(57)【要約】      （修正有）【課題】グルタミン酸受容体とカルシウム受容体のキメラ受容体を作製し、もとの両受容体の活性調節物質のスクリーニング法を提供する。【解決手段】代謝指向型グルタミン酸受容体の領域に相同な少なくとも１つの領域と、カルシウム受容体に相同な少なくとも１つの領域を含むキメラ受容体、及び該受容体を製造する方法、更に該受容体を用いて代謝指向型グルタミン酸受容体またはカルシウム受容体の活性を調節する化合物を同定し特徴づける方法。また、代謝指向型グルタミン酸受容体の活性を調節するか、または代謝指向型グルタミン酸受容体に結合する化合物および方法。代謝指向型グルタミン酸受容体の活性の調節は、鎮痛効果、認知増強、および筋弛緩効果を含む、神経学的傷害および疾患の治療等の種々の目的に用いることができる。【選択図】図１
2007006893.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
代謝指向型グルタミン酸受容体またはカルシウム受容体に結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）受容体のフラグメントをコードする核酸配列を調製し、
ｂ）前記配列を、宿主細胞中で前記フラグメントを発現しうる複製可能な発現ベクター中に挿入し、
ｃ）宿主細胞を（ｂ）のベクターで形質転換し、
ｄ）前記宿主細胞からフラグメントを回収し、
ｅ）前記フラグメントおよび前記化合物を許容可能な媒質中に導入し、そして
ｆ）化合物のフラグメントへの結合を物理学的に検出可能な手段によりモニターする；
の各工程を含む方法。
【請求項２】
前記受容体が代謝指向型グルタミン酸受容体である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記フラグメントが前記代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインを含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記フラグメントが前記代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインを含む、請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記フラグメントが代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞質テイルドメインを含む、請求項２記載の方法。
【請求項６】
前記受容体がカルシウム受容体である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記フラグメントが前記カルシウム受容体の細胞外ドメインを含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記フラグメントが前記カルシウム受容体の７回貫膜ドメインを含む、請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記フラグメントが前記カルシウム受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞質テイルドメインを含む、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
代謝指向型グルタミン酸受容体またはカルシウム受容体に結合するかまたはそれを調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）受容体のフラグメントをコードする核酸配列を調製し、
ｂ）前記配列を宿主細胞中において前記フラグメントを発現しうる複製可能な発現ベクター中に挿入し、
ｃ）宿主細胞を（ｂ）のベクターで形質転換し、
ｄ）前記形質転換された宿主細胞および前記化合物を許容可能な媒質中に導入し、そして
ｅ）前記化合物の前記宿主細胞に及ぼす影響をモニターする；
の各工程を含む方法。
【請求項１１】
前記フラグメントが代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞質テイルドメインを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記フラグメントがカルシウム受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞質テイルドメインを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
受容体に結合するかこれを調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）第１の受容体のフラグメントを含む第１のフラグメントをコードする核酸配列を調製し、
ｂ）該配列を宿主細胞中で前記第１のフラグメントを発現しうる複製可能な発現ベクター中に挿入し、
ｃ）宿主細胞を（ｂ）のベクターで形質転換し、
ｄ）第１のフラグメントを宿主細胞から回収し、
ｅ）第２の受容体のフラグメントを含む第２のフラグメントをコードする核酸配列を調製し、
ｆ）（ｅ）の配列を宿主細胞中で前記第２のフラグメントを発現しうる複製可能な発現ベクター中に挿入し、
ｇ）宿主細胞を（ｆ）のベクターで形質転換し、
ｈ）第２のフラグメントを（ｇ）の宿主細胞から回収し、
ｉ）前記第１のフラグメントおよび前記第２のフラグメントおよび前記化合物を許容可能な媒質中に導入し、そして
ｊ）化合物の結合および／または調節を物理学的に検出可能な手段によりモニターする；
の各工程を含む方法。
【請求項１４】
前記第１のフラグメントが代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインを含み、かつ
前記第２のフラグメントがカルシウム受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞質テイルドメインを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記第１のフラグメントが代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインおよび７回貫膜ドメインを含み、かつ
前記第２のフラグメントがカルシウム受容体の細胞質テイルドメインを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
前記第１のフラグメントがカルシウム受容体の細胞外ドメインを含み、かつ
前記第２のフラグメントが代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞質テイルドメインを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
前記第１のフラグメントがカルシウム受容体の細胞外ドメインを含み、かつ
前記第２のフラグメントが代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインおよびカルシウム受容体の細胞質テイルドメインを含む、請求項１３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、代謝指向型グルタミン酸受容体に相同な一つもしくは複数の領域、およびカルシウム受容体に相同な一つもしくは複数の領域を含むキメラ受容体に関する。
【背景技術】
【０００２】
以下の記述により本発明に関する情報の概要が提供される。これは、本明細書に提供される情報のいずれかが特許請求の範囲に記載される本発明に対する従来の技術であるか、あるいは具体的にもしくは暗示的に引用される刊行物のいずれかが前記発明に対する従来の技術であるということの承諾ではない。
【０００３】
グルタミン酸は哺乳類の脳における主要な興奮性伝達物質である。グルタミン酸は細胞表面受容体に結合し、そしてそのことによってその受容体を活性化することにより中枢のニューロンに影響を及ぼす。これらの受容体は２つの主要クラスであるイオンチャンネル内蔵型（ｉｏｎｏｔｒｏｐｉｃ）および代謝指向型（ｍｅｔａｂｏｔｒｏｐｉｃ）グルタミン酸受容体に既に細分されているが、その細分は受容体蛋白質の構造特性、受容体がシグナルを細胞内へ伝達する方法、および薬理学的特性に基づく。
【０００４】
イオンチャンネル内蔵型グルタミン酸受容体（ｉＧｌｕＲ）は、グルタミン酸結合の際に開口して所定の一価および二価のカチオンの選択的内向き電流を生じさせ、そしてそのことにより細胞膜を脱分極させるリガンド依存型イオンチャンネル（ｌｉｇａｎｄ−ｇａｔｅｄ  ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌ）である。それに加え、比較的高いカルシウム透過性を有する所定のｉＧｌｕＲは様々なカルシウム依存的細胞内過程を活性化させ得る。これらの受容体は自然界ではホモメリックもしくはヘテロメリックでありうるマルチサブユニット蛋白質複合体である。様々なｉＧｌｕＲサブユニットは全て共通の構造的モチーフを共有しており、これらのモチーフは、比較的大きなアミノ末端細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、その後に続く２つの膜スパニング領域（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｓｐａｎｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）（ＴＭ）を含む複数回貫膜ドメイン（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍｅｉｎ）（ＴＭＤ）、第二の小さい細胞内ループ、および第三のＴＭを含み、そして末端に至る前には細胞内カルボキシ末端ドメイン（ＣＴ）を含む。歴史的にｉＧｌｕＲは最初、アゴニストであるアルファ−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−イソオキサゾール−４−プロピオン酸（ＡＭＰＡ）、カイニン酸（ＫＡ）、およびＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）による優先的活性化に基づき、薬理学的に３つの分類に細分された。後に、分子クローニングによる調査と追加的な薬理学的研究とを組み合わせて、ＡＭＰＡ、ＫＡ、およびＮＭＤＡ受容体の複数のサブタイプが哺乳類ＣＮＳで発現される、より多岐にわたるｉＧｌｕＲの種類が見いだされた（Ｈｏｌｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：３１、１９９４）。
【０００５】
代謝指向型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ）は、グルタミン酸もしくは他の強力なアゴニスト（これにはキスカル酸および１−アミノシクロペンタン−１，３−ジカルボン酸（トランス−ＡＣＰＤ）が含まれる）の結合の後に様々な細胞内第二メッセンジャーシステムを活性化することが可能なＧ蛋白質共役型（Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ）受容体である（Ｓｃｈｏｅｐｐ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．  １１：５０８、１９９０；Ｓｃｈｏｅｐｐ  ａｎｄ  Ｃｏｎｎ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１４：１３、１９９３）。
【０００６】
インサイチューでの異なる代謝指向型グルタミン酸受容体サブタイプの活性化により、以下に記載の応答の内の一つもしくは複数が誘導される：ホスホリパーゼＣの活性化、ホスホイノシチド（ＰＩ）加水分解の増加、細胞内カルシウム放出、ホスホリパーゼＤの活性化、アデニリルシクラーゼの活性化もしくは阻害、サイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）の形成の増加および減少、グアニリルシクラーゼの活性化、サイクリックグアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）の形成の増加、ホスホリパーゼＡ2の活性化、アラキドン酸放出の増加、ならびに電位依存型イオンチャンネル（ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ  ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌ）およびリガンド依存型イオンチャンネルの活性の増加もしくは減少（Ｓｃｈｏｅｐｐ  ａｎｄ  Ｃｏｎｎ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．  １４：１３、１９９３；Ｓｃｈｏｅｐｐ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．２４：４３９、１９９４；Ｐｉｎ  ａｎｄ  Ｄｕｖｏｉｓｉｎ、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３４：１、１９９５）。
【０００７】
これまでには８つの異なるｍＧｌｕＲサブタイプが分子クローニングを介して既に単離されており、そして発見された順に従いｍＧｌｕＲ１〜ｍＧｌｕＲ８と命名されている（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ、Ｎｅｕｒｏｎ  １３：１０３１、１９９４、Ｐｉｎ  ａｎｄ  Ｄｕｖｏｉｓｉｎ、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３４：１、１９９５；Ｋｎｏｐｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８：１４１７、１９９５）。所定のｍＧｌｕＲサブタイプの別のスプライス形態の発現を介すると、更に別の分岐種が生じる（Ｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＮＡＳ  ８９：１０３３１、１９９２；Ｍｉｎａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．、ＢＢＲＣ  １９９：１１３６、１９９４）。全てのｍＧｌｕＲは、大きいアミノ末端細胞外ドメイン（ＥＣＤ）およびその後に続く仮想的７回貫膜ドメイン（７ＴＭＤ）（これは、３本の細胞内ループおよび３本の細胞外ループにより連結される７本の仮想的膜スパニングヘリックスを含む）、ならびに種々の長さの細胞内カルボキシ末端ドメイン（細胞質テイル）（ＣＴ）を保持する単一サブユニット膜蛋白質であるという点で構造的に類似する（概略図１ａを参照されたい）。
【０００８】
この８つのｍＧｌｕＲは、アミノ酸配列の同一性、利用する第二メッセンジャーシステム、および薬理学的特性に基づき、３つのグループに細分されている（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ、Ｎｅｕｒｏｎ  １３：１０３１、１９９４；Ｐｉｎｅ  ａｎｄ  Ｄｕｖｏｉｓｉｎ、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３４：１、１９９５；Ｋｎｏｐｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．  ３８：１４１７、１９９５）。所定のグループ内でのｍＧｌｕＲ間のアミノ酸同一性は約７０％であるが、異なるグループのｍＧｌｕＲ間では約４０％に減少する。同グループのｍＧｌｕＲについては、この関連性はおおまかにはシグナル伝達メカニズムおよび薬理学的特性における類似性に対応する。
【０００９】
グループＩのｍＧｌｕＲは、ｍＧｌｕＲ１、ｍＧｌｕＲ５、および別のスプライシングを受けたそれらの変異体を含む。これらの受容体に対するアゴニストの結合によりホスホリパーゼＣの活性化およびその後に続く細胞内カルシウムの移動がもたらされる。たとえば、組換えｍＧｌｕＲ１受容体を発現するゼノパス（Ｘｎｏｐｕｓ）卵母細胞が、電気生理学的手段により間接的にその効果を示すために既に利用されている（Ｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：７６０、１９９１；Ｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＮＡＳ  ８９：１０３３１、１９９２）。同様の結果が、組換えｍＧｌｕＲ５受容体を発現する卵母細胞を用いて達成された（Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６７：１３３６１、１９９２；Ｍｉｎａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．、ＢＢＲＣ  １９９：１１３６、１９９４）。別法では、チャイニーズ（Ｃｈｉｎｅｓｅ）ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞内で発現された組換えｍＧｌｕＲ１受容体のアゴニスト活性化は、標準的生化学的アッセイにより測定した際には、ＰＩ加水分解、ｃＡＭＰ形成、およびアラキドン酸放出を刺激した（Ａｒａｍｏｒｉ  ａｎｄ  Ｎａｋａｎｉｓｈｉ、Ｎｅｕｒｏｎ  ８：７５７、１９９２）。それと比較すると、ＣＨＯ細胞内で発現されたｍＧｌｕＲ５受容体の活性化は、ＰＩ加水分解およびその後に続く細胞内カルシウムの一過性変化（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）を刺激したが、ｃＡＭＰ形成もしくはアラキドン酸放出の刺激化は観察されなかった（Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６７：１３３６１、１９９２）。グループＩのｍＧｌｕＲについてのアゴニスト力価の概要は、キスカル酸＞グルタミン酸＝イボテン酸＞（２Ｓ，１’Ｓ，２’Ｓ）−２−カルボキシシクロプロピル）グリシン（Ｌ−ＣＣＧ−Ｉ）＞（１Ｓ，３Ｒ）−１−アミノシクロペンタン−１，３−ジカルボン酸（ＡＣＰＤ）である。キスカル酸は、グループＩＩおよびグループＩＩＩのｍＧｌｕＲと比較してグループＩの受容体については比較的選択的であるが、これはまたイオンチャンネンル内蔵型ＡＭＰＡ受容体を強く活性化させる（Ｐｉｎ  ａｎｄ  Ｄｕｖｏｉｓｉｎ、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、３４：１、Ｋｎｏｐｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．  ３８：１４１７、１９９５）。
【００１０】
グループＩＩのｍＧｌｕＲにはｍＧｌｕＲ２およびｍＧｌｕＲ３が含まれる。ＣＨＯ細胞内で発現されたこれらの受容体の活性化は、百日咳毒素感受性様式で阻害性Ｇ蛋白質Ｇiを介してアデニリルシクラーゼ活性を阻害する（Ｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｎ  ８：１６９、１９９２；Ｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３：１３７２、１９９３）。グループＩＩ受容体についてのアゴニスト力価の概要は、Ｌ−ＣＣＧ−Ｉ＞グルタミン酸＞ＡＣＰＤ＞イボテン酸＞キスカル酸である。予備実験により、Ｌ−ＣＣＧ−Ｉおよび（２Ｓ，１’Ｒ，２’Ｒ，３’Ｒ）−２−（２，３−ジカルボキシシクロプロピル）グリシン（ＤＣＧ−ＩＶ）は双方ともグループＩＩの受容体について比較的選択的なアゴニストであることが示唆される（Ｋｎｏｐｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．  ３８：１４１７、１９９５）。
【００１１】
グループＩＩＩのｍＧｌｕＲには、ｍＧｌｕＲ４、ｍＧｌｕＲ６、ｍＧｌｕＲ７、およびｍＧｌｕＲ８が含まれる。グループＩＩの受容体同様、これらのｍＧｌｕＲは、ＣＨＯ細胞内で発現される場合には、百日咳毒感受性様式でアデニレートシクラーゼに対して負に共役して細胞内ｃＡＭＰ蓄積を阻害する（Ｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  １３：１３７２、１９９３；Ｎａｋａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６８：１１８６８、１９９３；Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６９：１２３１、１９９４；Ｄｕｖｉｏｉｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  １５：３０７５、１９９５）。グループとしてのそれらのアゴニスト効力の概要は、（Ｓ）−２−アミノ−４−ホスホノ酪酸（Ｌ−ＡＰ４）＞グルタミン酸＞ＡＣＰＤ＞キスカル酸であるが、ｍＧｌｕＲ８は僅かに異なり、グルタミン酸はＬ−ＡＰ４より強い効力を示す（Ｋｎｏｐｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．  ３８：１４１７、１９９５；Ｄｕｖｏｉｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  １５：３０７５、１９９５）。Ｌ−ＡＰ４および（Ｓ）−セリン−Ｏ−リン酸（Ｌ−ＳＯＰ）の双方共がグループＩＩＩの受容体に対して比較的選択性のアゴニストである。
【００１２】
最後に、８つのｍＧｌｕＲサブタイプは哺乳類ＣＮＳにおける独特な発現パターンを有しており、多くの場合においてそのパターンは重複している（Ｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：７６０、１９９１；Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｎ  ９：２５９、１９９２；Ｏｈｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ５３：１００９、１９９３；Ｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３：１３７２；Ｏｈｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｎ  １３：５５、１９９４、Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６７：１３３６１、１９９２；Ｎａｋａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６８：１１８６８、１９９３；Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９；１２３１、１９９４；Ｄｕｖｏｉｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５：３０７５、１９９５）。その結果、所定のニューロンはだた一つの特定のｍＧｌｕＲサブタイプを発現であろうが、他のニューロンは細胞上の類似するおよび／または異なる位置に局在していてもよい複数のサブタイプを発現するであろう（すなわち、シナプス後樹状突起および／または細胞体  対  シナプス前軸索終末）。従って、所定のニューロンにおけるｍＧｌｕＲ活性化の機能面での結果は、発現される特定のｍＧｌｕＲ；グルタミン酸に対する受容体の親和性および細胞が露出されるグルタミン酸の濃度；受容体により活性化されるシグナル伝達経路；ならびに細胞上の受容体の位置に依存するであろう。所定の脳領域におけるｍＧｌｕＲ発現ニューロン間での多重相互作用により、更に高レベルの複雑さが導入されうる。これらの複雑さおよびサブタイプ−特異的ｍＧｌｕＲアゴニストおよびアンタゴニストの欠如の結果として、神経機能に影響を及ぼす生理学的および病態生理学的過程における特定のｍＧｌｕＲの役割は厳密には定義されていない。それにもかかわらず、利用可能なアゴニストおよびアンタゴニストに関する研究により、グループＩＩおよびグループＩＩＩのｍＧｌｕＲと比較してグループＩのｍＧｌｕＲに関するいくつかの一般的見識が得られている。
【００１３】
グループＩのｍＧｌｕＲの生理学的役割を解明する試みにより、これらの受容体の活性化は神経的興奮を誘発することが示唆される。様々な研究により、ＡＣＰＤは海馬、大脳皮質、小脳、および視床、ならびに他の脳領域のニューロンに対して適用したとき、シナプス後興奮を生成し得ることが既に示されている。この興奮はシナプス後ｍＧｌｕＲの直接的活性化に起因することが証拠により示されるが、ただし更にこの興奮はシナプス前ｍＧｌｕＲの活性化によって媒介されて神経伝達物質放出の増加をもたらすことも既に示唆されている（Ｂａｓｋｙｓ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．  １５：９２、１９９２；Ｓｃｈｏｅｐｐ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．  ２４：４３９、１９９４；Ｐｉｎ  ａｎｄ  Ｄｕｖｏｉｓｉｎ、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３４：１）。薬理学的実験によりグループＩのｍＧｌｕＲがこの刺激化の媒介物であることが暗示される。ＡＣＰＤの効果は、ｉＧｌｕＲアンタゴニストの存在下での低濃度のキスカル酸により再生することができ（Ｈｕ  ａｎｄ  Ｓｔｏｒｍ、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  ５６８：３３９、１９９１；Ｇｒｅｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２２９：２７６、１９９２）、そしてｍＧｌｕＲ１を活性化することが知られている２つのフェニルグリシン化合物、（Ｓ）−３−ヒドロキシフェニルグリシン（（Ｓ）−３ＨＰＧ）および（Ｓ）−３，５−ジヒドロキシフェニルグリシン（（Ｓ）−ＤＨＰＧ）もまた興奮を生じる（Ｗａｔｋｉｎｓ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｉｎｇｒｉｄｇｅ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．  １５：３３３、１９９４）。それに加え、興奮は、ｍＧｌｕＲ１アンタゴニストとして知られる化合物である（Ｓ）−４−カルボキシフェニルグリシン（（Ｓ）−４ＣＰＧ）、（Ｓ）−４−カルボキシ−３−ヒドロキシフェニルグリシン（（Ｓ）−４Ｃ３ＨＰＧ）、および（＋）−アルファ−メチル−４−カルボキシフェニルグリシン（（＋）−ＭＣＰＧ）により遮断することができる（Ｅａｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２４４：１９５、１９９３；Ｗａｔｋｉｎｓ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｉｎｇｒｉｄｇｅ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．  １５：３３３、１９９４）。
【００１４】
ｍＧｌｕＲの生理学的役割を調べる他の研究により、シナプス前ｍＧｌｕＲの活性化は、神経伝達物質の放出を阻害することにより興奮性および阻害性の両シナプス伝達を遮断し得ることが示されている（Ｐｉｎ  ａｎｄ  Ｄｕｖｏｉｓｉｎ、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３４：１）。ＡＣＰＤによる興奮性シナプス伝達のシナプス前遮断は、既に、視覚皮質、小脳、海馬、線条、および小脳扁桃のニューロンにおいて観察されており（Ｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇｓ：Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  １：１１１、１９９３）、一方で阻害的シナプス伝達の類似遮断が線条および嗅球において示されている（Ｃａｌｂｒｅｓｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．１３９：４１、１９９２；Ｈａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３６６：６８７、１９９３）。多数の証拠により、グループＩＩのｍＧｌｕＲは、このシナプス前阻害を媒介することが示唆される。他のニューロンにおける神経伝達物質放出のシナプス前阻害を媒介することが知られるアルファ2−アドレナリン作動性受容体およびＳＨＴ1A−セロトニン作動性受容体同様に、グループＩＩのｍＧｌｕＲはアデニリルシクラーゼの阻害と強く共役している。ＡＣＰＤの阻害効果はまたＬ−ＣＣＧ−ＩおよびＤＣＧ−ＩＶ（これらはグループＩＩのｍＧｌｕＲの選択的アゴニストである）により模倣することができる（Ｈａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３６６：６８７、１９９３；Ｊａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １１２：８０９、１９９４）。それに加え、ｍＧｌｕＲ２の活性化は、その受容体が交感神経性ニューロンにおいて発現されるときにシナプス前Ｎ−タイプカルシウムチャンネル活性を強く阻害し得ることが既に示されており（Ｉｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｎ  １４：１０２９、１９９５）、そしてそれらのチャンネルの不活化は神経伝達物質の放出を阻害することが知られている。最後に、グループＩＩのｍＧｌｕＲに対して選択的な濃度のＬ−ＣＣＧ−Ｉが、ラット線条体切片からの3Ｈ−吸引液の脱分極誘発放出を阻害することが既に観察されている（Ｌｏｍｂａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １１０：１４０７、１９９３）。シナプス後レベルでのグループＩＩ  ｍＧｌｕＲ活性化の生理学的効果についての証拠は限定されている。しかしながら、ある研究により、Ｌ−ＣＣＧ−Ｉのシナプス後作用が培養間脳ニューロンでのＮＭＤＡレセプター活性化を阻害し得ることが示唆される（Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４７：１０５７、１９９５）。
【００１５】
