(57)【要約】【課題】  本発明は、粘弾性の高いコムギ粉を効率良く生産することができると同時に、タンパク含量が高く、低カロリーで付加価値の高い良食味米を得る手段を提供することを目的とする。【解決手段】  コムギの高分子グルテニン・サブユニット及び／又は低分子グルテン・サブユニットをコードするＤＮＡが導入され、かつ安定して発現していることを特徴とするトランスジェニックイネ細胞；前記トランスジェニックイネ細胞を含むトランスジェニックイネ；前記トランスジェニックイネ由来の種子、切穂又は実；前記トランスジェニックイネ由来のコメ又はその加工品。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コムギの高分子グルテニン・サブユニット及び／又は低分子グルテン・サブユニットをコードするＤＮＡが導入され、かつ安定して発現していることを特徴とするトランスジェニックイネ細胞。
【請求項２】
コムギのグルテニン・サブユニットをコードするＤＮＡ及びその調節領域と核マトリックス結合領域が導入されてなることを特徴とするトランスジェニックイネ細胞。
【請求項３】
配列表の配列番号１記載の塩基配列からなる３−１１３クローン及び／又は配列表の配列番号２記載の塩基配列からなる４−２２８クローンが導入されてなることを特徴とする、請求項１又は２記載のトランスジェニックイネ細胞。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のトランスジェニックイネ細胞を含むトランスジェニックイネ。
【請求項５】
少なくともその種子にコムギの高分子グルテニン・サブユニット及び／又は低分子グルテン・サブユニットが蓄積している請求項４に記載のトランスジェニックイネ。
【請求項６】
請求項４又は５記載のトランスジェニックイネ由来の種子、切穂又は実。
【請求項７】
請求項４又は５記載のトランスジェニックイネ由来のコメ又はその加工品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コムギのグルテニン・サブユニットを発現するトランスジェニックイネに関し、詳しくは、農業や食品などの分野において食品加工成分として有用なコムギのグルテニン・サブユニットをコードするＤＮＡが導入されたイネ細胞、および該サブユニットが発現するイネ植物体、並びにその加工品に関する。
【背景技術】
【０００２】
コムギ粉に水を加えてこねることにより得られる生地には、粘弾性が発現する。
このため、コムギ粉は各種食品に粘弾性を与える目的で利用されており、例えばコムギ粉を工業的に処理して製造される粗製グルテンが、パン、製麺改良剤、ソーセージ、水産練り製品などに添加されている。
【０００３】
製パン性や製麺性に優れた、高い粘弾性を発現するコムギ粉を得るために、コムギ粉からうどんやパンを実際に作成して、粘弾性の高かった場合にそのコムギ粉の原料となったコムギを選抜して品種改良が行われていたが、大変に効率が悪かった。
一方、コムギは食品として重要であることから、その成分についての研究も進み、その過程で、コムギに含まれる良質タンパク質の基本構造単位の一種であるグルテニン・サブユニット群が、相互に架橋結合を生じて網目構造を形成することにより、粘弾性を生じさせることが明らかにされた。すなわち、グルテニン・サブユニットは、分子量９５〜１３６ｋＤの高分子グルテニン・サブユニットと分子量３６〜４４ｋＤの低分子グルテニン・サブユニットから構成され、分子間ジスルフィド結合により相互に架橋結合を生じて巨大な網目構造を形成することにより、グルテンの粘弾性を発現させる（非特許文献１及び非特許文献２参照）。
【０００４】
この高分子グルテニン・サブユニット及び低分子グルテニン・サブユニットのアミノ酸配列の解析も、既に進んでおり、高分子グルテニン・サブユニットは、その電気泳動パターンから、ｘ型（１Ａｘ１、１Ａｘ２、１Ｂｘ２０など）、ｙ型（Ｂ１ｙ９、Ｄ１ｙ１０、Ｄ１ｙ１２）等に分類され、また、低分子グルテニン・サブユニットは、グループ１〜１２に分類されている。
しかし、コムギは、我が国ではあまり生産されておらず、ほとんど輸入に頼っているのが現状である。
【０００５】
一方、イネは、その種子がコメとして我が国において主食として古くから利用されていることから、広く全国的に生産され、その生産量はコムギと比較にならないほど高い。
コメはデンプン含量が高く、高カロリーであることから、近年の消費者の健康志向に合わせて、高タンパク化によりデンプン含量を低下させる改良が進められている。
しかし、コメを高タンパク化すると、コメに含まれるプロラミンが増大するために、食味が低下するという問題があった。
【０００６】
【非特許文献１】T．M．Ikeda，K．Nakamichi，T．Nagamine，H．Yano and A．Yanagisawa（2003）Identification of Specific Low-Molecular-Weight-Glutenin Subunits Related to Gluten Quality in Bread Wheats．JARQ 37：99-103．
