(57)【要約】【課題】  被検体に対して軽い負担で且つ特異性及び感度高く膵臓癌を検出する。【解決手段】  被検体から単離された生物学的試料、例えば、血液試料における補体Ｃ３前駆体を検出する。ここで、補体Ｃ３前駆体は、補体Ｃ３前駆体ペプチド又は補体Ｃ３前駆体をコードする核酸配列であってもよく、また補体Ｃ３前駆体ペプチドに対する抗体又は補体Ｃ３前駆体をコードする核酸配列に相補的な核酸プローブを用いて検出してもよい。【選択図】        なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体から単離された生物学的試料における補体Ｃ３前駆体を検出することを特徴とする膵臓癌の検出方法。
【請求項２】
補体Ｃ３前駆体又はそのタンパク質断片を検出することを特徴とする請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
抗補体Ｃ３前駆体抗体を用いることを特徴とする請求項１又は２記載の検出方法。
【請求項４】
補体Ｃ３前駆体をコードする核酸を検出することを特徴とする請求項１記載の検出方法。
【請求項５】
補体Ｃ３前駆体をコードする核酸配列と相補的な検出用核酸プローブを用いることを特徴とする請求項１又は４記載の検出方法。
【請求項６】
前記検出用核酸プローブ又は抗補体Ｃ３前駆体抗体が、検出用支持担体に固定されていることを特徴とする請求項３又は５記載の検出方法。
【請求項７】
前記生物学的試料が、体液試料及び組織試料からなる群より選択されたものであることを特徴とする請求項１記載の検出方法。
【請求項８】
膵臓癌マーカーとして使用する補体Ｃ３前駆体の使用方法。
【請求項９】
検体から単離された生物学的試料について膵臓癌を診断するための診断キットであって、
補体Ｃ３前駆体を検出するための検出試薬
を含むことを特徴とする膵臓癌診断キット。
【請求項１０】
前記検出試薬が固定している検出用支持担体を更に含むことを特徴とする請求項９記載の診断キット。
【請求項１１】
前記検出試薬が、抗補体Ｃ３前駆体抗体であることを特徴とする請求項９又は１０記載の膵臓癌診断キット。
【請求項１２】
前記検出試薬が、補体Ｃ３前駆体をコードする核酸配列と相補的な検出用核酸プローブであることを特徴とする請求項９又は１０記載の膵臓癌診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵臓癌の検出方法及び膵臓癌診断キットに関し、特に、検体から単離された生物学的試料における膵臓癌の検出方法及び膵臓癌診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
膵臓は、胃のちょうど裏側にある長さ１５ｃｍ程度の臓器で、その働きは外分泌と内分泌の二つに分けられる。そのうち外分泌は、消化液である膵液を分泌する働きを有し、分泌された膵液は、十二指腸に流出する。
膵臓の疾患には、大きく分けて膵臓癌と膵炎とがあり、膵炎は急性膵炎と慢性膵炎に分類される。膵臓癌は、近年日本人の死亡率が上昇してきている癌の一つである。膵臓癌の原因は明らかではないが、食生活の欧米化による動物性脂肪やタンパク質、アルコールなどの過剰摂取、或いは喫煙などがリスクファクターと言われている。その他に、慢性膵炎、膵石症、糖尿病、急性膵炎の既往のある人も膵臓癌の高危険群と考えられている。
膵液には、トリプシン（タンパク質を分解）、アミラーゼ（澱粉を分解）、リパーゼ（脂肪を分解）などの消化酵素（膵酵素）が含まれており、膵炎は、この外分泌の働きと関係している。内分泌は、膵臓のランゲルハンス島から、血糖値を調節するインスリンやグルカゴンなどのホルモンを分泌するもので、インスリンは血糖値を下げ、グルカゴンは血糖値を上げる作用を持っている。この内分泌の働きは糖尿病と密接な関係がある。
膵臓癌は、外分泌の働きを持つ細胞、特に膵液が流れる膵管の細胞から発生する癌であり、膵臓にできる癌の９０％以上がこのタイプである。内分泌の働きを持つ細胞にできる腫瘍（膵内分泌腫瘍）とは区別される。
