(57)【要約】【課題】抗原抗体反応を利用した分析装置で使用される標識付き試薬において、抗体の反応性を向上させることと、磁気センサによる測定精度を向上する。【解決手段】標識付き試料として、「抗体を末端に有するポリエチレングリコールと、末端に前記抗体を有さないポリエチレングリコールと、がそれぞれアビジン・ビオチン結合を介して表面に結合されている磁気粒子」の集合体を使用する。この標識付き試料を第２多孔体２に溶出可能に保持させ、その下流の反応部３に同じ抗体を固定する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
「特定成分と特異的に結合する物質を末端に有するポリアルキレングリコールと、末端に前記物質を有さないポリアルキレングリコールと、が表面に結合されている標識粒子」の集合体からなることを特徴とする標識付き試薬。
【請求項２】
標識粒子が磁気粒子である請求項１記載の標識付き試薬。
【請求項３】
「抗体を末端に有するポリエチレングリコールと、末端に前記抗体を有さないポリエチレングリコールと、がそれぞれアビジン・ビオチン結合を介して表面に結合されている磁気粒子」の集合体からなることを特徴とする標識付き試薬。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の標識付き試薬に液状試料を接触させて、前記特定成分または抗体を検出するように構成された分析装置。
【請求項５】
特定成分と特異的に結合する試薬が固定された磁気粒子からなる標識付き試薬が保持された多孔体が、液体を浸透しない材料からなる基材上に固定され、
この基材上の前記多孔体の下流側に、前記特定成分と特異的に結合する試薬が固定された反応部が形成され、
液状試料を前記多孔体に吸収させた後に前記反応部に移動させ、前記反応部の状態を磁気検出装置で検出することにより、前記液状試料中の特定成分を分析する分析装置において、
前記標識付き試薬が、請求項２または３に記載の標識付き試薬であることを特徴とする分析装置。
【請求項６】
特定成分と特異的に結合する試薬が固定された磁気粒子からなる標識付き試薬を多孔体に保持させ、
この多孔体の下流側で、液体を浸透しない材料からなる基材上に、前記特定成分と特異的に結合する試薬が固定された反応部を設け、
前記多孔体に液状試料を吸収させて前記反応部まで移動させ、前記反応部の状態を磁気検出装置で検出することにより、前記液状試料中の特定成分を分析する分析方法であって、
前記標識付き試薬として、請求項２または３に記載の標識付き試薬を用いることを特徴とする分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、特定成分（例えば、抗原）と、これと特異的に結合する物質（例えば、抗体）との反応（例えば、抗原抗体反応）を利用した分析装置で使用する標識付き試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査、環境分析、食品分析等に好適に用いられる分析装置として、抗原抗体反応を利用した分析装置が提案されている。
特許文献１に記載された分析装置では、検体（抗原）に対して特異的に結合する試薬（抗体）が、標識が付いた状態で、多孔質キャリヤ（帯状の多孔質体）の第一区域に湿潤状態で移動可能に保持されている。また、同じ多孔質キャリヤの第一区域から空間的に区別される検出区域（反応部）に、検体に対して特異的に結合する試薬（抗体）が標識無しで固定されている。
【０００３】
また、この分析装置は、適用された液状試料が標識付き試薬を吸収した後に検出区域に浸透するように構成され、標識付き試薬が検出区域に結合された程度を観察できる手段を有している。この分析装置において、多孔質キャリヤは、不透湿性固体材料からなる中空ケーシング（箱体）内に収容されている。
