(57)【要約】【課題】結合反応過程を計測することができ、かつ、洗浄操作なしで簡便に使用できる生体分子検出素子を提供する。【解決手段】ソース２、ドレイン３間のゲート絶縁物４の表面に導電性電極５を設けた絶縁ゲート電界効果トランジスタ１を用い、導電性電極５の表面に生体分子検出用プローブ６を固定化する。測定の際には、表面に生体分子検出用プローブ６を固定化した導電性電極５と参照電極７を測定セル８中の測定溶液９中に配置し、参照電極７に電源１０により交流電圧を印加し、タンパク等の測定対象物を含む試料溶液１２の測定溶液９への導入前後で変化する絶縁ゲート電界効果トランジスタ１の電気特性変化、すなわちソース２とドレイン３との間を流れる電流値の変化を検出する。【選択図】図１
2007139468.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定溶液と接触し試料と反応する物質が表面に設けられた導電性電極を有する電界効果型トランジスタと、
前記測定溶液と接触する参照電極と、
前記導電性電極と前記参照電極との間に交流電圧を印加する手段と、
前記電界効果型トランジスタの出力を２回以上計測し差分を計算する手段とを備えることを特徴とする測定装置。
【請求項２】
請求項１記載の測定装置において、前記測定溶液に試料溶液を注入する手段を備えることを特徴とする測定装置。
【請求項３】
請求項２記載の測定装置において、前記試料溶液は生体分子、基質、核酸又はタンパク質を含有することを特徴とする測定装置。
【請求項４】
請求項２記載の測定装置において、前記電界効果型トランジスタの出力の計測は、前記試料溶液注入の前後で行うことを特徴とする測定装置。
【請求項５】
請求項１記載の測定装置において、前記電界効果型トランジスタの出力が安定していることを判断する手段を備えることを特徴とする測定装置。
【請求項６】
請求項５記載の測定装置において、前記電界効果型トランジスタの出力が安定していることを判断する手段は、前記試料溶液注入後の経過時間t、前記試料溶液注入後の前記電界効果型トランジスタの出力の変化値Δx、前記電界効果型トランジスタの出力の時間微分値s、0.4以下の基準値rの間でst/Δx＜rが成り立つか否かによって判断することを特徴とする測定装置。
【請求項７】
請求項１記載の測定装置において、前記交流電圧の周波数を用いて出力を平均化する手段を備えることを特徴とする測定装置。
【請求項８】
請求項７記載の測定装置において、前記出力を平均化する手段は、交流電圧の周波数f、サンプリング周波数fs、平均化回数n、任意の自然数m，lの間で、nf=mfsかつf/fs≠lの関係式が成り立つようにサンプリングと平均化を行う手段を備えることを特徴とする測定装置。
【請求項９】
請求項１記載の測定装置において、前記導電性電極は前記電界効果型トランジスタのゲートと導電性配線で接続されていることを特徴とする測定装置。
【請求項１０】
請求項１記載の測定装置において、前記交流電圧の周波数は１０ｋＨｚ以上であることを特徴とする測定装置。
【請求項１１】
請求項１記載の測定装置において、前記導電性電極は金からなることを特徴とする測定装置。
【請求項１２】
請求項１記載の測定装置において、前記電界効果型トランジスタは、ソースをドレインに電気的に結合するチャネルの形状がジグザグ形状をしていることを特徴とする測定装置。
【請求項１３】
請求項１記載の測定装置において、前記参照電極は前記電界効果型トランジスタと同じ基板上に形成されていることを特徴とする測定装置。
【請求項１４】
請求項１記載の測定装置において、前記導電性電極表面に生体分子検出プローブが固定化されていることを特徴とする装置。
【請求項１５】
試料と反応する物質が表面に設けられた導電性電極を有する電界効果型トランジスタの前記導電性電極を測定溶液に接触させ、前記導電性電極と前記測定溶液に接触した参照電極との間に電圧を印加し、試料と前記導電性電極表面の前記物質との反応の前後で前記トランジスタの電気特性を計測し、反応の前の計測値と反応した後での計測値の差分を計算することを特徴とする測定方法。
【請求項１６】
請求項１５記載の測定方法において、少なくとも反応前の前記トランジスタの電気特性を計測する前に、前記導電性電極と前記参照電極との間に１ｋＨｚ以上の交流電圧を印加することを特徴とする測定方法。
【請求項１７】
請求項１５記載の測定方法において、少なくとも反応後の前記トランジスタの電気特性を計測する前に、前記導電性電極と前記測定溶液に接触した参照電極との間に１０ｋＨｚ以上の交流電圧を印加することを特徴とする測定方法。
【請求項１８】
請求項１５記載の測定方法において、前記導電性電極は生体分子検出プローブが表面煮固定化されていることを特徴とする測定方法。
【請求項１９】
請求項１５記載の測定方法において、前記トランジスタの電気特性の計測を複数回行い、前記試料溶液注入後の経過時間t、前記試料溶液注入後の前記電界効果型トランジスタの出力の変化値Δx、前記電界効果型トランジスタの出力の時間微分値s、0.4以下の基準値rの間でst/Δx＜rが成り立つときに測定した計測値を前記反応後の計測値とすることを特徴とする測定方法。
【請求項２０】
