(57)【要約】【課題】  気管支拡張剤テオフィリンをはじめ薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２により代謝される薬物を医薬品として投与する前に、ＣＹＰ１Ａ２の代謝能に関連する遺伝子多型を検出し、個々の患者に応じた量のＣＹＰ１Ａ２により代謝される薬物を投与することで、該薬物による副作用を避けることを可能とする検査薬を提供する。【解決手段】  薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２の代謝能に関連するＣＹＰ１Ａ２遺伝子上の第１２５、１１３０又は１３６７番目における一塩基多型を検出することができるプライマーセット、プライマー及びプローブ、並びに該酵素の代謝活性の検査薬及びその検査方法とし、検出された一塩基多型をもとに薬物代謝異常の判定を行った上で、個々の患者のＣＹＰ１Ａ２代謝活性に応じた量のテオフィリン等の薬物を投与することにより、テオフィリン等の薬物の副作用を避けることを可能とする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の一塩基多型を検出するプライマーセットであって、該遺伝子上の第１２５番目を含む領域に対応するＤＮＡを増幅させることを特徴とするプライマーセット。
【請求項２】
前記一塩基多型について、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子上の第１２５番目の塩基シトシン（Ｃ）がグアニン（Ｇ）に変異しているものである請求項１記載のプライマーセット。
【請求項３】
薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２の第４２番目のアミノ酸残基がプロリン（Ｐｒｏ）からアルギニン（Ａｒｇ）に変異しているものである請求項１又は２に記載のプライマーセット。
【請求項４】
薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の一塩基多型を検出するプライマーセットであって、該遺伝子上の第１１３０番目を含む領域に対応するＤＮＡを増幅させることを特徴とするプライマーセット。
【請求項５】
前記一塩基多型について、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子上の第１１３０番目の塩基グアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に変異しているものである請求項４記載のプライマーセット。
【請求項６】
薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２の第３７７番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ａｒｇ）からグルタミン（Ｇｌｎ）に変異しているものである請求項４又は５に記載のプライマーセット。
【請求項７】
薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の一塩基多型を検出するプライマーセットであって、該遺伝子上の第１３６７番目を含む領域に対応するＤＮＡを増幅させることを特徴とするプライマーセット。
【請求項８】
前記一塩基多型について、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子上の第１３６７番目の塩基グアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に変異しているものである請求項７記載のプライマーセット。
【請求項９】
薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２の第４５６番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ａｒｇ）からヒスチジン（Ｈｉｓ）に変異しているものである請求項７又は８に記載のプライマーセット。
【請求項１０】
薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の一塩基多型を検出するプライマーであって、該遺伝子上の第１２５番目の塩基を決定するように設計されたプライマー。
【請求項１１】
前記一塩基多型について、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子上の第１２５番目の塩基シトシン（Ｃ）がグアニン（Ｇ）に変異しているものである請求項１０記載のプライマー。
【請求項１２】
薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２の第４２番目のアミノ酸残基がプロリン（Ｐｒｏ）からアルギニン（Ａｒｇ）に変異しているものである請求項１０又は１１記載のプライマー。
【請求項１３】
薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の一塩基多型を検出するプライマーであって、該遺伝子上の第１１３０番目の塩基を決定するように設計されたプライマー。
【請求項１４】
前記一塩基多型について、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子上の第１１３０番目の塩基グアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に変異しているものである請求項１３記載のプライマー。
【請求項１５】
薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２の第３７７番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ａｒｇ）からグルタミン（Ｇｌｎ）に変異しているものである請求項１３又は１４に記載のプライマー。
【請求項１６】
薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の一塩基多型を検出するプライマーであって、該遺伝子上の第１３６７番目の塩基を決定するように設計されたプライマー。
【請求項１７】
前記一塩基多型について、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子上の第１３６７番目の塩基グアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に変異しているものである請求項１６記載のプライマー。
【請求項１８】
薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２の第４５６番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ａｒｇ）からヒスチジン（Ｈｉｓ）に変異しているものである請求項１６又は１７に記載のプライマー。
【請求項１９】
薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子上の第１２５番目を含む領域に対応するＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブ。
【請求項２０】
薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子上の第１１３０番目を含む領域に対応するＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブ。
【請求項２１】
薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子上の第１３６７番目を含む領域に対応するＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブ。
【請求項２２】
請求項１乃至２１いずれか記載のプライマーセット、プライマー又はプローブを含む、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２により代謝される薬物に対するＣＹＰ１Ａ２代謝活性の検査薬。
【請求項２３】
前記薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２により代謝される薬物が、気管支拡張剤テオフィリン、抗精神病薬クロザピン、抗不整脈薬メキシレチンからなる群より選択されるいずれか一つである請求項２２記載の検査薬。
【請求項２４】
薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子上において、（ａ１）〜（ｃ１）で示される何れか一つの一塩基多型を確認することを特徴とするＣＹＰ１Ａ２代謝活性の検査方法。
（ａ１）ＣＹＰ１Ａ２遺伝子上の第１２５番目の塩基シトシン（Ｃ）がグアニン（Ｇ）に変異していること、
（ｂ１）ＣＹＰ１Ａ２遺伝子上の第１１３０番目の塩基グアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に変異していること、
（ｃ１）ＣＹＰ１Ａ２遺伝子上の第１３６７番目の塩基グアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に変異していること。
【請求項２５】
薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２上において、（ａ２）〜（ｃ２）で示される何れか一つのアミノ酸変異を確認することを特徴とするＣＹＰ１Ａ２代謝活性の検査方法。
