(57)【要約】【課題】ホスファチドを高収率、高純度で得ることのできる、工業的な製造法の提供。【解決手段】ホスファチドを、ストレプトバーテイシリウム・ハチジョウエンスＡＴＣＣ１９７６９株から採取されたホスファチジル基転移活性を有するホスホリパーゼＤの存在下、単一水性相において、第１級叉は第２級アルコールと反応させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：  Ｒ−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−Ｒ１
（式中、Ｒはジアシルグリセロール残基、Ｒ１はアルコール残基である。）
で示されるホスファチドを製造するにあたり、
一般式（ＩＩ）：  Ｒ−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−Ｒ２
（式中、Ｒは上記の通りであり、Ｒ２はＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２またはＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）３である。）
で示されるホスファチドを、ストレプトバーテイシリウム・ハチジョーエンス（Streptoverticillium hachijoense）ＡＴＣＣ 19769 株由来のホスファチジル基転移活性を有するホスホリパーゼＤの存在下、単一水性相において、第１級叉は第２級アルコールと反応させることを特徴とする方法。
【請求項２】
アルコール残基が、Ｃ２叉はＣ３鎖を有しており、当該鎖はアルコール性ヒドロキシル基に結合し、かつ、任意に１以上の極性基を有し得るものであり、当該鎖のいずれかの炭素原子と当該極性基のいずれかの原子との間で付加的な炭素原子が介在するか叉は介在することなく環状基が形成されていることもある、請求項１記載の方法。
【請求項３】
極性基が、アミノ、カルボキシ及びヒドロキシルから選択される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ジアシルグリセロール残基が、同一叉は異なった、飽和叉は不飽和の、Ｃ１２〜Ｃ２４の長さを有する、２個の脂肪酸残基を有するものである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
アルコールが、エタノールアミン、セリン、ホモセリン、４−ヒドロキシプロリン及びグリセロールから選択される、請求項１〜４のいずれか記載の方法。
【請求項６】
反応温度が、４５℃±５℃である、請求項１〜５のいずれか記載の方法。
【請求項７】
ホスホリパーゼＤが、陰イオン交換樹脂及び陽イオン交換樹脂で精製されたものである、請求項１〜６のいずれか記載の方法。
【請求項８】
使用するホスホリパーゼＤのフラクションが、陽イオン交換樹脂からｐＨ６.２で溶出されたものである、請求項１〜６のいずれか記載の方法。
【請求項９】
式（Ｉ）のホスファチドがホスファチジル−Ｄ−セリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジル−ホモセリン、ホスファチジル−ヒドロキシプロリン叉はホスファチジルグリセロールである、請求項１〜８のいずれか記載の方法。
【請求項１０】
式（Ｉ）のホスファチドがホスファチジル−Ｌ−セリンであり、式（II)のホスファチドが精製大豆レシチン、粗大豆レシチン叉は卵レシチンである、請求項１〜８のいずれか記載の方法。
【請求項１１】
大豆レシチン叉は卵レシチンのものと同じ脂肪酸組成を有し、過酸化物価が５以下である、請求項１〜８のいずれか記載の方法により製造された、ホスファチジル−Ｌ−セリン生成物。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか記載の方法により製造された式（Ｉ）のホスファチドを含む医薬品。
【請求項１３】
式（Ｉ）のホスファチドがホスファチジル−Ｌ−セリンである、請求項１２記載の医薬品。
【請求項１４】
老化に関連する精神物理的ストレス、注意力、集中力叉は記憶力の欠如を処置するために使用する、請求項１２叉は１３記載の医薬品。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか記載の方法により製造された式（Ｉ）のホスファチドを含む化粧品。
【請求項１６】
式（Ｉ）のホスファチドがホスファチジル−Ｌ−セリンである、請求項１４記載の化粧品。
【請求項１７】
生理機能障害を有する皮膚炎または皮膚の処置に使用する、請求項１５叉は１６記載の化粧品。
【請求項１８】
請求項１〜８のいずれか記載の方法により製造された式（Ｉ）のホスファチドを含む補助食品。
【請求項１９】
式（Ｉ）のホスファチドがホスファチジル−Ｌ−セリンである、請求項１８記載の補助食品。
【請求項２０】
老化に関連する精神物理的ストレス、注意力、集中力叉は記憶力の欠如を処置するために使用する、請求項１８叉は１９記載の補助食品。
【請求項２１】
