(57)【要約】      （修正有）【課題】ＤＮＡメチル化制御因子Ｄｎｍｔ３Ｌと相互作用を示すタンパク質をコードする新規遺伝子、及び不妊症疾患の検出のための、新規診断用マーカー遺伝子の提供。【解決手段】ＤＮＡメチル化制御因子Ｄｎｍｔ３Ｌと相互作用を示す新規タンパク質、これらのタンパク質をコードする特定の塩基配列からなるポリヌクレオチド、並びに、それらの１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド。【選択図】図１
2007006883.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかのポリヌクレオチドからなる新規遺伝子。
（Ａ）  配列番号１〜９及び１７、配列番号１の第４２６０〜５２８２番目、並びに、配列番号４の第４２６１〜５１１５番目のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｂ）  前記（Ａ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、かつ、Ｄｎｍｔ３Ｌタンパク質と相互作用するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ｃ）  前記（Ａ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、前記（Ａ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（Ｄ）  前記（Ａ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、前記（Ａ）のポリヌクレオチドとの相同性が９０％以上であるポリヌクレオチド
（Ｅ）  前記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド
【請求項２】
遺伝子が、配列番号１０又は１８のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはこれに相補的な塩基配列のポリヌクレオチドを含む、請求項１記載の新規遺伝子。
【請求項３】
遺伝子が、マウス由来の遺伝子である、請求項１または２記載の新規遺伝子。
【請求項４】
遺伝子が、精巣、卵巣、肝臓または胚由来の遺伝子である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の新規遺伝子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の新規遺伝子またはその部分配列からなるポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーであって、請求項１〜４のいずれか一項に記載の新規遺伝子の部分配列からなるポリヌクレオチドであるプライマー。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドの塩基数が１０〜３５の範囲である、請求項５記載のプライマー。
【請求項７】
プライマーが、配列番号１０のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、これに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、または、その部分配列からなるポリヌクレオチドである、請求項５または６記載のプライマー。
【請求項８】
プライマーが、配列番号１１〜１６のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項５〜７のいずれか一項に記載のプライマー。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の新規遺伝子を検出する方法であって、被検試料に対して、請求項５〜８のいずれか一項に記載のプライマーを用いてＰＣＲを行う工程と、ＰＣＲ増幅断片の有無によって前記新規遺伝子の有無を判断する工程とを含む検出方法。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の新規遺伝子とハイブリダイズするプローブであって、請求項１〜４のいずれか一項に記載の新規遺伝子またはその部分配列からなるポリヌクレオチドであるプローブ。
【請求項１１】
