(57)【要約】【課題】ワクチン接種したニワトリにおいて免疫反応を誘導することができる、生の及び不活性化したニワトリ貧血因子（ＣＡＡ）ワクチンを提供すること。【解決手段】ワクチンのＣＡＡウイルスは孵化卵内における連続継代により弱毒化する。この発明はまた、このような新規のＣＡＡウイルスおよび該ウイルスの製造方法も提供する。インビトロにおいてＣＡＡウイルスを高力価に増殖させることができ、得られたウイルスは免疫原性を保持し且つ病原性も極めて低い。これにより、該ワクチンは、ＣＡＡに対する家禽類の保護に有効である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニワトリ胚において病変を誘発することができるニワトリ貧血因子（ＣＡＡ）ウイルス。
【請求項２】
ウイルスがパスツール研究所のＣＮＣＭに寄託してあるＩ‐１１４１株のものであることを特徴とする、請求項１に記載のＣＡＡウイルス。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＣＡＡウイルスの微生物学的に純粋な組成物。
【請求項４】
組成物が１ｍｌ当たり少なくとも１０8.0 ＴＣＩＤ50を含むことを特徴とする、請求項３に記載の微生物学的に純粋な組成物。
【請求項５】
弱毒化した生きているＣＡＡウイルスを含む、ＣＡＡに対する家禽類の保護のためのワクチンであって、それが請求項１または２に記載のＣＡＡウイルスを含むことを特徴とするワクチン。
【請求項６】
ＣＡＡウイルスが孵化卵内において弱毒化されることを特徴とする、請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
ＣＡＡに対する家禽類の保護のためのワクチンであって、それが不活性化したＣＡＡウイルスの有効量を含み、そのワクチンはワクチン接種後にニワトリ内においてＣＡＡウイルス中和抗体の産生を誘導することができることを特徴とするワクチン。
【請求項８】
ＣＡＡウイルスの前不活性化量が用量当たり少なくとも約１０7.5 ＴＣＩＤ50であることを特徴とする、請求項７に記載のワクチン。
【請求項９】
前不活性化量が用量当たり少なくとも約１０8.0 ＴＣＩＤ50であり、好ましくは少なくとも約１０9.0 ＴＣＩＤ50であるという特徴を有する、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１０】
ワクチンが請求項１または２に記載のＣＡＡウイルスを含むことを特徴とする、請求項５〜９のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１１】
ワクチンが更にアジュバントを含むことを特徴とする、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１２】
ワクチンが更に１種類またはそれ以上の無関係の鳥類の病原体の抗原を含むことを特徴とする、請求項５または７に記載のワクチン。
【請求項１３】
ＣＡＡウイルス生成物の製造方法であって、
ａ）感受性基体に請求項１または２に記載のＣＡＡウイルスを接種し、
ｂ）ＣＡＡウイルスを増殖させ、および、
ｃ）ＣＡＡウイルスを含有する物質を取り出す
段階を含む方法。
【請求項１４】
基体が孵化卵であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニワトリ貧血因子（ＣＡＡ）に対する家禽類の保護のための、生のもしくは不活性化されたワクチン、このようなワクチンの製造方法、ＣＡＡウイルス産物の製造方法、並びに、ＣＡＡウイルスの微生物学的に純粋な組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニワトリ貧血因子（ＣＡＡ）は鳥類の感染性貧血の原因となる因子であり、最初にＹｕａｓａらにより１９７９年に記載された（Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ２３巻、３６６‐３８５ページ、１９７９年）。幼若で感受性であるニワトリにおいて、ＣＡＡは骨髄の形成不全症／減形成症及び胸腺の萎縮を伴う顕著な貧血を引き起こす。
【０００３】
ニワトリは、ＣＡＡに起因する実験的に誘導した疾患に対して年令抵抗性を発現する。これは主に２週令までに完了するが、それより年上の鳥もやはり感染に対して感受性である（Ｙｕａｓａ、Ｎ．ら、１９７９年、上掲；Ｙｕａｓａ、Ｎ．ら、Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ２４巻、２０２‐２０９ページ、１９８０年）。しかしながら、ニワトリがＣＡＡと免疫抑制剤（ＩＢＤＶ、ＭＤＶ等）で２重に感染される場合には、疾患に対する年令抵抗性は遅延する（Ｙｕａｓａ、Ｎ．ら、１９７９年及び１９８０年、上掲；Ｂｕｌｏｗ  ｖｏｎ  Ｖ．ら、Ｊ．  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３３巻、９３‐１１６ページ、１９８６年）。ＣＡＡを接種したニワトリにおける疾病率及び死亡率は、接種に使用されたＣＡＡの用量と強く関連しており、つまり、用量が多ければ疾患の重症度が高くなる（Ｙｕａｓａ、Ｎ．ら、１９７９年、上掲）。
