(57)【要約】【課題】  従来の方法よりもコストの低い、そして熱生成の低い、１０数ナノスケール程度の小型の導体および／または半導体の装置を製造するための新たな方法を提供することを目的の１つとする。【解決手段】  本発明は、複数のＴＲＡＰモノマーの遺伝子組換え融合分子から形成された改変されたＴＲＡＰタンパク質であって、当該融合分子が、２、３、または４個の野生型ＴＲＡＰモノマー等価物からなる、改変されたＴＲＡＰタンパク質を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のＴＲＡＰモノマーの遺伝子組換え融合分子から形成された改変されたＴＲＡＰタンパク質であって、当該融合分子が、２、３、または４個の野生型ＴＲＡＰモノマー等価物からなる、改変されたＴＲＡＰタンパク質。
【請求項２】
前記融合分子が、３または４個の野生型ＴＲＡＰモノマー等価物からなる、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
１２個の野生型ＴＲＡＰモノマーの等価物を含むリングを形成する、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記融合分子中の前記野生型ＴＲＡＰモノマーが、リンキングペプチドによって連結されている、請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項５】
前記ＴＲＡＰタンパク質の遺伝子が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来する、請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載される改変されたＴＲＡＰタンパク質の複数のコピーから形成されるナノチューブであって、前記改変されたＴＲＡＰタンパク質が、整列して積み重なってチューブを形成している、ナノチューブ。
【請求項７】
格子定数：ａ＝１１０±２Å、ｂ＝１１０±２Å、およびｃ＝３６±２Åを有し、空間群Ｐ４２１２において結晶化している、請求項２に記載のタンパク質の結晶。
【請求項８】
前記ＴＲＡＰタンパク質が、整列して積み重なって、密に充填された、直線状のナノチューブを形成している、請求項６に記載のナノチューブの結晶。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質、または請求項６に記載のナノチューブを含んでなる、バイオミネラリゼーション容器。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質および金属を含む、量子ドット。
【請求項１１】
請求項６のナノチューブおよび金属を含む、ナノワイヤ。
【請求項１２】
複数のＴＲＡＰモノマーの遺伝子組換え融合分子から形成される改変されたＴＲＡＰタンパク質、または当該改変されたＴＲＡＰタンパク質の複数のコピーから形成されるナノチューブを作製する方法であって、
複数のＴＲＡＰモノマー遺伝子を含む遺伝子構築物を調製する工程、
大腸菌細胞において前記遺伝子構築物を発現して、ＴＲＡＰモノマーの遺伝子組換え融合分子を生成する工程、および
発現された前記融合分子を精製する工程、
を包含する、方法。
【請求項１３】
前記ＴＲＡＰタンパク質の遺伝子が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項６に記載のナノチューブをフォトリソグラフィーのマスクとして使用する工程を包含する、超薄型半導体ワイヤまたはスイッチを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鋳型および／または反応容器として使用するための改変されたＴＲＡＰタンパク質、およびそのようなタンパク質を作製するための方法に関する。特に、本発明は、細菌ＴＲＡＰタンパク質の性質を、それらが、有用な対称性を有するリング様構造、ならびにそのキャビティが電子装置において使用するためのナノ粒子（例えば、量子ドット）およびナノワイヤの製造のための反応容器として使用することができるチューブ構造を形成し得るように変化させる、細菌ＴＲＡＰタンパク質の改変に関する。
【背景技術】
【０００２】
継続する半導体装置の小型化は、より速く、より強力なコンピュータ、および技術全体の継続する発展を可能にする望ましい傾向である。ナノスケールの電子装置を構築するにおいて使用される現在の方法は、代表的には、構成要素が、短い波長の電磁放射線を使用してシリコンウエハからエッチングされるリソグラフィーに依存する。この方法では、二酸化シリコン、ポリシリコン、およびフォトレジストの層が、正にドープされたシリコンウエハ表面上に積層される。フォトマスクがフォトレジストの上に置かれる。表面は、特定のパターンに従って表面のフォトマスク遮蔽部品を使用して電磁放射線に曝露される。次いで、放射線への曝露によって改変されたフォトレジストおよび改変されたまたは改変されていないフォトレジストのいずれかが、除去され得る。
