(57)【要約】      （修正有）【課題】コンパクトで簡単な構造で安価に迅速な試料走査が可能な方法およびレーザ走査型蛍光顕微鏡を提供すること。【解決手段】検査される試料（１）が、第１状態（Ｚ１、Ａ）から第２状態（Ｚ２、Ｂ）へと繰返し遷移可能な物質を含み、第１状態（Ｚ１、Ａ）及び第２状態（Ｚ２、Ｂ）が少なくとも１つの光学的性質で互いに相違しており、記録される試料領域（Ｐ）内で物質がまず第１状態（Ｚ１、Ａ）に移されるステップ、光学信号（４）によって第２状態（Ｚ２、Ｂ）が誘導され、記録される試料領域（Ｐ）内で、空間的に限定された部分領域が適切に残されるステップを含むものが、少なくとも１つの強度零地点（５）及び側方に隣接する最大強度（９）を備えた横断面プロフィルを有する焦線（１０）の態様で光学信号（４）が提供される。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を高い空間分解能で検査するための方法であって、検査される試料（１）が、第１状態（Ｚ１、Ａ）から第２状態（Ｚ２、Ｂ）へと繰返し遷移可能な物質を含み、第１状態（Ｚ１、Ａ）及び第２状態（Ｚ２、Ｂ）が少なくとも１つの光学的性質で互いに相違しており、記録される試料領域（Ｐ）内で物質がまず第１状態（Ｚ１、Ａ）に移されるステップ、光学信号（４）によって第２状態（Ｚ２、Ｂ）が誘導されて、記録される試料領域（Ｐ）内で、空間的に限定された部分領域が明確に除外されるステップを含むものにおいて、
前記光学信号（４）が、少なくとも１つの強度零地点（５）及び側方に隣接する最大強度（９）を備えた横断面プロフィルを有する焦線（１０）の態様で提供されることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記試料（１）が対物レンズ（３、１３）によって照明され、前記焦線（１０）が、対物レンズ（３、１３）の瞳（Ｐ１）と共役な瞳面（Ｐ３）内のライン状照射（瞳ライン（１４））によって、かつ、瞳ライン（１４）に沿う適当な位相変調によって生成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記瞳ライン（１４）に沿って少なくとも１つの位相飛躍が導入されるように、前記位相変調が行われることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記位相飛躍が、瞳中心に導入されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記導入された位相飛躍が、波連の半分の長さに一致することを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記複数の位相飛躍が、前記瞳ライン（１４）に沿って波連の半分ごとに導入されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記瞳ライン（１４）に沿う位相変調が、瞳（Ｐ１）の中間像に配置される液体ベースの空間的位相変調器によって実現されていることを特徴とする請求項２乃至請求項６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記瞳ライン（１４）に沿う位相変調が、位相遅延光学被膜（ＰＶ）を備えるとともに瞳（Ｐ１）の中間像に配置される光学部品（１９、２７）によって実現されることを特徴とする請求項２乃至請求項６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記瞳ライン（１４）に沿う位相変調が、前記瞳（Ｐ１）の中間像に配置される光学部品によって実現され、該光学部品がまず全反射による位相飛躍を発生させるとともに引き続いて金属膜での反射を発生させることを特徴とする請求項２乃至請求項６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記瞳ライン（１４）に沿う位相変調が、前記瞳（Ｐ１）の中間像に配置される光学素子によって実現され、該光学素子が変形可能および／または移動可能な少なくとも１つのミラーおよび／またはミラー素子を有していることを特徴とする請求項２乃至請求項６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記瞳ライン（１４）が、シリンドリカルレンズ（１７）またはパウエルレンズを有する照明光源の照明光線を集束することによって生成されていることを特徴とする請求項２乃至請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記瞳ライン（１４）が、スリット絞りを瞳面に結像することによって生成されることを特徴とする請求項２乃至請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記瞳ライン（１４）が、ホログラフィック素子によって生成されることを特徴とする請求項２乃至請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記瞳ライン（１４）が、アクロゲートフィルタによって光路に合わせられていることを特徴とする請求項２乃至請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記瞳ライン（１４）に沿う位相変調が、前記アクロゲートフィルタ上の付加的な位相遅延層によって実現されていることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記光学信号（４）を提供するための照明光源としてレーザが使用されていることを特徴とする請求項１乃至請求項１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記光学信号（４）の光が、前記瞳ライン（１４）に対して垂直に偏光されることを特徴とする請求項２乃至請求項１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記焦線（１０）が、異なる空間方向に順次生成されることを特徴とする請求項１乃至請求項１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記記録される試料領域（Ｐ）が、前記焦線（１０）の各空間方向に応じてそれぞれ数回走査されることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
個別の像が、数学的に組み合わされて１つの全体像とされていることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１状態（Ｚ１、Ａ）から第２状態（Ｚ２、Ｂ）への移行が、多光子吸収によって実現されることを特徴とする請求項１乃至請求項２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記試料（１）から出射する測定信号（８）が、多光子励起によって読み取られることを特徴とする請求項１乃至請求項２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記光学信号（４）および試験信号（７）が、前記第１状態（Ｚ１、Ａ）を読取るためにパルス光源によって生成されていることを特徴とする請求項１乃至請求項２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記パルス光源が、同期化されることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
試料を高い空間分解能で検査するための請求項１乃至請求項２４のいずれか１項に記載の方法を実施するための顕微鏡、特にレーザ走査型蛍光顕微鏡であって、
検査されるべき試料（１）が、第１状態（Ｚ１、Ａ）から第２状態（Ｚ２、Ｂ）へと繰返し遷移可能な物質を含み、第１状態（Ｚ１、Ａ）及び第２状態（Ｚ２、Ｂ）が少なくとも１つの光学的性質で互いに相違しており、記録される試料領域（Ｐ）内で物質がまず第１状態（Ｚ１、Ａ）に移されるステップ、光学信号（４）によって第２状態（Ｚ２、Ｂ）が誘導されて、前記記録される試料領域（Ｐ）内で、空間的に限定された部分領域が明確に除外されるステップを含むものにおいて、
前記光学信号（４）が、少なくとも１つの強度零地点（５）及び側方に隣接する最大強度（９）を備えた横断面プロフィルを有する焦線（１０）の態様で提供可能であることを
特徴とする顕微鏡。
【請求項２６】
顕微鏡の対物レンズ（３、１３）の瞳（Ｐ１）と共役な瞳面（Ｐ３）に照明線を生成するための光学部材（１１）を備えていることを特徴とする請求項２５に記載の顕微鏡。
【請求項２７】
前記瞳ライン（１４）の位相変調によって前記焦線（１０）の横断面プロフィルを生成するための位相変調素子（１９、２７）を備えていることを特徴とする請求項２６に記載の顕微鏡。
【請求項２８】
前記瞳ライン（１４）を生成するための前記光学部材（１１）及び位相変調素子（１９、２７）が、ユニットとして構成されていることを特徴とする請求項２６または請求項２７に記載の顕微鏡。
【請求項２９】
前記瞳ライン（１４）を生成するための光学部材（１１）及び位相変調素子（１９、２７）が、それぞれ個別ユニットとして照明光路内に配置されていることを特徴とする請求項２７または請求項２８に記載の顕微鏡。
【請求項３０】
前記位相変調素子（１９、２７）が、瞳（Ｐ１）の中間像に配置される液体ベースの空間的位相変調器として、または位相遅延誘電体被膜（ＰＶ）を備えた光学部材として構成されていることを特徴とする請求項２７乃至請求項２９のいずれか１項に記載の顕微鏡。
【請求項３１】
前記瞳ライン（１４）を生成するための前記光学部材（１１）が、シリンドリカルレンズ（１７）および／またはパワーレンズおよび／またはホログラフィック素子として構成されていることを特徴とする請求項２６乃至請求項３０のいずれか１項に記載の顕微鏡。
【請求項３２】
前記光学信号（４）を生成するための照明光源が、レーザとして構成されていることを特徴とする請求項２５乃至請求項３１のいずれか１項に記載の顕微鏡。
【請求項３３】
前記光学信号（４）を生成するための照明光源が、試料（１）から出射する測定信号（８）を読取りまたは第１状態（Ｚ１、Ａ）を誘導するために少なくとも１つの別の光源と組合せられていることを特徴とする請求項２５乃至請求項３２のいずれか１項に記載の顕微鏡。
【請求項３４】
前記別の光源が、試料（１）の全体または部分的に、好ましくは、ライン状に照明することを特徴とする請求項３３に記載の顕微鏡。
【請求項３５】
前記光学信号（４）の焦線（１０）が、別の線と空間的に重なっていることを特徴とする請求項２５乃至請求項３４のいずれか１項に記載の顕微鏡。
【請求項３６】
前記光学信号（４）の焦線（１０）の強度零地点（５）が、試料（１）から出射する測定信号（８）を読取るためにライン（１５）の最大値と空間的に重なっていることを特徴とする請求項３５に記載の顕微鏡。
【請求項３７】
各ライン（１０、１５）が、走査機構（２１）、好ましくは、走査ミラーの態様のものに割り当てられていることを特徴とする請求項３５または請求項３６に記載の顕微鏡。
【請求項３８】
走査方向が、瞳ライン（１４）の延びる方向と一致していることを特徴とする請求項３７に記載の顕微鏡。
【請求項３９】
試料（１）から出射する測定信号（８）のライン検出のためのライン検出器（２６）を
備えていることを特徴とする請求項２５乃至請求項３８のいずれか１項に記載の顕微鏡。
【請求項４０】
前記ライン検出器（２６）が、ＣＣＤライン、ＥＭＣＣＤまたはＡＰＤとして構成されていることを特徴とする請求項３９に記載の顕微鏡。
【請求項４１】
前記ライン検出器（２６）が、前記焦線（１０）と共焦点で配置されていることを特徴とする請求項３９または請求項４０に記載の顕微鏡。
【請求項４２】
前記ライン検出器（２６）が、検出方向において前記走査機構（２１）の下流側または前記走査機構（２１）の上流側に配置されていることを特徴とする請求項３９乃至請求項４１のいずれか１項に記載の顕微鏡。
【請求項４３】
少なくとも１つの光学的性質で互いに相違するさまざまな分子状態の間で染料分子を光誘導遷移させることへの、請求項２５乃至請求項４２のいずれか１項に記載の顕微鏡の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料を高い空間分解能で検査するための方法および顕微鏡、特に、レーザ走査型蛍光顕微鏡であって、検査される試料が、第１状態から第２状態へと繰返し遷移可能な物質を含み、第１状態及び第２状態が少なくとも１つの光学的性質で互いに相違しており、記録される試料領域内で物質がまず第１状態に移されるステップ、光学信号によって第２状態が誘導されて、記録される試料領域内で、空間的に限定された部分領域が明確に除外されるステップを含むものに関する。
