(57)【要約】【課題】本発明は、Ｃａ２＋チャネルであるＴＲＰＶ２特異的なアッセイ方法およびＴＲＰＶ２特異的な薬剤のスクリーニング方法を提供することを課題とする。【解決手段】ＴＲＰＶ２を特異的に発現しうる細胞株を用い、以下の手順を含む方法による。１）ＴＲＰＶ２発現用細胞を培養する；２）ＴＲＰＶ２発現用細胞に、カルシウム指示薬を添加する；３）さらに、２−ＡＰＢ(2-aminoethoxydiphenyl borate)をｐＨ５．０〜６．５になるように添加する；４）反応産物（Ｃａ２＋）を計測する。【選択図】図１
2007259745.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の手順を含むＴＲＰＶ２特異的アッセイ方法：
１）ＴＲＰＶ２発現用細胞を培養する；
２）ＴＲＰＶ２発現用細胞にカルシウム指示薬を添加し、細胞内にカルシウム指示薬を負荷する；
３）さらに、２−ＡＰＢ(2-aminoethoxydiphenyl borate)をｐＨ５．０〜６．５条件下で添加する；
４）カルシウム指示薬の反応産物を測定する。
【請求項２】
ＴＲＰＶ２発現用細胞が、以下のａ）〜ｄ）のいずれかに示すＤＮＡを組込んだ形質転換細胞である、請求項１に記載のアッセイ方法：
ａ）ＴＲＰＶ２をコードするＤＮＡ；
ｂ）配列番号１で特定される塩基配列のうち、少なくとも第368-2662位に示される塩基配列を含むＤＮＡ；
ｃ）配列番号２で特定される塩基配列のうち、少なくとも第455-2725位に示される塩基配列を含むＤＮＡ；
ｄ）上記ｂ）またはｃ）で特定されるＤＮＡのうち、１〜複数個のヌクレオチドが置換し、欠失し、挿入し、および／または付加されてなるＤＮＡ。
【請求項３】
ＴＲＰＶ２発現用細胞が、ＨＥＫ（ヒト胎児腎臓）細胞株由来である、請求項１または２に記載のアッセイ方法。
【請求項４】
ＴＲＰＶ２発現用細胞が、受領番号FERM AP-20836または受領番号FERM AP-20837で特定される細胞である請求項１〜３のいずれか１に記載のアッセイ方法。
【請求項５】
カルシウム指示薬が、蛍光カルシウム指示薬である請求項１〜４のいずれか１に記載のアッセイ方法。
【請求項６】
ＴＲＰＶ２発現用細胞と被検化合物を接触させ、請求項１〜５のいずれか１に記載のアッセイ方法により反応産物を測定することによる、ＴＲＰＶ２特異的薬剤のスクリーニング方法。
【請求項７】
ＴＲＰＶ２特異的薬剤が、ＴＲＰＶ２阻害剤若しくは活性増強剤である請求項６に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
以下のａ）〜ｄ）のいずれかに示すＤＮＡを組込んでなるＴＲＰＶ２発現用細胞：
ａ）ＴＲＰＶ２をコードするＤＮＡ；
ｂ）配列番号１で特定される塩基配列のうち、少なくとも第368-2662位に示される塩基配列を含むＤＮＡ；
ｃ）配列番号２で特定される塩基配列のうち、少なくとも第455-2725位に示される塩基配列を含むＤＮＡ；
ｄ）上記ｂ）またはｃ）で特定されるＤＮＡのうち、１〜複数個のヌクレオチドが置換し、欠失し、挿入し、および／または付加されてなるＤＮＡ。
【請求項９】
ＴＲＰＶ２発現用細胞が、ＨＥＫ（ヒト胎児腎臓）細胞株由来である、請求項８に記載のＴＲＰＶ２発現用細胞。
【請求項１０】
受領番号FERM AP-20836または受領番号FERM AP-20837で特定されるＴＲＰＶ２発現用細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃａ２＋チャネルであるＴＲＰＶ２(transient receptor potential cation channel, subfamily V, member 2)特異的なアッセイ方法およびＴＲＰＶ２特異的薬剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Trp (transient receptor potential)遺伝子産物スーパーファミリーは、ＴＲＰＣ（７種）、ＴＲＰＶ（５種）、ＴＲＰＭ（８種）の３ファミリーに分類され、いずれも形質膜を６回貫通するイオンチャネルであり、主としてＣａ２＋を通過させる。細胞膜に存在する多くのイオンチャネルはそれぞれに異なったチャネル特性を有し、これらに特異的に反応する薬物をスクリーニングするためには、それらに適合したアッセイ系を構築する必要がある。これらは、細胞応答が比較的限定されるＧタンパク質共役型受容体（ＧＣＰＲ）とは大きく異なる点である。
【０００３】
