(57)【要約】【課題】  現在環境汚染の原因となっているトリブチルスズ、トリメチルスズなどの有機スズ化合物を効果的に分解し、その毒性を低減し得る、有機スズ化合物の分解・除去方法や、トリブチルスズ、トリメチルスズなどの有機スズ化合物を効果的に分解することができる微生物を提供すること。【解決手段】  トリブチルスズのみを炭素源とする田代式無機培地で長崎港より採取した砂地を培養し、生き残った菌を単離して得た３０クローンについての解析を行った。その結果、アシネトバクター・ヘモリチカス菌がトリブチルスズ、トリメチルスズなどの有機スズ化合物を効果的に分解し、その毒性を低減し得ることを見い出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アシネトバクター（Acinetobacter）属に属する有機スズ化合物資化性菌を、有機スズ化合物存在下で培養することを特徴とする有機スズ化合物の分解・除去方法。
【請求項２】
アシネトバクター（Acinetobacter）属に属する有機スズ化合物資化性菌が、アシネトバクター・ヘモリチカス（Acinetobacter haemolyticus）であることを特徴とする請求項１記載の有機スズ化合物の分解・除去方法。
【請求項３】
有機スズ化合物が、トリメチルスズ、トリエチルスズ、トリプロピルスズ、トリブチルスズ、及びトリフェニルスズから選ばれる１種以上の有機スズ化合物であることを特徴とする請求項１又は２記載の有機スズ化合物の分解・除去方法。
【請求項４】
有機スズ化合物の分解・除去能を有するアシネトバクター・ヘモリチカス（Acinetobacter haemolyticus）
【請求項５】
有機スズ化合物が、トリメチルスズ、トリエチルスズ、トリプロピルスズ、トリブチルスズ、及びトリフェニルスズから選ばれる１種以上の有機スズ化合物であることを特徴とする請求項５記載のアシネトバクター・ヘモリチカス（Acinetobacter haemolyticus）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリブチルスズ等の有機スズの分解・除去方法や、有機スズ除去能を有するアシネトバクター・ヘモリチカス（Acinetobacter haemolyticus）に関する。
【背景技術】
【０００２】
環境ホルモンとも呼ばれる内分泌攪乱物質はヒトも含めた生態系の様々な生物に内分泌系の変調を及ぼすことで、地球の生物環境を大いに危機に追いやっていると言われている。有機スズ化合物は１９４０年代にポリ塩化ビニルの安定剤として使用されていた。環境ホルモンとしての疑いがもたれているトリブチルスズ（ＴＢＴ）は、スズ原子（Ｓｎ）にブチル基（Ｃ４Ｈ９−）が３つ結合した化合物で、酢酸塩、塩化物、リノール酸塩などの種類が知られており、農・漁業、製紙・製材・塗料製造事業で殺菌剤、防黴剤、防汚剤として、８０００ｔ／年で用いられてきた（例えば、非特許文献１参照）が、魚類を含む各種の生物への生殖器異常の原因物質としてトリブチルスズが懸念されるようになった結果、その使用は平成２年から禁止され、全国的な環境調査（水質、底質、生物）が毎年行われている。このように、ＴＢＴやトリフェニルスズなどの有機スズ化合物は、水棲生物に対して強い毒性を有する上に、生体内への蓄積性が高く、難分解性であるため、沿岸海域における魚類や海草類などの生体濃縮による汚染が大きな社会問題となっている。このため、わが国を始め、諸外国は、有機スズ含有船底防汚塗料の使用を規制しているが、まだ使用を規制していない国々も多く、有機スズ化合物による海域汚染の問題は、依然として解決されていない。
【０００３】
有機スズ化合物を分解して無害化することは、環境保全の観点から非常に重要である。しかし、水に難溶性である有機スズ化合物は微生物に難分解性であることから、微生物による有機スズ化合物の分解・除去方法に関する報告は数少ないが、現在環境汚染の原因となっているトリフェニルスズなどの有機スズ化合物を効果的に分解してその毒性を低減し得る、シュードモナス（Pseudomonas）属細菌が生産するシデロフォアを活性成分としてなる有機スズ化合物分解剤（例えば、特許文献１参照）が提案されている。
【０００４】
その他、ＴＢＴ化合物を特異的に分解する酵素を産生する識別のための表示Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＨＢ−ＮまたはＨａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＨＡ−Ｔの菌株を前記菌株の培養可能な条件に調整した被測定試料に加え、単離生成した無機化合物ＳｎＣｌ２をＩＣＰ発光分析計で測定し、被測定試料中のＴＢＴ化合物定量するＴＢＴ化合物の定量分析法（例えば、特許文献１参照）が知られている。
