(57)【要約】【課題】  生体内に存在する広範な種々のチロシンキナーゼの発現量を網羅的にかつ簡便に検出する手法を確立させること。【解決手段】  アミノ酸配列Ｘ１ＶＨＲＤＬＸ２ＡＸ３ＮＸ４ＬＶを含むペプチドを抗原として抗体を惹起させる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列Ｘ１ＶＨＲＤＬＸ２ＡＸ３ＮＸ４ＬＶからなるペプチド、またはそのフラグメントでありかつアミノ酸配列Ｘ１ＶＨＲＤＬＸ２ＡＸ３Ｎを含むことを特徴とするペプチド（ここで、Ｘ１はＹまたはＬであり、Ｘ２はＲまたはＡであり、Ｘ３はＡまたはＲであり、Ｘ４はＩまたはＶである）。
【請求項２】
Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ、Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｎ、Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−ＬｅｕまたはＴｙｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｖａｌのいずれかのアミノ酸配列からなることを特徴とするペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のペプチドを抗原として用いて抗体を惹起する工程を包含することを特徴とする抗体の生成方法。
【請求項４】
配列番号３〜８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドとアジュバントとの複合体を抗原として用いて抗体を惹起する工程を包含することを特徴とする請求項３に記載の抗体の生成方法。
【請求項５】
請求項３または４に記載の抗体の生成方法によって生成されることを特徴とする抗体。
【請求項６】
配列番号２２〜３１のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合することを特徴とする抗体。
【請求項７】
抗チロシンキナーゼ抗体であることを特徴とする請求項５または６に記載の抗体。
【請求項８】
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項５〜７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の抗体を備えることを特徴とする免疫アッセイキット。
【請求項１０】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の抗体を用いることを特徴とする免疫アッセイ方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チロシンキナーゼに対する抗体に関するものであり、より詳細には、特定の範囲に限定されることなく網羅的にチロシンキナーゼを検出し得る抗体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞は、外界からの刺激が加わると入力された外部情報に応じた出力を生成する。多細胞生物においては細胞間でも各々の情報を出入力しあう。その結果、数多くの細胞から構成される生物（特に高等生物）の生命活動が維持される。このように細胞は生物の基本構造であり、細胞間および細胞内における情報伝達によって種々の生命現象が制御されている。
【０００３】
生体内における情報伝達の方法は多様であるが、重要な役割を担うもののうちの１つが、タンパク質リン酸化反応を介する経路である。タンパク質リン酸化反応は、タンパク質リン酸化酵素（すなわち、タンパク質キナーゼ）によってＡＴＰのリン酸基が基質となるタンパク質に付加される可逆的反応である。リン酸化されるとタンパク質はその立体構造が変化し、その結果、その機能が正または負に制御される。
【０００４】
リン酸化を受け得るタンパク質は全タンパク質の３０％以上であると推測されている。真核生物中に存在するタンパク質キナーゼは、その数が全遺伝子産物の１．５％〜２．５％であると考えられており、約２００個程度のサブファミリーに分類される。
【０００５】
タンパク質キナーゼは、リン酸基を転移する標的アミノ酸の違いによって、セリン／トレオニン（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）キナーゼ、チロシン（Ｔｙｒ）キナーゼ、Ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙキナーゼの３種類に分類され得る。セリン／トレオニンキナーゼは、基質となるタンパク質のセリン残基またはトレオニン残基の水酸基にリン酸基を付加する酵素であり、例えば、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ（ＣａＭＫＩ、ＣａＭＫＩＩ、ＣａＭＫＩＶ）、ＭＡＰキナーゼなどが挙げられる。チロシンキナーゼはチロシン残基の水酸基にリン酸基を付加する酵素であり、Ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙキナーゼ（例えば、ＭＡＰキナーゼキナーゼ）は、セリン／トレオニンキナーゼおよびチロシンキナーゼの両方の機能を有する。
【０００６】
これらのタンパク質キナーゼによるタンパク質リン酸化反応は、代謝調節、細胞分裂、分化誘導、ストレス応答、神経伝達、アポトーシスといった重要な生命現象に深く関与することが知られている。中でも、チロシンキナーゼは、細胞または生体の発生、分化、生存および／または疾病に深く関与していることが知られている。
【０００７】
タンパク質キナーゼの大多数がセリン／トレオニンキナーゼであり、チロシンキナーゼは少数である。両者を進化的な側面から比較すると、セリン/トレオニンキナーゼは、単細胞生物から多細胞生物にわたってさまざまな生物の種々の生命現象に関わることが知られているが、チロシンキナーゼは、下等生物には見られず、植物にもこれまで報告されていない。よって、セリン／トレオニンキナーゼから得られた知見がそのままチロシンキナーゼに適用し得るという概念はなく、それぞれ独立して研究が進められている。
【０００８】
ヒトゲノムプロジェクトの結果、ヒトには９０種類のチロシンキナーゼ遺伝子が存在することが判明した。ヒトチロシンキナーゼは、１０個のサブファミリーに分類される３２種類の細胞質型チロシンキナーゼ、２０個のサブファミリーに分類される５８種類の膜結合型チロシンキナーゼからなる（非特許文献１を参照のこと）。
【０００９】
元々チロシンキナーゼは腫瘍ウイルス中に見出されたが、正常な生体内にも存在することが見出された。膜結合型（受容体型）チロシンキナーゼは、細胞外の刺激を細胞内に伝達し、様々な増殖因子の受容体として機能し、細胞の形態変化、増殖、移動性などに関与することが知られている。細胞質型（非受容体型）チロシンキナーゼには、造血細胞の生存分化および／または血管新生、Ｔ細胞およびＢ細胞の生存分化による免疫機構などに関与するものが知られている。また、癌原遺伝子産物の多くがチロシンキナーゼ活性を有しており、チロシンキナーゼが癌の増殖、転移性、および／または浸潤性を調節することが知られている。
【００１０】
このように生命現象に深く関与しているチロシンキナーゼを解析していくことで、基本的な生命現象だけでなく、種々の疾病についての原因解明、診断および／または治療に貢献することができると考えられる。
【００１１】
従来から、チロシンキナーゼに関する研究は、チロシン残基がリン酸化されたタンパク質（すなわち、チロシンリン酸化タンパク質）を特異的に認識する抗体（すなわち、抗ホスホチロシン抗体）を用いて行われている。抗ホスホチロシン抗体を用いれば、調査すべき対象においてチロシンリン酸化反応が生じているか否かを知ることができる。
【００１２】
抗ホスホチロシン抗体はチロシンリン酸化の程度を検出するためには非常に優れた抗体であるが、リン酸化を受けた基質タンパク質のタンパク質発現量を知ることができない。この場合、上記基質タンパク質と考えられるタンパク質に対する抗体を用いることによって基質タンパク質のタンパク質発現量を推測することができる。
【非特許文献１】Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ＤＲ．，Ｗｕ  ＹＭ．，Ｌｉｎ，ＳＦ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９，５５４８−５５５７（２０００）
【非特許文献２】Ｈａｎｋｓ，Ｓ．Ｋ．およびＨｕｎｔｅｒ，Ｔ．  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ９，５７６−５９６（１９９５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上述した調査すべき対象においてチロシンリン酸化反応が生じている場合には、この反応がどのチロシンキナーゼに起因するのかを調べる必要がある。
【００１４】
チロシンキナーゼに対する抗体（すなわち、抗チロシンキナーゼ抗体）としては、特定のタンパク質キナーゼ分子または特定のタンパク質キナーゼファミリーのみを特異的に検出し得る抗体しかこれまでに存在しない。よって、上記対象において発現しているチロシンキナーゼを検出するためには、全ての抗チロシンキナーゼ抗体を用いる以外に手立てはなく、非常に多くの労力および費用を必要とする。さらに、既存の抗チロシンキナーゼ抗体は、それぞれ抗原に対する結合特異性が異なるため、同一サンプル中での発現量を正確に比較することができなかった。
【００１５】
このように、チロシンキナーゼが、どの発生段階で、どの組織に、どのような状況で、どの程度発現し、どのように働いているか、さらにチロシンキナーゼ同士がどのように関与しているかなど、未だに解明されていない課題が数多く残されている。