膵臓は、胃や十二指腸、脾臓、小腸、大腸、肝臓、胆嚢など多くの臓器に囲まれているため、癌が発生しても発見することが困難である。また膵臓癌は、小さいうちから他の臓器に拡がったり、転移を起こしたりするという性質があるため、早期発見は非常に困難である。
診断のための血中腫瘍マーカーとしては、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、エラスターゼ１、Ｓｐａｎ−１、ＤＵＰＡＮ−２などがあり、また、腫瘍細胞に特異的に発現している遺伝子に基づいて、膵癌を検出可能な各種膵癌検出用マーカーが開発されている（例えば、特許文献１及び２）。画像診断では、スクリーニング検査として腹部超音波検査（体外式）が挙げられ、精密検査には、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、内視鏡的逆行性胆管膵管造影（ＥＲＣＰ）、超音波内視鏡（ＥＵＳ）、血管造影などがある。
【特許文献１】特開２００４−２４８５８５号公報
【特許文献３】特開２００４−２４８５７５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、既存の血中腫瘍マーカーは、感度、特異性が高くないため、精度高く膵癌を検出するという観点からはあまり期待できない。一方、画像診断や各種精密検査はいずれも直接的であるが、信頼性が高いものほど侵襲性が高く、被検体に対する負担が大きい。
従って、本発明の目的は、被検体に対して軽い負担で且つ特異性及び感度高く膵臓癌を検出する膵臓癌の検出方法、膵臓癌診断キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の膵臓癌の検出方法は、被検体から単離された生物学的試料における補体Ｃ３前駆体を検出することを特徴としている。
上記検出方法では、補体Ｃ３前駆体又はそのタンパク質断片を検出することが好ましい。この場合、抗補体Ｃ３前駆体抗体を用いるものであってもよい。
また上記検出方法では、補体Ｃ３前駆体をコードする核酸を検出することが好ましい。この場合、補体Ｃ３前駆体をコードする核酸配列と相補的な検出用核酸プローブを用いるものであってもよい。
本発明の補体Ｃ３前駆体の使用方法は、膵臓癌マーカーとして補体Ｃ３前駆体を使用することを特徴としている。
【０００５】
本発明の膵臓癌診断キットは、検体から単離された生物学的試料について膵臓癌を診断するための診断キットであって、補体Ｃ３前駆体を検出するための検出試薬を含むことを特徴としている。
上記診断キットでは、前記検出試薬が、抗補体Ｃ３前駆体抗体であってもよく、補体Ｃ３前駆体をコードする核酸配列と相補的な検出用核酸プローブであってもよい。
また、本膵臓癌検出キットは、前記検出試薬が固定している検出用支持担体を更に含むものであってもよい。
【０００６】
本発明は、補体Ｃ３前駆体が、正常被検体の生物学的試料においては検出されないが、膵臓癌被検体の生物学的試料では特異的に検出されるという知見に基づいたものである。この補体Ｃ３前駆体は、膵臓癌の被検体から単離された生物学的試料、例えば血液及び尿などの体液試料や組織試料において特異的且つ良好に検出されるため、非侵襲的な検出に使用することができる。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、被検体に対して軽い負担で且つ特異性及び感度高く膵臓癌を検出する膵臓癌の検出方法、膵臓癌診断キットを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の膵臓の検出方法では、被検体から単離された生物学的試料における補体Ｃ３前駆体を検出することを特徴としている。
ここで用いられる生物学的試料としては、被検体から単離されたものであればよく、体液試料及び組織試料からなる群より選択されたものが挙げられる。体液試料としては、例えば血液、リンパ液、尿、膵液等をあげることができ、組織試料としては、膵臓、膵臓細胞、膵臓切片等を挙げることができる。これらの試料は、検出の目的に応じて適宜選択すればよく、例えば、診断に用いる場合には、侵襲性の低い液体試料であることが好ましい。
【０００９】
