(57)【要約】      （修正有）【課題】免疫応答を調節するための手段および方法を提供する。【解決手段】ヒト樹状細胞（ＤＣ）の個別集団を特異的に認識する新規な抗体および該抗体を用いた該ＤＣの単離方法。さらに、上記抗体により認識される抗原およびエピトープ並びに該抗体をコードするポリヌクレオチド。さらに、該ポリヌクレオチドを含むベクター並びに該ベクターで形質転換した宿主細胞および該抗体の産生におけるその使用。さらに、上記抗体の結合部位のドメイン、または上記抗原またはエピトープおよび少なくとも一つのさらなる好ましくは機能性のドメインを含むポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。さらに、該ポリヌクレオチドを含むベクター、該ポリヌクレオチドまたはベクターでトランスフェクションした宿主細胞および上記ポリペプチドの製造のためのその使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からの未熟および／または成熟樹状細胞（ＤＣ）の特性を表示するＤＣ上のエピトープとは反応するが
（ii）他のＰＢＭＣとは反応しない
抗体であって、該ＤＣがＣＤ６４−、ＣＤ３３＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ１１ｃ＋、ｐ５５−およびＣＤ１６＋であることを特徴とする抗体。
【請求項２】
該ＤＣが未熟ＤＣと成熟ＤＣとの間の成熟化段階のＤＣ集団である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
該ＤＣがＨＬＡ−ＤＲ＋である、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
該ＤＣが光散乱表示においてリンパ球と単球との間に位置する限定されたサイズおよび顆粒度を有する、請求項１ないし３のいずれかに記載の抗体。
【請求項５】
モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、合成抗体、またはFab、Fv、scFvおよびF(ab')2よりなる群から選ばれた抗体断片である、請求項１ないし４のいずれかに記載の抗体。
【請求項６】
腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、Ｔ細胞、腫瘍関連タンパク質または微生物タンパク質に特異的なエピトープを認識する、請求項５に記載の二重特異性抗体。
【請求項７】
該ＤＣがハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ ＡＣＣ２２４１によって、ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ ＡＣＣ２３９９によって、またはハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ ＡＣＣ２３９８によって産生される抗体によって認識される、請求項１ないし６のいずれかに記載の抗体。
【請求項８】
ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ ＡＣＣ２２４１、ＤＳＭ ＡＣＣ２３９９またはＤＳＭ ＡＣＣ２３９８によって産生される、請求項１ないし７のいずれかに記載の抗体。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれかに記載の抗体を産生することができる、連続的で安定な抗体産生細胞株。
【請求項１０】
ハイブリドーマ細胞株である、請求項９に記載の細胞株。
【請求項１１】
受託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２２４１、ＤＳＭ ＡＣＣ２３９９またはＤＳＭ ＡＣＣ２３９８を有するハイブリドーマ細胞株である、請求項１０に記載の細胞株。
【請求項１２】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からの未熟および成熟樹状細胞（ＤＣ）を認識することができる抗体またはFab、Fv、scFvおよびF(ab')2よりなる群から選ばれたその機能的断片の製造方法であって、
（ａ）請求項９、１０または１１のいずれかに記載の細胞を培養し、ついで
（ｂ）該抗体、またはFab、Fv、scFvおよびF(ab')2よりなる群から選ばれたその機能的断片または免疫グロブリン鎖を培地から単離する
ことを含む方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法により得ることのできる、抗体、Fab、Fv、scFvおよびF(ab')2よりなる群から選ばれたその断片または免疫グロブリン鎖。
【請求項１４】
（ａ）請求項１ないし８および１３のいずれかに記載の抗体の免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変領域；および
（ｂ）少なくとも一つのさらなるドメイン
を含むポリペプチド。
【請求項１５】
該ドメインが共有結合または非共有結合により連結されている、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
該少なくとも一つのさらなるドメインが、生物学的活性に適したコンホメーションを有するか、イオンを封鎖し得るか、または固相支持体もしくは前以て選択した抗原決定基に選択的に結合できるエフェクター分子を含む、請求項１４または１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
該エフェクター分子が、酵素、毒素、抗原、レセプター、結合部位、生合成抗体結合部位、成長因子、細胞分化因子、リンホカイン、サイトカイン、ホルモン、遠隔的に検出しうる残基、または抗代謝産物である、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
該抗原が、腫瘍抗原、ウイルス抗原、微生物抗原、アレルゲン、自己抗原、ウイルス、微生物、ポリペプチド、ペプチドまたは複数の腫瘍細胞である、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
イオンを封鎖しうる該分子が、カルモジュリン、メタロチオネイン、その断片、またはグルタミン酸、アスパラギン酸、リジンおよびアルギニンの少なくとも一つに富むアミノ酸配列である、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
固相支持体に選択的に結合しうる該分子が、正または負に荷電したアミノ酸配列、システイン含有アミノ酸配列、ストレプトアビジン、Staphylococcusタンパク質Ａの断片、ＧＳＴ、ＨｉｓタグまたはＬｅｘＡである、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
該レセプターが、Ｔ細胞活性化に重要なコスティミュラトリー表面分子であるか、またはエピトープ結合部位もしくはホルモン結合部位を含む、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
該コスティミュラトリー表面分子がＣＤ８０（Ｂ７−１）またはＣＤ８６（Ｂ７−２）である、請求項２１に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
発現により請求項１４ないし２２のいずれかに記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項２３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２５】
請求項２３に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２４に記載のベクターでトランスフェクションした細胞。
【請求項２６】
請求項１４ないし２２のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法であって、請求項２５に記載の細胞を培養し、ついで培養液からポリペプチドを単離することを含む方法。
【請求項２７】
請求項１ないし３のいずれかに記載のＤＣを末梢血から単離または同定する方法であって、工程：
（ａ）末梢血のサンプルを請求項１ないし８のいずれかに記載の抗体と接触させ；
（ｂ）抗体／ＤＣ複合体の存在を検出し；ついで／または
（ｃ）該抗体またはFab、Fv、scFvおよびF(ab')2よりなる群から選ばれたその機能性の断片に結合した樹状細胞を回収する
を含む方法。
【請求項２８】
請求項１ないし３のいずれかに定められ、請求項１ないし８のいずれかに記載の抗体によって認識され、または請求項２７に記載の方法によって得ることのできる樹状細胞。
【請求項２９】
組換え核酸分子を発現するように改変された、請求項２８に記載の樹状細胞。
【請求項３０】
活性化された抗原特異的ヒトＴ細胞をインビトロで製造する方法であって、Ｔ細胞を請求項２８または２９に記載の樹状細胞とともに培養することを含み、その際、該樹状細胞は、抗原に暴露されているかまたは抗原を発現して該抗原に応答して該Ｔ細胞が増殖または細胞障害性となるように活性化することを特徴とする、方法。
【請求項３１】
該Ｔ細胞がＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞である請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
該樹状細胞が培地中でインキュベーションすることにより抗原に暴露される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
該抗原が、腫瘍抗原、ウイルス抗原、微生物抗原、アレルゲン、自己抗原、ウイルス、微生物、ポリペプチド、ペプチドまたは複数の腫瘍細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
Ｔ細胞により認識されうる抗原の同定方法であって、
（ａ）該抗原に暴露された請求項２８または２９に記載の樹状細胞とともにＴ細胞を培養し、ついで
（ｂ）Ｔ細胞の増殖、Ｔ細胞の細胞障害活性またはＴ細胞のリンホカイン産生を測定する
ことを含む方法。
【請求項３５】
該Ｔ細胞がＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞である請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
該樹状細胞が培地中でインキュベーションすることにより抗原に暴露される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
該抗原が、腫瘍抗原、ウイルス抗原、微生物抗原、アレルゲン、自己抗原、ウイルス、微生物、ポリペプチド、ペプチドまたは複数の腫瘍細胞である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
請求項３４に記載の方法の工程、および工程（ｂ）で同定した抗原を製薬学的に許容しうる形態に調合することを含む、医薬組成物の製造方法。
【請求項３９】
Ｔ細胞を活性化するまたはコスティミュレートする化合物の同定方法であって、
（ａ）請求項２８または２９に記載の樹状細胞およびＴ細胞を、Ｔ細胞活性化に応答して検出可能なシグナルを生成しうる成分の存在下、スクリーニングしようとする化合物とともに該化合物と該細胞との相互作用を可能とする条件下にて培養し、ついで
（ｂ）Ｔ細胞の活性化により生成したシグナルの存在を検出する
ことを含む方法。
【請求項４０】
該樹状細胞が培地中でインキュベーションすることにより抗原に暴露される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
該抗原が、腫瘍抗原、ウイルス抗原、微生物抗原、アレルゲン、自己抗原、ウイルス、微生物、ポリペプチド、ペプチドまたは複数の腫瘍細胞である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
請求項３９に記載の方法の工程、および工程（ｂ）で同定した化合物を製薬学的に許容しうる形態に調合することを含む、医薬組成物の製造方法。
【請求項４３】
Ｔ細胞活性化または刺激を抑制する化合物を同定する方法であって、
（ａ）Ｔ細胞および請求項２８または２９に記載の樹状細胞を、Ｔ細胞アクチベーターによる該Ｔ細胞の活性化に応答して検出可能なシグナルを生成しうる成分の存在下、スクリーニングしようとする化合物とともに該Ｔ細胞の活性化を可能とする条件下にて接触させ、ついで
（ｂ）該アクチベーターとＴ細胞との相互作用により生成したシグナルの存在または不在を検出する
ことを含む方法。
【請求項４４】
該樹状細胞が培地中でインキュベーションすることにより抗原に暴露される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
該抗原が、腫瘍抗原、ウイルス抗原、微生物抗原、アレルゲン、自己抗原、ウイルス、微生物、ポリペプチド、ペプチドまたは複数の腫瘍細胞である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
請求項４３に記載の方法の工程、および工程（ｂ）で同定した化合物を製薬学的に許容しうる形態に調合することを含む、医薬組成物の製造方法。
【請求項４７】
請求項１ないし８および１３のいずれかに記載の抗体、請求項１４ないし２２のいずれかに記載のポリペプチド、請求項２３に記載のポリヌクレオチド、請求項２４に記載のベクター、請求項２８または２９に記載の樹状細胞、請求項３０、３１または３５に記載の方法によって得られるＴ細胞または請求項３２〜３３、３６〜３８、４０〜４２、または４４〜４６のいずれかに記載の方法によって得られる化合物を含むキット。
【請求項４８】
請求項２３に記載のポリヌクレオチド、請求項２４に記載のベクター、請求項２８または２９に記載の樹状細胞、請求項３０、３１または３５に記載の方法によって得られるＴ細胞または請求項２５に記載の細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項４９】
請求項１ないし８および１３のいずれかに記載の抗体、請求項２２に記載のポリペプチド、請求項２３に記載のポリヌクレオチド、請求項２４に記載のベクターまたは請求項２５に記載の細胞および任意に検出に適した手段を含む診断用組成物。
【請求項５０】
請求項２８または２９に記載の抗原に暴露された樹状細胞または抗原発現ＤＣを含むワクチン。
【請求項５１】
適合性の免疫療法用医薬組成物を調製するための請求項３０〜３３のいずれかに記載の方法により得られるＴ細胞の使用。
【請求項５２】
ヒトまたは動物におけるＴ細胞活性化用医薬組成物を調製するための、抗原に暴露された請求項２８または２９に記載の樹状細胞の使用。
【請求項５３】
該樹状細胞への標的細胞補充用医薬組成物を調製するための請求項４または５に記載の二重特異性抗体の使用。
【請求項５４】
標的細胞が腫瘍細胞またはウイルス感染細胞または微生物に感染した細胞である、請求項５３に記載の使用。
【請求項５５】
サイトカインまたはシグナル伝達分子の遺伝子をトランスフェクションして免疫応答をインビトロで変調させることを含む、請求項１ないし４、７、２８または２９のいずれかに記載の樹状細胞の改変方法。
【請求項５６】
Ｔ細胞の抗原特異的活性化を促進、変調または抑制する作用を有するＤＣにより合成される分子を同定する方法であって、
（ａ）請求項２８に記載のＤＣによって培養上清中に分泌された分子を分離し、ついで富化したまたは単離した該分子を抗原特異的なＴ細胞活性化についてＤＣを欠く細胞培養系で試験し、ついで／または
（ｂ）請求項２８に記載のＤＣにおける遺伝子発現を他の抗原提示細胞での遺伝子発現と比較する
ことを含む方法。
【請求項５７】
インビトロでＤＣを増殖させる方法であって、
（ａ）請求項２８に記載のＤＣを、ＤＣの増殖を支持する特定のサイトカイン混合物中で培養し、ついで／または
（ｂ）形質転換遺伝子を形質導入することにより該ＤＣを不死化する
ことを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト樹状細胞（ＤＣ）の個別集団を特異的に認識する新規な抗体および該抗体を用いた該ＤＣの単離方法に関する。本発明はさらに、上記抗体により認識される抗原およびエピトープ並びに該抗体をコードするポリヌクレオチドに関する。さらに、本発明は、該ポリヌクレオチドを含むベクター並びに該ベクターで形質転換した宿主細胞および該抗体の産生におけるその使用に関する。本発明はさらに、上記抗体の結合部位のドメイン、または上記抗原またはエピトープおよび少なくとも一つのさらなる好ましくは機能性のドメインを含むポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。さらに、本発明は、該ポリヌクレオチドを含むベクター、該ポリヌクレオチドまたはベクターでトランスフェクションした宿主細胞および上記ポリペプチドの製造のためのその使用に関する。本発明はまた、上記ＤＣの単離または同定方法をも含み、該方法によって得ることのできる、および／または上記抗体の認識によって特徴付けられる、および／または上記抗原またはエピトープを含むＤＣに関する。
【０００２】
本発明はまた、ある種の状態にあるＴ細胞を調製または同定する方法並びにＴ細胞により媒体された免疫応答の活性化を妨害する化合物を同定する方法を含む。さらに、本発明は、上記方法によって得られる上記抗体、抗原、エピトープ、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、樹状細胞またはＴ細胞または化合物を含むキットおよび組成物、好ましくは医薬および診断組成物に関する。本発明のさらなる目的は、樹状細胞に暴露された抗原、抗原発現ＤＣを含む、または上記抗原またはエピトープを含むワクチンである。さらに、上記樹状細胞は免疫保護組成物の対象である。さらに、本発明は、好ましくは癌および感染疾患に対して採用できる免疫療法用の医薬組成物を調製するための、上記方法によって得られるＴ細胞、上記ＤＣ、抗体、ポリヌクレオチドおよびベクターの使用、およびワクチンおよび免疫療法剤を調製するための、または免疫療法用の新規な抗原標的を同定するためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
幾つかの文献を本願の明細書中に引用する。本明細書中に引用した各文献（製造業者の仕様書、教示等を含む）は、参照のため本明細書中に組み込まれる。しかしながら、引用した文献が実際に本発明の先行技術であることを認めるものではない。
【０００４】
外来抗原に対する免疫応答は、３つの異なる相互作用する細胞型、いわゆるＴ細胞、Ｂ細胞および抗原提示細胞（ＡＰＣ）により媒体される。胸腺由来リンパ球（Ｔ細胞）は２つの機能的および表現型的に区別されるサブセットに分けることができる。ヘルパーＴ細胞はリンホカインを産生および分泌することにより抗原刺激に応答し、リンホカインは免疫系において他の様々な細胞型を活性化する。細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、抗原陽性の標的細胞、たとえばウイルス感染細胞を直接殺傷すべく分化したものである。Ｂ細胞は細胞表面レセプターとしてかまたは分泌されたタンパク質としてのいずれかで抗体により抗原を認識し、これら抗体は固相表面上または溶液中の抗原に直接結合する。対照的に、Ｔ細胞は、小さな断片にプロセシングまたは分解されＡＰＣの表面などの固相上に提示された抗原のみを認識する。さらに、抗原性断片は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）によってコードされたクラスＩまたはクラスII分子とともにＴ細胞に提示される必要がある。ＣＤ４＋Ｔ細胞はＭＨＣクラスII生成物によって提示される抗原を認識するのに対し、ＣＤ８＋Ｔ細胞はＭＨＣクラスＩタンパク質との関連で抗原を認識する。
【０００５】
Ｔ細胞への抗原の提示はＡＰＣと呼ばれる分化した細胞集団によって行われる。免疫応答の初期の事象に関与するものとして、ＡＰＣはＴ細胞およびＢ細胞の両応答の開始に重要である。一般に、ＡＰＣはマクロファージ／単球、Ｂ細胞、および骨髄由来樹状細胞（ＤＣ）を含む。最も重要なＡＰＣは樹状細胞である（非特許文献１）。これら細胞は、適当なＴ細胞がペプチド−ＭＨＣ複合体を認識することができ活性化されることができるように、外来の抗原を嵌入させ、抗原を小さなペプチド断片にプロセシングし、これら断片をＭＨＣ分子とともに細胞表面上に提示すべく分化している（非特許文献２）。ＡＰＣはＭＨＣによりコードされるクラスＩおよびIIの両タンパク質を提示するので、ＡＰＣは免疫応答を開始するために抗原断片をＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の両者に提示することができる。
【０００６】
抗原特異的なレセプターによる抗原のＴ細胞への提示に加えて、ＡＰＣはＴ細胞活性化のためのすべてのシグナルを提供する。そのようなシグナルには、様々な細胞表面の接着分子およびコスティミュラトリー分子並びにサイトカインまたは成長因子が含まれる。ナイーブな（naive）または初回抗原刺激を受けたことのないＴ細胞の活性化に必要な因子は、以前に初回抗原刺激を受けた記憶Ｔ細胞の再活性化に必要な因子とは異なる。ＤＣとは対照的に、単球およびＢ細胞は機能的にナイーブなまたは初回抗原刺激を受けたことのないＴ細胞を直接活性化することができないので、これら細胞の抗原提示能は以前に感作したＴ細胞の再活性化に限られると思われる。
【０００７】
「樹状細胞」なる語は、種々のリンパ系および非リンパ系組織に存在する形態学的に類似の細胞の種々のグループをいう（非特許文献３）。これら細胞は、リンパ節や脾臓などのリンパ系器官のＤＣ、表皮のランゲルハンス細胞、輸入（afferent）リンパ管中のベール（veiled）細胞および循環血流中のＤＣを含む。表現型的にヒトＤＣは、高密度のＭＨＣクラスII抗原、広範囲の接着分子の存在、およびＴ細胞、Ｂ細胞、単球およびナチュラルキラー細胞に特徴的な所定範囲の細胞系列（lineage）特異的な細胞表面抗原（ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６）の不在もしくは低発現によって特徴付けられる。この表現型の特徴にもかかわらず、これら抗原の大多数が他の細胞型によっても発現されるためにＤＣの同定および精製は依然として困難である。大抵の刊行された報告はマウス脾臓から単離したＤＣを利用しており、このＤＣが一次抗原特異的応答においてナイーブＴ細胞を活性化することができる点で独特のＡＰＣであることを示している（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。それゆえ、ヒトＤＣもまた、そのような強力な抗原提示機能を果たし得る。
【０００８】
ヒト組織からＤＣを富ませるのに最も適したやり方は、その利用しやすからヒト末梢血から単離することである。幾つかの研究が末梢血からのヒトＤＣの単離を記載している（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３）。新鮮な血液ＤＣの単離のための現行のプロトコールは２つの異なる成分からなる：第一は、ＤＣによっては発現されない細胞表面抗原に対する細胞系列特異的なモノクローナル抗体を用いた他の細胞集団の連続的な涸渇によるＤＣの富化（enrichment）である。そのような抗体の例としては、Ｔ細胞に特異的な抗ＣＤ３、抗ＣＤ４および抗ＣＤ８；Ｂ細胞に特異的な抗ＣＤ１９および抗ＣＤ２０；単球に特異的な抗ＣＤ１４；およびナチュラルキラー細胞に特異的な抗ＣＤ５６が挙げられる。第二は、ＤＣによりＭＨＣクラスII抗原として異なって発現される細胞表面マーカーを用いることによる細胞系列マーカー陰性細胞画分からＤＣを積極的に選択することである（非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６）。
