(57)【要約】      （修正有）【課題】悪性腫瘍の性質を精度良く判定することのできる方法を提供する。【解決手段】  パラメータを獲得する工程と第一比較工程と第二比較工程と判定工程とを含む悪性腫瘍の性質の判定方法を提供する。パラメータを獲得する工程では、悪性腫瘍の腫瘍細胞に含まれる第一のサイクリン依存性キナーゼ（第一ＣＤＫ）の活性値及び発現量から得られる第一パラメータと、腫瘍細胞に含まれる第二のサイクリン依存性キナーゼ（第二ＣＤＫ）の活性値及び発現量から得られる第二パラメータと、第一パラメータと第二パラメータに基づいて得られる第三パラメータと、前記腫瘍細胞のサイクリンの発現量から得られる第四パラメータとが獲得される。第一比較工程では、前記第三パラメータが第一の閾値と比較される。第二比較工程では、前記第四パラメータが、第二の閾値と比較される。判定工程では、第一比較結果及び第二比較結果に基づいて悪性腫瘍の性質が判定される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
悪性腫瘍の腫瘍細胞に含まれる第一のサイクリン依存性キナーゼ（第一ＣＤＫ）の活性値及び発現量から得られる第一パラメータと、前記腫瘍細胞に含まれる第二のサイクリン依存性キナーゼ（第二ＣＤＫ）の活性値及び発現量から得られる第二パラメータと、前記第一パラメータ及び前記第二パラメータに基づいて得られる第三パラメータと、前記腫瘍細胞に含まれるサイクリンの発現量から得られる第四パラメータとを獲得する工程と、
前記第三パラメータを、第一の閾値と比較する第一比較工程と、
前記第四パラメータを、第二の閾値と比較する第二比較工程と、
第一比較結果及び第二比較結果に基づいて前記悪性腫瘍の性質を判定する工程と、
を含む悪性腫瘍の性質の判定方法。
【請求項２】
前記第一パラメータが、前記第一ＣＤＫの比活性である請求項１記載の判定方法。
【請求項３】
前記第二パラメータが、前記第二ＣＤＫの比活性である請求項1又は２記載の判定方法。
【請求項４】
前記第三パラメータが、第一パラメータと第二パラメータとの比である請求項１〜３の何れかに記載の判定方法。
【請求項５】
前記第一ＣＤＫ及び前記第二ＣＤＫが、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６からなる群から選択される請求項１〜４の何れかに記載の判定方法。
【請求項６】
前記サイクリンが、前記第一ＣＤＫ又は前記第二ＣＤＫと複合体を形成する請求項１〜５の何れかに記載の判定方法。
【請求項７】
前記サイクリンが、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＫと複合体を形成する請求項１〜６の何れかに記載の判定方法。
【請求項８】
前記サイクリンが、サイクリンＡ、サイクリンＢ、サイクリンＤ及びサイクリンＥからなる群から選択される請求項７に記載の判定方法。
【請求項９】
前記第一ＣＤＫがＣＤＫ１である請求項５の何れか記載の判定方法。
【請求項１０】
前記第二ＣＤＫがＣＤＫ２である請求項５の何れかに記載の判定方法。
【請求項１１】
前記サイクリンがサイクリンＢ又はサイクリンＥである請求項８の何れかに記載の判定方法。
【請求項１２】
前記悪性腫瘍が上皮細胞由来のがんである請求項１〜１１の何れかに記載の判定方法。
【請求項１３】
前記悪性腫瘍が乳がんである請求項１〜１２の何れかに記載の判定方法。
【請求項１４】
前記悪性腫瘍の性質が、前記悪性腫瘍の再発リスクである請求項１〜１３の何れかに記載の判定方法。
【請求項１５】
前記判定工程において、前記第一比較結果及び前記第二比較結果に基づいて、前記悪性腫瘍を再発リスクの異なる三群の何れかに分類する、請求項１〜１４の何れかに記載の判定方法。
【請求項１６】
前記悪性腫瘍が、ステージ分類においてステージI又はステージIIAの悪性腫瘍である、請求項１〜１５の何れかに記載の判定方法。
【請求項１７】
悪性腫瘍の腫瘍細胞に含まれる第一のサイクリン依存性キナーゼ（第一ＣＤＫ）の活性値及び発現量から得られる第一パラメータと、前記腫瘍細胞に含まれる第二のサイクリン依存性キナーゼ（第二ＣＤＫ）の活性値及び発現量から得られる第二パラメータと、前記第一パラメータ及び前記第二パラメータに基づいて得られる第三パラメータと、前記腫瘍細胞に含まれるサイクリンの発現量から得られる第四パラメータとを獲得する工程と、
前記第三パラメータを、第一の閾値と比較する第一比較工程と、
第一比較結果に基づいて、前記悪性腫瘍の性質を判定する第一判定工程と、を含み、
前記第一判定工程で判定が確定されなかった場合、
前記第四パラメータを、第二の閾値と比較する第二比較工程と、
第二比較結果に基づいて前記悪性腫瘍の性質を判定する第二判定工程と、
をさらに含む悪性腫瘍の性質の判定方法。
【請求項１８】
悪性腫瘍の腫瘍細胞に含まれる第一のサイクリン依存性キナーゼ（第一ＣＤＫ）の活性値及び発現量から得られる第一パラメータと、前記腫瘍細胞に含まれる第二のサイクリン依存性キナーゼ（第二ＣＤＫ）の活性値及び発現量から得られる第二パラメータと、前記第一パラメータ及び前記第二パラメータに基づいて得られる第三パラメータと、前記腫瘍細胞に含まれるサイクリンの発現量から得られる第四パラメータとを獲得する工程と、
前記第三パラメータを、第一の閾値と比較する第一比較工程と、
第一比較結果に基づいて、前記悪性腫瘍を、Ａ群及び前記Ａ群よりも再発リスクが高い群の何れかに分類する第一分類工程と、を含み、
前記悪性腫瘍が前記Ａ群よりも再発リスクが高い群に含まれると判定された場合、
前記第四パラメータを、第二の閾値と比較する第二比較工程と、
第二比較結果に基づいて前記Ａ群よりも再発リスクが高い群を、Ｂ群と前記Ｂ群よりも再発リスクが高いＣ群とに分類する第二分類工程と、
をさらに含む悪性腫瘍の再発リスクの判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、患者から採取した悪性腫瘍の腫瘍細胞において発現しているタンパク質を分析し、分析結果に基づいて悪性腫瘍の性質を判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、悪性腫瘍細胞のサイクリンの発現量を測定することによって悪性腫瘍の性質を判定できることが知られている。例えば、非特許文献１では、乳がんの予後予測をサイクリンＥの発現量を用いて行っている。非特許文献１では、乳がん患者から採取した腫瘍細胞におけるサイクリンＥの発現量を測定し、サイクリンＥの発現量が多い場合は生存率が低い、即ち予後が悪いということが報告されている。しかしながら、サイクリンＥが低発現の悪性腫瘍であっても再発する場合などがあり、サイクリンＥの発現量に基づく悪性腫瘍の予後予測や再発リスク判定の精度は充分ではない。
【０００３】
また、非特許文献２では、悪性及び非悪性のヒト乳房病変におけるサイクリンＢ１及びＣＤＫ１の発現量を測定している。この文献では、サイクリンＢ１やＣＤＫ１の発現量を用いることにより、良性又は前癌病変と乳がんとを区別できうることが報告されている。しかしながら、この文献では、サイクリンＢ１やＣＤＫ１の発現量しか測定されておらず、また、悪性腫瘍の再発リスクなどの悪性腫瘍の性質を判定する方法については一切記載されていない。
【０００４】
【非特許文献１】Keyomarsi K., et al., The New England Journal of Medicine, vol. 347, No. 20, 2002, pages 1566-1575.
