(57)【要約】【課題】新規のヒダントイナーゼを提供する。また、当該ヒダントイナーゼ及びそれらを用いた光学活性な５−置換ヒダントイン及び光学活性なＮ−カルバモイル−アミノ酸の製造方法を提供する。【解決手段】バチルス・エスピー（Bacillus sp.）ＫＮＫ２４５株由来のヒダントイナーゼのアミノ酸配列を１又は２箇所置換した変異型ヒダントイナーゼ、当該変異型ヒダントイナーゼをコードする遺伝子、当該遺伝子を含む組換えプラスミド、および当該変異型ヒダントイナーゼ遺伝子を導入された形質転換体。および上記形質転換体を培養し当該変異型ヒダントイナーゼを採取する、変異型ヒダントイナーゼの製造方法。ラセミ体５−置換ヒダントイン又はラセミ体Ｎ−カルバモイル−アミノ酸に作用させることによる、光学活性な５−置換ヒダントイン及び光学活性なＮ−カルバモイル−アミノ酸の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は、（ｂ）のポリペプチド：
（ａ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１５２残基目のアラニン以外の１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
以下の（ｃ）又は、（ｄ）のポリペプチド：
（ｃ）配列表配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｄ）配列表配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１５２残基目のアラニン及び１５９残基目のアラニン以外の１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項４】
以下の（ｅ）又は（ｆ）のＤＮＡ：
（ｅ）配列表配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｆ）配列表配列番号３に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／又は付加された塩基配列を有し、かつそのコードするポリペプチドの１５２番目の残基がアラニンであり、さらにヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項５】
以下の（ｇ）又は（ｈ）のＤＮＡ：
（ｇ）配列表配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｈ）配列表配列番号４に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／又は付加された塩基配列を有し、かつそのコードするポリペプチドの１５２番目及び１５９番目の残基が共にアラニンであり、さらにヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項６】
請求項４又は５に記載のＤＮＡをベクターに挿入して得られる組換えプラスミド。
【請求項７】
前記ベクターがｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＳＴＶ２８、ｐＳＴＶ２９、ｐＳＣ１０１、ｐＴ７Ｂｌｕｅ、又はｐＵＣＮＴ、若しくはそれらの誘導体である請求項７記載の組換えプラスミド。
【請求項８】
前記組換えプラスミドがｐＴＨ１０４Ｍ２、又はｐＴＨ１０４Ｍ４である請求項６又は７に記載の組換えプラスミド。
【請求項９】
請求項６から８のいずれか１項に記載の組換えプラスミドで宿主微生物を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項１０】
前記宿主微生物がエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）である請求項９に記載の形質転換体。
【請求項１１】
前記形質転換体がエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＴＨ１０４Ｍ２）、又はエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＴＨ１０４Ｍ４）である請求項１０に記載の形質転換体。
【請求項１２】
請求項１又は２に記載されているポリペプチドを生産する能力を有する微生物を培養し、培養物中に当該ポリペプチドを蓄積させ、これを採取することを特徴とするヒダントイナーゼの製造方法。
【請求項１３】
前記微生物が、請求項９から１１のいずれか１項に記載の形質転換体である、請求項１２に記載のヒダントイナーゼの製造方法。
【請求項１４】
請求項１又は２に記載のポリペプチド、又は請求項９から１１いずれか１項に記載の形質転換体を、５−置換ヒダントインに作用させ、光学活性な５−置換ヒダントイン及び／又は光学活性なＮ−カルバモイルアミノ酸を製造する方法。
【請求項１５】
