(57)【要約】【課題】  幹細胞に損傷を与えることなく効率的に海綿骨から分離・回収する。【解決手段】  採取された海綿骨にタンパク質分解酵素含有液を作用させ、海綿骨と幹細胞とを接着しているタンパク質を分解する分解ステップＳ１と、幹細胞に物理的または機械的な力を作用させ、海綿骨から幹細胞を分離する分離ステップＳ２とを備える幹細胞分離方法を提供する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
採取された海綿骨にタンパク質分解酵素含有液を作用させ、海綿骨と幹細胞とを接着しているタンパク質を分解する分解ステップと、
幹細胞に物理的または機械的な力を作用させ、海綿骨から幹細胞を分離する分離ステップとを備える幹細胞分離方法。
【請求項２】
分解ステップに先立って、海綿骨内表面を洗浄液で洗浄する洗浄ステップを備える請求項１に記載の幹細胞分離方法。
【請求項３】
採取した海綿骨を収容するカラムと、
タンパク質分解酵素含有液を貯留する酵素液槽と、
該酵素液槽に貯留されているタンパク質分解酵素含有液を前記カラム内に流通させる送液装置とを備える幹細胞分離装置。
【請求項４】
洗浄液を貯留する洗浄液槽を備え、
酵素液槽または洗浄液槽を選択的にカラムに接続する入口側切替弁を備える請求項３に記載の幹細胞分離装置。
【請求項５】
カラムの出口から流出する洗浄液を受ける廃液槽と、
カラムの出口から流出するタンパク質分解酵素含有液を受ける回収槽と、
これら廃液槽と回収槽とを選択的にカラムに接続する出口側切替弁とを備える請求項４に記載の幹細胞分離装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、幹細胞分離方法および幹細胞分離装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、様々なタイプの細胞に分化できる幹細胞は再生医療において中心的な役割を担っており、骨髄液から採取した幹細胞による治療の試みがなされている。しかしながら、骨髄液中に存在する幹細胞は微量であり、大量の骨髄液を採取する必要があるため、採取に伴う患者への負担が大きいという不都合がある。また、採取した骨髄液から遠心分離等によって幹細胞を回収した後に、所定期間にわたって培養することで、移植に必要な細胞数の幹細胞を得る必要がある。
【０００３】
一方、最近の研究の結果、骨内部の組織である海綿骨に大量の幹細胞が存在するという事実が判明した。海綿骨内の幹細胞は骨髄液と比較して約１００倍も存在している。したがって、海綿骨から幹細胞を効率的に採取できれば、採取に伴う患者の負担を低減することができ、また、必要な細胞数を得るのに要する培養期間を短縮できる可能性がある。
従来、海綿骨を利用した技術としては、骨形成性インプラントが知られている（例えば、特許文献１および特許文献２参照。）。
【特許文献１】特開平７−２３９９３号公報
【特許文献２】特表２００４−５０１７１９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１、特許文献２に開示されている技術では、骨形成性インプラントを製造するために、海綿骨を粉砕したり、殺菌処理を行ったりすることで、海綿骨中に存在する幹細胞を死滅させることを前提としており、幹細胞に損傷を与えることなく海綿骨から分離・回収する方法については何ら開示されていない。
【０００５】
海綿骨中に存在する幹細胞を利用できるようにするためには、採取された海綿骨から幹細胞を無傷で分離・回収する方法を開発する必要がある。幹細胞は海綿骨に強く接着していると考えられるため、機械的振動などによる処理では幹細胞を海綿骨から剥離するために高いエネルギを幹細胞に与えてしまい、振動によって幹細胞を損傷させてしまう虞がある。また、海綿骨をリン酸塩緩衝溶液のような流体で洗い流すことで幹細胞を海綿骨から剥離させる手段も考えられるが、機械的振動と同様に、剥離のために幹細胞に高いせん断応力をかけることになり、それによって幹細胞が損傷する虞がある。したがって、物理的あるいは機械的な方法のみでは海綿骨から幹細胞を無傷で分離することは困難である。
