(57)【要約】【課題】培養液を、培養容器以外のものに可能な限り接触しないように供給又は排出して、生体試料に与える影響を極力なくすこと。【解決手段】培養のために生体試料を収容する凹部２が形成された培養容器３に対して用いられ、該培養容器に重ねられて凹部を覆うものであって、凹部の底面２ａに対向する内面１ａと外面１ｂとを貫通する管路４を備え、該管路を介して培養液Ｗを凹部内に外部から供給、又は、凹部内に貯留された培養液を外部に排出するうち、少なくともいずれか一方を行う培養容器用蓋１を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養する生体試料を収容する凹部が形成された培養容器に対して用いられ、該培養容器に重ねられて前記凹部を覆う培養容器用蓋であって、
前記凹部の底面に対向する内面と外面とを貫通する管路を備え、該管路を介して培養液を前記凹部内に外部から供給、又は、凹部内に貯留された培養液を外部に排出するうち、少なくともいずれか一方を行うことを特徴とする培養容器用蓋。
【請求項２】
請求項１に記載の培養容器用蓋において、  
前記管路は、少なくとも一部が底面に垂直な方向に対して所定角度の傾きを有した状態で、前記内面から前記凹部の底面に向かって突出していることを特徴とする培養容器用蓋。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の培養容器用蓋において、  
前記管路は、少なくとも前記凹部に面した先端部分における断面積が、他の部分における断面積よりも小さくなるように形成されていることを特徴とする培養容器用蓋。
【請求項４】
請求項３に記載の培養容器用蓋において、  
前記管路は、前記先端部分のみの前記断面積が、他の部分における断面積よりも小さくなるように形成されていることを特徴とする培養容器用蓋。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載の培養容器用蓋において、  
前記管路は、前記培養液を前記凹部内に供給して貯留させる供給用管路と、凹部内に貯留された培養液を外部に排出する排出用管路とを備えていることを特徴とする培養容器用蓋。
【請求項６】
請求項５に記載の培養容器用蓋において、  
前記排出用管路は、前記供給用管路よりも前記凹部の底面に向けて先端が突出していることを特徴とする培養容器用蓋。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の培養容器用蓋において、  
前記排出用管路は、前記底面に垂直な方向に向けて移動可能とされていることを特徴とする培養容器用蓋。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項に記載の培養容器用蓋において、  
外部から照射された照明光を透過する光透過部を備えていることを特徴とする培養容器用蓋。
【請求項９】
請求項８に記載の培養容器用蓋において、  
前記管路は、前記光透過部を透過する前記照明光の光路外に配置されていることを特徴とする培養容器用蓋。
【請求項１０】
生体試料を培養しながら観察する生体試料培養システムであって、
培養する前記生体試料を収容する凹部が形成された培養容器に対して前記凹部を覆うように重ねられ、前記凹部の底面に対向する内面と外面とを貫通した状態で、培養液を前記凹部内に外部から供給する供給用管路及び前記凹部内に貯留された培養液を外部に排出する排出用管路を備えた培養容器用蓋と、
前記供給用管路を介して前記凹部内に前記培養液を供給する供給手段と、
該供給手段以上の送り容量に設定され、前記排出用管路を介して前記凹部内から前記培養液を外部に排出する排出手段とを備えていることを特徴とする生体試料培養システム。
【請求項１１】
請求項１０に記載の生体試料培養システムにおいて、  
前記排出用管路は、少なくとも一部が底面に垂直な方向に対して所定角度の傾きを有した状態で、前記内面から前記凹部の底面に向かって突出していることを特徴とする生体試料培養システム。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の生体試料培養システムにおいて、  
前記排出用管路は、少なくとも前記凹部に面した先端部分における断面積が、他の部分における断面積よりも小さくなるように形成されていることを特徴とする生体試料培養システム。
【請求項１３】
請求項１２に記載の生体試料培養システムにおいて、  
前記排出用管路は、前記先端部分のみの前記断面積が、他の部分における断面積よりも小さくなるように形成されていることを特徴とする生体試料培養システム。
【請求項１４】
請求項１０から１３のいずれか１項に記載の生体試料培養システムにおいて、  
前記排出用管路は、前記供給用管路よりも前記凹部の底面に向けて先端が突出していることを特徴とする生体試料培養システム。
【請求項１５】
請求項１０から１４のいずれか１項に記載の培養容器用蓋において、  
前記排出用管路は、前記底面に垂直な方向に向けて移動可能とされていることを特徴とする生体試料培養システム。
【請求項１６】
請求項１０から１５のいずれか１項に記載の生体試料培養システムにおいて、  
前記培養容器用蓋は、外部から照射された照明光を透過する光透過部を備えていることを特徴とする生体試料培養システム。
【請求項１７】
請求項１６に記載の生体試料培養システムにおいて、  
前記供給用管路及び前記排出用管路は、前記光透過部を透過する前記照明光の光路外に配置されていることを特徴とする生体試料培養システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞等の生体試料を培養する培養容器に蓋をする培養容器用蓋、及び、該培養容器用蓋で蓋をされた培養容器で生体試料を培養しながら観察を行う生体試料培養システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年の遺伝子解析技術の進歩に伴って、人を含む多くの生物における遺伝子配列が明らかになると共に、解析されたタンパク質等の遺伝子産物と疾病との因果関係も少しずつ解明され始めている。また、今後さらに各種タンパク質や遺伝子等を網羅的且つ統計的に解析するため、細胞を用いた様々な検査方法や装置が考えられ始めている。
通常、細胞はプラスチック製又はガラス製のディッシュやフラスコ等に播種され、インキュベータ内で培養されている。このインキュベータは、内部が例えば、二酸化炭素濃度５％、温度３７℃、湿度１００％に設定され、細胞の育成に適した環境に保たれている。更に、インキュベータは、細胞に養分を与えると共に培養に適したＰＨを保つために、２〜３日毎に培養液の交換がなされている。
【０００３】
このような培養中の細胞を観察する方法は、いくつかの方法が知られているが、その一つとして、インキュベータから上述したディッシュやフラスコ等を取り出し、位相差顕微鏡等の倒立顕微鏡を用いて観察を行う方法が知られている。
但しこの方法においては、可能な限り速やかに細胞の観察を行い、観察終了後、細胞をインキュベータ内に戻す必要がある。これは、細胞が通常環境下に長く置かれることにより、細胞の活性が損なわれるのを防止するためである。即ち、細胞の活性が不安定であると、正確な評価を行うことが困難であるためである。また、細胞をインキュベータから取り出す際は、コンタミネーション等が起こらないように十分注意して行われている。
