(57)【要約】【課題】  微量サンプル中の目的物質を迅速かつ高感度に検出可能な分析チップを提供することを課題としている。該分析チップは、抗体が抗原認識能を保った状態で高密度に整列固定されかつ非特異的吸着の少ない担体を備えた分析チップである。また、該分析チップは、Fc融合タンパク質がそのリガンド物質と相互作用する能力を保った状態で高密度に整列固定されかつ非特異的吸着の少ない担体を備えた分析チップである。【解決手段】反応室内部に、タンパク質と脂質二重膜からなる複合体により被覆された担体を有する分析チップを用いることにより、微量サンプル中の目的物質を迅速かつ高感度に検出することが可能となる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応室内部に、タンパク質と脂質二重膜からなる複合体により被覆された担体を有する分析チップ。
【請求項２】
液体流入口と液体流出口の間に反応室を有する請求項１記載の分析チップ。
【請求項３】
複合体を形成するタンパク質が、Fc領域結合部位を有している請求項１または２に記載の分析チップ。
【請求項４】
複合体を形成するタンパク質が、自己組織化能力を有するタンパク質である請求項１から３のいずれかに記載の分析チップ。
【請求項５】
タンパク質と脂質２重膜の複合体が、ナノサイズの粒子である請求項１から４のいずれかに記載の分析チップ。
【請求項６】
複合体が、自己組織化能力を有するタンパク質が脂質２重膜を取りこみながら形成した複合体である請求項４または５に記載の分析チップ。
【請求項７】
複合体を形成するタンパク質に、Fc融合タンパク質が結合している請求項１から６のいずれかに記載の分析チップ。
【請求項８】
Fc領域結合部位が、ＺＺタグである請求項３から７のいずれかに記載の分析チップ。
【請求項９】
Fc融合タンパク質が抗体である請求項７から８に記載の分析チップ。
【請求項１０】
複合体が、真核生物により生産される請求項１から９のいずれかに記載の分析チップ。
【請求項１１】
複合体を形成するタンパク質が、ウイルス由来タンパク質である請求項１から１０のいずれかに記載の分析チップ。
【請求項１２】
担体が球状である請求項１から１１のいずれかに記載の分析チップ。
【請求項１３】
反応室の液体流入口側および／または液体流出口側に、担体の流出を防ぐ堰き止め手段が配置され、少なくとも反応室、堰き止め手段の接液面が親水性高分子で被覆されている請求項１から１２のいずれかに記載の分析チップ。
【請求項１４】
反応室、堰き止め手段の接液面を被覆する親水性高分子の一部または全部が、接液面と化学結合している請求項１３に記載の分析チップ。
【請求項１５】
生体分子分析用である請求項１から１４のいずれかに記載の分析チップ。
【請求項１６】
請求項１から１５に記載の分析チップを用いる分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析チップに関し、特に、タンパク質およびタンパク質と相互作用する物質の分析に用いる分析チップに関する。さらに、本発明は、特に、抗原−抗体反応を用いた抗原の分析に使用する分析チップに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、特定の物質を他の物質と区別して選択的に検出、分析する研究が盛んに行われている。特に、生体内や環境中に極微量に存在するタンパク質や核酸あるいは化合物等を特異的かつ高感度に検出することは疾患の早期診断や環境ホルモンの計測など医学や環境、食品検査、生命科学分野などにおいて切実に要求されており、目的物質の特異的な検出方法や測定感度向上のための研究が盛んに行われている。
【０００３】
なかでも、抗体の特異性を利用した免疫学的分析（免疫分析）や、タンパク質とそのリガンド物質との特異性を利用した分析は、医療や生化学、環境などの分野で重要な分析方法のひとつであることが知られている。しかし従来の試験管、マイクロプレート、マイクロチューブ、マイクロウェル等を用いて行う酵素免疫分析方法（ＥＬＩＳＡ）などは、複数種の試薬の導入、反応、洗浄等の工程があり、操作が煩雑であるため、分析に多くの時間を要し、あるいは容器の容積が大きいため用いる試薬量が多いという欠点がある。
【０００４】
そこで、一枚の基板上にマイクロメートルオーダーのマイクロチャネル（微細溝）を形成した分析チップを使用することにより、その特性である微小容積、大きな比表面積、短い拡散移動距離を利用して反応効率を高めた、分析チップの免疫学的分析法への適用が行われてきた。
【０００５】
分析チップによる免疫学的分析法の一例として、ガラス、シリコン基板等からなるマイクロチップ内に反応室を設け、反応室内には免疫抗原−抗体反応のための反応固相として直径１ｍｍ以下のガラスビーズもしくはポリスチレン等の高分子固体微粒子を装入し、マイクロチャネル流入部から導入した抗原および標識抗体の反応を高分子固体微粒子上で行い、未反応物あるいは反応生成物を分離して光熱変換分析により分析する免疫分析装置が知られている（特許文献１参照）。
【０００６】
こうした抗原抗体反応による免疫学的分析においては、担体上に固層化もしくは結合させる抗体の方向を整列させ、抗原など目的とする物質を認識できるように固層化もしくは結合させることが目的物質の検出感度を高めるために重要な要素となる。しかし抗体の方向を整列させることは容易でなく、抗体の種類や担体の種類、溶液のイオン強度やpH等様々な要因の影響を受けることが知られている（非特許文献１参照）。抗体の方向を整列させて担体上に固層化もしくは結合させるには、多大な労力により最適な条件を抗体ごとに見つけ出す必要がある上、抗体の種類や純度、状態によっては不可能なこともある。
さらに、担体上に固層化もしくは結合された抗体やタンパク質の密度も目的物質の検出には重要な因子であり、目的物質の抗体による捕捉率は、単位面積あたりに固層化もしくは結合された抗体の量に依存する（非特許文献２参照）。
【０００７】
現在、抗体を結合することが可能なプロテインＡやプロテインＧなどを固定化した担体を用いることにより、担体上に抗体を結合させることは可能である。しかし担体に固定化されたプロテインＡやプロテインＧはその方向が不規則であることから、結果として固定化される抗体の方向も不規則となり、整列させることは不可能である。また、担体上に固定化される抗体の密度も満足のいくものではない。
【０００８】
また、微量物質の検出においては非特異的なシグナルが検出の精度を低下させる大きな要因となる。特に担体への非特異的な吸着や相互作用は微量な目的物質の検出や相互作用の検出において重大な問題となる。担体への目的物質の非特異的相互作用を防止する目的で、アルブミンやカゼインを含む溶液でブロッキング、コーティングすることが行われているが、非特異的相互作用を完全に防止するには不充分である。
【０００９】
このように、担体上の抗体が抗原認識能を保った状態で高密度に整列固定され、かつ担体への非特異的吸着の少ない優れた担体を用いた分析チップにより、抗体と抗原との特異的な結合を利用して微量のサンプル（試料）を高感度に分析可能な免疫学的分析チップを開発した例はない。
【００１０】
また、担体上にFc融合タンパク質を高密度に整列固定し、Fc融合タンパク質と相互作用するリガンド物質などを高感度かつ低バックグラウンドに検出可能な分析チップを開発した例はない。
【特許文献１】特開２００１−４６２８公報
【非特許文献１】ジョン  アール  クラウザー（Ｊｏｈｎ  Ｒ．  Ｃｒｏｗｔｈｅｒ）著、メソッヅ  イン  モレキュラー  バイオロジー１４９  ジ  イライサ  ガイドブック（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｔｈｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ）、ヒューマナ  プレス（ＨＵＭＡＮＡ  ＰＲＥＳＳ）、２００１年、ｐ２９７−２９９。
【非特許文献２】石川  榮治  著、生化学実験法４８、学会出版センター、２００３年、ｐ５１、ｐ６０．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
以上のような状況に鑑み、本発明では、抗体などが、抗原認識能を保った状態で高密度に整列固定されかつ非特異的吸着の少ない担体を備え、およびFc融合タンパク質などが、そのリガンド物質と相互作用する能力を保った状態で高密度に整列固定されかつ非特異的吸着の少ない担体を備えた分析チップを提供することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決する手法を鋭意検討した結果、反応室内部に、タンパク質と脂質二重膜からなる複合体により被覆された担体を有する分析チップは、上記課題を解決できることを見出し本発明に至ったものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の分析チップは、微小容積や高い比表面積効果を活かし、微量なサンプルを迅速に分析可能な分析チップである。
【００１４】