【００１６】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、生体内に存在する広範な種々のチロシンキナーゼの発現量を網羅的にかつ簡便に検出する手法を確立させて、チロシンキナーゼに関する研究をさらに発展させることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
タンパク質キナーゼの触媒ドメイン（キナーゼドメイン）には一次構造上１２ヶ所の共通したサブドメインが存在し、その領域のアミノ酸配列はタンパク質キナーゼファミリーの間で高度に保存されている（非特許文献２を参照のこと）。これら１２個のサブドメインの中で、特にサブドメインＶＩＢは、セリン／トレオニン（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）キナーゼ、チロシン（Ｔｙｒ）キナーゼ、Ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙキナーゼにわたるタンパク質キナーゼの間で高度に保存されている。
【００１８】
本発明者らは、チロシンキナーゼの触媒ドメイン中に存在するサブドメインＶＩＢ配列におけるチロシンキナーゼ特有のアミノ酸配列を見出し、その配列に基づいて作製したペプチドを抗原として用いることによって数多くのチロシンキナーゼを網羅的かつ簡便に検出し得る抗体を初めて取得し、本発明を完成するに至った。
【００１９】
すなわち、本発明に係るペプチドは、上記課題を解決するために、アミノ酸配列Ｘ１ＶＨＲＤＬＸ２ＡＸ３ＮＸ４ＬＶからなるペプチド、またはそのフラグメントでありかつアミノ酸配列Ｘ１ＶＨＲＤＬＸ２ＡＸ３Ｎを含むことを特徴としており、ここで、Ｘ１はＹまたはＬであり、Ｘ２はＲまたはＡであり、Ｘ３はＡまたはＲであり、Ｘ４はＩまたはＶである。
【００２０】
本発明に係るペプチドは、Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ、Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｎ、Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−ＬｅｕまたはＴｙｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｖａｌのいずれかのアミノ酸配列からなることを特徴している。
【００２１】
すなわち、本発明に係る抗体の生成方法は、上記課題を解決するために、上記ペプチドを抗原として用いて抗体を惹起する工程を包含することを特徴としている。
【００２２】
本発明に係る抗体の生成方法は、配列番号３〜８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドとアジュバントとの複合体を抗原として用いて抗体を惹起する工程を包含することを特徴としている。
【００２３】
すなわち、本発明に係る抗体は、上記抗体の生成方法によって生成されることが好ましい。
【００２４】
本発明に係る抗体は、配列番号２２〜３１のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合することを特徴としている。
【００２５】
本発明に係る抗体は、抗チロシンキナーゼ抗体であることが好ましい。
【００２６】
本発明に係る抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であることが好ましい。
【００２７】
本発明に係る免疫アッセイキットは、上記抗体を備えることを特徴としている。
【００２８】
本発明に係る免疫アッセイ方法は、上記抗体を用いることを特徴としている。
【発明の効果】
【００２９】
本発明に係る抗体を用いれば、チロシンキナーゼのタンパク質発現量を得ることができる。また、本発明に係る抗体を用いれば、正常サンプルと疾患サンプルとの間でのチロシンキナーゼのタンパク質発現量の差異を比較することができる、これにより、種々の疾患サンプルにおいて上記比較を行って、どの疾患においてどの分子量のチロシンキナーゼの発現量が変化しているかを示す発現プロファイルを作製することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
（ａ）抗原ペプチド
本発明者らは、特定の配列を有するペプチドが、広範な種々のチロシンキナーゼを網羅的に検出し得る抗体を惹起することを見出し、本発明を完成するに至った。なお、用語「チロシンキナーゼ」は、本明細書において他で言及されない限り、タンパク質のチロシン残基をリン酸化する活性を有する酵素全てが意図される。
【００３１】
１つの局面において、本発明は、アミノ酸配列Ｘ１ＶＨＲＤＬＸ２ＡＸ３ＮＸ４ＬＶを含むペプチドを提供する。好ましくは、本発明に係るペプチドは、アミノ酸配列Ｘ１ＶＨＲＤＬＸ２ＡＸ３ＮＸ４ＬＶからなるペプチドのフラグメントでありかつアミノ酸配列Ｘ１ＶＨＲＤＬＸ２ＡＸ３Ｎを含む。ここで、Ｘ１はＹまたはＬであり、Ｘ２はＲまたはＡであり、Ｘ３はＡまたはＲであり、Ｘ４はＩまたはＶである。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド」は、「ポリペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ペプチドの「フラグメント」は、当該ペプチドの部分断片が意図される。本発明に係るペプチドはまた、化学合成されても、天然供給源より単離されてもよい。
【００３３】
合成ペプチドは、化学合成の公知の方法を使用して合成され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎは、４週間未満で調製されそして特徴付けられたＨＡ１ポリペプチドセグメントの単一アミノ酸改変体を示す１０〜２０ｍｇの２４８の異なる１３残基ペプチドのような多数のペプチドの合成のための簡単な方法を記載している。Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５１３１−５１３５（１９８５）。この「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＭＰＳ）」プロセスは、さらにＨｏｕｇｈｔｅｎら（１９８６）の米国特許第４，６３１，２１１号に記載される。この手順において、種々のペプチドの固相合成に用いられる個々の樹脂は、別々の溶媒透過性パケットに含まれ、固相法に関連する多くの同一の反復工程の最適な使用を可能にする。完全なマニュアル手順は、５００〜１０００以上の合成が同時に行われるのを可能にする（Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、前出、５１３４）。これらの文献は、本明細書中に参考として援用される。
【００３４】
用語「単離された」ペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。
【００３５】
本発明に係るペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。
【００３６】
本発明に係るペプチドは、後述する本発明に係るポリヌクレオチド（本発明に係るペプチドをコードする遺伝子）を宿主細胞に導入して、そのポリペプチドを細胞内発現させた状態であってもよいし、細胞、組織などから単離精製された場合であってもよい。
【００３７】
また、本発明に係るペプチドは、付加的なペプチドを含むものであってもよい。付加的なペプチドとしては、例えば、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ペプチドが挙げられる。好ましい実施形態において、本発明に係るペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で組換え発現され得る。例えば、本発明に係るペプチドの付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間または引き続く操作および保存の間の安定性および持続性を改善するために、ペプチドのＮ末端に付加され得る。
【００３８】
一実施形態において、本発明に係るペプチドは、Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ、Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｎ、Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−ＬｅｕまたはＴｙｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｖａｌのいずれかのアミノ酸配列からなり得る。
【００３９】
本発明に係るペプチドは、広範な種々のチロシンキナーゼを検出し得る抗体を惹起するペプチド抗原として非常に有用である。すなわち、本発明に係るペプチドは、免疫アッセイに有効な抗体を生成するための方法およびキットにおいて有用である。本明細書中で使用される場合、用語「免疫アッセイ」は、抗原抗体反応に基づいた免疫学的な結合反応を利用して行われるアッセイが意図される。免疫学的な結合反応を利用したアッセイとしては、ウエスタンブロット、免疫沈降法、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ、放射性イムノアッセイ、および免疫拡散アッセイのような抗体アッセイ、ならびにアフィニティクロマトグラフィーなどが挙げられる。これらのアッセイは、分子の固定化および検出のためにアビジンおよびビオチンのような分子を用いる。これらの試薬を調製する技術およびそれを使用する方法は、当業者に公知である。さらに、多くの結合アッセイは、顔料、酵素、放射性物質または蛍光物質による標識を用いて検出が増強される。
