(57)【要約】【課題】  標的配列検出用のプローブで類似配列も検出されることが予想される試料から標的配列を検出し、正確に判定する方法を提供すること。【解決手段】  標的配列とその類似配列を区別するために、互いにクロスハイブリダイゼーションを起す標的配列増幅用のプライマーと、類似配列増幅用のプライマーとを用いて核酸試料の増幅を行い、得られた増幅産物でのこれらのプライマーの使用率から標的配列の試料中での有無を類似配列と区別して判定する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の類似配列中から選択した１つの配列を標的配列とし、該標的配列を他の類似配列と判別して検出する方法であって、
（１）前記標的配列の相補鎖とハイブリッドを形成可能であり、前記類似配列にクロスハイブリダイズし、かつ定量可能な第１の標識を有する第１のプライマーを用意する工程と、
（２）前記類似配列の少なくとも１つを対照配列として選択し、該対照配列の相補鎖とハイブリットを形成可能であり、前記標的配列にクロスハイブリダイズし、かつ前記第１の標識と区別して定量可能な第２の標識を有する少なくとも１つの第２のプライマーを用意する工程と、
（３）前記標的配列に対して前記第１のプライマー及び前記第２のプライマーを共に用いてＰＣＲによる増幅反応を行い、増幅産物を得た後、該増幅産物を、前記標的配列を含む伸長物を検出し得るプローブと反応させて、該プローブとハイブリダイズした増幅産物の有する標識の量を定量し、該増幅産物における前記第１の標識量と前記第２の標識の使用率を算出する工程と、
（４）前記対照配列に対して前記第１及び第２のプライマーを共に用いてＰＣＲによる増幅反応を行い、増幅産物を得た後、該増幅産物を、前記プローブと反応させて、該プローブとハイブリダイズした増幅産物の有する標識の量を定量し、該増幅産物における前記第１の標識量と前記第２の標識の使用率を算出する工程と、
（５）前記工程（３）及び（４）で得られた標識使用率を対比して、前記標的配列を前記対照配列と区別して検出する工程と、
を有することを特徴とする核酸配列の検出方法。
【請求項２】
複数の類似配列中から選択した１つの配列を標的配列とし、該標的配列を他の類似配列と判別して検出する方法であって、
（１）前記標的配列の相補鎖とハイブリッドを形成可能であり、前記類似配列にクロスハイブリダイズし、かつ定量可能な第１の標識を有する第１のプライマーを用意する工程と、
（２）前記類似配列の少なくとも１つを対照配列として選択し、該対照配列の相補鎖とハイブリットを形成可能であり、前記標的配列にクロスハイブリダイズし、かつ前記第１の標識と区別して定量可能な第２の標識を有する少なくとも１つの第２のプライマーを用意する工程と、
（３）前記対照配列に対して前記第１のプライマー及び前記第２のプライマーを共に用いてＰＣＲによる増幅反応を行い、増幅産物を得た後、該増幅産物を、前記対照配列を含む伸長物を検出し得るプローブと反応させて、該プローブとハイブリダイズした増幅産物の有する標識の量を定量し、該増幅産物における前記第１の標識量と前記第２の標識の使用率を算出する工程と、
（４）前記標的配列に対して前記第１及び第２のプライマーを共に用いてＰＣＲによる増幅反応を行い、増幅産物を得た後、該増幅産物を、前記プローブと反応させて、該プローブとハイブリダイズした増幅産物の有する標識の量を定量し、該増幅産物における前記第１の標識量と前記第２の標識の使用率を算出する工程と、
（５）前記工程（３）及び（４）で得られた標識使用率を対比して、前記標的配列を前記対照配列と区別して検出する工程と、
を有することを特徴とする核酸配列の検出方法。
【請求項３】
前記対照配列となり得る類似配列が２種以上ある場合には、これらの２種以上の類似配列のそれぞれを前記対照配列として選択し、前記（１）〜（５）の工程を行う請求項１または２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記定量可能な標識が蛍光物質である請求項１〜３のいずれかに記載の検出方法。
【請求項５】
前記類似配列のそれぞれが微生物に特徴的である請求項１〜３のいずれかに記載の検出方法。
【請求項６】
前記類似配列が、微生物の16S rRNAをコードする遺伝子配列の特徴的部分である請求項１〜５のいずれかに記載の検出方法。
【請求項７】
前記プローブとして２種以上のプローブを用い、各プローブが担体上の個別に区分された領域に固定化されている請求項１〜６のいずれかに記載の検出方法。
【請求項８】
前記担体上に前記２種以上のプローブが固定化されているＤＮＡマイクロアレイを用いる請求項７に記載の検出方法。
【請求項９】
前記（５）の工程が、事前に収集された参照データとの比較による判別である請求項１〜８のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１０】
前記標的配列及び前記対照配列の各々は、検体からの核酸調製物に対して目的とする配列を含む核酸断片をＰＣＲで増幅して得られた増幅産物として前記第１及び第２のプライマーを用いたＰＣＲに用いられる請求項１〜９のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１１】
標的配列を、該標的配列に対する類似配列と判別して検出するためのキットであって、
前記標的配列の相補鎖とハイブリッドを形成可能であり、前記類似配列にクロスハイブリダイズし、かつ定量可能な第１の標識を有する第１のプライマーと、
前記類似配列の相補鎖とハイブリットを形成可能であり、前記標的配列にクロスハイブリダイズし、かつ前記第１の標識と区別して定量可能な第２の標識を有する第２のプライマーの少なくとも１つと、
前記第１及び第２のプライマーを用いて核酸試料の増幅を行うための試薬と、
前記増幅により得られる前記標的配列を含む伸長物を検出し得るプローブを担体上に固定したプローブ担体と、
を有することを特徴とする検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸検出法に関し、なかでも標的配列をその類似配列と判別して検出可能な配列の検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノム計画に代表されるような近年の分子生物学の著しい進歩により、各種の生物の遺伝子配列が調査され、生命活動のメカニズム、病気、体質等と遺伝子の関連が次々と解明されつつある。これによって遺伝子産物の有無やその存在量(発現量)を知ることで、例えば癌などの病気のより詳細な遺伝的解析やタイピング、あるいは効果的な治療方法の選択などが可能となることがわかってきた。
