(57)【要約】【課題】  従来に比べて耐アルカリ性の高い耐熱性プロテアーゼ及び該プロテアーゼをコードする遺伝子を提供すること。【解決手段】  超好熱菌KOD1株からシグナルペプチドペプチダーゼ（SppA）をコードする遺伝子を単離し、この遺伝子を用いてSppA生産宿主細胞を得、そしてこの宿主細胞を培養することにより、SppAを製造する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２の１位〜３３４位のアミノ酸配列を含む耐熱性プロテアーゼ、または配列番号２の１位〜３３４位のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を含み、かつプロテアーゼ活性を有する耐熱性プロテアーゼ。
【請求項２】
配列番号２の５５位〜３３４位のアミノ酸配列を含む耐熱性プロテアーゼ、または配列番号２の５５位〜３３４位のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を含み、かつプロテアーゼ活性を有する耐熱性プロテアーゼ。
【請求項３】
超好熱菌に由来する、請求項１または２に記載の耐熱性プロテアーゼ。
【請求項４】
超好熱菌がThermococcus kodakaraensis KOD1株である、請求項３に記載の耐熱性プロテアーゼ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の耐熱性プロテアーゼをコードする耐熱性プロテアーゼ遺伝子。
【請求項６】
配列番号１の１位〜１００５位の塩基配列を含む、請求項５に記載の耐熱性プロテアーゼ遺伝子。
【請求項７】
配列番号１の１６３位〜１００５位の塩基配列を含む、請求項５に記載の耐熱性プロテアーゼ遺伝子。
【請求項８】
超好熱菌に由来する、請求項６または７に記載の耐熱性プロテアーゼ遺伝子。
【請求項９】
超好熱菌がThermococcus kodakaraensis KOD1株である、請求項８に記載の耐熱性プロテアーゼ遺伝子。
【請求項１０】
請求項５〜９のいずれかに記載の耐熱性プロテアーゼ遺伝子が挿入されてなるベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターが導入されてなる組換え宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１１に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、耐熱性プロテアーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐熱性プロテアーゼ及びそれをコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテアーゼはタンパク質やペプチド類のペプチド結合を切断する酵素であり、例えば、医薬品、食品加工および洗剤など産業上広く利用されている。かかるプロテアーゼには物理的、化学的に高い熱安定性が要求されることから、特に耐熱性のプロテアーゼが広く使用されている。
【０００３】
そこで、従来から、超好熱菌の産生するタンパク質が一般的に耐熱性が高いことに着目して、超好熱菌の産生する酵素の中から耐熱性のプロテアーゼを取得する試みがなされている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
【特許文献１】再表９７−０２１８２３号公報
【０００５】
特許文献１には、超好熱菌のひとつであるピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来の耐熱性プロテアーゼが開示されている。特許文献１により取得され得る耐熱性プロテアーゼは、耐熱性を有するとともに、ｐＨ５〜１１の範囲で、９５℃，６０分間の処理後も９５％以上の活性を保持していることが記載されている。したがって、前記耐熱性プロテアーゼは、耐熱性を有し、かつ耐アルカリ性についてもある程度高い酵素といえる。
【０００６】
しかしながら、過酷な条件下で使用されることを想定した場合、前記プロテアーゼの示す耐アルカリ性では必ずしも十分とはいえず、さらに高い耐アルカリ性を示す耐熱性プロテアーゼが要望されていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、従来に比べて耐アルカリ性の高い耐熱性プロテアーゼ及び該プロテアーゼをコードする遺伝子を提供すること、ならびに該遺伝子が挿入されてなるベクター及び該ベクターが導入されてなる組換え宿主細胞を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、超好熱菌の一種であるThermococcus kodakaraensis KOD1株に着目し、上記課題を達成するため鋭意検討した結果、該菌株に由来するシグナルペプチドペプチダーゼを単離し、その特性を調べたところ、耐熱性を有するとともに、驚くべきことに従来に比べて高い耐アルカリ性を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
〔１〕  配列番号２の１位〜３３４位のアミノ酸配列を含む耐熱性プロテアーゼ、または配列番号２の１位〜３３４位のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を含み、かつプロテアーゼ活性を有する耐熱性プロテアーゼ、
〔２〕  配列番号２の５５位〜３３４位のアミノ酸配列を含む耐熱性プロテアーゼ、または配列番号２の５５位〜３３４位のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を含み、かつプロテアーゼ活性を有する耐熱性プロテアーゼ、
〔３〕  超好熱菌に由来する、〔１〕または〔２〕に記載の耐熱性プロテアーゼ、