さらに、特許文献１には、標識の例として、染色ゾル、金属ゾル、および着色ラテックス粒子が挙げられている。そして、特許文献１の第１２図に示された分析装置は、液状試料を横方向に移動させるラテラルフロー方式の装置である。
特許文献２に記載された分析装置では、標識として磁性微粒子（磁気粒子）を用い、磁性微粒子の凝集を磁気センサで測定することにより分析を行っている。
【０００４】
【特許文献１】特公平７−４６１０７号公報
【特許文献２】特開昭６３−３０２３６７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ノルウェー国Ｄｙｎａｌ社製の磁気粒子「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）  ＭｙＯｎｅ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ」は、超常磁性ポリマービーズ（粒径１μｍ、２．８μｍ等）にストレプトアビジンを結合させたものである。例えば、この磁気粒子を標識として用い、その表面に、末端に抗体が結合されたポリエチレングリコールを、アビジン・ビオチン結合を介して結合することで得られた標識付き試薬は、ポリエチレングリコールを介在させないで得られた標識付き試薬よりも、抗体の抗原との反応性を良好にすることができる。
【０００６】
しかしながら、現実的な分析装置用の標識付き試薬としては、抗体の更なる反応性の向上が求められているとともに、抗体同士の凝集力を低減させて磁気センサによる測定精度を向上させることが求められている。
本発明の課題は、特定成分（例えば、抗原）と、これと特異的に結合する物質（例えば、抗体）との反応（例えば、抗原抗体反応）を利用した分析装置で使用される標識付き試薬において、特定成分の反応性を向上させることと、標識が磁気粒子の場合に磁気センサによる測定精度を向上させることである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明は、「特定成分と特異的に結合する物質を末端に有するポリアルキレングリコールと、末端に前記物質を有さないポリアルキレングリコールと、が表面に結合されている標識粒子」の集合体からなることを特徴とする標識付き試薬を提供する。
本発明の標識付き試薬によれば、標識粒子の表面に、特定成分と特異的に結合する物質を末端に有するポリアルキレングリコールだけでなく、末端に前記物質を有さないポリアルキレングリコールが結合されていることにより、特定成分と特異的に結合する物質を末端に有するポリアルキレングリコールだけが結合されている標識付き試薬と比較して、特定成分の反応性が向上する。また、標識粒子が磁気粒子の場合には、磁気センサによる測定精度が向上する。
【０００８】
本発明において、「特定成分」と「特定成分と特異的に結合する物質」の組み合わせとしては、抗原と抗体、リガンドとレセプター、相補的ＤＮＡ同士が挙げられる。
抗原と抗体の組み合わせとしては、例えば、インフルエンザＡウイルス（Ｈ３Ｎ２）と抗インフルエンザＡウイルス抗体（米国フィッツジェラルド社、Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ
ＩｇＧ１  ）、インフルエンザＡウイルス（Ｈ１Ｎ１）と抗インフルエンザＡウイルス抗体（ハイテスト社、Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１  ）、インフルエンザＢウイルスと抗インフルエンザＢウイルス抗体（米国フィッツジェラルド社、Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１  ）が挙げられる。
【０００９】
本発明の標識付き試薬を構成するポリアルキレングリコールとしては、ポリプロピレングリコールやポリエチレングリコール等が挙げられるが、ポリエチレングリコールを用いることが好ましい。
