(57)【要約】【課題】本発明の目的は、表面プラズモンセンサーでは対応できない微量成分の検出を可能とする検出感度の高いバイオセンサーを提供することである。  【解決手段】  本発明のバイオセンサー(S)は、水性媒体に不溶である固体物質（M）からなる周期構造体(N)から構成されるフォトニック結晶（C）を主要構成素子とし、周期構造体(N)の表面に特異的結合物質（X）を固定化するか、又は周期構造体（N）の構成単位(L) の表面に特異的結合物質（X）を固定化することを特徴とする。上記バイオセンサー（S）に、ターゲット物質(Y)を含有する被検体(A)を接触させて、(A)中に含まれる(Y)と（X）を結合させ、バイオセンサー（S）と被検体(A)を接触させる前後において、特定波長の電磁波をフォトニック結晶（C）に照射して得られる反射スペクトルのピーク波長を比較することにより、ターゲット物質(Y)を検出することができる。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性媒体に不溶である固体物質（M）からなる周期構造体(N)から構成されるフォトニック結晶（C）を主要構成素子とし、周期構造体(N)の表面に特異的結合物質（X）を固定化されたか、又は周期構造体（N）の構成単位(L) の表面に特異的結合物質（X）が固定化されたことを特徴とするバイオセンサー（S）。
【請求項２】
固体物質（M）の屈折率が1.3〜3.0である請求項１に記載のバイオセンサー（S）。
【請求項３】
構成単位（L）が真球状粒子（P）であって、周期構造体（N）の構造がオパール構造である請求項１又は2に記載のバイオセンサー（S）。
【請求項４】
周期構造体（N）の構造がオパール構造を鋳型として作製する逆オパール構造である請求項１又は2に記載のバイオセンサー（S）。
【請求項５】
周期構造体(N)が基板(Q)に集積されたものである請求項１〜４のいずれか１項に記載のバイオセンサー（S）。
【請求項６】
特異的結合物質（X）が免疫蛋白質である請求項１〜５のいずれか１項に記載のバイオセンサー（S）。
【請求項７】
水性媒体に不溶である固体物質（M）からなる周期構造体(N)から構成されるフォトニック結晶（C）を主要構成素子とし、周期構造体(N)の表面に特異的結合物質（X）を固定化するか、又は周期構造体（N）の構成単位(L) の表面に特異的結合物質（X）を固定化することを特徴とするバイオセンサー（S）に、ターゲット物質(Y)を含有する被検体(A)を接触させて、被検体(A)中に含まれるターゲット物質(Y)と特異的結合物質（X）を結合させ、バイオセンサー（S）と被検体(A)を接触させる前後において、特定波長の電磁波をフォトニック結晶（C）に照射して得られる反射スペクトルのピーク波長を比較することにより、ターゲット物質(Y)を検出することを特徴とするターゲット物質(Y)の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサーに関する。特に、臨床診断用途に使用できる高感度で、分析操作が容易なバイオセンサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
今日、遺伝子解析や臨床診断などの目的でDNAチップや免疫検査薬等のバイオセンサーが様々な研究機関や医療機関において使用されている。
現行のDNAチップは、被検体を蛍光色素で標識して用いる必要があるため、分析操作が煩雑であり、今後臨床検査用等に広く普及させるためには更なる分析操作の簡素化が必要である。また、DNAプローブの代わりにタンパク質をチップ上にスポットしたタンパク質チップも盛んに研究されているが、タンパク質は蛍光色素等で標識すると変性するものが多く、標識が不要なタンパク質チップが求められている。
【０００３】
一方、抗原抗体反応を利用した免疫試薬としては、ラテックス比濁法、化学発光法イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ等が挙げられるが、ラテックス比濁法は検出感度が低く、ラジオイムノアッセイでは放射性物質を用いるため危険性があるといった問題があるため、化学発光法イムノアッセイが主流となっている。
しかし、化学発光法も発光物質等での標識が不可欠であり、試薬コストが高く、分析操作も煩雑であるといった問題がある。また、極微量の発光を測定するために、高価な検出機を使用する必要があり、一般的に装置コストが高い。
【０００４】
被検体の標識が不要であり、小型かつ安価な装置にて測定できるバイオセンサーとして、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーが盛んに研究されている。本センサーは、チップの金属膜に接する有機機能膜近傍の屈折率変化を反射光波長のピークシフト又は一定波長における反射光量の変化を測定して求めることにより、表面近傍に起こる吸着及び脱着を検知する方法である。一般的には、透明基板（例えば、ガラス）、蒸着された金属膜、及びその上に抗体等を固定化できる官能基を有する薄膜からなり、その官能基を介し、金属表面に抗体等を固定化したものである。
【０００５】
しかし、表面プラズモンセンサーは、化学発光法レベルの高感度検出を未だ達成できておらず、その原因の一つとして、ターゲット物質をトラップする抗体等の集積密度が小さいことが挙げられる。合成繊維、天然繊維、無機繊維等からなる織物、編物、不織布などの多孔質材料の表面及び内部に抗体等を固定化して集積密度を高める方法が検討されているが、孔径が小さい等の理由から内部に被検体物質が拡散せず、有効な集積密度の向上は達成できていない（例えば、特許文献1参照）。
【特許文献１】特開平09−264843
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
即ち、本発明の目的は、表面プラズモンセンサーでは対応できない微量成分の検出を可能とする検出感度の高いバイオセンサーを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のバイオセンサー(S)は、水性媒体に不溶である固体物質（M）からなる周期構造体(N)から構成されるフォトニック結晶（C）を主要構成素子とし、周期構造体(N)の表面に特異的結合物質（X）を固定化されたか、又は周期構造体（N）の構成単位(L) の表面に特異的結合物質（X）が固定化されたことを特徴とする。
また、本発明のターゲット物質(Y)の検出方法は、上記バイオセンサー（S）に、ターゲット物質(Y)を含有する被検体(A)を接触させて、被検体(A)中に含まれるターゲット物質(Y)と特異的結合物質（X）を結合させ、バイオセンサー（S）と被検体(A)を接触させる前後において、特定波長の電磁波をフォトニック結晶（C）に照射して得られる反射スペクトルのピーク波長を比較することにより、ターゲット物質(Y)を検出することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のバイオセンサー（S）は、表面プラズモンセンサーと同様に被検体の標識が不要であり、小型かつ安価な装置にて測定できるという機能を有し、かつ、表面プラズモンセンサーよりも優れた検出感度を発揮する。特異的結合物質の高集積化やフォトニック結晶を利用した新しいセンシング原理によって、表面プラズモンセンサーでは対応できない微量成分の検出を可能とするバイオセンサーである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明において水性媒体に不溶である固体物質（M）としては、有機化合物(M1)、無機化合物(M2)又は有機無機複合物(M3)等のいずれも使用することができる。ここで水性媒体とは、水又は水を主成分とする0.01〜10重量部の酸、アルカリ、中和塩又は0.01〜50重量部有機溶剤との混合媒体を意味する。酸、アルカリ、中和塩としては、抗原抗体反応やDNAのハイブリダイゼーションに使用されている緩衝液に使用されているものが挙げられ、具体的には、塩酸、硫酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ホウ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム等である。有機溶剤としては、抗原抗体反応やDNAのハイブリダイゼーション、DNA等の洗浄等に使用されているものが挙げられ、具体的には、エタノール、プロパノール、イソプロパノールなどの低級アルコール等である。
固体物質（M）の屈折率としては、バイオセンサー（S）の検出感度向上等の観点から、1.3〜3.0であることが好ましく、更に好ましくは1.33〜2.5、より好ましくは1.35〜2.0特に好ましくは1.4〜2.0、極めて好ましくは1.45〜2.0である。屈折率がこの範囲内であれば、検出される反射スペクトルのピークがシャープなものとなり、バイオセンサー（S）の検出感度が更に良好なものとなる。
【００１０】
加えて、固体物質（M）は波長100〜1000cm-1の電磁波を吸収しないことが好ましく、さらに好ましくは波長300〜900 cm-1、より好ましくは波長300〜800 cm-1、特に好ましくは波長400〜800 cm-1の電磁波を吸収しないことである。後述する理由からフォトニック結晶（C）に照射する電磁波の特定波長は、100〜1000cm-1ぐらいであることが好ましく、物質（M）がこの特定波長の電磁波の吸収がなければ、反射スペクトルのピーク強度向上やノイズの低減等が可能で、バイオセンサー（S）の検出感度、定量精度等が更に良好なものとなる。  
【００１１】
有機化合物(M1)としては、開環重合系ポリマー、重付加系ポリマー、重縮合系ポリマー、ビニル重合系ポリマーなどの合成ポリマー、多糖類（セルロース、アミロース、アミロペクチン、キトサン、キチン、アラミド繊維など）、脂質（リン脂質、糖脂質、コレステロールなど）、各種ポリペプチド（コラーゲンなど）などの天然ポリマー等が挙げられる。
開環重合系ポリマー、重付加系ポリマー、重縮合系ポリマーなどの非ビニル重合系ポリマーとしては、ウレタン樹脂、ウレア樹脂、ポリアミド樹脂、ポリイミド樹脂、エポキシ樹脂、シリコーン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエーテル樹脂等が挙げられる。
ビニル重合系ポリマーは、ビニル基を有するモノマーを構成単位とするポリマーであり、
シアノ基含有ビニルモノマー、（メタ）アクリレート（アクリル樹脂）、カルボキシル基含有ビニルモノマー、芳香族ビニル炭化水素、脂肪族ビニル炭化水素、脂環式ビニル炭化水素、（メタ）アクリルアミド、ビニルスルホン酸、炭ビニルエーテル、ビニルケトン、架橋性モノマー、フッ素系モノマー等を構成単位として使用することができる。具体的には、ポリメチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸ソーダ、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどのホモポリマー、又は、これらの構成単位を共重合したコポリマーが挙げられる。
