(57)【要約】【課題】標識（磁気粒子）付き試薬（特定成分と特異的に結合する試薬）が保持された多孔体に液状試料を吸収させ、この液状試料を標識付き試薬とともに、前記試薬が固定された反応部に移動させる分析装置において、特定成分の検出感度および検出精度を向上させる。【解決手段】ポリカーボネート製の底板６に、第１多孔体１、第２多孔体２、反応部３、吸収体４を配置する。反応部３は、底板６の内面に、特定成分と特異的に結合する試薬を直接固定することで形成する。第２多孔体２に、特定成分と特異的に結合する試薬が固定された磁気粒子からなる標識付き試薬とともに、タンパク質と、糖と、水溶液中で緩衝作用を持つ塩を保持させる。これにより、第２多孔体２から反応部３に移動する液体の粘度が高くなって、反応部３を移動する速度が低くなる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定成分と特異的に結合する試薬が固定された磁気粒子からなる標識付き試薬が保持され、液状試料を吸収させて、吸収された液状試料とともに前記標識付き試薬を下流側に移動させる多孔体であって、
前記標識付き試薬とともに、タンパク質と、糖と、水溶液中で緩衝作用を持つ塩と、が保持されている多孔体。
【請求項２】
タンパク質として牛血清およびアルカリ処理カゼインが保持され、糖としてスクロースまたはトレハロースが保持されている請求項１記載の多孔体。
【請求項３】
前記標識付き試薬は、アビジン化された磁気粒子の表面に、ビオチン化ポリアルキレングリコールを介して、特定成分と特異的に結合する試薬が固定されたものである請求項１記載の多孔体。
【請求項４】
１〜２０質量％の牛血清および０．１〜５質量％のアルカリ処理カゼインと、０．１〜６質量％のスクロースまたはトレハロースが保持されている請求項２記載の多孔体。
【請求項５】
前記特定成分が抗原であり、前記試薬が前記抗原に対する抗体である請求項１記載の多孔体。
【請求項６】
特定成分と特異的に結合する試薬が固定された磁気粒子からなる標識付き試薬が保持された多孔体が、液体を浸透しない材料からなる基材上に固定され、
この基材上の前記多孔体の下流側に、前記特定成分と特異的に結合する試薬が固定された反応部が形成され、
液状試料を前記多孔体に吸収させた後に前記反応部に移動させ、前記反応部の状態を磁気検出装置で検出することにより、前記液状試料中の特定成分を分析する分析装置において、
前記多孔体が、請求項１〜５のいずれか一つに記載の多孔体であることを特徴とする分析装置。
【請求項７】
特定成分と特異的に結合する試薬が固定された磁気粒子からなる標識付き試薬を多孔体に保持させ、
この多孔体の下流側で、液体を浸透しない材料からなる基材上に、前記特定成分と特異的に結合する試薬が固定された反応部を設け、
前記多孔体に液状試料を吸収させて前記反応部まで移動させ、前記反応部の状態を磁気検出装置で検出することにより、前記液状試料中の特定成分を分析する分析方法であって、
前記多孔体として、請求項１〜５のいずれか一つに記載の多孔体を用いることを特徴とする分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、特定の分析装置に固定されて使用される多孔体、すなわち、特定成分と特異的に結合する試薬が固定された磁気粒子からなる標識付き試薬が保持され、液状試料を吸収させて、吸収された液状試料とともに前記標識付き試薬を下流側に移動させる多孔体に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査、環境分析、食品分析等に好適に用いられる生化学分析装置の一例として、下記の特許文献１には、検体（分析対象の特定成分）に対して特異的に結合する試薬が、標識が付いた状態で、多孔質キャリヤ（多孔体）の第一区域に存在し、第一区域から空間的に区別される検出区域（反応部）に、検体に対して特異的に結合する試薬が標識無しで固定され、適用された液状試料が標識付き試薬を吸収した後に検出区域に浸透するように構成され、標識付き試薬が検出区域に結合された程度を観察できる手段を含む分析装置が記載されている。この分析装置において、多孔質キャリヤは、不透湿性固体材料からなる中空ケーシング（箱体）内に収容されている。
【０００３】
また、下記の特許文献２には、生化学分析装置の一例として、標識として磁性微粒子（磁気粒子）を用い、磁性微粒子の凝集を磁気センサで測定することにより分析を行う装置が記載されている。
また、下記の特許文献３には、生化学分析装置の一例として、液状試料を毛細管現象により移動させて反応媒体と接触させるために、液体が浸透しない材料からなる溝状の流路を設けることが記載されている。
【０００４】
また、下記の特許文献４には、マクロ細孔体に保持した標識付き試薬の開放（マクロ細孔体から出ること）を促進し、抗体のような脆弱な特異的結合試薬の安定性を向上させる目的で、マクロ細孔体に含浸させる溶液に、標識付き試薬とともに界面活性剤および／または釉薬材料（スクロース等）を含ませることが記載されている。この溶液を含浸させた後に乾燥することで、マクロ細孔体に標識付き試薬を保持させている。この文献に記載された分析装置は、マクロ細孔体にクロマトグラフストリップ等の乾燥した多孔体担体の一端を接触させて配置し、この多孔体担体に、標識されてない試薬を固定して検出区域（反応部）としている。
