(57)【要約】      （修正有）【課題】  共役脂肪酸の製造用組成物、及び該組成物を用いた効率の良い新規な共役脂肪酸の製造方法の提供。【解決手段】Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来の3種の特定の酵素を少なくとも含有する共役脂肪酸の製造用組成物を得て、該組成物を用いた効率の良い新規な共役脂肪酸の製造方法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の１〜３の3種の酵素を含有することを特徴とする脂肪酸から共役脂肪酸を製造するための組成物。
１．次の１）〜４）の群から選択される１の酵素
１）配列表配列番号１のアミノ酸配列を含む酵素
２）配列表配列番号１のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む酵素
３）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列がコードする蛋白質を含む酵素
４）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列がコードする蛋白質を含む酵素。
２．次の１）〜４）の群から選択される１の酵素
１）配列表配列番号２のアミノ酸配列を含む酵素
２）配列表配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む酵素
３）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列がコードする蛋白質を含む酵素
４）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列がコードする蛋白質を含む酵素。
３．次の１）〜４）の群から選択される１の酵素
１）配列表配列番号３のアミノ酸配列を含む酵素
２）配列表配列番号３のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む酵素
３）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列がコードする蛋白質を含む酵素
４）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列がコードする蛋白質を含む酵素。
【請求項２】
次の１）〜３）に記載の３種の酵素を含有することを特徴とする請求項１に記載の共役脂肪酸の製造用組成物。
１）請求項１、１．１）に記載の酵素、
２）請求項１、２．１）に記載の酵素、及び
３）請求項１、３．１）に記載の酵素。
【請求項３】
次の１）〜３）に記載の３種の酵素を含有することを特徴とする請求項１に記載の共役脂肪酸の製造用組成物。
１）請求項１、１．２）に記載の酵素
２）請求項１、２．２）に記載の酵素、及び
３）請求項１、３．２）に記載の酵素。
【請求項４】
次の１）〜３）に記載の３種の酵素を含有することを特徴とする請求項１に記載の共役脂肪酸の製造用組成物。
１）請求項１、１．３）に記載の酵素
２）請求項１、２．３）に記載の酵素、及び
３）請求項１、３．３）に記載の酵素。
【請求項５】
次の１）〜３）に記載の３種の酵素を含有することを特徴とする請求項１に記載の共役脂肪酸の製造用組成物。
１）請求項１、１．４）に記載の酵素
２）請求項１、２．４）に記載の酵素、及び
３）請求項１、３．４）に記載の酵素。
【請求項６】
補因子をさらに含有する請求項１〜５のいずれかに記載の共役脂肪酸の製造用組成物。
【請求項７】
補因子がNADPH又は、NADH及びFADである請求項６に記載の共役脂肪酸の製造用組成物。
【請求項８】
モリブデン酸カリウム、モリブデン(VI)酸二ナトリウム無水和物、モリブデン(VI)酸二ナトリウム二水和物、オルトバナジン（Ｖ）酸ナトリウム、メタバナジン（Ｖ）酸ナトリウム、タングステン（VI）酸カリウム、タングステン(VI)酸ナトリウム無水和物、及びタングステン(VI)酸ナトリウム二水和物からなる群から選ばれる１又は２以上の化合物をさらに含有することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の共役脂肪酸の製造用組成物。
【請求項９】
酵素が、嫌気性菌由来である請求項1〜８のいずれかに記載の共役脂肪酸の製造用組成物。
【請求項１０】
嫌気性菌が、乳酸菌である請求項９に記載の共役脂肪酸の製造用組成物。
【請求項１１】
乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）・FERM BP-10549菌株である請求項９に記載の共役脂肪酸の製造用組成物。
【請求項１２】
共役脂肪酸が、Δ９にシス型、Δ１１位にトランス型の二重結合を有する共役脂肪酸、又はΔ９にトランス型、Δ１１位にトランス型の二重結合を有する共役脂肪酸である請求項１〜１１のいずれかに記載の共役脂肪酸の製造用組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の共役脂肪酸の製造用組成物を用いて、脂肪酸から共役脂肪酸を製造することを特徴とする共役脂肪酸の製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれかに記載の共役脂肪酸の製造用組成物を用いて、Δ９、Δ１２位にシス型の二重結合を有する脂肪酸からその共役幾何異性体を製造することを特徴とする共役脂肪酸の製造方法。
【請求項１５】
共役脂肪酸の製造用組成物を製造するための、配列表配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる酵素、又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素の使用。
【請求項１６】
共役脂肪酸の製造用組成物を製造するための、配列表配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる酵素、又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素の使用。
【請求項１７】
共役脂肪酸の製造用組成物を製造するための、配列表配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる酵素、又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素の使用。
【請求項１８】
配列表配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる酵素。
【請求項１９】
配列表配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる酵素。
【請求項２０】
配列表配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる酵素。
【請求項２１】
次の１〜３の３種の核酸配列が遺伝子工学的に導入されている形質転換体。
１．次の１）〜３）の群から選択される１の核酸配列
１）配列表配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列
２）配列表配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする核酸配列
３）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列
２．次の１）〜３）の群から選択される１の核酸配列
１）配列表配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列
２）配列表配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする核酸配列
３）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列
３．次の１）〜３）の群から選択される１の核酸配列
１）配列表配列番号３で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列
２）配列表配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする核酸配列
３）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列。
【請求項２２】
次の１）〜３）に記載の３種の核酸配列が遺伝子工学的に導入されている形質転換体。
１）請求項２１、１．１）に記載の核酸配列、
２）請求項２１、２．１）に記載の核酸配列、及び
３）請求項２１、３．１）に記載の核酸配列。
【請求項２３】
１）請求項２１、１．２）に記載の核酸配列、
２）請求項２１、２．２）に記載の核酸配列、及び
３）請求項２１、３．２）に記載の核酸配列。
【請求項２４】
１）請求項２１、１．３）に記載の核酸配列、
２）請求項２１、２．３）に記載の核酸配列、及び
３）請求項２１、３．３）に記載の核酸配列。
【請求項２５】
宿主がエシェリッヒ・コリ、ラクトバチルス・プランタルムである、請求項２０〜２２に記載の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は次の１〜３の3種の酵素を少なくとも含有することを特徴とする共役脂肪酸の製造用組成物、及び該組成物を用いた効率の良い新規な共役脂肪酸の製造方法に関する。
１．次の１）〜４）の群から選択される１の酵素として、１）配列表配列番号１のアミノ酸配列を含む酵素、２）配列表配列番号１のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む酵素、３）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列がコードする蛋白質を含む酵素または４）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列がコードする蛋白質を含む酵素。
２．次の１）〜４）の群から選択される１の酵素として、１）配列表配列番号２のアミノ酸配列を含む酵素、２）配列表配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む酵素、３）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列がコードする蛋白質を含む酵素または４）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列がコードする蛋白質を含む酵素。
３．次の１）〜４）の群から選択される１の酵素として、１）配列表配列番号３のアミノ酸配列を含む酵素、２）配列表配列番号３のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む酵素、３）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列がコードする蛋白質を含む酵素または４）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列がコードする蛋白質を含む酵素。
【背景技術】
【０００２】
共役脂肪酸とは分子内に共役した二重結合を有する脂肪酸の位置異性体、幾何異性体の総称である。１９７９年にウイスコンシン大学のパリザらは焼いたハンバーグの抽出物に変異原性調節作用があることを見いだし、この抽出物が７，１２−ジメチルベンツアントラセンによって引き起こされ皮膚ガンを抑制することを発見した。更に、この抽出物を精製、分離した結果、リノール酸の位置異性体と幾何異性体の混合物、すなわち共役リノール酸であることが判明した（非特許文献１）。この発見がきっかけとなり、共役脂肪酸に関するさまざまな生理活性に関する研究が行われるようになり、脂質代謝改善作用、抗動脈硬化作用、体脂肪減少作用、免疫調節作用、血圧上昇抑制作用など様々な生理活性が報告されおり、現在最も注目を集めている機能性脂質の１つとなった。
【０００３】
現在、研究用やサプリメント原料として市販されている共役脂肪酸はリノール酸をアルカリ異性化によって合成される共役リノール酸である。しかし、アルカリ処理による合成法は多くの非天然型の異性体を生成するため、健康を意識した製品としては好ましくなかった。
