(57)【要約】【課題】一細胞の操作と細胞−細胞間の瞬間的接着により、組織の構築を迅速、かつ的確に行うことができる細胞組織の構築方法および装置を提供する。【解決手段】細胞組織の構築方法において、ビオチン化細胞とアビジン化細胞とを得る工程と、前記細胞の蛍光標識を行うための染色を行う工程と、光ピンセット操作時に前記ビオチン化細胞と前記アビジン化細胞が可視光領域で区別できるように染色を行う工程と、光ピンセットにより、色分けされた前記ビオチン化細胞と前記アビジン化細胞が接合するように配置し、前記ビオチン化細胞と前記アビジン化細胞との強力結合による細胞−細胞間の瞬間接着を行う工程とを施す。よって、ビオチン化細胞とアビジン化細胞とが順次配置された細胞組織を構築することができる。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ビオチン化細胞とアビジン化細胞とを得る工程と、
（ｂ）前記細胞の蛍光標識を行うための染色を行う工程と、
（ｃ）光ピンセット操作時に前記ビオチン化細胞と前記アビジン化細胞が可視光領域で区別できるように染色を行う工程と、
（ｄ）光ピンセットにより、色分けされた前記ビオチン化細胞と前記アビジン化細胞が接合するように配置し、前記ビオチン化細胞と前記アビジン化細胞との強力結合による細胞−細胞間の瞬間接着を行う工程とを施すことを特徴とする細胞組織の構築方法。
【請求項２】
請求項１記載の細胞組織の構築方法において、前記ビオチン化細胞は、ディッシュにコンフルエントになった細胞を燐酸緩衝液で洗浄し、次に細胞ビオチン化試薬を加えてインキュベートし、そのシート状の細胞を剥がした細胞膜タンパク質のアミノ基がビオチン化された浮遊細胞であることを特徴とする細胞組織の構築方法。
【請求項３】
請求項１記載の細胞組織の構築方法において、前記アビジン化細胞は、ビオチン化して浮遊させた細胞懸濁液に燐酸緩衝液に溶かしたアビジンを添加して作製することを特徴とする細胞組織の構築方法。
【請求項４】
請求項１記載の細胞組織の構築方法において、前記（ｂ）工程における染色は、緑の蛍光色素と赤の蛍光色素によることを特徴とする細胞組織の構築方法。
【請求項５】
請求項１記載の細胞組織の構築方法において、前記（ｃ）工程における染色は、ニュートラルレッドによることを特徴とする細胞組織の構築方法。
【請求項６】
（ａ）ビオチン化細胞とアビジン化細胞とを得る手段と、
（ｂ）前記細胞の蛍光標識を行うための染色を行う染色手段と、
（ｃ）光ピンセット操作時に前記ビオチン化細胞と前記アビジン化細胞が可視光領域で区別できるように染色を行う染色手段と、
（ｄ）前記色分けされた前記ビオチン化細胞と前記アビジン化細胞とを接合するように配置する光ピンセット手段と、
（ｅ）該光ピンセット手段により前記ビオチン化細胞と前記アビジン化細胞との強力結合による細胞−細胞間の瞬間接着を行う手段を備えることを特徴とする細胞組織の構築装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞組織の構築方法に係り、特に光ピンセットを用いた細胞−細胞間の瞬間接着による細胞組織の構築方法および装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
組織工学や再生医療研究領域において、厳密な細胞配列を持つ細胞組織を作製することは非常に重要な課題の一つである。近年、この課題に関する研究として注目されているのは、インクジェットプリンタのノズルから細胞を射出することにより、多種類の細胞を複雑なパターンで配列させ、実際の体の中の臓器を模倣したような組織を作るというものである（下記非特許文献１，２，３参照）。このような方法であれば、確かに複数の細胞を高速で配列させることが出来るが、隣同士の細胞はすぐに接着できるわけではないので、細胞間接着が形成されるまで待たなければならない。また、細胞だけを射出することは困難であり、液体やゲルに細胞が包まれた状態で射出されるので、細胞同士を正確に配列できるわけではなく、インクジェットノズルによる細胞の射出自体にも限界が存在する。
