(57)【要約】  【課題】体細胞分裂のメカニズムを解明すること、そのメカニズムに基づく新規な抗がん剤を提供すること。  【解決手段】本発明者らは、今回、Ｓｇｏ（ｈＳｇｏ１又はｈＳｇｏ２）とＰＰ２Ａが相互作用すること、及び、ｈＳｏｇ１とＰＰ２Ａは、体細胞分裂の前期から中期にかけて、ともに、染色体（の動原体）付近に局在すること、を新規に見出した。これらの発明事項は、体細胞分裂の中期まで姉妹染色分体の動原体部分における接着が保持されるメカニズムを示唆する。そこで、本発明では、これらの知見に基づき、ＳｇｏとＰＰ２Ａの相互作用を阻害又は抑制する抗がん剤を提供する。これらの物質には、細胞分裂を特異的に阻害又は抑制する作用があるため、抗がん剤に適用できる可能性がある。  【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＰ２Ａと相互作用するＳｇｏ。
【請求項２】
ＰＰ２ＡのＢ５６サブユニットと相互作用することを特徴とする請求項１記載のＳｇｏ。
【請求項３】
ＰＰ２Ａとともにを染色分体に局在することを特徴とする請求項１記載のＳｇｏ。
【請求項４】
Ｓｇｏと相互作用するＰＰ２Ａ。
【請求項５】
Ｂ５６サブユニットで相互作用することを特徴とする請求項４記載のＰＰ２Ａ。
【請求項６】
リン酸化コヒーシンを脱リン酸化させ、染色分体の分離を阻害することを特徴とする請求項４記載のＰＰ２Ａ。
【請求項７】
ＳｇｏとＰＰ２Ａの相互作用を阻害又は抑制する物質を少なくとも含有する抗がん剤。
【請求項８】
前記物質は、Ｓｇｏの立体構造中の、ＰＰ２Ａとの結合部位に対して特異的に結合する物質であることを特徴とする請求項７記載の抗がん剤。
【請求項９】
前記物質は、Ｓｇｏの立体構造中の、ＰＰ２Ａとの結合部位の近傍に結合することにより、前記相互作用を阻害又は抑制する物質であることを特徴とする請求項７記載の抗がん剤。
【請求項１０】
前記物質は、Ｓｇｏと結合して、Ｓｇｏの立体構造を変化させる物質であることを特徴とする請求項７記載の抗がん剤。
【請求項１１】
前記物質は、ＰＰ２Ａの立体構造中の、Ｓｇｏとの結合部位に対して特異的に結合する物質であることを特徴とする請求項７記載の抗がん剤。
【請求項１２】
前記物質は、ＰＰ２Ａの立体構造中の、Ｓｇｏとの結合部位の近傍に結合することにより、前記相互作用を阻害又は抑制する物質であることを特徴とする請求項７記載の抗がん剤。
【請求項１３】
前記物質は、ＰＰ２Ａと結合して、前記タンパク質の立体構造を変化させる物質であることを特徴とする請求項７記載の抗がん剤。
【請求項１４】
前記物質は、抗Ｓｇｏ抗体、抗Ｓｇｏアプタマー、抗ＰＰ２Ａ抗体、抗ＰＰ２Ａアプタマーのいずれかであることを特徴とする請求項７記載の抗がん剤。
【請求項１５】
請求項１記載のＳｇｏの発現を抑制する物質を少なくとも含有する抗がん剤。
【請求項１６】
前記物質は、Ｓｇｏをコードする遺伝子の塩基配列の一部と同じ塩基配列を有する二本鎖ＲＮＡであって、ＲＮＡ干渉によって、前記タンパク質の発現を抑制する二本鎖ＲＮＡであることを特徴とする請求項１５記載の抗がん剤。
【請求項１７】
前記物質は、Ｓｇｏのプロモーター領域に作用する物質であることを特徴とする請求項１５記載の抗がん剤。
【請求項１８】
請求項４記載のＰＰ２Ａの発現を抑制する物質を少なくとも含有する抗がん剤。
【請求項１９】
前記物質は、ＰＰ２Ａをコードする遺伝子の塩基配列の一部と同じ塩基配列を有する二本鎖ＲＮＡであって、ＲＮＡ干渉によって、前記タンパク質の発現を抑制する二本鎖ＲＮＡであることを特徴とする請求項１８記載の抗がん剤。
【請求項２０】
前記物質は、ＰＰ２Ａのプロモーター領域に作用する物質であることを特徴とする請求項１８記載の抗がん剤。
【請求項２１】
ＳｇｏとＰＰ２Ａの相互作用を阻害又は抑制する物質を探索する抗がん剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳｇｏとＰＰ２Ａのタンパク質相互作用、前記相互作用を阻害又は抑制する物質を含有する抗がん剤、前記相互作用を用いたスクリーニング方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
体細胞分裂の場合、細胞周期は、ＤＮＡ合成準備期（Ｇ１期）、ＤＮＡ合成期（Ｓ期）、分裂準備期（Ｇ２期）、分裂期（Ｍ期）の４つの時期に分類される。分裂期（Ｍ期）は、さらに、前期（ｐｒｏ期）、中期（ｍｅｔａ期）、後期（ａｎａ期）、終期（ｔｅｌｏ期）に細分類される。
【０００３】
体細胞分裂の際、染色体は娘細胞に正確に分配される。ＤＮＡ合成期（Ｓ期）に染色体は複製されて一対の姉妹染色分体を形成する。細胞分裂の前期（ｐｒｏ期）に染色体（姉妹染色分体）は凝縮し、中期（ｍｅｔａ期）に一対の姉妹染色分体が細胞の赤道面に整列し、後期（ａｎａ期）に姉妹染色分体は分離して紡錐体（ｓｐｉｎｄｌｅ）の両極に向かって移動する。
【０００４】
各姉妹染色分体上には、動原体（セントロメア）が存在する。動原体には、細胞分裂の中期に紡錘糸が結合する。これにより、紡錘体が形成され、各姉妹染色分体には、紡錘体の両極に向かう張力が働くようになる。
【０００５】
一方、一対の姉妹染色分体は、その形成直後から分裂期の中期まで、コヒーシン複合体によって接着されており、分離しない。そのため、細胞分裂の中期では、紡錐体による張力と、コヒーシン複合体による接着力とのバランスにより、一対の姉妹染色分体が細胞の赤道面に整列する。