〔４〕  超好熱菌がThermococcus kodakaraensis KOD1株である、〔３〕に記載の耐熱性プロテアーゼ、
〔５〕  〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の耐熱性プロテアーゼをコードする耐熱性プロテアーゼ遺伝子、
〔６〕  配列番号１の１位〜１００５位の塩基配列を含む、〔５〕に記載の耐熱性プロテアーゼ遺伝子、
〔７〕  配列番号１の１６３位〜１００５位の塩基配列を含む、〔５〕に記載の耐熱性プロテアーゼ遺伝子、
〔８〕  超好熱菌に由来する、〔６〕または〔７〕に記載の耐熱性プロテアーゼ遺伝子、
〔９〕  超好熱菌がThermococcus kodakaraensis KOD1株である、〔８〕に記載の耐熱性プロテアーゼ遺伝子、
〔１０〕  〔５〕〜〔９〕のいずれかに記載の耐熱性プロテアーゼ遺伝子が挿入されてなるベクター、
〔１１〕  〔１０〕に記載のベクターが導入されてなる組換え宿主細胞、
〔１２〕  〔１１〕に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、耐熱性プロテアーゼの製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、従来に比べて耐アルカリ性の高い耐熱性プロテアーゼ及び該プロテアーゼをコードする遺伝子が提供される。また、本発明によれば、前記遺伝子が挿入されてなるベクター及び該ベクターが導入されてなる組換え宿主細胞が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の耐熱性プロテアーゼは、それ自体該プロテアーゼを産生する超好熱菌を培養することにより、または前記耐熱性プロテアーゼをコードする遺伝子を単離し、この遺伝子が挿入されたベクターを構築し、このベクターが導入された組換え宿主細胞を作製し、そしてこの宿主細胞を培養することにより、またはin vitroの転写・翻訳系によって製造することができる。
【００１２】
本発明において使用される「超好熱菌」とは、至適生育温度が８０℃以上、もしくは９０℃以上で生育する細菌または始原菌（古細菌）をいう。本発明に適用可能な超好熱菌は前記定義に該当する限り特に限定されない。現在１００種類以上の超好熱菌が分離・同定されており、これらはいずれも本発明に適用することができる。かかる超好熱菌としては、例えば、Aquifex pyrophilus，Geothermobacterium ferrireducens，Thermotoga maritima，Thermotoga neopolitana，Thermotoga petrophila，Thermotoga naphthophila，Acidianus infernus，Aeropyrum pernix，Archaeoglobus fulgidus，Archaeoglobus profundus，Caldivirga maquilingensis，Desulfurococcus amylolyticus，Desulfurococcus mobilis，Desulfurococcus mucosus，Ferroglobus placidus，Geoglobus ahangari，Hyperthermus butylicus，Ignicoccus islandicus，Ignicoccus pacificus，Methanococcus jannaschii，Methanococcus fervens，Methanococcus igneus，Methanococcus infernus，Methanopyrus kandleri，Methanothermus fervidus，Methanothermus sociabilis，Palaeococcus ferrophilus，Pyrobaculum aerophilum，Pyrobaculum calidifontis，Pyrobaculum islandicum，Pyrobaculum oguniense，Pyrococcus furiosus，Pyrococcus abyssi，Pyrococcus horikoshii，Pyrococcus woesei，Pyrodictium abyssi，Pyrodictium brockii，Pyrodictium occultum，Pyrolobus fumarii，Staphylothermus marinus，Stetteria hydrogenophila，Sulfolobus solfataricus，Sulfolobus shibatae，Sulfolobus tokodaii，Sulfophobococcus zilligii，Sulfurisphaera ohwakuensis，Thermococcus kodakaraensis，Thermococcus celer，Thermococcus litoralis，Thermodiscus maritimus，Thermofilum pendens，Thermoproteus tenax，Thermoproteus neutrophilus，Thermosphaera aggregans，Vulcanisaeta distributa，Vulcanisaeta sounianaなどが挙げられる（跡見晴幸ら，生化学，第７５巻，第７号，pp.561-575，2003を参照）。
【００１３】
本発明では、上記の超好熱菌のうち、実施例においてThermococcus kodakaraensis KOD1 株（以下、「KOD1株」という）が使用されている。KOD1株は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターに寄託されており、その受託番号は、JCM 12380である。
【００１４】