【非特許文献２】Hisanori Kawamoto., et al., American Journal of Pathology, vol. 150, No. 1, 1997, pages 15-23
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、患者から採取した悪性腫瘍の腫瘍細胞で発現している分子の分析結果に基づいて悪性腫瘍の性質を精度良く判定することのできる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段及び発明の効果】
【０００６】
本発明の第一の局面による悪性腫瘍の性質の判定方法は、悪性腫瘍の腫瘍細胞に含まれる第一のサイクリン依存性キナーゼ（第一ＣＤＫ）の活性値及び発現量から得られる第一パラメータと、前記腫瘍細胞に含まれる第二のサイクリン依存性キナーゼ（第二ＣＤＫ）の活性値及び発現量から得られる第二パラメータと、前記第一パラメータ及び前記第二パラメータに基づいて得られる第三パラメータと、前記腫瘍細胞に含まれるサイクリンの発現量から得られる第四パラメータを獲得する工程と、前記第三パラメータを、第一の閾値と比較する第一比較工程と、前記第四パラメータを、第二の閾値と比較する第二比較工程と、第一比較結果及び第二比較結果に基づいて前記悪性腫瘍の性質を判定する工程と、を含む。
【０００７】
この方法によると、悪性腫瘍の腫瘍細胞で発現している複数のＣＤＫ及びサイクリンの分析結果を用いるため、悪性腫瘍の性質を精度良く判定することができる。
【０００８】
本発明の第二の局面による悪性腫瘍の性質の判定方法は、悪性腫瘍の腫瘍細胞に含まれる第一のサイクリン依存性キナーゼ（第一ＣＤＫ）の活性値及び発現量から得られる第一パラメータと、前記腫瘍細胞に含まれる第二のサイクリン依存性キナーゼ（第二ＣＤＫ）の活性値及び発現量から得られる第二パラメータと、前記第一パラメータ及び前記第二パラメータに基づいて得られる第三パラメータと、前記腫瘍細胞に含まれるサイクリンの発現量から得られる第四パラメータとを獲得する工程と、前記第三パラメータを、第一の閾値と比較する第一比較工程と、第一比較結果に基づいて、前記悪性腫瘍の性質を判定する第一判定工程と、を含み、前記第一判定工程で判定が確定されなかった場合、前記第四パラメータを、第二の閾値と比較する第二比較工程と、第二比較結果に基づいて前記悪性腫瘍の性質を判定する第二判定工程と、をさらに含む。
【０００９】
この方法によると、悪性腫瘍の腫瘍細胞で発現している複数のＣＤＫ及びサイクリンの分析結果を用い、さらに第一判定工程で判定が確定されなかった腫瘍細胞について第二比較工程及び第二判定工程を実行するため、悪性腫瘍の性質を精度良く且つより少ないステップで判定することができる。
【００１０】
本発明の第三の局面による悪性腫瘍の再発リスクの判定方法は、悪性腫瘍の腫瘍細胞に含まれる第一のサイクリン依存性キナーゼ（第一ＣＤＫ）の活性値及び発現量から得られる第一パラメータと、前記腫瘍細胞に含まれる第二のサイクリン依存性キナーゼ（第二ＣＤＫ）の活性値及び発現量から得られる第二パラメータと、前記第一パラメータ及び前記第二パラメータに基づいて得られる第三パラメータと、前記腫瘍細胞に含まれるサイクリンの発現量から得られる第四パラメータとを獲得する工程と、前記第三パラメータを、第一の閾値と比較する第一比較工程と、第一比較結果に基づいて、前記悪性腫瘍を、Ａ群及び前記Ａ群よりも再発リスクが高い群の何れかに分類する第一分類工程と、を含み、前記悪性腫瘍が前記Ａ群よりも再発リスクが高い群に含まれると判定された場合、前記第四パラメータを、第二の閾値と比較する第二比較工程と、第二比較結果に基づいて前記Ａ群よりも再発リスクが高い群を、Ｂ群と前記Ｂ群よりも再発リスクが高いＣ群とに分類する第二分類工程と、をさらに含む。
【００１１】
この方法によると、悪性腫瘍の腫瘍細胞で発現している複数のＣＤＫの分析結果を用いて、腫瘍細胞を、Ａ群及びＡ群よりも再発リスクが高い群の何れかに分類し、Ａ群よりも再発リスクが高い群に分類された場合、さらにサイクリンの分析結果を用いてＢ群及びＣ群に分類するため、悪性腫瘍を再発リスクの程度の異なる三群に分類することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本実施形態の判定方法は、悪性腫瘍の腫瘍細胞に含まれる第一ＣＤＫ、第二ＣＤＫ及びサイクリンを用いて悪性腫瘍の性質を判定する方法である。
【００１３】
本明細書における悪性腫瘍とは、造血器由来の悪性腫瘍、上皮細胞由来の癌腫、肉腫などを含む。造血器由来の悪性腫瘍としては、白血病や悪性リンパ腫などを例示することができる。癌腫としては、乳がん、胃がん、大腸がん、食道がん、前立腺がんなどを例示することができる。肉腫としては、骨肉腫や軟部肉腫などを例示することができる。
【００１４】
判定に用いられる腫瘍細胞は、早期がんの腫瘍細胞であることが好ましい。本明細書における早期がんとは、ステージ分類においてステージＩ及びステージＩＩＡと判定されるがんのことである。
ステージ分類とは悪性腫瘍の悪性度を示す分類である。悪性腫瘍の種類により、分類方法は多少異なるが、例えば乳がんの場合、悪性度の低い順にステージ０〜ＩＶに分類される。また、一般的にステージＩＩは、悪性度の低い順にステージＩＩＡ及びステージＩＩＢに分類され、ステージＩＩＩは、悪性度の低い順にステージＩＩＩＡ及びステージＩＩＩＢに分類される。このステージ分類は、ＴＮＭ分類に基づいている。ＴＮＭ分類とは、国際対がん連合（ＵＩＣＣ）による悪性腫瘍の病期分類である。「Ｔ」は原発腫瘍の規模
を示し、Ｔ０（原発巣が確認できない）〜Ｔ４（腫瘤が体外へ露出）に分けられる。「Ｎ」は近傍リンパ節への浸潤度合いを示し、Ｎ０（リンパ節転移なし）〜Ｎ３（体の正中に近いところにあるリンパ節（胸骨傍リンパ節）に転移が疑われる）に分けられる。「Ｍ」は遠隔転移の有無を示し、Ｍ０（遠隔転移なし）及びＭ１（遠隔転移あり）に分けられる。
乳がんの場合、ステージＩの悪性腫瘍とは、ＴＮＭ分類において「Ｔ１，Ｎ０，Ｍ０」である悪性腫瘍を指し、ステージＩＩＡとは、ＴＮＭ分類において「Ｔ０，Ｎ１，Ｍ０」、「Ｔ１，Ｎ１，Ｍ０」又は「Ｔ２，Ｎ０，Ｍ０」である悪性腫瘍を指し、ステージＩＩＢとは、ＴＮＭ分類において「Ｔ２，Ｎ１，Ｍ０」又は「Ｔ３，Ｎ０，Ｍ０」である悪性腫瘍を指す。
【００１５】
上記判定方法で判定される悪性腫瘍の性質としては、腫瘍細胞の増殖能、再発リスク（転移のしやすさ）などが挙げられる。この判定方法は特に再発リスクの判定を行なうために用いられることが好ましい。再発とは、腫瘍の治療（摘出、抗がん剤治療、ホルモン治療など）から一定期間経過した後、同じ部位に悪性腫瘍が再現する場合及び腫瘍細胞が原発巣から分離して遠隔組織へ運ばれそこで自立的に増殖する場合をいう。再発が起こるか否かは腫瘍細胞の増殖能、生存能、移動能などに左右される。
【００１６】
本発明の一実施形態による悪性腫瘍の判定方法は、各パラメータを獲得するパラメータ獲得工程と、第一比較工程と、第二比較工程と、判定工程とを含む。
【００１７】
パラメータ獲得工程では、腫瘍細胞に含まれる第一ＣＤＫの第一パラメータと、腫瘍細胞に含まれる第二ＣＤＫの第二パラメータと、第一パラメータと第二パラメータから得られる第三パラメータと、腫瘍細胞に含まれるサイクリンの発現量から得られる第四パラメータとを求める。