【０００５】
また、下記の特許文献５には、コロイド粒子を標識として用いたクロマトグラフによる生化学分析装置において、コロイド粒子標識物質（特定成分と特異的に結合する試薬がコロイド粒子で標識化されている物質）のクロマトグラフ溶媒移動特性を改良する目的で、カゼインのような準可溶性タンパク質を添加した溶液を含浸させて乾燥することにより、コロイド粒子標識物質をクロマトグラフ基体に保持させることが記載されている。
【０００６】
【特許文献１】特公平７−４６１０７号公報
【特許文献２】特開昭６３−３０２３６７号公報
【特許文献３】特開２００４−１２５５４５号公報
【特許文献４】特表平３−５０４１６６号公報
【特許文献５】特公平７−６０１５９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
磁気粒子を標識として用い、特定成分と特異的に結合する試薬を固定した磁気粒子からなる標識付き試薬を多孔体に保持して、この多孔体に液状試料を吸収させ、前記標識付き試薬とともに前記反応部に移動させる分析装置として、前記反応部が液体を浸透しない材料からなる基材面に形成され、前記反応部の状態を磁気センサで検出する分析装置には、次のような問題点がある。
【０００８】
すなわち、蛍光体や酵素を標識とした場合に用いるラテックスやポリスチレンビーズと比較して、磁気粒子の粒径が大きく（１μｍ以上）比重も大きいために、運動性や拡散性が低く、多孔体に保持された磁気粒子が液状試料によって多孔体から流出し難い。また、磁気粒子と前記反応部との反応性が低い。これに伴って、この分析装置には、特定成分の検出感度および検出精度の向上という点で改善の余地がある。
本発明の課題は、上述の分析装置における特定成分の検出感度および検出精度を向上させることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明は、特定成分と特異的に結合する試薬が固定された磁気粒子からなる標識付き試薬が保持され、液状試料を吸収させて、吸収された液状試料とともに前記標識付き試薬を下流側に移動させる多孔体であって、前記標識付き試薬とともに、タンパク質と、糖と、水溶液中で緩衝作用を持つ塩と、が保持されている多孔体を提供する。
この多孔体は、前記標識付き試薬とともに、タンパク質と、糖と、水溶液中で緩衝作用を持つ塩と、が保持されているため、前記標識付き試薬だけが保持されている場合と比較して、液状試料が吸収された際に、液状試料とともに前記標識付き試薬がこの多孔体から外れ易くなる。
【００１０】
よって、この多孔体を、特定の分析装置（特定成分と特異的に結合する試薬が固定された磁気粒子からなる標識付き試薬が保持された多孔体が、液体を浸透しない材料からなる基材上に固定され、この基材上の前記多孔体の下流側に、前記特定成分と特異的に結合する試薬が固定された反応部が形成され、液状試料を前記多孔体に吸収させた後に前記反応部に移動させ、前記反応部の状態を磁気検出装置で検出することにより、前記液状試料中の特定成分を分析する分析装置）の多孔体として使用することにより、多孔体に保持された磁気粒子が液状試料によって多孔体からその下流側（例えば前記基材上の前記多孔体と反応部との間に形成された流路）に出易くなる。
【００１１】
また、前記標識付き試薬とともに、タンパク質と、糖と、前記塩とを含む液状試料が前記反応部に移動するため、前記標識付き試薬のみを含む液状試料が移動した場合と比較して、前記反応部に移動する前記液状試料の粘度が高くなって、前記液状試料が前記反応部を移動する速度が低くなることで、前記反応部と前記液状試料（標識付き試薬を含む）との反応性が向上する。
したがって、この多孔体を前記特定の分析装置の多孔体として使用することにより、この分析装置における特定成分の検出感度および検出精度を向上できる。
【００１２】
本発明の多孔体に保持させるタンパク質としては、牛血清およびアルカリ処理カゼイン（Ｃｌｉｎｉｃａ ＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ、１２３（１９８２）  １９３−１９８：以後アルカリ処理カゼインは本製法に従う。）が好ましく、糖としては、スクロースまたはトレハロースが好ましい。
前記標識付き試薬は、アビジン化された磁気粒子の表面に、ビオチン化ポリアルキレングリコールを介して、特定成分と特異的に結合する試薬が固定されたものであることが好ましい。
本発明の多孔体は、１〜２０質量％の牛血清および０．１〜５質量％のアルカリ処理カゼインと、０．１〜６質量％のスクロースまたはトレハロースが保持されていることが好ましい。
【００１３】
本発明の多孔体は、例えば、緩衝液に、所定濃度の牛血清およびアルカリ処理カゼインと、所定濃度のスクロースまたはトレハロースが添加されて得られた溶液に、前記標識付き試薬を添加して得られた溶液を、グラスファイバーからなる不織布に含浸させた後に乾燥させて得ることができる。
本発明の多孔体において、前記特定成分が抗原である場合には、前記試薬として前記抗原に対する抗体を使用する。