【０００４】
そこで、天然物からの抽出や微生物変換を利用した方法が注目されてきた。共役リノール酸は天然には、牛や羊、ヤギなどの反芻動物の肉や乳製品に比較的多く含有されるが、これは反芻胃に存在するバクテリアなどの微生物がリノール酸からバクセン酸を生成する際の中間体として共役リノール酸を生成するからであると考えられている。しかし、こうした反芻動物由来の油脂に含まれる共役リノール酸の含有率は１％にも満たないため、これを抽出してそのまま利用するのは現実的ではなかった。
【０００５】
微生物変換を利用した方法としてはラクトバチルス・リューテリPYR８（Lactobacillus reuteriPYR8PYR８、ATCC55739）菌株（特許文献１）を用いた方法が報告されているが反応基質のリノール酸を高濃度に添加すると反応が進まないために、反応効率が非常に悪く実用的なものではなかった。その後、ラクトバチルス・アシドフィラス、又はラクトバチルス・プランタルム（非特許文献２、３、４）菌株等に属する乳酸菌を用いた方法が効率的な生産方法として報告されているが、いまだ十分なものではなかった。
【０００６】
一方、共役リノール酸には理論的には２８種の異性体が存在するが、その中で特に生理活性が注目されているのはcis-9,trans-11-octadecadienoic acidとtrans-10,cis-12-octadecadienoic acidであり、前者には抗癌作用などが、後者には体脂肪低下作用などが報告されている。（非特許文献５）これらの異性体を生産しうる微生物としては、cis-9,trans-11-octadecadienoic acidを生産しうるラクトバチルス・リューテリPYR８（ATCC55739）やtrans-10,cis-12-octadecadienoic acidを生産しうるプロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes） ATCC 6919株などが報告されている（特許文献２）。
【０００７】
また、ラクトバチルス・リューテリPYR８（Lactobacillus reuteri）PYR8、ATCC55739菌由来のcis-9,trans-11-octadecadienoic acidを生産しうるリノール酸イソメラーゼのクローニングならびに大腸菌、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、ラクトバチルス・リューテリ（Lactobacillus reuteri）における発現に関する報告があるが、該酵素を発現する形質転換株では、大腸菌（Echerichia  coli）、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、ラクトバチルス・リューテリ（Lactobacillus reuteri）いずれにおいてもリノール酸を共役脂肪酸へ変換することはできなかったとされている（特許文献２）。一方、プロピオバクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes） ATCC 6919株菌由来のtrans-10,cis-12-octadecadienoic acidを生産しうるリノール酸イソメラーゼのクローニングならびに大腸菌、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）における発現に関する報告があり、該酵素を発現する形質転換大腸菌ならびにバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）における機能発現が報告されている（特許文献２）。しかし、これら形質転換株により生成する共役リノール酸はtrans-10,cis-12-octadecadienoic acidであるとされている。したがってこれまで、cis-9,trans-11-octadecadienoic acidならびにtrans-9,trans-11-octadecadienoic acidを生産する酵素系は知られていなかった。
【特許文献１】ＵＳＰ６，０６０，３０４号公報
【特許文献２】特表２００３−５０３０６１号公報
【非特許文献１】Ｙ．Ｌ．Ｈａら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、８、１８８１（１９８７）
【非特許文献２】小川順ら、生物工学、８２、２８５（２００４）
【非特許文献３】J．Ｏｇａｗａら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６７、１２４６（２００１）
【非特許文献４】小川順ら、科学と工学、７６、１６３（２００２）
【非特許文献５】M．W．Parizaら、Progress in Lipid Research、４０、２８３（２００１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は次の１〜３の3種の酵素を少なくとも含有することを特徴とする共役脂肪酸の製造用組成物、及び該組成物を用いた効率の良い新規な共役脂肪酸の製造方法に関するものである。
１．次の１）〜４）の群から選択される１の酵素として、１）配列表配列番号１のアミノ酸配列を含む酵素、２）配列表配列番号１のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む酵素、３）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列がコードする蛋白質を含む酵素または４）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列がコードする蛋白質を含む酵素。
２．次の１）〜４）の群から選択される１の酵素として、１）配列表配列番号２のアミノ酸配列を含む酵素、２）配列表配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む酵素、３）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列がコードする蛋白質を含む酵素または４）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列がコードする蛋白質を含む酵素。
３．次の１）〜４）の群から選択される１の酵素として、１）配列表配列番号３のアミノ酸配列を含む酵素、２）配列表配列番号３のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む酵素、３）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列がコードする蛋白質を含む酵素または４）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列がコードする蛋白質を含む酵素。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ラクトバチルス・リューテリPYR８（ATCC55739）菌由来のcis-9,trans-11-octadecadienoic acidを生産しうるリノール酸イソメラーゼのクローニングならびに大腸菌、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、ラクトバチルス・リューテリ（Lactobacillus reuteri）における発現に関する報告があるが、該酵素を発現する形質転換株では、大腸菌、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、ラクトバチルス・リューテリ（Lactobacillus reuteri）いずれにおいてもリノール酸を共役脂肪酸へ変換することはできなかったとされている（特表２００３−５０３０６１号公報）。本発明者等はこれらの結果から、ラクトバチルス・リューテリ（Lactobacillus reuteri）PYR８（ATCC55739）菌においてリノール酸イソメラーゼとして報告されているタンパク質のみでは、共役リノール酸を生産できないこと、ならびにこのタンパク質以外にも共役リノール酸生産に必要なタンパク質が存在することに想到し、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ラクトバチルス・プランタルムの菌体内に存在する３種類の酵素がリノール酸を共役リノール酸へ変換する反応に必須であることを発見し、本発明を完成するにいたった。
【００１０】
すなわち本発明は以下に関する。
（１）次の１〜３の3種の酵素を含有することを特徴とする脂肪酸から共役脂肪酸を製造するための組成物。
１．次の１）〜４）の群から選択される１の酵素
１）配列表配列番号１のアミノ酸配列を含む酵素
２）配列表配列番号１のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む酵素
３）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列がコードする蛋白質を含む酵素
４）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列がコードする蛋白質を含む酵素。
２．次の１）〜４）の群から選択される１の酵素
１）配列表配列番号２のアミノ酸配列を含む酵素
２）配列表配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む酵素
３）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列がコードする蛋白質を含む酵素
４）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列がコードする蛋白質を含む酵素。
３．次の１）〜４）の群から選択される１の酵素
１）配列表配列番号３のアミノ酸配列を含む酵素
２）配列表配列番号３のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む酵素
３）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列がコードする蛋白質を含む酵素
４）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列がコードする蛋白質を含む酵素。
（２）次の１）〜３）に記載の３種の酵素を含有することを特徴とする上記（１）に記載の共役脂肪酸の製造用組成物。
１）上記１、１．１）に記載の酵素、
２）上記１、２．１）に記載の酵素、及び
３）上記１、３．１）に記載の酵素。
（３）次の１）〜３）に記載の３種の酵素を含有することを特徴とする上記（１）に記載の共役脂肪酸の製造用組成物。
１）上記１、１．２）に記載の酵素
２）上記１、２．２）に記載の酵素、及び
３）上記１、３．２）に記載の酵素。
（４）次の１）〜３）に記載の３種の酵素を含有することを特徴とする上記（１）に記載の共役脂肪酸の製造用組成物。
１）上記１、１．３）に記載の酵素
２）上記１、２．３）に記載の酵素、及び
３）上記１、３．３）に記載の酵素。
（５）次の１）〜３）に記載の３種の酵素を含有することを特徴とする上記（１）に記載の共役脂肪酸の製造用組成物。
１）上記１、１．４）に記載の酵素
２）上記１、２．４）に記載の酵素、及び
３）上記１、３．４）に記載の酵素。
（６）補因子をさらに含有する上記（１）〜（５）のいずれかに記載の共役脂肪酸の製造用組成物。
（７）補因子がNADPH又は、NADH及びFADである上記（６）に記載の共役脂肪酸の製造用組成物。
（８）モリブデン酸カリウム、モリブデン(VI)酸二ナトリウム無水和物、モリブデン(VI)酸二ナトリウム二水和物、オルトバナジン（Ｖ）酸ナトリウム、メタバナジン（Ｖ）酸ナトリウム、タングステン（VI）酸カリウム、タングステン(VI)酸ナトリウム無水和物、及びタングステン(VI)酸ナトリウム二水和物からなる群から選ばれる１又は２以上の化合物をさらに含有することを特徴とする上記（１）〜（７）のいずれかに記載の共役脂肪酸の製造用組成物。