【００４０】
本明細書を読んだ当業者は、上記ペプチドを抗原として用いて抗体を惹起する工程を包含する抗体の生成方法およびキットもまた本発明の範囲内に含まれることを容易に理解する。なお、本発明に係る抗体の生成方法において、上記ペプチドをアジュバントとの複合体を抗原として用いてもよい。
【００４１】
つまり、本発明の目的は、広範な種々のチロシンキナーゼを網羅的に検出し得る抗体を生成し得る抗原ペプチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したペプチド（ポリペプチド）作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得されるチロシンキナーゼを網羅的に検出し得る抗体を生成し得るペプチドも本発明の範囲に属することに留意しなければならない。
【００４２】
（ｂ）抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチド
本発明は、本発明に係る上記ペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。
【００４３】
本発明に係るポリヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチド（例えば、チロシンキナーゼタンパク質をコードするｃＤＮＡ全長からなるポリヌクレオチド）の切断フラグメントとして生成されても、化学合成されてもよい。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波による剪断は、種々のサイズのフラグメントを作製するために容易に使用され得る。あるいは、このようなフラグメントは、合成的に作製され得る。適切なフラグメント（オリゴヌクレオチド）が、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ＡＢＩ，８５０  Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｄｒ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ  ９４４０４）３９２型シンセサイザーなどによって合成される。
【００４４】
本発明に係るポリヌクレオチドを取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、本発明におけるポリヌクレオチドのｃＤＮＡのうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明に係るポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
【００４５】
また本発明に係るポリヌクレオチドは、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合され得る。
【００４６】
つまり、本発明の目的は、広範な種々のチロシンキナーゼを検出し得る抗体を惹起し得る抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリヌクレオチドの作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される上記ペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明の範囲に属することに留意しなければならない。
【００４７】
（ｃ）抗体
本発明は、広範な種々のチロシンキナーゼを検出し得る抗体を提供する。本発明に係る抗体は、上述した抗体の生成方法によって生成されることが好ましい。本発明に係る抗体は、配列番号２２〜３１のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合し得、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。また、本発明に係る抗体は、上述のペプチドを抗原として用いて惹起されることが好ましいが、これらのペプチドを混合して抗原として用いることもまた好ましい。
【００４８】
従前の抗チロシンキナーゼ抗体としては、特定のファミリーの一部または全部に対して特異的に結合し得る抗体が多数知られている。しかし、このような抗体では種々のチロシンキナーゼ（ヒトでは９０種類）を複数のファミリーにわたって網羅的に検出することができなかった。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびこれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント）を意味し、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体およびヒト化抗体が挙げられるがこれらに限定されない。本発明に係る抗体は、チロシンキナーゼを発現する生物材料を選択するに有用であり得る。
【００５０】
「抗体」は、種々の公知の方法（例えば、ＨａｒＬｏｗら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）」、岩崎ら、「単クローン抗体  ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ、講談社（１９９１）」）に従って作製され得る。
【００５１】
ペプチド抗体は、当該分野に周知の方法によって作製され得る。例えば、Ｃｈｏｗ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。一般には、動物は遊離ペプチドで免疫化され得る；しかし、抗ペプチド抗体力価はペプチドを高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）にカップリングすることにより追加免疫され得る。例えば、システインを含有するペプチドは、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを使用してキャリアにカップリングされ得、一方、他のペプチドは、グルタルアルデヒドのようなより一般的な連結剤を使用してキャリアにカップリングされ得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離またはキャリア−カップリングペプチドのいずれかで、例えば、約１００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびＦｒｅｕｎｄのアジュバントを含むエマルジョンの腹腔内および／または皮内注射により免疫化される。いくつかの追加免疫注射が、例えば、固体表面に吸着された遊離ペプチドを使用してＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る有用な力価の抗ペプチド抗体を提供するために、例えば、約２週間の間隔で必要とされ得る。免疫化動物からの血清における抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択により、例えば、当該分野で周知の方法による固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出により増加され得る。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、用語「チロシンキナーゼと特異的に結合する抗体」は、チロシンキナーゼと特異的に結合し得る完全な抗体分子および抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を含むことが意図される。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは完全な抗体のＦｃ部分を欠いており、循環によってさらに迅速に除去され、そして完全な抗体の非特異的組織結合をほとんど有し得ない（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３）（本明細書中に参考として援用される））。従って、これらのフラグメントが好ましい。
【００５３】
さらに、抗原ペプチドに結合し得るさらなる抗体が、抗イディオタイプ抗体の使用を通じて二工程手順で産生され得る。このような方法は、抗体それ自体が抗原であるという事実を使用し、従って、二次抗体に結合する抗体を得ることが可能である。この方法に従って、チロシンキナーゼと特異的に結合する抗体は、動物（好ましくは、マウス）を免疫するために使用される。次いで、このような動物の脾細胞はハイブリドーマ細胞を産生するために使用され、そしてハイブリドーマ細胞は、チロシンキナーゼと特異的に結合する抗体に結合する能力が抗原ペプチドによってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニングされる。このような抗体は、チロシンキナーゼと特異的に結合する抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そしてさらなるチロシンキナーゼと特異的に結合する抗体の形成を誘導するために動物を免疫するために使用され得る。
【００５４】
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびに本発明に係る抗体の他のフラグメントは、本明細書中で開示される方法に従って使用され得ることが、明らかである。このようなフラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生じる）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生じる）のような酵素を使用するタンパク質分解による切断によって産生される。あるいは、チロシンキナーゼ結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術の適用または合成化学によって産生され得る。