生理学的研究により、Ｌ−ＡＰ４もまた様々なＣＮＳニューロンにおける興奮性シナプス伝達を阻害し得ることが既に示されている。これらのニューロンには、皮質、海馬、小脳扁桃、嗅球、および脊髄のニューロンが含まれる（Ｋｏｅｒｎｅｒ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ａｇｏｎｉｓｔｓ  ａｎｄ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｐ．３０８、１９９２；Ｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇｓ：Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  １：１１１、１９９３）。累積された証拠により、阻害はシナプス前ｍＧｌｕＲの活性化により媒介されていることが示される。Ｌ−ＡＰ４の効果はＬ−ＳＯＰにより模倣することができ、そしてこれら２つのアゴニストはグループＩＩＩのｍＧｌｕＲについて選択的であるため、このｍＧｌｕＲグループのメンバーはシナプス前阻害の媒介物であることが暗示される（Ｓｃｈｏｅｐｐ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．  ２４：４３９、１９９４；Ｐｉｎ  ａｎｄ  Ｄｕｖｏｉｓｉｎ、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３４：１）。嗅球ニューロンでは、ｍＧｌｕＲのＬ−ＡＰ４活性化がシナプス前カルシウム電流を阻害することが既に示されている（Ｔｒｏｍｂｌｅｙ  ａｎｄ  Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  １２：２０４３、１９９２）。従って、グループＩＩＩのｍＧｌｕＲの活性化により産生されるシナプス前阻害のメカニズムはグループＩＩのｍＧｌｕＲのものに類似する、すなわち、Ｎ−タイプのカルシウムチャンネルの遮断および神経伝達物質放出の阻害であるように思われる。Ｌ−ＡＰ４は更に、シナプス後に作用して網膜の両極細胞における過分極を生じさせることが知られている。この作用はこれらの細胞におけるｃＧＭＰホスホジエステラーゼに共役するｍＧｌｕＲの活性化が原因であるかもしれないことが既に示唆されている（Ｓｃｈｏｅｐｐ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．  ２４：４３９、１９９４；Ｐｉｎ  ａｎｄ  Ｄｕｖｏｉｓｉｎ、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３４：１）。
【００１６】
アゴニスト、アンタゴニスト、およびｍＧｌｕＲを発現する組換え脊椎動物細胞株を用いる代謝指向型グルタミン酸受容体の活性化の研究を用いて、異なる代謝指向型グルタミン酸受容体の刺激化および阻害の細胞性効果が評価されている。たとえば、ゼノパス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞で発現されたｍＧｌｕＲ１のアゴニスト刺激により、電気生理学的技術を間接的に用いて評定して、細胞内カルシウムの移動に対する受容体活性化の共役が示された（Ｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：７６０−７６５、１９９１）。ＣＨＯ細胞で発現されたｍＧｌｕＲ１のアゴニスト刺激は、ＰＩ加水分解、ｃＡＭＰ形成、およびアラキドン酸放出を刺激した（Ａｒａｍｏｒｉ  ａｎｄ  Ｎａｋａｎｉｓｈｉ、Ｎｅｕｒｏｎ  ８：７５７−７６５、１９９２）。ＣＨＯ細胞で発現されたｍＧｌｕＲ５のアゴニスト刺激もＰＩ加水分解を刺激し、これは蛍光カルシウムキレーター  ｆｕｒａ−２を細胞に負荷することにより評定してサイトゾルカルシウムの一過性増大と関連することが示された（Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６７：１３３６１−１３３６８、１９９２）。ＣＨＯ細胞におけるｍＧｌｕＲ１およびｍＧｌｕＲ５のアゴニスト誘導性活性化により誘導されるＰＩ加水分解はＡＰ３およびＡＰ４（これらは両方共インサイチューでグルタミン酸刺激化ＰＩ加水分解のアンタゴニストである）による拮抗作用は受けなかった（Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３３：１９３１−１９３５、１９８６；Ｓｃｈｏｅｐｐ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ５３：２７３−２７８、１９８９）。ｍＧｌｕＲ２（Ｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｎ  ８：１６９−１７９、１９９２）もしくはｍＧｌｕＲ７（Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６９：１２３１−１２３６、１９９４）を発現するＣＨＯ細胞のアゴニスト刺激によりｃＡＭＰ形成の受容体媒介性阻害がもたらされ、そして更にインサイチューで以前に観察されたリガンド特異性も確認された。部位特異的突然変異誘発を組み合わせて、アゴニストを用いる研究も実施され、グルタミン酸結合において重要な役割を担う特異的アミノ酸が明らかにされた（Ｏ’Ｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｎ  １１：４１−５２、１９９３）。
【００１７】
代謝指向型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ）は、発作、頭部創傷、脊髄損傷、癲癇、虚血、低血糖症、低酸素症、およびたとえばアルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ）病のような神経変性性疾患を初めとする様々な神経学的病理における関与が既に暗示されている（Ｓｃｈｏｅｐｐ  ａｎｄ  Ｃｏｎｎ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１４：１３、１９９３；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ５４：１３５、１９９４；Ｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３４：１、１９９５；Ｋｎｏｐｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．  ３８：１４１７、１９９５）。痛覚および無痛覚における代謝指向型グルタミン酸受容体についての役割もまた既に示されている（Ｍｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  ４：８７９、１９９３）。代謝指向型グルタミン酸受容体もまた、海馬の長期活性化（ｐｏｔｅｎｔｉｏｎａｔｉｏｎ）および小脳の長期抑制の誘導にとって必要とされることが既に示されている（Ｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：３４７、１９９３；Ｂｏｒｔｏｌｏｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：７４０、１９９４；Ａｉｂａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ  ７９：３６５およびＣｅｌｌ  ７９：３７７、１９９４）。
【００１８】
代謝指向型グルタミン酸受容体アゴニストが様々な生理学的活性に影響を及ぼすことが既に報告されている。たとえば、トランス−ＡＣＰＤは痙攣促進剤（ｐｒｏｃｏｎｖｕｌｓａｎｔ）薬および抗痙攣薬の両方の効果（Ｚｈｅｎｇ  ａｎｄ  Ｇａｌｌａｇｈｅｒ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．  １２５：１４７、１９９１；Ｓａｃａａｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｏｅｐｐ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．  １３９：７７、１９９２；Ｔａｓｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  ３：６２９、１９９２；Ｓｈｅａｒｄｏｗｎ、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  ３：９１６、１９９２）、ならびにインビトロおよびインビボにおける神経保護効果（Ｐｉｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ６１：６８３、１９９３；Ｋｏｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：９４３１、１９９１；Ｂｉｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ３２：１３５１、１９９３；Ｓｉｌｉｐｒａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２１９：１７３、１９９２；Ｃｈｉａｍｕｌｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２１６：３３５、１９９２）を保持することが報告された。代謝指向型グルタミン酸受容体アンタゴニストＬ−ＡＰ３は低酸素性損傷をインビトロで保護することが示された（Ｏｐｉｔｚ  ａｎｄ  Ｒｅｙｍａｎｎ、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  ２：４５５、１９９１）。続く研究により、トランス−ＡＣＰＤがＬ−ＡＰ３による拮抗作用を受ける神経保護を生じることが報告された（Ｏｐｉｔｚ  ａｎｄ  Ｒｅｙｍａｎｎ、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ３２：１０３、１９９３）。（５）−４Ｃ３ＨＰＧはＤＢＡ／２マウスにおける聴原発作を保護することが示された（Ｔｈｏｍａｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ６２：２４９２、１９９４）。代謝指向型グルタミン酸受容体調節剤の予期される他の調節効果には、シナプス伝達、ニューロン死、ニューロンの発達、シナプス形成性、空間的学習、嗅覚記憶、心臓活動の中枢制御、覚醒、動作の制御、および前庭眼反射の制御が含まれる（総説については、Ｎａｋａｎｉｓｈｉ、Ｎｅｕｒｏｎ  １３：１０３１−３７、１９９４；Ｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３４：１、１９９５；Ｋｎｏｐｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８：１４１７、１９９５、を参照されたい）。
【００１９】
当該技術分野で現在知られるｍＧｌｕＲ−活性分子の構造は、グルタミン酸結合部位に結合することにより作用するように思われるアミノ酸に限定されている（Ｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３４：１、１９９５；Ｋｎｏｐｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．  ３８：１４１８）。このことにより、そのような化合物の薬理学的特性および可能な治療的利用法の範囲が限定される。更に、それらのｍＧｌｕＲ−活性分子に関連する薬理学的特異性の範囲によっては、異なるサブタイプの代謝指向型グルタミン酸受容体間の完全な識別は可能にはならない（Ｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３４：１、１９９５、およびＫｎｏｐｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．  ３８：１４１８）。一層効力が高くかつ一層選択性の高いｍＧｌｕＲアゴニスト、アンタゴニスト、および調節剤が発見されるまでは、ｍＧｌｕＲ−活性分子の分野における迅速な進歩はなされ得ない（Ｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３４：１、１９９５；Ｋｎｏｐｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．  ３８：１４１８）。実際、現在臨床的開発段階にあるｍＧｌｕＲ−活性分子は存在しない。個々のｍＧｌｕＲを発現する細胞株を用いる化合物および化合物ライブラリーの高処理量機能性スクリーニングは、そのような新規化合物を同定するための重要なアプローチである（Ｋｎｏｐｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．  ３８：１４１８）。
【００２０】
幾つかの研究室は、適切に機能するように思われる、代謝指向型グルタミン酸受容体を発現する細胞株を既に構築している（Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１３３６１、１９９２；Ｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｎ  ８：１６９、１９９２；Ａｒａｍｏｒｉ  ａｎｄ  Ｎａｋａｎｉｓｈｉ、Ｎｅｕｒｏｎ  ８：７５７、１９９２、Ｎａｋａｎｉｓｈｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：５９７、１９９２；Ｔｈｏｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  ６１９：２２、１９９２；Ｔｈｏｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２２７：３６１、１９９２；Ｏ’Ｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｎ  １１：４１、１９９３；Ｎａｋｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６８：１１８６８、１９９３；Ｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  １３：１３７２、１９９３；Ｓａｕｇｓｔａｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ４５：３６７、１９９４；Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１２３１、１９９４；Ｇａｂｅｌｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．  ２４：５３３、１９９４；Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ａｂｓｔｒ．２０：４６８、１９９４；Ｆｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ａｂｓｔｒ．  ２０：４６８、１９９４；Ｆｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３４：１４９、１９９４）。他の論文には、機能的ｍＧｌｕＲ発現性細胞株の発現は予測可能でないことが既に記載されている。たとえば、Ｔａｎａｂｅら（Ｎｅｕｒｏｎ  ８：１６９、１９９２）はｍＧｌｕＲ３およびＧｌｕＲ４の機能的発現を示すことができず、ＣＨＯ細胞内での天然のｍＧｌｕＲ１の発現を生じさせることが困難であることを記載している。Ｇａｂｅｌｌｉｎｉら（Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．  ２４：５３３、１９９４）もまた、ＨＥＫ  ２９３細胞内でのｍＧｌｕＲ１発現の困難性を記載し、これらの困難性の幾つかはこれらの受容体の脱感作特性に起因するかもしれないことがありうることを記載している。それに加え、クラスＩのｍＧｌｕＲにおいて活性を示す化合物を同定するのに有用なスクリーニング法は、クラスＩＩおよびＩＩＩのｍＧｌｕＲにおいて活性を示す化合物の同定には容易に適用できず、かつ逆もできず、それは第二メッセンジャー共役の差異が原因となっている。最後に、ｍＧｌｕＲはアゴニスト刺激の際に迅速に脱感作を生じることが既に記載されており、このことがこれらの受容体を発現する細胞株の生存率に不利な影響を及ぼすかもしれず、かつスクリーニングのための天然のｍＧｌｕＲの使用を困難にしている。
【００２１】
異なるＧ蛋白質に共役する受容体は異なるリガンド親和性および第二メッセンジャーへの共役を呈する。Ｇ蛋白質共役型受容体は全て類似の構造を有している：Ｎ−末端細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、７つの膜スパニングヘリックスを含みしたがって３本の細胞内ループおよび３本の細胞外ループを規定する７回貫膜ドメイン（７ＴＭＤ）、および細胞質テイル（ＣＴ）。しかし各領域を含む厳密な配列は異なっている。これらの配列の差異により、異なる化学組成物のリガンドとの受容体相互作用および異なるＧ蛋白質との受容体相互作用の特異性が提供されるものと考えられる。関連する受容体からの小ペプチドセグメントが組換えＤＮＡ技術を用いて交換されたキメラ受容体の構築は、この特異性を決定するにあたって異なる配列領域の関与を評定するための有用な技術であることが既に証明されている。たとえば、様々なアドレナリン作動性受容体、ムスカリン性アセチルコリン受容体、およびアンジオテンシン受容体の間での第三細胞内ループの交換により、Ｇ蛋白質の共役特異性の変換がもたらされる。従って、活性化により通常アデニレートシクラーゼの阻害もしくは活性化がもたらされる受容体を、同一もしくは類似のリガンド結合性特性を有するがその活性化によりホスホリパーゼ−Ｃの刺激化がもたらされる受容体に変換することおよびその逆を行うことができる（Ｋｏｂｉｌｋａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１３１０、１９８８；Ｗｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ２５８：１３３、１９８９；Ｃｏｔｅｃｃｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２８９６、１９９０；Ｌｅｃｈｌｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ＥＭＢＯ  Ｊ．  ９：４３８１、１９９０；Ｗｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ３８：５１７、１９９０；Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６５：６２１９、１９９０；Ｃｏｔｅｃｃｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６７：１６３３、１９９２；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７０：１６６７７、１９９５）。第三細胞内ループを共有するこれらの受容体では、この第三細胞内ループがＧ蛋白質共役の特異性を決定する上での重要な役割を担っている。このような実験により第三細胞内ループがこれらの関連受容体におけるＧ蛋白質共役の特異性を決定する上での重要な役割を担っていることが示されるが、その原因となるいずれかの特異的アミノ酸配列モチーフを同定することには成功していない。それに加え、第三細胞内ループはそのような受容体の脱感作の少なくとも部分的な原因であることが既に示されている（Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ  ６７：７２３、１９９１；Ｌｉｇｇｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６７：４７４０、１９９２）。
【００２２】
代謝指向型グルタミン酸受容体は総体的トポロジーの点では他のＧ蛋白質共役型受容体に関連しているが、特異的アミノ酸配列の点では関連性がない。ｍＧｌｕＲの通常とは異なる特性は、それらの非常に巨大なＥＣＤ（約６００アミノ酸）である。多くの他のＧ蛋白質共役型受容体では、リガンド結合は７ＴＭＤ内で生じる。しかし、各ｍＧｌｕＲの巨大ＥＣＤがリガンド結合性決定基を提供するものと考えられる（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：５９７、１９９２；Ｏ’Ｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｎ  １１：４１、１９９３；Ｓｈｉｇｅｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｎ  １２：１２４５、１９９４）。異なるリガンド親和性および異なるＧ蛋白質共役を有するｍＧｌｕＲのＥＣＤが交換されているキメラｍＧｌｕＲを用いて、ｍＧｌｕＲのＥＣＤはリガンド特異性を決定するが、Ｇ蛋白質特異性は決定しないことが既に示されている（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９３４１、１９９３）。更に、第三細胞内ループがサイズおよび配列の点で可変である他のＧ蛋白質共役型受容体とは異なり、ｍＧｌｕＲの第三細胞内ループは小さくかつ非常に保存性が高い（Ｂｒｏｗｎ  Ｅ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３６６：５７５、１９９３）。第二細胞内ループおよび／または細胞質テイルが交換されたキメラｍＧｌｕＲが既に調製されている（Ｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＥＭＢＯ  Ｊ．  １３：３４２）。これらの実験により研究者らは、大半の他のＧ蛋白質共役型受容体とは異なり、「第二細胞内ループのＣ−末端および第７貫膜ドメインの下流に位置するセグメントの両方がｍＧｌｕＲ１ｃによるホスホリパーゼＣの特異的活性化に必要である」と結論付け、かつｍＧｌｕＲの第二細胞内ループは他のＧ蛋白質共役型レセプターの第三細胞内ループの役割を担っていることを示唆した。
【００２３】
天然に存在するｍＲＮＡスプライス変異体が本質的には同一のリガンド結合特性を有するプロスタグランジン  Ｅ３（ＥＰ３）受容体を産生するが、ただしこれらの変異体は異なる第二メッセンジャー経路を優先的に活性化させ（識別的Ｇ蛋白質共役）、かつ異なる脱感作特性を呈することが既に記載されている（Ｎａｍｂａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：１６６、１９９３；Ｓｇｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２７１２、１９９３；Ｎｅｇｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６８：９５１７、１９９３）。これらの変異体受容体異性体はそれらの細胞質テイルのみが異なっている。より長いテイルを有する異性体はホスホリパーゼ−Ｃに効率よく共役するが、より短いテイルを有するものは効率的な共役を示さない。しかしながらｍＧｌｕＲ１およびｍＧｌｕＲ５の天然に存在するｍＲＮＡスプライス変異体の分析により、それらの長い細胞質テイルはＧ蛋白質共役には直接的には関与しないかもしれないことが既に示されている（Ｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：１０３３１、１９９２；Ｊｏｌｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １５：３９７０、１９９５）。実際、Ｐｉｎら（上述）は、「しかしながら、ＰＬＣ−共役型ｍＧｌｕＲ（ｍＧｌｕＲ１および５）においてのみ見いだされる非常に長いＣ−末端ドメインは恐らくＰＬＣ−活性化Ｇ蛋白質との特異的相互作用には関与していないであろう」と記載している。
【００２４】
最近カルシウム受容体が記載されている（Ｂｒｏｗｎ  Ｅ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３６６：５７５、１９９３；Ｒｉｃｃａｒｄｉ  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２：１３１−１３５、１９９５；Ｇａｒｒｅｔｔ  Ｊ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ３１：１２９１９−１２９２５、１９９５）。このＣａＲは、他のｍＧｌｕＲを例外として、ｍＧｌｕＲと有意な配列相同性を示す唯一の既知の受容体である。ＣａＲはいずれか一つのｍＧｌｕＲに対して約２５％の配列相同性（アミノ酸同一性）を示すが、ｍＧｌｕＲ配列同士では＞４０％の相同性（アミノ酸同一性）である。このＣａＲは、受容体機能および恐らくはリガンド結合に関与することが既に暗示されている巨大ＥＣＤを有するｍＧｌｕＲと構造的に関連している（Ｂｒｏｗｎ  Ｅ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３６６：５７５、１９９３；Ｐｏｌｌａｋ  Ｍ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ  ７５：１２９７−１３０３、１９９３）。この構造類似性はリガンド結合の特異性における密接な類似性は付与しておらず、それはＣａＲにとっての天然のリガンドは無機イオンＣａ2+であり、グルタミン酸はＣａＲ活性を調節しないためである。ＣａＲもまた巨大な細胞質テイルを有し、かつホスホリパーゼ−Ｃの刺激化に共役する。すなわち、ＣａＲは構造的および機能的に、他のｍＧｌｕＲよりはｍＧｌｕＲ１および５に一層深い関連性を示す。Ｐｉｎら（ＥＭＢＯ  Ｊ．  １３：３４２、１９９４）は、所定のアミノ酸がホスホリパーゼ−Ｃに共役するｍＧｌｕＲの細胞内ループ内では保存されており、かつアデニレートシクラーゼの阻害に共役するｍＧｌｕＲの細胞内ループ内では異なるアミノ酸が同一の位置で保存されていることを記載している。細胞内ループ１および３はｍＧｌｕＲとＣａＲとの間では最も高度に保存されている配列であるが（Ｂｒｏｗｎ  Ｅ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３６６：５７５、１９９３）、これらの特定のアミノ酸の内の約半分のみがＣａＲの対応位置に見いだされるに過ぎず、かつ実際のところこれらの内の一つのみがホスホリパーゼ−Ｃに共役する受容体について予測されるアミノ酸である。すなわち、ＣａＲとｍＧｌｕＲとの間の配列保存は、リガンド結合およびＧ蛋白質共役に関与する構造的ドメインの保存にほぼ一致するように思われ、Ｇ蛋白質共役的特異性が予期される細胞内領域に含まれる特定の配列モチーフについての証拠を提供しない。ＣａＲを発現する細胞株が既に取得されており、かつＣａＲの活性を調節する化合物を同定するためのそれらの使用が開示されている（１９９４年１２月９日に出願され、現在係属中であり、引用により本明細書に取り込まれる米国特許出願第０８／３５３，７８４号）。
【００２５】
異なるｍＧｌｕＲの活性に特異的に影響を及ぼす分子を同定するための理想的スクリーニング法は、各々が同一の第二メッセンジャーシステムに共役し、かつ高処理量スクリーニングに適用しうる様式で各機能的ｍＧｌｕＲを発現する細胞株を提供するであろう。
【００２６】
本明細書に記載される引用文献はいずれも、請求の範囲に対する従来の技術として容認するものではない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本発明は、（１）代謝指向型グルタミン酸受容体およびカルシウム受容体からの配列を有するキメラ受容体蛋白質、ならびに代謝指向型グルタミン酸受容体、カルシウム受容体、およびキメラ受容体のフラグメント；（２）そのようなキメラ受容体蛋白質およびフラグメントをコードする核酸；（３）そのような受容体蛋白質、フラグメント、および核酸の使用；（４）そのような核酸を発現する細胞株；（５）そのようなキメラ受容体蛋白質およびフラグメントを用いる代謝指向型グルタミン酸受容体もしくはカルシウム受容体に結合するか、もしくはそれらの受容体の活性を調節する化合物をスクリーニングする方法；（６）そのようなスクリーニング法により同定される代謝指向型グルタミン酸受容体もしくはカルシウム受容体を調節するための化合物；（７）そのような化合物を利用して代謝指向型グルタミン酸受容体もしくはカルシウム受容体を調節するための方法；ならびに（８）そのような化合物を用いて神経学的障害を治療する方法、に関する。
【００２８】
本発明の化合物および方法の好ましい使用は、代謝指向性グルタミン酸受容体活性を調節する化合物をスクリーニングすること、および神経学的疾患および障害の治療を助けるためにそのような化合物を使用することである。
【００２９】
先の「発明の背景」に記載されるように、代謝指向型グルタミン酸受容体およびカルシウム受容体は類似構造を有する。両タイプの受容体共、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、７回貫膜ドメイン（７ＴＭＤ）、および細胞内細胞質テイル（ＣＴ）を有する。すなわち、本発明のキメラ受容体では、その受容体の配列の一部分はｍＧｌｕＲの配列の一部分と同一もしくは相同であり、かつその配列の一部分はＣａＲの配列の一部分と同一もしくは相同である。たとえば、キメラ受容体は、ｍＧｌｕＲのＥＣＤ、ならびにＣａＲの７ＴＭＤおよびＣＴからなることができる。同様に、キメラ受容体は、ｍＧｌｕＲのＥＣＤおよび７ＴＭＤ、ならびにＣａＲのＣＴを含むことができる。ｍＧｌｕＲおよびＣａＲのドメインもしくはドメインの部分の他の組み合わせ物を構築し使用することもできる。
【００３０】
これらのキメラ受容体が目的の受容体であるが、それは一部には、それらの受容体によりｍＧｌｕＲの所定の機能的特性とＣａＲの所定の機能的特性との結合が可能になるためである。すなわち、実験により、当該技術分野で知られ、かつ天然のｍＧｌｕＲにおけるアゴニストもしくはアンタゴニストであるリガンドが、その細胞外ドメインがｍＧｌｕＲからのものであるキメラ受容体においてもそのような活性を呈示することが示された。同様に、実験により、当該技術分野で知られ、かつｍＧｌｕＲを調節するリガンドが、細胞外ドメインおよび７ＴＭＤがｍＧｌｕＲからのものであるキメラ受容体に作用することが示された。これら両事例では、ｍＧｌｕＲ活性を調節する他のリガンドもこれらのタイプのキメラ受容体に作用するであろうことが予想される。
【００３１】
ｍＧｌｕＲ活性化合物についてのスクリーニングのためのｍＧｌｕＲの使用は、リガンドの結合／活性化の際の受容体の迅速な脱感作および組換え脊椎動物細胞においてその受容体を安定に発現させる困難性を初めとする多数の因子により複雑なものとなっている（たとえば、図８Ｂおよび更には公開されたＰＣＴ特許公開公報も参照されたい）。本発明の所定のキメラ受容体を利用してこれらの技術的困難性を克服し、かつカルシウム受容体の一層頑丈な特質を利用することによりはるかに改善されたスクリーニング法を提供することができる。たとえば、ＣａＲの７ＴＭＤおよびＣＴをｍＧｌｕＲの細胞外ドメインと、あるいはＣａＲのＣＴをｍＧｌｕＲのＥＣＤおよび７ＴＭＤと結合させることにより、ｍＧｌｕＲの細胞外ドメインはＣａＲのＧｑ共役特性ならびに迅速な脱感作の喪失という改善された特性という利点を有する（たとえば、図８Ｃを参照されたい）。従って、このようなキメラ受容体は天然のｍＧｌｕＲのものに類似するリガンド結合性および活性化特性を有するが、ＣａＲに類似する改善された第二メッセンジャー共役を有する。従って、このキメラ受容体により、ｍＧｌｕＲ活性分子を同定するためのスクリーニングが簡素化され、かつそのスクリーニングを効果的、実際的、および再現性のある機能的なものとすることができる。
【００３２】
これらの新規キメラ受容体については、あるキメラ受容体内のｍＧｌｕＲとＣａＲとの配列の組み合わせが新規であることのみならず、活性が首尾よく結合したことは予測外のことである。以前ではこのような結合は、密接に関連する配列を有する受容体の部分を用いてのみ達成されていた。この場合には代謝指向型グルタミン酸受容体とカルシウム受容体との間の配列同一性は僅か１９〜２５％に過ぎず、かつこの２タイプの受容体は僅か２５〜３０％の配列類似性を共有するに過ぎない（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３６６：５７５、１９９３）。