【非特許文献２】P．R．Shewry，N．G．Halford and A．S．Tatham（1992）High Molecular Weight Subunits of Wheat Glutenin．J．Cereal Sci．15：105-120．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のような従来の問題点に鑑み、本発明は、粘弾性の高いコムギ粉を効率良く生産することができると同時に、タンパク含量が高く、低カロリーで付加価値の高い良食味米を得る手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく検討を重ねる過程において、本発明者らは、上記のようなコムギのグルテニン・サブユニットをコードするＤＮＡをイネにおいて遺伝的に発現させることにより、製パン性、製麺性などのコムギ固有に見られる特性をイネに付与することができると共に、タンパク含量が高く、低カロリーで付加価値の高い良食味米を得ることができるものと推測し、検討を進めた。
【０００９】
しかしながら、コムギのグルテニン・サブユニットのうち、高分子グルテニン・サブユニット及び低分子グルテニン・サブユニットは、それらのアミノ酸配列に関して、イネの種子貯蔵タンパク質であるプロラミンと同じプロラミン・スーパーファミリーに属している（P．R．Shewry，J．A．Napier and A．S．Tatham（1995）Seed Storage Proteins：Structure and Biosynthesis．The Plant Cell 7：945-956）ことから、コムギのグルテニン・サブユニットをコードするＤＮＡをイネ細胞に導入すると、プロラミンの増大によりコメの食味が低下するという懸念があった。
しかし、本発明者らが、コムギのグルテニン・サブユニットをコードするＤＮＡをイネに導入し、得られるトランスジェニックイネ細胞を再生して作出したトランスジェニックイネから得たコメは、消化性の良いグルテンのタンパク質であるグルテニン・サブユニットの富化により、食味低下の原因となるプロラミンの増大が抑えられ、通常のコメと比べて遜色のない食味を呈する。
また、得られるトランスジェニックイネにおいては、コムギのグルテニン・サブユニットが発現しており、特に、イネ種子においては、蓄積したグルテニン・サブユニットがコムギ種子内と同じ限定的な分解を受けかつ、架橋構造をもつ成熟型として存在していることを見出した。即ち、本発明者らは、イネ種子においてコムギグルテン・タンパク質を発現させ、成熟した形態で蓄積させることに成功し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、請求項１記載の本発明は、コムギの高分子グルテニン・サブユニット及び／又は低分子グルテン・サブユニットをコードするＤＮＡが導入され、かつ安定して発現していることを特徴とするトランスジェニックイネ細胞である。
請求項２記載の本発明は、コムギのグルテニン・サブユニットをコードするＤＮＡ及びその調節領域と核マトリックス結合領域が導入されてなることを特徴とするトランスジェニックイネ細胞である。
請求項３記載の本発明は、配列表の配列番号１記載の塩基配列からなる３−１１３クローン及び／又は配列表の配列番号２記載の塩基配列からなる４−２２８クローンが導入されてなることを特徴とする、請求項１又は２記載のトランスジェニックイネ細胞である。
請求項４記載の本発明は、請求項１〜３のいずれかに記載のトランスジェニックイネ細胞を含むトランスジェニックイネである。
請求項５記載の本発明は、少なくともその種子にコムギの高分子グルテニン・サブユニット及び／又は低分子グルテン・サブユニットが蓄積している請求項４に記載のトランスジェニックイネである。
請求項６記載の本発明は、請求項４又は５記載のトランスジェニックイネ由来の種子、切穂又は実である。
請求項７記載の本発明は、請求項４又は５記載のトランスジェニックイネ由来のコメ又はその加工品である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、イネにコムギのグルテニン・サブユニットの持つ加工適性を遺伝的に付与することができるので、イネを利用した、製パン性や製麺性に優れたコムギ粉の効率的な利用拡大を図ることができる。
また、コムギのグルテニン・サブユニットを導入することにより、他の高タンパク質米のように食味を低下させることがないので、高タンパク低カロリーで付加価値の高い良食味米を得ることも可能である。
更に、コムギグルテニン・サブユニットは、日常食べているコムギ由来のタンパク質であるため、本発明により提供されるトランスジェニックイネ細胞やトランスジェニックイネは、安全性が高い点でも有益である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のトランスジェニックイネ細胞は、請求項１に記載するように、コムギの高分子グルテニン・サブユニット及び／又は低分子グルテン・サブユニットをコードするＤＮＡが導入され、かつ安定して発現していることを特徴とする。
