(57)【要約】    【課題】  簡易な手段によってグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を検出する方法を提供すること。    【解決手段】  ＧＡＧの固定化は、ＧＡＧ溶液に金属イオンを添加し（Ｓｔｅｐ１）、金属イオン添加ＧＡＧ溶液をシリカ基板などの固体媒体上に滴下移行させ（Ｓｔｅｐ２）、ついで乾燥させる（Ｓｔｅｐ３）過程から構成する。固体媒体上の遊離ＧＡＧは溶離液によって除去し（Ｓｔｅｐ４）、残存したＧＡＧを適宜の方法にて観察、測定する（Ｓｔｅｐ５）。【選択図】  図１
2007248340.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコサミノグリカン溶液に金属イオンを添加して金属イオン添加グリコサミノグリカン溶液とし、該金属イオン添加グリコサミノグリカン溶液を固体媒体上に移行させ、ついでこれを乾燥させることによって、グリコサミノグリカンを該固体媒体上に固定化する、グリコサミノグリカン固定化方法。
【請求項２】
前記グリコサミノグリカンは、硫酸化グリコサミノグリカンであることを特徴とする、請求項１に記載のグリコサミノグリカン固定化方法。
【請求項３】
前記金属イオンに係る元素は、Ａｌ、Ｓｃ、Ｇａ、Ｙ、Ｚｒ、Ｉｎ、Ｌａ、Ｙｂ、Ｌｕの少なくともいずれか一つであることを特徴とする、請求項２に記載のグリコサミノグリカン固定化方法。
【請求項４】
前記固体媒体はシリカであることを特徴とする、請求項２または３に記載のグリコサミノグリカン固定化方法。
【請求項５】
前記金属イオン添加グリコサミノグリカン溶液の移行は、前記固体媒体上に該金属イオン添加グリコサミノグリカン溶液を滴下させて液滴を形成させるものであることを特徴とする、請求項２ないし４のいずれかに記載のグリコサミノグリカン固定化方法。
【請求項６】
前記乾燥は、前記固体媒体上に形成された前記液滴の頂点から該固体媒体に向かう溶質の拡散流を自然に生起させるために、自然乾燥とすることを特徴とする、請求項５に記載のグリコサミノグリカン固定化方法。
【請求項７】
グリコサミノグリカン溶液に金属イオンを添加して金属イオン添加グリコサミノグリカン溶液とし、該金属イオン添加グリコサミノグリカン溶液を固体媒体上に移行させ、ついでこれを乾燥させることによってグリコサミノグリカンを該固体媒体上に固定化し、該固体媒体上に固定化されずに残っている遊離のグリコサミノグリカンを溶離液によって除去して固定化されたグリコサミノグリカンのみが残った状態とすることを特徴とする、グリコサミノグリカン検出方法。
【請求項８】
前記金属イオンに係る元素は、Ａｌ、Ｓｃ、Ｇａ、Ｙ、Ｚｒ、Ｉｎ、Ｌａ、Ｙｂ、Ｌｕの少なくともいずれか一つであり、検出目的が特定グリコサミノグリカンの選択的検出であるか否かにより、また該特定グリコサミノグリカンの如何により、添加する一または複数の金属イオン種類を特定することを特徴とする、請求項７に記載のグリコサミノグリカン検出方法。
【請求項９】
前記固定化されたグリコサミノグリカンの観察または測定は、予め被検グリコサミノグリカンを蛍光色素その他適宜の方法により標識しておくか、または前記固体媒体上にて発色処理することにより行うことを特徴とする、請求項８に記載のグリコサミノグリカン検出方法。
【請求項１０】
前記金属イオンにＬａ３＋を用いることにより、各種硫酸化グリコサミノグリカン混合系の中からデルマタン硫酸を選択的に検出可能とすることを特徴とする、請求項８または９に記載のグリコサミノグリカン検出方法。
【請求項１１】
前記金属イオンにＳｃ３＋およびＬａ３＋を用い、溶離液による遊離グリコサミノグリカン除去処理を２段階として、後段階の溶離液にはＬａ３＋を用いることにより、各種硫酸化グリコサミノグリカン混合系の中からコンドロイチン６-硫酸を選択的に検出可能とすることを特徴とする、請求項９または１０に記載のグリコサミノグリカン検出方法。
【請求項１２】
前記固定化されたグリコサミノグリカンの観察または測定のために予め被検グリコサミノグリカンを蛍光色素により標識しておき、測定される蛍光の明度と被検グリコサミノグリカン濃度の関係に基づき定量も併せて可能であることを特徴とする、請求項８ないし１１のいずれかに記載のグリコサミノグリカン検出方法。
【請求項１３】
被検グリコサミノグリカン溶液に添加するための、Ａｌ、Ｓｃ、Ｇａ、Ｙ、Ｚｒ、Ｉｎ、Ｌａ、Ｙｂ、Ｌｕのうち二以上の金属イオンについてそれぞれ個別に準備された金属イオン含有添加溶液と、これにより金属イオンの添加された被検グリコサミノグリカン溶液を移行させた固体媒体上に固定化されずに残った遊離のグリコサミノグリカンを除去するための溶離液とを備えてなることを特徴とする、グリコサミノグリカン検出用溶液セット。
【請求項１４】