一般式（ＩＩ）：  Ｒ−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−Ｒ２（式中、Ｒはジアシルグリセロール残基、Ｒ２はＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２またはＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）３である。）で示されるホスファチドを、第１級叉は第２級アルコールと共に、ホスファチジル基転移反応に付して、一般式（Ｉ）：  Ｒ−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−Ｒ１（式中、Ｒは上記のとおりであり、Ｒ１はアルコール残基である。）で示されるホスファチドを製造するために使用される、ストレプトバーテイシリウム・ハチジョーエンス（Streptoverticillium hachijoense）由来のホスファチジル基転移活性を有するホスホリパーゼＤ。
【請求項２２】
転移反応が、単一水性相において実施される、請求項２１記載のホスホリパーゼＤ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、天然ホスファチド（またはリン脂質）の混合物叉はその単一成分（例えば、大豆レシチン、卵レシチン、動物リン脂質など）若しくは合成ホスファチドから出発し、それらを、第１級叉は第２級アルコール基を含有する特定の基質の存在下、水性培地のみの中で、ホスファチジル基転移活性を有するホスホリパーゼＤと反応させることにより、純ホスファチドを製造する方法に関する。
本発明はさらに、その方法で用いられるホスホリパーゼＤの製造、精製および特性化に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
純ホスファチドの合成、特に工業的規模における製造には、よく知られた問題が存在する。実際、多くの技術文献および特許文献があり、その中には、様々な方法を記載したごく最近のものも幾つか含まれる。一般にそれらの方法は、ホスホリパーゼＤのホスファチジル基転移特性を利用して、光学的に活性なホスファチドを得るものである。主な問題の一つは、これらの方法がそれぞれ特定のホスファチドの製造には適しているいるものの、広い種類のホスファチド類の合成には適していないことである。一般に、最も広く研究されているリン脂質は、医薬組成物、リポソーム製剤、補助食品などの製造に広く使用されているように、ホスファチジルセリン（ＰＳ）である。スフィンゴリン脂質の合成に関する報告は極めて少ない。
【０００３】
技術文献および特許文献の両方で報告されている全ての方法に関する一つの制限は、ホスファチジル基転移反応が二相溶媒系、すなわち水／有機溶媒系で行なわれることである。これは、大量の溶媒の使用に伴う一連の技術的問題を引起こすことになり、特に工業的方法が良質品の取得を目的とする化学的性質のものである場合、そうである。特許出願ＤＥ１９９１７２４９  Ａ１には、水相のみを使用する方法が記載されているが、得られたＰＳの収率も純度も、更には使用された酵素の種類についても報告がない。さらに、同じ技術を用い、使用した基質から出発して、ＰＳ以外のリン脂質が得られるか否か、また記載された条件において他のリン脂質が反応基質として作用し得るか否かについて言及するところがない。特公平５−４２９１７号（特許第２１３００８８号）もまた、水のみ叉は水と有機溶媒の混合物からなる培地を用いる方法を開示している。しかしながら、この特許には、副作用を防止するためには、水含量が１０重量％以下であることが好ましいと記載されている。従って、この参考文献は、水性環境のみの使用が好ましくないことを示唆しているように思われる。実際、その文献の実施例には、水とエチルエーテルの二相混合物を用いる方法しか開示されていない。
【０００４】
水相単独におけるホスホリパーゼＤのホスファチジル基転移反応の適用性に関する上記先行技術に記載された情報の一般的性質叉は教示の欠如に鑑み、当業者は、これが当該問題を解決するものであるとは到底考えることが出来なかった。さらに、食品や医薬品分野において使用する製品の製造方法において、有機溶媒の使用により生ずる不純物を除去することの重要性は、近年のアメリカ薬局方（ＵＳＰ）およびヨーロッパガイドライン（ＣＰＭＰ／ＣＨ／２８３／９５）による制限により、漸く注目されるようになったものである。
【０００５】