グルテニン・サブユニットの由来となるコムギについての条件は特になく、Chinese Springをはじめとして広く様々な品種や週齢のものを用いることができる。
グルテニン・サブユニットは、高分子グルテニン・サブユニット、低分子グルテニン・サブユニットから構成されるタンパク質である。高分子グルテニン・サブユニット及び低分子グルテニン・サブユニットについては、上述のように、その電気泳動パターンから、前者についてはｘ型（１Ａｘ１、１Ａｘ２、１Ｂｘ２０など）、ｙ型（Ｂ１ｙ９、Ｄ１ｙ１０、Ｄ１ｙ１２）等に分類され、また、後者については、グループ１〜１２に分類されているが、これらのいずれであっても良く、特に限定されない。
本発明においては、このような高分子グルテニン・サブユニット及び／又は低分子グルテン・サブユニットを対象とすることにより、上述したようにグルテンの粘弾性を発現させる網目構造を形成させることができる。
尚、コムギのグルテニン・サブユニットに他の一種類又は二種類以上のタンパク質を組み合わせて発現させてもよい。
【００１３】
コムギの高分子グルテニン・サブユニット及び／又は低分子グルテン・サブユニットをコードするＤＮＡは、コムギのゲノミックＤＮＡを、Ｌｉｕらの方法（Gene，282：245-255，2002）、Ｏｓｏｅｇａｗａらの方法（Genomics，52：1-8，1998）等により抽出し、常法によりゲノミックライブラリーを構築して、その中から、既知の高分子グルテニン・サブユニット及び／又は低分子グルテン・サブユニットを構成するアミノ酸配列等を基に設計したプライマーを用いたＰＣＲにより単離して得ることができる。また、既知の高分子グルテニン・サブユニット及び／又は低分子グルテン・サブユニットのアミノ酸配列から推定された塩基配列を合成して得ることもできる。
【００１４】
本発明のトランスジェニックイネ細胞は、上記のようなコムギの高分子グルテニン・サブユニット及び／又は低分子グルテン・サブユニットをコードするＤＮＡをイネ細胞に導入することにより、得ることができる。
ここで、イネ細胞としては、イネの植物体を構成する細胞であれば、イネの品種、産地、日齢、栽培方法等に関して特に限定はないが、種子貯蔵タンパク質であるグルテリンの１つを欠失したイネＬＧＣ１を用いると、外来のタンパク質であるコムギの高分子グルテニン・サブユニット及び／又は低分子グルテン・サブユニットをより多く発現させることが期待できる点で、好ましい。
また、細胞の由来部位、器官、形態等に関して特に限定はないが、植物体に再生可能な点で、カルスを好ましく用いることができる。カルスとしては、例えばＦｕｋｕｏｋａらの方法（Plant cell Rep．，19：815-820，2000）に従いイネの種子の胚盤より誘導されたものを用いることができる。
【００１５】
コムギの高分子グルテニン・サブユニット及び／又は低分子グルテン・サブユニットをコードするＤＮＡを導入する際には、請求項２に記載するように、該ＤＮＡと共にその調節領域と核マトリックス結合領域（Matrix attachment region：以下、ＭＡＲという。）を導入すると、導入後に遺伝子を容易に発現させることができる点で好ましい。
調節領域とは、コムギのグルテニン・サブユニットをコードするＤＮＡの上流に導入されるプロモーター配列や、該ＤＮＡの下流に導入されるターミネーター配列を挙げることができる。プロモーター配列としては、イネ細胞内で転写可能なものであれば特に限定されず、例えば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター領域を挙げることができる。また、ターミネーター配列としては、ポリアデニル化に必要な配列を含むものを意味し、例えば、ノパリン合成酵素ターミネーター領域を挙げることができる。
特に、組織特異的な発現（例えば、イネの種子における発現）を期待する場合は、本来イネ種子の胚乳に特異的に遺伝子を発現させるグルテリン遺伝子のプロモーター領域とターミネーター領域や、他の麦類（例えば、オオムギ）のホルデイン遺伝子のプロモーターやターミネーター領域などを用いることができる。
また、ＭＡＲとは、核マトリックスに結合する機能を有する領域をいう。ＭＡＲは調節領域の近傍で頻繁に認められ、遺伝子の複製や発現に重要と考えられている。
【００１６】
コムギの高分子グルテニン・サブユニット及び／又は低分子グルテン・サブユニットをコードするＤＮＡ及びその調節領域とＭＡＲを含むものとして、具体的には、配列表の配列番号１記載の塩基配列からなる３−１１３クローン及び／又は配列表の配列番号２記載の塩基配列からなる４−２２８クローンを挙げることができる。
３−１１３クローンは、高分子グルテニン・サブユニット（ｙ型）をコードするＤＮＡのほかに、その調節領域として、ＧＣＮ４ボックス（高分子グルテニン・サブユニットをコードするＤＮＡの開始コドンから数えて−６２８〜−６１９番目、及び−５８２〜−５７３番目の２箇所）、ＡＡＣＡモチーフ（同様に開始コドンから数えて−５２９〜−５２４番目）、ＨＭＷプロラミンプロモーター（同様に開始コドンから数えて−２４６〜−２０９番目）、及びＴＡＴＡボックス（同様に開始コドンから数えて−９１〜−８５番目）の各プロモーター配列と、ターミネーターとしてのポリＡ化シグナル（開始コドンから数えて２２６７〜２２７３番目）とを含む（図１−１参照）。