【００３３】
先に記載される３つのドメインはたとえば、リガンド結合部位およびＧ蛋白質共役部位等のサブドメインから成り立っていることが認識される。従って幾つかの適用については、所望の活性を持たせる目的でキメラ受容体中に特定の受容体からの完全なドメインを含有させることは必要ではない。たとえば、ｍＧｌｕＲからのリガンド結合性部位のみをキメラ受容体中に取り込ませることができ、そのキメラ受容体では残りの配列の内の大半もしくは全てがＣａＲに相同である。同様に、あるキメラ受容体では７ＴＭＤの細胞質ループの一つがｍＧｌｕＲのループ配列に相同であることができ、かつ実質的にその受容体の残りの配列はＣａＲに相同であることができるか、あるいはその逆に、細胞質ループの内の一つがＣａＲのループ配列に相同であることができ、かつ実質的にその受容体の残りの配列がｍＧｌｕＲに相同であることができる。
【００３４】
すなわち、本発明の第一態様は、細胞外ドメイン、７回貫膜ドメイン、および細胞内細胞質テイルドメインを有するキメラ受容体を含む組成物を特徴とする。このキメラ受容体は、代謝指向型グルタミン酸受容体の配列に相同な少なくとも６つの連続するアミノ酸の配列、およびカルシウム受容体の配列に相同な少なくとも６つの連続するアミノ酸の配列を有する。
【００３５】
好ましい態様では、少なくとも一つのドメインが代謝指向型グルタミン酸受容体の一つのドメインに相同であるか、あるいは少なくとも一つのドメインがカルシウム受容体の一つのドメインに相同である。具体的には、これは、代謝指向型グルタミン酸受容体に相同なドメインおよびカルシウム受容体に相同なドメインを有するキメラ受容体を含む。
【００３６】
好ましい態様では更に、キメラ受容体は、代謝指向型グルタミン酸受容体からの２つのドメインおよびカルシウム受容体からの一つのドメインか、あるいはカルシウム受容体からの２つのドメインおよび代謝指向型受容体からの一つのドメインを有する。これは、３つのドメインの内の可能な組み合わせの各々を含む。たとえばより好ましい態様では、キメラ受容体は代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同な一つのドメイン、代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインに相同な一つのドメイン、およびカルシウム受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同な一つのドメインを有する。
【００３７】
他の好ましい態様では、キメラ受容体は、代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞質ループに相同な７回貫膜ドメインの内の少なくとも一つの細胞質ループを有する。同様に他の好ましい態様では、キメラ受容体はカルシウム受容体の細胞質ループに相同な少なくとも一つの細胞質ループを有する。
【００３８】
他の好ましい態様では更に、キメラ受容体は、カルシウム受容体のアミノ酸配列に相同な少なくとも６つの連続するアミノ酸の配列を有し、かつそのキメラ受容体の残りの配列は代謝指向型グルタミン酸受容体のアミノ酸配列に相同である。他の態様では、カルシウム受容体のアミノ酸配列に相同な配列は有利により長くてもよく、たとえば少なくとも１２、１８、２４、３０、３６、もしくはそれを上回るアミノ酸の長さである。
【００３９】
同様に他の好ましい態様では、キメラ受容体は、代謝指向型グルタミン酸受容体のアミノ酸配列に相同な少なくとも６つの連続するアミノ酸の配列を有し、かつそのキメラ受容体の残りの配列はカルシウム受容体のアミノ酸配列に相同である。他の態様では、代謝指向型グルタミン酸受容体のアミノ酸配列に相同な配列は有利により長くてもよく、たとえば少なくとも１２、１８、２４、３０、３６、もしくはそれを上回るアミノ酸の長さである。
【００４０】
関連する態様では、本発明は、先の態様について記載されるキメラ受容体をコードする単離、濃縮、もしくは精製された核酸分子を含む組成物を提供する。具体的にはこれは、カルシウム受容体のアミノ酸配列に相同な少なくとも６つの連続するアミノ酸の配列および代謝指向型グルタミン酸受容体のアミノ酸配列に相同な少なくとも６つの連続するアミノ酸配列を有するキメラ受容体をコードする核酸を含む。先の態様と同様に、特定の態様では、カルシウム受容体および／または代謝指向型グルタミン酸受容体からのアミノ酸配列に相同なキメラ受容体配列は有利により長くてもよく、たとえば少なくとも１２、１８、２４、３０、３６、もしくはそれを上回るアミノ酸の長さである。
【００４１】
好ましい態様では、キメラ受容体は、代謝指向型グルタミン酸受容体の一つのドメインに相同な一つのドメイン、および／またはカルシウム受容体に相同な一つのドメインを有する。より好ましい態様では、キメラ受容体は、代謝指向型グルタミン酸受容体のドメインに相同な２つのドメインおよびカルシウム受容体のドメインに相同な一つのドメインか、あるいはカルシウム受容体のドメインに相同な２つのドメインおよび代謝指向型グルタミン酸受容体のドメインに相同な一つのドメインを有する。
【００４２】
他の関連する態様では、先に記載されるキメラ受容体をコードする核酸は複製可能な発現ベクター中に存在する。従ってこのベクターは、記載されるキメラ受容体のいずれかをコードする核酸配列を含むことができる。
【００４３】
更に、ある関連態様では、本発明は先に記載される複製可能な発現ベクターで形質転換された組換え宿主細胞を提供する。
【００４４】
本発明は更に、キメラ受容体の産生のための方法を特徴とし；この方法は適切な栄養条件下で、先に記載されるキメラ受容体をコードする核酸配列を含む複製可能な発現ベクターで形質転換もしくはトランスフェクトさせた原核生物もしくは真核生物の宿主細胞を、そのキメラ受容体の発現を可能にさせる様式で増殖させることを含む。
【００４５】
核酸に関連して、「単離された」によっては、その核酸が天然に見いだされる以外の形態（すなわち、他の分子との会合）で存在することが意味される。たとえば、単離された受容体核酸は、同一染色体上に存在する一つもしくは複数の核酸から分離されている。単離された核酸は同一染色体上に存在する他の核酸の内の少なくとも９０％から分離されていることが好ましい。その核酸が、調製物中に存在する全核酸の内の少なくとも７５％、一層好ましくは８５％、更に好ましくは９５％に相当する実質的に精製された調製物として提供されることが好ましい。
【００４６】
単離された核酸の他の例は組換え核酸である。好ましくは、組換え核酸は、発現ベクター中にクローン化されたキメラ代謝指向型グルタミン酸受容体もしくは代謝指向型グルタミン酸受容体フラグメントをコードする核酸を含む。発現ベクターは、ポリペプチドを産生するためにクローン化された核酸配列を発現するための必須因子を含む。発現ベクターは、プロモーター領域（これはＲＮＡ転写の開始を指示する）、ならびにＲＮＡに転写された際には合成開始のシグナルを発するであろうＤＮＡ配列を含む。「発現ベクター」には、その中に含まれるＤＮＡ配列を発現することが可能なベクターが含まれ、すなわちコーディング配列はそれらを発現させることが可能な他の配列に動作可能なように連結されている。必ずしも常に明確に記述される訳ではないが、これらの発現ベクターは、エピソームもしくは染色体ＤＮＡに組込まれた部分のいずれかとして宿主生物体内で複製できる必要があることが暗示される。必須ではないが有用な、効率のよい発現ベクターの因子は、マーカーをコードする配列、それらの細胞を容易に同定することを可能にする蛋白質を含む細胞の表現型特性（たとえば、テトラサイクリン耐性）をもたらす蛋白質をコードする配列である。要するに「発現ベクター」には機能的定義が与えられており、特定の配列に適用される場合、含有される特定のＤＮＡコードの発現をもたらすことが可能な任意のＤＮＡ配列がこの用語に含まれる。現在のところこのようなベクターはしばしばプラスミドの形態であるため、「プラスミド」および「発現ベクター」はしばしば互換的に用いられる。しかしながら本発明は、ウイルスベクターを初めとする、等価の機能を与え、折々に当該技術分野に知られるようになるであろう他の形態の発現ベクターを含むことが意図される。組換え核酸は、キメラ代謝指向型グルタミン酸受容体、受容体フラグメント、もしくはキメラ代謝指向型グルタミン酸受容体誘導体をコードする核酸を、そのゲノムの調節剤の制御下か、もしくは外因性プロモーターを初めとする外因性調節剤の制御下に含有していてもよい。「外因性」によっては、代謝指向型グルタミン酸受容体もしくはカルシウム受容体のためのコーディング配列に対して通常はインビボで転写の上で共役しないプロモーターが意味される。
【００４７】
本発明は更に、代謝指向型グルタミン酸受容体および／またはカルシウム受容体に結合する、および／またはその活性を調節する化合物のためのスクリーニング法をも提供する。これらの方法は、先に記載されるキメラ受容体もしくはそのようなキメラ受容体をコードする核酸配列を利用する。このようなキメラ受容体は、たとえば代謝指向型グルタミン酸受容体からの結合特性とカルシウム受容体からの細胞シグナル伝達特性との組み合わせ等の、２タイプの受容体からの特性の有用な組み合わせを提供する。
【００４８】
すなわち、他の態様では、本発明は代謝指向型グルタミン受容体に結合するか、もしくはその活性を調節する化合物のスクリーニング法を提供する。この方法は、細胞外ドメイン、７回貫膜ドメイン、および細胞内細胞質テイルドメインを有するキメラ受容体を調製することを含み、ここで少なくとも一つのドメインが代謝指向型グルタミン酸受容体のドメインに相同であり、少なくとも一つのドメインがカルシウム受容体のドメインに相同である。キメラ受容体および被験化合物を許容される媒質中に導入する。キメラ受容体に対する被験化合物の結合性、もしくはその化合物によるキメラ受容体の調節を物理的に検出可能な手段によりモニターして、代謝指向型グルタミン酸受容体に結合するか、もしくはその活性を調節する化合物を同定する。
【００４９】
好ましい態様では、キメラ受容体の細胞外ドメインは代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同である。また好ましい態様では、キメラ受容体は、代謝指向型グルタミン酸受容体のドメインに相同な２つのドメインおよびカルシウム受容体の一つのドメインに相同なドメイン、あるいはカルシウム受容体のドメインに相同な２つのドメインおよび代謝指向型グルタミン酸受容体の一つのドメインに相同なドメインを有する。
【００５０】
他の態様では、本発明は、キメラ受容体をコードする核酸を利用する、代謝指向型グルタミン酸受容体に結合するかもしくはその活性を調節する化合物のスクリーニング法を提供する。この方法は、細胞外ドメイン、７回貫膜ドメイン、および細胞内細胞質テイルドメインを有するキメラ受容体をコードする核酸配列を調製することを含み、ここでキメラ受容体はカルシウム受容体のアミノ酸配列に相同な少なくとも６つの連続するアミノ酸の配列、および代謝指向型グルタミン酸受容体のアミノ酸配列に相同な少なくとも６つの連続するアミノ酸の配列を有する。核酸配列を、宿主細胞内でそのキメラ受容体を発現しうる複製可能な発現ベクター中に挿入する。適切な宿主細胞をこのベクターで形質転換させ、そしてその形質転換宿主細胞および被験化合物を許容される媒質中に導入する。被験化合物による結合もしくは調節の同定は、細胞におけるその化合物の効果をモニターすることにより実施する。
【００５１】
好ましい態様では、キメラ受容体は、代謝指向型グルタミン酸受容体のドメインに相同な少なくとも一つのドメインおよび／またはカルシウム受容体のドメインに相同な少なくとも一つのドメインを有する。このことは具体的には、キメラ受容体が、代謝指向型グルタミン酸レセプターの細胞外ドメインに相同な細胞外ドメイン、および／または代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインを有する好ましい態様を含む。特定の態様では、キメラ受容体は代謝指向型グルタミン酸受容体のドメインに相同な２つのドメインおよびカルシウム受容体のドメインに相同なドメインか、あるいはカルシウム受容体のドメインに相同な２つのドメインおよび代謝指向型グルタミン酸受容体の一つのドメインに相同なドメインを有する。
【００５２】
また好ましい態様では、キメラ受容体は、カルシウム受容体の細胞質ループに相同な、７回貫膜ドメインの少なくとも一つの細胞質ループを有し；特定の態様では、そのキメラ受容体の残りの配列は代謝指向型グルタミン酸受容体の配列に相同である。
【００５３】
他の好ましい態様では、キメラ受容体はカルシウム受容体のアミノ酸配列に相同な少なくとも６つの連続するアミノ酸の配列を有し、そしてそのキメラ受容体の残りのアミノ酸配列は代謝指向型グルタミン酸受容体のアミノ酸配列に相同である。更に他の好ましい態様では、キメラ受容体は代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞質ループに相同な、７回貫膜ドメインの少なくとも一つの細胞質ループを有する。
【００５４】
更に他の好ましい態様では、宿主細胞は真核生物細胞である。
【００５５】
本発明の方法の文脈では、宿主内で化合物の「効果をモニターすること」は、一つもしくは複数の細胞過程または一つもしくは複数の細胞構成成分の活性のレベルに及ぼすその化合物の効果を決定すること、あるいはその化合物と細胞性構成成分との間の相互作用を検出することを意味する。
【００５６】
本発明は更に、代謝指向型グルタミン酸受容体もしくはカルシウム受容体に結合するかもしくはそれを調節する化合物の、そのような受容体のフラグメントを用いるスクリーニング法も提供する。たとえばこのようなフラグメントを、受容体のシグナル経路の活性化の際に重要であることが既に示されている配列を含むように選択することができる。
【００５７】
従って他の態様では、本発明は、代謝指向型グルタミン酸受容体もしくはカルシウム受容体に結合する化合物を、そのような受容体のフラグメントをコードする核酸を調製し、宿主細胞内でそのフラグメントを発現することができる複製可能な発現ベクター中にその配列を挿入し、ベクターで適切な宿主細胞を形質転換させ、宿主細胞からフラグメントを回収し、被験化合物中のフラグメントを許容される媒質中に導入し、そして物理的に検出可能な手段によりフラグメントに対する化合物の結合をモニターすることによりスクリーニングする方法を特徴とする。
【００５８】
好ましい態様では、フラグメントは代謝指向型グルタミン酸受容体のフラグメントであり；一層好ましい態様では、フラグメントはその受容体の細胞外ドメインを含む。
【００５９】
他の好ましい態様では、フラグメントは代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインを含む。一層好ましい態様では、フラグメントは代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインと細胞質テイルドメインとの両方を含む。
【００６０】
同様に、他の好ましい態様においては、フラグメントは、カルシウム受容体のフラグメントであり、好ましくはその受容体の細胞外ドメインから７回貫膜ドメインまでを含むフラグメントである。一層好ましい態様では、フラグメントはカルシウム受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞質テイルドメインを含む。
【００６１】
所定の受容体フラグメントは、そのフラグメントが由来する受容体に類似する様式で一つもしくは複数の細胞応答を活性化することが可能である。従って関連する態様では、本発明は代謝指向型グルタミン酸受容体もしくはカルシウム受容体に結合するかもしくはそれを調節する化合物を、そのような受容体のフラグメントをコードする核酸配列を調製し、その配列を複製可能な発現ベクター中に挿入し、宿主細胞をそのベクターで形質転換し、宿主細胞および被験化合物を許容される媒質中に導入し、そして宿主細胞におけるその化合物の効果をモニターすることによりスクリーニングする方法を提供する。
【００６２】
所定の受容体については、ある受容体に結合するかもしくはそれを調節する化合物をスクリーニングするために２つの異なる受容体のフラグメントを利用することが可能である。この方法は、第一受容体のフラグメントをコードする核酸を調製し、その配列を、宿主内でそのフラグメントを発現しうる複製可能な発現ベクター中に挿入し、適切な宿主細胞をベクターで形質転換させ、そして宿主細胞から第一フラグメントを回収することを含む。第二受容体のフラグメントは類似様式で調製される。これら２本のフラグメントおよび被験化合物を許容される媒質中に導入し、そしてその化合物による結合および／または調節を物理的に検出可能な手段によりモニターする。
【００６３】
好ましい態様では、あるフラグメントは代謝指向型グルタミン酸受容体からのものであり、かつあるフラグメントはカルシウム受容体からのものである。特に好ましい態様では、第一フラグメントが代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインを含みかつ第二受容体がカルシウム受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞質テイルドメインを含むか、あるいは第一フラグメントが代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインおよび７回貫膜ドメインを含みかつ第二フラグメントがカルシウム受容体の細胞質テイルドメインを含む。
【００６４】
他の特定の態様では、第一フラグメントがカルシウム受容体の細胞外ドメインを含み、第二フラグメントが代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞質テイルドメインを含む。更に他の特に好ましい態様では、第一フラグメントがカルシウム受容体の細胞外ドメインを含み、第二フラグメントが代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインおよびカルシウム受容体の細胞質テイルドメインを含む。
【００６５】
代謝指向型グルタミン酸受容体およびカルシウム受容体の両方の活性を調節する所定の化合物を同定することができる。従って本発明は更に、代謝指向型グルタミン酸受容体の一つのドメインに相同な一つのドメインおよびカルシウム受容体の一つのドメインに相同な一つのドメインを含むキメラ受容体をコードする核酸配列を調製することによりそのような化合物をスクリーニングする方法も提供する。この配列を、宿主内でその受容体を発現しうる複製可能な発現ベクター中に挿入し；適切な宿主細胞をそのベクターで形質転換させ、そしてその形質転換宿主細胞および被験化合物を許容される媒質中に導入する。その化合物による結合もしくは調節は、その宿主細胞における化合物の影響をモニターすることにより観察される。
【００６６】
本発明は更に、代謝指向型グルタミン酸受容体もしくはカルシウム受容体に作用する化合物の作用部位を決定するための方法も提供する。この方法は、あるキメラ受容体をコードする核酸配列を調製することを含む。２つの関連する態様では、キメラ受容体はカルシウム受容体のアミノ酸配列に相同な少なくとも６つのアミノ酸配列を有し、かつ残りのアミノ酸配列が代謝指向型グルタミン酸受容体のアミノ酸配列に相同であるか、あるいはキメラ受容体は代謝指向型グルタミン酸受容体のアミノ酸配列に相同な少なくとも６つのアミノ酸配列を有し、かつ残りのアミノ酸配列がカルシウム受容体の配列に相同である。これらの態様では核酸配列は、宿主細胞内でその受容体を発現することができる複製可能な発現ベクター中に挿入される。このベクターを適切な宿主細胞中に形質転換させ、そして形質転換宿主細胞および化合物を許容される媒質中に導入する。この宿主細胞におけるその化合物の効果をモニターする；すなわち、化合物が対応する受容体からの少なくとも６つのアミノ酸の配列における相互作用を通して、受容体で活性を示す場合には、そのキメラ受容体は活性化を受けるであろうし、そして細胞効果を観察することができる。一方でその化合物が少なくとも６つのアミノ酸配列と相互作用せずこの作用により受容体を活性しない場合には、対応する細胞効果は観察されないであろう。
【００６７】
従って「作用部位」は、その受容体にとっての天然のリガンドか、もしくは他の目的の化合物との相互作用に関わる受容体上の位置（一つもしくは複数）を意味する。たとえば、その受容体への結合により代謝指向型グルタミン酸受容体の活性を調節する化合物については、その作用部位はその受容体へのその化合物の結合に関与するアミノ酸を含むことができるが、ただし他の配列を含んでもよい。そのような他の配列はたとえば、二次構造もしくは三次構造がその化合物の結合に応答して変化を受ける配列を含むことができる。
【００６８】
本発明の他の特徴および利点は以下の好ましい態様の記述、および請求の範囲から明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６９】
当業者には、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本明細書に開示される発明に対する様々な置換および改変を作製しうることが容易に認識されるであろう。
【００７０】
Ｉ．定義
以下の記載は本開示において用いられる幾つかの定義のリストである。これらの定義は本明細書に提供される全開示を考慮するものとして理解されるべきである。
【００７１】
「全身麻酔の際の補助剤」によっては、麻酔剤により生じる意識喪失に関連する、疼痛を知覚する能力を減少させる麻酔剤と組み合わせて用いられる化合物が意味される。
【００７２】
「異痛」によっては、通常は疼痛を誘発しない刺激が原因となる疼痛が意味される。
【００７３】
「鎮痛剤」によっては、意識喪失をもたらす麻酔剤を産生することなしに侵害刺激の知覚を変化させることにより疼痛を緩和させることが可能な化合物が意味される。
【００７４】
「鎮痛活性」によっては、通常は苦痛であるだろう刺激に応答する疼痛を減少させる能力が意味される。
【００７５】
「抗痙攣活性」によっては、たとえば、単純部分発作、複雑部分発作、癲癇発作重積、および創傷により誘導される発作（たとえば、頭部外科手術を初めとする頭部損傷後に生じるもの）による生じる痙攣を減少させる際の効果が意味される。
【００７６】
「結合するもしくは調節する」によっては、その試薬が、受容体に結合し、かつその活性を調節する両方を行うか、あるいはその試薬が、受容体に結合するか、もしくはその活性を調節するかのいずれかを行うことが意味される。
【００７７】
「カウザルギー」によっては、末梢神経の損傷に関連する苦痛な障害が意味される。
【００７８】
「中枢性疼痛」によっては、中枢神経系の病変に関連する疼痛が意味される。
【００７９】
「認識亢進活性」によっては、記憶の獲得もしくは学習した課題の実施を改善する能力が意味される。「認識亢進活性」によっては更に、通常の理性的思考プロセスおよび推論法を改善する能力が意味される。
【００８０】
「認識亢進剤」によっては、学習および記憶を改善することが可能な化合物が意味される。
【００８１】
「効力」によっては、ある選択された化合物で所望される活性の統計学的に有意なレベルが検出可能であることが意味され；「有意な」によってはｐ＜０．０５レベルでの統計的有意性が意味される。
【００８２】
「相同な」によっては、類似の核酸および／またはアミノ酸配列を有し、かつ関連する受容体の一つもしくは複数の活性をある程度は保持するドメイン、アミノ酸配列、もしくは核酸配列の機能的等価物が意味される。受容体の相同なドメインもしくは配列は、関連する受容体に対して少なくとも５０％の配列類似性、好ましくは７０％、一層好ましくは９０％、更に一層好ましくは９５％の配列類似性を有する。「配列類似性」は、ポリペプチドの起源に関わりなく２つの異なるポリペプチドにおけるアミノ酸配列間に観察される「相同性」を意味する。従って「相同である」は、核酸および／またはアミノ酸の配列が同一であるという状況を含む。関連する慣用句では、配列、サブドメイン、もしくはドメインが、「代謝指向型グルタミン酸受容体からの」もしくは「代謝指向型グルタミン酸受容体の」とは、その部分が代謝指向型グルタミン酸受容体の一部分と同様もしくは相同であることを意味し；同様に部分が、「カルシウム受容体から」もしくは「カルシウム受容体の」とは、それらの部分がカルシウム受容体の部分と同一もしくは相同であることも示す。これらの慣用句はアミノ酸配列および／または核酸配列に関して用いることができる。
【００８３】
ある程度の活性を保持する相同ドメインもしくは配列の能力は、本明細書に記載される技術を用いて測定することができる。このような相同ドメインは誘導体であることもある。誘導体には、翻訳中もしくは後に、たとえばリン酸化、グリコシル化、架橋形成、アシル化、蛋白質分解性開裂、抗体分子、膜分子、もしくは他のリガンドへの連結により生じる修飾が含まれる（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９８８、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５７：２８５−３２０、を参照されたい）。
【００８４】
誘導体の特定の種類には、たとえば、欠失、置換、付加、およびアミノ酸修飾のようなアミノ酸変化も含まれる。「欠失」は、関連するポリペプチドにおける一つもしくは複数のアミノ酸残基の不在を意味する。「付加」は、関連するポリペプチドにおける一つもしくは複数のアミノ酸残基の存在を意味する。あるポリペプチドへの付加もしくは欠失は、アミノ末端、カルボキシ末端、および／または内部でありうる。アミノ酸「修飾」は、天然に生じるアミノ酸を改変して非天然に生じるアミノ酸を産生することを意味する。「置換」は、他のアミノ酸残基（一つもしくは複数）によるそのポリペプチド内の一つもしくは複数のアミノ酸残基の置換を意味する。誘導体は、一つを上回る改変および違うタイプの改変を初めとする改変の様々な組み合わせを含むことができる。
【００８５】
アミノ酸変化の効果はたとえば、リン酸化、グリコシル化、鎖内連結、三次構造、ならびに活性部位もしくは潜在的なアロステリック部位でのそのアミノ酸の役割に依存して変化するが、置換されるアミノ酸が、入れ替わるアミノ酸と同一のグループからのものであることが一般的には好ましい。以下のグループはある程度は互換的なアミノ酸を含む：塩基性アミノ酸であるリシン、アルギニン、およびヒスチジン；酸性アミノ酸であるアスパラギン酸およびグルタミン酸；中性極性アミノ酸であるセリン、スレオニン、システイン、グルタミン、アスパラギン、および程度は劣るがメチオニン；非極性脂肪族アミノ酸であるグリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、およびロイシン（しかしながらサイズという理由で、グリシンとアラニンは一層緊密に関連し合い、そしてバリン、イソロイシン、およびロイシンは一層緊密に関連し合う）；ならびに芳香族アミノ酸であるフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン。それに加え、異なるカテゴリーに分類されてはいるものの、アラニン、グリシン、およびセリンはある程度は互換的であるように思われ、そしてシステインは追加的にこのグループに適合するか、あるいは極性中性アミノ酸と共に分類されてもよい。
【００８６】
プロリンは非極性中性アミノ酸であるが、立体配座における影響のためその置換は困難である。従って、プロリンによるもしくはプロリンのための置換は、同一もしくは類似の立体配座上の結果が取得され得る場合を除き好ましくない。プロリン残基の立体配座付与特性は、これらの内の一つもしくは複数がヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）により置換される場合に得ることができる。
【００８７】
修飾されたアミノ酸の例には以下のものが含まれる：変化させた中性非極性アミノ酸（たとえば、式Ｈ2Ｎ（ＣＨ2）nＣＯＯＨ［式中、ｎは２〜６である］のω−アミノ酸、サルコシン（Ｓａｒ）、ｔ−ブチルアラニン（ｔ−ＢｕＡｌａ）、ｔ−ブチルグリシン（ｔ−ＢｕＧｌｙ）、Ｎ−メチルイソロイシン（Ｎ−ＭｅＩｌｅ）、およびノルロイシン（Ｎｌｅｕ））；変化させた中性芳香族性アミノ酸（たとえば、フェニルグリシン）；変化させた中性の極性アミノ酸（たとえば、シトルリン（Ｃｉｔ）およびメチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）；変化させた中性の非極性アミノ酸（たとえば、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ））；変化させた酸性アミノ酸（たとえば、システイン酸（Ｃｙａ））；ならびに変化させた塩基性アミノ酸（たとえば、オルニチン（Ｏｒｎ））。
【００８８】
好ましい誘導体は、関連する受容体蛋白質の受容体活性には有意な影響を及ぼさない一つもしくは複数のアミノ酸変化を有する。受容体活性にとって必須でない受容体蛋白質の領域では、アミノ酸は、活性に影響を及ぼす低い危険でもって、欠失、付加、もしくは置換することができる。受容体活性にとって必須の領域では、アミノ酸変化はあまり好ましくはなく、それは受容体活性に影響を及ぼす一層大きな危険性が存在するためである。このような変化は保存的変化であるべきである。たとえば、その配列内の一つもしくは複数のアミノ酸残基を、機能的等価物として作用する類似極性の別のアミノ酸により置換することができる。
【００８９】
保存領域は非保存領域と比較して蛋白質活性にとって一層重要である傾向がある。標準法を用いて、受容体活性の重要な保存もしくは非保存領域を、インビトロ突然変異誘発技術もしくは欠失分析を用い、かつ本開示により記載される要領で受容体活性を測定して決定することができる。
【００９０】
誘導体は、標準的化学技術および組換え核酸技術を用いて産生することができる。特定のポリペプチドに対する修飾は、部位特異的突然変異誘発および固相合成中のアミノ酸置換を介するもののような慎重なものであってもよく、あるいはそのポリペプチドを産生する宿主内での突然変異を介するもののような偶発的なものであってもよい。誘導体を含むポリペプチドは、たとえば上述のセクションＩ．Ｇ．２．において、およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）により記載されるもののような標準技術を用いて取得することができる。たとえばＳａｍｂｒｏｏｋの第１５章は、クローン化ＤＮＡの部位特異的突然変異誘発のための方法を記載している。
【００９１】
「痛覚過敏」によっては、通常は苦痛である刺激に対する応答亢進が意味される。
【００９２】
「最少の」によっては、その薬剤のいずれかの副作用に対しては標準的個体による薬剤耐性が示されること、およびそのためその薬剤を標的疾患もしくは障害の治療に用いることができることが意味される。このような副作用は当該技術分野で良く知られている。最少副作用は、標的障害もしくは疾患についての薬剤認可については許容されるとしてＦＤＡ（米国食品医薬局）によって考慮されるであろうものである。
【００９３】
「調節する」によっては、細胞の受容体活性の増加もしくは減少を生じることが意味される。
【００９４】
「調節剤」によっては、アゴニスト、アンタゴニスト、およびアロステリック調節剤などを初めとする、受容体を調節する化合物が意味される。調節剤はその受容体に結合することが好ましい。