【０００３】
この技術に伴う問題点は、最終産物における過剰な電力消費および熱生成、２次元の部品（または構成要素）のみ産生できる能力、使用される光の波長に起因する作製される構成要素のサイズの根本的な制限、使用されるフォトマスクの寸法における制限、ならびに費用集約型の製造方法を含む。小型化のトレンドを継続するためには、新たな方法が、より小さな部品を構築するために使用されなければならず、最終的には熱生成の問題が取り組まれなければならない。
【０００４】
他方、細菌のタンパク質を使用して金のナノドットを作製することについての報告もある（例えば、ＭｃＭｉｌｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｍａｔｅｒ  １，  ２４７−２５２，  ２００２：非特許文献１）。
【非特許文献１】ＭｃＭｉｌｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｍａｔｅｒ  １，  ２４７−２５２，  ２００２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のような状況下で、上記の問題点のいくつかまたは全てを解決する小型の（例えば、１０数ナノメータのサイズ範囲の）電気装置を作製する新たな方法が求められている。
【０００６】
特に、従来の方法よりもコストの低い、そして熱生成の低い、そのような小型の導体および／または半導体装置を製造するための新たな方法が求められている。
【０００７】
寸法が加減され得るそのような小型の導体および／または半導体装置を製造することもまた、求められている。
【０００８】
そのような小型の装置を製造するために使用され得る材料、およびそのような装置を製造するためのさらに有用な鋳型を作製するために改変し得る材料もまた、求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記を鑑みて、本発明は以下を提供する。
（１）複数のＴＲＡＰモノマーの遺伝子組換え融合分子から形成された改変されたＴＲＡＰタンパク質であって、当該融合分子が、２、３、または４個の野生型ＴＲＡＰモノマー等価物からなる、改変されたＴＲＡＰタンパク質。
（２）上記融合分子が、３または４個の野生型ＴＲＡＰモノマー等価物からなる、上記（１）に記載のタンパク質。
（３）１２個の野生型ＴＲＡＰモノマーの等価物を含むリングを形成する、上記（１）または（２）に記載のタンパク質。
（４）上記融合分子中の上記野生型ＴＲＡＰモノマーが、リンキングペプチドによって連結されている、上記（１）〜（３）のいずれかに記載のタンパク質。
（４ａ）上記リンキングペプチドがＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｍｅｔからなる、上記（４）に記載のタンパク質。
（５）上記ＴＲＡＰタンパク質の遺伝子が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来する、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のタンパク質。
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載される改変されたＴＲＡＰタンパク質の複数のコピーから形成されるナノチューブであって、上記改変されたＴＲＡＰタンパク質が、整列して積み重なってチューブを形成している、ナノチューブ。
【００１０】
（７）格子定数：ａ＝１１０±２Å、ｂ＝１１０±２Å、およびｃ＝３６±２Åを有し、空間群Ｐ４２１２において結晶化している、上記（２）に記載のタンパク質の結晶。
（８）上記ＴＲＡＰタンパク質が、整列して積み重なって、密に充填された、直線状のナノチューブを形成している、上記（６）に記載のナノチューブの結晶。
【００１１】
（９）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のタンパク質、または上記（６）に記載のナノチューブを含んでなる、バイオミネラリゼーション容器。
（１０）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のタンパク質および金属を含む、量子ドット。
（１０ａ）上記金属が、上記改変されたＴＲＡＰタンパク質のリングの中央キャビティに捕捉されている、上記（１０）に記載の量子ドット。
（１０ｂ）上記金属が金である、上記（１０）または（１０ａ）に記載の量子ドット。
【００１２】
（１１）上記（６）のナノチューブおよび金属を含む、ナノワイヤ。
（１１ａ）上記金属が、上記改変されたＴＲＡＰタンパク質のリングの中央キャビティに捕捉されている、上記（１１）に記載のナノワイヤ。
