(57)【要約】【課題】幅広い過酸化水素濃度において、高い反応性、および安定性を有するペルオキシダーゼを提供し、よって洗濯またはすすぎ過程における染料移動阻止、並びに、溶液または分散液中の繊維染料の漂白を伴う繊維工業等での廃水処理を行う方法、およびその方法に用いる組成物を提供すること。【解決手段】幅広い過酸化水素濃度において、高い反応性、および安定性を有するペルオキシダーゼを発見しその効果を確認する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
洗液中で染色された布を含む複数の布を一緒に洗濯および／またはすすぐ場合において、染色された一方の布から他の布への繊維染料の移行を防止する方法であって、該洗液に過酸化水素の存在下で過酸化水素耐性を有するイネ由来ペルオキシダーゼを作用させることを特徴とする方法。
【請求項２】
溶液または分散液中の繊維染料を漂白する方法であって、前記溶液または分散液に過酸化水素の存在下で過酸化水素耐性を有するイネ由来ペルオキシダーゼを作用させることを特徴とする方法。
【請求項３】
過酸化水素の濃度が０．００１ｍＭ以上１．０Ｍ以下であることを特徴とする請求項の第１項、または第２項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
イネ由来ペルオキシダーゼを過酸化水素の濃度が０．００１ｍＭ以上１．０Ｍ以下の範囲で作用させ電子、または水素供与体を酸化させることを特徴とする方法。
【請求項５】
イネ由来ペルオキシダーゼが、イネモミガラ由来ペルオキシダーゼであることを特徴とする請求項の第１項、第２項、第３項または第４項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
過酸化水素が、過酸化水素前駆体、過酸化水素前駆体に作用し過酸化水素を発生しうる漂白活性化剤と過酸化水素前駆体との共存系、および過酸化水素を発生しうる酵素系のうちの少なくともどれか一つの手段により供給されることを特徴とする請求項の第１項、第２項、第３項第４項、または第５項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
過酸化水素耐性を有するイネ由来ペルオキシダーゼを含んでいる洗剤組成物もしくは漂白剤組成物。
【請求項８】
イネ由来ペルオキシダーゼが、イネモミガラ由来ペルオキシダーゼであることを特徴とする請求項の第７項に記載の組成物。
【請求項９】
洗剤もしくは漂白剤として使用するときに過酸化水素の濃度が０．００１ｍＭ以上１Ｍ以下となることを特徴とする請求項の第７項、または第８項に記載の組成物。
【請求項１０】
過酸化水素が、過酸化水素前駆体、過酸化水素前駆体に作用し過酸化水素を発生しうる漂白活性化剤と過酸化水素前駆体との共存系、および過酸化水素を発生しうる酵素系のうちの少なくともどれか一つの手段により供給されることを特徴とする請求項の第７項、第８項、または第９項のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、過酸化水素存在下、安定した反応性、保存性を示すペルオキシダーゼを用いた溶液中の着色物質（染料など）の分解（脱色・漂白）方法、および組成物の提供に関する。    
【背景技術】
【０００２】
ペルオキシダーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１１．１．７）は過酸化水素を酸化剤として、基質（電子又は水素供与体）の酸化触媒として作用する酵素である。ペルオキシダーゼは、補欠分子族並びに反応形式の違いによりいくつかのタイプに分類されるが、産業上、補欠分子族としてヘムを含んでいるヘム型ペルオキシダーゼの利用が最もよく知られている。
ペルオキシダーゼの産業上の利用については、重合反応によるポリマー合成、酸化反応による酸化化合物の合成、各種有機化合物の分解、たとえば、製紙用パルプの製造プロセスでの利用や繊維染料の漂白・分解を目的とする利用等幅広い提案が既になされている。これらの公知の方法においては、ペルオキシダーゼは、通常過酸化水素または現場において過酸化水素を発生しうる化合物や酵素系と一緒に使用される。過酸化水素はペルオキシダーゼの酸化剤であり、反応活性種を形成するのに必要であると同時に、ペルオキシダーゼに限らず酵素全般を酸化し、その機能を失わせる性質を有するものである。そこで幅広い濃度の過酸化水素に対し、安定した反応性、保存性を示すペルオキシダーゼが産業上の利用において強く望まれていたが未だ達成されていなかった。  繊維染料の漂白・分解という観点から見た場合においても以下に示すように同様である。
【０００３】
ペルオキシダーゼは、染料移動阻止剤および繊維染料の漂白剤としての利用が提案されている。ここで、“染料移動阻止”とは、例えば特許公報第２８０１３９８号に記載されたような布の洗浄中に染色された布から他の布への繊維染料の移動阻止からなるプロセスであるが、この染料移動の問題は、染料が洗濯の間に滲出する暗色の布と白色または淡色布を一緒に洗濯する場合に重要である。さらに、溶液または分散液中の繊維染料に対するペルオキシダーゼの漂白作用に基づいて、該酵素が繊維工業からの排水処理に有効であると期待されている。また、ペルオキシダーゼのこれら能力は、過酸化水素と共に、活性化剤と称される染料以外の被酸化性基質と組み合わせると、特に顕著になることも知られている。
【０００４】
