(57)【要約】【課題】少なくとも一つの反応部が高温下での反応を行うためのものである、複数の反応部を有する反応容器において、一つの反応部の高熱下での反応時に他の反応部また試薬収容部などに熱的な影響の少ない反応容器を提供することを目的とする。【解決手段】同一基板に、加熱領域を有し加熱反応を行う反応部および試薬収容部を有してなる反応容器であって、反応部の加熱部と試薬収容部の最短の距離が１５ｍｍ以上であることを特徴とする反応容器とする。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
同一基板に、加熱領域を有し加熱反応を行う反応部および試薬収容部を有してなる反応容器であって、反応部の加熱部と試薬収容部の最短の距離が１５ｍｍ以上であることを特徴とする反応容器。
【請求項２】
長尺状の同一基板に、加熱領域を有し加熱反応を行う第一反応部、および加熱領域を有し加熱反応を行う第ニ反応部および試薬収容部を有し、かつ試薬収容部、第一反応部、第ニ反応部の順に配置されてなる反応容器であって、
第一反応部の加熱部と試薬収容部の最短距離が１５ｍｍ以上であることを特徴とする反応容器。
【請求項３】
前記第一反応部の加熱領域と第ニ反応部の最短距離が１５ｍｍ以上であることを特徴とする請求項２記載の反応容器。
【請求項４】
前記試薬収容部及び／又は第一反応部及び／又は第ニ反応部が、凹形状または少なくとも一つの開口部を有する空洞形状であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の反応容器。
【請求項５】
前記第一反応部が遺伝子増幅反応部、第二反応部がＤＮＡのハイブリダイゼーション反応部であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の反応容器。
【請求項６】
前記試薬収容部が複数あり、該試薬収容部の一つに酵素が収容されており、かつ酵素が収容されている試薬収容部と、第一反応部の加熱領域の最短距離が３０ｍｍ以上であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の反応容器。
【請求項７】
前記基材が、樹脂組成物からなり、かつ熱伝導率が０．２（Ｋｃａｌ／ｍ／ｈ／℃）以下であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の反応容器。
【請求項８】
前記基材が、ポリプロピレンを主成分とすることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の反応容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば抗原抗体反応による抗原の検出及びＤＮＡの検出等の生化学反応に用いられる反応容器に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、化学反応やＤＮＡ反応、たんぱく質反応などの生化学反応をチップ上にて行うμ−Ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ技術やＬａｂ−ｏｎ−Ｃｈｉｐ技術が研究され実現して
きており、今まで大型の実験装置や大量の試薬が必要であった反応実験が数ミリ角以下の
チップで少量の試薬で行えるようになってきている。
【０００３】
生化学反応の例としては、酵素反応によるＤＮＡ増幅反応や、既知の配列を有するプローブＤＮＡを用い、ハイブリダイゼーション法により検体ＤＮＡの配列を検出する方法、ＤＮＡの配列決定の中でもＳＮＰ（一塩基多型）の検出法などがある。
ＳＮＰの検出法としては、インベーダー法、タックマンＰＣＲ法をタイピング工程に用いる方法が知られている（特許文献１参照）。
【０００４】
一般的にＤＮＡを用いた検出反応には血液等を採取し抽出したものを用いるが、採取する血液等の試料を少量で済ませるため、検体ＤＮＡの調製法として、酵素反応によるＤＮＡ増幅反応を用いることが多い。
試料中に含まれる微量のＤＮＡを増加させる方法には種々の方法が知られているが、その代表的な方法として、ＰＣＲ増幅反応が知られている。この方法は、試料中の二本鎖ＤＮＡの変性工程（一本鎖に解離）、アニーリング工程（一本鎖ＤＮＡとプライマーを結合）、伸長工程（プライマーからＤＮＡを合成）から構成される３工程を１サイクルとし、このサイクルを繰り返して試料中のＤＮＡを増加させる方法である。変性工程は約９５℃、アニーリング工程は５０〜６０℃、伸長工程は６０〜８０℃で行われる。ＰＣＲ増幅反応はこの熱サイクルを繰り返すことにより行われる。１サイクルに要する時間はせいぜい数分程度であり、このサイクルを繰り返して必要量のＤＮＡを得る。
なお、ＰＣＲ反応の前には前処理として９５℃で数分〜５、６分加熱することもある。
【０００５】
