(57)【要約】      （修正有）【課題】効率的、定量的に液体状試料の電子顕微鏡観察を行なう。【解決手段】凹部を有する微小容器に液体状試料をのせる工程１、及び該凹部を封入する工程２を有し、工程１でインクジェット法により凹部を有する微小容器に液体試料をのせ、工程２で液体試料が冷却されており、工程１と工程２が同時に行われる電子顕微鏡観察用試料作製方法において、液体資料中に凹部を有する微小容器を固定し、かつ封入用物質を液体状試料表面に浮かした状態にする工程、および封入物質を保った液面を下げることにより凹部を有する微小容器表面に該封入物質を移し取る肯定を有する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
凹部を有する微小容器に液体状試料をのせる工程１、及び該凹部を封入する工程２を少なくとも有することを特徴とする電子顕微鏡観察用試料作製方法。
【請求項２】
請求項１に記載の電子顕微鏡観察用試料作製方法において、工程１でインクジェット法により凹部を有する微小容器に液体状試料をのせることを特徴とする電子顕微鏡観察用試料作製方法。
【請求項３】
請求項１、又は、請求項２に記載の電子顕微鏡観察用試料作製方法において、工程２で液体状試料が冷却されていることを特徴とする電子顕微鏡観察用試料作製方法。
【請求項４】
請求項１に記載の電子顕微鏡観察用試料作製方法において、工程１及び工程２が同時に行なわれることを特徴とする電子顕微鏡観察用試料作製方法。
【請求項５】
請求項４に記載の電子顕微鏡観察用試料作製方法において、液体状試料中に凹部を有する微小容器を固定し、かつ封入用物質を液体状試料表面に浮かした状態する工程、及び封入用物質を保った液面を下げることにより、凹部を有する微小容器表面に該封入用物質を移し取る工程を少なくとも有することを特徴とする電子顕微鏡観察用試料作製方法。
【請求項６】
請求項１〜請求項５のいずれかに記載の電子顕微鏡観察用試料作製方法において、試料薄片化工程を少なくとも有することを特徴とする電子顕微鏡観察用試料作製方法。
【請求項７】
請求項６に記載の電子顕微鏡観察用試料作製方法において、試料薄片化工程がＦＩＢ加工工程を少なくとも有することを特徴とする電子顕微鏡観察用試料作製方法。
【請求項８】
凹部を有することを特徴とする電子顕微鏡観察用微小容器。
【請求項９】
請求項８に記載の電子顕微鏡観察用微小容器において、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｂを少なくとも有することを特徴とする電子顕微鏡観察用微小容器。
【請求項１０】
請求項８、又は、請求項９に記載の電子顕微鏡観察用微小容器において、凹部が溝状であることを特徴とする電子顕微鏡観察用微小容器。
【請求項１１】
請求項１０に記載の電子顕微鏡観察用微小容器を使用して、液体状試料のダイナミクスを観察することを特徴とする電子顕微鏡観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の電子顕微鏡観察用試料作製方法、電子顕微鏡観察用容器及び電子顕微鏡観察方法成膜装置及び方法は、液体状試料の電子顕微鏡観察に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
電子顕微鏡観察にとって長年の懸案事項の１つとして液体状試料の観察がある。この目的のために、特許文献１において、電子顕微鏡用メツシユにプラズマ重合Ｃ膜を形成して試料の支持膜とする工程と、このプラズマ重合Ｃ膜の上に試料をのせる工程と、さらにこの上にプラズマ重合Ｃ膜を形成して試料を封入する工程とを含むことを特徴とする封入検鏡試料の作製方法が開示されている。なお特許文献１では、含水生物試料への適用を第１のターゲットとしているが、無機試料、反応ガス、反応液への適用についても言及している。
