(57)【要約】【課題】ペプチドアレイを用いる測定系において、生体分子の非特異的な影響を受けることなく、結合シグナルを増幅させることにある。【解決手段】基板上に固定化されたペプチドのリン酸化を検出するためのアレイであって、該ペプチドの固定化されていない側の末端３残基のアミノ酸配列中に２残基以上の例えばリジンのような塩基性アミノ酸を含有しないことを特徴とするリン酸化検出用ペプチドアレイ。該塩基性アミノ酸が、例えばアラニンのような中性アミノ酸に置換されていてもよい。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上に固定化されたペプチドのリン酸化を検出するためのアレイであって、該ペプチドの固定化されていない側の末端３残基のアミノ酸配列中の塩基性アミノ酸は１残基以下であることを特徴とするリン酸化検出用ペプチドアレイ。
【請求項２】
塩基性アミノ酸がリジンであることを特徴とする請求項１に記載のリン酸化検出用ペプチドアレイ。
【請求項３】
ペプチドの固定化されていない側の末端３残基のアミノ酸配列中に２残基以上の中性アミノ酸が含有されることを特徴とする請求項１又は２に記載のリン酸化検出用ペプチドアレイ。
【請求項４】
中性アミノ酸がアラニンであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のリン酸化検出用ペプチドアレイ。
【請求項５】
基板表面が金であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のリン酸化検出用ペプチドアレイ。
【請求項６】
基板がガラスであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のリン酸化検出用ペプチドアレイ。
【請求項７】
ペプチドの固定化される側の末端がシステイン残基であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のリン酸化検出用ペプチドアレイ。
【請求項８】
アレイが表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に用いられることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のリン酸化検出用ペプチドアレイ。
【請求項９】
アレイがオートラジオグラフィに用いられることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のリン酸化検出用ペプチドアレイ。
【請求項１０】
リン酸化されるアミノ酸残基が、固定化されていない側の末端から４残基以上離れていることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載のリン酸化検出用ペプチドアレイ。
【請求項１１】
リン酸化されるアミノ酸がチロシンである請求項１〜１０のいずれかに記載のリン酸化検出用ペプチドアレイ。
【請求項１２】
リン酸化されるアミノ酸の基板側に少なくとも１個のスペーサーアミノ酸を連結してなる請求項１〜１１のいずれかに記載のリン酸化検出用ペプチドアレイ。
【請求項１３】
前記スペーサーアミノ酸がGly-Glyである請求項１２に記載のリン酸化検出用ペプチドアレイ。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載のペプチドアレイにＡＴＰ及びキナーゼを作用させ、リン酸化されたペプチドを検出することを特徴とする、ペプチドのリン酸化検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質相互作用の解析系に用いられるペプチドチップにおいて、非特異的な影響を受けることなく、標的とする物質間の結合シグナルを増大させることの可能なペプチドアレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体分子の相互作用解析、発現分子のプロファイリング、もしくは診断に用いるバイオチップが注目を集めている。基板上に生体分子が固定化されることで操作が容易になり、場合によっては非常に多くの物質の相互作用を解析することができる。特に比較的分子量の小さなペプチドを基板上に固定化したペプチドアレイは、蛋白質のような変性の問題が比較的少なく、またコンビナトリアルケミストリーの側面が強いことから、近年酵素の基質探索や、あるいはインヒビターの探索などに広く用いられるようになってきている。
【０００３】