【０００４】
また、別の細胞観察方法として、各種の細胞の培養条件を設定可能な顕微鏡観察用透明恒温培養容器を使用する方法も知られている（例えば、特許文献１参照）。
この顕微鏡観察用透明恒温培養容器は、温度調整器により所定温度に制御可能な一対の透明発熱プレート、容器内部の二酸化炭素濃度を調整するための二酸化炭素供給口、二酸化炭素排出口及びシール用パッキンにより密閉された容器内の湿度を保つための蒸発皿を有している。
この顕微鏡観察用透明恒温培養容器を使用しての観察では、容器内部の温度、二酸化炭素濃度及び湿度を制御可能であるので、細胞を培養しながら観察を行うことが可能である。例えば、透明発熱プレートの下方から対物レンズで観察することにより、細胞の培養状態の経時変化を連続的且つ簡単に観察及び記録することが可能である。
【特許文献１】特開平１０−２８５７６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記従来の方法では、以下の課題がまだ残されていた。
即ち、まず上述した倒立顕微鏡を用いての観察では、観察毎に細胞をインキュベータから出し入れする必要があるので、細胞の観察位置がインキュベータから出し入れする毎に異なってしまい、毎回同じ細胞群の観察を行うことは困難であった。
【０００６】
また、上記特許文献１に記載されている顕微鏡観察用透明恒温培養容器を使用しての観察では、細胞培養しながら観察することが可能ではあるが、容器内の培養液の交換を行った場合に、細胞の位置ズレが生じてしまっていた。そのため、やはり毎回同じ細胞群の観察を行うことが困難なものであった。即ち、この方法では、培養液の交換を要しない２〜３日位の細胞培養の観察を行うことは可能であるが、それ以上の期間、細胞培養を行う場合には、同じ細胞を追跡して観察を行うことは難しかった。
【０００７】
更に、細胞によっては基材によって性質が変化するものもあり、通常は経験的に各種細胞にそれぞれ適しているとわかっている容器を用いる。細胞でよく用いられる容器の一つに、ディッシュがあり、特に蛍光や発光観察を行うときには、ガラスボトムディッシュが常用される。しかし、通常のディッシュでは、ステージ上で培養液の交換や試薬の滴下が行えないため、一旦ステージから外してクリーンベンチに持ち込み、それぞれの操作を行う。
しかし、この方法では、細胞の位置がディッシュをステージから外すごとにずれてしまい、同じ細胞を同じものとして追跡し、その操作の前後での細胞の変化を検出することができない。特に、ディッシュのように円形のものは、回転方向に精度良く固定することが難しく、再度ステージに取り付けたときに元のような配置に再設定することが非常に難しいものであった。
【０００８】
また、新たな容器を用いる場合には、実験者はその容器の培養したい細胞に対する毒性の有無や形質転換の可能性等を予め調査する必要がある。ところがこれらの調査には、膨大な時間と手間がかかる。しかしながら、これらの細胞への影響を明らかにせずに実験を行ったとしても、容器による影響であるのか、試薬等の刺激による影響であるのか等の要因分析が不可能であり、その実験性は正確性を欠いてしまう。
【０００９】
この発明は、上記従来技術の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、培養液を、培養容器以外のものに可能な限り接触しないように供給又は排出して、生体試料に与える影響を極力なくした培養容器用蓋、及び、該培養容器用蓋を有して生体試料の蛍光、発光強度等を正確且つリアルタイムに測定することができる生体試料培養システムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の目的を達成するために、この発明は以下の手段を提供している。
請求項１に係る発明は、培養する生体試料を収容する凹部が形成された培養容器に対して用いられ、該培養容器に重ねられて前記凹部を覆う培養容器用蓋であって、前記凹部の底面に対向する内面と外面とを貫通する管路を備え、該管路を介して培養液を前記凹部内に外部から供給、又は、凹部内に貯留された培養液を外部に排出するうち、少なくともいずれか一方を行う培養容器用蓋を提供する。
【００１１】
この発明に係る培養容器用蓋においては、培養容器の凹部内で培養される生体試料に対して、内面及び外面を貫通する管路を通じて培養液を適時供給したり、外部に排出させたりすることができる。特に、上記のような蓋の管路を利用すれば、培養容器以外のものに培養液が極力接触しないように供給や排出を行えるので、生体試料に与える負担（影響）を最小限に抑えた状態で培養を行うことができる。
【００１２】
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の培養容器用蓋において、前記管路が、少なくとも一部が底面に垂直な方向に対して所定角度の傾きを有した状態で、前記内面から前記凹部の底面に向かって突出している培養容器用蓋を提供する。
【００１３】
請求項３に係る発明は、請求項１又は２に記載の培養容器用蓋において、前記管路が、少なくとも前記凹部に面した先端部分における断面積が、他の部分における断面積よりも小さくなるように形成されている培養容器用蓋を提供する。
【００１４】
請求項４に係る発明は、請求項３に記載の培養容器用蓋において、前記管路が、前記先端部分のみの前記断面積が、他の部分における断面積よりも小さくなるように形成されている培養容器用蓋を提供する。
【００１５】
請求項５に係る発明は、請求項１から４のいずれか１項に記載の培養容器用蓋において、前記管路が、前記培養液を前記凹部内に供給して貯留させる供給用管路と、凹部内に貯留された培養液を外部に排出する排出用管路とを備えている培養容器用蓋を提供する。
【００１６】
請求項６に係る発明は、請求項５に記載の培養容器用蓋において、前記排出用管路が、前記供給用管路よりも前記凹部の底面に向けて先端が突出している培養容器用蓋を提供する。
【００１７】
請求項７に係る発明は、請求項５又は６に記載の培養容器用蓋において、前記排出用管路が、前記底面に垂直な方向に向けて移動可能とされている培養容器用蓋を提供する。
【００１８】
請求項８に係る発明は、請求項１から７のいずれか１項に記載の培養容器用蓋において、外部から照射された照明光を透過する光透過部を備えている培養容器用蓋を提供する。
【００１９】
請求項９に係る発明は、請求項８に記載の培養容器用蓋において、前記管路が、前記光透過部を透過する前記照明光の光路外に配置されている培養容器用蓋を提供する。
【００２０】
請求項１０に係る発明は、生体試料を培養しながら観察する生体試料培養システムであって、培養する前記生体試料を収容する凹部が形成された培養容器に対して前記凹部を覆うように重ねられ、前記凹部の底面に対向する内面と外面とを貫通した状態で、培養液を前記凹部内に外部から供給する供給用管路及び前記凹部内に貯留された培養液を外部に排出する排出用管路を備えた培養容器用蓋と、前記供給用管路を介して前記凹部内に前記培養液を供給する供給手段と、該供給手段以上の送り容量に設定され、前記排出用管路を介して前記凹部内から前記培養液を外部に排出する排出手段とを備えている生体試料培養システムを提供する。
【００２１】