請求項１７記載の測定方法において、交流電圧の周波数f、サンプリング周波数fs、平均化回数n、任意の自然数m，lの間で、nf=mfsかつf/fs≠lの関係式が成り立つように前記計測値のサンプリングと平均化を行うことを特徴とする測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質等の生体物質を洗浄操作なしで簡便に測定することのできる測定装置及び測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
代表的なタンパク質の測定法である酵素免疫測定法は、抗体が特定のタンパク質に選択的に結合する反応、すなわち抗原抗体反応を利用しており、その測定法は、大きく分けて、サンドイッチ法と競合反応法がある。サンドイッチ法は、固体表面に固定化し不溶化した抗体（固相化抗体）に測定対象の抗原が結合し、さらにこの抗原を固相化抗体と共にはさみこむように酵素標識した抗体（標識化二次抗体）が抗原に結合する性質を用いている。抗原と結合した標識化二次抗体の量を計測することで、測定対象の抗原の量を求める。競合反応法は、濃度未知である測定対象の非標識抗原と濃度既知である酵素標識した抗原の間で、固相化抗体への結合が競合する性質を用いている。標識した抗原の結合量は、測定対象の抗原と標識した抗原の濃度比によって決まるため、標識した抗原の結合量を測定することで、測定対象の抗原の量を求める(Clinical Chemistry 22, (1976) 1243-1255)。標識には、酵素の他に、蛍光体、放射性同位体などを用いることもあるが、いずれの場合も、結合抗体又は抗原と非結合抗体又は抗原を区別するために、非結合抗体又は抗原を洗浄操作により除去する。そして、抗体と抗原の結合する反応は、結合状態と非結合状態が平衡に達するまで行う。また、抗体の代わりに、特定のタンパク質と特異的に結合する一本鎖ＤＮＡ（アプタマーＤＮＡ）を用いたものもある(Analytical Biochemistry 282, (2000) 142-146)。
【非特許文献１】Clinical Chemistry 22, (1976) 1243-1255
【非特許文献２】Analytical Biochemistry 282, (2000) 142-146
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
酵素免疫測定法は、非結合抗体又は抗原と結合抗体又は抗原を区別することができないため、結合抗体又は抗原を測定するためには、非結合抗体又は抗原を洗浄操作により除去する作業が必要であり、この作業は煩雑であった。さらに、洗浄操作は、結合した抗体と抗原の平衡状態を崩してしまう可能性があるため、作業には熟練が必要である。また、結合状態と非結合状態が平衡状態に達するまでの時間は、他の実験により求めるか、経験を基に判断する必要があった。
【０００４】
本発明の目的は、洗浄操作なしで簡便に使用でき、かつ結合反応過程を計測することができる生体分子検出素子を用いた、生体物質の測定装置及び測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、本発明では生体分子検出素子として、導電性電極を有する電界効果型トランジスタを用いた。導電性電極を有する電界効果型トランジスタは、導電性電極表面に結合した分子に対してのみ応答し、非結合分子に対しては応答しないため、非結合分子を除去するための洗浄操作を行うことなく、電極表面への測定対象分子の結合の有無を測定できる。そこで、導電性電極に生体分子検出プローブを固定化することで、生体分子検出プローブと結合していない生体分子を除去するための洗浄操作を行うことなく、測定対象の生体分子の生体分子検出プローブへの結合の有無を測定することができる。
【０００６】
測定溶液中に試料溶液を導入する前後での電界効果型トランジスタの出力の差分を計算することで外部変動を除去し、測定対象分子の導電性電極もしくは生体分子検出プローブへの結合による電界効果型トランジスタの出力の変化分のみを計測することができる。さらに、試料溶液導入後の電界効果型トランジスタの出力の変化を複数回測定し比較することによって、測定対象分子の導電性電極もしくは生体分子検出プローブへの結合の反応が平衡に達したことを知ることができる。
【０００７】
溶液中で導電性電極を使用する際に問題となる電極上の電気二重層の影響は、導電性電極と参照電極間に交流電圧を印加することにより、容易に除くことができる。尚、この交流電圧印加により、検出プローブと測定対象物との結合が外れることはない。また、導電性電極に金等の貴金属を用いることにより、溶液中の電極表面での反応は起こらない。さらに、この交流電圧印加により、試料溶液を注入する際に表面の電位が不安定になることを抑制できるため、生体分子検出プローブへの結合の反応過程を測定することができる。導電性電極と参照電極間に交流電圧を印加することにより電界効果型トランジスタの出力に生じるノイズは、交流電圧の周波数を考慮し平均化することにより除くことができる。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によると、表面反応検出素子として導電性電極を有する電界効果型トランジスタを用いて、測定対象を導入したことで生じる導電性電極表面での反応の時間変化を測定することにより、測定対象と導電性電極表面もしくは測定対象と生体分子検出プローブの結合の反応過程を計測することができる。そのため、洗浄操作は不要になり、簡便に測定でき、かつ、測定対象添加による反応の終了を検出することができる。また、洗浄操作が不要であるため、洗浄を自動化するための装置や送液装置（フロー装置）が不要となり、装置が小型になる。測定の際に問題となる電極表面上の電気二重層の影響は、電極と参照電極間に交流電圧を印加することにより、容易に除くことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