本発明において「耐熱性プロテアーゼ」とは、プロテアーゼＩＶ（エンドペプチダーゼＩＶ）のＳ４９ファミリーに属するシグナルペプチドペプチダーゼ（以下、「SppA」という）であって、耐熱性および耐アルカリ性がともに高いものをいう。
【００１５】
分泌タンパク質は一般にそのＮ末端にシグナル配列を持ち、機能発現する際には細胞膜でシグナル配列がシグナルペプチダーゼによって切断される。いくつかの細菌では、前記切断されたシグナル配列がさらにSppAによって分解されていくことが報告されている（Mark Paetzel ら，Chemical Reviews，102：4573，2002を参照）。
【００１６】
「耐熱性が高い」とは、７０℃で調製した５０ｍＭ ＣＨＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ１０．０）にSppAを終濃度１μｇ／ｍｌになるように添加し、添加時の酵素活性を基準にして、７０℃で６０分間インキュベートしたときの残存活性が８０％以上、好ましくは８５％、更に好ましくは９０％以上の値を示すことをいう。この場合の「酵素活性」は、５０ｍＭ ＣＨＥＳ（ｐＨ１０．０）緩衝液にSppA（終濃度：０．１μｇ／ｍｌ）と蛍光基質Ala-Ala-Phe-MCA（終濃度：２００μＭ）を添加して６０℃で反応させ、SppAにより切断された基質から遊離する７−アミノ−４−メチル−クマリン（ＡＭＣ）の蛍光の強さを３８０ｎｍの励起光と４６０ｎｍの放射光で測定し、反応後１２０〜１８０秒後の６０秒間における蛍光の増加量により算出することができる。
【００１７】
「耐アルカリ性が高い」とは、６０℃で調製した５０ｍＭ ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ１１．０）にSppAを終濃度１μｇ／ｍｌになるように添加し、添加時の酵素活性を基準にして、６０℃で２時間インキュベートしたときの残存活性がほぼ９０％以上、好ましくは９５％以上の値を示すことをいう。この場合の「酵素活性」も上記と同様に、５０ｍＭ ＣＨＥＳ（ｐＨ１０．０）緩衝液にSppA（終濃度：０．１μｇ／ｍｌ）と蛍光基質Ala-Ala-Phe-MCA（終濃度：２００μＭ）を添加して６０℃で反応させ、SppAにより切断された基質から遊離する７−アミノ−４−メチル−クマリン（ＡＭＣ）の蛍光の強さを３８０ｎｍの励起光と４６０ｎｍの放射光で測定し、反応後１２０〜１８０秒後の６０秒間における蛍光の増加量により算出することができる。
【００１８】
上記の耐熱性および耐アルカリ性を示す耐熱性プロテアーゼは、具体的には、配列番号２の１位〜３３４位のアミノ酸配列を含むもの、または配列番号２の１位〜３３４位のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を含み、かつプロテアーゼ活性を有するものである。
【００１９】
本発明者らは、KOD1株から調製した染色体DNAのゲノム解析を行い、全塩基配列を決定した（データ示さず）。そして、得られた２，３０６個のオープンリーディングフレーム（ORF）について、配列に基づくプログラム解析をした結果、配列番号１の１位〜１００５位のORFがSppAをコードしていると推定された。配列番号２は配列番号１の塩基配列から推定されるアミノ酸配列である。
【００２０】
また、図１はKOD1株由来のSppAのアミノ酸配列を示すものであり、後述するように、Ｎ末端近くの四角で囲まれたアミノ酸配列は推定膜貫通ドメインを示し、この膜貫通ドメインの下流（Ｃ末端側）に隣接して下線が付されたアミノ酸配列は、精製後において酵素により自己消化されやすい領域を示している。このように、前記SppAにはＮ末端の近傍に膜貫通ドメインと酵素により自己消化されやすい領域が隣接して存在する。このため、精製後において均一なSppAを取得したい場合、上記の耐熱性および耐アルカリ性を示す耐熱性プロテアーゼとしては、前記２つの領域のうち、片方または両方についてその一部分または全部を欠失させたSppAを公知の遺伝子工学的手法を用いて製造してもよい。なお、後述する実施例では、前記２つの領域を欠失させたSppA、すなわち、配列番号２の５５位〜３３４位のアミノ酸配列からなるSppAを公知の遺伝子工学的手法用いて製造し、その特性を評価している。
【００２１】
また、KOD1株由来のSppAは、上述した耐熱性および耐アルカリ性を示す他、例えば、ロイペプチン、アンチパイン、キモスタチン、ジイソプロピルフルオロリン酸などのセリンプロテアーゼ阻害剤に対してプロテアーゼ活性が阻害される傾向を示す。さらに、該SppAは、図１０に示す消光性蛍光基質と反応させると、図１０中、Xaaとして分子量の小さいアミノ酸（グリシン、セリン、アラニン、トレオニン）が導入された基質に対して高い特異性を示すとともに、各種のペプチジルMCA基質のうち、Ala-Ala-Phe-MCA基質に対して高い特異性を示す。
【００２２】
SppAは、例えば、（１）それ自体SppAを産生する超好熱菌を培養することにより、または（２）SppAをコードする遺伝子を単離し、この遺伝子が挿入されたベクターを構築し、このベクターが導入された宿主細胞を作製し、そしてこの宿主細胞を培養することにより、または（３）in vitro転写・翻訳系によって製造することができる。
【００２３】
前記（１）の方法について説明すると、まず、超好熱菌の培養は、例えばAppl. Environ. Microbiol. 60(12), 4559-4566(1994)に記載の培養条件下で実施することができる。培養は、静置培養または窒素ガスによる通気撹拌培養のいずれでもよく、また、連続的または回分的のいずれでもよい。そして、例えば、得られた培養物の酵素活性を測定して高い耐熱性と高い耐アルカリ性を示すSppAを生産する超好熱菌を選択することにより、または公知の方法で作製した、SppAに特異的な抗体（例えば、前記KOD1株由来のSppAの一部または全部を抗原として作製した抗体）と反応する酵素を生産する超好熱菌を選択し、さらに必要に応じて選択された超好熱菌を培養することによりSppAを大量に製造することができる。
