(57)【要約】【課題】  ２種類の細胞（例えば、上皮系細胞および間葉系細胞）の間で直接的な接触および相互作用を適切に行う二重の細胞層からなる細胞シートを提供すること。【解決手段】  樹脂からなりかつ複数の細孔を有する薄膜を備える構造体を用いて、該構造体の表面上にて細胞を培養し増殖させる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
樹脂からなりかつ複数の細孔を有する薄膜を備える、皮膚再生用の細胞シートを作製するための構造体。
【請求項２】
前記薄膜が０．０１〜５０μｍの範囲の膜厚を有する、請求項１に記載の構造体。
【請求項３】
前記薄膜を複数積層して備える、請求項１に記載の構造体。
【請求項４】
前記複数の細孔がハニカム様に配列されている、請求項１に記載の構造体。
【請求項５】
前記細孔の平均孔径が０．１〜１０μｍである、請求項１に記載の構造体。
【請求項６】
前記細孔中に生体活性物質を備える、請求項１に記載の構造体。
【請求項７】
前記細胞シートが、上皮系細胞および間葉系細胞の二重層からなる植皮用皮膚片である、請求項１に記載の構造体。
【請求項８】
上皮系細胞および間葉系細胞の二重層の間に、樹脂からなりかつ複数の細孔を有する薄膜を備える、植皮用皮膚片。
【請求項９】
皮膚再生用の細胞シートを作製する方法であって、
樹脂からなりかつ複数の細孔を有する薄膜の一方の表面上にて第１の細胞を増殖させる工程；および
該薄膜の他方の表面上にて第２の細胞を増殖させる工程
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞シートを作製するための構造体およびその利用に関するものであり、より詳細には、上皮系細胞と間葉系細胞とを含む植皮用皮膚片およびその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、重層した上皮細胞からなる表皮、および密な結合組織からなる真皮から構成される、人体における最大の器官である。皮膚は、外部環境に対する保護バリアとして、さらに体液の恒常性を維持する防水バリアとして機能している。
【０００３】
皮膚の弾力性およびバリア特性を付与するヒトの皮膚の上部層、すなわち表皮は、皮膚の最外層を形成する厚さ約１ｍｍの組織であり、直接外気と接して種々の刺激（例えば、太陽光線、乾燥、埃など）から皮膚内部を保護する。表皮は、４つの明確な分化段階によって規定される細胞型（真皮と表皮の接合部の境界である基底細胞層、有棘細胞層、顆粒層、および角化層）からなる。
【０００４】
表皮を構成する細胞は、その８０％が角化細胞（ケラチノサイト）である。分裂能を有するケラチノサイトは、基底細胞層に存在し、分化に伴って有棘細胞層、顆粒層、角化層へ移動する。基底細胞層では、常に細胞分裂が行なわれており、生じた細胞は形を変えて移動し、約２８日後に角質層から垢として剥がれ落ちる。このような２８日周期でターンオーバーする表皮の分化は、皮膚の本質的機能の付与、すなわち、外部環境に対する保護バリアの付与などに重要である。
【０００５】
例え一時的とはいえ、皮膚を喪失することにより、致命的または病的な状態がもたらされる危険性が非常に高い。広範囲に及ぶ皮膚の喪失は、大きな火傷に伴って生じることが多く、現在の治療基準では、体液の恒常性およびバリア機能を回復させるためにできる限り早く患者の皮膚を再形成させることが推奨されている。
【０００６】
皮膚の欠損は、火傷以外にも、外傷、手術、疾病などによって生じ得、従来、本人または他人の健康な皮膚片を移植すること（「植皮」）によりその欠損部を補われていた。火傷を負った患者に対して、多くの場合は、自己の皮膚移植片による皮膚の再形成が行われているが、成功しないことが多い。例えば、広範な火傷を負った患者は、移植部位を覆うために利用可能な十分なドナー皮膚をもはや有していない。
【０００７】
近年、細胞工学を利用した火傷治療法が開発されている。創傷部位への移植のための人工皮膚としては、皮膚の断片を患者から切り取り、ケラチノサイトをインビトロで培養して得られる拡張皮膚シートが提案された（非特許文献１などを参照のこと）。これまでに数多くの人工真皮および人工皮膚（ＨＳＥ）が生産されかつ市場販売されている。
【０００８】
組織工学を用いた創傷部位への皮膚移植は、初めて培養表皮細胞移植が行われてから現在までに著しく改良されているが、現在の移植用皮膚は依然として多くの問題を有している。
【０００９】
人工皮膚は、脆弱なために取り扱いが困難であり、高価であり、生産のために時間を必要とされる。また、表皮は本来、間葉系組織（真皮など）との相互作用を営んでいるので、患者由来の表皮細胞を培養して重層した培養表皮シートでは、真皮成分を欠いた全層皮膚欠損には適用され得ない。このように、得られた人工皮膚が正常な皮膚機能を発現するためには、血液から栄養補給がなされている条件下にて上皮系細胞−間葉系細胞間の相互作用が必要である。
【００１０】
しかし、上皮系細胞および間葉系細胞の２種類の細胞を混合させると、間葉系細胞（例えば、線維芽細胞）が上皮系細胞（例えば、表皮角化細胞）の増殖速度に影響を及ぼし、首尾よい相互作用が形成されないことが多い。そこで、上皮系細胞と間葉系細胞との間に適切な相互作用をもたらし得る直接的な接触を首尾よく制御するための手段の開発が望まれている。
【００１１】