図１は、本発明による生体分子検出素子の構成例を示す図である。本発明に使用する絶縁ゲート電界効果型トランジスタ１は、シリコン基板の表面にソース２、ドレイン３及びゲート絶縁物４を形成し、ソース、ドレイン間のゲート絶縁物表面に導電性電極５を設けてある。実際の測定の際には、導電性電極５と参照電極７を測定セル８中の測定溶液９中に配置し、参照電極７に電源１０により直流電圧（バイアス成分）及び交流電圧を印加し、試料注入器１１により試料溶液１２を注入し、絶縁ゲート電界効果型トランジスタ１の電気特性変化、すなわちソース２とドレイン３との間を流れる電流値の変化を検出することにより、導電性電極５の表面で生じる反応の過程を測定する。１３は試料注入管である。測定溶液には、硫酸ナトリウム水溶液、塩化ナトリウム水溶液、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液等を用いる。
【００１０】
導電性電極５の表面に生体分子検出プローブ６を固定化することにより、試料溶液１２中に含まれるＤＮＡやタンパク質などの測定対象物と生体分子検出プローブ６の反応の過程を測定することができる。生体分子検出プローブ６は、一本鎖ＤＮＡ断片等の核酸、抗体、抗原、酵素等のタンパク質・ペプチド、糖類等を用いることができる。生体分子検出用プローブの選択性は、生体成分固有の構造に由来する特異的な結合力（アフィニティ）の違いに基づいている。参照電極７は、測定溶液９中の導電性電極５の表面で起こる平衡反応あるいは化学反応に基づく電位変化を安定に測定するために、基準となる電位を与える。通常は参照電極としては、飽和塩化カリウムを内部溶液に使用している銀・塩化銀電極、あるいは甘こう（カロメル）電極が用いられるが、測定する試料溶液の組成が一定の場合には、疑似電極として銀・塩化銀電極のみを使用しても問題はない。参照電極７に所定の電圧を印加することにより、絶縁ゲート電界効果型トランジスタ１の電気的特性の動作点（すなわち、閾電圧）を調整することができる。
【００１１】
好ましくは、絶縁ゲート電界効果型トランジスタ１は、シリコン酸化物を絶縁膜として用いる金属酸化物半導体（Metal-oxide-semiconducor）電界効果型トランジスタ（ＦＥＴ）であるが、薄膜トランジスタ（ＴＦＴ）を用いても問題はない。ここでは、導電性電極の上に生体分子検出用プローブを固定した例を述べたが、生体分子検出用プローブの代わりにイオン感応膜を形成してもよい。例えば、ｐＨ計測の場合にはイオン感応膜として窒化シリコン（Ｓｉ3Ｎ4）や酸化タンタル（Ｔａ2Ｏ5）等の固体膜を、カリウムイオンの場合にはバリノマイシンを含有した液膜を形成すればよい。
【００１２】
図２は、本発明による生体分子検出素子を用いた生体分子測定装置を示すブロック図である。本発明の計測システムは、測定部２０、信号処理回路２１、データ処理装置２２、データ表示保存装置２３から構成される。測定部２０内には、絶縁ゲート型電界効果型トランジスタ１、参照電極７、試料注入器１１が配置されている。絶縁ゲート型電界効果型トランジスタ１の電流値が信号処理回路２１に伝達される。
【００１３】
測定手順は以下の通りである。最初、導電性電極５、及び導電性電極５の表面に固定化された生体分子検出用プローブ６と参照電極７を測定セル８中の測定溶液９中に配置し、参照電極７に電源１０によりバイアス成分を含む交流電圧を印加する。試料注入器１１を用いて測定セル８中の測定溶液９に試料溶液１２を導入する。導入した試料溶液１２中の分子が導電性電極５と結合したり、試料溶液１２中の生体物質が導電性電極５の表面に固定化された生体分子検出用プローブ６と結合したりすると、絶縁ゲート電界効果型トランジスタ１の電気特性が変化する。その電気特性変化を信号処理回路２１で処理し、データ処理装置２２でデータ処理を行い、データ表示保存装置２３でデータの表示及び保存を行う。
【００１４】
図３は、信号処理回路２１での信号処理方法を示すブロック図である。信号処理回路２１は、サンプリング装置４２、平均化装置４３から構成される。入力信号４１は、測定部２０からの出力値、すなわち絶縁ゲート型電界効果型トランジスタ１の電流値である。
【００１５】
信号処理手順は以下の通りである。入力信号４１をサンプリング周波数fsでサンプリングを行う。各サンプリングにより得られた値を平均化装置４３で平均化回数n回の平均化を行う。平均化した値を、出力信号４４としてデータ処理装置２２に伝達する。
【００１６】
この信号処理は、電源１０から印加した高周波に対して絶縁ゲート型電界効果型トランジスタ１が応答するために生じる成分を除去するために行う。電源１０から印加した高周波の周波数をf、時刻をtとすると、印加した高周波に対するトランジスタからの出力は、次式で表される。
【００１７】
【数１】
2007139468.tif 000003
【００１８】
