(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ゲノムＲＮＡの３’末端配列での新規なＲＮＡ配列の提供。【解決手段】Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ゲノムＲＮＡの特定の塩基配列を有する３’配列、その相補体、及び核酸ベースの診断及び新規なアンチＨＣＶ治療のためのそれらの使用。ＨＣＶゲノタイプ中に保存されたこの配列要素は、ウイルス複製に対して本質的であり、感染性ＲＮＡ、子孫ウイルス又は区制競争ＨＣＶ複製単位の生成の可能な全長ＨＣＶ ｃＤＮＡクローンの構成に必要とされる。かかる機能的クローンは、治療アプローチの評価に対し、そしてＨＣＶに対するワクチン接種のための低毒化又は不活性化されたＨＣＶ誘導体の最適なものを開発する物質として有用なツールである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えＤＮＡ又はＲＮＡからなる単離核酸であって、該組換えＤＮＡ又はＲＮＡはＨＣＶ分離体からの全長ＨＣＶヌクレオチド配列又は該全長ＨＣＶヌクレオチド配列由来のＨＣＶレプリコンヌクレオチド配列及び配列番号１、配列番号２、配列番号３、若しくは配列番号４又はそれらの相補的配列、あるいはそれらの配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するＨＣＶ３’末端配列要素であるヌクレオチド配列を有する、前記単離核酸。
【請求項２】
請求項１に記載されたヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列からなるｃＤＮＡ。
【請求項３】
ＨＣＶ−Ｈの配列と相同性のある配列からなる請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
全長ＨＣＶヌクレオチド配列の５’末端に操作可能に結合した発現制御配列をさらに含む請求項１から３に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
ＲＮＡである請求項１又は請求項３に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
ＤＮＡである請求項１又は請求項４に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項に記載の核酸分子で形質転換又は形質移入された宿主細胞。
【請求項８】
哺乳類の宿主細胞である請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
ヒト細胞である請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
肝細胞である請求項９に記載の宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の支持
この仕事はナショナル  キャンサー  インスティテュート／ナショナル  インスティテュート  オブ  ヘルス  許可番号ＣＡ５７９７３によりサポートされている。政府はこの発明に一定の権利を有する。
【０００２】
本発明の技術分野
本発明は一般に、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ウイルスゲノムＲＮＡの３’末端又はその近傍で同定された新規なヌクレオチド配列要素に関する。この要素はＨＣＶ遺伝子型中で高度に保存され、ＨＣＶ複製にとって本質的なものである。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
Ａ型肝炎ウイルス及びＢ型肝炎ウイルスのための診断試験の開発の後、チンパンジーに対して実験的に移された（Alter他，1978;Hollinger他，1978;Tabor他,1978)付加薬剤が輸血取得された肝炎の主な原因として理解されるようになった。
、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）と称される非Ａ非Ｂ（ＮＡＮＢ）型肝炎原因剤に対応するｃＤＮＡクローンは１９８９年報告された(Choo他,1989)。このブレークスルーは診断における、そしてＨＣＶの疫学、病因及び分子ウイルス学の我々の理解における急速な進歩に導いた。ＨＣＶ感染の証拠は世界中で発見され、抗ＨＣＶ抗体の有病率は多くの先進国での０．４−２％からエジプトでの１４％以上までの範囲にある(Hibbs他,1993)。血液若しくは血液生成物を介した感染、又はより少ない頻度の性的及び先天的経路の他に、知られた危険要因と関連しない散在性の症例が発生し、ＨＣＶ症例の４０％以上の原因である(Alter他,1990;Mast及びAlter,1993)。感染は通常慢性的であり(Alter他,1992)、診療結果は不明確なキャリア状態から急性肝炎、慢性活性肝炎、及び肝細胞癌細胞の進行と強く結び付けられる肝硬変に及ぶ。アルファＩＦＮは慢性ＨＣＶ感染の患者の治療に対して有用であることが示され(Davis他,1989;DiBisceglie他,1989)そしてサブユニットワクチンはチンパンジーモデルにおいて一定の見込みを示しているが(Choo他,1994)、更なる試みがより効果的な治療及びワクチンの開発に必要とされている。異なるＨＣＶ単体の中で観測された大きな多様性（検討のため、Ｂｕｋｈ他，１９９５参照）、慢性的に感染された個体における遺伝的変異の発生(Enomoto他,1993;Hijikata他,1991;Kato他,1992;Kato他,1993;Kurosaki他,1993;Lesniewski他,1993;Ogata他,1991;Weiner他,1991;Weiner他,1992)、及びＨＣＶ感染の後に誘出される保護免疫の不足(Farci他,1992;Prince他,1992)は、これらの目的に向かう主な課題を提供する。
【０００４】
ＨＣＶの分子生物学
分類  そのゲノム構造及びビリオン特性に基づき、ＨＣＶは、フラビウイルス〔黄熱ウイルス（ＹＦ）等〕及び動物ペスチウイルス〔牛ウィルス性下痢ウィルス（ＢＶＤＶ）及び豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）〕(Francki他,1991)という二つの異なる属を含む、フラビウイルスファミリーの独立した属として分類されている。このファミリーの全構成メンバーは、単一の長いオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ、下記参照）の翻訳を介する全ての公知のウイルスたんぱく質をコード化するプラス鎖のＲＮＡゲノムを含む、包まれたビリオンを有する。
【０００５】
ビリオンの構造と物理特性
ＨＣＶの構造と複製に関しては情報はほとんど得られない。研究は効果的なウイルス複製を支持できる細胞培養系の不足と、血清中に存在する感染ウイルスの典型的な低力価により妨げられている。濾過実験に基づく感染ウイルスのサイズは30-80nmの間である(Bradley他,1985;He他,1987;Yuasa他,1991)。プールされたヒト血漿から単離されたＨＣＶ粒子(Takahashi他,1992)、感染したチンパンジーからの肝細胞中に存在するＨＣＶ粒子及び細胞培養中(Shimizu他,1994a)に生成されたＨＣＶ粒子は、電子顕微鏡により（不十分だが）可視化される。ショ糖中の感染物質の浮遊密度の初めの測定は１．１ｇ／ｍｌ以下の低密度プールに大多数が存在する、範囲の値となった。続く研究は、慢性的に感染したヒト又は実験的に感染させたチンパンジーからの血清中に存在する潜在的な感染ウイルスの間接的な測定として、ＨＣＶ特異的なＲＮＡを検出するためにＲＴ／ＰＣＲを用いた。これらの研究から異なる臨床試料の間にかなりの異質性が存在し、多くの要因がＨＣＶ  ＲＮＡを含む粒子の行動に影響しうることがかなり明らかになった(Hijikata他,1993;Thomssen他,1992)。かかる要因はイムノグロブリン(Hijikata他,1993)又は低密度リポタンパク(Thomssen他,1992;Thomssen他,1993)との結合を含む。高度な感染の急性期チンパンジー血清において、ＨＣＶ特異的ＲＮＡは低浮遊密度（１．０３−１．１ｇ／ｍｌ）のフラクション中で通常検出される(Carrick他,1992;Hijikata他,1993)。別の試料において、ＨＣＶ抗体の存在及び免疫複合物の形成は粒子の密度の高さ及び感染性の低さと相関する(Hijikata他,1993)。感染性を不活性化するクロロホルムとの(Bradley他,1983;Feinstone他,1983)，又は非イオン性界面活性剤との粒子の処理は、ＨＣＶヌクレオカプシドを表すと解される、より高い密度（１．１７−１．２５ｇ／ｍｌ）の粒子を含むＲＮＡを生成する(Hijikata他,1993;Kanto他,1994;Miyamoto他,1992)。
【０００６】
血清及び血漿中の多様なレベルのマイナスセンスのＨＣＶ特異的ＲＮＡの報告が多数ある(Fong他,1991参照)。しかし、高い感染性を有するある血清は低い又は検出不能なレベルのマイナス鎖ＲＮＡを有しうるので、かかるＲＮＡは感染性粒子の本質的な構成要素であることはありそうもない（Ｓｈｉｍｉｚｕ他，１９９３）。ビリオンたんぱく質の組成物は厳密に決定されていないが、基本Ｃたんぱく質及び二つの膜糖タンパク質Ｅ１及びＥ２を含むと推定される。
ＨＣＶ複製
ＨＣＶ複製における初期段階は殆ど理解されてない。ＨＣＶ糖たんぱく質の細胞内受容体はまだ同定されていない。ベータ−リポタンパク及びイムノグロブリンとの幾つかのＨＣＶ粒子の結合は、これらのホスト分子がウイルス吸収と組織の向性を制御する可能性を提起する。ＨＣＶ複製を実験する研究は、ヒト検体又は実験的に接種されたチンパンジーに対して大きく制限されている。チンパンジーモデルにおいて、ＨＣＶ  ＲＮＡは接種後３日間程で血清中で検出され、血清アラニン  アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）のレベル（肝臓損傷の指標）のピークを過ぎて残存する(Shimizu他,1990)。ウイルス血症の開始は肝臓のＨＣＶ感染の間接的な印の発現により追随される。これらは細胞質抗体の出現(Shimizu他,1990)及びＨＣＶが前にクロロホルム感受性“管形成剤”又は“ＴＦＡ”と称される理由となった微小管集合体の形成等の肝細胞での超構造変化を含む(Bradley,1990によりレビューされる）。ウイルス抗原の発現(Blight他,1993;Hiramatsu他,1992;Krawczynski他,1992;Yamada他,1993)及びプラスとマイナスのセンスのＲＮＡの検出(Fong他,1991;Gunji他,1994;Haruta他,1993;Lamas他,1992;NouriAria他,1993;Sherkerh他,1993;Takahara他,1992;Tanaka他,1993)により見られるように、特に急性感染の間に肝細胞はＨＣＶ複製の主要部分となるようである(Negro他,1992)。ＨＣＶ感染のより後の段階では、ＨＣＶ特異的抗体の発現、ウイルス血症の持続又は解消、及び肝臓疾病の激しさは、チンパンジーモデル及び人検体の両方で大きく変化する。ある肝臓損傷はＨＣＶ感染及び細胞変性の直接的な結果として生じるが、新たな一致はホスト免疫反応、特にウイルス特異的な細胞毒性Ｔリンパ球が、細胞損傷の調節で、より主要な役割を果たすということである（Ｒｉｃｅ及びＷａｌｋｅｒ，１９９５をレビューとして参照）。
ＨＣＶはまた、特に慢性的な感染個体で、特別な肝貯蔵所において複製すると推定されている。幾つかの場合、ＲＴ／ＰＣＲ又はｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び単細胞を含む末梢血単核細胞とのＨＣＶ  ＲＮＡの結合を示す(Blight他,1992;Bouffard他,1992;Gil他,1993;Gunji他,1994;Moldvay他,1994;Nuovo他,1993;Wang他,1992;Young他,1993;Yun他,1993;Zignego他,1992)。かかる組織向性は慢性的感染の確立に関係しえて、ＨＣＶ感染と、混合型グリオブロブリン血症（Ｆｅｒｒｉ他，１９９３によりレビューされる）、糸球体腎炎、及び稀な非ホジキンＢ−リンパ腫瘍(Ferri他,1993;Kagawa他,1993)等の一定の免疫学的異常との間の結合において役割を果たす。しかし、血清中の循環するマイナス鎖のＲＮＡの検出、真の鎖特異性ＲＴ／ＰＣＲを得ることの困難さ(Gunji他,1994)、及び少ない数の感染された細胞は、in  vitroでのこれらの組織における複製の明確な証拠を得ることを困難にする。
【０００７】
効果的なＨＣＶ複製の可能な細胞培養系は開発されていないが、幾つかの進歩が形成されてきた。上記in  vivoでの観測と一致して、in  vitroでのＨＣＶ感染及び短期間の複製は、チンパンジー及びヒト肝細胞(Carloni他,1993;Lacovacci他,1993;Lanford他,1994)、ヒト肝癌系列（Ｈｕｈ７；Ｙｏｏ他，１９９５，以下を参照）、末梢血白血球(Muller他,1993)、ＥＢＶ抗原を発現するヒトＢ−細胞系列(Bertolini他,1993)、マウス  レトロウイルス感染ヒトＴ−細胞系列(Molt4-Ma; Shimizu他,1992)、ＨＴＬＶ−１形質転換ヒトＴ−細胞系列(MT-2;Kato他,1995)、及びヒト包皮から誘導された繊維芽細胞(Zibert他,1995)に対し報告されている。
【０００８】
今までは、これらの細胞の小さなフラクションのみが感染されて現れた。Ｍｏｌｔ４−Ｍａ  Ｔ細胞系列の許容状態のサブクローンを用いる異なるＨＣＶ接種のin  vitroでの感染力は、チンパンジーモデルのin  vivoでの感染力と良く相関する（Ｓｈｉｍｉｚｕ他，１９９３）。この細胞系列はまた、慢性感染の間のＨＣＶ結合と、中性エスケープ変異体の発現とを調べるのを開始するために用いられた（Ｓｈｉｍｉｚｕ他，１９９４ｂ）。
【０００９】
ゲノム構造
多数のＨＣＶ分離体の全長又は殆ど全長のゲノム配列は報告されている(Lin他,1994;Okamoto他,1994;Sakamoto他,1994及びそこでの記載を参照)。分離体中の多数の遺伝的拡散を考えると、幾つかの主要なＨＣＶ遺伝子型が世界中に広められていることは明確である（以下を参照）。米国で最も重要なものは、遺伝子型１、サブタイプ１ａ及び１ｂである。ＨＣＶゲノムＲＮＡは約９．４キロ塩基の長さである。５’ＮＴＲは３４１−３４４塩基であり、ＨＣＶゲノムの中の最も保存されたＲＮＡ配列要素である。長いＯＲＦの長さは分離体内で少し変化し、３０１０、３０１１又は３０３３アミノ酸のポリたんぱく質をコード化する。報告された３’ＮＴＲ構造は構成と長さ（２８−４２塩基）の両方で多様な変化を示し、３’末端ポリ（Ａ）領域を含むように現れる一の場合（ＨＣＶ−１，タイプ１ａ）(Han他,1991)を除いて、ポリ（Ｕ）で終わるように現れる(例えば、Chen他,1992;Okamoto他,1991;Tokita他,1994を参照)。