【００１４】
本発明はまた、特定成分と特異的に結合する試薬が固定された磁気粒子からなる標識付き試薬が保持された多孔体が、液体を浸透しない材料からなる基材上に固定され、この基材上の前記多孔体の下流側に、前記特定成分と特異的に結合する試薬が固定された反応部が形成され、液状試料を前記多孔体に吸収させた後に前記反応部に移動させ、前記反応部の状態を磁気検出装置で検出することにより、前記液状試料中の特定成分を分析する分析装置において、前記多孔体が、本発明の多孔体であることを特徴とする分析装置を提供する。
【００１５】
この分析装置において、分析対象の特定成分が抗原である場合には、前記多孔体に標識付き抗体（標識された二次抗体）を溶出可能なように保持させ、反応部に抗体（一次抗体）を固定しておく。そして、液状試料に抗原が含まれていると、この抗原が第２多孔体で、標識された二次抗体と特異的に結合して複合体となって溶出して反応部に移動する。次いで、反応部で、この複合体の抗原と一次抗体が特異的に結合するため、一次抗体、抗原、標識された二次抗体がサンドイッチ状となり、反応部に標識が固定される。
【００１６】
本発明で使用するタンパク質としては、ウシ血清アルブミン、アルカリ処理カゼイン、ゼラチン、ウシ血清、ウサギ血清、ラット血清などのタンパク質があげられるが、特にウシ血清、アルカリ処理カゼインを用いることが好適である。この場合、ウシ血清の濃度は１質量％〜２０質量％の範囲で使用することが好ましいが、５質量％〜１５質量％の濃度範囲で使用するのが特に好ましい。また、アルカリ処理カゼインの濃度は、０．１質量％〜５質量％の範囲で使用することが好ましいが、１質量％〜３質量％の濃度範囲で使用することが特に好ましい。
【００１７】
本発明で使用する糖としては、デキストラン、スクロース、トレハロース、セロビオース、ラクトースなど多糖類、或いは二糖類があげられるが、特にスクロース、トレハロースを用いることが好ましい。この場合、糖類の濃度範囲は、０．１質量％〜６質量％で使用することが好ましいが、０．５質量％〜４質量％で使用することが特に好ましい。
本発明で使用する「水溶液中で緩衝作用を持つ塩」としては、該当するｐＨ範囲に緩衝作用を持つものが使用でき、一般的な燐酸緩衝液、Ｇｏｏｄの緩衝液類が適用可能であり、特にＧｏｏｄの緩衝液であるＭＥＳ（2-Morpholino ethane sulfonic acid ）、ＭＯＰＳＯ（3-｛N-Morpholino｝-2-hydroxy-propane sulfonic acid）が好ましい。
【００１８】
ポリアルキレングリコールは、磁気粒子（以下「磁気ビーズ」とも称する。）と、これに結合する「特定成分と特異的に結合する試薬」との間で、直鎖状の親水性スペーサーとして機能する。本発明において、この用途で使用するポリアルキレングリコール化合物としては、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど種々の該当する化合物が挙げられるが、特にポリエチレングリコール（以下「ＰＥＧ」と略称する。）を使用することが好ましい。
【００１９】
ポリアルキレングリコールを介して二次抗体（特定成分と特異的に結合する試薬）に磁気ビーズを結合させることにより、二次抗体が反応液中でより自由に稼動可能となり、二次抗体としての反応性が増大し、結果的に大径、高比重の磁気ビーズで標識された二次抗体の免疫反応速度を飛躍的に向上することができる。
ＰＥＧと磁気ビーズ間の結合には、磁気ビーズ表面のＣＯＯＨ基やＮＨ2基を利用した共有結合法が利用されうるが、さらに好適にはビオチン化されたＰＥＧとアビジン化磁気ビーズを用いてアビジン／ビオチン結合により磁気ビーズを二次抗体に標識するのが望ましい。
【００２０】
さらに、非特異吸着の少ないＰＥＧを介して磁気ビーズと二次抗体を結合することにより、磁気ビーズの基材や一次抗体への非特異吸着特性を抑制することが可能であり、抗体の反応性向上とあわせて磁気標識化二次抗体反応の免疫反応Ｓ／Ｎ向上に寄与する。
本発明で使用されるＰＥＧ化合物の分子量は種々の範囲のものが使用可能であるが、比較的分子量の小さいＭＷ３０００前後のＰＥＧ化合物でも充分に磁気ビーズ標識化二次抗体の反応性向上の効果を発揮することが可能である。
【００２１】
本発明で用いる磁気ビーズとしては、少なくとも外部から磁界を作用させている間は磁化する粒子であれば良い。この磁気ビーズとしては、磁性体を単独で粒子状に成形した粒子、磁性体を核としてその表面をポリスチレン、シリカゲル、ゼラチン、若しくはポリアクリルアミドなどの高分子物質で被覆した粒子、ポリスチレン、シリカゲル、ゼラチン、若しくはアクリルアミドなどの高分子物質の粒子を核として、磁性体を被覆した粒子、赤血球、リポソーム若しくはマイクロカプセルなどの閉じた袋状の物質に磁性体を封入した粒子等を挙げることができる。
【００２２】
尚、前記の磁性体としては、例えば、鉄、コバルト、ニッケル等の強磁性金属やそれらを含む合金、非磁性体中に前記強磁性金属やそれらを含む合金を含有するもの、前記強磁性金属中若しくは前記強磁性金属を含む合金中に非磁性体を含有するもの等を挙げることができる。