また、本発明の分析チップが有する担体は、所望の抗体やFc融合タンパク質を抗原もしくはリガンド物質認識能を保ったまま高密度で整列固定可能な汎用的な担体であり、目的物質の捕捉率が高く、かつサンプル中の夾雑物質による非特異的吸着の少ない優れた担体である。したがって、該担体を有する分析チップは、サンプル量や使用される試薬の量を少なくすることが可能であり、また分析のスループットを高めることが可能であり、高感度、低バックグラウンドな分析を迅速に行うことが可能な分析チップである。
【００１５】
例えば、抗体を固定化した担体を有する本発明の分析チップを用いることにより、微量なサンプルおよび試薬量で、サンプル中に含まれる目的物質を迅速、高感度かつ低バックグラウンドに免疫学的測定、検出を行うことが可能である。また、抗体の替わりにFc融合タンパク質を固定化した担体を有する分析チップを用いることにより、Fc融合タンパク質と相互作用する低分子のリガンド物質（リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト）などを迅速、高感度かつ低バックグラウンドに検出、測定を行うことが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。また、この発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９；  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ，  １９９５等に記載されている。
【００１７】
本発明の分析チップは、反応室内部に、タンパク質と脂質二重膜からなる複合体により被覆された担体を有する分析チップである。
【００１８】
本発明における分析とは、例えば、目的物質を担体上の抗体やFc融合タンパク質を介して捕捉・結合・相互作用させ、その目的物質を、抗原抗体反応などを利用して蛍光や発色、発光、吸光、放射線強度などにより検出することを示す。これらの一例として、ＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  酵素免疫検定法）、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ  固相酵素免疫検定法）、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｓｓａｙ  放射線免疫検定法）、ＦＩＡ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  蛍光免疫検定法）、ＦＬＩＳＡ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ  固相蛍光免疫検定法）、ＥＬＩＳＰＯＴ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｓｐｏｔ）、免疫沈降法などが挙げられ、目的に応じて、直接抗体法、間接抗体法、競合法、二抗体サンドイッチ法などが選択される。また、目的物質自体が酵素活性を持つ物質である場合、もしくは蛍光物質、放射性物質である場合、抗原抗体反応を利用せずに、目的物質自体の機能を利用して検出してもよい。
【００１９】
本発明の分析チップは、サンプル中の目的物質を検出・分析可能なチップである。さらに、本発明の分析チップは、好ましくは微小容積や高い比表面積効果を活かし、微量なサンプルを迅速に分析可能なチップである。
【００２０】
本発明の分析チップは、好ましくは、サンプルもしくは試薬などを導入もしくは排出するための液体流入口と液体流出口を有する。
【００２１】
本発明の分析チップは、好ましくは、担体を有する反応室を内部に備え、反応室中の担体の表面の少なくとも一部が「タンパク質と脂質２重膜からなる複合体」により被覆されている。
【００２２】
本発明の分析チップは、好ましくは、液体流入口と液体流出口の間に反応室を有する。
【００２３】
本発明の分析チップにおける反応室は、好ましくは、目的物質が抗体やFc融合タンパク質もしくは「複合体を形成するタンパク質」に結合もしくは相互作用するための部分である。
【００２４】
本発明の分析チップは、好ましくは、反応室と液体流入口間および反応室と液体流出口間に微細流路を有する。
【００２５】
本発明の分析チップにおける微細流路の形状は特に限定されない。本発明の分析チップとして、微細流路が一枚のチップ上に２〜９６本設置された、同時に多流路を解析することができるチップを使用することもできる。多流路の並べ方は、並行、放射線状、円形状等があるが、その形状は特に限定されない。
【００２６】
本発明の分析チップにおける微細流路は、好ましくは、凹部を形成した板状の基材を別基材と接合して作製される。あるいは貫通したスリット形状を有する薄膜とこれを挟み込む少なくとも２つの基材によっても作製可能である。
【００２７】
本発明の分析チップの微細流路の幅、深さは、分析チップの大きさ、使用目的などにより適宜設定される。具体的には、微細流路の幅は、十分な検出精度を得る観点から、０．１μｍ以上、好ましくは１０μｍ以上であり、十分な検出感度を得る観点から、１０００μｍ以下、好ましくは５００μｍ以下であることが望ましい。また、前記微細流路の深さは、分析チップの大きさ、使用目的などにより適宜設定される。具体的には、十分な検出感度を得る観点から、０．１μｍ以上、好ましくは１０μｍ以上であり、十分な検出精度を得る観点から、１０００μｍ以下、好ましくは５００μｍ以下であることが望ましい。微細流路の長さは、分析チップの大きさ、解析対象の化合物に応じて適宜選択することができる。
【００２８】
本発明の分析チップは、流路、液体流入口および該液体流出口、あるいはそれ以外の場所に分離膜があっても良い。分離膜の厚さ・素材は試料を含む溶液が分離できるものであればよい。
【００２９】
該分離膜の厚さは任意ではあるが、好ましくは１μｍ以上で、より好ましくは１０μｍ以上かつ３ｍｍ以下である。単独で１μｍ以下の厚さの膜は強度が弱く、作成後、接合工程へ持ち込むための取り扱いが困難となる場合がある。１０μｍ以下の厚さの膜は、良好な挟み込みが実施できる。また、３ｍｍ以上の厚さの膜は微小なデバイスに適さない場合があるからである。
【００３０】
該分離膜の素材には既存の膜に用いられている種々の材料を用いることができる。セルロース、再生セルロース、酢酸セルロース、三酢酸セルロース、硝酸セルロース、その他セルロース誘導体、ポリアミド、芳香族ポリアミド、ポリアクリロニトリル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリビニルアルコール、ポリメタクリル酸ヒドロキシエチル、その他ポリ酢酸誘導体、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン、その他フッ素系樹脂、これらの共重合体、その他合成樹脂、ガラス、ゼオライト、その他セラミックス、金属類およびこれらの組み合わせがあるが、これに限定されない。
【００３１】
本発明の分析チップにおける反応室は、好ましくは、微細流路に担体が入る大きさである。反応室の幅は、十分な検出感度を得る観点から、０．１μｍ以上が好ましく、より好ましくは１０μｍ以上であり、十分な検出精度、検出感度を得る観点から、１００００μｍ以下が好ましく、より好ましくは５０００μｍ以下であることが好ましい。
【００３２】
また、反応室の深さは、分析チップの大きさ、使用目的などにより適宜設定される。反応室の深さは十分な検出感度を得る観点から、０．１μｍ以上が好ましく、より好ましくは１０μｍ以上であり、十分な検出精度を得る観点から、１００００μｍ以下が好ましく、より好ましくは５０００μｍ以下であることが好ましい。更に、微量分析を行う観点から、１０００μｍ以下、好ましくは５００μｍ以下であることが好ましい。
【００３３】
本発明の分析チップのサイズに特に制限はなく、数ミリ角から数十センチ角までのサイズであり得るが、試薬量を低減し、迅速な検出を行うため、そのサイズは一辺２０センチ以下であることが望ましい。
【００３４】
本発明の分析チップの基材は、シート状、板状、フィルム状、棒状、管状、塗膜状、円筒状、その他複雑な形状の成形物をとりうるが、これに限定されない。本発明の分析チップの基材は、加工性および取り扱いの容易さから、好ましくはシート状、板状、フィルム状である。
【００３５】
本発明における分析チップの素材は、樹脂もしくは金属、ガラス、シリカ、ゴム、有機／無機高分子材料であれば特に制限はない。例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリスルホン、ポリテトラフルオロテプロン（ＰＶＤＦ）、セルロース、シリコン、マイカー、ポリメチルペンテン（ＰＭＰまたはＴＰＸ（登録商標））、ポリスチレン（ＰＳｔ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ＡＢＳ樹脂、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリアクリルアミド、ポリイミド等の樹脂、それらの高分子化合物を含む共重合体あるいは複合体、石英ガラス、パイレックス（登録商標）ガラス、ソーダガラス、ホウ酸ガラス、ケイ酸ガラス、ホウケイ酸ガラス等のガラス類およびその複合体、金、白金、アルミナ、クロム、亜鉛、鉛、鉄、ステンレススチール、タンタル、銀、銅、ニッケル、コバルト、チタン等の金属およびその複合体や酸化物、セラミックスおよびその複合体、天然ゴムやラテックスゴム等の複合体、アガロースやデキストラン、セルロース、キチン、キトサンなど多糖類の混合物などが好ましく用いられる。また、複数の材料による複合体であっても良い。