【００１２】
その他、アクリル樹脂、エポキシ樹脂、ポリイミド樹脂等に感光性を付与した感光性樹脂も使用することができる。光重合型のオリゴマー、光重合型モノマー、光重合開始剤および光増感剤からなる。光重合型のオリゴマーとしては、例えばエポキシアクリレート、ウレタンアクリレート、ポリエステルアクリレート、ポリエーテルアクリレート、ポリオールアクリレート、アルキドアクリレート等が使用可能である。光重合型モノマーとしては、例えば単官能アクリレート、２官能アクリレート、３官能アクリレート、４官能アクリレート等のアクリルモノマーが使用可能である。光重合開始剤としては、例えばベンゾイン系、アセトフェノン系、パーオキサイド系、チオキサンソン系等の種々の光重合開始剤が使用可能である。光増感剤としては、例えばアミン系、キノン系等の種々の光増感剤が使用可能である。
【００１３】
無機化合物(M2)としては、天然物、天然物の変性物及び合成物（精製物を含む）のいずれも使用することができるが、生産ロットのブレ防止等の観点から、合成物であることが好ましい。例えば、金属化合物や有機物を前駆体とする炭化物等が挙げられる。  
金属化合物としては、元素の周期率表において、１族〜１６族の金属酸化物（酸化チタン、酸化ケイ素（シリカ）、酸化亜鉛、酸化アルミニウム、酸化クロム、酸化マンガン、酸化モリブデン、酸化タングステン、酸化バナジウム、酸化スズ、酸化鉄（磁性酸化鉄を含む）及び酸化インジウム等）、金属水酸化物（水酸化アルミニウム、水酸化金、水酸化マグネシウム等）、金属硫化物（硫化銅、硫化ナトリウム、硫化カドミウム、硫化亜鉛、硫化鉛、硫化ニッケル及び硫化白金等）、金属ハロゲン化物（フッ化カルシウム、フッ化スズ及びフッ化カリウム等）、金属炭化物（炭化カルシウム、炭化チタン、炭化鉄及び炭化ナトリウム等）、金属窒化物（窒化アルミニウム、窒化クロム、チッ化ケイ素、窒化ゲルマニウム及び窒化コバルト等）、炭酸金属塩（炭酸カルシウム（軽質炭酸カルシウム）、炭酸水素カルシウム、炭酸水素ナトリウム及び炭酸鉄等）、硫酸金属塩（硫酸アルミニウム、硫酸コバルト、硫酸水素ナトリウム、硫酸銅、硫酸ニッケル及び硫酸バリウム等）及びその他の金属塩（チタン酸塩（チタン酸バリウム、チタン酸マグネシウム、チタン酸カリウム等）、ホウ酸塩（ホウ酸アルミニウム、ホウ酸亜鉛等）、燐酸塩（リン酸カルシウム、燐酸ナトリウム、燐酸マグネシウム等）、アルミン酸塩（アルミン酸イットリウム（YAG）等）及び硝酸塩（硝酸ナトリウム、硝酸鉄、硝酸鉛等）など又はこれらの固溶体（チタン酸ジルコン酸ランタン鉛等）などが挙げられる。
【００１４】
有機物を前躯体とする炭化物としては、カーボンブラック、カーボンナノチューブ、グラファイト、活性炭、竹炭、木炭及びフラーレン等が挙げられる。
有機無機複合物(M3)としては、有機化合物（M1）及び無機化合物（M2）を各々粉砕又は溶融して混合したものやシランカップリング剤等を介して有機化合物（M1）と無機化合物（M2）を化学結合したもの等を使用することができる。
【００１５】
バイオセンサー（S）の検出感度向上等の観点から、固体物質（M）の屈折率が1.45以上2.0以下であり、波長400〜800ｃｍ-1の電磁波を吸収しないものであることが特に好ましく、有機化合物(M1)としては、合成ポリマー、無機化合物(M2)としては、金属化合物が好ましく、特に好ましくは合成ポリマーである。合成ポリマーとしては、ビニル重合系ポリマーが好ましく、特に好ましくは、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリシクロオレフィンを主成分とするポリマーである。また、水酸基、チオール基、カルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、イソシアナト基、エポキシ基などの官能基をポリマー骨格中に導入してもよく、スチレンやメチルメタクリレートと、メタクリル酸やヒドロキシエチルメタクリレート、グリシジルメタクリレート等とを共重合することによりこれら官能基をポリマー中に導入することができる。金属化合物としては、金属酸化物が好ましく、特に好ましくは、酸化チタン、ジルコニア、シリカである。
【００１６】
本発明において周期構造体（N）は、一定の規則性、即ち、周期性を有する構造体であって、その周期構造としては、結晶性無機固体と同様の結晶構造等が挙げられ、具体的には、六方最密充填構造、立方最密充填構造、体心立方充填構造、ログパイル構造（図1）、ダイヤモンド構造等である。
これらの周期構造のうち、周期構造体（N）の微細化や生産性向上等の観点から、六方最密充填構造、立方最密充填構造が好ましい。
【００１７】
構成単位（L）とは固体物質（M）からなる一定の形態を有するものであって、その形態としては、粒子状、繊維状、板状、針状、柱状等が挙げられる。これらの形態のうち、バイオセンサー（S）の生産性向上等の観点から粒子状であることが好ましい。構成単位（L）が粒子状であれば、後述する集積方法により周期構造体（N）を作製することができるため、生産性が向上し、安価なバイオセンサー（S）を提供することが可能となる。ここで粒子状とは、均一な周期構造体（N）を作製するために、不定形の粒子を含まない真球状（真球状粒子（P））であることが好ましい。
構成単位(L)のサイズとしては、繊維状、針状、柱状の場合は、短径が100〜1000nm、長径が0.5〜100μmであることが好ましく、板状の場合は、短径と長径は同一であってもよく、各々0.1〜100μmであることが好ましい。
【００１８】
真球状粒子（P）は、数平均粒子径が100〜1000nmであることが好ましく、更に好ましくは150〜800nm、特に好ましくは200〜700nmである。平均粒子径がこの範囲内であると、検出装置として小型かつ安価なものを使用することができるし、検出感度も大幅に向上する。
また、真球状粒子（P）の粒度分布はシャープなものであることが好ましく、具体的には変動係数が10％以下であることが好ましく、7％以下が更に好ましく、5％以下が特に好ましい。粒度分布がこの範囲内であると、更に精度の高いバイオセンサー（S）を作製することが可能となる。ここで変動係数とは、標準偏差を平均値で除した値の百分率を意味する。不定形の粒子であったり、粒度分布がブロードであったりすると周期構造中に粒子が集積されていない欠陥が存在する等、バイオセンサー（S）に適した周期構造体（N）を作製することができない。
【００１９】
真球状粒子（P）の組成としては、前述の如く、スチレン、メチルメタクリレートを主要成分とするポリマーや金属酸化物が好ましく、これらの組成からなる真球状粒子（P）は、公知の方法により合成することができる。例えば、スチレンを主要成分とする場合、乳化重合法、懸濁重合法、ソープフリー乳化重合法等が挙げられ、シリカの場合、ゾルゲル法等が挙げられる。これらの組成からなり、上記の好ましい平均粒子径及び粒度分布を有する真球状粒子（P）は数多く市販されており、それらの市販品を使用することもできる。
【００２０】
周期構造体（N）の作製方法としては、マイクロマニュピュレーター等を使用して構成単位（L）を1個ずつ集積する方法や構成単位（L）として真球状粒子（P）を使用し、重力や遠心力、毛細管力、液架橋力等により集積する方法が挙げられる。
前者の方法としては、構成単位（L）、具体的には、公知の微細加工技術（リソグラフィー及びエッチング、レーザー加工等）により作製した金属化合物や合成ポリマーからなる柱状体や板状体を電子顕微鏡等で確認しながら1個ずつ集積していく方法が挙げられる。  この方法によれば、後述するフォトニックバンドギャップを容易に得ることができるログパイル構造を作製することができる。具体的には、図2で示すような周期構造体（N）（フォトニック結晶（C））が得られる。
【００２１】
一方、後者の方法は、電子顕微鏡等で確認しながら集積する必要がなく、集積ドライビングフォースを適切に選択すれば、極めて容易に大量生産することができるため前者の方法よりも好ましい。後者の方法によれば、周期構造体（N）の周期構造は六方最密充填構造及び／又は立方最密充填構造となる。後述のように、ある特定形状のテンプレートを使用する場合には、選択的に立方最密充填構造が得られる。
これら六方最密充填構造及び／又は立方最密充填構造を総称してオパール構造という。
このオパール構造からなる周期構造体（N）を鋳型として、後述の方法において、逆オパール構造を作製することができる。逆オパール構造とは、オパール構造体の間隙に固体物質（M）の前駆体などを充填した後、オパール構造体を取り除くことにより形成される構造であり、オパール構造体をちょうど逆にした構造である。
ここで立方最密充填構造及び六方最密充填構造とは、いずれも最密充填構造であって、充填率は74体積％である。
立方最密充填構造は、面心立方格子構造とも呼ばれ、正四角形の単位格子の各頂点および各面の中心に粒子が位置し、最稠密面をABCABCABCの順に重ねた構造となっている。
六方最密充填構造は、単位格子を正六角柱で表し、この正六角柱の上面および底面の各角および中心と、六角柱の内部で高さ 1/2 のところに 3 つの粒子が存在する。底面の中心に位置する原子は、底面の角の 6 粒子および上下の各3粒子（計 12 粒子）と接しており、最稠密面をABABABの順に重ねた構造となっている。
また、バルク状の固体物質（M）をレーザーにより直接加工する方法も周期構造体（N）の作製方法として挙げることができる。具体的な方法としては、感光性レジストに短パルスレーザーを照射することによりレーザーを照射した部分のみを選択的に硬化させて周期構造を得る方法（特開2004-126312に記載の方法）などが挙げられる。
【００２２】
真球状粒子（P）を使用し、重力や遠心力、毛細管力、液架橋力等により集積する方法では、何らかのテンプレート基板(Q)が必要である。テンプレートの機能を有する基板(Q)としては、真球状微粒子（P）を規則的に集積できる基板であれば種々の基板を使用することができ、凹凸のない平面基板、穴が形成された基板、溝が形成された基板、チューブ状の基板等を使用することができる。これら基板の形状や大きさにより、得られる周期構造体（N）の形状や大きさが決定されるため、精度良く穴や溝、チューブ等のサイズが揃った基板が必要であり、穴が形成された基板、溝が形成された基板、チューブ状の基板等を使用することが好ましい。これらの基板(Q)を使用すれば、極めて欠陥の少なく規則性の高い周期構造体（N）を作製することができ、バイオセンサー（S）の感度が更に良好なものとなる。
基板(Q)を構成する材料としては、シリコンやシリカ、酸化チタン等の無機化合物からなるものやアクリル樹脂、エポキシ樹脂、ポリイミド樹脂や感光性樹脂などの合成ポリマー等からなるものを使用することができる。
【００２３】
