(57)【要約】      （修正有）【課題】アテローム性動脈硬化の予防および治療に有効な血管平滑筋細胞の増殖と移動抑制用薬剤組成物の提供。【解決手段】丹参（Salviae Miltiorrhiza）から分離されたリソスペルメートＢ（Lithospermate B）（以下、LAB）は、血管平滑筋細胞の増殖と移動を抑制する作用があり、アテローム性動脈硬化治療用抑制薬剤組成物として有効である。経口的にあるいは非傾向的に投与され、健康食品としても有効である。本化合物は有機合成法によって合成することもできる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リソスペルメートＢ（lithospermate B）を有効成分として含有することを特徴とする血管筋細胞（Vascular muscle cell）の増殖と移動抑制用薬剤組成物。
【請求項２】
リソスペルメートＢを有効成分として含有することを特徴とするアテローム性動脈硬化治療用薬剤組成物。
【請求項３】
前記組成物は経口または非経口投与用剤形であることを特徴とする請求項１または請求項２記載の薬剤組成物。
【請求項４】
リソスペルメートBを有効成分として含有することを特徴とする血管平滑筋細胞の増殖と移動抑制用健康食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は血管平滑筋細胞（以下、ＶＳＭＣともいう）の増殖と移動を抑制するリソスペルメートＢ（Lithospermate B）（以下、LABともいう）に関し、更に詳しくは、丹参（Salviae Miltiorrhiza）から分離されたLAB有効成分とし含有するアテローム性動脈硬化治療用薬剤組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一般に、アテローム性動脈硬化は心筋梗塞、脳出血、そして末梢血管疾患の主要原因であることが知られており、先進国での死亡原因の半分以上は動脈硬化に起因したものである。例えば、１９９６年の米国心臓学会の報告［Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature. Apr. 29 1993;362(6423):801-809］によると、米国人は毎年約５０万人は心筋梗塞で、約１５万人は脳梗塞で死亡していると報告している。
【０００３】
血管平滑筋細胞は血管壁を作る重要な成分のうちの一つであり、血管の形状と生理作用を維持する重要な機能を持っている［Vinters HV, Berliner JA. The blood vessel wall as an insulin target tissue. Diabete Metab. Jul 1987;13(3Pt 2):294-300］。血管平滑筋細胞の量的、質的増加および移動はアテローム性動脈硬化を引き起こすのに核心的な役割を果たす。
【０００４】
成長因子や酸化ストレス、および物理的シェアストレスなどの様々なファクターがアテローム性動脈硬化発生と関連がある。血小板誘導成長因子はジスルフィド結合により連結された二重体として、遺伝子発現と成長、分化、そして細胞移動を含む様々な細胞機能の調節に係ることで知られているタンパク質チロシンキナーゼ受容体と結合する。
【０００５】
血小板誘導成長因子が、多様な細胞、特に血管平滑筋細胞を増殖させる効果があるということは既に知られている。従って、血小板誘導成長因子による血管平滑筋細胞の増殖を抑制することでアテローム性動脈硬化進行を予防するため多くの研究が行われている［Nishio E, Watanabe Y. Homocysteine as a modulator of platelet-derived growth factor action in vascular smooth muscle cells: a possible role for hydrogen peroxide. Br J Pharmacol. Sep 1997;122(2):269-274］。
【０００６】
また、成長因子が血管平滑筋細胞内の活性酸素種（ROS’ともいう）のレベルを増加させることが知られている［Sundaresan M, Yu ZX, Ferrans VJ, et al. Requirement for generation of H2O2 for platelet-derived growth factor signal transduction. Science. Oct 13 1995;270(5234):296-299］。
【０００７】
活性酸素種は非常に不安定で反応性が高いためタンパク質や脂質のような高分子物質に対して不可逆化学反応を起こす。このような有害な化学反応は細胞機能の低下と細胞死滅を引き起こす［Takano H, Zou Y, Hasegawa H, et al. Oxidative stress-induced signal transduction pathway in cardiac myocytes: involvement of ROS in heart diseases. Antioxid Redox Signal. Dec 2003;5(6):789-794］。
【０００８】
スーパーオキシド・アニオン（O２−）や過酸化水素（H２O２）のような活性酸素種は細胞呼吸（ cellular respiration）の産物として既に知られているが、最近はこのような活性酸素種が哺乳動物の細胞信号伝達に関与しているという研究結果が数多く報告されている［Finkel T. Oxygen radicals and signaling. Curr Opin Cell Biol. Apr 1998;10(2):248-253］。
【０００９】
活性酸素種やPGDF−BBのような成長因子は、Raf−MEK−MAPKやホスファジルイノシトロール４，５−ビスリン酸３−キナーゼ（PI3K）−Aktのような信号伝達経路を活性化させることが知られている。 MAPK familyの１種であるp４２／４４細胞外調節キナーゼ（ERK１／２）は血管平滑筋細胞の信号伝達体であることで知られている［Graves  LM, Bornfeldt KE, Sidhu JS, et al. Platelet-derived growth factor stimulates protein kinase A through a mitogen-activated protein kinase-dependent pathway in human arterial smooth muscle cells. J Biol Chem. Jan 5 1996;271(1):501-511; Force T, Bonventre JV. Growth factors and mitogen-ctivated protein kinases. Hypertension. Jan 1998;31(1 Pt 2):152-161］。
【００１０】
このような信号伝達体の活性化は細胞膜や細胞質内の多くのタンパク質をリン酸化させ、結果的に遺伝子転写を調節する役割を果たし、Raf、MAPKキナーゼ１／２（ＭＥＫ−１／２）そしてERK１／２に至る信号伝達経路もリン酸化作用により調整される。ERK１／２の活性化は成長因子の信号伝達において非常に重要な伝達体であり、血管平滑筋細胞の増殖および移動においてもやはり必須要素である。また、PDGF−BBと活性酸素種はまた別の信号伝達体、即ち、PI3KやAktのように細胞生存に関係した信号伝達経路とも連関されている。
【００１１】
MAPKやAktの伝達経路は互いに異なる効果を有する独立的な２個の伝達体であるが、最近はこの二つの経路間にも混線が存在するという主張が提起されている［Guan KL, Figueroa C, Brtva TR, et al. Negative regulation of the serine/threonine kinase B-Raf by Akt. J Biol Chem. Sep 1 2000; 275(35):27354-27359; Zimmermann S, Moelling K. Phosphorylation and regulation of Raf by Akt(protein kinase B). Science. Nov 26 1999;286(5445):1741-1744; Rommel C, Clarke BA, Zimmermann S, Et al. Differentiation stage-specific inhibition of the Raf-MEK-ERK pathway by Akt. Science. Nov 26 1999;286(5445):1738-1741］。
【００１２】
Radix Salviae miltiorrhizaeは中国で“丹参”として知られている大衆的に使われている薬剤であり、血液循環を改善させ浮腫を減少させる効果があることで知られている。丹参は血管拡張や抗高血圧、抗凝固および抗菌などの作用があり、慢性心不全を持つラットに対して腎臓機能の向上効果が見られたという報告がある。
【００１３】
最近、本発明の発明者は前述した作用の主要物質であるリソスペルメートＢ（Lithospermate B）を丹参（S. miltiorrhizae）から分離することに成功した。本発明者らは以前、ＬＡＢの強力な抗酸化効果が糖尿病性ネフロパシー（腎症）を持つマウスの活性酸素種を減少させることで腎症を改善させるという報告を行っている［Lee GT, Ha H, Jung M, et al. Delayed treatment with lithospermate B attenuates experimental diabetic renal injury. J Am Soc Nephrol. Mar 2003;14(3):709-720; Yokozawa T, Oura H, Lee TW, et al. Augmentation of renal response by magnesium lithospermate B. Nephron. 1991;57(1):78-83; Fung KP, Wu J. Zeng LH, et al. Lithospermic acid B as an antioxidant-based protector of cultured ventricular myocytes and aortic endothelial cells of rabbits. Life Sci. 1993;53(12):PL189-193; Chung HY, Yokozawa T, Oura H. Effect of extract from Salviae miltiorrhizae radix on uremic rats. Chem Pharm Bull(Tokyo). Sep 1986;34(9):3818-3822］。
【非特許文献１】Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature. Apr 29 1993;362(6423):801-809
【非特許文献２】Vinters HV, Berliner JA. The blood vessel wall as an insulin target tissue. Diabete Metab. Jul 1987;13(3Pt 2):294-300
【非特許文献３】Nishio E, Watanabe Y. Homocysteine as a modulator of                  platelet-derived growth factor action in vascular smooth muscle cells: a possible role for hydrogen peroxide. Br J Pharmacol. Sep 1997;122(2):269-274
【非特許文献４】Sundaresan M, Yu ZX, Ferrans VJ, et al. Requirement for generation of H2O2 for platelet-derived growth factor signal transduction. Science. Oct 13 1995;270(5234):296-299
【非特許文献５】Takano H, Zou Y, Hasegawa H, et al. Oxidative stress-induced signal transduction pathway in cardiac myocytes: involvement of ROS in heart diseases. Antioxid Redox Signal. Dec 2003;5(6):789-794
