(57)【要約】【課題】標準物質として用いる糖化アルブミンを、凍結乾燥復元後においても、酵素法で検出を行うレベルにて安定に保つ手段を提供すること。【解決手段】糖化アルブミン、及び、スクロース等の二糖類を含有することを特徴とする糖化アルブミンの管理試料を提供し、これを酵素法による検体中の糖化アルブミンの検出において用いることにより、上記の課題を解決し得ることを見出した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖化アルブミン及び二糖類を含有することを特徴とする、糖化アルブミンの管理試料。
【請求項２】
前記管理試料において、二糖類の含有量が血清容量に対して８〜１２質量／容量％であることを特徴とする、請求項１記載の管理試料。
【請求項３】
前記管理試料において、二糖類がスクロースであることを特徴とする、請求項１又は２記載の糖化アルブミンの管理試料。
【請求項４】
前記管理試料において、糖化アルブミンが、健常人の血液に由来するアルブミン画分から分離して得られる糖化アルブミンであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の糖化アルブミンの管理試料。
【請求項５】
前記糖化アルブミン管理試料を標準物質として用いて検体中の糖化アルブミンを検出する当該管理試料の使用方法において、酵素法を糖化アルブミンの検出手段として用いることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の糖化アルブミンの管理試料の使用方法。
【請求項６】
前記使用方法における、糖化アルブミンの検出方法が、酵素法による糖化アルブミン検出試薬で、検体中の糖化アルブミンを定量し、その定量値を、同検体中の総アルブミンの定量値で除して補正し、かかる補正値を同検体中の糖化アルブミンの定量値とすることを特徴とする、請求項５記載の糖化アルブミンの管理試料の使用方法。
【請求項７】
前記使用方法において、糖化アルブミンの検出対象となる検体が、血清検体又は血漿検体であることを特徴とする、請求項６記載の糖化アルブミン管理試料の使用方法。
【請求項８】
標準物質として、請求項１〜４のいずれかに記載の糖化アルブミンの管理試料をキットの構成要素として含むことを特徴とする、糖化アルブミンの検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖化アルブミンの凍結乾燥復元後の保存性を格段に向上させた糖化アルブミンの管理試料に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病患者に対して、厳格な血糖コントロールを行うことは、網膜症、腎症、神経障害等の合併症の発症するために極めて重要である。血糖コントロール状態を判定する指標としては、ヘモグロビンＡ1c、糖化アルブミン、フルクトサミン、１，５−アンヒドロ−D−グルシトール等が実用化されている。
【０００３】
これらのうち、特に、ヘモグロビンＡ1cは、臨床上で最も汎用されている指標で、過去１〜２ヶ月の血糖コントロール状態を判定することが可能であり、長期的な病態の管理に有用であると考えられている。また、本発明の主題となる糖化アルブミンは、過去１〜２週間の血糖コントロール状態を反映し、薬剤投与開始時期、妊娠、外傷、急性合併症等の、糖尿病管理上で生ずる諸問題に対し、短期的管理を行う場合に有用であると考えられている。
【０００４】
検体における上記の成分を検出する場合には、品質が安定した管理試料を標準物質として用いることが好適であるが、これらの成分を凍結乾燥して復元する際に認められる品質劣化が問題となっている。この問題に対しては、ヘモグロビンＡ1cにおいては、ヘモグロビンＡ1cにスクロース（サッカロース）を安定化剤として配合した管理試料が提供されている（特許文献１）。なお、特許文献１は、ＨＰＬＣ法に対して有用な、ヘモグロビンＡ1cの安定化手段が開示されているものの、酵素法を用いる場合の安定化手段については一切開示されていない。
【特許文献１】特開平１０−１７５９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