【００９５】
「筋肉弛緩剤」によっては、筋肉の緊張を減少させる化合物が意味される。
【００９６】
「神経痛」によっては、一本もしくは複数本の神経の分布における疼痛が意味される。
【００９７】
「神経変性性疾患」によっては、中枢神経系の細胞に影響を及ぼし、正常に機能する神経系細胞の能力の進行性低下がもたらされる神経学的疾患が意味される。神経変性性疾患の例には、アルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ）病、ハンチントン（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ）病、およびパーキンソン（Ｐｅｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ）病が含まれる。
【００９８】
「神経学的障害および疾患」によっては、神経系の障害および疾患が意味される。神経学的障害および疾患の例には、全体性および局所性虚血性発作、ならびに出血性脳卒中、頭部創傷、脊髄損傷、心臓停止および新生児窮迫の際のような低酸素誘導性神経細胞損傷、ならびに癲癇が含まれる。
【００９９】
「神経保護活性」によっては、神経学的障害および疾患の治療における効果が意味される。
【０１００】
「物理的に検出可能な手段」によっては、本明細書に記載される結合法およびスクリーニング法を初めとする、ｍＧｌｕＲもしくはＣａＲ受容体への結合もしくはその調節を検出するための当業者に知られるいずれかの手段が意味される。従って、たとえば、このような手段は、分光光学的方法、クロマトグラフィー法、競合性結合アッセイ、および特定の細胞機能のアッセイ、ならびに他の技術を含むことができる。
【０１０１】
「強力な」によっては、代謝指向型グルタミン酸受容体で、一つもしくは複数の受容体活性に関し、１００μＭを下回る、一層好ましくは１０μＭを下回る、そして更に一層好ましくは１μＭを下回るＥＣ50値（半最大活性を生じる濃度）もしくはＩＣ50（半最大阻害を生じる濃度）もしくはＫd（半最大結合を生じる濃度）を有する化合物が意味される。
【０１０２】
「選択的」によっては、その化合物が、イオンチャンネル内蔵型グルタミン酸受容体を活性化する、その活性を阻害する、および／またはその受容体に結合するよりも低い濃度で代謝指向型グルタミン酸受容体を活性化する、その活性を阻害する、および／またはその受容体に結合することが意味される。好ましくは、濃度差は１０倍、一層好ましくは５０倍、および更に一層好ましくは１００倍である。
【０１０３】
「療法上有効な量」によっては、患者において所望される治療効果を生じる化合物の量が意味される。たとえば、疾患もしくは障害に関しては、これはその疾患もしくは障害の一つもしくは複数の症状をある程度減少させ、そして部分的もしくは完全のいずれかでその疾患もしくは障害に関連するかもしくはその原因となる生理学的もしくは生物学的パラメーターを正常に戻す量である。ある患者を療法的に治療するのに用いられる場合には、これは、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの間、好ましくは５０ｍｇ／ｋｇを下回る、一層好ましくは１０ｍｇ／ｋｇを下回る、一層好ましくは１ｍｇ／ｋｇを下回ることが予測される量である。その量が、代謝指向型グルタミン酸受容体において約１ｎＭ〜１０μＭの化合物の有効濃度を提供することが好ましい。化合物の量はそのＥＣ50（アンタゴニストの場合にはＩＣ50）、ならびに患者に関する年齢、サイズ、および疾患に依存する。
【０１０４】
ＩＩ．技術
Ａ．キメラ受容体および使用への一般的アプローチ
先の「要約」に示されるように、本発明は、代謝指向型グルタミン酸受容体とカルシウム受容体の両蛋白質の部分を含むキメラ受容体に関する。本発明は更に、代謝指向型グルタミン酸受容体およびカルシウム受容体のフラグメントにも関する。関連する態様には、そのようなキメラ受容体およびフラグメントをコードする核酸、そのような受容体、フラグメント、および核酸の使用、ならびにそのような核酸を発現する細胞株が含まれる。開示される使用には、そのようなキメラ受容体およびフラグメントを用いて、代謝指向型グルタミン酸受容体もしくはカルシウム受容体に結合するかもしくはその活性を調節する化合物をスクリーニングする方法が含まれる。本発明は更に、そのようなスクリーニング法により同定される代謝指向型グルタミン酸受容体もしくはカルシウム受容体を調節するための化合物、ならびにそのような化合物を利用して所定の障害を治療するため、あるいは代謝指向型グルタミン酸受容体もしくはカルシウム受容体を調節するための方法も含む。
【０１０５】
幾つかの異なるＧ蛋白質共役型受容体について実施された実験により、Ｇ蛋白質共役特異性および受容体脱感作は主に、細胞内に存在するアミノ酸配列（すなわち、３本の細胞質ループおよび／または細胞内細胞質テイルの内の一つもしくは複数内の配列）により決定されるという一般原則が既に示唆されている。異なる代謝指向型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ）からの個別の蛋白質セグメントを組み合わせることによりキメラ受容体を形成するという最近の実験により、これらの受容体ではリガンド結合特異性は細胞外ドメインにより決定されるということが示唆される。
【０１０６】
従って本発明の好ましい態様は、ｍＧｌｕＲの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、ならびにカルシウム受容体（ＣａＲ）の７回貫膜ドメイン（７ＴＭＤ）および細胞内細胞質テイル（ＣＴ）からなるキメラ受容体を含み、ＣａＲ活性分子がＣａＲに作用する際に観察されるものに類似するシグナル伝達によりｍＧｌｕＲ活性分子に応答する。
【０１０７】
同様に他の好ましい態様では、本発明は、選択されたｍＧｌｕＲの細胞内細胞質Ｃ−末端テイルドメインがカルシウム受容体のＣ−末端テイルにより置換されているキメラ受容体を含む。Ｃ−末端テイルは７回貫膜領域の後に存在する細胞質領域を包含する。
【０１０８】
本発明の好ましい態様は更に、ｍＧｌｕＲの細胞質ループドメイン（第一と第二、第三と第四、および第五と第六貫膜領域の間）の全てもしくは幾つかを包含するペプチド配列が一つもしくは複数のＣａＲからの対応するペプチド配列で類似様式で置換されているキメラ受容体をも含む。具体的にはそのような態様は、ｍＧｌｕＲのＥＣＤ、ｍＧｌｕＲの７ＴＭＤ、およびカルシウム受容体のＣ−末端テイルを有するキメラ受容体を含むが、ただし７−ＴＭＤの一つもしくは複数のサブドメインはＣａＲからの配列で置換されている。これは特に、７ＴＭＤの一つもしくは複数の細胞質ループがＣａＲからの配列で置換されている受容体を含む。細胞質ループのこのような置換は、単一もしくはいずれかの組み合わせで実施してもよい。一般的には当業者に知られる技術を用いて、そのような標的「ドメイン」および「サブドメイン」は個別もしくは組み合わせて「スワッピング」することができる。
【０１０９】
これらのキメラ受容体は当業者に知られておらず、機能的キメラ受容体はこれまでには一層緊密に関連し合った受容体の部分を組み合わせることによってのみその構築に成功していたに過ぎないため、それらの機能は予測できない。実際のところ、代謝指向型グルタミン酸受容体とカルシウム受容体との間の配列同一性は僅か１９〜２５％であり、かつこの２タイプの受容体は僅か約２５〜３０％の配列類似性を共有するに過ぎない（Ｂｒｏｗｎ  Ｅ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３６６：５７５、１９９３）。
【０１１０】
実験により、天然のｍＧｌｕＲについてのアゴニストもしくはアンタゴニストである当該技術分野で知られるリガンドも、細胞外ドメインがｍＧｌｕＲからのものであるキメラ受容体においてそのような活性を呈示することが既に示されている。ＥＣＤに結合し、かつｍＧｌｕＲの活性を調節する他のリガンド（たとえば、アゴニスト、アンタゴニスト、およびアロステリック調節剤など）もそのようなキメラ受容体に作用することが予測される。実験により更に、当該技術分野に知られるｍＧｌｕＲを調節するリガンドが、ＥＣＤおよび７ＴＭＤがｍＧｌｕＲからのものであるキメラ受容体に作用することも既に示されている。ｍＧｌｕＲ活性を調節する他のリガンドも、それらがｍＧｌｕＲのＥＣＤもしくは７ＴＭＤに結合するか否かには関わりなく、このタイプのキメラ受容体に作用することが予測される。
【０１１１】
キメラ受容体は、非修飾カルシウム受容体について知られる連結に類似する様式で細胞内もしくは第二メッセンジャーの機能に連結される。たとえばＣａＲについての場合と同様に、キメラ受容体はＧ蛋白質（一つもしくは複数）との共役を通してホスホリパーゼＣの活性化、イノシトールリン酸の生成、および／または細胞内貯蔵庫からのカルシウムイオンの放出を行う。ｍＧｌｕＲはリガンド結合／活性化の際には迅速に脱感作するが、ＣａＲはそうではないため、ＣａＲに活性を示す化合物の一層効果的な高処理量スクリーニングおよび組換え細胞株内での安定な受容体発現が可能となる。キメラｍＧｌｕＲ／ＣａＲ受容体はリガンド結合／活性化の際には迅速に脱感作せず、かつそのため高処理量スクリーニングのために効果的に用いることができることは重要である。それに加え、キメラ受容体は安定な細胞株で機能的に発現され得る。
【０１１２】
このようなキメラ受容体を発現する細胞を調製し、そして選択されたｍＧｌｕＲの活性を調節する化合物を同定するための機能性アッセイに用いることができる。たとえば、受容体の活性化によりもたらされる細胞内カルシウムレベルの増加を、蛍光カルシウムキレート染料の使用によりモニターすることができる。カルシウム受容体において作用を示す分子を同定するための機能性アッセイが既に記載されている（たとえば、公開されているＰＣＴ特許出願「Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、ＰＣＴ第ＵＳ９３／０１６４２号（国際公開第９４／１８９５９号）（１９９４年９月に公開され、引用によりその全文が本明細書に取り込まれる）。
【０１１３】
現代における薬剤の発見の際に益々一般的になってきている常法は、目的の活性を有する特異的分子を同定するための様々な標的部位特異的アッセイの使用である。これらのアッセイにより分子の巨大コレクションもしくはライブラリー（たとえば、組み合わせライブラリー、大規模な製薬会社により保持される所有化合物ライブラリーなど）から薬剤リード分子が選択される。薬剤リード分子は、それらが目的の薬理学的標的に結合し、このことにより潜在的にそれらの標的の活性を修飾する場合に「選択」される。このアッセイは、直接結合性置換アッセイもしくは間接的機能性アッセイを初めとする多くのタイプのものであることができる。治療用リード化合物を単離するためのアッセイを首尾よく開発および使用する目的では、標的分子（たとえば、受容体）をまず最初に同定および単離する必要がある。様々な受容体において活性を示す分子を同定するための多くの機能性アッセイが既に文献に記載されており、そしてそれらのアッセイにより結合性アッセイに勝る独特な利点が提供される。演繹的に、どのリガンド分子がインビトロでその受容体の活性を調節しているのかを知ることは必要ではないし、そしてその受容体の厳密な生理学的機能を知ることも必要ではない。機能性アッセイおよび後続の医薬品化学的研究において同定された化合物を、そのような情報を取得するための実験的被験化合物として用いることができる。
【０１１４】
８つの固有なｍＧｌｕＲが現在知られているが、それらの個々の機能の詳細はほとんど未明のままである。それにもかかわらず、ｍＧｌｕＲにおいて活性を示す分子が製薬会社により探索されているが、それはそれらの受容体が中枢神経系において見いだされ、かつ記憶、運動機能、疼痛感覚、および神経変性などに関連する過程の調節に関わっていることが知られているためである。従って、ｍＧｌｕＲを調節する化合物は、記憶、認識、および運動機能（たとえば、発作時の）に影響を及ぼす障害もしくは疾患の治療、ならびに疼痛および神経変性性障害（たとえば、卒中、およびアルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ）病など）の治療に有用であろう。
【０１１５】
ｍＧｌｕＲにおいて活性である分子を同定するためのスクリーンは、クローン化ｍＧｌｕＲ自体を用いて構築できる。しかし天然ｍＧｌｕＲを用いた機能性スクリーンは問題が多い。第１に、大部分のｍＧｌｕＲはＧ1蛋白質を介して共役しており、これが機能アッセイにそれらを用いるのを制限する。Ｇi蛋白質はアデニレートシクラーゼの阻害に連結しており、アデニレートシクラーゼの変化は大規模な化合物ライブラリーから薬物リード分子を選択するように設計された高処理量の機能性スクリーンでは容易には測定されないからである。
【０１１６】
他のＧ蛋白質を介してホスホリパーゼＣの活性化に共役している受容体（たとえばＧq共役受容体）はこの欠点をもたないので、ｍＧｌｕＲ１およびｍＧｌｕＲ５が機能アッセイに利用できると当初は考えられた。これら２種類のｍＧｌｕＲは、Ｇq蛋白質（１またはそれ以上）を介して、測定可能な細胞内機能（たとえばホスホリパーゼＣの活性化、イノシトールリン酸の生成、および細胞内貯蔵所からのカルシウムイオンの放出）に共役しているからである。
【０１１７】
しかしここに第２の制限が提起される。これらのｍＧｌｕＲはアゴニストが結合すると急速に脱感作されるからである。すなわち機能性応答が急速に消失し、速やかには回復できない（たとえば図８ａ参照）。さらに、それらが共役するＧ蛋白質に無関係にｍＧｌｕＲを発現する完全に機能性である安定な細胞株を得るのは必ずしも可能ではなかった（Ｔａｎａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｎｅｕｒｏｎ  ８：１６９−１７９；Ｇａｂｅｌｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  Ｉｎｔ．２４：５３３−５３９）。したがって天然ｍＧｌｕＲを最適な様式で高処理量の機能性スクリーニングアッセイに用いるためには重大な技術的難点を克服しなければならない。
【０１１８】
本明細書に記載する発明は、リガンド結合／活性化に際して急速に脱感作されることがなく、組換え脊椎動物細胞において安定に発現しうるカルシウム受容体の、より強固な面を利用することによって、これらの技術的難点を克服し、はるかに改良されたスクリーニング法を提供する（たとえば図８ｂ参照。公開された国際特許出願“カルシウム受容体−活性分子”、国際特許出願第ＵＳ９３／０１６４２号（ＷＯ９４／１８９５９）、１９９４年９月公開、も参照されたい。これは参考として本明細書に含まれる）。たとえばＣａＲの７ＴＭＤおよびＣＴをｍＧｌｕＲの細胞外ドメインに、またはＣａＲのＣＴをｍＧｌｕＲのＥＣＤおよび７ＴＭＤに結合させることにより、ｍＧｌｕＲの細胞外ドメインは急速に脱感作されないという改良された性質のほか、ＣａＲのＧｑ共役特性という利点をも備えている（たとえば図８ｃ参照）。したがって本発明は、天然ｍＧｌｕＲのものと類似のリガンド結合性および活性化特性を備え、ただしＣａＲと類似する改良された第２メッセンジャー共役性を備えたキメラ受容体を提供する。
【０１１９】
したがって、本発明のキメラ受容体はｍＧｌｕＲ活性分子の同定を簡単にし、効果的、実用的かつ再現性のある機能性スクリーンを可能にするので、本発明の組成物および方法はｍＧｌｕＲ活性またはカルシウム受容体活性を調節する分子の同定に有用である。これらの分子には、たとえばアゴニスト、アンタゴニスト、アロステリック調節剤などが含まれる。たとえば代謝指向型グルタミン酸受容体において活性である化合物をスクリーニングするために構築されるキメラ受容体に、カルシウム受容体の特定のドメインのシグナル伝達特性を使用できる。このようなキメラ受容体は、ホスホリパーゼＣを活性化して細胞内カルシウムを移動させるＧ蛋白質へのカルシウム受容体のアゴニスト誘導性共役に伴う特定の特異な特性を利用するであろう。これらの特性には、たとえばリガンド誘導によるダウンレギュレーション／脱感作がないことが含まれ、これに伴って代謝指向型グルタミン酸受容体がリガンド活性化される。こうして、ホスホリパーゼＣを活性化して細胞内カルシウムを移動させるＧ蛋白質と普通は共役しない代謝指向型グルタミン酸受容体、たとえばＧiと共役する受容体に、カルシウム受容体の卓越したシグナル伝達特性を伝達できる。
【０１２０】
ある態様においては、このようなキメラ受容体を発現する組換え細胞をスクリーニング法に用いる。細胞は前記の特性を獲得し、これによってそれらを高処理量機能アッセイに利用するのが容易になり、したがって代謝指向型グルタミン酸受容体に結合するかまたはその活性を調節する化合物についての、より効果的なスクリーニング法が提供される。
【０１２１】
一般に、有用なキメラ受容体はｍＧｌｕＲおよびＣａＲの部分を、それらの部分が目的とする結合、シグナル共役または他の機能性をキメラ受容体に付与するように含有する。個々の受容体に由来する配列の長さは、異なる用途においては異なる大きさであってよい。さらに、特定の受容体に由来する部分の配列は、ｍＧｌｕＲもしくはＣａＲ中の対応する配列と同一であってもよく、またはｍＧｌｕＲもしくはＣａＲ配列の当該機能を保持する相同配列であってもよい。したがって本発明のキメラ受容体は、細胞外ドメイン、７回貫膜ドメイン、および細胞内細胞質テイルドメインをもつ。これらのキメラ受容体は、ｍＧｌｕＲ由来の配列と相同な少なくとも６アミノ酸の連続配列、およびＣａＲ由来の配列と相同な少なくとも６アミノ酸の連続配列をもつ。しかし多くの場合、ｍＧｌｕＲおよび／またはＣａＲ由来の配列は６アミノ酸より長くてもよい。たとえばそれらの配列のうち一方または両方が少なくとも１２、１８、２４、３０、３６またはそれ以上のアミノ酸の長さであってもよい。
【０１２２】
ｍＧｌｕＲ由来の部分とＣａＲ由来の部分は通常は同一長さではないであろう。たとえばこれらのタイプのうち一方に由来する配列が上記の長さ（たとえば少なくとも６、１２、１８、２４、３０、３６またはそれ以上のアミノ酸）であり、これに対しキメラ受容体の残りの配列が他方のタイプの受容体に由来する配列と同一または相同であってもよい。
【０１２３】
ある態様においては、少なくとも一方の受容体タイプに由来する部分がサブドメインである。これに関して“サブドメイン”は、ドメインについてのアミノ酸の全配列より少ないアミノ酸配列を意味する。サブドメインの例にはリガンド結合性ドメインが含まれるが、これに限定されない。他の例には細胞質ループまたは７回貫膜ドメインの領域の１つが含まれる。したがってある場合には、キメラ受容体は細胞外ドメイン、７回貫膜ドメイン、および細胞内細胞質テイルドメインをもち、これらはサブドメインを含む。このようなキメラ受容体の１例においては、少なくとも１つのサブドメインがカルシウム受容体のサブドメインに相同であり、残りのサブドメインおよびドメインが代謝指向型グルタミン酸受容体のサブドメインおよびドメインに相同である。他の例においては、少なくとも１つのサブドメインが代謝指向型グルタミン酸受容体のサブドメインに相同であり、残りのサブドメインおよびドメインがカルシウム受容体のサブドメインおよびドメインに相同である。
【０１２４】
より具体的な例においては、キメラ受容体の７回貫膜ドメインは３つの細胞質ループを含有する；少なくとも１つの細胞質ループは代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞質ループに相同である；または少なくとも１つの細胞質ループはカルシウム受容体の細胞質ループに相同である。他の具体例においては、細胞外ドメインは代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同であり、７回貫膜ドメインは代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインに相同であり、ただし７回貫膜ドメインの１またはそれ以上の細胞質ループはカルシウム受容体の細胞質ループ（１またはそれ以上）と相同であり、細胞質テイルはカルシウム受容体の細胞質テイルと相同である。このように細胞質ループ１、２および３はいずれも、１個だけまたはいかなる組合わせにおいても、カルシウム受容体の細胞質ループ（１またはそれ以上）で置換できる。
【０１２５】
他の場合にはキメラ受容体は、ｍＧｌｕＲもしくはＣａＲのドメインまたは好ましくはｍＧｌｕＲおよびＣａＲそれぞれに由来する少なくとも１つのドメインの配列と同一または相同な配列のドメインをもつ。より好ましくは、キメラ受容体は１受容体タイプに由来する２つのドメインおよび他の受容体タイプに由来する１つのドメインをもつ。このようなキメラ受容体の特定の好ましい態様の組成物を以下に記載する：
下記をもつキメラ受容体を含む組成物
１．カルシウム受容体の細胞外ドメインに相同な１つのドメイン、代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインに相同な１つのドメイン、および代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同な１つのドメイン；または
２．代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同な１つのドメイン、カルシウム受容体の７回貫膜ドメインに相同な１つのドメイン、およびカルシウム受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同な１つのドメイン；または
３．代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同な１つのドメイン、カルシウム受容体の７回貫膜ドメインに相同な１つのドメイン、および代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同な１つのドメイン；または
４．カルシウム受容体の細胞外ドメインに相同な１つのドメイン、代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインに相同な１つのドメイン、およびカルシウム受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同な１つのドメイン；または
５．カルシウム受容体の細胞外ドメインに相同な１つのドメイン、カルシウム受容体の７回貫膜ドメインに相同な１つのドメイン、および代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同な１つのドメイン；または
６．代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同な１つのドメイン、代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインに相同な１つのドメイン、およびカルシウム受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同な１つのドメイン；または
７．代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同な１つのドメイン、代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインに相同な１つのドメイン（ただし１またはそれ以上の細胞質ループがカルシウム受容体の細胞質ループ（１またはそれ以上）と相同な細胞質ループ（１またはそれ以上）で置換されている）、およびカルシウム受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同な１つのドメイン。
【０１２６】
Ｂ．キメラ受容体をコードする核酸
上記のキメラ受容体をコードする単離された核酸分子を含有する組成物も本発明において有用である。そのような核酸分子を単離、精製または濃縮できる。好ましくは核酸は、調製物中に存在する全核酸の少なくとも７５％、より好ましくは８５％、最も好ましくは９５％となる、実質的に純粋な調製物として提供される。
【０１２７】
そのような核酸分子は複製可能な発現ベクター中に存在してもよい。複製可能な発現ベクターを好適な宿主細胞中へ形質転換して、組換え宿主細胞を得ることができる。本発明はそのような形質転換した宿主細胞を用いて、キメラ受容体を製造する方法をも提供する。この方法は、核酸分子をキメラ受容体の発現が可能な様式で含む複製可能な発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションした原核生物または真核生物宿主細胞を好適な栄養条件下で増殖させることを含む。
【０１２８】
キメラ受容体または受容体フラグメントをコードする核酸の用途には、以下のうち１またはそれ以上が含まれる：受容体蛋白質の製造、これはたとえば構造決定、受容体に対する分子の活性のアッセイ、療法薬として有用な分子のスクリーニング、および受容体に結合する抗体の入手に利用できる。本発明のキメラ受容体は、カルシウム受容体または代謝指向型グルタミン酸受容体のいずれか、または両方において活性である化合物の同定に有用である。また本発明のフラグメントは、カルシウム受容体または代謝指向型グルタミン酸受容体のいずれか、もしくは両方に結合するか、またはそれらを調節する化合物の同定に有用である。
【０１２９】
したがって本発明は、たとえば代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインをコードする単離した核酸であって、その代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞内細胞質テイルドメインを実質的に含まないものをも提供する。同様に、単離した核酸は、少なくとも１つの膜スパニングドメイン部分を実質的に含まない代謝指向型グルタミン酸受容体をコードすることができる。他の例においては、単離した核酸は、その代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインを実質的に含まない代謝指向型グルタミン酸受容体をコードすることができる。
【０１３０】
Ｃ．代謝指向型グルタミン酸受容体フラグメントおよびカルシウム受容体フラグメント
受容体フラグメントは代謝指向型グルタミン酸受容体またはカルシウム受容体の部分である。好ましくは受容体フラグメントは、全長受容体に結合する１またはそれ以上の結合剤に結合する。結合剤にはリガンド、たとえばグルタミン酸、キスカル酸、アゴニストおよびアンタゴニスト、ならびに受容体に結合する抗体が含まれる。フラグメントは、受容体に結合しうる他の分子を選択する用途など、種々の用途をもつ。
【０１３１】
フラグメントは標準法、たとえば受容体ＤＮＡのクローン化した部分配列の発現、および受容体蛋白質の蛋白質分解性開裂により生成できる。蛋白質は蛋白質分解酵素、たとえばトリプシン、キモトリプシンまたはペプシンによって特異的に開裂する。これらの酵素はそれぞれ、それが攻撃するタイプのペプチド結合に関して特異的である。トリプシンは、そのカルボニル基が塩基性アミノ酸、通常はアルギニンまたはリシンに由来するペプチド結合の加水分解を触媒する。ペプシンおよびキモトリプシンは芳香族アミノ酸、特にトリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニンに由来するペプチド結合の加水分解を触媒する。
【０１３２】
開裂蛋白質フラグメントの別の組が、蛋白質分解酵素に感受性である部位における開裂を阻止することにより生成する。たとえばリシンのε−アミノ基とエチルトリフルオロチオアセテートを緩和な塩基性の溶液中で反応させると、その隣のペプチド結合がトリプシンによる加水分解に対してもはや感受性でない遮断されたアミノ酸残基が得られる（Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ.,Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １：４０１，１９６２）。したがって、このようなポリペプチドをトリプシンで処理するとアルギニル残基においてのみ開裂する。
【０１３３】
蛋白質分解酵素による加水分解に対して感受性であるペプチド結合を形成するように、ポリペプチドを修飾することもできる。たとえばシステイン残基をβ−ハロエチルアミンでアルキル化すると、トリプシンで加水分解されるペプチド結合が得られる（Ｌｉｎｄｌｅｙ，Ｎａｔｕｒｅ  １７８：６４７，１９５６）。
【０１３４】
さらに、ポリペプチド鎖を特定の残基において開裂させる試薬を使用できる（Ｗｉｔｃｏｐ，Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．，１６．２２１，１９６１）。たとえば臭化シアンはポリペプチドをメチオニン残基において開裂させる（Ｇｒｏｓｓ  ＆  Ｗｉｔｋｉｐ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８３．１５１０，１９６１）。
【０１３５】
こうして代謝指向型グルタミン酸受容体またはそのフラグメントを修飾剤、蛋白質分解酵素および／または試薬の多様な組み合わせにより処理することによって、種々の大きさをもつ異なるオーバーラップしたペプチドが多数生成する。これらのペプチドフラグメントを、そのような消化物からクロマトグラフィー法により単離および精製できる。あるいは適切な固体状態での合成法を用いてフラグメントを合成できる。
【０１３６】
目的とする生物学的活性をもつフラグメントを選択できる。たとえばフラグメントはリガンド結合部位のみを含むことができる。そのようなフラグメントは、フラグメントに対する特異的結合を検出するためのルーティン法により当業者が容易に同定できる。たとえば代謝指向型グルタミン酸受容体の場合、受容体フラグメントをコードする核酸を発現させてポリペプチドフラグメントを生成させ、次いでこれを適切な結合条件下で受容体リガンドと接触させて、そのリガンドがそのフラグメントに結合するか否かを判定することができる。そのようなフラグメントは、グルタミン酸のアゴニストおよびアンタゴニストについての、ならびに血清または他の身体組織からグルタミン酸を分離するのに有用な療法効果についてのスクリーニングアッセイに有用である。
【０１３７】
他の有用なフラグメントには、受容体の細胞外部分、膜スパニング部分、または細胞内部分のみをもつものが含まれる。これらの部分は、受容体のアミノ酸配列を既知の受容体の配列と比較することにより、または他の標準的方法で、容易に同定できる。これらのフラグメントは他の受容体のフラグメントと共にキメラ受容体を形成して、細胞内で目的の機能を果たす細胞内部分、および細胞をグルタミン酸、または本明細書に記載するアゴニストもしくはアンタゴニストの存在に対して応答させる細胞外部分を備えた受容体を作成するのに有用である。キメラ受容体遺伝子は適切に配合された場合には、受容体の機能不全を伴う、または受容体機能の調節が患者に望ましい効果を与える、多様な疾病の遺伝子療法に有用である。
【０１３８】
さらに、細胞内ドメインを熱量測定、放射測定、発光測光、分光測光または蛍光測光アッセイによって容易に検出できる目的酵素プロセスに共役するように、また細胞外部分とその天然リガンド（たとえばグルタミン酸）あるいは本発明のアゴニストおよび／またはアンタゴニストとの相互作用によって活性化されるように、キメラ受容体を構築できる。そのようなキメラ受容体を発現する細胞を用いて、代謝指向型グルタミン酸受容体アゴニストおよびアンタゴニスト、ならびに場合によっては無機イオン受容体アゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニングを容易にすることができる。
