(57)【要約】【課題】簡易に修飾蛋白質の修飾率を評価できるイムノアッセイを提供する。【解決手段】反応系における修飾蛋白質の修飾率を算出するイムノアッセイであって、反応系は、修飾蛋白質の蛋白質と特異結合する抗体と、修飾蛋白質の修飾物を特異的に認識し蛍光性物質が感作されている蛍光性特異物質とを有し、免疫凝集測定原理に基づいて反応系内における蛋白質の濃度を測定し、蛍光偏光測定原理に基づいて反応系内における修飾蛋白質の濃度を測定し、両者の測定結果から修飾蛋白質の修飾率を算出する。【選択図】図１
2007120976.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応系における修飾蛋白質の修飾率を算出するイムノアッセイであって、
前記反応系は、前記修飾蛋白質の蛋白質と特異結合する抗体と、前記修飾蛋白質の修飾物を特異的に認識し蛍光性物質が感作されている蛍光性特異物質とを有し、
免疫凝集測定原理に基づいて前記反応系内における前記蛋白質の濃度を測定し、
蛍光偏光測定原理に基づいて前記反応系内における前記修飾蛋白質の濃度を測定し、
両者の測定結果から前記修飾蛋白質の修飾率を算出することを特徴とするイムノアッセイ。
【請求項２】
前記イムノアッセイは、
（１）前記修飾蛋白質を含む被検物質を前記蛍光性特異物質に作用させ、特異結合複合体を形成させる工程、（２）前記特異結合複合体を含む反応液の蛍光偏光度と、透過光強度もしくは散乱光強度とを測定する工程、（３）前記特異結合複合体を含む前記反応液に抗体を作用させ、特異結合凝集複合体を形成させる工程、（４）前記特異結合凝集複合体の蛍光偏光度と、透過光強度もしくは散乱光強度とを測定する工程、（５）（２）と（４）より得られた蛍光偏光度の差と、透過光強度の差もしくは散乱強度の差とを算出する工程、（６）前記蛍光偏光度の差より前記修飾蛋白質の濃度を、前記透過光強度の差、もしくは前記散乱強度の差より前記蛋白質の濃度を算出する工程、（７）（６）で得られた前記修飾蛋白質の濃度および前記蛋白質の濃度より前記修飾率を算出する工程、
を含むことを特徴とする請求項１記載のイムノアッセイ。
【請求項３】
単色光を用いて、前記透過光強度の測定もしくは前記散乱光強度の測定と、前記蛍光偏光度の測定とを実施することを特徴とする請求項２記載のイムノアッセイ。
【請求項４】
前記修飾蛋白質が糖化蛋白質により構成され、前記反応系における全ての蛋白質の濃度を免疫凝集測定原理に基づいて測定し、前記糖化蛋白質の濃度を蛍光偏光測定原理に基づいて測定することにより、前記全ての蛋白質に対する前記糖化蛋白質の割合を算出することを特徴とする請求項１又は請求項２記載のイムノアッセイ。
【請求項５】
前記蛍光性特異物質が有する特異物質は、糖修飾アミノ酸領域を認識する抗体により構成されることを特徴とする請求項４記載のイムノアッセイ。
【請求項６】
前記蛍光性特異物質が有する特異物質は、糖のジオールとアフィニティ形成するボロン酸誘導体により構成されることを特徴とする請求項４記載のイムノアッセイ。
【請求項７】
前記糖化蛋白質は、ＨｂＡ１ｃにより構成されることを特徴とする請求項６記載のイムノアッセイ。
【請求項８】
前記修飾蛋白質の蛋白質と特異結合する抗体は、前記蛋白質により構成される凝集体を形成することができることを特徴とする請求項１又は請求項２記載のイムノアッセイ。
【請求項９】
前記抗体は、微粒子に感作されていることを特徴とする請求項８記載のイムノアッセイ。
【請求項１０】
反応系を備え、前記反応系における修飾蛋白質の修飾率を測定するイムノアッセイに用いられるイムノアッセイキットであって、
前記反応系は、前記修飾蛋白質の蛋白質と特異結合する抗体と、前記修飾蛋白質の修飾物を特異的に認識し蛍光性物質が感作されている蛍光性特異物質とを有し、
免疫凝集測定原理に基づいて前記反応系内における前記蛋白質の濃度を測定し、