式(1)で表される成分を入力信号４１に与えた場合、出力信号４４は、サンプリング装置４２のサンプリング周波数fs、平均化装置４３の平均化回数nを用いて、式(2)で表される。
【００１９】
【数２】
2007139468.tif 000004
【００２０】
ここで、下式(3)が成り立つならば、式(2)の値は０となり、出力信号４４は０となる。式(3)の条件が成り立つように、サンプリング装置４２のサンプリング周波数fs、平均化装置４３の平均化回数nを設定することによって、電源１０から印加した高周波に対して絶縁ゲート型電界効果型トランジスタ１が応答するために生じるノイズ成分は完全に除去できる。
【００２１】
【数３】
2007139468.tif 000005
【００２２】
しかしながら、トランジスタの電気特性は、図４のようにドレイン電流値はゲート電圧に対して、完全には線形でない。ここで、トランジスタの電流・電圧特性の測定は、半導体パラメータアナライザ（Agilent 4155C Semiconductor Parameter Analyzer）を用いて、図５に示す構成で行った。絶縁ゲート型電界効果型トランジスタ１のソース２とドレイン３の間に、ドレインソース間電圧１０７を印加し、ソース２と導電性電極５の間にゲート電圧６(VG)を印加し、ドレイン３に流れる電流IDを電流計１０８により測定した。ドレインソース間電圧１０７は0.5Vとした。
【００２３】
印加する高周波の振幅が小さい場合は、ドレイン電流値はゲート電圧に対してほぼ線形であるとみなしても問題がない。そのため、測定部２０からの出力としてドレイン電流値を用いても式(1)は成り立つ。しかし、印加する高周波の振幅がドレイン電流値はゲート電圧に対する非線形性を無視できないほど大きい場合、測定部２０からの出力としてドレイン電流値を用いると、式(1)は成り立たなくなる。そこで、測定部２０からの出力のドレイン電流値を、図４の関係を用いてゲート電圧に変換することにより、式(1)が成り立つようになる。
【００２４】
ドレイン電流値をゲート電圧に変換する方法は、図４の関係を用いて計算機の演算によって変換する方法のほかに、電気回路を用いて行う方法もある。図６は、電気回路を用いてドレイン電流値をゲート電圧へ変換する方法を示すブロック図である。測定用絶縁ゲート型電界効果型トランジスタ５１、測定部５３、比較用絶縁ゲート型電界効果型トランジスタ５２、比較部５４、フィードバック回路５５から構成される。測定部５３から出力されたドレイン電流値と、比較部５４から出力されたドレイン電流値が同一の値となるように、フィードバック回路５５を用いて比較用絶縁ゲート型電界効果型トランジスタ５２の導電性電極５６に電圧を印加する。そして、その印加電圧を出力とすることで、ドレイン電流値をゲート電圧に変換することができる。
【００２５】
図７（ａ）は、データ処理装置でのデータ処理方法を示すフロー図である。ステップ１１で参照電極７に電源１０によりバイアス成分を含む1KHz以上の交流電圧を印加する。ステップ１２で電圧印加後5分以上待機する。ステップ１３で信号処理回路２１からの出力を記録し、x0とする。ステップ１４で試料注入器１１を用いて測定セル８中の測定溶液９に試料溶液１２を導入する。このときを時刻t = 0とする。ステップ１５で信号処理回路２１からの出力を記録しx1とし、時刻を記録しt1とする。ステップ１６で信号処理回路２１からの出力を記録しx2とし、時刻を記録しt2とする。ステップ１７でステップ１５とステップ１６で記録した値の傾きsを、次式を用いて計算する。
【００２６】
【数４】
2007139468.tif 000006
【００２７】
ステップ１８で、導電性電極５上での反応が平衡に達し、信号処理回路２１からの出力が安定したかを判定する。判定は、次式を用いて行う。
【００２８】
【数５】
2007139468.tif 000007
【００２９】
この式が成り立つならステップ１９に進み、この式が成り立たない場合はステップ１５に戻る。ステップ１９では、測定溶液９に試料溶液１２を導入したことによる信号処理回路２１からの出力の変化Δxを、次式を用いて計算し、出力する。
【００３０】
【数６】
2007139468.tif 000008
【００３１】
ステップ１８における判定は、以下の根拠に基づく。測定溶液９に試料溶液１２を導入したことによる信号処理回路２１からの出力の変化Δxが、次式の緩和曲線に従うと仮定する。
【００３２】
【数７】
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【００３３】
ここで、ΔxTは、平衡状態に達したときの出力の変化、tは試料注入時を0としたときの時刻、τは緩和時間とする。このとき、出力の時間変化は、式(8)である。式(9)とおくと、式(7)(8)から式(10)が導かれる。
【００３４】
【数８】
2007139468.tif 000010
【００３５】
式(10)の右辺の式を、横軸をuとして図８に表す。通常の酵素免疫測定法において、定量精度が80%程度あれば実用上十分であるため、実用上はΔxがΔxTの80%に達したことを判断できれば良い。ΔxがΔxTの80%に達したことは、式(11)のように表され、このとき、式(12)である。式(12)において、式(13)としたとき、上式(5)が得られる。
【００３６】
【数９】
2007139468.tif 000011
【００３７】