（ａ２）ＣＹＰ１Ａ２の第４２番目のアミノ酸残基プロリン（Ｐｒｏ）がアルギニン（Ａｒｇ）に変異していること、
（ｂ２）ＣＹＰ１Ａ２の第３７７番目のアミノ酸残基アルギニン（Ａｒｇ）がグルタミン（Ｇｌｎ）に変異していること、
（ｃ２）ＣＹＰ１Ａ２の第４５６番目のアミノ酸残基アルギニン（Ａｒｇ）がヒスチジン（Ｈｉｓ）に変異していること。
【請求項２６】
以下の（ａ３）〜（ｃ３）の工程を経ることを特徴とする請求項２４又は２５記載の検査方法。
（ａ３）被検者から調製されたＤＮＡ試料より薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子を含むＤＮＡを単離する工程、
（ｂ３）工程（ａ３）において単離したＤＮＡ試料の塩基配列を決定する工程、
（ｃ３）工程（ｂ３）において決定したＤＮＡの塩基配列を対照と比較する工程。
【請求項２７】
前記ＣＹＰ１Ａ２により代謝される薬物が、気管支拡張剤テオフィリン、抗精神病薬クロザピンおよび抗不整脈薬メキシレチンからなる群より選択されるいずれか一つである請求項２４乃至２６いずれか記載の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の多型を検出するプライマーセット、プライマー及びプローブ、並びに該酵素の代謝活性の検査薬及びその検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
気管支拡張剤テオフィリンは気管支喘息等の治療に広く用いられ、その作用機構は細胞内ホスホジエステラーゼ阻害による細胞内ｃＡＭＰ濃度の上昇に基づくものであるが、アデノシン受容体を介する作用も報告されている。
テオフィリンの有効血中濃度域は５〜１５ｍｇ／Ｌと比較的狭く、２０ｍｇ／Ｌを超えると副作用として、心拍増加、呼吸促進、不整脈、けいれん等の中毒症状が現れる。
このような副作用は生体内でテオフィリンの代謝に働く酵素の活性の高低により、影響を受けると考えられている。
【０００３】
生体内で気管支拡張剤テオフィリンの代謝に重要な役割をはたしている酵素として、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２が知られている（非特許文献１）。
薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子は第１５染色体に位置し（非特許文献２）、翻訳されないエクソン１を含む７個のエクソンから構成されている（非特許文献３）。
薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２は生体内で薬物を含む外来化学物質を触媒作用によって無毒化することで知られるチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）の一分子種で、肝臓にほぼ特異的に発現しており、他の組織での発現は低いとされている。
【０００４】
薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２は気管支拡張剤テオフィリンの他、抗精神病薬クロザピン（非特許文献４）、抗不整脈薬メキシレチン等の治療薬（非特許文献５）や、カフェイン（非特許文献６）等の嗜好品に含まれる化学物質の代謝に重要な役割を果たしている。
さらにＣＹＰ１Ａ２はアリルアミン類の代謝活性化に関与していることが報告されており、化学発癌の引きがねであるいわゆるイニシエーションに関わる重要な薬物代謝酵素の一つと考えられている（非特許文献６）。
【０００５】
薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２の活性が弱い場合、血中及び臓器におけるテオフィリン等の濃度が上昇し、高い濃度が持続されることにより副作用が強く現れると考えられる。
従って、テオフィリンによる副作用の程度を把握するには薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２の代謝活性について正確に知ることが重要となる。
しかしながら、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２の代謝活性は個々の患者に応じてそれぞれ著しく異なるので、それぞれのＣＹＰ１Ａ２代謝能に応じた量のテオフィリンを投与しなければ、上述した副作用の発現を抑制することができない。
【０００６】
最近の遺伝子解析の進歩に伴い、薬物代謝酵素ＣＹＰの代謝活性の個体差が遺伝的要因によりかなり規定されていることが知られてきている。
一塩基多型（ＳＮＰｓ）等の遺伝子多型によりＣＹＰの代謝活性が弱められたり、増強されたりする事象の報告がその好例である（非特許文献７）。
このことからテオフィリン等の投与前に薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２の代謝能に関連する前記ＣＹＰ１Ａ２遺伝子多型を調べ、個々の患者のＣＹＰ１Ａ２代謝能に応じた量のテオフィリンを投与することにより、テオフィリンによる副作用を避けることができると考えられた。
【０００７】
その為、テオフィリンの投与前に薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２の代謝能に関連する遺伝子多型を検出し、個々の患者に応じた量のテオフィリンを投与し、テオフィリンによる副作用を避けることを可能とするプライマーセット、プライマー、プローブ及びそれらを含む検査薬、並びにその検査方法の開発が強く望まれていた。
【０００８】
尚、テオフィリン同様、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２により代謝されることで知られる抗精神病薬クロザピンおよび抗不整脈薬メキシレチン等の他の治療薬に関しても、副作用があらわれるという問題があり、これらの副作用を避けることを可能とするプライマーセット、プライマー、プローブ及びそれらを含む検査薬、並びにその検査方法の開発も強く望まれていた。
【０００９】
【非特許文献１】Sarkar M.A. and Jackson B.J., Drug Metab. Dispos. 22: 827-834 (1994)
【非特許文献２】Corchero J. et al., Pharmacogenetics 11: 1-6 (2001)
【非特許文献３】Ikeya K. et al., Mol. Endocrinol. 3: 1399-1408 (1989)
【非特許文献４】Eiermann B. et al., Br. J. Clin. Pharmacol. 44: 439-446 (1997)
【非特許文献５】Nakajima M. et al., Br. J. Clin. Pharmacol. 46: 55-62 (1998)
【非特許文献６】Butler M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 7696-7700 (1989)
【非特許文献７】Ingelman-Sundberg M., Trends Pharmacol.Sci. 25: 193-200 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
気管支拡張剤テオフィリンをはじめとする薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２により代謝される薬物を医薬品として投与する前に、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２の代謝能に関連する遺伝子多型を検出し、個々の患者に応じた量のＣＹＰ１Ａ２により代謝される薬物を投与することで、該薬物による副作用を避けることを可能とするプライマーセット、プライマー、プローブ及びそれらを含む検査薬、並びに検査方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
即ち、請求項１は、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の一塩基多型を検出するプライマーセットであって、該遺伝子上の第１２５番目を含む領域に対応するＤＮＡを増幅させることを特徴とするプライマーセットに関する。
請求項２は、前記一塩基多型について、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子上の第１２５番目の塩基シトシン（Ｃ）がグアニン（Ｇ）に変異しているものである請求項１記載のプライマーセットに関する。
請求項３は、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２の第４２番目のアミノ酸残基がプロリン（Ｐｒｏ）からアルギニン（Ａｒｇ）に変異しているものである請求項１又は２に記載のプライマーセットに関する。
請求項４は、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の一塩基多型を検出するプライマーセットであって、該遺伝子上の第１１３０番目を含む領域に対応するＤＮＡを増幅させることを特徴とするプライマーセットに関する。
請求項５は、前記一塩基多型について、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子上の第１１３０番目の塩基グアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に変異しているものである請求項４記載のプライマーセットに関する。