【０００６】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、幹細胞に損傷を与えることなく効率的に海綿骨から分離・回収することができる幹細胞分離方法および幹細胞分離装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、採取された海綿骨にタンパク質分解酵素含有液を作用させ、海綿骨と幹細胞とを接着しているタンパク質を分解する分解ステップと、幹細胞に物理的または機械的な力を作用させ、海綿骨から幹細胞を分離する分離ステップとを備える幹細胞分離方法を提供する。
【０００８】
本発明によれば、分解ステップにおいてタンパク質分解酵素含有液を海綿骨に作用させることで、海綿骨と幹細胞とを接着しているタンパク質を分解し、それによって海綿骨から幹細胞を遊離させることができる。その後、分離ステップにおいて、幹細胞に物理的または機械的な力を作用させることにより、分解ステップで海綿骨から遊離されている幹細胞を容易に幹細胞から分離して効率的に回収することが可能となる。タンパク質分解酵素によって海綿骨から遊離させられている状態において、細胞に損傷を与えない程度の機械的または物理的な力を作用させるだけで、海綿骨から幹細胞を容易に分離することができる。したがって、本発明によれば、幹細胞に損傷を与えることなく簡易かつ効率的に海綿骨から分離・回収することができる。
【０００９】
上記発明においては、分解ステップに先立って、海綿骨内表面を洗浄液で洗浄する洗浄ステップを備えることが好ましい。
採取された海綿骨内には血液を始めとする不要成分が存在しているので、洗浄ステップの実施により、洗浄液を供給して洗浄した後に、分解ステップを実施することにより、タンパク質分解酵素によるタンパク質の分解をより効率的に行うことができる。その結果、さらに簡易に海綿骨から幹細胞を分離・回収することが可能となる。
【００１０】
また、本発明は、採取した海綿骨を収容するカラムと、タンパク質分解酵素含有液を貯留する酵素液槽と、該酵素液槽に貯留されているタンパク質分解酵素含有液を前記カラム内に流通させる送液装置とを備える幹細胞分離装置を提供する。
本発明によれば、採取した海綿骨をカラム内に収容し、送液装置を作動させて、酵素液槽内に貯留されているタンパク質分解酵素含有液をカラム内に流通させる。これにより、カラム内に収容されている海綿骨にタンパク質分解酵素が作用させられ、海綿骨と幹細胞とを接着しているタンパク質が分解される。そして、送液装置によってさらにタンパク質分解酵素含有液を流通させ続けることにより、その流動によって海綿骨から幹細胞を剥離させる物理的な力が幹細胞に作用し、幹細胞を海綿骨から容易に分離・回収することが可能となる。
【００１１】
上記発明においては、洗浄液を貯留する洗浄液槽を備え、酵素液槽または洗浄液槽を選択的にカラムに接続する入口側切替弁を備えることが好ましい。
このように構成することで、入口側切替弁の作動により洗浄液槽を選択して、洗浄液槽に貯留されている洗浄液を送液装置によってカラム内に供給し、海綿骨内に付着している血液等の不要成分を洗浄することができる。その後、入口側切替弁を作動させて酵素液槽を選択し、酵素液槽内に貯留されているタンパク質分解酵素含有液をカラム内に供給することにより、洗浄液によって洗浄された幹細胞をより効率的に海綿骨から剥離させ、分離・回収することができる。
【００１２】
また、上記発明においては、カラムの出口から流出する洗浄液を受ける廃液槽と、カラムの出口から流出するタンパク質分解酵素含有液を受ける回収槽と、これら廃液槽と回収槽とを選択的にカラムに接続する出口側切替弁とを備えることが好ましい。
