(57)【要約】【課題】脊椎動物細胞集団における分裂細胞の比率を増加する新規な方法の提供。【解決手段】細胞集団をp27のインヒビターに暴露することを含んでなり、この場合の当該p27のインヒビターの量が、非分裂細胞に対する分裂細胞の比率を、未処理細胞の集団における当該比率に比べて増加させるのに十分な量である、ことを特徴とする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊椎動物細胞集団における分裂細胞の比率を増加する方法において、
前記の細胞集団をp27のインヒビターに暴露することを含んでなり、この場合の当該p27のインヒビターの量が、非分裂細胞に対する分裂細胞の比率を、未処理細胞の集団における当該比率に比べて増加させるのに十分な量である、ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記細胞集団が、実質的に非分裂の又は末期的に分化した一次細胞集団である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞集団が、繊維芽細胞、骨芽細胞、骨髄芽細胞、ニューロン又は、上皮細胞を含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞集団が、造血始原細胞を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記暴露する段階がイン−ビトロで行われる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞集団を、所望の遺伝子産物をコードする核酸配列を含んでなるベクターに接触させる段階を更に含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
所望の遺伝子産物をコードする核酸配列を含んでなる前記ベクターが遺伝的に修飾されたウイルスベクターである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝的に修飾されたベクターが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、又はシンドビスウイルスベクターである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記遺伝的に修飾されたベクターがレトロウイルスベクターである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞集団が、造血始原細胞を含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記レトロウイルスベクターに接触した暴露された造血原始細胞を、所望の遺伝子の発現のための宿主に供与する段階を更に含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記インヒビターが、前記細胞集団におけるp27の発現を特異的に阻害するオリゴヌクレオチドである、請求項１〜11のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記脊椎動物細胞が哺乳類細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
注目の遺伝子産物をコードするウイルスベクターによる脊椎動物細胞集団の形質転換の効率を増加させる方法において、
細胞の集団をp27のインヒビターに暴露し、この場合の当該p27のインヒビターの量が、非分裂細胞に対する分裂細胞の比率を、未処理細胞の集団における当該比率に比べて増加させるのに十分な量であり；そして
前記暴露された細胞を、注目の遺伝子産物をコードするウイルスベクターに接触させる、
ことを含んでなる方法。
【請求項１７】
前記細胞集団が、造血始原細胞を含んでなる、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
P27をコードするDNA又はそれから転写されるRNAに特異時に結合しそしてp27蛋白質の発現を阻害するオリゴヌクレオチドを含んでなるp27のインヒビター。
【請求項１９】
前記オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌヌレオチドである、請求項18に記載のインヒビター。
【請求項２０】
P27のインヒビターにより処理された単離された脊椎動物細胞集団であって、非分裂細胞に対する分裂細胞の比率が、未処理細胞の集団における当該比率より高い細胞集団。
【請求項２１】
造血原始細胞を含む請求項20に記載の単離された細胞集団。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
哺乳動物細胞は、細胞周期の短時間のウィンドウ（briefwindow）の間においてのみ、増殖状態から静止状態にシフトすることができる。Temin、J.Cell.Phys.78:161(1971)。したがって、細胞周期におけるそれらの位置に依存して、マイトジェン、例えば、血清中に存在するマイトジェンは直ちの細胞周期の停止を行うか、あるいはそれらは次の細胞周期において有糸分裂および停止を完結する。マイトジェン依存性からマイトジェン独立性への移行は、細胞周期の中期から後期のG1期において起こる。Pardee、Proc.Natl.Acad.Sci.71:1286(1974)は、多数の異なる抗マイトジェンシグナルが反応速度論的に共通の点において細胞周期を停止させることを示し、そしてさらに細胞周期が細胞周期の中期から後期のＧ１においてこれらのシグナルに対してほぼ同時に非応答性となることを示した。この点を制限点、またはＲ点を命名された。
【０００２】
また、マイトジェン独立性への細胞周期の移行のタイミングを正確にマッピングするために、有糸分裂的に増殖する時間差シネマトグラフィーが使用されてきている。これによると、マイトジェンの消耗または他の増殖阻害シグナルは分裂終了の、前期G1細胞を細胞周期から直ちに出させ、そして細胞周期のコミットメント（マイトジェンのシグナルからの自律性）は中期G1において起こることが確証された（Larson et al.、J.Cell.Phys.139:477(1989)、およびZetterberg et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:5365(1985))。これらの観察を総合すると、細胞増殖に関するマイトジェン依存性制御は細胞周期の進行に連絡されることが示される。
【０００３】
G1を通してＳ期へに入る移行はサイクリン依存性キナーゼ（Cdks）の作用を必要とする（Sherr、Cell 79:551(1994))。増殖阻害シグナルは、G1期の間にこれらのCdksの活性化を防止することが示された（Serrano et al.、Nature 366:704(1993));HannonおよびBeach、Nature 371:257(1994))；E1-Deiry et al.、Cell 75:89(1993);Xiong et al.、Nature 366:701(1993))；Polyak et al.、Cell 78:59(1994)；ToyashimaおよびHunter、ibid.、p67;Lee et al.、Genes & Dev.9:639(1995)；Matsuoka et al.、ibid.、p.650；Koff et al.、Science 260:536(1993))。
【０００４】
Cdksの触媒活性は、２つの一般的メカニズム、すなわち、タンパク質のリン酸化および調節サブユニットとのアソシエーション、により調節されることが知られている（Gould et al.、EMBO J.、10:3297(1991)；Solomon et al.、ibid.、12:3133(1993)；Solomon et al．、Mol.Biol.Cell 3:13(1992)；Jeffrey et al.、Nature 376:313(1995)；Morgan、Nature 374:131(1995))。調節サブユニットの間で、Cdksと阻害CKIサブユニット（サイクリン依存性キナーゼインヒビター）とのアソシエーションは、細胞増殖およびCdk活性に対するマイトジェン消耗の効果に最も密接に関係づけられた。
【０００５】
マイトジェン依存性Cdk調節に直接関係づけられるCKIはp27Kip1である（Polyak et al.、Cell 78:59(1994)；ToyashimaおよびHunter、ibid.、p.677)。p27タンパク質は静止状態の細胞において高いレベルで蓄積し、そして静止状態の細胞が特異的マイトジェンで再刺激された後、急速に破壊される（Nourse et al.、Nature 372:570(1994)；Kato et al.、Cell 79：487(1994))。そのうえ、培養した細胞中のｐ２７の構成的発現はG1において細胞周期を停止させる（Polyak supra、ToyashimaおよびHunter、supra）。
【０００６】
遺伝子治療は広範な種類の後天性疾患および遺伝性疾患、例えば、感染症、癌などの治療および予防に提案されており、そして標的細胞への治療遺伝子の効率より送達に頼る。遺伝子治療についてターゲットされた体細胞、例えば、造血細胞、皮膚線維芽細胞およびケラチノサイト、肝細胞、内皮細胞、筋細胞およびリンパ球の大部分は通常非分裂性である。遺伝子治療に最も広く使用されているロタウイルスのベクターは、不都合なことには、有効な形質導入のために細胞分裂を必要とする（Miller et al.、Mol.Cell.Biol.：10:4239-4234(1990)。
【０００７】
また、これは他の遺伝子治療のベクター、例えば、アデノ関連ベクターについて真実である（Russel et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:8915-8919(1994)；Alexander et al.、J.Virol. 68:8282-8287(1994)；Srivastrava、Blood Cells 20:531-538(1994))。多数の遺伝子治療のための好ましい標的細胞である体細胞の大部分は、常態で増殖しない。したがって、形質導入の効率はしばしば比較的低く、そして遺伝子産物は治療的または予防的に有効な量において発現されない。これにより、研究者らは５−フルオロウラシルを使用する前処理、サイトカインの存在下の感染、および体細胞が感染の間に分裂する確度を増加する前のベクター感染の延長のような技術を開発しようとしてきたが、成功は制限されてきている。
【０００８】
１つの面において、この分野において必要なことは、種々の遺伝子治療の用途に有用である遺伝子転移の効率を改良する方法である。例えば、必要なことは、制限点を通る細胞周期のコミットメント、したがって細胞周期の進行における主要な分子の事象をコントロールすることによって、分裂する細胞のみを形質導入できるベクターを使用して広範な種類の脊椎動物の細胞の中への形質導入の効率を改良する手段である。
【０００９】
ターゲッティングポリヌクレオチド構築物と相同染色体配列との間の相同組換えにより仲介される遺伝子のターゲッティングは、HPRT遺伝子、β２−ミクログロブリン遺伝子、int-2プロト−オンコジーン、およびfosプロト−およびを包含するいくつかの遺伝子を崩壊するために使用されてきている（ThomasおよびCappechi(1987)Cell 51:503;Zijlstra et al.(1989)Nature 342:435；Mansour et al.(1988)Nature 336:348；およびJohnson et al.(1989)Science 245:1234；Adair et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.) 86:4574；Capecchi、M.(1989)TIG 5:70;Capecchi、M.(1989)Science 244:1288)。Mansour et al.(1988)op.cit.は、相同ターゲッティング構築物を記載し、この構築物は統合されたトランスジーンについての積極的選択と組み合わせて非相同統合事象に対する消極的選択を可能とするHSVtk遺伝子を包含する。
【００１０】
細胞増殖の誘導または阻害に要求される１または２以上の不活性化されたサイクリンインヒビター遺伝子、例えば、サイクリン調節タンパク質p27、p16、p14、p18、p21、およびその他を収容するトランスジェニック非ヒト哺乳動物細胞およびトランスジェニック非ヒト動物は、実験モデル系として、そして異種（例えば、ヒト）サイクリン関係タンパク質をコードするトランスジーンの発現のための宿主として望ましい。このような細胞および動物は、また、工業および農業において所望の細胞増殖の利点、例えば、細胞増殖の増加、動物の大きさの増加、および成長速度の増加を有する。
【００１１】
Lonberg(WO92/03918)は、内因性免疫グロブリン遺伝子座をターゲットするベクターの構築およびこのようなターゲッティングベクターによる内因性免疫グロブリン遺伝子の不活性化を記載している。Rahemtulla et al.(1991)Nature 353:180は、胚幹細胞における相同遺伝子のターゲッティングによる内因性ネズミＣＤ４遺伝子の崩壊を記載している。Jasin et al.(1990)Genes Devel. 4:157は、エピトープ付加によるＴリンパ腫細胞系統におけるヒトCD4遺伝子のターゲッティングを報告している。Koh et al.(1992)Science 256:1210は、ＥＳ細胞における相同遺伝子のターゲッティングによる内因性ネズミCD8遺伝子の崩壊を報告している。
【００１２】
Molina et al.(1992)op.cit.は、シグナル形質導入に関係するチロシンキナーゼをコードするネズミ1ck遺伝子のCD4およびCD8による崩壊を記載している。Grusby et al.(1991)Science 253:1417は、マウスにおける遺伝子のターゲッティングによるMHCクラスＩＩのAb ベータ遺伝子の崩壊を記載している；生ずるターゲッテッドマウスはＣＤ４＋  リンパ球を欠くことが報告されている。Nakayam et al.(1993)Science 261:1584は、キメラノックアウトマウスを作ることを記載しており、ここでキメラの体細胞のあるものは、機能的bcl-2遺伝子、およびノックアウトアレレの生殖細胞系統の伝達を欠如する。
【００１３】
機能的に不活性化された内因性サイクリンインヒビター遺伝子を有する遺伝子（必要に応じて、また、異種（すなわち、異なる種に由来する）または突然変異の変異型サイクリンインヒビター遺伝子産物を発現するトランスジーンを収容する）生物は、疾患の病因および基本的細胞生物学的を研究するためのモデルとして有用であり、ならびに異常な細胞増殖に関係する疾患を処理するための新規な処理剤をスクリーニングするために有用なモデルを提供するために有用である。
【００１４】
以上の説明に基づいて明らかなように、１または２以上の機能的に不活性化された内因性サイクリンインヒビター遺伝子を収容し、必要に応じてまた、宿主細胞の少なくとも１つのサブセットにおいて発現される異種サイクリンインヒビターポリペプチドまたは突然変異の変異型サイクリンインヒビターポリペプチドをコードするトランスジーンを収容する非ヒト細胞および生物が要求されている。したがって、本発明の目的は、相同組換え、内因性サイクリンインヒビター遺伝子、特にp27遺伝子による不活性化のためのターゲッティングトランスジーンを提供することである。
【００１５】
また、本発明の目的は、本発明の正しくターゲットされた相同的に組換えられたトランスジーンを収容するトランスジェニック非ヒト細胞およびトランスジェニック非動物を生産する方法を提供することである。また、前記方法を使用して患者から外植された細胞におけるp27遺伝子および／または他のサイクリンインヒビター遺伝子を不活性化する（例えば、ex vivo遺伝子治療のために）ことができ、例えば、生ずるターゲッテッド細胞に変更された細胞増殖の表現型を付与することができる。
【００１６】
ある種の植物遺伝子の発現をコントロールする方法を使用して、所望のように植物の表現型を修飾することができ、例えば、果実の成熟が起こる速度または時間をコントロールし、あるいは植物の生長速度さえもコントロールすることができる。内因性植物遺伝子の発現をコントロールする１つの方法は、アンチセンス抑制による特定の遺伝子の発現の阻害であり（米国特許第5,457,281号、第5,453,566号、第5,365,015号、第5,254,800号、第5,107,065号、および第5,073,676号）、そして特定の遺伝子の発現を阻害する他の方法はセンス抑制であり（米国特許第5,283,184号、第5,231,020号、および第5,034,323号）、前記特許の各は引用することによって本明細書の一部とされる。
【発明の開示】
【００１７】
本発明は、細胞の集団における分裂する細胞／非分裂細胞の比率を特異的に増加するp27のインヒビターを含んでなる組成物を提供する。インヒビターはp27タンパク質の発現を実質的に減少または排除し、これによりサイクリンCdk複合体、例えば、サイクリンE-Cdk2複合体および／またはサイクリンA-Cdk2複合体、の活性化を許す。特に、p27のオリゴヌクレオチドのインヒビター、例えば、三重形成オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびリボザイムは有用である。
【００１８】
他の態様において、本発明は、また、p27インヒビターで処理されており、そして未処理細胞の集団における同一比率に関して分裂する細胞／非分裂細胞の比率が増加した、単離された脊椎動物細胞集団を提供する。分裂する細胞、例えば、造血始原細胞は、分裂する細胞を優先的に形質導入するウイルスベクターの使用を包含する遺伝子治療の標的として有用である。したがって、本発明は、形質導入できる細胞の数を増加し、これにより所望の遺伝子産物の入手可能性を増加することによって、遺伝子治療技術の効率を増加する方法を提供する。
【００１９】
他の態様において、本発明は、脊椎動物細胞集団における分裂する細胞の比率を増加する方法を提供する。未処理細胞の集団における同一比率に関して分裂する細胞／非分裂細胞の比率を増加するために十分な量のp27遺伝子に、細胞の集団を暴露する。このような細胞集団はこのような非分裂性または末期的に分化した細胞集団であることができ、例えば、繊維芽細胞、骨芽細胞、骨髄芽細胞、ニューロンまたは上皮細胞を包含する。単離された脊椎動物細胞集団は本発明において特に有用である。
【００２０】
これらの細胞をin vitroまたはin vivoにおいてインヒビターに暴露する。in vitroにおいて実施するとき、特に暴露された細胞が所望の遺伝子を発現するように形質導入されているとき、この方法は暴露された細胞を宿主に投与する工程をさらに含む。したがって、この方法は問題の遺伝子産物をコードするウイルスベクターで脊椎動物細胞集団を形質導入する効率を増加する。分裂する細胞の比率を増加するために十分な量のp27遺伝子に、標的細胞、例えば、哺乳動物の造血始原細胞を暴露し、そして問題の遺伝子産物をコードするウイルスベクターに処理された細胞を接触させる。
【００２１】
本発明の広い面において、肥大生物（すなわち、細胞過多および／または過形成を示す生物を包含する、増大した大きさの生物）を生産する方法が提供され、この方法は生物において少なくとも１つのサイクリンインヒビター遺伝子（これはCDKインヒビター遺伝子を包含する）の発現を機能的に不活性化することからなる。関係する面において、本発明は、所望の大きさが非変異体生物に比較していっそう急速に達成されるように、生物の成長速度を増加する方法を提供する。
【００２２】
１つの態様において、非ヒト生物は動物、例えば、非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、雌牛、ウサギ、およびその他）、魚類（例えば、マス、サケ、ナマズおよびその他）、鳥類（例えば、家禽）およびその他、または植物である。１つの態様において、サイクリンインヒビター遺伝子は哺乳動物のｐ２７遺伝子である。一般に、この方法は生殖細胞系トランスジーンを使用するか、またはターゲッティング構築物との相同組換えにより発生した生殖細胞系の構造的に崩壊したサイクリンインヒビター遺伝子のアレレを使用する。
【００２３】
本発明の１つの面において、サイクリンインヒビター遺伝子の遺伝子座（これはCDKインヒビター遺伝子の遺伝子座を包含する）の中に存在するか、またはそれをフランクする配列に対して実質的に相同でありそして、対応するサイクリンインヒビター遺伝子に組込まれたとき、遺伝子の遺伝子座によりコードされるサイクリンインヒビタータンパク質の発現を機能的に不活性化する配列を有する少なくとも１つの部分を含有するターゲッティング構築物が提供される。このようなターゲッティング構築物またはその一部分は、内因性遺伝子の遺伝子座とターゲッティング構築物との間の相同組換えによりサイクリンインヒビター遺伝子の遺伝子座において組込み、そして正しく組込まれたターゲッティング構築物を収容する細胞を本明細書において記載する方法のために選択し、そして前記方法に従うスクリーニングにより同定する。
【００２４】
１つの態様において、ターゲッティング構築物は「ヒット・アンド・ラン（hit-and-run）」戦略により内因性サイクリンインヒビター遺伝子のすべてまたは一部分を欠失し、ここで生ずる機能的に不活性化されたサイクリンインヒビターの遺伝子座は欠失を含み、そして組込まれた選択可能なマーカーを含まない。別の態様において、典型的にはコーディング配列（すなわち、エクソン）の中に、配列を挿入するターゲッティング構築物により、内因性サイクリンインヒビター遺伝子は機能的に不活性化され、ここで生ずる不活性化されたサイクリンインヒビター遺伝子は機能的サイクリンインヒビタータンパク質を実質的に発現することができない。
【００２５】
本発明は、また、１または２以上のターゲッテッド部位特異的点突然変異により内因性サイクリンインヒビター遺伝子機能的に不活性化して、例えば、コーディング配列の中にミスセンスまたはナンセンスのコドンをつくるか、またはスプライスシグナルまたは転写因子の配列を切除する。本発明の好ましい態様において、内因性サイクリンインヒビターの遺伝子座、例えば、p27タンパク質をコードする遺伝子座は機能的に不活性化される。
【００２６】
本発明は、また、サイクリンインヒビター遺伝子の遺伝子座の中に存在するか、またはそれをフランクする配列に対して実質的に相同であり、そして対応する内因性サイクリンインヒビター遺伝子の遺伝子座の遺伝子変換のための鋳型として働く、配列を有する少なくとも１つの部分を含有するターゲッティング構築物を提供する。このようなターゲッテッド遺伝子変換は変換された（すなわち、遺伝子変換により仲介された）内因性サイクリンインヒビターの遺伝子座を生じ、この遺伝子座は機能的に不活性化され、そして機能的サイクリンインヒビタータンパク質の効率よい発現を指令することができない。
【００２７】
本発明は、また、正しくターゲットされた遺伝子変換から生ずる、不活性化されたサイクリンインヒビター遺伝子を有する細胞および非ヒト動物および植物を提供する。正しくターゲットされた遺伝子変換から生ずるヌクレオチド配列は、一般に、哺乳動物の１または２以上のゲノムの中に天然に存在する配列ではないので、ターゲッテッド遺伝子変換から生ずる配列は、一般に、宿主細胞または宿主動物の種の中の天然に存在する突然変異のサイクリンインヒビターアレレと区別することができる。遺伝子変換による機能的崩壊に好ましいサイクリンインヒビター遺伝子はp27遺伝子である。
【００２８】
本発明は、また、相同組換えにより、内因性サイクリンインヒビター遺伝子の少なくとも一部分を、異種サイクリンインヒビター遺伝子の対応する部分と置換するターゲッティング構築物を提供する。このような置換は、部分的であって、部分的に内因性コーディング配列および／または調節配列および部分的に異種サイクリンインヒビター遺伝子の配列から構成されたハイブリッドサイクリンインヒビター遺伝子を生ずるか、あるいは完全であって、内因性サイクリンインヒビター遺伝子は異種サイクリンインヒビター遺伝子により置換される。
【００２９】
ある態様において、異種サイクリンインヒビター遺伝子の配列は非必須配列、例えば、イントロンの配列の欠失を含み、そしてサイクリンインヒビターミニ遺伝子と呼ばれる。例えば、本発明は、ヒトまたはネズミのサイクリンインヒビターミニ遺伝子を提供し、このミニ遺伝子は非ヒト宿主の中で切除および翻訳されて、天然に存在する、非トランスジェニック動物における内因性宿主サイクリンインヒビター遺伝子と同一の方法で発生的に発現される機能的ヒトサイクリンインヒビタータンパク質を産生する。このようなヒトサイクリンインヒビターミニ遺伝子は、ターゲッティング構築物の一部分を含むことができるか、あるいはトランスジーンとして別に導入することができる。
【００３０】