【００５５】
上述したように、リン酸化酵素（タンパク質キナーゼ）は、基質タンパク質にリン酸を付加するという面は、セリン／トレオニン（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）キナーゼ、チロシン（Ｔｙｒ）キナーゼ、Ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙキナーゼの３種類に共通している。よって、構造面または機能面においてキナーゼ全般に共通した特徴をもたらす領域（例えば、ＡＴＰ結合部位など）は、キナーゼ全体において高度に保存されている。
【００５６】
通常、特定のタンパク質ファミリーにおいて高度に保存されている領域を抗原として用いて抗体を作製した場合は、当該ファミリー全体を認識し得る抗体が惹起される。よって、特定の領域（例えば、ＶＩＢサブドメイン）の配列に基づいて抗体を取得した場合、セリン／トレオニン（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）キナーゼまたはチロシン（Ｔｙｒ）キナーゼを別々に認識する抗体を取得し得るなどということを予想することは困難であり、実際に特定の領域の配列に基づいて両者を区別し得る抗体が取得されることはなかった。
【００５７】
本発明に係る抗体を用いれば、チロシンリン酸化を介するシグナル伝達経路およびその調節機構を解析するための研究材料として有用であり、こうした研究を通じて、当該シグナル伝達系やその調節機構に関わる種々の疾患の病態解析（例えば、該シグナル伝達経路関連分子のスクリーニング、および疾患と該シグナル伝達経路との相関性の検討など）に有効利用することができる。
【００５８】
また本発明に係る抗体を用いてアフィニティ精製を行い、引き続きアミノ酸分析、質量分析などを行うことにより、目的のタンパク質が既知のどのチロシンキナーゼであるかを同定すること、または新規チロシンキナーゼを見出すことができる。また、本発明に係る抗体は、生体組織、細胞、細胞内器官など様々な材料を用いたチロシンキナーゼの発現および動態解析などチロシンキナーゼの全体像に焦点を当てた研究を行う際に非常に有用な研究用ツールとなり得る。
【００５９】
このように、本発明に係る抗体は、少なくとも、本発明に係る抗原ペプチドを認識する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を備えていればよいといえる。すなわち、本発明に係る抗原ペプチドを認識する抗体フラグメントと、異なる抗体分子のＦｃフラグメントとからなる免疫グロブリンも本発明に含まれることに留意すべきである。
【００６０】
つまり、本発明の目的は、広範な種々のチロシンキナーゼを網羅的に検出し得る抗体を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々の免疫グロブリンの種類（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）、キメラ抗体作製方法、抗原ペプチド作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される抗体も本発明の範囲に属することに留意しなければならない。
【００６１】
〔２〕チロシンキナーゼを検出するためのキットおよび方法
本発明は、チロシンキナーゼを検出するための免疫アッセイキットを提供する。本発明に係る免疫アッセイキットは、チロシンキナーゼを検出するために、チロシンキナーゼと特異的に結合する抗体を備えることを特徴としている。好ましくは、上記抗体は本発明に係る抗体であり得る。なお、本発明に係る免疫アッセイキットは、上記抗体以外に、一般的な免疫アッセイに用いられる当該分野において公知の他の成分を備えていてもよい。
【００６２】
本発明はまた、チロシンキナーゼを検出するための免疫アッセイ方法を提供する。本発明に係る免疫アッセイ方法は、チロシンキナーゼを検出するために、チロシンキナーゼと特異的に結合する抗体をサンプルとインキュベートする工程を包含することを特徴としている。好ましくは、上記抗体は本発明に係る抗体であり得る。なお、本発明に係る免疫アッセイ方法は、上記抗体を投与する工程に、一般的な免疫アッセイに用いられる当該分野において公知の他の工程を含んでいてもよい。
【００６３】
本発明に係る免疫アッセイキットおよび免疫アッセイ方法を用いれば、正常な生物材料または病的状態にある生物材料から得られたサンプル中のチロシンキナーゼを検出して、両者のデータを比較することにより、特定の疾患において特異的に発現量を変化させるチロシンキナーゼに関する発現プロファイルを作製することができる。なお、本発明に係る免疫アッセイキットおよび免疫アッセイ方法が、診断キットおよび診断方法として用いられ得ることを、当業者は容易に理解する。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、用語「生物材料」は、生物学的サンプル（生物体から得られた組織サンプルまたは細胞サンプル）を得るための供給源が意図される。生物学的サンプルとしては、細胞株、組織培養物、体液（例えば、血液、唾液、歯垢、血清、血漿、尿、滑液、および髄液）、あるいはタンパク質またはそのＤＮＡもしくはｍＲＮＡを含む他の供給源から得られる任意のサンプルが意図される。本明細書中で使用される場合、用語「サンプル」としては、上記生物学的サンプルおよび上記組織サンプル以外に、上記生物学的サンプルおよび上記組織サンプルより抽出したゲノムＤＮＡサンプルおよび／または総ＲＮＡサンプルも挙げられる。生物学的サンプルがｍＲＮＡを含む場合、組織生検材料が好ましい供給源である。また、哺乳動物から組織生検材料および体液を得るための方法は当該分野で周知である。
【００６５】
なお、上述したように、用語「免疫アッセイ」には、アフィニティクロマトグラフィーも包含されるので、本発明に係る免疫アッセイキットはチロシンキナーゼをアフィニティ精製するためのキットであり得、本発明に係る免疫アッセイ方法はチロシンキナーゼをアフィニティ精製する方法でもあり得る。
【００６６】
本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、これらに限定されるべきではない。
【実施例】
【００６７】
＜Ｉ：手順＞
〔１：材料および方法〕
（１−１）動物
マウス（Ｂａｌｂ／ｃ、メス５週齢）およびラット（Ｗｉｓｔｅｒ、オス）を日本エスエルシーより購入した。これらの動物を、温度２５±２℃、湿度５０±２０％、明暗周期１２時間の環境条件に設定した飼育室にて、飼料および水を自由に摂取し得る状態で飼育し、上記飼育室への入舎日から１週間以上経過した後に免疫した。
【００６８】
（１−２）細胞
マウスミエローマ細胞Ｓｐ２／０株（ＢＡＬＢ／ｃマウス由来骨髄腫細胞、８−アザグアニン耐性、ｈｙｐｏｘａｎｔｉｎｅ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＨＧＰＲＴ）欠損株）を、岡崎勝一郎教授（香川大学農学部細胞工学研究室）よりご供与いただいた。細胞融合に用いる際には、形質の変化を考慮してアザグアニン含有培地にて選択した細胞を用いた。
【００６９】
（１−３）試薬
５０％ポリエチレングリコール溶液（ＰＥＧ−１５００）、ＨＡＴ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（５０×：６８０．５ｍｇ／ｌ  ｈｙｐｏｘａｎｔｉｎｅ、８．８ｍｇ／ｌ  ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎｅ、１９３．８ｍｇ／ｌ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）を、ＧＩＢＣＯより購入した。キーホールリンペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ））を、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍより購入した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）ならびにｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ（ＰＬＬ）を、Ｓｉｇｍａより購入した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰＯ））で標識された抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＡ＋ＩｇＭヤギ抗体を、ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌより購入した。抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより購入した。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ）を、Ｐｉｅｒｃｅより購入した。ｐＥＴ−２３ａ（＋）およびＢＬ２１（ＤＥ３）を、Ｎｏｖａｇｅｎより購入した。ｐＧＥＭ−Ｔ  ＥａｓｙをＰｒｏｍｅｇａより購入した。各制限酵素をニッポンジーンより購入した。各プライマーを北海道システムサイエンスにて合成した。ラットＣａ２＋／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩの３０ｋＤａ断片（３０Ｋ−ＣａＭＫＩＩ）、ラットＣａ２＋／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＶ（ＣａＭＫＶＩ）、マウスＣａ２＋／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ（ＣａＭＫＫ）、ラットＣａ２＋／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼホスファターゼ（ＣａＭＫＰ）、およびラットタンパク質ホスファターゼ２Ｃ（ＰＰ２Ｃ）を、木梨  智子、香川大学農学部生命機能科学科  平成１４年度卒業論文、および柘植敏之、香川大学農学研究科生物資源科学専攻  平成１４年度修士論文に記載の方法に従って調製した。ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＡ）を、ウシ心筋より精製した。特に記載のない試薬類については、和光純薬工業またはナカライテスクの特級試薬を使用した。
