(57)【要約】      （修正有）【課題】塩素化エチレン分解細菌の検出に利用することができる核酸であって、塩素化エチレン分解細菌の16S rRNAまたはrDNAに優先的にハイブリダイズする新規かつ有用な核酸、この核酸を用いた塩素化エチレン分解細菌の検出方法および塩素化エチレンまたはエタンの分解方法を提案する。【解決手段】塩素化エチレン分解細菌の16S rRNAまたはrDNAに優先的にハイブリダイズする18〜25ヌクレオチドからなる核酸であって、特定の塩基配列、これらの塩基配列と90％以上のホモロジーを有する塩基配列またはこれらの塩基配列と相補的な塩基配列を含む核酸をプライマー、試料中の核酸を鋳型としてPCRを行い、合成されたDNA断片を検出する塩素化エチレン分解細菌の検出方法、およびこの方法で検出された塩素化エチレン分解細菌を汚染土壌や地下水に導入して塩素化エチレンまたはエタンを分解する分解方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩素化エチレン分解細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに優先的にハイブリダイズする１８〜２５ヌクレオチドからなる核酸であって、配列番号１〜１５のいずれかの塩基配列、これらの塩基配列と９０％以上のホモロジーを有する塩基配列またはこれらの塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸。
【請求項２】
塩素化エチレン分解細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに優先的にハイブリダイズする１０〜５０ヌクレオチドからなる核酸であって、少なくとも１０個の連続する塩基配列が、配列番号１〜１５のいずれかの塩基配列と同じ塩基配列またはこれらの塩基配列と相補的な塩基配列である核酸。
【請求項３】
塩素化エチレン分解細菌検出用である請求項１または２記載の核酸。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれかに記載の核酸を放射性元素、酵素、蛍光物質、抗原、抗体または化学物質で標識した塩素化エチレン分解細菌検出用標識プローブ。
【請求項５】
請求項１ないし３のいずれかに記載の核酸をプライマー、試料中の核酸を鋳型としてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、合成されたＤＮＡ断片を検出する塩素化エチレン分解細菌の検出方法。
【請求項６】
請求項４記載の塩素化エチレン分解細菌検出用標識プローブと、試料または試料から調製した核酸とを接触させてＲＮＡまたはＤＮＡハイブリダイゼーションを行った後、標識を指標にして検出する塩素化エチレン分解細菌の検出方法。
【請求項７】
地下水または土壌を試料として請求項５または６記載のエチレン分解細菌の検出方法を実施し、
塩素化エチレン分解細菌が検出された地下水、土壌またはそれらを接種した培養液を、塩素化エチレンまたはエタンで汚染された土壌または地下水に導入する塩素化エチレンまたはエタンの分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、塩素化エチレン分解細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに優先的にハイブリダイズする核酸、この核酸からなる塩素化エチレン分解細菌検出用標識プローブ、これらの核酸または標識プローブを用いた塩素化エチレン分解細菌の検出方法、および塩素化エチレンまたはエタンの分解方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
塩素化エチレンまたはエタンで汚染された土壌または地下水などを浄化する方法として、汚染土壌中に元来存在する塩素化エチレン分解細菌を利用して、塩素化エチレンを嫌気的に脱塩素化する方法がある。またこれらの細菌を汚染土壌または地下水に添加する方法も知られている。塩素化エチレン分解細菌は、この細菌が保有する塩素化エチレン分解酵素により、塩素化エチレンだけでなく塩素化エタンも分解することができることも知られている。しかし、このような方法では、処理効果は常に良好、つまり完全に脱塩素化が行われる保証はないという問題点がある。
