(57)【要約】【課題】  生体分子、ＤＮＡ等を高集積度で配列し、透過電子顕微鏡を用いて観察、解析できる高集積度バイオチップ用試料支持体およびその製造方法を提供する。【解決手段】本発明の試料支持体は、導電性薄膜１０と、貴金属元素を含む複数の微小構造体１２であって、導電性薄膜１０中にそれぞれ一部が埋め込まれるように導電性薄膜１０に設けられた複数の微小構造体１２とを備えている。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
導電性薄膜と、
貴金属元素を含む複数の微小構造体であって、前記導電性薄膜中にそれぞれ一部が埋め込まれるように前記導電性薄膜に設けられた複数の微小構造体と、
を備えた試料支持体。
【請求項２】
前記複数の微小構造体の前記導電性薄膜の主面からの高さは１０ｎｍ以下である請求項１に記載の試料支持体。
【請求項３】
前記微小構造体は、少なくとも２ｎｍの深さで前記導電性薄膜の主面から埋め込まれている請求項１または２に記載の試料支持体。
【請求項４】
前記導電性薄膜は、炭素またはベリリウムからなる請求項１から３のいずれかに記載の試料支持体。
【請求項５】
前記複数の微小構造体は金、銀、白金族元素、または、これらを主成分とする合金からなる請求項１から４のいずれかに記載の試料支持体。
【請求項６】
前記複数の微小構造体のそれぞれは前記導電性薄膜の主面上においてストライプ形状を有している請求項１から５のいずれかに記載の試料支持体。
【請求項７】
前記複数の微小構造体のストライプ形状は前記導電性薄膜の主面上において第１の方向に伸びており、前記複数の微小構造体は、前記第１の方向と直交する第２の方向に所定のピッチで配置されている請求項６に記載の試料支持体。
【請求項８】
各微小構造体のストライプ形状の前記第２の方向に沿った幅は２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であり、前記第２の方向におけるピッチは０．５μｍ以上１０μｍ以下である請求項７に記載の試料支持体。
【請求項９】
前記複数の微小構造体は前記導電性薄膜の主面上において点形状を有している請求項１から５のいずれかに記載の試料支持体。
【請求項１０】
前記複数の微小構造体は前記導電性薄膜の主面上において概ね円形状または多角形形状を有している請求項９に記載の試料支持体。
【請求項１１】
各微小構造体の前記導電性薄膜の主面上における最大外形は２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下である請求項１０に記載の試料支持体。
【請求項１２】
前記複数の微小構造体は、前記導電性薄膜の主面上において第１の方向および前記第１の方向と直交する第２の方向に沿って２次元状に配列されている請求項１１に記載の試料支持体。
【請求項１３】
前記複数の微小構造体は、前記第１の方向および第２の方向に沿って所定のピッチで配列されており、前記第１の方向のピッチは、５０ｎｍ以上３００ｎｍ以下であり、前記第２の方向のピッチは、０．５μｍ以上１０μｍ以下である請求項１２に記載の試料支持体。
【請求項１４】
前記導電性薄膜の厚さは、２０ｎｍ以下である請求項１から１３のいずれかに記載の試料支持体。
【請求項１５】
前記導電性薄膜は、矩形形状を有し、前記矩形の一辺は５ｍｍ以下である請求項１４に記載の試料支持体。
【請求項１６】
貫通孔を有し、前記導電性薄膜を支持するグリッドをさらに備える請求項１から１５のいずれかに記載の試料支持体。
【請求項１７】
前記グリッドは銅または銀からなる請求項１６に記載の試料支持体。
【請求項１８】
前記グリッドの貫通孔内または貫通孔上に前記複数の微小構造体が位置するよう前記導電性薄膜と前記グリッドとは位置合わせされている請求項１７に記載の試料支持体。
【請求項１９】
前記導電性薄膜の前記複数の微小構造体が形成された主面の平坦度は±１００μｍ以下である請求項１から１８のいずれかに記載の試料支持体。
【請求項２０】
支持基板上に複数の開口部を有するマスクパターンを形成する工程（Ａ）と
各開口部内の前記支持基板上に貴金属を含む物質を設ける工程（Ｂ）と、
前記マスクパターンを除去することにより、前記貴金属を含む物質からなる複数の微小構造体が設けられた支持基板を得る工程（Ｃ）と、
前記支持基板上の前記複数の微小構造体を覆うように導電性薄膜を形成する工程（Ｄ）と、
前記導電性薄膜を前記支持基板から剥離する工程（Ｅ）と、
を包含する試料支持体の製造方法。
【請求項２１】
前記工程（Ｅ）の後に、貫通孔を有するグリッドを用いて前記導電性薄膜を支持する工程（Ｆ）をさらに包含する請求項２０に記載の試料支持体の製造方法。
【請求項２２】
前記工程（Ｃ）と工程（Ｄ）との間に、前記支持基板上の複数の微小構造体を囲むように前記支持基板上にグリッドを形成する工程（Ｇ）をさらに包含し、
前記工程（Ｄ）において、前記支持基板上の複数の微小構造体およびグリッドを覆うように導電性薄膜を形成する請求項２０に記載の試料支持体の製造方法。
【請求項２３】
前記工程（Ｇ）において、めっき法または無電解めっき法により銀からなるグリッドを形成する請求項２２に記載の試料支持体の製造方法。
【請求項２４】
前記マスクパターンの各開口部は、ストライプ形状またはドット形状を有する請求項２０に記載の試料支持体の製造方法。