ＣＤＫとは、サイクリンというタンパク質が結合することによって活性化される酵素の総称で、その種類に応じて細胞周期の特定時期で機能している。ＣＤＫの種類としては、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６、ＣＤＫ７などが挙げられる。本実施形態では少なくとも二種類のＣＤＫ（第一ＣＤＫ及び第二ＣＤＫ）が用いられ、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６からなる群から選択される二種類のＣＤＫを組み合わせて用いることが好ましい。これは、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６が、細胞周期の時期の移行に直接的に関与しているからである。例えば、細胞周期のG1期からS期への移行の引き金を引くのはＣＤＫ４又はＣＤＫ６とサイクリンD との複合体であり、それによってＣＤＫ２とサイクリンEとの複合体の活性化がおこり，細胞は本格的にS期に突入することになる。その後ＣＤＫ２とサイクリンAとの複合体の活性化により細胞はS期からG2期へ移行し、ＣＤＫ１とサイクリンBとの複合体の活性化によって細胞はM期へ進むことができる。また、ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の組み合わせを用いることがより好ましい。即ち、第一ＣＤＫがＣＤＫ１であり、第二ＣＤＫがＣＤＫ２であることがより好ましい。
【００１８】
第一パラメータは第一ＣＤＫの活性値及び発現量から得られるパラメータであり、第二パラメータは第二ＣＤＫの活性値及び発現量から得られるパラメータである。これらのパラメータとして、活性値及び発現量の何れかを単独で用いてもよいし、活性値と発現量とを加減乗除などして計算される値を用いてもよいが、活性値と発現量との比を用いることが好ましい。活性値と発現量との比としては、活性値を発現量で除することにより得られる値（比活性）、発現量を活性値で除することにより得られる値（比活性の逆数）などを用いることができる。
【００１９】
第三パラメータは第一パラメータと第二パラメータとに基づいて得られるパラメータである。第三パラメータとしては、第一パラメータと第二パラメータとを加減乗除などして計算される値を用いることができるが、第一パラメータと第二パラメータとの比を用いることが好ましい。第一パラメータと第二パラメータの比としては、第一パラメータを第二パラメータで除することにより得られる値、第二パラメータを第一パラメータで除することにより得られる値などを用いることができる。
【００２０】
サイクリンとは、細胞周期関連因子として知られるタンパク質の一種であり、ＣＤＫなどのタンパク質リン酸化酵素の調節サブユニットを構成する。サイクリンの種類としては、サイクリンＡ、サイクリンＢ、サイクリンＣ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、サイクリンＨ、サイクリンＫ、サイクリンＴなどが挙げられる。用いるサイクリンとしては、第一ＣＤＫ又は第二ＣＤＫと複合体を形成しうるサイクリンが好ましい。具体的には、上述したような理由から、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６からなる群から選択されるＣＤＫと複合体を形成するサイクリンが好ましく、このようなサイクリンとしては、サイクリンＡ、サイクリンＢ、サイクリンＤ、サイクリンＥが挙げられる。また、この中でも、サイクリンＢやサイクリンＥを用いることがより好ましい。なお、本明細書におけるサイクリンＢとは、サイクリンＢ１、サイクリンＢ２なども含む。本明細書におけるサイクリンＥとは、サイクリンＥ１、サイクリンＥ２なども含む。
【００２１】
第四パラメータは、発現量から得られるパラメータである。第四パラメータとしては、発現量と活性値とを加減乗除などして計算される値を用いてもよいが、発現量を単独で用いることが好ましい。
【００２２】
第一比較工程では、第一ＣＤＫに基づいた第一パラメータと第二ＣＤＫに基づいた第二パラメータから得られる第三パラメータを、このパラメータに対応する閾値（以下、第一の閾値とする）と比較する。
【００２３】
第一の閾値は、腫瘍細胞のどのような性質を判定するかによって適宜設定される。例えば、腫瘍細胞の再発リスクを判定する場合、複数の患者から採取された乳がん細胞のうち摘出手術後５年間の再発の有無が既知の細胞について、第三パラメータを算出し、算出された値を小さい順に並べて、患者集団を所定の分離比率で高値群（再発リスクが高い群）と低値群（再発リスクが低い群）とに分離できる値を第一の閾値とすることができる。分離比率としては、例えば、乳がんの場合、摘出手術後５年間の再発率が約３０％であるため、高値群の分離比率が少なくとも患者集団の３０％であることが好ましいが、低値群に分類された患者が再発を起こすということのないようにするため、高値群を３０％よりも高い割合とすることがより好ましい。即ち、第一の閾値として、患者集団を、高値群：低値群が３０：７０となる値、好ましくは４０：６０となる値、より好ましくは５０：５０となる値（中央値）、６０：４０となる値などを用いることができる。なお、正確に患者集団を５０：５０や６０：４０に分離できる値が存在しないことも考えられるため、分離比率は厳密に設定する必要はない。例えば、患者集団を構成する患者数が９９である場合は患者集団を５０：５０に分離できる値が存在しない。このような場合は分離比率を５０：４９などに設定してもよい。
【００２４】
腫瘍細胞によっては、第一パラメータ、第二パラメータ又はこれら両方の値が非常に小さい場合や、逆に、非常に大きい場合があり、第三パラメータが第一の閾値とはかけ離れた値となることがある。このような場合、第一の閾値だけでなく、第一パラメータ及び第二パラメータのそれぞれに対しても閾値を設定することが好ましい。即ち、第一比較工程において、第一パラメータとこれに対応する閾値との比較、第二パラメータとこれに対応する閾値との比較、及び第三パラメータと第一の閾値との比較を実行してもよい。例えば、第一パラメータが対応する閾値未満であり、且つ第二パラメータが対応する閾値未満であった場合は、第三パラメータと第一の閾値との比較結果に関わらず再発リスクが低いと判定してもよい。また、第二パラメータが対応する閾値以上であった場合は、第三パラメータと第一の閾値との比較結果に関わらず再発リスクが高いと判定してもよい。
【００２５】
また、第三パラメータとして、第一パラメータと第二パラメータとの比の値を用いると、分母が０となることがある。このような場合は比の値を算出することができないため、無限大として取り扱い、第一の閾値以上であるとすることができる。
【００２６】
第二比較工程では、腫瘍細胞に含まれるサイクリンの発現量から得られる第四パラメータを、このパラメータに対応する閾値（以下、第二の閾値とする）と比較する。
【００２７】
第二の閾値は、腫瘍細胞のどのような性質を判定するかによって適宜設定される。例えば、腫瘍細胞の再発リスクを判定する場合、一定期間経過後の再発の有無が既知である腫瘍細胞について、上記の第一比較工程の結果と組み合わせて再発リスクを判定する際に実際の再発の有無と高確率で合致する第二の閾値を設定することができる。
【００２８】
第一比較工程及び第二比較工程は、判定工程を実行する前であれば、どちらを先に実行してもよい。
【００２９】
活性値や発現量の測定に供される測定用試料は、患者から採取した腫瘍細胞を用いて調製することができる。ＣＤＫやサイクリンの所定のパラメータを測定することができれば、その調製方法は特に限定されない。例えば、測定用試料としては、細胞を可溶化した試料（細胞可溶化液）を用いることができる。細胞可溶化液は、患者から採取した腫瘍細胞に界面活性剤を含む緩衝液を添加し、緩衝液中で腫瘍細胞を物理的及び／又は化学的に処理することにより調製される。このような処理を行うことにより、細胞に含まれるＣＤＫやサイクリンなどのタンパク質が液中に遊離する。この細胞可溶化液を遠心分離してＣＤＫやサイクリンを含む上清を採取し、これを測定用試料とすることができる。
【００３０】
