(57)【要約】【課題】ＳＨ３ドメインに結合する領域を有するペプチドの固定方法の提供。【解決手段】ＳＨ３ドメインに結合する領域を有するペプチドの同定方法であって、  （ａ）ＳＨ３ドメインを含む標的タンパク質を固定化し；  （ｂ）この固定化標的タンパク質を、ランダムペプチドライブラリーから分取したアリコートとともにインキュベートし；  （ｃ）固定化標的タンパク質から未結合ペプチドを洗い流し；  （ｄ）固定化標的タンパク質に結合したペプチドを回収し；そして  （ｅ）ＳＨ３ドメイン結合性ペプチドの一次配列を決定する；ことを含んでなる方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳｒｃのＳＨ３ドメインに対する結合親和性を示し、かつ９個以上で４５個までのアミノ酸残基を有するペプチドであって、該ペプチドの任意の場所に式：Ｒ−２−Ｌ−Ｐ−５−６−Ｐ−８−９（配列番号１０）〔式中、各数字はアミノ酸残基を表すもので、２はシステイン以外の任意のアミノ酸残基を表し、５および６はそれぞれ疎水性アミノ酸残基を表し、８はシステイン以外の任意のアミノ酸残基を表し、９はシステイン以外の親水性アミノ酸残基を表し、そして各文字は対応アミノ酸の標準一文字表記である〕のアミノ酸配列が配置されているが、Ｒ−Ｐ−Ｌ−Ｐ−Ｐ−Ｌ−Ｐ−Ｔ−Ｓ（配列番号１１）であることはない上記のペプチド。
【請求項２】
２がＰ、Ｒ、Ａ、Ｌ、Ｑ、ＥまたはＳである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
５がＰ、Ｍ、ＩまたはＬである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
６がＰ、Ｌ、ＩまたはＶである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
８がＴ、Ｒ、Ｐ、Ｉ、Ｎ、Ｅ、Ｖ、Ｓ、Ａ、ＧまたはＬである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
９がＴ、Ｒ、Ｓ、ＨまたはＤである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項７】
式１０、１０−１１、１０−１１−１２、１０−１１−１２−１３（配列番号１２）または１０−１１−１２−１３−１４（配列番号１３）〔式中、各数字はシステイン以外の任意のアミノ酸残基を表し、１０がペプチド結合で９に結合されている〕のＣ末端フランキングアミノ酸配列をさらに含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項８】
１０がＴ、Ｒ、Ｌ、Ｓ、Ｄ、Ｐ、ＡまたはＮである、請求項７に記載のペプチド。
【請求項９】
１１がＲ、Ｐ、Ａ、Ｑ、ＳまたはＴである、請求項７に記載のペプチド。
【請求項１０】
１２がＰ、Ｓ、ＲまたはＴである、請求項７に記載のペプチド。
【請求項１１】
１３がＰ、Ｓ、Ｒ、Ｆ、ＨまたはＴである、請求項７に記載のペプチド。
【請求項１２】
１４がＳ、Ｒ、ＧまたはＴである、請求項７に記載のペプチド。
【請求項１３】
式１’、２’−１’、３’−２’−１’または４’−３’−２’−１’（配列番号１４）〔式中、各数字はシステイン以外の任意のアミノ酸残基を表し、１’がペプチド結合でＲに結合されている〕のＮ末端フランキングアミノ酸配列をさらに含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１４】
１’がＴ、Ｐ、Ｓ、Ｎ、Ｆ、Ｗ、Ｋ、Ｈ、ＱまたはＧである、請求項13に記載のペプチド。
【請求項１５】
２’がＳ、Ｔ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、ＡまたはＨである、請求項13に記載のペプチド。
【請求項１６】
３’がＲ、Ｓ、Ｐ、Ｇ、Ａ、Ｖ、ＹまたはＬである、請求項13に記載のペプチド。
【請求項１７】
４’がＲ、Ｓ、Ｖ、Ｔ、Ｇ、ＬまたはＦである、請求項13に記載のペプチド。
【請求項１８】
ＳｒｃのＳＨ３ドメインに対する結合親和性を示し、かつ１３個以上で４５個までのアミノ酸残基を有するペプチドであって、該ペプチドの任意の場所に式：３’−２’−１’−Ｒ−２−Ｌ−Ｐ−５−６−Ｐ−８−９−１０（配列番号１５）〔式中、各数字はアミノ酸残基を表すもので、３’、２’、１’、２、８および１０はそれぞれシステイン以外の任意のアミノ酸残基を表し、５および６はそれぞれ疎水性アミノ酸残基を表し、９はシステイン以外の親水性アミノ酸残基を表し、そして各文字は対応アミノ酸の標準一文字表記である〕のアミノ酸配列が配置されている上記のペプチド。
【請求項１９】
５がＰまたはＭである、請求項18に記載のペプチド。
【請求項２０】
１’がＴ、Ｐ、ＳまたはＮである、請求項18に記載のペプチド。
【請求項２１】
２’がＳまたはＴである、請求項18に記載のペプチド。
【請求項２２】
３’がＲまたはＳである、請求項18に記載のペプチド。
【請求項２３】
１０がＴまたはＲである、請求項18に記載のペプチド。
【請求項２４】
ＳｒｃのＳＨ３ドメインに対する結合親和性がペプチドＲＰＬＰＰＬＰにより示される結合親和性より少なくとも３倍大きい、請求項１に記載のペプチド。
【請求項２５】
ＳｒｃのＳＨ３ドメインに対する結合親和性がペプチドＲＰＬＰＰＬＰ（配列番号９）により示される結合親和性より少なくとも３倍大きい、請求項18に記載のペプチド。
【請求項２６】
ＳｒｃのＳＨ３ドメインに対する結合親和性がペプチドＲＰＬＰＰＬＰ（配列番号９）により示される結合親和性より少なくとも４倍大きい、請求項１に記載のペプチド。
【請求項２７】
ＳｒｃのＳＨ３ドメインに対する結合親和性がペプチドＲＰＬＰＰＬＰ（配列番号９）により示される結合親和性より少なくとも４倍大きい、請求項18に記載のペプチド。
【請求項２８】
Ａｂｌ、Ｇｒｂ２、ＰＬＣ−δ、ＰＬＣ−γ、Ｒａｓ ＧＡＰ、Ｎｃｋ、ｐ８５ ＰＩ−３’キナーゼ、およびこれらに関連したタンパク質のＳＨ３ドメインに対する一般的結合親和性をさらに示す、請求項１に記載のペプチド。
【請求項２９】
ＳｒｃおよびＳｒｃ関連タンパク質のＳＨ３ドメインに対する選択的結合親和性を示す、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３０】
Ａｂｌ、Ｇｒｂ２、ＰＬＣ−δ、ＰＬＣ−γ、Ｒａｓ ＧＡＰ、Ｎｃｋ、ｐ８５ ＰＩ−３’キナーゼ、およびこれらに関連したタンパク質のＳＨ３ドメインに対する一般的結合親和性をさらに示す、請求項18に記載のペプチド。
【請求項３１】
ＳｒｃおよびＳｒｃ関連タンパク質のＳＨ３ドメインに対する選択的結合親和性を示す、請求項18に記載のペプチド。
【請求項３２】
アミノ酸配列：ＲＳＴＰＲＰＬＰＭＬＰＴＴＲ（配列番号６２）を有するペプチド。
【請求項３３】
アミノ酸配列：ＲＳＴＰＲＰＬＰＰＬＰＴＴＲ（配列番号６７）を有するペプチド。
【請求項３４】
アミノ酸配列：ＧＩＬＡＰＰＶＰＰＲＮＴＲ（配列番号６３）を有するペプチド。
【請求項３５】
アミノ酸配列：ＶＬＫＲＰＬＰＩＰＰＶＴＲ（配列番号６４）を有するペプチド。
【請求項３６】
アミノ酸配列：ＧＰＨＲＲＬＰＰＴＰＡＴＲ（配列番号６５）を有するペプチド。
【請求項３７】
アミノ酸配列：ＡＮＰＳＰＡＴＲＰＬＰＴＲ（配列番号６６）を有するペプチド。
【請求項３８】
ＲＳＴＲＰＬＰＩＬＰＲＴＴ、ＳＴＰＲＰＬＰＭＬＰＴＴＲ、ＳＴＮＲＰＬＰＭＩＰＴＴＲ、ＲＳＴＲＰＬＰＳＬＰＩＴＴ、ＳＴＳＲＰＬＰＳＬＰＴＴＲ、ＲＳＴＲＳＬＰＰＬＰＰＴＴ、ＲＳＴＲＱＬＰＩＰＰＴＴＴ、ＳＴＰＲＰＬＰＬＩＰＴＴＰ、ＲＳＴＲＰＬＰＰＴＰＬＴＴ、およびＲＳＴＲＰＱＰＰＰＰＩＴＴ（配列番号８５−９４）よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項３９】
ＶＬＫＲＰＬＰＩＰＰＶＴＲ（配列番号６４）、ＹＳＴＲＰＶＰＰＩＴＲＰＳ（配列番号７６）、ＳＨＫＳＲＬＰＰＬＰＴＲＰ（配列番号７７）、ＧＰＨＲＲＬＰＰＴＰＡＴＲ（配列番号６５）、ＰＡＴＲＰＬＰＴＲＰＳＲＴ（配列番号
８１）、およびＳＧＧＩＬＡＰＰＶＰＰＲＮ（配列番号８４）よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項４０】
ＰＰＮＳＰＬＰＰＬＰＴＨＬ（配列番号７２）、ＴＧＲＧＰＬＰＰＬＰＮＤＳ（配列番号７４）、ＹＲＦＲＡＬＰＳＰＰＳＡＳ、ＬＡＱＲＱＬＰＰＴＰＧＲＤ、ＡＬＱＲＲＬＰＲＴＰＰＰＡ（配列番号７８−８０）、ＹＳＴＲＰＬＰＳＲＰＳＲＴ、およびＸＰＧＲＩＬＬＬＰＳＥＰＲ（配列番号８２−８３）よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項４１】
請求項１に記載のペプチドをコードする核酸またはその相補鎖を含む構築物。
【請求項４２】
ＤＮＡポリヌクレオチドである、請求項41に記載の構築物。
【請求項４３】
ＲＮＡポリヌクレオチドである、請求項41に記載の構築物。
【請求項４４】
請求項18に記載のペプチドをコードする核酸またはその相補鎖を含む構築物。
【請求項４５】
ＤＮＡポリヌクレオチドである、請求項44に記載の構築物。
【請求項４６】
ＲＮＡポリヌクレオチドである、請求項44に記載の構築物。
【請求項４７】
形質転換用のベクターである、請求項41に記載の構築物。
【請求項４８】
形質転換用のベクターである、請求項44に記載の構築物。
【請求項４９】
請求項47に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項５０】
請求項48に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項５１】
請求項１に記載のペプチドおよび第２の分子を含んでなるコンジュゲート。
【請求項５２】
第２の分子がアミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸、ヌクレオシド、グリコシド残基、標識、薬剤または小分子よりなる群から選ばれる、請求項51に記載のコンジュゲート。
【請求項５３】
ＳＨ３ドメイン結合性ペプチドおよび該ペプチドに直接的に、間接的にまたは複合体化により結合された検出可能な標識を含んでなる、ＳＨ３ドメインを検出するための診断用キットであって、該ペプチドが(i)式ＲＸＬＰφφＰ（配列番号７１）〔式中、Ｘはシステイン以外の任意のアミノ酸を表し、φは疎水性アミノ酸残基を表し、各文字は対応アミノ酸残基の標準一文字表記を表す〕のコア配列モチーフ；および(ii)該コア配列にそのＣ末端、Ｎ末端または両末端で隣接する２個以上の追加のアミノ酸残基；を含むことを特徴とする上記の診断用キット。
【請求項５４】
ＳＨ３ドメイン結合性ペプチドおよび該ペプチドに直接的に、間接的にまたは複合体化により結合された薬剤を含んでなるドラッグデリバリーシステムであって、該ペプチドが(i)式ＲＸＬＰφφＰ（配列番号７１）〔式中、Ｘはシステイン以外の任意のアミノ酸を表し、φは疎水性アミノ酸残基を表し、各文字は対応アミノ酸残基の標準一文字表記を表す〕のコア配列モチーフ；および(ii)該コア配列にそのＣ末端、Ｎ末端または両末端で隣接する２個以上の追加のアミノ酸残基；を含むことを特徴とする上記のドラッグデリバリーシステム。
【請求項５５】
非経口的に、経口的に、腸内に、局所的に、または吸入により投与することができる、請求項54に記載のドラッグデリバリーシステム。
【請求項５６】
鼻腔内に、眼内に、または膣内に投与することができる、請求項54に記載のドラッグデリバリーシステム。
【請求項５７】
固体、ゲル、液体またはエーロゾルの形態である、請求項54に記載のドラッグデリバリーシステム。
【請求項５８】
有効量の請求項１に記載のペプチドおよび担体を含む組成物を投与することを含んでなる、ＳｒｃまたはＳｒｃ関連タンパク質の活性をモジュレートする方法。
【請求項５９】
ＳｒｃまたはＳｒｃ関連タンパク質の活性を抑制する、請求項58に記載の方法。
【請求項６０】
ＳｒｃまたはＳｒｃ関連タンパク質を活性化する、請求項58に記載の方法。
【請求項６１】
ＳＨ３ドメインに結合する領域を有するペプチドの同定方法であって、
(a)ＳＨ３ドメインを含む標的タンパク質を固定化し；
(b)この固定化標的タンパク質を、ランダムペプチドライブラリーから分取したアリコートとともにインキュベートし；
(c)固定化標的タンパク質から未結合ペプチドを洗い流し；
(d)固定化標的タンパク質に結合したペプチドを回収し；そして
(e)ＳＨ３ドメイン結合性ペプチドの一次配列を決定する；
ことを含んでなる方法。
【請求項６２】
前記のライブラリーが表示ランダムペプチドライブラリーである、請求項61に記載の方法。
【請求項６３】
前記のライブラリーがファージ表示ランダムペプチドライブラリーである、請求項62に記載の方法。
【請求項６４】
前記のライブラリーがファージミド表示ランダムペプチドライブラリーである、請求項62に記載の方法。
【請求項６５】
ステップ(c)が固定化標的タンパク質から未結合ファージを洗い流すことを含み、ステップ(d)が固定化標的タンパク質に結合したファージを回収することを含み、そしてステップ(e)が結合しているファージの核酸の関係のあるヌクレオチド配列を決定し、これからＳＨ３ドメイン結合性ペプチドに対応する一次配列を推定することを含む、請求項61に記載の方法。
【請求項６６】
ＳＨ３ドメインに結合する領域を有するペプチドの同定方法であって、
(a)ＳＨ３ドメインを含む標的タンパク質を固定化し；
(b)この固定化標的タンパク質を、ファージ表示ランダムペプチドライブラリー（該ライブラリーは≧８アミノ酸残基のランダム配列を有するペプチドを含む）から分取したアリコートとともにインキュベートし；
(c)固定化標的タンパク質から未結合ファージを洗い流し；
(d)固定化標的タンパク質に結合したファージを回収し；そして
(e)結合しているファージの核酸の関係のあるヌクレオチド配列を決定し、ＳＨ３ドメイン結合性ペプチドに対応する一次配列を推定する；
ことを含んでなる方法。
【請求項６７】
回収したファージの力価を増幅することをさらに含む、請求項66に記載の方法。
【請求項６８】
ＳＨ３ドメイン結合性ペプチドを富化したファージを得るためにインキュベーション、洗浄および回収のステップを繰り返すことをさらに含む、請求項66に記載の方法。
【請求項６９】
ＳＨ３ドメイン結合性ペプチドおよび製剤学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物であって、該ペプチドが(i)式ＲＸＬＰφφＰＸψ（配列番号１０）〔式中、Ｘはシステイン以外の任意のアミノ酸を表し、φは疎水性アミノ酸残基を表し、ψはシステイン以外の親水性アミノ酸残基を表し、各文字は対応アミノ酸残基の標準一文字表記を表す〕の9-mer配列モチーフ；および場合により、(ii)該9-mer配列にそのＣ末端、Ｎ末端または両末端で隣接する追加のアミノ酸残基（該9-mer配列を加えて合計４５個までのアミノ酸残基）；を含むことを特徴とする上記の医薬組成物。
【請求項７０】
少なくとも１個の追加のアミノ酸が前記の9-mer配列に隣接して存在する、請求項69に記載の組成物。
【請求項７１】
少なくとも２個の追加のアミノ酸が前記の9-mer配列に隣接して存在する、請求項69に記載の組成物。
【請求項７２】
少なくとも３個の追加のアミノ酸が前記の9-mer配列に隣接して存在する、請求項69に記載の組成物。
【請求項７３】
有効量の請求項１に記載のペプチドを投与することを含んでなる、タンパク質チロシンキナーゼ媒介シグナル伝達経路の中断方法。
【請求項７４】
有効量の請求項１に記載のペプチドを投与することによる、ＲＮＡのプロセシング、トラフィッキング(trafficking)または翻訳の調節方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．発明の属する技術分野
本発明は、広範囲の結合特異性を有するＳＨ３結合性ペプチドに関する。ここで開示するＳＨ３結合性ペプチドの中には、ＳＨ３ドメインを含む別のタンパク質由来のＳＨ３ドメインとほぼ同じ容易さで結合するものがある。これとは対照的に、別のメンバーでは、特異的なＳＨ３ドメインに対してはるかに大きな親和性で結合するものがある。このＳＨ３結合性ペプチドを、ファージ表示のランダムペプチドライブラリーから得ることができる。ここでは、ＳＨ３ドメインターゲットに結合するファージクローンを得る方法、それらの関連ヌクレオチド配列、および、その結合性ペプチドの一次アミノ酸配列を決定する方法を説明する。ここで得られるＳＨ３結合性タンパク質は多くの点で有用で、細胞レベルでのシグナル伝達経路を調節する方法、発癌性タンパク質の活性を調節する方法ないしはシグナル伝達に関与するタンパク質の広いクラスおよび特異的なクラスを調節する能力のある薬剤を開発するためにリード化合物を提供するなどにおいて利用できるがこれらに限定されるものではない。
【背景技術】
【０００２】
２．発明の背景
２．１． ＳｒｃおよびＳＨ３ドメイン 
真核細胞シグナリングに関与している相当数のタンパク質には、ＳＨ３ドメインと呼ばれるコンセンサス配列モチーフがある。それは５０−７０個のアミノ酸の長さであり、一次構造において中程度に保存されており、シグナル伝達に関与する多数のタンパク質や細胞骨格タンパク質に１回から数回の頻度で存在しうる。
【０００３】
