]-DAMGOおよび[３H]-DPDPEを、MultiplePeptideSystems (San Diego, CA)によって調製されるように、National Institute on Drug Abuse(NIDA)の貯蔵庫から、そして[３H]-ナルトリンドールはDuPontNEN Research Products (LosAngeles, CA)から入手し得る。IC５０値の平均標準偏差は±20％であった。
【００４３】
それぞれのκ、μ、およびδ放射性レセプターアッセイにおける比較データは、μおよびδオピエートレセプターよりもκレセプターに対する新規オピオイドペプチドの選択性をさらに示し得る。  
【００４４】
実施例III
モルモット回腸アッセイによるカッパレセプターアゴニストまたはアンタゴニスト活性
この実施例は、ある新規なオピオイドペプチドが、モルモット回腸アッセイによって、κレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストとして同定され得ることを示す。  
【００４５】
モルモット回腸アッセイ
モルモット回腸（GPI）バイオアッセイは、ペプチドがオピオイドアゴニストであるか
どうかを決定するために行われ得る。また、このような情報は、上記の放射性レセプター結合アッセイから決定され得ない。
【００４６】
GPIアッセイ（Kosterlitzら、Br.J. Pharam. 39:398-418 (1970)、これは参考として本明細書に援用される）は、インビトロでのオピオイド活性の決定について最も広く使用されるアッセイの１つである。アッセイは、組織における電気的に刺激された収縮を阻害するオピオイドアゴニストの能力に基づく。GPIは、回腸調製物がμおよびκレセプターの
両方を含む限りでは、「完全な（clean）」アッセイではない。しかし、GPIにおけるκレセプターが媒介する効果を、アンタゴニストに対するKｅ値（κ効果：Kｅ約20〜30nM；μ効果：Kｅ約１〜３nM）を決定することによって、またはCTAP（(D)Tca-Cys-Tyr-(D)Trp-Arg-Thr-Pen-Thr-NH２、ここでTcaは環状(D)Trpアナログである）のような特異的μアン
タゴニストでμレセプターをブロックすることによって、μレセプターが媒介する効果と区別し得る。
【００４７】
モルモットを断頭によって殺し、回腸を取り出し、そして縦走筋−腸層間神経叢調製物をクレブス溶液（NaCl 118mM、KCL 4.75mM、NaH２PO４１mM、NaHCO３25mM、MgSO４ 1.2mM、グルコース 11mM、およびCaCl２2.5mM）中に置く。溶液を95％O２および５％CO２で
ガスを通し、37℃で維持する。組織を10mlの器官浴中で最終張力１g下でつるし、そして
１時間安定化する。直線の白金電極による電気的刺激を、0.4msパルスの上部(supra)最大電圧で適用し、0.1Hzの速度で送達する。次いで、等尺性収縮を緊張ゲージ力変換器によ
り測定し、そしてストリップチャート記録計で記録する。
【００４８】
本発明は上記の実施例に関して記載されているが、種々の改変が、本発明から逸脱することなく、当業者によって行われ得ることが理解されるべきである。したがって、本発明は以下の請求の範囲に述べられる。