技術文献にも特許文献にも充分に検討されていない別の重要な点は、ホスファチジル基転移反応の間、水／溶媒の異種相エマルジョンを用いることにより生じる生成物の過酸化、採用する反応条件及び高純度の生成物を得るために多くの工程（再沈降、洗浄及びさらに恐らくクロマトグラフィー）を行うことの必要性に関する。異種相におけるこれらの反応のために用いる溶媒の多くは、過酸化反応の開始に典型的なラジカル性前駆物質の不存在を保証するものではない。さらに、異種相において反応を達成するために必要な振盪／攪拌は、大気中の酸素に触れ、その結果、酸化現象を引き起こす可能性を高める。たとえこのような誘因が除去叉は抑制されていても、極く僅かな初期工程が時間をかけて壊滅的な結果をもたらすものであれば、この過酸化は連鎖反応のように作用する。トリグリセリド（油または脂肪）やリン脂質などの脂肪性物質の過酸化は、脂肪酸を変敗させ、その結果不快な臭いと味を形成する。特に重要なことは、その生成物、特にＰＳが、その含量富化のため、顆粒などの特有の製剤を有する食品補助材（機能性食品（nutraceuticals））叉はいわゆる“機能性食品(functional foods)”の製造に用いられる場合、高度な嗜好性（臭いおよび味）が要求されることである。従って、得られる生成物、特にＰＳは、脂肪酸の化学組成およびそれらの過酸化とその結果の嗜好性の程度の両方について、化学的用語で明確に特徴づけられることが重要である。
【０００６】
最後に、市販のホスホリパーゼＤ酵素は、主にリン脂質混合物のホスファチジルコリン（ＰＣ）・フラクションに対してホスファチジル基転移活性を有することが指摘される。従って、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）などの他の成分は、加水分解によりホスファチジン酸（ＰＡ）となり、このため、最終産物の収率および純度の両方が低下する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上の技術状態に鑑み、本発明者らは、ホスファチジル基転移反応により有用なホスファチドを良好な収率と純度で製造する工業的かつ普遍的方法を開発すべく種々研究を重ねた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明者らは、驚くべきことに、ストレプトバーテイシリウム・ハチジョウエンス（Streptoverticillium hachijoense）からのホスホリパーゼＤの精製フラクションを用いることにより、１００％水性環境において天然ホスファチドの混合物叉はその精製フラクションから出発して、様々なアルコール受容体によりホスファチジル基転移反応を実施し、単一の反応工程と単一の沈降により、高収率、高純度及び過酸化物価（過酸化度）５以下（ヨーロッパ薬局方−Suppl. 2000、４１頁（方法Ａ）参照）で生成物を得ることが可能であることを発見した。
【０００９】
本発明の要旨は、  一般式（Ｉ）：  Ｒ−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−Ｒ１
（式中、Ｒはジアシルグリセロール残基、Ｒ１はアルコール残基である。）
で示されるホスファチドを製造するにあたり、
一般式（ＩＩ）：  Ｒ−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−Ｒ２
（式中、Ｒは上記の通りであり、Ｒ２はＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２またはＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）３である。）
で示されるホスファチドを、ストレプトバーテイシリウム・ハチジョーエンス
ＡＴＣＣ 19769 株由来のホスファチジル基転移活性を有するホスホリパーゼＤの存在下、単一水性相において、第１級叉は第２級アルコールと反応させることを特徴とする方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
上記一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で示されるホスファチドは、一般にジアシル型グリセロリン脂質（（社）日本生化学会編：「脂質ＩＩ−リン脂質」１０２〜１５６頁（１９９１））の範疇に属するものである。
Ｒで示されるジアシルグリセロール残基は、通常、同一叉は異なった、飽和叉は不飽和の、Ｃ１２〜Ｃ２４の長さを有する、２個の脂肪酸残基を有する。
また、Ｒ１で示されるアルコール残基は、通常、Ｃ２叉はＣ３鎖を有しており、当該鎖はアルコール性ヒドロキシル基に結合し、かつ、任意に１以上の極性基を有し得るものである。なお、当該鎖のいずれかの炭素原子と当該極性基のいずれかの原子との間で付加的な炭素原子が介在するか叉は介在することなく環状基が形成されていることもある。なおまた、上記極性基としては、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシルなどを挙げることが出来る。
【００１１】
従って、原料物質として使用される式（ＩＩ）のホスファチドとしては、具体的に精製大豆レシチン、粗大豆レシチン、卵レシチン、合成ホスファチジルコリンなどが例示される。
【００１２】
式（ＩＩ）のホスファチドと反応させるべき第１級叉は第２級アルコールとしては、種々のものを挙げることが出来るが、その代表的なものは、エタノールアミン、セリン、ホモセリン、４−ヒドロキシプロリン、グリセロールなどである。
【００１３】