【請求項２５】
前記工程（Ｂ）において、置換めっきまたは無電解めっきにより、前記貴金属を含む物質を設ける請求項２０に記載の試料支持体の製造方法。
【請求項２６】
前記工程（Ｂ）は、前記マスクパターンをマスクとして、蒸着法により、前記マスクパターン上および前記開口部内の前記支持基板上に前記貴金属を含む物質からなる膜を形成する請求項２０に記載の試料支持体の製造方法。
【請求項２７】
前記工程（Ｃ）と（Ｄ）との間において、前記微小構造体を加熱する工程（Ｈ）をさらに包含する請求項２０から２５のいずれかに記載の試料支持体の製造方法。
【請求項２８】
前記工程（Ａ）は、
レジスト膜を前記支持基板上に形成する工程と、
前記レジスト膜に電子線を照射することにより前記レジスト膜を露光する工程と、
前記レジスト膜を現像する工程と、
を含む請求項２０に記載の試料支持体の製造方法。
【請求項２９】
前記工程（Ａ）は、ナノインプリント法により前記マスクパターンを形成する請求項２０に記載の試料支持体の製造方法。
【請求項３０】
前記支持基板は、シリコン基板と、前記シリコン基板表面に形成されたニッケル、銅、亜鉛、スズおよびアルミニウムから選ばれる少なくとも１つからなる金属膜とを含む請求項２０に記載の試料支持体の製造方法。
【請求項３１】
前記工程（Ｅ）は、前記金属薄膜を除去することにより、前記導電性薄膜を前記支持基板から剥離する請求項３０に記載の試料支持体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は透過電子顕微鏡で試料を観察するための試料支持体に関し、特にＤＮＡ、たんぱく質、糖鎖などの生体分子や、細胞などを支持するための支持体およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体分子の選択的な反応性を利用し、特定の生体分子や化学物質を検出するためのバイオチップが開発されてきている。バイオチップは、基板上に固定された生体分子や細胞（プローブ）を含み、固定された生体分子と検出したい生体分子や化学物質（ターゲット）とを接触させ、生じた特異的な相互作用を検出する。たとえば、基板上に核酸を高密度配列して固定し、ハイブリダイゼーションにより相補的な配列の存在を検出するＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）、たんぱく質を固定し、固定させたたんぱく質と相互作用を有するたんぱく質を検出するたんぱく質チップ（プロテインチップ）、糖鎖チップ、細胞チップなどが知られている。
【０００３】
バイオチップにおける相互作用の検出方法としては、検出したい生体分子や化学物質を蛍光標識し、相互作用によるスポット発光の有無を分光学的に検出する方法（蛍光検出方式）が主流である。しかし、分光学的な検出方法によれば、分解能が光の波長により制限されるため、バイオチップの基板上に固定すべき生体分子の集積密度はサブミクロンオーダー程度が限界となる。
【０００４】
分光学的検出方法を用いたバイオ分野における他の利用としては、遺伝子構造の解析が広く知られている。生物の遺伝子構造を解析するために、ＤＮＡの塩基配列を決定する必要があり、このために、サンガー法またはデオキシ法と呼ばれる方法を用いたＤＮＡシーケンサーが今日広く用いられている。
【０００５】
この方法によれば、比較的短いＤＮＡ断片（８００塩基程度）をクローニングの過程において蛍光物質などで標識し、電気泳動によってＤＮＡ断片の塩基配列情報を得る。得られたＤＮＡ断片の塩基配列を大型計算機などを用い、配列情報を再構成することにより遺伝子全体の塩基配列を決定することができる。
【０００６】
しかし、この方法では、クローニングなどの高価な前処理が必要である。また、理論的に低速であり、移動相に対する保持時間という一次元の情報しか得られない電気泳動法を利用しなければならない。したがって、比較的コストがかさみ、また、処理速度が遅いという問題がある。処理速度を向上させるために、今日のＤＮＡシーケンサーでは、電気泳動を多数並列しておこなうように工夫がなされているが処理速度の向上には限界がある。このため、たとえば、ヒトの遺伝子を解析するのには、何百台のＤＮＡシーケンサーを用いても一年以上を要する。
【０００７】
こうしたＤＮＡ塩基配列の決定に要する時間を短縮する技術として、特許文献１〜３は、透過電子顕微鏡の一種である電子位相差顕微鏡を用い、重元素でラベルしたＤＮＡの分子を直接識別することにより、塩基配列を決定する方法を提案している。この方法は、ＤＮＡを一本鎖に融解し、支持膜上に固定した後、重元素で標識された識別子を用いて、ＤＮＡを染色する。その後、標識化されたＤＮＡを電子位相差顕微鏡で撮像することにより、重元素の配列が確認可能な拡大画像を得ることができる。この画像を解析することによって、重元素の種類と配列情報を得ることができる。重元素は種類に応じて選択的に塩基と結合しているので、塩基の配列情報が決定できる。すべての断片の配列情報を再構成することによって、ＤＮＡ全体の塩基配列を決定することができる。
【０００８】
この方法によれば、識別子に用いられる重元素を一原子ずつ電子位相差顕微鏡により直接観察あるいは特定することができる。このため、ＤＮＡの断片が１つあれば、その断片の塩基配列を決定でき、クローニングは不要となる。また、画像処理を用いることによって、ＤＮＡ断片が２次元に配置されていても各断片の重元素の配列を解析することが可能となる。