下記〈Ａ〉に示す各溶液と、〈Ｂ〉〜〈Ｃ〉の少なくともいずれか一つに示す溶液とを備えてなることを特徴とする、請求項１３に記載のグリコサミノグリカン検出用溶液セット。
〈Ａ〉
〈Ａ１〉硫酸化グリコサミノグリカンの一斉検出に使用可能なＺｒ４＋イオン含有添加溶液。
〈Ａ２〉遊離グリコサミノグリカンの除去処理が１段階で可能な場合に使用可能な、金属イオンが含有されていない溶離液。
〈Ｂ〉デルマタン硫酸の選択的検出に使用可能なＬａ３＋イオン含有添加溶液。
〈Ｃ〉〈Ｃ１〉コンドロイチン６-硫酸の選択的検出に使用可能なＳｃ３＋イオン含有添加溶液、および、
〈Ｃ２〉コンドロイチン６-硫酸の選択的検出の際、遊離グリコサミノグリカンの除去処理の後段階で使用可能なＬａ３＋イオン含有溶離液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はグリコサミノグリカンの固定化方法、検出方法および検出用溶液セットに係り、特に、簡易な手段によって高精度かつ短時間にグリコサミノグリカン（以下、「ＧＡＧ」と略記することがある）の検出、選択的検出および定量を可能とする、ＧＡＧの固定化方法、検出方法および検出用溶液セットに関する。
【背景技術】
【０００２】
グリコサミノグリカンは親水性が非常に強い陰イオン性の多糖である。二糖の繰り返し構造を持ち、コンドロイチン４-硫酸（以下、「Ｃｈ４Ｓ」と略記することがある）、コンドロイチン６-硫酸（以下、「Ｃｈ６Ｓ」と略記することがある）、デルマタン硫酸（以下、「ＤＳ」と略記することがある）などが知られている。これらは生体中では、軟骨、皮膚、角膜などに存在して水分の保持や弾力性を担っており、ＧＡＧが配合された点眼薬やサプリメント等が既に市販されている。ＧＡＧを水溶液から単離・精製するためには、ＧＡＧの陰イオン性官能基と結合するような陽イオンを添加して難溶性として沈殿させる。そのために、塩化セチルピリジウム（ＣＰＣ）や臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムが使用される。この他にも、陽イオン性色素のＡｌｃｉａｎ  ＢｌｕｅやＴｏｌｕｉｄｉｎｅ  Ｂｌｕｅがプロテオグリカンの沈殿生成に、Ｐｂ（II）塩とＣｕ（II）塩がデルマタン硫酸（ＤＳ）とムコケラタン硫酸の沈殿生成に、さらにＢａ（II）塩が細胞顆粒中ＧＡＧの沈殿生成に使用されている。これらの反応は、Ｐｂ（II）塩がイズロン酸含量の高いＤＳに対して沈殿生成するのを除けば、非選択的な反応である。
【０００３】
ＣＰＣを含浸したニトロセルロース製メンブランは、ＧＡＧの固定化とＡｌｃｉａｎ  ＢｌｕｅやＴｏｌｕｉｄｉｎｅ  Ｂｌｕｅによる検出に使用されている。しかし、メンブラン調製、固定化、染色の各操作が煩雑であり、また選択性もない。Ａｌｃｉａｎ  Ｂｌｕｅ−ＧＡＧ錯体は陽電荷を帯びたポリビニリデンフルオリド製メンブランに、ろ過により捕集されるが、ここでも選択性は期待できない。
【０００４】
また、脂質と結合したオリゴ糖がニトロセルロース製メンブラン上にマイクロアレイ状に固定化されたとの報告もあるが、これはタンパク質との相互作用を観察するためのものであり、ＧＡＧ検出が目的ではなく、当然ＧＡＧ検出もなされない。
【０００５】
また、スペルミンとグルタルアルデヒドで処理したポリスチレン製マイクロプレートにヒアルロン酸（以下、「ＨＡ」と略記することがある）を共有結合的に結合させ、これにアグリカンと遊離のＨＡを含む溶液を添加すると、プレートに結合させたＨＡへのアグリカンの結合を遊離のＨＡが阻害するので、結合したアグリカンを定量すれば間接的に遊離のＨＡを定量できる（非特許文献１）。しかし、プレート上のＨＡとアグリカンの反応に一晩必要であり、分析に長時間を要する。
【０００６】
これと同様のマイクロプレートが、ビオチンで標識したコンドロイチン４-硫酸（ｂ-Ｃｈ４Ｓ）の固定化に用いられてもいる。ｂ-Ｃｈ４Ｓのプレートへの結合は静電的なものなので、遊離のＧＡＧによって阻害される。したがって、この阻害作用を利用してＧＡＧの定量が可能である（非特許文献２）。ここで、阻害作用は硫酸基の結合量が多いコンドロイチンとヘパラン硫酸が最も強く、続いてＣｈ４ＳとＤＳが同程度、ＨＡとケラタン硫酸は同程度であるが最も弱い。しかし、Ｃｈ４ＳとＤＳとの分別はできていない。なお、Ｃｈ４ＳとＤＳの分離は電気泳動により可能であるが、これは相当長時間を要するものである。
【０００７】
【非特許文献１】Grigoreas,G.H.A.,Anagnostides,S.Th.and Vynios,D.H.(2003)A solid-phase assay for the quantitative analysis of hyaluronic acid at the nanogram level. Anal.Biochem.,320,179-184.
