(57)【要約】【課題】プローブ固定化基体の製造過程において全数検査を行い、製造されたプローブ固定化基体が全て良好な測定精度を有することを可能にする、プローブ固定化基体の製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】生体分子を検出するための生体分子プローブ固定化基体の製造方法であって、標的生体分子と相互作用し得る生体分子プローブを、基体に備えられた電極に固定する工程と、該基体の電極に固定された生体分子プローブ量を電気化学的に測定し、固定量が所定の範囲外である電極を除外する工程とを具備することを特徴とする、生体分子プローブ固定化基体の製造方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子を検出するための生体分子プローブ固定化基体の製造方法であって、
標的生体分子と相互作用し得る生体分子プローブを、基体に備えられた電極に固定する工程と、
該基体の電極に固定された生体分子プローブ量を電気化学的に測定し、固定量が所定の範囲外である電極を除外する工程とを具備することを特徴とする、生体分子プローブ固定化基体の製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記生体分子プローブを固定化する工程に先立って、
基体上に電極を作製する工程と、
前記基体上に作製された電極の品質検査のために、該電極を電気化学的に測定し、測定された値が所定の範囲外である電極を除外する工程と、
をさらに含むことを特徴とする、生体分子プローブ固定化基体の製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法であって、
前記生体分子プローブ量が所定の範囲内である基体をブロッキング剤で処理し、電極を被覆する工程と、
該ブロッキング剤処理後の基体において、電極表面のブロッキング剤の被覆率を電気化学的に測定し、被覆率が所定の範囲外である基体を除外する工程と、
をさらに具備することを特徴とする、生体分子プローブ固定化基体の製造方法。
【請求項４】
前記固定された生体分子プローブ量の測定は、交流インピーダンス測定法によりピーク電位及びピーク面積を算出することによって行うことを特徴とする、請求項１〜３の何れか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記電極の電気化学的測定は、サイクリックボルタンメトリーでピーク電位及びピーク面積を算出することによって行う、請求項２〜４の何れか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記ブロッキング剤の被覆率の測定は、交流インピーダンス測定法によりピーク電位及びピーク面積を算出することによって行うことを特徴とする、請求項３〜５の何れか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記生体分子は、核酸、タンパク質又は糖鎖から成る群から選択される分子である、請求項１〜６の何れか一項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子をプローブとして用いるプローブ固定化基体の製造方法に関し、より詳細には、製造工程中に検査工程を含むプローブ固定化基体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、核酸やタンパク質等の生体分子を検出するためのチップが開発されている。チップを用いた検出方法では、チップに固定したプローブに標的物質を結合させて検出する。結合した標的物質の検出には、種々の方式が用いられるが、その一つに電流検出方式がある。電流検出方式は、検出装置が小型化可能である等の利点を有しており、開発が進められている。
【０００３】
従来、電流検出用のチップは、基体上に電極を作製し、該電極にプローブ物質を固定して製造されている。製造されたチップは、電極表面の面積、汚染具合、電極を構成する原子の結晶方位、プローブの固定量、ブロッキング剤の被覆率などについての品質検査を行うことが望ましく、これらを管理することにより、正確な測定が可能なチップとなりうる。
【０００４】
しかしながら、通常のチップの品質検査は、完成したチップを無作為に取り出し、実際に標的物質を測定することにより行っている。従って、検査に用いたチップは破棄されるため、全てのチップを検査することができず、不良品の混在を防ぐことが難しいという問題があった。
【０００５】
特許文献１並びに非特許文献１及び２には、電極に固定した核酸をインピーダンス法で検出する方法が開示されているが、アレイに固定された核酸の検出については記載されていない。
【特許文献１】特開2003-185662
【非特許文献１】J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 5194-5205