タンパク質のｐｐ６０ｃ−ｓｒｃは、少なくとも９個の非受容体タンパク質チロシンキナーゼ（ＮＲ−ＰＴＫｓ）のファミリーを表す。このファミリーのメンバーは、全体的な構造の構成が共通しており、その構成は一連の触媒ドメインと非触媒ドメインを含んでいる。Ｓｒｃにおいては、１４−アミノ酸ミリスチル化シグナルが最端のアミノ末端に存在し、その後にユニーク領域が続くが、このユニークな領域はファミリーメンバーの中で高度には保存されていない。この領域に続くのは、高度に保存された６０個のアミノ酸領域と１００個のアミノ酸領域の２つであり、それぞれ、Ｓｒｃ相同（ＳＨ）ドメイン３と２である。このＳＨ２とＳＨ３ドメインが多様なシグナリング経路でのタンパク質−タンパク質相互作用の仲介に重要な役目を果たしていることが分かっている(Koch，C.A.，ら、Science［1991］252: 668-74)。Ｓｒｃのカルボキシ末端の半分は、ＰＴＫ触媒ドメインとそのカルボキシ末端の近くにある負制御チロシン（Ｙ５２７）を含む。この残基がリン酸化（例えば、Ｃｓｋにより）されると、その結果として、ＰＴＫ活性を阻害することになる(Cooper，J.A．ら、Science［1986］231:1431-1434)。Ｙ５２７−＞Ｆの突然変異によりＰＴＫ活性と発癌活性が増加した形態のＳｒｃが形成される(Cartwright，C.A.，ら、Cell［1987］49:83-91，Kmiecik，T.E.ら、Cell[1987]49:65-73; およびPiwicna-Worms，H．ら、Cell（1987）75-82)。
【０００４】
Ｓｒｃ ＰＴＫ活性やトランスフォーミング活性を増加させるある種の突然変異が、Ｓｒｃ ＳＨ２ドメイン(Seidel-Dugan，C．ら、Mol．Cell．Biol．［1992］12:1835-45; およびHirai，H.およびVarmus，H.E.ら，Mol．Cell．Biol．［1990］10:1307-1318）やＳｒｃ ＳＨ３ドメイン(Seidel-Dugan，C.ら、同上；Hirai，H．およびVarmus，H.E．同上，Superti-Furga，G ら，Embo．J.[1993]12: 2625-34; およびPotts，W.M.ら、Oncogene Res．［1988］3:343-355）にマップされるという事実が、これらのドメインに対する負制御の役目を示唆している。特異的な配列コンテクスト内にあるホスホチロシン残基がＳＨ２ドメインに対して高親和性リガンドを示すということは、ＳＨ２ドメインが、リン酸化されたＹ５２７を結合させ、それによりキナーゼドメインを不活性な配置にロックすることによりＰＴＫ活性のＹ５２７介入阻害に関与するというひとつのモデルを示唆している(Matsuda，M.；Mayer，B.J.ら、Science［1990］248:1537-1539)。Ｓｒｃのカルボキシ末端テイルに対応するホスホペプチドがＳｒｃの不活性変異型ではなく活性変異型に結合するという観察から、このモデルの正さを支持できるのである(Roussel，R.R．ら、Proc．Natl．Acad．Sci，USA［1991］88:10696-700; およびLui，X.ら、Oncogene[1993]8:1119-1126)。
【０００５】
Ｓｒｃ ＰＴＫ活性に対するＳＨ３介入阻害作用のメカニズムは不明である。しかし、Ｓｒｃ ＰＴＫ活性のｐＹ５２７介入阻害にＳＨ２ドメイン、ＳＨ３ドメインが関与しているという証拠はある(Okada，M.，Howell ら、J．Biol．Chem.[1993]268:18070-5; Murphy，S.M．ら、Mol．Cele．Biol.[1993]13:5290-300; および Superti-Furga G．ら,同上)。これらの効果は、ＳＨ３介入のタンパク質ータンパク質相互作用の結果であると考えられているが、Ｓｒｃ ＳＨ３ドメインがどのように負制御効果を発揮するのかは正確には分かっていない。Ｓｒｃ ＳＨ３ドメインに対する高親和性リガンドを同定すればこの問題の解決に役立つ筈である。
【０００６】
２．２．タンパク質チロシンキナーゼと免疫応答 
Ｓｒｃ関連チロシンキナーゼは、免疫系の多様な細胞型（リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびナチュラルキラー細胞）と中枢神経系の多様な細胞型（神経細胞、ニューロン、乏突起神経細胞、小脳の一部など）を含む多様な細胞型に発現される(Umemori，H．ら、Brain Res．Mol．Brain Res.[1992]Dec．16[3-4]:303-310)。これらのキナーゼが、これらの細胞や組織に存在していること、および、それらが特異的な細胞表面受容体および免疫調節タンパク質（例：Ｔ細胞抗原受容体、ＣＤ１４、ＣＤ２，ＣＤ４，ＣＤ４０またはＣＤ４５）と相互作用をするということは、これらのキナーゼが中枢神経系だけでなく免疫系のシグナリング経路で重要な役目をしていることを示唆している（例えば、Ren，C.L．ら、J.Exp.Med.[1994]179(2):673-680：「ＣＤ４０によるシグナル伝達にはＬｙｎキナーゼの活性化が関与する」、Donovan，J.A．およびKoretzky，G.A，J.Am．Soc．Nephrol[1993]4(4):976-985:「ＣＤ４５、免疫応答およびＬｃｋキナーゼ、Ｆｙｎキナーゼの制御」；およびCarmo，A.M．ら、Eur．J．Immunol.[1993]23(9)2196-2201:「ＣＤ２の細胞質ドメインとｐ５６ｌｃｋとｐ５９ｆｙｎとの物理的会合」。
【０００７】
例えば、Ｓｈｃ様の遺伝子であるＨｃｋとＦｇｒが破壊されたマウスでは、マクロファージの食細胞活性が損傷を受けているか、または、リステリアモノサイトジエン(listeria monocytogenes)に感染しやすくなることにより特徴付けられる新規な免疫不全を示す(Lowell，C.A．ら、Gene Dev．[1994]814):387-398)。また、細菌リポ多糖（ＬＰＳ）は、ＣＤ１４関連ｐ５６ｌｙｎ、ｐ６８ｈｃｋ、ｐ５９ｃ−ｆｇｒを活性化させる一方で、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８のようなリンホカインの産生を誘導するということが分かっている。タンパク質チロシンキナーゼの阻害により、ＴＮＦ−αとＩＬ−１の産生がブロックされる。
【０００８】
２．３ ＳＨ３結合性ペプチド 
上記で述べたように、ＳＨ３ドメインはタンパク質−タンパク質相互作用の部位であると長年推測されてきたが、どのＳＨ３ドメインが実際に結合するのか不明であった。ＳＨ３ドメインに対するリガンドを同定しようと努力がなされた結果、多数のＳＨ３結合性タンパク質が特性決定された。例えば、３ＢＰ１と３ＢＰ２(Ren，R.，Mayer ら、Science[1993]259:1157-61)、ＳＯＳ(Olivier，J.P．ら、Cell[1993]73:179-91; およびRozakis-Adcock，M.ら、Nature［1993］363:83-5)、ｐ８５ ＰＩ−3’キナーゼ(Xingquan，L.ら、Mol．Cell．Biol．［1993］13:5225-5232)、ｄｙｎａｍｉｎ(Gout，I.ら、Cell［1993］75:25-36)、ＡＦＡＰ−１１０(Flynn，D.C.ら、Mol．Cell．Biol.[1993]13:7892-7900)、ＣＤ４２(Barfod，E.T．ら、J．Bio．Chem.[1993]268:26059-26062)である。これらのタンパク質は、短くてプロリンを多く含んだアミノ酸の伸張部を持つ傾向があり、そのいくつかはＳＨ３結合に直接的に関係してくる。別のＳＨ３結合性タンパク質のプロリンの多い領域間ではその類似性が極めて低い傾向があるけれども、多様なコンセンサス配列が提案されてきた。コンセンサス配列を構築しようとする試みは、別のＳＨ３ドメインを結合するタンパク質からのデータを取り込むことで混乱が発生しているように見える。
【０００９】
このような状況の中で、Cicchetti，P.らは、ａｂ１発癌遺伝子産物のＳＨ３ドメインによりin vitroで結合できる２個の天然のタンパク質の分離と配列決定に関する論文を発表したのである(Science［1992］257:803-806)。彼らは、ＳＨ３ドメインが、そのようなタンパク質の短いプロリンの多い領域に結合することを発見したのである。その後、この同じグループの研究者が、ＳＨ３結合性タンパク質のＳＨ３結合部位は、プロリン残基の９または１０アミノ酸伸張部に位置しているという結果をさらに開示した(Ren，R.ら、同上)。４個のＳＨ３結合性タンパク質のＳＨ３結合部位の特徴を取り込んだコンセンサス配列が提案された。その配列は、ＸＰＸＸＰＰＰ￥ＸＰ（配列番号１）で、式中Ｘは４個のＳＨ３結合性タンパク質の中では保存されていないアミノ酸配列の位置を示し、Ｐはプロリン、￥はＰやＬのような疎水性アミノ酸残基を示す。
【００１０】
複合ランダムペプチドライブラリーのスクリーニングを行い、モノクローナル(Scott，J.K.および Smith，G.P．Science［1990］249:386-390)、ポリクローナル(Kay，B.K.ら、Gene［1993］128:59-65)抗体に対するペプチドエピトープ、並びにストレプトアビジン(Devlin，J.J．ら、Science［1990］249:404-406 および Lam，K.ら、Nature［1991］354:82-84)、小胞体シャペロンＢｉｐ(Blond-Elguindi，S．ら、Cell［1993］75:717-728)、および、ＣａＭ(Deman，J.R.ら、J.Biol．Chem.[1993]268:23025-23030)を含む多様なタンパク質に対するペプチドリガンドを同定した。
【００１１】
最近、Chen，J.K.らは、バイアスコンビナトリアルライブラリー(biased combinatorial library)から単離したホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ−３’キナーゼ）のＳＨ３ドメインに対するリガンドについて発表している(J.Am．Chem．Soc.[1993]。「バイアス」ライブラリーは、合成ペプチドのある位置のアミノ酸残基は固定されている、すなわちランダムに変化ができないという点で、「ランダム」ライブラリーと区別する必要がある。実際、これらの研究者が述べているように、「ランダム」コンビナトリアルライブラリーのスクリーニングにより、ＰＩ−３’キナーゼＳＨ３ドメインプローブに対する適切なリガンドを得ることができなかったのである。これらの不適切なリガンドの結合親和性は、バイオセンサシステム(BIAcore)で測定した解離定数に基づいて、＞１００μＭの弱さであると記載されている。
【００１２】
さらに最近、Yuらは、ＳｒｃおよびＰＩ−３’キナーゼＳＨ３ドメインを結合する一連のペプチドを同定するために、ＸＸＸＰＰＸＰＸＸ（配列番号：２）（ここで、Ｘは、システイン以外の任意のアミノ酸）の形態の「バイアス」合成ペプチドライブラリーを使用した(Cell［1994］76:933-945)。「ランダム」ペプチド用に示された特異的アミノ酸の位置にプロリン残基を固定することでそのバイアスを達成した。上記で述べたように、このバイアスがなければ、開示技術ではどのようなＳＨ３ドメイン結合性ペプチドも同定することができないのである。
【００１３】
１３個の結合性ペプチドをベースとする以下のコンセンサス配列が提案された。ＲＸＬＰＰＲＰＸＸ（配列番号：３）であった（式中、Ｘは塩基性残基[例：Ｒ，ＫまたはＨ]である傾向がある）。８．７から３０μＭの範囲にあるような数個のＳＨ３結合性ペプチドの結合親和性が開示された。「複合」ペプチドＲＫＬＰＰＲＰＲＲ（配列番号：４）の結合親和性は７．６μＭであったと報告されている。この数値は、Ｇｒｂ２のＮ末端ＳＨ３ドメインに対する、ペプチドＶＰＰＰＶＰＰＲＲＲ（配列番号：５）の結合親和性に匹敵するものである(Kraulis，P.J．J．Appl．Crystallogr[1991]24:946を参照のこと）。Chen とその共同研究者達は、その同じ論文の中で、かれらの技術の限界を認めて、これらの結果は、「受容体のリガンド結合特性についての一般的知識がいくらかある系における、リガンドの発見のためのバイアスコンビナトリアルライブラリーの有用性を示すものである」と述べている（下線付与）。
【００１４】
Yuおよび共同研究者たちは、さらに、ＳＨ３結合部位コンセンサス配列ＸｐφＰｐＸＰ（配列番号：６）についても述べている（上出）。式中、Ｘは、保存されてない残基を表し、φは疎水性残基を表し、Ｐはプロリン、ｐはプロリンである傾向のある残基を表す。ＰＩ−３’キナーゼＳＨ３ドメインのリガンドとして、ＲＸＬＰＰＲＰＸＸ（配列番号：７）（式中、Ｘはシステイン以外の任意のアミノ酸を表す）のコンセンサスモチーフが提案された。Ｓｒｃ ＳＨ３ドメインのリガンドとしては、ＲＸＬＰＰＬＰＲφ（配列番号：８）（式中φは疎水性残基を表す）のコンセンサスモチーフが提案された。９−ｍｅｒペプチドについて報告された解離定数は約８−７０μＭのみの範囲にあり、ＳＨ３ドメインのひとつの型ともうひとつの型との選択性は比較的低く、ＫDＳは約４倍違っていた。
【００１５】
このように、部分的に予め決定したアミノ酸配列のセットに限定されているそのような「バイアス」コンビナトリアルペプチドライブラリーに頼らないＳｒｃ ＳＨ３結合性ペプチドの同定技術を開発する必要がある。実際、「ランダム」ペプチドライブラリーからのＳＨ３結合性ペプチドの分離は現在までのところ成功していない。より大きな結合親和性を有する特別なペプチド（特異的なＳＨ３ドメインに一般的に結合するか選択的に結合するかは別にして）の同定はまだこれからである。特別なＳＨ３ドメインに特異的な結合性ペプチドは有用である。例えば、ＳＨ３ドメインを有するその他のタンパク質はそのままなんら影響を受けない状態にしておきつつ、特別なＳＨ３ドメインを含むタンパク質の活性を調節するのに有用である。より無差別的な一般的結合性ペプチドは、広い範囲のＳＨ３ドメインを含むタンパク質の調節に有用である。
【００１６】
本発明は、そのようなＳＨ３結合性ペプチド、そのようなペプチドを同定する方法、そのようなペプチドを含む組成物に関する。特に、アミノ酸残基の特別な配列を含み、ランダムペプチドライブラリーから分離されたペプチドが開示されている。本発明では、ＳＨ３ドメインを含むタンパク質ターゲットに対して強力な結合親和性を示し、ファージ表示ランダムペプチドライブラリーからクローンが分離された。このようなタンパク質ターゲットには、Ａｂｌ、Ｓｒｃ、Ｇｒｂ２、ＰＬＣ−δ、ＰＬＣ−γ、Ｒａｓ ＧＡＰ、Ｎｃｋ、ｐ８５ ＰＩ−３’キナーゼが含まれる。結合ファージのヌクレトチド配列からペプチド挿入物のアミノ酸配列を推定した。望みのアミノ酸配列を有する合成ペプチドは、ターゲットタンパク質のＳＨ３ドメインを結合することが示される。特に、コアコンセンサス配列とコア配列に隣接する追加のアミノ酸残基を組み合わせた合成ペプチドは特別なターゲットタンパク質ＳＨ３ドメインへの結合において特に有効である。ここで開示されているＳＨ３結合性ペプチドは多様な方法で使用することができ、例えば、発癌性タンパク質活性のin vivoでの調節に使える可能性がある。これらのペプチドは、シグナル伝達経路と発ガンに関与する多数のクラスのタンパク質を調節をするペプチド擬似薬剤の生産で有益なリード役となるものである。
【発明の開示】
【００１７】
３．発明の概要
Ｓｒｃ相同領域３（ＳＨ３）とグリタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）からなる細菌融合タンパク質と結合する分離体について、３つのファージ表示ランダムペプチドライブラリーをスクリーニングした。この分離体のＤＮＡ配列決定により、この分離体は、その８、２２、または３６アミノ酸の長いランダム領域の中に、コンセンサスモチーフＲＰＬＰＰＬＰ（配列番号：９）と似た配列を含むことが判明した。ＳＨ３結合ファージのpIII挿入物に対応するペプチドを合成したところ、それらのペプチドは、ＳｒｃやＹｅｓ，（但し、Ｇｒｂ２は例外）、Ｃｒｋ、Ａｂｌ、 ＰＬＣγ１のような Ｓｒｃ関連タンパク質のＳＨ３ドメインのＧＳＴ融合物に結合した。これらの合成ペプチドは、Ｓｒｃ ＳＨ３ドメインと極めてうまく結合し、細胞溶解物中では、天然のＳｒｃ ＳＨ３相互作用の強力な競合相手として作用する。例えば、これらの合成ペプチドは、固定化したＳｒｃ−ＧＳＴとの結合に際して細胞溶解物からの放射能標識したタンパク質と競合できるもので、その見かけのＩＣ５０は１−１０μＭであった。コンセンサス配列ＲＰＬＰＰＬＰ（配列番号：９）を有するペプチドをアルリカツメガエル(Xenopus laevis)の卵母細胞に注入したところ、プレゲステロン誘発成熟速度が上昇した。これらの結果は、ファージ表示ランダムペプチドライブラリーを使用してＳＨ３結合性ペプチド配列を同定し、そのようにして同定されたペプチドがin vivoとin vitroで生物学的活性を示すことを証明している。
【００１８】
本発明の目的はペプチドを提供することであるが、そのペプチドは、少なくとも９個から４５個までのアミノ酸残基を有し、式：Ｒ−２−Ｌ−Ｐ−５−６−Ｐ−８−９（配列番号１０）のアミノ酸配列がそのペプチドのどこかの位置にあり、上記式中の各数字はアミノ酸残基を示し、２はシステイン以外の任意のアミノ酸残基を示し、５と６はいずれも疎水性アミノ酸残基を示し、８はシステイン以外の任意のアミノ酸残基を示し、９はシステイン以外の親水性アミノ酸残基を示し、そして、各文字は対応アミノ酸の標準一文字表記である。このペプチドはＳｒｃのＳＨ３ドメインに対して結合親和性を有するもので、その配列がＲ−Ｐ−Ｌ−Ｐ−Ｐ−Ｌ−Ｐ−Ｔ−Ｓ（配列番号１１）でないものである。本発明の特定の実施態様でのペプチドは、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、Ｌｃｋ、Ｈｃｋ、Ｆｇｒを含むＳｒｃ関連タンパク質のＳＨ３ドメインに対しても結合親和性を示すものである。
【００１９】
さらに、本発明は、式１０、１０−１１、１０−１１−１２、１０−１１−１２−１３（配列番号１２）、または、１０−１１−１２−１３−１４（配列番号１３）（ここで、各数字はシステイン以外の任意のアミノ酸残基を示し、１０がペプチド結合で９に結合している）のＣ末端フランキングアミノ酸配列をさらに含むＳＨ３ドメイン結合性ペプチドも含む。さらに、式１’、２’−１’、３’−２’−１’、または、４’−３’−２’−１’（配列番号１４）（ここで各数字はシステイン以外の任意のアミノ酸残基を示し、１’がペプチド結合でＲに結合している）のＮ末端フランキングアミノ酸配列をさらに含むペプチドも提供される。