【０００３】
検体中に含まれる特定の遺伝子産物の有無やその存在量を調べる方法としては、これまで多くの方法が考案されている。その中でも応用範囲が広く検出対象によらず適用可能な方法として、検出対象とする遺伝子配列の特徴的な部分配列（標的配列）を選び、その部分配列の有無や量を調べる方法が広く用いられている。具体的には、標的配列の相補鎖に相当する配列を有する核酸(プローブ)を用意し、検体中に含まれる標的配列と上記プローブがハイブリッドを形成する条件で反応（ハイブリダイゼーション）させた後、このハイブリッドを何らかの手段で検出することにより、検体中の核酸の有無を調べる方法がある。
【０００４】
検体中に含まれる核酸配列を検出することは、各種の遺伝病の診断に留まらず、がん、感染症等の診断など広範な応用が期待されている。
【０００５】
ハイブリダイゼーションを利用した標的核酸の検出方法には、固相反応、液相反応を問わず行なうことが可能である。例えば、固相上でハイブリダイゼーションを行う方法としては、プローブを固相上に固定または吸着させておき、その固相上に何らかの検出可能な標識物質により標識した標的核酸を含む検体を添加し、固相上からのプローブと反応した標識物質の信号を測定することにより標的物質を検出する方法が代表的である。中でもプローブをガラスや金属などの平面基板上に固定したチップ（DNA マイクロアレイ、DNA チップ、遺伝子チップ）、あるいは微少粒子表面へ固定したビーズ等は代表的な固相ハイブリダイゼーション用の固相の形態である。
【０００６】
近年、急速に研究が進んだDNAマイクロアレイの基本形態は、ガラス基板などの固相表面に目的配列（標的配列）を有する核酸と相補的な配列をもつ核酸断片（プローブ）を固定化したものである。目的配列を有する核酸と相補的な配列を持つ核酸断片は、オリゴDNAと呼ばれる化学合成されたものやcDNAと呼ばれる生物組織由来の酵素的に生合成されたものなどが一般的に利用される。オリゴDNAに関しては、例えば、米国特許第5,474,796号明細書(特表平9-500568号公報、出願人：ProtoGene Laboratories)に記載されるような基板上で逐次合成されたものと、特開平11-187900号公報（出願人：キヤノン株式会社）に記載されるようなオリゴDNAを、別途合成後、基板上に固定化したものに大別される。
【０００７】
核酸断片の基板への固定化には、様々な方式、例えば、基板の持つ電荷と核酸の電荷を利用した吸着固定法、ポリ-L-リジン、アミノシランカップリング剤などを基板表面にコートして固定効率の向上させた固定法などが提案されている。
【０００８】
固相上でのハイブリダイゼーションが好まれる理由として以下のような理由を挙げることができる。
（１）B/F分離（反応物と未反応物の分離）が容易である。
（２）検出領域を物理的に微小化でき高感度化が期待できる。
（３）複数種のプローブのそれぞれを物理的に隔離することにより同時多項目の検出が可能である。
（４）その取り扱いや応用が容易に出来る。
【０００９】
ところで、上記のようなハイブリダイゼーションを利用した標的核酸の検出方法では、一般的に検体中に含まれる検出対象核酸を増幅すること、また適当な方法により蛍光物質等により標識することが必要である。検出対象核酸を増幅する方法として一般的に最も広く用いられている方法はPCR（Polymerase Chain Reaction）法である。この増幅操作の基本技術は、米国特許第4683195号明細書、第4683202号明細書、第4965188号明細書などに記載されている。例えば、ハイブリダイゼーションのために試料調製を行う場合には、標的配列を含むように増幅領域を設定し、増幅領域の両末端にプライマーを設計する。そして設計した両プライマーを用いてPCR反応を行い、所望の標的配列領域を含む二本鎖核酸を大量に複製する。これらの増幅産物を標識する方法の一例としては、あらかじめ標識物質で修飾されたプライマーを用いてPCR反応を行うことで、標識された核酸を得る方法が挙げられる。
【特許文献１】米国特許第5,474,796号明細書
【特許文献２】特表平9-500568号公報
【特許文献３】特開平11-187900号公報
【特許文献４】米国特許第4683195号明細書
【特許文献５】米国特許第4683202号明細書
【特許文献６】米国特許第4965188号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ハイブリダイゼーション反応を利用した標的配列を有する核酸の検出を行う場合、標的配列に対応するプローブのみがハイブリダイズすることが望ましい。しかしながら、標的配列に対する類似配列に対してもプローブがクロスハイブリダイゼーションを起す場合が少なくない。変異遺伝子配列の検出や感染症微生物の同定検査などの場合、標的配列に対して数塩基のみが置換しているような類似配列をそれぞれ判別して検出することが要求される。この場合、標的配列に類似の配列を検出するためのプローブもそれぞれに数塩基のみが置換した類似の配列となる。ところが、上記のような標的配列の検出用として設計したプローブがその類似配列（変異配列）にもハイブリダイズするクロスハイブリダイゼーションが生じることが少なくない。そうすると、標的配列の検出用として設計したプローブのみでは標的配列の正確な検出が不可能となる。
【００１１】
すなわち、DNAマイクロアレイ等を用いた固相ハイブリダイゼーションで検出を行う場合に、複数のプローブに対して同時に検査を行うことになり、数塩基が置換したような類似配列検査用プローブにも標的配列が反応するという現象が観察される場合がある。この現象は、一般にクロスハイブリダイゼーションと呼ばれ、実験条件等である程度の制御はできるが、結果判定を困難にさせる要因となる。
【００１２】
本発明は、上記の問題点を解決するためになされたものであり、その目的は、標的配列検出用のプローブで類似配列も検出されることが予想される試料から標的配列を検出し、正確に判定する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