このため、塩素化エチレン分解細菌を利用して塩素化エチレンまたはエタンで汚染された土壌または地下水などを浄化する場合、脱塩素化が行われるかどうかを予め判定する方法が要望されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の課題は、塩素化エチレン分解細菌の検出に利用することができる核酸であって、塩素化エチレン分解細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに優先的にハイブリダイズする新規かつ有用な核酸、この核酸からなる塩素化エチレン分解細菌検出用標識プローブ、これらの核酸または標識プローブを用いた塩素化エチレン分解細菌の検出方法、および塩素化エチレンまたはエタンの分解方法を提案することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は次の塩素化エチレン分解細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに優先的にハイブリダイズする核酸、この核酸からなる塩素化エチレン分解細菌検出用標識プローブ、これらの核酸または標識プローブを用いた塩素化エチレン分解細菌の検出方法、および塩素化エチレンまたはエタンの分解方法である。
（１）  塩素化エチレン分解細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに優先的にハイブリダイズする１８〜２５ヌクレオチドからなる核酸であって、配列番号１〜１５のいずれかの塩基配列、これらの塩基配列と９０％以上のホモロジーを有する塩基配列またはこれらの塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸。
（２）  塩素化エチレン分解細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに優先的にハイブリダイズする１０〜５０ヌクレオチドからなる核酸であって、少なくとも１０個の連続する塩基配列が、配列番号１〜１５のいずれかの塩基配列と同じ塩基配列またはこれらの塩基配列と相補的な塩基配列である核酸。
（３）  塩素化エチレン分解細菌検出用である上記（１）または（２）記載の核酸。
（４）  上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の核酸を放射性元素、酵素、蛍光物質、抗原、抗体または化学物質で標識した塩素化エチレン分解細菌検出用標識プローブ。
（５）  上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の核酸をプライマー、試料中の核酸を鋳型としてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、合成されたＤＮＡ断片を検出する塩素化エチレン分解細菌の検出方法。
（６）  上記（４）記載の塩素化エチレン分解細菌検出用標識プローブと、試料または試料から調製した核酸とを接触させてＲＮＡまたはＤＮＡハイブリダイゼーションを行った後、標識を指標にして検出する塩素化エチレン分解細菌の検出方法。
（７）  地下水または土壌を試料として上記（５）または（６）記載のエチレン分解細菌の検出方法を実施し、
塩素化エチレン分解細菌が検出された地下水、土壌またはそれらを接種した培養液を、塩素化エチレンまたはエタンで汚染された土壌または地下水に導入する塩素化エチレンまたはエタンの分解方法。
【０００５】
塩素化エチレン分解細菌を用いて塩素化エチレンまたはエタンで汚染された土壌または地下水などを浄化する方法において処理効果が常に良好でない理由を検討した結果、脱塩素化を行う塩素化エチレン分解細菌が処理現場に生息している場合には処理効果が良好であり、生息していない場合には処理効果が期待できないことが我々の研究で明らかとなった。したがって、対象現場の土壌や地下水を調査し、塩素化エチレン分解細菌が生息しているかどうかを確認すれば、処理が良好に行えるか否かを判断できる。
本発明の核酸を利用することにより塩素化エチレン分解細菌の検出が可能であり、上記のような判定が可能になる。
【０００６】
本発明の核酸は、塩素化エチレン分解細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに優先的にハイブリダイズする１８〜２５ヌクレオチドからなる核酸であって、配列表の配列番号１〜１５のいずれかの塩基配列、これらの塩基配列と９０％以上のホモロジーを有する塩基配列またはこれらの塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸である。
また本発明の核酸は、塩素化エチレン分解細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに優先的にハイブリダイズする１０〜５０、好ましくは１５〜３５ヌクレオチドからなる核酸であって、少なくとも１０個の連続する塩基配列が、配列番号１〜１５のいずれかの塩基配列と同じ塩基配列またはこれらの塩基配列と相補的な塩基配列である核酸である。例えば、配列番号１の塩基配列の任意の位置から始まる連続した１０個以上の塩基配列と同じ塩基配列またはこの塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸であり、この配列番号１の塩基配列と同じ塩基配列またはこの塩基配列と相補的な塩基配列の上流および／または下流には塩基が結合していてもよい。