【０００４】
ＣＡＡは、腎臓、胸腺、ファブリシウスの粘液嚢、骨髄もしくは白血球細胞に由来するニワトリ胚の線維芽細胞（ＣＥＦ）、ニワトリ胚の脳細胞、ニワトリ胚の肝細胞、及び、ニワトリ細胞のような様々なニワトリ及びニワトリ胚の組織から誘導される標準的な培養単層細胞中においては増殖せず（Ｙｕａｓａ、Ｎ．ら、１９７９年、上掲；Ｙｕａｓａ、Ｎ．、Ｎａｔｌ．  Ｉｎｓｔ．  Ａｎｉｍ．  Ｈｅａｌｔｈ  Ｑ．、２３巻、１３‐２０ページ、１９８９年）、あるいは、ＶＥＲＯ、ＣＲＦＫ、ＭＤＣＫ及びＡ‐７２のような一般的に用いられる種々の哺乳類細胞系においても増殖しない（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｒ、Ｊ．Ｋ．及びＣｌｏｕｄ、Ｓ．Ｓ．、Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ３３巻、７０７‐７１３ページ、１９８９年）。ＣＡＡは、マレック病から樹立されたある種のリンパ芽球細胞系及びリンパ系白血症リンパ腫の中、特にＭＤＣＣ‐ＭＳＢ１細胞培養物中において増殖する（Ｙｕａｓａ、Ｎ．ら、１９８３年、上掲）。しかしながら、都合の悪いことに、ＣＡＡはＭＤＣＣ‐ＭＳＢ１細胞中においては比較的低い力価でしか増殖できない。すなわち、ＭＤＣＣ‐ＭＳＢ１細胞中においては、１０5.0 〜１０6.0 ＴＣＩＤ50／０．１ｍｌの力価が得られたにすぎなかった。更に、ＣＡＡは、ＭＤＣＣ‐ＭＳＢ１細胞中において、接種用量の約１０倍までしか増殖しないことが判明している（Ｙｕａｓａ、Ｎ．ら、１９８３年、上掲、Ｂｕｌｏｗ  ｖｏｎ  Ｖ．ら、Ｚｅｎｔｒａｌｂｌａｔｔ  Ｖｅｔ．  Ｍｅｄ．  ３２巻、６７９‐６９３ページ、１９８５年）。
【０００５】
ニワトリに加え、ＣＡＡは、ニワトリ胚中においても増殖することができる（Ｙｕａｓａ、Ｎ．及びＹｏｓｈｉｄａ、Ｉ．、Ｎａｔｌ．  Ｉｎｓｔ．  Ａｎｉｍ．  Ｈｅａｌｔｈ  Ｑ．  ２３巻、９９‐１００ページ、１９８３年；Ｂｕｌｏｗ  ｖｏｎ  Ｖ．及びＷｉｔｔ、Ｍ．、Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｍｅｄ．  ３３巻、６６４‐６６９ページ、１９８６年）。しかしながら、これらの胚については致死的もしくは病理学的作用は何ら観察されず、ＣＡＡは孵化卵内において、胚に影響を与えるほど充分大量には増殖しないことが示された。胚全体から取得できたＣＡＡの最高力価は、ＭＤＣＣ‐ＭＳＢ１細胞中においてアッセイした場合には１０5.0 〜１０6.5 ＴＣＩＤ50／ｍｌの間で変化し、これは、実験的に感染させたニワトリの肝臓抽出物から取得された力価に等しい。
【０００６】
Ｂｕｌｏｗ  ｖｏｎ  Ｖ．及びＷｉｔｔ、Ｍ．（上掲）は、ウイルスの弱毒化を必要としない親貯蔵株（ｐａｒｅｎｔ  ｓｔｏｃｋ）を投与することができる生ワクチンの製造のための手段として、孵化卵内における発病性ＣＡＡの増殖を研究した。しかしながら、ウイルスの弱毒化は、免疫原性の損失を引き起こすことがあるという理由から、それを避けなければならないことが下記の文献中に記載されている（Ｂｕｌｏｗ  ｖｏｎ、  Ｖ．及びＦｕｃｈｓ、Ｂ．、Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｍｅｄ．  ３３巻、５６８‐５７３ページ、１９８６年）。
【０００７】
Ｂｕｌｏｗ及びＦｕｃｈｓ（Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｍｅｄ．  ３３巻、５６８‐５７３ページ、１９８６年）は、ＣＡＡ株Ｃｕｘ‐１の病原性はＭＤＣＣ‐ＭＳＢ１細胞内での１２回連続の継代の後に低減することを報告しているが、これらの病原性の弱い株の免疫原性に関するデータはその文献中に何ら開示されていない。実際のところ、病原性の低減を伴う免疫能力の減少がＢｕｌｏｗ及びＦｕｃｈｓにより予想されている。
【０００８】
Ｙｕａｓａ（１９８３年、上掲）またはＧｏｒｙｏら（Ａｖｉａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １６巻、１４９‐１６３ページ、１９８７年）またはＯｔａｋｉら（Ａｖｉａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １７巻、３３３‐３４７ページ、１９８８年）のいずれもが、それぞれ、Ｇｉｆｕ‐１株の１９回の継代後、ＴＫ‐５８０３株の４０回の継代後、及び、ＣＡＡ８２‐２株の４０回の継代後のＭＤＣＣ‐ＭＳＢ１細胞における弱毒化に関する証拠を見出していない。
【０００９】