このように構成することで、入口側切替弁の作動によりカラムに洗浄液槽を接続する際には、出口側切替弁の作動によってカラムの出口に廃液槽を接続しておくことで、洗浄液とともにカラムの出口から流出してくる不要成分を廃液槽に回収することができる。また、入口側切替弁によってカラムに酵素液槽を接続する際には、出口側切替弁の作動によってカラムの出口に回収槽を接続しておくことで、タンパク質分解酵素含有液とともにカラムの出口から流出してくる幹細胞を回収槽内に回収することができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、海綿骨内に数多く存在する幹細胞を、損傷を与えることなく簡易かつ効率的に分離・回収することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の第１の実施形態に係る幹細胞分離方法および幹細胞分離装置について、図１〜図４を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る幹細胞分離方法は、図１に示されるように、分解ステップＳ１と分離ステップＳ２とを備えている。分解ステップＳ１は、採取された海綿骨にタンパク質分解酵素含有液を作用させ、海綿骨と幹細胞とを接着しているタンパク質を分解する。分離ステップはＳ２、分解ステップＳ１により、海綿骨から遊離された状態の幹細胞に物理的または機械的な力を作用させ、海綿骨から幹細胞を分離する。
【００１５】
海綿骨にタンパク質分解酵素含有液を作用させる方法は任意でよい。例えば、タンパク質分解酵素含有液内に海綿骨を浸漬させてもよい。また、ピペットやシリンジによってタンパク質分解酵素含有液を海綿骨に吹きかけることにしてもよい。また、以下の実施形態に示される幹細胞分離装置１のように、タンパク質分解酵素含有液を海綿骨の周囲に流通させることにしてもよい。
【００１６】
本実施形態に係る幹細胞分離装置１は、図２に示されるように、採取された海綿骨（ヒトあるいは哺乳動物のもの）を収容するカラム２と、タンパク質分解酵素含有液３を貯留する酵素液槽４と、該酵素液槽４に貯留されているタンパク質分解酵素含有液３をカラム２内に流通させるポンプ（送液装置）５と、カラム２から流出してくるタンパク質分解酵素含有液３および幹細胞の混合液６を回収する回収槽７とを備えている。
【００１７】
カラム２は、入口および出口を有する筒状の容器であって、出口側に約１００〜５００μｍの口径を有する複数の孔を備えたフィルタ（図示略）を有している。フィルタは、タンパク質分解酵素含有液３および幹細胞の通過を許容し、海綿骨粉等の通過を禁止するようになっている。
カラム２の大きさは、例えば、約１〜１０ｍｌ（流路全体で約５〜２０ｍｌ）とするのか好ましい。
【００１８】
酵素液槽４に貯留されているタンパク質分解酵素含有液３としては、例えば、ディスパーゼ溶液（０．０３〜０．１％濃度）、コラゲナーゼ溶液（０．０５〜０．１％濃度）またはトリプシン溶液（０．０５〜０．５％濃度）が挙げられる。
前記ポンプ５は、前記カラム２の入口と酵素液槽４との間に配管によって接続され、例えば、約０．５〜４ｍｌ／ｍｉｎの流速でタンパク質分解酵素含有液３をカラム２内に供給することができるようになっている。
【００１９】
このように構成された本実施形態に係る幹細胞分離装置１の作用について説明する。
本実施形態に係る幹細胞分離装置１により海綿骨から幹細胞を分離するには、採取した海綿骨をカラム２内に投入し、ポンプ５を作動させることによって、酵素液槽４からタンパク質分解酵素含有液３をカラム２内に供給する。
【００２０】
カラム２内には海綿骨が収容されているので、海綿骨の周囲および内部にポンプ５により供給されたタンパク質分解酵素含有液３が流通させられる。海綿骨内には多量の幹細胞がタンパク質によって接着しているが、タンパク質分解酵素含有液３が海綿骨の周囲および内部に流通させられることによって、幹細胞と海綿骨とを接着しているタンパク質が分解され、その接着力が低減される。
【００２１】
そして、タンパク質分解酵素含有液３をカラム２内に流通させ続けることにより、その流れの圧力によって幹細胞に、該幹細胞を海綿骨から剥離させるような物理的な力が作用する。タンパク質分解酵素の働きによってタンパク質による接着力が低減されているので、比較的小さな力によっても幹細胞が海綿骨から剥離し、分離されることになる。
