(57)【要約】【課題】  検体である微生物が乾燥した状態でも蛍光測定が可能な細胞染色方法を提供すること。【解決手段】  蛍光色素に、二本鎖DNAの検出に用いるインターカレータであって、二本鎖DNAに結合する結合部と、有機EL色素から成り連結部を介して結合部と結合された少なくとも１つの発色部とを有するインターカレータを用いる。そのインターカレータにより被検液中の微生物を染色して微生物の蛍光を測定する。【選択図】図３
2007006788.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光色素を用いる細胞染色方法であって、
上記蛍光色素に、二本鎖DNAの検出に用いるインターカレータであって、二本鎖DNAに結合する結合部と、有機EL色素から成り連結部を介して結合部と結合された少なくとも１つの発色部とを有するインターカレータを用いる細胞染色方法。
【請求項２】
上記インターカレータに、生細胞及び死細胞を染色する第１のインターカレータと、第１のインターカレータとは異なる発光波長を有し、死細胞を染色する第２のインターカレータとを用い、第１及び第２のインターカレータを発光させて生細胞と死細胞を識別する請求項１記載の細胞染色方法。
【請求項３】
上記第１のインターカレータには荷電基を含有しないインターカレータを用い、第２のインターカレータには、荷電基を含有するインターカレータを用いる請求項２記載の細胞染色方法。
【請求項４】
上記蛍光色素により染色した細胞を乾燥状態とし、細胞の蛍光を測定する請求項１から３のいずれか一つに記載の細胞染色方法。
【請求項５】
細胞染色に用いる蛍光色素であって、
二本鎖DNAに結合する結合部と、有機EL色素から成り連結部を介して結合部と結合された少なくとも１つの発色部とを有するインターカレータから成る蛍光色素。
【請求項６】
上記有機EL色素が、共役系を有する５員環化合物を含む化合物であって、該５員環化合物は１種以上のヘテロ原子、セレン原子又はボロン原子を含む請求項５記載の蛍光色素。
【請求項７】
上記有機EL色素が、上記５員環化合物と共役系を有する６員環化合物とから成る縮合多環化合物である請求項６記載の蛍光色素。
【請求項８】
上記５員環化合物が、アゾール誘導体又はイミダゾール誘導体である請求項６又は７に記載の蛍光色素。
【請求項９】
上記結合部が、単環又は多環芳香族基から成る請求項５から８のいずれか一つに記載の蛍光色素。
【請求項１０】
上記結合部が、アントラセン基、フェナントレン基、ピレン基、フルオレン基、ビフェニレン基、ナフタレンジイミド基、ナフタレンイミド基、アクリジン基そしてフェニルジイミド基から成る群から選択されたいずれか１種である請求項９記載の蛍光色素。
【請求項１１】
上記インターカレータが、結合部の両側に連結部を介して結合された発色部を有する縫い込み型インターカレータである請求項５から１０のいずれか一つに記載の蛍光色素。
【請求項１２】
上記インターカレータが、荷電基を含有し死細胞を染色する請求項５記載の蛍光色素。
【請求項１３】
上記荷電基がスルホニル基又は４級アミノ基である請求項１２記載の蛍光色素。
【請求項１４】
上記インターカレータが、荷電基を含有せず、生細胞と死細胞を染色する請求項５記載の蛍光色素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の形態や構造を観測したり、細胞の数やその種類を検査したりするための細胞染色方法に関し、さらに詳しくは医療分野や食品衛生分野における微生物学的検査に使用される細胞染色法及びそれに用いる蛍光色素に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品衛生分野における微生物学的検査には、被検材料を寒天平板培地等により所定時間培養し、出現するコロニーについて肉眼あるいは光学顕微鏡により菌数を計測する方法が広く使用されている。しかし、この方法は検査に２４時間以上を要し、また操作も煩雑である。そこで、より迅速で簡便な検査方法の一つとして、蛍光色素により染色した微生物の蛍光を測定し微生物を検出する、いわゆる蛍光染色法を用いた検査方法が提案されている。また、医療分野においても、臨床検査において細菌の塗抹検査等に蛍光染色法が用いられている。更に、臨床において、ヒト細胞の状態を観察することも可能である。
【０００３】
例えば、特許文献１には、生菌細胞及び死菌細胞に浸透するフルオレセイン若しくはその誘導体からなる蛍光染料と、死菌細胞に浸透するプロデュームイオダイドからなる蛍光染料を用い、それらの蛍光染料で染色した染色菌液を透光板上に滴下し、その透光板に励起光を照射し、染色菌液の発光数により、菌の種類及び生菌と死菌の菌数を拡大レンズにより視認する方法が開示されている。また、特許文献２には、生死細胞を発色させる第１の化合物と死細胞を発色させる第２の化合物を検出試薬として用い、微生物を含む被検液を付着プレート上に滴下し、その付着プレート上の被検液に検出試薬を滴下し、その付着プレートに励起光を照射し、蛍光波長及びその強度から生細胞と死細胞の数を計測する方法が開示されている。
【特許文献１】特開平９−２７５９９８号公報