また、式(10)と式(13)から求まる下式(14)をもとに、uを求め、式(6)(7)から求まる下式(15)に代入し、ΔxTを求めることもできる。
【００３８】
【数１０】
2007139468.tif 000012
【００３９】
図７（ａ）のステップ１５から１７の代わりに、図７（ｂ）のステップ２１から２４のような複数回の記録をもとに傾きを判定しても良い。この場合、傾きの判定には、多項式や指数関数を用いて最小二乗法などによりフィッティングを行うことが好ましい。また、ステップ１９での出力には、複数回の記録をもとに平均化やフィッティングを用いても良い。
【００４０】
図９は、本発明の他の実施例である絶縁ゲート電界効果トランジスタの構造例を示す図である。図９（ａ）、（ｂ）は、各々断面構造及び平面構造を表わしている。絶縁ゲート電界効果トランジスタ８１は、シリコン基板の表面にソース８２、ドレイン８３、及びゲート絶縁物８４を形成し、導電性電極８５を設けてある。検出プローブを固定化する導電性電極８５と絶縁ゲート電界効果トランジスタのゲート８６を導電性配線８７で接続してある。本構造を採用することにより、プローブを固定化する導電性電極８５を任意の場所に、かつ任意の大きさに形成できる。測定対象に応じて、測定感度を向上させるためにプローブ固定化電極面積を大きくすることも容易である。さらに、測定対象の違う様々なセンサチップを作製する場合にも個別に作製する必要がなく、従来の半導体プロセスを用いてプローブ固定化電極以外の部分を共通に作製し、最後に測定対象に合わせてプローブ固定化電極及び測定対象物の固定化を行なうことができ、大幅に製作コストが低減できる。
【００４１】
図１０（ａ）、（ｂ）は、図１に示した参照電極７に交流電圧を印加して、導電性電極５上の電気二重層の影響を除去した効果を示す図である。トランジスタの電流・電圧特性、インピーダンス、電気容量等の測定は、半導体パラメータアナライザ（Agilent 4155C Semiconductor Parameter Analyzer）及びインピーダンスアナライザ（Agilent 4294A Precision Impedance Analyzer）を用いて行った。溶液中の評価は、ゲート側に参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極）を使用して行った。ゲートへの交流電圧印加は、中心電圧５０ｍＶ、振幅電圧５０ｍＶで行った。図１０（ｂ）は、図１０（ａ）中の点線円中を拡大して表示したものである。
【００４２】
導電性電極５は、フローティングゲートとして用いられる。溶液中では導電性電極５の表面に電気二重層が形成され、絶縁ゲート電界効果トランジスタ１の電気特性変化に影響し、大きなバックグランドノイズとなる。特に、導電性電極５として金、銀等の貴金属を使用する場合には顕著である。本実施例では、導電性電極５として金を使用し、この電気二重層の影響を除去するために、参照電極７に交流電圧を印加している。図１０（ｂ）に示すように、直流（ＤＣ）印加に比べて、交流電圧を加えた場合にはドレイン電流値（ＩＤ）が減少し、電気二重層の影響除去の効果があることが分かる。その際、印加する交流電圧の周波数を大きくすることにより、ドレイン電流値（ＩＤ）は単調に減少し、交流電圧印加の効果が大きいことが分かる。
【００４３】
また、導電性電極上の電気二重層の大きさは、電気容量の大きさに比例する。実際に測定した金電極表面上の電気二重層の電気容量の印加電圧周波数依存性を図１１に示す。図１１（ａ）は、絶縁ゲート電界効果トランジスタの電気容量を表わしており、周波数依存性は無くほぼ一定の値である。一方、図１１（ｂ）は溶液中の値、すなわち絶縁ゲート電界効果トランジスタ単体の電気容量と金電極表面の電気二重層の電気容量の合計である。この場合、電気的等価回路ではコンデンサと見なせるため、測定値の逆数は各々の値の逆数の和を表わしている。図１１（ｂ）に示すように、交流電圧を印加することにより、電気容量は本来の絶縁ゲート電界効果トランジスタ単体の電気容量の値に近づき、１００ｋＨｚ以上でほぼ同じになった。すなわち、１００ｋＨｚ以上の交流電圧を印加すれば、金電極表面の電気二重層の影響をほぼ完全に除くことができることを示している。
【００４４】
交流電圧印加の効果を、他の実施例を用いて説明する。図１２（ａ）、（ｂ）は、測定開始からドレイン電流が安定するまでの経時変化を示した図である。使用した絶縁ゲート電界効果トランジスタの金電極表面には、２１塩基の一本鎖ＤＮＡ（5'-HS-(CH2)6-TACGC CACCA GCTCC AACTA C-3’、k-ras coden12遺伝子と相補的な配列）が６個の炭素鎖を介してチオールと金との結合により固定化されている。図１２（ａ）は正電位を、図１２（ｂ）は負電位を印加した場合のドレイン電流の経時変化を示している。通常の測定では、参照電極への電圧印加は直流を使用するが、絶縁ゲート電界効果トランジスタに試料溶液を導入すると、金電極表面の電位が変化し、安定するまでに３０分以上の時間を要する。しかし、図１２（ａ）、（ｂ）に示すように正電位印加、負電位印加いずれの場合も、印加する電圧の周波数を大きくすると、ドレイン電流値が安定化するまでの時間が短くなることが分かる。
【００４５】
