(57)【要約】【課題】  陽イオン交換液体クロマトグラフィーを用いたヘモグロビン類の測定方法に関し、特に安定型ヘモグロビンＡ１ｃを高精度で測定することが可能なヘモグロビン類の測定方法を提供する。【解決手段】  陽イオン交換液体クロマトグラフィーを用いて、アセチル化ヘモグロビン、カルバミル化ヘモグロビン、不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ、ヘモグロビンＡ、ヘモグロビンＡ２、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣからなる群より選択される少なくとも１種を測定するヘモグロビン類の測定方法であって、溶存酸素濃度が２．５ｍｇ／Ｌ以上の溶離液を用いるヘモグロビン類の測定方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
陽イオン交換液体クロマトグラフィーを用いて、アセチル化ヘモグロビン、カルバミル化ヘモグロビン、不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ、ヘモグロビンＡ、ヘモグロビンＡ２、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣからなる群より選択される少なくとも１種を測定するヘモグロビン類の測定方法であって、溶存酸素濃度が２．５ｍｇ／Ｌ以上の溶離液を用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、陽イオン交換液体クロマトグラフィーを用いたヘモグロビン類の測定方法に関し、特に安定型ヘモグロビンＡ１ｃを高精度で測定することが可能なヘモグロビン類の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有機化学、生化学、医学等の分野では、試料中の成分の分離や分取等を操作を行う機器として液体クロマトグラフィーが汎用されている。液体クロマトグラフィーは、通常、図３２に示すような構成となっており、移動相用タンク３１ａ及び３１ｂから送液された溶離液は、脱気装置（デガッサー）３２により脱気された後、マニホールド（液切換装置）３４を通り、送液ポンプ３５により圧力が掛けられ、検体用タンク３８から試料導入装置３７を介して検体が導入された後、フィルター３９を経由して分離カラム４０に導入される。そして、この分離カラム４０により試料中の各成分が分離される。分離された各成分は検出器４１によって、例えば、吸光度を測定する等によって検出され、その結果がデータ処理装置４２により処理されてクロマトグラムとして表される。また、移動相の定流量、定圧を目的として必要に応じてダンパー３６が設置される。
【０００３】
このような液体クロマトグラフィーを用いた測定方法は、血液中の糖化ヘモグロビンの測定にも用いられており、特にヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃという）は、過去１〜２カ月間の血液中の平均的な糖濃度を反映しているため、糖尿病のスクリーニング検査や糖尿病患者の血糖管理状態を把握するための検査項目として広く利用されている。なお、ＨｂＡ１ｃは、血液中のグルコースとヘモグロビンＡ（以下、ＨｂＡという）とが反応して生成された糖化ヘモグロビン（以下、ＧＨｂという）であり、可逆的に反応したものは、不安定型ＨｂＡ１ｃ（ｕｎｓｔａｂｌｅ  ＨｂＡ１ｃ）と呼ばれ、不安定型ＨｂＡ１ｃを経て不可逆的に反応したものは、安定型ＨｂＡ１ｃ（ｓｔａｂｌｅ  ＨｂＡ１ｃ）と呼ばれている。
【０００４】
通常、ヘモグロビンは２種類のサブユニット２つずつから構成される４量体のタンパク質である。ＨｂＡのサブユニットはα鎖とβ鎖であり、このβ鎖のＮ末端アミノ酸にグルコースが結合したものがＨｂＡ１ｃである。このうち過去１〜２カ月間の平均的な血糖値を良く反映しているものは、安定型ＨｂＡ１ｃであり、臨床検査分野では、安定型ＨｂＡ１ｃ値（％）を高精度に得ることができる測定法の開発が望まれている。
【０００５】
従来、ＨｂＡ１ｃの主な測定法としては、例えば、特許文献１に開示されているように、血液検体を溶血希釈して調製した試料中のヘモグロビン類を、陽イオン交換法により、ヘモグロビン成分毎に異なるプラス荷電状態の違いを利用して分離する液体クロマトグラフィーを用いた方法が行われてきた。
【０００６】
通常、陽イオン交換液体クロマトグラフィーを用い、充分な時間を掛けて溶血試料中のヘモグロビン類を分離すると、ヘモグロビンＡ１ａ（以下、ＨｂＡ１ａという）及びヘモグロビンＡ１ｂ（以下、ＨｂＡ１ｂという）、ヘモグロビンＦ（以下、ＨｂＦという）、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ及びヘモグロビンＡ０（以下、ＨｂＡ０という）の順に溶離されてくる。ここで、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ及びＨｂＡ１ｃはＨｂＡが糖化されたＧＨｂであり、ＨｂＦはα鎖とγ鎖から成る胎児性ヘモグロビンであり、ＨｂＡ０はＨｂＡを主成分とする一群のヘモグロビン成分であって、ＨｂＡ１ｃより強くカラムに保持されたものである。
【０００７】
しかしながら、従来の陽イオン交換液体クロマトグラフィーを用いた方法では、安定型ＨｂＡ１ｃから不安定型ＨｂＡ１ｃを充分に分離することができないばかりでなく、アセチル化ヘモグロビン（以下、アセチル化Ｈｂという）やカルバミル化ヘモグロビン（以下、カルバミル化Ｈｂという）等の修飾ヘモグロビンが安定型ＨｂＡ１ｃと重なって溶離してくるという問題があった。
即ち、陽イオン交換液体クロマトグラフィーによる安定型ＨｂＡ１ｃ値（％）の測定を目的として、血液検体のヘモグロビン類を測定する際、安定型ＨｂＡ１ｃの測定値に影響を与えないように、安定型ＨｂＡ１ｃと溶出挙動が近似している不安定型ＨｂＡ１ｃやアセチル化Ｈｂ及びカルバミル化Ｈｂピークを、安定型ＨｂＡ１ｃピークから分離することが困難であった。
【０００８】
これに対して、近年、カルバミル化Ｈｂ、アセチル化Ｈｂ等の修飾ヘモグロビンの分離性能を向上させ、安定型ＨｂＡ１ｃを測定できる技術が開発されており、例えば、特許文献２には、陽イオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法であって、カオトロピックイオンを含有し、かつ、ｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を持つ無機酸、有機酸及び／又はこれらの塩を含む溶離液を用いることで安定型ＨｂＡ１ｃを分離する方法が開示されている。
しかしながら、このような方法では、高度に修飾されたアセチル化Ｈｂ、カルバミル化Ｈｂを充分に分離できないという欠点があった。
【０００９】
また、特許文献３には、液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定において、尿素、界面活性剤等を含有する溶離液を用い、充填剤の平均粒子径、カラムサイズ、移動相の流速等を規定することにより、従来の方法と比較して、より安定型ＨｂＡ１ｃ分離性能を向上させる技術が開示されている。また、特許文献４には、陽イオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法において、カオトロピックイオンに加えて、尿素等を含有し、かつ、ｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を持つ無機酸、有機酸及び／又はこれらの塩を含有する溶離液を用い、更に、ヘモグロビン類の分離に用いる３種類の溶離液のｐＨ・塩濃度を規定することで、より安定型ＨｂＡ１ｃ分離性能を向上させる技術が開示されている。