請求項６は、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２の第３７７番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ａｒｇ）からグルタミン（Ｇｌｎ）に変異しているものである請求項４又は５に記載のプライマーセットに関する。
請求項７は、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の一塩基多型を検出するプライマーセットであって、該遺伝子上の第１３６７番目を含む領域に対応するＤＮＡを増幅させることを特徴とするプライマーセットに関する。
請求項８は、前記一塩基多型について、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子上の第１３６７番目の塩基グアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に変異しているものである請求項７記載のプライマーセットに関する。
請求項９は、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２の第４５６番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ａｒｇ）からヒスチジン（Ｈｉｓ）に変異しているものである請求項７又は８に記載のプライマーセットに関する。
請求項１０は、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の一塩基多型を検出するプライマーであって、該遺伝子上の第１２５番目の塩基を決定するように設計されたプライマーに関する。
請求項１１は、前記一塩基多型について、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子上の第１２５番目の塩基シトシン（Ｃ）がグアニン（Ｇ）に変異しているものである請求項１０記載のプライマーに関する。
請求項１２は、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２の第４２番目のアミノ酸残基がプロリン（Ｐｒｏ）からアルギニン（Ａｒｇ）に変異しているものである請求項１０又は１１記載のプライマーに関する。
請求項１３は、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の一塩基多型を検出するプライマーであって、該遺伝子上の第１１３０番目の塩基を決定するように設計されたプライマーに関する。
請求項１４は、前記一塩基多型について、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子上の第１１３０番目の塩基グアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に変異しているものである請求項１３記載のプライマーに関する。
請求項１５は、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２の第３７７番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ａｒｇ）からグルタミン（Ｇｌｎ）に変異しているものである請求項１３又は１４に記載のプライマーに関する。
請求項１６は、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の一塩基多型を検出するプライマーであって、該遺伝子上の第１３６７番目の塩基を決定するように設計されたプライマーに関する。
請求項１７は、前記一塩基多型について、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子上の第１３６７番目の塩基グアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に変異しているものである請求項１６記載のプライマーに関する。
請求項１８は、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２の第４５６番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ａｒｇ）からヒスチジン（Ｈｉｓ）に変異しているものである請求項１６又は１７に記載のプライマーに関する。
請求項１９は、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子上の第１２５番目を含む領域に対応するＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブに関する。
請求項２０は、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子上の第１１３０番目を含む領域に対応するＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブに関する。
請求項２１は、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子上の第１３６７番目を含む領域に対応するＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブに関する。
請求項２２は、請求項１乃至２１いずれか記載のプライマーセット、プライマー又はプローブを含む、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２により代謝される薬物に対するＣＹＰ１Ａ２代謝活性の検査薬に関する。
請求項２３は、前記薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２により代謝される薬物が、気管支拡張剤テオフィリン、抗精神病薬クロザピン、抗不整脈薬メキシレチンからなる群より選択されるいずれか一つである請求項２２記載の検査薬に関する。
請求項２４は、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子上において、（ａ１）〜（ｃ１）で示される何れか一つの一塩基多型を確認することを特徴とするＣＹＰ１Ａ２代謝活性の検査方法に関する。
（ａ１）ＣＹＰ１Ａ２遺伝子上の第１２５番目の塩基シトシン（Ｃ）がグアニン（Ｇ）に変異していること、
（ｂ１）ＣＹＰ１Ａ２遺伝子上の第１１３０番目の塩基グアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に変異していること、
（ｃ１）ＣＹＰ１Ａ２遺伝子上の第１３６７番目の塩基グアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に変異していること。
請求項２５は、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２上において、（ａ２）〜（ｃ２）で示される何れか一つのアミノ酸変異を確認することを特徴とするＣＹＰ１Ａ２代謝活性の検査方法に関する。
（ａ２）ＣＹＰ１Ａ２の第４２番目のアミノ酸残基プロリン（Ｐｒｏ）がアルギニン（Ａｒｇ）に変異していること、
（ｂ２）ＣＹＰ１Ａ２の第３７７番目のアミノ酸残基アルギニン（Ａｒｇ）がグルタミン（Ｇｌｎ）に変異していること、
（ｃ２）ＣＹＰ１Ａ２の第４５６番目のアミノ酸残基アルギニン（Ａｒｇ）がヒスチジン（Ｈｉｓ）に変異していること。
請求項２６は、以下の（ａ３）〜（ｃ３）の工程を経ることを特徴とする請求項２４又は２５記載の検査方法に関する。
（ａ３）被検者から調製されたＤＮＡ試料より薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子を含むＤＮＡを単離する工程、
（ｂ３）工程（ａ３）において単離したＤＮＡ試料の塩基配列を決定する工程、
（ｃ３）工程（ｂ３）において決定したＤＮＡの塩基配列を対照と比較する工程。
請求項２７は、前記ＣＹＰ１Ａ２により代謝される薬物が、気管支拡張剤テオフィリン、抗精神病薬クロザピンおよび抗不整脈薬メキシレチンからなる群より選択されるいずれか一つである請求項２４乃至２６いずれか記載の検査方法に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る、プライマーセット、プライマー、プローブ及びそれらを含む検査薬、並びに検査方法により、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２の代謝能に関連する遺伝子多型を検出できる。
検出された遺伝子多型をもとに薬物代謝異常の判定を行った上で、個々の患者のＣＹＰ１Ａ２代謝活性に応じた量のテオフィリンをはじめＣＹＰ１Ａ２により代謝される薬物を投与することにより、該薬物による副作用を避けることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明者らは、日本人由来ゲノムＤＮＡ２５０検体につき、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の転写制御領域及びエクソン領域を中心にシーケンシング解析し、アミノ酸置換を引き起こす新規遺伝子多型を３種見いだした。
即ち、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子（GenBank Accession No. NM_000761; NM_000761のヌクレオチド配列中６５〜６７番目のＡＴＧのＡを1番目の塩基とし、これに対応するメチオニンを１番目のアミノ酸残基とする）上の第１２５番目の塩基がシトシン（Ｃ）がグアニン（Ｇ）に変異した新規遺伝子多型、第１１３０番目の塩基がグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に変異した新規遺伝子多型および第１３６７番目の塩基がグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に変異した新規遺伝子多型である。
