(57)【要約】【課題】上皮細胞の損傷を処置または予防するための、改善された組成物を提供すること、ならびに、このような処置および予防のための改善された方法を提供すること。【解決手段】血小板由来増殖因子(PDGF)の生物学的活性を有する第１のポリペプチドおよびケラチノサイト増殖因子(KGF)の生物学的活性を有する第２のポリペプチドを含む、上皮組織の修復のための薬学的組成物であって、１つの実施形態において、上記第１のポリペプチドが、全長PDGFポリペプチドを含み、また、別の実施形態において、上記第１のポリペプチドが、全長PDGFポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントを含み、さらに別の実施形態において、上記第１のポリペプチドが、PDGFＡ鎖およびPDGFＢ鎖からなる群より選択されるPDGF鎖を含む、薬学的組成物など。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載されるような、創傷治癒のためのPDGF、KGF、IGF、およびIGFBPの配合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、上皮細胞の損傷の処置または予防のための、血小板由来増殖因子(PDGF)の生物学的活性を有するポリペプチド、および角質細胞増殖因子(KGF)の生物学的活性を有するポリペプチドの使用に関する。本発明はまた、本発明のPDGF/KGF配合物と組合せる、インシュリン様増殖因子(IGF-1またはIGF-2)の生物学的活性を有するポリペプチドの使用に関する；PDGF/KGF/IGF配合物は、上皮細胞の損傷の処置または予防に有用であり、上皮細胞の損傷を処置するための以前の方法に対する改良である。本発明はさらに、IGFと組合せ、そしてさらに本発明のPDGF/KGF配合物と組合せる、インシュリン様増殖因子結合タンパク質(IGFBP)の生物学的活性を有するポリペプチドの使用に関する。本発明はさらに、上皮細胞の損傷の処置または予防のための、PDGF/KGF配合物、PDGF/KGF/IGF、およびPDGF/KGF/IGF/IGFBP配合物を含む薬学的組成物に関する。本発明はまた、このような処置および予防のための、PDGF/KGF配合物として、またはPDGF/KGF/IGF配合物として、またはPDGF/KGF/IGF/IGFBP配合物としての、PDGFをコードするDNA、KGFをコードするDNA、IGFをコードするDNA、およびIGFBPをコードするDNAの使用に関する。さらに、本発明は、PDGFおよびKGFを含むキット、PDGF、KGF、およびIGFを含むキット、およびPDGF、KGF、IGF、ならびにIGFBPを含むキット、および／またはこれらの３つの配合物をコードするDNAを含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
特許出願EP  0  619  370は、創傷治癒目的のためのKGFの使用を開示している。PDGFもまた、米国特許第5,187,263号に開示されるように、間葉由来細胞を刺激する能力によって示されるように、創傷治癒目的のために使用され得る。
【０００３】
インシュリン様増殖因子IGFおよびIGF-2は、記載されそして当該分野で研究されている。IGFは、Rinderknecht,  J.  Biol.  Chem.  253:2769(1978)に記載され、そしてEP  0  128  733に記載されるように、種々の異なる細胞型に対してマイトジェンとして作用することが発見されている。インシュリンと同様に、IGFはIGFが結合するレセプターの細胞質ドメイン内の特定のチロシン残基でのリン酸化を刺激する(WO  93/98826に記載される)。IGF-IIは、Rinderknecht,  FEBS  Letters,  (1978)  89:283に記載される。
【０００４】
インシュリン様増殖因子はまた、クラス名ソマトメジンに入ることが知られており、そして特に発達の間に、種々の組織および細胞型の細胞の増殖を刺激するように作用するポリペプチドとして、種々の動物種において同定されている。ソマトメジンの増殖促進効果には、細胞分化の増強および軟骨増殖の刺激、アミノ酸の輸送の刺激、RNA、DNA、およびタンパク質の合成の刺激、ならびにプロテオグリカンへの硫酸の取り込みおよびコラーゲンへのプロリンの取り込みの刺激が挙げられる。多くの哺乳動物の出生後の成長は、ソマトメジンによる軟骨増殖の刺激に依存し、そして子宮内での成長もまたソマトメジン依存性である。
【０００５】
公知の刺激剤および増殖促進剤としてのIGFの使用には、  EP  303  855に記載されるような、骨修復および骨置換療法のための使用；JP  63-196524に記載されるような、制癌剤の特定の有害な副作用を相殺するための手段；および米国特許第4,783,524号に記載されるような、ウシおよび他の家畜における泌乳および肉の産生を増大させる手段が挙げられる。
【０００６】
IGF-1はまた、皮質の骨無機質密度の減少を示している哺乳動物、および骨密度の減少をもたらす薬物または環境状態および潜在的骨粗鬆症状態に曝露されている哺乳動物において、骨粗鬆症の処置に有用であることが見出されている(EP  560  723およびEP  436  469に記載される)。
【０００７】
IGF-Iは、重度の骨関節症のイヌにペントサンナトリウムポリスルフェート(PPS)とともに投与されて、軟骨における活性な中性のメタロプロテイナーゼのレベルを低下させることによって、この疾患の重篤度を低減させる効果をもたらした。軽度の骨関節症のイヌのモデルにおいて、IGF-IおよびPPSを共に用いる治療的介入によって、軟骨の構造および生化学が首尾良く維持されるが、一方、IGF単独では無効であるようである(Rogachefsky,  Osteoarthritis  and  Cartilage,  (1993)  1:105-114に記載される)。
【０００８】
IGF結合タンパク質は、広範に研究されており、そして現在では６つのIGFBPが知られている(IGFBP１〜６)。IGFBPは、血漿中でIGF-IおよびIGF-IIと複合体化し、そして代表的にはタンパク質ホルモンの結合タンパク質として機能する(すなわち、利用能、活性を調節し、それらが輸送するタンパク質ホルモンリガンドの半減期を延長する)と考えられている。150kDaの複合体であるIGFBP-3は、血漿中で最も豊富なIGFBPであり、そして血漿中においてIGF-Iのキャリアおよびレシーバーとして機能すると考えられているが、IGFBP-1は、肝臓および線維芽細胞で主に産生される小さな25kDaの結合タンパク質であり、そして循環と組織との間に分布し得、従って潜在的に両方の区分におけるIGFの生体利用能を調節する(Tsuboiら、J.  of  Inv.  Derm.  104:199-203(1995)に記載)。IGFは、IGFBPと組合せて、創傷治癒に有用であると記載されている(Tsuboiら、J.  of  Inv.  Derm.  104:199-203(1995)、Kratzら、Scand  J.  Plast  Reconstr  Hand  Surg.  28:107-112(1994)、およびJyungら、Surgery  115:233-239(1994)に記載)。
【０００９】
IGF発現は、創傷治癒と関連している(Gartnerら、J.  Surg.  Res.  52:389-394(1992)、およびSteenfosおよびJansson、Eur.  J.  Surg.  158:327-331(1992)に記載)。さらに、IGFは、創傷治癒のためにPDGFと組み合わせて投与された場合に有用であると記載されている(米国特許第4,861,757号に記載)。
【００１０】
従って、PDGFの単独投与を超える、KGFの単独投与を超える、PDGFとIGFとを超える、そしてIGF単独を超える、およびIGFとIGFBPとを超える、改善された特徴を有する、改善された組成物を見出し得る場合は、有利であり得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
発明の要旨
従って、本発明の目的は、上皮細胞の損傷を処置または予防するための、改善された組成物を提供することである。本発明のさらなる目的は、このような処置および予防のための改善された方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明によって以下が提供される：
（１）血小板由来増殖因子(PDGF)の生物学的活性を有する第１のポリペプチドおよびケラチノサイト増殖因子(KGF)の生物学的活性を有する第２のポリペプチドを含む、上皮組織の修復のための薬学的組成物。
（２）前記第１のポリペプチドが、全長PDGFポリペプチドを含む、項目１に記載の薬学的組成物。
（３）前記第１のポリペプチドが、全長PDGFポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントを含む、項目１に記載の薬学的組成物。
（４）前記第１のポリペプチドが、PDGFＡ鎖およびPDGFＢ鎖からなる群より選択されるPDGF鎖を含む、項目１に記載の薬学的組成物。
（５）前記第１のポリペプチドが、宿主細胞においてPDGFをコードするDNA分子の発現によって産生され、ここで、該宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、および昆虫細胞からなる群より選択される細胞を含む、項目１に記載の薬学的組成物。
（６）前記第２のポリペプチドが、全長KGFを含む、項目１に記載の薬学的組成物。
（７）前記第２のポリペプチドが、全長KGFポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントを含む、項目１に記載の薬学的組成物。
（８）前記第２のポリペプチドが、宿主細胞においてKGFをコードするDNA分子の発現によって産生され、ここで、該宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、および昆虫細胞からなる群より選択される細胞を含む、項目１に記載の薬学的組成物。
（９）薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、項目１に記載の薬学的組成物。
（１０）上皮組織を修復する方法であって、修復されるべき該組織に、項目１に記載の薬学的組成物を適用する工程を包含する、方法。
（１１）前記上皮組織が、皮膚、胃内膜、および腸内膜からなる群より選択される、項目１０に記載の方法。
（１２）前記薬学的組成物が、局所、経口、皮内、皮下、管腔内、胃内、および腹腔内からなる群より選択される様式で適用される、項目１０に記載の方法。
（１３）上皮細胞の損傷を修復または予防する方法であって、保護または修復されるべき該細胞に、PDGFを含む薬学的組成物およびKGFを含む組成物を適用する工程を包含する、方法。
（１４）PDGFを含む前記薬学的組成物およびKGFを含む前記薬学的組成物が、同一の薬学的組成物である、項目１３に記載の方法。
（１５）PDGFおよびKGFの適用が、同時である、項目１３に記載の方法。
（１６）上皮細胞の損傷を修復する方法であって、該上皮細胞に、第１のDNA分子および第２のDNA分子を含む薬学的組成物を適用する工程を包含し、ここで、該第１のDNA分子がPDGFをコードする第１のヌクレオチド配列を含み、そして該第２のDNA分子がKGFをコードする第２のヌクレオチド配列を含む、方法。
（１７）前記第１のDNA分子が、分泌リーダーコードヌクレオチド配列をさらに含み、ここで、該分泌リーダーが、PDGFの分泌に十分である、項目１６に記載の方法。
（１８）前記第１のDNA分子が、分泌リーダーコードヌクレオチド配列をさらに含み、ここで、該分泌リーダーが、KGFの分泌に十分である、項目１６に記載の方法。
（１９）前記第１および第２のDNA分子が、同一のプラスミド上に存在する、項目１６に記載の方法。
（２０）前記第１および第２のDNA分子が、別のプラスミド上に存在する、項目１６に記載の方法。
（２１）前記第１のDNA分子が、リポソーム中にカプセル化される、項目１６に記載の方法。
（２２）前記第２のDNA分子が、リポソーム中にカプセル化される、項目１６に記載の方法。
（２３）上皮細胞の予防および修復のための、項目１に記載の薬学的組成物およびその使用のための説明書を備えた、キット。
（２４）第１のDNA分子および第２のDNA分子を含むキットであって、ここで、該第１のDNA分子は、PDGFをコードする第１のヌクレオチド配列を含み、そして該第２のDNA配列は、KGFをコードする第２のヌクレオチド配列を含む、キット。
（２５）インシュリン様増殖因子(IGF)の生物学的活性を有する第３のポリヌクレオチドをも含む、項目１に記載の薬学的組成物。
（２６）IGFが、IGF-1およびIGF-2からなる群より選択されるIGFを含む、項目２５に記載の薬学的組成物。
（２７）インシュリン様増殖因子結合タンパク質(IGFBP)の生物学的活性を有する第４のポリヌクレオチドをも含む、項目２５に記載の薬学的組成物。
（２８）前記IGFBPが、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5、およびIGFBP-6からなる群より選択されるIGFBPを含む、項目２７に記載の薬学的組成物。