【特許文献２】特開２００１−２８６２９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記の特許文献１及び２の方法に開示される蛍光染色法は、従来の培養法に比べ、検査時間を大幅に短縮できるのみならず、生細胞と死細胞の数を個別に算出できるというという利点を有している。しかしながら、従来の蛍光色素を用いた場合、蛍光測定時、溶液状態でなければ発光しないため、励起光の照射に伴いあるいは時間経過に伴い水分が蒸発し検体である微生物が乾燥状態となると、消光しあるいは蛍光強度が低下し測定が困難になるという問題があった。
【０００５】
そこで、本発明は上記課題を解決し、検体である微生物が乾燥した状態でも蛍光測定が可能な細胞染色方法を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するため、本発明の細胞染色方法は、蛍光色素を用いる細胞染色方法であって、上記蛍光色素に、二本鎖DNAの検出に用いるインターカレータであって、二本鎖DNAに結合する結合部と、有機EL色素から成り連結部を介して結合部と結合された少なくとも１つの発色部とを有するインターカレータを用いることを特徴とする。
【０００７】
ここで、インターカレータに、生細胞及び死細胞を染色する第１のインターカレータと、第１のインターカレータとは異なる発光波長を有し、死細胞を染色する第２のインターカレータとを用い、第１及び第２のインターカレータを発光させて生細胞と死細胞を識別することもできる。
【０００８】
また、第１のインターカレータには荷電基を含有しないインターカレータを用い、第２のインターカレータには、荷電基を含有するインターカレータを用いることができる。
【０００９】
また、被検液中の検体細胞である微生物を濾別し、濾材に捕捉した微生物を蛍光色素により染色する方法を用いることができる。さらに、蛍光色素により染色した微生物を乾燥状態とし、微生物の蛍光を測定することができる。
【００１０】
本発明の細胞染色方法には、以下の蛍光色素を用いることができる。すなわち、細胞染色に用いる蛍光色素であって、二本鎖DNAに結合する結合部と、有機EL色素から成り連結部を介して結合部と結合された少なくとも１つの発色部とを有するインターカレータから成ることを特徴とする。
【００１１】
ここで、有機EL色素には、共役系を有する５員環化合物を含む化合物であって、該５員環化合物は１種以上のヘテロ原子、セレン原子又はボロン原子を含むものを用いることができる。さらに、この５員環化合物と共役系を有する６員環化合物とから成る縮合多環化合物を用いることができる。この５員環化合物には、アゾール誘導体又はイミダゾール誘導体を用いることができる。
【００１２】
また、結合部には、単環又は多環芳香族基を用いることができる。例えば、アントラセン基、フェナントレン基、ピレン基、フルオレン基、ビフェニレン基、ナフタレンジイミド基、ナフタレンイミド基、アクリジン基、フェニルジイミド基、ベンゾチアゾール基、ベンゾイミダゾール基、キノリン基、フェナントリジン基そしてインドール基から成る群から選択されたいずれか１種を用いることができる。
【００１３】
また、インターカレータに、結合部の両側に連結部を介して結合された発色部を有する縫い込み型インターカレータを用いることができる。
【００１４】
また、荷電基を含有するインターカレータは、死細胞の染色に用いることができる。この荷電基には、スルホニウム基や４級アミノ基、カルボキシル基等を用いることができる。また、荷電基を含有しないインターカレータは、生細胞と死細胞の染色に用いることができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の細胞染色方法によれば、蛍光色素に、二本鎖DNAの検出に用いるインターカレータであって、二本鎖DNAに結合する結合部と、有機EL色素から成り連結部を介して結合部と結合された少なくとも１つの発色部とを有するインターカレータを用いる。本発明に用いるインターカレータは細胞内の核に侵入し染色体中のDNAと結合するが、従来の蛍光色素と異なり、染色した微生物が乾燥した状態でも消光することがない。そのため、検体の微生物が乾燥状態であっても高感度の蛍光測定を行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明の細胞染色方法は、蛍光色素を用いる細胞染色方法であって、蛍光色素に、二本鎖DNAの検出に用いるインターカレータであって、二本鎖DNAに結合する結合部と、有機EL色素から成り連結部を介して結合部と結合された少なくとも１つの発色部とを有するインターカレータを用いることを特徴とするものである。
【００１７】
本発明の細胞染色方法には、細胞の形態や構造を観測したり、細胞の数やその種類を検査したりするために核を染色するすべての細胞染色方法が含まれる。特に、微生物学的検査に好適に用いることができる。本発明が対象とする微生物には、細菌、真菌、原虫が含まれ、さらに、細菌には、グラム陽性菌、グラム陰性菌、そしてグラム不定性菌が含まれる。
【００１８】
本発明に用いるインターカレータは、二本鎖DNAと結合する結合部と、有機EL色素から成り連結部を介して結合部と結合する少なくとも１つの発色部とからなるが、以下の一般式（１）〜（３）で表されるものが含まれる。