穴が形成された基板としては、図3のような基板が挙げられる。図3に示す穴の形状は基板表面に対して正確に54.7°の角度をなす逆ピラミッド型であり、このような極めて精度良くサイズの揃った穴を有する基板は、光や電子線を使用したリソグラフィー及びエッチング等の公知の微細加工技術により作製することができる。
例えば、図3に示す逆ピラミッド型基板は、電子線リソグラフィーと異方性エッチングにより作製することができる。具体的には、シリコン基板状に塗布したレジスト膜を電子線によりパターンニング（電子線リソグラフィー）した後、水酸化カリウム水溶液にて100面を選択的に溶解（異方性エッチング）することにより作製できる。逆ピラミッド型の穴を形成した基板を使用して、ピラミッドの先端部より順に真球状粒子（P）を集積すれば、立方最密充填構造のみからなる周期構造を作製することもできる。但し、立方最密充填構造と六方最密充填構造はいずれも最密充填構造であり、どちらの構造であっても又は両者の混合した構造であっても、フォトニックバンドギャップの効果等が変化することはない。
この方法を使用すれば、逆ピラミッド型の穴だけでなく、断面がV字型のアスペクト比が高い溝も精度良く作製することができるし、同様の微細加工技術を利用して、円柱型、柱状型の穴等も作製することができる。
【００２４】
その他、無機化合物等からなる平面基板に電子線リソグラフィー等により作製したレジスト膜のパターン自体を基板(Q)とすることもできるし、微細加工技術により金型基板を作製し、これを熱軟化点以上に加熱した熱可塑性樹脂等に押しつけパターンを転写する方法（ナノインプリント法）により作製した樹脂製の基板も使用することができる。
1つの穴の大きさ（μm）としては、直径が1〜1000であることが好ましく、更に好ましくは5〜500、特に好ましくは10〜100であり、大きさがこの範囲内であれば、短径と長径が存在してもよい。
【００２５】
溝が形成された基板としては、図4のような基板が挙げられ、同様の微細加工技術により作製することができる。ここで溝とは穴よりもアスペクト比（長径/短径、短径とは基板表面の断面の直径）が高い線状のものを意味し、具体的には、アスペクト比が10倍以上のものである（アスペクト比が10倍未満のものを穴とする）。
溝の断面の形状としては、四角形や図4のようなＶ字型等が挙げられる。
1つの溝の大きさ（μm）としては、短径が1〜1000、長径が10〜50000であることが好ましく、更に好ましくは短径が5〜500、長径が50〜20000、特に好ましくは短径が10〜100、長径が100〜10000である。
これらの溝としては、溝の両端が切り出されているもの、即ち、基板の端部に溝の両端が存在するものや片端だけが切り出されているもの、又は両端とも切り出されていないものを使用することができる。
【００２６】
チューブ状の基板としては、市販されているキャピラリーチューブ（石英キャピラッリーチューブ（モリテックス社製、TCI社製など））やマイクロチューブ（フッ素樹脂マイクロチューブなど（テックジャム社製））等を使用することができる。
【００２７】
これらの基板（Q）に真球状粒子（P）を重力や遠心力、毛細管力、液架橋力等により集積する方法としては公知の方法等を使用することができる。
重力による真球状粒子の集積方法は、自然沈降法とも呼ばれ、基板（Q）に真球状粒子のスラリーを滴下し、重力を集積ドライビングフォースとして真球状粒子を集積する方法である。ここで集積ドライビングフォースとは、真球状粒子（P）を基板（Q）に集積させるために働かせる力を意味する。
液架橋力による真球状粒子の集積方法（液架橋力法）は、基板（Q）に真球状粒子のスラリーを滴下し、溶媒の蒸発によって発生する液架橋力を集積ドライビングフォースとして真球状粒子を集積する方法である。
【００２８】
遠心力を使用した集積方法は、集積ドライビングフォースとして遠心力を使用することにより、周期構造体（N）の生産効率を高め、更に従来の方法では作製することが困難である均一性の高い周期構造単位の小さな周期構造体（N）を作製することが可能な方法である。例えば、遠心力を10Ｇ加えると、集積速度が10倍となる。また、5000Ｇ程度の強い遠心力を加えると、粒子径が300nm程度の小さな粒子も容易に集積することが可能であり、バイオセンサー（S）に適した周期構造単位の小さな周期構造体（N）を作製することができる。
【００２９】
遠心力とは、遠心力中心から外へと向かう方向の慣性力であり、次式で与えられる。  
F  =  ｍｒω２
ここで、ｍは真球状粒子（P）の質量、ｒは遠心場の中心から真球状粒子（P）までの距離、ωは角速度（回転数×2π）である。ｒは、正確には遠心場の中心（遠心機の中心）から真球状粒子（P）までの距離であるが、粒子は常に移動するので、便宜上遠心機の中心から基板（Q）までの距離として扱う。
使用する遠心力の強さとしては、粒子径や粒子の比重により好ましい強さは異なるが、生産速度向上の観点からは強い方がよい。但し、規則性の高い均一な真球状粒子（P）の集積体を作製するためには、遠心力の強さだけでなく、処理時間、粒子スラリーの濃度、溶媒の蒸発速度等のパラメーターを最適化する必要がある。
【００３０】
例えば、真球状粒子（P）として数平均粒子径が500nmのポリスチレン粒子、基板（Q）として直径が10μｍの正方形の穴径を有し、深さが12μｍの図3に示す逆ピラミッド型の穴が形成された基板を使用した場合のこれらパラメーターの好ましい範囲は、生産効率及び得られる周期構造体（N）の均一性等の観点から以下の通りである。
遠心力の強さとしては、10〜10000Ｇであることが好ましく、更に好ましくは100〜8000Ｇ、特に好ましくは500〜5000Ｇである。
処理時間としては、遠心力の強さによっても異なるが、5〜3600分であることが好ましく、更に好ましくは10〜1000分、特に好ましくは15〜120分である。
真球状粒子スラリーの濃度としては、粒子スラリーの量によっても異なるが、0.01〜20重量%であることが好ましく、更に好ましくは0.02〜15重量%、特に好ましくは0.05〜10重量%である。真球状粒子スラリーの調製方法としては、真球状粒子を水等に界面活性剤や超音波分散機を使用して分散することにより調整できるが、水中にて原料モノマー等からソープフリー乳化重合等により真球状粒子を合成して、そのまま真球状粒子スラリーとして用いることが好ましい。
溶媒の蒸発は、前述のように、集積処理中に行わないことが好ましい。
【００３１】
具体的な製造方法としては、基板（Q）に形成した穴又は溝に、真球状粒子（P）のスラリーを充填し、基板（Q）の表面に対して垂直に遠心力を加えて穴又は溝に真球状粒子（P）を集積する方法である。
真球状粒子（P）をそのまま使用するのではなく、溶媒に分散したスラリーとして使用するのは、粒子に機動性を持たせるためである。溶媒がない場合又は溶媒が蒸発してなくなった場合、粒子間や粒子と基板間において直ちに固着が起こり、粒子の機動性が無くなるため、均一性の高い周期構造体（N）を作製することができない。
【００３２】
ここで溶媒とは、真球状粒子（P）を溶解せず、分散させることができるものであれば販発明の構成上特に限定されず、水やアルコール、アセトンやトルエンなどの有機溶剤等を使用することができる。クリーンプロセス等の観点から、溶媒として水、低級アルコール又はこれらの混合溶媒を使用することが好ましい。
粒子のブラウン運動は規則的な集積を促進するため、遠心力の強度を定期的に増減させる、温度を高くする、何らかの振動を与える等に粒子に更に機動性を付与する方法は、均一性の高い周期構造体（N）を作製する方法として有効である。
基板（Q）の表面に対して垂直に遠心力を加えるとは、真球状粒子（P）が  基板（Q）の表面、穴や溝が形成された基板であれば、穴や溝の底部に対して垂直な力によって集積されることを意味する。具体的な方法としては、遠心力の増加に伴って基板（Q）を設置した遠心管の角度が変化する、所謂、スイングローター型の遠心機を使用する方法や遠心力が強い場合であって、遠心力がかかる方向に対して垂直に基板（Q）を設置することができる遠心機を使用する方法等が挙げられる。後者の方法において、遠心力が強い場合とは大凡500Ｇ以上の遠心力を加える場合を意味する。遠心力が大きくなると重力の影響が無視できるからである。
【００３３】
これらの方法に使用できる遠心機としては、市販されている多くの遠心機を使用することができる。例えば、冷却高速遠心機H2600、H923，H2000B、小型卓上遠心機H11NA、H19FMR（コクサン社製）、高速冷却遠心機GRX250、SRX201（トミー精工社製）などを使用することができる。使用できるローター（遠心管）としては、前者の方法の場合は、RF109Ｌ、RF127（H19FMR用）やSH1（H2600用）などが使用でき、後者の方法の場合は、DWH1（H2600用）などが使用できる。
【００３４】
遠心力を基板（Q）の表面に対して垂直ではなく平行にかける方法によっても周期構造体（N）を作製することができる。
この方法は、基板（Q）に形成した溝に必要により上部カバーを設置し、遠心場の外側に位置する溝の片端又はその片端直上の上部カバーに液量調整部を設け、溝に真球状粒子（P）のスラリーを充填した後、基板（Q）の表面に対して平行の方向に遠心力を加えて、必要により液量調整部を調整しながら、溝に真球状粒子（P）を集積する方法である。この方法に使用する装置の概念図を図5に示す。なお、遠心中心から基板（Q）までの距離が短い場合や基板（Q）が大きい場合等には、基板（Q）に形成される溝は遠心場の外側に位置する溝の片端から遠心中心に引いた線上に溝を形成することが好ましい。
【００３５】
上部カバーとは、真球状粒子（P）のスラリーの排出を防止する目的で基板（Q）に形成した溝又は基板（Q）全面の上部に設置されるカバーであり、排出のおそれがある場合には設置することが好ましい。
遠心場の外側に位置する溝の片端又はその片端直上の上部カバーに設置した液量調整部とは、溶媒のみを排出し真球状粒子（P）を透過させないフィルターや弁等であって、溶媒の排出速度を任意に調整できることが好ましい。真球状粒子（P）が集積された後において、閉じていた弁を開き溶媒を排出してもよいし、フィルターや適当に開いた弁を使用して真球状粒子（P）の集積過程において溶媒を排出してもよい。但し、フォトニック結晶の均一性向上等の観点から、真球状粒子（P）の集積が完了するまで、溶媒を完全に排出しないことが好ましい。
溝に真球状粒子（P）のスラリーを充填した後、基板（Q）の表面に対して平行の方向に遠心力を加えるとは、基板に形成した遠心場の外側に位置する溝の片端断面に対して垂直に遠心力をかけることを意味する。従って、真球状粒子（P）は遠心場外側に位置する溝の片端より順に集積されることになる。
【００３６】
前述の方法において、基板（Q）の表面に対して平行の方向に遠心力を加えた状態で、真球状粒子（P）のスラリーを遠心場の内側の片端から充填することにより3次元フォトニック結晶（C）を製造することもできる。この方法によれば生産効率が更に高くなり、連続的な製造方法として極めて有効である。