（９）酵素が、嫌気性菌由来である上記（１）〜（８）のいずれかに記載の共役脂肪酸の製造用組成物。
（１０）嫌気性菌が、乳酸菌である上記（９）に記載の共役脂肪酸の製造用組成物。
（１１）乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）・FERM BP-10549菌株である上記（９）に記載の共役脂肪酸の製造用組成物。
（１２）共役脂肪酸が、Δ９にシス型、Δ１１位にトランス型の二重結合を有する共役脂肪酸、又はΔ９にトランス型、Δ１１位にトランス型の二重結合を有する共役脂肪酸である上記（１）〜（１１）のいずれかに記載の共役脂肪酸の製造用組成物。
（１２−２）共役脂肪酸が、Δ９にシス型、Δ１１位にトランス型の二重結合を有する共役脂肪酸である上記（１２）に記載の共役脂肪酸の製造用組成物。
（１２−３）共役脂肪酸が、Δ９にトランス型、Δ１１位にトランス型の二重結合を有する共役脂肪酸である上記（１２）に記載の共役脂肪酸の製造用組成物。
（１３）上記（１）〜（１２）のいずれかに記載の共役脂肪酸の製造用組成物を用いて、脂肪酸から共役脂肪酸を製造することを特徴とする共役脂肪酸の製造方法。
（１３−２）上記（１２−２）又は（１２−３）に記載の共役脂肪酸の製造用組成物を用いて、Δ９、Δ１２位にシス型の二重結合を有する脂肪酸からその共役幾何異性体を製造することを特徴とする共役脂肪酸の製造方法。
（１４）上記（１）〜（１２）のいずれかに記載の共役脂肪酸の製造用組成物を用いて、Δ９、Δ１２位にシス型の二重結合を有する脂肪酸からその共役幾何異性体を製造することを特徴とする共役脂肪酸の製造方法。
（１５）共役脂肪酸の製造用組成物を製造するための、配列表配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる酵素、又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素の使用。
（１６）共役脂肪酸の製造用組成物を製造するための、配列表配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる酵素、又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素の使用。
（１７）共役脂肪酸の製造用組成物を製造するための、配列表配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる酵素、又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素の使用。
（１８）配列表配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる酵素。
（１９）配列表配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる酵素。
（２０）配列表配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる酵素。
（２１）次の１〜３記載の３種の核酸配列が遺伝子工学的に導入されている形質転換体。
１．次の１）〜３）の群から選択される１の核酸配列
１）配列表配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列
２）配列表配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする核酸配列
３）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列
２．次の１）〜３）の群から選択される１の核酸配列
又は該核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列、
１）配列表配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列又は該核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列、及び
２）配列表配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする核酸配列
３）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列
３．次の１）〜３）の群から選択される１の核酸配列
１）配列表配列番号３で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列
２）配列表配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする核酸配列
３）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列又は該核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列。
（２２）次の１）〜３）に記載の３種の核酸配列が遺伝子工学的に導入されている形質転換体。
１）上記２１、１．１）に記載の核酸配列、
２）上記２１、２．１）に記載の核酸配列、及び
３）上記２１、３．１）に記載の核酸配列。
（２３）次の１）〜３）に記載の３種の核酸配列が遺伝子工学的に導入されている形質転換体。
１）上記２１、１．２）に記載の核酸配列、
２）上記２１、２．２）に記載の核酸配列、及び
３）上記２１、３．２）に記載の核酸配列。
（２４）次の１）〜３）に記載の３種の核酸配列が遺伝子工学的に導入されている形質転換体。
１）上記２１、１．３）に記載の核酸配列、
２）上記２１、２．３）に記載の核酸配列、及び
３）上記２１、３．３）に記載の核酸配列。
（２５）宿主がエシェリッヒ・コリ、ラクトバチルス・プランタルムである、上記（２０）〜（２２）に記載の形質転換体。
（２６）１）配列表配列番号１で表されるアミノ酸配列、２）配列表配列番号２で表されるアミノ酸配列、及び３）配列表配列番号３で表されるアミノ酸配列、の少なくとも１つのアミノ酸配列において１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からそれぞれなる３種の酵素、を少なくとも含有することを特徴とする共役脂肪酸の製造用組成物。
（２７）１）配列表配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列、２）配列表配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列、及び３）配列表配列番号３で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列、がそれぞれコードするタンパク質を少なくとも含有することを特徴とする共役脂肪酸の製造用組成物。
（２８）共役脂肪酸の製造用組成物を製造するための、配列表配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる酵素の使用。
（２９）共役脂肪酸の製造用組成物を製造するための、配列表配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる酵素の使用。
（３０）共役脂肪酸の製造用組成物を製造するための、配列表配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる酵素の使用。
（３１）配列表配列番号1で表されるアミノ酸配列からなる酵素、又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素。
（３２）配列表配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる酵素、又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素。
（３３）配列表配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる酵素、又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は次の１〜３の3種の酵素を少なくとも含有することを特徴とする共役脂肪酸の製造用組成物、及び該組成物を用いた効率の良い新規な共役脂肪酸の製造方法を提供するものである。
１．次の１）〜４）の群から選択される１の酵素として、１）配列表配列番号１のアミノ酸配列を含む酵素、２）配列表配列番号１のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む酵素、３）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列がコードする蛋白質を含む酵素または４）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列がコードする蛋白質を含む酵素。
２．次の１）〜４）の群から選択される１の酵素として、１）配列表配列番号２のアミノ酸配列を含む酵素、２）配列表配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む酵素、３）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列がコードする蛋白質を含む酵素または４）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列がコードする蛋白質を含む酵素。
３．次の１）〜４）の群から選択される１の酵素として、１）配列表配列番号３のアミノ酸配列を含む酵素、２）配列表配列番号３のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む酵素、３）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列がコードする蛋白質を含む酵素または４）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列がコードする蛋白質を含む酵素。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明について、以下具体的に説明する。
本発明の共役脂肪酸の製造用組成物としては、上記１〜３からそれぞれなる３種の酵素を少なくとも含有すればよい。
【００１３】
ここで「アミノ酸配列を含む酵素」とは、当該アミノ酸配列を少なくとも一部として有する酵素であればよく、さらにそのアミノ酸配列の前後等にアミノ酸配列を付加した酵素等であってもよいことをいう。また、「蛋白質を含む酵素」とは、当該蛋白質を少なくとも有する酵素であればよく、さらにその蛋白質に他の物質を添加した酵素等であってもよいことをいう。
また、「３種」とは、上記の１〜３からそれぞれなる、配列表配列番号１、２および３に関わる３種の酵素のことをいい、本発明の共役脂肪酸の製造用組成物にはこれらが全て含まれていることが必須である。また、これら３種の酵素を少なくとも含んでいれば、その他の物質を含むものであってもよいことをいう。
【００１４】
本発明の共役脂肪酸の製造用組成物として、下記も有用である。
（１）上記１、１．１）に記載の酵素、上記１、２．１）に記載の酵素、及び上記１、３．１）に記載の酵素の３種の酵素を少なくとも含有するもの，（２）上記１、１．２）に記載の酵素、上記１、２．２）に記載の酵素、及び上記１、３．２）に記載の酵素の３種の酵素を少なくとも含有するもの，（３）上記１、１．３）に記載の酵素、上記１、２．３）に記載の酵素、及び上記１、３．３）に記載の酵素を少なくとも含有するもの，または（４）上記１、１．４）に記載の酵素、上記１、２．４）に記載の酵素、及び上記１、３．４）に記載の酵素を少なくとも含有するもの等である。
【００１５】
さらに、上記の共役脂肪酸の製造用組成物に、補因子をさらに含有するものも有用である。補因子としてはNADPH又は、NADH及びFAD等が挙げられる。また、上記の共役脂肪酸の製造用組成物に、１又は２以上の化合物をさらに含有するものも有用である。化合物としてはモリブデン酸カリウム、モリブデン(VI)酸二ナトリウム無水和物、モリブデン(VI)酸二ナトリウム二水和物、オルトバナジン（Ｖ）酸ナトリウム、メタバナジン（Ｖ）酸ナトリウム、タングステン（VI）酸カリウム、タングステン(VI)酸ナトリウム無水和物、及びタングステン(VI)酸ナトリウム二水和物等が挙げられる。