これら生体分子同士の相互作用を観察する際に問題になるのが非特異的吸着による影響である。非特異的吸着とは、本来であれば相互作用しない分子へ対象物質が非特異的に吸着する場合のことを言う。その結果、擬陽性の判定を与えるため好ましくない。非特異的な吸着を抑制するために、生体高分子が固定化された基板を、デキストラン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧということもある）などの親水性高分子で表面をコートしたバイオチップが開発されている。例えば、カルボキシメチルデキストランのカルボキシル基を水溶性カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化し、形成したスクシンイミド基と生体分子を固定化することに成功している（非特許文献１）。これらの親水性高分子には生体分子の非特異的吸着を抑制する効果があることが知られている。しかしながら、親水性高分子のコーティングによって、生体分子が親水性高分子中に埋没してしまい、生体高分子同士の相互作用が阻害されるという問題を生じる場合がある。
【０００４】
この生体高分子同士の相互作用の阻害は、測定シグナル低下の原因となる。この相互作用の阻害は、親水性高分子のコーティングに起因するだけでなく、生体高分子を基板に直接的に結合することによって生じることも少なくない。これは、生体高分子を基板に直接的に結合すると、生体高分子の自由度が抑制されるためである。バイオチップの測定シグナル向上のためには、生体高分子同士の相互作用を容易せしめる必要がある。
【０００５】
生体分子同士の相互作用をより容易に行わせるために、基板にスペーサーを介して生体分子を固定化する検討がなされている。しかしながら、特に高分子量のスペーサーを介して生体分子を固定化すると、固定化反応効率の低下や測定系への阻害などの悪影響が生じる可能性が高くなることもあり、必ずしも好ましくない。
【０００６】
特にペプチドを基板上に固定化するに際しては、高分子量のリンカーを介した固定化反応では、その収率が非常に低下し、測定シグナルの低下や非特異的なシグナルの増大を起こすことが頻繁に見られる。しかしながら、リンカーを介さない、もしくは低分子量のリンカーを介する固定化では、スペーサー効果が十分に機能しにくいため、固定化ペプチドの自由度が小さくなり、優れた測定結果が得られなくなる確率が高まるという問題がある。
【非特許文献１】Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８，２６８，１９９１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、生体分子の非特異的吸着を抑制しながらも、なおかつ標的物質における結合シグナルを増大することのできるペプチドアレイに関する技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示すような手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。
【０００９】
１．  基板上に固定化されたペプチドのリン酸化を検出するためのアレイであって、該ペプチドの固定化されていない側の末端３残基のアミノ酸配列中の塩基性アミノ酸は１残基以下であることを特徴とするリン酸化検出用ペプチドアレイ。
【００１０】
２．  塩基性アミノ酸がリジンであることを特徴とする項１に記載のリン酸化検出用ペプチドアレイ。
【００１１】
３．  ペプチドの固定化されていない側の末端３残基のアミノ酸配列中に２残基以上の中性アミノ酸が含有されることを特徴とする項１又は２に記載のリン酸化検出用ペプチドアレイ。
【００１２】
４．  中性アミノ酸がアラニンであることを特徴とする項１〜３のいずれかに記載のリン酸化検出用ペプチドアレイ。
【００１３】
５．  基板表面が金であることを特徴とする項１〜４のいずれかに記載のリン酸化検出用ペプチドアレイ。
【００１４】
６．  基板がガラスであることを特徴とする項１〜５のいずれかに記載のリン酸化検出用ペプチドアレイ。
【００１５】
７．  ペプチドの固定化される側の末端がシステイン残基であることを特徴とする項１〜６のいずれかに記載のリン酸化検出用ペプチドアレイ。
【００１６】
８．  アレイが表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に用いられることを特徴とする項１〜７のいずれかに記載のリン酸化検出用ペプチドアレイ。
【００１７】
９．    アレイがオートラジオグラフィに用いられることを特徴とする項１〜８のいずれかに記載のリン酸化検出用ペプチドアレイ。
【００１８】
１０．  リン酸化されるアミノ酸残基が、固定化されていない側の末端から４残基以上離れていることを特徴とする項１〜９のいずれかに記載のリン酸化検出用ペプチドアレイ。
【００１９】
１１．  リン酸化されるアミノ酸がチロシンである項１〜１０のいずれかに記載のリン酸化検出用ペプチドアレイ。
【００２０】