【０００９】
したがって、この方法によれば、従来の方法に比べて、塩基配列決定に要するエネルギや費用も少なくてすみ、また、短い時間で大量の塩基配列を決定することができると考えられる。試算によれば、この方法が実用化された場合、一日に１０億個の塩基の配列を決定できると推定される。この速度は従来の方法の約１０００倍である。また、ヒト一人のＤＮＡを解析するのに要する費用は３００万円程度であり、現在の１０００分の１程度で済むと推定されている。
【特許文献１】特開２００２−１５３２７１号公報
【特許文献２】米国特許出願公開第２００２／００８６３１７号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００４／００３８２６１号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
バイオチップにおいても、上述したＤＮＡの解析方法を用い、ターゲットとなる特定の生体分子や化学物質を透過電子顕微鏡により直接観察できれば、基板上のプローブの集積密度を高めることが可能であると考えられる。現在最も高い形態分解能を有する分析方法は透過型電子顕微鏡であり、０．０５ｎｍの分解能があると報告されている。このため、この透過電子顕微鏡を用いて、バイオチップ上のプローブ生体分子に選択的に反応した生体分子や化学物質を直接観察することができれば、１つのバイオチップによって固定される生体分子や化学物質の集積密度は格段に向上し、極微量の試料でも観察できることが期待される。また、短時間で大量あるいは多種の生体分子や化学物質を検出することのできるバイオチップが実現すると考えられる。
【００１１】
従来、透過電子顕微鏡を用いてウイルス粒子やたんぱく質の形状を観察することが行われている。このためにウイルス粒子やたんぱく質を導電性支持膜上に保持し、ウイルス粒子やたんぱく質の表面に金属膜を形成することが知られている。しかし、短時間で大量の生体分子や化学物質を検出することのできるバイオチップを実現するためには、従来よりも高い集積密度で生体分子などを基板上に固定する必要がある。
【００１２】
本発明はこのような課題を解決し、バイオチップなどにおいて、高い集積密度で生体分子を配列するための試料支持体およびその製造方法を提供することを目的とする。また、透過電子顕微鏡を用いてＤＮＡの塩基配列を決定するために、ＤＮＡを支持するための試料支持体およびその製造方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の試料支持体は、導電性薄膜と、貴金属元素を含む複数の微小構造体であって、前記導電性薄膜中にそれぞれ一部が埋め込まれるように前記導電性薄膜に設けられた複数の微小構造体とを備えている。
【００１４】
ある好ましい実施形態において、前記複数の微小構造体の前記導電性薄膜の主面からの高さは１０ｎｍ以下である。
【００１５】
ある好ましい実施形態において、前記微小構造体は、少なくとも２ｎｍの深さで前記導電性薄膜の主面から埋め込まれている。
【００１６】
ある好ましい実施形態において、前記導電性薄膜は、炭素またはベリリウムからなる。
【００１７】
ある好ましい実施形態において、前記複数の微小構造体は金、銀、白金族元素、または、これらを主成分とする合金からなる。
【００１８】
ある好ましい実施形態において、前記複数の微小構造体のそれぞれは前記導電性薄膜の主面上においてストライプ形状を有している。
【００１９】
ある好ましい実施形態において、前記複数の微小構造体のストライプ形状は前記導電性薄膜の主面上において第１の方向に伸びており、前記複数の微小構造体は、前記第１の方向と直交する第２の方向に所定のピッチで配置されている。
【００２０】
ある好ましい実施形態において、各微小構造体のストライプ形状の前記第２の方向に沿った幅は２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であり、前記第２の方向におけるピッチは０．５μｍ以上１０μｍ以下である。
【００２１】
ある好ましい実施形態において、前記複数の微小構造体は前記導電性薄膜の主面上において点形状を有している。
【００２２】
ある好ましい実施形態において、前記複数の微小構造体は前記導電性薄膜の主面上において概ね円形状または多角形形状を有している。
【００２３】
ある好ましい実施形態において、各微小構造体の前記導電性薄膜の主面上における最大外形は２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下である。
【００２４】
ある好ましい実施形態において、前記複数の微小構造体は、前記導電性薄膜の主面上において第１の方向および前記第１の方向と直交する第２の方向に沿って２次元状に配列されている。
【００２５】
ある好ましい実施形態において、前記複数の微小構造体は、前記第１の方向および第２の方向に沿って所定のピッチで配列されており、前記第１の方向のピッチは、５０ｎｍ以上３００ｎｍ以下であり、前記第２の方向のピッチは、０．５μｍ以上１０μｍ以下である。
【００２６】
ある好ましい実施形態において、前記導電性薄膜の厚さは、２０ｎｍ以下である。
【００２７】