【０００９】
細胞は、抗体に結合したら、該一次抗体の定常領域に向けられた二次抗体をコーティングした固相に吸着させることによって除去することができる。あるいは、ビオチンに結合した抗体はアビジンまたはストレプトアビジンをコーティングした表面により除去することができる。抗体をマグネチックビーズに結合させてある場合は、抗体結合細胞は磁場で分離することができる（非特許文献１７）。抗体選択に加え、密度勾配遠心分離および赤血球ロゼット形成法を応用する。この手順は時間を要し、限られた数の精製ＤＣしか得られない。さらに、単離したＤＣ画分は、しばしば他の混入細胞集団のために不均質である。そのうえ、勾配（gradient）化合物およびその浸透作用は細胞の表現型および機能の変化を引き起こす（非特許文献１８；非特許文献１９）。
【００１０】
ＤＣを得るために広く用いられている他の方法は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αまたはＩＬ−４による組み合わせインビトロ処理（少なくとも数日間保持しなければならない）により誘発される、骨髄もしくは血液由来ＣＤ３４＋細胞またはＣＤ１４＋単球の分化に基づく（非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３）。この手順の使用は、細胞の培養の間に起こる表現型および機能の変化に限られる。さらに、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４による処理はＴ細胞の非特異的な刺激を促進する（非特許文献２４）。
【００１１】
末梢血からのＤＣの直接的な単離は、循環血中のＤＣの頻度が低いことおよび選択的なマーカーの欠如のために行き詰まっている。ヒトのＤＣ特異的な細胞系列マーカーは同定されていない。これまでにＤＣに特異的であるとして報告されているわずかな数のマーカーは血液ＤＣを単離するのに適していない。Zhouら（非特許文献２５）によって記載されたＣＤ８３分子は、インビトロ培養で優先的に誘発される活性化マーカーであるとされている。モノクローナル抗体 ＣＭＲＦ−４４は、新たに単離した血液ＤＣには発現されないがＤＣを精製するのに通常用いられる物理的単離手順の間に誘発される初期活性化抗原を認識する（非特許文献２６）。ｐ５５抗原、アクチン束化（bundling）タンパク質は細胞質に限られている（非特許文献１６）。それゆえ、ヒトＤＣによって選択的に発現される抗原に対するモノクローナル抗体の必要性が依然として存在し、そのようなモノクローナル抗体は末梢血からＤＣを直接単離するのを容易にするであろう。これまでのヒトＤＣ特異的な抗体を単離する試みは大部分不成功に終わっており、ＤＣと他の白血球との両者に共通する抗原を認識する抗体が得られているにすぎない。
【非特許文献１】Sprentら、1987,Adv.Immunol.41:39-133
【非特許文献２】GoldbergおよびRock,1992,Nature 357:375-379
【非特許文献３】Steinmann,1991,Ann.Rev.Immunol. 9:271-296
【非特許文献４】Inabaら,1987,J.Exp.Med.166:182-194
【非特許文献５】Hengelら,1987,J.Immunol.139:4196-4202
【非特許文献６】Kastら,1988,J.Immunol.140:3186-3193
【非特許文献７】Romaniら,1989,J.Exp.Med.169:1169-1178
【非特許文献８】Macatoniaら,1989,J.Exp.Med.169:1255-1264
【非特許文献９】Inabaら,1990,J.Exp.Med.172:631-640
【非特許文献１０】YoungおよびSteinmann,1990,J.Exp.Med.171:1315-1332
【非特許文献１１】FreudenthalおよびSteinmann,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:7698-7702
【非特許文献１２】Macatoniaら,1989,Immunol.67:285-289
【非特許文献１３】MarkowiczおよびEngleman,1990,J.Clin.Invest.85:955-961
【非特許文献１４】O'Dohertyら,1994,Immunol.82:487-493
【非特許文献１５】Thomasら,1993,J.Immunol.150:821-834
【非特許文献１６】O'Dohertyら,1993,J.Exp.Med.178:1067-1076
【非特許文献１７】HarlowおよびLane, 1988, "Antibody",コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
【非特許文献１８】McLellanら,1995,Eur.J.Immunol.25:2064-2068
【非特許文献１９】Kabelら,1989,Immunology 179:341-395
【非特許文献２０】Cauxら,1992,Nature 360:258-261
【非特許文献２１】Bernhardら,1995,Cancer Res.55:1099-1104
【非特許文献２２】Sallustoら,1994,J.Exp.Med.179:1109-1118
【非特許文献２３】Romaniら,1994,J.Exp.Med.180:83-93
【非特許文献２４】Dillonら,1997,Scand.J.Immunol.46:1-9
【非特許文献２５】Zhouら,1995,J.Immunol.154: 3821-3835
【非特許文献２６】Hockら,1994,Immunology 83:573-581
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
それゆえ、本発明の技術的課題は免疫応答を調節するための手段および方法を提供することである。この技術的課題の解決は、特許請求の範囲において特徴付けられる態様を提供することによって達成される。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
従って、本発明は、
（i）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からの未熟および／または成熟樹状細胞（ＤＣ）の特性を表示するＤＣ上のエピトープとは反応するが
（ii）他のＰＢＭＣとは反応しない
抗体に関する。
【００１４】
通常、樹状細胞は異なる表現型および機能的特性を有する細胞の不均質な集団を含むが、抗原を提示し、ナイーブなＴリンパ球を初回抗原刺激する顕著な能力で際立っている１。細胞系列マーカー陽性細胞の涸渇とそれに引き続くＭＨＣクラスII発現細胞の単離などの従来の戦略は、主として成熟ＤＣおよび未熟ＤＣを表す２つの主要なＤＣ集団を定めるに至っている２，３。さらに最近では、幾つかの報告がＤＣを種々のカテゴリーに従ってリンパ系細胞または骨髄性の樹状細胞に分けたり（Wuら,J.Exp.Med.184(1996),903-911; Galyら,Immunity 3(1995),459-473）、またはマウス脾臓中の微細解剖位置に基づいて辺縁系細胞および交互嵌入合（interdigitating）細胞に分ける（Leenenら,J.Immunol.160(1998),2166-2173）試みがなされている。
【００１５】
本発明の抗体は、ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗ、ＣＤ３３ｄｉｍ、ＣＤ４５ＲＡｈｉｇｈ、ＣＤ１１ｃ−およびＣＤ６４−である未熟ＤＣの特性を提示するＤＣ、および表面マーカー特性ＨＬＡ−ＤＲｈｉｇｈ、ＣＤ３３ｈｉｇｈ、ＣＤ４５ＲＡｌｏｗ、ＣＤ１１ｃ＋およびＣＤ６４＋を有する実質的に成熟ＤＣに類似するＤＣを含む、これまでに同定されていないＤＣの集団と特異的に反応する。本発明の抗体により認識されるＤＣは、好ましくは、未熟ＤＣと成熟ＤＣとの間の成熟化段階として、およびモノクローナル抗体Ｍ−ＤＣ８として示される本発明の新規な抗体と反応する能力により定められる。従って、本発明のＤＣはまた、Ｍ−ＤＣ８＋またはＭ−ＤＣ８＋細胞として言及されるであろう。上記新規なモノクローナル抗体Ｍ−ＤＣ８は、Ｍ−ＤＣ８抗原を発現するJurkatＴ細胞リンパ腫サブクローンを特異的に選択するのに用いた（付属の実施例１０参照）。該Jurkatサブクローンは、さらに本発明の新規な抗体を産生するのに用いた。これらモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体Ｄ−ＤＣ８.１およびＤ−ＤＣ８.２を含む。これら抗体によって認識されるＤＣもまたＭ−ＣＤ８＋またはＭ−ＣＤ８＋細胞と称されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本明細書において「未熟ＤＣと成熟ＤＣとの間の成熟化段階を表すＤＣ集団」とは、図８に模式的に表示するように、何人かの研究者２，３，２０によってこれまでに定められている２つの主要なＤＣのサブセットに重複するヒト血液ＤＣの集団をいう。第一のサブセットの細胞はＨＬＡ−ＤＲｌｏｗ、ＣＤ３３ｄｉｍ、ＣＤ４５ＲＡｈｉｇｈ、ＣＤ１１ｃ−およびＣＤ６４−であって未熟ＤＣを表し、一方、第二のサブセットは表面マーカー特性ＨＬＡ−ＤＲｈｉｇｈ、ＣＤ３３ｈｉｇｈ、ＣＤ４５ＲＡｌｏｗ、ＣＤ１１ｃ＋およびＣＤ６４＋を有する成熟ＤＣを含む。これら細胞は、さらに、一夜培養後にＣＤ８３を発現する２０。確立された両ＤＣ集団とＭ−ＤＣ８＋細胞との主たる相違は、Ｍ−ＤＣ８およびＣＤ１６の発現および細胞質内ｐ５５抗原の不在である。それゆえ、Ｍ−ＤＣ８＋細胞は中間の発達段階を表すと推測したくなる。
【００１７】
本発明の意味における「末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）」とは、１.０７７ｇ／ｍｌの密度のFicollR−勾配で新たに採取した静脈血の遠心分離により単離した有核の血球をいう。
【００１８】
本明細書において「他のＰＢＭＣと反応しない」とは、本発明の抗体がＭ−ＤＣ８＋細胞を除く上記ＰＢＭＣ（Ｂリンパ球、Ｔリンパ球およびＣＤ１４ｈｉｇｈ＋単球など）と反応しないかまたは無視しうる程度に交叉反応することをいう。本発明の抗体の交叉反応性は、１０％未満、さらに好ましくは５％未満、特に好ましくは３％未満、またはさらには２％または１％未満である。
【００１９】
本発明は、極めてＤＣに富むヒト単核血球でマウスを免疫することにより得られる（付属の実施例１に記載のようにして得られる）新規なモノクローナル抗体（モノクローナル抗体Ｍ−ＤＣ８）が、ＨＬＡ−ＤＲを発現し共通の細胞系列特異的なマーカーを欠如するＰＢＭＣを１〜２％含む白血球と特異的に反応するという観察に基づいている。Ｍ−ＤＣ８＋細胞の特徴的な光分散プロフィルは、リンパ球と単球との間に位置する限定されたサイズおよび顆粒度（granularity）の細胞集団を示していた。細胞培養の４８時間以内に単離したＭ−ＤＣ８＋細胞は細胞質突出（cytoplasmatic protrusions）の波動（undulating）を特徴とする成熟ＤＣの典型的な形態を獲得した１。食作用の乏しい細胞としてＤＣを記載する以前の報告３とは対照的に、新たに単離したＭ−ＤＣ８＋細胞はラテックス粒子および抗体コーティング赤血球を貪欲に消化した。未熟ＤＣはエンドサイトーシスおよびマクロピノサイトーシスにより大量の抗原を取り込むが４、本発明に従って得られたＭ−ＤＣ８＋細胞に対する知見は食作用が抗原取り込みのさらなる重要な経路であることを示している。
【００２０】
ごく最近、FangerらはＤＣ上でのＦｃレセプターＣＤ６４およびＣＤ３２の発現および食作用におけるその機能的な関与を記載している２０。対照的に、Ｍ−ＤＣ８＋細胞はＣＤ６４を欠如しており、その代わりにＣＤ１６をＣＤ３２とともに発現する。それゆえ、Ｍ−ＤＣ８＋細胞によるオプソニン処理赤血球の食作用はＣＤ１６およびＣＤ３２の両者によって媒体されるのかもしれない。
【００２１】
本発明によれば、驚くべきことに新鮮なＭ−ＤＣ８＋細胞は顕著な食作用活性に加えて、効率的なアロ抗原依存性およびＴＴ依存性のＴ細胞増殖によって示されるようにＴ細胞を活性化する際立った能力を示すことがわかった。さらに、Ｍ−ＤＣ８＋細胞は自己由来白血球反応においてＴ細胞を刺激するのみならず、ＫＬＨに対して一次Ｔ細胞応答を誘発したが、これはすべてＤＣに典型的と考えられる活性である１。一次Ｔ細胞応答が生じるためにはナイーブなＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞を富ませる必要があるとのこれまでの報告２１，２２とは対照的に、Ｍ−ＤＣ８＋細胞は前以て富化することなくＫＬＨに対して未選択Ｔ細胞を初回抗原刺激することができた。さらに、Ｍ−ＤＣ８＋細胞はＭＨＣクラスＩに限定されたＴ細胞応答を非常に効率的に刺激した。Ｍ−ＤＣ８＋細胞は特定の抗原ペプチドで感作した後に細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを単球と同じくらい効率的に活性化したが、単球とは対照的にＣＤ４＋Ｔ細胞ヘルパー細胞の完全な不在下に精製ＣＤ８＋Ｔ細胞のアロ抗原特異的な細胞傷害性エフェクター細胞への分化を誘発した（ＤＣに特徴的な活性とされているものである１７，１８）。さらに、メラノーマ関連チロシナーゼペプチドを負荷した後にＭ−ＤＣ８＋細胞はメラノーマ患者および正常なドナーからのＴ細胞を刺激して、ＨＬＡに限定された仕方でメラノーマ細胞に対する特異的な細胞障害作用を生成させた。
【００２２】
Ｍ−ＤＣ８＋細胞は明らかにＣＤ１４＋単球と区別される独特のパターンの細胞表面分子を明らかにした。新たに単離したＭ−ＤＣ８＋細胞は低表面レベルのＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３３、ＣＤ４５Ｒ０およびＣＤ１１ｂを発現したが、一方、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＣＤ４の密度は単球のものと同様であった。一方、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｃおよびとりわけＣＤ１６の発現は単球よりも明らかに高かった。
【００２３】
Ｍ−ＤＣ８＋細胞は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下でＣＤ３４＋前駆細胞またはＣＤ１４＋単球からインビトロで生成される１４大部分のＤＣとは異なる。Ｍ−ＤＣ８＋細胞はインビトロでのサイトカインによる分化によって得られるＤＣと共通する多くの表面マーカーおよび機能的な特性を有する。しかしながら、Ｍ−ＤＣ８抗原は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αでの刺激によってＣＤ３４＋前駆細胞から得られるＤＣの２〜５％を含む小さなサブセットを例外として、インビトロで生成されるＤＣでは検出されなかった。Ｍ−ＤＣ８＋細胞の起源およびＭ−ＤＣ８マーカーの発現を誘発するシグナルは未だ解明されていない。
【００２４】
ＦｃγＲIII（ＣＤ１６）は、Ｍ−ＤＣ８＋細胞とこれまでに定められているＤＣとの間で発現が異なることがわかった他の表面分子である。これまでのところ、ＤＣによるＣＤ１６発現はマウスのランゲルハンス細胞でのみ記載されており、免疫複合体の嵌入および抗原の提示を促進すると推定されている２３。ヒトではＣＤ１６発現は主として顆粒球、ＮＫ細胞、マクロファージ、および単球のサブセットに限られており２４、ＤＣでは一般に発現されないと考えられている。対照的に、Ｍ−ＤＣ８抗体で新たに単離されたＤＣはＣＤ１６を高濃度で発現した。この明らかな不一致は、ＤＣ上でのＣＤ１６の短いインビトロ半減期によるものと思われる。というのはＣＤ１６はインビトロ培養で短時間で消失したからである。一般に、ＦｃγレセプターはFicoll密度勾配遠心分離などの長期の細胞の取扱いにより非常に速やかに下方制御（downregulated）されると思われる２５。
【００２５】
本発明の好ましい態様において、該ＤＣはＨＬＡ−ＤＲ＋であり、該ＰＢＭＣはＴ細胞およびＢ細胞および単球が涸渇している。好ましくは、該ＤＣはＣＤ６４−、ＣＤ３３＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ１１ｃ＋およびｐ５５−およびとりわけＣＤ１６＋であり、および／またはリンパ球と単球との間に位置する限定されたサイズおよび顆粒度を有する。
【００２６】
本発明の抗体は、たとえば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、合成抗体、Ｆａｂ、ＦｖまたはｓｃＦｖ断片などの抗体断片、またはこれらのいずれかの化学的に修飾した誘導体であってよい。モノクローナル抗体は、たとえば、KohlerおよびMilsteinによって最初に記載された技術（Nature 256(1975), 495, およびGalfre, Meth.Enzymol.73(1981),3）（マウスミエローマ細胞を免疫哺乳動物からの脾臓細胞に融合させることを含む）によって当該技術分野で開発された改変を採用しながら調製することができる。モノクローナル抗体は、とりわけ、マウス、たとえばＢＡＬＢ／ｃマウスを付属の実施例１に記載するようにして得られるヒト単核血球で免疫することによって得ることができる。
【００２７】
抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体または合成抗体、並びにＦａｂ、ＦｖまたはｓｃＦｖ断片などの抗体断片であってよい。さらに、上記ＤＣに対する抗体またはその断片は、たとえばHarlowおよびLane, "Antibodies, A Laboratory Manual"、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、１９８８に記載されている方法により得ることができる。これら抗体は、たとえば、本発明のＤＣの免疫沈降、免疫局在化（immunolocalization）または精製のため、並びにそのようなＤＣの存在のモニターのため、および本発明によるＤＣと相互作用する化合物の同定のために用いることができる。たとえば、BIAcoreシステムに用いられているような表面プラスモン共鳴（surface plasmon resonance）を用いて本発明の抗体により認識されるエピトープに結合する抗体のファージ展示の効率を高めることができる（Schier, Human Antibodies Hybridomas 7(1996),97-105;Malmborg, J.Immunol.Methods 183(1995),7-13）。
【００２８】
キメラ抗体の産生は、たとえばＷＯ８９／０９６２２に記載されている。ヒト化抗体の製造方法は、たとえばＥＰ−Ａ１ ０ ２３９ ４００およびＷＯ９０／０７８６１に記載されている。さらに、ヒト抗体は一般に利用しやすくなっている。なぜなら、ヒト抗体を発現するトランスジェニックマウス（異種抗体とも呼ばれる）（Bruggermann, Immunol.Today 17(1996), 391-397）およびおよびコンビナトリアル抗体ライブラリーおよびファージ展示法を利用できることが、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）のインビトロ組み合わせおよびその抗原結合特異性のインビトロ選択を可能にするからである（Winter, Annu.Rev.Immunol.12(1994),433-455）。ファージ展示法を用いることにより、１０７〜１０９の異なるＶＬ／ＶＨ−またはＶＨ／ＶＬ−ペアから一つの特異的結合種のような稀な事象を容易に単離することができる；このことは、レパートリークローニング（repertoire cloning）のための源として免疫宿主からのＢリンパ球を用いることにより可変領域のレパートリーが特定の結合種について富化されている場合にとりわけ当てはまる。
【００２９】
さらに、半合成または完全に合成したＶＨ−および／またはＶＬ−免疫グロブリン鎖レパートリーを用いる方法が開発されている。たとえば、インビボでのＶ−ＪまたはＶ−Ｄ−Ｊ組換えを真似て、再編成されていないヒトＶ遺伝子セグメントの殆ど完全なレパートリーをゲノムＤＮＡからクローニングし、機能的な可変領域をインビトロで組換えるのに用いられている（Hoogenboom,J.Mol.Biol.227(1992),381-388;Nissim,EMBO J.13(1994)692-698;Griffiths,EMBO J.13(1994),3245-3260）。それゆえ、上記および付属の実施例に記載する抗体の誘導体はすべて、それが上記ＤＣに特異的な抗原（好ましくはＭ−ＤＣ８、Ｄ−ＤＣ８.１および／またはＤ−ＤＣ８.２抗体によって認識される抗原）の少なくとも一つのエピトープを認識する限り、本発明の範囲に包含される。上記に記載したように、本発明の抗体は完全な抗体に加えて、たとえばＦｖ、ＦａｂおよびＦ(ａｂ)２並びに一本鎖を含む種々の形態で存在してよい（たとえば、ＷＯ８８／０９３４４参照）。
【００３０】
本発明の抗体または対応するその免疫グロブリン鎖は、当該技術分野で知られた通常の方法を用い、たとえばアミノ酸の欠失、挿入、置換、付加、および／または組換えおよび／または当該技術分野で知られた他の修飾法を単独もしくは組み合わせて用いることによりさらに修飾することができる。免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列の基礎となるＤＮＡ配列にそのような修飾を導入する方法は当該技術分野でよく知られている；たとえば、Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（１９８９）ニューヨークを参照。
【００３１】
本発明の好ましい態様において、本発明の該二重特異性抗体は、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、Ｔ細胞、腫瘍関連タンパク質、微生物タンパク質、アレルゲン、自己抗原またはサイトカインに特異的なエピトープを認識する。
【００３２】
本発明の好ましい態様において、該ＤＣはハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ ＡＣＣ２２４１によって産生される抗体によって認識され、好ましくは該抗体はハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ ＡＣＣ２２４１によって産生される抗体Ｍ−ＤＣ８（ＤＣ８）である。該ハイブリドーマ細胞は、ブダペスト条約に従い、カルチャーコレクション・ドイチェ・ザムルング・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルトゥーレン（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen）ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）（ブラウンシュベイク、ドイツ）に１９９５年１０月２６日に寄託してある。
【００３３】
上記および付属の実施例に記載するように、新規なモノクローナル抗体Ｍ−ＤＣ８はヒトＤＣの独特の集団に対して極めて選択的なマーカーを提供するものであり、該集団は血液の白血球の０.５〜１％を占め、１工程の免疫磁気手順を用いて血液から直接単離できる。Ｍ−ＤＣ８＋細胞はＦｃγＲIII（ＣＤ１６）を発現するのを特徴とし、極めて食作用が強く、また自己混合白血球反応、一次抗原に対するＴ細胞の活性化、アロ抗原特異的な細胞障害性エフェクター細胞への精製ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化の誘発、およびメラノーマ患者および正常な血液ドナーからのＴ細胞のメラノーマ特異的細胞障害性細胞への分化の誘発によって証拠立てられるように抗原をＴ細胞に提示する際立った能力を示す。それゆえ、モノクローナル抗体Ｍ−ＤＣ８は診断目的で循環ＤＣを決定するための、およびエクスイボおよびインビボでの抗原特異的なＴ細胞初回抗原刺激のためのＤＣを調製するための価値ある手段である。