図１に上記一塩基多型のシーケンシング結果を示す。
第１２５番目の塩基を含むＤＮＡ領域は、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子を構成する７個のエクソンの内、エクソン２に存在する。
第１１３０番目の塩基を含むＤＮＡ領域は、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子を構成する７個のエクソンの内、エクソン５に存在する。
第１３６７番目の塩基を含むＤＮＡ領域は、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子を構成する７個のエクソンの内、エクソン７に存在する。
【００１４】
ここで多型とは、遺伝学的には、人口中１％以上の頻度で存在している１遺伝子におけるある塩基の変化と一般的には定義される。
しかしながら、本発明の「多型」はこの定義に制限されず、１％未満の塩基の変化であっても「多型」に含む。
本発明における多型の種類としては、例えば、一塩基多型（single nucleotide polymorphism：ＳＮＰ）から数十塩基が欠失、置換あるいは挿入されている多型等が挙げられるが、これらに制限されるものではない。
更に多型部位の数についても特に制限はなく、１個以上の多型を有していてもよい。
【００１５】
薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の第１２５番目の塩基ＣがＧに変異することにより、ＣＹＰ１Ａ２の第４２番目のアミノ酸残基がプロリン（Ｐｒｏ）からアルギニン（Ａｒｇ）に変異したＣＹＰ１Ａ２（以下、「１２５Ｃ＞Ｇ（Ｐｒｏ４２Ａｒｇ）」と略記する場合がある）が（＊１５アレル）、
薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の第１１３０番目の塩基ＧがＡに変異することにより、ＣＹＰ１Ａ２の第３７７番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ａｒｇ）からグルタミン（Ｇｌｎ）に変異したＣＹＰ１Ａ２（以下、「１１３０Ｇ＞Ａ（Ａｒｇ３７７Ｇｌｎ）」と略記する場合がある）が（＊１６アレル）、
薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の第１３６７番目の塩基ＧがＡに変異することにより、ＣＹＰ１Ａ２の第４５６番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ａｒｇ）からヒスチジン（Ｈｉｓ）に変異したＣＹＰ１Ａ２（以下、「１３６７Ｇ＞Ａ（Ａｒｇ４５６Ｈｉｓ）」と略記する場合がある）が（＊８アレル）それぞれ発見された。
アリル頻度は「１２５Ｃ＞Ｇ（Ｐｒｏ４２Ａｒｇ）」及び「１１３０Ｇ＞Ａ（Ａｒｇ３７７Ｇｌｎ）」が０．００２、「１３６７Ｇ＞Ａ（Ａｒｇ４５６Ｈｉｓ）」が０．００４であった（Soyama A. et al., Drug Metab. Pharmacokinet. 20: 24-33 (2005)）。
【００１６】
本発明者らが見いだした薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子のアミノ酸置換を引き起こす遺伝子多型３種、１２５Ｃ＞Ｇ（Ｐｒｏ４２Ａｒｇ）、１１３０Ｇ＞Ａ（Ａｒｇ３７７Ｇｌｎ）及び１３６７Ｇ＞Ａ（Ａｒｇ４５６Ｈｉｓ）は全て、正常な（野生型）と比して、ｍＲＮＡ発現レベルに変化はないにも拘らず、蛋白質レベルで有意な発現量の低下が認められた。
さらに蛋白質当たりの酵素活性も、全ての多型で大幅な低下が認められた。
即ち、これら３種の置換体（異型酵素）は、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２の代謝活性について大幅な低下を引き起こす。
【００１７】
具体的には、野生型および３種の異型酵素（１２５Ｃ＞Ｇ（Ｐｒｏ４２Ａｒｇ）、１１３０Ｇ＞Ａ（Ａｒｇ３７７Ｇｌｎ）及び１３６７Ｇ＞Ａ（Ａｒｇ４５６Ｈｉｓ））の発現プラスミドを調製し、Ｖ７９細胞にトランスフェクションしたところ、野生型および異型酵素間で、ｍＲＮＡ発現レベルに変化はないにも拘らず、蛋白質レベルでは３種の置換体の全てで有意な発現量の低下が認められた。
また、ミクロソーム画分を用いて、インビトロで7-エトキシレゾルフィン及びフェナセチンのＯ-脱エチル化活性を検討したところ、３種の異型酵素の全てで、野生型に比べ、ミクロソーム蛋白質量あたり及びＣＹＰ１Ａ２蛋白質量あたりのいずれの場合も、それぞれ有意で顕著な活性の低下が認められた。
以上の結果から、１２５Ｃ＞Ｇ（Ｐｒｏ４２Ａｒｇ）、１１３０Ｇ＞Ａ（Ａｒｇ３７７Ｇｌｎ）及び１３６７Ｇ＞Ａ（Ａｒｇ４５６Ｈｉｓ）は、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２の代謝活性について大幅な低下を引き起こすことが明らかとなった。
【００１８】
これらの遺伝子多型を有するヒトでは、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２活性は低いことが予想され、ＣＹＰ１Ａ２により代謝される薬物の投与前に、これらの多型の存在を調べることにより、薬物の投与量を調節し、副作用の発現を抑制することが可能となる。
具体例として、上記薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の変異の結果、気管支拡張剤テオフィリンの生体内での代謝が、ＣＹＰ１Ａ２の量および酵素活性の低下に起因して下がり、テオフィリンが生体内に蓄積し、副作用が発現しやすいと考えられる。
従って、テオフィリン投与前に、ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の変異、即ち、該一塩基多型（ＳＮＰ）について検査することにより、薬物代謝異常の判定を行い、個々の患者のＣＹＰ１Ａ２代謝活性に応じた量のテオフィリンを投与することが可能となり、副作用を避けることができる。
【００１９】
前記ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の一塩基多型（ＳＮＰ）を利用する薬物代謝異常の判定に用いられる、本発明に係るプライマーセット、プライマー、プローブ及びそれらを含むＣＹＰ１Ａ２代謝活性の検査薬、並びにＣＹＰ１Ａ２代謝活性の検査方法について、以下、詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではなく、本発明の技術分野における通常の変更ができることは言うまでもない。
【００２０】
薬物代謝異常の判定において、薬物代謝異常ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の第１２５、１１３０及び１３６７番目の塩基における多型を決定し、その塩基の種類に基づいて、薬物代謝異常の判定、即ち、ＣＹＰ１Ａ２の代謝活性を判定する。
【００２１】
薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の第１２５番目の塩基がシトシン（Ｃ）である場合には問題ないが、前記塩基がグアニン（Ｇ）に変異している場合にはアミノ酸変異をもたらすものとなり、ＣＹＰ１Ａ２の第４２番目のアミノ酸残基がプロリン（Ｐｒｏ）からアルギニン（Ａｒｇ）に変異したＣＹＰ１Ａ２が発現する。
その結果、ＣＹＰ１Ａ２の代謝活性が低いと判断することができる。
【００２２】
薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の第１１３０番目の塩基がグアニン（Ｇ）である場合には問題ないが、前記塩基がアデニン（Ａ）に変異している場合には、アミノ酸変異をもたらすものとなり、ＣＹＰ１Ａ２の第３７７番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ａｒｇ）からグルタミン（Ｇｌｎ）に変異したＣＹＰ１Ａ２が発現する。
その結果、ＣＹＰ１Ａ２の代謝活性が低いと判断することができる。
【００２３】
薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の第１３６７番目の塩基がグアニン（Ｇ）である場合には問題ないが、前記塩基がアデニン（Ａ）に変異している場合には、アミノ酸変異をもたらすものとなり、ＣＹＰ１Ａ２の第４５６番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ａｒｇ）からヒスチジン（Ｈｉｓ）に変異したＣＹＰ１Ａ２が発現する。
その結果、ＣＹＰ１Ａ２の代謝活性が低いと判断することができる。
【００２４】
薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の第１２５、１１３０及び１３６７番目の塩基を決定する方法としては、被検者から調製されたＤＮＡ試料よりＣＹＰ１Ａ２遺伝子を含むＤＮＡを単離する工程、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと称する）により、当該領域の塩基を含むＣＹＰ１Ａ２遺伝子の部分断片を増幅する工程を経た後、単離したＤＮＡ試料の塩基配列を決定する工程、例えば、その部分断片（ＰＣＲ産物）の塩基配列を直接決定するダイレクトシークエンス法による工程を経ることにより行うことができる。
【００２５】