【背景技術】
【０００２】
冒頭に指摘した種類の方法および顕微鏡は、実務において公知である。
基本的にアッベの法則によれば、結像光学法の空間分解能には、回折限界によって理論的限界があり、回折限界は、使用される光の波長に依存している。
しかしながら、ここで問題とする方法および顕微鏡によれば、アッベにより公知の理論的回折限界を超えて改善される空間分解能が達成できる。
【０００３】
公知の方法ではこのため、検査されるべき試料内に、第１状態から第２状態へと繰返し遷移可能な物質が提供され、第１状態及び第２状態は少なくとも１つの光学的性質で互いに相違している。
多くの公知の方法では、第１状態が蛍光性状態（fluorescence-capable state）（以下「Ａ状態」という）、第２状態が非蛍光性状態（nonfluorescence-capable state）（以
下「Ｂ状態」という）である。
記録される試料領域内で物質が切換信号によって蛍光性状態Ａに移された後、記録される試料領域の空間的に限定された部分領域内で光学信号によってＢ状態が誘導され、それとともに蛍光分子の蛍光抑制がもたらされる。
この場合、蛍光抑制の物理的プロセスは、多様なもので有り得る。
例えば、事前に励起された状態からの誘導放出、または蛍光分子内の光学的に誘導された構造変化が知られている。
【０００４】
明白なのは、試料体積内で光学信号によって誘導される第１状態から第２状態への遷移が大きな領域では飽和し、すなわち、完全に生じ、試料体積の少なくとも１つの部分領域では、光切換信号を明確にそこに照射されないことによって、そうした遷移が生じないことである。
この効果は、光学信号の強度零地点を生成することによって達成することができる。
零地点とその近傍では第２状態（一般に非蛍光状態Ｂ）への遷移が起きず、第１状態（一般に蛍光状態Ａ）が維持される。
光学信号によるＡ→Ｂ遷移の飽和は、記録される試料領域の照射領域において強度零地点に近接する周囲でＢ状態への（ほぼ）完全な遷移をもたらす。
飽和へ導くプロセスが強ければ強いほど、すなわち、零地点周囲領域に光学信号によって加えられるエネルギーが多ければ多いほど、蛍光性状態Ａもしくは一般に「発光性（luminous）」状態にある蛍光分子を有する領域は一層小さくなる。
この領域は、零地点の近傍における飽和度に基づいて原則として任意に小さくすることができる。
従って、加えられる光学信号の、回折限界に基づいて可能な最小領域よりもはるかに任意に小さいＡ状態領域にマークを付けることができる。
その後、例えば、試験信号の照射によってＡ状態領域が読取られると、回折限界が許容するよりも小さくすることのできる限定された領域から（蛍光）測定信号が生じる。
試料が前記のように逐一走査されると、回折理論により許容される分解能よりも良好な
分解能で画像が得られる。
【０００５】
２つの状態の間の相違として蛍光性／非蛍光性の光学的性質が用いられる前記種類の方法は、例えば、特許文献１および特許文献２により公知である。
これらの方法では、光学信号によって蛍光分子がＡ（蛍光性）状態からＢ（非蛍光性）状態に移され、Ａ→Ｂ遷移で飽和が達成される。
蛍光性状態Ａのまま残る試料領域は、照射される光学信号の零地点を有する最小強度からそれぞれ生じる。
最小強度は、干渉パターンの一部である。
そして、試料の走査は、光学信号の最小強度を変位させることによって行われ、変位は、干渉光線の移相によって引き起こされる。
【特許文献１】独国特許出願公開第１０３２５４５９号明細書
【特許文献２】独国特許出願公開第１０３２５４６０号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
公知の方法では、干渉光線が局所的な点状の最小強度を有する干渉パターンを形成する欠点がある。
その結果、試料の走査は、少なくとも二次元での点状の走査作業を必要とし、そのことから走査作業がきわめて時間を要するものとなる。
【０００７】
そこで、本発明の目的は、コンパクトなデザインであるとともに簡単な構造で安価な手段によって迅速な試料走査が可能な、冒頭に指摘した種類の方法および顕微鏡を明示することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明によれば、この目的は、請求項１の特徴を有する方法によって達成される。
それによれば、本発明の方法は、少なくとも１つの強度零地点及び側方に隣接する最大強度を備えた横断面プロフィルを有する焦線（focal line）の態様で光学信号が提供されるように構成されかつ展開される。
【０００９】
前記本発明の目的は、さらに、請求項２５の特徴を有する顕微鏡によって達成される。
それによれば、この顕微鏡は、少なくとも１つの強度零地点及び側方に隣接する最大強度を備えた横断面プロフィルを有する焦線の態様で光学信号が提供可能であるように構成されかつ展開される。
【００１０】
本発明に関連してまず認識されたのは、公知の高分解能結像法の撮像速度が異なった分野への応用、例えば、生物試料のリアルタイムな顕微鏡の使用では十分でないことであった。
次に、本発明によれば、（基本的に任意の幅の）細いラインに沿って第２状態を誘導できるとき、点状走査と比較して、著しく迅速なライン状走査が可能であることが認識された。
本発明によれば、このため、焦線の態様で光学信号が提供され、焦線は（基本的に任意の幅の）細いラインに沿って（第１状態を維持するための）少なくとも１つの強度零地点及び（第２状態を飽和状態に誘導するための）側方に隣接する最大強度を備えた横断面プロフィルを有する。
【００１１】
本発明に係る方法および顕微鏡は、第１及び第２状態がきわめて長命かまたは時間的に永続して安定してさえいる点を併せて利用することができる。
この場合、第１状態から第２状態への遷移の飽和のために、飽和に不可欠な光信号エネ
ルギーが入射される比較的長い時間を選択することができる。
これにより、遷移飽和に関する局部的な強度はわずかな量に選択することができる。
とりわけ、光学信号の放射源から得られる全体のエネルギーは、試料空間内の大部分の空間領域に分布し、複数の強度零地点または拡張された零地点が生成される。
１つだけの点状零地点の周囲への信号全部の適用と比較して、１つ又は複数の零地点の周囲に生じる低い局部強度にもかかわらず、飽和は達成することができる。
これは、零地点の周囲ですべての分子が最終的に第２状態となるまで、信号が十分に長く照射されるようにするだけである。
これは、短命な状態（例えば、ＳＴＥＤ法では蛍光性状態Ａの通常の寿命が〜１ｎｓである）の場合と決定的に異なっている。
短命な状態の場合、飽和に不可欠なエネルギーが（Ａ→Ｂの遷移速度よりも著しく速い）短時間のうちに照射されねばならず、放射源の総出力は１つの（またはせいぜい若干数の）局部零地点を生成するだけにすぎない。
安定状態（例えばフォトクロミック（photochromic）染料）または長命状態（例えばＧＳＤ法におけるトリプレットシステム（triplet system）への遷移；ＧＳＤ＝Ground State Depletion＝基底状態の減衰）の場合では、安価な市販のレーザシステムの出力を広い領域に分布させて、複数の点状の強度零地点（＞＞１０）または強度のない完全なストライプ領域を試料内に生成することができ、その近傍では前もって飽和を達成できることを具体的なシステムで証明されるであろう。
これは、多数の点状の零地点または零地点ラインで試料が同時に走査されるとき並行撮像を可能とし、そして、信号が各零地点について同時に検出器によって分離して検出される。
こうして古典的な回折限界以下の分解能を有する顕微鏡を構成することができ、その撮像速度は、ＳＴＥＤに基づく方法の範囲内であり、単一の局部零地点を有するシステムと比較して著しく高まっている。
【００１２】
具体的な実施形態としては、顕微鏡の対物レンズの瞳（pupil）と共役な瞳面（pupil plane）に、まず照明ライン（illmination line）を生成する光学部品を顕微鏡に合体することによって焦線が発生される。
さらに、焦線の横断面プロフィルを生成するのに適した位相変調（phase modulation）を瞳ライン（pupil line）に沿って実現する位相変調素子が設けられている。
【００１３】
位相変調の間に、瞳ラインに沿って１つまたは複数の位相飛躍（phase jump）が導入されるようにすることができる。
位相飛躍を瞳中心に導入することが特に好ましい。
この位相飛躍は、ラインの半分が、波連（wave train）の半分だけ遅延するように波連の半分の長さに一致する長さに選択されれば、さらに有利である。
こうして、強度零地点及び側方に隣接する最大強度とからなる横断面プロフィルを有する焦線が焦点面に発生する。
選択的に、複数の位相飛躍を瞳ラインに沿って波連の半分ごとに導入することも可能であり、その結果、ライン全体の半分、すなわち瞳によって放射される光量の半分が、他方の半分と比較して同じように波連の半分だけ遅延している。
【００１４】
構造的に簡単な設計に関しては、瞳の中間像に配置される液体ベースの空間的位相変調器によって瞳ラインに沿う位相変調が実現される。
選択的に、位相遅延する光学被膜（optical coating）を備えた光学部品の付加が考え
られる。
基本的に、誘電体被膜（dielectric coatings）を備えた基板、液晶ベースの位相変調
器、または色消し位相フィルタ等の、あらゆる位相遅延素子を利用することができる。
理想的には、位相遅延性を有する光学素子が瞳面内またはその近傍に配置されている。
【００１５】
構造的に簡単な設計に関しては、シリンドリカルレンズ（cylindrical lens）、または、パウエルレンズ（Powell lens）を有する照明光源の照明光線を集束することによって
、瞳ラインが生成されるようにすることができる。
選択的に、スリット絞りを瞳面に結像することによって瞳ラインは生成することができる。ホログラフィック素子（holographic element）の利用も考えられる。
【００１６】
アクロゲートフィルタ（Achrogate filter）によって瞳ラインが光路に合せられるようにすれば、特に有利である。
その場合、好ましくは、フィルタ上の例えば誘電体被膜のような付加的な位相遅延膜によって瞳ラインに沿う位相変調を実現することができよう。
【００１７】
特に、コンパクトなデザインに関しては、瞳ラインを生成するための光学部品及び位相変調素子がユニットとして照明光路内に配置しておくことができる。
高い柔軟性を持たせることに関しては、瞳ラインを生成するための光学部品及び位相変調素子は、それぞれ個別ユニットとして照明光路の異なる位置に配置しておくこともできる。
【００１８】
顕微鏡の対物レンズの瞳のコヒーレントなライン状照明（coherent linear illumination）を確保するために、光学信号を生成するための照明光源はレーザ光源として構成されるのが好ましい。
【００１９】
減偏光効果が最大限に排除されるように、光学信号の光が瞳ラインに対して垂直に偏光されるようにすれば、特に有利である。
【００２０】
特に、好ましい実施形態としては、焦線は、異なる空間方向で順次生成される。
これは、例えば、互いに直角に向いた空間方向とすることができる。
同様に、記録される試料体積全体が各空間方向で順次走査されるようにすることができる。
その後、記録された個別の像は、数学的に組み合わされて１つの全体像とすることができ、これにより、１つ以上の方向で分解能向上が実現される。
【００２１】
第１状態から第２状態への移行が多光子吸収によって実現されるようにすることができる。
選択的にまたは付加的に、試料から出射する測定信号は、多光子励起によって読み取られる。
このような構成は、特殊な応用のとき、例えば、試料の漂白の防止を目的とする場合に提案される。
【００２２】
別の好ましい実施例として、第１状態を読取るために光学信号および試験信号は、それぞれパルス光源によって生成される。
その際、パルス光源の同期化が有利となる。
【００２３】
光学信号を生成するための照明光源は、少なくとも１つの別の光源と組合せておくことができ、別の光源は、試料から出射する測定信号を読取るのに、および／または第１状態を誘導するための切換信号を生成するのに利用することができよう。
特に、別の光源は、試料を全体的にまたは部分的に照射することができ、その場合、ライン状照射が好ましい。
【００２４】
さらに、光切換信号の焦線は、別の線と空間的に重ねることができよう。
そして、空間的な重なりは、試料から出射する測定信号を読取るために光学信号の焦線の強度零地点がラインの最大値と空間的に重なっているように選択される。
