(57)【要約】      （修正有）【課題】無血清培地等の特殊な条件においても、著しく優れた細胞接着性を発現し得る細胞接着性ポリペプチドを提供する。【解決手段】細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ１）及び補助アミノ酸配列（Ｙ）が交互に化学結合してなる直鎖状ポリペプチド（Ｐ）のＮ末端及びＣ末端以外のアミノ酸残基に、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ２）が化学結合してなることを特徴とする細胞接着性ポリペプチドを用いる。（Ｘ１、Ｘ２）はArg Gly Asp配列、Leu Asp Val配列、Leu Arg Glu配列、His Ala Val配列及び他の開示される特定の配列からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ１）及び補助アミノ酸配列（Ｙ）が交互に化学結合してなる直鎖状ポリペプチド（Ｐ）のＮ末端及びＣ末端以外のアミノ酸残基に細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ２）が化学結合してなることを特徴とする細胞接着性ポリペプチド。
【請求項２】
細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ１、Ｘ２）が、Arg Gly Asp配列、Leu Asp Val配列、Leu Arg Glu配列、His Ala Val配列、Arg Glu Asp Val配列（１）、Tyr Ile Gly Ser Arg配列（２）、Pro Asp Ser Gly Arg配列（３）、Arg Tyr Val Val Leu Pro Arg配列（４）、Leu Gly Thr Ile Pro Gly配列（５）、Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile配列（６）、Ile Lys Val Ala Val配列（７）、Asp Gly Glu Ala 配列（８）、Gly Val Lys Gly Asp Lys Gly Asn Pro Gly Trp Pro Gly Ala Pro配列（９）、Gly Glu Phe Tyr Phe Asp Leu Arg Leu Lys Gly Asp Lys配列（１０）、Tyr Lys Leu Asn Val Asn Asp Ser配列（１１）、Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys配列（１２）、Asn Arg Trp His Ser Ile Tyr Ile Thr Arg Phe Gly配列（１３）、Thr Trp Tyr Lys Ile Ala Phe Gln Arg Asn Arg Lys配列（１４）、Arg Lys Arg Leu Gln Val Gln Leu Ser Ile Arg Thr（１５）、Tyr Thr Ile Thr Ile Arg Gly Val配列（７４）、Pro His Ser Arg Asn配列（７５）、Lys Arg Ser Arg配列（７６）及びPhe His Arg Arg Ile Lys Ala配列（７７）からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の細胞接着性ポリペプチド。
【請求項３】
補助アミノ酸配列（Ｙ）が、（Gly Ala）ａ配列 、（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）ｂ配列、（Gly Ala Gly Ala Gly Tyr）ｃ配列、（Gly Ala Gly Val Gly Tyr）ｄ配列、（Gly Ala Gly Tyr Gly Val）ｅ配列、｛Asp Gly Gly (Ala)ｆ Gly Gly Ala｝ｇ配列、（Gly Val Pro Gly Val）ｈ配列、（Gly）i、（Ala）j、（Gly Gly Ala）k配列、（Gly Val Gly Val Pro）ｍ配列及び（Gly Pro Pro）ｎ配列からなる群より選ばれる少なくとも１種を有する請求項１又は２に記載の細胞接着性ポリペプチド。
なお、aは５〜１００の整数、b、ｃ、ｄ及びｅは２〜３３の整数、fは１〜１９４の整数、ｇは｛１｝〜｛２００／（６＋ｆ）｝の小数点以下を切り捨てした整数、hは２〜４０の整数、i及びjは１０〜２００の整数、kは３〜６６の整数、ｍは２〜４０の整数、ｎは３〜６６の整数である。
【請求項４】
直鎖状ポリペプチド（Ｐ）が遺伝子組換え法によって製造される請求項１〜３のいずれかに記載の細胞接着性ポリペプチド。
【請求項５】
アミノ基及び／又はアンモニオ基を含有する化合物（ＡＭ）でさらに修飾されてなる請求項１〜４のいずれかに記載の細胞接着性ポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の細胞接着性ポリペプチド及び基材（Ｂ）からなる細胞接着性ポリペプチド含有基材。
【請求項７】
請求項６に記載の細胞接着性ポリペプチド含有基材を用いて細胞培養する工程を含む細胞の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞接着性ポリペプチドに関する。さらに詳しくは、基材等に対する細胞の接着性を向上させる細胞接着性ポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
人工の細胞接着性ポリペプチドとして、プロネクチンＦ｛Arg Gly Asp配列と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）9配列（２０）とを各々約１３個有し、遺伝子組み換え大腸菌により製造される数平均分子量約１１万のポリペプチド｝及びプロネクチンＬ｛Ile Lys Val Ala Val配列（７）と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）9配列（２０）とを各々約１３個有し、遺伝子組み換え大腸菌により製造される数平均分子量約１１万のポリペプチド｝（非特許文献１）や、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）とが交互に化学結合してなる構造を有し、（Ｙ）に含まれる全アミノ酸個数が１〜５０個であり、かつ（Ｙ）に含まれるグリシン（Gly）及びアラニン（Ala）の合計含有割合が（Ｙ）の全アミノ酸個数に基づいて４２〜１００個数％である細胞接着性ポリペプチド（特許文献１）が知られている。
【０００３】
【非特許文献１】ハンドブック  オブ  バイオデグラダブル  ポリマーズ（アブラハム著，ハーウッド  アカデミック  パブリッシャーズ発行，アムステルダム１９９７（Abraham J. Dombら著, Handbook of Biodegradable Polymers, Harwood Academic Publishers発行, Amsterdam 1997年）
【特許文献１】特開２００５−２１０６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来の細胞接着性ポリペプチドは、無血清培地等の特殊な条件下において細胞培養する場合、細胞接着性が不十分な場合がある。本発明の目的は、無血清培地等の特殊な条件においても、著しく優れた細胞接着性を発現し得る細胞接着性ポリペプチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、鋭意研究を重ねてきた結果、特定のポリペプチドを使用することにより上記目的を達成することを見いだし本発明に到達した。
すなわち、本発明の細胞接着性ポリペプチドの特徴は、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ１）及び補助アミノ酸配列（Ｙ）が交互に化学結合してなる直鎖状ポリペプチド（Ｐ）のＮ末端及びＣ末端以外のアミノ酸残基に細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ２）が化学結合してなる点を要旨とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
「細胞接着性」とは、特定の最小アミノ酸配列が細胞のインテグリンレセプターに認識され、細胞が基材に接着しやすくなる性質を意味する（大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻 第１号、５８〜６６頁、１９９２年）。
細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ１）としては、例えば、「病態生理、第９巻 第７号、５２７〜５３５頁、１９９０年」や「大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻 第１号、５８〜６６頁、１９９２年」に記載されているもの等が用いられる。
【０００７】
これらの最小アミノ酸配列（Ｘ１）の中で、