【非特許文献６】Finkel T. Oxygen radicals and signaling. Curr Opin Cell Biol. Apr 1998;10(2):248-253
【非特許文献７】Graves  LM, Bornfeldt KE, Sidhu JS, et al. Platelet-derived growth factor stimulates protein kinase A through a mitogen-activated protein kinase-dependent pathway in human arterial smooth muscle cells. J Biol Chem. Jan 5 1996;271(1):501-511
【非特許文献８】Force T, Bonventre JV. Growth factors and mitogen-ctivated protein kinases. Hypertension. Jan 1998;31(1 Pt 2):152-161
【非特許文献９】Guan KL, Figueroa C, Brtva TR, et al. Negative regulation of the serine/threonine kinase B-Raf by Akt. J Biol Chem. Sep 1 2000; 275(35):27354-27359
【非特許文献１０】Zimmermann S, Moelling K. Phosphorylation and regulation of Raf by Akt(protein kinase B). Science. Nov 26 1999;286(5445):1741-1744
【非特許文献１１】Rommel C, Clarke BA, Zimmermann S, Et al. Differentiation stage-specific inhibition of the Raf-MEK-ERK pathway by Akt. Science. Nov 26 1999;286(5445):1738-1741
【非特許文献１２】Lee GT, Ha H, Jung M, et al. Delayed treatment with lithospermate B attenuates experimental diabetic renal injury. J Am Soc Nephrol. Mar 2003;14(3):709-720
【非特許文献１３】Yokozawa T, Oura H, Lee TW, et al. Augmentation of renal response by magnesium lithospermate B. Nephron. 1991;57(1):78-83
【非特許文献１４】Fung KP, Wu J. Zeng LH, et al. Lithospermic acid B as an antioxidant-based protector of cultured ventricular myocytes and aortic endothelial cells of rabbits. Life Sci. 1993;53(12):PL189-193
【非特許文献１５】Chung HY, Yokozawa T, Oura H. Effect of extract from Salviae miltiorrhizae radix on uremic rats. Chem Pharm Bull(Tokyo). Sep 1986;34(9):3818-3822
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
そこで、本発明の発明者はLABの強力な抗酸化効果が血管平滑筋細胞の増殖および移動を抑制し、アテローム性動脈硬化の予防および治療に有効であることを発見した。従って、本発明はアテローム動脈硬化の予防および治療のために、有効成分としてLAB を含有する血管平滑筋細胞（Vascular smooth muscle cell）の増殖と移動用薬剤組成物を提供することにその目的がある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の第１の視点は、有効成分としてリソスペルメートＢ（Lithospermate B）を含有する血管平滑筋細胞（Vascular smooth muscle cell）の増殖と移動抑制用組成物をその特徴とする。
【００１６】
また、本発明の第２の視点は、有効成分としてリソスペルメートＢを含有するアテローム性動脈硬化の治療用薬剤組成物を提供することである。
【００１７】
本発明の第１番目と第２番目の視点は、該組成物が経口的あるいは非経口的投与用に製剤化されていることが好ましい。
【００１８】
また、本発明の第３の視点は、有効成分としてリソスペルメートＢを含有する血管平滑筋細胞の増殖と移動抑制ための健康食品を提供するものである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のLABは、VSMCの増殖と移動を阻止しそれによってアテローム性動脈硬化を治療する治療効果を付与することができるので、本発明は好ましくない影響を何ら伴わずに医薬および機能性食品を供給できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の上記および他の目的および特徴は、添付図面に関連して理解すれば、本発明の以下の記述から明らかになるであろう。
【００２１】
一実施態様では、本発明は血管平滑筋細胞(以下、'VSMC'という）の増殖と移動を抑制するリソスペルメートB(以下、'LAB'という)を含む医薬組成物を提供する。
【００２２】
別の実施態様では、本発明はアテローム性動脈硬化を治療するためのLABを含む医薬組成物を提供する。
【００２３】
更なる実施態様では、本発明はVSMCの防止増殖と移動のための有効成分としてLABを含む健康食品を提供する。特に、この発明はアテローム性動脈硬化を治療するための有効成分として丹参（Salviae miltiorrhiza）から分離されたLABを含む医薬組成物を提供する。    
【００２４】
本発明で使用した下記化学式１に表されるLABは丹参（Salviae miltiorrhizae）から分離するか、または従来の有機合成方法により製造することができる。
【００２５】
【化１】
2007051139.tif 000002
【００２６】
LABは血管平滑筋細胞の増殖および移動を抑制する優れた効果を有することが確認された。 従って、LABまたはその薬学的に許容可能な塩は、血管平滑筋細胞の増殖および移動の抑制やアテローム性動脈硬化の治療に使用することができる。
【００２７】
本発明の薬剤組成物は臨床投与時、経口または非経口で投与、例えば静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用することができ、一般的に医薬品の形態で使用される。
【００２８】
本発明の組成物は経口投与用剤形、例えば錠剤、トローチ剤薬用キャンディ、水溶性または油性懸濁液、粉剤または顆粒、ハードまたはソフトカプセル、シロップまたはエリキシル剤に製剤化される。錠剤およびカプセルなどの剤形に製剤するためにラクトース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アミロペクチン、セルロースまたはゼラチンのような結合剤、第二リン酸カルシウムのような賦形剤、トウモロコシまたはサツマイモの澱粉のような崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリルフマル酸ナトリウムまたはポリエチレングリコールワックスのような潤滑剤が含有される。
【００２９】
カプセル剤形の場合は前述した物質以外にも脂肪油のような液体担体を含有する。
【００３０】
また、本発明の薬剤組成物は非経口で投与することができ、非経口投与は皮下注射、静脈注射、または筋肉注射のような注射方式による。
【００３１】
非経口投与用剤形に製剤化するためにはＬＡＢを安定剤または緩衝剤と一緒に水に混合して溶液または懸濁液を製造し、これをアンプルまたはバイアルの単位投与形態に製剤する。
【００３２】
また、前記有効成分の投与容量は一般的に成人患者の体重１ｋｇ当たり１〜１００ｍｇ／日であり、５〜５０ｍｇ／日が好ましく、医師または薬剤師の判断に従って１〜数回、一日２〜３回の粉末投与をすることが好ましい。
【００３３】
また、本発明では、健康食品とは、前記有効成分を飲料、茶類、香辛料、ガム、菓子類などの食品素材に添加するか、またはカプセル、粉末、懸濁液などに製造した食品として、これを摂取した後、健康上の特定効果をもたらすことを意味するが、一般薬品とは異なり、食品を原料とし、薬品の長期服用時に発生し得る副作用などがないという長所を持つ。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明を下記実施例に基づいて更に詳しく説明するが、本発明はこれらの例に限定されない。
【００３５】
（参照例１）スプラギューダウレイ（Sprague-Dawley）系ラットの血管平滑筋細胞の分離および培養
約１００〜１５０ｇのスプラギューダウレイ（Sprague-Dawley）系ラットの胸大動脈からコラゲナーゼ消化法を利用して血管平滑筋細胞を分離した後、先行研究で記述した内容に従って培養した［Gennaro G, Menard C, Giasson E, et al. Role of p44/p42 MAP kinase in the age-dependent increase in vascular smooth muscle cell proliferation and neointimal formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. Feb 1 2003;23(2):204-210; Hamaguchi A, Kim S, Izumi Y, et al. Contribution of extracellular signal-regulated kinase to angiotensin II-induced transforming growth factor-betal expression in vascular smooth muscle cells. Hypertension. Jul 1999;34(1):126-131］。
【００３６】
１０％（ｖ／ｖ）非働化ウシ胎児血清（heat inactivated fetal bovine serum）、１００単位／ｍＬペニシリン、そして１００ｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したダルベッコ（Dulbecco’s）変性イーグル培地（DMEM）を培養液として使用し、３７℃、湿度９５％の５％ＣＯ２を含有した恒温水槽器で血管平滑筋細胞を培養した。細胞にPDGF−BBを処理するのに先立ち、血清が含有していない培地で２４時間処理した後、LABや別の試薬を前処理した後、PDGF−BBの有無による反応を分析した。PDGF−BB（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）は１０ｎｇ／ｍＬを使用し、LABは濃度別に処理して最大３０μＭまで処理したが、最大濃度でも細胞の毒性は見られなかった。
【００３７】
VSMCはPDGF−BBによる治療前24時間血清を含まない培養液で処理し、LABあるいは他の試薬でよび処理した後に、PDGF-BBが存在しているかあるいは含まれていない場合の反応を分析した。使用したPDGF-BB(シグマ−アルドリッチ（Aldrich)、セントルイス、MO、米国)は10ng/mLで、LABは、濃度を30μMまで変えて使用したが、最高濃度でも望ましくない反応は観察されなかった。
【００３８】
（参照例２）  細胞増殖機能の測定
LDH法：１２個のウエルプレートに各ウエル当り血管平滑筋細胞（１×１０４個）を１０％FBSが含有されたDMEM（４００μＬ）に入れてＶＳＭＣを安定させた後、別の試薬処理に先立って血清がない培地に２４時間置き、細胞の成長および分化を停止させた。その後、LAB（１、５、１０、２０、３０μＭ）やU０１２６（１，４−ジアミノ−２，３−dyacyano−１，４−ビス（２−アミノ−フェニルチオ）ブタンジエン；MEK抑制剤）１０μＭ、ＬＹ２９４００２（（２−（４−モルホリニル）−８−フェニル）−４H−１−ベンゾピラン−４−ワン；PI3K抑制剤）４０μＭ、もしくは２０ｍＭ Ｎ−アセチルシステイン（NAC）で１時間前処理した後、PDGF−BB １０ｎｇ／ｍＬで２４時間処理した。PBSで２度洗浄し、０．５％Triton−X１００を使用して細胞を分解し、乳酸脱水素酵素（LDH）の酵素活性度をCytoTox-ONETM assay kit（Promega，Madison，WI，USA）で、蛍光は５６０／５９０ｎｍで測定した。