【００１６】
上記の共役脂肪酸の製造用組成物として用いる酵素は、嫌気性菌由来であることが好ましく、嫌気性菌が、乳酸菌であることがさらに好ましく、乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）・FERM BP-10549菌株であることが特に好ましい。
【００１７】
本発明によって得られる共役脂肪酸は、基質によって異なるが、Δ９にシス型、Δ１１位にトランス型の二重結合を有する共役脂肪酸、又はΔ９にトランス型、Δ１１位にトランス型の二重結合を有する共役脂肪酸であることが好ましい。
【００１８】
本発明の共役脂肪酸の製造用組成物に用いられる配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる酵素としては、その配列を有する限り、特にその起源（由来）は限定されない。由来が微生物である場合は、好ましくは嫌気性菌であり、より好ましくは通性嫌気性菌であり、より好ましくは乳酸菌であり、更に好ましくはラクトバチルス・プランタルム・（Lactobacillus plantarum）・FERM BP-10549である。また、遺伝子組換え技術によって生産された酵素も本発明の範疇に含まれる。本発明の共役脂肪酸の製造用組成物に用いられる配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる酵素は、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる酵素、及び配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる酵素と共に用いられることによって、本発明の共役脂肪酸変換活性、具体的には例えばΔ９、Δ１２位にシス型の二重結合を有する脂肪酸からその共役幾何異性体である共役脂肪酸を生成させる活性を有する。
【００１９】
本発明の共役脂肪酸の製造用組成物に含有される、配列番号１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる酵素、及び配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる酵素と共に用いられることによって、本発明の共役脂肪酸変換活性、具体的には例えばΔ９、Δ１２位にシス型の二重結合を有する脂肪酸からその共役幾何異性体である共役脂肪酸を生成させる活性を有するものであれば何ら限定されない。
【００２０】
本発明の共役脂肪酸の製造用組成物に含有される、配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列がコードするタンパク質としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる酵素、及び配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる酵素と共に用いられることによって、本発明の共役脂肪酸変換活性、具体的には例えばΔ９、Δ１２位にシス型の二重結合を有する脂肪酸からその共役幾何異性体である共役脂肪酸を生成させる活性を有するものであれば何ら限定されない。
【００２１】
本発明の共役脂肪酸の製造用組成物に含有される、配列番号１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列がコードするタンパク質としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列、及び配列番号３で表されるアミノ酸配列と共に用いられることによって、本発明の共役脂肪酸変換活性、具体的には例えばΔ９、Δ１２位にシス型の二重結合を有する脂肪酸からその共役幾何異性体である共役脂肪酸を生成させる活性を有するものであれば何ら限定されない。
【００２２】
本発明の共役脂肪酸の製造用組成物に用いられる配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる酵素としては、その配列を有する限り、特にその起源（由来）は限定されない。由来が微生物である場合は、好ましくは嫌気性菌であり、より好ましくは通性嫌気性菌であり、より好ましくは乳酸菌であり、更に好ましくはラクトバチルス・プランタルム・（Lactobacillus plantarum）・FERM BP-10549である。また、遺伝子組換え技術によって生産された酵素も本発明の範疇に含まれる。本発明の共役脂肪酸の製造用組成物に用いられる配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる酵素は、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる酵素、及び配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる酵素と共に用いられることによって、本発明の共役脂肪酸変換活性、具体的には例えばΔ９、Δ１２位にシス型の二重結合を有する脂肪酸からその共役幾何異性体である共役脂肪酸を生成させる活性を有する。
【００２３】
本発明の共役脂肪酸の製造用組成物に含有される、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる酵素、及び配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる酵素と共に用いられることによって、本発明の共役脂肪酸変換活性、具体的には例えばΔ９、Δ１２位にシス型の二重結合を有する脂肪酸からその共役幾何異性体である共役脂肪酸を生成させる活性を有するものであれば何ら限定されない。
【００２４】
本発明の共役脂肪酸の製造用組成物に含有される、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列がコードするタンパク質としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる酵素、及び配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる酵素と共に用いられることによって、本発明の共役脂肪酸変換活性、具体的には例えばΔ９、Δ１２位にシス型の二重結合を有する脂肪酸からその共役幾何異性体である共役脂肪酸を生成させる活性を有するものであれば何ら限定されない。
【００２５】
本発明の共役脂肪酸の製造用組成物に含有される、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列がコードするタンパク質としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列、及び配列番号３で表されるアミノ酸配列と共に用いられることによって、本発明の共役脂肪酸変換活性、具体的には例えばΔ９、Δ１２位にシス型の二重結合を有する脂肪酸からその共役幾何異性体である共役脂肪酸を生成させる活性を有するものであれば何ら限定されない。
【００２６】
本発明の共役脂肪酸の製造用組成物に用いられる配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる酵素としては、その配列を有する限り、特にその起源（由来）は限定されない。由来が微生物である場合は、好ましくは嫌気性菌であり、より好ましくは通性嫌気性菌であり、より好ましくは乳酸菌であり、更に好ましくはラクトバチルス・プランタルム・（Lactobacillus plantarum）・FERM BP-10549である。また、遺伝子組換え技術によって生産された酵素も本発明の範疇に含まれる。本発明の共役脂肪酸の製造用組成物に用いられる配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる酵素は、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる酵素、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる酵素と共に用いられることによって、本発明の共役脂肪酸変換活性、具体的には例えばΔ９、Δ１２位にシス型の二重結合を有する脂肪酸からその共役幾何異性体である共役脂肪酸を生成させる活性を有する。
【００２７】
本発明の共役脂肪酸の製造用組成物に含有される、配列番号３で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる酵素、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる酵素と共に用いられることによって、本発明の共役脂肪酸変換活性、具体的には例えばΔ９、Δ１２位にシス型の二重結合を有する脂肪酸からその共役幾何異性体である共役脂肪酸を生成させる活性を有するものであれば何ら限定されない。
【００２８】
本発明の共役脂肪酸の製造用組成物に含有される、配列番号３で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列がコードするタンパク質としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる酵素、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる酵素と共に用いられることによって、本発明の共役脂肪酸変換活性、具体的には例えばΔ９、Δ１２位にシス型の二重結合を有する脂肪酸からその共役幾何異性体である共役脂肪酸を生成させる活性を有するものであれば何ら限定されない。
【００２９】
本発明の共役脂肪酸の製造用組成物に含有される、配列番号３で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列がコードするタンパク質としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列と共に用いられることによって、本発明の共役脂肪酸変換活性、具体的には例えばΔ９、Δ１２位にシス型の二重結合を有する脂肪酸からその共役幾何異性体である共役脂肪酸を生成させる活性を有するものであれば何ら限定されない。
【００３０】
尚、本発明における、欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸の個数は、下限としては１個以上であることが好ましく、２個以上であることがより好ましく、５個以下であることが最も好ましい。１個が好ましい態様がある。
【００３１】
また、本発明に用いられるそれぞれ３種の酵素としては、次の１〜３の酵素が共に用いられることによって、本発明の共役脂肪酸変換活性、具体的には例えばΔ９、Δ１２位にシス型の二重結合を有する脂肪酸からその共役幾何異性体である共役脂肪酸を生成させる活性を有するものであればいずれでもよく、配列番号１で表されるアミノ酸配列、配列番号２で表されるアミノ酸配列、及び配列番号３で表されるアミノ酸配列、からなるそれぞれの酵素が遺伝的に改変された酵素であってもよい。
１．次の１）〜４）の群から選択される１の酵素として、１）配列表配列番号１のアミノ酸配列を含む酵素、２）配列表配列番号１のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む酵素、３）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列がコードする蛋白質を含む酵素または４）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列がコードする蛋白質を含む酵素。
２．次の１）〜４）の群から選択される１の酵素として、１）配列表配列番号２のアミノ酸配列を含む酵素、２）配列表配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む酵素、３）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列がコードする蛋白質を含む酵素または４）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列がコードする蛋白質を含む酵素。