【０００７】
本発明の核酸、すなわち配列番号１〜１５の塩基配列、これらの塩基配列と９０％以上のホモロジーを有する塩基配列、これらの塩基配列と相補的な塩基配列、および少なくとも１０個の連続する塩基配列が配列番号１〜１５のいずれかの塩基配列と同じである塩基配列またはこれらの塩基配列と相補的な塩基配列は、公知の方法により化学的に容易に合成することができる。
【０００８】
本発明の核酸は塩素化エチレン分解細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を決定後、それらに特異的な部分を利用してデザインしているので、塩素化エチレン分解細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに優先的にハイブリダイズする。
【０００９】
上記塩素化エチレン分解細菌の具体的なものとしては、Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ属の細菌などがあげられる。
塩素化エチレン分解細菌により分解（脱塩素化）される塩素化エチレンの具体的なものとしては、テトラクロロエチレン、トリクロロエチレン（ＴＣＥ）、ｃｉｓ−１，２−ジクロロエチレン、ｔｒａｎｓ−１，２−ジクロロエチレン、１，１−ジクロロエチレン、ビニルクロリドおよびこれらの脱塩素化中間体などがあげられる。また塩素化エチレン分解細菌により分解（脱塩素化）される塩素化エタンの具体的なものとしては、１，２−ジクロロエタン、モノクロロエタンなどがあげられる。
【００１０】
本発明の核酸は、後述するように、プライマーとして用いてＰＣＲを行うか、またはハイブリダイゼーションを行うことにより塩素化エチレン分解細菌を特異的に高精度で、しかも容易に検出することができる。
【００１１】
本発明の塩素化エチレン分解細菌検出用標識プローブは、前記本発明の核酸を放射性元素、蛍光物質、化学物質、抗原、抗体または酵素などの標識物質で標識したプローブである。このような標識物質としては従来から使用されている標識物質が使用でき、具体的なものとしては32Ｐ等の放射性元素；ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ローダミン等の蛍光物質；ジコキシゲニン等のハプテン；アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ等の酵素；ビオチン等の生化学物質などがあげられる。これらの標識物質は、公知の方法で核酸に導入することができる。
【００１２】
本発明の塩素化エチレン分解細菌検出用標識プローブは、塩素化エチレン分解細菌の有無を検出したい試料とハイブリダイゼーションを実施し、その後標識物質を指標にして検出することにより、標識プローブがハイブリダイゼーションした塩素化エチレン分解細菌を特異的に高精度で、しかも容易に検出することができる。
【００１３】
本発明の塩素化エチレン分解細菌の検出方法は、前記本発明の核酸を用いて塩素化エチレン分解細菌を検出する方法である。すなわち、前記本発明の核酸をプライマーとし、塩素化エチレン分解細菌の有無を検出したい試料から調製した核酸を鋳型としてＰＣＲを行い、予想される大きさのＤＮＡが合成されれば試料中に塩素化エチレン分解細菌が存在したと判断できる。
【００１４】
ＰＣＲは公知の方法で行うことができ、また市販されているＰＣＲ用キットを用いて行うこともできる。ＰＣＲは通常Ｕｐｐｅｒ  ＰｒｉｍｅｒおよびＬｏｗｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒの２種類のプライマーを使用するが、いずれか一方または両方のプライマーとして本発明の核酸を用いることができる。プライマーとして種類の異なる複数の核酸を用いて複数回検出を行うことにより、検出精度をより高くすることができる。
【００１５】
また本発明の塩素化エチレン分解細菌の検出方法は、前記本発明の塩素化エチレン分解細菌検出用標識プローブを用いて塩素化エチレン分解細菌を検出する方法である。すなわち、前記本発明の塩素化エチレン分解細菌検出用標識プローブを、塩素化エチレン分解細菌の有無を検出したい試料またはこの試料から調製した核酸に接触させてＲＮＡまたはＤＮＡハイブリダイゼーションを行った後、標識を指標にして塩素化エチレン分解細菌を検出する方法である。ハイブリダイゼーションは従来と同様の方法により行うことができる。
【００１６】