【非特許文献２】Biosensors and Bioelectronics 19 (2004) 1013-1019
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の問題に鑑み、本発明は、プローブ固定化基体の全数検査を可能にし、製造されたプローブ固定化基体が全て良好な測定精度を有することを可能にする、プローブ固定化基体の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するため、本発明は、生体分子を検出するための生体分子プローブ固定化基体の製造方法であって、標的生体分子と相互作用し得る生体分子プローブを、基体に備えられた電極に固定する工程と、該基体の電極に固定された生体分子プローブ量を電気化学的に測定し、固定量が所定の範囲外である電極を除外する工程とを具備することを特徴とする、生体分子プローブ固定化基体の製造方法を提供する。
【０００８】
また、本発明の他の態様として、前記生体分子プローブを固定化する工程に先立って、基体上に電極を作製する工程と、前記基体上に作製された電極の品質検査のために、該電極を電気化学的に測定し、測定された値が所定の範囲外である電極を除外する工程とをさらに含むことを特徴とする、生体分子プローブ固定化基体の製造方法を提供する。
【０００９】
本発明のさらに他の態様として、前記生体分子プローブ量が所定の範囲内である基体をブロッキング剤で処理し、電極を被覆する工程と、該ブロッキング剤処理後の基体において、電極表面のブロッキング剤の被覆率を電気化学的に測定し、被覆率が所定の範囲外である基体を除外する工程とをさらに具備することを特徴とする、生体分子プローブ固定化基体の製造方法を提供する。
【００１０】
前記固定された生体分子プローブ量の測定は、交流インピーダンス測定法によりピーク電位及びピーク面積を算出することによって行うことが好ましい。また、前記電極の電気化学的測定は、サイクリックボルタンメトリーでピーク電位及びピーク面積を算出することによって行うことが好ましい。さらに、前記ブロッキング剤の被覆率の測定は、交流インピーダンス測定法によりピーク電位及びピーク面積を算出することによって行うことが好ましい。また、前記生体分子は、核酸、タンパク質又は糖鎖から成る群から選択される分子であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、プローブ固定化基体の製造過程において検査工程を含めることにより、全数検査を可能にし、製造されたプローブ固定化基体が全て良好な測定精度を有することを可能にすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、生体分子を検出するためのプローブ固定化基体を製造する方法であって、製造工程中に検査工程を含めることにより、プローブ固定化基体の全数検査を実現するものである。
【００１３】
本発明において、「生体分子」とは、核酸、タンパク質及び糖鎖から選択される分子であり、好ましくは核酸である。基体に固定されるプローブは、検出されるべき生体分子と相互作用し、好ましくは結合する分子である。例えば、検出されるべき生体分子が核酸である場合、該核酸と相補的な核酸をプローブとして用いることができる。
【００１４】
ここで使用される「核酸」という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、メチルフォスホネート核酸、Ｓ−オリゴ、ｃＤＮＡ及びｃＲＮＡ等、並びに何れのオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド等、核酸及び核酸類似体を総括的に示す語である。また、そのような核酸は、天然に存在するものであっても、人工的に合成されたものであってもよい。核酸配列は、ゲノムＤＮＡ配列であっても、ゲノム全体が確保されない断片的な配列であってもよい。
【００１５】
また、ここで使用される「タンパク質」という用語は、アミノ核酸及びアミノ酸類類似体の重合体を総括的に示す語である。アミノ酸は、天然に存在するものであっても、人工的に合成されたものであってもよい。
【００１６】
また、ここで使用される「糖鎖」という用語は、グルコースやガラクトースなどの単糖が、鎖状に連なった物質を示す語である。糖鎖は、天然に存在するものであっても、人工的に合成されたものであってもよい。また、タンパク質等に結合したものでもよいい。
【００１７】
本発明で用いる基体は、電極が配置可能な基体であればよく、例えば非多孔性、硬質及び半硬質な材質による、ウェル、溝または平らな表面を有する板状形体、又は、球体などの立体形状を有するものであってよい。基体は、これに限定されるものではないが、シリコン、ガラス、石英ガラス、石英などのシリカ含有基材、およびポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリカーボネート、等のプラスチックおよびポリマーなどで製造され得る。
