(57)【要約】【課題】尿検体中のアルブミン量による分類では糖尿病性早期腎症ではないが、糖尿病性早期腎症に移行しつつある糖尿病患者又は糖尿病早期腎症であって、糖尿病性腎症に移行しつつある糖尿病患者を可能な限り早期に特定することを可能とする定量方法を見出すこと。【解決手段】固相担体に固着させた抗ヘパラン硫酸抗体に対して、標識ヘパラン硫酸と検体中のヘパラン硫酸とを競合的に抗原抗体反応させ、この固相担体における抗ヘパラン硫酸抗体に結合した標識ヘパラン硫酸を検出するヘパラン硫酸の定量方法、（２）抗ヘパラン硫酸抗体に対して、固相担体又は微粒子状固相担体に固着させたヘパラン硫酸と検体中のヘパラン硫酸とを、競合的に抗原抗体反応させ、固相担体上のヘパラン硫酸に結合した抗ヘパラン硫酸抗体又は凝集した微粒子状固相担体、を検出する検体中のヘパラン硫酸の定量方法、を提供することにより、上記の課題を解決し得ることを見出した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相担体に固着させた抗ヘパラン硫酸抗体に対して、標識ヘパラン硫酸と検体中のヘパラン硫酸とを競合的に抗原抗体反応させ、この固相担体における抗ヘパラン硫酸抗体に結合した標識ヘパラン硫酸を検出する、ヘパラン硫酸の定量方法。
【請求項２】
標識ヘパラン硫酸における標識物質が、特異的結合対の一方の物質、蛍光物質、酵素、ハプテン及びラジオアイソトープからなる群から選択される物質である、請求項１記載のヘパラン硫酸の定量方法。
【請求項３】
標識ヘパラン硫酸における標識物質が、特異的結合対の一方の物質である、請求項２記載のヘパラン硫酸の定量方法。
【請求項４】
特異的結合対の一方の物質がビオチンである、請求項３記載のヘパラン硫酸の定量方法。
【請求項５】
抗ヘパラン硫酸抗体に対して、固相担体に固着させたヘパラン硫酸と検体中のヘパラン硫酸とを、競合的に抗原抗体反応させ、固相担体上のヘパラン硫酸に結合した抗ヘパラン硫酸抗体を検出する、検体中のヘパラン硫酸の定量方法。
【請求項６】
抗ヘパラン硫酸抗体に対して、微粒子状固相担体に固着させたヘパラン硫酸と検体中のヘパラン硫酸とを競合的に抗原抗体反応させて、微粒子状固相担体を凝集させ、その凝集の程度を検出することによる、検体中のヘパラン硫酸の定量方法。
【請求項７】
抗ヘパラン硫酸抗体が、少なくともヘパラン硫酸におけるＮ−硫酸基を含むグルコサミン残基を抗原決定基とする抗ヘパラン硫酸抗体である、請求項１〜６のいずれかに記載のヘパラン硫酸の定量方法。
【請求項８】
下記の工程を含むヘパラン硫酸の定量方法：（１）少なくともＮ−硫酸基を有するグルコサミン残基を抗原決定基とする抗ヘパラン硫酸抗体を固着させたマイクロプレートに、検体及びビオチンにより標識した標識ヘパラン硫酸を接触させ、マイクロプレートに固着させた抗ヘパラン硫酸抗体に対し、接触させた検体中のヘパラン硫酸及び標識ヘパラン硫酸を競合的に抗原抗体反応させ、（２）マイクロプレートに結合した標識ヘパラン硫酸に、ペルオキシダーゼ標識したアビジン類を結合させ、（３）マイクロプレートにおけるペルオキシダーゼ活性を測定することにより、上記検体中のヘパラン硫酸を定量する工程。
【請求項９】
抗ヘパラン硫酸抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１〜８のいずれかに記載のヘパラン硫酸の定量方法。
【請求項１０】
少なくとも抗ヘパラン硫酸抗体を固着させた固相担体を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の定量方法を行うための、定量キット。
【請求項１１】
抗ヘパラン硫酸抗体が、少なくともヘパラン硫酸におけるＮ−硫酸基を含むグルコサミン残基を抗原決定基とする抗ヘパラン硫酸抗体である、請求項１０記載の定量キット。
【請求項１２】
抗ヘパラン硫酸抗体が、ヒアルロン酸に対する交叉反応性が認められない抗ヘパラン硫酸抗体である、請求項１０又は１１記載の定量キット。
【請求項１３】
抗ヘパラン硫酸抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１０〜１２のいずれかに記載の定量キット。
【請求項１４】
標識物質により標識されたヘパラン硫酸を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の定量法を行うための定量キット。
【請求項１５】
標識ヘパラン硫酸が、特異的結合対の一方の物質、蛍光物質、酵素、ハプテン及びラジオアイソトープからなる群から選択される物質で標識された標識ヘパラン硫酸である、請求項１４記載の定量キット。
【請求項１６】
標識ヘパラン硫酸が、特異的結合対の一方の物質で標識された標識ヘパラン硫酸である、請求項１４記載の定量キット。
【請求項１７】
