(57)【要約】      （修正有）【課題】関節鏡検査手順を含む一般的な外科的手順からの創傷における種々の疼痛および炎症のプロセスを阻害するため、ならびに軟骨分解を阻害するための方法および溶液を提供する。【解決手段】溶液は、好ましくは、生理学的キャリア（例えば、生理食塩水または乳酸加リンガー溶液）中の希釈濃度で、多発性の疼痛および炎症の阻害性を有する。この溶液は、疼痛を先制阻害し、そして一方で大用量の薬剤の経口、筋内、皮下または静脈内適用に関連する所望でない副作用を回避するために、外科的手順の間、創傷の連続的な洗浄により適用され得る。また、この溶液は、軟骨分解インヒビターと共に、関節に直接注射され得る。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬を製造する方法であって、該医薬は、治療有効量の第１の軟骨保護剤および治療有効量の第２の軟骨保護剤を含む溶液を含み、ここで該第１の軟骨保護剤は、同化性軟骨保護剤であり、そして該第２の軟骨保護剤は、軟骨異化作用のインヒビターであって、そして該溶液は、患者の関節に局所的に送達されて、そして該関節における軟骨分解を阻害する際に有効である、方法。
【請求項２】
医薬を製造する方法であって、該医薬は、液体キャリア中に、治療有効量の少なくとも１つの同化性軟骨保護剤および疼痛または炎症のインヒビターである少なくとも１つの異なる薬剤を含む溶液を含み、ここで該溶液は、患者の関節に局所的に送達されて、そして該関節における軟骨分解を阻害する際に有効である、方法。
【請求項３】
医薬を製造する方法であって、該医薬は、治療有効量の第１の軟骨保護剤ならびに第２の軟骨保護剤、疼痛のインヒビター、炎症のインヒビターおよびそれらの混合物からなる群より選択される少なくとも１つの治療有効量の第２の薬剤を含む溶液を含み、ここで該溶液は、患者の関節に対する外傷後の急性期内に該関節に局所的に送達されて、そして該関節における軟骨分解を阻害する際に有効である、方法。
【請求項４】
前記溶液が、外科的手順の間の手術中に前記関節へ送達される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
外科的手順の間に前記溶液で前記関節を灌注する工程を包含する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記手順が、関節鏡検査外科的手順であり、そして前記溶液が該外科的手順の前、その間またはその後に前記関節へ送達される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記手順が、関節鏡検査外科的手順であり、そして前記溶液が、該外科的手順の前、その間およびその後に前記関節へ送達される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記溶液のボーラスが、前記外科的手順の後の患者の前記関節中にとどまるように、十分な量の該溶液が、該外科的手順の後に該関節に送達される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記溶液が、関節内注射によって前記関節に送達される、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項１０】
前記溶液が、徐放性送達ビヒクルを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記徐放性送達ビヒクルが、ミクロ粒子、ミクロスフェア、ナノ粒子、タンパク質、リポソーム、炭水化物、合成有機化合物および無機化合物からなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記溶液が、注入によって前記関節に送達される、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項１３】
前記溶液が、調節されたポンプ送達システムによって前記関節に送達される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記溶液が、慢性軟骨変性状態の処置のために前記関節に送達される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１５】
前記溶液が、前記関節における予期された組織損傷の前に前記関節に送達される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１６】
前記溶液が、前記関節に対する損傷の時にか、または傷害の後すぐに前記関節に送達される、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項１７】
前記溶液が、前記関節に対する傷害の後の急性期内に該関節に送達される、請求項１または２の方法。
【請求項１８】
前記溶液が、手術の後の急性期の間に送達される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記溶液が、前記関節に対する傷害後の４週間以内に該関節に送達される、請求項１７または３に記載の方法。
【請求項２０】
前記溶液が、前記関節に対する傷害後の亜急性期内に該関節に送達される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２１】
前記溶液が、前記関節に対する傷害後の慢性期内に該関節に送達される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２２】
前記軟骨保護剤が、軟骨同化性プロセスを促進するインターロイキン（ＩＬ）アゴニスト、軟骨同化性プロセスを促進するトランスホーミング増殖因子βスーパーファミリーのメンバー、軟骨同化性プロセスを促進するインスリン様増殖因子および軟骨同化性プロセスを促進する線維芽細胞増殖因子からなる群より選択される同化性軟骨保護剤であり、ここで該トランスホーミング増殖因子βスーパーファミリーのメンバーは、ＴＧＦ−βアゴニストおよび骨形成タンパク質アンタゴニストを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項２３】
前記同化性軟骨保護剤が、軟骨同化性プロセスを促進するインターロイキン（ＩＬ）アゴニスト、軟骨同化性プロセスを促進するトランスホーミング増殖因子βスーパーファミリーのメンバー、軟骨同化性プロセスを促進するインスリン様増殖因子ならびに軟骨同化性プロセスを促進する線維芽細胞増殖因子からなる群より選択され、ここで該トランスホーミング増殖因子βスーパーファミリーのメンバーは、ＴＧＦ−βアゴニストおよび骨形成タンパク質アゴニストを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２４】
前記同化性軟骨保護剤が、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＩＧＦ−１、ｂＦＧＦならびに天然に存在する薬剤の生物学的特徴を保持するフラグメント、欠失体、付加体、アミノ酸置換体、変異体および改変体からなる群より選択される、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記軟骨保護剤が、軟骨異化を阻害するＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、軟骨異化を阻害するＴＮＦ−αレセプターアンタゴニスト、軟骨異化を阻害するシクロオキシゲナーゼ２特異的インヒビター、軟骨異化を阻害するＭＡＰキナーゼインヒビター、軟骨異化を阻害する一酸化窒素シンターゼインヒビター、および軟骨異化を阻害する核因子ｋＢインヒビターからなる群より選択される軟骨異化のインヒビターである、請求項３に記載の方法。
【請求項２６】
軟骨異化の前記インヒビターが、軟骨異化を阻害するＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、軟骨異化を阻害するＴＮＦ−αレセプターアンタゴニスト、軟骨異化を阻害するシクロオキシゲナーゼ２特異的インヒビター、軟骨異化を阻害するＭＡＰキナーゼインヒビター、軟骨異化を阻害する一酸化窒素シンターゼインヒビター、および軟骨異化を阻害する核因子ｋＢインヒビターからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記軟骨保護剤が、軟骨異化を阻害するマトリックスメタロプロテイナーゼのインヒビター、軟骨異化を阻害する細胞接着分子、軟骨異化を阻害する抗走化性剤、軟骨異化を阻害する細胞内シグナル伝達インヒビター、軟骨異化を阻害する細胞内プロテインチロシンホスファターゼのモジュレーター、ならびに軟骨異化を阻害するＳＨ２ドメインのインヒビターからなる群より選択される軟骨異化のインヒビターであり、ここで該細胞接着分子は、インテグリンアゴニストおよびインテグリンアンタゴニストを含み、該細胞内シグナル伝達インヒビターは、プロテインキナーゼＣインヒビターおよびプロテインチロシンキナーゼインヒビターを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項２８】
前記軟骨異化のインヒビターが、軟骨異化を阻害するマトリックスメタロプロテイナーゼのインヒビター、軟骨異化を阻害する細胞接着分子、軟骨異化を阻害する抗走化性剤、軟骨異化を阻害する細胞内シグナル伝達インヒビター、軟骨異化を阻害する細胞内プロテインチロシンホスファターゼのモジュレーター、ならびに軟骨異化を阻害するＳＨ２ドメインのインヒビターからなる群より選択され、ここで該細胞接着分子は、インテグリンアゴニストおよびインテグリンアンタゴニストを含み、該細胞内シグナル伝達インヒビターは、プロテインキナーゼＣインヒビターおよびプロテインチロシンキナーゼインヒビターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記軟骨保護剤が、軟骨異化を阻害する可溶性レセプターを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項３０】
軟骨異化の前記インヒビターが、軟骨代謝を阻害する可溶性レセプターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記可溶性レセプターが、可溶性インターロイキン−１レセプターおよび可溶性腫瘍壊死因子レセプターからなる群より選択される、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記可溶性レセプターが、組み換え可溶性ヒトＩＬ−１レセプター、可溶性腫瘍壊死因子レセプターおよびキメラｒｈＴＮＦＲ：Ｆｃからなる群より選択される、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記溶液が、１以上の疼痛阻害剤または炎症阻害剤をさらに含む、請求項１または３に記載の方法。
【請求項３４】
前記疼痛阻害剤または炎症阻害剤が、セロトニンレセプターアンタゴニスト、セロトニンレセプターアゴニスト、ヒスタミンレセプターアンタゴニスト、ブラジキニンレセプターアンタゴニスト、カリクレインインヒビター、タキキニンレセプターアンタゴニスト、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）レセプターアンタゴニスト、インターロイキンレセプターアンタゴニスト、アラキドン酸代謝産物についての合成経路おいて活性な酵素のインヒビター、プロスタノイドレセプターアンタゴニスト、ロイコトリエンレセプターアンタゴニスト、オピオイドレセプターアゴニスト、プリノセプターアゴニストおよびアンタゴニスト、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）感受性カリウムチャネルオープナー、ならびにカルシウムチャネルアンタゴニストからなる群より選択される、請求項２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記溶液が、前記患者の関節に予防的に局所適用される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３６】
前記溶液の手術中の送達が、該溶液の手順前送達または手順後送達と共に手順内送達を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項３７】
前記溶液の手術中の送達が、該溶液の手順後送達と共に手順前送達を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項３８】
前記溶液の手術中の適用が、該溶液の手順前適用、手順内適用、および手順後適用を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項３９】
関節における軟骨分解の危険がある患者を確認し、続いて、前記溶液を該確認された患者の該関節に送達する工程をさらに包含する、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項４０】
前記溶液中の前記薬剤の各々が、前記創傷に局所送達される場合に該創傷において阻害効果または治療効果のレベルをもたらすのに十分で、かつ全身的に送達される場合に該創傷において同じレベルの阻害効果または治療効果を達成することを必要とされる血漿濃度より低い血漿濃度を生じる濃度または投薬量にて含まれる、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項４１】
軟骨分解の阻害の際に使用するための溶液であって、該溶液は、同化性軟骨保護剤である少なくとも１つの第１の軟骨保護剤および軟骨代謝のインヒビターである少なくとも１つの第２の軟骨保護剤を含み、ここで、各薬剤は、該溶液が、関節に局所的に送達される場合に、治療的に有効である投薬量または濃度にて該溶液中に含まれる、溶液。
【請求項４２】
軟骨分解を阻害する際に使用するための溶液であって、該溶液は、少なくとも１つの同化性軟骨保護剤および疼痛または炎症のインヒビターである少なくとも１つの異なる薬剤を含み、ここで、各薬剤は、該溶液が、関節に局所的に送達される場合に、治療有効量である投薬量または濃度にて該溶液中に含まれる、溶液。
【請求項４３】
前記同化性軟骨保護剤は、軟骨同化性プロセスを促進するインターロイキン（ＩＬ）アゴニスト、軟骨同化性プロセスを促進するトランスホーミング増殖因子βスーパーファミリーのメンバー、軟骨同化性プロセスを促進するインスリン様増殖因子ならびに軟骨同化性プロセスを促進する線維芽細胞増殖因子からなる群より選択され、ここで該トランスホーミング増殖因子βスーパーファミリーのメンバーは、ＴＧＦ−βアゴニストおよび骨形成タンパク質アゴニストを含む、請求項４１または４２に記載の溶液。
【請求項４４】
前記同化性軟骨保護剤は、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＩＧＦ−１、ｂＦＧＦならびに天然に存在する薬剤の生物学的特徴を維持するフラグメント、欠失体、付加体、アミノ酸置換体、変異体および改変体からなる群より選択される、請求項４３に記載の溶液。
【請求項４５】
前記軟骨異化のインヒビターが、軟骨異化を阻害するＩＬ−レセプターアンタゴニスト、軟骨異化を阻害するＴＮＦ−αレセプターアンタゴニスト、軟骨異化を阻害するシクロオキシゲナーゼ２特異的インヒビター、軟骨異化を阻害するＭＡＰキナーゼインヒビター、軟骨異化を阻害する一酸化窒素シンターゼインヒビター、および軟骨異化を阻害する核因子ｋＢインヒビターからなる群より選択される、請求項４１に記載の溶液。
【請求項４６】
前記軟骨異化のインヒビターが、軟骨異化を阻害するマトリックスメタロプロテイナーゼのインヒビター、軟骨異化を阻害する細胞接着分子、軟骨異化を阻害する抗走化性剤、軟骨異化を阻害する細胞内シグナル伝達インヒビター、軟骨異化を阻害する細胞内プロテインチロシンホスホターゼのモジュレーター、ならびに軟骨異化を阻害するＳＨ２ドメインのインヒビターからなる群より選択され、ここで該細胞接着分子は、インテグリンアゴニストおよびインテグリンアンタゴニストを含み、該細胞内シグナル伝達インヒビターは、プロテインキナーゼＣインヒビターおよびプロテインチロシンキナーゼインヒビターを含む、請求項４１に記載の溶液。
【請求項４７】
前記軟骨異化のインヒビターが、軟骨異化を阻害する可溶性レセプターを含む、請求項４１に記載の溶液。
【請求項４８】
前記可溶性レセプターが、可溶性インターロイキン−１レセプターおよび可溶性腫瘍壊死因子レセプターからなる群より選択される、請求項４７に記載の溶液。
【請求項４９】
前記可溶性レセプターが、組み換え可溶性ヒトＩＬ−１レセプター、可溶性腫瘍壊死因子レセプターおよびキメラｒｈＴＮＦＲ：Ｆｃからなる群より選択される、請求項４７に記載の溶液。
【請求項５０】
前記溶液が、１以上の疼痛阻害剤または炎症阻害剤をさらに含む、請求項４１に記載の溶液。
【請求項５１】
前記疼痛阻害剤または炎症阻害剤が、セロトニンレセプターアンタゴニスト、セロトニンレセプターアゴニスト、ヒスタミンレセプターアンタゴニスト、ブラジキニンレセプターアンタゴニスト、カリクレインインヒビター、タキキニンレセプターアンタゴニスト、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）レセプターアンタゴニスト、インターロイキンレセプターアンタゴニスト、アラキドン酸代謝産物についての合成経路おいて活性な酵素のインヒビター、プロスタノイドレセプターアンタゴニスト、ロイコトリエンレセプターアンタゴニスト、オピオイドレセプターアゴニスト、プリノセプターアゴニストおよびアンタゴニスト、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）感受性カリウムチャネルオープナー、ならびにカルシウムチャネルアンタゴニストからなる群より選択される、請求項４２または５０に記載の溶液。
【請求項５２】
前記溶液が、徐放性送達ビヒクルを含む、請求項４１または４２に記載の溶液。
【請求項５３】
前記徐放性ビヒクルが、ミクロ粒子、ミクロスフェア、ナノ粒子、タンパク質、リポソーム、炭水化物、合成有機化合物および無機化合物からなる群より選択される、請求項５２に記載の溶液。
【請求項５４】
前記溶液中の前記薬剤の各々が、前記創傷に局所送達される場合に該創傷において阻害効果または治療効果のレベルをもたらすのに十分で、かつ全身的に送達される場合に該創傷において同じレベルの阻害効果または治療効果を達成することを必要とされる血漿濃度より低い血漿濃度を生じる濃度または投薬量にて含まれる、請求項４１または４２に記載の溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療的溶液および治療的方法、特に抗炎症性、抗疼痛性、および抗軟骨分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）のための溶液および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節鏡検査法は、遠隔光源とビデオモニターとに連結されたカメラを、上を覆う皮膚と関節包における小さな切開口を通して解剖学的関節（例えば膝、肩など）に挿入する外科的手順である。同様な切開口を通して、外科用機器を関節内に配置し得、その使用は関節鏡による映像化によって誘導される。関節鏡施術者の技術が進歩したので、かつて「開放」外科的技術によって実施されていた多くの操作手順が、現在では関節鏡により達成され得る。このような手順には、例えば、膝の部分的半月板切除術および靭帯再構築、肩の肩峰形成術および回旋筋腱板壊死組織切除法ならびに肘の滑膜切除術がある。外科適応の拡大および小径関節鏡開発の結果、手首および足首の関節鏡も慣用的になった。
【０００３】
各関節鏡検査法すべてを通して、生理的灌注液（例えば、通常の生理食塩水または乳酸加リンゲル液）が継続的に関節に流され、関節包を拡張すると共に手術による屑を除去し、それによって明瞭な関節内の画像を与える。Ｍａｒｓｈａｌｌに対する米国特許第４，５０４，４９３号は、関節鏡検査法用の非伝導性かつ光学的に透明な灌注液のための、水中グリセリンの等モル溶液を開示している。従来の生理的灌注液は、鎮痛効果、抗炎症効果、および抗軟骨分解効果を与えない。
【０００４】
術後患者の疼痛および苦痛の軽減は、特に毎年実施される外来患者の手術数の増加に伴ない、臨床用医薬において特別な関心がもたれる分野である。最も広く使用される全身性薬剤であるシクロオキシゲナーゼインヒビター（例えばイブプロフェン）およびオピオイド（例えばモルヒネ、フェンタニール）は、胃腸管刺激／出血および呼吸抑制を含む顕著な副作用を有する。オピオイドに関連する悪心および嘔吐の高率発生は、術後期間において特に問題である。有害な副作用を回避しつつ術後の疼痛を処置することを目的とする治療剤は、これらの薬剤の分子標的が身体内に広く分布し、そして多様な生理的作用を媒介するので、容易に開発されない。疼痛および炎症ならび軟骨分解を阻害することが重要な臨床的必要性を有するにもかかわらず、全身性副作用を最少化させつつ有効投薬量で、疼痛、炎症、および軟骨分解のインヒビターを送達する方法は、開発されていない。一例として、治療用量のアヘン剤の従来の（すなわち、静脈内、経口、皮下または筋肉内）投与方法は、重篤な呼吸抑制、気分の変化および意識混濁、強い悪心および嘔吐を含む顕著に有害な副作用をしばしば付随する。
【０００５】
先行技術研究は、セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン、本明細書中では時折「５−ＨＴ」という）、ブラジキニンおよびヒスタミンのような内因性因子が疼痛および炎症を生じさせる能力を示した。Ｓｉｃｕｔｅｒｉ，Ｆ．ら，Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ−Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｐａｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ Ｍａｎ，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．４，３０９−３１６頁（１９６５）；Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ｓ．Ｒ．，Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ａｓ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｄｉａｔｏｒ ｆｏｒ Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｐａｉｎ，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔ．６９，９８−１０５頁（１９７７）；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｂ．Ｐ．ら，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ Ｍ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｕｂｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｂｙ ａ Ｎｅｗ Ｃｌａｓｓ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ，Ｎａｔｕｒｅ ３１６，１２６−１３１頁（１９８５）；Ｗｈａｌｌｅｙ，Ｅ．Ｔ．ら，Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｋｉｎｉｎ Ａｇｏｎｉｓｔｓ ａｎｄ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ，Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂ Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３６，６５２−５７頁（１９８７）；Ｌａｎｇ，Ｅ．ら，Ｃｈｅｍｏ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｆｉｎｅ Ａｆｆｅｒｅｎｔｓ ｆｒｏｍ Ｒａｔ Ｓｋｉｎ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．６３，８８７−９０１頁（１９９０）。
【０００６】
例えば、ヒトの水疱基底（露出皮膚（ｄｅｎｕｄｅｄ ｓｋｉｎ））に適用した５−ＨＴは、５−ＨＴ3レセプターアンタゴニストにより阻害されうる疼痛を引き起こすことが実証された。Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら，（１９８５）。同様に、末梢的に適用したブラジキニンは、ブラジキニンレセプターアンタゴニストでブロックしうる疼痛を生ずる。Ｓｉｃｕｔｅｒｉら，１９６５；Ｗｈａｌｌｅｙら，１９８７；Ｄｒａｙ，Ａ．ら，Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ ａｎｄ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｐａｉｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６，９９−１０４頁（１９９３）。末梢に適用されたヒスタミンは、血管拡張、かゆみ、および疼痛を生じさせ、これらは、ヒスタミンレセプターアンタゴニストによって阻害され得る。Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，１９７７；Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｗ．Ｗ．，「Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ａｎｄ ５−Ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔａｍｉｎｅ（Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ）ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ」、Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｌ．Ｓ．ら編，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，６０５−６３８頁（１９８５）；Ｒｕｍｏｒｅ，Ｍ．Ｍ．ら，Ａｎａｌｇｅｓｉｃ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ａｎｔｉｈｉｓｔａｍｉｎｉｃｓ，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ３６，４０３−４１６頁（１９８５）。一緒に適用したこれら３種のアゴニスト（５−ＨＴ、ブラジキニンおよびヒスタミン）の組み合わせは、相乗的疼痛発生作用を示し、長期の強い疼痛シグナルを生ずることが示された。Ｓｉｃｕｔｅｒｉら，１９６５；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら，１９８５；Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｗ．ら，「Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ａｆｆｅｒｅｎｔ Ｎｅｒｖｅ Ｅｎｄｉｎｇｓ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ｂｙ ａ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ａｎｄ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ」，Ｅｘｐ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．９１：４６７−４７６（１９９２）。
【０００７】
身体中では、５−ＨＴは血小板および中枢神経中に存在し、ヒスタミンは肥満細胞において見出され、そしてブラジキニンは、組織外傷、ｐＨ変化、および温度変化の間に大きな前駆体分子から産生される。５−ＨＴは組織傷害部位の血小板から大量に放出され得、産生中の血漿レベルは休止中レベルよりも２０倍高い（Ａｓｈｔｏｎ，Ｊ．Ｈ．ら，「Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ ａｓ ａ Ｍｅｄｉａｔｏｒ ｏｆ Ｃｙｃｌｉｃ Ｆｌｏｗ Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｓｔｅｎｏｓｅｄ Ｃａｎｉｎｅ Ｃｏｒｏｎａｒｙ Ａｒｔｅｒｉｅｓ」，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ７３：５７２−５７８（１９８６））ので、内因性５−ＨＴが術後疼痛、痛覚過敏および炎症の発生に役割を果たす可能性がある。事実、血小板の活性化は、インビトロで末梢侵害受容器を興奮させることが示された。Ｒｉｎｇｋａｍｐ，Ｍ．ら，「Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ｉｎ Ｐｌａｓｍａ Ｅｘｃｉｔｅ Ｎｏｃｉｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ Ｒａｔ Ｓｋｉｎ，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ」，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．１７０：１０３−１０６（１９９４）。同様に、ヒスタミンおよびブラジキニンも外傷の間に組織中に放出される。Ｋｉｍｕｒａ，Ｅ．ら，「Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ Ｌｅｖｅｌ ｉｎ Ｃｏｒｏｎａｒｙ Ｓｉｎｕｓ Ｂｌｏｏｄ Ａｆｔｅｒ ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ｏｆ ａ Ｃｏｒｏｎａｒｙ Ａｒｔｅｒｙ」，Ａｍ Ｈｅａｒｔ Ｊ．８５：６３５−６４７（１９７３）；Ｄｏｕｇｌａｓ，１９８５；Ｄｒａｙら（１９９３）。
【０００８】
さらに、プロスタグランジン類はまた、疼痛および炎症を起こすことが公知である。シクロオキゲナーゼインヒビター、例えばイブプロフェンは、プロスタグランジン産生を阻害し、それによりプロスタグランジン媒介疼痛および炎症を減少させるために、非外科手術環境および術後環境において通常使用されている。Ｆｌｏｗｅｒ，Ｒ．Ｊ．ら，Ａｎａｌｇｅｓｉｃ−Ａｎｔｉｐｙｒｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ａｇｅｎｔｓ；Ｄｒｕｇｓ Ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｏｕｔ，Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｌ．Ｓ．ら編，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，６７４−７１５頁（１９８５）。シクロオキシゲナーゼインヒビターは、従来の方法で適用すると、いくつかの有害な全身性副作用を付随する。例えば、インドメタシンまたはケテロラックは、よく認識された胃腸管および腎性有害副作用を有する。