前記部分配列からなるポリヌクレオチドが、配列番号１０及び１８のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、これに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、または、その部分配列からなるポリヌクレオチドである、請求項１０記載のプローブ。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の新規遺伝子を検出する方法であって、被検試料と請求項１０または１１記載のプローブとをインキュベーションする工程と、前記両者のハイブリダイゼーションを検出することによって、前記新規遺伝子の有無を判断する工程とを含む検出方法。
【請求項１３】
不妊症疾患の診断用マーカー遺伝子であって、前記遺伝子が請求項１〜４のいずれか一項に記載の新規遺伝子である診断用マーカー遺伝子。
【請求項１４】
不妊症疾患のモデル動物であって、請求項１〜４のいずれか一項に記載の新規遺伝子が不活性化されている不妊症疾患モデル動物。
【請求項１５】
前記動物がマウスである、請求項１４記載の不妊症疾患モデル動物。
【請求項１６】
生殖腺で発現し、Ｃ末端領域でＤｎｍｔ３Ｌタンパク質と相互作用するタンパク質であって、Ｃ末端の３４１アミノ酸又は２８５アミノ酸がそれぞれ配列番号１０又は１８のアミノ酸配列もしくはそれらの相同配列で表されるタンパク質。
【請求項１７】
Ｄｎｍｔ３Ｌタンパク質と相互作用するタンパク質であって、３４１アミノ酸又は２８５アミノ酸のポリペプチドからなり、その配列が、それぞれ配列番号１０又は１８のアミノ酸配列もしくはそれらの相同配列で表されるタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡメチル化制御因子であるＤｎｍｔ３Ｌタンパク質と相互作用する新たなタンパク質をコードする新規遺伝子に関し、さらに、前記遺伝子のプライマーならびにプローブ、それを用いた新規遺伝子の検出方法、不妊症疾患診断用マーカー遺伝子および不妊症疾患モデル動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡのメチル化は、哺乳類の発生に必須の機構である。例えば、ＤＮＡメチル化酵素遺伝子が変異したノックアウトマウスは、発生初期もしくは生後間もない時期に死に至ることが知られているおり、このことからも正常なＤＮＡメチル化パターンやメチル化レベルの維持が、正常な発生に深く関与していることがわかる。
【０００３】
このＤＮＡメチル化は化学的に安定であり、ＤＮＡ配列自体に変化を加えることなく、細胞分裂を通じて伝達される情報である。このような特性から、ＤＮＡメチル化機構は、エピジェネティクス（ＤＮＡ配列に変化を加えることなく遺伝し得る情報）を支える主要な分子機構であり、特に組織特異的な遺伝子発現や、刷り込み、Ｘ染色体の不活性化、癌化等の様々現象において重要な役割を担っていると考えられている。近年では、ＤＮＡメチル化酵素遺伝子やＤＮＡメチル化状態の異常による先天的・後天的疾患、クローン動物におけるＤＮＡメチル化の異常等がすでに多数同定されつつあり、ポストゲノムの新しい研究領域として、基礎生命科学から畜産学・医療にわたる様々な分野で注目を浴びている。
【０００４】
哺乳類ゲノムのＤＮＡメチル化は、例えば、受精直後から胚胞にかけて脱メチル化により大幅に減少し、胚が着床すると新たなＤＮＡメチル化パターンが確立され、ＤＮＡ複製の間、繰り返し伝達される。つまり、ＤＮＡメチル化機構をはじめとするエピジェネティックなゲノム修飾には、厳密な時間的制御・空間的（領域的）制御が極めて重要といえる。しかしながら、哺乳類のＤＮＡメチル化酵素が見出されて既に十余年が経ち、高い関心と共に精力的な研究が行われているにもかかわらず、未だにＤＮＡメチル化制御機構は明らかになっておらず、特に、どのようにしてゲノム領域の情報を認識し、メチル化の標的となるゲノム領域を決定しているのか、その領域特異性の基本的なしくみすら明らかになっていない。これは、ＤＮＡメチル化機構が多様な生理機能を持ち、実験系で簡明な因果関係を示し難いことが要因の一つと考えられる。
【０００５】
他方、ＤＮＡメチル化制御因子としてＤｎｍｔ３Ｌタンパク質の存在が明らかとなっている（非特許文献１参照）。哺乳類は、一方の対立遺伝子からしか発現しないインプリント遺伝子を有しており、この特性は、精子や卵子のゲノムが配偶子形成過程においてメチル化により修飾（刷り込み）されることに起因するが、前述のＤｎｍｔ３Ｌタンパク質は、卵子形成過程で確立されるメチル化インプリンティングの制御に関与している。Ｄｎｍｔ３Ｌタンパク質の関与は、Ｄｎｍｔ３Ｌ遺伝子を欠損するホモ変異マウスの卵子において、ＤＮＡメチル化の中でも、インプリント遺伝子のメチル化のみが特異的に失われたという結果から明らかとっており、雌性生殖細胞でのインプリントに必須であり、インプリント遺伝子のメチル化を調整すると考えられている。このように、Ｄｎｍｔ３Ｌタンパク質は、『特定の細胞系列において特異的領域のＤＮＡメチル化のみを制御する因子』であって、標的特異性と生理的意義が遺伝学的に証明された唯一の例といえる。