ある好ましい実施形態において、前記導電性薄膜は、矩形形状を有し、前記矩形の一辺は５ｍｍ以下である。
【００２８】
ある好ましい実施形態において、試料支持体は、貫通孔を有し、前記導電性薄膜を支持するグリッドをさらに備える。
【００２９】
ある好ましい実施形態において、前記グリッドは銅または銀からなる。
【００３０】
ある好ましい実施形態において、前記グリッドの貫通孔内または貫通孔上に前記複数の微小構造体が位置するよう前記導電性薄膜と前記グリッドとは位置合わせされている。
【００３１】
ある好ましい実施形態において、前記導電性薄膜の前記複数の微小構造体が形成された主面の平坦度は±１００μｍ以下である。
【００３２】
本発明の試料支持体の製造方法は、支持基板上に複数の開口部を有するマスクパターンを形成する工程（Ａ）と、各開口部内の前記支持基板上に貴金属を含む物質を設ける工程（Ｂ）と、前記マスクパターンを除去することにより、前記貴金属を含む物質からなる複数の微小構造体が設けられた支持基板を得る工程（Ｃ）と、前記支持基板上の前記複数の微小構造体を覆うように導電性薄膜を形成する工程（Ｄ）と、前記導電性薄膜を前記支持基板から剥離する工程（Ｅ）とを包含する。
【００３３】
ある好ましい実施形態において、試料支持体の製造方法は、前記工程（Ｅ）の後に、貫通孔を有するグリッドを用いて前記導電性薄膜を支持する工程（Ｆ）をさらに包含する。
【００３４】
ある好ましい実施形態において、試料支持体の製造方法は、前記工程（Ｃ）と工程（Ｄ）との間に、前記支持基板上の複数の微小構造体を囲むように前記支持基板上にグリッドを形成する工程（Ｇ）をさらに包含し、前記工程（Ｄ）において、前記支持基板上の複数の微小構造体およびグリッドを覆うように導電性薄膜を形成する。
【００３５】
ある好ましい実施形態において、前記工程（Ｇ）はめっき法または無電解めっき法により銀からなるグリッドを形成する。
【００３６】
ある好ましい実施形態において、前記マスクパターンの各開口部は、ストライプ形状またはドット形状を有する。
【００３７】
ある好ましい実施形態において、前記工程（Ｂ）は、置換めっきまたは無電解めっきにより、前記貴金属を含む物質を設ける。
【００３８】
ある好ましい実施形態において、前記工程（Ｂ）は、前記マスクパターンをマスクとして、蒸着法により、前記マスクパターン上および前記開口部内の前記支持基板上に前記貴金属を含む物質からなる膜を形成する。
【００３９】
ある好ましい実施形態において、試料支持体の製造方法は、前記工程（Ｃ）と（Ｄ）との間において、前記微小構造体を加熱する工程（Ｈ）をさらに包含する。
【００４０】
ある好ましい実施形態において、前記工程（Ａ）は、レジスト膜を前記支持基板上に形成する工程と、前記レジスト膜に電子線を照射することにより前記レジスト膜を露光する工程と、前記レジスト膜を現像する工程とを含む。
【００４１】
ある好ましい実施形態において、前記工程（Ａ）は、ナノインプリント法により前記マスクパターンを形成する。
【００４２】
ある好ましい実施形態において、前記支持基板は、シリコン基板と、前記シリコン基板表面に形成されたニッケル、銅、亜鉛、スズおよびアルミニウムから選ばれる少なくとも１つからなる金属膜とを含む。
【００４３】
ある好ましい実施形態において、前記工程（Ｅ）は、前記金属膜を除去することにより、前記導電性薄膜を前記支持基板から剥離する。
【発明の効果】
【００４４】
本発明によれば、チオール化された末端を持つ生体分子、ＤＮＡ断片などの一端を結合により固定する微小構造体を導電性薄膜に有するため、導電性薄膜上に生体分子、ＤＮＡ断片などを配列させて支持することが可能となる。これにより、透過電子顕微鏡を用いてプローブとして機能する生体分子が高い集積度で配置されたバイオチップを実現したり、ＤＮＡの塩基配列を高速で決定したりすることができる。また、微小構造体の少なくとも一部は導電性薄膜に埋め込まれているため、微小構造体が導電性薄膜から脱離するのを防ぐことがきる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
以下、本発明による試料支持体の実施形態を説明する。本実施形態では、透過電子顕微鏡を用いてＤＮＡの塩基配列を決定ためのＤＮＡ支持膜として本発明を説明するが、本発明の試料支持体は、バイオチップのプローブとして機能する生体高分子を固定するための支持体としても好適に用いられる。また、ＤＮＡなどの生体分子や細胞を支持し、観察あるいは分析するための支持膜として広く一般的に用いることができる。
【００４６】
図１（ａ）は、は本発明による試料支持体５１の模式的な斜視図であり、図１（ｂ）および（ｃ）は、試料支持体５１の一部を拡大して示す平面図および断面図である。これらの図に示すように、試料支持体５１は、導電性薄膜１０と複数の微小構造体１２とを備えている。
【００４７】