（２９）前記第３のポリペプチドが、全長IGFを含む、項目２５に記載の薬学的組成物。
（３０）前記第３のポリペプチドが、IGFの生物学的に活性なフラグメントを含む、項目２５に記載の薬学的組成物。
（３１）前記第４のポリペプチドが、全長IGFBPを含む、項目２７に記載の薬学的組成物。
（３２）前記第４のポリペプチドが、IGFBPの生物学的に活性なフラグメントを含む、項目２７に記載の薬学的組成物。
（３３）前記第３のポリペプチドが、宿主細胞においてIGFをコードするDNA分子の発現によって産生され、ここで、該宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、および昆虫細胞からなる群より選択される細胞を含む、項目２５に記載の薬学的組成物。
（３４）前記第４のポリペプチドが、宿主細胞においてIGFBPをコードするDNA分子の発現によって産生され、ここで、該宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、および昆虫細胞からなる群より選択される細胞を含む、項目２７に記載の薬学的組成物。
（３５）薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、項目２５に記載の薬学的組成物。
（３６）薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、項目２７に記載の薬学的組成物。
（３７）上皮組織を修復する方法であって、修復されるべき該組織に項目２５に記載の薬学的組成物を適用する工程を包含する、方法。
（３８）上皮組織を修復する方法であって、修復されるべき該組織に項目２７に記載の薬学的組成物を適用する工程を包含する、方法。
（３９）前記上皮組織が、皮膚、胃内膜、および腸内膜からなる群より選択される組織を含む、項目３７に記載の方法。
（４０）前記上皮組織が、皮膚、胃内膜、および腸内膜からなる群より選択される組織を含む、項目３８に記載の方法。
（４１）前記薬学的組成物が、局所、経口、皮内、皮下、管腔内、胃内、および腹腔内からなる群より選択される様式で適用される、項目３９に記載の方法。
（４２）前記薬学的組成物が、局所、経口、皮内、皮下、管腔内、胃内、および腹腔内からなる群より選択される様式で適用される、項目４０に記載の方法。
（４３）上皮細胞の損傷を修復または予防する方法であって、保護または修復されるべき該細胞に、項目１３に記載の薬学的組成物を適用する工程を包含し、そしてIGFを含む組成物をさらに包含する、方法。
（４４）上皮細胞の損傷を修復または予防する方法であって、保護または修復されるべき該細胞に、項目４３に記載の薬学的組成物を適用する工程を包含し、そしてIGFBPを含む組成物をさらに包含する、方法。
（４５）上皮細胞の損傷を修復する方法であって、該上皮細胞に、第１のDNA分子、第２のDNA分子、および第３のDNA分子を含む薬学的組成物を適用する工程を包含し、ここで、該第１のDNA分子はPDGFをコードする第１のヌクレオチド配列を含み、該第２のDNA分子はKGFをコードする第２のヌクレオチド配列を含み、そして該第３のDNA分子はIGFをコードする第３のヌクレオチド配列を含む、方法。
（４６）上皮細胞の損傷を修復する方法であって、該上皮細胞に、第１のDNA分子、第２のDNA分子、第３のDNA分子、および第４のDNA分子を含む薬学的組成物を、適用する工程を包含し、ここで、該第１のDNA分子はPDGFをコードする第１のヌクレオチド配列を含み、該第２のDNA分子はKGFをコードする第２のヌクレオチド配列を含み、該第３のDNA分子はIGFをコードする第３のヌクレオチド配列を含み、そして該第４のDNA分子はIGFBPをコードする第４のヌクレオチド配列を含む、方法。
（４７）第１のDNA分子、第２のDNA分子、および第３のDNA分子を含むキットであって、ここで、該第１のDNA分子はPDGFをコードする第１のヌクレオチド配列を含み、該第２のDNA分子はKGFをコードする第２のヌクレオチド配列を含み、そして該第３のDNA分子はIGFをコードする第３のヌクレオチド配列を含む、キット。
（４８）第１のDNA分子、第２のDNA分子、第３のDNA分子、および第４のDNA分子を含むキットであって、ここで、該第１のDNA分子はPDGFをコードする第１のヌクレオチド配列を含み、該第２のDNA分子はKGFをコードする第２のヌクレオチド配列を含み、該第３のDNA分子はIGFをコードする第３のヌクレオチド配列を含み、そして該第４のDNA分子はIGFBPをコードする第４のヌクレオチド配列を含む、キット。
（４９）クリーム、フォーム、注射溶液、スプレー、ゲルマトリックス、スポンジ、点滴剤、および洗浄液からなる群より選択される組成物を含む、項目１に記載の薬学的組成物。
（５０）クリーム、フォーム、注射溶液、スプレー、ゲルマトリックス、スポンジ、点滴剤、および洗浄液からなる群より選択される組成物を含む、項目２５に記載の薬学的組成物。
（５１）クリーム、フォーム、注射溶液、スプレー、ゲルマトリックス、スポンジ、点滴剤、および洗浄液からなる群より選択される組成物を含む、項目２７に記載の薬学的組成物。
【００１３】
本発明の１つの目的によれば、本明細書中では、上皮細胞の損傷の処置または予防のための薬学的組成物が提供され、この組成物は、血小板由来増殖因子(PDGF)の生物学的活性を有する第１のポリペプチド、および角質細胞増殖因子(KGF)の生物学的活性を有する第２のポリペプチドを含有する。
【００１４】
本発明の１つの目的によれば、本明細書中では、上皮細胞の損傷の処置または予防のための薬学的組成物が提供され、この組成物は、血小板由来増殖因子(PDGF)の生物学的活性を有する第１のポリペプチド、角質細胞(KGF)の生物学的活性を有する第２のポリペプチド、およびインシュリン様増殖因子-1(IGF-I)の生物学的活性を有する第３のポリペプチドを含有する。
【００１５】
また、本発明の別の目的によれば、本明細書中で記載する本発明の薬学的組成物を含む、上皮細胞の損傷を処置および予防するためのキットが提供される。
【００１６】
本発明のさらなる目的によれば、上皮細胞に上記の薬学的組成物を適用することによって、上皮細胞の損傷を処置または予防する方法が提供される。
【００１７】
本発明の別の目的によれば、第１のヌクレオチド配列はPDGFをコードしそして第２のヌクレオチド配列はKGFをコードするように、第１のヌクレオチド配列を含む第１のDNA分子および第２のヌクレオチド配列を含む第２のDNA分子を含む薬学的組成物を、上皮細胞に適用することによってこの上皮細胞の損傷を処置または予防するための、薬学的組成物が提供される。
【００１８】
本発明の別の目的によれば、第１のヌクレオチド配列はPDGFをコードし、第２のヌクレオチド配列はKGFをコードし、そして第３のヌクレオチド配列はIGFをコードするように、第１のヌクレオチド配列を含む第１のDNA分子、第２のヌクレオチド配列を含む第２のDNA分子、および第３のヌクレオチド配列を含む第３のDNA分子を含む薬学的組成物を、上皮細胞に適用することによってこの上皮細胞の損傷を処置または予防するための、薬学的組成物が提供される。
【００１９】
薬学的組成物はまた、インシュリン様増殖因子結合タンパク質(IGFBP)の生物学的活性を有する第４のポリヌクレオチドを含み得る。
【００２０】
本発明の別の実施態様は、上皮組織を修復する方法であり、本方法は、修復されるべき組織に、KGF、PDGF、およびオルターナティブにIGFまたはIGFおよびIGFBPを含む薬学的組成物を適用する工程を包含する。
【００２１】
本発明のなお別の目的は、上皮細胞の損傷を修復または予防する方法によって達成される。本方法は、保護または修復されるべき細胞に、KGF、PDGFおよびIGFを含み、そしてIGFBPを含む組成物をさらに含む薬学的組成物を適用する工程を包含する。
【００２２】
本発明の別の目的は、保護または修復されるべき上皮細胞に、KGF、PDGF、およびIGFを含み、そしてIGFBPを含む組成物をさらに含む薬学的組成物を適用する工程を包含する、上皮細胞の損傷を修復または予防する方法によって達成される。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、上皮細胞に、第１のDNA分子、第２のDNA分子、および第３のDNA分子を含む薬学的組成物を適用する工程を包含する、この上皮細胞の損傷を修復する方法によって達成され、ここで、第１のDNA分子はPDGFをコードする第１のヌクレオチド配列であり、第２のDNA分子は、KGFをコードする第２のヌクレオチド配列であり、そして第３のDNA分子はIGFをコードする第３のヌクレオチド配列である。
【００２４】
本発明のなおさらなる目的は、上皮細胞に、第１のDNA分子、第２のDNA分子、第３のDNA分子、および第４のDNA分子を含む薬学的組成物を適用する工程を包含する、この上皮細胞の損傷を修復する方法によって達成され、ここで、第１のDNA分子はPDGFをコードする第１のヌクレオチド配列であり、第２のDNA分子は、KGFをコードする第２のヌクレオチド配列であり、第３のDNA分子はIGFをコードする第３のヌクレオチド配列であり、そして第４のDNA分子はIGFBPをコードする第４のヌクレオチド配列を含む。
【００２５】
本発明の別の目的は、第１のDNA分子、第２のDNA分子、および第３のDNA分子を有するキットによって達成され、ここで、第１のDNA分子はPDGFをコードする第１のヌクレオチド配列であり、第２のDNA分子はKGFをコードする第２のヌクレオチド配列であり、そして第３のDNA分子は、IGFをコードする第３のヌクレオチド配列である。
【００２６】
本発明の最後の目的は、第１のDNA分子、第２のDNA分子、第３のDNA分子、および第４のDNA分子を有するキットによって達成され、ここで、第１のDNA分子はPDGFをコードする第１のヌクレオチド配列であり、第２のDNA分子はKGFをコードする第２のヌクレオチド配列であり、第３のDNA分子は、IGFをコードする第３のヌクレオチド配列であり、そして第４のDNA分子はIGFBPをコードする第４のヌクレオチド配列である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
好ましい実施態様の詳細な説明
この開示は、本明細書において、科学文献、公開された特許または特許出願のような以前に公開された研究を引用する。すべてのこのような公開された研究は、本明細書中に参考として援用される。本発明は以下の定義に照らしてより良く理解され得る。
【００２８】
定義
本明細書中に明白に提供されない限り、用語「血小板由来増殖因子」または「PDGF」は、PDGFＡ鎖ポリペプチドおよびPDGFＢ鎖ポリペプチドを含み、そしてAA、BB、およびABダイマー、ならびにその生物学的に活性なフラグメント、アナログ、および誘導体を含む（例えば、米国特許第5,187,263号；Waterfieldら、Nature  304:35-39  (1983)；Wangら、J.  Biol.  Chem.  259:10645-48  (1984)；Antoniadesら、Biochem.  Pharm.  33:2833-38  (1984)；およびWestermarkら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  83:7197-7200  (1986)；米国特許第5,219,759号に記載される）。
【００２９】
また、本明細書中に明白に提供されない限り、用語「角質細胞増殖因子」または「KGF」はまた、任意の成熟ポリペプチドならびにその生物学的に活性なフラグメント、アナログ、および誘導体をいう（例えば、WO  90/08771号およびWO  95/01434号に記載に記載される）。
【００３０】
本明細書において用いられる用語「インシュリン様増殖因子」は、それらの実質的に精製された形態、天然の形態、組換え生産された形態、または化学的に合成された形態のIGF-IおよびIGF-IIを包含し、そしてIGF活性および／またはIGFレセプターに結合する能力を保持する、その生物学的に活性なフラグメント、アナログ、ムテイン（Ｃ末端欠失ムテインを含む）、および誘導体を含む（例えば、EP  135  094号、WO  85/00831号、米国特許第4,738,921号、WO  92/04363号、米国特許第5,158,875号、EP  123  228号、およびEP  128  733号に記載される）。IGFのアナログまたはフラグメントのアナログは、実質的にその特性に影響しない、１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、または置換により改変されている天然IGFを含む。好ましくは、アナログは、天然IGFに比較して増加した活性を有する。より好ましくは、少なくとも２倍の増加、最も好ましくは、少なくとも７〜10倍の増加。例えば、アナログは、保存的アミノ酸置換を含み得る。IGFアナログはまた、WO  91/04282号に記載のような、１つ以上のペプチド模倣物（peptide  mimic）(「ペプトイド」)を有するペプチドを含む。IGFムテインは、所望の特徴を生じる（例えば、システイン残基を非ジスルフィド結合形成アミノ酸で置換する）ように変化された１つ以上のアミノ酸を有するポリペプチド改変体である。ムテイン、アナログ、および誘導体は、従来の技術を使用して生成され得る。例えば、PCR変異誘発が使用され得る。以下の議論はDNAに言及するが、この技術はまたRNAでの適用を見出すことが理解される。PCR技術の例は、WO  92/22653号に記載される。アナログ、ムテイン、および誘導体を作製するための別の方法は、Wells,  Gene,  (1985)  34:315により記載される技術に基づくカセット変異誘発である。