細胞は、増殖因子またはサイトカインなどの液性因子だけでなく、種々の高分子からなる細胞外基質との接着によってその増殖および／または分化が制御されていることが知られている。この細胞と細胞外基質との相互作用において、細胞は、細胞外基質分子の化学的な性質だけでなく、基質を構成する高分子が織り成す微細な形状によってその増殖および／または分化が制御されることもまた知られている。これらの知見から、細胞の足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）としての細胞外基質に関する研究がすすんでいる。
【００１２】
足場が、人工物であってもその三次元構造に基づいて細胞の接着、増殖および／または分化を誘導し得ること、ならびに細胞を組込んだ足場を生体に移植することによって組織を再構築し得ることが見出されている。しかし、半導体技術において利用されているマイクロパターン技術は、非常に高度な技術が必要であり、大量生産が出来ず、高コストであるといった多くの問題を抱えている。
【００１３】
本発明者は、生分解性高分子と両親媒性ポリマーとを適当な割合で組み合わせることによって、経済的な調製が可能であり、自立性が有り、構造的にも安定な構造体を作製し、該構造体を用いた細胞培養用基材を完成させている（例えば、特許文献１および２を参照のこと）。
【特許文献１】特開２００２−３４７１０７公報（平成１４年１２月４日公開）
【特許文献２】特開２００２−３３５９４９公報（平成１４年１１月２６日公開）
【非特許文献１】Ｇａｌｌｉｃｏ，Ｇ．Ｇ．ら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１１：４４８−４５１（１９８４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上述したように、有用な人工皮膚を開発しようとする試みが数多くなされている。しかし、上皮系細胞と間葉系細胞との間の相互作用を首尾よく制御する技術は開発されていない。特に、皮膚再生用の細胞シートの作製は、これまで首尾よくなされていない。
【００１５】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、上皮系細胞と間葉系細胞との間に適切な相互作用をもたらし構造体を提供するとともに、当該構造体を用いて作製した、植皮に有用な人工皮膚片を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、鋭意検討した結果、特定の物理的空間を有する足場を提供することによって上皮系細胞と間葉系細胞との間に適切な相互作用をもたらし得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１７】
すなわち、本発明に係る細胞シートを作製するための構造体は、樹脂からなりかつ複数の細孔を有する薄膜を備えることを特徴としている。
【００１８】
本発明に係る構造体において、上記細胞シートは皮膚再生用であることが好ましい。
【００１９】
本発明に係る構造体において、上記薄膜は０．０１〜１００μｍの範囲の膜厚を有することが好ましい。
【００２０】
本発明に係る構造体は、上記薄膜を複数積層して備えることが好ましい。
【００２１】
本発明に係る構造体において、上記樹脂は生分解性ポリマーおよび／または両親媒性ポリマーを含むことが好ましい。
【００２２】
本発明に係る構造体において、上記生分解性ポリマーは、ポリ乳酸、ポリ（ε−カプロラクトン）、およびポリ（グリコール酸−乳酸）共重合体からなる群より選択されることが好ましい。
【００２３】
本発明に係る構造体において、上記両親媒性ポリマーは、疎水性側鎖としてドデシル基を有し親水性側鎖としてラクトース基またはカルボキシル基を有する、アクリルアミドポリマーを主鎖骨格とする両親媒性樹脂；ポリエチレングリコール系共重合体；および、アニオン性高分子と長鎖アルキルアンモニウム塩とのポリイオンコンプレックスからなる群より選択されることが好ましい。
【００２４】
本発明に係る構造体において、上記複数の細孔はハニカム様に配列されていることが好ましい。
【００２５】
本発明に係る構造体において、各細孔は貫通していることが好ましい。
【００２６】
本発明に係る構造体において、各細孔は連通していることが好ましい。
【００２７】
本発明に係る構造体において、上記細孔の平均孔径は０．１〜１０μｍであることが好ましい。
【００２８】
本発明に係る植皮用皮膚片は、上記細孔中に生体活性物質を備えることが好ましい。
【００２９】
本発明に係る植皮用皮膚片において、上記生体活性物質はコラーゲンまたはフィブリンであることが好ましい。
【００３０】
本発明に係る植皮用皮膚片において、上記コラーゲンまたはフィブリンはゲル形態またはスポンジ形態であることが好ましい。
【００３１】
本発明に係る植皮用皮膚片において、上記生体活性物質は増殖因子またはサイトカインであることが好ましい。
【００３２】
本発明に係る植皮用皮膚片において、上記生体活性物質は徐放性の容器中に格納されていることが好ましい。
【００３３】
本発明に係る構造体において、上記細胞シートは、上皮系細胞および間葉系細胞の二重層からなる植皮用皮膚片であることが好ましい。
【００３４】
本発明に係る構造体において、上記上皮系細胞は表皮角化細胞であることが好ましい。
【００３５】