【００３６】
本発明の分析チップにおける担体は、「タンパク質と脂質二重膜からなる複合体」による被覆がなされている。「タンパク質と脂質二重膜からなる複合体」による被覆は、担体表面の全面において行われる必要はなく、非特異的反応が抑えられる限りにおいて表面の一部分のみであっても良い。本発明の分析チップにおける担体は、好ましくは、非特異的反応を完全に抑える目的で、「タンパク質と脂質二重膜からなる複合体」により、全面が被覆されていることが好ましい。
【００３７】
本発明の分析チップの担体の大きさは特に制限はなく、担体が反応室に入る大きさであれば良い。担体の形状は単位容積あたりの比面積を大きくする点から、粒状が好ましく、更には球状が好ましい。担体が球状の場合、単位容積あたりの抗体やFc融合タンパク質の結合する比表面積を大きくする観点、および担体が堰き止め手段で堰き止められ、なおかつ、液体が反応室を支障なく通過する観点から、球体の直径は１０００μｍ以下０．１μｍ以上が好ましく、さらに好ましくは５００μｍ以下１０μｍ以上である。
【００３８】
本発明の分析チップの担体の形状は、粒状やフィルム膜あるいはフィルム状に限らない。本発明の分析チップの担体の形状は、例えば、スポンジ形状や繊維形状であってもよい。繊維形状を形成する担体の材料としては、例えば、ナイロン、シルク、アミロイド繊維などが挙げられるが、これらに限るものではない。また、その大きさも特に限定されない。
【００３９】
本発明の分析チップの担体の素材は、特に限定されない。本発明の分析チップの担体の素材は、金属、プラスチック、有機・無機高分子材料であることが好ましく、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリスルホン、ポリテトラフルオロテプロン（ＰＶＤＦ）、セルロース、シリコン、マイカー、ポリメチルペンテン（ＰＭＰまたはＴＰＸ（登録商標））、ポリスチレン（ＰＳｔ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ＡＢＳ樹脂、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリアクリルアミド、ポリイミド等の樹脂、それらの高分子化合物を含む共重合体あるいは複合体、石英ガラス、パイレックス（登録商標）ガラス、ソーダガラス、ホウ酸ガラス、ケイ酸ガラス、ホウケイ酸ガラス等のガラス類およびその複合体、金、白金、アルミナ、クロム、亜鉛、鉛、鉄、ステンレススチール、タンタル、銀、銅、ニッケル、コバルト、チタン等の金属およびその複合体や酸化物、セラミックスおよびその複合体、天然ゴムやラテックスゴム等の複合体、アガロースやデキストラン、セルロース、キチン、キトサンなど多糖類の混合物などが好ましく用いられる。
【００４０】
また、本発明の分析チップの担体は、その表面の全体、または少なくとも検出が行われる部分が、金属、プラスチック、有機・無機高分子材料によってコーティングされているものが好ましい。
【００４１】
本発明の分析チップの担体は、これらの担体材料を複数組み合わせて用いることもできる。例えば、ガラス担体を金属で被覆した組み合わせや樹脂担体の表面を金属でコーティングした担体などが好ましく用いられる。
【００４２】
また、本発明の分析チップの担体は、表面を親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコールやポリビニルアルコールなど）によりコーティングやグラフトなどの処理を行ったものや疎水化したもの、ラジカル化したもの、これら担体をタンパク質やＤＮＡなどの核酸または糖などでコーティング、修飾、処理した状態のものが好ましい。コーティングやグラフト、疎水化、ラジカル化処理した担体もしくは未処理の担体は、タンパク質と脂質２重膜からなる複合体による被覆をされることにより非特異的結合や相互作用を抑制することができる。
【００４３】
また、本発明の分析チップの担体は、その表面を、デキストランやアビジンなどによる修飾が行われていても良い、チオールアルカン基やアミノ基、チオール基、アルデヒド基、カルボキシル基などの官能基が存在していても良い。
【００４４】
本発明の分析チップの担体を構成する親水性高分子の具体例としては、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、酢酸セルロース及び酪酸セルロースのようなセルロースに基づく生成物、アクリル酸ヒドロキシエチル、メタクリル酸ヒドロキシエチル、アクリル酸グリセリル、メタクリル酸グリセリル、アクリル酸、メタクリル酸、アクリルアミドやメタクリルアミドから重合したようなアクリル樹脂、ポリビニルピロリドンやポリビニルアルコールのようなビニル樹脂、ポリカプロラクタム、ポリラウリルラクタム、ポリヘキサメチレンアジポアミドやポリヘキサメチレンドデカンジアミドのようなナイロン類、ポリウレタン類、ポリ乳酸、アミロース、デキストラン、キトサンやヒアルロン酸のような直鎖多糖類、アミロペクチン、ヒアルロン酸やヘミセルロースのような分岐多糖類などである。
【００４５】
本発明の分析チップは、好ましくは、反応室の液体流入口側および／または液体流出口側に、担体の流出を防ぐ堰き止め手段を有する。
【００４６】
本発明における堰き止め手段は、担体が液体流出口側流路に流れるのを防ぐためのものである。堰き止め手段は担体の粒径よりも、微細流路の深さが浅くなるか、流路幅が狭くなるか、あるいは、これらの組み合わせによって実現される。このために形成される流路を構成する基材自体が狭隘な構造を取る場合と、別部材の導入によって狭隘な構造とする場合、あるいはこれらの組み合わせを行うことができる。別部材の導入は作製工程を煩雑にするため、製作コストの観点から基材自体を狭隘な形状に加工することが望ましい。
【００４７】
本発明の分析チップには、好ましくは、液体流入口、反応室、液体流出口が微細流路で連結されている構造を取るものも含まれる。
【００４８】
本発明における液体流入口は、例えば、サンプルや試薬などの液体を流入する目的に用いられるが、液体を流出するために用いても良い。このとき液体流出口からは溶液もしくは気体が流入する。
【００４９】
本発明の分析チップでは、液体流入口と液体流出口は互いに役割を入れ替えて用いられることもある。すなわち液体流入口から液体を流出させても良く、逆に液体流出口から液体を流入させても良い。また、液体流入口、液体流出口の大きさは、試料の容量に応じて適宜設定することができる。具体的には、試料導入の操作の観点から、直径０．０５ｍｍ以上、好ましくは４ｍｍ以下であることが望ましい。
【００５０】
本発明の分析チップは、好ましくは、反応室が親水性高分子により被覆されている。
【００５１】
また、本発明の分析チップは、好ましくは、堰き止め手段の接液面の一部または全部が親水性高分子により被覆されている。
【００５２】
本発明の分析チップは、好ましくは、反応室および／または、堰き止め手段の接液面を被覆する親水性高分子の一部または全部が、接液面と化学結合している。
【００５３】
本発明の分析チップは、好ましくは、分析チップの微細流路内壁が親水性高分子で被覆される部分は反応室より上流が被覆される。
【００５４】
本発明の分析チップは、好ましくは、液体流入口および該液体流出口と前記反応室を連結する微細流路の内壁もしくは前記反応室の内壁が被覆されていることが好ましい。
【００５５】
本発明における反応室および／または堰き止め手段の接液面が親水性高分子により被覆された状態とは、堰き止め手段および反応室内の壁面に親水性高分子がファンデルワールス力、イオン結合、疎水結合、水素結合、共有結合などによって結合した状態のことをいう。
【００５６】
堰き止め手段および／または反応室から親水性高分子の剥離を防ぐ意味から、堰き止め手段の接液面および／または反応室と、親水性高分子は共有結合していることが望ましい。ここで、共有結合とは２個の原子が電子を共有してつくる結合のことを言い、シグマ結合、パイ結合、他の非局在共有結合および／または他の共有結合タイプを持つものをいう。
【００５７】
本発明における堰き止め手段の接液面および／または反応室に被覆する親水性高分子としては、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、エチレン−ビニルアルコール共重合体、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリα−ヒドロキシビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリα−ヒドロキシアクリル酸、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等のポリアルキレングリコール、馬鈴薯デンプン、とうもろこしデンプン、小麦デンプン等のデンプン、グルコマンナン、絹フィブロイン、絹セリシン、寒天、ゼラチン、卵白たんぱく質又はアルギン酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００５８】