（１）  （D1−L1）−I
（２）  （D1−L1）−I−L2
（３）  （D1−L1）−I−（L2−D2）
ここで、D1と D2 は発色部、L1 とL2 は連結部、そしてIは結合部を表す。また（３）は、結合部の両側に連結部を介して発色部が結合した、いわゆる縫い込み型のインターカレータを表す。一般に、インターカレータと二本鎖DNAと結合反応は、インターカレータの挿入と脱離に規定される平衡関係にある。したがって、インターカレータが脱離しやすいと、蛍光強度は低下する。しかし、縫い込み型インターカレータは、一方の発色部が二本鎖DNAの塩基対間を通り抜け、他方の発色部が二本鎖DNAからの脱離を抑制するストッパーとしての役割を果たすため、高い蛍光強度が期待できる。また、分子内に２つの発色部を有しているので、１つの発色部の場合に比べ２倍の蛍光強度を期待できるという利点も有する。
【００１９】
結合部（インターカレート基）は、二本鎖DNAの塩基対と塩基対との間に介入することにより、二本鎖DNAと結合するものであり、ヘテロ原子を含んでもよい単環又は多環芳香族基を用いることができる。好ましくは多環芳香族基、さらに好ましくは平面性の大きい縮合芳香族基を用いることができる。具体例を挙げれば、アントラセン基、フェナントレン基、ピレン基、フルオレン基、ビフェニレン基、ナフタレンジイミド基、ナフタレンイミド基、そしてフェニルジイミド基から成る群から選択されたいずれか１種、さらに好ましくはアントラセン基、フェナントレン基、ピレン基又はナフタレンジイミド基を用いることができる。なお、ナフタレンジイミド基には、1,8,4,5-ナフタレンジイミドと2,3,6,7-ナフタレンジイミドが含まれる。
【００２０】
なお、インターカレータでない従来の蛍光試薬、例えば、以下の蛍光色素を本発明の結合部に用いることができる。これら従来の蛍光色素は、検体が乾燥状態では消光するので、この従来の蛍光色素を結合部として含むインターカレータは、発色基からの発光のみを観測することができる。従来の蛍光色素としては、例えば、9-chloromethylacridine、9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine(ACMA)、4',6-diamidino-2-phenylindole、dihydrochloride(DAPI)、propidium iodide、TOTO(R)-1-iodide(514/533)、TO-PRO(R)-1-iodide(515/531)、acridine homodimer、acridine orange、Hoechst 33258等を挙げることができる。
【００２１】
［化１］
2007006788.tif 000003
【００２２】
［化２］
2007006788.tif 000004
【００２３】
［化３］
2007006788.tif 000005
【００２４】
［化４］
2007006788.tif 000006
【００２５】
［化５］
2007006788.tif 000007
【００２６】
［化６］
2007006788.tif 000008
【００２７】
［化７］
2007006788.tif 000009
【００２８】
［化８］
2007006788.tif 000010
【００２９】
連結基には、一般式A１-R１-A２ (2)で表される化合物を用いることができる。ここで、A１は上記インターカレート基と結合する第１結合基、A２は上記発色基と結合する第２結合基、そしてR１は第１結合基と第２結合基を連結するスペーサ基である。
具体例として、スペーサ基にはアルキレン基又は主鎖にヘテロ原子を含むアルキレン基を用いることが好ましい。アルキレン基には、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基を用いることが好ましい。また、主鎖にヘテロ原子を含むアルキレン基としては、エチレンオキサイド基を用い、繰り返し数を１から５とすることが好ましい。
【００３０】
また、第１結合基にはヘテロ原子、好ましくは酸素原子、窒素原子を用いることができる。また、第２結合基には置換又は未置換のアルキル基、エーテル基、チオエーテル基、置換又は未置換のイミノ基、アミド基、そしてエステル基からなる群から選択されたいずれか１種を用いることが好ましい。
【００３１】
なお、従来の蛍光色素を本発明のインターカレータの結合部に用いる場合、従来の蛍光色素と発色基の活性エステル体とを縮合させることによりインターカレータを合成するこ    ［化１］に示すように、従来の蛍光色素として、9-chloromethylacridineを用いる場合、アミノアルコールをアルコラートへ誘導した後、9-chloromethylacridineと反応させて、そのアミノ基含有誘導体を合成し、次いで、例えばオキサジアゾール活性エステルと反応させることにより、9-chloromethylacridineを結合部とするインターカレータを得る    ［化２］に示すように、ACMA誘導体とオキサジアゾール活性エステルとを反応させることにより、ACMA誘導体を結合部とするインターカレータを得ることができる。