【０００９】
考察されたように、５−ＨＴ、ヒスタミン、ブラジキニンおよびプロスタグランジン類は、疼痛と炎症を起こす。これらの薬剤が末梢組織にその作用を伝達する種々のレセプターは、過去２０年間に知られてきており、そして／または検討されてきた。多くの研究は、ラットまたは他の動物モデルで実施された。しかし、ヒトと動物種との間には薬理およびレセプター配列に相違がある。
【００１０】
さらに、これらのメディエーターのアンタゴニストは、現在、術後疼痛の処置に使用されていない。アミトリプチリンを含む、５−ＨＴおよびノルエピネフリン取り込みアンタゴニストと称される薬物のクラスが経口的に使用され、慢性疼痛状態において一応の成果をあげた。しかし、慢性 対 急性の疼痛状態の機構はかなり異なると考えられる。事実、アミトリプチリンを手術時に使用する急性疼痛環境の２種の研究は、アミトリプチリンの疼痛軽減作用を全く示さなかった。Ｌｅｖｉｎｅ，Ｊ．Ｄ．ら，「Ｄｅｓｉｐｒａｍｉｎｅ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｏｐｉａｔｅ Ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ａｎａｌｇｅｓｉａ，Ｐａｉｎ ２７：４５−４９（１９８６）；Ｋｅｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｍ．ら，「Ｌｏｗ−Ｄｏｓｅ Ａｍｉｔｒｉｐｔｙｌｉｎｅ ａｓ ａｎ Ａｄｊｕｎｃｔ ｔｏ Ｏｐｉｏｉｄｓ ｆｏｒ Ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ Ｐａｉｎ：ａ Ｐｌａｃｅｂｏ−Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｔｒｉａｌ Ｐｅｒｉｏｄ」，Ｐａｉｎ ５２：３２５−３０（１９９３）。双方の研究において、薬物は経口投与された。第２の研究は、経口のアミトリプチリンが実際に術後患者の総安寧感覚（ｏｖｅｒａｌｌ ｓｅｎｓｅ ｏｆ ｗｅｌｌ ｂｅｉｎｇ）を低くし、これが脳の多重アミンレセプターに対するその薬剤の親和性に起因し得ることに注目した。
【００１１】
アミトリプチリンは、５−ＨＴおよびノルエピネフリンの取り込みのブロックに加えて、強力な５−ＨＴレセプターアンタゴニストである。従って、上述の研究における術後疼痛軽減効果の欠如は、急性疼痛における内因性５−ＨＴの役割に関する提案に矛盾するように見える。これらの２種の研究においてアミトリプチリンで見出された急性疼痛軽減の欠如には数多くの理由が存在する。（１）第１の研究（Ｌｅｖｉｎｅら、１９８６年）は、アミトリプチリンを術前１週間から手術前夜まで手術前に使用し、一方、第２の研究（Ｋｅｒｒｉｃｋら、１９９３年）は、アミトリプチリンを術後にのみ使用した。したがって、実際の組織傷害相の間および５−ＨＴの放出が意図される時点に、手術部位の組織に存在したアミトリプチリンのレベルは未知である。（２）アミトリプチリンは、肝臓で大規模に代謝されることが知られている。第２の研究において、経口投与では、手術部位の組織におけるアミトリプチリンの濃度が、術後放出５−ＨＴの活性を阻害するに十分なほど長い期間にわたり、十分に高くなかった可能性がある。（３）多重の炎症のメディエーターが存在するので、研究は、炎症のメディエーター間の相乗作用を示し、一つの薬剤（５−ＨＴ）のみのブロックでは組織傷害に対する炎症応答を十分阻害しない可能性がある。
【００１２】
ヒスタミン1（Ｈ1）レセプターアンタゴニストの著しい高濃度（１％〜３％溶液、すなわち１ｍｌ当たり１０〜３０ｍｇ）が外科手順のための局所麻酔薬として作用する能力を示す研究が少数存在する。この麻酔効果は、Ｈ1レセプターによって媒介されるとは考えられず、むしろ（リドカインの作用と同様）神経膜のナトリウムチャネルとの非特異的相互作用によると考えられる。このヒスタミンレセプターアンタゴニストの高「麻酔」濃度に付随する副作用（例えば、鎮静）を考慮して、ヒスタミンレセプターアンタゴニストの局所投与は現在、手術時環境において使用されてない。
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、生理的電解質キャリア溶液中で疼痛、炎症、および軟骨分解のメディエーターを局所的に阻害することに関する、低濃度の複数薬剤混合物を構成する溶液を提供する。本発明はまた、これら薬物を含有する灌注液を手術部位に手術時に直接送達する方法を提供し、この方法では、この灌注液が、レセプターおよび酵素レベルで局所的に作用し、その部位において疼痛、炎症、軟骨分解を先制的に制限する。本発明の局所的手術時送達法により、他の送達法（すなわち、静脈内、筋内、皮下および経口）を採用したときの必要量よりも低い薬物用量により所望の治療効果が達成され得る。溶液中の抗疼痛および／または抗炎症薬、および／または抗軟骨分解薬は、下記分類クラスのレセプターアンタゴニスト、およびレセプターアゴニスト、ならびに酵素アクチベーターおよびインヒビターから選ばれた薬剤を含有し、各クラスは異なった分子的作用機構により疼痛および／または炎症阻害および／または軟骨分解に作用する。疼痛および／または炎症の阻害のための代表的薬剤としては、例えば、以下が挙げられる：（１）セロトニンレセプターアンタゴニスト；（２）セロトニンレセプターアゴニスト；（３）ヒスタミンレセプターアンタゴニスト；（４）ブラジキニンレセプターアンタゴニスト；（５）カリクレインインヒビター；（６）ニューロキニン1およびニューロキニン2レセプターサブタイプアンタゴニストを含む、タチキニンレセプターアンタゴニスト；（７）カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）レセプターアンタゴニスト；（８）インターロイキンレセプターアンタゴニスト；（９）（ａ）ＰＬＡ2イソ型インヒビターおよびＰＬＣイソ型インヒビターを含む、ホスホリパーゼインヒビター、（ｂ）シクロオキシゲナーゼインヒビター、および（ｃ）リポオキシゲナーゼインヒビターを含む、アラキドン酸代謝物合成経路で活性を示す酵素のインヒビター；（１０）エイコサノイドＥＰ−１およびＥＰ−４レセプターサブタイプアンタゴニストならびにトロンボキサンレセプターサブタイプアンタゴニストを含む、プロスタノイドレセプターアンタゴニスト；（１１）ロイコトリエンＢ4レセプターサブタイプアンタゴニストおよびロイコトリエンＤ4レセプターサブタイプアンタゴニストを含む、ロイコトリエンレセプターアンタゴニスト；（１２）μ−オピオイド、δ−オピオイドおよびκ−オピオイドレセプターサブタイプアゴニストを含む、オピオイドレセプターアゴニスト；（１３）Ｐ2xレセプターアンタゴニストおよびＰ2Yレセプターアゴニストを含む、プリン受容体アンタゴニスト；および（１４）カルシウムチャネルアンタゴニスト。上記各薬剤は、それぞれ抗炎症薬および／または抗侵害受容薬（すなわち、抗疼痛または鎮痛薬）のいずれかとして機能する。これらの化合物クラスからの薬剤の選択は具体的用途に応じて調整される。軟骨分解の阻害のための代表的な薬剤としては、例えば、以下が挙げられる：（１）インターロイキン−１ファミリーのタンパク質に対するレセプターのアンタゴニスト（例えば、ＩＬ−１β、ＩＬ−１７、およびＩＬ−１８を含む）；（２）腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプターファミリーのアンタゴニスト（例えば、ＴＮＦ−Ｒ１を含む）；（３）���ンターロイキン４、１０、および１３レセプターのアゴニスト；（４）ＴＧＦ−βレセプタースーパーファミリーのアゴニスト（例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、およびＢＭＰ−７を含む）；（５）ＣＯＸ−２のインヒビター；（６）ＭＡＰキナーゼファミリーのインヒビター（例えば、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼを含む）；（７）基質金属結合タンパク質（ＭＭＰ）ファミリーのタンパク質のインヒビター（例えば、ＭＭＰ−３およびＭＭＰ−９を含む）；（８）ＮＦ−κＢファミリーのタンパク質のインヒビター（例えば、ＩκＢとのｐ５０／ｐ６５ダイマー複合体を含む）；（９）一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）ファミリーのインヒビター（例えば、ｉＮＯＳを含む）；（１０）インテグリンレセプターのアゴニストおよびアンタゴニスト（例えば、αVβ3インテグリンのアゴニストを含む）；（１１）プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）ファミリーのインヒビター；（１２）タンパク質チロシンキナーゼファミリーのインヒビター（例えば、ｓｒｃサブファミリーを含む）；（１３）プロテインチロシンホスファターゼ調節因子；および（１４）タンパク質ｓｒｃホモロジー２（ＳＨ２）ドメインのインヒビター。
【００１４】
本発明のさらに他の局面では、１以上の代謝的に活性な軟骨防御（ｃｈｏｎｄｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）薬剤を、先に記載されたような、疼痛、炎症などの阻害のための１以上の薬剤と共に含む組成物、あるいは、薬学的に有効なキャリア中にある関節内送達のための２以上の代謝的に活性な軟骨防御薬剤の組合せを含む薬学的組成物を、患者の関節に直接投与することによって、関節内の関節軟骨の分解を減少または予防するための、方法および溶液が提供される。代謝的に活性な薬剤としては、細胞の生物学的状態、生化学的状態、または生物物理学的状態を調節または変更するように、直接的または間接的に作用する化合物（原形質膜の電位、細胞性レセプターのリガンド結合もしくは酵素活性、細胞内もしくは細胞外に位置付けられた酵素、タンパク質−タンパク質相互作用、ＲＮＡ−タンパク質相互作用、またはＤＮＡ−タンパク質相互作用を変更する薬剤を含む）が挙げられるが、これに限定されない。本発明の１つの局面では、異なる分子標的に対して同時に作用する少なくとも２つの薬剤の組合せに基づいた、代謝的に活性な軟骨防御薬剤の薬学的組成物が提供される。代表的な実施形態では、少なくとも１つの薬剤は、抗炎症活性を直接与え、および／または軟骨同化（ａｎａｂｏｌｉｃ）プロセスを促進する、サイトカインまたは増殖因子レセプターアゴニストであり、そして少なくとも第２の薬剤は、炎症促進（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）プロセスおよび／または軟骨異化プロセスを阻害するように作用する、レセプターアンタゴニストまたは酵素インヒビターである。抗炎症／同化性サイトカイン（これは、関節内において炎症促進サイトカインの役割を抑制するように機能的に作用する）は、軟骨基質合成を促進し、そして基質分解を阻害する。これらのレセプターアゴニストとしては、例えば、特異的抗炎症性および同化性サイトカイン（例えば、インターロイキン（ＩＬ）アゴニスト（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３））ならびにトランスホーミング増殖因子−βスーパーファミリーの特定のメンバー（例えば、ＴＧＦβおよびＢＭＰ−７）、インスリン様増殖因子（例えば、ＩＧＦ−１）、および線維芽細胞増殖因子（例えば、ｂＦＧＦ）が挙げられる。少なくとも第２の薬剤は、炎症促進分子標的の活性または発現を阻害し、そして減少させるように作用する、レセプターアンタゴニストまたは酵素インヒビターのクラスから得られる（例えば、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、ＴＮＦ−αレセプターアンタゴニスト、シクロオキシゲナーゼ−２インヒビター、ＭＡＰキナーゼインヒビター、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）インヒビター、および核因子κＢ（ＮＦκＢ）インヒビター）。同化薬剤（ａｎａｂｏｌｉｃ ａｇｅｎｔ）および異化のインヒビターの複数薬剤組合物は、関節内注射によって、または注入を介して、局所的に送達され得、これは、外科手術の関節鏡検手順の間に手順時（ｐｅｒｉｐｒｏｃｅｄｕｒａｌｌｙ）（すなわち、術前および／または手術時および／または術後）投与を含む。
【００１５】
関節軟骨は、代謝的に活性な関節軟骨細胞によって生成され、そして維持される特定の細胞外基質である。正常で健康な細胞外基質の維持は、基質成分の生合成速度と取り込み速度との間、およびその分解速度と、その後の軟骨から滑液中への損失速度との間の動力学的平衡を反映する。基質ホメオスタシスの根底をなす調節機構は十分に理解されていないが、これらは明らかに、炎症性関節疾患において、そして関節外傷に応答して変更され、その結果、基質分解速度が、基質成分の新規合成速度を超える。基質ホメオスタシスは、一般的に、異化サイトカインの影響と同化性サイトカイン（増殖因子を含む）の影響との間の動力学的平衡を表すとみなされている。軟骨防御に有用な治療用薬剤の最適な組合せは、合成速度を加速させること、そして同時に、分解速度を抑制すること、このようにして、同化性プロセスを最大化し、そして修復を促進することを通して、動力学的基質平衡をシフトさせる。
【００１６】
異化サイトカイン（例えば、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−α）は、軟骨細胞上の特定のレセプターで作用して、基質分解を誘導するＭＭＰの生成を誘導するが、この分解は、同化性サイトカイン（例えば、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ−２、およびＩＧＦ−１）によって阻害される。従って、異化プロセスの阻害のみに基づく治療的アプローチ（例えば、ＭＭＰインヒビターとＩＬ−１アンタゴニストとの組合せ）は、軟骨修復のために最適ではない。なぜなら、基質生成のための成分の生合成およびアセンブリを誘導または加速するために、同化性薬剤が必要とされるからである。第２に、軟骨基質破壊に寄与する複数の同化性サイトカイン（ＩＬ−１、ＴＮＦ、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＬＩＦ）は、これが、すべての異化サイトカイン活性をブロックするために実用的ではないことを示す。逆に、同化性薬剤（例えば、ＩＧＦ−１、ＢＭＰ−２、またはＢＭＰ−７）の使用のみに基づくアプローチは、最適ではない。なぜなら、これが、異化サイトカインの数を調節する役割を扱わないからである。ＴＧＦ−β、ＢＭＰ−２、およびＩＧＦ−１はまた、特定のレセプターで作用して、軟骨細胞を誘導し、基質成分を生成する。これは、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７およびＬＩＦによって阻害される。従って、軟骨防御のための最適な治療的組合せは、少なくとも１つの同化性薬剤と１つの軟骨異化のインヒビターとから構成される。
【００１７】
本発明はまた、関節鏡手術手順中に手術部位、代表的には患者の関節部位に、連続的に灌注するのに用いる希釈灌注液として配合された医薬品を製造する方法をも提供する。この方法で必然的に伴うのは生理的電解質キャリア液に少なくとも１つの抗軟骨分解剤および好ましくは１以上の抗疼痛／抗炎症剤を溶解し、また、いくつかの適用においては抗軟骨分解剤を溶解し、各薬剤は、好ましくは約１００，０００ナノモル濃度を超えない濃度、より好ましくは約２５，０００ナノモル濃度を超えない濃度、そして最も好ましくは、約１０，０００ナノモル濃度を超えない濃度で含有される。
【００１８】
本発明の方法は疼痛、炎症、軟骨分解の阻害のために、多種のレセプターアンタゴニストおよびアゴニストならびに酵素インヒビターおよびアクチベーターの希釈物の組合せを、治療もしくは診断手順中、創傷または手術部位に直接送達する手段を提供する。溶液中の活性成分は局所的に直接手術組織に連続的な態様で供給されるので、その薬物は、経口、筋肉内、皮下あるいは静脈内に同一薬物を送達した際の治療効果に必要な用量に比べ、非常に低用量で効率的に使用することができる。ここで用いる用語「局所」は創傷もしくは他の手術部位の内部または周囲への薬物の適応を包含し、経口、皮下、静脈内および筋肉内投与は含まない。ここで用いる用語「連続」は中断のない適用、時々中断するが繰り返し実施する適用、および中断することはないが例外的に一時的停止をする適用、例えば、他の薬物または薬剤または処置上の器具を導入するのに必要な停止を包含し、それによって実質的に一定所定量の濃度を創傷もしくは手術部位に局所的に維持する。
【００１９】
薬剤を低用量で適用する利点は三重である。最も重要なことは、これら薬剤の有用性をしばしば制限する全身性の副作用がないということである。加えて、本発明溶液において特別に適用するために選択した薬剤が、それらが作用するメディエーターおよび媒介標的に関して高い特異性を有することである。この特異性は低用量を利用したことにより維持される。最後に、これら活性薬物の手術当たりの経費は低い。
【００２０】
薬剤を灌注または他の流体物適応により局所投与することには以下のような利点がある：（１）局所投与は、患者間で代謝、血流などにばらつきがあるにもかかわらず標的部位での既知濃度を保証する；（２）直接送達法であるので、治療濃度が即座に入手可能であり、用量制御を改善したものとすることができる；そして（３）創傷もしくは手術部位に直接活性薬剤を局所投与することは、また実質的に、さもなくば、例えば、薬剤を経口、静脈内、皮下または筋肉内投与した場合に起こる一次および二次経路代謝での薬剤の分解を全身性のプロセスを通じて減少させる。このことは、急速に代謝されるペプチドなどの活性薬剤で特に当てはまる。このように局所投与は他の方法では治療に採用できないような化合物または薬剤の使用を可能とする。例えば、以下のクラスのいくつかの薬剤はペプチド性である：ブラジキニンレセプターアンタゴニスト；タキキニンレセプターアンタゴニスト；オピオイドレセプターアゴニスト；ＣＧＲＰレセプターアンタゴニスト；およびインターロイキンレセプターアンタゴニスト、ＴＮＦ−レセプターアンタゴニスト；ＴＧＦ−βレセプターアゴニスト；ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−７レセプターアゴニスト；ＩＬ４、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３レセプターアゴニスト；ならびにインテグリンレセプターアゴニストおよびアンタゴニスト。創傷もしくは手術部位に局所的連続送達することは薬剤の分解または代謝を最少化するばかりでなく、レセプター占拠または酵素飽和を維持するのに十分な局所での治療濃度が手術手順の間中維持されることを保証するために、分解可能性のある薬剤の部分を連続的に置換するものともなる。
【００２１】
本発明に従って手術時の外科手順中を通して、この溶液を局所投与すると、先制的鎮痛効果、抗炎症効果、軟骨防御効果を生ずる。本明細書中で使用される場合、用語「手術時」とは手順内での、処置前および処置内での、処置内および処置後、ならびに処置前、処置内および処置後の適用を包含する。先制的抗炎症、鎮痛（特定の適応において）、抗軟骨防御（特定の適応において）効果を最大とするために、本発明の溶液を、最も好ましくは処置前、処置内および処置後に適用する。有意な手術的外傷を局所的に加えるに先立って、標的レセプターを占拠することにより、あるいは標的酵素を不活性化もしくは活性化することにより、本発明の薬剤は標的の病理学的プロセスを先制的に阻害するために特別な経路を調整する。炎症のメディエーターとプロセスが、それらが組織障害を起こし得る前に本発明により先制的に抑制される場合、その利益は障害が起こってから投与されるよりもより価値の高いものとなる。
【００２２】
本発明の多重薬剤溶液を適用することによる一種より多い疼痛、炎症、軟骨分解メディエーターの阻害は、炎症および疼痛の程度を劇的に減少することが示され、さらに理論的には軟骨防御効果を与える。本発明の灌注用溶液は、各溶液が多数のレセプターまたは酵素に対して作用する薬剤の組み合わせを含有する。従って、薬剤類は、疼痛および炎症、軟骨ホメオスタシスの損失を含む病理学的プロセスの組み合わせに対して同時に有効である。このような薬剤の作用は、本発明の多数のレセプターアンタゴニストおよび阻害性アゴニストが、個々の薬剤の効果に対比して、組み合わせが不均衡に増加した効果をもたらす点で、相乗的と考えられている。本発明の数種の薬剤の相乗作用は、以下に示すこれらの薬剤の詳細な説明中で実施例として検討されている。
【００２３】
手術中に使用すると、この溶液は現在使用されている灌注液に較べて臨床的に顕著な手術部位疼痛および炎症、ならびに軟骨分解の減少をもたらし、それにより患者の術後鎮痛薬（すなわちアヘン剤）の必要性を減少し、適当な場合には、患者の手術部位の早期の可動化を可能にする。外科医および手術室要員の側には、本発明の溶液を使用するために、従来の灌注液に比較して余分な努力を全く必要としない。最適な軟骨防御のためには、本発明の溶液を、外科手順の前、外科手順の間、および／または外科手順の後に関節内に直接投与する。
【００２４】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明の灌注および注射用溶液は、生理学的キャリア中に１つ以上の軟骨保護剤、ならびに、必要に応じて、１つ以上の疼痛および／または炎症インヒビターの希釈液である。キャリアは溶液であって、ここで本明細書中で使用される場合、生適合性溶媒、懸濁液、重合性および非重合性ゲル、ペーストおよび軟膏、ならびに持続性放出送達系の成分（例えば、微粒子、ミクロスフェア、またはタンパク質、リポソーム、糖質、合成有機化合物、もしくは無機化合物から構成されるナノ粒子）、を包含ことが意図される。好ましくは、キャリアとしては正常食塩溶液または乳酸化リンガー溶液などの生理的電解質を含んでもよい水溶液である。
【００２５】
抗炎症および／または抗疼痛薬は、（１）セロトニンレセプターアンタゴニスト；（２）セロトニンレセプターアゴニスト；（３）ヒスタミンレセプターアンタゴニスト；（４）ブラジキニンレセプターアンタゴニスト；（５）カリクレインインヒビター；（６）ニューロキニン1およびニューロキニン2レセプターサブタイプアンタゴニストを含むタチキニンレセプターアンタゴニスト；（７）カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）レセプターアンタゴニスト；（８）インターロイキンレセプターアンタゴニスト；（９）（ａ）ＰＬＡ2イソ型インヒビターおよびＰＬＣイソ型インヒビターを含むホスホリパーゼインヒビター、（ｂ）シクロオキシゲナーゼインヒビター、および（ｃ）リポオキシゲナーゼインヒビターを含むアラキドン酸代謝物合成経路で活性な酵素のインヒビター；（１０）エイコサノイドＥＰ−１およびＥＰ−４レセプターサブタイプアンタゴニストならびにトロンボキサンレセプターサブタイプアンタゴニストを含むプロスタノイドレセプターアンタゴニスト；（１１）ロイコトリエンＢ４レセプターサブタイプアンタゴニストおよびロイコトリエンＤ4レセプターサブタイプアンタゴニストを含むロイコトリエンレセプターアンタゴニスト；（１２）μオピオイド、δオピオイドおよびκオピオイドレセプターサブタイプアゴニストを含むオピオイドレセプターアゴニスト；（１３）Ｐ2xレセプターアンタゴニストおよびＰ2Yレセプターアゴニストを含むプリノセプターアゴニストおよびアンタゴニスト；ならびに（１４）カルシウムチャネル拮抗剤からなる群から選ばれる。
【００２６】
適切な関節保護剤としては、例えば、以下が挙げられる：（１）例えば、ＩＬ−１β、ＩＬ−１７およびＩＬ−１８を含む、タンパク質のインターロイキン１ファミリーについてのレセプターのアンタゴニスト；（２）例えば、ＴＮＦ−Ｒ１を含む、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプターファミリーのアンタゴニスト；（３）インターロイキン４レセプター、インターロイキン１０レセプターおよびインターロイキン１３レセプターについてのアゴニスト；（４）例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４およびＢＭＰ−７を含む、ＴＧＦ−βレセプタースーパーファミリーについてのアゴニスト；（５）ＣＯＸ−２のインヒビター；（６）例えば、ｐ３８ＭＡＰキナーゼを含む、ＭＡＰキナーゼファミリーのインヒビター；（７）例えば、ＭＭＰ−３およびＭＭＰ−９を含む、マトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）ファミリーのタンパク質のインヒビター；（８）例えば、ＩκＢとのｐ５０／ｐ６５複合体を含む、ＮＦ−κＢファミリーのタンパク質のインヒビター；（９）例えば、ｉＮＯＳを含む、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）ファミリーのインヒビター；（１０）例えば、αvβ3インテグリンのアゴニストを含む、インテグリンレセプターのアゴニストおよびアンタゴニスト；（１１）タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）ファミリーのインヒビター；（１２）例えば、ｓｒｃサブファミリーを含む、タンパク質チロシンホスファターゼファミリーのインヒビター；（１３）タンパク質チロシンキナーゼのモジュレーター；および（１４）タンパク質ｓｒｃ相同性２（ＳＨ２）ドメインのインヒビター。
【００２７】
関節保護および関節鏡検査手順における使用のための本発明の溶液の特に好ましい実施形態としては、好ましくは、個別の分子標的に同時に作用して、関節同化作用を促進し、そして無関係のまたは過剰な関節異化プロセスを阻害して、炎症プロセスの最大限の阻害を達成し、そして関節の恒常性を維持し、これにより関節内の関節保護効果を達成する、薬剤の組合せが挙げられる。
【００２８】
本発明の外科用溶液のそれぞれにおいては、薬物が、液体または体液の溶液中に低濃度で含有されており、そして所望の治療効果を達成するのに従来の薬物投与法で必要とされる濃度および用量に比べ低い用量で局所的に送達される。本明細書中で用いられる場合、「液体」または「体液」は、薬学的に受容可能な生体適合性溶媒、懸濁液、重合性ゲルおよび非重合性ゲル、ペーストおよび軟膏を含むことが意図される。好ましくは、キャリアは、正常食塩溶液または乳酸化リンガー溶液のような物理的な電解質を含み得る水溶液である。薬物投与の他の経路（すなわち、静脈内、皮下、筋肉内または経口）介して同じ用量の薬物を送達しても、等価な治療効果を得るのは不可能または非実用的である。なぜならば、全身系的に与えられる薬物は一次および二次経路代謝をうけるからである。各薬剤の濃度はそのレセプター解離定数Ｋdまたは酵素阻害定数Ｋiに一部基づき決定される。本明細書中で使用されるように、解離定数という用語は、それぞれのアゴニストレセプターまたはアンタゴニストレセプター相互作用に対する平衡解離定数、およびそれぞれの活性剤−酵素またはインヒビター−酵素相互作用に対する平衡抑制定数両方を包含することを意図される。各薬剤は、好ましくは０．１〜１０，０００倍のＫdまたはＫiの低濃度で含有されている；但し、シクロオキシゲナーゼインヒビターは例外であって、このものは選択した特定のインヒビターに依存して高濃度を要することがある。好ましくは、各薬物は１．０〜１，０００倍のＫdまたはＫiの濃度で含有され、より好ましくは約１００倍のＫｄまたはＫiである。これらの濃度は必要により調整され、局所送達部位において代謝転換が起こらないように希釈するようにする。この溶液用に選択した的確な薬剤および薬剤濃度は後記するように特定の適用に応じて変更する。
【００２９】
本発明に従う溶液は、単一もしくは複数の疼痛および／または炎症抑制剤、複数の軟骨保護剤（これらの少なくとも１つは、同化性（ａｎａｂｏｌｉｃ）関節保護剤であり、そしてこれらの少なくとも１つは、関節異化のインヒビターである）、あるいは関節保護剤と疼痛および／または炎症抑制剤の両方の組合せを、低濃度で含有し得る。しかし、前記した多重薬剤の相乗作用ならびに広範囲に疼痛および炎症、ならびに関節破壊を遮断する目的のため、多重薬剤を使用するのが好ましい。
【００３０】
この外科用溶液は、明確なレセプターおよび／または酵素分子標的に作用する多重薬理作用剤を組み合わせることにより新規な治療的アプローチを構成するものである。今日まで、薬理学的な方策は、個々のシグナルを送る神経伝達物質およびホルモンに対する応答を媒介する個々のレセプターサブタイプおよび酵素イソ型に対して選択的な高特異性薬物の開発に、焦点を合わせてきた。さらに、単一のレセプターサブタイプまたは酵素の不活化にもかかわらず、他のレセプターサブタイプまたは酵素の活性化およびそれによって生ずるシグナルの伝達がしばしばカスケード効果の引き金になり得る。このことは、多重シグナル伝達物質（例えば、サイトカイン、増殖（成長）因子、またはエイコサノイド）が役割を演ずる病理学的過程の遮断に対する単一レセプター特異性薬物の使用に大きな困難が存在することの説明になる。それ故、特異的な個々のレセプターサブタイプまたはイソ型のみを標的とすることは、効果的でないようである。
【００３１】
薬理学的治療の標準的アプローチと異なり、本発明の外科用溶液の治療的アプローチは、明確な分子標的に同時に作用する薬物の組み合わせが、病理学的状態の発展の裏にある事象の全スペクトルを阻害するのに非常に効果的であるとの論拠に基づく。さらに、特異的レセプターサブタイプのみを標的とする代わりに、この外科用溶液は、疼痛、炎症、および軟骨破壊の発症に関係する異なった細胞生理学的過程で機能する共通の分子機構を標的とする薬物から構成されている（図１を参照のこと）。この方法で、侵害受容、炎症、および軟骨破壊経路における追加のレセプターおよび酵素によるカスケーディングがこの外科用溶液によって最小化される。これらの病理学的過程で、この外科用溶液は「上流」および「下流」の両方でカスケード効果を阻害する。
【００３２】
「上流」阻害の例は、疼痛および炎症環境におけるシクロオキシゲナーゼアンタゴニストである。シクロオキシゲナーゼ酵素（ＣＯＸ1およびＣＯＸ2）は、プロスタグランジン、ロイコトリエン、およびトロンボキサンを含む炎症および侵害受容メディエーターの生合成の中間体であるプロスタグランジンＨへのアラキドン酸の変換を触媒する。シクロオキシゲナーゼインヒビターは、これらの炎症および侵害受容メディエーターの生成の「上流」を遮断する。この方策は、７種のプロスタノイドレセプターの記載されるサブタイプとＣＯＸ生合成経路のｐロスタノイド産物との相互作用を遮断する必要性を排除する。この外科用溶液に含まれる同様な「上流」インヒビターは、カリクレインインヒビターであるアプロチニンである。セリンプロテアーゼである酵素カリクレインは、血漿中の高分子量キニノーゲンを切断して疼痛および炎症の重要なメディエーターであるブラジキニンを生成する。カリクレインを阻害することにより、アプロチニンは効果的にブラジキニンの合成を阻害し、それによりこれらの炎症のメディエーターの効果的な「上流」阻害をもたらす。
【００３３】
この外科用溶液はまた、病態生理学的経路の制御に「下流」インヒビターを利用する。進行性関節軟骨変性に関係する種々の炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１βおよびＴＮＦα）で処理した滑膜細胞および軟骨細胞の調製物において、ＭＡＰキナーゼインヒビターは、軟骨保護効果をもたらす。このｐ３８ＭＡＰキナーゼは、複数の異化サイトカインについてのシグナル伝達経路における運搬の分岐点であり、そしてその阻害は、軟骨変性を媒介する複数の細胞産物のアップレギュレーションを防ぐ。従って、このＭＡＰキナーゼインヒビターは、この外科用溶液に、移動軟骨恒常性を開始するサイトカインレセプターアゴニストの生理的組み合わせに無関係な「下流」軟骨保護作用をもたらすことにより、関節炎症環境において顕著な利益を与える。