この場合、用途に応じて、各ラインに対して専用の走査機構、好ましくは走査ミラーを割り当てることができ、また、複数のラインに対して１つの走査機構で一緒に走査されるようにすることができる。
【００２５】
像生成時において速度上の利点を最大限利用するために、走査方向は、理想的には、瞳ラインの各設定方向に調整される。
さらに有利には、試料から出射する測定信号のライン検出は、ライン検出器を用いて実行することができる。
ライン検出器は、例えばＣＣＤラインとして構成することができる。
ＥＭＣＣＤまたはＡＰＤ（アバランシェフォトダイオード；Avalanche Photodiode）の利用も同様に考えられる。
【００２６】
光軸に沿っても分解能を向上させることに関しては、検出器のラインは、好ましくは、焦線と共焦点となるように配置されている。
具体的には、検出器のラインは、検出方向において走査機構の下流側（走査後検出（descanned detection））または走査機構の上流側（走査前検出（nondescanned detection
））に配置しておくことができる。
【００２７】
上述した顕微鏡は、少なくとも１つの光学的性質で互いに相違するさまざまな分子状態の間で染料分子を光誘導遷移させるために利用すれば、特に有利である。
顕微鏡は、例えば、Trans-Cis異性化物の諸状態間で遷移を誘導しまたはフォトクロミ
ック染料を切換えるのに利用することができる。
さらに、ＧＳＤ（基低状態の減衰）法では、染料分子をそのトリプレット状態において遷移させるための利用が可能である。
最後に、ＳＴＥＤ法の実施が提案される。
【００２８】
ところで、本発明の構成を有利な仕方で構成しかつ展開するさまざまな可能性がある。
そのため、従属請求項を参照し、試料を高い空間分解能で検査するための本発明に係る方法および本発明に係る顕微鏡の実施形態について、以下の説明を参照されたい。
図面に基づく好ましい実施形態の説明と関連し、本発明の構成に関する好ましい諸構成および諸展開もまた全般に説明される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
図１は、回折による分解能限界を越えて試料を高い空間分解能で検査するのに利用される照明過程のサイクルに関する概略を示す。
図１（ａ）によれば、まず、記録される試料領域Ｐ全体に、試料１内に付与されているとともに第１状態Ｚ１から第２状態Ｚ２へと繰り返し遷移可能な物質が切換信号２によって第１状態Ｚ１に移される。
第１状態Ｚ１及び第２状態Ｚ２は、少なくとも１つの光学的性質で互いに相違している。  具体的に示される実施例では、第１状態Ｚ１は、蛍光状態Ａであり、第２状態Ｚ２は、非蛍光状態Ｂである。
試料１内に付与される物質は、具体的に示される実施例では、フォトクロミック物質であり、その分子は、第１波長の光である切換信号２の照射によって蛍光性状態Ａに移される。
これは、理想的には、先行技術により知られているように、試料領域Ｐ内で切換信号２の単一の照明ラインで対物レンズ３を通して照明することによって行われる。
選択的に、試料１は、試料領域Ｐ全体を照射されてもよい。
【００３０】
基底状態の減衰（Ground State Depletion、ＧＳＤ）のとき、蛍光性（シングレット）状態への遷移は、ふつう自発的に起きる。
そのため、こうした場合、光切換信号の照射は不要である。
一般的に、１〜１００μｓ（一部ではそれより若干長い）の待機時間を考慮すればよいだけである。
【００３１】
次の、すなわち、図１（ｂ）に示すステップ（ｂ）では、別の波長の光、いわゆる光学信号４が、記録される試料領域Ｐに加えられる。
これは、明確な強度零地点５を有する二重線９の態様で生じる。
光学信号４は、光学信号４の光で照明されたすべての領域６においてＡ→Ｂ遷移を飽和誘導する。換言するなら、強度零地点５の近傍の狭く限定された物質領域がＡ状態のまま残る。
このＡ状態のまま残る物質領域は、回折限界の構造よりもはるかに小さくすることができる。
Ａ状態のまま残る領域のサイズは、最小強度５の特性に、したがってＡ→Ｂ遷移の達成される飽和度に基づいて専ら決定される。
【００３２】
図１（ｃ）には、Ａ状態の読取り状態が略示されている。
この目的のため、図１（ｂ）で処理されて物質がＡ状態のまま残った領域が記録されるように、光試験信号７は、記録される試料領域Ｐに照射される。
試験信号７は、好ましくは、同様にライン状に照射される。
この場合、最大値を有する単一のラインが生成され、この最大値は光学信号４の強度零地点５と空間的に重ねられる。
その結果、検出も、好ましくはライン状に、例えばＣＣＤラインの態様の共焦点に配置されるライン検出器によって行うことができる。
【００３３】
図１（ａ）〜（ｃ）に示したサイクルが繰返され、ラインパターンは、繰返しのたびに多少変位されていく。
こうして、記録される試料領域Ｐ全体を回折より細分化された範囲内の分解能で結像することができる。
【００３４】
図２が示しているのは、Ａ状態を読取るための照明光の個別のライン構成の生成、すなわち、最大値を有する単一ラインの生成であり、この最大値は（上で述べたように）光学信号４の本発明に係る焦線１０の強度零地点５と重ねることができる。
図２（ａ）によれば、照明光は、適当な光学素子１１を通して焦点面ＦＥと共役な面ＦＥ’内にライン状に結像される。
結像レンズ１２は、照明ラインを、照明光が試料１に集束されるのを助ける対物レンズ１３の瞳面ＰＥにコヒーレントに集束されるのに用いられている。
図示した照明ラインは、ｘ方向に延びている。
その結果、図２（ｂ）に示すように、瞳ＰＥは点対称でｙ方向にライン状で照射される（瞳ライン１４）。
図２（ｃ）に示すように、対物レンズ１３の焦点面ＦＥに同様にライン状の光構成が生成され、この光構成は、ｘ方向において瞳ライン１４に垂直であり（焦線１５）、焦点面ＦＥと共役な面ＦＥ’にラインの像を構成している。
焦線１５の横断面は、瞳ライン１４が瞳直径全体にわたるとき、回折限界の広がりを有している。
そして、焦線１５の横断面の広がりは、回折により限定されて、回折により限定された点光源（エアリーの円盤）の広がりよりも約１．４倍大きい。
【００３５】
図２において略示した光学素子１１は、さまざまな態様で実現することができる。
ＦＥ’または瞳ＰＥのライン状照明は、例えば、スリット絞りを結像することによって、またはシリンドリカルレンズまたはパウエルレンズで拡げられた照明光源を集束することによって達成することができる。
パウエルレンズの使用は、生成されるライン状の光構成が特別均質な光分布を持つという利点を提供する。
別の変更例は、ライン状にのみ反射するビームスプリッターを介した照明であり、このビームスプリッターは、瞳面ＰＥと共役な顕微鏡面に配置されている。
試料１のライン状照明をｘ方向に生成（図２（ｃ））するうえで決定的なのは、基本的にｙ方向での瞳ＰＥのコヒーレントなライン状照明のみである（図２（ｂ））。
【００３６】
図３は、横断面で中央の零地点５及び側方の限定的な最大値９を有する本発明に係る焦線１０の生成に関する実施例を示している。
このため、瞳ライン１４に沿って光学信号４の位相変調が実現される。
図３（ａ）には、瞳ＰＥのライン状照射が示されている。
瞳ライン１４の一方の半分は、瞳ライン１４の他方の半分に対して波連の半分だけ遅延されるように、瞳ライン１４に沿って瞳中心に半波長の位相飛躍が導入される。
そのことが、図３（ａ）では異なるハッチング領域で示されている。
この位相変調の結果、図３（ｂ）に示すように、中央の強度零地点５を有する二重線９が焦点面ＦＥに生成される。
別の位相変調も、このような中央の最小値を有する構成を基本的にもたらすことができる。
瞳ライン１４の５０％が波連の半分だけ遅延する特性を有するそれぞれの点対称の位相変調は、横断面プロフィル内に中央の最小値を有するとともに瞳ライン１４に対して直角に整列した焦線１０を生成している。
しかしながら、この場合焦線１０の横断面は、さらに複雑となり、それとともに一般にさらに多くの最大値及び最小値を含む。
【００３７】
図３（ａ）に矢印で示されているように、光は、瞳ライン１４に垂直に、すなわち、ｘ方向に偏光されている。
こうして、理論的な接線方向成分を有する偏光ベクトルのみが入射瞳１４に生成する。
後続の光学素子を通過するときこれらの偏光ベクトルは、ｚ方向、すなわち、光線方向で、例えば、（瞳に関連して）半径方向成分を有する偏光ベクトルよりもはるかに弱く減偏光する。
【００３８】
図４は、本発明に係る顕微鏡の一実施例を示している。
図４（ａ）に示す実施形態では、放射源１６のコヒーレントな照明光が適当な光学素子１１によって顕微鏡の中間像面ＺＢ３にライン状に集束される。
この場合、そのラインは、ｘ方向に延びている。
ライン状の光構成を実現するための光学素子１１は、シリンドリカルレンズ１７として構成されている。
中間像ＺＢ３は、レンズ１８を介して、顕微鏡の対物レンズ１３の瞳Ｐ１と共役な瞳面Ｐ２に結像され、そこで、光分布は、ｙ方向でライン状に延びる。
【００３９】
ストライプ状の反射膜ＲＳを有するビームスプリッター１９が顕微鏡の瞳面Ｐ３に配置されている。
ビームスプリッター１９は、ラインＲＳの領域でのみ反射し、瞳面Ｐ３全体を照射するとともに後方で検出される測定信号８はほぼ完全に透過される。
【００４０】
瞳Ｐ３は、光学素子２０、１８によってＹ走査機構２１に結像され、この走査機構は、ｙ方向で撮像するためにビームを走査することができる。
この走査機構は、同様に瞳面Ｐ２内に配置されている。
別の結像は、走査用接眼レンズ２２を介して中間像ＺＢ１に行われ、そこで再びｘ方向に光のストライプが生成する。
この光のストライプは、チューブレンズ２３及び対物レンズ１３を介して試料空間内の焦点面ＦＥに結像される。
この場合、ビームスプリッター１９が配置される瞳面Ｐ３と同様に、ｙ方向にライン状光分布が対物レンズ１３の瞳Ｐ１に生成する。
（回折により限定される）照明ストライプが、中間像面ＺＢ３と同様に、焦点面ＦＥに生成する。
【００４１】
中央の強度零地点５及び側方の最大強度９を有する本発明に係る焦線１０を生成するために、瞳ライン１４に沿って位相変調が行われる。
図示された実施例では、このため、光の位相を波連の半分だけ遅延させる位相遅延構造ＰＶをビームスプリッター１９の一部に備えることによって、図示の瞳Ｐ３に位相飛躍が導入される。
図４（ｂ）に示すように、ここでは、透明に構成される被膜ＰＶは、瞳直径全体にわたって延びる反射膜ＲＳの一方の半分を覆う。
その膜の屈折率のために、被膜ＰＶを通過するとき光は、被覆されていない個所（つまり空気）を通過する光に対して遅延される。
被膜ＰＶは、例えば、フッ化マグネシウムまたは二酸化ケイ素等の誘電体から作成することができ、反射膜ＲＳ上に蒸着することができる。
液晶膜に基づく構造も考えられる。
【００４２】
別の結像レンズ（ここには図示せず）で生成することのできる別の瞳面内に位相遅延素子を挿入することが選択的に行われる。
その場合、この別の瞳面に、誘電体被膜を備えた基板、液晶ベースの位相変調器、または色消し位相フィルタ等の、位相遅延素子を配置することができよう。
上述の位相遅延性を有する光学素子を導入することがすべてであり、この光学素子は、理想的には、瞳面にまたはその近傍に配置されている。
【００４３】
検出光（一般に蛍光）は、測定信号８として、対物レンズ１３、チューブレンズ２３、走査用接眼レンズ２２、走査機構２１（走査後検出）、レンズ１８及び２０、スペクトルフィルタリングするためのフィルタ２４、検出器レンズ２５によって、共焦点に配置されるライン検出器２６に結像される。
走査前検出も考えられ、その際検出器２６は、スキャナ２１と対物レンズ１３との間に配置されよう。
【００４４】
図５は、本発明に係る顕微鏡の別の実施形態を示しており、その構成は、図４に示す顕微鏡の構成に概念的に類似している。
見易くする理由から光路は、図示されていない。
ライン状に照射される瞳面Ｐ３（ｙ方向の瞳ライン１４）に、（空間的な）ビームスプリッターおよび位相遅延素子として同時に機能するビームスプリッター１９は、（図４の構成とは異なり）配置されていない。
むしろ、両方の機能が分離され、ビームスプリッター１９が専ら空間的ビームスプリッターとして機能するのに対して、位相遅延は、付加的に導入される位相遅延光学素子２７によって行われる。
瞳Ｐ３またはその近傍に同様に配置される位相遅延光学素子２７は、空間的に構成された透明な位相遅延被膜ＰＶ（誘電体）を備えた基板とすることができる。
図５（ｂ）では、光学素子２７が円形に構成されており、負のｙ方向にある半円が位相遅延被膜ＰＶを備えている。
さらに、液晶ベースの位相変調器または色消し位相フィルタ、可動微小鏡列（arrays with movable micromirrors）または別の変形可能な鏡を有する列が考えられる。