【０１３９】
したがって本発明は、カルシウム受容体、代謝指向型グルタミン酸受容体、またはカルシウム受容体配列および代謝指向型グルタミン酸受容体配列を含有するキメラ受容体のフラグメントまたは精製ポリペプチドをも提供する。これらのフラグメントを用いて、代謝指向型グルタミン酸受容体またはカルシウム受容体において活性である化合物をスクリーニングすることができる。たとえば、カルシウム受容体または代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインを含有するフラグメントを可溶性受容体結合アッセイに用いて、組合わせライブラリー中のどの分子がアッセイ領域内の受容体を結合しうるかを同定できる。そのような“結合性”分子はその受容体の機能に影響を与えると推定できる。好ましい受容体フラグメントには、機能性受容体活性、結合部位、抗体認識のためのエピトープ（一般に少なくとも６個のアミノ酸）、および／または代謝指向型グルタミン酸受容体アゴニスト、アンタゴニストもしくは調節剤を結合する部位をもつものが含まれる。他の好ましい受容体フラグメントには、細胞外部分、貫膜部分、細胞内部分、および／または多重貫膜部分（たとえば７回貫膜部分）のみをもつものが含まれる。そのような受容体フラグメントは多様な用途をもち、たとえば特定の領域に対する抗体を得るために用いられ、またキメラ受容体または他の受容体のフラグメントを形成して特異な特性を備えた新規受容体を作成するために用いられる。
【０１４０】
精製したポリペプチドまたはフラグメントは、好ましくは代謝指向型グルタミン酸受容体またはカルシウム受容体またはキメラ受容体の少なくとも６個の連続アミノ酸を含む。ポリペプチドに関して“精製”とは、ポリペプチドが天然に産するポリペプチドと別個の形（すなわちそれと他の分子が結合したもの）であることを意味する。好ましくはポリペプチドは、調製物中に存在する全蛋白質の少なくとも７５％、より好ましくは８５％、最も好ましくは９５％となる実質的に純粋な調製物として提供される。
【０１４１】
多くの用途において、精製したポリペプチドまたはフラグメントは代謝指向型グルタミン酸受容体またはカルシウム受容体またはキメラ受容体に由来する６個より多い連続アミノ酸を含むことが好ましい。たとえば精製ポリペプチドは“母体”受容体の少なくとも１２、１８、１４、３０、３６またはそれ以上の連続アミノ酸を含むことができる。
【０１４２】
カルシウム受容体、代謝指向型グルタミン酸受容体、またはキメラ受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞質テイルドメインのみを含有する他のフラグメントを調製できる。そのようなフラグメントは、たとえばその作用部位が７回貫膜ドメインである化合物をスクリーニングするための機能アッセイに有用である。
【０１４３】
前記のように本発明は、受容体フラグメントを用いる、受容体に結合する化合物のスクリーニング法を提供する。１例においては本方法は以下の工程を含む：受容体のフラグメントをコードする核酸配列を調製し；宿主においてそのフラグメントを発現しうる複製可能な発現ベクターにこの配列を挿入し；宿主細胞をこのベクターで形質転換し；宿主細胞からフラグメントを回収し；フラグメントおよび被験化合物を許容しうる媒質に導入し；そしてこのフラグメントへのその化合物の結合を物理的に検出可能な手段でモニターする。受容体が代謝指向型グルタミン酸受容体である場合、フラグメントは好ましくは代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメイン、または代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメイン、または代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞質テイルドメインを含有する。受容体がカルシウム受容体である場合、フラグメントは好ましくはカルシウム受容体の細胞外ドメイン、またはカルシウム受容体の７回貫膜ドメイン、またはカルシウム受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞質テイルドメインを含有する。
【０１４４】
代謝指向型グルタミン酸受容体およびカルシウム受容体の特定のフラグメントは、相互作用する化合物と接触した際に普通は“母体”受容体によって活性化される１またはそれ以上の細胞応答を活性化する機能を維持する。たとえばｍＧｌｕＲまたはＣａＲの７ＴＭＤおよびＣＴを含有するがＥＣＤを含有しない細胞発現フラグメントは、７ＴＭＤと相互作用する化合物と接触した際に細胞応答（１またはそれ以上）を活性化できる。したがって代謝指向型グルタミン酸受容体またはカルシウム受容体に結合するかまたはそれらを調節する化合物、たとえばキメラ受容体につき本明細書に記載した化合物をスクリーニングするための、細胞を基礎とする方法にそのようなフラグメントを採用することは、欠失した配列ではなくそのフラグメントと相互作用する活性化合物を同定するのに有用である。
【０１４５】
カルシウム受容体、代謝指向型グルタミン酸受容体、またはカルシウム受容体配列と代謝指向型グルタミン酸受容体配列を含むキメラ受容体の単離されたフラグメントをインビトロ機能アッセイにおいて組み合わせて、いずれかの受容体において活性である化合物をスクリーニングできる。そのようなインビトロアッセイは、たとえば一方の受容体の細胞外ドメインをもつフラグメント、ならびに他方の受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞質テイルドメインをもつフラグメントを含むことができ、その際細胞外ドメインはインビトロで７回貫膜／細胞質テイルドメインフラグメントを相補するであろう。こうして、スクリーニングアッセイに有用な機能性キメラ受容体が、それらをコードする核酸の組換えの必要なしに調製される。代わりにこれらの機能性キメラ受容体は、異なる受容体の部分をインビトロで組み合わせることにより得られる。
【０１４６】
このようなフラグメントの組合わせにより、受容体に結合するかまたは受容体を調節する化合物をスクリーニングする方法が提供される。このような方法の例には、以下の工程が含まれる：第１受容体のフラグメントである第１フラグメントをコードする核酸配列を調製し；宿主においてそのフラグメントを発現しうる複製可能な発現ベクターにこの配列を挿入し；宿主細胞をこのベクターで形質転換し；宿主細胞からフラグメントを回収し；第２受容体のフラグメントである第２フラグメントをコードする核酸配列を調製し；宿主において第２フラグメントを発現しうる複製可能な発現ベクターにこの配列を挿入し；宿主細胞をこのベクターで形質転換し；宿主細胞から第２フラグメントを回収し；第１フラグメントおよび第２フラグメントの両方を許容しうる媒質に導入し；そしてこの化合物の結合および調節を物理的に検出可能な手段でモニターする。
【０１４７】
特に好ましい例においては、第１フラグメントは代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインを含有し、第２フラグメントはカルシウム受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞質テイルドメインを含有する；第１フラグメントはカルシウム受容体の細胞外ドメインを含有し、第２フラグメントは代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞質テイルドメインを含有する；または第１フラグメントはカルシウム受容体の細胞外ドメインを含有し、第２フラグメントは代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインおよびカルシウム受容体の細胞質テイルドメインを含有する。
【０１４８】
Ｄ．キメラ受容体を用いた、代謝指向型グルタミン酸受容体活性を調節する化合物を同定するためのスクリーニング法
科学文献に記載されるｍＧｌｕＲアゴニストおよびアンタゴニスト化合物は、内因性アゴニストであるグルタミン酸に関連をもつ（総説については以下を参照されたい：Ｃｏｃｋｃｒｏｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．２３：５８３−５９４，１９９３；Ｓｃｈｏｅｐｐ  ａｎｄ  Ｃｏｎｎ，ＴＩＰＳ  １４：１３−２０，１９９３；Ｈｏｌｌｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：３１−１０８，１９９４）。そのようなアゴニストおよびアンタゴニスト化合物は、酸性部分、通常はカルボン酸部分、時にはホスファチジン酸部分を含む。その場合、そのような化合物は恐らくアミノ酸であるグルタミン酸と同じ部位でｍＧｌｕＲを結合するのであろう。これは、グルタミン酸の競合的アンタゴニストであることが示されたメチルカルボキシルフェニルグリシンにつき確認された（Ｅａｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．−Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｅｃｔ．２４４：１９５−１９７，１９９３）。ｍＧｌｕＲにおいて活性であり、負の電荷をもたず、かつアミノ酸であるグルタミン酸に類似しない化合物は、グルタミン酸結合部位において作用しないと推定できる。
【０１４９】
代謝指向型グルタミン酸受容体を標的とする化合物は、診断用および治療用を含めた幾つかの用途をもつ。多数のそれらの化合物の合成がＮｅｍｅｔｈらにより“カルシウム受容体活性分子”と題する国際特許出願公開第ＷＯ  ９３／０４３７３号に記載されており、これは本明細書に参考として含まれるものとする。代謝指向型グルタミン酸受容体に結合する化合物、および代謝指向型受容体グルタミン酸の活性を調節するのに有効な化合物を、本明細書に記載する方法で同定できる。代謝指向型グルタミン酸受容体に選択的に結合しうる化合物は、他のグルタミン酸受容体に対比して代謝指向型グルタミン酸受容体の存在を測定するために診断用として使用できる。
【０１５０】
以下に、代謝指向型グルタミン酸受容体活性を調節する化合物を得るために使用しうる方法を記載する。ある化合物が代謝指向型グルタミン酸受容体調節剤またはカルシウム受容体調節剤の１またはそれ以上の活性をもつ効力を測定することによりそれが本発明のキメラ受容体の活性を調節する効力を評価するために、種々のスクリーニング法を実施できる。本発明のキメラ受容体を発現する細胞において、そのような活性には細胞内カルシウム、イノシトールリン酸およびサイクリックＡＭＰに及ぼす影響が含まれる。
【０１５１】
ｆｕｒａ−２による［Ｃａ2+］iの測定は、新規な有機分子の活性をスクリーニングするための極めて迅速な手段を提供する。午後だけで１０〜１５種類の化合物（または分子タイプ）を試験し、それらが細胞内Ｃａ2+を移動させる効力、または移動を阻害する効力を１回の実験で評価することができる。観察されるＣａ2+］iの増加の、ＰＭＡによる抑制に対する感受性も評価できる。
【０１５２】
たとえばｆｕｒａ−２を負荷した、本発明のキメラ受容体を発現する組換え細胞を、まず０．５ｍＭ  ＣａＣｌ2含有緩衝液に懸濁する。被験物質を小容量（５〜１５μｌ）のキュベットに添加し、蛍光信号の変化を測定する。キュベット内で、ある予定濃度に達するまで、またはそれ以上の蛍光の変化が認められなくなるまで、被験物質の濃度を累積増大させる。蛍光の変化が認められない場合、その分子は不活性であるとみなし、それ以上の試験を行わない。
【０１５３】
最初の試験では、分子を５または１０ｍＭという高い濃度で試験してもよい。比較的有効な分子が分かるにつれて、最高濃度を低下させた。たとえば新規分子を５００μＭ以下の濃度で試験する。この濃度で蛍光の変化が認められない場合、その分子は不活性であるとみなせる。
【０１５４】
［Ｃａ2+］iを増加させる分子を追加試験する。本発明のキメラ受容体の正の調節剤をスクリーニングする際に考慮しうる分子の２つの特性は、細胞内Ｃａ2+の移動およびＰＫＣ活性化剤に対する感受性である。
【０１５５】
１つの細胞調製物で［Ｃａ2+］i、サイクリックＡＭＰレベル、ＩＰおよび他の細胞内メッセンジャーに関するデータが得られる。典型的な方法は、細胞にｆｕｒａ−２を負荷し、次いで細胞懸濁液を二分し；大部分の細胞を［Ｃａ2+］iの測定に使用し、残りを分子と共にインキュベートしてサイクリックＡＭＰに対する作用を評価する。
【０１５６】
イノシトールリン酸の測定は時間のかかるスクリーニングである。しかしクロリド（ギ酸ではなく）で溶離するイオン交換カラムは回転蒸発（約３０時間かかる）が不必要であるので、ＩＰ3生成スクリーニングのための極めて迅速な手段を提供する。この方法によれば一人の実験者が約１００個の試料を午後だけで処理できる。［Ｃａ2+］i、サイクリックＡＭＰおよびＩＰ3の測定により評価して興味深いと分かった分子につき、ＨＰＬＣにより種々のイノシトールリン酸の形成を調べ、それらの異性体形を評価することによって、より厳密な分析を行うことができる。
【０１５７】
以下はこれらのスクリーニング操作に有用な方法の具体例である。
【０１５８】
１．サイクリックＡＭＰの測定
この節にはサイクリックＡＭＰレベルの測定につき記載する。細胞を前記に従ってインキュベートし、インキュベーション終了時に０．１５ｍｌの試料を採取し、０．８５ｍｌの熱湯（７０℃）に移し、この温度で５〜１０分間加熱した。次いで試験管を数回凍結融解し、細胞残滓を遠心分離により沈降させた。上清の一部をアセチル化し、放射免疫測定法によりサイクリックＡＭＰ濃度を測定した。
【０１５９】
２．イノシトールリン酸生成の測定
この節はイノシトールリン酸生成の測定法につき記載する。上皮小体細胞を４μＣｉ／ｍｌの3Ｈ−ミオイノシトールと共に２０〜２４時間インキュベートすることにより、膜のリン脂質を標識した。次いで細胞を洗浄し、０．５ｍＭのＣａＣｌ2および０．１％ＢＳＡを含有するＰＣＢに再懸濁した。ミクロ遠心管中で種々の濃度の有機ポリカチオンの不在下または存在下に種々の時間、インキュベーションを行った。１ｍｌクロロホルム−メタノール−１２Ｎ  ＨＣｌ（２００：１００：１；ｖ／ｖ／ｖ）の添加により反応を停止した。フィチン酸加水分解物水溶液（２００μｌ；２５μｇリン酸／試験管）を添加した。試験管を遠心し、６００μｌの水相を１０ｍｌの水に希釈した。
【０１６０】
ＡＧ１−Ｘ８を用いるイオン交換クロマトグラフィーによりクロリド形またはギ酸形のイノシトールリン酸を分離した。ＩＰ3レベルのみを測定したい場合にはクロリド形を用い、一方、主要イノシトールリン酸（ＩＰ3、ＩＰ2およびＩＰ1）を分離するためにはギ酸形を用いた。ＩＰ3のみを測定するためには、希釈した試料をクロリド形カラムに付与し、カラムを１０ｍｌの３０ｍＭ  ＨＣｌ、次いで６ｍｌの９０ｍＭ  ＨＣｌで洗浄し、ＩＰ3を３ｍｌの５００ｍＭ  ＨＣｌで溶離した。最後の溶出液を希釈し、計数した。すべての主要イノシトールリン酸を測定するためには、希釈した試料をギ酸形カラムに付与し、ギ酸緩衝液の濃度を高めることによりＩＰ1、ＩＰ2およびＩＰ3を順次溶離した。ギ酸カラムから溶出した試料を回転蒸発させ、残渣をカクテルに装入し、計数した。
【０１６１】
異性体形のＩＰ3をＨＰＬＣにより判定した。１ｍｌの０．４５Ｍ過塩素酸を添加することにより反応を停止し、氷上に１０分間保存した。遠心後に、上清をＮａＨＣＯ3でｐＨ７〜８に調整した。次いでこの抽出液をパーティシル（Ｐａｒｔｉｓｉｌ）ＳＡＸアニオン交換カラムに付与し、ギ酸アンモニウムの直線濃度勾配で溶離した。次いで種々の画分をダウエックス（Ｄｏｗｅｘ）で脱塩し、次いで回転蒸発させたのちパッカード、トリカーブ（Ｔｒｉ−ｃａｒｂ）１５００ＬＳＣで液体シンチレーション計数した。
【０１６２】
すべてのイノシトールリン酸分離法につき、有機ポリカチオンが分離を妨害するか否かを判定するために、基準品を用いた適切な対照を採用した。妨害する場合には、イノシトールリン酸の分離前に、障害分子を除去するために試料をカチオン交換樹脂で処理した。
【０１６３】
３．リード分子の使用
リード分子が天然リガンドの作用を模倣し、またはそれに拮抗する効力を系統的に測定することにより、アゴニストおよびアンタゴニストに関する種々の官能基の重要度を確認できる。試験した分子のうちあるものは薬物候補として好適であり、一方、他は薬物候補として必ずしも好適ではない。ある分子の薬物候補としての適性は、有効性および毒性などの要因に依存する。それらの要因は標準法により評価できる。たとえばリード分子を用いて、受容体による療法の基礎となる仮説が適切であることを証明し、また受容体調節剤が受容体に作用するのを可能にする構造特性を判定し、これにより本発明に有用な他の分子を得ることができる。
【０１６４】
本明細書に記載される実施例は、ｍＧｌｕＲおよびＣａＲの活性の調節剤として有用な分子の一般的な設計方法を提示する。これらの実施例には、他の分子を得るためのスクリーニング法、たとえば天然産物ライブラリーのスクリーニング法も記載される。これらの方法を用いて、当業者はｍＧｌｕＲおよびＣａＲの他の有用な調節剤を同定できる。
【０１６５】
カルシウム受容体を発現する細胞株は既に得られており、それらをカルシウム受容体の活性を調節する化合物の同定のための高処理量スクリーニングに利用しうる方法が開示されている（参照：米国特許出願第０８／３５３，７８４号、１９９４年１２月９日出願、本明細書に参考として含まれる）。代謝指向型グルタミン酸受容体を発現する細胞株は既に得られており、それらを代謝指向型グルタミン酸受容体の活性を調節する化合物の同定のために利用しうる方法が開示されている（欧州特許出願公開第０  ５６８  ３８４  Ａ１号；欧州特許出願公開第０  ５６９  ２４０  Ａ１号；国際特許出願公開第ＷＯ  ９４／２９４４９号；および国際特許出願公開第ＷＯ  ９２／１０５８３号）。したがって発現した受容体の活性の調節を検出するための生化学的、分光測光または他の物理的測定を用いる組換え細胞によるアッセイ法、特に影響を受けた細胞内メッセンジャーの変化を測定するアッセイ法は当業者に知られており、化合物および化合物ライブラリーの高処理量機能性スクリーニングに適するように構成できる。それぞれの機能アッセイ法が高処理量スクリーニングにとっての利点および欠点をもつことは当業者に自明であり、これらは当該受容体、用いる細胞株、受容体機能の調節を検出するために用いる生化学的測定および物理的測定の性質、スクリーニングされる化合物ライブラリーの性質、ならびに他の種々のパラメーターに依存する。殊に有用かつ実用的な方法は、ホスホリパーゼ−Ｃと共役した受容体の活性の調節を検出するための、細胞内Ｃａ2+の蛍光指示薬の使用である。
【０１６６】
［3Ｈ］グルタミン酸、または本明細書に記載した方法で見出した、ｍＧｌｕＲを調節することが認められた他の化合物をリード化合物として用いると、類似の、またはより強力な活性をもつ他の化合物を見出すことができ、次いでこれをリード化合物として使用しうることが期待される。［3Ｈ］グルタミン酸などのリード化合物を、標準法による分子設計および化合物ライブラリーのスクリーニングに利用できる。放射性リガンド結合法［放射性標識結合アッセイ法］を利用して、グルタミン酸結合部位に結合する化合物を同定できる。そのような結合アッセイ法はｍＧｌｕＲ上のグルタミン酸結合部位に結合する新規化合物を見出すのに有用であるが、本発明によればｍＧｌｕＲにおける特異かつ有用な活性をもつ新規化合物を見出し、これを放射性標識し、同様に放射性リガンドアッセイ法に使用して、この新規リード化合物が定める部位に結合する他の化合物をさらに見出すことができる。このスクリーニング試験によって、多数の潜在的に有用な化合物をそれらがグルタミン酸結合部位に結合する能力につきスクリーニングできる。標準的検出法を用いて、代謝指向型グルタミン酸受容体上のグルタミン酸結合部位への結合を検出するための他の迅速アッセイ法を考案できる。この節に記載した方法で、グルタミン酸結合部位において作用する他の化合物を同定できる。高処理量アッセイ法をまず生成物ライブラリー（たとえば天然産物ライブラリーおよび化合物ファイル）のスクリーニングに用いて、グルタミン酸（またはリード化合物）結合部位において活性をもつ化合物を同定する。次いでこれらの化合物を、代謝指向型グルタミン酸受容体上のグルタミン酸またはリード化合物結合部位を標的とする薬物開発プログラムのための化学的リード構造体として利用する。動物試験を含めたルーティン実験を行って、目的活性をもつ化合物を同定できる。
【０１６７】
以下のアッセイ法を高処理量アッセイ法として利用できる。ラット脳膜を、Ｗｉｌｌｉａｍｓら（Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３６：５７５，１９８９）の方法に従い、以下の点を変更して調製する：体重１００〜２００ｇの雄スプラーグ−ドーレイ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラット（ハーラン・ラボラトリーズ）を断頭により屠殺する。ラット２０匹からの皮質または小脳を清浄にし、切断する。得られた脳組織を、４℃で最低に設定したポリトロンホモジナイザーにより、５ｍＭ  Ｋ−ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）を含有する０．３２Ｍスクロース３００ｍｌ中でホモジナイズする。ホモジネートを１，０００×ｇで１０分間遠心し、上清を除去し、３０，０００×ｇで３０分間遠心する。得られたペレットを２５０ｍｌの５ｍＭ  Ｋ−ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）に再懸濁し、氷上で１５分間撹拌し、次いで３０，０００×ｇで３０分間遠心する。このペレットを３００ｍｌの５ｍＭ  Ｋ−ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）に再懸濁し、３２℃で３０分間インキュベートする。次いで懸濁液を１００，０００×ｇで３０分間遠心する。膜を５００ｍｌの５ｍＭ  Ｋ−ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）に再懸濁することにより洗浄し、３２℃で３０分間インキュベートし、１００，０００×ｇで３０分間遠心する。３０分間のインキュベーションを含めたこの洗浄処理を繰り返す。最終ペレットを６０ｍｌの５ｍＭ  Ｋ−ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）に再懸濁し、アリコートに分けて−８０℃で保存する。
【０１６８】
［3Ｈ］グルタミン酸（リード化合物の一例として）を用いた結合アッセイを行うには、ＳＰＭ（シナプス形質膜）のアリコートを融解し、３０ｍｌの３０ｍＭ  ＥＰＰＳ／１ｍＭ  Ｋ−ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）に再懸濁し、１００，０００×ｇで３０分間遠心する。ＳＰＭを緩衝液Ａ（３０ｍＭ  ＥＰＰＳ／１ｍＭ  Ｋ−ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）に再懸濁する。この反応混合物に［3Ｈ］グルタミン酸を添加する。結合アッセイをポリプロピレン試験管中で行う。最終インキュベーション容量は５００μｌである。１００μＭの非放射性グルタミン酸の存在下で非特異的結合を測定する。二重試料を０℃で１時間インキュベートする。３ｍｌの氷冷した緩衝液Ａを添加することによりアッセイを終結し、次いで予め０．３３％ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）に浸漬したガラス繊維フィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ  Ｎｏ．３０）で濾過する。フィルターをさらに３ｍｌの緩衝液Ａで３回洗浄し、3Ｈにつき３５〜４０％の効率でシンチレーション計数することにより放射能を測定する。
【０１６９】
上記アッセイの正当性を立証するために、以下の実験を実施できる：
（ａ）フィルターへの［3Ｈ］グルタミン酸の非特異的結合の量を下記により測定する：種々の濃度の［3Ｈ］グルタミン酸を含有する５００μｌの緩衝液Ａを、予め浸漬したガラス繊維フィルターに導通する。フィルターをさらに３ｍｌの緩衝液Ａで４回洗浄し、3Ｈにつき３５〜４０％の効率でシンチレーション計数することにより、フィルターに結合した放射能を測定する。
【０１７０】
（ｂ）ＳＰＭを緩衝液Ａに再懸濁することにより、飽和曲線を作成する。アッセイ緩衝液（５００μｌ）は６０μｇの蛋白質を含有する。１．０ｎＭから４００μＭの範囲の［3Ｈ］グルタミン酸濃度を半対数単位で用いる。これらのデータから飽和曲線を作成し、見掛けのＫD値およびＢmax値をスカッチャード分析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０，１９４９）により決定する。［3Ｈ］グルタミン酸の結合の協同性を、ヒルプロット（Ｈｉｌｌ，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．４０：１９０，１９１０）の作成により測定する。
【０１７１】
（ｃ）ＳＰＭを緩衝液Ａに再懸濁することにより、蛋白質（受容体）濃度に対する結合の依存性を測定する。アッセイ緩衝液（５００μｌ）は、それのＫD値に等しい濃度の［3Ｈ］グルタミン酸および増大する濃度の蛋白質を含有する。［3Ｈ］グルタミン酸の特異的結合は存在する蛋白質（受容体）の量に対して直線関係にあるはずである。
【０１７２】
（ｄ）ＳＰＭを緩衝液Ａに再懸濁することにより、リガンド−受容体の結合の時間経過を測定する。アッセイ緩衝液（５００μｌ）は、それのＫD値に等しい濃度の［3Ｈ］グルタミン酸および１００μｇの蛋白質を含有する。二重試料を０℃で種々の長さの時間インキュベーし；平衡に達した時間を測定し、この時点を以下のすべてのアッセイにルーティンに採用する。
【０１７３】
（ｅ）結合部位の薬理を競合実験により分析できる。そのような実験においては、［3Ｈ］グルタミン酸の濃度および蛋白質の量を一定に維持し、一方、被験（競合）薬物の濃度を変化させる。このアッセイにより、競合薬物につきＩＣ50および見掛けのＫDを測定できる（Ｃｈｅｎｇ  ａｎｄ  Ｐｒｕｓｏｆｆ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２２：３０９９，１９７３）。競合薬物の協同性を、ヒルプロット分析により測定する。
【０１７４】
［3Ｈ］グルタミン酸の特異的結合は、代謝指向型グルタミン酸受容体上のグルタミン酸結合部位への結合を表す。このように、グルタミン酸類似体は［3Ｈ］グルタミン酸の結合に対して競合的に作用し、このアッセイにおけるそれらの効力は代謝指向型グルタミン酸受容体活性の機能アッセイ（たとえばツメガエル属(Ｘｅｎｏｐｕｓ)卵母細胞において発現したクローン化代謝指向型グルタミン酸受容体の電気生理学的評価）におけるそれらの効力と相関するはずである。逆に、グルタミン酸結合部位以外の部位において活性をもつ化合物は、［3Ｈ］グルタミン酸結合を競合的に置換しないはずである。むしろ非競合的相互作用を示唆する［3Ｈ］グルタミン酸結合の複雑なアロステリック調節が起こる可能性がある。
【０１７５】
（ｆ）［3Ｈ］グルタミン酸を平衡に到達させ（前記（ｄ）参照）、非放射性である競合薬物を大過剰に反応混合物に添加したのち［3Ｈ］グルタミン酸の結合を測定することにより、解離反応速度を推定する研究を行う。次いで、種々の時間間隔で［3Ｈ］グルタミン酸の結合をアッセイする。このアッセイで［3Ｈ］グルタミン酸結合の結合速度および解離速度が測定される（Ｔｉｔｅｌｅｒ，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｄｏｐａｍｉｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｄｏｐａｍｉｎｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、マーセル・デッカー社、ニューヨーク、１９８３）。このパラメーターの温度依存性を理解するために、反応温度を変化させる実験をさらに行う（０〜３０℃）。
【０１７６】
以下は、代謝指向型グルタミン酸受容体活性を調節する化合物を得るための迅速スクリーニングアッセイ法の一例である。このスクリーニングアッセイではまず、グルタミン酸結合部位を含む組換え受容体または受容体フラグメントに化合物が結合する効力を測定する。次いで、代謝指向型グルタミン酸受容体に結合する化合物を、それらが代謝指向型グルタミン酸受容体における１またはそれ以上の活性を調節する能力につき試験する。
【０１７７】
１方法においては、好適な生物、たとえばヒトに由来するキメラ受容体または代謝指向型グルタミン酸受容体のフラグメントをコードする、ｃＤＮＡまたは遺伝子のクローンを標準法により得る。そのクローンの別個のフラグメントを適切な発現ベクター内で発現させて、グルタミン酸を結合しうる入手可能な最小受容体ポリペプチド（１またはそれ以上）を産生させる。こうしてグルタミン酸結合部位を含有するポリペプチドを同定する。そのような実験は、代謝指向型グルタミン酸受容体を発現する安定にトランスフェクションした哺乳動物細胞株（たとえばＨＥＫ  ２９３細胞）の使用によって容易になる。
【０１７８】
あるいは代謝指向型グルタミン酸受容体を化学的に修飾されたグルタミン酸と化学反応させて、選ばれた化合物と接触する（または隣接する）代謝指向型グルタミン酸受容体のアミノ酸残基を修飾し、これにより同定可能にすることができる。次いで、グルタミン酸と相互作用すると判定され、グルタミン酸との結合に十分であるアミノ酸を含有する代謝指向型グルタミン酸受容体のフラグメント（１またはそれ以上）を、標準法により組換え発現させることができる。
【０１７９】
目的とする結合特性をもつ組換えポリペプチド（１またはそれ以上）を、標準的な化学的操作により固相支持体に結合させることができる。次いでこの固相、すなわちアフィニティーマトリックスをグルタミン酸と接触させて、グルタミン酸がカラムに結合しうることを証明し、グルタミン酸を固相から分離しうる条件を確認する。次いで大規模な化合物ライブラリーを用いてこの操作を繰り返し、このアフィニティーマトリックスに結合しうる化合物を判定する。次いで結合した化合物をグルタミン酸と同様な方法で放出させる。他の結合および放出条件を用いて、グルタミン酸の結合に用いたものと異なる条件下で（たとえば特に病的状態で遭遇する生理学的条件をより良く模倣した条件）結合しうる化合物を得ることができる。こうして、グルタミン酸結合部位に結合する化合物を、液体媒質または抽出液中に存在する極めて多数の化合物から選択できる。
【０１８０】
別法においては、キメラ受容体をカラムその他の固相支持体に結合させる。次いで、その受容体上のグルタミン酸結合部位に結合する試薬により競合排除されない化合物を同定できる。それらの化合物は受容体上の別の結合部位を示す。それらの化合物は既知の化合物と構造的に異なる可能性があり、療法薬として有用なアゴニストまたはアンタゴニストの化合物群である可能性がある。
【０１８１】