１２．  リン酸化されるアミノ酸の基板側に少なくとも１個のスペーサーアミノ酸を連結してなる項１〜１１のいずれかに記載のリン酸化検出用ペプチドアレイ。
【００２１】
１３．  前記スペーサーアミノ酸がGly-Glyである項１２に記載のリン酸化検出用ペプチドアレイ。
【００２２】
１４．  項１〜１３のいずれかに記載のペプチドアレイにＡＴＰ及びキナーゼを作用させ、リン酸化されたペプチドを検出することを特徴とする、ペプチドのリン酸化検出方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明におけるリン酸化検出用ペプチドアレイは、固定化されていない側の末端３残基のアミノ酸配列中の塩基性アミノ酸は１残基以下であるペプチドを用いることで、Ｏｎ−ｃｈｉｐでのリン酸化効率が増し測定シグナルを向上させ、更に非特異的吸着が抑制された精度のよいペプチドチップを用いた測定系を得ることができる。
【００２４】
キナーゼによるリン酸化を測定するために、基質ペプチドのC末端にLys（K）を３個連結することで遊離ペプチド基質では、高効率でキナーゼによるリン酸化が生じることが知られているが、on-chipではキナーゼの効率が低下し、この固定化されていない末端のLys（K）ような塩基性アミノ酸の数を１個以下にするとｏｎ−ｃｈｉｐでのリン酸化の効率が飛躍的に向上することが本発明により明らかになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明におけるペプチドの基板上への固定化方法は特に限定されるものではないが、例えばチオール基を介してペプチドを固定化する方法が挙げられる。固定化されるペプチドに関しては、１種類のみであってもよいし、２種類以上であってもよい。ここで用いられるペプチドは一般的に用いられる意味のものを指し、アミノ酸が４個以上ペプチド結合により連結されたものであって、酵素の基質として機能しうる性質を有するものをいう。その基質配列部位のアミノ酸残基の数は特に限定されないが、通常は５〜６０残基程度であり、１０〜２５残基程度がより好ましい。分析する目的に応じて、アミノ酸残基のうち１乃至数残基において化学的な修飾を加えられたアミノ酸が含まれていてもよい。また特に限定されるものではないが、特定の酵素に対して基質としての機能を有しているペプチドを少なくとも１種は含むことが好ましい。
【００２６】
ここで、基板に固定化される部位とは、具体的には例えば固定化されるペプチドのアミノ酸配列において少なくとも１箇所以上のシステイン残基が存在する状態のものをいう。システイン残基は固定化されるペプチドが本来の機能を奏するために必要なアミノ酸配列として必須な残基として存在している場合であっても、あるいはペプチドが本来の機能を奏するために必要なアミノ酸配列に対してさらに付加された場合であってもよい。固定化されるペプチドにおけるシステイン残基の存在位置は特に限定されないが、好ましくは少なくとも一方の末端に、より好ましくは一方の末端のみに付加されてなる方がよい。また、別な態様として、固定化されるペプチドに対して、チオール基を有する化合物が１箇所以上のいずれかのアミノ酸残基において化学結合されている状態のものも挙げられる。この場合に該化合物の結合箇所も特に限定はされないが、いずれかの末端のアミノ酸残基に結合されていることが好ましい。システインは、側鎖のチオール基を介して基板に直接又は適当なスペーサーを介して結合する。
【００２７】
本発明のペプチドアレイにおいて用いられるペプチドは、ペプチドの固定化されていない側の末端３残基のアミノ酸配列中の塩基性アミノ酸は１残基以下であることを特徴とする。ここで、塩基性アミノ酸とは、リジン、アルギニン、ヒスチジンなどが挙げられる。蛋白質構成アミノ酸でないものとしては、ヒドロキシリジン、オルニチンなども例示される。特にはリジンが挙げられる。
【００２８】
より好ましくは、ペプチドの固定化されていない側の末端３残基のアミノ酸配列中に２残基以上の中性アミノ酸が含有されている。ここで、中性アミノ酸とは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン、グルタミン、メチオニン、プロリンなどが挙げられる。特にはアラニンであることが好ましい。
【００２９】
固定化されていない側の末端アミノ酸は、LysまたはAlaが特に好ましい。
【００３０】
固定化されていない側の末端にリジンのような塩基性アミノ酸がリッチな配列の基質ペプチドを用いると、その極性荷電の影響から、プロテインキナーゼを作用させた場合に、プロテインキナーゼが反発されやすくなり基質ペプチドに接近しにくくなるものと考えられる。特にアレイのように固定化されたペプチドにおいては、基質の自由度が低くなることから、その傾向がより顕著になり、その結果リン酸化を受けにくくなってしまうものと推定される。したがって、リン酸化検出用アレイに用いる基質を設計するに際して、溶液中のように遊離状態でリン酸化されやすいことが既知であるアミノ酸配列を用いる場合に、一方の末端付近に塩基性アミノ酸がリッチな場合、特に３残基以上存在する場合には、該塩基性アミノ酸を２残基以上削除して１残基以下にするか、もしくはアラニンのような中性アミノ酸に置換するという技術的手法を用いて最適化することが可能である。