ＴＲＰＶ２およびそのアゴニストの２−ＡＰＢの存在は公知であり、Ｃａ２＋チャネルの電気生理学的な性質を利用したＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＶ３の測定系について報告がある（非特許文献１）。ＴＲＰＶ２は、ストレッチ活性化Ｃａ２＋チャネルであり、正常組織では細胞内膜系に存在するが、筋変性疾患に伴って細胞膜に移行し、活性化される性質がある。ＴＲＰＶ２阻害剤は筋変性疾患を治療する有力な医薬品となる可能性がある。ＴＲＰＶ２の機能については未解明な部分が多く、ＴＲＰＶ２に関連する疾患については今後の解明が期待される。またＴＲＰＶ２の機能の解明とともに、ＴＲＰＶ２阻害剤や活性化剤のようなＴＲＰＶ２特異的な薬剤の開発により、ＴＲＰＶ２に関連する疾患の治療、予防薬の開発も期待される。そのような薬剤をスクリーニングするためには、ハイスループットなスクリーニング系が望まれるが、上記のような電気生理学的な性質を利用した測定手法は煩雑であるため、大量の検体を処理することは困難である。
【非特許文献１】J. Biological Chemistry, vol.279, No.34, 35741-35748 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、Ｃａ２＋チャネルであるＴＲＰＶ２特異的なアッセイ方法およびＴＲＰＶ２特異的な薬剤のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究を重ねた結果、ＴＲＰＶ２を特異的かつ安定的に発現しうる細胞株の樹立に成功し、さらに細胞内のＣａ２＋を感度良く測定しうるアッセイ条件を見出し、本発明のアッセイ方法並びにスクリーニング方法を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．以下の手順を含むＴＲＰＶ２特異的アッセイ方法：
１）ＴＲＰＶ２発現用細胞を培養する；
２）ＴＲＰＶ２発現用細胞にカルシウム指示薬を添加し、細胞内にカルシウム指示薬を負荷する；
３）さらに、２−ＡＰＢ(2-aminoethoxydiphenyl borate)をｐＨ５．０〜６．５条件下で添加する；
４）カルシウム指示薬の反応産物を測定する。
２．ＴＲＰＶ２発現用細胞が、以下のａ）〜ｄ）のいずれかに示すＤＮＡを組込んだ形質転換細胞である、前項１に記載のアッセイ方法：
ａ）ＴＲＰＶ２をコードするＤＮＡ；
ｂ）配列番号１で特定される塩基配列のうち、少なくとも第368-2662位に示される塩基配列を含むＤＮＡ；
ｃ）配列番号２で特定される塩基配列のうち、少なくとも第455-2725位に示される塩基配列を含むＤＮＡ；
ｄ）上記ｂ）またはｃ）で特定されるＤＮＡのうち、１〜複数個のヌクレオチドが置換し、欠失し、挿入し、および／または付加されてなるＤＮＡ。
３．ＴＲＰＶ２発現用細胞が、ＨＥＫ（ヒト胎児腎臓）細胞株由来である、前項１または２に記載のアッセイ方法。
４．ＴＲＰＶ２発現用細胞が、受領番号FERM AP-20836または受領番号FERM AP-20837で特定される細胞である前項１〜３のいずれか１に記載のアッセイ方法。
５．カルシウム指示薬が、蛍光カルシウム指示薬である前項１〜４のいずれか１に記載のアッセイ方法。
６．ＴＲＰＶ２発現用細胞と被検化合物を接触させ、前項１〜５のいずれか１に記載のアッセイ方法により反応産物を測定することによる、ＴＲＰＶ２特異的薬剤のスクリーニング方法。
７．ＴＲＰＶ２特異的薬剤が、ＴＲＰＶ２阻害剤若しくは活性増強剤である前項６に記載のスクリーニング方法。
８．以下のａ）〜ｄ）のいずれかに示すＤＮＡを組込んでなるＴＲＰＶ２発現用細胞：
ａ）ＴＲＰＶ２をコードするＤＮＡ；
ｂ）配列番号１で特定される塩基配列のうち、少なくとも第368-2662位に示される塩基配列を含むＤＮＡ；
ｃ）配列番号２で特定される塩基配列のうち、少なくとも第455-2725位に示される塩基配列を含むＤＮＡ；
ｄ）上記ｂ）またはｃ）で特定されるＤＮＡのうち、１〜複数個のヌクレオチドが置換し、欠失し、挿入し、および／または付加されてなるＤＮＡ。
９．ＴＲＰＶ２発現用細胞が、ＨＥＫ（ヒト胎児腎臓）細胞株由来である、前項８に記載のＴＲＰＶ２発現用細胞。
１０．受領番号FERM AP-20836または受領番号FERM AP-20837で特定されるＴＲＰＶ２発現用細胞。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のＴＲＰＶ２特異的アッセイ方法により、ＴＲＰＶ２特異的に起こる細胞内Ｃａ２＋上昇を検査することができる。さらに、本発明のアッセイ方法において、ＴＲＰＶ２発現用細胞と被検化合物を接触させることにより、ＴＲＰＶ２特異的な薬剤をハイスループットにスクリーニングすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の「ＴＲＰＶ２特異的アッセイ方法」とは、Ｃａ２＋チャネルであるＴＲＰＶ２特異的に増減するＣａ２＋量を指標として行うアッセイ方法をいう。具体的には、ＴＲＰＶ２発現用細胞にカルシウム指示薬を添加し、反応産物（Ｃａ２＋）を測定することにより行う。本発明の「ＴＲＰＶ２特異的薬剤のスクリーニング方法」とは、ＴＲＰＶ２と相互作用を有することにより、ＴＲＰＶ２特異的なＣａ２＋量を変動せしめる薬剤のスクリーニング方法をいう。かかる薬剤として、ＴＲＰＶ２阻害剤や活性増強剤が挙げられる。かかる薬剤のスクリーニングは、上記アッセイ系に被検化合物を加えることにより行うことができる。