【００１０】
しかしながら、特許文献３及び４に記載されている方法では、高度に修飾されたアセチル化Ｈｂ、カルバミル化Ｈｂの分離性能は格段に向上するが、溶離液の安定性が著しく低下するという欠点があった。従って、安定型ＨｂＡ１ｃの分離性能が高く、安定型ＨｂＡ１ｃを高精度で測定することができ、かつ、測定の際に用いる溶離液の保存安定性が良好なヘモグロビン類の測定方法が求められていた。
【特許文献１】特公平８−７１９８号公報
【特許文献２】特開２０００−１１１５３９号公報
【特許文献３】特開２０００−１７１４５４号公報
【特許文献４】特開２００３−１０７０６９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、上記現状に鑑み、陽イオン交換液体クロマトグラフィーを用いたヘモグロビン類の測定方法であって、特に安定型ＨｂＡ１ｃを高精度で測定することが可能なヘモグロビン類の測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、陽イオン交換液体クロマトグラフィーを用いて、アセチル化Ｈｂ、カルバミル化Ｈｂ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ、ヘモグロビンＡ２（以下、ＨｂＡ２という）、ヘモグロビンＳ（以下、ＨｂＳという）及びヘモグロビンＣ（以下、ＨｂＣという）からなる群より選択される少なくとも１種を測定するヘモグロビン類の測定方法であって、溶存酸素濃度が２．５ｍｇ／Ｌ以上の溶離液を用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法である。
以下に本発明を詳述する。
【００１３】
本発明者らは、鋭意検討した結果、従来の陽イオン交換液体クロマトグラフィー測定において、溶離液の脱気を行い、溶存酸素量を低下させることが、アセチル化Ｈｂ、カルバミル化Ｈｂ等の修飾ヘモグロビンの分離性能を低下させる大きな要因であることを見出した。そして、本発明者らは更に鋭意検討した結果、従来は極力低減させていた溶存酸素の濃度を所定の値以上とすることで、修飾ヘモグロビンを高度に分離することが可能となり、測定対象であるヘモグロビン類の測定精度が大幅に向上することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
本発明のヘモグロビン類の測定方法では、溶離液として、溶存酸素濃度が２．５ｍｇ／Ｌ以上のものを用いる。本発明では、従来の方法のように、充填剤に特殊なものを用いたり、溶離液に新たな物質を添加したりすることがないため、簡易かつ簡便な方法で測定対象であるヘモグロビン類の測定精度の大幅な向上を実現することができる。また、本発明では、測定時の溶離液の溶存酸素濃度が２．５ｍｇ／Ｌ以上であればよく、保管中の溶離液の溶存酸素濃度は特に限定されないことから、溶離液の保存安定性等に影響を与えることもない。
【００１５】
本発明において、溶離液の溶存酸素濃度を２．５ｍｇ／Ｌ以上とした場合に、分離性能が向上する理由としては、以下のことが考えられる。通常、検体に含まれるヘモグロビン類は、主に、ヘモグロビンに酸素が結合したもの（オキシヘモグロビン）である。ところが、脱気装置により脱気され、溶存酸素濃度が低下した溶離液に、ヘモグロビン類を含む検体が注入されると、酸素が結合したオキシヘモグロビンの一部が、次第に、脱酸素化された状態（デオキシヘモグロビン）に変化すると考えられる。これにより、同一成分のヘモグロビン（例えば、カルバミル化Ｈｂ）が、オキシヘモグロビンとデオキシヘモグロビンの混合状態になるため、分離性能が悪化するものと考えられる。
一方、本発明のように、溶離液の溶存酸素濃度を２．５ｍｇ／Ｌ以上とした場合は、脱酸素化が起こりにくく、デオキシヘモグロビンに対するオキシヘモグロビンの比率が非常に高くなるため、分離性能が向上するものと考えられる。
【００１６】
上記溶存酸素濃度が２．５ｍｇ／Ｌ未満であると、高度に修飾されたアセチル化Ｈｂ、カルバミル化Ｈｂを充分に分離することができず、測定対象であるヘモグロビン類の測定精度が低下する。なお、溶存酸素濃度の上限は特に限定されないが、飽和溶存酸素濃度以下とすることが好ましい。飽和溶存酸素濃度を超えて、過飽和状態とすると、測定の際、溶離液中に気泡が発生しやすくなり、その気泡が送液ポンプ中に入ることによって、溶離液の送液量が不安定となり、ヘモグロビン類測定の精度が低下することがある。
上記溶存酸素濃度の好ましい下限は３．５ｍｇ／Ｌ、好ましい上限は飽和溶存酸素濃度−０．５ｍｇ／Ｌ；より好ましい下限は４．５ｍｇ／Ｌ、より好ましい上限は飽和溶存酸素濃度−１．０ｍｇ／Ｌ；更に好ましい下限は５．５ｍｇ／Ｌ、更に好ましい上限は飽和溶存酸素濃度−１．５ｍｇ／Ｌである。
【００１７】
上記溶離液の溶存酸素濃度を２．５ｍｇ／Ｌ以上とする方法としては、例えば、脱気装置の脱気能力を調節する方法；脱気装置からカラムまでに、公知の酸素透過性を有する配管を用い、配管の長さ、太さを調整する方法；溶離液の温度を下げることで、溶離液中の飽和溶存酸素濃度を上げる方法；溶離液、脱気装置、酸素透過性を有する配管、送液ポンプ、検体注入器、カラム、検出器を含む測定系の一部の温度を下げることで、飽和溶存酸素濃度を上げる方法；脱気装置を使用しないでヘモグロビン類の測定を行う方法等を用いることができる。なお、これらの方法は、単独で用いてもよく、複数の方法を併用してもよい。具体的には、図３２に示す脱気装置３２と液切換電磁弁３４との間のチューブ３３の長さを調整する方法等を用いることができる。この方法では、脱気装置を用いることで、溶離液中の気泡の発生を抑制しつつ、溶存酸素量の増加を図ることができる。
【００１８】
上記溶存酸素濃度は、公知の溶存酸素計を用いることで測定可能であるが、より高い精度で測定するためには、大気中の酸素が測定対象に溶け込まないように、閉鎖系にする必要がある。従って、溶存酸素計としては、溶離液を流しながら、溶存酸素濃度を測定可能なフロータイプの溶存酸素計を用いることが好ましい。また、溶離液を送液する配管の素材としては、ステンレス、ＰＥＥＫ製の酸素バリア性の良い配管を用いることが好ましい。
【００１９】
上述したフロータイプの溶存酸素計の一例を図３０に示した。図３０に示すように、送液された移動相（溶離液）は、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）製等の配管７を通って、フロータイプの溶存酸素計１０の内部に導入される。そして、フロータイプ９に導入された移動相について、溶存酸素電極８によって溶存酸素濃度を計測した後、配管を通って溶存酸素計１０の外へと導出される。なお、溶存酸素計１０を設置する位置については特に限定されないが、図３２に示す送液ポンプ３５以降に設置することが好ましく、フィルター３９の前に設置することが好ましい。
【００２０】
上記溶離液は、酸解離定数（以下、ｐＫａという）が、２．１５〜６．３９及び６．４０〜１０．５０の範囲内である緩衝剤を含有することが好ましい。