請求項１又は２に記載のポリペプチド、又は請求項９から１１いずれか１項に記載の形質転換体を、Ｎ−カルバモイル−アミノ酸に作用させ、光学活性な５−置換ヒダントイン及び／又は光学活性なＮ−カルバモイルアミノ酸を製造する方法。
【請求項１６】
二価の金属イオンの存在下で反応を行なうことを特徴とする請求項１４又は１５に記載の製造方法。
【請求項１７】
二価の金属イオンがマンガンイオン、コバルトイオン、又はニッケルイオンである請求項１６に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の生産する新規なヒダントイナーゼ、これをコードするＤＮＡ、及びヒダントイナーゼを生産する能力を有する形質転換体を用いた光学活性アミノ酸誘導体の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
光学活性なＮ−カルバモイルアミノ酸及び光学活性な５−置換ヒダントインは、対応する光学活性なアミノ酸に容易に変換できる化合物であり、また、光学活性なアミノ酸は医薬品等の合成中間体として有用な化合物である。光学活性なＮ−カルバモイルアミノ酸の製造方法としては、微生物が生産する酵素をラセミ体の５−置換ヒダントインに作用させることにより、立体選択的に加水分解して対応するＮ−カルバモイル−Ｄ−アミノ酸に変換する方法が一般に知られている（特許文献１、２、３）。また、ラセミ体Ｎ−カルバモイルアミノ酸に微生物が生産する酵素を作用させて環化し、光学活性な５−置換ヒダントインを製造する方法も知られている（特許文献４及び５）。
【０００３】
一方、ヒダントイナーゼは、上記のような５−置換ヒダントインを加水分解してＮ−カルバモイルアミノ酸を生成する活性を有する酵素である。本酵素は、一般に、加水分解反応の逆反応として、Ｎ−カルバモイルアミノ酸を環化して５−置換ヒダントインを生成することが知られている。
【０００４】
また、ヒダントイナーゼをコードする遺伝子を導入することにより、ヒダントイナーゼ活性を有する形質転換体を製造する技術としては、高温菌由来のヒダントイナーゼ遺伝子を用いた例（特許文献６）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属に属する微生物由来のヒダントイナーゼ遺伝子を用いた例（特許文献７）、バチルス(Bacillus)属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、及びシュードモナス（Pseudomonas）属に属する微生物由来のヒダントイナーゼ遺伝子を用いた例（特許文献８）等が知られている。
【０００５】
一般に、上記の微生物または形質転換体等によって生産されるヒダントイナーゼの加水分解活性、あるいは環化活性は、基質となる５−置換ヒダントイン、あるいはＮ−カルバモイルアミノ酸の置換基によって異なることが知られている。
【０００６】
また、５−（ｐ−ヒドロキシフェニル）ヒダントイン等のように５位の置換基として芳香環を有するヒダントインに対する加水分解活性が、５位が無置換のヒダントインを基質とした場合と比べて低い、バチルス(Bacillus)属由来のヒダントイナーゼのアミノ酸配列のうち、１もしくは数個のアミノ酸を置換した変異型酵素を作成することにより、上記のような５位の置換基として芳香環を有するヒダントインに対する加水分解活性を向上させた例も知られている（非特許文献１）。
【０００７】
しかし、５位の置換基として芳香環を有するヒダントインに対する加水分解活性が、５位が無置換のヒダントインを基質とした場合と同様に高いヒダントイナーゼの活性を、さらに向上させた例、あるいは非常に嵩高い置換基を有する５−置換ヒダントイン、Ｎ−カルバモイルアミノ酸に対する活性を向上させた例については知られていない。
【特許文献１】特開昭５３−９１１８９号
【特許文献２】特開昭５３−４４６９０号
【特許文献３】特開昭５３−１３３６８８号
【特許文献４】特開昭６０−１８０５９６
【特許文献５】特開平１−１２４３９８
【特許文献６】特開昭６２−８７０８９号
【特許文献７】国際公開第ＷＯ９４／００５７７号公報
【特許文献８】国際公開第ＷＯ９６／２０２７５号公報
【非特許文献１】ヨン−フー・チェオン(Young-Hoon Cheon)ら、「基質特異性調整のための、(β/α)8バレル構造タンパク質であるＤ−ヒダントイナーゼの活性部位ループの改変」 (Manipulation of the active site loops of D-hydantoinase, a(β/α)8-barrel protein,for modulation of the substrate specificity),バイオケミストリー（Biochemistry）,２００４年, ４３巻, ７４１３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的の一つは、嵩高い置換基を有する５−置換ヒダントイン又はＮ−カルバモイルアミノ酸に対して高い活性を示す新規なヒダントイナーゼを提供することにある。