(57)【要約】【課題】ＤＮＡのメチル化検出を行うための生体試料の前処理方法を簡素化することにより解析時間を短縮することができる検出用試料の調製方法、ＤＮＡのメチル化検出方法、試料処理液及びキットを提供する。【解決手段】ＤＮＡのメチル化を検出するために用いられる検出用試料の調製方法であって、細胞を含む生体試料と、当該細胞を可溶化する界面活性剤を含む試料処理液とを混合する工程、及び前記工程で得られた混合液に、ＤＮＡに含まれる非メチル化シトシンを他の塩基に変換する変換剤を添加する工程、を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡのメチル化を検出するために用いられる検出用試料の調製方法であって、
細胞を含む生体試料と、当該細胞を可溶化する界面活性剤を含む試料処理液とを混合する工程、及び
前記工程で得られた混合液に、ＤＮＡに含まれる非メチル化シトシンを他の塩基に変換する変換剤を添加する工程、
を含むことを特徴とする検出用試料の調製方法。
【請求項２】
前記変換剤を添加する工程の前に、前記ＤＮＡを切断する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記変換剤が、亜硫酸水素塩である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が腫瘍細胞である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記試料処理液が、ＤＮＡを切断することのできる切断剤をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＤＮＡの所定の領域におけるメチル化を検出する方法であって、
細胞を含む生体試料と、当該細胞を可溶化する界面活性剤を含む試料処理液とを混合する工程、
前記工程で得られた混合液に、前記領域に含まれる非メチル化シトシンを他の塩基に変換する変換剤を添加する工程、及び
前記非メチル化シトシンから変換された前記他の塩基を有する前記領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドと、前記他の塩基への変換前の前記領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドとを用いて、前記領域におけるメチル化を検出する工程、
を含むことを特徴とするＤＮＡのメチル化検出方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡの所定の領域が、遺伝子のＣｐＧアイランドを含む領域である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝子が、癌抑制遺伝子、癌遺伝子、及び腫瘍マーカーをコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
細胞を含む生体試料からＤＮＡのメチル化検出に用いられる検出用試料を調製するための試料処理液であって、
前記細胞を可溶化する界面活性剤を含むことを特徴とする試料処理液。
【請求項１０】
ｐＨが７〜１０である請求項９に記載の試料処理液。
【請求項１１】
前記ＤＮＡを切断する切断剤をさらに含む請求項９又は１０に記載の試料処理液。
【請求項１２】
ＤＮＡのメチル化を検出するために用いられる検出用試料の調製用キットであって、
請求項９に記載の試料処理液及びＤＮＡに含まれる非メチル化シトシンを他の塩基に変換する変換剤を含むことを特徴とするキット。
【請求項１３】
ＤＮＡを切断する切断剤をさらに含む請求項１２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡのメチル化を検出するために用いられる試料（検出用試料）の調製方法、ＤＮＡのメチル化を検出する方法、これらの方法に用いられる試料処理液及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
高等真核生物の染色体ＤＮＡでは、ＤＮＡを構成する塩基のうちＣ（シトシン）の５位がメチル化修飾を受けていることがある。この高等真核生物におけるＤＮＡのメチル化は、原核生物の場合とは異なり、遺伝情報の発現抑制機構として機能している。例えば、ある遺伝子のＣｐＧを多く含む領域（ＣｐＧアイランド、ＣＧ島）がメチル化されていると、その遺伝子の転写が抑制される。それに対して、ＣｐＧアイランドがメチル化を受けていないと、プロモーター領域に転写因子が結合可能となり、遺伝子が転写可能な状態になる。このように、ＤＮＡのメチル化は、遺伝子発現の制御機構の１つであり、初期胚発生、組織特異的な遺伝子の発現、哺乳動物に特徴的な現象である遺伝子刷り込みやＸ染色体の不活性化、染色体の安定化、ＤＮＡ複製のタイミング等の様々な生理的、病理的な現象に重要な役割を果たしている。さらに近年、がんやその他の疾病にこのＤＮＡのメチル化が強く関与することが明らかになってきている。
【０００３】
ＤＮＡのメチル化を解析する方法として、一般的にメチル化特異的ＰＣＲ（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、以下「ＭＳ−ＰＣＲ」という）が用いられている（非特許文献１参照）。この従来用いられている方法（以下、「標準法」という）は、通常、１）生体試料からのゲノムＤＮＡ抽出（約３時間）、２）抽出されたゲノムＤＮＡの亜硫酸水素塩処理（約１６時間）、３）修飾されたゲノムＤＮＡの精製（約１時間）、及び４）ＰＣＲ（約２時間）の４ステップで行われており、非常に時間がかかっていた（合計約２２時間）。特に、ＰＣＲに至るまでの生体試料の前処理（検出用試料の調製）が煩雑であり、前処理（上記１〜３）だけで約２０時間かかることが問題であった。