類似配列を持つ２種類以上の核酸のどれかが検体中に存在し、それを検出・判定を行う場合において、類似の核酸配列それぞれに個別にハイブリダイズし、それぞれに異なる標識をしたプライマーを用いて核酸増幅もしくは標識反応（例えばＰＣＲ）を行い、そのプライマー伸長物とハイブリダイズしうるプローブを用いることで上記問題点が解決できることを見出した。
【００１４】
本発明の標的配列の検出方法の第１の態様は、複数の類似配列中から選択した１つの配列を標的配列とし、該標的配列を他の類似配列と判別して検出する方法であって、
（１）前記標的配列の相補鎖とハイブリッドを形成可能であり、前記類似配列にクロスハイブリダイズし、かつ定量可能な第１の標識を有する第１のプライマーを用意する工程と、
（２）前記類似配列の少なくとも１つを対照配列として選択し、該対照配列の相補鎖とハイブリットを形成可能であり、前記標的配列にクロスハイブリダイズし、かつ前記第１の標識と区別して定量可能な第２の標識を有する少なくとも１つの第２のプライマーを用意する工程と、
（３）前記標的配列に対して前記第１のプライマー及び前記第２のプライマーを共に用いてＰＣＲによる増幅反応を行い、増幅産物を得た後、該増幅産物を、前記標的配列を含む伸長物を検出し得るプローブと反応させて、該プローブとハイブリダイズした増幅産物の有する標識の量を定量し、該増幅産物における前記第１の標識量と前記第２の標識の使用率を算出する工程と、
（４）前記対照配列に対して前記第１及び第２のプライマーを共に用いてＰＣＲによる増幅反応を行い、増幅産物を得た後、該増幅産物を、前記プローブと反応させて、該プローブとハイブリダイズした増幅産物の有する標識の量を定量し、該増幅産物における前記第１の標識量と前記第２の標識の使用率を算出する工程と、
（５）前記工程（３）及び（４）で得られた標識使用率を対比して、前記標的配列を前記対照配列と区別して検出する工程と、
を有することを特徴とする核酸配列の検出方法である。
【００１５】
本発明にかかる標的配列の検出方法の第２の態様は、複数の類似配列中から選択した１つの配列を標的配列とし、該標的配列を他の類似配列と判別して検出する方法であって、
（１）前記標的配列の相補鎖とハイブリッドを形成可能であり、前記類似配列にクロスハイブリダイズし、かつ定量可能な第１の標識を有する第１のプライマーを用意する工程と、
（２）前記類似配列の少なくとも１つを対照配列として選択し、該対照配列の相補鎖とハイブリットを形成可能であり、前記標的配列にクロスハイブリダイズし、かつ前記第１の標識と区別して定量可能な第２の標識を有する少なくとも１つの第２のプライマーを用意する工程と、
（３）前記対照配列に対して前記第１のプライマー及び前記第２のプライマーを共に用いてＰＣＲによる増幅反応を行い、増幅産物を得た後、該増幅産物を、前記対照配列を含む伸長物を検出し得るプローブと反応させて、該プローブとハイブリダイズした増幅産物の有する標識の量を定量し、該増幅産物における前記第１の標識量と前記第２の標識の使用率を算出する工程と、
（４）前記標的配列に対して前記第１及び第２のプライマーを共に用いてＰＣＲによる増幅反応を行い、増幅産物を得た後、該増幅産物を、前記プローブと反応させて、該プローブとハイブリダイズした増幅産物の有する標識の量を定量し、該増幅産物における前記第１の標識量と前記第２の標識の使用率を算出する工程と、
（５）前記工程（３）及び（４）で得られた標識使用率を対比して、前記標的配列を前記対照配列と区別して検出する工程と、
を有することを特徴とする核酸配列の検出方法である。
【００１６】
また、本発明の標的物質検出用のキットは、標的配列を、該標的配列に対する類似配列と判別して検出するためのキットであって、
前記標的配列の相補鎖とハイブリッドを形成可能であり、前記類似配列にクロスハイブリダイズし、かつ定量可能な第１の標識を有する第１のプライマーと、
前記類似配列の相補鎖とハイブリットを形成可能であり、前記標的配列にクロスハイブリダイズし、かつ前記第１の標識と区別して定量可能な第２の標識を有する第２のプライマーの少なくとも１つと、
前記第１及び第２のプライマーを用いて核酸試料の増幅を行うための試薬と、
前記増幅により得られる前記標的配列を含む伸長物を検出し得るプローブを担体上に固定したプローブ担体と、
を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、標的配列に特異的なプローブによる試料中における標的配列の有無の検出の判定がその類似配列の存在によって難しい場合であっても、特定の機能を付与した２種の異なるプライマーを用いたＰＣＲを行い、増幅産物中に取り込まれた２種のプライマーの割合を概算することによって、試料中における標的配列の有無の判定をより正確に行なことが可能となる。本発明はこのような類似関係にある複数の核酸の判定において、検体の種類に限定されることはなく広く適用が可能である。また、DNAマイクロアレイをはじめとする固相ハイブリダイゼーション反応において特に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の標的配列の検出方法では、複数の類似配列中の１つの配列を標的配列として選択し、選択された標的配列を他の１つ以上の類似配列と区別して検出することができる。具体的には、まず、複数の類似配列から検出対象としての標的配列と、それ以外の配列のうちの１つを対照配列として選択する。次に、これらの標的配列増幅用の第１のプライマーと対照配列増幅用の第２のプライマーをそれぞれ設計し、調製する。ここで、標的配列と類似する対照配列は、標的配列検出用のプローブを用いた検出によって検出される範囲の類似性を有するものであり、このプローブを基準として設計される各プライマーは標的配列及び対照配列にクロスハイブリダイズするものとなる。
【００１９】
これらのプライマーを同一反応系中に用いて、例えばマルチプレックスＰＣＲ反応を行なって核酸の増幅を行い、各プライマー伸長物と、標的配列の検出用として設計したプローブとをハイブリダイズさせた第１の結果を得る。更に、対照配列についても同様のＰＣＲを行い、標的配列の検出用として設計したプローブとのハイブリダイズの結果を第２の結果として得る。こうして得られた第１の結果と第２の結果の各々における第１及び第２のプライマーの使用量比を算出し、対比することで、標的配列をその類似配列である対照配列と区別して判定することができる。更に、対照配列となり得る類似配列が２以上ある場合は、各類似配列ごとに１つの第２のプライマーを設定し、上記の検出操作を各類似配列毎に繰り返す方法が好適である。この繰り返し法によれば、標的配列と、その他の複数の類似配列とを区別して検出することが可能となる。