実際に染料移動阻止および漂白に関し効果のあるペルオキシダーゼとして、植物である西洋ワサビ由来、大豆由来、イネ由来（特許文献１を参照）、あるいは担子菌コルプリヌス・シネレウス由来ペルオキシダーゼが既に提案されている。
【０００５】
残念ながら、自然環境中における上記ペルオキシダーゼの活性レベルは、洗浄や廃水処理環境中で維持されないことがしばしばある。特に、反応性（反応速度）、熱安定性、ｐＨ安定性、酸化安定性および基質特異性等のペルオキシダーゼが有する種々の特性が、比較的非自然な条件である洗浄や廃水処理環境中での利用、あるいは造粒化物等の洗剤組成物としての加工時、並びに加工後の保存にとって必ずしも最適とは限らない。
【０００６】
例えば、コルプリヌス・シネレウス由来ペルオキシダーゼは既知のペルオキシダーゼと比較すると、反応速度が速い性質を有している。さらに衣類の染料には作用しないが、洗濯水中に遊離した色素には良く作用し脱色する能力を有していることから、工業的用途の一つとして、洗濯時の色移り防止が考えられてきた。このように優れた特徴を有するものの、洗濯時の条件の一つである高ｐＨ（１０．５）、高濃度の過酸化水素（５−１０ｍＭ）、５０℃で急速に失活するため、実用上解決すべき問題が残されていることが知られている（特許文献２、非特許文献２を参照）。
【０００７】
今日の遺伝子工学の進歩により、タンパク質のアミノ酸配列中における特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換させることが可能であり、かつ、比較的容易になっている。そして、置換されるアミノ酸残基の位置、置換されたアミノ酸残基の化学的な性質や物理的な大きさ等に応じて、元の酵素の性能を様々な程度に変化させうるし、場合によっては、元の酵素を不活化させることすらある。
【０００８】
コルプリヌス・シネレウス由来ペルオキシダーゼにおいてもランダムに変異を導入した変異型酵素を作製することにより上記問題を解決すべく鋭意研究が行われた。研究者らは変異型酵素集団を作製し、その中からｐＨ１０．５、１５ｍＭ過酸化水素、５０℃、２０分間という洗浄条件を模した不活化処理後も、残存活性が高いものを選抜した。さらに得られた変異型酵素にさらに変異を重ねる、あるいは効果のあった変異を組み合わせて新規な変異酵素群を選抜した。その結果、野生型酵素はｐＨ１０．５、１５ｍＭ過酸化水素、５０℃、２０分間の不活化処理後の残存活性が０％であったのに対し、不活化処理後の残存活性が３９％である新規な変異酵素に代表される変異酵素群が創生された。残存活性の向上の寄与により染料移動阻止効果が高まったことが示されているが、残念ながら未だ不十分な残存活性により実用的な活性レベルには達していない。つまり、洗濯時の条件の一つであるｐＨ１０．５、過酸化水素濃度  １５ｍＭ、高温（５０℃）において高度な残存活性を有する、染料移動阻止剤および繊維染料の漂白剤としての用途に供しうるペルオキシダーゼの存在は知られていない。
【０００９】
これに対する別の解決策は、過酸化水素の攻撃に対する安定性をデザインし実質的に向上することである。この目的を達成するための一つの方法が国際特許出願ＷＯ９４／１８３１４に記載されており、それによると、酸化感受性の高いアミノ酸（例えばメチオニン、トリプトファン、システインまたはチロシン）を酵素のアミノ酸配列から除くか、またはそれらアミノ酸の代わりに酸化安定性のより高い他のアミノ酸を導入する。国際特許出願ＷＯ９５／２１２４７にも同様の方法が記載されており、該特許出願は、酵素のアミノ酸配列中の少なくとも１個のメチオニンを、メチオニンおよびシステインのいずれでもないアミノ酸で置き替えることを推奨している。
【００１０】
いずれにせよ、洗濯時の条件の一つである高ｐＨ（１０．５）、高濃度の過酸化水素（１５ｍＭ）、高温（５０℃）といった酵素にとって極めて非自然的な条件で安定な酵素が強く望まれていたものの、遺伝子工学的手法を駆使しても未だ実現せず、ましてやそのような特徴を有する野生型酵素の存在は予想だにされていなかった。
【００１１】
加えて、洗濯時の洗浄効果を高めるために、あらかじめ洗浄液に数分から数時間放置しておく方法がつけ置き洗いとして広く知られているが、その環境で安定して働くことを期待しうるペルオキシダーゼの存在は知られていない。
【００１２】
さらに洗剤濃度の高い洗浄液を衣類に循環させることにより、皮脂汚れに対する洗浄力を向上させ、衣類の黄ばみをおさえる洗浄方法が普及しつつあるが、その環境で安定して働くことを期待しうるペルオキシダーゼの存在も知られていない。
【００１３】
加えて、造粒化等の洗剤組成物としての加工時、並びに加工後の保存時、過酸化水素に対して優れた安定性を示すことを期待しうるペルオキシダーゼの存在も知られていなかった。
【００１４】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０３３６１０号公報
【特許文献２】米国特許第５９６８８８３号公報
【非特許文献１】第３５回  洗浄に関するシンポジウム（日本油化学会）東京，第１０５〜１０６頁
【特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９９,１７，ｐ３７９−３８４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、前記の背景技術に鑑み、洗濯またはすすぎ過程における染料移動阻止、並びに、溶液または分散液中の染料の漂白を伴なう繊維工業等での排水処理に利用する際に含まれる濃度の過酸化水素が存在していても（１）充分な反応速度を有し、なおかつ（２）反応を期待される時間内において反応速度の低下率が低いペルオキシダーゼを見出し、これを利用する方法を提供する事にある。
