(57)【要約】【課題】  生物学的試料中のレトロウイルスの存在を検出する。【解決手段】  ａ）生物学的試料中に逆転写酵素が存在する場合、ＲＮＡ鋳型及びＤＮＡプライマーがアニーリングし、ＤＮＡ鎖がＤＮＡプライマーからの伸長部分として合成される条件下で、生物学的試料をＲＮＡ鋳型及び相補的ＤＮＡプライマーと接触させる工程、およびｂ）合成されたＤＮＡを増幅する工程、並びにｃ）生物学的試料中の逆転写酵素の存在を示し、従って、生物学的試料中のレトロウイルスの存在を示す、合成されたＤＮＡの増幅を検出する工程を行うことにより、生物学的試料中のレトロウイルスの存在を検出する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）生物学的試料中に逆転写酵素が存在する場合、ＲＮＡ鋳型及びＤＮＡプライマーがアニーリングし、ＤＮＡ鎖がＤＮＡプライマーからの伸長部分として合成される条件下で、生物学的試料を、ＲＮＡ鋳型及び相補的ＤＮＡプライマーと接触させる工程、
ｂ）合成されたＤＮＡ及びプライマー対を、９３〜９６℃で３０秒〜１分間、５３〜５６℃で３０秒〜１分間、及び７０〜７４℃で３０秒〜５分間加熱するサイクルを３０〜４０サイクル行うことを含む増幅条件でのポリメラーゼ連鎖反応法によって、合成されたＤＮＡを増幅する工程、並びに
ｃ）生物学的試料中の逆転写酵素の存在を示し、従って、生物学的試料中のレトロウイルスの存在を示す、合成されたＤＮＡの増幅を検出する工程、
を含む、生物学的試料中のレトロウイルスの存在を検出する方法。
【請求項２】
前記ＲＮＡ鋳型が脳心筋炎ウイルスゲノムの領域である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＮＡ鋳型が配列番号４のリボヌクレオチドである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記のＤＮＡの増幅条件が、合成されたＤＮＡ及びプライマー対を、約９５℃で１分間、約５５℃で１分間、及び約７２℃で１分間加熱するサイクルを約３５サイクル行うことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記プライマー対が、実質的に配列番号１からなるオリゴヌクレオチド及び実質的に配列番号２からなるオリゴヌクレオチドからなる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記の合成されたＤＮＡの増幅が、サザンブロットハイブリダイゼーションアッセイによって検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記の合成されたＤＮＡが、実質的に配列番号３のオリゴヌクレオチドからなるプローブを用いたサザンブロットハイブリダイゼーションアッセイにおいて検出される、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、逆転写酵素の存在を検出することによって、生物学的試料(biological sample)中のレトロウイルスの存在を検出する方法を提供する。この方法は、逆転写酵素が存在する場合、ＤＮＡ鎖が合成され、その後ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される条件において、鋳型とプライマーを利用するものである。
【背景技術】
【０００２】
レトロウイルスは脊椎動物の間に広く分布し、ヒトや動物に対し、免疫欠損症、白血病及びリンパ種などの様々な疾病を引き起こすことが知られている（１）。レトロウイルス科全体としての特徴は、特有の酵素である逆転写酵素（ＲＴ）が存在することであり、この酵素はウイルスのゲノムＲＮＡを二重鎖のＤＮＡコピーに転写する（１）。この特徴から、主として二つの用途について、ＲＴに特有な酵素的機能の研究が行われてきた。第一に、ＲＴが存在することは、レトロウイルス感染の診断、及び、細胞培養及び感染した宿主中のレトロウイルスの存在の包括的な検出の根拠となる。第二に、ＲＴ酵素は抗ウイルス薬インターベンションの一次標的となる（１，２）。
【０００３】
いくつかのレトロウイルス由来のＲＴについては、そのポリメラーゼの機能の特徴が詳細に検討されており、ＲＮＡ鋳型、プライマー、トリホスフェート、二価のカチオン及び生理的塩類を必要とすることが示されている（１）。従って、ＲＴ活性のアッセイでは、従来、これらの試薬類及び諸条件が用いられ、放射性物質で標識したヌクレオチド（例：3Ｈ−または32Ｐ−ｄＴＴＰ）を用いて相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーを合成することによって試料が既知の外来のＲＮＡ鋳型（例：ポリｒＡ）からＤＮＡコピーを生成する能力を測定していた。ＲＴが合成したＤＮＡは標識したヌクレオチドの取り込みを測定することによって検出するが（３，４）、最近では、下記に詳述するように、複数の形態が開発されている酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）において非放射活性のヌクレオチドを用いたアッセイ（５〜８）によって、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（１７）によって検出する。