照明光と検出光とを分離するためのビームスプリッター１９として利用されるのは、例えば、カットオフフィルタ（edge filter）の態様の従来のダイクロイックビームスプリ
ッター２８である。
位相遅延光学素子２７は、ダイクロイックビームスプリッター２８の下流側に設けられている。
【００４５】
本発明に係る方法および本発明に係る顕微鏡のさらに有利な諸構成に関しては、繰返しを避けるために明細書の全体的部分と添付した特許請求の範囲とを参照されたい。
【００４６】
最後に、以上述べた実施例は、特許請求の範囲に記載された本発明の構成を解説するのに役立つにすぎず、本発明の構成を本実施形態に限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】試料を高い空間分解能で検査するための方法の照明過程サイクルを示す概略図。
【図２】単一の最大強度を備えた横断面プロフィルを有する焦線の生成を示す概略図。
【図３】少なくとも１つの強度零地点及び側方に隣接する最大強度を備えた横断面プロフィルを有する焦線の本発明に係る生成を示す概略図。
【図４】本発明に係る顕微鏡の第１実施例の構成を示す概略図。
【図５】本発明に係る顕微鏡の第２実施例の構成を示す概略図。
【符号の説明】
【００４８】
１  ・・・試料
２  ・・・切換信号
３  ・・・対物レンズ
４  ・・・光学信号
５  ・・・強度零地点
６  ・・・領域
７  ・・・試験信号
８  ・・・測定信号
１０  ・・・焦線
１１  ・・・光学素子
１２  ・・・結像レンズ
１３  ・・・対物レンズ
１４  ・・・瞳ライン
１５  ・・・焦線
１６  ・・・放射源
１７  ・・・シリンドリカルレンズ
１８  ・・・レンズ
１９  ・・・ビームスプリッター
２０  ・・・光学素子
２１  ・・・ｙスキャナ
２２  ・・・走査用接眼レンズ
２３  ・・・チューブレンズ
２４  ・・・フィルタ
２５  ・・・検出器レンズ
２６  ・・・ライン検出器
２７  ・・・光学素子
２８  ・・・ビームスプリッター
Ａ  ・・・蛍光性状態
Ｂ  ・・・非蛍光状態
ＦＥ  ・・・焦点面
Ｐ  ・・・試料領域
Ｐ１〜Ｐ３  ・・・瞳面
ＰＥ  ・・・瞳
ＲＳ  ・・・反射膜
ＰＶ  ・・・被膜
Ｚ１  ・・・第１状態
Ｚ２  ・・・第２状態
ＺＢ１  ・・・中間像
ＺＢ３  ・・・中間像面
【図１】
2007233370.tif 000003
【図２】
2007233370.tif 000004
【図３】
2007233370.tif 000005
【図４】
2007233370.tif 000006
【図５】
2007233370.tif 000007
【外国語明細書】
【発明の名称】Method and microscope for high spatial resolution examination of samples
【技術分野】
【０００１】
The invention relates to a method and a microscope, in particular a laser scanning fluorescence microscope, for high spatial resolution examination of samples, the sample to be examined comprising a substance that can be repeatedly converted from a first state into a second state, the first and the second states differing from one another in at least one optical property, comprising the steps that the substance in a sample region to be recorded is firstly brought into the first state, and that the second state is induced by means of an optical signal, spatially delimited subregions being specifically excluded within the sample region to be recorded.
【背景技術】
【０００２】
Methods and microscope of the type named at the beginning are known from practice. In principle, Abbe's law sets a theoretical limit to the spatial resolution of imaging optical methods owing to the diffraction limit, the diffraction limit being a function of the wavelength of the light used. However, it is possible with the aid of the method and microscopes discussed here to achieve spatial resolutions that are improved beyond the theoretical diffraction limit known from Abbe.
【０００３】
In the known methods, there are provided for this purpose in the samples to be examined substances that can be repeatedly converted from a first state into a second state, the first and the second states differing from one another in at least one optical property. In the case of most known methods, the first state is a fluorescence-capable state (named state A below), and the second state is a nonfluorescence-capable state (named state B below). After the substance in a sample region to be recorded has been brought into the fluorescence-capable state A by means of a switching signal, state B is induced in spatially limited subregions of the sample region to be recorded by means of an optical signal, and the fluorescence of fluorescence molecules is thereby suppressed. The physical process of fluorescence suppression can be of a very different nature in this case. Thus, for example, stimulated emission from the previously excited state, or an optically induced structural change in the fluorescence molecules is known.
【０００４】
What is decisive is that the transition induced by an optical signal from the first into the second state in the sample volume takes place in large regions in a saturated fashion, that is to say completely, and precisely does not take place in at least one subregion of the sample volume in that the optical switching signal is specifically not irradiated there. This effect can be achieved by producing an intensity zero point of the optical signal. No transition into the second state (in general the nonfluorescing state B) takes place at the zero point and in its immediate vicinity, and so the first state (in general the fluorescing state A) is retained. Even in the close vicinity of the intensity zero points, a saturation of the transition A (R) B owing to the optical signal leads in the illuminated regions of the sample region to be recorded to a (virtually) complete transfer into the state B. The more strongly the process is driven into saturation, that is to say the more energy that is introduced by the optical signal into the regions around the zero point, the smaller becomes the region with fluorescence molecules in the fluorescence-capable state A, or generally in an "luminous" state. This region can be rendered arbitrarily small in principle as a function of the degree of saturation in the immediate zero point vicinity. It is therefore possible to mark regions of the state A that are arbitrarily much smaller than the smallest regions of an applied optical signal that are possible on the basis of the diffraction limit. If the region of the state A is subsequently read out, for example by irradiating a test signal, the (fluorescence) measuring signal originates from a defined region that can be smaller than is permitted by the diffraction limit. If the sample is scanned point by point in the way described, an image is produced with a resolution that is better than is allowed by diffraction theory. 
【０００５】