この発明に係る生体試料培養システムにおいては、培養容器の凹部内で培養される生体試料に対して、内面及び外面を貫通する管路を通じて供給手段から培養液を適時供給したり、培養液を排出手段により外部に排出させたりすることができる。特に、上記のような管路を利用すれば、培養容器以外のものに培養液が極力接触しないように供給や排出を行えるので、生体試料に与える負担（影響）を最小限に抑えた状態で培養を行うことができる。また、培養液の液面を排出用管路の先端付近でほぼ一定に保つこともできるので、培養液が培養容器用蓋の内面に接触することを防止することができる。
このように、生体試料に与える影響を最小限に抑えることができるので、生体試料の形質変化が生じ難く、正確な生体試料の観察を行える。また、生体試料の蛍光、発光強度等を正確且つリアルタイムに測定することができる。
【００２２】
請求項１１に係る発明は、請求項１０に記載の生体試料培養システムにおいて、前記排出用管路が、少なくとも一部が底面に垂直な方向に対して所定角度の傾きを有した状態で、前記内面から前記凹部の底面に向かって突出している生体試料培養システムを提供する。
【００２３】
請求項１２に係る発明は、請求項１０又は１１に記載の生体試料培養システムにおいて、前記排出用管路が、少なくとも前記凹部に面した先端部分における断面積が、他の部分における断面積よりも小さくなるように形成されている生体試料培養システムを提供する。
【００２４】
請求項１３に係る発明は、請求項１２に記載の生体試料培養システムにおいて、前記排出用管路が、前記先端部分のみの前記断面積が、他の部分における断面積よりも小さくなるように形成されている生体試料培養システムを提供する。
【００２５】
請求項１４に係る発明は、請求項１０から１３のいずれか１項に記載の生体試料培養システムにおいて、前記排出用管路が、前記供給用管路よりも前記凹部の底面に向けて先端が突出している生体試料培養システムを提供する。
【００２６】
請求項１５に係る発明は、請求項１０から１４のいずれか１項に記載の培養容器用蓋において、前記排出用管路が、前記底面に垂直な方向に向けて移動可能とされている生体試料培養システムを提供する。
【００２７】
請求項１６に係る発明は、請求項１０から１５のいずれか１項に記載の生体試料培養システムにおいて、前記培養容器用蓋が、外部から照射された照明光を透過する光透過部を備えている生体試料培養システムを提供する。
【００２８】
請求項１６に係る発明は、請求項１５に記載の生体試料培養システムにおいて、前記供給用管路及び前記排出用管路が、前記光透過部を透過する前記照明光の光路外に配置されている生体試料培養システムを提供する。
【発明の効果】
【００２９】
本発明に係る培養容器用蓋及び生体試料培養システムによれば、培養液を、培養容器以外のものに可能な限り接触しないように供給又は排出して、生体試料に与える影響を極力なくすことができる。よって、生体試料の蛍光、発光強度等を正確且つリアルタイムに測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下、本発明に係る培養容器用蓋の第１実施形態について、図１及び図２を参照して説明する。なお、本実施形態では、生体試料として細胞を例に挙げ、該細胞を培養容器により培養しながら、細胞の蛍光強度の検出を行う場合を例にして説明する。
但し、検出指標は蛍光のみならず、発光強度や細胞の形態変化等を検出することも可能である。また、培養液とは、細胞等の生体試料を培養するために用いられる市販の培養液であっても良いが、生体試料の性質に応じて種々の成分を混合させた液体や、生体試料の培養に必要な気体を混合させた液体等、生体試料の培養を行えるものであれば他の種々の液体であっても良い。
【００３１】
本実施形態の培養容器用蓋１は、図１に示すように、細胞を培養のために収容する凹部２が形成された培養容器３に対して用いられ、該培養容器３に重ね合わされて凹部２を塞ぐ蓋であって、凹部２の底面２ａに対向する内面１ａと外面１ｂとを貫通する管路４と、外部から照射された照明光Ｌを透過する透明部材（光透過部）５とを備えている。
【００３２】
なお、本実施形態では培養容器３として、市販されているガラスボトムディッシュのボトムを採用している。但し、このボトムに限られるものではない。凹部２の底面２ａには、開口２ｂが形成されており、該開口２ｂを塞ぐように、例えば底面２ａの外側にカバーガラス６が取り付けられている。但し、カバーガラス６は、開口２ｂ内に培養液Ｗを溜まり難くするため、培養容器３の内側に取り付けても良い。なお、この開口２ｂで囲まれたカバーガラス６の上面に細胞が配置されて培養されるようになっている。
【００３３】
上記培養容器用蓋１は、培養容器３上に被さるように断面コ形状に形成されている。また、後述する各チューブ１３、１５によってズレたり、浮いたりすることがないように、比重の重い材質で形成されている。なお、湿度や二酸化炭素にさらされるので、例えば、耐食性の高いステンレス（ＳＵＳ）等が適している。より、好ましくは、耐食性の高い材質であると共に、細胞毒性のない、或いは、細胞毒性の低い材質であると良い。例えば、ＳＵＳ３１６、ＰＥＥＫ（ポリエーテルエーテルケトン）、テフロン（登録商標）等のポリ４フッ化エチレン、シリコン等である。
【００３４】
培養容器用蓋１には、培養容器３のカバーガラス６に対向するように、上記透明部材５が嵌め込まれている。この透明部材５は、透過率の高い樹脂でも良いし、光学ガラスのようなガラスでも構わない。なお、透明部材５の外面１ｂ等に反射防止膜を施しても構わない。
また、培養容器３の外周面には、図示しないライン状の溝が形成されており、培養容器用蓋１を被せたときに、該培養容器用蓋１との間に若干の隙間Ｓが空くようになっている。そして、この隙間Ｓを介して外部から凹部２内に二酸化炭素が入り込むことができるようになっている。
【００３５】
上記管路４は、該管路４を介して培養液Ｗを凹部２内に外部から供給、又は、凹部２内に貯留された培養液Ｗを外部に排出するうち、少なくともいずれか一方を行うものである。本実施形態では、管路４が、培養液Ｗを凹部２内に供給して内部に貯留させる供給用管路１０と、凹部２内に貯留された培養液Ｗを外部に排出する排出用管路１１とで構成されている場合を例にして説明する。これにより、培養液Ｗの供給及び排出を行うことができるようになっている。
【００３６】
上記供給用管路１０は、培養容器用蓋１に固定された供給用継手１２と、該供給用継手１２に接続された供給用チューブ１３とによって構成されている。また、排出用管路１１も同様に、培養容器用蓋１に固定された排出用継手１４と、該排出用継手１４に接続された排出用チューブ１５とによって構成されている。
この際、排出用管路１１は、供給用管路１０よりも凹部２の底面２ａに向けて先端が突出するようになっている。つまり、排出用継手１４の先端は、供給用継手１２の先端よりも凹部２の底面２ａに向かって突出している。なお、排出用継手１４は、先端が可能な限り凹部２の底面２ａ近傍まで伸ばしても良い。これは培養液Ｗを培養容器３内から外部に排出したときに、残量を極力少なくすることができるためである。一方この場合には、供給用継手１２は、凹部２内に貯留された培養液Ｗの液面よりも上方に先端が位置するように取り付けると良い。
【００３７】
また、供給用管路１０及び排出用管路１１で構成される管路４は、透明部材５を通過する照明光Ｌの光路外に配されるようになっている。つまり、光学的に透過照明をケラない配置とされている。加えて、落射観察時に影にならない配置とされている。