【００１０】
翻訳及びたんぱく質分解処理
幾つかの研究が、翻訳開始における５’ＮＴＲの役割を調査するために細胞培養中の細胞フリーの翻訳及び一過性発現を使用している(Fukushi他,1994;Tsukiyama-Kohara他,1992;Wang他,1993;Yoo他,1992)。この高度に保存された配列は多数の短いＡＵＧで開始したＯＲＦを含み、ペスチウイルスの５’ＮＴＲ領域との重要な相同性を示す(Bukh他,1992;Han他,1991)。一連のステム・ループ構造はコンピュータのモデリング及び異なるリボヌクレアーゼによる消化に対する感応性に基づき提案されている(Brown他,1992;Tsukiyama-Kohara他,1992)。まだ議論の余地があるが(Wang他,1993;Yoo他,1992を参照)、幾つかのグループからの結果は、このエレメントが長いＯＲＦの最初のＡＵＧでの有効な翻訳開始をもたらす内部リボソームエントリーサイト（ＩＲＥＳ）として機能することを示す(Fuhushi他,1994;Tsukiyama-Kohara他,1992;Wang他,1993)。ＨＣＶ及びペスチウイルスＩＲＥＳ要素の予測された特徴の幾つかは互いに同じである(Brown他,1992)。５’末端ヘアピン構造及び短いＯＲＦは翻訳を下方制御するために機能することが提案されている（Yoo他,1992）。この要素のＩＲＥＳとして機能する能力は、ＨＣＶゲノムＲＮＡは５’キャップ構造を欠いている可能性を示す。
【００１１】
ＨＣＶポリたんぱく質の組織化及び処理はペスチウイルスのそれと殆ど同様であると思われる。少なくとも１０のポリペプチドが同定されており、ポリたんぱく質中のこれらの解裂生成物の順番は、ＮＨ２−Ｃ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ−ＣＯＯＨである。たんぱく質分解処理はホストシグナルペプチダーゼ及び二つのＨＣＶコード化プロテイナーゼ、ＮＳ２−３自己プロテイナーゼとＮＳ３−４Ａセリン  プロテイナーゼにより調節される。Ｃはウイルスコア又はカプシドたんぱく質であると解される基本たんぱく質であり；Ｅ１とＥ２はビリオン・エンベロープ糖たんぱく質と推定され；ｐ７は、Ｅ２グリコたんばく質から非効率に解裂される未知の機能の疎水性たんぱく質であり(Lin他,1994;Mizushima他,1994;Selby他,1994)、ＮＳ２−ＮＳ５Ｂは、ウイルスＲＮＡ複製複合体中で作用する非構造（ＮＳ）たんぱく質である。特に、そのＮ末端セリン  プロテイナーゼ領域の他に、ＮＳ３はＲＮＡヘリカーゼに特徴的なモチーフを含み、ＲＮＡ刺激性ＮＴＰアーゼ活性を保持することが示されており(Suzich他1993)；ＮＳ５Ｂはプラス鎖のＲＮＡウイルスのＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼに特徴的なＧＤＤモチーフを含む。
【００１２】
ビリオン組み立て及び放出
この工程は直接には調査されていないが、複合体グリカンの欠如、発現されたＨＣＶ糖たんぱく質のＥＲ局在(Dubuisson他,1994;Ralston他,1993)及び細胞表面でのこれらのたんぱく質の欠如(Dubuisson他,1994;Spaete他,1992)は最初のビリオン形態形成が分子間の小胞中に発芽することにより生じることを示す。今まで、効果的な粒子形成及び放出は一過性発現分析においては観測されておらず、これは、必須のウイルス又はホスト因子が失われているか阻害されていることを示唆するＨＣＶビリオン形成及び放出は効率的ではなく、ペスチウイルスに対して発見されたように、ウィルスの大部分の断片を細胞に結合した形で残す。最近の研究は、ヒト血漿から部分的に精製された細胞外ＨＣＶ粒子は複合体Ｎ−結合グリカンを含むことを示すが、これらの糖鎖部分がＥ１又はＥ２と特異的に結合していることは示されていない(Sato他,1993)。放出されたビリオン上で糖たんぱく質と結合した複合体グリカンは、トランス  ゴルジを通る転移とホストの分泌経路を通るビリオンの移動を提案する。この提案が正しければ、ＨＣＶ糖たんぱく質の細胞内への分画とビリオン形成は、免疫学的監視を最小化し、抗体及び相補体によるウイルス感染細胞の細胞溶解を阻害することによって、その後慢性感染の確立において役割を果たすかもしれない。
【００１３】
遺伝的可変性
プラス鎖ＲＮＡウイルスの全てについて、ＨＣＶ（ＮＳ５Ｂ）のＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼはミス結合された塩基の除去に対する３’−５’エキソヌクレアーゼ校正読み取り活性を欠いていると解される。複製はそのため間違いが起こりやすく、多数の変形からなる”疑似種”ウイルス集団となる(Martell他,1992;Martell他,1994)。この可変性は多数のレベルで明白である。第一に、慢性感染個体においてウイルス集団中の変化が長期にわたり生じ(Ogata他,1991;Okamoto他,1992）、これらの変化は疾病に対して重要な影響を有する。
【００１４】
特に興味ある例は、その他のポリたんぱく質より高度の可変性を示すＥ２グリコたんぱく質のＮ末端３０残基である(例えば、Higashi他,1993;Hijikata他,1991;Weiner他,1991を参照)。多分ＨＩＶ−ｌｇｐ１２０のＶ３領域に類似するこの超可変領域は、抗ウイルス抗体の循環による免疫選択の下にあるという証拠が累積している(Kato他,1993;Taniguchi他,1993; Weiner他,1992)。このモデルにおいて、Ｅ２のこの部分に対して向けられた抗体はウイルス中和に寄与し、従って中和を回避する置換基を有する変形の選択を促進する。この柔軟性は、Ｅ２超可変領域中の特異アミノ酸配列は、ビリオンの取付け、貫通、又は組み立て等のたんぱく質の他の機能に対して本質的ではない。遺伝的可変性は、アルファＩＦＮを用いた慢性感染患者の処置のあとに観察される異なる応答の多様性の一因となる。往々にして循環するＨＣＶ  ＲＮＡのレベルにおける減少と相関する、限定した血清ＡＬＴレベル及び改善した肝臓組織は処理された患者のたった〜４０％でしか観察されない(Greiser-Wilke他,1991）。処置の後、およそ７０％の応答者が再発する。幾つかの場合、循環ウイルスＲＮＡの一過性損失の後、新しくなったウイルス血症が処置の過程においてさえ観測される。このことはＩＦＮ抵抗ＨＣＶ遺伝子型又は変形の存在又は発生を示す一方、更なる作業が免疫応答性におけるウイルス遺伝子型及びホスト特異的差異の相対的寄与を決めるために必要とされる。最後に、世界中の異なるＨＣＶ分離体の配列比較はばく大な遺伝的多様性をカバーしていない(引用のBukh他,1995にレヒ゛ューされる)。交差中和試験等の生物学的関連血清学的分析が不足しているので、ＨＣＶタイプ（番号により名づけられる）、サブタイプ（文字により名づけられる）、及び分離体は最近、ヌクレオチド又はアミノ酸配列同一性に基づいてグループ化される。最も相違する遺伝子型の間のアミノ酸配列同一性は、比較されるたんぱく質次第では、〜５０％程度の小ささでありうる。この相違は、特に診断、ワクチン設計、及び治療に対し重要な生物学的示唆を有するようである。既に述べたように、遺伝子型１ａ及び１ｂは米国で最も普通なものである（遺伝子型普及及び分布の検討のためにBukh他,1995を参照)。
【００１５】
最近、Ｙｏｏ他（１９９５）の文献において、ヒトヘパトーマ細胞系列、Ｈｕｈ７への形質移入による複製する能力について、ＨＣＶ−１  ｃＤＮＡクローンの多様な誘導体からのＴ７転写を試験した。起こりうるＨＣＶ複製が、鎖特異的ＲＴ／ＰＣＲ（５’ＮＴＲプライマーを使用する）及び３Ｈ−ウリジンによるＨＣＶ特異的ＲＮＡの代謝性ラベリングによって評価された。ポリ（Ａ）又はポリ（Ｕ）の何れかで末端形成された転写は、これらの分析により陽性であるが、５’末端１４４塩基の遺伝子欠失を伴うものは陽性でない。幾つかの培養中、ＨＣＶ特異的ＲＮＡは培養媒体中で検出されえて、新鮮なＨｕｈ７細胞を再感染するのに使用されうる。これらのクレームは直接に反駁されえないが、著者は確実なＨＣＶ複製を実際に検出していないように解される。例えば、著者のポジティブ・コントロールは１ｍｌの高いＨＣＶ力価のチンパンジー血漿から抽出されたＲＮＡを有するＨｕｈ７細胞の生産的転写である。この抽出された試料は最大限の１０７潜在的伝染性完全長ＨＣＶ  ＲＮＡ分子を含む。最適形質移入条件（マイクロ注入と異なる）の下、ビリオンＲＮＡの１０５以上ＲＮＡ分子が（少なくともポリオウイルス、シンドビスウイルス、又はＹＦに対して）単一感染性イベントを誘導するために通常必要とされる。このことは、ＨＣＶ−１実験において、１００より少ない細胞が生産的に形質移入されることを示す。転写後１６日で、プラス及びマイナスの両方の鎖のＲＮＡは８時間の代謝性ラベリングの後容易に検出された。この方法によるマイナス鎖ＲＮＡの検出（形質移入されたビリオンＲＮＡと転写ＲＮＡの両方に対する）は、ＨＣＶが効果的な複製と伸長の両方が可能であり、ＨＣＶ  ＲＮＡ合成のレベルは（高度の多重感染のピークで）ＹＦ等のより丈夫なフラビウイルスに対して推定されたのと同様であることを示す。しかし、多数の試みに関わらず、著者は多様な抗血清又は全長のプラス若しくはマイナスの鎖を使用して、（３Ｈ−ウリジンを用いた代謝性ラベリングより高い感応性である）ノーザン分析によって、これらの細胞中のＨＣＶ抗原を検出できなかった（Ｊ．Ｈａｎの私信）。控えめに言っても、これらの結果は面倒であり、簡単に真正のＨＣＶ複製と一致しない。最後に、ＨＣＶ−１クローンから誘導されたＲＮＡ又はウイルスがチンパンジーモデル中で感染性であることを示す決定的な実験は報告されていない（２年以上前の会合でのこの仕事の初めのプレゼンテーションがあったにもかかわらず）。他のＲＮＡウイルス系における研究は、特異的な末端配列は機能的な、複製可能ＲＮＡの発生に対し重要であることを示した(Boyer及びHaenni,1994にレヒ゛ューされる)。かかる配列はマイナス及びプラス鎖ＲＮＡ合成において関与すると解される。幾つかの場合、二〜三の付加塩基、又はもっと長い非ウイルス配列が５’及び３’末端で許容され；これらの配列は真正のウイルス複製の間に、典型的には失われるか又は選別される。他のＲＮＡウイルスにとって、特に５’末端で過剰な塩基は有害である(Boyer及びHaenni,1994)。反対に、二〜三の場合を除き、確実な末端配列を欠く転写は非機能的である(Boyer及びHaenni,1994)。例えば、３’末端二次構造又はフラビウイルスゲノムＲＮＡの３’ＮＴＲの保存された配列要素の欠如はＹＦ(P.J.Bredenbeek及びC.M.R.,未発行)又はTBE(C.Mandlの私信）のＲＮＡ複製に対し致命的である。他のウイルスに対するこれらの配列要素の重要性を考えると、ＨＣＶ末端配列のより厳密な決定の形成が必要とされることは明白である。
【００１６】
発明の概要  
従来技術のＨＣＶ  ｃＤＮＡクローン並びにＨＣＶ複製の分析のため及びその治療組成物の開発のための細胞培養系に付随する前記した不十分さの観点から、感染性のＲＮＡ転写を生成することのできる全長ｃＤＮＡクローン中に結合でき、弱毒ＨＣＶワクチンの生産のための目標配列として使用でき、治療組成物の目標として使用できる、ＨＣＶの３’末端配列を特に同定するための技術的要求があることは明らかである。
【００１７】
本発明に従い、ＨＣＶの３’末端ＲＮＡ要素をコード化するクローニングｃＤＮＡから誘導されたヌクレオチド配列が提供される。新たに発見された３’要素は特にＨＣＶ遺伝子型内で高度に保存され、ＨＣＶ  ＲＮＡゲノムの一般的特性を示す。
【００１８】
本発明は、１０１ヌクレオチドの３’末端ＲＮＡ配列要素が後に続くポリ（ＵＣ）領域を含み、全長ＨＣＶウイルスＲＮＡ又は以下の配列を含む、誘導されたＨＣＶ  ＲＮＡ複製に関する。
【００１９】
【化１】
2007125028.tif 000002
【００２０】
本発明はまた、このＲＮＡ配列の相補鎖に関し、以下の配列を含む全長ＨＣＶのマイナスセンスのＲＮＡに関する。
【００２１】
【化２】
2007125028.tif 000003
【００２２】
本発明はまた、プラスセンスのＨＣＶゲノムＲＮＡ中の３’ＮＴＲ要素に対応するＤＮＡ配列に関する。
【００２３】
【化３】
2007125028.tif 000004
本発明はまた、マイナスセンスのＨＣＶ  ＲＮＡ中に存在する３’ＮＴＲ要素の相捕鎖に対応するＤＮＡ配列に関する。
【００２４】
【化４】
2007125028.tif 000005
【００２５】
この配列は“非コード化”のように見えるが、配列がＨＣＶ複製のために重要なポリペプチドをコード化することが可能であることは認識されるべきである。
【００２６】
ポリ（Ａ）が後に続くマイナスセンスのＲＮＡの５’となる３’末端エレメントの相補鎖の中に二つの短いオープンリーディングフレームがある。これらの配列はマイナス鎖ＲＮＡ（全長のマイナス鎖の又はサブゲノムのＲＮＡの何れか）の翻訳により発現されうる。
【００２７】
別の実施例において、以前に認められた、ポリ（Ｕ）又はポリ（Ａ）ホモポリマー鎖を超えて延びるこの要素は、ＨＣＶ−Ｈ及び他のＨＣＶ分離体（遺伝子型、タイプ、サブタイプ）（ＨＣＶ−１  ａｃｃ．＃Ｍ６２３２１；ＨＣ−Ｊ１  ａｃｃ．＃Ｄ１０７４９；ＨＣ−Ｊ  ａｃｃ．＃Ｄ９０２０８；ＨＣＶ−ＢＫ  ａｃｃ．＃Ｍ５８３３５；ＨＣＶ−Ｈ  ａｃｃ．＃Ｍ６７４６３；ＨＣ−Ｊ６  ａｃｃ．＃Ｄ００９４４；ＨＣ−Ｊ８  ａｃｃ．＃Ｄ０１２２１；ＨＣ−Ｊ４８３  ａｃｃ．＃Ｄ１３５５８；ＨＣ−Ｊ４９１  ａｃｃ．＃Ｄ１０７５０；ＨＣ−Ｃ２  ａｃｃ．＃Ｄ１０９３４；ＨＣＶ−ＪＫ  ａｃｃ．＃Ｘ６１５９６；ＨＣＶ−Ｎ  ａｃｃ．＃Ｓ６２２２０；ＨＣＶ−Ｔ  ａｃｃ．＃８４７４５；ＨＣＶ−ＪＴ  ａｃｃ．＃Ｄ０１１７１；ＨＣＶ−ＪＴ  ａｃｃ．＃Ｄ０１１７２；ＨＣ−Ｇ９  ａｃｃ．＃Ｄ１４８５３；ＨＣＶ−Ｋ３ａ  ａｃｃ．＃Ｄ２８９１７；ＮＺＬ１  ａｃｃ．Ｄ１７７６３；ＨＣＶ−Ｔｒ  ａｃｃ．＃Ｄ２６５５６）に対し全長ＨＣＶ  ｃＤＮＡクローンを組み立てるために使用されうる。かかる全長ウイルス又は誘導されたＨＣＶ  ＲＮＡレプリコンは、ＨＣＶ治療のためのスクリーニング分析の開発及び治療合成物の評価に対するのと同じく、ＨＣＶ複製及びウイルス−ホスト相互作用の研究に有用である。
【００２８】
更に別の実施例において、ＨＣＶの弱毒化系列がワクチンとしての使用のために提供される。
