(57)【要約】【課題】  核酸マイクロアレイを利用し、遺伝子発現等を検出するに際し、実験者の手技に左右されない核酸マイクロアレイ及びそれを使用した核酸検出方法を提供する。【解決手段】  洗浄レベルメータープローブを含む核酸マイクロアレイ、及び以下の（１）〜（４）の工程を含む核酸の検出方法。（１） 試料核酸を調製する工程。（２） 前記試料核酸を請求項１〜４のいずれかに記載のマイクロアレイに接触させ、ハイブリダイゼーション反応を行う工程。（３） ハイブリダイゼーション反応後のマイクロアレイを洗浄の度合の弱い側から、強い側へ段階的に洗浄を行う工程。（４） （４）形成したハイブリッドを検出する工程。【特許請求の範囲】
【請求項１】
洗浄レベルメータープローブを含む核酸マイクロアレイ。
【請求項２】
洗浄レベルメータープローブが、標的プローブのTm値付近で段階的に設計されたものである請求項１記載のアレイ。
【請求項３】
洗浄レベルメータープローブが、鎖長又は塩基配列の違いにより、各々のプローブのTm値が異なるように設計されたものである、請求項１又は２記載のアレイ。
【請求項４】
洗浄レベルメータープローブが、ある配列を１ユニットとし、そのユニットの繰り返し配列である請求項１〜３のいずれかに記載のアレイ。
【請求項５】
以下の（１）〜（４）の工程を含む核酸の検出方法。
（１） 試料核酸を調製する工程。
（２） 前記試料核酸を請求項１〜４のいずれかに記載のアレイに接触させ、ハイブリダイゼーション反応を行う工程。
（３） ハイブリダイゼーション反応後のアレイを洗浄の度合の弱い側から、強い側へ段階的に洗浄を行う工程。
（４） 形成したハイブリッドを検出する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸マイクロアレイ及びそれを用いた核酸検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸マイクロアレイとは、担体上に多数の核酸プローブをそれぞれ独立に固定化したものである。核酸プローブとしてはｃＤＮＡや合成オリゴ核酸が用いられることが多い。従来は、表面加工を施したガラスやシリコンなどの担体上に、核酸プローブを固定化したものが利用されている。近年ではゲル担体など、他の手法による担体の改質も行われている。
【０００３】
ハイブリダイゼーション技術を利用した核酸検出方法とは、核酸マイクロアレイに固定されている核酸プローブに対して、検査対象となる核酸試料を配列特異的にハイブリダイズさせ、配列特異的に形成したハイブリットを蛍光物質等により検出し、複数の核酸プローブに対応する試料中の核酸塩基配列を含む分子を、定量的又は定性的に調べる方法である。この方法は、複数の核酸塩基配列に関する発現量又は特定の核酸塩基配列の、配列自体等の解析に利用される。
【０００４】
核酸を検出する際、従来は予め設定した適切な条件下でハイブリダイゼーション反応を実施し、次いで洗浄操作により、アレイ表面に残存した核酸試料又はその他不要物の除去を行い、核酸プローブと特異的なハイブリッドを形成している核酸試料を検出する。核酸プローブは、配列解析、機能解析等、検出対象となる所望の核酸塩基配列と相補又は同一に設計されることが多い。核酸プローブとしては、ｃＤＮＡ等の比較的長鎖の核酸、短鎖の合成オリゴ核酸等が使用される。合成オリゴ核酸を核酸プローブとして使用する場合、ヒトやマウスなど、遺伝子情報の知見が蓄積している生物については、それらの塩基配列情報を用い、各配列の相同性や機能などに着目した上で、合成オリゴ核酸の配列を設計し、核酸プローブを作製することが可能である。
【０００５】