【０００６】
そして、細胞分裂の後期には、セパレース（エンドペプチダーゼ）によりコヒーシン複合体が分解されるため、姉妹染色分体間の接着力が働かなくなる。そのため、紡錘糸による張力により、姉妹染色分体は分離して紡錐体の両極に向かって移動する。
【０００７】
コヒーシン複合体は、４つのサブユニットで構成される（非特許文献１参照）。体細胞分裂におけるコヒーシン複合体は、２つのＳＭＣファミリータンパク質（Ｓｍｃ１、及び、Ｓｍｃ３）及び２つの非ＳＭＣファミリータンパク質（Ｓｃｃ１、及び、Ｓｃｃ３（動物細胞ではＳＡ））で構成される。一方、減数分裂におけるコヒーシン複合体は、Ｓｃｃ１がＲｅｃ８に置き換わった構造を備える。なお、「ＳＭＣ」は、ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅである。
【０００８】
コヒーシン複合体は、Ｓｍｃ１とＳｍｃ３が２量体を形成して２本の姉妹染色分体をリング状に取り囲み、Ｓｃｃ１が、Ｓｃｃ３の助けでそのリングを閉じることにより、一対の染色分体を接着させると推測されている（非特許文献２参照）。
【０００９】
コヒーシン複合体は、Ｐｌｋ１（ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ）によりリン酸化され、分解されることが知られている（非特許文献３参照）。ＤＮＡ合成期には、一対の姉妹染色分体は、コヒーシン複合体により、多数の点で接着される。それに対し、細胞分裂の前中期には、姉妹染色分体は、動原体付近以外では、ほとんどが分離している。これは、細胞分裂の前期において、コヒーシン複合体の大部分がＰｌｋによりリン酸化され、姉妹染色分体から解離するためであると推測されている。
【００１０】
Ｓｇｏ（ｓｈｕｇｏｓｈｉｎ／Ｍｅｉ−Ｓ３３２）は、減数分裂の際の染色体分配に関わるタンパク質として同定された。減数分裂の際、このタンパク質が、動原体部分のコヒーシン複合体に結合してそれを保護し、減数第一分裂の際における姉妹染色体の分離を防止することが報告されている（非特許文献４参照）。また、近年、ヒトの体細胞分裂においても、このタンパク質（ｈｕｍａｎ  Ｓｇｏ１）が、動原体からのコヒーシン複合体の分離を阻害していることが報告されている（非特許文献５参照）。その他、Ｓｇｏとがんとの関連性については、乳がんの細胞でＳｇｏ１の発現が上昇することが報告されている（例えば、非特許文献６参照）。
【００１１】
ここで、本発明と関連のあるタンパク質、ＰＰ２Ａについて、以下説明する。
【００１２】
ＰＰ２Ａ（ＰＲＯＴＥＩＮ  ＰＨＯＳＰＨＡＴＡＳＥ  ２Ａ）は、真核細胞における代表的なセリン／スレオニンフォスファターゼ（脱リン酸化酵素）の一つで、細胞内の多くの代謝・反応系に関与している。
【００１３】
ＰＰ２Ａは３つのサブユニットからなるヘテロトリマーである。ＰＰ２Ａのコア構造は、Ｃサブユニット（Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ；ＰＰ２Ａ−Ｃ）とＡサブユニット（Ｓｃａｆｆｏｌｄ  Ａ  ｓｕｂｕｎｉｔ；ＰＰ２Ａ−Ａ）のダイマーであり、そのコア構造にＢサブユニット（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｂ  ｓｕｂｕｎｉｔ；ＰＰ２Ａ−Ｂ）がリクルートされる。Ｃサブユニットは酵素活性中心を有し、Ｂサブユニット（ＰＰ２Ａ−Ｂ）は、基質特異性や細胞内局在を調節する。
【００１４】
Ｂサブユニット（ＰＰ２Ａ−Ｂ）は、Ｂファミリー（「Ｂ５５」又は「ＰＲ５５」）、Ｂ’ファミリー（「Ｂ５６」又は「ＰＲ６１」）、Ｂ’’ファミリー（「ＰＲ７２」）、Ｂ’’’ファミリー（「ＰＲ９３／ＰＲ１１０」）に分類される。そのうち、Ｂファミリー（Ｂ５５）には、α、β、γ、δの４種類が、Ｂ’ファミリー（Ｂ５６）には、α、β、γ、δ、εの５種類が、それぞれ知られている。リクルートされるＢサブユニット（ＰＰ２Ａ−Ｂ）の種類によって、酵素反応の種類（基質の種類）が選択されると推測されている（非特許文献７参照）。
【非特許文献１】Nasmyth K. et al “The structure and function of SMC and kleisincomplexes.” Annu Rev Biochem, 2005; 74 :595-648
【非特許文献２】Ivanov D. et al “A topological interaction between cohesin rings anda circular minichromosome.” Cell, 2005 Sep 23; 122(6): 89-60
【非特許文献３】Sumura I. et al “The dissociation ofcohesin from chromosomes in prophase is regulated by Polo-like kinase.” MolCell, 2002 Mar; 9(3): 515-25
【非特許文献４】Kitajima TS. et al “The conserved kinetochore protein shugoshinprotects centromeric cohesion during meiosis.” Nature, 2004 Feb 5; 427(6974):510-7. Epub 2004 Jan 18.