導電性薄膜１０上にＤＮＡを支持し、透過電子顕微鏡で観察をするためには、ＤＮＡがチャージアップしないよう導電性薄膜１０は導電性を有していることが好ましい。また、導電性薄膜１０の結晶構造により電子線が回折し、ＤＮＡの観察に悪影響が生じないよう、導電性薄膜１０は結晶構造を備えていないほうが好ましい。具体的には、導電性薄膜１０はアモルファス構造または非結晶性構造を有していることが好ましい。さらに、導電性薄膜１０を透過した電子線の減衰が大きくならないように導電性薄膜１０は原子番号の小さな元素で構成されていることが好ましい。このような条件を満たす物質として、導電性薄膜１０は、炭素あるいはベリリウムからなる薄膜であることが好ましい。炭素からなる導電性薄膜としては、グラファイト膜、導電性が付与されたＤＬＣ膜などの炭素薄膜を用いることができる。ベリリウムを用いる場合にはその毒性に注意をする必要がある。取り扱いおよび形成が容易であるという観点を考慮すると、炭素薄膜を導電性薄膜１０に用いることがより好ましい。
【００４８】
複数の微小構造体１２は、導電性薄膜１０のひとつの主面１０ａに形成されており、ＤＮＡの一端を導電性薄膜１０上において固定するためのアンカーとして機能する。具体的には、ＤＮＡの一部をチオール化し、ＤＮＡのチオールを微小構造体１２に結合させる。これにより、主面１０ａ上の所定の位置にＤＮＡを固定し、支持することができる。つまり、導電性薄膜１０上においてＤＮＡを配列させて支持することができる。チオールは金属表面に結合しやすいため、微小構造体１２は金属を含むことが好ましい。以下において詳細に説明するように、水溶液中に浮遊しているＤＮＡ断片を微小構造体１２に結合させて導電性支持膜１０に支持させるため、微小構造体１２の表面は水溶液中においても酸化膜等が形成されず活性を維持し得ることが好ましい。このためには微小構造体１２は貴金属元素を含むことが好ましく、金、銀、白金族元素、または、これらを主成分とする合金からなることがより好ましい。ここで、白金族元素とはルテニウム、ロジウム、パラジウム、オスミウム、イリジウム、および白金を言う。
【００４９】
また、複数の微小構造体１２のそれぞれに１つのＤＮＡ断片が結合するよう、微小構造体１２は、導電性薄膜１０の主面１０ａにおいて微細な点形状を有していることが好ましい。具体的には、微小構造体１２は導電性薄膜１０の主面１０ａ上において概ね円形状または多角形形状を有している。図１（ｂ）に示すように、主面１０ａ上における最大外形Ｌ３は２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることが好ましく、２０ｎｍ以上５０ｎｍ以下であることがより好ましい。２００ｎｍよりも最大外形が大きくなると複数のＤＮＡ断片が１つの微小構造体１２に結合しやすくなる。その結果、結合した複数のＤＮＡが重なって導電性薄膜１０上に支持され、透過電子顕微鏡による観察によってそれぞれの塩基配列の決定が困難となる場合がある。
【００５０】
本発明の試料支持体５１は、多数のＤＮＡ断片を配列させて支持し、ＤＮＡを重元素で標識した後、重元素の配列を透過電子顕微鏡で二次元的に撮像するために用いられる。このためには、試料支持体５１は多数のＤＮＡ断片を配列させて支持できることが好ましく、微小構造体１２は、好ましいＤＮＡの配置に対応した位置に配列されていることが好ましい。具体的には図１（ａ）に示すように、破線で示すＤＮＡ３０をｘ方向に沿って伸びるように支持する場合、複数の微小構造体１２をｘ方向およびｘ方向と垂直なｙ方向へそれぞれ所定のピッチＰ２およびＰ１で導電性薄膜１０上に配置することが好ましい。ここでピッチとは微小構造体１２のピッチを規定する方向における中心間距離をいう。ピッチＰ１は５０ｎｍ以上３００ｎｍ以下であることが好ましく、ピッチＰ２は０．５μｍ以上１０μｍ以下であることが好ましい。
【００５１】
ピッチＰ１が５０ｎｍより小さい場合、隣接するＤＮＡと接触しやすくなったり、透過電子顕微鏡による解析の精度が低下したりする。ピッチＰ２は、支持するＤＮＡ断片の長さに依存する。各ＤＮＡ断片は長いほど、一度に決定できる塩基配列を長くできるので好ましい。しかし、あまり長くなるとＤＮＡを伸長させて試料支持体５１に支持するのが困難となる。上述の範囲にピッチＰ２がある場合、１５００から３００００程度の塩基を含むＤＮＡを支持できる。前述したように、サンガー法によれば一度に配列を決定できるＤＮＡの長さは８００塩基程度である。したがって、本発明の試料支持体を用いれば、一度に配列を決定できるＤＮＡを長くすることができ、ＤＮＡ断片の塩基配列情報からＤＮＡ全体の塩基配列を決定する際に必要な演算を大幅に減らすことが可能となる。
【００５２】
図１（ｃ）に示すように、微小構造体１２は少なくともその一部が導電性薄膜１０内に埋め込まれていることが好ましい。特に導電性薄膜１０が炭素からなる場合、炭素と微小構造体１２を構成する貴金属とは結合が弱いため、導電性薄膜１０上に微小構造体１２が形成されているだけでは微小構造体１２が導電性薄膜１０から脱離し易いからである。また、微小構造体１２が小さくなると、熱などによるマイグレーションも生じ得る。十分な強度で微小構造体１２が導電性薄膜１０に保持されるために、微小構造体１２が導電性薄膜１０の主面１０ａから埋め込まれる深さＤ１は、少なくとも２ｎｍ以上であることが好ましく、５ｎｍ以上埋め込まれていることがより好ましい。
【００５３】