【０００９】
１．ＴＲＰＶ２発現用細胞の構築
本発明のアッセイ方法における「ＴＲＰＶ２発現用細胞」とは、ＴＲＰＶ２を安定的に発現しうる細胞であればよく、特に限定されない。具体的には、ＴＲＰＶ２を発現しうる遺伝子を人為的に組込んだ形質転換体とすることができる。このような形質転換体、つまりＴＲＰＶ２発現用細胞は、次のようにして得ることができる。
【００１０】
（１）発現用細胞を調製するための組込用ＤＮＡの調製
本発明において組込用ＤＮＡとは、ＴＲＰＶ２を発現しうるＤＮＡであればよく、特に限定されないが、例えばＴＲＰＶ２をコードするＤＮＡが挙げられる。組込用ＤＮＡを得るために、ＴＲＰＶ２をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡに特異的に設計したプライマーセットを用いて、例えばポリメラーゼチェーンリアクション法（以下、「ＰＣＲ法」という。）など、自体公知の核酸増幅方法を用いることができる。組込用ＤＮＡにはＤＮＡ若しくはｃＤＮＡも含まれる。
【００１１】
組込用ＤＮＡとして、ヒト型ＴＲＰＶ２としてGenbank accession No.NM_016113（配列番号１）、およびマウス型ＴＲＰＶ２としてGenbank accession No.NM_011706（配列番号２）で特定される塩基配列のヌクレオチドを鋳型としてｃＤＮＡを調製することができる。組込用ｃＤＮＡは、配列表の配列番号１または２で特定されるヌクレオチドのうち、少なくともタンパク質をコードしているＤＮＡ（以下「ＣＤＳ」という。）を含むものであればよい。ＴＲＰＶ２を発現しうるのであれば、上記で特定されるＤＮＡから１〜複数個のヌクレオチドが、置換し、欠失し、挿入し、および／または付加されているＤＮＡであってもよい。
【００１２】
ヒト型ＴＲＰＶ２をコードするＤＮＡは、配列表の配列番号１で特定される第1-2797位の塩基配列の開示があるが、ＣＤＳは配列番号１で特定される塩基配列のうち第368-2662位である。組込用ｃＤＮＡとして、ヒト型ＴＲＰＶ２のＣＤＳが含まれるのであれば、ＣＤＳの前後に位置するヌクレオチドは含まれていてもよいし、含まれていなくてもよい。
また、同様にマウス型ＴＲＰＶ２をコードするＤＮＡは、配列表の配列番号２で特定される第1-2824位の塩基配列の開示があるが、ＣＤＳは配列番号２で特定される塩基配列のうち第455-2725位である。組込用ｃＤＮＡとして、マウス型ＴＲＰＶ２のＣＤＳが含まれるのであれば、ＣＤＳの前後に位置するヌクレオチドは含まれていてもよいし、含まれていなくてもよい。
【００１３】
１〜複数個のヌクレオチドが、置換し、欠失し、挿入し、および／または付加されている組込用ＤＮＡは、自体公知の方法により調製することができる。１〜複数個とは、１〜１０個、好ましくは１〜６個、より好ましくは１〜３個を意味する。
１〜複数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加といった改変させた組込用ＤＮＡも、自体公知の方法により調製することができる。例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはＰＣＲを単独または適宜組み合わせて、例えばMolecular Cloning;A Laboratory Manual、２版、Sambrookら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、1989年；［ラボマニュアル遺伝子工学］、村松正實編、丸善株式会社、1988年；［ＰＣＲテクノロジー、ＤＮＡ増幅の原理と応用］、Ehrlich,HE.編、ストックトンプレス、1989年等に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、例えばＵｌｍｅｒの技術（Science(1983)219:666）を利用することができる。
【００１４】
（２）発現ベクターの作製