ＳＮＰの検出法の一つであるインベーダー法は、二種類の非蛍光標識オリゴヌクレオチド（アレルプローブ、インベーダープローブ）、一種類の蛍光標識オリゴヌクレオチド（ＦＲＥＴプローブ）及びＤＮＡ構造に特異的なエンドヌクレアーゼ（クリベース）を使用する。アレルプローブは、鋳型ＤＮＡの配列とは無関係な配列（フラップ）を５’側に有し、３’側に鋳型ＤＮＡに特異的な相補配列を有するオリゴヌクレオチドで、その相補配列の５’側末端はＳＮＰ部位となっている。他方、インベーダープローブは、前記ＳＮＰ部位から鋳型ＤＮＡの３’側に相補的に結合するように設計されている。また、ＦＲＥＴプローブは蛍光標識を有するオリゴヌクレオチドで、その５’末端に蛍光標識（レポーター）を有し、その上流にはクエンチャーが結合している。そして、このレポーターから３’側の部位が自己ハイブリゼーションして二本鎖を構成しており、この二本鎖から３’末端側に、アレルプルーブのフラップと相補的な配列である一本鎖の部位を有するものである。また、クリベースは、ヌクレオチドが三重に重なった部位を認識し、三重に重なったヌクレオチドの３’側を切断して遊離させる酵素である。
【０００６】
このインベーダー法においては、まず検査対象の鋳型ＤＮＡとアレルプローブをハイブリゼーションしたときに、ＳＮＰ部位にインベーダープローブの３’末端が侵入する。このため、このＳＮＰ部位で、鋳型ＤＮＡ、アレルプローブ及びインベーダープローブを重ね合わせて三重になる。このＳＮＰ部位の構造をクリベースが認識して、アレルプローブのフラップを切断・遊離させる。次に、アレルプローブ起源の前記遊離フラップはＦＲＥＴプローブとハイブリゼーションする。このハイブリゼーションによって、自己ハイブリゼーションの二本鎖とアレルプローブ起源の前記遊離フラップとの交点で三重となり、クリベースは再びこの構造を認識してＦＲＥＴプローブのレポーターを切断し、クエンチャーから開放される。そして、励起光を照射することにより、切断遊離されたレポーターの蛍光標識が蛍光発色する。仮にＳＮＰ部位の塩基がアレルプローブとマッチしないものであった場合、アレルプローブ起源のフラップは切断・遊離せず、したがって、蛍光発光率が著しく低いから、この蛍光強度の差を検出することによってＳＮＰを検査することができる。なお、励起光としては一般に紫外光又は可視光が利用されている。
また、これらの反応は約６３℃で数十分〜４時間程度インキュベートすることにより行われる。
【０００７】
なお、前述のインベーダー法や一般的なハイブリダイゼーション法では、検体ＤＮＡの前処理として９５℃で数分〜５、６分加熱することもある。
【０００８】
チップを用いて、これらの反応を行う場合、ＤＮＡの配列を決定する場合などは、スライドガラス上にプローブＤＮＡを固定し、その上でハイブリダイゼーション反応を行う方法が知られている。
また、チップ上に設けたウェルと呼ばれる微小な穴やくぼみが形成され反応場として用いることも知られている。ウェルは、半導体やガラスにエッチングで設けたり、穴のあいた板を積層することで形成されていた。
ウェルを用いる場合、試薬を基板上に固定する必要がなく、またＰＣＲ反応などにも適用できる。
【０００９】
ウェルタイプのものとしては、例えば、基板表面に多数のウェルが設けられている検出用基板が開示されている（特許文献２、３、４参照）。
また、内部に流路を設け、両端に開口部を有する、ＰＣＲ反応用の装置も知られている（特許文献５参照）。
【００１０】
しかし、複数の反応を同一のチップ上で行う場合、ある一つの反応時における、他の部分への影響が問題となることがある。例えば、同一のチップ上に、試薬を収容する部分と、ＰＣＲ反応を行う部分、そしてハイブリダイゼーション法でＤＮＡの反応検出を行う部分を設け、これらの反応を連続して行うことを想定してみる。一般的にＰＣＲ反応は９０〜１００℃に加熱する工程、５０〜７０℃程度に保温する工程がある。またハイブリダイゼーション反応はおよそ６０〜７０℃程度に加熱する工程がある。このように、同一チップ状で多数の反応を行うと、ある一つの反応を行っているときに、他の反応部分または試薬収容部分に熱的な影響を与えることが懸念される。
【００１１】
例えば、同一のチップ上に水、バッファ、酵素等の試薬を収容する試薬収容部と、１００℃近くまで加熱をする第一反応部と、第二反応部を有しているチップを用いた反応において、試薬収容部から第一の反応に必要な試薬を分注し、１００℃近い温度により加熱反応を行った場合、試薬収容部に収容されている水、バッファ等の試薬は蒸発する恐れがある。また、酵素には熱により変性し不可逆に失活してしまうため、例えば第一反応部での反応後、第二反応部の反応に酵素を使用する場合、反応効率の低下または反応が進行しない恐れがある。さらに、蒸発を防ぐためにフタ材をかぶせておいたとしても、蒸発した試薬がフタ材の裏面に付着し、例えば前記の例で言うと第一の反応終了後に第二の反応を行うために試薬収容部から第二反応部へ試薬を分注する際に、試薬を正確に所望の量を回収できないことがある。
【００１２】
【特許文献１】特開２００２−３００８９４号公報
【特許文献２】ＷＯ２００３／０３１９７２号公報
【特許文献３】特開平０９−９９９３２号公報
【特許文献４】特開２００３−７０４５６号公報
【特許文献５】特許第２７５９０７１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、このような事情を考慮してなされたもので、少なくとも一つの反応部が高温下での反応を行うためのものである、複数の反応部を有する反応容器において、一つの反応部の高熱下での反応時に他の反応部また試薬収容部などに熱的な影響の少ない反応容器を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