Methods of the type described here in the case of which the optical property of fluorescence capability/nonfluorescence capability is used as difference between two states are disclosed, for example, in DE 103 25 459 A1 and DE 103 25 460 A1. In these methods, fluorescence molecules are brought with the aid of an optical signal from a state A (fluorescence-capable) into a state B (nonfluorescence-capable), saturation being achieved in the transition A (R) B. The regions of the sample that remain in the fluorescence-capable state A result in each case from an intensity minimum, having a zero point, in the irradiated optical signal. The intensity minima are part of an interference pattern. The sample is scanned by displacing the intensity minima in the optical signal, the displacement being effected by shifting the phase of the interfering beams.
【０００６】
It is disadvantageous in the known methods that the interfering beams form an interference pattern with local punctiform intensity minima. Consequently, scanning the sample requires a point-to-point scanning operation in at least two dimensions, and this renders the scanning operation extremely time consuming.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
If is now the object of the present invention to specify a method and a microscope of the type mentioned at the beginning which enable rapid scanning of a sample with structurally simple and cost effective means in conjunction with a compact design.
【課題を解決するための手段】
【０００８】
According to the invention, the above object is achieved by means of a method having the features of patent claim 1. In accordance therewith, the method is configured and developed in such a way that the optical signal is provided in the form of a focal line with a cross-sectional profile having at least one intensity zero point with laterally neighboring intensity maxima.
【０００９】
The above object is achieved, furthermore, by a microscope having the features of patent claim 25. In accordance therewith, the microscope is configured and developed in such a way that the optical signal can be provided in the form of a focal line with a cross-sectional profile having at least one intensity zero point with laterally neighboring intensity maxima.
【００１０】
It was firstly realized in the way according to the invention that the imaging rates of known high resolution imaging methods is not sufficient for diverse applications for example in the field of real time microscopy of biological samples. It was then realized in a further inventive way that a line scan which is substantially quicker in comparison with a point scan is possible when the second state can be induced along a line that is narrow (arbitrarily, in principle). According to the invention to this end the optical signal is provided in the form of a focal line, the focal line exhibiting a cross-sectional profile having at least one intensity zero point - for conserving the first state along a line that is narrow (arbitrarily, in principle) - with laterally neighboring intensity  maxima - for inducing the second state in saturation.
【００１１】
The method according to the invention and the microscope according to the invention can be used in a particularly advantageous way in conjunction with first and second states that are very long lasting or are even temporally stable permanently. In this case, it is possible to select for the saturation of the transition from the first into the second state a comparatively long period within which the energy of the optical signal that is required for saturation is irradiated. The local intensities relating to transitional saturation can thereby be selected to be very slight. Above all, the total energy available from a radiation source of the optical signal can be distributed over voluminous regions in the sample space, and a number of intensity zero points, or an extended zero point can be produced. The saturation can be achieved despite the low local intensities resulting therefrom in the vicinity of the zero point(s) by comparison with the application of the total signal around only one punctiform zero point. This requires that the signal be irradiated only for a sufficiently long time  until all the molecules in the surroundings of the zero points are finally in the second state. This is a decisive difference from the case of a shortlived state (for example in the STED method with a typical lifetime of ~ 1 ns for a fluorescence-capable state A), where the energy required for saturation must be irradiated in such a short time (substantially faster than the rate A -> B) that the total power of the radiation source is sufficient only to produce one (or at most a few) local zero points. It may be demonstrated for concrete systems that it is possible in the case of stable states (for example photochromic dyes) or long lived states (for example transfer into the triplet system in the case of the GSD, GSD = Ground State Depletion, method) for the power of cost effective and commercial laser systems to be distributed over such large regions that a number of punctiform intensity zero points (>> 10) or entire stripes of vanishing intensity, in the immediate vicinity of which saturation can be achieved as before, can be produced in the sample. This enables a parallelized imaging when the sample is simultaneously scanned with the multiplicity of punctiform zero points or with zero point lines, and the signals are detected simultaneously for each zero point in a separate fashion by a detector. In this way, it is possible to design microscopes with resolutions below the classic diffraction limit, their imaging rate being in the region of STED-based methods, and being substantially increased by comparison with systems with a single local zero point.