核酸マイクロアレイによる核酸検出は現在、自動化、高速化が進みつつある。一方、検出結果が、未だに実験者の手技により結果が左右されることも多い。そのような実験者の手技を補正するために、核酸マイクロアレイに実験の成否を判断する基準が組み込まれる。この判断基準はコントロールプローブと呼ばれる。コントロールプローブには、核酸試料中に含まれていないはずの核酸配列に対応した配列であるネガティブコントロールプローブ、核酸試料中に確実に含まれている核酸配列に対応したポジティブコントロールプローブ、サンプル間の検出結果を補正するためのコントロールプローブ、核酸試料の品質を確認するためのコントロールプローブ等が存在する。これらのうち、実験手技自体の成否確認に使われるのはネガティブコントロールとポジティブコントロールであり、例えばネガティブコントロールプローブからシグナルが得られる場合や、ポジティブコントロールからシグナルが得られない場合は、データの信憑性を疑うこととなる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、ネガティブコントロールやポジティブコントロールのシグナルについて、洗浄操作の際、どの程度までシグナルを低下又は維持させればよいのか明確ではなく、更にはその基準を数値で表すことは困難であった。
【０００７】
また、特異的ハイブリッドと非特異的ハイブリッドの解離する条件（Tm値、塩濃度）が近接している場合、更には特異的ハイブリッドの特異性が類似している場合には、これらを完全に分割できる洗浄条件を一義的に決めることは困難であった。
【０００８】
本発明は、上記課題を解決すること目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意検討を行った結果、洗浄条件と相関の取れる既知の特定配列を含むプローブ配列を設計し、そのプローブを使用することにより洗浄進行度を定量できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
即ち、本発明は、洗浄レベルメータープローブを含む核酸マイクロアレイ、である。またそのアレイを用いた核酸の検出方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、核酸マイクロアレイの検出時、洗浄段階が定量的に明確化される。また、クロスハイブリダイゼーション由来のシグナルが含まれる可能性を推定でき、核酸マイクロアレイを用いた検出のデータ信頼性が向上する。さらには、核酸マイクロアレイに搭載されている標的プローブのTm値がばらついている場合でも、それぞれのプローブの洗浄度合を明確化することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の第１は、洗浄レベルメータープローブを含む核酸マイクロアレイ、である。
【００１３】
「洗浄レベルメータープローブ（以下、単に洗浄プローブと称する場合がある）」とは、核酸マイクロアレイ等によるハイブリダーゼーションを用いた核酸検出の際、洗浄段階を定量化するために用いられるプローブである。核酸マイクロアレイに固定される洗浄プローブは、各々、相補鎖又は部分相補鎖の解離に要する温度が異なる、プローブの集合体（プローブ群）を構成する。洗浄プローブ群を構成するプローブの各々は、Tm値の計算式等により算出された、各々異なった二本鎖核酸の解離温度を示す。また、それらは、検出目的とする標的配列を含むプローブ（以下、標的プローブと称する）の、同塩濃度におけるTm値付近で、段階的又は等差的に設計される。
【００１４】
そのような洗浄プローブの塩基組成としては、どのような塩基の組み合わせでも良い。また、各洗浄プローブの配列間の類似性は問題としない。但し、核酸試料に含まれる可能性が高い配列とハイブリダイズするような洗浄プローブは設計すべきでない。具体的には、洗浄プローブの設計に際して、GenBank等、公共データベースにより、設計した各洗浄プローブを検索し、少なくとも16塩基以上の連続的な相補配列を含まないように設計されることが望ましい。また、鎖長又は塩基配列の違いにより、各々の洗浄プローブのTm値が異なるように設計されたものが好ましい。さらには、ある配列を１ユニットとし、そのユニットの繰り返し配列から構成される洗浄プローブであることがより好ましい。このようなプローブであれば、ユニット数を変更することにより、容易にTm値の異なるプローブ群を設計することができる。