代謝指向型グルタミン酸受容体活性を調節することにより、代謝指向型グルタミン酸受容体の活性化に際して起こる細胞応答が増大または低下する。代謝指向型グルタミン酸受容体の活性化に対する細胞応答は、活性化される代謝指向型グルタミン酸受容体のタイプに依存する。一般に代謝指向型グルタミン酸受容体の活性化によって下記の１またはそれ以上の活性が生じる；（１）ＰＩ加水分解の増大；（２）ホスホリパーゼＣの活性化；（３）サイクリックアデノシンモノホスフェート（ｃＡＭＰ）の形成の増大および低下;（４）ｃＡＭＰの形成の低下;（５）イオンチャンネル機能の変化；（６）ホスホリパーゼＤの活性化；（７）アデニリルシクラーゼの活性化または阻害；（８）グアニリルシクラーゼの活性化;（９）サイクリックグアノシンモノホスフェート（ｃＧＭＰ）の形成の増大;（１０）ホスホリパーゼＡ2の活性化；（１１）アラキドン酸放出の増大;（１２）電位依存性およびリガンド依存性イオンチャンネルの活性の増大または低下；（１３）ならびに細胞内カルシウムの増加。代謝指向型グルタミン酸受容体の活性化を阻害すると、これらの活性のうち１またはそれ以上の起こるのが阻止される。
【０１８２】
特定の代謝指向型グルタミン酸受容体の活性化とは、それに続いて、活性化された受容体のタイプに付随する１またはそれ以上の活性を生じさせる事象を意味する。ｍＧｌｕＲ１の活性化によって下記の１またはそれ以上の活性が生じる：ＰＩ加水分解の増大、ｃＡＭＰ形成の増大、細胞内カルシウム（Ｃａ2+）の増加、およびアラキドン酸形成の増大。化合物がグルタミン酸結合部位活性化のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用することにより、１またはそれ以上の代謝指向型グルタミン酸受容体活性を調節できる。
【０１８３】
本発明のキメラ受容体は、ＣａＲにより生じるシグナルを検出することによってｍＧｌｕＲにおいて活性である化合物をスクリーニングする方法を提供する。これらのキメラ受容体は国際特許出願第ＵＳ９３／０１６４２号（ＷＯ９４／１８９５９）（これは本明細書に参考として含まれる）に記載のスクリーニング法に利用できる。これらの方法には、ｆｕｒａ−２を用いるスクリーニング法、およびカルシウム受容体を発現する細胞株を用いる細胞質ゾルＣａ2+の測定、および卵母細胞発現を用いるスクリーニング法が含まれる。
【０１８４】
本明細書に記載するスクリーニング法により同定される活性化合物は、代謝指向型グルタミン酸受容体活性を調節するための療法用分子として、または異常な代謝指向型グルタミン酸受容体活性を特色とする疾病を伴う患者を診断するための診断薬として有用である。好ましくは、これらのスクリーニング法を用いて、代謝指向型グルタミン酸受容体をもつ細胞において細胞外グルタミン酸または他の代謝指向型グルタミン酸受容体アゴニストの活性を模倣または遮断する効力につき潜在的に有用な分子をスクリーニングし、そしてその分子が１００μＭ以下のＥＣ50、ＩＣ50をもつか否かを判定することにより、代謝指向型グルタミン酸受容体調節剤を同定する。より好ましくは、それらの分子が細胞外グルタミン酸または他のｍＧｌｕＲアゴニストにより誘発される［Ｃａ2+］の増加を模倣または遮断する効力につき試験する。
【０１８５】
代謝指向型グルタミン酸受容体調節剤の同定は、高処理量スクリーニング系の採用によって促進される。高処理量スクリーニングによれば多数の分子を試験できる。たとえば多数の分子を高速自動化法を採用して個々に、または組合わせライブラリーを用いて一緒に試験できる。組合わせライブラリー中に存在する、代謝指向型グルタミン酸受容体活性を調節しうる個々の化合物は、組合わせライブラリーの画分を精製および再試験することにより得られる。こうして数千個ないし数百万個の分子を一日でスクリーニングできる。活性分子は、同等または増大した活性をもつさらに他の分子を設計するためのモデルとして使用できる。好ましくは同定法には組換えキメラ代謝指向型グルタミン酸受容体を用いる。受容体をコードするベクターを用いて、キメラ受容体を種々の細胞内に導入できる。好ましくは種々の細胞において分子の活性を試験して、第１タイプの代謝指向型グルタミン酸受容体においてはグルタミン酸の１またはそれ以上の活性を模倣または遮断するが、第２タイプの代謝指向型グルタミン酸受容体においてはその活性を模倣または遮断しない、代謝指向型グルタミン酸受容体アゴニスト分子または代謝指向型グルタミン酸受容体アンタゴニスト分子を同定する。
【０１８６】
前記のように本発明は、代謝指向型グルタミン酸受容体の部分およびカルシウム受容体の部分をもつキメラ受容体を用いて代謝指向型グルタミン酸受容体活性を調節する化合物をスクリーニングするための新規方法を提供する。種々の化合物をｍＧｌｕＲ部分への結合につき試験するので、このタイプの具体的な受容体においては、カルシウム受容体部分のシグナル伝達プロセスを利用してｍＧｌｕＲ活性の調節を検出する。このスクリーニング法は多様な様式で、たとえば代謝指向型グルタミン酸受容体およびカルシウム受容体に由来する異なる部分をもつキメラ受容体を用いて実施できる。特定の好ましい例を以下に記載する。
【０１８７】
一例においては、代謝指向型グルタミン酸受容体に結合するかまたはその活性を調節する化合物のスクリーニング法は、細胞外ドメイン、７回貫膜ドメインおよび細胞内細胞質テイルドメインをもつキメラ受容体の調製を伴う。少なくとも６個の連続アミノ酸の配列は代謝指向型グルタミン酸受容体由来の配列と同一または相同であり、かつ少なくとも６個の連続アミノ酸の配列はカルシウム受容体由来の配列と同一または相同である。キメラ受容体および被験化合物を許容しうる媒質に導入し、受容体に対する被験化合物の結合または被験化合物による受容体の調節を、このような結合性または調節性化合物の同定のために、物理的に検出しうる手段でモニターする。許容しうる媒質には、一般にｍＧｌｕＲおよび／またはＣａＲの天然リガンドがその中でｍＧｌｕＲまたはＣａＲと相互作用する媒質が含まれるであろう。
【０１８８】
ｍＧｌｕＲおよびＣａＲのうち一方または両方に由来する、より長い配列をもつキメラ受容体を用いることがしばしば有益であろう。たとえばキメラ受容体は、ｍＧｌｕＲまたはＣａＲのうち一方または両方に由来する配列と同一または相同である、少なくとも１２、１８、２４、３０、３６またはそれ以上のアミノ酸の配列をもつことができる。有用な１キメラ受容体においては、１つのドメインが代謝指向型グルタミン酸受容体の１つのドメインと相同であり、かつ少なくとも１つのドメインがカルシウム受容体の１つのドメインと相同である。
【０１８９】
第２の例において代謝指向型グルタミン酸受容体に結合するかまたはその活性を調節する化合物のスクリーニング法は、キメラ受容体をコードする核酸配列を用いる。その核酸を細胞内で発現させ、細胞に対する被験化合物の作用をモニターすることにより、被験化合物による結合または調節を観察する。したがって一般にこの方法は、キメラ受容体をコードする核酸配列を調製することを含む。コードされるキメラ受容体は細胞外ドメイン、７回貫膜ドメインおよび細胞内細胞質テイルドメインをもつ。上記の例の場合と同様にキメラ受容体は、ｍＧｌｕＲおよびＣａＲそれぞれに由来する配列と同一または相同である少なくとも６個の連続アミノ酸の配列をもつ。同様に上記のように、ｍＧｌｕＲおよびＣａＲのうち一方または両方に由来する配列は、特定の用途においてはより長く、少なくとも１２、１８、２４、３０、３６またはそれ以上のアミノ酸の長さであることが有益であろう。この核酸配列を、宿主細胞において上記キメラ受容体を発現しうる複製可能な発現ベクターに挿入し、宿主細胞をこのベクターで形質転換する。形質転換した宿主細胞および被験化合物を許容しうる媒質に導入し、宿主細胞に対する被験化合物の作用をモニターする（たとえば前記の手法またはアッセイ法により）。宿主細胞は真核細胞であることが好ましいが、必須ではない。
【０１９０】
キメラ受容体のアミノ酸配列は、個々の場合に多様な組合わせで選択できる。たとえばキメラ受容体は代謝指向型グルタミン酸受容体のドメインと相同である少なくとも１つのドメイン、およびカルシウム受容体のドメインと相同である少なくとも１つのドメインを含むことができる。キメラ受容体のドメイン（１またはそれ以上）は、たとえば代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインおよび／または７回貫膜ドメインと相同である。
【０１９１】
同様に３つの細胞質ループをもつキメラ受容体は、ｍＧｌｕＲの細胞質ループと相同である少なくとも１つのループ、またはＣａＲの細胞質ループと相同である少なくとも１つのループ、またはこれらの受容体それぞれの細胞質ループと相同である少なくとも１つのループをもつことができる。
【０１９２】
同様に他のキメラ受容体においては、一方のタイプの受容体（ＣａＲまたはｍＧｌｕＲ）の配列と相同である受容体部分があり、そのキメラ受容体の残りは他方のタイプの受容体（ＣａＲまたはｍＧｌｕＲ）の配列と相同である。たとえばキメラ受容体は、一方の受容体タイプの配列と相同である少なくとも６、１２、１８、２４、３０、３６またはそれ以上の連続アミノ酸の配列をもち、キメラ受容体の残りの配列は他方のタイプの受容体に由来する配列と相同でありうる。これにはさらに、少なくとも１つの細胞質ループがそれらの受容体タイプの一方に由来するか、または少なくとも１つのドメインがそれらの受容体タイプの一方に由来する場合が含まれる。
【０１９３】
特定の用途においては、他の組合わせの配列も有用であろう。
【０１９４】
代謝指向型グルタミン酸受容体およびカルシウム受容体の両方において活性である化合物をスクリーニングするためには、キメラ代謝指向型グルタミン酸受容体／カルシウム受容体も使用できる。これは、ＣａＲ中のものと異なるｍＧｌｕＲ中のドメインまたはサブドメインにおいて相互作用する化合物をスクリーニングするのに特に有用である。そのようなキメラは、たとえば代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメイン内において作用し、かつカルシウム受容体の７回貫膜ドメインまたは細胞質テイルドメイン内においても作用する化合物をスクリーニングするのに特に有用である。そのようなキメラは、カルシウム受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞質テイルに結合した、代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインを含有するであろう。
【０１９５】
代謝指向型グルタミン酸受容体およびカルシウム受容体の両方において活性であるそのような化合物をスクリーニングするためには、化合物を本発明の種々の方法に従ってキメラ受容体、カルシウム受容体および代謝指向型グルタミン酸受容体に対してスクリーニングする。キメラ受容体のカルシウム受容体部分の７回貫膜ドメインにおいて活性である化合物は、カルシウム受容体自身に対して試験した場合にも活性であるはずである。そのような化合物をスクリーニングするための好ましい方法は、それらを本発明方法に従って、まず代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインならびにカルシウム受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞質テイルドメインをもつキメラ分子に対してスクリーニングし、次いで陽性化合物を代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインおよび７回貫膜ドメインおよびカルシウム受容体の細胞質テイルドメインをもつキメラ分子ならびにカルシウム受容体自身との両方に対してスクリーニングすることである。両分子において活性である化合物は、３種類すべてのキメラ受容体に対して試験した場合に陽性であろう。
【０１９６】
逆に、代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞質テイルドメインに結合した、カルシウム受容体の細胞外ドメインを含有するキメラは、カルシウム受容体の細胞外ドメイン内において作用し、かつ代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインまたは細胞質テイル内においても作用する化合物をスクリーニングするのに特に有用である。好ましくは、カルシウム受容体の細胞外ドメインおよび代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞質テイルドメインを含有するキメラ受容体をさらに修飾して、カルシウム受容体の細胞質テイル部分を含有させる。このより好ましい態様は、これによってカルシウム受容体の卓越したシグナル伝達特性を獲得し、一方ではなおカルシウム受容体と代謝指向型グルタミン酸受容体の両方において作用する化合物をスクリーニングするのに有用である。
【０１９７】
したがって１態様においては、本発明はキメラ受容体をコードする核酸配列を調製することにより代謝指向型グルタミン酸受容体とカルシウム受容体の両方において活性である化合物をスクリーニングする方法を特徴とする。このキメラ受容体は細胞外ドメイン、７回貫膜ドメインおよび細胞質テイルドメインをもち、少なくとも１つのドメインは代謝指向型グルタミン酸受容体のドメインと相同であり、かつ少なくとも１つのドメインはカルシウム受容体のドメインと相同である。この核酸配列を、宿主細胞において上記キメラ受容体を発現しうる複製可能な発現ベクターに挿入し、宿主細胞をこのベクターで形質転換する。形質転換した宿主細胞および被験化合物を許容しうる媒質に導入し、細胞に対する被験化合物の作用をモニターする。
【０１９８】
一般にキメラ受容体を用いる上記のスクリーニング法それぞれにつき、個々の用途に適切な結合、調節および／またはシグナル共役特性を与えるように、ｍＧｌｕＲと相同なキメラ受容体部分およびＣａＲと相同な部分を選択する。
【０１９９】
Ｅ．作用部位
キメラ受容体分子は、代謝指向型グルタミン酸受容体またはカルシウム受容体に対して活性な化合物であると既に同定されている化合物の作用部位を決定する方法にも有用である。たとえばカルシウム受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞質テイルに結合した、代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインを含有するキメラ、ならびに代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞質テイルドメインに結合した、カルシウム受容体の細胞外ドメインを含有するキメラは、代謝指向型グルタミン酸受容体またはカルシウム受容体に対して活性な化合物の作用部位を決定する際に有用である。当業者はこれらが大きな配列交換の一例であって、作用部位の決定をより正確にするためにはより小さな配列交換も採用しうることが認識されるであろう。
【０２００】
したがって本発明は、代謝指向型グルタミン酸受容体に対して活性な化合物の作用部位を決定する方法であって、キメラ受容体をコードする核酸配列を調製し、その際キメラ受容体はカルシウム受容体のアミノ酸配列と相同である少なくとも６個のアミノ酸の配列を含み、残りのアミノ酸配列は代謝指向型グルタミン酸受容体のアミノ酸配列と相同であり；この配列を、宿主細胞において前記キメラ受容体を発現しうる複製可能な発現ベクターに挿入し；宿主細胞をこのベクターで形質転換し；形質転換した宿主細胞および前記化合物を許容しうる媒質に導入し；そして細胞に対する該化合物の作用をモニターすることによる方法を提供する。
【０２０１】
スクリーニング法につき前記に示したように、個々の用途においては種々の大きさの配列交換を用いることが有利である。たとえば他の用途においては、カルシウム受容体由来の配列と相同な配列はたとえば少なくとも１２、１８、２４、３０、３６またはそれ以上のアミノ酸の長さであってもよい。
【０２０２】
逆にカルシウム受容体に対して活性な化合物の作用部位を決定する方法は前記と同様な様式で実施され、ただし代謝指向型グルタミン酸受容体のアミノ酸配列と相同である少なくとも６個のアミノ酸の配列を含み、残りのアミノ酸配列はカルシウム受容体のアミノ酸配列と相同であるキメラ受容体をコードする核酸を用いる。また前記方法と同様に、代謝指向型グルタミン酸受容体由来の配列と相同な配列は種々の用途において異なる長さ、たとえば少なくとも１２、１８、２４、３０、３６またはそれ以上のアミノ酸の長さであってもよい。
【０２０３】
Ｆ．代謝指向型グルタミン酸受容体活性の調節
代謝指向型グルタミン酸受容体活性の調節を利用して、種々の作用、たとえば抗けいれん作用、神経保護作用、鎮痛作用、認識増強作用および筋弛緩作用を得ることができる。これらの作用それぞれが療法上利用される。療法用として使用される化合物は療法上有効な投与量では最小の副作用をもつべきである。
【０２０４】
ある化合物が代謝指向型グルタミン酸受容体の活性を調節する効力は、１またはそれ以上の代謝指向型グルタミン酸受容体活性を測定する電気生理学的および生化学的アッセイ法により判定できる。一般にそのようなアッセイは、当該代謝指向型グルタミン酸受容体（１またはそれ以上）を発現する細胞を用いて実施できるが、これらのアッセイはモニターすべき細胞活性を調節する本発明のキメラ受容体を発現する細胞を用いて実施することもできる。そのようなアッセイの例には以下のものが含まれる：クローン化した代謝指向型グルタミン酸受容体を発現するツメガエル卵母細胞における代謝指向型グルタミン酸受容体機能の電気生理学的評価、クローン化した代謝指向型グルタミン酸受容体を発現するトランスフェクション細胞株（たとえばＣＨＯ細胞、ＨＥＫ  ２３９細胞など）における代謝指向型グルタミン酸受容体機能の電気生理学的評価、クローン化した代謝指向型グルタミン酸受容体を発現するトランスフェクション細胞株におけるＰＩ加水分解およびｃＡＭＰ蓄積の生化学的評価、ラット脳（たとえば海馬、皮質、線条体など）切片におけるＰＩ加水分解およびｃＡＭＰ蓄積の生化学的評価、培養したラット小脳顆粒細胞における細胞質ゾルＣａ2+の蛍光測定、ならびにクローン化した代謝指向型グルタミン酸受容体を発現するトランスフェクション細胞株における細胞質ゾルＣａ2+の蛍光測定。
【０２０５】
ヒトにおいて療法用として使用する前に、それらの化合物を動物モデルを用いてインビボで試験することが好ましい。ある化合物が種々の疾患もしくは障害を処置し、または鎮痛作用、認識増強作用もしくは筋弛緩作用などの作用を及ぼす有効性を評価するための動物実験は、標準法により実施できる。
【０２０６】
Ｇ．新規な薬剤および薬剤組成物
本明細書に記載するキメラ受容体およびスクリーニング法は、キメラ代謝指向型グルタミン酸受容体に結合する効力により見出された代謝指向型グルタミン酸受容体結合剤（たとえば化合物および薬剤組成物）を提供する。それらの結合剤は好ましくは代謝指向型グルタミン酸受容体の調節剤である。これらの薬剤のうちあるものは、本明細書に記載したスクリーニング法により同定された新規化合物であろう。さらに、そのような同定された化合物を、同定された活性化合物の類似体に基づくスクリーニングアッセイにおいて、または同定された化合物をリード化合物として用いる医療化学物質開発において、リード化合物として使用すると、そのような同定された化合物から標準法により他のそのような化合物が誘導される。
【０２０７】
さらに、キメラ受容体を用いる新規かつ有効なスクリーニング法を提供することにより、本発明は代謝指向型グルタミン酸受容体において有効な薬剤を製造する方法を提供する。このような有効な方法がなければ、そのような薬剤は同定されない。本方法は、本明細書に記載するタイプのキメラ受容体を前記のスクリーニング法に用いるスクリーニング法によって、有効な薬剤を同定するものである。同定された薬剤またはその薬剤の類似体は、療法上有効な量で患者に投与するのに十分な量で合成される。
【０２０８】
Ｈ．疾患および障害の処置
本発明の化合物および方法の好ましい用途は、神経疾患および神経障害の処置である。神経疾患および神経障害を伴う患者は、標準的な臨床法により診断できる。
【０２０９】
神経疾患および神経障害には、神経変性性疾患、グルタミン酸興奮毒性、全身性および限局性虚血ならびに出血性発作、頭部外傷、脊髄損傷、低酸素誘発性神経細胞傷害、ならびにてんかんが含まれる。これら種々の疾患または障害はさらに医学的に特徴づけることができる。たとえば神経変性性疾患にはアルツハイマー病およびパーキンソン病が含まれる。
【０２１０】
本発明の他の好ましい用途は、他の療法効果、たとえば鎮痛作用、認識増強作用または筋弛緩作用を得ることにある。本発明は、好ましくはそのような処置を必要とする患者においてこれらの作用のうち１またはそれ以上を得るために用いられる。
【０２１１】
そのような処置を必要とする患者は、標準的な臨床法により診断できる。たとえば鎮痛作用の発生を利用して、急性および慢性疼痛の臨床状態を伴う患者を治療でき、これには下記のものが含まれる：予防的術前鎮痛；末梢神経障害、たとえば真性糖尿病および多発性硬化症に伴って起こるもの；幻想肢痛；灼熱痛；神経痛、たとえば帯状疱疹に伴って起こるもの；中枢痛、たとえば脊髄障害に伴って見られるもの；痛覚過敏症；ならびに異痛症。
【０２１２】
患者を処置する方法においては、代謝指向型グルタミン酸受容体の少なくとも１つの細胞外ドメインをもつキメラ受容体の活性をインビトロで調節する化合物を、療法上有効な量で患者に投与する。一般にこの化合物はグルタミン酸結合部位活性化のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用することにより、代謝指向型グルタミン酸受容体活性を調節する。好ましくは患者は神経疾患または神経障害を伴い、好ましくは化合物は生理学的活動に対して効果をもつ。そのような生理学的活動は、けいれん、神経保護、神経の死、神経の発達、心臓活動の中枢制御、覚醒、運動の制御、および前庭性眼球反射であってもよい。
【０２１３】
代謝指向型グルタミン酸受容体活性の調節により処置できる疾患または障害には、下記のうち１またはそれ以上が含まれる：（１）異常なグルタミン酸恒常性を特色とするもの；（２）代謝指向型グルタミン酸受容体活性によりその産生が影響される可能性のある異常な量の細胞外または細胞内メッセンジャーを特色とするもの；（３）それ自体が代謝指向型グルタミン酸受容体活性によって改善される可能性のある細胞内または細胞外メッセンジャーの異常な作用（たとえば種類または程度の異なる作用）を特色とするもの；および（４）代謝指向型グルタミン酸受容体活性の調節が有益な効果を及ぼす他の疾患または障害、たとえば受容体活性によって刺激された細胞内または細胞外メッセンジャーの産生が異常な量の異なるメッセンジャーを補償する疾患または障害。
【０２１４】
本発明の化合物および方法を用いて他の効果、たとえば鎮痛作用、認識増強作用または筋弛緩作用を得ることもできる。
【０２１５】
“患者”とは、代謝指向型グルタミン酸受容体活性の調節が有益な効果をもつ哺乳動物を意味する。代謝指向型グルタミン酸受容体活性の調節を伴う処置を必要とする患者は、医療の専門家に知られている標準的手法で確認できる。好ましくは患者は下記のうち１またはそれ以上を特色とする疾患または障害をもつヒトである：（１）異常なグルタミン酸活性；（２）代謝指向型グルタミン酸受容体活性によりその産生または分泌が影響される異常な量のメッセンジャー；および（３）代謝指向型グルタミン酸受容体活性によりその機能が影響される異常な量または活性のメッセンジャー。
【０２１６】
“療法上有効な量”とは、患者の疾患もしくは障害の１もしくはそれ以上の症状をある程度軽減し、またはその疾患に伴うかもしくはその原因である１もしくはそれ以上の生理学的もしくは生化学的パラメーターを部分的もしくは完全に正常に戻す薬剤の量を意味する。
【０２１７】
より一般的には、本発明は代謝指向型グルタミン酸受容体をもつ細胞に、代謝指向型グルタミン酸受容体におけるグルタミン酸の１もしくはそれ以上の作用を模倣するか、または代謝指向型グルタミン酸受容体におけるグルタミン酸の１もしくはそれ以上の作用を遮断するのに十分な量の代謝指向型グルタミン酸受容体調節分子を付与することにより、代謝指向型グルタミン酸受容体活性を調節する方法を提供する。この方法はインビトロまたはインビボで実施できる。
【０２１８】
Ｉ．配合物および投与
本発明方法により同定された活性化合物は、前記の種々の疾患および障害を処置するための薬剤または薬剤組成物として利用できる。これに関して薬剤または薬剤組成物とは、哺乳動物、好ましくはヒトに投与するのに適した形の薬剤または組成物を意味する。
【０２１９】
本発明の化合物を患者に投与するのに適した配合物および様式は、当技術分野で既知の要因、たとえば個々の疾患または障害、目的とする効果、および患者のタイプに依存する。本化合物は一般にヒトの患者を処置するために用いられるが、他の脊椎動物、たとえば他の霊長類、農場動物、たとえばブタ、ウシおよびニワトリ、ならびにスポーツ動物およびペット、たとえばウマ、イヌおよびネコにおける類似または同じ疾患の処置にも使用できる。
【０２２０】
好ましくは療法上有効な量を薬剤組成物として付与する。薬剤または薬剤組成物とは、多細胞生物、たとえばヒトに投与するのに適した形の薬剤または組成物を意味する。好適な剤形は、一部は用途または投与経路、たとえば経口、経皮または注射に依存する。そのような剤形は、標的細胞が多細胞宿主中または培養物中のいずれにあっても、薬剤または組成物を標的細胞に到達させるものでなければならない。たとえば血流中に注射される薬剤または薬剤組成物は可溶性でなければならない。他の要因は当技術分野で既知であり、これには毒性、および薬剤または薬剤組成物がその効果を発揮するのを阻止する剤形などの考慮事項が含まれる。
【０２２１】
本発明組成物は、その薬剤学的に許容しうる塩類（たとえば酸付加塩）および／または複合体としても配合できる。薬剤学的に許容しうる塩類は、それらを投与する濃度で無毒の塩類である。そのような塩類の製剤は、組成物がその生理学的効果を発揮するのを阻止することなく組成物の物理化学的特性を変化させることにより、薬剤としての使用を容易にする。物理的特性の有用な変化の例には、経粘膜投与を容易にするための融点降下、および高濃度の薬物の投与を容易にするための溶解度の増大が含まれる。
【０２２２】
薬物学的に許容しうる塩類には、酸付加塩、たとえば硫酸塩、塩酸塩、リン酸塩、スルファミン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、シクロヘキシルスルファミン酸塩およびキニン酸塩が含まれる（たとえば前掲の国際特許出願第ＵＳ９２／０３７３６号を参照されたい）。薬剤学的に許容しうる塩類は、酸、たとえば塩酸、硫酸、リン酸、スルファミン酸、酢酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、マロン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクロヘキシルスルファミン酸およびキニン酸から得られる。
【０２２３】
薬物学的に許容しうる塩類は標準的技術で調製できる。たとえば遊離塩基形の化合物を、適切な酸を含有する好適な溶剤、たとえば水性または水性アルコール溶液に溶解し、次いで溶液の蒸発により単離する。他の例においては、塩類は遊離塩基と酸を有機溶剤中で反応させることにより調製される。
【０２２４】
化合物の投与を容易にするためにキャリヤーまたは賦形剤を用いることもできる。キャリヤーおよび賦形剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖類、たとえば乳糖、グルコースもしくはスクロース、または種々のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、および生理学的に適合する溶剤が含まれる。組成物、すなわち薬物組成物は、静脈内、腹腔内、皮下、および筋肉内、経口、局所または経粘膜を含めた種々の経路で投与できる。
【０２２５】
本発明化合物は、全身および局所または限局投与を含めた多様な投与様式のために配合できる。方法および配合物は、一般にＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版、マック・パブリシング社、ペンシルベニア州イーストン、中に見られる。
【０２２６】
全身投与のためには経口投与が好ましい。経口投与のためには本化合物を一般的な経口投与剤形、たとえばカプセル剤、錠剤およびトニック剤中に配合する。
【０２２７】
あるいはたとえば筋肉内、静脈内、腹腔内、皮下、くも膜下または脳室内への注射を採用できる。注射のためには本発明化合物を溶液、好ましくは生理学的に適合する緩衝液、たとえばハンクス液またはリンガー液中に配合する。あるいは本発明化合物を、米国局方基準により規定されるように安全であるとして一般に受け入れられている１またはそれ以上の賦形剤（たとえばプロピレングリコール）中に配合する。さらに、本化合物を固体剤形中に配合し、使用直前に溶解または懸濁してもよい。凍結乾燥した形のものも含まれる。
【０２２８】
全身投与は経粘膜もしくは経皮によってもよく、または前記の分子を経口投与してもよい。経粘膜または経皮投与のためには、浸透すべきバリヤーに適切な浸透剤を配合物中に用いる。そのような浸透剤は一般に当技術分野で既知であり、たとえば経粘膜投与のためには胆汁酸およびフシジン酸の誘導体が含まれる。さらに、浸透を促進するために界面活性剤を用いてもよい。経粘膜投与はたとえば鼻内噴霧により、または坐剤を用いて行うことができる。経口投与のためには、前記の分子を一般的な経口投与剤形、たとえばカプセル剤、錠剤および液体製剤中に配合する。
【０２２９】
局所投与のためには、一般に当技術分野で知られているように本発明化合物を軟膏剤、膏薬、ゲル剤またはクリーム剤中に配合する。
【０２３０】
種々の化合物の投与量は標準法により決定できる。一般に療法上有効な量は、そのＥＣ50またはＩＣ50、ならびに患者の年齢および体格、ならびに患者に付随する疾患または障害に応じて、約１ｎｍｏｌ〜３μｍｏｌの分子、好ましくは０．１ｎｍｏｌ〜１μｍｏｌである。一般にそれは約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ（処置すべき動物の体重）である。
【０２３１】
Ｊ．トランスジェニック動物
本発明は、キメラ受容体、特にキメラ代謝指向型グルタミン酸受容体をコードするトランスジーンを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物をも提供する。トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、キメラ受容体導入の効果を研究するためのインビボ試験系として特に有用である。実験モデル系を用いて、細胞培養もしくは組織培養における、全動物体における、または全動物体もしくは組織培養系内の特定の細胞もしくは組織における作用を研究できる。これらの作用を一定の期間にわたって研究できる（胚形成期間を含む）。
【０２３２】
本発明は、前記受容体の生理学的作用を研究するための実験モデル系を提供する。種々の受容体発現度をもつモデル系を作成できる。たとえば受容体をコードする核酸を、天然に母体受容体を発現する細胞内へ挿入し、これによりキメラ遺伝子をはるかに高いレベルで発現させることができる。また組換え遺伝子を用いて相同組換えにより内因性遺伝子を不活性化し、これにより受容体欠損性の細胞、組織または動物を形成できる。
【０２３３】
遺伝子の不活性化は、たとえば挿入変異を含むように工学的に処理した組換え遺伝子（たとえばｎｅｏ遺伝子）を用いて行うことができる。この組換え遺伝子をレシピエント細胞、組織または動物のゲノムに挿入し、受容体の転写を不活性化する。そのような構築体を、トランスフェクション、形質導入および注入などの方法で細胞、たとえば胚幹細胞に導入できる。無傷の受容体配列を欠如する幹細胞からは、受容体を欠損するトランスジェニック動物が形成されるであろう。
【０２３４】