本発明は、また、少なくとも１つの組込まれたターゲッティング構築物を収容する非ヒト動物および細胞を提供し、前記ターゲッティング構築物は、典型的には遺伝的因子（例えば、エクソン配列、スプライシングシグナル、プロモーター、エンハンサー）（これは完全な遺伝子産物の効率よい機能的発現について必要である）を欠失または突然変異させることによって、内因性サイクリンインヒビター遺伝子の遺伝子座を機能的に不活性化する。１つの態様において、内因性サイクリンインヒビター遺伝子の遺伝子座の崩壊は、相同組換えまたは遺伝子変換により、内因性サイクリンインヒビター遺伝子の一部分を異種サイクリンインヒビター遺伝子（例えば、ヒトｐ２７遺伝子配列）の一部分と置換することによって達成することができる。別の態様において、ターゲッティング構築物を使用して、相同組換えにより、内因性サイクリンインヒビター遺伝子を機能的に崩壊させ、そして異種分子をコードしかつそれを発現するトランスジーンを宿主ゲノムの中に非相同部位において別に導入する。
【００３１】
本発明は、また、少なくとも１つの内因性サイクリンインヒビター遺伝子を収容するトランスジェニック非ヒト動物および植物を提供し、前記内因性サイクリンインヒビター遺伝子は、前記遺伝子を本発明のターゲッティング構築物と接触させることによって生成されたターゲッテッド遺伝子の修飾により、不活性化される。ターゲッティング構築物と内因性サイクリンインヒビター配列とのこのような接触は、一般に、この分野において知られているエレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム沈澱法、バイオリスチクス（biolistics）、または他のポリヌクレオチド転移法を包含する。
【００３２】
本発明は、また、内因性サイクリンインヒビター遺伝子を発現するが、欠失または突然変異した、発現された内因性サイクリンインヒビター遺伝子の一部分を有する細胞を提供する。例えば、しかし限定されないが、生殖細胞系DNAからの特定の前以て決定したエクソンを１または２以上のターゲッティング構築物で欠失することによって、内因性サイクリンインヒビター遺伝子を修飾することができ、好ましい欠失はサイクリンインヒビタータンパク質の構造的ドメインおよび／または機能的ドメインの境界とほぼ同一の境界を有する欠失である。別の態様において、内因性サイクリンインヒビター遺伝子の前以て決定したエクソンまたは構造的ドメインを、相同ターゲッティングにより、異種サイクリンインヒビター遺伝子の対応する部分と置換して、ハイブリッドのサイクリンインヒビター遺伝子を発生させることができる。
【００３３】
本発明は、また、少なくとも１つの不活性化された内因性サイクリンインヒビター遺伝子を有し、好ましくは不活性化されたサイクリンインヒビターアレレのホモ接合体であり、そして内因性サイクリンインヒビターの効率よい発現を実質的に指令することができない生物、例えば、トランスジェニック非ヒト動物を提供する。例えば、好ましい態様において、トランスジェニック非ヒト哺乳動物は不活性化された内因性サイクリンインヒビターアレレのホモ接合体であり、そして内因性（すなわち、天然に存在する）サイクリンインヒビター遺伝子によりコードされるサイクリンインヒビターを実質的に産生することができない。
【００３４】
本発明は、また、内因性サイクリンインヒビターの遺伝子座を崩壊させないで、サイクリンインヒビター遺伝子産物の１または２以上の種の発現を抑制するために有用であるベクター、方法、および組成物を提供する。このような方法は１または２以上の内因性サイクリンインヒビター遺伝子産物の発現を抑制するために有用であり、そして変法において、作用可能に連鎖された転写調節配列の使用により条件的にコントロールすることができ、前記転写調節配列は（例えば、インデューサーの存在において、組織特異的方法において、発育段階特異的方法において、またはその他）抑制アンチセンス転写体を発現し、１または２以上のサイクリンインヒビター遺伝子産物の調節された発現（または抑制）を許すことができる。
【００３５】
内因性サイクリンインヒビターの遺伝子座の遺伝的崩壊と異なり、サイクリンインヒビター遺伝子産物の発現の抑制は、崩壊された内因性遺伝子座の非トランスジェニック動物のホモ接合体を確立するために必要である。内因性サイクリンインヒビター遺伝子の崩壊に比較して抑制の追加の利点は、ある態様において、抑制が個々の動物内で可逆的であることである。例えば、サイクリンインヒビターの抑制は下記のものを使用して達成可能である：（１）内因性サイクリンインヒビター遺伝子配列に特異的にハイブリダイゼーションするアンチセンスＲＮＡをコードしかつそれを発現するトランスジーン、（２）内因性サイクリンインヒビター遺伝子配列に特異的にハイブリダイゼーションするアンチセンスオリゴヌクレオチド、および（３）内因性サイクリンインヒビターポリペプチドに特異的に結合しかつその機能を阻害する細胞内タンパク質。
【００３６】
１つの面において、本発明は、少なくとも１つのサイクリンインヒビター遺伝子の生理学的に高い発現（hyperphysiological expression）を実施することからなる、大きさおよび／または細胞数が減少した生物を生産する方法を提供する。関係する態様において、本発明は発現トランスジーンを提供し、前記トランスジーンは転写調節配列を含み、前記転写調節配列はサイクリンインヒビター遺伝子産物の発現に影響を与えかつ細胞増殖を遅延または阻害するサイクリンインヒビター遺伝子のエンコーディング配列に作用可能に連鎖されている。このようなトランスジーンは、非ヒト動物において発現されるとき、形態学的特性が減少した（例えば、より小さい体の大きさ、器官の減少した性、異型身体プランの寸法）、および他の関係する細胞増殖表現型を有する動物を生ずることができる。
【００３７】
本発明は、また、非ヒト宿主種におけるサイクリンインヒビター遺伝子産物をコードするトランスジーンを提供する。典型的には、このようなトランスジーンはサイクリンインヒビター遺伝子の発現カセットを含み、ここで連鎖したプロモーター、好ましくはエンハンサーはサイクリンインヒビタータンパク質をコードする構造配列の発現を推進する。例えば、本発明は、サイクリンインヒビタータンパク質をコードする構造配列に連鎖した、構成的ネズミエンハンサーおよびプロモーターを含んでなるトランスジーンを提供する。
【００３８】
このようなトランスジーンを収容するトランスジェニックマウスは、発育パターンにおいて、発現パターンに匹敵するレベルおよび正常の非トランスジェニックマウスにおいてプロモーターおよびエンハンサーを誘導したマウス遺伝子のレベルにおいて、サイクリンインヒビターを発現する。サイクリンインヒビタータンパク質をコードするトランスジーンは内因性転写調節配列に隣接してターゲットされることができるので、ターゲッテッド内因性染色体位置の中にトランスジーンが組込まれたとき、調節配列の作用可能な連鎖は起こる。
【００３９】
サイクリンインヒビター遺伝子を過度に発現しようとする態様において、少なくとも１つのサイクリンインヒビタータンパク質はトランスジェニック非ヒト生物において１または２以上のトランスジーンからコードされかつ発現されることができる。このようなトランスジーンは非ヒト動物の染色体中の非相同位置に組込まれるか、あるいは相同組換えまたは遺伝子変換により非ヒト遺伝子の遺伝子座の中に組込まれることができる。
【００４０】
発明の簡単な説明
図１はp27が細胞周期の除去（withdrawal）に必要であることを示し、ここで図1Aは、対照の増殖するBalb/c-3T3細胞（Hi）、サブコンフルエントの血清飢餓Balb/c-3T3細胞（Low）、およびp27ミスマッチ（MS）またはアンチセンス（AS）オリゴヌクレオチドでリポフェクションした後24時間の間血清飢餓させたサブコンフルエントのBalb/c-3T3細胞からの抽出物のp27イムノブロット分析である。図1Bは、増殖するBalb/c-3T3細胞（HI）、サブコンフルエントの血清飢餓Balb/c-3T3細胞（Lo）またはp27ミスマッチ（MS）またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（AS）でリポフェクションした後24時間の間血清飢餓させたBalb/c-3T3細胞からのサイクリンＡ、サイクリンＢまたはＣｄｋ２の免疫沈降物のp27イムノブロット分析である。
【００４１】
図２は、強化されたp27発現が血清飢餓細胞におけるp27アンチセンス作用を逆転することを示し、ここで図2Aは野生型p27または標識化（p27*）p27ゆらぎ突然変異をコードするプラスミドを使用する、p27アンチセンスオリゴヌクレオチドの存在（＋）または非存在（−）におけるリポフェクション後24時間における増殖するBalb/c-3T3細胞のp27イムノブロット分析である。図2Bは、増殖するBalb/c-3T3細胞繊維芽細胞（Hi）をp27ミスマッチ（MSM）またはアンチセンス（AS）オリゴヌクレオチドで高い血清中で６時間リポフェクションしたとき、得られた結果を示す。
【００４２】
図3Aは６〜７週齢の20匹の対照およびp27-/- マウスからの器官重量の平均および95％信頼区間を示し、そしてプロットは対照マウスと比較したノックアウトマウスにおける重量増加％である。第３Ｂ図は、週齢の関数として30匹の対照、p27-/- 、およびp27-/- 雌マウスの重量の平均および95％信頼区間を示し、ここでインセットは誕生日および10日に秤量した20匹の雄＋雌のマウスの別々のグループの重量を示す。21日からのデータは第１グループからの結果の平均である。第3C図の描写は第3B図と同一であるが、データは雄のマウスから得られた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
１．  定義
特記しない限り、本明細書おいて使用されるすべての技術的および科学的は、本発明が属する分野の当業者により普通に理解されているのと同一の意味を有する。本明細書において記載するものに類似するか、あるいは等しい方法および材料を本発明の実施および試験において使用することができ、好ましい方法および物質を説明する。本発明の目的に対して、下記の用語を定義する。
【００４４】
「サイクリンインヒビタータンパク質」は、本発明において使用するとき、サイクリン依存性キナーゼ（CDK）に結合しかつそれを不活性化するタンパク質、または細胞中のサイクリン経路における関係するタンパク質を意味する。p27タンパク質はサイクリンインヒビタータンパク質の１例である。サイクリンインヒビター遺伝子は、本発明において使用するとき、サイクリンインヒビタータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列である。
【００４５】
本発明において使用するとき、用語「サイクリンインヒビター遺伝子」または「サイクリンインヒビター遺伝子の遺伝子座」は、潜在的にサイクリンインヒビターポリペプチドをコードするエクソンのすべてをスパンし、そしてサイクリンインヒビタータンパク質の発現に参加するフランキング配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、およびその他を包含する）を通して延びる染色体の領域を意味する。サイクリンインヒビタータンパク質をコードする本質的任意の遺伝子をターゲットすることができる。特に好ましい遺伝子はｐ２７遺伝子であり、これをターゲットすることができ、そして、必要に応じて、同族異種遺伝子またはミニ遺伝子と置換することができる。
【００４６】
用語「構造的に崩壊した」は、本発明において使用するとき、崩壊した遺伝子が機能的遺伝子産物の効率よい発現を指令することができように、遺伝子の遺伝子座が少なくとも１つの突然変異または構造的変更を含むことを意味する。用語「機能的に不活性化された」は、発現されないか、あるいは遺伝子産物を発現することができない遺伝子の遺伝子座を意味する。機能的不活性化は、転写または翻訳のレベルにおいて、構造的崩壊および／または発現の中断から生ずることがある。内因性サイクリンインヒビター遺伝子、例えば、p27遺伝子の機能的不活性化は、また、他の方法、例えば、アンチセンスポリヌクレオチド遺伝子の抑制により生成することがある。
【００４７】
用語「に相当する」は、本明細書において、参照ポリヌクレオチド配列のすべてのまたは一部分に対する同一性を共有するポリヌクレオチド配列を意味するために使用される。用語「に対して相補的」は、本明細書において、配列が参照ポリヌクレオチド配列のすべてのまたは一部分に対して相補的であることを意味するために使用される。
【００４８】
用語「に実質的に相当する」、「実質的に相同」、または「実質的な同一性」は、本発明において使用するとき、核酸配列が参照配列に比較して少なくとも約70％の配列の同一性、典型的には少なくとも約85％の配列の同一性、好ましくは少なくとも約95％の配列の同一性を有する、核酸配列の特性を意味する。配列の同一性の百分率は、参照配列の合計25％より小である小さい欠失または付加を排除して計算される。参照配列はより大きい配列のサブセット、例えば、遺伝子またはフランキング配列の一部分、または染色体の反復部分であることができる。
【００４９】
しかしながら、参照配列は少なくとも18ヌクレオチドの長さ、典型的には約30ヌクレオチドの長さ、好ましくは少なくとも約50〜100ヌクレオチドの長さである。「実質的に相補的」は、本発明において使用するとき、参照配列に実質的に相当する配列に対して相補的である配列を意味する。一般に、ターゲッティング効率は、標的DNA（すなわち、クロスオーバー標的配列）の中に存在する参照配列に実質的に相当するターゲッティングトランスジーン部分（すなわち、相同領域）の長さとともに増加する。一般に、ターゲッティング効率は同質遺伝子のDNA相同クランプの使用で最適化されるが、種々のリコンビナーゼの存在は効率よい組換えに要求される配列の同一性の程度を減少することがあることが認識される。
【００５０】
用語「非相同配列」は、本発明において使用するとき、一般的意味および特定の意味を有する；それは一般に特定した参照配列と実質的に同一でない配列を意味し、そして、特定の参照配列が明確に同定されない場合、それはターゲッテッドサイクリンインヒビター遺伝子、例えば、p27遺伝子において少なくとも約50の隣接塩基の配列と実質的に同一ではない配列を特別に意味する。
【００５１】
特定のハイブリダイゼーションは、本明細書において、ターゲッティングトランスジーン配列（例えば、置換、欠失、および／または付加を含むことができるポリヌクレオチド）と、特定の標的DNA配列（例えば、p27遺伝子配列）との間のハイブリッドの形成として定義され、ここで標識化ターゲッティングトランスジーン配列は標的に優先的にハイブリダイゼーションし、こうして、例えば、前記標識化ターゲッティングトランスジーン配列をプローブとして細胞から調製されたDNAのサザンブロット上で、ゲノムのサイクリンインヒビター遺伝子の制限フラグメントに相当する単一のバンドを同定することができる。
【００５２】
最適なハイブリダイゼーション条件は、１または２以上のターゲッティングトランスジーンおよび１または２以上の内因性標的の配列の組成および１または２以上の長さ、および実施者が選択した実験方法に依存して変化するであろうことが明らかである。適当なハイブリダイゼーション条件を選択するために、種々のガイドラインを使用することができる（Maniatis et al.、Molecular Cloning：A Laboratory Manual(1989)、第２版、Cold Spring Harbor、N.Y.およびBergerおよびKimmel、Methods in Enzymology、Volume 152、Guide to Moecular Cloning Techniques（1987）、Academic Press,Inc.、カリフォルニア州サンディエゴ（これらは引用することによって本明細書の一部とされる）を参照のこと。
【００５３】
本発明において使用する用語「天然に存在する」は、ある物体に適用するとき、ある物体を自然に見出すことができることを意味する。例えば、天然の源から単離することができかつ実験室において人間により意図的に修飾されなかった生物（ウイルスを包含する）の中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列は、天然に存在する。本発明において使用するとき、古典的遺伝学に従い選択的に飼育することができた齧歯類の実験室の系統は、天然に存在すると考えられる。
【００５４】
用語「相同体」は、本発明において使用するとき、種の間において進化的および機能的に関係する遺伝子配列を意味する。
【００５５】
本発明において使用するとき、用語「ターゲッティング構築物」は下記のものを含んでなるポリヌクレオチドを意味する：（１）宿主細胞の内因性サイクリンインヒビター遺伝子の遺伝子座の中に存在する配列に実質的に同一であるか、あるいはそれに対して実質的に相補的である配列を有する、少なくとも１つの相同領域、および（２）ターゲッティング構築物の相同領域と前記内因性サイクリンインヒビター遺伝子の遺伝子座の配列との間の相同組換えにより、宿主細胞の内因性サイクリンインヒビター遺伝子の遺伝子座の中に組込まれるようになるターゲッティング領域。
【００５６】
ターゲッティング構築物が「ヒット・アンド・ラン」または「イン・アンド・アウト（in-and-out）」型の構築物である場合（ValanciusおよびSmithies（1991）Mol.Cell.Biol. 11：1402；Donehower et al.（1992）Nature 356:215；（1991）J.NIH Res. 3:59（これらは引用することによって本明細書の一部とされる）、ターゲッティング領域は内因性サイクリンインヒビター遺伝子の遺伝子座の中に一時的に組込まれるだけであり、そして選択により宿主ゲノムから排除される。
【００５７】
ターゲッティング領域は内因性サイクリンインヒビター遺伝子の配列に対して実質的に相同である配列からなることができ、および／または非相同配列、例えば、選択可能なマーカー（例えば、neo、tk、gpt）からなることができる。用語「ターゲッティング構築物」は、ポリヌクレオチドが宿主ゲノムの中に組込まれるようになる遺伝子を含むことを必ずしも示さず、また、ポリヌクレオチドが完全な構造遺伝子の配列を含むことを必ずしも示さない。この分野において使用されるように、用語「ターゲッティング構築物」は、本発明において使用する用語「ターゲッティングトランスジーン」と同義である。
【００５８】
用語「相同領域」および「相同クランプ」は、本発明において使用するとき、前以て決定した内因性サイクリンインヒビター遺伝子の配列に実質的に相当するか、あるいは前記配列に対して実質的に相補的であり、前記サイクリンインヒビター遺伝子をフランクする配列を含むことができる、配列を有するターゲッティング構築物のセグメント（すなわち、一部分）を意味する。相同領域は一般に少なくとも約100ヌクレオチドの長さ、好ましくは少なくとも約250〜500ヌクレオチドの長さ、典型的には少なくとも約1000ヌクレオチドまたはそれより大きい長さである。相同組換えを仲介する相同クランプに対して証明された理論的最小の長さは存在しないが、相同組換え効率は一般に相同クランプとともに増加すると考えられる。
【００５９】
同様に、組換え効率はターゲッティング構築物の相同性と内因性標的配列との間の配列の相同性の程度とともに増加し、相同クランプが内因性標的配列と同質遺伝子的であるとき、組換え効率は最適となる。用語「相同クランプ」および「相同領域」は本発明において使用するとき互換的であり、そしてこの分野における同様な用語の矛盾する使用にかんがみて、別の学術用語を明瞭のため提供する。相同クランプは、内因性配列をもつ塩基対のハイブリッド構造の形成を必ずしも含まない。トランスジーンの相同領域に実質的に相当するか、あるいはそれに対して実質的に相補的である内因性サイクリンインヒビター遺伝子の配列は、本明細書において「クロスオーバー標的配列」または「内因性標的配列」と呼ぶ。
【００６０】
本発明において使用するとき、用語「正しくターゲットされた構築物」は、内因性クロスオーバー標的配列内に組込まれたか、あるいはそれに隣接するターゲッティング構築物の部分、例えば、内因性p27遺伝子の遺伝子座の部分を意味する。１または２以上の正しくターゲットされたトランスジーンおよび１または２以上の不正確にターゲットされたトランスジーンの双方を有する細胞を発生させることができる。１または２以上の正しくターゲットされたトランスジーンおよび／または１または２以上の不正確にターゲットされたトランスジーンを有する細胞および動物は、PCRおよび／またはゲノムDNAのサザンブロット分析により同定および解析することができる。
【００６１】
本発明において使用するとき、用語「ターゲッティング領域」は、相同クランプと内因性サイクリンインヒビター遺伝子、例えば、p27遺伝子の配列との間の相同組換え後に、内因性染色体位置の中に組込まれるようになるターゲッティング構築物の部分を意味する。典型的には、ターゲッティング領域は各側において相同クランプによりフランクされ、こうして、相同クランプの各々とそれらの対応する内因性サイクリンインヒビター遺伝子の配列との間の二重クロスオーバー組換えは、ターゲッティング領域による内因性サイクリンインヒビター遺伝子の遺伝子座の部分の置換を生ずる；このような二重クロスオーバー遺伝子置換のターゲッティング構築物において、ターゲッティング領域を「置換領域」と呼ぶことができる。しかしながら、いくつかのターゲッティング構築物は単一の相同クランプのみを使用することができる（例えば、いくつかの「ヒット・アンド・ラン」）型のベクター、Bradley et al.、Bio/Technology 10：534（1992）（引用することによって本明細書の一部とされる）を参照のこと。
【００６２】
用語「因子（agent）」は、本明細書において、化学化合物、化学化合物の混合物、生物学的高分子、または生物学的材料、例えば、細菌、植物、真菌、または動物（特に哺乳動物）の細胞または組織から調製された抽出物を意味するために使用される。
【００６３】
用語「サイクリンインヒビターのノックアウト表現型」は、サイクリンインヒビター遺伝子−／−動物の中に存在し、そして同一条件下に飼育したとき、同一の種、株、性別、および年齢の野生型動物の中に存在しない、表現型の特性（例えば、機能的に不活性化されたサイクリンインヒビターアレレのマウスホモ接合体）を意味する。例は本明細書において記載するもの、例えば、過形成、全体の肥大、細胞過多、および本明細書において言及する他の表現型の特性を包含する。
【００６４】
本発明において使用するとき、「植物」は、全植物、植物の部分、植物の細胞、または植物の細胞のグループを意味する。本発明の方法において使用できる植物のクラスは、一般に、単子葉植物および双子葉植物の双方を包含する、形質転換技術が可能である高等植物のクラスと同様に広い。それは倍数体、二倍体および一倍体を包含する、種々の倍数性レベルの植物を包含する。
【００６５】
「単離された」ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それを天然に伴う他の汚染物質、例えば、タンパク質、脂質、および他のポリヌクレオチド配列から実質的に分離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。この用語は、ポリヌクレオチド配列の天然に存在する環境またはクローンのライブラリーから除去または精製されたポリヌクレオチド配列を包含し、そして組換えまたはクローニングされたＤＮＡ単離物、および化学的に合成された類似体または異種系により生物学的に合成された類似体を包含する。
【００６６】
II．  一般的方法および外観
本発明は、細胞集団をp27活性のインヒビターに暴露することによって、細胞集団中の増殖する細胞の比率を増加する方法および組成物を提供する。p27タンパク質をコードする核酸分子、すなわち、p27遺伝子またはそのRNA転写体に、あるいはp27タンパク質それ自体、またはそのサブユニットに、メディエイターを向けることができる。処理された細胞における細胞周期の進行を可能とし、これにより未処理細胞集団に関して細胞集団中の分裂する細胞の百分率を増加するために十分な条件下にかつ量において、インヒビターを細胞集団に供給する。
【００６７】
生物の大きさおよび成長速度に影響を与えるために、細胞周期の調節のモジュレーションを使用することができる。細胞周期をモジュレートする方法は、サイクリンインヒビターの発現または活性、サイクリンアクチベーターの発現または活性、サイクリンタンパク質の発現およびサイクリン分解のモジュレーションを、例えば、ユビキチン経路、例えば、ヒトCDC34を調節することによって、モジュレートすることを包含する。したがって、１つの面において、p27のモジュレーションは生物の成長速度および大きさに影響を与える。他の面において、サイクリンＥのモジュレーションを使用して、生物の大きさまたは成長速度に影響を与える。本明細書において記載する種々の細胞周期のレギュレーターのモジュレーションを組合わせて、細胞周期の進行速度、こうして生物の大きさまたは成長速度に対する作用を増幅することは有利であることがある。例えば、p27の阻害を他のサイクリンインヒビター、例えば、p21、p57、16、p57、p15、p18、およびp19の阻害と組合わせて、成長速度および大きさを増加することができる。
【００６８】
p27は、前期から中期のG1相において制限点を通る細胞周期の進行を阻害する、約27kDの分子量を有する細胞のタンパク質である。p27はサイクリンE-Cdk2複合体およびサイクリンA-Cdk2複合体に結合しかつそれらの活性を阻害することによって作用する。p27タンパク質の特性決定およびp27タンパク質をコードする遺伝子のクローニングおよび配列決定は、同時継続PCT出願WOPCT/US95/07361号明細書（引用することによって本明細書の一部とされる）にいっそう詳細に記載されている。