本発明方法によって製造される、式（Ｉ）のホスファチドの典型的な例としては、ホスファチジル−Ｌ−セリン、ホスファチジル−Ｄ−セリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジル−ホモセリン、ホスファチジル−ヒドロキシプロリン、ホスファチジルグリセロールなどが挙げられる。
【００１４】
ホスファチジル基転移反応は、基質の分散性により、様々な温度条件と基質濃度で実施することができ、例えば温度条件２０〜６０℃、好ましくは４５℃±５℃において、基質濃度１０〜５００mg/ml、好ましくは１５０mg/mlで行うことが出来る。
【００１５】
本発明で使用する、ホスファチジル基転移活性を有するホスホリパーゼＤは、ストレプトバーテイシリウム・ハチジョーエンス、特にＡＴＣＣ 19769 株由来のものである。この酵素は、ホスファチジルコリン（レシチン）以外の基質に対しても高い収率でホスファチジル基転移活性を示すものであり、従って、低コスト、非精製の原材料を用いて本発明方法を実施することを可能にする。
【００１６】
上記ホスホリパーゼＤは、後記実施例１で示されるように、陰イオン交換樹脂及び陽イオン交換樹脂で精製されたものであり、特に陽イオン交換樹脂からｐＨ６．２付近で溶出されたフラクションが好ましく使用される。
【００１７】
ホスホリパーゼＤおよびその分画の製造に使用される菌株の重要性は、下記の表から理解することが出来る。下記表は、実施例１に従って製造された精製酵素フラクションを、種々の市販酵素製剤と比較して示すものである。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
本発明による酵素製剤及び反応条件の他の利点は、特許第２１３００８８号の二相の水／有機溶媒系において達成された変換率が７０％以下であるのと比べて、基質が実質的に完全にＰＳに変換されることである。
【００２０】
本発明の更に他の利点は、上記の方法によって得られるホスファチドの過酸化物価（peroxide value）が例えば５以下のように比較的低く、高度の嗜好性を有する点であって、当該ホスファチドに基づく医薬組成物及び化粧品組成物並びに補助食品や栄養補助食品は、そのような特徴を有していない市販の他の類似生成物よりも好ましい。
【００２１】
ホスファチドを含む医薬組成物及び補助食品や栄養補助食品は、しばしば老化に関連する、注意力、集中力および記憶力の欠如に伴う精神物理的ストレスの症状を処置するのに必要とされるが、それらは例えばカプセル、錠剤および顆粒の形態で製造され得る。
【００２２】
化粧品用組成物は主に、湿疹および／または炎症タイプの皮膚炎の治療の補助として生理機能障害を有する皮膚の処置に適用され、例えば、クリームまたはゲルの形態で製造され得る。
【００２３】
説明を目的として、本発明によるホスホリパーゼＤとそれを使用して得られるリン脂質の製造例のいくつかを以下に示す。
【実施例】
【００２４】
実施例１：ホスホリパーゼＤの製造
ストレプトバーテシリウム・ハチジョウエンス  ＡＴＣＣ 19769 株を使用する。
発酵試験において使用する接種の準備は、ペトリ皿の固体培地上のコロニーから始まる。固体培地の組成は次の通りである：２１.０g/リットル  Ｙ.Ｍ.,  ２％寒天。ペトリ皿から採取した細菌類を用いて、次のようにエルレンマイヤーフラスコで“スケールアップ(scale-up)”システムを開始する：滅菌白金耳で固体培地から細菌類を採取し、次の組成：Ｙ.Ｍ.ブロス２１.０g/リットルを有する培地２０mlを含有する１００mlフラスコに接種する；フラスコを３０℃、１５０ｒｐｍに調整した振盪培養器中に４８時間置く；培養物２０mlを上記の組成を有する培地２.５リットルを含有する５.０リットルフラスコに移す；フラスコを３０℃、１５０ｒｐｍに調整した振盪培養器に７２時間置く。
この段階で培養物は発酵槽で接種される状態にある。培養物がシリコン管と針システムが取りつけてあるフラスコ中にあることにより、この操作は可能となる。使用する発酵槽は５０リットルの容量を有する（Braun Biostat U)。培地の組成は次の通りである：Ｙ.Ｍ.ブロス２１.０gr/lt、ｐＨ６.５（培地は消泡剤の添加により発酵槽において直接滅菌する）；発酵のパラメーターは：２００ｒｐｍ、温度３０℃、空気流０.５ｖｖｍ（空気容量／反応器容量／分）で振盪。
【００２５】
７２時間後発酵を中断する。達成される酵素の最大量は、５,０００Ｕ/リットルであり、酵素活性は文献（K.Shimbo et al., Agric. Biol. Chem. 54(5), 1189-93,（1990))記載の加藤らの修飾方法により決定する。
【００２６】