蛍光偏光測定原理に基づいて前記反応系内における前記修飾蛋白質の濃度を測定し、
両者の測定結果から前記修飾蛋白質の修飾率を算出することを特徴とするイムノアッセイキット。
【請求項１１】
反応系を備え、前記反応系における修飾蛋白質の修飾率を測定するイムノアッセイに用いられるイムノアッセイデバイスであって、
前記反応系は、前記修飾蛋白質の蛋白質と特異結合する抗体と、前記修飾蛋白質の修飾物を特異的に認識し蛍光性物質が感作されている蛍光性特異物質とを有し、
免疫凝集測定原理に基づいて前記反応系内における前記蛋白質の濃度を測定し、
蛍光偏光測定原理に基づいて前記反応系内における前記修飾蛋白質の濃度を測定し、
両者の測定結果から前記修飾蛋白質の修飾率を算出することを特徴とするイムノアッセイデバイス。
【請求項１２】
前記請求項１乃至請求項１１のいずれかに記載のイムノアッセイに用いられ、透過光強度の測定および蛍光偏光度の測定を同時に行うことを特徴とする読取装置。
【請求項１３】
前記請求項１乃至請求項１１のいずれかに記載のイムノアッセイに用いられ、散乱光強度の測定および蛍光偏光度の測定を同時に行うことを特徴とする読取装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の修飾蛋白質を分析するイムノアッセイに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
免疫測定法（以下、単にイムノアッセイという）は、抗原抗体反応を利用した測定方法である。これまでに、様々な測定原理に基づくイムノアッセイが報告されている。例えば、酵素免疫測定法、蛍光測定法、あるいは発光測定法など、免疫複合体と未反応物質とを分離するＢｉｎｄｉｎｇ／Ｆｒｅｅ分離（以下、単にＢＦ分離という）を必要とする測定法や、比濁法、比朧法、あるいはラテックス凝集法など、ＢＦ分離を必要としない測定法がある。これらは、検出対象物の大きさの変化を光学的に検出する方法で、検出対象物の大きさが大きく変化するほど散乱光強度は大きくなり、また透過光強度は小さくなることを利用している。
【０００３】
一方、検出対象物の大きさの変化を検出する別の方法として、蛍光偏光を用いた免疫測定法（以下、蛍光偏光免疫測定法という）が注目されている。蛍光偏光免疫測定法においても、ＢＦ分離を必要としないため洗浄操作がいらない。また、基本的には蛍光を測定するため、高感度の測定が可能となる。
【０００４】
蛍光偏光、あるいは蛍光偏光解消と称される現象は、１９５０年以後に生体高分子に適用するための研究が開始され、１９７０年代後半からは生化学あるいは生物学などの分野において広範囲に亘る応用研究が本格的に行われている。
【０００５】
蛍光偏光を測定するための専用の測定装置（以下、蛍光偏光測定装置という）は、簡単に述べると、従来の蛍光光度計と同様の構成に加えて、さらに２枚の偏光板を備えている（例えば、特許文献１参照）。
【０００６】
蛍光偏光測定装置は、光源から発せられる光線からフィルターあるいはグレイティングプリズムによってモノクロ波（単色光）を得て、それを偏光子により偏光して励起光を得る。偏光子を通過した励起光は、セルに入射されると、溶液中の蛍光色素をもつ分子のみによって吸収される。その後、蛍光色素の特性蛍光緩和時間内に発せられた蛍光の垂直成分と平行成分が検出される。検出された垂直成分と平行成分の蛍光強度をＰｅｒｒｉｎの式に当てはめ、結果として蛍光偏光度が算出される。
【０００７】
蛍光偏光度の値は、原理的に、分子の大小に依存する分子の回転運動の速度の差に依存する。このため、蛍光の検出を阻害する不純物などがあったとしても、算出される蛍光偏光度には直接的に影響しない。したがって、全く蛍光が検出されない状況以外では、試料を前処理することなく蛍光偏光度を測定でき、さらにＢＦ分離の必要性もない。
