(57)【要約】【課題】  蛋白質や核酸などの標的物質の検出を１ステップで簡単に行うことができ、これにより検出時間を短縮することができる、ブロッティング材料及びそれを用いた検出方法を提供すること。【解決手段】  局所プラズモンを発生させることができる金属微細構造を表面に有することを特徴とする、ブロッティング材料。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
局所プラズモンを発生させることができる金属微細構造を表面に有することを特徴とする、ブロッティング材料。
【請求項２】
金属が金又は銀である、請求項１に記載のブロッティング材料。
【請求項３】
金属微細構造中の金属の平均粒子径が、１ｎｍ以上２００ｎｍ以下である、請求項１又は２に記載のブロッティング材料。
【請求項４】
高分子膜またはガラス膜に金属を蒸着させることによって得られる、請求項１から３の何れかに記載のブロッティング材料。
【請求項５】
高分子膜が、PVDF（Polyvinylidene Fluoride）膜、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、セルロース膜、酢酸セルロース膜、ポリエチレンテレフタレート膜、又はポリプロピレン膜である、請求項４に記載のブロッティング材料。
【請求項６】
蒸着された金属の膜厚が０．１ｎｍ以上５０ｎｍ以下である、請求項４又は５に記載のブロッティング材料。
【請求項７】
金属板の表面を電気化学的に粗面化することによって得られる請求項１から３の何れかに記載のブロッティング材料。
【請求項８】
金属板の表面に交流電流を流すことによって、又は金属板の表面に電解めっきを行うことによって、金属板の表面を電気化学的に粗面化する請求項７に記載のブロッティング材料。
【請求項９】
（ａ）請求項１から８の何れかに記載のブロッティング材料に、標的物質又はそれを含む試料をブロッティングする工程；
（ｂ）該標的物質と相互作用する検出物質であって、該ブロッティング材料に含まれる金属と接近すると局所プラズモンを発生することができる金属で標識した検出物質を、該ブロッティング材料に接触させる工程；及び
（ｃ）該ブロッティング材料の呈色の変化を観察又は検出する工程：
を含む、標的物質の検出方法。
【請求項１０】
標的物質が蛋白質又は核酸である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
電気泳動された標的物質又はそれを含む試料を、請求項１から８の何れかに記載のブロッティング材料にブロッティングする、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
ブロッティング材料に含まれる金属が銀であり、検出物質を標識するために使用する金属が金である、請求項９から１１の何れかに記載の方法。
【請求項１３】
請求項９から１１の何れかに記載の方法に使用するための、請求項１から８の何れかに記載のブロッティング材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブロッティング材料及びそれを用いた検出方法に関する。より詳細には、本発明は、局所プラズモンを利用した検出原理により標的物質を検出することが可能なブロッティング材料及びそれを用いた検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質の電気泳動を利用した蛋白質の検出方法の一つとして、ウエスタンブロッティング法が知られている。ウエスタンブロッティング法は、電気泳動の優れた分離能と抗原抗体反応の高い特異性を組み合わせて、蛋白質混合物から特定の蛋白質を検出する手法である。ウエスタンブロッティング法では、先ず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動又は二次元電気泳動後のゲルから蛋白質を電気的にメンブレンに移動・固定化してブロット（メンブレン）を作製する。続いて、ブロットを目的（標的）蛋白質に対する抗体と反応させて検出する。この検出方法では、一次抗体と目的（標的）蛋白質を反応させた後に、酵素標識又は蛍光標識などで標識した二次抗体を反応させて、これを用いて検出を行っている。従って、従来のウエスタンブロッティング法では、検出のために２ステップ以上の反応を行っていた。
【０００３】