培養物ブロスを濾過してバイオマスを除去し、１０,０００Ｄの分子カットオフ能（molecular cut-off）を有する酢酸セルロースのスパイラル・カートリッジを用いて上澄み液を濃縮し、５０ｍＭ  Tris-ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８.０に対して透析する。このようにして得たサンプルを、透析に使用したのと同じ緩衝液でプレバランス（pre-balance）したウオットマン（Whatman） ＤＥ−５２陰イオン交換樹脂５００gを充填したクロマトグラフィー・カラム（内径１０cm、高さ５０cm）に添加する。酵素は、吸着されずにカラムから溶出し、２０ｍＭ  Ｎａ−ホスフェート緩衝液、ｐＨ５.４に対して透析され、酵素と同じ緩衝液でプレバランスした陽イオン交換樹脂ＣＭ−セファデックス  ファルマシア（Sephadex Pharmacia）Ｃ−５０  ５０gを充填したクロマトグラフィー・カラム（内径１０cm、高さ５０cm）に添加する。５.４〜７.０のｐＨ勾配でＮａ−ホスフェート緩衝液、２０ｍＭ、ｐＨ７.０を用いて酵素を溶出する。ｐＨ６.２で溶出するフラクションを採取し、濃縮し、Tris-ＨＣｌ緩衝液、５０ｍＭ、ｐＨ８.０に対して透析して、濃度１００U/mlとし、次いで凍結乾燥する。
【００２７】
【表２】
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【００２８】
実施例２：ＰＣからのＰＳの製造
振盪器および還流冷却器を備えたジャケット付（jacketed）反応器において、酢酸ナトリウム三水和物２７２ｇおよび塩化カルシウム三水和物５９ｇを水１０リットルに溶解する。ｐＨを５.６に調節し（酢酸塩緩衝液（０.２Ｍ）＋塩化カルシウム（０.０４Ｍ）、ｐＨ５.６）、Ｌ−セリン５.０kgを添加し、４５℃に加熱して溶解する。全工程は窒素下で行う。
【００２９】
溶解完了後、次の組成を有する精製大豆レシチン１.５kgを添加する：ＰＣ  ９５％、ＰＡ  ４％、lyso-ＰＣ  １％。１０分後、実施例１のホスホリパーゼＤ  １６,１００Ｕを添加し、これを４５℃で２４時間反応させる。
【００３０】
反応が完了したら、ｎ−ヘキサン／イソプロパノール／水（６０／８０／１５）の混合物１０リットルを添加する。内容物を反応器から取り出し、かたまりを振盪により溶解させ、振盪を停止してから、二相が分離するまで放置する。
【００３１】
下相を採取し、非反応性Ｌ−セリンを晶析装置で冷却して回収する。
上相をＨＣｌ  １Ｎ  ６,９５０ml及びイソプロパノール１,１１３mlを用いて、５℃で洗浄する。酸性相をヘキサン／イソプロパノール／水（６０／８０／１５）の混合物１０リットルで逆抽出し、その後、２つの有機相を水７リットルとイソプロパノール６リットルの混合物で段階的に洗浄する。
有機相を真空下で濃縮し、エタノール３３．２リットル中の４.５Ｍ酢酸ナトリウム水溶液４５０mlをゆっくりと添加することにより沈澱させる。
これを濾過し、乾燥させると、力価９５％以上、ホスファチジン酸含量５％以下及び過酸化物指数５以下のホスファチジルセリン１.１４kgを得る。結晶化および乾燥の後、Ｌ−セリン３.２５kgを得る。
【００３２】
実施例３：卵レシチンからのＰＳの製造
酢酸塩緩衝液（０.２Ｍ）＋塩化カルシウム（０.０４Ｍ）、ｐＨ５.６  １８０mlを振盪器及び還流冷却器を有するジャケット付反応器に入れ、その後、Ｌ−セリン９０ｇを添加し、４５℃に加熱して溶解させる。全工程は窒素下で行う。
溶解が完了したら、精製卵レシチン２７ｇを添加し（ＰＣ含有量＞９５％）、１０分後、実施例１のホスホリパーゼＤ  ２９０Ｕを添加し、４５℃で２４時間反応させる。
反応が完了したら、ｎ−ヘキサン／イソプロパノール／水（６０／８０／１５）の混合物２００mlを添加し、内容物を反応器から取り出し、かたまりを振盪により溶解させ、次いで振盪を停止し、二相が分離するまで放置する。
下相を捨てる。上相を１Ｎ  ＨＣｌ  １５０mlおよびイソプロパノール３０mlで５℃で洗浄する。酸性相をｎ−ヘキサン／イソプロパノール／水（６０／８０／１５）の混合物１８０mlで逆抽出し、二つの有機相を水１００ml及びイソプロパノール１３０mlの混合物で段階的に洗浄する。
有機相を真空下で濃縮し、エタノール６００ml中の４.５Ｍ酢酸ナトリウム水溶液８mlをゆっくりと添加して沈澱させる。それを濾過し、乾燥させる。
これにより、力価９５％以上、ホスファチジン酸含量５％以下及び過酸化物指数５以下のホスファチジルセリン２０.８ｇを得る。
【００３３】
実施例４：粗大豆レシチンからのホスファチジルセリンの製造
酢酸塩緩衝液（０.２Ｍ）＋塩化カルシウム（０.０４Ｍ）  １８０ml  ｐＨ５.６を振盪器および還流冷却器を有するジャケット付反応器に入れ、その後Ｌ−セリン９０ｇを添加し、４５℃に加熱して溶解させる。全工程を窒素下で行う。
溶解が完了したら、粗大豆レシチン２７ｇを添加する（全リン脂質含量７５％、組成％ＰＣ６０.６／ＰＥ２９.５／ＰＡ３.４／lyso-ＰＣ２.５／他３.９）；１０分後、実施例１のホスホリパーゼＤ  ２９０Ｕを添加し、４５℃で２４時間反応させる。
反応が完了したら、反応器にｎ−ヘキサン／イソプロパノール／水（６０／８０／１５）の混合物２００mlを添加し、内容物を反応器から取りだし、かたまりを振盪により溶解させる。次いで振盪を停止し、二相が分離するまで放置する。