これらの中でも被覆する親水性高分子としては、ポリアルキレングリコールが好ましく、特にポリエチレングリコールが好ましい。ポリアルキレングリコールは、例えばポリエチレングリコールやポリプロピレングリコールに代表される主鎖中に酸素原子を含む鎖状高分子であるが、ポリアルキレングリコールがグラフトしたポリマーであっても良い。ポリアルキレングリコールの分子量は、特に限定されるものではなく、数平均分子量で６００〜４００００００、チップへのタンパク質の吸着阻害能を考慮すると１００００〜１００００００程度のものが好ましく用いられる。
【００５９】
堰き止め手段の接液面および／または反応室と親水性高分子を共有結合させる手段としては、堰き止め手段の接液面および反応室表面に開始剤を浸漬し親水性高分子を重合する方法、親水性高分子をビニル基で修飾し低エネルギー線照射により結合させる方法があるが、操作の簡便性、開始剤、修飾剤などの混在を防ぐ面からも高エネルギー線照射によって共有結合させることが望ましい。
【００６０】
本発明における高エネルギー線とは、ある一定のエネルギー量を持つエネルギー線のことで、マイクロ波、赤外線、可視光線、紫外線、エックス線、ガンマ線、電子線、陽子線、中性子線も高エネルギー線に含まれる。本発明において、出来るだけ高いエネルギーを持つエネルギー線を用いることが好ましい。
【００６１】
高エネルギー線の照射量は特に限定されるものではなく、堰き止め手段の接液面および／または反応室と親水性高分子を固定化するだけの照射量があれば良く、ガンマ線を用いる場合は吸収エネルギーとして、通常１００ｋＧｙ以下、好ましくは４０ｋＧｙ以下、さらに好ましくは樹脂基板の黄変による被験試料検出への影響が少ない１０ｋＧｙ以下が用いられる。
【００６２】
本発明における複合体とは、２種以上の物質が複合して一体となった物質を示す。
【００６３】
本発明における「タンパク質と脂質２重膜からなる複合体」とは、タンパク質と脂質２重膜が複合して一体となった物質を示し、糖鎖やリン酸などが付加していても良い。
【００６４】
本発明における「脂質２重膜との複合体を形成するタンパク質」は、脂質２重膜との複合体を形成させるため、膜タンパク質であることが好ましい。この「複合体を形成するタンパク質」と特異的に相互作用する目的物質をサンプル中から捕捉し、捕捉した目的物質を「検出用抗体」などにより検出することが可能である。
【００６５】
本発明において、抗体やFc融合タンパク質を高密度で整列させるため、好ましくは、「複合体を形成するタンパク質」は「自己組織化能力を有するタンパク質」であることが望ましい。「複合体を形成するタンパク質」が自己組織化能力を有することにより、「Fc領域結合部位」を介して抗体やFc融合タンパク質を高密度で整列させることが可能となり、検出の感度および精度を向上させることができる。
【００６６】
タンパク質が自己組織化する能力を有することは、抗体やFc融合タンパク質を高密度で整列する上で重要な性質である。さらに、自己組織化する能力を有することは、自己組織化の過程で、他の夾雑タンパク質を排除することを示し、これは検出の精度を向上させる上で重要な性質である。さらに、脂質２重膜を取りこむことで、サンプル中の夾雑物質の非特異的吸着や相互作用を抑制し、検出の精度を向上させることもできる。
【００６７】
本発明において「自己組織化能力を有するタンパク質」とは、疎水的相互作用などのタンパク質間相互作用により自己集合する性質をもつタンパク質である。タンパク質間相互作用により自己集合する性質をもつタンパク質であることは、タンパク質が溶解した溶液の温度やｐＨ、塩濃度や溶媒を変化させることでタンパク質どうしで多量体を形成することにより確認することができる。
【００６８】
本発明における「自己組織化能力を有するタンパク質」は、例えば、酵母や動物細胞、昆虫細胞などの真核生物細胞で発現させたとき、脂質２重膜を取りこみながら自己組織化により集合する能力を有するタンパク質である。
【００６９】
このとき形成される「自己組織化能力を有するタンパク質」と脂質２重膜からなる複合体は、主にタンパク質と脂質、糖を主要な構成成分とし、そのうち主要な成分はタンパク質である。
【００７０】
「自己組織化能力を有するタンパク質」としては、種々のウィルスから得られるウィルス粒子構成タンパク質を適用することができる。具体的には、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨｅｐａｔｉｔｉｓＢ Ｖｉｒｕｓ：ＨＢＶ）やＣ型肝炎ウィルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ）、Ｍｉｃｒｏ ｖｉｒｕｓ、ｐｈａｇｅ ｖｉｒｕｓ、ａｄｅｎｏ ｖｉｒｕｓ、ｈｅｐａｓｏｎａ ｖｉｒｕｓ、Ｐａｒｂｏ ｖｉｒｕｓ、ｐａｐｏｖａ ｖｉｒｕｓ、Ｒｅｔｒｏ ｖｉｒｕｓ、 Ｒｅｏ ｖｉｒｕｓ、Ｃｏｒｏｎａ ｖｉｒｕｓ、カイコ細胞質多角体病ウイルス（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）、カリシウイルス、ノロウイルス、サポウイルスなどの構成タンパク質や膜タンパク質、表面抗原タンパク質、または多角体タンパク質等が例示される。後述の実施例や参考例に示すとおり、遺伝子組換え酵母で前記ＨＢＶ表面抗原Ｌタンパク質（Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質）を発現させることにより、発現されたＨＢＶ表面抗原Ｌタンパク質から酵母小胞体由来の脂質２重膜に多数の同タンパク質が埋め込まれた短径約２０ｎｍ、長径約１５０ｎｍの楕円状のナノ粒子が形成されることを見出し、報告されている（J. Bio. Chem., Vol.267, No.3, 1953-1961, 1992）。このような粒子は、ＨＢＶゲノムや他のＨＢＶタンパク質を全く含まないので、ウィルスとしては機能せず、人体への安全性は極めて高い。さらに、クローン化することで均一な品質の「自己組織化能力を有するタンパク質」と脂質２重膜からなる複合体を常に生産可能であり、またハンドリングしやすい酵母などを生産系として利用できるため、生産性や生産コストの面でも優れている。「自己組織化能力を有するタンパク質」は、前記のＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質に限られるものではなく、例えば、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、ウィルス、ファージ、細菌類、菌類等に由来する天然タンパク質や遺伝子工学的に組み替えられたタンパク質、種々の合成タンパク質等が考慮されるが、好ましくは、ウイルス由来タンパク質、更に好ましくは肝炎ウイルス由来のタンパク質、更に好ましくはＢ型肝炎ウイルス由来のタンパク質が用いられる。最も好ましくはＢ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質が用いられる。このとき、自己組織能が失われない限りにおいて、種々の変異を持つ変異体であってもよく、ｐｒｅＳ領域のアミノ酸の一部を欠失させることにより、ナノサイズの粒子の生産量や安定性を高めることができる。
【００７１】
本発明の分析チップは、「タンパク質と脂質２重膜からなる複合体」は、粒子構造であることが好ましい。複合体の形状は粒子構造であると、担体上での方向性すなわち裏表の制御が不要である。
【００７２】
本発明の分析チップは、好ましくは、タンパク質と脂質２重膜の複合体が、ナノサイズの粒子である。
【００７３】
本発明においてナノサイズの粒子は、好ましくは、２０〜５００ｎｍ、更に好ましくは５０〜２００ｎｍ、より好ましくは８０〜１５０ｎｍの直径を持つ粒子である。本発明においてナノサイズの粒子は、好ましくは内部に中空の空間を持つ中空ナノ粒子であり、その空間は必ずしも気体系の空間である必要はなく、溶液系の空間であってもよい。
【００７４】
粒子構造の複合体は、担体上においてドーム状、エンボス状、ブロック状などの構造に変化し得る。
【００７５】
本発明において、粒子構造でない場合とは、脂質２重膜にタンパク質が埋め込まれた、タンパク質と脂質２重膜を主要な構成成分とする複合体を示す。粒子構造でない場合は、粒子構造と同様に、抗体やFc融合タンパク質を整列することが可能であり、さらに非特異的吸着や相互作用を抑制し、検出の精度を向上させることも粒子構造のときと同様に可能である。粒子構造でない「タンパク質と脂質２重膜からなる複合体」は、真核生物細胞から直接得ることも可能であり、また、ナノサイズの粒子を温度変化や湿度変化、圧力変化や超音波処理、界面活性剤処理などにより粒子の構造変化を引き起こすことで得ることも可能である。