【００１２】
It is provided in a concrete embodiment that the focal line is generated by integrating in the microscope an optical component which firstly produces an illumination line in the pupil plane conjugate with the pupil of the microscope objective. Furthermore, a phase modulating element is provided with which a phase modulation suitable for producing the cross-sectional profile of the focal line is carried out along the pupil line. 
【００１３】
It can be provided in the course of the phase modulation that one or more phase jumps are introduced along the pupil line. It is particularly preferred to introduce a phase jump at the pupil midpoint. This phase jump is selected in a further advantageous way such that it corresponds to the length of half a wave train so that half of the line is retarded by half a wave train. There is thus produced in the focal plane a focal line with a cross-sectional profile that is composed of an intensity zero point with laterally neighboring intensity maxima. Alternatively, it is possible that a number of phase jumps by in each case half a wave train are introduced along the pupil line, such that as a result half of the total line, that is to say half of the light quantity that is radiated by the pupil, is likewise retarded by half a wave train by comparison with the other half.
【００１４】
With regard to a structurally simple design, it can be provided that the phase modulation along the pupil line is implemented by means of a spatial liquid-based phase modulator in an intermediate image of the pupil. Alternatively, it is possible to conceive the inclusion of an optical component with a phase retarding optical coating. It is possible in principle to use all phase retarding elements, such as substrates with dielectric coatings, phase modulators based on liquid crystals, or achromatic phase filters. The optics with the phase retarding property is ideally arranged in or near the pupil plane.
【００１５】
With regard to a structurally simple design, it can be provided that the pupil line is produced by focusing an illuminating light beam of an illuminating light source with a cylindrical lens or a Powell lens. Alternatively, the pupil line can be produced by imaging a slit diaphragm into the pupil plane. It is also conceivable to use holographic elements.
【００１６】
In a particularly advantageous way, the pupil line is coupled into the beam path by means of an Achrogate filter. It would then be possible in a preferred way to implement the phase modulation along the pupil line by means of additionally phase retarding layers on the filter, for example in the form of dielectric coatings.
【００１７】
With regard to a particularly compact design, the optical component for producing the pupil line, and the phase modulating element could be arranged as a structural unit in the illuminating beam path. With regard to a high degree of flexibility, the optical component for producing the pupil line, and the phase modulating element could also, however, be arranged as separate units at different positions in the illuminating beam path.
【００１８】
In order to ensure a coherent linear illumination of the pupil of the microscope objective, the illuminating light source for generating the optical signal is preferably designed as a laser light source.
【００１９】
In a particularly advantageous way, the light of the optical signal is polarized perpendicular to the pupil line in order in this way to exclude depolarization effects to a maximum extent.
【００２０】
In a particularly preferred embodiment, the focal line is produced sequentially in different spatial directions. Spatial directions oriented in an orthogonal fashion to one another can be involved in this case, for example. It can correspondingly be provided that the entire sample volume to be recorded is scanned sequentially in each of the spatial directions. Subsequently, the recorded individual images can be assembled mathematically to form an overall image, the result being to realize an increase in resolution in more than one direction. 
【００２１】
It can be provided that the transition from the first state into the second state is implemented by means of multiphoton absorption. Alternatively, or in addition, the measuring signal emanating from the sample is read out by means of multiphoton excitation. Such a configuration is suggested, in particular, in the case of special applications, for example when the aim is to prevent a bleaching of the sample.
【００２２】
It is provided in a further preferred design that the optical signal and a test signal are respectively generated in order to read out the first state by means of pulsed light sources. A synchronization of the pulsed light sources proves to be advantageous in this case.
【００２３】
The illuminating light source for generating the optical signal can be combined with at least one further light source, in which case the further light source could serve for reading out the measuring signal emanating from the sample, and/or for generating a switching signal in order to induce the first state. In particular, the further light source could illuminate the sample entirely or partially, a linear illumination being preferred.
【００２４】
In addition, the focal line of the optical switching signal could be spatially superposed by a further line. In a particularly advantageous way, the spatial superposition is selected in such a way that the intensity zero point of the focal line  of the optical signal is spatially superposed by the maximum of a line in order to read out the measuring signal emanating from the sample. Depending on the application, it is possible in this case for each line to be assigned a dedicated scanning device, preferably in the form of a scanning mirror, or for the lines to be scanned jointly with a single scanning device.
【００２５】
In order to exploit the speed advantages fully during imaging, the scanning direction is ideally tuned to the respective running direction of the pupil line. In a further advantageous way, a row detector can be used to carry out a line detection of the measuring signal emanating from the sample. The row detector can, for example, be designed as a CCD row. The use of an EMCCD or an APD (Avalanche Photodiode) is likewise conceivable.
【００２６】
With regard to an increase in the resolution along the optical axis, as well, the detector row is preferably arranged confocally with the focal line. In concrete terms, the detector row can in this case be arranged in the detection direction downstream of the scanning device (descanned detection) or upstream of the scanning device (nondescanned detection).
【００２７】
In a particularly advantageous way, the described microscope is used for the optically induced transition of dye molecules between various molecular states that differ from one another in at least one optical property. Thus, for example, the microscope can be used, for example, to induce a transition between the states of a trans-Cis isomerization or for switching photochromic dyes. Again, another possibility is use for transferring dye molecules in their triplet state during a GSD (Ground State Depletion) method. Finally, carrying out STED methods is suggested.
【００２８】
There are various possibilities of configuring and developing the teaching of the present invention in an advantageous way. To this end, reference is to be made, on the one hand, to the subordinate claims, and, on the other hand, to the subsequent explanation of preferred exemplary embodiments of the method according to the invention and the microscope according to the invention for high spatial resolution examination of samples. Preferred refinements and developments of the teaching are also explained in general in conjunction with explanations of the preferred exemplary embodiments and with the aid of the drawing, in which
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
Figure 1 shows a schematic of a cyclic illumination operation such as is used for high spatial resolution examination of samples beyond the diffraction limited resolving limit. In accordance with figure 1a, the first step is to use a switching signal 2 to bring into the first state Z1 in the entire sample space P to be recorded a substance that is provided in the sample 1 and can be converted repeatedly from a first state Z1 into a second state Z2, the first and the second states Z1, Z2 differing from one another in at least one optical property. In the exemplary embodiment illustrated in concrete terms, the first state Z1 is a fluorescing state A, and the second state Z2 is a nonfluorescing state B. In the example illustrated in concrete terms, the substance provided in the sample 1 is a photochromic substance whose molecules are brought into the fluorescence-capable state A by irradiation with light of a first wavelength, the switching signal 2. This happens ideally by illumination through an objective 3 with a simple illumination line of the switching signal 2 in the sample space P, as is known when viewed per se from the prior art. Alternatively, the sample 1 can also be irradiated in the entire sample space P.
【００３０】
In the case of ground state depletion (GSD), the transition into the fluorescence-capable (singlet) state usually takes place spontaneously. The irradiation of optical switching signals is therefore superfluous in this case, there being a need only to take account of waiting times of typically 1 to 100 μs (in part also a little longer).
【００３１】
In a next step - illustrated in figure 1b - light of another wavelength, the so-called optical signal 4, is applied to the sample region P to be recorded. This happens in the form of a double line 9 with defined intensity zero points 5. The optical signal 4 induces in a saturated fashion the transition A (R) B in all regions 6 illuminated with the light of the optical signal 4. In other words, it is only a region of the substance that is narrowly defined in the immediate vicinity of the intensity zero point 5 that remains in state A. This remaining region of the substance in state A can be much smaller than diffraction limited structures. The size of the remaining region in state A is determined entirely as a function of the quality of the intensity minimum 5, and thus of the degree of saturation of the transition A (R) B that is achieved.
【００３２】
In figure 1c is a schematic of the readout operation of state A. To this end, an optical test signal 7 is irradiated into the sample region P to be recorded in such a way that the region prepared in accordance with figure 1b and in which the substance has remained in state A, is recorded. The test signal 7 is preferably likewise radiated linearly. In this case, a single line with a maximum is produced, the maximum being spatially superposed with the intensity zero point 5 of the optical signal 4. Consequently, the detection can also preferably be performed linearly, for example by a confocally arranged row detector, for example, in the form of a CCD row.
【００３３】
The cycle illustrated in figures 1a to c is repeated, the line pattern being shifted somewhat further upon each repetition. It is possible in this way for the entire sample region P to be recorded to be imaged with a resolution in the subdiffraction region.
