(57)【要約】      （修正有）【課題】冷却水路系等に付着するアカフジツボ及びオオアカフジツボをノープリウス幼生からでも簡易且つ高精度に種判定し、さらに、死んでいるフジツボ幼生を試料として供しても種判定を可能とする種判定方法を提供する。【解決手段】フジツボ幼生１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅する工程と、ＤＮＡ断片に塩基配列ＡＣＴＡＧＴを認識する制限酵素を作用させる工程と、制限酵素を作用させたＤＮＡ断片をゲル電気泳動させる工程とを含み、ゲル電気泳動によるバンドの数及びその位置関係からフジツボ幼生種がアカフジツボ又はオオアカフジツボであるか否かを判定する。また、フジツボ幼生は、エタノールに浸漬した後に乾燥させたものであることが好ましく、フジツボ幼生としてノープリウス幼生を用いてもよい。また、制限酵素には、Ｓｐｅ Ｉ、Ａｈｌ Ｉ、Ｂｃｕ Ｉを用いることが好ましい。【選択図】図４
2007189908.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フジツボ幼生にプライマーを反応させてポリメラーゼ連鎖反応を行い１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅する工程と、前記ＤＮＡ断片に塩基配列ＡＣＴＡＧＴを認識して前記塩基配列を２つに分断する制限酵素を作用させる工程と、前記制限酵素を作用させた前記ＤＮＡ断片をゲル電気泳動させる工程とを含み、前記ゲル電気泳動により検出されるバンドの数及びその位置関係から前記フジツボ幼生種がアカフジツボ又はオオアカフジツボであるか否かを判定することを特徴とするフジツボ幼生の種判定方法。
【請求項２】
前記プライマーは配列番号１及び配列番号２に記載の塩基配列からなることを特徴とする請求項１に記載のフジツボ幼生の種判定方法。
【請求項３】
前記フジツボ幼生は、エタノールに浸漬した後に乾燥させたものであることを特徴とする請求項１又は２に記載のフジツボ幼生の種判定方法。
【請求項４】
前記フジツボ幼生はノープリウス期の幼生であることを特徴とする請求項１〜３いずれか１つに記載のフジツボ幼生の種判定方法。
【請求項５】
前記制限酵素はＳｐｅ Ｉ、Ａｈｌ Ｉ、Ｂｃｕ Ｉであることを特徴とする請求項１〜４いずれか１つに記載のフジツボ幼生の種判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フジツボ幼生の種判定方法に関する。さらに詳述すると、本発明は、形態分類学上の種判定が困難な幼生段階のフジツボを、遺伝子解析技術を用いて簡易且つ高精度に種判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フジツボは、様々な海洋構築物や火力・原子力発電所の冷却水路系等に付着する代表的生物である。冷却水路系にフジツボなどの生物が付着すると、冷却水の流動抵抗が増し流量の低下を引き起こして復水器の冷却効率が低下してしまう。また、復水器管内にフジツボが付着したり、剥がれたフジツボなどが詰まると管壁腐食の原因になり、このような点から、フジツボは汚損生物と呼ばれることもある。したがって、各発電所では、付着したフジツボなどを機械的に除去したり、フジツボの付着を抑制する等の様々な防除対策を行っている。
【０００３】
フジツボの付着を抑制する対策としては、防汚塗料を冷却水路系や復水器管等に塗布したり、あるいは塩素を注入してフジツボなどの付着生物幼生の付着を防ぐ手法がとられている。ここで、汚損性のフジツボとして特に問題なのは、アカフジツボやオオアカフジツボのような特定の種であるが、これら特定の種の付着時期を予測する技術が確立されておらず、結果的には長期間にわたって塩素注入を継続しているのが現状であり、環境負荷が非常に大きいという問題がある。したがって、環境負荷を低減し、また、防除対策のコストダウンを図るためにも、汚損性フジツボが付着する直前にピンポイントで塩素注入を行うことが好ましいため、これらの汚損性フジツボの付着時期を正確に予測する技術の確立が望まれている。
【０００４】
フジツボの付着時期を予測するためには、海域中に存在する付着前の汚損性フジツボ幼生の発生量を調査することが必要である。そこで、特定海域からプランクトンを採集して、顕微鏡下での観察によりフジツボ幼生を計数する方法が提案されている（非特許文献１）。しかしながら、混合プランクトンサンプル中に存在する複数種のフジツボ幼生から汚損性フジツボであるアカフジツボやオオアカフジツボの幼生を形態分類学上の差異から判定するのは極めて困難である。
【０００５】
そこで、付着期のフジツボ類の種を判定する技術として、特許文献１のような方法が提案されている。具体的には、海水から採集されたタテジマフジツボ、アメリカフジツボ、アカフジツボ、サンカクフジツボ、オオアカフジツボ、サラサフジツボ、イワフジツボ、シロスジフジツボおよびヨーロッパフジツボを含むフジツボ類の付着期幼生に対して、波長が４００〜４４０ｎｍの励起光を照射し、発光した波長４７５ｎｍ以上の蛍光分布パターンをデジタル画像情報としてコンピュータに入力し、この情報をコンピュータに予め登録された種に固有の体内蛍光分布パターン認識情報と比較し、これらの蛍光分布パターンがマッチングしたフジツボ類の種を判定するものである。
【特許文献１】特開２００４−１２４６７
【非特許文献１】加戸隆介（２００３）、  チシマフジツボ幼生の回帰と環境要因、Ｓｅｓｓｉｌｅ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ２０（２）、６３−６８．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１に記載の方法では、ノープリウス幼生期のフジツボの種判定を行うことができず、汚損種フジツボの付着時期の予測が遅れて付着抑制対策を確実に実行できなくなる虞がある。また、蛍光パターンが類似している種が存在するため、種判定に精度上の問題がある。さらに、キプリス幼生が死んでいる場合には、励起光を照射してもキプリス幼生からの蛍光発光が起こらず、種判定ができない。したがって、特許文献１に記載の方法においては、キプリス幼生を生きたまま種判定に供する必要があるという煩雑さが伴う。
【０００７】
そこで、本発明は、海洋構築物や火力・原子力発電所の冷却水路系等に付着する代表的汚損種フジツボであるアカフジツボ及びオオアカフジツボをノープリウス幼生からでも簡易且つ高精度に種判定でき、さらに、死んでいるフジツボ幼生を試料として供しても種判定が可能な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