本発明は、３’ＨＣＶ末端配列要素をコード化する組換えＤＮＡ又はＲＮＡ分子又はその縮重した変形の組み換えに関し、好ましくは核酸は配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１〜４又は図３（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２０−２４；ポリ（Ｕ）領域の下流のみの配列の部分）、図６（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２８−３１）及び図８（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：３３−３６）に示される配列並びに図４（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２５）のそれと同じ二次構造、また更に、３’末端配列要素（又はその相補鎖）と他のＨＣＶ  ＲＮＡ配列（例えば、５’末端配列又は３’ＮＴＲ又はその近傍の他の配列）との相互作用により形成される構造を形成する配列と実質的に同じヌクレオチド配列を含む。
【００２９】
本発明のＨＣＶ又はその部分の配列は、相補配列及び同じ若しくは異なる種の関連するクローンのスクリーニングのためのプローブ（又はＲＴ／ＰＣＲ用のプライマー）として調製される。本発明はｃＤＮＡライブラリ、血漿又はＨＣＶに感染された細胞のスクリーニングのために提供されるように調製されたプローブ又はプライマーに及ぶ。例えば、プローブは合成的に及びファージ、血清若しくはウイルス性のベクター等の多様な公知のベクターを用いた組換えＤＮＡにより調製される。本発明はまた、かかるベクターを含むプラスミドの調製、並びに図３（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２０−２４）、図６（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２８−３１）及び図８（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：３３−３６）若しくは上記のように配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１−４に前記された何れか又は全ての配列、又はその配列の誘導体、又は他のＨＣＶタイプ／サブタイプからの相同配列を含む、天然又は工業的なＨＣＶ  ＲＮＡを攻撃するアンチセンスＲＮＡ又はリボザイムを発現するベクターを構成するためのＤＮＡ／ＲＮＡ配列の使用を含む。同様に、アンチセンスＲＮＡ及びリボザイムの製造が本発明に含まれる。本発明はまた、ここに記される性質を有し、上記の配列及び配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１−４，２０−２４及び３３−３６から選択された配列を示すＲＮＡ分子を含む。
【００３０】
本発明の別の実施例では、前に決定された配列を含むＨＣＶの完全ヌクレオチド配列が適当なホストに導入される。本発明は従って、クローニングされたＨＣＶ配列及び／又はそれから誘導されたＲＮＡで形質移入又は形質転換されたホスト細胞、並びにより限定すると、複製構成要素及び／又は前記配列、又は上記の相同誘導体を用いて組み立てられた完全なＤＮＡ／ＲＮＡ配列に及ぶ。
本発明のある好ましい実施例の他の好ましい特徴に従い、一時的に形質移入された、又は安定な細胞系列が感染性ＨＣＶ、及びの低毒化種を生成するために提供される。
【００３１】
本発明は、ここで説明されたように公知の組み換え技術を含む、ＨＣＶ配列の調製のための幾つかの手段を通常予期し、本発明は従ってその範囲内のかかる合成的調製をカバーするように意図される。ここで開示された配列の単離は組換え技術等により核酸配列自身のみならず、感染性ＨＣＶ、及び低毒化されたＨＣＶの再生産もまた促進し、従って本発明は、野生型及び開示された配列から調製された低毒化のＨＣＶ、並びにこの配列を発現し、ＨＣＶ  ＲＮＡを複製し、及び／又はウイルスを生成する一時的に形質移入された細胞又は安定な細胞系列に及ぶ。
【００３２】
本発明は、ウイルスの生命サイクルを中断又は強化することにより目標細胞中のＨＣＶ複製を調整することに効果的な潜在的な薬剤のスクリーニングのための分析系を含む。強化は、治療体制（即ちワクチン）と同じく実験的な使用のために、ＨＣＶのストックが生成されるべき場合に望ましい。一例において、試験薬剤は、何れかの化学試料（ＤＮＡ又はＲＮＡを含む）の存在下での、又は試験薬剤に対する対照との比較により、ＨＣＶの複製活性への効果を決めるために感染性ＨＣＶ、ｃＤＮＡクローン又は複製能力のあるＲＮＡにより形質移入された細胞試料に投与する。
【００３３】
分析系はより重要に、複製を禁止若しくは強化するＨＣＶ  ＲＮＡに結合することができるか、これらの配列と相互作用する本質的な要因と結合する、薬剤又は他の存在を同定するために採用されうる。かかる分析は、配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１−４により同定される重要な３’末端配列モチーフの保存によって、広い範囲のＨＣＶ分離体に対し特異的な薬剤の開発において有用である。
【００３４】
また別の実施例において、本発明は、ＨＣＶの活性のアンタゴニスト、特に、ウイルス性複製又は転写活性を通常禁止する薬剤又は分子を意図する。特定の実施例において、アンタゴニストは、ＨＣＶの３’末端領域の部分の配列（又はその相補体）を有するオリゴヌクレオチドである。かかるオリゴヌクレオチドは、ウイルス複製、たんぱく質へのＨＣＶ  ＲＮＡの翻訳、又はウイルス粒子中へのゲノムＲＮＡの充填のために必要な鎖合成を途絶することができる。
【００３５】
本発明の診断用途は、ＨＣＶ感染をスクリーニングする分析における現在の３’末端配列の使用に及ぶ。特に、血液中の、又は感染細胞中のＨＣＶ感染を検出することのできるプローブ又はＰＣＲプライマーが生産される。かかるプローブはある検出可能な標識によりラベルされる。同位体３Ｈ，１４Ｃ，３２Ｐ，３５Ｓ，３６Ｃｌ，５１Ｃｒ，５７Ｃｏ，５８Ｃｏ，６９Ｆｅ，９０Ｙ，１２５Ｉ，１３１Ｉ及び１８６Ｒｅ等の放射線活性標識が使用される例において、公知の最近利用可能な計数方法が利用される。
【００３６】
標識が酵素である例において、検出は、現在利用される技術的に公知の比色分析、分光分析、蛍光分光分析、アンペロメトリー分析又はガス分析の技術の何れかによりなされる。
【００３７】
本発明は、ＨＣＶ配列の存在程度の定量分析用、又は薬剤若しくはかかる配列の活性を模倣若しくは遮断する他の薬剤を同定するための試験キットの形で準備される分析系を含む。その系又は試験キットは、ＨＣＶ核酸用のプローブにラベルを結合する、ここで検討された放射線活性及び／又は酵素技術の一つにより調整されたラベルされた構成要素、若しくはその結合相手、若しくはＨＣＶビリオン自身の結合相手と、少なくとも一つがラベルされた構成要素、その結合相手、決定されるべき構成要素の一つ若しくはそれらの結合相手の何れかと結合することのできる遊離若しくは固定されたリガンドである、一以上の付加免疫化学的試薬とからなる。
【００３８】
別の実施例において、本発明は、ＨＣＶ配列、若しくはその活性フラグメント、又は薬剤若しくは同じ活性を有すると決められた他の薬剤に基づく一定の治療方法に関する。第一の治療方法は、特にここで開示された配列要素を突然変異することにより設計された低毒化ＨＣＶからなるワクチンの提供により、ＨＣＶによる感染の抑制と関連する。
【００３９】
より限定すると、ここで通常言及する治療方法は、ＨＣＶ若しくはそのサブユニットの効果的な抑制剤又は例えば本発明の別の特徴に従い準備及び使用がされる薬剤スクリーニング分析により開発された他の同様に効果的な薬剤の投与による肝炎又はＨＣＶにより引き起こされる他の細胞不全の処置のための方法を含む。例えば、ＨＣＶ核酸又はそのコード化されたたんぱく質への薬剤又は他の結合相手は転写活性を抑制又は増強するために投与される。
【００４０】
特に、ＨＳＶ又はここで同定されたその３’の配列要素又はそのフラグメント、及びそれへの結合相手は、慢性ウイルス性肝炎又は他のＨＣＶに関連した疾病の処置のため等の、インターフェロン治療が適用される例中での投与のために薬剤形で調製されえた。
【００４１】
従って、野生型又はこの付加配列を有する低毒化されたＨＣＶをコード化する全長ＨＣＶゲノムと同じく、ＨＣＶの新規な３’配列要素を提供することが本発明の主な目的である。
【００４２】
本発明の別の目的は、ＨＣＶが存在すると推定される哺乳動物中のＨＣＶの存在を検出する方法を提供することである。
【００４３】
本発明の別の目的は、薬剤、試薬等の哺乳動物のＨＣＶの不利な効果に抵抗するのに潜在的に効果的な物質をスクリーニングする方法及び関連した分析系を提供することである。
【００４４】
本発明の更に別の目的は、その存在又活性の不利な結果を予防するために、ＨＣＶ又はそのフラグメントの量又は活性を制御するための哺乳動物の処置方法を提供することである。
【００４５】
本発明の更に別の目的は、病理状態の不利な結果を処置又は予防するために、ＨＣＶ又はそのサブユニットの量又は活性を制御するための哺乳動物の処置方法を提供することである。
【００４６】
本発明の更に別の目的は、ＨＣＶ、その配列要素、それらの結合相手からなる若しくはそれに基づく、又は生成を制御若しくはＨＣＶの活性を真似る若しくは遮断する試薬若しくは薬剤に基づく、治療方法に使用するための薬学的組成物を提供することである。
【００４７】
他の目的及び効果は、以下の説明図に従い進められる後に続く確実にする記載のレビューから、当業者には明白である。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】ＨＣＶの配列の３’末端を決定する方法を示す。リン酸化合成オリゴヌクレオチド（“オリゴＡ”；５’−ＧＡＣＴＧＴＴＧＴＧＧＣＣＴＧＣＧＡＧＧＣＣＧＡＡＴＴ−３’；配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：５）はｃＤＮＡ合成のための特異的プライマー部位として配されるようにＲＮＡの３’末端にライゲーションされる。ｃＤＮＡ合成のためのプライマー（“オリゴＢ”；(１)５−ＴＴＧＡＡＴＴＣＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＡＣＡＡＣＡ−３’；配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：６又はＢ（２）；５’−ＴＴＧＡＡＴＴＣＧＧＣＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＡＣＡＡＣＡＧＴＣ−３’；配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：７）はＲＮＡへのライゲーションのために使用されるものに対して相補的であり；ＰＣＲのための第二のプラスセンスのプライマーはＨＣＶ  ＯＲＦの３’末端近傍の配列に対応した（“オリゴＣ”；５’−ＣＡＡＧＴＣＧＡＣＧＧＧＧＡＧＡＣＡＴＴＴＡＴＣＡＣＡＧＣ−３’：配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：８）。
【図２】ＯＲＦの終止コドンとポリ（Ｕ）領域との間のＨＣＶ−Ｈ−ＡＡＫ〔配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１１；オリゴ（ｄＡ）プライマー及び“オリゴＣ”を使用するＰＣＲにより合成された非クローンニングＤＮＡフラグメントの配列により決定された〕の３’末端配列の部分（プラスセンスのＨＣＶゲノムＲＮＡに対応するＤＮＡ）を、他のＨＣＶ分離物（遺伝子型）〔ＨＣＶ−Ｈ（１ａ）分離物（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：９；ＨＣＶ−１（１ａ）（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１０；ＨＣＶ−Ｊ１（１ａ）（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１２；ＨＣＶ−ＢＫ（１ｂ）（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１３；ＨＣＶ−ＴＷ（１ｂ）（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１４；ＨＣＶ−Ｎ（１ｂ）（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１５；ＨＣＶ−Ｊ６（２ａ）（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１６；ＨＣＶ−Ｊ８（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１７；ＨＣＶ−ＮＺＬ１（３ａ）（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１８；及びＨＣＶ−Ｔｒ（３ｂ）（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１９］の発行された配列の部分的リストと比較するアライメントを示す。
【図３】Ｈ７７−＃１，２（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）２０、Ｈ７７−＃８（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）２１、Ｈ７７−＃１０（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）２２、Ｈ７７−＃７４（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）２３、Ｈ７７−＃５（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）２４を含むＨＣＶ−Ｈ３’クローンの配列（プラスセンスのＨＣＶゲノムＲＮＡに対応するＤＮＡ）を示す。
【図４】ＨＣＶ−Ｈ（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）２５）の３’末端のコンピュータ予想された（ＦＯＬＤＲＮＡ，ＧＣＧパーケージ）二次構造を示す。最後の４６ヌクレオチドはステム・ループ構造を形成する（推定エネルギー  −２５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）。