Arg Gly Asp配列、Leu Asp Val配列、Leu Arg Glu配列、His Ala Val配列、Arg Glu Asp Val配列（１）、Tyr Ile Gly Ser Arg配列（２）、Pro Asp Ser Gly Arg配列（３）、Arg Tyr Val Val Leu Pro Arg配列（４）、Leu Gly Thr Ile Pro Gly配列（５）、Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile配列（６）、Ile Lys Val Ala Val配列（７）、Asp Gly Glu Ala 配列（８）、Gly Val Lys Gly Asp Lys Gly Asn Pro Gly Trp Pro Gly Ala Pro配列（９）、Gly Glu Phe Tyr Phe Asp Leu Arg Leu Lys Gly Asp Lys配列（１０）、Tyr Lys Leu Asn Val Asn Asp Ser配列（１１）、Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys配列（１２）、Asn Arg Trp His Ser Ile Tyr Ile Thr Arg Phe Gly配列（１３）、Thr Trp Tyr Lys Ile Ala Phe Gln Arg Asn Arg Lys配列（１４）、Arg Lys Arg Leu Gln Val Gln Leu Ser Ile Arg Thr（１５）、Tyr Thr Ile Thr Ile Arg Gly Val配列（７４）、Pro His Ser Arg Asn配列（７５）、Lys Arg Ser Arg配列（７６）及びPhe His Arg Arg Ile Lys Ala配列（７７）からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく、細胞接着性の観点等から、さらに好ましくはArg Gly Asp配列、Tyr Ile Gly Ser Arg配列（２）、Ile Lys Val Ala Val配列（７）及びArg Lys Arg Leu Gln Val Gln Leu Ser Ile Arg Thr（１５）からなる群より選ばれる少なくとも１種、特に好ましくはArg Gly Asp配列である。
【０００８】
直鎖状ポリペプチド（Ｐ）は、最小アミノ酸配列（Ｘ１）を１分子中に少なくとも１個有すればよいが、細胞接着性の観点から、１分子中に２〜５０個有するものが好ましく、さらに好ましくは３〜３０個、特に好ましくは４〜２０個、最も好ましくは５〜１８個有するものである。
なお、２種以上の最小アミノ酸配列（Ｘ１）が一分子中に含まれてもよい。
【０００９】
補助アミノ酸配列（Ｙ）は、最小アミノ酸配列（Ｘ１）以外のアミノ酸配列であれば制限なく使用できるが、直鎖状ポリペプチド（Ｐ）の耐熱性及び細胞接着性の観点等から、Gly 及び／又はAlaを有するものが好ましく、例えば（Gly Ala）a 配列、（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）b配列、（Gly Ala Gly Ala Gly Tyr）c配列、（Gly Ala Gly Val Gly Tyr）d配列、（Gly Ala Gly Tyr Gly Val）e配列、｛Asp Gly Gly (Ala)f Gly Gly Ala｝g配列、（Gly Val Pro Gly Val）h配列、（Gly）i、（Ala）j、（Gly Gly Ala）k配列、（Gly Val Gly Val Pro）ｍ配列、（Gly Pro Pro）ｎ配列、（Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly）ｏ配列、（Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln）ｐ配列及び／又は（Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Ser Pro）ｑ配列を有するものが挙げられる。これらのうち、（Gly Ala）a配列、（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）b配列、（Gly Ala Gly Ala Gly Tyr）c配列、（Gly Ala Gly Val Gly Tyr）d配列、（Gly Ala Gly Tyr Gly Val）e、｛Asp Gly Gly (Ala)f Gly Gly Ala｝g配列、（Gly Val Pro Gly Val）h配列、（Gly Val Gly Val Pro）ｍ配列及び／又は（Gly Pro Pro）ｎ配列を有するものが好ましく、さらに好ましくは（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）b配列、（Gly Val Pro Gly Val）h配列、（Gly Val Gly Val Pro）ｍ配列及び／又は（Gly Pro Pro）ｎ配列を有するもの、特に好ましくは（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）b配列を有するものである。
なお、aは５〜１００の整数、b、ｃ、ｄ及びｅは２〜３３の整数、fは１〜１９４の整数、ｇは｛１｝〜｛２００／（６＋ｆ）｝の小数点以下を切り捨てした整数、hは２〜４０の整数、i及びjは１０〜２００の整数、kは３〜６６の整数、ｍは２〜４０の整数、ｎは３〜６６の整数、ｏは１〜２２の整数、ｐ及びｑは１〜１３の整数である。
【００１０】
補助アミノ酸配列（Ｙ）は、グリシン(Gly)及び／又はアラニン(Ala)を含むことが好ましい。グリシン（Gly）及び／又はアラニン（Ala）を含む場合、これらの合計含有割合（％）は、補助アミノ酸配列（Ｙ）の全アミノ酸個数に基づいて、１０〜１００が好ましく、さらに好ましくは２０〜９５、特に好ましくは３０〜９０、最も好ましくは４０〜８５である。この範囲であると、耐熱性がさらに良好となる。
グリシン（Gly）及びアラニン（Ala）の両方を含む場合、これらの含有個数割合（Gly／Ala）は、０．０３〜４０が好ましく、さらに好ましくは０．０８〜１３、特に好ましくは０．２〜５である。この範囲であると、耐熱性がさらに良好となる。
【００１１】
補助アミノ酸配列（Ｙ）には、以上の例示の他に、他のアミノ酸｛アラニン（Ala）、グリシン（Gly）、セリン（Ser）、トレオニン（Thr）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、システイン（Cys）、メチオニン（Met）、フェニルアラニン（Phe）、チロシン（Tyr）、プロリン（Pro）、トリプトファン（Trp）、アスパラギン（Asn）、グルタミン（Gln）、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）、アルギニン（Arg）、リジン（Lys）及びヒスチジン（His）等｝を含んでいてもよい。
【００１２】
（Gly Ala）a配列を有する補助与アミノ酸配列としては、配列番号（１６）〜（１８）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）b配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（１９）〜（２１）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Gly Ala Gly Tyr）c配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２２）〜（２４）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Gly Val Gly Tyr）d配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２５）〜（２７）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Gly Tyr Gly Val）e配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２８）〜（３０）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
｛Asp Gly Gly (Ala)f Gly Gly Ala｝g配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（３１）〜（３３）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Val Pro Gly Val）h配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（３４）〜（３７）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly）i配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（３８）〜（４０）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ala）j配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（４１）〜（４３）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Gly Ala）k配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（４４）〜（４６）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Val Gly Val Pro）ｍ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（４７）〜（４９）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Pro Pro）ｎ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（５０）〜（５２）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly）ｏ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（５３）〜（５５）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln）ｐ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（５６）〜（５８）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Ser Pro）ｑ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（５９）〜（６１）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