【００１５】
上記設計された洗浄プローブは、例えば、化学合成法、ｃDNAから調製する方法等、公知の方法により調製される。
【００１６】
調製された洗浄プローブは、核酸マイクロアレイ（以下、核酸アレイと称する）を構成するプローブとして、前記アレイ上又はアレイ中に固定される。核酸アレイとは、平面基板等の担体上に複数のプローブを各々独立に固定化されたものである。この核酸アレイに、検査対象となる核酸試料を、標的プローブの塩基配列に対して特異的にハイブリダイズさせることにより、核酸アレイに固定された標的プローブに対応する塩基配列を含む核酸試料分子を、定量的又は定性的に調べることができる。
【００１７】
核酸アレイとしては、上記平面基板を使用したもの以外にも、様々な形態物が知られている。本発明者らの一部も、プローブを固定する担体として繊維を使用した繊維型マイクロアレイ（ジェノパールTM、http://www.mrc.co.jp/genome/top.html）を開発している。
【００１８】
核酸アレイを製造する際のプローブの固定は、担体の性質等に鑑み、その方法が選択される。
【００１９】
上記のごとく調製された核酸アレイに、上述の洗浄プローブ又は洗浄プローブ群を搭載することにより、実験者の手技に左右されない、再現性の高いデータを取得することができる。
【００２０】
次に、第２の発明である、「核酸アレイを用いた核酸検出方法」について説明する。
【００２１】
核酸試料としては、核酸アレイに固定されている標的プローブと相補配列を有する核酸、標的プローブと相補配列を有さない核酸、又はその混合物が考えられる。その核酸試料は、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の種類又は由来を問わない。例えば、ＰＣＲ、逆転写反応、転写反応などを利用して調製することもできる（「Molecular Cloning(CSHL PRESS)」参照）。
【００２２】
さらに本発明では、核酸試料には、核酸アレイに搭載されている洗浄プローブと相補（場合によっては部分相補）の核酸が含まれる。これら相補の核酸は、後述する洗浄操作の際に洗浄レベルを判断する指標として使用される。また、元々の核酸試料に洗浄プローブに相補な配列を有する核酸が含まれている場合は、別途調製する必要はない。
【００２３】
次に、必要により核酸試料を標識化する。標識化としては、例えば、蛍光物質、ラジオアイソトープ、酵素等による標識が挙げられる（「ＤＮＡアレイと最新ＰＣＲ法（秀潤社）」参照）。また、検体に標識せずに、ハイブリットを形成した２本鎖にインターカレーターを導入する方法等も使用される。
【００２４】
次に、上述の核酸試料を核酸アレイに接触させ、ハイブリダイゼーション反応を行う。ハイブリダイゼーション反応は、核酸試料及び所定の試薬からハイブリダイゼーション溶液を調製し、これを核酸アレイに接触させて行う（「ＤＮＡアレイと最新ＰＣＲ法（秀潤社）」参照）。
【００２５】
ここで「接触」とは、核酸アレイに固定されているプローブ類が、核酸試料に接触している状態をいい、その方法としては、核酸アレイを核酸溶液中に浸漬する方法、核酸アレイのプローブ固定部位に、核酸試料を通過又は滞留させる方法等が挙げられる。
【００２６】
ハイブリダイゼーション反応に際しては、ハイブリダイゼーション温度、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度及び溶液のｐＨの条件設定が重要となる。それらの条件は、核酸アレイに固定されているプローブの塩基配列に対して、核酸試料中に含まれる、標的プローブと相補関係にある特異的核酸が、該プローブとハイブリッドを形成するに十分な条件であることが好ましい。より好ましくは、標的プローブに対して、特異的核酸試料が、非特異的核酸試料よりも優勢に、ハイブリッドを形成し得る条件である。