請求項１の発明は、同一基板に、加熱領域を有し加熱反応を行う反応部および試薬収容部を有してなる反応容器であって、反応部の加熱部と試薬収容部の最短の距離が１５ｍｍ以上であることを特徴とする反応容器である。
【００１５】
請求項２の発明は、長尺状の同一基板に、加熱領域を有し加熱反応を行う第一反応部、および加熱領域を有し加熱反応を行う第ニ反応部および試薬収容部を有し、かつ試薬収容部、第一反応部、第ニ反応部の順に配置されてなる反応容器であって、
第一反応部の加熱部と試薬収容部の最短距離が１５ｍｍ以上であることを特徴とする反応容器である。
【００１６】
請求項３の発明は、前記第一反応部の加熱領域と第ニ反応部の最短距離が１５ｍｍ以上であることを特徴とする請求項２記載の反応容器である。
【００１７】
請求項４の発明は、前記試薬収容部及び／又は第一反応部及び／又は第ニ反応部が、凹形状または少なくとも一つの開口部を有する空洞形状であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の反応容器である。
【００１８】
請求項５の発明は、前記第一反応部が遺伝子増幅反応部、第二反応部がＤＮＡのハイブリダイゼーション反応部であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の反応容器である。
【００１９】
請求項６の発明は、前記試薬収容部が複数あり、該試薬収容部の一つに酵素が収容されており、かつ酵素が収容されている試薬収容部と、第一反応部の加熱領域の最短距離が３０ｍｍ以上であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の反応容器である。
【００２０】
請求項７の発明は、前記基材が、樹脂組成物からなり、かつ熱伝導率が０．２（Ｋｃａｌ／ｍ／ｈ／℃）以下であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の反応容器である。
【００２１】
請求項８の発明は、前記基材が、ポリプロピレンを主成分とすることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の反応容器である。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、同一の基板上に加熱領域を有し加熱反応を行う反応部および試薬収容部を有してなる反応容器において、加熱による反応部や試薬収容部などへの影響のない反応容器とすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明は、同一基板に、加熱領域を有し加熱反応を行う反応部および試薬収容部を有してなる反応容器であって、反応部の加熱領域と試薬収容部の最短の距離が１５ｍｍ以上であることを特徴とする反応容器である。
または、長尺状の同一基板に、加熱領域を有し加熱反応を行う第一反応部、加熱領域を有し加熱反応を行う第二反応部および試薬収容部を有し、かつ試薬収容部、第一反応部、第二反応部の順に配置されてなる反応容器であって、第一反応部の加熱領域と試薬収容部の最短距離が１５ｍｍ以上であることを特徴とする反応容器である。
【００２４】
以下、詳細に説明する。
図１に、本発明における一実施形態を示す図を示す。図１は、略長方形の板状の基板２に、試薬を収容する複数の試薬収容部３と、複数の反応部４が形成されており、反応部を包含するように加熱領域５がある。そして加熱領域５と試薬収容部３の最短の距離６が１５ｍｍ以上である。
【００２５】
図２に、本発明における別の一実施形態を示す図を示す。図２は、略長方形の板状の基板２に、試薬を収容する複数の試薬収容部３と、第一反応部７としてＰＣＲ反応をおこなうＰＣＲ反応部と、第二反応部としてＰＣＲ反応により調製された核酸検体を反応検出するための複数の反応検出部９が形成されており、第一反応部の反応を行う部分に加熱領域８を有し、第二反応部である反応検出部を包含するように加熱領域９がある。なお、図２において、第一反応部７は基材に設けた２つの開口部を流路で接続てなり、流路は基材裏面に設けた溝部をフィルム７ｂで被覆することにより形成してなる。
そして加熱領域８と試薬収容部３の最短の距離１１が１５ｍｍ以上である。また、加熱領域８と反応検出部９の最短の距離１２が１５ｍｍ以上である。
【００２６】
本発明に用いる基板は、反応系に悪影響を与えないものであればよい。また、反応を検出する際、基板下方より光学検出する場合は透明性が高い方が好ましい。
【００２７】
また、熱伝導率（Ｋｃａｌ／ｍ／ｈ／℃）が０．２以下であることが好ましい。この範囲であれば、後述の試薬収容部と反応部を一定の距離を開けて設けることにより、反応部に加えた熱の影響が試薬収容部などにいかなくなるものである。
【００２８】
このようなものとして、例えば、ＰＣ（ポリカーボネート）、ＰＰ（ポリプロピレン）、シクロオレフィン系ポリマー、メチルペンテン系樹脂、フッ素ポリマー、シリコーン樹脂などを用いることができる。
