(57)【要約】      （修正有） 【課題】多分化能を有する細胞に特異的に発現しているＤＮＡ分子（ポリヌクレオチド）を同定し、それらの転写物質の生体機能を解析することにより、ＥＳ細胞等の多分化能を維持させる機能を解明し、又、それら遺伝子の発現プロファイルに基づき多分化能細胞の同定、及び多分化能のモニタリング・判定方法等を提供すること。【解決手段】ＨｉＣＥＰ法において、複数の特定の制限酵素からなる制限酵素順序及びNN-nnを用いて得られるＰＣＲ産物であって各フラグメント長（base）を有するポリヌクレオチド又はその部分ポリヌクレオチド、又は、複数の特定の配列からなる塩基配列又はその塩基配列と相補的な塩基配列から成るポリヌクレオチド又はその部分ポリヌクレオチドからなる。【選択図】 図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨｉＣＥＰ法において表１の番号３〜３６に示された制限酵素順序及びNN-nnを用いて得られるＰＣＲ産物であって、各フラグメント長（base）を有するポリヌクレオチド又はその部分ポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１記載のポリヌクレオチドの両端に、アダプターの一部であって夫々に対応するプライマーと結合する配列が結合したポリヌクレオチド。
【請求項３】
表２に示された塩基配列又はその塩基配列と相補的な塩基配列から成るポリヌクレオチド又はその部分ポリヌクレオチド。
【請求項４】
少なくともいずれかの末端に標識物質が結合している請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞の多分化能性マーカー。
【請求項６】
請求項５記載の多分化能性マーカーから成るハイブリダイゼーション用プローブ、又は該マーカー増幅用プライマーセット。
【請求項７】
請求項６記載のプローブ又はプライマーセットの少なくとも一種類を含む遺伝子スクリーニング用キット。
【請求項８】
マイクロアレイ又はマイクロチップである請求項７記載の遺伝子スクリーニング用キット。
【請求項９】
多分化能性細胞の同定用である、請求項７又は８記載の遺伝子スクリーニング用キット。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を含む転写物の少なくとも一種類の発現量に基づき多分化能性細胞を同定する方法。
【請求項１１】
転写物の少なくとも一種類からなる発現量を、ＨｉＣＥＰ法に基づき作成された、遺伝子発現プロファイルから求めることを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を含む転写物の少なくとも一種類の発現量の変化を測定すること特徴とする、細胞の多分化能性をモニタリングする方法。
【請求項１３】
発現量の変化を、ＨｉＣＥＰ法に基づき作成された遺伝子発現プロファイルから求めることを特徴とする、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を含む転写物の少なくとも一種類の発現量の変化を測定すること特徴とする、細胞の多分化能性を判定する方法。
【請求項１５】
発現量の変化を、ＨｉＣＥＰ法に基づき作成された遺伝子発現プロファイルから求めることを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
多分化能性細胞が胚性幹細胞である、請求項１０ないし１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
多分化能性細胞がマウス胚性幹細胞である、請求項１６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多分化能性細胞に特異的に発現するＤＮＡの断片であるポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドの検出を利用した遺伝子スクリーニング用キット、及び該ポリヌクレオチドの発現を利用した様々な方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞は潜在的にどのような体細胞にも分化できる多分化能を有する細胞である。その多分化能の維持及び分化の制御に関する分子メカニズムを解明することは細胞分化現象の理解、及び再生医学への応用における重要なステップであると考えられる。
【０００３】
これまでの研究によって、多くの生体組織に幹細胞（Stem Cells）の存在が示唆され、実際にいくつかの幹細胞が同定された（非特許文献１）。更に、これらの多分化能が示され、又、細胞表面マーカーを利用して、細胞集団中における幹細胞の割合を多くすることが成功している（非特許文献２）。
【０００４】
このような幹細胞のなかで、胚性幹細胞（Embryonic Stem: ES）細胞だけが全分化能（個体になりうる能力）を示す。ＥＳ細胞は分化の研究において、（１）充分な数の均一な細胞が用意できる、（２）ＬＩＦ（Leukemia Inhibitory Factor）によって人工的にこの細胞を多分化能を維持した状態で培養することができる、（３）インビボ又はインビトロのいずれにおいても、分化を誘導させることが出来る、等の利点を有する（非特許文献３）。
【０００５】
このようなＥＳ細胞の多分化能維持のメカニズムを解明するために、ＬＩＦの関与に関する生化学的経路の研究がされてきた。例えば、ＳＴＡＴ−３（Signal Transducer and Activator of Transcription）とＯｃｔ３／４（Octamer-binding Transcription Factor）のタンパク質は特に多くの研究対象となり、ＳＴＡＴ−３は多分化能を維持させる機能があることが示された（非特許文献４、５）。このように、生化学的経路から多分化能に関与する幾つかのタンパク質があきらかになった。
【非特許文献１】Dick, J.E., Magli, M.C., Huszar, D., Phillips, R.A. and Bernstein, A. (1985) Introduction of a selectable gene into primitive stem cells capable of long-term reconstitution of the hemopoietic system of W/Wv mice. Cell, 42, 71-79.