好ましい試験モデルはトランスジェニック動物である。トランスジェニック動物は、細胞に人為的に挿入され、そしてその細胞から発生する動物のゲノムに挿入されたＤＮＡを含有する細胞をもつ。好ましいトランスジェニック動物は、霊長類、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌおよびネコである。
【０２３５】
トランスジェニック動物を得るためには多様な方法がある。たとえばＤＮＡを雌雄の前核が融合する前に妊娠卵の前核に注入するか、または細胞分裂開始後に胚細胞（たとえば２細胞胚の核）に注入できる（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ ａｌ.,Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４４３８−４４４２，１９８５）。他の例では、本発明のキメラ受容体ヌクレオチド配列を運搬するように改変されたウイルス、特にレトロウイルスを胚に感染させることができる。
【０２３６】
胚の内細胞材料に由来する、培養において安定化した多能性幹細胞を、本発明のヌクレオチド配列を取り込むように培養において操作できる。そのような幹細胞から、胚盤胞に移植し、これを養母に移植して分娩させることにより、トランスジェニック動物を形成できる。トランスジェニック実験に適した動物は標準的な業者、たとえばチャールズ・リバー（マサチュセッツ州ウィルミントン）、タコニック（ニューヨーク州ジャーマンタウン）およびハーラン・スプラーグ・ドーレイ（インディアナ州インディアナポリス）から入手できる。
【０２３７】
胚細胞（ＥＳ）を培養し、次いでエレクトロポレーション、リン酸カルシウム／ＤＮＡ沈殿、および直接注入などの方法でＥＳ細胞にＤＮＡを導入することによりトランスジェニック動物を形成する方法も、当業者に周知である。たとえばＴｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編，ＩＲＬプレス（１９８７）を参照されたい。
【０２３８】
胚の操作方法は当技術分野で周知である。げっ歯類の胚の操作方法およびＤＮＡを接合体の前核にマイクロインジェクションする方法が当業者に周知である（Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，前掲）。魚類、両生類の卵、および鳥類へのマイクロインジェクション法はＨｏｕｄｅｂｉｎｅ  ａｎｄ  Ｃｈｏｕｒｒｏｕｔ（Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ  ４７：８９７−９０５，１９９１）に詳述されている。ＤＮＡを動物組織に導入するための他の方法が米国特許第４，９４５，０５０号（Ｓａｎｄｆｏｒｄら，１９９０年７月３０日）に記載されている。
【０２３９】
トランスフェクションおよび目的クローンの単離は標準法により実施できる（たとえばＥ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，前掲）。たとえばランダムな遺伝子組込みは、抗生物質耐性をコードする遺伝子と共に核酸をトランスフェクションすることにより実施できる。あるいはたとえば抗生物質耐性をコードする遺伝子を、本発明のキメラ受容体をコードする核酸配列に物理的に結合させる。
【０２４０】
ＥＳに導入されたＤＮＡ分子を相同組換え法により染色体に組み込むこともできる（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８８−１２９２，１９８９）。組換え事象の正の選択（たとえばネオマイシン耐性）および二重−正負選択（たとえばネオマイシン耐性とガンシクロビル耐性）、ならびにその後のＰＣＲによる目的クローン同定のための方法については、Ｃａｐｅｃｃｈｉ（前掲）およびＪｏｙｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：１５３−１５６，１９８９）により記載されており、それらの教示が本明細書に含まれる。
【０２４１】
操作の最終段階は標的ＥＳ細胞を胚盤胞に注入し、その胚盤胞を偽妊娠雌に移植することである。得られたキメラ動物を繁殖させ、子孫をサザンブロット法により分析して、トランスジーンを保有する個体を確認する。
【０２４２】
トランスジェニック動物の形成方法を記載した例は、以下のとおりである。雌マウスを過剰排卵誘発し、雄と交尾させる。交配した雌をＣＯ2窒息または頸椎脱臼法により屠殺し、切除した卵管から胚を回収する。周囲の卵丘細胞を除去する。次いで前核胚を洗浄し、注入時まで保存する。
【０２４３】
精管切除した雄とつがいにしたランダムな周期の雌マウス成体を、移植胚のレシピエントとして用いる。レシピエント雌をドナー雌と同時に交配させ、胚を外科手術によりレシピエント雌へ移植する。
【０２４４】
トランスジェニックラットの形成法はマウスのものと同様である。Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６３：１０９９−１１１２，１９９０を参照されたい。トランスジェニック非げっ歯類哺乳動物および他の動物の形成法は当技術分野で既知である。たとえばＨｏｕｄｅｂｉｎｅ  ａｎｄ  Ｃｈｏｕｒｒｏｕｔ（前掲）；Ｐｕｒｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８１−１２８８，１９８９；およびＳｉｍｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１７９−１８３，１９８８を参照されたい。
【０２４５】
Ｋ．トランスフェクション細胞株
機能性キメラ受容体を発現する核酸を用いて、特異的キメラ受容体を機能的に発現するトランスフェクション細胞株を形成できる。そのような細胞株は多様な用途をもち、たとえば代謝指向型グルタミン酸受容体活性を調節しうる分子の高処理量スクリーニングに用いられ；また代謝指向型グルタミン酸受容体への結合をアッセイするために用いられる。
【０２４６】
多様な細胞株が、内因性機能応答に外因性発現受容体を共役させることができる。多数のこれらの細胞株（たとえばＮＩＨ−３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＮＧ１１５、ＣＨＯ、ＨＥＫ  ２９３およびＣＯＳ７）を試験して、それらが内因性代謝指向型グルタミン酸を欠如することを確認できる。外因性グルタミン酸に対する応答を欠如する系を用いて、本発明のクローン化キメラ受容体を発現する安定にトランスフェクションした細胞株を樹立できる。
【０２４７】
これらの安定なトランスフェクション体の調製は、キメラ代謝指向型グルタミン酸受容体ｃＤＮＡをコードする配列を多重クローン部位にクローン化した真核細胞発現ベクター、たとえばＰＭＳＧで、適切な細胞株をトランスフェクションすることにより達成される。これらの発現ベクターは、多様な哺乳動物細胞においてｃＤＮＡの高レベル転写を駆動するプロモーター領域、たとえばマウス乳房腫瘍ウイルスプロモーター（ＭＭＴＶ）を含む。さらに、これらのベクターは当該ｃＤＮＡを安定に発現する細胞を選択するための遺伝子を含む。ＰＭＳＧベクター中の選択性マーカーは、非トランスフェクション細胞を死滅させるために培養に添加される代謝阻害薬に対する抵抗性を与える酵素、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）をコードする。高処理量スクリーニングアッセイに用いる代謝指向型グルタミン酸受容体発現細胞株の調製に最適な条件を決定するために、通常は多様な発現ベクターおよび選択方式が評価される。
【０２４８】
プラスミドＤＮＡを含む真核細胞株のトランスフェクションに最も有効な方法は、その細胞株に応じて異なる。キメラ受容体発現構築体を、Ｃａ2+ホスフェート沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションなどの適切な方法で、培養細胞内へ導入する。
【０２４９】
トランスフェクションＤＮＡを安定に取り込んだ、またはエピソーム保持している細胞は、前記のように選択培地に対するそれらの耐性により確認され、そして耐性コロニーの拡大によりクローン細胞株が得られる。これらの細胞株によるキメラ代謝指向型グルタミン酸受容体ｃＤＮＡの発現を、溶液ハイブリダイゼーションおよびノーザンブロット分析により評価する。この受容体蛋白質の機能性発現は、外部から付与されたカルシウム受容体アゴニストに応答した細胞内Ｃａ2+の移動を測定することにより判定される。
以下の実施例は本発明を説明するものであって、その範囲を限定するものではない。
【０２５０】
ＩＩＩ．実施例
本発明の種々の観点および態様を説明するために以下の実施例を提示する。これらの実施例は本明細書に開示する発明を限定するものではなく、本発明の新規なキメラ受容体を構築する方法を説明するものである。それらの実施例はまた、どの化合物が目的のｍＧｌｕＲを結合または調節するかをスクリーニングする方法を説明する。
【０２５１】
実施例１：  ｐｈＰＣａＲ４．０およびｐｍＧｌｕＲ１
プラスミドｐｈＰＣａＲ４．０（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：１２９１９，１９９５、本明細書に参考として含まれる）を、アンピシリン１００ｕｇ／ｍｌ（ベーリンガー・マンハイム）を含有する栄養ブロス中で増殖した、上記プラスミドを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞から単離した。このプラスミドＤＮＡを、ヒトカルシウム受容体をコードするＤＮＡ源として用い、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（ストラタジーン）のＥｃｏＲＩ部位にＴ７配向でクローン化した。制限酵素および修飾酵素は、別途明記しない限りすべてニュー・イングランド・バイオラボズから購入された。
【０２５２】
市販のラット嗅球ｃＤＮＡライブラリー（ストラタジーン）のオリゴヌクレオチドスクリーニングにより得たラットｍＧｌｕＲ１の２つのオーバーラップサブクローンから、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ中でプラスミドｐ７−３／６Ａを組み立てた。このプラスミドＤＮＡを代謝指向型グルタミン酸受容体ｍＧｌｕＲ１源として用いた。またそれを用いて、市販のヒト小脳ｃＤＮＡライブラリーをヒト類似体につきスクリーニングした。ヒト小脳ライブラリーを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１章，１９８９、に記載の方法により、放射性標識ラットｍＧｌｕＲ１でスクリーニングした。陽性プラークを製造業者のプロトコールにより採取し、制限酵素地図を作成して、それらを公開されたヒトｍＧｌｕＲ１配列（欧州特許出願公開第０  ５６９  ２４０Ａ１および０  ５６８  ３８４Ａ１号）と対比した。２つのサブクローンを組み立てて、完全なヒトｍＧｌｕＲ１を形成した。
【０２５３】
あるいはヒトｍＧｌｕＲ１の配列は欧州特許出願公開第０  ５６９  ２４０Ａ１および０  ５６８  ３８４Ａ１号により得られる。この配列を用いて調製したプローブを用いてヒトｃＤＮＡライブラリーを探査し、全長ヒトクローンを得ることができる。さらに、当該配列は本明細書に記載の配列を用いて合成できる。
【０２５４】
実施例２：  ｐｍＧｌｕＲ１／ＣａＲ
組換えＰＣＲおよび多工程クローニング法によりキメラ受容体を構築した。組換えＰＣＲの概説はＨｉｇｕｃｈｉ，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９０）、アカデミック・プレス社、により提示される。第１構築体においては、組換えＰＣＲを用いてｍＧｌｕＲ１とＣａＲの配列を細胞外ドメインと貫膜ドメインの接合部で結合した。この第１キメラｐＲ１／ＣａＲは、ｍＧｌｕＲ１の細胞外ドメイン、ならびにカルシウム受容体の貫膜領域および細胞内領域を含んでいた。キメラ接合部は３回の別個のＰＣＲ反応により形成された。第１反応はラットｍＧｌｕＲ１に特異的な２つのプライマー、すなわちヌクレオチド１１４６〜１１６７をコードする２２ｍｅｒであるＡ４、ならびにｍＧｌｕＲ１の２２塩基（ヌクレオチド−１７５５〜−１７７６）およびＣａＲ由来の２１塩基（ヌクレオチド−１８３７〜−１８５７）を含む４３ｍｅｒであるアンチセンスプライマーｏｌｉｇｏＢを用いた。これらのプライマーを用いてラットｍＧｌｕＲ１の６５０ｂｐフラグメントを増幅させた。別個のＰＣＲ反応において、ＣａＲの５００ｂｐフラグメントを、ハイブリッドプライマーＣ、すなわちｏｌｉｇｏＢの相補体である４３ｍｅｒ、およびＤ４、すなわちＣａＲのヌクレオチド−２２５６〜−２２７９に対応するアンチセンスプライマーにより増幅させた。これら２回のＰＣＲ生成物をアガロースゲルから精製し、等モル比で外部プライマーＡ４およびＤ４ならびにプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼＰｆｕ（ストラタジーン）の存在下にアニールした。この１，１００ｂｐキメラＰＣＲ生成物をＮｓｉ  Ｉで消化し、ＥｃｏＲＶおよびＮｓｉ Ｉで消化したｐｈＣａｒ４.０中へサブクローニングした。得られたサブクローンを次いでＸｈｏ  ＩおよびＳｆｉ  Ｉで消化してＣａＲの細胞外ドメインを除去し、これをラットｍＧｌｕＲ１のＸｈｏ  Ｉ−Ｓｆｉ  Ｉフラグメントで置換した。得られたキメラｐＲ１／Ｃａｒを、制限酵素地図作成およびシーケナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）バージョン２．０（ＵＳバイオケミカル）による二本鎖ＤＮＡ配列決定により証明した。ｐＲ１／ＣａｒのＤＮＡ配列および対応するアミノ酸配列を図２に示す。
【０２５５】
実施例３：  ｐＣａＲ／Ｒ１
第２構築体ｐＣａＲ／Ｒ１は、ＣａＲの細胞外ドメインならびにｍＧｌｕＲ１の貫膜領域および細胞内領域をコードするという点で、実施例２に記載したキメラの逆であった。キメラ接合部は前記に従って組換えＰＣＲにより形成された。第１反応はＣａＲに特異的な２つのプライマー、すなわちヌクレオチド８６２〜８８３に対応する２２ｍｅｒであるＣＲＳｆ１、ならびにＣａＲに対応する１８塩基（ヌクレオチド−１７７７〜−１７９４）およびｍＧｌｕＲ１由来の１８塩基（ヌクレオチド−２１１０〜−２１２７）を含む３６ｍｅｒであるアンチセンスプライマーＣＲ１７９４を用いた。これらのプライマーを用いてＣａＲの９３５ｂｐフラグメントを増幅させた。別個のＰＣＲ反応において、ｍＧｌｕＲ１の３６０ｂｐフラグメントを、ハイブリッドプライマーＲ１２１１０、すなわちｍＧｌｕＲ１の１８塩基（ヌクレオチド２１１０〜２１２７）に共有結合したＣａＲの１８塩基（ヌクレオチド１７７７〜１７９４）を含む３６ｍｅｒ、およびＲ１Ｂｇｌ、すなわちｍＧｌｕＲ１のヌクレオチド−２４５１〜−２４７０に対応するアンチセンスプライマーにより増幅させた。これら２回のＰＣＲ生成物をアガロースゲルから精製し、等モル比で外部プライマーＣＲＳｆ１およびＲ１ＢｇｌならびにプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼＰｆｕ（ストラタジーン）の存在下にアニールした。この１，２５０ｂｐキメラＰＣＲ生成物をＳｆｉ  ＩおよびＢｇｌ  ＩＩで消化し、同一酵素で消化したｐ７／３Ａ中へサブクローニングした。サブクローンを次いでＳａｌ  ＩおよびＳｆｉ  Ｉで消化してｍＧｌｕＲ１の細胞外ドメインを除去し、次いでＣａＲのＳａｌ  Ｉ−Ｓｆｉ  Ｉフラグメントで置換した。得られたキメラｐＣａＲ／Ｒ１を、制限酵素地図作成およびシーケナーゼ、バージョン２．０（ＵＳバイオケミカル）による二本鎖ＤＮＡ配列決定により証明した。ｐＣａＲ／Ｒ１のＤＮＡ配列および対応するアミノ酸配列を図３に示す。
【０２５６】
実施例４：  ｐｒａｔＣＨ３およびｐｈＣＨ４
これらのキメラは、ＣａＲの細胞質テイルをラットまたはヒトｍＧｌｕＲ１の細胞外ドメインおよび貫膜ドメインにスワッピングした結果である。組換えＰＣＲを用いてＣａＲのＣ−末端テイルをヒトｍＧｌｕＲ１（ラットｍＧｌｕＲ１シグナル配列をコードする）のヌクレオチド２５３５の後に結合させた。第１ＰＣＲ反応はヒトｍＧｌｕＲ１に特異的な２つのプライマー、すなわちヌクレオチド２２４２〜２２６５に対応する２４ｍｅｒであるＭ−１ｒｅｖ、ならびにｈｍＧｌｕＲ１の１８塩基（ヌクレオチド−２５１８〜−２５３５）およびＣａＲの１８塩基（ヌクレオチド−２６０２〜−２６１９）を含む３６ｍｅｒであるアンチセンスプライマーＣＨ３Ｒ１を用いた。これらのプライマーを用いてｈｍＧｌｕＲ１の３００ｂｐフラグメントを増幅させた。別個のＰＣＲ反応において、ＣａＲの７５０ｂｐフラグメントを、ハイブリッドプライマーＣＨ３ＣａＲ、すなわちｏｌｉｇｏ  ＣＨ３Ｒ１の相補体である３６ｍｅｒ、およびＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターにおいてＣａＲの３’末端から下流の領域で開始する市販のＴ３プライマー（ストラタジーン）により増幅させた。これら２回のＰＣＲ生成物をアガロースゲルから精製し、等モル比で外部プライマーＭ−１  ｒｅｖおよびＴ３ならびにプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼＰｆｕ（ストラタジーン）の存在下にアニールした。この１ｋｂキメラＰＣＲ生成物をＮｈｅ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉで消化し、同一酵素で消化したｐｈｍＧｌｕＲ１中へサブクローニングした。得られたキメラｐｈＣＨ４を、制限酵素地図作成および二本鎖ＤＮＡ配列決定により証明した。このクローンを用いた卵母細胞における機能活性を検出するためには、ラットｍＧｌｕＲ１由来の５’側非翻訳領域およびシグナル配列をこのヒトクローンの同一領域と交換する必要があった。これはＢｓｕ３６Ｉ制限部位を用いて行われた。さらに、ラットｍＧｌｕＲ１のＡｃｃ  ＩフラグメントをｐｈＣＨ４内へサブクローニングして、この同一キメラのラット型を形成した。このキメラをｒａｔＣＨ３と呼ぶ。ｐｒａｔＣｈ３のＤＮＡ配列および対応するアミノ酸配列を図４に示す。ｐｈＣＨ４４のＤＮＡ配列および対応するアミノ酸配列を図５に示す。
【０２５７】
したがって上記の各実施例に記載した方法で、他のｍＧｌｕＲ／ＣａＲキメラを構築し、評価し、かつスクリーニングできる。この例においてはグループＩの代謝指向型グルタミン酸受容体を採用した。これはカルシウム受容体と同様にホスホリパーゼＣの活性化および細胞内カルシウム移動に共役し、Ｃ−末端テイルのスワッピングにより第２メッセンジャー系の一体性を維持した。さらに、ＣａＲテイルをｍＧｌｕＲ１に付加した場合、脱感作特性が失われた。これは、細胞内ドメインのスワッピングにより代謝指向型グルタミン酸受容体の特異的なＧ蛋白質共役をＣａＲのものに変更しうることを証明する。たとえばグループＩＩのｍＧｌｕＲ、たとえばＧi共役するｍＧｌｕＲ２またはｍＧｌｕＲ３をＧｑ共役受容体に変更できる。これは、実施例２、３および４に記載のプロトコールによりこれらの受容体上へＣａＲのＣ−末端細胞質ゾルテイルを交換することによって実施できる。有効なＧｑ共役は、実施例５および６の記載に従って卵母細胞において評価できる。グループＩＩをＬ−ＣＣＧ−Ｉ（それらの最も有効なアゴニスト）により活性化すると、細胞内Ｃａ2+の移動が誘発され、これにより電位固定卵母細胞において検出可能な内向きの調整Ｃｌ-電流が測定されるであろう。
【０２５８】
Ｇ蛋白質結合の有効性を高めるために、ＣａＲの細胞内（細胞質）ループをさらに１またはそれ以上、ｍＧｌｕＲ１上へスワッピングするのが有用であろう。そのような置換は、たとえばカルシウム受容体の細胞内ループ１、細胞内ループ２および細胞内ループ３のいずれかを単独で、または任意のループの組合わせで行うことができる。そのようなサブドメインのスワッピングはＧ蛋白質結合特異性を最も効果的に伝達するのに必要であろう。
【０２５９】
実施例５：  ＲＮＡのインビトロ転写
実施例１〜４に記載した受容体をコードするＲＮＡ転写体を、ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ(商標、アンビオン）と共に供給されるＴ７ポリメラーゼにより、プラスミド鋳型からの酵素転写によって調製した。それぞれのプラスミドを制限酵素で処理して、ｃＤＮＡ挿入配列の３’末端に対して遠位で１回切断を行い、鋳型を直線化した。このＤＮＡをＴ７  ＲＮＡポリメラーゼと共に、ＧｐｐｐＧキャップヌクレオチド、ｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＵＴＰおよびｒＧＴＰの存在下でインキュベートした。この合成ＲＮＡ転写体を反応混合物のＤＮａｓｅ処理およびそれに続くアルコール沈殿により精製した。吸光分光法（ＯＤ260）によりＲＮＡを定量し、エチジウム染色した１．２％ホルムアルデヒドゲル上で視覚化した。
【０２６０】
実施例６：  卵母細胞における機能性発現
注入用の卵母細胞を、雌アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）成体から、Ｃ．Ｊ．Ｍａｒｃｕｓ−ＳｅｋｕｒａおよびＭ．Ｊ．Ｍ．Ｈｉｔｃｈｃｏｃｋ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２（１９８７）に記載の方法で得た。１．５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼタイプＩＡ（ワーシントン）を含有する無Ｃａ2+−変更バース塩類溶液（ＭＢＳ）中で、卵巣葉片を３０分間インキュベートした。次いで実施例５に従って調製した５ｎｇのＲＮＡ転写体を各卵母細胞に注入した。注入後に、０．５ｍＭ  ＣａＣｌ2を含有するＭＢＳ中で１６℃において２〜７日間、卵母細胞をインキュベートしたのち、電気生理学的に検査した。
【０２６１】
グルタミン酸およびカルシウム受容体アゴニストに応答した卵母細胞膜を横切る電流伝達電極の電位記録により、各キメラ受容体が機能する効力を測定した。アキソクランプ（Ａｘｏｃｌａｍｐ）２Ａ増幅器（アキソン・インスツルメンツ、カリフォルニア州フォスター・シティー）を用いて標準２電極電位固定法により、卵母細胞を−６０ｍＶの保持電位に電位固定した。電流をチャート記録計で記録した。標準対照塩類溶液は０．３ｍＭ  ＣａＣｌ2および０．８  ＭｇＣｌ2を含有するＭＢＳであった。被験物質を約５ｍｌ／分の流量で流すことにより供給した。実験はすべて室温で行われた。保持電流はその卵母細胞において安定であり、異なる卵母細胞につき＋１０から−２００ｎＡまで変化した。受容体の活性化に応答したＩClの活性化、およびそれに続く細胞内Ｃａ2+（［Ｃａ］in）を、−６０ｍＶにおける保持電流に対比した、アゴニスト、すなわち薬物により刺激された内向きピーク電流の測定により定量した。
図６  ｐＲ１／ＣａＲ対ラットｍＧｌｕＲ１(グルタミン酸およびキスカル酸)
図７  ＣａＲ／Ｒ１対ｈＰＣａｒ（カルシウム）
図８  ｐｒａｔＣＨ３対ラットｍＧｌｕＲ１およびＣａＲ（脱感作トレース）
【０２６２】
実施例７：  ｐＣａＲ／Ｒ１由来のｐＣＥＰＣａＲ／Ｒ１の構築
プラスミドｐＣａＲ／Ｒ１由来のＤＮＡを制限酵素Ｋｐｎ ＩおよびＮｏｔ Ｉで消化し、市販のエピソーム哺乳動物発現ベクターｐＣＥＰ４（インビトロゲン）中へクローン化した。このリゲーション生成物を、ＤＮＡ形質転換受容性にしたＤＨ５ａ細胞内へトランスフェクションした。これらの細胞を、アンピシリン１００ｕｇ／ｍｌを含有するルリア−ベルタニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ，ＬＢ）プレート（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９８９に記載）内で平板培養した。増殖したコロニーからクローンを選択した。このクローンｐＣＥＰＣａＲ／Ｒ１を制限酵素消化により解明した。
【０２６３】
実施例８：  ＨＥＫ２９３／ｐＣＥＰＣａＲ／Ｒ１のトランスフェクションおよび増殖
ヒト胚腎細胞（２９３，ＡＴＣＣ，ＣＲＬ  １５７３）をルーティン様式で増殖させた。細胞を１０ｃｍの細胞培養プレート内で、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および１×ペニシリン−ストレプトマイシン（ＰＳ、ライフ・テクノロジーズ）を含有するダルベッコの変更イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）中において平板培養すると、一夜のインキュベーション後に約７０％集密となった。ＤＮＡをトランスフェクション用に調製するために、プラスミドｐＣＥＰＣａＲ／Ｒ１をエタノールで沈殿させ、すすぎ、そして１ｕｇ／ｕｌの濃度で無菌水に再懸濁した。１４μｇのＤＮＡをリポソーム配合物ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標、ライフ・テクノロジーズ）と共に２０分間、無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標、ライフ・テクノロジーズ）中でインキュベートした。室温でインキュベートしたのち、６．８ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭをトランスフェクション配合物に添加した。この溶液を、予め無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ洗浄溶液５ｍｌで２回すすいだ細胞に添加した。細胞およびトランスフェクション配合物を３７℃で５時間インキュベートし、この時点で培地およびウシ胎児血清を追加して血清濃度を１０％にした。一夜のインキュベーション後に、培地を１０％ＦＣＳおよび１×ＰＳを含有するＤ−ＭＥＭに戻した。さらに２４時間のインキュベーション後に細胞をトリプシンで脱離させ、ハイグロマイシン(ベーリンガー・マンハイム)２００ｕｇ／ｍｌを含有する培地（ベーリンガー・マンハイム）中で再び平板培養した。増殖した細胞はハイグロマイシン耐性遺伝子をコードするｐＣＥＰＣａＲ／Ｒ１を含んでいた。個々のクローンを回収し、標準組織培養法により増殖させた。新鮮な組織培養培地中へ解離させ、新たな培養皿に最初の容量の１／１０で接種することにより、個々のクローンおよびプールした安定な細胞の両方の継代培養物を調製した。
【０２６４】
実施例９：  ＨＥＫ２９３／ｐＣＥＰＣａＲ／Ｒ１のＦｕｒａアッセイ
細胞外カルシウムの増加に応答した細胞内カルシウム放出の測定を、Ｆｕｒａアッセイ法（Ｐａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）により定量する。ｐＣＥＰＣａＲ／Ｒ１を含む安定にトランスフェクションした細胞に、１.２５ｍＭ ＣａＣｌ2、１ｍｇ／ｍｌグルコース、０．５％ＢＳＡ1を含有するＳＰＦ−ＰＣＢ（１２６ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）中で３７℃において２０〜３０分間のインキュベーションにより、２μＭのｆｕｒａ−２アセトキシメチルエステルを負荷する。次いで０．５ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．５％ＢＳＡを含有するＳＰＦ−ＰＣＢ中で細胞を１〜２回洗浄し、密度４〜５００万個／ｍｌとなるように再懸濁し、プラスチックビーカー内に２２℃で保存する。蛍光信号を記録するために、石英キュベット内へＢＳＡを含有しない３７℃のＳＰＦ−ＰＣＢで細胞を５倍希釈して、最終ＢＳＡ濃度０．１％を得る（ＢＳＡを含有しない３７℃のＳＰＦ−ＰＣＢ  １．２ｍｌ＋細胞懸濁液０．３ｍｌ）。蛍光の測定は、３７℃で常に撹拌しながら、注文製造した分光光度計（バイオメディカル・インスツルメンテーション・グループ、ペンシルベニア大学）を用いて行う。励起および発光波長はそれぞれ３４０および５１０ｎｍである。蛍光信号を検量するために、ジギトニン（シグマ、ミズーリ州セントルイス；カタログ＃Ｄ  ５６２８；５０μｇ／ｍｌ、最終）を添加してＦmaxを得る。見掛けのＦminをＥＧＴＡ（１０ｍＭ、最終）およびトリス塩基（ｐＨ約１０、最終）の添加により測定する。２２４ｎＭの解離定数（Ｋｄ）および下記の方程式を用いて、放出された細胞内Ｃａ2+の濃度を計算する：
［Ｃａ2+］i  ＝  （Ｆ−Ｆmin／Ｆmax−Ｆ）×Ｋｄ
結果を図９にグラフで示す。
【０２６５】
実施例１０：  組換え受容体結合アッセイ
下記は代謝指向型グルタミン酸受容体活性を調節する化合物の迅速スクリーニングアッセイ法の一例である。このスクリーニングアッセイ法では、まず化合物が組換えキメラ受容体、またはｍＧｌｕＲ、ＣａＲもしくはキメラ受容体の受容体フラグメントに結合する効力を測定する。次いで、それらの受容体またはフラグメントに結合する化合物を、それらが代謝指向型グルタミン酸受容体における１またはそれ以上の活性を調節する効力につき試験する。
【０２６６】
１方法においては、代謝指向型グルタミン酸受容体をコードするｃＤＮＡまたは遺伝子クローンを得る。そのクローンの別個のフラグメントを適切な発現ベクター内で発現させて、グルタミン酸に結合しうる可能な最小の受容体ポリペプチド（１またはそれ以上）を産生させる。このような実験は、代謝指向型グルタミン酸受容体を発現する安定にトランスフェクションした哺乳動物細胞株(たとえばＨＥＫ ２９３細胞）を用いることによって容易になる。
【０２６７】
目的とする結合特性を備えた組換えポリペプチド（１またはそれ以上）を、標準的な化学的方法で固相支持体に結合させることができる。この固相、すなわちアフィニティーマトリックスを、次いでグルタミン酸と接触させて、グルタミン酸がカラムに結合することを証明し、またグルタミン酸が固相から分離しうる条件を確認できる。次いで大規模な化合物ライブラリーを用いてこの方法を繰り返し、このアフィニティーマトリックスに結合しうる化合物を判定できる。次いで、結合した化合物をグルタミン酸と同様な様式で放出させることができる。他の結合および放出条件を用いて、グルタミン酸の結合に用いたものと異なる条件下で（たとえば特に病的状態で遭遇する生理学的条件をより良く模倣した条件）結合しうる化合物を得ることができる。こうしてｍＧｌｕＲに結合する化合物を、液体培地または抽出液中に存在する極めて多数の化合物から選択できる。
【０２６８】
他の方法においては、キメラ代謝指向型グルタミン酸／カルシウム受容体をカラムその他の固相支持体に結合させる。次いで、その受容体上のグルタミン酸結合部位に結合する試薬により競合排除されない化合物を同定できる。それらの化合物は受容体上の他の結合部位を規定する。それらの化合物は既知の化合物と構造的に異なる可能性があり、療法薬として有用なアゴニストまたはアンタゴニストの化合物群を示す可能性がある。
【０２６９】
本発明の種々の態様は以下のとおりである。
（１）キメラ受容体を含む組成物であって、
前記キメラ受容体は細胞外ドメイン、７回貫膜ドメイン、および細胞内細胞質テイルドメインを含み、
ここで、少なくとも６個の連続するアミノ酸の配列は代謝指向型グルタミン酸受容体の配列に相同であり、かつ少なくとも６個の連続するアミノ酸の配列はカルシウム受容体の配列に相同であることを特徴とする組成物。
（２）前記細胞外ドメイン、前記７回貫膜ドメイン、および前記細胞内細胞質テイルドメインの少なくとも１つのドメインが代謝指向型グルタミン酸受容体のドメインに相同である、および／または、少なくとも１つのドメインがカルシウム受容体のドメインに相同である、上記組成物。
（３）前記細胞外ドメイン、前記７回貫膜ドメイン、および前記細胞内細胞質テイルドメインの少なくとも１つのドメインが代謝指向型グルタミン酸受容体のドメインに相同であり、かつ