【非特許文献５】Kitajima TS. et al “Human Bub1 defines the persistent cohesion sitealong the mitotic chromosome by affecting Shugoshin localization.” Curr Biol,2005 Feb 22; 15(4): 353-9
【非特許文献６】Scanlan MJ. et al “Humoral immunity to human breast cancer: antigendefinition and quantitative analysis of mRNA expression.” Cancer Immun, 2001Mar 30; 1:4.
【非特許文献７】Janssens V. et al “Protein phosphatase 2A: a highly regulated familyof serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling.”Biochem J. 2001 Feb 1; 353(Pt3): 417-39
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上述の各知見より、体細胞分裂の際、Ｓｇｏが、姉妹染色分体の動原体付近におけるコヒーシン複合体を保護し、動原体からのコヒーシン複合体の分離（細胞分裂中期における姉妹染色分体の分離）を阻害している可能性が示唆される。しかし、その具体的なメカニズムに関してはほとんど解明されていない。
【００１６】
一方、がん細胞は、短い細胞周期で過剰な細胞分裂を繰り返す。従って、体細胞分裂のメカニズムは、抗がん剤のターゲットとなる可能性がある。
【００１７】
そこで、本発明は、体細胞分裂のメカニズムを解明すること、及び、そのメカニズムに基づく新規な抗がん剤を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明では、まず、ＳｇｏとＰＰ２Ａの相互作用（ＰＰ２Ａと相互作用するＳｇｏ、及び、Ｓｇｏと相互作用するＰＰ２Ａ）を提供する。ここで、Ｓｇｏは、ｈｕｍａｎ  Ｓｇｏ１、及び、ｈｕｍａｎ  Ｓｇｏ２の両者（以下、「ｈＳｇｏ１」及び「ｈＳｇｏ２」とする。）を含む。
【００１９】
上述の通り、細胞分裂の前期において、コヒーシン複合体の大部分はＰｌｋによりリン酸化され、姉妹染色分体から解離すると推測されている。一方、姉妹染色分体の動原体付近では、ｈＳｇｏ１と動原体が結合して保護することにより、コヒーシン複合体が姉妹染色分体から解離せず、両染色分体の接着状態が保持されると考えられている。
【００２０】
本発明者らは、今回、ＳｇｏとＰＰ２Ａが相互作用すること、及び、ｈＳｏｇ１とＰＰ２Ａは、体細胞分裂の前期から中期にかけて、ともに、染色体（の動原体）付近に局在すること、を新規に見出した。
【００２１】
ＰＰ２Ａが脱リン酸化酵素であることを勘案すると、これらの発明事項は、以下の体細胞分裂時におけるメカニズムを示唆する。体細胞分裂の前期から中期にかけて、Ｓｇｏが姉妹染色分体の動原体に結合し、ＳｇｏとＰＰ２Ａは、ともに、動原体付近に局在する。これにより、ＰＰ２Ａの脱リン酸化が、Ｐｌｋ１によるコヒーシン複合体のリン酸化に対して相反的に作用するため、動原体付近におけるコヒーシン複合体のリン酸化が抑制され、姉妹染色分体間の接着は保持される。
【００２２】
即ち、本発明は、体細胞分裂の中期まで姉妹染色分体の動原体部分における接着が保持されるメカニズムを解明した点で、重要な意義を有する。
【００２３】
続いて、本発明では、ＳｇｏとＰＰ２Ａの相互作用を阻害又は抑制する抗がん剤を提供する。
【００２４】
上述の通り、がん細胞は、短い細胞周期で過剰な細胞分裂を繰り返す。それに対し、ＳｇｏとＰＰ２Ａの相互作用を阻害又は抑制する物質は、細胞分裂を特異的に阻害又は抑制できるため、抗がん剤に適用できる可能性がある。
【００２５】
なお、Ｓｇｏは細胞分裂において特異的に機能するタンパク質であるため、
本発明に係る抗がん剤は、体細胞分裂を行っている細胞に特異的に作用すると推定できる。従って、本剤は、副作用が少ない可能性が高い。即ち、正常細胞は、がん細胞に比べて、体細胞分裂を行う頻度は低いため、本剤による影響は少ないと考える。また、本剤は、他の代謝系にほとんど影響を与えない可能性が高いため、副作用は少ないと考える。
【００２６】
以下、本発明に係るタンパク質について、説明する。