【００３４】
さらに、本発明の抗体は、該樹状細胞上のエピトープを認識、検出および／または反応する抗体であり、ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ ＡＣＣ２３９９またはＤＳＭ ＡＣＣ２３９８によって産生される。これらハイブリドーマ細胞株は、ブダペスト条約に従ってカルチャーコレクションＤＳＭＺ（ブラウンシュベイク、ドイツ）に１９９９年５月５日に寄託してある。上記および付属の実施例に記載するように、これら新規なモノクローナル抗体Ｄ−ＤＣ８.１およびＤ−ＤＣ８.２は上記特定のＭ−ＤＣ８＋細胞を認識するさらなる抗体を提供する。Ｍ−ＤＣ８と同様、モノクローナル抗体Ｄ−ＤＣ８.１およびＤ−ＤＣ８.２はとりわけ本発明の樹状細胞の免疫単離、免疫局在化および／または精製に用いることができる。さらに、これらモノクローナル抗体はまた、本発明によるＤＣと相互作用するまたは相互作用できる化合物を検出および同定するのにも有用である。
さらに、本発明の抗体は、該樹状細胞上のエピトープを認識、検出および／または反応
【００３５】
他の態様において、本発明は、たとえば免疫グロブリンの定常ドメインに連結した、Ｍ−ＤＣ８またはＤ−ＤＣ８.１またはＤ−ＤＣ８.２抗体の可変重鎖および軽鎖ドメインをコードするｃＤＮＡをヒトＢ細胞株中に形質導入することにより、ヒト化形態で本発明の抗体を産生しうるヒトＢ細胞株に関する。該ｃＤＮＡは当業者に知られた方法により得ることができ、とりわけSambrook（上掲）およびAusubel, "Current Protocols in Molecular Biology"、グリーン・パブリシング・アソシエーツ・アンド・ウイリー・インターサイエンス、ニューヨーク（１９８９）に記載されている。発現（またはシークエンシング）のための該ｃＤＮＡのクローニングは、たとえばOrlandi, PNAS 86(1986),3833-3837に記載されているように、あるいは付属の実施例９（モノクローナル抗体Ｍ−ＤＣ８の可変領域のクローニングを記載）で説明してあるように、標準プロトコールに従って行うことができる。
【００３６】
さらに、本発明は、本発明の抗体を産生することのできる連続的で安定な抗体産生細胞株に関する。該細胞株はハイブリドーマ細胞株、好ましくは受託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２２４１、受託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２３９９または受託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２３９８を有するハイブリドーマ細胞株であってよい。
【００３７】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の抗体によって認識される抗原またはそのエピトープに関する。該抗原またはエピトープはグリコシル化されていてよいし、グリコシル化されていなくてもよいし、または部分的に脱グリコシル化されていてもよい。本明細書に記載し実施例で説明するように、本発明のＤＣは上記抗体によって認識される、Ｍ−ＤＣ８などの新規な抗原を特徴とする。予備的な生化学データは、Ｍ−ＤＣ８抗原がタンパク質であること、より詳細にはタンパク質の炭水化物部分であることを示している。それゆえ、この抗原は、糖脂質上およびとりわけ膜タンパク質上に存在する炭水化物構造を含む。この新規なマーカーの主たる利点は、それが＞９７％純粋なＤＣを血液から極めて短時間に迅速に単離する手段として機能することができることである。この迅速なＤＣ単離法は、ウイルスまたは腫瘍抗原に対して免疫しようとする種々のエクスビボでの試みに対してＤＣを使用することを極めて容易にする。本発明の抗原およびエピトープの同定および単離のため、たとえば種々のｃＤＮＡを胞嚢体中に注入して充分な時間ｃＤＮＡ遺伝子産物の発現を起こさせ、ついでたとえば本発明の抗体を用いることによって所望のｃＤＮＡ発現産物の存在を試験することにより、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。
【００３８】
別法として、大腸菌でのｃＤＮＡ発現ライブラリーを、本発明の抗体を用いて本発明の少なくとも一つのエピトープを有するペプチドについて間接的にスクリーニングすることができる（ChangおよびGottlieb, J.Neurosci.,8:2123,1988）。そのような抗原の構造を明らかにした後、結合パートナーおよび／またはドメインを合理的にデザインすることが可能である。たとえば、構造モチーフのフォールディングシミュレーションおよびコンピューターリデザインを適当なコンピュータープログラムを用いて行うことができる（Olszewski, Proteins 25(1996),286-299;Hoffman, Comput.Appl.Biosci.11(1995),675-679）。さらに、コンピューターは、詳細なタンパク質モデルのコンホメーションおよびエネルギー分析に用いることができる（Monge, J.Mol.Biol.247(1995),955-1012;Renouf, Adv.Exp.Med.Biol.376(1995),37-45）。
【００３９】
他の態様において、本発明は、本発明の上記抗体のいずれかの免疫グロブリン鎖の少なくとも可変領域をコードするポリヌクレオチドに関する。該領域をコードするポリヌクレオチドは、当該技術分野でよく知られ、とりわけOrlandi, PNAS 86(1989),3833-3837またはSambrook（上掲）に記載されたクローニング法を含む方法により得ることができる。免疫グロブリンの一つの形態は抗体の基本構造単位を構成する。この形態は四量体であり、免疫グロブリン鎖の２つの同一のペアからなり、それぞれ一つの軽鎖および一つの重鎖を有する。各ペアにおいて、軽鎖および重鎖可変領域またはドメインは一緒になって抗原への結合に関与し、定常領域は抗体のエフェクター機能に関与する。免疫グロブリンは抗体に加えて、たとえばＦｖ、Ｆａｂ、およびＦ(ａｂ')２並びに一本鎖抗体を含む種々の他の形態（所望の活性を保持した完全長未満のものを含む）で存在する（たとえば、Huston, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988,5879-5883およびBird, Science 242(1988),423-426;上記をも参照）。
【００４０】
免疫グロブリンの軽鎖または重鎖可変ドメインは、３つの高度可変領域、いわゆるＣＤＲにより中断された「フレームワーク」領域からなる。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は正確に定められている；たとえば、"Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat、米国保健社会福祉省（１９９０）参照。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は一つの種内で比較的保存されている。ある抗体のフレームワーク領域（構成する軽鎖および重鎖の組み合わさったフレームワーク領域である）は、ＣＤＲを位置付け、配置する役割をする。ＣＤＲは主として抗原のエピトープへの結合に関与する。キメラ抗体は、その軽鎖および重鎖遺伝子を異なる種に属する免疫グロブリンの可変および定常領域遺伝子から典型的には遺伝子操作により構築した抗体である。たとえば、マウスモノクローナル抗体からの遺伝子の可変セグメントをヒト定常セグメントに結合させることができる。
【００４１】
それゆえ、本発明の抗体は、本発明の抗体の重鎖および軽鎖免疫グロブリン鎖をコードする組換えＤＮＡセグメントを単独または組み合わせて発現させることにより製造することができる。該ポリヌクレオチドは、たとえば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成して製造したＤＮＡまたはＲＮＡまたはこれらポリヌクレオチドのいずれかを単独または組み合わせて含む組換えにより製造したキメラ核酸分子であってよい。好ましくは、該ポリヌクレオチドはベクターの一部であってよい。そのようなベクターは、適当な宿主細胞中でおよび適当な条件下で該ベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子などのさらなる遺伝子を含んでいてよい。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、原核細胞または真核細胞中での発現を可能にする発現制御配列に作動可能に連結されている。該ポリヌクレオチドの発現は、ポリヌクレオチドの翻訳可能なｍＲＮＡへの転写を含む。真核生物、好ましくは哺乳動物細胞中での発現を確実にする制御配列は当業者によく知られている。これら制御配列には、通常、転写の開始を確実にする制御配列および任意に転写の終結および転写の安定化を確実にするポリＡシグナルが含まれる。さらなる制御配列としては、転写および／または翻訳エンハンサー、および／または天然に付随するまたは異種のプロモーター領域が挙げられる。この観点から、当業者は、軽鎖および／または重鎖の少なくとも可変ドメインをコードするポリヌクレオチドが免疫グロブリンの両方の鎖または一方のみの鎖の可変ドメインをコードしていてよいことを容易に認識するであろう。同様に、該ポリヌクレオチドは、同じプロモーターの制御下にあってもよいし、または発現のために別々に制御されていてもよい。
【００４２】
原核宿主細胞中での発現を可能にする制御配列としては、たとえば、大腸菌でのＰＬ、ｌａｃ、ｔｒｐまたはｔａｃプロモーターが挙げられ、真核宿主細胞での発現を可能にする制御配列の例は酵母でのＡＯＸ１またはＧＡＬ１プロモーター、または哺乳動物および他の動物細胞でのＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサーまたはグロビンイントロンである。そのような制御配列は、転写の開始に関与する配列に加えて、ＳＶ４０ポリＡ部位またはｔｋポリＡ部位などの転写終結シグナルをも該ポリヌクレオチドの下流に含んでいてよい。この関連で、オカヤマ−バーグｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Pharmacia）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（In-vitrogen）、ｐＳＰＯＲＴ１（GIBCO BRL）などの適当な発現ベクターが当該技術分野で知られている。
【００４３】
好ましくは発現制御配列は真核宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションできるベクター中の真核プロモーター系であろうが、原核宿主のための制御配列もまた用いることができる。ベクターが適当な宿主中に導入されたら、該宿主を該ヌクレオチド配列の高レベル発現に適した条件下で保持し、ついで所望により、免疫グロブリン軽鎖、重鎖、軽／重鎖二量体または完全な抗体、結合性断片または他の免疫グロブリン形態の回収および精製を行う；Beychok, Cells of Immunoglobulin Synthesis、アカデミック・プレス、ニューヨーク（１９７９）を参照。
【００４４】
上記のように、本発明のポリヌクレオチドは単独またはベクターの一部として、たとえば、悪性変換ＤＣに関連する疾患またはＤＣ関連白血病の遺伝子療法または診断のため、本発明の抗体を細胞中で発現させるのに用いることができる。上記抗体のいずれか一つをコードするＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドまたはベクターを細胞中に導入すると、該細胞は所望の抗体を産生する。遺伝子療法はエクスビボまたはインビボ技術により治療用遺伝子を細胞中に導入することに基づくものであるが、遺伝子伝達の最も重要な応用の一つである。インビトロまたはインビボ遺伝子療法に適したベクター、方法または遺伝子送達系は文献に記載されており、当業者によく知られている；たとえば、Giordano, Nature Medicine 2(1996),534-539;Schaper, Circ.Res.79(1996),911-919;Anderson, Science 256(1992),808-813;Isner, Lancet 348(1996),370-374;Muhlhauser, Circ.Res.77(1995),1077-1086;Wang, Nature Medicine 2(1996),714-716;ＷＯ９４／２９４６９；ＷＯ９７／００９５７、Onodua, Blood 91(1998),30-36;Verzeletti, Hum. Gene Ther.9(1998),2244-2251;Verma, Nature 389(1997),239-242;米国特許第５,５８０,８５９号；米国特許第５,５８９,４６６号；米国特許第４,３９４,４４８号またはSchaper, Current Opinion in Biotechnology 7(1996),635-640、およびその中の引用文献を参照。
【００４５】
本発明のポリヌクレオチドおよびベクターは、細胞中への直接導入またはリポソームまたはウイルスベクター（たとえば、アデノウイルス、レトロウイルス）を介した導入のためにデザインすることができる。好ましくは、該細胞は、生殖細胞、胚細胞、または卵細胞またはそれらに由来する細胞であり、最も好ましくは該細胞は幹細胞である。この態様は、たとえば一つの特異性が腫瘍抗原に対するものであり、これによって腫瘍細胞や可溶性腫瘍抗原などのその一部の嵌入、プロセシングおよび提示を容易にするものなどの、本発明の二重特異性抗体に特に適している。
【００４６】
さらに、本発明は、本発明の抗体の鎖の可変ドメインをコードするポリヌクレオチドを、任意に本発明の抗体の他の鎖の可変ドメインをコードする本発明のポリヌクレオチドとともに含むベクター、とりわけ遺伝子操作において通常用いられるプラスミド、コスミド、ウイルスおよびバクテリオファージに関する。好ましくは、該ベクターは、発現ベクターおよび／または遺伝子伝達またはターゲティングベクターである。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、またはウシ乳頭腫ウイルスなどのウイルスに由来する発現ベクターを、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを標的細胞集団に送達するのに用いることができる。組換えウイルスベクターを構築するために当業者によく知られた方法を用いることができる；たとえば、Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（１９８９）ニューヨークおよびAusubel, Current Protocols in Molecular Biology、グリーン・パブリシング・アソシエーツ・アンド・ウイリー・インターサイエンス、ニューヨーク（１９８９）を参照。
【００４７】
別法として、標的細胞への送達のために本発明のポリヌクレオチドおよびベクターをリポソーム中に再構築することができる。本発明のポリヌクレオチド（たとえば、免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖可変ドメインをコードする配列および発現制御配列）を含むベクターをよく知られた方法（細胞宿主の種類により変わってよい）により宿主細胞中に移すことができる。たとえば、塩化カルシウムトランスフェクションを一般に原核細胞に用いることができ、一方、リン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションを他の細胞宿主に用いることができる；たとえば、Sambrook（上掲）を参照。発現されたら、本発明の全抗体、その二量体、個々の軽鎖および重鎖、または他の免疫グロブリン形態を、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む標準法に従って精製できる；たとえば、Scopes, "Proteins Purification", Springer-Verlag、ニューヨーク（１９８２）を参照。医薬に使用するには少なくとも約９０〜９５％の均質性の実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８〜９９％またはそれ以上の均質性が最も好ましい。精製されたら、ついで、所望により部分的にまたは均質になるまで、ポリヌクレオチドを治療に（体外的な使用を含む）またはアッセイ手順を開発または行うのに用いることができる。
【００４８】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換した宿主細胞に関する。該宿主細胞は原核細胞であっても真核細胞であってもよい。宿主細胞中に存在する本発明のポリヌクレオチドまたはベクターは、宿主細胞のゲノム中に組み込むかまたは染色体外に保持してよい。
【００４９】
宿主細胞はいかなる原核細胞または真核細胞であってもよい。「原核」なる語は、本発明の抗体または対応免疫グロブリン鎖の発現のためにＤＮＡまたはＲＮＡ分子で形質転換またはトランスフェクションできるすべての細菌を意味する。原核宿主は、たとえば、大腸菌、S. typhimurium、Serratia marcescens、Bacillus subtilisなどのグラム陰性菌およびグラム陽性菌を含む。「真核」なる語は、これらに限られるものではないが、昆虫、真菌、植物、動物またはヒト細胞を含むことを意味する。好ましい真菌細胞は、たとえば、Saccharomyces属のもの、とりわけ種S. cerevisiaeである。本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドは、当業者に一般に知られた方法を用いて宿主に形質転換またはトランスフェクションするのに用いることができる。特に好ましいのは、真核細胞または原核細胞の形質転換またはトランスフェクションの目的のために、それぞれ本発明のＤＣを認識する抗体のコード配列を含むプラスミドまたはベクターの使用である。
【００５０】
融合され作動可能に連結した遺伝子を調製し、該遺伝子をたとえば哺乳動物細胞および細菌で発現する方法は当該技術分野でよく知られている（Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９）。その中に記載された遺伝子構築物および方法を用いて本発明の抗体を真核または原核宿主で発現するのに用いることができる。一般に、挿入したポリヌクレオチドの効率的な転写を容易にするプロモーター配列を含む発現ベクターを宿主と関連して用いる。発現ベクターは一般に、複製起点、プロモーターおよびターミネーター、並びに形質転換細胞の表現型選択を付与する特定の遺伝子を含む。形質転換宿主は当該技術分野で知られた方法に従って発酵槽で増殖させ、培養して最適の細胞増殖を達成することができる。ついで、本発明の抗体またはその対応免疫グロブリン鎖を増殖培地、細胞溶解液または細胞膜フラクションから単離することができる。たとえば微生物により発現された本発明の抗体または免疫グロブリン鎖の単離および精製は、たとえば分取クロマトグラフィー分離、およびたとえば本発明の抗体の定常領域に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の使用を含む免疫学的分離などの通常の手段によるものであってよい。
【００５１】
それゆえ、他の態様において、本発明は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からの未熟および成熟樹状細胞（ＤＣ）のＤＣ集団のＤＣを認識することができる抗体またはその機能的断片または誘導体の製造方法であって、
（ａ）本発明の細胞を培養し、ついで
（ｂ）該抗体、またはその機能的断片または免疫グロブリン鎖を該細胞または培地から単離する
ことを含む方法に関する。
【００５２】
本発明はまた、細胞を本発明のポリヌクレオチドまたはベクターで遺伝子操作することを含む、本発明の抗体またはその対応免疫グロブリン鎖を発現しうる細胞の製造方法にも関する。好ましくは、かくして発現された免疫グロブリン鎖はトランスフェクションした細胞の細胞表面上に提示される。この態様並びに本明細書で言及する幾つかの他の態様は、上記に記載したようなファージ展示法に適用することができる。本発明の方法により得られた細胞は、たとえば本発明の抗体とその抗原との相互作用を試験するのに用いることができる。上記方法により得られた細胞はまた、以下に記載するスクリーニング法にも用いることができる。さらに、本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞を含むトランスジェニック動物、好ましくは哺乳動物は、本発明の抗体の大スケールでの製造に用いることができる。
【００５３】
さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされる、または上記方法により得られる、または上記方法により製造される細胞からの本発明の抗体またはその断片または誘導体または免疫グロブリン鎖に関する。本発明の抗体は、一般にモノクローナル抗体に基づく療法を受けることのできる実質的にあらゆる疾患を治療するのに個々に用途を見出すであろう。とりわけ、該免疫グロブリンは、受動免疫または補体媒体溶解などによる望まない細胞または抗原の除去に用いることができ、すべて多くの先行抗体に付随する実質的な免疫反応（たとえば、アナフィラキシーショック）を伴うことなく行える。
【００５４】
本発明の抗体に関して治療に適した典型的な疾患状態としては、心臓、肺、腎臓、肝臓などの臓器移植を受けた患者での移植片対宿主病および移植拒絶反応が挙げられる。他の疾患としては、１型糖尿病、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、および重症筋無力症などの自己免疫疾患が挙げられる。本発明の抗体の誘導体は当業者に知られた方法、とりわけペプチドミメチック（peptidomimetics）により製造できる。ペプチドミメチックコンビナトリアルライブラリーの生成および使用方法は、たとえば、Ostresh, Methods in Enzymology 267(1996),220-234およびDorner, Bioorg.Med.Chem.4(1996),709-715に記載されている。さらに、Ｍ−ＤＣ８抗原などの抗原の三次元および／または結晶学的構造は、ペプチドミメチック抗体誘導体のデザインに用いることができる（Rose, Biochemistry 35(1995),12933-12944;Rutenber, Bioorg.Med.Chem.4(1996),1545-1558）。
【００５５】
この文脈において、本発明による抗体を当該技術分野で知られた常法によりさらに修飾できることも理解される。本発明による抗体を提供することにより、その結合活性に関連する部分を決定することも可能である。このことにより、結合活性にとって重要な本発明の抗体からのアミノ酸配列と、他の機能性のアミノ酸配列、たとえば核局在シグナル、トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、ホルモン結合ドメイン、タンパク質タグ（ＧＳＴ、ＧＦＰ、ｈ−ｍｙｃペプチド、Ｆｌａｇ、ＨＡペプチド）（異種タンパク質に由来するものであってよい）とを含むキメラタンパク質の構築が可能となる。