【００１６】
また造粒化等の洗剤組成物としての加工時、並びに加工後の保存時、過酸化水素に対して優れた安定性を示すペルオキシダーゼを見出し、これを利用する方法を提供する事にある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、驚くべきことにイネ由来モミガラペルオキシダーゼがｐＨ１０．５、高温（５０℃）、１５ｍＭの過酸化水素、２０分の不活化処理後であっても、５５％の残存活性を示すことを見出した。また、過酸化水素濃度が３７５ｍＭという極めて高濃度であっても、２０分以上に渡り、染料移動阻止および漂白に関して有効な活性レベルを維持できるという、特徴を有していることを見出した。さらに過酸化水素濃度が１Ｍという極めて高濃度であっても、触媒としての機能を有していることを見出した。加えて洗剤組成物として過酸化水素発生源と４週間保存しても安定であることを確認した。
【００１８】
以上の知見を基に、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）洗液中で染色された布を含む複数の布を一緒に洗濯および／またはすすぐ場合において、染色された一方の布から他の布への繊維染料の移行を防止する方法であって、該洗液に過酸化水素の存在下で過酸化水素耐性を有するイネ由来ペルオキシダーゼを作用させることを特徴とする方法。
（２）溶液または分散液中の繊維染料を漂白する方法であって、前記溶液または分散液に過酸化水素の存在下で過酸化水素耐性を有するイネ由来ペルオキシダーゼを作用させることを特徴とする方法。
（３）過酸化水素の濃度が０．００１ｍＭ以上１Ｍ以下であることを特徴とする請求項の第１項、または第２項のいずれか一項に記載の方法。
（４）イネ由来ペルオキシダーゼを過酸化水素の濃度が０．００１ｍＭ以上１Ｍ以下の範囲で作用させ電子、または水素供与体を酸化させることを特徴とする方法。
（５）イネ由来ペルオキシダーゼが、イネモミガラ由来ペルオキシダーゼであることを特徴とする請求項の第１項、第２項、第３項または第４項のいずれか１項に記載の方法。
（６）過酸化水素が、過酸化水素前駆体、過酸化水素前駆体に作用し過酸化水素を発生しうる漂白活性化剤と過酸化水素前駆体との共存系、および過酸化水素を発生しうる酵素系のうちの少なくともどれか一つの手段により供給されることを特徴とする請求項の第１項、第２項、第３項第４項、または第５項のいずれか１項に記載の方法。
（７）過酸化水素耐性を有するイネ由来ペルオキシダーゼを含んでいる洗剤組成物もしくは漂白剤組成物。
（８）イネ由来ペルオキシダーゼが、イネモミガラ由来ペルオキシダーゼであることを特徴とする請求項の第７項に記載の組成物。
（９）洗剤もしくは漂白剤として使用するときに過酸化水素の濃度が０．００１ｍＭ以上１Ｍ以下となることを特徴とする請求項の第７項、または第８項に記載の組成物。
（１０）過酸化水素が、過酸化水素前駆体、過酸化水素前駆体に作用し過酸化水素を発生しうる漂白活性化剤と過酸化水素前駆体との共存系、および過酸化水素を発生しうる酵素系のうちの少なくともどれか一つの手段により供給されることを特徴とする請求項の第７項、第８項、または第９項のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の効果】
【００１９】
１Ｍまでの過酸化水素に対して高い反応性と安定性を示すイネモミガラ由来ペルオキシダーゼを利用することで、幅広い過酸化水素濃度域での反応を期待することができる。イネ由来ペルオキシダーゼは耐熱性に優れているという別の好ましい性質を有していることから（ＷＯ２００４／０３３６１０号に記載）、特に繊維染料の移動阻止および漂白において幅広い適用を提供できるようになる。また、造粒化等の洗剤組成物としての加工時、並びに、加工時の保存時においても、優れた安定性を示すペルオキシダーゼを含む組成物を提供できるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、洗液中で布を一緒に洗濯および／またはすすぐ場合において、染色した布から他の布への繊維染料の移行を防止する方法であって、前記布を洗濯しおよび／またはすすぐ洗液に、過酸化水素耐性を有するイネ由来ペルオキシダーゼ、並びに、過酸化水素、または、過酸化水素前駆体、または、過酸化水素前駆体に作用し過酸化水素を発生しうる漂白活性化剤と過酸化水素前駆体との共存系、または、過酸化水素を発生しうる酵素系、を実質的に同時に存在させることを特徴とする方法に関するものである。
【００２１】
また、本発明は、溶液または分散液中の繊維染料を漂白する方法であって、前記溶液または分散液に、過酸化水素耐性を有するイネ由来ペルオキシダーゼ、並びに、過酸化水素、または、過酸化水素前駆体、または、過酸化水素前駆体に作用し過酸化水素を発生しうる漂白活性化剤と過酸化水素前駆体との共存系、または、過酸化水素を発生しうる酵素系、を実質的に同時に存在させることを特徴とする方法に関するものである。
【００２２】
さらに、本発明は、過酸化水素耐性を有するイネ由来ペルオキシダーゼ、並びに、過酸化水素、または、過酸化水素前駆体、または、過酸化水素前駆体に作用し過酸化水素を発生しうる漂白活性化剤と過酸化水素前駆体との共存系、または、過酸化水素を発生しうる酵素系、を実質的に同時に含有している洗剤組成物もしくは漂白組成物の提供に関するものである。