本発明の分析装置を構成する磁気検出装置としては、市販の装置、例えば、ホール素子、半導体ＭＲ素子（ＳＭＲ素子）、ＧＭＲ (Giant magnetoresistance)素子等を備えたものを使用することができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の多孔体によれば、特定成分と特異的に結合する試薬が固定された磁気粒子からなる標識付き試薬だけが保持されている多孔体と比較して、吸収された液状試料とともに前記標識付き試薬を下流側に移動させ易くなる。
本発明の分析装置によれば、本発明の多孔体を備えていることにより、多孔体から反応部に移動する液状試料（標識付き試薬を含む）の粘度が高くなって、反応部を移動する速度が低くなるため、特定成分の検出感度および検出精度を向上できる。
【００２４】
本発明の分析装置において、分析対象の特定成分が抗原である場合には、前記多孔体に標識付き抗体（標識された二次抗体）を溶出可能なように保持させ、反応部に抗体（一次抗体）を固定しておくが、このように構成した本発明の分析装置によれば、迅速で、簡便で、高感度な免疫学的検査が行える。よって、本発明の分析装置は、医療診断や健康診断のために行われる臨床検査用の装置として好適に使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
図１〜５を用いて、本発明の実施形態に相当する分析装置を説明する。
図１は、この分析装置を構成する本体を示す縦断面図である。図２は、この本体を構成する箱体の、組立前の状態を示す斜視図である。図３は、第１多孔体１、第２多孔体２、反応部３、および吸収体４の、箱体内での配置を示す斜視図である。図４は、この分析装置を構成する磁気検出装置を示す概略構成図である。図５は、図４の磁気検出装置による信号処理を説明するための模式図である。
【００２６】
〔本体について〕
図１および２に示すように、この箱体は、ポリカーボネート（液体を浸透しない性質の材料）製の底板６と、ポリスチレン（液体を浸透しない性質の材料）製の蓋部７とで構成されている。
底板６の内面には、周縁部の６カ所に、蓋部７との連結用のピン６７が固定されている。これらのピン６７を入れる筒状のピン受け７６が、蓋部７の内面に固定されている。蓋部７には、液状試料を入れるための試料導入口７１と、反応部３の上部に流路３１を形成する流路形成部７２が形成されている。これらの底板６および蓋部７は、汎用の射出成形機を用い、通常の条件で成形することができる。
【００２７】
図２および３に示すように、底板６の内面に、第１多孔体１、第２多孔体２、反応部３、および吸収体４が配置されている。
底板６の内面は、反応部３を形成する部分３０が、第１多孔体１を固定する部分１０、第２多孔体２を固定する部分２０、および吸収体４を固定する部分４０よりも低く形成されている。符号５０は、底板６の内面で最も低い面を示す。また、第１多孔体１を固定する部分１０と第２多孔体２を固定する部分２０は同じ高さで、吸収体４を固定する部分４０は、これらの部分１０，２０よりも高くなっている。そのため、図２に示すように、底板６内面の吸収体４を固定する部分４０は、周縁部と同じ高さの面６Ａとして形成し、反応部３を形成する部分３０、第１多孔体１を固定する部分１０、および第２多孔体２を固定する部分２０は、この面６Ａに凹部１０Ａ，２０Ａ，３０Ａを設けることにより形成した。
【００２８】
底板６の内面の、第２多孔体２を固定する部分２０と反応部３を形成する部分３０の間は、斜面２３になっている。反応部３を形成する部分３０と吸収部４を固定する部分４０の間は、斜面３４になっている。これらの斜面２３，３４に、それぞれ複数の流路形成部材２３１，３４１を配置することで、溝状の流路２３２，３４２が形成される。流路形成部材２３１，３４１は、蓋部７の流路形成部７２の傾斜部に固定されている。また、第１多孔体１と第２多孔体２は接触状態で配置される。
【００２９】
第１多孔体１は、グラスファイバーの不織布を長方形に打ち抜くことで作製し、これを両面テープで底板６の凹部１０Ａに固定する。
第２多孔体２は、下記の方法で第２多孔体２ａ〜２ｇの７種類を作製し、それぞれを両面テープで底板６の凹部２０Ａに固定する。すなわち、この実施形態では、第２多孔体２が異なる７種類の本体を作製する。
反応部３は、下記の方法で、底板６の凹部３０Ａに形成する。吸収体４は、セルロースの不織布を長方形に打ち抜くことで作製し、これを両面テープで底板６の凹部３０Ａに隣接する面６Ａに固定する。
【００３０】
この状態の底板６の上に蓋部７を載せて、底板６のピン６７を蓋図７のピン受け７６に入れることにより、図１に示すように分析装置の本体１０１が得られる。そして、この実施形態の分析装置は、本体１０１の反応部３の状態を、図４に示す磁気検出装置を用いて図１の矢印Ｂ方向から検出することで、試料導入口７１から導入された液状試料の特定成分を分析する。
この実施形態の分析装置によれば、反応部３を底板６の内面の最も低い凹部３０Ａに形成することにより、図１に示すように、箱体の底板６の厚さを反応部３の位置で極めて薄くして、第１多孔体１、第２多孔体２、および吸収体４が固定されている部分の厚さを機械的強度が確保できる十分な厚さにすることができる。