【００３１】
用語「インシュリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）」は、IGF結合タンパク質に結合することが同定される結合タンパク質をいう（例えば、Keiferら、J.  Biol.  Chem.  266:9043-9  (1991)、Camacho-Hubnerら、J.  Biol.  Chem.  267:11949-56  (1992)、McCuskerおよびClements,  THE  INSULIN  LIKE  GROWTH  FACTORS:STRUCTURE  AND  BIOLOGICAL  FUNCTIONS,  Oxford  Univ.  Press,  N.Y.  110-150頁  (1992)に記載および同定される）。
【００３２】
「PDGFの生物学的活性を有する」ポリペプチドは、皮膚の真皮層の細胞の増殖を優先的に刺激する、同一または増加した能力を有するポリペプチドをいう。このようなポリペプチドは、完全長PDGF、PDGFのフラグメント、アミノ酸の置換、欠失もしくは付加を有するPDGFのアナログ、またはPDGFの誘導体であり得る（例えば、米国特許第5,149,792号およびEP  458  959  B1号；ならびに米国特許第4,769,328号；同第4,801,542号；同第4,766,073号；同第4,849,407号；同第4,845,075号；同第4,889,919号；同第5,045,633号；および同第5,128,321号に記載されるもの）。
【００３３】
「KGFの生物学的活性を有する」ポリペプチドは、皮膚の表皮層の細胞の増殖を優先的に刺激する、同一または増加した能力を有するポリペプチドをいう。このようなポリペプチドは、WO  90/08771号およびWO  95/01434号に記載のように、完全長KGF、KGFのフラグメント、アミノ酸の置換、欠失もしくは付加を有するKGFのアナログ、またはKGFの誘導体であり得る。
【００３４】
「IGFの生物学的活性を有する」ポリペプチドは、インシュリン様効果（例えば、WO  93/98826号に記載のような、それが結合するレセプターの細胞質ドメイン内の特異的なチロシン残基のリン酸化の刺激、または例えば、いくつかの場合では、EP  0  128  733号に記載のような、特定の細胞に対するマイトジェン効果のような）の可能な増殖因子として作用する、同一または増加した能力を有するポリペプチドをいう。このようなポリペプチドは、完全長IGF、IGFのフラグメント、アミノ酸の置換、欠失、もしくは付加を有するIGFのアナログ、またはIGFの任意の誘導体であり得る。
【００３５】
「IGFBPの生物学的活性を有する」ポリペプチドは、IGFを結合し、そしてIGFが生物学的効果を有し得る組織および細胞にIGFを輸送することにより、IGF結合タンパク質として作用する、ほぼ同一または増加した能力を有するポリペプチドをいう。現在少なくとも６つの公知のIGFBPが存在し、その多くは他のIGFBPとは顕著に異なるので、所定のIGFBPの生物学的活性に関する特定の質は、IGF結合タンパク質の全体の群を必ずしも含まない。従って、IGFBPの生物学的活性は、他のIGFBPに対するいくらかの類似性を有し得るが、それを独特のIGFBPとして同定する差違もまた有し得る。
【００３６】
「完全長PDGF」または「成熟PDGF」および「完全長KGF」または「成熟KGF」および「完全長IGF」または「成熟IGF」および「完全長IGFBP」または「成熟IGFBP」は、ヒトまたは他の哺乳動物組織において見出されるようなそれぞれの天然ポリペプチドをいう。
【００３７】
PDGF、KGF、IGF、およびIGFBPタンパク質に関して、本明細書における用語「アナログ」は、その短縮体（truncation）、改変体、対立遺伝子変異体、および誘導体をいう。具体的に言及しない限り、これらの用語は「成熟」KGFまたは「成熟」PDGF、「成熟」IGFまたは「成熟」IGFBPの生物活性を包含する。従って、ヒトまたは非ヒト供給源のいずれに由来するにしても、成熟タンパク質と同一であるか、または少なくとも60％、好ましくは70％、より好ましくは80％、そして最も好ましくは90％の成熟タンパク質に対する配列同一性を含むポリペプチドが、この定義内に含まれる。本明細書におけるアナログは、タンパク質の生物活性を有する、１つ以上のペプチド模倣物（ペプトイドとしても知られる）を有するペプチドをさらに含む。１つ以上のアナログアミノ酸（例えば、非天然アミノ酸などを含む）を含むポリペプチド、置換結合を有するポリペプチド、ならびに当該分野で公知の他の改変（天然に生じる、および天然に生じないの両方）もまた定義内に含まれる。用語ポリペプチドはまた、ポリペプチドの発現後修飾（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など）を排除しない。
【００３８】
本明細書において、「改変体」および「誘導体」はアミノ酸の置換、欠失、または挿入を含む。アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換または非必須アミノ酸残基を除去する（例えば、グリコシル化部位、リン酸化部位、アセチル化部位を変化させるか、または機能のために必要でない１つ以上のシステイン残基の置換もしくは欠失によりミスフォールディングを最小にする）ための置換であり得る。保存的アミノ酸置換は、置換されるアミノ酸の一般的な電荷、疎水性／親水性、および／または立体的なかさを保存する置換であり、例えば、以下の群のメンバー間の置換は保存的置換である：Gly/Ala、Val/Ile/Leu、Asp/Glu、Lys/Arg、Asn/Gln、Ser/Cys/ThrおよびPhe/Trp/Tyr。
【００３９】
本明細書において用いられる用語「ポリヌクレオチド」は、DNA分子、RNA分子、またはその相補鎖をいう。ポリヌクレオチド分子は一本鎖または二本鎖であり得る。
【００４０】
本明細書において用いられる「治療有効量」は、所望の結果（これは本発明の場合は、上皮組織の修復である）を達成するために有効である、組成物の量をいう。その量は単回用量中であるかまたは一連の用量の一部としてであり得る。正確な量は、被験体の年齢、大きさ、体重、および健康、処置されるべき症状の性質および重篤度に依存して、被験体毎に変動する。治療的に有効な正確な量を事前に特定することは不可能である。しかし、所定の状況のための有効量は、慣例的な実験によるか、または本明細書中に提供される情報に基づいて組成物を投与している人の経験に基づいて、決定され得る。用量が比較的広い範囲内であり得ることが予想される。
【００４１】
本明細書における「薬学的に受容可能なキャリア」は、組成物を受けている個体に有害な抗体の産生をそれ自体は誘導しない任意のキャリアをいう。適切なキャリアは代表的には、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび不活性ウイルス粒子のような、大きな、穏やかに代謝される高分子である。このようなキャリアは当業者に周知である。薬学的に受容可能な賦形剤の十分な議論は、REMINGTON'S  PHARMACEUTICAL  SCIENCES（Merck  Pub.  Co.,  N.J.  1991）において見出され得る。例示的な薬学的に受容可能なキャリアは、塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などのような無機酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などのような有機酸の塩）を含み得る。
【００４２】
本明細書における「薬学的組成物」は、水、生理食塩水、グリセロール、またはエタノールのような１つ以上の成分をさらに含み得る。さらに、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝化物質、安定化剤、抗酸化剤などのような補助物質が、このような組成物中に存在し得る。本明細書における薬学的組成物は、局所的に塗布されるクリームとして、あるいは液体溶液もしくは懸濁液、または注射のための液体ビヒクル中の溶液もしくは懸濁液のために適切な固体形態として調製され得る。本明細書における薬学的組成物は、リポソーム中またはDepoFoamR中に被包されたもののようなリポソーム形態で調製され得る（例えば、米国特許第5,442,120号；WO  95/13796号；およびWO  91/14445号に記載される）。
【００４３】
本明細書において用いられる「同時投与」は、KGFおよびPDGFの、本発明の方法に従う、互いに組み合わせての投与、KGF/PDGFおよびIGFの同時投与、ならびにKGF/PDGF/IGF/IGFBPの同時投与を意味する。同時投与はまた、IGFとも組み合わせたPDGF/KGFの組み合わせ、またはIGFBPとも組み合わせたPDGF/KGF/IGFの組み合わせの投与を意味する。同時投与は、同時であり得るか（例えば、KGFおよびPDGFの混合物、またはPDGF、KGF、およびIGFの混合物、またはIGFおよびIGFBPを投与することによる）、あるいは薬剤の別々の（例えば、短い期間内の）投与により達成され得る。同時投与はまた、KGFおよびPDGFの連続投与、またはKGF、PDGFおよびIGFの連続投与、またはKGF、PDGF、ならびにIGFおよびIGFBPの同時投与の連続投与を含む。また、これらすべての投与の場合において（例えば、KGFおよびPDGFの投与の場合において）、２つのうち一方は予防的に投与され得、他方はその後処置のために、予防的投与後の合理的な期間内に投与される。例えば、KGF、PDGF、およびIGF、またはIGFおよびIGFBPの投与の場合において、１つまたは２つまたは３つが予防的に投与され得、そして１つまたは２つまたは３つがその後処置のために、予防的投与後の合理的な期間内に投与され得る。投与または同時投与のための投薬処置は、単回用量スケジュールまたは多回用量スケジュールであり得る。
【００４４】
用語「キット」は、特定された材料を含む包装をいい、そして材料の使用のための印刷された説明書を含む。例えば、本発明の方法のためのキットは、PDGFおよびKGFポリペプチドを別々にもしくは混合して、またはPDGFおよびKGFをコードするDNAを別々にもしくは混合して、またはDNAおよびポリペプチド（例えば、PDGFのDNAおよびKGFのポリペプチド）の組み合わせとして含み得る。また、例えば、本発明の方法のためのキットは、PDGF、KGF、およびIGFポリペプチドを別々にもしくは混合して、またはPDGF、KGF、およびIGFをコードするDNAを別々にもしくは混合して、またはDNAおよびポリペプチドの組み合わせで（例えば、PDGFおよびKGFのDNA、IGFのポリペプチド）含み得る。また、例えば、本発明の方法のためのキットは、PDGF、KGF、ならびにIGFおよびIGFBPポリペプチドを別々にもしくは混合して、またはPDGF、KGF、ならびにIGF  IGFBPをコードするDNAを別々にもしくは混合して、またはDNAおよびポリペプチドの組み合わせで（例えば、PDGFおよびKGFのDNA、IGFのポリペプチドおよびIGFBPのポリペプチド）含み得る。「印刷された説明書」は、紙またはその他の媒体に書かれるか印刷され得るか、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、CD-ROMなどのような電子媒体に付され得る。キットはまた、プレート、チューブ、ディッシュ、希釈剤、溶媒、洗浄液またはその他の従来の試薬を含み得る。
【００４５】
本発明者らは、本明細書中に開示するように、PDGFおよびKGFの組み合わせ、またはその生物学的に活性なフラグメント、アナログもしくは誘導体が、PDGFまたはKGF単独よりも、上皮細胞損傷の処置または予防においてさらに有効であるということを見出した。さらに、本発明者らは、本明細書において、PDGF/KGFの組み合わせへのIGFの付加が、３つの薬剤のいずれか単独により期待され得るものを大いに上回って上皮細胞損傷の処置または予防をさらに改善することを見出し；そしてさらに、本発明者らは、本明細書において、PDGF/KGFの組み合わせへのIGFおよびIGFBPの付加が、４つの薬剤のいずれか単独により期待され得るものを大いに上回って、そしてPDGF/KGFの組み合わせ、またはIGF/IGFBPの組み合わせの投与により誘導される上皮細胞損傷に対する改善に加えてさえ、上皮細胞損傷の処置または予防をさらに改善することを見出した。
【００４６】
本発明の１つの実施態様において薬学的組成物は治療有効量のPDGFおよびKGFを含有する。PDGFおよびKGFの各々は、任意の従来の技術により作製され得るか、またはその天然供給源から精製され得る。本発明の好ましい実施態様において、PDGFおよびKGFの各々は、それぞれのタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の別々の宿主における発現により、または単一の宿主におけるそれらの同時発現により作製される。宿主細胞は、原核生物または真核生物であり得る。例えば、PDGFは、米国特許第5,219,759号に記載のように作製され得る。KGFは、WO  95/01434号に記載のように作製され得る。他の発現系が、以下により詳細に記載されるように使用され得る。