また、３−１１３クローンは、ＭＡＲとして、配列表の配列番号１における塩基番号１１０００〜１１２００（高分子グルテニン・サブユニットをコードするＤＮＡの開始コドンから数えて−２４３０〜−２２３０番目）、塩基番号１７３００〜１８０００（同３８７１〜４５７１番目）、及び塩基番号５０４００〜５０９００（同３６９７１〜３７４７１番目）を含む（図１−２参照）。
【００１７】
また、４−２２８クローンは、低分子グルテニン・サブユニット（グループ１１又は１２）をコードするＤＮＡのほかに、その調節領域として、ＡＣＧＴモチーフ（低分子グルテニン・サブユニットをコードするＤＮＡの開始コドンから数えて−９７６〜−９６９番目）、ＧＣＮ４ボックス（同様に開始コドンから数えて−５６３〜−５５４番目、−３１１〜−３０２番目、及び−２８８〜−２７９番目の３箇所）、プロラミンボックス（同様に開始コドンから数えて−５７７〜−５７０番目、−３０１〜−２９４番目、及び−１１３〜−１０７番目の３箇所）、及びＴＡＴＡボックス（同様に開始コドンから数えて−７９〜−７３番目）の各プロモーター配列と、ターミネーターとしてのポリＡ化シグナル（開始コドンから数えて１２０６〜１２１番目、１２７５〜１２８１番目、及び１４２７〜１４３５番目）とを含む（図２−１参照）。
また、４−２２８クローンは、ＭＡＲとして、配列表の配列番号２における塩基番号５４００〜６０００（低分子グルテニン・サブユニットをコードするＤＮＡの開始コドンから数えて−３３５３６〜−３２９３６番目）、及び塩基番号４２７００〜４３３００（同３７６５〜４３６５番目）を含む（図２−２参照）。
なお、上記した３−１１３クローンおよび４−２２８クローンにおけるＭＡＲの位置は、ＭＡＲ解析用ソフトウェア「ＭＡＲ−Ｗｉｚ」（http://www.futuresoft.org/MAR-Wiz/）を用いて予測したものである。
【００１８】
３−１１３クローン及び／又は４−２２８クローンを導入することにより得られるトランスジェニックイネ細胞は、コムギの高分子グルテニン・サブユニット及び／又は低分子グルテン・サブユニットをコードするＤＮＡをイネの種子において特異的に発現させることができる。そして、その発現は世代に渡って安定しており、他のトランスジェニックイネにおいてしばしば見られるような、後代で発現しなくなってしまうサイレンシングは起こらない。
【００１９】
イネ細胞への導入は、上記ＤＮＡを適当な組換え体用ベクターにクローニングし、これらをイネ細胞に導入すれば良く、例えば、アグロバクテリウムを利用した間接導入法（Hiei，Y．et al．，Plant J．，6，271-282，1994、Takaiwa，F．et al．，Plant Sci．111，39-49，1995参照）に従って行うことが好ましいが、当技術分野における技術者に公知の種々の方法を用いて導入することも可能である。例えば、エレクトロポレーション法（Tada，Y．et al．Theor．Appl．Genet，80，475，1990）、ポリエチレングリコール法（Datta，S．K．et al．，Plant Mol．Biol．，20，619-629，1992）、パーティクルガン法（Christou，P．et al．，Plant J．2，275-281，1992、Fromm，M．E．，Bio／Technology，8，833-839，1990）などに代表される直接導入法を用いることが可能である。
【００２０】
このようにして得られた本発明のトランスジェニックイネ細胞は、コムギの高分子グルテニン・サブユニット及び／又は低分子グルテン・サブユニットをコードする遺伝子を発現可能に保持するので、例えば、Ｏｇａｗａらの方法（Ogawa，T．et al．，Plant Cell Rep．，18：576-581，1999）に基いて再生させることにより、請求項４に記載するような上記のトランスジェニックイネ細胞を含むトランスジェニックイネを得ることができる。
本発明のトランスジェニックイネは、その植物体（例えば、種子、穂、実など）の一部又は全部に、コムギの高分子グルテニン・サブユニット及び／又は低分子グルテン・サブユニットが蓄積しているが、中でも、請求項５に記載するように、少なくともその種子にコムギの高分子グルテニン・サブユニット及び／又は低分子グルテン・サブユニットを蓄積させることにより、食味の低下なしに高タンパク質化されたコメを得ることができる点で、好ましい。
【００２１】
このような本発明のトランスジェニックイネには、導入された高分子グルテニン・サブユニット及び／又は低分子グルテン・サブユニットをコードするＤＮＡの発現により、高分子グルテニン・サブユニット及び／又は低分子グルテン・サブユニットが、分子間相互に架橋構造を有する成熟型として安定に発現し蓄積する。また、請求項６に記載するようなトランスジェニックイネ由来の種子、切穂又は実にも、同様に高分子グルテニン・サブユニット及び／又は低分子グルテン・サブユニットが成熟型として安定に発現し蓄積する。