【００３１】
プロテインキナーゼとしては、cSrc、MAPK、PKA、PKC、EGFR、Insulin Receptor, Akt、CaMK等が挙げられるが、特に限定されるものではなく、あらゆる蛋白質のリン酸化に関与するプロテインキナーゼが対象となり得る。
ｃＳｒｃキナーゼの基質となるペプチドの配列がＩＹＧＥＦである場合、基板に必要に応じて適当なスペーサーを介して連結される本発明の特に好ましいペプチドとしては、Ｃ−（スペーサーペプチド）−ＩＹＧＥＦ−（Ａ又はＫ）が挙げられる。
【００３２】
他のプロテインキナーゼの基質ペプチドの場合にも、同様の規則により、基板に結合するのに特に好ましいペプチド配列は、当業者により容易に決定される。  
【００３３】
本発明においては、上記基板に固定化される部位と基質配列部位との間にスペーサーとして親水性化合物もしくは数残基からなるアミノ酸配列が挿入されていることがより好ましい。親水性化合物の場合に、その分子量は特に限定されないが、１００〜１０００が好ましく、４００〜１０００がより好ましい。また、上記親水性化合物とともに、アミノ酸残基数が１〜１０個、より好ましくは２〜６個からなるスペーサー配列を更に付加させてもよい。スペーサー配列を構成するアミノ酸残基の種類は特に限定されるものではないが、高次構造の形成を起こしにくいアミノ酸を含むことが好ましい。具体的には、少なくとも１つはグリシン残基を含むことが好ましい。より好ましくは、１残基のグリシン（Ｇ）、２残基のグリシン（ＧＧ）、グリシンとアラニン（ＧＡもしくはＡＧ）、あるいはグリシンとセリン（ＧＳもしくはＳＧ）残基の繰り返しを１回以上、更に好ましくは２回以上含んでなる。
【００３４】
ここで、親水性化合物とは水に可溶もしくは水に膨潤する性質をもつ、繰り返し単位をもつ化合物のことを言い、合成物であっても天然物であってもよい。具体的に例示すると、親水性高分子としては、例えば、ＰＥＧ、ポリビニルアルコール、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）アクリル酸塩、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリエチレンイミン、ポリビニルピロリドン、カルボン酸もしくはその塩やスルホン酸もしくはその塩を含有するモノマーまたはポリエチレングリコール等の親水性部分を共重合させたポリエステルやポリウレタン、カルボキシメチルセルロース、さらにはキトサン、カラギーナン、グルコマンナンなどの多糖類が挙げられる。なかでも、ＰＥＧが特に好ましい。こうしたスペーサーを付加させることにより、固定化された基質ペプチドの自由度を向上させることができ、それにより酵素により受ける作用の効率を高めることが可能となる。
【００３５】
上記親水性化合物をペプチドに挿入する方法は特に限定されるものではなく、種々の化学合成に基づく手法が適用されうるものであるが、合成効率面から考えると、ペプチド合成に際した一連の流れの中に親水性化合物の結合反応を組み込むのが好ましい。ペプチド合成においては、一般的にＦｍｏｃ基やｔＢｏｃ基のような保護基の結合されたアミノ酸が用いられるが、こうした保護基により修飾された親水性化合物をアミノ酸と同様に用いるのが好ましい。具体的には、式（Ｉ）に示されるようなＦｍｏｃ基で修飾されたＰＥＧ、式（ＩＩ）に示されるようなＮ−ＣＢＺで修飾されたＰＥＧ、式（ＩＩＩ）に示されるようなｔＢｏｃ基で修飾されたＰＥＧなどが例示される。式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）においてｎの値は２〜２５程度が好ましく、４〜１５程度がより好ましい。
【００３６】
【化１】
2007107946.tif 000003
【００３７】
【化２】
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【００３８】
【化３】
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【００３９】