長時間かかる前処理時間を短縮させるべく、上記２）の亜硫酸水素塩処理を、高濃度の亜硫酸水素塩で行う方法が提案された（非特許文献２参照）。
非特許文献２の方法（以下、「迅速法」という）によれば、標準法で約１６時間かかっていた亜硫酸水素塩処理を約０．３時間で行うことができるため、前処理時間が約２０時間から約４時間へと短縮される。しかしながら、この迅速法を用いても、前処理に約４時間を要する。
【非特許文献１】Ｊａｍｅｓ  Ｇ．ＨＥＲＭＡＮ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ：Ａ  ｎｏｖｅｌ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄｓ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  Ｖｏｌ．９３，  ｐｐ．９８２１−９８２６，  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９９６
【非特許文献２】Ｍａｓａｈｉｋｏ  ＳＨＩＲＡＩＳＨＩ  ａｎｄ  Ｈｉｋｏｙａ  ＨＡＹＡＴＳＵ，  Ｈｉｇｈ−Ｓｐｅｅｄ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｔｏ  Ｕｒａｃｉｌ  ｉｎ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ，  ＤＮＡ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  １１，４０９−４１５（２００４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、ＤＮＡのメチル化検出を行うための生体試料の前処理方法を簡素化することにより解析時間を短縮することができる検出用試料の調製方法、ＤＮＡのメチル化検出方法、試料処理液及びキットを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は上記目的を達成するために次の技術的手段を講じた。
検出用試料の調製方法に係る本発明は、ＤＮＡのメチル化検出に用いられる検出用試料の調製方法であって、
細胞を含む生体試料と、当該細胞を可溶化する界面活性剤を含む試料処理液とを混合する工程、及び
前記工程で得られた混合液に、ＤＮＡに含まれる非メチル化シトシンを他の塩基に変換する変換剤を添加する工程、
を含むことを特徴としている。
この検出用試料の調製方法によれば、細胞を含む生体試料と試料処理液とを混合し、そこに変換剤を添加すればよいので、生体試料からゲノムＤＮＡを抽出する工程を省くことができる。このため、短時間で検出用試料を調製することが可能になり、ＤＮＡのメチル化検出時間を短縮することができる。また、この方法は、煩雑なＤＮＡ抽出が必要ないため、装置等を用いた検出用試料調製の自動化に適している。
【０００６】
上記検出用試料の調製方法は、変換剤を添加する工程の前に、前記ＤＮＡを切断する工程を含んでもよい。
この場合には、生体試料に含まれるＤＮＡはそのまま塩基配列を解析するには大きすぎるため、予め適当な長さに切断しておくことにより、その後の工程をスムーズに進行させることができる。
上記検出用試料の調製方法において、変換剤が、亜硫酸水素塩であることが好ましい。
また、上記検出用試料の調製方法において、細胞が腫瘍細胞であることが好ましい。
【０００７】
さらに、ＤＮＡのメチル化検出方法に係る本発明は、ＤＮＡの所定の領域におけるメチル化を検出する方法であって、
細胞を含む生体試料と、当該細胞を可溶化する界面活性剤を含む試料処理液とを混合する工程、
前記工程で得られた混合液に、前記領域に含まれる非メチル化シトシンを他の塩基に変換する変換剤を添加する工程、及び
前記非メチル化シトシンから変換された前記他の塩基を有する前記領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドと、前記他の塩基への変換前の前記領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドとを用いて、前記領域におけるメチル化を検出する工程、
を含むことを特徴としている。
【０００８】
このＤＮＡのメチル化検出方法によれば、生体試料からゲノムＤＮＡを抽出する工程を省くことができるので、前処理方法が簡素化されるとともに前処理にかかる時間が短縮される。これにより、ＤＮＡのメチル化検出時間を短縮することができる。また、この方法は、煩雑なＤＮＡ抽出が必要ないため、装置等を用いたメチル化検出の自動化に適している。
【０００９】
上記ＤＮＡのメチル化検出方法において、ＤＮＡの所定の領域が、遺伝子のＣｐＧアイランドを含む領域であることが好ましい。
さらに、上記ＤＮＡのメチル化検出方法において、遺伝子が、癌抑制遺伝子、癌遺伝子、及び腫瘍マーカーをコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つであることが好ましい。
【００１０】
試料処理液に係る本発明は、細胞を含む生体試料からＤＮＡのメチル化の検出に用いられる検出用試料を調製するための試料処理液であって、
前記細胞を可溶化する界面活性剤を含む試料処理液であることを特徴としている。
この試料処理液を用いることにより、生体試料からゲノムＤＮＡを抽出する工程を省略することが可能となる。
【００１１】
上記試料処理液は、ｐＨが７〜１０であることが好ましい。この場合、生体試料とこの試料処理液を混合したときに、測定対象ではないＲＮＡの分解を促進することができる。