【００３４】
以下は、上記抗炎症／抗疼痛剤および軟骨保護剤のクラスに含まれる適当な薬物、ならびに本発明の溶液に使用するのに適当な濃度の記載である。理論的に限定されることを望むわけではないが、薬剤を実施可能にすると思われる薬剤の種々のクラスの選択を支える理由も示す。
【００３５】
（Ｉ．疼痛および／または炎症の阻害）
（１．セロトニンレセプターアンタゴニスト）
セロトニン（５−ＨＴ）は、末梢における侵害受容ニューロン上のセロトニン2（５−ＨＴ2）および／またはセロトニン3（５−ＨＴ3）レセプターを刺激することにより疼痛を生ずると考えられる。多くの研究者は、末梢侵害受容器上の５−ＨＴ3レセプターが５−ＨＴにより生ずる疼痛の感覚を媒介することを承認している（リチャードソンら、１９８５年）。５−ＨＴ3レセプターアンタゴニストは、５−ＨＴ誘導疼痛の阻害に加えて、侵害受容器の活性化を阻害することにより、神経原性の炎症をも阻害し得る。ピー・ジェイ・バーンズら、神経原性炎症の変調：炎症性疾患に対する新しいアプローチ、トレンズ・イン・ファーマコロジカル・サイエンス、１１巻、１８５−１８９頁（１９９０年）。しかし、ラット足根関節における研究は、５−ＨＴによる侵害受容器の活性化に５−ＨＴ2レセプターが関係することを主張する。ビー・ディー・グラッブら、正常および炎症ラット足根関節に位置する求心性神経に付随する５−ＨＴレセプターの研究、エイジェンツ・アクションズ、２５巻、２１６−１８頁（１９８８年）。それ故、５−ＨＴ2レセプターの活性化はまた末梢の疼痛および神経原性炎症において役割を演ずる可能性がある。
【００３６】
本発明の溶液の一つの目的は、疼痛およびいろいろな炎症過程を遮断することである。すなわち、以下に述べるように、５−ＨＴ2および５−ＨＴ3レセプターアンタゴニストは共に、独立してまたは一緒に、本発明の溶液に適切に使用することができる。アミトリプチリン（エラビル、商標）は、本発明で使用するのに適した５−ＨＴ2レセプターアンタゴニストである。アミトリプチリンは、多年にわたり抗うつ薬として臨床的に使用され、ある種の慢性疼痛患者で有用な効果をもつことが見出されている。メトクロプラミド（レグラン、商標）は、鎮吐薬として臨床的に使用されているが、緩和な５−ＨＴ3レセプター親和性を示し、このレセプターに対する５−ＨＴの作用を阻害することができ、おそらく血小板からの５−ＨＴ放出による疼痛を阻害する。従って、これもまた本発明で使用するに適する。
【００３７】
その他の適当な５−ＨＴ2レセプターアンタゴニストには、イミプラミン、トラザドン、デシプラミンおよびケタンセリンが含まれる。ケタンセリンは、その抗高血圧作用により臨床的に使用されてきた。ティー・ヘンダーら、実験的および臨床的高血圧における新規セロトニンアンタゴニストケタンセリンの作用、アメリカン・ジャーナル・オブ・ハイパーテンション、３１７ｓ−２３ｓ頁（１９８８年７月）。その他の適当な５−ＨＴ3レセプターアンタゴニストには、シサプリドおよびオンダンセトロンが含まれる。適当なセロトニン1Bレセプターアンタゴニストには、ヨヒンビン、Ｎ−［メトキシ−３−（４−メチル−１−ピペランジニル）フェニル］−２’−メチル−４’−（５−メチル−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）［１，１−ビフェニル］−４−カルボキシアミド（「ＧＲ１２７９３５」）およびメチオテピンが含まれる。これらの薬物を本発明の溶液に使用するための治療用のおよび好ましい濃度を表１に示す。
【００３８】
【表１】
2007077165.tif 000003
（２．セロトニンレセプターアゴニスト）
５−ＨＴ1A、５−ＨＴ1Bおよび５−ＨＴ1Dレセプターが、アデニレートシクラーゼ活性を阻害することが知られている。それ故、溶液に低用量のこれらのセロトニン1A、セロトニン1Bおよびセロトニン1Dレセプターアゴニストを含有させると、疼痛および炎症を伝達するニューロンを阻害するはずである。セロトニン1Eおよびセロトニン1Fレセプターアゴニストについても、これらのレセプターもアデニレートシクラーゼを阻害するため、同じ作用が期待される。
【００３９】
ブスピロンは、本発明で使用するのに適した１Ａレセプターアゴニストである。スマトリプタンも、適当な１Ａ、１Ｂ、１Ｄおよび１Ｆレセプターアゴニストである。適当な１Ｂおよび１Ｄレセプターアゴニストは、ジヒドロエルゴタミンである。適当な１Ｅレセプターアゴニストは、エルゴノビンである。これらのレセプターアゴニストの治療用のおよび好ましい濃度を表２に示す。
【００４０】
【表２】
2007077165.tif 000004
（３．ヒスタミンレセプターアンタゴニスト）
一般にヒスタミンレセプターはヒスタミン1（Ｈ1）およびヒスタミン2（Ｈ2）サブタイプに分類される。ヒスタミンの末梢投与に対する古典的炎症応答は、Ｈ1レセプターにより伝達される。ダグラス、１９８５年。それ故、本発明の溶液は、ヒスタミンＨ1レセプターアンタゴニストを含有することが好ましい。プロメタジン（フェネルガン、商標）は、Ｈ1レセプターを強力に遮断する、広く使用される鎮吐薬であり、本発明で使用するに適したものである。面白いことに、この薬物はまた局所麻酔作用をも有することが示されたが、この作用に必要な濃度はＨ1レセプターの遮断に必要な濃度より数オーダー高く、従ってその作用は別の機構により生ずると考えられる。溶液中のヒスタミンレセプターアンタゴニストの濃度は、侵害受容器の活性化に関係するＨ1レセプターを阻害するに充分であるが、「局所麻酔」作用は達成せず、それにより全身的副作用の心配を除外する。
【００４１】
他の適当なＨ1レセプターアンタゴニストには、テルフェナジン、ジフェンヒドラミン、アミトリプチリン、メピラミンおよびトリポリジンが含まれる。アミトリプチリンはセロトニン2レセプターアンタゴニストとしても有効であるため、本発明で使用するとき２重の機能を有する。これらのＨ1レセプターアンタゴニストそれぞれの治療用のおよび好ましい濃度を表３に示す。
【００４２】
【表３】
2007077165.tif 000005
（４．ブラジキニンレセプターアンタゴニスト）
一般にブラジキニンレセプターはブラジキニン1（Ｂ1）およびブラジキニン2（Ｂ2）サブタイプに分類される。研究は、ブラジキニンによって生ずる急性の末梢の疼痛と炎症はＢ2サブタイプにより媒介され、一方慢性炎症環境におけるブラジキニン誘導疼痛はＢ1サブタイプを介して媒介されることを示した。エム・エヌ・パーキンスら、ラット持続性痛覚過敏の２種モデルにおけるブラジキニンＢ１およびＢ２レセプターアンタゴニストｄｅｓ−Ａｒｇ9、［Ｌｅｕ8］−ＢＫおよびＨＯＥ１４０の抗侵害受容活性、ペイン、５３巻、１９１−９７頁（１９９３年）；エイ・ドレイら、ブラジキニンおよび炎症性疼痛、トレンズ・イン・ニューロサイエンシズ、１６巻、９９−１０４頁（１９９３年）。これらの文献は本明細書中で参考として引用させる。
【００４３】
現在、ブラジキニンレセプターアンタゴニストは臨床的に使用されていない。これらの薬物のいくつかはペプチドであり、従って、消化されるため経口摂取できない。Ｂ2レセプターに対するアンタゴニストは、ブラジキニン誘導急性疼痛および炎症を抑制する。ドレイら、１９９３年。Ｂ1レセプターアンタゴニストは、慢性炎症症状における疼痛を抑制する。パーキンスら、１９９３年；ドレイら、１９９３年。それ故、用途により異なるが、本発明の溶液はブラジキニンＢ1およびＢ2レセプターアンタゴニストの一方または両方を含有するのが好ましい。例えば、関節鏡検査法は急性および慢性症状の両方で実施され、従って、関節鏡検査法用の灌注用溶液はＢ1およびＢ2レセプターアンタゴニストの両方を含有し得る。
【００４４】
本発明で使用するに適したブラジキニンレセプターアンタゴニストには、下記のブラジキニン1レセプターアンタゴニストが含まれる：Ｄ−Ａｒｇ−（Ｈｙｐ3−Ｔｈｉ5−Ｄ−Ｔｉｃ7−Ｏｉｃ8）−ＢＫの［ｄｅｓ−Ａｒｇ10］誘導体（「ＨＯＥ１４０の［ｄｅｓ−Ａｒｇ10］誘導体」、ヘキスト・ファーマシューティカルス販売）；および［Ｌｅｕ8］ｄｅｓ−Ａｒｇ9−ＢＫ。適当なブラジキニン2レセプターアンタゴニストには、［Ｄ−Ｐｈｅ7］ＢＫ；Ｄ−Ａｒｇ−（Ｈｙｐ3−Ｔｈｉ5,8−Ｄ−Ｐｈｅ7）−ＢＫ（「ＮＰＣ３４９」）；Ｄ−Ａｒｇ−（Ｈｙｐ3−Ｄ−Ｐｈｅ7）−ＢＫ（「ＮＰＣ５６７」）；およびＤ−Ａｒｇ−（Ｈｙｐ3−Ｔｈｉ5−Ｄ−Ｔｉｃ7−Ｏｉｃ8）−ＢＫ（「ＨＯＥ１４０」）が含まれる。これらの化合物は、前に包含させたパーキンスら、１９９３年およびドレイら、１９９３年の文献にさらに詳細に記載されている。適当な治療用および好ましい濃度を表４に示す。
【００４５】
【表４】
2007077165.tif 000006
（５．カリクレインインヒビター）
前記のように、ペプチドであるブラジキニンは、重要な疼痛および炎症のメディエーターである。ブラジキニンは、血漿中の高分子量物質キニノーゲンに対するカリクレインの作用により切断生成物として産生される。それ故、カリクレインインヒビターは、ブラジキニンの産生ならびにそれによって生ずる疼痛および炎症を阻害することにより治療作用をもつと考えられる。本発明で使用するに適したカリクレインインヒビターは、アプロチニンである。本発明の溶液で使用するに適した濃度を、表５として下に示す。
【００４６】
【表５】
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（６．タチキニンレセプターアンタゴニスト）
タチキニン（ＴＫ）は、サブスタンスＰ、ニューロキニンＡ（ＮＫＡ）およびニューロキニンＢ（ＮＫＢ）を含む構造的に関連したペプチドのファミリーである。ニューロンは、末梢における主要なＴＫの供給源である。ＴＫの重要な一般的作用は神経刺激であるが、その他の作用には、内皮依存性血管拡張、血漿タンパク質溢出、マスト細胞動員ならびに炎症細胞の脱顆粒および刺激が含まれる。シー・エイ・マッギ、ゼネラル・ファーマコロジー、２２巻、１−２４頁（１９９１年）。ＴＫレセプターの活性化により媒介される上記の生理学的作用の組み合わせのため、ＴＫレセプターの標的化は、無痛覚の促進および神経原性炎症の処置のために都合の良いアプローチである。
【００４７】
（６ａ．ニューロキニン1レセプターサブタイプアンタゴニスト）
サブスタンスＰは、ＮＫ1と称されるニューロキニンレセプターサブタイプを活性化する。サブスタンスＰは、感覚神経の末端に存在するウンデカペプチドである。サブスタンスＰは、血管拡張、血漿溢出およびマスト細胞脱顆粒を含む、Ｃ−繊維の活性化後，末梢において炎症および疼痛を生ずる多数の作用を有することが知られている。ジェイ・ディー・レビンら、ペプチドおよび一次求心性侵害受容器、ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス、１３巻、２２７３頁（１９９３年）。適当なサブスタンスＰアンタゴニストは、（［Ｄ−Ｐｒｏ9［スピロ−ガンマ−ラクタム］Ｌｅｕ10，Ｔｒｐ11］フィザレミン−（１−１１））（「ＧＲ８２３３４」）である。ＮＫ1レセプターに作用し本発明で使用できるその他の適当なアンタゴニストは、１−イミノ−２−（２−メトキシフェニル）エチル）−７，７−ジフェニル−４−ペルヒドロイソインドロン（３ａＲ，７ａＲ）（「ＲＰ６７５８０」）；および２Ｓ，３Ｓ−シス−３−（２−メトキシベンジルアミノ）−２ーベンズヒドリルキヌクリジン（「ＣＰ９６，３４５」）である。これらの薬剤に関する適当な濃度を表６に示す。
【００４８】
【表６】
2007077165.tif 000008
（６ｂ．ニューロキニン2レセプターサブタイプアンタゴニスト）
ニューロキニンＡは、サブスタンスＰと共に感覚ニューロンに位置し、かつ炎症および疼痛を促進するペプチドである。ニューロキニンＡは、ＮＫ2と称される特異的ニューロキニンレセプターを活性化する。エス・エドモンズ−アルトら、ニューロキニンＡ（ＮＫ2）レセプターの強力かつ選択的非ペプチドアンタゴニスト、ライフ・サイエンス、５０巻、ＰＬ１０１（１９９２年）。適当なＮＫ2アンタゴニストの例には、（（Ｓ）−Ｎ−メチル−Ｎ−［４−（４−アセチルアミノ−４−フェニルピペリジノ）−２−（３，４−ジクロロフェニル）ブチル］ベンズアミド（「（±）−ＳＲ４８９６８」）；Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｄａｐ−Ｌｅｕ（「ＭＥＮ１０，６２７」）；およびｃｙｃ（Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ）（「Ｌ６５９，８７７」））が含まれる。これらの薬剤の適当な濃度を表７に示す。
【００４９】
【表７】
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（７．ＣＧＲＰレセプターアンタゴニスト）
カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）もまた、サブスタンスＰと共に感覚ニューロンに位置し、血管拡張薬として作用しサブスタンスＰの作用を強化するペプチドファミリーである。エス・ディー・ブレインら、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）と血管透過性増強メディエーターの相乗作用により誘導される炎症性浮腫、ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ファーマコロジー、９９巻、２０２頁（１９８５年）。適当なＣＧＲＰレセプターアンタゴニストの例は、ＣＧＲＰの短縮化バージョンであるＩ−ＣＧＲＰ−（８−３７）である。このポリペプチドは、ＣＧＲＰレセプターの活性化を阻害する。この薬剤の適当な濃度を表８に示す。
【００５０】
【表８】
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（８．インターロイキンレセプターアンタゴニスト）
インターロイキンは、サイトカインに分類され、炎症のメディエーターに応答して白血球およびその他の細胞が産生するペプチドである。インターロイキン（ＩＬ）は、強力な末梢性痛覚過敏薬であり得る。エス・エイチ・フェリーラら、トリペプチド類似体により拮抗される強力な痛覚過敏薬としてのインターロイキン−１β、ネイチャー、３３４巻、６９８頁（１９８８年）。適当なＩＬ−１βレセプターアンタゴニストの例は、ＩＬ−１βの短縮化バージョンであるＬｙｓ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒである。このトリペプチドは、ＩＬ−１βレセプターの活性化を阻害する。この薬剤の適当な濃度を表９に示す。
【００５１】
【表９】
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（９．アラキドン酸代謝物合成経路で活性を示す酵素のインヒビター）
（９ａ．ホスホリパーゼインヒビター）
ホスホリパーゼＡ2（ＰＬＡ2）酵素（ｃＰＬＡ2、ｉＰＬＡ2、ｓＰＬＡ2）およびホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）によるアラキドン酸の産生は、エイコサノイドとして知られる数々の炎症のメディエーターを産生する反応のカスケードをもたらす。この経路全体に亘って、阻害することができ、それによりこれら炎症のメディエーターの産生を減少し得る数多くの段階が存在する。これら種々の段階における阻害の例は下に示す通りである。
【００５２】
ＰＬＡ2イソ型酵素の阻害は、細胞膜からのアラキドン酸の放出阻害を起こし、それ故プロスタグランジンおよびロイコトリエンの産生を阻害し炎症と疼痛を減少させる。ケイ・ビー・グラーザー、ホスホリパーゼＡ２酵素の調節：選択的インヒビターおよびその薬理学的能力、アドバンシズ・イン・ファーマコロジー、３２巻、３１頁（１９９５年）。適当なＰＬＡ2イソ型インヒビターの例はマノアリドである。この薬剤の適当な濃度を表１０に記載する。ホスホリパーゼＣγ（ＰＬＣγ）イソ型の阻害もまたプロスタノイドおよびロイコトリエンの産生減少をもたらし、従って疼痛および炎症の減少をもたらす。ＰＬＣγイソ型インヒビターの例は、１−［６−（（１７β−３−メトキシエストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１７−イル）アミノ）ヘキシル］−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンである。
【００５３】
【表１０】
2007077165.tif 000012
（９ｂ．シクロオキシゲナーゼインヒビター）
非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、抗炎症、解熱、抗血栓および鎮痛薬として広く使用されている。アール・エイ・ルイス、プロスタグランジンおよびロイコトリエン、テキストブック・オブ・リューマトロジー、３版（ダブリュー・エヌ・ケリーら編）、２５８頁（１９８９年）。これらの薬物の分子標的は、Ｉ型およびＩＩ型のシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２）である。これらの酵素はまた、プロスタグランジンＨシンターゼ（ＰＧＨＳ）−１（構成酵素）および−２（誘導酵素）とも呼ばれ、アラキドン酸から、プロスタグランジンおよびトロンボキサンの生合成中間体であるプロスタグランジンＨへの変換を触媒する。ＣＯＸ−２酵素は、内皮細胞、マクロファージおよび線維芽細胞で同定された。この酵素は、ＩＬ−１およびＴＮＦ‐αにより誘導され、その発現は炎症部位でアップレギュレートされる。ＣＯＸ−１の構成活性およびＣＯＸ−２の誘導活性は、共に疼痛および炎症に寄与するプロスタグランジンの合成に導く。
【００５４】
現在市販されている多くのＮＳＡＩＤ（ジコロフェナック、ナプロキセンおよびインドメタシン、イブプロフェン等）は、一般に両イソ型のＣＯＸの非選択的インヒビターであり、比率は化合物が異なれば変化するがＣＯＸ−２よりＣＯＸ−１に対して大きな選択性を示すことがある。プロスタグランジン生成の遮断にＣＯＸ−１および２インヒビターを使用することは、天然リガンドとプロスタノイドレセプターの７種の既知サブタイプとの相互作用の遮断を試みるよりは、良好な治療方策を提示する。報告されているエイコサノイドレセプター（ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３）のアンタゴニストは全くまれであり、トロンボキサンＡ２レセプターの特異的高親和性アンタゴニストが報告されているに過ぎない。ジェイ・ワラスおよびジー・チリノ、トレンズ・イン・ファーマコロジカル・サイエンス、１５巻、４０５−４０６頁（１９９４年）。
【００５５】
溶液で使用するためのシクロオキシゲナーゼインヒビターの治療用および好適な濃度を表１１に示す。
【００５６】
【表１１】
2007077165.tif 000013
（９ｃ．リポキシゲナーゼインヒビター）
酵素リポキシゲナーゼの阻害は、炎症および疼痛の重要なメディエーターとして知られるロイコトリエンＢ4のようなロイコトリエンの産生阻害を起こす。
アール・エイ・ルイス、プロスタグランジンおよびロイコトリエン、テキストブック・オブ・リューマトロジー、３版（ダブリュー・エヌ・ケリーら編）、２５８頁（１９８９年）。５−リポキシゲナーゼアンタゴニストの例は、２，３，５−トリメチル−６−（１２−ヒドロキシ−５，１０−ドデカジイニイル）−１，４−ベンゾキノン（「ＡＡ８６１」）であり、その適当な濃度を表１２に記載する。
【００５７】
【表１２】
2007077165.tif 000014
（１０．プロスタノイドレセプターアンタゴニスト）
アラキドン酸代謝物として産生される特定のプロスタノイドは、その炎症効果をプロスタノイドレセプターの活性化により媒介する。特異的プロスタノイドアンタゴニストのクラスの例は、エイコサノイドＥＰ−１およびＥＰ−４レセプターサブタイプアンタゴニストおよびトロンボキサンレセプターサブタイプアンタゴニストである。適当なプロスタグランジンＥ2レセプターアンタゴニストは、８−クロロジベンズ［ｂ，ｆ］［１，４］オキサゼピン−１０（１１Ｈ）−カルボン酸、２−アセチルヒドラジド（「ＳＣ１９２２０」）である。適当なトロンボキサンレセプターサブタイプアンタゴニストは、［１５−［１α，２β（５Ｚ），３β，４α］−７−［３−［２−（フェニルアミノ）−カルボニル］ヒドラジノ］メチル］−７−オキソビシクロ−［２，２，１］−ヘプタ−２−イル］−５−ヘプタン酸（「ＳＱ２９５４８」）である。これらの薬剤に関する適当な濃度を表１３に示す。
【００５８】
【表１３】
2007077165.tif 000015
（１１．ロイコトリエンレセプターアンタゴニスト）
ロイコトリエン（ＬＴＢ4、ＬＴＣ4およびＬＴＤ4）は、酵素により生成しかつ重要な生物学的性質を有する、アラキドン酸代謝における５−リポキシゲナーゼ経路の産生物である。ロイコトリエンは、炎症を含む数々の病理学的症状に関与する。特定のアンタゴニストは、これらの病理に対する治療的介入の可能性のために現在多数の製薬会社が探求している。ピー・ブイ・ハルシュカら、アニュアル・レビユー・オブ・ファーマコロジー・アンド・トキシコロジー、２９巻、２１３−２３９頁（１９８９年）；エイ・フォード−ハッチンソン、クリティカル・レビユー・オブ・イムノロジー、１０巻，１−１２頁（１９９０年）。ＬＴＢ4レセプターは、好酸球および好中球を含むある種の免疫細胞に見出される。これらのレセプターに結合しているＬＴＢ4は化学走性とリソソームによる酵素放出を起こし、それにより炎症過程に関与する。ＬＴＢ4レセプターの活性化に伴うシグナル導入過程は、ホスホチドイノシトール（ＰＩ）代謝のＧタンパク質媒介刺激と細胞内カルシウム増加を含む（図２参照）。
【００５９】
適当なロイコトリエンＢ4レセプターアンタゴニストの例は、ＳＣ（＋）−（Ｓ）−７−（３−（２−（シクロプロピルメチル）−３−メトキシ−４−［（メチルアミノ）カルボニル］フェノキシ（プロポキシ）−３，４−ジヒドロ−８−プロピル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−プロパン酸（「ＳＣ５３２２８」）である。本発明の実施に適当なこの薬剤の濃度を表１４に示す。その他の適当なロイコトリエンＢ4レセプターアンタゴニストには、［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エチル］フェニル］［［３−（ジメチルアミノ−３−オキソプロピル）チオ］メチル］チオプロパン酸（「ＭＫ０５７１」）ならびに薬物ＬＹ６６，０７１およびＩＣＩ２０，３２１９が含まれる。ＭＫ０５７１はＬＴＤ4レセプターサブタイプアンタゴニストとしても作用する。
【００６０】
【表１４】
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（１２．オピオイドレセプターアゴニスト）
オピオイドレセプターの活性化は抗侵害受容効果をもたらし、それ故これらのレセプターに対するアゴニストが望ましい。オピオイドレセプターは、μ−、δ−およびκ−オピオイドレセプターサブタイプを含む。μ−レセプターは、末梢における感覚ニューロン末端にあって、これらのレセプターの活性化は感覚ニューロンの活性を阻害する。エイ・アイ・バスバウムら、オピエート無痛：なぜ末梢の標的が中枢なのか、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン、３２５巻、１１６８頁（１９９１年）。δ−およびκ−レセプターは交感神経の遠心性末端にあって、プロスタグランジンの放出を阻害し、それにより疼痛と炎症を阻害する。ワイ・オウ・タイヲら、κ−およびδ−オピオイドは交感神経依存性痛覚過敏を遮断する、ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス、１１巻、９２８頁（１９９１年）。オピオイドレセプターサブタイプはＧ−タンパク質結合レセプタースーパーファミリーのメンバーである。それ故、全てのオピオイドレセプターアゴニストはそれらの同族Ｇ−タンパク質結合レセプターと作用しそれらを通じてシグナル伝達を開始する。適当なμ−オピオイドレセプターアゴニストの例は、フェンタニルおよびＴｒｙ−Ｄ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−［Ｎ−ＭｅＰｈｅ］−ＮＨ（ＣＨ2）−ＯＨ（「ＤＡＭＧＯ」）である。適当なδ−オピオイドレセプターアゴニストの例は、［Ｄ−Ｐｅｎ2，Ｄ−Ｐｅｎ5］エンケファリン（「ＤＰＤＰＥ」）である。適当なκ−オピエートレセプターアゴニストの例は、（トランス）−３，４−ジクロロ−Ｎ−メチル−Ｎ−［２−（１−ピロリジニル）シクロヘキシル］−ベンゼンアセトアミド（「Ｕ５０，４８８」）である。これらの薬剤の各々に関する適当な濃度を表１５に示す。
【００６１】
【表１５】
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（１３．プリノセプターアンタゴニストおよびアゴニスト）
細胞外ＡＴＰは、Ｐ2プリノセプターとの相互作用を通してシグナル伝達分子として作用する。プリノセプターの一つの主要なクラスは、Ｎａ+、Ｋ+およびＣａ2+を透過させる固有のイオンチャネルをもつリガンド作動性（ｌｉｇａｎｄ ｇａｔｅｄ）イオンチャネルであるＰ2Xプリノセプターである。感覚ニューロンにおいて記載されるＰ2Xプリノセプターは、一次求心性神経伝達および侵害受容に重要である。ＡＴＰは、感覚ニューロンを脱分極することが知られており、そして障害細胞から放出されたＡＴＰはＰ2Xレセプターを刺激して侵害受容神経線維末端の脱分極に導くので、侵害受容活性化に役割をもつ。Ｐ２Ｘ3レセプターは、脊髄に入る感覚Ｃ−線維神経において選択的に発現されるので、著しく限定された分布をもち（シー・シー・チェンら、ネイチャー、３７７巻、４２８−４３１頁（１９９５年））、多数のこのようなＣ−線維が痛覚刺激に対するレセプターを有することが知られている。従って、Ｐ２Ｘ3レセプターサブユニットの著しく限定された発現の局在が、これらのサブタイプを鎮痛作用の優れた標的にしている（図３および７を参照のこと）。
【００６２】
Ｇタンパク質結合レセプターファミリーに属するカルシウム固定プリンレセプターは、哺乳動物軟骨細胞の表面において記載されている。ＡＴＰは、分化した初代軟骨細胞におけるカルシウムイオンの濃度における用量依存の一過性上昇を刺激する。異種脱感作実験は、軟骨細胞がＡＴＰを用いた初回刺激の後の、ＵＴＰに対する引き続く応答を示さなかったことを実証した。これらの結果は、軟骨細胞の細胞表面のＰ２Ｙレセプターの存在と一致する。継代軟骨細胞におけるプリン誘導カルシウム固定は、アゴニスト感受性に関して同じ薬理学的プロフィールを示した。ＡＴＰおよびＵＴＰは、軟骨体外移植組織または初代軟骨細胞によるグリコサミノグリカンへの［３５Ｓ］の取り込みの速度により測定した場合、軟骨マトリクス合成を変化させなかった。軟骨体外移植組織からのグリコサミノグリカンの放出により測定される、マトリクス分解はまた、いずれのアンタゴニストによっても変化されない。初期関節軟骨細胞の表面上の機能的Ｐ２Ｙプリンレセプターの存在は、細胞外プリン（例えば、ＡＴＰ）の濃縮して、軟骨細胞代謝を活性化することを可能にする。
【００６３】
他の研究は、ヒト関節軟骨によるＰ１プリンレセプター遺伝子およびＰ２プリンレセプター遺伝子の両方の発現を規定し、そしてリガンド媒介プロスタグランジンＥ２放出をプロフィールした。Ｐ２Ｙ２レセプターアゴニストであるＡＴＰおよびＵＴＰは、ＰＥＧ２の少量の放出を刺激した。この放出は、ヒトＩＬ−１αを用いて前処理した後に、相乗的に増大した。ＩＬ−１前処理後のＡＴＰおよびＵＴＰの同時添加に対するＰＧＥ２放出は、ホルボール ミリステート アセテート（ｐｈｏｒｂｏｌ ｍｙｒｉｓｔａｔｅ ａｅｔａｔｅ）により模倣された。Ｐ２Ｙ２レセプターの機能は、ＩＬ−１媒介ＰＧＥ２放出を増加させることであり、これにより関節内の疼痛および炎症を促進する。従って、本発明におけるＰ２Ｙ２アンタゴニストの使用は、滑膜細胞および軟骨細胞の両方により炎症のメディエーター産生の活性化を防ぐ。
【００６４】
本発明で使用するに適当なＰ2X／ＡＴＰプリノセプターの適切なアンタゴニストは、例として、スラミンおよびピリドキシルホスフェート−６−アゾフェニル−２，４−ジスルホン酸（「ＰＰＡＤＳ」）を含む。これらの薬剤に関する適当な濃度を表１６に示す。
【００６５】
【表１６】
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（１４．Ｃａ2+チャネルアンタゴニスト）
カルシウムチャネルアンタゴニストは、神経炎症を媒介する細胞応答の活性化に必要なカルシウムイオンの膜内外流動を妨げる特有の薬物の群である。滑膜細胞および軟骨細胞へのカルシウム流入は、これらの細胞における応答の活性化の媒介に重要な事象である。さらに、神経炎症、シグナル導入経路の媒介におけるブラジキニン、ヒスタミン、セロトニン（ＳＨＴ2）、およびニューロキニンレセプター（ＮＫ1およびＮＫ2）の役割は、細胞内カルシウムの増加を含み、形質膜上のカルシウムチャネルの活性化を導く。多くの組織において、ニフェジピンのようなカルシウムチャネルアンタゴニストは、種々の刺激により引き起こされるアラキドン酸、プロスタグランジンおよびロイコトリエンの放出を減少し得る。エス・モンカダ、アール・フラワーおよびジェイ・ベイン、グッドマン・ギルマン治療の薬理学的基礎、（第７版）、マクミラン・パブリッシャー・インコーポレイテッド発行、６６０−５頁（１９９５年）。
【００６６】
最終的に、カルシウムチャネルアンタゴニスト、ならびにタチキニンアンタゴニストか、ヒスタミンアンタゴニストか、またはブラジキニンアンタゴニストのいずれかは神経炎症の阻害に相乗作用を示す。神経炎症の媒介におけるニューロキニンレセプターの役割は確立されている。ニューロキニン1（ＮＫ1）およびニューロキニン2（ＮＫ2）レセプター（Ｇタンパク質結合スーパーファミリーの構成員）シグナル導入経路は、細胞内カルシウムの増加を含み、従って形質膜上のカルシウムチャネルの活性化を導く。同様に、ブラジキニン2（ＢＫ2）レセプターの活性化は、滑膜細胞および軟骨細胞において細胞内カルシウムの増加と結びつく。従って、カルシウムチャネルアンタゴニストは、一部がＬ型チャネルから流入する細胞内カルシウムの上昇を含む共通の機構を妨げる。これが、カルシウムチャネルアンタゴニストと、ニューロキニン、ヒスタミン、Ｐ2Ｙ、およびブラジキニン2レセプターに対するアンタゴニストとの間の相乗的相互作用の根拠である。
【００６７】
本発明の実施に適当なカルシウムチャネルアンタゴニストは、ニソルジピン、ニフェジピン、ニモジピン、ラシジピン、イスラジピン、およびアムロジピンを含む。これらの薬剤の適当な濃度を表１７に示す。
【００６８】
【表１７】
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（ＩＩ．軟骨分解の阻害のための薬剤）