【非特許文献１】Hata K, Okano M, Lei H, Li E. Development. 2002 Apr;129(8):1983-93
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明者らは、ＤＮＡメチル化制御機構の研究にあたって、配偶子形成過程におけるインプリント遺伝子のＤＮＡメチル化の確立をモデル系として、ＤＮＡメチル化関連因子Ｄｎｍｔ３Ｌタンパク質に着目した。そして、Ｄｎｍｔ３Ｌタンパク質がインプリント遺伝子のメチル化に関与することは明らかとなったものの、Ｄｎｍｔ３Ｌタンパク質にはインプリント遺伝子に対する標的特異性を示すような構造が見当たらないことから、本発明者らは、Ｄｎｍｔ３Ｌの標的特異性について、他の共役因子の存在を推測した。このような共役因子が明らかとなれば、これまで不明であったＤＮＡメチル化の標的特性の機構等、様々な機構が解明できる。
【０００７】
したがって、本発明は、ＤＮＡメチル化制御因子であるＤｎｍｔ３Ｌタンパク質と相互作用する新たなタンパク質をコードする新規遺伝子の提供を目的とし、さらに、前記遺伝子の検出に使用できるプライマーならびにプローブ、それらを用いた遺伝子の分析方法、ＤＮＡメチル化等のエピジェネティックな異常が関与する不妊症疾患の診断用マーカー遺伝子、および不妊症疾患モデルマウスの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明の新規遺伝子は、下記（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかのポリヌクレオチドからなる遺伝子である。
（Ａ）  配列番号１〜９及び１７、配列番号１の第４２６０〜５２８２番目、並びに、配列番号４の第４２６１〜５１１５番目のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｂ）  前記（Ａ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、かつ、Ｄｎｍｔ３Ｌタンパク質と相互作用するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ｃ）  前記（Ａ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、前記（Ａ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（Ｄ）  前記（Ａ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、前記（Ａ）のポリヌクレオチドとの相同性が９０％以上であるポリヌクレオチド
（Ｅ）  前記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド
【０００９】
本発明のプライマーは、本発明の新規遺伝子またはその部分配列からなるポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーであって、本発明の新規遺伝子の部分配列からなるポリヌクレオチドである。また、本発明の新規遺伝子の第１の検出方法は、被検試料に対して、本発明のプライマーを用いてＰＣＲを行う工程と、ＰＣＲ増幅断片の有無によって前記新規遺伝子の有無を判断する工程とを含む。
【００１０】
本発明のプローブは、本発明の新規遺伝子とハイブリダイズするプローブであって、本発明の新規遺伝子またはその部分配列からなるポリヌクレオチドである。また、本発明の新規遺伝子の第２の検出方法は、被検試料と本発明のプローブとをインキュベーションする工程と、前記両者のハイブリダイゼーションを検出することによって、前記新規遺伝子の有無を判断する工程とを含む。
【００１１】
つぎに、本発明の診断用マーカー遺伝子は、不妊症疾患診断用であって、前記遺伝子が本発明の新規遺伝子である。また、本発明のモデル動物は、不妊症疾患モデル動物であって、本発明の新規遺伝子が不活性化されている。
【発明の効果】
【００１２】