【００２７】
本発明に係るｈＳｇｏ１のアミノ酸配列を配列番号１に、ｈＳｇｏ２のアミノ酸配列を配列番号２に、それぞれ示す。なお、本発明に係るＳｇｏは、ｈＳｇｏ１、ｈＳｇｏ２、並びに前記いずれかのタンパク質のアミノ酸配列と相同性を有し、ＰＰ２Ａと相互作用するものを全て包含する。即ち、例えば、Ｓｇｏのスプライシング・バリアント（同一の遺伝子に由来するが、スプライシングにより、配列の一部が異なっているタンパク質、以下同じ）や、前記アミノ酸配列中の一部に、置換、欠損、挿入、付加部分が含まれるものも、本発明に係るＳｇｏに包含される。
【００２８】
本発明に係るＰＰ２ＡのＢ５６サブユニットのアミノ酸配列を、配列番号３から配列番号７に示す。それぞれ、配列番号３はＰＰ２Ａ−Ｂ５６α、配列番号４はＰＰ２Ａ−Ｂ５６β、配列番号５はＰＰ２Ａ−Ｂ５６γ、配列番号６はＰＰ２Ａ−Ｂ５６δ、配列番号７はＰＰ２Ａ−Ｂ５６εのアミノ酸配列である。なお、本発明に係るＰＰ２Ａは、ＰＰ２Ａの各サブユニット（Ｃサブユニット、Ａサブユニット、及び、Ｂ５６サブユニット（配列番号３から配列番号７のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するサブユニット））、並びにそれらのアミノ酸配列と相同性を有し、Ｓｇｏと相互作用するものを全て包含する。即ち、例えば、ＰＰ２Ａのいずれかのサブユニットのスプライシング・バリアントや、前記アミノ酸配列中の一部に、置換、欠損、挿入、付加部分が含まれるものも、本発明に係るＰＰ２Ａに包含される。
【発明の効果】
【００２９】
本発明は、体細胞分裂に関わるメカニズムの解明の一助となる。また、新規な作用機序に基づく抗がん剤又はそのスクリーニング方法などに応用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
＜本発明に係る相互作用について＞
はじめに、ＳｇｏとＰＰ２Ａの相互作用について、図１を用いて、以下説明する。
【００３１】
図１は、ＳｇｏとＰＰ２Ａの相互作用、及び、その相互作用に基づく細胞分裂のメカニズムを示す模式図である。図１中、左側の模式図は、ヒトの体細胞分裂（Ｈｕｍａｎ  ｍｉｔｏｓｉｓ）に関わるメカニズムを、右側の模式図は、分裂酵母の減数分裂（Ｆｉｓｓｉｏｎ  ｙｅａｓｔ  ｍｅｉｏｓｉｓ）に関わるメカニズムを、それぞれ表す。
【００３２】
体細胞分裂において、ｈＳｇｏ１は、ＰＰ２ＡのＢ５６サブユニットと相互作用する。ｈＳｇｏ１はＰＰ２Ａとともに、染色体上の動原体付近に局在する。ＰＰ２Ａ（のＣサブユニット）は、コヒーシン複合体のＳｃｃ３（ＳＡ）の脱リン酸化（ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）を行う。これにより、コヒーシン複合体の分解（リン酸化）が相反的に阻害され、姉妹染色分体の分離が阻害される。なお、ｈＳｇｏ１それ自体も、動原体と結合することによって、動原体付近のコヒーシン複合体をＰｌｋ（リン酸化酵素）から保護している。
【００３３】
ｈＳｇｏ２は、ＰＰ２ＡのＡサブユニットと相互作用する。ｈＳｇｏ２は、体細胞分裂において、ｈＳｇｏ１とＰＰ２Ａの複合体を動原体に局在させる働きを担っていると推測する。
【００３４】
一方、減数分裂においても、ｈＳｇｏ１は、ＰＰ２ＡのＢ５６サブユニットと相互作用する。ｈＳｇｏ１は、ＰＰ２Ａを動原体に局在させ、ＰＰ２Ａは、コヒーシン複合体のＲｅｃ８サブユニットを脱リン酸化する。これにより、第一減数分裂時におけるコヒーシン複合体の分解（染色体の分離）を阻害している。
【００３５】
＜ＳｇｏとＰＰ２Ａの相互作用を阻害又は抑制する抗がん剤について＞
上述の通り、ＳｇｏとＰＰ２Ａの相互作用を阻害又は抑制する物質は、抗がん剤として適用できる可能性がある。
【００３６】
ＳｇｏとＰＰ２Ａの相互作用を阻害又は抑制する物質として、例えば、（１）Ｓｇｏの立体構造中の、ＰＰ２Ａとの結合部位に対して特異的に結合する物質、（２）Ｓｇｏの立体構造中の、ＰＰ２Ａとの結合部位の近傍に結合することにより、前記相互作用を阻害又は抑制する物質、（３）Ｓｇｏと結合して、Ｓｇｏの立体構造を変化させる物質、（４）ＰＰ２Ａの立体構造中の、Ｓｇｏとの結合部位に対して特異的に結合する物質、（５）ＰＰ２Ａの立体構造中の、Ｓｇｏとの結合部位の近傍に結合することにより、前記相互作用を阻害又は抑制する物質、（６）ＰＰ２Ａと結合して、ＰＰ２Ａの立体構造を変化させる物質、（７）抗Ｓｇｏ抗体、抗Ｓｇｏアプタマー、抗ＰＰ２Ａ抗体、抗ＰＰ２Ａアプタマー、（８）Ｓｇｏの発現を抑制する物質、（９）ＰＰ２Ａの発現を抑制する物質、などを想定できる。以下、図２を用いて順に説明する。