【特許文献１】特開平１１−８１３３３２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
プロテオームという概念において、リン酸化、糖化やアセチル化された修飾蛋白質は、生体内で重要な働きをしており、その同定および機能解明は重要である。しかしながら、同定および機能解明を行うには、２次元電気泳動やＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、質量分析、ＮＭＲ（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）、ＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）等の高価な装置を使用して総合的に評価しなければならなかった。加えて、高度な専門性を必要とする場合が多かった。
【０００９】
本発明は、従来の問題を解決するためになされたもので、定性測定および定量測定を簡単に行うことができるイムノアッセイを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明のイムノアッセイは、反応系における修飾蛋白質の修飾率を算出するイムノアッセイであって、前記反応系は、前記修飾蛋白質の蛋白質と特異結合する抗体と、前記修飾蛋白質の修飾物を特異的に認識し蛍光性物質が感作されている蛍光性特異物質とを有し、免疫凝集測定原理に基づいて前記反応系内における前記蛋白質の濃度を測定し、蛍光偏光測定原理に基づいて前記反応系内における前記修飾蛋白質の濃度を測定し、両者の測定結果から前記修飾蛋白質の修飾率を算出するようにした構成を有している。
【００１１】
この構成により、本発明のイムノアッセイは、簡易な非ＢＦ分離方式の免疫凝集測定原理と蛍光偏光免疫測定原理を同時に行うことによって、母体となる蛋白質と、前記蛋白質に修飾された修飾物を含む修飾蛋白質の濃度を同時に測定することができる。
【００１２】
また、本発明のイムノアッセイは、（１）前記修飾蛋白質を含む被検物質を前記蛍光性特異物質に作用させ、特異結合複合体を形成させる工程、（２）前記特異結合複合体を含む反応液の蛍光偏光度と、透過光強度もしくは散乱光強度とを測定する工程、（３）前記特異結合複合体を含む前記反応液に抗体を作用させ、特異結合凝集複合体を形成させる工程、（４）前記特異結合凝集複合体の蛍光偏光度と、透過光強度もしくは散乱光強度とを測定する工程、（５）（２）と（４）より得られた蛍光偏光度の差と、透過光強度の差もしくは散乱強度の差とを算出する工程、（６）前記蛍光偏光度の差より前記修飾蛋白質の濃度を、前記透過光強度の差、もしくは前記散乱強度の差より前記蛋白質の濃度を算出する工程、（７）（６）で得られた前記修飾蛋白質の濃度および前記蛋白質の濃度より前記修飾率を算出する工程、を含むようにした構成を有している。
【００１３】
この構成により、本発明のイムノアッセイは、簡易な非ＢＦ分離方式の免疫凝集測定原理と蛍光偏光免疫測定原理を同時に行うことによって、母体となる蛋白質と、前記蛋白質に修飾された修飾物を含む修飾蛋白質の濃度を同時に測定することができ、簡易に修飾率を測定することができる。
【００１４】
さらに、本発明のイムノアッセイは、単色光を用いて、前記透過光強度の測定もしくは前記散乱光強度の測定と、前記蛍光偏光度の測定とを実施するようにした構成を有している。
【００１５】
この構成により、本発明のイムノアッセイは、回折格子等を備える必要がないので、簡単な光学系によって透過光強度の測定もしくは散乱光強度の測定と、蛍光偏光度の測定とを行うことができる。
【００１６】
さらに、本発明のイムノアッセイは、前記修飾蛋白質が糖化蛋白質により構成され、前記反応系における全ての蛋白質の濃度を免疫凝集測定原理に基づいて測定し、前記糖化蛋白質の濃度を蛍光偏光測定原理に基づいて測定することにより、前記全ての蛋白質に対する前記糖化蛋白質の割合を算出するようにした構成を有している。