本発明者らは、後述するようにTwo-hybridシステムにより、ＤＮＡメチル化制御因子であるＤｎｍｔ３Ｌタンパク質と相互作用を示す新たなタンパク質をコードする本発明の新規遺伝子を同定した。なお、本明細書において、本発明の新規遺伝子によりコードされるタンパク質を「新規タンパク質」という。また、本明細書において、「遺伝子」とは、ゲノムＤＮＡ及び転写産物（ｍＲＮＡ）を含み、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はその他の天然若しくは人工ヌクレオチドのポリヌクレオチドとして存在しうる。
【００１３】
このように、本発明の新規遺伝子がコードする新規タンパク質とＤｎｍｔ３Ｌタンパク質とが親和性に基づいて会合することが明らかとなったため、Ｄｎｍｔ３Ｌタンパク質の領域特異性等が新規タンパク質により制御されていることが示唆された。したがって、本発明の新規遺伝子を用いれば、Ｄｎｍｔ３Ｌタンパク質が関与するＤＮＡメチル化制御機構、すなわち生殖細胞に特異的なＤＮＡメチル化制御機構をさらに明らかにできる。また、このようなＤＮＡメチル化制御機構の解析に、本発明のプライマーやプローブを用いた検出方法、本発明の新規遺伝子を不活性化させたノックアウト動物等が有用となる。特に、不妊症疾患は、ＤＮＡメチル化をはじめとするエピジェネティックな異常との因果関係が示唆されていることから、前述のような新規遺伝子を不活性化させたノックアウト動物は、不妊症疾患モデル動物としても有効である。また、本発明の新規遺伝子を診断用マーカー遺伝子とすることによって、不妊症疾患を遺伝子レベルで診断することも可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の新規遺伝子は、前述のように、下記（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかのポリヌクレオチドからなる遺伝子である。
（Ａ）  配列番号１〜９及び１７、配列番号１の第４２６０〜５２８２番目、並びに、配列番号４の第４２６１〜５１１５番目のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｂ）  前記（Ａ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、かつ、Ｄｎｍｔ３Ｌタンパク質と相互作用するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（Ｃ）  前記（Ａ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、前記（Ａ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（Ｄ）  前記（Ａ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、前記（Ａ）のポリヌクレオチドとの相同性が９０％以上であるポリヌクレオチド
（Ｅ）  前記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド
【００１５】
前記（Ｂ）〜（Ｄ）において、欠失、置換または付加が可能な塩基数は、例えば、５０塩基に対して、１〜６個であり、好ましくは１〜５個であり、さらに好ましくは１〜４個、特に好ましくは１〜３個である。
【００１６】
前記（Ｃ）において、ハイブリダイズのストリンジェントな条件とは、例えば、当該技術分野における標準の条件があげられるが、例えば、温度条件は、各配列番号で示された塩基配列のＴｍ値の±５℃、好ましくは±２℃、より好ましくは±１℃である。条件の具体例として、５×ＳＳＣ溶液、１０×Denhardt溶液、１００μｇ/ｍｌサケ精子ＤＮＡおよび１％ＳＤＳ中、６５℃でのハイブリダイゼーション、０．２×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中、６５℃、３０分の洗浄（２回）、続いて、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中、６５℃、３０分の洗浄（２回）があげられる。また、前記（Ｄ）における相同性は、例えば、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７．５％以上である。
【００１７】