【００２０】
したがって、特定の実施態様において、ペプチドは、少なくとも１３個から４５個までのアミノ酸残基から成り、式３’−２’−１’−Ｒ−２−Ｌ−Ｐ−５−６−Ｐ−８−９−１０（配列番号１５）のアミノ酸配列がそのペプチドのどこかの位置にあり、上記式中の各数字はアミノ酸残基を示し、３’，２’，１’，２，８，および１０はそれぞれシステイン以外の任意のアミノ酸残基を示し、５と６は疎水性アミノ酸残基を示し、９はシステイン以外の親水性アミノ酸残基を示し、そして、各文字は対応アミノ酸の標準一文字表記である。このペプチドはＳｒｃのＳＨ３ドメインに対して結合親和性を示すものである。
【００２１】
本発明はまた、ＳＨ３ドメイン結合における選択性または特異性にばらつきを示す新しいコンセンサス配列を提供しようとするものである。本発明は、さらに、ＳＨ３結合性ペプチドと第２の分子または化学成分とのコンジュゲートも含む。この第２の分子は、ある特定のタンパク質（またはそのタンパク質を含む細胞）のＳＨ３ドメインの領域に送達しようとする所望の物質であり得る。考えられる標的細胞としては、Ｓｒｃ、Ｓｒｃ関連タンパク質、および他のＳＨ３ドメイン含有タンパク質を発現する神経細胞、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞など）、破骨細胞、血小板、上皮細胞などがあるが、これらに限らない。このようにして、ＳＨ３ドメインを有するタンパク質の生理活性のモジュレーションが可能となる。
【００２２】
本発明の目的と一致する他の方法および組成物についても同じように開示する。特に、ＳｒｃまたはＳｒｃ関連タンパク質の活性をモジュレートする方法を開示するが、その方法は、有効量の本発明のペプチドおよび担体（好ましくは、製剤学的に許容される担体）を含む組成物を投与することからなる。特定の実施態様では、この方法はＳｒｃまたはＳｒｃ関連タンパク質の活性を抑制する。また、この方法はＳｒｃまたはＳｒｃ関連タンパク質を活性化するのに有効である。
【００２３】
さらに別の実施態様では、ＳＨ３ドメインに結合する領域を有するペプチドの同定方法を開示し、その方法は、（ａ）ＳＨ３ドメインを含む標的タンパク質を固定化し、（ｂ）固定化標的タンパク質をランダムペプチドライブラリーから分取したアリコートとともにインキュベートし、（ｃ）固定化標的タンパク質から未結合ライブラリーペプチドを洗い流し、（ｄ）固定化標的タンパク質に結合しているペプチドを回収し、そして（ｅ）ＳＨ３ドメイン結合性ペプチドの一次配列を決定することを含んでなる。
【００２４】
さらに、ＳｒｃまたはＳｒｃ関連タンパク質を発現する細胞、組織、器官のイメージング方法を開示し、この方法は、検出可能な標識やイメージング剤に結合したＳＨ３ドメイン結合性ペプチドを含む組成物の有効量を投与することを含んでなる。
【００２５】
本発明の他の目的については、上記の説明と、この後に続く好適な実施態様の詳細な説明により、当業者には明白であろう。
【００２６】
４．図面の簡単な説明
（図面の簡単な説明については後述）
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
５．好適な実施形態の詳細な説明 
５．１．一般的考慮
本発明は、多くの生理学的に重要なタンパク質中に存在することが知られているＳＨ３ドメインに対する結合親和性を示すペプチドに関するものである。特に、これらに限定されるものではないが、Ａｂｌ、Ｓｒｃ、Ｇｒｂ２、ＰＬＣ−δ、ＰＬＣ−γ、Ｒａｓ ＧＡＰ、Ｎｃｋ、およびｐ85ＰＩ−３’キナーゼを含む一群のタンパク質に含まれるＳＨ３ドメインに対して、一般的な結合特性を示すペプチドを開示する。好適なペプチドは、特異的でない場合には、ＳｒｃのＳＨ３ドメインに対する選択的結合親和性を示す。ここで記載されたように、本発明のペプチドはコア配列、好ましくはコンセンサス配列と、コア配列に隣接する別のアミノ酸残基とを含む。これらのペプチドは、複数の方法によって同定することを含めて、以下に非常に詳細に記載されている。
【００２８】
したがって、本発明の特別の実施形態においては、式 
Ｒ−２−Ｌ−Ｐ−５−６−Ｐ−８−９（配列番号10）
に類似するアミノ酸配列を含めて、最低９個から約４５個までのアミノ酸残基をペプチド中の任意の位置に含むペプチドが提供される。上記式中、各数字はアミノ酸残基を表し、例えば、２システイン以外のアミノ酸残基を表し、５および６は疎水性アミノ酸残基を表し、８はシステイン以外のアミノ酸残基を表し、そして９はシステイン以外の親水性アミノ酸残基を表す。この式中で用いられた各文字は、対応するアミノ酸の標準的一文字表記である。このペプチドが９−mer の場合に、Ｒ−Ｐ−Ｌ−Ｐ−Ｐ−Ｌ−Ｐ−Ｔ−Ｓ（配列番号11）は除外される。特に目的のペプチドは、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、Ｌｃｋ、ＨｃｋおよびＦｇｒを含む、ＳｒｃまたはＳｒｃ−関連タンパク質のＳＨ３ドメインに対する結合親和性を示すものである。好ましくは、本発明のペプチドは、ＳｒｃのＳＨ３ドメインに対する結合親和性よりも、ペプチドＲＰＬＰＰＬＰ（配列番号９）により示される結合親和性が、少なくとも３倍、さらに好ましくは少なくとも４倍、最も好ましくは少なくとも約５倍の結合親和性を示すものである。さらに別の実施形態では、このペプチドは、ペプチドＲＰＬＰＰＬＰ（配列番号９）が示す結合親和性よりも、少なくとも１０倍高いＳｒｃのＳＨ３ドメインに対する結合親和性を示す。
【００２９】
特別の実施形態においては、示された位置にある種々のアミノ酸残基が下記の好ましい単位を独立に有してもよいペプチドが開示される：２は、Ｐ、Ｒ、Ａ、Ｌ、Ｑ、ＥまたはＳ、好ましくはＰまたはＲであり；５は、Ｐ、Ｍ、ＩまたはＬ、好ましくはＰまたはＭを表し；６は、Ｐ、Ｌ、ＩまたはＶ、好ましくはＰまたはＬであり；８は、Ｔ、Ｒ、Ｐ、Ｉ、Ｎ、Ｅ、Ｖ、Ｓ、Ａ、ＧまたはＬ、好ましくはＴまたはＲであり；９は、Ｔ、Ｒ、Ｓ、ＨまたはＤ、好ましくはＴまたはＲである。５および６においては、疎水性アミノ酸残基が優先的であるにもかかわらず、幾つかの場合には、これらの位置に親水性アミノ酸残基が存在することが望ましいかもしれない。特に、アミノ酸残基５は、Ｔ、ＲまたはＳであってもよく、アミノ酸残基６はＴまたはＲであってもよい。
【００３０】
同様に、親水性アミノ酸残基が９位では優先であるが、場合によっては、ＰまたはＡなどの疎水性アミノ酸残基が望ましい可能性がある。
【００３１】
本発明はまた、ＳＨ３ドメイン−結合性ペプチドとともに最小長１０、１１、１２、１３、１４、１５またはさらに長いアミノ酸残を予定している。このようなペプチドは、コア配列Ｒ−２−Ｌ−Ｐ−５−６−Ｐ（配列番号７１）のＣ−末端またはＮ−末端のいずれか、または双方に隣接している別のアミノ酸残基を含む。そこで、例えば、このようなペプチドは、式１０、１０−１１、１０−１１−１２、１０−１１−１２−１３（配列番号１２）または１０−１１−１２−１３−１４（配列番号１３）のＣ−末端フランキングアミノ酸残基をさらに含むペプチドを包含し、ここで各数字はシステインを除くいずれかのアミノ酸残基を表し、例えば、アミノ酸残基１０はアミノ酸残基９にペプチド結合で結合している。その場合、特別の実施形態には、アミノ酸残基１０が、Ｔ、Ｒ、Ｌ、Ｓ、Ｄ、Ｐ、ＡまたはＮで、好ましくはＴまたはＲであり、アミノ酸残基１１が、Ｒ、Ｐ、Ａ、Ｑ、ＳまたはＴで、好ましくはＲまたはＰであり、アミノ酸残基１２が、Ｐ、Ｓ、ＲまたはＴで、好ましくはＰまたはＳであり、アミノ酸残基１３が、Ｐ、Ｓ、Ｒ、Ｆ、ＨまたはＴで、好ましくはＰまたはＳであり、アミノ酸残基１４が、Ｓ、Ｒ、ＧまたはＴで、好ましくはＳまたはＲであるものが含まれる。
【００３２】
さらに、式１’、２’−１’、３’−２’−１’または４’−３’−２’−１’（配列番号１４）のＮ−末端フランキングアミノ酸配列を含むペプチドもまた提供される。ここで、各数字はシステイン以外のいずれかのアミノ酸残基を表し、例えば、１’がＲにペプチド結合によって結合されている。この場合、特別の実施形態には、アミノ酸残基１’が、Ｔ、Ｐ、Ｓ、Ｎ、Ｆ、Ｗ、Ｋ、Ｈ、ＱまたはＧで、好ましくはＴまたはＰであり、アミノ酸残基２’が、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｑ、Ｌ、ＡまたはＨで、好ましくはＳまたはＴであり、アミノ酸残基３’が、Ｒ、Ｓ、Ｐ、Ｇ、Ａ、Ｖ、ＹまたはＬで、好ましくはＳまたはＴであり、アミノ酸残基４’が、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｔ、Ｇ、ＬまたはＦで、好ましくはＲまたはＳであるものが提供される。
【００３３】
特別な実施形態においては、式３’−２’−１’−Ｒ−２−Ｌ−Ｐ−５−６−Ｐ−８−９−１０（配列番号１５）をペプチドの任意の場所に含む、最低１３個かつ４５個までのアミノ酸残基を有するペプチドが開示される。ここで、各数字はアミノ酸残基を示し、３’、２’、１’、２、８および１０という数字はそれぞれシステイン以外のアミノ酸残基を表し、５および６はそれぞれ疎水性アミノ酸残基を表し、９はシステイン以外の親水性アミノ酸残基を表し、各文字は、対応アミノ酸残基の標準一文字表記である。上記ペプチドはＳｒｃのＳＨ３ドメインに対する結合親和性を示す。好ましい13-merのものは、これらのものに限定されないが、アミノ酸残基５がＰまたはＭ、アミノ酸残基１’がＴ、Ｐ、ＳまたはＮ、アミノ酸残基２’がＳまたはＴ、アミノ酸残基３’がＲまたはＳ、およびアミノ酸残基１０がＴまたはＲであるものを含む。ここで記載されたすべてのＳＨ３ドメイン−結合性ペプチドにおいて、親水性アミノ酸残基であるシステイン（Ｃ）の使用禁止は、７-merの「コア」配列と総計（コア＋フランキング）約２０個までのアミノ酸までのコアにフランキングしている別のアミノ酸残基を超えて拡張されるものではない。すなわち、システインを随時使用することが、完全に禁止される訳ではない。心に留めておくべきことは、分子内ジスルフィド結合が形成されて環構造が形成される可能性をできる限り小さくすることである。出願人は、少なくとも、約１５個のアミノ酸残基長より短い潜在的な結合性タンパク質では環状構造は好適ではないらしいということを発見した。コア配列を含む環状構造の形成についての心配は、ペプチドのサイズが大きくなるにつれて減少する。おそらく、十分に大きな構造は、環とはいっても、重要なコアをより大きなまたは小さなコンホーメーションに適合させることができる可能性がある。
【００３４】
とりわけ、ＳＨ３ドメインに対する結合親和性を示す特異的ペプチドが開示される。これらは、ＲＳＴＰＲＰＬＰＭＬＰＴＴＲ（配列番号62）、ＲＳＴＰＲＰＬＰＰＬＰＴＴＲ（配列番号67）、ＧＩＬＡＰＰＶＰＰＲＮＴＲ（配列番号63）、ＶＬＫＲＰＬＰＩＰＰＶＴＲ（配列番号64）、ＧＰＨＲＲＬＰＰＴＰＡＴＲ（配列番号65）、およびＡＮＰＳＰＡＴＲＰＬＰＴＲ（配列番号66）といったペプチドを含む。
【００３５】
ファージクローンもまた、ＳＨ３ドメインの結合に応答するアミノ酸配列とともに開示される。これらのファージクローンは、図５で特定される。
【００３６】
本発明の他の実施形態では、ＳＨ３−ドメイン結合性ペプチドが、合計11、13、14、18、20、22、23、25、30、36、38または45個のアミノ酸残基を有することが予定されている。
【００３７】
ここで開示された本発明のペプチドは、かなり多数の実用的な方法で調製されてもよく、これらの方法には、液相合成、固相合成、形質転換した宿主による発現、天然由来、合成または半合成ポリペプチドの切断、またはこれらの技術の組み合わせなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３８】
ＳＨ３結合性ペプチドは、本来の機能の増強（または、特定のペプチドまたはペプチドの標的分子の性質に依拠する阻害、この場合タンパク質はＳＨ３ドメインを有している）を含む、広範な生物学的活性またはペプチドの標的分子の生物学的活性を示す。例えば、本発明の結合性ペプチドの相互作用は、ＳＨ３ドメインを有する標的分子の発ガン活性の調節を生じ得るはずである。標的分子がまた天然の結合パートナーまたはリガンドを有する場合、本発明のペプチドもまた、天然の結合パートナーの生物学的活性に関連するアンタゴニスト活性またはアゴニスト活性を示し得る。
【００３９】
したがって、ここで全般的に記載されたＳＨ３ドメイン−結合性ペプチドの有効量を投与することによって、ＳｒｃまたはＳｒｃ−関連タンパク質チロシンキナーゼを活性化する方法を提供することが本発明の目的である。したがって、免疫応答の強度は、例えば、ＴＮＦ−αやインターロイキン−１などのある種のリンホカインの産生増強によって、このように刺激することができる。当業者には公知のように、より強い免疫応答は、ウイルスその他の、または悪性の特殊な執拗な感染と闘っているといったある状態で生じ得る。
【００４０】
さらに、本発明の特別の実施形態においては、本発明のペプチドと第二の化学的部分とを含むコンジュゲート化合物が予定されている。第二の化学的部分は、ペプチドそれ自身をも含む広範な化合物から選択することができる。しかしながら、典型的には、本発明のペプチド以外のものである第二の化学的部分は、アミノ酸、本発明のＳＨ３結合性ペプチド以外のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質（すなわち、コンジュゲートは融合タンパク質）、核酸、ヌクレオシド、グリコシド残基（すなわち、任意の糖または炭化水素）、標識試薬またはイメージ−増強剤（金属、同位体、放射性同位体、発色団、蛍光団（ＦＩＴＣ，ＴＲＩＴＣ等）、および酵素基質）、薬物（合成、半合成、および天然の化合物）、小分子（例えば、ビオチン、各種ホルモン、各種因子）から選択されるが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
本発明発明のペプチドは、第二の化学的部分と直接（例えば、アミン、イミン、アミド、エステル、アシルまたは他の炭素−炭素結合を形成するアミン基またはカルボン酸基などの適当な官能基を介して）、またはリンカー基（例えば、脂肪族または芳香族ポリヒドロキシ、ポリアミン、ポリカルボン酸、ポリオレフィンまたはそれらの適当な組み合わせ）を仲立ちとして間接に、コンジュゲートさせることができる。さらに、ここで用いられる「コンジュゲート」という用語は、イオン性の親和性またはその他の複合体形成（complexation）の相互作用などを含むがこれらには限定されず、非共有結合性相互作用を包含する。このような他の非共有結合相互作用は定義が可能であることが好ましく、化学的コンジュゲート種から分離可能なものであることがさらに好ましい。
【００４２】
さらにここで記載するように、本発明のペプチドは、ＳｒｃまたはＳｒｃ関連タンパク質を含むある種の細胞内コンパートメント中に局在を示した。次いで、上記のコンジュゲートは、ＳＨ３ドメイン含有タンパク質を含む、細胞、組織または器官への薬物の輸送系として利用することができる。
【００４３】
本発明は、ＳＨ３ドメイン、好ましくはＳｒｃのＳＨ３ドメインに結合する領域を有するペプチドをコードするコドンまたはヌクレオチド配列を含む核酸またはその相補体からなる組換え構築物を提供しようとするものであるということをも指摘すべきである。組換え核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドのいずれでもよい。
【００４４】
特別の実施形態においては、本発明は、形質転換ベクターである組換え構築物を予定している。このようなベクターには当業者には公知である、組換えプラスミド、ファージまたは酵母の人工染色体なども含まれ、宿主への導入後、ヌクレオチド配列の転写や発現に影響を与える。これらのベクターは、閉じた環でもよく、直鎖状にしたものであってもよい。予定されたベクターは、宿主の形質転換またはトランスフェクション後に染色体外に存在するもの、ならびに宿主染色体中に組み込まれているか宿主染色体の置換部分をも含む。ベクターは、感染補助(transfection aid)または当業者に公知の技術を用いて細胞中に導入してもよい。例えば、これらの補助または技術は、エレクトロポレーションや、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、リポソームまたはリポフェクチンまたはリポフェクタミンとして知られている極性の脂質試薬の使用といった形をとる。さらに、本発明は、任意の核酸を、例えば、注入によって、細胞に直接に導入することも予定している。
【００４５】
形質転換された宿主細胞は、また、目的のポリヌクレオチド配列を再生産でき、および／または対応するペプチド産物を発現することができる本発明の方法によっても得ることができる。原核細胞または真核細胞の宿主を含む種々の宿主が予定されている。特に、細菌、ウイルス、酵母、動物、および植物細胞が潜在的な形質転換可能な宿主である。このようにして、ＳＨ３ドメインに結合する領域を有するペプチド、好ましくは分泌型のペプチドを産生し得る形質転換細胞を得るために開示された方法は、(a)発現ベクター、好ましくは分泌型の発現ベクターを提供する工程を含み、ＳＨ３ドメインに結合する領域を有するペプチドのコピーを少なくとも１つコードするヌクレオチド配列を含み、そして(b)ベクターをコンピテントな宿主細胞に導入する工程とを含む。
【００４６】
このようにして得られたペプチドは、次いで、細胞、組織、器官に導入され、またはその中に存在するＳＨ３ドメイン−含有タンパク質の生化学的活性をモジュレートするために、被験体に投与される。したがって、本発明の特別の実施形態では、コア配列とフランキング配列とを含むＳＨ３ドメイン結合性ペプチドと、適当な担体とを含む組成物が提供される。
【００４７】