本発明の標識付き試薬を構成する「末端に前記物質を有するポリアルキレングリコール（以下、「ＰＡＬＧ」と略称する。）」としては、モノマーの重合度が２〜５００であるものが使用でき、特に５０〜５００であるものが好ましい。ポリエチレングリコール（以下、「ＰＥＧ」と略称する。）の場合は、重量平均分子量が１００〜２２０００であるものが使用でき、２５００〜４０００であるものが好ましい。
【００１０】
末端に前記物質を有さないＰＡＬＧとしては、モノマーの重合度が２〜５００であるものが使用でき、特に２〜１５０であるものが好ましい。すなわち、末端に前記物質を有するＰＡＬＧは有さないＰＡＬＧと同じか大きな重合度（有するＰＡＬＧの重合度：有さないＰＡＬＧの重合度＝１：１〜１０：１）であることが好ましい。末端に前記物質を有さないＰＡＬＧの重合度の方が大きいと、前記物質の表面が露出し難くなって、反応性が低下する。また、末端に前記物質を有さないＰＡＬＧは僅かでも存在していればよく、末端に前記物質を有するＰＡＬＧに対するモル比が０．００１以下であってもよい。
【００１１】
末端に前記物質を有さないＰＡＬＧの末端は、メチル基、アミノ基、カルボキシル基等の一般的な官能基とすることができる。すなわち、前記物質を末端に有さないＰＡＬＧの誘導体が、前記物質を末端に有するＰＡＬＧとともに標識粒子の表面に結合されていればよい。また、末端に前記物質を有するＰＡＬＧと、前記物質を末端に有さないＰＡＬＧは、標識粒子に同時に結合させても良いし、どちらか片方を一定量結合させた後、他方を結合させてもよい。
【００１２】
本発明の標識付き試薬としては、「抗体を末端に有するポリエチレングリコールと、末端に前記抗体を有さないポリエチレングリコールと、がそれぞれアビジン・ビオチン結合を介して表面に結合されている磁気粒子」の集合体からなるものが挙げられる。
本発明は、また、本発明の標識付き試薬に液状試料を接触させて、前記特定成分または抗体を検出するように構成された分析装置を提供する。
【００１３】
本発明は、また、特定成分と特異的に結合する試薬が固定された磁気粒子からなる標識付き試薬が保持された多孔体が、液体を浸透しない材料からなる基材上に固定され、この基材上の前記多孔体の下流側に、前記特定成分と特異的に結合する試薬が固定された反応部が形成され、液状試料を前記多孔体に吸収させた後に前記反応部に移動させ、前記反応部の状態を磁気検出装置で検出することにより、前記液状試料中の特定成分を分析する分析装置において、前記標識付き試薬が、「特定成分と特異的に結合する物質を末端に有するポリエチレングリコールと、末端に前記物質を有さないポリエチレングリコールと、がそれぞれアビジン・ビオチン結合を介して表面に結合されている磁気粒子」の集合体からなる標識付き試薬であることを特徴とする分析装置を提供する。
【００１４】
本発明は、また、特定成分と特異的に結合する試薬が固定された磁気粒子からなる標識付き試薬を多孔体に保持させ、この多孔体の下流側で、液体を浸透しない材料からなる基材上に、前記特定成分と特異的に結合する試薬が固定された反応部を設け、前記多孔体に液状試料を吸収させて前記反応部まで移動させ、前記反応部の状態を磁気検出装置で検出することにより、前記液状試料中の特定成分を分析する分析方法であって、前記標識付き試薬として、「特定成分と特異的に結合する物質を末端に有するポリエチレングリコールと、末端に前記物質を有さないポリエチレングリコールと、がそれぞれアビジン・ビオチン結合を介して表面に結合されている磁気粒子」の集合体からなる標識付き試薬を用いることを特徴とする分析方法を提供する。
本発明の分析装置を構成する磁気検出装置としては、市販の装置、例えば、ホール素子、半導体ＭＲ素子（ＳＭＲ素子）、ＧＭＲ (Giant magneto resistance) 素子等を備えたものを使用することができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の標識付き試薬は、従来の標識付き試薬と比較して特定成分の反応性が向上し、標識が磁気粒子の場合に磁気センサによる測定精度が向上する。そして、これを用いた本発明の分析装置によれば、従来の標識付き試薬を用いた分析装置と比較して分析精度を向上できる。
