(57)【要約】【課題】疎水性有機化合物の水性溶液と溶離剤への溶解度の順列によって溶出体積が異なることを利用して、疎水性有機化合物を明確に分離できテイリングが生じ難く分離能に優れ、疎水性有機化合物の定性分析やおよその定量分析も可能で、さらに詳細な分析条件の事前検討を行わなくても再現性の良い分析結果が得られ易く操作性に著しく優れる疎水性有機化合物の分析方法を提供することを目的とする。【解決手段】疎水性高分子鎖が末端に結合した親水性化合物と、前記親水性化合物と架橋結合した親水性不飽和単量体と、を有する橋かけ重合体の微粒子を充填剤とするカラムに、疎水性有機化合物を含有する水性溶液と溶離剤とを通過させる分離工程と、前記カラムを通過した前記溶離剤に溶出した前記疎水性有機化合物を検出する検出工程と、を備える。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性高分子鎖が末端に結合した親水性化合物と、前記親水性化合物と架橋結合した親水性不飽和単量体と、を有する橋かけ重合体の微粒子を充填剤とするカラムに、疎水性有機化合物を含有する水性溶液と溶離剤とを通過させる分離工程と、
前記カラムを通過した前記溶離剤に溶出した前記疎水性有機化合物を検出する検出工程と、
を備えていることを特徴とする疎水性有機化合物の分析方法。
【請求項２】
前記溶離剤に対する前記疎水性有機化合物の溶解度が、前記水性溶液に対する溶解度よりも大きいことを特徴とする請求項１に記載の疎水性有機化合物の分析方法。
【請求項３】
前記疎水性有機化合物が、フェノール及びフェノール誘導体、芳香族炭化水素化合物、有機酸、ニトリル化合物、内分泌撹乱物質の内の１種若しくは複数種であることを特徴とする請求項１又は２に記載の疎水性有機化合物の分析方法。
【請求項４】
疎水性高分子鎖が末端に結合した親水性化合物と、前記親水性化合物と架橋結合した親水性不飽和単量体と、を有する橋かけ重合体の微粒子が充填されていることを特徴とする液体クロマトグラフ用カラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水性溶液中の内分泌撹乱物質等の疎水性有機化合物を分析する疎水性有機化合物の分析方法及び液体クロマトグラフ用カラムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来より、自然環境中の有機化合物は環境汚染の原因として、最近では、生態系に影響を与える外因性内分泌撹乱物質（環境ホルモン）として関心を集めている。そのため、環境中に存在する有機化合物の種を同定する技術は重要である。また、このような有機化合物は類似の化学構造をもつ数種類の誘導体が存在するため、それらを効率的に分離し同定する技術は、医薬や農薬等の新薬開発の有用な有機化合物の取得のみならず諸科学の発展に不可欠な技術である。
【０００３】
水中に微量に溶存した環境ホルモン等の疎水性有機化合物を分析する方法としては、従来より、前処理として（非特許文献１）に記載の液・液抽出により濃縮し、これを高速液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィー等の分析機器を適用して分析を行っていた。
また、抽出・濃縮等の前処理を行わずに分析する方法として、（特許文献１）に「アルカリ条件下かつ相間移動触媒の存在のもと、水試料中のアルキルフェノール類を、蛍光ラベル化剤を用いて超音波処理により蛍光ラベル化する工程と、未反応の蛍光ラベル化剤と副生成物とを除去した後に蛍光ラベル化されたアルキルフェノール類を逆相液体クロマトグラフィーにより分離し化学蛍光検出する工程と、を有するアルキルフェノール類の測定方法」が開示されている。
【非特許文献１】化学大辞典、株式会社東京化学同人発行、第１版、第２４１頁
【特許文献１】特開２００１−１２４７５０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら上記従来の技術においては、以下のような課題を有していた。
（１）（非特許文献１）に記載の液・液抽出は確立された有用な技術であるが、水中に低濃度で存在する有機化合物の抽出では、非常に多量の有機溶媒と多段階の抽出操作を要する。多量の有機溶媒中に溶解する目的の有機化合物を濃縮するためには、さらに多量のエネルギーを要する。このため、操作の簡便性、迅速性および省エネルギー性に欠けるという課題を有していた。
（２）（特許文献１）に開示の技術は、検出対象のアルキルフェノール類をアルカリ条件下かつ相間移動触媒の存在のもとで蛍光ラベル化剤を用いて超音波処理により蛍光ラベル化しなければならないため、操作が煩雑で作業性に欠けるという課題を有していた。
（３）また、蛍光ラベル化されたアルキルフェノール類を検出するのに化学発光検出器が必須なので、汎用性に欠けるという課題を有していた。
【０００５】