【００３１】
そして、例えば、第１多孔体１および第２多孔体２を固定する部分の厚さを１．０ｍｍとし、反応部３を形成する部分の厚さを０．２ｍｍとし、吸収体４を固定する部分の厚さを１．５ｍｍとすることで、磁気センサによる検出感度および検出精度を良好にしながら、底板６の機械的強度を確保することができる。
また、蓋部７の流路形成部７２により、反応部３の上部に流路３１を形成することで、反応部３の汚染が防止される。
【００３２】
〔第２多孔体２の作製方法〕
Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ＣＯ2−ＮＨＳ（米国シェアーウオーター社製、ＭＷ３４００）を２．９ｍｇ計量して、２００μｌの蒸留水に溶解することにより、濃度が４．２６ｍＭである水溶液を調製した。この水溶液４９．２μｌと、欧州特許登録番号ＥＰ１１０４７７２号公報に開示されている抗マイコプラズマ抗体ＡＭＭＰ−１をＰＢＳに脱塩・ｂｕｆｆｅｒ交換したもの（抗体濃度６．９９ｍｇ／ｍｌ）１．５ｍｌを混合して、室温で４時間反応させた。これにより、前記抗体にＰＥＧ鎖を結合した。
【００３３】
上記反応液を、遠心型限外ろ過装置（アミコン社、分子量３万カット）を用いて回転速度７５００ｒｐｍ、１０分間の条件で濃縮し、得られた濃縮液にＰＢＳを３ｍｌ添加して、同限外ろ過装置で同様の条件で再び濃縮した。さらに、得られた濃縮液にＰＢＳを３ｍｌ添加して、同限外ろ過装置で同様の条件で濃縮する操作を２回繰り返した。これにより、未反応のＢｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ＣＯ2−ＮＨＳが除去された、精製ＰＥＧ−ｂｉｏｔｉｎ化抗体液を得た。
【００３４】
次に、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ノルウェー国Ｄｙｎａｌ社製の磁気ビーズ、直径１．０μｍ、超常磁性高分子ポリマービーズにストレプトアビジンを結合させたもの）を１％含有するＰＢＳ溶液を１００μｌ、エッペンドルフチューブに計量し、これに、得られた精製ＰＥＧ−ｂｉｏｔｉｎ化抗体液を４０μｌ添加した。さらに、ＰＢＳを４６０μｌ入れて、全液量を５００μｌとした後、室温で４時間攪拌しながら反応を行った。これにより、磁気ビーズ標識化二次抗体液を得た。
【００３５】
この磁気ビーズ標識化二次抗体液から、ノルウェー国Ｄｙｎａｌ社製のＭＰＣ（磁石を用いた磁性粒子収集装置）を用いて、磁気ビーズ標識化二次抗体のみを回収した。回収された磁気ビーズ標識化二次抗体にＰＢＳを１ｍｌ添加して洗浄し、この液体から同じ方法で磁気ビーズ標識化二次抗体のみを回収した。最終的に、この磁気ビーズ標識化二次抗体に、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を入れて、濃度が１％の磁気ビーズ標識化二次抗体分散液を得た。
【００３６】
このようにして得られた磁気ビーズ標識化二次抗体分散液を１０μｌ採取して、この分散液から、前記と同じ方法で磁気ビーズ標識化二次抗体のみを回収した。回収された磁気ビーズ標識化二次抗体にＰＢＳを２００μｌ添加して洗浄し、この液体から同じ方法で磁気ビーズ標識化二次抗体のみを回収した。回収された磁気ビーズ標識化二次抗体に蒸留水を１０μｌ添加した。このようにして、磁気ビーズ標識化二次抗体と蒸留水（１０μｌ）とからなる分散液Ａを得た。この分散液Ａを用い、下記の方法で液体ａ〜ｆを調製した。
【００３７】
＜液体ａ＞
濃度０．２ｍｏｌｅ／ｌの「ＭＯＰＳＯ」（和光純薬工業（株）製）に、Ｆｅｔａｌ
Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ウシ胎児血清。米国ＧＩＢＣＯ社製。以下、「ＦＢＳ」と略す。）を２０質量％となるように溶解させるとともに、アルカリ処理カゼインを４質量％となるように溶解させて、ＦＢＳとアルカリ処理カゼインとＭＯＰＳＯを含む水溶液を調製した。
また、蒸留水にスクロース（和光純薬工業（株）製）を溶解させて、濃度２４質量％のスクロース水溶液を調製した。
前出の分散液Ａに、このＦＢＳとアルカリ処理カゼインとＭＯＰＳＯを含む水溶液を２０μｌ、スクロース水溶液を３．４μｌ添加し、さらに蒸留水を６．６μｌ添加して、ｔｏｔａｌ液量が４０μｌで、磁気ビーズ標識化二次抗体が分散されている液体ａを得た。
【００３８】
＜液体ｂ＞
前出の濃度０．２ｍｏｌｅ／ｌの「ＭＯＰＳＯ」に、前出のＦＢＳを１５質量％となるように溶解させるとともに、前出のアルカリ処理カゼインを３質量％となるように溶解させて、ＦＢＳとカゼインとＭＯＰＳＯを含む水溶液を調製した。
【００３９】
前出の分散液Ａに、このＦＢＳとアルカリ処理カゼインとＭＯＰＳＯを含む水溶液を２０μｌ、スクロース水溶液を３．４μｌ添加し、さらに蒸留水を６．６μｌ添加して、ｔｏｔａｌ液量が４０μｌで、磁気ビーズ標識化二次抗体が分散されている液体ｂを得た。
【００４０】
＜液体ｃ＞
前出の濃度０．２ｍｏｌｅ／ｌの「ＭＯＰＳＯ」、前出のＦＢＳを１０質量％となるように溶解させるとともに、前出のアルカリ処理カゼインを２質量％となるように溶解させて、ＦＢＳとアルカリ処理カゼインとＭＯＰＳＯを含む水溶液を調製した。