したがって、本発明の分析装置は、医療診断や健康診断のために行われる臨床検査用の装置として好適に使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
図１〜３を用いて、本発明の実施形態に相当する分析装置を説明する。
図１は、この分析装置を構成する本体を示す縦断面図である。図２は、この本体を構成する箱体の、組立前の状態を示す斜視図である。図３は、第１多孔体１、第２多孔体２、反応部３、および吸収体４の、箱体内での配置を示す斜視図である。
【００１７】
〔本体について〕
図１および２に示すように、この箱体は、ポリカーボネート（液体を浸透しない性質の材料）製の底板６と、ポリスチレン（液体を浸透しない性質の材料）製の蓋部７とで構成されている。
底板６の内面には、周縁部の６カ所に、蓋部７との連結用のピン６７が固定されている。これらのピン６７を入れる筒状のピン受け７６が、蓋部７の内面に固定されている。蓋部７には、液状試料を入れるための試料導入口（試料導入部）７１と、反応部３の上部に流路３１を形成する流路形成部７２が形成されている。これらの底板６および蓋部７は、汎用の射出成形機を用い、通常の条件で成形することができる。
【００１８】
図２および３に示すように、底板６の内面に、第１多孔体（試料導入部）１、第２多孔体２、反応部３、および吸収体４が配置されている。
底板６の内面は、反応部３を形成する部分（反応部形成面）３０が、第１多孔体１を固定する部分１０、第２多孔体２を固定する部分２０、および吸収体４を固定する部分４０よりも低く形成されている。符号５０は、底板６の内面で最も低い面を示す。また、第１多孔体１を固定する部分１０と第２多孔体２を固定する部分２０は同じ高さで、吸収体４を固定する部分４０は、これらの部分１０，２０よりも高くなっている。そのため、図２に示すように、底板６内面の吸収体４を固定する部分４０は、周縁部と同じ高さの面６Ａとして形成し、反応部形成面３０、第１多孔体１を固定する部分１０、および第２多孔体２を固定する部分２０は、この面６Ａに凹部１０Ａ，２０Ａ，３０Ａを設けることにより形成した。
【００１９】
底板６の内面の、第２多孔体２を固定する部分２０と反応部形成面３０の間は、斜面２３になっている。反応部形成面３０と吸収部４を固定する部分４０の間は、斜面３４になっている。これらの斜面２３，３４に、それぞれ複数の流路形成部材２３１，３４１を配置することで、溝状の流路２３２，３４２が形成される。流路形成部材２３１，３４１は、蓋部７の流路形成部７２の傾斜部に固定されている。また、第１多孔体１と第２多孔体２は接触状態で配置される。
【００２０】
第１多孔体１は、グラスファイバーの不織布を長方形に打ち抜くことで作製し、これを両面テープで底板６の凹部１０Ａに固定する。
第２多孔体２は、グラスファイバーの不織布に、下記の方法で得られた液体を含浸した後に風乾することで得、これを両面テープで底板６の凹部２０Ａに固定する。
反応部３は、下記の方法で底板６の凹部３０Ａに形成する。吸収体４は、セルロースの不織布を長方形に打ち抜くことで作製し、これを両面テープで底板６の凹部３０Ａに隣接する面６Ａに固定する。
【００２１】
この状態の底板６の上に蓋部７を載せて、底板６のピン６７を蓋７のピン受け７６に入れることにより、図１に示すように分析装置の本体１０１が得られる。そして、この実施形態の分析装置は、本体１０１の反応部３の状態を、磁気検出装置を用いて図１の矢印Ｂ方向から検出することで、試料導入口７１から導入された液状試料の特定成分（抗体Ｂと特異的に結合する抗原）を分析する。
【００２２】