【００２０】
一方、上記のプローブとしては対照配列の検出用として設計されたものを用いることもできる。
【００２１】
例えば、後述の実施例２ではＳ．ａｕｒｅｕｓの有する遺伝子に特徴的である配列を標的配列と、Ｓ.ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの有する遺伝子に特徴的である配列を対照配列として、標的配列検出用のプローブ（Ａ１〜Ａ６）での検出を行ない、プライマーＲ１及びＲ２の使用率の比からＳ．ａｕｒｅｕｓからの試料中に標的配列の存在を対照配列と区別して検出している。この実施例２におけるＳ.ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの有する遺伝子に特徴的である配列を標的配列とし、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの有する遺伝子に特徴的である配列を対照配列としても、同様に２種のプライマーの使用率の比からＳ.ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの有する遺伝子に特徴的である配列をＳ．ａｕｒｅｕｓの有する遺伝子に特徴的である配列と区別して検出することができる。
【００２２】
なお、第１及び第２のプライマーを用いたＰＣＲに供する標的配列を含む試料としては、標的配列で特徴付けられる検体（例えば微生物）からの核酸試料にＰＣＲを行なって標的配列を含む核酸断片を増幅させて得られた増幅産物を用いることもできる。更に、対照配列を含む試料についても同様である。
【００２３】
標的配列の有無について検査すべき核酸試料を、標的配列に相補的な配列を有するプローブとハイブリッド形成可能な条件下で反応させることによって、試料中に標的配列が存在すればハイブリッドが形成される。更に、形成されたハイブリッド体に導入された標識からの信号を検出することによって検体中に含まれていた核酸配列が明らかにされる。しかしながら、プローブと試料中に存在した標的配列は理想的には特異的な組み合わせであり、他の配列とは反応しないはずであるが、数塩基程度が異なるような類似配列が存在する場合は、条件によっては標的配列認識用のプローブに対して類似配列もハイブリダイズし得る。標的配列の有する標識と、類似配列の有する標識が同一の場合には、正真のハイブリッド（標的配列＋標的配列認識用プローブ）もクロスハイブリダイゼーションによる擬似ハイブリッド（類似配列＋標的配列認識用プローブ）も、定性的には同じ信号を発する。このような条件下では、類似配列を標的配列として誤って検出することになる。そこで、本発明においては、プライマー毎に判別可能な標識を付与することでプローブの配列特異性情報を得ることに加えて、増幅時のプライマーの使用率（各プライマーから発せられる信号の量比）に基づくプライマーの配列特異性情報も同時に得ることにより、更に正確な判定を可能とする。
【００２４】
要するに、本発明では標的核酸に対して第１及び第２のプライマーがアニーリング（ハイブリダイズ）することが許容される。
【００２５】
標的配列増幅用の第１のプライマーは、標的配列そのものに対する相補配列の一部（プライマーがハイブリダイズする部分）と完全マッチする配列を有するように設計される。更に、第１のプライマーは、標的配列のＰＣＲ増幅時に第２のプライマーよりも多く増幅産物中に取り込まれ、更に、標的配列検出用のプローブを用いた検出反応において第２のプライマーよりも高い検出強度が得られる配列を有するように設計されることが好ましい。
【００２６】
対照配列増幅用の第２のプライマーは、標的配列に対して１以上の塩基置換を有し、標的配列検出用のプローブでの検出において標的配列と誤認される可能性のある類似配列の相補配列の一部（プライマーがハイブリダイズする部分）と完全マッチする配列を有するように設計される。更に、ＰＣＲ増幅時及びプローブとのハイブリダイゼーションにおいて第１のプライマーと異なる使用率を示すように第１のプライマーとの関係を調整する。
【００２７】
すなわち、第１のプライマーと第２のプライマーは、ＰＣＲ増幅時やプローブによる検出時におけるプライマー使用率が他のプライマーと異なるように設計される。また、増幅反応条件におけるＴｍ値がそれぞれのプライマーで規定の範囲内で等しくなるように設計することが好ましい。第１のプライマーに対し、第２のプライマーのＴｍ値が±１０℃以内になるように設定するのが好ましい。
【００２８】
Ｔｍ値を所望の温度に設定する方法としては、プライマーとしての配列特異性を著しく損なわない範囲でプライマーの長さを変えるようにプライマーを設計することが一般的である。プライマーのＴｍ値の算出方法は、実際の増幅反応条件下で温度を変えて吸収強度を測定することによっても算出可能だが、一般的に良く知られている、最近接塩基対法、Wallace法、GC％法などの方法によって計算することも可能である。設計したプライマーにはそれぞれ異なる標識をする。すでに記載したが、同一の系において検出が行える物質による標識（例えばＣｙ３、Ｃｙ５などの蛍光物質）を用いることが望ましい。これにより同時に全ての標識を検出が可能となり、標識物の混合率、つまりプライマーの使用率の算出が可能となる。
【００２９】
第１及び第２のプライマーの使用率（種類及び量比）を数値化し、対比することによって、核酸に対して特異的なプローブをハイブリダイズさせただけでの検体中の核酸の判別に比べ、より正確な判別が可能となる。
【００３０】
以上、１つの標的配列と１つの対照配列の組合せを選択して標的配列を対照配列と区別して検出する方法について述べたが、この検出方法は、１つの標的配列と、２以上の対照配列との組合せにも適用可能である。例えば、１つの標的配列と２つの対照配列との組み合わせの場合は、標的配列増幅用の第１のプライマー、第１の対照配列増幅用の第２のプライマー、第２の対照配列増幅用の第３のプライマーを用意する。各プライマーには、各プライマーが識別可能なように異なる標識を付与しておく。更に、上述したとおり、各プライマーのＴｍ値が規定の範囲内で一定となるように設定することが好ましい。
【００３１】