【００２４】
続いて、前記（２）の方法について説明する。まず、SppAをコードする遺伝子は、塩基配列が既知の遺伝子を単離する際に行われる公知の方法を用いて単離することができる。具体的には、例えば、DNA合成機を使用して、配列番号１に示す１位〜１００５位の塩基配列からなるDNAを全合成する方法、または前記塩基配列を複数領域に分けて複数のDNA断片を合成した後、該DNA断片を連結させる方法が挙げられる。
【００２５】
超好熱菌としてKOD1株を用いる場合、例えば、配列番号１に示す１位〜１００５位の塩基配列が増幅されるように適宜プライマーを設計し、KOD1株の染色体DNAを鋳型にしてPCRを行う方法を採用することができる。また、KOD1株を培養して得られたコロニーから前記塩基配列からなる領域を直接PCRする方法を採用することができる。
【００２６】
KOD1株以外の超好熱菌を使用する場合であって、その染色体DNAの全塩基配列が既知のときは、まず相同性検索を行う。その結果、配列番号１に示す１位〜１００５位の塩基配列が検索された場合は、基本的にKOD1株を使用するときと同様の方法を採用することで対象とする超好熱菌由来のSppA遺伝子を単離することができる。また、SppA遺伝子と推定されるが塩基配列が異なる場合は、例えば、対象とする超好熱菌由来の推定されるSppA遺伝子の塩基配列が増幅されるように適宜プライマーを設計し、対象とする超好熱菌由来の染色体DNAを鋳型にしてPCRを行う方法を採用することができる。
【００２７】
KOD1株以外の超好熱菌を使用する場合であって、その染色体DNAの塩基配列が未知のときは、例えば、該染色体のDNAライブラリーに対して、KOD1株由来のSppA遺伝子（または該遺伝子に特徴的な塩基配列部分からなるオリゴDNA）をプローブとしてハイブリダイゼーションを実施することで対象とする超好熱菌由来のSppA遺伝子を単離することができる。また、該染色体DNAを鋳型として、KOD1株由来のSppA遺伝子に特徴的な塩基配列部分からなるオリゴDNAを用いたPCRを行うことによりSppA遺伝子あるいはその一部を単離することができる。一部であった場合においてはこのDNA断片を用いて上記ハイブリダイゼーションを行うことによりSppA遺伝子を単離することができる。また、このDNA断片の塩基配列をもとにインバースPCRを行うことによってもSppA遺伝子を単離することができる。また、公知の方法で作製した、KOD1株由来のSppAに特異的な抗体（例えば、前記KOD1株由来のSppAの一部または全部を抗原として作製した抗体）と反応するタンパク質を生産する組換え体を選択することによってもSppA遺伝子を単離することができる。
【００２８】
そして、上記の方法により単離されたSppA遺伝子を、使用される宿主細胞に適合性を有する発現ベクター中に作動可能に挿入し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、形質転換された宿主細胞を培養することにより、SppAを発現させることができる。
【００２９】
組換え宿主細胞を培養する条件は、使用される宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。宿主細胞としては、組換えDNA技術において使用可能な任意の宿主細胞を使用することができる。かかる宿主細胞としては、例えば、原核細胞、酵母細胞、動物細胞、植物細胞および昆虫細胞などが挙げられる。これらの中で好ましい宿主細胞は細菌細胞である。
【００３０】
培養後、得られた培養物から当該分野で公知の方法によりSppAを精製することができる。SppAが細胞外に分泌される場合は、例えば培養物を遠心分離またはろ過することによって上清を得、これからSppAを直接精製するかあるいは沈澱法または限外ろ過などにより濃縮してから精製する。SppAが細胞中に蓄積される場合は、該細胞を、細胞壁溶解酵素、浸透圧の変化、ガラスビーズ、ホモジナイザーまたは超音波処理などを用いて破壊して細胞抽出物を得、これからSppAを精製する。精製は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動などの当該分野で公知の方法を組み合わせて実施することができる。
【００３１】
続いて、前記（３）の方法について説明する。まず、KOD1株由来のSppAをコードする遺伝子は塩基配列が既知の遺伝子を単離する際に行われる公知の方法を用いて単離することができる。この遺伝子またはその一部を改変させたものを含むDNA断片と原核生物あるいは真核生物、例えば大腸菌、小麦胚芽細胞、ウサギ網膜細胞の無細胞抽出液を用いてin vitroで転写反応あるいは翻訳反応あるいはそれらの組合わせによってもSppAを製造することができる。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【００３３】
１．KOD1株の染色体DNAの調製
人工海水（１．６％ＮａＣｌ、０．２４％ＭｇＣｌ２・６Ｈ２０、０．４８％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０、０．４８％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０８％ＮａＨＣＯ３、０．０１６％ＣａＣｌ２・２Ｈ２０、０．０４％ＫＣｌ、０．０３３６％ＫＨ２ＰＯ４、０．００４％ＮａＢｒ、０．００１６％ＳｒＣｌ２・６Ｈ２０、０．０００８％Ｆｅ（ＮＨ４）２Ｈ（Ｃ６Ｈ５０７）２）、０．５％酵母エキス及び０．５％トリプトンからなる培地を１０リットル作成し、１リットル容ボトル１０本に分注し、これをオートクレーブ（１２１℃、２ａｔｍ、２０分間）で滅菌処理を行った。滅菌処理された前記培地に対して硫黄を０．１％添加し、次いでKOD1株を接種して培養を行った。培養は８５℃で約１６時間嫌気的に行った。培養終了後、培養液を８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより菌体を回収した。回収した菌体から上清を除去した後、該菌体を前記人工海水に懸濁し、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する操作を２回繰り返して菌体を洗浄した。