【００１３】
これらの補助アミノ酸配列のうち、配列番号（１６）、（１７）、（１９）、（２０）、（２１）、（２２）、（２３）、（２５）、（２６）、（２８）、（２９）、（３１）、（３２）、（３３）、（３４）、（３５）、（３７）、（３８）、（３９）、（４１）、（４２）、（４４）、（４５）、（４７）、（４８）、（５０）、（５１）、（５３）、（５４）、（５６）、（５７）、（５９）又は（６０）で表されるアミノ酸配列が好ましく、さらに好ましくは配列番号（１７）、（１９）、（２０）、（２１）、（２３）、（２６）、（２９）、（３３）、（３４）、（３５）、（３６）、（３７）、（３９）、（４２）、（４５）、（４８）、（５１）、（５４）、（５７）又は（６０）で表されるアミノ酸配列、特に好ましくは配列番号（１９）、（２０）又は（３７）で表されるアミノ酸配列である。
【００１４】
直鎖状ポリペプチド（Ｐ）は、補助アミノ酸配列（Ｙ）を１分子中に少なくとも１個有すればよいが、細胞接着性及び熱安定性の観点等から、１分子中に２〜５０個有するものが好ましく、さらに好ましくは３〜３０個、特に好ましくは４〜２０個有するものである。また、２種以上の補助アミノ酸配列（Ｙ）が１分子中に含まれてもよい。
【００１５】
直鎖状ポリペプチド（Ｐ）は、最小アミノ酸配列（Ｘ１）と補助アミノ酸配列（Ｙ）とが交互に化学結合してなる直鎖構造を有するものである（分岐構造、環状構造及び架橋構造を持たない。）。なお、直鎖構造にはβ構造（直鎖状ペプチドが折れ曲がってこの部分同士が平行に並び、その間に水素結合が作られる二次構造）も含まれる。
【００１６】
直鎖状ポリペプチド（Ｐ）中の最小アミノ酸配列（Ｘ１）と補助アミノ酸配列（Ｙ）との繰り返し単位（Ｘ１−Ｙ）数（個）は、２〜５０が好ましく、さらに好ましくは３〜３０、特に好ましくは４〜２０、最も好ましくは５〜１８である。
【００１７】
直鎖状ポリペプチド（Ｐ）の数平均分子量（Ｍｎ）は、３００〜３，０００，０００が好ましく、さらに好ましくは１，０００〜１，０００，０００、特に好ましくは３，０００〜３００，０００。なお、数平均分子量（Ｍｎ）は、公知の方法により測定でき、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法により、測定サンプルを分離し、泳動距離を標準物質と比較することによって求められる（以下、同じ）。
【００１８】
直鎖状ポリペプチド（Ｐ）の好適な例を以下に示す。
（１）最小アミノ酸配列（Ｘ１）がArg Gly Asp配列（ｘ１）の場合
（ｘ１）の１３個と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）9配列（２０）（ｙ１）の１３個とを有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約１１万のポリペプチド｛「プロネクチンＦ」、プロネクチンは三洋化成工業（株）の登録商標（日本及び米国）である。三洋化成工業（株）製＜以下同じ＞｝；
（ｘ１）の５個と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）3配列（１９）（ｙ２）の５個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約２万のポリペプチド（「プロネクチンＦ２」）；
（ｘ１）の３個と（Gly Val Pro Gly Val）2 Gly Gly （Gly Ala Gly Ala Gly Ser）3配列（３７）（ｙ３）の３個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約１万のポリペプチド（「プロネクチンＦ３」）等。
【００１９】
（２）最小アミノ酸配列（Ｘ１）がIle Lys Val Ala Val配列（ｘ２）の場合
プロネクチンＦ、プロネクチンＦ２又はプロネクチンＦ３のArg Gly Asp配列（ｘ１）をIle Lys Val Ala Val配列（７）（ｘ２）に変更した「プロネクチンＬ」、「プロネクチンＬ２」、又は「プロネクチンＬ３」等。
【００２０】
（３）最小アミノ酸配列（Ｘ１）がTyr Ile Gly Ser Arg配列（ｘ３）の場合
プロネクチンＦ、プロネクチンＦ２又はプロネクチンＦ３のArg Gly Asp配列（ｘ１）をTyr Ile Gly Ser Arg配列（ｘ３）に変更した「プロネクチンＹ」、「プロネクチンＹ２」、又は「プロネクチンＹ３」等。
【００２１】
直鎖状ポリペプチド（Ｐ）は、人工的に製造でき、有機合成法（酵素法、固相合成法及び液相合成法等）、及び遺伝子組み換え法等によって容易に製造できる。有機合成法に関しては、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ（１９８１年７月１日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）又は続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）（昭和６２年５月２０日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）に記載されている方法等が適用できる。遺伝子組み換え法に関しては、特許第３３３８４４１号公報に記載されている方法等が適用できる。有機合成法及び遺伝子組み換え法とも、直鎖状ポリペプチド（Ｐ）を作製できるが、直鎖状ポリペプチド（Ｐ）を安価に大量生産できるという観点等から、遺伝子組み換え法が好ましい。
【００２２】
直鎖状ポリペプチド（Ｐ）のＮ末端及びＣ末端以外のアミノ酸残基としては、直鎖状ポリペプチド（Ｐ）のＮ末端及びＣ末端以外に位置し、反応性基を有するアミノ酸残基等が含まれ、セリン残基、トレオニン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、リシン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基及びトリプトファン残基等が挙げられる（バイオコンジュゲート  テクニークス、Ｇｒｅｇ  Ｔ．  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ著、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ発行、１９９６）。
これらのアミノ酸残基のうち、セリン残基、トレオニン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、リシン残基及びアルギニン残基が好ましく、さらに好ましくはセリン残基、トレオニン残基、アスパラギン酸残基及びグルタミン酸残基、特に好ましくはセリン残基及びトレオニン残基である。
【００２３】
本発明の細胞接着性ポリペプチドは、このアミノ酸残基の反応性基｛水酸基、カルボキシル基、メルカプト基、及び１級又は２級アミノ基等｝に、最小アミノ酸配列（Ｘ２）が化学結合｛共有結合、イオン結合及び／又は水素結合等｝してなるものである。
化学結合のうち、結合の強さの観点等から、共有結合が好ましい。
これらの反応性基のうち、水酸基、カルボキシル基及び１級アミノ基が好ましく、さらに好ましくは水酸基及びカルボキシル基、特に好ましくは水酸基である。
【００２４】
細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ２）は、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ１）と同じでも、異なっていてもよいが、細胞接着性の観点等から、異なることが好ましい。
【００２５】
最小アミノ酸配列（Ｘ２）は、以上の例示の他に、他のアミノ酸（アラニン（Ala）、グリシン（Gly）、セリン（Ser）、トレオニン（Thr）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、システイン（Cys）、メチオニン（Met）、フェニルアラニン（Phe）、チロシン（Tyr）、プロリン（Pro）、トリプトファン（Trp）、アスパラギン（Asn）、グルタミン（Gln）、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）、アルギニン（Arg）、リジン（Lys）及びヒスチジン（His）等）を含んでいてもよい。他のアミノ酸を含む場合、その個数は、１５個以下が好ましく、さらに好ましくは１０個以下、特に好ましくは５個以下である。
他のアミノ酸を含む細胞接着性最小アミノ酸配列としては、Arg Gly Asp Ser配列（６２）、Arg Gly Asp Cys配列（６３）、Arg Gly Asp Thr配列（６４）、Tyr Arg Gly Asp Ser配列（６５）、Gly Arg Gly Asp Ser配列（６６）、Gly Arg Gly Asp Ser Pro配列（６７）、Gly Arg Gly Asp Asn Pro配列（６８）、Gly Arg Gly Asp Thr Pro配列（６９）、Gly Arg Gly Asp Ser Pro Cys配列（７０）、Gly Arg Gly Asp Ser Pro Lys配列（７１）、Ser Ile Lys Val Ala Val配列（７２）及びCys Ser Arg Ala Arg Lys Gln Ala Ala Ser Ile Lys Val Ala Val Ser Ala Asp Arg配列（７３）等が挙げられる。
【００２６】
直鎖状ポリペプチド（Ｐ）１分子中に含まれる最小アミノ酸配列（Ｘ２）の個数は、細胞接着性の観点等から、２〜５０個が好ましく、さらに好ましくは３〜３０個、特に好ましくは４〜２０個である。
なお、２種以上の最小アミノ酸配列（Ｘ２）が一分子に結合していてもよい。
また、最小アミノ酸配列（Ｘ２）の結合位置及び含有個数は、公知の方法｛例えば、ポリペプチドを部位特異的に切断する消化酵素を用いて断片化した後、各断片の質量分析等によりペプチドマップを作製する方法（プロテオーム解析、平野久著、株式会社東京化学同人発行、２００１年）｝によって確認できる。
【００２７】