また、本発明の新規遺伝子は、新規タンパク質のカルボキシル末端側（Ｃ末端側）ポリペプチドをコードする塩基配列として、配列番号１０及び１８のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、または、これに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むことが好ましい。後述する実施例に示すように、本発明の新規遺伝子では、配列番号１０又は１８のアミノ酸配列をコードする塩基配列が高く保存されている。なお、配列番号１０又は１８のポリペプチドをコードする塩基配列は、下記表１の通りであるである。したがって、本発明は、生殖腺で顕著に発現し、Ｃ末端領域でＤｎｍｔ３Ｌタンパク質と相互作用する新規なタンパク質であって、Ｃ末端の３４１アミノ酸又は２８５アミノ酸がそれぞれ配列番号１０又は１８のアミノ酸配列もしくはこれらの相同配列で表されるタンパク質を提供する。その具体例としては、配列番号１〜９及び１７の塩基配列で表されるｍＲＮＡにコードされるタンパク質である。さらに、本発明は、Ｄｎｍｔ３Ｌタンパク質と相互作用するポリペプチドであって、それぞれ配列番号１０及び１８で表される３４１又は２８５のアミノ酸配列もしくはこれらの相同配列からなるポリペプチドであるタンパク質を提供する。これらの本発明のタンパク質は、生殖腺においてＤＮＡメチル化制御因子であるＤｎｍｔ３Ｌタンパク質と相互作用し、ＤＮＡメチル化制御に関与しうる。本発明のタンパク質は、さらに、他のタンパク質との融合タンパク質（組み換えタンパク質）であってもよい。さらにまた、本発明は、本発明のタンパク質に特異的なモノクローナル及び／又はポリクローナル抗体、並びに、それらの断片を提供する。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
本発明の新規遺伝子は、例えば、マウス等の哺乳類由来の遺伝子であり、また、精巣および卵巣の生殖巣、肝臓、胚等の遺伝子である。
【００２０】
つぎに、本発明のプライマーは、本発明の新規遺伝子またはその部分配列からなるポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーであって、本発明の新規遺伝子の部分配列からなるポリヌクレオチドである。このようなプライマーを用いたＰＣＲによって、例えば、被検試料における新規遺伝子の有無を検出したり、様々な生物、特に哺乳類動物から、本発明の新規遺伝子に相当する遺伝子を得ることもできる。
【００２１】
前記プライマーの長さは、特に制限されず、一般的なプライマーの長さに設定できるが、例えば、塩基数１０〜３５の範囲であり、好ましくは塩基数１５〜３０の範囲であり、より好ましくは塩基数２０〜２５の範囲である。
【００２２】
また、本発明の新規遺伝子は、前述のように、新規タンパク質のＣ末端側をコードする塩基配列が高く保存されていることから、例えば、配列番号１０のアミノ酸配列をコードする塩基配列、これに相補的な塩基配列、または、その部分配列を有することが好ましい。
【００２３】
本発明のプライマーの具体例としては、例えば、配列番号１１〜１６の塩基配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。これらのプライマーは単独で使用してもよいし、Forward primerおよびReverse primerとして組み合わせて使用することもできる。
【００２４】
つぎに、本発明のプローブは、本発明の新規遺伝子とハイブリダイズするプローブであって、本発明の新規遺伝子またはその部分配列からなるポリヌクレオチドである。このように本発明の新規遺伝子全体またはその部分配列をプローブとして被検試料とハイブリダイズさせることにより、本発明の新規遺伝子の有無を検出できる。なお、ハイブリダイズの条件は、例えば、前述と同様である。
【００２５】
また、本発明の新規遺伝子は、前述のようにタンパク質のＣ末端側をコードする塩基配列が高く保存されていることから、前記部分配列からなるポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１０又は１８のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、これに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、または、その部分配列からなるポリヌクレオチドであることが好ましい。したがって、本発明は、ポリヌクレオチドであって、前述の本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。そして、本発明は、さらに、ベクターであって、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００２６】