ここで、第１のプライマーは、ＰＣＲ増幅時及び標的配列検出用のプローブとのハイブリダイゼーションにおいて他のプライマーに対して最も使用率が高くなるように設計することが好ましい。第１〜第３のプライマーを同一系中に用いて、１つの標的配列及び２つの対照配列のそれぞれについてのＰＣＲによる増幅を行い、更に上記の１つの標的配列に対して１つの対照配列を用いた場合と同様にして増幅産物と標的配列検出用のプローブとの反応を行なって、各プライマーの使用率を算出し、その結果に基づいて、試料中における標的配列の存在を２つの対照配列と区別して判別できる。
【００３２】
プローブは、検出しようとする標的配列に対して特異的にハイブリダイズするように設計する。標的配列に対するプローブの１種以上を用い、その数が２種以上であればより正確な判別が可能となる。
【００３３】
上記の構成の異なる標識を有する複数のプライマーを含むプライマーセットと標的配列の含まれる検体を用いて増幅用の混合液を調整し、増幅反応を行うことで標的配列を有する標識されたプライマー伸長物を得ることができる。一般に増幅を行いたい核酸（断片）の配列とプライマー配列が１〜数塩基程度異なっていても、ある確率でアニーリングし、伸長反応は行われる。
【００３４】
本発明の方法によると検出対象の１つの標的配列が複数のプライマーによって伸長されることとなり、複数の標識が混在したプライマー伸長反応物が得られる。ここで得られたプライマー伸長物と検出したい標的配列に対して特異的に設計したプローブを適当な条件において反応させ、ハイブリッド形成によりプローブと結合したプライマー伸長物の標識を検出する。
【００３５】
核酸増幅時に用いられる複数のプライマーの配列は、プライマー配列の部分がプローブとハイブリダイズするように設計しても、プライマーから伸びた伸長部分がプローブで検出可能な配列を有するように設計してもよい。いすれにしても、検出される標識のシグナルは、核酸増幅反応時に用いられた複数のプライマーの量比によって決定されることになる。プローブに捕捉された標識の混合比を算出することによって、増幅時のプライマー使用率が算出される。
【００３６】
判定方法は二段階となる。すなわち、検体中に存在しうる標的核酸に対する特異的なプローブによる判定と検体中に存在する核酸とハイブリダイズしたプライマーの量比（プライマー配列の特異性）による判定の両方を行う。
【００３７】
本発明の方法においては、異なる標識により互いに区別し得る複数のプライマーを同一系中で用いて行なったＰＣＲ及び標的配列検出用のプローブへハイブリダイズしたプライマー伸長物での各プライマーの使用率は、標的配列と対照配列においてほぼ一定の比率となる。そこで、標準品で予め求めておいた標的配列と対照配列との間での利用率の比を基準として試料中での標的配列の有無を対照配列と区別して検出することができる。例えば、後述の実施例２では、プローブＡ１〜Ａ５で検出される２つのプライマーの使用量比は、Ｓ.ａｕｒｅｕｓからの試料では５．４９１〜５．７６６の範囲にあり、Ｓ.ｅｐｉｄｅｒｍｉｓからの試料では１．５６９〜１．５７４の範囲にある。そこで、未知試料に対する２つのプライマーの使用量の比を同様の求めて、Ｓ.ａｕｒｅｕｓからの試料における数値範囲と一致すれば、試料中がＳ.ａｕｒｅｕｓ由来であり、Ｓ.ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ由来ではない点を判別できる。あるいは、未知試料に対する２つのプライマーの使用量の比が、Ｓ.ｅｐｉｄｅｒｍｉｓからの試料における数値範囲と一致すれば、試料中がＳ.ａｕｒｅｕｓ由来ではなく、Ｓ.ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ由来である点を判別できる。また、未知試料に対する２つのプライマーの使用量の比が、どちらの範囲にも属さない場合は、これらの種に由来するものでないと判断できる。なお、この既知試料を用いたプライマー使用量比は、未知試料の検査に対して予め求めておいてもよいし、未知試料の検査と同時に、あるいは並行して標準検査として行なってもよい。
【００３８】
本発明は固相上でのハイブリダイゼーション反応に特に有効である。固相上に複数のプローブをそれぞれ区別し得る領域に固定もしくは吸着させておくことにより、より正確な判定を行うことが可能である。固相ハイブリダイゼーションを利用した検出デバイスとしてのプローブ担体の構成は特に限定されない。例えば、代表的な固相材料としてのガラス、プラスチック、金属などの基板上にプローブを固定化したものが用いられる。中でも平板状のデバイスに多数のDNAプローブが固定されたDNAチップ（DNAマイクロアレイ、遺伝子チップ）などは、本発明の方法に特に有用である。
【００３９】
本発明は、検体の種類に限定されることなく、核酸を含む検体に広く利用可能である。検体が微生物自体である場合や、検体に微生物由来の核酸が含まれている場合にその微生物を特定するために本発明の方法は特に有用である。一般に同属に属する複数の微生物の核酸配列は、これらの微生物間で類似している場合が多い。また、近年研究が進みつつある微生物の遺伝子診断法（感染症起炎菌同定検査など）においては、多種多様な候補微生物の核酸配列に対して、検体中に含まれる核酸配列の一致検査を行うため、その検出領域は、種によらない保存領域と種特異的な可変領域を併せ持つ領域（例えば16s rRNA遺伝子など）が好んで用いられる。しかしながら、近縁種の微生物においては、種特異的な可変領域にもほとんど差がなく、類似配列を持つ場合がある。本発明はそのような場合において特に有効である。
【００４０】
本発明の方法を行なうためのキットは、以下の各成分から構成することができる。
（１）標的配列の相補鎖とハイブリッドを形成可能であり、類似配列にクロスハイブリダイズし、かつ定量可能な第１の標識を有する第１のプライマー。
（２）標的配列に類似する対照配列の相補鎖とハイブリットを形成可能であり、標的配列にクロスハイブリダイズし、かつ第１の標識と区別して定量可能な第２の標識を有する第２のプライマー。
（３）第１及び第２のプライマーを用いて核酸試料の増幅を行うための試薬。
（４）増幅により得られる標的配列を含む伸長物を検出し得るプローブを担体上に固定したプローブ担体。
【００４１】
上記（２）の成分における対照配列が２以上ある場合は、第２のプライマーとして２以上の異なる標識により互いに識別し得るプライマーを用意する。また、上記の（１）〜（４）の成分に加えて必要に応じて、ＰＣＲ用の装置、プローブとのハイブリダイゼーションを行なうための装置、標識検出用の試薬や装置を追加することもできる。
【実施例】