【００４７】
本発明の１つの実施態様において、薬学的組成物は、単回用量または多回用量のいずれかで、PDGF単独およびKGF単独を含有する組成物、または単一の組成物中に一緒に混合されたPDGFおよびKGFの両方のいずれかであり得る。本発明の別の実施態様において、遺伝子治療目的のために、薬学的組成物は、PDGFをコードするポリヌクレオチド単独を含有する組成物、KGFをコードするポリヌクレオチド単独を含有する組成物、または単一の組成物中に一緒に混合された両方のポリヌクレオチドであり得る。
【００４８】
別々に維持される場合、PDGFおよびKGFの組成物は、別々にまたは同時期に投与され得る。組成物の直接送達は、一般に、注射（皮下、皮内、腹腔内、管腔内、胃内、腸内、静脈内、または筋内のいずれか）により達成される。投与の他の様式としては、経口および肺投与、坐剤、ならびに経皮塗布が挙げられる。投薬処置は、単回用量スケジュールまたは多回用量スケジュールであり得る。
【００４９】
本発明の別の実施態様において、薬学的組成物は、治療有効量のPDGF、KGF、およびIGFを含有する。PDGF、KGF、およびIGFの各々は、任意の従来の技術により作製され得るか、またはその天然供給源から精製され得る。本発明の好ましい実施態様において、PDGF、KGF、およびIGFの各々は、それぞれのタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の別々の宿主における発現により、または単一の宿主におけるそれらの同時発現により作製される。宿主細胞は、原核生物または真核生物であり得る。IGFは、米国特許第4,738,921号に記載のように作製され得る。IGFはまた、Li,  PNAS,  (1983)  80:2216-2220に記載のように、固相法により合成され得る。この方法において、IGF-Iのペプチド配列は、アミノ酸残基をカップリングすることにより組み立てられ得る。
【００５０】
別々に維持される場合、PDGF、KGF、およびIGFの組成物は、別々にまたは同時期に投与され得る。組成物の直接送達は、一般に、注射（皮下、皮内、腹腔内、管腔内、胃内、腸内、静脈内、または筋内のいずれか）により達成される。投与の他の様式としては、経口および肺投与、坐剤、ならびに経皮塗布が挙げられる。投薬処置は、単回用量スケジュールまたは多回用量スケジュールであり得る。
【００５１】
なお別の実施態様において、薬学的組成物は、治療有効量のPDGF、KGF、およびIGFBPをともなうIGFを含有する。PDGF、KGF、ならびにIGFおよびIGFBPの各々は、任意の従来の技術により作製され得るか、またはその天然供給源から精製され得る。本発明の好ましい実施態様において、PDGF、KGF、ならびにIGFおよびIGFBPの各々は、それぞれのタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の別々の宿主における発現により、または単一の宿主におけるそれらの同時発現により作製される。宿主細胞は、原核生物または真核生物であり得る。
【００５２】
別々に維持される場合、PDGF、KGF、IGF、およびIGFBPの組成物は、別々にまたは同時期に投与され得る。組成物の直接送達は、一般に、注射（皮下、皮内、腹腔内、管腔内、胃内、腸内、静脈内、または筋内のいずれか）により達成される。投与の他の様式としては、経口および肺投与、坐剤、ならびに経皮塗布が挙げられる。投薬処置は、単回用量スケジュールまたは多回用量スケジュールであり得る。
【００５３】
IGFは、Biochem.  and  Biophys.  Res.  Comm.,  (1990)  169:832-839（IGF  II）およびCell  Regulation,  (1990)  1:197-213,（IGF  II）、およびBiotechnology  News,  (1983)  3:1-3（IGF-IおよびIGF-II）に記載のように、従来の組換えDNA技術により作製され得る。例えば、IGFは、米国特許第4,738,921号に記載のように、E.  coliにおいて、trpE遺伝子との融合タンパク質として、改変トリプトファンオペロンの制御下で産生され得る。あるいは、IGFは、EP  478  333号に記載のように、E.  coliにおいて、水疱性口内炎ウイルス（VSV）プロモーターおよびプロテクター（protector）配列の制御下で合成され得る。本明細書における発現のために使用されるE.  coli発現系は、米国特許第5,158,875号に記載のように改変されて、IGFタンパク質の適正なフォールディングを可能にするための改変された正に荷電したリーダー配列を含み得る。さらに、IGFは、タンパク質産物の分泌およびタンパク質分解的プロセッシングを指向させるシグナル配列に連結されたIGFコード配列を有するメチロトローフ性酵母形質転換体において産生され得る。本明細書において適切なシグナル配列としては、WO  92/04363号に記載の、プロテアーゼ欠損P.  pastoris株におけるS.  cerevisiaeα接合因子プレプロ配列が挙げられる。IGF-IIの産生のためのDNA構築物は、WO  89/03423号に記載のように、作製されそしてE.  coliにおいて発現され得る。組換えIGF-IIの合成はまた、EP  434  605号（これは、共有結合された外来部分を有し、そしてＮ末端結合メチオニンを欠く組換えIGF-IIの産生に関する）に記載のプロトコルに従うことにより達成され得る。IGFはまた、EP  123  228号および米国特許出願第06/922,199号に記載のように、酵母において作製され得る。本明細書において適切である組換えDNA技術を使用してIGFを産生する別の方法は、Biotechnology  News,  (1983)  10:1-3に記載のとおりである。IGF-IまたはIGF-IIコード配列は、ウイルス性または環状プラスミドDNAベクター中に挿入されて、ハイブリッドベクターが形成され得、そして得られるハイブリッドベクターは、宿主微生物（例えば、細菌細胞または酵母細胞）を形質転換するために使用され得る。EP  135  094号に記載のように、形質転換された微生物は、適切な栄養条件下で増殖させられて、IGFを発現し得る。IGFはまた、EP  434  625号に記載のように作製され得る。
【００５４】
IGFBPは、任意の公知のIGFBP（例えば、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5、およびIGFBP-6）であり得る。IGFBPは、Brinkmanら、EMBO  J.  7:2417-2423  (1988)、Mohanら、Proc.  Natl.  Acad  Sci.  USA  86:8338-42  (1989)、米国特許第5,407,913号、WO  92/12243号、92/03471号、92/03470号、WO  92/03469号、およびBrewerら、Biochem.  Biophys.  Res.  Commun.  152:1289-97  (1988)に記載のように作製され得る。
【００５５】
本発明の１つの実施態様において、薬学的組成物は、単回用量または多回用量のいずれかで、PDGF単独、KGF単独、IGF単独、およびIGFBPをともなうIGFを含有する組成物、または一緒に混合された４つのうちの任意の２つならびに第３および第４単独、または一緒に混合された４つのうちの任意の３つおよび第４単独、または単一の組成物中に一緒に混合された４つすべてのいずれかであり得る。本発明の別の実施態様において、遺伝子治療目的のために、薬学的組成物は、PDGFをコードするポリヌクレオチド単独を含有する組成物、KGFをコードするポリヌクレオチド単独を含有する組成物、IGFをコードするポリヌクレオチド単独を含有する組成物、IGFおよびIGFBPのみを含有する組成物、または単一の組成物中に一緒に混合された４つすべてのヌクレオチドであり得る。
【００５６】
別々に維持される場合、PDGF、KGF、IGF、およびIGFBPをともなうIGFの組成物は、別々にまたは同時期に投与され得る。さらに、各々の濃度は、因子の強度、および患者の必要性に依存して、異なり得る。組成物の直接送達は、一般に、注射（皮下、皮内、腹腔内、管腔内、胃内、腸内、静脈内、または筋内のいずれか）により達成される。投与の他の様式としては、経口および肺投与、坐剤、ならびに経皮塗布が挙げられる。投薬処置は、単回用量スケジュールまたは多回用量スケジュールであり得る。
【００５７】
PDGF、KGF、IGFまたはIGFBPが、ポリペプチドとして投与される場合（単一の組成物中で一緒に、または複数の組成物中で）、ポリペプチドは、ポリペプチドのために適切な任意の発現系により発現され得る。
【００５８】
例示的な発現系が、PDGF、KGF、IGF、およびIGFBPのポリペプチドを生成するための、または遺伝子治療プロトコルにおける適用のためのそれらをコードするポリヌクレオチドをクローン化するために以下に列挙される。
【００５９】
細菌細胞における発現
細菌発現系は、本発明の構築物とともに用いられ得る。細菌における使用のための制御エレメントには、プロモーター(必要に応じて、オペレーター配列を含む)、およびリボソーム結合部位が含まれる。有用なプロモーターには、糖代謝酵素(例えば、ガラクトース、ラクトース(lac)、およびマルトース)由来の配列が含まれる。さらなる例として、生合成酵素(例えば、トリプトファン(trp)、βラクタマーゼ(bla)プロモーター系、バクテリオファージλPL、およびT7)由来のプロモーター配列が挙げられる。さらに、tacプロモーターのような合成プロモーターが使用され得る。βラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系は、Changら、Nature  (1978)  275:615、およびGoeddelら、Nature  (1979)  281:544に記載され；アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系は、Goeddelら、Nucleic  Acids  Res.  (1980)  8:4057  およびEP  36,776に記載され、そしてtacプロモーターのようなハイブリッドプロモーターは、米国特許第4,551,433号、およびde  Boerら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  (1983)  80:21-25に記載される。しかし、真核生物タンパク質の発現に有用な他の公知の細菌プロモーターもまた、適切である。当業者は、このようなプロモーターを、例えば、Siebenlistら、Cell  (1980)20:269に記載されるように、任意の必要な制限部位を供給するためのリンカーまたはアダプターを使用して、本発明のPDGFおよびKGFコード配列に作動可能に連結し得る。細菌系で使用するためのプロモーターはまた、一般に、標的ポリペプチドをコードするDNAに作動可能に連結されているシャインダルガーノ(SD)配列を含む。天然の標的ポリペプチドシグナル配列を認識せずそしてプロセシングしない原核生物宿主細胞については、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、lpp、または熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列によって置換され得る。プラスミドpBR322由来の複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に適切である。
【００６０】
前述の系は、特にEscherichia  coliに適合する。しかし、細菌宿主での使用のための多数の他の系には、とりわけ、Bacillus  spp.、Streptococcus  spp.、Streptomyces  spp.、P.  aeruginosaのようなPseudomonas種、Salmonella  typhimurium、またはSerratia  marcescansのようなグラム陰性またはグラム陽性生物が含まれる。外来DNAをこれらの宿主に導入するための方法には、代表的には、CaCl2、または２価カチオンおよびDMSOのような他の薬剤の使用が挙げられる。DNAはまた、Sambrookら、(1989)（前出）に一般的に記載される、エレクトロポレーション、核注入、またはプロトプラスト融合によって細菌細胞中に導入され得る。これらの例は、例示であって、限定しない。好ましくは、宿主細胞は、最少量のタンパク質分解酵素を分泌する。あるいは、クローニングのインビトロ方法(例えば、PCRまたは他の核酸ポリメラーゼ反応)が適切である。
【００６１】
本発明のPDGFの発現のためにもまた有用であるのは、EP  0  622  456-A1（本明細書中で参考として援用される）に記載されるベクターであり、これは細菌細胞における選択および自律複製のためのDNAを開示する。
【００６２】