【非特許文献２】Vynios,D.H.,Faraos,A.,Spyracopoulou,G.,Aletras,A.J. and Tsiganos,C.P.(1999) A solid-phase assay for quantitative analysis of sulfated glycosaminoglycans at the nanogram level.Application to tissue samples. J.Pharm.Biomed.Anal.,21,859-865.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
以上のように従来、ＧＡＧについては種々の分離方法が開発されてきた。しかしながら、従来の方法はいずれも、操作に長時間を要したり、あるいは操作手順が煩雑であり、さらに検出の選択性に乏しいものであった。特に硫酸化ＧＡＧ相互を選択的に検出、定量できる方法は、未だに明らかにされていない。
【０００９】
また、従来のＧＡＧ固定化方法はいずれも、有機陽イオンと疎水性イオンの会合体を形成することに基づくものであり、したがって選択性に乏しい上、固定化するための固体基板も有機ポリマー製のメンブランやプレートであり、調製や操作性の点で、分離・抽出・生成・検出に必ずしも適切な基板ではなかった。ＧＡＧは、健康食品への添加やある種の疾病における存在率の変動に基づく臨床診断の指標としても有用であり、生産管理用、臨床診断用の簡便な検出方法が求められている。
【００１０】
本発明が解決しようとする課題は、上記従来技術の問題点を除き、簡易な手段によってグリコサミノグリカンを固体媒体上に操作性よく固定することができ、高精度かつ短時間でのＧＡＧの検出、選択的検出および定量を可能とする、ＧＡＧの固定化方法、検出方法および検出用溶液セットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本願発明者は上記課題について検討した。具体的には、従来沈殿生成に使用されてはいるが固体媒体への固定化が試みられていない各種金属イオンの固体媒体への固定化について網羅的に検討し、その結果、特定の多価金属イオンをＧＡＧの固定化に用いることに基づいて上記課題の解決が可能であることを見出した。さらに、Ｌａ３＋とＤＳのような、特定の金属イオンと特定のＧＡＧとの相互作用が存在することを見出し、本発明に至った。すなわち、上記課題を解決するための手段として本願で特許請求される発明、もしくは少なくとも開示される発明は、以下の通りである。
【００１２】
（１）  グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）溶液に金属イオンを添加して金属イオン添加グリコサミノグリカン溶液とし、該金属イオン添加グリコサミノグリカン溶液を固体媒体上に移行させ、ついでこれを乾燥させることによって、グリコサミノグリカンを該固体媒体上に固定化する、グリコサミノグリカン固定化方法。
（２）  前記グリコサミノグリカンは、硫酸化グリコサミノグリカンであることを特徴とする、（１）に記載のグリコサミノグリカン固定化方法。
（３）  前記金属イオンに係る元素は、Ａｌ、Ｓｃ、Ｇａ、Ｙ、Ｚｒ、Ｉｎ、Ｌａ、Ｙｂ、Ｌｕの少なくともいずれか一つであることを特徴とする、（２）に記載のグリコサミノグリカン固定化方法。
（４）  前記固体媒体はシリカであることを特徴とする、（２）または（３）に記載のグリコサミノグリカン固定化方法。
（５）  前記金属イオン添加グリコサミノグリカン溶液の移行は、前記固体媒体上に該金属イオン添加グリコサミノグリカン溶液を滴下させて液滴を形成させるものであることを特徴とする、（２）ないし（４）のいずれかに記載のグリコサミノグリカン固定化方法。
（６）  前記乾燥は、前記固体媒体上に形成された前記液滴の頂点から該固体媒体に向かう溶質の拡散流を自然に生起させるために、自然乾燥とすることを特徴とする、（５）に記載のグリコサミノグリカン固定化方法。
【００１３】
（７）  グリコサミノグリカン溶液に金属イオンを添加して金属イオン添加グリコサミノグリカン溶液とし、該金属イオン添加グリコサミノグリカン溶液を固体媒体上に移行させ、ついでこれを乾燥させることによってグリコサミノグリカンを該固体媒体上に固定化し、該固体媒体上に固定化されずに残っている遊離のグリコサミノグリカンを溶離液によって除去して固定化されたグリコサミノグリカンのみが残った状態とすることを特徴とする、グリコサミノグリカン検出方法。
（８）  前記金属イオンに係る元素は、Ａｌ、Ｓｃ、Ｇａ、Ｙ、Ｚｒ、Ｉｎ、Ｌａ、Ｙｂ、Ｌｕの少なくともいずれか一つであり、検出目的が特定グリコサミノグリカンの選択的検出であるか否かにより、また該特定グリコサミノグリカンの如何により、添加する一または複数の金属イオン種類を特定することを特徴とする、（７）に記載のグリコサミノグリカン検出方法。