また、微小構造体１２は、導電性薄膜１０の主面１０ａからできるだけ突出していないほうが好ましい。具体的には、微小構造体１２の上面１２ａと導電性薄膜１０の主面１０ａとの距離である高さＨ１は、１０ｎｍ以下であることが好ましい。図２に示すように、微小構造体１２が導電性薄膜１０の主面１０ａから大きく突出している場合、微小構造体１２に端部３０ｅで結合したＤＮＡ３０は、その一部３０ｎが導電性薄膜１０から突出するように配置されてしまう。この場合、ＤＮＡ３０の一部３０ｎではＤＮＡを標識した重原子が重なって透過電子顕微鏡に観測されてしまい、正しく塩基配列を決定できない可能性がある。同様の理由から、図３に示すように、支持したＤＮＡ３０を正しく観測するために、導電性薄膜１０の主面１０ａの１ｍｍ四方における平坦度Ｒ１が±１００μｍ以下であることが好ましい。
【００５４】
導電性薄膜１０の形状およびサイズは、ＤＮＡの観察に用いる透過電子顕微鏡の試料室内に導入が可能であり、試料を支持するステージに保持可能な大きさであれば特に制限はない。しかし、上述したピッチで微小構造体１２を形成し、透過電子顕微鏡により効率的に観察を行うために、図１（ａ）に示すように導電性薄膜１０は矩形を有しており、二辺の長さＬ１およびＬ２はそれぞれ５ｍｍ以下であることが好ましい。より好ましくは、長さＬ１およびＬ２は１ｍｍ程度である。また、図１（ｃ）に示すように、導電性薄膜１０の厚さＴ１は、５ｎｍ以上２０ｎｍ以下であることが好ましい。５ｎｍより導電性薄膜１０が薄いと、ＤＮＡを支持して取り扱うのに十分な強度が得られない可能性がある。また、２０ｎｍよりも導電性薄膜１０が厚いと、透過電子顕微鏡による観察の際電子線が導電性薄膜１０によって減衰し、十分な精度で観察を行えない可能性がある。
【００５５】
上述のサイズを有する試料支持体５１を用いる場合、長さ１０μｍのＤＮＡ断片を３０万個程度１つの試料支持体５１に配列させて支持することが可能である。これにより、９０億個程度塩基配列を決定することが可能である。
【００５６】
試料支持体５１は、実用的な観点から透過電子顕微鏡の観察に一般的に用いられるグリッドをさらに備え、グリッドにより導電性薄膜１０を支持することが好ましい。図４は、導電性薄膜１０の主面１０ａを表側とした場合に裏面となる主面１０ｂ側から導電性薄膜１０を支持するグリッド１４をさらに備えた試料支持体５１の一部を模式的に示している。グリッド１４は貫通孔１４ｈを有し、導電性薄膜１０に設けられた微小構造体１２が貫通孔１４ｈ上または貫通孔１４ｈ内に位置するよう、グリッド１４と導電性薄膜１０とが位置合わせされていることが好ましい。グリッド１４の部分は透過電子顕微鏡により観測ができないためである。グリッド１４は、導電性薄膜１０の微小構造体１２が設けられた主面１０ａと接するように導電性薄膜１０を支持してもよい。また、グリッド１４は、透過電子顕微鏡に用いられる一般的なもの以外に、試料支持体５１の作製時にめっきあるいは無電解めっきなどによって同時に形成してもよい。
【００５７】
これまで説明した試料支持体５１は点状の微小構造体１２を備えていたが、微小構造体は他の形状を有していてもよい。図５（ａ）および（ｂ）はストライプ状の微小構造体２０を有する試料支持体５２を模式的に示している。試料支持体５２は導電性薄膜１０および貴金属元素またはその合金を含む複数の微小構造体２０を備えている。各微小構造体２０は、導電性薄膜１０の主面１０ａ上においてｙ方向に伸びるストライプ形状を有している。図５（ｂ）に示すように各微小構造体２０のｘ方向の幅Ｌ４は２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることが好ましい。また、複数の微小構造体２０はｘ方向にピッチＰ３で配列されており、ピッチＰ３は０．５μｍ以上１０μｍ以下であることが好ましい。
【００５８】
試料支持体５２を用いてＤＮＡを支持する場合、図５（ａ）に示すようにＤＮＡ３０はｘ方向に伸びるようにＤＮＡの一端が微小構造体２０に結合され、導電性薄膜１０上に支持される。ｙ方向には微小構造体２０が連続しているため、ＤＮＡ３０のｙ方向における配列を制御するためには、ＤＮＡ３０の一端を微小構造体２０に結合させる際に溶液中のＤＮＡ３０の濃度などを調節する。試料支持体５２においても微小構造体２０は導電性薄膜１０にその一部が埋め込まれていることが好ましく、また、微小構造体２０は導電性薄膜１０の主面１０ａからあまり突出していないことが好ましい。
【００５９】
このような構造を有する試料支持体５１または５２によれば、チオール化された末端を持つＤＮＡ断片の一端を結合により固定する微小構造体を導電性薄膜に有するため、導電性薄膜上にＤＮＡ断片を配列させて支持することが可能となる。微小構造体の少なくとも一部は導電性薄膜に埋め込まれているため、微小構造体の外形が小さく、微小構造体を構成する原子と導電性薄膜を構成する原子との間の結合が弱くても微小構造体が導電性薄膜から脱離することがない。また、微小構造体を導電性薄膜の主面からあまり突出しないようにすることによって、ＤＮＡを透過電子顕微鏡により正しく観察し易いように導電性薄膜上に支持することができる。
【００６０】
次に、図６から図１０を参照しながら本発明による試料支持体の製造方法を説明する。まず図６（ａ）に示すように支持基板１００を用意する。支持基板１００は平滑な表面を備えており、微小構造体が埋め込まれた導電性薄膜を剥離するのに容易であればどのような基板を用いてもよい。本実施形態ではこれらの特徴を備えており、入手が容易であるという理由で支持基板１００として２インチのＳｉウエハを用いる。次に、用意した支持基板１００を洗浄する。洗浄にはシリコン半導体プロセスにおいて用いられる脱脂および洗浄工程を用いることができる。具体的には、１６０度に加熱した王水（硝酸：塩酸＝１：３）に支持基板１００を１０分間浸す。その後、純水をオーバーフローさせながら支持基板１００を１０分間洗浄する。