この実施形態の分析装置によれば、反応部３を底板６の内面の最も低い凹部３０Ａに形成することにより、図１に示すように、箱体の底板６の厚さを反応部３の位置で極めて薄くして、第１多孔体１、第２多孔体２、および吸収体４が固定されている部分の厚さを機械的強度が確保できる十分な厚さにすることができる。
そして、例えば、第１多孔体１および第２多孔体２を固定する部分の厚さを１．０ｍｍとし、反応部形成面３０の部分の厚さを０．２ｍｍとし、吸収体４を固定する部分の厚さを１．５ｍｍとすることで、磁気センサによる検出感度および検出精度を良好にしながら、底板６の機械的強度を確保することができる。
また、蓋部７の流路形成部７２により、反応部３の上部に流路３１を形成することで、反応部３の汚染が防止される。
【００２３】
〔第２多孔体に含浸させる液体（標識付き試薬を含有する液体）の作製方法〕
先ず、末端のうち一方がビオチンであり、他方が−ＮＨＳ、マレイミドなどの官能基であるＰＥＧを用いて、抗体にＰＥＧ鎖およびビオチンを導入する。
ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）、Ｔｅｔｏｒａｂｏｒａｔｅなどの緩衝液中において、抗体０．１ｍｇ〜１０ｍｇ（６．７×１０-7ｍｍｏｌ〜６．７×１０-5ｍｍｏｌ）に、蒸留水で溶解したＢｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ＣＯ2−ＮＨＳ（米国シェアーウオーター社製、ＭＷ３４００）試薬３〜１０倍モル等量を添加し、４℃〜室温で２時間〜１２時間反応させる。上記反応液を遠心型限外ろ過又はゲルろ過によって精製し、ＰＥＧ−ｂｉｏｔｉｎ化抗体液とする。
【００２４】
得られたＰＥＧ−ｂｉｏｔｉｎ化抗体液の分子あたりのビオチン化量をＨＡＢＡ試薬（米国ピアース社製）により定量し、Ｂｉｏｔｉｎ化度が１〜１０個／抗体１分子であることを確認する。
次に、磁気粒子として、前述のＤｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを０．１ｍｇ〜１０ｍｇ用意した。この磁気粒子に、前述のＰＥＧ−ｂｉｏｔｉｎ化抗体と、ＰＥＧ−ｂｉｏｔｉｎ試薬（ビオチンポリエチレングリコールアミン、Ｓｉｇｍａ社）を、モル比で、ＰＥＧ−ｂｉｏｔｉｎ化抗体：ＰＥＧ−ｂｉｏｔｉｎ＝１：１〜１０００となる比率で添加し、４℃〜室温で１時間〜１２時間、攪拌しながら反応させる。
【００２５】
この反応で得られた二次抗体結合磁気粒子分散液（標識付き試薬を含有する液体）から二次抗体結合磁気粒子（標識付き試薬）のみを、磁石を用いて回収し、２〜３回ＰＢＳで洗浄した後、最終的に二次抗体結合磁気粒子の粒子濃度が０．０１％〜１％濃度となるように、１％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）／ＰＢＳ溶液を添加して調整する。
【００２６】
〔反応部３の形成工程〕
抗インフルエンザＢウイルス抗体（ハイテスト社製、Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ）を、１μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ濃度になるよう燐酸ナトリウム緩衝液など適当な緩衝液中へ溶解する。この溶解液を底板６の凹部３０Ａに１〜５０μｌ滴下し、この底板６を湿潤箱に入れて４℃〜室温で、３０分〜２４時間反応させる。次に、蒸留水にて底板６の凹部３０Ａ側の表面を洗浄後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液１μｌ〜５０μｌを滴下し、さらに、この底板６を湿潤箱に入れて４℃〜室温で、３０分〜２４時間反応させる。次に、蒸留水にて底板６の凹部３０Ａ側の表面を洗浄する。
【実施例】
【００２７】
〔標識付き試薬の調製〕