【００４２】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
＜実施例１＞Ｃｙ３標識のみによるStaphylococcus aureusとStaphylococcus epidermidisの判別
（1）標識用プライマーの設計
S.aureusとS.epidermidisを検出するために、標識物質を結合させたプライマーを2種設計した。S.aureusに対して配列Ｒ１をプライマーとして設計し、S.epidermidisに対して配列Ｒ２を設計した。また配列R1およびR2にはそれぞれ5'末端部分にＣｙ３を標識した。
R1：（Cy3）：5' atccagccgcaccttccgatac 3'
R2：（Cy3）：5' atccagccgcaggttcccctac 3'
（2）標識用プライマーの合成
（1）で設計した2種の標識用プライマーを合成した。プライマーの合成は定法に従ってDNA合成機で行った。配列R1およびＲ2には5'末端側にCy3をそれぞれ結合させた。精製は、ＨＰＬＣ精製により行い、２種のプライマーを得た。得られたプライマーは、ＴＥバッファーにて１０μＭの濃度に希釈した。
（3）標識PCR増幅
（2）で合成した2種の標識プライマー、S.aureusのゲノムまたはS.epidermidisゲノムが存在するサンプル、タカラバイオ株式会社製PCRキット  TaKaRa Ex Taqを用いてPCR反応を行った。PCRの反応条件は以下のようなプロトコルによって行った。
【００４３】
【表１】
2007006747.tif 000002
【００４４】
上記組成の反応液を図１に示すプロトコルにしたがって、市販のサーマルサイクラーを用いて増幅反応を行った。
【００４５】
反応終了後、精製用カラム（QIAGEN QIAquick PCR Purification Kit）を用いて精製した。精製後の液量が50μlになるように調製した。
【００４６】
(4)DNAマイクロアレイの作製
(4-1)ガラス基板の洗浄
合成石英のガラス基板（サイズ：25mmｘ75mmｘ1mm、飯山特殊ガラス社製）を耐熱、耐アルカリのラックに入れ、所定の濃度に調製した超音波洗浄用の洗浄液に浸した。一晩洗浄液中で浸した後、20分間超音波洗浄を行った。続いて基板を取り出し、軽く純水ですすいだ後、超純水中で20分超音波洗浄をおこなった。次に、80℃に加熱した１N水酸化ナトリウム水溶液中に10分間基板を浸した。再び純水洗浄と超純水洗浄を行い、DNAチップ用の石英ガラス基板を用意した。
【００４７】
(4-2)表面処理
シランカップリング剤KBM-603(信越シリコーン社製)を、１重量（wt）％の濃度となるように純水中に溶解させ、2時間室温で攪拌した。続いて、先に洗浄したガラス基板をシランカップリング剤水溶液に浸し、20分間室温で放置した。ガラス基板を引き上げ、軽く純水で表面を洗浄した後、窒素ガスを基板の両面に吹き付けて乾燥させた。次に、乾燥した基板を120℃に加熱したオーブン中で１時間ベークし、カップリング剤処理を完結させ、基板表面にアミノ基を導入した。次いで、同仁化学研究所社製のN-マレイミドカプロイロキシスクシイミド(N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimido)（以下EMCSと略す）を、ジメチルスルホキシドとエタノールの1:1混合溶媒中に最終濃度が0.3mg/mlとなるように溶解したEMCS溶液を用意した。ベークの終了したガラス基板を放冷し、調製したEMCS溶液中に室温で2時間浸した。この処理により、シランカップリング剤によって表面に導入されたアミノ基とEMCSのスクシイミド基が反応し、ガラス基板表面にマレイミド基が導入された。EMCS溶液から引き上げたガラス基板を、先述のＥMCSを溶解した混合溶媒を用いて洗浄し、さらにエタノールにより洗浄した後、窒素ガス雰囲気下で乾燥させた。
【００４８】
(4-3) プローブDNAの合成
下記の配列を有するプローブ6種を合成した。なお、この配列は、S.aureusの16Ｓ rRNA遺伝子領域をコードする配列に相補的な配列となっている。プローブDNAはガラス基板に対して共有結合させるため、定法に従って5'末端にチオール化処理を施したのち、DNA合成時に副反応を避けるために結合してある保護基を全て除去し、さらにHPLC精製および脱塩処理を施した。
名称：配列
A1：5' tgcacatcttgacggtacctaatcag 3'
A2：5' aatacaaagggcagcgaaaccgc 3'
A3：5' ccggtggagtaaccttttaggagct 3'
A4：5' taaccttttaggagctagccgtcga 3'
A5：5' tttaggagctagccgtcgaaggt 3'
A6：5' tagccgtcgaaggtgggacaaat 3'
得られたプローブDNAは純水に溶解し、それぞれ、最終濃度（インク溶解時）10μMとなるように分注した後、凍結乾燥を行い、水分を除いた。
【００４９】
（4-4） BJプリンターによるDNA吐出、および基板への結合
グリセリン7.5wt%、チオジグリコール7.5wt%、尿素7.5wt%、アセチレノールEH(川研ファインケミカル社製)1.0wt%を含む水溶液を用意した。続いて、先に用意したプローブを上記の混合溶媒に規定濃度(10μM)となるように溶解した。得られたDNA溶液をバブルジェットプリンター（商品名：BJF-850  キヤノン社製）用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。なお、ここで用いたバブルジェットプリンターは平板への印刷が可能なように改造を施したものである。またこのバブルジェットプリンターは、所定のファイル作成方法に従って印字パターンを入力することにより、約5ピコリットルのDNA溶液を約120マイクロメートルピッチでスポッティングすることが可能となっている。続いて、この改造バブルジェットプリンターを用いて、印字操作をおこなった。1枚のDNAチップあたり、16スポットの吐出が行われるよう印字のパターンをあらかじめ作成し、印字した。印字が確実に行われていることを拡大鏡等により確認した後、30分間加湿チャンバー内に静置し、ガラス基板表面のマレイミド基と核酸プローブ末端のチオール基とを反応させた。
【００５０】
(4-5）洗浄
30分間の反応後、100mMのNaClを含む10mMのリン酸緩衝液(pH7.0)により表面に残ったDNA溶液を洗い流し、ガラス基板表面に一本鎖DNAが固定したDNAマイクロアレイを得た。