この方法に使用する装置の概念図を図6に示す。遠心中心に真球状粒子（P）のスラリーを滴下し一時的に溜めておくための凹部（WP）があり、その周囲に基板（Q）を設置する。基板装着部（QS）は凹部の壁が除去されており、基板（Q）に形成された溝の底部とWPの底部が同じ高さとなるように設計及び設置することが好ましい。本発明の構成上、基板装着部（QS）の数に制限はなく、多数も受けることにより、更に生産性が向上する。
上部カバーを設置する場合には、遠心中心に真球状粒子（P）スラリーの供給部（WI）を設けておき、ここから遠心中心にスラリーを滴下することができる。
【００３７】
遠心力を基板（Q）の表面に対して平行にかける方法に使用できる遠心機としては、市販されているスピンコーター等を使用することができる。例えば、1Hシリーズ（ミカサ社製）、ACTシリーズ、ASSシリーズ（アクティブ社製）、K359シリーズ（共和理研社製）等が挙げられる。
スピンコーターの回転数としては、回転半径等によって好ましい回転数が異なるが、前述の強さの遠心力が加わるように調整することが好ましい。
【００３８】
毛細管力を使用した集積方法としては、細い管の中の溶媒が管の中を上昇する現象（毛細管現象）を集積ドライビングフォースとして真球状粒子を集積する方法である。
溶媒が上昇する高さは、溶媒の表面張力、管の濡れ易さ、溶媒の密度等によって決まり、次式により計算することができる。
h= 2Tcosθ/pgr
ここでTは表面張力(N/m)、θは接触角、pは溶媒の密度(kg/m3)、gは重力加速度(m/s2)
、rは管の半径(m)である。
溶媒中に分散されている真球状粒子（P）は溶媒の上昇により一緒に上昇し、管の上から順に集積されていく。真球状粒子（P）の集積は、溶媒が蒸発することにより発生する液架橋力によって最終的に行われるが、通常の液架橋力とは異なり力がほぼ垂直方向のみに働く。溶媒の蒸発が管の上から順に起こるため、通常の液架橋力のように四方八方に力が働くものではないため、通常の液架橋力を使用した方法よりも均一性の高い周期構造体（N）を作製することが可能な方法である。
【００３９】
この方法に使用できる基板（Q）としては、チューブ状の基板を使用することが好ましく、前述のように、市販されているキャピラリーチューブ（石英キャピラッリーチューブ（モリテックス社製、TCI社製など））やマイクロチューブ（フッ素樹脂マイクロチューブなど（テックジャム社製））等を使用することができる。
具体的な方法としては、チューブ状の基板を真球状粒子（P）のスラリーに片端を浸漬するだけであるが、浸漬していない上部の片端から吸引する方法や、異なる種類の真球状粒子（P）のスラリーに順次浸漬してストライブ状に集積された周期構造体（N）のアレイを作製する方法など、生産効率の向上等を目的とした改良方法を幾つか挙げることができる。また、管表面の親疎水性を調整する等集積の条件を最適化することにより、更に均一性の高い周期構造体（N）を作製することができる。
【００４０】
真球状粒子（P）を使用し、重力や遠心力、毛細管力、液架橋力等により集積する方法としては、前述のように、公知の方法を使用することができるが、生産性を更に高め、かつ、バイオセンサー（S）に適した欠陥のない周期構造体（N）を作製する等の観点から、集積ドライビングフォースとして、遠心力、毛細管力を使用することが好ましい。
上記の方法により作製したオパール構造からなる周期構造体（N）を鋳型として、逆オパール構造の周期構造体（N）を作製することができる。構成単位（L）としてポリスチレン微粒子を使用したオパール構造の周期構造体（N）を鋳型として、シリカを固体物質（M）とする逆オパール構造の周期構造体（N）を作製する方法を以下に説明する。
前述の方法を使用して作製したポリスチレン微粒子を使用したオパール構造体の間隙に固体物質（M）の前駆体であるエタノール、テトラエトキシシラン、少量の水から作成されたシリカゾルを充填し、エタノール及び水を乾燥除去した後、ポリスチレン微粒子を除去することによりシリカからなる逆オパール構造体を作製することができる。ポリスチレン微粒子の除去方法としては、400〜500℃程度に加熱してポリスチレン微粒子を熱分解してガス化する方法やトルエンやジメチルスルホキシド等の有機溶剤を使用して溶解除去する方法が挙げられる。
一方、構成単位（L）としてシリカ微粒子を使用したオパール構造の周期構造体（N）を鋳型として、ポリスチレンを固体物質（M）とする逆オパール構造の周期構造体（N）を作製することもできる。シリカ微粒子を使用したオパール構造体の間隙に固体物質（M）の原料であるスチレンモノマー及び重合開始剤を充填し、加熱することによりスチレンを重合しポリマー化した後、シリカ微粒子を除去することによりポリスチレンからなる逆オパール構造体を作製することができる。シリカ微粒子の除去方法としては、フッ酸に浸漬してシリカ微粒子を溶解除去する方法が挙げられる。
他にも種々のオパール構造からなる周期構造体（N）を鋳型として、前述と同様の方法にて、チタニアやジルコニアの無機化合物、ポリオレフィン等の有機化合物を構成材料（M）とする逆オパール構造からなる周期構造体（N）を作製することができる。
逆オパール構造からなる周期構造体（N）は、ターゲット物資（Y）が特異的結合物質（X）に結合することにより発生する反射スペクトルピークのシフトの幅が、オパール構造よりも数倍から数十倍程度大きく、従って、逆オパール構造体のフォトニック結晶をバイオセンサー（S）として使用するほうが検出感度の観点からは好ましい。但し、オパール構造体の作製は極めて容易であることから低コストで作製できるため、使用者のニーズに応じて使い分けることが好ましい。
【００４１】
本発明においてフォトニック結晶（C）とは、特定の電磁波の波長と同程度の周期的な屈折率変化を内部にもつ構造体を意味し、3次元的な屈折率分布をもつ3次元フォトニック結晶である。このような構造では、半導体において原子核の周期ポテンシャルによって電子(電子波)がブラッグ反射を受けバンドギャップが形成されるのと同様に、周期的な屈折率分布によって対応する波長の電磁波がブラッグ反射を受け、電磁波に対するバンドギャップ(フォトニックバンドギャップ)が形成されるという特長がある。
具体的には、フォトニック結晶（C）は周期構造体（N）とその構造体の間に存在する物質からなる。その構造体の間に存在する物質とは、気体、液体、固体のいずれも使用することができるが、屈折率が1.0〜1.4の気体又は液体であることが好ましく、具体的には、空気、窒素、希ガス、水性媒体等である。
【００４２】
フォトニック結晶（C）は、基板（Q）に集積された状態でバイオセンサー（S）として使用することもできるし、基板を除去してフォトニック結晶（C）のみからバイオセンサー（S）を構成したり、基板を除去した後で別の基板にフォトニック結晶（C）を設置してバイオセンサー（S）に組み込むこともできる。
基板（Q）から取り出す場合には、例えば、周期構造体（N）がオパール構造である場合、粒子同士を固定化することが好ましい。粒子同士を固定化する方法としては、熱有着する方法が一般的であり、真球状微粒子（P）が有機化合物からなる場合だけでなく、無機化合物からなる場合にも適用することができる。例えば、真球状微粒子（P）がポリスチレンからなる場合には、90℃付近にて1〜5分程度熱処理することにより固定化することができ、シリカの場合も500℃付近にて1〜5分程度熱処理することにより固定化することができる。その他の方法としては、真球状微粒子（P）に反応性官能基を導入し、その官能基と反応する基を有する架橋剤を加えて化学的に結合する方法が挙げられる。これらの方法により、フォトニック結晶（C）を取り出す場合には、特異的結合物質（X）の変性を防止するため、周期構造体（N）（フォトニック結晶）を作製した後に（X）を固定化することが好ましい。
【００４３】
基板（Q）から取り出さずに使用する場合には、粒子同士はヴァンデルワールス力或いは静電的引力等により物理的に吸着しているので、必ずしも固定化は必要ではない。
基板（Q）から取り出す具体的な方法としては、上記の方法により固定化した3次元フォトニック結晶を粘着テープ等を表面に付着させて物理的に取り出す方法や基板（Q）を酸やアルカリ、有機溶剤等を使用して除去する方法等が挙げられる。
生産効率等の観点から、テンプレート基板に集積された状態でバイオセンサー（S）として使用できることが好ましく、テンプレート基板はテンプレートとしての役割だけでなく、バイオセンサー（S）の主要構成要素であるフォトニック結晶（C）の固定部品としての機能を有することが好ましい。
【００４４】
本発明において、特異的結合物質（X）は被検体(A)中に含まれるターゲット物質と特異的に結合する物質であれば制限なく使用でき、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチド若しくはオリゴペプチドなどが挙げられる。
ここで被検体(A)としては、血液（血清、血漿）、尿、大便、喀痰、髄液等が挙げられる。
被検体(A)中に含まれる特異的結合物質（X）と特異的に結合するターゲット物質とは、特異的結合物質（X）と同様のものであって、例えば（X）が抗体の場合、ターゲット物質は、その抗体が認識する抗原であり、例えば（X）が糖鎖の場合、ターゲット物質は、レクチン、例えば（X）が遺伝子の場合、ターゲット物質は、相補的な遺伝子である。
【００４５】
免疫蛋白質としては、抗原、抗体やハプテンを例示することができる。抗体としては、次の抗原に対する抗体が使用でき、該抗原としては、薬剤、低分子ホルモン、腫瘍マーカー、ウイルス、高分子ホルモン、サイトカイン、各種グロスファクター等が挙げられる。薬剤としては、例えば、テオフィリン、フェニトイン、バルプロ酸などが挙げられる。低分子ホルモンとしては、例えば、サイロキシン、エストロゲン、エストラジオールなどが挙げられる。腫瘍マーカーとしては、例えば、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＣＡ１９−９などが挙げられる。ウイルスとしては、例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶなどが挙げられる。高分子ホルモンとしては、例えば、甲状腺刺激ホルモン、インシュリンなどが挙げられる。サイトカインとしては、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６などが挙げられる。各種グロスファクターとしては、例えば、ＥＧＦ、ＰＤＧＦなどが挙げられる。これらの抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってもよく、さらに抗体の分解物であるＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂであってもよい。
【００４６】