【図５】４つの異なるＨＣＶサブタイプ（１ｂ，３，４及び４ａ）（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８−３１）の部分的３’末端のＲＴ／ＰＣＲ増幅及びクローニングに用いられるスキームを示す。即ち、オリゴＤ（５’−ＴＡＡＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＧ−３’）（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２６がゲノミックＲＮＡの３’末端にアニーリングされ、ｃＤＮＡが合成された。次に、ＰＣＲがオリゴＣ（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：８）及びオリゴＥ（５’−ＣＴＣＡＣＧＧＡＣＣＴＴＴＣＡＣＡＧＣ−３’）（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２７）を使用して行なわれた。ＰＣＲ生成物はクローニングされ配列決定された。
【図６】図５に記載されたように増幅されクローニングされたＨＣＶサブタイプ１ｂ，３，４及び４ａからの３つのセグメントに対して決定された配列（５’−３’）（プラスセンスのＨＣＶゲノムＲＮＡに対応するＤＮＡ配列）の列を示す。終止コドン（ＴＧＡ）を太字で示す。
【図７】３’末端オリゴヌクレオチドライゲーション、ＲＴ／ＰＣＲ及び４の異なるＨＣＶ遺伝子型／サブタイプ（１ｂ，３，４及び４ａ）からのＨＣＶ  ＲＮＡのクローニングのためのスキームを示す。方法は、オリゴＦ（５’−ＣＣＡＡＧＡＡＴＴＣＣＣＴＧＡＴＣＡＣＧＧＣＴＡＧＣ−３’）（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：３２がオリゴＣの代わりに使用される以外は、図２のアウトラインに本質的に従う。
【図８】図７に記載された分析から得た配列（プラスセンスのＨＣＶゲノムＲＮＡに対応するＤＮＡ配列）（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：３３−３６）を示す。分離体に特異的である配列の違いは太字で示す。
【図９】別の３’末端プライマーライゲーション及びＨＣＶの遺伝子型４分離体用のＲＴ／ＰＣＲのためのスキームを示す。異なるオリゴヌクレオチド（“オリゴＧ”；５’−ＣＧＣＡＣＣＣＴＧＴＣＣＧＡＣＴＡＣＡＡＣＡＴＣＣ−３’；配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：３７）がＲＮＡライゲーション段階に用いられた。ｃＤＮＡ合成のために（“オリゴＨ”；ＣＡＧＡＡＴＴＣＴＴＧＴＡＧＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＴＧＣＧ−３’；は配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：３８）及びＰＣＲ（“オリゴＦ“及び”オリゴＨ”）のために使用されたプライマーが示された。
【図１０】全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ（正確な符号番号はＨＣＶ−Ｈである）の予想された構造を示す。ゲノムＲＮＡは多分Ｇ残基で開始し、３４１塩基の５’非翻訳領域（ＮＴＲ）を含む。ＯＲＦは３０１１アミノ酸残基のポリたんぱく質をコード化する９０３３塩基からなる。オパル（ＵＧＡ）停止コドンの後は４０塩基、ポリ（Ｕ）領域、ポリピリミジン伸長、及び１０１塩基の新規な保存ＲＮＡ要素の配列である。
【００４９】
詳細な記載
本発明に従い、使用された通常の分子生物学、微生物学及び組み換えＤＮＡ技術は従来技術の範囲内にある。かかる技術は文献の中で完全に説明される。例えば、Maniatis,Fritsch & Sambrookの“分子クローニング：実験室マニュアル”（１９８９）；“分子生物学における最近のプロトコル”Ｉ−ＩＩＩ巻〔Ausubel,R.M.編(1994)］；“細胞生物学：実験室ハンドブック”Ｉ−ＩＩＩ巻〔J.E.Celis,編(1994)〕；“免疫学における最近のプロトコル”Ｉ−ＩＩＩ巻〔Coligan,J.E.編(1994)〕；“オリゴヌクレオチド合成”（M.J.Gait編,1984）；“核酸ハイブリッド形成”〔B.D.Hames  &  S.J.Higgins編(1985)〕；“転写と翻訳”〔B.D.Hames  &  S.J.HiGGins編(1984)〕；“動物細胞培養”〔R.I.Freshney編(1986)〕；“固定された細胞と酵素”〔IRL  Press,(1986)〕;B.Perbarの“分子クローニングへの実施ガイド”（１９８４）を参照のこと。
【００５０】
従って、以下の用語は使用された場合、以下に設定された定義を有する。
【００５１】
用語“３’末端配列要素”、“３’末端”、“３’配列要素”及び特にリストされない変形は、ここに相互変換可能に使用され、本明細書及び請求の範囲を通して、ここに記載された及び配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１−４に示された配列データ又は図３（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２０−２４；ポリ（Ｕ）領域の下流の配列部分のみ）、図６（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２８３１）及び図８（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：３３−３６）に示されたもの並びに本願明細書及び請求の範囲内に説明された特性のプロファイルを有するヌクレオチド配列のことを言う。用語“３’末端配列要素”、“３’末端”、“３’配列要素”は以下の配列：（ｉ）プラスセンスのゲノムＲＮＡの３’末端でのＲＮＡ配列；（ｉｉ）ＨＣＶのマイナスセンスのＲＮＡの５’末端でのこのＲＮＡ配列の相補鎖；（ｉｉｉ）ＲＮＡ要素のプラスセンスの配列に対応するＤＮＡ配列；（ｉｖ）ＲＮＡ要素のマイナスセンスの配列に対応するＤＮＡ配列、の全ての包括した意味であることが認識される必要がある。かかる配列の例は配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１−４にそれぞれ示される。従って、実質的に同一又は変更された性質を示すヌクレオチド配列は同じように意図される。これらの改良は、例えば、部位特異的突然変異を通して得られる修飾等、計画的なものであるか、又は複合体若しくはその所謂サブユニットの生産元であるホスト中での突然変異を通して得られたもの等、偶発的なものである。また、用語“３’末端配列”、“３’末端”、及び“３’配列要素”はそれらの範囲内に、全ての実質的に相同な類似体及び対立遺伝子変形と同じくここで特異的に列挙された核酸分子を含むことが意図される。
【００５２】
ここに記載されたいずれのアミノ酸残基も“Ｌ”異性体形状の中にあることが望ましい。しかし、“Ｄ”異性体形状の中の残基は、免疫グロブリン結合の所望の機能特性がポリペプチドにより保持されるかぎり、いずれかのＬ−アミノ酸残基と置換されうる。ＮＨ２は、ポリペプチドのアミノ末端にある自由アミノ基を意味する。ＣＯＯＨはポリペプチドのカルボキシ末端にある自由カルボキシ基を意味する。J.Biol.CHem.,２４３巻の３５５２−５９ページ（１９６９）の標準ポリペプチド命名を維持し、アミノ酸残基に関する略語は以下の対応表に示される。
【００５３】
【表１】
2007125028.tif 000006
【００５４】
全てのアミノ酸残基配列は、左から右方向がアミノ末端からカルボキシ末端に向かう通常の方向である式によりここで表されることが記載される必要がある。さらに、アミノ酸残基の始まり又は末端にあるダッシュは一以上のアミノ酸残基の別の配列とのペプチド結合を示すことは記載される必要がある。上記表は、ここで択一的に表される３字と１字の記号を対応するために示される。
【００５５】
“レプリコン”は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＤＮＡ又はＲＮＡ複製の自律ユニット；即ちそれ自身の制御の下で複製が可能なものとして機能する、いずれかの遺伝的要素（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。Bradenbeck及びRice(1992)のSemin.Virol.の3巻の297-310ページはＲＮＡレプリコンの記述を含む。
【００５６】
“ベクター”は、結合セグメントの複製が成し遂げられるように別のＤＮＡ（又はＲＮＡ）セグメントが結合される、プラスミド、ファージ若しくはコスミッド等のレプリコンである。
【００５７】
“ＤＮＡ分子”は、一本鎖形態、又は二本鎖ヘリックスのいずれかにあるデオキシボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、又はシトシン）の高分子形態のことを言う。この用語は分子の一次及び二次の構造のことのみを示し、それを何れか特定の三次形状に限定することはない。従って、この用語は、中でも直線状ＤＮＡ分子（例えば、制限フラグメント）、ウイルス、プラスミド、及び染色体中に見いだされた二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造の検討において、配列は、ＤＮＡの非転写の鎖（即ち、ｍＲＮＡと相同の配列を有する鎖）に沿って５’から３’の方向にある配列のみを与える正常な慣例に従いここで記載される。
【００５８】
“ＲＮＡ分子”は、一本鎖形態、又は二本鎖ヘリックスのいずれかにあるリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、ウリジン、又はシトシン）の高分子形態のことを言う。この用語は分子の一次及び二次の構造のことのみを示し、それを何れか特定の三次形状に限定することはない。従って、この用語は、中でも直線状若しくは環状のＲＮＡ分子中に見いだされた一本鎖ＲＮＡ及びに二本鎖ＲＮＡを含む。特定のＲＮＡ分子の構造の検討において、配列は、５’から３’の方向にある配列を与える正常な慣例に従ってここで記載される。
【００５９】
“複製の起点”はＤＮＡ合成に加わるＤＮＡ配列のことを言う。
【００６０】
“コード化配列”又は“オープンリーディングフレーム”は、適当な調節配列の制御の下に置かれた時に、転写されポリペプチドへ生体内で翻訳されるヌクレオチド配列である。コード化配列の境界は５’（アミノ）末端にある開始コドン及び３’（カルボキシ）末端にある翻訳停止コドンにより決定される。コード化配列は限定はされないが、原核性配列、真核性ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核性（例えば、哺乳動物）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列をも含みうる。ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列は通常コード化配列の３’の配置される。
【００６１】
転写及び翻訳制御配列は、ホスト細胞中でのコード化配列の発現のために配されるプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター等のＤＮＡ調整配列である。
【００６２】
“プロモーター配列”は、細胞中のＲＮＡポリメラーゼと結合でき、下流（３’方向）コード化配列の転写を誘導できるＤＮＡ調整領域である。本発明を画成する目的で、プロモーター配列は転写開始部位によりその３’末端で境界付けられ、バックグランド以上の検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小限の数の塩基又は要素を含むように上流（５’方向）にのびる。プロモーター配列内で、ＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するたんぱく質結合領域（コンセンサス配列）と同じく、転写開始部位（ヌクレアーゼＳ１を用いたマッピングにより通常定義される）が見出される。真核性プロモータは往々にして、しかし常にではなく、“ＴＡＴＡ”ボックス及び“ＣＡＴ”ボックスを含む。原核プロモーターは、〜１０及び〜３５コンセンサス配列に加えＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を含む。プロモーター配列はまた、ＲＮＡウィルスの複製及び転写において同様の機能を有する類似のＲＮＡ配列又は構造を示すのにも用いられうる。
【００６３】
“発現制御配列”は別のＤＮＡ配列の転写と翻訳の制御と調整を行なうＤＮＡ配列である。ＲＮＡポリメラーゼがコード化配列によりコード化されたたんぱく質へその後翻訳される、ｍＲＮＡにコード化配列を転写する時に、コード化配列は細胞中で転写及び翻訳制御配列の“制御下”にある。ＲＮＡ配列はまた、翻訳、ＲＮＡの安定性、及び複製（ＲＮＡウイルスに対する）を調整する能力を有するため発現制御配列としても配される。
【００６４】
“シグナル配列”はコード化配列の前に含まれうる。この配列はポリペプチドを細胞表面に向けるか又はポリペプチドを媒体中に分泌するようにホスト細胞に伝達する、シグナルペプチドをポリペプチドへのＮ末端にコード化し、この信号ペプチドはたんぱく質が細胞を離れる前にホスト細胞により切り取られる。シグナル配列は、原核細胞及び真核細胞に生来の多様なたんぱく質と結合されて見出されうる。
【００６５】
本発明のブローブに関してここで使用される用語“オリゴヌクレオチド”は、二以上のリボヌクレオチド、好ましくは三以上のそれからなる分子として定義される。その正確なサイズはオリゴヌクレオチドの根本的機能及び使用に依存する多くの要因に依存する。
【００６６】
ここで使用される用語“プライマー”は、精製された制限消化物中に自然に発生するか又は合成的に生成されたかの何れかであっても、オチゴヌクレオチドを示し、それはプライマー伸長生成物の合成の条件下に置かれた時に合成の開始点として作用することができ、核酸鎖に相補的であって、即ち、ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼ等の導入試薬の存在下で適当な温度とｐＨで導入される。プライマーは一本鎖又は二本鎖のいずれかであり、導入試薬の存在下で所望の伸長生成物の合成を準備するのに十分な長さである必要がある。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーのソース及び方法の使用を含む多くの要因に依存する。例えば、目標配列の複雑さに依存する診断応用のために、オリゴヌクレオチドプライマーは、より少ないヌクレオチドも含みうるが典型的には１５−２５又はそれ以上のヌクレオチドを含む。