つぎに、本発明の新規遺伝子を検出する方法としては、本発明のプライマーを使用する第１の方法、および、本発明のプローブを使用する第２の方法があげられる。本発明の第１の検出方法は、被検試料に対して、本発明のプライマーを用いてＰＣＲを行う工程と、ＰＣＲ増幅断片の有無によって新規遺伝子の有無を判断する工程とを含む方法であり、一方、本発明の第２の検出方法は、被検試料と本発明のプローブとをインキュベーションする工程と、前記両者のハイブリダイゼーションを検出することによって、新規遺伝子の有無を判断する工程とを含む方法である。なお、本発明の分析方法は、本発明のプライマーやプローブを用いることを特徴としており、具体的な操作方法や条件は、従来公知のＰＣＲ法や各種ハイブリダイゼーション法に従って行うことができる。
【００２７】
つぎに、本発明の診断用マーカー遺伝子は、不妊症疾患の診断用マーカー遺伝子であり、前記遺伝子が本発明の新規遺伝子であることを特徴とする。前述のように、不妊症疾患は、ＤＮＡメチル化をはじめとするエピジェネティックな異常との因果関係が示唆されていることから、本発明のマーカー遺伝子によって、不妊症疾患を遺伝子レベルで診断することが可能になる。また、本発明のタンパク質も診断用マーカーとして使用することができる。
【００２８】
また、本発明の疾患モデル動物は、不妊症疾患のモデル動物であり、本発明の新規遺伝子を不活性化させた動物（ノックアウト動物）である。このようなモデル動物は、不妊症疾患の解析に非常に有用である。
【００２９】
動物の種類は、特に制限されないが、例えば、マウス等の非ヒト動物があげられる。なお、ノックアウト動物の調製方法は、特に制限されず、ジーンターゲティング等の従来公知の方法で行うことができる。
【実施例１】
【００３０】
酵母Two-hybrid法により、Ｄｎｍｔ３Ｌタンパク質と相互作用する新規タンパク質のスクリーニングを行い、その遺伝子配列を決定した。
【００３１】
酵母Two-hybrid法によるスクリーニング
Two-hybridシステムとしてMatchmaker 2-ハイブリッドシステム3（商品名：クロンテック社）を用い、当該製品に添付されている標準的使用法に従って以下の実験を行った。まず、ＤＮＡメチル化酵素関連因子Ｄｎｍｔ３Ｌタンパク質をおとりタンパク質（ｂａｉｔ）とし、Ｄｎｍｔ３Ｌの全長ｃＤＮＡ（マウス由来ｃＤＮＡ）を用いて、ＤＮＡ結合ドメイン（ＢＤ）とＤｎｍｔ３Ｌタンパク質とが融合したタンパク質を発現する発現ベクターを作製した。このおとり発現ベクターを酵母Ｙ１８７株に遺伝子導入し、トリプトファン非要求性で成育できるコロニーを選択して形質転換体を得た。他方、同様にクロンテック社より市販されている、マウスの７日胚から作製されたｃＤＮＡの発現ライブラリーベクター（商品名マッチメーカーｃＤＮＡライブラリー：ＤＮＡ転写活性化ドメイン（ＡＤ）とライブラリーｃＤＮＡとが結合した発現ベクター）を酵母ＡＨ１０９株に遺伝子導入し、ロイシン非要求性で成育できるコロニーを選択して形質転換体を得た。これらの形質転換体を接合させ、アデニン・ヒスチジン・ロイシン・トリプトファン非要求性で成育できたコロニーを、候補コロニーとして選択した。これらの候補コロニーから、標準的使用法に従って発現ベクターを単離し、Ｄｎｍｔ３Ｌタンパク質と相互作用を示す候補因子のｃＤＮＡ配列（部分配列）を決定した。その結果、得られた発現ベクター４つが、Ｃ末端側に共通の３４１アミノ酸残基（配列番号１０）をコードしていた。
【００３２】
新規遺伝子のｃＤＮＡ配列の決定
続いて、マウスの各臓器からそれぞれＲＮＡを調製し、前記酵母two-hybrid法から得られた候補因子のＣ末端側アミノ酸配列情報を基に、候補因子の上流塩基配列をさらに同定した。
【００３３】
まず、様々な発生・発達段階のマウスから、生殖巣および主要臓器を回収し、直ちにＲＮＡ抽出用試薬（商品名ISOGEN：ニッポンジーン社）で処理することにより各々のＲＮＡを回収した。そして、前述のＣ末端側配列に特異的な下記プライマー（配列番号１１、１２）を用いてｃＤＮＡライブラリーを作製し、5’-RACE法等の一般法により、候補因子の上流側未知配列を決定した。なお、前記ライブラリーは、例えば、CapFishing Full-length cDNA Premix Kit(商品名：Seegene社)等の試薬を用いて一般法により作製したり、Marathon ready cDNA library(商品名：Clontech社)等の調製済み製品を利用した。
【００３４】
配列番号１１  Forward primer ： 5’-aagccagtcaccaccgatac-3’