（９）  前記固定化されたグリコサミノグリカンの観察または測定は、予め被検グリコサミノグリカンを蛍光色素その他適宜の方法により標識しておくか、または前記固体媒体上にて発色処理することにより行うことを特徴とする、（８）に記載のグリコサミノグリカン検出方法。
（１０）  前記金属イオンにＬａ３＋を用いることにより、各種硫酸化グリコサミノグリカン混合系の中からデルマタン硫酸を選択的に検出可能とすることを特徴とする、（８）または（９）に記載のグリコサミノグリカン検出方法。
（１１）  前記金属イオンにＳｃ３＋およびＬａ３＋を用い、溶離液による遊離グリコサミノグリカン除去処理を２段階として、後段階の溶離液にはＬａ３＋を用いることにより、各種硫酸化グリコサミノグリカン混合系の中からコンドロイチン６-硫酸を選択的に検出可能とすることを特徴とする、（９）または（１０）に記載のグリコサミノグリカン検出方法。
【００１４】
（１２）  前記固定化されたグリコサミノグリカンの観察または測定のために予め被検グリコサミノグリカンを蛍光色素により標識しておき、測定される蛍光の明度と被検グリコサミノグリカン濃度の関係に基づき定量も併せて可能であることを特徴とする、（８）ないし（１１）のいずれかに記載のグリコサミノグリカン検出方法。
（１３）  被検グリコサミノグリカン溶液に添加するための、Ａｌ、Ｓｃ、Ｇａ、Ｙ、Ｚｒ、Ｉｎ、Ｌａ、Ｙｂ、Ｌｕのうち二以上の金属イオンについてそれぞれ個別に準備された金属イオン含有添加溶液と、これにより金属イオンの添加された被検グリコサミノグリカン溶液を移行させた固体媒体上に固定化されずに残った遊離のグリコサミノグリカンを除去するための溶離液とを備えてなることを特徴とする、グリコサミノグリカン検出用溶液セット。
（１４）  下記〈Ａ〉に示す各溶液と、〈Ｂ〉〜〈Ｃ〉の少なくともいずれか一つに示す溶液とを備えてなることを特徴とする、請求項１３に記載のグリコサミノグリカン検出用溶液セット。
〈Ａ〉
〈Ａ１〉硫酸化グリコサミノグリカンの一斉検出に使用可能なＺｒ４＋イオン含有添加溶液。
〈Ａ２〉遊離グリコサミノグリカンの除去処理が１段階で可能な場合に使用可能な、金属イオンが含有されていない溶離液。
〈Ｂ〉デルマタン硫酸の選択的検出に使用可能なＬａ３＋イオン含有添加溶液。
〈Ｃ〉〈Ｃ１〉コンドロイチン６-硫酸の選択的検出に使用可能なＳｃ３＋イオン含有添加溶液、および、
〈Ｃ２〉コンドロイチン６-硫酸の選択的検出の際、遊離グリコサミノグリカンの除去処理の後段階で使用可能なＬａ３＋イオン含有溶離液。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のグリコサミノグリカンの固定化方法、検出方法および検出用溶液セットは上述のように構成されるため、これによれば、簡易な手段によってグリコサミノグリカンを固体媒体上に操作性よく固定することができ、高精度かつ短時間でのＧＡＧの検出、優れた選択的検出、および定量が可能となる。特に硫酸化ＧＡＧについては、これらを相互に選択的に検出でき、定量することができる。固定化するための固体基板も有機ポリマー製ではなくシリカを用いることができるため、固体媒体の調製や取扱いの点でも便利である。その上、検出は簡易的な蛍光観察で可能である点も便利である。ＧＡＧは、健康食品への添加やある種の疾病における存在率の変動に基づく臨床診断の指標としても有用であり、生産管理用、臨床診断用の簡便な検出方法を、本発明は提供することができる。
【００１６】
従来の分離方法に対する優位性をより具体的に述べると、本発明は金属イオンを用いるため、従来のように脂質やタンパク質を介した結合よりも熱的に安定であり、経時変化も少ない方法、キットを提供することができる。また金属イオンの種類による選択性があり、選択的検出に便利である。また、有機陽イオン使用のＧＡＧ固定化では、基板調製、固定化、染色の各操作が煩雑な上、過剰の試薬を除去する必要があるが、本発明方法では、金属イオン自体は吸収・蛍光を持つものではないため、固定化に要する時間も１０分程度であって、迅速な検出、定量を行うことができる。また、電気泳動法では高圧電源の準備、支持電解質やアガロースゲル等の支持体の調製が必要であるが、本発明方法では、典型的な例ではシリカ基板１枚があれば足り、しかも自然乾燥中に起こる液滴中の溶液の流れを利用するものであり、分析結果を目視観察することも可能であり、きわめて簡便である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を、図面により詳細に説明する。
図１は、本発明のグリコサミノグリカン固定化方法および検出方法の基本的構成例を示すフロー図である。図に例示するように、本発明のＧＡＧの固定化方法は、ＧＡＧ溶液に金属イオンを添加して金属イオン添加ＧＡＧ溶液とする第１過程（Ｓｔｅｐ１）、金属イオン添加ＧＡＧ溶液を固体媒体上に移行させる第２過程（Ｓｔｅｐ２）、ついでこれを乾燥させる第３過程（Ｓｔｅｐ３）から、基本的に構成される。フロー図中例示の通り、Ｓｔｅｐ１での金属イオン添加は溶液状態にて好適になすことができる。またＳｔｅｐ２では、固体媒体としてシリカ基板などの無機質固体基板を好適に用い、移行は滴下により行うものとすることができる。