直鎖状ポリペプチド（Ｐ）のＮ末端及びＣ末端以外のアミノ酸残基に細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ２）を化学結合させる方法としては、公知の方法が適用でき、たとえば以下の方法等が挙げられる。
＜共有結合させる方法＞
（１）直鎖状ポリペプチド（Ｐ）中のセリン残基及び／又はトレオニン残基の水酸基と、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ２）からなるペプチド中のアミノ基とを反応させる方法。
（２）（Ｐ）中のアスパラギン酸残基及び／又はグルタミン酸残基のカルボキシル基と、（Ｘ２）からなるペプチド中のアミノ基や水酸基とを反応させる方法。
（３）（Ｐ）中のリシン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基及び／又はトリプトファン残基の１級又は２級アミノ基と、（Ｘ２）からなるペプチド中のカルボキシル基とを反応させる方法。
【００２８】
これらの反応は公知の方法（例えば、「ペプチド合成の基礎と実験、平成９年１０月５日、丸善株式会社発行」に記載の方法等）で行うことができる。具体的には、以下の（１）〜（３）の通りである。
（１）直鎖状ポリペプチド（Ｐ）中のセリン残基及び／又はトレオニン残基の水酸基と、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ２）からなるペプチド中のアミノ基とを反応させる場合、（Ｐ）の水酸基を予めカルボニルジイミダゾール化合物と反応させ、イミダゾール誘導体｛Ｒ−Ｉｍ；Ｉｍはイミダゾリン環、Ｒは（Ｐ）に由来｝とした後、（Ｘ２）からなるペプチドのうち１級アミノ基又は２級アミノ基を有するものを加えることによって、カルバメート結合を形成させて共有結合させることができる。カルボニルジイミダゾール化合物としては、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール等が挙げられる。
【００２９】
（２）（Ｐ）中のアスパラギン酸残基及び／又はグルタミン酸残基のカルボキシル基と、（Ｘ２）からなるペプチド中のアミノ基や水酸基とを反応させる場合、（Ｐ）のカルボキシル基を予めカルボジイミド化合物と反応させ、アシルイソ尿素｛Ｒ’−Ｎ＝Ｃ（−ＯＣＯＲ）−ＮＨ−Ｒ’；−ＯＣＯＲが（Ｐ）に由来する部分｝とした後、（Ｘ２）からなるペプチドのうち１級アミノ基若しくは２級アミノ基を有するもの、又は水酸基を有するものを加えることによって、アミド結合もしくはエステル結合を形成させて共有結合させることができる。カルボジイミド化合物としては、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等が挙げられる。
【００３０】
（３）（Ｐ）中のリシン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基、及び／又はトリプトファン残基の１級又は２級アミノ基と、（Ｘ２）からなるペプチド中のカルボキシル基とを反応させる場合、（Ｘ２）からなるペプチドのカルボキシル基を予めカルボジイミド化合物と反応させ、アシルイソ尿素とした後、（Ｐ）を加えることによって、（Ｐ）に（Ｘ２）をアミド結合を形成させて共有結合させることができる。
【００３１】
＜イオン結合、水素結合させる方法＞
溶媒等に直鎖状ポリペプチド（Ｐ）と細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ２）からなるペプチドとを投入し混合して作製する方法（たとえば、特許文献１に記載された細胞接着性ポリペプチドと基材との結合方法と同様の方法）。
【００３２】
本発明の細胞接着性ポリペプチドは、アミノ基及び／又はアンモニオ基を含有する化合物（ＡＭ）でさらに修飾されていてもよい。（ＡＭ）で修飾されていると、本発明の細胞接着性ポリペプチドの細胞接着性がさらに良好となる。なお、（ＡＭ）には細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ１、Ｘ２）は含まれない。
【００３３】
アミノ基及び／又はアンモニオ基を含有する化合物（ＡＭ）としては、ポリアミン、アミノアルコール、アミノ基を有するハロゲン化物、アミノ基含有モノマー及びアミノ基含有モノマーを構成単量体とする重合体、並びにこれらの４級化物等が使用できる。
ポリアミンとしては、少なくとも１個の１級アミノ基又は２級アミノ基を有するポリアミン（炭素数２〜５６）等が用いられ、脂肪族ポリアミン、脂環式ポリアミン、複素環式ポリアミン及び芳香族ポリアミン等が用いられる。
【００３４】
脂肪族ポリアミンとしては、アルキレンジアミン（エチレンジアミン、プロピレンジアミン、トリメチレンジアミン、テトラメチレンジアミン及びヘキサメチレンジアミン等）、アルキレン基の炭素数が２〜６であるポリアルキレンポリアミン（ジエチレントリアミン、イミノビスプロピルアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン及びペンタエチレンヘキサミン等）、及びこれらのアルキル（炭素数１〜１８）置換体（ジメチルアミノプロピルアミン、ジエチルアミノプロピルアミン、ジプロピルアミノプロピルアミン、メチルエチルアミノプロピルアミン、トリメチルヘキサメチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルエチレンジアミン、トリオクタデシルエチレンジアミン及びメチルイミノビスプロピルアミン等）等が挙げられる。
【００３５】
脂環式ポリアミンとしては、１，３−ジアミノシクロヘキサン、１，３−ビス（メチルアミノ）シクロヘキサン、１，３−ビス（ジヒドロキシアミノ）シクロヘキサン、イソホロンジアミン、メンタンジアミン及び４，４’−メチレンジシクロヘキサンジアミン等が挙げられる。
【００３６】
複素環式ポリアミンとしては、ピペラジン、Ｎ−メチルピペラジン、Ｎ−アミノエチルピペラジン及び１，４−ジアミノエチルピペラジン等が挙げられる。
【００３７】
芳香族ポリアミンとしては、フェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ジメチルフェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’−トリメチルフェニレンジアミン、ジフェニルメタンジアミン及び２，６−ジアミノピリジン、トリレンジアミン、ジエチルトリレンジアミン、４，４’−ビス（メチルアミノ）ジフェニルメタン及び１−メチル−２−メチルアミノ−４−アミノベンゼン等が挙げられる。
【００３８】
アミノアルコールとしては、炭素数２〜５８のアミノアルコール等が用いられ、炭素数２〜１０のアルカノールアミン［モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、モノイソプロパノールアミン、モノブタノールアミン、トリエタノールアミン、トリプロパノールアミン、トリブタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン及びＮ，Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラキス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン等］、これらのアルキル（炭素数１〜１８）置換体［Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルエタノールアミン、Ｎ−エチルジエタノールアミン、Ｎ−オクタデシルジエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン及びＮ，Ｎ，Ｎ’−トリオクタデシル−Ｎ’−ヒドロキシエチルエチレンジアミン等］等が挙げられる。
【００３９】
アミノ基を有するハロゲン化物としては、炭素数２〜１７のアルキルアミンのハロゲン（塩素及び臭素等）化物等が用いられ、アミノエチルクロリド、Ｎ−メチルアミノプロピルクロリド、ジメチルアミノエチルクロリド、ジエチルアミノエチルクロリド、ジベンジルアミノエチルブロミド、ジメチルアミノプロピルブロミド、ジエチルアミノプロピルクロリド及びジベンジルアミノプロピルクロリド等が挙げられる。
【００４０】
アミノ基含有モノマーとしては、炭素数５〜２１のアミノ基含有ビニル化合物、エチレンイミン及び炭素数２〜２０のアミノ酸等が用いられる。
アミノ基含有ビニル化合物としては、アミノ基含有（メタ）アクリレート、アミノ基含有（メタ）アクリルアミド、アミノ基含有芳香族ビニル炭化水素及びアミノ基含有アリルエーテル等が用いられる。なお、（メタ）アクリ・・・は、アクリ・・・及び／又はメタクリ・・・を意味する。
【００４１】
アミノ基含有（メタ）アクリレートとしては、アミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−メチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジベンジルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジベンジルアミノプロピル（メタ）アクリレート、モルホリノエチル（メタ）アクリレート及びＮ−メチルピペチジノエチル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
【００４２】
アミノ基含有（メタ）アクリルアミドとしては、アミノエチルアクリルアミド、Ｎ−メチルアミノプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、モルホリノエチル（メタ）アクリルアミド及びＮ−メチルピペチジノエチル（メタ）アクリルアミド等が挙げられる。
【００４３】
アミノ基含有芳香族ビニル炭化水素としては、アミノエチルスチレン、Ｎ−メチルアミノエチルスチレン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスチレン、Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノスチレン及びＮ−ベンジル−Ｎ−メチルアミノスチレン等が挙げられる。