その結果を、周波数と安定化するまでの時間の関係として図１３に表わしている。図１３が示すように、安定化するまでの時間は、正電位印加（●で表示）、負電位印加（○で表示）いずれの場合も、印加する電圧の周波数が１ｋＨｚ以上でほぼ一定になった。尚、低周波印加電圧の場合に、正電位電圧印加に比べ負電位電圧印加の安定化時間が短いのは、ＤＮＡが負電荷を帯びており、金電極表面と反発した状態、すなわちＤＮＡ断片が立った状態になっていることに起因していると思われる。
【００４６】
本発明の交流電圧印加の効果を、他の実施例を用いて説明する。一般に、チオールを有する化合物は、金表面と反応してＡｕ−Ｓ結合し、高密度・高配向な自己組織化単分子膜（Self-Assembled Monolayers; SAMs）を形成することが知られている。その性質を利用して表面状態もアルキル基や末端の官能基、主鎖の親水基などにより容易に変化させることができる。例えば、図１４に示すように、アルカンチオール９１の末端の官能基にアミノ基を用いれば、金電極９２の表面は正電荷９３になり、アルカンチオール９４の末端の官能基にカルボキシル基を用いれば、金電極９５の表面は負電荷９６になる。この性質を利用して、本発明のトランジスタの金電極上の表面電荷状態を変化させたサンプルを作製し、交流電圧印加の効果を調べた。金電極表面の電荷状態が違うサンプルは、末端の官能基の違うアルカンチオール；アミノ基（１１−アミノ−１−ウンデカンチオール；１１−ＡＵＴ）、水酸基（１１−ヒドロキシ−１−ウンデカンチオール；１１−ＨＵＴ）、カルボキシル基（１０−カルボキシ−１−デカンチオール；１０−ＣＤＴ）を用いた。金電極への固定化は、金電極をアルカンチオールエタノール溶液中に約１時間浸漬し、その後、エタノール及び純水で洗浄して使用した。
【００４７】
電荷状態の違いを測定した結果を、図１５（ａ）、（ｂ）に示す。本実験においても、図１２（ａ）、（ｂ）で説明したように、参照電極に直流電圧を印加した場合にはドレイン電流値が安定化するまで１時間以上要した。そのため、参照電極に直流電圧を印加した場合は測定溶液に浸漬１時間後のデータで、１ＭＨｚの交流電圧印加の場合は測定溶液に浸漬５分後のデータである。アルカンチオールを固定化することにより、未処理金電極（図中ではbareと表記）に比べて、ドレイン電流が減少した。さらに、末端の官能基に違いを反映し、アミノ基（正電荷；＋１）、水酸基（中性電荷；±０）、カルボキシル基（負電荷；−１）の順番にドレイン電流が流れやくなった。つまり、金電極表面にプラスチャージが存在するとドレイン電流が流れやすくなる。反対に金電極表面にマイナスチャージが存在するとドレイン電流が流れ難くなる（図１５（ａ））。この傾向はＦＥＴセンサの特性を良く表わしており、センサが正常に駆動していることを示している。
【００４８】
図１５（ｂ）に示すように、ゲート（すなわち、参照電極）に交流電圧（１ＭＨｚ）を印加すると、全体のドレイン電流が小さくなり、かつ末端の官能基に違いよるドレイン電流の差も大きくなり、交流電圧印加の効果があることが分かる。本実験に使用した金電極の面積（０．１６ｍｍ２；０．４×０．４ｍｍ）と金電極上のアルカンチオールの密度（４個／ｎｍ２）を用いると、本測定では約１ｐｍｏｌの分子の電荷の違いを検出できたことになる。尚、金電極上のアルカンチオールの密度は、強アルカリ条件下のボルタンメトリーにより測定した。
【００４９】
本発明の交流電圧印加の効果を、他の実施例を用いて説明する。図１６（ａ）は、図２に示した参照電極７に交流電圧を印加して、試料溶液１２を測定溶液９内に導入した際のドレイン電流の経時変化を示す図である。図１６（ｂ）は、図１６（ａ）の試料溶液導入前後を拡大したものである。参照電極７にはＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極を使用した。参照電極７への交流電圧印加は、中心電圧１００ｍＶ、振幅電圧１００ｍＶで行った。測定開始時の絶縁ゲート電界効果型トランジスタ１の導電性電極５には未処理金電極を用いた。測定溶液９には0.1M Na2SO4水溶液1.9mlを用いた。試料溶液１２にはアルカンチオール水溶液として1mM 6-HHT（６−ヒドロキシ−１−ヘキサンチオール；HS-(CH2)6-OH）水溶液0.1mlを用いた。
【００５０】
測定開始600秒後に、試料溶液１２全量を測定溶液９に導入した。いずれの周波数でも、試料溶液１２の導入後、ドレイン電流値の減少が見られた。周波数が1KHz以下の場合には、ドレイン電流値は減少後再び増加し、安定化までには10分以上を要した。一方で、周波数が10KHz以上の場合には、ドレイン電流値は減少後ほとんど増加することなく、安定化までの時間は周波数が1KHz以下の場合と比べて短かった。これは、周波数が1KHz以下の場合には、試料溶液１２を導入したことにより、導電性電極５の表面電位が不安定になるが、周波数が10KHz以上の場合には、試料溶液１２を導入による導電性電極５の表面電位の乱れが無くなるためであると考えられる。この交流電圧印加により表面電位を安定化させる効果により、周波数を10KHz以上とすることで、導電性電極５の表面で生じる反応の過程を測定することができるようになる。
【００５１】
試料溶液１２の導入によりドレイン電流値が減少したことは、図１５によって説明できる。図１４では、未処理金電極の電流値よりも１１−ＨＵＴを固定化した金電極の電流値の方が小さくなっている。６−ＨＨＴが固定化された金電極の電流値も同様に、未処理金電極の電流値よりも小さくなる。すなわち、試料溶液１２の導入により導電性電極５上に６−ＨＨＴが固定化されたために、ドレイン電流値は減少した。この固定化は、次の化学反応によって書き表される。