【００２３】
本発明における過酸化水素耐性を有するイネ由来ペルオキシダーゼは、精製の程度により該酵素と共に含まれる不純物の量や質が異なってくるが、好ましくはそのＲＺ値が０．０１以上、より好ましくは０．１以上、さらに好ましくは１．０以上のものを使用すればよい。尚、ここでいうＲＺ値とは、２７５ｎｍと４０３ｎｍに於ける吸光度の比である（Ａ２７５ｎｍ／Ａ４０３ｎｍ）。この値は、ペルオキシダーゼ溶液中の蛋白質含量に対するヘム含量の比を表しており、ペルオキシダーゼの精製度の指標となる。
【００２４】
本発明における過酸化水素耐性を有するイネ由来ペルオキシダーゼとは、同酵素を含有しているイネモミガラから分離・精製・回収されるイネモミガラ由来ペルオキシダーゼを代表例として挙げることができるが、過酸化水素耐性を有するイネ由来ペルオキシダーゼであれば、その局在部等に関しては特に制限はない。たとえば、糠や茎葉部由来のイネ由来ペルオキシダーゼであっても、過酸化水素耐性を有していれば、本発明でいう過酸化水素耐性を有するイネ由来ペルオキシダーゼとする。尚、本発明においては、以下の条件のいずれか一つを満たしていれば過酸化水素耐性を有していると判定する。（条件１）０．１Ｍ  Ｔｒｉｓバッファー  ｐＨ１０．５、過酸化水素濃度１５ｍＭ、５０℃、２０分間の不活化処理後においても、処理前の５０％以上の活性が保持されていれば、過酸化水素耐性を有していると判定する。（条件２）０．１Ｍ  Ｔｒｉｓバッファー  ｐＨ１０．５、過酸化水素濃度１５ｍＭ、５０℃、２０分間の不活化処理後においても、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓバッファー  ｐＨ１０．５、過酸化水素濃度１５ｍＭで反応速度定数が０．４以上の活性が保持されていれば、過酸化水素耐性を有していると判定する。（条件３）ｐＨ１０．５、過酸化水素濃度３７５ｍＭ、５０℃、２０分間の不活化処理後においても、１％以上の残存活性が保持されていれば、過酸化水素耐性を有していると判定する。後述の実施例のように、５０％以上の活性が保持されているような場合が最も好適な事例と言える。（条件４）ｐＨ１０．５、過酸化水素濃度１Ｍ、５０℃、において反応速度定数が０．２以上の活性が保持されていれば、過酸化水素耐性を有していると判定する。
【００２５】
本発明におけるイネ由来ペルオキシダーゼ、特にイネモミガラ由来ペルオキシダーゼは、特公平５−２２５１０記載の精製方法により、イネモミガラより容易に入手することができる。
【００２６】
さらに、近年のイネゲノム解析の成果等により、イネにおいても、複数のペルオキシダーゼ遺伝子の存在が報告されている（Phytochemistry  65,pp.1879-1893(2004)）。すなわち、今日の遺伝子工学的な手法を利用すれば、これらのイネ由来のペルオキシダーゼをコードするＤＮＡ配列と、該ペルオキシダーゼをコードするＤＮＡ配列の発現を目的とする機能を有するＤＮＡ配列を結合させた組換えＤＮＡ分子を構築し、続いて該組換えＤＮＡ分子で宿主細胞や宿主植物体を形質転換して、イネ由来ペルオキシダーゼを効率良く生産させることも可能である。以上のような技術的な背景を踏まえた場合、形質転換された宿主細胞を培養し、もしくは、形質転換された宿主植物体を生育させて、得られた培養物、培養細胞、もしくは植物体からペルオキシダーゼを分離・精製・回収することにより得られる過酸化水素耐性を有するイネ由来ペルオキシダーゼも、本発明の過酸化水素耐性を有するイネ由来ペルオキシダーゼの範疇に含まれるものとする。
【００２７】
本発明における過酸化水素耐性を有するイネ由来ペルオキシダーゼの形態についての制限は特にないが、洗剤組成物や漂白剤組成物の成分として添加される場合を考慮すれば、無粉塵性顆粒や液体酵素製剤の形態であることが好ましい。尚、無粉塵性顆粒の場合は、米国特許第４，１０６，９９１号および第４，６６１，４５２号に記載のように作られ、そして場合により当該技術で公知の方法により被覆することができる。また、液体酵素製剤の場合は、確立された方法にしたがってポリオールたとえばプロピレングリコール、糖または糖アルコール、乳酸またはホウ酸等を加えることにより安定化させることができる。
【００２８】
本発明における洗液中で布を一緒に洗濯および／またはすすぐ場合、または、溶液または分散液中の繊維染料を漂白する場合においては、洗液や漂白液１リットル当たり０．００１ｍｇから１０００mgのイネ由来ペルオキシダーゼを添加すればよい。さらに、その温度は、１０℃から８０℃の範囲、好ましくは２０℃から７０℃の範囲、より好ましくは２０℃から６０℃の範囲で実施すればよい。さらに、洗液や漂白液のｐＨは、一般的ｐＨ、洗濯および／またはすすぐ場合の一般的なｐＨ、すなわちｐＨ６．５〜１０．５、好ましくは６．５〜９．５、より好ましくは７．５〜９．５で実施すればよい。
【００２９】
本発明における洗濯またはすすぎ過程における染料移動阻止、並びに、溶液または分散液中の繊維染料の漂白を行う場合においては、イネ由来ペルオキシダーゼと過酸化水素が実質的に同時に存在していることが必須である。この際、過酸化水素は洗濯および／またはすすぐプロセスの初め又は途中で、０．００１〜１．０Ｍの量で存在させればよい。好ましくは２５ｍＭ〜１．０Ｍで存在させれば良い。あるいは１１０ｍＭ〜１．０Ｍ、さらに好ましくは３３０ｍＭ〜１．０Ｍ、一層好ましくは４００ｍＭ〜１．０Ｍで存在させれば良い。あるいは６００ｍＭ〜１．０Ｍで存在させても良い。さらに８００ｍＭ〜１．０Ｍで存在させても良い。