【００３７】
図２は、本発明に係る抗がん剤の作用メカニズムを模式的に示す図である。符号１はＳｇｏを、符号２はＰＰ２Ａを、符号ＡはＳｇｏとＰＰ２Ａの相互作用を示す。図２に示す通り、Ｓｇｏ（符号１）は、立体構造中に、ＰＰ２Ａとの相互作用部位１１を有し、ＰＰ２Ａ（符号２）は、立体構造中に、Ｓｇｏとの相互作用部位２１を有する。
【００３８】
（１）Ｓｇｏの立体構造中の、ＰＰ２Ａとの結合部位に対して特異的に結合する物質について：例えば、この物質（符号Ｍ１）が、Ｓｇｏの立体構造中の、ＰＰ２Ａとの結合部位１１に対して特異的に結合した場合、ＳｇｏとＰＰ２Ａの相互作用が阻害又は抑制されるため、細胞分裂が抑制される。従って、この物質は、抗がん剤として有効な可能性がある。なお、これらの物質には、該部位（符号１１）に特異的に結合する抗Ｓｇｏ抗体も含まれる。
【００３９】
（２）Ｓｇｏの立体構造中の、ＰＰ２Ａとの結合部位の近傍に結合することにより、ＳｇｏとＰＰ２Ａの相互作用を阻害又は抑制する物質について：例えば、この物質（符号Ｍ２）が、Ｓｇｏの立体構造中の、ＰＰ２Ａとの結合部位１１の近傍に結合した場合、前記と同様、ＳｇｏとＰＰ２Ａの相互作用が阻害又は抑制されるため、細胞分裂が抑制される。従って、この物質は、抗がん剤として有効な可能性がある。なお、これらの物質には、該部位に特異的に結合する抗Ｓｇｏ抗体も含まれる。
【００４０】
（３）Ｓｇｏと結合して、前記タンパク質の立体構造を変化させる物質について：例えば、この物質（符号Ｍ３）がＳｇｏと結合して、Ｓｇｏの立体構造を変化させた場合、前記と同様、ＳｇｏとＰＰ２Ａの相互作用が阻害又は抑制されるため、細胞分裂が抑制される。従って、この物質は、抗がん剤として有効な可能性がある。
【００４１】
（４）ＰＰ２Ａの立体構造中の、Ｓｇｏとの結合部位に対して特異的に結合する物質について：例えば、この物質（符号Ｍ４）がＰＰ２Ａの立体構造中の、Ｓｇｏとの結合部位２１に対して特異的に結合した場合、前記と同様、ＳｇｏとＰＰ２Ａの相互作用が阻害又は抑制されるため、細胞分裂が抑制される。従って、この物質は、抗がん剤として有効な可能性がある。なお、これらの物質には、該部位（符号２１）に特異的に結合する抗ＰＰ２Ａ抗体も含まれる。
【００４２】
（５）ＰＰ２Ａの立体構造中の、Ｓｇｏとの結合部位の近傍に結合することにより、前記相互作用を阻害又は抑制する物質について：例えば、この物質（符号Ｍ５）がＰＰ２Ａの立体構造中の、Ｓｇｏとの結合部位２１の近傍に結合した場合、前記と同様、ＳｇｏとＰＰ２Ａの相互作用が阻害又は抑制されるため、細胞分裂が抑制される。従って、この物質は、抗がん剤として有効な可能性がある。なお、これらの物質には、該部位に特異的に結合する抗ＰＰ２Ａ抗体も含まれる。
【００４３】
（６）ＰＰ２Ａと結合して、ＰＰ２Ａの立体構造を変化させる物質について：例えば、この物質（符号Ｍ６）がＰＰ２Ａと結合して、ＰＰ２Ａの立体構造を変化させた場合、前記と同様、ＳｇｏとＰＰ２Ａの相互作用が阻害又は抑制されるため、細胞分裂が抑制される。従って、この物質は、抗がん剤として有効な可能性がある。
【００４４】
（７）抗Ｓｇｏ抗体、抗Ｓｇｏアプタマー、抗ＰＰ２Ａ抗体、抗ＰＰ２Ａアプタマーについて：抗Ｓｇｏ抗体又は抗Ｓｇｏアプタマー（符号Ｍ７）、及び、抗ＰＰ２Ａ抗体又は抗ＰＰ２Ａアプタマー（符号Ｍ８）は、Ｓｇｏ又はＰＰ２Ａと特異的に結合し、その機能を抑制する。そのため、前記と同様、ＳｇｏとＰＰ２Ａの相互作用が阻害又は抑制されるため、細胞分裂が抑制される。従って、この物質は、抗がん剤として有効な可能性がある。ここで、アプタマーは、抗体代替分子であり、標的分子を特異的に認識するオリゴヌクレオチドである。抗体又はアプタマーは、公知の方法により作製できる。
【００４５】
（８）Ｓｇｏの発現を抑制する物質について：例えば、この物質（図示せず）によりＳｇｏの発現が抑制された場合、ＳｇｏとＰＰ２Ａの相互作用が抑制されるため、細胞分裂が抑制される。従って、この物質は、抗がん剤として有効な可能性がある。なお、Ｓｇｏは細胞分裂に特異的なタンパク質であるため、Ｓｇｏの発現を抑制する物質は、がん細胞以外の正常細胞にあまり影響を与えない可能性が高い。即ち、本物質は、副作用が少ない可能性が高い。
【００４６】