【００７０】
（４）ペプチド合成
免疫に用いるためのペプチドを、産業技術総合研究所にて合成した。なお、これらのペプチド全てにおいて、二価性の架橋試薬を用いた担体との架橋を可能にするためにＮ末端にシステインを導入した。合成したペプチドを、１０ＲＡＡＮ、１０ＡＡＲＮ、１１ＲＡＡＮ、１３ＲＡＡＮ、１３ＡＡＲＮ、１３ＲＡＲＮ、１３ＡＡＡＮ、および１４ＲＡＡＮと名付けた（図１Ｂ）。
【００７１】
〔２：ポリクローナル抗体の作製〕
（２−１）ＫＬＨ−ペプチド複合体の作製
キャリアタンパク質としてのＫＬＨ  ２ｍｇを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）０．２ｍｌに溶解し、２５ｍｇ／ｍｌ  Ｎ−（６−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＥＭＣＳ）を２２μｌ添加し、スターラーで撹拌しながら室温にて３０分間反応させた。この反応液を、室温にて１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で予め平衡化しておいたＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０  Ｆｉｎｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムでゲル濾過した。カラムからの溶出画分について、２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、キャリアタンパク質のピークを回収した。回収したキャリアタンパク質画分に１０ｍｇ／ｍｌの抗原ペプチド溶液０．２ｍｌを添加し、撹拌しながら２時間以上インキュベートした。ｐＨ試験紙を用いて反応液のｐＨを測定し、反応液を０．４Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４を用いてｐＨ７以上に調整した後、さらに３時間以上インキュベートした。同様の操作を繰り返し、ｐＨの降下が確認できなくなった時点で最終濃度５ｍＭとなるようにｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ）を加えて１時間撹拌して反応を停止させ、ペプチド複合体を得た。作製したペプチド複合体を、使用時まで−３０℃で保存した。
【００７２】
（２−２）エマルジョン作製およびマウスへの免疫
ＫＬＨ−ペプチド複合体（マウス１匹あたりペプチド１００μｇ相当）をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（２．６８ｍＭ  ＫＣｌ，１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，１３７ｍＭ  ＮａＣｌ，８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４）に添加して０．２ｍｌとして、２．５ｍｌ用のシリンジ中にて同量の完全フロイントアジュバント（ＦＣＡ；ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と混合した後に超音波処理してエマルジョン化した。
【００７３】
得られたエマルジョン０．４ｍｌ（１００μｇ）を、エーテル麻酔したマウスの前肢、後肢の裏に１ヶ所ずつ、背側、腹側に数ヶ所に２５Ｇ注射針を用いて皮下注射して、マウスを免疫した。免疫の２週間後に、不完全フロイントアジュバント（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をフロイント完全アジュバントの代わりに使用してエマルジョンを調製し、初回免疫と同様に２回目の免疫を行った。その後２週間毎に、ＰＢＳで１００μｌに希釈したＫＬＨ−ペプチド複合体（マウス１匹あたりペプチド５０μｇ相当）を、マウスに腹腔内注射した。１種類の抗原に対してマウス３匹以上を用い、全て同条件下で免疫を行った。
【００７４】
（２−３）マウス抗血清の調製
２回目の免疫の後、各免疫の約１週間後にマウスの眼採血による部分採血を行い、最終免疫の約１週間後にエーテル麻酔したマウスの頚動脈および心臓から全採血を行った。採取した血液を室温で１時間静置した後、４℃で一晩静置した。この血液を、２℃で１５，０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離し、その上清を抗血清として回収し、使用時まで−８０℃で保存した。
【００７５】
〔３：モノクローナル抗体の作製〕
（３−１）細胞融合およびハイブリドーマ培養
ペプチド（１３ＲＡＡＮおよび１１ＲＡＡＮ）にてマウスを免疫し、抗体価が最大にまで上昇したＢＡＬＢ／ｃマウスを選択した。このマウスを、最終免疫から４日後にエーテル麻酔し、首から腹部にかけて７０％エタノールで消毒し、頚動脈および心臓から全採血した。その後腹部を切開して、脾臓を摘出した。摘出した脾臓を、シャーレ中にてＰＢＳに浸し、脂肪組織および結合組織を除去した後、シャーレ２枚で５回ずつ洗浄した（合計１０回）。シャーレ中の脾臓を安全キャビネット内に移動した後同様に洗浄し、脾臓の中心部に切り込みを入れてダウンスホモジナイザーに移した。このホモジナイザーにウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含まないＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ）（ＤＭＥＭ（−））５ｍｌを加え、穏やかに組織を破砕して、得られた浮遊細胞を１５ｍｌチューブに移した。ＤＭＥＭ（−）５ｍｌをホモジナイザーに加えて軽くピペッティングした後、同じチューブに移し、１，０００ｒｐｍ、室温で５分間遠心分離した。上清を除去した後、赤血球溶解溶液（８２９ｍｇ  ＮＨ４Ｃｌ，１００ｍｇ  ＫＨＣＯ３，３７ｍｇ／１００ｍｌ  ＥＤＴＡ  ２Ｎａ（ｐＨ７．４））３ｍｌを細胞ペレットに添加し、軽くピペッティングして赤血球を破壊した。この溶液を、ＤＭＥＭ（−）１０ｍｌに混合して、１，０００ｒｐｍ、室温で５分間遠心分離した。上清を除去した後、ＤＭＥＭ（−）１０ｍｌを細胞ペレットに加えて、軽くピペッティングし、この溶液を、１，０００ｒｐｍ、室温で５分間遠心分離した後、上清を除去することにより、細胞を洗浄した。この洗浄操作を３回行った後、細胞をＤＭＥＭ（−）１０ｍｌ中に懸濁して、脾細胞懸濁液を得た。
【００７６】
培養していたミエローマ細胞を、ピペッティングにより浮遊させ、遠心分離によって回収した後、ＤＭＥＭ（−）１０ｍｌで３回洗浄（１，０００ｒｐｍ，室温で５分間遠心分離）し、ＤＭＥＭ（−）１０ｍｌ中に懸濁して、ミエローマ細胞懸濁液を得た。
【００７７】
上記細胞懸濁液の一部をＤＭＥＭ（−）で１０倍希釈した。脾細胞については、さらにその一部を等量のトリパンブルー溶液（０．２％トリパンブルー，０．８％塩化ナトリウム）と混合して死細胞を染色した後、Ｂｕｒｋｅｒ−Ｔｕｒｋ型血球計算板を用いて生細胞数を計測した。
【００７８】
１３ＲＡＡＮ免疫マウスについては脾細胞数７に対してミエローマ細胞数１、１１ＲＡＡＮ免疫マウスについては脾細胞数５に対してミエローマ細胞数１で、細胞融合を行った。脾細胞全量（約１．２×１０８細胞）およびミエローマ細胞（１３ＲＡＡＮについては約１．７×１０７細胞、１１ＲＡＡＮについては約２．４×１０７細胞）を５０ｍｌチューブ内にて混合し、１，０００ｒｐｍ、室温で５分間遠心分離した後上清を完全に除去した。チューブを軽くたたきながら細胞をほぐし、脾細胞およびミエローマ細胞を十分に混合した。チューブを傾けて回転させながら５０％ポリエチレングリコール溶液１ｍｌを注射器で１滴ずつ１分間かけて混合溶液に添加することによって細胞を融合させた。同様にチューブを回転させながらＤＭＥＭ（−）７ｍｌをこの溶液に７分間かけて添加し、さらに１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（１０％  ＦＢＳ培地）８ｍｌを静かに加えた。この混合溶液を、１，０００ｒｐｍ、室温で５分間遠心後、上清を除いた。細胞ペレットに１０％  ＦＢＳ培地２ｍｌを加え、チューブを軽くたたきながら細胞をほぐした。１０％  ＦＢＳ培地４２ｍｌをチューブに静かに加えて転倒混和により細胞を懸濁した後、同培地で容量を５０ｍｌとした。４８ウェルマルチプレート（住友ベークライト）４枚に、細胞懸濁液を１ウェルあたり０．２５ｍｌずつ分注し、３７℃、５％  ＣＯ２、湿潤条件下で細胞を培養した。翌日（２４時間以内）２倍濃度のＨＡＴを含む１０％  ＦＢＳ培地を１ウェルあたり０．２５ｍｌずつ加えた。その後３日毎にＨＡＴ選択培地を半量ずつ交換し、ハイブリドーマの選択培養を行った。
【００７９】
（３−２）陽性ウェルのスクリーニング