【００２７】
上記条件は、プローブ配列情報及びハイブリダイゼーション反応の条件等を考慮し、各プローブのTm値を計算し、そのTm値を指標として決定することができる。Tm値の計算は、例えば、Baldino F.Jらによって提唱された計算式により算出することができる。
【００２８】
次に、洗浄操作を行う。通常、ハイブリダイゼーション後の核酸アレイには、特異的核酸とプローブとのハイブリッドの他に、プローブと非特異結合をしている非特異的ハイブリッドや試料中に混入している酵素類などの共雑物が存在する。特異的核酸ハイブリッドのみを検出するには、これら共雑物を取り除く洗浄操作が必要になる。
【００２９】
洗浄液としては、塩及び界面活性剤が含まれていることが望ましいが、主に塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム等から調製されたＳＳＣ溶液、Tris-HCl溶液、Tween20溶液、ＳＤＳ溶液又はその混合物を使用することが多い。また、洗浄液は、適切な塩濃度、温度、ｐＨとする必要がある。この条件は、上述したＴｍ値を指標にして決定される。
【００３０】
洗浄操作としては、一定の塩濃度、温度、ｐＨで最適化された、核酸試料を含まない溶液を洗浄液として用い、核酸アレイをその溶液中に浸漬する方法、核酸アレイの表面又はプローブ結合部位に、該洗浄液を通過又は滞留させる方法等が使用される。例えば、温度制御可能な容器中に、洗浄液を注入し、洗浄液の温度を一定に保持し、その容器中に核酸アレイを浸漬することにより実施される。
【００３１】
上記洗浄操作により、理想的には、標的プローブとのハイブリッド（特異的ハイブリッド）のみ、核酸アレイ上に残り、非特異的なハイブリッド、共雑物等はすべて洗い流される。しかし、特異的ハイブリッドと非特異的ハイブリッドの解離する条件（Tm値、塩濃度）が近接している場合、更には特異的ハイブリッドの特異性が類似している場合には、これらを完全に分割できる洗浄条件を一義的に決めることは困難である。
【００３２】
上記の問題は、本発明の「洗浄レベルメータープローブを搭載した核酸マイクロアレイ」を使用することにより解決できる。
【００３３】
すなわち、核酸アレイに搭載された洗浄プローブに対して、洗浄の度合を、弱い側（よりハイブリッドが解離しにくい洗浄条件）から、強い側（よりハイブリッドが解離しやすい条件）へと段階的に変えていき、洗浄プローブとのハイブリッドの解離状況を見ながら、洗浄条件を決定することができる。上述のように、洗浄プローブは標的プローブのTm値付近で段階的に設計されており、且つ核酸試料には、それら洗浄プローブに対応する相補（部分相補）の核酸が含まれているため、標的プローブ及び核酸試料に対応する最適の洗浄条件を決定することができる。
【００３４】
具体的には、塩濃度が高く、溶液温度の低い洗浄溶液を用いて洗浄を行った後、検出を行い、検出後の核酸アレイを、前回の洗浄溶液よりも塩濃度が低い及び／又は溶液温度が高い洗浄溶液を用いて洗浄を行い、再度検出を行う工程を、段階的、複数回にわたって行い洗浄条件を決定する。
【００３５】
検出方法としては、核酸試料の標識方法により、種々の検出方法を用いることができる。例えば、蛍光ラベル化検出法、化学発光法、ラジオアイソトープ等の手法が利用できる。
【００３６】
蛍光ラベル化検出法では、予め標識した核酸試料、又はハイブリッドに対してインターカレーターで標識した核酸の蛍光シグナルを検出する。
【００３７】
検出装置としては、例えば冷却ＣＣＤカメラ等、核酸アレイの蛍光を検出するに適した部材を具備した蛍光顕微鏡により検出することできる。他の検出装置としては、レーザースキャナーやX線フィルムなどが利用できる。
【００３８】