かかる課題を解決するため、本願発明者が種々検討を行ったところ、フジツボのノープリウス幼生そのものをポリメラーゼ連鎖反応に供することにより、１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域を含むＤＮＡ断片を増幅することが可能であることを知見した。また、アカフジツボ及びオオアカフジツボの１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域を含むＤＮＡ断片には、他のフジツボ種にはない特異な塩基配列が存在することを見出した。そこで、当該塩基配列を制限酵素により切断してゲル電気泳動に供することで、ノープリウス幼生期のフジツボが、代表的な汚損種フジツボであるアカフジツボあるいはオオアカフジツボであるか否かを判定可能であることを知見し、本発明に至った。
【０００９】
かかる知見に基づく本発明のフジツボの種判定方法は、フジツボ幼生にプライマーを反応させてポリメラーゼ連鎖反応を行い１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅する工程と、ＤＮＡ断片に塩基配列ＡＣＴＡＧＴを認識して塩基配列を２つに分断する制限酵素を作用させる工程と、制限酵素を作用させたＤＮＡ断片をゲル電気泳動させる工程とを含み、ゲル電気泳動により検出されるバンドの数及びその位置関係からフジツボ幼生種がアカフジツボ又はオオアカフジツボであるか否かを判定するようにしている。
【００１０】
フジツボ幼生そのものを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより、フジツボ幼生からのＤＮＡ抽出工程を経ることなく、１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅することができる。また、アカフジツボ、オオアカフジツボ及びタテジマフジツボにおいては、ポリメラーゼ連鎖反応により得られる１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片中に他のフジツボ種には存在しない塩基配列ＡＣＴＡＧＴが含まれている。そこで、当該塩基配列を２つに分断する制限酵素を当該ＤＮＡ断片に作用させ、これをゲル電気泳動に供することにより、２本のバンドが検出される。したがって、２本のバンドが検出される場合には、フジツボ幼生がアカフジツボ、オオアカフジツボあるいはタテジマフジツボであると判定することができる。
【００１１】
さらに、アカフジツボとオオアカフジツボは、１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片中のほぼ同じ領域に塩基配列ＡＣＴＡＧＴを有している。一方、タテジマフジツボは、アカフジツボとオオアカフジツボとは異なる領域に塩基配列ＡＣＴＡＧＴを有している。したがって、制限酵素により分断されるＤＮＡ断片のそれぞれの長さは、アカフジツボ及びオオアカフジツボと、タテジマフジツボとで異なるので、２本のバンドの位置関係からフジツボ幼生種がアカフジツボ又はオオアカフジツボであるか否かを判定することができる。
【００１２】
ここで、プライマーとしては、配列番号１及び配列番号２に記載された塩基配列からなるものを用いることが好ましい。これにより、１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を含む約３５０ｂｐの長さのＤＮＡ断片を増幅することができる。
【００１３】
この場合、塩基配列ＡＣＴＡＧＴは、アカフジツボとオオアカフジツボにおいては上記ＤＮＡ断片中の約１２０ｂｐ付近の位置に存在するが、タテジマフジツボにおいては、５’側末端に近い１〜５０ｂｐの領域に存在している。したがって、タテジマフジツボのＤＮＡ断片から検出される２本のバンドの内の１本は、１〜５０ｂｐの範囲内に検出される。したがって、２本のバンドが検出され、且つ２本のバンドの双方が１〜５０ｂｐの範囲内に検出されない場合には、フジツボ幼生がアカフジツボあるいはオオアカフジツボであると判定することができる。尚、２本のバンドが検出され、且つ２本のバンドの内の１本が１〜５０ｂｐの範囲内に検出される場合には、フジツボ幼生の種はタテジマフジツボであると判定することができる。
【００１４】
尚、本発明の種判定に供するフジツボ幼生は、エタノールに浸漬した後に乾燥させたものであることが好ましい。死んでいるフジツボ幼生を海水あるいは水分のある状態で放置しておくと、フジツボ幼生中に含まれる酵素等の作用により、ＤＮＡが分解される虞があるが、エタノールに浸漬することによりフジツボ幼生に含まれる酵素等が失活してＤＮＡの分解等が起こらなくなる。したがって、種判定に供するフジツボ幼生を長期保存することが可能となる。また、海水から採集したフジツボ幼生を乾燥させると、塩分が析出してポリメラーゼ連鎖反応に悪影響を及ぼす虞があるが、エタノールに浸漬してから乾燥させることで、塩分の析出はほとんど起こらなくなり、しかも、エタノールは揮発しやすいため、乾燥させやすいという利点もある。
【００１５】
また、種判定に供するフジツボ幼生として、キプリス幼生のみならず、ノープリウス幼生を用いることも可能である。したがって、汚損種フジツボの付着時期の予測を早い段階で行うことが可能となる。
【００１６】
尚、制限酵素としてはＳｐｅ Ｉ、Ａｈｌ Ｉ、Ｂｃｕ Ｉを用いることが好ましい。これらの酵素は塩基配列ＡＣＴＡＧＴをＡとＣＴＡＧＴの２つに分断することができ、種判定を確実に行うことが可能となる。
【発明の効果】
【００１７】
しかして、本発明によれば、採集したフジツボ幼生がアカフジツボあるいはオオアカフジツボであるか否かを簡易且つ高精度に判定することが可能となる。また、フジツボ幼生そのものをそのままポリメラーゼ連鎖反応に供することができるので、フジツボ幼生からＤＮＡを抽出する手間を削減できると共に種判定に要する時間を大幅に短縮することができる。さらに、フジツボ幼生のＤＮＡさえ保存されていれば種判定を行うことが可能であるから、生きたままのフジツボ幼生を試料として供しなければならない種判定方法と比較してその煩雑さを格段に低減することができる。  
【００１８】
また、種判定に供するフジツボ幼生をエタノールに浸漬することにより、フジツボ幼生に含まれる酵素等が失活してＤＮＡが分解等を起こすことがなくなるので、種判定に供するフジツボ幼生を長期保存することが可能となる。さらに、海水から採集したフジツボ幼生を乾燥させると、塩分が析出してポリメラーゼ連鎖反応に悪影響を及ぼす虞があるが、エタノールに浸漬してから乾燥させることで、塩分の析出はほとんど起こらなくなり、しかも、エタノールは揮発しやすいため、乾燥させやすいという利点もある。
【００１９】