【０００４】
ＲＴアッセイは、依然、既知及び新規のレトロウイルスの同定に必須の実験道具であるが（４〜１１）、ＲＴアッセイによって好結果が得られるのは培養上清中のレトロウイルス粒子の検出に限られており（４〜８）、ウイルス検出の前に培養する必要があるという欠点がある。この方法では、ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）等のレンチウイルス(lentivirus)は容易に検出されると思われるが、ヒトＴリンパ球ウイルスＩ及びII型（ＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−II）等のオンコウイルスは検出がはるかに困難である。これはおそらくＲＴ活性が低いことと、典型的には細胞と結合していて、培養上清中でＲＴを検出する可能性が低いためであろう（６〜８）。この制約があることから、ＲＴ試験はＨＴＬＶ感染の検出にはほとんど価値がなかった。
【０００５】
ＲＴアッセイの感度を改善するために多くの検討がなされているが、臨床試料（例：血清）中のレトロウイルスは直接検出されていない（４〜１２）。例えば、ＨＩＶ−１感染者の研究では、ＲＴアッセイによって血漿中のウイルスを検出することは、この方法の感度が低いために、ほとんど諦められていた（１２）。
【０００６】
血清中のＲＴ活性が検出できないことから、このウイルス学的マーカーを、疾病の診断、患者の薬効のモニタリング、ウイルス負荷のモニタリング、及び疾病の進行の予測のために用いることができない。現在の血漿ＨＩＶ−１の定性的及び定量的検出方法には、ウイルスの単離とｐ２４抗原の捕捉が含まれる（１３〜１５）。しかしながら、これらのア
ッセイには欠点がある。血漿からウイルスを単離するにはウイルスを培養することが必要であって、ウイルスの培養は、典型的には１４〜２８日間継続し、労働集約的であり、多くの時間が必要であり、生物学的変異を伴い、ＣＤ４＋のＴリンパ球数が２００／ｍｍ3未満の患者でＨＩＶ−１が低値の感染集団においては普遍的なマーカーではない。同様にｐ２４抗原は、遊離体、ウイルス粒子との結合体、または免疫複合体のいずれも、ＨＩＶ−１感染集団において常に存在するものではない。
【０００７】
ＲＴ−ＰＣＲによって、外来のＲＴ、及び、血漿中のウイルスのＲＮＡ配列を増幅する、配列が判っているプライマー対(primer pair)を使用して、血漿中で細胞から遊離したウイルスが定性的に検出される（１５，１６）。ＲＴ−ＰＣＲは高感度であることが報告されているが、このアッセイでは、ＲＮＡの抽出、及び、ＰＣＲが汚染される危険性を増す多くの試料操作が必要である。ＲＴ−ＰＣＲアッセイは、標準化された普遍的な定量試験が無いこと、及び、ゲノムＲＮＡの分解に関してプロセッシング及び貯蔵の間に変化する可能性があることからも、複雑であろう。ＲＴ−ＰＣＲは抗原の捕捉と同様に特異性が高いが、標的のレトロウイルス断片のヌクレオチド配列の情報が、プライマーの開発に必要である。この制約のために、ＲＴ−ＰＣＲは、変異型、新規または未知のレトロウイルスの検出には適しない。
【０００８】
最近、鋳型としてバクテリオファージＭＳ２またはチャヒキモザイクウイルス（brome mosaic virus, ＢＭＶ）のＲＮＡを、また、検出システムとしてＰＣＲを使用する、二種のＲＴのアッセイによって、血清中のマウス白血病ウイルスのＲＴ及び他の系統のレトロウイルスが高感度で検出されることが報告されている（１８，１９）。しかしながら、十分な数の血清標本についてのこれらのアッセイの特異性及び感度の評価は開示されなかった（１８，１９）。加えて、これら両方のアッセイについて、血清中のＲＴ活性の阻害因子及びＲＴ活性の非特異的なバックグラウンド値についての問題が記載されており（２０）、これらのアッセイの診断上の価値について、重大な問題が提起されている。
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、ＲＴ反応による既知のｃＤＮＡ産物を検出する、ＰＣＲに基づく増幅システムを利用したＲＴアッセイを提供するものである。本発明のアッセイは、以下Ａｍｐ−ＲＴと示すが、感度及び特異性が高く、ウイルスのゲノム配列の情報が不必要で、レトロウイルスに感染した個体の試料におけるＲＴ活性またはＲＴを産生する他のあらゆる生物学的存在物の検出を可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、ａ）生物学的試料中に逆転写酵素が存在する場合、ＲＮＡ鋳型及びＤＮＡプライマーがアニーリングし、ＤＮＡ鎖がＤＮＡプライマーからの伸長部分として合成される条件下で、生物学的試料をＲＮＡ鋳型及び相補的ＤＮＡプライマーと接触させる工程、ｂ）合成されたＤＮＡを増幅する工程、並びにｃ）生物学的試料中の逆転写酵素の存在を示し、従って、生物学的試料中のレトロウイルスの存在を示す、合成されたＤＮＡの増幅を検出する工程を含む、生物学的試料中のレトロウイルスの存在を検出する方法を提供する。