【００３９】
MTT法：前記のＬＤＨ方法により１２枚のウエルプレートに血管平滑筋細胞を準備して試薬で処理した。水溶性で黄色のメチルーチアゾーエテラゾリウム（MTT）［Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA］がミトコンドリアのスクシニルデヒドロゲナーゼの作用により不溶性で青色のホルマザンに変わる程度を測定する比色法を使用したが、これは細胞の代謝の程度を測定することのできる方法であり、生きている細胞の数を反映すると言える。０．５ｇ／ｍＬのMTTを入れて４時間恒温恒湿の水槽器で培養させた後、４００Ｌのジメチルスルホキシド（DMSO）を入れてホルマザン結晶を溶かした後、波長５７０ｎｍでELISA プレートリーダ（Spectra MAX3 340，Molecular devices Corp，Sunnyvale CA，USA）で光学濃度を測定した。
【００４０】
（参照例３）  細胞移動の測定
８μｍの気孔を有するポリカーボネート膜からなるコラーゲンでコーティングしたトランスウエル組織培養インサート（collagen-coated transwell tissue culture inserts）を利用した変更を加えたボイデン（Ｂｏｙｄｅｎ）チェンバー方法を使用して［Brown C, Pan X, Hassid A. Nitric oxide and C-type atrial natriuretic peptide stimulate primary aortic smooth muscle cell migration via a cGMP-dependent mechanism: relationship to microfilament dissociation and altered cell morphology. Circ Res. Apr 2 1999;84(6):655-667］により血管平滑筋細胞の移動を測定した。３．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの血管平滑筋細胞を血清が含まれていないＤＭＥＭ培養液に浮遊しておき、これにＬＡＢを濃度別に処理して３０分間３７℃で培養した。その後、０．５ｍＬの血清が含まれていないDMEMを単独またはPDGF−BB １０ｎｇ／ｍＬと一緒に処理してチェンバーの下側に置き、１００μＬの細胞浮遊物（最終３．０×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）をチェンバーの上側に添加して３７℃で１６時間培養させた。その後、細胞を固定してヘマトキシリンで染色してフィルタを乾燥させた後、現像した。
【００４１】
（参照例４）  細胞内活性酸素種の量の測定
細胞内活性酸素種の量を以前の研究報告書に記述した通り測定した［Hamaguchi A, Kim S, Izumi Y, et al. Contribution of extracellular signal-regulated kinase to angiotensin II-induced transforming growth factor-betal expression in vascular smooth muscle cells. Hypertension. Jul 1999;34(1):126-131］。血管平滑筋細胞を血清が含まれていない培養液に２４時間置いて細胞成長を中止させた後、LAB １、５、１０、２０、３０μＭで１時間前処理した後、１０ｎｇ／ｍＬのPDGF−BBで１０分間処理するか、または１００μＭのＨ２Ｏ２で１分間処理してから、暗室で５−（アンド−６）−クロロメチル−２'，７’−ジクロロヒドロフルオレセイン二酢酸（CM−H2DCF−DA：Molecular Probes Inc., Eurogene, OR, USA）の中で１０分間培養し、蛍光顕微鏡で培養した細胞と活性酸素種の生成を観察した。
【００４２】
（参照例５）  ウエスタンブロット分析
血管平滑筋細胞をPBSで洗浄し、溶解バッファ（２５ｍＭ トリス HCl、ｐH７．４，２５ｍＭ NaCl、２５ｍＭ NaF、２５ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭバナジウム酸ナトリウム、２．５ｍＭ EDTA、２．５ｍＭ EGTA、０．０５％（ｗｔ／ｖｏｌ）トリトンX−１００、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）SDS、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）デオキシコール酸塩、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ノニデットP−４０、５ｇ／ｍＬロイペプチン、５ｇ／ｍＬアプロチニン、１ｍＭ PMSF）で溶解した。細胞をかき集めて１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上層液のタンパク質濃度をブラッドフォード法（Bradford assay）で測定した。タンパク質はSDS−PAGEの条件下で変性させ、ニトロセルロース膜に移した。膜は５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳と０．１％ Tween２０が含有されたTBS（TBS−T）の混合液に入れ、３時間室温に置いておいた。そしてブロットを抗ERK１／２や抗Akt抗体（Cell signaling Technologh, Berely. MA, USA）と一緒に４℃で６時間置いた。膜はTBS−Tで４回洗浄し、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（１：２，０００希釈液）に抱合された抗ウサギIgG抗体を入れて室温に１時間置いた。ECL試薬で検出された免疫反応性バンドをHyperfilm−ECL（Amersham Life Science, Little Chalfont, UK）を利用して現像した。免疫反応性バンドはデンシトメトリーで定量して対照群と比較した。
【００４３】
（参照例６）アテローム性動脈硬化を有する動物モデル
白色オスのスプラギューダウレイ（Sprague-Dawley）（３００ｇ）を対象に、２つのフレンチ・フォガティ血栓摘出カテーテル（French Fogarty embolectomy catheter）を左外頚動脈を通して挿入した後、共通の頚動脈に任意的に血管損傷を与えるために生理食塩水を入れて膨らませたカテーテルを共通の頚動脈で上下に３回動かし、血管を拡張させて内皮細胞を脱落させ、損傷モデルを作った。総３０匹を使用して３群に分けて比較するが、１群は何も処置を与えなかった対照群、２群は血管損傷のみ与えた群、３群はLABを服用させて血管損傷を与えた群として、各々１０匹ずつ実験した。LAB（１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）は、血管を損傷させる２日前から血管を損傷させた後２８日目まで総３０日間、腹腔内に注入した。血管を損傷させてから２８日目のＳＤラットの頚動脈を切り取った後ネズミを殺し、４％ホルムアルデヒドで固定し、ヘマトキシリン−エオシンで染色した。損傷された血管の中間部位を各々２〜４個程度の切片で分析し、この時、コンピュータ形態計測（SCNイメージ）で形態学的分析を行った。血管の中間層（media，M）の中で新成された部分（neointimal area，N）の比率を百分率で表示した（N／M％）。
【００４４】
（実施例１）  LABがPDGF−BBにより誘発される血管平滑筋細胞の増殖に及ぼす影響
LABがPDGF−BBにより誘発される血管平滑筋細胞の増殖を減少させるかを調べるため下記実験を行った。血管平滑筋細胞を血清が含まれていない培養液に２４時間置き、細胞増殖を抑制させておいた後、LABで濃度別（１、５、１０、２０、３０μM）に前処理し、１０ｎｇ／ｍＬのPDGF−BBを２４時間処理した。血管細胞の増殖程度は先で説明した通り、LDHとMTT法を通して対照群と比較・分析した［図１］。図１Ａに図示した通り、LABを前処理した場合、PDGF−BBによる血管平滑筋細胞の増殖はLABの濃度と比例して減少した。LAB濃度を３０μMまで処理したが、MTTやLDH法において細胞の毒性を見せなかったためLABの細胞毒性によって増殖が抑制されないことが分かった。
【００４５】
LABの分子レベルでの反応機構およびその信号の伝達過程を調べるため、PDGF−BBにより血管平滑筋細胞の増殖を抑制するU０１２６（２０μＭ，MEK抑制剤）、ＬＹ２９４００２（４０μＭ，PI3K抑制剤）、そして細胞内で抗酸化作用を行うNAC（２０ｍＭ）などのような様々な信号伝達過程抑制剤を使用して実験を行った［図１Ｂ］。しかし、ＳＢ２０２１９０（ｐ３８ MAPK抑制剤）やJNK抑制剤I（JNK抑制剤）はPDGF−BBによる血管平滑筋細胞の増殖抑制効果を示さなかった。
【００４６】
（実施例２）  LABがPDGF−BBにより誘発される血管平滑筋細胞の移動に及ぼす影響
LABは血管平滑筋細胞の増殖だけでなく移動またはアテローム性動脈硬化発生に重要な役割を果たすことが知られている。したがって前述したように変更ボイデンチェンバー法（modified Boyden chamber method）を利用してLABがPDGF−BBにより誘発される血管平滑筋細胞の移動を抑制するかを調べた。図２の結果のように、PDGF−BBにより血管細胞の移動が増加したが（〜６０％）、LABを前処理した場合、濃度と比例してその移動程度が減少することが分かった。
【００４７】
（実施例３）  LABがPDGF−BBによる血管平滑筋細胞内の活性酸素種生成に及ぼす影響
活性酸素種が、細胞内の信号伝達過程を媒介する様々なサイトカインや成長因子の中間媒介物質の役割を果たすということが知られている。PDGF−BBもやはり、細胞内の活性酸素種生成を促進させる物質として知られている。したがって、本研究ではLABがPDGF−BBにより誘発される細胞内の活性酸素種生成を抑制する効果があるか調査した。
【００４８】
まず、過酸化物感受性蛍光プローブDCFを利用してPDGF−BBにより生成される細胞内活性酸素種の量を測定した。図３Ａの（Ｂ−１）の結果から分かるように、PDGF−BBによりDCFの蛍光プローブの量が２．７倍高く測定された。PDGF−BBによるDCFの蛍光プローブは一時的に増加したが、５分間のみ増加蛍光を示し、その量は２０分間持続された。そのため本実験ではPDGF−BBを１０分間処理した。LABを前処理する場合、PDGF−BBの単独処理の際、よりDGFの蛍光プローブの量が減少した［図３Ａの（Ａ）］。ＰＤＧＦ−ＢＢにより生成される活性酸素種の量はLABの濃度と比例して減少した［図３Ｂの（Ｂ）］。過酸化水素は細胞内の活性酸素種生成を増加させるが、LABは過酸化水素のこのような効果を濃度と比例して減少させた［図３Ａの（Ｃ）］。
【００４９】
（実施例４）  LABがPDGF−BBによる血管平滑筋細胞の増殖を抑制させるメカニズム
血管平滑筋細胞を増殖させる正確なメカニズムについては、まだはっきり知られていない。タンパク質キナーゼのリン酸化および脱リン酸化反応は様々なタンパク質合成に重要な役割を果たす［Servant MJ, Giasson E, Meloche S. Inhibition of growth factor-induced protein synthesis by a selective MEK inhibitor in aortic smooth muscle cells. J Biol Chem. Jul 5 1996;271(27):16047-16052］。
【００５０】
図１Ｂに表されるように、Ｕ０１２６（２０μＭ）とＬＹ２９４００２（４０μＭ）はPDGF−BBによりLDHとMTT活性を抑制した。したがって、PDGF−BBにより血管平滑筋細胞の増殖を引き起こす信号伝達過程を調べるため、PDGF−BBがERK１／２やAktのような下位信号伝達過程を活性化させるかを調査した。図４Ａおよび図５Ａに見られるように、PDGF−BBを処理する場合、ERK１／２は１１倍、Aktは７倍も活性が増加した。しかし、LABは濃度と比例してPDGF−BBによるAktやERK１／２のリン酸化を抑制し、特に３０Mで最大効果を見せた［図４Ｂ、図５Ｂ］。
【００５１】
LABが細胞内の活性酸素種を減少させることが血管平滑筋細胞の増殖を抑制することと関連があるのかを確認するために、PDGF−BBで処理する前にLABを抗酸化剤で前処理して細胞増殖の抑制程度を比較した。ERK１／２リン酸化の場合、LABは０．８倍、NACは０．６倍減少し、Aktリン酸化の場合、LABは８倍、NACは３．４倍減少した［図４Ｃ、図５Ｃ］。
【００５２】