前記方法においては、最初に被検者からＤＮＡ試料を調製する。
ＤＮＡ試料は、例えば被検者の末梢血白血球、肝臓、腎臓、副腎、脳、子宮等の組織または細胞から抽出した染色体ＤＮＡ、あるいはＲＮＡを基に調製することができる。
【００２６】
薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子を含むＤＮＡ、さらにはＣＹＰ１Ａ２遺伝子の第１２５、１１３０及び１３６７番目の塩基を含むＤＮＡを単離する。
薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の第１２５、１１３０及び１３６７番目の塩基を含むＣＹＰ１Ａ２遺伝子を含むＤＮＡ領域をＰＣＲ法により増幅する際に使用するプライマーは、当該領域の塩基を含むＣＹＰ１Ａ２遺伝子の部分断片を増幅可能なプライマーである限り、特に限定されるものではなく、当業者であれば、ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の塩基配列に基づいて容易に決定することができる。
【００２７】
ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の第１２５番目における一塩基多型を検出するプライマーセットとしては、例えば、配列表の配列番号１に示される塩基配列を有するプライマーまたは当該プライマーよりも１〜１０塩基分短いプライマーと、配列表の配列番号２に示される塩基配列を有するプライマーまたは当該プライマーよりも１〜１０塩基分短いプライマーとを含むプライマーセットを例示することができる。
ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の第１１３０番目における一塩基多型を検出するプライマーセットとしては、例えば、配列表の配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーまたは当該プライマーよりも１〜１０塩基分短いプライマーと、配列表の配列番号４に示される塩基配列を有するプライマーまたは当該プライマーよりも１〜１０塩基分短いプライマーとを含むプライマーセットを例示することができる。
ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の第１３６７番目における一塩基多型を検出するプライマーセットとしては、例えば、配列表の配列番号５に示される塩基配列を有するプライマーまたは当該プライマーよりも１〜１０塩基分短いプライマーと、配列表の配列番号６に示される塩基配列を有するプライマーまたは当該プライマーよりも１〜１０塩基分短いプライマーとを含むプライマーセットを例示することができる。
これらのプライマーセットを用いてＰＣＲ法を実施すると、第１２５、１１３０及び１３６７番目の塩基を含むＣＹＰ１Ａ２遺伝子の部分断片を得ることができる。
【００２８】
薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の第１２５、１１３０及び１３６７番目の塩基を含むＣＹＰ１Ａ２遺伝子の部分断片の塩基配列を決定する。
単離した遺伝子断片の塩基配列の決定は、マクサムギルバート法やサンガー法など、当業者に公知の方法で行うことができる。
塩基配列を決定するにあたり使用するプライマー（シークエンシングプライマー）としては、ＣＹＰ１Ａ２遺伝子上の第１２５、１１３０及び１３６７番目の塩基を決定するように設計されたものであれば、特に限定されるものではなく、当業者であれば、ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の塩基配列に基づいて容易に決定することができる。
ＰＣＲ法により得られるＰＣＲ産物のダイレクトシークエンス法においては、ＰＣＲに用いたプライマーと同じ塩基配列を有するプローブを用いることができる。
【００２９】
ＣＹＰ１Ａ２遺伝子上の第１２５番目の塩基を決定するには、例えば配列表の配列番号７に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたは当該オリゴヌクレオチドよりも１〜１０塩基分短いオリゴヌクレオチドからなるプライマー、若しくは、配列表の配列番号８に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたは当該オリゴヌクレオチドよりも１〜１０塩基分短いオリゴヌクレオチドからなるプライマーを使用して実施することができる。
ＣＹＰ１Ａ２遺伝子上の第１１３０番目の塩基を決定するには、例えば配列表の配列番号９に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたは当該オリゴヌクレオチドよりも１〜１０塩基分短いオリゴヌクレオチドからなるプライマー、若しくは、配列表の配列番号１０に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたは当該オリゴヌクレオチドよりも１〜１０塩基分短いオリゴヌクレオチドからなるプライマーを使用して実施することができる。
ＣＹＰ１Ａ２遺伝子上の第１３６７番目の塩基を決定するには、例えば配列表の配列番号１１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたは当該オリゴヌクレオチドよりも１〜１０塩基分短いオリゴヌクレオチドからなるプライマー、若しくは、配列表の配列番号１２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたは当該オリゴヌクレオチドよりも１〜１０塩基分短いオリゴヌクレオチドからなるプライマーを使用して実施することができる。
【００３０】
決定したＤＮＡの塩基配列を対照と比較する。
本法における対照とは、正常な（野生型）ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の配列を言う。
一般に健常人のＣＹＰ１Ａ２遺伝子の配列は正常であるものと考えられることから、上記工程の「対照と比較する」とは、通常、健常人のＣＹＰ１Ａ２遺伝子の配列と比較することを意味するが、GenBankに野生型として登録されているＣＹＰ１Ａ２遺伝子の配列（NM_000761）と比較してもよい。
【００３１】
このような比較の結果、被検者のＣＹＰ１Ａ２遺伝子、第１２５、１１３０及び１３６７番目の塩基配列が対照と異なっていた場合、被検者はテオフィリン等のＣＹＰ１Ａ２により代謝される薬物に対する代謝能が低く、それらの薬物の投与による副作用が生じやすいと考えられる。
【００３２】
対照のＣＹＰ１Ａ２遺伝子、第１２５番目の塩基がシトシン（Ｃ）であるのに対し、被検者のＣＹＰ１Ａ２遺伝子、第１２５番目の塩基がグアニン（Ｇ）である場合、当該一塩基多型（ＳＮＰ）により、被検者はテオフィリン等のＣＹＰ１Ａ２により代謝される薬物に対する代謝能が低く、それらの薬物の投与による副作用が生じやすいと考えられる。
即ち、ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の第１２５番目の塩基ＣがＧに変異することにより、ＣＹＰ１Ａ２の４２番目のアミノ酸残基がプロリン（Ｐｒｏ）からアルギニン（Ａｒｇ）へと変異し、テオフィリン等の生体内での代謝が、ＣＹＰ１Ａ２量および酵素活性の低下により下がり、それらの薬物が生体内に蓄積し、副作用が発現しやすいと考えられる。
【００３３】
対照のＣＹＰ１Ａ２遺伝子、第１１３０番目の塩基がグアニン（Ｇ）であるのに対し、被検者のＣＹＰ１Ａ２遺伝子、第１１３０番目の塩基がアデニン（Ａ）である場合、当該一塩基多型（ＳＮＰ）により、被検者はテオフィリン等のＣＹＰ１Ａ２により代謝される薬物に対する代謝能が低く、それらの薬物の投与による副作用が生じやすいと考えられる。
即ち、ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の第１１３０番目の塩基ＧがＡに変異することにより、ＣＹＰ１Ａ２の３７７番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ａｒｇ）からグルタミン（Ｇｌｎ）へと変異し、テオフィリン等の生体内での代謝が、ＣＹＰ１Ａ２量および酵素活性の低下により下がり、それらの薬物が生体内に蓄積し、副作用が発現しやすいと考えられる。
【００３４】
対照のＣＹＰ１Ａ２遺伝子、第１３６７番目の塩基がグアニン（Ｇ）であるのに対し、被検者のＣＹＰ１Ａ２遺伝子、第１３６７番目の塩基がアデニン（Ａ）である場合、当該一塩基多型（ＳＮＰ）により、被検者はテオフィリン等のＣＹＰ１Ａ２により代謝される薬物に対する代謝能が低く、それらの薬物の投与による副作用が生じやすいと考えられる。
即ち、ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の第１３６７番目の塩基ＧがＡに変異することにより、ＣＹＰ１Ａ２の４５６番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ａｒｇ）からヒスチジン（Ｈｉｓ）へと変異し、テオフィリン等の生体内での代謝がＣＹＰ１Ａ２量および酵素活性の低下により下がり、それらの薬物が生体内に蓄積し、副作用が発現し易いと考えられる。
【００３５】
上述の一塩基多型により、ＣＹＰ１Ａ２量および酵素活性が減少しているかどうかを調べる手段としては、以下のような工程を含む方法を例示することができる。
（１）多型を含むＣＹＰ１Ａ２遺伝子を発現する発現ベクターを構築する、
（２）該発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入する、
（３）該宿主細胞をＣＹＰ１Ａ２が発現される条件下で培養する、