【００１１】
また、本発明は、ａ）生物学的試料を、配列番号４のリボヌクレオチドからなる脳心筋炎ウイルスの適合領域であるＲＮＡ鋳型、及び、配列番号２のオリゴヌクレオチドである相補的ＤＮＡプライマーと、生物学的試料中に逆転写酵素が存在する場合、ＲＮＡ鋳型及びＤＮＡプライマーがアニーリングし、ＤＮＡ鎖がＤＮＡプライマーからの伸長部分として合成される条件下で、接触させる工程、ｂ）合成されたＤＮＡ、及び、実質的に配列番号１からなるオリゴヌクレオチド及び実質的に配列番号２からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対を、９３〜９６℃で３０秒〜１分間、５３〜５６℃で３０秒〜１分間
、及び７０〜７４℃で３０秒〜５分間加熱するサイクルを３０〜４０サイクル行うことを含む増幅条件でのポリメラーゼ連鎖反応法によって、合成されたＤＮＡを増幅する工程、並びに、ｃ）実質的に配列番号３のオリゴヌクレオチドからなるプローブを用いるサザンブロットハイブリダイゼーションアッセイによって、生物学的試料中の逆転写酵素の存在を示し、従って、生物学的試料中のレトロウイルスの存在を示す、合成されたＤＮＡの増幅を検出する工程を含む、生物学的試料中のレトロウイルスの存在を検出する方法を提供する。
【００１２】
加えて、本発明は、ＲＮＡ鋳型としての脳心筋炎ウイルスゲノムの適合領域、逆転写酵素のための相補的ＤＮＡプライマー、及び、ポリメラーゼ連鎖反応のためのプライマー対を含み、それぞれの成分が別々の容器に準備されるか、それら成分のいずれかの組合せが一つの容器に準備されることを特徴とする、生物学的試料中のレトロウイルスの存在を検出するキットを提供する。
明細書及び請求の範囲で使用する各名詞は、文脈によって単数または複数を意味する。
【００１３】
本発明は、ａ）生物学的試料中に逆転写酵素が存在する場合、ＲＮＡ鋳型及びＤＮＡプライマーがアニーリングし、ＤＮＡ鎖がＤＮＡプライマーからの伸長部分として合成される条件下で、生物学的試料をＲＮＡ鋳型及び相補的ＤＮＡプライマーと接触させる工程、ｂ）合成されたＤＮＡを増幅する工程、並びにｃ）生物学的試料中の逆転写酵素の存在を示し、従って、生物学的試料中のレトロウイルスの存在を示す、合成されたＤＮＡの増幅を検出する工程を含む、生物学的試料中のレトロウイルスの存在を検出する方法を提供する。
【００１４】
ＲＮＡ鋳型は、例えば脳心筋炎ウイルスゲノム等の、あらゆるリボヌクレオチド配列の適合領域から構成され得る。ここで「適合領域(suitable region)」とは、重要な二次構造を持たず、Ｇ−Ｃ含有量が５０％未満であるＲＮＡ配列の領域を意味し、本明細書で詳述するように、ＤＮＡ鎖の合成に適した反応温度の範囲内にＴm値（融解温度）を有する、この領域に対して相補的なＤＮＡプライマーが産生され得る。ＲＮＡ鋳型は、長さが１００〜５００塩基対、最も好ましくは、長さが約３００塩基対のＤＮＡ産物を産生するのに十分な長さであってもよい。ＲＮＡ鋳型は、配列番号４のリボヌクレオチドであってもよい。
【００１５】
ここで「相補的ＤＮＡプライマー」とは、本明細書で述べる条件下、生物学的試料中にＲＴが存在する場合に、ナセント(nascent)ＤＮＡ鎖の合成を可能にする特定の方向でＲＮＡ鋳型にアニーリングするオリゴヌクレオチドを意味する。また、ここで、ＤＮＡ鎖が合成される「条件」としては、逆転写酵素が存在する場合、ＲＮＡ鋳型及びＤＮＡプライマーがアニーリングし、オリゴヌクレオチドが合成されたＤＮＡ鎖に取り込まれるような量のヌクレオチド、カチオン及び適当な緩衝剤の存在及び温度などが挙げられる。これらの条件のさらに具体的な例を実施例に示す。記載した条件は、他の公知のＲＴ／ｃＤＮＡ合成のプロトコルを最適化したものである。当業者に公知のプロトコルに基づいて特定のＲＴ反応を最適化するために他の条件を設定し得ることは、一般的に知られている。ＤＮＡプライマーは、例えば配列番号２（ＥＭＣＲ２）のオリゴヌクレオチド等の、ＰＣＲによる次の増幅に使用されるプライマー対の逆プライマーであってもよい。
【００１６】
生物学的試料は、あらゆる生体組織または体液（例：細胞、血清、血漿、精液、尿、唾液、痰、脳脊髄液）から得ることが可能である。合成されたＤＮＡ鎖は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（１７）、連結増幅反応（ligation amplifica- tion reaction, ＬＡＲ）（２１）、リガーゼ基準増幅システム（ligase-based amplification system, ＬＡＳ）（２２）、自己維持配列複製（self-sustained sequence replication, ３ＳＲ）システム（２３）、転写基準増幅システム（transcription-based amplification system, 
ＴＡＳ）（２４）、及びＱβレプリカーゼ増幅法（２５）などの、これらに限定されない、現在または将来、この技術分野において知られているあらゆる増幅プロトコルによって増幅され得る。
【００１７】