３．次の１）〜４）の群から選択される１の酵素として、１）配列表配列番号３のアミノ酸配列を含む酵素、２）配列表配列番号３のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む酵素、３）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列がコードする蛋白質を含む酵素または４）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列がコードする蛋白質を含む酵素。
【００３２】
遺伝的に改変する方法としては、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列、配列番号２で表されるアミノ酸配列、及び配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する酵素をコードする遺伝子の塩基配列の情報を基にして該酵素類を取得することができる。なお、遺伝子組換え技術については、公知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら；「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂａｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９等の遺伝子操作実験マニュアル）に従って実施することが可能である。
【００３３】
具体的には例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列、配列番号２で表されるアミノ酸配列、及び配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する酵素をコードする遺伝子配列の情報を基にして適当なプライマー又はプローブを設計し、前記プライマー又はプローブと、目的とする生物由来の試料とを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法又はハイブリダイゼーション法を実施することにより目的の遺伝子を取得し、続いて遺伝子を改変するために通常用いられる方法、例えば部位特異的変異誘発法（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６６２−５６６６，１９８４）により遺伝子を改変し、その改変された遺伝子を適当な発現系、例えば大腸菌や乳酸菌を宿主として用いて発現させることにより改変された酵素を取得することができる。
【００３４】
又、本発明におけるストリンジェントな条件とは、当業者には十分理解できることであり、たとえば、T.Maniatisらの実験操作書（Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory 1982、1989）などに従えば容易に実施できる。
【００３５】
すなわち、ストリンジェントな条件とは、３０％ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中（５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性せん断サケ精子ＤＮＡ）で３７℃のインキュベーションを一晩行ない、その後２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１０分の洗浄を３回行ない、次いで１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で１０分の洗浄を２回行なう条件である（低ストリンジエンシー）。より好ましい条件は、４０％ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中で４２℃のインキュベーションを一晩行ない、その後２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１０分の洗浄を３回行ない、次いで０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ中、４２℃で１０分の洗浄を２回行なう条件である（中ストリンジエンシー）。最も好ましい条件は、５０％ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中で４２℃のインキュベーションを一晩行ない、その後２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１０分の洗浄を３回行ない、次いで０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃で１０分の洗浄を２回行なう条件である（高ストリンジエンシー）。
【００３６】
また、本発明に用いられるそれぞれ３種の酵素としては、上記１〜３の酵素が共に用いられることによって、本発明の共役脂肪酸変換活性、具体的には例えばΔ９、Δ１２位にシス型の二重結合を有する脂肪酸からその共役幾何異性体である共役脂肪酸を生成させる活性を有するものであれば、配列番号１で表されるアミノ酸配列、配列番号２で表されるアミノ酸配列、及び配列番号３で表されるアミノ酸配列との相同性が７５％以上であるアミノ酸配列からなる酵素であってもよい。相同性としては、８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることが特に好ましく、９８％以上であることが最も好ましい。
【００３７】
本発明のおける「相同性」とはアミノ酸配列、DNAレベルにおける相同性を意味し、これは既知の方法、例えばコンピュータを用いた配列比較で決定することができる。解析ソフトとしてはGENETEX  WIN  ５．２（ソフトウエア株式会社製）を使用した。相同性決定に用いられるコンピュータプログラムには、GAP（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２  （１２）：３８７（１９８４）を含むＧＣＧプログラムパッケージ、ＢＬＡＳＴパッケージ（ＮＣＢＩ，又はＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））、又はスミス−ウオーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズムが例示されるが、これらに限定されない。
【００３８】
本発明における３種の酵素の反応液への添加量は、効率的に共役脂肪酸へ変換される量であれば何ら問題はなく、例えば、０．００１〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．２〜２ｍｇ／ｍｌである。
【００３９】
本発明に用いられる補因子としては、上記１〜３からそれぞれなる３種の酵素、を少なくとも含有することを特徴とする共役脂肪酸の製造用組成物を用いて、脂肪酸から共役脂肪酸に変換する際に、該変換反応を助長するものであれば何ら限定されず、例えば、NAD、NADP、及びFADからなる群から選択される１種又は２種以上が挙げられる。好ましくはNADP、またはNAD及びFADが挙げられる。その添加濃度は変換反応が効率良く反応する濃度であればよい。好ましくは０．１〜２０ｍM、より好ましくは１〜１０ｍMである。
【００４０】
本発明の組成物としては上記の組成物に対して、脂肪酸から共役脂肪酸に変換する際に、該変換反応を活性化させる化合物を添加させることも大変に好ましい。該活性化剤或いは活性化因子としては、上記１〜３からそれぞれなる３種の酵素、を少なくとも含有することを特徴とする共役脂肪酸の製造用組成物を用いて、脂肪酸から共役脂肪酸に変換する際に、該変換反応を活性化するものであれば何ら限定されないが、例えば好適な例として、モリブデン酸カリウム、モリブデン(VI)酸二ナトリウム無水和物、モリブデン(VI)酸二ナトリウム二水和物、オルトバナジン（Ｖ）酸ナトリウム、メタバナジン（Ｖ）酸ナトリウム、タングステン（VI）酸カリウム、タングステン(VI)酸ナトリウム無水和物、及びタングステン(VI)酸ナトリウム二水和物からなる群から選ばれる１又は２以上の化合物が挙げられる。その添加濃度は変換反応が効率良く反応する濃度であればよい。好ましくは０．１〜２０ｍM、より好ましくは１〜１０ｍMである。
【００４１】
本発明に用いられる嫌気性菌としては、上記１〜３からなる酵素を含有する菌であれば何ら問題はなく、好ましくは土壌分離菌であるラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）・FERM BP-10549菌株が良い。
【００４２】
ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）・FERM BP-10549菌株の菌学的性状は以下の通りである。
細胞形態                        桿菌（１×２μｍ）
グラム染色                        ＋
胞子                              −
運動性                            −
コロニー形態                    円形、全縁なめらか、低凸状、光沢性、クリーム状
カタラーゼ                        −
オキシダーゼ                      −
ＯＦ試験                          ＋
炭水化物からの酸生産
グリセロール                    −
エリスリトール                  −
Ｄ−アラビノース                −
Ｌ−アラビノース                ＋
リボース                        ＋
Ｄ−キシロース                  −
Ｌ−キシロース                  −
アドニトール                    −
β−メチル−Ｄ−キシロース      −
ガラクトース                    ＋
グルコース                      ＋
フルクトース                    ＋
マンノース                      ＋
ソルボース                      −
ラムノース                      −
ズルシトール                    −
イノシトール                    −
マンニトール                    ＋
ソルビトール                    ＋
α−メチル−Ｄ−マンノース      −
α−メチル−Ｄ−グルコース      −
Ｎ−アセチルグルコサミン        ＋
アミグダリン                    ＋
アルブチン                      ＋
エスクリン                      ＋
サリシン                        ＋
セロビオース                    ＋
マルトース                      ＋
乳糖                            ＋
メリビオース                    ＋
白糖                            ＋
トレハロース                    ＋
イヌリン                        −
メレチトース                    ＋
ラフィノース                    ＋
澱粉                            −
グリコーゲン                    −
キシリトール                    −
ゲンチオビオース                ＋
Ｄ−ツラノース                  ＋
Ｄ−リキソース                  −