本発明の標的ポリぺプチドを産生するために使用される原核生物細胞は、Sambrookら（前出）に一般的に記載されるように、適切な培地中で培養される。
【００６３】
酵母細胞における発現
発現ベクターおよび形質転換ベクター(染色体外レプリコンまたは組み込みベクターのいずれか)が、多くの酵母中への形質転換のために開発されている。例えば、発現ベクターは、とりわけ、以下の酵母について開発されている：  Hinnenら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  (1978)  75:1929;  Itoら、J.  Bacteriol.  (1983)  153:163に記載されるSaccharomyces  cerevisiae;  Kurtzら、Mol.  Cell.  Biol.  (1986)  6:142に記載されるCandida  albicans；Kunzeら、J.  Basic  Microbiol.  (1985)25:141に記載されるCandida  maltosa；Gleesonら、J.  Gen.  Microbiol.(1986)  132:3459およびRoggenkamp  ら、Mol.  Gen.  Genet.  (1986)  202:302に記載されるHansenula  polymorpha；Dasら、J.  Bacteriol,  (1984)  158:1165に記載されるKluyveromyces  fragilis；De  Louvencourtら、J.  Bacteriol.  (1983)  154:737およびVan  den  Bergら、Bio/Technology(1990)8:135に記載されるKluyveromyces  lactis;  Kunzeら、J.  Basic  Microbiol.  (1985)  25:141に記載されるPichia  guillerimondii；Creggら、Mol.  Cell.  Biol.  (1985)  5:3376および米国特許第4,837,148号および同第4,929,555号に記載されるPichia  pastoris；BeachおよびNurse,  Nature  (1981)  300:706に記載されるSchizosaccharomyces  pombe；ならびにDavidowら、Curr.  Genet.  (1985)  10:380およびGaillardinら、Curr.  Genet.(1985)  10:49に記載されるYarrowia  lipolytica、Ballanceら、Biochem.  Biophys.  Res.  Commun.  (1983)  112:284-289；Tilburnら、Gene  (1983)  26:205-221およびYeltonら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  (1984)  81:1470-1474に記載されるA.  nidulans、およびKellyおよびHynes,  EMBO  J.  (1985)  4:475479に記載されるA.  nigerのようなAspergillus宿主；EP  0  244  234に記載されるTrichoderma  reesia、ならびにWO  91/00357に記載される、例えば、Neurospora,  Penicillium,  Tolypocladiumのような糸状菌。
【００６４】
酵母ベクターのための制御配列は、公知であり、そしてEP  0  284  044に記載されるアルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)、EP  0  329  203に記載されるエノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース-6-ホスフェートイソメラーゼ、グリセルアルデヒド-3-ホスフェート-デヒドロゲナーゼ(GAPまたはGAPDH)、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、3-ホスホグリセレートムターゼ、およびピルベートキナーゼ(PyK)  のような遺伝子由来のプロモーター領域を含む。酵母PHO5遺伝子(酸性ホスファターゼをコードする)はまた、Myanoharaら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  (1983)  80:1に記載されるように、有用なプロモーター配列を提供する。酵母宿主での使用に適切な他のプロモーター配列としては、Hitzemanら、J.  Biol.  Chem.  (1980)  255:2073に記載される3-ホスホグリセレートキナーゼ、またはHessら、J.  Adv.  Enzyme  Reg.  (1968)  7:149およびHollandら、Biochemistry(1978)  17:4900に記載される、他の解糖酵素(例えば、ピルベートデカルボキシラーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、およびホスホグルコースイソメラーゼ)のプロモーターが挙げられる。増殖条件によって制御される転写のさらなる利点を有する誘導性酵母プロモーターとしては、上記のリストおよび他(アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用を担う酵素のプロモーター領域を含む)に由来するプロモーターが挙げられる。酵母発現での使用に適切なベクターおよびプロモーターは、Hitzeman、EP  0  073  657にさらに記載される。酵母エンハンサーはまた、酵母プロモーターとともに有利に使用される。さらに、天然には存在しない合成プロモーターもまた、酵母プロモーターとして機能する。例えば、１つの酵母プロモーターの上流活性化配列(UAS)は、別の酵母プロモーターの転写活性化領域と連結され得、合成ハイブリッドプロモーターを作製し得る。このようなハイブリッドプロモーターの例として、米国特許第4,876,197号および同第4,880,734号に記載される、GAP転写活性化領域に連結されたADH調節配列が挙げられる。ハイブリッドプロモーターの他の例としては、EP  0  164  556に記載される、GAPまたはPyKのような解糖酵素遺伝子の転写活性化領域と合わせられた、ADH2、GAL4、GAL10、またはPH05遺伝子のいずれかの調節配列からなるプロモーターが挙げられる。さらに、酵母プロモーターは、酵母RNAポリメラーゼに結合しそして転写を開始する能力を有する非酵母起源の天然に存在するプロモーターを含み得る。
【００６５】
酵母発現ベクターに含まれ得る他の制御エレメントは、例えば、Hollandら、J.  Biol.  Chem.  (1981)  256:1385に記載される、GADPH由来およびエノラーゼ遺伝子由来のターミネーター、および分泌のためのシグナル配列をコードするリーダー配列である。適切なシグナル配列をコードするDNAは、EP  0  012  873およびJP  62,096,086に記載される酵母インベルターゼ遺伝子、ならびに米国特許第4,588,684号、同第4,546,083号、および同第4,870,008号、ならびにEP  0  324  274、およびWO  89/02463に記載されるα因子遺伝子のような分泌酵母タンパク質の遺伝子に由来し得る。あるいは、インターフェロンリーダーのような非酵母起源のリーダーはまた、EP  0  060  057に記載されるように、酵母での分泌を提供する。
【００６６】
外来DNAを酵母宿主に導入する方法は、当該分野で周知であり、そして代表的には、スフェロプラストまたはアルカリカチオンで処理したインタクトな酵母細胞の形質転換のいずれかを含む。酵母への形質転換は、Van  Solingenら、J.  Bact.  (1977)  130:946およびHsiaoら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  (1979)  76:3829に記載される方法に従って行われ得る。しかし、細胞へDNAを導入するための他の方法（例えば、核注入、エレクトロポレーション、またはプロトプラスト融合)もまた、一般に、Sambookら、前出に記載されるように使用され得る。
【００６７】
酵母分泌のために、天然の標的ポリペプチドシグナル配列が、酵母インベルターゼ、α因子、または酸性ホスファターゼリーダーによって置換され得る。２μプラスミド起点由来の複製起点は、酵母に適切である。酵母での使用に適切な選択遺伝子は、Kingsmanら、Gene  (1979)  7:141またはTschemperら、Gene  (1980)  10:157に記載される酵母プラスミド中に存在するtrp1遺伝子である。trp1遺伝子は、トリプトファン中での増殖能を欠く酵母の変異株のための選択マーカーを提供する。同様に、Leu2-欠損酵母株(ATCC  20,622または38,626)が、Leu2遺伝子を保有する公知のプラスミドによって相補される。
【００６８】
酵母における本発明のポリペプチドの細胞内産生のために、酵母タンパク質をコードする配列が、PDGFまたはKGFポリペプチドのコード配列に連結され得、発現の際に酵母細胞によって細胞内で切断され得る融合タンパク質を産生し得る。このような酵母リーダー配列の例は、酵母ユビキチン遺伝子である。
【００６９】
昆虫細胞における発現
バキュロウイルス発現ベクター(BEV)は、発現されるべき外来遺伝子のコード配列がウイルス遺伝子(例えば、SmithおよびSummers、米国特許第4,745,051号に記載されるポリヘドリン)の代わりに、バキュロウイルスプロモーターの後ろに挿入されている、組換え昆虫ウイルスである。
【００７０】
本明細書中の発現構築物は、昆虫細胞系の感染または形質転換のための中間体として有用なDNAベクター、バキュロウイルス転写プロモーターをコードするDNAを一般に含み、必要に応じて、しかし好ましくは、所望のタンパク質の分泌を指向させ得る昆虫シグナルDNA配列が下流に続く、ベクター、および外来タンパク質をコードする外来遺伝子の挿入のための部位を含み、シグナルDNA配列および外来遺伝子はバキュロウイルスプロモーターの転写制御下に置かれており、本明細書中の外来遺伝子はPDGFおよびKGFポリペプチドのコード配列である。
【００７１】
本明細書中での使用のためのプロモーターは、一般に昆虫(例えば、Lepidoptera、Diptera、Orthoptera、Coleoptera、およびHymenoptera目)に感染する500を超える任意のバキュロウイルスに由来する、バキュロウイルス転写プロモーター領域であり得、例えば、Autographo  calfornica  MNPV、Bombyx  mori  NPV、rrichoplusia  ni  MNPV、Rachlplusia  ou  MNPV、またはGalleria  mellonella  MNPVのウイルスDNAが含まれるが、これらに限定されない。従って、バキュロウイルス転写プロモーターは、例えば、バキュロウイルス即時初期遺伝子IEIまたはIENプロモーター；39Kおよび、遅延初期遺伝子を含有するHindIIIフラグメントからなる群より選択されるバキュロウイルス遅延初期遺伝子プロモーター領域との組合せの即時初期遺伝子；またはバキュロウイルス後期遺伝子プロモーターであり得る。即時初期プロモーターまたは遅延初期プロモーターは、転写エンハンサーエレメントで増強され得る。
【００７２】
本明細書中での使用に特に適切なものは、Friesenら、(1986)「バキュロウイルス遺伝子発現の調節」：THE  MOLECULAR  BIOLOGY  OF  BACULOVIRUSES  (W.  Doerfler編)；EP  0  127  839およびEP  0  155  476に記載される、バキュロウイルスの強力なポリヘドリンプロモーター(これは、DNAインサートの高レベルの発現を指向させる)、および、Vlakら、J.  Gen.  Virol.  (1988)69:765-776に記載される、p10タンパク質をコードする遺伝子由来のプロモーターである。
【００７３】
本明細書中での使用のためのプラスミドはまた、通常、ポリヘドリンポリアデニル化シグナル(Millerら、Ann.  Rev.  Microbiol.  (1988)42:177に記載される)、ならびにE.  coliでの選択および増殖のための原核生物アンピシリン耐性(amp)遺伝子および複製起点を含む。適切なシグナル配列をコードするDNAがまた含まれ得、そしてそれは一般に、分泌される昆虫またはバキュロウイルスタンパク質の遺伝子(例えば、バキュロウイルスポリヘドリン遺伝子)(Carborellら、Gene  (1988)  73:409に記載される)、ならびに以下をコードする遺伝子由来のシグナル配列のような哺乳動物シグナル配列に由来する：ヒトαインターフェロン(Maedaら、Nature  (1985)  315:592-594に記載される)；ヒトガストリン放出ペプチド(Lebacq-Verheydenら、Mol.  Cell.  Biol.  (1988)  8:3129に記載される)；ヒトIL-2(Smithら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  (1985)  82:8404に記載される)；マウスIL-3(Miyajimaら、Gene(1987)58:273に記載される)；およびヒトグルコセレブロシダーゼ(Martinら、DNA  (1988)  7:99に記載される)。