炎症および軟骨分解の生化学および分子生物学の理解における近年の進歩は、多くの内因性サイトカインについての役割と関係を有する。炎症した関節における軟骨の損失の発生に関係してきた複数の炎症促進メディエーターは、サイトカイン、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＩＬ−８である。上昇したレベルの多数のこれらの炎症促進サイトカインは、急性的に損傷した膝関節の滑液中に急速に現れ、そして少なくとも４週間の間、患者において上昇したままである（Ｃａｍｅｒｏｎ，ＭＬら、「Ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ａｓ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｐｒｏｇｎｅｓｔｉｃ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ＡＣＬ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｋｎｅｅ」、Ｋｎｅｅ Ｓｕｒｇ．Ｓｐｏｒｔｓ Ｔｒａｕｍａｔｏｌ．Ａｒｔｈｒｏｓｃｏｐｙ ２：３８−４４（１９９４））。これらのサイトカインは、いくつかの活性化した細胞型（滑膜線維芽細胞、滑膜マクロファージ、および軟骨細胞を含む）から関節中に局所的に産生される。局所的に産生されたサイトカインは、急性炎症状態および慢性炎症状態において病態生理学的な事象を媒介し、そして軟骨異化作用の有用な自己分泌およびパラ分泌メディエーターである。これらのサイトカインの作用は、別個の細胞標的に対して複数の効果をもたらすそれらの能力によって、および陽性または陰性のいずれかの相乗作用様式で他のサイトカインと相互作用するそれらの能力によって、特徴付けられる。ＩＬ−１およびＴＮＦ−αは、特に重要である。なぜなら、こららはまた、内因性タンパク質（例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）およびメタロプロテイナーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰ））の活性を調節することにより、軟骨マトリックス成分の正常な代謝回転と破壊との間のバランスを乱すことによって、軟骨破壊効果を開始させるからである。軟骨ホメオスタシスのサイトカイン制御は、マトリックス分解または修復が起こるか否かを決定する軟骨細胞に作用する活性なメディエーター間での高度に調節されたバランスを示す。
【００６９】
関節の損傷は、しばしば、滑膜組織関節空間内の炎症性応答を生じ、そして関節軟骨の分解を引き起こし得る。ヒトの膝の滑膜代謝および軟骨代謝における劇的な変化は、以下の関節損傷および関節鏡手術に記載されている（Ｃａｍｅｒｏｎ，Ｍ．Ｌ．ら（１９９４）、前出；Ｃａｍｅｒｏｎ，Ｍ．Ｌ．ら、「Ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｅｒｉｏｒ ｃｒｕｃｉａｔｅ ｌｉｇａｍｅｎｔ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｋｎｅｅ：Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ａｎｄ ｋｅｒａｔａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ」、Ａｍ．Ｊ．Ｓｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ．２５：７５１−７５４（１９９７））。特定の炎症促進サイトカインレベルは、前十字靱帯（ＡＣＬ）破断の後に見られる急性炎症段階の間に、膝関節滑液中で劇的に増加する（２〜４桁まで）。有意な変化はまた、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）（例えば、コラゲナーゼおよびストロメライシン−１）の過剰産生により、軟骨マトリックス分子の濃度において生じる。これらのＭＭＰは、急性外傷の後に患者の滑液中で増大する（Ｌｏｈｍａｎｄｅｒ，Ｌ．Ｓ．ら、「Ｔｅｍｐｏｒａｌ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ−１ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ａｎｄ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｋｎｅｅ ｊｏｉｎｔ ｆｌｕｉｄ ａｆｔｅｒ ｉｎｊｕｒｙ ｔｏ ｔｈｅ ｃｒｕｃｉａｔｅ ｌｉｇａｍｅｎｔ ｏｒ ｍｅｎｉｓｃｕｓ」、Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ Ｒｅｓ．１２：２１−２８（１９９４））。時間的に、滑液中のサイトカインおよび軟骨マトリックスマーカー（例えば、プロテオグリカン）（これらは、軟骨変性に関連する）における変化は、急性損傷期間において最大であるが、延長した期間（３ヶ月〜１年）持続し、ゆっくりと減少し、そして損傷前のベースラインレベルよりも大きいままである。
【００７０】
関節鏡手術自体による外傷は、かなりの手術後炎症を引き起こし、これは、関節における細胞のさらなる炎症性活性化（シクロオキシゲナーゼ−２および他の炎症促進サイトカインの上方制御を含む）を反映する。ＡＣＬの破断を有する患者のかなりの割合（６０〜９０％）が、損傷の１０〜１５年後に変形性関節症（ＯＡ）を示す膝のレントゲン撮影の変化を示す（Ｃａｍｅｒｏｎ，Ｍ．Ｌ．ら（１９９４）、前出）。従って、初期の関節損傷および外科的外傷の組み合わされた効果は、軟骨マトリックス代謝における持続した炎症状態および関連する変化を誘導し得、これらは、関節軟骨における変性性変化の引き続く発症および変形性関節症の初期の発症を生じる原因となる因子であるようである。１９９６年に米国のみにおいて行われた関節鏡手順の推定される総数は１８００万回であり、毎年約１０％の推定される増加速度を有するので、この健康問題の規模はかなり大きい。従って、関節における関節軟骨の分解を防ぐための薬学的方法を提供することが望ましい。
【００７１】
手術後の疼痛および炎症は、重要な臨床的問題として認識されているが、関節鏡手術のための現在の薬理学的処置レジメンは、急性の手術後鎮痛を指向するのみである。現存する外科処置様式は、手術後に誘導され、そして手術により処置された関節の軟骨破壊を阻害する必要性がある、慢性炎症状態を検討しない。従って、疼痛および炎症の急性および慢性の局面、ならびに損傷した関節および手術により処置された関節の軟骨代謝における生理学的変化の両方を検討する、有効な一体化された薬物治療を開発する明らかな必要性が存在する。
【００７２】
本発明のこの局面に従って、組成物を患者の関節に直接投与することによって、関節における関節軟骨の破壊を減少するかまたは予防するための方法が提供される。この組成物は、１以上の代謝的に活性な軟骨保護剤を、以前記載されたような疼痛および／または炎症の阻害のための１以上の薬剤とともに、あるいは２つ以上の代謝的に活性な軟骨保護剤（これらのうちの少なくとも１つは、軟骨タンパク同化プロセスを促進し、そしてこれらのうちの１つは、軟骨異化プロセスの阻害剤である）の組み合わせを、関節内送達のための薬学的に有効なキャリア中に含む。代謝的に活性な薬剤としては、細胞の生物学的、生化学的、または生物物理学的状態を直接的または間接的に調節または変更するように作用するすべての薬剤（原形質膜の電位、結合するリガンド、または細胞レセプターの酵素活性、細胞内もしくは細胞外に位置する酵素、タンパク質−タンパク質相互作用、ＲＮＡ−タンパク質相互作用、またはＤＮＡ−タンパク質相互作用を変更する薬剤を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、このような薬剤としては、シグナル変換カスケードを開始するレセプターアゴニスト、シグナル伝達経路を阻害するレセプターのアンタゴニスト、細胞内酵素または細胞外酵素のアクチベーターまたはインヒビター、および転写因子のＤＮＡへの結合を調節する薬剤が挙げられる。
【００７３】
詳細には、本発明の１つの局面は、最大の治療的利点を達成するために局所的に送達された軟骨保護薬剤の組み合わせを用いて、損傷したかまたは手術により処置した関節を処置する薬理学的方法を提供する。軟骨保護薬剤の組み合わせの使用は、変性多因子性の軟骨破壊プロセス（このプロセスにおいて、異化プロセスのために合成と分解との間の変化が生じている）をブロックするための単一の薬剤の使用による、現存する治療的アプローチの限界を克服する。本発明のこの局面は、別個の分子標的に対して同時に作用する薬剤の組み合わせのアプローチを独自に使用して、炎症プロセスの最大の阻害を達成しそして軟骨ホメオスタシスを維持するために、軟骨同化作用を促進しそして制御されていないかまたは過剰な軟骨異化プロセスを阻害する。これによって、関節内の軟骨保護効果が達成される。単一の分子標的の阻害または軟骨破壊（異化作用）を誘導することが公知の生化学的機構（例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）のＩＬ−１レセプターへの結合の阻害）は最適ではないようである。なぜなら、例えば独自のレセプターを介して媒介されたＴＮＦ−αの作用は、多くの重複する炎症促進機能および軟骨異化機能をＩＬ−１と共有し、そしてまた関節における軟骨破壊の主要なメディエーターとして認識されているからである。同様に、異化プロセスを阻害することなく軟骨タンパク同化プロセスを増強するのみの薬学的薬剤の使用は、損傷した関節内に存在する異化因子を最適には相殺しない。
【００７４】
詳細には、本発明の１つの局面は、代謝的に活性な軟骨保護剤の薬学的組成物を提供し、これは、別個の分子標的に同時に作用する少なくとも２つの薬剤の組み合わせに基づく。代表的な実施形態においては、少なくとも１つの薬剤は、サイトカインまたは増殖因子レセプターアゴニストであり、これらは抗炎症活性を直接的に提供し、そして／または軟骨タンパク同化プロセスを促進し、そして少なくとも第２の薬剤は、炎症促進プロセスおよび／または軟骨異化プロセスを阻害するように作用するレセプターアンタゴニストまたは酵素インヒビターである。代表的な薬剤の組み合わせは、関節における炎症促進サイトカインの役割を抑制し、軟骨マトリックス合成を促進し、そしてマトリックス分解を阻害するようにするように機能的に作用する、抗炎症性／タンパク同化性サイトカインのクラスから引き出された少なくとも１つの薬剤を含む。これらのレセプターアンタゴニストとしては、特定の抗炎症性およびタンパク同化性サイトカイン（例えば、インターロイキン（ＩＬ）アゴニスト（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３）およびトランスフォーミング増殖因子−βスーパーファミリーの特定のメンバー（例えば、ＴＧＦβおよびＢＭＰ−７））、インシュリン様増殖因子（例えば、ＩＧＦ−１）および線維芽細胞増殖因子（例えば、ｂＦＧＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。少なくとも第２の薬剤は、炎症促進分子標的の活性または発現を阻害および減少するように作用するレセプターアンタゴニストまたは酵素インヒビターのクラスから引き出された薬剤（例えば、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、ＴＮＦ−αレセプターアンタゴニスト、シクロオキシゲナーゼ−２インヒビター、ＭＡＰキナーゼインヒビター、酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）インヒビター、および核因子κＢ（ＮＦκＢ）インヒビター）である。代謝的に活性な薬剤は、細胞の表面に位置するレセプターの機能的アゴニストおよびアンタゴニスト、ならびに膜結合または細胞外に分泌された酵素（例えば、ストロメライシンおよびコラゲナーゼ）のインヒビターの両方を含む。さらに、多くの薬剤が新規な標的において指向され、これらは、細胞内に局在化する酵素および表面レセプターのシグナルを伝達し、組み込む転写因子（酵素ＮＯＳ、ＣＯＸ−２、およびマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）のインヒビターならびにタンパク質−ＤＮＡ相互作用のインヒビター（例えば、転写因子ＮＦκＢ）を含む）である。この方法は、サイトカイン誘導性タンパク同化プロセスの促進および異化プロセスの阻害を同時に行うことによって維持されるべき軟骨の完全性を可能にする。
【００７５】
複数の薬物の組み合わせは、外科的関節鏡手順の間に、単独でまたは手術後の持続性送達（例えば、制御ポンプ送達システムまたは他の持続放出性送達システムによって）と組み合わせて、関節内注射によるかまたは注入（手順に沿った（ｐｅｒｉｐｒｏｃｅｄｕｒａｌｌｙ）投与（すなわち、手術前および／または手術中および／または手術後）を含む）を介して、局所的に送達され得る。持続放出性送達システムとしては、タンパク質、リポソーム、炭水化物、合成有機化合物または無機化合物で構成される微粒子、ミクロスフェアまたはナノ粒子が挙げられ得るが、これらに限定されない。従って、いくつかの実施形態においては、本発明は、注射または注入を介して、単独または鎮痛剤および／または抗炎症剤とともに送達される薬剤の組み合わせを提供する。損傷時または損傷時の直後（例えば、手順に沿って）における軟骨保護剤の直接的な局所的送達によって達成される作用の迅速な開始は、引き続く応答をトリガーし得る前に初期のプロセスを阻害し、それによって局所的な組織の損傷および引き続く軟骨の損失を先手を打って制限する可能性を有する。
【００７６】
本発明のこの局面の利点としては、以下が挙げられる：１）急性および慢性状態の間の軟骨破壊の多因子性の原因に関する組み合わせ薬剤治療；２）軟骨保護剤の組み合わせは、抗炎症剤および鎮痛剤と組み合わされ得る；３）薬物の組み合わせの局所的送達は、関節内の軟骨保護剤の即時の治療的濃度を達成する；４）灌注溶液を手順に沿って用いることによって、関節内の薬剤レベルを、関節鏡外科手順の間、治療的に望ましい範囲に連続的に維持する；５）局所的送達は、全身的送達と比較して全薬剤用量および投与頻度の減少を可能にする；６）関節への局所的部位指向的送達は、全身的な毒性を避け、そして悪影響を減少させる；そして７）関節への直接的な局所的送達は、新規な薬学的に活性なペプチドおよびタンパク質（サイトカインおよび増殖因子を含む）の使用を可能にし、これらは、投与の全身的経路に限定しない場合には、治療的に有用でないかも知れない。
【００７７】
（１．インターロイキン−１（ＩＬ−１）レセプターアンタゴニスト）
インターロイキンは、２つの形態（ＩＬ−１αおよびＩＬ−１β）で存在し、これらは、免疫調節機能および炎症促進機能の類似のスペクトルを共有する別々の遺伝子産物から誘導されるポリペプチドである。ＩＬ−１は、１７ｋＤのポリペプチドであり、関節内の多数の細胞型（滑膜線維芽細胞およびマクロファージ、軟骨細胞、内皮細胞、ならびに単球およびマクロファージを含む）に作用し得るし、そして関節内の多数の細胞型により産生もされ得る。ＩＬ−１が、損傷した関節において起こる関節炎症および関節軟骨の病態生理学的な損失において中心的な役割を果たすことの実質的な証拠が存在する。
【００７８】
この軟骨破壊サイトカインの両方の形態の作用は、２つのＩＬ−１レセプター（ＩＬ−１Ｒ）（Ｉ型ＩＬ−１レセプターまたはＩＩ型ＩＬ−１レセプター）のうちの１つによって媒介される。ＩＬ−１レセプターは、構造的に異なり、そして免疫グロブリン結合ドメインの存在によって特徴付けられる別々のスーパーファミリーに属する。これらのレセプターは、免疫グロブリンドメインを有する多のレセプターとの近接したアミノ酸相同性を有する。より大きなＩ型ＩＬ−１レセプターの発現は、Ｔ細胞および線維芽細胞上に存在するが、より小さなＩＩ型ＩＬ−１レセプターは、Ｂ細胞、単球、好中球、および骨髄細胞上に存在する。
【００７９】
ＩＩ型ＩＬ−１レセプターは、ＩＬ−１βと高い親和力で結合するが、ＩＬ−１β結合は、Ｉ型ＩＬ−１レセプターへの結合の際に開始するような細胞内シグナル伝達を開始しない。対照的に、ＩＩ型レセプターは、細胞から流出されることが示されている可溶性ＩＬ−１結合因子の前駆体として役立ち、そしてこの可溶性レセプターは、生理学的ＩＬ−１βアンタゴニストとして作用する。ＩＩ型レセプターの可溶性外部タンパク質に対応する天然に存在するＩＬ−１結合タンパク質が記載されている。
【００８０】
ＩＬ−１レセプターに結合する天然に存在する分泌可溶性リガンド（あるいは、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（ｓＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−１ｒａ）ともいう）は、クローン化され、配列決定され、２２ｋＤタンパク質をコードすることが見出されてきた。ＩＬ−１Ｒａは、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βのＩ型ＩＬ−１レセプターおよびＩＩ型ＩＬ−１レセプターの両方への結合競合的に阻害する。ＩＬ−１Ｒａは、純粋なレセプターアンタゴニストである。なぜなら、そのレセプターへの結合は、ＩＬ−１レセプターに付随する膜の細胞シグナル伝達機構を活性化しないからである。このタンパク質のＩＬ−１Ｒａへの高い親和力の結合にも関わらず、Ｉ型ＩＬ−１Ｒを発現する細胞のＩＬ−１生物学的応答を阻害するためには、１０〜１００倍モル過剰が必要とされる。ＩＬ−１Ｒａを産生することが知られている細胞としては、単球、好中球、マクロファージ、骨膜細胞および軟骨細胞が挙げられる。ＩＬ−Ｒａは、ＰＧＥ2合成、炎症促進サイトカインおよびＭＭＰの誘導、および酸化窒素の生成を阻害することが示されてきた。分泌ＩＬ−１Ｒａは、実験的に誘導された炎症の間にインビボで放出される。重要なことには、ＩＬ−１Ｒａは、滑膜組織において発現され、そして正常なヒト滑液中に存在する。膝損傷を有する患者においては、滑液中のＩＬ−１Ｒａのレベルは、損傷後の急性期において劇的に増加し、そして引き続いて準急性（ｓｕｂ−ａｃｕｔｅ）状態および慢性状態においては、正常レベル未満まで減少する。従って、ＩＬ−１Ｒａは、損傷に対する関節の応答において生理学的役割を果たすことが示されてきた。
【００８１】
ＩＬ−１は、軟骨細胞および滑膜細胞の両方による分解酵素および炎症促進サイトカインの産生を刺激するその能力により、関節破壊において中心的役割を果たす主要な軟骨破壊サイトカインであると考えられる。さらに、ＩＬ−１βは、軟骨細胞によるプロテオグリカンおよびコラーゲン合成の強力なインヒビターである。細胞レベルにおいては、滑膜線維芽細胞のＩＬ−１β誘導応答は、ＰＧＥ２、コラゲナーゼおよび他の中性プロテアーゼの増加した産生、ならびに炎症促進サイトカイン、ＩＬ−６およびＩＬ−８の上方制御を含む。
【００８２】
ＩＬ−１（これは、関節炎疾患を有する患者の関節液中に存在する）は、以下のために軟骨細胞を刺激する：１）増加した量の酵素（例えば、ストロメライシン、線維芽細胞および好中球コラゲナーゼならびにプラスミノーゲンアクチベーター）を合成するため、および２）プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１およびＴＩＭＰの合成を阻害するため。さらに、ＩＬ−１βは、マトリックス成分（例えば、ＩＩ型コラーゲン、関節軟骨中のコラーゲンの主要な形態、およびプロテオグリカン）の合成の強力なインヒビターである。インヒビターのレベルとプロテアーゼのレベルとの間の不均衡は、活性プロテアーゼの量の増加を導く。この増加は、マトリックス生合成の抑制と組み合わされて、軟骨の分解を生じる。動物研究においては、ウサギ膝関節へのＩＬ−１の注射は、関節軟骨からのプロテオグリカンの減少を引き起こす。
【００８３】
ＩＬ−１は、慢性骨膜炎および軟骨分解の病因に関与する重要なサイトカインの１つであるので、その産生の減少またはその作用のブロッキングは、滑膜炎症を減少させ、そして軟骨保護効果を提供するための新規な処置のための適切な戦略を示す。アゴニスト（ＩＬ−１）のその天然の膜結合レセプターとの相互作用をアンタゴナイズするための種々の治療的アプローチが使用され得、これらのアプローチとしては以下が挙げられる：１）現在までに特徴付けられている、天然に存在する特定のＩＬ−１活性のインヒビター（ＩＬ−１Ｒａおよび可溶性ＩＬ−１レセプターを含む）；２）抗ＩＬ−１ Ａｂ；および３）ペプチド性または非ペプチド性のいずれかであり得る小分子アンタゴニスト。
【００８４】
この重要なサイトカインの作用をブロックする能力は、関節における多くの細胞型（例えば、滑膜線維芽細胞および軟骨細胞）に影響を及ぼし、従って引き続く病理学的効果（例えば、炎症細胞の関節への侵入、滑膜過形成、滑膜細胞活性化、ならびに軟骨崩壊および軟骨マトリックス合成の阻害）を阻害する。ＩＬ−１レセプターアンタゴニストは、ＩＬ−１による炎症性応答の伝達をブロックするべきであり、それによって疾患の進行を妨げる。多数のＩＬ−１レセプターアンタゴニストの治療可能性は、炎症および関節炎（ＲＡおよびＯＡ）の動物モデルにおいて確立されてきた。ＲＡを患っている患者は、ＩＬ−１Ｒａの皮下注射または可溶性Ｉ型ＩＬ−１Ｒの関節内注射後に臨床的に改善された。
【００８５】
ＩＬ−１βおよびＩＬ−１Ｒａの効果は、それらのそれぞれの局所的濃度に依存する。ＲＡ滑膜切片の上清においては、ＩＬ−１βレベルはＩＬ−１Ｒａのレベルより３倍高かった。従って、ＩＬ−１Ｒａの自発的な局所的産生は、ＩＬ−１β効果を阻害するには十分ではない。なぜなら、より大きな（１０〜１００倍）モル過剰のＩＬ−１Ｒａは、Ｉ型ＩＬ−１Ｒを発現する細胞におけるＩＬ−１誘導生物学的応答を阻害することが必要とされるからである。従って、ＩＬ−１Ｒａの高い用量は、ＲＡを有する患者におけるヒトボランティアにおいて、ＩＬ−１をブロックするためにインビボで使用されてきた。ＩＬ−１Ｒａは、滑膜中に局所的に存在し、陰性のシグナルを提供し、滑膜炎におけるＩＬ−１媒介プロセス（例えば、炎症組織における白血球蓄積、滑膜細胞によるＰＧＥ2産生およびコラゲナーゼ産生）の少なくとも一部を下方制御する。ＩＬ−１Ｒａの軟骨保護効果は、イヌＡＣＬモデルにおける関節へのＩＬ−１Ｒａの直接的な注射を用い、そしてヒト滑膜線維芽細胞へのＩＬ−１Ｒａ遺伝子のトランスフェクションに基づく遺伝子治療アプローチを使用することによって実証されてきた。
【００８６】
本発明は、ＩＬ−１可溶性レセプタータンパク質（これは、ＩＬ−１Ｒの細胞外ドメインを構成し、そして溶液中でＩＬ−１サイトカイン分子を結合し得る）の局所的送達を開示する。特に、そして例示の目的で、米国特許第５，３１９，０７１号および米国特許第５，７２６，１４８号に開示されるようなアミノ酸配列１〜３１２を本質的に含む可溶性ヒトＩＬ−１レセプター（ｓｈｕＩＬ−１Ｒ）ポリペプチドは、抗炎症クラス、抗疼痛クラス、または軟骨保護クラスのいずれかから選択される１以上の薬物と組み合わせて使用するために本明細書中で開示される。あるいは、ｓＩＬ−１Ｒ結合ドメインポリペプチドからなる融合タンパク質の局所的送達は、米国特許第５，３１９，０７１号に開示されるように、軟骨保護を促進するために提案される。さらに、米国特許第５，８１７，３０６号に開示されるようなＩＬ−１レセプターアンタゴニストの局所的送達は、本発明における使用のために開示される。ｓｈｕＩＬ−１Ｒ可溶性レセプターは、ナノモル濃度の親和力でＩＬ−１と結合することが示されてきた。治療的に有効な濃度のＩＬ−１Ｒ可溶性レセプター（例えば、ｓｈｕＩＬ−１Ｒ）の局所的送達は、関節の直接的な注射または灌注溶液中（例えば、関節鏡外科手順の間）により、１以上の軟骨保護薬、抗炎症薬、または抗疼痛薬との組み合わせで起こり得、そして種々の炎症状態または病態生理学的状態における関節の組織に局所的に適用される場合に、軟骨保護剤として本明細書中で開示される。このような処置は、コラゲナーゼ−１およびストロメライシン−１の産生のＩＬ−１刺激を先手を取って阻害する。ＩＬ−１および／またはＴＮＦ−αに対する１型可溶性レセプターの局所的産生のための、遺伝子送達に基づく完全に異なる方法を使用することによって、これらのサイトカインに対する可溶性レセプターの存在が、抗原誘導関節炎の急性炎症期の間にウサギ膝関節に対する保護を与えることが見出された。
【００８７】
ヒトＩ型ＩＬ−１レセプターと高い親和力で特異的に結合するＩＬ−１レセプターアンタゴニストペプチド（１１〜１５アミノ酸）は、軟骨保護剤としての本発明における使用に適切である。これらの小さなペプチドは、より大きな組換えＩＬ−１可溶性レセプターまたは組換えＩＬ−１ｒａよりも、多くの利点を提供し、これらの利点としては、合成の容易さおよび費用、ならびに生物学的バリアを透過する能力が挙げられる。インビトロでの効力に基づく最も強力なペプチドのうちの２つは、以下である：Ａｃ−ＦＥＷＴＰＧＷＹＱＪＹＡＬＰＬ−ＮＨ2（ＡＦ１２１９８、ＩＣ50＝０．５〜２ｎＭ）およびＡｃ−ＦＥＷＴＰＧＷＹＱＪＹ−ＮＨ2（ＡＦ１１５６７）。ＡＦ１１５６７は、ＡＦ１２１９８の短縮形態であり、４Ｃ末端残基を欠き、Ｉ型ＩＬ−１レセプターに対してわずかにより低い親和力を示すが、２．３〜２．６時間の同様の血漿半減期を有する。乏しい溶解度および迅速な代謝は、静脈内注入を介して全身的に投与された場合に、ＡＦ１２１９８のインビボにおける効力を制限するようである。これらの制限は、本発明において記載されるような直接的な局所的送達方法（例えば、関節内の関節空間への注射または外科灌注液もしくは他の注入液への包含により）を介して、ある程度克服される。本発明のために適切なＩＬ−１レセプターアンタゴニスト薬剤の例は、以下に列挙される。局所的送達のすべての様式（すなわち、注射、注入および灌注）のために、各適切な薬剤の最適な用量および／または濃度は、治療的に有効な用量および／または濃度である。例として、列挙された薬剤の各々について、列挙した薬剤を含有する灌注溶液の好ましい濃度および最も好ましい濃度が提供され、このような濃度は、治療的に有効であると予想される。
【００８８】
【表１８】
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（２．腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプターアンタゴニスト）
ＴＮＦ−α（活性化マクロファージによって主に産生されるサイトカイン）は、多くの生物学的作用（特定のＴＮＦレセプターにより媒介されるいくつかの遺伝子の転写調節、ならびに免疫調節活性を含む）を有する。本来、ＴＮＦ−Ｒ１およびＴＮＦ−Ｒ２と呼ばれる２つの異なるレセプターは、クローン化および特徴付けされ、そしてまた可溶性レセプターとして産生されることが見出された。
【００８９】
このファミリーにおけるレセプターは、それらの細胞外ドメインにおいてかなりの相同性を有する単一の膜貫通タンパク質であるのに対して、それらの比較的短い細胞内ドメインは、ほんのわずかな配列相同性を有する。ＴＮＦの作用は、研究された実質的にすべての細胞型上に存在する細胞表面レセプターに結合する因子の結果である。２つのレセプターは、同定およびクローン化されてきた。１つのレセプター型（ＴＮＦＲ−ＩＩ（またはＡ型もしくは７５ｋＤａ）と呼ばれる）は、４３９アミノ酸の膜貫通タンパク質をコードし、そして７５ｋＤａの見かけの分子量を有する。第２のレセプター型（ＴＮＦＲ−Ｉ（またはＢ型もしくは５５ｋＤａ）と呼ばれる）は、５５ｋＤａの見かけの分子量を示し、そして４２６アミノ酸の膜貫通タンパク質をコードする。ＴＮＦＲ１は、ＮＦ−κＢ経路を介してシグナル伝達を開始し得る細胞内ドメインを含む。
【００９０】
両方のＴＮＦレセプターは、結合ＴＮＦαに対する高い親和力を示す。可溶性ＴＮＦレセプター（ｓＴＮＦＲ）は、単離され、そして膜結合レセプターの細胞外ドメインの分断の結果として生じることが立証されてきた。２つの型のＴＮＦＲは、同定され、ｓＴＮＦＲ１（ＴＮＦ ＢＰＩ）およびｓＴＮＦＲＩＩ（ＴＮＦ ＢＰＩＩ）と命名された。これらの可溶性レセプター形態の両方は、上記の２つの型のＴＮＦＲの短縮形態を表わすことが示されてきた。
【００９１】
ＴＮＦ−αは、炎症性応答および軟骨破壊の根底にある一連の細胞事象および分子事象において、中心的役割を果たす。ＴＮＦ−αの多くの効果は、ＩＬ−１の炎症促進効果と重複する。ＴＮＦ−αの炎症促進作用の中でも、他の炎症促進サイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＩＬ−８を含む）の放出の刺激である。ＴＮＦ−αはまた、好中球、線維芽細胞および軟骨細胞からのマトリックスメタロプロテイナーゼの放出を誘導し、これは部分的にコラゲナーゼの刺激を介して軟骨を分解する。さらに、ＴＮＦ−αは、正常なヒト関節軟骨細胞および滑膜線維芽細胞においてＣＯＸ−２を上方制御し、増加したＰＧＥ２産生を生じる。
【００９２】
このサイトカインは、ＩＬ−１とともに、関節内の軟骨に対する病理学的効果（白血球侵入、滑膜過形成、滑膜細胞活性化、軟骨破壊、および軟骨マトリックス合成の阻害を含む）を開始し、そしてこれらを生じると考えられる。特に、滑膜炎症の間、増加したレベルのＴＮＦ−αが関節の滑液中に見出され、そして滑膜細胞による増加したＴＮＦ−αの産生が生じる。従って、灌注溶液、注入または注射における可溶性ＴＮＦ−αレセプターの局所的送達は、遊離ＴＮＦ−αと結合し、そして周りの組織におけるＴＮＦレセプターのアンタゴニストとして機能し、従って軟骨保護効果を提供する。
【００９３】
本発明は、機能的なＴＮＦ−αのアンタゴニストの使用を記載し、このアンタゴニストは、利用可能な遊離リガンドを捕捉すること、またはレセプター自身との直接的な競合的相互作用のいずれかによって、単独または軟骨保護効果を提供するための他の薬剤と組み合わせて、細胞外でリガンドとそれらの同族の膜レセプターとの相互作用をブロックするように作用する。アゴニスト（ＴＮＦ−α）のその天然の膜結合レセプターとの相互作用をアンタゴナイズするための、種々の治療的アプローチが使用され得、これらのアプローチとしては、以下が挙げられる：１）現在までに特徴付けられたＴＮＦ−α活性の天然に存在する特定のインヒビター（可溶性ＴＮＦ−αレセプターを含む）の使用；２）抗ＴＮＦ−α抗体の使用；および３）ペプチド性または非ペプチド性であり得る小分子アンタゴニストの使用。
【００９４】
本発明は、キメラ可溶性レセプター（ＣＳＲ）タンパク質の使用を開示する。このタンパク質において、ＴＮＦレセプターの細胞外ドメイン（これは、ＴＮＦ分子に対する結合活性を有する）は、ＩｇＧ分子のドメインに共有結合している。特に、そして第１の例として、米国特許第５，４４７，８５１号に開示されるように、マウスＩｇＧ１重鎖ポリペプチドのＣＨ２およびＣＨ３領域に結合したＴＮＦレセプター細胞外ポリペプチドの細胞外ドメインを含むキメラポリペプチド（組換えキメラ）が使用され得る。このキメラＴＮＦ可溶性レセプター（米国特許第５，４４７，８５１号においては「キメラＴＮＦインヒビター」とも呼ばれる）は、高い親和力でＴＮＦ−αと結合することが示され、そしてＴＮＦ−α生物学的活性のインヒビターとして非常に活性であることが実証されてきた。さらに、第２の例は、Ｆｃ抗体の部分を有するＴＮＦレセプターのリガンド結合ドメインを含むキメラ融合構築物（Ｆｃ融合可溶性レセプターと呼ぶ）であり、これは、ＴＮＦ−αレセプターについて作製されてきた。本発明はまた、可溶性ＴＮＦレセプター：Ｆｃ融合タンパク質、または米国特許第５，６０６，６９０号に開示されるような任意の改変形態の使用を開示する。活性な可溶性レセプター融合タンパク質の分子形態は、単量体または二量体のいずれかであり得る。現在の研究は、このような可溶性ＴＮＦレセプター：Ｆｃ融合タンパク質が、ＴＮＦ−αに対する高い結合親和力を保持することを確立した。
【００９５】
薬理学的なアンタゴニストとして可溶性レセプターを規定するという文脈において、用語可溶性レセプターは、以下を包含するが、これらに限定されない：（１）完全長膜レセプターの細胞外ドメインからなる、天然（内因性）産生アミノ酸配列またはその可溶性フラグメントに対応する、可溶性レセプター、（２）完全長の天然に存在するレセプターアミノ酸配列の短縮型または部分配列である組換え可溶性レセプターおよびそのアナログであって、同属のリガンドに結合する能力を保持し、かつ生物学的活性を保持する、組換え可溶性レセプターおよびそのアナログ、ならびに（３）オリゴマー（例えば、アミノ酸）によってＩｇＧポリペプチド（例えば、ＩｇＧヒンジおよびＦｃドメイン）の一部に対応する配列に結合された、完全長のレセプターアミノ酸配列の細胞外結合ドメインの一部に対応する短縮型または部分配列から構成される組換え可溶性レセプターであるキメラ可溶性レセプターであって、生物学的活性および同属のリガンドに結合する能力を保持する、キメラ可溶性レセプター。
【００９６】