酵素としては、酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、ターゲット物質がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、ターゲット物質がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等をターゲット物質とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
【００４７】
核酸としては、ターゲットとする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡの化学合成は、市販の合成装置を用いて行うことができるし、市販されているＤＮＡプローブをそのまま使用することもできる。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
【００４８】
特異的結合物質（X）は、周期構造体（N）の表面に固定化されており、（X）が表面に固定化された構成単位（L）を使用して周期構造体（N）を構成してもよいし、周期構造体（N）を作製した後に（X）を表面に固定化してもよい。
特異的結合物質（X）を固定化する方法としては、化学的に結合する方法、物理吸着による方法など公知の方法が使用できる。
【００４９】
特異的結合物質（X）が免疫蛋白質や酵素等の蛋白質である場合、化学的に結合する方法としては、周期構造体（N）又は構成単位（L）にアミノ基、スルフヒドリル基などの官能基を導入し、特異的結合物質（X）のアミノ基、スルフヒドリル基などの官能基をグルタルアルデヒド、サクシンアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロサクシンイミドエステル、ｏ−フェニレンビスマレイミドなどで架橋する方法が使用できる（例えば、米国特許第４２８０９９２号、米国特許第３６５２７６１号に記載されている。）。
他にも、周期構造体（N）又は構成単位（L）にカルボキシル基を導入し、カルボジイミドを介して特異的結合物質（X）のアミノ基と結合する方法が挙げられる。構成単位（L）として、カルボキシル基を表面に有するポリスチレンを主成分とする真球状粒子（P）（平均粒子系300nm・商品名K1-030・モリテックス社製）を使用する場合について具体的に説明する。まず、K1-030のスラリーにカルボジイミドを加え、室温で約１時間反応させた後、未反応のカルボジイミドを十分に洗浄除去する。次に、AFP抗体等の蛋白質を加え、約２時間反応させた後、未反応の蛋白質を洗浄除去することにより、蛋白質を化学的に結合した真球状粒子（P）を得ることができる。ここで洗浄除去の方法としては、遠心分離機を使用して粒子を沈降させ、上澄み液のみを除去して、更に超純水等を加えて同様の操作を繰り返す方法が挙げられる。
【００５０】
物理吸着による方法としては、例えば、固体物質（M）がポリスチレンの場合、特異的結合物質（X）を０．００１〜０．０４％（Ｗ／Ｖ）含む炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）に担体を適当時間浸漬する方法が使用できる（例えば、バイオシム・バイオフィズ・アクタ、２５１巻、４２７頁、１９７１年に記載されている。）。
特異的結合物質（X）が核酸である場合、物理的に結合する方法としては、周期構造体（N）又は構成単位（L）に正電荷を付与し、電気的引力により結合するものである。この方法は、DNA が負電荷を有していることを利用するものであり、ポリリジンを表面にコートする方法やアミノシランを周期構造体（N）又は構成単位（L）に反応させアミノ基を導入する方法など、公知の方法を使用することができる。
数十程度の塩基からなる、いわゆるオリゴDNA と呼ばれる短いDNA 鎖の固定には、化学的に結合する方法が好ましい。最も知られている方法は、前述のように周期構造体（N）又は構成単位（L）にアミノ基を導入し、DNA 断片鎖の末端にもアミノ基を導入して、グルタルアルデヒドのような架橋剤により固定する方法である。
【００５１】
本発明のバイオセンサー（S）は、フォトニック結晶（C）を必須構成要素とするものであり、このフォトニック結晶（C）がセンシングを司る部位である。
本バイオセンサー（S）は、特異的結合物質（X）が被検体中のターゲット物質と特異的に結合し、その結合によりフォトニック結晶（C）に生じる変化を観測してターゲット物質を検出・定量するものである。
具体的な検出方法としては、バイオセンサー（S）の主要構成素子であるフォトニック結晶（C）部位と被検体物質とを接触させる前後において、特定波長の電磁波をフォトニック結晶（C）に照射して得られる反射スペクトルの波長を比較することにより、被検体物質中に含まれる特異的結合物質（X）と特異的に結合するターゲット物質を検出する方法であり、フォトニック結晶のフォトニックバンドギャップを利用した検出方法である。この検出方法によれば、フォトニック結晶の表面における極くわずかなターゲット物質（Y）の結合による表面状態変化も感知することが可能である。特異的結合物質（X）と特異的に結合したターゲット物質がフォトニック結晶（C）の表面に付着することによりフォトニック結晶（C）の表面状態が変化し、フォトニックバンドギャップに由来する反射スペクトルの波長が高波長側若しくは低波長側にシフトする。このシフトにより、ターゲット物質を検出し、シフト量により、ターゲット物質の存在量を定量することができる。
【００５２】
ここでフォトニックバンドギャップとは、前述の通り、電磁波に対するバンドギャップであり、電磁波の絶縁帯域を意味する。そのギャップに対応する波長の電磁波は結晶の内部に透過できず完全に反射されることになる。従って、フォトニックバンドギャップに対応する波長の電磁波をフォトニック結晶（C）に照射すると反射スペクトルのピークが検出される。この反射スペクトルのピークは、フォトニックバンドギャップに由来するものであり、フォトニックバンドギャップはフォトニック結晶の表面状態変化に敏感に反応するため、被検体物質と接触させる前後において、この反射スペクトルのピーク波長を比較することによりターゲット物質を検出することができる。
【００５３】
特定波長の電磁波としては、γ線、X線、紫外線、可視光線、赤外線、ミリ波、マイクロ波等が挙げられる。
これらのうち、X線、紫外線、可視光線、赤外線を使用することが好ましく、更に好ましくは、波長100〜1000nmの紫外線、可視光線、赤外線であり、特に好ましくは、波長300〜750nmの紫外線、可視光線である。この特定波長の電磁波を使用すれば、検出感度が良好なものとなり、また、汎用的で安価な検出装置を使用することができる。
反射スペクトルの検出装置としては、汎用の分光光度計等を使用することができる。例えば、顕微紫外可視分光光度計MSV-350（日本分光社製）、分光測光装置PMA-11（浜松ホトニクス社製）、マルチスペクトロフォトメーターATRAS-25、FTIR-IRT-3000（日本分光社製）、紫外可視近赤外分光光度計UV-3600（島津社製）、反射測定装置MCPD-3000（大塚電子社製）などが挙げられる。
【００５４】
特定の波長の電磁波を周期構造体に照射して得られる反射スペクトルの波長は、主にフォトニック結晶（C）の周期サイズに対応し、例えば、平均粒子径200〜300nmの真球状粒子（P）から構成されるオパール構造の周期構造体（N）からなるフォトニック結晶（C）の場合には、200〜500nm付近に反射スペクトルが現れる。
【００５５】
特異的結合物質（X）に、被検体（A）中に含まれるターゲット物質（Y）を特異的に結合させる方法としては、種々の調整を行った被検体をバイオセンサー（S）の主要構成素子であるフォトニック結晶（C）に接触させることにより行う。フォトニック結晶（C）の表面に特異的結合物質（X）が固定化されているため、被検体物質中に含まれるターゲット物質の反応がフォトニック結晶（C）の表面にて起こる。
被検体（A）をフォトニック結晶（C）に接触させる方法としては、被検体（A）をフォトニック結晶（C）の表面に滴下する方法、フォトニック結晶（C）が固定化された基板の溝やチューブに、被検体（A）を圧入する方法、被検体（A）の希釈液等にフォトニック結晶（C）を浸漬する方法などが挙げられる。
接触の条件、即ち、反応時の温度、時間等の条件は、公知の条件を適用することができ、例えば、免疫蛋白質の場合、室温〜３７℃で1〜６０分反応させる。
未結合のターゲット物質（Y）や被検体（A）中のその他のタンパク質などをフォトニック結晶（C）中から取り除くため、被検体（A）の接触後、水性媒体等により洗浄することもでき、バイオセンサー（S）の検出感度向上の観点からは、洗浄操作を行うことが好ましい。
また、被検体（A）中のターゲット物質（Y）以外のタンパク質が特異的結合物質（X）や周期構造体（N）に非特異的に吸着する場合もあるため、牛血清アルブミン（BSA）等の親水性の高いタンパク質を周期構造体（N）に吸着させる等の公知の非特異的吸着防止法を採用することもできる。
【００５６】
バイオセンサー（S）は、主要構成素子であるフォトニック結晶（C）のみから構成することもできるが、取り扱いやすいようにフォトニック結晶（C）を固定化したチップや、或いは被検体物質を効率的に接触させるための溝や流路等を設けたチップとすることが好ましい。
【００５７】
[実施例]
次に本発明を実施例によって具体的に説明するが、本発明の主旨を逸脱しない限り本発明は実施例に限定されるものではない。なお、特記しない限り部は重量部、％は重量％を意味する。
【００５８】
＜基板（Q）の作製＞
（1）穴を形成した基板（基板（Q-1））
外観；図3参照
穴の形状；逆ピラミッド型
穴のサイズ；一辺；10μmの正方形（断面）、深さ；12μm、ピラミッドの角度；54°、穴の数；100個 
基板（Q）の大きさ；一辺1cmの正方形
作製方法；
一辺1cmのシリコン基板（基板（Q））を1000℃で1.5時間、大気中で加熱することにより酸化膜を形成した後、ピラニア液（硫酸と30%過酸化水素水を体積比1：9で混合したもの）にて洗浄して有機物を完全に除去した。
乾燥後、スピンコーターによりレジストを塗布し、約400nmの膜厚のレジスト膜をシリコン基板上に形成した（180℃で3分間プリベーク）。レジストはαメチルスチレン-αクロロアクリレート共重合体（ZEP520（ポジ型レジスト）、日本ゼオン社製）を使用した。
このレジスト膜に電子線描画装置にて上記の穴のサイズ等に対応するようにパターンを描画した後、現像液（ZEP-RD、日本ゼオン社製）に浸漬してマスクパターンを作製した。
BHF（フッ化アンモニウムとフッ酸を体積比1：9で混合したもの）に数分間浸漬して酸化膜のみを取り除いた後、水酸化カリウム（30％）とイソプロピルアルコール（12％）からなる水溶液に1時間浸漬して、異方性エッチングを行った。最後に、酸化膜をBHFにて取り除き、基板（Q-1）を得た。