【００６７】
プライマーはここで、特定の目標ＤＮＡ配列の異なる鎖に対して“実質的に”相補的であるように選択される。このことは、プライマーがそれらの対応する鎖とハイブリッド形成するのに十分に相補的である必要があることを意味する。従って、プライマー配列はテンプレートの正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的なヌクレオチドフラグメントは、鎖に対して相補的であるプライマー配列の残り部分を用いて、プラマーの５’末端に取り付けられる。更に、プライマー配列が鎖の配列とハイブリッド形成するのにそれと十分な相補性を有し、それにより伸長生成物の合成のためのテンプレートを形成する場合、非相補的塩基又はより長い配列はプライマー中に点々と配置される。
【００６８】
ここで使用されるように、用語“制限エンドヌクレアーゼ”及び“制限酵素”は、特定のヌクレオチド配列及びその近傍で二本鎖ＤＮＡを切断する菌酵素のことを言う。
【００６９】
細胞は、ＤＮＡが細胞内に導入されたときに、外因性又は異種のＤＮＡにより“形質転換”される。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムを作り上げる染色体ＤＮＡ中に組み込まれる（共有結合により結合される）か又は組み込まれない。原核細胞、イースト、及び哺乳動物の細胞において、例えば、形質転換ＤＮＡはプラスミド等のエピソームの要素上に維持される。真核細胞に関しては、安定に形質転換された細胞は、その中で形質転換ＤＮＡが、それが染色体複製を通して娘細胞により遺伝されるように、染色体中に組み込まれるものである。この安定性は、転換ＤＮＡを含む娘細胞の集団からなる細胞系列又はクローンを確立する真核細胞の能力により示される。“クローン”は単一細胞又は有糸核分裂による通常の祖先から誘導された細胞の集団である。“細胞系列”は多数の世代に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏでの安定成長を可能にする初期細胞のクローンである。この定義は、細胞を形質転換又は“形質移入”するのに使用されうるＲＮＡ分子に対しても適用されうる。幾つかのＲＮＡウイルスに対して、かかる方法は、ウイルス複製を一時的に又は連続してサポートし、ある場合、感染性ウイルス粒子を生成する感染細胞系列の生成に使用されうる。
【００７０】
少なくとも７５％（好ましくは少なくとも約８０％、そして最も好ましくは約９０若しくは９５％）のヌクレオチドが限定された長さのＤＮＡ配列と一致する時に、二つのＤＮＡ又はＲＮＡ配列は“実質的に相同”である。実質的に相同な配列は、配列データバンクで利用可能な標準ソフトウェアを用いた配列の比較により、又は例えば、特定の系の為に限定された厳格な条件の下、サザーンハイブリッド形成実験により同定されうる。適当なハイブリダイゼーションの条件を限定することは当業者がなせる範囲内である。例えば、上記のＭａｎｉａｔｉｓ他；上記のＤＮＡクローニング、第Ｉ＆ＩＩ巻；上記の核酸ハイブリッド形成を参照のこと。同じ若しくは同様の機能を有する、より遠い関係にある配列又は構造は、“相同”であると称される。極端な場合、かかる配列は一次の配列同定の見地からは関係しえないが、実質的に同様な二次構造を有する。
【００７１】
ＤＮＡ又はＲＮＡ構成の“異種”領域は、天然には大きな分子と結合して見出されることのない、大きな核酸内のＤＮＡ又はＲＮＡ分子の同定可能なセグメントである。例えば、異種領域が哺乳動物遺伝子をコード化するとき、その遺伝子は、ソース生体のゲノムの中では哺乳動物ゲノミックＤＮＡに隣接しないＤＮＡにより通常は隣接される。異種コード化配列の別の例は、コード化配列自身が天然には見出されない構成である（例えば、ゲノムコード化配列がイントロンを含むｃＤＮＡ、又は天然遺伝子と異なるコドンを有する合成配列）。対立遺伝子変形又は天然発生の突然変異イベントはここで定義されるようなＤＮＡの異種領域を発生させない。
【００７２】
“抗体”は、特定のエピトープに結合する抗体及びそのフラグメントを含む何れかの免疫グロブリンである。その用語はポリクローナル、モノクローナル、及びキメラ抗体を含み、最後に記載されたものは米国特許第４，８１６，３９７号及び第４，８１６，５６７号により詳細に記載される。
“抗体結合部位”は、特異的に抗原が結合する重鎖及び軽鎖の可変及び超可変領域からなる抗体分子の構造部分である。
【００７３】
ここで使用されるその多様な文法形態中の語句“抗体分子”は元のままの免疫グロブリン及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の両方を意図する。
典型的な抗体分子は、ここに記載された治療方法での使用に好ましい部分であるＦａｂ，Ｆａｂ’，Ｆ（ａｂ’）２及びＦ（Ｖ）として技術的に知られた部分を含む、損なわれていない免疫グロブリン分子、実質的に損なわれていない免疫グロブリン分子及びパラトーブを含む免疫グロブリン分子の部分である。
【００７４】
抗体分子のＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２部分は、良く知られた方法により実質的に損なわれていない抗体分子上で、それぞれパパイン及びペプシンのたんぱく質分解反応により調製される。例えば、Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｌｏｓ他への米国特許第４，３４２，５６６号を参照するに、Ｆａｂ’抗体分子部分は良く知られ、メルカプトエタノールを用いる二つの重鎖部分を結合させるジスルフィド結合の還元の後、ヨードアセトアミド等の試薬により得られたたんばく質メルカプタンをアルキル化させることによってＦ（ａｂ’）２部分から生成された。損なわれていない抗体分子を含む抗体がここでは好ましい。
多様な文法形態における語句“モノクローナル抗体”は、特定の抗原との免疫反応が可能なただ一種の抗体結合部位を有する抗体を言う。モノクローナル抗体はそこで、免疫反応する何れかの抗原に対し単一結合親和力を典型的には示す。モノクローナル抗体は従って、異なる抗原に対しそれぞれが免疫特異的である、複数の抗体結合部位を有する抗体分子を含み；例えば、二重特異性（キメラ）モノクローナル抗体である。
【００７５】
語句“医薬的に許容”は、ヒトに投与された時に、生理学的に耐えられて、胃の荒れ、めまい等のアレルギー若しくは同様の不適当な反応を典型的には発生させない分子実在及び合成物を言う。
【００７６】
語句“治療的に有効な量”はここで、目標細胞集団のＳ期の活性での診療的に重要な変化、又は例えば、上昇された血圧、熱又はそれの存在と活性に付随するような白血球数等の病理学の他の特徴を、抑制し、そして好ましく少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも９０％抑制するのに十分な量を意味する。
【００７７】
ＤＮＡ配列は、発現制御配列がそのＤＮＡ配列の転写と翻訳を制御し、調整するときに、発現制御配列に“操作可能なように結合される”。用語“操作可能なように結合される”は、発現されるべきＤＮＡ配列の前に適当な開始信号（例えば、ＡＴＧ又はＡＵＧ）を含むこと並びに発現制御配列の制御の下でのＤＮＡ配列の発現及びＤＮＡ配列によりコード化された所望の生成物の生成を許容するために正しいリーディングフレームを維持することを含む。組み換えＤＮＡ分子に挿入することが望ましい遺伝子が適当な開始信号を含まない場合、かかる開始信号は遺伝子の前に挿入されうる。
【００７８】
用語“標準ハイブリッド形成条件”は通常、ハイブリッド形成及び洗浄の両方に対して５×ＳＳＣ及び６５°Ｃと実質的に等しい塩及び温度条件を言う。しかし、当業者は、かかる“標準ハイブリッド形成条件”が、緩衝液中のナトリウムとマグネシウムの濃度、ヌクレオチド配列の長さと濃度、不整合のパーセント、ホルムアミドのパーセント等を含む特定の条件に依存することを認識する。また“標準ハイブリッド形成条件”の決定において重要なのは、ハイブリダイゼーションする二つの配列がＲＮＡ−ＲＮＡ，ＤＮＡ−ＤＮＡ又はＲＮＡ−ＤＮＡの何れであるかということである。かかる標準ハイブリッド形成条件は、必要ならばより高いストリンジェンシーである、典型的には予測され又は決められたＴｍの１０−２０°Ｃ下で洗浄をともなう公知の方式に従い、当業者により簡単に決定される。
【００７９】
“ＨＣＶ”により、フラビウイルスファミリーの分離属として分類される関連ウイルスの多様なグループが意味される。この属の特徴は上記発明の背景中に記載され、ＨＣＶ−１，ＨＣＶ−Ｊ１，ＨＣＶ−Ｊ，ＨＣＶ−ＢＫ，ＨＣＶ−Ｈ，ＨＣ−Ｊ６，ＨＣ−Ｊ８，ＨＣ−Ｊ４８３，ＨＣ−Ｊ４９１，ＨＣ−Ｃ２，ＨＣＶ−ＪＫ，ＨＣＶ−Ｎ，ＨＣＶ−Ｔ，ＨＣＶ−ＪＴ，ＨＣ−Ｇ９，ＨＣＶ−Ｋ３ａ，ＮＺＬ１，ＨＣＶ−Ｔｒ等の構成員を含む。
【００８０】
その第一の特徴において、本発明はＨＣＶのプラスセンスのゲノムＲＮＡ中にある新規な末端配列の同定に関する。
【００８１】
特定の実施例において、本発明はここに開示されたＨＣＶの全ての構成員により高度に保存される新規な５’及び３’末端配列に関する。
上記のように、本発明はまた、配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１−４又は図３（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：０−２４；ポリ（Ｕ）領域の下流の配列の部分のみ）、図６（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２８−３１）及び図８（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：３３−３６）に示されたヌクレオチド配列又はそれらに示されたヌクレオチド配列と相補的である、ＨＣＶ、又はそのフラグメントをコード化する、組み換えＤＮＡ若しくはＲＮＡの分子又はクローニングされた遺伝子、又はその縮重変形に関する。
【００８２】
本発明はまた、ポリ（Ｕ）又はポリ（Ａ）領域（ＨＣＶ−１  ａｃｃ．＃Ｍ６２３２１；ＨＣ−Ｊ１  ａｃｃ．＃Ｄ１０７４９；ＨＣ−Ｊ  ａｃｃ．＃Ｄ９０２０８；ＨＣＶ−ＢＫ  ａｃｃ．＃Ｍ５８３３５；ＨＣＶ−Ｈ  ａｃｃ．＃Ｍ６７４６３；ＨＣ−Ｊ６  ａｃｃ．＃Ｄ００９４４；ＨＣ−Ｊ８  ａｃｃ．＃Ｄ０１２２１；ＨＣ−Ｊ４８３  ａｃｃ．＃Ｄ１３５５８；ＨＣ−Ｊ４９１  ａｃｃ．＃Ｄ１０７５０；ＨＣ−Ｃ２  ａｃｃ．＃Ｄ１０９３４；ＨＣＶ−ＪＫ  ａｃｃ．＃Ｘ６１５９６；ＨＣＶ−Ｎ  ａｃｃ．＃Ｓ６２２２０；ＨＣＶ−Ｔ  ａｃｃ．＃８４７４５；ＨＣＶ−ＪＴ  ａｃｃ．＃Ｄ０１１７１；ＨＣＶ−ＪＴ  ａｃｃ．＃Ｄ０１１７２；ＨＣ−Ｇ９  ａｃｃ．＃Ｄ１４８５３；ＨＣＶ−Ｋ３ａ  ａｃｃ．＃Ｄ２８９１７；  ＮＺＬ１  ａｃｃ．Ｄ１７７６３；ＨＣＶ−Ｔｒ  ａｃｃ．＃Ｄ２６５５６及びその他）、ポリピリミジン鎖、及び１０１塩基の新規な３’要素（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１ｃ，ｄ又は関連配列）をコード化する配列を含む、既に開示した５’非コード化、コード化及び３’非コード化配列からなる感染性ＨＣＶ  ｃＤＮＡに関する。
【００８３】
全長ＨＣＶクローンの存在によりもたらされる診断及び治療の両方の可能性は、ウイルスゲノムの末端配列が機能的な、複製構成要素ＲＮＡの発生に対し重要でありうるという事実から得られる(Boyer他,J.Gen.Virol,198巻:415-426)。先に提案され、ここで更に詳しく記述されるように、本発明はＨＣＶの感染性生命環における薬学的介在を意図する。
【００８４】
従って、ＨＣＶの感染性を抑制することが望まれる例において、３’配列要素の適当な抑制剤が、ウイルス複製のために要求されるマイナス及びプラスの鎖の合成の開始の相互作用を遮断するために導入されうる。同様に、感染は、３’配列要素又はその化学的若しくは薬学的同族体、類似体及びフラグメント等をコード化する核酸分子の追加量の導入により取り除かれる。
【００８５】
既に検討したように、３’配列要素に対して模倣若しくはアンタゴニスト作用の何れか、又はＨＣＶの複製の制御を示す分子又は薬剤は、適当な担体を用い、その処置のためにＨＣＶと関連する不利な医療条件を経験する患者に対しての多様な手段による投薬に効果的な強度で、医薬的な組成物中に調製される。皮下、静脈内及び腹腔内の注入、カテーテル法等の非経口技術の中で、多様な投薬技術が利用される。分子又はそれらのサブユニットの有益な量は変化し、特に資格のある医師又は獣医の推薦及び処方に基づく必要がある。
【００８６】
既に示されたように、本発明の診断方法は、ＨＣＶ  ＲＮＡへの結合相手の効果的な量を含む分析による細胞試料又は媒体の検査からなる。前に検討されたように、この方法から利益を受けることのできる患者はＨＣＶによる感染に苦しむものである。目標細胞の検査において助けになるためにＨＣＶ配列の結合する分子の分離方法は当業者に良く知られている。
【００８７】
本発明は更にこの発明の治療方法の実施に有用な治療組成物を意図する。目的の治療組成物は、混合物中、医薬的に許容できる賦形剤（担体）と、一以上の末端配列要素若しくはその類似体若しくはそのフラグメント、又は活性構成要素としてここで記載されたその配列要素の性質若しくは活性を抑制する分子を含む。好ましい実施例において、合成物は、ＨＣＶ  ＲＮＡの３’末端の二次構造形成を調整、及び／又はマイナス及びプラス鎖のＲＮＡ合成の開始及び／又はＲＮＡ充填をできる分子からなる。
【００８８】
別の治療組成物は、ＨＣＶ感染に対するワクチンとして使用されうる全長低毒化ＨＣＶを含み、ＨＣＶのゲノム内の配列、特に３’末端配列要素（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１−４）は、天然発生分離物としてか又はin  vitro評価若しくは部位特異的突然変異によるかの何れかにより、改良されている。かかる低毒化ウイルスに適する特定の突然変異は、ＨＣＶゲノムＲＮＡの３’末端（若しくはマイナスセンスのＨＣＶ  ＲＮＡの５’末端）の構造を変え、そしてそうすることによりマイナス及びプラス鎖のＲＮＡ合成及び／又はＲＮＡ充填の開始及び／又は転写を変えるものを含む。かかる改良はコンピュータによるモデル化によって促進され、感染性分析を使用して評価される。
【００８９】