上記試料処理液は、前記ＤＮＡを切断する切断剤をさらに含むことが好ましい。この場合、生体試料と試料処理液とを混合するだけで、細胞の可溶化と、ＤＮＡの切断を行うことができるため、前処理時間をさらに短縮することができる。
【００１２】
ＤＮＡのメチル化検出に用いられる検出用試料の調製用キットに係る本発明は、上記試料処理液と、ＤＮＡに含まれる非メチル化シトシンを他の塩基に変換する変換剤とを含むことを特徴としている。
このキットを用いれば、検出用試料を短時間で調製することができる。
上記キットは、ＤＮＡを切断する切断剤をさらに含んでいてもよい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ＤＮＡのメチル化検出を行うための生体試料の前処理を簡便且つ短時間で行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の検出用試料の調製方法は、ＤＮＡのメチル化検出に用いられる検出用試料の調製方法であって、細胞を含む生体試料と、当該細胞を可溶化する界面活性剤を含む試料処理液とを混合する工程（第１工程）、及び前記工程で得られた混合液に、ＤＮＡに含まれる非メチル化シトシンを他の塩基に変換する変換剤を添加する工程（第２工程）、を含んでいる。
【００１５】
第１工程において、細胞を含む生体試料と、当該細胞を可溶化する界面活性剤を含む試料処理液とが混合される。
上記生体試料としては、例えば、ヒト等の動物から採取したリンパ節や血液等の組織、血漿、血清、尿、唾液、体液、乳頭分泌物等が挙げられる。さらに、ヒト等の動物から採取した組織、当該細胞を培養して得られる培養組織や培養細胞も挙げられる、また、植物等の非動物由来の試料を用いてもよい。
【００１６】
試料処理液は、細胞を含む生体試料からＤＮＡのメチル化検出に用いられる検出用試料を調製するためのものであって、前記細胞を可溶化する界面活性剤が含まれる。界面活性剤としては、上記細胞を可溶化できるものであれば、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤及び非イオン性界面活性剤のうち、いずれを使用してもよく、その中でも陰イオン性界面活性剤が好ましい。陰イオン性界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、テトラデシル硫酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム、テトラデシルスルホン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム（ＣＨＯ）、デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）、タウロコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム等が挙げられ、この中でもタンパク質に対して高い親和性を有するドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が好ましい。試料処理液に含まれる界面活性剤の濃度は、使用する界面活性剤の種類に応じて好適な濃度を選択することが望ましい。例えば、試料処理液に含まれる陰イオン性界面活性剤の濃度は、０．１〜１０体積％が好ましく、０．５〜５体積％がより好ましい。
【００１７】
また、試料処理液のｐＨは、上記界面活性剤を溶かすことができるｐＨ範囲であればよいが、生体試料と混合したときに、細胞に含まれるＲＮＡの分解を促進するためにも中性から弱アルカリ性、特にｐＨ７〜１０が好ましい。さらに、前記ｐＨを一定に保つために、前記試料処理液は、公知の緩衝液を含んでもよい。
【００１８】
生体試料に含まれる細胞の可溶化は、生体試料と上記の試料処理液とを混合し、例えば１０〜４０℃で５〜１５分間攪拌することにより行うことができる。また、生体試料と試料処理液とを混合する前或いは混合した後に、生体試料に含まれる細胞を物理的に破砕してもよい。例えば、生体試料として切除組織などの細胞塊を用いる場合は、細胞塊と試料処理液との混合後に細胞塊をホモジナイズすることが好ましい。
試料処理液の添加量としては、生体試料に含まれる細胞数により適宜調節することができる。例えば、生体試料が１×１０６個の細胞を含む場合、試料処理液を３００〜５００μｌ添加することにより、細胞の可溶化を行うことができるが、これに限定されない。
【００１９】
第２工程においては、上記第１工程で得られた混合液に、ＤＮＡに含まれる非メチル化シトシンを他の塩基に変換する変換剤が添加される。
変換剤は、ＤＮＡに含まれる非メチル化シトシンを他の塩基に変換する、すなわち、非メチル化シトシンを、シトシン以外の塩基（ウラシル、チミン、アデニン又はグアニン）に変換するものである。このような変換剤として、亜硫酸水素塩が好ましく用いられる。亜硫酸水素塩としては、亜硫酸水素のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などを用いることができる。これらのうち何れか１つ以上を用いてＤＮＡを処理すると、ＤＮＡ中の非メチル化シトシンは脱アミノ化によってウラシルへ変換される。一方、上記のような変換剤はＤＮＡ中のメチル化シトシンには作用せず、変換は起こらない。この変換剤は、溶媒に溶解し、溶液として用いることが好ましい。
【００２０】