本発明に係る構造体において、上記間葉系細胞は線維芽細胞であることが好ましい。
【００３６】
本発明に係る植皮用皮膚片は、上皮系細胞および間葉系細胞の二重層を有することを特徴としている。
【００３７】
本発明に係る植皮用皮膚片は、上記二重層の間に、樹脂からなりかつ複数の細孔を有する薄膜を備えることが好ましい。
【００３８】
本発明に係る細胞シートを作製する方法は、樹脂からなりかつ複数の細孔を有する薄膜の一方の表面上にて第１の細胞を増殖させる工程；および、該薄膜の他方の表面上にて第２の細胞を増殖させる工程、を包含することを特徴としている。
【００３９】
好ましくは、上記細胞シートは皮膚再生用であり得る。
【００４０】
本発明に係る細胞シートを作製する方法において、上記第１の細胞は上皮系細胞であることが好ましい。
【００４１】
本発明に係る細胞シートを作製する方法において、上記第２の細胞は間葉系細胞であることが好ましい。
【００４２】
本発明に係る細胞シートを作製する方法において、上記細胞シートは植皮用皮膚片であることが好ましい。
【発明の効果】
【００４３】
本発明に係る構造体を用いれば、物理的空間を制御することにより、２種類の細胞（例えば、上皮系細胞および間葉系細胞）の間での直接的な接触および相互作用を適切にもたらし得、天然物に類似する人工の細胞シート（特に、皮膚再生用の細胞シート）を作製することができる。
【００４４】
単純な多孔膜の両面にて表皮細胞と線維芽細胞とを培養した場合、線維芽細胞が膜の両面に移行することにより細胞が混在してしまい、その結果として、表皮細胞の超微細構造が破壊され、正常なヒト皮膚と類似する人口皮膚を作製することが困難になり得る。本発明の一実施形態である構造体を用いれば、この危険性を回避することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
上述したように、本発明者らは、生分解性高分子と高分子の自己組織化によって新規合成した両親媒性高分子との希薄混合溶液をシャーレ上にキャストして高湿度の空気を吹き付けることにより規則的な多孔構造を有する多孔性フィルムを作製することができること、および該多孔性フィルムが細胞培養用基材として利用可能であることを、これまでに見出している。そこで、本発明者らは、上記フィルムが備える未知の特性に基づく新規用途を見出すこと、およびより好ましい構造体を完成させることを目的として鋭意検討を行い、その結果、本発明を完成させた。
【００４６】
なお、本明細書中で使用される場合、用語「細胞」は主に動物細胞が意図されるが、植物細胞であってもよい。好ましい細胞は、哺乳動物細胞であり、より好ましくは、ヒト細胞である。
【００４７】
本発明は、細胞シートを作製するための構造体を提供する。本明細書中で使用される場合、細胞シートを構成する「細胞層」は単層であってもよいが、機能的であるためには複数の層が折り重なって三次元構造を構成するものであることが好ましい。好ましくは、上記細胞シートは皮膚再生用であり得る。一実施形態において、本発明に係る構造体は、薄膜を備えることを特徴としている。本発明に係る構造体において、上記薄膜は樹脂からなりかつ複数の細孔を有することが好ましい。好ましい実施形態において、本発明に係る構造体は、０．０１〜１００μｍの範囲の膜厚を有する薄膜を備え得る。本実施形態に係る構造体において、上記薄膜は１層であっても複数積層されていてもよく、基板（例えば、プラスチック、ガラスなど）上に該薄膜が積層されていてもよい。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、用語「シート」は、平面状の薄い構造物が意図される。本明細書中で意図されるシートの厚さは特に限定されないが、好ましくは０．５ｍｍ以下、より好ましくは０．１ｍｍ以下である。当業者は、０．０１〜１００μｍの範囲の膜厚を有する薄膜もまたシートであることを容易に理解する。
【００４９】
本実施形態に係る構造体において、上記樹脂としては、特に限定されないが、植皮用皮膚片などのヒトに適用するための細胞シートを作製する場合は、毒性の少ないものが好ましい。また、本実施形態に係る構造体を、特許文献２に記載されるような方法に従って作製する場合は、有機溶媒に溶解する高分子化合物（ポリマー）であることが好ましい。本実施形態に係る構造体がポリマーからなる薄膜を備える場合、高分子薄膜を形成するために、インクジェット方式またはスクリーン方式のような印刷法を用いて高分子を所望の形状およびサイズにペーストもよいし、フォトリソグラフィー法などを用いてさらに表面を整形してもよい。
【００５０】
なお、このような手法を用いてポリマーからなる薄膜を形成する場合は、支持体（基板）が必要であるが、基板としては、寸度的に安定なものであれば特に限定されず、例えば、紙、プラスチック（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン等）がラミネートされた紙、金属板（例えば、アルミニウム、亜鉛、銅等）、プラスチックフィルム（例えば、二酢酸セルロース、三酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酪酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、硝酸セルロース、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリビニルアセタール等）等が挙げられる。これらは、樹脂フィルムまたは金属板などの単一成分のシートであっても、２以上の材料の積層体であってもよい。