【非特許文献２】Ema, H., Takano, H., Sudo, K. and Nakauchi, H. (2000) In vitro self-renewal division of hematopoietic stem cells. J. Exp. Med., 192, 1281-1288.
【非特許文献３】Rathjen, J. and Rathjen, P.D. (2001) Mouse ES cells: experimental exploitation of pluripotent differentiation potential. Curr. Opin. Genet. Dev., 11, 587-594.
【非特許文献４】Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I. and Smith, A. (1998) Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev., 12, 2048-2060.
【非特許文献５】Raz, R., Lee, C.K., Cannizzaro, L.A., d'Eustachio, P. and Levy, D.E. (1999) Essential role of STAT3 for embryonic stem cell pluripotency. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 96, 2846-2851.
【非特許文献６】Fukumura, R., Takahashi, H., Saito, T., Tsutsumi, Y., Fujimori, A., Sato, S., Tatsumi, K., Araki, R. and Abe, M. (2003) A sensitive transcriptome analysis method that can detect unknown transcripts. Nucleic Acids Res, 31, e94
【非特許文献７】Hosler, B.A., Rogers, M.B., Kozak, C.A. and Gudas, L.J. (1993) An octamer motif contributes to the expression of the retinoic acid-regulated zinc finger gene Rex-1 (Zfp-42) in F9 teratocarcinoma cells. Mol. Cell. Biol., 13, 2919-2928.
【非特許文献８】Wilder, P.J., Kelly, D., Brigman, K., Peterson, C.L., Nowling, T., Gao, Q.S., McComb, R.D., Capecchi, M.R. and Rizzino, A. (1997) Inactivation of the FGF-4 gene in embryonic stem cells alters the growth and/or the survival of their early differentiated progeny. Dev. Biol., 192, 614-629.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者は、多分化能を有する細胞に特異的に発現しているＤＮＡ分子（ポリヌクレオチド）を同定し、それらの転写物質の生体機能を解析することによって、ＥＳ細胞等の多分化能を維持させる機能を解明し、又、それら遺伝子の発現プロファイルに基づき多分化能細胞の同定、及び多分化能のモニタリング・判定方法等を提供することを目的として鋭意研究を行った。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
その結果、本発明者は、多分化能を有する細胞に特異的に発現しているＤＮＡに含まれる断片の塩基配列を具体的に特定し、それらに基づき本発明を完成した。
【０００８】
即ち、本発明は、以下の各態様の発明に係る。
［１］ＨｉＣＥＰ法において表１の番号３〜３６に示された制限酵素順序及びNN-nnを用いて得られるＰＣＲ産物であって、各フラグメント長（base）を有するポリヌクレオチド又はその部分ポリヌクレオチド。
［２］表２に示された塩基配列又はその塩基配列と相補的な塩基配列から成るポリヌクレオチド又はその部分ポリヌクレオチド。