【００２２】
カラム２の出口にはフィルタが配置されているので、分離された幹細胞はフィルタの孔を通過して出口から流出し回収槽７に回収される。一方、海綿骨はフィルタによってカラム２内から出ることを禁止されているので、カラム２内に残る。このようにして、本実施形態に係る幹細胞分離装置１によれば、海綿骨内に存在している幹細胞を、効率的に、しかも、損傷を与えることなく、簡易に分離・回収することができる。
【００２３】
なお、本実施形態においては、タンパク質分解酵素含有液３をカラム２内に流通させることとしたが、タンパク質分解酵素含有液３をカラム２内に流通させる前に、図３および図４に示されるように、洗浄液８によって海綿骨を洗浄することが好ましい（ステップＳ０）。洗浄液８としては、エチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）またはエチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸塩）溶液が挙げられる。
【００２４】
タンパク質分解酵素含有液３の流通に先立って洗浄液８をカラム２内に流通させるには、図４に示されるように、酵素液槽４に代えて洗浄液８を貯留した洗浄液槽９をポンプ５に接続し、回収槽７に代えて廃液槽１０をカラム２の出口に接続する。この状態でポンプ５を作動させ、洗浄液槽９内の洗浄液８をカラム２内に供給し、カラム２の出口から出てくる洗浄液８と海綿骨内の血液等の不要成分との混合液１１を廃液槽１０に回収する。
【００２５】
この後に、図２に示されるように、酵素液槽４をポンプ５に接続し、廃液槽１０に代えて回収槽７をカラム２の出口に接続することにより、上述したように、カラム２の出口から流出してくる幹細胞をタンパク質分解酵素含有液３とともに回収槽７内に回収することができる。この場合に、洗浄ステップＳ０において、海綿骨内の不要成分が洗浄液８によって除去されているので、タンパク質分解酵素によるタンパク質の分解が不要成分によって妨害されることがなく、さらに効率的に行われることになる。
【００２６】
また、回収槽７に回収されたタンパク質分解酵素含有液３と幹細胞との混合液６は、遠心分離処理にかけられることで、タンパク質分解酵素含有液３と幹細胞とに分離され、分離された幹細胞は、培地により洗浄された後に、培養される。
本実施形態に係る幹細胞分離装置１および分離方法によれば、海綿骨内に存在する幹細胞を、損傷を与えることなく効率的に回収できる。したがって、骨髄液から幹細胞を分離回収する場合と比較して、大量の幹細胞を得ることができ、患者にかける負担を低減し、移植に必要な必要細胞数を短期間で取得することができる。
【００２７】
次に、本発明の第２の実施形態に係る幹細胞分離装置２０について、図５および図６を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る幹細胞分離装置２０は、図２および図４に示される第１の実施形態に係る幹細胞分離装置１を組み合わせたものである。
なお、本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係る幹細胞分離装置１と構成を共通とする箇所に同一符号を付して説明を省略する。
【００２８】
本実施形態に係る幹細胞分離装置２０は、酵素液槽４と洗浄液槽９とを第１の三方弁２１を介してポンプ５に接続し、回収槽７と廃液槽１０とを第２の三方弁２２を介してカラム２の出口に接続している。
第１，第２の三方弁２１，２２は、それらに接続されている酵素液槽４または洗浄液槽９、あるいは、回収槽７または廃液槽１０のいずれかを択一的に選択し、ポンプ５あるいはカラム２に接続させることができるようになっている。
【００２９】
例えば、図５に示されるように、第１の三方弁２１により洗浄液槽９が選択されたときには、第２の三方弁２２により、廃液槽１０が選択されるようになっている。また、図６に示されるように、第１の三方弁２１により酵素液槽４が選択されたときには、第２の三方弁２２によって回収槽７が選択されるようになっている。