（2）溝を形成した基板（基板（Q-2））
外観；図4参照
溝の断面形状；Ｖ字型
溝のサイズ；幅；10μm、長さ；1000μm、深さ；12μm、溝の数；100個 
基板の大きさ；1cm×0.1cmの長方形
その他；溝は短い方の辺と平行な方向に形成し、基板の両端部に溝の両端が位置する。
作製方法；
上記の溝のサイズ等に対応するようにパターンを作製して、基板（Q-1）と同様にして基板（Q-2）を作製した。
（3）チューブ状の基板（基板（Q-3））
以下の内径、長さを有する石英製キャピラリーチューブ（TSP030150、ポリミクロ社製）を使用した。
内径；30μm  （外径；150μm）    
長さ；3cm    
（4）溝を形成した基板（基板（Q-4））
外観；図4及び図6参照
溝の断面形状；Ｖ字型
溝のサイズ；幅；10μm、長さ；1000μm、深さ；12μm、溝の数；100個 
基板の大きさ；扇型、内円半径0.7cm、外円半径1.1cm、面積2.1cm2（溝の数；300個）
その他；基板の両端部に溝の両端が位置する
溝は遠心場の外側に位置する溝の片端から遠心中心に引いた線上に溝を形成。
（上記条件を満たす位置に基板（Q-4）を設置する）
作製方法；
上記の溝のサイズ等に対応するようにパターンを作製して、基板（Q-1）と同様にして基板（Q-4）を作製した。
（5）チューブ状の基板（基板（Q-5））
以下の内径、長さを有する石英製キャピラリーチューブ（TSP030150、ポリミクロ社製）を使用した。
内径；5μm  （外径；150μm）    
長さ；3cm    
（6）平面状の基板（基板（Q-6））
一辺24mm×24mm、厚さ0.2mmの凹凸のないガラス製カバーガラス（マツナミ社製）を使用した。
（7）チューブ状の基板（基板（Q-7））
厚さ（内径）0.1mm、幅（内径）1mm、長さ30mmのガラス製キャピラリーチューブを使用した。
【００５９】
＜構成単位（L）への特異的結合物質（X）の固定化＞
（1）AFP抗体固定化ポリスチレン真球状粒子（LX-1）
構成単位（L）；ポリスチレン真球状微粒子（P-1）
（数平均粒子径320nm、標準偏差3.0%、屈折率1.59）
特異的結合物質（X）；AFP抗体
作製方法；
数平均粒子径320nm、標準偏差3.0%、粒子濃度4重量%のカルボキシル基のついたポリスチレンを主成分とする真球状粒子（P-1）の水スラリー（W030CA、モリテックス社製）250μlに、0.2重量%の1-エチル-3ジメチルアミノプロピルカルボジイミド水溶液100μlを加え、室温で1時間反応させる。未反応の1-エチル-3ジメチルアミノプロピルカルボジイミドをリン酸緩衝液にて十分に洗浄除去した後、0.2重量%のAFP抗体を含有するリン酸緩衝液100μlを加えて室温で2時間反応させることによりカルボジイミドを介してAFP抗体を真球状粒子（P-1）の表面に固定化した。未反応のAFP抗体をリン酸緩衝液にて十分に洗浄除去した後、粒子濃度をリン酸緩衝液にて0.1重量%に調整した。
【００６０】
（2）CEA抗体固定化ポリスチレン真球状粒子（LX-2）
構成単位（L）；（P-1）
特異的結合物質（X）；CEA抗体
作製方法；
真球状粒子（P-1）の水スラリー（W030CA、モリテックス社製）250μlに、0.2重量%の1-エチル-3ジメチルアミノプロピルカルボジイミド水溶液100μlを加え、室温で1時間反応させる。未反応の1-エチル-3ジメチルアミノプロピルカルボジイミドをリン酸緩衝液にて十分に洗浄除去した後、0.2重量%のCEA抗体を含有するリン酸緩衝液100μlを加えて室温で2時間反応させることによりカルボジイミドを介してCEA抗体を真球状粒子（P-1）の表面に固定化した。未反応のCEA抗体をリン酸緩衝液にて十分に洗浄除去した後、粒子濃度をリン酸緩衝液にて0.1重量%に調整した。
【００６１】
（3）AFP抗体固定化シリカ真球状粒子（LX-3）
構成単位（L）；シリカ真球状微粒子（P-2）
（数平均粒子径500nm、標準偏差4.0%、屈折率1.46）
特異的結合物質（X）；AFP抗体
作製方法；
数平均粒子径500nm、標準偏差4.1%、粒子濃度2重量%のシリカ真球状粒子（P-2）の水スラリー（標準粒子8050、モリテックス社製）にエタノールを加えながら室温、30mmHgの減圧条件下にて脱水して水分含量0.3重量%、粒子濃度4重量%のエタノールスラリーとし、このエタノールスラリー250μlに、0.5重量%のアミノプロピルトリエトキシシランのエタノール溶液100μlを加え、室温で2時間反応させる。未反応のアミノプロピルトリエトキシシランをリン酸緩衝液にて十分に洗浄除去した後、0.2重量%のグルタルアルデヒド水溶液100μlを加え、室温で1時間反応させる。未反応のグルタルアルデヒドをリン酸緩衝液にて十分に洗浄除去した後、0.2重量%のAFP抗体を含有するリン酸緩衝液100μlを加えて室温で2時間反応させることによりグルタルアルデヒドを介してAFP抗体を真球状粒子（P-2）の表面に固定化した。未反応のAFP抗体をリン酸緩衝液にて十分に洗浄除去した後、粒子濃度をリン酸緩衝液にて0.1重量%に調整した。
【００６２】
（4）DNA固定化ポリスチレン真球状粒子（LX-4）
構成単位（L）；（P-1）
特異的結合物質（X）；一本鎖DNA（3’末端をチオール基で修飾）（宝バイオ社製） 
塩基配列（CAAgCATgACTTCgACTTCATCgTCACCgg）
作製方法；
真球状粒子（P-1）の水スラリー（W030CA、モリテックス社製）250μlに、0.2重量%のグルタルアルデヒド水溶液100μlを加え、室温で1時間反応させる。未反応のグルタルアルデヒドをリン酸緩衝液にて十分に洗浄除去した後、0.2重量%の一本鎖DNA（3’末端をチオール基で修飾）を含有するリン酸緩衝液100μlを加えて室温で2時間反応させることによりカルボジイミドを介して一本鎖DNAを真球状粒子（P-1）の表面に固定化した。未反応の一本鎖DNAをリン酸緩衝液にて十分に洗浄除去した後、粒子濃度をリン酸緩衝液にて0.1重量%に調整した。
【００６３】
＜被検体（A）の調整＞
（1）ターゲット物質（Y）が免疫蛋白質の場合
ボランティア3名（被検者ｂ1、ｂ2、ｂ3）から採集した血液をそれぞれ遠心分離機にて10000rpmで15分間遠心処理して上澄みの血漿を採取し、これを被検体（A-b1）、（A-b2）、（A-b3）とした。
（2）ターゲット物質（Y）が核酸の場合
LX-4の表面に存在する一本鎖DNAと相補的な塩基配列を有する一本鎖DNA（塩基配列（gTTCgTACTgAAgCTgAAgTAgCAgTggCC））を20.0ng/mlと、該一本鎖DNAと塩基配列が異なる一本鎖DNAが100種類をそれぞれ10〜100ng/mlの濃度で含有するリン酸緩衝液を調整し、これを被検体（A-4）とした。
【００６４】
＜実施例1＞    
基板（Q-2）に、（LX-1）のスラリー0.01gを滴下し、遠心機（H30R、コクサン社製）を使って、4000Gにて90分間、基板（Q-2）の表面に対して垂直に遠心力を加えて（LX-1）を集積した。遠心機には、基板（Q-2）の表面に対して垂直に遠心力が加わるように、スイングローター（RF121）に図7に示す遠心管を設置した。
遠心集積後、基板（Q-2）を遠心管から取り外し、余分なスラリーをリン酸緩衝液で洗浄しながら除去し、フォトニック結晶（C-1）（周期構造体（N-1）の隙間をリン酸緩衝液で満たしたもの）を得た。周期構造体（N-1）の周期構造は、立方最密充填構造と六方最密充填構造の両方が混合したオパール構造で、大きさは幅10μm、長さ1000μm、深さ12μmあった。以下、周期構造は表１及び２に記載した。
フォトニック結晶（C-1）が集積された基板（Q-1）上に、親水性スライドガラス（極東製薬工業社製）を設置してバイオセンサー（S-1）とした。
【００６５】
＜実施例2＞
基板（Q-2）に、（LX-2）のスラリーを滴下し、実施例1と同様にして、フォトニック結晶（C-2）及びバイオセンサー（S-2）を得た。
【００６６】
＜実施例3＞
基板（Q-2）に、（LX-3）のスラリーを滴下し、実施例1と同様にして、フォトニック結晶（C-3）及びバイオセンサー（S-3）を得た。
【００６７】
＜実施例4＞
基板（Q-2）に、（LX-4）のスラリーを滴下し、実施例1と同様にして、フォトニック結晶（C-4）及びバイオセンサー（S-4）を得た。
【００６８】
＜実施例5＞
基板（Q-2）の代わりに基板（Q-1）を使用して、（LX-1）のスラリーを滴下し、実施例1と同様にして、フォトニック結晶（C-5）を得た。フォトニック結晶（C-1）が基板（Q-1）に集積された状態でバイオセンサー（S-5）とした。
【００６９】
＜実施例6＞
基板（Q-3）の片端を、真球状粒子(P-1)（構成単位（L））の水スラリー（W030CA、モリテックス社製）を超純水にて10倍に希釈したものに2cm浸漬して、30時間静置することにより毛細管力を利用して真球状粒子(P-1)を集積した。
集積後、基板（Q-3）を真球状粒子(P-1)のスラリーから取り外し、90℃にて3分間熱処理を行うことで粒子間を固定化して、周期構造体（N-6）得た。得られた周期構造体（N-6）の大きさは、直径30μm、長さ3mmであった。
（LX-1）の作製の場合と同様にして、1-エチル-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド、AFP抗体の順に周期構造体（N）が集積された基板（Q-3）に注入し反応させて、周期構造体（N-6）の表面に特異的結合物質（X）としてAFP抗体を固定化した。
周期構造体（N-6）の隙間をリン酸緩衝液で満たすことでフォトニック結晶（C-6）を得た。
フォトニック結晶（C-6）が基板（Q-3）に集積された状態でバイオセンサー（S-6）とした。
【００７０】
＜実施例7＞
真球状粒子(P-1)（構成単位（L））の水スラリー（W030CA、モリテックス社製）を超純水にて10倍に希釈したものの代わりに、数平均粒子径300nm、標準偏差1.3%、粒子濃度1重量%のポリスチレンを主成分とする真球状粒子（P-3）の水スラリー（3300A、モリテックス社製）を使用する以外は、実施例6と同様にして周期構造体（N-7）を得た。得られた周期構造体（N-6）の大きさは、直径30μm、長さ3mmであった。
濃度1mg/mlのAFP抗体含有リン酸緩衝液5μlを基板（Q-3）内に注入してAFP抗体を周期構造体（N-6）の表面に物理的に固定化した。余分なAFP抗体をリン酸緩衝液で洗浄除去し、周期構造体（N-7）の隙間をリン酸緩衝液で満たすことでフォトニック結晶（C-7）を得た。
フォトニック結晶（C-7）が基板（Q-3）に集積された状態でバイオセンサー（S-7）とした。
【００７１】
＜実施例8＞