ＰＣＲによる合成されたＤＮＡの増幅条件として、合成されたＤＮＡ及びプライマー対を、９３〜９６℃（最も好ましくは９５℃）で３０秒〜１分間（最も好ましくは１分間）、５３〜５６℃（最も好ましくは５５℃）で３０秒〜１分間（最も好ましくは１分間）、及び７０〜７４℃（最も好ましくは７２℃）で３０秒〜５分間（最も好ましくは１分間）加熱するサイクルを、３０〜４０（最も好ましくは３５）サイクル行うことが挙げられる。
【００１８】
ここで「プライマー対(primer pair)」とは二つのプライマーを意味し、センス及びアンチセンス配列からなる二本鎖ＤＮＡ分子上のそれぞれの方向に関し、一方は前進(forward)を示し、他方は逆(reverse)を示し、その結果、本明細書に述べた増幅条件下で、前進プライマーはアニーリングしてセンス配列の増幅を開始し、また、逆プライマーはアニーリングしてアンチセンス配列の増幅を開始する。プライマーは、Ｇ−Ｃ含有量が５０％未満であり、反応中の他のプライマーとの相補性が最小であり（プライマーの二量体の形成を最低限にする）、ＰＣＲに適した反応温度の範囲内にＴm値（融解温度）を有することを基準として、増幅反応に使用するために選択され得る。さらには、プライマーは、生じるＤＮＡ増幅産物が長さが１００〜５００塩基対、最も好ましくは、長さが約３００塩基対であるようなＲＮＡ鋳型の特異的な領域にアニーリングするものが選択され得る。例えば、上述した条件において、プライマー対は、前進プライマーとして配列番号１のオリゴヌクレオチド（ＥＭＣＦ１）、及び逆プライマーとして配列番号２のオリゴヌクレオチド（ＥＭＣＲ２）から成るものであってもよい。
【００１９】
ここで、増幅されたＤＮＡの「検出」とは、ＲＴが生物学的試料中に存在する場合のみ合成される増幅ＤＮＡ鎖の存在を、定量的または定性的に測定することを意味する。合成されたＤＮＡの増幅は、この技術分野で知られているあらゆるＤＮＡの検出方法によって検出され得る。例えば、増幅ＤＮＡの検出は、サザンブロットハイブリダイゼーションアッセイ、臭化エチジウムで染色したアガロースゲル上での特異的分子量のＰＣＲ産物の可視化、オートラジオグラフィーまたはシンチレーション測定による放射性物質標識したヌクレオチドの合成されたＤＮＡへの取り込みの測定、増幅ＤＮＡに結合する検出可能部位を捕捉する改良ＥＬＩＳＡ法、または、当業者に知られているあらゆる他の検出方法によって、実施することが可能である。
【００２０】
サザンブロットハイブリダイゼーションアッセイによる検出では、合成されたＤＮＡは、鋳型から合成されたＤＮＡに特異的なプローブによって検出され得る。例えば、そのような特異的なプローブは、実質的に配列番号３のオリゴヌクレオチド（ＥＭＣＰ１）から成るものであってもよい。本発明で使用するサザンブロットハイブリダイゼーションのプロトコルを実施例に示す。
【００２１】
本発明は、ａ）生物学的試料中に逆転写酵素が存在する場合、ＲＮＡ鋳型及びＤＮＡプライマーがアニーリングし、ＤＮＡ鎖がＤＮＡプライマーからの伸長部分として合成される条件下で、生物学的試料を、ＲＮＡ鋳型としての脳心筋炎ウイルスゲノムの適合領域及び相補的ＤＮＡプライマーと接触させる工程、ｂ）合成されたＤＮＡを増幅する工程、並びにｃ）生物学的試料中の逆転写酵素の存在を示し、従って、生物学的試料中のレトロウイルスの存在を示す、合成されたＤＮＡの増幅を検出する工程、を含む、生物学的試料中のレトロウイルスの存在を検出する方法を提供する。
【００２２】
また、本発明は、ａ）生物学的試料中に逆転写酵素が存在する場合、ＲＮＡ鋳型及びＤ
ＮＡプライマーがアニーリングし、ＤＮＡ鎖がＤＮＡプライマーからの伸長部分として合成される条件下で、生物学的試料を、ＲＮＡ鋳型及び相補的ＤＮＡプライマーと接触させる工程、ｂ）合成されたＤＮＡ及びプライマー対を、９３〜９６℃で３０秒〜１分間、５３〜５６℃で３０秒〜１分間、及び７０〜７４℃で３０秒〜５分間加熱するサイクルを３０〜４０サイクル行うことを含む増幅条件でのポリメラーゼ連鎖反応法によって、合成されたＤＮＡを増幅する工程、並びにｃ）生物学的試料中の逆転写酵素の存在を示し、従って、生物学的試料中のレトロウイルスの存在を示す、合成されたＤＮＡの増幅を検出する工程、を含む、生物学的試料中のレトロウイルスの存在を検出する方法を提供する。
【００２３】
さらには、本発明は、ａ）生物学的試料中に逆転写酵素が存在する場合、ＲＮＡ鋳型及びＤＮＡプライマーがアニーリングし、ＤＮＡ鎖がＤＮＡプライマーからの伸長部分として合成される条件下で、生物学的試料を、ＲＮＡ鋳型としての脳心筋炎ウイルスゲノムの領域及び相補的ＤＮＡプライマーと接触させる工程、ｂ）合成されたＤＮＡ及びプライマー対を、９３〜９６℃で３０秒〜１分間、５３〜５６℃で３０秒〜１分間、及び７０〜７４℃で３０秒〜５分間加熱するサイクルを３０〜４０サイクル行うことを含む増幅条件でのポリメラーゼ連鎖反応法によって、合成されたＤＮＡを増幅する工程、並びにｃ）生物学的試料中の逆転写酵素の存在を示し、従って、生物学的試料中のレトロウイルスの存在を示す、合成されたＤＮＡの増幅を検出する工程、を含む、生物学的試料中のレトロウイルスの存在を検出する方法を提供する。
【００２４】