（４）ＣＹＰ１Ａ２に対する抗体を用いたウエスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、酵素結合免疫測定法（ELISA）及び免疫蛍光法等の方法を用いて、野生型のＣＹＰ１Ａ２遺伝子を導入した場合の結果と比較することにより、ＣＹＰ１Ａ２蛋白質の発現レベルの変化を決定することができる。
（５）また多型を含むＣＹＰ１Ａ２遺伝子を導入した（３）の細胞よりミクロソーム画分を調製し、これを用いてテオフィリン等を基質として代謝活性を調べ、野生型のＣＹＰ１Ａ２遺伝子を導入した場合の結果と比較することにより、酵素活性レベルの変化を決定することができる。
（４）および（５）の結果、ＣＹＰ１Ａ２量および酵素活性が減少していれば、被検者はテオフィリン等のＣＹＰ１Ａ２により代謝される薬物に対する代謝能が低く、それらの薬物の投与による副作用が生じやすいと判定される。
【００３６】
本発明の検査方法は、上記の如く直接被検者由来のＤＮＡの塩基配列を決定する方法以外に、多型の検出が可能な種々の方法によって行うことができる。
例えば、本発明における多型の検出は、以下の方法によっても行うことができる。
被検者からＤＮＡ試料を調製した後、該試料を制限酵素により切断する。
ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離した後、検出されたＤＮＡ断片の大きさを対照と比較する。
【００３７】
他の一つの態様においては被検者からＤＮＡ試料を調製した後、ＣＹＰ１Ａ２遺伝子を含むＤＮＡを増幅する。
増幅したＤＮＡを制限酵素により切断し、ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離した後、検出されたＤＮＡ断片の大きさを対照と比較する。
【００３８】
このような方法としては、例えば、制限酵素断片長多型（Restriction Fragment Length Polymorphism／RFLP）を利用した方法やＰＣＲ−ＲＦＬＰ法等が挙げられる。
具体的には、制限酵素の認識部位に変異が存在する場合、あるいは制限酵素処理によって生じるＤＮＡ断片内に塩基挿入または欠失がある場合、制限酵素処理後に生じる断片の大きさが対照と比較して変化する。
変異を含む部分をＰＣＲ法によって増幅し、それぞれの制限酵素で処理することにより、これらの変異を電気泳動後のバンドの移動度の差として検出することができる。
【００３９】
或いは、染色体ＤＮＡをこれらの制限酵素によって処理し、電気泳動した後、本発明に係るプローブ、例えばＣＹＰ１Ａ２遺伝子上の第１２５、１１３０及び１３６７番目を含む領域に対応するＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブを用いてサザンブロッティングを行うことにより、変異の有無を検出することができる。
【００４０】
用いられる制限酵素は、それぞれの変異に応じて適宜選択することができる。
この方法では、ゲノムＤＮＡ以外にも被検者から調製したＲＮＡを逆転写酵素でｃＤＮＡにし、これをそのまま制限酵素で切断した後、サザンブロッティングを行うことも可能である。
このｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲでＣＹＰ１Ａ２遺伝子を含むＤＮＡを増幅し、それを制限酵素で切断した後、移動度の差を調べることも可能である。
【００４１】
さらに別の方法においては、被検者からＤＮＡ試料を調製した後、ＣＹＰ１Ａ２遺伝子を含むＤＮＡを増幅する。
増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させた後、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する。
分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する。
該方法としては、例えばＰＣＲ-ＳＳＣＰ（single-strand conformation polymorphism、一本鎖高次構造多型）法が挙げられる。
この方法は操作が比較的簡便であり、また被検試料の量も少なくて済む等の利点を有するため、特に多数のＤＮＡ試料をスクリーニングするのに好適である。
その原理は次の通りである。
二本鎖ＤＮＡ断片を一本鎖に解離すると、各鎖はその塩基配列に依存した独自の高次構造を形成する。
この解離したＤＮＡ鎖を、変性剤を含まないポリアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、それぞれの高次構造の差に応じて、相補的な同じ鎖長の一本鎖ＤＮＡが異なる位置に移動する。
一塩基の置換によってもこの一本鎖ＤＮＡの高次構造は変化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において異なる移動度を示す。
従って、この移動度の変化を検出することによりＤＮＡ断片に点突然変異や欠失、あるいは挿入等による変異が存在することを検出することができる。
【００４２】
具体的には、ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の第１２５、１１３０及び１３６７番目の塩基を含むＤＮＡをＰＣＲ法等によって増幅する。
増幅される範囲としては、通常２００〜４００ｂｐ程度の長さが好ましい。
ＰＣＲは、当業者においては反応条件等を適宜選択して行うことができる。
ＰＣＲの際に、32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識したプライマーを用いることにより、増幅ＤＮＡ産物を標識することができる。
あるいはＰＣＲ反応液に32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を加えてＰＣＲを行うことにより、増幅ＤＮＡ産物を標識することも可能である。
ＰＣＲ反応後にクレノウ酵素等を用いて、32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を、増幅ＤＮＡ断片に付加することによっても標識を行うことができる。
【００４３】
こうして得られた標識ＤＮＡ断片を、熱を加えること等により変性させ、尿素などの変性剤を含まないポリアクリルアミドゲルによって電気泳動を行う。
この際、ポリアクリルアミドゲルに適量（５から１０％程度）のグリセロールを添加することにより、ＤＮＡ断片の分離の条件を改善することができる。
泳動条件は各ＤＮＡ断片の性質により変動するが、通常、室温（２０〜２５℃）で行い、好ましい分離が得られないときには４〜３０℃までの温度で最適の移動度を与える温度の検討を行う。
電気泳動後、ＤＮＡ断片の移動度を、Ｘ線フィルムを用いたオートラジオグラフィーや、蛍光を検出するスキャナー等で検出し、解析を行う。
移動度に差があるバンドが検出された場合、このバンドを直接ゲルから切り出し、ＰＣＲによって再度増幅し、それを直接シークエンシングすることにより、変異の存在を確認することができる。
標識したＤＮＡを使わない場合においても、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドや銀染色法などによって染色することによって、バンドを検出することができる。
【００４４】
上記の方法以外にも、特定位置の変異のみを検出する目的にはアレル特異的オリゴヌクレオチド（Allele Specific Oligonucleotide／ASO）ハイブリダイゼーション法が利用できる。
変異が存在すると考えられる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを作製し、これと試料ＤＮＡでハイブリダイゼーションを行わせると、変異が存在する場合、ハイブリッド形成の効率が低下する。
それをサザンブロット法や特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法等により検出することができる。
リボヌクレアーゼＡミスマッチ切断法による検出も可能である。
具体的には、ＣＹＰ１Ａ２遺伝子を含むＤＮＡをＰＣＲ法等によって増幅し、これをプラスミドベクター等に組み込んだＣＹＰ１Ａ２遺伝子ｃＤＮＡ等から調製した標識ＲＮＡとハイブリダイゼーションを行う。
変異が存在する部分においてはハイブリッドが一本鎖構造となるので、この部分をリボヌクレアーゼＡによって切断し、これをオートラジオグラフィー等で検出することによって変異の存在を検出することができる。
【００４５】
本発明に係る、ＣＹＰ１Ａ２遺伝子上の第１２５、１１３０及び１３６７番目の塩基を同定し得る、プライマー及びプローブは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。
プローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖ＤＮＡ断片として作製することもできる。
【００４６】
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。
標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの5'端を32Pでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
【００４７】
上述したプライマーセット、プライマー及びプローブは、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２により代謝される薬物に対するＣＹＰ１Ａ２代謝活性の検査薬として利用することができる。