【００３４】
得られた菌体をＴＥ緩衝液Ａ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１０ｍＭ ＥＤＴＡ）１６０ｍｌに懸濁し、この懸濁液に１０％ドデシル硫酸ナトリウム２mｌとプロテイナーゼＫ４０mgを添加し、５５℃で１時間反応させた。次に、前記懸濁液に中性フェノールを１００ｍｌ添加して１０分間混合した。得られた混合液を２０，０００×ｇで１０分間遠心分離した後、上層にある水層部分を取り出した。取り出した水層と等量（約１５０ｍｌ）のＰＣＩ（フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール）（５０：４８：２ ％（ｖ／ｖ））を添加して１０分間混合し、得られた混合液を２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、次いで上層にある水層部分を取り出した。取り出した水層にエタノール約３００ｍｌと３Ｍ 酢酸ナトリウム溶液１５mｌを添加し、−２０℃で３０分間静置した。そして、静置後の混合液を２０，０００×ｇで１０分間遠心分離することにより核酸の沈殿を得た。
【００３５】
この沈殿に７０％エタノールを５０ｍｌ添加し、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離を行って核酸をリンスした。上清を除去後、沈殿を乾燥させ、該乾燥した沈殿にＴＥ緩衝液Ｂ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ）を４０mｌ添加して核酸を溶解した。次に、得られた核酸溶液４０mｌにリボヌクレアーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）を４００μｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。反応終了後の核酸溶液に前記ＰＣＩを４０mｌ添加して５分間混合した。この混合液を２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、水層部分を取り出した。そして、前記ＰＣＩの添加、遠心分離、水層部分の取り出し操作を再度行った。取り出した水層部分（約４０mｌ）にエタノール約８０ｍｌと３Ｍ 酢酸ナトリウム溶液４mｌを添加し、−２０℃で３０分間静置した。
【００３６】
静置処理した溶液を２０，０００×gで１０分間遠心分離してDNAの沈殿を得た。この沈殿に７０％エタノールを５０ｍｌ添加し、次いで２０，０００×gで１０分間遠心分離を行った。上清を除去した後、沈殿を乾燥させ、上記ＴＥ緩衝液Ｂを２０mｌ添加することにより染色体DNAの水溶液を得た。
【００３７】
２．ゲノム解析
得られた染色体DNAの塩基配列は、全ゲノム・ランダム・ショットガン・シークエンシングなどを行うことにより決定した。概略を説明すると、まず前記染色体DNAの２kbpの断片（１５５５２個）と５kbpの断片（４８００個）をプラスミドpUC18 に挿入したプラスミドライブラリーを構築し、該断片の塩基配列をMegaBACE 1000 シーケンサー（Amersham Biosciences 社）を使用して決定した。そして、得られた塩基配列データをアセンブルしたところ、５１個の主要なコンティグが得られた。続いて、隣り合うコンティグの末端にアニールするように設計したプライマーを使用して、ダイレクトPCRを行って各コンティグ間のギャップを埋めた。以上の解析結果から、前記染色体DNAの全塩基数は２，０８８，７３７ bp であることが確認され、その塩基配列が決定された。
【００３８】
３．SppAの相同性検索と一次構造解析
染色体DNAの配列データの解析は、３種類のピロコッカス種（Pyrococcus spp.）の一連のＣＤＳを備えたCritica プログラムとHidden Markov modelを使用したGeneHacker Plus プログラムとを組み合わせて行った。次いで、タンパク質をコードしていると推測される一連の塩基配列を、BLASTプログラムを使用して NCBIおよびSwiss-Prot に登録されているデータベースと比較した。続いて、ORF検索を行って種々の遺伝子を同定し、その後に相同性検索およびモチーフ検索を行った。そして、タンパク質のアミノ酸配列を InterPro を使用してさらに分析するとともに、COGs（Cluster of Orthologous Groups of proteins）データベースと比較した。最後に、SOSUIプログラムを使用して膜貫通領域を予測した。
【００３９】
以上の解析結果から、染色体DNA中にORFが２，３０６個存在することが推定され、このうちSppAをコードする推定ORFとして、塩基数１，００５bpからなる領域が見出された（図２を参照）。この塩基配列を配列番号１に示す。このORFは３３４個のアミノ酸（配列番号２）からなるポリペプチドをコードしていた。また、図１は、SppAのアミノ酸配列を示すものであるが、このうち四角で囲んだ部分は、SOSUIプログラムから予測された膜貫通ドメインを示している。
【００４０】
４．SppA遺伝子の増幅
SppA遺伝子を大腸菌内で発現させるに際し、配列番号１に示す塩基配列からなるSppA遺伝子を使用することも考えられるが、大腸菌による発現に有利な点、及び取得したSppAの特性評価に際し、精製後においてもアミノ酸配列の分解がほとんどなく均一なSppAを得ることができる点から、配列番号１の１６３位〜１００５位の塩基配列からなるSppA遺伝子を増幅することにした。