上述したようなチオール基を介してペプチドを固定化するに際しては、予め基板表面にアミノ基を導入させて、スクシンイミド（ＮＨＳ）基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するヘテロ二官能型架橋剤を用いてマレイミド表面を形成させて反応させる方法が推奨される。チップ上にアミノ基を導入する手段は特に限定されるものではない。基板表面に分子を整列させる自己組織化表面の手法、反応試薬を用いて導入する方法、官能基を有する物質をチップ上にコーティングする手段などが挙げられる。また、表面に導入しておいた官能基を起点として、架橋剤を用いてアミノ基を導入する手段なども含まれる。こうしたヘテロ二官能型架橋剤としては、種々市販されているものもあり、特に限定されるものではないが、例えばＳｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（以下、ＳＭＣＣと示す。）もしくはＳｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（以下、ＳＳＭＣＣと示す。）などを挙げることができる。またこれらの化合物と完全に同一構造のものでなくても、その機能を損なわない範囲でアナログ化された化合物も適用することが可能である。ＳＭＣＣ及びＳＳＭＣＣのいずれも適用することが可能であるが、水に対する溶解性の点からは、緩衝液のような水系で反応させる場合においてはＳＳＭＣＣを用いる方がより好ましい。また、その他にも、ＰＥＧのような高分子の末端にスクシンイミド（ＮＨＳ）基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するものも用いることができる。
【００４０】
本発明におけるペプチドチップの固定化方法はさまざまな用途に応用可能である。一般にアレイにおける検出手段としてよく用いられている蛍光性物質、化学発光性物質、放射性物質等による検出系においても有効であるが、特に表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）や和周波発生（ＳＦＧ）、局在プラズモン共鳴（ＬＰＲ）、エリプソメトリなどの光学的検出方法に絶大な効果を発揮する。なかでも、ＳＰＲによる解析系において特に有用である。一般的なチップ、アレイにおいては、相互作用の検出方法として蛍光物質や放射線同位体によるラベル手段による検出が用いられる。この場合、最終的にラベル物質が結合したかどうかだけを検出することができ、相互作用に関係のない物質が非特異的に吸着しても、誤って検出されることはない。従って、相互作用する対象物質がネガティブコントロールに対して非特異的に吸着してなければ、正確に測定できているものと判断することができる。
【００４１】
しかし、ラベルフリーな光学的検出方法においては、どのような物質がチップ上に吸着してもシグナルとして検出される。すなわち、測定対象ではない物質が非特異的に吸着するのと、特異的な吸着を区別することが難しい。よって、よりシビアに非特異的な吸着を抑制する手段が求められるため、本発明の固定化方法は非常に効果的である。
【００４２】
ＥＬＩＳＡ法やラベル物質を用いる相互作用解析方法においてはブロッキング方法として牛血清アルブミンやカゼインなどによる物理吸着が一般的に選択されている。物理吸着の方法は容易ではあるが、安定しておらず、経時的にチップ表面から脱離する場合がある。上記の光学的検出方法にはブロッキング剤の脱離さえも検出するため、共有結合によるブロッキングを行うことが好ましい。特に未反応のマレイミド基表面をブロッキングする場合は、チオール基を有する化合物を用いるのが好ましく、特にＰＥＧの誘導体が好適に用いられる。
【００４３】
ＳＰＲ、ＳＦＧ、ＬＰＲ、エリプソメトリにおいては、金属基板が使用される。本発明において、基板の素材は、酸・アルカリ・有機溶媒などに非常に安定な金が好ましい。実際、金は上記光学的検出方法で多用される物質である。また、金を支持する物質は透明である方が好ましく、透明なガラスであるとより好ましい。透明なガラスは容易に入手できるだけでなく、ＳＰＲやＬＰＲの測定に極めて適しているからである。
【００４４】
金属基板を形成する方法としては、金属薄層をコーティングする方法が好ましい。金属をコーティングする方法は特に限定されるものではないが、一般的に蒸着法、スパッタリング法、イオンコーティング法などが選択される。光学的な検出方法に供するために、金属薄層の厚みをナノレベルでコントロールする必要がある。金属薄層の厚みも特に限定されるものではないが、一般的には３０ｎｍから８０ｎｍの範囲で選択される。金属薄層の剥離を抑制するため、０．５ｎｍから１０ｎｍのクロム層やチタン層を予め基板にコーティングしておいてもよい。
【００４５】
このＳＰＲを応用したＳＰＲイメージング法は、広範囲に偏光光束を照射し、その反射像を解析することで、物質間の相互作用の様子を、画像処理技術等を駆使することによりモニター化する方法であり、複数の物質を固定化したチップをスクリーニングすることや、表面に吸着する物体のモルホロジーを高感度に観察することが可能である。
【００４６】