サイトカインレセプターの可溶性細胞外リガンド結合ドメインは、体液に天然に存在し、サイトカインの生物学的活性の制御に関与すると考えられる。多数の造血性サイトカインレセプターの可溶性の短縮形態の天然の存在が報告されている（ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＴＮＦＲ）。例えば、可溶性ＴＮＦＲは、健康な被験体の血清および尿において約１〜２ｎｇ／ｍｌの濃度で見出される。シグナル伝達機能を欠いているので、これらのサイトカイン結合タンパク質は、完全なレセプター配列（膜結合形態）に対するｍＲＮＡの選択的スプライシングの結果として、または膜結合形態のレセプターのタンパク質分解切断および放出の結果として生じる。これらの可溶性短縮型レセプターのインビボ機能が完全には確立されていないが、これらは、それらの相補的な内因性サイトカインの生理学的なアンタゴニストとして作用するようである。この拮抗作用は、（１）遊離のリガンドの、その同属の可溶性レセプターへの結合による除去によって、膜結合レセプターに対して有効な効果的な遊離濃度を減少するため、および（２）サイトカインの作用のみが細胞表面レセプターへの結合に続いて生成されるため、生じる。
【００９７】
ＴＮＦ−α可溶性レセプターは、ＴＮＦ−Ｒ１およびＴＮＦ−Ｒ２の天然のアンタゴニストとして、これらの細胞表面レセプターと遊離のリガンドの共通のプールについて競合することによって機能する。薬理学的に、ＴＮＦ可溶性レセプターは、競合阻害の機構（すなわち、膜レセプターにおいて共通の結合部位について内因性リガンドと競合すること）によるよりもむしろ遊離のリガンドのバイオアベイラビリティーを減少するその能力によってアンタゴニストとして機能する。関節に対する治療的に有効な量のＴＮＦ可溶性レセプターの添加は、リガンドの生物学的活性を効果的に中和するはずである。組換え可溶性レセプタがインビボで投与される実験は、炎症応答を阻害しアンタゴニストとして作用する能力を示している。
【００９８】
本発明において、軟骨破壊を阻害するために、他の軟骨保護剤、抗疼痛剤および／または抗炎症剤と組み合わせて使用するのに軟骨保護剤として適切な薬剤としては、可溶性ＴＮＦＲ、ヒトキメラポリペプチド（組換えキメラ）（ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に連結されたＴＮＦ−αレセプター（ｐ８０）の細胞外ドメインを含む）、および抗ＴＮＦ−α抗体が挙げられる。局所投与（すなわち、注射、注入および灌注）のすべての様式について、それぞれの適切な薬剤の最適の用量および／または濃度は、治療的に有効な用量および／または濃度である。例として、列挙された薬剤のそれぞれについて、列挙された薬剤を含む灌注溶液の好ましいおよび最も好ましい濃度は、例えば、治療的に有効であると期待される濃度で提供される。
【００９９】
【表１９】
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（３．インターロイキンレセプターアゴニスト）
いくつかのサイトカインは、滑膜炎症および軟骨破壊の重要なメディエーターであるシグナル伝達糖タンパク質である。軟骨破壊の機構の最近の分析は、軟骨の損失を決定する際の重要な炎症促進マスターサイトカインＩＬ−１の絶対的なレベルだけではなく、軟骨恒常性のサイトカイン制御が異化制御サイトカインと同化制御サイトカインとのバランス、および同化性増殖因子によって支配される。ＩＬ−１β産生とＩＬ−１Ｒα産生の間のバランスがＩＬ−１βのために炎症状態において変更される場合、これは、慢性炎症状態および軟骨破壊の病因に寄与し、例えば、ひざ関節外科手術の後に生じることが知られている。関節内の炎症部位における炎症促進サイトカインの生成を阻害する強力な治療薬剤としては、抗炎症サイトカイン、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３が挙げられる。これらのサイトカインは、ＩＬ−１の衝撃を減少するある範囲の経路に対するそれらの効果によって、インビトロおよびインビボで関節軟骨の破壊を大いに減少することが観測された。従って、抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３）は、１）炎症促進サイトカインの産生の減少、および２）最近、ＩＬ−４についてインビボで示された、ＩＬ−１Ｒａのような天然の抗炎症性サイトカインの産生の誘導によって炎症を減少するのに有用であり得る。
【０１００】
ＩＬ−４は、慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者の滑膜における炎症プロセスを弱めるようである。リウマチ様滑膜において、ＩＬ−４は、滑膜細胞の増殖を阻害し、そして骨再吸収を減少させるために、滑膜の片による炎症促進サイトカインの産生を阻害することが示された。ＩＬ−４は、ヒト関節軟骨細胞におけるマトリクスメタロプロテイナーゼ−３（ＭＭＰ３）合成の抑制による直接的な軟骨保護効果を促進し得る。ヒト関節軟骨細胞を使用する細胞培養系は、ＭＭＰ−３のＩＬ−１誘導産生およびメタロプロテイナーゼ−１（ＴＩＭＰ−１）の組織インヒビターに対するＩＬ−４の効果を評価するために使用された。ＩＬ−４がＩＬ−１刺激ＭＭＰ−３タンパク質および酵素活性を抑制したことを見出した。さらに、ＩＬ−４は、ＩＬ−１誘導ＭＭＰ−３ ｍＲＮＡを抑制した。ｉＮＯＳの誘導は、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３によって阻害され得る。従って、ＩＬ−４は、炎症性関節疾患において見られる関節破壊の保護性のメディエーターとして特徴付けられ得る。
【０１０１】
さらに、ＩＬ−１制御サイトカインレベルのバランスに対するＩＬ−４の効果がまた軟骨保護性の役割を支持することを見出した。ＩＬ−４およびＩＬ−１０が新たに調製されたリウマチ様滑膜細胞による炎症性サイトカインの産生を抑制することが見出された。それぞれのインターロイキンが単独で効果的であるが、ＩＬ−４とＩＬ−１０の組み合わせが、細胞生存能に対する効果なしで、ＩＬ−６およびＩＬ−８のＩＬ−１およびＴＮＦ−α刺激産生を相乗的に阻害した。ＲＡ滑膜培養物へのＩＬ−４の添加は、ＩＬ−１Ｒａの産生を増加し、そしてＩＬ−１βの産生を減少した。ＩＬ−４を用いたインビボ処置はＩＬ−１β／ＩＬ−１Ｒａバランスに対して差示的に作用することによってラットの実験関節炎における減少を促進することが最近報告された。ＩＬ−１３（ＩＬ−４と多くの性質を共有する別のサイトカイン）もまた、ＲＡ滑膜におけるＩＬ−１Ｒａを誘導した。従って、ＩＬ−４およびＩＬ−１３の組み合わせの局所送達は、相乗的な治療価値を提供し得る。
【０１０２】
ＩＬ−１０は、軟骨破壊を阻害する良好な候補であることを示す多くの性質を有する。ＩＬ−１０は、ＩＬ−１放出とＴＮＦ−α放出との両方を阻害し、ＭＭＰ−２を阻害しながらＴＩＭＰ−１産生を刺激する。ＲＡ滑膜の内側でのＩＬ−１０の産生が最近報告され、ＩＬ−１０の抗炎症性効果が特徴付けられた。ＩＬ−１０は、滑膜の片を使用するエキソビボＲＡモデルにおけるＩＬ−１β産生を抑制したが、ＩＬ−４よりも少ない程度であった。
【０１０３】
ＩＬ−４およびＩＬ−１０処置の軟骨破壊に対する保護性の効果は、サイトカイン送達の非局所的な方法を使用する関節炎の動物モデルにおいて見出された。マウスコラーゲン誘導関節炎モデルにおいて、ＩＬ−４およびＩＬ−１０の組み合わせ処置は、実質的な改良を生み出した。炎症の巨視的な徴候の抑制に加えて、ＩＬ−４およびＩＬ−１０を用いた組み合わせ処置はまた、滑膜組織における細胞性侵入を減少し、そして軟骨破壊に対する明確な保護をもたらす。さらに、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１に対するｍＲＮＡのレベルが滑膜組織と関節軟骨の両方において高度に抑制された。対称的に、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）ｍＲＮＡのレベルが上昇したままであり、これは、保護の機構がＩＬ−１Ｒａ／ＩＬ−１バランスの上方制御と同時に、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１の抑制された産生に関連し得る。これらのデータは、炎症性応答および関節軟骨の破壊の内因性の抑制におけるＩＬ−１０の主要な役割と一致し、そしてＩＬ−４とＩＬ−１０との組み合わせ処置が潜在的な治療価値のようである。
【０１０４】
内因性ＩＬ−４およびＩＬ−１０の役割、ならびにマクロファージ依存性マウスストレプト連鎖球菌細胞壁（ＳＣＷ）関節炎モデルの初期段階における関節炎症および軟骨破壊に対するこれらのサイトカインの添加の治療効果もまた、調査されている。内因性ＩＬ−１０がＳＣＶＷ関節炎の制御においてある役割を演じることが示された。外因性ＩＬ−１０の添加は、内因性ＩＬ−１０の抑制効果をさらに増大させた。なおより主要な効果は、ＩＬ−４およびＩＬ−１０の組み合わせで見出された。この組み合わせは、腫脹の減少をもたらし、そして軟骨細胞プロテオグリカン合成の上昇をもたらした。ＩＬ−４およびＩＬ−１０の組み合わせを用いた処置は、実質的にＴＮＦ−αのレベルを減少し、これはＩＬ−１０処置単独でも生じるが、滑膜におけるＩＬ−１βレベルの大きな減少（潜在的な臨床的利益のさらなる効果）をまたもたらした。全体的に、このデータは、軟骨破壊を妨げるために関節に局所的に送達された軟骨保護薬剤としてＩＬ−４とＩＬ−１０の両方についてのある役割と一致し、ＩＬ−４およびＩＬ−１０を含む組み合わせがいずれかの薬剤単独でよりも大きな潜在的治療的価値を提供し得ることを示す。
【０１０５】
重篤複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスをモデルとして使用して、軟骨分解およびインビボでのヒトリウマチ様滑膜への単核細胞（ＭＮＣ）の漸増に対するＩＬ−４またはＩＬ−１０注射の効果を評価した。５人の慢性関節リウマチ患者からのヒトリウマチ様滑膜および軟骨を、組換えヒトＩＬ−４（ｒｈＩＬ−４、１００ｎｇ；ｒｈＩＬ−１０、１００ｎｇ）、ＩＬ−４およびＩＬ−１０の組み合わせ、またはＴＮＦ−α（１０００Ｕ）、またはリン酸緩衝化生理食塩水で４週間にわたって週２回注射した。ヒトＩＬ−４およびＩＬ−１０の組み合わせが軟骨破壊およびヒト滑膜組織による侵襲を阻害し、これらのインターロイキンアゴニストの軟骨保護性質を確立することを見出した。
【０１０６】
ヒトＩＬ−１３がクローン化されそして配列決定され、そしてＩＬ−４の性質の多くを共有することが見出された。ＩＬ−１３は、ＩＬ−４に対して約２５％の相同性である。ＩＬ−４と同様に、ＩＬ−１３が、滑液単核細胞によって、ＩＬ−１およびＴＮＦ−αを含む炎症促進サイトカインの産生を減少する。ＩＬ−１３は、インビボにおいて抗炎症性効果を示し、従って関節における軟骨破壊の処置において治療的潜在性を有する。
【０１０７】
ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３アゴニストとして有用な化合物には、天然に存在するヒトＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３、ヒト組換えＩＬ−４（ｒｈＩＬ−４）、ｒｈＩＬ−１０、およびｒｈＩＬ−１３、ならびにこれらの部分配列、またはＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３レセプターを認識するために組換えＤＮＡ技術を使用して構築され、細胞表面においてこれらのレセプターを活性化し得るペプチド配列が挙げられる。これは、詳細には、抗Ｆｃレセプター部分ならびに抗ＩＬ−４レセプター部分、抗ＩＬ−１０レセプター部分、および抗ＩＬ−１３レセプター部分から構成されるマルチ特異性分子を含み、ここで、少なくとも１つの部分が組換えＤＮＡ技術を使用して構築される。薬理学的アゴニストとしてインターロイキンアゴニストを規定するという文脈において、用語インターロイキンアゴニストは、以下を包含するが、これらに限定されない：（１）天然に（内因性で）産生されるアミノ酸配列またはそのフラグメントに対応するペプチド配列、（２）完全長の天然に存在するインターロイキンアミノ酸配列の短縮型または部分配列である組換えインターロイキンおよびそのアナログであって、同属のレセプターに結合する能力を保持し、かつ生物学的活性を保持する、組換えインターロイキンおよびそのアナログ、ならびに（３）オリゴマー（例えば、アミノ酸）によってＩｇＧポリペプチド（例えば、ＩｇＧヒンジおよびＦｃドメイン）の一部に対応する配列に結合された、完全長のレセプターアミノ酸配列の一部に対応する短縮型または部分配列から構成される組換えポリペプチドであるキメラインターロイキンであって、同属のレセプターに結合する能力を保持しかつ生物学的活性を保持する、キメラインターロイキン。
【０１０８】
本発明に適切なインターロイキンアゴニストの例が以下に列挙される。局所送達（すなわち、注射、注入および灌注）のすべての様式について、それぞれの適切な薬剤の最適の用量および／または濃度は、治療的に有効な用量および／または濃度である。例として、列挙された薬剤のそれぞれについて、列挙された薬剤を含む灌注溶液の好ましいおよび最も好ましい濃度は、例えば、治療的に有効であると期待される濃度で提供される。
【０１０９】
【表２０】
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（４．増殖因子−βスーパーファミリーアゴニストの形質転換）
形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーメンバーは、２５ｋＤの多面発現性の種々の細胞機能を与え得る多機能タンパク質であり、組織修復および再構築に関与することが知られている。多くの場合において、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）との細胞相互作用を高め、そしてＥＣＭタンパク質およびプロテアーゼインヒビターの産生および分泌を刺激することによってＥＣＭの蓄積を増加する。ＴＧＦ−βはまた、他のサイトカインとの相乗的相互作用を有することが示されており、一般的に抗炎症性活性を示す。ＴＧＦ−βの複数のアイソフォームが同定され、これらは、近いアミノ酸配列相同性を共有する。ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３は、ヒト組織において見出され、そして哺乳動物細胞において活性であるが、結合親和性において異なる。
【０１１０】
ＴＧＦ−βサブファミリーのメンバーは、軟骨細胞増殖、分化および細胞外マトリクス蓄積の強力なモジュレーターである。軟骨器官培養において、ＴＧＦ−β１は、プロテオグリカンの代謝を制御し、そしてウサギ関節軟骨細胞によるコラーゲンおよびグリコサミノグリカン合成を刺激する。さらに、ＴＧＦ−β１がヒト関節軟骨細胞におけるＴＩＭＰ発現を増加し、そして関節の軟骨のＩＬ−１レセプターの発現を下方制御する。
【０１１１】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）−βスパーファミリーに属する細胞増殖、分化およびアポトーシスの複数の機能の調節因子である。１ダースより多くのメンバーのＢＭＰタンパク質ファミリーは、哺乳動物において同定され、それらの構造に依存するいくつかの群に細分類され得る。ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４は、互いに非常に類似する。ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、骨形成原タンパク質（ＯＰ）−１（ＢＭＰ−７とも呼ばれる）、およびＯＰ−２／ＢＭＰ−８は、互いに構造的に類似する。増殖分化因子（ＧＤＦ）−５（軟骨誘導形態形成タンパク質−１とも呼ばれる）、ＧＤＦ−６（軟骨誘導形態形成タンパク質−２とも呼ばれる）、およびＧＤＦ−７は、別の関連のグループを形成する。ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、およびＯＰ−１／ＢＭＰ−７（インビボで骨および軟骨の形成を誘導する）とは対照的に、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、およびＧＤＦ−７は、より効率的にインビボで軟骨および腱様構造を誘導する（Ｗｏｌｆｍａｎら、１９９７）。
【０１１２】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーは、２つの型のセリン／トレオニンキナーゼレセプター（これらはともに、シグナル伝達に必須である（Ｍａｓｓａｇｕｅ、１９９８））への結合によってそれらの効果を発揮する。ＩＩ型レセプターは、本質的に活性なキナーゼであり、これは、リガンド結合時にＩ型レセプターをトランスリン酸化する。Ｉ型レセプターは、Ｓｍａｄタンパク質のような細胞内基質を活性化し、そしてこの機構によって、細胞内シグナル伝達の特異性が生じる。７個の異なるＩ型レセプターが哺乳動物において単離され、これは、もともとアクチビンレセプター様キナーゼ（ＡＬＫ）−１−ＡＬＫ７と呼ばれた。ＢＭＰ ＩＡ型レセプター（ＢＭＰＲ−ＩＡまたはＡＬＫ−３）およびＢＭＰ ＩＢ型レセプター（ＢＭＰＲ−ＩＢまたはＡＬＫ−６）は、互いに構造的に類似し、ＩＩ型レセプターと一緒にＢＭＰに特異的に結合する。ＡＬＫ−２は、アクチビンに結合することが示されているが、最近のデータは、それは、特定のＢＭＰ（例えば、ＯＰ−１／ＢＭＰ−７（Ｍａｃｉａｓ−Ｓｉｌｖａら、１９９８）に対するＩ型レセプターであることを明かにした。ＡＬＫ−１は、ＡＬＫ−２に対して構造的に非常に類似しているが、その生理学的なリガンドはまだ知られていない。ＡＬＫ−５およびＡＬＫ−４は、それぞれＴＧＦ−β（ＴβＲ−１）およびアクチビン（ＡｃｔＲ−ＩＢ）のＩ型レセプターである。ＡＬＫ−７は、構造的にＡＬＫ−４およびＡＬＫ−５に類似するが、そのリガンドは、まだ決定されていない。
【０１１３】
本発明の軟骨保護溶液における使用に適切な天然のＴＧＦ−βおよびＢＭＰアゴニスト、ならびに合成またはヒト組換え（ｒｈ）アゴニストは、上記ＢＭＰレセプターの任意と相互作用し得る。本明細書中で使用されるように、用語「ＴＧＦ−βおよびＢＭＰアゴニスト」は、フラグメント、欠失、付加、アミノ酸置換、変異、およびそれらの改変を含み、これらは、天然のヒトＴＧＦ−βおよびＢＭＰアゴニストリガンドの生物学的な特徴を保持する。ＴＧＦ−βまたはＢＭＰアゴニストは、単独で、または同化作用軟骨薬剤（軟骨形成性または軟骨マトリクス修復を促進する）としてＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーと相乗的に組み合わされて、または軟骨異化作用を遮断する阻害性の薬剤と組み合わせて使用され得る。
【０１１４】
Ｉ型レセプターは、ＩＩ型レセプターの下流成分として機能する。Ｉ型レセプターによる細胞内シグナルの特異性は、Ｌ４５ループと呼ばれるセリン／トレオニンキナーゼドメインにおける特定の領域によって決定される。従って、ＢＭＰＲ−ＩＡ／ＡＬＫ−３およびＢＭＰＲ−ＩＢ／ＡＬＫ−６（ＢＭＰＲ−Ｉ群）のＬ４５ループの構造は、互いに同一であり、そしてそれらは、細胞内に類似のシグナルを伝達し得る。同様に、ＴβＲ−Ｉ／ＡＬＫ−５、ＡｃｔＲ−ＩＢ／ＡＬＫ−４、およびＡＬＫ−７（ＴβＲ−Ｉ群）のＬ４５ループは、互いに同一であり、それらは、類似の基質を活性化する（Ｃｈｅｎら、１９９８）。ＡＬＫ−１およびＡＬＫ−２（ＡＬＫ−１群）のＬ４５ループは、他のＩ型レセプターとは最も異なっているが、これらは、ＢＭＰＲ−Ｉ群のＩ型レセプターのＬ４５ループと同じ基質を活性化する（Ａｒｍｓら、１９９９）。
【０１１５】
種々のタンパク質が、ＴＧＦ−βおよびＢＭＰセリン／トレオニンキナーゼレセプターからのシグナルを伝達し得る。それらのうち、最も研究された分子は、Ｓｍａｄファミリーのタンパク質である。８個の異なるＳｍａｄタンパク質が哺乳動物において同定され、そしてこれらのタンパク質が３つのサブグルーグ（すなわち、レセプター制御Ｓｍａｄｓ（Ｒ−Ｓｍａｄｓ）、共通パートナーＳｍａｄｓ（ｃｏ−Ｓｍａｄｓ）、および阻害性Ｓｍａｄｓ）に分類される。Ｒ−Ｓｍａｄｓは、Ｃｏ−Ｓｍａｄｓとの複合体からＩ型レセプターによって直接活性化され、そして核にトランスロケートする。Ｓｍａｄヘテロマーは、他のＤＮＡ結合タンパク質によって直接的および間接的にＤＮＡに結合し、従って標的遺伝子の転写を制御する。Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、およびＳｍａｄ８は、ＢＭＰによって活性化され、一方Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３は、ＴＧＦ−βによって活性化される。例えば、Ｓｍａｄ２は、Ｃｏ−Ｓｍａｄとして機能するＳｍａｄ４と組み合わせて、核にトランスロケートされ、ここで、これは、ＴＧＦの生物学的効果を媒介する遺伝子の転写を活性化する。Ｓｍａｄ６およびＳｍａｄ７は、他のＳｍａｄに構造的に離れて関連し、そして阻害性のＳｍａｄとして作用する。ＢＭＰがインビトロおよびインビボにおいて新たな軟骨および骨の形成を誘導し、そして軟骨細胞の増殖および分化を制御することが示された。さらに、これらのタンパク質はまた、軟骨修復プロセスにおいて関連する。種々の研究によって、ＢＭＰもまた軟骨表現型を促進しそして維持することが示されたが、これは、ニワトリ肢芽細胞培養物および胎児ラット軟骨芽細胞において、ならびにウサギおよびウシ関節軟骨細胞においてプロテオグリカン合成を刺激するそれらの能力によって示される。軟骨および骨の形成についてのＢＭＰの重要性は、特定ＢＭＰ遺伝子ノックアウトが研究されるトランスジェニックアプローチによって証明されている。
【０１１６】
ＢＭＰファミリーの１つのメンバー、骨形成性タンパク質（ＯＰ−１またはＢＭＰ−７）は、正常な状態および病理学的な状態（例えば、軟骨の修復の間）において軟骨恒常性について特に重要であるようである。ＯＰ−１は、成人の関節軟骨細胞によって発現される軟骨誘導性形態形成タンパク質とともに、ＢＭＰファミリーの唯一のメンバーであるようである（Ｃｈｕｂｉｎｓｋａｙａ，Ｓ．、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４８：２３９−５０（２０００））。ＯＰ−１は、骨マトリクスからもともと精製され、軟骨および骨形成を誘導することが示された。ヒトＯＰ−１遺伝子は、クローン化され、そして生物学的に活性な組換えＯＰ−１ホモダイマーが生成された。ヒト組換えＯＰ−１は、インビトロでヒト関節軟骨細胞によってアグリカンおよびコラーゲンＩＩ型の合成を刺激し得る。これはまた、これらの軟骨細胞の代謝に対するＩＬ−１の有害な効果に対抗し得、そしてフィブロネクチンフラグメントによって媒介されるウシ軟骨損傷を遮断し得る。この効果は、インターロイキン１βの存在下で培養されるヒト関節軟骨細胞によるプロテオグリカン、プロスタグランジン Ｅ２、およびＩＬ−１レセプターアゴニストの産生に対する組換えヒトＯＰ−１の効果を研究することによって示された。ＯＰ−１を用いたヒト関節軟骨細胞の処置は、ＩＬ−１βの低用量によって誘導されるプロテオグリカン合成の下方制御に打ち勝つ際に効果的であった。さらに、ある研究は、ＯＰ−１がヒアルロナンおよびＣＤ４４の合成を刺激し、他の分子は、ヒト滑膜細胞によるマトリクス構築に必要とされることが見出された。ヒト成人軟骨におけるＯＰ−１に対する発現および制御のこれらの研究は、軟骨保護および修復におけるＯＰ−１の役割を示唆し、そしてＯＰ−１がヒト関節軟骨の軟骨同化作用および修復を促進する治療薬剤として使用され得ることを示す。
【０１１７】
ＯＰ−１（ＢＭＰ−７）は、インビボで骨格内部および骨格外部位で移植される場合に軟骨および骨形成を誘導する。全厚関節軟骨欠損の治癒に対するＯＰ−１の影響が、ウサギのひざ関節の関節軟骨を通して２つの隣接する穴を穿孔することによって調査された。ＯＰ−１は、成熟関節軟骨細胞と似ている細胞を含んだ関節表面の関節軟骨治癒および再生を誘導した。
【０１１８】
これらのデータは、外科的外傷後に、ヒトにおいて、軟骨の分解の予防および関節軟骨の生物学的ホメオスタシスを維持のために本発明を実施するのに有用な溶液の１つの好ましい実施形態は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー（好ましくは、ＴＧＦβ２、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）またはＢＭＰ−２のいずれか）あるいは等価なアゴニスト（このアゴニストは、これらのリガンドによって使用される同じレセプターを介して作用する）の局所的適用が挙げられる。局所的送達は、軟骨異化プロセスのインヒビター（例えば、ＭＡＰキナーゼインヒビター、ＭＭＰインヒビターまたは酸化窒素シンターゼインヒビター）である薬物（単数または複数）および／または疼痛および炎症の阻害のための他の試薬を組合せることで起こり得る。
【０１１９】
薬理学的なアゴニストとしてＴＧＦ−βおよびＢＭＰを規定する文脈の中で、用語ＴＧＦ−βおよびＢＭＰアゴニストとしては、以下の（１）〜（３）が挙げられるが、これらに限定されない：（１）天然に（内在的）産生されるアミノ酸配列またはそれらのフラグメントに対応するペプチド配列、（２）天然に存在する、全長ＴＧＦ−βおよびＢＭＰアミノ酸配列の短縮型破裂または部分配列である組換えＴＧＦ−βおよびＢＭＰであって、これらは、それらの同属の各レセプターと結合する能力を保持し、かつ生物学的活性およびそのアナログを保持する、組換えＴＧＦ−βおよびＢＭＰ（３）ＩｇＧポリペプチド（例えば、ＩｇＧヒンジおよびＦｃドメイン）の一部に対応する配列にオリゴマー（例えば、アミノ酸）を介して結合される、全長アミノ酸配列の一部に対応する短縮型または部分配列からなる組換えポリペプチドである、キメラＴＧＦ−βおよびＢＭＰ（これは、同属のレセプターと結合する能力を保持し、かつ生物学的活性を保持する）。
【０１２０】
本発明に適切なＴＧＦ−βおよびＢＭＰアゴニストの例は、以下に列挙される。局所送達の全モード（すなわち、注射、注入および洗浄）のために、各適切な薬剤の最適な用量および／または濃度は、治療学的に有効である用量および／または濃度である。例として、列挙される薬剤の各々に対して、列挙した薬剤を含む洗浄溶液の好ましいおよび最も好ましい濃度は、例えば、治療学的に有効であると予想される濃度で提供される。
【０１２１】
外科的溶液の関節への送達のための治療学的濃度の範囲は、その同属のレセプターに対する各リガンドの解離濃度（Ｋｄ）の値から見積もられ得る。これらの値は、特定の細胞型および組織に対して変化するが、以下の例がＢＭＰ−４のために与えられる。125Ｉ−ＢＭＰ−４の結合実験により、１１０ｐＭの見掛け解離定数および１細胞当たり約６０００個のレセプターを有する、特異的な高親和性結合部位の存在が明らかとなった。従って、１１ｎＭのＢＭＰ−４において、リガンドの結合が最大となり、そして利用可能なレセプターで完全に占有される（飽和される）。第１関節軟骨細胞におけるＢＭＰ−４に対する機能的レセプターの存在が、実証された。
【０１２２】
【表２１】
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（５．シクロオキシゲナーゼ−２（Ｃｏｘ−２）インヒビター）
非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、抗炎症剤として幅広く使用されているが、軟骨保護剤として特異的に展開または治療学的に使用されていなかった。ＮＳＡＩＤ薬物のための直接的な分子標的は、プロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼまたは脂肪酸シクロオキシゲナーゼのいずれかとして言及される、プロスタグランジン合成経路の第１酵素である。シクロオキシゲナーゼ−１または１型（ＣＯＸ−１）およびシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）と呼ばれる、シクロオキシゲナーゼの関連する２種の形態が、特徴付けされている。これらの異性体はまた、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｇ／Ｈ Ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＰＧＨＳ）−１およびＰＧＨＳ−２として公知である。両方の酵素は、アラキドン酸をプロスタグランジンＨ２に変換するプロスタノイドの形成における律速段階を触媒する。ＣＯＸ−１は、血小板および内皮細胞中に存在し、そして構成的に活性を示す。これに対し、ＣＯＸ−２は、関節中の内皮細胞、マクロファージ、線維芽細胞および他の細胞中で同定され、そしてこの発現は、炎症促進サイトカイン（例えば、ＩＬ−１およびＴＮＦ−α）によって誘導される。
【０１２３】
炎症した関節において、ＣＯＸ−２の発現は上方制御され、そしてこのＣＯＸ−２の発現は、ＣＯＸ−２の活性の大幅な増加がこの上方制御で同時に発生することが示され、炎症性関節症を患った患者の滑液中に存在するプロスタグランジンの増加した合成に導かれる。関節内のプロスタグランジン（ＰＧ）の細胞供給源には、活性化軟骨細胞、Ａ型またはＢ型滑膜細胞および湿潤性マクロファージが挙げられる。ＰＧによって調整される軟骨の代謝において重要である細胞の機能には、遺伝子発現、細胞外マトリクス合成および増殖が挙げられる。ＣＯＸ−２は、炎症した関節組織において、すなわち炎症のメディエーター（例えば、損傷または外科的外傷の結果として）への曝露後に発現されるので、ＣＯＸ−２インヒビターの使用は、抗炎症活性および軟骨保護活性の両方を提供すると期待される。
【０１２４】
炎症性関節症での軟骨の破壊は、関節の損傷の結果および関節鏡検査の外科的手順の結果として誘発され得る。軟骨細胞は、関節軟骨中の唯一の細胞型であり、ＰＧを含む内因的炎症のメディエーターの放出により、それ自体のマトリクスの分解に関ることが公知である。研究により、正常なヒト関節軟骨細胞中のＣＯＸ−２遺伝子の発現、タンパク質合成およびＰＧ放出が、ＩＬ−１、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６を含むサイトカインによって迅速に誘導されることが示された。ｍＲＮＡのレベルは、サイトカインの導入後２時間程度の速さで検出され、６時間で高いレベルに達し、そして少なくとも７２時間で著しく長期間の発現を示す。同様に、ヒトの滑膜細胞のＩＬ−１αおよびＴＮＦ−α活性化の細胞培養研究により、ＣＯＸ−２の発現およびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の産生の大きな増加が示された。種々のＮＳＡＩＤ（例えば、ケトプロフェン）を用いた処理により、導入されたＰＥＧ２の応答がなくされる。軟骨細胞培養系において、ＰＥＧ２産生の増加を妨げる特定のＣＯＸ−２インヒビター化合物ＮＳ−３９８は、サイトカインにより誘導されるが、ＣＯＸ−１のレベルは、安定したままであった（Ｍｏｒｉｓｓｅｔ，Ｓ．，１９９８，Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２５：１１４６−５３）。従って、ＣＯＸ−２の発現に関連する活性化された軟骨細胞によってＰＧ産物を遮断することで、軟骨保護効果を提供し得ることが推定され得る。
【０１２５】
ＮＳＡＩＤは、変形性関節症または慢性関節リウマチを有する患者の処置に一般に使用されるが、これらの関節炎疾患の状態における関節軟骨代謝に対するそれらの効果は、議論の主題のままである。例えば、ＮＳＡＩＤを有する変形性関節症および慢性関節リウマチの臨床処置は、炎症を軽減するに成功している。しかし、ＣＯＸ−２に対して選択的でないいくつかのＮＳＡＩＤ（主に、サリチル酸塩およびインドメタシン）は、軟骨細胞によってプロテオグリカン合成を減少させるこで、変形性関節症軟骨破壊を加速すると考えられ、一方他のＮＳＡＩＤは、軟骨の修復を刺激することによっていくらかの軟骨保護効果を有すると考えられる。ほとんどの研究により、ＮＳＡＩＤは軟骨に対してほとんどまたは全く効果を有さないことが示された。滑膜炎および軟骨の破壊、続く外傷性関節損傷および外科的外傷の処置において、現在のこのクラスの薬物の使用の欠如に起因して、軟骨の破壊に寄与する病態生理学的機構における各ＮＳＡＩＤの独特の特性を、構築する必要がある。