本発明は上記従来の課題を解決するもので、疎水性有機化合物の水性溶液と溶離剤への溶解度の順列によって溶出体積が異なることを利用して、疎水性有機化合物を明確に分離できテイリングが生じ難く分離能に優れ、疎水性有機化合物の定性分析やおよその定量分析も可能で、さらに詳細な分析条件の事前検討を行わなくても再現性の良い分析結果が得られ易く操作性に著しく優れる疎水性有機化合物の分析方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、溶離剤を通ずることによって捕捉された疎水性有機化合物が容易に溶出され、溶解度の違いを利用して疎水性有機化合物を分離できテイリングが生じ難く分離能に優れるとともに、溶離剤や分析条件等の選択の幅が広く、詳細な分析条件の事前検討を行わなくても再現性の良い分析結果が得られ易く操作性に著しく優れる液体クロマトグラフ用カラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記従来の課題を解決するために本発明の疎水性有機化合物の分析方法及び液体クロマトグラフ用カラムは、以下の構成を有している。
本発明の請求項１に記載の疎水性有機化合物の分析方法は、疎水性高分子鎖が末端に結合した親水性化合物と、前記親水性化合物と架橋結合した親水性不飽和単量体と、を有する橋かけ重合体の微粒子を充填剤とするカラムに、疎水性有機化合物を含有する水性溶液と溶離剤とを通過させる分離工程と、前記カラムを通過した前記溶離剤に溶出した前記疎水性有機化合物を検出する検出工程と、を備えた構成を有している。
この構成により、以下のような作用が得られる。
（１）親水性化合物と親水性不飽和単量体とが架橋結合した橋かけ重合体は三次元的な網目構造を有しており、網目構造内の親水性化合物の末端には疎水性高分子鎖が結合しているので、親水性化合物は水性溶液中で疎水性高分子鎖を内側に向けて配向することによってミセル構造を構成し、数ナノメートルの大きさの疎水場（以下、疎水性ナノドメインという）を形成する。水性溶液中に含まれる疎水性有機化合物は、疎水性ナノドメインと疎水性相互作用によって会合し迅速に捕捉される。一方、疎水性ナノドメインと疎水性有機化合物との会合は比較的弱いので、疎水性有機化合物と親和性の高い溶離剤をカラムに通ずることにより、捕捉された疎水性有機化合物は容易に溶出されるため、疎水性有機化合物の水性溶液と溶離剤への溶解度の順列によって溶出体積が異なることを利用して、疎水性有機化合物を明確に分離できテイリングが生じ難く疎水性有機化合物のシャープなピークを検出することができる。
（２）化学修飾等の煩雑な疎水性有機化合物のシャープなピークを検出することができるので、疎水性有機化合物に固有な複数のピークの各々のリテンションタイムを求め、既知の疎水性有機化合物のピークのリテンションタイムと照合することにより、疎水性有機化合物の定性分析を行うことができる。
（３）疎水性有機化合物のシャープなピークを検出することができるので、濃度が既知の疎水性有機化合物のピークのリテンションタイムを予め測定し、濃度とピーク高さ又はピーク面積の関係を求めて検量線を作成し、同一の条件で未知の水性溶液を分析したときのピーク高さ又はピーク面積から、検量線によって水性溶液に含まれる疎水性有機化合物のおよその定量分析も行うことができる。
（４）一般に液体クロマトグラフィーでは、充填剤表面の性質や溶離剤の組成、ｐＨ等を調整することで生じる各成分と充填剤及び溶離剤との相互作用の差を利用して分離するので、わずかな条件の違いによって分析結果が異なるため、充填剤や溶離剤の条件を事前に詳細に検討することが必要であり煩雑な予備試験を要するが、親水性化合物と親水性不飽和単量体とが架橋結合した橋かけ重合体の微粒子が充填されたカラムは、疎水性有機化合物との会合が比較的弱くテイリングを生じ難いので、溶離剤や分析条件等の選択の幅が広く、詳細な分析条件の事前検討を行わなくても再現性の良い分析結果が得られ易く操作性に著しく優れる。
【０００７】
ここで、橋かけ重合体を構成する親水性化合物の疎水性高分子鎖としては、少なくとも１個以上のＣ６〜Ｃ２５のアルキル基又はアルケニル基、好ましくはＣ８〜Ｃ２０のアルキル基又はアルケニル基を有するものが用いられ、例えば、ステアリル基、２−エチルデシル基等が用いられる。
なお、アルキル基又はアルケニル基の炭素数が８より少なくなるにつれ疎水性有機化合物との相互作用が小さく結合が弱くなり疎水性有機化合物の捕捉能が低下する傾向がみられ、２０より多くなるにつれ疎水性が強く均一に分散し難くなる傾向がみられる。特に、６より少なくなるか２５より多くなると、これらの傾向が著しくなるため、いずれも好ましくない。
【０００８】
親水性化合物としては、疎水性高分子鎖が結合した他方の末端にビニル基等の炭素−炭素二重結合を有する原子団を備えた線状高分子であれば、公知のものやその変性物等を特に制限なく用いることができる。例えば、一方の末端にヒドロキシル基を有するポリエチレングリコールモノステアレートをアクリル酸クロリドとエステル化したもの等が好適に使用される。親水性化合物は、単独で使用しても良いし、２種以上を併用しても良い。
【０００９】