ＳＰＲイメージング法においては、反射像を解析するためにチップに広範囲で偏光光束を照射し、かつ光束の照度を十分に確保するための手段が必要である。図１においてその一例を示した。偏光光束の照度は明るいほどセンサーの感度が上昇してより好ましい。
【００４７】
光源の種類は特に限定されるものではないが、ＳＰＲ共鳴角の変化が特に敏感になる近赤外光を含む光を用いるのが好ましい。具体的には、メタルハライドランプ、水銀ランプ、キセノンランプ、ハロゲンランプ、蛍光灯、白熱灯などの広範囲に光を照射することのできる白色光源を用いることができるが、なかでも得られる光の強度が十分に高く、光の電源装置が簡易で安価なハロゲンランプが特に好ましい。
【００４８】
通常の白色光源はフィラメント部に光の明暗ムラが生じる欠点がある。光源の光をそのまま照射すると、反射して得られる像に明暗ムラが生じ、スクリーニングやモルホロジー変化を評価するのが困難となる。したがって、チップに均一に光を照射する手段として、光をピンホールに通してから平行光にする方法が好ましい。ピンホールを通す手段は、明るさの均一な光束を得る手段としては好ましいが、そのままピンホールに光を通すと照度が低下する欠点がある。そこで、十分な照度を確保する手段として、ピンホールと光源の間に凸レンズを設置し、集光してピンホールを通す方法を用いることが好ましい。
【００４９】
白色光源は放射光であるため、集光する前に凸レンズを用いて平行光にする必要がある。凸レンズの焦点距離近傍に光源を設置することで、平行光を得ることができる。もう一枚凸レンズを設置し、そのレンズの焦点距離近傍にピンホールを設置することで集光した光をピンホールに通すことが可能である。ピンホール内で交差し、通過した光はカメラ用のＣＣＴＶレンズで平行光とするが、その際に得られる平行光束の断面面積は１０〜１０００ｍｍ２に調節するのが好ましい。この方法によって広範囲にわたるスクリーニングやモルホロジー観察が可能となる。
【００５０】
相互作用をモニターする際に、上記偏光光束は物質あるいは物質の集合体が固定化されている金属薄膜の反対面に照射される。上記偏光光束は物質もしくは物質の集合体が固定化されている金属薄膜の反対面に照射され、その反射光束が得られる。金属薄膜からの反射光束は近赤外波長の光干渉フィルターを通し、ある波長付近の光のみを透過させてからＣＣＤカメラで撮影される。
【００５１】
光干渉フィルターの中心波長は、ＳＰＲの感度が高い６００〜１０００ｎｍが好ましい。光干渉フィルターの透過率が極大時の半分になる波長の波長幅を半値巾と呼ぶが、半値巾は小さい方が波長の分布がシャープとなり好ましく、具体的には半値巾１００ｎｍ以下が好ましい。光干渉フィルターを通してＣＣＤカメラで撮影された像はコンピュータに取り込まれ、ある部分の明るさの変化をリアルタイムで評価することや、画像処理により全体像の評価が可能である。こうして複数の物質を固定化したチップをスクリーニングすることや、表面に吸着する物体のモルホロジーを高感度に観察することができる。
【００５２】
本発明において用いるＳＰＲ用のチップは好ましくは透明な基板上に金属薄膜が形成された金属基板からなり、上記金属薄膜上に直接的もしくは間接的に、化学的もしくは物理的に、物質もしくは物質の集合体が固定化されているスライドが用いられる。基板の素材は特に限定されるものではないが、透明なものを用いるのが好ましい。具体的にはガラス、あるいはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、アクリルなどのプラスチック類が挙げられる。中でもガラスが特に好ましい。
【００５３】
基板の厚さは０．１〜２０ｍｍ程度が好ましく１〜２ｍｍ程度がより好ましい。金属薄膜からの反射像を評価する目的を達成するために、ＳＰＲ共鳴角はできるだけ小さい方が撮影される画像がひしゃげる恐れがなく解析がしやすい。したがって、透明基板あるいは透明基板とそれに接触するプリズムの屈折率ｎＤは１．５以上であることが好ましい。
【００５４】
また、本発明のリン酸化検出用アレイは、ラジオアイソトープ（ＲＩ）を用いたオートラジオグラフィにも非常に有用である。この方法は、直接的にＲＩの取り込みをモニターすることにより、基質ペプチドのリン酸化を高感度にモニターできるという優位性がある。ＲＩとしては、例えばγ３２Ｐ−ＡＴＰもしくはγ３３Ｐ−ＡＴＰが好適に用いられる。
【実施例】
【００５５】
以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例に特に限定されるものではない。
［実施例１］
図２に示したようなスキームに基づき、ペプチドアレイの調製を行った。
（ペプチド固定化）