一方、電気泳動を利用して試料中の物質を分析する電気泳動センサーとして、表面プラズモン共鳴分析を利用した電気泳動センサーが知られている。例えば、特許文献１には、試料を含浸する電気泳動媒体と、この電気泳動媒体の一端に接する状態に配された、金属膜からなる第１の電極と、前記電気泳動媒体の他端側に配された第２の電極と、前記第１および第２の電極を介して前記電気泳動媒体に、前記試料中の検出対象物質を前記他端から一端側に泳動させる直流電圧を印加する手段と、前記電気泳動媒体の一端と反対側から前記第１の電極に接する状態に配置されたプリズムと、光ビームを前記プリズムに通し、該プリズムと第１の電極との界面に対して、種々の入射角が得られるように入射させるビーム照射系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を、前記種々の入射角毎に検出可能な光検出手段とを備えてなる電気泳動センサーが記載されている。
【０００４】
また、特許文献２には、誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成された、該誘電体ブロックよりも低屈折率の薄膜層と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記薄膜層との界面で全反射条件が得られるように入射させる入射光学系と、前記薄膜層の上に形成された電気泳動媒体と、この電気泳動媒体に、前記薄膜層に沿った向きで、かつ該薄膜層に対する前記光ビームの入射面と交わる向きの直流電界を印加する手段と、前記界面で全反射した光ビームの強度を、そのビーム断面内の複数の位置毎に測定する２次元光検出手段とからなる電気泳動装置が記載されている。
【０００５】
【特許文献１】特開平９−３０４３３９号公報
【特許文献２】特開２００４−２３９６６４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、蛋白質や核酸などの標的物質の検出を１ステップで簡単に行うことができ、これにより検出時間を短縮することができる、ブロッティング材料及びそれを用いた検出方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、表面に局所プラズモンを発生させることができる金属微細構造を設けたブロッティング材料を使用し、該ブロッティング材料に標的物質をブロッティングした後に、金属で標識した検出物質を該ブロッティング材料に接触させて呈色の変化を観察又は検出することによって、蛋白質や核酸などの標的物質の検出を１ステップで簡単に行うことができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものである。
【０００８】
すなわち本発明によれば、局所プラズモンを発生させることができる金属微細構造を表面に有することを特徴とする、ブロッティング材料が提供される。
【０００９】
好ましくは、金属は金又は銀である。
好ましくは、金属微細構造中の金属の平均粒子径は、１ｎｍ以上２００ｎｍ以下である。
【００１０】
好ましくは、本発明のブロッティング材料は、高分子膜またはガラス膜に金属を蒸着させることによって得られる。
好ましくは、高分子膜は、PVDF（Polyvinylidene Fluoride）膜、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、セルロース膜、酢酸セルロース膜、ポリエチレンテレフタレート膜、又はポリプロピレン膜である。
好ましくは、蒸着された金属の膜厚は０．１ｎｍ以上５０ｎｍ以下である。
【００１１】
好ましくは、本発明のブロッティング材料は、金属板の表面を電気化学的に粗面化することによって得られる。
好ましくは、金属板の表面に交流電流を流すことによって、又は金属板の表面に電解めっきを行うことによって、金属板の表面を電気化学的に粗面化することができる。
【００１２】
本発明の別の側面によれば、（ａ）上記した本発明のブロッティング材料に、標的物質又はそれを含む試料をブロッティングする工程；
（ｂ）該標的物質と相互作用する検出物質であって、該ブロッティング材料に含まれる金属と接近すると局所プラズモンを発生することができる金属で標識した検出物質を、該ブロッティング材料に接触させる工程；及び
（ｃ）該ブロッティング材料の呈色の変化を観察又は検出する工程：
を含む、標的物質の検出方法が提供される。
【００１３】
好ましくは、標的物質は蛋白質又は核酸である。
好ましくは、電気泳動された標的物質又はそれを含む試料を、本発明のブロッティング材料にブロッティングする。
【００１４】
好ましくは、ブロッティング材料に含まれる金属は銀であり、検出物質を標識するために使用する金属は金である。
【００１５】