橋かけ重合体を構成する親水性不飽和単量体としては、重合によって親水性重合体が得られる単量体であれば特に制限なく用いることができ、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、無水マレイン酸、β−アクリロイルオキシプロピオン酸、フマール酸、クロトン酸、イタコン酸、ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸、２−（メタ）アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、２−（メタ）アクリロイルエタンスルホン酸、２−（メタ）アクリロイルプロパンスルホン酸、スルホエトキシポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート等の酸基含有の親水性不飽和単量体及びその塩；アクリルアミド、メタアクリルアミド、Ｎ−エチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシルプロピル（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ビニルピリジン、Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ−アクリロイルピペリジン、Ｎ−アクリロイルピロリジン等のノニオン性の親水性不飽和単量体；Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド及びその四級塩等のカチオン性の親水性不飽和単量体等の内の１種若しくは２種以上が用いられる。
また、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、酢酸ビニル等のように重合後の官能基の加水分解によって親水性重合体を形成する親水性不飽和単量体を用いることもできる。
なお、親水性不飽和単量体に、所定量の疎水性不飽和単量体を加えてもよい。このような疎水性不飽和単量体としては、スチレン、塩化ビニル、ブタジエン、イソブテン、エチレン、プロピレン、ステアリル（メタ）アクリレート、ラウリル（メタ）アクリレート等を挙げることができる。これらの疎水性不飽和単量体は、親水性不飽和単量体と疎水性不飽和単量体の総量に対して０〜２０モル％好ましくは０〜１０モル％の範囲で使用することができる。
疎水性不飽和単量体の含有量が、親水性不飽和単量体と疎水性不飽和単量体の総量に対して１０モル％より多くなるにつれ疎水性が強くなり水により十分な膨潤が得られ難くなる傾向がみられ、２０モル％より多くなるとこの傾向が著しいので好ましくない。
【００１０】
橋かけ重合体は、赤外線吸収スペクトル法によって測定した架橋度が１〜３０％好ましくは３〜１５％であるのが好ましい。橋かけ重合体が水性溶液に浸されて膨潤し水性ゲルとなるので形状保持性を有し、溶離剤や水性溶液を通過させ疎水性有機化合物を捕捉する充填剤として用いることができるからである。
架橋度が３％より小さくなるにつれ、形状保持性が乏しく溶離剤が通過するときに溶離剤とともにカラムから流出し易く圧損が大きくなる傾向がみられ、１５％より大きくなるにつれ水性ゲルの膨潤度が低くなり疎水性有機化合物の捕捉能が低下する傾向がみられる。特に、１％より低くなるか３０％より大きくなると、これらの傾向が著しくなるためいずれも好ましくない。
【００１１】
また、橋かけ重合体は、疎水性高分子鎖が、親水性化合物及び親水性不飽和単量体の全量の１０〜７０重量％好ましくは２０〜５０重量％を占めるのが好ましい。所定量の疎水性ナノドメインを有し、橋かけ重合体における疎水性有機化合物との親和性と水性溶液との親和性とを両立させることができ、短時間に多量の疎水性有機化合物を捕捉できるからである。
疎水性高分子鎖が、親水性化合物及び親水性不飽和単量体の全量の２０重量％より少なくなるにつれ、疎水性有機化合物との親和性が乏しく疎水性有機化合物の捕捉効率が低下する傾向がみられ、５０重量％より多くなるにつれ、疎水性が強くなり橋かけ重合体の製造時に橋かけ重合体内に均一に分散し難くなる傾向がみられる。特に、１０重量％より少なくなるか７０重量％より多くなると、これらの傾向が著しくなるため、いずれも好ましくない。
【００１２】
また、橋かけ重合体は、疎水性高分子鎖が、親水性化合物の１０〜７０重量％好ましくは２０〜５０重量％を占めるのが好ましい。親水性化合物が水性溶液中でミセルを形成し、疎水性有機化合物を捕捉する所定量の疎水性ナノドメインを形成することができ、橋かけ重合体における疎水性有機化合物との親和性と水性溶液との親和性とを両立させることができ、短時間に多量の疎水性有機化合物を捕捉できるからである。
疎水性高分子鎖が占める割合が、親水性化合物の２０重量％より少なくなるにつれ疎水性高分子鎖の量が少なくミセル形成能が低下し疎水性有機化合物の捕捉能が低下する傾向がみられ、５０重量％より多くなるにつれ疎水性が強くなり橋かけ重合体の製造時に橋かけ重合体内に均一に分散し難くなる傾向がみられる。特に、１０重量％より少なくなるか７０重量％より多くなると、これらの傾向が著しくなるので、いずれも好ましくない。
【００１３】
また、橋かけ重合体は、疎水性高分子鎖が末端に結合した臨界ミセル濃度以上の親水性化合物を水溶液中で会合させミセルを形成するミセル形成工程と、前記ミセル形成工程でミセルが形成された前記水溶液に所定量の親水性不飽和単量体を加え橋かけ重合体を形成する重合反応工程と、を経て製造することができる。