本発明によって予定される組成物はまた、組成物の導入または投与を促進するものからそれら自身の生来の活性、例えば、予防、診断または治療作用などを有するものまでの他の組成物を含む。このような生来の活性は、本発明のペプチドの活性から区別することができ、またはそれらに相補的なものである。いずれにしても、本発明の組成物は、ヒトを含む哺乳類への投与に適当な組成物をも含む。他のものは化粧品、農薬または医薬用に許容されることだけを要求されるが、本発明の組成物（必ず担体を含む）は滅菌されることが好ましい。さらに別の組成物は、獣医学的使用に適合させることができる。
【００４８】
ここで記載した薬物輸送系を含む組成物は、非経口的、経口的、経腸的、局所的または吸入によるなどの種々の方法で投与することが予定されている。組成物はまた、鼻腔内、点眼または膣内に投与することもできる。さらにまた、本発明の組成物は、固形剤、ゲル剤、液剤、エアロゾル剤またはパップ剤などの幾つかの剤形をとることができる。
【００４９】
本発明の別の実施形態で提供されるＳＨ３ドメインに結合する領域を有するペプチドを同定する方法は、(a)ＳＨ３ドメインを含む固定化標的タンパク質を提供する工程と；(b)８アミノ酸残基より大きなランダム配列を有するペプチドを含む、ファージ−表示ランダムペプチドライブラリーから得られたアリコートとともに固定化標的タンパク質をインキュベートする工程と；(c)固定化標的タンパク質から未結合のファージを洗浄する工程と；(d)固定化標的タンパク質に結合したファージを回収する工程と；(e)上記結合性ファージ核酸の関連するヌクレオチド配列を決定する工程とＳＨ３ドメイン結合性ペプチドに対応する一次配列を推定する工程とを含む。好ましくは、この方法は、回収されたファージの力価を増加させる工程と、インキュベーションの工程を繰り返す工程と、洗浄工程とＳＨ３ドメイン結合性ペプチド富化ファージを提供するための回収とをさらに含む。
【００５０】
しかし、「表示」され得るランダムまたは他のペプチドライブラリーによる任意の別の様式は、本発明で利用することができる。さらに、本発明の出願人は、より長いランダムなペプチド配列（例えば、６以上のアミノ酸残基、好ましくは10以上のアミノ酸残基、最も好ましくは12以上のアミノ酸残基）は、非常に大きな多様性ばかりでなく、結合活性に資するより豊かな二次構造度を提供するものと考えている。ペプチドのランダム領域が８-merかそれよりも短い場合には、環化されないことが好ましい。
【００５１】
５．２．ランダムペプチドライブラリー 
好ましいファージ表示ランダムペプチドライブラリーの調製と特徴づけは、他で記載されている。例えば、Kay，B.K．ら、Gene(1992)128:59-65を、下記ＴＳＡＲ−９として知られるファージ表示ランダムペプチドライブラリーの調製の記載について参照せよ。特に、バクテリオファージ中の一定の長さのオリゴヌクレオチドのクローニング変性によって、Ｍ13ウイルス粒子の表面上のpIIIタンパク質のアミノ−末端に発現しているランダムペプチドの組換えライブラリーが生成される。（各粒子の表面上にpIII融合タンパク質の３〜５コピーがある）。ファージ表示により、第一に、発現されたペプチドがウイルス粒子の表面上にあり、相互作用に関与することができること；第二に、組換えウイルス粒子は安定であること（すなわち、凍結が可能で、極端なｐＨに曝すことができる）；第三に、ウイルスが増殖可能であること；そして第四に、各ウイルス粒子が組換えゲノムをコードするＤＮＡを含むという、幾つかの証拠が提供された。続いて、これらのライブラリーを、標的に結合するウイルス粒子を単離することによってスクリーニングする。単離物は終夜増殖可能であり、そして結合に応答可能な表示ペプチド配列をＤＮＡ配列を決定することによって推定することができる。
【００５２】
これらのライブラリーは、約108を超える異なる組換え体を含み、インサートのヌクレオチド配列は、発現されたペプチドがアミノ酸配列において確かにランダムであるということを示唆する。これらのライブラリーは、ここでＴＳＡＲライブラリーと呼ばれ、ＴＳＡＲはTotally Synthetic Affinity Reagents を表す。ＴＳＡＲライブラリーの調製を、さらに以下に示す。
【００５３】
５．３．ＳＨ３結合性クローンおよびそれらの特性 
したがって、ＳＨ３ドメインに対する結合親和性を示すペプチドは非拘束ランダムペプチドライブラリーから単離された。さらに、開示したペプチドが示す結合親和性はそれらの選択性の点で異なっており、いくつかのペプチドは様々なタンパク質から誘導されたＳＨ３ドメインに対して同様の結合親和性を示すが、他のものは特定のＳＨ３ドメインに対してより大きい親和性を示す。
【００５４】
本方法により単離された種々のペプチドのアミノ酸配列を図５に示してある。
【００５５】
このリストからわかるように、ＳＨ３ドメイン結合性ペプチドのいくつかのグループは、それぞれが異なるタイプのランダムペプチドインサートに基づく３つの別個のランダムペプチドライブラリーから単離され、すべてがＭ１３ウイルス粒子の表面上のｐＩＩＩタンパク質のアミノ末端に表示された。Ｒ８Ｃライブラリーからは１０個のクローンが、ＴＳＡＲ−１２ライブラリーからは７個のクローンが、そしてＴＳＡＲ−９ライブラリーからは７個のクローンがそれぞれ単離された。ＳＨ３ドメインに直接結合すると考えられる特定のアミノ酸残基を強調して示し、同時に、ランダムインサートの残りのアミノ酸残基および各グループのクローンに共通するウイルスフランキング配列および相補部位のアミノ酸残基を示すために、配列が提示される。それぞれの特定クローンが各ライブラリー中に見いだされる頻度も図５に示してある。こうして、クローン T12.SRC3.1 およびT12.SRC3.2は３つのライブラリー中にとび抜けて豊富に存在するクローンである。
【００５６】
おもしろいことに、すべての結合性ペプチドはプロリンに富むアミノ酸残基モチーフをもつことが見いだされ、このモチーフは結合に関与しているらしく、主にインサートのＣ末端に位置づけられるが、各クローンはまたＮ末端にインサートを含んでいる。この観察の意義は現在のところ理解されていないが、この知見はＳＨ３ドメイン結合におけるＣ末端ウイルスフランキング配列の重要性を示すかもしれない。
【００５７】
実際、コアコンセンサス配列ＲＰＬＰＰＬＰ（配列番号９）のみをもつ合成ペプチドは、コア配列に隣接する追加のアミノ酸残基をさらに含む合成ペプチドよりも標的ＳＨ３ドメインへの結合が効率的でなかった。したがって、配列：ＲＳＴＰＲＰＬＰＭＬＰＴＴＲ（配列番号６２）、ＲＳＴＰＲＰＬＰＰＬＰＴＴＲ（配列番号６７）、ＧＩＬＡＰＰＶＰＰＲＮＴＲ（配列番号６３）、ＧＰＨＲＲＬＰＰＴＰＡＴＲ（配列番号６５）、およびＶＬＫＲＰＬＰＩＰＰＶＴＲ（配列番号６４）を有する13-merおよび14-merを製造したところ、配列ＲＰＬＰＰＬＰ（配列番号９）の7-merよりも強烈にＳＨ３ドメイン（例えば、ＳｒｃおよびＹｅｓのＳＨ３ドメイン）に結合することがわかった。ＡＮＰＳＰＡＴＲＰＬＰＴＲ（配列番号６６）の13-merは、コアコンセンサス配列に匹敵する結合親和性をもつことが示された。それぞれの場合に、13-merは7-mer“コア”配列と該コア配列に隣接する追加のアミノ酸残基（追加のアミノ酸残基のいくつかはウイルスフランキング配列により提供される）からなる。
【００５８】
かくして、本発明の一つの実施態様では、7-merコアが式ＲＸＬＰφφＰ（配列番号７１）〔式中、Ｒはアルギニン、Ｌはロイシン、Ｐはプロリン、Ｘはシステイン以外の任意のアミノ酸を表し、そしてφは疎水性アミノ酸残基を表す〕のコンセンサスモチーフを含む。「疎水性アミノ酸残基」とは、本出願人はＦ、Ｙ、Ｗ、Ｖ、Ａ、Ｉ、Ｌ、ＰまたはＭを含むことを指し、ここで各文字は対応するアミノ酸残基の標準一文字表記を表す。
【００５９】
さらに、コア配列のＣ末端に２個の追加のアミノ酸を含む9-merペプチドは、式ＲＸＬＰφφＰＸψのコンセンサスモチーフをもつと考えられる。この好適な9-merコンセンサスモチーフにおいて、記号ψはシステイン以外の親水性アミノ酸残基を表す。「親水性アミノ酸残基」とは、本出願人はＫ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、ＳまたはＣを含むことを指し、他の記号は上で定義したとおりである。本発明の目的のためには、グリシン残基（Ｇ）は疎水性アミノ酸残基とも親水性アミノ酸残基とも見なしうる。一文字記号ＢおよびＺはそれぞれＮまたはＤおよびＱまたはＥを表し、親水性アミノ酸残基と見なされる。
【００６０】
本発明の特定の13-merペプチドとしては以下に列挙したものが含まれる。しかしながら、下記の13-merペプチドがすべて、上記の好適な9-merコンセンサスモチーフと厳密に関係があり、該モチーフに従うとは限らないことに注目されたい。それゆえ、従わないペプチド（イタリック体で示し、従わないアミノ酸残基には下線が引いてある）は、好適な9-merコンセンサスモチーフに従うペプチド（標準体で示す）に「似ている」として記載される：
2007259856.tif 000002
したがって、好適な9-merコンセンサスモチーフに従うか、または「似ている」他のペプチドを特定して開示していないが、これらは当業者には容易に推察でき、上に開示したものと同様であると考えられる。特に、従わないものは１位（Ｒの代わりにＳ、ＧおよびＩが許容される）、３位（Ｌの代わりにＶ、ＡおよびＱが許容される）、４位（Ｐの代わりにＬが許容される）、５位（疎水性アミノ酸残基の代わりに親水性アミノ酸残基、Ｓ、ＲおよびＴが許容される）、６位（疎水性アミノ酸残基の代わりに親水性アミノ酸残基、ＲおよびＴが許容される）、７位（Ｐの代わりにＴおよびＳが許容される）、および９位（親水性アミノ酸残基の代わりにＰおよびＡが許容される）に観察された。
【００６１】
５．３．１．結合特異性 
開示の結合性ペプチドのいくつかがひとつのSH3ドメインに対してもうひとつのものよりも高い相対的結合親和性を有することが発見されている。ここで図８に言及すると、異なるSH3 ドメインターゲットに対する上記の種々のペプチドの相対的結合親和性がグラフで表示されている。見てのとおり、各ペプチドの相対的結合親和性は大きさ(magnitude)の順序により異なることがある。従って、図８に示されているように、T12.SRC3.3と同定されたファージクローンの関連配列を有するペプチドGPHRRLPPTPATR(配列番号65)は、Src、Yes、Lek、Hck、Fgr、Fyn、およびLynを含むが、これらに限定されることはないSrcファミリーSH3ドメインに特異的である。このSH3結合性ペプチドは、PLCγまたはGrb2に由来するSH3ドメインに対してはほとんど親和性を有さない。一方、ファージクローンT12.SRC3.1（これは、本方法により見いだされた最も豊富な結合性クローンのひとつである。）の関連配列に相当するペプチドGILAPPVPPRNTR(配列番号63)は、Src、PLCγ、およびGrb2を含む広い範囲のSH3ドメインに一般的に(generically)結合する。
【００６２】
中間のレベルにおいて、本発明は、また、Src優先的である、ファージクローンT12.SRC3.6の関連配列に相当するペプチドVLKRPLPIPPVTR(配列番号64)を明らかにした。すなわち、このペプチドは、Src ファミリーのメンバーに対して強い結合親和性を、Grb2タンパク質に対してはいくらかの結合親和性を示すが、PLCγドメインに対してはほとんど結合親和性を示さないことがわかった。ファージクローンT12.SRC3.2の関連配列に相当するペプチドANPSPATRPLPTR(配列番号66)も、GPHRRLPPTPATR(配列番号65)と同様にSrcファミリー特異性を示す。ペプチドRSTPRPLPMLPTTR（R8C.YES3.5; 配列番号62）およびRSTPRPLPPLPTTR（代表的なコンセンサスモチーフ; 配列番号67）は、Src、Yesおよび他のSrc関連タンパク質のSH3 ドメインに対する特異性が高い。
【００６３】
５．４．結合実験のさらなる考察 
最初に、SrcおよびSrc関連タンパク質のSH3ドメインに対するある種のペプチドの結合親和性は、好ましいコアコンセンサス配列RPLPPLP(配列番号9)またはRPLPMLP(配列番号95; すなわち、RPLP(P/M)LP、配列番号96)の存在のみによって少なからず支配されることは明らかである。従って、合成ペプチドRSTPRPLPMLPTTR（R8C.YES3.5;配列番号62）およびRSTPRPLPPLPTTR(コンセンサス；配列番号67)はSrc SH3 に対して強い特異的結合親和性を示す一方、試験した他の合成ペプチドも7-merのRPLPPLP(配列番号９)と比べてSH3ドメインに対して強烈な結合親和性を示した。これらの他のペプチドであるGILAPPVPPRNTR(配列番号63)、VLKRPLPIPPVTR(配列番号64)、GPHRRLPPTPATR(配列番号65)、およびANPSPATRPLPTR(配列番号66)、スポートコア配列(sport core sequence)並びにフランキング配列は、好ましいコアコンセンサス配列に密着しない。従って、これらの結果は、SH3ドメインに対する結合親和性がかなりの程度までコア7-mer 配列に隣接するアミノ酸残基の性質によって支配されることを示唆している。
【００６４】
Src SH3選択ペプチドの結合特性は、Src SH3選択ファージにより表示された配列に相当する合成ビオチン化ペプチドを用いて決定された。これらのビオチン化ペプチドは固定化Src SH3-GSTへの直接結合についてアッセイされた。試験した５つのライブラリー由来のペプチドの各々は、バックグラウンド以上にSrc SH3-GSTおよびYes SH3-GSTに結合することがわかった（図８）。さらに、あるペプチドと好ましいコアコンセンサス配列RPLP(P/M)LP との類似性とそのペプチドのSrc SH3-GST に対する親和性との間に強い相関関係が観察された。クローンT12.SRC3.1のコア配列（GILAPPVPPRNTR;配列番号63）は、より一般的なSH3 ドメイン結合特性を与えるようである。
【００６５】
様々のタンパク質から得られたSH3ドメインへの種々のファージクローンの相対的結合を比較する実験により、これらのクローンが、他のタンパク質から得られたSH3ドメインよりもSrcおよびSrc関連SH3ドメインを好むことが証明された。
【００６６】
さらに、コンセンサス配列RPLPPLP(配列番号９)を有する7-mer はSrc SH3-GSTへ弱く結合するに過ぎなかったが、Src SH3選択クローン（RSC.YES3.5）、Ｎ末端のRSTP（配列番号97）およびＣ末端のTTR のひとつがコードする残基が隣接するコンセンサス配列を含むペプチドは、試験したペプチドのいずれよりも有意によく結合した（図７）。従って、前に述べたように、RPLP(P/M)LP(配列番号96)コアに隣接する配列はSH3結合への貢献度が高いようである。さらに、配列RSTPAPPVPPRTTR（配列番号98）を有するか、この配列に似ているペプチドは、様々なSH3ドメインへの強くてかつ一般的な結合を示すことが推測される。
【００６７】
同様に、Src SH3結合モチーフのほとんどが、ランダムペプチドのカルボキシ末端に近くに、すべてのクローンにおいて固定されている配列に隣接して位置することが観察される（図５）。例外的なクローンは固定されたフランキング配列を含むモチーフに似た配列を有する傾向がある。このクラスタリングは、結合モチーフがこのランダムペプチドの至る所に分布しているという前の結果と対照をなすものである。Kay，B.K．ら，Gene（1993）128:59-65。
【００６８】
ライブラリー由来のSrc SH3結合性ペプチドの結合を天然タンパク質のプロリンに富む領域に相当するペプチドの結合と比較した。ヒトPI-3’キナーゼにおけるSH3結合領域（KISPPTPKPRPPRPLPV;配列番号69）およびヒトSOS1.20におけるSH3結合領域（GTVEPVPPPVPPRRRPESA;配列番号68）、並びに細胞骨格タンパク質ビンキュリンのプロリンに富む領域(LAPPKPPLPEGEV; 配列番号70）に相当するペプチドは、ライブラリー由来のペプチドほどにはSrc SH3をよく結合しなかった（図７）。
【００６９】
前記のように、結合の相対的特異性を調べた。かくして、異なるタンパク質からのSH3ドメインへの当量のGST 融合物へのSrc SH3選択ペプチドの相対的結合を測定した（図８）。ライブラリー由来のペプチドのすべてはSrcおよびYes SH3ドメインをほとんど等しくよく結合したが、いずれのペプチドも（試験したなかで最もかけ離れたペプチドであるペプチドT12.SRC3.1を除く。）Grb2、Crk、AblまたはPLCγ1のSH3ドメインを容易に感知できる程には結合しなかった。従って、SOS1由来のペプチドとは対照的に、ライブラリー由来のペプチドは、Srcファミリーメンバーに対して比較的特異的であるSH3結合を示す。
【００７０】
次に、Src SH3ドメインへの結合が、SH3ドメインと細胞溶解物に見られる天然のタンパク質との相互作用に質的に似ているかどうかを測定した。かくして、放射能標識したタンパク質をNIH 3T3細胞溶解物から調製し、グルタチオン結合セファロースに固定化したSrc SH3-GST上でクロマトグラフィー分離を行った。SDS-PAGEは、いくつかのタンパク質がこの方法でアフィニティー精製できることを示している。合成したペプチドは、１〜10 mM のIC50で、固定化Src-GSTへの細胞溶解物からの放射能標識タンパク質の結合と競合できるので、この合成ペプチドはSrc SH3ドメインへ非常によく結合する（図９）。結論として、これらのペプチドは細胞タンパク質とSrc SH3との相互作用をin vitroで効率的に阻害することができる。
【００７１】