下相を捨てる。上相を１Ｎ  ＨＣｌ  １５０mlおよびイソプロパノール３０mlを用いて５℃で洗浄する。酸性相をｎ−ヘキサン／イソプロパノール／水（６０／８０／１５）の混合物１８０mlで逆抽出し、次いで二つの有機相を水１００ml及びイソプロパノール１３０mlの混合物で段階的に洗浄する。
有機相を真空下に濃縮し、エタノール６００ml中、４.５Ｍ酢酸ナトリウム水溶液８mlをゆっくりと添加して、沈澱させる。沈澱物を濾取し、乾燥させる。
これにより、力価８３.５％（ＰＡ  ７．７％、ｌｙｓｏ−ＰＳ  ２．３％、ＰＥ  １．９％、その他  ４．５％）及び過酸化物指数５以下のホスファチジルセリン１９ｇを得る。
【００３４】
実施例５：ホスファチジル−Ｄ−セリンの製造
酢酸塩緩衝液（０.２Ｍ）＋塩化カルシウム（０.０４Ｍ）  １８０ml、ｐＨ５.６を振盪器および還流冷却器を備えたジャケット付反応器に入れ、その後Ｄ−セリン９０ｇを添加し、４５℃に加熱して溶解させる。全工程を窒素下で行う。
溶解が完了したら、実施例２の精製大豆レシチン２７ｇを添加し、１０分後、実施例１のホスホリパーゼＤ  ２９０Ｕを添加し、４５℃で２４時間反応させる。
反応が完了したら、ｎ−ヘキサン／イソプロパノール／水（６０／８０／１５）の混合物２００mlを添加し、内容物を反応器を取り出し、かたまりを振盪により溶解させる。次いで振盪を停止し、二相が分離するまで放置する。
下相を捨てる。上相を１Ｎ  ＨＣｌ  １５０ml及びイソプロパノール３０mlを用いて５℃で洗浄する。酸性相をｎ−ヘキサン／イソプロパノール／水（６０／８０／１５）の混合物１８０mlで逆抽出し、次いで二つの有機相を水１００ml及びイソプロパノール１３０mlの混合物で段階的に洗浄する。
有機相を真空下で濃縮し、エタノール６００ml中、４.５Ｍ酢酸ナトリウム水溶液８mlをゆっくりと添加して、沈澱させる。それを濾取し、乾燥する。
これにより、力価９５％以上、ホスファチジン酸含量５％以下及び過酸化物指数５以下のホスファチジル−Ｄ−セリン１８.７ｇを得る。
【００３５】
実施例６：ＰＣからのホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）の製造
酢酸塩緩衝液（０.２Ｍ）＋塩化カルシウム（０.０４Ｍ）  ２００ml、ｐＨ５.６を振盪器および還流冷却器を備えたジャケット付反応器に入れる。全工程を窒素下で行う。
エタノールアミン５８ｇを添加し、温度３０℃で氷酢酸によりｐＨ５.６に調整する。操作の最後に４５℃に加熱し、実施例１の精製大豆レシチン３０ｇを添加する。１０分後、実施例１のホスホリパーゼＤ  ３２５Ｕを添加し、４５℃で２４時間反応させる。
反応が完了したら、ｎ−ヘキサン／イソプロパノール／水（６０／８０／１５）の混合物４００mlを添加し、内容物を反応器から取り出し、かたまりを振盪により溶解する。次いで振盪を停止し、二相が分離するまで放置する。
下相を捨てる。上相を１Ｎ  ＨＣｌ  １５０ml及びイソプロパノール３０mlを用いて５℃で洗浄する。酸性相をｎ−ヘキサン／イソプロパノール／水（６０／８０／１５）の混合物１８０mlで逆抽出し、次いで二つの有機相を水１００ml及びイソプロパノール１３０mlの混合物、次いで１Ｎの酢酸ナトリウム１００mｌ及びイソプロパノール１３０mlで段階的に洗浄する。
有機相を真空下で濃縮する。クロロホルム／メタノール（８０／２０）で平衡化された１リットルカラムによる軸圧クロマトグラフを用いてシリカゲルクロマトグラフィーにより有機相を精製する。勾配溶出は、クロロフォルム／メタノール／水（７０／３０／３）まで行う。
純粋なフラクションを蒸発させ、シクロヘキサン２５０mlに溶解し、凍結乾燥させて、ホスファチジン酸及びリゾ誘導体（lyso derivatives）を含まない、純度９９％以上の淡黄色固体生成物２４ｇを得る。
【００３６】
実施例７:ＰＣからのホスファチジル−ホモセリンの製造
酢酸塩緩衝液(０.２Ｍ)＋塩化カルシウム(０.０４Ｍ)  １８０ml、ｐＨ５.６を振盪器および還流冷却器を備えたジャケット付反応器に入れ、その後ホモセリン１０２ｇを添加し、４５℃に加熱して溶解させる。全工程は窒素下で行う。
溶解が完了してから、実施例２の精製大豆レシチン２７ｇを添加し、１０分後、実施例１のホスホリパーゼＤ  ２９０Ｕを添加し、４５℃で２４時間反応させる。
反応完了後、ｎ−ヘキサン／イソプロパノール／水（６０／８０／１５）の混合物２００mlを添加し、内容物を反応器から取り出す。かたまりを振盪により溶解させ、次いで振盪を停止し、二相が分離するまで放置する。
下相を捨てる。上相を１Ｎ  ＨＣｌ  １５０ml及びイソプロパノール３０mlを用いて５℃で洗浄する。酸性相をｎ−ヘキサン／イソプロパノール／水（６０／８０／１５）の混合物１８０mlで逆抽出し、次いで二つの有機相を水１００ml及びイソプロパノール１３０mlの混合物で段階的に洗浄する。
有機相を真空下で濃縮し、エタノール６００ml中、４.５Ｍ酢酸ナトリウム水溶液８mlをゆっくりと添加して沈澱させる。これを濾過し、乾燥させる。