細胞融合の約１０日後に、ハイブリドーマの培養上清を０．１ｍｌ回収して、後述のドットイムノバインディングアッセイ(ｄｏｔ  ｉｍｍｕｎｏｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ（ＤＩＡ）)により抗体産生陽性ウェルをスクリーニングした。
【００８０】
（３−３）クローニング
スクリーニングの結果が陽性であったウェルについて、限界希釈法によるクローニングを行った。この際、フィーダー細胞として、調製したマウス胸腺細胞を通常用いるが、その代替として、ハイブリドーマ増殖補助試薬であるブライクローン（大日本製薬）を用いた。
【００８１】
２×ＨＴおよび１０％ブライクローンを予め添加した１０％  ＦＢＳ培地を、９６ウェルマルチプレート（Ｎｕｎｃ）の各ウェルに０．１ｍｌずつ加えて、このプレートを、使用時まで３７℃、５％  ＣＯ２、湿潤条件下（細胞培養条件）においた。
【００８２】
スクリーニングの結果が陽性であったウェルの細胞をピペッティングして浮遊させ、Ｂｕｒｋｅｒ−Ｔｕｒｋ型血球計算板を用いて生細胞数を計測した。０．１ｍｌあたりの細胞数が２０個となるように１０％  ＦＢＳ培地で希釈した細胞懸濁液を、上記の９６ウェルマルチプレートに０．１ｍｌずつ分注し、これらの細胞を３７℃、５％  ＣＯ２、湿潤条件下で培養した。約１週間培養した後、各ウェルを観察してコロニーが形成されていることを確認した。ＤＩＡ法によるスクリーニングを行い、抗体産生陽性ウェルについて、限界希釈法によって０．１ｍｌあたりの細胞数が２個となるように細胞懸濁液を１０％  ＦＢＳ培地で希釈した。この細胞懸濁液を、９６ウェルマルチプレートに０．１ｍｌずつ分注した後、二次クローニングを行った。二次クローニングにおいてコロニー数が１個かつ抗体産生陽性であったウェルに対して、二次クローニングと同様の操作を行った。スクリーニング後、全てのウェルが抗体産生陽性であることを確認して、クローニングを終了とした。得られた細胞について、６ウェルプレート、９４ｍｍディッシュ（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）と順次培養規模を拡大し、抗体産生ハイブリドーマとして樹立した。
【００８３】
（３−４）細胞の凍結保存
樹立したハイブリドーマを９４ｍｍディッシュにて培養し、コンフルエントの状態となったところで凍結保存した。凍結保存には、凍結保護剤として最終濃度１０％のｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）を保存用培地（２０％  ＦＢＳ）に添加したものを使用した。この培地１ｍｌに約５×１０６細胞を懸濁し、−８０℃で保存した。
【００８４】
（３−５）マウス腹水からのモノクローナル抗体の調製
６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに０．５ｍｌのプリスタンを腹腔内注射し、約１週間後に約１×１０８細胞のハイブリドーマを１０％ＦＢＳ培地０．５ｍｌに懸濁し、この懸濁液をマウスの腹腔内に注射した。ハイブリドーマ投与後にマウスの腹水の貯留を観察した。腹水が十分に貯まった段階でマウスをエーテル麻酔して頚動脈および心臓から全採血を行い、その後開腹して腹水を採取した。採取した血液については、抗血清の調製時と同様の処理を行った。腹水については、採取後５，０００ｒｐｍ、２℃で１５分間遠心分離して上清を回収し、使用時まで−８０℃で保存した。
【００８５】
〔４：ドットイムノバインディングアッセイ（ＤＩＡ）〕
（４−１）ＰＬＬ−ペプチド複合体の作製
１０ｍｇ／ｍｌのＰＬＬ２０μｌ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１０μｌを混合し、精製水にて０．１ｍｌに調整した後、２５ｍｇ／ｍｌ  ＥＭＣＳを１１μｌ加え、混合液をスターラーで撹拌しながら室温で３０分間反応させた。未反応物を除去するため、ジクロロメタンによる抽出を繰り返し、界面に生ずる白色中間層が見えなくなった段階で水層を回収した。回収した水層２５μｌに１０ｍｇ／ｍｌの抗原ペプチド溶液を５μｌ加え、精製水にて５０μｌに調整した後、この混合液を撹拌しながら室温で３時間以上反応させた。得られたペプチド複合体を使用時まで−３０℃で保存した。
【００８６】
（４−２）ドットイムノバインディングアッセイ（ＤＩＡ）
ボールペンで４ｍｍ×４ｍｍのマス目を付したニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）を精製水に浸し、室温で５分間振盪した。５０℃で３０分間乾燥させた後、マス目の中央に免疫の際に抗原として用いたペプチドのＰＬＬ−複合体（２０μｇ／ｍｌ）を０．５μｌずつスポットし、白色光を３０分間照射して抗原ペプチドを膜に固定化した。抗原ペプチドを固定化した膜を、ブロッキング緩衝液（５％スキムミルク（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），ＰＢＳＴ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ））に浸し、室温で１時間振盪した。ブロッキングした膜を、区切った大きさに切り離し、その各々を９６ウェルマルチプレートのウェルにスポット面が上になるように移し、上述した培養上清０．１ｍｌを一次抗体として各ウェルに添加した。室温で２時間インキュベートした後、各ウェルの培養上清を除き、０．１ｍｌのＰＢＳＴで５分×３回洗浄した。さらにブロッキング緩衝液で１０００倍希釈したＨＲＰＯ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＡ＋ＩｇＭを二次抗体として各ウェルに０．１ｍｌずつ添加し、室温で１時間振盪しながら反応させた。反応終了後、膜をＰＢＳＴで２回、ＰＢＳで２回洗浄し、３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＤＡＢ）溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．０５％  ＤＡＢ，０．０１％  Ｈ２Ｏ２）をウェルに添加して発色反応を行った。発色を水による洗浄により停止させた。細胞融合前に採取したマウスの抗血清をブロッキング緩衝液で１００倍希釈したものを一次抗体の陽性コントロールとして用いて同様に行った。
【００８７】
〔５：組織抽出液および細胞抽出液の調製〕
（５−１）ラット大脳抽出液の調製
ラットから摘出した大脳を、秤量した後にテフロン−グラスホモジナイザーに移し、重量（ｇ）の５倍容量（ｍｌ）の氷冷抽出緩衝液Ａ（５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５），０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，２ｍＭ  ２−メルカプトエタノール，１ｍＭ  ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ  （ＰＭＳＦ））を加えた。氷浴中にて、ホモジナイザー（８００ｒｐｍ）で脳を完全に破砕し、さらに上下に１２回ストロークして脳組織抽出液を得た。この脳組織抽出液を、使用時まで−３０℃で凍結保存した。
【００８８】
（５−２）Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞抽出液の調製
マウス神経芽腫瘍細胞Ｎｅｕｒｏ２ａを、１０％  ＦＢＳ培地中で９４ｍｍディッシュにて３７℃、５％  ＣＯ２、湿潤条件下で培養した。培地を除去した後、ディッシュに０．５ｍｌ  ＳＤＳサンプル緩衝液を加えて細胞を溶解し、チューブに回収したこの溶解液を５分間煮沸して、泳動用サンプルを得た。
【００８９】
〔６：タンパク質定量〕
サンプルのタンパク質濃度を、Ｌｏｗｒｙ変法（ＢｅｎｓａｄｏｕｎとＷｅｉｎｓｔｅｉｎの方法）に従って、ＢＳＡの濃度標準曲線に基づいて決定した。
【００９０】
〔７：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＣＢＢ染色ならびにウエスタンブロッティング〕
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を、Ｌａｅｍｍｌｉの方法に従って、１０％アクリルアミド分離ゲルと３％アクリルアミド濃縮ゲルとを用いて行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ（ＣＢＢ）溶液（０．２５％  ＣＢＢ，  ５０％  トリクロロ酢酸）中で１０分間振盪することにより、分離されたタンパク質を染色した。
【００９１】
ウエスタンブロッティングを以下の手順で行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離したタンパク質をニトロセルロース膜にブロッティング緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１９２ｍＭ  グリシン，２０％メタノール）中で電気的に転写（４℃，３００ｍＡ，１時間）した後、転写後の膜をブロッキング緩衝液に浸し室温で１時間振盪した。ブロッキングの終了した膜を、ブロッキング緩衝液で２〜２００倍に希釈した一次抗体液とともに室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳＴで５分×３回洗浄した後、二次抗体と室温で１時間インキュベートした。二次抗体としては、ＨＲＰＯ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＡ＋ＩｇＭをブロッキング緩衝液で１，０００倍希釈して使用した。次に、抗体反応終了後の膜をＰＢＳＴで２回、ＰＢＳで２回洗浄した後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌと室温で５分間反応させた。抗体反応陽性バンドの化学発光をＸ線フィルム（富士写真フィルム）で検出した。