３’末端配列要素若しくはそのアンタゴニスト、又は全長低毒化ＨＣＶ、活性構成要素である類似体若しくは活性フラグメントを含む治療組成物の調製は技術的に良く理解されている。通常、かかる組成物は、液状溶液又は懸濁液の何れかとして注入可能なように調製されるが、注入に先立ち、液中の溶液に若しくは懸濁液に適する固体形状もまた調製されうる。その調製はまた乳化されうる。活性治療構成要素は度々、医薬的に許容できる活性構成要素と互換性を示す賦形剤と共に混合される。適当な賦形剤は、例えば水、サリン、デキストロース、グリセロール又はエタノール等及びその組み合わせである。更に、必要であれば、合成物は、活性構成要素の効果を高める湿潤若しくは乳化試薬、ｐＨ緩衝剤等の少量の補助物質を含みうる。
【００９０】
ポリペプチド、類似体又は活性フラグメントは、中和された医薬的に許容できる塩形態として治療合成物中に調製されうる。薬学的に受容可能な塩は、酸付加塩（ポリペプチド若しくは抗体分子の自由なアミノ基と共に形成される）を含み、それは、例えば塩酸若しくは硫酸等の無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸及びマンデリン酸等の有機酸と共に形成される。自由なカルボキシ基から形成された塩はまた、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、若しくは水酸化第二鉄等の無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン及びプロカイン等の有機塩基から誘導される。
【００９１】
治療組成物は、例えば単位投薬量の注入により静脈内に容易に投与される。本発明の治療組成物に対して使用される場合の用語“単位投薬量”は、ヒトに対する単位投薬に適する物理的に区別された単位のことを指し、各単位は例えば担体若しくはビヒクルといった所要の希釈剤と結合して所望の治療効果を生み出すように計算された所定の量の活性物質を含む。
【００９２】
組成物は投薬製剤と互換性のある方法及び治療的に効果のある量で投与される。投与されるべき量は処置される被検体、その被検体の免疫系の活性構成要素を利用する能力、及び所望のＨＣＶの抑制若しくは中和の程度に依存する。投薬されるのに必要とされる活性構成要素の正確量は医師の判断に依存し、各個体に特有である。しかし、適当な投薬量は、一日毎に個体のキログラム体重当たり約０．１から２０、好ましくは約０．５から約１０、そしてより好ましくは１から数ミリグラムの活性構成要素の範囲にあり、投薬経路に依存する。ワクチンとして使用される低毒化ウイルスの場合、投薬量は１０から１０６の感染量の範囲を有しえた。不活性化されたウイルスワクチンに対し、より高い投薬量のＨＣＶ抗原及び適当なアジュバンドが必要とされえた。初めの投薬とカンフル剤に対する適当な治療法もまた変化するが、初めの投薬の後、引き続きの注入又は他の投薬により一時間以上の間隔で反復投与するのが典型的である。更に、血液中で１０ナノモルから１０マイクロモルの濃度を維持するのに十分な連続の静脈内注入が意図される。
【００９３】
治療組成物は、抗生物質、ステロイド、インターフェロン又は他の抗ＨＣＶ治療物と組み合わされた効果的な量の３’配列要素、そのアンタゴニスト、又はその類似体を更に含む。典型的な製剤は以下に示される。
製剤
静脈内製剤Ｉ
構成要素 ｍｇ／ｍｌ
セフォタキシム（cefotaxime）                            ２５０．０
ＨＣＶ，フラグメント又はアンタゴニスト                    １０．０
デキストロース  ＵＳＰ                                    ４５．０
ナトリウム  ビスルファイト  ＵＳＰ                          ３．２
エデト酸ジナトリウム  ＵＳＰ                                ０．１
注入用水  ｑ．ｓ．ａ．ｄ．                                  １．０ｍｌ
静脈内製剤ＩＩ
構成要素 ｍｇ／ｍｌ
アンピシリン（ampicillin）                                ２５０．０
ＨＣＶ，フラグメント又はアンタゴニスト                      １０．０
ナトリウム  ビスルファイト  ＵＳＰ                            ３．２
エデト酸ジナトリウム  ＵＳＰ                                ０．１
注入用水  ｑ．ｓ．ａ．ｄ．                                  １．０ｍｌ
静脈内製剤ＩＩＩ
構成要素 ｍｇ／ｍｌ
ゲンタミシン（gentamicin）（硫酸塩として電荷付与される）  ４０．０
ＨＣＶ，フラグメント又はアンタゴニスト                    １０．０
ナトリウム  ビスルファイト  ＵＳＰ                          ３．２
エデト酸ジナトリウム  ＵＳＰ                                ０．１
注入用水  ｑ．ｓ．ａ．ｄ．                                  １．０ｍｌ
静脈内製剤ＩＶ
構成要素 ｍｇ／ｍｌ
ＨＣＶ，フラグメント又はアンタゴニスト                      １０．０
デキストロース  ＵＳＰ                                      ４５．０
ナトリウム  ビスルファイト  ＵＳＰ                            ３．２
エデト酸ジナトリウム  ＵＳＰ                                  ０．１
注入用水  ｑ．ｓ．ａ．ｄ．                                    １．０ｍｌ
静脈内製剤Ｖ
構成要素 ｍｇ／ｍｌ
ＨＣＶ，フラグメント又はアンタゴニスト                        ５．０
ナトリウム  ビスルファイト  ＵＳＰ                            ３．２
エデト酸ジナトリウム  ＵＳＰ                                  ０．１
注入用水  ｑ．ｓ．ａ．ｄ．                                    １．０ｍｌ
【００９４】
ここに記載されるように、“ｐｇ”はピコグラムを意味し、“ｎｇ”はナノグラムを意味し、“ｕｇ”又は“μｇ”はマイクログラムを意味し、“ｍｇ”はミリグラムを意味し、“ｕｌ”又は“μｌ”はマイクロリットルを意味し、“ｍｌ”はミリリットルを意味し、“ｌ”はリットルを意味する。
【００９５】
本発明からの配列の結合により形成された機能的なＨＣＶ  ｃＤＮＡクローンを使用して誘導された場合に、広い範囲の細胞タイプはＨＣＶ複製用のホスト細胞として有用である。これらのホスト細胞は、連続ヒト細胞系列〔例えば、ＨｅｐＧ２，Ｈｕｈ７，ＨＵＴ７８，ＨＰＢ−Ｍａ．ＭＴ−２（並びに他のＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩ感染Ｔ細胞系列）、ナマローワ（Namalowa）、ダウジ（Daudi）、ＥＢＶ−形質転換ＬＣＬ〕と同じく、原始ヒト細胞（例えば、肝細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単核細胞／マクロファージ、包皮繊維芽細胞）を含む。
【００９６】
更に、ＲＮＡにより素早く形質転換され、フラビウイルス若しくはペスチウイルスの複製を許す連続細胞系列がＨＤＶ複製を支持する（例えば、ＳＷ−１３，ベロ（Vero），ＢＨＫ−２１，ＣＯＳ，ＰＫ−１５，ＭＢＣＫ）。当業者は、本発明の範囲から逸脱すること無く所望の感染性分析を達成するために、過度な実験無しに適当なホスト細胞を選択できる。
【００９７】
３’末端配列類似体又はＨＣＶ類似体が本発明の範囲内で誘導されたヌクレオチド配列から調製されることが更に意図される。フラグメント又は突然変異体（例えば、“突然変異たんぱく質”）等の類似体は、分解酵素よる標準分裂又はＨＣＶコード化及び非コード化（５’及び３’末端）配列の部位特異的突然変異ににより生成されうる。プロモーター又は抑制剤の何れかとして機能する小さい分子等の“ＨＣＶ抑制活性”を示す類似体は、知られたin  vivo及び/又はin  vitroの分析により同定される。
【００９８】
上記したように、３’配列要素をコード化するＤＮＡ配列はその相補鎖、又は全長の野生型若しくは低毒化されたＨＣＶはクローニングされるよりむしろ合成的に調製されうる。ＤＮＡ配列は、ＨＣＶオープンリーディングフレームによりコード化されたアミノ酸配列のための適当なコドンを用いて設計されうる。完全配列は標準方法により調製されたオーバーラップオリゴヌクレオチドから組み立てられ、完全なコード化配列中に組み立てられる。例えば、EdgeのNature,第292巻の756ページ(1981年);Nambair他のScienceの第223巻の1229ページ(1984年);Jay他のJ.Biol.Chem.の第259巻の6311ページ(1984年)を参照。
【００９９】
複製可能ＨＣＶ  ＲＮＡを駆動する３’末端配列要素の能力は、ＨＣＶのＯＲＦが、直接に検出されえて細胞中のＨＣＶ  ＲＮＡのレベルに相関される、ルシフェラーゼ等のリポーター遺伝子によって置換される構成を使用することにより分析されうる。特に、３’末端配列要素は、完全な複製及びウイルス生成が可能な全長ＲＮＡかまたはレプリコンの何れかである、複製能力のある構成要素ＨＣＶ  ＲＮＡを駆動するために使用されうる。かかる複製単位はＲＮＡ複製が可能であるが、構造領域／充填機構を欠いており、そのためウイルスを生成しない。３’要素又はその相補体の機能を妨げるものを含む、かかるレプリコン（３’要素を含む）を用いて形質移入／転換された細胞は、ＨＣＶ  ＲＮＡ複製の抑制剤として有用である。ＲＮＡ複製は、ＨＣＶ  ＲＮＡ複製と翻訳機構の制御の下で、ＨＣＶＲＮＡのレベルを直接にみること（ＲＴ／ＰＣＲ，Ｂ−ＤＮＡ，ノーザンプロット分析）若しくは感応性リポーター（ルシフェラーゼのような）と結合することの何れかにより評価されうる。
【０１００】
合成ＤＮＡ配列はＨＣＶ，ＨＣＶ変形、又は低毒ＨＣＶを発現する遺伝子の簡便な構成を可能にする。更に、ＤＮＡコード化変形又は低毒ＨＣＶは天然ＨＣＶ  ｃＤＮＡの部位特異的突然変異により形成されうる。
【０１０１】
非天然アミノ酸のたんぱく質への位置特異的結合のための一般的な方法は、Christopher  J.Noren,Spencer  J.Anhtony-Cahill,Michael  C.Griffith,Peter  G.SchultzのScience第244巻の182-188ヘ゜ーシ゛(1989年4月）に記載される。この方法は非天然アミノ酸を有するたんぱく質を含有するＨＣＶウイルスを生成するのに使用される。
【０１０２】
本発明は、ＨＣＶ  ＲＮＡの翻訳、安定性、複製／転写及び／又は充填を妨げるのに使用される、アンチセンスヌクレオチド及びリボザイムの調製に及ぶ。このアプローチは、アンチセンス核酸でＨＣＶ  ＲＮＡをマスクするか又はリボザイムでそれを分解するかの何れかによってウイルス複製を妨害するために、アンチセンス核酸及びリボザイムを利用する。
【０１０３】
アンチセンス核酸は、少なくとも特異的なＲＮＡ分子の一部分に対して相補的なＤＮＡ又はＲＮＡ分子である。(Weintraub,1990;Marcus-Sekura,1988を参照)細胞中、それらは二本鎖分子を形成するＲＮＡにハイブリッド形成する。従って、アンチセンス核酸はウイルス複製を（直接の妨害効果又は細胞酵素により目標ＲＮＡの分解を導くことの何れかにより）妨げる。それらは合成するのが簡単であり、ＨＣＶ感染細胞中に導入する時に、より長い分子に比べ問題が少ないと解されるため、約１５ヌクレオチドのオリゴマーが適当である。しかし、天然構造のオリゴヌクレオチド又は安定性、促進性、吸収等を高めるための改良を有するオリゴヌクレオチドが適当である。更に、より長いアンチセンスＲＮＡは、遺伝子治療アプローチを用いて肝細胞又は他のＨＣＶ目標細胞中in  vivoで生成されうる。アンチセンス方法はin  vivoの多くの遺伝子の発現を禁止するのに使用されている(Marcus-Sekura,1988;Hamabor他,1988)。
【０１０４】
リボザイムは他の一本鎖ＲＮＡ分子をＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼと幾分似た方法で特異的に分解する能力を有する。リボザイムは、一定のｍＲＮＡがそれら自身のイントロンを切除する能力を有するという観察から発見された。これらのＲＮＡのヌクレオチド配列を改良することにより、研究員はＲＮＡ中の特定のヌクレオチド配列を認識し、それを分解する分子を設計することができる(Cech,1988)。それらが配列特異的であるため、特定の配列を有するＲＮＡ（ＨＣＶプラスセンスのゲノムＲＮＡ又はその相補鎖）のみが不活性化される。
【０１０５】
調査者は、二つのタイプのリボザイム、テトラヒメナ（Tetrahymene）−タイプ及び“ハンマーヘッド”−タイプを同定した(Hasselhoff及びGeriach,1988)。テトラヒメナ−タイプのリボザイムは４塩基配列を認識し、一方“ハンマーヘッド”−タイプは１１から１８塩基配列を認識する。認識配列が長いほど、目標ｍＲＮＡ種内でより独占的に生じるようである。従って、ハンマーヘッド−タイプのリボザイムは特定のｍＲＮＡ種の不活性化に対してテトラヒメナ−タイプのリボザイムより好ましく、１８塩基認識配列はより短い認識配列より好ましい。
【０１０６】
ここで記載されたＤＮＡ配列はアンチセンス分子とＨＣＶ  ＲＮＡを分解するリボザイムとを調製するために使用される。かかるアンチセンス分子及びリボザイムは、プラス及びマイナス鎖の両方のＨＣＶ  ＲＮＡに結合するようなプラス及びマイナスの両方の鎖の極性のヌクレオチド配列を含む。
【０１０７】
本発明はまた、ＨＣＶの検出方法を含む多様な診断応用に関する。本発明はまた、３’ＮＴＲ配列を疾病重症度、インターフェロンを用いる処置への応答、及び免疫状態等の多様な診療パラメータと対応させる方法、又は組織向性（予測的診断）を決定するための方法に関する。
【０１０８】
本ＨＣＶ配列は、保存と相違の別の領域を画成するための多様なＨＣＶゲノタイプに対する３’ＮＴＲ配列をきめるために、付加的な３’配列を含むＨＣＶ分離体を実験的に同定するのに使用されうる。また、ＲＮＡマッピング及びＲＮＡの三次元構造分析によるＲＮＡの化学的修飾及び分析は、配列と相関するホスト又はウイルス要因の同定及び／又は複製を抑制する分子の同定を目的とする。
【０１０９】
ＨＣＶ  ＲＮＡはまた、治療に使用され、即ち低毒化ＨＣＶはワクチン開発に使用され、３’ＮＴＲ配列要素は遺伝子治療によるＨＣＶ複製のトランスドミナント（trans dominant)抑制剤として使用される。
【０１１０】