【００３４】
Figure 2 shows a schematic of the production of an individual line structure of the illuminating light for reading out the states A, that is to say a single line with a maximum that - as set forth above - can be superposed with the intensity zero point 5 of the inventive focal line 10 of the optical signal 4. In accordance with figure 2a, the illuminating light is firstly imaged linearly through a suitable optics 11 in a plane FE’ conjugate with the focal plane FE. An imaging lens 12 is used to focus the illumination line coherently in the pupil plane PE of an objective 13 with the aid of which the illuminating light is focused in the sample 1. The illumination line runs in the x-direction in the example illustrated. Consequently - as shown in figure 2b - the pupil PE is illuminated linearly in the y-direction in a centrally symmetrical fashion (pupil line 14). As shown in figure 2c - there is likewise produced in the focal plane FE of the objective 13 a linear light structure that is perpendicular to the pupil line 14 in the x-direction (focal line 15), and constitutes an image of the line in the plane FE’ conjugate with the focal plane FE. The cross section of the focal line 15 has a diffraction limited extent when the pupil line 14 covers the entire pupil diameter. The cross-sectional extent of the focal line 15 is approximately 1.4 times greater (in a fashion limited by diffraction) than that of a diffraction limited point source (Airy disk).
【００３５】
The optics 11 indicated purely schematically in figure 2 can be implemented in various forms. Thus, a linear illumination of FE’ or of the pupil PE can be achieved, for example, by imaging a slit diaphragm or by focusing an expanded illuminating light beam by means of a cylindrical lens or a Powell lens. The use of a Powell lens offers the advantage that the linear light structure produced has a particularly homogeneous light distribution. A further variant is the illumination via a beam splitter that reflects only in a linear fashion and is arranged in a plane of the microscope conjugate with the pupil plane PE. In principle, only the coherent linear illumination of the pupil PE in the y-direction (figure 2b) is decisive for generating a linear illumination of the sample 1 in the x-direction (figure 2c).
【００３６】
Figure 3 is a schematic of an exemplary embodiment for the production of an inventive focal line 10 for the central zero point 5 in the cross section and laterally limiting maxima 9. A phase modulation of the optical signal 4 is implemented to this end along the pupil line 14. The linear illumination of the pupil PE is illustrated in figure 3a. A phase jump of half a wavelength is introduced at the pupil midpoint along the pupil line 14 such that one half of the line 14 is retarded by half a wave train by comparison with the other half of the line 14. This is indicated in figure 3a by the differently hatched regions. The consequence of this phase modulation is that a double line 9 with a central intensity zero point 5 is produced in the focal plane FE, as is illustrated in figure 3b. It is also possible in principle for other phase modulations to lead to structures with such a central minimum. Thus, each centrally symmetrical phase modulation having the property that 50% of the pupil line 14 is retarded by half a wave train produces a focal line 10 that is aligned in an orthogonal fashion to the pupil line 14 and has a central minimum in the cross-sectional profile. However, the cross section of the focal line 10 becomes more complicated in this case and thus in general comprises more maxima and minima.
【００３７】
As indicated in figure 3a by the arrows illustrated, the light is polarized perpendicular to the pupil line 14, that is to say in the x-direction. As a consequence of this, only polarization vectors with a pure tangential component occur in the entrance pupil 14. When traversing subsequent optics, these are depolarized much more weakly in the z-direction, that is to say in the beam direction, than are, for example, polarization vectors having (with reference to the pupil) radial components.
【００３８】
Figure 4 shows a schematic of an exemplary embodiment of an inventive microscope. In the case of the embodiment illustrated in figure 4a, coherent illuminating light of a radiation source 16 is focused linearly into an intermediate image plane ZB3 of the microscope through a suitable optics 11. In this case, the line runs in the x-direction. The optics 11 for implementing a linear light structure is designed as a cylindrical lens 17. The intermediate image ZB3 is imaged via a lens 18 into the pupil plane P2 conjugate with the pupil P1 of the microscope objective 13, where the light distribution runs linearly in the y-direction.
【００３９】
Arranged in the pupil plane P3 of the microscope is a beam splitter 19 with a strip-shape reflection layer RS. The beam splitter 19 is reflecting only in the region of the line RS, and so the measuring signal 8 that is to be detected backwards and illuminates the entire pupil plane P3 is transmitted virtually completely.
【００４０】
The pupil P3 is imaged through optics 20 and 18 onto a Y scanner 21 that can scan the beam for imaging in the y-direction. This is likewise located in the pupil plane P2. Via the scanning eyepiece 22, further imaging is performed into an intermediate image ZB1 where a light strip is again produced in the x-direction. This is imaged into the focal plane FE in the sample space via the tube lens 23 and the objective 13. There is produced in this case in the pupil P1 of the objective 13 a linear light distribution in the y-direction analogous to the pupil plane P3 in which the beam splitter 19 is located. A (diffraction limited) illumination strip analogous to the intermediate image plane ZB3 is produced in the focal plane FE.
【００４１】
A phase modulation is carried out along the pupil line 14 in order to produce the inventive focal line 10 with a central intensity zero point 5 and lateral intensity maxima 9. To this end, in the exemplary embodiment illustrated a phase jump is introduced in the pupil P3 in the exemplary embodiment illustrated by providing a portion of the beam splitter 19 with a phase retarded structure PV that retards the phase of the light by half a wave train. As shown in figure 4b - the coating PV, here of transparent design, in this case covers one half of the reflection layer RS running over the entire pupil diameter. Because of the refractive index of the layer, when traversing the coating PV the light is retarded as against the light that traverses uncoated sites (that is to say air). The coating PV can be produced, for example, from a dielectric such as magnesium fluorite or silicon dioxide, and vapor deposited onto the reflection layer RS. A structure based on a liquid crystal layer is also conceivable.
【００４２】
An alternative implementation would be the insertion of a phase retarding element in a further pupil plane that can be produced by further imaging lenses (not illustrated here). It would then be possible to arrange in this further pupil plane phase retarding elements such as substrates with dielectric coatings, phase modulators based on liquid crystals or achromatic phase filters. All that is decisive is the introduction of an optics with the described phase retarding property, this ideally being arranged in or near a pupil plane.
【００４３】
The detection light (generally fluorescence) is imaged as measuring signal 8 onto a confocally arranged row detector 26 through the objective 13, the tube lens 23, the scanning eyepiece 22, the scanner 21 (descanned detection), the lenses 18 and 20, a filter 24 for spectral filtering, and a detector lens 25. A non-descanned detection is also conceivable, and in this case the detector 26 would need to be arranged between the scanner 21 and objective 13.
【００４４】
Figure 5 is a schematic of a further embodiment of an inventive microscope, the design being conceptually similar to the design of the microscope in accordance with figure 4. The beam paths are not illustrated for reasons of clarity. In a departure from the design in accordance with figure 4, no beam splitter 19 that functions simultaneously as a (spatial) beam splitter and as a phase retarding element is arranged in the pupil plane P3, which is linearly illuminated (pupil line 14 in the y-direction). Rather, the two functions are separated in that the beam splitter 19 now functions exclusively as a spatial beam splitter, whereas the phase retardation is performed by an additionally inserted phase retarding optics 27. The phase retarding optics 27, that is likewise arranged in or near the pupil P3 can, in turn, be a substrate that is provided in a spatially structured fashion with a phase retarding, transparent coating PV (dielectric). The optics 27 is of circular design in figure 5b, the semicircle lying in the negative y-direction being provided with the phase retarding coating PV. Furthermore, phase modulators based on liquid crystals, or achromatic phase filters, arrays with movable micromirrors, or other deformable mirrors are also conceivable. A conventional dichroic beam splitter 28, for example in the form of an edge filter, comes into use as beam splitter 19 for separating illuminating light and detection light. The phase retarding optics 27 is arranged downstream of the dichroic beam splitter 28.
【００４５】
In order to avoid repetitions, reference may be made to the general part of the description and to the attached patent claims with regard to further advantageous refinements of the method according to the invention and of the microscope according to the invention.
【００４６】
Finally, it may be pointed out expressly that the abovedescribed exemplary embodiments serve merely for discussing the teaching claimed, but do not restrict the latter to the exemplary embodiments.
【図面の簡単な説明】
【００４７】
figure 1    shows a schematic of a cyclic illumination scheme of a method for high spatial resolution examination of samples,
figure 2    shows a schematic of the production of a focal line with a cross-sectional profile having a single intensity maximum,
figure 3    shows a schematic of the inventive production of a focal line with a cross-sectional profile having at least one intensity zero point with laterally neighboring intensity maxima,
figure 4    shows a schematic of the design of a first exemplary embodiment of an inventive microscope, and
figure 5    shows a schematic of the design of a second exemplary embodiment of an inventive microscope.
【請求項１】
1.    A method for high spatial resolution examination of samples, the sample (1) to be examined comprising a substance that can be repeatedly converted from a first state (Z1, A) into a second state (Z2, A), the first and the second states (Z1, A; Z2, B) differing from one another in at least one optical property, comprising the steps that the substance in a sample region (P) to be recorded is firstly brought into the first state (Z1, A), and that the second state (Z2, B) is induced by means of an optical signal (4), spatially delimited subregions being specifically excluded within the sample region (P) to be recorded,
wherein the optical signal (4) is provided in the form of a focal line (10) with a cross-sectional profile having at least one intensity zero point (5) with laterally neighboring intensity maxima (9).