【００１８】
かかるフローにより、まずＳｔｅｐ１では、被検ＧＡＧ溶液に金属イオンが添加されて金属イオン添加ＧＡＧ溶液となる。ついでＳｔｅｐ２で、金属イオン添加ＧＡＧ溶液は固体媒体上に移行させられる。そしてＳｔｅｐ３でこれが乾燥されて、ＧＡＧは固体媒体上に固定化される。Ｓｔｅｐ３における乾燥は、滴下されて形成された液滴における溶質挙動を自然な状態で維持するため、自然乾燥とすることが望ましい。
【００１９】
本発明のＧＡＧ固定化方法では、前記金属イオンに係る元素を、Ａｌ、Ｓｃ、Ｇａ、Ｙ、Ｚｒ、Ｉｎ、Ｌａ、Ｙｂ、Ｌｕの少なくともいずれか一つとすることができる。つまり、固定化に用いる金属イオンとしては、特定のものが効果がある。これは実施例に後述する通り、２５種の元素についてその金属イオンを網羅的に検討した結果、明らかにしたものである。中でも後述するように、選択的検出が不要で一斉検出する場合、多くのＧＡＧを固定化したい場合には、Ｚｒ４＋、Ｓｃ３＋、Ａｌ３＋、などを添加するのがよい。また、ＤＳの選択的検出にはＬａ３＋を添加するのがよい。
【００２０】
固体媒体はとしてはシリカ基板を好適に用いることができる。これによれば、ＧＡＧ固定化方法、さらには検出方法を簡易迅速に行うことのできるチップを構成することもできる。
【００２１】
前述の通り、金属イオン添加ＧＡＧ溶液の移行は、固体媒体上に金属イオン添加ＧＡＧ溶液を滴下させて液滴を形成させることによって、良好な結果を得ることができる。これは、液滴における溶質の挙動に基づくものである。つまり、乾燥によって液滴では、金属イオンとＧＡＧが高度に濃縮され、固体媒体上の官能基も関与した相互作用が生じる。水分の蒸発は液滴の頂点で優先的であると考えられ、その結果、頂点付近の濃度が局所的に上昇する。このため、液滴頂点から固体媒体に向かう溶質の拡散流が生じる。
【００２２】
このとき、金属イオンの中には固体媒体表面に保持されているものもあると考えられ、この金属イオンとの相互作用が弱いＧＡＧにおいては最終的に外縁に濃縮されて、乾燥後は溶質が外縁部に主として存在し、逆に強い相互作用を有するＧＡＧは液滴の広い領域に亘って保持され、乾燥後は溶質は全体的に存在することになる。つまり、乾燥後の残存溶質のパターン（形状）もまた、検出ＧＡＧ同定には有益なものであり、本発明のＧＡＧ検出方法はこの保持された溶質（ＧＡＧ）の観察・測定をもって行うものであるため、自然乾燥が望ましいとするものである。
【００２３】
図１は、本発明のグリコサミノグリカン検出方法の基本的構成例をも示すフロー図であるが、該検出方法では、上述の固定化過程（Ｓｔｅｐ１〜３）に続いて、固体媒体上に固定化されずに残っている遊離のＧＡＧを溶離液によって除去して固定化されたＧＡＧのみが残った状態とする第４過程（Ｓｔｅｐ４）が付加される。さらに、このようにして残存した検出対象ＧＡＧを適宜の方法にて観察、測定する過程（Ｓｔｅｐ５）が設けられる。
【００２４】
かかるフローにより、Ｓｔｅｐ４では、固体媒体上に固定化されずに残っている遊離のＧＡＧが溶離液によって除去されて固定化されたＧＡＧのみが残った状態になる。溶離液が、Ｓｔｅｐ３で乾燥された金属イオン添加ＧＡＧ溶液のスポットに対して滴下されると、遊離のＧＡＧは溶離液に溶離するので、直ちにこれをろ紙等によって吸い取ることによって、遊離ＧＡＧを固体媒体上から除去することができる。溶離液には、簡便には水を用いることができるが、これに限定されない。
【００２５】
Ｓｔｅｐ５ではこのようにして残存した検出対象ＧＡＧが適宜の方法にて観察、測定される。Ｓｔｅｐ５における固定化されたＧＡＧの観察または測定は、予め被検ＧＡＧを蛍光色素その他適宜の方法により標識しておくか、または前記固体媒体上にて発色処理することにより、簡易に行うことができる。また実施例に詳述する通り、本発明ＧＡＧ検出方法では、検出目的が特定ＧＡＧの選択的検出であるか否かにより、また特定ＧＡＧが具体的に何であるかにより、添加する一または複数の金属イオン種類を特定して行う。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明の実施例として、シリカ基板上での簡易なＧＡＧ検出法の確立を目的として行った金属イオンとＧＡＧとの選択的相互作用の探索・検討過程を、詳細に説明する。しかしながら、本発明が以下の実施例に限定されるものではない。
＜１  実験方法＞
実験したＧＡＧはＣｈ４Ｓ、Ｃｈ６ＳおよびＤＳである。Ｃｈ４Ｓ、Ｃｈ６ＳおよびＤＳは還元的アミノ化反応により７-アミノ-４-メチルクマリンで蛍光標識し、それぞれ０．１７、０．３３および０．１７ｍｇｍｌ−１水溶液として用いた。金属イオンとの相互作用の探索は、各種金属イオンを含むＧＡＧ溶液１μｌをシリカ基板（２０Ｘ２０ｍｍ）上に滴下し、これを自然乾燥（１０〜１５分間）させた後、５μｌの溶離液をスポットして、ろ紙でこの溶離液を吸収したとき、シリカ基板上にＧＡＧが固定されて残存するか否かを観察することにより行った。