【特許文献１】特公平０５−８５０１７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、従来の技術で述べた封入検鏡試料作製方法においては、以下に示すような課題があった。
【０００４】
（１）平坦なＣ膜上に液体状試料をのせているので、液体状試料を制御良くのせるのが困難である。そのために適量をのせるための条件出しの作業が必要であり、非効率的である。
【０００５】
（２）平坦なＣ膜上に液体状試料をのせているので、液体状試料を多くのせすぎてしまう可能性がある。そのためにＣ膜破れが起こる可能性があると同時に、多量の液体が装置内に一気に放出される可能性があるので好ましくない。
【０００６】
（３）平坦なＣ膜上に液体状試料をのせているので、液体状試料の体積を一定にしてのせるのが困難である。そのために液体状試料の定量的な評価が必要な場合、例えば、液体状試料中の粒子の定量的な評価（単位体積当たりの個数など）が不可能である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記の目的を達成するために種々の検討を重ねた結果、本発明を完成した。
【０００８】
本発明は第１に、凹部を有する微小容器に液体状試料をのせる工程１、及び該凹部を封入する工程２を少なくとも有することを特徴とする電子顕微鏡観察用試料作製方法に関する。
【０００９】
本発明は第２に、上記第１の発明において、工程１でインクジェット法により凹部を有する微小容器に液体状試料をのせることを特徴とする電子顕微鏡観察用試料作製方法に関する。
【００１０】
本発明は第３に、上記第１、２の発明において、工程２で液体状試料が冷却されていることを特徴とする電子顕微鏡観察用試料作製方法に関する。
【００１１】
本発明は第４に、上記第１の発明において、工程１及び工程２が同時に行なわれることを特徴とする電子顕微鏡観察用試料作製方法に関する。
【００１２】
本発明は第５に、上記第４の発明において、液体状試料中に凹部を有する微小容器を固定し、かつ封入用物質を液体状試料表面に浮かした状態する工程、及び封入用物質を保った液面を下げることにより、凹部を有する微小容器表面に該封入用物質を移し取る工程を少なくとも有することを特徴とする電子顕微鏡観察用試料作製方法に関する。
【００１３】
本発明は第６に、上記第１〜５の発明において、試料薄片化工程を少なくとも有することを特徴とする電子顕微鏡観察用試料作製方法に関する。
【００１４】
本発明は第７に、上記第６の発明において、試料薄片化工程がＦＩＢ加工工程を少なくとも有することを特徴とする電子顕微鏡観察用試料作製方法に関する。
【００１５】
本発明は第８に、凹部を有することを特徴とする電子顕微鏡観察用微小容器に関する。
【００１６】
本発明は第９に、上記第８の発明において、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｂを少なくとも有することを特徴とする電子顕微鏡観察用微小容器に関する。
【００１７】
本発明は第１０に、上記第８、９の発明において、凹部が溝状であることを特徴とする電子顕微鏡観察用微小容器に関する。
【００１８】
本発明は第１１に、上記第１０の発明の電子顕微鏡観察用微小容器を使用して、液体状試料のダイナミクスを観察することを特徴とする電子顕微鏡観察方法に関する。
【００１９】
（作用）
本発明の電子顕微鏡観察用試料作製方法によれば、以下の作用により、前述の課題を解決できる。
【００２０】
（１）凹部を有する微小容器に液体状試料をのせているので、液体状試料を制御良くのせるのが容易である。そのために適量をのせるための条件出しの作業が不必要であり、効率的である。
【００２１】
（２）凹部を有する微小容器に液体状試料をのせているので、液体状試料を多くのせすぎてしまう可能性は非常に少ない。そのためにＣ膜破れが起こる可能性は非常に少なく、多量の液体が装置内に一気に放出される可能性も非常に少ないので好ましい。
【００２２】