【００５６】
本発明の抗体、抗原およびエピトープは、たとえば、膵臓の島（β）細胞などのホルモン産生細胞、胸腺細胞、ミエリン鞘を含む中枢神経系の神経膠細胞、滑液細胞または滑液組織、ブドウ膜の細胞または組織、または血管壁の細胞または組織のタンパク質または糖タンパク質に対する自己免疫応答を有する患者の治療に用いることができる。そのような治療は、たとえば、本発明の抗体、抗原またはエピトープを投与することにより行うことができる。そのような投与は、非標識および標識抗体または抗原を利用できる。たとえば、非標識の抗原またはエピトープを有利に利用するに際しては、たとえば免疫応答を刺激するには小さすぎるが自己免疫応答の継続に結合または阻止するには充分に大きな断片である抗原の形態であってよい。たとえば、本発明の抗原を酵素消化してエピトープサイズのペプチド（典型的に長さが５〜１２アミノ酸）にし、それによって自己免疫疾患の患者の体液中、またはＤＣの表面上に存在するＦａｂ部分に結合することができる。
【００５７】
別のやり方として、本発明の抗体、抗原およびエピトープを治療剤に結合させて投与することができる。これら治療剤は、本発明の抗体または抗原に直接または間接的に結合させることができる。間接的な結合の一つの例は、スペーサー残基の使用である。これらスペーサー残基は、今度は不溶性または可溶性であってよく（Dienerら、Science,231:148,1986）、標的部位で抗原から薬剤を放出できるように選択することができる。免疫療法のために本発明の抗体、抗原およびエピトープに結合させることのできる治療剤の例は、医薬、放射性同位元素、レクチン、および毒素である。本発明の抗体、抗原およびエピトープに結合させることのできる医薬としては、マイトマイシンＣ、ダウノルビシン、およびビンブラスチンなどの古典的に医薬として言及されている化合物が挙げられる。
【００５８】
たとえば、免疫療法のために放射性同位元素を結合した本発明の抗体、抗原またはエピトープを使用するに際しては、白血球の分布並びに安定性および放射電磁波などの要素に依存してある種の同位元素が他の同位元素よりも好ましい。自己免疫応答に応じて、ある種のエミッターが他のエミッターよりも好ましい。一般に、α粒子およびβ粒子を放射する放射性同位元素が免疫療法には好ましい。好ましいのは、２１２Ｂｉなどの短飛程で高エネルギーのαエミッターである。治療目的で本発明の抗体、抗原またはエピトープに結合することのできる放射性同位元素の例は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、２１２Ｂｉ、２１２Ａｔ、２１１Ｐｂ、４７Ｓｃ、１０９Ｐｄおよび１８８Ｒｅである。
【００５９】
レクチンは、特定の糖残基に結合する、通常、植物材料から単離されるタンパク質である。多くのレクチンはまた、細胞を凝集させ、リンパ球を刺激することができる。しかしながら、リシンは免疫療法に用いられる毒性のレクチンである。このことは、毒性に関与するリシンのα鎖を抗体分子に結合させることによって毒性作用の部位特異的な送達を可能とすることによって行う。
【００６０】
毒素は、植物、動物または微生物によって産生される有毒物質であり、充分な投与量ではしばしば致死性である。ジフテリア毒素はCorynebacterium diphtheriaによって産生される物質であり、治療に用いることができる。この毒素はαおよびβサブユニットからなり、各サブユニットは適当な条件下で分離することができる。毒性のＡ成分は、抗体または抗原に結合させて、それぞれＤＣまたは該抗原のレセプターを発現するＴ細胞への部位特異的な送達に用いることができる。
【００６１】
本発明の抗体、抗原またはエピトープに結合させることのできる上記に記載したような他の治療剤並びにエクスビボおよびインビボ治療プロトコールは、当業者には知られており、または容易に確かめることができる。適当な場合はいつでも、当業者はタンパク質物質自体の代わりに上記抗体、抗原またはエピトープのいずれか一つをコードするポリヌクレオチドまたは対応ベクターを用いることができる。さらに、本発明による方法に従って得られ任意に修飾した樹状細胞および／またはＴ細胞を上記態様に従って用いることができる。
【００６２】
上記に従って、本発明はさらに、
（ａ）本発明の抗体の結合部位のドメインまたは本発明の抗原またはエピトープ；および
（ｂ）少なくとも一つの他のドメインであって、共有結合または非共有結合により結合したもの
を含むポリペプチドに関する。
【００６３】
本発明のポリペプチドに含まれる該結合部位ドメインは、本発明の抗体の少なくとも一つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。当業者であれば、抗体の各可変ドメイン（重鎖ＶＨおよび軽鎖ＶＬ）が、４つの比較的保存されたフレームワーク領域すなわち「ＦＲ」によってフランキングされた３つの高度可変領域（しばしば相補性決定領域あるいは「ＣＤＲ」と呼ばれる）を含むことを理解しているであろう。本発明の抗体の可変領域に含まれるＣＤＲは、たとえば、Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest"（米国保健社会福祉省、第３版、１９８３、第４版、１９８７、第５版、１９９０）に従って決定できる。当業者であれば、所望の特異性および生物学的機能を有する他のポリペプチドまたは抗体を構築するために本発明の抗体の結合部位ドメインまたは本発明の抗原またはエピトープを用いることができることを容易に理解するであろう。それゆえ、本発明は、本発明の結合部位ドメインまたは抗原またはエピトープを含むポリペプチドおよび抗体にも関する。当業者であれば、上記結合部位またはＣＤＲを用い、当該技術分野で知られた方法、たとえばＥＰ−Ａ１ ０ ４５１ ２１６、ＥＰ−Ａ１ ０ ５４９ ５８１およびＷＯ８８／０９３４４などに記載された方法に従って抗体を構築できることが容易に理解されるであろう。
【００６４】
組換え２官能性抗体構築物などの多価ポリペプチドは、とりわけ医学分野において、たとえば癌や自己免疫疾患の新たな治療法の開発において、または細胞シグナル伝達経路の分析および調節のための興味のもてる手段として、ますます重要な治療学的および科学的役割を果たしつつある。たとえば、Ｔ細胞上のＣＤ３活性化抗原を腫瘍細胞上の腫瘍関連抗原と架橋させることにより、２特異的な一本鎖抗体は両細胞を一緒に引き合わせ、細胞−細胞接触の間に腫瘍細胞を有効に溶解させることができる（Mack, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92(1995)7021-7025）。対応するアプローチが他の標的細胞（たとえば、ウイルス感染細胞）に対しておよび他のエフェクター細胞集団（たとえば、ＮＫ細胞および単核食細胞）の補充（recruitment）のために開発されており、または開発されつつある。
【００６５】
ターゲティング機構として抗体断片を含む２官能性の融合タンパク質を用い、選択した細胞集団上の所定の表面分子に多数の異なるレセプターおよびリガンドを特異的に結合させることができる。細胞の機能または細胞の活性化または分化の状態を調節するために、同じ細胞上の表面分子を二重特異性抗体により架橋できることは特に興味深い。この種のアプローチが可能な応用は、多くの自己免疫疾患において病原的な役割を果たしている自己攻撃性のＢまたはＴリンパ球にアネルギーを誘発することである。広範な科学的および治療学的な関連性に関しては、機能性の抗原結合部位を含む組換えポリペプチドを製造するための有効かつ再現可能な方法が特に重要である；そのような方法は、細菌および哺乳動物細胞で発現させることにより、たとえば機能的に活性な二重特異性抗体構築物を生成する。
【００６６】
該組換え２官能性一本鎖タンパク質は、通常、異なるｓｃＦｖ−抗体断片によって構築されており、各断片はそれぞれ一つの免疫グロブリン可変重鎖（ＶＨ）および一つの可変軽鎖（ＶＬ）抗原結合ドメインからなる。別の態様では、そのようなタンパク質は、そのような抗体断片と一つの非免疫グロブリン部分とを含んでいてよい。すべての機能性のドメインは単一のポリペプチド鎖上に位置しており、可撓性のグリシン−セリン−または他の適当なペプチドリンカーにより連結されている。２官能性ポリペプチド鎖は、対応のＤＮＡ配列（任意のタンパク質−タグ、好ましくはポリヒスチジン−タグをさらにコードすることによってたとえばニッケル−キレート−カラムを用いて組換えタンパク質の容易な精製を可能にするものであってよい）で哺乳動物細胞またはより好ましくはないが他の宿主細胞をトランスフェクションすることにより機能性のタンパク質として製造することができる。ＣＨＯ細胞において機能的に発現された２特異的一本鎖抗体の例で示されているように、ｓｃＦｖ−抗体断片は原則として２官能性一本鎖構築物のＮ末端部分かまたはＣ末端部分のいずれかとして抗原に結合することができる（Mack, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92(1995)7021-7025）。
【００６７】
本発明の好ましい態様において、該少なくとも一つのさらなるドメインは、生物学的活性に適したコンホメーションを有するエフェクタータンパク質、イオンを封鎖しうるアミノ酸配列、および固相支持体または前以て選択した抗原に選択的に結合できるアミノ酸配列よりなる群から選ばれたポリペプチドを含む。
【００６８】
好ましくは、該エフェクタータンパク質は、酵素、毒素、レセプター、結合部位、生合成抗体結合部位、成長因子、細胞分化因子、リンホカイン、サイトカイン、ホルモン、遠隔的に（remotely）検出しうる残基、抗代謝産物または抗原である。該抗原は、たとえば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、微生物抗原、アレルゲン、自己抗原、ウイルス、微生物、ポリペプチド、ペプチドまたは複数の腫瘍細胞であってよい。
【００６９】
さらに、イオンを封鎖しうる該配列は、好ましくはカルモジュリン、メタロチオネイン、その断片、またはグルタミン酸、アスパラギン酸、リジンおよびアルギニンの少なくとも一つに富むアミノ酸配列から選ばれる。
さらに、固相支持体に選択的に結合しうる該ポリペプチド配列は、正または負に荷電したアミノ酸配列、システイン含有アミノ酸配列、アビジン、ストレプトアビジン、またはStaphylococcusタンパク質Ａの断片であってよい。
【００７０】
上記エフェクタータンパク質およびアミノ酸配列は、プロ形（それ自体活性であっても活性でなくてもよく、たとえばある種の細胞環境に入ったときに除かれてよい）で存在してよい。
【００７１】
本発明の最も好ましい態様において、該レセプターは、Ｔ細胞活性化に重要なコスティミュラトリー表面分子であるか、またはエピトープ結合部位もしくはホルモン結合部位を含む。
【００７２】
本発明のさらに最も好ましい態様において、該コスティミュラトリー表面分子はＣＤ８０（Ｂ７−１）またはＣＤ８６（Ｂ７−２）である。
【００７３】
有利には、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインを含む該ドメインは、該ドメイン間に配置した可撓性のリンカーにより、好ましくはポリペプチドリンカーにより連結されており、その際、該ポリペプチドリンカーは、該ポリペプチドが水溶液中に配置されたときに結合に適したコンホメーションを担う場合に該ドメインの一方のＣ末端と該ドメインの他方のＮ末端との間の距離を隔てるに充分な長さの複数の親水性ペプチド結合アミノ酸を含む。
【００７４】
さらに他の態様において、本発明は発現に際して上記抗原、エピトープまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。該ポリヌクレオチドは、該ポリペプチドの適正な転写および翻訳を確実にするために当該技術分野で知られた適当な発現制御配列に融合していてよい。さらに、該ポリヌクレオチドはベクター中に含まれていてよく、該ベクターはさらに選択マーカーを含んでいてよい（上記参照）。
【００７５】
さらに他の態様において、本発明は上記ポリヌクレオチドまたはベクターを含む細胞に関する。好ましくは、該細胞は、該ポリペプチドの治療用の使用を考慮する場合には哺乳動物細胞である。もちろん、酵母および細菌細胞もまた、とりわけ生成する抗原、エピトープまたはポリペプチドを診断手段として用いる場合に用いることができる（上記参照）。
【００７６】
他の態様において、本発明は、上記抗原またはポリペプチドの製造方法であって、本発明の細胞を該抗原またはポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、ついで該抗原またはポリペプチドを該細胞または培養液から単離することを含む方法に関する（上記参照）。
【００７７】
それゆえ、本発明は、本発明のＤＣのエピトープまたは抗原に対するアフィニティーおよび特異性を有する結合部位を含む、または該抗原またはエピトープを含むポリペプチドの組換え製造を可能にする。上記から明らかなように、本発明は、治療および診断アプローチにおけるあらゆる使用のためにそのような結合部位または抗原またはエピトープを含むポリペプチドの大きなファミリーを提供する。当業者には、該結合部位ドメインおよび抗原またはエピトープは、たとえば薬剤ターゲティングおよび造影応用のために上記他の残基にさらに結合できることが明らかであろう。そのような結合は、該ポリペプチドの発現後に付着部位に対して化学的に行うことができるし、あるいは結合生成物をＤＮＡレベルで本発明のポリペプチド中に操作して入れることもできる。
【００７８】
ついで、該ＤＮＡを適当な宿主系で発現させ、発現したタンパク質を所望なら回収および復元させる。上記に記載したように、結合部位ドメインは抗体、好ましくは本発明のモノクローナル抗体の可変領域からのものであるのが好ましい。この観点において、ハイブリドーマ法は、免疫応答を生じる本質的にあらゆる所望の物質に対する抗体を分泌する細胞株を産生することを可能にする。ついで、免疫グロブリンの軽鎖および重鎖をコードするＲＮＡを該ハイブリドーマの細胞質から得ることができる。ｍＲＮＡの５'末端部分は、本発明の方法に使用するｃＤＮＡを調製するのに用いることができる。ついで、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを細胞中、好ましくは哺乳動物細胞中で発現することができる。
【００７９】
宿主細胞によっては適正なコンホメーションを達成するために復元法が必要である。必要なら、通常のカセット突然変異誘発または本明細書に記載するような他のタンパク質工学法を用い、最適の結合を探るべく点置換をＤＮＡ中で行うことができる。本発明のポリペプチドの製造は、生物学的に活性なタンパク質、たとえば酵素、毒素、成長因子、細胞分化因子、レセプター、抗代謝産物、ホルモンまたは種々のサイトカインまたはリンホカインのアミノ酸配列（または対応ＤＮＡまたはＲＮＡ配列）に関する知見に依存する。そのような配列は、文献に報告されているかまたはコンピューター化したデータバンクから利用できる。
【００８０】
たとえば、本発明のポリペプチドは、本発明の抗体、好ましくはＭ−ＤＣ８の一本鎖Ｆｖ断片とヒトコスティミュラトリータンパク質ＣＤ８０（Ｂ７−１）の細胞外部分とがペプチドリンカーによって連結されたものとして構築することができる。ＣＤ８０コスティミュラトリータンパク質はＩｇスーパーファミリーに属する。該タンパク質は２６２のアミノ酸からなる非常にグリコシル化されたタンパク質である。一層詳細な記載は、Freeman G.J.ら, J.Immunol.143,(1989)2714-2722によって刊行されている。安定な発現は、Kaufmann R.J. (1990)Methods Enzymol.185,537-566によって記載されているように、たとえばＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞で行うことができる。ついで、Ｎｉ−ＮＴＡ−カラムを用いることにより、Ｃ末端に付着したＨｉｓ−タグを介して該タンパク質を精製することができる（Mackら, Proc,Natl.Acad.Sci.U.S.A.92(1995)7021-7025）。結合特性を分析するため、種々のＥＬＩＳＡアッセイを行うことができる。たとえば、１７−１Ａ抗原への結合の分析は、記載に従って得られる（Mackら, Proc,Natl.Acad.Sci.U.S.A.92(1995)7021-7025）可溶性の１７−１Ａ抗原を用い、ＧＡ７３３−２としても知られる１７−１Ａ抗原の最初の２６４アミノ酸をコードするＤＮＡをＣＨＯ細胞中で安定に発現させることによって行うことができる（Szala, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87(1990)3542-3546）。
【００８１】
他の態様において、本発明は、上記ＤＣを末梢血から単離または同定する方法であって、工程：
（ａ）末梢血のサンプルを本発明の抗体と接触させ；
（ｂ）抗体／ＤＣ複合体の存在を検出し；および／または
（ｃ）該抗体またはその機能性の断片に結合したＤＣを回収する
を含む方法に関する。
【００８２】
ＤＣは、最も効率的な抗原提示細胞として、その成熟の異なる段階を反映していると思われる、表現型および機能面でのかなりの異質性を明らかにしている１，２，３。最近に提唱されたモデルによれば、初期のＤＣは脊椎動物の種々の部位で殆どいたるところで見出され、その細胞質膜上のＭＨＣ分子による提示のために外来抗原を効率的に取り込み、プロセシングしている４，５。その後、抗原の取り込みが完了すると、ＤＣはさらに分化を受けて異なるパターンの表面分子を発現し、移動性となる。この段階でＭＨＣおよびコスティミュラトリー分子の発現が非常に増加すると、ＤＣはナイーブなＴリンパ球を初回抗原刺激しうるのみならずＴｈ１またはＴｈ２型に対するサイトカイン発現のプログラムをも指令できる６，７。ＤＣがＴリンパ球を初回抗原刺激できる際立った能力は、免疫調節戦略の開発にとってＤＣを特に魅力的なものにしている。とりわけ、所定の腫瘍ペプチドまたはウイルス抗原に対する細胞溶解Ｔ細胞を治療用にエクスビボで初回抗原刺激するためにＤＣを用いることが提唱されている８。
【００８３】
同様に、ＤＣは自己免疫疾患またはアトピー性疾患を攻略するためにＴ細胞を再プログラムする手段としても機能する。本発明以前のそのような治療戦略の開発における主たる障害は、血中のＤＣの頻度が極めて低いことであった。これまでに報告されているわずかなＤＣ特異的マーカーは、血液ＤＣを単離するのに適していない。ＣＤ８３はインビトロ培養においてのみ誘発され、アクチン束化タンパク質ｐ５５は細胞質に限られている１０。現在の単離プロトコールは、細胞系列特異的なモノクローナル抗体を用いた細胞集団の連続的な涸渇を密度勾配遠心分離または識別付着（differential adherence）と組み合わせたものによっている２，３，１１。現在のところ、最も広く用いられている依然として煩雑な富化方法は、ＣＤ３４＋細胞をインビトロ培養してそのような（稀な）先祖細胞から幾日もかけてＤＣを発生および分化させることである１２，１３，１４。
【００８４】
Ｍ−ＤＣ８モノクローナル抗体によって例示されるような本発明による新規な抗体の提供は、今や、特徴的な表面表現型と典型的な機能的活性を有するヒトＤＣの新規で独特の集団を精製することを可能にするものである。並外れた均質性を示すこのＤＣ集団は際立っており、精製ＣＤ８ Ｔ細胞のアロ抗原特異的な細胞溶解性細胞への分化を促進する。
【００８５】
単離したＤＣ（Ｍ−ＤＣ８＋細胞とも呼ばれる）は循環ＤＣの実質画分を含み、未熟ＤＣの表現型および機能特性を示す。培養するとＭ−ＤＣ８＋細胞は、Ｔ細胞を刺激する際立った能力によって示されるように成熟ＤＣへと分化する。それゆえ、本発明の抗体はヒトＤＣの検出および直接的な単離に適した手段として機能しうる。単離したＭ−ＤＣ８＋細胞の種々の用途が本明細書に記載した本発明により包含され、それには、これらに限られるものではないが、ＡＰＣとしてのＭ−ＤＣ８＋細胞の使用、適合性の（adoptive）細胞免疫療法に使用するための抗原特異的なＴ細胞のインビトロでの活性化および拡張、抗原パルス（antigen-pulsed）ＤＣのワクチンとしてのインビボ投与、およびワクチン開発のための抗原性エピトープの同定が含まれる。それゆえ、Ｍ−ＤＣ８＋細胞は感染性疾患および癌に対する免疫療法に使用するため、並びに自己免疫疾患の治療のための理想的な候補である。この観点から、本発明の抗体は、ＤＣ細胞と標的細胞上の抗原とに向けられた二重特異性抗体を生成することにより、ＤＣへの標的細胞のインビボ補充に用いることができる。
【００８６】
それゆえ、本発明はまた、本発明の抗体により認識され、および／または本発明の抗原またはエピトープを含むまたは上記方法により得ることのできる、上記樹状細胞にも関する。本発明の方法に従って単離したヒト樹状細胞は、たとえば、Ｔ細胞を刺激するため、および抗原特異的なＴ細胞媒体免疫応答の誘発のために抗原を提示するために用いることができる。本明細書に記載するヒト樹状細胞の単離集団はまた広範囲の応用に用いることができ、それにはこれらに限られるものではないが、癌および感染疾患に対する適合性の免疫療法に使用するための抗原特異的なＴ細胞の活性化および拡張が含まれる。さらに、本発明のヒト樹状細胞は抗原でパルスすることができ、それゆえワクチンおよび／または免疫療法剤としておよび免疫療法のための新規な抗原標的の同定のために用いることができる。
【００８７】
本発明のＤＣは、たとえば組換え核酸分子を発現するためにさらに修飾できることも当業者には明らかである。たとえば、本発明のＤＣをサイトカインまたはシグナル伝達分子の遺伝子でトランスフェクションして免疫応答をインビトロまたはインビボで調節させることができる。たとえば、分泌されたＩＬ−１２がＴ細胞刺激のミクロな環境に存在する場合にはＴ細胞のＴｈ１型のＴヘルパー細胞への分化が指令され、一方、ＩＬ−４はＴ細胞をＴｈ２型のＴヘルパー細胞にプログラムする（Seder & Paul, Ann.Rev.Immunol.12(1994),635-673）。かかる修飾は当該技術分野で知られた方法に従って行うことができる（上掲文献参照）。組換えＤＮＡで細胞をトランスフェクションする標準法は分子生物学の当業者によく知られている（たとえば、上記ＷＯ９４／２９４６９参照）。さらに、遺伝子療法は、本発明の組換えＤＮＡ分子またはベクターを患者に直接投与するかまたはＤＣのような細胞を該ポリヌクレオチドまたはベクターでエクスビボでトランスフェクションし、トランスフェクションした細胞を患者に注入することにより行うことができる。
【００８８】
さらに、生殖細胞中への遺伝子伝達を行う研究は生殖生物学でも最も進展の著しい分野の一つである。遺伝子療法は治療用遺伝子を細胞中へエクスビボまたはインビボ法により導入することに基づくものであるが、遺伝子伝達の最も重要な応用の一つである。インビトロまたはインビボ遺伝子療法に適したベクターおよび方法は、上記に記載したように文献に記載されており、当業者にも知られている。ポリヌクレオチドおよびベクターは、細胞中への直接的な導入のため、あるいは該組換えＤＮＡ分子を含むリポソームまたはウイルスベクター（たとえば、アデノウイルス、レトロウイルス）を介した導入のためにデザインすることができる。該細胞は、好ましくは生殖細胞、胚細胞、幹細胞または卵細胞またはそれらに由来する細胞である。本発明による医薬組成物はまた、ＤＣにより媒体されるものとしてこれまでに未知の疾患の治療にも用いることができる。胚細胞は、たとえばNagy, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)8424-8428に記載されているように胚幹細胞であってよい。
【００８９】