以上のようにして製造することで、ミセル形成工程において臨界ミセル濃度以上の親水性化合物を水溶液中で会合させ形成されたミセルを、重合反応工程において橋かけ重合体の三次元網目構造内に保持させることができるので、ミセルが形成する疎水性ナノドメインを橋かけ重合体内に分散させ保持させることができ、疎水性有機化合物の捕捉効率に優れた橋かけ重合体を製造できる。
【００１４】
ここで、ミセル形成工程において用いられる水溶液は、イオン交換水等の水を反応媒体とするものが用いられる。ミセルを形成することができるのであれば、水とアルコール等の混合媒体も用いることができる。
【００１５】
重合反応工程において、橋かけ重合体は公知の方法、例えばラジカル重合法、レドックス重合法、リビングラジカル重合法、放射線又は電子線を照射する方法、光増感剤の存在下に光照射する方法等を用いることができる。なかでも、ラジカル重合法が好適に用いられる。他の単量体との共重合に対して汎用性が極めて高いためである。
【００１６】
重合反応工程で用いる架橋剤としては、２官能以上で水溶性不飽和単量体と親水性化合物とを共重合可能な水溶性化合物、例えば、Ｎ，Ｎ´−メチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ´−メチレンビスメタクリルアミド等のビスアクリルアミド類；エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等の長鎖ジアクリレート類；ジビニルベンゼン等が好適に用いられる。これらは、単独で若しくは２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００１７】
ラジカル重合法における開始剤としては、水溶性のものであれば特に制限されず用いることができる。例えば、過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム、過酸化水素、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロパーオキサイド等；亜硫酸塩，亜硫酸水素塩，硝酸第二セリウムアンモニウム等のレドックス系開始剤；２，２´−アゾビス−２−アミジノプロパン塩酸塩、２，２´−アゾビス−２，４−ジメチルバレロニトリル、４，４´−アゾビス−４−シアノバレリン酸やその塩等のアゾ化合物等を用いることができる。これらの開始剤は、単独で若しくは２種以上を組み合わせて用いることができる。
開始剤は、親水性化合物と親水性不飽和単量体の合計量に対して０．０１〜１０重量％好ましくは０．０１〜８重量％の範囲で用いられる。開始剤の量が０．０１重量％より少なくなると重合効率が極めて低下し生産性に欠けるため好ましくない。８重量％より多くなるにつれ生成される橋かけ重合体の分子量が小さくなり疎水性有機化合物捕集材としての強度が維持できなくなる傾向がみられ、特に１０重量％より多くなると、この傾向が著しくなるため好ましくない。
【００１８】
充填剤は、橋かけ重合体をボールミル，万能ミル等の粉砕機で粉砕し微粒子を製造することによって得られる。また、重合反応工程において、水溶液をホモミキサー，プロペラ撹拌機等を用いて撹拌したり乳化重合させたりして微粒子を製造することによっても得られる。
充填剤としては、直径１μｍ〜１ｍｍのものが好適に用いられる。充填剤の粒子径が１μｍより小さくなると充填したカラムから流出し易くなり、また流出を防ぐためカラム内に開口径の小さなフィルタ等を配設すると溶離剤が通過するときに大きな損失が生じるため好ましくない。充填剤の粒子径が１ｍｍより大きくなると、表面積が小さくなり疎水性有機化合物の捕捉能が低下するため好ましくない。なお、充填剤の形状は球状だけでなく、種々の形状をしたものを用いることができる。
【００１９】
カラムの材質や大きさ等としては、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で用いられるものと同様のものを用いることができる。例えば、内径が１〜２０ｍｍのものが好ましく、特に１〜５ｍｍのものが好適に用いられる。また、長さは５〜４０ｃｍのものが好ましく、特に１０〜２０ｃｍのものが好適に用いられる。材質としては、ステンレス製，合成樹脂製等のものを特に限定されることなく用いることができる。
【００２０】
水性溶液としては、水、水とアルコールとの混合溶液等が用いられる。なお、水性溶液は無機塩等を含有していてもよい。このような水性溶液としては、水道水、浄水、河川水、湖沼水、地下水、雨水、排水、汽水、海水等が用いられる。
水性溶液として水とアルコールとの混合溶液が用いられる場合は、アルコール濃度が４０容量％以下の水性溶液が用いられる。アルコール濃度が４０容量％より大きくなるにつれ、疎水性ナノドメインを形成する親水性化合物の会合が阻害され橋かけ重合体内に疎水性ナノドメインを維持できなくなるからである。
【００２１】
分析可能な疎水性有機化合物としては、フェノール，ニトロフェノール，アルキル化フェノール，ビスフェノールＡ等のフェノール及びフェノール誘導体、ベンゼン，トルエン，キシレン等の芳香族炭化水素化合物、カルボン酸等の有機酸、ケトン，アルデヒド，エステル，有機アミン，芳香族アミン，アセトニトリル，ベンゾニトリル等のニトリル化合物、クロロホルム，ジクロロエタン，エストラジオール−１７−グルクロリド，エストラジオール−３−グルクロリド等の内分泌撹乱物質等を挙げることができる。