【０１２６】
２種のＣＯＸイソ酵素が薬理学的に異なるので、抗炎症性治療に有用であるイソ酵素特異的（選択的）シクロオキシゲナーゼインヒビターを開発し、そしてこれらの同一のＣＯＸ−２インヒビターのいくつかを、関節炎のモデルで試験した。しかし、軟骨プロテオグリカンの合成および分解における、ＣＯＸ−２インヒビターのインビトロでの効果、ならびに、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびプロスタノイドの産生は、特定のＮＳＡＩＤがインターロイキンおよびエイコサノイドの軟骨での産生および滑膜での産生におけるインビボのそれらの効果を著しく変え得、その結果、これらのパラメータの一体的な効果は、軟骨の完全性においてＣＯＸ−２インヒビターの結果に影響を与え得る。例えば、いくつかのＮＳＡＩＤは、炎症促進サイトカインの産生を増強するか、または軟骨プロテオグリカン合成を阻害することによって、変形性関節症での関節損傷を加速し得る。しかし、ＣＯＸ−２特異的インヒビターのうちで臨床効果における可能な変動にも関らず、ＣＯＸ−２の阻害により、代表的に、滑膜炎の減少および軟骨損傷の危険性の予想される減少が得られる。
【０１２７】
種々の生化学的アッセイおよび細胞アッセイおよび動物アッセイを展開し、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２アイソフォームのついて、インヒビターの相対的選択性を評価した。一般に、選択性を規定するための判断基準は、所定の生化学的アッセイ系または細胞アッセイ系から得られるＣＯＸ−１／ＣＯＸ−２（またはＣＯＸ−２／ＣＯＸ−１）の阻害定数の比である。この選択比により、顆粒体と細胞アッセイ系（組換えヒトＣＯＸイソ酵素を安定して発現する血小板とマクロファージ細胞株）との間で得られる酵素活性の阻害について、異なる絶対値ＩＣ50を評価する。さらに、ＣＯＸ−２の阻害は、軟骨保護（阻害性）サイトカイン（例えば、ＩＬ−４）によって誘発される阻害効果を模倣し、これにより、細胞内ＣＯＸ−２合成を下方制御する。４５より多いＮＳＡＩＤの選択性および選択的ＣＯＸ−２インヒビターを比較すると（１９９７，Ｃａｎ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７５：１０８８−９５）、ＣＯＸ−２ 対 ＣＯＸ−１について以下の序列の相対的選択性を示した：ＤｕＰ６９７＞ＳＣ−５８４５１＝セレコキシブ（ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ）＞ニメスリド＝メロキシカム＝ピロキシカム＝ＮＳ−３９８＝ＲＳ−５７０６７＞ＳＣ−５７６６６＞ＳＣ−５８１２５＞フロスリド（ｆｌｏｓｕｌｉｄｅ）＞エトドラク＞Ｌ−７４５，３３７＞ＤＦＵ−６１４（７ｎＭ〜１７μＭの範囲のＩＣ50値）。
【０１２８】
選択的ＣＯＸ−２インヒビター（例えば、セレコキシブおよびロテコキシブ（ｒｏｔｅｃｏｘｉｂ））について規定される作用の分子機構および細胞機構から、ならびに動物の研究から、これらの化合物は、洗浄溶液または関節への直接的注射で手術中に適用した場合に、軟骨保護作用を示すことが期待される。特に、ＣＯＸ−２インヒビターは、関節鏡検査の外科手順の間に洗浄溶液で、あるいは外科的手順もしくは他の注射の前、その間、またはその後に、関節へ直接的に注射することにより、送達されるに有効な薬物であると期待される。
【０１２９】
本発明に適切なＣＯＸ−２インヒビターの例が、以下に列挙される。局所送達の全モード（すなわち、注射、注入および洗浄）のために、各適切な薬剤の最適な用量および／または濃度は、治療学的に有効である用量および／または濃度である。例として、列挙される薬剤の各々に対して、列挙した薬剤を含む洗浄溶液の好ましいおよび最も好ましい濃度は、例えば、治療学的に有効であると予想される濃度で提供される。
【０１３０】
【表２２】
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（６．ＭＡＰキナーゼインヒビター）
マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼは、細胞表面から核に信号を伝達する際に、種々の細胞外刺激および機能に応答して活性化される、タンパク質セリン／トレオニンキナーゼの群である。このＭＡＰキナーゼカスケードは、初期遺伝子を媒介するために成長因子、ホルモンおよび炎症性サイトカインからの信号を伝達する主な細胞内シグナル伝達経路の一つである。他のシグナル伝達経路と組合せて、これらの活性化マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）は、リン酸化状態および転写因子の活性を差差的に変化させ、そして細胞増殖、分化および環境的ストレスに対する細胞応答を究極的に調節する。例えば、ＭＡＰＫファミリー（ｐ３８）のメンバーは、強力な炎症促進サイトカイン（ＩＬ−１およびＴＮＦ−α）からの主な生化学的シグナル伝達経路を媒介し、ＣＯＸ−２遺伝子の転写制御に関連するシス作用因子を介して、刺激されたマクロファージ中でのシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）の誘導に導く。
【０１３１】
ＭＡＰキナーゼクラスの薬剤のメンバーは、少なくとも３つのファミリーを構成し、このファミリーは、配列、活性化ループのサイズ、および異なるシグナル伝達経路での細胞外刺激または関与による活性化が異なることで公知である。このＭＡＰキナーゼのファミリーの中で顕著なメンバーとしては、細胞内シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）、ＥＲＫ１およびＥＲＫ２（それぞれｐ４４ＭＡＰＫおよびｐ４２ＭＡＰＫ）；ストレス−活性化タンパク質キナーゼ１（ＳＡＰＫ１）ファミリー（このファミリーはまた、ＪＮＫまたはＮ末端キナーゼファミリーとして言及される）；およびｐ３８ ＭＡＰキナーゼファミリー（このファミリーはまた、ストレス−活性化キナーゼ２／３（ＳＡＰＫ−２／３）として公知である）が挙げられる。ｐ３８キナーゼは、ストレス（最も特に、炎症促進サイトカイン）によって活性化される。ｐ３８ファミリー内で、少なくとも４つの異なるホモログ（アイソタイプまたはイソ酵素）が存在する。この標準的命名法は、それぞれ、ＳＡＰＫ２ａ、ＳＡＰＫ２ｂ、ＳＡＰＫ２ｄ、ＳＡＰＫ３、またはｐ３８α、β、δ（ＳＡＰＫ４）およびγとしていずれかを言及する。本発明の実施に有用であるＭＡＰキナーゼのインヒビターは、上記ＭＡＰキナーゼのいずれか１個または組合せで相互作用し得る。特定のＭＡＰキナーゼインヒビターについて、精製されたインビトロ酵素のアッセイを介しておよび細胞アッセイにおいて特徴付けされた阻害定数が、広範な濃度範囲にわたって変化し得、そしてこの適用での利用を実証し得る。ｐ３８ ＭＡＰキナーゼの活性化は、トレオニンおよびチロシン残基の二重のリン酸化によって媒介される。細胞のＴＮＦ−αとＩＬ−１の両方の処置により、迅速（５分内）にリン酸化を増強し、そしてｐ３８ ＭＡＰキナーゼを活性化することを示した。
【０１３２】
以前の仕事により、小分子のインヒビターが、ｐ３８ キナーゼを特異的に阻害し得（Ｌｅｅ，Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ３７２：７３９−７４６（１９９４））、そして生化学レベルおよび種々の動物モデルにおいて抗炎症性効果を生じることが示された。Ｃｕｅｎｄａおよび共同研究者（Ｃｕｅｎｄａ，Ａ．ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３６４：２２９（１９９５））は、化合物ＳＢ２０３５８０［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール］が、インビトロでｐ３８を阻害（ＩＣ50＝０．６μＭ）し、ＭＡＰＫ活性化プロテインキナーゼ−２の活性を抑制し、そしてインビボでＩＬ−１および細胞ストレスに応答して、熱ショック蛋白（ｈｓｐ）２７のリン酸化を阻害した。ｐ３８に対するＳＢ２０３５８０阻害作用のキナーゼ選択性は、その失敗によって、またはインビトロで少なくとも１５の他のタンパク質キナーゼの最も弱い阻害で実証された。このキナーゼとしては、ＰＫＣ、ＰＫＡ、ｓｒｃおよびレセプターチロシンキナーゼファミリーのメンバーが挙げられる（Ｌｅｅ，Ｊ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．８２：３８９−３９７（１９９９））。細胞の研究において、ＳＢ２０３５８０でのプレインキュベーションにより、酵素のＩＬ−１およびＴＮＦ−α誘導リン酸化および続くＩＬ−８の産生を阻害することが示された。このことは、外科手術の間に、インヒビターを送達する先取り効果を支持する。
【０１３３】
軟骨の破壊から得られる生化学的炎症性応答におけるｐ３８マイトジェン−活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の役割を、ＳＢ２０３５８０を使用して研究し、これは、この酵素を特異的に阻害した。ｐ３８ ＭＡＰＫによって選択的に制御されるＩＬ−１の作用は、プロスタグランジンＨシンターゼ−２（ＣＯＸ−２）、メタロプロテイナーゼ、およびＩＬ−６の調節である（Ｒｉｄｌｅｙ，Ｓら、１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３１６５−７３）。ヒトの線維芽細胞および血管内皮細胞において、ＳＢ２０３５８０は、他の公知のＩＬ−１活性化プロテインキナーゼ経路（ｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰＫ，ｐ５４ ＭＡＰＫ／ｃ−Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ）に影響を与えない線維芽細胞中のｈｓｐ２７（ｐ３８ ＭＡＰＫ活性のインディケーター）のＩＬ−１誘導リン酸化を阻害した（ＩＣ50＝０．５μＭ）。さらに、ＳＢ２０３５８０は、ＩＬ−１−刺激−ＩＬ−６（３０〜５０％（１μＭ））を有意に阻害したが、ヒトの線維芽細胞および内皮細胞からのＩＬ−８の産生を阻害しなかった。
【０１３４】
重要なことは、ＳＢ２０３５８０は、線維芽細胞およびヒト内皮細胞による、ＩＬ−１刺激プロスタグランジンの産生を強力に阻害した。このことは、ＣＯＸ−２タンパク質およびｍＲＮＡの誘発の阻害と関連していた。ＰＧＥ2は、軟骨の破壊の重要なメディエーターであるマトリクスメタロプロテイナーゼの増加した発現に寄与する。滑膜線維芽細胞と軟骨細胞の両方は、サイトカインによる活性化および細胞外刺激で、高いレベルのＣＯＸ−２遺伝子を発現する。ＭＡＰＫインヒビターは、これらの細胞型および他の細胞型において発現するＭＡＰキナーゼの阻害活性に起因して、軟骨保護活性を提供する。
【０１３５】
ＭＡＰＫインヒビターは、種々の炎症性状態または病態生理学的状態において、関節の組織に局所的に適用された場合に、軟骨保護薬として有用であることが期待される。ＳＢ２０３５８０は、インビボで数種の病態生理学的モデルにおいて特徴付けされ、そして長期の経口投与下で活性を有することが実証された。ＳＢ２０３５８０は、ＴＩＭＰ−１の合成に影響を与えることなく、ＩＬ−１によるコラゲナーゼ−１およびストロメライシンー１の産生の刺激を阻害することが見出された。さらに、ＳＢ２０３５８０は、ＩＬ−１刺激コラーゲナーゼ−１およびストロメライシンー１ ｍＲＮＡの増加を防止する。軟骨の破壊のモデルにおいて、短時間のＩＬ−１刺激プロテオグリカンの再吸収およびプロテオグリカン合成の阻害は、ＳＢ２０３５８０によって影響されなかったが、一方で、長時間のコラーゲンの破壊が、防止された。さらに、ＳＢ２０３５８０は、ウシの関節軟骨移植片および軟骨細胞においてＩＬ−１誘導一酸化窒素の産生を阻害するのに有効であることが見出された（Ｂａｄｇｅｒ １９９８）。インビトロでのこれらの観察は、関節中のこれらの組織に直接的または局所的に投与されるＭＡＰキナーゼインヒビターの軟骨保護活性についての基礎を提供する。
【０１３６】
ｐ３８ ＭＡＰキナーゼは、ＴＮＦ−誘導キナーゼの発現に関し、そして、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性のインヒビターとして機能する薬物が炎症促進サイトカインの産生を阻害する（Ｂｅｙａｅｒｔ，Ｒ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．１５：１９１４−２３（１９９６））。細胞のＴＮＦ−α処置により、増加したｐ３８ ＭＡＰＫ自体のリン酸化およびその基質タンパク質の活性化によって示されるように、ｐ３８ ＭＡＰＫ経路を活性化した。ＳＢ２０３５８０を用いた細胞の処置により、タンパク質キナーゼ−２およびｈｓｐ２７リン酸化を活性化するＭＡＰＫのＴＮＦ−α誘導活性を完全に阻害した。同じ条件下で、ＳＢ２０３５８０はまた、ＩＬ−６のＴＮＦ−α誘導合成および２つのＮＦ−６Ｂエレメントを含む最小のプロモータによって駆動されたレセプター遺伝子の発現を完全に阻害した。従って、他のｐ３８インヒビターについての、これらの研究および関連する研究は、インヒビター（例えば、ｐ３８ ＭＡＰＫにおけるＳＢ２０３５８０およびＦＲ１３３６０５）の作用により、軟骨の分解物に結合する種々のタンパク質のＴＮＦ−α−およびＩＬ−１誘導活性を選択的に妨害することを示す。従って、レセプターのキナーゼ下流の阻害によって、これらの鍵となる炎症促進サイトカインの経路をシグナル伝達するＭＡＰキナーゼの選択的な阻害は、ＭＡＰキナーゼインヒビターが軟骨保護効果を提供し得ることを示す。
【０１３７】
ＳＢ２０３５８０を、サイトカイン阻害および炎症性疾患のいくつかの動物モデルにおいて評価した。１５〜２５ｍｇ／ｋｇのＩＣ50値を有するマウスおよびラットの両方において、インビボで炎症性サイトカイン産生の強力なインヒビターであることを実証した。ＳＢ２０３５８０は、ＤＢＡ／ＬＡＣＪマウスのコラーゲン誘導関節炎において治療学的活性を有し、５０ｍｇ／ｋｇの投与により足の炎症の有意な阻害が得られた。抗関節炎活性はまた、ＳＢ２０３５８０が、３０および６０ｍｇ／ｋｇ／日で経口投与された場合に、Ｌｅｗｉｓラットのアジュバンド誘導関節炎において観測された。さらなる証拠が、０．６μＭのＩＣ50での骨再吸収において有利な効果で得られた。
【０１３８】
要約すると、種々の生化学研究、細胞研究および動物研究により、Ｐ３８ ＭＡＰＫがＩＬ−１およびＴＮＦ−αへの応答の制御において重要な役割を果たすこと、ならびにいくらかの炎症性応答遺伝子（例えば、ＣＯＸ−２）のｍＲＮＡレベルの調節に関与していることが示される。ｐ３８のインヒビターは、炎症促進サイトカインの産生を遮断し、そしてＭＭＰの産生を阻害し、そして軟骨移植片のコラーゲン破壊を阻害することが実証された。
【０１３９】
鍵となる炎症促進サイトカイン（例えば、ＩＬ−１およびＴＮＦ−α）の活性を遮断するためのＭＡＰＫの使用は、滑膜線維芽細胞、マクロファージおよび軟骨細胞を含む、関節中の多くの細胞型で有利な効果を有し、これにより、続く病理学的効果（例えば、炎症性細胞の関節への侵入、滑膜の増殖、滑膜細胞の活性化、および軟骨の破壊）を阻害する。従って、ＭＡＰＫインヒビターは、上述のサイトカインによる炎症性応答の伝播を遮断し、これにより、疾患プロセスを妨害する。
【０１４０】
本発明に適切なＭＡＰＫインヒビターの例は、以下に列挙される。局所送達の全モード（すなわち、注射、注入および洗浄）のために、各適切な薬剤の最適な用量および／または濃度は、治療学的に有効である用量および／または濃度である。例として、列挙される薬剤の各々に対して、列挙した薬剤を含む洗浄溶液の好ましいおよび最も好ましい濃度は、例えば、治療学的に有効であると予想される濃度で提供される。
【０１４１】
【表２３】
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（７．マトリクスメタロプロテイナーゼのインヒビター）
関節軟骨の破壊は、関節疾患（例えば、変形性関節症および慢性関節リウマチ）の共通した特徴であるが、関節へ損傷に続いて発生する。病態生理学的に、軟骨の生化学特性を損なう、プロテオグリカンおよびコラーゲンの構造破壊が観測される。正常な健康な細胞外マトリクスの維持は、生合成およびマトリクス成分の取り込みの速度と、それらの分解および軟骨から滑液への続く損失の速度との間の平衡を反映する。種々のプロテアーゼは、軟骨を分解する能力を有し、分解プロセス（最も著しくは、マトリクスプロテイナーゼ）に関与する。
【０１４２】
マトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）またはマトリキシン（ｍａｔｒｉｘｉｎ）は、細胞外で機能する少なくとも１５個の亜鉛エンドペプチダーゼのファミリーであり、そして組織の病理学的な分解において鍵となる役割を果たす。ＭＭＰのメンバーの現在の命名法および別名を、表２３に提供する。ほとんどのＭＭＰは、高度に制御され、そしてほとんどのＭＭＰは、正常の組織において構成的に発現されない。しかし、炎症促進サイトカイン（例えば、ＩＬ−１およびＴＮＦ−α）は、転写および発現を開始する。組織分解ＭＭＰの上方制御および活性化によって生じる不均衡は、関節損傷後の慢性炎症性疾患および持続性滑膜炎症性応答の間に、軟骨破壊プロセスの第１の原因となる因子である。軟骨マトリクスの代謝が、膝の半月板損傷または前十字靱帯断裂のいずれかを有する患者において研究されている。ストロメライシン−１（ＭＭＰ−３）、コラゲナーゼ、メタロプロテイナーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰ−１）、およびプロテリオグリカンフラグメントの濃度が、膝損傷の治療後に、ヒトの膝滑液中で増加することが示された。時間的に、これらの値は、参照のレベルを上回って即座に上昇し、そして１年の期間にわたって有意に上昇（１０倍の増加）したままであった。これらの変化は、膝の靭帯損傷後に、滑液において観測されるプロテオグリカンフラグメントの濃度の増加をおそらく駆動する。
【０１４３】
【表２４】
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ＭＭＰファミリーの酵素は、ヒト軟骨細胞から、および滑膜の細胞（例えば、滑膜線維芽細胞）によって分泌されることが示されている。さらに、インサイチュハイブリダイゼーションを用いて、ヒト滑膜がストロメライシン−１およびコラゲナーゼの両方を合成することが示された。ストロメライシン−１（ＭＭＰ−３）は、軟骨基質の全ての成分を分解し得る。軟骨細胞が、基質分解酵素であるコラゲナーゼ−３の放出によって軟骨分解に寄与するという証拠が存在する。炎症促進サイトカインによる活性化によって、ＭＭＰは、細胞から潜伏形態で分泌され、細胞外で活性化され、そしてメタロプロテイナーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰ）によって阻害される。ＭＭＰの活性化とＴＩＭＰの活性化との間のバランスは、インタクトな軟骨基質の維持のために重要であると考えられる。変形性関節症および慢性関節リウマチのような病理学的条件下で、いくつかの研究は、上昇した量のＭＭＰを示し、観察された軟骨破壊についての原因であると考えられる、ＭＭＰとＴＩＭＰとの間の不均衡を生じた。
【０１４４】
ＭＭＰは、軟骨細胞および滑膜細胞（ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅ）に対して作用するサイトカイン（例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）および増殖因子）によって調節されて、それらのプロテアーゼ産生を増強する。他の炎症促進サイトカイン（例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦ−α）もまた、基質分解酵素の産生をアップレギュレートする。これは、軟骨破壊をもたらし、軟骨破壊は通常、硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の喪失およびコラーゲンの切断として評価される。ＩＬ−１は、関節炎疾患を有する患者の関節液に存在し、軟骨細胞が上昇した量の酵素（例えば、ストロメライシン、線維芽細胞および好中球のコラゲナーゼ、ならびにプラスミノーゲンアクチベーター）を合成するのを刺激する。さらに、ＩＬ−１は、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１およびＴＩＭＰの合成を阻害し、そしてまた、コラーゲンのような基質成分の合成を阻害する。インヒビターのレベルと酵素のレベルとの不均衡は、活性なプロテアーゼの量における増加をもたらし、そして基質生合成の抑制と組み合わさって、軟骨分解をもたらす。
【０１４５】
軟骨スライスをインビトロモデルとして用いて、コラゲナーゼインヒビターが、リウマチ様滑膜線維芽細胞（ＲＳＦ）による関節軟骨のＩＬ−１刺激浸潤またはＩＬ−８刺激浸潤のいずれかを阻害し得ることが示された。コラゲナーゼインヒビターである、１，１０−ｏ−フェナントロリンおよびホスホラミドン（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ）は、１０〜１５０μＭの濃度で、ＲＳＦ細胞による軟骨の濃度依存性浸透を実質的に阻害した。プロテイナーゼの分泌に対するサイトカインの選択的効果は、滑膜線維芽細胞様細胞が媒介する関節分解が、非常に調節されているプロセスであることを実証する。従って、関節内で局所的にプロテアーゼ活性および関連した基質分解を阻害する能力は、軟骨破壊プロセスを阻害すると予測される。制限されたインビトロ系におけるインヒビターの作用は、適切な薬物動態（ｐｈａｒｍｏｋｉｎｅｔｉｃ）を伴った合成ＭＭＰインヒビターの局所送達を用いた治療的介入が、軟骨保護剤（ｃｈｏｎｄｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）として有効であることを示唆する。
【０１４６】
本発明のために適切なＭＭＰインヒビターの例としては、Ｕ２４５２２（（Ｒ，Ｓ）−Ｎ−［２−［２−（ヒドロキシルアミノ）−２−オキソエチル］−４−メチル−１−オキソペンチル］−Ｌ−ロイシル−Ｌ−フェニルアラニアミド）、ペプチド（例えば、ＭＭＰインヒビターＩおよびＭＭＰ−３インヒビター）、ならびにより大きなタンパク質（例えば、ＴＩＭＰ−１）またはそれらのフラグメントが挙げられ、これらは、以下の表に列挙される：局所送達の全ての形態（すなわち、注射、注入および灌注）について、各適切な薬剤の最適な用量および／または濃度は、治療的に有効である用量および／または濃度である。一例として、列挙した薬剤の各々について、上記に列挙した薬剤を含む、好ましい濃度および最も好ましい濃度の灌注溶液は、治療的に有効であると予想されるような濃度で提供される。
【０１４７】
【表２５】
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（８．核因子κＢ（ＮＦκＢ）のインヒビター）
炎症促進性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）および軟骨破壊性細胞経路は、新規な治療的局所薬物送達について標的化される、細胞外シグナル伝達機構および細胞内シグナル伝達機構によって調節される。炎症促進サイトカインインターロイキン−１（ＩＬ−１）によって転写因子である核因子κＢ（ＮＦκＢ）を活性化するために利用される競合性分子シグナル伝達機構は、ほとんど規定されていない。それにもかかわらず、遺伝子転写のレベルで細胞内シグナル伝達に関与する重要な分子は、炎症促進転写因子（ＮＦκＢ）である。ＮＦκＢ活性は、ホモダイマーまたはヘテロダイマーのいずれかの形態でＤＮＡに結合する転写因子サブユニットのファミリーによって媒介される。これらのサブユニットは代表的に、細胞の細胞質内に、ＩκＢと呼ばれる阻害性サブユニットの結合に起因して不活性な形態で存在する。ＩＬ−１レセプターの活性化、および他の細胞外シグナルは、ＩκＢの分解およびインヒビターからのＮＦκＢの付随した解離、続いて核へのトランスロケーションを誘導する。ＮＦκＢは、ＩＬ−１誘導性発現に関与することが見出され、そして炎症促進ＣＯＸ−２タンパク質の発現をＲＡ滑膜線維芽細胞において上昇させ得た。
【０１４８】
重要な分子標的としてのＮＦκＢの同定は、関節炎症経路および軟骨破壊経路と結びついたいくつかの重要の炎症のメディエーターの遺伝子発現を調節する共通の下流のシグナル伝達エレメントとしてのその役割に基づく。多くの遺伝子（ＣＯＸ−２、コラゲナーゼ、ＩＬ−６、ＩＬ−８）の応答は、両方のＮＦκＢプロモーターエレメントを含むプロモーターによって支配される。ＮＦκＢの活性化は、炎症プロセスに重要な多くのタンパク質（例えば、サイトカイン、細胞接着分子、メタロプロテイナーゼ、ならびに滑膜細胞におけるプロスタグランジンおよびロイコトリエン（ＣＯＸ−２）の産生に関与する他のタンパク質）の誘導を媒介する。従って、この転写因子は、ヒト滑膜線維芽細胞、ヒト関節軟骨細胞、ならびに関節における他の細胞の傷害応答に対して指向される治療において生理学的に重要な標的を表す。
【０１４９】
特に、ヒトリウマチ様滑膜線維芽細胞（ＲＳＦ）のインターロイキン１β（ＩＬ−１β）への曝露が、８５−ｋＤのホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）および誘導性シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ２）の協調したアップレギュレーションをもたらすことが示された。一緒になって、これらの２つの酵素は、関節における主な炎症のメディエーターであるＰＧＥ2のその後の生合成を促進する。オリゴヌクレオチドオトリおよびアンチセンスを用いて、プロスタノイド代謝酵素の調節における（ＮＦκＢ）の関与を実証した。アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてＮＦκＢ ｍＲＮＡを拮抗することは、ＣＯＸ遺伝子プロモーターへの結合の減少をもたらした。
【０１５０】
マウスの天然産物であるヒメニアルジシン（ｈｙｍｅｎｉａｌｄｉｓｉｎｅ）は、ＮＦκＢ活性化のインヒビターとして近年特徴付けられ、そして、ＩＬ−１刺激ＲＳＦの曝露は、ＰＧＥ２産生を濃度依存性様式で阻害した（ＩＣ50＝１μＭ）。分子標的の特異性を、不活性である、アナログの１つであるアルジシン（ａｌｄｉｓｉｎｅ）、およびプロテインキナーゼＣインヒビターであるＲＯ ３２−０４３２の使用によって示した。ＩＬ−１誘導性ＮＦκＢ活性化に対するヒメニアルジシンの直接的作用は、古典的κＢコンセンサスモチーフに対するＮＦκＢ結合における顕著な減少（約８０％）および処理された細胞の細胞質ゾルからの刺激されたｐ６５移動の阻害によって実証された。ＮＦκＢ転写調節のインヒビターについて予測されるように、ヒメニアルジシン処理ＲＳＦは、ＩＬ−１に応答して、ＣＯＸ−２またはＰＬＡ２のいずれについてもｍＲＮＡを転写しなかった。その結果、これらの酵素についての減少したタンパク質レベルおよびＰＧＥ２を産生する能力における減少が観察された。さらに、ＩＬ−１刺激インターロイキン−８（ＩＬ−８）の産生は、ＮＦκＢによって調節される事象であることが公知であり、この産生もまた、ヒメニアルジシンによって阻害され、一方、血管内皮増殖因子（ＮＦκＢによって調節されない遺伝子）のＩＬ−１誘導性産生は、ヒメニアルジシンへの曝露によって影響を受けなかった。従って、ヒメニアルジシンは、ＮＦκＢ活性化に対するその阻害効果を通して、ＩＬ−１によって刺激される、ＰＧＥ２の滑膜線維芽細胞形成を阻害する。これは、関節での炎症および軟骨破壊におけるＮＦκＢの役割をブロックする新規なインヒビターとしてのその用途を規定する基礎を提供する。
【０１５１】
本発明に適切なＮＦκＢインヒビターの例を以下に列挙する。局所送達の全ての形態（すなわち、注射、注入および灌注）について、各適切な薬剤の最適な用量および／または濃度は、治療的に有効である用量および／または濃度である。一例として、列挙した薬剤の各々について、上記に列挙した薬剤を含む、好ましい濃度および最も好ましい濃度の灌注溶液は、治療的に有効であると予想されるような濃度で提供される。
【０１５２】
【表２６】
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（９．一酸化窒素シンターゼインヒビター）
一酸化窒素（ＮＯ）は、いくつかの結合組織疾患の病態生理学的機構に関与する、広く行き渡った細胞内メディエーターおよび細胞間メディエーターである。ＮＯは、細胞内に局在する酵素のファミリーであるＮＯシンターゼによってＬ−アルギニンから形成される。ＮＯシンターゼの３つのイソ型がクローニングされ、そして配列決定された。内皮細胞ＮＯシンターゼ（ｅｃＮＯＳ）および脳ＮＯシンターゼ（ｂＮＯＳ）は、構成的に活性である。ＮＯシンターゼの別のイソ型である、誘導性ＮＯＳ（ｉＮＯＳ）は、多くの細胞型（軟骨細胞を含む）において見出される。誘導性ＮＯＳは、基底条件では存在しないが、炎症促進メディエーター（例えば、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−α）に応答してアップレギュレートされる。近年の知見は、ＩＬ−１が軟骨細胞ＮＯ合成の非常に強力な刺激因子であること、およびＩＬ−１がｉＮＯＳのレベルをアップレギュレートするその能力を通して作用することを示す。関節内で、軟骨細胞は、ＮＯの主な供給源であり、そして炎症促進サイトカインによって誘導される軟骨細胞ｉＮＯＳは、炎症性関節症におけるＩＬ−１の多くの効果を媒介すると考えられる。
【０１５３】
軟骨細胞誘導性ＮＯシンターゼ（ｉＮＯＳ）を特異的に阻害する薬物は、関節の傷害（例えば、関節に関連する手術手順）に起因して生じる軟骨破壊の予防において治療的役割を有し得る。このような有益な治療効果を支持する証拠は、変形性関節症を有する患者由来の培養された軟骨細胞および軟骨の外植片における誘導性ＮＯシンターゼ活性を阻害する能力について種々のｉＮＯＳインヒビターを評価したかなりの数の研究に基づく。Ｓ置換イソチオウレアと名付けられたあるクラスの化合物は、軟骨におけるＮＯ生合成の強力なインヒビターとして特徴付けられた。Ｓ−メチルイソチオウレアおよびＳ−（アミノエチル）イソチオウレアは、ＮG−モノメチル−Ｌ−アルギニンよりも２〜４倍より強力であり、アミノグアニジンよりも５〜１０倍より強力であり、そしてＮω−ニトロ−Ｌ−アルギニンおよびＮω−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステルよりも３００倍よりもさらに高く強力であった。これらのイソチオウレア化合物は、軟骨においてｉＮＯＳの強力でかつ比較的特異的な、従って、近年の発明（Ｊａｎｇ、Ｄ．、１９９６、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３１２：３４１−３４７）における局所送達に適切である、クラスのインヒビターを提供する。
【０１５４】