【０００３】
一方、光を物体に斜めから入射することで吸引力を生じさせ、物体をトラップする技術はすでに１９９２年に開発された。それ以来、この技術は生細胞にも応用されるようになり、非接触操作による微生物の運動に関する研究や細胞融合の分野で用いられるようになった。そして、このレーザートラッピング技術はこれからの発展が期待されるところである。
【０００４】
また、本発明者らは、既に、アビジン−ビオチン結合による高密度な細胞組織の構築について発表している（非特許文献４参照）。
【０００５】
図６はかかる従来のアビジン−ビオチン結合を利用した細胞接着の工程模式図、図７はそのアビジン−ビオチン結合を利用した細胞接着フローチャートである。
【０００６】
まず、図６（ａ）に示すように、担体１０１上にアビジン１０２を吸着させる（図７のステップＳ１）。一方、図６（ｂ）に示すように、ビオチン１０３を細胞（ハイブリッド型人工肝臓のモデル細胞として知られるヒト肝ガン細胞株：Ｈｅｐ  Ｇ２）１０４に結合させて（図７のステップＳ２）、図６（ｃ）に示すように、アビジン１０２を吸着させた担体１０１にビオチン化した細胞１０４を播種する（図７のステップＳ３）。次に、図６（ｄ）に示すように、１０分後に非接着細胞を洗い流し、担体１０１上に細胞１０４を接着させる（図７のステップＳ４）ようにした。
【０００７】
すなわち、図７に示すように、（１）まず、担体上にアビジンを吸着させる（ステップＳ１）。（２）ビオチンを細胞に結合させる（ステップＳ２）。（３）アビジンを吸着させた担体にビオチン化した細胞を播種する（ステップＳ３）。（４）次に、１０分後に非接着細胞を洗い流し、担体上に細胞を接着させる（ステップＳ４）。
【非特許文献１】Ｖｌａｄｉｍｉｒ  Ｍｉｒｏｎｏｖ  ｅｔ．ａｌ.,“Ｏｒｇａｎ  ｐｒｉｎｔｉｎｇ：ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ａｉｄｅｄ  ｊｅｔ−ｂａｓｅｄ  ３Ｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”，ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４，ｐｐ．１５７−１６１，Ａｐｒｉｌ，２００３  １５７−１６１
【非特許文献２】Ｅ．Ａ．Ｒｏｔｈ  ｅｔ．ａｌ.,“Ｉｎｋｊｅｔ  ｐｒｉｎｔｉｎｇ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｃｅｌｌ  ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ”，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２５（２００４），ｐｐ．３７０７−３７１５
【非特許文献３】Ｔａｏ  Ｘｕ  ｅｔ．ａｌ.,“Ｉｎｋｊｅｔ  ｐｒｉｎｔｉｎｇ  ｏｆ  ｖｉａｂｌｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ”，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２６（２００５），ｐｐ．９３−９９
【非特許文献４】「生産研究」，第５７巻，第２号，発行所  東京大学生産技術研究所，２００５．３月１日発行，ｐｐ．１３−１５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上記した従来のアビジン−ビオチン結合を利用した細胞接着は、図８に示すように、担体２０１上で細胞２０２を作製するようにしており、その場合には、細胞２０２が、まず担体２０１に接着し、その後に（細胞増殖を伴って）細胞同士が接着するために、単純なシート状の組織を作製するのにも、数日間待つ必要がある。
【０００９】