【００５１】
このようなポリマーとしては、ポリブタジエン、ポリイソプレン、スチレン−ブタジエン共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体などの共役ジエン系高分子；ポリε−カプロラクトン；ポリウレタン；酢酸セルロース、セルロイド、硝酸セルロース、アセチルセルロース、セロファンなどのセルロース系高分子；ポリアミド６、ポリアミド６６、ポリアミド６１０、ポリアミド６１２、ポリアミド１２、ポリアミド４６などのポリアミド系高分子；ポリテトラフルオロエチレン、ポリトリフルオロエチレン、パーフルオロエチレン−プロピレン共重合体などのフッ素系高分子；ポリスチレン、スチレン−エチレン−プロピレン共重合体、スチレン−エチレン−ブチレン共重合体、スチレン−イソプレン共重合体、塩素化ポリエチレン−アクリロニトリル−スチレン共重合体、メタクリル酸エステル−スチレン共重合体、スチレン−アクリロニトリル共重合体、スチレン−無水マレイン酸共重合体、アクリル酸エステル−アクリロニトリル−スチレン共重合体などのスチレン系高分子；ポリエチレン、塩素化ポリエチレン、エチレン−α−オレフィン共重合体、エチレン−酢酸ビニル共重合体、エチレン−塩化ビニル共重合体、エチレン−酢酸ビニル共重合体、ポリプロピレン、オレフィン−ビニルアルコール共重合体、ポリメチルペンテンなどのオレフィン系高分子；フェノール樹脂、アミノ樹脂、尿素樹脂、メラミン樹脂、ベンゾグアナミン樹脂などのホルムアルデヒド系高分子；ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレートなどのポリエステル系高分子；エポキシ樹脂；ポリ（メタ）アクリル酸エステル、ポリ−２−ヒドロキシエチルアクリレート、メタクリル酸エステル−酢酸ビニル共重合体などの（メタ）アクリル系高分子；ノルボルネン系樹脂；シリコン樹脂；ポリ乳酸、ポリヒドロキシ酪酸、ポリグリコール酸などのヒドロキシカルボン酸の重合体などが挙げられ、これらは単独で使用されても組み合わせて使用されてもよい。
【００５２】
なお、本発明に係る構造体を構成するポリマーは、非生分解性樹脂であっても生分解性樹脂であってもよい。また、構造体の効果を生体内で長期間持続させることが好ましい場合は、非生分解性樹脂を用いればよく、生体で長期間持続させることが好ましくない場合は、生分解性樹脂を用いればよい。好ましい生分解性樹脂としては、ポリ乳酸、ポリ（ε−カプロラクトン）、およびポリ（グリコール酸−乳酸）共重合体が挙げられ、好ましい非生分解性樹脂としては、ポリブタジエン、ポリウレタン、およびポリ（メタ）アクリレートが挙げられる。
【００５３】
本実施形態に係る構造体において、上記樹脂が両親媒性のポリマーを含んで構成されることが好ましい。本実施形態において、好ましい両親媒性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール／ポリプロピレングリコールブロック共重合体；アクリルアミドポリマーを主鎖骨格とし疎水性側鎖としてドデシル基と親水性側鎖としてラクトース基またはカルボキシル基を併せ持つ両親媒性樹脂；ヘパリンやデキストラン硫酸、核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）などのアニオン性高分子と長鎖アルキルアンモニウム塩とのイオンコンプレックス；ゼラチン、コラーゲン、アルブミンなどの水溶性タンパク質を親水性基とした両親媒性樹脂；ポリ乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体、ポリε−カプロラクトン−ポリエチレングリコールブロック共重合体、ポリリンゴ酸−ポリリンゴ酸アルキルエステルブロック共重合体などの両親媒性樹脂などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
なお、多乳酸高分子（例えば、ポリ（ｅ―カプロラクトン））からなる生成物は、生体適合性および生体分解性を有しており、すでに外科縫合、血管ステント、およびその補助に使用されているので、本発明において使用されることが好ましい。
【００５５】
本実施形態に係る構造体において、上記複数の細孔は、貫通孔または非貫通孔のいずれであってもよく、少なくとも表面部に多孔構造を有していればよい。また本実施形態に係る構造体においては、上記複数の細孔の各々が構造体内部において連通している「連続性多孔構造」であることがより好ましい。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、「細孔の平均孔径」は、「細孔サイズ」および「細孔径」と交換可能に用いられる。本実施形態に係る構造体において、上記細孔の平均孔径は、０．１〜５０μｍであることが好ましく、０．１〜２０μｍであることがより好ましく、０．１〜１０μｍであることが最も好ましい。また、本実施形態に係る構造体において、上記細孔の開口形状は特に限定されず、円形状、楕円形状、正方形状、長方形状、六角形状などのいかなる形状であってもよい。
【００５７】