前出の分散液Ａに、このＦＢＳとアルカリ処理カゼインとＭＯＰＳＯを含む水溶液を２０μｌ、前出のスクロース水溶液を３．４μｌ添加し、さらに蒸留水を６．６μｌ添加して、ｔｏｔａｌ液量が４０μｌで、磁気ビーズ標識化二次抗体が分散されている液体ｃを得た。
【００４１】
＜液体ｄ＞
前出の濃度０．２ｍｏｌｅ／ｌの「ＭＯＰＳＯ」、前出のＦＢＳを３０質量％となるように溶解させるとともに、前出のアルカリ処理カゼインを６質量％となるように溶解させて、ＦＢＳとアルカリ処理カゼインとＭＯＰＳＯを含む水溶液を調製した。
前出の分散液Ａに、このＦＢＳとアルカリ処理カゼインとＭＯＰＳＯを含む水溶液を２０μｌ、前出のスクロース水溶液を３．４μｌ添加し、さらに蒸留水を６．６μｌ添加して、ｔｏｔａｌ液量が４０μｌで、磁気ビーズ標識化二次抗体が分散されている液体ｄを得た。
【００４２】
＜液体ｅ＞
前出の濃度０．２ｍｏｌｅ／ｌの「ＭＯＰＳＯ」、前出のＦＢＳを３０質量％となるように溶解させるとともに、前出のアルカリ処理カゼインを６質量％となるように溶解させて、ＦＢＳとアルカリ処理カゼインとＭＯＰＳＯを含む水溶液を調製した。
前出の分散液Ａに、このＦＢＳとアルカリ処理カゼインとＭＯＰＳＯを含む水溶液を２０μｌ、前出のスクロース水溶液を６．７μｌ添加し、さらに蒸留水を３．３μｌ添加して、ｔｏｔａｌ液量が４０μｌで、磁気ビーズ標識化二次抗体が分散されている液体ｅを得た。
【００４３】
＜液体ｆ＞
前出の濃度０．２ｍｏｌｅ／ｌの「ＭＯＰＳＯ」、前出のＦＢＳを３０質量％となるように溶解させるとともに、前出のアルカリ処理カゼインを６質量％となるように溶解させて、ＦＢＳとアルカリ処理カゼインとＭＯＰＳＯを含む水溶液を調製した。
前出の分散液Ａに、このＦＢＳとアルカリ処理カゼインとＭＯＰＳＯを含む水溶液を２０μｌ、前出のスクロース水溶液を１０μｌ添加して、ｔｏｔａｌ液量が４０μｌで、磁気ビーズ標識化二次抗体が分散されている液体ｆを得た。
得られた液体ａ〜ｆを、それぞれグラスファイバー不織布に含浸した後に、風乾することで、第２多孔体２ａ〜２ｆを得た。
【００４４】
得られた各第２多孔体２ａ〜２ｆに保持されているＦＢＳ、アルカリ処理カゼイン、スクロースの含有率は、多孔体の質量に対する質量％で、それぞれ以下の通りである。
第２多孔体２ａ→ＦＢＳ：１０．０、アルカリ処理カゼイン：２．０、スクロース：２．０
第２多孔体２ｂ→ＦＢＳ：７．５、アルカリ処理カゼイン：１．５、スクロース：２．０
第２多孔体２ｃ→ＦＢＳ：５．０、アルカリ処理カゼイン：１．０、スクロース：２．０
第２多孔体２ｄ→ＦＢＳ：１５．０、アルカリ処理カゼイン：３．０、スクロース：２．０
第２多孔体２ｅ→ＦＢＳ：１５．０、アルカリ処理カゼイン：３．０、スクロース：４．０
第２多孔体２ｆ→ＦＢＳ：１５．０、アルカリ処理カゼイン：３．０、スクロース：６．０
また、比較例として、前出の分散液Ａをそのままグラスファイバー不織布に含浸した後に風乾することで、第２多孔体２ｇを得た。
【００４５】
〔反応部３の形成方法〕
先ず、欧州特許登録番号ＥＰ１１０４７７２号公報に開示されている「マイコプラズマニューモニアのリボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対するモノクローナル抗体ＡＭＭＰ−３（公報中のＡＭＭＰＲＢ−３より得られる）」を、０．１質量％のシュークロースを含有する０．１ｍｏｌｅ／ｌのＭＥＳ（ｐＨ６）緩衝液で、濃度が１０μｇ／ｍｌになるように希釈した。
【００４６】
次に、この希釈液を、底板６の内面の凹部３０Ａ上に５μｌ滴下し、この底板６を、直ぐに、予め４５℃に加温しておいた減圧インキュベーター（ＥＹＥＬ社製、型番ＶＯＳ−３０１ＳＤ）中に入れ、０．０８ＭＰａとなるまで減圧し、この圧力で正確に３０分間保持することで減圧乾燥処理を行った。これにより、底板６の内面の凹部３０Ａに、反応部３を形成した。
【００４７】
〔図４の磁気検出装置の説明〕
この実施形態では、分析装置の本体１０１を保持する台１２にモータ１０２を接続し、このモータ１０２の駆動により、台１２に保持された本体１０１が、磁場中で図中の矢線Ａで示す方向に移動されるようにした。本体１０１の下面が露出されるように、台１２の底面は開口部１２ａとなっている。
【００４８】
磁気検出装置は、本体１０１の反応部に固定された磁性粒子によって出力される磁気的な変化を検出し、この変化をアナログ信号として出力する磁気センサ１０６と、磁気センサ１０６によって出力されたアナログ信号を増幅し、増幅されたアナログ信号をフィルタ処理するアナログ信号処理部１０８と、アナログ信号処理部１０８によってフィルタ処理されたアナログ信号をデジタル信号に変換するＡ／Ｄ変換素子１０９、Ａ／Ｄ変換素子１０９から出力されたデジタル信号に含まれるノイズを除去するデジタルフィルタ１１０と、ノイズが除去されたデジタル信号のプラス出力またはマイナス出力のいずれか一方を出力する信号出力部１１１と、を備えている。
【００４９】