Ｖｉｅｌｉｔｚ  Ｅ．ら（Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｍｅｄ．  ３４巻、５３３‐５５７ページ、１９８７年）は、Ｃｕｘ‐１株に由来するＣＡＡ生ワクチンの評価を報告している。しかしながら、その文献中では弱毒化したＣＡＡ株を使用していない。発病性ＣＡＡを含むこのワクチンを９〜１５週令のニワトリに投与したが、接種した鳥において何ら病原性を示さなかった。ＣＡＡに起因する実験的に誘導した疾患に対する年令抵抗性は２週令までに本質的に完了するというこの公知の年令抵抗性の点で、接種される鳥自身のための生ワクチンの弱毒化のレベルは、この場合あまり重要でない。しかしながら、ＣＡＡ生ワクチンとの接触後の幼若なニワトリにおける病理学的兆候を予防するために、ＣＡＡ生ワクチンウイルスを大いに弱毒化するべきである。
【００１０】
ＣＡＡ生ワクチンの代替物、不活性化し、アジュバントを加えたワクチンであろう。このような不活化ワクチンを、ニワトリ中に存在する免疫性を増強するために使用することができる。しかしながら、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）においてＣＡＡウイルスを高力価にまで増殖させることが現在不可能であることによりこのアプローチを複雑なものにするという理由から、現在までに不活化ＣＡＡワクチンは報告されていない（ＭｃＮｕｌｔｙ、Ｍ．Ｓ．、Ａｖｉａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２０巻、１８７‐２０３ページ、１９９１年）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
そのため、本発明の第１の目的は、インビトロにおいて高力価にまで増殖することができるＣＡＡウイルスを提供することである。
【００１２】
更に、本発明の目的は、野生種の単離体に関して、幼若ニワトリにおいて病原性の著しい低下を示しかつその免疫原性を保持するＣＡＡウイルス株から誘導されたＣＡＡワクチンを提供することである。
【００１３】
更に、本発明の目的は、ワクチン接種後にニワトリにおける免疫反応を引き起こすために十分高い量のＣＡＡ抗原を含む不活化ＣＡＡワクチンを提供することである。
【００１４】
更に、本発明の目的は、ＣＡＡウイルス株の弱毒化のための一般的な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、新しいＣＡＡウイルス、すなわち、ニワトリ胚において病変を誘発することができるＣＡＡウイルスに関する。ＣＡＡに起因する病変は、死亡、青白い胚、及び、出血、特に頭部の出血、を含む。これらの種類のＣＡＡウイルスは、様々な有利な特性を示す。本発明のＣＡＡウイルスの好ましい特性のうちの一つは、詳細を下記に述べてあるように、それらがインビトロにおいて高力価にまで増殖することができるということである。
【００１６】
当該ＣＡＡウイルスの更に別の利点は、これらのウイルスは、ニワトリ胚に対してより強い発病性を示すものの、ＣＡＡ野生型ウイルスと比較した場合１日令のヒナに対しては低減された病原性を有し、かつ、それらの免疫原性特性を保持しているということである。
【００１７】
本発明はパスツール研究所のＣＮＣＭに寄託してあるＩ‐１１４１株のＣＡＡウイルスに関する（１９回目の継代レベル）。これらのウイルスを少なくとも１０8.4 ＴＣＩＤ50／ｍｌの力価にまで孵化卵内で培養することができ、更に、これらは親の野生型株よりも１日令のヒナに対してより低い病原性を示しかつ親株同様の免疫原性を示す。
【００１８】
新しい種類のＣＡＡを、以下及び実施例において記載するように、孵化卵内において入手できる任意のＣＡＡウイルスを継代することにより取得することができる。
【００１９】
ＣＡＡに対する家禽類の保護のための新規のワクチンは、そのワクチンが、ニワトリ胚において病変を誘発することができるＣＡＡウイルスを含み、好ましくは、それらのウイルスが孵化卵内における継代の手法により取得されるという特徴を有する。
【００２０】
ニワトリ組織、例えば肝臓からの入手できるＣＡＡ株の単離後、組織ホモジネートを多段階の弱毒化過程に使用することができる。まず最初に、所望ならば、卵内への接種前に、ＭＤＣＣ‐ＭＳＢ１細胞内のような、ＣＡＡに適する組織もしくは細胞内でＣＡＡウイルスを継代及び増殖させることができる。このウイルスストックをその後、孵化卵に感染させ、更に、その後の増殖、及び孵化卵内でのウイルスの継代のために、この目的について当業者に公知の方法により使用することができる。
【００２１】
より具体的には、標準方法に従い、卵当たり少なくとも１０4.5 ＴＣＩＤ50で卵黄嚢を通して卵をＣＡＡで感染する。感染された胚を、接種後約１３日後に取り出し、ホモジナイズし、更に、例えばトリプトース２．５％（１：２０  ｖ／ｖ）で希釈する。その後、新鮮な孵化卵に、各卵継代段階において、卵当たり０．２ｍｌのホモジネートを接種した。最後の卵継代の後、ウイルスを増殖させ、その後取り出し、更に、ＣＡＡ感染に対する免疫化活性を有するワクチンに加工する。最終継代のウイルスを、孵化卵、または、ＭＤＣＣ‐ＭＳＢ１細胞のようなＣＡＡに対して感受性である細胞もしくは組織培養内で増殖させることができる。孵化卵の場合には、胚および／または膜および／または尿膜液を取り出す。