本明細書中において使用される場合、用語「孔径」または「細孔径」は、細孔の開口形状に対する最大内接円の直径が意図され、例えば、細孔の開口形状が実質的に円形状である場合はその円の直径が意図され、実質的に楕円形状である場合はその楕円の短径が意図され、実質的に正方形状である場合はその正方形の辺の長さが意図され、実質的に長方形状である場合はその長方形の短辺の長さが意図される。
【００５８】
さらに、本実施形態に係る構造体において、上記細孔径の変動係数〔＝標準偏差÷平均値×１００（％）〕は３０％以下であることが好ましい。
【００５９】
なお、本発明に係る構造体において、幹幅が０．０１〜１０μｍであることが好ましい。本明細書中において使用される場合、「幹」は、細孔と細孔との間が意図され、「幹幅」は、幹（細孔と細孔との間）の幅が意図される。
【００６０】
本実施形態に係る構造体において、上記複数の細孔は規則的に配列されていることが好ましく、該複数の細孔はハニカム様に配列されていることがより好ましい。本明細書中において使用される場合、用語「ハニカム様（ハニカム様構造）」は、孔径がほぼ一定の複数の細孔が規則正しく蜂巣状に配列してなる多孔構造が意図される。すなわち、本明細書中で使用される場合、「ハニカム薄膜」はハニカム様の多孔構造を有する薄膜が意図される。
【００６１】
ハニカム様構造体の製造方法としては、特許文献２に記載の方法以外に、ナノインプリントを含む金型技術（サブミクロン〜１００ミクロン程度の均一な空孔を持つハニカム構造体を得る技術）、コロイド微粒子分散液を乾燥させ、集積したコロイド結晶を鋳型としてハニカム状の多孔質膜を得る方法などが知られている。しかし、前者の方法では、鋳型を剥離する際に空孔の形状が崩れるため、原理的に鋳型の構造を正確に反映させることが困難であり、後者の方法では、集積に時間がかかること、材料を流し込んだ後に鋳型を除去しなければならないことなどの問題を有する。よって、多孔構造が規則正しく配列するハニカム様構造体の簡便な作製方法は、特許文献２に記載される方法が最も好ましいが、本発明に係る構造体を作製するための方法は、これに限定されない。
【００６２】
本発明に係る構造体は、上述したような構造を有するので、多孔の中心部に生体活性物質を備え得る。生体活性物質としては、フィブリン、コラーゲン（Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ＶＩＩ型コラーゲンなど）、増殖因子、サイトカインなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
増殖因子としては、例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）が挙げられ、サイトカインとしては、例えば、インターフェロン類（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βなど）、インターロイキン類（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６など）、コロニー刺激因子類（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などが挙げられる。
【００６４】
フィブリンまたはコラーゲンは、ゲルまたはスポンジの形態であることが好ましく、増殖因子またはサイトカインは徐放性容器中に格納されていることが好ましい。生体活性物質を備えることにより、本発明に係る構造体は、細胞シートを皮膚片として植皮する際に非常に有効である。
【００６５】
本発明に係る構造体を用いる細胞は、異なる２種の細胞であれば特に限定されないが、植皮用皮膚片を作製するためには上皮系細胞および／または間葉系細胞であることが好ましい。一実施形態において、上皮系細胞は表皮角化細胞であることが好ましく、間葉系細胞は線維芽細胞であることが好ましい。本発明に係る構造体を用いれば、ヒト皮膚由来の細胞（例えば、表皮細胞および線維芽細胞）の単独培養または三次元２層培養が可能である。
【００６６】
なお、本発明の一実施形態である多孔性樹脂フィルムを備えた構造体を用いて細胞を組織化し得るので、本発明に係る構造体を用いて作製した細胞シートを植皮用皮膚片として植皮しても、本発明に係る構造体を植皮用皮膚片の一部として含んだまま植皮してもよい。本発明に係る構造体は全ての方向に柔軟である。よって、本発明に係る植皮用皮膚片は、皮膚のひだ、耳、まぶたなどのような複雑な形状を有する部位に対しても適用され得る。本発明に係る構造体を植皮用皮膚片の一部として植皮する場合は体内（体表）に埋め込むことが必要であるので、本発明に係る構造体は長期的には生体内へ吸収されることが好ましい。
【００６７】
つまり、本発明の目的は、植皮用皮膚片を作製するための構造体を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した薄膜の製造方法、薄膜の厚さ、樹脂成分、細孔の数および深さ、細孔の形状等の条件に存するのではない。したがって、上記方法以外を用いて製造された構造体もまた本発明の範囲に属することに留意しなければならない。
【００６８】
本発明はさらに、樹脂からなりかつ複数の細孔を有する薄膜を備える構造体を用いることによって作製された植皮用皮膚片を提供する。一実施形態において、本発明に係る植皮用皮膚片は、上皮系細胞および間葉系細胞の二重層を有し得る。
【００６９】