Au+HS-(CH2)6-OH → Au-S-(CH2)6-OH+1/2H2
【００５２】
図１７は、試料溶液１２に用いたアルカンチオール水溶液の濃度が異なるときに、反応速度が異なることを示す図である。アルカンチオール水溶液として0.05mM 6-HHT水溶液0.1mlと1mM 6-HHT水溶液0.1mlを用いた。参照電極７への交流電圧印加は、中心電圧１００ｍＶ、振幅電圧１００ｍＶ、周波数１ＭＨｚで行った。測定開始時の絶縁ゲート電界効果型トランジスタ１の導電性電極５には未処理金電極を用いた。測定溶液９には0.1M Na2SO4水溶液1.9mlを用いた。
【００５３】
1mMの場合は反応が1分以内に終了しているが、0.05mMの場合は反応が終了するのに10分以上かかっている。このように、濃度により反応速度が異なることを測定できたのは、試料溶液導入の前後で測定を行い、交流電圧を印加したためである。従来は反応が終了するまでの時間を推測、もしくは別途測定により検討する必要があったが、試料溶液導入の前後で測定を行い、ドレイン電流値が安定したか判断することにより、反応により変化したドレイン電流値の差分を迅速にかつ確実に得ることができる。
【００５４】
表面状態検出素子を用いたタンパク質検出法を以下に説明する。図２の構成において、導電性電極５に金電極を、生体分子検出用プローブ６にタンパク質検出プローブを、参照電極７にＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極を、参照電極７への交流電圧印加には中心電圧５０ｍＶ、振幅電圧５０ｍＶ、周波数１ＭＨｚを、測定溶液９には0.1M リン酸バッファー(pH7)450μLを、試料溶液１２には750nMのトロンビンを含む0.1M リン酸バッファー(pH7)50μLを用いた。
【００５５】
タンパク質検出プローブとして、タンパク質の一種のトロンビンと特異的に結合する一本鎖ＤＮＡ（アプタマーＤＮＡ；HS-(CH2)6-5'-TTTTT TTTTT GGTTG GTGTG GTTGG-3'）を用いた。タンパク質検出プローブの固定化の際に、アルカンチオールとの混合液を用いることで、タンパク質検出プローブの固定化密度を制御した。アルカンチオールとして、６−ヒドロキシ−１−ヘキサンチオールを用い、タンパク質検出プローブとアルカンチオールの濃度比を１：１０とし、タンパク質検出プローブの密度を2.6×1012個/cm2に制御した。タンパク質検出プローブが格子状に固定化されていると仮定すると、タンパク質検出プローブの間隔は6.2nmであり、この間隔はトロンビンの直径約5nmよりも大きい。尚、金電極上のタンパク質検出プローブの密度は、強アルカリ条件下のボルタンメトリーにより測定した。
【００５６】
測定した結果を図１８に示す。試料溶液の導入から30秒程度遅れて、ドレイン電流値は減少した。30秒程度の遅れは、導入した試料溶液の拡散にこの程度の時間を要したためである。ドレイン電流値の減少は、タンパク質検出プローブとトロンビンが結合したことにより、金薄膜表面の電位が変化したためである。すなわち、試料溶液注入によるドレイン電流の時間変化を測定することにより、非結合タンパク質を洗浄操作により除去することなくタンパク質検出プローブと試料溶液内の測定対象タンパク質（トロンビン）との結合を測定することができた。結果、非結合タンパク質を洗浄操作により除去することなく、試料溶液内に測定対象タンパク質が含まれていることを明らかにした。
【００５７】
本実施例の他にも、タンパク質検出プローブとして、抗体、抗原、又は抗体の一部分（例えば、Fab'）を固定化することで、様々な抗体、抗原を洗浄操作なしで測定することができる。
【００５８】
図１９は、本発明による生体分子検出素子の他の構成例を示す図である。本実施例の生体分子検出素子は、同一素子にサンプル測定用電極とリファレンス用電極を混載したものである。本実施例の素子は、サンプル測定用電極１１１、リファレンス用電極１１２、及び温度計測用ダイオード１１３が混載された構造になっている。本素子のサンプル測定用電極１１１及びリファレンス用電極１１２は、各々絶縁ゲート電界効果トランジスタのゲート１１４，１１５と導電性配線１１６，１１７で接続されている。すなわち、本素子は延長ゲート型の構造である。また、絶縁層はＳｉＯ2（厚さ１７．５ｎｍ）で、電極として金電極（４００μｍ×４００μｍ）を用いている。尚、本素子も水溶液を使用するため、ＦＥＴの閾値電圧を−０．５Ｖ付近に設定してある。本素子に混載する温度計測用ダイオードはｎ＋／ｐ接合型を用いた。
【００５９】
図２０は、本発明による生体分子検出素子の他の構成例を示す図である。本発明で使用する素子の動作原理は、ゲートあるいはフローティングゲート（すなわち、導電性電極）表面に固定したプローブに測定対象物が結合する際に生じるゲート表面の電位変化により、ソース・ドレイン間の電流が変化する原理に基づいている。その際のドレイン電流ＩDは次式で表される。
【００６０】
【数１１】
2007139468.tif 000013
【００６１】
ここで、Ｗはチャネル幅、Ｌはチャネル長、μcは移動度、ＣGはゲート絶縁膜と金表面の結合電気容量、ＶGはゲート電圧、Ｖtはチャネルが形成される閾値電圧、ＶDSはソース・ドレイン間の電圧である。