具体的に図２を参照して説明する。図２は、透過照明光Ｌと、透明部材５の直径と、両継手１２、１４との位置関係を示した図である。なお、図２において、透明部材５とカバーガラス６とは、共に同心円状（略同じ軸を中心とした円形状で）に配置されているものとする。測定対象範囲は、直径φの円とし、透明部材５は、直径Ｄの円形とする。但し、実施には円形に限られず、四角形等の多角形状でも構わない。また、細胞接着面（カバーガラス６の上面）から培養容器用蓋１の外面１ｂまでの高さをｈとする。また、コンデンサレンズＲ１によって集光された光の最外周における入射角をαとする。また、対物レンズＲ２への光の角度若しくは落射蛍光の照射角度をβとする。
【００３８】
上述した条件の下、透過照明光Ｌが培養容器用蓋１によってケラれないためには、ほぼ“Ｄ≧２ｈ／ｔａｎα＋φ”となる。供給用継手１２及び排出用継手１４は、直径Ｄよりも外側（図２において、紙面に対して左右方向）に配されている必要がある。なお、培養容器用蓋１の上面からの高さ及び円周方向の位置についても、上述した式と同様の式から求めることができる。
なお、図２に示すｈが、対物レンズＲ２の焦点深度よりも十分離されており、ボケ像としても撮像した画像に影響を与えないならば、上述した式のみで直径Ｄを決定して良い。しかし、ボケ像として写りこむ程度にｈが低いならば、対物レンズＲ２の集光する範囲に各継手１２、１４や培養容器用蓋１の非透過部が存在しないように構成する必要がある。つまり、ほぼ“Ｄ≧２ｈ／ｔａｎβ＋α”となり、両継手１２、１４をさらに外側に配置すると良い。
【００３９】
このように構成された培養容器用蓋１で蓋をされた培養容器３により、細胞を培養する場合について説明する。
まず、培養容器用蓋１を取り外した状態で、培養容器３のカバーガラス６上に細胞を接着させて飼う。次いで、供給用管路１０及び排出用管路１１が取り付けられた培養容器用蓋１を、速やかに培養容器３に重ね合わせて蓋をする。次いで、供給用管路１０から培養液Ｗを凹部２内に供給して貯留させる。これにより、図１に示すように、細胞は培養液Ｗに浸された状態となる。また、供給された培養液Ｗは、凹部２内において徐々に液面が上昇するが、排出用継手１４の先端に触れた時点で外部に排出される。これにより、培養液Ｗはこれ以上液面が上昇することはなく、以降一定の液量となる。
【００４０】
なお、培養容器３の周辺の温度及び二酸化炭素濃度は、培養を行うための温度に設定されているものとする。そのため、細胞は、所定の温度（例えば、３７℃）、所定の二酸化炭素濃度（例えば、５％）に維持された状態で培養されている。なお、二酸化炭素に関しては、培養容器３と培養容器用蓋１との間の隙間Ｓを通じて外部から凹部２内に入り込んで、培養液Ｗ内に溶解する。
【００４１】
次いで、図示しない光源から照明光Ｌを照射する。照射された照明光Ｌは、透明部材５を透過して凹部２内で培養されている細胞を照射する。これにより、細胞は蛍光を発する。そして、図示しない検出器により、カバーガラス６を介して細胞が発した蛍光を観察することで、細胞の状態を観察することができる。
【００４２】
特に、本実施形態の培養容器用蓋１によれば、供給用管路１０及び排出用管路１１を備えているので、培養容器３以外のものに培養液Ｗが極力接触しないように培養液Ｗの供給や排出を行えるので、細胞に与える負担（影響）を最小限に抑えた状態で培養が行うことができる。
また、供給用管路１０及び排出用管路１１により、培養液Ｗの供給と排出とを同時に行えるので、培養液Ｗを循環させることができる。よって、新たな培養液Ｗを供給したとしても、古い培養液Ｗとの混合時間を短くでき、細胞に与える影響を低減できる。また、培養液Ｗを循環できるので、培養途中で死んでしまった細胞を速やかに排出することもできる。この死んでしまった細胞は、自家蛍光が増加するので観察結果に影響を与えるが、培養液Ｗを循環させることにより排出できるので、死んだ細胞の影響をなくして観察結果の精度を向上することができる。更に、死んでしまった細胞は、培養液Ｗに溶けこんで該培養液Ｗを濁らせる恐れがあるが、循環により排出できるので、培養液Ｗの濁りをなくして観察が行い易くなる。
【００４３】
また、排出用継手１４の先端が、供給用継手１２の先端よりも凹部２の底面２ａに向けて突出していると共に、供給用継手１２の先端が培養液Ｗの液面に触れないように配置されているので、培養液Ｗの液面が過度に上昇して培養容器用蓋１の内面１ａに接触したり、供給用継手１２の先端に接触したりすることがない。このことからも、培養液Ｗが培養容器３以外のものに接触することをより確実に防止している。従って、細胞に与える影響をより低減することができる。
【００４４】
また、培養容器３内に培養液Ｗを一定量だけ貯留できるので、細胞に対する栄養の補給量や培養液ＷのｐＨ値等の培養育成に関する条件を一定とすることができる。このため、細胞観察時に培養液量による育成差をなくすことができ、同一条件下での観察を行うことができる。
更に、透明部材５を備えているので、上述したように培養容器３の外部から、培養中の細胞の観察を行える。よって、使い易く観察が容易である。特に、供給用管路１０及び排出用管路１１で構成される管路４は、図２に示すように照明光Ｌの光路外に配置されているので、管路４によって照明光Ｌに影が生じたり、光路を管路４が遮ったりすることがなく、細胞の観察に何ら影響を与えることはない。
【００４５】
なお、上記第１実施形態において、培養液Ｗを常に循環させても構わないし、必要時に所定量だけ適時交換しても構わない。また、交換する際は、古い培養液Ｗを新しい培養液Ｗに全て交換する方式でも構わないし、古い培養液Ｗを半分排出すると共に新しい培養液Ｗを半分供給して交換する半バッチ方式でも構わない。
【００４６】
また、上記第１実施形態において、排出用継手１４の先端を、供給用継手１２の先端よりも凹部２の底面２ａに向かって突出するようにしたが、この場合に限られず、例えば、図３に示すように、両継手１２、１４の先端を略同じ高さに揃えても構わない。また、供給用継手１２の方が排出用継手１４よりも突出していても構わない。
【００４７】
また、図４に示すように、排出用管路１１を底面２ａに垂直な方向に移動可能にして、任意の高さに変更できるように構成しても構わない。こうすることで、必要に応じて適宜培養液Ｗの液量を調整することができるので、より多角的な培養を行える。
【００４８】
更に、図５に示すように、供給用継手１２を培養容器３の内壁により近づけるように配置しても構わない。こうすることで、培養液Ｗを、例えば、一滴一滴垂らしながら供給するのではなく、内壁に伝わらせながら供給することができる。一滴一滴垂らしながら供給した場合には、培養液Ｗが落下した時の水圧変化により培養中の細胞を刺激し易くなってしまうが、内壁を伝わらせることで、このような水圧変化を極力なくすことができ細胞を刺激し難くなる。また、液面の揺らぎについても可能な限り抑えることができるので、照明光Ｌの屈折等を抑えることができ、より正確な細胞観察を行える。
【００４９】
また、図６に示すように、排出用継手１４を、先端が底面２ａに垂直な方向に対して所定角度θの傾きを有した状態で、内面１ａから凹部２の底面２ａに向かって突出させても構わない。こうすることで、培養液Ｗが内部を流れ易くなるので、排出する際の効率を高めることができる。
【００５０】