特にポリプロピレン系の樹脂を用いることが好ましい。
【００２９】
また、このような合成樹脂を用いて基板を作成すれば、耐熱性、耐薬品性、成形加工性などに優れているため好ましい。さらに、２種類以上の樹脂を接合して用いてもよい。この場合、それぞれの樹脂の特徴を活かして基板を作成することにより、試薬及び試料等の特性に応じた多様な基板とすることが可能となり、用途ごとに使い分けることができる。例えば、基板の上半分と下半分とで材料を分けたりすることも可能となる。また、後述の試薬収容部やＰＣＲ反応部など部分ごとに材料を分けることもできる。
なお、基板の素材としてガラスを用いてもよい。
【００３０】
通常、熱伝導率は金属で１００（Ｋｃａｌ／ｍ／ｈ／℃）以上、ガラスで約１（Ｋｃａｌ／ｍ／ｈ／℃）、樹脂で１（Ｋｃａｌ／ｍ／ｈ／℃）以下である。
反応部でＤＮＡのハイブリダイゼーションやインベーダー反応、ＰＣＲ反応を行う場合、反応工程や前処理工程で、１００℃近い加熱工程を経る。しかし、例えば試薬収容部に水、バッファなどを収容する場合、熱による蒸発試薬の蒸発を防ぐために、６０℃以上にならないようにすることが好ましい。またその他、熱に弱い試薬を熱から守るためには、その試薬の特性に合わせて適宜距離、材質などを設定すればよいが一般的には６０℃程度以上にならないようにすれば多くの反応系では問題ない。
【００３１】
基材として樹脂組成物を用いる場合、樹脂の熱伝導率は一般的に１（Ｋｃａｌ／ｍ／ｈ／℃）以下程度であるので、試薬収容部と反応部の加熱部を前述の範囲にすることで、熱の伝播を抑え、試薬収容部内の温度上昇を抑えることができる。
【００３２】
また、基材の厚みは０．０５〜５ｍｍの範囲内であることが好ましい。さらに好ましくは０．５〜１．５ｍｍの範囲内である。
薄すぎると強度が低下する。熱伝導率の低い材質のものであっても、空気に比べると熱伝導度は高いため、この範囲より厚すぎると伝わる熱の量が増大するため好ましくない。
【００３３】
試薬収容部は、開口部を有する凹形状（ウェル形状）であることが好ましい。
試薬収容部は、複数設けることもでき、試薬収容部を複数設ける場合、大きさが異なっていても良い。試薬収容部の数は、目的に応じて適宜設定できる。
また、試薬収容部は、予め一つの試薬を入れておき、後から別の試薬を入れ、混合させる混合場として用いることもできる。
【００３４】
試薬収容部の凹形状としては、中でも半球状または円筒状で底部が半球状なものが好ましい。半球状であれば試薬を充填する際、試薬の飛び散り、気泡の混入を防げるものとなる。また収容した試薬を分取、回収の分取性、回収性に優れるものとなる。
窪みを有する試薬収容部の場合、窪みを除いた部分の底部が半球状になっていれば良い。窪みの底部も半球状になっていることが好ましい。微量試薬の液滴は収容されるとき、玉状で供給されるとすると、ちょうど試薬の液滴が半球状の窪みにはまり保持される構造になる。また、試薬の量が窪みの容量より大きい場合でも、半球状であれば、気泡の混入なく、試薬の一部が窪みに入り込み保持される。
なお、それ以外にも、開口部が円形または多角形で、断面が三角形状、四角形状、台形形状になっているものでもかまわない。
【００３５】
試薬収容部の容量は、１０〜３００μｌの範囲内であることが好ましい。特にＤＮＡを扱う生化学反応では、反応量が微量であり、用いる試薬は高価であることが多い。
そのため、反応に用いる試薬などは多くても数百μｌ程度になり、前述の範囲内であることが好ましい。また、数百μｌ以上の試薬を用いる場合は試薬収容部を２つ以上用いてもよい。
【００３６】
前記試薬収容部の開口径が１〜５０ｍｍの範囲内であることが好ましい。
試薬の量は、数百ｎｌ程度の極微量〜数百μｌ程度であり、また一般的な分注針や分注チップの径は数十μｍ〜数ｍｍ程度である、そのため、分注適性、目的容量を考慮すると、試薬収容部の開口径が１〜５０ｍｍの範囲内であることが好ましい。
【００３７】
また、深さは１〜５０ｍｍの範囲内であることが好ましい。
【００３８】
また、前記試薬収容部は、図６（ｂ）に示すような基板をくりぬいた形状にしてもよいし、図６（ａ）に示すように基板裏面が反応部の形状に沿って基板下方向に凸形状になっていても良い。
【００３９】
また、試薬収容部上に蓋材を設けても良い。蓋材を設けることにより、ごみ、汚染物質などによる汚染を防ぐことができる。
蓋材としてはフィルム状のものを用いることができる。このようなものとしては、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン等のポリオレフィンフィルム、ポリメチルアクリレート、ポリメチルメタクリレート等のアクリル系フィルム、ポリスチレンフィルム、ポリアセタールフィルム、ポリアミドフィルム、ポリアクリロニトリルフィルム、ポリカーボネートフィルム、シクロオレフィン系フィルム、シリコン樹脂系フィルム、フッ素系樹脂フィルムなどが挙げられる。
また、アルミニウムなどの金属箔や、金属箔と前述の樹脂フィルムの積層フィルムを用いても良い。
【００４０】
これらのフィルム状蓋材は、接着剤を用いて貼り合わせることができる。接着剤としては、耐熱性の硬化性接着剤を用いることができる。