（１１ｂ）上記金属が金である、上記（１１）または（１１ａ）に記載のナノワイヤ。
【００１３】
（１２）ＴＲＡＰモノマーの複数の遺伝子組換え融合分子から形成される改変されたＴＲＡＰタンパク質、または上記改変されたＴＲＡＰタンパク質の複数のコピーから形成されたナノチューブを作製する方法であって、
複数のＴＲＡＰモノマーを含む遺伝子構築物を調製する工程、
培養細胞において上記遺伝子構築物を発現して、ＴＲＡＰモノマーの遺伝子組換え融合分子を生成する工程、および
発現された上記融合分子を精製する工程、
を包含する、方法。
（１２ａ）上記培養細胞が大腸菌細胞である、上記（１２）に記載の方法。
（１３）上記ＴＲＡＰタンパク質の遺伝子は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来する、上記（１２）に記載の方法。
（１３ａ）上記融合分子が自己会合して１２員環のＴＲＡＰリングになる、上記（１２）
に記載の方法。
（１４）上記（６）に記載のナノチューブをフォトリソグラフィーのマスクとして使用する工程を包含する、超薄型半導体ワイヤまたはスイッチを製造する方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、従来の技術を使用して現在可能であるものよりも非常に小さい寸法のトランジスタおよび電子部品を作製するために使用され得る量子ドット（図６を参照）およびナノワイヤの製造を可能にする。
【００１５】
本発明の改変されたＴＲＡＰリングの中央の孔（またはキャビティ）の直径は、約３０Å程度の小さいものであり得る。本発明のＴＲＡＰリングのこの小さい直径は、半導体産業によって現在製造し得る部品のサイズよりも小さい。寸法が小さいことにより、より速いコンピュータ装置が導かれ得る。なぜなら、電子が移動しなければならない距離が減少し、そしてまた所定の領域に組み込まれ得る部品の数が増えるからである。このような小さなサイズを有することにより、このような部品がより少ない電子を使用して作動可能となる。サイズ、および部品どうしの間の空間が十分に小さい場合、電子１個のみを使用しての作動が可能になり、したがって、部品当たりの熱出量がかなり減少する。
【００１６】
さらに、タンパク質が自己会合する能力を有することは、現在の製造技術に対してコストの面で明確な有利点を提供する。
【００１７】
さらに、本発明の改変されたＴＲＡＰタンパク質は、寸法が改変され得、そして対称性が変更し得るバイオミネラリゼーションのためのケージタンパク質を提供するため、表面上に密接かつ規則正しく充填された量子ドットをより良く生成することができる。このようなドットは、現在使用されているものよりも小さい寸法のフォトマスクとして、または直接的に電子伝達装置の部品として使用され得る。
【００１８】
さらに、量子ドットが互いに十分に近く配置されると、それらは提唱される量子計算装置の重要な構成要素である単一の電子トランジスタとして使用され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（改変されたＴＲＡＰタンパク質）
本発明の１つの局面において、複数のＴＲＡＰモノマーの遺伝子組換え融合分子から形成される、改変されたＴＲＡＰタンパク質が提供される。上記融合分子は、少なくとも２つの野生型ＴＲＡＰモノマー等価物からなる。
【００２０】
本明細書中で使用される用語「ＴＲＡＰ」は、細菌のｔｒｐ  ＲＮＡ−結合減弱タンパク質（ｔｒｐ  ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＴＲＡＰ）のことをいう。ＴＲＡＰタンパク質が由来し得る細菌は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｉｓを含む。とりわけ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓが、本発明において使用するためのＴＲＡＰ遺伝子またはＴＲＡＰタンパク質の最も好ましい由来である。野生型ＴＲＡＰタンパク質は、代表的には、１１個のモノマーサブユニットからなる。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＴＲＡＰタンパク質およびそれをコードする遺伝子に関する配列情報は、例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔのような公に利用可能な配列データベースから、Ｑ９Ｘ６Ｊ６のアクセッション番号で得ることができる。他の細菌ＴＲＡＰタンパク質に関する配列情報もまた、公に利用可能な配列データベースから入手可能である。天然のＴＲＡＰタンパク質に関する構造情報は、Ｐｔｏｔｅｉｎ  ＤａｔａＢａｎｋから、アクセッションコード１ＱＡＷ、１Ｃ９Ｓ、１ＧＴＦ、１ＵＴＤ、１ＵＴＦ、および１ＵＴＶで利用可能である。
【００２１】