変換剤として亜硫酸水素塩を用いる場合、試料中のＤＮＡの非メチル化シトシンを充分に変換できる程度であれば第１工程で得られた混合液への添加量は特に限定されないが、好ましくは１〜１０ｍｍｏｌ、より好ましくは４〜８ｍｍｏｌである。例えば、混合液に６ｍｍｏｌの亜硫酸水素ナトリウムを添加する場合、１０〜３０分間、５０〜８０℃でインキュベートすることにより非メチル化シトシンのウラシルへの変換を行うことができる。また、上述の標準法のように亜硫酸水素塩を低濃度（例えば３Ｍの亜硫酸水素ナトリウム溶液５２０μｌ）で用いる場合は、非メチル化シトシンを充分に変換できる程度の時間及び温度で変換を行えばよい。変換剤は亜硫酸水素塩に限られるものではなく、メチル化シトシンではなく非メチル化シトシンを選択的に他の塩基に変換する他の変換剤を使用することもできる。
【００２１】
ＤＮＡのメチル化検出に用いられる検出用試料を上記の第１工程及び第２工程で調製することにより、従来必要であったゲノムＤＮＡの抽出を省略することができる。このため、短時間で検出用試料を調製することが可能である。また、前処理を１つの容器内で行えるため、分注の必要がない。従って、分注の際に生じる試料のロスを減らすことができ、検出感度を上げることができる。さらに、この方法は少ない工程で簡便に実行され得るため、装置等による検出用試料調製の自動化に非常に適している。また、本法を用いると、標準法で長時間かけて非メチル化シトシンのウラシルへの変換を行った場合と同等又はそれ以上の効率で非メチル化シトシンからウラシルへの変換を行うことができる。
【００２２】
上記検出用試料の調製方法において、第２工程を行う前に、ＤＮＡを切断する工程を含むことが好ましい。生体試料に含まれるＤＮＡを予め適当な長さに切断して断片化しておくことにより、第２工程での非メチル化シトシンの変換を効率よく行うことができる。ＤＮＡの切断は、超音波処理（ソニケーション）等の物理的処理、アルカリ処理等の化学的処理、制限酵素等を用いる酵素処理等により行うことができる。これらのうち水酸化ナトリウムや制限酵素等のＤＮＡを切断できる物質（切断剤）を用いることが好ましい。例えば、切断剤として水酸化ナトリウムを用いる場合、５〜１５Ｎの水酸化ナトリウム溶液を、第１工程で得られた混合液に５〜３０μｌ添加し、５〜１５分間１０〜４０℃でインキュベートすることによりＤＮＡの切断を行うことができる。
【００２３】
ＤＮＡの切断に上記化学的処理又は酵素処理を行う場合には、アルカリ処理に用いる物質（例えば、水酸化ナトリウム）又は酵素（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）を切断剤として、上記試料処理液に添加することも可能である。この場合、生体試料と試料処理液との混合を行うだけで、試料の可溶化と、切断工程とを一度の操作で行うことができるため、検出用試料の調製時間（前処理時間）をさらに短縮することができる。水酸化ナトリウムを用いる場合、試料処理液中の水酸化ナトリウム濃度は、好ましくは０．１〜１Ｎ、より好ましくは０．２〜０．５Ｎである。ＤＮＡの切断は、変換剤の添加前であれば、どの時点で行ってもよい。
【００２４】
本発明の方法を実施するために、上記試料処理液と、上記変換剤とを含む検出用試料の調製用キットを用いることができる。このキットを用いることにより、検出用試料を短時間で調製することができる。このキットには、上記切断剤をさらに含ませてもよい。試料処理液、変換剤及び切断剤はそれぞれ別の容器に収容してもよいし、試料処理液と切断剤とを同一の容器に収容し、変換剤を別の容器に収容してもよい。
【００２５】
また、本発明のＤＮＡのメチル化検出方法は、ＤＮＡの所定の領域におけるメチル化を検出する方法であって、細胞を含む生体試料と、当該細胞を可溶化する界面活性剤を含む試料処理液とを混合する工程（第１工程）、前記工程で得られた混合液に、前記領域に含まれる非メチル化シトシンを他の塩基に変換する変換剤を添加する工程（第２工程）、及び前記非メチル化シトシンから変換された前記他の塩基を有する前記領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドと、前記他の塩基への変換前の前記領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドとを用いて、前記領域におけるメチル化を検出する工程（第３工程）、を含んでいる。
この方法は、第２工程の前に上述のＤＮＡ切断工程を含むことが好ましい。また、上述したように切断剤を含む試料処理液を用いて第１工程を行うことにより、細胞の可溶化とＤＮＡの切断を一度の操作で行うことができる。
【００２６】
本発明のＤＮＡのメチル化検出方法は、第１工程及び第２工程において、上述した検出用試料を調製し、第３工程において、当該検出用試料におけるメチル化を検出する方法である。第１工程及び第２工程は、上記検出用試料の調製方法の第１工程及び第２工程と同じであるため説明を省略する。
【００２７】
上記方法により調製された検出用試料は、生体試料と試料処理液との混合液に変換剤を添加して得られる試料であって、この中には変換剤によって非メチル化シトシンから変換された他の塩基と５−メチルシトシンとが存在している。この変換された他の塩基と５−メチルシトシンとを識別するため、検出用試料についてＤＮＡの増幅、検出、又はこの両方の方法を行い、ＤＮＡの所定の領域のメチル化状態を決定することができる。
ＤＮＡのメチル化検出は、非メチル化シトシンを他の塩基に変換した場合の配列（以下、変換配列とする）に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドと、変換前の配列（即ち、メチル化シトシンを含む配列：以下、非変換配列とする）に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドを用いて行われる。これらのポリヌクレオチドをプライマーとして用い、ＰＣＲ等の核酸増幅を行うことによりメチル化を検出することができる。また、これらのポリヌクレオチドを基板に固定したＤＮＡチップを用いてメチル化検出を行ってもよい。