【００９２】
〔８：Ｓｒｃ変異体の作製〕
（８−１）インバースＰＣＲ法による発現ベクターの構築
本研究室で取得していたｐＥＴ−ｓｒｃを鋳型（テンプレート）として、ＮｈｅＩ部位（下線部）を付加した上流プライマー（５’−ＴＴＣ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＧＧＣ  ＡＧＣ  ＡＡＣ  ＡＡＧ  ＡＧＣ  ＡＡＧ  ＣＣ−３’：配列番号９）およびＸｈｏＩ部位（下線部）を付加した下流プライマー（５’−ＣＴＣ  ＴＣＧ  ＡＧＴ  ＡＧＧ  ＴＴＣ  ＴＣＣ  ＣＣＧ  ＧＧＣ  ＴＧＧ−３’：配列番号１０）を用いるＰＣＲにて増幅したフラグメントをｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙのマルチクローニング部位に組み込むことによって、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｓｒｃを構築した。
【００９３】
ｓｒｃＲＮ−５’上流プライマー（５−ＣＧＡ  ＡＡＴ  ＡＴＣ  ＣＴＡ  ＧＴＡ  ＧＧＧ  ＧＡＧ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  Ｇ−３’：配列番号１１）およびｓｒｃＡＡ−３’下流プライマー（５’−ＧＧＣ  ＴＧＣ  ＡＡＧ  ＧＴＣ  ＣＣＧ  ＧＴＧ  ＣＡＣ  ＡＴＡ  ＧＴＴ−３’：配列番号１２）を用いるＰＣＲによって、ｐＥＴ−ｓｒｃ  ＡＡＲＮフラグメントを取得した。ｓｒｃＲＮ−５’上流プライマーおよびｓｒｃＲＡ−３’下流プライマー（５’−ＧＧＣ  ＴＣＧ  ＡＡＧ  ＧＴＣ  ＣＣＧ  ＧＴＧ−３’：配列番号１３）を用いるＰＣＲによって、ｐＥＴ−ｓｒｃ  ＲＡＲＮフラグメントを取得した。ｓｒｃＡＮ−５’上流プライマー（５’−ＧＣＣ  ＡＡＴ  ＡＴＣ  ＣＴＡ  ＧＴＡ  ＧＧＧ  ＧＡＧ  ＡＡＣ−３’：配列番号１４）およびｓｒｃＡＡ−３’下流プライマーを用いるＰＣＲによって、ｐＥＴ−ｓｒｃ  ＡＡＡＮフラグメントを取得した。ｓｒｃＩＨ−５’上流プライマー（５’−ＡＴＣ  ＣＡＣ  ＣＧＧ  ＧＡＣ  ＣＴＴ  ＧＣＡ  ＧＣＣ  ＣＧ−３’：配列番号１５）およびｓｒｃＮＹ−３’下流プライマー（５’−ＡＴＡ  ＧＴＴ  ＣＡＴ  ＣＣＧ  ＣＴＣ  ＣＡＣ  ＡＴＡ  ＧＧＣ−３’：配列番号１６）を用いるＰＣＲによって、ｐＥＴ−ｓｒｃ  ＹＩＨＲフラグメントを取得した。ｓｒｃＶＨ−５’上流プライマー（５’−ＧＴＧ  ＣＡＣ  ＣＧＧ  ＧＡＣ  ＣＴＴ  ＧＣＡ  ＧＣ−３’：配列番号１７）およびｓｒｃＮＬ−３’下流プライマー（５’−ＣＡＧ  ＧＴＴ  ＣＡＴ  ＣＣＧ  ＣＴＣ  ＣＡＣ  ＡＴＡ  ＧＧＣ  Ｃ−３’：配列番号１８）を用いるＰＣＲによって、ｐＥＴ−ｓｒｃ  ＬＶＨＲフラグメントを取得した。ｓｒｃＶＨ−５’上流プライマーおよびｓｒｃＮＦ−３’下流プライマー（５’−ＧＡＡ  ＧＴＴ  ＣＡＴ  ＣＣＧ  ＣＴＣ  ＣＡＣ  ＡＴＡ  ＧＧＣ−３’：配列番号１９）を用いるＰＣＲによって、ｐＥＴ−ｓｒｃ  ＦＶＨＲフラグメントを取得した。ｓｒｃＲＮ−５’上流プライマーおよびｓｒｃＡＴ−３’下流プライマー（５’−ＧＧＴ  ＴＧＣ  ＡＡＧ  ＧＴＣ  ＣＣＧ  ＧＴＧ  ＣＡＣ−３’：配列番号２０）を用いるＰＣＲによって、ｐＥＴ−ｓｒｃ  ＡＴＲＮフラグメントを取得した。ｓｒｃＩＨ−５’上流プライマーおよびｓｒｃＮＦ−３’下流プライマーを用いるＰＣＲによって、ｐＥＴ−ｓｒｃ  ＦＩＨＲフラグメントを取得した。ｓｒｃＩＨ−５’上流プライマーおよびｓｒｃＮＣ−３’下流プライマー（５’−ＧＣＡ  ＧＴＴ  ＣＡＴ  ＣＣＧ  ＣＴＣ  ＣＡＣ  ＡＴＡ  ＧＧＣ−３’：配列番号２１）を用いるＰＣＲによって、ｐＥＴ−ｓｒｃ  ＣＩＨＲフラグメントを取得した。なお、上述したＰＣＲを、ｐＥＴ−ｓｒｃ  ＡＡＲＮ、ｐＥＴ−ｓｒｃ  ＲＡＲＮ、ｐＥＴ−ｓｒｃ  ＡＡＡＮについてはｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｓｒｃをテンプレートに、ｐＥＴ−ｓｒｃ  ＹＩＨＲ、ｐＥＴ−ｓｒｃ  ＬＶＨＲ、ｐＥＴ−ｓｒｃ  ＦＶＨＲ、ｐＥＴ−ｓｒｃ  ＦＩＨＲ、ｐＥＴ−ｓｒｃ  ＣＩＨＲについてはｐＥＴ−ｓｒｃ  ＡＡＲＮをテンプレートに、ｐＥＴ−ｓｒｃ  ＡＴＲＮについてはｐＥＴ−ｓｒｃ  ＦＶＨＲをテンプレートに用い、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）にてＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ）を使用して行った。ｐＥＴ−ｓｒｃ  ＡＡＲＮ、ｐＥＴ−ｓｒｃ  ＲＡＲＮ、ｐＥＴ−ｓｒｃ  ＡＡＡＮ、ｐＥＴ−ｓｒｃ  ＹＩＨＲ、ｐＥＴ−ｓｒｃ  ＬＶＨＲ、ｐＥＴ−ｓｒｃ  ＦＶＨＲ、ｐＥＴ−ｓｒｃ  ＦＩＨＲ、ｐＥＴ−ｓｒｃ  ＣＩＨＲについては、９８℃で１０秒間の熱変性、６３℃で１０秒間のアニーリング、７２℃で７分間の伸長反応を３０サイクル繰り返すことによりフラグメントを増幅し、ｐＥＴ−ｓｒｃ  ＡＴＲＮについては９８℃で１０秒間の熱変性、５９．８℃で１０秒間のアニーリング、７２℃で７分間の伸長反応を３０サイクル繰り返すことによりフラグメントを増幅した。その後、ｐＥＴ−ｓｒｃ  ＡＡＲＮ、ｐＥＴ−ｓｒｃ  ＲＡＲＮ、ｐＥＴ−ｓｒｃ  ＡＡＡＮについては、アガロースゲル電気泳動でＰＣＲ産物（フラグメント）を単離し、ＮｈｅＩとＸｈｏＩで消化した後にｐＥＴ−２３ａ（＋）のマルチクローニング部位に組み込んだ（図３Ａ）。
【００９４】
（８−２）大腸菌での発現と精製
各種Ｓｒｃ発現ベクターおよびｐＥＴ−２３ａ（＋）を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）にエレクトロポレーション法により導入し、この大腸菌を５ｍｌのＬＢ／アンピシリン液体培地（１％トリプトン，０．５％酵母エキス，０．５％  ＮａＣｌ，１００μｇ／ｍｌアンピシリン）中で３７℃で１２時間振盪培養した。培養液１ｍｌを遠心分離して菌体を回収し、０．１ｍｌのホモゲナイジング緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ４０）中にて、菌体を超音波破砕した。得られた菌破砕液を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，４℃，１０分間）し、上清を除き、再度菌体を０．１ｍｌのホモゲナイジング緩衝液で遠心洗浄した。得られた沈殿に０．１ｍｌのホモゲナイジング緩衝液を加えて懸濁して泳動サンプルとした。
【００９５】
ＳｒｃＲＡＡＮ（ＷＴ）、ＳｒｃＡＡＲＮ、ＳｒｃＲＡＲＮ、ＳｒｃＡＡＡＮについては、さらに精製した。発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）にエレクトロポレーション法により導入し、３００ｍｌのフラスコに調製した１００ｍｌのＬＢ／アンピシリン液体培地中でで、この菌を３７℃で１２時間振盪培養した。培養液を遠心分離（５，０００ｒｐｍ，４℃，１０分間）して菌体を回収し、１０ｍｌのホモゲナイジング緩衝液中にて、菌体を超音波破砕した。得られた菌破砕液を遠心分離（５，０００ｒｐｍ，４℃，１０分間）して、可溶性画分と不溶性画分とに分離した。不溶性画分に可溶化溶液（６Ｍグアニジン塩酸塩，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）を加えた後に超音波処理を行って、不溶性画分を完全に可溶化した。可溶化した不溶性画分を、予め可溶化溶液で平衡化しておいたＨｉＴｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ＨＰカラム（１ｍｌ）にアプライした。その後、１０ｍｌの可溶化溶液、２０ｍＭイミダゾールを含む可溶化溶液１０ｍｌ、５０ｍＭイミダゾールを含む可溶化溶液１０ｍｌをカラムに通して、非特異的に結合しているタンパク質を除いた。次いで、２００ｍＭイミダゾールを含む可溶化溶液１０ｍｌでＨｉｓ６−ＳｒｃおよびＨｉｓ６−Ｓｒｃ変異体を溶出した。２００ｍＭイミダゾールを含む可溶化溶液の画分を１ｍｌずつ１０本に分画した。その後、各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してＳｒｃおよびＳｒｃ変異体の溶出画分を確認し、それぞれの溶出サンプルを透析チューブに入れ、５００ｍｌのホモゲナイジング緩衝液に対して２時間×３回透析して溶液中のイミダゾールとニッケルイオンおよびグアニジン塩酸塩を除去した。透析後、各サンプルを使用時まで−３０℃で保存した。
【００９６】
＜ＩＩ．結果＞
〔１：ポリクローナル抗体の作製とその反応特異性〕
本発明者らは、チロシンキナーゼの触媒ドメイン中に存在するサブドメインＶＩＢが、他のタンパク質キナーゼとは異なるアミノ酸配列を有していること、その配列にはＳｒｃファミリーチロシンキナーゼのみで見られるＲＡＡＮ配列と、それ以外のチロシンキナーゼで見られるＡＡＲＮ配列との２種類が存在していることを見出した（配列番号３２〜４５（図１Ａ））。そこで、これらのアミノ酸配列をもとに表１に示した９種類のペプチドを合成し（配列番号１〜８（図１Ｂ））、これらのペプチドとＫＬＨとの複合体をマウスに免疫して抗体を惹起させた。
【００９７】