また、ヒートシールにより貼り合わせてもかまわない。ヒートシールであれば、試薬への接着剤の影響を考慮しなくても良いので好ましい。
【００４１】
ヒートシールの条件は、温度１４０℃〜２２０℃、圧力１ｋｇ〜３ｋｇ、時間０．３秒〜２．０の範囲内で、加圧しながら貼り合わせることが好ましい。温度、圧力、時間がこれ以上であると基材が変形を起こしやすくなる。また、これ以下の温度、圧力、時間であるると貼り合わせが困難である。また、温度を上げる場合は、内容物の熱劣化を考慮して時間を短くするとよい。
【００４２】
また、蓋材を設けた場合、試薬の回収は、蓋材の上から注射器のような針状の回収具を用いて、突き刺し、回収しても良い。
【００４３】
なお、蓋材を剥がさずに試薬を回収する場合は、蓋材は剥離する必要がない。
【００４４】
また、例えば図５に示すように開口部周囲に凸部を設けても良い。凸部を設けることにより、蓋材を貼り合わせやすくできる。
特にヒートシールにより貼り合わせる場合、加熱する部分が、基材全体ではなく、凸部のところだけでよいので、試薬収容部内の試薬への熱的な影響を低減することができる。
【００４５】
このような凸部としては、幅は０．１〜２ｍｍ、好ましくは０．３〜０．７ｍｍの範囲内であることが好ましい。この範囲より小さいと、凸部でヒートシールすることができず、この範囲より大きいと、基材、内容物への影響（ダメージ）が大きくなってしまう。
また、凸部を設けることにより収容部の容量を増やしてもよい。その場合、収容部の強度とヒートシール適性を考慮して、凸部を例えば図５（ｂ）に示すように２段階に形成してもよい。すなわち、強度を出すためにある程度の厚みを持たせた凸部を設け、その上に幅の小さい凸部を設ける２段階構造にすることにより強度とヒートシール適性を両立させてもよい。
【００４６】
反応部としては、凹形状または少なくとも一つの開口部を有する空洞形状のものがあげられる。反応部では、反応の有無を検出してもよい。
また、第一反応部、第二反応部を有する場合、両方が凹形状または少なくとも一つの開口部を有する空洞形状であってもよいし、片方が凹形状でもう片方が一つの開口部を有する空洞形状であってもよい。
第一反応部、第二反応部を有する場合、例えば第一反応部が開口部を有する空洞形状であり、第二反応部が凹形状でもよい。
【００４７】
凹形状の反応部は、基板がプラスチック、合成樹脂系であれば切削加工、成型加工により形成することができる。ガラスであれば切削加工により形成することができる。また、反応部は複数有することができ、目的に応じて適宜設定できる。
凹形状の反応部の開口径は０．１〜５ｍｍの範囲内、深さが０．１〜５ｍｍ範囲内であることが好ましい。前述のようにライフサイエンス分野では、微量試薬を用いて厳密な温度制御を行うことが多く、効率的に反応を行うためには、前記範囲内であることが好ましい。
また、反応部内には予め、反応に必要な試薬を収容していても良い。
【００４８】
また、凹形状は特に限定するものではないが、底部が平坦でありウェル開口部から底部まで壁面が傾斜している円錐台形形状であることが好ましい。底部が平坦でありウェル開口部から底部まで壁面が傾斜している円錐台形状であれば、下方からの光学的な検出に有利である。例えば反応部内に蛍光物質を下方から紫外線を照射し、同じく下方から蛍光を検出する場合、球状やその他複雑な形状であると、蛍光物質の励起源である紫外線が屈折、散乱して蛍光物質に照射される量が減少してしまう。また生じた蛍光も屈折、散乱し、検出する蛍光強度の低下、誤検出などの原因となってしまう。
なお、それ以外にも、開口部が円形または多角形で、断面が半球形状、Ｕ字形状、三角形状、四角形状になっているものでもかまわない。また、開口部が多角形で断面が台形形状でもかまわない。
【００４９】
また、前記反応部は、図６（ｂ）に示すような基板をくりぬいた形状にしてもよいし、図６（ａ）に示すように基板裏面が反応部の形状に沿って基板下方向に凸形状になっていても良い。
【００５０】
また、反応部上に保護フィルムを設けても良い。保護フィルムを設けることにより、ごみ、汚染物質などによる汚染を防ぐことができる。
保護フィルムとしてはフィルム状のものを用いることができる。このようなものとしては、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン等のポリオレフィンフィルム、ポリメチルアクリレート、ポリメチルメタクリレート等のアクリル系フィルム、ポリスチレンフィルム、ポリアセタールフィルム、ポリアミドフィルム、ポリアクリロニトリルフィルム、ポリカーボネートフィルム、シクロオレフィン系フィルム、シリコン樹脂系フィルム、フッ素系樹脂フィルムなどが挙げられる。
また、アルミニウムなどの金属箔や、金属箔と前述の樹脂フィルムの積層フィルムを用いても良い。
【００５１】
これらの保護フィルムは、接着剤を用いて貼り合わせることができる。接着剤としては、耐熱性の硬化性接着剤を用いることができる。
また、ヒートシールにより貼り合わせてもかまわない。反応部内に予め試薬を収容しておく場合、ヒートシールであれば、試薬への接着剤の影響を考慮しなくても良いので好ましい。
【００５２】