さらに、構成的に活性なSrc をコードするmRNAを注入したアフリカツメガエル（Xenopus laevis）の卵母細胞は、水またはc-Src mRNAを注入された卵母細胞と比べて促進された速度で、プロゲステロンの誘導により成熟する。Unger，T.F.およびSteele，R.E.，Mol．Cell．Biol．(1992)12:5485-5498。ライブラリー由来のSrc SH3結合性ペプチドがin vivoで生化学的作用を及ぼす能力を調べるために、アフリカツメガエル卵母細胞の成熟に対するこれらのペプチドの影響を検討した。VI期の卵母細胞にペプチドを注入し、プロゲステロンにさらし、胚胞の破壊についてスコアを付けた。図10は、クローンT12.SRC3.6からの残基(VLKRPLPIPPVTR; 配列番号64)に隣接したRPLPPLP(配列番号９)から成るSH3 結合性ペプチドを卵母細胞に注入すると、成熟速度が約１時間促進されたが、対照としての水またはビンキュリンのプロリンに富むセグメント（LAPPKPPLPEGEV;配列番号70）に相当するペプチドを卵母細胞に注入しても、成熟速度が促進されなかったことを示している。この作用の大きさは、構成的に活性なSrcをコードするmRNAの注入により観察されたものと大体等しい。例えば、Unger，T.F．およびSteele，R.E.，上出のFigure 3Bを参照のこと。この結果は、ライブラリー由来のSrc SH3結合性ペプチドがSrc PTK活性に対するSrc SH3ドメインの抑制作用を効果的に緩和していることを示唆している。このモデルは、Srcキナーゼに対するSrc SH3 ドメインの抑制作用とトランスフォーミング活性を証明したいくつかの研究と一致している。例えば、Okada，M．ら，上出；Murphy，S.M．ら，上出；およびSuperti-Furga，G．ら，上出を参照のこと。
【００７２】
５．５．ＳＨ３結合性ペプチドをベースとする診断および治療薬およびそれらの使用のさらなる方法
既に上で示したように、本発明は、また、本明細書に記載したSH3結合性ペプチドをベースとする診断、予防、および治療薬を提供することを目的とする。
【００７３】
ひとつの態様において、SH3ドメイン結合性ペプチドおよび該ペプチドに直接的に、間接的にあるいは複合体形成により結合した検出可能な標識を含む、診断薬、好ましくはキットの形態の診断薬が提供される。ここで、前記ペプチドは、(i)式RXLPφφP(配列番号71)(式中、Xはシステイン以外の任意のアミノ酸を表し、φはF、Y、W、V、A、I、L、P、M またはGを含む疎水性アミノ酸残基を表し、各文字は対応するアミノ酸残基の標準一文字表記を表す。)のコア配列モチーフ；および(ii)Ｃ末端、Ｎ末端またはその両方で該コア配列に隣接する２つ以上の追加のアミノ酸残基を含む。
【００７４】
本発明の診断薬を使用して、細胞、組織または器官における一般的な(generic)または特異的(specific)なタイプのSH3ドメインの存在をin vitroまたはin vivoのいずれかで検出することができる。in vivoで使用するためには、腸内、非経口または特定の用途の必要により指定される何らかの他の経路のいずれかで投与するのための製剤学的に許容できる担体と診断薬を混合することが好ましい。
【００７５】
特定の態様において、例えば、本発明のSrc SH3 ドメイン結合性ペプチドおよび脱調節(deregulated)ないしは“活性化”されたSrcの基質を含む、融合産物をベースとするアッセイが意図される。例えば、ラウス肉腫ウイルスに感染していることが疑われている被検者から得られた筋肉生検を有効量の融合産物で処理することができる。続いて基質の変換の程度を分析することによって、その被検者、特に哺乳動物、とりわけニワトリにおけるラウス肉腫ウイルスの感染を検出することが潜在的に可能となる。かくして、脱調節ないしは“活性化”されたSrc の発現を引き起こすレトロウイルスの存在が、多量の変換基質により明らかとなるような通常より高いレベルのSrcにより示されうる。例えば、Paxton，W.G.ら，Biochem．Biophys．Res．Commun．(1994)200(1):260-267（アンジオテンシンII AT1レセプターのリン酸化されたチロシンおよびセリン残基、Srcファミリーチロシンキナーゼの基質の検出）を参照のこと; もうひとつの適当な基質はプロテインp68であるかもしれない(Fumagalli，S．ら，Nature（1994）368(6474):871-874; Taylor，S.J.およびShalloway，D．同書，867-871)。
【００７６】
あるいはまた、酵素を選択的な結合により本発明のSH3ドメイン結合性ペプチドの形態に単離することができる（例えば、ビオチン−ペプチド結合体）。タンパク質−ペプチド結合複合体の単離（例えば、ストレプトアビジンを含むカラム上で）の後、慣用の方法により酵素の活性をアッセイし、脱調節ないしは“活性化”された形態の酵素の存在を示すものとみなすことができるプロテインキナーゼ活性のレベルを決定することができる。Src キナーゼのアッセイはKlinz およびManessにより、Neuroprotocols (a companion to Neuroscience)（1992）1(3):224-231に記載されている。
【００７７】
さらに、本発明の診断薬は、細胞、組織または器官、とりわけSH3ドメインを有するタンパク質を含有するそれらのものの画像診断薬として役立つ。例えば、神経細胞（例えば、ニューロン、脳の他の領域）、破骨細胞、骨芽細胞、血小板、免疫細胞、および他の分割細胞(dividing cells)がSH3ドメインを有するタンパク質を発現したり、あるいは含有することが知られている。従って、身体の部分の画像を撮り、これをその被検者の身体の生理的または生化学的変化を検出するための次の画像のベースラインとして役立てることができる。例えば、Src の細胞レベルの状態の変化または細胞Src が“活性化”形態に転換したことは、本発明の診断薬または画像診断薬を用いて検出されうる。
【００７８】
従って、蛍光エミッターのタグ付きのSH3結合性ペプチドが細胞骨格の画像を与えることができることが証明されている。この画像は図11に提示されている。図11からわかるように、パネルＡ、Ｂ、およびＣは、蛍光タグを含むように修飾されたSH3ドメイン結合性ペプチドでNIH 3T3繊維芽細胞を処理して得られる蛍光画像を示している。これと非常に対照的に、パネルＤは、対照としてビンキュリンのプロリンに富むセグメントでその細胞を処理したときに形成される暗い画像しか示していない。
【００７９】
もうひとつの態様において、SH3 ドメイン結合性ペプチド−ホースラディッシュイムノペルオキシダーゼ複合体または関連免疫組織化学的薬剤を使用して、組織、血清または体液における特定のレセプター分子を検出および定量することができるかもしれない。特に、本発明は、イムノアッセイ、サザンまたはノーザンハイブリダイゼーション、およびin situアッセイでの使用に役立つ診断用試薬を提供する。従って、本明細書に記載した診断薬はin vitroおよびin vivoでの使用に適しているかもしれない。
【００８０】
さらに、本発明の診断剤または造影剤は、検出可能な標識の特性により限定されない。したがって、診断剤は、１つまたはそれ以上の、ラジオアイソトープ、蛍光タグ、常磁性物質、重金属、または他の造影増強剤のような標識を含むが、それにより限定されるものではない。当業界の通常の技術を有する者であれば、標識の範囲およびそれらをＳＨ３ドメイン結合性ペプチドに組み込むかまたは結合させて診断剤を形成する方法を知っている。
【００８１】
別の態様では、医薬組成物は、ＳＨ３ドメイン結合性ペプチドおよび医薬上許容しうる担体を包含して提供される。本発明の特定の態様では、医薬組成物はＳＨ３ドメイン含有タンパク質の活性をモジュレートさせるのに有用である。「モジュレート」は、タンパク質標的の活性を阻害するかまたは増強することを意味する。したがって、医薬組成物はＳＨ３ドメイン結合性ペプチドおよび医薬上許容しうる担体を包含することが開示され、そのペプチドは、（ｉ）式ＲＸＬＰφφＰＸψ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）（式中、Ｘはシステインを除く任意のアミノ酸を表し、φは疎水性アミノ酸残基を表し、さらにここでψは、システインを除く親水性アミノ酸残基であり、各文字は、対応のアミノ酸残基のための標準一文字標記を表す。）の９−ｍｅｒの配列モチーフ、及び所望する場合には（ｉｉ）前記９−ｍｅｒ配列を含む総数４５アミノ酸残基に及ぶ、９−ｍｅｒ配列をそのＣ末端、Ｎ末端あるいは両方で隣接する付加アミノ酸残基を包含する。
【００８２】
上述したように、本発明の治療剤または診断剤は、適切な医薬上許容しうる担体、希釈剤、およびアジュバントをも含有できる。このような医薬担体は、水、および例えば落花生油、大豆油、鉱油、胡麻油のような石油系、動物性、植物性、合成系起源の油でありうる。医薬組成物が静脈投与される場合、水は好ましい担体である。生理学的食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール溶液も液体担体として、特に注射溶液用に使用できる。適切な医薬賦形剤としては、澱粉、グルコース、ラクトース、蔗糖（スクロース）、ゼラチン、麦芽、米、粉（フロー）、チョーク、シリカゲル、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、除放性処方等の形態を取ることができる。適切な医薬担体は、E.W．Martin による「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載される。
【００８３】
このような組成物は、対象（患者）に対して適切な投与の形態を提供するため、治療上有効量の活性化合物を適切量の担体とともに含有する。静脈注射は、投与の非常に効果的な形態であるが、筋肉内、腹腔内、および皮下注射、さらに経口、鼻腔内、腸管内、および非経口投与を含むが、これにより限定されない他の様式も使用できる。
【００８４】
本発明の治療剤および診断剤は、動物、そしてさらに好ましくは、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、モルモット、マウスおよびラットと同様にヒトを含む哺乳類に対する処置および／または診断に使用される。したがって、本発明で意図される他の方法としては、哺乳類での骨吸収をモジュレートする、すなわち阻害するかまたは増強する方法（例えば、Hall，T.J.,Biochem．Biophys．Res．Commun．(1994)199(3):1237-44を参照）、タンパク質チロシンキナーゼ媒介シグナル伝達経路を中断する方法、または本発明のＳＨ３ドメイン結合性ペプチドの有効量を導入するかまたは投与することにより細胞中のプロセシング、トラフィッキングまたは翻訳ＲＮＡを調整する方法(例えば、Taylor,S.J．およびShalloway,D.,上述の文献)を含むがこれに限定されるものではない。
【００８５】
本発明の診断剤または治療剤はタンパク質、多糖、または合成ポリマーのような水溶性の巨大分子に結合させることにより修飾できる。例えば、ペプチドは、スチレン-マレイン酸共重合体（例えばMatsumura and Maeda，Cancer Res.(1986)46:6387参照）、メタクリルアミド共重合体(Kopececk and Duncan,J．Controlled Release（1987）6:315)、またはポリエチレングリコール(PEG)(例えば、Hershfield and Buckley，N．Engl．J．Med．（1987）316:589、HoらのDrug Metab．Dispos（1986）14:349、ChuaらのAnn．Intern．Med．（1988）109:114）に結合できた。所望であれば、この剤は、さらに抗体、特にモノクローナル抗体に結合させて標的化される。このような抗体としては、キメラ、シグナル鎖、Fab断片、およびFab 発現ライブラリーが挙げられるがこれらによって限定されるものではない。１つの態様では、この剤は、分解可能な結合を介して巨大分子と結合されているので、in vivoでその活性形で放出される。
【００８６】
別の態様では、治療剤または診断剤は、小胞、特にリポソームで供給してもよい。LangerのScience(1990)249:1527-1533、Treat らのLiposomes in the Therapy of Infectious Disease and Canser,lopez-Berestein and Fidler（eds.）、Liss，New York(1989)pp.353-365，lopez-Beresteinの上述の文献pp.317-327参照。
【００８７】
さらに別の態様では、治療剤またはin vivo診断剤は、コントロールされた放出系で供給できる。１つ態様では、ポンプが使用できる(Langer，上記、SeftonのCRC Crit．Ref．Biomed．Eng．（1987）14:201、BuchwaldらのSugery（1980）88:507、SaudekらのN．Engl．J．Med．（1989）321:574)。別の態様で、重合性材料が使用できる(Medical Applications of Controlled Release，LangerおよびWise（編）、CRC Pres.，Boca Raton，Florida，1974; Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design and Performance，SmolenおよびBall（eds.）Wiley，New York 1984; Raner およびPeppasのJ．Macromol．Sci．Rev．Macromol．Chem．（1983）23:61 参照；Levy らのScience（1985）228:190; DuringらのAnn．Neurol．（1989）25:351；HowardらのJ．Neurosurg．（1989）71:105も参照)。好ましい態様では、コントロールされた放出系が、治療標的の次に置かれ、したがって全身投与の画分のみを必要とすることができる（例えば、Goodson のin Medical Applications of Controlled Release，上記（1984）2:115-138 参照）。本発明の特定の利点は、ペプチドがコントロールされた放出系に体のあるほとんどの環境である暖かな所で保持されるタンパク質に関して変性および凝集の問題にならないことであることが当業界で通常の技術のものに認識される。
【００８８】
他のコントロールされた放出系は、Langerのin Science（1990）249:1527-1533による検討で記述される。
【００８９】
6.実施例
6.1.TSAR-9ライブラリーの調製
6.1.1.オリゴヌクレオチドの合成および構築 
図１は、オリゴヌクレオチドの式およびＴＳＡＲ−９ライブラリーの構築の際に使用した構築スキームを示す。アプライドバイオシステムズ380a合成機(Foster City，CA)でオリゴヌクレオチドを合成し、そして全長ヌクレオチドをHPLCにより精製した。
【００９０】
５つの微生物のオリゴヌクレオチドの各対を一緒に、0.1%トリトンX-100、2mM dNTP's、および20単位のTag ＤＮＡポリメラーゼを用いた緩衝液（10mMトリス-HCl、ｐＨ8.3、15mM KCl、0.001%ゼラチン、1.5mM 塩化マグネシウム）中で混合した。構築反応混合液を72℃で30秒間、その後30℃で30秒間インキュベートした。変性段階が使用されていないので、構築反応はPCRでないことは注目すべきである。次のプロトコール（72℃で30秒、30℃で30秒、60サイクル繰り返し）で、加熱サイクル装置(Ericomp，LaJolla，CA)でフィル−イン反応を行った。温度が低ければ、２組のオリゴヌクレオチド対の間の6塩基の相補的領域をアニールさせる。反応生成物をフェノール/クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。90%より多くのヌクレオチドが、２重鎖合成オリゴヌクレオチドに変換されていることが分かった。
【００９１】
10mMトリス-HCl、ｐＨ7.5、1mM EDTAを含有する300 μLの緩衝液(TE緩衝液)に再懸濁させた後、供給者の推奨に従って、オリゴヌクレオチド断片の末端をXba IおよびXho I (New England Biolabs，Beverly，MA)で開裂した。4%アガロースゲル電気泳動により断片を精製した。正確なサイズのバンドを取り出し、そして電気溶出し、エタノール沈殿で濃縮し、100 μl TE緩衝液に再懸濁した。およそ5%の構築オリゴヌクレオチドが内部Xho IまたはXba I部位を有することが予測されるが、唯一全長分子が構築スキームのライゲーション段階で使用された。合成オリゴヌクレオチド断片の濃度は、適当な定量マーカーで行われた臭化エチジウム染色ゲルでの強度が比較されることで計算された。詳細に記載しないが、全ＤＮＡ操作は上述のManiatisにしたがって行った。
【００９２】
構築された酵素消化オリゴヌクレオチドがライゲートされうることを証明するために、自己ライゲートに対する能力について、合成されたＤＮＡ断片を試験した。消化断片を一夜18℃でT4 ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーション緩衝液中でインキュベートした。アガロースゲル電気泳動によりライゲーション産物を試験したときに、バンドのコンカテマーは、臭化エチジウム染色により目視することができた。５つの異なった単位長のコンカテマーと同じ数のバンド（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー）が明白であり、その結果合成ＤＮＡ断片がライゲーションの効果的な基質であることが示唆された。
【００９３】
6.1.2.ベクターの構築