【００７６】
複合体の形状が粒子構造でない場合、担体上での複合体の方向性を制御する目的で、「複合体を形成するタンパク質」は「担体との親和性を持つ領域もしくはタグ」を持つことが望ましい。「担体との親和性を持つ領域もしくはタグ」としては、担体表面が金属を含む場合、ニッケルなど金属二価カチオンへの結合能を持つポリヒスチジンタグや、他の金属結合タンパク質ドメイン、金属イオン結合性タンパク質ドメインなどが挙げられる。担体表面が樹脂などの場合、疎水的なアミノ酸を６０％以上含む６アミノ酸以上のポリペプチドからなるドメインなどが「担体との親和性を持つ領域もしくはタグ」として挙げることができる。好ましくは、立体障害の低さから、少なくとも４残基以上の連続したヒスチジンからなるポリヒスチジンタグが好適に用いられる。
【００７７】
「脂質２重膜との複合体を形成するタンパク質」が各種レセプターである場合、レセプターに対するリガンド物質を結合もしくは相互作用させ、その後、リガンド物質などに対する「検出用抗体」などを用いることにより、目的物質すなわちリガンド物質などを分析、検出、測定することが可能となる。
【００７８】
本発明における「脂質２重膜との複合体を形成するタンパク質」は、「Fc領域結合部位」を有していることが好ましい。
【００７９】
本発明の分析チップは、好ましくは、Fc領域結合部位が、ＺＺタグである。
【００８０】
本発明におけるFc領域とは、抗体をパパインで消化して得られる抗原認識能を持たないフラグメントであり、一般に抗体のＣＨ２とＣＨ３領域を含む、抗体のＨ鎖のＣ末端フラグメントの２量体を示す。
【００８１】
「Fc領域結合部位」は「複合体を形成するタンパク質」と疎水的に結合していてもよく、化学結合などにより共有的に結合していても良い。好ましくは融合タンパク質として「複合体を形成するタンパク質」に融合していることが好ましい。また融合の部位はＮ末端からＣ末端までの全ての場所に存在し得る。
【００８２】
本発明における「Fc領域結合部位」は、抗体の抗原認識部位以外の領域と結合もしくは相互作用し得るポリペプチドであり、好ましくはFcレセプター、プロテインＡ（Protein A）、プロテインＧ（Protein G）、Protein A/G、プロテインＬ（protein L）のいずれかの全長もしくは一部であり、より好ましくは、プロテインＡ（protein A）もしくはプロテインＧ（Protein G）の持つ「Fc領域結合部位」もしくはその変異体を含むポリペプチドである。
【００８３】
「脂質２重膜との複合体を形成するタンパク質」が「Fc領域結合部位」を有することにより、所望の抗体やFc融合タンパク質を整列固定した担体を簡便に作製することが可能となる。すなわち、数ある抗体やFc融合タンパク質のうち、所望の抗体やFc融合タンパク質のみを整列固定化できる汎用性の高い担体を提供することが可能となる。さらに好ましくはＺ領域と呼ばれるprotein AのもつFc領域結合部位がタンデムにならんだＺＺ領域（ＺＺタグ）と呼ばれるポリペプチドもしくはその変異体であり、次のような繰返し配列もしくはその変異体である。ＶＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫＶＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ。
【００８４】
本発明における「脂質２重膜との複合体を形成するタンパク質」は、Fc融合タンパク質が結合していることが好ましい。
【００８５】
本発明におけるFc融合タンパク質とは、Fc領域を持つタンパク質を示し、抗体を含む。また、本発明におけるFc融合タンパク質は、Fc領域と任意のタンパク質との融合タンパク質も含む。
【００８６】
Fc融合タンパク質を構成する任意のタンパク質は、とくに制限はなく、膜タンパク質や可溶性タンパク質などが挙げられる。具体的には、サイトカインレセプターや成長因子レセプター、ホルモンレセプター、神経伝達物質レセプター、カテコールアミンレセプター、オータコイドレセプター、ダイオキシンレセプター、ケモカインレセプター、Ｇタンパク質共役受容体などのレセプター分子が挙げられる。またタンパク質もしくはペプチドからなるリガンド物質（リガンドもしくはアゴニスト、アンタゴニスト）等もFc融合タンパク質を構成する任意のタンパク質の一例として挙げられる。また、細胞接着分子／細胞付着分子もFc融合タンパク質の一つの例である。膜タンパク質の場合、細胞外ドメインが任意のタンパク質として好適に用いられる。
【００８７】
「複合体を形成するタンパク質」にFc融合タンパク質が結合した担体を有する分析チップにおいては、Fc融合タンパク質に相互作用するリガンド物質（リガンドやアゴニスト、アンタゴニスト）などの目的物質を捕捉、結合もしくは相互作用させ、この目的物質を「検出用抗体」を用いることにより分析、測定、検出することが可能である。
【００８８】
本発明におけるFc融合タンパク質の作製方法にとくに制限はない。Fc融合タンパク質の一種である抗体は、生物個体や細胞から得ることも可能である、その他のFc融合タンパク質は遺伝子組換えの手法を用いた生物個体や細胞から得ることも可能である、無細胞合成などの手法により得ることも可能である。Fc融合タンパク質は、好ましくは動物もしくは昆虫細胞を用いて発現、精製することにより得ることができる。このとき用いる細胞やベクター、発現方法に特に制限はなく、細胞の内外を問わずFc融合タンパク質が発現しさせすれば良い。発現の方法の一例として、任意のタンパク質をコードする遺伝子をInvivoGen社製pFUSE-Fcベクターへ連結し、動物細胞へ導入することにより作製することが可能である。ベクターの種類により、ヒト、マウス、ラビットIgGのFc領域との融合タンパクを作製することが可能である。もしくはProtein Expression and Purification 14, 120-124, 1998に記載の手法を用いることも可能である。すなわち抗体のCH2・CH3領域を含む遺伝子領域をPCR等により取得し、任意のタンパク質をコードする遺伝子および適切なプロモーターおよびポリＡ付加部位を連結し、細胞に導入後で発現させることにより任意のタンパク質がFc領域に融合したタンパク質を作製することが可能である。発現の際に細胞外への分泌を促すための領域が付加されていても良い。
【００８９】
作製されたFc融合タンパク質を、単離・精製するための方法に特に限定はなく、通常のタンパク質の精製方法を用いることができる。例えば、シリカゲル担体、イオン交換性担体、ゲル濾過担体、キレート性担体、色素担持担体等を用いたクロマトグラフィーや、限外濾過、ゲル濾過、透析、塩析等による脱塩、濃縮を組み合わせることによって精製し単離することができる。また、抗体Fc領域との結合能を持つプロテインＡやプロテインＧを用いたアフィニティクロマトグラフィーによる精製を用いても良い。同様に、抗IgG抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィーによる精製を用いても良い。また、任意のタンパク質と相互作用を持つタンパク質などの物質を固定したアフィニティクロマトグラフィーによる精製を用いても良い。
【００９０】
「複合体を形成するタンパク質」のもつ「Fc領域結合部位」に抗体やFc融合タンパク質などを結合させることにより、抗体の認識する抗原やFc融合タンパク質と相互作用するリガンド物質などを捕捉することが可能となり、その後、抗原やリガンド物質などに対する「検出用抗体」などを用いることにより、目的物質すなわち抗原やリガンド物質などを検出することが可能となる。このとき、目的物質自体が活性を持つもしくは蛍光および放射性物質などである場合、「検出用抗体」を用いることなく、目的物質自体の蛍光や放射線、活性などを指標に検出することができる。
【００９１】
本発明において脂質２重膜とは、２枚の脂質の層からなっており、それぞれの層の中で、両親媒性脂質の極性の頭が親水系の溶媒と接触しており、非極性の炭化水素の部分が２重層の内部を向いているものをいう。脂質２重膜の例としては、細胞膜や核膜、小胞体膜、ゴルジ体膜、液胞膜のような生細胞における生体膜、または人工的に作製したリポソーム等が挙げられる。中でも小胞体膜由来の脂質２重膜がより好ましい。脂質２重膜としては、真核生物、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、昆虫細胞など由来のものが好ましく、特に好ましくは酵母由来の脂質２重膜が用いられる。
【００９２】
タンパク質と脂質２重膜からなる複合体を生産する生物種はとくに制限はなく、真核生物、原核生物いずれによる生産であっても良いが、自己組織化能力を高めるため、真核生物による生産であることが好ましく、さらに好ましくは酵母細胞による生産である。ウイルス、ファージなどの感染工程を含むことや、組換え体も本発明の生物種の範囲である。
【００９３】
本発明の分析チップは、反応室内部に、タンパク質と脂質二重膜からなる複合体により被覆された担体を有する。
【００９４】