ヒートシールの条件は、温度１４０℃〜２２０℃、圧力１ｋｇ〜３ｋｇ、時間０．３秒〜２．０の範囲内で、加圧しながら貼り合わせることが好ましい。温度、圧力、時間がこれ以上であると基材が変形を起こしやすくなる。また、これ以下の温度、圧力、時間であるると貼り合わせが困難である。また、温度を上げる場合は、内容物の熱劣化を考慮して時間を短くするとよい。
【００５３】
保護フィルムは使用する前に剥がす必要があるため、易剥離性であることが好ましい。
【００５４】
また、例えば図５に示すように開口部周囲に凸部を設けても良い。凸部を設けることにより、蓋材を貼り合わせやすくできる。特にヒートシールにより貼り合わせる場合、加熱する部分が、基材全体ではなく、凸部のところだけでよいので、反応部内に予め試薬を収容しておく場合、試薬への熱的な影響を低減することができる。
また、剥離する際も、接点が開口部を除いた基材全体ではなく、凸部上だけであるので剥離が容易にできる。
【００５５】
このような凸部としては、幅は０．１〜２ｍｍ、好ましくは０．３〜０．７ｍｍの範囲内であることが好ましい。この範囲より小さいと、凸部でヒートシールすることができず、この範囲より大きいと、基材、内容物への影響（ダメージ）が大きくなってしまう。
また、凸部を設けることにより反応部の容量を増やしてもよい。その場合、反応部の強度とヒートシール適性を考慮して、凸部を例えば図５（ｂ）に示すように２段階に形成してもよい。すなわち、強度を出すためにある程度の厚みを持たせた凸部を設け、その上に幅の小さい凸部を設ける２段階構造にすることにより強度とヒートシール適性を両立させてもよい。
また、凸部同士を凸部と同じ高さで連結させても良い。そのようにすることで、剥離する際に、引っ掛かりがなくスムーズに剥離ができる。
【００５６】
ウェル状の試薬収容部、反応部に試薬、検体などの溶液を充填する際、ウェル内部に表面処理を施しておくと気泡の混入なく溶液を注入できる。また、ウェルから溶液を回収する際にも高回収率が期待できる。
また、予め試薬を入れあるウェルに後から別の試薬を入れ、混合する場合にも試薬が適切に広がるために混合がしやすい。さらに、ウェル内で加熱により反応を行う際、液在籍位置が安定し、また蒸発しにくいものとなる。
なお、溶液が水系の場合、親水処理を施すことが好ましい。具体的には水との接触角が７０°以下、好ましくは４０°以下がよい。
また、接触角の測定は、公知の接触角計を用いて測定する。また、ウェル内の接触角の測定は困難であるため、同様の表面状態である基板の表面を用いて測定しても良い。
【００５７】
開口部を有する空洞形状の反応部は、両端に基材を貫通する貫通孔を設け、基材の裏面に両貫通孔を接続する溝部を設ける。この溝部上に底部形成用フィルムを貼り合わせることにより、流路状反応部を形成する。
この時、溝部の幅、高さはそれぞれ１ｍｍ〜５ｍｍの範囲内であることが好ましい。
【００５８】
前記溝部は両貫通孔を直線で結んでいても良いし、試薬や検査対象の蒸発を防ぐために屈曲した形状であっても良い。
【００５９】
底部形成用フィルムとしてはフィルム状のものを用いることができる。このようなものとしては、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン等のポリオレフィンフィルム、ポリメチルアクリレート、ポリメチルメタクリレート等のアクリル系フィルム、ポリスチレンフィルム、ポリアセタールフィルム、ポリアミドフィルム、ポリアクリロニトリルフィルム、ポリカーボネートフィルム、シクロオレフィン系フィルム、シリコン樹脂系フィルム、フッ素系樹脂フィルムなどが挙げられる。
また、アルミニウムなどの金属箔や、金属箔と前述の樹脂フィルムの積層フィルムを用いても良い。
【００６０】
底部形成用フィルムは接着剤を用いて貼り合わせることができる。また、ヒートシールにより貼り合わせても良い。ヒートシールであれば、反応部内への接着剤の影響を考慮しなくても良いので好ましい。
また、底部形成用フィルムは、一部溝部へ食い込む形状であれば好ましい。基材と底部形成用フィルムの間に隙間が生じず、試薬や検査対象の漏れがないものとなるからである。
【００６１】
また、例えば図３に示すように、貫通孔開口部は容量を増やすために基材から上部に突出した形状にしてもよい。
【００６２】
また、開口部にはフタ材を設けてもよい。
【００６３】
本発明の加熱領域とは、反応部の加熱される領域のことをいう。例えば複数の凹形状の反応部を有し、複数の反応部をちょうど包含するような加熱部材を接近させて加熱する場合、加熱部材により、目的の反応温度に加熱される領域を言う。そしてその加熱領域から試薬収容部までの距離が１５ｍｍ以内であることが必要である。（図１においては６、図２においては１１）、また、第一反応部、第二反応部を有する場合、第一反応部と第二反応部の距離（図２の１２）も１５ｍｍ以内であることが好ましい。
【００６４】
また、その他の反応部を設けても良いが、熱の影響を考慮して位置設計することが重要である。
【００６５】
また、凹形状の反応部を用いる場合、反応部同士を接続する流路を設けてもよい。またウェル状反応部と試薬収容部、反応部、その他の反応部を接続する流路を設けてもよい。これら流路を形成することにより、連続した反応を行わせることが可能となる。
【００６６】