また、本発明の目的の一つは、当該ヒダントイナーゼを生産する能力を有する微生物あるいは形質転換体、及びそれらを用いた当該ヒダントイナーゼの製造方法を提供することにある。さらに本発明の目的の一つは、当該ヒダントイナーゼを利用した効率的な光学活性アミノ酸誘導体の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題に鑑み、バチルス・エスピー（Bacillus sp.）ＫＮＫ２４５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６３）（国際公開第ＷＯ９６／２０２７５号公報参照）由来のヒダントイナーゼの立体構造モデルをもとに、アミノ酸配列のうち１又は２個のアミノ酸を置換することにより、嵩高い置換基を有する５−置換ヒダントイン又はＮ−カルバモイルアミノ酸に対して結合しやすくなるような変異型酵素を設計した。そして、嵩高い置換基を有するＮ−カルバモイルアミノ酸に対する当該変異型酵素の環化活性が、野生型の酵素に比べて向上していることを見出した。なお、野生型の酵素は、５位の置換基として芳香環を有するヒダントインを基質とした場合、５位が無置換のヒダントインを基質とした場合共に高い加水分解活性を示すヒダントイナーゼである。
【００１０】
さらに、当該変異型ヒダントイナーゼ遺伝子の宿主微生物での発現を達成し、高活性な形質転換体を育種した。本発明で得られた変異型酵素、当該変異型酵素を生産する形質転換体を５−置換ヒダントイン又はＮ−カルバモイルアミノ酸に作用させることにより、光学活性なＮ−カルバモイルアミノ酸及び光学活性な５−置換ヒダントインを効率的に製造することが可能となり、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は、以下の１または複数の特徴を有する。
１）本発明の一つの特徴は、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドである：
（ａ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１５２残基目のアラニン以外の１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチド。
２）本発明の一つの特徴は、以下の（ｃ）又は（ｄ）のポリペプチドである：
（ｃ）配列表配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｄ）配列表配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１５２残基目のアラニン及び１５９残基目のアラニン以外の１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチド。
４）本発明の一つの特徴は、以下の（ｅ）又は（ｆ）のＤＮＡである：
（ｅ）配列表配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｆ）配列表配列番号３に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／又は付加された塩基配列を有し、かつそのコードするポリペプチドの１５２番目の残基がアラニンであり、さらにヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
５）本発明の一つの特徴は、以下の（ｇ）又は（ｈ）のＤＮＡである：
（ｇ）配列表配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｈ）配列表配列番号４に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／又は付加された塩基配列を有し、かつそのコードするポリペプチドの１５２番目及び１５９番目の残基が共にアラニンであり、さらにヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
６）本発明の一つの特徴は、前記ＤＮＡを含む組換えプラスミドである。
９）本発明の一つの特徴は、前記組換えプラスミドで宿主微生物を形質転換して得られる形質転換体である。
１２）本発明の一つの特徴は、前記ポリペプチドを生産する能力を有する微生物を培養し、培養物中に当該ポリペプチドを蓄積させ、これを採取することを特徴とするヒダントイナーゼの製造方法である。
１４）本発明の一つの特徴は、前記ヒダントイナーゼ（ヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチド）、形質転換体、または微生物を、５−置換ヒダントインに作用させ、光学活性Ｎ−カルバモイルアミノ酸及び／又は光学活性５−置換ヒダントインを製造する方法である。