【００３２】
［化９］
2007006788.tif 000011
【００３３】
［化１０］
2007006788.tif 000012
【００３４】
ここで、連結基の役割について説明する。
連結基は、第１結合基と第２結合基とにより、発色基とインターカレート基との連結を確保する。さらに、スペーサ基の存在は、発色基とインターカレート基との物理的距離を確保して、発色基とインターカレート基の分子骨格の選択の自由度を確保する一方、発色基とインターカレート基とのスタッキングを抑制して発色基の発光波長の変化あるいは発光強度の低下を防止する。また、第１結合基に窒素原子などのヘテロ原子を用いると、分子全体をより剛直な構造とすることができるので、スタッキングをさらに抑制することができる。また、酸素原子などを導入することで柔軟な分子構造となり、スタッキング強度をコントロールすることが可能である。
【００３５】
また、本発明においては、結合部が連結部を兼ねることができ、その例としてはペプチド化合物を挙げることができる。ここで、ペプチド化合物を構成するアミノ酸は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、オルニチン、より好ましくはリジンであり、より強く二本鎖DNAに結合することができる。ペプチド化合物は、さらにアクリジンを含むことが好ましい。より強く二本鎖DNAに結合することができるからである。なお、以下、ペプチド化合物を含むインターカレータをペプチドインターカレータという。
【００３６】
本発明に用いる有機EL色素は、一対の陽極と陰極との間に固体状態で挟持され、陽極から注入された正孔と陰極から注入された電子とが再結合する際のエネルギーにより発光可能な色素であれば特に限定されない。例えば、テトラフェニルブタジエンやペリレン等の多環芳香族化合物、シクロペンタジエン誘導体、ジスチリルピラジン誘導体、アクリドン誘導体、キナクドリン誘導体、スチルベン誘導体、フェノチアジン誘導体、ピラジノピリジン誘導体、アゾール誘導体、イミダゾール誘導体、カルバゾール誘導体そしてテトラフェニルチオフェン誘導体等を用いることができる。
【００３７】
本発明の検出方法に用いる好ましい有機EL色素は、共役系を有する５員環化合物を含む化合物であって、その５員環化合物が１種以上のヘテロ原子、セレン原子又はボロン原子を含むものを挙げることができる。さらに、詳しくは共役系を有する５員環化合物から成る単環化合物と、その５員環化合物と共役系を有する６員環化合物から成る縮合多環化合物を挙げることができる。固体状態であっても、量子収率が大きく、強い蛍光を示すからである。
【００３８】
以下に、縮合多環化合物の具体例について説明する。
（モノアゾール誘導体１）
［化１１］
2007006788.tif 000013
【００３９】
ここで、式中、R1、 R2、 R3、 R4、 R6、 R7は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、シアノ基、あるいはスルホニル基などの置換基を有しても良い芳香族炭化水素基又は炭化水素基又は複素環基又はヘテロ原子を環内に含む芳香族基を示す。R1、 R2、 R3、 R4、 R6、 R7は同じでも異なっていてもよい。
R'は芳香環を含んでも良いアルキル基又はアルケニル基等の脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基、An-は、Cl-、Br-、I-等のハロゲン化物イオン、CF3SO3-、BF4-、PF6-を示す。なお、以下の一般式においても、特に断らない限り同様である。
【００４０】
（モノアゾール誘導体２）
［化１２］
2007006788.tif 000014
【００４１】
ここで、式中、R8、R9は、それぞれ、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基などの置換基を有しても良い芳香族炭化水素基又は炭化水素基又は複素環基又はヘテロ原子を環内に含む芳香族基を示す。R8、R9は同じでも異なっていてもよい。なお、以下の一般式においても、特に断らない限り同様である。また、nは１以上の整数、好ましくは１〜５であり、以下の一般式中でも同様である。
【００４２】
（ジアゾール誘導体１）
［化１３］
2007006788.tif 000015
【００４３】
（ジアゾール誘導体２）
［化１４］
2007006788.tif 000016
【００４４】
（ジアゾール誘導体３）
［化１５］
2007006788.tif 000017
【００４５】
ここで、式中、R1、 R2、 R3、 R4は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、シアノ基、あるいはスルホニル基などの置換基を有しても良い芳香族炭化水素基又は炭化水素基又は複素環基又はヘテロ原子を環内に含む芳香族基を示す。R1、 R2、 R3、 R4、 R6、 R7は同じでも異なっていてもよい。R2、 R3は、置換基を有しても良い芳香族炭化水素基を用いることが好ましく、その置換基には炭素数１から４のアルキル基やアルコキシ基、又は臭素原子を用いることが好ましい。さらに、アルキル基にはメチル基、アルコキシ基にはメトキシ基を用いることが好ましい。また、Xは、置換基を有しても良い窒素原子、硫黄原子、酸素原子、セレン原子又はボロン原子であり、特に断らない限り以下の一般式中でも同様である。