次に、PDGF−BBによるERK１／２とAktリン酸化の過程間の連関性を調べた。ウエスタンブロット分析の結果から分かるように、Aktリン酸化はＬＹ２９４００２によってのみ減少したが（３．５倍）、ERK１／２リン酸化はＬＹ２９４００２とＵ０１２６の全てで減少した。即ち、PDGF−BBによるAktリン酸化がERK１／２リン酸化より上位信号伝達過程であると推測される［図４Ｃ、図５Ｃ］。
【００５３】
（実施例５）  動脈硬化動物モデルにおいてLABが新生内膜過形成に及ぼす影響
スプラギューダウレイ（Sprague−Dawley）系ラットを対象に、先で言及した経皮経管的血管拡張（PTA）を使用して血管を損傷させた。PTA施術の２日前からLAB１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙやプラシーボを投与し、施術後２０日目にネズミを殺し、内膜中膜複合体厚（Intima−Media Thickness：IMT）を測定した。図６の通り、血管損傷を与えなかった対照群と比較して、LABを投与したラットはプラシーボを投与したラットに比べてIMTの増加が著しく低かった。
【００５４】
（実施例６）  SDラットに対する経口投与による急性毒性実験
６週齢のSPF SDラットを使用して急性毒性実験を実施した。群当り２匹ずつの動物にLABを各々０．５％メチルセルロース溶液に懸濁し、１ｇ／ｋｇ／１ｍｌの容量で１回、経口投与した。試験物質の投与後、動物の斃死可否、臨床症状、体重変化を観察して血液学的検査と血液生化学的検査を実施し、剖検して肉眼で腹腔臓器と胸腔臓器の異常可否を観察した。試験結果、試験物質を投与した全ての動物において異常な臨床症状や斃死した動物はいなかったが、体重変化、血液検査、血液生化学検査、剖検所見などからも毒性変化は観察されなかった。以上の結果、実験に使われた化合物は５００ｍｇ／ｋｇまで全てのラットにおいて毒性変化を示さず、経口投与の最小致死量（LD５０）は５００ｍｇ／ｋｇ以上の安全な物質と判断された。
【００５５】
（製剤例１）シロップ剤の製造
本発明のLABを有効成分２％（重量／ｖｏｌ）として含有するシロップを下記方法により製造した。
【００５６】
LAB、サッカリン、糖を温水８０ｇに溶解した。この溶液を冷却させた後、これにグリセリン、サッカリン、香味料、エタノール、ソルビン酸および蒸留水とからなる溶液を製造して混合した。この混合物に容量が１００ｍｌになるように水を添加した。前記シロップ剤の構成成分は下記の通りである。
【００５７】
LAB                ２ｇ
サッカリン          ０．８ｇ
糖                  ２５．４ｇ
グリセリン          ８．０ｇ
香味料              ０．０４ｇ
エタノール          ４．０ｇ
ソルビン酸          ０．４ｇ
蒸留水              適量
【００５８】
（製剤例２）  錠剤の製造
有効成分１５ｍｇが含有された錠剤を下記のような方法で製造した。
【００５９】
LAB２５０ｇをラクトース１７５．９ｇ、ジャガイモ澱粉１８０ｇおよびコロイド性ケイ素３２ｇと混合した。この混合物に１０％ゼラチン溶液を添加した後、粉砕して１４メッシュの篩にかけた。これを乾燥させてこれにジャガイモ澱粉１６０ｇ、滑石５０ｇおよびステアリン酸マグネシウム５ｇを添加し、得られた混合物で錠剤を製造した。
【００６０】
（製剤例３）  注射液剤の製造
ＬＡＢ１０ｍｇが含有された注射液剤を下記のような方法で製造した。
【００６１】
LAB１ｇ、塩化ナトリウム０．６ｇおよびアスコルビン酸０．１ｇを蒸留水に溶解し、１００ｍｌの溶液を作った。この溶液を瓶に入れて２０℃で３０分間加熱して滅菌させた。
【００６２】
（製剤例４）  飲料の製造
LAB５００ｍｇを適当量の水に溶解した後、補助成分としてビタミンＣ、甘味剤としてクエン酸、クエン酸ナトリウム、オリゴ糖を適当量ほど加え、保存剤として適当量の安息香酸ナトリウムを加えた後、水を加えて１００ｍｌの飲料用造成物を製造した。
【００６３】
この時、タウリンやミオイノシトール、葉酸、パントテン酸などを単独もしくは一緒に添加することができる。
【産業上利用可能性】
【００６４】
以上説明したとおり、本発明によるLABは血管平滑筋細胞の増殖と移動を抑制し、副作用のない動脈硬化の治療効果を示すため、機能性食品および医薬品の素材として有用に使用することができ、医薬産業上非常に有用である。
【００６５】
本発明をその好適な実施態様に言及して詳細に記載したが、当業者であれば、本開示内容を考慮すれば本発明の範囲及び精神の範囲内で変更改良を加えることが出来ることは理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】LABおよび様々な信号伝達過程抑制剤がPDGF−BBによる血管平滑筋細胞の増殖に及ぼす影響を表すグラフである。図１Ａ： VSMCをLABが無い場合と種々の投与量の場合において1時間培養し、10ng/mlのPDGF-BBでさらに24時間刺激した。図１Ｂ：VSMCs１時間１０μM Uの0126(MEKインヒビター)、40μMのLY294002(PI3Kインヒビター)および20mM N-アセチルシステイン(NAC)が無い場合とある場合において1時間培養し、10ng/mlのPDGF-BBでさらに24時間刺激した。その時以降、生存細胞の数をLDHおよびMTT測定法を使用して算定した。数値は平均値±SDです。*、p<0.001はコントロールとの比較。#、p<0.001はPDGF-BB単独で処理したグループの存在(n=18)との比較。
【図２】LABが血管平滑筋細胞の移動に及ぼす影響を表すグラフである。１ウエルあたり3.0xの105細胞と化学誘引物質としてPDGF-BB(10ng/ml)で種付けしたトランスウエル（Transwel）細胞培養チャンバーを使用し１６時間移動分析評価を行った。フィルタの外側の上あるいはプレートの上の細胞を同一のフィルタの８つのランダムに選択した領域においてx200倍率で数えた。各コラムは平均±s.e.を表す (n=6)。 コントロール値と比べ*p<0.05。
【図３Ａ】LABがPDGF−BBによる細胞内活性酸素種の生成に及ぼす影響を表すものである。図３Ａの第一列（Ａ）は、VSMCにおける細胞内のROSレベルへのLABの影響を示している(A-1: コントロール, A-2: 2.5 μM LAB, A-3: 5 μM LAB, A-4: 10 μM LAB)。図３Ａの２番目の列（Ｂ）は、10 ng/mL PDGF-BB (B-1: PDGF-BB, B-2: PDGF-BB + 2.5 μM LAB, B-3: PDGF-BB + 5 μM LAB, B-4: PDGF-BB + 10 μM LABによって誘発された細胞内ROSレベルへのLABの効果に示す。図３Ａの３番目の列（Ｃ）は、100 μMH2O2 (C-1: H2O2, C-2: H2O2 + 2.5 μM LAB, C-3: H2O2 + 5 μM LAB, C-4: H2O2 + 10 μM LABによって誘発された細胞内のROSレベルへのLABの影響に示す。
【図３Ｂ】LABがPDGF−BBによる細胞内活性酸素種の生成に及ぼす影響を表すものである。図３Ｂは平均±SDの数値を示す。*、p<0.001はコントロールとの比較。#、p<0.001はPDGF-BBだけで処理したグループとの比較。%、p<0.001はH2O2だけで処理したグループ(n=5）との比較。（さらに詳しく述べると、VSMCをLABが無い場合と種々の投与量の場合において1時間培養し、10ng/mlのPDGF-BBでさらに１０分間あるいは１００μMH2O2で1分刺激した。そして、細胞を10分間、暗所でDCF-DAで培養した。培養皿を蛍光顕微鏡画像システムによって観察して、セル蛍光を視覚化した)。
【図４】LABがPDGF−BBによる細胞内Aktのリン酸化および活性に及ぼす影響を表すものである。図４Ａ：VSMCを５分から１時間の範囲内で10ng/mlのPDGF-BBによって処理した。図４Ｂ：VSMCにおけるPDGF-BB誘引Aktの活性化へのLABの影響。VSMCは1時間、LAB(1、5、10、20、および30μM)の指摘した濃度で予備処理し、次に、さらに10分間、10ng/mLのPDGF−BBにより刺激した。図４Ｃ：VSMCsにおけるPDGF-BB誘引Akt活性化への様々なインヒビターの影響。VSMCを10μM のU0126、10μMのSB203580、40μMのLY294002、および20mMのNAC及び３０μMのLABで1時間予備処理し、次に10 ng/mLのPDGF-BBで１０分間刺激した。数値は平均値±SD。*、p<0.001はコントロールとの比較。#、p<0.001はPDGF-BB単独で処理したグループ(n=3)との比較。
【図５】LABがPDGF−BBによって誘発されている細胞内ERK１／２のリン酸化および活性に及ぼすＬＡＢの影響を示すグラフである。図５Ａ:PDGF-BBはVSMC中でERK1/2のリン酸化を増加させた。VSMCを５分から１時間の範囲内で10ng/mlのPDGF-BBによって処理した。図５Ｂ:VSMCにおけるPDGF-BB誘引ERK1/2の活性化へのLABの影響。VSMCは１時間、LAB(1、5、10、20、および30μM)の指摘した濃度で予備処理し、次に、さらに１０分間、10ngのPDGF−BBにより刺激した。図５Ｃ:VSMCsにおけるPDGF-BB誘引ERK1/2の活性化への様々なインヒビターの影響。VSMCを10μM のU0126、10μMのSB203580、40μMのLY294002、および20mMのNAC及び３０μMのLABで1時間予備処理し、次に10 ng/mLの PDGF-BBで１０分間刺激した。数値は平均値±SD。*、p<0.001はコントロールとの比較。#、p<0.001はPDGF-BB単独で処理したグループ(n=3)との比較。
【図６Ａ】血管損傷動物モデルにおいてLABが血管の再狭窄を抑制する効果を表すものである。代表的な観察結果は損傷のない血管(Ａ)、バルーンで損傷した血管(Ｂ)及びLAB処理したバルーン損傷血管(Ｃ)の断面図である。また、データは各群の動物研究(B)からのバルーン損傷後の総頚動脈の新生内膜/メディア比によって定量化される(B)。矢印は、新生内膜層が存在する弾性の積層体を示す。全ての画像はx200倍率で撮った。数値は平均±SDです。#、p<0.05は基本値との比較。*、p<0.01はコントロール(n=8)との比較。
【図６Ｂ】血管損傷動物モデルにおいて LAB が血管の再狭窄を抑制する効果を表すグラフである。また、データは各群の動物研究(6B)からのバルーン損傷後の総頚動脈の新生内膜/メディア比によって定量化される。
【図１】
2007051139.tif 000003
【図２】
2007051139.tif 000004
【図６Ｂ】
2007051139.tif 000005
【図３Ａ】
2007051139.tif 000006
【図３Ｂ】
2007051139.tif 000007
【図４】
2007051139.tif 000008
【図５】
2007051139.tif 000009
【図６Ａ】
2007051139.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成18年10月3日(2006.10.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
リソスペルメートＢ（lithospermate B）を有効成分として含有することを特徴とする血管平滑筋細胞（Vascular smooth muscle cell）の増殖と移動抑制用薬剤組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
そこで、本発明の発明者はLABの強力な抗酸化効果が血管平滑筋細胞の増殖および移動を抑制し、アテローム性動脈硬化の予防および治療に有効であることを発見した。従って、本発明はアテローム動脈硬化の予防および治療のために、有効成分としてLAB を含有する血管平滑筋細胞（Vascular smooth muscle cell）の増殖と移動抑制用薬剤組成物を提供することにその目的がある。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
更なる実施態様では、本発明はVSMCの増殖と移動の予防のための有効成分としてLABを含む健康食品を提供する。特に、この発明はアテローム性動脈硬化を治療するための有効成分として丹参（Salviae miltiorrhiza）から分離されたLABを含む医薬組成物を提供する。
【外国語明細書】
[TITLE OF THE INVENTION]
PREVENTION AND TREATMENT OF ATHEROSCLEROSIS WITH LITHOSPERMATE B
[TECHNICAL FIELD]