（３）凹部を有する微小容器に液体状試料をのせているので、液体状試料の体積を一定にしてのせるのが容易である。そのために液体状試料の定量的な評価が必要な場合、例えば、液体状試料中の粒子の定量的な評価（単位体積当たりの個数など）を行なうことが可能である。
【発明の効果】
【００２３】
以上説明したように、本発明の電子顕微鏡観察用試料作製方法によれば、以下の効果により、前述の課題を解決できる。
【００２４】
（１）凹部を有する微小容器に液体状試料をのせているので、液体状試料を制御良くのせるのが容易である。そのために適量をのせるための条件出しの作業が不必要であり、効率的である。
【００２５】
（２）凹部を有する微小容器に液体状試料をのせているので、液体状試料を多くのせすぎてしまう可能性は非常に少ない。そのためにＣ膜破れが起こる可能性は非常に少なく、多量の液体が装置内に一気に放出される可能性も非常に少ないので好ましい。
【００２６】
（３）凹部を有する微小容器に液体状試料をのせているので、液体状試料の体積を一定にしてのせるのが容易である。そのために液体状試料の定量的な評価が必要な場合、例えば、液体状試料中の粒子の定量的な評価（単位体積当たりの個数など）を行なうことが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、図１を用いて、本発明の電子顕微鏡観察用試料作製方法について説明する。
【００２８】
図１のa)〜c)順に追って説明する。以下の工程a)〜c)は、図１のa)〜c）に対応する。
【００２９】
なお図１において、１は凹部、２は微小容器、３は液体状試料、４は封入用物質である。
【００３０】
a)凹部を有する微小容器の準備
凹部１を有する微小容器２を準備する。
【００３１】
本発明の凹部の形状としては、球形状のもの、円柱状のもの、円錐状のもの、回転楕円体状のもの、立方体状のもの、直方体状のもの、溝状のものなど、あるいはこれらの一部を切り取ったり組み合わせたりした形状のものなど、任意のものが挙げられるが、電子顕微鏡観察に不都合がなければ、凹部の形状は特に制限されるものではない。
【００３２】
本発明の凹部の配置としては、孤立して配置されたもの、ライン状に配置されたもの、マトリックス状に配置されたもの、ランダムに配置されたものなど、任意のものが挙げられるが、液体状試料の電子顕微鏡観察に不都合がなければ、凹部の配置は特に制限されるものではない。
【００３３】
本発明の微小容器の形状としては、膜状のものの中に凹部が含まれているようなもの、板状のものの中に凹部が含まれているようなもの、段差状のものの中に凹部が含まれているようなものなど、任意のものが挙げられるが、液体状試料の電子顕微鏡観察に不都合がなければ、微小容器の形状は特に制限されるものではない。
【００３４】
本発明の凹部を有する微小容器の材質の成分としては、電子線が透過しやすいように軽元素（Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｂなど）を含有するものが好ましいが、液体状試料の電子顕微鏡観察に不都合がなければ、凹部を有する微小容器の材質の成分は特に制限されるものではない。
【００３５】
本発明の凹部を有する微小容器の保持方法としては、電子顕微鏡観察用のメッシュに保持する方法がハンドリングなどで便利であるが、液体状試料の電子顕微鏡観察に不都合がなければ、凹部を有する微小容器の保持方法は特に制限されるものではない。
【００３６】
本発明の微小容器のメッシュへ保持するための取り付け方法としては、微小容器を液体上に浮かした状態からメッシュですくい上げる方法、微小容器を浮かした液面を下げることにより液中にあるメッシュ上にのせる方法、ＦＩＢ−μサンプリング法により微小容器をメッシュに貼り付ける方法など、任意のものが挙げられるが、液体状試料の電子顕微鏡観察に不都合がなければ、微小容器のメッシュへ保持するための取り付け方法は特に制限されるものではない。
【００３７】