【００４６】
（ジアゾール誘導体４）
［化１６］
2007006788.tif 000018
【００４７】
（ジアゾール誘導体５）
［化１７］
2007006788.tif 000019
ここで、N→Oは、窒素原子が酸素原子に配位結合している状態を示す。
【００４８】
（ジアゾール誘導体６）
［化１８］
2007006788.tif 000020
【００４９】
（ジアゾール誘導体７）
［化１９］
2007006788.tif 000021
【００５０】
（ジアゾール誘導体８）
［化２０−１］
2007006788.tif 000022
【００５１】
［化２０−２］
2007006788.tif 000023
【００５２】
ここで、式中、R10、R11は、それぞれ、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、シアノ基、あるいはスルホニル基などの置換基を有しても良い芳香族炭化水素基又は炭化水素基又は複素環基又はヘテロ原子を環内に含む芳香族基を示す。R10、 R11は同じでも異なっていてもよい。また、R12は、置換基を有してもよいオレフィン基又はパラフィン基であり、nは１から３の整数、好ましくは１である。なお、以下の一般式においても、特に断らない限り同様である。
【００５３】
（ジアゾール誘導体９）
［化２１−１］
2007006788.tif 000024
【００５４】
［化２１−２］
2007006788.tif 000025
【００５５】
上記のジアゾール誘導体ではあれば特に限定されないが、以下の一般式で表されるオキサジアゾロピリジン誘導体を好適に用いることができる。
［化２２］
2007006788.tif 000026
【００５６】
オキサジアゾロピリジン誘導体は、そのカルボン酸誘導体を合成後、例えば、以下のスキーム２に示す反応により、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）を縮合剤として用い、N−ヒドロキシ−スクシンイミドエステルを含む活性エステル体へ誘導したものを用いることができる。
【００５７】
［化２３］
2007006788.tif 000027
スキーム２．
【００５８】
（トリアゾール誘導体１）
［化２４］
2007006788.tif 000028
【００５９】
（トリアゾール誘導体２）
［化２５］
2007006788.tif 000029
【００６０】
５員環化合物として、チオフェン基を含む以下の誘導体を用いることもできる。
（チオフェン誘導体１）
［化２６］
2007006788.tif 000030
【００６１】
（チオフェン誘導体２）
［化２７］
2007006788.tif 000031
【００６２】
（チオフェン誘導体３）
また、チオフェン誘導体の場合、非縮合系の化合物であり、以下の一般式で示される2,3,4,5-テトラフェニルチオフェン誘導体を用いることもできる。
【００６３】
［化２８］
2007006788.tif 000032
【００６４】
ここで、式中、R13,R14,R15はそれぞれ独立に、水素原子、直鎖、分岐または環状のアルキル基、置換または未置換のアリール基、あるいは置換または未置換のアラルキル基を表し、Ar1およびAr2は置換または未置換のアリール基を表し、さらに、Ar1とAr2は結合している窒素原子と共に含窒素複素環を形成してもよい。また、Y1およびY2は水素原子、ハロゲン原子、直鎖、分岐または環状のアルキル基、直鎖、分岐または環状のアルコキシ基、置換または未置換のアリール基、置換または未置換のアラルキル基、あるいは置換または未置換のアミノ基を表す。
【００６５】
（チオフェン誘導体４）
また、以下の一般式で示される2,3,4,5-テトラフェニルチオフェン誘導体を用いることもできる。
【００６６】
［化２９］
2007006788.tif 000033
【００６７】
ここで、式中、Ar1〜Ar6はそれぞれ独立に、置換または未置換のアリール基を表し、さらに、Ar1とAr2、Ar3とAr4およびAr5とAr6は結合している窒素原子と共に含窒素複素環を形成していても良い。
【００６８】
また、５員環化合物にイミダゾールを用い、以下の一般式で示すイミダゾール誘導体を用いることもできる。ここで、イミダゾール誘導体を構成するイミダゾール基は４級アミノ基を有することが好ましい。水溶性を向上させることができるからである。さらに、ピリジノ基を含む場合、より水溶性を向上させるために、ピリジノ基も４級アミノ基を有していても良い。なお、以下の一般式中、R''は芳香環を含んでも良いアルキル基又はアルケニル基等の脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基を示す。
【００６９】
（イミダゾール誘導体１）
［化３０］
2007006788.tif 000034
【００７０】
（イミダゾール誘導体１）
［化３１］