【００７４】
多数のバキュロウイルス株および変異体、ならびに宿主(例えば、Spodoptera  frugiperda(毛虫)、Aedes  aegypti(蚊)、Aedes  albopictus(蚊)、Drosophila  melanogaster(ショウジョウバエ)、およびBombyx  mori宿主細胞)由来の対応する許容性の昆虫宿主細胞が、同定され、そして本明細書中で使用され得る。例えばLuckowら、Bio/Technology(1988)  6:47-55、Millerら、GENETIC  ENGINEERING  (Setlow,  J.  K.ら編)、第８巻(Plenum  Publishing,  1986)、277-279頁、およびMaedaら、Nature,  (1985)  315:592-594の記載を参照のこと。種々のこのようなウイルス株は、公共に入手可能である(例えば、Autographa  californica  NPVのL-1変異体およびBombyx  mori  NPVのBm-5株)。このようなウイルスは、Spodoptera  frugiperda細胞のような宿主細胞のトランスフェクションのためのウイルスとして使用され得る。
【００７５】
ポリヘドリンプロモーターに加えて、他のバキュロウイルス遺伝子は、バキュロウイルス発現系において有利に用いられ得る。これらには、それらが発現される間のウイルス感染の期によって、即時初期(α)、遅延初期(β)、後期(γ)、または超後期(very  late)(δ)が含まれる。これらの遺伝子の発現は、おそらくは転写調節の「カスケード」機構の結果として、連続的に起こる。従って、即時初期遺伝子は、他のウイルス機能の非存在下で感染の直後に発現され、そして、生じる遺伝子産物の１つ以上は、遅延初期遺伝子の転写を誘導する。次に、いくつかの遅延初期遺伝子産物は、後期遺伝子の転写を誘導し、そして最終的には、超後期遺伝子は、１つ以上のより初期のクラスからの既に発現されている遺伝子産物の制御下で発現される。この調節カスケードの１つの比較的良く規定されている成分は、Autographo  calfornica多核体病ウイルス(AcMNPV)の好ましい即時初期遺伝子であるIEIである。IEIは、他のウイルス機能の非存在下で発現され、そして遅延初期クラスのいくつかの遺伝子(好ましい39K遺伝子(GuarinoおよびSummers、J.  Virol.  (1986)  57:563-571およびJ.  Virol.  (1987)  61:2091-2099に記載される)ならびに後期遺伝子(GuarinoおよびSummers、Virol.  (1988)  162:444-451に記載される)を含む)の転写を刺激する産物をコードする。
【００７６】
上記の即時初期遺伝子は、遅延初期カテゴリーのバキュロウイルス遺伝子プロモーター領域と組み合わせて使用され得る。即型初期遺伝子とは異なり、このような遅延初期遺伝子は、即時初期遺伝子または遺伝子産物のような、他のウイルス遺伝子または遺伝子産物の存在を必要とする。即時初期遺伝子の組合せは、39KまたはバキュロウイルスゲノムのHindIIIフラグメント上に見出される遅延初期遺伝子プロモーターの１つのような、任意のいくつかの遅延初期遺伝子プロモーター領域と共に作製され得る。本発明の場合では、39Kプロモーター領域は、発現されるべき外来遺伝子に連結され得、その結果、発現はIEIの存在によってさらに制御され得る(L.  A.  GuarinoおよびSummers  (1986a)、前出；GuarinoおよびSummers  (1986b)  J.  Virol,.  (1986)  60:215-223、およびGuarinoら、(1986c),  J.  Virol.  (1986)  60:224-229に記載される)。
【００７７】
さらに、即時初期遺伝子と遅延初期遺伝子プロモーター領域との組合せを使用する場合、異種遺伝子の発現の増強は、遅延初期遺伝子プロモーター領域との直接的なシス連関でのエンハンサー配列の存在によって実現される。このようなエンハンサー配列は、即時初期遺伝子またはその産物が限定されている状況における、遅延初期遺伝子発現のその増強によって特徴づけられる。例えば、GuarinoおよびSummers(1986a)、(1986b)、およびGuarinoら(1986)に記載されるように、hr5エンハンサー配列は、シスで直接的に遅延初期遺伝子プロモーター領域(39K)に連結され得、それによって、  クローン化された異種DNAの発現が増強され得る。
【００７８】
ポリヘドリン遺伝子は、超後期遺伝子として分類されている。従って、ポリヘドリンプロモーターからの転写は、未知の、しかし恐らくは多数の他のウイルスおよび細胞遺伝子産物の先の発現を必要とする。ポリヘドリンプロモーターのこの遅延発現のため、当該分野の状態のBEV、例えば、米国特許第4,745,051号で、SimthおよびSummersにより記載される例示のBEVシステムは、ウイルスゲノムの残りからの遺伝子発現の結果としてのみ、そしてウイルス感染が良好に進行した後にのみ外来遺伝子を発現する。これは、現存のBEVの使用に対する制限を意味する。新たに合成されたタンパク質をプロセッシングする宿主細胞の能力は、バキュロウイルス感染が進行するにつれて減少する。従って、ポリヘドリンプロモーターからの遺伝子発現は、新たに合成されたタンパク質をプロセッシングする宿主細胞の能力が特定のタンパク質（例えば、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子）について潜在的に小さくなるときに起こる。結果として、BEVシステムにおける分泌糖タンパク質の発現は、クローン化された遺伝子産物の不完全な分泌、それによってクローン化された遺伝子産物を細胞内に不完全なプロセッシング形態に捕獲することに起因して複雑である。
【００７９】
昆虫シグナル配列を用いて、切断されて成熟タンパク質を産生し得る外来タンパク質を発現し得ることが認識されているが、好ましくは、本発明は、哺乳動物シグナル配列（例えば、PDGFシグナル配列またはKGFシグナル配列またはIGFシグナル配列またはIGFBPシグナル配列）を用いて実施する。
【００８０】
本明細書で適切な例示の昆虫シグナル配列は、鱗翅目脂肪動員ホルモン(AKH)ペプチドをコードする配列である。AKHファミリーは、昆虫のエネルギー基質の動員および代謝を調節する短ブロックの神経ペプチドからなる。好ましい実施態様では、鱗翅目Manduca  sexta  AKHシグナルペプチドをコードするDNA配列を使用し得る。直翅目Schistocerca  gregariaの遺伝子座由来のシグナルペプチドのような他の昆虫AKHシグナルペプチドもまた有利に使用され得る。別の例示の昆虫シグナル配列は、CP1、CP2、CP3またはCP4のようなショウジョウバエ小皮タンパク質をコードする配列である。
【００８１】
現在、外来遺伝子をAcNPV中に導入するために本明細書で用いられ得る最も一般的に用いられる移入ベクターは、pAc373である。当業者に公知の多くの他のベクターもまた、本明細書で用いられ得る。バキュロウイルス/昆虫細胞発現系のための材料および方法は、Invitrogen(San  Diego  CA)のような会社からキット形態(「MaxBac」キット)で市販されている。本明細書で利用される技術は、一般に、当業者に公知であり、そしてSummersおよびSmithの  A  MANUAL  OF  METHODS  FOR  BACULOVIRUS  VECTORS  AND  INSECT  CELL  CULTURE  PROCEDURES、Texas  Agricultural  Experiment  Station  Bulletin No.1555、Texas  A  &  M  University(1987)；Smithら、Mol.Cell.Biol.(1983)3：2156、およびLuckowおよびSummers(1989)に十分に記載されている。これらは、例えば、LuckowおよびSummers、Virology(1989)17:31に記載されるように、ポリヘドリン開始コドンをATGからATTに変え、そしてこのATTから32塩基対下流にBamHIクローニング部位を導入するpVL985の使用を含む。
【００８２】
従って、例えば、本発明のポリペプチドの昆虫細胞発現には、所望のDNA配列を、公知の技術を用いて移入ベクター中に挿入し得る。昆虫細胞宿主は、野生型バキュロウイルスのゲノムDNAとともに、挿入された所望のDNAを含む移入ベクターで、通常同時トランスフェクションにより同時形質転換され得る。ベクターとウイルスゲノムは組換えられ、容易に同定および精製され得る組換えウイルスを生じる。パッケージ化された組換えウイルスを用いて、昆虫宿主細胞を感染し、PDGFおよびKGFポリペプチドを発現し得る。
【００８３】
本明細書で利用可能である他の方法は、上記で引用したSummersおよびSmith(1987)で呈示されている、昆虫細胞培養、プラスミドの同時トランスフェクションおよび調製の標準的な方法である。この参考文献はまた、AcMNPV移入ベクター中への遺伝子のクローニング、プラスミドDNA単離、AcmMNPVゲノム中への遺伝子の移入、ウイルスDNA精製、組換えタンパク質の放射能標識および昆虫培養培地の調製の標準的な方法にも関係する。ウイルスおよび細胞の培養手順は、VolkmanおよびSummers、J.Virol.(1975)19:820-832ならびにVolkmanら、J.Virol.(1976)19:820-832に記載されている。
【００８４】
哺乳動物細胞中の発現
哺乳動物細胞発現のための代表的なプロモーターには、とりわけSV40初期プロモーター、CMVプロモーター、マウス乳癌ウイルスLTRプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター(AdMLP)、および単純ヘルペスウイルスプロモーターなどが含まれる。マウスメタロチオネイン遺伝子由来のプロモーターのような他の非ウイルスプロモーターもまた、哺乳動物構築物における使用を見出す。哺乳動物発現は、プロモーターに依存して構成性または調節性(誘導性)のいずれかであり得る。代表的には、翻訳停止コドンの3'側に位置する転写停止およびポリアデニル化配列もまた存在し得る。好ましくは、PDGFまたはKGFポリペプチドコード配列の5'側に位置する翻訳開始の最適化のための配列もまた存在する。転写停止/ポリアデニル化シグナルの例は、先に引用したSambrookら(1989)に記載のような、SV40由来のシグナルを含む。スプライスドナーおよびアクセプター部位を含むイントロンもまた、本発明の構築物中に設計され得る。
【００８５】
哺乳動物構築物の発現レベルを増加するために、エンハンサーエレメントもまた本明細書で用いられ得る。例としては、Dijkemaら、EMBO J.(1985)4:761に記載されるようなSV40初期遺伝子エンハンサー、およびGormanら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982b)79:6777に記載のようなラウス肉腫ウイルスの長末端反復(LTR)由来のエンハンサー/プロモーター、およびBoshartら、Cell(1985)41:521に記載のようなヒトサイトメガロウイルスが挙げられる。哺乳動物細胞中で外来タンパク質の分泌を提供するためのシグナルペプチドをコードする配列を含むリーダー配列もまた存在し得る。好ましくは、リーダー配列がインビボまたはインビトロのいずれかで切断され得るように、リーダーフラグメントと目的の遺伝子との間にコードされるプロセッシング部位が存在する。アデノウイルス三部分リーダーは、哺乳動物細胞中で外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列の例である。
【００８６】
標的ポリペプチドをコードするDNAの哺乳動物細胞における一時的発現を提供する発現ベクターが存在する。一般に、一時的発現は、宿主細胞が発現ベクターの多コピーを蓄積し、そして次いで発現ベクターによりコードされる高レベルの所望のポリペプチドを合成するように、宿主細胞中で効率的に複製され得る発現ベクターの使用を含む。適切な発現ベクターおよび宿主細胞を含む一時的発現系は、クローン化したDNAによりコードされるポリペプチドの便利なポジティブ同定、および所望の生物学的または生理学的特性についてこのようなポリペプチドの迅速スクリーニングを可能にする。従って、一時的発現系は、標的ポリペプチド様活性を有する標的ポリペプチドのアナログおよび改変体を同定する目的に特に有用である。
【００８７】
EP  0622  456  A1に開示されるPDGF  B鎖の発現のための発現ベクターもまた、哺乳動物細胞において機能的であるウイルスプロモーターによるPDGFの発現のための本発明に有用である。
【００８８】