Ｄ−タガトース                  −
Ｄ−フコース                    −
Ｌ−フコース                    −
Ｄ−アラビトール                −
Ｌ−アラビトール                −
グルコネート                    ＋Ｗ
２−ケトグルコン酸              −
５−ケトグルコン酸              −
発育性
１５℃                          ＋
４５℃                          −
エスクリン加水分解                ＋
硝酸塩還元                        −
アルギニン加水分解                −
本菌株は非運動性無芽胞のグラム陽性桿菌で、カタラーゼ陰性を示しブドウ糖を発酵的に分解することからラクトバチルス属と推定された。
【００４３】
炭水化物の発酵試験ではＢｅｒｇｙ‘ｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ｐ．Ｈ．Ａ  Ｓｎｅａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｅｒｇｙ‘ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．ｖｏｌ．２，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，１９８６）による所の、ラムノース及びキシロースで陰性を示し、他の基質に対しては全て陽性を示すとの知見、更に１５℃での生育、エスクリン加水分解で陽性、アルギニン加水分解性及び硝酸還元能で陰性を示すことから（Ｃｏｗａｎ  ａｎｄ  Ｓｔｅｅｌｓ医学細菌同定の手引き，第３版，近代出版，１９９３）本菌株をラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）と同定し、産業技術総合研究所特許生物寄託センターにラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）・FERM BP-10549として寄託した。
【００４４】
本発明に用いる共役脂肪酸を製造するときの基質となる脂肪酸は、を少なくとも上記１〜３のからからそれぞれなる３種の酵素が作用して脂肪酸から共役脂肪酸へ変換されるものであれば何ら限定されない。
【００４５】
基質とする脂肪酸は、リノール酸類、、γ−リノレン酸類、ジホモ−γ−リノレン酸類、アラキドン酸類、α−リノレン酸類、又はエイコサペンタエン酸類等が挙げられるが、このうち特にリノール酸類、γ−リノレン酸類または、α−リノレン酸類のようにΔ９、Δ１２位にシス型の二重結合を有する脂肪酸であることが好ましい。
Δ９、Δ１２位にシス型の二重結合を有する脂肪酸を基質とした場合には、その共役幾何異性体（Δ９位にシス型、Δ１１位にトランス型の二重結合を有する共役脂肪酸、又はΔ９、Δ１１位にトランス型の二重結合を有する共役脂肪酸等）へ変換されるものであればよく、何ら限定されない。
【００４６】
Δ９、Δ１２位にシス型の二重結合を有する脂肪酸としては、炭素数１８又は２０の脂肪酸が好ましく、炭素数１８の脂肪酸が特に好ましい。具体的には例えば、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、又はステアリドン酸が挙げられる。また、脂肪酸がトリグリセリド含有油にリパーゼ、ホスホリパーゼ、又はエステラーゼのような脂質加水分解酵素の作用により、遊離する脂肪酸であっても良い。トリグリセリド含有油としてはヒマワリ油、ベニバナ油、コーン油、亜麻仁油、パーム油、菜種油、イワシ油、ニシン油、からし油、落花生油、ゴマ油、紫蘇油、エゴマ油、綿実油、大豆油、ひまし油、又はくるみ油が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００４７】
本発明における共役脂肪酸の製造方法において、本発明に用いる３種類の酵素は固相支持体（人口膜、有機支持体、生体高分子支持体、無機支持体など）に結合されていても何ら問題ない。
【００４８】
本発明の共役脂肪酸製造方法における反応は、脂肪酸を基質として、基質中に存在する非共役の２以上の二重結合を共役状態に異性化する変換反応であり、具体例としてはΔ９、Δ１２位にシス型の二重結合を有する脂肪酸からその共役幾何異性体（Δ９位にシス型、Δ１１位にトランス型の二重結合を有する共役脂肪酸、又はΔ９、Δ１１位にトランス型の二重結合を有する共役脂肪酸等）を得る反応である。該反応において反応のｐHは脂肪酸から共役脂肪酸を変換し得るｐHであれば良く、好ましくはｐH５〜８．５、更に好ましくはｐH６〜７である。反応のｐHを好適範囲に維持するために、適当な緩衝液（リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液など）を添加しても良い。基質の脂肪酸の濃度は共役脂肪酸に効率良く変換し得る濃度であれば良く、好ましくは０．０１％〜９０％、より好ましくは０．０５〜５０％、更に好ましくは０．１〜１０％である。
【００４９】
反応液には塩化コバルト（II）、塩化ニッケル（II）、硫酸鉄（II）、塩化カドミウム（II）、硫酸マンガン（II）、モリブデン酸カリウム、モリブデン酸ナトリウム、オルトバナジン酸ナトリウム、メタバナジン酸ナトリウム、タングステン酸カリウム、タングステン酸ナトリウム等を加えても何ら問題はない。添加濃度は共役脂肪酸に効率良く変換し得る濃度であれば良く、好ましくは０．０１％〜９０％、より好ましくは０．０５〜５０％、更に好ましくは０．１〜１０％である。
【００５０】
酵素の安定化を目的として、ディチオスレイトールやエチレングリコールを添加しても良い。添加濃度は共役脂肪酸に効率良く変換し得る濃度であれば良く、好ましくは０．０１％〜９０％、より好ましくは０．０５〜５０％、更に好ましくは０．１〜１０％である。
【００５１】
反応の温度は共役脂肪酸に効率良く変換し得る温度であれば良く、好ましくは５〜５０℃、より好ましくは２０〜４５℃、更に好ましくは３０〜４０℃である。
反応時間は該反応において不飽和脂肪酸から共役不飽和脂肪酸に変換しうる反応時間であれば何ら問題は無く、１〜１２０時間、好ましくは２〜２４時間、より好ましくは３〜１０時間、もっと好ましくは４〜６時間である。
反応は反応容器内を窒素置換や酸素吸着剤の使用などにより酸素濃度の低い条件下、より好ましくは嫌気的条件下で行えばよい。
【００５２】
本発明の形質転換体としては、次の１〜３の核酸配列が遺伝子工学的に導入されているものが本発明の範囲内に含まれる。
１．次の１）〜３）の群から選択される１の核酸配列として、１）配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列、２）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする核酸配列または３）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列を含む形質転換体。
２．次の１）〜３）の群から選択される１の核酸配列として、１）配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列、２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする核酸配列または３）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列を含む形質転換体。
３．次の１）〜３）の群から選択される１の核酸配列として、１）配列番号３で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列、２）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする核酸配列または３）１）又は２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列を含む形質転換体。
【００５３】
さらに、本発明の形質転換体としては、次の１）〜３）に記載の３種の核酸配列が遺伝子工学的に導入されているものであってもよい。
（１）１）上記１．１）に記載の核酸配列、上記２．１）に記載の核酸配列、及び上記３．１）に記載の核酸配列が導入された形質転換体，（２）１）上記１．２）に記載の核酸配列、上記２．２）に記載の核酸配列、及び上記３．２）に記載の核酸配列が導入された形質転換体，または（３）上記１．３）に記載の核酸配列、上記２．３）に記載の核酸配列、及び上記３．３）に記載の核酸配列が導入された形質転換体。
【００５４】
さらにこれらの形質転換体の宿主がエシェリッヒ・コリ、ラクトバチルス・プランタルムである、形質転換体であることが特に好ましい。
【００５５】
本発明の製造法に製造される共役脂肪酸を有効成分として含有する医薬、化粧品及び食品を製造しても何ら問題はない。
その場合、本発明の製造法により製造される共役脂肪酸を有効成分として含有する医薬の剤型としては、散在、顆粒剤、丸剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル錠、速崩錠、シロップ、液剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、粘付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製されるが、本発明により製造される共役脂肪酸は水に難溶性であるため、植物性油、動物性油等の非親水性有機溶媒に溶解するか又は、乳化剤、分散在もしくは界面活性剤等とともに、ホモジナイザー（高圧ホモジナイザー）を用いて水溶液中に分散、乳化させて用いる。更に、本発明の製造法により製造される共役脂肪酸の吸収性を高めるために、平均粒子系を１ミクロン程度まで微粉砕し用いることも可能である。
【００５６】
製剤化のために用いることができる添加剤には、例えば大豆油、サフラー油、オリーブ油、胚芽油、ひまわり油、牛脂、いわし油等の動植物性油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール等の多価アルコール、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル等の界面活性剤、精製水、乳糖、デンプン、結晶セルロース、Ｄ−マンニトール、レシチン、アラビアガム、ソルビトール液、糖液等の賦形剤、甘味料、着色料、ｐＨ調整剤、香料などをあげることができる。尚、液体製剤は、服用時に水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形であってもよい。また、錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしても良い。
【００５７】
注射剤の形で投与する場合には、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経皮、関節内、滑液嚢内、胞膜内、骨膜内、舌下、口腔内等に投与することが好ましく、特に静脈内投与又は腹腔内投与が好ましい。静脈内投与は、点滴投与、ポーラス投与のいずれであってもよい。
【００５８】
本発明の製造法により製造される共役脂肪酸を含有する機能性食品としては、例えば本発明の製造法により製造される共役脂肪酸含有サプリメント（散在、顆粒剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル錠、速崩錠、シロップ、液剤等）、本発明の製造法により製造される共役脂肪酸含有飲料（お茶、炭酸飲料、乳酸飲料、スポーツ飲料等）、本発明の製造法により製造される共役脂肪酸含有菓子（グミ、ゼリー、ガム、チョコレート、クッキー、キャンデー等）、本発明の製造法により製造される共役脂肪酸含有油、本発明の製造法により製造される共役脂肪酸含有油脂食品（マヨネーズ、ドレッシング、バター、クリーム、マーガリン等）、本発明の製造法により製造される共役脂肪酸含有ケチャップ、本発明の製造法により製造される共役脂肪酸含有ソース、本発明の製造法により製造される共役脂肪酸含有流動食、本発明の製造法により製造される共役脂肪酸含有乳製品（牛乳、ヨーグルト、チーズ等）、本発明の製造法により製造される共役脂肪酸含有パン類、本発明の製造法により製造される共役脂肪酸含有麺類（うどん、そば、ラーメン、パスタ、やきそば、きしめん、そーめん、ひやむぎ、ビーフン等）等が挙げられる。