[0001] This invention relates to lithospermate B (‘LAB’ hereinafter) that inhibits proliferation and migration of vascular smooth muscle cells (‘VSMC’ hereinafter). More specifically, this invention relates to a pharmaceutical composition comprising LAB isolated from Salviae miltiorrhiza as an active ingredient for treating atherosclerosis.
[BACKGROUND ART]
[0002] Generally, atherosclerosis is known as a major cause of cardiac infarction, cerebral hemorrhage, and peripheral vascular diseases and it accounts for more than half of the deaths in advanced countries. According to the report from American Heart Association, for example, [Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature. Apr. 29, 1993; 362 (6423): 801-809], about 500,000 people die of cardiac infarction every year while about 150,000 people die of cerebral infarction in U.S.
[0003] ‘VSMC’, being one of the major components that forms blood vessel wall, serves to maintain the shape and the physiological activities of blood vessels[Vinters HV, Berliner JA. The blood vessel wall as an insulin target tissue. Diabete Metab. Jul 1987;13(3 Pt 2):294-300]. In addition, the quantitative and qualitative increase of ‘VSMC’ as well as itsmigration play a key role in developing atherosclerosis.
[0004] Various factors such as growth factor, oxidation stress, physical shear and the like are associated with the development of atherosclerosis. Platelet-derived growth factor is a dimer connected by a disulfide bond and binds tyrosine kinase receptor, which is known to be involved in various cellular functions including gene expression, growth, differentiation, and migration of cells and the like.
[0005] It has been already known that platelet-derived growth factor enables to proliferate various kinds of cells, in particular, vascular smooth muscle cells. Therefore, numerous researches have been conducted to find ways to prevent atherosclerosis by inhibiting the proliferation of ‘VSMC’ by means of platelet-derived growth factor [Nishio E, Watanabe Y. Homocysteine as a modulator of platelet-derived growth factor action in vascular smooth muscle cells: a possible role for hydrogen peroxide. Br J Pharmacol. Sep 1997;122(2):269-274]. 
[0006] Further, growth factors are known to increase the level of reactive oxygen species (‘ROS’ hereinafter) in the ‘VSMC’ [Sundaresan M, Yu ZX, Ferrans VJ, et al. Requirement for generation of H2O2 for platelet-derived growth factor signal transduction. Science. Oct 13 1995;270(5234):296-299].
[0007]‘RSO’ is very unstable and also highly reactive so that it induces an irreversible chemical reaction to polymers such as proteins and lipids. These harmful chemical reactions deteriorate cellular functions and cause cell apoptosis [Takano H, Zou Y, Hasegawa H, et al. Oxidative stress-induced signal transduction pathways in cardiac myocytes: involvement of ROS in heart diseases. Antioxid Redox Signal. Dec 2003;5(6):789-794].
[0008] ROS such as superoxide anion (O2-) or hydrogen peroxide (H2O2) is known as a product of cellular respiration and there have been many reports recently disclosing that the ROS is involved in cellular signal transduction in mammals [Finkel T. Oxygen radicals and signaling. Curr Opin Cell Biol. Apr 1998;10(2):248-253].
[0009] Growth factors such as ROS or PDGF-BB are known to activate signal transduction pathways such as Raf-MEK-MAPK and phosphatidyl inositol 4,5-bisphosphate 3-kinase(PI3K)-Akt.     For example, p42/44 extracellular-regulated kinase(ERK 1/2), as one of MAPK families, is a well known modulator of signal transduction in ‘VSMC’ [Graves LM, Bornfeldt KE, Sidhu JS, et al. Platelet-derived growth factor stimulates protein kinase A through a mitogen-activated protein kinase-dependent pathway in human arterial smooth muscle cells. J Biol Chem. Jan 5 1996;271(1):505-511; Force T, Bonventre JV. Growth factors and mitogen-activated protein kinases. Hypertension. Jan 1998;31(1 Pt 2):152-161.]. 
[0010] The activation of these signal transduction modulators leads to phosphorylation of many proteins in cell wall or cytoplasm thereby regulating transcription of genes. For example,   the signal transduction pathways of Raf, MAPK kinase 1/2(MEK-1/2) and ERK1/2 are also regulated by the phosphorylation. The activation of  ERK1/2 is a very critical modulator in signal transduction of growth factors and is also essential for the proliferation and migration of ‘VSMC’. Besides, ROS and PDGF-BB are also related to other signal transduction modulators, that is, other signal transduction pathway related to cell vitality as in the PI3K and Akt.
[0011] MAPK or Akt transduction pathways have been known as two independent modulators having different effects. However, recent reports suggested that there may be present a cross-talk between the two pathways [Guan KL, Figueroa C, Brtva TR, et al. Negative regulation of the serine/threonine kinase B-Raf by Akt. J Biol Chem. Sep 1 2000;275(35):27354-27359;  Zimmermann S, Moelling K. Phosphorylation and regulation of Raf by Akt(protein kinase B). Science. Nov 26 1999;286(5445):1741-1744; Rommel C, Clarke BA, Zimmermann S, et al. Differentiation stage-specific inhibition of the Raf-MEK-ERK pathway by Akt. Science. Nov 26 1999;286(5445):1738-1741.].
[0012] Radix Salviae miltiorrhizae, known as a sage plant in China, is a publicly known herbal medicine that can improve blood circulation and reduce edema. It has been also reported to have effects of vasodilation, antihypertension, anti-coagulation and antibacterial activities. In addition, it has been also reported that it is effective in improving kidney functions in rats with chronic kidney failure.