［３］本発明のポリヌクレオチドを含む細胞の多分化能性マーカー、該多分化能性マーカーから成るハイブリダイゼーション用プローブ又は該マーカー増幅用プライマーセット、該プローブ又はプライマーセットの少なくとも一種類を含む遺伝子スクリーニング用キット。
［４］本発明のポリヌクレオチド配列を含む転写物の少なくとも一種類の発現量に基づき多分化能性細胞を同定する方法、本発明のポリヌクレオチド配列を含む転写物の少なくとも一種類の発現量の変化を測定すること特徴とする、細胞の多分化能性をモニタリングする方法、及び、本発明のポリヌクレオチド配列を含む転写物の少なくとも一種類の発現量の変化を測定すること特徴とする、細胞の多分化能性を判定する方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によって提供されるポリヌクレオチドを用いて、細胞の多分化能性のモニタリング・判定、多分化能性細胞の同定、及び、多分化能性細胞に特異的に発現するＤＮＡの検出・スクリーニング等を行うことが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の第一及び第二の態様
本発明の第一の態様であるポリヌクレオチドは、ＨｉＣＥＰ法において表１に示された制限酵素順序及びNN-nnを用いて得られ、各フラグメント長を有していることにより特徴付けられる。従って、このようなポリヌクレオチドはＨｉＣＥＰ法で得られるＰＣＲ産物に含まれているものである。一方、本発明の第二の態様であるポリヌクレオチドは、表２に示した塩基配列又はその塩基配列と相補的な塩基配列、又はその一部を有することを特徴とする。
【００１１】
このような本発明のポリヌクレオチドは、多分化能性細胞に特異的に発現するＤＮＡの断片である。従って、その塩基配列情報は多分化能性細胞で特異的に転写されるｍＲＮＡ（例えば、遺伝子のコード領域に含まれる断片、タンパク質をコードしないＲＮＡ等）の一部として含まれているものである。従って、本発明のポリヌクレオチドは細胞の多分化能性マーカーとしての用途を有しており、このようなＤＮＡ又はその転写物であるｍＲＮＡを検出・スクリーニングするためのハイブリダイゼーション用プローブとしての機能を有する。
【００１２】
本明細書中において、「多分化能を有する細胞に特異的に発現するＤＮＡ」とは、本明細書の実施例におけるＨｉＣＥＰ法において、未分化状態の細胞におけるピーク高が1000以上であり且つ分化状態の細胞におけるピーク高が５倍以上減少したもの（表１におけるクラス２）、及び、未分化状態の細胞におけるピーク高が1000未満であり且つ分化状態の細胞におけるピーク高が５倍以上減少したもの（表１におけるクラス３）を意味する。
多分化能を有する細胞としては上記の引例に記載されているような当業者に公知の任意の細胞を含み、特に、マウス、サル及びヒト等の哺乳動物由来の胚性幹細胞を挙げることが出来る。
【００１３】
尚、「未分化状態の細胞」とは多分化能性を有している状態を意味し、具体的には、本明細書の実施例におけるＨｉＣＥＰ法において細胞培養培地中にＬＩＦが存在している状態（LIF 除去0h）を示し、又、「分化状態の細胞」とは、細胞培養培地からＬＩＦを除去した結果多分化能性を喪失した状態（LIF 除去48h）を示す。
【００１４】
本発明のポリヌクレオチドを取得又は調製する方法に特に制限はない。例えば、国際公開02/48352号パンフレット（2001年12月12日公開）及び国際公開2005/118791号パンフレット（2005年12月15日公開）に記載された高カバー率遺伝子プロファイル解析法（ＨｉＣＥＰ）法によって取得することが出来る。あるいは、本明細書の配列表に記載されたポリヌクレオチドの塩基配列情報に基づいて、化学合成法、各種ＰＣＲ法及びＩＣＡＮ等のＤＮＡ増幅法等の当業者に公知の任意の方法で調製することも可能である。
【００１５】
又、調製方法に応じて、本発明のポリヌクレオチドの５’ 末端及び／又は３’ 末端に夫々適当な長さの塩基配列が結合していても良い。例えば、ＨｉＣＥＰ法においては、本発明のポリヌクレオチドは、その両末端に、該方法において使用する制限酵素の認識部位及びアダプターの一部であって、夫々に対応するプライマーに相補的な配列が結合した状態のＰＣＲ産物として得られる。
【００１６】