糖化アルブミンの凍結乾燥復元後の保存性について、検出を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて行っている限りでは、特に問題とはなっていなかった。しかしながら、近年、糖化アルブミンの検出は、その簡便性と鋭敏性故に、酵素法で行われることが多くなり、この酵素法の実施における新たな問題として、上記の保存性の問題が挙がっている。すなわち、糖化アルブミンの検出を酵素法にて行う場合には、標準物質として用いる糖化アルブミンの検出上の安定性が経時的に低下する減少が認められている。これは、ＨＰＬＣ法が、糖化アルブミン分子における糖の結合数にかかわらず、分子単位で糖化アルブミンを等しく検出可能であるのに対し、酵素法による定量の場合には、経時的に変動しやすい糖の結合数によって、測定値に対して無視できない影響を与えてしまうためであると考えられる。
【０００６】
よって、本発明が解決すべき課題は、標準物質として用いる糖化アルブミンを、凍結乾燥復元後においても、酵素法にて検出を行うレベルで安定に保つ手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記の課題について鋭意検討を重ねた結果、糖化アルブミンに対して二糖類を共存させることにより、凍結乾燥復元後の保存性を酵素法レベルで飛躍的に向上させることが可能であることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、糖化アルブミン及び二糖類を含有することを特徴とする、糖化アルブミンの管理試料（以下、本管理試料ともいう）を提供する発明である。
【０００９】
なお、上記した特許文献１の発明は、ＨＰＬＣ法を行うことに対して提供された、ヘモグロビンＡ1cの安定化手段についての発明である点において酵素法を想定した本発明とは異なり、かつ、そもそもヘモグロビンＡ1cと糖化アルブミンとは、全く性質も構造も異なる物質である、という点で大きく異なる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、標準物質として用いる糖化アルブミンを、凍結乾燥復元後においても、酵素法で検出を行うレベルで安定に保つ手段が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
［糖化アルブミン］
本管理試料において用いられる糖化アルブミンは、人工タイプと天然タイプの両者を用いることができるが、天然タイプの糖化アルブミンを用いることが好適である。
【００１２】
人工タイプの糖化アルブミンは、アルブミンをコードする遺伝子を組み込んだ大腸菌等から得られる、組換え型アルブミン又はヒト由来のアルブミン画分を、グルコース存在下で、３７℃付近で保温することにより、強制的にアルブミンを糖化して得られる糖化アルブミンである。しかしながら、本来、少なくとも健常人の血清に存在する糖化アルブミンにおける糖の結合数は、１分子あたり１〜２程度であるのに対し、かかる人工糖化アルブミンでは、４カ所存在するアルブミン分子の糖鎖結合部位のほぼ全てにグルコースが結合しており、生体における状態を必ずしも忠実には反映していない面があり、特に、酵素法を検出手段として用いる場合には、検出誤差が大きくなることが懸念される。
【００１３】
これに対して天然タイプの糖化アルブミンは、ヒト（健常人）の血清に存在する糖化アルブミンを分離・採取して得られるものであり、これを用いる場合には、人工タイプの糖化アルブミンにおいて懸念される検出誤差の問題は回避され得る。
【００１４】
健常人（本発明においては、糖尿病又は糖尿病境界域ではない人のことを意味する。具体的には、健常人は、空腹時血漿血糖値が１１０ｍｇ／ｄｌ未満で、かつ、７５ｇグルコース負荷試験の２時間後の血漿血糖値が１４０ｍｇ／ｄｌ未満の者として定義される）の血液に由来する糖化アルブミン（以下、天然糖化アルブミンともいう）とは、通常、健常人の血清において存在する糖化アルブミンのことを意味するものであり、具体的には、糖化部位が４か所存在するアルブミンにおける、アルブミン１分子当りの平均糖化数が、４未満、上述したように、通常は１〜２である糖化アルブミンのことを意味する。
【００１５】
このように、天然糖化アルブミンの、１分子当りの糖結合数の平均は、一般的には１〜２であり、好適には、概ね１．３〜２．１（小数点第２位以下は四捨五入）である。
【００１６】
天然糖化アルブミンを製造するには、直接、ヒトの血清から、非糖化アルブミンと糖化アルブミンとを分別する手段（例えば、アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定した担体）を用いて、天然糖化アルブミンを分別採取することが、効率的、かつ、現実的である。しかしながら、天然糖化アルブミンの製造方法は、これに限定されるべきものではなく、例えば、非糖化アルブミン分子の糖化部位の一部分を保護基等で、糖化を起こさない状態とし、これに対して、人工糖化アルブミンの製造工程として行われている、上述した強制糖化を行った後に、保護基等を除去すること等を行うことによっても、天然糖化アルブミンを得ることができる。