ＮＯシンターゼインヒビターの軟骨保護治療的可能性もまた、インビトロ系（例えば、単離された軟骨細胞）を用いて評価されて、軟骨基質に対する効果が規定された。確立されたＮＯシンターゼインヒビターであるＮG−モノメチル−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＭＭＡ）による内因性ＮＯ産生の阻害は、ＩＬ−１β刺激軟骨細胞によるゼラチナーゼ、コラゲナーゼおよびストロメライシンの産生の抑制をもたらす。ＮＯ産生の阻害はまた、ＩＬ−１βに対する軟骨細胞の曝露から生じるラクテート産生における増加を部分的に低減する。Ｌ−ＮＭＭＡを用いた軟骨フラグメントの処置は、グリコサミノグリカン合成のＩＬ−１β阻害効果を部分的に逆転させ、ＩＬ−１β刺激ＭＭＰ活性を阻害し、そしてＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）産生を増加させる。ＮＯはまた、ＩＬ−１βに曝露された軟骨細胞によるＴＧＦ−β１の産生を減少させることによってプロテオグリカン合成を直接的に調節し得る。ＮＯは、ＴＧＦ−β１における自己分泌刺激増加を妨げ、従って、軟骨細胞におけるこのサイトカインのアナボリック効果を減少させる。
【０１５５】
研究は、新たなアミノグアニジンであるＳ−メチルイソチオウレア（ＳＭＴ）、Ｓ−メチルエチルイソチオウレア（ＡＥＴＵ）、Ｌ−ＮＭＭＡおよびＮ−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）というＮＯＳインヒビターの、プロテオグリカン合成およびＮＯ産生における組換えヒトＩＬ−１応答の阻害効果に対する効力を比較した。種々の培養系は、濃度依存様式でＩＬ−１β投与に対して、ＮＯ産生における大きな増加およびプロテオグリカン合成の顕著な抑制を伴って応答することを示した。上記のＮＯＳインヒビター（１〜１０００μＭにて）は、ＩＬ−１βで処理した軟骨細胞によるＮＯ産生を阻害し、そして軟骨細胞内のプロテオグリカン合成を修復する際に顕著な効果を有した。それゆえ、治療的に有効な濃度および用量を用いてＮＯ産生がブロックされ得る場合、プロテオグリカン合成のＩＬ−１β阻害が妨げられる。
【０１５６】
ＮＯシンターゼは、関節性疾患を有する患者の関節から得られる軟骨において発現される。慢性関節リウマチまたは変形性関節症のいずれかを提示する患者において、滑液において上昇したレベルの亜硝酸塩が観察され、そしてこれらの患者におけるＮＯ産生の顕著な供給源は、関節軟骨から誘導されることが示された。さらに、ｉＮＯＳの強力なインヒビターであるＬ−ＮＩＬ（ＡＣＬの分泌によって誘導される）の持続した全身送達は、イヌにおいて実験的なＯＡの進行を減少させ、そしてＩＬ−１β、ＰＧＥ2、ＮＯおよびＭＭＰの産生におけるかなりの減少を引き起こすことが見出された。これらの知見は、ＮＯがＩＬ−１βの効果の強力な調節因子であり、そして関節性疾患の病態生理学に対して寄与することを示唆する。
【０１５７】
従って、これらのインビトロおよびインビボでの結果は、滑膜の炎症の臨床的処置のための潜在的な新規の薬物であるＮＯシンターゼの特異的インヒビターを示し、そして手術によって処置された関節または他の傷害を受けた関節を処置するために抗炎症クラス、軟骨保護クラス、および抗疼痛クラスから選択される１以上の薬物と組み合わせて局所的に送達された場合、軟骨保護効果を提供し得る。
【０１５８】
本発明に適切なＮＯシンターゼインヒビターの例を以下に列挙する。局所送達の全ての形態（すなわち、注射、注入および灌注）について、各適切な薬剤の最適な用量および／または濃度は、治療的に有効である用量および／または濃度である。一例として、列挙した薬剤の各々について、上記に列挙した薬剤を含む、好ましい濃度および最も好ましい濃度の灌注溶液は、治療的に有効であると予想されるような濃度で提供される。１つの実施形態では、本発明の溶液に含まれるのに好ましいＮＯシンターゼインヒビターは、ｉＮＯＳの選択的な、ゆっくりで、強力な結合インヒビターである、１４００Ｗ（（Ｎ−３−（アミノメチル）ベンジル）アセタミジン）、ジフェニレンヨードニウムおよび１，３−ＰＢＩＴである。
【０１５９】
【表２７】
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（１０．細胞接着分子）
（１０ａ インテグリンアゴニストおよびアンタゴニスト）
インテグリンは、原形質膜に存在するヘテロダイマーレセプターであり、このレセプターは、細胞外基質（ＥＣＭ）成分であるかまたは他の大きなタンパク質（例えば、コラーゲン、ラミニン、ビトロネクチン、オステオポンチン（ＯＰＮ）およびフィブロネクチン（ＦＮ））であり得るリガンドに結合する、αサブユニットおよびβサブユニットを含む。軟骨基質の分解は、軟骨細胞によって、これらの細胞とＥＣＭとの相互作用に依存する機構を通して調節される。軟骨細胞遺伝子発現は部分的に、軟骨細胞を取り囲む環境における、インテグリンとＥＣＭの成分との相互作用を含む細胞接触を通して制御される。それ故、軟骨細胞上のインテグリンは、軟骨ホメオスタシスの制御に関与し、そしてこのファミリーのレセプターは、軟骨分解を妨げるためのあるクラスの治療標的を表す。
【０１６０】
ヒト軟骨細胞は、別々のαサブユニットおよびβサブユニット（α1β1、α5β1、αＶβ1およびより少ない量の他のものを含む）から構成される多数のインテグリンレセプターを発現する。特に重要なのは、αＶβ3インテグリンであり、これは、ＯＰＮに結合することが公知である。αＶβ3複合体特異的機能をブロックするモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＬＭ６０９は、リガンドであるＯＰＮと類似した様式でアゴニストとして作用する。ＬＭ６０９は、多数の炎症促進性および軟骨破壊性メディエーター（例えば、ＩＬ−１、ＮＯおよびＰＧＥ２）の産生を減らす。従って、拮抗性ｍＡｂ ＬＭ６０９は、本発明における使用のために適切であると考えられる。
【０１６１】
さらに、２つのペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）（ＭＫ−３８３（Ｍｅｒｃｋ）およびＲＯ４４８３（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−ＬａＲｏｃｈｅ））は、第ＩＩ相臨床試験（ｃｌｉｎｉｃａｌｓ）において研究されている。これらは２つとも低分子であるため、短い半減期および高い効力を有する。しかし、これらはまた、あまり特異的ではなく、他の密接に関連したインテグリンと相互作用するようである。これらのペプチド模倣物はまた、本発明における使用に適切である。
（表２８ インテグリンの治療的濃度および好ましい濃度）
【０１６２】
【表２８】
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（１１．抗走化性因子）
抗走化性因子は、炎症性細胞の走化性を防ぐ。これらの因子が作用する抗走化性標的の代表例としては、Ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅレセプター、ＩＬ−８レセプター、ＭＣＰ−１レセプター、およびＭＩＰ−１−Ｉ／ＲＡＮＴＥＳレセプターが挙げられるが、これらに限定されない。このクラスの薬剤に含まれる薬物は、開発の初期段階であるが、この薬物は、本発明の使用に適切であり得ると推定される。
【０１６３】
（１２．細胞内シグナル伝達インヒビター）
（１２ａ．プロテインキナーゼインヒビター）
（ｉ．プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）インヒビター）
プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）は、多数の生理学的プロセスについての細胞表面シグナル伝達において重要な役割を果たす。ＰＫＣアイソザイムは、Ｇタンパク質結合レセプター（例えば、セロトニン、ブラジキニンなど）または炎症促進サイトカインレセプターのいずれかの最初の活性化から生じる下流標的として活性化され得る。これらのレセプターのクラスの両方は、軟骨破壊の媒介において重要な役割を果たす。
【０１６４】
分子クローニング分析は、ＰＫＣが少なくとも８の亜種（アイソザイム）からなる大きなファミリーとして存在することを明らかにした。これらのアイソザイムは、構造およびレセプター活性化を特定の細胞の増殖応答における変化と結び付ける機構において実質的に異なる。特定のアイソザイムの発現は、以下を含む広範な種々の細胞型において見出される：滑膜細胞（ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅ）、軟骨細胞、好中球、骨髄性細胞、および平滑筋細胞。従って、ＰＫＣのインヒビターは、インヒビターがアイソザイム特異性を示さなければ、いくつかの細胞型においてシグナル伝達経路をもたらすようである。従って、ＰＫＣのインヒビターは、滑膜細胞および軟骨細胞の活性化をブロックする際に効果的であると予測され得、そしてまた、好中球活性化およびその後の付着をブロックする際に抗炎症効果を有し得る。いくつかのインヒビターが記載されており、そして最初の報告は、ｃａｌｐｈｏｓｔｉｎＣ阻害活性についての５０μＭのＩＣ50を示す。Ｇ−６２０３（Ｇｏ６９７６としても公知）は、２〜１０μＭ範囲におけるＩＣ50値で特定のＰＫＣアイソタイプについて高い選択性を有する、新しい強力なＰＫＣインヒビターである。これらの薬物および本発明における使用に適切と考えられる別の薬物（ＧＦ１０９２０３Ｘ（Ｇｏ６８５０またはビスインドリルマレイミドＩとしても公知）（Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔから入手可能））の濃度を以下に述べる。
（表２９ 軟骨破壊阻害剤の治療的濃度および好ましい濃度）
【０１６５】
【表２９】
2007077165.tif 000033
（ｉｉ．プロテインチロシンキナーゼインヒビター）
レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）ファミリーの多数のメンバーの間には、多大な多様性が存在するが、これらのレセプターにより使用されるシグナル伝達機構は、多くの共通する特徴を共有する。生化学および分子工学の研究は、ＲＴＫの細胞外ドメインへのリガンドの結合が、細胞内ドメインの内因性のチロシンキナーゼ触媒活性を急速に活性化することを示した（図５を参照のこと）。増加した活性は、共通の配列モチーフを含む多数の細胞内基質のチロシン特異的リン酸化を生じる。結果的に、これは、多数の「下流」シグナル伝達分子の活性化、ならびにリン脂質代謝、アラキドン酸代謝、タンパク質リン酸化（プロテインキナーゼ以外の機構を含む）、カルシウム動員および転写活性を調節する細胞内経路のカスケードを引き起こす（図２を参照のこと）。ＲＴＫ細胞質ドメインの成長因子依存性チロシンキナーゼ活性は、細胞増殖をもたらす細胞内シグナルを生成するための主な機構である。従って、インヒビターは、このシグナル伝達をブロックし、それにより滑膜細胞および軟骨細胞の活性化を妨げる潜在能力を有する。
【０１６６】
いくつかの関連するチルホスチン（ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ）化合物のいずれかは、チロシンキナーゼ活性の特異的インヒビターとしての能力を有する（０．５〜１．０μＭ範囲のインビトロでのＩＣ50）。なぜならば、これらの化合物は、他のプロテインキナーゼおよび他のシグナル伝達系に対してほとんど影響を及ぼさないからである。現在までに、多くのチルホスチン化合物のうちわずかしか市販されておらず、そしてこれらの薬剤の本発明において使用される場合の適切な濃度は、以下に示される。さらにスタウロスポリン（ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）は、ｓｒｃサブファミリーのいくつかのプロテインチロシンキナーゼに対する強力な阻害効果を示すことが報告されており、そして本発明において使用される場合のこの薬剤の適切な濃度もまた、以下に述べられる。
（表３０ 阻害剤の治療的濃度および好ましい濃度のモジュレーター）
【０１６７】
【表３０】
2007077165.tif 000034
（１２ｂ．細胞内プロテインチロシンホスファターゼ）
ｓｒｃ−ｈｏｍｏｌｏｇｙ2 ＳＨ２ドメインを含む非膜貫通プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰａｓｅ）は、公知であり、そしてこれらの名称は、ＳＨ−ＰＴＰ１およびＳＨ−ＰＴＰ２という。さらに、ＳＨ−ＰＴＰ１は、ＰＴＰ１Ｃ、ＨＣＰまたはＳＨＰとしても公知である。ＳＨ−ＰＴＰ２は、ＰＴＰ１ＤまたはＰＴＰ２Ｃとしても公知である。同様に、ＳＨ−ＰＴＰ１は、全ての直系および全ての分化段階の造血細胞において高いレベルで発現され、そしてＳＨ−ＰＴＰ１遺伝子は、虫食い状（ｍｏｔｈｅａｔｅｎ）（ｍｅ）マウス表現型の原因であると同定されており、そしてこれは、細胞基質との相互作用をブロックするインヒビターの効果を推測するための基礎を提供する。走化性ペプチドでの好中球の刺激は、好中球応答を媒介するチロシンキナーゼの活性化を生じることが公知であり（Ｃｕｉら、１９９４ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、そしてＰＴＰａｓｅ活性は、細胞刺激の最初の段階において活性化されたチロシンキナーゼの効果を逆方向にすることにより、アゴニスト誘導活性を調節する。ＰＴＰａｓｅ活性を刺激し得る薬剤は、抗炎症のメディエーターとして潜在的な治療的適用を有し得る。
【０１６８】
これらの同じＰＴＰａｓｅはまた、特定のＲＴＫの活性を調節することが示されてきた。これらは、活性化レセプターキナーゼの効果を相殺するようであり、従って重要な薬物標的を提示し得る。インビトロでの実験は、ＰＴＰａｓｅの注射が、内因性タンパク質上のチロシル残基のインスリン刺激リン酸化をブロックすることを示す。ＰＴＰａｓｅの活性化のアクチベーターは、再狭窄におけるＰＴＫレセプター作用の活性化を逆にするように作用し得、そして本発明の溶液において有用であると考えられる。さらに、レセプター連結ＰＴＰａｓｅはまた、細胞接着分子のＰＴＰａｓｅと同様に、細胞外リガンドとして機能する。リガンドの細胞外ドメインへの結合の機能的結果は、まだ規定されていないが、結合が細胞内でホスファターゼ活性を調節するのに役立つと仮定することは妥当である（ＦａｓｈｅｎａおよびＺｉｎｎ、１９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５，１３６７−１３６９）。このような作用は、他の細胞表面接着分子（ＮＣＡＭ）により媒介される接着をブロックし得、そして抗炎症性効果を提供する。このような適用のために開発された薬物はまだない。
【０１６９】
（１２ｃ．ＳＨ２ドメイン（ｓｒｃＨｏｍｏｌｏｇｙ2ドメイン）の阻害）
ＳＨ２ドメイン（元々プロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）のｓｒｃサブファミリーで同定された）は、非触媒的タンパク質配列であり、そして種々のシグナル伝達タンパク質の間で保存される約１００個のアミノ酸からなる（Ｃｏｈｅｎら、１９９５）。ＳＨ２ドメインは、ホスホチロシン結合モジュールとして機能し、それにより、細胞内のシグナル伝達経路における重要なタンパク質−タンパク質結合を媒介する（Ｐａｗｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，５７３−５８０，１９９５）。特に、ＳＨ２ドメインの役割は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）レセプターの場合のように、レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）媒介シグナル伝達に重要であると、明確に規定された。自己リン酸化ＲＴＫ上のホスホチロシン含有部位は、ＳＨ２−タンパク質の結合部位として作用し、それにより、生化学的シグナル伝達経路の活性化を媒介する（図２を参照のこと）（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｇ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．６：３２８３−３２８９，１９９２；Ｓｉｅｒｋｅ，Ｓ．およびＫｏｌａｎｄ、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１０１０２−１０１０８，１９９３）。ＳＨ２ドメインは、活性化成長因子レセプターの細胞応答への結合を担い、この応答は、遺伝子発現における変更、および最終的に細胞増殖を含む。従って、滑膜細胞表面上に発現される特定のＲＴＫ（ＩＧＦＲおよびＦＧＦＲを除く）の活性化の効果を選択的にブロックするインヒビターは、関節鏡検査手順後の軟骨分解をブロックする際に効果的であると予測される。
【０１７０】
少なくとも２０の細胞質ゾルタンパク質は、ＳＨ２ドメインを含み、そして細胞内シグナル伝達において機能すると同定されている。ＳＨ２ドメインの分布は、特定のタンパク質ファミリーに限られず、いくつかのクラスのタンパク質、プロテインキナーゼ、脂質キナーゼ、タンパク質ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、Ｒａｓ制御タンパク質およびいくつかの転写因子において見出される。多くのＳＨ２含有タンパク質は、既知の酵素活性を有するが、他のタンパク質（Ｇｒｂ２およびＣｒｋ）は、細胞表面レセプター間の「リンカー」および「アダプター」ならびに「下流」エフェクター分子として機能する（Ｍａｒｅｎｇｅｒｅ，Ｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３６９：５０２−５０５，１９９４）。シグナル伝達の際に活性化される酵素活性を有するＳＨ２ドメイン含有タンパク質の例としては、プロテインチロシンキナーゼのｓｒｃサブファミリー（ｓｒｃ（ｐｐ６０c-src）、ａｂｌ、ｌｃｋ、ｆｙｎ、ｆｇｒなど）、ホスホリパーゼＣγ（ＰＬＣγ）、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ−３−キナーゼ）、ｐ２１−ｒａｓ ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）およびＳＨ２含有プロテインチロシンホスファターゼ（ＳＨ−ＰＴＰａｓｅ）が挙げられるが、これらに限定されない（Ｓｏｎｇｙａｎｇら、Ｃｅｌｌ ７２，７６７−７７８，１９９３）。活性化細胞表面レセプターから最終的に細胞応答を規定するさらなる分子相互作用のカスケードへシグナルを伝達する際のこれらの種々のＳＨ２−タンパク質が占める中心的役割に起因して、特定のＳＨ２タンパク質（例えば、ｃ−ｓｒｃ）結合をブロックするインヒビターは、軟骨保護の潜在的な治療的適用を有する薬剤として望ましい。
【０１７１】
さらに、多くの免疫／炎症応答の調節が、ＳＨ２ドメインを含む非レセプターチロシンキナーゼを介してシグナルを伝達するレセプターにより媒介される。抗原特異的Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）を介するＴ細胞活性化は、リンホトキシン分泌およびＴ細胞増殖をもたらすシグナル伝達カスケードを開始する。ＴＣＲ活性化に続く最も初期の生化学的応答の１つは、チロシンキナーゼ活性の増加である。特に、好中球活性化は、細胞表面免疫グロブリンＧレセプターの応答により部分的に制御される。これらのレセプターの活性化は、ＳＨ２ドメインを有することが既知である、同定されていないチロシンキナーゼの活性化を媒介する。いくつかのｓｒｃ−ファミリーキナーゼ（ｌｃｋ、ｂｌｋ、ｆｙｎ）が、サイトカインおよびインテグリンレセプターからのシグナル伝達に関与し、従っていくつかの独立したレセプター構造から受ける刺激を統合するように作用し得ることを、さらなる証拠が示す。従って、特定のＳＨ２ドメインのインヒビターは、多くの好中球機能をブロックする能力を有し、そして抗炎症のメディエーターとして作用する。
【０１７２】
ＳＨ２ドメインを標的とする薬物を開発する努力は、現在では生化学的インビトロレベルおよび細胞レベルで行われている。このような努力が成功すると、得られる薬物は、本発明の実施において有用であると予測される。
【０１７３】
（ＩＩＩ．抗疼痛剤および／または抗炎症剤ならびに軟骨保護溶液において使用される他の薬剤の治療的組合せから誘導される共力作用性相互作用）
関節鏡治療手順後の炎症および軟骨ホメオスタシスの損失に関連する疾患プロセスの複雑性、ならびに関与する分子標的の多重性を考慮すると、単一の分子標的の遮断または阻害は、軟骨分解および変形性関節症の発症の予防における適切な有効性を提供するようである。実際、異なる個々の分子レセプターおよび／または酵素を標的化した多数の動物研究は、動物モデルにおいて効果的であることを証明されていないか、または今までの臨床試験において有効性が得られていない。従って、個々の分子標的に作用し、かつ局所的に送達される薬物の治療用組合せは、軟骨保護への治療的アプローチにおける臨床的有効性のために望ましいようである。以下に示されるように、この共力作用性分子標的化治療についての理論的解釈は、基本的な生化学的機構の理解における最近の進歩に由来し、これにより、滑液および軟骨中の滑膜細胞および軟骨細胞が、関節鏡手順の間に曝される刺激を伝達および統合する。
【０１７４】
（主要なシグナル伝達経路における「クロストーク」および収束）
細胞シグナル伝達を担う分子スイッチは、伝統的に主要な別個のシグナル伝達経路に分けられ、各々の経路は、細胞外刺激の特定の組についてのトランスデューサーとして作用しそして別個の細胞応答を媒介するタンパク質ファミリーの別々の組を含む。このような経路の１つは、神経伝達物質およびホルモンからのシグナルを、Ｇタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）を介して変換して、炎症のメディエーター（例えば、ＰＧＥ２）の産生を含む収縮性応答を生じる。ＧＰＣＲは、細胞内標的に三量体Ｇタンパク質の活性化を介して結合する（図２を参照のこと）。滑膜細胞および軟骨細胞の活性化に関与する、ＧＰＣＲ経路を介するシグナル伝達分子の例は、ヒスタミン、ブラジキニン、セロトニンおよびＡＴＰである。第２の主要な経路は、炎症促進サイトカイン（例えば、ＩＬ−１）からのシグナルを、キナーゼカスケードおよびＮＦ−６Ｂタンパク質を介して、遺伝子発現の調節ならびに異化サイトカインおよび他の異化因子（ＮＯを含む）の産生へと変換する。
【０１７５】
神経伝達物質およびホルモンからのシグナルは、以下の２つのクラスのレセプターのいずれかを刺激する：７ヘリックスの膜貫通領域からなるＧＰＣＲまたはリガンド作働性イオンチャネル。両方の種類のレセプターからの「下流」シグナルは、細胞質Ｃａ2+の濃度を調節する際に収束する（図３を参照のこと）。各ＧＰＣＲ膜貫通レセプターは、特定のクラスの三量体Ｇタンパク質（Ｇq、Ｇiまたは多くの他のＧタンパク質を含む）を活性化する。Ｇqサブユニットは、ホスホリパーゼＧγを活性化し、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化および細胞質カルシウムのレベルの増加を生じる（図３）ことが認識される。次いで、増加した細胞内カルシウムは、ｃＰＬＡ２の活性化およびアラキドン酸（ＡＡ）の産生をもたらす。ＡＡは、滑膜細胞および軟骨細胞の両方においてＣＯＸの基質として作用し、ＰＧＥ２の産生をもたらす。ＰＫＣ活性化はまた、ＮＦ−Ｂの活性化をもたらすＭＡＰキナーゼの活性化を生じ、炎症促進サイトカインへの曝露によりプライムされた細胞および組織において軟骨異化に関与するタンパク質の増加した遺伝子発現を調節する。
【０１７６】
ＩＬ−１およびＴＮＦ−αの両方により異なる同種レセプターを介して媒介されるような炎症促進サイトカインシグナル伝達はまた、細胞遺伝子発現の調節の際に収束する。これらの異なるレセプターにより利用されるシグナル変換経路は、レセプターの近傍の異なるキナーゼを使用するが、シグナル伝達経路は、続いてＭＡＰキナーゼのレベルで異化する（図３および４）。シグナル変換は、キナーゼ（ｐ３８ ＭＡＰキナーゼのような「下流」酵素を含む）のカスケードにおける残基のリン酸化に依存する。ＩＬ−１レセプターおよびＴＮＦレセプターの活性化はまた、ＭＡＰキナーゼの刺激をもたらし、共通の段階がＧq結合ＧＰＣＲにより共有される（図３を参照のこと）。リガンド非依存生「クロストーク」が、特定のＧＰＣＲおよびサイトカイン（例えば、ＩＬ−１）の同時刺激に応じてキナーゼ経路を相互活性化（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｅ）し得、共力作用性細胞応答をもたらす（図３を参照のこと）。従って、（図１および２に示されるような）共通のシグナル伝達経路の相互活性化をブロックして炎症促進サイトカイン（ｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２、およびＭＭＰ）の増加した遺伝子発現をもたらす選択的インヒビターの組合せは、共力作用的に作用して、関節鏡検査外科手順後の炎症および軟骨分解を防ぐ。
【０１７７】
（ＩＶ  要約）
これらの軟骨保護因子について規定された作用の分子的機構および細胞性機構から、これらの化合物は、手術時（ｐｅｒｉｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）に灌流溶液に（本明細書中に記載される、他の軟骨保護剤と組合せるか、または他の抗疼痛および抗炎症剤と組合せて）適用されるか、そうでなければ注入または注射により直接関節に投与される場合、軟骨保護作用を示すと予測される。特に、これらの薬剤は、関節鏡検査外科手順の間、灌流溶液により送達される場合、有効な薬物であることが期待される。各々の代謝的に活性な軟骨保護剤は、１つ以上の他の軟骨保護剤（低分子薬物、ペプチド、タンパク質、組換えキメラタンパク質、抗体、オリゴヌクレオチドまたは遺伝子治療ベクター（ウイルス性および非ウイルス性）を含む）と組合せて、関節の空隙に送達され得る。例えば、ＭＡＰＫインヒビターのような薬物は、関節の正常な機能に関与するかもしくは病理学的状態に起因して存在する、関節または関節を含む構造の流体空隙に関連する任意の細胞に対してその作用を発揮し得る。これらの細胞および構造としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ａ型線維芽細胞およびＢ型マクロファージの両方を含む、滑膜細胞；関節の軟骨成分（例えば、軟骨芽細胞および軟骨細胞）；骨に関連する細胞（骨膜細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞を含む）；炎症性細胞（リンパ球、マクロファージ、肥胖細胞、単球、好酸球を含む）；ならびに他の細胞（内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞および神経細胞を含む）；ならびに上記の組合せ。
【０１７８】
本発明のこの局面はまた、活性治療剤の処方を提供する。この活性治療剤は、薬物の関節ヘの導入および投与に有用な処方で送達され得、軟骨保護剤の送達、摂取、安定性または薬物動態を増強する。このような処方物としては、以下が挙げられ得るがこれらに限定されない：タンパク質、リポソーム、炭水化物、合成有機化合物、もしくは無機化合物を含む微粒子、ミクロスフェア、またはナノ粒子。本発明は、軟骨保護剤の組み合わせの送達、または均質ビヒクル（例えば、単一のカプセル化したミクロスフェア）内の複数の薬学的に活性な物質もしくは個々の送達ビヒクル（例えば、１つ以上の因子をカプセル化するミクロスフェアの群）の別々の混合物のいずれかとして存在する１つ以上の抗疼痛剤および／もしくは抗炎症剤を有する１つ以上の軟骨保護剤の送達を提供する。処方分子の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：親水性ポリマー、ポリカチオン（例えば、プロタミン、スペルミジン、ポリリジン）、特定の細胞型に物質を標的化ペプチドまたはゲル、遅放性マトリクス、可溶性粒子および不溶性粒子、ならびに列挙されない処方エレメント。
【０１７９】
１つの局面において、本発明は、２つ以上の軟骨保護剤の組み合わせ、または１つ以上の抗疼痛剤および／もしくは抗炎症剤と組合せた１つ以上の軟骨保護剤、単独または組合せた１つ以上の抗疼痛剤および／もしくは抗炎症剤の、灌流溶液を介した局所送達を提供し、輸液は治療的に有効な低濃度で存在する薬物を含有し、薬物が変質した（ａｆｆｅｃｔｅｄ）組織または関節に直接送達されることを可能にする。薬物含有輸液または灌流溶液は、手術手順に関連して手術前に、および／もしくは手術中に、および／もしくは手術後に使用され得るか、または外科手順に関連しない他の時点で投与され得る。薬物送達のために使用される他の従来の方法は、全身的（例えば、筋肉内、静脈内、皮下）投与を必要とし、これは、標的の関節において有意な治療的濃度を達成するために、患者に投与される高濃度の薬物（およびより高い総用量）を必要とする。全身的投与はまた、標的関節以外の組織において高濃度を生じ、これは望ましくなく、用量に依存して、不利な副作用を生じ得る。これらの全身的方法は、薬物を第２経路（ｓｅｃｏｎｄ−ｐａｓｓ）代謝および急速な分解に供され、それにより、有効治療濃度を制限する。軟骨保護剤（１つ以上の抗疼痛剤および／または抗炎症剤を伴うかまたは伴わない）の組合せは注入または灌流により直接関節に投与されるので、血管灌流は、薬物を標的組織に運ぶために必要ではない。この重要な利点は、種々の軟骨保護薬物のより低濃度の有効全用量の局所送達を可能にする。
【０１８０】
（Ｖ．適用方法）
本発明の溶液は、種々の手術／介入手順（外科技術、診断技術および治療的技術を含む）のための適用を有する。本発明の軟骨保護剤は、注入または灌流により投与され得る。注入のための溶液については、キャリア材料と組合されて単一投薬形態を生成し得る活性成分の量は、処置される患者、溶液中の活性因子の性質、および投与の特定の形態に依存して変化する。しかし、任意の特定の患者のための特定の用量レベルは、種々の要因（使用される特定の化合物の活性、患者の年齢、体重、全体的な健康、性別、および食事、投与の時間、投与経路、薬物の組合せの排出速度、および治療を受ける特定の疾患の重篤度を含む）に依存することが理解される。
【０１８１】
注射可能な調製物（例えば、滅菌注射可能水性懸濁液または油性（ｏｌｅａｇｅｎｏｕｓ）懸濁液）は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して公知の技術に従って処方され得る。滅菌注射可能調製物はまた、皮毒性の皮経口受容可能希釈剤または溶媒中の滅菌注射可能溶液または懸濁液（例えば、１／３−プロパンジオール溶液）であり得る。使用され得る受容可能なビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンガー溶液、および等張性塩化ナトリウム溶液がある。さらに、滅菌不揮発性油は、従来、溶媒または懸濁媒体として使用される。この目的のために、任意の刺激の強くない不揮発性油が使用される（合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む）。さらに、脂肪酸（例えば、オレイン酸）が、注射可能な調製物において使用される。
【０１８２】
本発明の注射のための溶液は、関節鏡検査外科手順と共に投与され得るか、または患者の診療を指示する医師により望ましいと決定された任意の時点で投与され得る。
【０１８３】
本発明の灌注溶液は、解剖学的関節の関節鏡検査手術の間、手術時に適用され得る。本明細書中で使用される場合、用語「手術時」とは手順内での、手順前および手順内での、手順内および手順後での、ならびに手順前、手順内および手順後の適用を包含する。好ましくは、この溶液は、手順前および／または手順後ならびに手順内で適用される。そのような手順は、当業者に周知の技術によって外科的部位に適用される生理学的灌注流体（例えば、通常の生理食塩水または乳酸加リンガー溶液）を慣習的に利用する。本発明の方法は、従来で適用された灌注流体に代えて、本発明の抗疼痛／抗炎症／軟骨保護性灌注溶液で代用することを含む。この灌注溶液は、手順の開始前、好ましくは組織外傷の前およびその手順の始めから終わりまでの間連続的に創傷または外科的部位に適用されて、疼痛および炎症、ならびに軟骨分解を先制的にブロックする。本明細書の全体に渡って使用される場合、用語「灌注」とは、液体の流れで創傷または解剖学的構造を洗うことを意味することを意図する。用語「適用」とは、灌注および本発明の溶液を局所的に導入する他の方法（例えば、ゲル化可能バージョンのその溶液を操作部位に導入し、次いでこのゲル化溶液が手順の間中ずっとその部位に残存する）を包含することを意図する。本明細書の全体に渡って使用される場合、用語「連続的」とは、適用される薬剤の予め決定された治療的局所濃度を維持するために十分な頻度で、創傷の反復かつ頻繁な灌注が存在する状況、および操作技術により必要とされる灌注流体流の断続的停止が存在し得る適用をも含むことを意図する。