特異的結合対の一方の物質がビオチンである、請求項１６記載の定量キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘパラン硫酸の定量手段に関する発明である。本発明は、糖尿病性腎症の病態の把握において有用である。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、数々の合併症を惹き起こすことが知られており、これらの合併症の中でも致命的なものの一つに、重篤な腎不全を惹き起こす「糖尿病性腎症」を挙げることができる。健常な腎臓においては、糸球体基底膜に存在するヘパラン硫酸プロテオグリカンのヘパラン硫酸糖鎖における陰性荷電が、血中のタンパク質等に対する「チャージバリア」としての機能を果たしており、これによりタンパク質等の糸球体への沈着や尿への漏洩が防御されている（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:1303,1979）。
【０００３】
しかしながら、糖尿病性腎症では糸球体基底膜が傷害を受けて「チャージバリア」としての役割を果たさなくなることが多い。この糖尿病性腎症の診断法として、従来はこの「チャージバリア」を通り抜けて尿中に漏洩したアルブミンを検量し、その検量値を健常人の正常値と対比して糖尿病性早期腎症を特定する方法が用いられてきた。
【０００４】
また、ヘパラン硫酸を測定する方法としては、抗ヘパラン硫酸抗体ＪＭ４０３を用いる方法が知られていたが、この抗ヘパラン硫酸抗体は、ヘパラン硫酸の他にヒアルロン酸にも特異性を有することが知られており(Kidney International,41(1992)pp115-123)、ヘパラン硫酸の定量において正確性を欠くために、ヘパラン硫酸のみの特異的な定量方法としては実用的ではなく、糖尿病性腎症診断への利用は不可能であった。
【０００５】
糖尿病患者は糖尿病性腎症を罹患する確率が高く、尿中アルブミン量によって、（１）糖尿病（高血糖値／クレアチニン補正（ＣＲ）尿中アルブミン量１２mg/gＣＲ未満：以下ＤＭ１とも記載する）、（２）糖尿病性早期腎症（高血糖値／クレアチニン補正尿中アルブミン量１２mg/gＣＲ以上，２００mg/gＣＲ未満：以下ＤＭ２とも記載する）、（３）糖尿病性腎症（高血糖値／クレアチニン補正尿中アルブミン量２００mg/gＣＲ以上：以下ＤＭ３とも記載する）とに分類されている。
【０００６】
ＤＭ１の段階では腎臓の異常は検出されず、ＤＭ２の段階では腎臓に軽度の異常を有するが適切な治療によってＤＭ１の状態へ病状が回復する症例も見られる。しかしながらＤＭ３の段階では腎臓に重篤な傷害を有し、適切な治療を施したとしても病状の回復はほとんど見られない。このように、糖尿病性腎症が本格的に発症した際の予後は極めて不良であるため、この糖尿病性腎症への移行を可能な限り早期に診断することが必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、従来糖尿病性腎症の診断の指標として用いられている尿検体中のアルブミン量は健常人においても変動し、このアルブミン量のみをもって、糖尿病（ＤＭ１）から糖尿病性早期腎症（ＤＭ２）、さらに糖尿病性腎症（ＤＭ３）に移行しつつある糖尿病患者の病態を正確に把握することは困難である。
【０００８】
また、この尿検体中のアルブンミン量の変化から糖尿病性早期腎症又は糖尿病性腎症と確定的診断が下された時点で適切な治療を開始したとしても、糖尿病性腎症がＤＭ３の段階まで進行してしまっている場合が大部分であり、治療効果が現れず、重篤な腎症、更に腎不全へと進行する症例が多い。
【０００９】
そこで本発明が解決すべき課題は、尿検体中のアルブミン量による分類では糖尿病性早期腎症ではないが、糖尿病性早期腎症に移行しつつある糖尿病患者、又は糖尿病早期腎症であって、糖尿病性腎症に移行しつつある糖尿病患者を可能な限り早期に特定する手段を、定量手段として見出すことにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上述した課題に対して、糖尿病性腎症における腎臓の糸球体の構造変化に先んじて、基底膜に存在するヘパラン硫酸の代謝異常が起こることに着目し、上記課題の解決に向けて鋭意検討を行った。その結果、糖尿病性腎症患者の尿においては、この腎症が進行するに従ってヘパラン硫酸が量的及び／又は質的に変化することを見出し、この変化を、特定の定量方法を行うことにより、検出することが可能であることを見出し、本発明を完成した。なお、「ヘパラン硫酸の量的及び／又は質的変化」とは、例えば、ヘパラン硫酸の構成糖のいずれかの残基が、何らかの修飾を受けた、特定のヘパラン硫酸の量の変化、分子量の変化、硫酸基量の変化、又は特定部位に硫酸基を有するヘパラン硫酸の量の変化等が挙げられる。
【００１１】
すなわち、本発明は、下記（１）〜（３）のヘパラン硫酸の定量方法（以下、本発明定量方法ともいう）、及び、当該方法を用いる定量キット、を提供する発明である。
【００１２】
（１）固相担体に固着させた抗ヘパラン硫酸抗体に対して、標識ヘパラン硫酸と検体中のヘパラン硫酸とを競合的に抗原抗体反応させ、この固相担体における抗ヘパラン硫酸抗体に結合した標識ヘパラン硫酸を検出する、ヘパラン硫酸の定量方法。
【００１３】
（２）抗ヘパラン硫酸抗体に対して、固相担体に固着させたヘパラン硫酸と検体中のヘパラン硫酸とを、競合的に抗原抗体反応させ、固相担体上のヘパラン硫酸に結合した抗ヘパラン硫酸抗体を検出する、検体中のヘパラン硫酸の定量方法。
【００１４】