上記ｐＫａが上記範囲外であると、溶離液のｐＨを、測定目的のピークを分離するのに適切な範囲とすることができず、結果として、ヘモグロビン類が変性したり、ヘモグロビン類の分離が困難となったりすることがある。
なお、上記緩衝剤としては、ｐＫａを２．１５〜６．３９及び６．４０〜１０．５０の範囲に少なくとも１つずつもつ単一の物質を用いてもよく、２．１５〜６．３９の範囲内に少なくとも１つのｐＫａをもつ物質と６．４０〜１０．５０の範囲内に少なくとも１つのｐＫａをもつ物質とを組み合わせて緩衝剤として用いてもよい。また、上記緩衝剤を複数組み合わせて用いてもよい。
【００２１】
上記緩衝剤のｐＫａの範囲は、測定目的のピークを分離するのに適切な溶離液のｐＨ付近において、より優れた緩衝能を発揮できるように、２．６１〜６．３９及び６．４０〜１０．５０の範囲内であることが好ましく、より好ましくは、２．８０〜６．３５及び６．８０〜１０．００の範囲内である。更に好ましくは、３．５０〜６．２５及び７．００〜９．５０の範囲内である。
【００２２】
上記緩衝剤としては、例えば、リン酸、ホウ酸、炭酸等の無機物のほか、カルボン酸、ジカルボン酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキシカルボン酸、アニリン又はアニリン誘導体、アミノ酸、アミン類、イミダゾール類、アルコール類等の有機物が挙げられる。また、エチレンジアミン四酢酸、ピロリン酸、ピリジン、カコジル酸、グリセロールリン酸、２，４，６−コリジン、Ｎ−エチルモルホリン、モルホリン、４−アミノピリジン、アンモニア、エフェドリン、ヒドロキシプロリン、ペリジン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、グリシルグリシン等の有機物でもよい。
【００２３】
上記カルボン酸としては、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、安息香酸等が挙げられる。上記ジカルボン酸としては、例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、マレイン酸、フタル酸、フマル酸等が挙げられる。
【００２４】
上記カルボン酸誘導体としては、例えば、β，β’−ジメチルグルタル酸、バルビツール酸、５，５−ジエチルバルビツール酸、γ−アミノ酪酸、ピルビン酸、フランカルボン酸、ε−アミノカプロン酸等が挙げられる。
【００２５】
上記ヒドロキシカルボン酸としては、例えば、酒石酸、クエン酸、乳酸、リンゴ酸等が挙げられる。上記アニリン又はアニリン誘導体としては、例えば、アニリン、ジメチルアニリン等が挙げられる。上記アミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシン、α−アラニン、β−アラニン、ヒスチジン、セリン、ロイシン等が挙げられる。
【００２６】
上記アミン類としては、例えば、エチレンジアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジエタノールアミン等が挙げられる。上記イミダゾール類としては、例えば、イミダゾール、５（４）−ヒドロキシイミダゾール、５（４）−メチルイミダゾール、２，５（４）−ジメチルイミダゾール等が挙げられる。
【００２７】
上記アルコール類としては、例えば、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−エチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール等が挙げられる。
【００２８】
また、上記緩衝剤としては、２−（Ｎ−モリホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス−（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミドジ酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）−メチルアミノ）プロパン（Ｂｉｓｔｒｉｓｐｒｏｐａｎｅ）、Ｎ−（アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−（Ｎ−モルフォリン）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン（Ｔｒｉｓ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、グリシルグリシン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、グリシン、シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等の一般にグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液といわれるものを組成する物質も使用できる。これらの物質のｐＫａを表１、２に示す。（引用文献：堀尾武一、山下仁平著、蛋白質・酵素の基礎実験法、南江堂）
【００２９】
【表１】
2007315816.tif 000002
【００３０】
【表２】
2007315816.tif 000003
【００３１】
上記溶離液中の緩衝剤の含有量は、緩衝作用がある範囲であればよく、好ましい下限は１ｍＭ、好ましい上限は１０００ｍＭである。より好ましい下限は１０ｍＭ、より好ましい上限は５００ｍＭである。また、上記緩衝剤は、単独でも複数混合して用いてもよく、例えば、有機物と無機物を混合して用いてもよい。
【００３２】
上記溶離液は、ヘモグロビン類のピーク溶出を最適化することを目的として、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、リン酸ナトリウム等の無機塩類を含有していてもよい。なお、これらの無機塩類の濃度は、特に限定されないが、好ましい下限が１ｍＭ、好ましい上限が１５００ｍＭである。
【００３３】
上記溶離液は、ｐＨ調節剤として、公知の酸、塩基を含有していてもよい。上記酸としては、例えば、塩酸、リン酸、硝酸、硫酸等が挙げられ、上記塩基としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。これらの酸、塩基の含有量は、特に限定されないが、好ましい下限は０．００１ｍＭ、好ましい上限は５００ｍＭである。
【００３４】
上記溶離液は、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン等の水溶性有機溶媒を含有していてもよい。上記有機溶媒の濃度は、塩等が析出しない程度で用いることが好ましく、好ましい上限は８０％（ｖ／ｖ）である。
【００３５】
また、上記溶離液は、アジ化ナトリウム、チモール等の防腐剤を含有していてもよく、ヘモグロビンの安定剤として、公知の安定剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤、グルタチオン、アジ化ナトリウム等の還元剤・酸化防止剤等を含有していてもよい。
【００３６】
本発明において用いる溶離液は、カオトロピックイオンを含有することが好ましい。上記カオトロピックイオンとは、化合物が水溶液に溶解したときに解離により生じたイオンであり、水の構造を破壊し、疎水性物質と水が接触したときに起こる水のエントロピー減少を抑制するものである。