本発明によればさらに、上記した本発明の方法に使用するための、上記した本発明のブロッティング材料が提供される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のブロッティング材料及びそれを用いた検出方法によれば、蛋白質や核酸などの標的物質の検出を、局所プラズモンを利用した検出原理に基づいて１ステップで行うことができるため、検出時間を短縮することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明のブロッティング材料は、局所プラズモンを発生させることができる金属微細構造を表面に有することを特徴とする。上記した金属微細構造中の金属は、局所プラズモンを発生させることができるものであれば特に限定されず、例えば、金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、好ましくは金又は銀であり、特に好ましくは銀である。また、金属微細構造中の金属の平均粒子径は、１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることが好ましい。
【００１８】
金属微細構造は、例えば、高分子膜またはガラス膜に、金属をスパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって塗布することによって作製することができるが、好ましくは、高分子膜またはガラス膜に、金属を蒸着させることによって作製することができる。この場合、蒸着された金属の膜厚は、好ましくは０．１ｎｍ以上５０ｎｍ以下である。
【００１９】
本発明で用いることができる高分子膜の種類は、蛋白質又は核酸などのブロッティングに適した材料であれば特に限定されないが、好ましくは、PVDF（Polyvinylidene Fluoride）膜、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、セルロース膜、酢酸セルロース膜、ポリエチレンテレフタレート膜、又はポリプロピレン膜などを使用することができる。高分子膜は、多孔膜でも非多孔膜でもよい。多孔膜を使用する場合の平均孔径は、好ましくは０.０１〜１０μｍ、特に好ましくは０.１〜１０μｍである。
【００２０】
あるいはまた、金属微細構造は、金属板の表面を電気化学的に粗面化することによって作製することもできる。この場合、金又は銀などの金属板の表面に交流電流を流すことによって、又は金属板の表面に電解めっきを行うことによって、金属板の表面を電気化学的に粗面化することができる。
【００２１】
本発明のブロッティング材料は、例えば、サザンブロッティング 、ノーザンブロッティング、ウエスタンブロッティング、ドットブロッティングなどのように核酸又は蛋白質等の標的物質をメンブレンに転写（ブロッティング）・吸着・固定させて、これらの標的物質と相互作用する物質との相互作用の有無を検出するために使用することができる。また、蛋白質の一種である抗体を、本発明のブロッティング材料に固定化し、免疫アッセイを行うことも可能である。
【００２２】
本発明のブロッティング材料にブロッティングされる標的物質の種類は特に限定されないが、好ましくは、核酸、蛋白質、又は糖類等を挙げることができる。本発明では、上記したような標的物質を含む試料を電気泳動した後に、上記標的物質を電気泳動ゲルから本発明のブロッティング材料にブロッティング（転写）することができる。例えば、蛋白質を電気泳動する場合には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、又は二次元電気泳動などを行うことができる。また核酸を電気泳動する場合には、アガロース電気泳動を行うことができる。
【００２３】
標的物質のブロッティングは、常法により行うことができる。例えば、市販のブロッティング装置を用いて、定電流を用いて電気的に標的物質のブロッティングを行うことができる。次いで、標的物質をブロッティングしたブロッティング材料は、ブロッキングすることができる。ブロッキングは、例えば、ブロッティング材料全体を1％BSA/0.1％Tween20/PBS pH7.4に浸すことによって行うことができる。このようにしてブロッティング及びブロッキング処理を行ったブロッティング材料は、乾燥後、検出のために使用するまで保管しておくことができる。
【００２４】
本発明では、標的物質と相互作用する検出物質を用いて、ブロッティング材料にブロッティングされた標的物質を検出する。本発明で用いる検出物質としては、ブロッティング材料に含まれる金属と接近すると局所プラズモンを発生することができる金属で標識されている検出物質を用いる。例えば、ブロッティング材料に含まれている金属が銀である場合には、検出物質を標識するための金属として金を使用することができる。あるいは、ブロッティング材料に含まれている金属が金である場合には、検出物質を標識するための金属として銀を使用することができる。
【００２５】