尚、ＨｉＣＥＰ法は、制限酵素ＤＮＡ断片長多型（ＲＦＬＰ）とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づき開発された遺伝子発現プロファイル法であり、ＰＣＲ産物の電気泳動から得られる移動距離とピークのデータから、ある条件下における特定の細胞における遺伝子の発現パターン、公知及び未知遺伝子の発現の有無、それらの発現量等に関する情報から成る遺伝子発現プロファイルを得、それらに基づき、遺伝子発現頻度の解析及び各遺伝子の同定をすることが出来る。このＨｉＣＥＰ法では、擬陽性シグナルを２％以下にすることが可能であり、その結果、存在率の高い４塩基認識制限酵素を使用することにより、８０％という非常に高いカバー率（全発現転写物の中で観察可能な転写物の割合）を達成することが出来、更に、１．２倍までの発現差を検出することも可能である。
【００１７】
ＨｉＣＥＰ法の例として、例えば、遺伝子発現プロファイルを作製する方法であって、
(a)ポリ(A)RNAを鋳型として一本鎖cDNAを合成する工程であって、該一本鎖cDNAを基準として5'末端にタグ物質が付加された一本鎖cDNAを合成する工程、
(b)工程(a)で合成された一本鎖cDNAを鋳型として二本鎖cDNAを合成する工程であって、該二本鎖cDNAを基準として3'末端側にタグ物質が付加された二本鎖cDNAを得る工程、
(c)工程(b)で得られた二本鎖cDNAを第1の制限酵素Xで切断する工程、
(d)該タグ物質に高親和性を有する物質を用いて、工程(c)で得られた断片から該タグ物質が付加している断片を回収する工程、
(e)工程(d)で回収された断片の第1の制限酵素Xによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列及びXプライマーに相補的な配列を含むXアダプターを結合させて、二本鎖cDNAを基準として5'末端側にXアダプターが結合している断片を得る工程、
(f)工程(e)で回収された断片を、該Xアダプターを切断しない第2の制限酵素Yで切断する工程、
(g)該タグ物質に高親和」性を有する物質を用いて、工程(f)で得られた断片から該タグ物質が結合している断片を取り除くことにより、二本鎖cDNAを基準として3'末端側に第2の制限酵素Yによる切断部位を含む断片を回収する工程、
(h)工程(g)で回収された断片の第2の制限酵素Yによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列及びYプライマーに相補的な配列を含むYアダプターを結合させて、二本鎖cDNAを基準として3'末端側にYアダプターが結合している二本鎖配列の断片を得る工程、
(i)該Xアダプターの配列に相補的な配列を含むXプライマーであって、該Xプライマーを基準として3'末端に2塩基配列であるNlN2(Nl及びN2は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である)を含むXプライマーと、該Yアダプターの配列に相補的な配列を含むYプライマーであって、該Yプライマーを基準として3'末端に2塩基配列であるN3N4(N3及びN4は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である)を含むYプライマーとからなるプライマーセットを用いて、工程(h)で得られた二本鎖配列の断片を鋳型としてPCR反応を行う工程、及び、
(j)得られたPCR産物を電気泳動し、その移動距離及びピークを検出することにより遺伝子発現プロファイルを作製する工程、を含む方法である。
【００１８】
上記方法で、遺伝子プロファイル作成に際して、プライマーのミスアニーリングに起因する偽ピークの発生を減少させるためには、工程(i)において、Xプライマー及びYプライマーのそれぞれXアダプター及びYアダプターへのアニーリングを、プライマーのTmMAX+6℃〜TmMAX+14℃の温度で行うことが好ましい。又、特に断りのないかぎり、二本鎖cDNAのセンス鎖(鋳型となるポリ(A)RNAに相同な配列を有する鎖)の5'末端側を二本鎖cDNAの5'末端側とし、当該センス鎖の3'末端側を二本鎖cDNAの3'末端側とする。
【００１９】
「タグ物質」及び「タグ物質に高親和性を有する物質」とは、互いに高親和性をもって特異的に結合することが可能な結合対を構成する一方の物質を意味する。互いに高親和性をもって特異的に結合するこが可能な結合対であれば使用することが可能である。本発明に使用可能なタグ物質とタグ物質に高親和性を有する物質との組合せの例には、ビオチンとストレプトアビジン、ビオチンとアビジン、FITCとFITC抗体、DIGとアンタイDIG及びプロテインAとマウスIgG及びラテックス粒子等が含まれるが、これらに限られるものではない。タグ物質のDNA配列への付加は、当業者に公知の適当な条件により達成することが可能である。また、「タグ物質」と「タグ物質に高親和性を有する物質」との間の親和性に基づくDNA断片の回収(工程(d)及び(g))は、当業者に公知の適当な条件により達成することが可能である。