例えば、メチル化又は非メチル化のいずれかに変換したＤＮＡと特異的にハイブリダイズするＰＣＲプライマーを用いるメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳ−ＰＣＲ）、亜硫酸水素塩ゲノム配列決定、ＣＯＢＲＡ（Combined Bisulfite Restriction Analysis）、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ（Methylation-sensitive Single-Nucleotide Primer Extension）等が挙げられる。また、上記のポリヌクレオチドを用いてＬＡＭＰ法（ＵＳＰ６４１０２７８号参照）を行うことによりメチル化の検出を行ってもよい。
ＭＳ−ＰＣＲを用いる場合、具体的には以下のようにしてメチル化を検出することができる。
１）生体試料から調製された検出用試料を２つのチューブに分注する（これらを検出用試料１及び検出用試料２とする）。
２）検出用試料１に変換配列に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、及びｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰ）を添加し、ＰＣＲ反応液１を調製する。
３）検出用試料２に非変換配列に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、及びｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰ）を添加し、ＰＣＲ反応液２を調製する。
４）ＰＣＲ反応液１及び２を用いて、ＰＣＲを行う。
５）アガロースゲル電気泳動など、後述の検出方法で目的とする配列が増幅しているか否かを確認する。
５）の結果、ＰＣＲ反応液１でＤＮＡの増幅が確認され、ＰＣＲ反応液２でＤＮＡの増幅が確認されなかった場合、ポリヌクレオチドがハイブリダイズする領域がメチル化されていないことがわかる。逆に、ＰＣＲ反応液１でＤＮＡの増幅が確認されず、ＰＣＲ反応液２でＤＮＡの増幅が確認された場合、ポリヌクレオチドがハイブリダイズする領域がメチル化されていることがわかる。
【００２８】
増幅されたＤＮＡを検出する方法は、特に限定されず、公知の方法によって検出することができる。例えば、アガロースゲル電気泳動法、蛍光標識を使用したプローブにより検出するリアルタイム検出法（この場合、上記４）及び５）を同時に行うことができる）、ＤＮＡ合成の際の副生成物（ピロリン酸マグネシウム）の濁り（濁度）を測定する濁度測定法、必要に応じて酵素による切断パターンの確認や、直接シークエンス解析で塩基配列を決定する方法等を用いることができる。また、非特異的な増幅バンドが多くて特異バンドの判別が困難な場合は、標的とする増幅域内のプローブを用いたサザンブロット法等により特異バンドを確認することができる。
【００２９】
ここで、上記ポリヌクレオチドはプライマーとして働くことができ、修飾型又は非修飾型ＤＮＡの相補鎖と配列特異的なハイブリダイゼーション（アニーリング）が可能な、直線状の一本鎖のオリゴマーのＤＮＡ又はＲＮＡであり、増幅過程の間、特異的且つ効率的な重合反応（プライマー伸長）の開始を提供するような適当な配列および十分な長さを有するものである。プライマーの長さとしては、特に限定されないが、ＰＣＲに用いる場合は、５〜５０ｍｅｒが好ましく、１０〜３０ｍｅｒがより好ましい。プライマーは一本鎖が好ましいが、鎖が最初に分離されるならば二本鎖を使用することも可能である。プライマーは、任意の適当な方法、例えば常用のホスホトリエステル法及びホスホジエステル法又は当業界で一般的に知られている自動化された態様を用いて調製することができる。
【００３０】
本発明の方法で使用するプライマーは、上述のＤＮＡの所定の領域に実質的に相補的になるように、しかも適切なＧＣ含量となるようにデザインされることが好ましい。すなわち、上記ポリヌクレオチドは、上記第２工程の後で、特に、未処理又は非修飾ＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、及び非メチル化ＤＮＡを識別する。センスプライマー中にはＣが存在せず、アンチセンスプライマー中にはＧが存在しないであろうから、通常、本発明の方法で使用するオリゴヌクレオチドプライマーには、その配列中に比較的少量のＣ又はＧが含まれる。
【００３１】
ここでは、第２工程で変換剤として亜硫酸水素塩を用いた場合について説明する。第２工程で、亜硫酸水素塩によって非メチル化シトシンは、ウラシルに変換されるが、５−メチルシトシンは変換されることなくそのまま残っている。従って、変換されたウラシルを有する（非メチル化）ゲノムＤＮＡを鋳型として、ウラシルを有する領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドを用いて核酸増幅を行うことにより、増幅産物が生成されるが、５−メチルシトシンを含む領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドでは増幅されずに産物が得られない。その一方で、５−メチルシトシンを有する（メチル化）ゲノムＤＮＡは、ウラシルを有する領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドでは増幅されずに産物が得られないが、５−メチルシトシンを含む領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって増幅されて産物を与える。この産物を、例えばアガロースゲル電気泳動法によって検出することにより、ＤＮＡの所定の領域がメチル化されていたか否かを解析することができる。