【００６２】
そのため、本素子の測定感度を向上させるためには、電流の変化率、すなわちＷ／Ｌを大きくすれば良い。従来は測定感度向上のために、チャネル幅を長くし、チャネル長を短くするためチャネルの形状が縦長の構造（例えば、Ｗ／Ｌ＝１００／１）になっていた。本実施例では、図２０に示すように、ソース１２１とドレイン１２２をくし形にし、その間のチャネルをジグザグ形状１２３にし、ソース１２１、ドレイン１２２の間のチャネルの長さと幅の比を大きくした（Ｗ／Ｌ＝４８０／１）。本構造では、４００×４００μｍの形状の中にくし形構造を形成してあり、同じ広さの中に形成した従来の構造（例えば、４００×５μｍ）に比べて、約６倍以上の高感度である。尚、本素子の導電性電極１２４と絶縁ゲート電界効果トランジスタのゲート（ジグザグ形状のチャネル１２３の上層部）が導電性配線１２５で接続されている。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】本発明による生体分子検出素子の構成例を示す図。
【図２】本発明による生体分子検出素子を用いた生体分子測定装置を示すブロック図。
【図３】本発明による信号処理方法を示すブロック図。
【図４】本発明による絶縁ゲート電界効果トランジスタの電気特性の測定結果を示す図。
【図５】本発明による絶縁ゲート電界効果トランジスタの電気特性の測定方法を示す図。
【図６】本発明による絶縁ゲート電界効果トランジスタのドレイン電流値をゲート電圧値に変換する方法を示す図。
【図７】本発明による生体分子検出素子を用いた生体分子測定方法を示すフローチャート。
【図８】式(10)の関係を示す図。
【図９】本発明による絶縁ゲート電界効果トランジスタの構造例を示す図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は断面図。
【図１０】（ａ）は参照電極に交流電圧を印加した際の各周波数でのドレイン電流値を示す図であり、（ｂ）は（ａ）中の点線円中の拡大図。
【図１１】絶縁ゲート電界効果トランジスタの電気容量の周波数依存性の測定結果を示す図であり、（ａ）は単体（すなわち、空気中）の測定結果、（ｂ）は溶液中の測定結果を示す図。
【図１２】測定開始からドレイン電流が安定するまでの経時変化を示す図であり、（ａ）は正電位印加時の図、（ｂ）は負電位印加時の図。
【図１３】測定開始からドレイン電流が安定するまでの時間と周波数の関係を示す図。
【図１４】アルカンチオールを用いた金表面の電荷状態制御法を示す図。
【図１５】生体分子検出素子による表面の電荷の違いを検出した一例を示す図。
【図１６】試料溶液導入後のドレイン電流値の経時変化の周波数依存性を示す図。
【図１７】試料溶液導入後のドレイン電流値の経時変化の試料溶液濃度依存性を示す図。
【図１８】生体分子検出プローブにアプタマーＤＮＡを用いて、プローブに対するトロンビンの結合過程を測定した例を示す図。
【図１９】本発明による生体分子検出素子の他の構成例を示す図。
【図２０】本発明による生体分子検出素子の他の構成例を示す図。
【符号の説明】
【００６４】
１，５１，５２，８１，１０１…絶縁ゲート電界効果トランジスタ、２，８２，１０２…ソース、３，８３，１０３…ドレイン、４，８４，１０４…ゲート絶縁物、５，８５，１０５…導電性電極、６…生体分子検出用プローブ、７…参照電極、８…測定セル、９…測定溶液、１０…電源、１１…試料注入器、１２…試料溶液、１３…試料注入管、２０，５３…測定部、２１…信号処理装置、２２…データ処理装置、２３…データ表示装置、４１…入力信号、４２…サンプリング装置、４３…平均化装置、４４…出力信号、５４…比較部、５５…フィードバック回路、８６…絶縁ゲート電界効果トランジスタのゲート、８７…導電性配線、９１，９４…アルカンチオール、９２，９５…金電極、９３…正電荷、９６…負電荷、１０６，１０７…直流電源
【図１】
2007139468.tif 000014
【図２】
2007139468.tif 000015
【図３】
2007139468.tif 000016
【図４】
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【図５】
2007139468.tif 000018
【図６】
2007139468.tif 000019
【図７】
2007139468.tif 000020
【図８】
2007139468.tif 000021
【図９】
2007139468.tif 000022
【図１０】
2007139468.tif 000023
【図１１】
2007139468.tif 000024
【図１２】
2007139468.tif 000025
【図１３】
2007139468.tif 000026
【図１４】
2007139468.tif 000027
【図１５】
2007139468.tif 000028
【図１６】
2007139468.tif 000029
【図１７】
2007139468.tif 000030
【図１８】
2007139468.tif 000031
【図１９】
2007139468.tif 000032
【図２０】
2007139468.tif 000033
【配列表】
2007139468000001.app