ＴＲＡＰモノマーの融合分子は、遺伝子工学の慣用技術を使用して作製され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）。本発明において使用されるＴＲＡＰモノマーの融合分子は、少なくとも２つの野生型ＴＲＡＰモノマーからなる。本発明の１つの実施形態において、融合分子は、３または４個の野生型ＴＲＡＰモノマー等価物からなる。融合分子は、自己会合して、３または４個の融合分子からなる１２員環ＴＲＡＰリングを形成し、その結果、そのリングは、天然に存在する一般的な１１員環のリングではなく、１２個の野生型モノマーサブユニットの等価物からなる。本発明者らのＴＲＡＰ３およびＴＲＡＰ４のＸ線結晶構造は、この１２マーリングの構造を原子の詳細にわたって示す。
【００２２】
この１２員環は、２次元において規則正しい、密に充填したアレイを形成しやすくなるような対称性の利点を有する。そして、それが３または４個の融合タンパク質からできているため、不均一に変異させることができる。異なるサイズのリングキャビティが必要であれば、異なる数（例えば、５、７、または８個）のＴＲＡＰモノマーを融合させることによって可能になる。
【００２３】
３または４個の野生型ＴＲＡＰモノマー等価物からなる本発明のＴＲＡＰ融合分子は、密に、規則正しく充填した量子ドットを表面上に作製するために適切な対称性を有するバイオミネラリゼーションのためのケージタンパク質を提供する。このような量子ドットは、導体材料をＴＲＡＰリングの中央のコアにおいて鉱化する（ｍｉｎｅｒａｌｉｚｅ）ことによって作製することができる。量子ドットは、現在使用されているものよりも小さい寸法のフォトマスクとして、または直接的に電子伝達装置の部品として使用され得る。このような目的に使用され得る導体材料には、金、銀、白金、鉄、およびカドミウムが含まれる。とりわけ、金が最も好ましい。
【００２４】
本発明の別の局面において、本発明は、上記の改変されたＴＲＡＰタンパク質の複数のコピーから形成されるナノチューブを提供する。本発明は、長いチューブを形成するように積み重なった改変されたＴＲＡＰタンパク質を利用する。このチューブは、その中央のコアにおいて導体材料を鉱化することによってナノワイヤを作製するために使用される。この目的に使用され得る導体材料には、金、銀、白金、鉄、およびカドミウムが含まれる。とりわけ、金が最も好ましい。したがって、本発明は、小さい直径（約１０〜２０ｎｍ）のナノワイヤの作製を可能にする。
【００２５】
（改変されたＴＲＡＰタンパク質を作製する方法）
本発明の別の局面において、ＴＲＡＰモノマーの複数の遺伝子組み換え融合分子から形成される改変されたＴＲＡＰタンパク質を作製する方法、およびこの改変されたＴＲＡＰタンパク質の多数のコピーから形成されるナノチューブを作製する方法が提供される。この方法は、多数のＴＲＡＰモノマー遺伝子を含む遺伝子構築物を調製する工程；この遺伝子構築物を培養細胞中で発現して、ＴＲＡＰモノマーの遺伝子組み換え融合分子を生成する工程；および発現された融合分子を精製する工程を包含する。
【００２６】
上記遺伝子構築物は、遺伝子工学の分野で周知の手順に本質的に従って、細菌ＴＲＡＰ、好ましくは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＴＲＡＰをコードする遺伝子を使用して調製され得る。本発明において使用され得る他の細菌ＴＲＡＰ遺伝子には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｉｓのＴＲＡＰ遺伝子が含まれる。培養細胞としては、大腸菌細胞が好ましい。本発明の目的に使用し得る他の培養細胞には、酵母が含まれる。インビトロシステムもまた使用し得る。
【００２７】
遺伝子構築物の調製の１つの例は、図１を参照して記載される。図１は、多数のＴＲＡＰ遺伝子の構築の模式図を示す。Ａ）開始プラスミドにおいて、野生型Ｂａｓｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＴＲＡＰモノマーをコードする遺伝子が、発現プラスミドｐＥＴ２１ｂのＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位にクローニングされる。このプラスミドを変異させ、Ｂ）におけるＮ末端のＮｄｅＩ部位が除去されたプラスミドＡを形成し、ＳＴＯＰコドンが配列ＧＣＣと置換され、Ｃ末端のＢａｍＨＩ部位がＮｄｅＩ部位と置換され、Ｃ）において、Ｃ末端のＢａｍＨＩ部位がＮｄｅＩ部位と置換される。両方のプラスミドは、ＮｄｅＩで消化されて、Ｃ末端で線状化されたＴＲＡＰ遺伝子の１つのコピーを含有するＤ）のプラスミドを得、Ｅ）で、両方の末端においてＮｄｅＩ部位で消化されたＴＲＡＰ遺伝子をコードするＤＮＡの線状片を得る。これらの２つの生成物を精製し、ライゲーションすることによって、中央のＮｄｅＩ部位を有するＴＲＡＰ遺伝子の２つのコピーを含有するＦ）のプラスミドを得る。中央のＮｄｅＩ部位を、リンキング配列ＧＣＣＧＣＣＡＴＧで置換して、２つのＴＲＡＰモノマー遺伝子の融合物からなる新規な遺伝子をコードするＧ）のプラスミドを得る。このプラスミドのさらなる変異は、Ｎ末端配列およびＣ末端配列をＡ）におけるそれらの配列に戻すことができ、次いで、このプロセスがＴＲＡＰ遺伝子のさらなるコピーを追加するために繰り返され得る。