[0013] Recently, the inventors of the present invention succeeded in isolating Lithospermate B, a major substance exhibiting the above-mentioned functions, S. miltiorrhizae. The inventors have previously reported that the strong antioxidizing effect of LAB improves the nephrotic in diabetic nephritic rats by reducing ROS [Lee GT, Ha H, Jung M, et al. Delayed treatment with lithospermate B attenuates experimental diabetic renal injury. J Am Soc Nephrol. Mar 2003;14(3):709-720;     Yokozawa T, Oura H, Lee TW, et al. Augmentation of renal response by magnesium lithospermate B. Nephron. 1991;57(1):78-83;  Fung KP, Wu J, Zeng LH, et al. Lithospermic acid B as an antioxidant-based protector of cultured ventricular myocytes and aortic endothelial cells of rabbits. Life Sci. 1993;53(12):PL189-193; Chung HY, Yokozawa T, Oura H. Effect of extract from Salviae miltiorrhizae radix on uremic rats. Chem Pharm Bull (Tokyo). Sep 1986;34(9):3818-3822.]
[DISCLOSURE OF THE INVENTION]
[PROBLEM TO BE SOLVED BY THE INVENTION]
[0014] The inventors of the present invention discovered that LAB has such a strong anti-oxidizing activity to prevent vascular smooth muscle tissues from proliferation and migration thereby preventing and treating atherosclerosis. Therefore, the object of this invention is to provide a pharmaceutical composition for proliferation and migration of vascular smooth muscle tissues comprising LAB as an active ingredient to prevent and treat atherosclerosis.
[COUNTERMEASURES TO SOLVE THE PROBLEM]
[0015] A first aspect of the present invention is to provide a pharmaceutical composition comprising lithospermate B as an active ingredient for inhibiting proliferation and migration of vascular muscle cells.
[0016] A second aspect of the present invention is to provide a pharmaceutical composition comprising lithospermate B as an active ingredient for treating atherosclerosis.
[0017] In the first and second aspects of the present invention, it is preferable that said composition is formulated for oral or parenteral administration.
[0018] A third aspect of the present invention is to provide a health food comprising lithospermate B as an active ingredient for preventing proliferation and migration of vascular smooth muscle cells.
[EFFECT OF THE IINVENTION] 
[0019] Since LAB of the present invention can inhibit the proliferation and migration of VSMC thereby providing a therapeutic effect for treating atherosclerosis, the present invention can provide a pharmaceutical drug and a functional food without any adverse effects.
[PREFERRED EMBODIMENTS FOR CARRYING OUT THE INVENTION]
[0020] The above and other objects and features of the present invention will become apparent from the following description of the invention, when taken in conjunction with the accompanying drawings, wherein:
[0021] In an embodiment, this invention provides a pharmaceutical composition comprising lithospermate B (‘LAB’ hereinafter) that inhibits proliferation and migration of vascular smooth muscle cells (‘VSMC’ hereinafter). 
[0022] In another embodiment, this invention provides a pharmaceutical composition comprising LAB for treating atherosclerosis.
[0023] In a further embodiment, this invention provides a health food comprising LAB as an active ingredient for preventing proliferation and migration of VSMC. In particular, this invention provides a pharmaceutical composition comprising LAB isolated from Salviae miltiorrhiza as an active ingredient for treating atherosclerosis.
[0024] The LAB expressed in the following formula 1 used in the present invention can be isolated from Salviae miltiorrhiza or prepared via the conventional organic synthesis.
[0025]
【化１】
2007051139.tif 000011
[0026] LAB has been shown to have excellent effect in inhibiting proliferation and migration of VSMC. Therefore, LAB or its pharmaceutically acceptable salts can be used to treat atherosclerosis by inhibiting the proliferation and migration of VSMC.
[0027] The pharmaceutical composition of the present invention can be administrated orally or parenterally, for example, intravenously, subcutaneously, peritoneally or tropically, and can be used as a conventional type of a pharmaceutical drug.
[0028] The pharmaceutical composition of the present invention can be formulated in the form of oral preparations such as tablets, troches, lozenges, hydrophilic or lipophilic suspensions, powders, granules, hard or soft capsules, syrups or elixirs.
[0029] For the formulation into tablets or capsules, the pharmaceutical composition of the present invention comprises a binder such as lactose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, amylopectin, cellulose or gelatine; an excipient such as dicalcium phosphate; a disintegrater such as corn starch or sweet potato starch; and a lubricator such as magnesium state, calcium stearate, sodium stearylfumarate, or polyethylene glycol wax.
[0030] In case of capsule preparations, they can further comprise a liquid carrier such as fat oil in addition to the above-mentioned substances.
[0031] The pharmaceutical composition of the present invention can be administrated parenterally including subcutaneous, intravenous, or intramuscular injections.
[0032] To formulate the pharmaceutical composition of the present invention into a preparation for parental administration it is necessary to mix LAB with a stabilizer or a buffer in the presence of water or prepare it into a suspension and then manufactured in the unit dosage form of ampoules or vials.
[0033] The effective amount of administration of the active ingredient is 1 - 100 mg/day per 1 kg of an adult patient, preferably 5 - 50 mg/day. It can be administered from one to several times daily upon consultation with a physician or a pharmacist, preferably 2 -3 times daily.
[0034] In the present invention, health food refers to those where the above active ingredient is added to food substance such as drinks, teas, spices, gums, snacks, etc., or is manufactured in the form of capsules, powders, and suspensions, dietary intake of which results in a certain health effect but does not exhibit any known adverse effects even when administered for a long period of time unlike in the case of administration of normal medicinal drugs.
[Examples]
[0035] This invention is explained in more detail based on the following Examples, however, they should not be construed as limiting the scope of this invention.
[0036] Reference Example 1: Separation of Vascular Smooth Muscle Cells of a Sprague-Dawley and Their Culture
[0037] Vascular smooth muscle cells (‘VSMC’ hereinafter) were separated from thoracic aorta of a Sprague-Dawley weighted about 100-150g by using collagenase digestion method and then cultured them according to the method disclosed in previous studies [Gennaro G, Menard C, Giasson E, et al. Role of p44/p42 MAP kinase in the age-dependent increase in vascular smooth muscle cell proliferation and neointimal formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. Feb 1 2003;23(2):204-210.; Hamaguchi A, Kim S, Izumi Y, et al. Contribution of extracellular signal-regulated kinase to angiotensin II-induced transforming growth factor-beta1 expression in vascular smooth muscle cells. Hypertension. Jul 1999;34(1):126-131].
[0038] The VSMC was cultured in a waterbath kept at 37 °C with the condition of 95% of humidity and 5% CO2 using Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) containing 10% (v/v) heat inactivated fetal bovine serum, 100 unit/mL penicillin, and 100 g/mL streptomycin as a culture medium.
[0039] The VSMC was treated in a culture medium not containing serum for 24 hrs prior to treatment with PDGF-BB, and the reaction according to the presence or absence of PDGF-BB was analyzed after pretreating with LAB or other reagents. PDGF-BB(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) used was 10 ng/mL, and LAB was used by varying its concentration up to 30μM and there was no adverse reaction observed even in the highest concentration.
[0040] Reference Example 2: Measurement of Cell Proliferation Capability
[0041] LDH Assay: LDH assay: VSMC was stabilized by adding them into DMEM (400 mL) containing 10% FBS in each of the 12 well plates (1 x 104 cells/well) and placed for 24 hrs without serum prior to treatment with other reagents to stop cell proliferation and differentiation. Then, the cells were pretreated with LAB (1, 5, 10, 20, 30μM), U0126(1,4-diamino-2,3-dyacyano-1,4-bis (2-amino-phenylthio) butandiene; a MEK inhibitor) 10 mM, LY294002 ((2-(4-morpholinyl)-8-phenyl)-4H-1-benzopyran-4-one; a PI3K inhibitor) 40 mM, or 20 mM NAC(N-acetylcysteine) for 1 hr, and then treated with PDGF-BB 10 ng/mL for 24hrs. The cells were then washed twice with PBS, lysed by using 0.5% Triton-X100, and then the activity of lactate dehydronase(LDH) was measured by using CytoTox-ONETM assay kit (Promega, Madison, WI, USA) with fluorescence at 560/590 nm. 
[0042] MTT Assay: VSMCwas prepared in the 12 well plates as in the above LDH Assay and treated with reagent. Colorimetric method, which measures the level of conversion of the yellow water-soluble methyl-thiazo-etetrazolium (MTT)[Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA] into the bluish non-water-soluble formazan by succinyl dehydrogenase of mitochondria. This method can measure the level of metabolism of live cells and thus the result can reflect the number of live cells.     MTT in the amount of 0.5 g/mL was cultured in a waterbath with constant temperature and humidity for 4 hrs, added with 400 L of  dimethylsulfoxide(DMSO) to dissolve formazan crystal, and then optical densitywas measured at 570 nm by using ELISA plate reader(Spectra MAX3 340, Molecular devices Corp, Sunnyvale CA, USA).
[0043] Reference Example 3: Measurement of Cell Migration
[0044] The migration of VSMC with 8 mm of pores was measured by using modified Boyden chamber method[Brown C, Pan X, Hassid A. Nitric oxide and C-type atrial natriuretic peptide stimulate primary aortic smooth muscle cell migration via a cGMP-dependent mechanism: relationship to microfilament dissociation and altered cell morphology. Circ Res. Apr 2 1999;84(6):655-667], which utilizes collagen-coated transwell tissue culture inserts consisting of polycarbonate membrane. 3.0 x 106 cells/mL of the above vascular smooth muscle cells were allowed to float in a culture medium without serum, treated with LAB with various concentrations and then cultured at 37°C for 30 min. Then, the cells were treated with either 0.5 mL DMEM without serum or 0.5 mL DMEM without serum along with PDGF-BB 10 ng/mL and then placed in the lower part of a chamber. 100 μL of the folating materials of the above cells (final 3.0 x 105cells/well) was added to the upper part of the chamber and cultured at 37°C for 16 hrs. The cells were then fixed, dyed with hematoxylin, and filters were dried and developed.