【００３０】
過酸化水素の供給に際しては、過酸化水素自体が洗液、溶液または分散液に添加されてもよいし、現場において過酸化水素を発生する過酸化水素前駆体として供給されてもよい。
【００３１】
代表的な過酸化水素前駆体として、過ホウ酸塩、過炭酸塩、ペルオキシカルボン酸、またはその塩等が挙げられる。具体的には、過ホウ酸ナトリウムや過炭酸ナトリウムが挙げられる。
【００３２】
また、上述の過酸化水素前駆体に作用し過酸化水素を発生しうる漂白活性化剤を過酸化水素前駆体と共存させてもよい。その様な漂白活性化剤としては、具体的には、ノナノイルオキシベンゼンスルホナート・ナトリウム塩、ドデカノイルオキシベンゼンスルホナート・ナトリウム塩、４−デカノイルオキシ安息香酸、テトラアセチルエチレンジアミン等が挙げられる。共存させるべき漂白活性化剤の量は、洗濯および／またはすすぐプロセスの初め又は途中で、約１μＭ〜1０ｍＭ、より好ましくは、約１０μＭ〜1ｍＭの間が適当である。
【００３３】
さらに、過酸化水素供給源として、現場において過酸化水素を発生させる過酸化水素生成酵素系を選択してもよい。好ましい過酸化水素生成酵素系は、洗剤組成物へ都合良く含まれる安価で容易に入手可能な基質（過酸化水素前駆体）に作用するものである。このような基質（過酸化水素前駆体）の例としてはグルコースであり、これはグルコースオキシダーゼを用いることにより過酸化水素を供給することができる。他の適当なオキシダーゼは尿酸オキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼおよびコレステロールオキシダーゼである。
【００３４】
本発明における洗濯またはすすぎ過程における染料移動阻止、並びに、溶液または分散液中の繊維染料の漂白を行う場合においては、使用する過酸化水素耐性を有するイネ由来ペルオキシダーゼの染料移動阻止および漂白効果を強化するために、別の酸化性基質を共存させてもよい。これらの酸化性基質は、一般に活性化剤と称され、ｐ−ヨードフェノール、Ｌ−アスコルビン酸、ｐ−アミノフェノール、ｐ−アミノ安息香酸基質などが具体例として挙げられるが、これらに限られたものではない。また、共存させるべき酸化性基質の量は、約１μＭ〜1０ｍＭ、より好ましくは、約１０μＭ〜1ｍＭの間が適当である。
【００３５】
本発明における洗濯またはすすぎ過程における染料移動阻止、並びに、溶液または分散液中の繊維染料の漂白を行う場合においては、陰イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤ならびにこれら界面活性剤の混合物が共存していてもよい。このような界面活性剤の例としては、アルキルベンゼンスルホン酸塩（ＬＡＳ：陰イオン界面活性剤）、α−オレフィンスルホン酸塩（ＡＯＳ：陰イオン界面活性剤）、硫酸アルキルポリオキシエチレン塩（ＡＥＳ：陰イオン界面活性剤）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ：陰イオン界面活性剤）ラウリン酸ナトリウムのような長鎖脂肪酸塩（石けん：陰イオン界面活性剤）、Ｂｒｉｊ３５（非イオン界面活性剤）、アルキルポリオキシエチレンエーテル（非イオン界面活性剤）、アルキルトリメチルアンモニウム塩（陽イオン界面活性剤）、ジアルキルジメチルアンモニウム塩（陽イオン界面活性剤）、ジメチルアルキルアミンオキシド（両性界面活性剤）などが挙げられるが、これらに限られたものではない。また、共存させるべき界面活性剤の量は、特に制限はないが、各界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）以上が好ましい。
【００３６】
本発明において過酸化水素耐性を有するイネ由来ペルオキシダーゼにより染料移動阻止および漂白の対象となる繊維染料については特に制限はなく、上述の活性化剤との共存下も含めて、通常使用される繊維染料に対して効果を発揮する。尚、ここでいう繊維染料とは、天然染料はいうまでもなく、合成的に作られるがただし構造および特性は天然染料と同じである天然同一性染料、一般的なアゾ染料をはじめとして、アントラキノン染料などその他の合成染料を挙げることができる。さらに、繊維と共有結合により結合する反応性染料に対しても有効である。
【００３７】
最後に、本発明は、過酸化水素耐性を有するイネ由来ペルオキシダーゼ含んでいる組成物に関する。具体的には、洗剤組成物もしくは漂白剤組成物に関する。また、過酸化水素、または、その供給を目的とする成分との共存が必須であるが、そのために、過酸化水素前駆物質、漂白活性化剤や過酸化水素生成酵素系を成分の一つとして選択してもよい。すなわち、本発明は、過酸化水素耐性を有するイネ由来ペルオキシダーゼ、および、過酸化水素、過酸化水素の前駆体、過酸化水素前駆体に作用し過酸化水素を発生しうる漂白活性化剤と過酸化水素前駆体との共存系、および、過酸化水素を発生せしめることのできる酵素系のうちの少なくともどれか一つを含んでいることを特徴とする洗剤組成物もしくは漂白剤組成物に関する。もちろん洗浄効果を増強するための界面活性剤を含んでいてもよい。
【００３８】
この組成物中の過酸化水素耐性を有するイネ由来ペルオキシダーゼ量については、特に制限はないが、好ましくは、洗液、溶液、もしくは分散液１リットル当たり０．００１ｍｇから１０００mgのイネ由来ペルオキシダーゼを含有させればよい。
【００３９】