（３）抗ヘパラン硫酸抗体に対して、微粒子状固相担体に固着させたヘパラン硫酸と検体中のヘパラン硫酸とを競合的に抗原抗体反応させて、微粒子状固相担体を凝集させ、その凝集の程度を検出することによる、検体中のヘパラン硫酸の定量方法。
【００１５】
なお、本発明定量方法において、「定量」は、例えば、ヘパラン硫酸の構成糖のいずれかの残基が、何らかの修飾を受けた特定のヘパラン硫酸の量等を測定、特定することを意味するものである。
【００１６】
本発明定量方法では、特に尿検体や血液検体等の検体におけるヘパラン硫酸と抗ヘパラン硫酸抗体との抗原抗体反応を用いるため操作が容易であり、熟練した技術者でなくとも多くの検体を一度にスクリーニングすることが可能である。また、多数の検体であっても測定値の数値化が可能であるため、このヘパラン硫酸の定量法を用いることで、正確にヘパラン硫酸を定量することができる。
【００１７】
なお、「尿検体」とは、尿又は原尿あるいはそれらから血球成分等を除去する処理によって得た液体成分を意味するが、本発明においては採取したままの尿を尿検体として用いることが好ましい。また、「ヘパラン硫酸の検出」という場合には、特に断らない限り検体中のヘパラン硫酸を定量することを技術的概念として包含する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、糖尿病性腎症に移行しつつある糖尿病患者を可能な限り早期に特定する手段、すなわち検体中のヘパラン硫酸を的確に定量する定量方法、及び、当該定量方法を行うための定量キットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００２０】
本発明定量方法は、下記（１）〜（３）にて示されるヘパラン硫酸の定量方法である。
（１）固相担体に固着させた抗ヘパラン硫酸抗体に対して、標識ヘパラン硫酸と検体中のヘパラン硫酸とを競合的に抗原抗体反応させ、この固相担体における抗ヘパラン硫酸抗体に結合した標識ヘパラン硫酸を検出する、ヘパラン硫酸の定量方法。
【００２１】
（２）抗ヘパラン硫酸抗体に対して、固相担体に固着させたヘパラン硫酸と検体中のヘパラン硫酸とを、競合的に抗原抗体反応させ、固相担体上のヘパラン硫酸に結合した抗ヘパラン硫酸抗体を検出する、検体中のヘパラン硫酸の定量方法。
【００２２】
（３）抗ヘパラン硫酸抗体に対して、微粒子状固相担体に固着させたヘパラン硫酸と検体中のヘパラン硫酸とを競合的に抗原抗体反応させて、微粒子状固相担体を凝集させ、その凝集の程度を検出することによる、検体中のヘパラン硫酸の定量方法。
【００２３】
本発明におけるヘパラン硫酸は、ほ乳類では肺，肝臓，腎臓，脳，脾臓，大動脈等でタンパク質と結合したプロテオグリカンの状態（本明細書中において、「ヘパラン硫酸プロテオグリカン」とも記載する）で細胞膜や基底膜に存在する硫酸化多糖である。その基本糖鎖構造はヘパリンと共通のＤ−グルコサミンとヘキスロン酸（Ｄ−グルクロン酸及びＬ−イズロン酸）のくり返し構造をもち、Ｄ−グルコサミンのＮ位の硫酸基、６位の硫酸基及び／又はヘキスロン酸の２位の硫酸基の置換体であるが、ヘパリンと比して、硫酸基，Ｌ−イズロン酸，Ｎ−硫酸化グルコサミン含量が低く、抗血液凝固活性は極めて低い。
【００２４】
また、本発明定量方法において用いられる抗体は、ヘパラン硫酸を認識し得る抗ヘパラン硫酸抗体である限り、モノクローナル抗体であっても，ポリクローナル抗体であっても、検体中のヘパラン硫酸の定量をすることは可能であるが、ヘパラン硫酸に特異性を有し、かつヒアルロン酸には交叉性を示さない抗体を用いることが好ましい。また、より精度の高い結果を得るためにはヘパラン硫酸中の特定の抗原決定基に対して特異性（その抗体が特定の抗原決定基を認識して抗原抗体反応を惹起し得ること）を有するモノクローナル抗体を用いることが好ましい。
【００２５】
モノクローナル抗体は、ヘパラン硫酸を免疫原とした免疫細胞のハイブリドーマから所望する抗体産生クローンを選択する通常公知の方法を採用して製造することができる。このようにして、本発明定量方法が提供される。
【００２６】
本発明定量方法を適用して検出可能な、糖尿病性腎症への進行に際しては、糸球体基底膜に存在するヘパラン硫酸のＮ−硫酸基を含むグルコサミン残基が、特に減少する傾向が強い（Diabetologia.38,161-172(1995))。よって、本発明定量方法において用いる抗ヘパラン硫酸抗体は、少なくともこのヘパラン硫酸のＮ−硫酸基を含むグルコサミン残基を抗原決定基とする抗体を用いることが好ましい。
【００２７】
特に、この抗ヘパラン硫酸抗体としてモノクローナル抗体を用いる場合には、ヘパラン硫酸のＮ−硫酸基を含むグルコサミン残基を抗原決定基とするモノクローナル抗体を選択することが特に好ましい。このようなモノクローナル抗体としては、抗ヘパラン硫酸抗体１０Ｅ４、同ＨｅｐＳＳ−１（共に生化学工業株式会社製）等を挙げることができる。
【００２８】
例えば、これらの抗ヘパラン硫酸抗体１０Ｅ４等のような、ヘパラン硫酸のＮ−硫酸基を含むグルコサミン残基を抗原決定基とするモノクローナル抗体をヘパラン硫酸の定量手段の一つとして用いる場合には、この境界値は３ＥＵ/mg ＣＲ以上，４０ＥＵ/mg ＣＲ以下、好ましくは５ＥＵ/mg ＣＲ以上，３０ＥＵ/mg ＣＲ以下に設定することが好ましい（ここに記載したＥＵの意味は、実施例において記載する）。