【００６９】
p27のインヒビターは、本発明において、サイクリンE-Cdk2複合体およびサイクリンA-Cdk2複合体の活性化を可能とし、かつ細胞分裂を通る細胞周期の進行を確実するために有用である。p27を十分に低いレベルに維持することによって、反復的細胞周期を達成することができる。所定の細胞集団における分裂する細胞の比率が増加するにつれて、なかでも、形質導入の効率は所望の遺伝子産物をコードするウイルスベクターについて増加する。したがって、インヒビターは遺伝子治療の努力を無駄にした障害を克服するために有用である。インヒビターは造血幹細胞の中の分裂する細胞の比率を増加するために有用であり、造血幹細胞は多数の遺伝子治療のプロトコールのための好ましい標的細胞集団を表す。
【００７０】
一般に、以後において使用する命名法および下に記載する細胞培養、分子遺伝学および核酸化学およびハイブリダイゼーションにおける実験室の手法は、この分野においてよく知られておりかつ普通に使用されているものである。組換え核酸法、ポリヌクレオチド合成、細胞培養、およびトランスジーンの組込み（例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション）のために、標準的技術を使用する。一般に、酵素反応、オリゴヌクレオチド合成、および精製工程を製造業者の使用説明書に従い実施する。技術および手法は、一般に、この分野およびこの書類を通じて提供される種々の一般的参考文献における慣用法に従い実施される。本明細書における手法はこの分野においてよく知られていると考えられ、そして読者の好都合のために提供される。その中に含有されるすべての情報は引用することによって本明細書の一部とされる。
【００７１】
キメラのターゲッテッドマウスは、下記の参考文献に従い誘導される：Hogan、et al.、Manupulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory（1988）およびTeratocarcinomas and Embryonic Stem Cells：A Practical Approach、E.J.Robertson編、IRL Press、Washington、D.C.（1987）（これらは引用することによって本明細書の一部とされる）。
【００７２】
胚幹細胞は発表された手法に従い操作される（Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells：A Practical Approach、E.J.Robertson編、IRL Press、Washington、D.C.（1987)；Zjilstra et al.、Nature 342：435-438（1989)；およびSchwartzberg et al.、Science 246:799-803(1989)（それらの各々は引用することによって本明細書の一部とされる）。
【００７３】
オリゴヌクレオチドは、製造業者により提供される使用説明書に従いアプライド・バイオ・システムス（Aplied Bio Systems）のオリゴヌクレオチド合成装置で合成することができる。
【００７４】
一般に、本発明は、非ヒトトランスジェニック生物を発生させるために使用する方法およびポリヌクレオチド構築物を包含し、ここで非ヒトトランスジェニック生物は機能的に不活性化された少なくとも１つの内因性サイクリンインヒビター遺伝子、例えば、p27を有しそして、ある態様において、また、少なくとも１つの発現できる異種サイクリンインヒビター遺伝子を収容する。前述の種々の用途において有用であることに加えて、このような生物は、また、細胞周期の進行の他のメディエイターについてのスクリーニングにおいて有用である。
【００７５】
III ．  遺伝子ターゲッティング
遺伝子ターゲッティングは、哺乳動物のゲノムを修飾するための相同組換えを使用する方法であり、培養した細胞の中に変化を導入するために使用することができる。胚幹（ＥＳ）細胞中の問題の遺伝子をターゲットすることによって、これらの変化を実験室の動物の生殖細胞系の中に導入して、他の使用の中で、全生物に対する修飾の効果を研究することができる。遺伝子ターゲッティング法は、組織培養細胞の中にターゲッティング構築物を導入することによって達成され、ここでターゲッティング構築物はターゲット遺伝子座に対して相同のセグメントを有し、また、意図する配列の修飾（例えば、挿入、欠失、点突然変異）を含む。
【００７６】
次いで、処理された細胞を正確なターゲッティングについてスクリーニングして、適切にターゲットされたものを同定し、単離する。ＥＳ細胞中の遺伝子ターゲッティングにより遺伝子機能を崩壊する普通のスキームは、ＥＳ細胞のゲノム中のその染色体の相手と相同組換えを行うように設計されたターゲッティング構築物を構築することである。典型的には、ターゲッティング構築物は追加の配列、例えば、積極的選択マーカーを標的遺伝子のコーディング因子の中に挿入し、これによりそれを機能的に不活性化するように、ターゲッティング構築物は配置されている。通常、ターゲッティング構築物は挿入型または置換型の構築物である（Hasty et al.(1991)Mol.Cell.Biol. 11:4509（引用することによって本明細書の一部とされる）。
【００７７】
ＩＶ．  内因性サイクリンインヒビター遺伝子のターゲッティング
本発明は、相同組換えターゲッティング構築物を使用する遺伝子ターゲッティングにより不活性化された内因性サイクリンインヒビター遺伝子（すなわち、少なくとも１つのサイクリンインヒビター遺伝子座）を有する非ヒト生物を生産する方法を包含する。典型的には、このような非ヒト生物は少なくとも１つの機能的に不活性化されたサイクリンインヒビター遺伝子を有する。典型的には、ターゲッティング構築物において相同クランプとして使用される領域をフランクするPCRプライマーを生成するベースとして、サイクリンインヒビター遺伝子の配列を使用する。
【００７８】
次いで、PCRプライマーを使用して、高い信頼性のPCR増幅（Maniatis et al.(1991)Nucleic Acids Res. 19:4967；Eckert、K.A.およびKunkel、T.A.(1991)PCR Methods and Applications 1:17；米国特許第4,683,202号（これらは引用することによって本明細書の一部とされる）により、ゲノムのクローンライブラリーからか、あるいはゲノムDNAの調製から、好ましくはターゲッティング構築物でターゲットすべき非ヒト動物の系統からのゲノム配列を増幅する。
【００７９】
次いで、増幅されたDNAを相同クランプおよび／またはターゲッティング領域として使用する。したがって、この分野において入手可能なヌクレオチド配列の情報に基づいておよび／または日常的クローニングにより、本質的任意のサイクリンインヒビター遺伝子をターゲットするための相同クランプを容易に調製することができる。ターゲッティング構築物の構築および選択法に関する一般的原理は、Bradley et al.(1992)Bio/Technology 10:534（引用することによって本明細書の一部とされる）において概観されている。
【００８０】
ターゲッティング構築物を多能性幹細胞、例えば、ネズミ胚幹細胞の中に転移させ、ここでターゲッティング構築物は内因性サイクリンインヒビター遺伝子の遺伝子座の一部分と組換えられ、１または２以上の突然変異（すなわち、挿入、欠失、再配列、配列の置換、および／または点突然変異）をつくり、これらは内因性サイクリンインヒビター遺伝子の機能的発現を防止する。
【００８１】
本発明の好ましい方法は、ターゲッテッド相同組換えにより、内因性サイクリンインヒビター遺伝子の構造的因子を欠失することである。例えば、ターゲッティング構築物を内因性ｐ２７遺伝子と相同的に組換えそして、典型的には１または２以上の対応するエクソンを欠如する置換領域を挿入することによって、１または２以上のエクソンの本質的にすべてをスパンする部分を欠失してエクソン欠失アレレをつくることができる。エクソン欠失アレレについてホモ接合性の非トランスジェニック動物（例えば、互いに対するヘテロ接合体の飼育により）は、機能的内因性p27分子を本質的発現することができない細胞を産生する。同様に、相同的遺伝子ターゲッティングを必要に応じて使用して、内因性サイクリンインヒビター遺伝子の一部分のみを欠失させることによって、サイクリンインヒビター遺伝子を機能的に不活性化することができる。
【００８２】
また、サイクリンインヒビター遺伝子の必須の調節因子、例えば、プロモーター、エンハンサー、スプライス部位、ポリアデニル化部位、および他の調節配列（サイクリンインヒビター構造遺伝子の上流または下流に存在するが、サイクリンインヒビター遺伝子の発現に参加する配列を包含する）を欠失させるために、ターゲッティング構築物を使用することができる。調節因子の欠失は、典型的には、挿入、相同二重クロスオーバー組換え、１または２以上の対応する調節因子を欠如する置換領域により達成される。
【００８３】
本発明の別の好ましい方法は、ポリヌクレオチド配列のターゲッテッド挿入により内因性サイクリンインヒビター遺伝子の必須の構造的および／または調節因子を中断し、これにより内因性サイクリンインヒビター遺伝子を機能的に不活性化することである。例えば、ターゲッティング構築物は内因性p27遺伝子と相同的に組換え、そして相同配列、例えば、neo発現カセットを構造因子（例えば、エクソン）および／または調節因子（例えば、エンハンサー、プロモーター、スプライス部位、ポリアデニル化部位）の中に挿入して、挿入の中断を有するターゲッテッドp27アレレ生成することができる。挿入された配列は約１ヌクレオチド（例えば、エクソン配列中のフレームシフトを生成するために）から数キロ塩基またはそれより大きい大きさの領域であることができ、この大きさは長い非相同置換領域を有するターゲッティング構築物を使用する相同的遺伝子ターゲッティングの効率により制限される。
【００８４】
また、内因性サイクリンインヒビター遺伝子を外因性配列（すなわち、ターゲッティングトランスジーンの一部分）と置換するために、本発明のターゲッティング構築物を使用することができる；例えば、ナンセンスまたはミスセンスの突然変異を含有する実質的に同一の部分と、サイクリンインヒビター遺伝子の第１エクソンを置換することができる。
【００８５】
Ｖ．  ターゲッティング構築物
いくつかの遺伝子ターゲッティング技術が記載されてきており、これらは下記のものを包含するが、これらに限定されない：コエレクトロポレーション、「ヒット・アンド・ラン」、一重クロスオーバー組込み、および二重クロスオーバー組換え（Bradley et al.(1992)Bio/Technology 10:534、引用することによって本明細書の一部とされる）。本発明は、この分野において知られている本質的任意の適用可能な相同遺伝子ターゲッティング戦略を使用して実施することができる。ターゲッティング構築物の立体配置は、選択した特定のターゲッティング技術に依存する。例えば、一重クロスオーバー組込みまたは「ヒット・アンド・ラン」ターゲッティングのためのターゲッティング構築物はターゲッティング領域に連鎖した単一の相同クランプを有することが必要であるだけであるが、二重クロスオーバー置換型ターゲッティング構築物は２つの相同クランプを必要とし、１つは置換領域の各側をフランクする。
【００８６】
例えば、制限されないが、１つの態様は下記の順序で下記のものを含んでなるターゲッティング構築物である：（１）内因性サイクリンインヒビター遺伝子のエクソンの約３キロ塩基の上流内（すなわち、サイクリンインヒビター遺伝子のエクソンの翻訳リーディングフレームに対して反対の方向の）配列と実質的に同一の配列を有する第１相同クランプ、（２）neo遺伝子の転写を推進するｐｇｋプロモーターを有する積極的選択カセットを含んでなる置換領域、（３）内因性サイクリンインヒビター遺伝子の前記エクソンの約３キロ塩基の下流内の配列と実質的に同一の配列を有する第２相同クランプ、および（４）HSVtk遺伝子の転写を推進するHSVtkプロモーターを含んでなる消極的選択カセット。
【００８７】
このようなターゲッティング構築物は二重クロスオーバー置換組換えに適し、この組換えは前記エクソンをスパンする内因性サイクリンインヒビターの遺伝子座の一部分を欠失させ、そしてそれを積極的選択カセットを有する置換領域と置換する。欠失されたエクソンが機能的サイクリンインヒビター遺伝子産物の発現のために必須である場合、生ずるエクソン欠失アレレは機能的に不活性化され、そしてヌルアレレと命名される。
【００８８】
本発明のターゲッティング構築物は、ターゲッティング領域に対するポリヌクレオチド連鎖（すなわち、ホスホジエステル結合による）で連鎖された少なくとも１つの相同クランプを含む。相同クランプは、非ヒト宿主生物の前以て決定した内因性サイクリンインヒビター遺伝子の配列に実質的に相当するか、あるいはそれに対して実質的に相補的である配列を有し、そして前以て決定したサイクリンインヒビター遺伝子をフランクする配列を含むことができる。
【００８９】
遺伝子ターゲッティングのための組換え促進相同クランプのより小さいか、あるいはより大きい境界がこの分野において結論的に決定されたが、相同クランプの最良のモードは約50塩基対〜数10キロ塩基の領域であると考えられる。結局、ターゲッティング構築物は一般に少なくとも50〜100ヌクレオチドの長さ、好ましくは少なくとも約250〜500ヌクレオチドの長さ、より好ましくは少なくとも約1000〜2000ヌクレオチドの長さ、またはそれより大きい長さである。構築物の相同領域（相同クランプ）は、一般に少なくとも50〜100塩基の長さ、好ましくは少なくとも約250〜500塩基の長さ、より好ましくは少なくとも約750〜2000塩基の長さである。
【００９０】
約７〜８キロ塩基の長さの相同領域は好ましいと考えられ、１つの好ましい態様は置換領域の１つの側をフランクする約７キロ塩基の第１相同領域、および前記置換領域の他の側をフランクする約１キロ塩基の第２相同領域を有する。前以て決定した内因性サイクリンインヒビター遺伝子の１または２以上の標的配列の配列の組成および複雑さ、およびこの分野において提供された手引きに基づく実施者の判断により、相同領域の相同性（すなわち、実質的な同一性）の長さを選択することができる（Hasty et al.(1991)Mol.Cell.Biol.11:5586;Shulman et al.(1990)Mol.Cell.Biol.10:4466（これらは引用することによって本明細書の一部とされる）。
【００９１】
前以て決定した配列（例えば、エクソン配列、エンハンサー、プロモーター、イントロン配列、またはサイクリンインヒビター遺伝子の約３〜20kb内のフランキング配列）に実質的に相当するか、あるいはそれに対して実質的に相補的である配列は、相同的対合および実質的に同一の内因性サイクリンインヒビター遺伝子の１または２以上の配列との組換えのための鋳型として働く。ターゲッティング構築物において、このような相同領域は典型的には置換領域をフランクし、この置換領域はターゲッテッド内因性サイクリンインヒビター遺伝子の配列との置換を行うべきターゲッティング構築物の領域である（Berinstein et al.、Mol.Cell.Biol.12:360(1992)（これは引用することによって本明細書の一部とされる）。
【００９２】
したがって、相同領域によりフランクされたターゲッティング構築物のセグメントは、二重クロスオーバー相同組換えにより、内因性サイクリンインヒビター遺伝子の配列のセグメントと置換することができる。相同領域およびターゲッティング領域は慣用の直鎖状ポリヌクレオチド連鎖において一緒に連鎖される（５’→３’ホスホジエステル主鎖）。ターゲッティング構築物は、一般に二本鎖ＤＮＡ分子、最も通常には直鎖状である。
【００９３】
相同組換えまたは遺伝子変換のいかなる特定の理論にも拘束されたくないが、このような二重クロスオーバー置換組換えにおいて、第１ターゲッティング構築物の相同領域と第１内因性サイクリンインヒビター遺伝子の配列との間の第１相同組換え（例えば、鎖の交換、鎖の対合、鎖の切断、鎖の結合）は、第２ターゲッティング構築物の相同領域と第２内因性サイクリンインヒビター遺伝子の配列との間の第２相同組換えにより達成され、これにより第１および第２の内因性サイクリンインヒビター遺伝子の配列の間に位置した内因性サイクリンインヒビター遺伝子の一部分を置換する２つの相同領域を生ずる。
【００９４】
この理由で、相同領域は一般に同一向きにおいて使用される（すなわち、上流方向は各相同領域について同一であって再配列を回避する）。したがって、二重クロスオーバー置換組換えを使用して、内因性サイクリンインヒビター遺伝子の一部分を欠失し、付随的に非相同部分（例えば、neo遺伝子発現カセット）を対応する染色体位置に転移させることができる。また、二重クロスオーバー組換えを使用して、内因性染色体部分を欠失しないで、非相同部分を内因性サイクリンインヒビター遺伝子の中に付加することができる。
【００９５】
しかしながら、内因性サイクリンインヒビター遺伝子の中に非相同部分を転移させないで、内因性遺伝子配列の一部分を欠失させるために二重クロスオーバー組換えを単に使用することができる（Jasin et al.(1988) Genes Devel. 2:1353を参照のこと）。非相同部分から上流および／または下流に、二重クロスオーバー相同組換えが起こったかどうかの同定を提供する遺伝子が存在することができる；このような遺伝子は典型的には消極的選択のために使用できるｔｋ遺伝子である。
【００９６】
積極的選択発現カセットは、積極的選択発現カセットをスパンするターゲッティングトランスジーン配列を組込んだ細胞を選択する手段を提供する選択可能なマーカーをコードする。消極的選択発現カセットは、消極的選択発現カセットの組込まれたコピーをもたない細胞を選択する手段を提供する選択可能なマーカーをコードする。したがって、積極的マーカーの存在および消極的マーカーの非存在について選択することによって、組合わせの積極的−消極的選択プロトコールにより、相同置換組換えを行い、そして染色体位置の中に相同領域（すなわち、置換領域）の間のトランスジーンの一部分を組込んだ細胞を選択することが可能である。また、選択可能なマーカーは典型的にはヒット・アンド・ランターゲッティング構築物および選択スキームのために使用される（ValanciusおよびSmithies、op.cit.、引用することによって本明細書の一部とされる）。
【００９７】
典型的には、発現カセットは、ターゲッテッド宿主細胞上の選択可能な表現型、およびポリアデニル化シグナルを付与するタンパク質またはポリペプチドをコードする構造配列に連鎖したターゲッテッド宿主細胞（例えば、ES細胞）中で操作的であるプロモーターを含む。発現カセットの中に含まれるプロモーターは、構成的、細胞型特異的、段階特異的、および／またはモジュレート可能（例えば、ホルモン、例えば、グルココルチコイド；MMTVプロモーターにより）であることができるが、選択の前におよび／または間に発現される。発現カセットは、典型的にはプロモーターの上流にかつ約３〜10キロ塩基内に連鎖した、１または２以上のエンハンサーを操作的に含むことができる。
【００９８】
しかしながら、１または２以上のターゲッテッド内因性部位における相同組換えが機能的内因性プロモーターの下流に非相同配列を配置するとき、ターゲッティング構築物の置換領域は選択可能なマーカーをコードする構造配列のみを含み、そして転写を推進するために内因性プロモーターに頼ることが可能である（Doetschman et al.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:8583、引用することによって本明細書の一部とされる）。同様に、ターゲッテッド内因性部位付近に位置する内因性エンハンサーは、エンハンサーを含まないターゲッティング構築物においてトランスジーン配列の転写を増強することに頼ることができる。
【００９９】
本発明の好ましい発現カセットは、選択可能な薬物耐性マーカーおよび／またはＨＳＶチミジンキナーゼ酵素をコードしかつ発現する。適当な薬物耐性遺伝子は、例えば、下記のものを包含する：gpt（キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）、これはミコフェノール酸で選択することができる；neo（ネオマイシンリン酸転移酵素）、これはG418またはヒグロマイシンを使用して選択することができる；およびDFHR（ジヒドロフォレートリダクターゼ）、これはメトトレキセートを使用して選択することができる（MulliganおよびBerg(1981) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 78:2072;SouthernおよびBerg（1982) J .Mol. Appl .Genet. 1:327、これらは引用することによって本明細書の一部とされる）。
【０１００】
正しくターゲットされた組換え体についての選択は、一般に、少なくとも積極的選択を使用し、ここで非相同発現カセットは内因的に組込まれた発現カセットを有するターゲッテッド細胞に選択可能な表現型を付与する機能的タンパク質（例えば、neoまたはgpt）をコードしかつ発現するので、選択因子（例えば、G418またはミコフェノール酸）の添加により、ターゲッテッド細胞は組込まれた発現カセットをもたない細胞を越えた生長または生存の利点を有する。
【０１０１】
正しくターゲットされた組換え体についての選択は、また、消極的選択を使用することができるので、トランスジーンの非相同組込みのみを有する細胞をそれに対して選択することが好ましい。典型的には、このような消極的選択はトランスジーンの中に位置する単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（HSVtk）をコードする発現カセットを使用するので、それは非相同組換えによってのみ組込むであろう。このようなポジショニングは、相同領域の二重クロスオーバー置換組換えが積極的選択カセットを染色体位置に転移するが、HSVtk遺伝子（または消極的選択カセット）を染色体位置に転移しないように、組換え促進相同領域に対して遠位にHSVtk発現カセット（または他の消極的選択カセット）を連鎖することによって達成される。
【０１０２】
ヌクレオシド類似体のガンシクロビールは、ＨＳＶｔｋを発現する細胞に対して優先的に毒性であり、組込まれたHSVtk発現カセットをもたない細胞を選択するので、消極的選択因子として使用することができる。また、FIAUを選択因子として使用して、ＨＳＶｔｋを欠如する細胞について選択することができる。
【０１０３】
不正確に組込まれたターゲッティング構築物の配列を有する細胞のバックグラウンドを減少するために、組合わせの積極的−消極的選択スキームが典型的には使用される（Mansour et al. (1998) op.cit.、引用することによって本明細書の一部とされる）。積極的−消極的選択は２つの活性選択カセットの使用を包含する：（１）積極的なもの（例えば、neo遺伝子）、これはランダム組込みまたは相同ターゲッティング後に安定に発現することができる、および（２）消極的なもの（例えば、HSVtk遺伝子）、これはランダム組込み後にのみ安定に発現することができ，そして正しくターゲットされた二重クロスオーバー相同組換え後に発現させることができない。積極的および消極的の双方の選択工程を組合わせることによって、トランスジーンと内因性サイクリンインヒビター遺伝子との間の正しくターゲットされた相同組換えを得ることができる。
【０１０４】
一般に、本発明のターゲッティング構築物は下記のものを含む：（１）宿主細胞の内因性サイクリンインヒビター遺伝子の配列と実質的に同一である２つの相同領域によりフランクされた積極的選択発現カセット，および（２）遠位の消極的選択発現カセット。しかしながら、積極的選択発現カセットのみを含むターゲッティング構築物を使用することもできる。典型的には、ターゲッティング構築物は、プロモーター、例えば、HSVtkプロモーターまたはpgkプロモーターの下流に（すなわち、翻訳リーディングフレームの向きにおいてコードされたポリペプチドのカルボキシ末端に向かって）neo遺伝子を含む積極的選択発現カセットを含有するであろう。より典型的には、ターゲッティングトランスジーンは、また、HSVtkプロモーターの下流に連鎖されたＨＳＶｔｋ遺伝子を含む消極的選択発現カセットを含有するであろう。
【０１０５】
本発明のターゲッティング構築物は、１または２以上の前以て決定した標的内因性DNA配列に対して高度に相同性であり、好ましくは同質遺伝子的（すなわち、同一配列）である相同領域を有することが好ましい。遺伝子ターゲッティング手法において使用されるES細胞の源である非ヒト哺乳動物の系統からのゲノムDNAのゲノムのクローニングまたは高い忠実度のPCR増幅により、同質遺伝子的またはほぼ同質遺伝子的である配列を得ることができる。したがって、相同領域の長さおよび配列の相同性の程度の双方は特定の前以て決定した配列を参照することによってのみ決定することができるが、相同領域は一般に少なくとも約50ヌクレオチドの長さでなくてはならず、また、前以て決定した内因性標的配列に実質的に相当するか、あるいはそれに対して実質的に相補的でなくてはならない。