【００２０】
「制限酵素」とは、一般的に、制限エンドヌクレアーゼとも称される酵素であり、特定の配列において二本鎖DNAを加水分解し切断する酵素である。本発明においては、適切な断片を得るために2種類の制限酵素X及びYを組み合わせて使用する。本発明に使用可能な制限酵素は、発現された遺伝子であるmRNAから合成された二本鎖cDNAを、識別可能な長さを有する断片に切断することが可能な酵素が好ましい。また、得られた当該二本鎖のより多くを、好ましくはほとんど全ての二本鎖を切断するような酵素が好ましい。例えば、国際公開０２／４８３５２号パンフレットに記載されているような当業者に公知の６塩基認識酵素又は４塩基認識酵素を使用することが出来る。但し、既に記載したように、高いカバー率を達成する為には、例えば、ＭｓｐＩ及びＭｓｅＩのような４塩基認識酵素を組み合わせて使用することが好ましい。
【００２１】
「アダプター」は、ＰＣＲ反応においてプライマーを結合させるために使用され、使用する制限酵素及びプライマーの構造に種類等に応じて適宜設計することが出来る。安定したＰＣＲ反応を行わせるためには、通常、プライマーの長さは３０塩基程度である。
【００２２】
「Ｘプライマー」及び「Ｙプライマー」は、対象ＲＮＡ配列と出来るだけ一致させないために、１６塩基以上の長さを有することが好ましい。更に、例えば、「バイオラッド実験イラストレイテッド（３）新版  本当にふえるＰＣＲ」中山広樹  著、秀潤社、２００２年、第２版、第４刷に記載されているような、ＰＣＲプライマーとして一般的に要求される条件を満たしている必要がある。また、各プライマーは当業者に公知の一般的なプライマー合成方法（Letsinger et al., Nucleic Acids Research, 20, 1879-1882, 1992; 特開平１１−０８０１８号公報）に従い調製することができる。
【００２３】
更に、ＰＣＲ反応後の検出を容易にするために、これらプライマーの少なくともいずれかの末端に、当業者に公知の任意の蛍光物質等の標識物質が結合していることが好ましい。例えば、適当な蛍光物質として、６−カルボキシフルオレッセイン（ＦＡＭ）、４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロー６−カルボキシフルオレッセイン（ＨＥＸ）、ＮＥＤ（アプライドシステムズジャパン社）及び６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（Ｒｏｘ）等を挙げることが出来る。
【００２４】
更に、ＨｉＣＥＰ法の実施に際してのその他の条件及び使用する装置等は、国際公開02/48352号パンフレット及び国際公開2005/118791号パンフレットの記載を参照することが出来る。尚、得られた遺伝子発現プロファイルは、当業者に公知の解析ソフトウェア、例えば、ＧｅｎｅＳｃａｎTM （アプライドバイオシステムズジャパン社）を使用して解析することが出来る。尚、上記の基本的特徴を有している限り、更なる技術的改良又は変更が加えられた方法であっても、本明細書中の「ＨｉＣＥＰ法」に含まれるものである。
【００２５】
本発明の第三の態様
既に記載したように、本発明のポリヌクレオチドは多分化能を有する細胞に特異的に発現しているＤＮＡに含まれる断片（一部）に相当するものであるから、細胞の多分化能性マーカーとして有用であり、多分化能を有する細胞で特異的に発現されるＤＮＡ又はその転写物であるｍＲＮＡを検出するためのサザンハイブリダイゼーション及びノザンハイブリダイゼーション等の当業者に公知の様々なスクリーニングで使用することが出来る。即ち、ポリヌクレオチド又はその一部を含むハイブリダイゼーション用プローブを用いることによって、多分化能を有する細胞で特異的に発現される遺伝子を検出することが出来る。更に、該マーカー増幅用プライマーセットを用いる各種のＰＣＲ等の核酸分子増幅法を用いてスクリーニングすることも可能である。このようなプローブ又はプライマーセットには検出する際に使用する標識剤として、当該技術分野で公知の、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質など結合させることが出来る。
【００２６】