脂質２重膜を含む複合体による被覆が担体表面上に形成されることにより、検出の目的とする物質以外の物質が担体に非特異的に吸着・相互作用することを抑制し、検出ノイズを低下させる効果や検出の精度を向上させることができる。また、検出の目的とする物質が抗体やFc融合タンパク質を介さず直接担体と吸着・相互作用することによるノイズ抑制の効果を持つ。さらに、脂質２重膜と共に被覆を形成する「複合体を形成するタンパク質」に結合している抗体やFc融合タンパク質が、直接担体と接触することによる抗体やFc融合タンパク質の失活や抗原認識能の低下を抑制する効果を持つ。
【００９５】
本発明の分析チップは、好ましくは、Fc融合タンパク質が抗体である。
【００９６】
本発明において抗体とは、天然に産生されるか、または全体的にもしくは部分的に合成され産生されるかのいずれかの免疫グロブリンを意味する。抗原認識能を維持するその全ての誘導体や変異体も含まれる。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであり得る。また、合成抗体、組換え抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、単鎖抗体、抗体断片としてはＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片などを含む。好ましくはFc領域を持つ抗体であり、さらに好ましくはFcレセプター、protein A、Protein G、Protein A/G、protein Lのいずれかと結合し得る抗体を示す。また、抗体は蛍光物質や酵素、ビオチンなどにより標識されていても良い。
【００９７】
本発明における「複合体を形成するタンパク質」と抗体との結合様式、および「複合体を形成するタンパク質」とFc融合タンパク質との結合様式、および「複合体を形成するタンパク質」とFc領域との結合様式は、抗体の抗原認識能が失われないもしくはFc融合タンパク質の活性が失われない限りにおいてとくに制限はなく、イオン結合、疎水結合、水素結合、金属結合、あるいはジスルフィド結合などの共有結合等、あるいはこれらの組み合わせで合って良い。好ましくは検出過程での抗体やFc融合タンパク質の脱落を防止する目的から、共有結合であることが好ましく、さらに好ましくは架橋剤による共有結合である。
【００９８】
本発明における架橋剤とは、「複合体を形成するタンパク質」と抗体や、「複合体を形成するタンパク質」とFc融合タンパク質とを共有結合させる働きをするものを示し、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、水酸基などを利用して結合させるための試薬が市販されており、抗体の抗原認識能が失われない、もしくはFc融合タンパク質の活性が失われない限りにおいて、特に制限はない。架橋剤は、「複合体を形成するタンパク質」の持つ「Fc領域結合部位」に対して、弱い結合や相互作用を示す種類の抗体やFc融合タンパク質であっても強固に結合させることが可能となる。さらに、分析の工程での洗浄作業で抗体が脱落することを防止することができる。架橋剤として、例えば臭化シアン化合物、カルボジイミド基を持つ化合物、アルデヒド基を持つ化合物、イミドエステル基を持つ化合物、マレイミド基を持つ化合物、N-ヒドロキシサクシイミドエステル基を持つ化合物、ハロアセチル基を持つ化合物、ピリジルジスルフィド基を持つ化合物、アリルアザイド化合物などが単独もしくは組み合わせて用いられる。好ましくは、抗原認識能や活性の低下を引き起こしにくい穏やかな条件下で一級アミンとのみ反応することから、イミドエステル基を持つ化合物が持いられ、さらに好ましくはＤＭＡ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｄｉｐｉｍｉｄａｔｅ）化合物、ＤＭＰ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｐｉｍｅｌｉｍｉｄａｔｅ）化合物、ＤＭＳ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｂｅｒｉｍｉｄａｔｅ）化合物、ＤＭＢＰ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓｐｒｏｐｉｏｎｉｍｉｄａｔｅ）化合物が用いられる。
【００９９】
本発明において、抗体の変異体もしくはFc融合タンパク質の変異体、「複合体を形成するタンパク質」の変異体、「自己組織化能力を有するタンパク質」の変異体もしくは「Fc領域結合部位」の変異体、ＺＺタグの変異体とは、これらタンパク質に遺伝子工学的に点、あるいは複数のアミノ酸置換を起こしたもの、またはタンパク質の全長から一部を削り取るか、新しくタンパク質配列を付け加えたもの、さらには核酸・糖・脂質・化合物等によってタンパク質の一部に修飾を施したものであって変異を起こす前の抗体と同一の物質を認識する能力を持つ変異体、Fc融合タンパク質と同一の活性を持つ変異体、「自己組織化能力を有するタンパク質」と同様に脂質２重膜を取りこんで自己組織化によりナノサイズの粒子を形成する能力を有する変異体、または「Fc領域結合部位」やＺＺタグと同様にFc領域と相互作用する能力を有する変異体を示す。このような変異体を作製するには該タンパク質を発現する遺伝子を含む環状プラスミド上でアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を行うためのプライマーとＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ、またはＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ｍｕｌｔｉ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ、またはＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＸＬ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）等の変異を起こすためのキットを用いて１２〜１８サイクルのＰＣＲを行い、その産物を制限酵素ＤｐｎＩで切断し、大腸菌に形質転換することにより可能である。さらに、ランダム変異導入法、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、またはポリメラーゼ連鎖増幅法（ＰＣＲ）を単独または適宜組み合わせて行うことができる。例えば亜硫酸水素ナトリウムを用いた化学的な処理によりシトシン塩基をウラシル塩基に置換する方法や、マンガンを含む反応液中でPCRを行い、DNA合成時のヌクレオチドの取り込みの正確性を低くする方法、部位特異的変異導入のための市販されている各種キットを用いることもできる。例えばSambrook等編［Molecular Cloning-A Laboratory Manual、第２版］Cold Spring Harbor Laboratory、1989、村松正實編［ラボマニュアル遺伝子工学］丸善株式会社、１９８８、エールリッヒ、ＨＥ．編［ＰＣＲテクノロジー、ＤＮＡ増幅の原理と応用］ストックトンプレス、１９８９等の成書に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができる。また、核酸・糖・脂質・化合物等によってタンパク質の一部に修飾を施したものとして具体的にはリン酸化酵素によるタンパク質中のセリン、またはスレオニン残基のリン酸化、糖鎖付加酵素によるアスパラギン、またはセリン、またはスレオニン残基の糖鎖付加、または還元・アルキル試薬によるシステイン残基の還元・アルキル化のようなものを例示することができ、これらのものを作製するにはタンパク質にリン酸、または糖鎖等を混ぜて、リン酸化酵素や糖鎖付加酵素を加え、その酵素が働く最適な条件（温度、ｐＨ、塩濃度等）を維持したり、タンパク質の入った溶液に還元剤であるジチオツレイトールやメルカプトエタノール等を終濃度で５ｍＭ濃度になるように入れ、温度６０℃付近、ｐＨ中性以上で１時間反応させ、���にアルキル化剤として５〜１５ｍＭ濃度のヨードアセトアミドを加え室温で１時間以上反応させることにより可能である。もちろん例示した上記の修飾以外にもタンパク質に対する様々な修飾が考えられる。
【０１００】
本発明の分析チップには、被験者の疾患の診断に用いる臨床検体である喀痰、唾液、尿、便、精液、血液、組織、臓器、その他の体液、またはこれらの体液の分画、を被験材料（サンプル）として用いることができる。ここで被験者とは、哺乳動物、例えば非限定的にヒト、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ラットなどを指す。また同様に、食品、飲料水、土壌、排水、河川水、海水、環境のふき取り液、環境のふき取り綿の滲出液などを被験材料として用いることができる。また、菌体の培養液や、固形培地上に培養された菌体（コロニー）を使用することができる。
【０１０１】