上述したように、上記構造体は植皮用皮膚片の一部として含まれたまま植皮されてもよいので、本発明に係る植皮用皮膚片は、上記構造体を備えていてもよい。好ましくは、本発明に係る植皮用皮膚片は、二重層の間に上記構造体を備え得る。
【００７０】
本発明に係る植皮用皮膚片は、従来の移植片の作製に利用されている自系細胞を必要とせず、同種異系細胞を単独で利用しても、自系細胞と同種異系細胞との混合物を利用してもよい。よって、本発明を用いれば、時間を要する培養によって完全に自系である移植材料を調製する必要がない。このように、常時大量に入手し得る本発明は、迅速な処置を必要とする広範な火傷に特に有用である。
【００７１】
本発明はまた、樹脂からなりかつ複数の細孔を有する薄膜を備える構造体を用いることによって細胞シートを作製する方法を提供する。好ましくは、上記細胞シートは皮膚再生用であり得る。一実施形態において、本発明に係る細胞シートを作製する方法は、樹脂からなりかつ複数の細孔を有する薄膜の一方の表面上にて第１の細胞を増殖させる工程；および、該薄膜の他方の表面上にて第２の細胞を増殖させる工程、を包含し得る。好ましくは、第１の細胞は上皮系細胞であり、第２の細胞は間葉系細胞である。さらに好ましくは、細胞シートは植皮用皮膚片である。
【００７２】
尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様および以下の実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、当業者は、本発明の精神および添付の特許請求の範囲内で変更して実施することができる。
【００７３】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００７４】
〔１：植皮用皮膚片を作製するための構造体の作製〕
ポリ（ε−カプロラクトン）（Ｐｏｌｙ（ε−ｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ）；（株）和光純薬工業、ＭＷ７０，０００〜１００，０００：以下ＰＣＬと称する）と両親媒性アクリルアミドポリマー（Ｃａｐ）とを重量比１０：１の割合で混合した後にクロロホルムに溶解し、濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調製した。多孔フィルムを、ガラスシャーレ（直径９ｃｍ）にて作製した高分子混合溶液をキャストして高湿度雰囲気下にて作製した。多孔フィルムの孔径は、キャストする高分子溶液の量を変えることにより制御することができた。各フィルムの孔径、幹径および空孔率を、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（ＨＩＴＡＣＨＩ，Ｓ−３５００）を用いて測定した。画像１枚あたり５個の細孔を選択してその直径の平均を孔径として求め、合計５枚の画像について孔径を測定した。多孔フィルムの幹幅の最も細い部分を幹径として測定し、画像解析用ソフトウエアＳｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて空孔率を測定した。
【００７５】
またＰＣＬ平膜を、上記混合溶液を１８ｍｍ角のカバーガラス上に滴下し、１０００ｒｐｍ、３０秒の条件でスピンコーター（ＭＩＫＡＳＡ）を用いて作製した。
【００７６】
〔２：細胞調製〕
正常ヒト新生児由来表皮角化細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を、ＫＧＭ−Ｉ培養液（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，ＭＤ）中で２継代目（Ｐ２）まで培養および増殖させた。次いで、トリプシン処理して回収した細胞を、１０％ＤＭＳＯを補充した培地中に懸濁し、使用するまで液体窒素中にて保存した。
【００７７】
正常ヒト真皮由来線維芽細胞を、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中で３継代目（Ｐ３）まで培養および増殖させた。次いで、トリプシン処理して回収した細胞を、１０％ＤＭＳＯを補充した培地中に懸濁し、使用するまで液体窒素中にて保存した。
【００７８】
〔３：細胞培養〕
ＰＣＬ多孔フィルムを空気乾燥し、エタノール処理および紫外線照射によって滅菌した。滅菌したＰＣＬ多孔フィルムを、滅菌済Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳで迅速に３回洗浄した後、培養細胞を薄膜上に直接播種した。
【００７９】
〔４：二層膜の作製〕
細胞（表皮角化細胞および線維芽細胞）の二層膜を以下のように作製した。
【００８０】
ヒト真皮由来線維芽細胞を、１０％ＦＣＳ（牛胎児血清）およびペニシリン・ストレプトマイシン（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を補充したＤＭＥＭ培地中にてＰＣＬ多孔フィルム上で２〜３週間培養した。フィルムを反転した後、表皮角化細胞を、ＫＧＭ−Ｉ培養液（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中にて線維芽細胞側と反対側のフィルム上でコンフルエントになるまで培養した。細胞がコンフルエントになった後（約２１日後）、表皮角化細胞膜側表面を空気と培地との境界面へ引き上げ、さらに１０日間培養することによって、表皮角化細胞の分化および重層化を誘導した。