力価９５％以上、ホスファチジン酸含量５％以下、過酸化物指数５以下のホスファチジル−ホモセリン２２.６ｇを得る。
【００３７】
実施例８：ＰＣからのホスファチジル−ヒドロキシプロリンの製造
酢酸塩緩衝液（０.２Ｍ）＋塩化カルシウム（０.０４Ｍ）  １８０ml、ｐＨ５.６を振盪器及び還流冷却器を備えたジャケット付反応器に入れ、その後ヒドロキシプロリン１１２ｇを添加し、４５℃に加熱して溶解する。全工程は窒素下で行う。
溶解完了後、実施例２の精製大豆レシチン２７ｇを添加する。１０分後、実施例１のホスホリパーゼＤ  ２９０Ｕを添加し、４５℃で２４時間反応させる。
反応完了後、ｎ−ヘキサン／イソプロパノール／水（６０／８０／１５）混合物２００mlを添加してから、内容物を反応器から取り出す。かたまりを振盪により溶解させ、次いで振盪を停止し、二相が分離するまで放置する。
下相を捨てる。上相を１Ｎ  ＨＣｌ  １５０ml及びイソプロパノール３０mlを用いて５℃で洗浄する。
酸性相をｎ−ヘキサン／イソプロパノール／水（６０／８０／１５）混合物１８０mlで逆抽出し、次いで二つの有機相を水１００ml及びイソプロパノール１３０mlの混合物で段階的に洗浄する。有機相を真空下で濃縮し、エタノール６００ml中、４.５Ｍ酢酸ナトリウム水溶液８mlをゆっくりと添加して沈澱させる。それを濾過し、乾燥させる。
これにより、力価９５％以上、ホスファチジン酸含量５％以下、過酸化物指数５以下を有するホスファチジル−ヒドロキシプロリン１８.４ｇを得る。
【００３８】
実施例９：ＰＣからのホスファチジルグリセロールの製造
酢酸塩緩衝液（０.２Ｍ）＋塩化カルシウム（０.０４Ｍ）  ２００ml、ｐＨ５.６を振盪器及び還流冷却器を備えたジャケット付反応器に入れる。全工程は窒素下で行う。
グリセロール８０ｇを添加し、４５℃に加熱し、次いで実施例２の精製大豆レシチン３０ｇを添加する。１０分後、実施例１のホスホリパーゼＤ  ３２５Ｕを添加し、４５℃で２４時間反応させる。
反応完了後、ｎ−ヘキサン／イソプロパノール／水（６０／８０／１５）混合物４００mlを添加してから、内容物を反応器を取り出し、かたまりを振盪して溶解させる。次いで振盪を停止し、二相が分離するまで放置する。
下相を捨てる。上相を１Ｎ  ＨＣｌ  １５０ml及びイソプロパノール３０mlを用いて５℃で洗浄する。酸性相をｎ−ヘキサン／イソプロパノール／水（６０／８０／１５）混合物１８０mlで逆抽出し、次いで二つの有機相を水１００ml及びイソプロパノール１３０mlの混合物、次いで１Ｎ酢酸ナトリウム１００mlおよびイソプロパノール１３０mlで段階的に洗浄する。
有機相を真空下で濃縮する。クロロホルム／メタノール（８０／２０）で平衡化された１リットルカラムによる軸圧クロマトグラフを用いてシリカゲルクロマトグラフィーにより精製を行う。勾配溶出をクロロフォルム／メタノール／水（７０／３０／３）まで行う。
純粋なフラクションを蒸発させ、シクロヘキサン２５０mlに溶解し、凍結乾燥させると、ホスファチジン酸及びリゾ誘導体を含まない、純度９５％以上の白色固体生成物２２.２ｇを得る。これを濾過し、乾燥する。
【００３９】
実施例１０：Ｌ−セリンの収集とリサイクル
実施例２の酵素反応の最初の分画からの母液を０℃に２４時間保持し、結晶化生成物を濾取する。これをエタノール洗浄し、乾燥させると、最初のものと同一の白色針状の純生成物を得る。量的不足（約２０％）を補足することにより、生成物を正常に使用することが出来る。
【００４０】
実施例１１：医薬組成物の例
（ａ）各ゼラチンカプセルに以下のものを含有させる：
ホスファチジルセリン            １００.０mg
植物油                          ２７０.０mg
大豆レシチン                      ３０.０mg
（ｂ）各注射用バイアルに以下のものを含有させる：
ホスファチジルセリン              ５０.０mg
マンニトール                    １００.０mg
大豆レシチン（注射用グレード）      ７.５mg
リン酸緩衝液                        ２.２mg
水                適量を加え、全量  ２.０ml  とする。
【００４１】
実施例１２：補助食品および栄養補助食品の例
（ａ）各ゼラチンカプセルに以下のものを含有させる：
ホスファチジルセリン        １００.０mg
ビタミンＥ                      ５.０mg
植物油                      ２９５.０mg
（ｂ）各小包（sachet）に以下のものを含有させる：
ホスファチジルセリン        １００.０mg
クレアチン                      １.５g
ベータ−カロチン                ０.６mg
ビタミンＥ                      ５.０mg
ビタミンＣ                    ３０.０mg
ビタミンＢ１                    ０.７mg
ビタミンＢ６                    １.０mg