ＣＤＫの活性値の測定方法は特に限定されず、従来公知の方法で測定することができる。例えば、３２Ｐ標識したＡＴＰ（γ−〔３２Ｐ〕−ＡＴＰ）を用いる方法が挙げられる。この方法によると、測定用試料と、基質と、γ−〔３２Ｐ〕−ＡＴＰとを混合し、キナーゼの作用によって基質に３２Ｐを導入する。次に、３２Ｐで標識されたリン酸化基質の標識量を測定し、キャリブレータで作成された検量線をもとにリン酸化基質を定量する。定量されたリン酸化基質量に基づいてキナーゼの活性値を算出する。また、放射性物質を用いない方法として、特開２００２−３３５９９７号公報に開示の方法を用いることができる。この方法によると、先ずこれらキナーゼの何れか又は両方を含む試料と、基質と、アデノシン５’−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）（ＡＴＰ−γＳ）とを混合し、キナーゼの作用によって基質にモノチオリン酸基を導入する。導入されたモノチオリン酸基の硫黄原子に標識蛍光物質又は標識酵素を結合させることによって基質を標識し、標識されたモノチオリン酸化基質の標識量を測定し、キャリブレータで作成された検量線を基にモノチオリン酸化基質を定量する。定量されたモノチオリン酸化基質量に基づいてキナーゼの活性値を算出する。測定は、抗ＣＤＫ抗体を含む試薬、ＣＤＫの基質を含む試薬、ＡＴＰ−γＳを含む試薬及びリン酸化された基質に結合可能な標識物質を含む試薬を備えた試薬キットを用いて行うことができる。なお、ＣＤＫの基質及びＡＴＰ−γＳは同一の容器に収容されていてもよい。
【００３１】
ＣＤＫやサイクリンの発現量の測定方法は特に限定されず、従来公知の方法で測定することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、特開２００３−１３０８７１号公報に開示の方法などを用いて測定用試料を測定して、ＣＤＫやサイクリンの発現量を得ることができる。特開２００３−１３０８７１号公報に開示の方法を利用する場合、下記に示す方法でＣＤＫやサイクリンの発現量を測定することができる。まず、測定用試料を疎水性多孔性膜に接触させて、測定用試料中のＣＤＫ又はサイクリンを該膜に結合させる。次に、標識化されているか、または標識との反応性部位を有し、かつＣＤＫ又はサイクリンと特異性を有する抗体を、ＣＤＫ又はサイクリンと結合させる。標識化されていない抗体を用いた場合には、標識との反応性部位に標識を作用させて該抗体を標識化する。そして、ＣＤＫ又はサイクリンに結合した標識の量を測定する。予め作製した検量線をもとに、該標識の量を用いて、ＣＤＫ又はサイクリンの発現量を測定する。
【００３２】
測定用試料は患者から採取した腫瘍細胞から調製されるため、測定用試料によって含まれる腫瘍細胞数が異なる。このため、サイクリンなどのタンパク質の発現量の測定値は測定用試料に含まれる腫瘍細胞の多寡によって変動してしまう。従って、発現量の測定値を補正することが好ましい。発現量の測定値の補正としては、例えば、ハウスキーピング遺伝子によってコードされるタンパク質（以下、ハウスキーピングタンパク質とする）の発現量を用いて行なうことができる。ハウスキーピングタンパク質はどの細胞でもほぼ一定量発現しているタンパク質であり、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）やアクチンなどを例示することができる。具体的には、測定用試料のタンパク質の発現量だけでなく、ハウスキーピングタンパク質の発現量も測定し、測定用試料のタンパク質の発現量をハウスキーピングタンパク質の発現量で除することにより発現量の測定値を補正することができる。なお、第一パラメータとして発現量又は活性値と発現量との比を用い、第二パラメータとして発現量又は活性値と発現量との比を用い、第三パラメータとして第一パラメータと第二パラメータとの比を用いる場合、第一ＣＤＫの発現量及び第二ＣＤＫの発現量が測定されるが、ハウスキーピングタンパク質の発現量は計算上相殺されるため上記のような補正は必要ない。
【００３３】
判定工程では、第一ＣＤＫの活性値及び発現量から得られる第一パラメータと、第二ＣＤＫの活性値及び発現量から得られる第二パラメータとに基づいて得られる第三パラメータを対応する第一の閾値と比較した結果と、サイクリンの発現量から得られる第四パラメータを対応する第二の閾値と比較した結果とに基づいて悪性腫瘍の性質を判定する。例えば、悪性腫瘍の性質として再発リスクの判定を行う場合、これらの結果に基づいて、判定対象の悪性腫瘍を再発リスクの程度の異なる三群（例えば、高、中及び低）の何れかに分類することができる。判定の具体的な方法としては、例えば、下記に示す第一の判定方法〜第五の判定方法の何れかを用い、再発リスクを判定することができる。
【００３４】
第一の判定方法では、第三パラメータを第一の閾値と比較した結果と、第四パラメータを第二の閾値と比較した結果とを組み合わせて再発リスクを判定する。これらの比較結果の両方で閾値未満の場合には再発リスクが低いと考えられ、「Ａ群」と判定する。これらの比較結果の何れか一方が閾値以上、他方が閾値未満の場合には、「Ａ群」と判定された腫瘍細胞よりも再発リスクが高い「Ｂ群」と判定する。これらの比較結果の両方が閾値以上の場合には、「Ｂ群」と判定された腫瘍細胞よりも再発リスクが高い「Ｃ群」と判定する。
また、ここで、「Ｂ群」と判定されるものについて、第三パラメータが第一の閾値以上のものと第四パラメータが第二の閾値以上のものと再発リスクの程度の異なる場合も考えられる。そのような場合は、さらに、第三パラメータが第一の閾値以上のものを「Ｂ−１群」と判定し、第四パラメータが第二の閾値以上のものを「Ｂ−２群」と判定してもよい。これにより、判定対象の悪性腫瘍を再発リスクの程度の異なる四群の何れかに分類することができる。
【００３５】
第二の判定方法は、第三パラメータを第一の閾値と比較し、第三パラメータが閾値以上の場合には「Ｃ群」であるとの判定を確定させる。第三パラメータが閾値未満の場合は判定が確定されないため、第四パラメータを第二の閾値と比較する。第四パラメータが閾値以上の場合には、「Ｃ群」と判定された腫瘍細胞よりも再発リスクが低い「Ｂ群」と判定する。第四パラメータが閾値未満の場合には、「Ｂ群」と判定された腫瘍細胞よりも再発リスクが低い「Ａ群」と判定する。
【００３６】
第三の判定方法では、第四パラメータを第二の閾値と比較し、第四パラメータが閾値以上の場合には「Ｃ群」であるとの判定を確定させる。第四パラメータが閾値未満の場合は判定が確定されないため、第三パラメータを第一の閾値と比較する。第三パラメータが閾値以上の場合には、「Ｃ群」と判定された腫瘍細胞よりも再発リスクが低い「Ｂ群」と判定する。第三パラメータが閾値未満の場合には、「Ｂ群」と判定された腫瘍細胞よりも再発リスクが低い「Ａ群」と判定する。
【００３７】
第四の判定方法では、第三パラメータを第一の閾値と比較し、第三パラメータが閾値未満の場合には、「Ａ群」であるとの判定を確定させる。第三パラメータが閾値以上の場合は判定が確定されないため、第四パラメータを第二の閾値と比較する。第四パラメータが閾値未満の場合には、「Ａ群」と判定された腫瘍細胞よりも再発リスクが高い「Ｂ群」と判定する。第四パラメータが閾値以上の場合には、「Ｂ群」と判定された腫瘍細胞よりも再発リスクが高い「Ｃ群」と判定する。
【００３８】
第五の判定方法では、第四パラメータを第二の閾値と比較し、第四パラメータが閾値未満の場合には、「Ａ群」であるとの判定を確定させる。第四パラメータが閾値以上の場合は判定が確定されないため、第三パラメータを第一の閾値と比較する。第三パラメータが閾値未満の場合には、「Ａ群」と判定された腫瘍細胞よりも再発リスクが高い「Ｂ群」と判定する。第三パラメータが閾値以上の場合には、「Ｂ群」と判定された腫瘍細胞よりも再発リスクが高い「Ｃ群」と判定する。
【００３９】
なお、第一〜第五の判定方法において、Ａ群、Ｂ群及びＣ群は、それぞれの判定方法における相対的な再発リスクの相違を示している。各判定方法において、Ａは相対的に再発リスクが低いことを示し、Ｃは相対的に再発リスクが高いことを示し、ＢはＡとＣとの中間であることを示す。なお、閾値は各判定方法で同一であってもよいし、異なっていてもよい。
【００４０】
第一の判定方法〜第五の判定方法の何れを用いるかは、悪性腫瘍の種類、パラメータの種類、臨床データとの相関などを考慮して決定することができる。悪性腫瘍の再発リスクを判定する場合、第一及び第四の判定方法の何れかを用いることが好ましく、第四の判定方法を用いることがより好ましい。