ハイブリダイゼーション後の検出は、標識物質の種類に応じて公知の方法により行うことができる。例えば、放射性元素で標識した場合は公知の方法で放射能を測定することにより検出できる。また螢光物質で標識した場合は公知の方法により光量を測定することにより検出できる。また酵素で標識した場合は公知の方法で酵素活性を測定することにより検出できる。化学物質で標識した場合は、その化学物質を分析することにより検出できる。また抗原または抗体で標識した場合は、標識した抗原または抗体と特異的に反応する抗体または抗原を用いて抗原抗体反応させ、反応生成物を公知の方法により測定することにより検出できる。
【００１７】
上記のような方法で塩素化エチレン分解細菌を検出することにより、塩素化エチレン分解細菌を利用して塩素化エチレンまたはエタンで汚染された土壌または地下水などを浄化する場合に、脱塩素化が良好に行われるかどうかを予め判定することができる。また塩素化エチレン分解細菌が検出できない場合、塩素化エチレン分解細菌を添加するなどの対策を打つことが可能となる。
【００１８】
本発明の塩素化エチレンまたはエタンの分解方法は、地下水または土壌を試料として上記本発明のエチレン分解細菌の検出方法を実施し、塩素化エチレン分解細菌が検出された地下水、土壌またはそれらを接種した培養液（以下、これらをまとめて塩素化エチレン分解細菌検出物等という場合がある）を、塩素化エチレンまたはエタンで汚染された土壌または地下水（以下、これらをまとめて汚染環境という場合がある）に導入して塩素化エチレンまたはエタンを分解する方法である。
【００１９】
汚染環境に導入する塩素化エチレン分解細菌検出物等は、どこの場所で検出（採取）されたものでもよい。例えば、塩素化エチレンまたはエタンで汚染されていない場所において塩素化エチレン分解細菌が検出された地下水、土壌またはそれらを接種した培養液を、塩素化エチレンまたはエタンで汚染された土壌または地下水に導入することもできる。また塩素化エチレンまたはエタンで汚染された場所において塩素化エチレン分解細菌が検出された地下水、土壌またはそれらを接種した培養液を、同一区域内の塩素化エチレンまたはエタンで汚染された場所に導入することもできるし、同一区域でない別の場所に導入することもできる。
【００２０】
塩素化エチレン分解細菌検出物を汚染環境に導入する方法としては、塩素化エチレン分解細菌検出物を汚染された土壌表面に散布する方法、注入管（注入井）から土壌中に注入する方法、地下水源に注入する方法などがあげられる。導入地点は汚染された場所はもちろん、汚染環境の上流などに導入することができる。
【００２１】
塩素化エチレンまたはエタンを分解する際、塩素化エチレン分解細菌が検出された地下水、土壌またはそれらを接種した培養液を汚染環境に導入するだけでもよい場合もあるが、場合によっては水、栄養源等をさらに導入することもできる。また１回の導入により完全に分解できない場合には、導入を繰り返すこともできる。さらに塩素化エチレン分解細菌検出物に凝集剤を添加して凝集させたり、あるいは担体に担持させた後導入することもできる。
このようにして塩素化エチレンまたはエタンを分解することにより、塩素化エチレンまたはエタンで汚染された汚染環境を浄化することができる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の核酸は新規かつ有用である。本発明の核酸は特定の塩基配列を有し、塩素化エチレン分解細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに優先的にハイブリダイズするので、塩素化エチレン分解細菌の検出に利用することができる。
本発明の塩素化エチレン分解細菌検出用核酸は上記核酸からなるので、この核酸を用いることにより、塩素化エチレン分解細菌を特異的に高精度で、しかも容易に検出することができる。
本発明の塩素化エチレン分解細菌検出用標識プローブは上記核酸を標識しているので、この標識を指標にして塩素化エチレン分解細菌を特異的に高精度で、しかも容易に検出することができる。
本発明の塩素化エチレン分解細菌の検出方法は、上記核酸または標識プローブを用いているので、塩素化エチレン分解細菌を特異的に高精度で、しかも容易に検出することができる。
本発明の塩素化エチレンまたはエタンの分解方法は、上記検出方法で塩素化エチレン分解細菌が検出された地下水、土壌またはそれらを接種した培養液を、塩素化エチレンまたはエタンで汚染された土壌または地下水に導入して塩素化エチレンまたはエタンを分解しているので、塩素化エチレンまたはエタンを容易に効率よく分解して環境を浄化することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
次に本発明の実施例について説明する。
【実施例１】
【００２４】
実施例１