【００６１】
次に１６０度に加熱したアンモニア過酸化水素水（水酸化アンモニウム：過酸化水素水：水＝１：１：６）に支持基板１００を１０分間浸す。さらに１６０度に加熱した塩酸過酸化水素水（塩酸：過酸化水素水：水＝１：１：６）に支持基板１００を１０分間浸す。その後、純水をオーバーフローさせながら支持基板１００を１０分間洗浄する。希フッ酸（フッ酸：水＝１：５０）に支持基板１００を３０秒間浸した後、純水をオーバーフローさせながら支持基板１００を５分間洗浄する。その後、スピナーを用いて支持基板をスピン乾燥させる。
【００６２】
図６（ｂ）に示すように、支持基板１００上に厚さ１０ｎｍの金属膜１０４を形成する。金属膜１０４の形成には、スパッタリング装置、電子ビーム加熱蒸着装置、抵抗加熱蒸着装置、ＭＢＥ装置など種々の蒸着装置を用いることができる。金属膜１０４は支持基板１００と支持基板１００上に形成する試料支持体との剥離を容易にするために形成されている。したがって、金属膜１０４が形成された支持基板を用いてもよいし、剥離が容易であれば金属膜１０４は形成しなくてもよい。好ましくは、硫酸や塩酸などの強酸に金属膜１０４を溶解させることによって、支持基板１００から試料支持体を剥離する。このために、金属膜１０４としてニッケル、亜鉛、スズ、アルミニウムなど酸に容易に溶解する金属を用いることが好ましい。
【００６３】
次に図６（ｃ）に示すように、支持基板１００の金属膜１０４上にフォトレジスト１０６を形成する。支持基板１００をアセトンおよびメタノールで洗浄し、支持基板１００を１８０℃で２０分間保持した後、プライマーを塗布する。ベーク後、レジスト（日本ゼオン：ＺＥＰ５２０Ａ−７）をスピンコートし、プリベークを行う。
【００６４】
図７（ａ）に示すように、所定の開口部パターンとなるように電子線１０８をフォトレジスト１０６に照射し、露光を行う。露光にはＥＢ描画装置（日本電子：ＪＢＸ-５ＳＧ）を用いる。その後キシレンを用いて現像を行い、溶剤でリンス後、ポストベークを行う。これにより、図７（ｂ）に示すようにフォトレジスト１０６に開口部１１０が形成される。さらに酸素アッシャーを用いてレジスト残渣を除去することによって、開口部１１０を有するマスクパターン１０６’が得られる。なお、本実施形態では、電子線描画法を用いた露光によってマスクパターン１０６’を形成しているが、マスクパターン１０６’は公知のナノインプリント技術を用いて形成してもよい。微小構造体を形成するための開口部１１０のパターンは単純であるため、ナノインプリント技術を好適に用いることができる。
【００６５】
図７（ｄ）に示すように、マスクパターン１０６’の開口部１１０内において露出している金属膜１０４上にニッケル１１２を無電解めっきによって形成する（メルテック社：ＮＩ−８６７）。さらに図８（ａ）に示すように、開口部１１０内に金１１４が堆積するように、置換金メッキ浴に支持基板１００を浸し、置換めっき（化学めっき）を行う（メルテック社：ＡＵ−７６２０）。これにより、開口部１１０内のニッケル１１２が溶出し、金１１４が開口部１１０内の金属膜１０４上に析出する。置換めっきは微細なパターンを制御よく形成することができるため、開口部１１０のサイズが小さい本発明に好適に用いられる。その後マスクパターン１０６’をＵＶ-オゾンクリーナで溶剤に溶解しやすくなるよう処理し、溶剤にて残渣を完全に除去することにより、図８（ｃ）に示すように、金属膜１０４上に所定のパターンを有する金が形成される。
【００６６】
なお本実施形態では、開口部１１０内にまずニッケルを無電解めっきによって形成し、その後、置換金メッキにより堆積したニッケルを溶解させながら金１１４を開口部１１０内において堆積していた。しかし、無電解金メッキなどによって、開口部１１０内の金属膜１０４上に金を直接形成してもよい。また、図８（ｂ）に示すように蒸着法などによって開口部１１０内の金属膜１０４上およびマスクパターン１０６’上に金からなる膜１１６を蒸着法などによって形成し、リフト法によってマスクパターン１０６’およびマスクパターン１０６’上に堆積した金からなる膜の一部を除去することにより図８（ｃ）に示すように所定のパターンを有する金１１４を金属膜１０４上に形成してもよい。
【００６７】
図８（ｄ）に示すように、その後、好ましくは、支持基板１００を５００℃程度の温度で１０分間加熱することによって、金属膜１０４上の金１１４を溶解および凝固させる。めっきによって形成された金の密度は低いことがあるが、加熱をおこなうことによって、密度の高い金を得ることができる。これにより、図８（ｄ）に示すように金からなる微小構造体１１４’が形成される。
【００６８】
図９（ａ）に示すように、次に、導電性薄膜１１８を形成する。導電性薄膜１１８は炭素からなり、微小構造体１１４’を覆うように形成される。導電性薄膜１１８を形成には炭素をターゲットとしてスパッタリング法に形成することができる。本実施形態では導電性薄膜１１８の厚さは１０ｎｍである。
【００６９】