【００４１】
第一の判定方法を用いる場合、第三パラメータを第一の閾値と比較する第一比較工程及び第四パラメータを第二の閾値と比較する第二比較工程は、再発リスクを判定する工程の前であれば、どちらを先に実行してもよい。
【００４２】
第二〜第五の判定方法を用いる場合、第三パラメータを第一の閾値と比較する第一比較工程又は第四パラメータを第二の閾値と比較する第二比較工程のうち、まず、いずれか一方の比較工程を実行し、その比較結果に基づいて第一の再発リスク判定工程を実行し、ここで判定が確定されない場合においてのみ、他方の比較工程を実行し、その比較結果に基づいて第二の再発リスク判定工程を実行するようにしてもよい。これにより、より少ないステップで再発リスクの判定を行うことができる。具体的には、第四の判定方法では、第三パラメータを第一の閾値と比較する第一比較工程を実行し、この比較結果に基づいて、前記悪性腫瘍を、Ａ群及び前記Ａ群よりも再発リスクが高い群の何れかに分類する工程を実行し、悪性腫瘍が前記Ａ群よりも再発リスクが高い群に含まれると判定された場合、さらに、第四パラメータを第二の閾値と比較する第二比較工程を実行し、この比較結果に基づいて前記Ａ群よりも再発リスクが高い群を、Ｂ群と前記Ｂ群よりも再発リスクが高いＣ群とに分類する工程を実行する。これにより、より少ないステップで再発リスクの程度の異なる三群に分類することができる。
【００４３】
ＣＤＫは細胞の増殖に深く関わるため、ＣＤＫを用いた比較工程（第一比較工程）を実行することにより、腫瘍細胞の増殖能を精度良く捉えることができる。前述のように細胞の増殖能は細胞の再発リスクを左右する一つの大きな要素である。また、細胞周期関連因子であるサイクリンも細胞の増殖に関連し、悪性腫瘍の再発リスクを判定する有用な因子であるが、判定の精度が充分ではない。また、第一比較工程及び第二比較工程の何れか一方を用いると、悪性腫瘍を再発リスクの異なる二群に分類することができる。さらに、例えば本実施形態の第四の判定方法を用いると、これらの比較工程の結果を組み合わせることにより、第一比較工程の結果を用いて再発リスクが高いと判定された群を、第二比較工程の結果を用いてさらに再発リスクが極めて高い群と一般的な再発率を示す群とに分類することができる。このため、悪性腫瘍の再発リスクをより精度良く予測することができる。
【００４４】
上記のような悪性腫瘍の性質の判定結果は、治療方法を選択する際の指標となり得る。例えば、悪性腫瘍を患う患者に対して化学療法（抗がん剤療法）などのアグレッシブな治療を行なうか、ホルモン療法などのマイルドな治療を行なうかなどを決定する一助となる。また判定結果によって薬剤の投与量や種類を調節することも可能である。
【００４５】
上記本実施形態の方法は、コンピュータにおいて実行されることが好ましい。以下、上記の方法を実施するためのコンピュータシステム（図１）及び判定フロー（図２）について説明する。
【００４６】
図１に示すシステム１００は、コンピュータ本体１１０、必要データをコンピュータ本体１１０に入力する入力デバイス１３０、及び入出力データ等を表示するディスプレイ１２０を備え、さらに必要に応じて外部記録媒体１４０が含まれ得る。ここで、本実施形態のプログラム１４０ａは、外部記録媒体１４０に記録されていてもよいし、コンピュータ本体１１０に備え付けのメモリ１１０ｂ〜１１０ｄに保存されていてもよい。コンピュータ本体１１０内において、ＣＰＵ１１０ａ、メモリ１１０ｂ〜１１０ｄ、入出力インターフェイス１１０ｆ、画像出力インターフェイス１１０ｈ、読出装置１１０ｅは、それぞれバス１１０ｉにて、データの送受信可能なように接続されている。
【００４７】
図２は、上記第一の判定方法による再発リスク判定を実行するためのプログラムの動作を示すフローチャートであり、このプログラムはメモリ１１０ｄに格納されている。
まず、入力デバイス１３０により検体のＣＤＫ２比活性とＣＤＫ１比活性との比（ＣＤＫ２比活性／ＣＤＫ１比活性：第三パラメータ）及びサイクリンの発現量（第四パラメータ）が入力されると、ＣＰＵ１１０aが入出力インターフェイス１１０ｆを介してこれらのパラメータデータを取得し、ＲＡＭ１１０ｃに記憶させる（ステップＳ１１）。
【００４８】
ＣＰＵ１１０aは、予めプログラムのデータとしてメモリ１１０ｄに記憶されていた第三パラメータに対応する閾値、および第四パラメータに対応する閾値を呼び出して、これらの閾値とパラメータデータとの比較を実行する（ステップＳ１２）。
【００４９】
次に、ＣＰＵ１１０aは、比較結果に基づいて再発リスクの予測判定を行う（ステップＳ１３）。ＣＰＵ１１０aは、第三パラメータが閾値以上であり、且つ第四パラメータが閾値以上である場合には、再発リスク「高」と判定する。第三パラメータが閾値以上であり、且つ第四パラメータが閾値未満である場合には、再発リスク「中」と判定する。第三パラメータが閾値未満であり、且つ第四パラメータが閾値以上である場合には、再発リスク「中」と判定する。第三パラメータが閾値未満であり、且つ第四パラメータが閾値未満である場合には、再発リスク「低」と判定する。
【００５０】
そして、ＣＰＵ１１０aは、上記の判定結果を、ＲＡＭ１１０ｃに格納するとともに画像出力インターフェイス１１０ｈを介してディスプレイ１２０に出力する（ステップＳ１４）。
【００５１】
なお、本実施形態においては、各種パラメータデータや活性値、発現量などを、入力デバイス１３０を用いて入力したが、これに限定されるものではなく、例えば、操作者による入力ではなく、各種パラメータデータや活性値、発現量などが測定装置から入出力インターフェイス１１０ｆを介して自動的に取得されるようにしてもよい。また、第三パラメータとして、ＣＤＫ２比活性／ＣＤＫ１比活性の値を入力したが、ＣＤＫ１の発現量と活性値およびＣＤＫ２の発現量と活性値を入力し、ＣＰＵ１１０ａがこれらの値からＣＤＫ２比活性／ＣＤＫ１比活性の値を算出して、この値を閾値との比較に用いてもよい。
【００５２】
（実施例１）
（１）測定用試料の調製
乳がんステージ分類においてステージＩ又はステージＩＩＡに分類される乳がん患者５１名（患者１〜５１）から摘出した腫瘍細胞塊５１検体を用いて、下記のような手順で測定用試料１〜５１を調製した（なお、各患者のステージ分類は下記表１に示される）。
先ず、緩衝液中の腫瘍細胞塊が約１５０ｍｇ／ｍｌとなるように、緩衝液Ａ（０．１ｗ／ｖ％のノニデットＰ−４０（カルビオケム社）、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのフッ化ナトリウム、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム及び１００μｌ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ社）を含む）と腫瘍細胞塊とをチューブに収容した。
電動ホモジナイザを用いて、緩衝液Ａ中で腫瘍細胞塊をホモジナイズし、腫瘍細胞を破砕して細胞可溶化液を調製した。次に、細胞可溶化液を４℃で１５０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清を測定用試料として用いた。
【００５３】
（２）サイクリンＥ及びＧＡＰＤＨ発現量の測定
タンパク質含有量が１５μｇとなる量の測定用試料と、この測定用試料の３分の１の量のＳＤＳローディングバッファ（２００ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ６．８）、４０％のグリセロール、８％のＳＤＳ及び１０％の２−メルカプトエタノールを含む）とを混合し、１００℃で５分間加熱した。
加熱後の測定用試料を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ゲルを室温で１５分間トランスファーバッファー（３９ｍＭのグリシン、４８ｍＭのトリス、０．１％のＳＤＳ及び２０％のメタノールを含む）に浸漬して平衡化した。