従って、請求項７に記載するように、これら由来のコメやその加工品は、高分子グルテニン・サブユニット及び／又は低分子グルテン・サブユニットが保持する特性を有しており、製パン性や製麺性に優れたコムギ粉を生産することができるとともに、高タンパク質低カロリーであるにもかかわらず風味についても遜色ないことから、付加価値の高い良食味米として有用である。
【実施例】
【００２２】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００２３】
実施例１（トランスジェニックイネ細胞の作製）
本実施例においては、コムギのグルテニン・サブユニットをコードするＤＮＡをイネ細胞へ導入した。
コムギのグルテニン・サブユニットをコードするＤＮＡのクローニングには、長鎖ＤＮＡ断片（４０〜１００ｋｂｐ）をクローニングでき、しかもイネ科植物を直接形質転換することができるＴＡＣ（transformation-competent artificial chromosome）ベクターであるｐＹＬＴＡＣ１７（Liu et al．2002，Gene，282：247-255）を用いた。
まず、Ｌｉｕらの方法（Gene，282：245-255，2002）に従い、コムギ（Chinese Spring）のゲノミックＤＮＡを抽出し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで部分消化し約５０ｋｂｐのサイズにしたものを用いてゲノミックライブラリーを構築した。
【００２４】
次に、ゲノミックライブラリー中から各クローンを単離した。すなわち、まず、プールしたライブラリーのＤＮＡに対してＰＣＲ法で１次スクリーニングを行ない、ＰＣＲ産物が得られたものについて再度絞り込みを行った後、個々のコロニーを単離し、単一のコロニーを単離した。
ＰＣＲプライマーとしては、高分子及び低分子グルテニン・サブユニットをそれぞれコードするＤＮＡを特異的に増幅するものとして、ＨＭＷ５−１（配列表の配列番号３記載の塩基配列参照）及びＨＭＷ５−２（配列表の配列番号４記載の塩基配列）からなる対合プライマー、Ｇｌｕ−４．２（配列表の配列番号５記載の塩基配列参照）及びＧｌｕ−５．４（配列表の配列番号６記載の塩基配列参照）からなる対合プライマーを用いた。ＰＣＲ法の反応は、２５μｌの反応液（１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭの各ｄＮＴＰ、５ｐｍｏｌの各プライマー、０．５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（アプライドバイオシステムズ）、ｘ１  ＰＣＲ  Ｇｏｌｄ  ｂｕｆｆｅｒ（アプライドバイオシステムズ）、約５０ｎｇのトータルＤＮＡ）を用い、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（アプライドバイオシステムズ）にて行った。反応条件は、最初にＤＮＡの変性を９４℃、５分で行ない、その後、９４℃３０秒−５５℃３０秒−７２℃１分の繰り返しを３５回行ない、７２℃、７分で反応を完了させるものとした。
得られた増幅産物について、上記ＰＣＲを再度繰り返すことにより絞込みを行った後、個々のコロニーを単離して、その中から単一のコロニーを単離した。その結果、高分子グルテニン・サブユニットをコードするＤＮＡを含むクローン（３−１１３：配列表の配列番号１参照）及び、低分子グルテニン・サブユニットをコードするＤＮＡを含むクローン（４−２２８：配列表の配列番号２参照）を得ることができた。
個々のクローンは、低分子、及び高分子グルテニン・サブユニットのそれぞれをコードするＤＮＡを、１コピーずつ持っていた。それぞれのクローンの塩基配列から予想されるアミノ酸配列を、コムギのグルテニン・サブユニットの既知のアミノ酸配列との比較を行い、３−１１３クローンの結果を図３のＡに、４−２２８クローンの結果を図３のＢに示した。
図３のＡ及びＢのそれぞれから、３−１１３クローン中の高分子グルテニン・サブユニットはｙ型であることが明らかになり、４−２２８クローン中の低分子グルテニン・サブユニットはグループ１１または１２に対応するものであることが明らかになった。
【００２５】
更に、これらのグルテニン・サブユニットがコードされている遺伝子座を明らかにするため、各グルテニン・サブユニットをコードするＤＮＡに特異的なプライマーとして、ＨＭＷ８−１．１（配列表の配列番号７記載の塩基配列参照）及びＨＭＷ８−２．３（配列表の配列番号８記載の塩基配列参照）からなる対合プライマー、Ｇｌｕ２４（配列表の配列番号９記載の塩基配列参照）及びＧｌｕ１３（配列表の配列番号１０記載の塩基配列参照）からなる対合プライマーを設計し、グルテニン・サブユニット遺伝子が座乗する第１同祖群の染色体である１Ａ，１Ｂ，及び１Ｄ染色体をそれぞれを欠失する系統に対してＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件は、最初にＤＮＡの変性を９４℃、３０秒で行ない、その後、９４℃３０秒−５５℃３０秒−７２℃１分３０秒の繰り返しを３５回行ない、７２℃、７分で反応を完了させた。