【０１０６】
好ましくは、相同領域は少なくとも約100ヌクレオチドの長さであり、そしてサイクリンインヒビター遺伝子の中に存在するか、あるいはそれをフランクする前以て決定した標的配列に実質的に相当するか、あるいはそれに対して実質的に相補的である。正しくターゲットされた相同組換えを高い効率で発生しようとする場合、少なくとも１つの相同領域は同質遺伝子的である（すなわち、内因性サイクリンインヒビター遺伝子の１または２以上のクロスオーバー標的配列と同一である正確な配列を有する）ことが好ましく、そして同質遺伝子的相同領域はターゲッテッド内因性サイクリンインヒビター配列を置換すべき外因性ターゲッティング構築物の配列をフランクすることがより好ましい。
【０１０７】
一般に、任意の前以て決定した内因性サイクリンインヒビターの遺伝子座は、ターゲッティングトランスジーンとの相同組換え（これは遺伝子変換を含む）により変更可能であり、ここでターゲッティングトランスジーンは少なくとも１つの相同領域を有し、前記相同領域は前記前以て決定した内因性サイクリンインヒビター遺伝子の配列を有する哺乳動物細胞中の前以て決定した内因性サイクリンインヒビター遺伝子の遺伝子座の配列に実質的に相当するか、あるいはそれに対して実質的に相補的である。
【０１０８】
典型的には、ターゲッティングトランスジーンは１または２以上の前以て選択したターゲッテッド配列の中に存在しない配列（すなわち、非相同部分）を有し、前記配列は単一のミスマッチのヌクレオチド程度に小さいか、あるいは約数キロ塩基までか、あるいはそれより大きい非相同配列をスパンすることができる。置換、付加、および欠失は１ヌクレオチド程度に小さいか、あるいは約２〜10キロ塩基までか、あるいはそれより大きい範囲であることができる。ターゲッティングトランスジーンを使用して細胞、例えば、ネズミＥＳ細胞中の１または２以上のサイクリンインヒビター遺伝子を不活性化することができ、そしてこのような不活性化された遺伝子を収容するトランスジェニック非ヒト生物を生産することができる。
【０１０９】
修飾すべき１または２以上の特定のサイクリンインヒビター遺伝子がいったん選択されると、それらの配列を可能な崩壊部位について走査する。問題のサイクリンインヒビター遺伝子の中に欠失または挿入をもつ適当な大きさの構築物の置換配列と、内因性標的ＤＮＡ配列に実質的に相当するか、あるいはそれに対して実質的に相補的であるフランキング相同領域の少なくとも１つとを含有するように、プラスミドを操作する。典型的には、２つのフランキング相同領域を使用し、各々は置換領域の配列の各側に存在する。例えば、本発明を限定しないが、１つの相同領域はネズミp27の第１エクソンの上流（すなわち、１または２以上の転写開始部位に向かう方向）の配列と実質的に同一であることができ、そして第２の相同領域はネズミp27の第２エクソンの下流の配列と実質的に同一であることができる。
【０１１０】
本発明の方法は、宿主芽細胞の中に注入後にトランスジェニック非ヒト動物を発生させるために使用できる多能性幹細胞系統の中に、ターゲッティングトランスジーンを転移させることである。本発明の１つの態様において、p27遺伝子のターゲッティング構築物は積極的（例えば、neo）および、必要に応じて、消極的（例えば、HSVtk）の双方の選択発現カセットを含有する。エレクトロポレートしたＥＳ細胞の生活可能性を維持するために適当な条件下に、p27ターゲッティングトランスジーンをマウスＥＳ細胞の中に転移させる（例えば、エレクトロポレーションにより）。
【０１１１】
エレクトロポレートされたＥＳ細胞を、積極的選択の選択的条件（例えば、G418の選択的濃度）下に培養し、必要に応じて、同時にまたは順次に、消極的選択の選択的条件（例えば、ガンシクロビールまたはFIAUの選択的濃度）下に培養する。次いで、選択された細胞は、この分野において知られている標準的PCRまたはサザンブロッティング法に従うPCR分析により、正しくターゲットされたターゲッティングトランスジーンの組換えを有するとして確認される（米国特許第4,683,202号; Erlich et al.、Science 252:1643 (1991）、これらは引用することによって本明細書の一部とされる）。次いで、正しくターゲットされたES細胞を、この分野において知られている方法に従い、キメラ非トランスジェニック動物を発生させるために適当な芽細胞の宿主の中に移す（Capecchi, M. (1989) op.cit.、引用することによって本明細書の一部とされる）。
【０１１２】
簡単に述べると、本発明は、細胞周期の調節、例えば、サイクリンインヒビター遺伝子、通常p27遺伝子の不活性化を包含する。１つの例の範囲内で、マウスサイクリンインヒビター遺伝子（例えば、p27遺伝子）の変更されたコピーを含有するDNA構築物を胚幹細胞の核の中に導入する。細胞の一部分において、導入されたDNAはマウス遺伝子の内因性コピーと組換え、それを変更されたコピーと置換する。新しく操作された遺伝的欠陥を含有する細胞を宿主マウスの胚の中に注入し、この胚をレシピエントの雌の中に再移植する。これらの胚のあるものはキメラマウスに発育し、このマウスは突然変異の細胞系統に由来する胚芽細胞を有する。したがって、キメラマウスを飼育することによって、導入された遺伝的欠陥を含有するマウスの新しい系統を得ることが可能である（Capecchi, M. (1989) op.cit.において概観されている）。
【０１１３】
１例において、ネズミp27Kip1遺伝子を崩壊するために、マウスβ２−ミクログロブリン遺伝子の成功した崩壊にJaenischおよび共同研究者らが使用した設計に基づくターゲッティング構築物（Zjilstra et al. (1989) op.cit.）を使用することができる。プラスミドpMC1NEOからのネオマイシン耐性遺伝子（neo）を、標的bc1-2遺伝子のコーディング配列の中に挿入する。pMC1NEOインサートはハイブリッドのウイルスのプロモーター／エンハンサー配列を使用して、neo発現を推進する。このプロモーターは胚幹細胞において活性である。したがって、neoをノックアウト構築物の組込みのための選択可能なマーカーとして使用することができる。HSVチミジンキナーゼ（tk）遺伝子を、ランダム挿入事象に対する消極的選択マーカーとして、構築物の末端に付加する（Zjilstra、et al.、op.cit.）。
【０１１４】
ターゲッティング構築物を含有するベクターを典型的には大腸菌（E. coli）中で増殖させ、次いで標準的微生物学的方法を使用して単離するか、あるいはオリゴヌクレオチドとして合成することができる。原核または真核ベクターを必要としない直接的ターゲッテッド不活性化を実施することもできる。ターゲッティングトランスジーンを、任意の適当な技術、例えば、なかでも、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、バイオリスチクス（biolistics）、リン酸カルシウム沈澱法、およびウイルスをベースとするベクターにより、宿主細胞の中に転移させることができる。哺乳動物細胞を形質転換するために使用する他の方法は、ポリブレン、プロトプラスト融合、およびその他の使用を包含する（一般に、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、1989、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、これは引用することによって本明細書の一部とされる、を参照のこと）。
【０１１５】
１または２以上の修飾された標的遺伝子配列のみを含有し、ベクター配列をもたない、線状化トランスジーンを用いるトランスフェクション技術を使用することが好ましい。修飾された遺伝子部位は、外因性ターゲッティング構築物と内因性DNA標的配列との間の相同組換えを注意して選択したプライマーおよびPCRを使用するか、あるいはサザンブロット分析により同定し、次いで分析により所望のターゲッテッド事象に対して特異的なＰＣＲ生成物またはサザンブロットのバンドが存在するかどうかを検出することができるようなものである（Erlich et al. (1991) op.cit.）（これは引用することによって本明細書の一部とされる）。
【０１１６】
いくつかの研究において、所望のトランスフェクトされた細胞系統を首尾よく同定するためにＰＣＲが既に使用された（ZimmerおよびGruss(1988) Nature 338: 150； Mouellic et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 87:4712； Shesely et al. (1991) Proc. Natl. Acad.Sci. 88: 4294、これらは引用することによって本明細書の一部とされる）。１または２以上の外因性ターゲッティングトランスジーンを受け取る細胞の数が大きく、そしてターゲッテッド細胞集団を拡張させるとき、このアプローチは非常に有効である（Capecchi, M. (1989) op.cit.、引用することによって本明細書の一部とされる）。
【０１１７】
トランスジェニック非ヒト生物（これは相同的にターゲットされた非ヒト動物を包含する）を作るために、胚幹細胞（ＥＳ細胞）は好ましい。本質的に記載されているように（Robertson, E.J. (1987）、Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:A Practical Approach、E.J.Robertson編（Oxford: IRL Press) p.71-112）有糸分裂的に不活性なSNL76/7細胞フィーダー層上で増殖されたネズミES細胞、例えば、AB-1系統（McMahonおよびBradley、Cell 62: 1073-1085 (1990)）を相同遺伝子のターゲッティングに使用することができる。
【０１１８】
他の適当なES系統は下記のものを包含するが、これらに限定されない：E14系統（Hooper et al. (1987) Nature326: 292-295）、D3系統（Doetschman et al. (1985) J.Embyrol.Exp.Morph. 87: 27-45）、およびCCE系統（Robertson et al. (1986) Nature 323: 445-448）。特定のターゲッテッド突然変異を有するＥＳ細胞からのマウス系統の発生の成功は、ＥＳ細胞の多能性に依存する（すなわち、いったん宿主芽細胞の中に注入されたとき、胚形成に参加し、そして生ずる動物の生殖細胞に寄与するそれらの能力）。
【０１１９】
注入されたＥＳ細胞を含有する芽細胞を、偽妊娠非ヒト雌の子宮中で発育させ、キメラマウスとして誕生する。得られるトランスジェニックマウスは、不活性化された内因性サイクリンインヒビターの遺伝子座を有する細胞についてキメラであり、戻し交雑されており、そして子孫の尾の生検についてのPCRまたはサザンブロット分析により、１または２以上の正しくターゲットされたトランスジーンの存在についてスクリーニングして、１または２以上の不活性化されたサイクリンインヒビター遺伝子座のトランスジェニックマウスのヘテロ接合体を同定する。
【０１２０】
適当な交雑を実施することによって、多数の機能的に不活性化されたサイクリンインヒビター遺伝子座のための、およびまた、異種サイクリンインヒビタータンパク質をコードするトランスジーンのための、トランスジェニック非ヒト動物のホモ接合体を生産することができる。このような非トランスジェニック動物は、内因性サイクリンインヒビター遺伝子産物を実質的に作ることができない。これらの理由で、このような非トランスジェニック動物は異種サイクリンインヒビタータンパク質をコードするトランスジーン、例えば、マウスのゲノムの中に組込まれたヒトp27をコードするトランスジーンを導入するための、満足すべき宿主である。
【０１２１】
内因性マウスサイクリンインヒビター遺伝子座の不活性化は、マウス胚幹細胞中の相同組換えによる適当な遺伝子のターゲッテッド崩壊により達成される。不活性化のために、標的サイクリンインヒビター遺伝子の遺伝子座の中に遺伝的変更を生成して、その遺伝子座の機能的遺伝子産物の有効な発現を防止する、任意のターゲッティングトランスジーンを使用することができる。調節因子のみをターゲットする場合、ターゲッテッド遺伝子の多少の低いレベルの発現が起こることがある（すなわち、ターゲッテッドアレレは「漏失性」である）が、発現のレベルは漏失性ターゲッテッドアレレが機能的に不活性化されるように、十分に低いレベルであることがある。
【０１２２】
VI．ノックアウト動物
本発明の１つの態様において、非ヒト宿主における内因性サイクリンインヒビター遺伝子は、異種サイクリンインヒビター遺伝子のセグメントを含まないターゲッティング構築物を使用する相同組換えにより機能的に不活性化される。この態様において、ターゲッティング構築物の一部分は内因性サイクリンインヒビター遺伝子の遺伝子座の必須の構造的因子または調節因子の中に組込み、これによりそれを不活性化してヌルアレレを発生させる。典型的には、ターゲッティング構築物の相同クランプと内因性サイクリンインヒビター遺伝子の配列との相同組換えにより、選択可能なマーカー（例えば、neo遺伝子の発現カセット）をコードする非相同配列をサイクリンインヒビター遺伝子の必須の構造的および／または調節の配列の中に組込むことによって、ヌルアレレは産生されるが、他の戦略（下を参照のこと）を使用することができる。
【０１２３】
最も通常には、ターゲッティング構築物をエレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションにより全能性胚幹（ES）細胞系統、例えば、ネズミAB-1またはCCE系統の中に転移させる。ターゲッティング構築物はサイクリンインヒビター遺伝子の遺伝子座の中に存在するか、あるいはそれをフランクする内因性配列と相同的に組換え、サイクリンインヒビター遺伝子の少なくとも１つのアレレを機能的に不活性化する。典型的には、ターゲッティング構築物と内因性サイクリンインヒビターの遺伝子座の配列との相同組換えは、選択可能なマーカー、例えば、neoを、通常、積極的選択カセットの形態で、コードしかつ発現する非相同配列の組込みを生ずる（下を参照のこと）。機能的に不活性化されたアレレはサイクリンインヒビターのヌルアレレと命名される。
【０１２４】
選択可能なマーカーを発現する細胞の優先的増殖を許す培地中で細胞を増殖させることによって、少なくとも１つのサイクリンインヒビターのヌルアレレを有するES細胞を選択する。選択されたES細胞をPCR分析および／またはサザンブロット分析により検査して、正しくターゲットされたサイクリンインヒビターのアレレの存在を確かめる。ヌルアレレのヘテロ接合体である非ヒト動物の飼育を実施して、前記ヌルアレレの非ヒト動物のホモ接合体、いわゆる「ノックアウト」動物を生産することができる（Donehower et al. (1992) Nature 56: 215; Science 256: 1392、引用することによって本明細書の一部とされる）。
【０１２５】
また、組込まれた選択可能なマーカーを有するヌルアレレのES細胞のホモ接合体を、高いレベルの選択因子（例えば、G418またはヒグロマイシン）を含有する培地中の選択により、培養において生産することができる。選択されたES細胞クローンのアリコートからおよび／または尾の生検から単離されたDNAのPCR分析および／またはサザンブロット分析により、正しくターゲットされたヌルアレレのヘテロ接合性および／またはホモ接合性を確認することができる。
【０１２６】
必要に応じて、異種サイクリンインヒビタータンパク質をコードするトランスジーンを、サイクリンインヒビターのヌルアレレを有する非ヒト宿主の中に、好ましくはヌルアレレのホモ接合体である非ヒトES細胞の中に転移させることができる。一般に、トランスジーンは、機能的異種サイクリンインヒビター遺伝子産物をコードする構造的配列の発現を推進するプロモーターまたはエンハンサーを含むことが好都合である。したがって、例えば、限定されないが、p27Kip1遺伝子座におけるヌルアレレに対してホモ接合性のノックアウトマウスは、機能的ヒトｐ２７タンパク質をコードしかつ発現するトランスジーンの宿主であることが好ましい。
【０１２７】
機能的に不活性化されたサイクリンインヒビター遺伝子、例えば、構造的に崩壊されたp27遺伝子の生殖細胞系コピーを含む非ヒト動物が生産される。好ましくは、ノックアウト動物は、機能的に不活性化されたサイクリンインヒビター遺伝子に対してホモ接合性である。
【０１２８】
サイクリンインヒビター遺伝子産物の模倣物（すなわち、CDK阻害活性を有する；サイクリンインヒビター遺伝子のノックアウトのバックグラウンドにおいて遺伝子機能を置換することができる）またはサイクリンインヒビターのアゴニスト（すなわち、ホモ接合体において内因性p27の機能を増強する）またはサイクリンインヒビターのアンタゴニスト（すなわち、ホモ接合体において残留p27機能を阻害する）である因子を同定する方法において、ノックアウト生物を使用することができる。機能的サイクリンインヒビターのアレレを欠如するトランスジェニック非ヒト動物は、全動物のサイクリンインヒビターのノックアウト表現型を定める。
【０１２９】
サイクリンインヒビターのノックアウト動物に投与したとき、全動物のサイクリンインヒビターのノックアウト表現型を逆転できる（すなわち、正常の、非ノックアウト動物の表現型の特性への逆転を誘発できる）因子は、サイクリンインヒビターの模倣物として同定される。動物に投与したとき、全動物のサイクリンインヒビターのノックアウト表現型を逆転でき（すなわち、正常の、非ノックアウト動物の表現型の特性への逆転を誘発でき）、減少したインヒビター機能（例えば、部分的サイクリンインヒビターのノックアウトまたは減少したサイクリンインヒビターの発現の動物；例えば、半接合性または部分的アンチセンス抑制による）を含む因子は、サイクリンインヒビターのアゴニストとして同定される。
【０１３０】
正常の、非ノックアウト動物に投与したとき、全動物のサイクリンインヒビターのノックアウト表現型を誘発できる（すなわち、サイクリンインヒビター−ノックアウト動物の表現型特性を誘発できる）因子は、サイクリンインヒビターのアンタゴニストとして同定される。これらのタイプの因子を、細胞増殖のコントロールに関係する他の使用の中で、バイオテクノロジーの工業および研究所に販売できる商用実験室用試薬（特許された制限エンドヌクレアーゼ、PCR試薬、およびその他に類似する）として使用して、形態学的生長の調節のための細胞増殖をコントロールして動物の大きさおよび体の特性をコントロールし、異常な細胞増殖の疾患（腫瘍形成、過形成、炎症、およびその他）を治療または予防することができる。
【０１３１】
細胞増殖のコントロール経路が弱体化した動物を代表するノックアウト動物に対する被験因子の毒物学的評価のために、サイクリンインヒビター遺伝子、例えば、p27のノックアウトアレレを含む非ヒト動物を商業的に使用することができる。本発明のサイクリンインヒビター遺伝子のノックアウトは、細胞増殖が増強し、そして正常の（非ノックアウト）動物に比較して、発育する細胞増殖のコントロールに疾患にかかりやすい動物を生ずる。
【０１３２】
このような遺伝子のノックアウト動物は、細胞増殖のコントロールを行うか、あるいはそれに影響を与える化合物の同定を包含するが、これらに限定されない多数の用途を有する；１つの変法において、因子はこれにより毒物学的危険として同定される。細胞増殖をモジュレートする因子を開発するために、ノックアウト動物を使用することもできる；このような因子は細胞増殖に関係する疾患、例えば、新形成または過形成（例えば、BPH）を治療する治療剤として働くことができる。本発明のノックアウト動物は、また、細胞増殖に関係する病理学的症状（例えば、ALS、アルツハイマー病、エイズ、およびその他）のための疾患のモデルとして働くことができる。
【０１３３】
VII ．内因性サイクリンインヒビターの遺伝子座の発現の抑制
抑制は内因性サイクリンインヒビターの遺伝子座の発現を防止する別の方法である。１または２以上の組込まれたトランスジーンから生産されたアンチセンスRNAを使用して、アンチセンスオリゴヌクレオチドにより、および／またはサイクリンインヒビター遺伝子産物を不活性化する細胞内ポリペプチドの発現により、内因性サイクリンインヒビター遺伝子の抑制をすることができる。
【０１３４】
VIII．アンチセンスポリヌクレオチド
アンチセンスＲＮＡトランスジーンを使用して、特定の遺伝子の発現を部分的または完全にノックアウトすることができる（Pepin et al. (1991 )Nature 355: 725; Helene.,C.およびToulme, J.(1990) Biochemica Biophys. Acta 1049: 99; Stout、J.およびCaskey, T. (1990) Somat. Cell Mol.Genet. 16: 369; Munir et al. (1990) Somat.Cell Mol. Genet. 16: 383、それらの各々は引用することによって本明細書の一部とされる）。
【０１３５】
「アンチセンスポリヌクレオチド」は、下記のようなポリヌクレオチドである：（１）参照配列、例えば、内因性サイクリンインヒビター遺伝子の領域の配列のすべてのまたは一部分に対して相補的である、そして（２）相補的標的配列、例えば、染色体遺伝子の遺伝子座またはmRNAに特異的にハイブリダイゼーションする。このような相補的アンチセンスポリヌクレオチドは、関係する標的配列に対する特異的ハイブリダイゼーションがポリヌクレオチドの機能的性質として保持されるかぎり、ヌクレオチドの置換、付加、欠失、または転移を含むことができる。
【０１３６】
相補的アンチセンスポリヌクレオチドは、個々のｍＲＮＡ種に対して特異的にハイブリダイゼーションし、そしてmRNA種の転写および／またはRNAのプロセシングおよび／またはコードされたポリペプチドの翻訳を防止する可溶性アンチセンスRNAまたはDNAオリゴヌクレオチドを包含する（Ching et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 10006-10010 (1989)； Broder et al.、Ann. Int. Med. 113: 604-618 (1990)； Loreau et al.、FEBS Letters 274:53-56 (1990); Holcenberg et al.、WO91/11535; U.S.S.N.07/530,165 (″New humanCRIPTO gene″）； WO91/09865； WO91/04753; WO91/13641;およびEP386563、それらの各々は引用することによって本明細書の一部とされる）。
【０１３７】
アンチセンス配列は、少なくとも約11隣接ヌクレオチド長さ、典型的には少なくとも約20〜30ヌクレオチド長さ、好ましくは約30より大きいヌクレオチド長さの少なくとも１つのサイクリンインヒビター遺伝子の配列に対して相補的である。しかしながら、ある態様において、特定のハイブリダイゼーションがアンチセンスポリヌクレオチドの性質として保持されるかぎり、相補的サイクリンインヒビター遺伝子の配列に比較して、アンチセンス配列は置換、付加、または欠失を有することができる。
【０１３８】
一般に、サイクリンインヒビター遺伝子産物をコードするか、あるいはDNAの再配列後にサイクリンインヒビター遺伝子産物をコードする潜在的能力を有する、内因性サイクリンインヒビター遺伝子の配列に対して、アンチセンス配列は相補的である。ある場合において、サイクリンインヒビター遺伝子の配列に相当するセンス配列は、特に転写を妨害することによって、発現を抑制する機能することができる。
【０１３９】
したがって、アンチセンスポリヌクレオチドは１または２以上のコードされたポリペプチドの産生を阻害する。これに関して、１または２以上の内因性サイクリンインヒビターの遺伝子座の転写および／または翻訳を阻害するアンチセンスポリヌクレオチドは、非ヒト生物の能力および／または特異性を変更して、内因性サイクリンインヒビターの遺伝子座によりコードされるサイクリンインヒビター遺伝子産物を産生し、これにより変更された細胞増殖の表現型を示すことができる。
【０１４０】
アンチセンスポリヌクレオチドは、トランスフェクタント細胞またはトランスジェニック細胞、例えば、個体の幹細胞集団のすべてまたは一部分を再構成するために使用されるトランスジェニック多能性造血幹細胞、の中の異種発現カセットから生産することができるか、あるいはトランスジェニック非ヒト動物のゲノムの中に組込まれた（またはそうでなければエピソーム的に複製された）生殖細胞系のコピーとして生産することができる。また、アンチセンスポリヌクレオチドは、in vitroの培地中で、あるいはin vivoの循環系または間質の流体中で、外部環境に投与される可溶性オリゴヌクレオチドを含んでなることができる。
【０１４１】