即ち、該プローブ又はプライマーセットの少なくとも一種類を用いて、当業者公知の適当な遺伝子スクリーニング用キット、例えば、ＤＮＡチップ、マイクロアレイ（ＤＮＡアレイ）等を構成することにより、多分化能を有する細胞に特異的に発現しているＤＮＡを包括的・網羅的にスクリーニングすることが出来る。ＤＮＡアレイなどに関しては、「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」(細胞工学別冊  ゲノムサイエンスシリーズ１、村松正明、那波宏之監修、２０００年３月１６日第１版第１刷発行)などを参照されたい。
【００２７】
本発明の第四の態様
本発明は更に、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列情報を利用した、本発明のポリヌクレオチド配列を含む転写物の少なくとも一種類の発現量に基づき多分化能性細胞を同定する方法、本発明のポリヌクレオチド配列を含む転写物の少なくとも一種類の発現量の変化を測定すること特徴とする、細胞の多分化能性をモニタリングする方法、又は、本発明のポリヌクレオチド配列を含む転写物の少なくとも一種類の発現量の変化を測定すること特徴とする、細胞の多分化能性を判定する方法にも係る。
【００２８】
これらの方法において、ポリヌクレオチドを含む転写物の発現量又は発現量の変化を測定する手段・原理に特に制限はない。例えば、絶対発現解析（ある臓器で発現している遺伝子の分子数を定量する）又は相対的発現解析（発現量の相対値を測定する）のいずれでもよく、具体的な方法としては、ハイブリダーゼーション及び各種ＰＣＲ等を利用することが出来る。従って、既に記載した遺伝子スクリーニング用キット等を用いて当業者に公知の任意の方法で行うことが出来る。
【００２９】
特に、既に記載したように、ＨｉＣＥＰ法は非常に高いカバー率（全発現転写物の中で観察可能な転写物の割合）及び、約１．２倍までの発現差を検出することも可能である、という優れた技術的特徴を有しているので、この方法に基づき作成された遺伝子発現プロファイルを用いると、発現頻度及び発現頻度の比が大きい遺伝子のみならず、相対的に発現頻度又は発現頻度の比が小さい遺伝子も検出することが可能である。
【実施例】
【００３０】
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はそれらに限定されるものではない。又、本明細書中に引用されたか各文献の開示内容も本明細書の記載の一部をなすものである。
【００３１】
（実施例１）
培養条件およびES細胞の多分化能の判定
マウスESであるE14細胞株（エジンバラ大学Dr. M Hooper研究室にて保管され、希望により分与可能。尚、E14細胞はノックアウトマウス作出の際に世界中で最も広く使われている細胞株のひとつである）は、0.1%ゼラチン、LIF（終濃度500units/ml）、2一メルカプトエタノール(2-ME) （終濃度50μM）及びKnockoutTM Serum Replacement (KSR)(Invitrogen life technologies, CA, USA) （終濃度15%）を含むKnockoutTM D-MEM (Invitrogen life technologies, CA, USA)を培地として用いた。分化の誘導は、LIFを培地から除去することにより行った。FCSとしてKSRを代用した。アルカリフォスファターゼ活性の測定には、AlkalinePhosphatasekits用いた。尚、該ES細胞株をblastcystに導入した結果、それらが正常なマウスに発生することを確認した。
【００３２】
（実施例２）
ES細胞の網羅的遺伝子発現解析
totalRNAは、RNA easy mini kit (Qiagen)を用いてES細胞から抽出された。LIFを加えた通常のES細胞維持用の培地から、LIFを含まないES細胞培地に入れ替え後、12時間、24時間、及び48時間のそれぞれの時点で、ES細胞を回収し、また、それぞれの同じ条件で、細胞のアルカリフォスファターゼ活性の測定を行った。その結果によれば、LIFを培地から除き48時間を経た時点で、ES細胞の殆どはアルカリフォスファターゼの活性を失い多分化能を失っていると判断された。
【００３３】
一方、それぞれ時点での回収した細胞サンプルから、国際公開02/48352号パンフレットの実施例１の記載のＨｉＣＥＰ法に準じて網羅的遺伝子発現プロファイルを作成した。こうして得られた多分化能を維持したEl4株が示す遺伝子発現プロファイルにおける各ピークは、それぞれが異なる転写物に対応しており、その高さの違いはそれぞれの転写物(mRNA)の発現量の違いを反映している。それぞれの条件における異なる遺伝子発現の様子が、ピークの有無や、その高さの違いとしてイメージングされる。