１５）本発明の一つの特徴は、前記ヒダントイナーゼ（ヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチド）、形質転換体、または微生物を、Ｎ−カルバモイルアミノ酸に作用させ、光学活性Ｎ−カルバモイルアミノ酸及び／又は光学活性５−置換ヒダントインを製造する方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は上述の構成からなり、新規なヒダントイナーゼを効率よく製造することができる。また、当該ヒダントイナーゼを生産する形質転換体を利用することで、５−置換ヒダントイン又はＮ−カルバモイルアミノ酸から、光学活性Ｎ−カルバモイルアミノ酸及び／又は光学活性５−置換ヒダントインを効率良く製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、実施形態に基づいて本発明を詳細に説明する。本発明の範囲は、実施形態および実施例によって限定されるものではない。
１．ヒダントイン加水分解活性測定
実施形態において、ポリペプチドのヒダントイン加水分解活性は、反応で生成するＮ−カルバモイルアミノ酸を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて定量することにより測定することができる。
【００１４】
適宜希釈した酵素溶液０．１ｍｌを、１５ｍＭの各種５−置換ヒダントイン、０．１ｍＭ  硫酸マンガン、０．１Ｍ  炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．７）からなる基質液４ｍｌと混合し、４０℃で１５分間反応させた後、５Ｎ  硫酸１ｍｌを加えて反応を停止する。この反応液を遠心分離して得た上清をＨＰＬＣを用いて分析し、予め作成した検量線に基づき、反応液中に生成したＮ−カルバモイルアミノ酸の量を定量する。
２．Ｎ−カルバモイルアミノ酸環化活性測定
実施形態において、ポリペプチドのＮ−カルバモイルアミノ酸環化活性は、反応で生成する５−置換ヒダントインを、ＨＰＬＣを用いて定量することにより測定することができる。
【００１５】
適宜希釈した酵素溶液０．１ｍｌを、１５ｍＭ  各種Ｎ−カルバモイルアミノ酸、０．１ｍＭ  硫酸マンガン、５０ｍＭ  ２−[４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ]ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳＨＥＰＥＳ）−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）からなる基質液４ｍｌと混合し、４０℃で１５分間反応させた後、アセトニトリル４ｍｌを加えて反応を停止する。この反応液を遠心分離して得た上清をＨＰＬＣを用いて分析し、予め作成した検量線に基づき、反応液中に生成した５−置換ヒダントインの量を定量する。
３．ポリペプチド及びその取得方法
本発明の実施形態としてのポリペプチドは、配列表配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列である。また、本発明のポリペプチドは、配列表配列番号１において、１５２残基目のアラニン以外の１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチドであってもよい。また、本発明のポリペプチドは、配列表配列番号２において、１５２残基目及び１５９番目のアラニン以外の１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチドであってもよい。「数個のアミノ酸」とは、ヒダントイナーゼ活性が失われない限り、その個数は制限されないが、好ましくは２０アミノ酸以下であり、より好ましくは１５アミノ酸以下、さらに好ましくは１０アミノ酸以下、最も好ましくは、５、４、３、または２個以下である。
【００１６】
また、「ヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチド」とは、上記の活性測定条件において活性が検出可能なものであればよいが、配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いた場合の１０％以上の活性を有していることが好ましく、さらに好ましくは４０％以上、６０％以上、より好ましくは８０％以上の活性を示すポリペプチドのことをいう。
【００１７】
本発明のポリペプチドは、当業者に周知である部位特異的変異導入方法を利用して、例えばバチルス・エスピー（Bacillus sp.）ＫＮＫ２４５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６３）（国際公開第ＷＯ９６／２０２７５号公報参照）由来のヒダントイナーゼの１５２番目の残基であるフェニルアラニンのみをアラニンに置換（配列表配列番号１に対応）、あるいは１５２番目及び１５９番目の残基であるフェニルアラニンをアラニンに置換（配列表配列番号２に対応）することにより取得することができる。
【００１８】