その結果、高分子グルテニン・サブユニットはＧｌｕ−Ｂ３遺伝子座にコードされるサブユニット８であること、また、低分子グルテニン・サブユニットはＧｌｕ−Ａ３遺伝子座にコードされていることが明らかとなった。
【００２６】
一方、イネ細胞としては、コシヒカリ及びＬＧＣ１のカルスを用いた。すなわち、Ｆｕｋｕｏｋａらの方法（Plant Cell Rep．，19：815-820，2000）に従って、イネの完熟種子の胚盤より誘導しカルスを培養した。すなわち、まず、殺菌した登熟イネ種子をカルス増殖培地に１日置き、胚を切り出した。カルス誘導培地は、３０ｇ／Ｌ  マルトース、１ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄ、５ｍＭ  アラニン、１０ｍＭ  プロリン及び２ｇ／Ｌ  ゲルライトからなり、ｐＨ５．８である。
切り出した胚からカルスを誘導して約１ヶ月増殖させた後、導入遺伝子を持つアグロバクテリュウムをアセトシリンゴンの存在下で感染させ、暗所下で３日間共存培養した。
カルスを洗浄した後、ビアラフォスを含む選抜培地で３週間培養し、再分化培地に移して再分化してきたシュートを根誘導培地に移して生育させた。再分化培地は、３０ｇ／Ｌ  マルトース、３０ｇ／Ｌ  ソルビトール、２ｍｇ／Ｌ  キネチン、０．０２ｍｇ／Ｌ  ＮＡＡ、２．５ｍＭ  硫酸アンモニウム、２ｇ／Ｌ  カザミノ酸、２５０ｍｇ／Ｌ  カルベニシリン及び４ｇ／Ｌ  ゲルライトからなり、ｐＨ５．８である。
【００２７】
一方、クローン１−１１３又は４−２２８をｐＹＬＴＡＣ１７に導入してプラスミドを調製し、これをアグロバクテリウム法（Hiei，Y．et al．，Plant J．，6，271-282，1994、Takaiwa，F．et al．，Plant Sci．111，39-49，1995参照）によって上記カルスに導入した。トランスジェニックイネ細胞の選抜は、前記したカルス増殖培地および再分化培地に選抜マーカーのビアラフォス剤を１０ｍｇ／ｌ添加して行った。
このようにして、クローン１−１１３又は４−２２８が導入されたＬＧＣ１系統と、クローン１−１１３が導入されたコシヒカリの３種類のトランスジェニックイネ細胞を得た。
【００２８】
実施例２（トランスジェニックイネの作製）
上記実施例１において得られたトランスジェニックイネ細胞を生育させて、トランスジェニックイネを得ると共に、その種子においてコムギのグルテニン・サブユニットが発現しているか否かの確認を行った。
上記実施例１においてクローン１−１１３又は４−２２８が導入されたＬＧＣ１系統と、クローン１−１１３が導入されたコシヒカリとを生育させた。生育後のイネがトランスジェニックイネであることは、Ｌｉｕらの方法（Liu et al．2002，Gene，282：247-255）に従い、ベクターに存在するＢａｒ−Ｎｏｓ３’領域とＳａｃＢ配列特異的なプライマーを用いてＰＣＲにより確認した。
すなわち、Ｂａｒ−Ｎｏｓ３´配列特異的なプライマーとして、ＢａｒＮｏｓ３´／５´（配列表の配列番号１１記載の塩基配列参照）及びＢａｒＮｏｓ３´／３´（配列表の配列番号１２記載の塩基配列参照）からなる対合プライマーを、ＳａｃＢ配列特異的なプライマーとして、ＳａｃＢ５´（配列表の配列番号１３記載の塩基配列参照）及びＳａｃＢ３´（配列表の配列番号１４記載の塩基配列参照）からなる対合プライマーを用いて、反応条件は、最初にＤＮＡの変性を９４℃、５分で行ない、その後、９４℃３０秒−５５℃３０秒−７２℃１分の繰り返しを３５回行ない、７２℃、７分で反応を完了させた。
【００２９】
各トランスジェニックイネの完熟種子において、高分子及び低分子グルテニン・サブユニットが発現しているかどうかを確認するために、各種子の全タンパク質を、２次元電気泳動法（ＩＥＦｘＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって解析した。
尚、対照として、組換えを行わなかったＬＧＣ１についても同様の解析を行った。
結果を図４に示す。図４中、（１）は、組換えを行わなかったＬＧＣ１、（２）は、クローン１−１１３が導入されたＬＧＣ１、（３）はクローン４−２２８が導入されたＬＧＣ１、（４）はクローン１−１１３が導入されたコシヒカリの結果を示す。また、○を付けた部分は、新たなタンパク質が発現した箇所を示す。
【００３０】
図４から明らかなように、組換えを行わなかったＬＧＣ１（図４の（１）参照）と比べて、クローン１−１１３が導入された組換えイネ（図４の（２）及び（４）参照）では、高分子量の新たなタンパク質が比較的少量であるが発現していた。一方、クローン４−２２８が導入されたＬＧＣ１（図４の（３）参照）では、比較的低分子量のタンパク質が、イネのグルテリンとほぼ同じレベルで発現していることが明らかになった。