【００５９】
本発明の製造法により製造される共役脂肪酸を含有する機能性食品には、必要に応じて各種栄養素、各種ビタミン類（ビタミンＡ、ビタミンB１、ビタミンB２、ビタミンB６、ビタミンC、ビタミンＤ、ビタミンE、ビタミンＫ等）、各種ミネラル類（マグネシウム、亜鉛、鉄、ナトリウム、カリウム、セレン等）、食物繊維、多価不飽和脂肪酸（アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸等）、リン脂質（レシチン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルＤＨＡ等）、糖脂質類（セレブロシド等）、カロチノイド類（β-カロチン、リコピン、アスタキサンチン、β−クリプトキサンチン等）、フラボノイド類（ケルセチン、ルテオリン、イソフラボン等）、キサントフィル類（カプサンチン、ルテイン、ゼアキサンチン等）、アミノ酸類（グリシン、セリン、アラニン、グルタミン、バリン、ロイシン、イソロイシン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、トリプトファン、フェニルアラニン、ヒスチジン、プロリン、メチオニン、システイン等）、その他の栄養素（カルニチン、セサミン、α−リポ酸、イノシトール、Ｄ−カイロイノシトール、ピニトール、タウリン、グルコサミン、コンドロイチン硫酸、Ｓ−アドノシルメチオニン、クルクミン、γ−オリザノール、グルタチオン、γ−アミノ酪酸、シネフリン、ピロロキノリンキノン、カテキン、カプサイシン等）、分散剤、乳化剤等の安定剤、甘味料、呈味成分（クエン酸、リンゴ酸等）、フレーバー、ローヤルゼリー、プロポリス、アガリクス等を配合することができる。また、ペパーミント、ベルガモット、カモンミール、ラベンダーなどのハーブ類を配合してもよい。また、テアニン、デヒドロエピアンドステロン、メラトニンなどの素材を配合してもよい。
【００６０】
本発明の化粧料としては、クリーム、乳液、ローション、マイクロエマルジョンエッセンス、入浴剤などが挙げられ、香料等を混合してもよい。
【実施例１】
【００６１】
ラクトバチルス・プランタラウムFERM BP-10549の培養方法
4℃にて保管している2%寒天を含むMRS高層培地よりラクトバチルス・プランタラルムFERM BP-10549を15 ml のMRS液体培地（Difco製; pH 6.5）に植菌し、28℃で20時間、120 rpmにて前培養を行った。本培養は、以下に示すリノール酸溶液を7.7 ml含む550 ml のMRS液体培地に前培養を全量植菌し、28℃で24時間、120 rpmにて行った。リノール酸溶液は、50 mgのリノール酸に10 mgの牛血清アルブミンを加え、1 mlの0.1 Mリン酸カリウムバッファー（pH 6.5）に懸濁し、10分間の超音波により均一にした後、0.45 μmのフィルターを用い除菌したものを用いた。培養後、3,000 rpm、4℃にて10分間遠心分離することにより集菌し、ラクトバチルス・プランタルラムFERM BP-10549の菌体を得た。
【実施例２】
【００６２】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する酵素（CLA-HY：CLA-ヒドラターゼ：共役リノール酸−ヒドラターゼ）の遺伝子のクローニング
(1) ゲノムDNAの取得
ラクトバチルス・プランタラルムFERM BP-10549の湿菌体14 gを180 mlのTENバッファー（10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 1 mM EDTA; 10 mM NaCl）に懸濁した。これに9 mlのSETバッファー（20％ Sucrose; 50 mM EDTA; 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)）、135 mgのリゾチームを加え37℃で10分間インキュベートしたのち、90 mlのTENバッファー、9 mlの25% SDS、18 mlの5 M NaCl、180 mlのフェノール、32 mlのクロロホルムを加えゆっくりと完全に混合した。その後、3,500 x gにて20分間室温にて遠心分離し、上層を回収した。続いて、上層と等量のクロロホルムを加え完全に混合し、3,500 x gにて20分間室温にて遠心分離し、上層を回収した。これに等量のエタノールを加え、完全に混合し、3,500 x gにて20分間室温にて遠心分離した。得られた沈殿を20分間真空デシケーターにて乾燥した後、少量のTEバッファー（10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA）に溶解した。これに20 μlのRNaseA溶液を添加し、37℃で15時間インキュベートした後、1.2 mlのクロロホルムを加え、3,500 x gにて20分間室温にて遠心分離し上層を回収した。これに6 mlのクロロホルムを加え、3,500 x gにて20分間室温にて遠心分離し、上層を回収した。さらに6 mlのイソプロパノールを加え完全に混合した後、30分室温にてインキュベートし、3,500 x gにて20分間室温にて遠心分離した。得られた沈殿物を70%エタノールにて洗浄した後、真空デシケーターにて乾燥し、TEバッファーに溶解し、ゲノムDNAを得た。
【００６３】
(2) PCRによるCLA-HY遺伝子の取得
ラクトバチルス・リューテリPYR8(ATCC55739)菌株（特許文献1）においてリノール酸イソメラーゼ遺伝子として報告されている遺伝子配列情報をもとに、公表されているラクトバチルス・プランタラムWCFS1株の全ゲノム遺伝子配列より有意な相同性を示す領域を検索した。その結果得られたopen-reading-frame (ORF)の開始コドンの5'側5〜33塩基上流の配列をもとに、センスプライマー（配列番号７）を、また、終止コドンの3'側7〜25塩基下流の配列を基にアンチセンスプライマー（配列番号８）を設計した。これらのプライマーを用い、ラクトバチルス・プランタラルムFERM BP-10549のゲノムDNAを鋳型とし、PCRを行った。PCRの結果増幅された遺伝子断片約1.8 kbpの塩基配列の解読を行った結果、本遺伝子断片には開始コドンTTGから始まり終止コドンTAAで終わる1,710 bpの一つのopen-reading-frame (ORF)（配列番号４）が含まれていることが判明し、本遺伝子をCLA-HY遺伝子とした。本CLA-HY遺伝子は配列番号１に示す５６９残基のアミノ酸からなるタンパク質をコードしていた。
【実施例３】
【００６４】
（CLA-HY）の大腸菌での発現
大腸菌発現用ベクターpET101/D-TOPO (Invitrogen)とロゼッタ2(DE3)株からなる宿主ベクター系を用いた。ラクトバチルス・プランタラルムFERM BP-10549のCLA-HY遺伝子の開始コドンTTGをATGに変え、そのATGの前にCACCを付加し、開始コドンならびにそれを含む3'末端側26塩基の配列に基づいて設計したセンスプライマー（配列番号９）と、終止コドンならびにそれを含む5'末端側30塩基の配列に基づいて設計したアンチセンスプライマー（配列番号１０）を用い、ラクトバチルス・プランタラルムFERM BP-10549のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った。PCRの結果増幅された約1.7 kbpの遺伝子断片をpET101/D-TOPOに挿入し、発現ベクター(pCLA-HY)を構築した。pCLA-HYをロゼッタ2(DE3)株に形質転換し、形質転換株ロゼッタ/pCLA-HY株を得た。得られたロゼッタ/pCLA-HY株を1 mgアンピシリンを含む10 ml LB培地（1%バクトトリプトン(Difco)、0.5%酵母エキス、1%塩化ナトリウムを含む培地(pH 7.0)）にて37℃、15時間好気的に培養し、前培養とした。これを14 mgアンピシリンを含む140 ml LB培地に2.8 ml植菌し、1時間37℃で好気的に培養した後、1 M IPTGを140 μl添加し、さらに20℃にて6時間好気的に培養した。培養後3,000 rpmにて10分間遠心分離し、ロゼッタ/pCLA-HY株の湿菌体を得た。得られた菌体を3 mlのバッファーA（20 mMリン酸カリウムバッファー(pH 6.5)、1 mM DTT、10%エチレングリコール）に懸濁し、3 mgのリゾチームを添加し氷上で30分間インキュベートした。その後、超音波により菌体を破砕し、遠心分離後、上清を無細胞抽出液CFE/pCLA-HYとして回収した。
【実施例４】
【００６５】
配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する酵素（CLA-DH：CLA-デヒドロゲナーゼ：共役リノール酸−デヒドロゲナーゼ）の精製及びN末端配列分析
(1) 共役リノール酸生成活性測定法
反応液は、40 μlのCFE/pCLA-HY、0.5 mM K2MoO4、0.5 mM NADH、0.01 mM FAD 0.2%リノール酸を含むバッファーAで、全量を0.8 mlとした。反応は、37℃にて、酸素吸着剤アネロパック（三菱化学）存在下で嫌気的に4時間、120 rpmで振とうしながら行った。反応後、反応液よりブライダイヤ−法にて脂質を抽出し、メチルエステル化した後にガスクロマトグラフィーにて、共役リノール酸の生成を評価した。
【００６６】
(2) CLA-DHの精製びN末端アミノ酸配列分析
ラクトバチルス・プランタラルムFERM BP-10549の洗浄菌体15 gを30 mlのバッファーAに懸濁し超音波により破砕した後、100,000 x g、90分間4℃にて超遠心分離を行った。超遠心分離により得られた上清画分を可溶性画分として回収した。得られた可溶性画分について、FPLCを用いてゲル濾過カラム(HiLoad 26/60 Superdex 200 prep grade)にて分画を行った結果、共存してはじめて活性を示す２つの画分すなわちフラクションAならびにフラクションBを得た。このうち、フラクションBについて、反応液にフラクションAを常に添加した条件下にて共役リノール酸生成活性を評価しながら、イオン交換カラム(Mono Q HR 5/5)、ゲル濾過カラム(Superose 6 HR 10/30)、による精製を行った。得られた精製画分をSDS-PAGE電気泳動にて分析し、活性の挙動と同じ挙動をしめすタンパク質のバンドを確認した後、このタンパク質CLA-DHをPVDF膜にブロッティングした。PVDF膜にブロッティングしたタンパク質CLA-DHのN末端アミノ酸配列を解読したところ、MKDFKDKVMFITの結果を得た。
【実施例５】
【００６７】
CLA-DHの遺伝子のクローニング及び大腸菌での発現
実施例４で得たCLA-DHのN末端アミノ酸配列情報をもとに公表されているラクトバチルス・プランタラルムWCFS1株の全ゲノム遺伝子配列より高い相同性を示す領域を検索した。その結果得られた相同性の高いORFの開始コドンの5'側9〜29塩基上流の配列を基にセンスプライマー（配列番号１１）を、また、終止コドンの3'側9〜31塩基下流の配列を基にアンチセンスプライマー（配列番号１２）を設計した。これらのプライマーを用い、ラクトバチルス・プランタラルムFERM BP-10549のゲノムDNAを鋳型とし、PCRを行った。PCRの結果増幅された遺伝子断片約0.9 kbpの塩基配列の解読を行った結果、本遺伝子断片には、開始コドンATGから始まり終止コドンTAAで終わる861 bpのCLA-DHをコードする一つのORF（配列番号５）が含まれていることが判明した。本CLA-DH遺伝子は配列番号２に示す２８６残基のアミノ酸からなるタンパク質をコードしていた。
【００６８】