上記組込用ＤＮＡをベクターに導入して、発現ベクターを作製する。ＴＲＰＶ２の発現ベクターは、ＴＲＰＶ２を発現可能であれば特に限定されるものではなく、使用する宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。宿主細胞が真核細胞の場合には、プロモーター、シグナル配列、リボソーム結合部位、転写終結配列（ターミネーター）が配置されているものを用いる。ベクターへの組込用ＤＮＡの導入は、通常の方法により行うことができる。例えば、プラスミドベクターの場合は宿主細胞内で自律的に複製可能なように自己複製配列 (autonomic replicative sequence:ＡＲＳ)を導入してもよい。インテグレーションベクターの場合は宿主細胞の染色体に組込まれ、宿主細胞の増殖と共に増殖するので、ＡＲＳを導入する必要がない。
【００１５】
ＴＲＰＶ２発現ベクターとして、例えばサイトメガロウイルスプロモーターを有するpIRESpuro (CLONTEC社）やpEGFP-N1(CLONTEC社)等を使用することができる。発現ベクターへの組込用ＤＮＡの導入は、通常の方法により行うことができる。例えば、HindIII およびEcoRI等の制限酵素で消化切断したトランスファーベクターに組込むことができる。
【００１６】
（３）ＴＲＰＶ２発現用細胞（形質変換体）の構築
ＴＲＰＶ２発現用細胞として利用可能な宿主細胞は、ＴＲＰＶ２を発現しうる細胞であればよく特に限定されるものではないが、公知の培養細胞、例えば哺乳動物系細胞であるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、またはアフリカミドリザル腎臓（ＣＯＳ）細胞、あるいは昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）などを挙げることができる。特にＨＥＫ細胞が好適であり、さらにはＨＥＫ２９３細胞が好適に使用される。
【００１７】
形質変換体の取得は、通常の方法により行うことができる。上記の発現ベクターを、宿主細胞にエレクトロポレーション法や化学的方法、例えばリポフェクタミン試薬などのトランスフェクション試薬を用いる方法でトランスフェクションし、形質変換体を得ることができる。
【００１８】
（４）ＴＲＰＶ２発現用細胞の培養
ＴＲＰＶ２発現用細胞は、常法に従って培養することができる。培養液は、宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択することができる。例えばＣＨＯ細胞の場合は、ＨａｍＦ１２培地に加熱不活化処理した牛胎仔血清（以下「不活化ＦＢＳ」という。）等を添加した培養液を用い、あるいはＨＥＫ２９３細胞の場合には、ＤＭＥＭ培地にグルコース、不活化ＦＢＳ等を添加したものを培養液として使用することができる。さらに必要に応じて、ペニシリン、ゲンタマイシンやストレプトマイシンなどの抗生物質を常法に応じて添加してもよい。
【００１９】
（５）ＴＲＰＶ２発現の確認
発現して得られたタンパク質が、ＴＲＰＶ２であるかどうかを確認することが必要である。確認は、自体公知の方法により行うことができ、例えばウエスタンブロッティングや細胞の抗体染色などにより行うことができる。
具体的には、次の手法により行うことができる。上記培養したＴＲＰＶ２発現用細胞を採取し、細胞を界面活性剤ＳＤＳで可溶化したものをＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開させた後、特異的抗体を用いたウエスタンブロッティングにより確認することができる。細胞へのＴＲＰＶ２の発現の確認は、標識抗ＴＲＰＶ２抗体を用いたイムノヒストケミストリー法により行うことができる。
【００２０】
２．ＴＲＰＶ２特異的アッセイ方法
本発明のＴＲＰＶ２特異的アッセイは、ＴＲＰＶ２発現細胞中の細胞内カルシウム量を指標として行うことができる。
【００２１】
細胞内カルシウム量は、自体公知の方法、例えばカルシウム指示薬を用いた蛍光強度法により測定することができる。
カルシウム指示薬として、Ｃａ２＋との結合により励起スペクトル（吸収スペクトル）に変化が起こり、蛍光スペクトルが移動する性質を利用して測定するFura-2、Indo-1等が例示される。このスペクトル変化を利用して、励起スペクトルに変化がある際には２つの波長で交互に励起することで、また蛍光スペクトルに変化がある場合は２つの蛍光波長で観察する。蛍光強度が増加する波長と減少する波長の蛍光強度の比をとると、色素の量や細胞の厚さなど考慮せずに、細胞内カルシウム濃度を測定することができる。
【００２２】