外部環境の中に存在する可溶性アンチセンスポリヌクレオチドは細胞質へのアクセスを獲得し、そして特定のmRNA種の翻訳を阻害する。ある態様において、アンチセンスポリヌクレオチドはメチルホスホネート成分を含み、交互にホスホロチオレートまたはＯ−メチルリボヌクレオチドを使用することができ、そしてキメラオリゴヌクレオチドを使用することもできる（Dagle et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18: 4751）。ある用途のために、アンチセンスオリゴヌクレオチドはポリアミド核酸を含むことができる（Nielsen et al.(1991) Science 254: 1497）。アンチセンスポリヌクレオチドに関係する一般的方法については、下記の参考文献を参照のこと： Antisense RNA and DNA、（1988）、D.A.Melton編、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY）。
【０１４２】
可溶性アンチセンスオリゴヌクレオチドとして、あるいはアンチセンスＲＮＡとして、アンチセンストランスジーンから転写されたかどうかにかかわらず、ｉｎ  ｖｉｖｏの生理的条件において内因性サイクリンインヒビター遺伝子の配列に対して優先的にハイブリダイゼーションするように、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを選択する。
本発明のポリヌクレオチドは植物ゲノムの中に導入するためのアンチセンスベクターまたはセンス抑制構築物として働くことができるか、あるいは植物ゲノムの中に天然に存在するサイクリンインヒビター遺伝子座以外の位置に、あるいは天然に存在するサイクリンインヒビター遺伝子座の代わりに組込まれることができる（例えば、置換相同組換えにより）。
【０１４３】
IX．  サイクリンインヒビターのトランスジーン
内因性サイクリンインヒビター遺伝子および／またはコードされたタンパク質の発現はアンチセンス抑制および／または関係する方法により阻害することができるが、本発明は、また、サイクリンインヒビター遺伝子産物またはその変異体をコードしそして、適当な動物または植物ゲノムの中に導入されるとき、宿主動物または植物において機能的サイクリンインヒビタータンパク質として発現されるポリヌクレオチドを提供する。
【０１４４】
サイクリンインヒビター遺伝子産物の発現または過度の発現のために、検出可能なＣＤＫ阻害活性を有するサイクリンインヒビターのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、p27）を、必要に応じて発現のために適当な形態で、適当な動物または植物のゲノムの中に導入される。典型的には、翻訳可能なmRNAが究極的に産生されるように（すなわち、一次転写体のＲＮＡスプライシングがある態様において要求される）、サイクリンインヒビターをコードするポリヌクレオチドは、サイクリンインヒビターをコードする配列の転写を推進することができる転写調節配列（例えば、プロモーター、任意のエンハンサー、ポリアデニル化配列、およびその他）に作用可能に連鎖されている。
【０１４５】
変法において、生ずる内因性染色体遺伝子座が、内因性プロモーターと作用可能な連鎖にあるサイクリンインヒビターをコードするポリヌクレオチドと、必要に応じて内因性ポリアデニル化配列および転写停止配列とを含んでなるように、サイクリンインヒビターをコードするポリヌクレオチドを、相同組換え遺伝子のターゲッティングにより、ゲノム中の作用可能な内因性プロモーターに隣接する位置の中にターゲットすることができる。
【０１４６】
ある態様において、サイクリンインヒビターをコードするポリヌクレオチドは全長のサイクリンインヒビタータンパク質をコードすることができるが、トランケーテッド変異体または他の欠失、付加、または置換の変異体を使用することができる。ある態様において、サイクリンインヒビターをコードするポリヌクレオチドは融合タンパク質をコードし、前記融合タンパク質は融合相手の配列、例えば、サイクリンインヒビター遺伝子以外の天然に存在する遺伝子の配列にポリペプチド連鎖した全長のサイクリンインヒビタータンパク質またはその活性部分からなる。
【０１４７】
典型的には転写調節配列（例えば、プロモーター）に作用可能に連鎖しかつ発現が可能であるサイクリンインヒビターをコードするポリヌクレオチドを、適当な動物（例えば、非ヒト哺乳動物、魚類、爬虫類、鳥類）または植物の変種（例えば、コショウ、トマト、オオブドウホオズキ、およびその他）のゲノムの中に導入される。導入されたポリヌクレオチドによりコードされるサイクリンインヒビタータンパク質の発現により特性決定された所望の表現型を発現する個体は、決定される所望の表現型に基づいて、例えば、酵素アッセイ、視的検査、病理学的症状、およびその他により選択される。
【０１４８】
したがって、本発明は、任意の所望の目的のための異種プロモーターの制御下に、サイクリンインヒビター遺伝子（例えば、p27）を発現する手段を提供する。細胞、細胞の型、組織、器官、または生物において生理的に高いレベルのサイクリンインヒビター遺伝子産物の発現を生成するために、サイクリンインヒビター遺伝子の発現構築物を使用することが好都合であることがある。例えば、このような動物および植物は、増大したレベルのサイクリンインヒビターの活性を示し、有利な性質、例えば、減少した大きさおよび細胞性、およびその他を有することができる。
【０１４９】
Ｘ．構築物および導入
導入された遺伝子の発現の期待された一時的に段階を考慮するとき、関係する因子は、ゲノム内のその位置にかんがみて、プロモーターの型、プロモーターの一時的パターン、およびプロモーターの操作を包含する。相同内因性配列の正常の活性化と同時に、あるいはその前に発現されるプロモーターは好ましい。構成的プロモーター、例えば、CMVプロモーターはしばしば好ましい。このプロモーターの操作はそれを含有する細胞の発育段階に対して比較的独立であるので、このプロモーターは構成的である。また、調節されたプロモーターも適当である。このコントロールは細胞の発育段階に関して一時的であるか、あるいは生物の異なる部分または器官による分差的発現に基づく。
【０１５０】
導入された配列の発現時間を調節する他の方法は、導入された配列を誘発可能なプロモーターに連鎖することであり、前記誘発可能なプロモーターは、誘発因子（例えば、ステロイド応答性プロモーター／エンハンサーの場合においてステロイドホルモン）、化学的、紫外線または他の光源、あるいは他の活性化処理に生物（またはその部分）を暴露することによって活性化可能である。また、生物の１つの部分または器官のみ（すなわち、植物の果実を生じる部分）において転写を指令するプロモーターを使用して、生物の１つの部分のみの中の遺伝子を抑制することが望ましいことがある。
【０１５１】
前述したように、プロモーターの操作はゲノム中のその位置に依存して変化することができる。したがって、調節されたプロモーターは、それがその正常位置にどのように存在するかから異なって操作することができる、例えば、それは完全にまたは部分的に構成的であることができる。
十分な転写活性を保証するように、プロモーターが常態で最も有効である距離に相当するプロモーターからの距離においてDNA配列を連鎖しかつ位置させることは好ましい。これは距離は翻訳開始コドンの約1000ヌクレオチド内、好ましくは約500ヌクレオチド内、より好ましくは約100ヌクレオチド内であろう。
【０１５２】
コーディング配列の３'末端において、作用可能に連鎖した配列を含めることもできる。したがって、ポリアデニル化部位および任意の関係する転写停止配列を含有する３’非翻訳を有することは最適であろう。約1000ヌクレオチドより小さい３’配列は十分であり、約500は好ましく、そして内因性配列の約300、または長さの３’非翻訳テイルはより好ましい。
【０１５３】
導入されたサイクリンインヒビター遺伝子が無傷の遺伝子またはcDNAである場合、遺伝子に依存して、独立のトランスゲノート（transgenotes）の画分は、異常な発現、すなわち、発生における異常な時間における発現を生ずる位置に導入された遺伝子を有することができる。導入された遺伝子がキメラ遺伝子であり（他の遺伝子からの１または２以上の因子、例えば、プロモーターが無傷の遺伝子の成分と置換されているか、あるいは無傷の遺伝子に付加されており、発現に必要であるか、あるいは有益である上流または下流の配列に融合されたコーディング配列を包含することを意味する）そして構成的（完全にまたは部分的に）プロモーターにより推進され、次いで発現の異常なレベルおよび時間はトランスジェノートの大きい画分において活性化されるであろう。
【０１５４】
導入された遺伝子がキメラ遺伝子であり、そして、プロモーターに依存して、発生的に調節されたプロモーターにより推進されるとき、トランスジェノートのある画分は導入された遺伝子の異常なレベルおよび時間を示すであろう。プロモーターまたは他のシス因子の強さは、コーディング配列の通常のプロモーターと同一であるか、あるいはそれよりも低いか、あるいは高いことができる。発生におけるタイミングはより早いか、あるいは同一であることができる。
【０１５５】
全長のサイクリンインヒビター遺伝子産物またはそれらのフラグメントまたは類似体をコードするポリヌクレオチドは、コードされたポリペプチド産物が産生されるように、コーディング配列の転写（発現配列）および翻訳を促進する配列を含むことができる。二次培養物ポリヌクレオチドの構築はこの分野においてよく知られており、そしてManiatis et al.、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、（1989）、 Cold Spring Harbor、 N.Y.にさらに記載されている。
【０１５６】
例えば、限定されないが、このようなポリヌクレオチドはプロモーター、転写停止配列（真核発現宿主においてポリアデニル化部位）、リボソーム結合部位、および、必要に応じて、真核発現宿主において使用するためのエンハンサー、および、必要に応じて、ベクターの複製に必要な配列を含むことができる。典型的な真核発現カセットは、必要に応じてエンハンサーに連鎖された、プロモーター、例えば、HSVtkプロモーターまたはpgk（ホスホグリセレートキナーゼ）プロモーターの下流に連鎖した（すなわち、翻訳リーディングフレームの向きで；ポリヌクレオチド連鎖）サイクリンインヒビターのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および下流のポリアデニル化部位（例えば、SV40の大きいTAgポリＡ付加部位）を含むであろう。
【０１５７】
さらに、高いレベルでおよび／または転写コントロール配列（これはサイクリンインヒビター遺伝子に隣接して天然に存在しない）の転写のコントロール下に、サイクリンインヒビターのポリペプチドを発現させるために、サイクリンインヒビター遺伝子またはcDNAを使用してトランスジーンを構築することができる。
【０１５８】
例えば、限定されないが、構成的プロモーター（例えば、HSV-tkまたはpgkプロモーター）または細胞系列特異的転写調節配列（例えば、CD4またはCD8遺伝子のプロモーター／エンハンサー）をサイクリンインヒビターをコードするポリヌクレオチド配列に作用可能に連鎖して、ランスジーンを形成することができる（典型的には選択可能なマーカー、例えば、neo遺伝子の発現カセットと組み合わせて）。このようなトランスジーンを細胞（例えば、ES細胞、造血幹細胞）の中に導入することができ、そしてトランスジェニック細胞およびトランスジェニック非ヒト動物を慣用法に従い得ることができる。
【０１５９】
望ましいトランスジェノートを得る確度は、スクリーニングしたトランスジェノートの数および外来核酸配列の実際の形質転換および発現の効率に依存するであろう。典型的には、少なくとも約25〜50のトランスジェノートをスクリーニングするが、記載する作用が見られる前に、100〜500またはそれ以上をスクリーニングすることが必要であることがある。
【０１６０】
植物における抑制および発現トランスジーン
一般に、転写可能なサイクリンインヒビターのポリヌクレオチド配列またはその逆補体は、その中にポリヌクレオチドを転移すべき細胞中で機能することができる作用可能に連鎖したプロモーターを含有する。転写可能なサイクリンインヒビターのポリヌクレオチド配列は、少なくとも25ヌクレオチドの長さ、より好ましくは少なくとも50〜100ヌクレオチドの長さ、しばしば少なくとも100〜250ヌクレオチドの長さ、しばしば少なくとも５００ヌクレオチドの長さまたはより大きい長さであり、完全な内因性遺伝子の長さ（転写停止配列／ポリアデニル化部位を通るプロモーターをスパンする）までにである。転写可能な配列のRNA転写体が内因性遺伝子のmRNA転写体と同一または逆の補体の方向性である（すなわち、センスまたはアンチセンスの向き）。
【０１６１】
抑制ポリヌクレオチドはより大きいポリヌクレオチドの一部分、例えば、選択可能なマーカーを有するトランスジーンであり、トランスジーン、または相同組換え構築物を有する細胞を同定することができ、前記相同組換え構築物は１または２以上の選択可能なマーカーおよび相同領域を有し、発現ポリヌクレオチドを細胞のゲノム中の前以て決定した位置にターゲットする。抑制ポリヌクレオチドはトランスフェクタント細胞またはトランスジェニック細胞において異種発現カセットの形態であることができる。
【０１６２】
しばしば、抑制ポリヌクレオチドは、抑制すべき標的内因性遺伝子のクローニングされたコピー（またはその一部分）から単離されたDNAを使用して生産されたベクターとして得られる。通常、抑制ポリヌクレオチド配列はゲノム遺伝子クローンの一部分として単離されるが、ある態様において、抑制すべき標的遺伝子のcDNAクローン（またはその一部分）を使用することができる（一般的cDNA法については、下記の参考文献を参照のこと： Goodspeed et al. (1989) Gene 76: 1;Dunn et al. (1989) J.Biol.Chem. 264:13057)。
【０１６３】
抑制ポリヌクレオチドを含有するベクターを典型的には大腸菌（E. coli）中で増殖させ、次いで標準的微生物学的方法を使用して単離するか、あるいはオリゴヌクレオチドとして合成することができる。原核または真核のベクターを必要としない、ポリヌクレオチドの直接的合成および結合（必要に応じて）を実施することもできる。ポリヌクレオチド（およびそれを含むトランスジーン）を任意の適当な技術により宿主細胞に転移させることができ、このような技術は、なかでも、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、バイオリスチクス，リン酸カルシウム沈澱法、およびウイルスをベースとするベクターを包含する（例えば、米国特許第5,442,052号、第5,354,854号、第5,278,057号、第5,262,316号、第5, 137, 817号、および第4,962,028号、引用することによって本明細書の一部とされる）。
【０１６４】
植物細胞の中に核酸セグメントを導入する好ましい方法は、植物細胞、外植体、分裂組織または種子を前記セグメントで形質転換されたアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）で感染させることである。この分野において知られている適当な条件下に、形質転換された植物細胞を生長させてシュート、根を形成させ、さらに植物に発育させる。核酸セグメントを適当な植物細胞の中に、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴｉプラスミドにより導入することができる。
【０１６５】
Tiプラスミドはアグロバクテリウム・ツメファシエンスが感染したとき植物細胞に転移し、そして植物ゲノムの中に安定に組込まれる（Horsch et al. (1984)″Inheritance of Functional Foreign Genes in Plants″、 Science、 233: 496-498； Fraleyet al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 80: 4803）。１つのアグロバクテリウム（Agrobacterium）法は、例えば、成体のアラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）植物の浸潤による、イン・プランタ・アグロバクテリウム（in planta Agrobacterium）仲介遺伝子転移である； Bechtold et al. (1993） C.R.Acad.Sci.Life Science 316: 1194以降（引用することによって本明細書の一部とされる）を参照のこと。
【０１６６】
アグロバクテリウムにより形質転換することができるすべての植物細胞および形質転換された細胞から再生された全植物を、また、本発明に従い形質転換して、転移された外来核酸配列を含有する形質転換された全植物を生産することができる。
下記の方法を包含する種々の方法において、植物細胞をアグロバクテリウムで形質転換することができる：培養した単離されたプロトプラストとのアグロバクテリウムの同時培養、アグロバクテリウムによる細胞または組織の形質転換、あるいはアグロバクテリウムによる種子、頂部または分裂組織のアグロバクテリウムによる形質転換。
【０１６７】
好ましい系は２つのプラスミドを必要とするバイナリー系である：プラスミドを含有するT-DNAおよびvirプラスミド。プラスミドを含有する多数のT-DNAの任意の１つを使用することができ、唯一の要件は２つのプラスミドの各々について独立に選択できることである。
植物細胞または植物の形質転換後、所望のDNAセグメントが組込まれるように、Tiプラスミドで形質転換された植物細胞または植物を適当な表現型マーカーにより選択することができる。これらの表現型マーカーは下記のものを包含するが、これらに限定されない：抗生物質耐性、除草剤耐性または視的観察。他の表現型マーカーはこの分野において知られており、そして本発明において使用することができる。
【０１６８】
裸の核酸の導入方法を選択する場合、追加の他の配列を必要としないで、ベクターは所望の特性を付与するために必要な最小核酸配列以下である。したがって、可能なベクターは、Tiプラスミドのベクター、大きい数のコピーを単に最大に生ずるように設計されたシャトルベクター、いったん形質転換が起こったとき究極的複製に必要な最小配列を含有するベクター、トランスポゾンベクター、相同組換えベクター、ミニ染色体ベクター、およびウイルスベクター（遺伝子配列のＲＮＡの形態の可能性を含む）を包含する。ベクターの選択およびそれらを構築する方法は当業者に普通に知られており、そして一般的技術的参考文献に記載されている（Methods in Enzymology、 supra）。
【０１６９】
しかしながら、導入すべき核酸フラグメントの分解に対する耐性を付与し、ゲノムの組込みのプロセスを助けるか、あるいは、事実、実際に形質転換される細胞または植物を容易に選択する手段を提供する、任意の追加の取付けられたベクターは有利であり、使用可能なトランスジェノートを選択する困難を大きく減少する。
【０１７０】
全再生植物を発生させることができる形質転換可能な植物のすべてを、本発明において使用することができる。単子葉植物をアグロバクテリウムでエレクトロポレーションにより（Fromm et al.[1986] Nature 319: 791-793; Rhodes et al. Science [1988] 240: 204-207）；直接的遺伝子転移により（Baker et al. [1985] Plant Genetics 201-211）；花粉仲介ベクターを使用することにより（EP0,270,356）；そして花の分けつの中へのＤＮＡの注入(de la Pena et al.H [1987]、 Nature 325: 274-276）形質転換することができる。
【０１７１】
サイクリンインヒビター
サイクリンE-Cdk2複合体および／またはサイクリンA-Cdk2複合体の活性化を可能とするp27インヒビターを、種々のスクリーニングアッセイのフォーマットにおいて同定することができる。p27の存在におけるサイクリンE-Cdk2および／またはサイクリンA-Cdk2のp27仲介活性化のインヒビターは、例えば、アッセイを使用してスクリーニング可能であり、このアッセイにおいて、p27の非存在において活性サイクリンE-Cdk2複合体またはサイクリンA-Cdk2複合体の形成を可能とする条件下に、被験物質を適当量のp27タンパク質、サイクリンＥおよび／またはサイクリンＡ、およびCdk2に暴露する。次いで、形成したサイクリンE-Cdk2複合体および／またはサイクリンA-Cdk2複合体を定量し、被験物質の非存在において形成した活性複合体と比較する。
【０１７２】
p27インヒビターとして働くことができる物質は下記のものを包含するが、これらに限定されない：サイクリンE-Cdk2複合体の活性化のp27仲介阻害を阻害することができる化合物、p27とサイクリンE-Cdk2複合体との間および／またはp27とサイクリンA-Cdk2複合体との間の相互作用を特異的に阻害するが、p27の非存在においてサイクリン−Cdk2複合体のCdk2成分の部位特異的リン酸化を阻害しない化合物、p27タンパク質を分解または不活性化する化合物、およびp27タンパク質の発現を妨害する化合物。
【０１７３】
このような因子は、p27、タンパク質またはペプチドのp27アンタゴニストの化学的化合物のインヒビター、およびp27の発現を阻害する分子、例えば、トリプレックス形成オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボソーム、およびその他を包含することができる。
【０１７４】
細胞周期の進行を仲介するために本発明においてｐ２７インヒビターとして使用するために、トリプレックス形成オリゴヌクレオチドはｐ２７の転写を妨害するｐ２７配列特異的ＤＮＡ結合薬物である。トリプレックス形成オリゴヌクレオチドは一般的に下記の参考文献に記載されている：Maher、Bioessays 14:807-815(1992);Gee et al.、Gene 149:109-114(1994)；Noonberg etal.、Gene 149:123-126(1994）；Song et al.、Ann.NY Acad. Sci.761:97-108(1995)； Westin et al.、Nuc. Acids Res. 23: 2184-2191 (1995); およびWandおよびGlazer、 J. Biol. Chem. 207: 22595-22901 (1995)。
【０１７５】
これらのオリゴヌクレオチドは、p27DNA鋳型へのRNAポリメラーゼまたは転写因子のアクセスを物理的にブロックすることによって、p27の転写を選択的阻害する二本鎖ＤＮＡ上で、生理的条件下に、三重らせんの複合体を形成する。また、例えば、WO95/25818; WO95/20404; WO94/15616; WO94/04550；および WO93/09788（それらの各々は引用することによって本明細書の一部とされる）を参照のこと。p27遺伝子にターゲットされた三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドのテイルを含有するとして、転写因子の結合の阻害を増強することができる。
【０１７６】
p27の発現を妨害しかつ細胞周期の進行を許すアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書において記載する実施例において例示されているように、本発明において特に有用である。p27アンチセンスインヒビターは、例えば、実施例において詳細に記載されている方法を使用して同定される。アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用およびそれらの用途は、一般に、例えば、下記の参考文献に記載されている：MolおよびVan der Krul編、Antisense Nucleic Acids and Proteins Fundamentals and Applications、New York、NY、1992、これはその全体において引用することによって本明細書の一部とされる。適当なアンチセンスオリゴヌクレオチドは少なくとも11ヌクレオチドの長さであり、そしてp27の上流の非翻訳の関連するコーディング配列までのかつそれを含む。
【０１７７】
当業者にとって明らかなように、アンチセンスオリゴヌクレオチドの最適な長さは、アンチセンスオリゴヌクレオチドとmRNA上のそれらの相補的配列との間の相互作用の強さ、転写が起こる温度およびイオンの環境、アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列、およびmRNA中のおよび／またはアンチセンスオリゴヌクレオチド中の二次および三次構造の存在に依存する。アンチセンスオリゴヌクレオチドの適当な標的配列は、イントロン−エクソン接合部（適切なスプライシングを防止するために）、DNA/RNAハイブリッドが核から細胞質へのmRNAの輸送を防止する領域、開始因子の結合部位、リボソーム結合部位、およびリボソームの進行を妨害する部位を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドに特に向き標的領域は、p27遺伝子の5’非翻訳領域である。
【０１７８】