検出の際には、核酸アレイ表面又は全体の乾燥を防ぐため、少なくとも、水分蒸発のない環境下で検出することが望ましい。乾燥を防ぐ方法としては、例えば、核酸アレイを溶液の入ったケースに浸漬させて、液相中で検出する方法、又は核酸アレイを水分の蒸発のない飽和水蒸気雰囲気にした密閉容器中に封入して検出する方法等が挙げられる。ただし、アレイ表面を乾燥させたとしても、再洗浄、再検出が可能な限りにおいては、アレイ表面の乾燥を防ぐ必要はない。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例を用いて本発明を具体的に説明する。
【００４０】
＜実施例１＞
洗浄プローブが期待通りに機能するかを確認するため、洗浄プローブとして機能するオリゴ核酸を含む、核酸アレイを調製し、洗浄実験を実施した。
【００４１】
１．核酸試料の調製
洗浄プローブにハイブリダイズさせる外部コントロール核酸試料として、配列番号１及び２に示す配列のＣｙ５末端標識オリゴヌクレオチドを、洗浄レベルメータープローブ以外にハイブリさせるモデル核酸試料として、配列番号３及び４に示す配列のＣｙ５末端標識オリゴヌクレオチドを合成した（表１参照）。これらCy5末端標識オリゴヌクレオチドを含む、表２の組成からなるモデル核酸試料溶液を調製した。
【表１】
2007006723.tif 000002
【表２】
2007006723.tif 000003
【００４２】
２．プローブの合成
表３に示すプローブを合成した。なお、配列番号５〜１０は、洗浄プローブとして機能する。
【００４３】
配列番号１１のプローブは、配列番号１２と対比するためのクロスハイブリダイゼーションのモデルとして使用した。配列番号１２の核酸プローブは、配列番号４の試料核酸を、完全相補で捕らえることができるため、正確なデータの指標として使用した。
【表３】
2007006723.tif 000004
【００４４】
３．核酸アレイの製造
図１に示す配列固定器具を利用して中空繊維束を製造した。なお、図中のｘ、ｙ、ｚは直交の３次元軸であり、ｘ軸は繊維の長手方向と一致する。
【００４５】
まず、直径０．３２ｍｍの孔が、孔の中心間距離を０．４２ｍｍとして、縦１２列、横各１９列で合計２２８個設けられた厚さ０．１ｍｍの多孔板（２１）２枚を準備した。これらの多孔板を重ね合わせて、そのすべての孔に、ポリカーボネート中空繊維（３１）（三菱エンジニアリングプラスチック社製  カーボンブラック1質量%添加）を１本づつ、通過させた。
【００４６】
各繊維に０．１Ｎの張力をＸ軸方向にかけた状態で２枚の多孔板の位置を移動させて、中空繊維の一方の端部から２０ｍｍの位置と１００ｍｍの位置の２ヶ所に固定した。即ち、２枚の多孔板の間隔を８０ｍｍとした。
【００４７】
次いで、多孔板間の空間の周囲３面を板状物（４１）で囲った。このようにして上部のみが開口状態にある容器を得た。この容器の上部から容器内に樹脂原料を流し込んだ。樹脂としては、ポリウレタン樹脂接着剤（日本ポリウレタン工業（株）ニッポラン4276、コロネート4403）の総重量に対し、2.5質量％のカーボンブラックを添加したものを使用した。２５℃で１週間静置して樹脂を硬化させた。次いで多孔板と板状物を取り除き、中空繊維束を得た。
【００４８】
次に表４に示すの質量比で混合した単量体及び開始剤を含むゲル前駆体重合性溶液をアレイに搭載するプローブ毎にそれぞれ調製した。
【表４】
2007006723.tif 000005
【００４９】
次に、図２に示したプローブ配置になるように、中空繊維束の対応する中空繊維の中空部に上記で作製した各核酸プローブを含むゲル前駆体重合性溶液を充填するために、該重合性溶液の入った容器及び上記で作製した中空繊維束をデシケーター内に設置した。デシケーター内を減圧状態にしたのち、中空繊維束の各糸の封止されていない端部を所定の前記重合性溶液の入った容器に浸漬した。デシケーター内に窒素ガスを封入し、中空繊維の中空部にキャプチャープローブを含むゲル前駆体重合性溶液を導入した。次いで、容器内を70℃とし、３時間かけて重合反応を行った。
【００５０】