本発明における測定対象成分（目的物質）は特に限定されず、目的物質としてはタンパク質、核酸、糖、脂質又は低分子化合物等の「生体分子」が挙げられるが、その中でもタンパク質が望ましい。タンパク質とは、複数のアミノ酸がペプチド結合により連結された構造を有する化合物をいい、天然由来物、合成物、および短鎖のペプチドをも含むことを意味する。構成成分としてアミノ酸以外に糖、核酸、脂質を含んでいてもよい。
【０１０２】
本発明の分析チップを用いて解析されうるタンパク質としては、特に限定されることなく、天然由来物、合成物およびアミノ酸以外の構成成分を含む核タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質等を解析することができるが水溶性タンパク質に特に好適に使用される。
【０１０３】
本発明の分析チップは、好ましくは、生体分子分析用である。
【０１０４】
本発明における「生体分子」とは、分析チップによる分析／検出／測定の測定対象成分すなわち生体由来目的物質の一つの例であり、抗体およびFc融合タンパク質と結合もしくは相互作用可能な物質であれば特に制限はない。抗体およびFc融合タンパク質と結合もしくは相互作用可能なかぎりにおいて、「生体分子」には、化学的もしくは生物学的に修飾が加えられていても良い。
【０１０５】
本発明における分析方法とは、例えば、「複合体を形成するタンパク質」に結合した抗体や「複合体を形成するタンパク質」に結合したFc融合タンパク質に対して、目的物質すなわち測定対象成分を結合もしくは相互作用させ、該目的物質を検出もしくは測定する分析法である。「複合体を形成するタンパク質」に目的物質すなわち測定対象成分を結合もしくは相互作用させ、該目的物質を検出もしくは測定する分析法も含まれる。
【０１０６】
また、本発明の分析方法は、「複合体を形成するタンパク質」に結合した抗体や「複合体を形成するタンパク質」に結合したFc融合タンパク質、もしくは「複合体を形成するタンパク質」に対して、目的物質すなわち測定対象成分を結合もしくは相互作用させる第１の工程と、該目的物質すなわち測定対象成分を検出するための「検出用抗体」により生じる発色量、発光量、放射量、蛍光強度、あるいは酵素活性などを測定する第２の工程からなる。「検出用抗体」とは、発色性、発光性、放射性、蛍光性または酵素的に活性な標識物質もしくはビオチンなどの化合物もしくは酵素とポリマーの複合体により標識された抗体を示す。「検出用抗体」は直接目的物質を認識するものであっても良く、もしくは目的物質を認識する抗体を認識する、いわゆる抗イムノグロブリン抗体であってもよい。また「検出用抗体」がビオチンで標識されている場合、アビジンとビオチンと酵素の複合体を作用させることにより、「検出用抗体」により認識された目的物質を酵素活性を利用して検出することもできる。「検出用抗体」は、「Fc領域結合部位」への結合力が弱いもしくは結合しない抗体であることが望ましく、ヒトやマウス、ラット、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウサギ、ブタ、イヌ、チキン、ハムスターなどの特定のクラスおよびサブクラスに属する抗体が用いられる。もしくは、遺伝子工学的に若しくはタンパク質工学的にFc領域への結合を弱めた抗体を用いてもよい。好ましくはチキン由来の抗体が、最も好ましくはFc領域を持たないFab抗体が好適に用いられる。
【０１０７】
以下、添付した図面と実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能である。
【０１０８】
図１に、「複合体を形成するタンパク質」と脂質２重膜からなる複合体による被覆が担体上に形成され、該タンパク質がFc領域結合部位を持つ様態の一例を示す。
【０１０９】
図２に、「複合体を形成するタンパク質」と脂質２重膜からなる複合体による被覆が担体上に形成され、該タンパク質のFc領域結合部位に抗体が結合している様態の一例を示す。
【０１１０】
図３に、「複合体を形成するタンパク質」と脂質２重膜からなる複合体による被覆が担体上に形成され、該タンパク質のFc領域結合部位に抗体が結合が架橋剤により共有結合している様態の一例を示す。
【０１１１】
図４に、「複合体を形成するタンパク質」と脂質２重膜からなる複合体による被覆が担体上に形成され、該タンパク質のFc領域結合部位に抗体が結合が架橋剤により共有結合しており、抗体が目的物質を捕捉・結合した様態の一例を示す。
【０１１２】
図５に、「複合体を形成するタンパク質」が、脂質２重膜を取りこんでナノサイズの粒子を形成し、これが担体上に被覆を形成し、「複合体を形成するタンパク質」のもつFc領域結合部位が抗体と架橋剤により共有結合し、抗体が目的物質を捕捉・結合した様態の一例を示す。
【０１１３】
図６に、「複合体を形成するタンパク質」が、「Fc領域結合部位」であるＺＺタグと「担体との親和性を持つ領域もしくはタグ」とを膜貫通領域を挟んだ部位に有しており、「担体との親和性を持つ領域もしくはタグ」を介して担体と結合している様態の一例を示す。
【０１１４】
図７に、「複合体を形成するタンパク質」と脂質２重膜からなる複合体による被覆が担体上に形成され、該タンパク質の「Fc領域結合部位」に抗体が結合が架橋剤により共有結合しており、抗体が目的物質を捕捉・結合し、該目的物質を標識された「検出用抗体」により検出、測定する様態の一例を示す。
【０１１５】
図８に、「複合体を形成するタンパク質」と脂質２重膜からなる複合体による被覆が担体上に形成され、該タンパク質の「Fc領域結合部位」にFc融合タンパク質が結合している様態の一例を示す。
【０１１６】
図９に、「「複合体を形成するタンパク質」と脂質２重膜からなる複合体による被覆が担体上に形成され、該タンパク質の「Fc領域結合部位」にFc融合タンパク質が結合が架橋剤により共有結合している様態の一例を示す。
【０１１７】
図１０に、「複合体を形成するタンパク質」と脂質２重膜からなる複合体による被覆が担体上に形成され、該タンパク質の「Fc領域結合部位」にFc融合タンパク質が結合が架橋剤により共有結合しており、Fc融合タンパク質が目的物質であるリガンド物質を捕捉・結合、相互作用した様態の一例を示す。
【０１１８】
図１１に、「複合体を形成するタンパク質」が、脂質２重膜を取りこんでナノサイズの粒子を形成し、これが担体上に被覆を形成し、「複合体を形成するタンパク質」のもつ「Fc領域結合部位」がFc融合タンパク質と架橋剤により共有結合し、Fc融合タンパク質が目的物質であるリガンド物質を捕捉・結合、相互作用した様態の一例を示す。
【０１１９】
図１２に、本発明にかかる分析チップの一実施形態の平面模式図の一例を示す。液体流入口と液体流出口の間に反応室を有し、反応室内部に、タンパク質と脂質二重膜からなる複合体により被覆された担体を有する分析チップであり、液体流出口側流路および液体流入口側流路を有する態様の一例を示す。
【０１２０】
図１３に、図１２に示す分析チップの分解模式図の一例を示す。本実施形態の分析チップは、略平面板状の基板に蓋が積層され、これらが接合により一体化されて概略構成されている。基板には溝が形成されている。また液体流入口側および液体流出口側の流路の間の部分に反応室が形成され、担体が存在している。また、反応室と液体流出口側の流路の間には担体の堰き止め手段が形成されている。
【０１２１】
図１４に、図１２に示す分析チップの堰き止め部拡大図を示す。担体を堰き止めるための堰き止め手段が形成されている。
【０１２２】
図１５に、図１２に示す分析チップのＡ−Ａ線の要部縦断面図を示す。
【実施例】
【０１２３】
以下、実施例をもって本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１２４】
参考例１に示すとおり、遺伝子組換え酵母で前記ＨＢＶ表面抗原Ｌタンパク質（Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質）を発現させることにより、発現されたＨＢＶ表面抗原Ｌタンパク質から酵母小胞体由来の脂質２重膜に多数の同タンパク質が埋め込まれた短径約２０ｎｍ、長径約１５０ｎｍの楕円状のナノ粒子が形成されることが知られている（J. Bio. Chem., Vol.267, No.3, 1953-1961, 1992）。このような粒子は、ＨＢＶゲノムや他のＨＢＶタンパク質を全く含まないので、ウィルスとしては機能せず、人体への安全性は極めて高い。さらに、クローン化することで均一な品質の「自己組織化能力を有するタンパク質」と脂質２重膜の複合体を常に生産可能であり、またハンドリングしやすい酵母などを生産系として利用できるため、生産性や生産コストの面でも優れている。
【０１２５】
参考例１（遺伝子組換え酵母によるＺＺタグを付加したナノサイズの粒子（ＺＺナノ粒子）の発現）
特開２００４−００２３１３号公報実施例記載の方法に基づいて、ＺＺタグをもつナノサイズの粒子を作製した。
【０１２６】
実施例１  
本実施例では、本発明の分析チップを用いたヒトインターロイキン−８タンパク質（ｈＩＬ−８）の測定を行った。
【０１２７】
図１２記載のポリメチルメタクリレート製の分析チップを、親水性高分子として分子量５００，０００、２，０００ｐｐｍのポリエチレングリコール水溶液に浸漬した。浸漬したポリメチルメタクリレート板を密封し、２．５ｋＧｙのガンマ線を照射し、グラフト化した。