【００５１】
(5)ハイブリダイゼーション
(4)で作製したDNAマイクロアレイと（3）で作製したPCR産物を用いて以下のとおり検出反応を行った。
(5-1) DNAマイクロアレイのブロッキング
BSA（牛血清アルブミンFraction V：Sigma社製）を1wt％となるように100mM NaCl / 10mM Phosphate Bufferに溶解し、この溶液に4で作製したDNAマイクロアレイを室温で2時間浸し、ブロッキングを行った。ブロッキング終了後、0.1wt％SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む２ｘSSC溶液（NaCl 300mM 、Sodium Citrate (trisodium citrate dihydrate, C6H5Na3・2H2O) 30mM、p.H. 7.0）で洗浄を行った後、純水でリンスしてからスピンドライ装置で水切りを行った。
(5-2)ハイブリダイゼーション溶液の調製
最終濃度が下記の構成となるようハイブリダイゼーション溶液を調製した。
ハイブリダイゼーション溶液：
6 x SSPE / 10% Form amide /PCR産物
(6xSSPE: NaCl 900mM、NaH2PO4・H2O 60mM、EDTA 6mM、p.H. 7.4)
(5-3) ハイブリダイゼーション
水切りしたDNAマイクロアレイをハイブリダイゼーション装置（Genomic Solutions Inc.   Hybridization Station）にセットし、以下に示すハイブリダイゼーション条件でハイブリダイゼーション反応を行った。
＜ハイブリダイゼーション条件＞
Injection →  92℃  2min  →  45℃  4hr  →  Wash  2ｘSSC / 0.1% SDS  at 25℃  →  Wash  2 x SSC at 20℃  → (Rinse with H2O  :  Manual)  →  Spin dry
(6) 蛍光測定
上記のハイブリダイゼーション反応終了後のDNAマイクロアレイをDNAマイクロアレイ用蛍光検出装置（Axon社製、GenePix 4000B）を用いで蛍光測定を行った。励起波長５３２nmの測定モードによってＣｙ３の蛍光輝度を測定した。S.aureusを検出した時のDNAマイクロアレイの様子を図２に、S.epidermidisを検出したときのDNAマイクロアレイの様子を図３に示す。またそれぞれのCｙ３蛍光輝度の測定結果を下記に示す。なお、バックグランドに相当するスポットの無い部分からの蛍光強度を引いた値を蛍光輝度の実測値とした。また、測定は2回実施してその平均値を測定結果とした。
（１）S.aureusからの試料を検出したとき
プローブ：Ｃｙ３蛍光輝度
Ａ１：８１０．３
Ａ２：９６２３．２
Ａ３：６８１４．４
Ａ４：６４１６．８
Ａ５：８９５４．１
Ａ６：１００５０．７
（２）S.epidermidisからの試料を検出したとき
プローブ：Ｃｙ３蛍光輝度
Ａ１：６２０．４
Ａ２：９３２３．５
Ａ３：６４５２．６
Ａ４：６２０８．１
Ａ５：８６９１．１
Ａ６：９７３５．４
これらの結果から、S.aureusに特異的なプローブに対し、S.epidermidisがクロスハイブリダイゼーションしており、この2種類の菌に対しては特異的なプローブだけでは判別が難しいことを確認した。
【００５２】
＜実施例２＞ 2種の蛍光標識を用いたStaphylococcus aureusとStaphylococcus epidermidisの判別
(1)標識用プライマーの設計
実施例１の（1）に記載の方法によりプライマー配列を決定した。また、配列R1の5'末端部分にCy3を標識、配列R2の5'末端部分にCy5を標識した。
(2)標識用プライマーの合成
実施例１の（2）に記載の方法によりプライマーを合成した。また、配列R１の5'末端部分にCy3を、配列R2の5'末端部分にCy5を結合させた。
(3)標識PCR増幅
実施例１の（3）に記載の方法で標識PCR増幅を行った。
(4)  DNAマイクロアレイの作製
実施例1の（4）に記載の方法でDNAマイクロアレイを作製した。
(5)ハイブリダイゼーション
上記(4)で作製したDNAマイクロアレイと上記（3）で作製したPCR産物を用いて検出反応を行った。
(6)蛍光測定
上記のハイブリダイゼーション反応終了後のDNAマイクロアレイをDNAマイクロアレイ用蛍光検出装置（Axon社製、GenePix 4000B）を用いで蛍光測定を行った。励起波長５３２nm、６３５nmの２種類の測定モードによってＣｙ３、Ｃｙ５それぞれの蛍光輝度を測定した。同濃度におけるＣｙ３とＣｙ５の蛍光輝度をそろえるために、光電子増倍管の電圧を励起波長５３２nmに対しては３８０Ｖ、６３５ｎｍに対しては４６０Ｖに設定した。測定結果を下記に示す。なお、バックグランドに相当するスポットの無い部分からの蛍光強度を引いた値を蛍光輝度の実測値とした。また、測定は2回実施してその平均値を測定結果とした。
（１）S.aureusからの試料を検出したとき
プローブ：Ｃｙ３蛍光輝度：Ｃｙ５蛍光輝度
Ａ１：７１５．５：１３０．３
Ａ２：９４６２．１：１６７５．１
Ａ３：６５３８．２：１１７９．８
Ａ４：３２７９．４：５６８．７
Ａ５：８８２０．７：１５４８．６
Ａ６：９８２５．４：１７４２
（２）S.epidermidisからの試料を検出したとき
プローブ：Ｃｙ３蛍光輝度：Ｃｙ５蛍光輝度
Ａ１：４８０．５：３０５．２
Ａ２：８９４５．２：５７０１．１
Ａ３：５８６２．６：３７３０．５
Ａ４：４１５８．１：２６４１．５
Ａ５：６２５９．４：３９８７．９
Ａ６：８２０１．７：５２２０．７
それぞれのプローブにおけるＣｙ３蛍光輝度とＣｙ５蛍光輝度の比を算出した。
（１）S.aureusからの試料を検出したとき
プローブ：Ｃｙ３／Ｃｙ５
Ａ１：５．４９１
Ａ２：５．６４９
Ａ３：５．５４２
Ａ４：５．７６６
Ａ５：５．６９６
Ａ６：５．６３７
（２）S.epidermidisからの試料を検出したとき
プローブ：Ｃｙ３／Ｃｙ５
Ａ１：１．５７４
Ａ２：１．５６９
Ａ３：１．５７２
Ａ４：１．５７４
Ａ５：１．５７０
Ａ６：１．５７１