ゲル中のタンパク質を、Mini Trans-Blot cell transfer system（バイオラッド社）を用いて１００Ｖ、４℃、一時間でImmobilon FL membrane（ミリポア社）に転写した。
メンブレンを、ブロッキング試薬Ａ（ブロックエース（商品名：大日本製薬）を含む）で３７℃、１時間ブロッキングを行い、さらに洗浄液Ａ（２５ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び０．０２％のＴｗｅｅｎ２０を含む）で洗浄した。
洗浄後、メンブレンに、サイクリンＥに特異的に結合するマウス抗サイクリンＥ抗体（クローンＨＥ）（一次抗体：サンタクルズ社）溶液５ｍｌをブロットし、メンブレンのサイクリンと一次抗体とを反応させた。
メンブレンを２０ｍｌの洗浄液Ａで洗浄した後、メンブレンに、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ウサギ抗マウスＩｇＧ（二次抗体：ダコ社）溶液５ｍｌをブロットし、メンブレンの一次抗体と二次抗体とを反応させた。
メンブレンを２０ｍｌの洗浄液Ａで洗浄した後、メンブレンをＥＣＬｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社）に５分間浸漬し、メンブレンに吸着したサイクリンＥの量を蛍光イメージアナライザMolecular Imager FX（バイオラッド社）によって蛍光の検出を行った。
【００５４】
ＧＡＰＤＨ発現量の測定は、ブロッキング試薬として、ブロッキング試薬Ａではなくブロッキング試薬Ｂ（４％のＢＳＡ、２５ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び０．０２％のＴｗｅｅｎ２０を含む）を用いること、一次抗体として、ウサギ抗サイクリンＥ抗体ではなくウサギ抗ＧＡＰＤＨ抗体を用いること、二次抗体としてＨＲＰ標識ウサギ抗マウスＩｇＧではなく、ビオチン標識化ヤギ抗ウサギ抗体を用いること、及びＥＣＬｐｌｕｓにメンブレンを浸漬するのではなくメンブレン上でFITC conjugated streptavidin（ベクター社）をビオチン標識化ヤギ抗ウサギ抗体に結合させることにより蛍光の検出を行うこと以外は、上述のサイクリンＥの発現量測定と同様の実験手順で行なった。
【００５５】
ＧＡＰＤＨの発現量は、サイクリンＥの発現量の測定値を補正するために用いられた。以下でサイクリンＥの発現量とされる値は、ＧＡＰＤＨの発現量による補正後の値（サイクリンＥ発現量／ＧＡＰＤＨ発現量で算出される値）である。
【００５６】
サイクリンＥ発現量の測定結果は、下記表１に示される。
【００５７】
（３）ＣＤＫ１及びＣＤＫ２発現量の測定
ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社製）をセットしたブロッターの各ウェルに、測定用試料を５０μｌずつ収容し、ウェルの底面、すなわちメンブレンの裏面から負圧約２５０ｍｍＨｇで約３０秒間吸引してメンブレンに測定用試料中のタンパク質を吸着させた。
ウェルに洗浄液Ｂ（２５ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）及び１５０ｍＭのＮａＣｌを含む）を１００μｌ収容し、負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引してメンブレンを洗浄した。
洗浄後、ブロッキング試薬Ｂ（４％のＢＳＡ、２５ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）及び１５０ｍＭのＮａＣｌを含む）を各ウェルに４０μｌ収容し、１５分間静置した後、負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引してメンブレンをブロッキングした。
ブロッキング後、ウェルにＣＤＫ１に特異的に結合するウサギ抗ＣＤＫ１抗体（一次抗体：サンタクルズ社）溶液４０μｌを収容し、室温で約３０分間静置してメンブレンのＣＤＫ１と一次抗体とを反応させた後、ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇで約１５間吸引した。
ウェルに洗浄液Ｂを１００μｌ収容し、負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引してメンブレンを洗浄した。
ウェルにビオチン化した抗ウサギＩｇＧ−Ｂ抗体（二次抗体：サンタクルズ社）溶液４０μｌを収容し、室温で約３０分間静置してメンブレンの一次抗体と二次抗体とを反応させた後、ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇで約１５秒間吸引した。
ウェルに洗浄液Ｂを１００μｌ収容し、負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引してメンブレンを洗浄した。
ウェルにＦＩＴＣで標識したストレプトアビジンを含む標識溶液５０μｌを収容し、室温で約３０分間静置して、メンブレンの二次抗体をＦＩＴＣで標識した後、ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇで約１５秒間吸引した。
ウェルに洗浄液Ｂを５０μｌ収容し、負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引した。これを５回繰り返し、メンブレンを洗浄した。
メンブレンをブロッターからとりはずし、２０％メタノール約５分間濯ぎ、約２０分間室温で乾燥させた後、メンブレンに吸着されたタンパク質の蛍光強度を、蛍光イメージアナライザMolecular Imager FX（バイオラッド社）によって分析、測定した。測定値は検量線をもとに算出した。
【００５８】
検量線は、０．００５％のノニデットＰ−４０及び５０μｇ／ｍｌのＢＳＡを含む洗浄液Ｂ中に、５種類の濃度の組換えＣＤＫ１を溶解した溶液を、上記と同様に処理したウェルに５０μｌずつ注入し、上記と同様の実験手順でＦＩＴＣ標識し、蛍光強度を測定して、蛍光強度とＣＤＫ１発現量との関係を表すことにより検量線を作成した。
【００５９】
ＣＤＫ２発現量の測定は、一次抗体としてウサギ抗ＣＤＫ１抗体ではなくウサギ抗ＣＤＫ２抗体を用いること以外は上述のＣＤＫ１の発現量測定と同様の実験手順で行なった。
【００６０】
（４）ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の活性測定
１．５ｍｌエッペンドルフチューブに緩衝液Ａを５００μｌ収容し、さらに測定用試料を添加した。測定用試料は、チューブに収容した混合液中の全タンパク質量が１００μｇとなるように調節して添加された。
ここに抗ＣＤＫ１抗体（サンタクルズ社）２μｇ及び２０μｌのプロテインＡをコートしたセファロースビーズ（バイオラッド社）を加えて４℃、１時間静置してＣＤＫ１と抗ＣＤＫ１抗体とを反応させた。
反応後、ビーズをビーズ洗浄用緩衝液（０．１ｗ／ｖ％のノニデットＰ−４０及び５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．０）を含む）で三回洗浄し、１５μｌの溶解緩衝液Ａ中に再懸濁させて、抗ＣＤＫ１抗体を介してＣＤＫ１が結合したセファロースビーズを含む試料を得た。
この試料に、ＣＤＫ１の基質溶液（１０μｇヒストンＨ１（アップステイトバイオテクノロジー社）１０μｇ、５ｍＭのＡＴＰ−γＳ（シグマ社）、２０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）及び０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）を添加した。基質溶液は、チューブに収容した混合液の総量が５０μｌとなるように調節して添加された。これを３７℃で１０分間震蕩してキナーゼ反応を行ない、ヒストンＨ１にモノチオリン酸基を導入した。