【００４４】
アミノ基含有アリルエーテルとしては、アミノエチルアリルエーテル、Ｎ−メチルアミノエチルアリルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアリルエーテル及びＮ，Ｎ−ジエチルアミノエチルアリルエーテル等が挙げられる。
【００４５】
アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、プロリン、システイン、リシン、セリン、グリシン、３−アミノプロピオン酸、８−アミノアクタン酸及び２０−アミノエイコサン酸等が挙げられる。
【００４６】
アミノ基含有モノマーの重合体としては、アミノ基含有ビニル化合物からなるビニルポリマー、ポリエチレンイミン及びポリペプチド（直鎖状ポリペプチド（Ｐ）は含まない。）等が挙げられる。
アミノ基含有モノマーの重合体の重量平均分子量は、５００〜１００万が好ましく、さらに好ましくは１，０００〜８０万、特に好ましくは２，０００〜５０万である。なお、重量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定することができる｛基準物質：分子量４２０〜２０,６００,０００のポリスチレンスタンダード（東ソー製）等｝。
【００４７】
これらの４級化物としては、これらのアミノ基を４級化剤（メチルクロリド、エチルクロリド、ベンジルクロリド、ジメチル炭酸、ジメチル硫酸及びエチレンオキシド等）によって４級化したもの等が挙げられる。
【００４８】
アミノ基及び／又はアンモニオ基を含有する化合物（ＡＭ）で修飾する方法としては、（１）アミノ基及び／又はアンモニオ基を含有する化合物（ＡＭ）と、修飾前の細胞接着性ポリペプチドとを化学結合｛共有結合、イオン結合及び／又は水素結合等｝させる方法、並びに、（２）アミノ基及び／又はアンモニオ基を含有する化合物（ＡＭ）を修飾前の細胞接着性ポリペプチドに物理吸着（ファンデルワールス力による吸着）させる方法等が適用できる。
これらのうち、結合強度の観点等から、（１）の化学結合させる方法が好ましく、さらに好ましくは共有結合である。
アミノ基及び／又はアンモニオ基を含有する化合物（ＡＭ）と修飾前の細胞接着性ポリペプチドとを化学結合させる方法としては、直鎖状ポリペプチド（Ｐ）と最小アミノ酸配列（Ｘ２）との場合と同様である。
アミノ基及び／又はアンモニオ基を含有する化合物（ＡＭ）と修飾前の細胞接着性ポリペプチドとを物理吸着させる方法としては、イオン結合及び／又は水素結合させる方法と同様の方法がそのまま利用でき、好ましいものも同じである。
【００４９】
本発明の細胞接着性ポリペプチド中に含まれるアミノ基及びアンモニオ基｛以下、アミノ基と省略する。なお、このアミノ基には、化合物（ＡＭ）に由来するアミノ基を含み、アミノ酸に由来するアミノ基及びアミド結合の広義のアミノ基を含まない。｝の平均個数（個）は、本発明の細胞接着性ポリペプチド１分子あたり、０．００１〜１００，０００が好ましく、さらに好ましくは０．０１〜１０，０００、特に好ましくは０．１〜１，０００である。
アミノ基の平均個数は、公知の方法等により定量でき、例えば、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）法［タンパク質の化学ＩＶ（東京化学同人発行、１９８１年）等］や塩酸・指示薬（ブロムフェノールブルー等）滴定法による全アミン価測定法［ＪＩＳ  Ｋ７２３７−１９８６や、ＡＳＴＭ  Ｄ２０７４−６６等］が適用できる。具体的には、例えば、アミノ基の個数が既知のアミノ基を含有する化合物を、単位容積当たりの濃度を変化させてＴＮＢＳ法によって測定し、検量線（アミノ基の個数と吸光度のグラフ）を作製する。また修飾前の細胞接着性ポリペプチドをＴＮＢＳ法で測定し、得られた吸光度を、検量線を用いてアミノ基の個数に換算する。同時に修飾後の細胞接着性ポリペプチドをＴＮＢＳ法で測定し、得られた吸光度を、検量線を用いてアミノ基の個数に換算する。これら修飾前後のアミノ基の個数の差を算出して、その値を測定に用いた細胞接着性ポリペプチドの分子数で除することで、細胞接着性ポリペプチドに修飾されるアミノ基の平均個数とする。
【００５０】
本発明の細胞接着性ポリペプチドは、基材（Ｂ）とともに細胞接着性ポリペプチド含有基材とすることができる。
基材（Ｂ）の材質、形状、及び細胞接着性ポリペプチドの基材（Ｂ）への結合方法は、特許文献１に記載されたものをそのまま適用できる。
【００５１】
本発明の基材中の細胞接着性ポリペプチドの含有量は、細胞接着性の観点等から、本発明の基材の単位面積あたり、０．１ｎｇ／ｃｍ2〜１００ｍｇ／ｃｍ2が好ましく、さらに好ましくは１ｎｇ／ｃｍ2〜１０ｍｇ／ｃｍ2、特に好ましくは１０ｎｇ／ｃｍ2〜１ｍｇ／ｃｍ2、最も好ましくは１００ｎｇ／ｃｍ2〜１００μｇ／ｃｍ2である。
なお、本発明において、単位面積は、基材（Ｂ）の表面のうち、培養される細胞が接着し得る表面の表面積を意味し、細胞が入り込まないような微小な凹凸（例えば、１μｍ以下）は平坦な表面として取扱うが、単位面積を高める目的でリブ（畝）等が設けてあるものについてはそのリブの表面積を単位面積に含まれる。
単位面積あたりの細胞接着性ポリペプチドの含有量の測定方法は特に限定されないが、例えば、免疫学的測定法が利用できる。具体的な方法としては、特許文献１に記載されたものをそのまま適用できる。
【００５２】
本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材は、必要に応じて滅菌処理を施してもよい。
滅菌方法としては、特に限定されないが、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、プラズマ滅菌、γ線滅菌、アルコール滅菌、オートクレーブ滅菌及び乾熱滅菌等が挙げられる。
【００５３】
細胞接着性ポリペプチド含有基材を用いて細胞培養する工程を含む細胞の生産方法としては、公知の培養基材の代わりに本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材を使用する以外、公知の方法が適用できる。
細胞培養工程としては、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材又は、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材が入った適当な容器（シャーレ、プレート、フラスコ、ビーカー及びファーメンター等）に、細胞（ＣＥ）を縣濁させた培地を加えて適当な条件で培養する方法等が挙げられる。
【００５４】
本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材に接着できる細胞（ＣＥ）としては細胞であれば制限がないが、主に医薬品等の有用物質生産や治療等に用いられる哺乳動物由来の正常細胞、哺乳動物由来の株化細胞及び昆虫細胞が適している。具体的には特許文献１に記載された細胞等が挙げられる。
【００５５】
本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材を用いる細胞培養方法に用いる培地は、特に制限無く一般の細胞培養に用いられるものが利用でき、また、これら培地に必要に応じて、血清、細胞増殖因子、抗菌剤等を添加したものも利用できる。培地、血清およびその使用量、細胞増殖因子及びその使用量、抗菌剤及びその使用量の具体例としては、特許文献１に記載されたものがそのまま利用できる。
また、細胞の播取量、培養条件、培養後の細胞回収方法についても、特許文献１に記載されたものがそのまま利用できる。
【００５６】
細胞接着性ポリペプチド含有基材を用いる細胞培養で得られる細胞（ＣＥ２）としては、細胞接着性ペプチド含有基材に接着できる細胞（ＣＥ）と同じものが挙げられる。なお、細胞（ＣＥ）が分化して、元の細胞（ＣＥ）とは異なる細胞（ＣＥ２）が得られる場合がある。例えば、元の細胞（ＣＥ）が骨髄未分化間葉系幹細胞であって、細胞（ＣＥ２）が骨芽細胞、軟骨細胞又は脂肪細胞等の場合である（ティッシュ・エンジニアリング、上田実 編、財団法人名古屋大学出版会、１９９９年１０月１０日）。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
＜実施例１＞
（１）直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−０）の作製
特表平３−５０２９３５号公報中の実施例記載の方法に準じて、Ile Lys Val Ala Val配列（７）と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）9配列（２０）とを各々約１３個有し、数平均分子量約１１万のペプチドを遺伝子組換え大腸菌により製造し、カラムクロマトグラフィーにて精製して直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−０）を得た。
【００５８】
（２）直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−１）の作製
直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−０）５０ｍｇと塩酸Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルクロリド１５０ｍｇとを４．５Ｍ過塩素酸リチウム水溶液１．５ｍＬに溶解した後、その溶液を攪拌しながら、水酸化ナトリウム１００ｍｇを溶解した４．５Ｍ過塩素酸リチウム水溶液１．３２５ｍＬを一定速度で滴下した。室温（約２５℃）で１時間攪拌したのち、反応液を透析、凍結乾燥して、水溶性の直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−１）を得た。
【００５９】
（３）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−２）の作製