さらに、体内に移植するなど、再生医療的応用の際には、担体２０１と細胞２０２を剥がす手間がかかる。生分解性の担体を用いたとしても、担体の消化には時間がかかるといった問題があった。
【００１０】
また、細胞組織を自在に形成するためには、「一細胞の操作」と「細胞−細胞間の瞬間的接着」を行う必要があるが、十分な成果を挙げられていないのが現状である。
【００１１】
本発明は、上記状況に鑑みて、一細胞の操作と細胞−細胞間の瞬間的接着により、組織の構築を迅速、かつ的確に行うことができる細胞組織の構築方法および装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、上記目的を達成するために、
〔１〕細胞組織の構築方法において、ビオチン化細胞とアビジン化細胞とを得る工程と、前記細胞の蛍光標識を行うための染色を行う工程と、光ピンセット操作時に前記ビオチン化細胞と前記アビジン化細胞が可視光領域で区別できるように染色を行う工程と、光ピンセットにより、色分けされた前記ビオチン化細胞と前記アビジン化細胞が接合するように配置し、前記ビオチン化細胞と前記アビジン化細胞との強力結合による細胞−細胞間の瞬間接着を行う工程とを施すことを特徴とする。
【００１３】
〔２〕上記〔１〕記載の細胞組織の構築方法において、前記ビオチン化細胞は、ディッシュにコンフルエントになった細胞を燐酸緩衝液で洗浄し、次に細胞ビオチン化試薬を加えてインキュベートし、そのシート状の細胞を剥がした細胞膜タンパク質のアミノ基がビオチン化された浮遊細胞であることを特徴とする。
【００１４】
〔３〕上記〔１〕記載の細胞組織の構築方法において、前記アビジン化細胞は、ビオチン化して浮遊させた細胞懸濁液に燐酸緩衝液に溶かしたアビジンを添加して作製することを特徴とする。
【００１５】
〔４〕上記〔１〕記載の細胞組織の構築方法において、前記（ｂ）工程における染色は、緑の蛍光色素と赤の蛍光色素によることを特徴とする。
【００１６】
〔５〕上記〔１〕記載の細胞組織の構築方法において、前記（ｃ）工程における染色は、ニュートラルレッドによることを特徴とする。
【００１７】
〔６〕細胞組織の構築装置において、ビオチン化細胞とアビジン化細胞とを得る手段と、前記細胞の蛍光標識を行うための染色を行う染色手段と、光ピンセット操作時に前記ビオチン化細胞と前記アビジン化細胞が可視光領域で区別できるように染色を行う染色手段と、前記色分けされた前記ビオチン化細胞と前記アビジン化細胞とを接合するように配置する光ピンセット手段と、この光ピンセット手段により前記ビオチン化細胞と前記アビジン化細胞との強力結合による細胞−細胞間の瞬間接着を行う手段を備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、一細胞の操作と細胞−細胞間の瞬間的接着により、組織の構築を迅速、かつ的確に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の細胞組織の構築方法は、ビオチン化細胞とアビジン化細胞とを得る工程と、前記細胞の蛍光標識を行うための染色を行う工程と、光ピンセット操作時に前記ビオチン化細胞と前記アビジン化細胞が可視光領域で区別できるように染色を行う工程と、光ピンセットにより、色分けされた前記ビオチン化細胞と前記アビジン化細胞が接合するように配置し、前記ビオチン化細胞と前記アビジン化細胞との強力結合による細胞−細胞間の瞬間接着を行う工程とを施す。
【実施例】
【００２０】
以下、本発明の実施態様について詳細に説明する。
【００２１】
〔Ａ〕まず、細胞のビオチン化とアビジン化の工程について説明する。
【００２２】
（１）ビオチン化された浮遊細胞を得る工程（図１参照）