【００２７】
図２に、本発明のＧＡＧ固定化方法および検出方法の開発のために行った実験方法の手順を示す。図示するように、滴下、乾燥、溶離液吸収の各処理を経たシリカ基板を写真撮影し、最後に撮影写真を画像処理ソフト（Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標））を用いて画像処理（ＲＧＢ系からＬａｂ表色系への変換）を行った。蛍光の観察はハンディーＵＶランプ（λ＝３６５ｎｍ）で行った。また、写真撮影の際はＵＶランプを黄色セロハンで覆って行った。
【００２８】
ＧＡＧ溶液の調製は、
１．５μｌＧＡＧ溶液：緩衝溶液＝８：２  （対照）
２．５μｌＧＡＧ溶液：金属イオンを含む緩衝溶液＝８：２  （試料）  とした。用いた緩衝溶液の組成は下記の通りである。
ｐＨ７．０：０．０２Ｍ  ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４
ｐＨ５．０：０．０２Ｍ  ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４＋０．０２Ｍ  ＣＨ３ＣＯＯＨ
ｐＨ２．４：０．０２Ｍ  ＣＨ２ＣｌＣＯＯＮＨ４＋０．０２Ｍ  ＣＨ２ＣｌＣＯＯＨ
ｐＨ１．９：０．０２Ｍ  ＣＨ２ＣｌＣＯＯＨ＋０．０５Ｍ  ＨＣＩ
また、２．で試験した金属イオンおよび濃度は下記の通りである。
０．２５Ｍ  Ｃａ２＋溶液
５×１０−３Ｍ  Ｚｎ２＋、Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｙ３＋、Ｌａ３＋、Ｃｅ３＋、Ｐｒ３＋、Ｅｕ３＋、Ｈｏ３＋、Ｙｂ３＋、Ｌｕ３＋、Ｔｉ４＋、Ｚｒ４＋、Ｖ４＋、  Ｃｒ３＋、Ａｌ３＋、Ｆｅ３＋、Ｇａ３＋、Ａｕ３＋、Ｉｎ３＋、Ｍｏ６＋溶液
２×１０−２  Ｍ  Ｓｃ３＋溶液
なお、必要に応じてＮａＯＨを添加した。
【００２９】
また、溶離液の組成は、
１．水：緩衝溶液＝８：２
２．水：金属イオンを含む緩衝溶液＝８：２  とした。緩衝溶液および金属イオンは、上述の通りである。
【００３０】
図２−２は、実験において基板上への金属イオン添加ＧＡＧ溶液の滴下位置を示す側面視の説明図である。図示するように、本実験ではすべて、左からＣｈ４Ｓ、ＤＳ、Ｃｈ６Ｓの順にスポットした。後出の各観察画像もすべて、この順である。
【００３１】
＜２  ＧＡＧと金属イオンの相互作用＞
上述方法により、各種金属イオンについて、ＧＡＧとの相互作用の如何を調べた。二価金属イオン６種、三価金属イオン１３種など合わせて２５種の金属イオンについて検討した。その結果、ＧＡＧが捕捉され、特定のＧＡＧとの間における選択性が見られた金属は、Ｓｃ、Ｙ、Ｌａ、ＹｂおよびＬｕであった。ＧＡＧが捕捉されたが選択性がみられなかった金属は、Ａｌ、Ｇａ、ＺｒおよびＩｎであった。また、ＧＡＧが捕捉されなかった金属は、Ｃａ、Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｓｒ、Ｍｏ、Ｂａ、Ａｕ、Ｃｅ、Ｐｒ、ＥｕおよびＨｏであった。結局、二価のアルカリ土類金属イオンや遷移金属イオンではＧＡＧは残存しなかった。
以上より、Ａｌ、Ｇａ、ＺｒおよびＩｎはＧＡＧの一斉検出に、またＳｃ、Ｙ、Ｌａ、ＹｂおよびＬｕは個別のＧＡＧの選択的検出に有効であることが明らかとなった。
【００３２】
＜３  シリカ基板の検討＞
ＧＡＧの固定化、検出に適する固体媒体を明らかにするため、シリカ基板およびこれに各種処理を施したものについて、その固定化状態を試験した。使用したシリカ基板の種類は、次の通りである。
１．未処理のシリカプレート
２．ゾル−ゲル後のシリカプレート
３．金属イオン担持シリカプレート
ここで試料溶液に用いた金属イオンは、Ｓｃ３＋、Ｙ３＋、Ｌａ３＋、Ｙｂ３＋およびＬｕ３＋である。Ｓｃ３＋は濃度４Ｘ１０−３Ｍ、ｐＨ１．９、その他は濃度１Ｘ１０−３Ｍ、ｐＨ５．０とした。なお、金属イオン濃度はＧＡＧ溶液と混合後の濃度である（以下も同様）。
【００３３】
図３は、種々のシリカ基板を用いて行った実験の結果を示す観察画像図である。各画像図とも、スポット位置は左から順に、Ｃｈ４Ｓ、ＤＳ、Ｃｈ６Ｓである（以下の画像図でも同様である）。図示されるように、各種処理を施したシリカ基板においては、一部の金属について、未処理シリカよりも固定化がより顕著になされるなど、ＧＡＧの固定化、一斉検出および選択的検出用途として有用である可能性が示唆された。しかしながら、未処理シリカ基板であっても概ね充分な蛍光強度により固定化が観察されており、金属イオンの選択にもよるが、本発明での使用が充分に可能であることが明らかとなった。以下の各実験では、未処理シリカ基板を用いることとした。
【００３４】
＜４  乾燥過程の観察＞