また、種判定に供するフジツボ幼生として、ノープリウス幼生を用いることができるので、汚損種フジツボの付着時期の予測を早い段階で行うことが可能となり、その時期に塩素注入等の付着抑制対策をピンポイントで行うことで、コストダウンや労力の低減につながるだけでなく、環境負荷の低減にも貢献できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明を実施するための最良の形態について、図面に基づいて詳細に説明する。
【００２１】
図１に本発明のフジツボ幼生の種判定方法の実施の一形態を示す。本発明のフジツボ幼生の種判定方法は、フジツボ幼生にプライマーを反応させてポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと略記する。）を行い１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅する工程（Ｓ１）と、ＤＮＡ断片に塩基配列ＡＣＴＡＧＴを認識して塩基配列を２つに分断する制限酵素を作用させる工程（Ｓ２）と、制限酵素を作用させたＤＮＡ断片をゲル電気泳動させる工程（Ｓ３）とを含み、ゲル電気泳動により検出されるバンドの数及びその位置関係からフジツボ幼生種がアカフジツボ又はオオアカフジツボであるか否かを判定する。（Ｓ４、Ｓ５）。
【００２２】
ここで、フジツボの生活史について説明する。まず、付着成体間で交尾、受精した後に孵出されるノープリウス幼生が海水中を浮遊しながら脱皮を繰り返し、キプリス幼生となる。キプリス幼生は基盤への一時付着と離脱を繰り返しながら、基盤との固着適正を確認し、最終的に決定された定着地点に永久固着して、幼フジツボへと変態した後、成体となる。
【００２３】
本発明の種判定方法に供するフジツボ幼生としては、ノープリウス幼生及びキプリス幼生どちらも用いることが可能であるが、上記のように、キプリス幼生の場合には基盤へ付着し始めるものも存在するので、汚損種フジツボの付着時期の予測を汚損種フジツボの付着前に確実に予測するという観点からは、ノープリウス幼生を用いることが好ましい。
【００２４】
また、本発明の種判定方法に供するフジツボ幼生は、エタノールに浸漬した後に乾燥させたものであることが好ましい。エタノール浸漬は、例えば、採集したプランクトン類を実体顕微鏡下で観察してフジツボ幼生個体と確認できたものから海水をできるだけ除去した後に行う。これにより、フジツボ幼生乾燥時の塩分の析出が確実に抑えられる。尚、実体顕微鏡観察によりフジツボ幼生個体を確認する前に採集したプランクトン類をエタノールに浸漬して、その後にフジツボ幼生個体を確認する作業を行っても勿論よい。
【００２５】
ここで、フジツボ幼生をエタノールに浸漬しなくても、塩分の析出を抑えて乾燥させることができるのであれば、このような方法に限られるものではない。例えば、滅菌水等でフジツボ幼生を十分に洗浄したのち、風乾等を行うようにしても良いし、ＤＮＡが分解しない程度に熱をかけて乾燥を行うようにしても良い。
【００２６】
また、エタノール以外の揮発性有機物、例えば、メタノール、プロパノール、ブタノール、ベンゼン、トルエン等を用いても同様の効果を発揮する。尚、エタノール浸漬後のフジツボ幼生は、１５℃程度で保存することが好ましく、より好ましくは１０℃程度、さらに好ましくは５℃程度である。低温保存することで、フジツボ幼生中の酵素の活性を確実に抑えることができ、ＤＮＡの分解を防止することができる。
【００２７】
次に、フジツボ幼生にプライマーを反応させてポリメラーゼ連鎖反応を行う（Ｓ１）。
【００２８】
フジツボ幼生は、エタノール浸漬されているものから取り出し、これをＰＣＲチューブに入れて自然乾燥させるのが、簡便であり好ましいが、この方法に限られるものではない。尚、ＰＣＲチューブに入れて乾燥させたフジツボ幼生に滅菌水を例えば１０〜２０μｌ程度添加した後、５〜１０秒程度撹拌混合処理（ｖｏｌｔｅｘ)することが好ましい。撹拌混合処理により、フジツボ幼生サンプル組織が破壊されて、プライマーと反応しやすくなり、ＰＣＲを効率よく行うことが可能となる。尚、ＰＣＲに供するフジツボ幼生の数は特に限定されず、１個体のみを供することでその個体がアカフジツボ又はオオアカフジツボであるか否かを判定することができるし、複数の個体を用いても、その複数の個体中にアカフジツボ又はオオアカフジツボが存在するか否かの判定を行うことができる。また、フジツボ幼生以外のプランクトンが存在していても、アカフジツボ又はオオアカフジツボが存在するか否かの判定を行うことが可能である。
【００２９】
ＰＣＲ条件としては、一般的に知られている条件を採用すれば良い。しかしながら、本発明のように、フジツボ幼生そのものを試料とする場合、反応可能な鋳型ＤＮＡが少なく、フジツボ幼生を構成する生体成分中にＰＣＲを阻害する成分が含まれている場合があり、例えば、ミネフジツボやケハダカイメンフジツボではＰＣＲを良好に行えない場合がある。したがって、これらの影響を排除できるポリメラーゼ及びバッファー系を用いることが好適である。一例を挙げると、Ｔａｑポリメラーゼアドバンテージ２（クローンテック社）が挙げられるが、これに限られるものではない。尚、汚損種であるアカフジツボに関しては、一般的に用いられているＴａｑポリメラーゼにより、十分にＰＣＲが可能である。したがって、アカフジツボを種判定するという観点からは、特にポリメラーゼを限定する必要はない。
【００３０】
アニーリング温度に関しては、４５℃〜６５℃であれば良いが、より好適には５０℃〜６０℃、さらに好適には５２℃〜５６℃、最も好適には５４℃である。この温度範囲でアニーリングすることにより、目的のＤＮＡ断片を効率よく得ることが可能となる。
【００３１】
プライマーとしては、フジツボ幼生の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅するものであれば、特に限定されず、例示すると、配列番号１及び配列番号２、あるいは配列番号３及び配列番号４の塩基配列を有するプライマーを用いることができるが、配列番号１及び配列番号２の塩基配列を有するプライマーを用いることが好ましい。これらのプライマーを用いる場合、１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を含む約３５０ｂｐの長さのＤＮＡ断片が増幅し、アカフジツボ及びオオアカフジツボは、このＤＮＡ断片中の約１２０ｂｐ付近に塩基配列ＡＣＴＡＧＴを有している。また、タテジマフジツボも、このＤＮＡ断片中の１〜５０ｂｐの領域に塩基配列ＡＣＴＡＧＴを有している。尚、塩基配列ＡＣＴＡＧＴは他のフジツボ種には存在しない。したがって、約３５０ｂｐの長さを有する１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片中に当該塩基配列を有していれば、アカフジツボ、オオアカフジツボあるいはタテジマフジツボであり、当該塩基配列の存在領域を調査することにより、５０ｂｐ以下の領域に塩基配列ＡＣＴＡＧＴを有していればタテジマフジツボ、約１２０ｂｐ付近に塩基配列ＡＣＴＡＧＴを有していればアカフジツボ又はオオアカフジツボであると判定できる。したがって、ＰＣＲにより得られるＤＮＡ断片をシーケンシングして、塩基配列を明らかにし、塩基配列ＡＣＴＡＧＴの存在及びその存在領域を調べることにより、アカフジツボ、オオアカフジツボあるいはタテジマフジツボであるとの判定を行うことができるが、より簡便に判定を行うために、塩基配列ＡＣＴＡＧＴを２つに分断する制限酵素を作用させて（Ｓ２）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（制限酵素断片長多型解析）により種判定することで、シーケンシングを行うことなく短時間に種判定を行うことができる。また、配列番号３及び４のプライマーを用いても１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅することが可能である。
【００３２】
制限酵素としては、アカフジツボ、オオアカフジツボ及びタテジマフジツボの有する特異塩基配列であるＡＣＴＡＧＴを認識して、これを２つに分断する、即ち、ＡとＣＴＡＧＴ、ＡＣとＴＡＧＴ、ＡＣＴとＡＧＴ、ＡＣＴＡとＧＴ、ＡＣＴＡＧとＴに分断することができる酵素であればどのような酵素でも採用することができる。ここで、塩基配列ＡＣＴＡＧＴをＡとＣＴＡＧＴに分断する制限酵素として、Ｓｐｅ Ｉ、Ａｈｌ Ｉ、Ｂｃｕ Ｉを挙げることができる。
【００３３】
ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片に制限酵素を作用させることにより、そのＤＮＡ断片がアカフジツボ、オオアカフジツボあるいはタテジマフジツボ由来のものである場合には、当該ＤＮＡ断片が２つに分断される。ＤＮＡ断片に制限酵素を作用させる際には、例えば、ＤＮＡ断片に、制限酵素と反応バッファー（例えば、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ）を添加し、３７℃で６０分間程度反応させるようにする。
【００３４】
制限酵素を作用させたＤＮＡ断片は、例えばエチジウムブロミドやＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等の染色液を含んだアガロースゲルによる電気泳動に供して（Ｓ３）、電気泳動後に紫外線照射してバンドを発光させて可視化した後に撮像する。
【００３５】
上記により得られた電気泳動結果におけるバンド数及びその位置関係からフジツボ幼生の種を判定する。即ち、アカフジツボとオオアカフジツボは、１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片中のほぼ同じ領域に塩基配列ＡＣＴＡＧＴを有している。一方、タテジマフジツボは、アカフジツボとオオアカフジツボとは異なる領域に塩基配列ＡＣＴＡＧＴを有している。したがって、制限酵素により分断されるＤＮＡ断片のそれぞれの長さは、アカフジツボ及びオオアカフジツボと、タテジマフジツボとで異なるので、２本のバンドの位置関係からフジツボ幼生種がアカフジツボ又はオオアカフジツボあるか否かを判定することができる。配列番号１及び配列番号２の塩基配列を有するプライマーを用いた場合を例に挙げて説明すると、アカフジツボ及びオオアカフジツボのＤＮＡ断片を可視化した場合、約１２０ｂｐ付近と約２３０ｂｐ付近にバンドが出現する。タテジマフジツボの場合には、３５０ｂｐより若干低分子側と１〜５０ｂｐの間にバンドが出現する。その他のフジツボについては、３５０ｂｐ付近に一本のバンドが出現するのみである。このバンドの出現の仕方の差から、フジツボの種判定を行うことができる。即ち、２本のバンドが出現する場合には、アカフジツボ、オオアカフジツボ及びタテジマフジツボのいずれかの種のフジツボであり（Ｓ４）、２本のバンドとも１〜５０ｂｐの領域に存在しない場合には、フジツボ種はアカフジツボ又はオオアカフジツボであり、２本のバンドの内の１本が１〜５０ｂｐの領域に存在する場合には、フジツボ種がタテジマフジツボであると判定することができる（Ｓ５）。
【００３６】
以上の方法により、特定の海域からサンプリングした一定量の海水中のフジツボ幼生の総数が通常より増加しており、この中に占めるアカフジツボまたはオオアカフジツボの割合が多い場合、例えば、ノープリウス幼生のフジツボを１０個体程度、さらに好ましくは１００個体程度種判定することにより、その中の７割程度以上がアカフジツボ又はオオアカフジツボであった場合には大量付着時期が近いと判断される。
【００３７】
なお、上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に示すが、本発明はこれに限定されるものではなく、適宜発明の範囲内で変更できるものである。
【００３９】
＜各種フジツボ成体のｒＲＮＡ遺伝子塩基配列のデータベース化＞
１５種のフジツボ成体のｒＲＮＡ遺伝子塩基配列のデータベース化を行った。データベース化に供したフジツボ種を表１に示す。タテジマフジツボ、アカフジツボ、サラサフジツボ、ケハダカイメンフジツボは採集後に室内でアルテミア、珪藻（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）などを餌として与えて飼育されたものを９９．５％エタノール（和光純薬製）に浸し、実験に使用するまで４℃に保存した。なお、エタノール浸漬前は、数日間餌を与えずアルテミア由来のＤＮＡの影響を排除した。その他のフジツボは採集直後に９９．５％エタノールに浸漬し４℃で保存した。
【００４０】
【表１】
2007189908.tif 000003
【００４１】
大型のフジツボ成体であるアカフジツボ、キタアメリカフジツボ、ミネフジツボ、アメリカフジツボ、タテジマフジツボ、サラサフジツボ、シロスジフジツボ、サンカクフジツボ、チシマフジツボ、クロフジツボ、カメノテ、ミミエボシは、解剖後、軟体部、可能であれば筋肉組織の小片（２〜３ｍｍ角）を清浄なメスを用いて切り出し、インビトロジェン社のＥａｓｙ−ＤＮＡキットにより総ＤＮＡの抽出を行った。具体的には、前述したエタノール浸漬保存したフジツボ成体からエタノールを除いた後、これを１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに入れ、５０μＬのリシスバッファー（インビトロジェン製）を加えてプラスチックペッスルですり潰し、さらに３００μＬのリシスバッファーを加えて６５℃で１０分間処理した。次に、ＤＮＡ沈澱用バッファー（インビトロジェン製、名称Precipitation Solution）１５０μＬを加えて強く撹拌混合（ｖｏｌｔｅｘ）し、さらにクロロホルム（和光純薬製）５００μＬを加えた後、１３,８００ｇで１５分間遠心分離処理してＤＮＡの含まれる水層を別のチューブに移した。これに氷冷した９９．５％エタノール１ｍＬを加え撹拌混合して０℃に３０分間静置してＤＮＡを沈澱させ、遠心分離処理後エタノールを除き、さらに氷冷８０％エタノール（和光純薬製）５００μＬを加えて沈澱させた。最終的に得られた沈澱（ＤＮＡ）を風乾後、５０μｌのＴＥバッファー（インビトロジェン製）に溶解した。抽出用組織が小さい場合は適宜溶解バッファー量を減らした。また小型のフジツボであるイワフジツボ、ケハダカイメンフジツボ、ムツアナフジツボ、また、上記大型のフジツボ成体に属するタテジマフジツボの中でも小型の個体に関しては、１個体の軟体部全体をそのまま同様の方法で抽出に供した。