【００３１】
次に、上記解析の結果種子中で発現が確認された高分子量のタンパク質及び比較的低分子量のタンパク質を同定するため、それぞれのＮ末端配列の解析を行った。
すなわち、ドライストリップゲル、ｐＨ３−１０，１１ｃｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を１次元目に用いた２次元電気泳動法（ＩＥＦｘＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離した各タンパク質を、ＰＶＤＦ膜にブロッティングし、アミドブラックで染色したものを切り出して、アミノ酸シークエンサー（島津ＰＰＳＱ−２１）でＮ末端配列を決定した。
その結果、高分子量のタンパク質は、高分子グルテニン・サブユニットと同じ配列を持ち、低分子のものは低分子グルテニン・サブユニットと同じ配列であった。また、どちらのタンパク質も、コムギ種子中のものと同じ部位にプロセッシングを受け成熟型となっていることが明らかとなった。
このことから、トランスジェニックイネの種子中では、コムギの高分子グルテニン・サブユニット又は低分子グルテニン・サブユニットが発現していることが証明された。
【００３２】
更に、種子中で高分子グルテニン・サブユニット、もしくは、低分子グルテニン・サブユニットを発現しているトランスジェニックイネ（ＬＧＣ１）の各系統から、第２（Ｔ２）世代を育成し、その種子において各サブユニットが発現しているか否かを上記と同様にして調べた。
その結果、それぞれの系統について、高分子グルテニン・サブユニットまたは、低分子グルテニン・サブユニットを発現していることが判明した。
【００３３】
また、第２世代の各種子について、還元状態のバッファーによるグルテニン分画を行った。
すなわち、種子を粉砕し、５０％  １−プロパノールで３０分間懸濁した後、６０００回転で１０秒間遠心分離し、上澄み（グリアジン分画）を捨てた。この操作を２回繰り返した。
続いて、ペレットを、５０％  １−プロパノール、１％  ＤＴＴ（還元剤）及び５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）に１時間懸濁し、１２，５００回転で１分間遠心分離し、上澄みを得て、これをグルテニン分画とした。
一方、１−プロパノールに代えて２％  ＳＤＳを含むバッファーを用いた他は上記グルテニン分画の場合と同様の操作を行ってグルテリンを分画した。
各分画の結果を、図５に示す。尚、図５中、（１）及び（２）は、組換えイネのグルテニン分画（５０％  １−プロパノール及び１％  ＤＴＴを含むバッファーによって抽出される成分）の結果を、（３）及び（４）は、組換えイネのグルテリン分画（２％  ＳＤＳ及び１％  ＤＴＴを含むバッファーによって抽出される成分）の結果を示す。また、円で囲った部分は、組換えイネにおいて発現したグルテニン・サブユニット（（１）及び（３）は高分子グルテニン・サブユニット、（２）及び（４）は低分子グルテニン・サブユニット）を示す。
【００３４】
図５から明らかなように、いずれのタンパク質も、１％のＤＴＴ存在下の還元状態で５０％１−プロパノールまたは２％ＳＤＳで抽出されたことから（図５の丸部分参照）、コムギ種子中と同じくグルテニン分子間で架橋構造を形成していると考えられた。
即ち、本発明者らは、高分子グルテニン・サブユニットと低分子グルテニン・サブユニットをイネゲノムに固定し、各々を発現蓄積し機能させることに成功した。
【００３５】
実施例３（高分子グルテニン・サブユニット遺伝子及び低分子グルテニン・サブユニット遺伝子の二種類の遺伝子を導入したトランスジェニックイネの作製）
本実施例においては、コムギの高分子グルテニン・サブユニットをコードするＤＮＡおよび低分子グルテニン・サブユニットをコードするＤＮＡの二種類のＤＮＡを固定してもつイネを作製した。
まず、上記実施例２において得られた高分子グルテニン・サブユニット、もしくは低分子グルテニン・サブユニットを発現しているＬＧＣ１のトランスジェニックイネを人工交配し、雑種（Ｆ１）種子を得た。Ｆ１種子からイネを生育させ、Ｆ２世代種子を得た。
【００３６】
各Ｆ２世代種子から幼苗を育成し、実施例１と同様にしてＤＮＡを抽出し、上記実施例１において使用した高グルテニン・サブユニット遺伝子、あるいは、低分子グルテニン・サブユニット遺伝子を検出できる対合プライマー（ＨＭＷ５−１及びＨＭＷ５−２からなる対合プライマー、Ｇｌｕ−４．２及びＧｌｕ−５．４からなる対合プライマー）を用いたＰＣＲを実施例１と同様にして行い、高分子及び低分子グルテニン・サブユニットをコードするＤＮＡがともに導入されているＦ２世代個体を選抜した。
更に、高分子グルテニン・サブユニット、及び、低分子グルテニン・サブユニット遺伝子の二種類が導入されていた各Ｆ２世代個体を生育させ、Ｆ３世代系統群の種子を得た。
【００３７】