TSARライブラリーを発現させるのに有用なM13起源のファージベクターの構築が最近記述された(Fowlkes，D.らのBioTech．（1992）13:422-427)。TSAR-9ライブラリーを発現するために、M13起源のベクターm663をFowlkesに記載されたとおり構築した。m663ベクターは、c-mycエピトープを有するpIII遺伝子を含む、すなわち、スタッファー断片として成熟N-末端で導入され、Xho IおよびXba I制限部位により隣接された（Fowlkesの図１も参照）。
【００９４】
6.1.3. TSAR-9ライブラリーの発現
その後、合成オリゴヌクレオチドを、リガーゼで一夜12℃インキュベートすることにより、pIII遺伝子(Fowlkes)を含むXho IおよびXba I二重消化m663 RFＤＮＡにライゲートした。さらに詳細には、50ngのベクターＤＮＡおよび5ngの消化された合成ＤＮＡを、T4 ＤＮＡリガーゼを用いて50μLライゲーション緩衝液(50mM トリス、ｐＨ8.0、10mM MgCl2、20mM DTT、0.1mM ATP)で一緒に混合した。一夜12℃でライゲーションした後、エタノール沈殿および70%エタノールでの洗浄によりＤＮＡを濃縮した。その後、電気穿孔法によりライゲートされたＤＮＡをE．coli(DH5αF'；GIBCO BRL，Gaithersburg，MD)に導入した。
【００９５】
少量の電気穿孔した細胞をプレートにかけ、プラークの数を計測して、106組換え体が発生するのを測定した。組換え体ベクターを含むE．coli細胞のライブラリーを高密度（150mM ペトリ皿当たり-400,000）で組換え体ファージの単一増幅のためにプレートにかけた。８時間後、SMG緩衝液(100mM NaCl, 10mMトリス-HCl、ｐＨ7.5、10mM MgCl2、0.05%ゼラチン)で18時間、各プレートを洗浄することで組換え体バクテリオファージを回収し、グリセロールを50%まで添加した後、-80℃で凍結した。形成されたTSAR-9ライブラリーは、-2×1011pfu/mlの作業力価を示した。
【００９６】
6.2. TSAR-12ライブラリーの製造
図2は、合成オリゴヌクレオチドのための式およびTSAR-12ライブラリーの構築に使用した構築スキームを示す。以下の除外をもって図2に示したように、上記セクション6.1に記載したTSAR-9ライブラリーと実質的に同じようにTSAR-12ライブラリーを製造した。(1)変異の予測されないオリゴヌクレオチド配列の各々、すなわちNNBは、54ヌクレオチドよりむしろ30ヌクレオチド長であった。（2）変異の予測されない配列の5'末端に含まれる制限部位は、Xho IおよびXba IよりむしろSal IおよびSpo Iだった。そして(3)２つの鎖をアニールすることを助けるための3'末端での不変の配列はCCAGGTおよびGGTCCAよりむしろGCGGTGおよびCGCCACであった(5’から3'へ)。
【００９７】
ｄＮＴＰおよびＴａｇ ＤＮＡポリメラーゼの存在下でのアニールおよび鎖伸長の多数ラウンド、およびセクション6.1.1.で上述したとおりの精製を含む合成後、合成二重鎖、オリゴヌクレオチド断片は、Sal IおよびSpe I制限酵素で消化し、そしてT4 ＤＮＡリガーゼで、m663ベクター中に含まれるM13 pIII遺伝子をコードするヌクレオチド配列にライゲートし、セクション6.1.2.および6.1.3.で上述されたとおりのTSAR発現ベクターのライブラリーを得た。その後、電気穿孔法によりライゲートしたＤＮＡをE．coli（(DHS αF'；GIBCOBRL，Gaithersburg，MD)に導入した。E．coli細胞のライブラリーを、高密度(150mM ペトリ皿当たり-400,000)で組換え体ファージの増幅のためにプレートした。約８時間後、SMG 緩衝液で18時間、各プレートを洗浄することで組換え体バクテリオファージを回収し、グリセロールを50%まで添加した後、-80℃で凍結した。
【００９８】
形成されたTSAR-12 ライブラリーは、-2×1011pfu/mlの作業力価を示した。
【００９９】
6.3. TSAR-9およびTSAR-12ライブラリーの特徴
上記セクション6.1および6.2に記載されたTSARライブラリーのそれぞれに挿入された合成オリゴヌクレオチドは、それぞれ2036(-1047)および2020の潜在的なコード複雑さを示し、-1014分子を各形質転換実験に使用したので、これらのTSARライブラリーの各員は、特徴的であった。プレート増幅後、ライブラリー溶液または保存液は104コピーの各員／mLを示した。
【０１００】
ライブラリーの両方にこの程度まで特徴づけられた非常に小さな(<10%)挿入オリゴヌクレオチド配列が、欠失または挿入を示すことが観察された。これは、用いられた条件下でオリゴヌクレオチドを急速に構築することの反映のようであり、特定のタイプの突然変異(すなわち、フレームシフト)が、ファージ増殖のための必須タンパク質をpIIIとして許容しないという事実である。
【０１０１】
任意のコード偏りが、これらのライブラリーにより発現された種々の予測しないペプチドに存在するかどうかを決めるために、おそらくオリゴヌクレオチドの合成の間にin vitro で、または繁殖ファージにより発現されたin vivoでかけられた偏りのために、挿入が以下に記載されたとおりシーケンスされた。
【０１０２】
6.3.1. TSAR-9ライブラリーの特徴づけ
23のランダムに選択された分離物の導入された合成オリゴヌクレオチド断片を、TSAR-9ライブラリーから試験した。個々のプラークは、E．coli(DH5 αF')細胞を含む2XYTブロスの1 mLを接種するのに使用し、培養液を一夜37℃で通気して成長させた。Maniatisの上記文献にしたがって、培養上清からＤＮＡを分離した。オリゴヌクレオチド5'-AGCGTAACGATCTCCCG(SEQ ID NO．99)をプライマーとして使用するSanger(Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1979）74:5463-5467)の方法にしたがって、23の個々の分離物をシーケンスした。そのオリゴヌクレオチドは、TSARを発現するのに使用されたm663ベクターのpIII遺伝子クローニング部位の89ヌクレオチド下流である。
【０１０３】
マックベクターコンピュータプログラム(IBI，New Haven，CT)で、ヌクレオチド配列およびそれらのコード化アミノ酸配列を分析した。マイクロソフトEXCELプログラムは、アミノ酸頻度を評価するために使用した。このような分析では、アミノ酸についてそしてその結果ほとんどのアミノ酸についてコードするヌクレオチドコドンは、発現したタンパク質のTSAR-9ライブラリーで予測される頻度で起こることが示された。注目すべき例外は、グルタミンおよびトリプトファンであって、それぞれ過剰にまた過少に現れた。
【０１０４】
挿入物中の少量のTAG停止コドン、すなわち特徴づけられた-200分離物のわずか2つが、TAG停止コドンを含むに注目することは興味深い。使用された構築スキームの点で、約半分[1-(47/46)36]のファージ挿入が、少なくとも１つのＴＡＧコドンを示すことが予測された。しかし、細菌宿主がｓｕｐＥであっても、ＴＡＧ付随ファージのほとんどは、ライブラリーから消失したように見える。これは、抑制の結果が１００％有効より少ないものであってよい。
【０１０５】
固定されたＰＧコード中心を遮断する挿入された二重鎖合成オリゴヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸が、単一配列に連結され、そしてマイクイロソフトＥＸＣＥＬプログラムを使用して、各アミノ酸について使用頻度が測定された。これらの頻度は、オリゴヌクレオチドの構築スキームから予測されたものと比較され、そして予測された値からの散開は、ベースラインの上下のバーのサイズによって表される。Ｃｈｉスクエアー分析は、逸脱の顕著さを測定するのに使用された。グルタミンおよびトリプトファンは、おのおのいささか過剰にそして過少に現れるという着目すべき例外をともないながらも大部分のアミノ酸は、予測される頻度で起こることが分かった。したがって、不変Ｐｒｏ−Ｇｌｙについてを除き、任意の位置は、任意のアミノ酸を示すことができた、したがって配列は予想できないか、またはランダムである。
【０１０６】
6.3.2. TSAR-12ライブラリーの特徴づけ 
TSAR-12ライブラリー由来のおよそ10のランダムに選択された挿入オリゴヌクレオチドが、セクション6.3.1.で上述されたとおりＤＮＡシーケンシングにより試験された。分離物は、TSAR-9分離物にしたようにTSAR-12ライブラリーからランダムに選択され、そしてシーケンシングのために製造された。分析では、不変のGly を除き、任意位置が、任意のアミノ酸を有することができた。したがって、配列は、予想できないか、またはランダムである。
【０１０７】
6.4. ＲＳＣライブラリーの製造
ここで図３にしたがって、配列
2007259856.tif 000003
（式中、Ｎは、デオキシヌクレオチドＡ，Ｃ，ＧおよびＴの当モル比であり、そしてＫは、ＧおよびＴの当モル比である。）を用い、アブライドバイオシステムズ380a合成機で、２つのオリゴヌクレオチドが合成された。５０ピコモルの各オリゴヌクレオチドを５０μLのSequenase(登録商標)緩衝液（U.S．Biochemicals，Cleveland，Oh）中で、０．１μｇ／mLアセチル化ＢＳＡおよび１０ｍＭ ＤＴＴを用いて４２℃で、５分間、その後３７℃で１５分間インキュベートした。アニーリング後、１０単位のSequenaase（登録商標）緩衝液(U.S．Biochemicals)および０．２ｍＭの各ｄＮＴＰを添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。その後、サンプルを６５℃で２時間加熱し、１００単位のXho IおよびXba Iの両方(New England BioLabs，Beverly，MA）で消化し、フェノール抽出し、エタノール沈殿し、そして15% 非変性ポリアクリルゲルに溶かした。構築された消化断片はゲル精製してからライゲーションした。ベクターm663(Fowlkes，D.らのBiotech.(1992)13:422-427)をXho IおよびXba Iで消化して製造し、子ウシアルカリホスファターゼ(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)で処理し、フェノール抽出し、そしてアガロースゲル電気泳動により精製した。ライゲートするために、製造者の指示にしたがって、20μg ベクターを、T4 ＤＮＡリガーゼ(Boehringer Mannheim)を有する3 mL中に0.2 μgの挿入物とともに混合した。フェノール抽出およびエタノール沈殿によりタンパク質および緩衝液を除去した後、ライゲートしたＤＮＡをXLI-ブルーE．coli(Stratagene，San Diego，CA)に電気穿孔し、そして8時間37℃で、プレートにかけた。組換え体ファージを回収するために、スパチュラで頂部寒天を収集し、同量の100mM NaCl、10mM MgCl2、および50mM トリス-HCl(ｐＨ7.5)と混合し、18-ゲージのシリンジ針を2回通過することにより中断させた。遠心分離により細菌細胞を取り除き、そしてポリエチレングリコール沈殿によりファージ粒子を収集し、-70℃で、25%グリセロール中に貯蔵した。ライブラリーは、全部で106総組換え体を有し、そして6 ×1013pfu/mLの作業力価を示した。
【０１０８】
ポリメラーゼ連鎖反応(SaikiらのScience（1988）239:487-491）による挿入についてライブラリーの構成員を調べた。ペトリ皿上の個々のプラークを、滅菌楊枝で触れ、そしてその頂部を、F+ E．coli細菌を有する2XYT中に攪拌し、一夜37℃で通気してインキュベートした。５マイクロリットルのファージ上清をその後緩衝液(67mM トリス-HCl、ｐＨ8.8/10mMβ-メルカプトエタノール/16.6mM 硫酸アンモニア/6.7mM EDTA/1 mL当たり50μg ウシ血漿アルブミン)、0.1mM デオキシヌクレオチドトリホスフェート、および1.25単位のTaq ＤＮＡポリメラーゼ(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)を100 ピコモルのオリゴヌクレオチドプライマーとともに含む新たな管に移した。プライマーは、m663の遺伝子III中のクローニング部位に隣接させた(5'-TTCACCTCGAAAGCAAGCTG-3'(SEQ ID NO.100)および5'-CCTCATAGTTAGCGTAACG-3'(SEQ ID NO.101))。構築反応液を、94℃で1分、56℃で2分、そして72℃で3分間インキュベートした。このサイクルを24時間繰り返した。その後、電気穿孔法により、反応生成物をNuSieve2.0% アガロースゲル(FMC，Rockland，ME)上に溶かした。20プラークについて試験にかけたゲルは全て、組換え体であり、予測部位の単独の挿入を示した。
【０１０９】
ライブラリーのサンプルサイズに基づき、100%の組換え体が単独の挿入を示すことが予測された。しかし、R8C ライブラリーから分離されたＳＨ結合性ファージの全てが、二重挿入を示した。このようなファージは、ライブラリーの中で推定される比(すなわち、<5%)であるが、しかしSH 3- 結合性ペプチドがリニヤーである必要があるように見えるので、それらを我々のスクリーニング法により選択した。ほどんど同様に、それらは、ライブラリーの世代じゅうに形成された。１つのシナリオは、挿入物を一緒にライゲートして頭から頭の二量体を形成すること、そしてベクターのXho I粘着性末端を用いたライゲーションにより、そしてベクターのXba I部位を用いた異常なライゲーションによりそれを連続してm663ＤＮＡにクローンした(図4参照)。
【０１１０】
6．5．標的被覆マイクロタイターウェルの製造
6．5.1．GST-SH3融合タンパク質の製造
Src-GST融合タンパク質の製造は最初Smith and Johnsonにより、Gene(1988)67:31で記載された。この開示は、ここに参照として組み込まれる。簡潔には、Src、Grb2、Crk AblまたはPLCγのSH3ドメインを含むGST融合タンパク質を発現するpGEX誘導(Pharmacia，Piscataway，NJ)構築物をChanning Der博士(University of North Carolina at Chapel Hill)から得た。SH3 ドメインを発現する構築物をMarius Sudol（Rockefeller University）から得た。GST-SH3融合タンパク質を製造するためのpGEX細菌発現ベクターを使用することが当業者によく知られている。Cicchetti，P．らのScience（1992）257:803-806参照。簡潔には、特にSH3ドメインのためのコード領域を、pGEX-2TのBam HI部位でインフレームに融合できる。したがって、融合タンパク質を製造者の指示にしたがい製造し、SDSポリアクリルアミドゲルのクマシーブルー染色により定量した。100mM NaHCO3(ｐＨ8.5)中の5-20μg GST-SH3融合タンパク質、を用いてマイクロタイターウェルを被覆し、100mM NaHCO3(ｐＨ8.5)で保護し、1% BSAで洗浄した。全ての洗浄は、IXPBS、0.1%ツイーン20、0.1% BSA(バッファーA)の5つの応用からなった。各ウェルに結合されたタンパク質の量を抗-GST抗体をベースとしたELISA(Pharmacia，Piscataway，NJ)を用いて適切に定量し、この作業工程の間GST-結合性ファージで単離した。
【０１１１】
6.5.2.マイクロタイターウェルの被覆
製造者の指示にしたがって、細菌に発現されたSrc SH3グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(Src-GST)融合タンパク質を、グルタチオンアガロース4B(Pharmacia)を用いて細菌溶解産物から精製した。PBS 中の10mMグルタイオンを用い、グルタチオンアガロース4Bから結合性Src-GST 融合タンパク質を溶出させた。その後、マイクロタイターウェルを、4 ℃で一夜でSrc-GST融合タンパク質(1-10μg/ウェル、50mM NaHCO3、ｐＨ8.5)で被覆した。ファージの非特異的結合を保護するために、100mM NaHCO3中の1% BSA(ｐＨ8.5)100 μLを、各ウェルに添加して、室温で1時間インキュベートさせた。その後、200 μL PBS、0.1%ツイーン20、0.1% BSA(バッファーA)でウェルを5回洗浄した。
【０１１２】
6.6. 標的分子としてSrc-GST 融合タンパク質を用いたファージ表示ランダムペプチドライブラリーのバイオパンニングおよびサブシーケント特徴化
6.6.1. Src SH 結合性ファージの単離 
先述のとおりに、ライブラリースクリーンを行った。Kay，B.K．らのGene(1993)128:59-65。簡潔には、バッファーA 中の1×1011pfu TSAR 9、TSAR 12またはRBCファージをSrc SH3-GST-被覆ウェルで、２時間インキュベートした。ウェルを洗浄し、そして結合性ファージを100 μL の50mM グリシン-HCl(ｐＨ2.2)で溶出し、新たなウェル移し、そして100mLの200mM NaHPO4(ｐＨ7.0)で中和した。回収されたファージを、20mL 2xYT中の1×109DH5 αP'E．coli細胞に感染させるのに使用した。感染細胞を一夜生育し、1000〜10000倍の増殖のファージ力価を得た。増幅段階外は上述の通り増殖ファージを2回以上パンした。3週目のパンニング後回収した結合性ファージをDH5 αP'E．coli細胞の低い密度でプレートして、クローナル分析のための単離プラークを得た。単離プラークを使用して、各々ファージ結合実験およびジデオキシシーケンシング(Sanger,P.らのProc．Natl．Acad．Sci．USA(1977)74:5483-5467)のためのファージ貯蔵物およびＤＮＡを回収した少量の培養物を作った。Src SH3-GSTまたはGSTのみを含有するファージの当力価をウェルにかけることによりSH3ドメインを結合することが、クローンで確認され、各ウェルから溶出粒子の数を滴定するか、または抗ファージ抗体をベースとしたELISA(Pharmacia)を用いて結合性ファージを予測した。