2007006788.tif 000035
【００７１】
（イミダゾール誘導体２）
［化３２］
2007006788.tif 000036
【００７２】
（イミダゾール誘導体３）
［化３３−１］
2007006788.tif 000037
【００７３】
［化３３−２］
2007006788.tif 000038
【００７４】
ここで、イミダゾール骨格は中央のベンゼン環R8, R9, R10, R11 の任意の位置に複数ユニットが結合していても良い。また、R12は、置換基を有してもよいオレフィン基又はパラフィン基であり、nは１から３の整数、好ましくは１である。
【００７５】
（カルバゾール誘導体）
また、以下の一般式で示されるカルバゾール誘導体を用いることもできる。
【００７６】
［化３４］
2007006788.tif 000039
【００７７】
また、共役系を有する５員環化合物であって、１種以上のヘテロ原子、セレン原子又はボロン原子を含む単環化合物を用いることもできる。特に限定されないが、例えば、以下の一般式で表されるアゾール誘導体を用いることができる。
【００７８】
［化３５］
2007006788.tif 000040
【００７９】
ここで、式中、R1、 R4、 R5は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、シアノ基、あるいはスルホニル基などの置換基を有しても良い芳香族炭化水素基又は炭化水素基又は複素環基又はヘテロ原子を環内に含む芳香族基を示す。R1、 R4、 R５は同じでも異なっていてもよい。
【００８０】
本発明の細胞染色方法は、例えば以下の手順で行うことができる。
（生細胞と死細胞の全体数を計測する場合）
死滅した細胞であっても、産生された毒素が残存する場合、死細胞も有害であるので、生細胞と死細胞の全体数を計測する必要があり、死細胞のみを別途測定する必要がない場合である。この場合、上述したインターカレータの中で、荷電基、具体的にはスルホニル基を含有しないインターカレータを用いることが好ましい。荷電基を含有しないインターカレータ（第１のインターカレータ）は、生細胞の細胞膜を透過して核の染色体のDNAを染色し、かつ死細胞の核の染色体のDNAを染色することから生細胞と死細胞の全体を染色することができる。
【００８１】
具体的には、検体が固体である場合には、これに滅菌水を加えてホモジナイズし、必要に応じて希釈して被検液とする。また、検体が液体の場合には、そのまま被検液とする。
また、拭き取り検査の場合は、拭き取りに使用した部材を滅菌水に浸漬して被検液とする。これらの被検液を濾別して、濾材に微生物を捕捉する。濾材には、微生物を捕捉可能な、1.0μｍ以下、より好ましくは0.4μｍ以下の孔径を有するものであれば、濾紙、酢酸セルロース膜、ポリカーボネート膜、テフロン膜等の公知の濾材を用いることができる。濾材に固定した微生物に、第１のインターカレータを滴下して、微生物を染色する。ここで、過剰の第１のインターカレータは濾過されて除去される。自然乾燥あるいは冷風ドライヤーで微生物を乾燥させた後、蛍光顕微鏡により、発光数から生細胞と死細胞の全体数を計測する。
【００８２】
（生細胞と死細胞の全体数と死細胞数とを計測する場合）
例えば、殺菌の効果を調べたり、死細胞が毒素を産生しない場合等、生細胞の数を算出する必要がある場合である。この場合、生細胞と死細胞の全体数を計測し、かつ死細胞数を計測し、細胞の全体数から死細胞数を差し引いて生細胞数を算出する。
【００８３】
具体的には、上述のようにして被検液中の微生物を濾材に捕捉する。次いで、濾材に捕捉した微生物に第１のインターカレータを滴下し、第１のインターカレータにより生細胞と死細胞を染色する。次いで、荷電基、好ましくはスルホニル基を含有するインターカレータ（第２のインターカレータ）を滴下して、死細胞を染色する。ここで、第１のインターカレータと第２のインターカレータは異なる励起波長と発光波長を有しているので、第１のインターカレータと第２のインターカレータを同時に異なる励起波長で励起し、それぞれの発光数を計測することにより、細胞の全体数と死細胞数を算出し、これから生細胞数を算出することができる。なお、第１のインターカレータと第２のインターカレータの滴下順序を上記と逆に、最初に第２のインターカレータを滴下し、次いで第１のインターカレータを滴下しても良い。また、第１のインターカレータと第２のインターカレータを別々に励起する方法を用いることもできる。例えば、最初に第１のインターカレータを励起して細胞の全体数を計測し、次いで第２のインターカレータを励起して死細胞数を計測することもできる。また、逆に、最初に第２のインターカレータを励起して死細胞数を計測し、次いで第１のインターカレータを励起して全体の細胞数を計測することもできる。
【００８４】
ここで、第１のインターカレータの好ましい例を挙げると、結合部にアントラセン基、ナフタレンジイミド基、アクリジン基のいずれか１種を用い、発色部に、荷電基を含有しない、アゾール誘導体又はイミダゾール誘導体、より好ましくはアゾール誘導体、さらに好ましくは［化２２］で示されるオキサジアゾロピリジン誘導体又は［化１５］中のベンゾチアジアゾール誘導体を用いたインターカレータである。