【００１８】
また本発明で使用される電極は、特に限定されるものではないが、例えば、グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カーボンペースト、カーボンファイバーのような炭素電極、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウムのような貴金属電極、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛のような酸化物電極、Ｓｉ、Ｇｅ、ＺｎＯ、ＣｄＳ、ＴｉＯ2、ＧａＡｓのような半導体電極、チタン等によって形成されることができる。これらの電極は導電性高分子によって被覆しても、単分子膜によって被覆してもよく、所望に応じてその他の表面処理剤を処理してもよい。
【００１９】
本発明の第一の態様では、まず基体に作製された電極にプローブを固定する。種類の異なるプローブは異なる電極に固定化するが、同じ基体上に複数の電極を配置することもできる。
【００２０】
プローブを基体に固定する方法は、公知の手段によって行えばよい。例えば、スペーサーを電極に固定し、該スペーサーにプローブを固定することによって、スペーサーを介してプローブを電極に固定してもよい。または、予めプローブにスペーサーを結合させ、そのスペーサーを介して電極に固定してもよい。或いは、電極上でスペーサーとプローブを公知の手段によって合成してもよい。また、スペーサーを介してのプローブの固定は、処理又は無処理の電極表面に対して当該スペーサーを、共有結合、イオン結合又は物理吸着などによって直接固定化してもよい。或いは、スペーサーを介したプローブの固定を助けるリンカー剤を用いても良い。
【００２１】
次いで、基体の電極に固定されたプローブの量を電気化学的に測定する。固定されたプローブの量が所定の範囲外である場合、生体分子を検出する際の測定精度が悪く、信頼度の低い電極であると言える。よって検出測定に用いるには不適切であり、その電極は不良品であるとすることができる。この工程において、プローブ固定量が所定の範囲外であると判定された電極は除外する。なお、基体に複数の電極が形成されている場合、不良品と判定された電極のみを除外し、又は使用不可としてもよく、或いは不良な電極を有する基体ごと除外してもよい。
【００２２】
適切なプローブ固定量の範囲は、生体分子プローブの固定量とピーク電位及びピーク面積などの測定値との相関関係を予め明らかにしておき、望ましい範囲を設定しておく。
【００２３】
固定された生体分子プローブ量の測定は、交流インピーダンス測定法によって行うことが好ましく、ピーク電位及びピーク面積を算出することによって行うことができる。
【００２４】
上記第一の態様における一連の操作の概要図を図１に示した。図１は、生体分子として核酸を用い、プローブ固定化基体がアレイである場合の例である。まず、電極アレイに核酸を固定化する。次いで、核酸を固定化した電極アレイを例えばラックにセットし、検査用容器に設置する。この容器を検査用溶液で満たし、アレイの電極部分を浸漬させる。このとき、電流値を検出するための電極パットは液外に露出させておく。露出してある電極パットに、ポテンシオスタットに接続した電極プローブを接触させ、電気化学的測定を行う。例えば交流インピーダンス測定を行い、ピーク電位及びピーク面積を算出する。
【００２５】
測定で得られたピーク電位及びピーク面積などの数値が、予め設定した所定の範囲外である電極は、不良品として除外する。残った電極アレイは純粋で洗浄して乾燥させる。このまま検査用アレイとして供してもよいが、さらなる工程に供してもよい。
【００２６】
本発明で電極の検査に使用する検査用溶液は、硫酸、過塩素酸、水酸化カリウム、水酸化ナトリウムなどの溶液が挙げられるが、特にこれらに限定されるわけではない。また使用濃度も限定されない。
【００２７】
電気化学的測定方法は、交流インピーダンス測定法に限られず、サイクリックボルタンメトリー、パルスボルタンメトリー、クロノアンペロメトリーなど任意の方法を用いてよい。
【００２８】
次に、本発明の第二の態様を説明する。本発明の第二の態様では、上記第一の態様に加えて、基体に電極を作製する工程をも包含する。本態様においては、前記生体分子プローブを固定化する工程に先立って、基体上に電極を作製する工程を有し、さらに作製した電極の品質検査を行う。
【００２９】
電極の作製は、従来公知の方法によって行えばよい。作製された電極の検査は、電極を電気化学的に測定することにより行う。測定した値が所定の範囲外である電極は不良品として除外し、残った電極を次工程のプローブ固定化工程に移行させる。適切な測定値の範囲は、予めピーク電位及びピーク面積などの測定値との相関関係を明らかにしておき、望ましい範囲を設定しておく。
【００３０】