【００３７】
上記カオトロピックイオンには、陰イオン及び陽イオンのカオトロピックイオンがあり、上記陰イオンのカオトロピックイオンとしては、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオン、塩化物イオン、酢酸イオン等が挙げられ、陽イオンのカオトロピックイオンとしては、バリウムイオン、カルシウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、グアニジンイオン等が挙げられる。
【００３８】
上記カオトロピックイオンの中でも、陰イオンのカオトロピックイオンとしては、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオン等を用いることが好ましく、陽イオンのカオトロピックイオンとしては、バリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオン、グアニジンイオン等を用いることが好ましい。より好ましくは、チオシアン酸イオン、過塩素酸イオン、硝酸イオン、グアニジンイオン等が用いられる。
【００３９】
上記溶離液中のカオトロピックイオンの含有量の好ましい下限は０．１ｍＭ、好ましい上限は３０００ｍＭである。０．１ｍＭ未満であると、ヘモグロビン類の測定において、分離効果が低下するおそれがあり、３０００ｍＭを超えて添加しても、ヘモグロビン類の分離効果はそれ以上向上しない。より好ましい下限は１ｍＭ、より好ましい上限は１０００ｍＭであり、更に好ましい下限は１０ｍＭ、更に好ましい上限は５００ｍＭである。
【００４０】
本発明において、ヘモグロビン類の測定を行う場合は、ｐＨの異なる少なくとも２種類以上の溶離液を用いることが好ましい。その場合、測定目的のピークを分離するにあたって用いる溶離液は、同一の緩衝剤を含有するものを用いるのが好ましいが、溶離液を切り替える際の、検出器出力のベースライン変動が、測定値に悪影響を与えなければ、必ずしもこれに限定されない。なお、溶離液のｐＨは、例えば、ｐＨ調節剤の添加量によって調節することができる。
更に、ベースライン変動をより小さくするために、上記測定目的のピークを分離するにあたって用いる溶離液は、緩衝剤の濃度も同一であるものを用いるのがより好ましい。
【００４１】
本発明において、上記溶離液を送液する方法としては特に限定されないが、ｐＨの異なる２種類以上の溶離液を用いる場合は、少なくとも溶出力の異なる３種の溶離液を用い、ＨｂＡ０を溶出するための溶離液を送液する前に、ＨｂＡ０より前に溶出されてくる各ヘモグロビン成分を分離することを目的として、該ＨｂＡ０を溶出するための溶離液以外の溶離液を送液する方法を行うことが好ましい。
なお、通常のヘモグロビン類の測定において、測定目的となるヘモグロビン類としては、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、ＨｂＦ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０等が挙げられるが、このうちＨｂＡ０より前に溶出されてくる各ヘモグロビン成分とは、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、ＨｂＦ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃのことをいう。
【００４２】
また、安定型ＨｂＡ１ｃの測定に悪影響を与える可能性のあるＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等のヘモグロビン成分を含む血液検体を測定する場合は、ＨｂＡ０成分（ピーク）として主にＨｂＡを溶出させた後、ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等を溶離させることが好ましい。これにより、ＨｂＡ０ピークからＨｂＡ以外のヘモグロビン成分を除けるため、より正確な安定型ＨｂＡ１ｃ（％）を算出できる。
なお、ＨｂＡ０を溶出するための溶離液を送液した後、ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等を溶離するために使用する溶離液としては、より溶出力の強い溶離液を使用する必要がある。
【００４３】
また、本発明のヘモグロビン類の測定方法では、溶離液を勾配溶出法又は段階溶出法によって送液し、その途中において溶出力の低い溶離液を送液することが好ましい。
【００４４】
従来のヘモグロビン類の測定方法では、分離対象成分のピークをシャープにしたり、隣り合って溶出する２つ以上のピークの分離度を向上させたりするために、複数の溶離液を用いた勾配溶出法や段階溶出法が利用されていた。
【００４５】
上記勾配溶出法は「グラジエント溶出」と呼ばれる方法であり、例えば、複数台の送液ポンプを用い、溶出力が異なる複数の溶離液の送液比率を連続的に変化させることにより送液する方法である。これにより、図２７に示すように、時間と共に溶出力が連続的に上昇するように溶出が行われる。
【００４６】
また、上記段階溶出法は「ステップワイズ溶出」と呼ばれる方法であり、例えば、１台の送液ポンプを、電磁弁等を介して複数の溶離液に連結し、電磁弁を切り替えることにより、溶出力の低い溶離液から、溶出力の高い溶離液に切り替えて送液する方法である。従って、図２８に示すように、溶出力は段階的に上昇する。
【００４７】
しかしながら、従来の勾配溶出法や段階溶出法では、溶出される各成分の性質が類似していたり、短時間で溶出することが要求されている場合、類似した性質の成分間でピークが重なり、分離度が低下するおそれがあった。
【００４８】
これに対して、勾配溶出法又は段階溶出法によって溶離液を送液するに際し、その途中、即ち、勾配溶出法又は段階溶出法により複数の溶離液を順に切り替えて送液していく途中において、溶出力が低い溶離液を送液することにより、分離対象のピーク又はピーク間の分離状態を良くすることができる。具体的には、段階溶出法の場合、溶出力の弱い溶離液から溶出力の強い溶離液に切り替えて送液した後、溶出力の弱い溶離液に切り替え、しばらくしてから溶出力の強い溶離液に切り替えて送液する方法等が挙げられる。
【００４９】
本発明の方法を段階溶出法によって行う場合の、装置の構成例を図２９に示した。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄは、各々溶出力の異なる（例えば、塩濃度、ｐＨ、極性等において異なる）溶離液であり、電磁弁１によって設定時間に各溶離液に切り替えられるように構成されている。溶離液は、送液ポンプ２により、試料注入部３から導入された試料とともにカラム４に導かれ、各成分が検出器５により検出される。各ピークの面積、高さ等はインテグレータ６により算出される。
【００５０】
本発明では、ヘモグロビン類の測定において、陽イオン交換液体クロマトグラフィーを用いる。上記陽イオン交換液体クロマトグラフィーの充填剤は、少なくとも１種以上のカチオン交換基を有している粒子よりなるものであり、例えば、高分子粒子にカチオン交換基を導入することにより得ることができる。
【００５１】