具体的には、細胞培養用プレート、例えば９６穴のマイクロプレートにＴＲＰＶ２発現細胞を播種し、該細胞がコンフルエントな状態になるまで３７±１℃で培養したものに、上述のカルシウム指示薬を適当な濃度で添加し、一定時間、例えば１０〜６０分間、好ましくは２０〜４０分間、さらに好ましくは約３０分間、３７±１℃で反応させる。反応時間は、使用する細胞数およびカルシウム指示薬の濃度により適宜選択することができる。
【００２３】
Ｃａ２＋量の検出感度を上昇させるために、細胞をＢＳＳ(Balanced Salt solution)のような緩衝液を用いて洗浄し、該洗浄した細胞に最終ｐＨ５．０〜６．５、好ましくはｐＨ６．３となるようにｐＨ調整したＴＲＰＶ２アゴニスト（２−ＡＰＢ(2-aminoethoxydiphenyl borate)）含有溶液を添加し、一定時間３７±１℃で反応させる。反応時間は、１〜１０分間、好ましくは１〜５分間、さらに好ましくは約１分間とすることができ、反応時間は使用するＴＲＰＶ２アゴニストの濃度などにより適宜選択することができる。
【００２４】
測定は、上記の蛍光強度法による場合は蛍光強度を測定しうる機器であればよく、一般的なもの、例えばマイクロプレートリーダーを使用することができる。
【００２５】
３．ＴＲＰＶ２特異的薬剤のスクリーニング方法
本発明においてＴＲＰＶ２特異的薬剤とは、ＴＲＰＶ２と相互作用を有し、ＴＲＰＶ２特異的なＣａ２＋量を変動せしめる薬剤をいい、ＴＲＰＶ２阻害剤や活性増強剤が挙げられる。
【００２６】
上述した本発明のアッセイ方法において、候補化合物（被検化合物）をＴＲＰＶ２発現用細胞と接触させることで、カルシウム指示薬の反応（この場合細胞内Ｃａ２＋量上昇）を測定し、候補化合物が存在しない場合とを比較することにより、スクリーニングすることができる。本発明のアッセイ方法により、例えば９６穴のマイクロプレートにＴＲＰＶ２発現用細胞を培養させ、各ウェルごとに異なる候補化合物を添加したものについて、必要な操作後、マイクロプレートリーダーによりＣａ２＋量を測定することができるため、ハイスループットなスクリーニング系を構築することができる。
【００２７】
本発明は、上記アッセイ方法に使用するＴＲＰＶ２発現用細胞にも及ぶ。具体的には、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 茨城県つくば市東1-1-1 中央第6）に寄託した細胞である（受領番号FERM AP-20836およびFERM AP-20837）。
【００２８】
Ｃａ２＋チャネルであるＴＲＰＶ２は、正常組織では細胞内膜系に存在するが、生体内に異常が生じた場合、例えば筋ジストロフィーや拡張型心筋症などの場合の筋変性疾患に伴って、ＴＲＰＶ２が細胞膜に移行し、活性化される性質がある。本発明のＴＲＰＶ２検出方法は、ＴＲＰＶ２に起因する未知の疾患を解明するためのアッセイ方法として活用することができる。さらに、本発明のスクリーニング方法は、これらの疾患を治療および／または予防するための医薬品開発に利用することができる。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明の理解を深めるために実施例により本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではないことはいうまでもない。
【００３０】
（実施例１）ＴＲＰＶ２発現用細胞１（ヒト型）
（１）組込用ｃＤＮＡの調製
本実施例において、ヒト型ＴＲＰＶ２をコードする遺伝子は、Genbank accession No. NM_016113（配列番号１）に示される。ヒト型ＴＲＰＶ２を発現させるために、ＣＤＳ部分（第368-2662位）を増幅するプライマーを設計した。具体的には、配列表の配列番号３および４に示すプライマーをプライマーセットとした。フォワードプライマー（配列番号３）にはHindIIIの認識部位（aagctt）、リバースプライマー（配列番号４）にはEcoRIの認識部位（gaattc）が含まれている。
【００３１】
・ヒト型ＴＲＰＶ２増幅用プライマー配列
フォワードプライマー：5'-aataagcttatgacctcaccctccagctctcc-3'  （配列番号３）
リバースプライマー  ：5'-aattgaattccgttggactggaggagctg-3'  （配列番号４）
【００３２】
ＰＣＲ操作は、上記プライマーをそれぞれ０．４μＭ、ｄＮＴＰを０．２ｍＭおよびExTaq (TAKARA)を２．５Ｕ用いて行った。ＰＣＲ反応は、９６℃で２分熱処理したのち、９６℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で２分を２５回繰り返し、７２℃で７分の延長サイクルを１回行い、組込用ｃＤＮＡを調製した。
【００３３】
（２）発現ベクターの作製