磁気センサ１０６は、磁場の変化によって電気特性が変化する半導体薄膜を有するセンサ部１０３と、センサ部１０３および本体１０１の反応部に静磁場を印加する静磁場発生部１０４と、を備えている（印加される静磁場の磁力線をＢとして示す）。センサ部１０３および静磁場発生部１０４は、基体１０５にそれぞれ固定されてユニット化されている。なお、センサ部１０３の半導体薄膜としては、インジウムアンチモンなどの化合物半導体、シリコンなどの半導体からなる薄膜が適用できる。
【００５０】
静磁場発生部１０４には、永久磁石またはコイルに直流電流を流す形態の電磁石等が適用できるが、磁場の安定性の点から永久磁石がより好ましい。静磁場発生部１０４に用いられる永久磁石には、小型であって強い磁場がかけられるサマリウムコバルト磁石やネオジウム磁石などが好ましい。また、磁場発生源の磁場強度は、センサ部１０３である半導体磁気抵抗薄膜が強磁場下で高感度であるという特性を考慮すると、５００エルステッド以上、好ましくは１０００エルステッド以上が望ましく、より好ましくは１５００エルステッド以上が望ましい。
【００５１】
静磁場発生部１０４は、図中のＢで示す方向の磁力線で表される磁場を発生する。磁場は、本体１０１の少なくとも一部およびセンサ部１０３を含む領域に形成される。磁場が形成された領域を本体１０１の反応部３が移動することによって、反応部３に磁気粒子が固定されている場合にはその量に応じて、形成された磁場に変化が生じる。
センサ部１０３は、磁場の変化によって例えば電気抵抗が変化する半導体素子である。センサ部１０３から出力される信号は、磁場の変化の程度に応じて変化し、アナログ信号処理部１０８にアナログ信号ａとして出力される。
【００５２】
アナログ信号処理部１０８は、増幅回路および微分型アナログフィルタを備えている。アナログ信号ａは、アナログ信号処理部１０８によって増幅処理とフィルタ処理される。微分型アナログフィルタは、磁気センサおよび回路部品の１／ｆノイズを除去するために使用されるフィルタであって、低周波数ノイズを除去している。微分型アナログフィルタの周波数特性は、磁気センサおよび回路部品のノイズ特性、高分子基材１０１の速度、出力される信号とノイズとの比から決定される。
【００５３】
アナログ信号処理部１０８によって処理されたアナログ信号ａは、アナログ信号処理部１０８からＡ／Ｄ変換素子１０９にアナログ信号ｂとして出力される。
Ａ／Ｄ変換素子１０９は、アナログ信号ｂを入力し、デジタル変換した後にデジタル信号ｃとしてデジタルフィルタ１１０に出力する。このようなＡ／Ｄ変換素子１０９は、Ａ／Ｄコンバータ等を用いることによって実現可能である。デジタル信号ｃは、Ａ／Ｄ変換素子１０９からデジタルフィルタ１１０へ出力される。
【００５４】
デジタルフィルタ１１０は、デジタル信号ｃのオフセットやオフセットドリフトなどを除去し、デジタル信号ｄとして出力する。デジタルフィルタ処理は、高速フーリエ変換によって実現可能であるが、このような手法によってなされる処理に限定されるものではない。
信号出力部１１１は、デジタル信号ｄのプラス信号またはマイナス信号のいずれか一方だけを出力する。
【００５５】
図５は、デジタル変換されるアナログ信号のプラス信号またはマイナス信号を説明するための模式図である。すなわち、この実施形態の磁気検出装置では、図５（ａ）および（ｂ）に示すように、アナログ信号の振幅ｅをデジタル化した信号（プラス信号）または振幅ｆをデジタル化した信号（マイナス信号）だけを検出信号として採用している。図５（ｃ）は、従来の信号の検出方法であって、信号のＰｅａｋ  ｔｏ  Ｐｅａｋを使って得たデジタル信号を検出値としている。図５（ｃ）に示した振幅ｇは、信号のプラス方向の振幅のみを示し、振幅ｈは、同じ信号のＰｅａｋ  ｔｏ  Ｐｅａｋであって従来の検出値とされていた値である。
【００５６】
この実施形態の磁気検出装置は、Ａ／Ｄ変換素子１０９におけるアナログデジタル変換の際に信号オフセットやドリフトが除去されて信号の０レベルが調整されることに着目して、０レベルを基準として表される信号のプラスまたはマイナスの一方だけを検出値としている。よって、信号のＰｅａｋ  ｔｏ  Ｐｅａｋで値を検出してデジタル変換する従来の磁気検出装置よりも、ノイズの影響が少ない正確なデジタル信号を検出値として得ることができる。
【００５７】
具体的には、磁気センサ１０６のセンサ部１０３として、インジウムアンチモンからなる化合物半導体を使用し、磁場発生源１０４として、サマリウムコバルトからなる永久磁石（磁場発生源の図中上面において約２０００エルステッド）を使用した。そして、磁気センサ１０６から出力されたアナログ信号を高インピーダンスアンプによって約２００万倍に増幅した。信号処理のための微分型アナログフィルタとしては、二次型のフィルタを用いた。このフィルタの低周波数領域における特性を図６に示す。
また、微分型アナログフィルタから出力されたアナログ信号をＡ／Ｄコンバータによりデジタル信号化し、デジタル信号の出力の際に高速フーリエ変換によりオフセット周波数を除去し、さらに逆フーリエ変換して出力した。
【００５８】
〔実際の分析例〕
このようにして得られた、第２多孔体２として、前述の７種類（第２多孔体２ａ〜２ｇ）のうちの一つがそれぞれ固定されている７種類の分析装置を用いて、実際の分析を行った例を以下に示す。