なお、図６に示す場合に限られず、排出用継手１４の少なくとも一部が底面２ａに垂直な方向に対して角度が付いていれば構わない。
例えば、図６に示すように排出用継手１４を外面１ｂ上から傾けるのではなく、図７（ａ）に示すように内面１ａを越えて凹部２内に入った付近で傾けても構わない。また、図７（ｂ）に示すように、凹部２内に入った途中から先端に亘って傾けても構わないし、図７（ｃ）に示すように、凹部内に入った途中部分のみを傾けても構わない。
【００５１】
次に、本発明に係る培養容器用蓋の第２実施形態を、図８から図１０を参照して説明する。なお、この第２実施形態においては、第１実施形態における構成要素と同一の部分については、同一の符号を付しその説明を省略する。
第２実施形態と第１実施形態との異なる点は、第１実施形態では、排出用管路１１が均等の断面積で同じ太さであったが、第２実施形態の培養容器用蓋２０は、排出用管路２１の先端部分における断面積が他の部分による断面積よりも小さくなるように形成されている点である。また、供給用管路１０から供給された培養液Ｗがそのまま培養容器３内を流れていたが、第２実施形態では、供給用管路１０から供給された培養液Ｗを、整流した状態で流す点である。
【００５２】
即ち、本実施形態の培養容器用蓋２０は、図８に示すように、排出用管路２１の排出用継手２２が、先端に向かって漸次断面積が縮径するテーパー状に形成されており、最先端部分における断面積が最も他の部分の断面積よりも小さくなっている。更に、本実施形態の排出用継手２２は、底面２ａに垂直な方向に対して所定角度θの傾きを有した状態で斜めに配置されている。また、排出用継手２２の先端部分は、極力培養容器３の底面２ａ（特にカバーガラス６付近）に近づけた状態で配置されている。
【００５３】
また、本実施形態の培養容器用蓋２０は、供給用継手１２の近くに複数の整流子２３を備えている。この整流子２３は、例えば、底面２ａに垂直な方向に向いた直径２ｍｍの円柱であり、１ｍｍ間隔毎に横一列に並ぶように内面１ａにぶら下がる形で設けられている。なお、この整流子２３は、先端ができるだけ凹部２の底面２ａに近くづくように配置されるのが望ましい。
また、培養容器３と培養容器用蓋２０とは、図８及び図１０に示すように、例えば、上面視三日月状に形成された２枚のプレート状の固定板２４によって互いに固定されている。これにより、培養容器３と培養容器用蓋２０とを正確に位置決めした状態で組み合わせることができ、回転方向への位置ズレを防止することができる。そのため、本実施形態では、培養容器用蓋２０を比重の軽い材質で形成しても構わない。例えば、透明樹脂等で培養容器用蓋２０を形成することで、より軽くすることができる。更に、この重量の利点に加え、仮に透明部材５がなくても光学的な観察を行うことができる。
【００５４】
このように構成された培養容器用蓋２０を有する培養容器３によれば、排出用継手２２の先端部分の断面積が他の部分の断面積よりも小さいので、培養液Ｗがより内部を流れ易くなり、培養液Ｗの排出効率を高めることができる。特に、排出用継手２２の先端部分が底面２ａに極力近づけられているので、凹部２内に残留する培養液Ｗの量を極力減らすことができる。なお、排出用継手２２の先端位置は、測定対象範囲に対して光学的に邪魔しない位置に配置されている。
また、供給用継手１２から供給された培養液Ｗは、整流子２３の間を流れることで整流効果が得られ、均一な流れとなる。よって、流れの不均一による細胞への影響を低減することができる。
【００５５】
なお、上記第２実施形態では、排出用継手２２をテーパ状にして先端の断面積を小さくしたが、テーパ状のように徐々に縮径するのではなく、先端のみを針の如く細くしても構わない。このように先端を細くすることで、窪み等の微小な凹み部分に培養液Ｗが溜まったとしても、確実に排出することができ、残量をより低減することができる。
【００５６】
なお、上記第２実施形態では、整流子２３を円柱としたが、この場合に限られず、例えば、図１１及び図１２に示すように、角柱にしても構わない。この場合においても、同様の作用効果を奏することができる。
また、図１２（図１１のＡ−Ａ断面）に示すように、培養容器用蓋２０の内面１ａを若干薄くして通気溝２５としても構わない。この通気溝２５は、例えば、０．１ｍｍ以下の溝である。こうすることで、雰囲気の交換をより効率的に行うことができる。なお、この通気溝２５は、菌等が外部から入り込まない程度には閉じられている。
【００５７】
また、図１３及び図１４（図１３のＢ−Ｂ断面）に示すように、排出用継手２２側の側面にメッシュ２６ａが取り付けられた直方体状のブロック部２６を、供給用継手１２の先端に取り付けても構わない。こうすることで、供給用継手１２から供給された培養液Ｗは、メッシュ２６ａを通過することにより整流効果により流れが均一となる。つまり、整流子２３と同じ効果を得ることができる。よって、別個に整流子２３を設ける必要がないので、構成の簡略化を図ることができる。  
【００５８】
次に、本発明に係る培養容器用蓋の第３実施形態を、図１５から図１７を参照して説明する。なお、この第３実施形態においては、第２実施形態における構成要素と同一の部分については、同一の符号を付しその説明を省略する。
第３実施形態と第２実施形態との異なる点は、第２実施形態では、テーパ状に形成された排出用継手２２の先端を、底面２ａに極力近づけた状態で配置したが、第３実施形態の培養容器用蓋３０は、排出用継手２２の先端を、底面２ａに形成された開口２ｂとカバーガラス６とで形成される段差の中に位置するように配置している点である。また、第２実施形態では、培養容器３内が円形の空間とされていたが、第３実施形態では、培養容器用蓋３０によって、培養液Ｗの流れが一方向となるように培養容器３内の空間が仕切られている点である。
【００５９】
即ち、本実施形態の培養容器用蓋３０は、図１５に示すように、排出用継手２２の先端部分が、底面２ａに形成された開口２ｂ内であって、カバーガラス６に極力近づくように配置されている。なお、本実施形態の測定対象範囲φは、排出用継手２２が光学的に邪魔をしない部分に限られる。また、培養容器用蓋３０には、図１６及び図１７に示すように、整流子２３を間に挟んで対向配置されるように２つの仕切り部材３１が形成されている。これにより、培養容器３内の空間が略四角形の空間となっている。この仕切り部材３１は、できるだけ培養容器３の壁面及び底面２ａに近づけるように形成することが好ましい。
【００６０】
更に、培養容器用蓋３０には、図１７（図１６のＣ−Ｃ断面）に示すように、上面に蝶番３２が取り付けられている。（なお、図１５においては、蝶番３２の図示を省略している）この蝶番３２は、培養容器用蓋３０を培養容器３に重ね合わせたときに、該培養容器３を下方から覆う押さえ部材３３に固定できるようになっている。つまり、培養容器用蓋３０を培養容器３上に被せた後、蝶番３２を押さえ部材３３に固定することで、押さえ部材３３を用いて培養容器用蓋３０と培養容器３とを強固に固定できるようになっている。その結果、培養容器３と培養容器用蓋３０とを正確に位置決めした状態で組み合わせることができ、回転方向への位置ズレを防止することができる。従って、本実施形態も第２実施形態と同様に、培養容器用蓋３０を比重の軽い材質で形成することが可能である。
【００６１】
このように構成された培養容器用蓋３０を有する培養容器３によれば、排出用継手２２の先端が底面２ａに形成された開口２ｂ内であってカバーガラス６に極力近づいた位置に配されているので、培養液Ｗを排出する際に、培養液Ｗをより確実に排出することができ、残量をさらに減らすことができる。