この比率はターゲットに標識をした時の2種類のプライマーR1とR3のそれぞれの使用量の比を表している。これらのデータから、R1、R2の2種のプライマーでS.aureusの伸長反応を行うと、配列Ｒ２のプライマー対してＲ１のプライマーが約5.6倍使用され、S.epidermidisの伸長反応を行うと、配列Ｒ２に対してＲ１が約1.57倍使用されることが確認された。この比率は同じプライマーセットを用いたときはそれぞれの菌種で保存されるため、これによる判別が可能である。
【００５３】
＜実施例3＞ ターゲット増幅ステップと2種の蛍光標識を用いたStaphylococcus aureusとStaphylococcus epidermidisの判別
（1）ターゲット増幅用プライマーの設計
S.aureusの標準株ATCC 12600とS.epidermidisの標準株ATCC 14990の２種類の株についてそれぞれの16S rＲＮＡ遺伝子領域コードする配列を標的配列とし、両方の菌においてその領域を増幅させることが可能である以下に記載の4種類のプライマーを設計した。S.aureusおよびS.epidermidisの16S rRNA遺伝子領域の配列情報は、公開されているデータベースから入手した。
名称：配列
F1：5' gcggcgtgcctaatacatgcaag 3'
F3：5' gcggcaggcttaacacatgcaag 3'
R1：5' atccagccgcaccttccgatac 3'
R3：5' atccagccgcaggttcccctac 3'
（2）プライマーの合成
上記（1）で設計したプライマーの合成を行った。各プライマーの合成は、それぞれの塩基配列を有するＤＮＡ鎖を定法に従ってＤＮＡ合成機で合成した。精製は、カートリッジ精製により行い、4種のプライマーを得た。
（3）PCR増幅
上記（2）で合成したプライマー、S.aureusまたはS.epidermidisのゲノム、タカラバイオ株式会社製PCRキット  TaKaRa Ex Taqを用いてPCR反応を行った。PCRの反応条件は以下のようなプロトコルによって行った。
【００５４】
【表２】
2007006747.tif 000003
【００５５】
上記組成の反応液を図４に示すプロトコルにしたがって、市販のサーマルサイクラーを用いて増幅反応を行った。
【００５６】
反応終了後、精製用カラム（QIAGEN QIAquick PCR Purification Kit）を用いて精製した。精製後の液量が50μlになるように調製した。得られたPCR産物の一部を取り、定法に従って電気泳動を行い、1500bp相当のバンドが出ていることを確認した。電気泳動の画像を図５に示す。
（4）標識用プライマーの設計
実施例2の（1）に記載の方法により標識用プライマーを設計した。
（5）標識用プライマーの合成
実施例２の（2）に記載の方法により標識用プライマーを合成した。
（6）標識PCR増幅
上記（5）で合成した2種の標識プライマー、実施例3の（3）で調製したS.aureusまたはS.epidermidisのＰＣＲ産物、タカラバイオ株式会社製PCRキット  TaKaRa Ex Taqを用いてPCR反応を行った。PCRの反応条件は以下のようなプロトコルによって行った。
【００５７】
【表３】
2007006747.tif 000004
【００５８】
上記組成の反応液を図１に示すプロトコルにしたがって、市販のサーマルサイクラーを用いて増幅反応を行った。
【００５９】
反応終了後、精製用カラム（QIAGEN QIAquick PCR Purification Kit）を用いて精製した。精製後の液量が50μlになるように調製した。
(7)DNAマイクロチップの作製
実施例１の（4）に記載の方法によって作製した。
(8)ハイブリダイゼーション
実施例１の（5）に記載の方法によりハイブリダイゼーション反応を行った。
(9) 蛍光測定
実施例２の（６）に記載の方法により蛍光輝度の測定を行った。測定結果を下記に示す。
（１）S.aureusの検出を行ったとき
プローブ：Ｃｙ３蛍光輝度：Ｃｙ５蛍光輝度
Ａ１：３６０２．５：６２１．８
Ａ２：４７５４１．５：８４１６．９
Ａ３：３２８４６．２：５７９６．５
Ａ４：１６３６５．４：２７６２．０
Ａ５：４３９５３．７：７７３１．５
Ａ６：４６０５６．７：８２０２．７
（２）S.epidermidisの検出を行ったとき
プローブ：Ｃｙ３蛍光輝度：Ｃｙ５蛍光輝度
A1；2384.3：1536.4
A2；44691.2：28610.6
A3； 29394.8：18825.4
A4； 20861.5：13365.7
A5；31389.4：20152.6
A6；41522.5：26453.2
それぞれのプローブにおけるＣｙ３蛍光輝度とＣｙ５蛍光輝度の比を算出した。
（１）S.aureusの検出を行ったとき
プローブ：Ｃｙ３／Ｃｙ５
Ａ１：５．７９４
Ａ２：５．６４８
Ａ３：５．６６７
Ａ４：５．９２５
Ａ５：５．６８５
Ａ６：５．６１５
（２）S.epidermidisの検出を行ったとき
プローブ：Ｃｙ３／Ｃｙ５
Ａ１：１．５５２
Ａ２：１．５６２
Ａ３：１．５６１
Ａ４：１．５６１
Ａ５：１．５５８
Ａ６：１．５７０
この比率はターゲットに標識をした時の2種類のプライマーR1とR2のそれぞれの使用量の比を表している。これらのデータから、R1、R2の2種のプライマーでS.aureusの16Ｓ rRNA遺伝子領域をコードする配列の伸長反応を行うと、配列Ｒ２のプライマーに対して配列Ｒ１のプライマーが約5.6倍使用され、S.epidermidisの16S rRNA領域をコードする配列の伸長反応を行うと、配列R2に対して配列R1が約1.56倍使用されることが確認された。この比率は同じプライマーセットを用いたときはそれぞれの菌種で保存されるため、これによる判別が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】増幅反応のプロトコルを示す図である。
【図２】S.aureusからの試料を検出した時のDNAマイクロアレイの様子を示す図である。
【図３】S.epidermidisを検出したときのDNAマイクロアレイの様子を示す図である。
【図４】増幅反応のプロトコルを示す図である。
【図５】実施例３における電気泳動の結果を示す図である。
【図１】
2007006747.tif 000005
【図２】
2007006747.tif 000006
【図３】
2007006747.tif 000007
【図４】
2007006747.tif 000008
【図５】
2007006747.tif 000009
【配列表】
2007006747000001.app