【００２９】
本発明定量方法の態様としては、例えば、（１）固相担体（後述する）に固着させた抗ヘパラン硫酸抗体と、標識されたヘパラン硫酸及び検体中のヘパラン硫酸との間の抗原抗体反応をその原理として用いる方法や、（２）固相担体に固着させたヘパラン硫酸及び検体中のヘパラン硫酸と抗ヘパラン硫酸抗体との間の抗原抗体反応をその原理として用いる方法、さらには（３）ヘパラン硫酸を固着させた、微粒子状固相担体（後述する）に検体を接触させ、さらに抗ヘパラン硫酸抗体をこの微粒子状固相担体に接触させて、微粒子状固相担体同士を凝集させることにより、検体中のヘパラン硫酸を検出する方法等が挙げられ、かつ好ましい。
【００３０】
これらの抗原抗体反応をその原理として用いる本発明定量方法において用い得る、各々の要素〔例えば、固相担体（微粒子状固相担体を含む）、標識されたヘパラン硫酸，抗ヘパラン硫酸抗体等〕は、具体的な検出方法の態様に応じて適宜選択することが可能であり、特に限定されるものではないが、ここに各々の要素における代表的な態様を具体的に例示する。
【００３１】
抗ヘパラン硫酸抗体又はヘパラン硫酸を固着させる固相担体としては、例えばマイクロプレート，ビーズ，チューブ，メンブレン，ゲル，微粒子状固相担体〔例えば、ゼラチン粒子，カオリン粒子，合成ポリマー粒子（ラテックス粒子等）〕等が挙げられ、これらの固相担体の中でも、マイクロプレート，ビーズ，チューブ又は微粒子状固相担体を用いることが好ましい。特に正確な定量性とその実施に際しての簡便性等を考慮すると、マイクロプレートを固相担体として用いることが好ましい。
【００３２】
例えば、抗ヘパラン硫酸抗体を固着させたマイクロプレートを用いた抗原抗体反応を用いるヘパラン硫酸の検出方法としては、「1)抗ヘパラン硫酸抗体を固着させたマイクロプレートに、検体と標識されたヘパラン硫酸とを同時に加え、検体中のヘパラン硫酸と標識されたヘパラン硫酸との、競合的な抗ヘパラン硫酸抗体への結合を利用して、検体中のヘパラン硫酸を検出する競合的抗原抗体反応、又は2)抗ヘパラン硫酸抗体を固着させたマイクロプレートに検体を接触させ、この検体中のヘパラン硫酸をマイクロプレート上の抗ヘパラン硫酸抗体に結合させた後、標識されたヘパラン硫酸をマイクロプレートに接触させて、マイクロプレート上の抗ヘパラン硫酸抗体に結合している検体に由来するヘパラン硫酸に対して、マイクロプレート上の抗ヘパラン硫酸抗体に、標識させたヘパラン硫酸を、阻害的に結合させて、検体中のヘパラン硫酸を検出する阻害的抗原抗体反応」等をその原理として利用した検出方法を挙げることができる。
【００３３】
ここに挙げた抗ヘパラン硫酸抗体を、固着させたマイクロプレートを用いる態様の検出方法は、多数の検体の同時検出を容易にするため、極めて好ましい検出態様として挙げることができる。
【００３４】
マイクロプレート等の固相担体への抗ヘパラン硫酸抗体の固着方法としては、物理的吸着法，共有結合法，包括法等の一般的に用いる方法に従い、抗ヘパラン硫酸抗体を固相担体に固着させることができる。一般的には、その操作の簡便性により物理的吸着法によって抗ヘパラン硫酸抗体を固相担体に固着させることが好ましいが、この物理的吸着法に採り得る固着方法が限定されるものではない。
【００３５】
さらに、ヘパラン硫酸を固着させたマイクロプレート等の固相担体を用いる方法も、代表的な検出態様の一つとして挙げることができる。例えば、ヘパラン硫酸を固着させたマイクロプレートに検体を添加して、このマイクロプレートに固着させたヘパラン硫酸及び検体中のヘパラン硫酸を抗ヘパラン硫酸抗体に対して競合的に反応させた後、マイクロプレートに固着させたヘパラン硫酸と反応して、このヘパラン硫酸に結合した抗ヘパラン硫酸抗体を、標識した二次抗体（抗ヘパラン硫酸抗体に特異性を有する）等を用いて検出して、検体中のヘパラン硫酸を検出する方法等の、競合的又は阻害的抗原抗体反応を利用した方法を挙げることができる。
【００３６】
これらの一連の検出方法において用い得る、標識されたヘパラン硫酸は、標識物質をヘパラン硫酸に結合させたものである。この標識物質として例えば、特異的結合対（例えばビオチンとストレプトアビジン等のアビジン類、又はレクチンと糖鎖等）の一方の物質；ＦＩＴＣ，フィコエリトリン，ユーロピウム，フィコシアニン，ローダミン，テキサスレッド，ウンベリフェロン，トリカラー，シアニン，７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）等の蛍光物質；アルカリホスファターゼ，β−ガラクトシダーゼ，ペルオキシダーゼ，グルコースオキシダーゼ等の酵素類；ジニトロフルオロベンゼン，ＡＭＰ（アデノシン一リン酸）、２，４−ジニトロアニリン等のハプテン；125Ｉ、131Ｉ、3Ｈ等のアイソトープなどを用いることが可能であり、特に限定されるものではないが、上記の特異的結合対の一方の物質を標識物質として選択することが好ましく、特に、ビオチンとアビジン類からなる特異的結合対の一方の物質を選択することが好ましい。
【００３７】