【００１７】
なお、アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定した担体においては、担体にリガンドとして結合しているアミノフェニルボロン酸の水酸基と、糖化アルブミンにおいて結合しているグルコースのｃｉｓ−ｄｉｏｌ基と結合することにより、糖化アルブミンが選択的に捕捉される。この担体に捕捉された糖化アルブミンを、溶出することにより、所望する天然糖化アルブミンを製造することができる。糖化アルブミンの溶出手段としては、アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定した担体であれば、例えば、Ｄ−ソルビトール等のような、ｃｉｓ−ｄｉｏｌ基を有する他の物質を、担体に捕捉された糖化アルブミンに対して置換すること等が挙げられるが、選択する分別担体の具体的な種類に応じて選択されるべきものであり、これに限定されるものではない。
【００１８】
糖化アルブミンを含む画分からの、天然糖化アルブミンの精製・採取は、蛋白質を精製・採取する際に汎用されている、公知の方法を駆使して行うことができる。すなわち、通常の蛋白沈澱剤による処理、限外濾過、ゲル濾過、液体クロマトグラフィー、遠心分離、電気泳動、透析法等を適宜用いることにより、糖化アルブミンを含む画分から、天然糖化アルブミンを精製・採取することができる。
【００１９】
［本管理試料］
二糖類を、糖化アルブミンと共存させることにより、本管理試料とすることができる。二糖類としては、マルトース、スクロース、ラクトース、セロビオース等を例示することができるが、還元性のない二糖類として、スクロース（サッカロース、ショ糖）を用いることが好適である。
【００２０】
前記管理試料において、二糖類の含有量が血清容量に対して８〜１２質量／容量％であることが好適である。当該含有量が８質量／容量％未満であると、十分に糖化アルブミンの安定化効果を発揮することが困難になり、同１２質量／容量％を超えると、かえって糖化アルブミンの安定化効果が低下する傾向が認められる。
【００２１】
このように、糖化アルブミンと二糖類を組み合わせて配合することにより、糖化アルブミンの安定性、特に凍結乾燥後の糖化アルブミンの安定性を飛躍的に向上させることができる。
【００２２】
なお、本管理試料中には、上記必須成分の他に、糖化アルブミンの変性防止等を目的として、本発明の所期の効果を損なわない範囲で他の任意成分を配合することが可能である。例えば、アスコルビン酸，三リン酸塩，カテキン，亜硫酸ナトリウム，亜硫酸水素ナトリウム，硫酸第一鉄，グルタチオン等を本管理試料中に配合することができる。
【００２３】
本管理試料の経時的安定効果を発揮させる最も好適な形態は、凍結乾燥品としての形態であり、この凍結乾燥品の調製に際しては通常公知の方法を採ることができる。
【００２４】
例えば、−３０℃〜−４０℃で試料を凍結し、減圧し、棚温−２０℃〜４℃で５〜１００時間程度乾燥することにより所望する凍結乾燥製剤を得ることができる。なお、本発明においては、特に本発明組成物中のスクロースを乾燥させるために、９０〜１００時間程度乾燥させることが好ましい。
【００２５】
このようにして、本管理試料を製造することができる。
【００２６】
［本管理試料の使用］
本管理試料は、上述したように、検体中の糖化アルブミンを定量する際の糖化アルブミンの標準物質として用いることができる。なお、検体は、通常は血液検体であり、特に、血清検体又は血漿検体であることが好適であるが、具体的な検査の目的によっては尿検体とすることも可能である。また、本管理試料は、酵素法で検体中の糖化アルブミンを検出することを想定して提供されるものであるが、他の方法、例えば、ＨＰＬＣ法で糖化アルブミンを検出する場合の標準物質として用いることができる。
【００２７】
血清又は血漿中の糖化アルブミンを、酵素法にて検出する場合は、酵素法を測定原理とする検出試薬を用いて測定する。
【００２８】
この測定の大まかな原理は、以下のごとくである。
【００２９】