【０１１３】
実際、種々の異なるタンパク質から誘導された数種のSH3ドメインに結合する単離ファージクローンの能力は、上述の方法により調べることができた。種々の異なるタンパク質由来のSH3ドメインを含むGST-SH3 融合タンパク質をマイクロタイターウェルに結合した。前述のファージ貯蔵物のアリコート(50 μL)を、種々の異なるGST-SH3融合タンパク質を含むウェルに入れた。室温で1-2時間インキュベーションした後、マイクロタイタープレートの液体内容物を除去し、ウェルを5 回200 μL バッファーAで洗浄した。結合性ファージを、100 μL の50mMグリシン(ｐＨ2.2)で溶出し、新たなウェルに移して、100 μL 200mM NaHPO4(ｐＨ7.0)で中和させた。ファージを10-3〜10-5倍に希釈し、アリコートをDH5 αP'E．coli細胞のローン上に載せ、アウトプットサンプル中のプラーク形成単位の数を確認した。こられの実験から、他のタンパク質から誘導されたSH3ドメインに対する異なるSrc SH3結合クローンの比較特異性が決定された。
【０１１４】
6.6.2. ファージELISAおよびヌクレオチド配列決定 
単離物のさまざまな標的タンパク質への結合について評価するために、酵素結合イムノアッセイ(ELISA)もおこなった。細菌培養液をファージ単離物で感染させ、2XYT中、37℃で一晩培養した。細胞を遠心沈殿させ、25mlの上清を50mlのタンパク質で被ったマイクロタイタープレートウェルに加え（100mM NaHCO3中1mg/ml、pH8.4；４℃で一晩または室温で２、３時間）、遮断した（100mM NaHCO3中1mg/ml BSA、pH8.4；約１時間）。ファージをウェル中で25mlのPBS-0.1% Tween 20とともに室温で２時間インキュベートする。次いで、ウェルを30分間にわたり何度も洗浄する。それぞれのウェルにホースラディッシュペルオキシダーゼをコンジュゲートしたポリクローナル抗ファージ抗体を50μL加える。抗体はPharmacia（Piscataway，NJ; カタログ番号27-9402-01）より購入したもので、BSA-PBS-Tween 20で1：3000に希釈する。30分後、BSA-PBS-Tween20で20分間、ウェルを再度洗浄した。最後に、呈色のために100μLのABTS試薬（Pharmacia，H2O2とともに）をそれぞれのウェルに加える。プレートを、プレートリーダー（Molecular Devices，Menlo Park，CA）を用いて波長405nmで測定する。
【０１１５】
Src SH3結合性クローン（または他のタンパク質のSH3ドメインに結合するファージクローン）の関連セグメントのヌクレオチド配列は、標準的な方法により決定された。Sanger，F.，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1977）74：5463-5467参照。M13 m666の遺伝子IIIクローニング部位の89ヌクレオチド下流にあるオリゴプライマー、5'−ＡＧＣＧＴＡＡＣＧＡＴＣＴＡＡＡ−3'(配列番号102)をクレオチド配列は、MacVectorコンピュータープログラム(IBI，New Haven，CT，USA)を用いて分析した。このヌクレオチド配列の情報からそれぞれのSrc SH3結合性ペプチドの一次配列が推定された。次いで、対応する合成ペプチドを、フランキング配列とともにまたはフランキング配列なしで、当業者に公知の方法により合成した。実際に、これらの合成ペプチドは、より大きな結合親和性を示すファージ隣接アミノ酸残基を有するものとともに、SH3 ドメイン標的と結合することが示された。
【０１１６】
6.7 in vitroのペプチド結合アッセイ 
ペプチドは、Research Genetics(Birmingham，AL)、Chiron Mimotopes(Victoria，Australia)より購入、またはCytogen Corporation（Princeton，NJ）のDr．J．Mark Carterによる一般的な方法により合成した。ペプチドの純度はHPLCおよび/または質量分析により検定された。ビオチニル化ペプチドは、ビオチンとペプチドのN-末端との間の、ＫＳＧＳＧ(配列番号103)またはＧＳＧＳ（配列番号104）ペプチドリンカー（スペーサー）のいずれかを用いて合成された。結合実験は、ファージに代わりに10μMのペプチドを用いる以外は、上記のとおりにおこなった。結合したビオチニル化ペプチドはアルカリホスファターゼ(Sigma Chemical Co.，St．Lois，MO)とコンジュゲートしたストレプトアビジンにより検出した。１時間室温でインキュベーションをおこなった後、ウェルを洗浄し、3mM リン酸 p-ニトロフェニル（US Biochemicals，Cleveland，OH）の50mM NaCO3(pH9.8)溶液および50mM MgCl2を加えて、呈色させた。ELISAプレートリーダー(Molecular Devices，Menlo Park，CA)を用いて、波長405nmで測定した。結合実験は３回繰り返した。図７および８に結果を示す。
【０１１７】
6.8. 細胞溶解物のGST-SH3親和性沈降のペプチドの競合 
HeLa細胞の培養物を、≧100μCi/mL 35S-メチオニンとともに一晩インキュベートすることにより、標識したタンパク質を調製する。次いで細胞を洗浄し、弱い界面活性剤を用いて溶解する。この放射性タンパク質の混合物を、グルタチオン結合セファロースビーズ（Pharmacia，Piscataway，NJ）に固定化したSrc-GST融合タンパク質とともにインキュベートする。数時間撹拌した後、低速の遠心分離により、ビーズを静かに沈殿させ、上清を捨てる。次いで、ビーズを再度PBS-0.1% Tween20に懸濁させてスラリーを作り、沈殿させ、さらに数回洗浄する。最後に、サンプルに2% SDS溶液を加え、次いで、100℃で３分間煮沸する。その後、サンプルを遠心分離し、上清を電気泳動のために10% ポリアクリルアミドSDSゲル上にのせた。タンパク質が溶解した後、ゲルを固定し、乾燥して、オートラジオグラフィー用のＸ-線フィルムまたはMolecular Dynamics Phosphorlmagerによる走査のための燐光体プレートにさらした。
【０１１８】
Src-SH3の一定の35S-標識タンパク質に結合する能力については、外因性のペプチドとの競合能力により試験をおこなう。グルタチオン結合セファロースビーズに固定化されたSrc-GST融合タンパク質とともに溶解物をインキュベートする時点で、ファージ表示挿入断片およびモチーフに相当する合成ペプチドを加えるSH3結合性ペプチドは一部または全部の標識タンパク質の結合を遮断するのに対して、ネガティブコントロールのペプチド（無関係のペプチド配列）は遮断しなかった。競合の量を定量化し、加えたSH3-ドメイン結合性ペプチドの量と相互に関係づけた。
【０１１９】
他の方法として、NIH 3T3細胞をDulbeccoのModified Eagle Medium（DME）+ 10% ウシ胎児血清（FCS）+ 80μCi/mL Tran35S標識（ICN）中で増殖させ、PBSで洗浄し、RIPA緩衝液中で溶解し、沈殿させた。1.5×106細胞からの上清を100μgのグルタチオン-アガロース-固定化GSTであらかじめきれいにした。次いで上清を10μgのグルタチオン-アガロース-固定化GST-SH3融合タンパク質とともに、被験ペプチドを加えてまたは加えずに、最終的な量が250μLとなるようにしてインキュベートした。沈殿したビーズを、それぞれ1mLの、RIPA、RIPA + 1% デオキシコール酸塩 + 0.1% SDS,およびPBSで洗浄し、50μLのSDS-PAGEサンプル緩衝液に再懸濁し、煮沸し、SDS-PAGE(7.5%)処理した。燐光イメージング（Molecular Dynamics）により標識タンパク質を検出した。図９に結果を示す。
【０１２０】
6.9. 細胞溶解物から得られたPI-3'キナーゼのGST-SH3親和性沈降のペプチド競合 
PI-3'キナーゼの沈降に続いて、SH3-結合性ペプチドの存在下、または不在下において、細胞溶解物から得られたSrcによりPI-3’の沈降の追跡がが可能である。HeLa細胞を界面活性剤で溶解して、タンパク質混合物を、グルタチオン結合セファロースビーズに固定化されたSrc-GST融合タンパク質とともに数時間インキュベートする。数時間撹拌した後、低速の遠心分離によりビーズを静かに沈殿させ、、上清を捨てる。次いで、ビーズを、PBS-0.1% Tween 20中に再懸濁させてスラリーとし、沈殿させ、さらに数回洗浄する。最後に、サンプルにSDS溶液を加えた後、100℃で３分間煮沸する。その後、サンプルを遠心分離し、上清を、電気泳動のために10%ポリアクリルアミドSDSゲル上にのせる。タンパク質が溶解した後、ゲルをニトロセルロースまたはナイロンにブロットする（例、ウエスタンブロット）。次いで、フィルターに、PI-3'キナーゼ抗体（モノクローナルおよびポリクローナル抗体は、Upstate Biotechnology Incorporated，Lake Placid，NY)から購入できる）を結合させ、さらに酵素-結合第二抗体を結合させる。次いで、PI-3'キナーゼの量を定量する。
【０１２１】
Src-SH3がPI-3'キナーゼに結合する能力について、外因性のペプチドとの競合能力により試験をおこなう。グルタチオン結合セファロースビーズに固定化したSrc-GST融合タンパク質とともに溶解物をインキュベートする時点で、ファージ表示挿入断片およびモチーフに対応する合成ペプチドを加える。SH3タンパク質に対して10倍および100倍モル過剰のペプチドを用いる。SH3結合性ペプチドは、ウエスタンブロットで検出されるPI-3'キナーゼの結合を遮断するが、ネガティブコントロールのペプチド（無関係のペプチド配列）は遮断しない。競合の量を定量化して、加えたSH3-ドメイン結合性ペプチドの量と相互に関連づける。
【０１２２】
6.10. SH3-結合性ペプチドとタンパク質のSH3-ドメインのin vivo会合 
細胞内でSH3-結合性ペプチドとタンパク質のSH3-ドメインが会合することを示すため、SH3-結合性ペプチドにタグをつけて細胞内に局在化させた。たとえば、Bar-Sagi et al.，Cell（1993）74：83-91には、SH3-結合性タンパク質は細胞内にはいると細胞骨格に局在することが示されている。こうして、本発明のSH3ドメイン結合性ペプチドは、細胞のターゲッティングシグナル（例、細胞骨格への）として使うことができる。すなわち、ペプチドにビオチンでタグをつけた後、細胞内に注入する。別の方法として、SH3-結合性ペプチドと緑の蛍光を有するタンパク質(GFP、Chalfie et al.，Science（1994）263：802-805)からなる融合タンパク質を発現する組換えプラスミドを細胞内に移入することもできる。次いで、ビオチニル化ペプチドの位置またはGFP融合タンパク質の位置を、それぞれ、パラホルムアルデヒドで固定した細胞内のFITC-標識ストレプトアビジンにより、または生細胞内で直接蛍光を測定することによりアッセイする。SH3-結合性ペプチドが細胞骨格に局在することは、SH3-結合性ペプチドがin vivoでSH3-ドメインタンパク質と結合し得ることを示している。これに加えて、Src富化病巣索状帯(focal adhesion)もまたSH3-結合性ペプチドの細胞下局在の可能性がある位置である。
【０１２３】
以上のように、NIH 3T3繊維芽細胞をin vitroで、フィブロネクチンでコートしたガラスのカバースリップ上で培養した。37℃での２日間の増殖の後、2%パラホルムアルデド(pH7.5)の存在下、室温で１時間細胞を固定した。カバースリップをPBS-0.1% Tween 20で数回洗浄して固定液を除去した。次に、カバースリップをアセトン（-20℃に冷却しておく）に約20秒間浸し、空気乾燥した。カバースリップをBSA(1mg/mL)を含んだPBS-0.1% Tween 20で再度洗浄し、さまざまなビオチニル化ペプチドをPBS-0.1% Tween 20中に溶かしたものとともに室温で２時間インキュベートした。カバースリップを洗浄した後、1mg/mLのストレプトアビジン-Cy3（Jackson Immunoresearch Co.,West Grove，PA）とともに１時間室温でインキュベートした。最後に、カバースリップをPBS-0.1% Tween 20で洗浄し、ガラススライド上のグリセロール溶液に乗せて、Nicon Optiphotの上蛍光顕微鏡および60×のオイルに浸したレンズで観察した。
【０１２４】
結果を図11に示したが、ここで、枠Aには、ビオチン−スペーサー−ＶＬＫＲＰＬＰＩＰＶＴＲ（配列番号64）コンジュゲートにより染色された細胞を記載し；枠Ｂには、ビオチン−スペーサー−ＧＩＬＡＰＰＶＰＰＲＮＴＲ（配列番号63）コンジトにより染色された細胞を示し；枠Ｃには長いコンセンサスペプチド、ビオチン−スペーサー−ＲＳＴＰＲＰＬＰＰＬＰＴＴＲ（配列番号67）により染色さを示し；枠Ｄには、プロリン富化ビンキュリンペプチドコンジュゲート、ビオチン−スペーサー−ＬＡＰＰＫＰＰＬＰＥＧＥＶ（配列番号70）により染色されを示す。「スペーサー」配列はＫＳＧＳＧ（配列番号103）である。図11に示されるように、SH3ドメイン結合性ペプチドを使用した枠は、鮮明な蛍光表示を示しており、枠Ｄ（非SH3ドメイン結合性ビンキュリンセグメント）に表される、相対的に「暗い」結果と鋭い対照をみせている。これらの結果はさらに、本発明のSH3ドメイン結合性ペプチドの、細胞内のタンパク質標的（例、SrcおよびSrc-関連タンパク質）に局在してその像を提供する能力を示している。
【０１２５】
６．11．ＳＨ３−結合性ペプチドを用いた卵母細胞中のSrcのIn Vivo モジュレート 
ツメガエル属ラエビス(Xenopus laevis)卵母細胞に脱制御ＳｒｃをコードするｍＲＮＡを注入すると、卵母細胞に劇的な細胞学的変化および生化学的変化が起こる(Unger，T.F．and Steele，R.E.，in Mol.Cell.Biol.(1992)12:5485-5498)。出願人はＳｒｃのｍＲＮＡを生成するためのプラスミドをDr.Robert Steele（カリフォルニア大学アーヴィン校）から入手した。合成ＳＨ３−結合性ペプチドを、予めＳｒｃのｍＲＮＡを注入しておいた卵母細胞に注入する。表層色素粒の配置を解剖顕微鏡で観察することによって、細胞骨格の状態を視覚的に調べた。幾つかのタンパク質のリン酸化の状態を、上記のUnger とSteeleの記載のように、抗ホスホチロシンモノクロナール抗体を用いたウエスタンブロッティングによって調べた(4G10;Upstate Biotechnology Incorporated)。
【０１２６】
６．12．プロゲステロンによって誘発されるツメガエル属ラエビス卵母細胞の成熟 
成熟した卵巣部分を外科的に取り除き、それを0.1%コラゲナーゼタイプD(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)を含むCa2+無添加OR2(82.5mM NaCl，2.5mM KCl，1.0mM MgCl2，1.0mM Na2HPO，5.0mM HEPES,及び3.8mM NaOH，pH7.6)中でインキュベートした。その後、卵母細胞を1.0mM CaCl2を含むOR2で3-5回洗浄した。18℃で一晩、OR2中で再生させた。VI期の卵母細胞に40nLの100mM ペプチド又は水を注入した。注入後、その卵母細胞を2mg/mLのプロゲステロン(Sigma,StLouis,MO）を含むOR2中に置き、20℃でインキュベートした。１時間ごとの卵母細胞の胚胞崩壊(GVBD)を記録した。
【０１２７】
図10にこの実験の結果を示す。グラフに示すように、ＳＨ３ドメイン結合性ペプチドであるＶＬＫＲＰＬＰＩＰＰＶＴＲ（配列番号64）を注入した卵母細胞は、水又はプロリンに富化ビンキュリンペプチド，ＬＡＰＰＫＰＰＬＰＥＧＥＶ（配列番号70）を注入した卵母細胞よりも速いプロゲステロン誘発胚胞崩壊速度を示す。これらの結果は、既出のUnger とSteeleによって得られた結果、すなわち、野性型Ｓｒｃ（“細胞性”Ｓｒｃ）をコードするＲＮＡを注入した卵母細胞の表層に対して、脱制御Ｓｒｃ変異型(“活性”Ｓｒｃ)をコードするＲＮＡを注入した卵母細胞の表層においては、著しい変化が観察されたという結果に匹敵する。また、UngerとSteeleの論文の図3Bに示すように、脱制御又は活性化ＳｒｃのＲＮＡを注入した卵母細胞は水又は野性型ＳｒｃのＲＮＡを注入した卵母細胞よりも速い速度で成熟した。
【０１２８】
ＳｒｃのＳＨ３ドメイン結合性ペプチドを用いて得られた本結果により、これらのペプチドが“細胞性”Ｓｒｃの生化学的活性をモジュレートすることが示唆される。特に、本発明のＳｒｃのＳＨ３ドメイン結合性ペプチドの少なくも幾つかが、正常の状態ではダウンレギュレート又は阻害され得る“細胞性”Ｓｒｃの生化学的活性をアップレギュレートすることが示唆される。それ故、本発明のＳＨ３ドメイン結合性ペプチドの投与は、Ｓｒｃ又はＳｒｃ関連タンパク質の活性をモジュレートする新しい方法を構築し得る。特に、これらのペプチドの幾つかは、Ｓｒｃファミリータンパク質を活性化し得る。
【０１２９】
６．13．Ｓｒｃ形質転換細胞中のＳｒｃとＳＨ３結合性ペプチドとのIn Vivo拮抗作用 