配列番号１２  Reverse primer ： 5’-ggtcttggtcatttgccact-3’
【００３５】
その結果、候補因子について、配列番号１〜９及び１７で表される塩基配列が同定された。これらの遺伝子でコードされるタンパク質が、Ｄｎｍｔ３Ｌタンパク質と相互作用するタンパク質であると考えられる。なお、配列番号１〜６は３週齢精巣由来の新規遺伝子、配列番号７は成体肝臓由来の新規遺伝子、配列番号８は胎生７日の胚由来の新規遺伝子、配列番号９及び１７は一週齢卵巣由来の新規遺伝子の塩基配列をそれぞれ示す。上記表１のとおり、配列番号１〜３、７〜９及び１７のｍＲＮＡは、コード領域の３'末端に、Ｄｎｍｔ３Ｌタンパク質と相互作用を示す３４１アミノ酸残基（配列番号１０）からなるポリペプチドをコードするｍＲＮＡであった。そして、配列番号４〜６のｍＲＮＡは、前記３４１アミノ酸残基（配列番号１０）の第１３２〜１８７番目の５６アミノ酸残基が欠失した２８５アミノ酸残基（配列番号１８）からなるスプライシングバリアントのポリペプチドをコードするｍＲＮＡであった。これらの各新規遺伝子は、例えば、ＲＮＡを調製した臓器の種類によって、または、同一臓器内であってもわずかに異なる配列を示すことから、スプライシングバリアント（スプライシング多型）の存在が示唆される。なお、これらの塩基配列情報を、公的な遺伝子・タンパク質配列データベースでＢＬＡＳＴ法によりサーチした結果、マウス１０番染色体に存在する配列であることが確認されたが、塩基配列が決定されているのみであって、固有の名称を持たず、その機能も不明であり、既知遺伝子配列やタンパク質構造との相同性も見られなかった。このことから、上述の３４１アミノ酸からなるポリペプチドが、ＤＮＡメチル化制御因子であるＤｎｍｔ３Ｌタンパク質と相互作用し、ＤＮＡメチル化制御に関与することは、本発明者らが初めて見出したことといえる。
【実施例２】
【００３６】
新規遺伝子発現の臓器特異性を確認した。
【００３７】
ＲＴ‐ＰＣＲ法
一週齢のマウスから、生殖巣（卵巣：ovary、精巣：testis）および主要臓器（脳：brain、心臓：heart、肺：lung、胸腺：thymus、肝臓：liver、脾臓：spleen、腎臓：kidney、腸：intestine、横紋筋：muscle）を回収し、直ちにＲＮＡ抽出用試薬（商品名ISOGEN：ニッポンジーン社）で処理することにより各々のＲＮＡを回収した。これらのＲＮＡを、ランダムプライマーとSuperscript II(商品名：Invitrogen社)とを用いて逆転写酵素処理し、cDNAライブラリーを作製した。このcDNAライブラリーを鋳型とし、前述と同様のＣ末端側配列に特異的なプライマー（配列番号１１、１２）およびＤＮＡポリメラーゼ（商品名Takara ExTaq ：タカラバイオ社）を用いてＰＣＲ反応を行った。いずれの反応も、
酵素に添付の標準的使用法に従って行った。
【００３８】
配列番号１１  Forward primer ： 5’-aagccagtcaccaccgatac-3’
配列番号１２  Reverse primer ： 5’-ggtcttggtcatttgccact-3’
【００３９】
得られたＰＣＲ産物を一般法によりアガロースゲル電気泳動に供し、各臓器における新規遺伝子の発現を確認した。なお、コントロールとして、GAPDH（グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素）遺伝子の発現をあわせて確認した。これらの結果を、図１の電気泳動写真に示す。同図に示すように、新規遺伝子は、脳、心臓、脾臓、腎臓、腸において発現が確認されず、肺、胸腺、肝臓、横紋筋で若干発現したのに対して、卵巣において発現が最も顕著であった。一方、卵巣と同様に生殖細胞である精巣においては発現が認められなかった。一週齢の時期には、Ｄｎｍｔ３Ｌタンパク質は精巣でほとんど機能していないと考えられている。したがって、この結果より、新規遺伝子がコードするタンパク質はＤｎｍｔ３Ｌとの相互作用を介して生殖腺で機能していると強く示唆される。
【実施例３】
【００４０】
新規遺伝子発現の発生時期特異性を確認した。
【００４１】
胎生１３．５日（Ｅ１３．５）、１５．５日（Ｅ１５．５）、１８．５日（Ｅ１８．５）、生後６日目（Ｐ６）の雌マウス生殖腺および生後６日目（Ｐ６）の雌マウス肝臓から、前述と同様にしてＲＮＡを回収し、ＲＴ‐ＰＣＲ法により、新規遺伝子、Ｄｎｍｔ３Ｌ遺伝子ならびにコントロールＧＡＰＤＨ遺伝子の発現をそれぞれ確認した。なお、Ｄｎｍｔ３Ｌの発現は、以下のプライマー（配列番号１３、１４）を使用した以外は、新規遺伝子と同様にして確認を行った。これらの結果を、図２の電気泳動写真に示す。