先ず、Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ＣＯ2−ＮＨＳ（米国シェアーウオーター社製、ＭＷ３４００）を４．３ｍｇ計量して、５００μｌの蒸留水に溶解することにより、濃度が２．５ｍＭである水溶液を調製した。
この水溶液１４．８μｌと、抗インフルエンザＢウイルス抗体（ハイテスト社製、Anti-Mouse IgG）をＰＢＳに脱塩・ｂｕｆｆｅｒ交換したもの（抗体濃度３．４４ｍｇ／ｍｌ）６６０μｌを混合して、室温で２時間反応させた。これにより、前記抗体にＰＥＧ鎖を結合した。
【００２８】
上記反応液を、遠心型限外ろ過装置（アミコン社、分子量３万カット）を用いて回転速度７５００ｒｐｍ、１０分間の条件で濃縮し、得られた濃縮液にＰＢＳを３ｍｌ添加して、同限外ろ過装置で同様の条件で再び濃縮した。さらに、得られた濃縮液にＰＢＳを３ｍｌ添加して、同限外ろ過装置で同様の条件で濃縮する操作を２回繰り返した。これにより、未反応のＢｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ＣＯ2−ＮＨＳが除去された、精製ＰＥＧ−ｂｉｏｔｉｎ化抗体液を得た。
【００２９】
得られたＰＥＧ−ｂｉｏｔｉｎ化抗体液に含まれる抗体の濃度は１．６９ｍｇ／ｍｌであった。また、この液体の抗体１分子あたりのＢｉｏｔｉｎ化率を「ＥＺ−ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ試薬（米国ピアース社製）」のｂｉｏｔｉｎ定量試薬により定量したところ、１．２分子であった。
【００３０】
次に、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ノルウェー国Ｄｙｎａｌ社製の磁気ビーズ、直径１．０μｍ、超常磁性高分子ポリマービーズにストレプトアビジンを結合させたもの）を１％含有するＰＢＳ溶液を２００μｌ、エッペンドルフチューブに計量した。このエッペンドルフチューブから、ノルウェー国Ｄｙｎａｌ社製のＭＰＣ（磁石を用いた磁性粒子収集装置）を用いて上澄み液を除去した。次に、このエッペンドルフチューブに、得られた精製ＰＥＧ−ｂｉｏｔｉｎ化抗体液を４９７．６μｌと、ＰＥＧ−ｂｉｏｔｉｎ試薬（ビオチンポリエチレングリコールアミン、Ｓｉｇｍａ社）の水溶液（濃度５００μｇ／ｍｌに調製）を２７．３μｌ添加した。さらに、ＰＢＳを入れて全液量を６００μｌとした後、室温で１時間攪拌しながら反応を行った。
【００３１】
これにより、磁気ビーズ標識化二次抗体分散液を得た。この分散液中の磁気ビーズ標識化二次抗体は、「末端に抗体を有するＰＥＧと有さないＰＥＧが表面に、それぞれアビジン・ビオチン結合を介して表面に結合された磁気粒子」の集合体であり、本発明の標識付き試薬の実施例に相当する。
得られた分散液から、ノルウェー国Ｄｙｎａｌ社製のＭＰＣ（磁石を用いた磁性粒子収集装置）を用いて、磁気ビーズ標識化二次抗体のみを回収した。回収された磁気ビーズ標識化二次抗体にＰＢＳを１ｍｌ添加して洗浄し、この液体から同じ方法で磁気ビーズ標識化二次抗体のみを回収した。最終的に、この磁気ビーズ標識化二次抗体に、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を入れて、濃度が０．５％の磁気ビーズ標識化二次抗体分散液Ａを得た。
【００３２】
次に、本発明の標識付き試薬の比較例に相当する磁気ビーズ標識化二次抗体、すなわち「末端に抗体を有するＰＥＧのみが、表面にアビジン・ビオチン結合を介して表面に結合された磁気粒子」の集合体が分散されている分散液Ｂを、以下のようにして得た。
前記と同じ磁気ビースを１％含有するＰＢＳ溶液を１００μｌ、エッペンドルフチューブに計量した。このエッペンドルフチューブから、前記と同様に上澄み液を除去した後、このエッペンドルフチューブに、前述の方法で得られた精製ＰＥＧ−ｂｉｏｔｉｎ化抗体液を２４８．８μｌ添加した。さらに、ＰＢＳを入れて全液量を５００μｌとした後、室温で１時間攪拌しながら反応を行った。