また、これらの標識物質のヘパラン硫酸との結合方法は、常法に従うことが可能である。例えば、ヘパラン硫酸をビオチンで標識する方法としては、例えば、ヘパラン硫酸溶液にＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）緩衝液等で溶解したＥＤＣ（１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）及びビオチン−ヒドラジド溶液を添加して反応させる方法を挙げることができる。なおこの結合方法においては、未反応のビオチンは、例えば透析，エタノール分画又は限外濾過等の常法によって除去することが可能であり、容易にビオチン−ヒドラジド標識したヘパラン硫酸を得ることができる点で好ましい。
【００３８】
さらに上記の標識物質が結合したヘパラン硫酸の標識物質の定量方法自体は、各々の標識物質の検出方法として既に確立している方法を用いて行うことができる。例えば、ビオチンにより標識したヘパラン硫酸を検出する方法としては、ビオチンに対して親和性の高いアビジン類（標識済み：例えばペルオキシダーゼに代表される検出が容易な特定の酵素で標識することが好ましい）とヘパラン硫酸に結合したビオチンを反応させることにより、間接的にヘパラン硫酸を検出する方法が挙げられる。
【００３９】
なお、上記のペルオキシダーゼをストレプトアビジン等のアビジン類の標識物質として用いる場合には、このペルオキシダーゼにより発色させる基質としては、通常この用途に用いられるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）等の発色物質と、ペルオキシダーゼの基質として、過酸化水素水等を使用することが好ましい。
【００４０】
また、上述した抗ヘパラン硫酸抗体を検出するために用いる、抗ヘパラン硫酸抗体に特異性を有する二次抗体は、特に限定はされないが、抗ヘパラン硫酸抗体がウサギ由来であればウサギ免疫グロブリンに対する抗体、マウス由来であればマウス免疫グロブリンに対する抗体等が挙げられ、一次抗体である抗ヘパラン硫酸抗体に由来及びその種類に応じて適宜選択される。二次抗体を標識する物質としては、前述のヘパラン硫酸を標識するための物質として例示した物質群が挙げられるが、その中でも酵素類を用いるのが一般的である。これらの二次抗体を標識する物質及びこの標識物質を検出するための方法は、必要に応じて適宜選択することができる。抗ヘパラン硫酸抗体−標識二次抗体の特に好ましい組み合わせを例示すると、マウスＩｇＭ抗体である１０Ｅ４とペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＭ抗体との組み合わせ等を挙げることができる。
【００４１】
本発明定量方法においては、これらのマイクロプレートのような容器状固相担体、その他、個々が目視できる程度の大きさの固相担体を用いる態様以外の形態も用い得る。このような態様の代表的な例として、上述の微粒子状固相担体の抗原抗体反応に基づく凝集反応を指標にする方法が挙げられる。
【００４２】
例えば、合成ポリマー粒子であるラテックス粒子等の微粒子状固相担体を用い、ヘパラン硫酸を固着させた微粒子状固相担体に検体を接触させ、さらに抗ヘパラン硫酸抗体を、この微粒子状固相担体に接触させることによって起こる、抗ヘパラン硫酸抗体を介したラテックス粒子同士の凝集反応について、検体との接触によりこの凝集反応が、この検体中のヘパラン硫酸により阻害される度合いを検出することにより、検体中のヘパラン硫酸を検出することが可能である。
【００４３】
本発明定量方法は、糖尿病性腎症に移行しつつある糖尿病患者を可能な限り早期に特定する手段、すなわち、検体中のヘパラン硫酸を的確に定量し得る定量方法、及び、当該定量方法を行うための定量キットに応用することも可能である。
【００４４】
健常な腎臓においては、糸球体基底膜に存在するヘパラン硫酸プロテオグリカンのヘパラン硫酸糖鎖における陰性荷電が、血中のタンパク質等に対する「チャージバリア」としての機能を果たしており、これによりタンパク質等の糸球体への沈着や尿への漏洩が防御されている。
【００４５】
そして、尿検体中の通常の形態のヘパラン硫酸の量は、糖尿病患者が糖尿病性腎症へと移行するにつれて減少する傾向が強い。本発明定量方法を用いて、この通常の形態のヘパラン硫酸の尿検体中における増減を検出し、当該検出値を指標として、糖尿病患者の状態の特定を行うことが可能であり、糖尿病性腎症への移行段階を検出することができる。
【００４６】
すなわち、本発明定量方法を行うことにより、上述のＤＭ１の糖尿病患者がＤＭ２の糖尿病性早期腎症へ、さらにはＤＭ３の糖尿病性腎症へと移行していく中間段階、言い換えれば従来の尿検体中アルブミン量によって規定される糖尿病性腎症の病態分類（ＤＭ１〜ＤＭ３）間における移行段階、すなわち「糖尿病性腎症への移行段階」を検出することができる。
【００４７】
本発明定量方法により、尿検体から定量される通常の形態のヘパラン硫酸の量が、通常の値よりも少ないことが検出されれば、その糖尿病患者は糖尿病性腎症へと移行しつつあることを示しており、このことにより糖尿病患者の状態を特定することができる。
【００４８】
例えば、尿検体中におけるヘパラン硫酸の境界値を設定して、本発明定量方法により、この設定値よりもヘパラン硫酸の検出量が少ないことが定量されれば、「その糖尿病患者が糖尿病性腎症への移行段階にある」として、逆に、当該設定値よりも多ければ「糖尿病性腎症への移行段階にはない」とすることにより、糖尿病患者の糖尿病性腎症への移行段階を検出することが可能である。