図４は、実験において液滴の乾燥過程を追跡した観察画像図である。緩衝溶液、および金属イオンを添加した２種の試料溶液について検討した。縦方向に示された時間は、スポットした時点からの経過時間である。図示されるように、自然乾燥過程は大体１２分間あれば充分であることが明らかとなった。また、図には明示していないが、スポットの乾燥後の痕跡は、種類によってリング状になる場合と円盤状になるものがあり、後者の方がより相互作用が強いものと推察された。後述するＤＳの選択的検出も、単に観察、測定、元素定性分析されるか否かだけではなく、このような溶質残存パターンの相違を利用して行うことができる。
【００３５】
＜５  ＧＡＧの一斉検出方法＞
一斉検出に適することを明らかにした数種の金属イオンのうち、観察される蛍光強度が特に強い一つであるＺｒ４＋を用いて、改めて試験した。試料溶液は、金属イオン濃度１Ｘ１０−３Ｍ、またｐＨ１．５とした。
図５は、Ｚｒ４＋を用いてＧＡＧの一斉検出が可能であることを示す観察画像図である。図示されるように、Ｃｈ４Ｓ、ＤＳ、Ｃｈ６Ｓのいずれについても、視認上は特段の差異なく観察・測定に充分な蛍光強度が得られ、Ｚｒ４＋を用いたＧＡＧの一斉検出が可能であることが改めて示された。
【００３６】
図６は、Ｚｒ４＋を用いた場合におけるＧＡＧ固定の特徴を示すＥＰＭＡ（電子プローブマイクロアナライザー）による線分析グラフである。本分析は、特定の金属イオンを用いた固定化によりＧＡＧが固定されたシリカ基板を試料として、基板上における該金属イオンの分布をＥＰＭＡを用いて分析することによって、観察により確認された各金属イオンのＧＡＧ固定化の特徴を、元素分析面から検証するものである。線分析は、基板上の各スポットを横断する線上にて行った。グラフの縦軸は所定測定条件による検出Ｘ線強度（ｃｐｓ）、横軸は距離（ｍｍ）である。グラフ中の両端矢印は、その上方に記載されたＧＡＧ種のスポット範囲を示すものである。
【００３７】
その結果、図示されるように、Ｃｈ６Ｓではスポットの中心部−外縁部の全域に亘ってＺｒが検出され、一方ＤＳとＣｈ４Ｓではスポットの外縁部においてＺｒがより検出された。このように、ＧＡＧの種類によって金属分布には相違も観られたが、いずれにせよ各ＧＡＧが、特に選択性なく一斉にかつ充分に固定されたことが示された。
【００３８】
図７は、Ｚｒ４＋を用いたＧＡＧの定量分析に用いる検量線の例を示すグラフである。Ｚｒ４＋を用いた一斉検出では、蛍光標識された各試料の観察結果に基づき得られるＬ値（明度）は、ＧＡＧ濃度に依存することが明らかとなった。したがって、図示したような検量線を用いて、Ｌ値からＧＡＧ濃度の定量分析が可能であることが明らかとなった。
【００３９】
なお、検量線の回帰式は下記の通りである（ｘの単位はｍｇｍｌ−１）。分子量はそれぞれ、Ｃｈ４Ｓ（３４ｋＤ）、ＤＳ（３２ｋＤ）、Ｃｈ６Ｓ（６４ｋＤ）であるため、傾きもほぼそれに対応している。
Ｃｈ４Ｓ
ｙ＝１．２８＊１０３ｘ＋５５．５
ｒ＝０．９９７９
ＤＳ
ｙ＝１．５３＊１０３ｘ＋３．８５
ｒ＝０．９９１７
Ｃｈ６Ｓ
ｙ＝６．１８＊１０２ｘ＋４．８６
ｒ＝０．９９８２
【００４０】
＜６  ＤＳの選択的検出方法＞
選択的検出に適することを明らかにした数種の金属イオンのうち、特にＤＳ検出に適すると考えられるＬａ３＋を用いて試験した。試料溶液は、ｐＨを、２．４、４．０、５．０、７．０と変えて、ＤＳの選択的検出に適する条件の探索も試みた。
図８は、Ｌａ３＋を用いてＤＳの選択的検出が可能であることを示す観察画像図である。特にｐＨ５．０では、Ｃｈ４ＳおよびＣｈ６Ｓは観察されず、一方ＤＳのみは観察・測定に充分な蛍光強度が得られ、Ｌａ３＋を用いたＤＳの選択的検出が可能であることが改めて示された。
【００４１】
図９は、Ｌａ３＋を用いた場合におけるＧＡＧ固定の特徴を示すＥＰＭＡによる線分析グラフである。分析方法は＜５＞と同様である。その結果、図示されるように、Ｃｈ６ＳとＣｈ４Ｓではスポットの外縁部においてごくわずかなＬａの検出が認められるのみだったが、ＤＳではスポットの中心-外縁全域に亘ってＬａが相当強度にて検出された。すなわち元素分析においても、Ｌａ３＋を用いたＤＳの選択的検出が可能であることが示された。
【００４２】
図１０は、Ｌａ３＋を用いたＤＳの定量分析に用いる検量線の例を示すグラフである。Ｌａ３＋を用いたＤＳ検出では、Ｌ値はＧＡＧ濃度に依存することが明らかとなり、図示したような検量線を用いて、Ｌ値からＧＡＧ濃度の定量分析が可能であることが明らかとなった。
【００４３】
＜７  Ｃｈ６Ｓの選択的検出方法＞
選択的検出に適することを明らかにした数種の金属イオンのうち、特にＣｈ６Ｓ検出に適すると考えられるＳｃ３＋、Ｌａ３＋の組合せを用いて試験した。まず、Ｃｈ６ＳとＤＳの両者を固定することのできる金属イオンＳｃ３＋と、ＤＳのみを選択的に固定できるＬａ３＋の両者を含む試料溶液を調製して、所定通り基板上に滴下し、金属イオンを含まない通常の溶離液である溶離液１を用いて溶離処理し、Ｃｈ６ＳとＤＳを基板上に保持した。ついで、ＤＳのみを選択的に固定・検出できる金属イオンであるＬａ３＋を含む溶離液２を用いた溶離処理によって、基板上に保持されているＤＳをＬａ３＋に捕捉させ、Ｌａ３＋を溶離液２側に移行させてこれを除去することによってＤＳも同時に除去し、もって基板上にＣｈ６Ｓのみを残すことを試みた。試料溶液、溶離液の詳細は下記の通りである。