その形態についても特に制限はなく、目的に都合の良いように紛体または液体いずれかの形態を選択すればよい。具体的には、上述のような無粉塵性顆粒や種々の安定剤により安定化された液体酵素製剤を選択することができる。特に、粉体の場合は、該組成物中の全成分を混合した造粒物からなる組成物、該組成物中の個別成分単独の造粒物や任意の複数成分の混合造粒物を混合させた組成物であってもよい。尚、ここでいう任意の複数成分の混合造粒物とは、一例を挙げれば、イネ由来ペルオキシダーゼと過酸化水素前駆体に作用し過酸化水素を発生しうる漂白活性化剤を混合させた造粒物のことである。
【００４０】
さらに、洗剤組成物を目的とする場合には、さらに当該技術での公知となっている他の洗剤成分、たとえば、ビルダー、抗腐蝕剤、金属イオン封鎖剤、抗−よごれ再付着剤、芳香剤、酵素安定剤等、他の洗剤酵素（たとえばプロテアーゼ、リパーゼまたはアミラーゼ）を含んでもよい。
【００４１】
本発明の洗剤組成物が添加された洗液もしくは漂白剤組成物が添加された漂白液のｐＨは、６．５〜１２であり、好ましくは、６．５〜１０．５である。
【実施例】
【００４２】
次に、本発明について、以下の実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に制限されるものではない。
【００４３】
［実施例１］５０℃、ｐＨ１０．５、１５ｍＭ過酸化水素下における２０分間の不活化処理がイネ由来ペルオキシダーゼおよびコルプリヌス・シネレウス由来ペルオキシダーゼの残存活性率に与える影響
オレンジＩＩ（C.I. Acid Orange 7：関東化学より購入：以下同じ）を基質とした退色反応により、不活化処理が残存活性率に与える影響について検討した。
【００４４】
日立製紫外可視分光光度計Ｕ−２０１０のセル内（光路１ｃｍ）に、０．０６ｍＭオレンジＩＩを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ１０．５）２．５ｍＬを加え、１分間プレインキュベートした。ここに３４０ｎＭ  ペルオキシダーゼと１５ｍＭ過酸化水素を含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ１０．５）を２０分間、共存混合させ保存したものを注入して反応を開始し、反応開始１分後のオレンジＩＩの最大吸収波長である４８５ｎｍの値の減少値を求めた。反応開始一分後の減少値を、保存時間０分で同様に反応させたときの減少値で割り、これを１００倍したものを残存活性率（％）として求めた。その結果を以下の（表１）に示した。  尚、イネ由来ペルオキダーゼは、フナコシ株式会社より販売されているイネモミガラ由来ペルオキダーゼ（商品番号Ｋ０３１０１００：純度ＲＺ＞１．２）を使用した。また、両酵素のモル吸光係数は、西洋ワサビと同じく１．０２×１０５ｍｏｌ−１ｄｍ３ｃｍ−１（４０３ｎｍ）とした。また、オレンジＩＩは、和光純薬製の試薬を再結晶法で精製し、ロ紙分配クロマトグラムとUVスペクトルで純度を確認して使用した。その結果を以下の（表１）に示した。
【００４５】
すなわちイネ由来ペルオキシダーゼは５０℃、ｐＨ１０．５、１５ｍＭ過酸化水素下における２０分間の不活化処理後も残存活性率５５％を示すことが判明した。
【００４６】
【表１】
2007107148.tif 000002
【００４７】
［実施例２］  ５０℃、ｐＨ１０．５、１５ｍＭ過酸化水素下における２０分間の不活化処理がイネ由来ペルオキシダーゼおよびコルプリヌス  シネレウス由来ペルオキシダーゼの速度定数に与える影響
日立製紫外可視分光光度計Ｕ−２０１０のセル内（光路１ｃｍ）に、０．０６ｍＭオレンジＩＩを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ１０．５）２．５ｍＬを加え、１分間プレインキュベートした。ここに０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ１０．５）に３４０ｎＭ  ペルオキシダーゼ０．２５ｍＬと１５ｍＭ過酸化水素０．２５ｍＬを注入して反応を開始し、オレンジＩＩの最大吸収波長である４８５ｎｍの２０℃での経時的な吸光度の変化を測定した。以下の式に基づいて不活化処理前の反応速度定数を求めた。また同様に日立製紫外可視分光光度計Ｕ−２０１０のセル内（光路１ｃｍ）に、０．０６ｍＭオレンジＩＩを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ１０．５）２．５ｍＬを加え、１分間プレインキュベートした。ここに０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ１０．５）に３４０ｎＭ  ペルオキシダーゼと１５ｍＭ過酸化水素をを２０分間、５０℃で共存混合させ保存したものを注入して反応を開始し、オレンジＩＩの最大吸収波長である４８５ｎｍの２０℃での経時的な吸光度の変化を測定した。以下の式に基づいて不活化処理後の反応速度定数を求めた。
このオレンジＩＩの退色曲線から、反応速度式を解析した結果、退色反応はいずれの場合も擬一次反応で進行することが明らかとなった。そこで、以下の式（１）（数１）
【００４８】
【数１】
2007107148.tif 000003
【００４９】
ここで、ｋｔ（ ｍｉｎ−１ ）は擬一次速度定数、Ｃ０はオレンジＩＩの初濃度、Ｃｔは反応時間 t におけるオレンジＩＩの濃度である。）に示す擬一次反応速度式からオレンジＩＩの退色反応における過酸化水素濃度と反応開始後３０秒の値を用いた速度定数ｋｔの関係を求めた。その結果を以下の（表２）に示した。