導入したポリヌクレオチドおよびベクターは該細胞中に導入した後に遺伝子産物を発現し、好ましくは該細胞の生涯を通じてこの状態に留まることが理解されなければならない。たとえば、適当な制御配列の制御下にポリヌクレオチドを発現する細胞株は、当業者によく知られた方法により操作することができる。ウイルス由来の複製起点を含む発現ベクターを用いるよりも、宿主細胞は本発明のポリヌクレオチドまたはベクターおよび選択マーカーで同じかまたは別々のベクター上にて形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後、操作した細胞を１〜２日間、富化培地で増殖させ、ついで選択培地に切り替える。組換えプラスミド中の選択マーカーは該選択に対して耐性を付与し、その染色体中にプラスミドが安定に組み込まれた細胞の選択を可能にし、増殖してフォーカスを生成し、これを今度はクローニングし、細胞株へ拡張することができる。そのように操作した細胞はまた、以下に記載するスクリーニング法において特に有用である。
【００９０】
多くの選択系を採用することができ、それには、それぞれｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞またはａｐｒｔ細胞でのヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler, Cell 11(1977),223）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48(1962),2026）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy, Cell 22(1980),817）が含まれるがこれらに限られるものではない。また、ｄｈｆｒ（メトトレキセートに対する耐性を付与する）に対する（Wigler, Proc.Natl.Acad.Sic.USA 77(1980),3567;O'Hare, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1981),1527）、ｇｐｔ（ミコフェノール酸に対する耐性を付与する）に対する（Mulligan, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1981),2072）、ｎｅｏ（アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与する）に対する（Colberre-Garapin, J.Mol.Biol.150(1981),1）、ｈｙｇｒｏ（ハイグロマイシンに対する耐性を付与する）に対する（Santerre, Gene 30(1984),147）、またはｐｕｒｏｍｙｃｉｎに対する（pat、ピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ）選択に基づいて抗代謝産物耐性を用いることができる。さらなる選択遺伝子も記載されており、たとえば、ｔｒｐＢ（細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にする）；ｈｉｓＤ（細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にする）（Hartman, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988),8047）；およびＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（オルニチンデカルボキシラーゼインヒビター、２−(ジフルオロメチル)−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯに対する耐性を付与する）（McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー編）が挙げられる。
【００９１】
Ｍ−ＤＣ８＋細胞は未熟ＤＣに類似しているにもかかわらず、極めて強力にＴ細胞を刺激する。この活性は、Ｍ−ＤＣ８＋細胞がインビトロで培養された後にその細胞表面上でのＭＨＣクラスII発現が増大しコスティミュラトリー分子の提示が上昇したことを反映している。同種Ｔ細胞と一緒に培養するとＭ−ＤＣ８＋細胞上のこれら分子を特に強力に上方制御する（upregulate）と思われる。Ｔ細胞を活性化するためにＤＣを用いる種々の方法が記載されている（たとえば、ＷＯ９４／０２１５６を参照）。
【００９２】
それゆえ、さらなる態様において、本発明は、Ｔ細胞を本発明の樹状細胞（抗原に暴露されているかまたは抗原を発現して該抗原に応答してＴ細胞が増殖または細胞障害性となるように活性化する）とともに培養することを含む、活性化された抗原特異的ヒトＴ細胞をインビトロで製造する方法に関する。Ｔ細胞の刺激のために抗原性分子をＤＣにより提示させるのに用いることのできる種々の方法が存在する。これら方法は当業者には知られている。ある個人のＭＨＣクラスＩまたはクラスII遺伝子のアレル組成がわかっている場合、外来の抗原性ペプチドを公知のアルゴリズムに従って選択し、該単離したペプチドとともにＤＣをインキュベートすることによりＤＣ表面のＭＨＣ分子に直接結合させることができる。別法として、ＤＣを完全な抗原性タンパク質分子に暴露することができる。
これら分子はエンドサイトーシスされ、エンドソーム内で酵素開裂され、ＭＨＣクラスII分子の結合グローブ（grove）中に結合され、ついでこれら分子との複合体としてＣＤ４＋Ｔ細胞への提示のために細胞膜へ輸送される。エンドサイトーシスを受けたタンパク質の一部はサイトソル画分に達し、そこでプロテアソーム装置により開裂される（「クロスプライミング（cross priming）」）。
【００９３】
生成したペプチドは、ＴＡＰ分子により小胞体の内腔に輸送され、そこで発生中のＭＨＣクラスＩ分子と結合され、その後、細胞障害性ＣＤ８＋Ｔ細胞またはその先駆細胞へ提示すべく細胞表面に輸送される。外来タンパク質に由来する抗原性ペプチドは、該タンパク質が発現ベクター中のコード遺伝子の形質導入後にＤＣ内で合成される場合にはＤＣ上のＭＨＣクラスＩ分子によって効率的に提示され得る（上掲文献をも参照）。それゆえ、そのようにインビトロで教育されたおよび／または初回抗原刺激を受けたＴ細胞は、たとえば免疫に障害を受けた患者でのＣＭＶについて記載されているような重篤なウイルス感染症に打ち勝つため（Walterら, New Engl.J.Med.333(1995),1038-1044）、あるいは腫瘍転移の免疫拒絶を誘発するために（Nestleら, Nature Med.4(1998),328-332）、臨床試験で用いることができる。それゆえ、本発明によるＤＣの迅速かつ容易な獲得は、癌を含む種々の適応症のために適合できる免疫療法戦略をさらに開発することを可能にする。
【００９４】
さらに、本発明は、Ｔ細胞により認識されうる抗原の同定方法であって、
（ａ）該抗原に暴露された本発明の樹状細胞とともにＴ細胞を培養し、ついで
（ｂ）Ｔ細胞の増殖、Ｔ細胞の細胞障害活性またはＴ細胞のリンホカイン産生を測定する
ことを含む方法に関する。
【００９５】
好ましくは、上記方法におけるＴ細胞はＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞である。たとえば、ＣＤ４＋Ｔ細胞により認識される抗原を同定するには、ＤＣを問題の抗原性タンパク質とともに、または異なる抗原性タンパク質の混合物とともに、または問題の抗原性タンパク質のアミノ酸配列に従ってまたはペプチドライブラリーから得たペプチドにより合成した１５〜２５アミノ酸長の重複ペプチドとともにインキュベートする。Ｔ細胞応答の決定を３、５または７日後に、［３Ｈ］チミジンの取り込みを測定することにより、またはインターフェロンγなどのサイトカインの分泌をＥＬＩＳＡによりアッセイすることにより、または蛍光染色で標識した特定のモノクローナル抗体で染色した後に細胞内サイトカインをＦＡＣＳ分析により評価することにより行う。
【００９６】
ＣＤ８＋Ｔ細胞により認識される抗原を同定するには、ＤＣを発現ベクター中の抗原性タンパク質またはその断片をコードする遺伝子でトランスフェクションするか、または９〜１０アミノ酸長の重複ペプチドとともにまたはペプチドライブラリーの形態で生成したペプチドとともにインキュベートする。ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の決定は、腫瘍壊死因子αやインターフェロンγなどのサイトカインの分泌を測定することにより行うことができる。細胞障害活性の評価は、その表面上にＭＨＣクラスＩ分子に結合した各抗原性ペプチドを発現する５１Ｃｒ−標識標的細胞の溶解によって行うことができる。
【００９７】
さらに他の態様において、本発明は、Ｔ細胞を活性化するまたはコスティミュレートする化合物の同定方法であって、
（ａ）本発明の樹状細胞およびＴ細胞を、Ｔ細胞活性化に応答して検出可能なシグナルを生成しうる成分の存在下、スクリーニングしようとする化合物とともに該化合物と該細胞との相互作用を可能とする条件下にて培養し、ついで
（ｂ）Ｔ細胞の活性化により生成したシグナルの存在を検出する
ことを含む方法に関する。
【００９８】
他の態様において、本発明は、Ｔ細胞活性化または刺激を抑制する化合物を同定する方法であって、
（ａ）Ｔ細胞および本発明の樹状細胞を、Ｔ細胞アクチベーターによる該Ｔ細胞の活性化に応答して検出可能なシグナルを生成しうる成分の存在下、スクリーニングしようとする化合物とともに該Ｔ細胞の活性化を可能とする条件下にて接触させ、ついで
（ｂ）該アクチベーターとＴ細胞との相互作用により生成したシグナルの存在または不在を検出する
ことを含む方法に関する。
【００９９】
Ｔ細胞によって生成したシグナルの検出は、上記または付属の実施例に記載するような当該技術分野で知られた方法（上記方法に容易に適合させることができる）に従って行うことができる。好ましくは、本発明の方法において、該樹状細胞は培地でインキュベートすることにより抗原に暴露される。
【０１００】
本発明の方法における「化合物」は、単一の物質かまたは複数の物質（同じであっても同じでなくてもよい）を含む。さらに、該化合物は、当該技術分野で知られたものであってよいが、Ｔ細胞活性化を抑制しうることはこれまで知られていないかまたはＴ細胞コスティミュラトリー因子として有用であることは知られていなかったものであってよい。複数の化合物は、たとえば、培地に加えるかまたは細胞中に注入することができる。
【０１０１】
化合物を含むサンプルが本発明の方法で同定されたら、問題の化合物を含むものとして同定された最初のサンプルから該化合物を単離することができるし、またはたとえばサンプルが複数の異なる化合物からなる場合にサンプル毎の異なる物質の数が減少するように最初のサンプルをさらに分割し、これら最初のサンプルの分割物について本発明の方法を繰り返すことができる。ついで、該サンプルまたは化合物が、たとえば本明細書、付属の実施例または文献に記載した方法により所望の特性を示すか否かを決定することができる。サンプルの複雑さに依存して、上記工程は、好ましくは本発明の方法によって同定したサンプルが限られた数の物質または唯一の物質を含むようになるまで、数回行うことができる。好ましくは、該サンプルは、類似の化学的および／または物理的特性を有する物質を含み、最も好ましくは該物質は同一である。
【０１０２】
本発明の方法は、たとえば従来技術に記載された他の細胞ベースのアッセイに従って、または付属の実施例に記載した方法を改変することにより、当業者により容易に実行し、デザインすることができる。さらに、当業者であれば、本発明の方法を行うために、たとえばインターロイキンまたは酵素など（ある種の化合物を前駆体に変換し、該前駆体が今度はＴ細胞活性化を抑制する）のどのようなさらなる化合物および／または細胞を必要に応じて用いてよいかを容易に認識するであろう。本発明の化合物のそのような適合は充分に当業者の範囲内であり、不当な実験なしに行うことができる。
【０１０３】
本発明の方法の好ましい態様において、該化合物または抗原は、腫瘍抗原、ウイルス抗原、微生物抗原、アレルゲン、自己抗原、ウイルス、微生物、ポリペプチド、ペプチドまたは複数の腫瘍細胞である。
【０１０４】
本発明に従って使用できる化合物および抗原としては、ペプチド、タンパク質、核酸、抗体、小さな有機化合物、リガンド、ペプチドミメチック、ＰＮＡなどが挙げられる。該化合物はまた、公知のＴ細胞アクチベーターまたはインヒビターの機能的な誘導体またはアナログであってよい。化学的な誘導体およびアナログの製造方法は当業者にはよく知られており、たとえば、Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer編、New York Inc.（米国、１００１０ニューヨーク、ニューヨーク、フィフス・アベニュー、１７５番）およびOrganic Synthesis、ウィリー、ニューヨーク、米国に記載されている。
【０１０５】
さらに、該誘導体およびアナログは、当該技術分野で知られた方法に従ってまたはたとえば付属の実施例に記載されているようにして、その作用を試験することができる。さらに、Ｔ細胞活性化の適当なアクチベーターまたはインヒビターのペプチドミメチックおよび／またはコンピューターによるデザインを、たとえば本明細書に記載した方法に従って用いることができる。本発明の推定インヒビターおよび抗原の相互作用部位の同定のため、相補的な構造モチーフのコンピューター支援サーチによって適当なコンピュータープログラムを用いることができる（Fassina, Immunomethods 5(1994),114-120）。タンパク質およびペプチドのコンピューター支援デザインに適したさらなるコンピューターシステムは、従来技術、たとえば、Berry, Biochem.Soc.Trans.22(1994),1033-1036;Wodak, Ann.N.Y.Acad.Sic.501(1987),1-13;Pabo, Biochemistry 25(1986),5987-5991に記載されている。
【０１０６】
上記コンピューター分析で得られた結果は、本発明の方法、たとえば、知られたＴ細胞アクチベーターまたはインヒビターを最適化する方法と組み合わせて用いることができる。適当なペプチドミメチックの同定はまた、たとえば本明細書や付属の実施例に記載した方法に従い、連続的な化学修飾および得られた化合物の試験を行うことによるペプチドミメチックコンビナトリアルライブラリーの合成によって行うことができる。ペプチドミメチックコンビナトリアルライブラリーの生成および使用方法は、従来技術、たとえばOstresh, Methods in Enzymology 267(1996),220-234およびDorner, Bioorg.Med.Chem.4(1996),709-715に記載されている。さらに、ＤＣ／Ｔ細胞相互作用のインヒビターまたはアクチベーターの三次元および／または結晶学的構造を、Ｔ細胞活性化のペプチドミメチックインヒビターまたはアクチベーターのデザインのために、たとえば本発明の抗体または抗原と組み合わせて用いることができる（Rose, Biochemistry 35(1996),12933-12944;Rutenber, Bioorg.Med.Chem.4(1996),1545-1558）。
【０１０７】
要約すると、本発明は、ＤＣおよびＴ細胞により媒体された免疫応答を調節しうる化合物の同定方法を提供する。Ｔ細胞媒体応答を活性化することがわかった化合物は、癌の治療、たとえば乳、前立腺、消化管、腎臓、肺、皮膚および／または他の部位などの上皮癌の治療、および細胞増殖疾患などの関連疾患の治療に用いることができる。さらに、ウイルス疾患を特異的に抑制および／または保護し、それによってウイルス感染またはウイルスの拡散を防ぐことも可能である。Ｔ細胞活性化または刺激のサプレッサーとして同定された化合物は、移植拒絶を回避するために臓器移植に用いることができる（上記参照）。
【０１０８】
従って、本発明の方法によって同定されまたは得られた化合物は、診断的な応用において、とりわけ治療的な応用において非常に有用であることが期待される。それゆえ、さらなる態様において本発明は、本発明の上記方法の工程（ｂ）において同定した化合物を製薬学的に許容しうる形態に調合することを含む医薬組成物の製造方法に関する。
【０１０９】
本発明の方法に従って同定した治療的に有用な化合物は、特定の化合物に適した方法、たとえば経口、非経口、経皮、経粘膜（transmucosally）で、または該化合物の作用を付与することが望まれる部位の近くに外科または移植により（たとえば、該化合物は固形または半固形の生物学的に適合性で吸収性のマトリックスの形態で）、患者に投与することができる。治療用の投与量は、当業者により適当なものに決定される（上記参照）。
【０１１０】
さらに、本発明は、本発明の抗体、上記抗原またはエピトープ、上記ポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは樹状細胞、本発明の方法によって得られるＴ細胞または上記方法によって得られる化合物を含むキットおよび組成物に関する。好ましくは、該組成物は医薬組成物である。
【０１１１】
本発明の医薬組成物はさらに製薬学的に許容しうる担体を含んでいてよい。適当な製薬学的担体の例は当該技術分野でよく知られており、リン酸緩衝食塩水、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、種々のタイプの湿潤化剤、滅菌溶液等がまれる。そのような担体を含む組成物はよく知られた従来法により調合することができる。これら医薬組成物は、適当な投与量で患者に投与することができる。適当な組成物の投与は、種々の経路により、たとえば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所または皮内投与により行うことができる。投与計画は、担当医および他の臨床因子により決定されるであろう。医学の分野でよく知られているように、ある１人の患者に対する投与量は患者のサイズ、体表面積、年齢、投与すべき特定の化合物、性別、投与時間および経路、一般的な健康状態、および現在投与している他の薬剤を含む多くの因子に依存する。一般に、医薬組成物の規則的な投与としての投与計画では、１日当たり１μｇ〜１０ｍｇ単位の範囲でなければならない。投与計画が連続な注入である場合は、それぞれ１分当たり、体重１ｋｇ当たりで１μｇ〜１０ｍｇ単位の範囲でなければならない。進行は定期的な評定によりモニターできる。投与量は変わるであろうが、ＤＮＡの静脈内投与のための好ましい投与量は約１０６〜１０１２コピーのＤＮＡ分子である。
【０１１２】
本発明の組成物は局所的にまたは全身的に投与することができる。投与は一般には非経口的、たとえば静脈内であろう；ＤＮＡはまた、たとえば内部または外部の標的部位へのバイオリスティックデリバリー（biolistic delivery）によりまたは動脈中の部位へのカテーテルにより、標的部位へ直接投与することもできる。非経口投与用の調製物としては、滅菌水溶液または滅菌非水溶液、懸濁液、およびエマルジョンが挙げられる。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体としては、水、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液（食塩水および緩衝媒体を含む）が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸含有（lactated）リンゲル、または固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、液体および栄養補給剤、電解質補給剤（リンゲルデキストロースに基づくものなど）などが挙げられる。たとえば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガスなどの保存剤および他の添加物も配合できる。
【０１１３】
本発明の種々のポリヌクレオチドおよびベクターは、標準ベクターおよび／または遺伝子送達システムを用いて単独かまたは組み合わせにて、任意に適当な化合物、たとえば腫瘍、アレルギー、または自己免疫疾患に特異的な（自己）抗原とともに、および／または製薬学的に許容しうる担体または賦形剤とともに投与することが本発明により認識される。投与後、該ポリヌクレオチドまたはベクターは患者のゲノム中に安定に組み込まれる。一方、ある種の細胞または組織、好ましくはＤＣに特異的で該細胞中に持続するウイルスベクターを用いてもよい。適当な医薬担体および賦形剤は当該技術分野でよく知られている。本発明に従って調製した医薬組成物は、様々な種類の疾患（免疫不全またはウイルス感染または癌に関連する）の予防、治療または遅延のために用いることができる。さらに、該医薬組成物はワクチンであってもよい。
【０１１４】
ワクチンは、とりわけ、１またはそれ以上の抗体、該抗体の断片、該抗体の誘導体、本発明のポリヌクレオチドまたは抗原から調製できる。
たとえば、本発明のポリヌクレオチドは遺伝子ワクチンのためまたはＤＮＡワクチンとして用いることができる。遺伝子／ＤＮＡワクチンの投与経路は当該技術分野でよく知られており、ＤＮＡワクチン接種はアロ免疫、抗腫瘍抗体または抗イディオタイプ免疫応答を誘発するのに首尾良く用いられている（Tighe M.ら、Immunology Today 19(1998),89-97）。さらに、核酸分子／ＤＮＡの接種は、様々な様式の疾患を防御することがわかっている（Fynan, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90(1993),11478-11482;Boyer,Nat.Med.3(1997),526-532;Webster, Vaccine 12(1994),1495-1498;Montgomeryら, DNA Cell Biol.12(1993),777-783;Barry, Nature 311(1995),632-635;XuおよびLiew, Immunology 84(1995),173-176;Zhoug, Eur.J.Immunol.26(1996),2749-2757;Luke, J.Inf.Dis.175(1997),91-97;Mor, Biochem.Pharmacology 55(1998),1151-1153;Donelly, Annu.Rev.Immun.15(1997),617-648;MacGregor, J.Infect.Dis.178(1998),92-100）。
【０１１５】
ワクチンとしての医薬組成物に用いる本発明の抗体、該抗体の断片または誘導体またはポリヌクレオチドは、たとえば中性または塩の形態で調合できる。製薬学的に許容しうる塩、たとえば酸付加塩その他は当該技術分野で知られている。ワクチンは、とりわけウイルスなどの病原体の感染の治療および／または予防のために用いることができ、調合方法に適合した剤型で、および予防または治療処置に薬理学的に有効な量で投与される。
【０１１６】
ワクチンとして使用されるタンパク質、タンパク質断片および／またはタンパク質誘導体は当該技術分野でよく知られている（たとえば、Cryz, "Immunotherapy and Vaccines", VCH Weinheim(1991);Paul (1989)、上掲文献を参照）。さらに、細菌病原体の細胞内酵素さえも、免疫保護を付与する抗原性物質として作用しうることが示されている（Michetti, Gastroenterology 107(1994),1002;Radcliff, Infec.Immun.65(1997),4668;Lowrie, Springer Semin.Immunopathol.19(1997),161）。
【０１１７】