試料溶液  ４Ｘ１０−３Ｍ  Ｓｃ３＋：１Ｘ１０−３Ｍ  Ｌａ３＋：ＧＡＧ  ＝  １：１：８（ｐＨ  １．９  ）
溶離液１  ｐＨ  １．９緩衝溶液
溶離液２  ｐＨ  １．９緩衝溶液  ＋  Ｌａ３＋
【００４４】
図１１−１は、Ｓｃ３＋、Ｌａ３＋それぞれを単独で用いた場合のＧＡＧ固定の特徴を示す観察画像図である。（Ａ）がＳｃ３＋、（Ｂ）がＬａ３＋である。また、
図１１−２は、Ｓｃ３＋、Ｌａ３＋を用いてＣｈ６Ｓの選択的検出が可能であることを示す観察画像図である。これらに図示されるように、本方法によってＣｈ４ＳおよびＤＳはまったく観察されず、Ｃｈ６Ｓのみが観察された。
【００４５】
図１２は、Ｓｃ３＋およびＬａ３＋を用いて行ったＣｈ６Ｓの選択的検出状況を示すＥＰＭＡによる線分析グラフである。分析方法は＜５＞と同様である。その結果、図示されるように、第２段階的に溶離処理されたＬａは、ＤＳ位置にまったく検出されず、またＣｈ６ＳとＤＳ位置に検出されるはずのＳｃも、Ｃｈ６Ｓ位置においてのみ検出され、ＤＳ位置には検出されなかった。したがって、上述の方法によって、Ｃｈ６Ｓの選択的検出が可能であることが明らかとなった。
【００４６】
すなわち本実験では、単独の金属イオンのみでは選択的検出ができないＧＡＧであっても、ＧＡＧ固定特性の異なる複数の金属イオンを用い、さらにいったん基板上に固定されたＧＡＧをこれと相互作用のある金属イオンを含む溶離液により除去する技術を組み合わせることによって、選択的検出の可能な場合があることが示された。
【００４７】
したがって、ＤＳ、Ｃｈ６Ｓの各選択的検出の例のように、ＧＡＧ固定特性の異なる複数の金属イオンの単独溶液、あるいは混合溶液と、いったん基板上に固定されたＧＡＧを除去するための、所定のＧＡＧ固定特性（相互作用）を有する金属イオンを含む溶離液を揃えることによって、簡易にＧＡＧの選択的検出や定量分析、あるいは一斉検出や定量分析が可能なキットを構成することができる。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明のグリコサミノグリカンの固定化方法、検出方法および検出用溶液セットによれば、簡易な手段によってグリコサミノグリカンを固体媒体上に操作性よく固定することができ、高精度かつ短時間でのＧＡＧの検出、優れた選択的検出、および定量が可能となる。ＧＡＧについては上述の通り、健康食品への添加やある種の疾病における臨床診断などにおいても有用であり、生産管理用、臨床診断用の簡便な検出キットを本発明により実現することも可能であるため、関連する複数の産業分野において利用価値が高い発明である。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明のグリコサミノグリカン固定化方法および検出方法の基本的構成例を示すフロー図である。
【図２】本発明のＧＡＧ固定化方法および検出方法の開発のために行った実験方法の手順を示す説明図である。
【図２−２】実験において基板上への金属イオン添加ＧＡＧ溶液の滴下位置を示す側面視の説明図である。
【図３】種々のシリカ基板を用いて行った実験の結果を示す観察画像図である。
【図４】実験において液滴の乾燥過程を追跡した観察画像図である。
【図５】Ｚｒ４＋を用いてＧＡＧの一斉検出が可能であることを示す観察画像図である。
【図６】Ｚｒ４＋を用いた場合におけるＧＡＧ固定の特徴を示すＥＰＭＡによる線分析グラフである。
【図７】Ｚｒ４＋を用いたＧＡＧの定量分析に用いる検量線の例を示すグラフである。
【図８】Ｌａ３＋を用いてＤＳの選択的検出が可能であることを示す観察画像図である。
【図９】Ｌａ３＋を用いた場合におけるＧＡＧ固定の特徴を示すＥＰＭＡによる線分析グラフである。
【図１０】Ｌａ３＋を用いたＤＳの定量分析に用いる検量線の例を示すグラフである。
【図１１−１】Ｓｃ３＋、Ｌａ３＋それぞれのＧＡＧ固定の特徴を示す観察画像図である。（Ａ）がＳｃ３＋、（Ｂ）がＬａ３＋である。
【図１１−２】Ｓｃ３＋、Ｌａ３＋を用いてＣｈ６Ｓの選択的検出が可能であることを示す観察画像図である。
【図１２】Ｓｃ３＋およびＬａ３＋を用いて行ったＣｈ６Ｓの選択的検出状況を示すＥＰＭＡによる線分析グラフである。
【図１】
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【図７】
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【図１０】
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【図２】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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