【０１８４】
本発明の溶液内の各々の薬剤について列挙される濃度は、代謝変換の非存在下において、操作部位における効果の予め決定されたレベルを達成するために操作部位に局所的に送達される薬剤の濃度である。所定の溶液中の薬物濃度は、送達の際の局所希釈を補償するように調節されることを必要とし得るということが理解される。溶液濃度は、代謝変換または体全体の分布による希釈を補償するように調節されない。なぜなら、これらの状況は、経口適用、皮下適用、静脈内適用または筋肉内適用とは対照的に、局所送達により回避されるからである。
【０１８５】
本発明の溶液が使用され得る関節鏡検査技術としては、非限定例として、膝における部分的半月板切除術および靭帯再構築、肩峰形成術、回旋筋腱板壊死組織切除、肘滑膜切除術ならびに手首関節鏡検査および足首関節鏡検査が挙げられる。灌注溶液は、手術細片を除去し、そして遮るもののない関節内の可視化を可能にするために、関節包を拡張するのに十分な流速で関節に手術中に連続的に供給される。
【０１８６】
そのような関節鏡検査技術の間、軟骨分解の阻害ならびに疼痛および炎症の制御のための適切な関節鏡検査灌注溶液は、本明細書中以下の実施例１〜４において提供される。
【０１８７】
本発明の各々の溶液において、薬剤は、低濃度で含まれ、そして所望の治療効果を達成するために薬物投与の従来の方法で必要とされた濃度および用量に対して低い用量で局所的に送達される。薬物投与の他の経路（すなわち、静脈内、皮下、筋肉内または経口）を介して、同様に服用される薬剤を送達することによって同等な治療効果を得ることは不可能である。なぜなら、全身に与えられた薬物は、第１通過代謝および第２通過代謝に供され、そしてしばしば体系循環から迅速に浄化されるからである。
【０１８８】
本発明の実施は、従来のアヘン剤関節内注射および／または関節鏡もしくは関節（例えば膝、肩等）「解放」手順終了時の局所麻酔と明確に区別される。本発明の溶液は、疼痛および炎症の先制的抑制を提供するために外科処置の間ずっと連続的注入に使用される。対照的に、現在使用されている局所麻酔薬の一定注入による治療効果達成に必要な高濃度は、甚大な全身毒性をもたらし得る。
【０１８９】
本発明の手順の終了後、アヘン剤の代わりまたは補助として、手術部位に、灌注溶液に使用したのと同じ軟骨保護剤ならびに／または疼痛および／もしくは炎症インヒビターをより高濃度で注射または他の方法で適用することが望ましい。さらに、本明細書中に詳述されるように、軟骨保護剤の組み合わせの直接注射が所望され得る。注射のための適切な軟骨保護溶液は、本明細書中以下の実施例５において提供される。
【実施例】
【０１９０】
以下に示すのは、特定の手術的手順に適当な本発明によるいくつかの処方と、それに続く、本発明の薬剤を用いた３種の臨床研究の要約である。
【０１９１】
（実施例１）
（関節鏡検査用灌注溶液）
以下の組成物は、関節鏡手順中に解剖学的関節の灌注に使用するのに適当な組成物である。各薬物は、通常の食塩水または乳酸化リンガー液のような、以下の実施例に記載する残留溶液である生理学的電解質を含有するキャリア流体に溶解されている。
【０１９２】
薬剤のクラス 薬物 濃度（ナノモル）
ＭＡＰキナーゼインヒビター  ＳＢ２０３５８０                    ２００
マトリックス
メタロプロテアーゼ          Ｕ−２４５２２                      ２００
インヒビター
ＴＧＦ−βアゴニスト        ＴＧＦ−β２                        ２００
（実施例２）
（関節鏡検査用代替灌注溶液）
以下の組成物は、関節鏡手順中に解剖学的関節の灌注に使用するのに適当な代替処方である。
【０１９３】
薬剤のクラス 薬物 濃度（ナノモル）
ＭＡＰキナーゼインヒビター  ＳＢ２０３５８０                  ２００
マトリックス
一酸化窒素シンターゼ        Ｌ−ＮＩＬ                    １，０００
インヒビター
インターロイキンレセプター
アゴニスト                  ＩＬ−１０                        １００
（実施例３）
（代替灌注溶液）
生理学的キャリア流体における以下の薬物および溶液中の濃度範囲は、本発明における使用のために適切である。
【０１９４】
薬剤のクラス 薬物 濃度（ナノモル）
ＭＡＰキナーゼインヒビター  ＳＢ２４２２３５                  ２００
一酸化窒素シンターゼ        Ｌ−ＮＩＬ                  １０，０００
インヒビター
ＴＧＦ−βアゴニスト          ＴＧＦ−β２                      １００
（実施例４）
（代替灌注溶液）
以下の組成物もまた、本発明において有用である。
【０１９５】
薬剤のクラス 薬物 濃度（ナノモル）
ＭＡＰキナーゼインヒビター  ＳＢ２４２２３５                ２００
ＭＭＰインヒビター          Ｕ−２４５２２                  ２００
（実施例５）
（注射用軟骨保護溶液）
以下の組成物は、解剖学的関節に注射するのに適切である。各薬物は、生理学的電解質を含有するキャリア流体（例えば、通常の生理食塩水または乳酸化リンガー液）に溶解されている。この溶液の２０ｍｌの投薬量は、患者に対する投与に対して適切である。
【０１９６】
薬剤のクラス 薬物 濃度
ＢＭＰレセプターアゴニスト  ＢＭＰ−７                １００ｎｇ／ｍｌ
一酸化窒素シンターゼ
インヒビター                １，３ＰＢＩＴ              ４．４μｇ／ｍｌ
ＴＧＦ−βアゴニスト        ピロリジン              １６．４μｇ／ｍｌ
ジチオカルバメート
（実施例６）
（ＩＬ−１アゴニストおよびＧＰＣＲアゴニストに対する曝露の際の迅速なＰＧＥ２バーストの相乗刺激）
線維芽細胞様滑膜細胞は、炎症細胞の特徴を示し、そして関節炎および軟骨分解の重要な調節因子であるようである。滑膜細胞培養モデル系を使用して、関節組織の破壊（関節鏡検査手術の間の組織損傷の結果として生じる損傷を含む）を調節する際に重要である、ＩＬ−１と非サイトカイン炎症のメディエーターとの間の相乗的相互作用を特徴付けた。実験を実施して、培養されたヒト滑膜線維芽細胞におけるサイトカインおよびプロスタノイド産生の調節について、Ｇタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）アゴニスト（ヒスタミン、ブラジキニンおよびイソプロテロノール）を研究し、そしてこの系におけるケトプロフェンの活性を特徴付けた。インターロイキン−１（ＩＬ−１）を用いる刺激に応じたプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ2）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）およびインターロイキン−８（ＩＬ−８）の誘導の動態学が記載される。ＩＬ−１プライミング後のサイトカイン産生を増強するＧＰＣＲリガンドの能力を研究した。
【０１９７】
実施例６〜８において、他に示されない限り、以下の実験方法および材料を使用した。
【０１９８】
（細胞培養）滑膜組織を、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｍａｃ Ｎｅａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌによって関節置換手術を受けた骨関節炎患者から入手し、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）およびフンギソン（０．２５μｇ／ｍｌ）を含む、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において、研究所に輸送した。滑膜を解剖して、はさみでみじん切りにし、そしてＬ−グルタミン（２ｍＭ）、熱非働化ウシ胎仔血清（１０％ｖ／ｖ）および抗生物質を含むＤＭＥＭからなる培養培地中に外植片として配置した。培養物を、５％ＣＯ2の加湿雰囲気中３７℃にて収用した。付着性滑膜細胞は、２〜３週間以内でその外植片から生じ、そしてトリプシン処理により継代された。種培養物を毎週２回与え、そしてコンフルエンシーにて継代した。実験を、３〜８継代に由来する細胞に対して実施した。実験培養物を、２ｍｌ培養培地において７．５×１０３細胞／ｃｍ2の密度で３５ｍｍ皿中にプレートした。培養物を、実験のためにコンフルエンシー近くまで増殖させ、そして２．３±０．３×１０5細胞（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝３）および１０４±１３μｇタンパク質（ｎ＝１０）を含んだ。この増殖培地を毎週２回交換した。
【０１９９】
（実験的処置）実験的処置を開始する前の日に、培地を、上記のように、２％熱非働化ウシ胎仔血清およびＬ−グルタミンならびに抗生物質を含むＤＭＥＭからなる実験用培養培地に代えて、細胞を休止状態にした。次の日、示されるように、培養物を、馴化増殖培地に対して１２〜２４時間間隔で特定濃度のＩＬ−１またはさらなるリガンドの添加によりプライミングした。いくつかの実験において、馴化増殖培地を、ＩＬ−１を用いるプライミング後の分析のために収集した。急性の実験処理を、このプライミング間隔後、以下のように実施した。培養物をインキュベーターから取り出し、ロック生理学的緩衝液（ｍＭにおけるＬＢ組成：ＮａＣｌ、１５４；ＫＣｌ、２．６；ＫＨ2ＰＯ4、２．１５；Ｋ2ＨＰＯ4、０．８５；ＭｇＣｌ2、５；ＣａＣｌ2、２；Ｄ−グルコース、１０；ＨＥＰＥＳ、１０；ｐＨ７．４、ＢＳＡ、０．１％ ｗ／ｖ）の２ｍｌアリコートで３回洗浄し、次いで、ＬＢ含有特定リガンドのさらなるアリコートを用いて３７℃浴上で１０分間平衡化した。この溶液を吸引により除去し、そして特定の時間間隔の間３７℃において、示されるリガンドを含む新鮮な緩衝液アリコートで置換した。薬理学的インヒビターを、代表的に、１０分間の予備インキュベーション間隔の間に添加し、そしてアゴニストおよび特定インヒビターは、３分間のチャレンジ間隔の間存在した。
【０２００】
（プロスタグランジンＥ２の測定）表示された処置プロトコルの後、培養上清のアリコート（１ｍｌ）を収集して、液体窒素中で急速冷凍した。サンプルを、処理するまで−８０℃にて保存した。培養上清のアリコートを、プロスタグランジンＥ２およびＥ１に対して等価な反応性を有する抗体を使用して、製造業者（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）より指示されるように、競合結合ラジオイムノアッセイによって分析した。定量化のために、[3Ｈ]プロスタグランジンＥ２の固定濃度、および標準の競合プロスタグランジンＥ２の増加する濃度を使用して、標準曲線を各アッセイについて作成した。
【０２０１】
（ＩＬ−６の測定）サイトカイン、ＩＬ−６の産生もまた、−８０℃にて冷凍保存されていた上清培養培地のアリコートにおいて測定した。ＩＬ−６を、製造業者（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）により記載されるようにアルカリホスファターゼ検出を伴うサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定し、そしてそれぞれ純粋な組換えヒトサイトカインを用いて作成された標準曲線を使用して、定量した。実験決定を、二連の培養物に対して実施した。
【０２０２】
（[3Ｈ]チミジン取り込みおよびＭＴＴについてのアッセイ）
滑膜細胞株を、[3Ｈ]チミジンの取り込みとして測定される、ＩＬ−１に応じた増殖能力について慣用的に評価した（Ｋｉｍｂａｌｌ＆Ｆｉｓｈｅｒ、１９８８）。この調製物において、ＩＬ−１の最大有効濃度は、２％血清中に維持される休止状態の培養物と比較して約１０〜２０倍の[3Ｈ]チミジンの取り込みを刺激する（データは示さず）。
【０２０３】
（データ分析）免疫アッセイを、各培養物に由来する二連のアリコートにおいて慣用的に実施した。実験決定を、二連または三連の培養物に対して実施した。各実験を少なくとも２つの細胞株で反復した。非線形回帰曲線のフィッティングおよび統計学的分析を、Ｇｒａｐｈ−ＰＡＤ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して実施した。
【０２０４】
（材料）細胞培養：細胞培養培地をＳｉｇｍａまたはＧｉｂｃｏ／ＢＲＬから入手した。ウシ胎仔血清をＡｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．（Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）から入手した。薬物：組換えヒトインターロイキン−１を、Ｇｅｎｚｙｍｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から入手した。ケトプロフェンは、Ｏｍｅｒｏｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）により提供された。アミトリプチリン、フォルスコリン、５−ヒドロキシトリプタミン、イソプロテレノール、ブラジキニン、ヒスタミンおよびプロスタグランジンＥ２を、Ｓｉｇｍａから入手した。放射化学物質：[3Ｈ]プロスタグランジンＥ２を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。他の全ての試薬を、標準的な商業供給業者から入手可能な最高純度で入手した。
【０２０５】
ヒト滑膜細胞におけるＰＧＥ２産生に対するＧＰＣＲアゴニスト、ヒスタミンおよびブラジキニンの効果を、これらの異なるクラスのレセプターを介する共通の薬理学的効果を媒介するアゴニスト間の機能的相互作用を評価するために、ＩＬ−１に対する前刺激を伴い、そして伴わずに測定した。培養したヒト滑膜線維芽細胞のＩＬ−１（１０Ｕ／ｍｌ）への一晩の曝露は、ＰＧＥ２産生（これは、培養上清中に増加したＰＥＧ２として、ラジオイムノアッセイによって測定され得る）の遅延され（４時間）かつ持続された大増強を生じる。延長されたＩＬ−１処理（１６〜２４時間）の間のＰＧＥ２産生の漸増は、協調的上方制御されたｃＰＬＡ２およびＣＯＸ−２の発現から生じることが示されてきた（Ｃｒｏｆｆｏｒｄ、１９８４、Ｈｕｌｋｏｗｅｒら、１９８４）。ＩＬ−１への一晩曝露により準備されていた培養物は、さらなる迅速（数分）かつ旺盛なＰＧＥ２の産生と共に、最大有効濃度のヒスタミン（１００μＭ）またはブラジキニン（１μＭ）を用いる引続くチャレンジに応答する。ヒスタミンまたはブラジキニン刺激に応じたＰＧＥ２産生の時間経過についての代表的なデータは、図７に示される。これらの条件下において、ヒスタミンは、ＧＰＣＲアゴニスト添加を受けなかったＩＬ−１プライミング細胞と比較して、５〜１０倍増のＰＥＧ２産生を誘発する。ブラジキニンは、１０〜１５倍増を誘発する。短期２分間のアゴニストチャレンジの間に産生されるＰＥＧ２の絶対量は、１８時間ＩＬ−１プライミング間隔全体の間に累積的に産生される量に近づくか、または超える。これは、図７が、最小のさらなる蓄積が引続き６０分間に渡って観察されるので、ＰＥＧ２産生におけるヒスタミン誘発性バーストの大部分は、初めの２分間以内に生じるということを示すという範囲で注目すべきことである。ブラジキニン刺激されたＰＧＥ２応答は同じ期間にわたって増加し続ける（２倍）。ＩＬ−１プライミングの非存在下において、未処理の滑膜細胞は、いずれかのＧＰＣＲアゴニストを単独で用いる刺激に応じた検出可能なＰＧＥ２産生を示さない。ＩＬ−１プライミングの条件下において、ヒスタミンおよびブラジキニンの両方は、相乗的にＰＧＥ２放出を増強した。
【０２０６】
骨関節炎患者に由来する培養された滑膜線維芽細胞を使用して、本発明者らは、ＰＧＥ２産生に対して、プロ炎症性サイトカイン（ＩＬ−１）と、生理学的に関連するＧタンパク質結合化レセプターとの間の時間依存性相乗的相互作用を見出し、そして標的治療薬剤の作用を評価した。結合される内因性滑膜細胞レセプターを介して作用するＧＰＣＲアゴニストは、細胞内カルシウム、イノシトールホスフェートを増加し、そしてＰＫＣシグナル伝達経路は、ＩＬ−１により予めプライミングされた細胞において迅速かつ劇的にＰＧＥ２産生を増幅する。ＣＯＸインヒビターは、アゴニスト誘発化迅速バーストおよびＰＧＥ２の長期蓄積の両方を効率的に減弱する。従って、細胞内シグナル伝達について異なるＧＰＣＲ経路およびＩＬ−１経路は、相乗的に相互作用して迅速またはより緩慢のいずれかのＰＧＥ２応答の長期調節を引き起こす。
【０２０７】
迅速なＰＧＥ２バーストを産生する滑膜細胞において、ＩＬ−１とカルシウム調節ＧＰＣＲとの間の相乗作用は、アラキドン酸放出の迅速増大（多くの細胞型におけるｃＰＬＡ２活性化の基準）によって部分的に説明され得る。ＣＯＸ−２発現を誘導することに加えて、ＩＬ−１は、ｃＰＬＡ２の発現を増加させる（Ｈｕｌｋｏｗｅｒら、１９９４）。これらの２つのタンパク質は、一緒に作用して、遊離のアラキドン酸基質をＣＯＸ−２に提供する。ＩＬ−１によって誘導される重要なエイコサノイド代謝酵素の上方制御は、従って、ＧＰＣＲリガンドのアラキドネート放出を活性化する能力と相まって、プロスタノイド合成を介して基質流動全体を増加させることが予期される。ｃＰＬＡ２は、レセプター調節を示す機能特性を示す単なる公知のＰＬＡ２であり、そしておそらくエイコサノイド産生および細胞内シグナル伝達に関与する。ｃＰＬＡ２は、完全な活性のために、カルシウム濃度を増大させることによって活性化されて、そしてブラジキニンＢ２レセプターおよびヒスタミンＨ１レセプターの活性化は、細胞内カルシウムの動員と共役されるので、これはおそらく、ＰＧＥ２産生において迅速アゴニスト刺激バーストを調節する優勢因子である。最終的に、Ｂ２レセプターまたはＨ１レセプターの活性化により引き起こされる細胞質内カルシウムの非常に迅速かつ一過性の増加は、ｃＰＬＡ２の活性化、アラキドン酸放出および観察されたＰＧＥ２バーストについて公知の動態学に類似している。
【０２０８】
（実施例７）
（シクロオキシゲナーゼインヒビターによるＰＧＥ２バースト形成の阻害）
ケトプロフェン（シクロオキシゲナーゼインヒビター）のＰＧＥ２形成を減弱させる作用を、図８に示されるように、長い曝露の間（１６時間）のＩＬ−１との同時インキュベーションおよび引続くＧＰＣＲアゴニストチャレンジ間隔の前の短いプレインキュベーションによって決定した。ＩＬ−１を用いる一晩プライミングの間のケトプロフェンの特定濃度の添加は、ＰＧＥ２形成を無効にし、非線形回帰分析によりＩＣ50＝４．５±０．８ｎＭと決定された（平均±ＳＥＭ、ｎ＝４滑膜細胞株）。類似の決定（データは示さず）をシクロオキシゲナーゼインヒビター（エトドラック（ｅｔｏｄｏｌａｃ）（ＩＣ50＝１５．２±４．６ｎＭ、ｎ＝４）、ケトロラック（ｋｅｔｏｒｏｌａｃ）（２．２±０．４ｎＭ、ｎ＝４）およびインドメタシン（３．２±１．５ｎＭ、ｎ＝２））を用いて実施した。
【０２０９】
図８はまた、ＩＬ−１（１０Ｕ／ｍｌ）を用いて一晩プライミングされた滑膜細胞における、１００μＭヒスタミン（ＩＣ50＝３．４±０．２ｎＭ、ｎ＝３）または１μＭブラジキニン（ＩＣ50＝９．５±２．０ｎＭ、ｎ＝３）によるチャレンジに応じたアゴニスト誘発性ＰＧＥ２バーストのケトプロフェン濃度依存性阻害を示す。これらの値は、ＰＧＥ２の一晩のＩＬ−１誘導の間にケトプロフェン阻害について観察された値に匹敵する。この結果は、ＣＯＸインヒビターによる阻害の徴候が、ＧＰＣＲアゴニスト添加前の１０分間の前処理間隔内に生じ、これはＣＯＸ活性の直接的で可逆的な阻害と一致し、そしてプロスタノイド調節酵素の発現レベルにおける変化に関連する機構に起因しないということを実証する。この即時性阻害効果はまた、この薬物が関節鏡検査手術の間に灌注溶液において関節内に局所的に送達される場合、その薬物の即時有効性についての基礎を提供する。
【０２１０】
（実施例８）
（ＩＬ−１およびＧＰＣＲアゴニストによるＩＬ−６産生の誘導およびケトプロフェンによる阻害）
ＩＬ−１を用いる刺激に応じたインターロイキン−６の誘導の動態学が記載される。滑膜細胞培養物を、ＩＬ−１、およびイノシトールトリホスフェート（ＩｎｓＰ３）／プロテインキナーゼＣ経路を介するシグナル伝達を活性化するヒスタミンまたは細胞内ｃＡＭＰの増加を活性化するイソプロテレノール（ｉｓｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ）のいずれかを用いる指示された処置に曝露した。ＰＧＥ2、ＩＬ−６およびＩＬ−８の産生を、１、２、４、６、および２４時間処理後に、培養上清において測定した。この実験において、各々の処理間隔を、別個の培養物において実施した。上記の処置レジメにおいて、ＩＬ−６の産生は、２４時間曝露後に、ＩＬ−１によりかなり増大されるが、初めの６時間間隔内ではＩＬ−６は検出されなかった。ＩＬ−１に応じたＩＬ−６産生は、ヒスタミンの添加によってさらに増強されず、そしてヒスタミン単独は、ＩＬ−６産生を刺激しなかった。ＩＬ−１はまた、ＩＬ−８の有意な上昇を生じ（２０００ｐｇ／ｍｌ）、これは、処理の６時間目に初めて測定可能であった。ＩＬ−８産生は、ＩＬ−１への２４時間曝露において持続され、そしてかなり増加した。
【０２１１】
ＩＬ−１およびＧＰＣＲアゴニストによるサイトカイン産生の誘導に対するケトプロフェンの効果を試験した。このプロトコルはまた、ＩＬ−６定常状態誘導に対するＩＬ−１濃度依存性の効果を試験した。滑膜細胞培養物を指示された濃度のＩＬ−１アゴニストおよびＧＰＣＲアゴニストに曝露した。培養上清を収集し、そして８時間間隔において、同じアゴニスト添加物を含む新鮮な培地アリコートで置換した。上清中のＰＧＥ2、ＩＬ−６およびＩＬ−８を記載されるようにアッセイした。
【０２１２】
ＩＬ−６産生についてのデータは、図９に示されており、これは、ＩＬ−１および添加されたリガンドの指示濃度の存在下において、１６時間（８〜１６時間の処理間隔に対応する）におけるＩＬ−６産生を示す。ヒスタミンまたはイソプロテレノールの添加は、ＩＬ−１単独と比較してＩＬ−６産生を増強しない。１．０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１において、ケトプロフェンは、ＩＬ−１誘発性ＩＬ−６産生の部分（５０％以下）阻害を引き起こす。さらに、ケトプロフェンは、ヒスタミンまたはイソプロテレノール／ＩＬ−１同時刺激サンプルにおけるＩＬ−６産生を阻害した。
【０２１３】
滑膜細胞培養モデル系を使用して、ＩＬ−１と関節組織の破壊（関節鏡検査手術の間の組織損傷の結果として生じる損傷を含む）を調節する際に重要である非サイトカイン炎症のメディエーターとの間の相乗的相互作用を特徴付けた。この結果は、以下のように要約され得る：（１）ＩＬ−１は、培養した滑膜細胞におけるＰＧＥ2、ＩＬ−６およびＩＬ−８の大きな増加を誘導するが、休止状態の培養物は、これらのメディエーターの検出可能な量を産生しない（２）ＰＧＥ2の誘導は、最も迅速に生じ、そして４時間で培養上清へのＰＧＥ2の放出を生じ、次いで６時間後にＩＬ−８の放出を生じ、そしてより長い間隔でＩＬ−６の放出を生じる、そして（３）３つ全てのメディエーターが２４時間のＩＬ−１曝露後の培養上清中で上昇したままである。
【０２１４】
ＰＧＥ2産生におけるそれらの作用とは対照的に、ＧＰＣＲアゴニストは、ＩＬ−６またはＩＬ−８のＩＬ−１誘導を増強せず、そしてまたＩＬ−１を用いるプライミング後のＩＬ−６およびＩＬ−８の放出を増加させない。ＩＬ−６およびＩＬ−８のＩＬ−１誘導は、ＰＧＥ2の同時誘導により強化されるようである。なぜなら、ケトプロフェンは、ＩＬ−１に応じるこれらのサイトカインの産生を減少させるからである。この結果は、ケトプロフェンが、手術手順の間に関節に送達される場合、治療的軟骨保護効果を提供し得るということを示す。
【０２１５】
まとめると、これらの結果は、特定のＧ結合レセプターシグナル伝達経路とＩＬ−１を用いるプロ炎症性刺激による滑膜細胞の活性化との間の相互作用を実証している。類似の機構が、軟骨細胞において作動し得ることが予期される。これらの相互作用は、滑膜細胞および軟骨細胞のプロ炎症性応答を統合し、そして調節する手段を提供し、それは、関節内の他のオートコイドまたは神経伝達物質のレセプター系からの入力に依存する。これらの知見は、カルシウム動員、ホスホイノシチド加水分解およびＰＫＣ活性化を介するシグナル伝達を媒介し、なおかつ関節鏡検査手術におけるＰＧＥ2の産生の増加と共役される、Ｇタンパク質結合レセプターの阻害を標的とする治療処置の合理的かつ潜在的な臨床利益を強調する。滑膜細胞および軟骨細胞上のこれらのレセプターとしては、ヒスタミンＨ1、ブラジキニン、サブスタンスＰ、５ＨＴ２、およびプリン性Ｐ２Ｙレセプターが挙げられる。
【０２１６】
独占的な特性または独占権が請求される本発明の実施形態は、添付の請求の範囲におけるように規定される。
【０２１７】
本発明を、以下に、例として、添付の図面を参照してより詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【０２１８】
【図１】図１は、分子標的、ならびに炎症のメディエーターの生成および軟骨代謝における変化へと導くシグナル伝達情報のフローを示す、軟骨細胞の概略図である。細胞表面レセプターのいくつかのファミリー（インターロイキン−１（ＩＬ−１）レセプターファミリーおよび腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプターファミリーのようなサイトカインレセプター、ＴＧＦ−βレセプタースーパーファミリー、およびインテグリンを含む）を通した外因性シグナルの統合が、本発明の溶液中に含まれる薬物の治療的標的であるタンパク質分子の主要な群（ＭＡＰキナーゼ、ＰＫＣ、チロシンキナーゼ、ＳＨ２タンパク質、ＣＯＸ、ＰＬＡ２およびＮＦ−６Ｂ）を含む一般的な細胞内シグナル伝達経路において変換されることを示す。これらのシグナル伝達経路の活性化が、炎症および／または軟骨分解、あるいは基質分子の合成、ならびに軟骨細胞増殖へと導き得る多数の誘導可能な遺伝子産物（ＩＬ−１、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびストロメライシン（ＭＭＰ−３）、ならびに他のメディエーター（一酸化窒素（ＮＯ）およびＰＧＥ２）を含む）の軟骨細胞発現を制御する。
【図２】図２は、分子標的、ならびに炎症のメディエーターの生成および軟骨代謝における変化へと導くシグナル伝達情報のフローを示す、滑膜細胞の概略図である。細胞表面レセプターのいくつかのファミリー（インターロイキン−１（ＩＬ−１）レセプターファミリーおよび腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプターファミリーを含むサイトカインレセプター、ブラジキニン、ヒスタミンおよびセロトニンサブタイプを含むＧタンパク質共役型レセプター、ならびにインテグリンを含む）を通した外因性シグナルの統合が、本発明の溶液中に含まれる薬物の治療的標的であるタンパク質分子の主要な群（ＭＡＰキナーゼ、ＰＫＣ、チロシンキナーゼ、ＳＨ２タンパク質、ＣＯＸ、ＰＬＡ２およびＮＦ−６Ｂ）を含む一般的な細胞内シグナル伝達経路において変換されることを示す。これらのシグナル伝達経路の活性化が、炎症および／または軟骨分解へと導き得る多数の誘導可能な遺伝子産物（ＩＬ−１、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびストロメライシン（ＭＭＰ−３）を含む）の滑膜細胞発現を制御する。
【図３】図３は、軟骨細胞および滑膜細胞の両方における一般的なシグナル伝達経路の図であり、これは、ＧＰＣＲ活性化レセプター経路と、炎症および／または軟骨分解へと導く炎症促進サイトカイン経路との間の「クロストーク」を担う重要なシグナル伝達タンパク質を含む。
【図４】図４は、軟骨細胞および滑膜細胞の両方における一般的なシグナル伝達経路の図であり、これは、ＧＰＣＲ活性化レセプター経路と、炎症促進サイトカイン経路との間の「クロストーク」を担う重要なシグナル伝達タンパク質を含む。本発明の好ましい軟骨防御溶液におけるいくつかの薬物についての特定の分子作用部位が同定される。
【図５】図５は、軟骨の同化応答を促進する、軟骨細胞または滑膜細胞いずれかに存在する分子標的の図である。本発明の好ましい軟骨防御溶液におけるいくつかの薬物についての特定の分子作用部位が同定される。
【図６】図６は、軟骨の異化応答を促進する、軟骨細胞または滑膜細胞いずれかに存在する分子標的の図である。本発明の好ましい軟骨防御溶液におけるいくつかの薬物についての特定の分子作用部位が同定される。
【図７】図７は、インターロイキン−１（ＩＬ−１、１０Ｕ／ｍｌ）での一晩のプライミング後の、Ｇタンパク質調節性アゴニストによる滑膜培養物中におけるプロスタグランジンＥ２の生成のグラフ表示である。培養物を、示される時点で、ヒスタミン（１００μＭ、白棒）またはブラジキニン（１μＭ、黒棒）で刺激し、そして培養上清に放出されたプロスタグランジンＥ２を、実施例６に記載のように決定した。示される値は、代表的な実験からの平均±標準偏差であり、そして刺激していない培養物による基底プロスタグランジンＥ２生成に対して補正した。
【図８】図８は、ケトプロフェンによる滑膜培養物中におけるプロスタグランジンＥ２生成の阻害のグラフ表示である。培養物を一晩、示される濃度のケトプロフェンの存在下（「黒四角」として示される）または不在下（「白三角」として示される）において、ＩＬ−１（１０Ｕ／ｍｌ）でプライミングした。１日後、プロスタグランジンＥ２を、ケトプロフェンで一晩処理した培養物上清において測定し、そして残存する培養物を洗浄し、示される濃度のケトプロフェンと共に１０分間インキュベートし、次いで、示される量のケトプロフェンの継続存在下において、ヒスタミン（１００μＭ、逆白三角）またはブラジキニン（１μＭ、正白三角）での引き続く３分間のチャレンジに応答するプロスタグランジンＥ２生成を測定した。示されるデータを、それぞれの各アゴニストについて得られた最大応答に対して正規化した。これは、異なる細胞株において実施された３つの研究から導き出された平均±標準偏差を表す。
【図９】図９は、示される濃度のＩＬ−１および添加されたＧタンパク質共役型レセプターリガンドの存在下での１６時間の滑膜細胞培養によるＩＬ−６生成に対する、ケトプロフェンの効果のグラフ表示である。培養物を、以下のさらなるレセプターリガンドのうちの１つを有する実験増殖培地における、０．７５μＭケトプロフェンの不在および存在下で、示される濃度（０．３、１．０、および３．０ｐｇ／ｍｌ）のＩＬ−１と共に１６時間インキュベートした：１）ｃａｍｐ経路を活性化するためのイソプロテレノール（ＩＳＯ）１．０μＭ、または２）ＩＰ３／カルシウム経路を活性化するためのヒスタミン（ＨＩＳ）１００μＭ。培養物上清を収集し、そして８時間間隔で、同じアゴニスト添加物を含む新鮮培地のアリコートで置換した。実験後、８〜１６時間の処理間隔に対応する上清培地を収集し、ＩＬ−６について分析した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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