エチレン化（脱塩素化）が起きている地点Ａ、ＢおよびＣ、ならびにエチレン化が起きていない地点Ｄ、ＥおよびＦの合計６か所から地下水をサンプリングし、この地下水１００ｍＬ中からＤＮＡを下記の通り抽出した。
【００２５】
（１）ＤＮＡの抽出
地下水１００ｍＬを孔径０．２μｍのフィルターで濾過した後、このフィルターを２ｍＬ容のチューブに入れた。さらにそのチューブにＺｉｒｃｏｎｉａ／Ｓｉｌｉｃａ  Ｂｅａｄｓ（直径０．１ｍｍ）１ｍＬおよびＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］，１００ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ＥＤＴＡ［ｐＨ８．０］，１００ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ［ｐＨ８．０］，１．５Ｍ  ＮａＣｌ）１ｍＬを加え、細胞破砕機Ｂｅａｄ  Ｂｅａｔｅｒで２分間処理した。次に凍結融解を３回繰り返した後、１０μＬのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（１０ｍｇ／ｍｌ）を加え、３７℃にて３０分間保温した。この液に、２５０μＬの１０％ＳＤＳ溶液を加え、６５℃で２時間保温した後、再び上記のＢｅａｄ  Ｂｅａｔｅｒ処理を行った。その後８０００ｘｇにて室温で１０分間遠心分離し、上清を採取した。上清はクロロホルム抽出し、等量のイソプロパノールを添加後、室温で６０分間静置、８０００ｘｇにて室温で２０分間遠心分離し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿は７０％エタノールで洗浄後、乾燥させた後、５０μＬの滅菌蒸留水に溶解した。
この抽出ＤＮＡ溶液を利用して下記の通りＰＣＲ反応を行い塩素化エチレン分解細菌が存在するか否かを調査した。
【００２６】
（２）ＰＣＲによる１６Ｓ ｒＤＮＡの増幅
前記（１）で得た抽出ＤＮＡ溶液１μＬをテンプレートにして、１６Ｓ ｒＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ増幅の反応液の全容量は１００μＬとし、２．５ＵのＥｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造製）、２００μＭのｄＮＴＰを使用した。プライマーペアとしては、表１に示すように、ＫＷＩ−Ｄｅ１ないしＫＷＩ−Ｄｅ６のいずれかをＵｐｐｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒとし、Ｂａｃｔ１４９２（５′−ＡＣＧＧ  Ｃ／Ｔ  ＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＧＧＡＣＴＴ−３′）をＬｏｗｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒとする６組のプライマーペア、およびＢａｃｔ００１１（５′−ＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３′）をＵｐｐｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒとし、ＫＷＩ−Ｄｅ７ないしＫＷＩ−Ｄｅ１５の相補的な塩基配列のいずれかをＬｏｗｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒとする９組のプライマーペアをそれぞれ２０ｐｍｏｌ使用した。その他の反応液組成はＰＣＲキットに添付のマニュアルに従った。ＰＣＲ反応は、Ｐｒｅ−ｈｅａｔｉｎｇ；９４℃、２分に続き、第１段階；９４℃、２０秒、第２段階；５５℃、３０秒、第３段階；７２℃、２分を３０サイクル繰り返し、Ｐｏｓｔ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ；７２℃、７分を行った。
【００２７】
上記ＰＣＲ反応液２μＬをアガロース電気泳動にかけ、予想される大きさのＤＮＡ断片が合成されれば塩素化エチレン分解細菌が存在すると判断した。結果を表１に示す。
【００２８】
【表１】
2007259862.tif 000002
【００２９】
表１のＫＷＩ−Ｄｅ１〜ＫＷＩ−Ｄｅ１５の塩基配列は表２に示す次の通りである。
【００３０】
【表２】
2007259862.tif 000003
＊１  塩基配列中RはAまたはGである。
【００３１】
表１の結果から、エチレン化が観察されているＡ、Ｂ、Ｃ地点では、前記ＰＣＲおよび電気泳動によりＤＮＡ合成が観察されなかった例外は４５回中５回観察されたが、ほとんどＤＮＡ合成が観察された。一方、エチレン化が全く観察されないＤ、Ｅ、Ｆ地点ではＤＮＡ合成は全く観察されなかった。この結果から、エチレン化反応が起きている地点では、必ず塩素化エチレン分解細菌が存在し、これらのモニタリングが可能であることが示された。