少なくとも１つのドメインがカルシウム受容体のドメインに相同である、上記組成物。
（４）前記キメラ受容体が、
カルシウム受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、
代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、および
代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメイン
を含む、上記組成物。
（５）前記キメラ受容体が、
カルシウム受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、
カルシウム受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、および
代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメイン
を含む、上記組成物。
（６）前記キメラ受容体が、
代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、
カルシウム受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、および
代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメイン
を含む、上記組成物。
（７）前記キメラ受容体が、
代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、
代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、および
カルシウム受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメイン
を含む、上記組成物。
（８）前記キメラ受容体が、
代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、
カルシウム受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、および
カルシウム受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメイン
を含む、上記組成物。
（９）前記キメラ受容体が、
カルシウム受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、
代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、および
カルシウム受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメイン
を含む、上記組成物。
（１０）前記キメラ受容体が、
代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、
代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、ただし前記７回貫膜ドメインはカルシウム受容体の少なくとも１つの細胞質ループを含み、および
カルシウム受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメイン
を含む、上記組成物。
（１１）前記７回貫膜ドメインの少なくとも１つの細胞質ループが代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞質ループに相同である、上記組成物。
（１２）前記７回貫膜ドメインの少なくとも１つの細胞質ループがカルシウム受容体の細胞質ループに相同である、上記組成物。
（１３）前記キメラ受容体の少なくとも６個の連続するアミノ酸配列がカルシウム受容体のアミノ酸の配列に相同であり、かつ前記キメラ受容体の残りのアミノ酸配列が代謝指向型グルタミン酸受容体のアミノ酸の配列に相同である、上記組成物。
（１４）前記キメラ受容体の少なくとも６個の連続するアミノ酸配列が代謝指向型グルタミン酸受容体のアミノ酸の配列に相同であり、かつ前記キメラ受容体の残りのアミノ酸の配列がカルシウム受容体のアミノ酸の配列に相同である、上記組成物。
（１５）キメラ受容体をコードする、濃縮された、精製された、または単離された核酸分子を含む組成物であって、
前記キメラ受容体は細胞外ドメイン、７回貫膜ドメイン、および細胞内細胞質テイルドメインを含み、
ここで、少なくとも６個の連続するアミノ酸の配列は代謝指向型グルタミン酸受容体の配列に相同であり、かつ少なくとも６個の連続するアミノ酸の配列はカルシウム受容体の配列に相同であることを特徴とする組成物。
（１６）前記キメラ受容体が、
カルシウム受容体のドメインに相同である少なくとも１つのドメイン、および
代謝指向型グルタミン酸受容体のドメインに相同である少なくとも１つのドメイン
を含む、上記組成物。
（１７）前記キメラ受容体が、
代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、
カルシウム受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、および
代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメイン
を含む、上記の組成物。
（１８）前記キメラ受容体が、
代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、
代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、および
カルシウム受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメイン
を含む、上記組成物。
（１９）前記キメラ受容体が、
代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、
カルシウム受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、および
カルシウム受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメイン
を含む、上記組成物。
（２０）前記キメラ受容体が、
代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、
代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、ただし前記７回貫膜ドメインはカルシウム受容体の少なくとも１つの細胞質ループを含み、および
カルシウム受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメイン
を含む、上記組成物。
（２１）上記キメラ受容体をコードする核酸を含む組成物。
（２２）上記キメラ受容体をコードする核酸を含む組成物。
（２３）上記キメラ受容体をコードする核酸分子を含む、複製可能な発現ベクター。
（２４）上記ベクターにより形質転換された組換え宿主細胞。
（２５）キメラ受容体を製造する方法であって、上記発現ベクターで形質転換されたまたはトランスフェクトされた原核生物または真核生物宿主細胞を、適切な栄養状態下で、前記キメラ受容体の発現を可能にする様式で増殖させることを含む方法。
（２６）代謝指向型グルタミン酸受容体に結合するかまたはその活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）細胞外ドメイン、７回貫膜ドメイン、および細胞内細胞質テイルドメインを含むキメラ受容体を調製し、ここで、少なくとも１つのドメインは代謝指向型グルタミン酸受容体のドメインに相同であり、かつ少なくとも１つのドメインはカルシウム受容体のドメインに相同であり、
ｂ）前記キメラ受容体および前記化合物を許容可能な媒質中に導入し、そして
ｃ）物理学的に検出可能な手段により結合または調節をモニターし、このことにより、前記代謝指向型グルタミン酸受容体に結合するかまたはその活性を調節する化合物を同定する；
の各工程を含む方法。
（２７）前記キメラ受容体の前記細胞外ドメインが代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同である、上記方法。
（２８）前記キメラ受容体が、
代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、
カルシウム受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、および
代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメイン
を含む、上記方法。
（２９）前記キメラ受容体が、
代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、
代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、および
カルシウム受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメイン
を含む、上記方法。
（３０）前記キメラ受容体が、
代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、
カルシウム受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、および
カルシウム受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメイン
を含む、上記方法。
（３１）前記キメラ受容体が、
代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、
代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、ただし、前記７回貫膜ドメインはカルシウム受容体の少なくとも１つの細胞質ループを含み、および
カルシウム受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメイン
を含む、上記方法。
（３２）代謝指向型グルタミン酸受容体に結合するかまたはその活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）細胞外ドメイン、７回貫膜ドメイン、および細胞内細胞質テイルドメインを含むキメラ受容体をコードする核酸配列を調製し、ここで該キメラ受容体はカルシウム受容体のアミノ酸の配列に相同である少なくとも６個の連続するアミノ酸の配列、および代謝指向型グルタミン酸受容体のアミノ酸の配列に相同である少なくとも６個の連続するアミノ酸の配列を含み、
ｂ）該配列を宿主細胞中で前記キメラ受容体を発現しうる複製可能な発現ベクター中に挿入し、
ｃ）宿主細胞を（ｂ）のベクターで形質転換し、
ｄ）前記形質転換された宿主細胞および前記化合物を許容可能な媒質中に導入し、そして
ｅ）前記化合物の前記宿主細胞に及ぼす影響をモニターする；
の各工程を含む方法。
（３３）前記キメラ受容体が、代謝指向型グルタミン酸受容体のドメインに相同である少なくとも１つのドメイン、および／または、カルシウム受容体のドメインに相同である少なくとも１つのドメインを含む、上記方法。
（３４）前記キメラ受容体が、代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同である細胞外ドメインを含む、上記方法。
（３５）前記キメラ受容体が、
代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、
カルシウム受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、および
代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメイン
を含む、上記方法。
（３６）前記キメラ受容体が、
代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、
代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、および
カルシウム受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメイン
を含む、上記方法。
（３７）前記キメラ受容体が、
代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、
カルシウム受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、および
カルシウム受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメイン
を含む、上記方法。
（３８）前記キメラ受容体が、
代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに相同であるドメイン、
代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインに相同であるドメイン、ただし、前記７回貫膜ドメインはカルシウム受容体の少なくとも１つの細胞質ループを含み、および
カルシウム受容体の細胞内細胞質テイルドメインに相同であるドメイン
を含む、上記方法。
（３９）前記キメラ受容体が代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインに相同である７回貫膜ドメインを含む、上記方法。
（４０）前記７回貫膜ドメインの少なくとも１つの細胞質ループがカルシウム受容体の細胞質ループに相同である、上記方法。
（４１）前記キメラ受容体の残りの配列が代謝指向型グルタミン酸受容体の配列に相同である、上記方法。
（４２）前記キメラ受容体がカルシウム受容体のアミノ酸の配列に相同である少なくとも６個の連続するアミノ酸の配列を含み、かつ前記キメラ受容体の残りのアミノ酸配列が代謝指向型グルタミン酸受容体のアミノ酸の配列に相同である、上記方法。
（４３）前記７回貫膜ドメインの少なくとも１つの細胞質ループが代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞質ループに相同である、上記方法。
（４４）前記宿主細胞が真核生物細胞である、上記方法。
（４５）代謝指向型グルタミン酸受容体またはカルシウム受容体に結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）受容体のフラグメントをコードする核酸配列を調製し、
ｂ）前記配列を、宿主細胞中で前記フラグメントを発現しうる複製可能な発現ベクター中に挿入し、
ｃ）宿主細胞を（ｂ）のベクターで形質転換し、
ｄ）前記宿主細胞からフラグメントを回収し、
ｅ）前記フラグメントおよび前記化合物を許容可能な媒質中に導入し、そして
ｆ）化合物のフラグメントへの結合を物理学的に検出可能な手段によりモニターする；
の各工程を含む方法。
（４６）前記受容体が代謝指向型グルタミン酸受容体である、上記方法。
（４７）前記フラグメントが前記代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインを含む、上記方法。
（４８）前記フラグメントが前記代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインを含む、上記方法。
（４９）前記フラグメントが代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞質テイルドメインを含む、上記方法。
（５０）前記受容体がカルシウム受容体である、上記方法。
（５１）前記フラグメントが前記カルシウム受容体の細胞外ドメインを含む、上記方法。
（５２）前記フラグメントが前記カルシウム受容体の７回貫膜ドメインを含む、上記方法。
（５３）前記フラグメントが前記カルシウム受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞質テイルドメインを含む、上記方法。
（５４）代謝指向型グルタミン酸受容体またはカルシウム受容体に結合するかまたはそれを調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）受容体のフラグメントをコードする核酸配列を調製し、
ｂ）前記配列を宿主細胞中において前記フラグメントを発現しうる複製可能な発現ベクター中に挿入し、
ｃ）宿主細胞を（ｂ）のベクターで形質転換し、
ｄ）前記形質転換された宿主細胞および前記化合物を許容可能な媒質中に導入し、そして
ｅ）前記化合物の前記宿主細胞に及ぼす影響をモニターする；
の各工程を含む方法。
（５５）前記フラグメントが代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞質テイルドメインを含む、上記方法。
（５６）前記フラグメントがカルシウム受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞質テイルドメインを含む、上記方法。
（５７）受容体に結合するかこれを調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）第１の受容体のフラグメントを含む第１のフラグメントをコードする核酸配列を調製し、
ｂ）該配列を宿主細胞中で前記第１のフラグメントを発現しうる複製可能な発現ベクター中に挿入し、
ｃ）宿主細胞を（ｂ）のベクターで形質転換し、
ｄ）第１のフラグメントを宿主細胞から回収し、
ｅ）第２の受容体のフラグメントを含む第２のフラグメントをコードする核酸配列を調製し、
ｆ）（ｅ）の配列を宿主細胞中で前記第２のフラグメントを発現しうる複製可能な発現ベクター中に挿入し、
ｇ）宿主細胞を（ｆ）のベクターで形質転換し、
ｈ）第２のフラグメントを（ｇ）の宿主細胞から回収し、
ｉ）前記第１のフラグメントおよび前記第２のフラグメントおよび前記化合物を許容可能な媒質中に導入し、そして
ｊ）化合物の結合および／または調節を物理学的に検出可能な手段によりモニターする；
の各工程を含む方法。
（５８）前記第１のフラグメントが代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインを含み、かつ
前記第２のフラグメントがカルシウム受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞質テイルドメインを含む、上記方法。
（５９）前記第１のフラグメントが代謝指向型グルタミン酸受容体の細胞外ドメインおよび７回貫膜ドメインを含み、かつ
前記第２のフラグメントがカルシウム受容体の細胞質テイルドメインを含む、上記方法。
（６０）前記第１のフラグメントがカルシウム受容体の細胞外ドメインを含み、かつ
前記第２のフラグメントが代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインおよび細胞質テイルドメインを含む、上記方法。
（６１）前記第１のフラグメントがカルシウム受容体の細胞外ドメインを含み、かつ
前記第２のフラグメントが代謝指向型グルタミン酸受容体の７回貫膜ドメインおよびカルシウム受容体の細胞質テイルドメインを含む、上記方法。
（６２）代謝指向型グルタミン酸受容体およびカルシウム受容体の両方の活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）キメラ受容体をコードする核酸配列を調製し、ここで該キメラ受容体は細胞外ドメイン、７回貫膜ドメイン、および細胞内細胞質テイルドメインを含み、ここで少なくとも１つのドメインは代謝指向型グルタミン酸受容体のドメインに相同であり、かつ少なくとも１つのドメインはカルシウム受容体のドメインに相同であり、
ｂ）該配列を宿主細胞中で前記キメラ受容体を発現しうる複製可能な発現ベクター中に挿入し、
ｃ）宿主細胞を（ｂ）のベクターで形質転換し、
ｄ）前記形質転換した宿主細胞および前記化合物を許容可能な媒質中に導入し、そして
ｅ）前記化合物の前記細胞に及ぼす影響をモニターする；
の各工程を含む方法。
（６３）代謝指向型グルタミン酸受容体活性化合物の作用部位を決定する方法であって、
ａ）キメラ受容体をコードする核酸配列を調製し、ここで該キメラ受容体はカルシウム受容体のアミノ酸の配列に相同である少なくとも６アミノ酸配列を含み、かつ残りのアミノ酸配列は代謝指向型グルタミン酸受容体のアミノ酸の配列に相同であり、
ｂ）該配列を宿主細胞中で前記キメラ受容体を発現しうる複製可能な発現ベクター中に挿入し、
ｃ）宿主細胞を（ｂ）のベクターで形質転換し、
ｄ）前記形質転換した宿主細胞および前記化合物を許容可能な媒質中に導入し、そして
ｅ）前記化合物の前記細胞に及ぼす影響をモニターする；
の各工程を含む方法。
（６４）カルシウム受容体活性化合物の作用部位を決定する方法であって、
ａ）キメラ受容体をコードする核酸配列を調製し、ここで該キメラ受容体は代謝指向型グルタミン酸受容体のアミノ酸の配列に相同である少なくとも６アミノ酸配列を含み、かつ残りのアミノ酸配列はカルシウム受容体のアミノ酸の配列に相同であり、
ｂ）該配列を宿主細胞中で前記キメラ受容体を発現しうる複製可能な発現ベクター中に挿入し、
ｃ）宿主細胞を（ｂ）のベクターで形質転換し、
ｄ）前記形質転換した宿主細胞および前記化合物を許容可能な媒質中に導入し、そして
ｅ）前記化合物の前記細胞に及ぼす影響をモニターする；
の各工程を含む方法。
【図面の簡単な説明】
【０２７０】
【図１】図１は、本明細書に記載される様々なキメラの概略図であり、それらキメラの細胞外ドメイン、７回貫膜ドメイン、および細胞内細胞質テイルドメインを示す。
【図２ａ】図２ａは、実施例２に記載されるｐｍＧｌｕＲ１／ＣａＲのヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列の図である。
【図２ｂ】図２ｂは、実施例２に記載されるｐｍＧｌｕＲ１／ＣａＲのヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列の図である。
【図２ｃ】図２ｃは、実施例２に記載されるｐｍＧｌｕＲ１／ＣａＲのヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列の図である。
【図２ｄ】図２ｄは、実施例２に記載されるｐｍＧｌｕＲ１／ＣａＲのヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列の図である。
【図２ｅ】図２ｅは、実施例２に記載されるｐｍＧｌｕＲ１／ＣａＲのヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列の図である。
【図２ｆ】図２ｆは、実施例２に記載されるｐｍＧｌｕＲ１／ＣａＲのヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列の図である。
【図２ｇ】図２ｇは、実施例２に記載されるｐｍＧｌｕＲ１／ＣａＲのヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列の図である。
【図２ｈ】図２ｈは、実施例２に記載されるｐｍＧｌｕＲ１／ＣａＲのヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列の図である。
【図３ａ】図３ａは、実施例３に記載されるｐＣａＲ／Ｒ1のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列の図である。
【図３ｂ】図３ｂは、実施例３に記載されるｐＣａＲ／Ｒ1のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列の図である。
【図３ｃ】図３ｃは、実施例３に記載されるｐＣａＲ／Ｒ1のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列の図である。
【図３ｄ】図３ｄは、実施例３に記載されるｐＣａＲ／Ｒ1のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列の図である。
【図３ｅ】図３ｅは、実施例３に記載されるｐＣａＲ／Ｒ1のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列の図である。
【図３ｆ】図３ｆは、実施例３に記載されるｐＣａＲ／Ｒ1のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列の図である。
【図３ｇ】図３ｇは、実施例３に記載されるｐＣａＲ／Ｒ1のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列の図である。
【図３ｈ】図３ｈは、実施例３に記載されるｐＣａＲ／Ｒ1のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列の図である。
【図４ａ】図４ａは、実施例４に記載されるｐａｒｔＣＨ３のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列の図である。
【図４ｂ】図４ｂは、実施例４に記載されるｐａｒｔＣＨ３のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列の図である。
【図４ｃ】図４ｃは、実施例４に記載されるｐａｒｔＣＨ３のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列の図である。
【図４ｄ】図４ｄは、実施例４に記載されるｐａｒｔＣＨ３のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列の図である。
【図４ｅ】図４ｅは、実施例４に記載されるｐａｒｔＣＨ３のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列の図である。
【図４ｆ】図４ｆは、実施例４に記載されるｐａｒｔＣＨ３のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列の図である。
【図４ｇ】図４ｇは、実施例４に記載されるｐａｒｔＣＨ３のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列の図である。
【図５ａ】図５ａは、実施例４に記載されるｐｈＣＨ４のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列の図である。
【図５ｂ】図５ｂは、実施例４に記載されるｐｈＣＨ４のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列の図である。
【図５ｃ】図５ｃは、実施例４に記載されるｐｈＣＨ４のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列の図である。
【図５ｄ】図５ｄは、実施例４に記載されるｐｈＣＨ４のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列の図である。
【図５ｅ】図５ｅは、実施例４に記載されるｐｈＣＨ４のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列の図である。
【図５ｆ】図５ｆは、実施例４に記載されるｐｈＣＨ４のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列の図である。
【図５ｇ】図５ｇは、実施例４に記載されるｐｈＣＨ４のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列の図である。
【図６】図６は、卵母細胞内の細胞内Ｃａ2+の放出に応答して生じるＣｌ-電流により測定される、ｍＧｌｕＲ１のアゴニストであるキスカル酸およびＬ−グルタミン酸によるｍＧｌｕＲ１／ＣａＲの活性化を示すグラフ表示である。
【図７】図７は、細胞外カルシウムを増加させることによるＣａＲおよびＣａＲ／Ｒ１キメラの活性化のグラフ表示である。応答振幅（細胞内Ｃａ2+の増加に応答するＣｌ-電流）が示される。このデータは、ＣａＲ／Ｒ１がＣａＲに類似する様式で細胞外Ｃａ2+により活性化されることを示す。
【図８】図８は、細胞外グルタミン酸が、ａ）ｒａｔｍＧｌｕＲ１  ＲＮＡ、およびｂ）ｒａｔＣＨ３  ＲＮＡを注射したゼノパス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞内のＣｌ-電流のオシログラフ上での増加を誘発することを示すグラフ表示である。しかしながら、卵母細胞を繰り返しアゴニストに供するとラットｍＧｌｕＲ１受容体は脱感作を生じ、そして細胞内Ｃａ2+の放出を活性化しなくなる。ラットＣＨ３はＣａＲの細胞質テイルをコードするが、これは天然のラットｍＧｌｕＲ１のようには脱感作せず、そしてそのため化合物での反復攻撃誘発に適用しうる。
【図９】図９は、ｆｕｒａ−２を負荷した安定にトランスフェクションした、ｐＣＥＰＣａＲ／Ｒ１を発現するＨＥＫ２９３細胞内での細胞外カルシウムにより誘導される細胞内カルシウムの増加を示すグラフ表示である。
【図１】
2007006893.tif 000003
【図２ａ】
2007006893.tif 000004
【図２ｂ】
2007006893.tif 000005
【図２ｃ】
2007006893.tif 000006
【図２ｄ】
2007006893.tif 000007
【図２ｅ】
2007006893.tif 000008
【図２ｆ】
2007006893.tif 000009
【図２ｇ】
2007006893.tif 000010
【図２ｈ】
2007006893.tif 000011
【図３ａ】
2007006893.tif 000012
【図３ｂ】
2007006893.tif 000013
【図３ｃ】
2007006893.tif 000014
【図３ｄ】
2007006893.tif 000015
【図３ｅ】
2007006893.tif 000016
【図３ｆ】
2007006893.tif 000017
【図３ｇ】
2007006893.tif 000018
【図３ｈ】
2007006893.tif 000019
【図４ａ】
2007006893.tif 000020
【図４ｂ】
2007006893.tif 000021
【図４ｃ】
2007006893.tif 000022
【図４ｄ】
2007006893.tif 000023
【図４ｅ】
2007006893.tif 000024
【図４ｆ】
2007006893.tif 000025
【図４ｇ】
2007006893.tif 000026
【図５ａ】
2007006893.tif 000027
【図５ｂ】
2007006893.tif 000028
【図５ｃ】
2007006893.tif 000029
【図５ｄ】
2007006893.tif 000030
【図５ｅ】
2007006893.tif 000031
【図５ｆ】
2007006893.tif 000032
【図５ｇ】
2007006893.tif 000033
【図６】
2007006893.tif 000034
【図７】
2007006893.tif 000035
【図８】
2007006893.tif 000036
【図９】
2007006893.tif 000037