p27遺伝子にターゲットされたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、DNA分子が遺伝子それ自体に比較して逆向きにプロモーターの下流に挿入されるように、標的DNA配列を含有するDNA分子を適当な発現ベクターの中に挿入することによって調製される。次いで、発現ベクターを適当な細胞の中に形質導入、形質転換またはトランスフェクトして、アンチセンスポリヌクレオチドを発現させることができる。また、標準的マニュアルまたは自動化合成技術を使用して、アンチセンスオリゴヌクレオチドを合成することができる。エレクトロポレーション（例えば、Yang et al.、Nucleic Acids Res. 23: 2803-2810 (1995）に記載されているように）、リン酸カルシウム沈澱法、マイクロインジェクション、ポリ−Ｌ−オルニチン／DMSO (Dong et al.、Nucleic Acids Res. 21:771-772 (1993)）を包含する種々の手段により、合成されたオリゴヌクレオチドを適当な細胞の中に導入することができる。
【０１７９】
適当なアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与方法の選択は当業者にとって明らかであろう。合成されたオリゴヌクレオチドに関係すると、アンチセンスオリゴヌクレオチド−mRNAハイブリッドの安定性は、オリゴヌクレオチドに安定剤を添加することによって増加可能である。安定剤は、オリゴヌクレオチドのいずれかまたは双方の末端に共有結合する内位添加剤を包含する。例えば、ホスホトリエステル、ホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロアミデイトまたはホスホロジチオエートの導入によりホスホジエステル主鎖を修飾することによって、オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼに対して耐性とすることができる。また、一般的にMolおよびVan der Krul、supra、に記載されているように、デオキシリボヌクレオチドのアルファ−アノマーを使用してオリゴヌクレオチドを合成することによって、オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼ耐性とすることができる。
【０１８０】
オリゴヌクレオチドをベースとするインヒビターについて、適当な配列の選択は、例えば、インヒビターの型（すなわち、トリプレックスを形成するオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド）および処理すべき種によりガイドされるであろう。種の間に保存されて容易に入手可能な動物モデルにおける使用を可能とする配列を選択することが好ましいであろう。下記においてより詳細に示すように、マウスとヒトとの間で保存されたp27内の配列に対してアンチセンスのオリゴヌクレオチドをマウスモデルにおいて使用するために選択した。次いで、このような配列を再処方なしにヒト細胞において使用することができる。
【０１８１】
本発明は、また、p27を阻害し、これによりリボザイムを使用して細胞周期の進行を可能とする組成物および方法を提供する。リボザイムは、所望の細胞にターゲットされた遺伝子治療を包含する、種々の方法において投与することができる。本発明のリボザイムは、p27遺伝子のRNA転写体をターゲットする。各RNA分子はp27 RNAを切断できる触媒的に活性なセグメントを含有し、さらにターゲッテッドＲＮＡの部分に対して相補的なヌクレオチド配列を有するフランキング配列を含む。フランキング配列は、部位特異的方法においてリボザイムをRNAにアニールする働きをする。しかしながら、標的p27配列に対するフランキング配列の絶対的相補性は不必要である。なぜなら、標的RNAと二重らせんを形成しかつリボザイムの触媒的に活性なセグメントが標的挿入に切断できるようにするために十分な量の相補性が必要であるだけであるからである。したがって、リボザイムを標的RNAとハイブリダイゼーションさせるために十分な相補性のみが要求される。
【０１８２】
本発明において使用するとき、用語「リボザイム」は、ヌクレオチド塩基配列特異的方法において他の別のRNA分子を切断またはスプライスすることができる酵素活性を有するRNA分子を意味する。触媒的または酵素的RNA分子とは、基質結合領域の中に特定のp27 RNA標的に対する相補性を有し、また、その標的中のＲＮＡを切断および／またはスプライスするために活性である酵素活性を有し、これにより標的分子を変更するRNA分子を意味する。本発明の好ましい態様において、酵素のRNA分子はハンマーヘッドのモチーフで形成されるが、また、リボザイムはヘアピン、肝炎デルタウイルス、グループＩイントロンまたはRNアーゼＰのRNA（RNAガイド配列とアソシエートした）のモチーフで形成されることができる。
【０１８３】
ハンマーヘッドのモチーフの例はRossi et al.、AIDS Res. Hum. Retrovir. 8:183 (1992）に記載され、ヘアピンのモチーフはHampel et al.、Biochem. 28:4929 (1990）に記載され、肝炎デルタウイルスのモチーフはPerrottaおよびBeen、Biochem. 31:16 (1992）の中に例示され、RNアーゼＰのモチーフはGuerrier-Takada et al.、Cell 35:849 (1983）に記載されて、そしてグループＩイントロンのモチーフの例はCech et al.、米国特許第4,987,071号明細書に記載されており、それらの各々は引用することによって本明細書の一部とされる。これらの特定のモチーフは本発明において限定されず、そして本発明の酵素のRNA分子が標的p27のRNA領域の１または２以上に対して相補的である特定の基質結合部位を有すること、およびそれがRNA切断活性をそれに付与する基質結合部位内にまたはそれを取り囲むヌクレオチド配列を有することを当業者は認識するであろう。
【０１８４】
リボザイムの触媒部位の上流および下流のフランキング配列は、リボザイムに対する所望の程度のターゲッティング特異性を効果的に付与する任意の長さのセグメントを含むことができる。好ましくは、フランキング配列は約４〜約24ヌクレオチド、より好ましくは約６〜約15ヌクレオチド、典型的には約９〜14ヌクレオチドを含み、そして切断部位を含むp27のRNA配列の直ぐ上流および下流の基質配列に対する塩基の対合を生ずる。
【０１８５】
p27インヒビターは単独で使用することができるか、あるいは組合わせで種々のモードの投与のモードのための処方することができる。インヒビターの投与は全身的または局所的投与を包含することができる。技術および処方物は一般的にRemington’s Pharmaceutical Sciences、Mack Publshing Company、ペンシルベニア州イーストン、後の編集、に記載されている。一般に、インヒビターは薬学上許容される担体、例えば、希釈剤または賦形剤と組合わされる。適当な担体は、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、表面活性剤、または滑剤を包含することができる。このような成分の選択は、投与のモードおよび投与の形態に依存する。典型的な投与形態は、錠剤、粉剤、液状調製物、例えば、懸濁液、乳濁液および溶液、顆粒、カプセル剤および坐剤を包含する。また、注射用の液状調製物は典型的であり、そしてリポソーム調製物を包含する。
【０１８６】
オリゴヌクレオチドのp27インヒビター、例えば、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、およびその他、またはｐ２７ＤＮＡまたは対応するRNAの異なる部分に対してターゲットされたこのような阻害性の組合わせを含んでなるか、あるいはコードする配列を、広範な種類の方法においてターゲッテッド細胞に送出して細胞周期の進行を促進することができる。オリゴヌクレオチドは合成オリゴヌクレオチドとして投与するか、あるいは発現ベクターから発現させることができる。オリゴヌクレオチドをex vivoで投与する、すなわち、個体または他の細胞源から取出され、処理され、そして戻された標的細胞と接触させることができるか、あるいはオリゴヌクレオチド分子をin vivoで投与することができる。ex vivoで投与されるとき、典型的には標的細胞をマイトジェン、例えば、血清マイトジェン（SCF、IL-3、EPO、TPO、およびその他）またはその他に、特定の細胞集団に依存して、暴露する。
【０１８７】
ターゲッテッド細胞集団への分配は、適当な送出しベヒクル、例えば、リポソーム、調節放出性ベヒクル、を介して、イオントホレシス、エレクトロポレーションまたはイオン対分子、または共有結合付加物、および他の薬理学上許容される送出し法を使用して実施することができる。好ましくは、担体は所望の細胞集団内に、またはその集団にオリゴヌクレオチドを蓄積する手段を提供する。送出しベヒクルは遅い放出性の貯蔵所として働くか、あるいはその含量を標的細胞に直接的に送出すように設計することができる。オリゴヌクレオチドの送出しベヒクルの例は、リポソーム、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生物分解性ナノカプセル、および微小球を包含する。リポソームは容易に種々の組織または細胞調製物にターゲットすることができる。他の態様において、抗ｐ２７オリゴヌクレオチドは、哺乳動物の宿主細胞中の前記オリゴヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチドの送出しおよび発現に適当である発現ベクターを介して投与される。
【０１８８】
in vivo使用のために、オリゴヌクレオチドの投与のルートは、筋肉内、エーロゾル、静脈内、非経口、腹腔内、およびその他を包含する。選択したオリゴヌクレオチドのための特定の送出しルートは、種々の因子、例えば、オリゴヌクレオチドの形態、意図する標的、治療すべき症状、およびその他に依存するであろう。例えば、未修飾オリゴヌクレオチドは細胞により吸収されるが、例えば、オリゴヌクレオチドの供給を減少して細胞膜を横切って拡散することができる分子を生成することによって、修飾を行って細胞の吸収を増強することができる。オリゴヌクレオチドの活性を維持するために必要な構造的要件は、一般に、この分野において認識されている。また、ヌクレアーゼ分解に対する感受性を減少するように、細胞の送出しを増強する修飾を設計することができる。
【０１８９】
オリゴヌクレオチドの投与量は、また、種々の因子、例えば、オリゴヌクレオチドの形態、投与のルート、細胞周期の段階、選択された集団中の非分裂細胞の百分率、最終的分化に到達したかどうか、およびその他に依存するであろう。一般に、投与はp27活性の完全な阻害を生ずるか、あるいはサイクリンE-Cdk2複合体および／またはサイクリンA-Cdk2複合体の活性化および細胞周期の進行を可能とするために十分なターゲッテッド細胞内の十分に低いレベルを生ずるであろう。ターゲッテッド細胞集団内のp27インヒビターの有効レベルの確立は、例えば、吸収（または特定のベクターの発現）の速度、およびインヒビターが分解する速度に依存する。
【０１９０】
処理期間は、例えば、未処理対照細胞集団に比較して分裂する細胞の比較的に高い百分率の形質導入を可能とするために十分な時間の間延長することができ、通常、少なくとも約２〜４日間、時には６〜10日間であるが、静止状態または末期的に分化した細胞集団について、より長い期間が必要であることがある。投与の回数またはタイミングは、前述の因子、特定のインヒビターまたはそれらの混合物の効能、送出しベヒクルおよび投与のルート、およびその他に依存して、かなり変化することがある。
【０１９１】
p27のヌクレオチドインヒビター、例えば、p27アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｐ２７特異的トリプレックス形成オリゴヌクレオチドについて、本発明のオリゴヌクレオチドとともに有効濃度の脂質処方物を含めることが好ましいことがある。適当な脂質処方物および濃度は、細胞によりオリゴヌクレオチドの吸収を増強するものである。このような脂質は、リポフェクションに使用されるカチオン性脂質、例えば、N-[1-(2,3-ジオールイルオキシ）プロピル-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロライド（DOTMA）およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）を包含する。当業者は、オリゴヌクレオチドの吸収を増強するために有効な、特定の脂質処方物および濃度を決定することができる。
【０１９２】
本明細書において詳細に説明した方法内において、細胞が細胞周期の停止に入るを阻害するか、あるいはある種の細胞集団の増殖を伴うことがある分化を阻害する他の化合物と組み合わせて、p27インヒビターを使用することができる。例えば、レチノイン酸レセプターアンタゴニストを開示した方法および組成物と組み合わせて、細胞集団中の増殖する細胞の数を増加することができる。レチノイン酸レセプターαアンタゴニストRo41-5253(Apfel et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7129-7133、1992）は、前骨髄球細胞系統HL-60のレチノイン酸誘導分化に対する反作用することが示された。
【０１９３】
また、有糸分裂インヒビターのアンタゴニスト、例えば、p14(Guan et al.、Genes Dev. 8:2939-2952 (1994)）、p15（HannonおよびBeach、Nature 371: 257-261 （1994)）、p16(Okamoto et al.、Cancer Research 55: 1448-151 (1995）およびSerrano et al.、Nature 366:704-707 (1993)）、p18(Guan et al.、ibid.）、p19(Chan et al.、Mol. Cell. Biol. 15: 2682-2686 (1955）およびZhang et al.、Cell 82: 915-925 (1995）およびp21(Harper et al.、Cell 805-816 (1993)を本発明のp27インヒビターと組み合わせてを使用して、細胞集団中の増殖する細胞の比率を増加することができる。
【０１９４】
これらの有糸分裂インヒビターのアンタゴニストは、インヒビターの転写または翻訳、タンパク質の破壊を妨害する因子、およびタンパク質の直接的インヒビターを包含するが、これらに限定されない。それ自体、有糸分裂インヒビターのインヒビターは、有糸分裂インヒビターの化学的化合物のインヒビター、タンパク質またはポリペプチドの有糸分裂インヒビターのアンタゴニスト、トリプレックス形成オリゴヌクレオチドおよび有糸分裂インヒビターの発現を阻害するアンチセンス分子、リボザイム、およびその他を包含することができる。
【０１９５】
本発明の方法は、遺伝子治療に特に有用である。遺伝子治療の標的細胞を、標的細胞集団中の分裂する細胞の比率を増加するために適当な条件下にかつ十分な時間の間ｐ２７インヒビターに暴露する。次いで、分裂する細胞を問題の遺伝子を含む適当なウイルスベクターに暴露する。１つの態様内で、細胞をp27インヒビターおよびウイルスベクターに同時に暴露する。適当なウイルスベクターは、ロタウイルスのベクター（Miller、Curr. Top. Microbiol. Immnol. 158:1-24 (1992)；SalmonsおよびGunzburg、Human Gene Therapy 4: 129-141 (1993)；Miller et al.、Methods in Enzymology 217: 581-599、（1994）を参照のこと）およびアデノ関連ベクター（下記の参考文献において概観されている：Cartr、Curr. Opinion Biotech. 3: 533-539 (1992)；Muzcyzka、Curr. Top. Microbiol. Immnol. 158: 97-129 (1992)）。
【０１９６】
この方法内で使用できる他のウイルスベクターは、アデノウイルスのベクター、ヘルペスウイルスのベクターおよびシンドビスウイルスのベクター、例えば、下記の参考文献に一般的に記載されている：Jolly、Cancer Gene Therapy 1: 51-64 (1994)；Latchman、Molec. Biotechnol. 2:179-195 (1994)；およびJohanning et al.、Nucl.Acids Res. 23: 1495-1501 (1995）、それらの各々は引用することによって本明細書の一部とされる）。ベクターの選択は、一部分、ターゲットする細胞の型、治療する疾患の状態、および転移すべき遺伝子の大きさに頼るであろう。
【０１９７】
細胞周期から出るのを阻害するために十分な量および時間においてp27インヒビターに暴露する細胞を、分裂する細胞をターゲットする種々の物質で処理することができる。１つの態様において、例えば、分裂する細胞の比率がp27インヒビターにより増加された細胞集団は、問題の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列でいっそう効率よく形質導入またはトランスフェクタントされる。したがって、本明細書において記載する方法は遺伝子治療技術の効能を増加する。例えば、p27インヒビターで処理された標的細胞を、問題の発現産物、典型的にはRNAまたはタンパク質分子をコードする少なくとも１つの遺伝子で形質導入する。
【０１９８】
コードされたRNAまたはタンパク質は、処理される細胞集団または宿主に、直接的または間接的に、利益を付与するものである。この遺伝子は分泌されたまたは非分泌のタンパク質、またはその活性部分をコードすることができる。治療される症状に適当な遺伝子の選択は、治療または予防される症状および当業者にとって明らかな他の因子に依存するであろう。「遺伝子」とは、所望の産物、例えば、サイトカイン、凝固因子、ホルモン、酵素、輸送タンパク質、調節タンパク質、構造タンパク質、レセプター、抗原、リボザイム、アンチセンス分子、およびその他をコードするDNAを意味する。
【０１９９】
ヒトの中に導入するために適当な遺伝子の代表的例は、ヒトエリトロポイエチン（米国特許第4,703,008号明細書に記載されている）、ヒトG-CSF、ヒトGM-CSF(Anderson et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6250 (1985)）、プラスミノーゲンアクチベーター、ウロキナーゼ、インスリン（例えば、米国特許第4,652,525号明細書に記載されているヒトインスリンまたは米国特許第4,431,740号明細書に記載されているプロインスリン）、インターロイキン（例えば、インターロイキン−１、インターロイキン−２［米国特許第4,738,927号明細書に記載されている］、インターロイキン−３［欧州特許公開EP第275,598号および第282,185号明細書に記載されている］、インターロイキン−４、インターロイキン−５［米国特許第4,965,195号明細書に記載する］、およびその他）、インターフェロン、因子VIII、因子IX、フォン・ウィルスタンド因子、ADA、ヒト成長ホルモン（米国特許第4,342,832号明細書に記載する）、およびその他、それらの類似体および融合体（例えば、GM-CSFおよびIL-3［米国特許第5,108,910号明細書に記載されている］をコードするものである。上記特許および刊行物の各々は引用することによって本明細書の一部とされる。
【０２００】
ある場合において、p27インヒビターで処理した細胞の混合物を使用することが可能であり、ここで前記混合物は問題の遺伝子で形質導入した第１グループおよび問題の第２の、異なる遺伝子で形質導入した第２グループを含む。また、処理した細胞を２以上の問題の遺伝子で形質導入することができる。
【０２０１】
よく確立されたプロトコールを使用してｐ２７インヒビターで処理された標的細胞集団の中に、遺伝子を形質導入またはトランスフェクタントすることができる。典型的には、遺伝子転移ベクターはロタウイルスのベクターであるが、また、他のベクター、例えば、下記のものを使用することができる：アデノウイルスのベクター（例えば、Rosenfeld et al.、Cell 68: 143-155 (1992）およびCuriel et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8850-8854 (1991）、アデノウイルス関連ベクター（例えば、Muzyczka、Curr. Top. Microbiol. Immnol. 158: 97-129 (1992）、およびMiller、Nature 357: 455-460 (1992）に概観されている、これら刊行物は引用することによって本明細書の一部とされる）。
【０２０２】
タウイルスのベクターの構築は記載された、例えば、MillerおよびRosman、Biotechniques 7: 980-990 (1989)；Adam et al.、J.Virol. 65: 4985-4990 (1991)；Miller、Curr. Top. Microbiol. Immnol. 158: 1-24 (1992）；および英国特許公開GB第2,269,175A号、それらの各々は引用することによって本明細書の一部とされる。好ましいロタウイルスのベクターは、Miller、米国特許第4,861,719号明細書（引用することによって本明細書の一部とされる）に記載されているように、PA317両栄養性ロタウイルスのパッケージ細胞を使用して作られる。
【０２０３】
p27インヒビターで処理した細胞集団をex vivoにおいて問題の遺伝子で形質導入またはトランスフェクタントするとき、典型的には選択因子、例えば、G418、ネオマイシンまたはその他の存在において、ベクターにおいて使用される選択可能なマーカーに依存して、１または２以上の所望の遺伝子を含有する細胞がしばしば発生し、次いで細胞を宿主に戻すか、あるいは宿主に戻すために十分な数の細胞が入手可能であるまで増殖させる。
【０２０４】
本発明の組成物および方法を使用して、広範な種類の細胞の型を処理する。遺伝子治療のために最もしばしばターゲットされるものの中には、造血前駆体（幹）細胞がある。他の細胞は、ターゲッテッド細胞のある比率が非分裂性であるか、あるいは遅い分裂性であるものを包含する。これらは、例えば、繊維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞、骨格細胞および平滑筋細胞、骨芽細胞、静止状態のリンパ球、末期的に分化した細胞、遅いサイクリングまたは非サイクリングの一次細胞、およびその他を包含する。これらの方法および組成物は、ヒトの細胞集団に加えて、広範な種類の脊椎動物の細胞とともに使用することができる、ここで脊椎動物は、例えば、哺乳動物、特に獣医学的重要性をもつもの、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、齧歯類、ウサギ、ブタ、およびその他を包含する。
【０２０５】
本発明は、造血前駆体細胞、特にヒトおよび他の哺乳動物のものの中の分裂する細胞の比率を、ex vivoまたはin vivoにおいて、増加するために特に好ましい。ex vivo法において、造血前駆体細胞を血液産物、例えば、骨髄、末梢血、またはドナーの臍帯血液、胎児末梢血および他の源から分離する。このような分離は、例えば、抗原、例えば、実質的にすべてのヒト造血前駆体細胞上に存在するが、いっそう成熟した造血細胞に実質的に存在しないCD34抗原のそれらの発現に基づいて免疫選択することによって実施することができる。
【０２０６】
分離された造血前駆体細胞を凍結して貯蔵し、後の日に融解して、栄養培地を含んでなる培養培地を含有する適当な容器の中に接種する。また、分離した細胞を最初の凍結なしに培養物の中に直接的に接種することができる。双方の場合において、本明細書において記載するように血液産生物の中に最初に存在した分割する造血前駆体細胞の比率に関してこのような細胞の比率を増加するために十分な条件下にかつ時間の間p27インヒビターとともに、得られた細胞を培養する。次いで、問題の遺伝子産物を発現することができるベクターで細胞を処理する。次いで、細胞を宿主の中に注入または移植するか、あるいは後の日の注入のために凍結して貯蔵することができる。
【０２０７】
さらに、本発明の方法をin vitroにおいて使用して、新規な幹細胞系統をつくることができる。本発明のこの面によれば、p27インヒビターを細胞集団に投与し、これにより細胞が細胞周期から出るのを防止しかつ細胞周期中の細胞の百分率を増加し、また、外因性血清マイトジェンを含める必要性を減少することができる。また、これらの方法を、例えば、幹細胞系統をつくる方法と組み合わせて、分裂する細胞の集団の増加のために適当な条件下にかつ十分な時間の間p27アンタゴニストに細胞集団を暴露し、そして生ずる細胞が遺伝子産物を発現しかつ自己更新するように、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子を含んでなる適当な発現ベクターに分裂する細胞を暴露することによって、使用することができる。
【実施例】
【０２０８】
下記の実施例により、本発明を例示する。これらの実施例は本発明を限定しない。
実施例１.