【００２８】
発現された融合分子の精製は、代表的には、イオン交換カラム（例えば、Ｑ−セファローズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を、例えば、ＮａＣｌの０ｍＭから１Ｍ  ＮａＣｌの上昇勾配を使用して行い得る。発現された分子は、必要に応じて、例えば、ヘパリンセファローズカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のようなアフィニティーカラム、および／またはＨｉＬｏａｄ  ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のようなゲルろ過カラムを用いて、さらに精製され得る。
【００２９】
本発明の改変されたＴＲＡＰタンパク質の結晶化は、当該分野で周知の慣用的な結晶化方法に従って、行い得る。このような結晶化方法には、シッティングドロップ蒸気拡散法、ハンギングドロップ蒸気拡散法、サンドイッチドロップ法、バッチ法、マイクロバッチ法、アンダーオイル法、マイクロ透析法、および自由界面拡散法が含まれる。本発明の目的には、蒸気拡散法が好ましく、そしてハンギングドロップ蒸気拡散法が最も好ましい。
【００３０】
簡単には、ハンギングドロップ法において、結晶化試薬と混合したサンプルの小さな液滴（０．１〜４０μｌ）が、その試薬での蒸気平衡下でリザーバの上に反転されたシリコン処理をしたカバーガラススライド上に置かれる。液滴中の最初の試薬の濃度は、リザーバ中の濃度よりも低い。時間と共に、リザーバは液滴から水分を引くため、液滴とリザーバとの間で平衡が存在するようになる。この平衡化プロセスの間に、サンプルもまた濃縮され、液滴中のサンプルの相対的過飽和を増大させる。
【００３１】
サンプル液滴中のタンパク質の濃度は、約１〜２０ｍｇ／ｍｌであり得る。サンプル液滴は、サンプル液滴のｐＨを約９〜１０に保つために、ＣＡＰＳまたはＴｒｉｓのような緩衝剤を、５０ｍＭと１００ｍＭとの間の濃度で含み得る。サンプル液滴はまた、種々の分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような沈降剤を含有してもよい。とりわけ、本発明にはＰＥＧ３００が最も好ましい。結晶化は通常、４〜２５℃で行われ、そして結晶は、例えば、数日または数週間後に得ることができる。
【００３２】
本発明の別の局面において、同じ改変された細菌タンパク質を用いて、結晶中でナノリングまたはナノチューブを作製し、量子ドットまたはナノワイヤを作製するための鋳型を提供する方法が提供される。
【００３３】
本発明の１つの実施形態において、ＴＲＡＰ３およびＴＲＡＰ４の構造（図３を参照）は、野生型ＴＲＡＰモノマーとほとんど同一の３次元構造を示す。ＴＲＡＰ３およびＴＲＡＰ４によって形成されるリングは、本質的にサイズが同一であり、直径３１．１Å（相対するＳｅｒ７  Ｃαどうしの間）の中央の孔を有し、リングの高さ（Ｌｙｓ４０  ＣαとＡｓｐ２９  Ｃαとの間）は３１．８Åであり、そして全体の直径（相対するＧｌｙ１８  Ｃαどうしの間）は８１．０Åである。これに対して、野生型の構造は、それぞれ、２７．７Å、３２．１Å、および７７．０Åである。リング構造のこのような寸法は、そこに含まれるモノマーの数に依存して様々であり得ることが理解される。
【００３４】
ＴＲＡＰ３およびＴＲＡＰ４のモノマーは、それぞれ３および４個の野生型モノマー等価物から構築され、そしてドメインどうしは、図４に示すようにリンキングペプチド鎖で結合されている。本明細書中で、用語「モノマー等価物」は、融合タンパク質が野生型モノマーに対応するポリペプチドを含むだけでなく、リンキングペプチドも含んでいることを意味するために用いられる。
【００３５】
図４は、融合タンパク質内のモノマー等価物どうしの間の推定の結合を示す模式図を示す。図において、モノマー等価物は、青のブロックで示される。ＮおよびＣ末端等価物は、ＮおよびＣとそれぞれ示されている。野生型モノマータンパク質において、ＮおよびＣ末端の残基は、リングの反対の面にあって、Ｎ末端残基がキャビティの内部に向いており、Ｃ末端残基は、リングの外側表面にある可能性が高い。野生型構造における最後の視認可能なＮ末端残基とＣ末端残基（それぞれＳｅｒ５およびＬｙｓ７３）との間の距離は、３７．８Åであり、アミノ酸鎖の方向は、残基１とＣ末端残基７４との間の実際の距離は、これよりも大きいことを示唆する。構築されたタンパク質において、アミノ酸のループ（赤のラインで示す；構造中では視認不可能）は、示されるようにモノマー等価物を連結しなければならない。