ワクチン接種プロトコールは、能動免疫または受動免疫を含み、能動免疫は防御免疫応答を誘発させるために本発明の抗体（および／またはその誘導体または断片）を用いて抗原を宿主／患者に投与することを必要とする。ワクチン接種およびワクチンの原理は当業者に知られている（たとえば、Paul, "Fundamental Immunology"、ラベン・プレス、ニューヨーク（１９８９）またはMorein, "Concepts in Vaccine Development"、S.H.E. Kaufmann編、Walter de Gruyter、ベルリン、ニューヨーク（１９９６）、２４３〜２６４を参照）。典型的に、ワクチンは、液体溶液としてかまたは懸濁液のいずれかとして、注射剤として調製される；注射前の液状の溶液または懸濁液のための固形形態もまた調製できる。調製物を乳化することもできるし、またはタンパク質をリポソーム中にカプセル納入（encapsulated）することもできる。
【０１１８】
活性な免疫成分は、しばしば、該活性成分と適合性の薬理学的に許容しうる賦形剤と混合される。適当な賦形剤としては、これらに限られるものではないが、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどが挙げられる；これら賦形剤を種々の量で組み合わせて用いることもできる。ワクチンはまた、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および／または該ワクチンの効力を増大させるアジュバントなどの補助物質を少量含んでいてよい。たとえば、そのようなアジュバントとしては、２％スクワレン／Tween-80Rエマルジョン中の水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは水酸化リンアルミニウム（aluminumphosphohydroxide）（「Gen H-B-VaxR」「DPT-Impfstoff Behring」として使用する）などのアルミニウム構成物（compositions）、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（thr-DMP）、Ｎ−アセチル−ノルアドレナリンムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（CGP 11687、「nor-MDP」ともいう）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１'２'−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシファオスフォリルオキシ）エチルアミン（CGP 19835A、「MTP-PE」ともいう）、ＭＦ５９およびＲＩＢＩ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）が挙げられる。さらなるアジュバントとしては、とりわけＣｐＧ含有モチーフなどのＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドが挙げられる（CpG-oligonucleotides; Krieg, Nature 374(1995),546-549;Pisetsky, An.Internal.Med.126(1997),169-171）。
【０１１９】
ワクチンは、通常、静脈内または筋肉内注射により投与する。他の様式の投与に適したさらなる調合物としては、坐剤およびある場合には経口調合物が挙げられる。坐剤については、伝統的な結合剤および担体として、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが挙げられるが、これらに限られるものではない。経口調合物は、たとえば、製薬グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような通常用いられるものを含む。これら組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放製剤または散剤の形態であってよく、約１０％〜約９５％の活性成分、好ましくは約２５％〜約７０％の活性成分を含む。
【０１２０】
ワクチンは、投与剤型に適合した仕方で、および予防および／または治療に有効な量で投与されるであろう。投与すべき量は、一般に投与量当たり約５μｇ〜約２５０μｇの抗原の範囲であり、投与すべき患者、患者の免疫系が抗体を合成する能力、意図する保護の程度に依存する。投与に必要な活性成分の正確な量は実施者の判断に委ねられてよいし、各患者ごとに特有であってよい。ワクチンは単回または多回投与スケジュールで与えられてよい。多回投与は、第一のワクチン接種を１〜１０の別個の投与とそれに続いて免疫応答を維持および／または強化するのに必要な所定の時間間隔で（たとえば、第二の投与のために１〜４ヶ月にて）さらなる投与を行い、さらに患者が必要とすれば数ヶ月後に引き続く投与を行うものである。投与計画はまた、少なくともその一部は、患者の必要性によって決定され、実施者の判断に委ねられるであろう。
【０１２１】
本発明の範囲にはまた、細胞または細胞断片ベースのワクチンも包含される。たとえば、樹状細胞（ＤＣ）ベースのワクチンを、Ｍ−ＤＣ８＋細胞を選択し、腫瘍またはウイルス感染細胞に特異的な抗原でエクスビボパルスすることにより製造することができる。本発明の抗体を用いて単離できるＤＣは、とりわけ腫瘍ワクチン接種または抗ウイルスワクチン接種のための抗原担体として用いる。ＤＣの抗原積載（loading）は当該技術分野でよく知られており、最小のＭＨＣクラスＩ制限ペプチドからタンパク質に至る（Mayordomo, Nature Med.1(1995),1297-1302;Hsu, Nature Med.2(1996),52-58;Paglia, J.Exp.Med.183(1996),317-322;Pardoll, Nature Medicine Vaccine Suppl.4(5)(1998),525-531において概説）。さらに、抗原は、全腫瘍細胞とのＤＣの融合により（Gong, Nature Med.(1996),558-561）、または複製欠損組換えウイルスベクターを用いて（Specht, J.Exp.Med.186(1997),1213-1221;Song, J.Exp.Med.186(1997),1247-1256）、提示／積載できる。
【０１２２】
さらに、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含むトランスジェニック非ヒト動物も本発明の範囲に含まれる。そのようなトランスジェニック非ヒト動物は当該技術分野でよく知られた方法に従って製造することができ、本発明の抗体、抗原およびポリペプチドの生物学的活性および／またはＤＣ媒体免疫応答の対応インヒビターおよびアクチベーターを研究するうえで有用である。
【０１２３】
それゆえ、本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを生殖細胞、胚細胞、幹細胞または卵またはそれに由来する細胞中に導入することを含む、トランスジェニック動物、好ましくはトランスジェニックマウスの製造方法に関する。本発明の方法に使用する非ヒト動物は、トランスジェニックしていない健常な動物であってよく、またはウイルス疾患や癌、またはＤＣもしくはＴ細胞媒体自己免疫疾患を有していてよい。トランスジェニック胚の製造およびそのスクリーニングは、たとえば、A.L. Joyner編、Gene Targeting, A Practical Approach(1993)、オックスフォード・ユニバーシティー・プレスに記載されているようにして行うことができる。胚の胚膜のＤＮＡは、適当なプローブを使用したサザーンブロットを用いて分析できる。
【０１２４】
本発明はまた、本発明のまたは本発明の方法により得ることのできるポリヌクレオチドまたはベクターを含むトランスジェニックマウス、ラット、ハムスター、イヌ、サル、ウサギまたはブタなどのトランスジェニック非ヒト動物であって、好ましくは該ポリヌクレオチドまたはベクターが該非ヒト動物のゲノム中に安定に組み込まれており、好ましくは該ポリヌクレオチドまたはベクターの存在が本発明の抗体、抗原またはポリペプチドの発現へと導くトランスジェニック非ヒト動物に関する。一方、本発明の抗原をもはや発現することができないノックアウト非ヒト動物を生成することができる。
【０１２５】
他の態様において、本発明は、上記本発明の抗体、抗原またはエピトープ、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはベクターのいずれか一つを含む診断組成物に関する。
【０１２６】
本発明の抗原は、とりわけイムノアッセイに使用するのに適しており、該抗原は液相にてまたは固相支持担体に結合させて用いることができる。さらに、これらアッセイに用いる抗原は種々の仕方で検出可能に標識することができる。本発明の抗原を用いることのできるイムノアッセイの例は、直接または間接のいずれかの形態の競合および非競合イムノアッセイである。そのようなイムノアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチ（イムノアッセイ）およびウエスタンブロッティングアッセイである。本発明の抗原またはエピトープに結合した抗体の検出は、生理学的サンプル上での免疫組織化学的アッセイを含む、フォアウォード、リバースまたは同時の様式で行うイムノアッセイを用いて行うことができる。本発明の抗原およびポリペプチドは多くの異なる担体に結合させることができ、本発明のＤＣと特異的に反応する抗体の存在を検出するのに用いることができる。よく知られた担体の例は、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然および改変セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、およびマグネタイトである。担体の性質は、本発明の目的により可溶性かまたは不溶性のいずれかであってよい。
【０１２７】
当業者に知られた多くの異なる標識および標識方法が存在する。本発明に用いることのできる標識のタイプの例としては、酵素、放射性同位元素、コロイド状金属、蛍光化合物、化学ルミネセンス化合物、および生物ルミネセンス化合物などが挙げられる（上記参照）。
【０１２８】
本発明のアッセイに使用するための材料は、キットの調製に理想的に適している。そのようなキットは、バイアル、チューブなどの１またはそれ以上の容器手段を密に収容すべく区画化した担体手段であって、各容器手段が本発明の方法に使用する別個の要素の一つを含むようにしたものを含んでいてよい。たとえば、容器手段の一つは担体に結合した本発明の抗原を含んでいてよい。第二の容器は可溶性で検出可能に標識した第二の抗体を凍結乾燥形態かまたは溶液中にて含んでいてよい。さらに、容器手段は複数の容器を含んでいてよく、それら容器の各々が本発明の抗原を様々な前以て決定した量で含んでいてよい。ついで、これら後者の容器は標準曲線を作成するのに使用でき、該標準曲線に本発明の抗原に対する抗体を未知量で含むサンプルから得られた結果を内挿することができる。
【０１２９】
さらに他の態様において、本発明は、抗原に暴露された樹状細胞または抗原を発現するＤＣまたは上記抗原またはエピトープを含むワクチンに関する。単離したＤＣはインビトロで調製して、以下に記載するようにＣＤ４＋かまたはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかを刺激するための抗原性ペプチドを提示することができる。ついで、これらＤＣを皮内、皮下、筋肉内、またはとりわけ抗腫瘍ワクチン接種の場合には腫瘍増殖の領域または腫瘍増殖のリンパ管またはリンパ節排出領域に注入する。抗原提示ＤＣの注入は、種々の間隔をあけて数回繰り返す（Nestle, Nature Med.4(1998)328-332）。
【０１３０】
他の態様において、本発明は、本発明の樹状細胞およびある種の疾患に罹りやすいヒトまたは動物において該疾患に対する防御免疫応答を生成しうる上記抗原の少なくとも一つを含む免疫賦活組成物に関する。ワクチン接種に使用するＤＣの免疫原性は、たとえば分泌サイトカインまたはケモカインまたは膜分子をコードするｃＤＮＡをＤＣ中に形質導入することにより、Ｔｈ１かまたはＴｈ２指令免疫応答のいずれかをプログラムするように増強し特異的に改変することができる。Ｔｈ１指令免疫応答をプログラムするには、抗原提示ＤＣをＩＬ−１２をコードするｃＤＮＡで形質導入し、Ｔｈ２指令免疫応答をプログラムするには、抗原提示ＤＣをＩＬ−４を分泌するように改変する。
【０１３１】
本発明はまた、上記方法により得られたＴ細胞を適合性の免疫療法のための医薬組成物を調製するために使用すること、および抗原に暴露された本発明の樹状細胞をヒトまたは動物においてＴ細胞を活性化するための医薬組成物に使用することに関する。たとえば、Ｔリンパ球をＴ細胞に対して抗原性ペプチドを提示するように調製した本発明の自己由来ＤＣとともにインビトロで数日間一緒に培養して、Ｔ細胞の抗原特異的な活性化を誘発させる。抗原は腫瘍抗原またはアレルゲンまたは自己抗原であってよい。活性化Ｔ細胞の増殖は、ＩＬ−２などのサイトカインを加えることによって支持できる。Ｔ細胞の抗原特異的な刺激は数回繰り返す。ついで、Ｔ細胞を大抵は注入によりドナーに適合して移す。
【０１３２】
本発明のさらなる目的は、標的細胞に該樹状細胞を補充するための医薬組成物の調製のために上記二重特異性抗体を使用することである。好ましくは、該標的細胞は腫瘍細胞またはウイルス感染細胞または微生物が感染した細胞である（上記参照）。
【０１３３】
本発明の抗体、抗原およびエピトープ投与の投与量範囲は、自己免疫応答の徴候または細胞破壊が改善されるような所望の効果が得られるに充分大きなものである。投与量は、所望でない交叉反応やアナフィラキシー反応などの副作用を引き起こすほど大きなものであってはならない。一般に、投与量は、患者の年齢、健康状態、性別、および疾患の程度によって変わるであろうが、当業者により決定することができる。投与量は、矛盾する適応症（couterindications）の場合には個々の医師によって調節することができる。
【０１３４】
さらに、本発明は、免疫応答をインビトロでまたはインビボで調節またはプログラムするためにサイトカインまたはシグナル伝達分子の遺伝子をトランスフェクションすることにより樹状細胞を改変する方法を含む。そのようなサイトカインおよび分子の例については上記を参照のこと。
【０１３５】
さらに、本発明は、Ｔ細胞の抗原特異的活性化を促進、調節または抑制する作用を有するＤＣにより合成される分子を同定する方法であって、
（ａ）本発明のＤＣによって培養上清中に分泌された分子をたとえば通常の生化学的方法によって分離し、ついで富化したまたは単離した該分子を抗原特異的Ｔ細胞活性化についてＤＣを欠く細胞培養系で試験し、ついで／または
（ｂ）本発明のＤＣにおける遺伝子発現を差し引きクローニングまたは識別表示（differential display）ＲＴ−ＰＣＲにより単球などの他の抗原提示細胞での遺伝子発現と比較する
ことを含む方法に関する。
【０１３６】
さらに、本発明は、インビトロでＤＣを増殖させる方法であって、
（ａ）本発明のＤＣを、ＤＣの増殖を支持する特定のサイトカイン混合物（cocktail）中で培養し、ついで／または
（ｂ）ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードする遺伝子などの形質転換遺伝子を形質導入することにより該ＤＣを不死化する
ことを含む方法を包含する。
【０１３７】
たとえば、全ＲＮＡを、たとえばRNAzol B法（Tel-Test, Inc.）を用いて本発明のＤＣおよび他の抗原提示細胞から単離し、識別表示を当該技術分野に記載されているようにして行うことができる（たとえば、Kojima, J.Biol.Chem.271(1996),12327-12332を参照）。
【０１３８】
これらおよび他の態様が本発明の記載および実施例により開示および包含される。本発明に従って用いることのできる方法、使用および化合物のいずれか一つに関するさらなる文献は、たとえば電子装置を用いて公共の図書館およびデータベースから検索することができる。たとえば、公共データベースの「Medline」を利用できるが、これはたとえばhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.htmlにてインターネット上で入手できる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.infobiogen.fr/, http://www.fmi.ch/biology/research tools.html, http://www.tigr.org/などの他のデータベースおよびアドレスも当業者には知られており、たとえばhttp://www.lycos.comを用いて得ることができる。バイオテクノロジーにおける特許情報の概観および過去に遡る（retrospective）調査および現在の了解（awareness）に有用な特許情報の関連する源のサーベイはBerks, TIBTECH 12(1994),352-364で得られる。
【０１３９】
本発明の医薬組成物、使用および方法は、自己免疫疾患、アレルギー疾患などの過敏性疾患、免疫不全症に関連することが、または免疫系の応答が関与するウイルス性疾患または癌または他の感染性疾患に依存することがわかっているあるいはこれまでのところわかっていない全ての種類の疾患の治療に有利に用いることができる。本発明の医薬組成物、使用および方法はヒトに用いるのが望ましいが、動物の治療もまた本発明の方法および使用に包含される。
【０１４０】
以下の実施例により本発明を説明する。
実施例１：Ｍ−ＤＣ８＋白血球の単離および特徴付け
ヘパリン処理した全血およびバフィーコート調製物を、血液ドナーのインフォームドコンセントを得てＴＵドレスデン、医学部、輸血課から得た。血球を２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸（Biochrom AG、ベルリン、ＦＲＧ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ともにGibco、エッゲンシュタイン、ＦＲＧより入手）および１０％加熱不活化プールヒト血清を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（完全培地（ＣＭ）と称する）中で培養した。全白血球のＦＡＣＳ分析のため、赤血球を溶解液（Becton Dickinson & Co.、ハイデルベルグ、ＦＲＧ）で製造業者の指示に従って溶解させた。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をフィコール−ハイパック（Pharmacia、フライブルグ、ＦＲＧ）密度遠心分離により調製した。
【０１４１】
ＣｒＣｌ３法２７を本質的に記載に従って用い、精製ＣＤ２（Ｍ−Ｔ９１０）、ＣＤ３７（Ｍ−Ｂ３７２）またはＣＤ１４（Ｍ−Ｍ４２）モノクローナル抗体（本発明者らの研究所に由来し、"IVth Int. Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens"２６で群集させた（clustered））をコーティングしたウシ赤血球（ＢＲＢＣ）を用いた直接モノクローナル抗体ロゼット法（ＤＡＲＴ）により、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球および単球をＰＢＭＣから除去した。各モノクローナル抗体をコーティングしたＢＲＢＣを用いた２回目のロゼット法により９９％以上の涸渇が得られた。アミノエチルイソチウロニウム（isothiuronium）ブロマイド（ＡＥＴ、Sigma、ダイゼンホーフェン、ＦＲＧ）で処理したヒツジ赤血球でロゼットし、ついで記載に従って２７フィコール密度遠心分離により＞９８％純度のＴリンパ球をＰＢＭＣから得た。この集団から＞９８％純度のＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＤ４モノクローナル抗体Ｍ−Ｔ３１０をコーティングしたＢＲＢＣとのロゼットとしてＣＤ４＋細胞の涸渇により調製した２８。
【０１４２】
Ｔ細胞、Ｂ細胞および単球を涸渇させたＨＬＡ−ＤＲ＋ＰＢＭＣ上でのスクリーニングにより、６×１０３を超えるハイブリドーマ上清からＭ−ＤＣ８を選択した。赤血球の溶解後、Ｍ−ＤＣ８モノクローナル抗体は全白血球集団の０.５〜１％を標識した（図１Ａ）。１０μｇ／ｍｌの抗体を含むＭ−ＤＣ８ハイブリドーマの非希釈上澄み液とともにＰＢＭＣを４℃で１５分間インキュベートすることによりＭ−ＤＣ８＋細胞を得た。ＰＢＳで洗浄後、常磁性のマイクロビーズ（Miltenyi Biotec、ベルギッシュ−グラッドバッハ、ＦＲＧ）に結合させた１０μｌのラット抗マウスＩｇＭで細胞を４℃にてさらに１５分間標識した。洗浄後、細胞の凝集を防ぐために細胞を充分に再浮遊させ、ＶＳ＋分離カラム（Miltenyi）上で貯蔵した。必要なら、高度に富化した細胞をＲＳ＋分離カラム（Miltenyi）を用いた２回目のマグネチックセルソーティングによりさらに精製した。１％ヒト血清を含む脱気し氷冷したＰＢＳを操作（running）および溶出緩衝液として用いた。
【０１４３】
抗ＣＤ１４コーティング常磁性マイクロビーズ（Miltenyi）とのインキュベーションによる最初のマグネチックセルソーティングの後、純粋な単球を調製した。ＶＳ＋分離カラムを用いたマグネチックセルソーティングの後、ＣＤ１４＋の＞９５％純度の集団を得た。サイズおよび顆粒度に関しては、Ｍ−ＤＣ８＋細胞は光散乱表示においてリンパ球と単球との間に位置する別個の集団を示していた（図１Ｂ、１Ｃ）。以下の細胞系列特異的モノクローナル抗体ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ１４およびＣＤ５６の各々とともにＭ−ＤＣ８モノクローナル抗体を用いた２色免疫蛍光分析により、Ｍ−ＤＣ８＋細胞はＴ細胞、Ｂ細胞、単球またはＮＫ細胞からそれぞれ排除することができた（図２Ａ〜２Ｄ）。２色蛍光分析のため、細胞を非希釈Ｍ−ＤＣ８ハイブリドーマ上清とともにインキュベートし、ついでＰＥ−またはＦＩＴＣコンジュゲートヤギＦ(ａｂ')２抗マウスＩｇＭ（Coulter-Immunotec、ハンブルグ、ＦＲＧ）とともにインキュベートした。
【０１４４】
二次抗体の非複合結合部位を１／１０希釈の正常マウス血清で飽和した後、以下の蛍光染色コンジュゲートモノクローナル抗体を供給者の推奨する濃度にて適用した：ＣＤ２（Ｔ９−１０、ＩｇＧ１、ＦＩＴＣ）、ＣＤ４（１３Ｂ８.２、ＩｇＧ１、ＰＥ）、ＣＤ１１ｂ（ＺＬＰＭ１９Ｃ、ＩｇＧ１、ＰＥ）、ＣＤ１４（Ｔ＋Ｋ４、ＩｇＧ２ａ、ＦＩＴＣ）、ＣＤ１８（ＭＨＭ２３、ＩｇＧ１、ＦＩＴＣ）（すべてDako、ハンブルグ、ＦＲＧから購入）；ＣＤ１ａ（Ｍ−Ｔ１０２、ＩｇＧ２ｂ、ＰＥ）、ＣＤ１１ａ（Ｇ４３−２５Ｂ、ＩｇＧ１、ＦＩＴＣ）、ＣＤ１１ｃ（Ｂ−ＬＹ６、ＩｇＧ１、ＰＥ）、ＣＤ３２（ＦＬ１８.２６、ＩｇＧ２ｂ、ＦＩＴＣ）、ＣＤ３３（ＷＭ５３、ＩｇＧ１、ＰＥ）、ＣＤ４０（５Ｃ３、ＩｇＧ１、ＦＩＴＣ）、ＣＤ５４（ＨＡ５８、ＩｇＧ１、ＰＥ）、ＣＤ５６（Ｂ１５９、ＩｇＧ１、ＰＥ−Ｃｙ５）、ＣＤ８０（ＢＢ１、ＩｇＭ、ＦＩＴＣ）、ＣＤ８６（ＩＴ２.２、ＩｇＧ２ｂ、ＦＩＴＣ）（ＦＵＮ１、ＩｇＧ１、ＦＩＴＣ）、ＣＤ１０６（５１−１０Ｃ９、ＩｇＧ１、ＦＩＴＣ）、ＨＬＡ−ＤＰ（ＨＩ４３、ＩｇＧ１、ＦＩＴＣ）、ＨＬＡ−ＤＱ（Ｔ＋１６９、ＩｇＧ２ａ、ＦＩＴＣ）、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ（Ｇ４６−２.６、ＩｇＧ１、ＦＩＴＣ）（すべてPharmingen、ハンブルグ、ＦＲＧより入手）；ＣＤ３（ＵＣＨＴ１、ＩｇＧ１、ＰＥ−Ｃｙ５）、ＣＤ１３（ＷＭ１５、ＩｇＧ１、ＦＩＴＣ）、ＣＤ１６（３Ｇ８、ＩｇＧ１、ＦＩＴＣ）、ＣＤ１９（Ｊ４.１１９、ＩｇＧ１、ＰＥ）、ＣＤ３４（ＱＢＥＮＰ１０、ＩｇＧ１、ＦＩＴＣ）、ＣＤ４５ＲＯ（ＵＣＨＬ１、ＩｇＧ２ａ、ＰＥ）、ＣＤ４５ＲＡ（ＡＬＢ１１、ＩｇＧ１、ＦＩＴＣ）、ＣＤ５０（ＨＰ２／１９、ＩｇＧ２ａ、ＰＥ）、ＣＤ５８（ＡｌＣＤ５８、ＩｇＧ２ａ、ＰＥ）、ＣＤ６４（２２、ＩｇＧ１、ＦＩＴＣ）、抗ＨＬＡ−ＤＲ（Ｂ８.１２.２、ＩｇＧ２ｂ、ＰＥ）（すべてCoulter-Immunotech、ハンブルグ、ＦＲＧから購入）。