補体Ｃ３前駆体は、補体Ｃ３の不活性前駆体（酵素原）であり、血清中に含まれる分子量１１６ｋＤａのポリペプチド鎖からなる糖タンパク質である。そのアミノ酸配列は、配列番号１に示されており、また対応する核酸配列も公知である。本発明において補体Ｃ３前駆体としては、配列番号１と７０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは１００％の相同性を有するペプチドを挙げることができる。
【００１０】
補体Ｃ３前駆体の検出は、その全ペプチドであってもよく、また検出可能なその断片であってもよい。補体Ｃ３前駆体ペプチド断片を検出する場合には、フォールディングの際に外側となる領域のペプチドであることが好ましく、例えば親水性アミノ酸配列の部分であることが好ましい。ペプチド断片を標的とする場合には、少なくとも１０個以上のペプチドであればよいが、精度よく検出するためには、１０〜５０個のアミノ酸で構成されたものであることがより好ましい。
【００１１】
補体Ｃ３前駆体ペプチド（タンパク質）の検出は、質量分析等の既知のタンパク質検出手段を用いて行ってもよいが、利便性等の観点から抗補体Ｃ３前駆体抗体を用いた検出であることが好ましい。使用可能な抗補体Ｃ３前駆体抗体としては、補体Ｃ３前駆体を検出可能な抗体であればよく、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれであってもよい。抗補体Ｃ３前駆体抗体は、精製された補体Ｃ３前駆体又はその断片を免疫源として用いて作製したものであってもよいが、公知のモノクローナル抗体をそのまま用いてもよい。補体Ｃ３前駆体又はその断片を用いて抗補体Ｃ３前駆体抗体を作製する場合には、常法に従って作製・単離すればよく、他のタンパク質と交差しない特異性の高いものを選択することが好ましい。抗体の作製方法及び特異性の高い抗体の選択等の条件は公知であり、当業者であれば、適宜条件設定等を行って、適切な抗体を選択することができる。
また、補体Ｃ３前駆体ペプチドの検出では、抗体以外に、タンパク質結合性の核酸プローブや特異的結合タンパク質を用いてもよい。
【００１２】
また補体Ｃ３前駆体の検出は、補体Ｃ３前駆体をコードする核酸配列を検出することによって行ってもよい。ここで検出対象となる核酸配列は、ＤＮＡであってもよく、ｍＲＮＡであってもよい。このような核酸配列の検出には、補体Ｃ３前駆体をコードする核酸配列と相補的な検出用核酸プローブを用いてハイブリダイゼーション等を行うことによるものであることが効率的であるため好ましい。このとき、補体Ｃ３前駆体をコードする核酸配列をより精度よく検出するためには、検出用核酸プローブは、少なくとも３０以上、好ましくは３０〜１５０の長さを有すること及び／又は特徴的な配列部分に相補的であることが好ましい。
なお、検出用核酸プローブを用いて補体Ｃ３前駆体をコードする核酸配列を検出する場合、要求される検出精度によってハイブリダイゼーションの条件を適宜変更してもよい。
【００１３】
上記検出用核酸プローブ及び抗補体Ｃ３前駆体抗体は、電気的又は光学的に検出可能となるように、標識化されていてもよい。このような標識化試薬としては、既知のものをそのまま適用することができ、例えば蛍光色素、酵素、基質、放射性同位元素等を挙げることができる。
【００１４】
本発明において検出用核酸プローブ又は抗補体Ｃ３前駆体抗体を用いる場合、これらは溶液中で遊離状態であってもよく、検出用支持担体に固定されているものであってもよい。
検出用支持担体としては、このような検出用の用途に通常用いられ、抗体又は核酸プローブが固定可能な無機又は有機材料を挙げることができ、例えば、ガラス、プラスチック、メチルセルロースメンブレン、多孔質ゲル等が該当する。これらの支持担体への抗体又は核酸プローブの結合はこの分野で公知である。
【００１５】
例えば、抗補体Ｃ３前駆体抗体を用いる場合には、抗体をプラスチックプレート上に固定すると共に公知の酵素で標識化して、ＥＬＩＳＡ等の既知の検出方法に適用することができる。
一方、検出用核酸プローブを用いる場合には、中間層を介して又は介さずに、核酸プローブをガラス基板上に点着して固定して、ＤＮＡマイクロアレイ等の既知の検出方法に適用することができる。
【００１６】