直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−１）３ｍｇをガラス試験管中で乾燥（１００℃、３０分）した後、脱水ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）２ｍＬに溶解した。さらに、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール２ｍｇを加え、溶解した。細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ２）からなるペプチドとしてGly Arg Gly Asp Ser配列（６７）からなるペプチド７ｍｇを加え、室温（約２５℃）で２０時間攪拌した。得られた反応溶液を分画分子量１２，０００〜１４，０００の透析膜を用いて、脱イオン水１Ｌに対して２４時間透析した。なお、最初の１２時間は、4時間経過毎に脱イオン水を交換した。次いで、凍結乾燥して本発明の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−２）を得た。
【００６０】
（４）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１］の調製
細胞接着ポリペプチド（Ｐ１−２）１ｍｇを脱イオン水１ｍＬに溶解し、さらに、９９．５重量％塩化ナトリウムを０．８５重量％含有する０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、ＰＢＳ）で２００倍希釈して、細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−２）溶液Ａ（Ｐ１−２の濃度：５μｇ／ｍＬ）を作製した。この溶液Ａを９６穴のポリスチレンプレート（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）中の８穴に５０μＬ／穴で投入し、室温（約２５℃）で２時間放置した。アスピレーターを用いて溶液を除去した後、生理食塩水１００μＬ／穴で２回洗浄しさらに脱イオン水１００μＬ／穴で洗浄して、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１］を得た。
【００６１】
＜実施例２＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ２−２）の作製
「直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−０）」を、「Ile Lys Val Ala Val配列（７）と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）9配列（２０）とを各々約４個有し、数平均分子量約３万５千の直鎖状ポリペプチド（Ｐ２−０）｛実施例１と同様にして調製した｝」に変更したこと以外、実施例１と同様にして本発明の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ２−２）を得た。
【００６２】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ２］の調製
「細胞接着ポリペプチド（Ｐ１−２）」を「細胞接着性ポリペプチド（Ｐ２−２）」に変更した以外、実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ２］を得た。
【００６３】
＜実施例３＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ３−２）の作製
「直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−０）」を、「Ile Lys Val Ala Val配列（７）と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）3配列（１９）とを各々約５個有し、数平均分子量約２万の直鎖状ポリペプチド（Ｐ３−０）｛実施例１と同様にして調製した｝」に変更した以外、実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ３−２）を得た。
【００６４】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ３］の調製
「細胞接着ポリペプチド（Ｐ１−２）」を「細胞接着性ポリペプチド（Ｐ３−２）」に変更した以外、実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ３］を得た。
【００６５】
＜実施例４＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ４−２）の作製
「直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−０）」を、「Ile Lys Val Ala Val配列（７）と（Gly Val Pro Gly Val）2 Gly Gly （Gly Ala Gly Ala Gly Ser）3配列（３７）とを各々約３個有し、数平均分子量約１万の直鎖状ポリペプチド（Ｐ４−０）｛実施例１と同様にして調製した｝」に変更した以外、実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ４−２）を得た。
【００６６】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ４］の調製
「細胞接着ポリペプチド（Ｐ１−２）」を「細胞接着性ポリペプチド（Ｐ４−２）」に変更した以外、実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ４］を得た。
【００６７】
＜実施例５＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ５−２）の作製
「直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−０）」を、「Tyr Ile Gly Ser Arg配列（２）と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）９配列（２０）とを各々約１３個有し、数平均分子量約１１万の直鎖状ポリペプチド（Ｐ５−０）｛実施例１と同様にして調製した｝」に変更した以外、実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ５−２）を得た。
【００６８】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ５］の調製
「細胞接着ポリペプチド（Ｐ１−２）」を「細胞接着性ポリペプチド（Ｐ５−２）」に変更した以外、実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ５］を得た。
【００６９】
＜実施例６＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ６−２）の作製
「直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−０）」を、「Tyr Ile Gly Ser Arg配列（２）と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）3配列（１９）とを各々約５個有し、数平均分子量約２万の直鎖状ポリペプチド（Ｐ６−０）｛実施例と同様にして調製した｝」に変更した以外、実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ６−２）を得た。
【００７０】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ６］の調製
「細胞接着ポリペプチド（Ｐ１−２）」を「細胞接着性ポリペプチド（Ｐ６−２）」に変更した以外、実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ６］を得た。
【００７１】
＜実施例７＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ７−２）の作製
「直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−０）」を、「Tyr Ile Gly Ser Arg配列（２）と（Gly Val Pro Gly Val）2 Gly Gly （Gly Ala Gly Ala Gly Ser）3配列（３７）とを各々約３個有し、数平均分子量約１万の直鎖状ポリペプチド（Ｐ７−０）｛実施例１と同様にして調製した｝」に変更した以外は実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ７−２）を得た。
【００７２】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ７］の調製
「細胞接着ポリペプチド（Ｐ１−２）」を「細胞接着性ポリペプチド（Ｐ７−２）」に変更した以外、実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ７］を得た。
【００７３】
＜実施例８＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ８−２）の作製
「直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−０）」を、「Arg Gly Asp配列と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）９配列（２０）とを各々約１３個有し、数平均分子量約１１万の直鎖状ポリペプチド（Ｐ８−０）｛実施例１と同様にして調製した｝」に変更したこと、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ２）として、「Gly Arg Gly Asp Ser配列（１１１）」を「Ser Ile Lys Val Ala Val配列（７３）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして本発明の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ８−２）を得た。