【００２２】
溶離剤としては、溶離剤に対する疎水性有機化合物の溶解度が水性溶液に対する溶解度よりも大きいものが用いられる。疎水性有機化合物の水性溶液と溶離剤への溶解度の順列を利用して分離できるからである。このような溶離剤は、カラムクロマトグラフィーで通常用いられる溶媒やそれらの混合物の中から選択することができ、例えば、メタノール、エタノール、アセトン、テトラヒドロフラン等の水溶性の有機溶媒の１種若しくは複数種、これらの有機溶媒と水との混合物が用いられる。特に、エタノールが好適に用いられる。水との混和性が良好であるとともに疎水性有機化合物の溶解度が比較的高いからである。
【００２３】
カラムにおける溶離剤の流量としては、疎水性有機化合物が分離できるのであれば特に限定されないが、例えば０．５〜１０ｍＬ／分好ましくは１〜５ｍＬ／分が好適である。
また、カラムの温度は、疎水性有機化合物が分離できるのであれば特に限定されないが、例えば０〜５０℃好ましくは１５〜３０℃が好適である。
【００２４】
検出工程において疎水性有機化合物を検出する検出器としては、カラムクロマトグラフィーで通常用いられるものであれば特に限定はされないが、例えば、示差屈折率検出器、紫外線吸収検出器、蛍光検出器、フォトダイオードアレイ検出器等が用いられる。
【００２５】
本発明の請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の疎水性有機化合物の分析方法であって、前記溶離剤に対する前記疎水性有機化合物の溶解度が、前記水性溶液に対する溶解度よりも大きいという構成を有している。
この構成により、請求項１で得られる作用に加え、以下のような作用が得られる。
（１）溶離剤に対する疎水性有機化合物の溶解度が、水性溶液に対する溶解度よりも大きいので、疎水性有機化合物の水性溶液と溶離剤への溶解度の順列によって溶出体積が異なることを利用して疎水性有機化合物を分離し分析することができる。
【００２６】
本発明の請求項３に記載の発明は、請求項１又は２に記載の疎水性有機化合物の分析方法であって、前記疎水性有機化合物が、フェノール及びフェノール誘導体、芳香族炭化水素化合物、有機酸、ニトリル化合物、内分泌撹乱物質の内の１種若しくは複数種である構成を有している。
この構成により、請求項１又は２で得られる作用に加え、以下のような作用が得られる。
（１）疎水性有機化合物が、フェノール及びフェノール誘導体、芳香族炭化水素化合物、有機酸、ニトリル化合物、内分泌撹乱物質なので、環境中に存在する汚染物質の同定や、医薬や農薬等の新薬開発に有用な化学物質の同定を簡便・迅速に行うことができる。
【００２７】
本発明の請求項４に記載の液体クロマトグラフ用カラムは、疎水性高分子鎖が末端に結合した親水性化合物と、前記親水性化合物と架橋結合した親水性不飽和単量体と、を有する橋かけ重合体の微粒子が充填された構成を有している。
この構成により、以下の作用が得られる。
（１）親水性化合物と親水性不飽和単量体とが架橋結合した橋かけ重合体は三次元的な網目構造を有しており、網目構造内の親水性化合物の末端には疎水性高分子鎖が結合しているので、親水性化合物は水性溶液中で疎水性高分子鎖を内側に向けて配向することによってミセル構造を構成し、数ナノメートルの大きさの疎水性ナノドメインを形成する。水性溶液中に含まれる疎水性有機化合物は、疎水性ナノドメインと疎水性相互作用によって会合し迅速に捕捉される。一方、疎水性ナノドメインと疎水性有機化合物との会合は比較的弱いので、疎水性有機化合物と親和性の高い溶離剤を通ずることにより、捕捉された疎水性有機化合物は容易に溶出されるため、疎水性有機化合物の水性溶液と溶離剤への溶解度の順列によって溶出体積が異なることを利用して、疎水性有機化合物を明確に分離できテイリングが生じ難く分離能に優れる。
（２）親水性化合物と親水性不飽和単量体とが架橋結合した橋かけ重合体の微粒子が充填されているので、疎水性有機化合物との会合が比較的弱くテイリングを生じ難いので、溶離剤や分析条件等の選択の幅が広く、詳細な分析条件の事前検討を行わなくても再現性の良い分析結果が得られ易く操作性に著しく優れる。
【００２８】
ここで、疎水性高分子鎖、親水性化合物、親水性不飽和単量体、橋かけ重合体、微粒子としては、請求項１で説明したものと同様なので説明を省略する。
【発明の効果】
【００２９】
以上のように、本発明の疎水性有機化合物の分析方法及び液体クロマトグラフ用カラムによれば、以下のような有利な効果が得られる。
請求項１に記載の発明によれば、
（１）橋かけ重合体はミセル構造を構成し数ナノメートルの大きさの疎水場（疎水性ナノドメイン）を形成し、水性溶液中に含まれる疎水性有機化合物は、疎水性ナノドメインと疎水性相互作用によって弱く会合し迅速に捕捉される一方で、疎水性有機化合物と親和性の高い溶離剤をカラムに通ずることにより捕捉された疎水性有機化合物は容易に溶出されるので、疎水性有機化合物の水性溶液と溶離剤への溶解度の順列によって溶出体積が異なることを利用して、疎水性有機化合物を明確に分離できテイリングが生じ難く分離能に優れる疎水性有機化合物の分析方法を提供できる。