本第二の態様における、電極アレイを例にした検査工程の概要を図２に示した。作製した電極アレイをラックにセットし、検査用容器に設置する。この容器を上記と同様の検査用溶液で満たし、アレイの電極部分を浸漬させる。露出してある電極パットに、ポテンシオスタットに接続した電極プローブを接触させ、電気化学的測定を行う。電気化学的測定では、例えば電極表面の結晶方位、汚染、有効面積などについて検査することができるが、これらに限定されない。測定には、例えばサイクリックボルタンメトリーを用いることができる。上記と同様に、測定で得られる値の好適範囲を予め設定しておき、測定値が設定範囲から外れた電極アレイを、不良品として除外する。検査を通過した電極アレイは、純粋で洗浄して乾燥し、次の工程に移行する。
【００３１】
次に、本発明の第三の態様を説明する。本発明の第三の態様では、上記第一の態様に加えて、電極をブロッキング剤で処理する工程をも包含する。また、任意に上記第二の態様を加えてもよい。本態様においては、前記生体分子プローブを固定化する工程に続いて、電極をブロッキング処理し、さらに処理後の電極の品質検査を行う。
【００３２】
ブロッキング剤は、電極表面を被覆し、検出されるべき生体分子やその他の生体分子が、電極に非特異的に直接結合するのを防止することができる。ブロッキング剤による処理は、周知の方法に従って行えばよい。
【００３３】
プローブを固定化した基体をブロッキング剤で処理した後、ブロッキング剤による電極表面の被覆率を電気化学的に測定する。被覆率の測定は、交流インピーダンス測定法によりピーク電位及びピーク面積を算出することによって行うことができる。
【００３４】
この工程において、被覆率が所定の範囲外である電極は除外する。なお、基体に複数の電極が形成されている場合、不良品と判定された電極のみを除外し、又は使用不可としてもよく、或いは不良な電極を有する基体ごと除外してもよい。
【００３５】
本第三の態様における、電極アレイを例にした検査工程の概要を図３に示した。作製した電極アレイをブロッキング剤を含む溶液に浸漬し、ブロッキング処理を行う。次いで、処理後の電極アレイをラックにセットし、検査用容器に設置する。この容器を検査用溶液で満たし、アレイの電極部分を浸漬させる。露出してある電極パットに、ポテンシオスタットに接続した電極プローブを接触させ、電気化学的測定を行う。例えば交流インピーダンス測定により、ピーク電位及びピーク面積を算出する。上記と同様に、測定で得られる値の好適範囲を予め設定しておき、測定値が設定範囲から外れた電極アレイを、不良品として除外する。検査を通過した電極アレイは、純粋で洗浄して乾燥し、完成した電極アレイとする。
【００３６】
なお、ブロッキング剤の処理は、プローブを固定する際にリンカー剤と共に電極に処理しても良い。ここで使用されるリンカー剤及びブロッキング剤は、生体分子の電気化学的検出を有利にする物質であってもよい。
【００３７】
上記の各態様において電気化学的測定により得られる情報は、電極の有効面積、汚染具合、電極を構成する原子の結晶方位、電極に固定された分子の固定量、グロッキング剤による電極の被覆率などを挙げたが、これらに限定されるものではなく、電極の用途に対して影響のある因子であれば何れのものでもよい。
【００３８】
以上に記載したように、本発明の方法に従って製造されたプローブ固定化基体は、製造過程において簡便に且つ全数の品質を検査することができる。また、製造過程において不良品を除外することができるため、製造効率を向上させることができる。さらに、完成したプローブ固定化基体のなかに、不良品が混在することを防ぐことができ、測定精度の安定した信頼度の高い製品を製造することができる。
【００３９】
また、本発明の他の態様から、上記のような電気化学的な検査に用いられる検査用容器が提供される。本発明の検査用容器は、基体中の電極部分が溶液内に浸漬され、且つ、電極パット部分が溶液外に保持される構成を有する。複数の基体が収納可能であることが好ましい。該検査用容器は、検査に用いられる検査用溶液を保持するのに適するものであれば何れの材質から構成されてもよい。
【００４０】
本発明によって製造されたプローブ固定化基体は、核酸、タンパク質、糖鎖などの生体分子の検出に用いられる。例えば核酸を検出する場合、基体に固定化された核酸プローブと標的核酸をハイブリダイズさせ、その結果生じた二本鎖の存在を検知する。検出手段としては、電気化学的方法を用いることができるが、これに限定されない。
【００４１】
電気化学的方法による二本鎖核酸の検出は、例えば、公知の二本鎖認識物質を用いて行えばよい。二本鎖認識物質は特に限定されるものではないが、例えば、ヘキスト３３２５８、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーターおよびポリインターカレーター等を用いることが可能である。更に、これらのインターカレーターを電気化学的に活性な金属錯体、例えば、フェロセン、ビオロゲン等で修飾しておくことも可能である。また、その他の公知の二本鎖認識物質も使用可能である。