例として、本発明は、ａ）生物学的試料を、ＲＮＡ鋳型としての脳心筋炎ウイルスゲノムの適合領域であってＲＮＡ鋳型が配列番号４のリボヌクレオチド、及び、配列番号２のオリゴヌクレオチドである相補的ＤＮＡプライマーと、生物学的試料中に逆転写酵素が存在する場合、オリゴヌクレオチド及びリボヌクレオチドがアニーリングし、ＤＮＡ鎖がオリゴヌクレオチドからの伸長部分として合成される条件下で、接触させる工程、ｂ）合成されたＤＮＡ、及び、実質的に配列番号１からなるオリゴヌクレオチド及び実質的に配列番号２からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対を、９５℃で１分間、５５℃で１分間、及び７２℃で１分間加熱するサイクルを約３５サイクル行うことを含む増幅条件下でのポリメラーゼ連鎖反応による増幅で合成されたＤＮＡを増幅する工程、並びにｃ）合成されたＤＮＡの増幅を、実質的に配列番号３のオリゴヌクレオチドからなるプローブを用いたサザンブロットハイブリダイゼーションアッセイによって検出する工程、を含む、生物学的試料中のレトロウイルスを検出する方法を提供し得る。
【００２５】
加えて、本発明は、この技術分野でよく知られている、ＲＴ及びＰＣＲ反応のための酵素、緩衝剤、カチオン及びオリゴヌクレオチドを含む、生物学的試料中のレトロウイルスの存在を検出するキットを提供する。また、このキットは、ＲＮＡ鋳型としての脳心筋炎ウイルスゲノムの適合領域、逆転写酵素のための相補的ＤＮＡプライマー、及び、ポリメラーゼ連鎖反応のためのプライマー対を含む。ＲＮＡ鋳型、相補的ＤＮＡプライマー、及びプライマー対をなすプライマーは、それぞれ別々の容器に入れるか、または、これらの成分の全部またはあらゆる組合せを、一つの容器内に混合することができる。相補的ＤＮＡプライマーは、配列番号２のオリゴヌクレオチド（ＥＭＣＲ２）であってもよく、ＲＮＡ鋳型は配列番号４のリボヌクレオチドであってもよく、また、プライマー対は、実質的に配列番号１からなるオリゴヌクレオチド（ＥＭＣＦ１）及び実質的に配列番号２からなるオリゴヌクレオチド（ＥＭＣＲ２）から成るものであってもよい。
【００２６】
本発明には、ＲＴが生物学的試料中で検出され定量され得るという基本的発明原理に基づいた、付加的な応用がある。この原理の一つの応用としては、異なるレトロウイルスのＲＴに対する抗体（例：感染個体においてＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２によって産生されるＲＴを識別可能な抗体）を用いて検出されるＲＴの特異的反応性に基づいて、レトロウイルスの差異を同定することがある。それぞれのレトロウイルスは異なるＲＴを有してお
り、それぞれに対して特異的な抗体を産生でき、それによって特異的なレトロウイルスを同定することができる。本発明の方法は、第一に、ＲＴの存在の検出に使用することができ、次に、異なるレトロウイルスのＲＴに特異的な様々な抗体を生物学的試料に添加し、存在するレトロウイルスのタイプを同定することができる。抗体がそのウイルスに特異的で且つそのウイルス活性を阻害するようなウイルスによってＲＴが産生される場合、公知のＲＴ特異性を有する抗体は、生物学的試料中に存在するＲＴと結合し、抗体の存在下ではＤＮＡ合成は起こらない。
【００２７】
本発明のもう一つの応用は、薬物療法に耐性のある患者のスクリーニングである。抗ＲＴ薬に対するＲＴの感受性は、患者が抗ＲＴ薬療法を受けている間にわたり、モニターすることができる。本発明は、使用された抗ＲＴ薬に対する患者の血清中のＲＴの感受性の指標としてのＲＴ活性について、患者の血清を直接試験することによって、患者の抗ＲＴ薬耐性の発現の検出に使用することができる。薬剤耐性が検出される場合、代替の治療計画を実施することができる。本発明によって、患者の薬剤耐性を検討するために現在使用されている、冗長で労働集約的な培養法を実施する必要がなくなる。
【００２８】
本発明の第三の応用は、ＲＴを産生する生物学的存在物が感染している患者におけるウイルス負荷(virus load)のモニタリングである。疾病の進行を追跡し患者の疾病の予後を診断する目的において、経時的なＲＴの定量は、これらの存在物による疾病の罹患者の生存率及び／または回復率と相関する可能性がある。
【００２９】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、多数の改良及び変更が当業者にとって明らかであることから、実施例は単なる例示として記載する。
【実施例】
【００３０】
以下の実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明を何ら制限するものではない。記載されたプロトコルは使用され得る代表的なものであり、当業者に知られた他の手法も代替として使用され得る。
【００３１】
ウイルス