上記カチオン交換基としては、公知のものを用いることができ、例えば、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基等のカチオン交換基等が挙げられる。なお、上記カチオン交換基は、複数種導入してもよい。
【００５２】
充填剤として用いる粒子の直径の好ましい下限は０．５μｍ、好ましい上限は２０μｍであり、より好ましい下限は１μｍ、より好ましい上限は１０μｍである。
また、上記粒子の粒度分布を示す変動係数値（ＣＶ値）の好ましい上限は４０％、より好ましい上限は３０％である。なお、上記変動係数値（ＣＶ値）は、粒子径の標準偏差÷平均直径×１００から求めることができる。  
【００５３】
上記高分子粒子としては、例えば、シリカ、ジルコニア等の無機系粒子；セルロース、ポリアミノ酸、キトサン等の天然高分子粒子；ポリスチレン、ポリアクリル酸エステル等の合成高分子粒子等が挙げられる。
上記高分子粒子において、導入されるカチオン交換基以外の構成成分は、より親水性であることが好ましい。また耐圧性・耐膨潤性の点から架橋度の高いものが好ましい。
【００５４】
上記高分子粒子へのカチオン交換基の導入は、公知の方法により行うことができるが、例えば、高分子粒子を調製後、粒子が有する官能基（水酸基、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基等）に、化学反応でカチオン交換基を粒子に導入させる方法により行うことができる。
【００５５】
また、カチオン交換基を有する単量体を重合して高分子粒子を調製する方法によってもカチオン交換基を有する充填剤粒子を調製することができる。例えば、カチオン交換基含有単量体と架橋性単量体等とを混合し、重合開始剤の存在下に重合する方法等が挙げられる。
【００５６】
更に、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル等の重合性カチオン交換基含有エステルを架橋性単量体等と混合し、重合開始剤存在下で重合した後、得られた粒子を加水分解処理し、エステルをカチオン交換基に変換させる方法により、カチオン交換基を有する充填剤粒子を調製してもよい。
また、特公平８−７１９７号公報に記載のように、架橋重合体粒子を調製した後、カチオン交換基を有する単量体を添加して、重合体粒子の表面付近に、該単量体を重合させる方法により、カチオン交換基を有する充填剤粒子を調製してもよい。
【００５７】
本発明では、上記充填剤をカラムに充填して使用する。上記カラムの材質としては特に限定されず、例えば、公知のステンレス製、ガラス製、樹脂製等が挙げられる。
上記カラムのサイズとしては、内径０．１〜５０ｍｍ、長さ１〜３００ｍｍのものが好ましく、内径０．２〜３０ｍｍ、長さ５〜２００ｍｍのものがより好ましい。
【００５８】
上記充填剤のカラムへの充填方法としては、特に限定されず、公知の方法を使用できるが、特にスラリー充填法が好ましい。具体的には、例えば、充填剤粒子を溶離液等の緩衝液に分散させたスラリーを送液ポンプ等により、充填剤をカラムに圧入する方法等が挙げられる。
【００５９】
本発明に使用される陽イオン交換液体クロマトグラフィー装置としては、公知のものを使用することができ、例えば、図３２に示すように、溶離液用タンク３１、脱気装置３２、液切換電磁弁３４、送液ポンプ３５、ダンパー３６、試料導入装置３７、検体用タンク３８、フィルター３９、カラム４０、検出器４１及びデータ処理装置４２から構成されるものを用いることができる。また、カラム恒温槽等の他の付属装置が適宜付加されてもよい。なお、液切換電磁弁３４は、電磁弁を用いたマニホールド方式としてもよく、ロータリーバルブ方式等の公知の液切換装置としてもよい。
【００６０】
脱気装置３２としては、ヘモグロビン類の分離性能を向上できる溶存酸素濃度の範囲内に設定できるものであれば、公知の脱気装置を用いることができる。
本発明において用いられる脱気装置の一例を図３１に示した。脱気装置２０は、真空ポンプ２１によって、真空化することが可能な真空チャンバー２３の内部に気液分離膜２２が導入された構成となっており、真空チャンバー２３に進入した移動相（溶離液）は、気液分離膜２２によって気体のみが脱気されるような構成となっている。
【００６１】
フィルター３９としては、公知のフィルター素材で、測定成分の測定値に影響を与えないものが好ましい。具体的には例えば、不織布とろ紙とが積層されたフィルター、不織布とメンブレンフィルターとが積層されたフィルター、焼結フィルターを表面処理剤（シリコーン処理、ブロッキング剤）で処理したフィルター等を用いることができる。
【００６２】
上記フィルターの材質としては、測定成分の吸着が少ない素材が好ましく、例えば、不織布の素材としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン、レーヨン、アクリル、ココナッツファイバー、塩化ビニリデン、綿、ウール、麻、ガラス繊維等が挙げられる。
また、必要に応じて、生体試料成分の吸着を小さくするために、上記不織布の表面を少なくとも、セルロース系樹脂、フッ素系樹脂、スルホン系樹脂、ポリエチレン、エチレンのアルキル誘導体の重合体、アクリル系樹脂、ナイロン、炭化物セラミック、窒化物セラミック、珪化物セラミック、硼化物セラミック、表面がシリル化処理された二酸化珪素、ガラス及びチタンからなる群より選ばれる少なくとも１種からなるもの、又は、これらを複数組み合わせた素材で処理しても良い。
【００６３】
上記不織布の厚みの好ましい下限は０．１ｍｍ、好ましい上限は１０ｍｍであり、上記不織布の空隙率の好ましい下限は４０％、好ましい上限は９０％である。
【００６４】
上記ろ紙としては、公知のものを用いることができ、素材は特に限定されないが、セルロース、ガラス繊維、フッ素樹脂、シリカ繊維等からなるものを用いることができる。また、ろ紙の強度向上、生体試料の吸着抑制等を実現するため、公知のろ紙に特殊処理を施したものを用いることができる。具体的には例えば、湿潤強度を高めたろ紙（アドバンテック東洋社製、ウェットストレングスろ紙）等が挙げられる。上記ろ紙の保留粒子径は、生体試料中の異物を除去するため、３μｍ以下であることが好ましい。
【００６５】
上記フィルターは、不織布及びろ紙の有効ろ過面積を大きくするために、カラムから離れた側から、「支持体、不織布、ろ紙、支持体」又は「不織布、ろ紙、支持体」の順の構成にすることができる。上記支持体の形状は、不織布及びろ紙の有効ろ過面積を大きくできるものであれば特に限定されないが、メッシュ状のものが好ましい。上記支持体の素材としては、例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、ナイロン、ポリエチレンテレフタレート、金属メッシュ（ステンレス、チタン）等が挙げられる。
【００６６】
上記フィルターは、必要に応じて、シリコーンコーティングされてもよく、更に、ブロッキング試薬でブロッキング処理されていることが好ましい。上記ブロッキング試薬としては、例えば、ウシ血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン、ヘモグロビン、ミオグロビンなどの蛋白質；例えば、リン脂質等の極性脂質；例えば、ＳＤＳ、ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）などの界面活性剤などが挙げられる。
【００６７】