【００３３】
得られた分散液から、前記と同じ方法で磁気ビーズ標識化二次抗体のみを回収した。回収された磁気ビーズ標識化二次抗体にＰＢＳを１ｍｌ添加して洗浄し、この液体から同じ方法で磁気ビーズ標識化二次抗体のみを回収した。最終的に、この磁気ビーズ標識化二次抗体に、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を入れて、濃度が０．５％の磁気ビーズ標識化二次抗体分散液Ｂを得た。
【００３４】
〔平板への一次抗体の固定（反応部の形成）〕
先ず、抗インフルエンザＢウイルス抗体（ケミコン社製、Anti Mouse IgG）を０．１Ｍの燐酸ナトリウムｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７）に１０μｇ／ｍｌ濃度になるよう溶解し、この溶液を５０μｌ、ポリスチレン製の平板（１ｃｍ×１ｃｍ×厚さ１ｍｍ）上に滴下した。次に、この平板を室温・湿潤箱に入れて１時間保持することにより、ポリスチレン平板の上に抗体Ｂを固定した。
【００３５】
次に、蒸留水で、この平板の表面（抗体Ｂが固定された側の面）を洗浄した後、牛血清アルブミンを０．１Ｍの燐酸ナトリウムｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７）に溶解させた１％溶液を５０μｌ、ポリスチレン平板上の抗体Ｂ溶液を滴下した位置と同じ位置に滴下した。次に、この平板を室温・湿潤箱に入れて１時間保持した。これにより、ポリスチレン平板上の抗体Ｂ溶液が滴下された位置の抗体Ｂが固定されなかった部分に、牛血清アルブミンを固定した。
次に、蒸留水で平板の表面（抗体Ｂおよび牛血清アルブミンが固定された側の面）を洗浄し、１０分間ドラフト内で風乾した。このようにして、ポリスチレン平板の表面に反応部（抗体Ｂおよび牛血清アルブミンが固定された部分）を形成した。同様にして、反応部が形成された６枚の平板を用意した。
【００３６】
〔反応部への抗原および標識付き試薬の結合〕
６枚の平板のうちの２枚（No. １とNo. ２）には、インフルエンザＢウィルス（Ｂ／門真／５０６／９９、１０7.0ＴＣＩＤ50／ｍｌ）の生理食塩水による５０倍希釈液を、別の２枚（No. ３とNo. ４）には同じウイルスの生理食塩水による５００倍希釈液を、残りの２枚には、生理食塩水を、反応部にそれぞれ２０μｌ滴下して、室温にて１０分間反応させた。
【００３７】
次に、各平板の表面を蒸留水にて洗浄し、ペーパーパッドにて軽く水分をふき取った。これにより、前記希釈液が滴下された４枚の平板については、平板の表面に固定された抗体Ｂ上にインフルエンザＢウィルス（抗原）が捕捉された。なお、生理食塩水が滴下された２枚の平板（No. ５とNo. ６）は陰性サンプルとして用意した。
【００３８】
次に、No. １，３，５の平板の反応部に、前記工程で得られた「磁気ビーズ標識化二次抗体分散液Ａ」をそれぞれ１０μｌ滴下し、室温にて１０分間反応させた。この反応により、インフルエンザＢウィルス（抗原）が捕捉された平板（No. １と３）の反応部では、抗原抗体反応が生じて、抗原の上に本発明の実施例に相当する標識付き試薬（抗体Ｂを末端に有するＰＥＧと、抗体Ｂを末端に有さないＰＥＧが、それぞれアビジン・ビオチン結合を介して表面に結合されている磁気粒子）が結合される。
【００３９】
また、No. ２，４，６の平板の反応部に、前記工程で得られた「磁気ビーズ標識化二次抗体分散液Ｂ」をそれぞれ１０μｌ滴下し、室温にて１０分間反応させた。この反応により、インフルエンザＢウィルス（抗原）が捕捉された平板（No. ２と４）の反応部では、抗原抗体反応が生じて、抗原の上に本発明の比較例に相当する標識付き試薬（抗体Ｂを末端に有するＰＥＧがアビジン・ビオチン結合を介して表面に結合され、抗体Ｂを末端に有さないＰＥＧは結合されていない磁気粒子）が結合される。