【００４１】
すなわち、前記膜貫通ドメインは、生体内では生体膜と結合しており、SppAの活性とは無関係であること、および大腸菌内での発現の際に不溶化する可能性がゼロとはいえないので、前記膜貫通ドメインに対応する塩基配列（配列番号１の１９位〜８７位）を増幅対象から除くことにした。また、本発明者らが、配列番号１の８８位〜１００５位の塩基配列からなるSppA遺伝子を使用して大腸菌内で実際に発現させたところ、精製後において配列番号２の３０位〜５４位のアミノ酸配列（図１において下線が付された部分）が酵素の自己消化により分解することを見出したため（図４を参照）、前記分解される領域に対応する塩基配列（配列番号１の８８位〜１６２位）を増幅対象から除くことにした。
【００４２】
NdeIに対する制限酵素切断部位を含むプライマーＦ１（配列番号３）およびEcoRIに対する制限酵素切断部位を含むプライマーＲ１（配列番号４）を使用して、前記染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、SppA遺伝子のDNA断片を増幅した。PCRは、上記で調製した染色体DNA（４００ｎｇ）、各プライマー２０pmol及びKOD-plus-DNAポリメラーゼ（TOYOBO社製）を含む５０μｌの反応液中で、まず９４℃で１８０秒反応させ、９４℃で１５秒、６３℃で３０秒および７２℃で６０秒のサイクルを２５回繰り返し、最後に７２℃で３００秒反応させた。
【００４３】
５．塩基配列の確認
PCRにより得られたSppA遺伝子の増幅産物をアガロースゲル電気泳動し、目的の分子量の断片が得られたことを確認した後、アガロースゲルから増幅断片を回収しGFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Biosciences社製)にて精製した。HincIIで制限酵素処理し、同様にアガロースゲル電気泳動及びGFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Biosciences社製)にて精製したクローニング用プラスミドベクター pUC18に、精製した増幅産物をLigation high(TOYOBO社製)を用いてライゲーションした。ライゲーション反応溶液を、大腸菌コンピテントセルDH5αを宿主として塩化カルシウム法にて形質転換を行った。形質転換後、SOC培地にて３７℃で1時間プレ培養を行った後、アンピシリン含有LB寒天培地に植菌し、３７℃で１２時間培養した。
【００４４】
得られた形質転換体についてInsertCheck-ready-(TOYOBO社製)を用いてコロニーダイレクトPCRを行い、前記プラスミドにSppA遺伝子が挿入されていることを確認した。この確認した形質転換体をアンピシリン含有ＬＢ液体培地にて３７℃で１２時間培養し、Plasmid Mini Kit(QIAGEN社製)を用いて精製プラスミド(SppA /pUC18)を得た。最後にオートシーケンサー(ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer(Applied Biosystems社製))を用いてジデオキシ法により、挿入したSppA遺伝子の塩基配列を確認した。
【００４５】
６．SppA遺伝子の発現
塩基配列を確認したプラスミド(SppA/pUC18)を NdeI 及び EcoRI で制限酵素処理し、次いでアガロースゲル電気泳動を行い、SppA 遺伝子断片部位を回収し、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Biosciences社製)にて精製した。同様にNdeI及びEcoRIで制限酵素処理したプラスミドベクター pET21a(+)もアガロースゲル電気泳動及びGFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Biosciences社製)にて精製し、SppA遺伝子断片をLigation high(TOYOBO社製)を用いてライゲーションした。ライゲーション反応溶液を、大腸菌コンピテントセルDH5αを宿主として塩化カルシウム法にて形質転換を行った。形質転換後、ＳＯＣ培地にて３７℃で１時間プレ培養を行った後、アンピシリン含有ＬＢ寒天培地に植菌し、３７℃で１２時間培養した。得られた形質転換体についてコロニーPCRを行い、プラスミドにSppA遺伝子が挿入されていることを確認した。
【００４６】
SppA遺伝子の挿入を確認した形質転換体をアンピシリン含有ＬＢ液体培地にて３７℃で１２時間培養し、Plasmid Mini Kit(QIAGEN社製)を用いて精製プラスミド(SppA/pET21a(+))を得た（図３を参照）。また、オートシーケンサー(ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer(Applied Biosystems社製)) を用いてジデオキシ法により、挿入したSppA遺伝子の塩基配列を確認した。
【００４７】
塩基配列を確認したプラスミド(SppA/pET21a(+))を用いて大腸菌コンピテントセルBL21-CodonPlus(DE3)-RILを塩化カルシウム法にて形質転換を行った。形質転換後、ＳＯＣ培地にて３７℃で１時間プレ培養を行った後、アンピシリン含有ＬＢ寒天培地に植菌し、３７℃で１２時間培養した。得られた形質転換体をアンピシリン含有ＬＢ液体培地にて３７℃，１２時間の条件で前培養を行った後、この培養液をアンピシリン含有ＬＢ液体培地に１%植菌し、OD660が約０．３〜０．４になるまで３７℃で培養した。イソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノシドを終濃度０．１ｍＭで添加し、さらに５〜６時間培養を続けた。