一旦完成すれば、哺乳動物発現ベクターを用いて任意のいくつかの哺乳動物細胞を形質転換し得る。異種ポリヌクレオチドの哺乳動物細胞中への導入方法は、当該技術分野で公知であり、そしてデキストラン介在トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン介在トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソーム中へのカプセル化、およびDNAの核への直接マイクロインジェクションを含む。哺乳動物細胞宿主系形質転換の一般的局面は、Axelにより米国特許第4,399,216号に記載されている。
【００８９】
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株もまた公知であり、そしてAmerican  Type  Culture  Collection(ATCC)から入手可能な多くの不死化細胞株を含み、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、サル腎臓細胞(COS)、ヒト肝細胞癌腫細胞(例えばHep G2)、ヒト胎児腎臓細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、マウスセルトリ細胞、イヌ腎臓細胞、バッファローラット肝臓細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝臓細胞、マウス乳癌細胞などを含むがこれらに限定されない。
【００９０】
本発明の標的ポリペプチドを産生するために用いられる哺乳動物宿主細胞は種々の培地で培養され得る。Ham's F10(Sigma)、Minimal  Essential  Medium([MEM]、Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、およびDulbecco's  Modified  Eagles's  Medium([DMEM]、Sigma)のような市販の培地が宿主細胞を培養するために好適である。さらに、HamおよびWallace、Meth.Enz.(1979)58:44、BarnesおよびSato、Anal.Biochem.(1980)102:255、米国特許第4,767,704号、同第4,657,866号、同第4,927,762号、または同第4,560,655号、WO  90/103430、WO87/00195、および米国特許再発行第30,985号に記載される任意の培地が、宿主細胞用の培養培地として用いられ得る。これらの任意の培地は、必要に応じて、ホルモンおよび/または他の生長因子(インシュリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子など)、塩類(塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸など)、緩衝液(HEPESなど)、ヌクレオシド(アデノシンおよびチミジンなど)、抗生物質(Gentamycin(tm)Ｍ薬剤)、微量元素(通常マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される)、およびグルコースまたは等価なエネルギー供給源で補充され得る。当業者に公知の他の必要な任意の補充物もまた、適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨなどのような培養条件は、発現のために選択された宿主細胞について以前に用いられている培養条件であり、そして当業者に明らかである。
【００９１】
PDGFおよびKGF、またはPDGF、KGFおよびIGF、またはPDGF、KGF、IGFおよびIGFBPの遺伝子治療投与
遺伝子治療の目的のために、PDGFおよびKGF、またはPDGF、KGFおよびIGF、またはPDGF、KGF、IGFおよびIGFBPをコードするポリヌクレオチドは、発現のために動物に投与され得る。さらに、このポリヌクレオチドは、裸のポリヌクレオチドとして投与され得るか、または送達の目的のために他のポリヌクレオチド(例えば、ウイルスベクター)と連結され得る。このようなポリヌクレオチドはまた、リポソームまたは当該分野で従来の他の送達手段にカプセル化され得る。KGF、PDGF、IGF、およびIGFBPの投与のための遺伝子治療プロトコルの使用の例を以下に詳細に記載する。
【００９２】
遺伝子治療技術を本発明に適用する場合、KGFおよびPDGFは、異なるベクターまたは同じベクターにより発現され得る；また、KGF、PDGFおよびIGFは異なるベクターまたは同じベクターにより発現され得る；また、KGF、PDGF、IGFおよびIGFBPは、異なるベクターまたは同じベクターにより発現され得る。各遺伝子産物の調節制御は異なり、そして遺伝子治療および発現の当業者は、KGFおよびPDGFの両方のための適切な調節配列、またはIGFも投与される場合は、KGF、PDGF、およびIGFのための適切な調節配列、そしてIGFBPも投与される場合は、IGFBPについても適切な調節配列を選択し得る。
【００９３】
あるいは、KGFおよびPDGFポリペプチド、およびIGFも投与される場合はIGFポリペプチド、およびIGFBPも投与される場合はIGFBPをコードする、ポリヌクレオチド配列を含むベクターは、遺伝子治療のために直接使用され得、そして標準的な遺伝子送達プロトコルを用いて投与され得る。この点に関して、KGFおよびPDGFポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、およびIGFも投与される場合はIGF、およびIGFBPも投与される場合はIGFBPをコードするヌクレオチド配列は、宿主細胞ゲノムに安定に組み込まれ得るか、または宿主細胞中の安定なエピソームエレメントに維持され得る。遺伝子送達の方法は、米国特許第5,399,346号に記載されるように、当該分野で公知である。
【００９４】
本発明の構築物の送達のための遺伝子治療ストラテジーは、インビボまたはエキソビボの様式に適切なウイルスベクターまたは非ウイルスベクターアプローチを利用し得る。このようなコード配列の発現は、内因性の哺乳動物のプロモーターまたは異種プロモーターを用いて誘導され得る。コード配列のインビボ発現は、構成的であるかまたは調節されるかのいずれかであり得る。
【００９５】
ウイルスベクターを用いる送達のために、Jolly,  Cancer  Gene  Therapy  1:51-64(1994)に記載されるように、任意の多くのウイルスベクターを使用し得る。例えば、コード配列は、Kimuraら、Human  Gene  Therapy(1994)  5:845-852に記載されるようなレトロウイルスベクター、Connellyら、Human  Gene  Therapy(1995)６:185-193に記載されるようなアデノウイルスベクター、Kaplittら、Nature  Genetics(1994)６:148-153に記載されるようなアデノウイルス随伴ウイルスベクター、およびシンドビスベクターにおける発現のために設計されたプラスミドに挿入され得る。これらのベクターとの使用に適切なプロモーターには、モロニーレトロウイルスLTR、CMVプロモーター、およびマウスアルブミンプロモーターが包含される。複製欠損の遊離ウイルスは、エキソビボでの自己細胞の形質導入後に、注射することにより産生され得、そして動物またはヒトに直接注射され得る(Zatloukalら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA(1994)91:5148-5152に記載される)。
【００９６】
改変したコード配列はまた、インビボまたはエキソビボでのポリペプチドの発現のためにプラスミドに挿入され得る。インビボ治療のために、コード配列は、組織への直接的注射により、または静脈点滴により送達され得る。この様式での使用に適切なプロモーターには、内因性プロモーターおよび異種プロモーター(例えば、CMV)が包含される。さらに、合成T7T7/T7OBプロモーターは、Chenら、(1994)  Nucleic  Acids  Res.  22:2114-2120に従って構築され得、ここで、T7ポリメラーゼは、その自己のプロモーターの調節制御下にあり、そしてまたもT7プロモーターの制御下に位置するコード配列の転写を駆動する。コード配列は、Zhuら、Science(1993)261:209-211に記載されるように、このコード配列を安定化し、そして細胞への形質導入を促進するかおよび／または標的化を提供し得る緩衝液を含む処方で注入され得る。
【００９７】
ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターのいずれかによる遺伝子治療目的のための送達の際の、インビボでのコード配列の発現は、Gossenら、  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA(1992)89:5547-5551に記載されるように、調節遺伝子発現プロモーターの使用により、最大の有効性および安全のために調節され得る。例えば、コード配列は、テトラサイクリン応答性プロモーターにより調節され得る。これらのプロモーターは、調節分子を用いる処置により、陽性または陰性の様式で調節され得る。
【００９８】
コード配列の非ウイルス送達のために、この配列は、高レベル発現のための従来の制御配列を含有する従来のベクターに挿入され得、そして次いで合成遺伝子移入分子(例えば、ポリリジン、プロタミン、およびアルブミンのような重合DNA結合カチオン)とインキュベートされ得、以下のような細胞標的化リガンドに連結され得る。アシアロオロソムコイド(WuおよびWu、J.  Biol.  Chem.(1987)262:4429-4432に記載されるように)；イシュリン(Huckedら、Biochem.  Pharmacol.  40:253-263(1990)に記載されるように)；ガラクトース(Plankら、Bioconjugate  Chem.  3:533-539(1992)に記載されるように)；ラクトース(Midouxら、Nucleic  Acids  Res.  21:871-878（1993）に記載されるように)；またはトランスフェリン(Wagnerら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  87:3410-3414(1990)に記載されるように)。他の送達系には、Nabelら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  90:11307-11311(1993)、およびPhilipら、Mol.  Cell  Biol.  14:2411-2418(1994)に記載されるように、種々の組織特異的プロモーターまたは遍在的に活性なプロモーターの制御下の遺伝子を含むDNAをカプセル化するためのリポソームの使用が包含される。さらに、使用に適切な非ウイルス送達には、Woffendinら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA(1994)91(24):11581-11585に記載される生分解的アプローチのような機械的送達系が含まれる。さらに、コード配列およびこの発現の産物は、光重合化ヒドロゲル物質の沈着によって送達され得る。コード配列の送達のために使用され得る遺伝子送達のための他の従来の方法には、例えば、米国特許第5,149,655号に記載されるような手操作遺伝子移入粒子銃の使用；米国特許第5,206,152号およびPCT出願第WO  92/11033号に記載されるような、移入された遺伝子を活性化するためのイオン化放射線の使用が含まれる。
【００９９】
本発明のペプチドおよびポリペプチド、並びにそれらのアナログまたは変異体に関する遺伝子治療技術の適用は、例えば、潰瘍のような慢性創傷、または創傷の部位の細胞が遺伝子治療プロトコルに応答性である任意の創傷を有する創傷の遺伝子治療による処置に有利である場合に行われる。
【０１００】
一般に、本発明に従う遺伝子治療は、例えば、結合対の相互作用の正常な活性を調節するために、本発明のペプチドまたはそのアナログ、変異体、あるいはドミナントネガティブの十分な量を遺伝子治療プロトコルに従って投与することによって創傷を治癒するのに有利である全ての場合において、適用され得る。創傷の症状およびこれが存在する環境に依存して、続いての投与が必要であるかもしれない。
【０１０１】
KGF、PDGF、IGF、およびIGFBPポリペプチドをコードするベクターはまた、被験体または被験体由来の細胞への送達の前に、リポソームにパッケージされ得る。脂質カプセル化は、一般に、核酸と安定に結合するかまたはそれを捕獲し、そして保持し得るリポソームを用いて達成される。脂質調製物に対する縮重DNAの比は、変化し得るが、一般には、１：１(mgのDNA：マイクロモルの脂質)程度であり、より多くの脂質でもあり得る。核酸の送達のためのキャリアとしてのリポソームの使用の総説については、HugおよびSleight、Biochim.  Biophys.  Acta.  1097:1-17(1991)；Straubingerら、Methods  of  Enzymology,  101:512-527(1983)を参照のこと。
【０１０２】