さらに、前記以外の方法で本発明のポリペプチドを取得する手段として、他のヒダントイナーゼ活性を有する微生物から取得したヒダントイナーゼ遺伝子を取得した後に、適当な変異を導入する方法が挙げられる。このような酵素から目的のポリペプチドを得るためには、バチルス・エスピー（Bacillus sp.）ＫＮＫ２４５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６３）（国際公開第ＷＯ９６／２０２７５号公報参照）由来のヒダントイナーゼの１５２番目のフェニルアラニンと構造上同等の位置にあるフェニルアラニンのみ、あるいは、１５２番及び１５９番目の残基であるフェニルアラニンと構造上同等の位置にあるフェニルアラニンを、部位特異的変異あるいはランダム変異によりアラニンに置換する方法が挙げられる。
【００１９】
また、本発明において「構造上同等の位置にあるフェニルアラニン」とは、当該ヒダントイナーゼのアミノ酸配列の一次構造を、バチルス・エスピー（Bacillus sp.）ＫＮＫ２４５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６３）（国際公開第ＷＯ９６／２０２７５号公報参照）由来のヒダントイナーゼのアミノ酸配列と相同性が最も高くなるように配置して比較した場合、同位置に存在するフェニルアラニン残基を意味する。
【００２０】
なお、上記ヒダントイナーゼ遺伝子は、もとの微生物から直接クローン化したものを用いてもよいし、適当なベクター、宿主を用いて作成した形質転換体から取得したものを用いてもよい。なお、当業者に周知である変異導入方法として、例えば部位特異的変異導入法としてはオーバーラッピングＰＣＲ法（Nucleic Acid Reseach,(1988), 16, 7351参照）、オリゴヌクレオチドダイレクテッドデュアルアンバー法（Gene,(1995),152,271参照）等を、ランダム変異導入法としてはエラープローンＰＣＲ法(Nucleic Acid Reseach,(1990),18,3739参照)等を挙げることができる。
４．ＤＮＡ
本発明の実施形態としての「ＤＮＡ」について説明する。本発明のＤＮＡは、上記のようなポリペプチドをコードするＤＮＡであればよい。また、配列表の配列番号３又は４に示されるＤＮＡであってもよいし、配列表配列番号３に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／又は付加された塩基配列を有し、かつそのコードするポリペプチドの１５２番目の残基がアラニンであり、さらにヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、または配列表の配列番号４に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／又は付加された塩基配列を有し、かつそのコードするポリペプチドの１５２番目及び１５９番目の残基が共にアラニンであり、さらにヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであってもよい。上記ＤＮＡにおいてポリペプチドの１５２番目及び１５９番目のアラニン残基をコードする部分のＤＮＡ配列は、アラニンをコードする４種類のコドンのいずれであってもよい。また、「数個の塩基」とは、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドがヒダントイナーゼ活性を失われない限り、その個数は制限されないが、好ましくは５０塩基以下であり、より好ましくは３０塩基以下、さらに好ましくは２０塩基以下、最も好ましくは、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２個以下である。
５．ヒダントイナーゼ活性を有する微生物
実施形態のポリペプチドは、前記のようにバチルス・エスピー（Bacillus sp.）ＫＮＫ２４５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６３）（国際公開第ＷＯ９６／２０２７５号公報参照）由来のヒダントイナーゼを改変することにより取得することができる。また、特に由来は限定されないが、以下に述べるヒダントイナーゼ活性を有する微生物からも取得することができる。さらに、同微生物が生産するヒダントイナーゼのアミノ酸配列を改変することにより得ることもできる。このような微生物としては、同酵素を生産する微生物であれば特に限定されないが、例えば、以下の公知の微生物を挙げることができる。