キナーゼ反応後、２０００ｒｐｍで２０秒間遠心分離してビーズを沈殿させ、上清１８μｌを採取した。
この上清に、結合緩衝液（１５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ９．２）及び５ｍＭのＥＤＴＡを含む）１５μｌと、１０ｍＭのヨードアセチルビオチン溶液（１００ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．５）及び１ｍＭのＥＤＴＡを含む）とを添加して９０分間、室温、暗所で静置することにより、モノチオリン酸基を導入された基質（モノチオリン酸化基質）の硫黄原子にヨードアセチルビオチンを結合させた。
ヨードアセチルビオチンとモノチオリン酸基との反応の停止は、２−メルカプトエタノールの添加により行なった。
ヨードアセチルビオチンが結合したモノチオリン酸化基質０．４μｇを含む試料を、スロットブロッターを用いてＰＶＤＦメンブレン上にブロットした。
このＰＶＤＦメンブレンを１ｗ／ｖ％のＢＳＡを含む溶液でブロッキングし、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（ベクター社）を添加して３７℃で一時間反応させた。
反応後、ＰＶＤＦメンブレンを５０ｍＭの洗浄液Ｂで三回洗浄した。
洗浄後、蛍光イメージアナライザMolecular Imager FX（バイオラッド社）を用いてＰＶＤＦメンブレンの蛍光分析を行なった。活性値は、検量線に基づいて算出された。
【００６１】
検量線は、二種類の濃度のタンパク質（ビオチン標識免疫グロブリン）を含む溶液をＰＶＤＦメンブレンにブロットし、上記と同様の方法でＦＩＴＣ標識し、タンパク質の蛍光強度を蛍光イメージアナライザで測定することによって作成した。従って、測定されるＣＤＫ１の活性１Ｕ（ユニット）は、前記タンパク質１ｎｇのときの蛍光量と同等の蛍光強度を示す値をいう。
【００６２】
ＣＤＫ２の活性値は、抗ＣＤＫ１抗体ではなく、抗ＣＤＫ２抗体（サンタクルズ社）を用いること以外はＣＤＫ１の活性値の測定と同様にして測定された。
【００６３】
（５）ＣＤＫ比活性の算出
上記で測定したＣＤＫ活性値及びＣＤＫ発現量から、下記式により、ＣＤＫ比活性（ｍＵ／ｎｇ）を算出した。
ＣＤＫ比活性＝ＣＤＫ活性値／ＣＤＫ発現量
【００６４】
算出されたＣＤＫ１の比活性及びＣＤＫ２の比活性を基に、ＣＤＫ１比活性とＣＤＫ２比活性との比（ＣＤＫ２比活性／ＣＤＫ１比活性；以下、比活性の比とする）を算出した。ＣＤＫ１比活性、ＣＤＫ２比活性及び比活性の比は、下記表１に示される。
【００６５】
（６）閾値の設定及び再発リスク判定
サイクリンＥ発現量に対応する閾値と、比活性の比に対応する閾値とを設定した。サイクリンＥ発現量と閾値との比較結果と、比活性の比と閾値との比較結果とを組み合わせて悪性腫瘍の性質の判定を行なった。
【００６６】
比活性の比の閾値は、４６に設定した。この値は、乳がん患者１２９名から採取した腫瘍細胞１２９検体の比活性の比を算出し、比活性の比の値を小さい方から順に並べた際に、１２９検体を６５：６４に分離できる値である。比活性の比の値が４６以上の場合に「Ｈｉｇｈ」とし、４６未満の場合に「Ｌｏｗ」とした。また、ＣＤＫ１比活性が２０未満且つＣＤＫ２比活性が５００未満の場合は比活性の比の値に関わらず「Ｌｏｗ」とした。さらに、ＣＤＫ２比活性が１００００以上の場合は比活性の比の値に関わらず「Ｈｉｇｈ」とした。この比較結果は、下記表１に示される。
【００６７】
サイクリンＥ発現量の閾値は、１．７に設定した。この値は、患者１〜６１の再発の有無と、比活性の比と対応する閾値との比較結果を考慮に入れて設定された値である。サイクリンＥ発現量が１．７以上の場合は「Ｈｉｇｈ」とし、０．７未満の場合は「Ｌｏｗ」とした。この比較結果は、下記表１に示される。
【００６８】
これらの比較結果を用い、下記判定条件に基づいて再発リスク判定を行なった。
比活性の比と閾値との比較結果が「Ｌｏｗ」であった場合は、サイクリンＥの発現量に関わらず、「再発リスク低」と判定した。
比活性の比と閾値との比較結果が「Ｈｉｇｈ」であり、サイクリンＥ発現量と閾値との比較結果が「Ｌｏｗ」であった場合は、「再発リスク中」と判定した。
比活性の比と閾値との比較結果が「Ｈｉｇｈ」であり、サイクリンＥ発現量と閾値との比較結果が「Ｈｉｇｈ」であった場合は、「再発リスク高」と判定した。
【００６９】
再発リスク判定において、「再発リスク低」と判定された腫瘍細胞は、細胞の増殖能が低く、生存能や移動能なども低いと考えられるため、再発の可能性は低いと解される。「再発リスク中」と判定された腫瘍細胞は、「再発リスク低」と判定された腫瘍細胞よりも再発のリスクが高いと解される。「再発リスク高」と判定された腫瘍細胞は、「再発リスク中」と判定された腫瘍細胞よりも再発のリスクが高いと解される。
【００７０】
再発リスクの判定結果及び再発の有無を下記表１に示す。表中「再発」の列において、０は「再発無し」を示し、１は「再発有り」を示す。なお、再発の有無は、患者１〜５１から腫瘍細胞塊を摘出した後、各患者に対してホルモン治療を施し、摘出手術後５年間で再発が認められたか否かを示したものである。
【００７１】
【表１】
2007259846.tif 000002
【００７２】
表１において、発現量や活性値が検出限界以下であった場合は０として取り扱った。また、ＣＤＫ１比活性が０であり、ＣＤＫ２比活性が０よりも高値であった場合は、比活性の比が「無限大（∞）」であるとし、比活性の比の閾値４６に比べて「Ｈｉｇｈ」であると判定した。また、ＣＤＫ１比活性及びＣＤＫ２比活性の両方が０であった場合は、比活性の比が「０」であるとし、比活性の比の閾値４６に比べて「Ｌｏｗ」であると判定した。なお、表１において患者３５は、比活性の比が無限大となっているが、ＣＤＫ１比活性が２０未満且つＣＤＫ２比活性が５００未満であるため、上述の通り、比活性の比と閾値４６との比較結果は、「Ｌｏｗ」となった。
【００７３】
再発リスク毎の再発率を下記表２に示す。表２において、「患者数」の列には、各再発リスクの患者の総数が示されており、「再発者数」の列には、各再発リスクの患者のうち悪性腫瘍の再発が確認された患者数を示す。再発リスク高と判定された患者５名（患者１〜５）は何れも、ホルモン治療を行ったにも関わらず術後５年間で再発を起こした（再発率１００％）。再発リスク中と判定された患者１１名（患者６〜１６）のうち術後５年間で再発を起こしたのは二名であった（再発率１８％）。再発リスク低と判定された患者３５名（患者１７〜５１）は何れも術後５年間では再発を起こさなかった（再発率０％）。
【００７４】
【表２】
2007259846.tif 000003
【００７５】
以上の結果より、本実施例の方法によって「再発リスク高」と判定された場合は、ホルモン治療を行っても悪性腫瘍が再発する可能性が非常に高い、と予想することができる。また、「再発リスク低」と判定された場合は、ホルモン治療を行うと悪性腫瘍が再発する可能性が非常に低くなる、と予想することができる。また、「再発リスク中」と判定された患者に対してホルモン治療を行った場合の再発率１８％は、一般的な早期乳がんの再発率（１０〜２０％）とほぼ等しい。
【００７６】
特に、本実施例の方法によると、ＣＤＫ比活性の比と閾値との比較結果が「Ｈｉｇｈ」である患者を、サイクリンの発現量と閾値との比較結果を用いて「再発リスク高」及び「再発リスク中」の何れかに細分類することができ、再発予測の精度を向上することができる。
【００７７】
（実施例２）
（１）測定用試料の調製
乳がんステージ分類においてステージＩ又はステージＩＩＡに分類される乳がん患者７６名（患者１〜７６）から摘出した腫瘍細胞塊７６検体を用いて、実施例１の測定用試料の調製と同様の手順で測定用試料１〜７６を調製した（なお、各患者のステージ分類は下記表３及び表４に示される）。
【００７８】
（２）サイクリンＢ１発現量の測定