【００８１】
〔５：細胞の接着に関する解析〕
正常ヒト新生児表皮角化細胞（Ｐ３）を、ＫＧＭ−Ｉ培養液中で培養および増殖させた。この細胞を、種々の材質の基材（ガラス、ポリカプトラクトン（ＰＣＬ）製の平膜、および種々の孔径を有するＰＣＬ多孔フィルム）上に播種し、２４時間培養して基材上に細胞を接着させた。播種２４時間後、各シャーレを滅菌済の０．１Ｍ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳで４回洗浄し、０．０５μｇ／ｍｌ  Ｃ−３６９  ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ（ＡＭＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）と５分間反応させて生細胞を蛍光標識し、ＰＢＳおよびＤＭＥＭの両方で細胞を５分間×２回洗浄し、生存する表皮角化細胞数を計測した。
【００８２】
接着している生細胞を、Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  ＦＶ３００共焦点レーザー顕微鏡およびＩＸ７０倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）においてＦＩＴＣフィルターを用いて計数した。各材質からなる基材について、細胞を播種してから２４時間経過時点に、接着している生細胞について強拡視野（ｎ＞５）における生存細胞数を計測した。以上の実験を３回独立して行った。結果を図１および図２に示す。
【００８３】
〔６：細胞の増殖に関する解析〕
正常ヒト新生児表皮角化細胞（Ｐ３）を、前述した材質のシャーレに播種し、ＫＧＭ−Ｉ培養液中で培養した。播種の２４時間、４８時間、１００時間後に、シャーレを滅菌済の０．１Ｍ  ＰＢＳで４回洗浄し、０．０５μｇ／ｍｌ  Ｃ−３６９  ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ（ＡＭＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）と５分間反応させて生細胞を蛍光標識し、ＰＢＳおよびＤＭＥＭの両方で細胞を５分間洗浄し、生存する表皮角化細胞数を計測した。
【００８４】
接着している生細胞を、デジタルカメラ付倒立培養顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ，Ｔｏｋｙｏ  Ｊａｐａｎ）による計測、およびＯｌｙｍｐｕｓ  Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  ＦＶ３００共焦点レーザーとＩＸ７０倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）においてＦＩＴＣ励起による計測を行った。それぞれの材質について、各材質からなる基材について、上記した細胞播種後の各時点において、接着している生細胞について強拡視野（ｎ＞５）における生存細胞数を計測した。以上の実験を２回独立して行った。結果を図１および図２に示す。
【００８５】
〔７：カバーグラスを用いた細胞移動に関する解析〕
３継代目（Ｐ３）の正常表皮角化細胞または線維芽細胞を、種々の材質の基材（ガラスまたはプラスチック製のシャーレ、ポリカプトラクトン（ＰＣＬ）製の平膜、および種々の孔径を有するＰＣＬＰＣＬ多孔フィルム）上に播種し、培養した。各基材の表面の一部を、５ｍｍ２のガラス製カバーグラスによって予めかぶせて覆っておいた。播種４８時間後にカバーグラスを静かに取り除き、細胞がカバーグラス部分を覆うのに要した時間を計測した。
【００８６】
〔８：ビデオを用いた単一の細胞の移動に関する解析〕
上述した細胞の移動に関する実験において、基材（特にＰＣＬ多孔フィルム）に損傷を与えることなくカバーグラスを除去することは困難である。よって、単一の細胞の移動を、自動的に経時的に録画するビデオ付培養用顕微鏡を用いて観察した。種々の材質の基材上に播種して培養した細胞を、温度およびＣＯ２濃度が制御された顕微鏡ステージに設置して観察する。使用した顕微鏡は、ＴＥ−２０００倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、顕微鏡ステージはＩＮＵ−ＮＩ  ｓｅｒｉｅｓ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  ｓｔａｇｅ（Ｎｉｋｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）である。
【００８７】
〔９：走査型電子顕微鏡による細胞の形態的観察〕