【００７４】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ８］の調製
「細胞接着ポリペプチド（Ｐ１−２）」を「細胞接着性ポリペプチド（Ｐ８−２）」に変更した以外、実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ８］を得た。
【００７５】
＜実施例９＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ９−２）の作製
「直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−０）」を、「Arg Gly Asp配列と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）3配列（１９）とを各々約５個有し、数平均分子量約２万のペプチド（Ｐ９−０）｛実施例１と同様にして調製した｝」に変更したこと、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ２）として、「Gly Arg Gly Asp Ser配列（１１１）」を「Ser Ile Lys Val Ala Val配列（７３）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして本発明の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ９−２）を得た。
【００７６】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ９］の調製
「細胞接着ポリペプチド（Ｐ１−２）」を「細胞接着性ポリペプチド（Ｐ９−２）」に変更した以外、実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ９］を得た。
【００７７】
＜実施例１０＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１０−２）の作製
「直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−０）」を、「Arg Gly Asp配列と（Gly Val Pro Gly Val）2 Gly Gly （Gly Ala Gly Ala Gly Ser）3配列（３７）とを各々約３個有し、数平均分子量約１万の直鎖状ポリペプチド（Ｐ１０−０）｛実施例１と同様にして調製した｝」に変更したこと、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ２）として、「Gly Arg Gly Asp Ser配列（１１１）」を「Ser Ile Lys Val Ala Val配列（７３）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして本発明の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１０−２）を得た。
【００７８】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１０］の調製
「細胞接着ポリペプチド（Ｐ１−２）」を「細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１０−２）」に変更した以外、実施例１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１０］を得た。
【００７９】
＜比較例１＞
「細胞接着ポリペプチド（Ｐ１−２）」を「直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−１）」に変更した以外、実施例１（４）と同様にして、比較用の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１１］を得た。
【００８０】
＜比較例２＞
「細胞接着ポリペプチド（Ｐ１−２）」を「直鎖状ポリペプチド（Ｐ４−１）」に変更した以外、実施例１（４）と同様にして、比較用の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１２］を得た。
【００８１】
＜比較例３＞
「細胞接着ポリペプチド（Ｐ１−２）」を「直鎖状ポリペプチド（Ｐ７−１）」に変更した以外、実施例１（４）と同様にして、比較用の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１３］を得た。
【００８２】
＜比較例４＞
９６穴のポリスチレンプレート（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）をそのまま比較用の基材［Ｂ１］とした。
【００８３】
＜評価１：ＶＥＲＯ細胞（アフリカミドリザル腎由来細胞）の細胞接着活性＞
（１）ＰＢＳに牛血清アルブミンを０．２重量％含有する水溶液を評価基材に５０μＬ／穴で投入し、２７±３℃で２時間放置した。アスピレーターを用いて溶液を除去した後、生理食塩水１００μＬ／穴で２回洗浄し、さらに脱イオン水１００μＬ／穴で洗浄した。次に、血清を含まないＤＭＥＭ（ICN Biomedicals社製）を１００μＬ／穴で添加し、３７℃インキュベーター内に１時間保存した。１時間後、ＶＥＲＯ細胞（大日本製薬株式会社製）を１万ｃｅｌｌｓ／穴で添加し、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中にて２時間放置して培養した。
【００８４】
（２）培養終了後、アスピレーターを用いて培地を除去し、生理食塩水を細胞に直接当たらないように注意しながら１００μＬ／穴で添加し、アスピレーターを用いて生理食塩水を除去した。次にＰＢＳを５０μＬ／穴で添加し、さらにテトラカラーワン（生化学工業株式会社）を１０μＬ／穴で添加して、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中に４時間放置した。
【００８５】
（３）４時間後に、ホルマザン生成量を、４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定し、この値を細胞接着活性とした。細胞接着活性は、当該吸光度の高さに比例する。これらの結果を表１に示す（これらの結果は各々８穴分の平均データである。）。
【００８６】
【表１】
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【００８７】
＜評価２：ＨＴ−１０８０細胞（ヒト繊維肉腫由来細胞）の細胞接着活性＞
（１）ＰＢＳに牛血清アルブミンを０．２重量％含有する水溶液を評価基材に５０μＬ／穴で投入し、２７±３℃で２時間放置した。アスピレーターを用いて溶液を除去した後、生理食塩水１００μＬ／穴で２回洗浄しさらに脱イオン水１００μＬ／穴で洗浄した。次に、血清を含まないＤＭＥＭ（ICN Biomedicals社製）を１００μＬ／穴で添加し、３７℃インキュベーター内に１時間保存した。１時間後、ＨＴ−１０８０細胞（大日本製薬株式会社製）を１万ｃｅｌｌｓ／穴で添加し、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中にて２時間放置して培養した。
【００８８】
（２）培養終了後、アスピレーターを用いて培地を除去し、生理食塩水を細胞に直接当たらないように注意しながら１００μＬ／穴で添加し、アスピレーターを用いて生理食塩水を除去した。次にＰＢＳを５０μＬ／穴で添加し、さらにテトラカラーワン（生化学工業株式会社）を１０μＬ／穴で添加して、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中に４時間放置した。
【００８９】
（３）４時間後に、ホルマザン生成量を、４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定し、この値を細胞接着活性とした。細胞接着活性は、当該吸光度の高さに比例する。これらの結果を表２に示す（これらの結果は各々８穴分の平均データである。）。
【００９０】
【表２】
2007051127.tif 000003
【００９１】
＜実施例１１＞
（１）ポリウレタンフィルム（ＵＦ）の準備
ウレタンエマルション（商品名：パーマリンＵＡ２００、三洋化成工業株式会社製）６．６７ｇとイオン交換水３．３３ｇとを混合して、ウレタンエマルションを調製した。このウレタンエマルションを、縦２０ｃｍ×横２０ｃｍの剥離紙（ＥＶ１３０ＴＰＤ；リンテック株式会社製）上に均一に広げ、膜厚が３００μｍになるように、両端に３００μｍの高さにビニールテープを巻いたガラス棒を用いてキャストした後、室温（約２５℃）に放置した。室温放置２４時間後に、循風乾燥機中で１２０℃、１時間乾燥した。乾燥後、剥離紙上に形成されたフィルムを、剥離紙から剥離し、この中央部から１０ｃｍ×１０ｃｍの大きさを切り出して、ポリウレタンフィルム（ＵＦ）を得た。
【００９２】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１４］の調製
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−２）の水溶液｛（Ｐ１−２）の濃度：５μｇ／ｍＬ｝５０ｍＬをガラスシャーレ(直径１５０ｍｍ)に投入し、この水溶液中にポリウレタンフィルム（ＵＦ）を浸漬させ、２５℃で１時間静置することにより、ポリウレタンフィルム（ＵＦ）に細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−２）を物理吸着させた。その後、１００ｍＬのイオン交換水で５回洗浄し、３７℃の循風乾燥機の中で１２時間乾燥させ、細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１４］を調製した。