本発明に使用するためのリポソーム調製物には、カチオン性(正に荷電された)、アニオン性(負に荷電された)、および中性の調製物が含まれるが、カチオン性リポソームが特に好ましい。カチオン性リポソームは、機能的形態で、プラスミドDNA(Felgnerら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA(1987)84:7413-7416)；mRMA(Maloneら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA(1989)86:6077-6081)；および精製された転写因子(Debsら、J.  Biol.  Chem.  (1990)265:10189-10192)の細胞内送達を媒介することが示されている。
【０１０３】
カチオン性リポソームは容易に入手できる。例えば、N[1-2,3-ジオレイロキシ)プロピル]-N,N,N-トリエチルアンモニウム(DOTMA)リポソームは、Lipofectinの商標で、GIBCO  BRL,  Grand  Island,  NYから入手できる。(Felgnerら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA(1987)84:7413-7416をも参照のこと)。他の市販のリポソームには、transfectace(DDAB/DOPE)およびDOTAP/DOPE(Boerhinger)が含まれる。他のカチオン性リポソームは、当該分野で周知の技術を用いて容易に入手できる物質から調製され得る。例えば、DOTAP(1,2-ビス(オレイロキシ)-3-(トリメチルアンモニオ)プロパン)リポソームの合成の記載については、Szokaら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA(1978)75:4194-4198；PCT公報第WO  90/11092号を参照のこと。
【０１０４】
同様に、アニオン性および中性のリポソームは、例えば、Avanti  Polar  Lipids(Birmingham,  AL)から容易に入手できるか、または容易に入手できる物質を用いて容易に調製され得る。このような物質には、とりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジオレイルホスファチジルグリセロール(DOPG)、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)が含まれる。これらの物質はまた、DOTMAおよびDOTAP出発物質と適切な比率で混合され得る。これらの物質を用いてリポソームを調製するための方法は、当該分野で周知である。
【０１０５】
リポソームは、多重層ベシクル(MLV)、小さな単層ベシクル(SUV)、または大きな単層ベシクル(LUV)を含む。種々のリポソーム-核酸複合体は、当該分野で公知の方法を用いて調製される。例えば、Straubingerら、Methods  of  Immunology(1983)、101巻、512-527頁；Szokaら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA(1978)75:4194-4198；Papahadjopoulosら、Biochim.  Biophys.  Acta(1975)394:483；Wilsonら、Cell(1979)17:17；DeamerおよびBangham  Biochim.  Biophys.  Acta(1976)443:629；Ostroら、Biochem.  Biophys.  Res.  Commun.(1977)76:836；Fraleyら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA(1979)76:3348；EnochおよびStrittmatter  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA(1979)76:145；Fraleyら、J.  Biol.  Chem.(1980)255:10431；SzokaおよびPapahadjopoulos  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA(1978)75:145；およびSchaefer-Ridderら、Science(1982)215:166を参照のこと。
【０１０６】
リポソームは、薬学的に受容可能なキャリアの定義に含まれる。用語「リポソーム」とは、例えば、米国特許第5,422,120号、WO  95/13796、WO  94/23697、WO  91/14445およびEP  524,968  B1に記載されるリポソーム組成物をいう。リポソームは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのための、またはこれらの２つの組み合わせのための薬学的なキャリアであり得る。治療剤は、リポソームに結合され得るか、またはヒドロゲルポリマー、およびリポソームによって結合またはカプセル化されたヒドロゲルポリマー(またはヒドロゲルポリマーの成分)に結合され得る。
【０１０７】
組換えベクター(リポソームにカプセル化されたか否かに関わらず)は、上記の薬学的組成物において投与され得る。薬学的組成物は、十分な遺伝的物質を含有して、治療有効量の上記のアナログ(単数または複数)を産生する。本発明の目的のために、有効な用量は、投与される個体において、約0.05mg/kg〜約50mg/kgのDNA構築物である。
【０１０８】
一旦処方されると、本発明の組成物は、被験体に直接投与され得るか、あるいは、上記のベクターの場合、被験体由来の細胞にエキソビボで送達され得る。エキソビボ送達および形質転換された細胞の被験体への再移植のための方法は、当該分野で公知であり、そして例えば、WO93/14778に記載されている。一般に、このような方法には、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中のポリヌクレオチドのカプセル化、およびDNAの核への直接的マイクロインジェクションが含まれ、これらの全ては、当該分野で周知である。
【０１０９】
本発明の治療的配合物の投与は、例えば、ゲルマトリックス、スポンジ、滴下および洗浄において、局所用クリーム、フォーム、注入、エアロゾルスプレーにより達成され得る。投与は、例えば、局所、経口、皮内、皮下、管腔内、胃内、および腹腔内の投与により、特定の処置に適切な治療剤の組み合わせから調合した選択された組成物の適切な処方を用いて行われ得る。
【０１１０】
本発明の治療剤は、患者の処置に治療的に有効なプロトコルのプロセスにおいて、治療的に有効な用量および量で投与され得る。投与される最初のおよび続く全ての用量は、患者の年齢、体重、症状、および処置される疾患、創傷、障害または生物学的状態に依存する。投与のための用量およびプロトコルは、治療剤に依存して変化し、そして用量はまた、選択された投与方法(例えば、局所的または全身的投与)に依存する。
【０１１１】
治療的配合物が適用される創傷は、内部または外部であり得、そして創傷を示す任意の組織(例えば、内皮組織)に指向し得る。IGFの局所的投与のために、Tarnowら、Scand  J.  Plast  Reconstr  Hand  Surg.  28:255-259(1994)に記載の、IGFの局所的産生を誘導する酸化亜鉛処方物が適用され得る。本発明の治療的配合物の投与は、治療剤の任意の組み合わせを用いて、例えば、PDGFおよびKGFを投与し、続いてIGFBPと共にIGFを投与することにより、またはPDGF、KGF、IGF、およびIGFBPを同時もしくは近接する時間で投与することにより達成され得る。所定の創傷および特定の患者に対する各治療剤の用量は、この治療剤の最大有効用量を達成するように設計される。所定の処置に適切な用量は、処置のために選択された治療剤の特定の組み合わせに依存し得る。例えば、IGF単独では、IGFBPと共に投与されるIGFよりも効力が低いことが示されている。
【０１１２】
特定の創傷のための用量は、患者の基準により決定され、そして創傷の大きさ、損傷のタイプ、および適用される組成物に依存する。個々の治療剤の用量は、範囲内で決定されている。例えば、PDGFの有効用量は、米国特許第4,861,757号に記載されるように、局所的に適用される場合に５ng/mm２以上であり、そしてLepistoら、Biochem  Biophys  Res.  Comm.  209:393-399(1995)に記載されるように、線維芽細胞の集団に適用されるイソ型PDGF(例えば、PDGF-AA、PDGF-BB、またはPDGF-AB)は、少なくもと１ng/mlの局所的濃度から約30ng/mlの局所的濃度までであることが決定されている。PDGFは、カルボキシメチルセルロースゲル処方物において、ゲルの約10μg/gm〜約500μg/mg、約20μg/mg〜約200μg/mg、およびゲルの約30μg/mg〜100μg/mg、最適にはゲルの約100μg/mgの濃度で投与され得る。PDGFの効力は、投与された溶液の約３μg/ml溶液〜約300μg/ml溶液の範囲内で達成されている。
【０１１３】
Sotozonoら、Invest.  Opthal.  Vis.  Science  36:1524-29(1995)に記載されるように、約５μg/mlの濃度の約50μlのKGFは、内皮組織への局所的適用により創傷の治癒に有効である。米国特許第4,861,757号に記載されるように、PDGFと同時に投与される場合のIGFの有効量は、少なくとも2.5ng/mm２〜約５ng/mm２の範囲であり、IGFに対するPDGFの重量比は、約１：10〜約25：１の範囲であり、IGFに対するPDGFの最も有効な重量比は約１：１〜約２：１である。IGFと組み合わせて投与されるIGFBPは、Jyungら、Surgery  115：233-239(1994)に記載されるように、約５μgのIGFと約1.5μgのリン酸化されたIGFBPの用量レベル(IGF：IGFBPのモル比は約11：１)で創傷の治癒を増大することが示されている。
【０１１４】
ポリペプチド治療剤(例えば、PDGF、KGF、IGFおよびIGFBPポリペプチド)の投与について、用量は、適用が行われた組織１kgあたり、約５μg〜約50μgの範囲であり、また１kgあたり約50μg〜約５mg、また組織１kgあたり約100μg〜500μg、および１kgあたり約200μg〜250μgであり得る。ポリヌクレオチド治療剤の場合、例えば、遺伝子治療投与プロトコルにおいて、組織標的化投与について、患者におけるポリヌクレオチドの発現強度に依存して、PDGF、KGF、IGF、およびIGFBPコード配列を含む発現可能な構築物を含有するベクターは、遺伝子治療プロトコルにおける局所的投与について、約100ng〜約200mgのDNA、また約500ng〜50mg、また約１μg〜２mgのDNA、約５μgのDNA〜約500μgのDNAの範囲、および遺伝子治療プロトコルにおける局所的投与の間に約20μg〜100μgの範囲、および１注入または１投与あたり250μgで投与され得る。従って、作用の方法ならびに形質転換および発現の効力のような要素は、DNA治療剤の投与の究極的な効力に必要とされる用量に影響を及ぼす要因であると考えられる。より多くの発現が所望される場合、より大きな面積の組織にわたってより多量のDNAまたは連続的投与プロトコルにおいて再投与された同じ量のDNA、あるいは例えば、創傷部位に隣接または近接する異なる組織部分への数回の投与は、正の治療結果を生じるために必要であるかもしれない。全ての場合において、臨床試験の日常的な実験法は、最大の治療効果、各治療剤、各投与プロトコルのために特定の範囲を決定し、そして特定の患者への投与もまた、患者の症状および最初の投与に対する応答性に依存して、有効かつ安全な範囲内に調節される。
【０１１５】
本発明のさらなる目的、特徴、および利点は、詳細な説明から明らかになる。しかし、詳細な説明は、本発明の好適な実施態様を示すが、例示のみのために提供されることが理解されるべきである。なぜなら、本発明の精神および範囲内の種々の変更および改変は、この詳細な説明から、当業者にとって明らかになるからである。以下の実施例は、例示だけであり、そして本発明を限定することを意図しない。
【０１１６】
本発明は、ここで、特に好都合な実施態様を呈示する以下の実施例を参照して例示される。しかし、これらの実施態様は例示的であり、そしていかなるようにも本発明を限定するとして解釈されるべきではないことに注意すべきである。
【０１１７】
実施例１
二度の焼傷を、10μg/mlのKGF、30ng/mlのイソ型PDGF、10ng/mlのIGF-1、および30ng/mlのIGFBP-1を含有するスプレー処方物で処置する。スプレーを風乾させる。２時間おきの再塗布を勧める。
【０１１８】
実施例２
縫合創傷を塞ぎ、包帯をする前に、この縫合に10％のKGFおよび５％PDGFから構成される局所軟膏を塗布する。軟膏の再塗布を、１日３回行う。
【０１１９】
実施例３
５％のKGF、2.5％のPDGF、および10％のIGFBPをも含有する20％の酸化亜鉛処方物を、擦過傷、日焼けおよびすり傷に、これらの創傷をより早く治癒させるために塗布する。
【０１２０】
実施例４
リポソーム処方物を使用して、それぞれ、発現のためのベクター中のKGF、PDGF、IGFおよびIGFPB  DNAをカプセル化する。DNAの重量比は、それぞれ、10：５：2.5：7.5である。リポソーム組成物を、ゲルカプセルにおいて胃腸潰瘍の処置のために経口投与する。約１カ月の期間、毎日再投与するか、または顕著な改善が投与の頻度の減少を指示するまで投与する。