また、第２のインターカレータの好ましい例を挙げると、結合部にアントラセン基、ナフタレンジイミド基、アクリジン基のいずれか１種を用い、発色部に、荷電基を含有する、アゾール誘導体又はイミダゾール誘導体、より好ましくはアゾール誘導体、さらに好ましくは［化２２］で示されるオキサジアゾロピリジン誘導体又は［化１５］中のベンゾチアジアゾール誘導体を用いたインターカレータである。ここで、荷電基には、スルホニル基や４級アミノ基が含まれるが、スルホニル基を含むことが好ましい。
【００８５】
荷電基は、例えば、以下の方法により導入することができる。
アントラセン基又はナフタレンジイミド基の連結部に１級、２級及び３級アミノ基を有する化合物を塩基性下にて処理することにより荷電を持たないインターカレータを合成することができる。一方、荷電基を導入するには、酸性下にて処理を行うことで４級アミノ基を形成することにより、荷電を有するインターカレータを合成することができる。あるいは、アントラセン基又はナフタレンジイミド基の連結部末端に１級もしくは２級アミノ基を導入し、分子内に２カ所のアミノ基を存在させる。その内の一カ所のアミノ基と活性エステル体を反応させることで片末端に一つのアミノ基を持たせたインターカレータを合成する。塩基性下にて処理することにより荷電を持たないインターカレータを合成することができる。又は酸性下にて処理を行うことで４級アミノ基を形成し、荷電を有するインターカレータを合成することができる。
【００８６】
また、本発明の細胞染色方法は、抗酸菌塗抹検査方法にも適用することができる。この場合、塗抹標本に第１のインターカレータを滴下し、自然乾燥又は冷風ドライヤーにより塗抹標本を乾燥させ、蛍光顕微鏡で鏡検する。従来のローダミン・オーラミン蛍光染色法に比べ、高感度で抗酸菌を検出することができる。また、ローダミン・オーラミンは使用期間が調製後１ヶ月程度と短かいのに対し、本発明のインターカレータは、優れた保存安定性を有する。
【実施例】
【００８７】
以下、実施例を用いてさらに詳細に本発明について説明する。
合成例１．
ナフタレンジイミド系インターカレータの合成例を示す。エチレングリコールジアミン１をジオキサン中、片方のアミノ基のBoc化し、2を得た。次に、片末端がBoc化された2とナフタレン二無水物3との縮合反応を行い、目的とする4を収率64%で得た。その後、TFA中、Boc基の脱離を行い、ナフタレンジイミド誘導体5を収率82%で得た(Scheme 1)。
【００８８】
［化３６］
2007006788.tif 000041
Scheme 1
【００８９】
次にナフタレンジイミド誘導体5とオキサジアゾール活性エステル体6との縮合反応を行い、一置換のインターカレータ7a及び二置換のインターカレータ7bを得た (Scheme 2)。
【００９０】
［化３７］
2007006788.tif 000042
Scheme 2
【００９１】
合成例２．
アントラセン系インターカレータの合成例を示す。アントラセン誘導体9は、低温下、NaHを用いて対応するアミノアルコールをアルコラートへと誘導し、そこへ9,10-ビスクロロアントラセン(8)を投入することにより合成した。反応で生成したNaClを濾別した後、DMFを減圧下留去し残渣をクロロホルムに溶解した。そこへ水を添加し、TFA酸性条件下で目的化合物の抽出を行った。その後、水を濃縮し有機溶媒を用いた再沈法により目的化合物を得た。次に、アントラセン誘導体９とオキサジアゾール活性エステル６との縮合反応により連結の片末端及び両末端を置換したインターカレータ10a及び10bを合成した (Scheme 3)。
【００９２】
［化３８］
2007006788.tif 000043
Scheme 3
【００９３】
合成例３．
比較のため、従来の蛍光色素フルオレセインを有するインターカレータも合成した。具体的には、合成例２で合成したアントラセン誘導体9の一端を（チオウレア結合）によりフルオレセインで置換して合成した。
【００９４】
合成例４． 
ペプチドインターカレータの合成例を示す。
１．Ac-Lys(EL)-Lys-Lys-Lys(Acr)-Lys-Lys-Lys(Acr)-Lys-Lys-NH2の合成
（１）Ac-Lys(Mtt)-(Lys(Boc))2-Lys(Acr)-(Lys(Boc))2-Lys(Acr)-(Lys(Boc))2-Resinの合成
（実験操作）
リアクションベッセルにFmoc-NH-SAL Resin 0.15g(0.61mmol/g)を入れ、カートリッジ3, 6にFmoc-Lys(Acr)-OHを0.26gずつ、カートリッジ1,2,4,5,7,8にFmoc-Lys(Boc)-OHを0.18gずつ、カートリッジ9にFmoc-Lys(Mtt)-OHを0.23g入れた。後は、Applied Biosystems社の431A peptide synthesizerを用いて合成を行った。Methodは、standard Fmoc法で行い、N末端はアセチル化した。黄色固体のペプチドレジンが得られ、収量は0.30gであった。
【００９５】
（２）Ac-Lys(Mtt)-(Lys(Boc))2-Lys(Acr)-(Lys(Boc))2-Lys(Acr)-(Lys(Boc))2-ResinのMtt基の脱保護、ELの修飾及びレジンからの切り出し、及び側鎖の脱保護