【００１７】
この構成により、本発明のイムノアッセイは、糖尿病のマーカ物質となりうる糖化蛋白質を測定対象とするので、検査分野に適用することができる。
【００１８】
さらに、本発明のイムノアッセイは、前記蛍光性特異物質が有する特異物質は、糖修飾アミノ酸領域を認識する抗体により構成されている。
【００１９】
さらに、本発明のイムノアッセイは、前記蛍光性特異物質が有する特異物質は、糖のジオールとアフィニティ形成するボロン酸誘導体により構成されている。
【００２０】
さらに、本発明のイムノアッセイは、前記糖化蛋白質は、ＨｂＡ１ｃにより構成されている。
【００２１】
さらに、本発明のイムノアッセイは、前記修飾蛋白質の蛋白質と特異結合する抗体は、前記蛋白質により構成される凝集体を形成することができるようにした構成を有している。
【００２２】
この構成により、本発明のイムノアッセイは、反応系に入射された光の散乱強度が、凝集体の体積の２乗に比例して変化するので、散乱強度の変化に基づいて反応系内における蛋白質の濃度を測定することができる。
【００２３】
さらに、本発明のイムノアッセイは、前記抗体は、微粒子に感作された構成を有している。
【００２４】
さらに、本発明のイムノアッセイキットは、反応系を備え、前記反応系における修飾蛋白質の修飾率を測定するイムノアッセイに用いられるイムノアッセイキットであって、前記イムノアッセイキットの反応系は、前記修飾蛋白質の蛋白質と特異結合する抗体と、前記修飾蛋白質の修飾物を特異的に認識し蛍光性物質が感作されている蛍光性特異物質とを有し、免疫凝集測定原理に基づいて前記反応系内における前記蛋白質の濃度を測定し、蛍光偏光測定原理に基づいて前記反応系内における前記修飾蛋白質の濃度を測定し、両者の測定結果から前記修飾蛋白質の修飾率を算出する構成を有している。
【００２５】
この構成により、本発明のイムノアッセイキットは、簡易な非ＢＦ分離方式の免疫凝集測定原理と蛍光偏光免疫測定原理を同時に行うことによって、母体となる蛋白質と、前記蛋白質に修飾された修飾物を含む修飾蛋白質の濃度を同時に測定することができ、簡易に修飾率を測定することができる。
【００２６】
さらに、本発明のイムノアッセイデバイスは、反応系を備え、前記反応系における修飾蛋白質の修飾率を測定するイムノアッセイに用いられるイムノアッセイデバイスであって、前記イムノアッセイデバイスの反応系は、前記修飾蛋白質の蛋白質と特異結合する抗体と、前記修飾蛋白質の修飾物を特異的に認識し蛍光性物質が感作されている蛍光性特異物質とを有し、免疫凝集測定原理に基づいて前記反応系内における前記蛋白質の濃度を測定し、蛍光偏光測定原理に基づいて前記反応系内における前記修飾蛋白質の濃度を測定し、両者の測定結果から前記修飾蛋白質の修飾率を算出する構成を有している。
【００２７】
この構成により、本発明のイムノアッセイデバイスは、簡易な非ＢＦ分離方式の免疫凝集測定原理と蛍光偏光免疫測定原理を同時に行うことによって、母体となる蛋白質と、前記蛋白質に修飾された修飾物を含む修飾蛋白質の濃度を同時に測定することができ、簡易に修飾率を測定することができる。
【００２８】
さらに、本発明の読取装置は、上記イムノアッセイに用いられ、透過光強度の測定および蛍光偏光度の測定を同時に行う構成を有している。
【００２９】
さらに、本発明の読取装置は、上記イムノアッセイに用いられ、散乱光強度の測定および蛍光偏光度の測定を同時に行う構成を有している。
【発明の効果】
【００３０】