【００４８】
培養終了後、菌体を遠心分離により回収し、さらに５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８．０)を添加し懸濁後、さらに遠心分離し、上清を除き菌体の洗浄を行った。この菌体に５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８．０)，１５０ｍＭ ＮａＣｌを添加して懸濁後、超音波処理により細胞を破砕した。これを再度遠心分離することにより可溶性タンパク質が含まれる画分を回収した。
【００４９】
次に前記可溶性画分について、８５℃で１５分間の熱処理を行い、遠心分離により沈澱を除き、熱に安定なタンパク質を含む可溶性画分を得た。この可溶性画分に飽和濃度が３５％になるように硫酸アンモニウムを徐々に添加し、遠心分離を行うことによりSppA活性を含む沈殿を得た。この沈殿に適当量の緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を添加し、再可溶化した後、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いてさらに精製を行った。陰イオン交換クロマトグラフィーは、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），２００ｍＭ ＮａＣｌで平衡化したResourceQカラム（Amersham Biosciences社製）を用い、SppAを含む試料を該カラムに付与し、前記カラムを前記緩衝液で洗浄後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５００ｍＭ ＮａＣｌまで塩濃度を徐々に増加させ、SppA活性画分を溶出させた。
【００５０】
脱塩カラムHiPrep26/10Desalting（Amersham Biosciences社製）を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１５０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液で平衡化し、該カラムにSppA活性画分を含む試料を付与し該緩衝液で脱塩した。脱塩したSppAをゲルろ過クロマトグラフィーを用いて精製するにあたり、まずCentriplus YM-10（Amicon社製）を用いて限外ろ過し、濃縮した。ゲルろ過クロマトグラフィーは、Superdex200HR10/30（Amersham Biosciences社製）を用い、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１５０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液で平衡化後、濃縮試料をカラムに付与し、同緩衝液でSppA活性画分のピークを分離した。（図４を参照）
【００５１】
７．SppAの酵素学的性質
精製SppAの酵素学的性質は、酵素活性を指標として検討した。酵素活性は、蛍光ペプチドであるAla-Ala-Phe-MCA（ペプチド研究所製）を基質とし、SppA により切断された基質から遊離する７-アミノ-４-メチル-クマリン(ＡＭＣ)の蛍光の強さを３８０ｎｍの励起光と４６０ｎｍの放射光により測定することにより算出した。
【００５２】
（最適ｐＨ）
SppAの最適ｐＨは、６０℃，ｐＨ６．０〜１２．０の範囲で SppA の活性測定を行い、SppAに対するｐＨの影響を調べることにより検討した。緩衝液はＭＥＳ−ＮａＯＨ(ｐＨ６．０〜７．０)、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ(ｐＨ７．０〜８．０)、Ｂｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨ(ｐＨ８．０〜９．０)、ＣＨＥＳ−ＮａＯＨ(ｐＨ９．０〜１０．０)及びＣＡＰＳ−ＮａＯＨ(ｐＨ１０．０〜１２．０)を用いた。それぞれの緩衝液は測定温度である６０℃でｐＨを調整した。
反応系：SppA(０．１μg)及び蛍光基質Ala-Ala-Phe-MCA（終濃度２００μＭ）を終濃度５０ｍＭの各緩衝液に添加し、合計１ｍｌとした。
測定方法：反応温度６０℃で分光蛍光光度計（日立社製）にて測定した。反応１２０〜１８０秒後における６０秒間の蛍光の増加量を各ｐＨでの酵素活性とした。
結果：ｐＨ１０．０〜１０．５で最も高い活性値が得られた。また、ｐＨ１１で最高値の約７５％、ｐＨ１２．０についても最高値の約５０％の活性が認められた（図５を参照）。
【００５３】
（最適温度）
SppAのプロテアーゼ活性を３０〜９５℃の範囲で測定することにより、SppAに対する温度の影響を調べた。
反応系：SppA(０．１μg)及び蛍光基質Ala-Ala-Phe-MCA（終濃度２００μＭ）を終濃度５０ｍＭのＣＨＥＳ(ｐＨ１０．０)緩衝液に添加し、合計１ｍｌとした。ＣＨＥＳ(ｐＨ１０．０)緩衝液は測定する各温度でｐＨ値を調整した。
測定方法：分光蛍光光度計（日立社製）を各温度に設定して測定した。反応後６０〜９０秒後における３０秒間の蛍光の増加量を各温度での酵素活性とした。
結果：８０℃付近で最も高い活性値が得られた。また、９０℃においても最高値の９０％以上の活性が認められた（図６を参照）。
【００５４】
（耐熱性）
SppAを６０〜９０℃の各温度でインキュベートし、インキュベートした様々な時間における残存活性を調べた。インキュベート溶液は、各温度で調整した５０ｍＭ ＣＨＥＳ−ＮａＯＨ(ｐＨ１０．０)に SppA を１μg／ｍｌ加えたものを使用した。
反応系：インキュベートした SppA 溶液１００μl(SppAとして０．１μg)及び蛍光基質Ala-Ala-Phe-MCA（終濃度２００μＭ）を終濃度５０ｍＭのＣＨＥＳ(ｐＨ１０．０，６０℃)緩衝液に添加し、合計１ｍｌとした。