細胞としてはヒト肝ガン細胞株であるＨｅｐ  Ｇ２細胞を用いた。まず、図１（ａ）に示すように、細胞をビオチン化するために、ディッシュ１にＨｅｐ  Ｇ２細胞２を播種し、増殖させてコンフルエントする。次に、図１（ｂ）に示すように、その細胞２を燐酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄する。次に、図１（ｃ）に示すように、市販の細胞ビオチン化試薬（ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ｂｉｏｔｉｎ，ＰＩＥＲＣＥ）３を加え、図１（ｄ）に示すように、３７℃で３０分インキュベートする。この細胞２をトリプシンでディッシュ１から剥がすことで、図１（ｅ）に示すように、細胞膜タンパク質のアミノ基がビオチン化された浮遊細胞４を得ることができた。
【００２３】
（２）アビジン化された浮遊細胞を得る工程（図２参照）
まず、図２（ａ）に示すように、ビオチン化して浮遊させた細胞懸濁液１１を用意する。
【００２４】
次に、図２（ｂ）に示すように、その細胞懸濁液１１に燐酸緩衝液（ＰＢＳ）１２に溶かしたアビジン１３を添加して、図２（ｃ）に示すようなアビジン化された浮遊細胞１４を作製する。余剰のアビジンは細胞を遠心して上清を取り除く操作を２回行うことで取り除く。
【００２５】
〔Ｂ〕次に、アビジン化細胞とビオチン化細胞の蛍光標識を行うための染色の工程について説明する。
【００２６】
アビジン化細胞をＰＫＨ６７（緑の蛍光色素、ＳＩＧＭＡ社製）で、ビオチン化細胞をＰＫＨ２６（赤の蛍光色素、ＳＩＧＭＡ社製）で、それぞれの試薬ごとの染色方法に従って染色を行う。
【００２７】
〔Ｃ〕光ピンセット操作時に前記ビオチン化細胞と前記アビジン化細胞が区別できるように染色を行う工程；ニュートラルレッド（ＳＩＧＭＡ社製）によるビオチン化細胞の染色を行う工程について説明する。
【００２８】
光ピンセット使用時は、同時に蛍光観察ができないため、アビジン化細胞集団とビオチン化細胞集団を区別することができない。そこで、ビオチン化細胞集団のみ、ニュートラルレッド（ＳＩＧＭＡ社製）による染色を行う。これにより、ビオチン化細胞を可視光領域でアビジン化細胞と区別することができる。
【００２９】
〔Ｄ〕次に、ビオチン化細胞とアビジン化細胞の光ピンセットによる操作について説明する。
【００３０】
光ピンセットとしては、レーザーシステム（シグマ光機製）と、顕微鏡（オリンパス製）を使用した。
【００３１】
そこで、図３に示すように、光ピンセット２２で、ディッシュ２１に播種された、ビオチン化細胞２３（ニュートラルレッドによる染色）とアビジン化細胞２４とを操作して配列させてビオチン化細胞２３とアビジン化細胞２４との強力結合（ＡＢ反応）による細胞−細胞間の瞬間接着を行わせた。
【００３２】
このように、染色されてそれぞれ区別されたビオチン化細胞２３とアビジン化細胞２４とを一細胞ずつ操作して、ビオチン化細胞２３とアビジン化細胞２４とを配列して細胞−細胞間の瞬間的接着を可能とする技術として、図４に示すように、生体分子アビジンとビオチンの強力な結合反応（ＡＢ反応）を用いることにより、細胞組織３１を構築することができた。
【００３３】
なお、光ピンセットで配列させた細胞組織の観察には、共焦点顕微鏡（オリンパス）２５を使用した。
【００３４】
そして、試験の結果、細胞をアビジン化、もしくはビオチン化し、蛍光色素とニュートラルレッドで染色することで、位相差顕微鏡、共焦点顕微鏡のどちらでも、二種類の細胞を区別することができた。このような細胞をグラスボトムディッシュ内に適当な密度で浮遊させ、光ピンセットを用いて、アビジン化細胞とビオチン化細胞を交互にならべることを試みた。アビジン１分子はビオチン４分子と結合することができる。細胞を配列させた後に共焦点顕微鏡で細胞組織を観察したところ、図５に示すように、緑色の細胞と赤色の細胞が交互に並んでいることが観察できた。
【００３５】
このような結果から、ビオチン化細胞とアビジン化細胞の前処理と細胞の厳密な配列を可能とする光ピンセット操作と細胞−細胞間の瞬間接着技術であるＡＢ反応技術を用いることで、複雑な細胞配列を持つ細胞組織を作製できた。
【００３６】
ＡＢ反応による接着によって、細胞毒性が生じるという懸念があるが、これまでの実験から、細胞の増殖やタンパク質の分泌、遺伝子発現の誘導、細胞膜受容体によるシグナル伝達などにおいて、ほとんど機能阻害が見られない。