（２）疎水性有機化合物のシャープなピークを検出することができるので、疎水性有機化合物に固有な複数のピークの各々のリテンションタイムを求め、既知の疎水性有機化合物のピークのリテンションタイムと照合することにより、疎水性有機化合物の定性分析が可能な疎水性有機化合物の分析方法を提供できる。
（３）疎水性有機化合物のシャープなピークを検出することができるので、濃度が既知の疎水性有機化合物のピークのリテンションタイムを予め測定し、濃度とピーク高さ又はピーク面積の関係を求めて検量線を作成し、同一の条件で未知の水性溶液を分析したときのピーク高さ又はピーク面積から、検量線によって水性溶液に含まれる疎水性有機化合物のおよその定量分析も可能な疎水性有機化合物の分析方法を提供できる。
（４）親水性化合物と親水性不飽和単量体とが架橋結合した橋かけ重合体の微粒子が充填されたカラムを用いているので、疎水性有機化合物との会合が比較的弱くテイリングを生じ難いので、溶離剤や分析条件等の選択の幅が広く、詳細な分析条件の事前検討を行わなくても再現性の良い分析結果が得られ易く操作性に著しく優れた疎水性有機化合物の分析方法を提供できる。
【００３０】
請求項２に記載の発明によれば、請求項１の効果に加え、
（１）溶離剤に対する疎水性有機化合物の溶解度が、水性溶液に対する溶解度よりも大きいので、疎水性有機化合物の水性溶液と溶離剤への溶解度の順列によって溶出体積が異なることを利用して疎水性有機化合物を分離し分析することができる疎水性有機化合物の分析方法を提供できる。
【００３１】
請求項３に記載の発明によれば、請求項１又は２の効果に加え、
（１）疎水性有機化合物が、フェノール及びフェノール誘導体、芳香族炭化水素化合物、有機酸、ニトリル化合物、内分泌撹乱物質なので、環境中に存在する汚染物質の同定や、医薬や農薬等の新薬開発に有用な化学物質の同定が簡便・迅速にできる疎水性有機化合物の分析方法を提供できる。
【００３２】
請求項４に記載の発明によれば、
（１）疎水性有機化合物は疎水性ナノドメインと疎水性相互作用によって会合し迅速に捕捉されるとともに、疎水性ナノドメインと疎水性有機化合物との会合は比較的弱いので、溶離剤によって捕捉された疎水性有機化合物が容易に溶出され、溶解度の違いを利用して疎水性有機化合物を分離できテイリングが生じ難く分離能に優れた液体クロマトグラフ用カラムを提供できる。
（２）親水性化合物と親水性不飽和単量体とが架橋結合した橋かけ重合体の微粒子が充填されているので、疎水性有機化合物との会合が比較的弱くテイリングを生じ難いので、溶離剤や分析条件等の選択の幅が広く、詳細な分析条件の事前検討を行わなくても再現性の良い分析結果が得られ易く操作性に著しく優れた液体クロマトグラフ用カラムを提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
以下、本発明を実施するための最良の形態を、図面を参照しながら説明する。
（実施の形態１）
図１は本発明の実施の形態１における液体クロマトグラフ用カラムを用いた疎水性有機化合物の分析装置の構成図である。
図中、１は疎水性有機化合物の分析装置、２は容器、３は容器２に収容されたエタノール，テトラヒドロフラン等の水溶性の有機溶媒や有機溶媒と水との混合溶媒である溶離剤、４は一端が溶離剤３に浸漬された液体流路、５は液体流路４に配設され溶離剤３を液体流路４から後述する液体クロマトグラフ用カラム７へと送るポンプ、６はポンプ５の下流の液体流路４に配設された試料注入部、７は一端が液体流路６の他端に接続された液体クロマトグラフ用カラムである。液体クロマトグラフ用カラム７は、ステアリル基等の疎水性高分子鎖が末端に結合した親水性化合物と架橋結合したアクリルアミド等の親水性不飽和単量体を有する橋かけ重合体の微粒子が充填剤として充填されている。８は液体クロマトグラフ用カラム７を収容したカラム恒温槽、９は一端が液体クロマトグラフ用カラム７の他端に接続された液体流路、１０は液体流路９に配設された示差屈折率検出器，紫外線吸収検出器，蛍光検出器，フォトダイオードアレイ検出器等の検出器である。
【００３４】
以上のように構成された分析装置１を用いて、以下、疎水性有機化合物の分析方法について説明する。
カラム恒温槽８内を所定の温度に保持して液体クロマトグラフ用カラム７を所定の温度に保持した後、試料となる疎水性有機化合物が含まれる水性溶液を試料注入部６から注入する。ポンプ５を駆動させ溶離剤３を液体流路４に送り、溶離剤３によって試料注入部６から注入した試料（水性溶液）を液体クロマトグラフ用カラム７に通ずる。液体クロマトグラフ用カラム７にはミセル構造を構成し疎水場（疎水性ナノドメイン）を形成した橋かけ重合体の充填剤が充填されているので、水性溶液中に含まれる疎水性有機化合物は、疎水性ナノドメインと疎水性相互作用によって会合し迅速に捕捉されるが、疎水性ナノドメインと疎水性有機化合物との会合は比較的弱いので、疎水性有機化合物と親和性の高い溶離剤３に容易に溶出される。疎水性有機化合物の水性溶液と溶離剤３への溶解度の順列によって溶出体積が異なるので、液体クロマトグラフ用カラム７で疎水性有機化合物が分離される（以上、分離工程）。次に、検出工程において、分離された疎水性有機化合物を検出器１０で検出することによって疎水性有機化合物を分析できる。
【００３５】
以上のような疎水性有機化合物の分析方法によれば、以下のような作用が得られる。