基板（Q-4）に液量調整弁を設けた上部カバーを設置し、スピンコーター（1H360S、ミカサ社製）を使って1500Gの遠心力を加えた後、真球状粒子（P-3）の水スラリー（3300A、モリテックス社製）を超純水にて10倍に希釈したもの0.1gを上部カバーのスラリー供給部からスピンコーターの中心の液溜に0.01g/分の速度で滴下してポリスチレン粒子を集積した。集積処理中において液量調整弁を開き、ポリスチレン粒子が完全に集積した後に溶媒が排出されるように設定した（図6参照）。
スラリーの供給終了10分後にスピンコーターを停止した後、上部カバーを外し、90℃にて3分間熱処理を行うことで粒子間を固定化して、周期構造体（N-8）得た。得られた周期構造体（N-8）の大きさは、幅10μm、長さ900μm、深さ12μmであった。
濃度1mg/mlのAFP抗体含有リン酸緩衝液3μlを基板（Q-4）内に注入してAFP抗体を周期構造体（N-8）の表面に物理的に固定化した。余分なAFP抗体をリン酸緩衝液で洗浄除去し、周期構造体（N-8）の隙間をリン酸緩衝液で満たすことでフォトニック結晶（C-8）を得た。
フォトニック結晶（C-8）が基板（Q-4）に集積された状態でバイオセンサー（S-8）とした。
【００７２】
＜実施例9＞
基板（Q-4）の代わりに基板（Q-5）を使用する以外は実施例7と同様にして、フォトニック結晶（C-9）及びバイオセンサー（S-9）を得た。
得られた周期構造体（N-9）の大きさは、直径5μm、長さ5mmであった。
【００７３】
＜実施例10＞
固体物質（M）として光硬化性樹脂（ネガティブ・フォトレジストＳＵ−８、μリソグラフィーケミカル社製）を使用し、特開2004-126312に記載の方法に準拠してバルク状の固体物質（M）を直接加工することにより周期構造体（N-10）を作製した。
マルチビーム干渉パターンの記録に使用される三次元ホログラフィック記録装置として、レーザ光源から発生したフェムト秒レーザパルスのレーザビームを複数光束に分割する回折ビームスプリッタ（ＤＢＳ（ｄｉｆｆｒａｃｔｉｖｅ  ｂｅａｍ  ｓｐｌｉｔｔｅｒ））を設置し、その回折ビームスプリッタ通過後のレーザビームの光路上に焦点距離が１７５ｍｍの色消しレンズと顕微鏡の対物レンズを設置し、色消しレンズと対物レンズの間に４光束を選択するためのアパーチャを設置した。
これらの光学機器を用い、まずレーザー光源で発生したフェムト秒レーザパルスビームを回折ビームスプリッタにより複数光束に分割し、回折ビームスプリッタの後方に配置された色消しレンズでそれら複数光束を平行方向に集光し、さらにその後方に設置されたアパーチャにより3次元干渉パターンを得るための４光束の選択を行った後、顕微鏡の対物レンズで４光束レーザビームを集光し、ＳＵ−８薄膜にそれらレーザビームを集光させ、４光束を干渉露光させた。
４光束のレーザパルスビームにより、ＳＵ−８薄膜中で４回対称（正方形）干渉パターンを形成した。露光には再生増幅器付のＴｉサファイア発振器（Ｔｓｕｎａｍｉ  ＆  Ｓｐｉｔｆｉｒｅ，  Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｈｙｓｉｃｓ）で得られるフェムト秒レーザパルスを使用した。このレーザパルスの繰返し周波数は１ｋＨｚでありパルス幅は１５０ｆｓであって波長が８００ｎｍであった。また、フェムト秒レーザパルスの回折ビームスプリッタ（ＤＢＳ）の手前でのレーザパワーは２１０ｍＷであったが、ＳＵ−８薄膜の位置では３分の露光時間で１．７ｍＷであった。
光硬化性樹脂薄膜（ＳＵ−８薄膜）は、スピンコーターを使用して、ガラス基板上に５μｍの厚さで均一に形成した。その薄膜に対し露光前に事前焼付けを行い、レーザパルスビームを照射後、事後焼付けして光励起架橋反応を強化し、引き続いて現像を行うことにより非架橋領域を取り除き1辺20μm、厚さ5μm、構造周期が0.5μmの周期構造体（N-10）を得た（図1）。
濃度1mg/mlのAFP抗体含有リン酸緩衝液3μlを周期構造体（N-10）部に滴下してAFP抗体を表面に物理的に固定化した。余分なAFP抗体をリン酸緩衝液で洗浄除去し、周期構造体（N-8）の隙間をリン酸緩衝液で満たすことでフォトニック結晶（C-10）を得た。
フォトニック結晶（C-10）が光硬化生樹脂薄膜を作製する際に使用したガラス基板上に集積された状態でバイオセンサー（S-10）とした。
【００７４】
＜実施例11＞
基板（Q-6）上に、一辺5mm×5mmの穴を開けた厚み1mmのシリコンゴムを設置し、シリコンゴムの穴の中に真球状粒子（P-3）の水スラリー（3300A、モリテックス社製）を濃縮して固形分濃度を10重量%としたものを25μL滴下し、室温で乾燥させることにより（P-3）を集積した(液架橋力による集積)。
90℃にて10分間熱処理を行うことで粒子間を固定化して、一辺5mm×5mm、厚み0.5mmのオパール構造からなる周期構造体（N-11）を得た。
濃度1mg/mlのAFP抗体含有リン酸緩衝液に周期構造体（N-11）を浸漬してAFP抗体を周期構造体（N-11）の表面に物理的に固定化した。余分なAFP抗体をリン酸緩衝液で洗浄除去し、周期構造体（N-11）の隙間をリン酸緩衝液で満たすことで一辺5mm×5mm、厚み0.4mmのフォトニック結晶（C-11）を得た。
フォトニック結晶（N-11）を基板（Q-6）上に設置してバイオセンサー（S-11）とした。
【００７５】
＜実施例12＞
周期構造体（N-11）の間隙に、シリカゾル（エタノール5ml、テトラエトキシシラン5ml、35％塩酸水溶液0.5ml、イオン水0.5mlを配合し、10時間室温にて攪拌して作成）を充填し、乾燥させた。乾燥して形成するシリカの厚みが、周期構造体（N-11）の厚みの80％になるまで、この充填・乾燥の操作を繰り返した。
シリカを充填した周期構造体（N-11）を基板（Q-6）と共に、500℃の電気炉にて2時間加熱処理して（P-3）を除去することにより、一辺5mm×5mm、厚み0.4mmの逆オパール構造からなる周期構造体（N-12）を得た。
濃度1mg/mlのAFP抗体含有リン酸緩衝液に周期構造体（N-12）を浸漬してAFP抗体を周期構造体（N-12）の表面に物理的に固定化した。余分なAFP抗体をリン酸緩衝液で洗浄除去し、周期構造体（N-12）の隙間をリン酸緩衝液で満たすことで一辺5mm×5mm、厚み0.4mmのフォトニック結晶（C-12）を得た。
フォトニック結晶（N-12）を基板（Q-6）上に設置してバイオセンサー（S-12）とした。
【００７６】
＜実施例13＞
基板（Q-6）上に、一辺5mm×5mmの穴を開けた厚み1mmのシリコンゴムを設置し、シリコンゴムの穴の中にシリカからなる真球状微粒子（P-4）の水スラリー（粒径300nm、Cv3％、固形分濃度10重量％）を70μL滴下し、室温で乾燥させることにより（P-4）を集積した。
200℃にて30分間熱処理を行うことで粒子間を固定化して、一辺5mm×5mm、厚み0.4mmのオパール構造からなる周期構造体（N-13）を得た。
（LX-1）の作製の場合と同様にして、1-エチル-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド、AFP抗体の順に反応させて、周期構造体（N-13）の表面にAFP抗体を固定化した後、リン酸緩衝液で満たすことで一辺5mm×5mm、厚み0.4mmのフォトニック結晶（C-13）を得た。
フォトニック結晶（N-13）を基板（Q-6）上に設置してバイオセンサー（S-13）とした。
【００７７】
＜実施例14＞
周期構造体（N-13）の上部に基板（Q-6）をもう一枚のせて粘着テープにて基板（Q-6）と周期構造体（N-13）とを完全に密着させて、その間隙にスチレンモノマー及びアゾビスイソブチロニトリルを充填した。60℃、窒素雰囲気下にて20時間重合を行いポリスチレンを充填した周期構造体（N-14）を得た。これをフッ酸水溶液に2日間浸漬して、（P-4）及び基板(Q-6)を溶解除去して、一辺5mm×5mm、厚み0.4mmの逆オパール構造からなる周期構造体（N-14）を得た。
濃度1mg/mlのAFP抗体含有リン酸緩衝液に周期構造体（N-14）を浸漬してAFP抗体を周期構造体（N-14）の表面に物理的に固定化した。余分なAFP抗体をリン酸緩衝液で洗浄除去し、周期構造体（N-14）の隙間をリン酸緩衝液で満たすことで一辺5mm×5mm、厚み0.4mmのフォトニック結晶（C-14）を得た。
フォトニック結晶（N-14）を基板（Q-6）上に設置してバイオセンサー（S-14）とした。
【００７８】
＜実施例15＞
基板（Q-7）の片端から2cmを、真球状粒子（P-3）の水スラリー（3300A、モリテックス社製）に2日間浸漬することにより、浸漬していない片端に厚み0.3mm、幅1mm、長さ5mmのオパール構造からなる周期構造体（N-15B）（90℃で10分間の熱処理を行った）を得た。
以降の操作は実施例12と同様にして、厚み0.3mm、幅1mm、長さ5mmのシリカを固体物質（M）とする逆オパール構造からなる周期構造体（N-15）、及びフォトニック結晶（C-15）を得た。
フォトニック結晶（N-15）が基板（Q-7）内にある状態でバイオセンサー（S-15）とした。
【００７９】
＜実施例16＞
シリカゾルに代えて、チタニアゾル（作成方法は同じ）を使用する以外は、実施例12と同様にして、一辺5mm×5mm、厚み0.4mmのチタニアを固体物質（M）とする逆オパール構造からなる周期構造体（N-16）、及びフォトニック結晶（C-16）を得た。
フォトニック結晶（N-16）を基板（Q-6）上に設置してバイオセンサー（S-16）とした。
【００８０】
＜実施例17＞
（LX-1）の作製の場合と同様にして、1-エチル-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド、AFP抗体の順に反応させて、周期構造体（N-15）の表面にAFP抗体を固定化した以外は、実施例12と同様にして周期構造体（N-15X）、及びフォトニック結晶（C-17）を得た。
フォトニック結晶（C-17）を基板（Q-6）上に設置してバイオセンサー（S-17）とした。
【００８１】
＜実施例18＞
液架橋力による集積の代わりに、遠心力による集積とする以外は実施例11と同様にして周期構造体（N-18B）を得た。
以降の操作は実施例12と同様にして、一辺5mm×5mm、厚み0.4mmの逆オパール構造からなる周期構造体（N-18）、及びフォトニック結晶（C-18）を得た。
フォトニック結晶（N-18）を基板（Q-6）上に設置してバイオセンサー（S-18）とした。
【００８２】
表１〜３に作成したバイオセンサー（S-1）〜（S-18）の一覧表を示した。
【００８３】
【表１】
2007271609.tif 000003
【００８４】
【表２】
2007271609.tif 000004
【００８５】
【表３】
2007271609.tif 000005
【００８６】
＜実施例19＞
被検体（A-b1〜3）100μlに、AFP抗体濃度を50.0ng/mlに調整したリン酸緩衝液（AFP抗原リン酸緩衝液）100μlを添加混合して試験サンプルAFPb1、AFPb2、AFPb3を作製した。