【０１４５】
２つの非標識モノクローナル抗体Ｍ−ＤＣ８およびＣＤ８３（ＨＢ−１５ａおよびＨＢ−１５ｂ、Vth Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigensに際して入手）を用いた２色免疫蛍光染色を以下のようにして行った：細胞をまずＣＤ８３モノクローナル抗体とともにインキュベートし、ついでＦＩＴＣコンジュゲートヤギＦ(ａｂ')２抗マウスＩｇ（Dako、ハンブルグ、ＦＲＧ）とともにインキュベートした。１／１０希釈の正常マウス血清で反応停止した（quenching）後、細胞をＭ−ＤＣ８モノクローナル抗体および第二抗体としてのＰＥコンジュゲートヤギＦ(ａｂ')２抗マウスＩｇＭ（Coulter-Immunotec）で染色した。
【０１４６】
モノクローナル抗体Ｍ−ＤＣ８およびｐ５５（E. Langhoff博士の好意により提供された）を用いた２色染色のため、ＰＢＭＣをまず上記のようにＭ−ＤＣ８について表面染色し、ついで氷冷４％パラホルムアルデヒド（Merck、ダルムシュタット、ＦＲＧ）で固定し、０.１％サポニン（Sigma、ダイゼンホーフェン、ＦＲＧ）で透過性にし、モノクローナル抗体ｐ５５で染色し、ついでＦＩＴＣコンジュゲートラット抗マウスＩｇＧ１で処理した。各インキュベーションの後に細胞を細胞洗浄液（Becton-Dickinson & Co.、ハイデルベルグ、ＦＲＧ）で２回洗浄した。染色した細胞を溶解IIプログラムを用いてＦＡＣＳｃａｎ（Becton Dickinson）で分析した。ヒト血液ＤＣの２つのマーカーであるＣＤ８３およびｐ５５は同一のＤＣサブセットを定めるので９，１０、Ｍ−ＤＣ８が重複した細胞集団を特徴付けるか否かを知ることに興味がもたれた。未分離のＰＢＭＣをｐ５５およびＭ−ＤＣ８について同時に染色すると、これら２つのマーカーにより２つの異なる細胞集団が定められた（図２Ｅ）。ＣＤ８３発現を誘発させるため、ＰＢＭＣをＴ細胞およびＢ細胞について涸渇させ、４８時間培養した。これら細胞をＣＤ８３およびＭ−ＤＣ８モノクローナル抗体で染色すると２つの異なる細胞サブセットが明らかとなった（図２Ｆ）。それゆえ、Ｍ−ＤＣ８は、公知の細胞系統およびＤＣマーカーによって同定されるものとは異なる独特の白血球集団を定める。
【０１４７】
表１は、新たに単離し培養したＭ−ＤＣ８＋細胞とＣＤ１４＋単球とを比較して広範な表面マーカーについて分析した結果を示す。新鮮なＭ−ＤＣ８＋細胞は、ＨＬＡクラスII抗原（ＨＬＡ−ＤＲ、−ＤＰ、−ＤＱ）、β２−インテグリンＣＤ１１ａ，ｂ，ｃ／ＣＤ１８およびβ１−インテグリン鎖ＣＤ２９などの接着分子、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）およびＩＣＡＭ−３（ＣＤ５０）などの細胞接着分子、ＬＦＡ−３（ＣＤ５８）およびＦｃγレセプターＣＤ３２（ＦｃγＲII）およびＣＤ１６（ＦｃγＲIII）を示した。さらに、Ｍ−ＤＣ８＋細胞はミエロイド（myeloid）マーカーＣＤ１３およびＣＤ３３について陽性であり、ＣＤ４を適度の密度で発現した。表皮ＤＣのマーカーであるＣＤ１ａ１５並びに胸腺ＤＣによって発現されるＣＤ１０６（ＶＣＡＭ−１）１６は、新鮮なＭ−ＤＣ８＋細胞では検出されなかった。
【０１４８】
Ｍ−ＤＣ８＋細胞は、ＭＨＣクラスIIおよび接着分子１，９に加えてＢ−７.１（ＣＤ８０）、Ｂ−７.２（ＣＤ８６）およびＣＤ４０などの抗原提示細胞の古典的な特徴を発現した。ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０およびＣＤ８６は新たに単離したＭ−ＤＣ８＋細胞では低レベルでしか発現されなかったが、これら分子はインビトロで３６時間培養した後には上方制御された（upregulated）。この時点で、コスティミュラトリー分子Ｂ−７.１（ＣＤ８０）も低密度でのみではあるが検出されるようになった。新たに単離し培養したＭ−ＤＣ８＋細胞の表面マーカーを表１にまとめて示す；下記参照。比較のため、新たに調製したＣＤ１４＋単球の表現型をも示す。
【０１４９】
表１：ＣＤ１４＋単球と比較した新たに単離および培養したＭ−ＤＣ８＋細胞の表面表現型
【表１】
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【０１５０】
Ｍ−ＤＣ８＋細胞およびＣＤ１４＋単球をイムノマグネチック法によりＰＢＭＣから単離した。単離直後かまたはＣＭ中で３６時間培養した後、細胞を免疫蛍光染色およびＦＡＣＳ分析に供した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）レベルを−として与え、４ログスケール（four log scale）での第一の１０のＭＦＩを示し、これは同位元素の対照レベルに対応する；＋、＋＋および＋＋＋は、それぞれ第二、第三および第四の１０のＭＦＩを示す。符号のないものは決定しなかったことを意味する。これらデータは、少なくとも５つの個々の実験を示す。
【０１５１】
Ｍ−ＤＣ８＋細胞をＣＤ１４＋単球から識別する最も顕著な特徴は、Ｍ−ＤＣ８＋細胞での高密度のＣＤ１６（ＦｃγＲIII）、およびＣＤ６４（ＦｃγＲI）発現の欠如であった。興味深いことに、ＣＤ１６は３６時間のインビトロ培養の間にＭ−ＤＣ８＋細胞の表面から消失した。さらに、Ｍ−ＤＣ８＋細胞は単球に比べてＣＤ４５Ｒ０を一貫して低レベルにて発現したのに対し、ＣＤ１１ａおよびＣＤ１１ｃおよびＣＤ４５分子のＲＡイソ型はＭ−ＤＣ８＋細胞ではかなり高かった。
【０１５２】
実施例２：Ｍ−ＤＣ８＋細胞の形態学的および機能的特徴付け
Ｍ−ＤＣ８抗体は、マグネチックセルソーティングを用いた１工程法によりＤＣをＰＢＭＣから単離するのに特に有効であることがわかった。この方法を用い、生存能力のあるＭ−ＤＣ８＋細胞を６０〜９０％の収率および＞９７％の純度で再現可能に単離することができた（図２Ｇ、２Ｈ）。これら細胞はサイトスピン（cytospins）上で丸い中位のサイズの白血球として現れ（図３Ａ）、培養の間にサイズは大きくなり、樹状の細胞質突出を示した（図３Ｂ）。新たに単離した細胞は、１μのラテックスビーズおよび抗体コーティングＳＲＢＣを貪欲に食作用により取り込んだ（図３Ｃおよび３Ｄ）。
【０１５３】
新たに単離した単球およびＭ−ＤＣ８＋細胞を、抗ＳＲＢＣ血清１：１００（Sigma、ダイゼンホーフェン、ＦＲＧ）でオプソニン処理したヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）かまたは１もしくは５μの直径のラテックスビーズ（Sigma）とともに３７℃、５％ＣＯ２にてインキュベートした。３０分後、嵌入しなかったＳＲＢＣを低浸透圧溶解（蒸留水で５秒後、等容量の１.８％ＮａＣｌを添加）により溶解した。ＳＲＢＣの嵌入は、May Grunvald Giemsa染色後にサイトスピン上で評価した。嵌入したラテックスビーズの視覚化を共焦点レーザースキャニング顕微鏡（Lieca TCS 4D、レイカ、ハンブルグ、ＦＧＲ）により行った。
【０１５４】
実施例３：同種および自己ＭＬＲ
Ｍ−ＤＣ８＋細胞が抗原特異的なＴ細胞活性化を誘発する能力を評価するため、種々のＴ細胞刺激アッセイを行った。比較のため、単球を常に平行してアッセイした。１×１０５の精製Ｔリンパ球を、９６ウエルの丸底マイクロタイタープレート（Corning、ニューヨーク、ニューヨーク、米国）中の０.２ｍｌのＣＭ中で段階的な（graded）数のＡＰＣとともに培養した。破傷風毒素（ＴＴ、Behringwerke、マールブルグ、ＦＲＧ）またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ、Boehringer-Mannheim、マンハイム、ＦＲＧ）を抗原としてそれぞれ５μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌの濃度にて添加した。
【０１５５】
Ｔ細胞の増殖を、５日後に３Ｈ−チミジン（比活性７９.１Ｃｉ／ミリモル、濃度１.０ｍＣｉ／ｍｌ、DuPont、バート・ホンブルグ、ＦＲＧ）（回収の１２〜１５時間前に２μＣｉ／ウエルの濃度で添加）の取り込みにより決定した。クローニングしたメラノーマ特異的細胞障害性Ｔ細胞を抗原性ペプチドを外部より負荷したＡＰＣにより活性化させる実験においては、ＨＬＡ−Ａ０２０１ドナーからのＡＰＣ調製物を、１％ヒト血清を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中、３７℃にて１００μｇ／ｍｌのチロシナーゼペプチドＹＭＤＧＴＭＳＱＶとともに一夜インキュベートした。充分に洗浄した後、１０４のペプチドパルスＡＰＣを２５Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ−２（Genzyme、ミュンヘン、ＦＲＧ）の存在下、丸底マイクロタイタープレート（Corning）中の２００μｌのＣＭ中、Ｔ細胞クローンＩＶＳＢ（T. Wolfel博士、ユニバーシティー・オブ・マインツ、ＦＲＧの好意により提供された）の１０４細胞とともに培養した。
【０１５６】
細胞障害性のＣＤ８＋Ｔ細胞クローンは、ＨＬＡ−Ａ０２０１分子と複合体を形成した上記チロシナーゼペプチドを特異的に認識した（１９）。４０時間後に放出されたＴＮＦ−αをＥＬＩＳＡにより（R & D Systems、ミネアポリス、米国）上澄み液中で決定した。図４Ａから明らかなように、精製した細胞は１×１０５のＴ細胞を種々の数の同種ＡＰＣとともに培養したときに同種ＭＬＲを有効に誘発した。Ｍ−ＤＣ８＋細胞は同時に試験した単球に比べて少なくとも５倍有効であることがわかった。自己ＭＬＲの誘発はＤＣの特徴的な性質であると考えられるので１、単離したＭ−ＤＣ８＋細胞を自己Ｔ細胞とともに培養した。図４Ｂが示すように、自己Ｔ細胞は用量依存的な仕方で刺激された。しかしながら、絶対的な値は自己ＭＬＲでは同種ＭＬＲに比べてはるかに低かった。同じ条件下でアッセイしたときに、ＣＤ１４＋単球は下限に近いＴ細胞反応性しか示さなかった。
【０１５７】
実施例４：想起（recall）抗原およびネオ抗原（neoantigen）に対するＴ細胞の活性化
図４Ｃは、Ｍ−ＤＣ８＋細胞が破傷風毒素（ＴＴ）ワクチン接種したドナーから得たＴ細胞に対してＴＴを非常に有効に提示したことを示している。１×１０５のＴ細胞中で既に６００のＭ−ＤＣ８＋細胞が破傷風特異的なＴ細胞活性化を誘発することができた。同時に試験したときに、単球では約２５００の単球が同じレベルのＴ細胞増殖を得るのに必要であった。ＣＤ１４＋単球とは対照的に、Ｍ−ＤＣ８＋細胞はキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に対してインビトロで顕著な一次Ｔ細胞応答を誘発した（図４Ｄ）。
【０１５８】
実施例５：細胞障害性Ｔ細胞クローンの活性化
ＣＤ４＋Ｔリンパ球を活性化する能力に加え、ＤＣはクラスＩ提示内生ペプチドによりＣＤ８＋Ｔリンパ球を刺激するうえでも枢要である１７，１８。Ｍ−ＤＣ８＋細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞にＭＨＣクラスＩ結合ペプチドを提示する能力は、まず黒色腫患者に由来しＨＬＡ−Ａ０２０１分子上のチロシナーゼ由来ペプチドを認識する細胞障害性Ｔ細胞クローン（ＩＶＳＢ）で示された１９。刺激のため、Ｍ−ＤＣ８＋細胞およびＨＬＡ−Ａ０２０１陽性血液ドナーからの単球を、クローニングＴ細胞を添加する前に該ペプチドとともに一夜プレインキュベートした。４８時間後、分泌されたＴＮＦ−αを測定することにより細胞障害性クローンの応答を決定した。図５に示すように、Ｍ−ＤＣ８＋細胞はペプチドパルスした単球と同じくらい有効にクローニングＴリンパ球に対して該ペプチドを提示した。
【０１５９】
実施例６：アロ抗原特異的な細胞障害性ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘発
Ｍ−ＤＣ８＋細胞がＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞をインビトロで初回抗原刺激する能力を決定するため、Ｍ−ＤＣ８＋細胞を未分離の同種Ｔ細胞かまたは精製同種ＣＤ８＋Ｔリンパ球とともに培養した。ＣＤ８＋Ｔリンパ球の抗原特異的な初回抗原刺激は、５１Ｃｒ標識した同種ＰＨＡ芽球細胞（blasts）の溶解により評価した。精製Ｔ細胞または単離したＣＤ８＋Ｔ細胞（１×１０６）をスティミュレーター細胞としての５×１０４の同種Ｍ−ＤＣ８＋細胞または単球とともに２４ウエルCostarプレート（Costar、ハイデルベルグ、ＦＲＧ）中の全容量２ｍｌのＣＭ中にて培養した。７日後、細胞を回収し、洗浄し、ついでスティミュレーターの５１Ｃｒ標識したＰＨＡ芽球細胞に対する細胞障害活性、およびリスポンダー由来の５１Ｃｒ標識したＰＨＡ芽球細胞に対する細胞障害活性について試験した。培養の最後の２４時間の間にｒｈＩＬ−２（Genzyme）を２５Ｕ／ｍｌの濃度で加えた。ＰＨＡ芽球細胞を生成するため、１×１０６のＰＢＭＣを２ｍｌのＣＭ中の１μｌ／ｍｌのＰＨＡ（Gibco）で３日間刺激した。
【０１６０】
ついで、細胞を２５Ｕ／ｍｌのｈｒＩＬ−２（Genzyme）の存在下でさらに１日間培養した。洗浄後、１×１０６の細胞を１００μｌのＦＣＳ中に再浮遊させ、１００μＣｉの５１Ｃｒ（クロム酸ナトリウム、比活性４４０ｍＣｉ／ｍｇ、DuPont）を３７℃にて１時間かけて加えた。アロ抗原刺激したＴリンパ球の細胞障害活性を、マイクロタイタープレート中の２００μｌのＣＭ中で種々の数のエフェクター細胞を５×１０３の５１Ｃｒ標識ＰＨＡ芽球細胞とともに３７℃で４時間インキュベートすることにより決定した。細胞をスピンダウンし（spun down）、ガンマシンチレーションカウンター（Packard、ドライアイヒ、ＦＲＧ）で放射能を決定するために１００μｌの上澄み液を取り出した。標識細胞からの最大の放出を３回の凍結および解凍の後に決定した。
【０１６１】
比細胞障害活性は式：
比溶解（パーセント）＝１００×[(試験放出(ｃｐｍ)−自然放出(ｃｐｍ))／(最大放出(ｃｐｍ)−自然放出(ｃｐｍ))]
に従って計算した。図６Ａは、Ｍ−ＤＣ８＋細胞および単球が未分離のＴリンパ球とともに培養したときに同じ効率でアロ抗原特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘発することを示している。しかしながら、Ｍ−ＤＣ８＋細胞は、精製した同種ＣＤ８＋Ｔリンパ球とともに培養したときに単球に比べてアロ特異的な細胞障害性エフェクター細胞を活性化するうえではるかに有効であった（図６Ｂ）。
【０１６２】
実施例７：腫瘍特異的な細胞障害性Ｔ細胞の誘発
Ｍ−ＤＣ８＋細胞が腫瘍由来ペプチドに対して細胞障害性Ｔ細胞を初回抗原刺激する能力を試験するため、健康なドナーおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１抗原を発現する黒色腫患者のＰＢＭＣを、このＨＬＡクラスＩ分子に結合することが知られているチロシナーゼ由来ペプチドＹＭＤＧＴＭＳＱＶを積載した自己Ｍ−ＤＣ８＋細胞で４回連続して刺激することにより活性化した。誘発したＴ細胞の特異性の決定は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１抗原を発現するペプチド積載Ｔ２細胞の溶解およびチロシナーゼ発現メラノーマ細胞との接触後のＴＮＦ−αの放出の両者により行った。
【０１６３】
新たに単離したＭ−ＤＣ８＋細胞を血清不含培地中、３７℃にて４時間、５０μｇ／ｍｌのチロシナーゼ由来ペプチドＹＭＤＧＴＭＳＱＶおよび３μｇ／ｍｌのヒトβ２−ミクログロブリン（Sigma）を負荷した。洗浄後、２×１０５のペプチド積載Ｍ−ＤＣ８＋細胞を２４ウエル組織培養プレートのウエル当たり２ｍｌのＣＭ中、２×１０６の自己ＰＢＭＣとともに培養した。３日後、培地に２５Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ−２（Genzyme、ミュンヘン、ＦＲＧ）を補充した。１週間後、リスポンダー細胞を回収し、洗浄し、１×１０６細胞／ウエルにて分配し、ついでチロシナーゼペプチドを積載した１×１０５の新たに調製したＭ−ＤＣ８＋細胞で再刺激した。再刺激を２週間および３週間後に繰り返した。
【０１６４】
１週間後、ペプチドを積載し５１Ｃｒ標識したＴ２標的細胞の溶解かまたはチロシナーゼ発現メラノーマ細胞との接触後のＴＮＦ−αの放出の決定のいずれかにより細胞障害活性を試験した。Ｔ２細胞（ＡＴＣＣ、ロックビル、メリーランドより入手）を１００μｇ／ｍｌのチロシナーゼ由来ペプチドとともに一夜インキュベートし、洗浄し、１×１０６の細胞を１００μＣｉの５１Ｃｒで３７℃にて１時間標識した。洗浄後、細胞を丸底マイクロタイタープレートのウエル当たり５×１０３にて植え付け、種々の濃度の細胞障害性エフェクター細胞とともに４時間インキュベートした。比溶解を上記のようにして決定した。ＴＮＦ−α放出試験については、１×１０４のペプチド刺激細胞を２５Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ−２の存在下、２００μｌのＣＭ中、３７℃にて２×１０４の培養メラノーマ細胞とともにインキュベートした。２４時間後、放出されたＴＮＦ−αをＥＬＩＳＡ（R & D Systems、ヴィーズバーデン、ＦＲＧ）により上澄み液中で決定した。
【０１６５】
図７は、健康なドナーおよび黒色腫患者からのＰＢＭＣで得られた代表的な実験のデータを示す。両ドナーからのＰＢＭＣはペプチド特異的な細胞障害活性を誘発することができた。ペプチド認識の特異性は、チロシナーゼペプチドを添加しないＴ２標的細胞も制限ＨＬＡ−Ａ＊０２０１アレルを欠如する突然変異メラノーマ細胞株ＳＫ２９−Ｍｅｌ１.２２のいずれも生成した細胞障害性エフェクター細胞を活性化することができなかった対照実験により得られた。細胞障害活性が真実、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって引き起こされたことは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の選択的なイムノマグネチック除去によって細胞障害活性が完全に排除されたことにより示された。
【０１６６】
実施例８：抗体Ｍ−ＤＣ８の可変領域（ＶＬおよびＶＨ）のクローニング
モノクローナル抗体Ｍ−ＤＣ８の可変領域ＶＬおよびＶＨを、Orlandiら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989),3833-3837）の記載に従い、対応ハイブリドーマ細胞株（ＤＳＭ ＡＣＣ２２４）の全ＲＮＡからクローニングした。ＶＬおよびＶＨのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を図９および図１０に示す。
【０１６７】
実施例９：Ｍ−ＤＣ８陽性樹状細胞（Ｍ−ＤＣ８＋細胞）と従来のＣＤ１４陽性樹状細胞（ＤＣ）との比較
免疫単離法を用い、モノクローナル抗体Ｍ−ＤＣ８（受託番号：ＤＳＭ ＡＣＣ２２４１にて寄託してある）を用いて単離したＤＣを、抗ＣＤ１４モノクローナル抗体を用いて単離した単球由来ＤＣと、エンドサイトーシス能および抗原提示細胞に特徴的な表面マーカーの発現に関して比較した。
【０１６８】
Ｍ−ＤＣ８陽性細胞を、バフィーコート（５〜８×１０８ＰＢＭＣ）当たりハイブリドーマ細胞株Ｍ−ＤＣ８（ＤＳＭ ＡＣＣ２２４１）からの３０μｌの上澄み液を用いてヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離した。すべての実験において、同じ健康なドナーから得たサンプルを用いた。ラット抗マウスＩｇＭをコーティングしたマグネチックビーズ（ともにMiltenyi l.ベルギッシュ・グラードバッハ、ドイツ）[Werden die "beads" mit diesen IgM beladen order werden sie so gekauft? Wurde ein sog. "sandwich bead" hergestellt?]により細胞を回収した。
【０１６９】
新たに単離したＭ−ＤＣ８陽性細胞を、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸、１％ピルビン酸、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン（すべてGibco）、５０μＭ ２−メルカプトエタノール（Merck）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；HyClone Laboratories）、５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（Leucomax; Novartis）および１０００Ｕ／ｍｌのヒト組換えＩＬ−４（Basel Institute for Immunology）を補充したＲＰＭＩ培地中で３×１０５／ｍｌにて７日間培養した。従来のＤＣは、マグネチックマイクロビーズに結合させた抗ＣＤ１４抗体（Miltenyi l.ベルギッシュ・グラードバッハ、ドイツ）を用い、本質的に記載に従って（Sallusto, J.Exp.Med.179(1994),1109-1118）ヒト末梢血単核細胞から単離した。ＣＤ１４＋細胞（〜９９％純度）をＭ−ＤＣ８陽性細胞について上記で記載したのと同様にして培養した。Salmonella abortus equi（Sigma）からの１μｇ／ｍｌのリポ多糖（ＬＰＳ）を４０時間かけて添加することによりＤＣ成熟を誘発させた。
【０１７０】
ＤＣは抗原捕捉のために２つの特別の機構：マンノースレセプター系およびマクロピノサイトーシスを有する（Sallustoら、J.Exp.Med.182(1995),389-400）。これら系は、ＤＣがＭＨＣクラスII区画中に巨大分子を取り込み、濃縮することを可能にする。マクロファージとは対照的に、ＤＣは非常に高くかつ構成的な（constitutive）レベルのマクロピノサイトーシスを示す。他のすべての細胞型では表面分子は選択的な分子フィルターとして機能する被覆壁孔（pits）を介して嵌入されるが、ＤＣではすべての表面分子は主としてマクロピノサイトーシス（非選択的なプロセスである）を介して嵌入される。
【０１７１】
培養したＭ−ＤＣ８＋細胞と従来のＤＣとのエンドサイトーシス能を、２つの古典的なマーカー：ルシフェールイエローＣＨ（ＬＹ；カリウム塩；Molecular Probes Inc.、オイゲネ、ＯＲ）およびリジン固定（fixable）ＦＩＴＣ−デキストラン（ＦＩＴＣ−ＤＸ；Molecular Probes Inc.）を用いて調べた。両マーカーは、ＦＡＣＳ分析により単一細胞レベルでの取り込みの定量を可能にする。細胞を２５ｍＭ ＨＥＰＥＳで３７℃にて緩衝した１０％ＦＣＳ培地中に再浮遊させた。ＦＩＴＣ−ＤＸまたはＬＹを最終濃度１ｍｇ／ｍｌにて３０分間かけて添加した。細胞を１％ＦＣＳおよび０.０１％ＮａＮ３を含有する冷ＰＢＳで４回洗浄し、死んだ細胞を排除するためにプロピジウムヨーダイド（propidium iodide）を用いてＦＡＣＳｃａｎ（Becton Dickinson）で分析した。バックグラウンド（０℃でパルスした細胞）を差し引いた。Ｍ−ＤＣ８＋細胞は従来のＤＣに比べて流動相の取り込み活性が２倍であったが（図１１、左のパネル）、マンノースレセプターを介したＦＩＴＣ−ＤＸの取り込みは匹敵するレベルであった（図１１、右のパネル）。
【０１７２】