（実験操作）
i）Mtt基の脱保護
スクリュー管に1で合成したペプチドレジン0.30g入れ、これに過剰のジクロロメタン（DCM）を加えて30分かけて膨潤させた後、過剰のDCMを窒素ガスで除いた。その後、DCM:TFA:TIPS（トリイソプロピルシラン）=94:1:5の混合溶液4mlを加えて2分攪拌し、窒素ガスで溶媒を除いた。この操作を5回繰り返した後、吸引濾過しDCM、トリエチルアミン、DCMで洗浄後、減圧乾燥させた。
【００９６】
ii）メトキシ型有機ＥＬ色素の修飾
減圧乾燥させたペプチドレジンにNMP 6mlを加えて30分間攪拌して膨潤させ、トリエチルアミン 0.15mlを加えて攪拌した。さらに、オキサジアゾール活性エステル6を0.2g加えて室温で24時間攪拌した。その後吸引濾過し、NMP、DCMで洗浄して減圧乾燥させた。
【００９７】
iii）レジンからの切り出し及び側鎖の脱保護
減圧乾燥させたペプチドレジンにm-クレゾール 0.08ml、チオアニソール 0.48ml、TFA 3.44mlを加えて室温で1時間半撹拌した。その後、吸引濾過しTFAで洗浄した。TFAを減圧留去した後、氷浴中でエーテル15ml加えた。超音波処理後、しばらく放置し、上澄み液を取り除いた。次に、氷浴中で酢酸エチル15mlを加えて、超音波処理後、しばらく放置した。その後、吸引濾過しエーテルで洗浄後、減圧乾燥させた。
【００９８】
黄橙色固体が得られ、収量は0.29ｇであった。図１に生成物の精製前後のHPLCスペクトルを示す。R.T.=12.5min付近のピークのサンプルについてTOF-Mass測定を行ったところEL色素とペプチドの複合体（EL-Peptide）の分子量：2055.30に対応するピークが2057.33に観測され、目的物の生成を確認した。（Matrix：α-CHCA；図２）
【００９９】
実施例１．
（検出方法）
合成したアントラセン系インターカレータ10bとフルオレセイン系インターカレータとをDMSOに溶解し、それぞれ1mMの溶液を調製した。次いで、５mLのサンプル管に超純水995μLを計量し、そこへアントラセン系インターカレータ10b を 1μL加えた。また、フルオレセイン系インターカレータも同様の手順により同濃度の溶液を調製した。次に、二本鎖DNAとして32 mM  ct DNAを4μL添加して、十分に攪拌した。調製したサンプル溶液を、マイクロアレイヤーにてガラス基板上に1 nL（色素の相対濃度  1 pmol）ずつスポットした。乾燥させた後、蛍光スキャナーにて観測を行った。ここで、検出機器には、BIO-RAD  モレキュラーイメージャー  FX Proを用いた。レーザの波長は488 nm、スキャン間隔は50nmである。
【０１００】
（結果）
図３に標識された二本鎖DNAの観測結果を示す。ここで、図３中、(a) はアントラセン系インターカレータ10b中にct DNAを添加したサンプル、(b)及び(c)はフルオレセイン系インターカレータ中にct DNAを添加したサンプル、そして(d)及び(e)は10bのみをスポットした場合の観測結果である。二本鎖DNAに結合した10bは、乾燥状態でも発光して安定して観測することができた。これに対し、フルオレセイン系インターカレータは、乾燥状態で消光を生じ、観測は不可能であった。
【０１０１】
実施例２．
合成したアントラセン系インターカレータ10aについて実施例１と同様の方法により蛍光を測定した。図４は、同一試料を複数スポットした結果を示している。乾燥状態でも安定して観測することができた。
【０１０２】
実施例３．
合成したペプチドインターカレータについて実施例１と同様の方法により蛍光を測定した。その結果、実施例１と２の場合と同様に乾燥状態でも安定して観測することができた。
【０１０３】
比較例．
従来の蛍光色素（4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI)）を用いて実施例１と同様の方法により蛍光を測定した。しかし、乾燥状態では消光を生じ、観測は不可能であった。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】標識されたペプチドの精製前(a)及び精製後(b)のHPLCスペクトルである。
【図２】標識されたペプチドのTOF MSスペクトルの一例である。
【図３】本発明の実施例１における、標識された二本鎖DNAの発光パターンの一例であり、(a) はアントラセン系インターカレータ10b中にct DNAを添加したサンプル、(b)及び(c)はフルオレセイン系インターカレータ中にct DNAを添加したサンプル、そして(d)及び(e)は10bのみをスポットした場合の結果を示す。
【図４】本発明の実施例１における、標識された二本鎖DNAの発光パターンの一例であり、アントラセン系インターカレータ10a中にct DNAを添加したサンプルの結果を示す。
【図１】
2007006788.tif 000044
【図２】
2007006788.tif 000045
【図３】
2007006788.tif 000046
【図４】
2007006788.tif 000047