本発明における補体Ｃ３前駆体の検出は、生物学的試料における補体Ｃ３前駆体の量を測定すればよく、正常被験者において検出される量（微量又は検出されない）よりも多く検出された場合に、膵臓癌として診断することができる。
より精度よく膵臓癌であるとの診断を行うには、既知の膵臓癌マーカーと併用してもよい。このような膵臓癌マーカーとしては、ＣＡ１９−９、ＣＡ５０、ＤＵＰＡＮ−２、ＳＰａｎ−１、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、エラスターゼ１、ＳＬＸ等を挙げることができる。
【００１７】
このように補体Ｃ３前駆体は、膵臓癌のガンマーカーとして使用することができる。従って、本発明は、補体Ｃ３前駆体の膵臓癌マーカーとしての使用方法も包含する。
【００１８】
本発明の膵臓癌診断キットは、被検体から単離された生物学的試料について膵臓癌を診断するための診断キットであって、補体Ｃ３前駆体を検出するための検出試薬を含むことを特徴としている。
これによれば、補体Ｃ３前駆体を検出するための検出試薬を含む診断キットであるので、膵臓癌であることを簡便に診断することができる。
【００１９】
本診断キットにおける検出試薬は、前述の抗補体Ｃ３前駆体抗体及び、補体Ｃ３前駆体をコードする核酸配列と相補的な検出用核酸プローブのいずれであってもよい。これらの抗体及び検出用核酸プローブについては、前述した記載内容をそのまま適用することができる。
【００２０】
本発明によれば、補体Ｃ３前駆体を指標として、被検体に対して軽い負担で且つ特異性及び感度高く膵臓癌を診断することができる。
また、補体Ｃ３前駆体の存在に基づいて膵臓癌であるか否かを容易に判定することができるので、摘出された組織試料が膵臓癌であるか否かを確認する確認方法としても使用することができる。この場合、膵臓癌と膵炎との区別がつきにくい組織試料であっても簡便に判定することができる。
【００２１】
また本発明では、上記血清中の補体Ｃ３前駆体の代わりに又はこれに加えて、血清中の２００ｋＤａのタンパク質、３０ｋＤａのタンパク質、更には２１ｋＤａのタンパク質をそれぞれ又は組み合わせて、１１６ｋＤａのタンパク質（補体Ｃ３前駆体）と同様に膵臓癌マーカーとして使用してもよい。これにより、診断の感度及び精度を上げることができる。
２００ｋＤａのタンパク質は、α−２−マクログロブリン前駆体であることが配列比較の結果からわかっている（配列番号２、図５参照）。このα−２−マクログロブリン前駆体は、プロテアーゼ阻害剤であり、トリプシン、トロンビン及びコラゲナーゼを含む多くのタンパク質分解酵素を阻害するものである。
４０ｋＤａのタンパク質は、ｃ３ｄ変異体Ｃ１７Ａであることが配列比較の結果からわかっている（配列番号３、図６参照）。これは、１１６ｋＤａのタンパク質と同様にポリペプチド鎖からなる糖タンパク質である。
２１ｋＤａのタンパク質は、ハプトグロビン（Ｈｐ）２−アルファであることが配列比較の結果からわかっている（配列番号４、図７参照）。ハプトグロビン分子は、ヘモブロビンと特異的に結合する糖タンパク質である。
【実施例】
【００２２】
以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。また実施例中の％は、特に断らない限り、重量（質量）基準である。
【００２３】
［実施例１］
ヒト血清中における膵臓癌特異的タンパク質の確認
（１）  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用血清サンプルの調整
膵癌患者及び健常者からの各ヒト血清を、マイクロコンYM-30（Millipore）に供し、１４，０００×ｇ（Microfuge 18 Centrifuge、BECKMAN COULTERTM）で３０分間遠心した。フィルターに溶液を継ぎ足しながら同じ作業を３回繰り返した。これにより脱塩され濃縮されたサンプルを回収した。
（２）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