特にＣＹＰ１Ａ２により代謝される代表的薬物である気管支拡張剤テオフィリン、抗精神病薬クロザピン、抗不整脈薬メキシレチン等に対するＣＹＰ１Ａ２代謝活性の検査薬として好ましく利用することができる。
上記の検査薬においては、有効成分であるオリゴヌクレオチド以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、タンパク質安定剤（ＢＳＡやゼラチンなど）、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
【００４９】
〔実施例１〕異型ＣＹＰ１Ａ２酵素の発現
[プラスミド構築]
完全長野生型ＣＹＰ１Ａ２断片をｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）に組み込んだものを野生型とした。Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene, La Jolla, CA, USA）を用いて、野生型ＣＹＰ１Ａ２／ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドを鋳型として、異型酵素である１２５Ｃ>Ｇ（Ｐｒｏ４２Ａｒｇ）、１１３０Ｇ>Ａ（Ａｒｇ３７７Ｇｌｎ）及び１３６７Ｇ＞Ａ（Ａｒｇ４５６Ｈｉｓ）の発現プラスミドを構築した。野生型及び３種の置換体（Ｐｒｏ４２Ａｒｇ、Ａｒｇ３７７Ｇｌｎ及びＡｒｇ４５６Ｈｉｓ）の全配列をＤＮＡ配列決定により確認した。
【００５０】
[ＤＮＡ配列決定]
ゲノムコンティグ配列（GenBank Accession No. AC091230.23）に基づき、遺伝子増幅用プライマー（表１）およびシーケンシング用プライマーを設計した（表２）。
【００５１】
【表１】
2007006713.tif 000003
【００５２】
【表２】
2007006713.tif 000004
【００５３】
１種類のプライマーセット（表１上段; 各0.5 μＭ）とZ-Taqポリメラーゼ（1 unit;Takara Bio.Inc.,Shiga,Japan）を用い、ゲノムＤＮＡ（200ng）についてＣＹＰ１Ａ２遺伝子のほぼ全長に相当する８．３ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した。
この際のＰＣＲの条件としては、98℃で5秒、55℃で5秒および72℃で190秒を、30サイクル行った。
各エクソン（２、５及び７）のＰＣＲ増幅用プライマーセット（表１下段; 各0.5 μＭ）を用いて、第一段ＰＣＲの産物であるＤＮＡ断片より、各エクソンを含むＤＮＡ断片をEx-Taq酵素（1 unit; Takara Bio. Inc.）を用いて増幅した。
この際ＰＣＲの条件は、94℃で5分処理後、「94℃で30秒、55℃で1分および72℃で2分」を30サイクル行い、その後72℃で7分処理した。
その後、PCR Product Pre-Sequencing Kit (USB Co., Cleveland, OH, USA)を用いて精製したＰＣＲ産物を両鎖について、ABI BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を用い、表２で例示したそれぞれのシーケンシング用プライマーにて直接配列決定した。
これはサイクルシーケンシング反応後、過剰な色素をDyeEx96 plate (Qiagen, Hilden, Germany)を用いて除去した後、溶出液をABI Prism 3700 DNA Analyzer (Applied Biosystems)により分析することにより行った。
【００５４】
[細胞培養及びトランスフェクション]
チャイニーズハムスター肺繊維芽細胞株Ｖ７９を５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を加えたダルベッコ改変イーグルス培地（ＤＭＥＭ）中、５％ ＣＯ2下、37℃で培養した。トランスフェクションの前日に、細胞を80%コンフルエントとなるよう10cm培養皿に接種した。細胞を無血清OPTI-MEM 培地(Invitrogen)で洗浄した後、本培地を加え、7μｇの野生型CYP1A2または3種のいずれかの置換体発現プラスミド、または、空のpcDNA3.1プラスミドをLipofectAMINE Plus 試薬(Invitrogen)を用いて、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。37℃にて4時間インキュベーション後、3倍容の6.7% FCSを含むDMEMを加え、さらに24時間インキュベートした。細胞を氷冷したPBS (pH 7.4)にて洗浄後、0.25 M Sucrose, 25 mM KCl, 0.5 mM EDTAを含む50 mM リン酸カリウム緩衝液 (pH 7.4)中でスクレーパーにて剥がし、ホモジナイズして破砕した。4℃にて9,000 g x 10分間遠心後の上清を、さらに105,000 g x 1時間遠心し、その沈殿を10% Glycerolを含む50 mMリン酸カリウム緩衝液 (pH 7.4)に懸濁しミクロソーム画分として使用まで-90℃で保存した。また、別途、mRNA定量のため全RNA画分をISOGEN (（株）ニッポンジーン、富山)により調製した。ミクロソーム画分の蛋白質量は、ウシγグロブリンを標準としてProtein Assay Kit(BioRad Labo., Hercules, CA, USA)により定量した。
【００５５】
[発現ＣＹＰ１Ａ２ ｍＲＮＡの定量]
５００ｎｇの全ＲＮＡ画分をDNase（Invitrogen）処理後、High capacity cDNA archive kit（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）を用いて、ランダムプライマー法によりcDNAに逆転写した。Real-time PCR反応は、Assay-On Demand kit(Hs01070371_g1, Applied Biosystems)を用いて、以下の通り行った。即ち、25 μＬのTaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)、500 pgの全RNA画分に相当する１μＬ（10倍希釈）の逆転写反応液、1×のFAM標識TaqMan probe (Applied Biosystems)、およびCYP1A2のExon 3とExon 4をまたぐ領域を特異的に増幅するforwardおよびreverseプライマー(Applied Biosystems)を含む５０μＬの反応液につき、ABI Prism 7700 sequence detection system (Applied Biosystems)により増幅・検出反応を行った。増幅PCR反応は、50℃で2分間を1サイクル、さらに９５℃で１０分間を１サイクルの後、さらに「９５℃で１５秒間と６０℃で１分間」の反応を４０サイクル行い、増幅されてくるフラグメント量を定量した。標準ｍＲＮＡとしてTaqMan Rodent GAPDH Control reagents (Applied Biosystems)により定量されるGlyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)を用い、ＣＹＰ１Ａ２ ｍＲＮＡ量はＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ量に対する相対量として算出した。尚、negative controlとしては、逆転写酵素を添加せずに（逆転写）反応を行ったものを用いた。本試験を３回繰り返した結果につき、One-way ANOVA及びそれに引き続きScheffe検定を行い、ｐ＜０．０５を有意とした。
Ｖ79細胞にトランスフェクトした野生型ＣＹＰ１Ａ２および３置換体（Ｐｒｏ４２Ａｒｇ、Ａｒｇ３７７Ｇｌｎ及びＡｒｇ４５６Ｈｉｓ）のｍＲＮＡレベルを調べたところ、３置換体のｍＲＮＡ発現レベルは野生型のレベルとほぼ同じであり、有意な差は認められなかった（図２）。
【００５６】
[発現ＣＹＰ１Ａ２蛋白質の定量]
ＣＹＰ１Ａ２及び３種の置換体（Ｐｒｏ４２Ａｒｇ、Ａｒｇ３７７Ｇｌｎ及びＡｒｇ４５６Ｈｉｓ）のＶ７９細胞における発現レベルを決定するため、ミクロソーム画分（蛋白質30μｇ）をＳＤＳサンプルバッファー中に溶解し、８％ ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、さらにニトロセルロース膜に電気的に転写した。免疫染色のため、ヤギ抗CYP1A1/1A2抗血清 (1,000倍希釈、第一化学薬品（株）、 東京)、またはウサギ抗カルネキシン抗血清（2,000倍希釈、StressGen Biotechnologies Corp., Victoria, BC, Canada）のいずれかを一次抗体とし、西洋わさびのペルオキシダーゼ標識抗ヤギ抗体（ICN Pharmaceuticals Inc., Aurora, OH, USA）、または同標識抗ウサギ抗体（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA）を二次抗体として使用し、Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus (PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA, USA)を用いた化学発光をDiana III (Raytest, Straubenhardt, Germany) により検出・定量した。ミクロソーム画分中のＣＹＰ１Ａ２含有量は、そのバンド強度をＣＹＰ１Ａ２発現量が測定されているヒト肝ミクロソーム（BD Gentest, Woburn, MA, USA）のバンド強度と比較して算出した。本試験を3回繰り返した結果につき、One-way ANOVA及びそれに引き続きScheffe検定を行い、ｐ＜０．０５を有意とした。