【００４２】
さらに、他の一般的な電気化学的検出法と同じように、対極および／または参照極を基体に備えてもよい。参照極を設置する場合、例えば、銀／塩化銀電極や水銀／塩化水銀電極などの一般的な参照極を使用することができる。
【実施例】
【００４３】
以下に、金電極アレイの製造工程の例を記載する。  
まず、電極を作製した。基板を硫酸・過酸化水素溶液で洗浄した後、電子ビーム法により、チタンを５００オングストロームの厚さとなるように蒸着した。或いは、スパッタリングにより、クロムを５００オングストロームの厚さとなるように成膜した。次いで同様に金を５０００オングストロ−ムの厚さとなるように蒸着又は成膜した。電極の作製方法の詳細は、特開平10-146183を参照されたい。
【００４４】
次に、作製された金電極アレイをラックにセットし、検査用容器にセットし、過塩素酸（100mM）に浸漬して蓋をした。過塩素酸溶液から露出されている電極パットに対し、ポテンシオスタットに接続されている電極プローブを接触させた。全てのアレイについて、全ての金電極に対するサイクリックボルタンメトリーを行い、ピーク電位及びピーク面積を算出した。ピーク電位、ピーク面積が設定範囲から外れた電極アレイを、不良品として除外した。
【００４５】
サイクリックボルタンメトリーの後、電極アレイがセットされたラックを洗浄用純水に浸漬し、振動させた。ラックを純水中から取り出し、電極表面に付着している純水を乾燥させた。
【００４６】
以上のように作製した電極アレイに対し、続いて核酸を固定化した。  
検査済み金電極アレイの各金電極に、チオール標識核酸鎖を含む溶液をスポットし、チオールと金との結合を介して核酸鎖を金電極に結合させた。核酸を固定化した電極アレイをラックにセットして検査用容器にセットし、過塩素酸（100mM）に浸漬して蓋をした。過塩素酸溶液から露出されている電極パットに対し、ポテンシオスタットに接続されている電極プローブを接触させた。全てのアレイについて、全ての金電極に対する交流インピーダンス測定を行い、ピーク電位及びピーク面積を算出した。ピーク電位、ピーク面積が設定範囲から外れた電極アレイを、不良品として除外した。
【００４７】
交流インピーダンス測定の後、電極アレイがセットされたラックを洗浄用純水に浸漬し、振動させた。ラックを純水中から取り出し、電極表面に付着している純水を乾燥させた。
【００４８】
以上の工程で得られた電極アレイを、続いてブロッキング剤で処理した。プローブが固定された金電極アレイを、ブロッキング剤を含む溶液に浸漬し、金電極表面をブロッキング剤により被覆した。
【００４９】
次いで、作製されたプローブ固定化電極アレイをラックにセットして検査用容器にセットし、過塩素酸（100mM）に浸漬して蓋をした。過塩素酸溶液から露出されている電極パットに対し、ポテンシオスタットに接続されている電極プローブを接触させた。全ての金電極アレイの全ての金電極に対して、交流インピーダンス測定を行い、ピーク電位及びピーク面積を算出した。ピーク電位、ピーク面積が設定範囲から外れた電極アレイを、不良品として除外した。
【００５０】
交流インピーダンス測定を行った後、複数の電極アレイを含むラックを洗浄用純水に浸漬し、振動させた。ラックを純水中から取り出し、電極表面に付着している純水を乾燥させた。以上によって、核酸プローブが固定化された電極アレイが得られた。
【００５１】
次に、作製した電極アレイの測定精度を試験した。上記の方法で得られた核酸固定化金電極アレイに対して、標的核酸を含む溶液を適用し反応させた。反応後、電気化学的に活性のある挿入剤（Hoechst 33258）を作用させた。
【００５２】
反応後の各電極に対して電位を掃引し、核酸プローブと標的核酸から成る二本鎖に結合した挿入剤を酸化させ、電流値を検出した。  
また、従来の製造工程により製造した電極アレイに対しても、標的核酸を反応させて同様に試験した。
【００５３】
それぞれから得られた電流値により、標準偏差を算出して比較したところ、本発明に従って製造した電極アレイの標準偏差が、従来法により作製した電極アレイと比較して低かった。このように、本発明の方法によれば、製造された電極アレイの平均的な測定精度を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】プローブ固定化基体の製造工程の概要図。
【図２】プローブ固定化基体用電極の製造工程の概要図。
【図３】プローブ固定化基体のブロッキング剤処理工程の概要図。
【図１】
2007271326.tif 000003
【図２】
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【図３】
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