【００５０】
【表２】
2007107148.tif 000004
【００５１】
［実施例３］
（イネ由来ペルオキシダーゼおよび種々のペルオキシダーゼの２０℃、ｐＨ１０．５、０．７５ｍＭ過酸化水素下における保存時間と退色率の関係）
日立製紫外可視分光光度計Ｕ−２０１０のセル内（光路１ｃｍ）に、０．０６ｍＭオレンジＩＩを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ１０．５）２．５ｍＬを加え、１分間プレインキュベートした。ここに６８０ｎＭ  ペルオキシダーゼ５ｍＬと１．５ｍＭ過酸化水素溶液５ｍＬを任意の時間、共存混合させ保存したものを注入して反応を開始した。反応開始３０分後の４８５ｎｍの値を過酸化水素溶液の代わりに精製水を用いて反応させたときの４８５ｎｍの値で割ったものに１００倍を乗し退色率（％）として求めた。その結果を以下の（表３）に示した。
【００５２】
すなわち、２０℃、ｐＨ１０．５、０．７５ｍＭ過酸化水素の保存条件下では、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼは１５０分の保存処理により退色率が６０％程度まで低下したが、イネ由来、およびダイズ由来ペルオキシダーゼの退色率は８５％前後を維持し、高い安定性を示した。イネ由来ペルオキシダーゼは洗剤条件の一つである０．７５ｍＭ過酸化水素存在下で、長時間処理後も安定であることが示された。
【００５３】
【表３】
2007107148.tif 000005
【００５４】
［実施例４］
（イネ由来ペルオキシダーゼの５０℃、ｐＨ１０．５、１５ｍＭ過酸化水素下における保存時間と残存活性率の関係）
ペルオキシダーゼが過酸化水素と共存する溶液組成物として存在した場合の保存加速試験、および洗濯条件の一つでの安定性評価を実施した。
【００５５】
日立製紫外可視分光光度計Ｕ−２０１０のセル内（光路１ｃｍ）に、０．０６ｍＭオレンジＩＩを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ１０．５）２．５ｍＬを加え、１分間プレインキュベートした。ここに６８０ｎＭ  ペルオキシダーゼ５ｍＬと３０ｍＭ過酸化水素５ｍＬを５０℃、ｐＨ１０．５において、共存混合させ、任意の時間保存したものを注入して５０℃で反応を開始し、反応開始１分後の４８５ｎｍの値の減少値を求めた。任意の時間、共存混合させ保存したもので反応したときの減少値を、保存時間０分のサンプルを反応させたときの減少値で割り、これを１００倍したものを残存活性率（％）として求めた。その結果を以下の（表４）に示した。
【００５６】
すなわち、イネ由来ペルオキシダーゼは５０℃、ｐＨ１０．５、１５ｍＭ過酸化水素下で保存した場合、保存時間２０分で５５％、保存時間２０分から１００分に渡り残存活性率１０％以上の高い安定性を示した
【００５７】
【表４】
2007107148.tif 000006
【００５８】
［実施例５］
（イネ由来ペルオキシダーゼの５０℃、ｐＨ１０．５、３７５ｍＭ過酸化水素下における保存時間と残存活性率の関係）
ペルオキシダーゼが過酸化水素と共存する溶液組成物として存在した場合の保存加速試験、および洗濯条件の一つでの安定性評価を実施した。
【００５９】
日立製紫外可視分光光度計Ｕ−２０１０のセル内（光路１ｃｍ）に、０．０６ｍＭオレンジＩＩを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ１０．５）２．５ｍＬを加え、１分間プレインキュベートした。ここに６８０ｎＭ  ペルオキシダーゼ５ｍＬと７５０ｍＭ過酸化水素５ｍＬを５０℃、ｐＨ１０．５において、共存混合させ、任意の時間保存したものを注入して５０℃で反応を開始し、反応開始１分後の４８５ｎｍの値の減少値を求めた。任意の時間、共存混合させ保存したもので反応したときの値を、保存時間０分のサンプルを反応させたときの減少値で割り、これを１００倍したものを残存活性率（％）として求めた。その結果を以下の（表５）に示した。
【００６０】
すなわち、イネ由来ペルオキシダーゼは５０℃、ｐＨ１０．５、３７５ｍＭ過酸化水素下で保存した場合であっても、保存時間５分で７９％、２０分で５１％、４０分で２２％、１２０分でも２１％の残存活性率という高い安定性を有していることが判明した。
【００６１】
【表５】
2007107148.tif 000007
【００６２】
［実施例６］
（イネ由来ペルオキシダーゼの５０℃、ｐＨ１０．５、３７５ｍＭ過酸化水素下における保存時間と速度定数、退色率の関係）
ペルオキシダーゼが過酸化水素と共存する組成物として存在した場合の保存加速試験、および洗濯条件の一つでの安定性評価を実施した。
【００６３】
実施例５と同様に、日立製紫外可視分光光度計Ｕ−２０１０のセル内（光路１ｃｍ）に、０．０６ｍＭオレンジＩＩを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ１０．５）２．５ｍＬを加え、１分間プレインキュベートした。ここに６８０ｎＭ  ペルオキシダーゼ５ｍＬと７５０ｍＭ過酸化水素５ｍＬを５０℃、ｐＨ１０．５において、共存混合させ、任意の時間保存したものを注入して５０℃で反応を開始し、反応開始３０秒後の４８５ｎｍの値から反応速度定数Ｋｔを求めた。また反応直後、および反応開始後３０分後の４８５ｎｍの値から退色率（％）を求めた。その結果を以下の（表６）に示した。
【００６４】