【００４９】
さらに、本発明定量方法は、単独で糖尿病患者の状態を特定する手段として用いることも可能であるが、例えば、当該定量値を、既存の尿検体中のアルブミン値等の他の指標と組み合わせて用いることで、一層その信頼性を向上させることが可能である。
【００５０】
上述した本発明定量方法を行うためのキットは、検体中のヘパラン硫酸を定量することが可能なキットである。
【００５１】
この本発明定量方法を実施するためのキットは、上述した本発明定量方法を簡便に実施するためのキットであれば特に限定はされない。具体的には、このキットは、少なくとも抗ヘパラン硫酸抗体と、標識したヘパラン硫酸又は固相へ固着したヘパラン硫酸（以下、これらのヘパラン硫酸を、「競合ヘパラン硫酸」と指称する）を含むキットとしての形態をとるが、抗ヘパラン硫酸抗体を固着させた固相担体を含むキットの態様が最も好ましい態様である。
【００５２】
さらに、本発明定量方法を実施するためのキットは、最も好ましくは、上記の要素に加えて、（１）競合ヘパラン硫酸として標識物質によりヘパラン硫酸を標識した標識ヘパラン硫酸を含む試薬及び（２）この標識ヘパラン硫酸に結合した標識物質を検出するための試薬を含むキットである。
【００５３】
なお、このキット中の標識ヘパラン硫酸を含めて、試薬中のヘパラン硫酸は、一定量であり、かつ試薬系中に均一に存在することが好ましいことは勿論である。また、この態様のキットにおける標識ヘパラン硫酸における標識物質の種類と、それに応じた検出物質の種類については、上述の本発明定量方法における説明に従い選択することができる。
【００５４】
また、このような本発明定量方法を実施するためのキットには、通常の定量キットに含まれる緩衝液、蒸留水又は超純水等を必要に応じ本発明の所期の効果を損なわない限りにおいて、その構成要素とすることができる。
【００５５】
上述した本発明定量方法を実施するためのキットは、糖尿病性腎症の移行段階を検出して、糖尿病患者の状態を特定するための診断キットとしての形態も採り得る。当該診断キットは、予め健常人（糖尿病性腎症に罹患していない糖尿病患者を含む）の尿検体中のヘパラン硫酸を定量して得た正常値と、糖尿病性腎症に移行しつつある可能性のある糖尿病患者の尿検体中のヘパラン硫酸とを定量して比較することにより、その糖尿病患者の尿検体におけるヘパラン硫酸ついての変化を特定し、その糖尿病患者の糖尿病性腎症への移行段階を検出し、糖尿病患者の状態を特定し得るキットである。
【００５６】
この糖尿病性腎症の移行段階を検出して、糖尿病患者の状態を特定するためのキットに含まれ得る要素は、原則として上記の本発明定量キットと同一であるが、検体として尿を用いるために特に必要な、例えば、尿の前処理試薬等の要素を含ませることが好ましいことは勿論である。
【実施例】
【００５７】
以下、本発明を実施例等を用いてより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲がこの実施例等により限定されるべきものではない。
【００５８】
抗ヘパラン硫酸抗体１０Ｅ４の抗原決定基の解析
ヘパラン硫酸分子中の硫酸基の変化に伴う、抗ヘパラン硫酸モノクローナル抗体１０Ｅ４の反応性の変化を検討することで、同１０Ｅ４の抗原決定基の解析を行った。すなわち、抗ヘパラン硫酸抗体１０Ｅ４を固着させたプレートに、（１）；各種の濃度の牛腎臓由来のヘパラン硫酸〔生化学工業株式会社、Lot.No.S94Z02 ：HS（BK）〕、（２）；（１）のヘパラン硫酸を完全に脱硫酸化した上記牛腎臓由来ヘパラン硫酸修飾物（CDSNAc-HS）、（３）；（２）のCDSNAc-HSのN位に硫酸基を再び導入したヘパラン硫酸修飾物（CDSNS-HS）、及び、（４）；（３）のN位の硫酸基のみを完全に脱硫酸化した上記牛腎臓由来のヘパラン硫酸（NDSNAc-HS）を添加した。同時にビオチン標識ヘパラン硫酸を添加し、プレートに固着させた抗ヘパラン硫酸抗体10E4と競合的抗原抗体反応により反応させた。
【００５９】
抗ヘパラン硫酸抗体１０Ｅ４と反応しなかったヘパラン硫酸、各ヘパラン硫酸修飾物及びビオチン標識ヘパラン硫酸を洗浄して除去した。続いて、ビオチンの検出を、後述するように、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを用いて行った。ペルオキシダーゼの酵素活性は、後述するように、発色基質として過酸化水素を含むＴＭＢ溶液を用い、最終的に450nmの吸光度を指標として定量した（図１）。図１において、縦軸は吸光度（O.D.）を、横軸はヘパラン硫酸量及び各修飾ヘパラン硫酸量を示す。
【００６０】
この結果より、抗ヘパラン硫酸抗体１０Ｅ４の反応性は、ヘパラン硫酸のグルコサミン残基中のＮ−硫酸基の有無に依存することが判明した。すなわち、抗ヘパラン硫酸抗体１０Ｅ４の抗原決定基は、少なくともヘパラン硫酸のグルコサミン残基中のＮ−硫酸基を含む構造であることが明らかになった。また、ヘパラン硫酸と同様の方法で製造したビオチン標識ヒアルロン酸に対する抗ヘパラン硫酸抗体１０Ｅ４の反応性を調べた結果、抗ヘパラン硫酸抗体１０Ｅ４は、ヒアルロン酸に対する交叉反応性を示さないことも明らかになった。