本発明の微小容器をメッシュへ保持する時期としては、液体状試料を微小容器にのせる前、液体状試料を凹部に封入した後、試料薄片化を行なった後など、任意のものが挙げられるが、液体状試料の電子顕微鏡観察に不都合がなければ、微小容器のメッシュへ保持する時期は特に制限されるものではない。
【００３８】
本発明の微小容器の保持に使用するメッシュの形状としては、単孔状のもの、ライン状のもの、クロス状のもの、切り欠け状のもの、櫛歯状のものなど、任意のものが挙げられるが、液体状試料の電子顕微鏡観察に不都合がなければ、微小容器の保持に使用するメッシュの形状は特に制限されるものではない。
【００３９】
b)凹部を有する微小容器に液体状試料をのせる工程
凹部１を有する微小容器２に液体状試料３をのせる。
【００４０】
本発明の液体状試料の種類としては、液晶のような液体そのもの、ミセルあるいは逆ミセル体のような液体中に粒子を含んだものなど、任意のものが挙げられるが、液体状試料の電子顕微鏡観察に不都合がなければ、液体状試料の種類は特に制限されるものではない。
【００４１】
本発明の液体状試料の材質としては、水系材料、有機系材料、無機系材料や、あるいはこれらの一部あるいは全部を組み合わせたものなど、任意のものが挙げられるが、液体状試料の電子顕微鏡観察に不都合がなければ、液体状試料の材質は特に制限されるものではない。
【００４２】
本発明の液体状試料の粘度としては、水溶液のような粘度の低いもの、液晶のような粘度の高いものなどが挙げられるが、液体状試料の電子顕微鏡観察に不都合がなければ、液体状試料の粘度は特に制限されるものではない。
【００４３】
本発明の液体状試料の液体成分の割合としては、水溶液のような液体成分が多い割合のもの、含水生物材料のような液体成分の少ない割合のものなどが挙げられるが、液体状試料の電子顕微鏡観察に不都合がなければ、液体状試料の液体成分の割合は特に制限されるものではない。
【００４４】
本発明の微小容器に液体状試料をのせる方法としては、液体状試料をそのまま上に置く方法、微小容器を液体中に置いた後に液面をさげることによりのせる方法、液体状試料をインクジェット法によりのせる方法など、任意のものが挙げられるが、液体状試料の電子顕微鏡観察に不都合がなければ、小容器に液体状試料をのせる方法は特に制限されるものではない。
【００４５】
c)凹部を封入する工程
液体状試料３をのせた微小容器２の凹部１を封入する。すなわち凹部１の上に封入用物質４を形成して封入する。
【００４６】
本発明の封入用物質を形成して封入する方法としては、封入用物質を堆積する方法、封入用物質をのせる方法など、任意のものが挙げられるが、液体状試料の電子顕微鏡観察に不都合がなければ、封入用物質を形成して封入する方法は特に制限されるものではない。
【００４７】
本発明の封入用物質を堆積する方法としては、蒸着法、スパッタ法、プラズマ重合法、ＣＶＤ法、ＦＩＢ−ＣＶＤ法など、任意のものが挙げられるが、液体状試料の電子顕微鏡観察に不都合がなければ、封入用物質を堆積する方法は特に制限されるものではない。
【００４８】
本発明の封入膜をのせる方法としては、液体状試料中に凹部を有する微小容器を固定し、かつ封入用物質を液体状試料表面に浮かした状態にしてから、封入用物質を保った液面を下げることにより、凹部を有する微小容器表面に封入用物質をのせる方法など、任意のものが挙げられるが、液体状試料の電子顕微鏡観察に不都合がなければ、封入用物質をのせる方法は特に制限されるものではない。
【００４９】
本発明の封入用物質の材質の成分としては、電子線が透過しやすいように軽元素（Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｂなど）を含有するものが好ましいが、液体状試料の電子顕微鏡観察に不都合がなければ、凹部を有する微小容器の材質の成分は特に制限されるものではない。
【００５０】