（１）血清又は結晶中の糖化アルブミンをプロナーゼ、プロテイナーゼＫ等のプロテアーゼにより消化し、フルクトシルアミノ酸として、（２）このフルクトシルアミノ酸を基質として、酸素の存在下でケトアミノオキシダーゼまたはフルクトサミンオキシダーゼを作用させて過酸化水素を発生させ、（３）この過酸化水素を定量〔例えば、４−アミノアンチピリンとＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン等の存在下で、ペルオキシダーゼを作用させて発色させ、これを５５０ｎｍにおける吸光度測定により定量する方法等〕する。
【００３０】
この態様の測定試薬として、ルシカＧＡ−Ｌシリーズが旭化成ファーマ（株）から販売されている。
【００３１】
本発明では、このような酵素法による測定において、標準物質として、本管理試料を用いることを特徴とする。
【００３２】
また、当該測定においては、上記の糖化アルブミンを定量する血清又は血漿において、別途、総アルブミンを定量することが必要である。
【００３３】
かかる総アルブミンの定量方法は、特に限定されず、免疫比濁法、ラテックス法、色素法等を例示することができる。
【００３４】
このようにして得られる総アルブミンの定量値で、上記の糖化アルブミンの定量値を除して補正することにより、血清又は血漿中の糖化アルブミン値を的確に定量・検出することができる。
【００３５】
この検出プロセスの最も好ましい態様は、（ａ）天然アルブミンを用いた本管理試料を、標準物質として用いた血清又は血漿中の糖化アルブミンの定量過程、（ｂ）同血清又は血漿中の総アルブミンの定量過程、および、（ｃ）  （ａ）で得られた値を（ｂ）で得られた値で除する補正過程の、３つの過程を、自動化して行うことである。
【００３６】
かかる自動化過程は、既存の血清又は血漿検査用の自動化定量装置を、検出態様に応じて調整することで、当業者であれば、容易に行うことができる。
【００３７】
本発明により、低コストで、簡便・鋭敏に、検体中の糖化アルブミンを検出することが可能である。
【００３８】
また、本発明は、標準物質として、本管理試料を、キットの構成要素として含む、酵素法を用いた検体中の糖化アルブミンを検出するための検出用キット（以下、本検出用キットともいう）をも提供する発明である。本検出用キットには、検出の標準物質として用いる、上述した内容の本管理試料の他に、非糖化アルブミン、酵素法による糖化タンパク質を定量するための、定量試薬等を必要に応じてキットの構成要素として含有させることができる。
【実施例】
【００３９】
以下に本発明の実施例を記載し、さらに本発明を具体的に説明するが、当該記載は、本発明の範囲を限定するためのものではない。また、血清中の糖化アルブミン等の含有量の単位（％）は、特に断らない限り、血清容量に対する質量／容量％を意味することとする。
【００４０】
［実施例１］本管理試料の凍結乾燥前後における経時的安定性の検討（Ａ）
（１）健常人の血清における検討
健常人のプール血清に対して、下記の試験系を構築した。
【００４１】
添加剤［スクロース（ナカライ特級）又はラクトース（ラクトース一水和物：和光特級）］は、血清容積を１００とし、それに対する指定の質量／容量％（０％、２％、５％、１０％）として、血清に対して添加した。次いで、これらの血清試料を、ＣＶＡ−２バイアルに１ml分注し、予備凍結後、−２０℃×５時間→−１０℃×５時間→−４℃×５時間→４℃×９時間の内容の凍結乾燥を行った。凍結乾燥後は、真空のまま封栓した。これらの凍結乾燥品は、真空凍結直後又は一定時間の加速（３７℃・１週間、３７℃・２週間）の後から測定日まで−２５℃にて保管し、全ての試料は同時に、糖化アルブミン量（GA：ｇ／ｄL）、総アルブミン量（ALB：ｇ／ｄL）測定し、糖化アルブミンの総アルブミンに対する質量％を、糖化アルブミン値（GA：％）として、次式に従って算出した。
【００４２】
［GA（ｇ／ｄL）×１００］／［ALB（ｇ／ｄL）×１．１４］＋２．９
［式中、１．１４は、ＨＰＬＣ法に対する傾きの補正値であり、２．９は、同切片の補正値である］
なお、上記の糖化アルブミン量は、上述した酵素法を用いた糖化アルブミンの測定試薬であるルシカＧＡ−Ｌ（旭化成ファーマ（株））を用いて求めた。また、測定装置は、日立７１７０を用いた。
【００４３】
また、総アルブミン量は、試料にブロモクレゾールパープル（ＢＣＰ）溶液を作用させ、アルブミンとＢＣＰの結合によりなる青色結合体の吸光度を測定することにより定量した。
【００４４】
この試験の結果を表１に示す。表１において、「測定値」は、同一出所の血清から２群サンプリングを行い、各サンプリング群について２回同一の試験を行った結果、すなわち、ｎ＝４の平均値で表している。また、「回収率」は凍結乾燥直後の各測定値を１００％とした場合の相対値（％）である。かかる回収率が１００％に近似しているほど、凍結乾燥直後の状態が保たれていることを意味する。