次に、支持基板１００を０．５Ｎ塩酸水に約４時間浸す。これにより、金属膜１０４が０．５Ｎ塩酸水に溶解し、図９（ｂ）に示すように導電性薄膜１１８が支持基板１００から遊離する。０．５Ｎ塩酸水を水で希釈しながら塩酸水を水に置換し、その後純水で洗浄する。図９（ｃ）に示すように、遊離した導電性薄膜１１８の空気に接している側の面から透過電子顕微鏡用のグリッド１２０を静かに押し当てて、微小構造体１１４’が形成された面から導電性薄膜１１８をすくい上げる。このとき、グリッド１２０の貫通孔１２２に微小構造体１１４’位置するようにグリッド１２０を導電性薄膜１１８を位置合わせすることが好ましい。これにより、グリッド１２０に支持された導電性薄膜１１８を備えた試料支持体が完成する。
【００７０】
グリッドも一体的に形成する場合には微小構造体１１４’の形成後（図８（ｄ））、以下の工程を行う。図９（ｄ）に示すように、微小構造体１１４’を覆うようにレジストパターン１２２を金属膜１０４上に形成する。金属膜１０４の表面が露出している部分にはグリッドが形成される。次に図１０（ａ）に示すように、金属膜１０４の表面が露出している部分に銅または銀メッキを施し、グリッド１２４を形成する。グリッド１２４は以下の工程におい硫酸水を使用するため硫酸水に溶解しにくい導電性材料から形成されることが好ましい。金もこのような条件に適した材料であるが、金を用いた場合、微小構造体１１４’と同程度に生体分子のチオール末端に対して活性を有する。このため、完成した試料支持体に生体分子を支持させる際、グリッドにも生体分子のチオールが結合する可能性がある。したがって、酸に溶解しにくく、金に比べて酸化膜が形成しやすい銅または銀を用いてグリッドを形成することが好ましい。
【００７１】
図１０（ｂ）に示すように、レジスト１２２を除去することによって微小構造体１１４’をグリッド１２４の貫通孔１２６内において露出させる。次に導電性薄膜１２８を形成する。導電性薄膜１２８は炭素からなり、微小構造体１１４’およびグリッド１２４を覆うように形成される。導電性薄膜１２８を形成するには炭素をターゲットとしてスパッタリング法に形成することができる。その後図１０（ｄ）に示すように０．５Ｎ塩酸水に約４時間浸し、金属膜１０４を溶解する。０．５Ｎ塩酸水を水で希釈しながら塩酸水を水に置換し、その後純水で洗浄する。これにより、グリッド１２４に支持された導電性薄膜１２８が遊離する。導電性薄膜１２８を純水から引き上げることによって、グリッド１２４に支持された導電性薄膜１２８を備えた試料支持体が得られる。
【００７２】
図１１は、上述の方法によって作製された試料支持体を走査電子顕微鏡で観察したＳＥＭ画像を示している。図１１では、直径約１００ｎｍの円形を有する微小構造体が１μｍピッチで炭素からなる導電性薄膜上に２次元に配置されている。微小構造体が導電性薄膜に埋め込まれており、微小構造体が脱離することなく規則的に配置されているのがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明は、生体分子を高集積度で透過電子顕微鏡により観察あるは分析するための支持体として好適に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】（ａ）（ｂ）および（ｃ）は、それぞれ本発明による試料支持体の模式的な斜視図、平面図および断面図である。
【図２】試料支持体の微小構造体が導電性薄膜から大きく突出している場合において支持されるＤＮＡ断片の形状を示す模式的断面図である。
【図３】試料支持体の導電性薄膜における表面の凹凸を示す模式的断面図である。
【図４】グリッドに導電性薄膜が支持された試料支持体を示す図である。
【図５】（ａ）および（ｂ）は、それぞれ本発明による試料支持体の他の形態の斜視図および平面図である。
【図６】（ａ）から（ｃ）は、本発明による試料支持体の製造方法を説明するための工程断面図である。
【図７】（ａ）から（ｄ）は、本発明による試料支持体の製造方法を説明するための工程断面図である。
【図８】（ａ）から（ｄ）は、本発明による試料支持体の製造方法を説明するための工程断面図である。
【図９】（ａ）から（ｄ）は、本発明による試料支持体の製造方法を説明するための工程断面図である。
【図１０】（ａ）から（ｄ）は、本発明による試料支持体の製造方法を説明するための工程断面図である。
【図１１】本発明による試料支持体の製造方法によって製造された試料支持体のＳＥＭ写真である。
【符号の説明】
【００７５】
１０、１１８、１２８    導電性薄膜
１２、２０、１１４’    微小構造体
１４、１２０、１２４    グリッド
３０    生体分子
１００    支持基板
１０４    金属膜
１０６    フォトレジスト
１０６’  マスクパターン
１０８    電子線
１１０    開口部
１１２    ニッケル
１１４    金
１１６    金膜
【図１】
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【図２】
2007139510.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2007139510.tif 000011
【図１０】
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【図１１】
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