また、基板には、変形などを軽減するためにリブを設けてもよい。リブとしては、基板端部の下部及び／又は上部に幅０．１〜３ｍｍ、高さ０．１〜３ｍｍ程度のものを設ければよい。また、置いたときに安定するよう、支持用脚部を設けてもよい。
【００６７】
本発明では、様々な生化学系の反応用として用いることができ、例えば抗原抗体反応及びＤＮＡ反応の検出などに用いることができる。
抗原抗体反応による抗原検出の場合、例えば、予め各ウェル状反応部内に抗原を含む試料を入れておき、後から検体として抗体を含む試薬を添加し、抗原または抗体のいずれかに標識物質を付けておくことで、反応の有無を検出できる。標識物質としては、蛍光などの発光物質が一般的に用いられる。なおこの場合、基板上に試薬収容部を設けて置き、検体を収容しておいてもよい。
【００６８】
ＤＮＡの検出の場合、例えば、予めウェル状反応部内に核酸プローブを用意しておく。その後、検体ＤＮＡをウェル状反応部に供給し、核酸プローブと検体ＤＮＡのハイブリダイゼーション反応により、ＤＮＡの検出を行うことができる。その際、検体ＤＮＡに標識物質を付けておけば、その標識物質の有無を検出することにより検出が可能となる。また、検体ＤＮＡは、血液等から抽出したＤＮＡをＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法などにより調製しておいたものを用いることができる。また、核酸プローブとして配列の異なる核酸を複数用意することで検出物質としての検体ＤＮＡがどのような配列であるかを検出することができる。なおこの場合、基板上に試薬収容部を設けて置き、検出物質を収容しておいてもよい。
【００６９】
また、基板上に遺伝子増幅反応部を設けておき、チップ上で連続して、血液などから抽出したＤＮＡを遺伝子増幅反応により増幅させ、それを検体とし、反応部で核酸プローブとの反応の有無を検出してもよい。具体的には、例えばウェル状試薬収容部に検体として血液などから抽出したＤＮＡを収容しておき、分注動作により、遺伝子増幅反応部へ分注し、遺伝子増幅反応により調製した検体をウェル状の反応部へ分注すればよい。ウェル状試薬収容部から遺伝子増幅反応部、ウェル状反応部へは流路を用いて送液しても良い。
なお、ここでいう遺伝子とはＤＮＡ、ＲＮＡなどのことをいう。また遺伝子増幅反応方法としては前記ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法などがある。
【００７０】
また、一塩基遺伝子多型（ＳＮＰ）の解析にも用いることができる。なお、検体を検出するための試薬は複数あってもよく、検体が蛍光標識されていない場合には、試薬のひとつが標識されていればよい。
【００７１】
また、標識物質は、反応物に特有に作用するものを、反応後に加えることもできる。このようなものとしては、ＤＮＡの検出におけるインターカレーターなどがある。また、ここでいう標識物質とは間接的なものも含む。すなわち、蛍光物質などに結合する物質を標識物質として検体またはプローブ核酸などの検体を検出するための試薬に結合させておき、後から蛍光物質を加えても良い。
【００７２】
また、多段階反応を行ってＳＮＰまたはＤＮＡを検出してもよい。
例えば、インベーダー・アッセイ法（サードウェイブテクノロジーズ，Ｉｎｃ（米国ウィスコンシン州マディソン市）を用いても良い。これによりＳＮＰ解析の具現化を図ることが可能となる。
【００７３】
この場合、検体を検出するための試薬が複数種でもよく、予めウェル状反応部内に少なくとも１種の試薬を入れておき、その後、検体と試薬を同時または順次注入し、反応をおこなっても良い。
【００７４】
また、ウェル状反応部、ＰＣＲ反応部には、反応用液の乾燥を防ぐ目的でミネラルオイルなどの反応用液より比重の軽い不揮発性液体を加えても良い。
また、検体を検出するための試薬はウェル状反応部内に固定してもよいし、固定させずに保持させておくだけでもよい。
【実施例】
【００７５】
＜実施例１＞
図４の検出チップを、金型成形により作成する。成形に用いた樹脂は、ポリプロピレン（プライムポリマー株式会社製）を用いて寸法縦２．５ｃｍ×横１２ｃｍの成形品を作成した。
【００７６】
試薬収容部３は直径１３ｍｍ、深さ６ｍｍで先端が半球状とした。試薬収容部は間隔１．５ｍｍにし、横方向に２行、縦方向に２列にし計４個設けた。
【００７７】
第一反応部７であるＰＣＲ反応部は、直径９ｍｍ、深さ４ｍｍで先端が半球状のものを形成した。
【００７８】
第二反応部９は反応検出用で直径３ｍｍ、深さ２ｍｍで側面が傾斜し底面が平坦である、断面台形形状とした。第二反応部は間隔１．５ｍｍにし、横方向に４行、縦方向に５列にし計２０個設けた。
【００７９】
なお、基材厚みは１ｍｍで試薬収容部、第一反応部及び第二反応部の底部は基板から下方にはみ出す形状にした。基板の端から試薬収容部、第一反応部（ＰＣＲ反応部）、第二反応部（反応検出部）という順に設け、第一反応部加熱領域と試薬収容部の最短距離は１５ｍｍにし、第一反応部の加熱領域と第二反応部の最短距離は１５ｍｍとした。
なお、第一反応部の加熱領域は、後述の加熱部材が縦９×横９ｍｍなので、第一反応部を包含する９×９ｍｍの領域である。
【００８０】