【００３７】
また、本発明の細胞組織の構築装置は、上記したように、ビオチン化細胞とアビジン化細胞とを得る手段と、前記細胞の蛍光標識を行うための染色を行う染色手段と、光ピンセット操作時に前記ビオチン化細胞と前記アビジン化細胞が可視光領域で区別できるように染色を行う染色手段と、前記色分けされた前記ビオチン化細胞と前記アビジン化細胞とを接合するように配置する光ピンセット手段と、この光ピンセット手段により前記ビオチン化細胞と前記アビジン化細胞との強力結合による細胞−細胞間の瞬間接着を行う手段を備える。
【００３８】
なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨に基づいて種々の変形が可能であり、これらを本発明の範囲から排除するものではない。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明の細胞組織の構築方法および装置は、組織工学・再生医療の分野へ利用可能である。例えば、肝臓に存在する肝細胞や類洞内皮細胞、星細胞などを、うまく配合させることで、実際の肝臓に近い配列と機能を持つ人工肝臓組織を作製できる。作製された人工的な肝臓組織は、薬剤スクリーニングに非常に有用であると考えれれ、出来上がった組織を移植できれば、医療的な貢献も可能である。その他の臓器などに関しても、作製が可能と考えられる。また、ＥＳ細胞から分化させた細胞集団を適切に組み合わせることで、発生途中の臓器に似た組織を作ることも可能と考えている。発生において、このような組織は自律的に増殖・自己組織化を経て成熟した臓器が完成するが、このような自律的増殖・自己組織化を引き起こすことが出来るような、最低限の細胞組織を作るためには、細胞の配列を厳密に制御できる本発明が必要不可欠である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明の実施例を示すビオチン化された浮遊細胞を得る工程図である。
【図２】本発明の実施例を示すアビジン化された浮遊細胞を得る工程図である。
【図３】本発明の実施例を示すビオチン化細胞とアビジン化細胞の光ピンセットによる操作状況を示す図である。
【図４】本発明の実施例を示すビオチン化細胞とアビジン化細胞の生体分子アビジンとビオチンの強力な結合反応（ＡＢ反応）により細胞組織が構築された状態を示す図である。
【図５】本発明によって細胞を配列させた後に共焦点顕微鏡で細胞組織を観察した図である。
【図６】従来のアビジン−ビオチン結合を利用した細胞接着の工程模式図である。
【図７】従来のアビジン−ビオチン結合を利用した細胞接着フローチャートである。
【図８】従来のアビジン−ビオチン結合を利用した細胞接着の説明図である。
【符号の説明】
【００４１】
１，２１    ディッシュ
２    細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）
３    市販の細胞ビオチン化試薬
４    ビオチン化された浮遊細胞
１１    ビオチン化して浮遊させた細胞懸濁液
１２    燐酸緩衝液（ＰＢＳ）
１３    アビジン
１４    アビジン化された浮遊細胞
２２    光ピンセット
２３    ビオチン化細胞（ニュートラルレッドによる染色）
２４    アビジン化細胞
２５    共焦点顕微鏡
３１    細胞組織
【図１】
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【図２】
2007189998.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
2007189998.tif 000008
【図８】
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【図５】
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