細胞中のＨＣＶの複製は分枝ＤＮＡ（Ｂ−ＤＮＡ）、定量ＲＴ／ＰＣＲ及び免疫学的製法、又はウイルス滴定濃度決定の標準の方法（即ち、チノパンジー内の滴定）を使用して確かめられうる。製法及びその応用は当業者に良く知られ、従って本発明の範囲内で利用されうる。製法に結合する“競争”抗体は、米国特許第３，６５４，０９０号及び第３，８５０、７５２号に記載される。“サンドイッチ”製法は米国特許ＲＥ第３１，００６号及び第４，０１６，０４３号に記載される。更に他の製法は“二重抗体”又は“ＤＡＳＰ”製法等として知られる。
【０１１１】
各例において、ＨＣＶたんぱく質は一以上の抗体又は結合相手との複合体を形成し、その複合体の一つのメンバーは検出可能な標識でラベルされる。更に、本ＨＣＶ３’末端配列要素に結合する抗体が挙げられ、又はＨＣＶ感染患者中で同定される。複合体が形成された事実、必要ならば、その量が標識の検出に利用可能な公知の方法により決定される。
【０１１２】
本発明の範囲内でまた、ＲＮＡ分子は３’末端配列要素若しくはその相補鎖を模倣する、又は“ＳＥＬＥＸ”（Tuerk及びGold,19-）若しくは他のin  vitroの選択／評価アプローチを使用してin  vitroで選択されたこれらの要素に結合するＲＮＡ分子は、本発明の範囲内である。これらの方法は、目標（この場合、３’末端配列、その相補鎖、若しくはこれらそれぞれの要素の機能のために必要な同種の結合相手）への反復結合により選択されうるランダム化された配列を有するＲＮＡのライブラリを提供し、それと結合するＲＮＡはＰＣＲにより増幅される。かかる分子は３’末端要素の構造を模倣するか又は３’末端要素の競合的抑制剤である。
【０１１３】
かかるＳＥＬＥＸ  ＲＮＡは、本発明の範囲内の診断及び治療用途にも適する。
【０１１４】
更に、ＨＣＶ  ＲＡＮの存在はノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びプライマー伸長等により決定されうる。
【０１１５】
これらの検討において最も普通に使用される標識は放射線活性要素、酵素、紫外線にさらされたときに蛍光発光する化学物等である。
【０１１６】
多数の蛍光性物質が知られ、標識として利用されうる。これらは、例えばフルオレッセイン、ローダミン、オウラミン、テキサスレッド、ＡＭＣＡブルー及びルシファーイエローを含む。特定の検出物質は、ヤギの中で調製され、イソチオシアナートを通してフルオレッセインとコンジュゲートされた抗ウサギ抗体である。
【０１１７】
ＨＣＶたんぱく質への抗体、又はＨＣＶ  ＲＮＡ若しくはそれらの結合相手のためのプローブは放射線活性要素又は酵素によってもラベルされうる。放射線活性ラベルは利用可能な計数方法の何れかにより検出されうる。好ましい同位体は３Ｈ，１４Ｃ，３２Ｐ，３５Ｓ，３６Ｃｌ，５１Ｃｒ，５７Ｃｏ，５８Ｃｏ，５９Ｆｅ，９０Ｙ，１２５Ｉ，１３１Ｉ及び８６Ｒｅから選択される。
【０１１８】
酵素標識は同様に有用であり、現在利用される比色分析、分光分析、蛍光分光分析、電流分析又はガス分析技術の何れかにより検出されうる。酵素はカルボジイミン、ジイソシアナート及びグルタルアルデヒド等の架橋分子との反応により選択されたプローブにコンジュゲートされる。これらの方法に使用可能な多くの酵素が知られ、利用されうる。好ましいのは、ペルオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼを伴うグルコースオキシダーゼ及びアルカリンホスファターゼである。米国特許第３，６５４，０９０号；第３、８５０、７５２号；及び第４，０１６，０４３号は、別の標識物質及び方法の開示の例により参照される。更に、プローブはビオチンラベルされ、その後ラベルされたアビジン、又はアビジンとラベルされた抗アビジン抗体の組み合わせにより検出される。プローブはまた、その中に組み込まれたジゴキシゲニンを有し、その後ラベルされた抗ジゴキシゲニンで検出され、ラベルされた抗ジゴキシゲニン抗体で検出される。
【０１１９】
本発明の別の実施例において、医療専門家による使用のための市販の試験キットは、疑わしい患者試料中の感染性ＨＣＶの有無を決めるために調製される。かかる試験キットはＲＴ／ＰＣＲ，分枝ＤＮＡ及びライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）等の技術を使用する。上記の検討された試験技術に従い、かかるキットの一クラスは少なくともラベルされたＨＣＶ抗体若しくはオリゴヌクレオチドプローブ若しくはその結合相手、並びにもちろん選択された方法に従う指示書を含む。キットはまた緩衝剤、安定化剤等の周辺薬剤も含む。
【０１２０】
従って、試験キットは：  （ａ）検出可能な標識へのオリゴヌクレオチド若しくはその特定の結合相手の直接若しくは間接の取付けにより得られた、ＨＣＶゲノムの３’配列要素に向けられた所定量の少なくとも一つのラベルされたオリゴヌクレオチドプローブと；
（ｂ）他の試薬と；
（ｃ）該キットの使用のための指示書とからなり、ＨＣＶの存在の実証のために調製される。
【０１２１】
更に限定すると、診断試験キットは：  （ａ）公知の量の、免疫吸着剤を形成するために固体相に通常結合された、又は代わりに適当なタグ、若しくは複数のかかる末端生成物等（若しくはその結合相手）のそれぞれの一つに結合された上記のラベルされたオリゴヌクレオチドプローブ（又は結合相手）と；
（ｂ）必要な場合の他の試薬と；
（ｃ）該キットの使用のための指示書とからなる。
【０１２２】
上記に従い、ＨＣＶ  ＲＮＡの複製活性の調節に有効な潜在的薬剤をスクリーニングするための分析系が調製される。感染性ＨＣＶ  ＲＮＡは試験系に導入され、候補薬剤もまた得られる細胞培養中に導入され、培養はその後に候補薬剤の添加により、細胞の複製活性における変化を観測するために試験される。
【０１２３】
予備的考察  
最近数年間の間に大きな進歩が形成された一方、ＨＣＶ複製、病因及び免疫性に関する非常に多数の答えられない疑問がまだある。その分野は、ＨＣＶゲノムＲＮＡの機能の幾つかの特徴及びそのコード化されたたんぱく質が理解される隘路に素早く達しているが、本発明の前には、真正のウイルス複製に関する構造／機能の疑問を実験的に試験する方法はなかった。かかる分析は、防御ワクチンの設計及び慢性的に感染された患者に対する効果的な治療を可能にするレベルでウイルスの生命循環における各段階を理解するために重要である。
【０１２４】
本発明は、ＨＣＶ、特にＨＣＶ−Ｈ株に対する機能的なｃＤＮＡクローンの構成の試みから発した。本発明の前、ｃＤＮＡからの感染性ＨＣＶ  ＲＮＡの回収の試みは成功しなかった。ミス若しくは正しくない末端配列、ＨＣＶ複製に対して有毒若しくは致死の内部エラー、又は感染性及び複製を分析するための不適当な方法を含む、幾つかの可能な説明が単独もしくは組み合わされて、以前の失敗を説明する。
【０１２５】
ＨＣＶ−Ｈ末端を厳密に決定する原理
【０１２６】
ＨＣＶ−Ｈの５’及び３’末端配列は以前から知られていない。機能的な転写を発生するための以前の試みは他のＨＣＶ分離体に対して決められた末端配列を使用した。上記のように、他のＲＮＡウイルス系における作用は、特異な末端配列は機能的な複製能力のあるＲＮＡの発生のために重要でありうることを示している（Boyer及びHaenni,(1994)のJ.Gen.Virol.198巻:415-426ヘ゜ーシ゛)。かかる配列はマイナス及びプラス鎖のＲＮＡ合成の開始に関与すると解される。他のウイルスに対するこれらの配列要素の重要性を考慮すると、本発明はＨＣＶ−Ｈ末端配列をより厳密に決定した。
【０１２７】
５’ＮＴＲの構造
【０１２８】
ＲＮＡの最後の５’末端を増幅及びクローニングするのに使用された方法は、一次鎖ｃＤＮＡへのホモポリマーのテーリング若しくは合成オリゴヌクレオチドのライゲーション（５’ＲＡＣＥ）、一次鎖ｃＤＮＡの環化後の逆ＰＣＲ(Zeiner及びGehring(1994)のBioTechniques第17巻:1051-1053ページ)、又は（必要な場合、５’キャップ構造を除去する処理の後の）ＲＮＡリガーゼによるゲノムＲＮＡの環化とその後の５’−３’接合点に沿ってｃＤＮＡ合成とＰＣＲ増幅（Ｍａｎｄｌ他（１９９１）のＢｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ第１０巻：  ４８６ページ）を含む。５’末端配列は多数のＨＣＶ分離物に対して決定され、一般に一致する。
【０１２９】
ＨＣＶ−Ｈに対し、環化／逆ＰＣＲと５’ＲＡＣＥ法の両方は５’末端コンセンサス配列：５’−ＧＣＣＡＧＣＣＣＣＣＴＧＡＴＧＧＧＧＧＣＧＡＣＡＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＴＣ−３’（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：３９）
を決めるために使用された。
【０１３０】
この配列は他の分離物のために決められた配列に対し高度に相同的である。より低い頻度で、付加的な５’残基（通常１つの付加的Ｇ）とのクローンも回収された。このことは付加配列又はＨＣＶ５’末端での異種性を反映しているが、これらのクローンは人工的であり、５’キャップ構造の部分的な複写若しくは一次鎖のｃＤＮＡ合成の間の逆転写による非テンプレート３’塩基の付加により形成される。ＨＣＶゲノムＲＮＡの５’末端が５’キャップ構造又はピコルナウイルスのＶＰｇ等の共有結合により結合された末端たんぱく質を含むことは排除されるべきではない。ペスチウイルスに対し、最近の研究は、ゲノムＲＮＡは５’キャップを含まず（Ｂｒｏｃｋ他（１９９２）のＪ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．第３８巻：  ３９−４６ページ）、この構造は転写されたＲＮＡの感染性には必要ない（Ｒ．Ｄｏｎｉｓ，Ｒ．Ｊ．Ｍｏｏｒｍａｎの私信）ことを示す。これらの観測と一致して、ＨＣＶ若しくはペスチウイルスの何れも、キャップ構造のキャッピング又はメチル化に含まれたウイルスコード化された酵素の特徴を含まない（Ｒｉｃｅ（１９９５））。
【０１３１】
ＨＣＶゲノムＲＮＡの５’末端に共有結合的に結合されたたんぱく質の可能性があるが、かかる５’構造を通常含むウイルスに対応する合成ＲＮＡ転写は感染性であり、それらは複製の開始に対して通常絶対に必要なものではないことを示す。
【０１３２】
例１
ＨＣＶ−Ｈ  ３’ＮＴＲの構造
３’最末端ＨＣＶ配列の決定はより大きな挑戦を提供した。ＨＣＶゲノムＲＮＡの限定された量のため、３’末端ラベリング及び直接ＲＮＡ配列分析の旧式の方法は利用できない。最初の報告の一つはＨＣＶ  ＲＮＡが３’末端ポリ（Ａ）領域（ＨＣＶ−１について）を含むことを示した。Ｈａｎ他（１９９１）は、ｃＤＮＡ合成のためにタグされたオリゴ（ｄＴ）プライマーを使用し、ＰＣＲ増幅、クローニング及び配列分析を行なった。この方法は、３’ポリ（Ａ）又はポリプリン領域を前提とし、そのような領域を有するＲＮＡが低い量で存在する場合でも選択するので、これは３’末端決定に対し受容可能な方法ではない。
【０１３３】
ある報告は、オリゴ（ｄＴ）プライミングされたｃＤＮＡ合成の前に大腸菌ポリ（Ａ）ポリメラーゼを３’ホモポリマー領域を付加するのに利用し、３’末端ポリ（Ｕ）の証拠を発見し（即ち、Ｋａｔｏ他，１９９０）、又はランダムにプライミングされたｃＤＮＡライブラリイからポリ（Ｕ）領域を伴う３’クローンを分離した。３’末端配列を実際に決定し、この矛盾〔３’ポリ（Ａ）対ポリ（Ｕ）〕を解消するために，５’ＲＡＣＥがＨＣＶの負の鎖のＲＮＡの５’末端配列を決定するために使用された（Chen他、1992）。この研究はＨＣＶゲノムＲＮＡに対する３’末端ポリ（Ｕ）領域を予測する。
【０１３４】
続いて、他のグループは実際の３’末端を決定する検討をせず、むしろ３’ポリ（Ｕ）領域を推定し、ｃＤＮＡ合成をプライミングするためにオリゴ（ｄＡ）を使用し、又はランダムにプライミングされたｃＤＮＡライブラリからポリ（Ｕ）領域を有する３’クローンを分離した。実際の３’構造により、これらすべてのアプローチは潜在的な問題を有し（幾つかは以下で検討される）、文献を批評的に読めばゲノムＲＮＡの３’末端が今まで殆ど特徴付けられておらず、殆ど不確かであることが明確である。ＨＣＶ−Ｈの末端配列の決定のための別のアプローチがそのため求められた。
【０１３５】
５’末端決定のために上に記載された一つのかかるアプローチは、Ｔ４リガーゼを用いてＲＮＡを環化して、その後ｃＤＮＡ合成及び５’ＮＴＲ中の配列に相補的な負のセンスのプライマーと３’末端近くの正のセンスのプライマーを用いて増幅した（Mandl他,1991）。理想的には、クローニング及びかかる生成物の配列分析は同じＲＮＡ分子に存在する５’及び３’末端配列に関する情報を提供すべきものである。ＨＣＶの場合、５’末端は他の方法により合理的により明確にされているので、これらのデータは３’末端の決定を可能にすべきである。不幸にも、繰り返しの検討に関わらず、この方法はＨＣＶ−Ｈ末端配列（高度に特異的な感染性の血漿から得られたＲＮＡを使用してさえも）決定に失敗した。（ｉ）５’末端がブロックされていること（ｉｉ）３’−ＯＨ基の欠如又はＲＮＡリガーゼに対する弱い受容体（Ｕ残基等;Moore及びSharp,1992）（ｉｉｉ）ＲＮＡ調製又はＲＮＡライゲーションの間のリボヌクレアーゼ活性（以下参照）、又は（ｉｖ）５’−３’ライゲーションを立体的に阻害する末端ＲＮＡ構造のような問題がありうる。何れの場合においても、最近の仕事は、大量の精製された初期の損なわれていないＴＢＥゲノムＲＮＡを使用するときでさえ、この方法は信頼できないことを示す。同様に、タバコ酸ピロホスファターゼ及びＴ４  ＲＮＡリガーゼの殆どの市販の調製の中のＲＮアーゼ夾雑物（A.A.kolykhalov、未発表）及びポリ（Ｕ）／ポリピリミジン領域のＲＮアーゼの作用に対する可能な過剰感応性という問題もある。何れの場合においても、ＴＢＥゲノムＲＮＡの末端配列がポリ（Ａ）を有するとするのは不正確であって、一方、後の実験はかかるポリ（Ａ）領域が内部にあり、３’末端ヘアピン構造を含む付加配列によって追随されることを示した(C.Mandlの私信）。興味深いことに、転写されたＴＢＥ  ＲＮＡの感染性にポリ（Ａ）領域でなく、正しい３’構造が必要とされる(C.Mandlの私信）。
【０１３６】
二つの他の方法が考察された。ＹＦの３’末端を決定するために、大腸菌のポリ（Ａ）ポリメラーゼが３’末端ポリ（Ａ）を付加するために使用され、その後オリゴ（ｄＴ）プライミング及び選択的クローニングという方法が続く。
【０１３７】