すなわちイネ由来ペルオキシダーゼは５０℃、ｐＨ１０．５、３７５ｍＭ過酸化水素下における保存時間が２０分で０．２５、１２０分後でも０．０５の反応速度定数を示した。退色率も保存時間２０分で５６％、１２０分で３８％であった。高濃度の過酸化水素存在下でも高い保存安定性、反応性を有していることが判明した。
【００６５】
【表６】
2007107148.tif 000008
【００６６】
［実施例７］
（ペルオキシダーゼと過酸化水素前駆体混合物の保存安定性の確認試験）
過酸化水素前駆体混合物として過炭酸ナトリウムを用いて保存安定性試験を行った。漂白剤を含まない市販の酵素入り合成洗剤（ペルオキシダーゼ非含有）２０ｇに過炭酸ナトリウム５ｇ、ペルオキシダーゼ０．１ｇを攪拌混合し、１００ｍＬのポリエチレン容器に入れ、３７℃、暗所で保存した。１ヵ月後、これを０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ９．０）に溶解しサンプルとした。
【００６７】
日立製紫外可視分光光度計Ｕ−２０１０のセル内（光路１ｃｍ）に、０．０６ｍＭオレンジＩＩを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ９．０）２．５ｍＬを加え、１分間プレインキュベートした。ここにサンプル０．２５ｍＬ，および９ｍＭ過酸化水素  ０．２５ｍＬを注入して反応を開始した。反応開始３０分後の４８５ｎｍの値を過酸化水素溶液の代わりに精製水を用いて反応したときの４８５ｎｍの値で割ったものに１００倍を乗し退色率（％）として求めた。その結果を以下の（表７）に示した。
【００６８】
すなわち、保存１ヶ月後も１３％の退色率を示し、洗剤組成物として安定に機能し、また酵素の公知の製剤処方を適用することでさらなる保存安定性も期待しうる結果となった。
【００６９】
【表７】
2007107148.tif 000009
【００７０】
［実施例８］  ２５℃、ｐＨ１０．５における種々の過酸化水素濃度下でのイネ由来ペルオキシダーゼの反応速度定数の検討
日立製紫外可視分光光度計Ｕ−２０１０のセル内（光路１ｃｍ）に、０．０６ｍＭオレンジＩＩを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ１０．５）２．５ｍＬを加え、１分間プレインキュベートした。ここに０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ１０．５）に３４０ｎＭ  ペルオキシダーゼ０．２５ｍＬと種々の濃度の過酸化水素０．２５ｍＬを混合して反応を開始し、オレンジＩＩの最大吸収波長である４８５ｎｍの反応開始後の吸光度の変化から反応速度定数を求めた。
【００７１】
その結果を（表８）に示す。ここに示した過酸化水素濃度は反応開始時の過酸化水素濃度を表す。すなわち過酸化水素濃度が０．７５ｍＭから７５ｍＭまで１．２以上の反応速度定数を示し、それ以上１Ｍ以下でも０．３以上の反応速度を有することが示された。
【００７２】
【表８】
2007107148.tif 000010
【００７３】
［実施例９］  試験布への移染防止効果
イネ由来ペルオキシダーゼによる試験布への移染防止効果について、オレンジＩＩをモデル繊維染料とした系にて検討した。
【００７４】
衣生活研究会の実験用ナイロン白生地を容量比１：１のメタノール−水混合溶液中で水溶性成分を除去した後、風乾し、ついでベンゼンで油性成分を除去し、風乾した。これを試験布（白布、以下同じ）として使用した。
【００７５】
試験布０．２ｇをバイアル瓶に入れ、最終の浴比が１：５０となるようにイネ由来ペルオキシダーゼ（３６０ｎＭ）と過酸化水素（１５ｍＭ）を含むＣａｒｍｏｄｙ緩衝溶液（ｐＨ１０．５）９．５ｍＬを加え、５０℃にて撹拌を開始した。つぎに，バイアル瓶に１ｍＭオレンジＩＩ水溶液を０．５ｍＬ加え、５０℃で３０分間反応を行った。反応後，取り出した試験布を風乾した。続いて、移染防止実験を行った後のオレンジＩＩの試験布への着色の度合いを表すために、ミノルタ製色彩色差計ＣＲ−３００を用いて色差（△Ｅ）を測定した。
【００７６】
尚、ここでいう色差（△Ｅ）とは、国際照明委員会（ＣＩＥ）による感覚的表色法の色相、明度、彩度の３属性ではなく色の感覚を定量的に表示するために定義している数値を示す。すなわち、色差（△Ｅ）のパラメータであるＬ、ａ、ｂを色差計を用いて測定し、以下に示すＨｕｎｔｅｒの色差式（数２）により△Ｅを算出することができる。
【００７７】
【数２】
2007107148.tif 000011
【００７８】
また、比較例として、イネ由来ペルオキシダーゼを添加しない系でも同様の検討を行った。さらに、上記の系に界面活性剤として、アルキルベンゼンスルホネート（ＬＡＳ：陰イオン界面活性剤）を終濃度がそれぞれ７．３５ｍＭとなるように添加した場合についても検討を行った。以下の表−９にそれぞれの試験区の結果をまとめた。
【００７９】
下記に示すとおり、イネ由来ペルオキシダーゼの添加により５０℃、ｐＨ１０．５，過酸化水素濃度１５ｍＭの条件下で試験布へのオレンジＩＩの移染が防止された。また、ＬＡＳの存在下でも移染防止効果が確認された。
【００８０】
【表９】
2007107148.tif 000012
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明は、洗濯またはすすぎ過程における染料移動阻止、並びに、溶液または分散液中の繊維染料の漂白を伴う繊維工業等での排水処理を行う方法、およびその方法に用いる組成物として有用である。