底板６の厚さは、第１多孔体１および第２多孔体２を固定する部分の厚さを１．０ｍｍとし、反応部３を形成する部分の厚さを０．２ｍｍとし、吸収体４を固定する部分の厚さを１．５ｍｍとした。また、第１多孔体１の大きさは１２ｍｍ×８ｍｍ×厚さ２ｍｍ、第２多孔体２の大きさは１２ｍｍ×５ｍｍ×厚さ２ｍｍ、吸収体４の大きさは１２ｍｍ×１１ｍｍ×厚さ２ｍｍとした。
【００５９】
先ず、生理食塩水に、精製抗原（マイコプラズマニューモニアのリボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２）を、濃度が１０００（ｎｇ／ｍｌ）となるように添加し、さらに、界面活性剤「Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００」を、濃度が１．０％となるように添加した。このようにして得られた液状試料を２００μｌ、試料導入口７１に滴下した。
【００６０】
滴下された液状試料は、第１多孔体１に吸収された後、毛細管現象で横方向に移動して第２多孔体２に入り、流路２３２を通って反応部３の流路３１に入り、流路３４２を通って吸収体４に吸収される。この液状試料は、前述の抗原を含有しているため、この抗原と第２多孔体２の磁気ビーズ標識化二次抗体が結合する。そして、この結合体が反応部３の流路３１に入り、この結合体の抗原が反応部３の抗体と結合して、磁気ビーズの凝集が生じる。
【００６１】
なお、滴下された液状試料に前述の抗原（分析対象の特定成分）が含まれていないときには、第２多孔体２および反応部３での前述の結合が生じないため、液状試料および標識付き試薬は反応部３を素通りして吸収体４に全て吸収される。
この装置の板材６はポリカーボネート製であるため、板材６から箱体内の状態を見ることができるが、図１のＢ方向からの目視で、この磁気ビーズの凝集が確認された。
【００６２】
試料導入口７１に滴下した液状試料が吸収体４に吸収されるまでに要した時間を測定した。その結果、第２多孔体２ａを備えた装置では８０４秒であり、第２多孔体２ｂを備えた装置では７５２秒であり、第２多孔体２ｃを備えた装置では６５２秒であり、第２多孔体２ｄを備えた装置では１０２４秒であり、第２多孔体２ｅを備えた装置では１０８６秒であり、第２多孔体２ｆを備えた装置では１２００秒であり、第２多孔体２ｇを備えた装置では５０３秒であった。
【００６３】
この結果から、第２多孔体２に、磁気ビーズ標識化二次抗体とともに、ＦＢＳを５．０〜１０．０質量％、アルカリ処理カゼインを１．０〜３．０質量％、スクロースを２．０〜６．０質量％の含有率で保持させることにより、磁気ビーズ標識化二次抗体のみを保持された場合と比較して、液状試料が反応部３を移動する速度が低くなって、反応部３と液状試料（二次抗体と反応する抗原が含まれている場合）との反応性が向上することが分かる。
【００６４】
また、第２多孔体２の違いによる磁気検出装置で検出された磁気信号強度の違いを、図７にグラフで示す。このグラフから、第２多孔体に保持されているスクロースの含有率が２．０質量％でＦＢＳの含有率が異なる２ａと２ｂと２ｃと２ｄ〜２ｆとの比較では、ＦＢＳの含有率が高いほど磁気信号強度が大きいことが分かる。また、ＦＢＳの含有率が同じ１５．０質量％である２ｄ、２ｅ、２ｆでは、スクロールの含有率が高いほど磁気信号強度が大きいことが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】実施形態の分析装置を示す図であって、本体の縦断面図である。
【図２】図１の本体の組立前の状態を示す斜視図である。
【図３】第１多孔体、第２多孔体、反応部、および吸収体の、箱体内での配置を示す斜視図である。
【図４】実施形態で使用した磁気検出装置を示す概略構成図である。
【図５】図４の磁気検出装置による信号処理を説明するための模式図である。
【図６】実施形態で使用した微分型アナログフィルタの低周波数領域における特性を示すグラフである。
【図７】第２多孔体２の違いによる、磁気検出装置で検出された磁気信号の違いを示すグラフである。
【符号の説明】
【００６６】
１  第１多孔体
１０  第１多孔体を固定する部分
１０Ａ  凹部
２  第２多孔体
２０  第２多孔体を固定する部分
２０Ａ  凹部
２３１  流路形成部材
２３２  溝状の流路
３  反応部
３０  反応部を形成する部分
３０Ａ  凹部
３１  反応部上部の流路
３４１  流路形成部材
３４２  溝状の流路
４  吸収体
４０  吸収体を固定する部分
５０  底板の内面で最も低い面
６  箱体の底板
６７  ピン
７  箱体の蓋部
７１  試料導入口
７２  流路形成部
７６  ピン受け
６Ａ  底板内面の周縁部と同じ高さの面
１０１  本体
１２  台
１２ａ  開口部
１０２  モータ
１０３  センサ部
１０４  静磁場発生部
１０５  基体
１０６  磁気センサ
１０８  アナログ信号処理部
１０９  Ａ／Ｄ変換素子
１１０  デジタルフィルタ
１１１  信号出力部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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