本研究で使用するレトロウイルスは、下記の通り調製した。ＨＩＶ−１  Ｌａｉ及びシミアン免疫欠損ウイルス（ＳＩＶＢ６７０）を、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）中で増殖させた。ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ−６３）をヤギ胎児の滑膜細胞中で増殖させた。ＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−IIは、ＭＴ−２及びＭｏ−Ｔ細胞系の上清より得、シミアンレトロウイルス１型及び２型（ＳＲＶ−１及びＳＲＶ−２）はＲａｊｉ細胞中で培養し、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）はＪｕｒｋａｔ細胞中で培養し、シミアンフォーミイ(foamy)ウイルス３型（ＳＦＶ−３）はＣｆ２Ｔｈ細胞系で培養した。
【００３２】
ＲＮＡ鋳型のインビトロでの転写
脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）から得たＲＮＡ配列を、鋳型として使用し、Ｎｏｖａｇｅｎ（米国ウィスコンシン州、マディソン）より入手したプラスミドベクターから産生した。短いＥＭＣＶの配列（３５０塩基対）（配列番号４）を、標準的なＰＣＲの条件、並びにプライマー対Ｔ７−ＥＭＣＦ１（配列番号６）及びＥＭＣＲ２（配列番号２）を使用して、プラスミドから増幅した。Ｔ７−ＥＭＣＦ１（配列番号６）の配列は、
５’ＧＧＴＡＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＡＴＴＡＧＣＣＡＴＴＴＣＡＡＣＣＣＡＴ３’
であり、ＥＭＣＲ２（配列番号２）の配列は、
５’ＧＴＴＣＡＴＧＡＣＡＧＧＣＣＧＡＴＡＣＡＧＡＧＧ３’
である。
このＰＣＲ産物をインビトロで転写するために、センスプライマーであるＥＭＣＦ１、
５’ＣＡＴＴＡＧＣＣＡＴＴＴＣＡＡＣＣＣＡＴ３’（配列番号１）
を、５’末端にＴ７プロモーター配列、
５’ＧＧＴＡＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴ−３’（配列番号５）
を付加することによって修飾した。
【００３３】
次に、ＥＭＣＶ増幅産物は、ＮｏｖａｇｏｎのラージスケールＴ７転写キットを使用し、製造元の指示に従って転写した。続いて、ＲＮＡ標品中のＤＮＡを、ＲＮａｓｅフリーのＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）２０単位によって、３７℃で６０分間２回消化し、ＤＮａｓｅは９５℃で１０分間加熱して不活化した。ＲＮＡ標品の純度は、ＥＭＣＦ１（配列番号１）及びＥＭＣＲ２（配列番号２）を使用したＰＣＲ増幅、及び、続く32Ｐで末端を標識した内部プローブＥＭＣＰ１（配列番号３）、
５’ＴＧＣＴＣＴＣＡＣＣＴＴＡＴＣＡＡＡＡＴＣＣＡＡＴ３’
とのサザンブロットハイブリダイゼーションによって、残存するＤＮＡの混入に関し確認した。
【００３４】
Ａｍｐ−ＲＴ
２０μｌ以下の被検生物学的試料を、ＲＮＡ鋳型１０ｎｇ、ＲＮａｓｉｎ１０単位、０．０６％ＮＰ−４０、プライマー（ＥＭＣＲ２、配列番号２）２００ｎｇ、０．８ｍＭ  ＥＧＴＡ，２ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭトリス塩酸、５０ｍＭ塩化カリウム、及び１０ｍＭ塩化マグネシウムを含むＲＴ緩衝液４０μｌに添加した。反応は、３７℃で２時間インキュベートし、その後９５℃で１０分間加熱して全てのＲＴ活性を不活化した。この混合物に、Ｔａｑポリメラーゼ０．５単位及びＴ７配列を持たないセンスプライマー（ＥＭＣＦ１、配列番号１）２００ｎｇを含む標準的なＰＣＲ緩衝液（１７）５０μｌを添加した。反応は、９５℃で１分間、５５℃で１分間、及び７２℃で１分間のサイクルを、３５サイクル行った。反応生成物の２０μｌを、１．８％アガロースゲルで電気泳動し、32Ｐで末端を標識した内部プローブ（ＥＭＣＰ１、配列番号３）と、４２℃で一晩、サザンブロット法でハイブリッド形成させた。ブロットは、２Ｘ  ＳＳＣ（塩化ナトリウム及びクエン酸ナトリウム）、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中で、１〜２時間洗浄した。ブロットは６〜２４時間感光した。
【００３５】
ＲＮＡ鋳型の標品の完全性及び純度を確認するために、ＥＭＣＶ  ＲＮＡ鋳型（配列番号４）及びＲＴ源としてＨＩＶ−１ウイルス株を使用して、ＲＴ反応を実施した。ＨＩＶ−１反応は陽性であり、ＨＩＶ−１を使用しないか、またはＨＩＶ−１を添加する前にＲＮａｓｅで前処理する対照反応は、全て陰性であった。これらの陰性の結果から、Ａｍｐ−ＲＴの根本的な反応はＲＮＡ依存性であり、ＲＮＡ鋳型と他のアッセイの成分は混入標的ＤＮＡを全く含まないことが示された。この反応がＲＴによって媒介されていることを更に確証するために、非ヌクレオシドＲＴ阻害物質であるテトラヒドロイミダゾベンゾジアゼピン（ＴＩＢＯ）化合物（２）２μｇの存在下でＨＩＶ−１培養上清を使用して、Ａｍｐ−ＲＴ反応を行った。その結果、ＴＩＢＯ化合物の存在下でのみＡｍｐ−ＲＴ反応が阻害され、一方、対照の増幅反応においてＴａｑのＤＮＡポリメラーゼ活性は影響を受けなかったことが示された。
【００３６】
Ａｍｐ−ＲＴの比較感度分析