末端官能基がチオール基であるＰＥＧ３−ＯＨアルカンチオール（ＳｅｎｓｏＰａｔｈ製；以下、ＰＥＧチオールという。）を１ｍＭの濃度で７ｍｌのエタノール：水＝６：１の混合溶液に溶解させた。末端のチオール基は、特に金に対する金属結合性を示す。１８ｍｍ四方、２ｍｍ厚のＳＦ１５ガラススライドにクロムを３ｎｍ蒸着し、金を４５ｎｍ蒸着した金蒸着スライドを、上記ＰＥＧチオール溶液に３時間浸漬させ、金基板全体にＰＥＧチオールを結合させた。
【００５６】
このスライドの上にフォトマスクを載せ、５００Ｗ超高圧水銀ランプ（ウシオ電機製）で２時間照射し、ＵＶ照射部の４ａｒｍＰＥＧチオールを除去した。フォトマスクは５００μｍ四方の正方形の穴が９６個有し（８個×１２個のパターンからなる。）、穴の中心間のピッチは１ｍｍに設計されている。フォトマスクの穴があいている部分はＵＶ光が透過し、スライドに照射されてパターン化される。照射されなかった部分はＰＥＧが残り、チップのバックグラウンド（Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）部分としてレファレンス部として機能する。
【００５７】
８−Ａｍｉｎｏ−１−Ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ， Ｈｙｄｒｏｃｈｒｏｌｉｄｅ（８−ＡＯＴ，同仁化学研究所製）の１ｍＭエタノール溶液に１時間浸漬し、ＵＶ照射部に８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させた。ＳＳＭＣＣ（ピアス製）をリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に０．４ｍｇ／ｍｌで溶解し、金表面の８−ＡＯＴに室温で１５分間反応させた。８−ＡＯＴのアミノ基とＳＳＭＣＣのＮＨＳ基が反応して、ＭＡＬ基は未反応のまま残り表面に導入することができた。
【００５８】
上記のようにして得られた表面に、配列表に示したようなアミノ酸配列からなる１２種のペプチドを固定化した。各ペプチドの固定化パターンは図３に示した通りである。いずれのペプチドにおいても、そのＣ末端にシステイン残基を付加している。システイン残基と基質配列の間には、スペーサーとしてはグリシン１又は２残基を挿入している。いずれのペプチドにおいてもリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に１ｍｇ／ｍｌで溶解して、ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒスポッター（東洋紡績製）を用いて１０ｎｌずつスポッティングを行った。その後、ウェットな環境下で室温、１６時間静置させて固定化反応を行った。チップの表面に形成させたマレイミド基と基質ペプチド末端のシステイン残基が有するチオール基とが反応し、基質ペプチドを共有結合的に表面に固定化することができるものである。
（未反応マレイミド基のブロッキング）
基質ペプチドを固定化した表面をリン酸緩衝液で洗浄した後、未反応のマレイミド基をブロッキングするために、上記ＴＥＧ−ＳＨを１ｍＭ濃度になるようにリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に溶解して、２５０μｌをチップ上に注出し、室温で１時間反応させた。また比較例として、片末端の官能基がチオール基、もう一方の官能基がメトキシ基であるＰＥＧチオール（日本油脂製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＳＨ−５０Ｈ）を１ｍＭ濃度になるようにリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に溶解して、２５０μｌをチップ上に注出し、室温で３０分間反応させた。ここで用いたＰＥＧチオールの分子量は５，０００である。
［実施例２］
（オートラジオグラフィによるｃＳｒｃリン酸化の検出）
実施例１においてブロッキング処理までを行ったアレイを用いて、ｃＳｒｃキナーゼによるリン酸化を行った。ｃＳｒｃキナーゼ溶液３００μｌをアレイ上にドロップして、３０℃で１５分もしくは５時間の反応を行った。ｃＳｒｃ溶液の組成は、ｃＳｒｃキナーゼ（Ｕｐｓｔａｔｅ製；５Ｕ／μｌ）６μｌ、５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．８）２７８μｌ、１Ｍ塩化マグネシウム溶液１５μｌ、１０ｍＭ  γ３２Ｐ−ＡＴＰ（アマシャムバイオサイエンス製）１μｌとした。その後、ＰＢＳ及び水で３回ずつアレイの洗浄を行い、アレイ表面を乾燥した後、オートラジオグラフィによる各固定化基質におけるＲＩの取り込みの読み取りを、ＢＡＳ−１８００II（富士写真フイルム製）を用いて行った。露光は装置専用のシート（富士写真フイルム製ＳＧイメージングプレート）を用いて３０分間行った。結果を図４に示した。
【００５９】