【００６１】
検量線の作成
（１）ビオチン標識ヘパラン硫酸の調製ヘパラン硫酸（生化学工業株式会社）を0.1M 2-モルホリノエタンスルホン酸（MES）緩衝液（pH5.5）に溶解して、10mg/mL のヘパラン硫酸溶液1.0 mLを調製した。このヘパラン硫酸溶液に、ジメチルスルホキシド（DMSO）で20mMに調製したビオチン-LC-ヒドラジド（ＰＩＥＲＣＥ社製）を25μL 添加した。続いて、0.1MＭＥＳ緩衝液（pH5.5）で100mg/mLに調製したＥＤＣ（ＰＩＥＲＣＥ社製）12.5μLをこれに添加し、よく撹拌した後、常温で16-24時間撹拌反応を行った。反応終了後、この反応物を分子量3,500 cutoffの透析膜において、透析液としてPBS（−）等を用い、微量透析装置（ＢＩＯ−ＴＥＣＫ社製）で、十分に遊離のビオチンを除去した。透析終了後、ビオチン標識ヘパラン硫酸を5mg/mL の濃度に調製し、凍結保存した。
【００６２】
（２）抗ヘパラン硫酸抗体コーティングプレートの調製抗ヘパラン硫酸抗体１０Ｅ４（生化学工業株式会社）をリン酸緩衝生理食塩水〔pH7.2〜7.5、カルシウムイオン等の2価イオン不含：以下、ＰＢＳ（-）とも記載する〕で、20μg/mLに希釈し、この溶液50μLずつをヌンクイムノプレート（商品名：マキシソープ、ヌンク社製）の各ウェルに加え、4℃で14〜18時間保存することにより、均一にコーティングした。このプレートをＰＢＳ（-）で2回洗浄し、ウエルの抗ヘパラン硫酸抗体１０Ｅ４でコーティングされていない部分をブロッキングするためのブロッキング物質として，3％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（生化学工業株式会社販売）を含むＰＢＳ（−）溶液を加え、室温で2時間静置した。静置後、このプレートを洗浄液（0.05％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（-））で3回洗浄して、所望する抗ヘパラン硫酸抗体コーティングプレートを得た。
【００６３】
（３）検量線の作成上記洗浄後、（２）において調製した抗ヘパラン硫酸抗体コーティングプレートの各ウエルに、0.05％Ｔｗｅｅｎ２０及び1％ＢＳＡを含むＰＢＳ（-）（以下、反応液という）を100μL ずつ加えた。続いて、各濃度のヘパラン硫酸標準液（牛腎臓由来、生化学工業株式会社製）（25〜800μg/mLの各濃度）10μL をこのプレートの各ウエルに添加した。更に各ウエルに反応液で至適濃度に希釈した，上記（１）において調製したビオチン標識ヘパラン硫酸を100μL 加え、37℃で60分間静置して抗原抗体反応を行った（ヘパラン硫酸標準液の溶媒としては、反応液を用いた）。
【００６４】
この反応終了後、前記洗浄液で各ウエルを3回洗浄した後、反応液で1000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＨＲＰ標識ストレプトアビジン：ＶＥＣＴＯＲ社製）を各ウェルに100μL加え、これを37℃で30分間静置して反応させた。
【００６５】
反応終了後、このプレートを前記洗浄液で3回洗浄し、ペルオキシダーゼの基質としてＴＭＢ溶液（モス社製）を100μL 加え、37℃で15分間反応させ、発色させた。プレートに1N-HClを100μL 加えて反応を停止させ、ＴＭＢの分解による着色液の波長450nmの吸光度（対照波長630nm）をウェルリーダー（SK-601、生化学工業株式会社販売）で測定して、検量線を作成した（図２）。
【００６６】
なお、ヘパラン硫酸は多様性に富むため、独自の定義として牛腎臓由来のヘパラン硫酸（生化学工業株式会社、Lot.No．S94Z02）1μg を1EU と定義し、ヘパラン硫酸の力価をこの牛腎臓由来ヘパラン硫酸当量で表示する。
【００６７】
また、抗ヘパラン硫酸抗体の代わりにマウスＩｇＭをプレートに固着させた場合、反応が全く認められず、この反応は、非特異的反応ではなく、抗ヘパラン硫酸抗体（１０Ｅ４）に特異的な反応であることが示された（図２：control）。
【００６８】
検体中のヘパラン硫酸の定量による糖尿病患者の糖尿病性腎症の移行段階の検出
健常人（２７例）及び糖尿病患者（６８例）から採取した尿を検体として、この尿検体中に存在するヘパラン硫酸の定量を上記の方法で行った。
【００６９】
すなわち、糖尿病患者を尿中アルブミン濃度（クレアチニン補正値：ＡＣＲ；mg/g・ＣＲ）によりＤＭ１、ＤＭ２、ＤＭ３の３群に分類した。ＤＭ１はＡＣＲ＜１２であり、ＡＣＲに関しては健常人と同レベルの糖尿病患者群である。ＤＭ２は１２≦ＡＣＲ＜２００であり、糖尿病性早期腎症患者群である。ＤＭ３は２００≦ＡＣＲであり、糖尿病性腎症患者群である。
【００７０】
図３は、尿検体中のヘパラン硫酸のレベルを各群間で比較したものであるが、尿検体中においては糖尿病患者（ＤＭ１）と健常人との間においても明らかにヘパラン硫酸レベルの差が認められた（糖尿病患者の尿検体中ヘパラン硫酸レベルは健常人に比べて明らか低い）。
【００７１】