金又は銀などの金属を用いて検出物質を標識する方法は常法によって行うことができる。例えば、検出物質が抗体の場合には、金コロイド標識抗体を常法によって作製して、用いることができる。具体的には、沸騰した超純水に、１％テトラクロロ金(III)四水和物(HAuCl・4H2O)及び１％クエン酸ナトリウムを加え、加熱後200mM炭酸カリウムでpH9.15に調整することによって金コロイド溶液を作製する。次いで、金コロイド溶液に対して抗体を添加して反応させることにより、金コロイド標識抗体を作製することができる。
【００２６】
本発明では、上記のような金属で標識した検出物質を、標的物質をブロッティングさせたブロッティング材料に接触させ、該ブロッティング材料の呈色の変化を観察又は検出することによって標識物質を検出することができる。即ち、検出物質をブロッティング材料に接触させることによって検出物質が標的物質と相互作用する場合には、検出物質が、ブロッティング材料の表面に集積し、これにより、ブロッティング材料が有する金属微細構造を構成する金属と、検出物質に標識されている金属との相互作用により局所プラズモンが発生し、ブロッティング材料の色の変化が生じる。従って、ブロッティング材料の呈色の変化を観察又は検出することによって、標的物質と検出物質との相互作用の有無を検出することができ、これにより標的物質を検出することができる。
【００２７】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されることはない。
【実施例】
【００２８】
（１）ブロッティング材料の作製
PVDF膜にAgを蒸着させる方法としては、装置は日本電子（株）製 JEE-400を用いて、真空度0.1mPaでＡｇを0.1mm/secの蒸着速度となる電流値で膜厚をQCMでモニターしながら3nmになるまで蒸着した。また、Ａｇを蒸着したPVDF膜の上部から電子顕微鏡で観察して金属粒子の平均径を測定した結果、平均粒子径は１００ｎｍであった。
【００２９】
（２）電気泳動及びブロッティング
蛋白の電気泳動は、市販の電気泳動装置（TEFCO製）、市販ポリアクリルアミドゲル（TEFCO SDS-PAGE mini 4-20％）を使用し、メーカー推奨の泳動条件（20mA,50分）に従ってSDS-PAGEを行った。９種類の蛋白質（Miosin, β-galactosidase, Phosphorylase B, Serum albumin, Ovalbumin, carbonic anhydrase, Trypsin inhibitor, Lysozyme, Aprotinin, 各蛋白質の濃度は、0.5μg/sampleとした）を含有するサンプルを電気泳動用に供した。
【００３０】
泳動終了後、ゲルを取り出し専用のブロッティング装置にセットした、この際に使用したメンブレンは、PVDF膜にAg蒸着したものである。ブロッティング条件はメーカー推奨条件（定電流180mA,60min）で行い、ゲルから蛋白質を電気的にメンブレンに移動・固定化した。この時の蛋白質が固定化されたPVDF膜は黄色味を帯びている。
【００３１】
次に、メンブレン全体を1％BSA/0.1％Tween20/PBS pH7.4でブロッキングした。この段階では、PVDF膜は、膜全体が赤みを帯びている。メンブレンを室温で３０分間乾燥させ、抗原抗体反応時までろ紙でサンドイッチし更にアルミ箔で包み冷蔵庫に保管した。
【００３２】
（３）金コロイド標識抗体の作製方法
（ａ）抗ＣＡ（Carbonic Anhydrase）抗体
検出抗体として、市販のAnti-Carbonic Anhydrase polyclonal antibody(Nordic immunological Laboratories製)を、金コロイド標識抗体として用いた。
【００３３】
（ｂ）金コロイドの調製
100mlの超純水を沸騰させ、１％テトラクロロ金(III)四水和物(HAuCl・4H2O)1ml及び1％クエン酸ナトリウム1.5mlを加え、５分加熱後200mM炭酸カリウムでpH9.15に調整した。
【００３４】
（ｃ）金コロイド標識抗体の作製
金コロイド溶液１ｍｌに対して抗ＣＡ抗体蛋白量を6μgと成るように抗体溶液と金コロイド溶液を室温で２分間反応させた。次に、10％ＦＢＳでブロッキングを行った。ブロキング後、25℃、7000ｒｐｍで25分間遠心し、その沈査の吸光度を測定し金コロイド溶解液でO.D570nm＝2.1に調整した。
【００３５】
（４）検出
メンブレンを金コロイド標識抗ＣＡ抗体（約６μg/ml）溶液に浸し、一定時間反応させた後に、メンブレンを観察すると抗原抗体反応と局所プラズモン現象により、赤紫色を呈した部分があった。ここの部分は、ＣＡ抗原であることを確認した。