このような物質として、例えば、Ｓｇｏをコードする遺伝子の塩基配列の一部と同じ塩基配列を有する二本鎖ＲＮＡであって、ＲＮＡ干渉によって、そのタンパク質の発現を抑制する二本鎖ＲＮＡ、及び、Ｓｇｏのプロモーター領域に作用する物質、が挙げられる。なお、ＲＮＡ干渉に基づく二本鎖ＲＮＡは、公知方法により設計・作製できる（以下同じ）。
【００４７】
（９）ＰＰ２Ａの発現を抑制する物質について：
例えば、この物質（図示せず）によりＰＰ２Ａの発現が抑制された場合、前記と同様、ＳｇｏとＰＰ２Ａの相互作用が抑制されるため、細胞分裂が抑制される。従って、この物質は、抗がん剤として有効な可能性がある。
【００４８】
このような物質として、例えば、ＰＰ２Ａをコードする遺伝子の塩基配列の一部と同じ塩基配列を有する二本鎖ＲＮＡであって、ＲＮＡ干渉によって、そのタンパク質の発現を抑制する二本鎖ＲＮＡ、及び、ＰＰ２Ａのプロモーター領域に作用する物質、が挙げられる。
【００４９】
＜本発明に係るスクリーニング方法について＞
上述の通り、ＳｇｏとＰＰ２Ａの相互作用を阻害又は抑制する物質は、抗がん剤に適用できる可能性がある。従って、例えば、ＳｇｏとＰＰ２Ａの相互作用を阻害又は抑制する物質を探索することにより、新規薬剤を見つけ出すことができる可能性がある。
【００５０】
相互作用の検出は、例えば、タンパク質間の結合を検出することによって行うことができる。タンパク質間の結合は、既知の方法、例えば、共免疫沈降法、免疫ブロット法、カラムを用いたプルダウン法、質量分析計を用いた方法、蛍光標識を用いたイメージング、又はそれらの組み合わせなどにより行うことができる。
【００５１】
本発明に係るスクリーニング方法は、キット化が可能である。その場合、例えば、Ｓｇｏ、ＰＰ２Ａ、抗Ｓｇｏ抗体、抗ＰＰ２Ａ抗体、相互作用検出（共免疫沈降法、免疫ブロット法、免疫染色法など）に用いる試薬などを、検出方法に応じて適宜組み合わせ、キット化する。
【実施例１】
【００５２】
実施例１では、Ｓｇｏ１とＰＰ２Ａの相互作用を調べた。
【００５３】
まず、培養したＨｅＬａ細胞を、ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを用いて溶解し、細胞抽出液を得た。次に、抗ｈＳｇｏ１抗体を用いて免疫沈降を行い、内因性のｈＳｇｏ１及びその相互作用複合体を回収した。次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミド電気泳動、以下同じ）により、回収した相互作用複合体をゲル内で展開させた後、抗ＰＰ２Ａ−Ａ抗体、抗ＰＰ２Ａ−Ｃ抗体、抗ＰＰ２Ａ−Ｂ５６α抗体、抗ＰＰ２Ａ−Ｂ５５抗体、の各抗体を用いて、免疫ブロットを行った。
【００５４】
結果を図３に示す。図３は、抗ｈＳｇｏ１抗体を用いて免疫沈降を行った場合における免疫ブロット写真である。
【００５５】
図３中、「ＩＰ（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）」は、その抗体を用いて免疫沈降を行ったことを表し、「ｃｏｎｔ．  ＩｇＧ」は、対照としてＩｇＧ抗体を用いて免疫沈降を行ったことを、「αｈＳｇｏ１」は、抗ｈＳｇｏ１抗体を用いて免疫抗体を行ったことを、それぞれ表す。なお、「ＷＣＥ（ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｅｘｔｒａｃｔ）」は、細胞抽出液を免疫ブロットしたことを表す（コントロール）。
【００５６】
図３の免疫ブロット写真の左側に記載された「ｈＳｇｏ１」、「ＰＰ２Ａ−Ａ」、「ＰＰ２Ａ−Ｃ」、「ＰＰ２Ａ−Ｂ５６α」、「ＰＰ２Ａ−Ｂ５５」は、それぞれ、免疫ブロットに用いた抗体を表す。
【００５７】
図３に示す通り、抗ｈＳｇｏ１抗体を用いて免疫沈降を行った場合、抗ＰＰ２Ａ−Ａ抗体、抗ＰＰ２Ａ−Ｃ抗体、抗ＰＰ２Ａ−Ｂ５６α抗体を用いて免疫ブロットを行ったレーンで、バンドを検出した。また、抗ＰＰ２Ａ−Ｂ５６α抗体を用いて免疫ブロットを行ったレーンで、最も濃いバンドを検出した。
【００５８】
一方、抗ＰＰ２Ａ−Ｂ５５を用いて免疫ブロットを行ったレーンでは、バンドが検出されなかった。
【００５９】
これらの結果は、ｈＳｇｏ１とＰＰ２Ａが相互作用することを示し、ｈＳｇｏ１がＰＰ２ＡのＢ５６サブユニットと直接相互作用することを示唆する。
【００６０】
なお、本発明者らが別途行った実験より、ｈＳｇｏ１がＰＰ２ＡのＢ５６サブユニットに直接相互作用すること、及び、その際、ｈＳｇｏ１が、Ｂ５６サブユニットを介して、ＰＰ２Ａ（Ａサブユニット及びＣサブユニット）と相互作用することが確認された。