顕微紫外可視分光光度計MSV-350（日本分光社製）を使用して、バイオセンサー（S-1）の1本のフォトニック結晶（C-1）における反射スペクトル（RS）を測定した（ブランク測定）。RSのピークは波長710.0nmに観測された。ここで1本のフォトニック結晶（C-1）とは、基板（Q-2）に形成された溝1個に集積された周期構造体(N-1)から構成されるフォトニック結晶（C-1）を意味し、以下の全ての処理及び測定は、この1本のフォトニック結晶（C-1）について行う（以下、フォトニック結晶（C-1）と称する）。
フォトニック結晶（C-1）の片端から、マイクロシリンジを使用して、試験サンプルAFPb1を1μl注入し、固定化したAFP抗体と試験サンプルAFPb1中のAFP抗原（ターゲット物質（Y））とを反応させた。ここで試験サンプルAFPb1はフォトニック結晶（C-1）の中を通過して、もう一方の片端より排出される。試験サンプルAFPb1の注入終了後、リン酸緩衝液5μlを注入して、AFP抗原以外の未反応の蛋白質等を洗浄除去した後、リン酸緩衝液を再び充填した。
ブランク測定と同様にRSを測定した。RSのピークは、波長714.0 nmに観測された。同様の操作を試験サンプルAFPb2、AFPb3についても行ない（ブランクのRSのピークはいずれも波長710.0nmに観測された）、それぞれ波長713.8、713.7nmにRSのピークが観測された。ここで使用したバイオセンサー（S1）は同一のものであって、同一基板（Q）上の異なるフォトニック結晶（C-1）を使用して測定を行った。
検量線を作製して、各試験サンプル中におけるAFP抗原濃度を決定した結果、試験サンプルAFPb1が25.5ng/ml、試験サンプルAFPb2が25.2ng/ml、試験サンプルAFPb3が25.1ng/mlであった。
AFP抗原リン酸緩衝液の濃度を減少させて、前述と同様の条件にて、検出下限濃度を決定した。検出下限濃度は、RSピークのシフト量（ターゲット物質（Y）との反応後のRSピーク波長から、ブランク測定のRSピーク波長を引いた値）が観測不可能になる濃度、具体的にはシフト量が0.1nmとなる濃度とした。
バイオセンサー（S-1）の検出下限濃度（ng/ml）は0.05であった。
【００８７】
＜実施例20＞
被検体（A-b1〜3）10μlに、CEA抗体濃度を50ng/mlに調整したリン酸緩衝液（CEA抗原リン酸緩衝液）10μlを添加混合して試験サンプルCEAb1、CEAb2、CEAb3を作製した。
バイオセンサー（S-2）を使用し、実施例19と同様にして、試験サンプルCEAb1、CEAb2、CEAb3中のCEA濃度の定量を行った。それぞれ、波長709.6、709.3、709.2nmにRSのピークが観測された（ブランクのRSスペクトルピークは、いずれも波長705.9 nmに観測された）。
検量線を作製して、各試験サンプル中におけるCEA抗原濃度を決定した結果、試験サンプルCEAb1が25.3ng/ml、試験サンプルCEAb2が25.1ng/ml、試験サンプルCEAb3が25.1ng/mlであった。
実施例19と同様にして、検出下限濃度の測定を行った。
【００８８】
＜実施例21＞
バイオセンサーがバイオセンサー（S-3）である以外は、実施例19と同様にして検出下限濃度の測定を行った。
【００８９】
＜実施例22＞
バイオセンサー（S-4）を使用し、実施例19と同様にして、被検体（A-4）の定量を行った。波長720.0nmにRSのピークが観測された（ブランクのRSスペクトルピークは、波長718.5 nmに観測された）。
検量線を作製して、被検体（A-4）中における相補的DNAの濃度を決定した結果、20.0ng/mlであり、予め調整した濃度と一致した。
実施例19と同様にして検出下限濃度の測定を行った。
【００９０】
＜実施例23＞
バイオセンサーがバイオセンサー（S-5）である以外は、実施例19と同様にして検出下限濃度の測定を行った。
なお、実施例19の1本のフォトニック結晶は、基板（Q-1）に形成された穴1個に集積された周期構造体(N-5)から構成されるフォトニック結晶（C-5）を意味する。また、抗原抗体反応等は、試料サンプルをフォトニック結晶（C-5）表面に直接滴下することにより行なった。
【００９１】
＜実施例24＞
バイオセンサーがバイオセンサー（S-6）である以外は、実施例19と同様にして検出下限濃度の測定を行った。
【００９２】
＜実施例25＞
バイオセンサーがバイオセンサー（S-7）である以外は、実施例19と同様にして検出下限濃度の測定を行った。
【００９３】
＜実施例26＞
バイオセンサーがバイオセンサー（S-8）である以外は、実施例19と同様にして検出下限濃度の測定を行った。
【００９４】
＜実施例27＞
バイオセンサーがバイオセンサー（S-9）である以外は、実施例19と同様にして検出下限濃度の測定を行った。
【００９５】
＜実施例28＞
バイオセンサーがバイオセンサー（S-10）である以外は、実施例19と同様にして検出下限濃度の測定を行った。
なお、抗原抗体反応等は、試料サンプルをフォトニック結晶（C-10）表面に直接滴下することにより行った。
【００９６】
＜実施例29＞
試験サンプル100μlを、バイオセンサー（S-11）のフォトニック結晶部（C-11）に滴下(或いはフォトニック結晶を試験サンプルに浸漬)する以外は、実施例19と同様にして検出下限濃度の測定を行った。
なお、実施例19の1本のフォトニック結晶は、基板（Q-6）に形成されたフォトニック結晶（C-11）を意味する。
【００９７】
＜実施例30＞
バイオセンサーがバイオセンサー（S-12）である以外は、実施例29と同様にして検出下限濃度の測定を行った。
【００９８】
＜実施例31＞
バイオセンサーがバイオセンサー（S-13）である以外は、実施例29と同様にして検出下限濃度の測定を行った。
【００９９】
＜実施例32＞
バイオセンサーがバイオセンサー（S-14）である以外は、実施例29と同様にして検出下限濃度の測定を行った。
【０１００】
＜実例33＞
バイオセンサーがバイオセンサー（S-15）である以外は、実施例29と同様にして検出下限濃度の測定を行った。
【０１０１】
＜実施例34＞
バイオセンサーがバイオセンサー（S-16）である以外は、実施例29と同様にして検出下限濃度の測定を行った。
【０１０２】
＜実施例35＞
バイオセンサーがバイオセンサー（S-17）である以外は、実施例29と同様にして検出下限濃度の測定を行った。
【０１０３】
＜実施例36＞
バイオセンサーがバイオセンサー（S-18）である以外は、実施例29と同様にして検出下限濃度の測定を行った。
【０１０４】
＜比較例1＞
表面プラズモンセンサーを使用して、試験サンプルAFPb1〜AFPb3の測定を行った。
表面プラズモンセンサーとしてはビアコアX（ビアコア社製）、センサーチップとしてCM5（ビアコア社製）を使用した。構成単位（L-1）の作製の場合と同様にして、CM5の表面にAFP抗体を固定化した。具体的には、1-エチル-3ジメチルアミノプロピルカルボジイミドでカルボキシル基を活性化した後、AFP抗体を含有するリン酸緩衝液を加えて室温で2時間反応させることにより固定化した。
ビアコアXによれば、洗浄処理や試料サンプルの供給、表面プラズモンシグナルの観測等は、全て自動で行われる。ビアコアセンサーグラムは、センサーチップ表面の質量変化（縦軸）と質量の時間変化（横軸）を測定データーとして表示し、質量変化量が平衡になった時点の質量変化量からターゲット物質の定量を行うものである。
試料サンプルは、1分間に20μlの速度で5分間供給し、合計100μl必要であった。
まず、実施例のバイオセンサーと同一のAFP抗原量を供給して検出感度を比較するために、試料サンプルAFPb1〜AFPb3をリン酸緩衝液にて100倍に希釈して供給した。その結果、明確な質量変化が観測されず（センサーグラムが作製できない）、測定不可能であった。
次に、試料サンプルAFPb1〜AFPb3を100μlそれぞれ供給し、同様に測定を行ったところ、質量変化が観測され、その平衡点から試験サンプルAFPb1、AFPb2、AFPb3いずれも25ng/mlという定量結果が得られた。
実施例の場合と同様に、AFP抗原リン酸緩衝液の濃度を増減させて、前述と同様の条件にて、検出下限濃度（ng/ml）を決定した。
【０１０５】
表４〜７に作成したバイオセンサー（S-1）〜（S-18）、比較例の表面プラズモンセンサーを使用した場合の検出評価結果を示した。
バイオセンサー（S-1）〜（S-10）は、検出部であるフォトニック結晶が極めて微細であるため、必要な試験サンプル量はいずれも1μlと極微量であり、かつ、検出下限濃度は5ng/ml以下であった。比較例の表面プラズモンセンサーよりも、ターゲット物質（Y）絶対量あたりの検出感度で数十倍高く、試験サンプル量を100μlとして表面プラズモンセンサーで測定した場合においても、検出感度は2〜10倍も優れていた。
バイオセンサー（S-11）〜（S-18）の検出感度も、表面プラズモンセンサーよりも高く、特に逆オパール構造の周期構造体からなるフォトニック結晶を有するバイオセンサーは検出感度が高かった。
【０１０６】
【表４】
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【０１０７】
【表５】
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【０１０８】
【表６】
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【０１０９】
【表７】
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【産業上の利用可能性】
【０１１０】
本発明のバイオセンサーは、新たなセンシング原理を取入れた極めて検出感度の高いバイオセンサーとして様々な用途に使用することができる。特に、蛋白質解析、遺伝子解析等の研究用途や、腫瘍検査、ウイルス検査等の臨床検査用途に好適である。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】レーザー加工法により作製した3次元フォトニック結晶
【図２】角柱の積み上げにより作製した3次元フォトニック結晶
【図３】穴が形成された基板（逆ピラミッド型構造）
【図４】溝が形成された基板（V字溝）
【図５】概念図
【図６】概念図
【図７】スイングローター用遠心管
【符号の説明】
【０１１２】
Ｑ：基板（テンプレート）
Ｃ：上部カバー
ＳＱ：スピンコーター基板
ＤＩ：溝部
ＰＩＮ：固定用ビス
ＶＡ：液量調整部（調整弁）
ＱＳ：基板装着部
ＷＩ：粒子スラリー供給部
ＷＰ：粒子スラリー溜
ＣＷ：溶媒蒸発防止カバー
ＯＲ：オーリング
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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