上記調製した組込用ｃＤＮＡを、あらかじめHindIII およびEcoRIで消化切断したサイトメガロウイルスプロモーターを有するpEGFP-N1(CLONTEC社)トランスファーベクターに組込み、発現ベクターpEGFP-N1 TRPV2を作製した。
【００３４】
（３）ＴＲＰＶ２発現用細胞の構築
トランスフェクション試薬（LipofectAMINE 2000; GIBCO BRL社製）を用い、添付文書の手法に従って、上記（２）で作製した発現ベクターpEGFP-N1 TRPV2をＣＨＯ細胞に導入し、ＴＲＰＶ２発現用細胞を作製した。上記ＴＲＰＶ２発現用細胞について、ＨａｍＦ１２培地に不活化ＦＢＳを５％（ｖ／ｖ）およびＧ４１８（ゲンタマイシンB1に類似した構造）を１ｍｇ／ｍｌ添加した培養液を用いて３７℃で７日間培養した。出現したコロニーを個別に取得し、ＴＲＰＶ２の発現を確認した。ＴＲＰＶ２の発現は抗体染色により確認した。
【００３５】
上記により得られたＴＲＰＶ２発現用細胞は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 茨城県つくば市東1-1-1 中央第6）に寄託した（受領番号FERM  AP-20836）。
【００３６】
（実施例２）ＴＲＰＶ発現用細胞２（マウス型）
（１）組込用ｃＤＮＡの調製
本実施例において、マウス型ＴＲＰＶ２をコードする遺伝子は、Genbank accession No. NM_011706（配列番号２）に示される。マウス型ＴＲＰＶ２を発現させるために、ＣＤＳ部分（第455-2725位）を増幅するプライマーを設計した。具体的には、配列表の配列番号５および６に示すプライマーをプライマーセットとした。フォワードプライマー（配列番号５）にはNotIの認識部位（gcggccgc）、リバースプライマー（配列番号６）にはEcoRIのの認識部位（gaattc）が含まれている。さらにリバースプライマーにはHA-tag標識に必要な配列のための塩基配列ggcgtagtctggcacgtcgtatgggta（配列番号７）を組込んでおり、HA発現の有無によってもＴＲＰＶ２の発現が確認できるようにした。
【００３７】
・マウス型ＴＲＰＶ２増幅用プライマーセット
フォワードプライマー：
aattgcggccgcatgacttcagcctccaac（配列番号５）
リバースプライマー：
aatgaattctcaggcgtagtctggcacgtcgtatgggtagtgggactggaggac（配列番号６）
【００３８】
ＰＣＲ操作は、上記プライマーをそれぞれ０．４μＭ、ｄＮＴＰを０．２ｍＭおよびExTaq (TAKARA)を２．５Ｕ用いて行った。ＰＣＲ反応は、９６℃で２分熱処理したのち、９６℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で２分を２５回繰り返し、７２℃で７分の延長サイクルを１回行い、組込用ｃＤＮＡを調製した。
【００３９】
（２）発現ベクターの作製
上記調製した組込用ｃＤＮＡを、あらかじめNotI およびEcoRIで消化切断したサイトメガロウイルスプロモーターを有するpIRESpuro(CLONTEC社)トランスファーベクターに組込み、発現ベクターpIRES TRPV2を作製した。
【００４０】
（３）ＴＲＰＶ２発現用細胞の構築
トランスフェクション試薬（LipofectAMINE 2000; GIBCO BRL社製）を用い、添付文書の手法に従って、上記（２）で作製した発現ベクターpIRES TRPV2をＨＥＫ２９３細胞株に導入し、ＴＲＰＶ２発現用細胞を構築した。上記ＴＲＰＶ２発現用細胞について、ＤＭＥＭ培地に不活化ＦＢＳを５％（ｖ／ｖ）およびピューロマイシン（Puromycin、アミノヌクレオシド系抗生物質）を１０μｇ／ｍｌ添加した培養液を用いて、３７℃で７日間培養した。出現したコロニーを個別に取得し、ＴＲＰＶ２の発現を確認した。ＴＲＰＶ２の発現は抗体染色により確認した。
【００４１】
上記により得られたＴＲＰＶ２発現用細胞は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 茨城県つくば市東1-1-1 中央第6）に寄託した（受領番号FERM  AP-20837）。
【００４２】
（実施例３）ＴＲＰＶ２特異的アッセイ方法
（１）ＴＲＰＶ２発現用細胞の培養
実施例２で構築したＴＲＰＶ２発現用細胞（発現ベクターpIRES TRPV2を導入したＨＥＫ２９３細胞株）を、ＤＭＥＭ培地に不活化ＦＢＳを５％（ｖ／ｖ）およびピューロマイシンを１０μｇ／ｍｌ添加した培養液を用いて、細胞濃度（３×１０５個／ｍｌ）の細胞浮遊液を調製した。細胞浮遊液１００μｌを、ポリ−Ｌ−リジン（０．００５％）でコートした９６穴のマイクロプレートの各ウェルに加え、３７℃で１〜２日間培養し、測定時にコンフルエントになるようにした。細胞がコンフルエントな状態になった後、９６穴のマイクロプレート中の細胞を１００μｌのＢＳＳ(Balanced Salt solution)で２回洗浄した。