（１）ミセル構造を構成し疎水場（疎水性ナノドメイン）を形成した橋かけ重合体の充填剤が充填された液体クロマトグラフ用カラム７に、疎水性有機化合物が含まれる水性溶液を解離剤３によって通ずるので、水性溶液中に含まれる疎水性有機化合物は、疎水性ナノドメインと疎水性相互作用によって会合し迅速に捕捉される一方で、疎水性ナノドメインと疎水性有機化合物との会合は比較的弱いので溶離剤３によって捕捉された疎水性有機化合物が容易に溶出されるため、疎水性有機化合物の水性溶液と溶離剤への溶解度の順列によって溶出体積が異なることを利用して、疎水性有機化合物を明確に分離できテイリングが生じ難く、疎水性有機化合物のシャープなピークを検出器１０で検出することができる。
（２）疎水性有機化合物のシャープなピークを検出することができるので、疎水性有機化合物に固有な複数のピークの各々のリテンションタイムを求め、既知の疎水性有機化合物のピークのリテンションタイムと照合することにより、疎水性有機化合物の定性分析を行うことができる。
（３）疎水性有機化合物のシャープなピークを検出することができるので、濃度が既知の疎水性有機化合物のピークのリテンションタイムを予め測定し、濃度とピーク高さ又はピーク面積の関係を求めて検量線を作成し、同一の条件で未知の水性溶液を分析したときのピーク高さ又はピーク面積から、検量線によって水性溶液に含まれる疎水性有機化合物のおよその定量分析も行うことができる。
（４）ミセル構造を構成し疎水場（疎水性ナノドメイン）を形成した橋かけ重合体の充填剤が充填された液体クロマトグラフ用カラム７は、疎水性有機化合物との会合が比較的弱くテイリングを生じ難いので、溶離剤や分析条件等の選択の幅が広く、詳細な分析条件の事前検討を行わなくても再現性の良い分析結果が得られ易く操作性に著しく優れる。
【００３６】
また、以上のような本発明の実施の形態１における液体クロマトグラフ用カラム７によれば、以下のような作用が得られる。
（１）ミセル構造を構成し疎水場（疎水性ナノドメイン）を形成した橋かけ重合体の充填剤が充填されているので、疎水性有機化合物が含まれる水性溶液を解離剤３によって通ずることで、疎水性有機化合物が疎水性ナノドメインと疎水性相互作用によって弱く会合し捕捉される一方で、疎水性有機化合物と親和性の高い溶離剤３に容易に溶出されるため、疎水性有機化合物の水性溶液と溶離剤への溶解度の順列によって溶出体積が異なることを利用して、疎水性有機化合物を明確に分離できテイリングが生じ難く分離能に優れる。
（２）親水性化合物と親水性不飽和単量体とが架橋結合した橋かけ重合体の微粒子が充填されているので、疎水性有機化合物との会合が比較的弱くテイリングを生じ難いので、溶離剤や分析条件等の選択の幅が広く、詳細な分析条件の事前検討を行わなくても再現性の良い分析結果が得られ易く操作性に著しく優れる。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
撹拌装置付きのガラス容器に入れた溶媒としてのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに、疎水化されていない末端がヒドロキシル化された数平均分子量２０００のポリエチレングリコールモノステアレート（東京化成社製）、アクリル酸クロリド（東京化成社製）、及び４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンを１：１．０２：１のモル比で加え、室温下、乾燥窒素気流中で２４時間撹拌し、ポリエチレングリコールモノステアレートの末端がアクリレート化した親水性化合物（ポリエチレングリコールモノステアレート。以下、Ｍ１と表記する。）を得た。高分解能核磁気共鳴（ＪＥＯＬ社製ＪＮＭ−ＥＣＰ５００）を用いて分析することにより、得られた親水性化合物（Ｍ１）の末端がアクリレート化していることを確認した。
製造された親水性化合物（Ｍ１）の臨界ミセル濃度以上となる１ｍｏｌを水に溶解し、ミセルを形成した（ミセル形成工程）。
次に、この水溶液に親水性不飽和単量体としてアクリルアミド（以下、ＡＡＭと表記する）１ｍｏｌ、架橋剤としてメチレンビスアクリルアミド（以下、ＭＢＡと表記する）０．１ｍｏｌ、開始剤として過硫酸カリウム（以下、ＫＰＳと表記する）０．０１ｍｏｌ、触媒としてテトラメチルエチレンジアミン（以下、ＴＭＥＤＡと表記する）０．０１ｍｏｌを加え、反応温度４０℃で重合させ、三次元網目状の橋かけ重合体を形成した（重合反応工程）。橋かけ重合体には親水性化合物（Ｍ１）で水溶液中に形成したミセル構造がそのまま保持されており、橋かけ重合体を水で膨潤させたゲル中にもミセル構造が保持されていることを、小角Ｘ線散乱法によって確認した。また、赤外線吸収スペクトル法によって測定した架橋度は１０％であった。
以上のようにして製造された橋かけ重合体を万能ミルによって粉砕した後、篩を使って粒子径２０〜１００μｍに分級して、実施例１の充填剤を得た。
得られた充填剤をイオン交換水でスラリー状にして長さ１０ｃｍ、内径５ｍｍのステンレス製のカラムに充填することによって、実施例１の液体クロマトグラフ用カラムを得た。
【００３８】
（比較例１）