【００４５】
【表１】
2007107950.tif 000002
表１の結果から、添加剤として二単糖（スクロース又はラクトース）を添加することにより、血清中の糖化アルブミンが、凍結乾燥直後に近似した状態で保たれることが判明した。特に、これらの二単糖を５％以上添加した例が良好であり、殊に１０％配合することにより良好な結果を示していた。また、等量添加におけるスクロースとラクトースを比較すると、スクロースの方が保存性を効果的に向上させていた。
【００４６】
（２）糖化アルブミンの高値試料
上記と同様の試験を、ヒト血清に代えて、ヒト血清由来の糖化アルブミンの高値試料を用いて行った。
【００４７】
高値試料の調製
アミノフェニルボロン酸カラム（２５０ml）に対して、再生液１（生理食塩水）を１０００ml、再生液２（PBS：ｐH7.3〜7.5(25℃)）を１２５０ml、及び、精製水を２５００mlの順に、流速５０ml/min程度にて流して、カラムの再生を行った。次いで、平衡化液（精製水５Lあたり、EPPS25.25g、NaCl43.85g、MgCl2・6H2O10.15g、NaN35g、1N NaOH82.2ml:pH8.4〜8.6(25℃)）２５００mlを流速５０ml/min程度にて流して、カラムの平衡化を行った。健常人のプール血清を、平衡化した上記カラムに２５０〜２７０ml入れ、ゲルと混合した後、当該混合ゲルを冷暗所に１６〜２４時間放置した。
【００４８】
放置後、ゲルの上にたまった試料を排出し、上記平衡化液２５００mlを、流速５０ml/min程度にて流し、さらに分離液（精製水１．５Lあたり、EPPS7.575g、NaCl13.155g、ソルビトール27.33g、NaN31.5g、1N NaOH24.7ml:pH8.4〜8.6(25℃)）１５００mlを、流速２５ml/min程度にて流し、フラクションコレクターを使用し、約１０mlずつ分別回収を行い、色の濃い分画を５００mlプールした。
【００４９】
このようにして調製した処理血清を、２５０mlずつ透析チューブに入れて、１８LのPBS中で、４時間冷暗所で透析した。次いで、９０LのPBSを透析液として、さらに冷暗所で１６時間の透析を行った。
【００５０】
次いで、透析チューブを濃縮剤（精製水１０L中、NaCl85.0g、NaN310.0g、PEG20000 3000g）１０Lの中に移し、約２４時間冷蔵庫内に保管した。保管後、透析チューブの周りに付着した濃縮剤を精製水で洗い流し、当該透析チューブをPBS中に入れ、５〜６時間冷蔵庫内に放置した。なお、PBSの量は３L程度とし、２〜３回交換した。
【００５１】
次いで、透析チューブの中身を回収した。次いで、試料のALBとTPを測定し、PBSで希釈してALB＝５ｇ／dLに合わせ、１０％スクロースを添加後、−２０℃以下にて凍結保存した。
【００５２】
このようにして得た試料の濃縮物を、糖化アルブミンの高値試料（糖化アルブミン）とした。
【００５３】
上記（１）と同様にして行った、本管理試料の凍結乾燥前後における経時的安定性についての検討結果を表２に表す。
【００５４】
【表２】
2007107950.tif 000003
表２より、糖化アルブミンの高値試料においても、上述したヒト血清を用いた場合と同様の結果が得られ、糖化アルブミンの高値試料に二糖類を添加することの有用性が明らかになった。
【００５５】
［実施例２］本管理試料の凍結乾燥前後における経時的安定性の検討（Ｂ）
本実施例では、上述した実施例１と同様の試験系を、添加剤をスクロースに絞り、かつ、添加量の範囲を８〜１２％に変更した（対照を除く）。また、サンプリング群を３群とし、各サンプリング群について２回同一の試験を行い、ｎ＝６の平均値を「測定値」とした。このような相違の他は、上記の実施例１と同一の試験を（１）健常人の血清と、（２）糖化アルブミンの高値試料に対して行った。それぞれの結果を、表３と表４に示す。
【００５６】
（１）健常人の血清における検討
【００５７】
【表３】
2007107950.tif 000004
【００５８】
【表４】
2007107950.tif 000005
表３も表４も、スクロースの添加が、糖化アルブミンの凍結乾燥直後の状態を安定化させる効果があることを、実施例１の結果と同様に示している。また、スクロースの添加量の範囲である８〜１２％のうち、１２％よりもむしろ１０％の方が良好な結果を示した。よって、二単糖をスクロースとした場合の至適添加量は１０％近傍であることが明らかになった。