【００３４】
尚、上記ＨｉＣＥＰ法における条件としては、(1) 制限酵素X,YにはMspI, MseIおよび、MseI,MspIを用いた実験を行い、6-FAM, VIC, NED 標識プライマーをXプライマーとしたPCR産物を用い（6-FAM標識プライマーの3'端NN: -AA, -AC, -AG, -AT, -TT, -GT； VIC標識プライマーの3'端NN: -CT, -TC, -TG, -GC, -GG； NED標識プライマーの3'端NN: -CA, -GA, -TA, -CC, -CG）、(2) 電気泳動装置はPRISM3100 (Applied Biosystems)を用いて泳動し、その際、(3) キャピラリーは36cm長のもの、ポリマーはPOP4(Applied Biosystems)、(4) 分子量マーカーはGeneScan500 ROX Size standardとGene Scan 1000red Dye(ROX)の混合物 (いずれもApplied Biosystems)、(5) 電気泳動条件は電圧15kVで温度60℃、(6) 解析ソフトウエアはGene Scan3.7.1を用いることとした。尚、使用したプライマー配列は、Fukumura, R., Takahashi, H., Saito, T., Tsutsumi, Y., Fujimori, A., Sato, S., Tatsumi, K., Araki, R. and Abe, M. (2003) A sensitive transcriptome analysis method that can detect unknown transcripts. Nucleic Acids Res, 31, e94（非特許文献６）に記載されている。
【００３５】
こうして得られた遺伝子発現プロフィルにおいて、E14細胞株の培養培地からがLIFを除いた後の時間経過に従って減少していくピークに着目した。これらのピークにおいて、上記の基準に従って、多分化能を有する細胞に特異的に発現するＤＮＡ」の断片であると判断されたポリヌクレオチドを以下の表１にまとめた。こうして得られた塩基配列を公共のデータベース（NCBIのnr database）に対して当業者に公知の方法（BLAST検索を用いて、queryの90％以上の配列が一致率90%以上という条件）で検索することによりそれらが含まれる遺伝子シンボル（gene symbol）を及び名称（UniGene title）を同定した。尚、このようなピークに対応する遺伝子の中に、すでに多分化能をもつES細胞特異的マーカーであることが報告されているZfp42及びFgf4（非特許文献７，８）の遺伝子転写物が確かに含まれていることが確認された。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
又、これらの中の３種類（No.10, N0.15, No.25）の代表的なポリヌクレオチドに相当する発現ピークの経時的変化を図１〜３に示す。
【００３８】
次に、表１に示した３６種類のポリヌクレオチドの中の一部のもの（１６種類）について塩基配列を決定し、それらを表２に示した。尚、各塩基配列は非特許文献６に記載の手順で決定した。試薬はBigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)を用いた。
【００３９】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明に係るポリヌクレオチドは、ES細胞等の多分化能を有する細胞の同定、及びある培養条件において多分化能を維持している状態かどうかということを検出・スクリーニングするためのマーカー及び各種プローブとして利用することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】多分化能を有する細胞に特異的に発現しているＤＮＡに含まれるポリヌクレオチドに相当する発現ピークの経時的変化を示す。
【図２】多分化能を有する細胞に特異的に発現しているＤＮＡに含まれるポリヌクレオチドに相当する発現ピークの経時的変化を示す。
【図３】多分化能を有する細胞に特異的に発現しているＤＮＡに含まれるポリヌクレオチドに相当する発現ピークの経時的変化を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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