【００３０】
このように構成された本実施形態に係る幹細胞分離装置２０を用いて海綿骨から幹細胞を分離するには、まず、図５に示されるように、第１の三方弁２１を洗浄液槽９に接続し、第２の三方弁２２を廃液槽１０に接続した状態で、ポンプ５を作動させる。これにより、洗浄液槽９内の洗浄液８がポンプ５によってカラム２内に流通させられる。
【００３１】
洗浄液８は、カラム２内に流入するとカラム２内に収容されている海綿骨の周囲に流通させられて、海綿骨内に存在している血液等の不要成分を洗浄し、カラム２の出口から流出させる。不要成分を洗浄した洗浄液８と不要成分との混合液１１は、カラム２の出口から流出して第２の三方弁２２を介して廃液槽１０に回収される。
【００３２】
このようにして海綿骨を洗浄した後に、第１の三方弁２１を切り替えて、図６に示されるように、ポンプ５を酵素液槽４に接続するとともに、第２の三方弁２２を切り替えてカラム２の出口を回収槽７に接続する。これにより、ポンプ５が作動することによって、酵素液槽４内のタンパク質分解酵素含有液３がカラム２内に流入し、カラム２内に収容されている洗浄された海綿骨の周囲および内部に流通させられる。タンパク質分解酵素含有液３が接触することにより、海綿骨と幹細胞とを接着しているタンパク質が分解され、幹細胞が海綿骨から遊離した状態となる。
【００３３】
この状態で、さらにタンパク質分解酵素含有液３をカラム２内に流通させ続けることにより、流動するタンパク質分解酵素含有液３の圧力によって幹細胞が物理的に押されることにより、海綿骨から剥離させられる。この場合に、幹細胞はタンパク質分解酵素によって海綿骨から遊離した状態とされているので、さほど大きくない押圧力によって海綿骨から剥離することができ、したがって、損傷を受けることなく剥離されることになる。そして、海綿骨から剥離した幹細胞は、フィルタの孔を通過してタンパク質分解酵素含有液３とともにカラム２の出口から流出し、回収槽７によって回収されることになる。回収された幹細胞は、第１の実施形態と同様に処理される。
【００３４】
このように、本実施形態に係る幹細胞分離装置２０によれば、第１の実施形態と同様に、簡易に、幹細胞に損傷を与えることなく、海綿骨から効率的に分離・回収することができる。また、洗浄液槽９と酵素液槽４とを第１の三方弁２１の作動によって容易に切り替えることができ、第１の実施形態よりもさらに簡易に幹細胞を回収することができるという利点がある。
【００３５】
なお、上記各実施形態においては、タンパク質分解酵素含有液の圧力により、幹細胞を海綿骨から剥離させることとしたが、これに代えて、他の機械的あるいは物理的な力、例えば、振動を与えることとしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る幹細胞分離方法を示すフローチャートである。
【図２】本発明の第１の実施形態に係る幹細胞分離装置を示す模式図である。
【図３】図１の幹細胞分離方法の変形例を示すフローチャートである。
【図４】図２の幹細胞分離装置の酵素液槽および回収槽に代えて、洗浄液槽および廃液槽を接続した模式図である。
【図５】本発明の第２の実施形態に係る幹細胞分離装置による洗浄ステップを示す模式図である。
【図６】図５の幹細胞分離装置による分解および分離ステップを示す模式図である。
【符号の説明】
【００３７】
Ｓ０  洗浄ステップ
Ｓ１  分解ステップ
Ｓ２  分離ステップ
１，２０  幹細胞分離装置
２  カラム
３  タンパク質分解酵素含有液
４  酵素液槽
５  ポンプ（送液装置）
７  回収槽
８  洗浄液
９  洗浄液槽
１０  廃液槽
２１  第１の三方弁（入口側切替弁）
２２  第２の三方弁（出口側切替弁）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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