図４より明らかなように、Ｎｏ．３，９，１０，１１，１２に関して非常に強いＲＩの取り込みが認められた。図５にはＲＩ取り込み量を定量化した結果を示した。図中、横軸は基質の固定化されていない側の末端部分のアミノ酸配列を示している。末端部分のリジン残基の数によりリン酸化の受けやすさが大きく変化している。末端にリジン残基が２つ以上存在する場合と比較して、１つもしくはゼロの場合にはｄｒａｓｔｉｃに強くリン酸化を受けている。リジン残基が２つ以上アラニン残基に置換されている場合も強いリン酸化が確認されている。
［実施例３］
（ＳＰＲイメージングによるｃＳｒｃリン酸化の検出）
実施例１においてブロッキング処理までを行ったアレイを用いて、ｃＳｒｃキナーゼによるリン酸化を行った。ｃＳｒｃ溶液の組成は、ｃＳｒｃキナーゼ（Ｕｐｓｔａｔｅ製；５Ｕ／μｌ）６μｌ、５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．８）２７６μｌ、１Ｍ塩化マグネシウム溶液１５μｌ、１０ｍＭ  ＡＴＰ３μｌとした。その後、ＰＢＳ及び水で３回ずつアレイの洗浄を行い、アレイ表面を乾燥した後、ＳＰＲイメージング機器（ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ：東洋紡績製）にセットし、ランニングバッファーとして５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を１００μｌ／ｍｉｎの速度でフローセル内に流した。ＳＰＲからのシグナルが安定したのを確認した後に、リン酸化チロシン抗体ＰＴ−６６（シグマ製）をＳＰＲ装置内のセルへ注入して作用させた。抗体は上記のランニングバッファーで２０００倍希釈した溶液を用いて作用させた。シグナル上昇がプラトー状態になった時点で再度ランニングバッファーを送液して洗浄を行った。その際のＳＰＲシグナルの変化を観察した。シグナル変化の観察は、各基質のスポット部位に加え、Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄにおいても実施した。
【００６０】
上記測定終了後、ＳＰＲイメージングによる解析も検討した。上記ＳＰＲ解析に際して、ＣＣＤカメラによりアレイ表面を撮像した画像の取り込みを２秒ごとに行い、抗体反応後における時点で取り込まれた画像から、反応前の時点での画像を画像演算処理ソフトウエアＳｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ  Ｃｏｒｐ．製）を用いて引き算処理を行うことにより、アレイ全体においての抗体が結合している様子を示すことができる。結果を図６に示した。
【００６１】
この場合もオートラジオグラフィと同様に、Ｎｏ．３，９，１０，１１，１２に関して比較的強いリン酸化が確認された。図７には、定量的な対比のため、ＳＰＲシグナル上昇の比較を行った結果を示した。傾向としては、オートラジオグラフィとＳＰＲイメージングとでよく一致していたが、その効果はオートラジオグラフィの場合と比較すると、あまりｄｒａｓｔｉｃなものではない。しかしながら、ＳＰＲイメージングにおいても、末端のリジン残基の改変により一定の作用効果を確認することができた。固定化される部位から離れた箇所、特に末端にリジンのような塩基性アミノ酸がリッチであると、その極性荷電の影響によりキナーゼの接近が反発されやすくなり、その結果リン酸化を受けにくくなるものと推測される。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明の方法により、ペプチドチップにおける結合シグナルを著しく増幅させることができつつ、非特異的吸着に関しても抑制することができ、より正確で高感度な測定が可能となる。非常に容易な改良系であり、今後産業界に大きく寄与することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】ＳＰＲイメージングの原理を示す図である。
【図２】実施例１におけるアレイ作製のスキームを示す図である。
【図３】実施例１において作製したアレイにおける基質ペプチドの固定化のパターンを示す図である。
【図４】実施例２において、オートラジオグラフィを行った結果を示す図である。
【図５】図４における各基質ペプチドに関する、ＲＩ取り込み量を定量化して比較を行った結果を示す図である。
【図６】実施例３において、ＳＰＲイメージングを行った結果を示す図である。
【図７】図５おける各基質ペプチドに関する、リン酸化によるＳＰＲシグナル上昇の比較を行った結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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