10％のウシ胎児血清を含有する培地中のサブコンフルエント、指数的に非同調的な増殖するBalb/c-3T3繊維芽細胞（Rb野生型；p53状態、未知）を無血清培地で１回すすぎ、マイトジェンを含有する低血清培地（0.1％血清）に移した。フローサイトメトリー分析（Firpo et al.、Mol. Cell. Biol. 14: 4889 (1994)）により、ほぼ１細胞周期の長さである24時間以内に、細胞の95%はG1を停止することが明らかに示され、これらの細胞は各分裂周期を通して進行するためにマイトジェンのシグナルを必要とすることを示す。
【０２０９】
増殖する細胞および血清飢餓細胞のイムノブロット分析（Nourse et al.、Nature 372:570 (1994)；Kato et al.、Cell 79:487 (1994）により測定して、G1の停止はp27Kip1タンパク質の６〜８倍の誘導と相関した。血清マイトジェンを欠く初代ヒト二倍体繊維芽細胞、およびIL-2を除去した後の初代ヒトＴリンパ球において、p27発現の同様な増加が起こり、これは正常の、非形質転換細胞におけるp27発現の共通のパターンであることが示される（Nourse、ibid.、Kato、ibid.）。
【０２１０】
次いで、Balb/c-3T3細胞において、p27レベルは血清除去の４時間以内に増加し始め、１２時間以内に最大レベルの60％に到達し、そして２４時間までにピークに到達することが示された。再栄養補給後の４、８、12、16および24時間に収獲した細胞について、p27のウェスタンブロット（ECL、Amersham）を実施した。p27レベルは４時間に増加し始め、１２時間に最大の60％であった。したがって、p27タンパク質の誘導はG1における初期の非同調性細胞集団の蓄積と平行し、そして細胞周期から出ることに関連する初期の事象における重要な役割を示す。
【０２１１】
増殖するおよび血清飢餓のBalb/c-3T3細胞から作った抽出物から免疫沈降したサイクリンＡ、サイクリンＥおよびCdk2 (Firpo et al.、Mol. Cell. Biol. 14: 4889 (1994)）について、ヒストンH1キナーゼアッセイを実施した。Balb/c-3T3細胞の細胞周期の停止はサイクリンA-Cdk2およびサイクリンE-Cdk2のタンパク質キナーゼのダウンレギュレーションと相関することを結果は示し、そしてこれはp27の誘導に関係するように見えた。マイトジェン除去後に、サイクリンE-Cdk2およびサイクリンA-Cdk2の双方をp27の増加した量に関係付けた。また、免疫枯渇実験を実施して、p27に結合したサイクリンＥの量を測定した。
【０２１２】
非同調的に増殖するBalb/c-3T3細胞および24時間の間血清飢餓させたBalb/c-3T3細胞からの細胞抽出物を、100μgの各抽出物をp27抗血清およびプロテインＡアガロースと４℃において１時間インキュベートし、免疫沈降物を13,000rpmにおいて５秒間遠心し、残りの非結合上清をp27抗血清およびプロテインＡアガロースで２回免疫沈降させることによって、ｐ２７について枯渇させた。免疫枯渇した抽出物（αp27）をサイクリンE(OhtsuboおよびRoberts、Science 259:1908(1993)；Matsushime et al.、Cell 65:701 (1991)；Koff et al.、Science 257: 1689 (1992)）およびp27のイムノブロットにより分析し、非枯渇抽出物およびp27前免疫血清で枯渇させた抽出物と比較した。
【０２１３】
結果により、増殖する細胞中のサイクリンＥの小さい部分のみがp27に結合したが、停止した細胞中のサイクリンＥのすべてはp27に結合することが示された。同様な結果がサイクリンＡについて得られた：実験をサイクリンＥについてと同様に実施したが、サイクリンＡおよびp27のイムノブロットをp27について枯渇させた抽出物について実施した。サイクリンＡのすべては血清飢餓細胞からのp27に結合したが、サイクリンＡの小さい画分（５％）は増殖する細胞中のp27とアソシエートした。
【０２１４】
要約すると、Balb/c-3T3繊維芽細胞は、マイトジェン除去後、最初のＧ１において停止し、これはp27の発現の増加、サイクリンＥおよびＡとのp27のアソシエーションの増加、およびサイクリンE-Cdk2およびサイクリンA-Cdk2キナーゼの不活性化と相関した。
【０２１５】
p27のダウンレギュレートおよび細胞増殖の誘導の双方に対する特異的血清マイトジェンの相対的能力を試験することによって、p27発現と細胞増殖との間の関係を研究した。非同調的に増殖するBalb/c-3T3細胞（Hi血清）および個々の成長因子（PDGF、IGF-1またはEGF）またはすべての３つの成長因子（PIE）の存在において24時間の間血清飢餓（低い血清）させたサブコンフルエントBalb/c-3T3細胞の双方について、フローサイトメトリー分析を実施した。成長因子で処理した細胞からの細胞抽出物（10μg）について、p27のイムノブロットを実施した。
【０２１６】
PDGFのみがG1の停止を防止することができ、そしてPDGFのみがp27の誘導を防止した。高い密度において増殖したBalb/c-3T3繊維芽細胞は、サブコンフルエントに増殖したときよりも、複雑なマイトジェンの要件を有する；単一のマイトジェンは高い密度において細胞の増殖を引き起こすことができない。その代わり、PDGFは最初に密度停止した、静止状態の細胞系統を刺激して、「進行」因子、IGF-1およびEGFに対して応答するように「コンピテント」とさせる（Pledger et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 4481 (1977)；Leof et al.、Exp .Cell Res. 147: 202 (1983)）。したがって、これらの条件下に、細胞がすべての３つのマイトジェンに暴露されてしまうまで、制限点を通して進行は起こらない。
【０２１７】
また、密度−停止した細胞において、PDGF単独はp27の発生量を変更するためには不十分であることが観察された；いったん細胞がPDGF、EGFおよびIGF-1の組合わされた活性により提供される完全なマイトジェンのシグナルに応答して増殖を行うようになると、むしろp27レベルは減少した。密度−停止したBalb/c-3T3繊維芽細胞を無血清培地中ですすぎ、0.1％の血清および10ng/mlのPDGF、IGF、EGF、IGFおよびEGF、またはすべての３つの成長因子を含有する低血清培地を再供給した。細胞を24時間後に収獲し、フローサイトメトリーによりDNA含量について分析しそして、また、p27のイムノブロットにより分析した。結果により、細胞周期に入り、かつp27レベルを10倍減少するために細胞の７０％を刺激するためには、すべての３つの成長因子の組合わせを必要とすることが示された。
【０２１８】
したがって、２つの異なる増殖停止の条件下に、制限点の通過を刺激する特定のマイトジェンの能力はp27を調節するそれらの能力と相関した。これらの結果が示すように、p27は必ずしも任意の特定のマイトジェンのための下流のエフェクターではない。むしろ、p27の発現の減少は細胞増殖に要求されるマイトジェンの収集の統合された作用を反映する。
【０２１９】
実施例２.
p27タンパク質の発現をブロックするためにアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することによって、p27の調節とマイトジェンのシグナリングとの間の観測された相関を拡張した。これにより、血清マイトジェンによる細胞周期のコントロールに、ｐ２７の領域を必要であることが示された。
【０２２０】
塩基の積み重ねを増強しかつセンス−アンチセンスの相互作用を促進すると考えられる、ピリミジン塩基へのプロピル基の付加により、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを修飾した（Raviprakash et al.、J.Virol. 69: 69 (1995)）。コントロールされた孔のガラス（CPG）支持体上で標準的化学を使用して、自動化合成装置（8750型、Miilgen Bioresearch、マサチュセッツ州ベッドフォード）でＨ−ホスホネート法により、オリゴヌクレオチドを合成した。
【０２２１】
ヌクレオチド類似体を以前に記載されているように製造した（B.Froehler、Protcols for Oligonucleotides and Analogs：Synthesis and Properties. Humana、Totowa、NJ(1993)；Froehler et al.、Tetrahedron Lett. 33: 5307 (1992)；およびFroehler et al.、Tetrahedron Lett. 34: 1003 (1993)）。マウスp27配列およびヒトp27配列（これらはWO PCT/US95/07361に記載されており、そして、それぞれ、受け入れ番号U09968およびU10906でGenbankに受託された）の間において同一である配列をターゲットするように、アンチセンスオリゴヌクレオチドを設計した。
【０２２２】
これらの実験において使用したアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列、オリゴヌクレオチド3163（［配列番号：１］5’UGG CUC UCC UGC GCC 3’）（ネズミKip1の塩基対306-320をターゲットする、その配列はWO PCT/US95/07361、引用することによって本明細書の一部とされる、に記載されておりそして、また、受け入れ番号U09968でGenbankに受託された）およびそのミスマッチの対照オリゴヌクレオチド3436（［配列番号：２］） 5’UCC CUU UGG CGC GCC 3’)、およびオリゴヌクレオチド3162（［配列番号：３］）5’GCG UCU GCU CCA CAG 3’）（ネズミKip1の塩基対548-562をターゲットする、その配列はWO PCT/US95/07361、引用することによって本明細書の一部とされる、に記載されておりそして、また、受け入れ番号U09968でGenbankに受託された）およびそのミスマッチの対照オリゴヌクレオチド3437（［配列番号：４］）5’GCA UCC CCU GUG CAG 3’）。ミスマッチ対照オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドと同一の塩基組成を有するが、スクランブルされたヌクレオチド配列を有するように設計された。
【０２２３】
オリゴヌクレオチドは、親油性試薬、ジオクチルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）とのアソシエーションにより細胞に効果的に送出された。リポフェクション手法について、30 nMの各オリゴヌクレオチドを無血清培地中で2.5μg/mlのDOPE(2:1)(Gilead Sciences, Inc.、カリフォルニア州フォスターシティー）と混合し、37℃において10分間インキュベートした。増殖するBalb/c-3T3繊維芽細胞を無血清培地中で１回すすぎ、0.1％の血清を含有する低血清培地中のオリゴヌクレオチド／DOPE溶液を再供給した。次いで、細胞を加湿インキュベーター中の37℃＋5%CO2 において24時間インキュベートした。
【０２２４】
増殖するBalb/c-3T3細胞をFITC標識化ランダムオリゴヌクレオチド（Gilead Sciences,Inc.）でリポフェクションし、次いで0.1％の血清を含有する低血清培地を24時間再供給することによって、オリゴヌクレオチドを吸収した細胞の百分率を決定した。FITC標識化オリゴヌクレオチドの吸収について陽性であった細胞の百分率を、UV蛍光顕微鏡検査により測定した。FITC標識化オリゴヌクレオチド対照の使用は、90〜95％の細胞が吸収され、そしてオリゴヌクレオチドが細胞核の中に濃縮されたことを示した。
【０２２５】
p27のアンチセンスまたはミスマッチの対照オリゴヌクレオチドでトランスフェクタントした血清飢餓（0.1％の血清を含有する低血清培地中で24時間）Balb/c-3T3繊維芽細胞からの細胞抽出物を、抗p27抗血清でイムノブロットすることによって分析した。イムノブロットにおいて、p27タンパク質の発現がアンチセンス処理細胞（第1A図）において実質的に減少したが、ミスマッチオリゴヌクレオチドは血清除去後においてp27の蓄積に対して作用しなかったことが示された。結果は１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび対照オリゴヌクレオチドについて示されているが、他のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび対照オリゴヌクレオチドを使用して同一の結果が得られた。
【０２２６】
p27アンチセンス処理は関係するCK２、p21の発現を減少させなかった。増殖するBalb/c-3T3繊維芽細胞を、前述したようにアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびミスマッチオリゴヌクレオチドでリポフェクションした。細胞に0.1％の血清を含有する低血清培地を再供給し、34時間後にフローサイトメトリーおよびp21のイムノブロットにより分析した。Firpo et al.、Mol. Cell .Biol. 14:4889 (1994)）において観察されるように、p21は血清飢餓細胞に比較して増殖する細胞中の増加した。p27のミスマッチまたはアンチセンスのオリゴヌクレオチドでリポフェクトされた細胞は、血清飢餓対照細胞に比較して、わずかにより高いレベルのp21を発現した。
【０２２７】
サイクリンＡおよびサイクリンＥとのp27のアソシエーションの減少は、アンチセンス処理細胞におけるp27の全体のレベルの減少に相当した（第1B図）。これは血清飢餓細胞におけるサイクリンＥおよびサイクリンＡ関連キナーゼ活性の回復に関係づけられた。増殖するBalb/c-3T3繊維芽細胞を、p27のミスマッチオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドで６時間リポフェクトし、次いで0.1％の血清を含有する低血清培地を再供給した。24時間後、細胞を収獲し、ヒストンH1キナーゼアッセイをサイクリンＥおよびサイクリンＡの免疫沈降物について実施した。p27のアンチセンスオリゴヌクレオチドでリポフェクトした血清飢餓細胞は、血清飢餓細胞に比較して、増加したレベルのサイクリンＥおよびサイクリンＡ関連のヒストンＨ１キナーゼ活性を含有した。
【０２２８】
Balb/c-3T3繊維芽細胞の増殖する集団において、細胞の27％はＳ期にあり、そしてこれは血清除去後24時間以内に細胞の約９％の低下する。前述したようにp27のミスマッチオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドでリポフェクトした後２４時間の間血清飢餓したサブコンフルエントBalb/c-3T3細胞のフローサイトメトリーは、ミスマッチオリゴヌクレオチドに暴露した細胞が対照細胞と同一に挙動することを示した。しかしながら、p27のアンチセンスオリゴヌクレオチドに暴露した細胞は、血清除去後に、G1の停止を行わなかった；細胞の23％はＳ期止まった（表１）。また、p27のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、骨肉腫細胞系統SAOS-2(Rb突然変異した；p53突然変異した）が血清除去に応答して細胞周期を出るのを防止した（表１）。これにより証明されるように、p27の必要性は２以上の細胞の型において発揮され、そして細胞のRb状態に対して独立のマイトジェン応答性のためにp27は必要とされる。
【０２２９】
【表１】
2007259871.tif 000002
【０２３０】
核DNAの中へのブロデオキシウリジン（BrdU、Amersham）およびトリチウム標識チミジンの組込みを、細胞周期の進行に対するp27アンチセンスの作用の独立の測度として使用した。血清飢餓後24時間において、p27アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはミスマッチオリゴヌクレオチドでトランスフェクタントしたBalb/c-3T3細胞をBrdUで３時間パルス標識化して、トランシットＳ期に連続する細胞の画分を測定した。記載されているように抗BrdU抗体で免疫染色することによって、BrdUの吸収により染色された核の百分率を決定した（OhtsuboおよびRoberts、ibid.；およびKoff et al.、ibid.；それらの各々は引用することによって本明細書の一部とされる）。
【０２３１】
BrdUの組込み（標識化された核の百分率）について陽性に染色される細胞を百分率を、1mmのカバーガラス上に存在する細胞の合計数として決定した。トランスフェクトされた細胞を本質的に前述したようにトリチウム標識チミジンで標識化し、1uCi/moのトリチウム標識チミジンを使用して血清飢餓細胞を３時間のパルス標識化した。トリチウム標識チミジンで３時間パルス標識化した非同調的に増殖する細胞に比較して、血清飢餓細胞およびリポフェクトされた細胞の中へ組込まれたトリチウム標識チミジン（c.p.m.）の百分率として、トリチウム標識チミジンの組込みの百分率を決定した。
【０２３２】
p27アンチセンスオリゴヌクレオチドに暴露した細胞は、血清除去後少なくとも24時間DNAを合成し続けた。p27アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した血清のうちで、35%はBrdUを核DNAの中に組込んだが、ミスマッチ対照オリゴヌクレオチドで処理した細胞のわずかに２〜３％はそれをなした。DNA合成速度を測定するためにトリチウム標識チミジンの組込みを使用することによって、類似の結果が得られた。
【０２３３】
要約すると、これらの結果が示すように、p27アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した細胞はマイトジェン枯渇に応答してp27タンパク質を誘導することができず、そして細胞周期を出ることができなかった。このアンチセンス調製物についての作用期間は制限されたが、p27アンチセンスで処理された細胞は低いレベルのp27タンパク質を発現し、そして血清マイトジェン非存在において少なくとも４８時間増殖し続けた。
【０２３４】
実施例３.
ターゲッテッドタンパク質の発現を回復することによってアンチセンス処理の効果を克服できることを示すことによって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの特異性を証明した。
アンチセンスオリゴヌクレオチドにより阻害できないが、それにもかかわらず野生型ｐ２７タンパク質によりコードされるｐ２７発現プラスミドを構築するために、遺伝暗号の縮重を使用した（p27「ゆらぎ」プラスミド）：
［配列番号：５］                (102) L   A   Q   E   S (106)
［配列番号：６］          p27野生型  CTG GCG CAG GAG AGC
［配列番号：７］  p27ゆらぎ突然変異  --T --A --A --A TCA
【０２３５】
p27「ゆらぎ」発現プラスミドを構築するために、プラスミド配列に対するプライマー（T7）およびプライマー（［配列番号：８］5’-TAA AGG CAC CGC CTG GCG ACT ACC GCT GAC GTC CTG TGA TTC TTG TGC AAG CAC CTT GCA GGC GCT C−３’）（これはネズミp27のアミノ酸配列LAQESQD［配列識別No:9］（アミノ酸102−108）のためのゆらぎ位置に突然変異を含有する）を使用するPCR増幅により「メガプライマー」を発生させた。引き続いて「メガプライマー」３’末端におけるプラスミド配列に対するプライマー（T3プライマー）とともに使用して全長のクローンをPCR増幅し、これを発現ベクターpCS2+の中にサブクローニングした。これらの突然変異はp27アンチセンスオリゴヌクレオチドに対して７つの非合致塩基をもつp27配列をつくり、そしてユニークAatII部位をつくった。
【０２３６】
また、p27ゆらぎプラスミドの「標識化バージョン」を構築し、これはアンチセンスオリゴヌクレオチドによりターゲットされたドメインの外側の単一のアミノ酸変化から生ずるp27の電気泳動の変異型をコードした。アミノ酸102−108について上記に列挙した塩基変化に加えて、p27「標識化」ゆらぎ突然変異体は、また、セリン（111）およびアルギニン（112）に突然変異を含有した。
【０２３７】
それらのアミノ酸を、それぞれ、スレオニンおよびセリンに変換して、内因性ネズミp27および外因性野生型p27よりもわずかに低く移動するp27ゆらぎ突然変異体を生じた。標識化p27を分離し、これにより内因性p27と区別することができ、同一細胞における野生型およびゆらぎp27遺伝子からの発現に対するp27アンチセンスオリゴヌクレオチドの作用を同時に試験することができる。p27アンチセンスオリゴヌクレオチドは、外因性野生型p27遺伝子および内因性p27遺伝子の双方からの発現を効果的に阻害したが、p27ゆらぎプラスミドからのp27タンパク質の発現を阻害することができないことが観察された（図2A）。
【０２３８】
次いで、p27ゆらぎプラスミドを使用して、アンチセンス処理した細胞におけるp27タンパク質の発現がマイトジェン枯渇に対するそれらの応答性を更新するかどうかを決定した。これらの実験はp27発現の生理的効果を研究するように設計され、したがって、前述の電気泳動の変異体よりむしろ、完全に野生型のp27をコードするゆらぎプラスミドを使用して。Balb/c-3T3細胞をミスマッチオリゴヌクレオチドまたはp27アンチセンスオリゴヌクレオチドでリポフェクトし、次いでβ−ガラクトシダーゼをコードするプラスミド（注入した細胞をマークするために）およびp27ゆらぎプラスミドの双方を使用してマイクロインジェクションした。
【０２３９】
下記の参考文献に記載されているように、マイクロインジェクション、免疫蛍光染色、および蛍光顕微鏡検査を実施した：Fisher et al.、Nucl. Acid Res. 21:3857 (1993)；Hanvey et al.、Science 258:1481 (1992)；Wagner et al.、Science 260:1510 (1993)；Moulds et al.、Biochem. 34: 5044 (1995）、それらの各々は引用することによって本明細書の一部とされる。細胞を無血清培地中の１回すすぎ、次いで0.1％の血清を含有する低血清培地中で２４時間血清飢餓させた。前述したように、細胞をBrdUで３時間パルス標識化し、次いでβ−ガラクトシダーゼおよびBrdUの共染色するために、細胞を固定し、次いでまずポリクローナル抗ガラクトシダーゼ抗体（5'3'Inc.Bouldr、CO）と60分間インキュベートし、次いでフルオレセイン結合ヤギ抗ウサギIgG（Jackson Immunoresearch Laboratories、ペンシルベニア州ウェストグローブ）と30分間インキュベートした。
【０２４０】
次いで、細胞をフルオレセイン結合ウサギ抗ヤギIgG抗体と30分間インキュベートした。この手法の終わりにおいて、スライドを再び3.7％ホルムアルデヒドで10分間固定し、次いでアセトン中で１分間インキュベートした。細胞をTBSで再水和し、4N HClで10分間処理し、最後にTBSで洗浄した。BrdU染色を可視化するために、細胞をモノクローナル抗BrdU抗体（Boehringer Mannheim、ドイツ国）と１時間インキュベートし、次いでローダミン結合ロバ抗マウス抗体（Jackson Immunoresearch Laboratories、ペンシルベニア州ウェストグローブ）と30分間インキュベートした。
【０２４１】
前述したように実施したBrdUでパルス標識化により、Ｓ期の細胞の百分率を測定した。BrdUを組込まれたβ−ガラクトシダーゼ陽性細胞の百分率を決定し、そしてβ−ガラクトシダーゼの発現について陽性に染色する細胞の合計数に比較して、Ｓ期の細胞の百分率として会わした。p27アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する細胞のリポフェクションは、マイトジェン枯渇後における細胞周期から出る細胞の百分率を著しく減少させ、そしてこれはp27ゆらぎプラスミドを使用するマイクロインジェクションにより逆転した（図2B）。
これらの結果が示すように、p27アンチセンス処理した細胞は、p27発現の喪失により、マイトジェン枯渇後に細胞周期から特異的に出ることができなかった。
【０２４２】
実施例４.