本発明の測定方法における、他の測定条件は、使用する測定試料、カラム等の種類によって適宜選択できるが、溶離液の流速は、好ましくは０．０５〜５ｍＬ／分、より好ましくは０．２〜３ｍＬ／分である。ヘモグロビン類の検出は、４１５ｎｍの可視光が好ましいが、特にこれのみに限定されるわけではない。測定試料は、通常、界面活性剤等溶血活性を有する物質を含む溶液により溶血された溶血液を希釈したものを用いる。試料注入量は、血液検体の希釈倍率により異なるが、好ましくは０．１〜１００μＬ程度である。
【発明の効果】
【００６８】
本発明によれば、陽イオン交換液体クロマトグラフィーを用いたヘモグロビン類の測定の際に用いる溶離液に、溶存酸素の濃度を所定の値以上とすることで、修飾ヘモグロビン等を高度に分離することが可能となり、測定対象であるヘモグロビン類の測定精度を大幅に向上させることが可能なヘモグロビン類の測定方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６９】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００７０】
（実施例１）
（１）充填剤の調製
テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４００ｇ及び２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸１５０ｇの混合物に過酸化ベンゾイル（和光純薬社製）１．５ｇを溶解した。これを４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液２５００ｍＬに分散させ、撹拌しながら窒素雰囲気下で７５℃に昇温し、８時間重合した。重合後、洗浄し乾燥した後、分級して平均粒子径６μｍの粒子を得た。
【００７１】
（２）充填剤のカラムへの充填
得られた粒子０．７ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）３０ｍＬに分散し、５分間超音波処理した後、よく撹拌した。全量をステンレス製の空カラム（内径４．６×３０ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。次いで、パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力３０ＭＰａで定圧充填した。
【００７２】
（３）溶離液Ａ、Ｂの調製
５０ｍＭリン酸緩衝液に、過塩素酸ナトリウムを６０ｍＭ添加し、ｐＨを５．３に調整して溶離液Ａとした。また、８０ｍＭリン酸緩衝液に、過塩素酸ナトリウムを３００ｍＭ添加し、ｐＨを８．０に調整して溶離液Ｂとした。
【００７３】
（４）測定試料の調製
健常人血をフッ化ナトリウム採血した全血検体から以下の試料を調製した。なお、溶血試薬として、０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）（東京化成社製）を含有するリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．０）を用いた。
（ａ）糖負荷血：全血検体に２０ｇ／Ｌのグルコース水溶液を添加し、３７℃で３時間反応させ、次いで上記溶血試薬により溶血し、９０倍に希釈して試料ａとした。
（ｂ）カルバミル化Ｈｂ含有試料：全血検体１５ｍＬに、７．５ｇ／Ｌのシアン酸ナトリウムの生理食塩水溶液１ｍＬを添加し、３７℃で２時間反応させ、次いで上記溶血試薬により溶血し、９０倍に希釈して試料ｂとした。
（ｃ）アセチル化Ｈｂ含有試料：全血検体１５ｍＬに、７．５ｇ／Ｌのアセトアルデヒドの生理食塩水溶液１ｍＬを添加し、３７℃で２時間反応させ、次いで上記溶血試薬により溶血し、９０倍に希釈して試料ｃとした。
【００７４】
（５）ヘモグロビン類の測定
得られたカラム、溶離液Ａ、Ｂ及び試料ａ〜ｃを用いて、以下の条件でヘモグロビン類の測定を行った。また、健常人血をフッ化ナトリウム採血した全血検体を上記溶血試薬により溶血し、９０倍に希釈した試料についても同様に測定した。なお、測定は、室温（２５℃）で行った。また、溶離液は２５℃に保温したものを用い、測定開始より０〜２分の間は溶離液Ａを送液し、２〜３分の間は溶離液Ｂを送液し、３〜５分の間は溶離液Ａを送液した。
【００７５】
測定装置としては、図３２に示す構成のものを用い、送液ポンプはＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）、オートサンプラはＡＳＵ−４２０（積水化学工業社製）、検出器はＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）を使用し、脱気装置３２と液切換電磁弁３４との間を送液するチューブ３３として、長さが溶離液Ａ用、溶離液Ｂ用ともに４０ｃｍ、外径３ｍｍ、内径２ｍｍのフッ素樹脂チューブ（ジーエルサイエンス社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．６０１０−３５３０５）を用いた。また、図３２の送液ポンプ３５以降で、フィルター３９の直前の位置に、図３０に示すようなフロータイプの微量溶存酸素計（ＤＯ−５５Ｇ、東亜ディーケーケー社製）を設置し、溶離液中の溶存酸素濃度を測定した。なお、測定条件は以下の通りとした。
測定条件：流速：２．０ｍＬ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μＬ
【００７６】
（実施例２〜５、比較例１〜３）
実施例１の（５）において、フッ素樹脂チューブとして表３に示す長さのものを用いた以外は、実施例１と同様にして、ヘモグロビン類の測定を行った。なお、フッ素樹脂チューブは、溶離液Ａ用、溶離液Ｂ用を同じ長さとした。
実施例１〜５及び比較例１〜３における溶存酸素濃度測定の結果を表３に示す。表３に示すように、フッ素樹脂チューブの長さと溶存酸素濃度の大きさはほぼ比例しており、フッ素樹脂チューブの長さが長いほど、溶存酸素濃度が大きいことが分かる。これは、フッ素樹脂チューブが酸素透過性を有することにより、溶離液の送液距離が長いほど、溶存酸素が多くなるためであると考えられる。
【００７７】
（測定結果）
実施例１の方法を用いて、ヘモグロビン類を測定することにより、得られたクロマトグラムを図１〜４に示す。図１は試料ａ、図２は試料ｂ、図３は試料ｃ、図４は健常人血を測定した結果である。また、ピーク１は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク２は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク３はＨｂＡ０、ピーク４はカルバミル化Ｈｂ、ピーク５はアセチル化Ｈｂを示す。
図１では、ピーク１（不安定型ＨｂＡ１ｃ）及び２（安定型ＨｂＡ１ｃ）が良好に分離されている。また、図２ではピーク４（カルバミル化Ｈｂ）が、図３ではピーク５（アセチル化Ｈｂ）がピーク２（安定型ＨｂＡ１ｃ）から良好に分離されている。
また、実施例２〜５の方法を用いて、ヘモグロビン類を測定することにより得られたクロマトグラムを図５〜２０に示す。図５〜８は実施例２の方法、図９〜１２は実施例３の方法、図１３〜１６は実施例４の方法、図１７〜２０は実施例５の方法で測定することにより、得られたクロマトグラムである。また、図５、９、１３、１７は試料ａ；図６、１０、１４、１８は試料ｂ；図７、１１、１５、１９は試料ｃ；図８、１２、１６、２０は健常人血を測定した結果である。図５〜２０に示すように、実施例２〜５においても、良好に不安定型ＨｂＡ１ｃ、カルバミル化Ｈｂピーク及びアセチル化Ｈｂピークを安定型ＨｂＡ１ｃピークから分離できたことがわかる。