タンパク定量（ビシンコニン酸法）後、全てのサンプルのタンパク量を合わせてから、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、２％（ｖ／ｖ）ＳＤＳ、１０％グリセリン、５％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール、１０μｇ／ｍｌ ＢＰＢ）に溶解し、５分間煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルとして調製した。得られたサンプルは、分離ゲル濃度１０％で、泳動用緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、１９５ｍＭ  グリシン、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）中で、ゲル一枚あたり２０ｍＡ一定でＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（Atto社）を行った。
（３）ＣＢＢ染色
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動後、速やかにゲルを取り出し、ＣＢＢ染色液中で１０分間揺らし、溶液を捨てた後、グル脱色液（２５％（ｖ／ｖ）エタノール、８％（ｖ／ｖ）酢酸）でゲルが透明になるまで脱色した。
結果を図１に示す。
【００２４】
図１では、第１レーンが分子量マーカー（Ｍｒ）、第２〜４レーンが健常者（コントロール１、２、３）、第５〜１０レーンが膵臓癌患者（４〜９）の血清サンプルである。図１に示されるように、膵癌患者の血清にのみ、健常者とは異なるパターンの１１６ｋＤａ、２００ｋＤａ、７０ｋＤａ、４０ｋＤａ及び２１ｋＤａの各血清タンパク質が確認された（矢印）。
次に、これらの血清タンパク質の同定を試みた。
【００２５】
［実施例２］
ペプチドマスフィンガープリンティング法による膵臓癌特異的血清タンパク質の同定
（１）ゲルの脱色
ＣＢＢ染色したゲルを１〜２ｍｍ角に切断しチューブに入れた。１００μｌのバッファー１（５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、２５ｍＭ  重炭酸アンモニウム）を加えて振とうし、１０分間室温で静置してから液を除去した。ゲルの色が抜けるまでこの作業を繰り返した。次に１００μｌのアセトニトリルを加えて振とうし、５分間室温に静置してから液を除去した。遠心エバポレーターを用いてチューブ内を乾燥させた。
（２）脱水
脱色工程後のチューブに、１００μｌの還元液（１０ｍＭ  ＤＴＴ、２５ｍＭ  重炭酸アンモニウム）を加えて振とうし、６０分間５６℃で静置し、室温に戻してから液を除去した。１００μｌの洗浄バッファー（２５ｍＭ  重炭酸アンモニウム）を加えて振とうし、１０分間室温で静置してから液を除去した。次に１００μｌのアルキル化液（５５ｍＭ  ヨードアセトアミド、２５ｍＭ  重炭酸アンモニウム）を加えて振とうし、遮光して４５分間室温で静置してから液を除去した。続いて１００μｌの洗浄バッファーを加えて振とうし、１０分間室温で静置してから液を除去した。
【００２６】
（３）還元・アルキル化
脱水工程後のチューブに、１００μｌのバッファー１を加えて振とうし、１０分間室温で静置してから液を除去した。この作業を２回繰り返して行った。そして遠心エバポレーターでチューブ内を乾燥させてから２０μｌのトリプシン溶液（２．５％（ｖ／ｖ）トリプシン（promega社）、０．０５Ｍ  重炭酸アンモニウム）を加えて氷上で３０分間静置し、次いで液を完全に除去した。その後３７℃の状態に置き１６時間静置した。５０μｌの抽出液（５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、０．５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（nacalai tesque社））を加えて振とうし、３０分間室温で静置してから液を回収した。同様に２５μｌの抽出液を加えて振とうし、３０分間室温で静置してから液を回収した。遠心エバポレーターでチューブ内を乾燥させた。
【００２７】
（４）ゲル内消化