【００４０】
〔磁気ビーズの検出〕
前記工程後のNo. １〜６の平板の表面を、反応部に結合された磁気ビーズが剥がれないように蒸留水で洗浄し、風乾した。
次に、各平板の反応部を、斜めからの散乱光の存在下、ＣＣＤカメラで１０倍に拡大して観察し、磁気ビーズが存在しているかどうかを調べた。
その結果、No. １〜６の平板のうち、本発明の実施例に相当する標識付き試薬を用いたNo. １と３の平板では、ＣＣＤカメラにより磁気ビースの存在が確認できたが、本発明の比較例に相当する標識付き試薬を用いたNo. ２，４の平板と、陰性サンプルNo. ５，６では、ＣＣＤカメラにより磁気ビースの存在が確認できなかった。
また、各平板の反応部に存在する磁気ビーズの量を示す出力信号を、図４に示す回転式の磁気検出装置を用いて、回転速度５０ｒｐｍ、電圧増幅倍率１０万倍の条件で検出した。その結果を、図５にグラフで示す。
【００４１】
〔磁気検出装置の説明〕
図５の装置は、磁気センサ８１ａおよび磁場発生装置８１ｂが固定された内側テーブル８１と、試料Ｓの設置台８２ａが固定された外側テーブル８２とが、同心で相対的に回転可能に配置され、磁気センサ８１ａおよび磁場発生装置８１ｂの周囲を試料Ｓが回転することにより、試料Ｓの反応部の状態を磁気センサ８１ａで検出するものである。
内側テーブル８１と外側テーブル８２が回転軸８３を中心に配置され、内側テーブル８１は回転軸８３に固定されている。また、回転機構８４の回転軸８５に固定されたディスク８６が、外側テーブル８３の外周に接触するように配置されている。この回転軸８５の回転により、ディスク８６を介して外側テーブル８３が回転する。
また、磁気センサ８１ａらの検出信号は図示されない信号処理回路に入力される。さらに、この信号処理回路は、回転機構８４や他の装置から必要な信号が入力されて、各種処理がなされて適切な検出がなされるように構成されている。
【００４２】
図５に示すように、本発明の実施例に相当する標識付き試料を用いたNo. １，３，５では、抗原の濃度に応じた信号出力値が得られている。これに対して、本発明の比較例に相当する標識付き試料を用いたNo. ２，４，６では、５０倍希釈と５００倍希釈と陰性サンプルで同程度の信号出力値となっている。
これらの結果から、本発明の実施例に相当する標識付き試料を用いることにより、抗原抗体反応を使用した分析において、標識粒子が有する抗体の反応性が向上し、磁気センサによる測定精度を向上できることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】実施形態の分析装置を示す図であって、本体の縦断面図である。
【図２】図１の本体の組立前の状態を示す斜視図である。
【図３】第１多孔体、第２多孔体、反応部、および吸収体の、箱体内での配置を示す斜視図である。
【図４】実施例で使用した磁気検出装置の概要を示す概略構成図である。
【図５】実施例の試験結果を示すグラフである。
【符号の説明】
【００４４】
１  第１多孔体
１０  第１多孔体を固定する部分
１０Ａ  凹部
２  第２多孔体
２０  第２多孔体を固定する部分
２０Ａ  凹部
２３１  流路形成部材
２３２  溝状の流路
３Ａ，３ｂ  反応部
３０  反応部を形成する部分（反応部形成面）
３０Ａ  凹部
３１  反応部上部の流路
３４１  流路形成部材
３４２  溝状の流路
４  吸収体
４０  吸収体を固定する部分
５０  底板の内面で最も低い面
６  箱体の底板
６７  ピン
７  箱体の蓋部
７１  試料導入口
７２  流路形成部
７６  ピン受け
６Ａ  底板内面の周縁部と同じ高さの面
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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