液体クロマトグラフィーで一般に用いられているシリカゲル（Ｗａｋｏｇｅｌ、Ｃ−３００Ｅ、和光純薬製）を充填剤として、実施例１と同一形状のカラムに充填することによって、比較例１の液体クロマトグラフ用カラムを得た。
【００３９】
（試料の定性分析）
実施例１、比較例１の液体クロマトグラフ用カラムを、実施の形態１で説明した分析装置１に各々装着し、以下の条件で試料の分析を行った。なお、検出器として紫外線吸収検出器（波長２８０ｎｍ）を用いた。
溶離剤：エタノール、カラム恒温槽の温度：２５℃、溶離剤の流量：１ｍＬ／分、試料注入量：１００μＬ。
試料：ビスフェノールＡ（以下、ＢＰＡと表記する）１ｐｐｍ、ビフェノール（以下、ＢＰと表記する）１ｐｐｍ、ドデシルフェノール（以下、ＤＰと表記する）１ｐｐｍ、１，２，４−トリクロロベンゼン（以下、ＴＣＢと表記する）１ｐｐｍをイオン交換水に溶解した水溶液。
分析結果を図２に示す。図２は実施例１及び比較例１の液体クロマトグラフ用カラムを用いて上記の試料を溶出分析した溶出曲線であり、横軸は溶出時間（リテンションタイム）（分）を示し、縦軸は紫外線吸収ピーク高さを示している。
図２から、比較例１ではテイリングを生じ、検出されたピークがブロードで４種類の疎水性有機化合物が明瞭に分離されていないことがわかる。これに対し、実施例１では、４つの明瞭なシャープなピークを確認することができた。
既知のドデシルフェノール（ＤＰ）、ビスフェノールＡ（ＢＰＡ）、ビフェノール（ＢＰ）、１，２，４−トリクロロベンゼン（ＴＣＢ）のピークのリテンションタイムを予め求めておき、この既知のデータと照合することにより定性分析を行うことができる。照合の結果、４つのピークは、左から順に、ドデシルフェノール（ＤＰ）、ビスフェノールＡ（ＢＰＡ）、ビフェノール（ＢＰ）、１，２，４−トリクロロベンゼン（ＴＣＢ）であることがわかった。
【００４０】
（疎水性有機化合物の定量分析）
実施例１の液体クロマトグラフ用カラムを装着した分析装置を用い、上記と同一の条件で、２ｐｐｍビスフェノールＡ（ＢＰＡ）水溶液、５ｐｐｍビスフェノールＡ（ＢＰＡ）水溶液、８ｐｐｍビスフェノールＡ（ＢＰＡ）水溶液、１０ｐｐｍビスフェノールＡ（ＢＰＡ）水溶液を試料として各々溶出分析して、検出器で検出されるピーク高さを求めた。疎水性有機化合物の濃度に対するピーク高さ（又はピーク面積）をプロットすることにより、疎水性有機化合物の検量線を求めることができる。
図３は以上のようにして求めたビスフェノールＡ（ＢＰＡ）の検量線であり、横軸は濃度を示し、縦軸はピーク高さを示している。
図３に示すように、ピーク高さはＢＰＡの濃度に対して直線的に増加しているので、ピーク高さを測定することによって試料に含まれる疎水性有機化合物の濃度を求めることができることがわかった。また、複数の疎水性有機化合物が含まれる水性溶液（試料）の溶出分析によって、図２に示すように、各々の疎水性有機化合物についてシャープなピークを検出できることから、疎水性有機化合物のピークのリテンションタイム及び各々の疎水性有機化合物の検量線を予め求めておけば、水性溶液（試料）の１回の溶出分析で、疎水性有機化合物の定性分析及びおよその定量分析が一度にできることが明らかになった。
以上のように本実施例によれば、水中に極微量に溶存する複数の疎水性有機化合物を極めて簡単な方法でシャープに分離できることが明らかになった。また、１回の溶出分析の結果から、疎水性有機化合物の定性分析及びおよその定量分析を行うことができ、簡便で極めて操作性に優れることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明は、水性溶液中の内分泌撹乱物質等の疎水性有機化合物を分析する疎水性有機化合物の分析方法及び液体クロマトグラフ用カラムに関し、疎水性有機化合物の水性溶液と溶離剤への溶解度の順列によって溶出体積が異なることを利用して、疎水性有機化合物を明確に分離できテイリングが生じ難く分離能に優れ、疎水性有機化合物の定性分析やおよその定量分析も可能で、さらに詳細な分析条件の事前検討を行わなくても再現性の良い分析結果が得られ易く操作性に著しく優れる疎水性有機化合物の分析方法を提供でき、また溶離剤を通ずることによって捕捉された疎水性有機化合物が容易に溶出され、溶解度の違いを利用して疎水性有機化合物を分離できテイリングが生じ難く分離能に優れるとともに、溶離剤や分析条件等の選択の幅が広く、詳細な分析条件の事前検討を行わなくても再現性の良い分析結果が得られ易く操作性に著しく優れる液体クロマトグラフ用カラムを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】実施の形態１における液体クロマトグラフ用カラムを用いた疎水性有機化合物の分析装置の構成図
【図２】実施例１及び比較例１の液体クロマトグラフ用カラムを用いて溶出分析した溶出曲線
【図３】ビスフェノールＡ（ＢＰＡ）の検量線
【符号の説明】
【００４３】
１  分析装置
２  容器
３  溶離剤
４，９  液体流路
５  ポンプ
６  試料注入部
７  液体クロマトグラフ用カラム
８  カラム恒温槽
１０  検出器
【図１】
2007271310.tif 000003
【図２】
2007271310.tif 000004
【図３】
2007271310.tif 000005