【００４２】
ＴＥバッファーに溶解したＤＮＡの濃度を分光光度計（GeneQuant Pro、アマシャムバイオサイエンス社）により測定した結果、ほとんどのサンプルで５μｇ以上のＤＮＡが得られていることが確認されたが、イワフジツボなど非常に小型のフジツボにおいては１個体から得られるＤＮＡ量が少なかった。ＤＮＡ濃度の測定結果に基づいて、２０ｎｇ／μｌのＤＮＡ濃度としたＴＥバッファー溶液を調整し、これをＰＣＲの際に鋳型ＤＮＡとして供した。
【００４３】
次に、上記操作により得られた総ＤＮＡを鋳型として、１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲにより増幅した。プライマーには、フジツボミトコンドリアの１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対するプライマーとして文献１〜４で報告されているものを用いた（文献１：R. A. Begum, T. Yamaguchi and S. Watabe (2004). Molecular phylogeny of thoracican barnacles based on the mitochondrial 12S and 16S rRNA genes. Sessile organisms, 21, 47-54.  文献２：T. D. Kocher, W. K. Thomas, A. Meyer, S. V. Edwards, S. Paabo, F. X. Villablansca and A. C. Wilson (1989). Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals: amplification and sequencing with conserved primers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6196-6200.  文献３：O. Mokady, S. Rozenblatt, D. Graur and Y. Loya (1994). Coral-host specificity of red sea Lithophaga bivalves: interspecific and intraspecific variation in 12S mitochondrial ribosomal RNA. Mol. Mar. Biol. Biotech., 3, 158-164.  文献４：S. R. Palumbi (1996). Nucleic acids II: the polymerase chain reaction. In: Molecular Systematics, ed. D. M. Hillis, C. Mortiz and B. K. Mable, Sinauer Associates, Sunderland, pp. 205-248.）。表２と配列番号１、２、５及び６に各プライマーの配列を示す。なお、各プライマーは、合成（シグマジェノシス）により得られたものであり、ＰＣＲに供するまで５０ｐｍｏｌ／μｌのストック溶液（シグマジェノシス製）中に−２０℃で保存した。使用前にストック溶液を純水（脱塩蒸留水、無菌、DNase、RNaseフリー、和光純薬）で５倍希釈し１０ｐｍｏｌ／μｌとしてＰＣＲに供した。ＰＣＲは、上記の操作により抽出した総ＤＮＡを鋳型とし、Ｔａｑポリメラーゼとしてジーンタック（ニッポンジーン）またはアドバンテージ２（クローンテック）を用いて行った。なお、鋳型ＤＮＡは２０ｎｇ／μｌに調製した溶液を２μｌ（４０ｎｇ）、各プライマー溶液１μｌ（１０ｐｍｏｌ）を２０μｌの反応液に加えた。反応にはタカラＰＣＲサーマルサイクラーＤｉｃｅ（ＴＰ６００）を用い、反応液の調製はそれぞれのＴａｑポリメラーゼに添付された方法に従った。具体的には、ジーンタックに関しては、滅菌水１３．２０μｌ、１０ｘＰＣＲバッファー（１０ｘＧｅｎｅ  Ｔａｑ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｂｕｆｆｅｒ）２．００μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物１．６０μｌ、ジーンタックポリメラーゼ０．２０μｌ、プライマーはそれぞれ０．５０μｌ、鋳型ＤＮＡは２．０μｌとした。クローンテックアドバンテージ２に関しては、滅菌水１４．２０μｌ、１０ｘＰＣＲ ＳＡバッファー（１０ｘＧｅｎｅ  Ｔａｑ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｂｕｆｆｅｒ）２．００μｌ、５０×ｄＮＴＰ混合物０．４０μｌ、５０×ポリメラーゼ ｍｉｘ０．４０μｌ、プライマーはそれぞれ０．５０μｌ、鋳型ＤＮＡは２．０μｌとした。なお、アドバンテージ２においては、添付された２種類の反応バッファーのうち良好な結果が得られたＳＡバッファーを使用した。
【００４４】
【表２】
2007189908.tif 000004
【００４５】
まず、グラジエント機能を利用して最適アニーリング温度の推定を行った。グラジエントＰＣＲでのアニーリング温度は、４５．０℃〜６５．０℃の１２段階に設定した。９６℃（ジーンタック）または９５℃（アドバンテージ２）で１分間保ったあと、熱変性９６℃（ジーンタック）または９５℃（アドバンテージ２）３０秒間、各温度でのアニーリング３０秒間、伸長反応７２℃（ジーンタック）または６８℃（アドバンテージ２）３０秒間という反応を３５サイクル繰り返す条件で行った。反応産物はサイズマーカーとともに２％アガロースゲル電気泳動に供し、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ（インビトロジェン）によるＤＮＡバンドの可視化により特定領域の増幅の有無を確認した。
【００４６】