現在、多数の特異的及び遺伝的アッセイが、レトロウイルスの存在の検出に用いられている。これらのアッセイのＡｍｐ−ＲＴに対する相対感度を比較するために、ＨＩＶ−１の培養上清を連続的に１０倍に希釈し、等量に分けた。それぞれの希釈液について、標準的ＲＴアッセイ、分枝型ＤＮＡ(branched DNA)検出、ｐ２４抗原捕捉、組織培養５０％感染量（ＴＣＩＤ50）測定、ＲＴ−ＰＣＲ、及びＡｍｐ−ＲＴによって、試験を行った。
【００３７】
標準的ＲＴアッセイ
ＲＴ活性は、Willeyらの方法（３）に従って、ポリ（ｒＡ）.オリゴｄＴの鋳型プライマーを用いて、培養上清の活性を測定した。酵素活性は、トリチウム化したチミジン一リン酸の取り込みを測定することによって評価した。
【００３８】
ＨＩＶ−１の分枝型ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）検出
ＨＩＶ−１の分枝型ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）検出は、製造元の指示（Ｃｈｉｒｏｎ、米国カリフォルニア州、Ｅｍｒｙｖｉｌｌｅ）に従って実施した。製造元の推奨の通り、カットオフを５，０００ＲＮＡ等量／ｍｌとした。
【００３９】
ｐ２４抗原捕捉
ＨＩＶ−１の、塩基が解離したｐ２４抗原は、Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｋａ（米国ノースカロライナ州）が販売しているＥＬＩＳＡキットによって測定した。
【００４０】
ＴＣＩＤ50測定
ＨＩＶ−１ウイルス株のＴＣＩＤ50は、ＭｃＤｏｕｇａｌらの報告（２６）の通り、ＰＢＬについて測定した。
【００４１】
ＲＴ−ＰＣＲ
培養上清中の、粒子と結合したＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡは、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ、４０μｌのＲＴ緩衝液［５０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．３）、２０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム］（１５）中で再構成した。ＲＮＡをさらに、１０ｍＭ酢酸ナトリウムの存在下、ＤＮａｓｅ−Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（５単位）で、３７℃で３０分間消化した。ＤＮａｓｅは９５℃で１０分間加熱して不活化した。逆転写のために、１０ｍＭ  ＤＴＴ、ＲＮａｓｉｎ２０単位、ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ及びＴＴＰをそれぞれ０．８７５ｍＭ、逆プライマー（ＳＫ３９，配列番号８）２００ｎｇ及びＡＭＶ−逆転写酵素０．０２単位を含むＲＴ混合物２０μｌに、ＲＮＡ１０μｌを加えた。この混合物を、４２℃で４５分間逆転写させた。対照には、逆転写を行わない溶液１０μｌを用いた。次に全ての試料を１００μｌの反応容量中、プライマーとしてＳＫ３８／ＳＫ３９（配列番号７及び８）を使用して３５サイクルＰＣＲによって増幅させ、増幅産物は32Ｐで標識したＳＫ１９（配列番号９）プローブとサザンブロット法でハイブリッド形成させた（２７）。
【００４２】
表１に示した結果から、Ａｍｐ−ＲＴが最も感度の高いアッセイであり、標準的ＲＴアッセイの１００，０００倍、ｂＤＮＡ検出システム及びｐ２４抗原捕捉アッセイの１０，０００倍、及び、ＴＣＩＤ50及びＲＴ−ＰＣＲの１００倍、高感度であることが示された。希釈していないＨＩＶ−１試料中のｐ２４抗原の濃度は、１．６ｎｇであった。
【００４３】
Ａｍｐ−ＲＴを用いた臨床試料の試験
米国ジョージア州アトランタで、同性愛の男性におけるＨＩＶのナチュラルヒストリーの研究に登録しているＨＩＶ−１血清陽性(seropositive)群から得た４２例の血清試料について、Ａｍｐ−ＲＴ試験を行った。これらの男性のＨＩＶ−１感染の臨床段階は、米国の疾病対策・予防センター（ＣＤＣ）が改訂した分類システム（２９）に基づいて決定した。ＣＤ４＋のリンパ球数及び血液中のＣＤ４＋のリンパ球のパーセンテージなどの研究のマーカーは、標準的なフローサイトメトリー法によって決定した。対照として、ＨＴＬＶ−Ｉ／II及びＨＩＶ−１の血清陰性(seronegative)の健常者群２０例の血清試料を使用した。
【００４４】
ＨＩＶ−１でスパイク(spike)した正常ヒト血清を使用した予備実験では全てＡｍｐ−ＲＴ陰性であり、この実験から、Ａｍｐ−ＲＴに用いる血清試料の調製には、培養上清の条件と異なる特別な条件が必要であることが示唆された。例えば、ＰＣＲサイクルの高温
の段階でタンパク質が沈澱することから、少量（５〜２０μｌ）の血清または血漿であっても、Ａｍｐ−ＲＴでは直接試験できなかった。従って、この問題を回避するために、血清を遠心分離し、ウイルスの沈殿物を使用してＡｍｐ−ＲＴアッセイを実施した。
【００４５】