ビタミンＢ１２                  ０.５mcg
葉酸                            ０.１mg
（ｃ）各チュアブル錠に以下のものを含有させる：
ホスファチジルセリン          ７５.０mg
ビタミンＥ                      ５.０mg
ビタミンＣ                    ３０.０mg
ビタミンＢ１                    ０.７mg
ビタミンＢ６                    １.０mg
ビタミンＢ１２                  ０.５mcg
葉酸                            ０.１mg
【００４２】
実施例１３：化粧品用組成物の例
（ａ）各ボディクリームチューブに以下のものを含有させる：
ホスファチジルセリン                            ４.０g
マカダミアテルニフォリア(macadamia ternifolia)  ２.０g
ヒアルロン酸ナトリウム                        １０.０mg
セテアリルオクタノエート(cetearyl octanoate）    ８.０g
カプリリック/カプリック(caprylic/capric)
トリグリセリド                                  ７.０ｇ
ソルビトール                                    ５.０g
セテアリルアルコール                            ４.０g
ポリソルベート(polysorbate)２０                  １.０g
カルボマー（carbomer)                           ０.８gr
デヒドロ酢酸ナトリウム                          ０.４g
二ナトリウムＥＤＴＡ                            ０.３gr
抗酸化剤（トコフェロール）                    ５０.０mg
水                      適量を加えて、全量  １００.０ml  とする。
（ｂ）各ボディ軟膏チューブに以下のものを含有させる：
ホスファチジルセリン                            ３.０g
コレステロール                                  ２.０g
ヒアルロン酸ナトリウム                        １０.０mg
セテアリルオクタノエート(cetearyl octanoate）    ９.０g
カプリリック/カプリック(caprylic/capric)
トリグリセリド                                  ７.０ｇ
ソルビトール                                    ７.０g
セテアリルアルコール                            ３.５g
ポリソルベート(polysorbate)２０                  １.０g
カルボマー（carbomer)                           ０.６g
デヒドロ酢酸ナトリウム                          ０.５g
二ナトリウムＥＤＴＡ                            ０.３g
抗酸化剤（トコフェロール）                    ５０.０mg
水                      適量を加えて、全量  １００.０ml  とする。
【００４３】
上記実施例１１および１２の組成物は、しばしば老化に関連した、注意力、集中力および記憶力の欠如を伴う精神物理的ストレスの症状を処置するのに使用され、例えば、カプセル、錠剤および顆粒の形態で製造することが出来る。
【００４４】
本発明のホスファチド類を含有する錠剤およびカプセルは、経口で、典型的には１日２〜３錠の錠剤またはカプセルを服用してもよい。
【００４５】
実施例１３に記載の化粧品用組成物およびボディ軟膏は、冒された領域に直接適用してもよく、生理機能障害を有する皮膚の処置および皮膚炎の処置の補助として使用される。
【００４６】
上記医薬組成物は、特定の担体を有する特定の物理的形態で記載されているが、本発明の医薬組成物は、既知の他の医薬的に許容される担体、賦形剤および希釈剤と組み合わされた他の標準的物理形態で製剤化され得ることが認識されてよい。
【００４７】
本発明は上記記載のとおりであって、これらの方法は様々な態様に変更することが可能である。このような変更は、本発明の精神および目的から逸脱しているものと理解されるべきではなく、叉、当業者にとって明らかであるいかなる変更も請求の範囲内にあるものと認識されるべきである。
【００４８】
［発明の効果］
上記したところから明らかなように、本発明は、新しいホスホリパーゼを使用することにより、有用なホスファチドを高収率かつ高純度で提供することが出来るものである。