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−３５２９９４号公報
【特許文献２】特開２００４−３０１６０２号公報
【非特許文献１】Fent,K 1996.Organotin compounds in municipal westewater and swage sludge:contamination,fate in treatment process and ecotoxicological consequencens.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
長崎港は有機スズ化合物の含有濃度が４０ｎｇ／ｇ湿重を上回るほど高いことが環境省調査で明らかにされている。本発明の課題は、現在環境汚染の原因となっているＴＢＴ、トリメチルスズなどの有機スズ化合物を効果的に分解し、その毒性を低減し得る、有機スズ化合物の分解・除去方法や、ＴＢＴ、トリメチルスズなどの有機スズ化合物を効果的に分解することができる微生物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するため、有機スズを浄化あるいは無毒化するミクロ海洋生物の発掘を目的とした研究を鋭意行った。一般に、土壌中の有害物質は自然浄化作用とも呼ばれる未知の微生物の働きによって分解されると考えられるが、有害物質にさらされた環境では通常の菌は死滅もしくは増殖を停止し、耐性を獲得した菌や分解能を獲得した菌が生き残ることが予想され、有用菌をより多く含むことが期待される。そこで、ＴＢＴのみを炭素源とする田代式無機培地で長崎港より採取した砂地を培養し、生き残った菌を単離して得たクローンについての解析を行った。その結果、アシネトバクター・ヘモリチカス菌がＴＢＴ、トリフェニルスズなどの有機スズ化合物を効果的に分解し、その毒性を低減し得ることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、（１）アシネトバクター（Acinetobacter）属に属する有機スズ化合物資化性菌を、有機スズ存在下で培養することを特徴とする有機スズ化合物の分解・除去方法や、（２）アシネトバクター（Acinetobacter）属に属する有機スズ化合物資化性菌が、アシネトバクター・ヘモリチカス（Acinetobacter haemolyticus）であることを特徴とする上記（１）記載の有機スズ化合物の分解・除去方法や、有機スズ化合物が、トリメチルスズ、トリエチルスズ、トリプロピルスズ、ＴＢＴ、及びトリフェニルスズから選ばれる１種以上の有機スズ化合物であることを特徴とする上記（１）又は（２）記載の有機スズ化合物の分解・除去方法に関する。
【０００９】
また本発明は、（３）有機スズ化合物の分解・除去能を有するアシネトバクター・ヘモリチカス（Acinetobacter haemolyticus）や、（４）有機スズ化合物が、トリメチルスズ、トリエチルスズ、トリプロピルスズ、ＴＢＴ、及びトリフェニルスズから選ばれる１種以上の有機スズ化合物であることを特徴とする上記（３）記載のアシネトバクター・ヘモリチカス（Acinetobacter haemolyticus）に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によると、現在環境汚染の原因となっているＴＢＴ、トリフェニルスズなどの有機スズ化合物を効果的に分解し、その毒性を低減し得る、有機スズ化合物の分解・除去方法や、ＴＢＴ、トリフェニルスズなどの有機スズ化合物を効果的に分解することができる微生物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の有機スズ化合物の分解・除去方法としては、アシネトバクター属に属する有機スズ化合物資化性菌を、有機スズ化合物存在下で培養する方法であれば特に制限されるものではなく、上記アシネトバクター属に属する有機スズ化合物資化性菌として、アシネトバクター・ヘモリチカスを好適に例示することができる。また、上記有機スズ化合物としては、トリメチルスズ、トリエチルスズ、トリプロピルスズ、ＴＢＴ、及びトリフェニルスズから選ばれる１種以上の有機スズ化合物を挙げることができ、例えば、トリメチルスズとトリフェニルスズの混在下に上記有機スズ化合物資化性菌を培養してもよい。