【００３２】
ＤＮＡの所定の領域としては、遺伝子のＣｐＧアイランドが好ましい。この領域は遺伝子の転写に関係するＤＮＡ配列である。ＣｐＧアイランドは主に遺伝子のエクソンの上流領域（プロモーター領域）に存在し、イントロンやエクソンに存在することもある。ＣｐＧアイランドがメチル化されている場合は、遺伝子の転写が抑制されていることを示し、メチル化されていない場合はプロモーター領域に転写因子が結合可能であるため、この遺伝子が転写されている、或いは転写可能な状態であることを示す。
【００３３】
前記遺伝子は、がん抑制遺伝子、がん遺伝子、及び腫瘍マーカーをコードする遺伝子（以下、腫瘍マーカー遺伝子とする）からなる群より選択される少なくとも１つであることが好ましい。がん抑制遺伝子としては、ＲＢ１（網膜芽細胞腫タンパク質：Retinoblastoma 1 protein）遺伝子、ＲＲＣＡ１遺伝子、ＡＰＣ（大腸腺腫症：Adenomatous polyosis of the colon）遺伝子、ｐ５３遺伝子、ｐ１６遺伝子、ｐ１５遺伝子、ＥＲα（エストロゲンレセプター１：Estrogen Receptor 1）遺伝子、Ｅ−ｃａｄ（Ｅカドヘリン）遺伝子、ＶＨＬ（von Hipple-Lindau病）遺伝子、ＲＡＳＳＦ１Ａ（RAS
association domain family protein）遺伝子等が挙げられ、がん遺伝子としては、ＲＡＳ遺伝子、ＲＡＦ遺伝子、ＭＹＣ遺伝子等が挙げられる。腫瘍マーカー遺伝子としては、ＣＥＡ（癌胎児性抗原：Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5）遺伝子、ＰＳＡ（前立腺特異抗原：Prostate specific antigen）遺伝子、ＣＡ１５−３遺伝子、ＥｐＣＡＭ（Epithelial cellular adhesion molecule）遺伝子等が挙げられる。
【００３４】
本発明の方法を用いてこれらの遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化を検出することにより、疾患に罹患するリスクや薬剤感受性の予測などの遺伝子検査に応用することができる。
例えば、所定の腫瘍細胞のがん抑制遺伝子のＣｐＧアイランドがメチル化されている場合及び／又はがん遺伝子のＣｐＧアイランドがメチル化されていない場合、この腫瘍細胞は悪性であると予測することができる。
また、抗がん剤などの特定の薬剤を細胞外に排出する遺伝子や薬剤を分解する遺伝子のＣｐＧアイランドがメチル化されている場合、この細胞は薬剤に対する耐性が低い、即ち、この薬剤に対して感受性であると判定することができる。
また、所定の腫瘍細胞の腫瘍マーカー遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化を検出することにより、腫瘍の種類を特定する（原発巣を特定する）ことも可能である。
また、がん細胞の存否が不明な生体試料を用いて上述の遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化を検出することにより、この生体試料に腫瘍細胞が含まれているか否かを判定することができ、腫瘍の早期発見や腫瘍に罹患するリスクの判定などを行うことができる。
【００３５】
従来のメチル化検出方法は、迅速法でも検出用試料の調製に約４時間を要していたため、臨床への応用が困難であったが、本発明の検出用試料の調製方法及びＤＮＡのメチル化検出方法は、短時間且つ簡便な操作で行うことができるため、上述のような遺伝子検査などの臨床検査に好適に用いることができる。
また、迅速且つ簡便な本発明の方法を用いることにより、ＤＮＡのメチル化に関する研究スピードを向上させることができる。
【実施例】
【００３６】
（実施例１）
本発明のＤＮＡのメチル化検出方法（以下、「本法」という）、迅速法及び標準法を用いて、ヒト乳癌由来の培養細胞であるＭＣＦ−７及びＭＤＡ２３１のＥＲα遺伝子及びＥ−ｃａｄ遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化状態を決定して、両者の結果を比較した。
本法の操作手順は以下の通りである。まず、ＭＣＦ−７細胞系又はＭＤＡ２３１細胞系の培養細胞（１×１０６ｃｅｌｌｓ）に、１％  ＳＤＳ，１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び２５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む試料処理液４００μｌを加えて室温で１０分間攪拌した（細胞の可溶化）。次に、１２μｌの１０Ｎ  ＮａＯＨを加えて１０分間室温でインキュベートした（ゲノムＤＮＡの切断）。そこへ、６００μｌの１０Ｍ  亜硫酸水素ナトリウム溶液を加え、７０℃で２０分間インキュベートした（非メチル化シトシンの変換）。そして、この亜硫酸水素塩処理されたゲノム溶液（検出用試料）を、ＤＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社製ＱｌＡｑｕｉｋ（商品名））を用いて回収した（ゲノムＤＮＡ精製工程）。
【００３７】
細胞の可溶化工程に約３０分、ゲノムＤＮＡの切断工程に約１０分、非メチル化シトシンの変換工程に約２０分、ゲノムＤＮＡ精製工程に約３０分要した。実験開始からＰＣＲに用いる検出用試料の調製までに約１．５時間を要した。
【００３８】
次に、回収した検出用試料２．０μｌと、以下の物質とを混合してＰＣＲ反応液を調製した。
１０×  ＰＣＲバッファー（２．５μｌ）
ｄＮＴＰ（０．５μｌ）
１０μＭ  センスプライマー（１．０μｌ）
１０μＭ  アンチセンスプライマー（１．０μｌ）
ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（０．２μｌ、Ｒｏｃｈｅ  １２０３２９０２００１）
水（１７．８μｌ）
【００３９】
ＥＲα遺伝子ＣｐＧアイランドのメチル化検出用プライマーとして、以下の変換配列に特異的なプライマーセット（以下、非メチル化プライマーセットとする）及び非変換配列に特異的なプライマーセット（以下、メチル化プライマーセットとする）を用いた。
＜非メチル化プライマーセット＞
センスプライマー：TTGTGTATAATTATTTTGAGGGTG  （配列番号１）
アンチセンスプライマー：CCAAACCATTAAAACCAAACACCA  （配列番号２）
＜メチル化プライマーセット＞
センスプライマー：TTTTGGGATTGTATTTGTTTTCGTC  （配列番号３）
アンチセンスプライマー：AACAAAATACAAACCGTATCCCCG  （配列番号４）
【００４０】
上記ＥＲα遺伝子ＣｐＧアイランドのメチル化検出のために調製したＰＣＲ反応液を用いて下記条件でＰＣＲを行った。
９５℃、４．５分
以下の工程i)〜iii)を４０サイクル；
i)  ９５℃、３０秒
ii) ６０℃、３０秒
iii)７２℃、３０秒
【００４１】
Ｅ−ｃａｄ遺伝子ＣｐＧアイランドのメチル化検出用プライマーとして、以下の非メチル化プライマーセット及びメチル化プライマーセットを用いた。
＜非メチル化プライマーセット＞
センスプライマー：5'-TAATTTTAGGTTAGAGGGTTATTGT-3'  （配列番号５）
アンチセンスプライマー：5'-CACAACCAATCAACAACACA-3'  （配列番号６）
＜メチル化プライマーセット＞
センスプライマー：5'-TTAGGTTAGAGGGTTATCGCGT-3'  （配列番号７）
アンチセンスプライマー：5'-TAACTAAAAATTCACCTACCGAC-3'  （配列番号８）
【００４２】
上記Ｅ−ｃａｄ遺伝子ＣｐＧアイランドのメチル化検出のために調製したＰＣＲ反応液を用いて下記条件でＰＣＲを行った。
９５℃、４．５分
以下の工程i)〜iii)を４０サイクル；
i)  ９５℃、３０秒
ii) 非メチル化プライマーセットを用いた場合は５３℃３０秒、メチル化プライマーセットを用いた場合は５７℃３０秒
iii)７２℃、３０秒
【００４３】
また、ネガティブコントロール（ＮＣ）として、ＤＮＡ溶液ではなく、精製水２．０μｌを用いてＰＣＲを行った。
ＥＲα遺伝子のプライマーセットを用いて行ったＰＣＲ反応後の反応液及びネガティブコントロール（ＮＣ）をそれぞれ、２％アガロースゲルのウェルに収容し、電気泳動を行った。
Ｅ−ｃａｄ遺伝子のプライマーセットを用いて行ったＰＣＲ反応後の反応液及びネガティブコントロールをそれぞれ、２％アガロースゲルのウェルに収容し、電気泳動を行った。
電気泳動後のアガロースゲルを臭化エチジウムで染色し、ＥＲα遺伝子及びＥ−ｃａｄ遺伝子のそれぞれのバンドの確認を行った。
【００４４】
迅速法は以下のようにして行われた。
ＭＣＦ−７細胞系又はＭＤＡ２３１細胞系の培養細胞（１×１０６ｃｅｌｌｓ）を用いてそれぞれの細胞からゲノム抽出を行った（ゲノムＤＮＡの抽出）。ゲノム抽出は、キアゲン社製のキット（商品名：Blood & Cell Culture DNA mini Kit）を用い、添付のプロトコルに従って行った。
ゲノムＤＮＡの抽出工程には約３時間を要した。実験開始からＰＣＲに用いる検出用試料の調製までに約４．５時間を要した。
抽出したゲノムＤＮＡを用いて、上記本法と同様にしてゲノムＤＮＡの切断工程及び非メチル化シトシンの変換工程を行い、ゲノム溶液を得た。さらにこのゲノム溶液を用いて上記本法と同様にしてＰＣＲ及びアガロースゲル電気泳動を行い、バンドの確認を行った。
【００４５】
標準法は、非メチル化シトシンの変換工程において、３Ｍの亜硫酸水素ナトリウム溶液５２０μｌを加え、５０℃１６時間インキュベートすること以外は迅速法と同様にしてＰＣＲの反応液の調製、ＰＣＲ及びアガロースゲル電気泳動を行い、バンドの確認を行った。実験開始からＰＣＲに用いる検出用試料の調製までに約２０．５時間を要した。
【００４６】
本法、迅速法及び標準法を用いて得られた電気泳動の結果を図１に示す。図１には、ＭＣＦ−７細胞のＥＲα遺伝子ＣｐＧアイランド及びＥ−ｃａｄ遺伝子ＣｐＧアイランドのメチル化検出結果と、ＭＤＡ２３１細胞のＥＲα遺伝子ＣｐＧアイランド及びＥ−ｃａｄ遺伝子ＣｐＧアイランドのメチル化検出結果とが示される。
図１より、本法、迅速法及び標準法の何れを用いても、ＭＣＦ−７細胞のＥＲα遺伝子のＣｐＧアイランド及びＥ−ｃａｄ遺伝子のＣｐＧアイランドがメチル化されていないことが判明した。
また、本法、迅速法及び標準法の何れを用いても、ＭＤＡ２３１細胞のＥＲα遺伝子のＣｐＧアイランド及びＥ−ｃａｄ遺伝子のＣｐＧアイランドがメチル化されていないことが判明した。
以上より、本法を用いることにより、短時間且つ簡便な操作で従来用いられている方法と同じ検出結果を得られることが確認された。
【００４７】
（実施例２）
実施例１の本法により、ＭＣＦ−７細胞及びＭＤＡ２３１細胞のＥ−ｃａｄ遺伝子ＣｐＧアイランドのメチル化を検出した（実施例２−１）。
【００４８】
また、切断剤ＮａＯＨを試料処理液に含有させることにより、細胞の可溶化工程と切断工程とを一度の操作で行い、Ｅ−ｃａｄ遺伝子ＣｐＧアイランドのメチル化の検出を行った（実施例２−２）。即ち、１％  ＳＤＳ，１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び０．３Ｎ  ＮａＯＨを含む試料処理液４１２μｌを用いること以外は実施例１の本法と同様にしてゲノム溶液（検出用試料）を得た。