次に表面処理として、コロナ処理を行った。処理条件は電源に３８０Ｗ（電圧６４Ｖ、電流４．９Ａ）印加し、コロナ放電を発生させ、表面処理を行った。
【００８１】
このチップを用いてＰＣＲによる検体ＤＮＡの増幅及びインベーダ反応によるＳＮＰの検出を行った。インベーダー反応はインベーダーアッセイキット（ＴｈｉｒｄＷａｖｅＴｅｃｈｏｎｏｇｙ社製に順ずる）。
【００８２】
まず、４つの試薬収容部３にはそれぞれ
・ミネラルオイル１２０μｌ［ウェル１］
・ＰＣＲ試薬（純水、バッファー、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、Ｐｒｉｍｅｒ）２０μｌ［ウェル２］
・インベーダー試薬（純水、バッファー、酵素（クリベース）、フレットプローブ）６５μｌ［ウェル３］
・血液から採取し、前処理を施した検体ＤＮＡ８μｌ［ウェル４］
を針の内径２ｍｍのピペットを用いて加え収容した。
なお、図４において試薬収容部の各ウェルは、左上をウェル１、右上をウェル２、左下をウェル３、右下をウェル４とした。
反応部にはインベーダープローブ０．１５μｌづつを針の内径２ｍｍのピペットを用いて加えて、乾燥させた。
【００８３】
まず、ウェル２からＰＣＲ試薬を１２μｌとり、ウェル４に入れ、ピペットを数回ポンピングすることにより混合した。混合した試薬のうち５μｌを第二反応部（ＰＣＲ反応部）にいれ、その上からウェル１からミネラルオイル５μｌを入れた。
液の回収注入にはいずれも針の内径２ｍｍのピペットを用いた。
【００８４】
第一反応部（ＰＣＲ反応部）内で９５℃５分加熱した後、９５℃３０秒−７０℃３０秒−６５℃９０秒のサイクルを３０回行うことで、ＰＣＲ反応を行った。なお、加熱冷却の温度制御は第一反応部の上下に縦９×横９ｍｍのペルチェ素子を配置し行った。
【００８５】
ＰＣＲ反応終了後、ＰＣＲ反応終了液を全量取り出し、ウェル３に入れ、インベーダー試薬と混合した。なお、反応液のうち、ミネラルオイルの下にある反応終了液だけを針の内径２ｍｍのピペットにより抽出した。
なお、この時、Ａ点における表面の温度を測定したが、ＰＣＲ反応中最大で５４℃までしか上昇しなかった。
【００８６】
混合した液を４０μｌとり、２μｌづつ２０の第二反応部に分注し、その後ウェル４からミネラルオイル８０μｌとり、４μｌづつを同じく２０の反応部に分注した。なお分注には針の内径２ｍｍのピペット用いた。
【００８７】
次に２０の第二反応部に６１℃、２０分間の加熱環境下に置き、インベーダー反応を行った。反応時には２０のウェル状反応部全てで気泡の膨張による反応液の噴出しは見られなかった。
反応が完了したら、蛍光検出を行った。検出した結果、蛍光が検出されＳＮＰの検出ができた。また、蛍光増幅曲線を見たところ、５分でＰＬＡＴＥＡＵに達し、効率よく反応が検出された。
【００８８】
＜比較例１＞
試薬収容部、第二反応部を基板中央の方へよせた設計にし、第一反応部加熱領域と試薬収容部の最短距離は１．５ｍｍにし、第一反応部の加熱領域と第二反応部の最短距離は１．５ｍｍとした以外は実施例１と同様、図４のような配置のチップを用いて行った。
【００８９】
比較例１では、ＰＣＲ反応時、Ａ点における表面の温度を測定したが、ＰＣＲ反応中最大で８７℃に上昇した。
【００９０】
また、第二反応部でインベーダー反応を行った結果、蛍光が検出されＳＮＰの検出ができたが、蛍光増幅曲線を見たところ、ＰＬＡＴＥＡＵに達する時間が１４分であり、実施例１に比べ反応効率低かった。
これは第一反応部におけるＰＣＲ反応時に試薬収容部の温度が上昇し、クリベースが熱により一部失活してしまったためであると思われる。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】本発明の反応容器の一例を示す概要図である。
【図２】本発明の反応容器の一例を示す概要図である。
【図３】本発明の反応容器の一例を示す概要図である。
【図４】本発明の反応容器の一例を示す概要図である。
【図５】本発明の反応容器の一例を示す概要図である。
【図６】本発明の反応容器の一例を示す概要図である。
【符号の説明】
【００９２】
１      反応容器
２      基材
３      試薬収容部
４      反応部
５      反応部の加熱領域
６      試薬収容部と反応部の加熱領域の距離
７      第一反応部
７ａ    貫通孔開口部突出部
７ｂ    底部形成用フィルム
８      第一反応部の加熱領域
９      第ニ反応部
１０      第ニ反応部の加熱領域
１１    試薬収容部と第一反応部の加熱領域の距離
１２    第一反応部の加熱領域と第ニ反応部の距離
２０    加熱部材
Ａ      測定点
【図１】
2007189962.tif 000003
【図２】
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【図３】
2007189962.tif 000005
【図４】
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【図５】
2007189962.tif 000007
【図６】
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