【００７８】
これに対して、比較例１の方法を用いて、ヘモグロビン類を測定することにより、得られたクロマトグラムを図２１〜２４に示す。図２１は試料ａ、図２２は試料ｂ、図２３は試料ｃ、図２４は健常人血を測定した結果である。図２１では、ピーク１及び２が良好に分離された。また、図２２ではピーク４（カルバミル化Ｈｂ）が、図２３ではピーク５（アセチル化Ｈｂ）がピーク２（安定型ＨｂＡ１ｃ）から分離されていなかった。また、比較例２、３の方法を用いて、ヘモグロビン類を測定した場合も図２１〜２４と同様の結果であった。
従って、溶存酸素が少ない場合は、糖負荷血検体では、良好な分離性能が得られたが、カルバミル化Ｈｂピーク及びアセチル化Ｈｂピークを安定型ＨｂＡ１ｃピークから良好に分離することが出来なかったことがわかる。
【００７９】
図１〜２４の結果から、実施例１〜５及び比較例１〜３の方法を用いた場合における修飾ヘモグロビン（アセチル化Ｈｂ、カルバミル化Ｈｂ、不安定型ＨｂＡ１ｃ）の分離性能を評価し、表３に示した。なお、評価基準は以下の通りとした。
○：各修飾ヘモグロビンピークと安定型ＨｂＡ１ｃピークとが良好に分離されている。
△：各修飾ヘモグロビンピークと安定型ＨｂＡ１ｃピークとの分離が不完全である。
×：各修飾ヘモグロビンピークと安定型ＨｂＡ１ｃピークとの分離が不良である。
【００８０】
また、安定型ＨｂＡ１ｃの測定精度を乖離値で評価したものを表３に示した。なお、乖離値は、試料ａ〜ｃを測定したクロマトグラムから求めた安定型ＨｂＡ１ｃ値から、未修飾検体を測定したクロマトグラムから求めた安定型ＨｂＡ１ｃ値を差し引いた数値である。なお、安定型ＨｂＡ１ｃ値は、ＨｂＡ０ピークの面積に対する安定型ＨｂＡ１ｃピークの面積の比率（％）を求めることにより算出することができる。
通常、同一人の血液検体を分離性能が良好な測定方法で測定した場合は、修飾ヘモグロビン等の有無に関わらず、安定型ＨｂＡ１ｃ値は一定の数値を示す。従って、乖離値は、安定型ＨｂＡ１ｃの分離性能を示す目安となり、乖離値が大きいほど、安定型ＨｂＡ１ｃの分離性能が悪いと言うことができる。
【００８１】
（実施例６）
実施例１の（５）において、測定温度を４℃とし、溶離液は４℃で保温したものを用いるとともに、脱気装置の電源を入れず使用しなかった以外は、実施例１と同様にして、ヘモグロビン類の測定を行った。
【００８２】
（実施例７）
測定温度を２０℃として、溶離液は２０℃で保温したものを用いた以外は、実施例６と同様にしてヘモグロビン類の測定を行った。
【００８３】
（実施例８）
測定温度を４０℃として、溶離液は４０℃で保温したものを用いた以外は、実施例６と同様にしてヘモグロビン類の測定を行った。
【００８４】
（測定結果）
実施例６〜８の方法を用いて、ヘモグロビン類を測定することにより、得られたクロマトグラムは、図１７〜２０と同様のものであった。また、修飾ヘモグロビンの分離性能及び乖離値を表３に示した。これらの結果から、実施例６〜８の方法を用いた場合、良好に不安定型ＨｂＡ１ｃ、カルバミル化Ｈｂピーク及びアセチル化Ｈｂピークを安定型ＨｂＡ１ｃピークから分離できることがわかる。
【００８５】
（実施例９）
下記の操作を行った以外は、実施例１と同様にしてヘモグロビン類の測定を行った。
【００８６】
（３）溶離液Ｃ〜Ｆの調製
５０ｍＭリン酸緩衝液に、過塩素酸ナトリウムを６０ｍＭ添加し、ｐＨを５．３に調整したものを溶離液Ｃ、４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を溶離液Ｄ、２０ｍＭリン酸緩衝液に、過塩素酸ナトリウムを９０ｍＭ添加し、ｐＨを５．３に調整したものを溶離液Ｅ、及び、５０ｍＭリン酸緩衝液に、過塩素酸ナトリウムを３００ｍＭ添加し、ｐＨを８．５に調整したものを溶離液Ｆとした。
【００８７】
（４）測定試料の調製
ＡＦＳＣコントロール（ヘレナ社製）を溶血試薬により溶血し、６７倍に希釈して試料ｄとした。なお、溶血試薬としては、０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）（東京化成社製）を含有するリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．０）を用いた。
【００８８】
（５）ヘモグロビン類の測定
得られたカラム、溶離液Ｃ〜Ｆ及び試料ｄを用いて、以下の条件でヘモグロビン類の測定を行った。なお、測定は、室温（２５℃）で行った。また、溶離液は２５℃に保温したものを用い、測定開始より０〜１．７分の間は溶離液Ｃを送液し、１．７〜３．０分の間は溶離液Ｄを送液し、３．０〜３．５分の間は溶離液Ｅを送液し、３．５〜３．６分の間は溶離液Ｆを送液し、３．６〜４．０分の間は溶離液Ｃを送液した。
【００８９】
測定装置としては、図３２に示す構成で４種類の溶離液を使用できるように改良したものを用い、送液ポンプはＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）、オートサンプラはＡＳＵ−４２０（積水化学工業社製）、検出器はＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）を使用し、脱気装置３２と液切換電磁弁３４との間を送液するチューブ３３として、長さが溶離液Ｃ用、溶離液Ｄ用、溶離液Ｅ用、溶離液Ｆ用ともに４０ｃｍ、外径３ｍｍ、内径２ｍｍのフッ素樹脂チューブ（ジーエルサイエンス社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．６０１０−３５３０５）を用いた。また、図３２の送液ポンプ３５以降で、フィルター３９の直前の位置に、図３０に示すようなフロータイプの微量溶存酸素計（ＤＯ−５５Ｇ、東亜ディーケーケー社製）を設置し、溶離液中の溶存酸素濃度を測定した。なお、測定条件は以下の通りとした。
測定条件：流速：２．０ｍＬ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μＬ
【００９０】
（実施例１０、比較例４）
実施例９の（５）において、フッ素樹脂チューブとして表３に示す長さのものを用いた以外は、実施例９と同様にして、ヘモグロビン類の測定を行った。なお、フッ素樹脂チューブは、溶離液Ｃ用、溶離液Ｄ用、溶離液Ｅ用、溶離液Ｆ用を全て同じ長さとした。実施例１０及び比較例４における溶存酸素濃度測定の結果を表３に示す。
【００９１】
（測定結果）
実施例９の方法を用いて、ヘモグロビン類を測定することにより、得られたクロマトグラムを図２５に示す。図２５は試料ｄを測定した結果である。また、ピーク１１はＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂ、ピーク１２はＨｂＦ、ピーク１３は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク１４はＨｂＡ０（主にＨｂＡ）、ピーク１５はＨｂＡ２、ピーク１６はＨｂＳ、ピーク１７はＨｂＣを示す。
図２５では、ピーク１１〜１７が良好に分離されている。また、実施例１０の方法を用いて、ヘモグロビン類を測定した場合も図２５と同様の結果であった。