【００１２】
有機スズ化合物資化性菌の培養条件としては、有機スズ化合物資化性菌が増殖する条件であれば特に制限されず、例えば、好気的条件下で、好ましくは液体培地による振盪培養法、静置培養法、撹拌培養法などによって培養することができる。上記液体培地には、炭素源として、グルコース、デンプン、糖蜜などを用いることができ、また、窒素源として、イースト、大豆粉、小麦胚芽、コーンスティープリカー、落花生粉、綿実粉、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素等を使用できる。その他、必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、リン酸等の無機塩類を添加することもできる。培養温度は、通常２０〜３０℃、好ましくは２５〜２８℃の範囲であり、また培養ｐＨは、通常６．５〜８．０、好ましくは７．２〜７．６の範囲である。そして、培養期間は培地や培養条件などによって異なるが、一般に２〜１５日間、好ましくは２〜１０日程度である。
【００１３】
本発明の微生物としては、有機スズ化合物の分解・除去能を有するアシネトバクター・ヘモリチカスであれば特に制限されず、トリメチルスズ、トリエチルスズ、トリプロピルスズ、ＴＢＴ、及びトリフェニルスズから選ばれる１種以上の有機スズ化合物の分解・除去能を有するアシネトバクター・ヘモリチカスを好適に例示することができる。有機スズ化合物の分解・除去能を有するアシネトバクター・ヘモリチカスは、例えば、ＴＢＴのみを炭素源とする田代式無機培地で、長崎港より採取した砂地等のＴＢＴ含有土壌を培養し、生残した菌を単離することにより、不当な実験をすることなく得ることができる。実際、長崎港周辺の３地点（小菅町、戸町、西泊町）より採取した砂地のうち２カ所（戸町及び小菅町）から、トリブチルスズ分解・除去能を有するアシネトバクター・ヘモリチカスを得ることができている。また、ＴＢＴやトリメチルスズに対して優れた分解・除去能を有するアシネトバクター・ヘモリチカスＴ１株は長崎大学大学院医歯薬学総合研究科分子薬理学教室において保管されており、一定の条件下分譲されるようになっている。
【００１４】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１５】
（トリブチルスズ分解菌の単離培養と菌体の生化学的及び遺伝子学的同定）
長崎港周辺の３地点（小菅町、戸町、西泊町）より採取した砂地（１〜２ｇ）を、トリブチルスズ（ＴＢＴ；和光純薬工業株式会社製：０．１％）のみを炭素源とした以下に示す田代式無機培地（ｐＨ７．４）で１週間振盪培養（２５℃）を行った。１週間後増殖してきた菌体の一部を分取し、新たに調製したＴＢＴのみを炭素源とした田代式無機培地にて１週間振盪培養（２５℃）を行った。同様の操作をもう一度繰り返し、計３回の操作によって増殖してくる菌をスクリーニングした。増殖した菌体を単離する目的で、菌体を含む培養液の一部を、０．１％ＴＢＴを塗布した田代式無機寒天培地に塗布し、７〜１０日後にコロニーを形成する微生物のクローン３０個を得た。ＴＢＴ分解菌の単離培養の概要を図１に示す。
【００１６】
得られた３０クローンについて、グラム染色及びカタラーゼ試験をあらかじめ実施した。次ぎに、微生物の資化性を調べるために必要な９５種類の炭素源と、酸化還元発色試薬が、乾燥状態でマイクロプレートの個々のウエルに充填されているバイオログシステム（株式会社ＧＳＩクレオス）を利用した。同定するコロニーの懸濁液を分注後、１６〜２４時間培養するとその代謝反応により呼吸が行われたウエルは発色し、発色は紫色単色で得られるため、プレートリーダーを用いて、染色されたウエルの場所や濃さから、データベースに登録されている既存の菌体情報と比較検討して、菌体を判定した。
【００１７】
［田代式無機培地の組成］
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；３４．４ｍｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；０，１ｇ，ＮＨ４ＮＯ３；１０ｇ，ＦｅＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；２０ｍｇ，ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；２ｍｇ，ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；０．１ｍｇ，ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；０．１１４ｍｇ，  Ｈ３ＢＯ３；０．１μｇ，ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；０．１ｍｇ，ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ  ０．１μｌ，ＫＨ２ＰＯ４；０．１１４４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４；２．９６４ｇ ｉｎ ＭＱ１Ｌ。