【００４３】
（２）カルシウム指示薬の添加
次いで、ＢＳＳで溶解した４μＭのFura-2-AM(TM)（ドージンドー社）１００μｌを細胞に添加して３７℃で３０分間接触させ、細胞内にカルシウム指示薬を負荷した。その後、１００μｌの１ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＢＳＳで細胞を２回洗浄し、５０μｌの１ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＢＳＳを加えた。Fura-2-AMは脂溶性で容易に細胞内に取り込まれ、その後細胞内エステラーゼの作用によりアセトキシメチル部位（ＡＭ）が切断され、細胞内に濃縮されたFura-2がＣａ２＋指示薬となる。
【００４４】
１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＢＳＳの組成：ＮａＣｌ（１４６ｍＭ）、ＫＣｌ（４ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（２ｍＭ）、ＣａＣｌ２（０．５ｍＭ）、グルコース（１０ｍＭ）、ＢＳＡ（０．１％）、ＨＥＰＥＳ／Ｔｒｉｓ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）
１ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＢＳＳの組成：ＮａＣｌ（１４６ｍＭ）、ＫＣｌ（４ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（２ｍＭ）、ＣａＣｌ２（０．５ｍＭ）、グルコース（１０ｍＭ）、ＢＳＡ（０．１％）、ＨＥＰＥＳ／Ｔｒｉｓ（１ｍＭ、ｐＨ７．４）
【００４５】
（３）２−ＡＰＢ(2-aminoethoxydiphenyl borate)の添加
ＴＲＰＶ２特異的Ｃａ２＋の測定感度を向上させるために、２−ＡＰＢを測定系に加えた。２−ＡＰＢを、１０ｍＭＣａＣｌ２含有５０ｍＭ ＭＥＳ−ＢＳＳ（ｐＨ５．０〜６．５）に溶解し、１ｍＭの２−ＡＰＢ溶液とした。５０μｌのＢＳＳを含む９６穴マイクロプレートの各ウェルに２−ＡＰＢ溶液（１ｍＭ）を５０μｌ添加した。反応溶液は、２−ＡＰＢの終濃度が０．５ｍＭ、ＣａＣｌ２の終濃度が５．２５ｍＭで、ｐＨ５．０〜６．５の範囲であった。２−ＡＰＢ溶液添加後、室温にて１分間反応させたものについて、反応産物（Ｃａ２＋）を測定した。
５０ｍＭ ＭＥＳ−ＢＳＳの組成：ＮａＣｌ（１４６ｍＭ）、ＫＣｌ（４ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（２ｍＭ）、ＣａＣｌ２（１０ｍＭ）、グルコース（１０ｍＭ）、ＢＳＡ（０．１％）、ＭＥＳ（５０ｍＭ、ｐＨ５．０〜６．５）
【００４６】
（４）Ｃａ２＋の測定
Ｃａ２＋は、蛍光／発光／吸光マルチプレートリーダー（ジェニオスプラス（TECAN社））を用いて測定した。測定は、励起波長３４０ｎｍおよび３８０ｎｍにおける測定波長５１０ｎｍでの蛍光強度を計測することにより行った。Fura-2試薬は、３４０ｎｍで励起したとき蛍光は増加し、３８０ｎｍで励起したときに減少するという性質を有するため、異なる励起波長で励起させたときの蛍光強度の比を調べることで、上昇した細胞内のカルシウム濃度の相対値をより正確に測定することができる。予め、Fura-2試薬を含まない状態での細胞の自家蛍光強度を同様の波長にて計測し、上記測定値より差し引いた。
【００４７】
（実験例１）ＴＲＰＶ２特異的薬剤のスクリーニング１
（１）細胞の準備
実施例３に示す方法で、ＴＲＰＶ２発現用細胞（発現ベクターpIRES TRPV2を導入したＨＥＫ２９３細胞株）を９６穴のマイクロプレートに培養し、コンフルエントになったものを用いた。１００μｌのＢＳＳで細胞を２回洗浄したものについて、励起波長３４０ｎｍおよび３８０ｎｍにおける測定波長５１０ｎｍでの蛍光強度を計測した。
対照として、発現ベクターpIRES TRPV2を導入していないＨＥＫ２９３細胞株についても同様に培養し、同様に蛍光強度を測定した。
【００４８】
（２）カルシウム指示薬およびＴＲＰＶ２特異的薬剤の添加