本発明は、簡易な非ＢＦ分離方式の免疫凝集測定原理と蛍光偏光免疫測定原理を同時に行うことによって、母体となる蛋白質と、前記蛋白質に修飾された修飾物を含む修飾蛋白質の濃度を同時に測定することができ、簡易に修飾率を測定することができるイムノアッセイを提供することができるものである。また、修飾蛋白質の中においても、糖尿病患者のマーカとして特に重要な糖化蛋白質類の検査に適用できるイムノアッセイを提供することができるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下、本発明の一実施の形態のイムノアッセイについて、図１乃至図３を用いて説明する。
【００３２】
本発明の一実施の形態のイムノアッセイは、反応系１における修飾蛋白質１３の修飾率を測定する方法であって、反応系１は、修飾蛋白質１３の蛋白質１１と特異結合する抗体１６と、修飾蛋白質１３の修飾物１２を特異的に認識し蛍光性物質１５が感作されている蛍光性特異物質とを有し、免疫凝集測定原理に基づいて反応系１内における蛋白質１１の濃度を測定し、蛍光偏光測定原理に基づいて反応系１内における修飾蛋白質１３の濃度を測定し、両者の測定結果から修飾蛋白質１３の修飾率を測定することにある。
【００３３】
反応系１の状態を示す模式図を図１に示す。本実施の形態のイムノアッセイは、図１（ａ）に示すように、検体１０に含まれる全ての蛋白質１１のうち、蛋白質１１が修飾物１２により修飾された修飾蛋白質１３を測定対象とし、修飾蛋白質１３の全ての蛋白質１１に対する修飾率を簡易的に測定するようになっている。
【００３４】
修飾率を測定するにあたり、必要要件となるのは、蛍光感作抗体１４などの蛍光性特異物質であり、図１（ｂ）に示すように、蛍光感作抗体１４が図１（ａ）に示す状態における反応系１に導入される。この蛍光感作抗体１４には蛍光性物質１５が感作されている。蛍光性特異物質は、これ以外にも、例えば、糖化修飾蛋白質の糖化物にあるジオール基と特異結合を示すボロン酸誘導体でもよく、この場合は、ボロン酸に蛍光性物質１５を感作させる。いずれにおいても、修飾物１２と特異的に結合する物質であればよい。
【００３５】
さらに、必要要件としては、修飾蛋白質１３と修飾されていない蛋白質１１の共通領域、即ち、母体となる蛋白質１１と特異的に結合する抗体１６があり、図１（ｃ）に示すように、抗体１６が図１（ｂ）に示す状態における反応系１に導入される。
【００３６】
抗体１６は、母体となる蛋白質１１を介して凝集複合体１７を形成するようになっている。したがって、抗体１６は、ポリクローナル抗体、ラテックスや金コロイドのような微粒子に感作された抗体、あるいは、異なる抗原決定基（エピトープ）を認識するモノクローナル抗体の混合物等により構成されている。母体となる蛋白質１１が多量体であるならば、抗体１６は、ただ一つのエピトープを認識するモノクローナル抗体により構成されていてもよい。
【００３７】
以上、蛍光感作抗体１４と抗体１６を、修飾蛋白質１３を含む検体１０と作用させることにより、図１（ｃ）に示す最終的な反応系１には、凝集複合体１７と、未反応の蛍光感作抗体１４および抗体１６が存在することになる。
【００３８】
図１において不図示の光源から反応系１に任意の波長をもつ光を入射すると、入射光の散乱強度は、凝集複合体１７の形成前後で変化し、また、蛍光偏光度も変化する。したがって、散乱強度の変化の測定に基づいて、蛋白質１１全体の濃度を算出し、蛍光偏光度の変化の測定に基づいて、修飾蛋白質１３の濃度を算出し、これらの結果に基づいて蛋白質の修飾率を測定する。
【００３９】
本発明のイムノアッセイにおいて、重要因子となるのは、反応前の各物質の大きさと凝集複合体１７の大きさの変化量の差、および蛍光性物質１５の蛍光寿命である。
【００４０】
散乱強度の変化は、検出対象となる物質の体積の変化の２乗に比例する。蛍光偏光度は、物質の大きさに起因する回転速度が遅くなれば蛍光偏光が保持されるので、反応前後における蛍光偏光度差が大きくなる。蛍光性物質１５の蛍光寿命は、蛍光が消えるまでの時間が早いと回転運動の差を捉えられず、逆に蛍光が消えるまでの時間が長いと、ブラウン運動の影響により反応前後における回転運動の変化をみられない。したがって、蛍光寿命は、数１０ｎｓｅｃ〜数１００ｎｓｅｃであることが好ましい。蛍光寿命が数１０ｎｓｅｃの蛍光性物質１５として代表的なものはダンシル骨格をもつものであり、数１００ｎｓｅｃの蛍光性物質１５として代表的なものはピレン骨格をもつものである。