各種フジツボから得られたＤＮＡを鋳型とした１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ産物（アニーリング温度：５４℃、Ｔａｑポリメラーゼ：アドバンテージ２（クローンテック））のアガロース電気泳動像を図２に示す。図２において、ａはアカフジツボ、ｂはキタアメリカフジツボ、ｃはミネフジツボ、ｄはアメリカフジツボ、ｅはタテジマフジツボ、ｆはサラサフジツボ、ｇはシロスジフジツボ、ｈはサンカクフジツボ、ｉはチシマフジツボ、ｊはケハダカイメンフジツボ、ｋはイワフジツボ、ｌはクロフジツボ、ｍはムツアナヒラフジツボ、ｎはカメノテ、ｏはエボシガイである。また、Ｍは１００ｂｐのＤＮＡラダーである。１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲにおいては、ニッポンジーンのジーンタックを用いた場合、アニーリング温度は５３℃が最適であり、クローンテックのアドバンテージ２を用いた場合は５４℃が最適ではあったが、４５．０℃〜６５．０℃のアニーリング温度範囲であれば、安定してＰＣＲすることが可能であった。なお、増幅されたＤＮＡ断片はいずれのフジツボにおいても約３５０ｂｐの長さであった。
【００４７】
一方、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲにおいては、ジーンタックを用いた場合４７℃が最適アニーリング温度であることが判明したため、この条件で実験を行い、増幅される断片が約４５０ｂｐであることを確認した。しかし、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲは、１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲに比べて最適条件下でもサンプルにより増幅されない場合があるなど不安定であった。したがって、１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の解析データを種判定に用いることとした。
【００４８】
アガロース電気泳動にて増幅を確認したＰＣＲ産物からエタノール沈澱によりＤＮＡを回収し、その一部を塩基配列決定に供した。ＰＣＲ産物に９９．５％エタノール５０μＬ、３Ｍの酢酸ナトリウム（和光純薬製）２μＬ、１２５ｍＭのＥＤＴＡ（和光純薬製）２μＬを加え、撹拌混合して１５分間室温で静置した後、１３，８００ｇで２０分間遠心分離処理した。沈澱はさらに７０μＬの７０％エタノールで洗浄し、得られた沈澱を乾燥後、６μＬの純水（脱塩蒸留水、無菌、DNase、RNaseフリー、和光純薬）に溶解した。回収されたＰＣＲ産物（鋳型ＤＮＡ）１μＬと配列番号１に記載された塩基配列からなるプライマーを用い、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）により、サイクルシーケンス反応を行った。反応は、９６℃１０秒間、５０℃５秒間、６０℃４分間を２５サイクル行い、終了後、再度エタノール沈澱を行った。得られた乾燥標品にＨｉＤｉ  Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（アプライドバイオシステムズ）２０μＬを加え、９５℃で２分間の反応後、サンプルをＤＮＡシーケンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０に供してシーケンシングを行った。また、塩基配列のデータはＤＮＡＳＩＳ  Ｐｒｏ（日立ソフトウェアエンジニアリング）を用いて解析した。
【００４９】
各種フジツボ総ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１及び配列番号２に記載された塩基配列からなるプライマーを用いて得られた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片のシーケンシングの結果を図３に示す。なお、解析領域は、得られたＤＮＡ断片のうち、全てのサンプルで塩基配列が決定できた領域である２９７ｂｐ〜３０５ｂｐの範囲とした。この解析領域はＤＤＢＪに登録されているオオアカフジツボ（Ｍｅｇａｂａｌａｎｕｓ  ｖｏｌｃａｎｏ）ミトコンドリアゲノム完全長ＤＮＡ配列（ＡＢ１６７５３９．１、ＧＩ：５２０００４９０）の１４２９５番〜１３９９６番に該当する。また、図３に示した各塩基配列はそれぞれの種において最も出現頻度の高かった塩基配列である。図３において、「：」はアカフジツボと同じ塩基であることを表し、「−」は塩基配列が欠損している部分を表している。種内変異が見られたものについて、表３にその詳細を示す。１５種のフジツボ成体サンプルから得られた塩基配列は、いくつかの種内変異（１塩基多型、ＳＮＰｓ）がみられるものの、種間での変異が種内変位に比べて十分に大きく、種判定が十分可能であることが判明した。例えば、最も重要な汚損性フジツボであるアカフジツボでは解析した２９８塩基のうち、種内では３塩基の変異（９９％が一致）が見られたのに対し、種間では３０塩基（チシマフジツボ、９０％一致）から７８塩基（エボシガイ、７４％一致）の変異が認められた。他のフジツボにおいても種内変異は種判定に影響を与えるほど大きなものはなかった。図３に示すように、便宜上、比較するＤＮＡ断片の塩基に１から３１１まで番号をつけた。このなかで、種間で変異の大きい領域とほとんど変異のみられない領域があったが、特に５５番付近、７０番付近、１３０番付近、１７２番付近、２２２番付近などは変異の大きな領域であった。なお、同一の鋳型ＤＮＡから１２Ｓ ｒＲＮＡ用プライマーを用いてジーンタック、アドバンテージ２の２種類のＴａｑポリメラーゼにより増幅した場合、得られた塩基配列データは全く同じであった。
【００５０】
【表３】
2007189908.tif 000005
【００５１】
図３に示す塩基配列データについて、ＤＮＡＳＩＳ  Ｐｒｏによる制限酵素サイト検索を行ったところ、アカフジツボの６８〜７３番目の配列であるＡＣＴＡＧＴは、他のフジツボの塩基配列には存在しないことが明らかとなった。また、この配列領域でのアカフジツボの種内変異は見られなかった。すなわち、この配列ＡＣＴＡＧＴを認識し、６９〜７２番目の配列ＣＴＡＧの部分で切断する制限酵素ＳｐｅＩを作用させることでアカフジツボ１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を特異的に断片化することができる考えられた。そこで、実際にすべてのフジツボ成体から増幅されたＰＣＲ産物に対し、制限酵素ＳｐｅＩ（タカラバイオ）を用いて制限酵素断片長多型解析ＰＣＲ−ＲＦＬＰを行った。すなわち、１２Ｓ  ｒＲＮＡ特異的プライマーを用いてＰＣＲで増幅した産物５μＬに制限酵素０．２５μＬ（２．５  Ｕ）、ｘ１０反応バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ７．５，  １００ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  １０ｍＭ  Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，  ５００ｍＭ  ＮａＣｌ）０．５μＬを加え３７℃で６０分間反応させた。反応後、３％アガロースゲルを用いた電気泳動により断片化を判定した。