還元・アルキル化工程後のチューブに、１０μｌの０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を加えて懸濁した。マイクロピペットにZipTip（Millipore社）を取り付けて１００％（ｖ／ｖ）アセトニトリルで数回ピペッティングしてZipTipの樹脂を前処理した後に０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸で数回ピペッティングをして平衡化した。そして試料を数回ピペッティングし、樹脂に添着させてから０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸で数回ピペッティングすることで洗浄した。溶出液（５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸）を吸い上げて溶出させた。
（５）解析
得られた試料を遠心エバポレーターで乾燥させ、１μｌのＤＨＢＡ溶液（２％（ｗ／ｖ）ＤＨＢＡ、０．００６７％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸、３３％（ｖ／ｖ）アセトニトリル）を添加してからターゲットにアプライして、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（BRUKER社）を用いて質量分析を行った。得られた数値を、Ｍａｓｃｏｔを用いてデータベース検索し、サンプルの同定を行った。
結果を図２に示す。
【００２８】
図２は、実施例１で特定されたゲル上のバンドを切り取ってＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる解析を行った結果である。得られた数値をＭａｓｃｏｔによってデータベース検索を行った結果、１１６ｋＤａのタンパク質は、図３に示されるような補体Ｃ３前駆体（配列番号１）との相同性が最も高かった（図３において太字及び下線部が補体Ｃ３前駆体と相同性のある領域を示す。図４参照）。また、２００ｋＤａ、４０ｋＤａ、２１ｋＤａの各タンパク質は、α−２−マクログロブリン前駆体（配列番号２）、ｃ３ｄ変異体Ｃ１７Ａ、Ｈｐ２−アルファ（フラグメント）とそれぞれ相同性が最も高かった（図５〜７参照、各図面において太字及び下線部がそれぞれ相同性のある領域を示す）。
【００２９】
従って、膵臓癌患者では、補体Ｃ３前駆体を始めとする４つの血清タンパク質が血清中で検出されることが明らかとなった。特に、この補体Ｃ３前駆体は健常者の血清中では検出されなかったので、補体Ｃ３前駆体が膵臓癌に対する特異性の高いマーカーとして使用可能であることが明らかとなった。
このことから、本発明によれば、補体Ｃ３前駆体を指標（マーカー）として使用して、精度よく、軽い侵襲性で膵臓癌を検出することができることが明らかである。
さらに、補体Ｃ３前駆体の他に、α−２−マクログロブリン前駆体、ｃ３ｄ変異体Ｃ１７Ａ、Ｈｐ２−アルファを組み合わせることによって膵癌の診断精度が上がるばかりでなく、早期診断が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の実施例にかかる健常者及び膵臓癌患者のヒト血清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢＢ染色したゲル写真である。
【図２】図１において膵臓癌患者に特異的タンパク質をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって解析したチャートである。
【図３】本発明にかかる補体Ｃ３前駆体ペプチドの配列を示す図である。
【図４】ヒト補体Ｃ３前駆体ペプチドとの相同性部分の一覧である。
【図５】本発明にかかるα−２−マクログロブリン前駆体の配列を示す図である。
【図６】本発明にかかるｃ３ｄ変異体Ｃ１７Ａの配列を示す図である。
【図７】本発明にかかるＨｐ２−アルファの配列を示す図である。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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