【００２２】
好ましい増殖及び弱毒化された性質を有するＣＡＡウイルスを取得するために必要な卵継代の回数は、特に、特有のＣＡＡ株、及び、弱毒化および／または所望のインビトロでの力価に依存する。
【００２３】
本発明の生ワクチンを製造するのに適する、病原性の顕著な減少を有するウイルスを結果として生じるＣＡＡウイルスの卵継代の典型的な合計回数は、１８回もしくはそれ以上の回数であり、３４回もしくはそれ以上の回数であることが好ましい。
【００２４】
特に、本発明のワクチンはインターベット（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ）ＣＡＡ株２６Ｐ４のウイルスに由来する。この株は、元々、貧血を患う野生のニワトリの肝臓から単離された。単離後、この株をＭＤＣＣ‐ＭＳＢ１細胞内で５回継代し、更にその後、孵化卵内で１９回継代した。この株のサンプルは受託番号Ｉ‐１１４１としてフランスのパスツール研究所のＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏ‐ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に寄託してある。１９回目の継代レベルのＣＡＡウイルスのみが本発明のワクチンの製造に使用できるだけでなく、この株のその後の継代レベルのウイルスも非常に適切なものである。
【００２５】
この弱毒化された株は、卵を適用させなかったこの株のウイルスに関してウイルス中和（ＶＮ）テストを用いて測定する場合、その病原性の著しい低下を示す一方、この株のウイルスの免疫原特性は何の影響も受けない。
【００２６】
上述の方法に従って取得することができる新規のＣＡＡ生ウイルスは、いくつかの他と異なる特性を有しており、特に、
‐これまでに開示されている全てのＣＡＡ株に対立するものとして、そのＣＡＡウイルスは胚中において致死的または病理学的作用を含む、ＣＡＡに特異的な病変を誘導する。（Ｙｕａｓａ、Ｎ．ら、１９７９年、上掲；Ｙｕａｓａ、Ｎ．及びＹｏｓｈｉｄａ、Ｉ．、１９８３年、上掲；Ｂｕｌｏｗ  ｖｏｎ、Ｖ．及びＷｉｔｔ、Ｍ．、１９８６年、上掲）。他の好ましい特性は、
‐このＣＡＡウイルスは弱毒化され、つまり、１日令のＳＰＦニワトリに投与する場合、野外から単離したＣＡＡに関して顕著に低い病原的兆候を誘発するにすぎない、
‐このＣＡＡウイルスは、孵化卵中において高力価にまで増殖するのに適合している。
【００２７】
生の弱毒化されたＣＡＡを含む本発明のワクチンを、それ自体公知の方法で懸濁液の形態もしくは凍結乾燥物として製造し、かつ、市販することができる。
【００２８】
生ワクチンについて、ヒナ当たりの用量割合は弱毒化ウイルスの１０1.0 〜１０7.0 ＴＣＩＤ50の範囲であることができる。
【００２９】
特に、乾燥組成物を凍結乾燥により製造する場合には、安定剤を添加すると都合がよい。適切な安定剤は、例えば、ＳＰＧＡ（Ｂｏｖａｒｎｉｋら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ５９巻、５０９ページ、１９５０年）、炭水化物（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、ショ糖、デキストランもしくはグルコース）、蛋白質類（例えば、アルブミンもしくはカゼイン）、あるいは、それらの分解産物、及び、バッファー（例えば、リン酸アルカリ金属塩）である。所望ならば、アジュバント活性を有する１種類もしくはそれ以上の化合物を添加することができる。この目的に適する化合物は、例えば、ビタミンＥアセテートのｏ／ｗ（油中水型）乳化液、水酸化アルミニウム、リン酸塩もしくは酸化物、鉱物油（例えば、Ｂａｙｏｌ  Ｆ（登録商標）、Ｍａｒｃｏｌ  ５２（登録商標））及びサポニン類である。
【００３０】
本発明の他の重要な態様は、この病原体により引き起こされるニワトリにおける疾患の予防のための、不活性化したＣＡＡワクチンの使用である。現在までに、接種されるニワトリにおいて免疫反応を誘導する不活性化ＣＡＡワクチンは製造されていない。
【００３１】
最初に本発明は、ＣＡＡウイルスの有効量を含む不活性化ＣＡＡワクチンを提供するが、このワクチンは、ワクチン接種後ニワトリ内でＣＡＡウイルス中和抗体の産生を誘起することができる。
【００３２】
特に不活性化ワクチンは、本発明の新しい種類のＣＡＡウイルスから誘導される。
【００３３】
本発明の好ましい不活性化ＣＡＡワクチンは、上述したように、連続した継代により孵化卵内において弱毒化された不活性化ＣＡＡの１種類もしくはそれ以上の単離物を含む。所望ならば、卵を適応させたＣＡＡを、不活性化過程の前に、ＭＤＣＣ‐ＭＳＢ１細胞のような感受性の細胞もしくは組織培養内において増殖させることができる。
【００３４】