【００５２】
その結果を図４に示す。図４において、ａはアカフジツボ、ｂはキタアメリカフジツボ、ｃはミネフジツボ、ｄはアメリカフジツボ、ｅはタテジマフジツボ、ｆはサラサフジツボ、ｇはシロスジフジツボ、ｈはサンカクフジツボ、ｉはチシマフジツボ、ｊはケハダカイメンフジツボ、ｋはイワフジツボ、ｌはクロフジツボ、ｍはムツアナヒラフジツボ、ｎはカメノテ、ｏはエボシガイである。また、Ｍは１００ｂｐのＤＮＡラダーである。酵素処理後、アカフジツボのＰＣＲ産物では、約１２０ｂｐと約２３０ｂｐの位置に２本のバンドがはっきりと確認できたのに対し、他のフジツボではすべて１本のバンドしか観察されなかった。今回示した塩基配列では６９〜７２番目にこの酵素の切断部位があったが、実際のＤＮＡ断片の５’側には解読不能の配列があったため、解読不能領域の塩基対分を含めた約１２０ｂｐの断片が検出されたと考えられる。また、タテジマフジツボのＰＣＲ産物をＳｐｅ Ｉで処理したところ、わずかではあるが移動度の低分子側へのシフトが観察された。タテジマフジツボの１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列はデータベース（ＥＭＢＬ）に登録されていたので、それを確認したところ、 ５’側末端に近い（データベースの配列の２２〜２７番目）ところにＳｐｅ  Ｉの認識部位ＡＣＴＡＧＴが存在することが判明した。さらにＳｐｅ Ｉ処理したタテジマフジツボ１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子では５０ｂｐ以下の低分子領域にうっすらとバンドが確認され、この部分で切断されることが強く示唆された。しかしながら、アカフジツボ１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のバンドパターンとははっきりと区別されることから、Ｓｐｅ Ｉを用いたＰＣＲ−ＲＦＬＰ法はアカフジツボの検出法として十分に有効であると判断された。一方、アカフジツボの近縁種で、やはり地域によっては汚損性フジツボの代表であるオオアカフジツボＭｅｇａｂａｌａｎｕｓ  ｖｏｌｃａｎｏの１２Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子もデータベース（ＤＤＢＪ）に登録されていたので、その塩基配列を比較したところ、アカフジツボと同じ箇所にＳｐｅ Ｉ認識部位が存在することが明らかとなった。したがって、汚損種であるアカフジツボとオオアカフジツボをこの酵素を使ったＲＦＬＰで識別できることが判明した。
【００５３】
＜各種フジツボ幼生からの１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲとアカフジツボ幼生の識別＞
実験室内でタテジマフジツボ、アカフジツボ、ケハダカイメンフジツボおよびミネフジツボ成体から孵出したノープリウス幼生に珪藻（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）を餌として与え、キプリス幼生まで飼育し、飼育中の幼生の一部を実験に使用した。すべての幼生サンプルは海水をできるだけ除いた後、９９．５％エタノールを十分量加え４℃で保存した。
【００５４】
台場岸壁付近（東京）、志津川湾（宮城）、東海村発電所付近（茨城）でプランクトンネット（１３ＸＸ）によりプランクトンサンプルの採集を行い、実験室に持ち帰った後、実体顕微鏡下で観察して、フジツボの幼生と確認できた個体を回収した。回収したフジツボ幼生サンプルから海水をできるだけ除いた後、９９．５％エタノールを十分量加えて４℃で保存した。また、フジツボ幼生以外のプランクトンも一部回収し、解析に供した。
【００５５】
フジツボの幼生、特に初期ノープリウス幼生はきわめて小型であり、１個体からＤＮＡを抽出することは困難である。そこで、幼生まるごと１個体をＰＣＲ反応に供する方法について検討した。タテジマフジツボ、アカフジツボ、ケハダカイメンフジツボ、ミネフジツボから孵出したノープリウス幼生を材料とし、これまでに報告のある二枚貝幼生の調製法（M. Hosoi, S. Hosoi-Tanabe, H. Sawada, M. Ueno, H. Toyohara and I. Hayashi (2004). Sequence and polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphosm analysis of the large subunit rRNA gene of bivalve: simple and widely applicable technique for multiple species identification of bivalve larva. Fish. Sci., 70, 629-637.）、具体的には、二枚貝Ｄ型幼生を時計皿上で蒸留水により３回洗浄し、その後８０℃で水分を１５分間蒸発させた後、ＰＣＲに供する方法を参考にして下記（１）〜（５）に示す５種類の方法を試みた（表４）。
（１）エタノールに浸漬したサンプルから１個体の幼生を１．５ｍＬエッペンドルフチューブに入れ純水で洗浄し、ＰＣＲチューブに移した後８０℃で１０分間乾燥させたものを直接ＰＣＲに供した。なお、ＰＣＲ前に純水中で５〜１０秒間撹拌混合した。
（２）エタノールに浸漬したサンプルから１個体の幼生を直接ＰＣＲチューブに移して自然乾燥後、そのままＰＣＲに供した。なお、ＰＣＲ前に純水中で５〜１０秒間撹拌混合した。
（３）エタノールに浸漬したサンプルから１個体の幼生を直接ＰＣＲチューブに移して８０℃で１０分間熱処理、乾燥後、ＰＣＲに供した。なお、ＰＣＲ前に純水中で５〜１０秒間撹拌混合した。
（４）エタノールに浸漬したサンプルから、１個体の幼生を１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移して自然乾燥後、純水を２０μＬ加えてプラスチックペッスルですり潰した後、上清１５．２μＬをＰＣＲチューブに移してＰＣＲに供した。なお、ＰＣＲ前に５〜１０秒間撹拌混合した。
（５）エタノールに浸漬したサンプルから１個体の幼生を直接ＰＣＲチューブに移して自然乾燥後、そのままＰＣＲに供した。なお、ＰＣＲ前に純水中で５〜１０秒間撹拌混合し、さらに約５秒間超音波処理をした。
なお、ＰＣＲにはジーンタック（ニッポンジーン）とアドバンテージ２（クローンテック）の２種類のＴａｑポリメラーゼを用い、両者の結果を比較した。
【００５６】