Ｍ−ＤＣ８陽性細胞および従来のＤＣ上での抗原提示細胞に特徴的な細胞表面マーカーの発現をＦＡＣＳにより分析した。マウスモノクローナル抗体を用い、ついでＦＩＴＣ−またはＰＥ−コンジュゲートしアフィニティー精製したイソ型特異的ヤギ抗マウス抗体（Southern Biotechnology Associates、バーミンガム、ＡＬ）を添加して、細胞表面染色を行った。以下のモノクローナル抗体を用いた：Ｗ６／３２（ＩｇＧ２ａ、抗ＨＬＡクラスI；Basel Inst. of Immunologyより入手）；ＨＢ５５（ＩｇＧ２ａ、抗ＨＬＡクラスII；Basel Inst. of Immunologyより入手）；ＩＴ２.２（ＩｇＧ２ｂ、抗Ｂ７.２；Pharmingenより入手）およびＭ−ＤＣ８ ＩｇＭモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株からの上澄み液。
【０１７３】
図１２に示すように、新たに単離したＭ−ＤＣ８陽性細胞は、新たに単離した従来のＣＤ１４陽性ＤＣ先駆細胞に匹敵するレベルのＨＬＡクラスIおよびクラスIIおよびコスティミュラトリー分子Ｂ７.２の発現を示した。唯一の違いは、従来のＤＣ先駆細胞からはＭ−ＤＣ８抗原が存在しないことであった。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で７日間培養した後、Ｍ−ＤＣ８陽性細胞は有意に上昇したレベルのＨＬＡクラスIおよびクラスII分子並びにＢ７.２の表面発現を示した（図１３、Ａ、上側のパネル）。従来のＤＣもまたこれら４つの分子の発現の増大を示したが、Ｍ−ＤＣ８陽性細胞で観察されたレベルには達しなかった（図１３、Ａ、下側のパネル）。
【０１７４】
ＬＰＳで４０時間刺激すると、ＨＬＡクラスIおよびII発現のさらなる増大がＭ−ＤＣ８陽性細胞および従来のＤＣの両者で認められた（図１３、Ｂ）。再び、ＤＣ８陽性細胞はより高いレベルのＨＬＡ発現に達した。最も劇的であったのは、ＬＰＳに応答したＢ７.２表面発現の増大であった。以上をまとめると、これらのデータは、Ｍ−ＤＣ８陽性ＤＣが従来の単球由来ＤＣに匹敵するマンノースレセプターを介したエンドサイトーシス能および従来のＤＣよりも優れたミクロピノサイトーシス能を有することを示している。同様に、Ｍ−ＤＣ８陽性ＤＣは、非刺激およびＬＰＳ誘発の両条件下で従来のＤＣを上回る抗原提示分子およびＴ細胞コスティミュラトリー分子の表面発現レベルを有する。これらデータは、モノクローナル抗体ｍＤＣ８が、ヒト血液から免疫応答の誘発のための抗原の取り込みおよび提示の非常に高い能力を有する細胞集団を単離することができることを示している。
【０１７５】
実施例１０：Ｍ−ＤＣ８抗原を発現するJurkat Ｔ細胞リンパ腫サブクローンの確立
Jurkatは、もともとヒトＴ細胞リンパ腫に由来する細胞株である。図１４に示すように、これら細胞は通常、Ｍ−ＤＣ８によって認識される抗原を発現しない（上側のパネル、左上の四分円）。しかしながら、極めて少数の細胞（＜１％）がＭ−ＤＣ８と反応するのが認められた（左上側の四分円中の２つのＭ−ＤＣ８陽性細胞を参照）。これら細胞をＭ−ＤＣ８モノクローナル抗体を用いた複数回のセルソーティングおよび引き続く増殖により単離した。最終的に、Ｍ−ＤＣ８抗原を高レベルで安定に発現するJurkatＴリンパ腫細胞のサブクローンを確立することができた（図１４、左下側のパネル）。同様に、Ｍ−ＤＣ８陽性細胞を除去することにより、Ｍ−ＤＣ８発現細胞を本質的に欠如しているJurkatサブクローンが確立された（図１４、右下側のパネル）。これら２つのJurkatサブクローンを用い、Ｍ−ＤＣ８抗原並びに該Ｍ−ＤＣ８抗原を認識する他のモノクローナル抗体を特徴付けた（以下の実施例１２を参照）。
【０１７６】
実施例１１：モノクローナル抗体Ｍ−ＤＣ８によって認識される抗原の特徴
Ｍ−ＤＣ８モノクローナル抗体によって認識される抗原は、膜タンパク質のポリペプチド構造かまたは炭水化物残基のいずれかである。炭水化物構造は、膜タンパク質の細胞外ドメインかまたは脂質二重層に組み込まれた成分である糖脂質のいずれか、またはその両者に結合していることが考えられる。この問題を調べるため、Ｍ−ＤＣ８ ＩｇＭの結合について脂質を分析した。これら脂質を細胞膜（Ｍ−ＤＣ８陰性かまたはＭ−ＤＣ８陽性のいずれかである上記Jurkatサブクローンから単離した）から抽出した。
【０１７７】
Jurkat細胞（３〜５×１０９）を遠心分離により回収し、ＰＢＳ中で３回洗浄し、１５ｍｌの１：２クロロホルム／メタノール中で５分間超音波処理した。２０００×ｇで１０分間遠心分離した後、上澄み液を回収し、細胞ペレットを１５ｍｌのクロロホルム／メタノールで２回再抽出した。プールした抽出物を真空乾燥させ、５０ｍｌのＫＣｌ ０.８８％中に再懸濁した。懸濁液を２.８×１０ｃｍ Ｃ１８カラム（Bakerbond）に負荷した。５０ｍｌのＫＣｌ溶液で洗浄し、２００ｍｌの蒸留水で脱塩（de-sulfing）した後、脂質を２５０ｍｌのエタノールで溶出した。真空乾燥した溶出液を５ｍｌのクロロホルム／メタノール中に溶解した。１ｍｌの水を加え、攪拌した後、下層を１ｍｌの水で再抽出し、コンバインした上層（膜脂質を含有する）を真空下で還元し（reduced）凍結乾燥した。
【０１７８】
脂質抽出物の１％アリコートを２.５×１０ｃｍ ＨＰＬＣプレート（Merck Si 60）上に負荷し、溶媒としてクロロホルム／メタノール／水（１２０：７０：１７（容量））を０.０２％塩化カルシウムとともに用いて３５分間展開した。ウエスタンブロッティングと同様にして、記載に従い（Bethkeら、J.Immunol.Methods 89:111-116,1986）クロマトグラムをＭ−ＤＣ８抗体と反応させた。結合したＭ−ＤＣ８ ＩｇＭをアルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＭ（μ鎖）（Caltag）により検出した。Ｍ−ＤＣ８は、Ｍ−ＤＣ８陽性のJurkatサブクローンでのみ得られた２つの区別される脂質バンドと反応した（図１５、第一のレーン）。これら２つのバンドは、Ｍ−ＤＣ８陰性のJurkatＴリンパ腫細胞から抽出された脂質を含んでいなかった。これら細胞では非常にマイナーな別個に移動するバンドのみが検出された（図１５、第二のレーン）。脂質の脂肪酸残基は通常、免疫原性を呈しないので、これら２つの脂質種とのＭ−ＤＣ８の免疫反応性はその炭水化物残基によるものと思われた。
【０１７９】
Ｍ−ＤＣ８ ＩｇＭによって認識される炭水化物残基がポリペプチド上にも存在するか否かを調べるため、組み込まれた膜タンパク質を記載に従って（Pasqualら、Electroporesis 18:2573-2581,1997）Ｍ−ＤＣ８陽性およびＭ−ＤＣ８陰性のJurkat細胞から調製した。調製した膜タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ついでモノクローナル抗体Ｍ−ＤＣ８を用いてウエスタンブロッティングを行った。結合したＩｇＭの検出はＡＰ−コンジュゲートヤギ抗マウス抗μ抗体（Biosource）により行った。Ｍ−ＤＣ８はウエスタンブロッティングにおいて幾つかのポリペプチドのバンドを認識した（図１６、レーン１）。このことは、Ｍ−ＤＣ８抗原がＭ−ＤＣ８陽性のJurkat細胞の種々の組み込まれた膜タンパク質上にも存在し得ることを示している。そのようなシグナルは、Ｍ−ＤＣ８陰性のJurkat Ｔ細胞では得られなかった（図１６、レーン２）。
【０１８０】
Ｍ−ＤＣ８と免疫反応性であったバンドの一つは、抗Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド１（ＰＳＧＬ−１）抗体（Pharmingen）を用い、ウエスタンブロッティングによりＰＳＧＬ−１として同定された。ＰＳＧＬ−１は多くのリンパ球細胞型で認められるポリペプチドであり（Yangら、Thromb.Haemost.81:1-7,1999）、Ｍ−ＤＣ８陽性およびＭ−ＤＣ８陰性のJurkat細胞上に同様の量で存在していた（図１６、レーン３およびレーン４）。Ｍ−ＤＣ８陽性ＰＳＧＬ−１と同一のシグナルは、ヒトＰＢＭＣからＭ−ＤＣ８により単離した樹状細胞からの膜タンパク質をウエスタンブロッティングにより分析したときに得られた（図１６、レーン５）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでのＰＳＧＬ−１バンドのぼやけた形状は、その知られた高炭水化物含量のためである。
【０１８１】
以上をまとめると、これらデータは、Ｍ−ＤＣ８抗原がＭ−ＤＣ８陽性JurkatサブクローンおよびヒトＭ−ＤＣ８陽性樹状細胞の糖脂質および組み込まれた膜タンパク質上に存在する炭水化物構造であることを示している。樹状細胞およびＭ−ＤＣ８陽性Jurkat細胞上のＭ−ＤＣ８炭水化物抗原に対する一つの主要な担体タンパク質はＰＳＧＬ−１として同定された。
【０１８２】
実施例１２：新規な樹状細胞特異的モノクローナル抗体の生成
Ｄ−ＤＣ８.１およびＤ−ＤＣ８.２と称する新規なモノクローナル抗体を、Ｍ−ＤＣ８陽性JurkatＴリンパ腫サブクローンからの膜調製物か（Ｄ−ＤＣ８.１について）または完全なＭ−ＤＣ８陽性Jurkat細胞を用いて（Ｄ−ＤＣ８.２について）Balb/c × Ｃ５７Ｂ１ Ｆ１マウスを免疫することにより生成した。細胞質膜の調製を、標準法を用い（Pasqualら、Electrophoresis 18:2573-2581,1997）、細胞の低浸透圧溶解、ついで細胞の機械的破砕、連続的な遠心分離および膜の洗浄および炭酸ナトリウムで処理することによる周縁膜タンパク質の除去により行った。マウスに１５０μｇの等価量の膜タンパク質（Ｄ−ＤＣ８.１について）または１〜２×１０７細胞（Ｄ−ＤＣ８.２について）を３〜４週間の間隔で５回の腹腔内注射により注入した。最後の注射の３日後に脾臓細胞を調製し、Ｍ−ＤＣ８について記載したようにＸ６３Ａｇ８.６５３と融合させた。得られた抗体はともにＩｇＭクラスのものであった。
【０１８３】
これら２つのモノクローナル抗体Ｄ−ＤＣ８.１およびＤ−ＤＣ８.２がＭ−ＤＣ８と同じ樹状細胞の集団を認識するか否かを調べるため、ヒトＰＢＭＣの二重免疫蛍光染色の後にヒトＰＢＭＣをＦＡＣＳにより分析した。示したすべての実験には同じ健康なドナーを用いた。図１７に関し、ヒトＰＢＭＣを、細胞表面マーカーＣＤ１４（左のパネル）、ＨＬＡ−ＤＲ（中央のパネル）またはＣＤ１６（右のパネル）（すべてPharmingenから得た）を認識する抗体とともにモノクローナル抗体Ｍ−ＤＣ８（上の列）、Ｄ−ＤＣ８.１（中央の列）またはＤ−ＤＣ８.２（下の列）で二重染色した。ＩｇＭモノクローナル抗体の検出は、ヤギ抗マウスフィコエリトリン（ＰＥ）標識抗μ二次抗体（Immunotech）により行った。
【０１８４】
図１７においてＦＡＣＳスキャンの右上の四分円に認められるように、Ｄ−ＤＣ８.１およびＤ−ＤＣ８.２はともにモノクローナル抗体Ｍ−ＤＣ８によって認識されたのと極めて類似の量のＰＢＭＣを認識した。これら細胞は、ＨＬＡ−ＤＲ（図１７、中央のパネル）およびＣＤ１６（右のパネル）の発現は高いが、ＣＤ１４（左のパネル）の発現は低いという点で共通であった。このことは、Ｄ−ＤＣ８.１およびＤ−ＤＣ８.２がともに頻度並びにＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１６およびＣＤ１４の細胞表面発現に関して、Ｍ−ＤＣ８によって認識されるものと極めて類似の特徴を有するＰＢＭＣの別個のサブセットを認識したことを示している。３つの抗体はすべて、本明細書においてＭ−ＤＣ８樹状細胞として言及するＤＣのクラスを認識すると思われる。
【０１８５】
モノクローナル抗体Ｄ−ＤＣ８.１およびＤ−ＤＣ８.２がともにＭ−ＤＣ８抗原を認識することを実証するため、これら抗体をＭ−ＤＣ８陰性およびＭ−ＤＣ８陽性Jurkatサブクローンへの結合について試験した。両抗体はＭ−ＤＣ８陰性のJurkat細胞には有意に結合しなかったが（図１８、左のパネル、左上の四分円）、Ｍ−ＤＣ８陽性のJurkat細胞にはともに強く反応した（右のパネル）。
【０１８６】
要約すると、これら結果は、Ｍ−ＤＣ８抗原（新規なクラスの樹状細胞に特徴的である）は少なくとも２つの他のモノクローナル抗体Ｄ−ＤＣ８.１およびＤ−ＤＣ８.２によって認識され得ることを示している。
【０１８７】
参照文献
【表２】
2007125012.tif 000003
【０１８８】
【表３】
2007125012.tif 000004
【０１８９】
【表４】
2007125012.tif 000005
【０１９０】
【表５】
2007125012.tif 000006
【０１９１】
【表６】
2007125012.tif 000007
【０１９２】
【表７】
2007125012.tif 000008
【０１９３】
【表８】
2007125012.tif 000009
【０１９４】
【表９】
2007125012.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【０１９５】
【図１】Ｍ−ＤＣ８＋細胞の頻度、サイズおよび顆粒度。赤血球の溶解およびモノクローナル抗体Ｍ−ＤＣ８とそれに続くフィコエリトリンコンジュゲート抗Ｉｇ抗体による染色後のヒト末梢血血球のフローサイトメトリー分析（Ａ）。各四分円中の数字は細胞のパーセントを示す。ゲートを開いた（gated）Ｍ−ＤＣ８＋細胞の散乱プロフィルを（Ｂ）に示す。比較のため、（Ｃ）はゲートを開いていない（ungated）白血球の散乱プロフィルを示す。
【０１９６】
【図２】Ｍ−ＤＣ８＋細胞上の細胞系列特異的なおよびＤＣに関連する表面マーカーの発現およびＭ−ＤＣ８＋細胞のイムノマグネチック単離の効率の分析。Ｍ−ＤＣ８＋細胞の二重免疫蛍光染色を、ＰＢＭＣ（Ａ、ＥおよびＧ）、Ｔ細胞涸渇ＰＢＭＣ（Ｂ−Ｄ）、Ｔ細胞およびＢ細胞涸渇ＰＢＭＣ（Ｆ）または精製Ｍ−ＤＣ８＋細胞（Ｈ）上で行った。細胞内ｐ５５抗原の検出のため（Ｅ）、未分離のＰＢＭＣをＭ−ＤＣ８抗原に対して染色し、パラホルムアルデヒドで固定し、サポニンで透過性にし、ついでｐ５５特異的モノクローナル抗体で標識した。ＣＤ８３抗原はＴ細胞およびＢ細胞涸渇ＰＢＭＣ上で示され、Ｍ−ＤＣ８モノクローナル抗体およびＣＤ８３モノクローナル抗体で同時に染色しながら４８時間培養した（Ｆ）。マグネチックセルソーティングによるＰＢＭＣからのＭ−ＤＣ８＋細胞の単離前後のＭ−ＤＣ８＋細胞およびＨＬＡ−ＤＲ＋細胞の頻度を（Ｇ）および（Ｈ）に示す。結果は２０人（Ａ−Ｄ、ＧおよびＨ）および５人（ＥおよびＦ）の異なるドナーを表すものである。各四分円中の数字は細胞のパーセントを示す。
【０１９７】
【図３】Ｍ−ＤＣ８＋細胞の形態および食作用活性。上側のパネルでは、単離直後（Ａ）およびインビトロで４８時間培養後（Ｂ）の精製Ｍ−ＤＣ８＋細胞のサイトスピンを示す。下側のパネルはラテックスビーズを食作用した後（Ｃ）または抗体コーティングＳＲＢＣを食作用した後（Ｄ）のＭ−ＤＣ８＋細胞を示す。光学顕微鏡のため、細胞をMay-Gruenwald/Giemsa染色した（Ａ、ＢおよびＤ、倍率×１００）。（Ｃ）では細胞をゼラチンに包埋した後、共焦レーザースキャニング顕微鏡に供した。
【０１９８】
【図４】Ｍ−ＤＣ８＋細胞によるＴ細胞の刺激。精製Ｔ細胞（１×１０５）を外来可溶性抗原の存在下（Ｃ、Ｄ）または不在下（Ａ、Ｂ）で段階的な数のＭ−ＤＣ８＋細胞（黒丸）かまたはＣＤ１４＋単球（白丸）とともに培養した。（Ａ）、同種ＡＰＣ；（Ｂ）、自己由来ＡＰＣ；（Ｃ）、ＴＴ（５μｇ／ｍｌ）の存在下での自己由来ＡＰＣ；（Ｄ）ＫＨＬ（１μｇ／ｍｌ）の存在下での自己由来ＡＰＣ。５日後（Ａ、Ｃ）または７日後（Ｂ、Ｄ）にＴ細胞の増殖を３Ｈ−チミジン取り込みにより決定した。（Ｃ）および（Ｄ）において可溶性抗原の不在下でのＴ細胞増殖の値を全ｃｐｍから差し引いた。図示した値は３つのサンプルの平均値を表す。ＳＥＭは＜１５％であった。（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）に示す結果は６つの独立した実験を表し、（Ｄ）は３つの異なる実験を表す。
【０１９９】
【図５】ペプチドを積載したＭ−ＤＣ８＋細胞およびＣＤ１４＋単球によるＣＴＬクローンの刺激。Ｍ−ＤＣ８＋細胞およびＣＤ１４＋単球をチロシナーゼ由来ペプチド（１００μｇ／ｍｌ）で一夜パルスし、ついでチロシナーゼ特異的なクローニングＣＴＬとともにさらに４０時間培養した。Ｔ細胞の活性化を、３つの培養の上澄み液に分泌されたＴＮＦ−αを決定することによりアッセイした。縦列は３つの個々の値の平均であり、足し算で表してある。
【０２００】
【図６】アロ抗原特異的細胞障害性Ｔエフェクター細胞の誘発。未分離のＴリンパ球（Ａ）および精製ＣＤ８＋Ｔリンパ球（Ｂ）を同種Ｍ−ＤＣ８＋細胞（黒丸）またはＣＤ１４＋単球（白丸）とともに７日間培養した。Ｔリンパ球を４時間クロム放出試験において５１Ｃｒ標識スティミュレータータイプＰＨＡ芽球細胞に対して試験した。
【０２０１】
【図７】チロシナーゼ由来ペプチドに特異的な細胞障害性エフェクター細胞の誘発。健康なドナーおよび黒色腫患者からのＰＢＭＣを、精製自己由来Ｍ−ＤＣ８＋細胞により提示されるチロシナーゼ由来ノナマー（９量体）ペプチドに対して４回の連続的な刺激により活性化した。（Ａ）エフェクター／標的細胞比 ４０：１でのペプチドを積載した５１Ｃｒ標識Ｔ２細胞の特異的溶解。（Ｂ）チロシナーゼを欠くまたは発現する黒色腫細胞と接触した後にエフェクター細胞により放出されるＴＮＦ−α（Ｅ／Ｔ比 １：２）。棒は３つの決定の平均値を示し、ＳＥＭは＜１５％であった。
【０２０２】
【図８】表面マーカー発現に基づいて特徴付けた種々のヒト血液ＤＣサブセットの概要。
【０２０３】
【図９】モノクローナル抗体ＤＣ８の可変領域の重鎖（ＶＨ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）およびそれから導かれる１文字コードでのアミノ酸配列（配列番号２）。番号は、示したトリプレットの３'末端のヌクレオチド配列位置を指している。配列の５'末端および３'末端を示してある。
【０２０４】
【図１０】モノクローナル抗体ＤＣ８の可変領域の軽鎖（ＶＬ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３）およびそれから導かれる１文字コードでのアミノ酸配列（配列番号４）。番号は、示したトリプレットの３'末端のヌクレオチド配列位置を指している。配列の５'末端および３'末端を示してある。
【０２０５】
【図１１】ｍＤＣ８陽性細胞（黒い棒）と従来のＤＣ（斜線を付した棒）とのエンドサイトーシス能の比較。マイクロピノサイトーシスを、ルシフェールイエローを用いたＦＡＣＳ（ＬＹ取り込み；左のパネル）およびＦＩＴＣコンジュゲートデキストランによるマンノースレセプターにより媒体された取り込み（ＦＩＴＣ−ＤＸ；右のパネル）により測定した。ＦＡＣＳ分析からの結果を定量化し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表した。
【０２０６】
【図１２】新たに単離したｍＤＣ８陽性細胞（上側のパネル）と従来のＤＣの前駆細胞（ＣＤ１４由来；下側のパネル）の間の細胞表面分子発現能の比較。ＦＡＣＳ分析からのヒストグラムプロットを示す。第一のヒストグラムは二次抗体単独で得られた。ｙ軸は細胞数を示す；ｘ軸は蛍光強度を示し、細胞表面発現レベルの測定値である。表面抗原の名称の下の数字は、計算した平均蛍光強度を与えている。
【０２０７】
【図１３】培養したｍＤＣ８陽性細胞（上側のパネル）と従来のＤＣの前駆細胞（ＣＤ１４由来；下側のパネル）の間の細胞表面分子発現能の比較。Ａ．ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４のみの存在下で７日間培養した細胞；Ｂ．第５日目のＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４培養を１μｇ／ｍｌのＬＰＳで４０時間刺激した細胞。ＦＡＣＳ分析からのヒストグラムプロットを示す。第一のヒストグラムは二次抗体単独で得られた。ｙ軸は細胞数を示す；ｘ軸は蛍光強度を示し、細胞表面発現レベルの測定値である。表面抗原の名称の下の数字は、計算した平均蛍光強度を与えている。
【０２０８】
【図１４】モノクローナル抗体Ｍ−ＤＣ８によって認識される抗原を発現するまたは発現しないJurkat Ｔリンパ種細胞サブクローンの確立。Jurkat Ｔ細胞をＭ−ＤＣ８ ＩｇＭでの染色およびＰＥコンジュゲート抗ＩｇＭ抗体での検出後のＦＡＣＳにより分析した（ｙ軸）。通常のJurkat Ｔ細胞（上側のパネル）は極めてわずかしかＭ−ＤＣ８陽性細胞を有しない（左上側の四分円）。これら細胞を単離し、多くの回数の選択を行って増殖させ、Ｍ−ＤＣ８を高度に発現するサブクローンとした（左下側のパネル）。実質的にＭ−ＤＣ８陽性細胞を示さないJurkat細胞のサブクローン（右下側のパネル）を、Ｍ−ＤＣ８抗体で修飾したマグネチックビーズを用いてＭ−ＤＣ８陽性細胞を涸渇させることにより単離した。
【０２０９】
【図１５】Ｍ−ＤＣ８抗原を発現するJurkatから抽出した糖脂質へのモノクローナル抗体Ｍ−ＤＣ８の結合。脂質は、Ｍ−ＤＣ８抗原を高度に発現するか（レーン１）または該抗原を発現しない（レーン２）Jurkatサブクローンから抽出した。脂質を薄層クロマトグラフィーにより分離し、クロマトグラムをＭ−ＤＣ８ＩｇＭでプローブし、二次抗ＩｇＭ抗体により検出した。脂質によるウエスタンブロッティングを示す。Ｍ−ＤＣ８ ＩｇＭと免疫応答反応する２つの脂質の位置を矢印により示す。白丸はＭ−ＤＣ８陰性細胞からのマイナーなバンドを記録したものである。
【０２１０】
【図１６】モノクローナル抗体Ｍ−ＤＣ８と免疫反応する膜タンパク質の特徴付け。組み込まれた（integral）膜タンパク質を、Ｍ−ＤＣ８陽性Jurkat細胞（レーン１および３）、Ｍ−ＤＣ８陰性Jurkat細胞（レーン２および４）およびヒトＰＢＭＣから単離したＭ−ＤＣ８陽性樹状細胞（レーン５）から調製した。ウエスタンブロッティングを示す。レーン１、２および５についてはフィルターをＭ−ＤＣ８ ＩｇＭでプローブし、二次抗ＩｇＭ抗体により検出した。レーン３および４については糖タンパク質ＰＳＧＬ−１を認識する抗体を使用した。ＰＳＧＬ−１の位置（右）および３つのＭ−ＤＣ８陽性タンパク質の位置（左）を矢印で示す。２００および１１６ｋＤａの２つの分子量標準の位置を右側に示す。
【０２１１】
【図１７】モノクローナル抗体Ｄ−ＤＣ８.１およびＤ−ＤＣ８.２により認識されるＰＢＭＣの特徴付け。同じドナーからのヒトＰＢＭＣを、ＣＤ１４、ＨＬＡ−ＤＲまたはＣＤ１６に対する抗体および所定の３つのモノクローナル抗体で二重標識し、ＦＡＣＳにより分析した。二重に陽性の細胞は右上の四分円に認められる。
【０２１２】
【図１８Ａ】Ｍ−ＤＣ８抗原を発現するJurkatサブクローンへのモノクローナル抗体Ｄ−ＤＣ８.１およびＤ−ＤＣ８.２の結合。Ｍ−ＤＣ８抗原を発現するJurkatサブクローン（Ｍ−ＤＣ８＋）およびＭ−ＤＣ８抗原を発現しないJurkatサブクローン（Ｍ−ＤＣ８−）をＤ−ＤＣ８.１およびＤ−ＤＣ８.２への結合について試験した。ＦＡＣＳ分析を示す。モノクローナル抗体ＩｇＭをＰＥコンジュゲート抗ＩｇＭ抗体により検出した（Ｙ軸）。該モノクローナル抗体に結合する細胞を左上の四分円に示す。
【０２１３】
【図１８Ｂ】Ｍ−ＤＣ８抗原を発現するJurkatサブクローンへのモノクローナル抗体Ｄ−ＤＣ８.１およびＤ−ＤＣ８.２の結合。Ｍ−ＤＣ８抗原を発現するJurkatサブクローン（Ｍ−ＤＣ８＋）およびＭ−ＤＣ８抗原を発現しないJurkatサブクローン（Ｍ−ＤＣ８−）をＤ−ＤＣ８.１およびＤ−ＤＣ８.２への結合について試験した。ＦＡＣＳ分析を示す。モノクローナル抗体ＩｇＭをＰＥコンジュゲート抗ＩｇＭ抗体により検出した（Ｙ軸）。該モノクローナル抗体に結合する細胞を左上の四分円に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【配列表】
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