【００３６】
図５は、Ａ）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の野生型ＴＲＡＰ；Ｂ）１つのリングにＲＮＡが結合したＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の野生型ＴＲＡＰ；Ｃ）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の野生型ＴＲＡＰ、およびＤ）本発明のＴＲＡＰ３およびＴＲＡＰ４についての結晶中でのＴＲＡＰ分子の充填状態（パッキング）を示す模式図である。図中、ＲＮＡはＢにおいて、明確性のために、示されていない。Ａにおいて、ＴＲＡＰリングは、他のリングとほとんど接触しておらず、チューブ状構造を形成するように配列しない。ＢおよびＣにおいて、チューブ状構造は形成するが、ＴＲＡＰリングどうしの間の相互作用は、チューブが２回および４回繰り返された後にそれぞれキャップされてしまい、結晶中でそれより長いチューブを形成しないようになっている。しかしながら、ＴＲＡＰ３およびＴＲＡＰ４については、リングどうしの相互作用は、形成されたチューブが無限に伸びることを意味する（点線で示す）。
【００３７】
結晶構造中で、改変されたＴＲＡＰ３およびＴＲＡＰ４タンパク質は、整列された様式で積み重なり、本質的に無限のチューブを形成する（図５Ｄを参照）。解析されたＴＲＡＰの他の構造では、パッキングは連続的なチューブを形成しない（図５Ｂおよび図５Ｃを参照）。
【００３８】
したがって、本発明の改変されたＴＲＡＰタンパク質の代表的な例において、その本質的なサブユニットは、３個（ＴＲＡＰ３の場合）または４個（ＴＲＡＰ４の場合）いずれかの融合モノマータンパク質から形成される。これらのサブユニット自体は、自己会合して１２個の野生型モノマーサブユニットの等価物からなるＴＲＡＰリングを形成する。本発明者らは、このタンパク質を使用して結晶内でチューブを作製した。本発明者らはまた、炭素グリッド表面上にリングタンパク質を配列した。これらのチューブおよびリングは、金のような金属を鉱化するために使用されて、量子ドットおよびナノワイヤを形成することができる（図６を参照）。
【００３９】
本発明の任意の局面において使用するためのＴＲＡＰ遺伝子は、元々の野生型ＴＲＡＰタンパク質のアミノ酸配列において１つ以上（例えば、数個（例：１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜６個、または１〜３個））のアミノ酸の置換、付加、および／または欠失を有するアミノ酸配列からなる変異体ＴＲＡＰタンパク質をコードする任意の野生型ＴＲＡＰ遺伝子の変異体を含み得る（本発明に従う、その変異体タンパク質を含む改変されたＴＲＡＰリングまたはナノチューブが生成され得る限り）ことが理解されるべきである。
【００４０】
以下の実施例において、本発明がより詳細に記載される。しかしながら、本発明は以下の実施例に限定されないことは理解されるべきである。
【実施例】
【００４１】
（複数ＴＲＡＰ遺伝子の構築）
複数のＴＲＡＰ遺伝子を、図１に示すように構築した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＴＲＡＰをコードする遺伝子を、大腸菌中において発現させるために配列最適化し、ｐＥＴ  ２８ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素部位で、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＮＪ，  ＵＳＡ）によってクローニングした。ＴＲＡＰ遺伝子の第２のコピーを挿入するために、ＴＲＡＰ遺伝子を有するプラスミドの２つのコピーを異なる様式で改変した。１つのコピー（プラスミド「Ａ」）では、Ｎ末端のＮｄｅＩ部位を変異誘発によって除去し（Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ）、終止コドンをアラニンをコードするＧＣＣで置換し、そしてＣ末端のＢａｍＨＩ部位をＮｄｅＩ部位で置換した。プラスミドの第２のコピー（プラスミド「Ｂ」）では、Ｎ末端のＮｄｅＩ部位および終止コドンをそのまま残し、Ｎ末端のＢａｍＨＩ部位を再びＮｄｅＩで置換した。
【００４２】