実施例３に示す方法で、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＢＳＳで溶解した４μＭのFura-2-AM(TM)（ドージンドー社）１００μｌを細胞に添加し、３７℃で３０分間接触させ、細胞内にカルシウム指示薬を負荷した。次に１００μｌの１ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＢＳＳで２回洗浄し、ＴＲＰＶ２特異的薬剤候補化合物を含むＢＳＳ５０μｌを加え、３７℃で３０分反応させた。候補化合物として、カルシウム阻害剤であるガドリニウム（ＣｄＣｌ３（１μＭ））またはルテニウムレッド（１０μＭ）用いた。カルシウム阻害剤を含まない１ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＢＳＳ（５０μｌ）の系についても同様に行った。陽性コントロールとして、Ｃａ２＋カルシウムイオノフォア（ionomycin,１０μＭ）を添加した１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＢＳＳ（５０μｌ）の系についても同様に行った。
【００４９】
（３）２−ＡＰＢ(2-aminoethoxydiphenyl borate)の添加
実施例３に示す方法で２−ＡＰＢ溶液を各ウェルに５０μｌ添加し、室温にて１分間反応させた。反応溶液は、２−ＡＰＢの終濃度０．５ｍＭ、ＣａＣｌ２の終濃度５．２５ｍＭで、ｐＨ６．３であった。２−ＡＰＢを含まない溶液および測定時のｐＨ７．４（中性）の溶液についても同様に反応させた。
【００５０】
（４）結果
Ｃａ２＋の測定は、実施例３の方法に従った。その結果、中性（ｐＨ７．４）条件下では、２−ＡＰＢ添加の有無にかかわらずＣａ２＋の上昇は認められなかった。酸性（ｐＨ６．３）条件下では、ＴＲＰＶ２発現用細胞の２−ＡＰＢ添加の系において、Ｃａ２＋カルシウムイオノフォアを添加した系に匹敵する強いＣａ２＋の上昇が認められた。このＣａ２＋の上昇は、カルシウム阻害剤であるガドリニウムまたはルテニウムレッドを加えた系では、抑制された（図１）。
【００５１】
（実験例２）ＴＲＰＶ２特異的薬剤のスクリーニング２
（１）細胞の準備
実験例１と同様に行った。
【００５２】
（２）カルシウム指示薬およびＴＲＰＶ２特異的薬剤候補化合物の添加
実験例１と同様に行った。候補化合物として、トラニラストを終濃度６０、１２５、５００μＭで用いた。
【００５３】
（３）２−ＡＰＢ(2-aminoethoxydiphenyl borate)の添加
実験例１と同様に行った。
【００５４】
（４）結果及び考察
Ｃａ２＋の測定は実施例３および実験例１の方法に従った。実験例１の結果と同様、中性（ｐＨ７．４）条件下では、２−ＡＰＢ添加の系でもＣａ２＋の上昇は認められなかった。また酸性（ｐＨ６．３）条件下では、ＴＲＰＶ２発現用細胞の２−ＡＰＢ添加の系において、Ｃａ２＋カルシウムイオノフォアを添加した系に匹敵する強いＣａ２＋の上昇が認められた。このＣａ２＋の上昇は、トラニラストを加えた系では濃度依存的に抑制された（図２）。
【００５５】
トラニラストは、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、ケロイド・肥厚性瘢痕に対して効能・効果を有する薬剤であり、これを有効成分とする医薬として、リザベン（Ｒ）（キッセイ薬品工業株式会社）が販売されている。トラニラストの筋変性モデルにおける筋肉芽細胞 (myoblast) 中のカルシウム抑制作用について、Biochemical Pharmacology, 70, p.740-751 (2005)に報告されている。本発明のアッセイ方法により、トラニラストのＴＲＰＶ２発現用細胞におけるＣａ２＋の上昇抑制効果が認められたため、トラニラストはＴＲＰＶ２特異的に作用する薬剤であることが確認された。これにより、本発明のアッセイ方法を用いて反応産物を測定することで、ＴＲＰＶ２特異的薬剤をスクリーニングすることが可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
以上説明したように、本発明のアッセイ方法は、ＴＲＰＶ２特異的なＣａ２＋の上昇を測定することができる。本アッセイ方法により、ＴＲＰＶ２に起因する未知の疾患を解明するためのツールとして活用することができる。さらに本発明のスクリーニング方法は、ＴＲＰＶ２特異的薬剤、例えばＴＲＰＶ２特異的なＣａ２＋の上昇を制御しうる薬剤などの医薬品開発に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】実験例１の結果を示す図である。
【図２】実験例２の結果を示す図である。
【図１】
2007259745.tif 000003
【図２】
2007259745.tif 000004
【配列表】
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