【００４１】
本発明のイムノアッセイの反応系１の設計において、従来のイムノアッセイの反応系を設計する場合と比較して重要となるのは、散乱強度の変化に起因する凝集複合体１７の大きさ分布全てに対して、蛍光偏光度が一定に保持されることである。散乱強度の変化を示す分子の大きさ変化の範囲で、蛍光偏光度が変化すると、正確な修飾蛋白質１３の濃度を算出できない。したがって、上記に挙げた重要因子、反応前の各物質の大きさと凝集複合体１７の大きさの変化量の差、および蛍光性物質１５の蛍光寿命などを考慮した上で反応系１を設計しなければならない。
【００４２】
蛍光偏光度の変化は、反応系１において、蛍光感作抗体１４と凝集複合体１７の存在比で決まる統計的なものである。即ち、測定対象物である修飾蛋白質１３の修飾物１２の量による。したがって、反応系１における蛍光感作抗体１４の濃度は厳密に設定されるべきである。必要以上の蛍光感作抗体１４が反応系１に導入されると、それがノイズとなるため蛍光偏光度が小さくなり、結果として検出されるダイナミックレンジが小さくなる。
【００４３】
本実施の形態において凝集複合体１７を形成するための反応条件は、従来の免疫比朧法、免疫比濁法で構築される際の反応条件を定める因子をそのまま適用させる。ここで、因子とは反応系ｐＨ、塩濃度、高分子添加物、抗体や測定対象物の等電点、純度等をいう。また、反応系１において非特異凝集を起こさせないようにすることも重要である。
【００４４】
本発明のイムノアッセイの測定操作としては、（１）修飾蛋白質を含む被検物質を蛍光性特異物質に作用させ、特異結合複合体を形成させる工程、（２）特異結合複合体を含む反応液の蛍光偏光度と、透過光強度もしくは散乱光強度とを測定する工程、（３）特異結合複合体を含む反応液に抗体を作用させ、特異結合凝集複合体を形成させる工程、（４）特異結合凝集複合体の蛍光偏光度と、透過光強度もしくは散乱光強度とを測定する工程、（５）（２）と（４）より得られた蛍光偏光度の差と、透過光強度の差もしくは散乱強度の差とを算出する工程、（６）蛍光偏光度の差より修飾蛋白質の濃度を、透過光強度の差、もしくは散乱強度の差より蛋白質の濃度を算出する工程、（７）（６）で得られた修飾蛋白質の濃度および蛋白質の濃度より修飾率を算出する工程、を含む。
【００４５】
本実施の形態のイムノアッセイの測定操作は、汎用の吸光分光光度計、蛍光分光光度計を用いて実施できるが、図２および図３に示される光学系を構築した場合、より簡易に本発明のイムノアッセイを実施することができる。
【００４６】
図２は、本実施の形態のイムノアッセイを実施するための光学系の構成の一例を示す模式図であり、１つの光源２１と、光源２１に対して９０°の位置に散乱強度の検出器２２と蛍光測定用の検出器２３が配置されている。蛍光偏光度を測定するためには、反応系１を構成するセル２０と光源２１との間に、固定の偏光子２４を設置し、一方、セル２０と蛍光測定用の検出器２３との間に回転可能な偏光子２５を設置する。これは、免疫比朧法測定と蛍光偏光測定を同時に実施しうる光学系システムである。
【００４７】
図３は、本実施の形態のイムノアッセイを実施するための光学系システムの他の例を示す構成図であり、図２に示す光学系システムと基本的な構成は同じであるが、散乱強度の検出器２２の代わりに、透過光強度の検出器２６を備えるようになっている。
【００４８】
ここで、測定に単色光が用いられる場合、光学系システムは、光源を１つ備えれば十分であり、かつ複数の波長の光波を分離するための回折格子等を備える必要がないという点で、好ましい。この場合、長波長側、特に５００〜７００ｎｍ付近の光源を使用すると、散乱強度の測定時に不純物等の影響を受けないので好ましい。したがって、蛍光性物質１５もこの領域の光の波長により励起されるものが好ましい。