大腸菌での発現には、大腸菌発現用ベクターpET101/D-TOPO (Invitrogen)とロゼッタ2(DE3)株からなる宿主ベクター系を用いた。ラクトバチルス・プランタラルムFERM BP-10549のCLA-DH遺伝子の開始コドンATGの前にCACCを付加し、開始コドンならびにそれを含む3'末端側26塩基の配列に基づいて設計したセンスプライマー（配列番号１３）と、終止コドンならびにそれを含む5'末端側25塩基の配列に基づいて設計したアンチセンスプライマー（配列番号１４）を用い、ラクトバチルス・プランタルラムFERM BP-10549のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った。PCRの結果増幅された約0.9 kbpの遺伝子断片をpET101/D-TOPOに挿入し、発現ベクター(pCLA-DH)を構築した。pCLA-DHをロゼッタ2(DE3)株に形質転換し、形質転換株ロゼッタ/pCLA-DH株を得た。得られたロゼッタ/pCLA-DH株を1 mgアンピシリンを含む10 ml LB培地にて37℃、15時間好気的に培養し、前培養とした。これを14 mgアンピシリンを含む140 ml LB培地に2.8 ml植菌し、1時間37℃で好気的に培養した後、1 M IPTGを140 μl添加し、さらに20℃にて6時間好気的に培養した。培養後3,000 rpmにて10分間遠心分離し、ロゼッタ/pCLA-DH株の湿菌体を得た。得られた菌体を3 mlのバッファーAに懸濁し、3 mgのリゾチームを添加し、氷上で30分間インキュベートした。その後、超音波により菌体を破砕し、遠心分離後、上清を無細胞抽出液CFE/pCLA-DHとして回収した。
【実施例６】
【００６９】
配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する酵素（CLA-DC：CLA-デカルボキシラーゼ：共役リノール酸−デカルボキシラーゼ）の精製及びN末端配列分析
(1) 共役リノール酸生成活性測定法
反応液は、40 μlのCFE/pCLA-HY、40 μlのCFE/pCLA-DH、0.5 mM K2MoO4、0.5 mM NADH、0.01 mM FAD 0.2%リノール酸を含むバッファーAで、全量を0.8 mlとした。反応は、37℃にて、酸素吸着剤アネロパック（三菱化学）存在下で嫌気的に4時間、120 rpmで振とうしながら行った。反応後、反応液よりブライダイヤ−法にて脂質を抽出し、メチルエステル化した後にガスクロマトグラフィーにて、共役リノール酸の生成を評価した。
【００７０】
(2) CLA-DCの精製びN末端アミノ酸配列分析
ラクトバチルス・プランタラルムFERM BP-10549の洗浄菌体15 gを30 mlのバッファーAに懸濁しフレンチプレスにより破砕後、100,000 x g、90分間4℃にて超遠心分離を行った。超遠心分離により得られた上清画分を可溶性画分として回収した。得られた可溶性画分について、FPLCを用いてゲル濾過カラム(HiLoad 26/60 Superdex 200 prep grade)、イオン交換カラム(Mono Q HR 5/5)、ゲル濾過カラム(Superose 6 HR 10/30)、イオン交換カラム(Mono Q HR 5/5)、ゲル濾過カラム(Superose 6 HR 10/30)による精製を行った。得られた精製画分をSDS-PAGE電気泳動にて分析し、活性の挙動と同じ挙動を示すタンパク質のバンドを確認した後、このタンパク質CLA-DCをPVDF膜にブロッティングした。PVDF膜にブロッティングしたタンパク質CLA-DCのN末端アミノ酸配列を解読したところMASFIASDQDVKNの結果を得た。
【実施例７】
【００７１】
CLA-DCの遺伝子のクローニング及び大腸菌での発現
実施例6で得たCLA-DCのアミノ酸配列情報をもとに公表されているラクトバチルス・プランタラルムWCFS1株の全ゲノム遺伝子配列より高い相同性を示す領域を検索した。その結果得られた相同性の高いORFの開始コドンの5'側6〜30塩基上流の配列を基にセンスプライマー（配列番号１５）を、終止コドンの3'側4〜27塩基下流の配列を基にアンチセンスプライマー（配列番号１６）を設計した。これらのプライマーを用い、ラクトバチルス・プランタラルムFERM BP-10549のゲノムDNAを鋳型とし、PCRを行った。PCRの結果増幅された遺伝子断片約0.9 kbpの塩基配列の解読を行った結果、本遺伝子断片には、開始コドンATGから始まり終止コドンTAGで終わる846 bpのCLA-DCをコードする一つのORF（配列番号６）が含まれていることが判明した。本CLA-DC遺伝子は配列番号３に示す２８１残基のアミノ酸からなるタンパク質をコードしていた。
【００７２】
大腸菌での発現には、大腸菌発現用ベクターpET101/D-TOPO (Invitrogen)とロゼッタ2(DE3)株からなる宿主ベクター系を用いた。ラクトバチルス・プランタラルムFERM BP-10549のCLA-DC遺伝子の開始コドンATGの前にCACCを付加し、開始コドンならびにそれを含む3'末端側20塩基の配列に基づいて設計したセンスプライマー（配列番号１７）と、終止コドンならびにそれを含む5'末端側27塩基の配列に基づいて設計したアンチセンスプライマー（配列番号１８）を用い、ラクトバチルス・プランタラルムFERM BP-10549のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った。PCRの結果増幅された約0.9 kbpの遺伝子断片をpET101/D-TOPOに挿入し、発現ベクター(pCLA-DC)を構築した。pCLA-DCをロゼッタ2(DE3)株に形質転換し、形質転換株ロゼッタ/pCLA-DC株を得た。得られたロゼッタ/pCLA-DC株を1 mgアンピシリンを含む10 ml LB培地にて37℃、15時間好気的に培養し、前培養とした。これを14 mgアンピシリンを含む140 ml LB培地に2.8 ml植菌し、1時間37℃で好気的に培養した後、1 M IPTGを140 μl、以下に示すリノール酸溶液を1.9 ml添加しさらに20℃にて6時間好気的に培養した。リノール酸溶液は、50 mgのリノール酸に10 mgの牛血清アルブミンを加え、1 mlの0.1 Mリン酸カリウムバッファー（pH 6.5）にて懸濁し10分間の超音波により均一にした後、0.45μmのフィルターを用い除菌したものを用意した。培養後3,000 rpmにて10分間遠心分離し、ロゼッタ/pCLA-DC株の湿菌体を得た。得られた菌体を3 mlのバッファーAに懸濁し、3 mgのリゾチームを添加し、氷上で30分間インキュベートした。その後、超音波により菌体を破砕し、遠心分離後、上清を無細胞抽出液CFE/pCLA-DCとして回収した。
【実施例８】
【００７３】
大腸菌で発現させたCLA-HY、CLA-DH及びCLA-DCを用いた共役脂肪酸の生成
上記の方法により得られた無細胞抽出液CFE/pCLA-HY、CFE/pCLA-DH及びCFE/pCLA-DCそれぞれ100μlを用い共役リノール酸生成試験を行った。反応液は、0.5 mM K2MoO4、0.5 mM NADH、0.01 mM FAD 0.2%リノール酸を含むバッファーAを基本とし、上記三種の無細胞抽出液すべてを含む場合、いずれか２つを含む場合、いずれか１つを含む場合、いずれも含まない場合の計８条件で行い、反応液の全量を0.8 mlとした。反応は、37℃にて、酸素吸着剤アネロパック（三菱化学）存在下で嫌気的に4時間、120 rpmで振とうしながら行った。反応後、反応液よりブライダイヤ−法にて脂質を抽出し、メチルエステル化した後にガスクロマトグラフィーにて共役リノール酸の生成を評価した。その結果、三つ全ての無細胞抽出液が存在する時のみ共役リノール酸の生成を確認した。本条件で生成する共役リノール酸は、cis-9,trans-11-octadecadienoic acid (0.3 mg)と、trans-9,trans-11-octadecadienoic acid (0.08 mg)であった。
【実施例９】
【００７４】
大腸菌で発現させたCLA-HY、CLA-DH及びCLA-DCを用いた共役脂肪酸の生成に対する様々な化学物質の影響
無細胞抽出液CFE/pCLA-HY、CFE/pCLA-DH及びCFE/pCLA-DCすべてが共存する実施例８と同様の反応系にて反応を行った。この反応系に下記の化合物を5 mMの濃度になるように添加し、実施例８と同様の反応条件、分析条件下にて、活性化効果を共役リノール酸生産の増加にて評価したところ、モリブデン酸カリウム、モリブデン(VI)酸二ナトリウム無水和物、モリブデン(VI)酸二ナトリウム二水和物、オルトバナジン（Ｖ）酸ナトリウム、メタバナジン（Ｖ）酸ナトリウム、タングステン（VI）酸カリウム、タングステン(VI)酸ナトリウム無水和物、タングステン(VI)酸ナトリウム二水和物といった酸化金属類に活性化効果を認めた。
また、無細胞抽出液CFE/pCLA-HY、CFE/pCLA-DH及びCFE/pCLA-DCすべてが共存する実施例８と同様の反応系に、補酵素類としてNADPH、NADH、FMN、FAD、FMN＋NADPH、FAD＋NADPH、FMN＋NADHまたはFAD＋NADHを5ｍMとなるように各々添加し、実施例８と同様の反応条件、分析条件下にて、阻害効果を共役リノール酸生産の低下にて評価したところ、NADPHを単独で加えた場合、ならびに、NADHとFADを共に加えた場合においても、活性化効果が認められた(図１)。
尚、表１には記載していないが、Methylene Blue、BQ、PMS、K3FE(CN)6はほぼ0％であり、Benzyl viologen、SAMは10％以下であり、α-NQ、NADP、NADは約20〜25％であり、いずれも低値を示した。
【００７５】
また、無細胞抽出液CFE/pCLA-HY、CFE/pCLA-DH及びCFE/pCLA-DCすべてが共存する実施例８と同様の反応系に、金属キレーターとしてEDTA、EGTA、8-Hydroxyquinoline、o-phenanthrolineまたはα-α´-Bipyridylを3 mMの濃度になるように各々添加し、実施例８と同様の反応条件、分析条件下にて、阻害効果を共役リノール酸生産の低下にて評価したところ、o-phenanthrolineの添加により共役リノール酸の生産が非添加時の10%に低下した（図２）。続いて、o-phenanthroline存在下において、さらに10 mMの金属塩を添加し、実施例８と同様の反応条件、分析条件下にて、共役リノール酸生産の回復を評価したところ、塩化コバルト(II)（無水）、塩化ニッケル(II)（無水）、硫酸鉄(II)（七水和物）、塩化カドミウム(II)（無水）、硫酸マンガン(II)（一水和物）にo-phenanthroline添加により低下した共役リノール酸生産を回復させる効果を認めた（図３）。
さらに、o-phenanthroline存在下、５ mMモリブデン酸カリウム、モリブデン(VI)酸二ナトリウム無水和物、モリブデン(VI)酸二ナトリウム二水和物、オルトバナジン（Ｖ）酸ナトリウム、メタバナジン（Ｖ）酸ナトリウム、タングステン（VI）酸カリウム、タングステン(VI)酸ナトリウム無水和物、タングステン(VI)酸ナトリウム二水和物といった酸化金属類の添加により活性化効果を認めた(図４)。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明において提供された共役脂肪酸の製造用組成物、及び該組成物を用いた効率の良い新規な共役脂肪酸の製造方法を用いることにより、得られた共役脂肪酸を研究用やサプリメント基質等とすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】補酵素類の添加による共役脂肪酸生成の活性化効果を評価した図である(実施例９)。
【図２】金属キレーターの添加による共役脂肪酸生成の活性化効果を評価した図である(実施例９)。
【図３】o-phenanthroline存在下における金属塩の添加による共役脂肪酸生成の活性化効果を評価した図である(実施例９)。
【図４】o-phenanthroline存在下における酸化金属類の添加による共役脂肪酸生成の活性化効果を評価した図である(実施例９)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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