またさらに、健常人（８３例）、ＤＭ１（４０例）、ＤＭ２（４１例）及びＤＭ３（４３例）の尿を検体として採取し、この検体中のアルブミン濃度（クレアチニン補正値：ＡＣＲ；mg/gＣＲ）及びヘパラン硫酸濃度（クレアチニン補正値：mg/gＣＲ）をプロットした際の分布領域を解析した（図４）。健常人とＤＭ１患者の尿検体中アルブミン濃度は同レベルである。また、ＤＭ１患者の尿検体中ヘパラン硫酸濃度は健常人と同じレベルからその１０分の１程度の低レベルまでと、分布が広い。糖尿病性腎症の病態の進行に従い、尿検体中ヘパラン硫酸濃度が低下する傾向は、ＤＭ１の段階ですでに認められると考えられる。そして、尿検体中ヘパラン硫酸濃度が低いＤＭ１患者は、糖尿病性早期腎症（ＤＭ２）へ病態が進行する危険度が高いと考えられる。
【００７２】
そこで、仮に５ＥＵ/mg ＣＲを境界値として、この境界値未満又は同境界値以上で分類し、境界値以上を陰性及び境界値未満を陽性とすると、糖尿病性腎症の進行に伴い陽性の割合が増加した（図５）。よって、このように５ＥＵ/mg ＣＲを境界値とすることは、本発明定量方法を用いて定量した尿検体中のヘパラン硫酸を基に本発明検出方法を実施する上で好ましいことが示唆された。
【００７３】
さらに、糖尿病性腎症の発症と関連する糖尿病の罹病期間に関して分類すると、罹病期間に伴い陽性の割合が増加した（図６）。糖尿病の罹病期間が５〜１０年で糖尿病性早期腎症、１５年程度で糖尿病性腎症と診断される患者が増加する傾向が一般的に見られることと，この第６図の結果を照らし合わせて検討すると、この結果は本発明定量方法を技術的基軸とする本発明特定方法により糖尿病性腎症の病態の進行段階を把握し、糖尿病患者の状態を特定することが可能であることを示しており、本発明定量方法及び本発明特定方法の有用性を裏付けるものである。
【００７４】
本発明に係わるキット
本発明に係わるキットの構成及び使用法の一例を以下に記載する。本実施例におけるキットは、次の１〜８の要素からなる。
【００７５】
１．抗ヘパラン硫酸抗体１０Ｅ４を固着させたイムノプレート（ブロッキング剤でブロッキング済み）：１枚
２．標準ヘパラン硫酸溶液（25、50、100、200、400、800EU/mL、各0.1mL）：１バイアルずつ
３．ビオチン標識ヘパラン硫酸溶液（至適濃度、15mL）：１バイアル
４．ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン溶液（1μg/mL、15mL）：１バイアル
５．テトラメチルベンジジン溶液（1.25mM ＴＭＢ、2.21mM 過酸化水素、1%ＤＭＳＯ、0.08M 酢酸緩衝液、pH4.9、15mL）：１バイアル
６．反応液（1％ＢＳＡ、0.05% Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（-）、40mL）：１バイアル７．洗浄液（0.05％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（-）（500mL））：１バイアル
８．反応停止液（1N HCl（15mL））：１バイアル
【００７６】
この本発明に係わるキットの使用に際しては、抗ヘパラン硫酸抗体１０Ｅ４固着済みイムノプレートの各ウェルを予め洗浄液で洗浄し、各ウェルに反応液を100μL ずつ分注した。この、糖尿病腎症の移行段階の検出用キットにおいては、各濃度のヘパラン硫酸標準液又は糖尿病患者の検体尿を１０μL ずつ添加し、さらに各ウエルにビオチン標識ヘパラン硫酸液を１００μL ずつ添加して、３７℃で６０分間静置した。
【００７７】
その後、このキットにおいて、洗浄液で各ウェルを3回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン液を各ウェルに100μL 加え、これを37℃で30分間静置して反応させた。静置後、各ウェルを洗浄液で3回洗浄し、その後各ウェルにテトラメチルベンチジン溶液100μL を添加し、37℃で15分間反応させ、発色させた。
【００７８】
発色後、各ウェルに反応停止液を100μL 加えて反応を停止させ、ペルオキシダーゼによるＴＭＢとH2O2との反応生成着物の着色波長である450nmの吸光度（対照波長630nm）をウェルリーダー（SK601、生化学工業株式会社販売）で定量した。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】ヘパラン硫酸と各種修飾体における、抗ヘパラン硫酸抗体１０Ｅ４の認識率を示した図面である。
【図２】ヘパラン硫酸標準液を用いて作成した検量線である。
【図３】尿検体中のヘパラン硫酸のレベルを、尿検体中のアルブミン濃度を指標にした各群間での比較を表す図面である。
【図４】尿検体中のアルブミン濃度とヘパラン硫酸濃度を対比し、その分布領域を示す図面である。
【図５】仮に５ＥＵ/mg ＣＲを境界値として、この境界値未満又は同境界値以上で分類して、糖尿病性腎症の症状との相関を検討した図面である。
【図６】仮に５ＥＵ/mg ＣＲを境界値として、この境界値未満又は同境界値以上で分類して、糖尿病性腎症の発症と関連する罹病期間との相関を検討した図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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