このようにしてプローブがゲル状物を介して中空繊維の中空部に保持された中空繊維束を得た。
【００５１】
次に得られた中空繊維束を、ミクロトームを用いて繊維の長手方向と直交する方向でスライスし、厚さ０．２５ｍｍの薄片シート（核酸アレイ）を５０枚得た。
【００５２】
４．ハイブリダイゼーション反応、洗浄及び検出操作
上記３．で作製した核酸アレイに、上記１．で調製した核酸試料を接触させ、恒温槽中で、６５℃で１７時間ハイブリダイゼーションを行った。
【００５３】
ハイブリダイゼーション後、該アレイを表５に示す洗浄条件で洗浄を行い、逐次、検出を行った。検出操作は、冷却ＣＣＤカメラ方式の核酸アレイ自動検出装置を用いて、アレイを２×ＳＳＣ中に浸漬し、カバーガラスをかぶせた後に、標識核酸試料分子の蛍光シグナル強度を測定した。
【表５】
2007006723.tif 000006
【００５４】
５．シグナル強度測定結果
得られた蛍光シグナル強度を、図３にまとめた。本実施例においては、配列番号５から１０までが、洗浄レベルメーターとして使用するプローブ配列であり、配列番号５から順次、二本鎖が解離しやすくなるように、Tm値の計算値を元にして設計されている。これらのシグナル強度のパターンを指標とすることにより、再現性の高い洗浄を行うことが可能であり、信頼性の高いデータが得られる。
【００５５】
本実施例においては、第６回目洗浄後に配列番号６と配列番号７のシグナル強度の差が100倍以上になる。その際、擬似クロスハイブリである配列番号１１のシグナル強度が大幅に低減する。しかし、完全相補である配列番号１２のシグナル強度はそれほど低減していない。
【００５６】
つまり、この第6回目の測定結果は、完全相補配列のハイブリダイゼーションを捕らえ、非完全相補配列のハイブリダイゼーションを排除している結果であり、信頼性の高い洗浄条件であることを示している。
【００５７】
よって、今回の実験を再現性よく、正確に行うためには、若干ストリンジェンシーの弱い、たとえば65℃、0.5xSSC程度の洗浄から開始し、検出、再洗浄を繰り返し、配列番号６と７のシグナル強度の差を目安に、その差が100倍以上になった際のデータを採用すれば、正確性が高いデータが再現性よく得られる。
【００５８】
通常、核酸アレイのデータバリデーションには、明確なシグナル強度が得られるプローブとしてのポジティブコントロールや、シグナルが得られないはずであるネガティブコントロールを搭載することがあるが、これらのみでは、ハイブリダイゼーション反応後の洗浄操作の進行度を定量的に捕らえることは非常に困難であった。本実施例の通り、Tm値の異なる複数の洗浄プローブを搭載し、外部からそれに対応する検体を添加することにより、洗浄の進行度を定量的に把握することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】繊維配列体を製造する配列固定治具の図である。
【図２】核酸アレイのデザインを示す図である。
【図３】各洗浄条件における核酸アレイの蛍光シグナル強度を示した図である。
【符号の説明】
【００６０】
１１・・・・孔
２１・・・・多孔板
３１・・・・中空繊維
４１・・・・板状物
【配列表フリーテキスト】
【００６１】
配列番号１        合成DNA
配列番号２        合成DNA
配列番号３        合成DNA
配列番号４        合成DNA
配列番号５        合成DNA
配列番号６        合成DNA
配列番号７        合成DNA
配列番号８        合成DNA
配列番号９        合成DNA
配列番号１０      合成DNA
配列番号１１      合成DNA
配列番号１２      合成DNA
【図１】
2007006723.tif 000007
【図２】
2007006723.tif 000008
【図３】
2007006723.tif 000009
【配列表】
2007006723000001.app