【実施例２】
【００３２】
実施例２
（１）Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒによる検出
実施例１の抽出ＤＮＡ溶液について、さらに高精度なＰＣＲ検出をロッシュ・ダイアグノスティック株式会社製のＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒを用いて行った。
その際、Ｕｐｐｅｒ  ＰｒｉｍｅｒとしてはＫＷＩ−Ｄｅ８を、Ｌｏｗｅｒ  ＰｒｉｍｅｒとしてはＫＷＩ−Ｄｅ１５に相補的なオリゴヌクレオチドを利用した。また、ハイブリダイゼーションプローブとして、ＫＷＩ−Ｄｅ１０の３′末端をＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）にて標識したもの、およびＫＷＩ−Ｄｅ１１の３′末端をリン酸化し、５′末端をＦＩＴＣにて標識したものを使用した。ＰＣＲ反応はＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓキット（商標）を使用し、そのマニュアルに従って行った。反応条件は表３〜表６に示す通りである。
【００３３】
【表３】
2007259862.tif 000004
【００３４】
【表４】
2007259862.tif 000005
【００３５】
【表５】
2007259862.tif 000006
【００３６】
【表６】
2007259862.tif 000007
【００３７】
結果は、地点Ａ、Ｂ、Ｃの地下水では目的のＤＮＡがＰＣＲ合成され、塩素化エチレン分解細菌が存在することが分かった。しかしながら、地点Ｄ、Ｅ、Ｆでは目的のＤＮＡは合成されず塩素化エチレン分解細菌は存在しないと判断された。このように、表２に示されたプライマーはハイブリダイゼーションプローブとしても利用できることがわかる。
【実施例３】
【００３８】
実施例３
ｃｉｓ−ジクロロエチレン（ｃｉｓ−ＤＣＥ）で汚染されている土壌１００ｇと地下水５０ｍＬを１５０ｍＬ容積のバイアルビンに入れ、乳酸を１００ｍｇ／Ｌの濃度となるように添加した後ブチルゴム栓をし、アルミキャップでシールした。バイアルビンは同じものを２個用意し、一方のバイアルビンには塩素化エチレン分解細菌遺伝子が検出された菌懸濁液を植菌し、塩素化エチレン分解遺伝子が最終濃度で１０5copies／ｍＬになるようにした。また他方のバイアルビンには何も植菌せず、コントロールとした。これらのバイアルビンを３０℃で静置培養しながら定期的にサンプリングを行い、バイアルビン中のエチレン類の濃度を測定した。結果を図１および図２に示す。
【００３９】
塩素化エチレン分解遺伝子が検出された菌懸濁液を添加した場合（図１）、塩素化エチレン分解は実験開始約２０日で顕著となり、塩化ビニル（ＶＣ）が検出され始めた。その後、ＶＣも分解され、約１３５日で完全にエチレンに転換された。一方コントロールの場合（図２）、試験期間中塩化ビニルおよびエチレンは全く検出されなかった。
上記結果から、塩素化エチレン分解細菌が検出された液を添加することは塩素化エチレン分解反応を促進する効果があることがわかる。
【実施例４】
【００４０】
実施例４
塩素化エチレンで汚染されている現場の１ｍ離れた２点に井戸（ＡおよびＢ）を設置し、Ｂ地点から３Ｌ／ｍｉｎで揚水し、その水をＡ地点に注入した。Ａ地点への注入の際には、乳酸を１００ｍｇ／Ｌの濃度で添加した。汚染帯水層は地面より３ｍ下にあり、帯水層厚は４ｍであった。
Ｂ地点で定期的に地下水をサンプリングし、エチレン類の濃度を測定した。結果を図３に示す。横軸は経過時間で、０点が塩素化エチレン分解細菌が検出された液（遺伝子濃度：１０7copies／ｍＬ）５０ＬをＡ地点から注入した時点である。
【００４１】
図３の結果からわかるように、注入以前にはジクロロエチレンの分解は全く認められないが、注入後２０日で分解が顕著になり、約１７０日後にはエチレン化が１００％となった。
上記結果から、塩素化エチレン汚染現場においても、塩素化エチレン分解細菌が検出された液を添加することは塩素化エチレン分解反応を促進する効果があることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】実施例３の結果を示すグラフである。
【図２】実施例３のコントロールの結果を示すグラフである。
【図３】実施例４の結果を示すグラフである。
【図１】
2007259862.tif 000008
【図２】
2007259862.tif 000009
【図３】
2007259862.tif 000010
【配列表】
2007259862000001.app