ＭＤＣＣ‐ＭＳＢ１細胞上でアッセイする場合、この不活性化ワクチンが、用量当たり約１０7.5 ＴＣＩＤ50を上回る、好ましくは用量当たり約１０8.0 ＴＣＩＤ50を上回る、更に、より好ましくは用量当たり約１０9.0 ＴＣＩＤ50を上回る、前不活性化ウイルス力価を有するＣＡＡを含むことが好ましい。
【００３５】
不活性化ＣＡＡ液を、アミコン濃縮器のような有効な技術、ポリエチレングリコールを用いるような沈殿技術、超遠心の方法による濃縮、あるいは、アジュバント濃縮技術のうち任意の数の技術を用いて濃縮することができる。
【００３６】
ＣＡＡウイルスの不活性化の目的は、ウイルスの再生をなくすことである。一般的には、これを化学的もしくは物理学的方法により行うことができる。化学的不活性化は、ウイルスを、例えば、酵素、フォルムアルデヒド、β‐プロピオラクトン、エチレンイミンもしくはそれらの誘導体で処理することにより実施することができる。必要ならば、この不活性化用化合物をその後中和するが、例えば、フォルムアルデヒドで不活性化された材料をチオ硫酸で中和することができる。物理学的不活性化は、好ましくは、紫外線、Ｘ線照射もしくはγ線照射のような高エネルギー照射にウイルスを供することにより実施することができる。所望ならば、ｐＨを処理後に約７の値に戻すことができる。
【００３７】
通常は、１種類のアジュバント（例えば上述したようなもの）、及び、所望ならば、さらに、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）及びＳｐａｎ（登録商標）のような１種類以上の乳化剤を不活性化した材料に添加する。
【００３８】
本発明のワクチンを、ウイルス材料の有効用量、すなわち、ＣＡＡに対するニワトリ内の免疫反応を誘導するウイルス材料の量で投与する。
【００３９】
本発明のワクチンを、任意の年令において、噴霧、点眼、点鼻、経口的（例えば、飲料水）、あるいは、筋肉内もしくは非経口的な注射により投与することができる。
【００４０】
生であれ不活性化物であれ、本発明のワクチンを、この病原体での感染に冒されているニワトリから入手できるもしくは取得できる任意のＣＡＡ株から製造することができる。多数のＣＡＡ単離物が従来の技術において既に記載されており、それらは例えば、Ｃｕｘ‐１株（Ｂｕｌｏｗ  ｖｏｎ、Ｖ．ら、Ｊ．  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３０巻、７４２‐７５０ページ、１９８３年）、Ｇｉｆｕ‐１株（Ｙｕａｓａ、Ｎ．ら、１９７９年、上掲）、ＴＫ‐５８０３株（Ｇｏｒｙｏ、Ｍ．ら、１９８７年、上掲）及びＣＡＡ８２‐２株（Ｏｔａｋｉら、１９８８年、上掲）である。
【００４１】
生であれ不活性化物であれ、本発明のワクチンは、受託番号Ｉ‐１１４１としてＣＮＣＭに寄託してあるインターベットＣＡＡ株２６Ｐ４のウイルスから誘導される。
【００４２】
本発明のワクチン、好ましくは不活性化したＣＡＡを含むワクチンは、ＣＡＡ成分と１種類もしくはそれ以上の無関係な鳥類ウイルスとの組合せ物を含むことができ、その鳥類ウイルスは、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、伝染性粘液嚢疾患ウイルス（ＩＢＤＶ）、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）、七面鳥のヘルペルウイルス（ＨＶＴ）、伝染性喉頭気管炎、もしくは他の鳥類のヘルペスウイルス、レオウイルス、エッグドロップ（Ｅｇｇ  Ｄｒｏｐ）症候群ウイルス、鳥類の脳脊髄膜炎ウイルス、細網内膜症ウイルス、白血症（Ｌｅｕｃｏｓｉｓ）ウイルス、伝染性上皮腫ウイルス、七面鳥の鼻気管支炎ウイルス（ＴＲＴＶ）、もしくはアデノウイルスである。
【００４３】
本発明の他の重要な態様は、ＣＡＡウイルス生成物のための新しい生産系である。得られたウイルス生成物を、家禽類におけるＣＡＡ感染の撲滅のためのワクチン組成物を処方するために使用することができる。本発明の完成以前は、インビトロの増殖から取得できる最高力価は約１０6.0 〜１０7.0 ＴＣＤＩ50／ｍｌの範囲であった。手頃な値段で、本生産系によるＣＡＡ抗原を充分なレベル取得することが不可能であったことを、従来の技術においてはまだ克服できなかった。更に、ＣＡＡウイルスを高力価にまで増殖させることが現在不可能であることが、高濃度の抗原を必要とする不活性化ＣＡＡワクチンの製造を妨げてきた。
【００４４】
本発明のＣＡＡウイルス生成物の製造方法は、ニワトリ胚において病変を誘発することができるＣＡＡウイルス、特に孵化卵内で弱毒化されたＣＡＡウイルスを感受性の基体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）接種し、ＣＡＡを増殖させ、更に、ＣＡＡを含有する物質を取り出す段階を含む。
【００４５】