【００９２】
これに対して、比較例４の方法を用いて、ヘモグロビン類を測定することにより、得られたクロマトグラムを図２６に示す。図２６は試料ｄを測定した結果である。また、ピーク１１はＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂ、ピーク１２はＨｂＦ、ピーク１３は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク１４はＨｂＡ０（主にＨｂＡ）、ピーク１５はＨｂＡ２、ピーク１６はＨｂＳ、ピーク１７はＨｂＣを示す。図２６では、ピーク１１、ピーク１２は良好に分離されているが、ピーク１４〜１７は良好に分離されていなかった。
【００９３】
【表３】
2007315816.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明によれば、陽イオン交換液体クロマトグラフィーを用いたヘモグロビン類の測定方法に関し、特に安定型ＨｂＡ１ｃを高精度で測定することが可能なヘモグロビン類の測定方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】実施例１の測定条件により、試料ａの測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図２】実施例１の測定条件により、試料ｂの測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図３】実施例１の測定条件により、試料ｃの測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図４】実施例１の測定条件により、健常人血（未修飾検体）の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図５】実施例２の測定条件により、試料ａの測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図６】実施例２の測定条件により、試料ｂの測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図７】実施例２の測定条件により、試料ｃの測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図８】実施例２の測定条件により、健常人血（未修飾検体）の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図９】実施例３の測定条件により、試料ａの測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図１０】実施例３の測定条件により、試料ｂの測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図１１】実施例３の測定条件により、試料ｃの測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図１２】実施例３の測定条件により、健常人血（未修飾検体）の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図１３】実施例４の測定条件により、試料ａの測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図１４】実施例４の測定条件により、試料ｂの測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図１５】実施例４の測定条件により、試料ｃの測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図１６】実施例４の測定条件により、健常人血（未修飾検体）の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図１７】実施例５の測定条件により、試料ａの測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図１８】実施例５の測定条件により、試料ｂの測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図１９】実施例５の測定条件により、試料ｃの測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図２０】実施例５の測定条件により、健常人血（未修飾検体）の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図２１】比較例１の測定条件により、試料ａの測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図２２】比較例１の測定条件により、試料ｂの測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図２３】比較例１の測定条件により、試料ｃの測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図２４】比較例１の測定条件により、健常人血（未修飾検体）の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図２５】実施例９の測定条件により、試料ｄの測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図２６】比較例４の測定条件により、試料ｄの測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図２７】勾配溶出法における溶出力と時間との関係を示すグラフである。
【図２８】段階溶出法における溶出力と時間との関係を示すグラフである。
【図２９】段階溶出法を行う場合の装置の構成例である。
【図３０】溶存酸素計の一例を示す断面模式図である。
【図３１】脱気装置の一例を示す断面模式図である。
【図３２】一般的に使用されている液体クロマトグラフィーの概略図である。
【符号の説明】
【００９６】
１  電磁弁
２  送液ポンプ
３  試料注入部
４  カラム
５  検出器
６  インテグレータ
【図１】
2007315816.tif 000005
【図２】
2007315816.tif 000006
【図３】
2007315816.tif 000007
【図４】
2007315816.tif 000008
【図５】
2007315816.tif 000009
【図６】
2007315816.tif 000010
【図７】
2007315816.tif 000011
【図８】
2007315816.tif 000012
【図９】
2007315816.tif 000013
【図１０】
2007315816.tif 000014
【図１１】
2007315816.tif 000015
【図１２】
2007315816.tif 000016
【図１３】
2007315816.tif 000017
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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