[0045] Reference Example 4: Measurement of the Amount of Reactive Oxygen Species
[0046] The amount of reactive oxygen species in cells was measured as described in the previous report [Hamaguchi A, Kim S, Izumi Y, et al. Contribution of extracellular signal-regulated kinase to angiotensin II-induced transforming growth factor-beta1 expression in vascular smooth muscle cells. Hypertension. Jul 1999;34(1):126-131].     VSMC was cultured in a culture medium without serum for 24 hrs to stop cell proliferation and then pretreated with LAB with various concentrations of 1, 5, 10, 20, 30 μM for 1 hr. The cells were treated with either 10 ng/mL of PDGF-BB for 10 min or with 100 μM H2O2 for 1 min and then cultured in the presence of 5-(and-6)-chloromethyl-2',7'-dichlorohydrofluorescein diacetate(CM-H2DCF-DA: Molecular Probes Inc., Eurogene, OR, USA) in the dark room for 10 min and cultured cells and generation of reactive oxygen species were observed by using fluorescent microscope. 
[0047] Reference Example 5: Western Blot Analysis
[0048] VSMC was washed with PBS and then dissolved in lysis buffer(25mM Tris HCl, pH 7.4, 25mM NaCl, 25mM NaF, 25mM sodium pyrophosphate, 1mM sodium vanadate, 2.5mM EDTA, 2.5mM EGTA, 0.05% (wt/vol) Triton X-100, 0.5% (wt/vol) SDS, 0.5% (wt/vol) deoxycholate, 0.5% (wt/vol) Nonidet P-40, 5 g/mL leupeptin, 5 g/mL aprotinin, and 1mM PMSF). The cells were collected and centrifuged at   13,000 rpm for 15 min and the protein concentration of the resulting supernatant was measured by Bradford assay. The proteins were denatured and were   subjected to SDS-PAGE and then blotted onto nitrocellulose membranes.     The membranes were placed in 5%(w/v) non-fat dry milk in TBS with 0.1% Tween20(TBS-T) and then placed at room temperature for 3 hrs. The blots were placed at 4 °C along with anti-ERK1/2 or anti-Akt antibodies(Cell signaling Technologh, Berely. MA, USA) for 16 hrs.    The membranes were washed 4 times with TBS-T, added with anti-rabbit IgG antibody conjugated with horseradish peroxidase(1:2,000 diluent) and then placed at room temperature for 1 hr.   The immunoreactive bands detected by ECL reagents were developed by Hyperfilm-ECL(Amersham Life Science, Little Chalfont, UK). Thebands showing positive responses were quantitated by densitometry and then compared with that of control.
[0049] Reference Example 6: Animal Model with Atheroscleosis
[0050] Two French Forgarty embolectomy catheters were inserted into white male Sprague-Dawley (300 g) through external carotid arteries, and blood vessels were intentionally damaged by moving catheters, which were swollen by adding a physiological saline solution, 3 times vertically within the common carotid thereby expanding blood vessels while shedding off the endothelial cells.  A total of 30 rats were divided into 3 groups (10 rats/group) and used in this experiment: group 1 was not treated; group 2 was damaged with their blood vessels; and group 3 was treated with LAB and then damaged with their blood vessels.     LAB (10 mg/kg/day) was injected intravenously for a period of 30 days (i.e., from 2 days prior to the blood vessel damage to 28 days after the blood vessel damage). The rats were sacrificed on the 28th day after the blood vessel damage by ablating carotid artery and it was fixed with 4% formaldehyde and then dyed with hematoxylin-eosin.  The mid parts of the damaged blood vessel were cut into 2-4 parts and analyzed via computerized morphometry(SCN Image).    The portion of the newly generated part (neointimal area, N) in the mid parts were indicated in percentage (N/M %).
[0051] Example 1: Influence of LAB on Proliferation of VSMC induced by PDGF-BB
[0052] To investigate whether LAB decreases the proliferation of VSMC induced by PDGF-BB an experiment was performed as follows. The VSMC was placed in a culture medium not containing serum for 24 hrs to inhibit cell proliferation, and then pretreated with LAB with various concentrations of 1, 5, 10, 20, 30μM and treated with PDGF-BB for 24 hrs. The extent of VSMC proliferation was compared with that of control as stated above via LDH and MTT assays (Fig.1). As shown in Fig.1, VSMC proliferation was decreased in proportion to the concentration of LAB. The concentration of LAB was used up to 30μM but there was no cytotoxic activities observed (data not shown) and therefore it was concluded that the above decrease in VSMC proliferation was not due to the cytotoxicity of LAB.
[0053] To investigate the reaction mechanism of LAB at the molecular level and its signal transduction pathway, several inhibitors of VSMC proliferation such as U0126 (20μM, MEK inhibitor), LY294002(40 μM, PI3K inhibitor), and NAC(20 mM), which is involved in intracellular antioxidation (Fig. 1B), were tested. However, SB202190(p38 MAPK inhibitor) and JNK inhibitor I(JNK inhibitor) showed no distinct inhibitory activity against VSMC proliferation induced by PDGF-BB (data not shown).
[0054] Example 2: Influence of LAB on Migration of VSMC induced by PDGF-BB
[0055] It is known that LAB plays an important role in proliferation of VSMC as well as development of atherosclerosis. To investigate whether LAB decreases the migration of VSMC induced by PDGF-BB, an experiment was performed as follows by using the aforementioned modified Boyden chamber method. As shown in Fig.2, the migration of VSMC was increased by PDGF-BB about 60%. However, when it was pretreated with LAB, the migration was decreased in proportion to the concentration of LAB.
[0056] Example 3: Influence of LAB on Production of Reactive Oxygen Species present in intracellular VSMC induced by PDGF-BB
[0057] It has been known that reactive oxygen species serve as an intermediate mediator for cytokines or other growth factors which are involved in signal transduction pathways. PDGF-BB has been also well known that it can expedite the generation of intracellular reactive oxygen species. Therefore, to investigate whether LAB inhibits the production of VSMC induced by PDGF-BB an experiment was performed as follows.
[0058] First, the amount of intracellular reactive oxygen species generated by PDGF-BB was measured by using peroxide-sensitive fluorophore DCF. As shown in Fig. 3A (B-1), the amount of intracellular reactive oxygen species generated by PDGF-BB evaluated with DCF fluorescence was 2.7 times greater. DCF fluorescence due to PDGF-BB was temporarily increased within 5 min and maintained for about 20 min. In this experiment, LAB was treated with PDGF-BB for 10 min.     When LAB was pretreated, the amount of DCF fluorescence was decreased as compared to when it was treated only with PDGF-BB [Fig. 3A(A)]. The amount of intracellular reactive oxygen species generated by PDGF-BB  PDGF-BB was decreased in proportion to the concentration of LAB[Fig. 3A(B)].  Further, LAB decreased the activity of hydrogen peroxide, which increases the generation of intracellular reactive oxygen species, in proportion to its concentration (Fig. 3A(C)).
[0059] Example 4: LAB’s Mechanism of Inhibiting VSMC Proliferation induced by PDGF-BB
[0060] It is not yet clearly known how VSMC grows. The phosphorylation and dephosphorylation of protein kinase play crucial roles in various kinds of protein syntheses [Servant MJ, Giasson E, Meloche S. Inhibition of growth factor-induced protein synthesis by a selective MEK inhibitor in aortic smooth muscle cells. J Biol Chem. Jul 5 1996;271(27):16047-16052.]. 
[0061] In Fig. 1B, it is shown that both U0126 (20 μM) and LY294002 (40 μM) inhibited activities of LDH and MTT induced by PDGF-BB. As a way to investigate the signal transduction pathway involved in VSMC proliferation induced by PDGF-BB, an experiment was conducted to examine whether PDGF-BB activates a relatively lower signal transduction pathway such as ERK1/2 and Akt. As shown in Figs. 4A and 5A, there were increases in activity level when treated with PDGF-BB; that is, the activity of ERK1/2 was increased 11 folds while that of Akt increased 7 folds. However, it was shown that LAB inhibits phosphorylation of ERK1/2 and Akt due to PDGF-BB in proportion to its concentration, and it was most effective at 30 mM [Figs. 4B, 5B].
[0062] To examine whether the decrease in intracellular reactive oxygen species by LAB is related with the inhibition of VSMC proliferation, LAB was pretreated with an antioxidizing agent before treating with PDGF-BB and the inhibitory level of VSMC proliferation. The results showed that LAB decreased 0.8 fold and NAC decreased 0.6 fold in the event of ERK1/2 phosphorylation; whereas LAB decreased 8 folds and NAC decreased 3.4 folds in the event of Akt phosphorylation[Figs. 4C, 5C].
[0063] Then, the relationship between the phosphorylation of ERK1/2 and Akt due to PDGF-BB. As shown in the Western blot analysis, the phosphorylation of Akt was decreased only by LY294002 (3.5 folds), whereas ERK1/2 phosphorylation was decreased by both LY294002 and U0126. Therefore, it is speculated that Akt phosphorylation due to PDGF-BB is in an upper signal transduction pathway than ERK1/2 phosphorylation in its hierarchy [Figs. 4C, 5C].
[0064] Example 5: Effect of LAB on neointimal hyperplasia in an Animal Model
[0065] White Sprague-Dawley rats were damaged by using percutaneous transluminal angioplastyas (‘PTA’) as stated above. LAB in the amount of 10 mg/kg/day or placebo was administered to the above rats starting from 2 days prior to ‘PTA’ surgery. On the 2oth day after the surgery the rats were sacrificed and the Intima-Media Thickness (‘IMT’) was measured. The rats were compared with undamaged rats and the result shows that the increase in ‘IMT’ was much low in LAB-treated rats than in those treated with placebo.