これらのＣＡＡウイルスが増殖する基体はＳＰＦ孵化卵であることが好ましい。孵化卵に、例えば、卵当たり少なくとも１０4.5 ＴＣＩＤ50を含むＣＡＡ含有懸濁液もしくはホモジネート０．２ｍｌを接種することができる。卵に約１０6.0 ＴＣＩＤ50で接種し、更にその後、１００°Ｆで１３日間インキュベートすることが好ましい。１３日後、ＣＡＡウイルス生成物を、胚および／または膜および／または尿膜液を採取することにより取り出すことができ、更にこの物質を適切にホモジナイズする。このホモジネートを、その後１０分間、２５００ｇで遠心することができ、その後上清をフィルター（１００μｍ）を通して濾過する。
【００４６】
あるいは、上述のＣＡＡウイルスを、例えばＭＤＣＣ‐ＭＳＢ１細胞のような、感受性の細胞培養上へ接種することができ、その後、その細胞を培養し、更に、増殖したウイルスを回収する。
【００４７】
ＭＤＣＣ‐ＭＳＢ１細胞内においてアッセイする場合、少なくとも約１０8.0 ＴＣＩＤ50／ｍｌの、通常は少なくとも約１０8.4 ＴＣＩＤ50／ｍｌの手取可能なウイルス力価を、接種後１０から１８日後、好ましくは接種後１３日後に取得することができる。取り出した液体を、最終生成物をそのまま充填および／または塊状に凍結するかあるいは凍結乾燥する前に、前述したウイルス安定剤と配合することができる。
【００４８】
あるいは、取り出した液体を不活性化することができる。ＣＡＡ液を、二成分エチレンイミン、アセチルエチレンイミンのような不活性化用試薬の数々のもので不活性化することができるが、その試薬はこれらに限定されることはなく、０．１から０．５％の濃度のβ‐プロピオラクトンが好んで用いられる。この不活性化用試薬を、ホモジネートもしくはその濾液中に含まれるウイルスに添加することができる。
【００４９】
水酸化ナトリウムもしくは重炭酸ナトリウム溶液で調整しながらｐＨを酸性側に逆シフトさせて、β‐プロピオラクトンをウイルス液に添加する。配合された不活性化用試薬‐ウイルス液を、４℃から３７℃の温度でインキュベートする。１から７２時間のインキュベーション時間を用いることができる。
【００５０】
更に、本発明は、孵化卵内で弱毒化したＣＡＡ株のウイルスから製造したワクチンを投与することを含む、家禽類においてＣＡＡ感染を制御するための方法を含む。この方法は生もしくは不活性化したワクチンの投与を含む。
【実施例】
【００５１】
実施例１
孵化卵内でのＣＡＡの弱毒化
親株であるインターベット株２６Ｐ４を、貧血を患っている野生のニワトリの肝臓から単離した（ｅｘｐ．  ＶＩＭ‐ＣＡ‐８９‐４‐１５３）。単離後、その株を、卵内に接種する前にＭＤＣＣ‐ＭＳＢ１細胞内で５回継代した。卵の卵黄嚢内に、０．２ｍｌのＣＡＡ株２６Ｐ４もしくはＧｉｆｕ（Ｙｕａｓａ、Ｎ．ら、Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ２３巻、３６６‐３８５ページ、１９７９年）を接種した。１３日間の１００°Ｆでのインキュベーションの後（湿度：５５％）、胚を取り出し、更に、ホモジナイズした。このホモジネートを２５００ｇで１０分間遠心した。上清を集め、更に、１００μｍのフィルターを通して濾した。このホモジネートをトリプトース２．５％で２０倍に希釈し、更に、卵当たり０．２ｍｌを接種した。同様に処理することにより、１９回より多い回数の継代を、株２６Ｐ４に施した。この株の１９回目の卵継代の試料（ＣＡＡの種親（ｍａｓｔｅｒ  ｓｅｅｄ）１８‐０９‐１９９０；１ｍｌ／ｆｌ）を、受託番号Ｉ‐１１４１として、パスツール研究所（パリ、フランス）のＣＮＣＭに寄託した。Ｇｉｆｕ株を、孵化卵内で１４回継代することにより弱毒化した。
【００５２】
実施例２
２種類の高卵継代ＣＡＡウイルスと低卵継代ＣＡＡウイルスの孵化ニワトリ卵内における増殖特性の比較
３０から６０個のＳＰＦ卵の卵黄嚢内に、様々な卵継代レベルのウイルスを接種した。１００°Ｆでの７日間のインキュベーションの後（湿度５５％）、卵に燭光をあて、死んだ孵化卵もしくは未受精卵は廃棄した。接種後（ｐ．ｉ．）７日目から、卵を毎日燭光をあて、胚死亡率を記録した。ＣＡＡに起因する胚死の記録は、接種後１０日後、つまり１１日目に開始した。接種後１３日目に胚を取り出し、ホモジナイズし、更に、２５００ｇで１０分間遠心した。上清を集め、ＭＤＣＣ‐ＭＳＢ１細胞内でウイルス感染を測定した。
【００５３】
表１及び２は、胚病変および／または胚死を誘導することができる高卵継代ＣＡＡウイルスが、低卵継代ウイルスと比較して高い力価にまでインビトロで増殖することができることを示す。
【００５４】
【表１】
2007125039.tif 000002
【００５５】
【表２】
2007125039.tif 000003
【００５６】
胚を接種後１３日目に取り出した。３回目の卵継代の２６Ｐ４株を接種した胚は全く胚病変を示さなかった。１７回目の卵継代株を接種した胚は青白く、数個の胚（特に死んだ胚）は頭部の出血を示した。
【００５７】
実施例３
ＣＡＡ生ワクチンでの実験的ワクチン接種
ＣＡＡウイルスの弱毒化及び、孵化卵を通してのウイルスの継代による免疫原性の維持を測定するために実験を行った。
【００５８】
‐ＣＡＡ生ワクチンの病原性
実験１においては、以下に示すインターベット株の継代レベルを使用した：
＊  １回目の卵継代レベル（低卵継代レベル）
＊  １８回目の卵継代レベル（高卵継代レベル）