本発明の凹部を封入する時期としては、液体状試料を微小容器にのせた後や、液体状試料を微小容器にのせると同時などが挙げられるが、液体状試料の電子顕微鏡観察に不都合がなければ、凹部を封入する時期は特に制限されるものではない。
【００５１】
本発明の凹部を封入するときの液体状試料の状態としては、液体の状態のまま、液体を凍結した状態など、任意のものが挙げられるが、液体状試料の電子顕微鏡観察に不都合がなければ、凹部を封入するときの液体状試料の状態は特に制限されるものではない。ただし封入工程を真空装置内で行なおうとする場合には、液体を凍結した状態にすることが好ましいことが多い。
【００５２】
d)電子顕微鏡観察
液体状試料３を封入した微小容器２の電子顕微鏡観察を行なう。
【００５３】
本発明の電子顕微鏡観察を行なう時期であるが、凹部を封入する工程が終わった後でも良いし、さらに試料薄片化工程をおこなってからも良く、液体状試料の電子顕微鏡観察に不都合がなければ、電子顕微鏡観察を行なう時期は特に制限されるものではない。
【００５４】
本発明の試料薄片化工程としては、ＦＩＢ法による薄片化工程、ミクロトーム法による薄片化工程など、任意のものが挙げられるが、液体状試料の電子顕微鏡観察に不都合がなければ、電子顕微鏡観察を行なう時期は特に制限されるものではない。
【００５５】
本発明の電子顕微鏡観察の種類としては、静的な電子顕微鏡観察、動的な電子顕微鏡観察など、任意のものが挙げられるが、液体状試料の電子顕微鏡観察に不都合がなければ、電子顕微鏡観察の種類は特に制限されるものではない。
【００５６】
本発明の動的な電子顕微鏡観察の種類としては、液体状試料のダイナミクスの観察、例えば、液体中に含まれる微粒子の動きの観察、２種類の液体状試料が混合される状態の観察など、任意のものが挙げられるが、液体状試料の電子顕微鏡観察に不都合がなければ、動的な電子顕微鏡観察の種類は特に制限されるものではない。
【００５７】
以下に実施例をあげて、本発明を説明する。
【実施例１】
【００５８】
a)凹部を有する微小容器の準備
図１a)に示すように、凹部１を有する微小容器２を準備する。
【００５９】
まず凹部１を有する微小容器２は、Ｓｉ基板上に形成した凹部にプラズマ重合Ｃ膜を成膜した後に、Ｓｉ基板を溶解除去することにより作製したものである。
【００６０】
次にこの凹部を有する微小容器を電子顕微鏡観察用のクロス状のメッシュ（不図示）に保持した。
【００６１】
b)凹部を有する微小容器に液体状試料をのせる工程
図１b)に示すように凹部１を有する微小容器２に液体状試料３をのせる。
【００６２】
まず液体状試料３は、逆ミセル法により形成された微粒子を含む液体である。
【００６３】
次にインクジェット法により、微小容器２の凹部１に液体状試料３をのせる。
【００６４】
c)凹部を封入する工程
図１c)に示すように液体状試料３をのせた微小容器２の凹部１を封入する。すなわち凹部１の上に封入用物質４を形成して封入する。
【００６５】
まず液体状試料３をのせた微小容器２を冷却して凍結した状態にする。
【００６６】
次に凍結した微小容器２を冷却機能付き成膜装置に入れた後に、封入用物質４であるプラズマ重合Ｃ膜を成膜することにより、凹部１を封入する。
【００６７】
d)電子顕微鏡観察
液体状試料３を封入した微小容器２の電子顕微鏡観察を行なう。
【００６８】
なお電子顕微鏡観察は微小容器２を常温にもどしてから行なった。
【００６９】
評価
電子顕微鏡観察の結果、液体状試料である逆ミセル法により形成された微粒子を含む液体を良好に観察できた。溶液の体積がわかっているので、液体状試料中の粒子の定量的な評価（単位体積当たりの個数など）も可能であった。
【実施例２】
【００７０】
a)凹部を有する微小容器の準備
図１a)に示すように、凹部１を有する微小容器２を準備する。
【００７１】
実施例１と同様にして凹部１を有する微小容器２を準備した。
【００７２】
b)凹部を有する微小容器に液体状試料をのせる工程
凹部１を有する微小容器２に液体状試料３をのせる。
【００７３】