細胞の可溶化及びゲノムＤＮＡの切断工程に約３０分、非メチル化シトシンの変換工程に約２０分、ゲノムＤＮＡ精製工程に約３０分要した。実験開始からＰＣＲに用いる検出用試料の調製までに約１時間２０分を要した。
【００４９】
ＰＣＲ反応液は、Ｅ−ｃａｄ遺伝子用のメチル化プライマーセット及び非メチル化プライマーセットを用いて調製され、実施例１と同様にしてＰＣＲ及びアガロースゲル電気泳動を行ってバンドの確認を行った。
【００５０】
実施例２−１及び２−２の電気泳動の結果を図２に示す。
図２より、実施例２−１で得られたメチル化の検出結果と、実施例２−２で得られたメチル化の検出結果とは、整合していた。
従って、切断剤を試料処理液に添加して細胞の可溶化工程とゲノムＤＮＡの切断工程とを一度の操作で行った場合（実施例２−２）、より短時間且つ簡便な操作で正確にメチル化を検出できることが確認された。
【００５１】
（実施例３）
本法と標準法を用いた場合の非メチル化シトシンからウラシルへの変換効率を比較した。
実施例１でＭＣＦ−７及びＭＤＡ２３１から調整した検出用試料に、以下に示すＥＲα遺伝子ＣｐＧアイランドにハイブリダイズするプライマーを添加して、上述の本法と同様の操作手順によりＰＣＲ反応液を調製してＰＣＲ増幅を行った。
プライマーの配列は以下の通りである。
5'-GGTTTTTGAGTTTTTTGTTTTG-3'（配列番号９）
5'-AACTTACTACTATCCAAATACACCTC-3'（配列番号１０）
増幅産物をｐＣＲ−ＴＯＰＯベクター（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組み込み、このプラスミドを大腸菌（ＴＯＰ１０）にトランスフォームした。この大腸菌を培養し（ＬＢ培地、３７℃、一晩静置）、１０コロニーをピックアップした。ピックアップされた１０コロニー（クローン１〜１０）をさらに別々の容器に収容して培養し（ＬＢ培地、３７℃一晩振とう）、これらのクローンのプラスミドを、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ（キアゲン社）によりそれぞれ精製した。精製した１０クローンのプラスミドを用い、組み換えＤＮＡのヌクレオチド配列を、ＢｉｇＤｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法によりＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１００（アプライドバイオシステムズ社）を使用して、添付のプロトコルに従って決定した。
【００５２】
同様にして、標準法で得られた検出用試料から増幅された産物を大腸菌にトランスフォームし、培養した後、１０コロニー（クローン１１〜２０）をさらに培養した。これらのクローンの配列を上記と同様にして決定した。
【００５３】
Ｇｅｎｅｔｙｘ−ｗｉｎ（ソフトウェア開発株式会社）を用いて、理論的に全ての非メチル化シトシンが完全にウラシルに置換された場合に得られる配列（以下、理論配列とする：配列番号１１）と、本法で得られた１０クローン（クローン１〜１０）の配列（配列番号１２〜２１）とのマルチプルアラインメントを行った。この結果を図３及び４に示す。また、同様にして標準法で得られた理論配列（配列番号２２）と１０クローン（クローン１１〜２０）の配列（配列番号２３〜３２）とのマルチプルアラインメントを行った。この結果を図５及び６に示す。
なお、図３〜６のヌクレオチド配列は、ＰＣＲ反応後の配列であるため、非メチル化シトシンから変換されたウラシルは、チミンとして表記されている。
【００５４】
図３及び４より、本法を用いて非メチル化シトシンからウラシルへの変換を行った場合、クローン１の４６位、及びクローン２の４２位のヌクレオチドの塩基がシトシンのまま、ウラシルに変換されなかったことが分かる（図中、下線で示す）。
図５及び６より、標準法を用いて非メチル化シトシンからウラシルへの変換を行った場合、クローン１２の９０位、１４６位、１６９位、及びクローン１４の７６位のヌクレオチドの塩基がシトシンのままウラシルに変換されなかったことが分かる（図中、下線で示す）。
即ち、標準法では４カ所で変換が行われなかったが、本法で変換が行われなかったのは２カ所のみであった。
以上より、本法を用いて試料の調製を行うことにより、標準法と同等かそれ以上の効率で非メチル化シトシンのウラシルへの変換が行われることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】本法、迅速法及び従来法で行ったＥＲα遺伝子ＣｐＧアイランド及びＥ−ｃａｄ遺伝子ＣｐＧアイランドのメチル化検出結果を示す図である。
【図２】本法で行ったＥ−ｃａｄ遺伝子ＣｐＧアイランドのメチル化検出結果を示す図である。
【図３】本法を用いてメチル化検出したＥＲα遺伝子ＣｐＧアイランドの遺伝子配列を示す図である。
【図４】同じく本法を用いてメチル化検出したＥＲα遺伝子ＣｐＧアイランドの遺伝子配列を示す図である。
【図５】標準法を用いてメチル化検出したＥＲα遺伝子ＣｐＧアイランドの遺伝子配列を示す図である。
【図６】同じく標準法を用いてメチル化検出したＥＲα遺伝子ＣｐＧアイランドの遺伝子配列を示す図である。
【図３】
2007259750.tif 000003
【図４】
2007259750.tif 000004
【図５】
2007259750.tif 000005
【図６】
2007259750.tif 000006
【図１】
2007259750.tif 000007
【図２】
2007259750.tif 000008
【配列表】
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