＊  未感染のＳＰＦ孵化卵からの胚ホモジネート（１３日間インキュベーシンしたもの）。
【００５９】
実験２においては、以下に示すインターベット株の継代レベルを使用した：
＊  ４回目の卵継代レベル（低卵継代レベル）
＊  １９回目の卵継代レベル（高卵継代レベル）
１９回目の継代レベルのＣＡＡウイルスを「種親」として貯蔵した。
【００６０】
＊  未感染のＳＰＦ孵化卵からの胚ホモジネート（１３日間インキュベーシンしたもの）。
【００６１】
０．２ｍｌの希釈したＣＡＡ株が約１０6.0 ＴＣＩＤ50を含むようにウイルスを希釈した。１日齢のＳＰＦニワトリに、筋肉内経路により、０．２ｍｌのワクチンを接種した。
【００６２】
実験３においては、以下に示すＧｉｆｕ株の継代レベルを使用した：
＊  １回目の卵継代レベル
＊  １４回目の卵継代レベル
１０７羽の１日齢のニワトリを３５〜４６羽の３つの群に分けた（上述を参照せよ）。３番目の群はワクチン接種しなかった（対照群）。ワクチン接種後１０及び１４日目に、群当たり１０羽の鳥を、ヘマトクリット値測定及び検死のため隔離室（ｉｓｏｌａｔｏｒ）から取りだした。ワクチン接種後３週間後に鳥を脱血し、更に、間接免疫蛍光法テスト（ＩＩＦＴ）によりＣＡＡ抗体について血清を調べた。ワクチン接種は、実験１及び２について記載したように行った。
【００６３】
実験１及び２においては、１５０羽の１日齢のＳＰＦニワトリを各５０羽の３つの群に分け、更に、各群を陰圧隔離室内に入れた。群当たり４０羽の鳥に、上述のウイルスの内の１種類をワクチン接種し、更に、群当たり１０羽の鳥はワクチン接種せず、接触対照として利用した。ワクチン接種後１０、１４及び２１日目に、群当たり４もしくは８羽の鳥を、ヘマトクリット値測定及び検死のため隔離室から取り出した。ワクチン接種後５週間目に鳥を脱血し、更に、ＶＮテストによりＣＡＡ抗体について調べた。
【００６４】
ウイルス滴定
９６穴マイクロプレート（組織培養グレード）を用いて、ＭＤＣＣ‐ＭＳＢ１細胞内でウイルスを滴定した。ウイルスの連続した１０倍希釈液を、１０％のウシ胎児血清及び抗生物質を補充したＲＰＭＩ１６４０培地内で調整した。９６穴マイクロプレートの１０穴を、各ウイルス希釈液の穴当たり１００μｌで満たした。その後、１００μｌのＭＤＣＣ‐ＭＳＢ１細胞（終濃度は１ｍｌ当たり６×１０5 細胞である）を添加した。その細胞を２、３日毎に二次培養し、更に、１０回の二次培養後に終点を読み取った。感染力価をＲｅｅｄ及びＭｕｅｎｃｈ（Ｒｅｅｄ、Ｌ．Ｊ．及びＭｕｅｎｃｈ、Ｈ．、Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｙｇ．  ２７巻、４９３‐４９７ページ、１９３８年）に従い計算した。
【００６５】
血清学的テスト
ＣＡＡに対する抗体を、９６穴のマイクロプレートを使用し、ＭＤＣＣ‐ＭＳＢ１細胞及び従来の定常ウイルスを用いてＶＮテスト、改良した血清法により測定した。（Ｋｕｎｉｔｏｓｈｉ、Ｉ．、及びＹｕａｓａ、Ｎ．、Ｊｐｎ．  Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｓｃｉ．  ５２巻、８７３‐８７５ページ、１９９０年）。ＩＩＦＴは、標準的な方法に従って行った（Ｙｕａｓａ、Ｎ．ら、Ａｖｉａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １４巻、５２１‐５３０ページ、１９８５年）。
【００６６】
ヘマトクリット値
血液は、羽の血管からヘパリン処理マイクロヘマトクリット毛細管内へ採取した。ヘマトクリット値（％）は、１２，０００ｒｐｍで５分間の遠心の後読み取った。ニワトリは、２７．０％を下回るヘマトクリット値を示す場合に貧血であると見なされる（Ｙｕａｓａ、Ｎ．ら、１９７９年、上掲）。
【００６７】
実験１〜３からの、ＳＰＦニワトリ内に誘導された主な病理学的病変を、表３〜５にそれぞれ要約した。
【００６８】
【表３】
2007125039.tif 000004
【００６９】
【表４】
2007125039.tif 000005
【００７０】
【表５】
2007125039.tif 000006
【００７１】
影響を受けた鳥の総数ばかりでなく、平均Ｈｔ値の差により証明される病理学的変化の重症度においても、ＣＡＡ単離物の低卵継代ウイルスと高継代ウイルスとの間の病理学的変化に著しい差異が存在する。また、高卵継代ウイルスにより誘導される骨髄及び胸腺の病変全般は、低卵継代ウイルスにより誘導される病変に比較して重症度はより低かった。
【００７２】
‐ＣＡＡ生ワクチンの免疫原性
表５は、Ｇｉｆｕ株の免疫原性はＣＡＡウイルスの弱毒化の結果として悪影響を受けなかったことを証明している。表６は、実験１及び２の血清学の結果を示している。高継代ウイルスの病原性の低下にも拘わらず、このウイルスの免疫原性の低下は何ら認められなかった。
【００７３】
【表６】
2007125039.tif 000007
【００７４】
実施例４
配合生ワクチンでのワクチン接種