c)凹部を封入する工程
液体状試料３をのせた微小容器２の凹部１を封入する。すなわち凹部１の上に封入用物質４を形成して封入する。
【００７４】
本実施例では、b)及びc)の工程を同時に行なっている。
【００７５】
まず液体状試料３は、ミセル法により形成された微粒子を含む液体である。
【００７６】
図２ａ)に示すように、容器５に入れた液体状試料３中に凹部１を有する微小容器２を固定した後に、封入用物質４であるプラズマ重合Ｃ膜を液体状試料３の表面に浮かした状態する。
【００７７】
次に図２ｂ)に示すように、ドレイン６を開いて封入用物質４を保った液面を下げることにより、凹部１を有する微小容器２の上に封入用物質４を移し取ることにより封入する。
【００７８】
d)電子顕微鏡観察
液体状試料３を封入した微小容器２の電子顕微鏡観察を行なう。
【００７９】
評価
電子顕微鏡観察の結果、液体状試料であるミセル法により形成された微粒子を含む液体を良好に観察できた。溶液の体積がわかっているので、液体状試料中の粒子の定量的な評価（単位体積当たりの個数など）も可能であった。
【実施例３】
【００８０】
a)凹部を有する微小容器の準備
図３a)に示すように、凹部１を有する微小容器２を準備する。
【００８１】
まず凹部１を有する微小容器２は、細孔終点部材９であるＮｂ膜／Ｓｉ基板１０上に形成した陽極酸化アルミナナノホール１１である。ここでアルミナナノホール１１は凹部１である細孔とバリア層８から形成されている。なお余分な部分はレーザー照射により除去している。
【００８２】
b)凹部を有する微小容器に液体状試料をのせる工程
図３b)に示すように、凹部１を有する微小容器２に液体状試料３をのせる。
【００８３】
まず液体状試料３は、逆ミセル法により形成された微粒子を含む液体である。
【００８４】
次に液体状試料３を微小容器２であるアルミナナノホール１１にたらすことにより、凹部１である細孔７に液体状試料３をのせる。
【００８５】
c)凹部を封入する工程
図３c)に示すように、液体状試料３をのせた微小容器２の凹部１を封入する。すなわち凹部１の上に封入用物質４を形成して封入する。
【００８６】
まず液体状試料３をのせた微小容器２であるアルミナナノホール１１を冷却して凍結した状態にする。
【００８７】
次に凍結したアルミナナノホール１１を冷却機能付きＦＩＢ−ＳＥＭに入れた後に、封入用物質４であるＥＢ−ＣＶＤ法によるＣ膜を成膜することにより、凹部１である細孔７を封入する。
【００８８】
d)電子顕微鏡観察
液体状試料３を封入した微小容器２の電子顕微鏡観察を行なう。
【００８９】
冷却機能付きＦＩＢ−ＳＥＭの中で引き続き、ＦＩＢ加工によりリフトオフ法のための薄片化工程を行なう。
【００９０】
次に薄片化工程をへた微小容器２であるアルミナナノホール１１を常温にもどしてからＦＩＢ−ＳＥＭから出した後、リフトオフ法によりマイクログリッド付きメッシュにのせてから電子顕微鏡観察を行なった。
【００９１】
評価
電子顕微鏡観察の結果、液体状試料である逆ミセル法により形成された微粒子を含む液体を良好に観察できた。溶液の体積がわかっているので、液体状試料中の粒子の定量的な評価（単位体積当たりの個数など）も可能であった。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】本発明の電子顕微鏡観察用試料作製方法の一例を示す模式図。
【図２】本発明の電子顕微鏡観察用試料作製方法の一例を示す模式図。
【図３】本発明の電子顕微鏡観察用試料作製方法の一例を示す模式図。
【符号の説明】
【００９３】
１  凹部
２  微小容器
３  液体状試料
４  封入用物質
５  容器
６  ドレイン
７  細孔
８  バリア層
９  細孔終点部材
１０  基板
１１  アルミナナノホール
【図１】
2007113952.tif 000003
【図２】
2007113952.tif 000004
【図３】
2007113952.tif 000005