培養上清の試験では、２０μｌ以下の上清をＲＴ反応に使用した。血清または血漿試料の試験では、０．５ｍｌを、ＤＥＰＣ処理したリン酸緩衝溶液で１０倍に希釈し、１，０００ｇで１０分間遠心分離して透明にし、４４，０００ｇで１時間、超遠心分離した。沈殿物を０．６％ＮＰ−４０を含むＲＴ緩衝液５０μｌ中に１５分間懸濁し、５〜４５μｌをＡｍｐ−ＲＴアッセイに使用した。
血清試料の試験結果から、Ａｍｐ−ＲＴは、３６例（８５．７％）の血清試料でＲＴ活性を検出できたことが示され（表２）、そのうち３１例（８６．１％）でｐ２４抗原が検出された。ＨＩＶ−１／ＨＴＬＶ血清陰性の試料で陽性の結果が得られたものは無いので、この試験は高感度であるとともに特異性も高かった。Ａ１に分類された患者の試料６例のうち、３例（５０％）はＡｍｐ−ＲＴ陽性であり、一方、Ｂ２及びＣ３に分類された患者の試料では、それぞれ、７例中５例（７１．４％）、及び、２６例中２５例（９６．１％）でＡｍｐ−ＲＴ陽性であった。
【００４６】
Ａｍｐ−ＲＴによるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の試験
ＨＢＶのポリメラーゼ遺伝子がＲＴ様の活性を有することが報告されているので（３０）、ＨＢＶ関連のＲＴ活性の検出にＡｍｐ−ＲＴを使用した。ＨＢＶ感染群２１例からの血清試料を選択し、そのうち１１例でＨＢｅ抗原が検出され（Abbott HBe EIA、米国シカゴ）、その他の１０例ではＨＢｅ抗原は検出されなかった。
【００４７】
１１例の血清標本でＨＢＶウイルス粒子が存在したが、Ａｍｐ−ＲＴ分析では陽性の結果は１例も得られなかった。これらの陰性の結果から、少なくともこれらの条件下では、ＨＢＶ関連のＲＴがＡｍｐ−ＲＴアッセイにおいて干渉する可能性が除外され、従って、レトロウイルスのＲＴのみを検出するという、アッセイの特異性の範囲が確認される。
【００４８】
Ａｍｐ−ＲＴによる異なるレトロウイルスの検出
レトロウイルスの三亜科全てにわたる多種のレトロウイルスについて、Ａｍｐ−ＲＴの検出能力を調べた。レンチウイルスとしては、ＨＩＶ−１、ＳＩＶ及びＣＡＥＶについて試験を行った。オンコウイルスとしては、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−II、ＧＡＬＶ、ＳＲＶ−１及びＳＲＶ−２を用い、スプマウイルスとしては、ＳＦＶ−３を使用した。Ａｍｐ−ＲＴでは、試験を行った全てのレトロウイルスを検出することが可能であった。最も重要な点は、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−II及びＧＡＬＶなどのウイルスは、標準的なＲＴ法で検出するのが難しいものの典型であるが、このアッセイでは容易に同定されたことである。
【００４９】
これらのウイルスは、元の濃縮しない培養上清を０．０４〜０．００００４μｌ含む希釈溶液中、Ａｍｐ−ＲＴで検出された。被検レトロウイルスは、非感染細胞系（Ｈｕｔ−７８、Ａ３０１またはＵ９３７）から得た上清で連続希釈した。被検レトロウイルスの希釈の終点からわかるように、三種の上清は全て陰性であった。
公知のＲＴアッセイの並行比較(side by side comparison)
【００５０】
本発明のアッセイが、発表されている他のＲＴアッセイ［２２，２３］と比較して特異性及び感度が高いことを実証するために、これらのアッセイの並行比較を実施できる。これらのアッセイは、特定のＲＮＡ鋳型配列、プライマー配列、ＲＴ緩衝液組成、増幅条件、検出条件及び使用した試料の調製について異なっている。従って、二つのアッセイの比較として、本アッセイ及び他の各アッセイの教示に従って、ＨＩＶ−１血清陽性群及びＨＩＶ−１及びＨＴＬＶ−Ｉ／II陰性群からの血清試料のパネル調査を行ってもよい。陽性
対照として、ＨＩＶ−１ウイルス粒子でスパイクした正常ヒト血清を使用し得る。次に、これらのアッセイの特異性及び感度を計算し、比較する。
この出願では、多数の文献は全てかっこ内の数字で参照する。これらの文献の詳細は下記の通りである。本発明が属する技術分野の状態をより詳細に記載するため、これらの文献を引用することによって、本出願に文献の開示を全て包含させる。
本発明の方法を、ある態様について具体的な詳細により説明したが、この詳細な説明は、発明の請求の範囲が包含する範囲を除外し、発明の範囲を制限するものではない。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
【表２−１】
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【００５３】
【表２−２】
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【００５４】
【表３−１】
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【００５５】
【表３−２】
2007006897.tif 000006
【００５６】
【表３−３】
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【配列表】
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