種々の材質の基材上に播種して培養した細胞を、５％グルタールアルデヒド中で４時間固定し、各サンプルを数種類の濃度のエタノール系列により脱水し、ｉｓｏａｍｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ処理を２回行った後、Ｈｉｔａｃｈｉ  ＨＣＰ−２にてＣＯ２臨界点乾燥、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｅ−１０３０（Ｈｉｔａｃｈｉ，Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）にてｐｌａｔｉｎｕｍ−ｐａｌｌａｄｉｕｍの金属イオンコートを行った後に、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した。デジタルカメラを搭載したＨｉｔａｃｈｉ  Ｓ−４５００  ＳＥＭ（Ｈｉｔａｃｈｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて細胞を観察した。結果を図２に示す。
【００８８】
〔１０：結果〕
ガラス基板または種々の孔径を有するＰＣＬ多孔フィルムに対する表皮角化細胞の接着率、細胞増殖および細胞移動、ならびに繊維芽細胞の細胞移動の結果を、表１に示す。
【００８９】
【表１】
2007006987.tif 000002
【００９０】
接着初期の表皮細胞について、ＰＣＬ多孔フィルムの細孔径が小さいほど（≦１０μｍ）より強い細胞接着が観察された。細胞接着の程度は、ＰＣＬ多孔フィルムの細孔径が３μｍの膜と５μｍの膜との間で比較すると、３μｍの膜での細胞接着の方がより強かった。
【００９１】
表皮細胞を、ＰＣＬ多孔フィルム（細孔サイズ３〜２０μｍ）上で６〜１１日間培養し、細孔サイズのＰＣＬ多孔フィルムにおける細胞の増殖速度を比較した結果、細孔サイズ３μｍのＰＣＬ多孔フィルム上で培養した細胞が最も早く増殖したが、高カルシウムＫＧＭ培養液中での培養開始６日後までは、細孔サイズ５μｍのＰＣＬ多孔フィルム上での細胞の増殖速度は細孔サイズ３μｍのものと同程度であった。
【００９２】
細孔面積あたりの細孔周囲の長さは、細孔サイズが小さいほど長くなるので、細胞は、細孔周囲に細胞膜を拡げて基底面へより強固に接着し、これにより、増殖を促すシグナルをより効果的に得ることができると考えられる。
【００９３】
小さな細孔サイズのＰＣＬ多孔フィルム上で培養した際、表皮細胞および線維芽細胞の伸展が早かった。細孔サイズ３μｍの膜の方が細孔サイズ５μｍの膜よりもわずかに効果的であった。
【００９４】
さらに、細孔サイズが小さいＰＣＬ多孔フィルムは、線維芽細胞の膜の通過と反対側への移動を防ぐことがわかった。線維芽細胞が膜の両面に移行して２種類の細胞が混合すると、線維芽細胞が表皮細胞の増殖速度に影響を与える。このことは、表皮細胞の超微細構造にとって非常に阻害的であるので、正常な成人皮膚と類似する表皮細胞シートの作製にダメージを与えかねない。しかし、ＰＣＬ多孔フィルムはこのような細胞の移行を防止し得るという利点がある。
【００９５】
以上のように、表皮細胞および線維芽細胞はいずれも、細孔サイズ３〜２０μｍのＰＣＬ多孔フィルムに接着し、首尾よく伸展しかつ増殖した。接着の初期段階においては、ＰＣＬ多孔フィルムにおいて間隙のないガラスまたは平坦な高分子Ｌ−カプロラクトン（ＰＣＬ平膜）上よりもよく接着し、その程度は細孔サイズ３μｍのＰＣＬ多孔フィルムにおいて最も強力であった。表皮細胞は、細孔サイズ３μｍのＰＣＬ多孔フィルム上で最も顕著に増大し、５μｍがこれに続く。
【００９６】
表皮細胞および線維芽細胞はいずれも、細孔サイズが小さいフィルム上で早く伸展した（３μｍ＞５μｍ＞１０μｍ＞１５μｍ＞２０μｍ）。特に細孔サイズが３μｍのフィルムにおいては、細胞（特に、線維芽細胞）が膜内へ伸展することを阻止し、最も効果的に二層膜を形成し得る。このような特徴は、複数の細胞を共に培養する際、あるいは２層からなる人工のヒト皮膚または人工の真皮培養の基板として用いられる際に、異種細胞が混ざり合うことを避けるために有効である。
【００９７】
以上より、角化細胞および線維芽細胞はいずれも、孔径３μｍのＰＣＬ多孔フィルム上で最もよく接着しかつ増殖するが、細胞移動は、より多いより小さな孔によって阻害されるということがわかった。このように、ＰＣＬ多孔フィルム（ハニカム基材）は、ヒト角化細胞および真皮線維芽細胞を培養する際に最も効果的であることがわかった。
【００９８】
ＰＣＬ多孔フィルムのこのような特性は、二重層培養における可能性のある他の用途に本技術を展開する際に、そして慢性ヒト皮膚傷害に対する可能性のある治療として、本フィルムが有用であることを大いに示唆する。
【００９９】
本発明に係る構造体を用いれば、表皮細胞または線維芽細胞の単独培養時に電子顕微鏡下で観察される表皮細胞基底膜が形成されなかった。さらに本発明に係る構造体の中空部分にはフィブロネクチン（細胞外マトリクスタンパク質）が形成され、本発明に係る構造体が細胞シートの作製に非常に有用であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明は、遺伝子治療、臓器移植、骨髄移植、ガン治療、または再生医学といった多岐にわたる医療分野において非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】ガラス基板または種々の孔径を有するＰＣＬ多孔フィルムに対する正常ヒト新生児表皮角化細胞の接着率測定の結果を示すグラフである。
【図２】ガラス基板または種々の孔径を有するＰＣＬ多孔フィルムに対する正常ヒト新生児表皮角化細胞の細胞接着形態を、走査型電子顕微鏡によって観察した結果を示す写真である。
【図１】
2007006987.tif 000003
【図２】
2007006987.tif 000004