【００４２】
配列番号１３  Forward primer : 5’- actctccaggtgtacactcg -3’
配列番号１４  Reverse primer : 5’- tcttccatgcagacactgtc -3’
【００４３】
同図に示すように、新規遺伝子は、胎生期の生殖腺（Ｅ１３．５、Ｅ１５．５、Ｅ１８．５）や生後の肝臓（Ｐ６ ｌｉｖｅｒ）ではほとんど発現しなかったが、生後６日目（Ｐ６）の生殖腺（卵巣）において発現が増加した。この発現傾向は、Ｄｎｍｔ３Ｌ遺伝子の発現傾向と極めて類似している。このことからも、新規遺伝子がコードするタンパク質がＤｎｍｔ３Ｌタンパク質と協調して機能していることが強く示唆される。
【実施例４】
【００４４】
新規タンパク質のＣ末端側アミノ酸配列（３４１アミノ酸）を、哺乳類培養細胞内で強制発現させ、新規遺伝子がコードするタンパク質（Ｃ末端領域）の組換え体タンパク質について、細胞内局在を確認した。
【００４５】
Gateway system(商品名：Invitrogen社)を用いて、新規タンパク質のＣ末端側アミノ酸配列（３４１アミノ酸）のアミノ基末端（Ｎ末端）側に蛍光タンパク質ＧＦＰまたはペプチド配列Ｖ５を付加した組換え体タンパク質の発現ベクターを作製した。
【００４６】
まず、前述の酵母two-hybrid法により酵母内でＤｎｍｔ３Ｌタンパク質と結合することが明らかになったＣ末端領域（３４１アミノ酸）をコードするｃＤＮＡを、下記プライマー（配列番号１５、１６）を用いてＰＣＲにより増幅した。得られたＰＣＲ産物をエントリーベクターpENTR/D-TOPOにサブクローニングし、その配列をABI PRISM 3130xl（商品名：アプライドバイオシステムズ社）で確認した。続いて、前記エントリーベクターからデスティネーションベクターであるpcDNA-DEST53、pcDNA3.1/nV5-DESTへ、相同組換えを利用して前記ＰＣＲ産物である挿入断片を移し替え、ＧＦＰ又はＶ５融合組換え体タンパク質発現ベクターを得た。
【００４７】
配列番号１５  Forward primer : 5’-cggaaaggcaaggagaaatctgc-3’
配列番号１６  Reverse primer : 5’-gggggcgttactttttctttcc-3’
【００４８】
ＣＯＳ７細胞とＮＩＨ３Ｔ３細胞を標準的培養法に従って牛胎児血清を含む改変ダルベッコ培地で培養し、培養２４時間後、前記発現ベクターとリポフェクトアミン(Invitrogen社)とを添付プロトコールに従って添加して、前記両細胞に前述の発現ベクターを導入した。そして、リポフェクタミン添加から２４時間後に細胞を蛍光顕微鏡により観察した。
【００４９】
これらの結果を、図３の蛍光顕微鏡写真に示す。同図において、緑色の部分は、発現した新規タンパク質のＣ末端領域を示し、赤色の部分は、細胞の核を示す。このように、組換えタンパク質の緑色シグナルは、主に細胞質内に局在した。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
以上のように、本発明の新規遺伝子がＤＮＡメチル化制御因子Ｄｎｍｔ３Ｌタンパク質に相互作用する新規タンパク質をコードすることが明らかとなった。このため、本発明の遺伝子やその検出方法等を用いることによって、Ｄｎｍｔ３Ｌが関与するＤＮＡメチル化の機構解明が可能となり、さらに、ＤＮＡメチル化等のエピジェネティックの異常が関与する不妊症疾患の診断や解析等も有効に行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、本発明の実施例における、一週齢マウス主要臓器での新規遺伝子の発現量を示す電気泳動写真である。
【図２】図２は、本発明にその他の実施例における、各発生時期の雌マウス生殖腺での新規遺伝子の発現量を示す電気泳動写真である。
【図３】図３は、本発明のさらにその他の実施例における、新規遺伝子がコードするタンパク質のＣ末端側ポリペプチド（３４１アミノ酸）の細胞局在を示す蛍光顕微鏡写真である。
【配列表フリーテキスト】
【００５２】
配列番号１１：フォワードプライマー
配列番号１２：リバースプライマー
配列番号１３：フォワードプライマー
配列番号１４：リバースプライマー
配列番号１５：フォワードプライマー
配列番号１６：リバースプライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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