ＹＦの３’末端は大きな困難を伴いクローニングされ、高度に安定なヘアピン構造であることが発見された（Hahn他,1987;Rice他,1985）。しかし、このアプローチは、３’ポリ（Ａ）付加がＨＣＶポリ（Ｕ）領域での自己プライミングと、第２の鎖であるｃＤＮＡ合成の間とクローニングとの間にある潜在的な配列の引き続きの排除をもたらす。むしろ、代わりの３’ＲＡＣＥ法が、ｃＤＮＡ合成のための特定のプライミング位置として配されるように高濃度で存在する合成オリゴデオキシヌクレオチドがＲＮＡの３’末端にライゲーションされて、使用される（図１）。ライゲーション条件は５’末端ラベルされたオリゴヌクレオチドを合成受容体ＲＮＡにライゲーションするためのＴ４  ＲＮＡリガーゼの能力を分析するとにより最適化される（Brennan他(1983）のMeth.Enz.第100巻:38-52ページ）。評価パラメータはＲＮＡリガーゼの一回の使用量（多くはＲＮアーゼが高度に混入している）、ＤＭＳＯの濃度（２０−３０％）及びライゲーションに使用された特定のオリゴヌクレオチドを含む（A.A.Kolykhalov未発表）。ＨＣＶ−Ｈの３’分析に対し、高タイターＨ７７血漿からＲＮＡの１０４分子が精製され、合成オリゴヌクレオチドにライゲーションされ、この改良ＲＮＡはＲＴ／ＰＣＲのために使用された（図１）。ｃＤＮＡ合成及びＰＣＲ増幅のための一のプライマー（オリゴＢ−配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：６及び７）はＲＮＡへライゲーションするために使用されるもの（オリゴＡ−配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：５に対し相補的であり；第二の正のセンスのプライマーはＨＣＶ  ＯＲＦの３’末端近くの配列に対応した（オリゴＣ−配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：８）。
【０１３８】
４０サイクルのＰＣＲ増幅の後に、増幅された生成物のスメアーが、アガロースゲル電気泳動による分析で得られた。このＤＮＡは追加のＰＣＲ分析にかけられるか、又は配列決定のために直接にクローニングされた。予想された内部ＨＣＶの配列及びホモポリマー領域の存在は組になった正のセンスのプライマー並びにオリゴ（ｄＡ）若しくはオリゴ（ｄＴ）の何れかを用いて分析された。予測されたサイズ（従来のＨＣＶ  ３’ＮＴＲ配列に基づく）の生成物がオリゴ（ｄＡ）プライマーを使用して得られ；オリゴ（ｄＴ）を使用しては生成物は見出されなかった。ポリ（Ａ）又はポリ（Ｔ）の何れかにおいて終結するプロトタイプＨＣＶ  ｃＤＮＡクローンはこれらのプライマー対に対する正対照及び負対照として配され、予想された結果を与えた。これらのデータは、ＨＣＶ−Ｈがポリ（Ａ）を含まないが、むしろ殆どのＨＣＶ分離体に対して見出されるように、その３’末端又はその近傍にポリ（Ｕ）領域〔又は少なくともオリゴ（ｄＡ）によりプライミングする位置）を含むことを強く示す。クローニングされた物質〔オリゴ（ｄＡ）を使用した更なる増幅にかけなかった〕から、２０の独立クローンからの配列が決定された。本質的にこれらのクローンの全ては、（５’から３’への正のセンスの）（ｉ）以前に決められたＨＣＶ−Ｈ配列(Inchauspe他(1991)のProc.Natl.Acad.Sci.USA  第88:10292-10296ページ）（ｉｉ）他のＨＣＶ分離体に対する４０塩基相同体（図２）（ｉｉｉ）多様な長さのポリ（Ｕ）領域及び（ｉｖ）ＲＮＡライゲーションに使用されたオリゴヌクレオチドの配列を含む。二つの異なるＰＣＲ増幅実験から誘導された５つの独立クローンは、通常でない構造を有することが見出された。時折の所々に入るＣ残基を伴って主にＵからなる多様な長さのポリ（Ｕ）及びポリピリミジン伸長に引続き、これらクローンのうち４つは、全てのクローンでほとんど同じである１０１塩基の新規な配列（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１）を含んだ（二つのクローンがそれぞれ１置換で異なり；１クローンがこの配列の３９塩基のみので終結した）（図３）。この１０１塩基配列、特に３’末端の４６塩基は、フラビウイルス遺伝子のメンバーの３’末端の高安定の二次構造のレミニッセンスを形成すると予測された（ＦＯＬＤＲＮＡ，ＧＣＧパッケージ）（Chambers他(1990)のVirology第177巻;159-174ページ）（図４）。しかし、データベースの徹底的な調査（BLAST,FASTA）はこの新規なＨＣＶ配列に対して有意な相同を示す存在を示さなかった。
【０１３９】
証拠の幾つかの系列はこの１０１塩基配列がＲＴ／ＰＣＲアーチファクトでなく、ＨＣＶゲノムＲＮＡの３’末端配列を表すことを示す。
【０１４０】
第一に、上記したように、類似だが同一ではない構造を有するＨＣＶ−Ｈクローンが二つの独立の実験から得られた（図３）。これらのクローンはポリ（Ｕ）／ポリピリミジン領域の長さと１０１塩基要素内の２〜３の塩基置換において異なるが、新規な配列とライゲーションされたオリゴヌクレオチドとの間のブレイク点を越える配列は４つのクローンにおいて同一であった。
【０１４１】
実験の第二の組において、負のセンスのオリグヌクレオチドが１０１塩基要素の配列に基づいて設計され、ＨＣＶ−Ｈ若しくは国中の調査者から得られた４つの異なる臨床試料の何れかからのＨＣＶ  ＲＮＡのＲＴ／ＰＣＲ増幅、並びにクローニングのために使用された。試料は慢性的なＣ型肝炎の患者から得られ、全てＨＣＶ  ＲＮＡ陽性で、以前分析されたＨＣＶ−Ｈ（１ａ）と比べ異なるゲノタイプ（１ｂ，３及び二つのゲノタイプ４の試料）のものであった。多数の独立クローンが得られ、各増幅された試料に対し配列決定された（図６）。上記したように、ＨＣＶ−Ｈに対し、全てのクローンはＯＲＦの末端及びポリ（Ｕ）／ポリピリミジン領域に先行する３’ＮＴＲ配列で同じ配列を含んだ。このポリ（Ｕ）／ポリピリミジン領域は長さにおいて多様であり、新規な３’要素により追随される。
【０１４２】
他の分離体からのクローンは、ゲノタイプ特異的な差異がＯＲＦ中及びポリ（Ｕ）／ポリピリミジン領域に先行する３’ＮＴＲ配列で得られる以外は、同様の構造を有する。これらの全てのクローンにおいて、新規な３’要素の配列が存在し完全に同一であることは、この要素が異なるゲノタイプのゲノムＲＮＡに存在し、高度に保存されていることを示唆する。この実験はまた、この構造がＴ４  ＲＮＡリガーゼにより生成された生体外のアーチファクトではないことを証明する。
この分析は、新規な３’要素が他のＨＣＶゲノタイプ中に存在するが、しかしこれらゲノムＲＮＡの実際の３’末端を定義しないことを示す。同様のＲＮＡライゲーション製造を使用し（図７）、これらの異なるＨＣＶゲノタイプの３’末端配列が決定された。同じ新規な３’末端配列（一若しくは二の分離体特異的置換を伴う）が正確に同じブレーク点でＴ４  ＲＮＡライゲーションに使用されたオリゴヌクレオチドの配列に結合されて見出された（図８）。
【０１４３】
４つ目の実験は、３’新規配列はＨＣＶゲノムＲＮＡの３’末端を表すという更なる証拠を提供する。ｃＤＮＡ合成（及びＰＣＲ増幅）に使用された合成プライマー３’部分が偶然に、ＨＣＶ  ３’ＮＴＲ内の配列に相補的である場合、新規な構造を有するクローンが３’ＮＴＲ内での内部プライミングにより得られうることが議論されうる。この問題にアドレスするため、異なる患者（ＷＤ）からの血清及び配列が初めの実験使用されたオリゴヌクレオチドと相同ではないオリゴヌクレオチド（”オリゴＧ”；配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：３７）をＲＮＡライゲーション段階において使用して、分析が繰り返された。このオリゴヌクレオチドの相補体（”オリゴＨ”；配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：３８）がｃＤＮＡ合成及び”オリゴＦ”（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：３２を伴うＰＣＲ増幅が使用され、生成物がクローニングされ配列決定された。同じ新規な３’末端配列が厳密に同じブレーク点で別の合成オリゴヌクレオチドの配列に結合されて見出された。
【０１４４】
この新規な３’ＮＴＲ構造はＨＣＶ分離物内で高度に保存されて現れ、ウイルス複製に必要でｃＤＮＡからの感染性ＨＣＶ  ＲＮＡの好結果の回収に必要な本質的なＲＮＡ要素であるようである。
【０１４５】
これらのデータに基づき、ＨＣＶ−Ｈゲノム構造の現在の図面が図１０に示された。ゲノムＲＮＡは多分Ｇ残基と共に開始し、３４１塩基の５’ＮＴＲを含む。ＯＲＦは３０１１アミノ酸残基のポリたんぱく質をコード化する９０３３塩基からなる。オパル（ＵＧＡ）停止コドンに続き、４０塩基の配列、ポリ（Ｕ）領域、ポリピリミジン伸長、及び約１００塩基の高度に保存されたＲＮＡ要素がある。ある正の鎖のＲＮＡウイルス（ポリオウイルス、シンドビスウイルス）は３’末端ポリ（Ａ）を含むが、他の多く（ブロモウイルス、フラビウイルス）は、往々にして安定な二次構造にたたまれた保存されたＲＮＡ配列により終結する。３’末端二次構造の前の内部ポリ（Ａ）を含むＴＢＥ分離体の他に、ここでＨＣＶに対し示されたのと同じ３’ＮＴＲを含むウイルスの一の別の例がある。ＧＢＶ−Ｂと称されるこのウイルスは新たにクローニングされ、配列決定されたＧＢ肝炎病原体の一つである（Simons他(1995)のProc.Natl.Acad.Sci.USA第92巻:3401-5ページ）。ＨＧＶ（Genelabsによりクローニングされた病原体）を伴うこれら二つの分離体（ＧＢＶ−Ａ及びＧＢＶ−Ａ）はＨＣＶの最も密接に関連するものとして現れる。〜９−１０ｋｂの正の鎖のゲノムＲＮＡ及びＨＣＶに対して有意な相同性を有するたんぱく質をコード化する単一の長いＯＲＦを有するようである。ＧＢＶ−Ｂの場合、３’ＮＴＲは２７塩基、ポリ（Ｕ）領域、及び付加的な４９塩基の配列からなる（Simons他、1995）。ポリ（Ｕ）領域以外、この配列はＨＣＶ−Ｈ  ３’ＮＴＲと有意な相同を示さない（A.A.Kolykhalov、未発表）。
【０１４６】
検討
本発明は、ＨＣＶ−Ｈ（タイプ１ａ分離体）のゲノムＲＮＡが以前考えられたようにホモポリマー領域ではなく、むしろ１０１塩基の新規な配列で終結するようであることを示す配列データを提供する。更に、結果はこの３’ＮＴＲ構造及び推定上の３’末端要素が他のＨＣＶゲノタイプと共通の特徴であることを示す。ＨＣＶ複製及びｃＤＮＡからの確実なＨＣＶの回収に対する３’ＮＴＲの潜在的な重要性に加えて、保存された３’要素の明確な保存は診断と治療に対する重要な実用性を有する。患者の血漿及び組織内のＨＣＶ  ＲＮＡレベルの決定は抗体反応の存在しないＨＣＶ感染の診断に対してのみならず、以下の治療養生の効能に対してもまた重要である(Bresters他(1994)のJ.Med.Virol.第43巻:262-8ページ;Cha他(1991)のJ.Clin.Microbiol.第29巻:2528-34ページ;Chazouilleres他(1994)のGastroenterology第106巻:994-9;Davis他(1994)のHepatology第19巻:1337-41ページ;Feray他(1994)のhepatology第20巻:1137-43ページ;Gordon他(1994)のAm.J.Gastroenterol.第89巻:1458-61ページ;Simmonds他(1994)のJ.Gen.Virol.第75巻:1053-1061ページ; Wright他(1994)のHepatology第20巻:773-9ページ)。定量ＲＴ／ＰＣＲ又は分枝ＤＮＡ等の最近の方法は、遺伝−、タイプ−、又はサブタイプ−特異的の何れかでありうるＨＣＶゲノム内の保存されたＲＮＡ目標をあてにする。この新規な保存された配列の検出は、ＨＣＶ感染の診断に対する有用な代替となる。治療の観点においては、ＲＮＡウイルスゲノム中の高度に保存された要素は、殆どの場合、効果的なウイルス複製に対して必須であることを示している。かかる要素は、ウイルス及び／又はホストの要因との相互作用により、負及び正の鎖のＲＮＡ合成のためのプロモーターとして、及びウイルスＲＮＡの選択的充填のための標識として、来入ウイルスＲＮＡの翻訳において機能する。一以上のこれらのプロセスに対して重要であるようであるＨＣＶゲノム内の保存された３’要素は魅力ある治療目標を提供する。この要素の同系のホスト又はウィルス要因との相互作用を遮蔽する化合物の同定あるいは移植された肝細胞中、その同種のホスト若しくはウイルス要因若しくはＲＮＡのおとりとしてこの要素を使用する遺伝子治療アプローチ（Sullenger他(1990)のCell第63巻:601-608ページ）は慢性的なＨＣＶ感染の根絶若しくは制御に有用であることを立証する。
【０１４７】
本発明は、新規な配列要素とＨＣＶ感染との関連があることを示す。新規な３’配列要素は、（ｉ）感染性ＲＮＡ及びウイルスの生成が可能な全長ＨＣＶ  ＲＮＡクローンの構成（ワクチン開発、治療化合物評価）；（ｉｉ）ＨＣＶ複製研究と治療評価用の機能的なＨＣＶ  ＲＮＡ複製単位の設計；（ｉｉｉ）他のＨＣＶゲノタイプに対する３’ＮＴＲ配列の決定及び保存と発散の領域を画成するための系統発生的分析（ＨＣＶ検出に対する核酸ベースの診断）；（ｉＶ）ＨＣＶ  ３’ＮＴＲ配列の決定方法の改善と、ＨＣＶ  ３’ＮＴＲの特徴と診療パラメータ（疾病重症度、ＩＦＮ応答、免疫状態）若しくは組織向性（予言的な診断）との間の可能な相関の実験；（ｖ）化学修飾及びＲＮアーゼマッピングを使用する３’ＮＴＲ二次構造の決定並びにＮＭＲによる３Ｄ構造の決定；（ｖｉ）感染性クローンを使用した３’ＮＴＲに関する構造／機能研究（治療、ワクチン開発）；（ｖｉｉ）配列と相互作用するホスト若しくはウイルス要因の明確化（治療）；（ｖｉｉｉ）要素とその同種のホスト及び／又はウイルス要因との相互作用を抑制する化合物を同定するための、及び同定された化合物をＨＣＶ複製に対するそれらの効果について試験するためのスクリーニング分析の組み立て（治療）；（ｉｘ）ＨＣＶ複製のトランス独占抑制剤である保存された３’ＮＴＲ配列要素の試験（遺伝子治療）；に使用される。
【０１４８】
以下は、上記の開示に関する、そして特に実験方法及び検討に関する文献リストである。文献はここまで現れた同じ数の文献に対応するように番号付けがなされる。
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【図１】
2007125028.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2007125028.tif 000013
【図８】
2007125028.tif 000014
【図９】
2007125028.tif 000015
【図１０】
2007125028.tif 000016
【配列表】
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