プラスミドＡおよびＢを両方とも、ＮｄｅＩで消化した。プラスミドＢの場合、生じるＴＲＡＰ遺伝子を親プラスミドからゲル精製（Ｑｉａｇｅｎ）によって除去し、そして線状化したプラスミドＡに付加した。プラスミドＢからプラスミドＡへのＴＲＡＰ遺伝子のライゲーションを、代表的には、約１００ｎｇの線状プラスミド、過剰の挿入遺伝子、および１７５ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｔａｋａｒａ）を２０μｌの総容量において使用して行い、１２時間１６℃でインキュベートした。生じた遺伝子構築物は、ＤＮＡ配列ＣＡＴＡＴＧ、アミノ酸ヒスチジンおよびメチオニンをコードするＮｄｅＩ部位によって連結されたＴＲＡＰ遺伝子の２つのコピーを含有していた。この配列を、配列ＧＣＣＧＣＣＡＴＧで置換し、遺伝子の２つのコピーを連結する最終配列は、アミノ酸ＡＡＡＭに翻訳されるＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＴＧであった。
【００４３】
さらなるコピーのＴＲＡＰを用いた遺伝子構築物の伸長を、さらなる変異誘発および配列決定反応を用いて同様のやり方で行い、必要とされない追加的なＮｄｅＩ制限部位が除去されることを確実にした。
【００４４】
（発現および精製）
ＴＲＡＰモノマーの３つのコピーからなる遺伝子産物（ＴＲＡＰ３）および４つのコピーからなる遺伝子産物（ＴＲＡＰ４）を、大腸菌  ＢＬ２１  ＤＥ３細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中で発現させた。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）中の細胞溶解物を３４，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、上清を除去した。代表的な精製手順において、上清を、５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．５）で平衡化したＱセファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアプライし、ＮａＣｌの上昇勾配で溶出した。ＴＲＡＰ３は、カラムを通過することが見出されたが、混入するタンパク質のほとんど（これらはカラムに結合する）から精製された。ＴＲＡＰ４は、約２００ｍＭ  ＮａＣｌで溶出することが見出された。次いで、ＴＲＡＰタンパク質をヘパリンセファローズカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアプライし、１５０ｍＭより多くのＮａＣｌを含有するタンパク質を１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．５）緩衝液に移した。タンパク質をＮａＣｌの上昇勾配で溶出した。ＴＲＡＰ３およびＴＲＡＰ４の両方とも、典型的に、約２００〜３００ｍＭ  ＮａＣｌで溶出した。タンパク質のさらなる精製が必要な場合、および任意の結合したトリプトファンを除去するために、タンパク質を、５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．５）および１Ｍ  ＮａＣｌを含有する緩衝液に交換し、ＨｉＬｏａｄ  ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ゲルろ過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアプライした。
【００４５】
ＴＲＡＰ３およびＴＲＡＰ４の同一性を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計によってＡｕｔｏｆｌｅｘ−ＹＳ分光光度計（Ｂｒｕｋｅｒ）を用いて確認した。
【００４６】
（電子顕微鏡解析）
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、図２）を用いて、ＴＲＡＰをさらに同定した。透過型電子顕微鏡解析を、２００ｋｅＶ  ＪＥＭ−２２００（ＪＥＯＬ）または３００ｋｅＶ  ＪＥＭ−３１００ＦＥＦ（ＪＥＯＬ）を使用して行った。代表的に、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液中、約１．６ｍｇ／ｍｌのＴＲＡＰタンパク質を、炭素被覆銅グリッドに添加し、３％  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｔｕｎｇｓｔｅｎ  ａｃｅｔａｔｅで染色した。
【００４７】
ＴＥＭ下でのＴＲＡＰの観察により、野生型サンプル中ではっきりと見え、そして同様のリングが、ＴＲＡＰ３およびＴＲＡＰ４サンプル中でも視認可能であった。
【００４８】
（結晶化）
ＴＲＡＰ３およびＴＲＡＰ４を、ハンギングドロップ法を使用して結晶化した。ＴＲＡＰ３結晶を、２０℃で、１０ｍＭ  Ｌ−トリプトファンと１：１で母液（３０％ｖ／ｖＰＥＧ３００，９０ｍＭ  ＣＡＰＳ（ｐＨ９．５）、１５０ｍＭ  硫酸アンモニウム）と混合させた約１１ｍｇ／ｍｌのタンパク質のストックを用いて成長させた。結晶は、立方体形状の結晶として３週間の期間にわたって成長した。ＴＲＡＰ４結晶を約０．６ｍｇ／ｍｌのタンパク質のストックを使用して、１：１で母液（４０％ｖ／ｖ  ＰＥＧ２００、９０ｍＭ  ＣＡＰＳ（ｐＨ９．５）、２００ｍＭ  硫酸アンモニウム）と混合させて、２０℃で成長させた。結晶は、立方体形状の結晶として、９日間の期間にわたって成長させた。