レオウイルスワクチン：市販の（インターベット  インターナショナル  Ｂ．Ｖ．、オランダ）レオ生ワクチン  Ｎｏｂｉｌｉｓ（登録商標）（バッチ  ０１６９０１）。このワクチンを製造元の推奨により希釈剤で希釈した。
【００７５】
ＣＡＡワクチン：インターベット株の１９回目の卵継代レベルのＣＡＡ生ワクチンを、１羽の鳥用量（０．２ｍｌ）が１０2.6 ＴＣＩＤ50を含むように希釈剤で希釈した。
【００７６】
４週齢のＳＰＦニワトリを、１羽の鳥用量のレオ生ワクチン、１羽用量のＣＡＡ生ワクチン、あるいは、１羽用量の配合したレオ及びＣＡＡ生ワクチン、のいずれかで筋肉内注射でワクチン接種した。接種後４及び６週目に血液試料を採取し、更に、その血清を、ＣＡＡとレオウイルスに対する抗体の存在について、ウイルス中和テストでテストした（表７）。
【００７７】
【表７】
2007125039.tif 000008
【００７８】
上の表から、配合したワクチンは生の形態で両方の種類のウイルスを含むけれども、それらの免疫原性の負の相互干渉（妨害）は観察されないことが明らかである。
【００７９】
実施例５
不活性化ＣＡＡワクチンでの実験的ワクチン接種
４週齢のＳＰＦニワトリに、油中水型の乳化剤（ｗ／ｏ）中で不活性化したＣＡＡワクチンを筋肉内注射によりワクチン接種した。そのワクチンは、インターベット株の１９回目の卵継代レベルの胚ホモジネートから調製した。そのウイルスをβ‐プロピオラクトンで、３７℃で３時間不活性化した。５０％の不活性化したＣＡＡ‐卵材料と５０％の鉱物油‐乳化液を含むｗ／ｏ乳化液を調製した。
【００８０】
感染力価に基づく、ニワトリ当たり１０7.5 ＴＣＩＤ50ウイルス抗原を含むｗ／ｏ乳化液０．５ｍｌを、筋肉内に注射した。その鳥は、ワクチン接種後８週間目に、筋肉内注射により同一の不活性化ワクチンで２回目のワクチン接種を受けた。第１及び第２ワクチン接種後の様々な時間に、血液試料を採取し、更に、その血清を、ＶＮテストでＣＡＡ‐抗体の存在についてテストした（表８）。１０7.5 ＴＣＩＤ50ウイルス抗原を含む不活性化ワクチンは接種した動物内において免疫反応を誘導することができることが証明された。
【００８１】
他のワクチン接種実験においては、ワクチンの用量が１ｍｌの油中水型乳化液中あたり１０8.0 及び１０9.0 ＴＣＩＤ50であることを除き、上述してあるものと同一の方法に従った（表９）。
【００８２】
【表８】
2007125039.tif 000009
【００８３】
【表９】
2007125039.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成19年3月6日(2007.3.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニワトリ胚において病変を誘発することができるニワトリ貧血因子（ＣＡＡ）ウイルス。
【請求項２】
請求項１に記載のＣＡＡウイルスの微生物学的に純粋な組成物。
【請求項３】
組成物が１ｍｌ当たり少なくとも１０8.0 ＴＣＩＤ50を含むことを特徴とする、請求項２に記載の微生物学的に純粋な組成物。
【請求項４】
弱毒化した生きているＣＡＡウイルスを含む、ＣＡＡに対する家禽類の保護のためのワクチンであって、それが請求項１に記載のＣＡＡウイルスを含むことを特徴とするワクチン。
【請求項５】
ＣＡＡウイルスが孵化卵内において弱毒化されることを特徴とする、請求項４に記載のワクチン。
【請求項６】
ＣＡＡに対する家禽類の保護のためのワクチンであって、それが不活性化したＣＡＡウイルスの有効量を含み、そのワクチンはワクチン接種後にニワトリ内においてＣＡＡウイルス中和抗体の産生を誘導することができることを特徴とするワクチン。
【請求項７】
ＣＡＡウイルスの前不活性化量が用量当たり少なくとも約１０7.5 ＴＣＩＤ50であることを特徴とする、請求項６に記載のワクチン。
【請求項８】
前不活性化量が用量当たり少なくとも約１０8.0 ＴＣＩＤ50であり、好ましくは少なくとも約１０9.0 ＴＣＩＤ50であるという特徴を有する、請求項７に記載のワクチン。
【請求項９】
ワクチンが請求項１に記載のＣＡＡウイルスを含むことを特徴とする、請求項４〜８のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１０】
ワクチンが更にアジュバントを含むことを特徴とする、請求項６〜９のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１１】
ワクチンが更に１種類またはそれ以上の無関係の鳥類の病原体の抗原を含むことを特徴とする、請求項４または６に記載のワクチン。
【請求項１２】
ＣＡＡウイルス生成物の製造方法であって、
ａ）感受性基体に請求項１に記載のＣＡＡウイルスを接種し、
ｂ）ＣＡＡウイルスを増殖させ、および、
ｃ）ＣＡＡウイルスを含有する物質を取り出す
段階を含む方法。
【請求項１３】
基体が孵化卵であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。