【００１８】
（トリブチルスズ分解菌の単離培養と菌体の生化学的及び遺伝子学的同定）
得られた３０クローンのうち、後述する環境中ＴＢＴ除去能の測定において優れたＴＢＴ分解能を有するアシネトバクター・ヘモリチカスＴ１株をＬＢ(Luria-Bertani)培地［Tryptone １０ｇ， Yeast ５ｇ，ＮａＣｌ １０ｇ ｉｎ ＭＱ１Ｌ］にて１８時間培養することで大量に増殖させ、常法に従い、菌体より１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子配列をゲノムＤＮＡより得た。得られた１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子配列を遺伝子配列解析装置(ABI PRISM; 3100 AVANT Genetic Analyzer)によって解析した結果、配列番号１に表される塩基配列を有することがわかった。明らかになった塩基配列を、データベース(The European Ribosomal RNA database, http://www.psb.ugent.be/rRNA/index.html)との比較検討によって菌種の同定を行った。比較検討によってアシネトバクター・ヘモリチカス（Acinetobacter haemolyticus）と９２％の相同性を示したことから菌体を同定した。このアシネトバクター・ヘモリチカスＴ１株グラム染色陽性の桿菌で、白色の菌体色素を生産し、Ｏ／Ｆテスト（酸化的）、カタラーゼ試験（＋）、オキシダーゼ試験（＋）であった。
【実施例２】
【００１９】
（アシネトバクター・ヘモリチカスによる環境中ＴＢＴ除去能の測定）
実施例１で単離されたアシネトバクター・ヘモリチカス菌をＬＢ培地で１８時間振盪培養し増殖させた後、０．１％ＴＢＴのみを炭素源とした田代式無機培地中で菌体を１２日間振盪培養した。培養液を２４時間おきに１００μＬずつ分取し、分取した培養液を０．５Ｍ塩酸で２００倍希釈した溶液２ｍｌに、増感剤であるＰｄ／Ｍｇを最終濃度１００ｐｐｍになるように調製した。調製した培養液に含まれるＴＢＴ由来のＳｎ (スズ)の量（吸光度：２２４．６ｎｍ）を原子吸光光度計(AAS: ゼ-マン式, 日立, Z-5010)で２２４．６ｎｍの吸光度を測定した。２２４．６ｎｍの吸光度と培養上清中のＳｎ量の関係を図２に示す。また、培養液中のＴＢＴの濃度を培養上清中のＳｎ量から推定した。ＴＢＴ分解能に優れたアシネトバクター・ヘモリチカスＴ１株（●）と、対照としてＴＢＴ存在下でも生存するもののＴＢＴ分解能を持たないアシネトバクター・ヘモリチカスＫ８株（○）における培養液中のＴＢＴ濃度の経時変化を図３に示す。その結果、アシネトバクター・ヘモリチカスＴ１株による培養液中のＴＢＴの分解・除去は、培養の３日目から認められ、４日目には最初の量の約１３％にまで減少することがわかった。
【実施例３】
【００２０】
（アシネトバクター・ヘモリチカスＴ１株のトリメチルスズ含有培地での生育）
アシネトバクター・ヘモリチカスＴ１株の菌体を含む培養液の一部を、０．１％トリメチルスズ（和光純薬工業株式会社製）を塗布した田代式無機寒天培地に塗布し、７〜１０日の培養を室温にて行ったところ、コロニーが確認され菌体が生育していくことがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明のＴＢＴ分解菌の単離培養の概要を示す図である。
【図２】２２４．６ｎｍの吸光度（原子吸光光度計）と培養上清中のＳｎ量の関係を示す図である。
【図３】本発明のアシネトバクター・ヘモリチカスの培養液中のＴＢＴの濃度を培養上清中のＳｎ量から推定した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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