【００４９】
いずれのタンパク質も、Ｐ４２１２空間群において、対称性ユニット当たり３個のＴＲＡＰモノマーで、格子定数：ａ＝１１０±２Å、ｂ＝１１０±２Å、およびｃ＝３６±２Åで結晶化した。ＴＲＡＰ３は２．０Åに回折し、ＴＲＡＰ４は１．８Åに回折した。データは、筑波市のフォトンファクトリー（Ｐｈｏｔｏｎ  Ｆａｃｔｏｒｙ）でビームラインＢＬ５で収集した。
【００５０】
図３に示されるように、ＴＲＡＰ３およびＴＲＡＰ４の構造は、野生型ＴＲＡＰモノマーとほとんど同一の３次構造を示す。ＴＲＡＰ３およびＴＲＡＰ４によって形成されたリングは、サイズにおいて本質的に同一であり、３１．１Åの直径（相対するＳｅｒ７  Ｃαどうしの間）を有する中央の孔を有し、リングの高さは、３１．８Å（Ｌｙｓ４０  ＣαとＡｓｐ２９  Ｃαとの間）であり、そして全体の直径（相対するＧｌｙ１８  Ｃαどうしの間）は、８１．０Åである。これに対して、野生型の構造ではそれぞれ２７．７Å、３２．１Å、および７７．０Åである。
【００５１】
図４に示されるように、ＴＲＡＰ３およびＴＲＡＰ４のモノマーは、リンキングペプチド鎖によって連結されている。
【００５２】
図５に示されるように、結晶構造において、改変されたＴＲＡＰ３およびＴＲＡＰ４タンパク質は、整列された様式で積み重なって、本質的に無限のチューブを形成する（図５Ｄを参照）。解析されたＴＲＡＰの他の構造では、パッキングは連続的なチューブの形成を生じない（図５Ｂおよび図５Ｃを参照）。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
ＴＲＡＰ３またはＴＲＡＰ４タンパク質から作製されるＴＲＡＰリングは、バイオミネラリゼーション容器として金もしくは他の金属をバイオミネラライズするために、または半導体として量子ドットを形成するために使用され得る（図６を参照）。結晶中のＴＲＡＰチューブは、フォトリソグラフィーのためのマスクとして超薄型半導体ワイヤまたはスイッチを製造するために使用され得る。結晶中のチューブはまた、溶液中でチューブを作製するためのさらなる改変のための基礎を提供し、これはコアの長さ全体にわたって導体／半導体をバイオミネラライズすることによってナノワイヤを製造するためのバイオミネラリゼーション容器として作製するために使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】複数のＴＲＡＰ遺伝子の構築を示す模式図である。
【図２】炭素被覆銅メッシュ上に沈着されたＴＲＡＰ３のＴＥＭ画像である。多数のリング様構造が観察される。赤の四角は、挿入図において拡大されており、直径約９．１ｎｍの単一のＴＲＡＰリングを示す（緑の丸で示す）。
【図３】結晶中のタンパク質の充填を示す結晶構造である。Ａ）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の野生型ＴＲＡＰ；Ｂ）ＲＮＡが１つのリングに結合したＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の野生型ＴＲＡＰ；Ｃ）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の野生型ＴＲＡＰ；およびＤ）ＴＲＡＰ３。構造は、左側において「正面向き」に、右側において「側面」から示されている。ＴＲＡＰ４の構造は、実質的にＴＲＡＰ３と同一である。
【図４】モノマー等価物どうしの間の結合を示す模式図である。Ａ）ＴＲＡＰ３タンパク質、およびＢ）ＴＲＡＰ４タンパク質。
【図５】ＴＲＡＰ分子の充填を示す模式図である。Ａ）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の野生型ＴＲＡＰ；Ｂ）１つのリングにＲＮＡが結合したＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の野生型ＴＲＡＰ；Ｃ）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の野生型ＴＲＡＰ；ならびにＤ）ＴＲＡＰ３およびＴＲＡＰ４。ＴＲＡＰ３およびＴＲＡＰ４についてのみ、隣接するリングは孔を整列し、単一の配向で積み重なる。
【図６】改変されたＴＲＡＰリングの金ナノ粒子との予想される相互作用を示す模式図（ｉ）。リングは中央のキャビティにおいて金を結合して、量子ドットを形成し得る（ｉｉ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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