【０１２８】
担体として金蒸着したポリスチレンビーズを用い、リン酸緩衝液で洗浄し、参考例１で作製したセＺＺナノ粒子（５０μｇ／ｍｌ）をセファロースビーズと同量混合し、担体を被覆した。担体と等量の０．１μｇ／ｍｌ抗ｈＩＬ−８抗体（鎌倉テクノサイエンス社）０．０５％トゥイーン２０・架橋剤ＤＭＰ（６．６ｍｇ／ｍｌ）含有リン酸緩衝液を添加し、ＺＺタグと抗体を相互作用させ、４℃で１時間架橋させた。架橋後、０．０５％トゥイーン２０含有リン酸緩衝液で洗浄し、未結合の抗体を洗浄した。その後、０．２Ｍ  Ｍｏｎｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  緩衝液  ｐＨ８．０で担体を洗浄し、架橋剤をマスクした。さらに５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０で担体を洗浄し、架橋剤をマスクした。担体を０．０５％トゥイーン２０含有リン酸緩衝液で洗浄し、上記分析チップの流路内に２μｌ充填した。
【０１２９】
チップの流路内を０．０５％トゥイーン２０含有リン酸緩衝液で洗浄した後、０．２５％ウシ血清アルブミン、０．０５％トゥイーン２０含有リン酸緩衝液で溶解させたｈＩＬ−８（鎌倉テクノサイエンス社）２０μｌを２．５μｌ／分の流速でシリンジポンプを用いて流路内に注入した後、引き続いて０．０５％トゥイーン２０含有リン酸緩衝液を２０μｌ／分の流速で注入することにより、流路内を１０分間洗浄した。洗浄後、０．２５％ＢＳＡ、０．０５％トゥイーン２０含有リン酸緩衝液で溶解させた０．６μｇ／ｍｌのＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識抗ｈＩＬ−８抗体（鎌倉テクノサイエンス社）２０μｌを２．５μｌ／分の流速でシリンジポンプを用いて流路内に注入して先に注入したｈＩＬ―８と反応させ、さらに０．０５％トゥイーン２０含有リン酸緩衝液を２０μｌ／分の流速で流路内に注入して１０分間洗浄した。洗浄後、２０μＭ過酸化水素水、１３μｇ／ｍｌ  Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を２０μｌ／分の流速でシリンジポンプを用いて流路内に注入し、流路内で産生されたレゾルフィンの量を分析チップ基板上で蛍光顕微鏡ＩＸ−７１（オリンパス社）を用いて測定した。
【０１３０】
比較例１
本比較例では、プロテインＡで被覆されたセファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用い、比較対象とした。
【０１３１】
図１２記載のポリメチルメタクリレート製の分析チップを、親水性高分子として分子量５００，０００、２，０００ｐｐｍのポリエチレングリコール水溶液に浸漬した。浸漬したポリメチルメタクリレート板を密封し、２．５ｋＧｙのガンマ線を照射し、グラフト化した。
【０１３２】
担体としてプロテインＡで被覆されたセファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用い、リン酸緩衝液で洗浄し、担体と等量の０．１μｇ／ｍｌ抗ｈＩＬ−８抗体（鎌倉テクノサイエンス社）０．０５％トゥイーン２０・架橋剤ＤＭＰ（６．６ｍｇ／ｍｌ）含有リン酸緩衝液を添加し、プロテインＡと抗体を相互作用させ、４℃で１時間架橋させた。架橋後、０．０５％トゥイーン２０含有リン酸緩衝液で洗浄し、未結合の抗体を洗浄した。その後、０．２Ｍ  Ｍｏｎｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  緩衝液  ｐＨ８．０で担体を洗浄し、架橋剤をマスクした。さらに５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０で担体を洗浄し、架橋剤をマスクした。担体を０．０５％トゥイーン２０含有リン酸緩衝液で洗浄し、上記分析チップの流路内に２μｌ充填した。
【０１３３】
チップの流路内を０．０５％トゥイーン２０含有リン酸緩衝液で洗浄した後、０．２５％ウシ血清アルブミン、０．０５％トゥイーン２０含有リン酸緩衝液で溶解させたｈＩＬ−８（鎌倉テクノサイエンス社）２０μｌを２．５μｌ／分の流速でシリンジポンプを用いて流路内に注入した後、引き続いて０．０５％トゥイーン２０含有リン酸緩衝液を２０μｌ／分の流速で注入することにより、流路内を１０分間洗浄した。洗浄後、０．２５％ＢＳＡ、０．０５％トゥイーン２０含有リン酸緩衝液で溶解させた０．６μｇ／ｍｌのＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識抗ｈＩＬ−８抗体（鎌倉テクノサイエンス社）２０μｌを２．５μｌ／分の流速でシリンジポンプを用いて流路内に注入して先に注入したｈＩＬ―８と反応させ、さらに０．０５％トゥイーン２０含有リン酸緩衝液を２０μｌ／分の流速で流路内に注入して１０分間洗浄した。洗浄後、２０μＭ過酸化水素水、１３μｇ／ｍｌ  Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を２０μｌ／分の流速でシリンジポンプを用いて流路内に注入し、流路内で産生されたレゾルフィンの量を分析チップ基板上で蛍光顕微鏡ＩＸ−７１（オリンパス社）を用いて測定した。
【０１３４】
実施例１および比較例１で得られた、各濃度のIL-8を用いた時の蛍光強度を図１６に示す。比較例１と比較し、実施例１では、非特異的シグナルが低く、また、検出感度も向上した。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】図１は、タンパク質と脂質二重膜からなる複合体により被覆された担体の様態の一例を示す図である。
【図２】図２は、タンパク質と脂質二重膜からなる複合体により被覆された担体の様態の一例を示す図である。
【図３】図３は、タンパク質と脂質二重膜からなる複合体により被覆された担体の様態の一例を示す図である。
【図４】図４は、タンパク質と脂質二重膜からなる複合体により被覆された担体の様態の一例を示す図である。
【図５】図５は、タンパク質と脂質二重膜からなる複合体により被覆された担体の様態の一例を示す図である。
【図６】図６は、タンパク質と脂質二重膜からなる複合体により被覆された担体の様態の一例を示す図である。
【図７】図７は、タンパク質と脂質二重膜からなる複合体により被覆された担体の様態の一例を示す図である。
【図８】図８は、タンパク質と脂質二重膜からなる複合体により被覆された担体の様態の一例を示す図である。
【図９】図９は、タンパク質と脂質二重膜からなる複合体により被覆された担体の様態の一例を示す図である。
【図１０】図１０は、タンパク質と脂質二重膜からなる複合体により被覆された担体の様態の一例を示す図である。
【図１１】図１１は、タンパク質と脂質二重膜からなる複合体により被覆された担体の様態の一例を示す図である。
【図１２】図１２は、本発明にかかる分析チップの一実施形態の平面模式図の一例を示す図である。
【図１３】図１３は、図１２に示す分析チップの分解模式図の一例を示す図である。
【図１４】図１４は、図１２に示す分析チップの堰き止め部拡大図である。
【図１５】図１５は、図１２に示す分析チップのＡ−Ａ線の要部縦断面図である。
【図１６】図１６は、実施例１および比較例１で得られた各IL-8濃度における蛍光強度をプロットした検量線を示す図である。
【符号の説明】
【０１３６】
１  担体
２  複合体を形成するタンパク質
３  脂質２重膜
４  Fc領域結合部位
５  抗体
６  架橋剤
７  目的とする物質（目的物質）
８  ナノサイズの粒子
９  担体との親和性を持つ領域もしくはタグ
１０  Fc融合タンパク質
１１  Fc融合タンパク質と相互作用する物質（目的物質）
１２  基板
１３  蓋
１４  堰き止め手段
１５  反応室
１６  液体流出口側流路
１７  液体流入口側流路
１８  液体流入口
１９  液体流出口
２０  検出用抗体
【図１】
2007107992.tif 000002
【図２】
2007107992.tif 000003
【図３】
2007107992.tif 000004
【図４】
2007107992.tif 000005
【図５】
2007107992.tif 000006
【図６】
2007107992.tif 000007
【図７】
2007107992.tif 000008
【図８】
2007107992.tif 000009
【図９】
2007107992.tif 000010
【図１０】
2007107992.tif 000011
【図１１】
2007107992.tif 000012
【図１２】
2007107992.tif 000013
【図１３】
2007107992.tif 000014
【図１４】
2007107992.tif 000015
【図１５】
2007107992.tif 000016
【図１６】
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