また、培養容器３内の空間が２つの仕切り部材３１によって仕切られているので、供給用継手１２から供給された培養液Ｗは、整流子２３で整流されることに加え、仕切り部材３１に沿って一方向に流れ易くなる。つまり、培養容器３内の空間が円形であることに起因する流れの不均一を低減することができる。よって、より細胞に影響を与え難くなり、さらに正確な細胞観察を行うことができる。
【００６２】
なお、上記第３実施形態では、培養容器用蓋３０に仕切り部材３１を形成したが、この場合に限られず、例えば、図１８に示すように、培養容器３内に収納できる大きさで円形に形成されると共に、開口３５が中心に形成されたブロック３６を、培養容器３内に収納させても構わない。こうすることで、培養容器用蓋３０を複雑な形状にする必要がないので、製作が容易となる。なお、このブロック３６を、第１実施形態の培養容器３内に収納させても構わない。また、このブロック３６に整流子を設けても構わない。
【００６３】
次に、本発明に係る生体試料培養システムの一実施形態を、図１９及び図２０を参照して説明する。
本実施形態の生体試料培養システムは、上記第１実施形態の培養容器用蓋１を有する培養容器３を備えているものとして説明する。よって、第１実施形態における構成要素と同一の部分については、同一の符号を付しその説明を省略する。
即ち、本実施形態の生体試料培養システム４０は、培養容器３内で培養中の細胞の経時的変化を観察する装置であって、図１９に示すように、培養容器用蓋１を有する培養容器３と、該培養容器３を収容するインキュベータボックス４１と、細胞を観察する観察光学系４２と、培養容器３内の細胞に対して、培養又は観察に必要な複数種類の液体又は気体を貯留する複数の試薬容器４３、４４、４５から、液体又は気体を選択的に供給する供給装置４６とを備えている。
【００６４】
なお、本実施形態においては、図２０に示すように、インキュベータボックス４１内にアダプタ４７を介して３つの培養容器３が収納されている例を示している。
【００６５】
インキュベータボックス４１は、図１９に示すように、観察光学系４２の後述するＸ軸動作ステージ７６上に固定される開閉可能なボックス状のものであって、所定の培養環境Ｅに制御された内部に、３つの培養容器３を収納すると共に、外部から照射された照明光Ｌを透過させるガラス板等の透明板４８を有する蓋部４９を備えている。透明板４８は、少なくとも片面に反射防止膜が形成されている。
蓋部４９は、例えば、アルマイト処理されたアルミニウムや防食性に優れたステンレス等からなる筐体５０の上部開口を塞ぐものであって、後述する対物レンズ７２の交換やクリーニング等の必要に応じて取り外しができるようにビス等で固定されている。
また、このインキュベータボックス４１は、市販されている通常のインキュベータと同様に湿度や温度等が制御されている。これにより内部の培養環境Ｅは、例えば、二酸化炭素濃度５％、飽和湿度、温度３７℃に制御されている。
【００６６】
また、インキュベータボックス４１内には、開口面積が広く確保されるように環状に形成され、滅菌水等の加湿水Ｗ１を貯留する水槽５１を備えている。この加湿水Ｗ１によって、インキュベータボックス４１内の培養環境Ｅは、上述したように所定の湿度条件に調整されている。また、加湿水Ｗ１は、筐体５０に取り付けられた加湿水供給継手５２及び該加湿水供給継手５２に接続された加湿水供給チューブ５３を介して、供給装置４６内に設置された加湿水タンク５４からベリスタポンプ５５によって供給されている。なお、単に供給されるだけでなく、加湿水タンク５４内に再度加湿水Ｗ１を排出して循環できるように構成しても構わない。また、水槽５１を補助的に加温するために、水槽５１に接するように図示しない小型若しくはテープ状のヒータが取り付けられている。
【００６７】
また、加湿水タンク５４に隣接してＣＯ２混合槽５６が供給装置４６内に設けられており、ＣＯ２供給チューブ５７によって互いに接続された状態となっている。このＣＯ２混合槽５６には、略１００％の二酸化炭素が供給されるようになっていると共に、該二酸化炭素と空気とを内部で混合させて所定の二酸化炭素濃度に調整した培養ガスＧを造りだしている。そして、ＣＯ２混合槽５６は、造り出した培養ガスＧを、エアポンプ５８によってＣＯ２供給チューブ５７を通して加湿水タンク５４に供給するようになっている。
【００６８】
また、加湿水タンク５４の下部には、図示しないステーラが取り付けられており、ＣＯ２混合槽５６から供給された培養ガスＧを加湿水タンク５４内に溶解させている。これにより、インキュベータボックス４１内の培養環境Ｅは、加湿水Ｗ１が気化することで上述したように所定の二酸化炭素条件に調整されている。
なお、ＣＯ２混合槽５６とインキュベータボックス４１の筐体５０に設けられた二酸化炭素供給配管５９とを、二酸化炭素供給チューブ６０で接続して、直接的に二酸化炭素をインキュベータボックス４１内に供給しても構わない。
【００６９】
また、インキュベータボックス４１の周囲には、ヒータ等の加温体６１が設けられており、インキュベータボックス４１内を加温している。この加温体６１によって、インキュベータボックス４１内の培養環境Ｅは、上述したように所定の温度条件（例えば、３７℃）に調整されている。なお、インキュベータボックス４１内には、培養容器３の周辺に該培養容器３近傍の温度を測定する図示しない小型の温度センサが取り付けられている。
【００７０】
また、インキュベータボックス４１の内部には、内部温度及び気化した二酸化炭素混入加湿空気を、インキュベータボックス４１内で均一に対流させて分散させるファン６２が適宜取り付けられている。このファン６２によって、インキュベータボックス４１内の培養環境Ｅは、ムラがなくなり均一な条件となる。更に、インキュベータボックス４１の内部には、培養環境Ｅの二酸化濃度を測定する図示しないＣＯ２センサが取り付けられている。
【００７１】
上述したインキュベータボックス４１は、遮光ボックス６３によって覆われており、観察に必要な光以外が細胞に当たらないように構成されている。この遮光ボックス６３は、外部環境光の遮断の他に、外部温度環境の影響を低減する効果がある。なお、遮光ボックス６３内にヒータ等の加温体を設置することにより、インキュベータボックス４１全体を所定温度環境に維持することも可能である。
【００７２】
上記観察光学系４２は、例えば、顕微鏡によって構成され、細胞を透過した照明光Ｌに基づいて細胞の光学的観察を行うものであって、インキュベータボックス４１の上方に配され、培養容器３に照明光Ｌを照射する透過照明光学系７０と、インキュベータボックス４１を載置するステージ７１及び対物レンズ７２を有すると共に透過した照明光Ｌを検出する検出器７３とを備えている。
ステージ７１は、ベース７４と、該ベース７４上に移動可能に設けられ、奥行き方向に往復動作するＹ軸動作ステージ７５と、該Ｙ軸動作ステージ７５上に移動可能に設けられ、左右に往復動作するＸ軸動作ステージ７６とからなっている。これらＹ軸動作ステージ７５及びＸ軸動作ステージ７６は、図示しないコンピュータによって電動操作可能とされており、Ｘ軸動作ステージ７６上に固定されたインキュベータボックス４１を、所定範囲内で任意の位置に移動させることができるようになっている。
【００７３】