【００４９】
また、散乱強度の検出器２２あるいは透過光強度の検出器２６と、蛍光測定用の検出器２３と、光源２１とは、読取装置の一部を構成している。したがって、読取装置は、光源２１からセル２０に入射された光波の散乱強度あるいは透過光強度と、蛍光偏光度とを同時に測定することができる。
【００５０】
蛍光感作抗体１４の作製方法は、蛍光感作抗体１４を作製するための抗体に含まれる一級〜三級アミノ基、カルボキシル基、チオール基、フェニル基、フェノール基またはヒドロキシル基と蛍光性物質１５とを反応させて感作する。このため、蛍光性物質１５としては、イソチオシアノ基、サクシイミジル基、スルフォニルクロライド基、アジド基、チオール基、マレイミド基などの官能基が公知の方法に従って導入されたものを用いれば良い。また、蛍光性物質１５としては、金属錯体などを用いてもよい。
【００５１】
修飾蛋白質１３は、生体内で重要な機能を発現するものであり、例えば、アセチル化、リン酸化、硫酸化、メチル化、ヒドロキシル化、アミド化、糖化等の蛋白質である。ここで機能とは、例えば、アセチル化の場合は蛋白質分解阻害機能、リン酸化の場合は細胞内情報伝達機能、硫酸化の場合はホルモン活性化機能もしくは蛋白質輸送機能が現在推定されている。
【００５２】
また、糖化蛋白質は、糖尿病のマーカ物質となりうるので重要であり、本発明のイムノアッセイの測定対象物として好ましく、イムノアッセイを検査分野に適用することも期待できる。ここで、代表的な糖化蛋白質としては糖化アルブミン、ＨｂＡ１ｃがあげられる。ＨｂＡ１ｃは、従来から免疫測定原理、ボロン酸アフィニティ原理に基づいて測定される例が多くあるが、本発明に係るイムノアッセイへの適用も例外ではない。
【００５３】
本発明の他の実施の形態としては、反応系を備え、反応系における修飾蛋白質の修飾率を測定するためのイムノアッセイに用いられるイムノアッセイキットがあり、反応系は、修飾蛋白質の蛋白質と特異結合する抗体と、修飾蛋白質の修飾物を特異的に認識し蛍光性物質が感作されている蛍光性特異物質とを有し、免疫凝集測定原理に基づいて反応系内における蛋白質の濃度を測定し、蛍光偏光測定原理に基づいて反応系内における修飾蛋白質の濃度を測定し、両者の測定結果から修飾蛋白質の修飾率を測定することを特徴とするイムノアッセイキットとして提供することができる。イムノアッセイキットは、必要最低限の構成として、蛍光性特異物質と抗体とを、例えば、乾燥状態で有している。これに加えて、例えば、測定対象物がＨｂＡ１ｃである場合は、希釈液や変性剤、さらには、コントロール試薬を有している。
【００５４】
さらに、本発明の他の実施の形態としては、反応系を備え、反応系における修飾蛋白質の修飾率を測定するイムノアッセイに用いられるイムノアッセイデバイスがあり、反応系は、修飾蛋白質の蛋白質と特異結合する抗体と、修飾蛋白質の修飾物を特異的に認識し蛍光性物質が感作されている蛍光性特異物質とを有し、免疫凝集測定原理に基づいて反応系内における蛋白質の濃度を測定し、蛍光偏光測定原理に基づいて反応系内における修飾蛋白質の濃度を測定し、両者の測定結果から修飾蛋白質の修飾率を測定することを特徴とするイムノアッセイデバイスであってもよい。この場合、例えば、図４に示すような円盤形状を有するデバイス４０が考えられる。デバイス４０には、半径方向に沿って第１乃至第３のチャンバ４１乃至４３が形成されており、第１のチャンバ４１と第２のチャンバ４２、第２のチャンバ４２と第３のチャンバ４３は、流路４４によってそれぞれ連通している。第２のチャンバ４２に蛍光性特異物質を乾燥状態で保持させ、第３のチャンバ４３に抗体を乾燥状態で保持させておく。
【００５５】