得られた各Ｆ３系統群の種子から幼苗を育成し、上記と同様にしてＤＮＡを抽出し、高分子グルテニン・サブユニット遺伝子と低分子グルテニン・サブユニット遺伝子の検出を上記と同様の高グルテニン・サブユニット遺伝子、あるいは、低分子グルテニン・サブユニット遺伝子を検出できる対合プライマーを用いたＰＣＲを上記と同様にして行い、高分子グルテニン・サブユニット遺伝子と低分子グルテニン・サブユニット遺伝子の２種類の遺伝子をともに固定している各Ｆ３系統を選抜した。
このようにして、高分子グルテニン・サブユニット、及び、低分子グルテニン・サブユニットの二種類の遺伝子が固定して導入されたＬＧＣ１のトランスジェニックイネを得た。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明により、イネにコムギのグルテニン・サブユニットの持つ加工適性を遺伝的に付与することができるので、イネを利用した、製パン性や製麺性に優れたコムギ粉の効率的な利用拡大を図ることができる。
また、コムギのグルテニン・サブユニットを導入することにより、他の高タンパク質米のように食味を低下させることがないので、高タンパク低カロリーで付加価値の高い良食味米を得ることも可能である。
更に、コムギグルテニン・サブユニットは、日常食べているコムギ由来のタンパク質であるため、本発明により提供されるトランスジェニックイネ細胞やトランスジェニックイネは、安全性が高い点でも有益である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１−１】３−１１３クローンに含まれる高分子グルテニン・サブユニット遺伝子の調節領域を示す図である。
【図１−２】３−１１３クローンに含まれるＭＡＲを示す図である。
【図２−１】４−２２８クローンに含まれる低分子グルテニン・サブユニット遺伝子の調節領域を示す図である。
【図２−２】４−２２８クローンに含まれるＭＡＲを示す図である。
【図３】３−１１３クローン（図中のＡ）及び４−２２８クローン（図中のＢ）の塩基配列から予想されるアミノ酸配列と、コムギのグルテニン・サブユニットの既知のアミノ酸配列との比較図である。
【図４】各トランスジェニックイネの完熟種子の全タンパク質についての、２次元電気泳動法（ＩＥＦｘＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による解析図である。
【図５】第２世代の種子のグルテニン分画後における２次元電気泳動法による解析図である。
【図６】高分子グルテニン・サブユニット遺伝子、及び、低分子グルテニン・サブユニット遺伝子の１種もしくは２種を導入した系統におけるＰＣＲ法による解析図である。
【図７】高分子グルテニン・サブユニット遺伝子と低分子グルテニン・サブユニット遺伝子の二種類を導入した系統における２次元電気泳動法による解析図である。
【符号の説明】
【００４０】
図１−２中、矢印は、高分子量グルテニン・サブユニットを含む３−１１３クローンの塩基配列に存在するＭＡＲ配列の部位を示す。
図２−２中、矢印は、低分子量グルテニン・サブユニットを含む４−２２８クローンの塩基配列に存在するＭＡＲ配列の部位を示す。
図４中、（１）は、組換えを行わなかったＬＧＣ１、（２）は、クローン１−１１３が導入されたＬＧＣ１、（３）はクローン４−２２８が導入されたＬＧＣ１、（４）はクローン１−１１３が導入されたコシヒカリの結果を示す。また、○を付けた部分は、新たなタンパク質が発現した箇所を示す。
また、図５中、（１）及び（２）は、組換えイネのグルテニン分画（５０％  １−プロパノール、１％  ＤＴＴ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．０）の結果を、（３）及び（４）は、組換えイネのグルテリン分画（２％  ＳＤＳ、１％  ＤＴＴ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．０）の結果を示す。また、円で囲った部分は、組換えイネにおいて発現したグルテニン・サブユニット（（１）及び（３）は高分子グルテニン・サブユニット、（２）及び（４）は低分子グルテニン・サブユニット）を示す。
図６中、（１）及び（２）は、高分子グルテニン・サブユニット及び低分子グルテニン・サブユニット遺伝子の２種が導入されたＬＧＣｌ、（３）及び（４）は低分子グルテニン・サブユニット遺伝子が導入されたＬＧＣｌ、（５）及び（６）は高分子グルテニン・サブユニット遺伝子が導入されたＬＧＣｌ、（７）及び（８）は遺伝子組換えを行わなかったＬＧＣｌの結果である。また、（１）、（３）、（５）及び（７）は、低分子グルテニン・サブユニット遺伝子を検出できる対合プライマーによるＰＣＲの結果を示し、（２）、（４）、（６）及び（８）は、高分子グルテニン・サブユニット遺伝子を検出できる対合プライマーによるＰＣＲの結果を示す。
図７中、円で囲った部分は、組換えイネにおいて発現したグルテニン・サブユニット（Ｈは高分子グルテニン・サブユニット、Ｌは低分子グルテニン・サブユニット）を示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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