また、免疫したマウスより得られた抗血清の反応性を調べるためにＳｒｃ変異体（ＳｒｃＡＡＲＮ，ＳｒｃＲＡＲＮ，ＳｒｃＡＡＡＮ）を作製した（配列番号２２〜２５（図２Ａ））。具体的には、インバースＰＣＲ法を用いて作製したＳｒｃ変異体発現ベクターを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入して、カルボキシル末端にＨｉｓ６タグのついた融合タンパク質としてＳｒｃ変異体を発現させた。発現したＳｒｃ変異体は大腸菌抽出液の不溶性画分に大量に回収されたので、可溶化を行った後にニッケルアフィニティーカラムにより単一バンド（約６０ｋＤａ）にまでＳｒｃ変異体を精製した。
【００９８】
ＳｒｃおよびＳｒｃ変異体を分析サンプルとして用いて、得られた抗血清の反応性をウエスタンブロッティングにより調べた結果を図２Ｂに示す。これらの抗血清は、免疫したペプチドに応じて様々な反応性を有し、１１ＲＡＡＮ、１３ＲＡＡＮ，１３ＡＡＲＮ，１４ＲＡＡＮが４種類のＳｒｃを認識し得る抗体であることがわかった。また、幅広い特異性を有しかつ反応性の強い抗血清を得るためには、１１ＲＡＡＮペプチドが有効であることが示された。
【００９９】
〔２：モノクローナル抗体の作製とその反応特異性〕
幅広い特異性を有しかつ反応性の強い抗体を惹起した１１ＲＡＡＮペプチド免疫マウスおよび反応性は弱いが特異性が広い抗体を惹起した１３ＲＡＡＮペプチド免疫マウスについて、最終免疫から４日後に脾臓を摘出して調製した脾細胞を、ミエローマ細胞と融合した。その後ＨＧＲＰＴ陽性株（核酸合成サルベージ経路欠損株）をＨＡＴ選択培地により選択しかつスクリーニングした。抗原ペプチドをスポットしたニトロセルロース膜を用いるＤＩＡにより、１９２ウェルをスクリーニングした結果、シグナルの強度に差異はあるものの、１１ＲＡＡＮペプチド免疫マウスからは７個の陽性ウェル、１３ＲＡＡＮペプチド免疫マウスからは４４個の陽性ウェルが得られた。その後、陽性ウェルの中でも特に反応性の強いウェル（１１ＲＡＡＮでは２ウェル，１３ＲＡＡＮでは８ウェル）について、一次クローニング後、細胞がコロニー形成した段階で培養上清を回収してスクリーニングした。その結果、１１ＲＡＡＮでは１９２ウェル中５６ウェル、１３ＲＡＡＮでは７６８ウェル中１１９ウェルが陽性であった。さらに、１１ＲＡＡＮについては２ウェル、１３ＲＡＡＮについては５ウェルを二次クローニングし、その後スクリーニングしたところ、１１ＲＡＡＮでは１１６ウェル中３１ウェル、１３ＲＡＡＮでは１１２ウェル中３４ウェルが陽性であった。得られた陽性ウェル中で単一コロニーからなるウェルについて三次クローニングし、その後スクリーニングしたところ、全てのウェルが陽性であった。よってクローニングを完了したと判断した。
【０１００】
各々の陽性ウェルについて、１１ＲＡＡＮからは２つ、１３ＲＡＡＮからは１つのハイブリドーマを樹立した。１１ＲＡＡＮ由来のハイブリドーマをＹＫ３４、ＹＫ８４とし、１３ＲＡＡＮ由来のハイブリドーマをＹＫ６８と名付けた。
【０１０１】
これらのハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体がどの程度のチロシンキナーゼを認識し得るかを検討した。具体的には、ヒトに存在するチロシンキナーゼのサブドメインＶＩＢのアミノ酸配列を調べ、その中でもチロシンキナーゼで高度に保存されているアミノ酸配列を有するＳｒｃ変異体を作製した。
【０１０２】
本発明者らは、ヒトに存在する９０種類のチロシンキナーゼについて、そのアミノ酸配列をデータベース上より取得し、サブドメインＶＩＢに相当する配列を比較した。その結果、９０種類のチロシンキナーゼのうち２種類（ＥｐｈＸおよびＡＡＴＹＫ３）にはサブドメインＶＩＢが存在しなかった。そこで本発明者らは、それ以外の８８種類について、サブドメインＶＩＢ配列におけるアミノ酸のバリエーションを見出し、２９通り７種類に分類した（データは示さず）。
【０１０３】
このように分類したサブドメインＶＩＢのアミノ酸配列の中でも、多くのチロシンキナーゼに見られる配列に基づいてＳｒｃ変異体（ＳｒｃＹＩＨＲ，ＳｒｃＬＶＨＲ，ＳｒｃＦＶＨＲ，ＳｒｃＡＴＲＮ，ＳｒｃＦＩＨＲ，ＳｒｃＣＩＨＲ）を作製した（配列番号２６〜３１（図３Ａ））。具体的には、インバースＰＣＲ法を用いて作製したＳｒｃ変異体発現ベクターを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入して、カルボキシル末端にＨｉｓ６タグのついた融合タンパク質としてＳｒｃ変異体を発現させた。
【０１０４】
発現したＳｒｃ変異体は大腸菌抽出液の不溶性画分に大量に回収されたので、不溶性画分をＳｒｃおよびＳｒｃ変異体を分析サンプルとして用いて、３種類のハイブリドーマ（ＹＫ３４、ＹＫ８４およびＹＫ６８）の産生するモノクローナル抗体（それぞれ、１４−２、Ｃ４およびＨ４）の反応性をウエスタンブロッティングによって調べた。ＹＫ３４由来の抗体（Ｃ４）はＳｒｃおよび全てのＳｒｃ変異体と強く反応し、その中でもＳｒｃおよびＳｒｃＲＡＲＮと非常に強く反応した（図３Ｂ）。図３Ｃは、抗Ｈｉｓ抗体を用いた結果であり、野生型および変異体のＳｒｃタンパク質が全て同等に発現していることを示す。図３Ｂおよび４Ｃにおいて、レーン１：モック（ｍｏｃｋ）、レーン２：ＳｒｃＲＡＡＮ、レーン３：ＳｒｃＡＡＲＮ、レーン４：ＳｒｃＲＡＲＮ、レーン５：ＳｒｃＡＡＡＮ、レーン６：ＳｒｃＹＩＨＲ、レーン７：ＳｒｃＬＶＨＲ、レーン８：ＳｒｃＦＶＨＲ、レーン９：ＳｒｃＡＴＲＮ、レーン１０：ＳｒｃＦＩＨＲ、レーン１１：ＳｒｃＣＩＨ、を示す。
【０１０５】
なお、ＹＫ６８由来の抗体（１４−２）はＳｒｃおよび全てのＳｒｃ変異体と反応はするものの、その反応性はポリクローナル抗体と同様で非常に弱いものであり、モノクローナル抗体とすることで反応性を上げることはできなかった（データは示さず）。また、ＹＫ８４由来の抗体（Ｈ４）はＳｒｃおよび全てのＳｒｃ変異体と反応し、その中でもＳｒｃおよびＳｒｃＲＡＲＮと強く反応するが、ＳｒｃＹＩＨＲ、ＳｒｃＦＩＨＲ、ＳｒｃＣＩＨＲとの反応性は若干弱かった（データは示さず）。
【０１０６】
さらに、上記モノクローナル抗体とＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼまたは他のタンパク質との反応性をウエスタンブロッティングによって調べた結果を図４に示す。図４Ａは、ＣＢＢ染色を行った結果であり、ゲルの各レーンにタンパク質が存在していることを示す。ＹＫ３４由来の抗体（Ｃ４）およびＹＫ８４由来の抗体（Ｈ４）はいずれもＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼである３０Ｋ−ＣａＭＫＩＩ、ＣａＭＫＩＶ、ＣａＭＫＫおよびＰＫＡと反応しないこと、また既知のプロテインホスファターゼであるＣａＭＫＰ、ＰＰ２Ｃとも反応しないことを確認した（図４Ｂ，Ｃ）。次に、ＹＫ３４由来の抗体（Ｃ４）およびＹＫ８４由来の抗体（Ｈ４）が組織または細胞抽出液中のチロシンキナーゼを検出することができるのかどうかを調べるために、これらの抗体とラット大脳抽出液またはＮｅｕｒｏ２ａ細胞抽出液との反応性を調べた。その結果、これらの抗体が、ラット大脳抽出液およびＮｅｕｒｏ２ａ細胞抽出液に含まれる多数のタンパク質と反応することを確認した（図４Ｂ，Ｃ）。反応したタンパク質は大部分が５０ｋＤａ以上のタンパク質であり、ラット大脳抽出液とＮｅｕｒｏ２ａ細胞抽出液との間で同じ泳動度のバンド、異なる泳動度のバンドが多数検出された（図４Ｂ，Ｃ）。これらの結果から、得られたモノクローナル抗体Ｃ４およびＨ４は、タンパク質キナーゼの中でも様々なチロシンキナーゼと反応することが示された。なお、図４Ａ〜Ｃにおいて、レーン１：ＳｒｃＲＡＡＮ、レーン２：３０Ｋ−ＣａＭＫＩＩ、レーン３：ＣａＭＫＩＶ、レーン４：ＣａＭＫＫ、レーン５：ＰＫＡ、レーン６：ＣａＭＫＰ、レーン７：ＰＰ２Ｃ、レーン８：ラット脳抽出液、レーン９：Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞抽出液、を示す。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明は、チロシンキナーゼの研究用ツールとして非常に有用である。さらに本発明を用いれば、チロシンキナーゼが関与する種々の疾患において、原因の解明、診断または治療のための手段の開発、および医薬開発に大きく寄与し得る。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】種々のキナーゼのサブドメインＶＩＢについてのアミノ酸配列アラインメント（Ａ）、および本発明に係る抗体を惹起させるために作製したペプチドのアミノ酸配列（Ｂ）を示す図である。
【図２】Ｓｒｃチロシンキナーゼおよび変異体のサブドメインＶＩＢについてのアミノ酸配列アラインメント（Ａ）、ならびにＳｒｃチロシンキナーゼおよび変異体について種々の抗血清または抗Ｈｉｓ抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果（Ｂ）を示す図である。
【図３】Ｓｒｃチロシンキナーゼおよび変異体のサブドメインＶＩＢについてのアミノ酸配列アラインメント（Ａ）、Ｓｒｃチロシンキナーゼおよび変異体についてモノクローナル抗体（Ｃ４）を用いたウエスタンブロッティングの結果（Ｂ）、ならびに抗Ｈｉｓ抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果（Ｃ）を示す図である。
【図４】種々のキナーゼについてＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にＣＢＢ染色したゲル（Ａ）、モノクローナル抗体（Ｃ４）を用いたウエスタンブロッティングの結果（Ｂ）、ならびにモノクローナル抗体（Ｈ４）を用いたウエスタンブロッティングの結果（Ｃ）を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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