【実施例２】
【００６１】
実施例２では、免疫染色により、体細胞分裂の各期におけるｈＳｇｏ１及びＰＰ２Ａの細胞内局在を検討した。
【００６２】
まず、ホルムアルデヒドで細胞を固定し、界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で細胞膜の浸透性を高めた。次に、細胞を抗Ｓｇｏ抗体又は抗ＰＰ２Ａ−Ｂ５６α抗体（一次抗体）で処理した後、蛍光物質で標識した抗体（二次抗体）で処理し、「細胞内タンパク質（Ｓｇｏ又はＰＰ２Ａ）−一次抗体−二次抗体（蛍光物質）」の複合体を形成させた。そして、光学顕微鏡を用いて、体細胞分裂の各期における細胞について、Ｓｇｏ又はＰＰ２Ａの細胞内局在を観察した。
【００６３】
結果を図４に示す。
【００６４】
図４は、抗Ｓｇｏ抗体又は抗ＰＰ２Ａ−Ｂ５６α抗体を用いて行った、体細胞分裂の各期における免疫染色の光学顕微鏡写真である。図４中の各光学顕微鏡写真について、一番左側の列の各写真は、抗ＰＰ２Ａ−Ｂ５６α抗体を用いて行った免疫染色の写真、真ん中の列の書く写真は、抗Ｓｇｏ抗体を用いて行った免疫染色の写真、一番右側の列の各写真は、ＤＮＡ染色と抗Ｓｇｏ抗体及び抗ＰＰ２Ａ−Ｂ５６α抗体を用いて行った免疫染色の両方を行った場合の写真である。一方、各段は、細胞周期のステージが、上から、中間期（ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ）、前期（ｐｒｏ）、前中期（ｐｒｏｍｅｔａ）、中期（ｍｅｔａ）、後期の前半（ｅａｒｌｙ  ａｎａ）、後期の後半（ｌａｔｅ  ａｎａ）における写真である。
【００６５】
図４に示す通り、ｈＳｇｏ１とＰＰ２Ａ−Ｂ５６は、ともに、細胞分裂の前期から中期にかけて、核（内の動原体）付近に局在していた。
【実施例３】
【００６６】
実施例３では、ＲＮＡ干渉によりＰＰ２Ａ又はＳｇｏの発現を抑制した場合における染色体の状態を観察した。
【００６７】
まず、ｈＳｇｏ１、ｈＳｇｏ２、及び、ＰＰ２Ａ−Ａサブユニットの各ｓｉＲＮＡを作製した。ｈＳｇｏ１のｓｉＲＮＡの塩基配列を配列番号８に、ｈＳｇｏ２のｓｉＲＮＡの塩基配列を配列番号９に、ＰＰ２Ａ−ＡサブユニットのｓｉＲＮＡの塩基配列を配列番号１０に、それぞれ示す。
【００６８】
次に、培養液中にｓｉＲＮＡを添加し、培養細胞にｓｉＲＮＡを取り込ませ、所定時間培養した。
【００６９】
次に、実施例１などと同様の方法により細胞抽出液を抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより細胞抽出液中のタンパク質を分離し、ゲル内で展開させた後、免疫ブロットを行った。免疫ブロットは、抗ＰＰ２Ａ−Ａ抗体、抗ｈＳｇｏ１抗体、抗ｈＳｇｏ２抗体、抗γ−ｔｕｂｕｌｉｎ抗体の各抗体を用いて行った。
【００７０】
また、ｓｉＲＮＡを取り込ませ、所定時間培養した細胞について、ギムザ染色を行い、光学顕微鏡で、細胞分裂中期の細胞における染色体の状態を観察した。
【００７１】
結果を図５から図７に示す。
【００７２】
図５は、ＲＮＡ干渉によりＰＰ２Ａの発現を抑制したことを示す免疫ブロット写真である。図５中、「ｃｏｎｔｒｏｌ」はＲＮＡ干渉を行っていない細胞について免疫ブロットを行ったレーンであることを（コントロール）、「ＰＰ２Ａ−Ａ  ＲＮＡｉ」はＲＮＡ干渉によりＰＰ２Ａ−Ａの発現を抑制した場合のレーンであることを、それぞれ表す。図中、「ＰＰ２Ａ−Ａ」、「ｈＳｇｏ１」、「ｈＳｇｏ２」、「γ−ｔｕｂｕｌｉｎ」は、それぞれ、免疫ブロットを行った際に用いた抗体の種類を表す。
【００７３】
図５より、ＲＮＡ干渉によりＰＰ２Ａの発現が抑制されたことが確認された。
【００７４】
図６は、ＲＮＡ干渉により各タンパク質の発現を抑制した場合における細胞分裂中期の細胞のギムザ染色写真である。図６中、「ｃｏｎｔｒｏｌ」はＲＮＡ干渉を行っていない細胞の写真、「ＰＰ２Ａ−Ａ  ＲＮＡｉ」はＲＮＡ干渉によりＰＰ２Ａ−Ａの発現を抑制した細胞の写真、「ｈＳｇｏ２  ＲＮＡｉ」は同じくｈＳｇｏ２の発現を抑制した細胞の写真、「ｈＳｇｏ１  ＲＮＡｉ」は同じくｈＳｇｏ１の発現を抑制した細胞の写真である。「ｃｅｎ  ｌｏｓｔ（ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ  ｌｏｓｔ）」は動原体付近の接着が失われている細胞の写真、「ｓｅｐａｒａｔｅｄ」は姉妹染色分体が完全に分離している細胞の写真である。
【００７５】