【００９３】
＜実施例１２＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−ＡＭ１）の作製
直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−１）３ｍｇをガラス試験管中で乾燥（１００℃、３０分）した後、脱水ＤＭＳＯ２ｍＬに溶解し、さらに、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール２ｍｇを加え、溶解した後、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ２）からなるペプチドとしてGly Arg Gly Asp Ser配列（６７）からなるペプチド７ｍｇと、アミノ基及び／又はアンモニオ基を含有する化合物（ＡＭ）としてポリエチレンイミン（数平均分子量４２３）１３ｍｇを加え、室温（約２５℃）で２０時間攪拌した。得られた反応溶液を分画分子量１２，０００〜１４，０００の透析膜を用いて、脱イオン水１Ｌに対して２４時間透析した。なお、最初の１２時間は、4時間経過毎に脱イオン水を交換した。次いで、透析液を凍結乾燥して本発明の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−ＡＭ１）を得た。
【００９４】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１５］の調製
「細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−２）」を「細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−ＡＭ１）」に変更した以外、実施例１１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１５］を得た。
【００９５】
＜実施例１３＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−ＡＭ２）の作製
「ポリエチレンイミン（数平均分子量４２３）１３ｍｇ」を「ポリエチレンイミン（数平均分子量６００）１８ｍｇ」に変更した以外、実施例１２（１）と同様にして、細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−ＡＭ２）を得た。
【００９６】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１６］の調製
「細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−２）」を「細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−ＡＭ２）」に変更した以外、実施例１１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１６］を得た。
【００９７】
＜実施例１４＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−ＡＭ３）の作製
「ポリエチレンイミン（数平均分子量４２３）１３ｍｇ」を「ポリエチレンイミン（数平均分子量１８００）５３ｍｇ」に変更した以外、実施例１２（１）と同様にして、細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−ＡＭ３）を得た。
【００９８】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１７］の調製
「細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−２）」を「細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１−ＡＭ３）」に変更した以外、実施例１１と同様にして、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１７］を得た。
【００９９】
＜比較例５＞
「細胞接着ポリペプチド（Ｐ１−２）」を「直鎖状ポリペプチド（Ｐ１−１）」に変更した以外、実施例１１と同様にして、比較用の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１８］を得た。
【０１００】
＜評価３：ＮＨＤＦ細胞（正常ヒト表皮角化細胞）の細胞接着活性＞
実施例１１〜１４、比較例５の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１４］〜［ＰＢ１８］を各々直径１．２ｃｍの大きさに切り取ったものを、クリーンベンチ中で表裏各１時間づつＵＶ照射を行い、滅菌した。なお、１種類の細胞接着性ポリペプチド含有基材につき、６枚用意し、各基材について６回ずつ評価を繰り返した。
また、正常ヒト皮膚繊維芽細胞増殖用低血清培地（倉敷紡績株式会社製）１０ｍＬ中で正常ヒト皮膚線維芽細胞（倉敷紡績株式会社製）を５日間プレ培養して得た正常ヒト皮膚線維芽細胞を１．５万個／穴の割合で２４穴ポリスチレンプレート（ベクトンディッキンソン社製；２枚使用した）の各穴に置いたコラーゲンタイプＩゲル（商品名：セルマトリックス、新田ゼラチン社製）に播種した後、３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のインキュベーター中にて７日間の細胞培養を行い、培養真皮モデルを作成した。
【０１０１】
引き続き、培養真皮モデルを、無血清表皮角化細胞増殖用培地（倉敷紡績株式会社製）を各穴１５０μＬ入れた別の２４穴ポリスチレンプレートに移した後、培養真皮モデルの上面中央部に、正常ヒト表皮角化細胞（倉敷紡績株式会社製）３μＬを播種し、さらに播種した正常ヒト表皮角化細胞上に予め滅菌しておいた細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１４］〜［ＰＢ１８］を貼りつけた。貼りつけは、接着剤等は用いず、正常ヒト表皮角化細胞を播種した培養真皮モデルと細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１４］〜［ＰＢ１８］が接するように、正常ヒト表皮角化細胞を播種した培養真皮上にピンセットを用いて細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１４］〜［ＰＢ１８］を置いた。
細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１４］〜［ＰＢ１８］を貼りつけた培養真皮モデルは再び３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のインキュベーターに戻し、さらに７日間培養を行った。
【０１０２】
培養７日後に、細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１４］〜［ＰＢ１８］を培養真皮の上面から各々剥がし、新しい２４穴ポリスチレンプレートに、剥がした細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１４］〜［ＰＢ１８］を１枚／穴で投入した後、各穴へ、塩化ナトリウムを０．８５重量％で含有するリン酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ７．２）１２５μＬ及びテトラカラーワン（生化学工業社製）２５μＬを投入し、３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のインキュベーター中にて４時間インキュベートした。
【０１０３】
次いで、インキュベートした２４穴プレートの各穴から６０μＬの液を抜き出し、液中のホルマザン生成量を、各々１穴について２回測定した｛４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）の吸光度；プレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）｝。
各細胞接着性ポリペプチド含有基材について、１２個のデータ（６枚×２回）の平均値を算出し、この平均値を、細胞接着性ポリペプチド含有基材表面に付着している細胞の細胞接着活性とした。これらの数値を表３に示した。なお、細胞接着活性は吸光度の高さに比例する。
【０１０４】
【表３】
2007051127.tif 000004
【０１０５】
表１及び表２の結果から、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材は、比較用の基材に比べて、細胞接着性（細胞の接着活性）が極めて高かった。また、表３の結果から、アミノ基含有化合物を有することでさらに細胞接着性が高くなった。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明の細胞接着性ポリペプチドは、細胞接着性が極めて高いため、従来は無血清培養条件下において接着が困難であった細胞（ＶＥＲＯ細胞やＨＴ−１０８０細胞等）を基材上に効率良く接着させることができる。したがって、本発明の細胞接着性ポリペプチド、細胞接着性ポリペプチド含有基材及び細胞接着性ポリペプチド含有基材を用いて細胞培養する工程を含む製造方法は、細胞が関係する、研究開発、有用物質生産及び治療等に極めて有用である。
研究開発用としては、動物実験（毒性試験、刺激性試験及び代謝機能試験等）の代替、遺伝子導入、目的物質（細胞、生理活性物質、遺伝子、有害化学物質及び薬効成分等）のスクリーニング及び細胞の精製や機能解析等に利用できる。
有用物質生産用としては、サイトカイン、血栓溶解剤、血液凝固因子製剤、ワクチン、ホルモン、抗生物質、抗体及び増殖因子等の生産に利用できる。
治療用としては、皮膚、頭蓋骨、筋肉、皮膚組織、骨、軟骨、血管、神経、腱、靭帯、毛胞組織、粘膜組織、歯周組織、象牙質、骨髄、網膜、漿膜、胃腸管及び脂肪等の組織、並びに肺、肝、膵及び腎等の臓器の治療に利用できる。
【配列表】
2007051127000001.app