【００５７】
図３に、空のプラスミド、野生型、または３置換体（Ｐｒｏ４２Ａｒｇ、Ａｒｇ３７７Ｇｌｎ及びＡｒｇ４５６Ｈｉｓ）プラスミドでトランスフェクトしたＶ７９細胞のミクロソーム画分中のＣＹＰ１Ａ２蛋白質の発現レベルを示す。
３置換体の発現レベルはいずれも野生型の発現レベルと比べて有意に減少していた。即ち、野生型に比して、Ｐｒｏ４２Ａｒｇ置換体では６６．０±１３．４％（ｐ＜０．００１）に、Ａｒｇ３７７Ｇｌｎ置換体では２９．８±３．５％（ｐ＜０．００１）に、Ａｒｇ４５６Ｈｉｓ置換体では３１．６±８.１％（ｐ＜０．００１）に、それぞれ低下していた。尚、ＣＹＰ１Ａ２は小胞体膜上に発現するが、ミクロソーム画分中の小胞体含有量を、小胞体固有蛋白質カルネキシン（Williams D.B., Biochem. Cell Biol. 73:123-132 (1995) ）のイムノブロットにより評価したが、上記５種のプラスミドでトランスフェクトしたＶ７９細胞のミクロソーム画分間で、有意な差は認められなかった。
【００５８】
これらｍＲＮＡ発現レベル及び蛋白質発現レベルの定量結果は、３置換体（Pro42Arg、Arg377Gln、及びArg456His）の蛋白質発現レベルの減少が、これら発現プラスミドのトランスフェクション効率の低さによるものではないことを示している。この様な蛋白質発現レベルの減少は、ＣＹＰ２Ｄ６＊１０において示唆されるように（Johansson I. et al., Mol. Pharmacol. 46: 452-459 (1994)；Nakamura K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 293: 969-973 (2002)）、成熟蛋白質の安定性がこれらアミノ酸置換により減少した可能性が考えられる。
【００５９】
〔実施例２〕異型ＣＹＰ１Ａ２酵素の活性測定
野生型ＣＹＰ１Ａ２及び３置換体（Ｐｒｏ４２Ａｒｇ、Ａｒｇ３７７Ｇｌｎ及びＡｒｇ４５６Ｈｉｓ）の酵素活性は、それぞれの発現プラスミドをトランスフェクトしたＶ７９細胞のミクロソーム画分を酵素源として、ＣＹＰ１Ａ２の代表的基質である７−エトキシレゾルフィン（Ｏ-脱エチル化活性）及びフェナセチン（Ｏ-脱エチル化活性）を測定した。
【００６０】
[7-エトキシレゾルフィン Ｏ-脱エチル化活性の分析]
400 μｇのミクロソーム画分、０．２５〜４．０μＭの7-エトキシレゾルフィン (Sigma, St. Louis, MO, USA)を含む２００μＬの５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液 (pH7.4)を37℃で1分間プレインキュベートした後、１ｍＭ ＮＡＤＰＨ（Roche Diagnostics, 東京）を加え、さらに37℃で30分間インキュベートした。同量の氷冷メタノールを加えて攪拌後、12,000 x gで20分間遠心した。その上清をフィルター濾過した後、50μｌを高速液体クロマトグラフィー(HPLC)に付した。即ち、Inertsil ODS-80A カラム（内径4.6 mm×150 mm; GL Sciences, 東京）を装着したSCL-6Bシステム（Shimadzu, 京都）を用いてHPLC分析を行った。7-エトキシレゾルフィンO-脱エチル化体（レゾルフィン）はカラム温度30℃下、0.7 ml/分の流速で20 mM リン酸緩衝液 (pH 6.8)/アセトニトリル/メタノール(52:4:44. v/v/v)で溶出した。レゾルフィンの検出は励起波長566 nm、蛍光波長584 nmで行った。Km値（最大反応速度の50%を与える基質濃度）及びVmax値（最大反応速度）はPrism v4.0ソフトウェア(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)を用いてLineweaver-Burkプロットにより算出した。本試験を３回繰り返した結果につき、One-way ANOVA及びそれに引き続きScheffe検定を行い、ｐ＜０．０５を有意とした。
【００６１】
野生型ＣＹＰ１Ａ２及び３置換体（Ｐｒｏ４２Ａｒｇ、Ａｒｇ３７７Ｇｌｎ及びＡｒｇ４５６Ｈｉｓ）の7-エトキシレゾルフィンO−脱エチル化活性を比較したところ、3種の置換体共に活性の有意で顕著な低下が認められた（表３）。
まずＫｍ値はＡｒｇ３７７Ｇｌｎで、野生型に比して有意に上昇していたことから、基質に対する親和性の低下が示唆された。また、Vmax値及びVmax/Km値は、ミクロソーム蛋白質量当たり、およびＣＹＰ１Ａ２蛋白質量当たりで表したいずれの場合でも、全ての置換体において有意で大幅に減少していた。活性の指標となるVmax/Km値に着目すると、ミクロソーム蛋白質量当たりでは、全ての置換体で野生型の１％以下、ＣＹＰ１Ａ２当たりでも野生型に比して全ての置換体で２％以下であった。本結果から、３種の置換体共に、7-エトキシレゾルフィン代謝能の低下には、蛋白質発現レベルの低下に加え、ＣＹＰ１Ａ２蛋白質当たりの代謝能の低下が関与していることが示唆された。
【００６２】
【表３】
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【００６３】
[フェナセチン Ｏ−脱エチル化活性の分析]
400μｇのミクロソーム画分、5 又は 100μＭ のフェナセチン(Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, USA)を含む２００μＬの５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液 (pH7.4)を37℃で1分間プレインキュベートした後、１ｍＭ ＮＡＤＰＨ（Roche Diagnostics）を加え、さらに３７℃で４０分間インキュベートした後、2.5 mlの酢酸エチルの添加により反応を停止した。反応液に内部標準物質として５００ｐｍｏｌの３−アセトアミドフェノール（Aldrich Chemical Co.,）を加え、２分間激しく攪拌した。2,000 x gで10分間遠心した後、有機溶媒層を分取し、窒素ガス気流下（35℃）で乾固させた。残渣を100μｌの50％（v/v）メタノールに再溶解した後、この中50μｌをHPLCに供した。即ち、Inertsil ODS-80A カラム（内径4.6 mm×150 mm; GL Sciences）を装着したSCL-6Bシステム（Shimadzu）を用いてHPLC分析を行った。フェナセチンO-脱エチル化体（4-アセトアミドフェノール）は、カラム温度３０℃下、流速1.2 ml/分にて２０ｍＭ リン酸緩衝液 (pH 5.4)-メタノール (86:14, v/v)で溶出した。4-アセトアミドフェノールの検出はＵＶ ２４５ｎｍで行った。本試験を3回繰り返した結果につき、One-way ANOVA及びそれに引き続きScheffe検定を行い、ｐ＜０．０５を有意とした。
【００６４】
野生型ＣＹＰ１Ａ２及び３置換体（Ｐｒｏ４２Ａｒｇ、Ａｒｇ３７７Ｇｌｎ及びＡｒｇ４５６Ｈｉｓ）のフェナセチンO−脱エチル化活性を基質濃度５μＭ及び１００μＭで比較したところ、３種の置換体共に、活性の有意で顕著な低下が認められた（表４）。
この活性低下は、代謝活性をミクロソーム蛋白質量当たり、およびＣＹＰ１Ａ２蛋白質量当たりで表したいずれの場合でも認められた。即ち、基質濃度５μＭでは３種の置換体の活性はいずれも検出限界以下であり、また１００μＭではミクロソーム蛋白質量あたりで全ての置換体につき約９６％以上の、ＣＹＰ１Ａ２蛋白質量あたりで全ての置換体につき約８９％以上のそれぞれ顕著な活性の低下が認められた。本結果から、３種の置換体共に、フェナセチン代謝能の低下には、蛋白質発現レベルの低下に加え、ＣＹＰ１Ａ２蛋白質当たりの代謝能の低下が関与していることが示唆された。
【００６５】
【表４】
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【００６６】
[結果のまとめ]
今回の結果は、薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２の３種の遺伝子多型、１２５Ｃ＞Ｇ（Ｐｒｏ４２Ａｒｇ）、１１３０Ｇ＞Ａ（Ａｒｇ３７７Ｇｌｎ）及び１３６７Ｇ＞Ａ（Ａｒｇ４５６Ｈｉｓ）が活性の顕著な低下を引き起こすことを示したものである。
これらの遺伝子多型を有するヒトでは、ＣＹＰ１Ａ２活性は低いことが予想され、ＣＹＰ１Ａ２により代謝される薬物の投与前に、これらの遺伝子多型を調べることによりＣＹＰ１Ａ２により代謝される薬物の投与量を調節し、副作用の発現を抑制することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２遺伝子上の第１２５番目（Ａ）、第１１３０番目（Ｂ）及び第１３６７番目（Ｃ）における一塩基多型のシーケンシング結果を示した図である。
【図２】Ｖ７９細胞にトランスフェクトした薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２のｍＲＮＡ発現レベルを示した図である。
【図３】Ｖ７９細胞にトランスフェクトした薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２の蛋白質発現レベルを示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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