サイクリンＢ１の発現量の測定は、一次抗体としてウサギ抗ＣＤＫ１抗体ではなく、サイクリンＢ１に特異的に結合するウサギ抗サイクリンＢ１抗体（サンタクルズ社）を用いること以外は実施例１のＣＤＫ１の発現量測定と同様の実験手順で行なった。
【００７９】
（３）ＣＤＫ１及びＣＤＫ２発現量の測定
ＣＤＫ１及びＣＤＫ２発現量の測定は、実施例１のＣＤＫ１及びＣＤＫ２の発現量測定と同様の実験手順で行なった。
【００８０】
（４）ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の活性測定
ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の活性の測定は、実施例１のＣＤＫ１及びＣＤＫ２の活性測定と同様の実験手順で行なった。
【００８１】
（５）ＣＤＫ比活性の算出
ＣＤＫ１比活性、ＣＤＫ２比活性及びＣＤＫ１比活性とＣＤＫ２比活性との比（比活性の比）は、実施例１のＣＤＫ比活性の算出で用いた式と同じ式を用いて算出した。
ＣＤＫ１比活性、ＣＤＫ２比活性及び比活性の比は、下記表３及び表４に示される。
【００８２】
（６）閾値の設定及び再発リスク判定
サイクリンＢ１発現量に対応する閾値と、比活性の比に対応する閾値とを設定した。サイクリンＢ１発現量と閾値との比較結果と、比活性の比と閾値との比較結果とを組み合わせて悪性腫瘍の性質の判定を行なった。
【００８３】
比活性の比の閾値は、４６に設定した。この値は、乳がん患者１２９名から採取した腫瘍細胞１２９検体の比活性の比を算出し、比活性の比の値を小さい方から順に並べた際に、１２９検体を６５：６４に分離できる値である。比活性の比の値が４６以上の場合に「Ｈｉｇｈ」とし、４６未満の場合に「Ｌｏｗ」とした。また、ＣＤＫ１比活性が２０未満且つＣＤＫ２比活性が５００未満の場合は比活性の比の値に関わらず「Ｌｏｗ」とした。さらに、ＣＤＫ２比活性が１００００以上の場合は比活性の比の値に関わらず「Ｈｉｇｈ」とした。この比較結果は、下記表３及び表４に示される。
【００８４】
サイクリンＢ１発現量の閾値は、０．０１９５に設定した。この値は、患者１〜７６の再発の有無と、比活性の比と対応する閾値との比較結果を考慮に入れて設定された値である。サイクリンＢ１発現量が０．０１９５以上の場合は「Ｈｉｇｈ」とし、０．０１９５未満の場合は「Ｌｏｗ」とした。この比較結果は、下記表３及び表４に示される。
【００８５】
これらの比較結果を用い、下記判定条件に基づいて再発リスク判定を行なった。
比活性の比と閾値との比較結果が「Ｌｏｗ」であり、サイクリンＢ１発現量と閾値との比較結果が「Ｌｏｗ」であった場合は、「再発リスク低」と判定した。
比活性の比と閾値との比較結果が「Ｈｉｇｈ」であり、サイクリンＢ１発現量と閾値との比較結果が「Ｌｏｗ」であった場合は、「再発リスク中」と判定した。また、比活性の比と閾値との比較結果が「Ｌｏｗ」であり、サイクリンＢ１発現量と閾値との比較結果が「Ｈｉｇｈ」であった場合も、「再発リスク中」と判定した。
比活性の比と閾値との比較結果が「Ｈｉｇｈ」であり、サイクリンＢ１発現量と閾値との比較結果が「Ｈｉｇｈ」であった場合は、「再発リスク高」と判定した。
【００８６】
再発リスク判定において、「再発リスク低」と判定された腫瘍細胞は、細胞の増殖能が低く、生存能や移動能なども低いと考えられるため、再発の可能性は低いと解される。「再発リスク中」と判定された腫瘍細胞は、「再発リスク低」と判定された腫瘍細胞よりも再発のリスクが高いと解される。「再発リスク高」と判定された腫瘍細胞は、「再発リスク中」と判定された腫瘍細胞よりも再発のリスクが高いと解される。
【００８７】
再発リスクの判定結果及び再発の有無を下記表３及び表４に示す。表中「再発」の列において、０は「再発無し」を示し、１は「再発有り」を示す。なお、再発の有無は、腫瘍細胞塊を摘出した後に治療を施さなかったもしくはホルモン治療を施した患者１〜７６について、摘出手術後５年間で再発が認められたか否かを示したものである。
【００８８】
【表３】
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【００８９】
【表４】
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【００９０】
表３及び表４において、発現量や活性値が検出限界以下であった場合は０として取り扱った。また、ＣＤＫ１比活性が０であり、ＣＤＫ２比活性が０よりも高値であった場合は、比活性の比が「無限大（∞）」であるとし、比活性の比の閾値４６に比べて「Ｈｉｇｈ」であると判定した。また、ＣＤＫ１比活性及びＣＤＫ２比活性の両方が０であった場合は、比活性の比が「０」であるとし、比活性の比の閾値４６に比べて「Ｌｏｗ」であると判定した。なお、表４において患者５８は、比活性の比が無限大となっているが、ＣＤＫ１比活性が２０未満且つＣＤＫ２比活性が５００未満であるため、上述の通り、比活性の比と閾値４６との比較結果は、「Ｌｏｗ」となった。
【００９１】
再発リスク毎の再発率を下記表５に示す。表５において、「患者数」の列には、各再発リスクの患者の総数が示されており、「再発者数」の列には、各再発リスクの患者のうち悪性腫瘍の再発が確認された患者数を示す。再発リスク高と判定された患者１５名（患者１〜１５）は何れも、ホルモン治療を行ったにも関わらず１５人中９人が術後５年間で再発を起こした（再発率６０％）。なお、「再発リスク高」と判定された患者に対してホルモン治療を行った場合の再発率６０％は、ステージ分類でステージＩＩＩに分類される乳がんの再発率と同等である。「再発リスク中」と判定された患者２９名（患者１６〜４４）のうち術後５年間で再発を起こしたのは二名であった（再発率６．９％）。なお、この二名のうち、患者２２は比活性の比と閾値との比較結果では「Ｌｏｗ」に分類され、患者４４はサイクリンＢ１発現量と閾値との比較結果では「Ｌｏｗ」に分類される。「再発リスク低」と判定された患者３２名（患者４５〜７６）は何れも術後５年間では再発を起こさなかった（再発率０％）。
【００９２】
【表５】
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【００９３】
以上の結果より、本実施例の方法によって「再発リスク高」と判定された場合は、ホルモン治療を行っても悪性腫瘍が再発する可能性が高い、と予想することができる。また、「再発リスク低」と判定された場合は、ホルモン治療を行うと悪性腫瘍が再発する可能性が非常に低くなる、と予想することができる。
【００９４】
特に、本実施例の方法によると、ＣＤＫ比活性の比と閾値との比較結果とサイクリンの発現量と閾値との比較結果とを組み合わせることにより、個々の比較結果では「Ｌｏｗ」と分類されてしまう患者の中から再発する可能性のある患者を「再発リスク中」として分類することができ、再発予測の精度を向上することができる。
【００９５】
上述したような再発リスクの予測結果は、悪性腫瘍患者の治療方針を決定する際の指標として有用である。例えば、再発リスク高と判定された場合はよりアグレッシブな治療法（例えば、化学療法など）を選択することができる。また、再発リスク中と判定された場合は、その患者に応じて、他の様々な要因（例えば、年齢、核異型度、腫瘍径など）を複合的に鑑みて治療方法を選択することができる。また、再発リスク低と判定された場合は、副作用が強く経済的負担の重い化学療法ではなく、ホルモン治療によって再発を抑制できる可能性が高いことがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】本実施形態の方法を実施するためのコンピュータシステムの概略図である。
【図２】第一の判定方法に基づいた判定フローである。
【図１】
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【図２】
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