【請求項２】
2.    The method as claimed in claim 1, the sample (1) being illuminated by an objective (3, 13), wherein the focal line (10) is produced by means of a linear illumination in a pupil plane (P3) conjugate with the pupil (P1) of the objective (3, 13) - pupil line (14) - and by suitable phase modulation along the pupil line (14).
【請求項３】
3.    The method as claimed in claim 2, wherein the phase modulation is undertaken in such a way that one or more phase jumps are introduced along the pupil line (14). 
【請求項４】
4.    The method as claimed in claim 3, wherein a phase jump is introduced at the pupil midpoint.
【請求項５】
5.    The method as claimed in claim 4, wherein the introduced phase jump corresponds to the length of half a wave train.
【請求項６】
6.    The method as claimed in claim 2, wherein a number of phase jumps by in each case half a wave train are introduced along the pupil line (14).
【請求項７】
7.    The method as claimed in one of claims 2 to 6, wherein the phase modulation along the pupil line (14) is implemented by means of a spatial liquid-based phase modulator in an intermediate image of the pupil (P1).
【請求項８】
8.    The method as claimed in one of claims 2 to 6, wherein the phase modulation along the pupil line (14) is implemented by means of an optical component (19, 27) having a phase-retarding optical coating (PV) and arranged in an intermediate image of the pupil (P1).
【請求項９】
9.    The method as claimed in one of claims 2 to 6, wherein the phase modulation along the pupil line (14) is implemented by means of an optical component arranged in an intermediate image of the pupil (P1), the component firstly generating a phase jump by total reflection, and subsequently generating a reflection at a metal layer.
【請求項１０】
10.   The method as claimed in one of claims 2 to 6, characterized in that the phase modulation along the pupil line (14) is implemented by means of an optical element arranged in an intermediate image of the pupil (P1), the element having one or more deformable and/or movable mirrors and/or mirror elements.
【請求項１１】
11.   The method as claimed in one of claims 2 to 10, wherein the pupil line (14) is produced by focusing an illuminating light beam of an illuminating light source with a cylindrical lens (17) or a Powell lens.
【請求項１２】
12.   The method as claimed in one of claims 2 to 10, wherein the pupil line (14) is produced by imaging a split diaphragm into the pupil plane.
【請求項１３】
13.   The method as claimed in one of claims 2 to 10, wherein the pupil line (14) is produced by means of holographic elements.
【請求項１４】
14.   The method as claimed in one of claims 2 to 10, wherein the pupil line (14) is coupled into the beam path by means of an Achrogate filter.
【請求項１５】
15.   The method as claimed in claim 14, wherein the phase modulation along the pupil line (14) is implemented by means of additional phase-retarding layers on the Achrogate filter.
【請求項１６】
16.   The method as claimed in one of claims 1 to 15, wherein a laser is used as an illuminating light source for providing the optical signal (4).
【請求項１７】
17.   The method as claimed in one of claims 2 to 16, wherein the light of the optical signal (4) is polarized perpendicular to the pupil line (14).
【請求項１８】
18.   The method as claimed in one of claims 1 to 17, wherein the focal line (10) is produced sequentially in different spatial directions.
【請求項１９】
19.   The method as claimed in claim 18, wherein the sample region (P) to be recorded is multiply scanned in each case in accordance with the respective spatial direction of the focal line (10).
【請求項２０】
20.   The method as claimed in claim 19, wherein the individual images are assembled mathematically to form an overall image.
【請求項２１】
21.   The method as claimed in one of claims 1 to 20, wherein the transition from the first state (Z1, A) into the second state (Z2, B) is implemented by means of multiphoton absorption.
【請求項２２】
22.   The method as claimed in one of claims 1 to 21, wherein the measuring signal (8) emanating from the sample (1) is read out by means of multiphoton excitation.
【請求項２３】
23.   The method as claimed in one of claims 1 to 22, wherein the optical signal (4) and a test signal (7) are generated in order to read out the first state (Z1, A) by means of pulsed light sources.
【請求項２４】
24.   The method as claimed in claim 23, wherein the pulsed light sources are synchronized.
【請求項２５】
25.   A microscope, in particular a laser scanning fluorescence microscope, for high spatial resolution examination of samples and, in particular, for carrying out a method as claimed in one of claims 1 to 24, the sample (1) to be examined comprising a substance that can be repeatedly converted from a first state (Z1, A) into a second state (Z2, B), the first and the second states (Z1, A; Z2, B) differing from one another in at least one optical property, comprising the steps that the substance in a sample region (P) to be recorded is firstly brought into the first state (Z1, A), and that the second state (Z2, B) is induced by means of an optical signal (4), spatially delimited subregions being specifically excluded within the sample region (P) to be recorded,
wherein the optical signal (4) can be provided in the form of a focal line (10) with a cross-sectional profile having at least one intensity zero point (5) with laterally neighboring intensity maxima (9).
【請求項２６】
26.   The microscope as claimed in claim 25, defined by an optical component (11) for producing an illumination line in a pupil plane (P3) conjugate with the pupil (P1) of the microscope objective (3, 13).
【請求項２７】
27.   The microscope as claimed in claim 26, defined by a phase modulating element (19, 27) for producing the cross-sectional profile of the focal line (10) by phase modulation of the pupil line (14).
【請求項２８】
28.   The microscope as claimed in claim 26 or 27, wherein the optical component (11) for producing the pupil line (14), and the phase modulating element (19, 27) are designed as a structural unit.
【請求項２９】
29.   The microscope as claimed in claim 27 or 28, wherein the optical component (11) for producing the pupil line (14), and the phase modulating element (19, 27) are respectively arranged as separate units in the illuminating beam path.
【請求項３０】
30.   The microscope as claimed in one of claims 27 to 29, wherein the phase modulating element (19, 27) is designed as a spatial liquid-based phase modulator arranged in an intermediate image of the pupil (P1), or as an optical component having a phase retarding dielectric coating (PV).
【請求項３１】
31.   The microscope as claimed in one of claims 26 to 30, wherein the optical component (11) for producing the pupil line (14) is designed as a cylindrical lens (17) and/or as a Powell lens and/or as a holographic element.
【請求項３２】
32.   The microscope as claimed in one of claims 25 to 31, wherein the illuminating light source for generating the optical signal (4) is designed as a laser.
【請求項３３】
33.   The microscope as claimed in one of claims 25 to 32, wherein the illuminating light source for generating the optical signal (4) is combined with at least one further light source in order to read out the measuring signal (8) emanating from the sample (1), or to induce the first state (Z1, A).
【請求項３４】
34.   The microscope as claimed in claim 33, wherein the further light source illuminates the sample (1) entirely or partially, preferably linearly.
【請求項３５】
35.   The microscope as claimed in one of claims 25 to 34, wherein the focal line (10) of the optical signal (4) is spatially superposed by a further line.
【請求項３６】
36.   The microscope as claimed in claim 35, wherein the intensity zero point (5) of the focal line (10) of the optical signal (4) is spatially superposed by the maximum of a line (15) in order to read out the measuring signal (8) emanating from the sample (1).
【請求項３７】
37.   The microscope as claimed in claim 35 or 36, wherein each line (10, 15) is assigned a scanning device (21), preferably in the form of a scanning mirror.
【請求項３８】
38.   The microscope as claimed in claim 37, wherein the scanning direction corresponds to the running direction of the pupil line (14).
【請求項３９】
39.   The microscope as claimed in one of claims 25 to 38, defined by a row detector (26) for the line detection of the measuring signal (8) emanating from the sample (1).
【請求項４０】
40.   The microscope as claimed in claim 39, wherein the row detector (26) is designed as a CCD row, as an EMCCD or as an APD.
【請求項４１】
41.   The microscope as claimed in claim 39 or 40, wherein the row detector (26) is arranged confocally with the focal line (10).
【請求項４２】
42.   The microscope as claimed in one of claims 39 to 41, wherein the row detector (26) is arranged in the detection direction downstream of the scanning device(s) (21) or upstream of the scanning device(s) (21).
【請求項４３】
43.   The use of a microscope as claimed in one of claims 25 to 42 for the optically induced transition of dye molecules between various molecular states that differ from one another in at least one optical property.
【要約】
A method and a microscope, in particular a laser scanning fluorescence microscope, for high spatial resolution examination of samples, the sample (1) to be examined comprising a substance that can be repeatedly converted from a first state (Z1, A) into a second state (Z2, A), the first and the second states (Z1, A; Z2, B) differing from one another in at least one optical property, comprising the steps that the substance in a sample region (P) to be recorded is firstly brought into the first state (Z1, A), and that the second state (Z2, B) is induced by means of an optical signal (4), spatially delimited subregions being specifically excluded within the sample region (P) to be recorded, are defined in that the optical signal (4) is provided in the form of a focal line (10) with a cross-sectional profile having at least one intensity zero point (5) with laterally neighboring intensity maxima (9).
【選択図】
(Figure 3)
【図１】
2007233370.tif 000008
【図２】
2007233370.tif 000009
【図３】
2007233370.tif 000010
【図４】
2007233370.tif 000011
【図５】
2007233370.tif 000012