[0066] Example 6: Test of Acute Toxicity due to Oral Administration in SD Rats
[0067] Acute toxicity test was performed using 6 week old SPF SD rats. The SD rats were divided two per each group and each rat was orally administered once with LAB in the amount of 1 g/kg/1mL, which was suspended in 0.5% methylcellulose. After the above administration, the rats were subjected to examination with regard to survival, clinical symptoms, change in body weight, and the like and also hematological examination, biochemical blood test. Further, autopsies were performed to observe abnormalities in abdominal organs. The results showed that all experimental rats survived and also there were observed no abnormal clinical symptoms, no toxicities and other abnormalities in the above-mentioned tests.  Therefore, it was concluded that the tested compound has no toxicity to rats up to 500 mg/kg and the LD50 was greater than 500 mg/kg thus proving that the compound is a safe material.
[0068] Preparation Example 1: Syrup Preparation
[0069] A syrup comprising LAB of the present invention in the amount of 2%(wt/vol.) as an active ingredient was prepared as follows.
[0070] LAB, saccharin, and sugar were dissolved in 80 g of warm water. The solution was cooled down and added with a mixture consisting of glycerine, saccharin, flavour, ethanol, sorbic acid and distilled water, which was then added with water to a final volume of 100 mL.
[0071] The components of the above syrup preparation is as follows:
LAB                            2 g 
saccharin                    0.8 g 
sugar                       25.4 g 
glycerin                     8.0 g 
flavor                      0.04 g 
ethanol                      4.0 g 
sorbic acid                  0.4 g 
distilled water             adequate 
[0072] Preparation Example 2: Tablet Preparation
[0073] A tablet comprising LAB in the amount of 15 mg was prepared as follows.
[0074] LAB in the amount of 250 g was mixed with 175.9 g of lactose, 180 g of potato starch, and 32 g of colloidal silicic acid. The mixture was added with 10% gelatine solution, then pulverized and then passed through a mesh of 14 in size. The resultant was dried and added with 160 g of potato starch, 50 g of talc and 5 g of magnesium stearate to finally obtain a tablet.
[0075] Preparation Example 3: Injection Preparation
[0076] An injection preparation comprising LAB in the amount of 10 mg was prepared as follows.
[0077] One gram of LAB, 0.6 g of sodium chloride and 0.1 g of ascorbic acid were dissolved in distilled water to a final volume of 100 mL. The mixture was added into a vial and sterilized by heating at 20 °C for 30 min. 
[0078] Preparation Example 4 : Drink Preparation
[0079] An injection preparation comprising LAB in the amount of 10 mg was prepared as follows.
[0080] LAB in the amount of 500 mg was dissolved in an adequate amount of water and then added with an adequate amount of vitamin C as a supplementary component; with an adequate amount of citric acid, sodium citrate, and with an adequate amount of oligosaccharide as a sweetener; with an adequate amount of sodium benzoate as a preservative; and then added with water to a final volume of 100 mL to finally obtain a drink preparation. Here, taurine, Myo-inositol, folic acid, or pantothenic acid can be added alone or in combination.
[INDUSTRIAL APPLICABILITY]
[0081] As stated above, LAB of the present invention can inhibit the proliferation and migration of VSMC thereby providing a therapeutic effect for treating atherosclerosis. Therefore, the LAB of the present invention can be usefully used as a functional food and a pharmaceutical drug without any adverse effects.
[0082] The invention has been described in detail with reference to preferred embodiments thereof.  However, it will be appreciated that those skilled in the art, upon consideration of the disclosure, may make modifications and improvements within the scope and spirit of the invention.
[BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS]
[0083] Figs. 1A-1B respectively show the effects of LAB and other various inhibitors in signal transduction pathway on proliferation of vascular smooth muscle cells due to PDGF-BB [1A: VSMCs were incubated in the absence or presence of varying doses of LAB for 1 h and stimulated with 10 ng/ml of PDGF-BB for an additional 24 h. 1B: VSMCs were incubated in the absence or presence of 10μM U0126 (MEK inhibitor), 40μM LY294002 (PI3K inhibitor) and 20 mM N-acetylcysteine (NAC) for 1 h and stimulated with 10 ng/ml PDGF-BB for an additional 24 h. After then, the number of living cells were assessed using LDH and MTT assay. Values are means ± SD. *, p< 0.001 compared with the control; #, p< 0.001 compared with the presence of PDGF-BB alone treated group (n=18)];
Fig. 2 is a graph showing the effect of LAB on migration of VSMC [16h migration assays were performed using Transwell cell culture chambers seeded with 3.0 x 105 cells per well and PDGF-BB (10 ng/ml) as the chemoattractant.  Cells on the outer side of filter or on plates were counted in the eight randomly chosen fields of duplicated filters at x200 magnification.  Each column represents the mean ± s.e. (n=6). * p<0.05, when compared to the control value.]; 
First row (A) of Fig. 3Ashows the effect of LAB on intracellular ROS levels in VSMCs (A-1: Control, A-2: 2.5 μM LAB, A-3: 5 μM LAB, A-4: 10 μM LAB);
Second row (B) of Fig. 3A shows the effect of LAB on intracellular ROS levels induced by 10 ng/mL PDGF-BB (B-1: PDGF-BB, B-2: PDGF-BB + 2.5 μM LAB, B-3: PDGF-BB + 5 μM LAB, B-4: PDGF-BB + 10 μM LAB);
Third row (C) of Fig. 3A shows the effect of LAB on intracellular ROS levels induced by 100 μM H2O2 (C-1: H2O2, C-2: H2O2 + 2.5 μM LAB, C-3: H2O2 + 5 μM LAB, C-4: H2O2 + 10 μM LAB)
Fig. 3B shows Values that mean ± SD. *, p< 0.001 compared with the control; #, p< 0.001 compared with PDGF-BB alone treated group; %, p< 0.001 compared with H2O2 alone treated group (n=5) (more particularly, VSMCs were incubated in the absence or presence of varying doses of LAB for 1 h and stimulated with 10 ng/mL PDGF-BB for 10 min or 100μM H2O2for 1 min. Then the cells were incubated in the dark for 10 min with DCF-DA. Culture dishes were inspected with a fluorescence microscope imaging system, and the cellular fluorescence was visualized);
Fig. 4A-4C are graphs showing the effects of LAB on phosphorylation and activity of intracellular Akt induced by PDGF-BB [4A: VSMCs were treated with 10 ng/ml PDGF-BB for time periods ranging from 5 min to 1 h. 4B: Effect of LAB on PDGF-BB-induced Akt activation in VSMCs. VSMCs were pretreated with the indicated concentrations of LAB(1, 5, 10, 20 and 30 μM) for 1 h, then stimulated with 10 ng/mL PDGF-BB for an additional 10 min. 4C: Effect of various inhibitors on PDGF-BB-induced Akt activation in VSMCs. VSMCs were pretreated with 10μM U0126, 10 μM SB203580, 40 μM LY294002 and 20mM NAC and 30μM LAB for 1h, and then stimulated with 10 ng/mL PDGF-BB for 10 min. Values are means ± SD. *, p< 0.001 compared with the control; #, p< 0.001 compared with the PDGF-BB alone treated group (n=3).];
Fig. 5A-5C are graphs showing the effects of LAB on phosphorylation and activity of intracellular ERK1/2 induced by PDGF-BB [5A: PDGF-BB increased ERK 1/2 posphorylation in VSMCs.  VSMCs were treated with 10 ng/mL PDGF-BB for time periods ranging from 5 min to 1 h. 5B: Effect of LAB on PDGF-BB-induced ERK 1/2 activation in VSMCs. VSMCs were pretreated with the indicated concentrations of LAB (1, 5, 10, 20 and 30μM) for 1 h, then stimulated with 10ng PDGF-BB for an additional 10 min. 5C: Effect of various inhibitors on PDGF-BB-induced ERK 1/2 activation in VSMCs. VSMCs were pretreated with 10μM U0126, 10μM SB203580, 40μM LY294002 and 20mM NAC and 30μM LAB for 1h, and then stimulated with 10 ng/mL PDGF-BB for 10 min. Values are means ± SD. *, p< 0.001 compared with the control ; #, p< 0.001 compared with the PDGF-BB alone treated group (n=3).]; and
Figs. 6A to 6C show the effects of LAB inhibiting re-stricturization of vessels in an animal model with injured vessels [Representative observations are sections from an uninjured vessel(6A), a balloon-injured vessel(6B), and a LAB-treated balloon injured vessel(6C). Data are also quantified by the neointima/media ratio of common carotid arteries after balloon injury from each group of animal studies(6B). Arrows indicate the elastic laminae over which are the neointimal layers. All pitures were taken at x 200 magnification. Values are means± SD. #, p< 0.05 compared with the basal ; *, p< 0.01 compared with the control (n=8).] 
【Claim 1 】Apharmaceutical composition comprising lithospermate B as an active ingredient for inhibiting proliferation and migration of vascular muscle cells.
【Claim 2 】Apharmaceutical composition comprising lithospermate B as an active ingredient for treating atherosclerosis.
【Claim 3 】The pharmaceutical composition according to claim 1 or claim 2, wherein said composition is formulated for oral or parenteral administration.
【Claim 4 】A health food comprising lithospermate B as an active ingredient for preventing proliferation and migration of vascular smooth muscle cells.
[PROBLEM]The object of this invention is to provide a pharmaceutical composition for proliferation and migration of vascular smooth muscle tissues to prevent and treat atherosclerosis.
[COUNTERMEANS FOR SOLVING THE PROBLEM] This invention relates to lithospermate B (‘LAB’ hereinafter) that inhibits proliferation and migration of vascular smooth muscle cells (‘VSMC’ hereinafter), more specifically, a pharmaceutical composition comprising LAB isolated from Salviae miltiorrhiza as an active ingredient for treating atherosclerosis.
[SELECTED DRAWING] NON
【FIG.1】
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【FIG.2】
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【FIG.3A】
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【FIG.3B】
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【FIG.4】
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【FIG.5】
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【FIG.6A】
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【FIG.6B】
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