また、ベース７４、Ｙ軸動作ステージ７５及びＸ軸動作ステージ７６には、それぞれ開口が形成されており、これら開口内に対物レンズ７２が収まるように配されている。この際、Ｙ軸動作ステージ７５に形成された開口は、例えば奥行き方向に縦長となっており、Ｘ軸動作ステージ７６に形成された開口は、例えば左右方向に縦長となっている。これにより、両ステージ７５、７６をそれぞれの方向に移動させたときに、各ステージ７５、７６が対物レンズ７２に接触しないようになっている。
【００７４】
上記供給装置４６は、遮光ボックス６３に隣接して設けられており、内部の天井部には供給装置４６内の環境を清潔に維持するための殺菌用のＵＶランプ８０と、ヘパフィルタ及びファンが組み合わされた空気清浄用の空気浄化ユニット８１とが固定されている。
供給装置４６の内部には、培養液Ｗ又は試薬Ｗ２又はＰＢＳ（−）等のバッファ緩衝液Ｗ３を貯留する上記試薬容器４３、４４、４５と、古くなった培養液Ｗを貯留する廃液タンク８２と、これら試薬容器４３、４４、４５及び廃液タンク８２を冷凍保存する冷蔵庫８３とを備えている。  
【００７５】
各試薬容器４３、４４、４５には、培養液Ｗ又は試薬Ｗ２又はバッファ緩衝液Ｗ３を培養容器３に供給するための培養液供給チューブ８４の一端が接続されている。また、この培養液供給チューブ８４の他端は、使用したい試薬Ｗ２等を選択するための流路切替弁８５に接続されている。なお、流路切替弁８５は、予備ポートを備えている。各培養液供給チューブ８４は、流路切替弁８５で１本にまとめられて、供給用チューブ１３として培養容器用蓋１の供給用継手１２に接続されている。
【００７６】
また、供給用チューブ１３には、流路切替弁８５から培養容器３に向かって順に、培養液用供給ポンプ８６（供給手段）、加温タンク８７が介在されている。加温タンク８７は、供給用チューブ１３内を流れる培養液Ｗ等を、所定温度（例えば、３７℃）に加温するためのものである。
また、廃液タンク８２は、排出用チューブ１５及び排出用継手１４を介して培養容器３に接続されている。この排出用チューブ１５には、排出用ポンプ８８（排出手段）が介在されている。この排出用ポンプ８８は、培養液用供給ポンプ８６よりも容量が大きく設定されている。これにより、培養液Ｗの供給量より排出量を多く設定でき、培養容器３内における培養液Ｗの液量を確実に一定にすることができる。
【００７７】
また、上述したベリスタポンプ５５、エアポンプ５８、加温体６１、温度センサ、ファン６２、ＣＯ２センサ、ヒータ、培養液用供給ポンプ８６、加温タンク８７、流路切替弁８５、排出用ポンプ８８等は、それぞれコンピュータに接続されており、総合的に制御されるようになっている。
【００７８】
次に、このように構成された生体試料培養システム４０を用いて、細胞を培養しながら、該細胞の経時的変化を観察する場合について、以下に説明する。
まず、インキュベータボックス４１内に、アダプタ４７を介して３つの培養容器３をそれぞれセットした後、流路切替弁８５を試薬容器４３が培養容器３に連通するように切り替えて、培養液用供給ポンプ８６を作動させる。これにより、培養液Ｗを、培養容器用蓋１の供給用チューブ１３及び供給用継手１２を介して培養容器３に直接供給することができる。この際の作用効果は、第１実施形態と同様である。
また、この際同時に排出用ポンプ８８を作動させて、培養容器３内の培養液Ｗを、排出用継手１４及び排出用チューブ１５を介して廃液タンク８２に排出させる。これにより、培養容器３内の液面をほぼ一定に保つことができる。これは、排出用ポンプ８８の方が培養液用供給ポンプ８６よりも容量が大きく設定されていると共に、排出用継手１４の方が供給用継手１２よりも底面２ａ側に突出しているためである。
【００７９】
なお、排出用継手１４の先端よりも培養液Ｗの液面が高い場合には、培養液Ｗのみを外部に排出する状態となり、排出用継手１４の先端よりも培養液Ｗの液面が低い場合には、培養容器３内の気体だけを排出する状態となり、排出用継手１４の先端が培養液Ｗの液面とほぼ同じ位置にある場合には、培養液Ｗ及び気体を両方排出している状態となる。このように状況に応じて、３つの状態が考えられる。
本実施形態は、この３つの状態のうち、最後の状態である。特にこの状態は、培養液Ｗが排出用継手１４の先端のみにしか接触しないので、不純物等が混ざり難い。そのため、細胞に与える影響を最小限に抑えることができる。
【００８０】
また、培養液Ｗの供給と同時に、水槽５１に滅菌水等の加湿水Ｗ１を貯留させる。そして、コンピュータが、温度センサからの信号に基づいて加温体６１を制御することで、インキュベータボックス４１内の培養環境Ｅが所定の温度条件になるように維持される。また、図示しないヒータをオン・オフ制御等することにより水槽５１に貯留された加湿水Ｗ１の温度を制御して、該加湿水Ｗ１を蒸発させる。これにより、インキュベータボックス４１内の培養環境Ｅが、所定の湿度条件に維持される。
【００８１】
また、この加湿水Ｗ１には二酸化炭素が混入されているので、加湿水Ｗ１の蒸発に伴ってインキュベータボックス４１内には二酸化炭素も供給される。よって、二酸化炭素についても、培養環境Ｅは所定の濃度条件に維持される。この際、ＣＯ２センサからの信号に基づいて、濃度調整を行う。これらの結果、インキュベータボックス４１内は、例えば、二酸化炭素濃度５％、飽和湿度、温度３７℃の環境になり、この環境条件下にて培養容器３内の細胞を培養し続けることができる。
【００８２】
そして、透過照明光学系７０より照明光Ｌを照射する。この照明光Ｌは、インキュベータの透明板４８及び培養容器用蓋１の透明部材５を通過して、各培養容器３内に収容された細胞を照射すると共に、該細胞を透過して対物レンズ７２に入射する。検出器７３は、この透過照明光Ｌに基づいて細胞の経時的変化を観察することができる。
このように細胞を培養しながら観察を行えるので、培養過程で生じる細胞内の挙動を、正確且つ経時的に測定することができる。即ち、培養条件を変化させながら観察対象の細胞の反応をリアルタイムで測定することができ、タンパク質の発現の有無や発現量の測定、時間経過に伴う発現量の変化等を正確に測定することができる。
【００８３】
更に、コンピュータが、各解析ステップにより撮像された撮像画像を細胞の幾何学的特長量、光学的特徴量、座標位置及び面積より、細胞の１つ１つをそれぞれ確実に区別して認識し、各細胞を追跡する。そのため、蓄積されたデータの経時的な処理を施すことができ、培養中の１つ又は複数の細胞に対して、各細胞を間違えることなく、培養過程で生じる細胞内の挙動を正確且つ経時的（連続的）に測定することができる。そして、セルサイクルを一致させる等の煩雑な作業を必要としないため、プロトコルを制限することもない。
【００８４】
特に、供給用管路１０及び排出用管路１１を有する培養容器用蓋１を利用することで、培養容器３以外のものに培養液Ｗが極力接触しないように供給や排出を行えるので、細胞に与える負担を最小限に抑えた状態で培養しながら観察を行える。また、培養液Ｗの液面を排出用管路１１の先端付近でほぼ一定に保つこともできるので、培養液Ｗが培養容器用蓋１の内面１ａに接触することを防止することができる。従って、細胞の形質変化が生じ難く、正確な細胞の観察を行える。また、生細胞の蛍光、発光強度等を正確且つリアルタイムに測定することもできる。
【００８５】
更に、本実施形態の生体試料培養システム４０は、各試薬容器４３、４４、４５及び流路切替弁８５を有しているので、様々な条件下で観察を行うことができ、より多角的な細胞の観察を行うことができる。