図７は、ＲＮＡ干渉により各タンパク質の発現を抑制した場合において、動原体の接着が失われている細胞及び姉妹染色分体が完全に分離している細胞の細胞数の割合を示すグラフである。
【００７６】
図６及び図７に示す通り、ＰＰ２Ａ−Ａの発現を抑制した場合、ｈＳｇｏ１の発現を抑制した場合と同様、姉妹染色分体の分離が促進した。この結果は、体細胞分裂の中期において、ＰＰ２Ａが、姉妹染色分体間の接着の保持に関与していることを示唆する。
【００７７】
即ち、実施例１及び実施例２の結果、及び、ＰＰ２Ａが脱リン酸化酵素であることを勘案すると、本実験結果は、体細胞分裂の中期において、ＰＰ２Ａが、ｈＳｇｏ１と相互作用して動原体付近に局在し、コヒーシン複合体のリン酸化を相反的に阻害することにより、姉妹染色分体間の接着を保持している可能性を示唆する。
【００７８】
その他、図６及び図７に示す通り、ｈＳｇｏ２の発現を抑制した場合も、ｈＳｇｏ１の発現を抑制した場合と同様、姉妹染色分体の分離が促進した。この結果は、体細胞分裂の中期において、ｈＳｇｏ２も、姉妹染色分体間の接着の保持に関与していることを示唆する。
【実施例４】
【００７９】
実施例４では、Ｓｇｏ２とＰＰ２Ａの相互作用について、実験を行った。
【００８０】
実験手順は実施例１と同様である。
【００８１】
結果を図８に示す。図８は、抗ｈＳｇｏ２抗体を用いて免疫沈降を行った場合における免疫ブロット写真である。
【００８２】
図８中、「ＩＰ（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）」は、その抗体を用いて免疫沈降を行ったことを表し、「ｃｏｎｔ．  ＩｇＧ」は、対照としてＩｇＧ抗体を用いて免疫沈降を行ったことを、「αｈＳｇｏ２」は、抗ｈＳｇｏ２抗体を用いて免疫抗体を行ったことを、それぞれ表す。なお、「ＷＣＥ（ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｅｘｔｒａｃｔ）」は、細胞抽出液を免疫ブロットしたことを表す（コントロール）。
【００８３】
図８の免疫ブロット写真の左側に記載された「ｈＳｇｏ２」、「ＰＰ２Ａ−Ａ」、「ＰＰ２Ａ−Ｃ」、「ＰＰ２Ａ−Ｂ５６α」、「ＰＰ２Ａ−Ｂ５５」は、それぞれ、免疫ブロットに用いた抗体を表す。
【００８４】
図８に示す通り、抗ｈＳｇｏ２抗体を用いて免疫沈降を行った場合、抗ＰＰ２Ａ−Ａ抗体及び抗ＰＰ２Ａ−Ｃ抗体を用いて免疫ブロットを行ったレーンで、バンドを検出した。また、抗ＰＰ２Ａ−Ａ抗体を用いて免疫ブロットを行ったレーンで、濃いバンドを検出した。
【００８５】
一方、抗ＰＰ２Ａ−Ｂ５５及び抗ＰＰ２Ａ−Ｂ５５抗体を用いて免疫ブロットを行ったレーンでは、バンドが検出されなかった。
【００８６】
これらの結果は、ｈＳｇｏ２とＰＰ２Ａが相互作用することを示し、ｈＳｇｏ２がＰＰ２ＡのＡサブユニットと直接相互作用することを示唆する。
【００８７】
なお、本発明者らが別途行った実験より、ｈＳｇｏ２がＰＰ２ＡのＡサブユニットに特異的に相互作用することが確認された。また、本発明者らが別途行った実験より、ｈＳｇｏ２が、体細胞分裂において、ＰＰ２Ａ（及びｈＳｇｏ１）の動原体への局在に関与することが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】ＳｇｏとＰＰ２Ａの相互作用、及び、その相互作用に基づく細胞分裂のメカニズムを示す模式図。
【図２】本発明に係る抗がん剤の作用メカニズムを模式的に示す図。
【図３】実施例１において、抗ｈＳｇｏ１抗体を用いて免疫沈降を行った場合における免疫ブロット写真。
【図４】実施例２において、抗Ｓｇｏ抗体又は抗ＰＰ２Ａ−Ｂ５６α抗体を用いて行った、体細胞分裂の各期における免疫染色の光学顕微鏡写真。
【図５】実施例３において、ＲＮＡ干渉によりＰＰ２Ａの発現を抑制したことを示す免疫ブロット写真。
【図６】実施例３において、ＲＮＡ干渉により各タンパク質の発現を抑制した場合における細胞分裂中期の細胞ギムザ染色写真。
【図７】実施例３において、ＲＮＡ干渉により各タンパク質の発現を抑制した場合において、動原体の接着が失われている細胞及び姉妹染色分体が完全に分離している細胞の細胞数の割合を示すグラフ。
【図８】実施例４において、抗ｈＳｇｏ２抗体を用いて免疫沈降を行った場合における免疫ブロット写真。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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