増殖する細胞において発現するp27の基礎レベルは、G1の間のCdk活性化に付与される阻害限界値に寄与することができる（SherrおよびRoberts、Genes & Dev. 9:1149 (1995）。有糸分裂的に増殖する細胞において、サイクリン−Cdk複合体の数がCKI限界値を越えるとき、こうしてCdk活性化を起こるであろう。したがって、G1の間のCdk活性化の時間はサイクリン合成速度およびCKI発現のレベルの双方に依存するであろう。（G1サイクリンの過度の発現は、サイクリン−Cdk複合体およびより短いG1の初期の活性化を引き起こす。OhtsuboおよびRoberts、Science 259:1908 (1993)；Quelle et al.、Genes & Dev. 7:1559 (1993)；ResnitzkyおよびReed、Mol. Cell. Biol. 15: 3463 (1995))。
【０２４３】
この実施例において、p27の限界値がCdk活性化のタイミングに影響を及ぼし、したがってG1の期間に影響を及ぼすことを示す実験を記載する。１つの極端において、高いレベルのp27はCdk活性化を妨害し、G1において細胞周期を停止することが示された（Polyak et al.、Cell 78:59(1994)、ToyashimaおよびHunter、ibid.、p.67)。
p27発現の減少が早期のCdk活性化およびG1の短縮を可能とするかどうかを決定するために、指数的に増殖するBalb/c-3T3細胞をp27アンチセンスまたはミスマッチ対照オリゴヌクレオチドでリポフェクトし、高い血清中でさらに24時間の間連続して増殖させた。
【０２４４】
p27アンチセンス処理は増殖する細胞中のp27タンパク質の発現を正常のレベルよりに減少させることが観察されたが、ミスマッチ対照においてp27発現に対する作用は見られなかった。これらの細胞集団をフローサイトメトリーにより分析すると、p27アンチセンスオリゴヌクレオチドはG1における細胞の百分率を著しく減少することが明らかにされ、G1の長さが細胞周期の他の期に関して短縮されたことが示された。
【０２４５】
実施例５.
トランスジェニックマウスにおいてp27遺伝子のターゲッテッド欠失をつくり、そして生活可能なホモ接合性p27「ノックアウト」動物（これらの動物において、p27遺伝子座は遺伝子の構造的崩壊により機能的に不活性化される）を生産した。ゲノムp27配列をマウスの129/SV系統から誘導し、こうして相同組換えが129/SVマウスの胚幹細胞中のコンジェニックバックグラウンドにおいて起こることができるようにした。32P放射線標識化p27 cDNAプローブを使用して129/SVマウス（Soriano et al.、Cell 64:693-707(1991)；これは引用することによって本明細書の一部とされる）から調製したゲノムライブラリーから、p27ゲノムクローンを単離した。
【０２４６】
プラスミドpPNT（Tybulewicz et al.、Cell 65:1153-1163 (1991）、これは引用することによって本明細書の一部とされる）（これはネオマイシン耐性遺伝子（neo、積極的選択マーカー）および単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子（hsv-tk；消極的選択マーカー）をPGKプロモーターのコントロール下に含有する）は、ターゲッティング構築物のベクターの主鎖を提供した。p27フラグメントの５’末端がPGKプロモーター−neo発現カセットの上流に挿入されるように、p27のゲノム５’非翻訳配列を含有する7kbのXhoIフラグメントをpPNTベクターのXhoI部位に挿入した。
【０２４７】
ゲノムフラグメントの５’および３’が同一向きにあるように、３’非翻訳p27ゲノム配列を含有する1.8kbのBglII−EcoRIフラグメントをBglII部位とEcoRI部位との間に、PGK−プロモーター−neo発現カセットの下流に挿入した。これにより、pPNTベクターからのPGKプロモーター−neo発現カセットにより置換された全体のp27コーディング領域と、p27のフランキング領域から合計8.8 kbの相同性が生じた。この構築物において、hsv-tkはまたPGKプロモーターにより推進されるが、３’→p27フランキングDNAに横たわり、１（２−デオキシ−２−フルオロ−ベータ−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−ヨードウラシル（FIAU、ヌクレオシド類似体）の存在において細胞の死を引き起こすことによってランダム組込み事象に対する選択の手段を提供する。
【０２４８】
ターゲッティング構築物を線状化し、そしてマウス胚幹（ES）細胞の中へのエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。129/Sv誘導ES細胞系統、AK-7（Zhuang et al.、Cell 79:875-884 (1994）、これは引用することによって本明細書の一部とされる、に記載されている）をエレクトロポレーションに使用した。これらのES細胞を日常的にミトマイシンＣ処理した（Sigma）SNL76/7STO細胞（フィーダー細胞）（McMahonおよびBradley、Cell 62:1073-1085(1990）、これは引用することによって本明細書の一部とされる）上で１５％の胎仔ウシ血清（Hyclone）および0.1 mMのβ−メルカプトエタノールを補充した高いグルコースDMEMを含有する培地中で培養した。
【０２４９】
トランスフェクションのためのターゲッティング構築物を製造するために、25μgのターゲッティング構築物をHindIIIを使用する消化により線状化し、フェノール−クロロホルム抽出し、そしてエタノール沈降させた。次いで線状化ベクターを107 ES細胞の中にエレクトロポレートした。エレクトロポレートした細胞を、ミトマイシンＣ不活性化SNL76/8STOフィーダー細胞のサブコンフルエント層で、２つのゼラチン化プレート上に播種した。エレクトロポレーション後24時間において、１つのプレートに0.2mMのG418を含有する培地を添加し、そして残りのプレートに0.2mMのG418および0.2mMのFIAUを添加した。FIAUの存在は、G418単独を有する対照プレートに比較して、形成したコロニーの数をほぼ10倍減少させた。
【０２５０】
各プレートの培地を最初の数日間毎日交換し、次いで選択が起こった後、必要に応じて交換した。p27遺伝子がneo遺伝子で置換された、真の相同組換え（HR）事象を有するES細胞のコロニーを、p27−ノックアウト構築物に対してユニークな2kbのPCR断片を増幅する能力により同定した。10日間の選択後、各コロニーの一部分を顕微鏡的に吸引マイクロピペットで取り上げ、そしてJoyner et al.、Nature 338:153-156 (1989)（これは引用することによって本明細書の一部とされる）に記載されているように、PCRにより直接的に分析した。簡単に述べると、PCR増幅を記載されているように（Kogan et al.、New England J.Med. 317:985990 (1987）、これは引用することによって本明細書の一部とされる）93℃で30秒間の４サイクル、93℃で30秒間の36サイクル、55℃で30秒間、および65℃で２分間、を使用して実施した。
【０２５１】
突然変異体p27アレレを検出するために、プライマーneo-1（CCT TCT ATG GCC TCC TTG ACG）およびmgk2（TTC TTA AAA GGG ACA CTA ATC）［それぞれ、配列識別No:10および11］をPCR反応において使用した。陽性のコロニーをPCRにより同定し、４−ウェルのプレートの中にサブクローニングし、60 mmのプレートの中に拡張し、そして２〜３本のアンプルの中に凍結させた。ターゲッティング構築物の５’および３’末端の双方に対して外部のプローブを使用するサザンブロット分析により、真の相同組換え事象が概観した12のクローンの各々において起こったことが確証された。
【０２５２】
キメラマウスを発生させるために、６つの陽性のクローンをトリプシン処理して単細胞にし、そしてC57Bk/6Jマウスから得られた芽細胞の各々に個々のクローンからほぼ１５の細胞を注入した。次いで、注入した芽細胞を偽妊娠Ｆ１マウス（C57Bk/6J×129/Sv）の中に移植した。主としてアグーティの毛皮（体の組織へのES細胞の主要な寄与を示す）を有するキメラのネズミの子をそれ以上の飼育のために選択した。３つの別々のＥＳ細胞クローンを表す９匹の完全な雄のキメラが引き続いて同定された。雄のキメラをC57Bk/6J雌に対して交配させた。また、キメラの雄を129/Svの雌に対して交配させて、コンジェニックバックグラウンドの中にノックアウト突然変異を配置した。
【０２５３】
再び、Fiアグーティ子孫の50％において突然変異p27トランスジーンの伝達がPCRで示された。簡単に述べると、テイル生検から調製したゲノムDNAを前述したようにPCRにかけてプライマーmgk-3（TGG AAC CCT GTG CCA TCT CTA T）およびneo-1［配列番号：12および10］を使用して突然変異体（p27ノックアウト遺伝子）を同定し、そしてプライマーmgk-3およびmck-5（GAG CAG ACG CCC AAG AAG C）［配列番号：12および13］を使用して野生型遺伝子を同定した。ホモ接合性p27欠失がF2世代において得られ、これは突然変異トランスジーンに対してユニークな0.5 bkのフラグメントをPCRする能力の非存在、および0.9 kbの野生型フラグメントの非存在により確証された。これらのマウスからのp27タンパク質の完全な非存在は、ウサギポリクローナル抗p27抗血清を使用する全組織抽出物のウェスタンブロットにより確証された。
【０２５４】
ハイブリッド遺伝的バックグラウンド（129/Sv×C57Bk/6J）に対する各遺伝子型（ホモ接合性ノックアウト、-/-；ヘテロ接合性ノックアウト、-/+；および野生型、+/+）のマウスの比較において、野生型マウスに関するホモ接合性p27ノックアウトマウスの間の大きさの差が証明された。Ｆ野生型129/SvマウスがそれらのC57Bk/6J相手よりもかなり大きいので、２世代からのハイブリッドマウス（129/Sv×C57Bk/6J）はかなりの大きさの変動を示した。しかしながら、ホモ接合性ノックアウトマウスは、平均すると、性別が合致した同腹子の交配の対照よりも約30％より大きい体重を示した（図3Bおよび図3Cを参照のこと）。この差は３週齢において存在し、成体まで持続した（p＜0.05）。この大きさの差は同系交配（129/Sv）バックグラウンドにおいて確証された。
【０２５５】
ノックアウトマウスと野生型との間の大きさの差をさらに検査するために、ランダムに選択されたノックアウトマウスおよび野生型の同腹子の交配の対照からの内部の器官を解剖した。ノックアウトマウスの内部器官の重量は身体の大きさに比例したが、顕著な例外は胸腺および脾臓であり、これらは、平均すると、ノックアウト動物においてほぼ２倍大きかった。ノックアウトマウスからの脾臓および胸腺からの核化した細胞の計数はこれらの組織の細胞過多を確証し、そして器官の重量に比例した。p27は皮質およびマウス胸腺のより成熟した髄質区域の双方において発現されることが示された。しかしながら、胸腺および脾臓の質量の増加は動物の全体の体重に比較して小さく、したがって、全体として動物の重量の差を説明しなかった。したがって、p27欠失は、脂肪または器官巨大症における不釣り合いな増加なしに、動物の大きさの全体の増加に導くように見える。
【０２５６】
脾臓のCFU-Meg（巨核球コロニー形成単位）、CFU-GM（顆粒球／マクロファージコロニー形成単位）、BFU-E（赤血球バースト形成単位）を、２匹の野生型および２匹のホモ接合性ノックアウトマウスから収獲した脾臓（重量および合計の細胞数の２つの差が１桁より小さかった）について、本質的に記載されているようにしてコロニー形成単位のアッセイにより測定した（Kaushansky et al.、Nature 85:1719-1726(1995)；Kaushansky et al.、J. Clin. Invest. 96: 1683-1687 (1995）、これらは引用することによって本明細書の一部とされる）。ノックアウトマウスおよび野生型マウスの脾臓からのCFU-Meg、CFU-GM、BFU-Eの合計数の比較により、野生型マウスの脾臓からの各細胞型の数に関して、ノックアウトマウスからの細胞型の各々の数の10倍までの増加が証明された。
【０２５７】
【表２】
2007259871.tif 000003
【０２５８】
正常のネズミのES細胞の抽出物のウェスタンブロットは、マウスの発育のこの初期の段階においてさえｐ２７が発現することを明らかにする。ウェスタンブロットは、胸腺組織における発現の拡散パターンを包含する、正常のマウスの組織におけるｐ２７発現を検出した。ノックアウトマウスからの組織のウェスタンブロットにおいて、検出可能なｐ２７発現は見られなかった。
【０２５９】
実施例６.  永久分裂能化された細胞系統の産生
標準的3T3法を使用して、永久分裂能化された繊維芽細胞を誘導した。例えば、AaronsonおよびTodaro、J. Cell Physiol. 72: 141-148 (1968）および、TodaroおよびおよびGreen、J. Cell. Biol. 17: 299-313 (1963）を参照のこと。p27+/-ヘテロ接合性マウスを交雑させ、子孫の雌を犠牲にし、そしてe10〜e14胚を収獲した。各胚のヘッドおよび内部器官を除去した。上記実施例ＶのPCR方法を使用して、胚ヘッドから調製したDNAについてトランスジーンの存在を決定した。各胚からの残りの組織を細かく切り、10％の胎仔ウシ血清を補充したダルベッコ変性イーグル培地（DMEM）の中に入れた。細胞を培養し、３日毎に60cmの培養皿の中に3×105 細胞の密度に分割した。細胞を記載するように危機を通して継代させ、この時永久分裂能化された細胞は増殖し、p27+/+3T3、p27+/-3T3およびp27-/-3T3と表示した。
【０２６０】
本発明を理解を明瞭にする目的で図解および実施例により多少詳細に説明したが、添付した請求の範囲の範囲内である種の変化および変更を行うことができることが明らかである。この明細書の中に引用したすべての刊行物および特許明細書は、各個々の刊行物および特許明細書が個々に意味するのと同一の程度にすべての目的のためのそれらの全体において引用することによって本明細書の一部とされる。
【０２６１】
本発明に関連する他の態様
（１）  肥大非ヒト動物の生産方法において、非ヒト動物中のp27サイクリンインヒビター遺伝子の発現を機能的に不活性化することを含んでなり、ここで前期肥大が、p27サイクリンインヒビター遺伝子の機能的発現を有する非ヒト動物に比べて生産される、ことを特徴とする方法。
（２）  前記肥大非ヒト動物のゲノムが、機能的に破損したp27サイクリンインヒビターを含む、（１）に記載の方法。
（３）  前記p27サイクリンインヒビター遺伝子が、ポリヌクレオチドターゲティング構築物により破壊され、ここで当該ポリヌクレオチドターゲティング構築物は、p27サイクリンインヒビター遺伝子中に存在する配列に対して相同であり且つ対応するp27サイクリンインヒビター遺伝子座に組み込まれた場合にp27サイクリンインヒビター蛋白質の発現を機能的に破壊しそして不活性化するポリヌクレイチド配列を含んでなる、（２）に記載の方法。
（４）  前記相同なポリヌクレオチド配列が、p27のゲノム性５'非翻訳配列を含有する７kb Xho Iフラグメント及びp27のゲノム性３'非翻訳配列を含有する1.8 kb Bgl II-Eco RＩフラグメントを含んでなる、（３）に記載の方法。
（５）  アンチセンスポリヌクレオチドが、非ヒト動物において前記p27サイクリンインヒビター遺伝子の発現を機能的に不活性化する、（１）に記載の方法。
（６）  前記p27アンチセンスポリヌクレオチドが、ヌクレオチド配列5'-UGG CUC UCC UGC GCC-3'（配列番号：１）又はヌクレオチド配列5'-GCG UCU GCU CCA CAG-3'（配列番号：３）を有する、（５）に記載の方法。
（７）  非ヒト動物の成長速度を増加させる方法において、非ヒト動物中のp27サイクリンインヒビター遺伝子の発現を機能的に不活性化することを含んでなり、ここで前記非ヒト動物の成長速度が、p27サイクリンインヒビター遺伝子の機能的発現を有する非ヒト動物に比べて増加される、ことを特徴とする方法。
（８）  前記非ヒト動物のゲノムが、機能的に破損されたp27サイクリンインヒビターを含む、（７）に記載の方法。
（９）  前記p27サイクリンインヒビター遺伝子が、ポリヌクレオチドターゲティング構築物により破壊され、ここで当該ポリヌクレオチドターゲティング構築物は、p27サイクリンインヒビター遺伝子中に存在する配列に対して相同であり且つ対応するp27サイクリンインヒビター遺伝子座に組み込まれた場合にp27サイクリンインヒビター蛋白質の発現を機能的に破壊しそして不活性化するポリヌクレイチド配列を含んでなる、（８）に記載の方法。
（１０）  前記相同なポリヌクレオチド配列が、p27のゲノム性５'非翻訳配列を含有する７kb Xho Iフラグメント及びp27のゲノム性３'非翻訳配列を含有する1.8 kb Bgl II-Eco RＩフラグメントを含んでなる、（９）に記載の方法。
（１１）  アンチセンスポリヌクレオチドが、非ヒト動物において前記p27サイクリンインヒビター遺伝子の発現を機能的に不活性化する、（７）に記載の方法。
（１２）  前記p27アンチセンスポリヌクレオチドが、ヌクレオチド配列5'-UGG CUC UCC UGC GCC-3'（配列番号：１）又はヌクレオチド配列5'-GCG UCU GCU CCA CAG-3'（配列番号：３）を有する、（11）に記載の方法。
（１３）  前記非ヒト動物が、哺乳類、魚類又は鳥類である、（１）〜（12）のいずれか１項に記載の方法。
（１４）  前記非ヒト哺乳類が、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ又はマウスである、（13）に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０２６２】
【図１Ａ】図１Ａは、p27が細胞周期の除去（withdrawal）に必要であることを示し、対照の増殖するBalb/c-3T3細胞（Hi）、サブコンフルエントの血清飢餓Balb/c-3T3細胞（Low）、およびp27ミスマッチ（MS）またはアンチセンス（AS）オリゴヌクレオチドでリポフェクションした後24時間の間血清飢餓させたサブコンフルエントのBalb/c-3T3細胞からの抽出物のp27イムノブロット分析である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、p27が細胞周期の除去（withdrawal）に必要であることを示し、増殖するBalb/c-3T3細胞（HI）、サブコンフルエントの血清飢餓Balb/c-3T3細胞（Lo）またはp27ミスマッチ（MS）またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（AS）でリポフェクションした後24時間の間血清飢餓させたBalb/c-3T3細胞からのサイクリンＡ、サイクリンＢまたはＣｄｋ２の免疫沈降物のp27イムノブロット分析である。
【０２６３】
【図２Ａ】図２Ａは、強化されたp27発現が血清飢餓細胞におけるp27アンチセンス作用を逆転することを示し、野生型p27または標識化（p27*）p27ゆらぎ突然変異をコードするプラスミドを使用する、p27アンチセンスオリゴヌクレオチドの存在（＋）または非存在（−）におけるリポフェクション後24時間における増殖するBalb/c-3T3細胞のp27イムノブロット分析である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、強化されたp27発現が血清飢餓細胞におけるp27アンチセンス作用を逆転することを示し、増殖するBalb/c-3T3細胞繊維芽細胞（Hi）をp27ミスマッチ（MSM）またはアンチセンス（AS）オリゴヌクレオチドで高い血清中で６時間リポフェクションしたとき、得られた結果を示す。
【０２６４】
【図３Ａ】図３Ａは６〜７週齢の20匹の対照およびp27-/- マウスからの器官重量の平均および95％信頼区間を示し、そしてプロットは対照マウスと比較したノックアウトマウスにおける重量増加％である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、週齢の関数として30匹の対照、p27-/- 、およびp27-/- 雌マウスの重量の平均および95％信頼区間を示し、ここでインセットは誕生日および10日に秤量した20匹の雄＋雌のマウスの別々のグループの重量を示す。21日からのデータは第１グループからの結果の平均である。
【図３Ｃ】図3Cの描写は第3B図と同一であるが、データは雄のマウスから得られた。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2007259871.tif 000009
【図３Ｃ】
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【配列表】
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