例えば、試薬Ｗ２によって細胞に刺激を与える場合には、流路切替弁８５を、試薬容器４４が培養容器３に連通するように切り替えて、培養液用供給ポンプ８６を作動させる。これにより、試薬Ｗ２を供給用チューブ１３及び供給用継手１２を介して培養容器３に直接供給することができる。
【００８６】
また、試薬Ｗ２によって細胞に刺激を与える他の方法としては、流路切替弁８５を切り替えて、例えば、培養液Ｗを貯留している試薬容器４３を供給用チューブ１３に連通させ、培養液用供給ポンプ８６を作動させることにより、加温タンク８７内に予め培養液Ｗを貯えておく。次いで、流路切替弁８５を切り替えて、試薬Ｗ２を貯えている他の試薬容器４４を供給用チューブ１３に連通させる。そして、再度培養液用供給ポンプ８６を作動させて加温タンク８７内に試薬Ｗ２を供給させる。これにより、試薬Ｗ２は培養液Ｗに溶解される。このように、試薬Ｗ２を溶解させた培養液Ｗを、培養容器３に供給することも可能である。
【００８７】
また、培養容器３内の培養液Ｗを全て廃棄して、培養液Ｗや試薬Ｗ２を新たに供給したい場合には、まず、排出用ポンプ８８のみを作動させ、排出用チューブ１５を介して培養液Ｗを全て廃液タンク８２に排出させる。そして、同時に或いはやや遅れて培養液用供給ポンプ８６を作動させ、流路切替弁８５を適時切り替えて、培養液Ｗ或いは試薬Ｗ２を培養容器３に供給すれば良い。
【００８８】
更に、投与した試薬Ｗ２を完全に除去したい場合には、上述したように、予め培養容器３の培養液Ｗを除去した後、流路切替弁８５を切り替えてバッファ緩衝液Ｗ３を培養容器３内に供給する。これにより、供給用チューブ１３や培養液用供給ポンプ８６の洗浄を行うことができる。次いで、流路切替弁８５を切り替えて、培養液Ｗを培養容器３に再供給すれば良い。こうすることで、試薬Ｗ２間の汚染を防ぐことができる。
【００８９】
なお、培養容器３への培養液Ｗ等の供給方法としては、１時間あたり予め決められた量だけ連続的に供給する方法がある。また、他の供給方法としては、いわゆるバッチ式の方法がある。これは、所定日数毎に、培養容器３中の培養液Ｗを半分或いは全部廃棄し、それに代わって新たな培養液Ｗを所定量供給する方法がある。本実施形態の生体試料培養システム４０によれば、連続式或いはバッチ式のいずれの方式であっても、自由に選択することができる。
【００９０】
なお、本発明の技術範囲は上記実施の形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々の変更を加えることが可能である。
【００９１】
例えば、図２１に示すように、透明部材５を所定の間隔が空くように２枚有する培養容器用蓋９０としても構わない。但し、蓋全体を光学的に透明な材質で形成すれば、透明部材５が不要となる。    
また、２枚の透明部材５間は、真空状態でも構わないし、空気、水やエマージョンオイル等を封入しても構わない。こうすることで、培養容器用蓋９０の曇りを軽減することができる効果を付加することができる。特に、２枚の透明部材５の間に、例えば、継手を介して暖めた空気等を流入させても良い。こうすることで、さらに曇りを抑えることができるので、より好ましい。
【００９２】
また、図２２に示すように、供給用継手１２及び排出用継手１４を、培養容器３の内壁に沿うように配置しても構わない。こうすることで、培養液Ｗを供給する際に積極的に一方向に向かう流れを造りだすことができ、特に整流子を設けなくても整流効果を得ることができる。なお、このような配置を行ったときに、両継手の先端を塞ぐと共に、側面に複数の孔を形成しても構わない。この場合においても、整流効果を得ることができる。
【００９３】
また、上記各実施形態では、供給用管路及び排出用管路を設け、培養液の供給及び排出をそれぞれ専用に行ったが、この場合に限らず、１本の管路で供給と排出とを例えば交互に行っても構わない。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】本発明に係る培養容器用蓋の第１実施形態を示す図であって、培養容器に重ね合わせて蓋をしている状態の断面図である。
【図２】図１に示す培養容器蓋の各構成部品と、培養容器の各構成部品との位置関係を示す図である。
【図３】図１に示す培養容器用蓋の変形例であって、供給用継手の先端と排出用継手の先端とが同じ高さに設定されている培養容器用蓋の断面図である。
【図４】図１に示す培養容器用蓋の変形例であって、排出用継手が底面に垂直な方向に移動可能とされている培養容器用蓋の断面図である。
【図５】図１に示す培養容器用蓋の変形例であって、供給用継手が培養容器の内壁に近接している培養容器用蓋の断面図である。
【図６】図１に示す培養容器用蓋の変形例であって、排出用継手が底面に垂直な方向に対して傾いていると共に、先端の断面積が他の部分よりも小さい培養容器用蓋の断面図である。
【図７】図６に示す排出用継手の変形例を示す図である。
【図８】本発明に係る培養容器用蓋の第２実施形態を示す図であって、培養容器に重ね合わせて蓋をしている状態の断面図である。
【図９】図８に示す培養容器用蓋を下方から見た図である。
【図１０】図８に示す培養容器用蓋を上方から見た図である。
【図１１】図８に示す培養容器用蓋の変形例であって、角柱の整流子を有する培養容器用蓋を下方から見た図である。
【図１２】図１１に示す断面矢視Ａ−Ａ図である。
【図１３】図８に示す培養容器用蓋の変形例であって、供給用継手の先端が整流効果を有するメッシュを備えた培養容器用蓋の断面図である。
【図１４】図１３に示す断面矢視Ｂ−Ｂ図である。
【図１５】本発明に係る培養容器用蓋の第３実施形態を示す図であって、培養容器に重ね合わせて蓋をしている状態の断面図である。
【図１６】図１５に示す培養容器用蓋を下方から見た図である。
【図１７】図１６に示す断面矢視Ｃ−Ｃ図である。
【図１８】培養容器内の空間を、所定の形に仕切る仕切り部材を有するブロックの図であって、（ａ）は上面図、（ｂ）は（ａ）に示す断面矢視Ｄ−Ｄ図である。
【図１９】本発明に係る培養容器用蓋で蓋をされた生体試料培養システムの一実施形態を示す構成図である。
【図２０】図１９に示す生体試料培養システムのインキュベータボックス内を示す図である。
【図２１】本発明に係る培養容器用蓋の変形例を示す断面図である。
【図２２】本発明に係る培養容器用蓋の変形例を示す上面図である。
【符号の説明】
【００９５】
Ｌ    照明光
Ｗ    培養液
１、２０、３０、９０    培養容器用蓋
１ａ    内面
１ｂ    外面
２    凹部
２ａ    凹部の底面
３    培養容器
４    管路
５    透明部材（光透過部）
１０    供給用管路
１１、２１    排出用管路
４０    生体試料培養システム
８６    培養液供給用ポンプ（供給手段）  
８８    排出用ポンプ（排出手段）
【図１】
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【図２】
2007166983.tif 000004
【図３】
2007166983.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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