【表４】
2007189908.tif 000006
【００５７】
上記（１）〜（５）によりＰＣＲを行ったところ、ジーンタックを用いた場合、どの方法においても大きな差は見られず、サンプルにより遺伝子増幅がうまくいく場合と、増幅されない場合があった。いくつかのサンプルでＰＣＲが成功しなかった原因については不明であるが、タテジマフジツボやアカフジツボでは成功率が高く、ミネフジツボ、ケハダカイメンフジツボでは低かったことから種により反応に影響を与える因子が存在する可能性が考えられる。いずれにしても、エタノールに浸漬されたフジツボ幼生サンプルでは、二枚貝の幼生で報告されている（１）の処理は必要ないと判断された。また、プラスチックペッスルでのホモジナイズ、超音波処理もそれほど有効ではなかった。そこで、最も簡便な（２）の方法を採用することとした。この方法は野外で採集してすぐに解析ができないサンプルにおいても有効である。次にこの方法を用い、Ｔａｑポリメラーゼをアドバンテージ２（クローンテック）に変更した場合に、結果が著しく改善されることが明らかになった。この酵素によるＰＣＲでは、ほぼ１００％の幼生サンプルにおいて１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域が増幅されることが判明した。ジーンタック（図５中のＧ）によるＰＣＲとアドバンテージ２（図５中のＡ）によるＰＣＲで得られた産物のアガロースゲル電気泳動像を図５に示す。図５において、アカはアカフジツボ、ミネはミネフジツボ、タテジマはタテジマフジツボ、ケハダカイメンはケハダカイメンフジツボを示している。幼生１個体サンプルの場合、反応可能な鋳型ＤＮＡの量が少ないこと、他の生体成分が含まれることなどが、ＰＣＲに影響を与える可能性があり、これらの影響を排除できる効率のよいポリメラーゼおよびバッファー系を用いる必要があると考えられる。しかしながら、アカフジツボ幼生に関しては、いずれのＴａｑポリメラーゼを用いても十分にＰＣＲが可能であることから、アカフジツボ幼生を他のフジツボ幼生種から識別するという観点からは、ポリメラーゼを特に限定する必要はない。なお、各ＰＣＲ産物からのシーケンシングの結果は、成体サンプルと同様であり、この方法で十分正確なシーケンシングが可能であると判断された。
【００５８】
次に、東京都台場、茨城県東海村および宮城県志津川湾で採集されたプランクトンサンプルの中から顕微鏡観察での種の同定は困難と思われるフジツボ幼生をピックアップして９９．５％エタノールで処理し、１個体ずつＰＣＲに供して１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の増幅を試みた。５０個体以上の幼生で試み、ほぼすべてのサンプルで１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の増幅が確認されたので、それぞれのＰＣＲ産物をシーケンシングおよびＳｐｅＩによるＰＣＲ−ＲＦＬＰに供した。２００５年８月に志津川湾で採集された幼生サンプルの分析結果を図６に示す。図６において、ｃは対照区として用いたミネフジツボの飼育幼生である。図で示したように分析した１０サンプルのうち、Ｎｏ．８を除く９サンプルでＰＣＲによる１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の増幅が確認され、さらにＮｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．７およびＮｏ．１０は、ＳｐｅＩによる分解を受けることが明らかとなり、これらはアカフジツボ幼生である可能性が高いと考えられた。一方Ｎｏ．１、Ｎｏ．６およびＮｏ．９のサンプルはＳｐｅＩで分解されないことから、この３個体は他の種であると推測された。実際にそれぞれのＰＣＲ産物の塩基配列を調べた結果、予想通りＳｐｅＩで分解されるＤＮＡはすべてアカフジツボの塩基配列と一致し、それ以外はイワフジツボ（Ｎｏ．１）、サンカクフジツボ（Ｎｏ．６）及び未知のフジツボ種（Ｎｏ．９）であることが判明した。
【００５９】
上記Ｎｏ．９のようにＰＣＲによる遺伝子増幅がみられたものの、そのシーケンスから種判定ができないサンプルも少数ながら存在した。また、多くのプランクトンサンプルの中での密度が高いコペポーダ（カイアシ）類は、今回使用したプライマーを用いた場合、遺伝子増幅が観察されるものがあったが、明らかにそのＤＮＡ断片の長さがフジツボ類と異なる（短い）ため、容易に判定することができた。その他、二枚貝の幼生などでは、遺伝子増幅が認められなかった。
【００６０】
以上、ミトコンドリアＤＮＡにコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の解析によりノープリウス幼生期のフジツボから、アカフジツボを種判定することが可能であることが明らかとなった。また、アカフジツボと同じ領域に特異な塩基配列を有するオオアカフジツボも種判定が可能であることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】フジツボ幼生の種判定方法の流れ図である。
【図２】各種フジツボ成体のＰＣＲにより増幅された１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域を含むＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動像を示す図である。
【図３】各種フジツボの１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域の塩基配列を示す図である。図中の□で囲まれている部分は制限酵素の認識配列を示す部分である。
【図４】各種フジツボ幼生の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域を含むＤＮＡ断片のＳｐｅ ＩによるＰＣＲ−ＲＦＬＰの結果を示す図である。
【図５】幼生１個体のＰＣＲに用いたポリメラーゼの違いによる結果を示す図である。Ｇがジーンタック（日本ジーン）、Ａがアドバンテージ２（クローンテック）である。
【図６】野外採集したフジツボ幼生の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域を含むＤＮＡ断片のＳｐｅ ＩによるＰＣＲ−ＲＦＬＰの結果を示す図である。
【図１】
2007189908.tif 000007
【図３】
2007189908.tif 000008
【図２】
2007189908.tif 000009
【図４】
2007189908.tif 000010
【図５】
2007189908.tif 000011
【図６】
2007189908.tif 000012
【配列表】
2007189908000001.app