測定方法：反応温度６０℃で分光蛍光光度計（日立社製）にて測定した。反応後１２０〜１８０秒後における６０秒間の蛍光の増加量をプロテアーゼ活性とした。
結果：１２０分間インキュベートした後も７０℃で約７５％、８０℃で約５０％の残存活性が認められた（図７を参照）。
【００５５】
（耐アルカリ性）
各ｐＨ緩衝液（５０ｍＭ ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ(ｐＨ１０．０〜１２．０)）に添加したSppA(１μg／ｍｌ)を６０℃でインキュベートし、様々なインキュベート時間における残存活性を調べた。
反応系：インキュベートした SppA 溶液１００μl(SppAとして０．１μg)及び蛍光基質Ala-Ala-Phe-MCA（終濃度２００μＭ）を終濃度５０ｍＭのＣＨＥＳ(ｐＨ１０．０，６０℃)緩衝液に添加し、合計１ｍｌとした。
測定方法：反応温度６０℃で分光蛍光光度計（日立社製）にて測定した。反応後１２０〜１８０秒後における６０秒間の蛍光の増加量をプロテアーゼ活性とした。
結果：１２０分間インキュベートした後もｐＨ１１で９０％以上、ｐＨ１１．５で約８５％の残存活性が認められた（図８を参照）。
【００５６】
（プロテアーゼ阻害剤の効果）
SppA(０．１μg／ml)及び各プロテアーゼ阻害剤を５０ｍＭのＣＨＥＳ(ｐＨ１０．０，６０℃)緩衝液に添加し、SppAに対する各プロテアーゼ阻害剤の効果を調べた。
反応系：SppA(０．１μg)及びそれぞれの阻害剤（２００μＭまたは１mMまたは１０mM）及び蛍光基質Ala-Ala-Phe-MCA（終濃度２００μＭ）を終濃度５０ｍＭのＣＨＥＳ(ｐＨ１０．０)緩衝液に添加し、合計１ｍｌとした。
測定方法：反応温度６０℃で分光蛍光光度計（日立社製）にて測定した。反応後１２０〜１８０秒後における６０秒間の蛍光の増加量をプロテアーゼ活性とした。プロテアーゼ阻害剤を添加しない場合の蛍光の増加量を１００％として、各阻害剤添加時における増加量の割合を算出した。
結果：セリンプロテアーゼ阻害剤であるロイペプチン、アンチパイン、キモスタチン、ジイソプロピルフルオロリン酸に高い阻害効果が認められた。（図９を参照）
【００５７】
（基質特異性）
FRETS-Xaaシリーズを用いた検討
FRETS-Xaaシリーズ（図１０を参照）を基質としてSppAの基質特異性を調べた。これは蛍光基（２-（N-メチルアミノ）ベンゾイル、Nma）と消光基（D-２、３-ジニトロフェニル、Dnp）を各々D-２、３-ジアミノプロピオン酸（D-A2pr）とリシン（Lys）の側鎖に有する蛍光共鳴エネルギー移動（Fluorescence Resonance Energy Transfer（FRET））タイプの消光性蛍光基質であり、Xaa部分にはCys以外の１９種類のアミノ酸が導入されているものである。また、YaaとZaaには各々５種類のアミノ酸の混合物（Yaaにはプロリン（Pro）、チロシン（Tyr）、リシン（Lys）、イソロイシン（Ile）、アスパラギン酸（Asp）、Zaaにはフェニルアラニン（Phe）、アラニン（Ala）、バリン（Val）、グルタミン酸（Glu）、アルギニン（Arg））が導入されている。SppAによりD-A2pr（Nma）とLys（Dnp）の間が切断されたときの分子内のDnp基で消光されていたNma基の蛍光強度を３４０ｎｍの励起光と４４０ｎｍの放射光で測定することにより、プロテアーゼ活性を算出することができる。
反応系：SppA（１μg）及びFRETS-Xaaシリーズの各基質（終濃度３０μM）を終濃度５０ｍＭのＣＨＥＳ(ｐＨ１０．０)緩衝液に添加し、合計１ｍｌとした。
測定方法：反応温度６０℃で分光蛍光光度計（日立社製）にて測定した。反応後２００〜６００秒後における４００秒間の蛍光の増加量をプロテアーゼ活性とした。最も蛍光の増加量の大きい基質のプロテアーゼ活性を１００％として、各基質の蛍光の増加量の割合を算出した。
結果：Xaaの部分が分子量の小さいアミノ酸（グリシン、セリン、アラニン、トレオニン）の基質に高い特異性を示した。（図１１を参照）
【００５８】
ペプチジルMCA基質を用いた検討
様々な種類のペプチジルMCA基質を用いて、SppAの基質特異性を調べた。
反応系：SppA（０．１μg）及び各基質（終濃度３００μM）を終濃度５０ｍＭのＣＨＥＳ(ｐＨ１０．０)緩衝液に添加し、合計１ｍｌとした。
測定方法：反応温度６０℃で分光蛍光光度計（日立社製）にて測定した。反応後１２０〜１８０秒後における６０秒間の蛍光の増加量をプロテアーゼ活性とした。
結果：Ala-Ala-Phe-MCA基質に対して高い特異性を示した。（図１２を参照）
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】SppAのアミノ酸配列を示す図である。
【図２】SppAのアライメントを示す図である。
【図３】SppA遺伝子を組み込んだプラスミドベクターを示す図である。
【図４】SppAのSDS-PAGEの結果を示す図である。
【図５】SppAの最適ｐＨを示す図である。
【図６】SppAの最適温度を示す図である。
【図７】SppAの耐熱性を示す図である。
【図８】SppAの耐アルカリ性を示す図である。
【図９】SppAに対するプロテアーゼ阻害剤の効果を示す図である。
【図１０】FRETS-25Xaa基質の構造を示す図である。
【図１１】FRETS-25Xaa基質を用いたSppAの基質特異性を示す図である。
【図１２】ペプチジルMCA基質を用いたSppAの基質特異性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図４】
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【配列表】
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