ＳＨ３結合性ペプチドをコードする領域を、動物細胞中で発現するベクター中にクローニングする。c-mycエピトープ及びＳＨ３結合性ペプチドを有するタンパク質をコードする二連遺伝子(bipartite gene)を、強力な構造プロモーター（例えば、SV40，CMV,HSV TK，カルモジュリン）から転写して構築する。ベクターを、トランスフェクション（例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム、リポソーム、DEAEデキストラン）を介して、正常の又はＳｒｃで形質転換された細胞のいずれかに導入する。トランスフェクションされた細胞は、培養され、一時的に二連遺伝子を発現する。安定した形質転換された細胞系を作るために、ベクターは選択可能なマーカー（例えば、ネオマイシン耐性）を有するか、又はトランスフェクションを選択可能なマーカー（例えば、ネオマイシン耐性）を有する過剰のプラスミド及びそのマーカーのために選択された細胞の存在下で行なう。トランスフェクションされた細胞を免疫蛍光法によって染色し、二連タンパク質(bipartite protein)の発現を検出する。ハイブリドーマ 9E10 が、c-myc エピトープ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮ(配列番号105)；Evan,G.A．ら.,in Mol.Cell.Biol.(1985)5:3610-3616参照）に対して高い特異性を有するモノクロナール抗体を分泌する。二連タンパク質が細胞中に発現され、ある場合には、ＳＨ３ドメイン保持タンパク質(SH3 domain bearing protein)中に豊富に存在する亜細胞性構造に局在することを明らかにするために、この抗体が免疫蛍光法の実験に用いられる。
【０１３０】
これらの実験で幾つかの対照が用いられる。第一に、細胞を、ＳＨ３結合性ペプチドをコードする領域を有していないベクターでトランスフェクトする。第二に、正常の（形質転換されていない）細胞をトランスフェクトする。第三に、Ｓｒｃ以外の腫瘍遺伝子によって形質転換された細胞をトランスフェクション実験に用いる。第四に、c-mycエピトープを認識しない他のモノクロナール抗体で細胞を染色する。
【０１３１】
トランスフェクトされた細胞を、ＳＨ３結合性ペプチドを発現する結果としての細胞形態、性質及び代謝におけるすべての変化に関して調べる。細胞形態は、トランスフェクションの後、数回、位相差顕微鏡によって調べられる。特に、細胞の扁平度、基質に対する付着、及び細胞の波打ち運動の程度がモニターされる。細胞分裂速度、細胞移動及び接触阻害もまた、逐次観察される。最後に、トランスフェクトされた細胞中のリン酸化チロシンの量が、ホスホアミノ酸分析及びウエスタンブロッティング実験において抗ホスホチロシンモノクロナール抗体(4G10;Upstate Biotechnology Incorporated)を用いることによって定量される。
【０１３２】
６．14．ＰＸＸＰバイアスペプチドライブラリーの調製 
好ましいファージ表示ランダムペプチドライブラリーの調製及び特性決定を上記６．１−６．４節に記載した。
【０１３３】
これらの節に記載された方法に類似する方法を用いて、図12に与えられた図式に従って、オリゴヌクレオチド挿入物を構築した。その後、その挿入物をｍＢＡＸベクターへクローニングした。バイアスペプチドライブラリーを上記のように発現させた。
【０１３４】
ｍＢＡＸベクターは、Fowlkes らの方法(1992)(Biotechniques 13，422-427)において、Ｍ13mp18ベクター(Messing，J.(1991)．Cloning in M13 phage or how to use biology at its best．Gene 100,3-12)の遺伝子IIIのクローニング部位を生成させることによって、Kay Laboratoryで作られた。ｍＢＡＸベクターは、マウスモノクロナール抗体7E11のエピトープをコードする成熟pIIIタンパク質のＮ末端に、ペプチド配列を表示する（図13参照）。ｍＢＡＸベクターは、コーディング領域中に終止コドンＴＡＧを包含し、この終止コドンはsupE又はsupFとして知られているサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子の突然変異を有する大腸菌中で抑制されている。ｍＢＡＸゲノム中には他に終止コドンは存在しない。また、ｍＢＡＸベクターは、β−ガラクトシダーゼのαフラグメントセグメントをも有する。β−ガラクトシダーゼのωフラグメントを発現するバクテリア細胞は、透明なXGal基質を不溶性の青色沈殿物に転化する。プラークは青く見える。
【０１３５】
組換えｍＢＡＸ分子は、ｍＢＡＸの遺伝子III のXho I-Xba Iセグメント中のＴＡＧコドンによって、組換えられていない分子と容易に区別できる。Xho I-Xba I断片をランダムペプチドをコードするオリゴヌクレオチドで置き換えることにより組換え体が生成されると、その組換え体はサプレッサーｔＲＮＡ突然変異遺伝子を有するバクテリア（すなわち、DH5αF'）又は有しないバクテリア（すなわち、JS5）中で増殖できる。一方、組換えられていないｍＢＡＸ分子は、そのようなサプレッサー遺伝子を欠いているバクテリア(すなわち、JS5)のバクテリア層(bacterial lawns)上でプラークを作ることができない。これは、JS5 においては、ＴＡＧコドンが終止コドンとして作用し、翻訳の間に末端切断型のpIII 分子を産生するからである。pIIIは生存可能なＭ13ウイルス分子の必須のタンパク質成分であるから、プラークは形成されない。
【０１３６】
６．14．１ 検討 
ＳＨ３結合性ペプチドにＲＰＬＰＰＬＰコンセンサスモチーフの全部又は一部を固定し、隣接する残基をランダム化する、第二世代又はバイアス(biased)ペプチドライブラリーの使用により、選択的なＳＨ３結合を示す追加の配列残基が定義された。
【０１３７】
下記の表１〜５に、それぞれのＳＨ３ドメイン結合性ペプチドの各セットのバイアスペプチドライブラリーから得られた関連したアミノ酸配列を示す。下線を引いたアミノ酸残基は固定位置を示す。また、「コンセンサス」配列は新しい結合体の各セットについて示されるが、この「コンセンサス」配列は、新しい結合性ペプチドから集められた追加の特徴を含もうとするものである。記号「φ」は疎水性残基を示す。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【０１３８】
他の実施形態が本発明の範囲及び精神に含まれるにもかかわらずに上述した好ましい実施形態以外に、多くの他の本発明の実施形態が予想され得ることは当業者には明らかであろう。したがって、本発明は、本明細書に記載した好ましい実施形態に限定されるものと解釈されるべきではなく、これらの実施形態は本発明を説明するのに役立つにすぎず、本発明は以下の特許請求の範囲によってのみ限定されるべきである。
【０１３９】
また、非常に多くの参考文献が本明細書の至る所に引用されている。これらの参考文献の開示内容はすべて参照文献として本明細書に組み込まれる。
【０１４０】
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【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】図１に、ランダムな36アミノ酸ペプチドライブラリー（ＴＳＡＲ−９；例えば、配列番号16）の一般的な模式図を示す。オリゴヌクレオチドを合成し（配列番号17−18）、２本鎖ＤＮＡに変換し、制限酵素で切断し（配列番号19−20）、そしてＭ13ベクター、m663中にクローニングした。このオリゴヌクレオチドでコードされるランダムペプチド領域は枠内に示し（配列番号16）、成熟タンパク質III（配列番号21）のＮ−末端にある。
【図２】図２に、ランダムな22アミノ酸ペプチドライブラリー（ＴＳＡＲ−１２；例えば、配列番号23）の生成のための模式図を示す。オリゴヌクレオチドを合成し（配列番号24−25）、２本鎖ＤＮＡに変換し、制限酵素で切断し（配列番号26−27）、そしてＭ13ベクター、m663中にクローニングした。このオリゴヌクレオチドでコードされるランダムペプチド領域は枠内に示し（配列番号23）、成熟タンパク質III（配列番号28）のＮ−末端に呈示する。
【図３】図３に、ランダムな８アミノ酸ペプチドライブラリー（Ｒ８Ｃ；配列番号30）の生成のための模式図を示す。オリゴヌクレオチドを合成し（配列番号31−32）、２本鎖ＤＮＡに変換し、制限酵素で切断し（配列番号33−34）、そしてＭ13ベクター、m663中にクローニングした。このランダムペプチド領域（配列番号30）はシステイン残基でフランキングされており、成熟タンパク質III（配列番号35）のＮ−末端に呈示する。
【図４】図４に、１のクラスの二重挿入Ｒ８Ｃ組換え体（例えば、配列番号３６をコードする）の可能なオリジンを示す。２本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、配列番号37）は、Xho I-Xba I切断Ｍ13ベクター中にクローニングする前に、Xba I部位で頭−頭様式によりライゲートすることができる。
【図５】図５に、本発明の方法によって単離されたランダムペプチド組換え体（配列番号38−61および106）のリストおよび表示されたペプチド配列とを示す。このアミノ酸配列をコア配列の最重要点にアライン（Align）した。フランキング配列はコア配列のＮ−末端およびＣ−末端に示される。
【図６】図６に、種々のＳＨ３ドメインのための選択されたファージクローンの相対結合親和性をグラフで示したものである。この結果から、ある種のアミノ酸配列は通有のＳＨ３ドメイン結合を提供するが、他のアミノ酸配列はＳｒｃのＳＨ３ドメインに対するより大きな選択性を提供することが示された。さらに別のクローンは、ＳｒｃのＳＨ３ドメインの優先的結合を示す。
【図７】図７に、ＳｒｃのＳＨ３−選択ファージインサートに相当する合成ペプチド（配列番号９および62−70）のＳｒｃのＳＨ３−ＧＳＴ融合標的（影をつけたカラム）への結合は、ＲＰＬＰＰＬＰ（配列番号９）のコア配列と天然に存在するタンパク質に由来するプロリンに富むペプチドセグメントに比例してバックグラウンドのＧＳＴ結合（影をつけていないカラム）を超えるものであることを示す。結合したビオチニル化ペプチドをストレプトアビジン−アルカリホスファターゼＥＬＩＳＡで検出した。各点については３つに分けた試料を用いて検出を行い、405nm における平均の吸光度をとった。誤差は、ＳＤで表した。
【図８】図８に、異なるタンパク質に由来するＳＨ３ドメインのための選択されたペプチド（配列番号９および62−70）の相対的選択性を示す。特に、下記のタンパク質融合標的のＳＨ３ドメインについてペプチドの結合親和性を試験した：ＳｒｃのＳＨ３−ＧＳＴ、ＹｅｓのＳＨ３−ＧＳＴ、Ｇｒｂ２−ＧＳＴ、ＣｒｋのＳＨ３−ＧＳＴ、ＡｂｌのＳＨ３−ＧＳＴ、ＰＬＣγ１のＳＨ２ＳＨ３−ＧＳＴ。結合したビオチニル化ペプチドは、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼで検出した。各点については３つに分けた試料を用いて検出を行い；ＧＳＴのバックグラウンドを超える平均シグナル（405nm における吸光度）をとり、標準偏差を表す誤差を示した。細かい斜線をつけた棒は、ＥＬＩＳＡシグナルが振り切れたことを示す。
【図９】図９は、競合実験の結果を示す。ここでは、選択されたペプチドが細胞溶解物からのタンパク質の、固定化されたＳｒｃのＳＨ３−ＧＳＴまたはＡｂｌのＳＨ３−ＧＳＴタンパク質融合標的への結合を阻害することが明らかにされた。
【図１０】図10は、本発明のＳＨ３ドメイン結合性ペプチドである、ＶＬＫＲＰＬＰＩＰＰＶＴＲ（配列番号64）を注入された卵母細胞のプロゲステロン−誘導成熟速度の上昇を示すグラフである。すなわち、第VI期の卵母細胞が調製され、上記のように注入された（Kay，B.K.，Methods in Cell Biol．(1991)36:663-669）。卵母細胞に100 μＭの被験ペプチドまたは水を40ｎＬ注入した。注入後、卵母細胞を２μｇ/mLのプロゲステロン（Sigma，St．Louis，MO）中に入れ、胚胞の崩壊（GVBD，germal vesicle breakdown）を１時間ごとに記録した。
【図１１−１】図11には、蛍光実験の結果を示す。ここでは、本発明のある種のペプチド、パネルＡ＝ＶＬＫＲＰＬＰＩＰＰＶＴＲ（配列番号64）、パネルＢ＝ＧＩＬＡＰＰＶＰＰＲＮＴＲ（配列番号63）、パネルＣ＝ＲＳＴＰＲＰＬＰＰＬＰＴＴＲ（配列番号67）は、ＳｒｃまたはＳｒｃ−関連タンパク質を含むと考えられる細胞内コンパートメント中に局在することが示された。
【図１１−２】図11には、蛍光実験の結果を示す。ここでは、本発明のある種のペプチド、パネルＡ＝ＶＬＫＲＰＬＰＩＰＰＶＴＲ（配列番号64）、パネルＢ＝ＧＩＬＡＰＰＶＰＰＲＮＴＲ（配列番号63）、パネルＣ＝ＲＳＴＰＲＰＬＰＰＬＰＴＴＲ（配列番号67）は、ＳｒｃまたはＳｒｃ−関連タンパク質を含むと考えられる細胞内コンパートメント中に局在することが示された。
【図１２】図12は、バイアスペプチドライブラリー（biased peptide library）生成の模式図である。以下の実施例の章にさらに記載したように、オリゴヌクレオチドを合成し、２本鎖ＤＮＡに変換し、制限酵素Xho IおよびXba Iで切断し、ｍＢＡＸベクター中にクローニングした。バイアスペプチド領域(biased peptide region)は、成熟pIIIタンパク質のＮ−末端に呈示する。
【図１３】図13は、成熟pIIIタンパク質のＮ−末端に呈示された、ｍＢＡＸベクター中でコードされたペプチド配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年4月16日(2007.4.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＨ３ドメインに結合する領域を有するペプチドの同定方法であって、
（ａ）ＳＨ３ドメインを含む標的タンパク質を固定化し；
（ｂ）この固定化標的タンパク質を、ランダムペプチドライブラリーから分取したアリコートとともにインキュベートし；
（ｃ）固定化標的タンパク質から未結合ペプチドを洗い流し；
（ｄ）固定化標的タンパク質に結合したペプチドを回収し；そして
（ｅ）ＳＨ３ドメイン結合性ペプチドの一次配列を決定する；
ことを含んでなり、
ここで該ランダムペプチドライブラリーが、９個以上で４５個までのアミノ酸残基を有するＳｒｃのＳＨ３ドメインに対する結合親和性を示すペプチドを含み、かつ該ペプチドが、該ペプチドの任意の場所に式：Ｒ−２−Ｌ−Ｐ−５−６−Ｐ−８−９（配列番号１０）〔式中、各数字はアミノ酸残基を表すもので、２はシステイン以外の任意のアミノ酸残基を表し、５および６はそれぞれ疎水性アミノ酸残基を表し、８はシステイン以外の任意のアミノ酸残基を表し、９はシステイン以外の親水性アミノ酸残基を表し、そして各文字は対応アミノ酸の標準一文字表記である〕のアミノ酸配列が配置されているが、Ｒ−Ｐ−Ｌ−Ｐ−Ｐ−Ｌ−Ｐ−Ｔ−Ｓ（配列番号１１）ではないものである、上記方法。
【請求項２】
前記のライブラリーが表示ランダムペプチドライブラリーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記のライブラリーがファージ表示ランダムペプチドライブラリーである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記のライブラリーがファージミド表示ランダムペプチドライブラリーである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｃ）が固定化標的タンパク質から未結合ファージを洗い流すことを含み、ステップ（ｄ）が固定化標的タンパク質に結合したファージを回収することを含み、そしてステップ（ｅ）が結合しているファージの核酸の関係のあるヌクレオチド配列を決定し、これからＳＨ３ドメイン結合性ペプチドに対応する一次配列を推定することを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ＳＨ３ドメインに結合する領域を有するペプチドの同定方法であって、
（ａ）ＳＨ３ドメインを含む標的タンパク質を固定化し；
（ｂ）この固定化標的タンパク質を、ファージ表示ランダムペプチドライブラリー（該ライブラリーは≧８アミノ酸残基のランダム配列を有するペプチドを含む）から分取したアリコートとともにインキュベートし；
（ｃ）固定化標的タンパク質から未結合ファージを洗い流し；
（ｄ）固定化標的タンパク質に結合したファージを回収し；そして
（ｅ）結合しているファージの核酸の関係のあるヌクレオチド配列を決定し、ＳＨ３ドメイン結合性ペプチドに対応する一次配列を推定する；
ことを含んでなり、
ここで該ランダムペプチドライブラリーが、９個以上で４５個までのアミノ酸残基を有するＳｒｃのＳＨ３ドメインに対する結合親和性を示すペプチドを含み、かつ該ペプチドが、該ペプチドの任意の場所に式：Ｒ−２−Ｌ−Ｐ−５−６−Ｐ−８−９（配列番号１０）〔式中、各数字はアミノ酸残基を表すもので、２はシステイン以外の任意のアミノ酸残基を表し、５および６はそれぞれ疎水性アミノ酸残基を表し、８はシステイン以外の任意のアミノ酸残基を表し、９はシステイン以外の親水性アミノ酸残基を表し、そして各文字は対応アミノ酸の標準一文字表記である〕のアミノ酸配列が配置されているが、Ｒ−Ｐ−Ｌ−Ｐ−Ｐ−Ｌ−Ｐ−Ｔ−Ｓ（配列番号１１）ではないものである、上記方法。
【請求項７】
回収したファージの力価を増幅することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＳＨ３ドメイン結合性ペプチドを富化したファージを得るためにインキュベーション、洗浄および回収のステップを繰り返すことをさらに含む、請求項６または７に記載の方法。