デバイス４０は、図５に示すように、回転装置７０によって回転されるようになっている。回転装置７０は、デバイス４０を固定するクランパー７１と、デバイス４０を支持するターンテーブル７３と、ターンテーブル７３を回転させるスピンドルモータ７４と、スピンドルモータ７４の回転を制御する制御デバイス７５とを備えている。したがって、回転装置７０によってデバイス４０の回転がコントロールされると、第１のチャンバ４１に導入された測定対象物を含む液体は、遠心力によって流路４４を介して移送されるので、結果として本発明のイムノアッセイを実施することができる。
【００５６】
本発明のイムノアッセイが実施可能かどうかの予備検討結果を図６および図７に示す。予備検討は、測定対象物にＣＲＰ（Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ−ｐｒｏｔｅｉｎ）として、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体を用いて蛍光偏光度を測定した。
【００５７】
図６において、黒点は、１つのエピトープを認識するモノクローナル抗体の蛍光性特異物質を加えた場合におけるＣＲＰの濃度と蛍光偏光度との関係を示している。なお、白点は、比較のためにポリクローナル抗体を加えた場合におけるＣＲＰの濃度と蛍光偏光度との関係を示している。
【００５８】
図６に示すように、モノクローナル抗体を加えた場合は、蛍光偏光度応答性が見られない。しかしながら、モノクローナル抗体が存在する状態においてポリクローナル抗体を更に加えた場合、図７に示すように、モノクローナル抗体が蛍光偏光度応答性を示すようになる。ここで、蛍光性モノクローナル抗体は、本発明の一実施の形態の反応系１における修飾物１２に対する抗体に相当し、ポリクローナル抗体は、本発明の一実施の形態の反応系１における母体となる蛋白質１１に対する抗体に相当する。したがって、本発明のイムノアッセイが実施可能であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
以上のように、本発明にかかるイムノアッセイは、生体内で重要な機能をもたらす修飾蛋白質を簡易に評価できるという効果を有し、プロテオーム解析の予備評価に使用できるという効果を有するイムノアッセイとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】本発明の一実施の形態のイムノアッセイの反応系の状態を示す模式図
【図２】本発明の一実施の形態の光学系の構成の一例を示す模式図
【図３】本発明の一実施の形態の光学系の構成の一例を示す模式図
【図４】本発明の他の実施の形態におけるイムノアッセイデバイスの構造を示す模式図
【図５】本発明の他の実施の形態における回転装置の構造を示す模式図
【図６】モノクローナル抗体を加えた場合におけるＣＲＰの濃度と蛍光偏光度との関係を示すグラフ
【図７】モノクローナル抗体とポリクローナル抗体とを加えた場合におけるＣＲＰの濃度と蛍光偏光度との関係を示すグラフ
【符号の説明】
【００６１】
１  反応系
１０  検体
１１  蛋白質
１２  修飾物
１３  修飾蛋白質
１４  蛍光感作抗体
１５  蛍光性物質
１６  抗体
１７  凝集複合体
２０  セル
２１  光源
２２  散乱強度の検出器
２３  蛍光測定用の検出器
２４  固定の偏光子
２５  回転可能な偏光子
２６  透過光強度の検出器
４０  デバイス
４１  第１のチャンバ
４２  第２のチャンバ
４３  第３のチャンバ
４４  流路
７０  回転装置
７１  クランパー
７３  ターンテーブル
７４  スピンドルモータ
７５  制御デバイス
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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