すなわち、細菌に属するものとしてはアセトバクター属（Acetobacter）、アクロモバクター属（Achromobacter）、アエロバクター属（Aerobacter）、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）、アルカリゲネス属（Alcaligenes）、アルスロバクター属（Arthrobacter）、バチルス属（Bacillus）、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、エンテロバクター属（Enterobacter）、エルウイニア属（Erwinia）、エシェリヒア属（Escherichia）、クレブシエラ属（Klebsiella）、ミクロバクテリウム属（Microbacterium）、ミクロコッカス属（Micrococcus）、プロタミノバクター属（Protaminobacter）、プロテウス属（Proteus）、シュードモナス属（Pseudomonas）、サルチナ属（Sartina）、セラチア属（Serratia）、キサントモナス属（Xanthomonas）、アエロモナス属（Aeromonas）、フラボバクテリウム属（Flavobacterium）、又はリゾビウム属（Rhizobium）など、放線菌に属するものとしてはアクチノミセス属（Actinomyces）、ミコバクテリウム属（Mycobacterium）、ノカルデイア属（Nocardia）、ストレプトミセス属（Streptomyces）、アクチノプラネス属（Actinoplanes）、又はロドコッカス属（Rhodococcus）など、かびに属するものとしてはアスペルギルス属（Aspergillus）、パエシロミセス属（Paecilomyces）、又はペニシリウム属（Penicillium）など、酵母に属するものとしてはキャンディダ属（Candida）、ピヒア属（Phichia）、ロードトルラ属（Rhodotorula）又はトルロプシス属（Torulopsis）などがある。
【００２１】
なお、上述の微生物は野生株であっても良いし、変異改良された変異株であってもよい。変異株は、ＵＶ照射や、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）等の薬剤による処理といった当業者に周知の方法で取得することができる。
６．形質転換体・ベクター
ヒダントイナーゼを効率良く高生産する高活性菌を得るためには、形質転換微生物を作成することが有効である。作成方法としては、上記方法によって取得したＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換えプラスミドを用いることにより、特に限定されないが、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等の宿主微生物を形質転換することにより形質転換体を得ることができる。なお、組換えＤＮＡ技術については当該分野において周知である。
【００２２】
ベクターとしては宿主内で自律複製できる微生物由来のプラスミド、ファージまたはその誘導体が使用できる。なかでも、宿主微生物として、例えば、菌学的性質が当業者に周知であって、形質転換用に提供されているエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、ベクターとして当該微生物中で自律複製できるベクターを用いるのが好ましい。このようなベクターとしては、例えば、当業者が容易に入手可能、あるいは市販されているｐＵＣ１８（タカラバイオ株式会社）、ｐＵＣ１９（タカラバイオ株式会社）、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ株式会社）、ｐＡＣＹＣ１８４（株式会社 ニッポンジーン）、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ株式会社）、ｐＳＴＶ２９（タカラバイオ株式会社）、ｐＳＣ１０１（フナコシ株式会社）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（タカラバイオ株式会社）、又は国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号公報の明細書の記載に基づいて当業者が製造しうるｐＵＣＮＴ、若しくはそれらの誘導体を挙げることができる。それらの誘導体とは、酵素の生産量上昇、プラスミド安定化を目的として、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ＳＤ配列、複製開始部位（ｏｒｉ）、その他の調節などに関わる遺伝子を改質したもの、また、薬剤耐性、クローニング部位の制限酵素サイトを改質したものなどを指す。
【００２３】
形質転換体の一例として、前述の方法に従って得た、バチルス  スピーシーズ（Bacillus sp.）ＫＮＫ２４５（ＦＥＲＭ  Ｐ−４８６３）（国際公開第ＷＯ９６／２０２７５号公報参照）由来のヒダントイナーゼの１５２番目のフェニルアラニンをアラニンに置換した変異型ヒダントイナーゼをコードするＤＮＡを上述のｐＵＣＮＴに組み込んだ組換えプラスミドｐＴＨ１０４Ｍ２、又はバチルス  スピーシーズ（Bacillus sp.）ＫＮＫ２４５（ＦＥＲＭ  Ｐ−４８６３）（国際公開第ＷＯ９６／２０２７５号公報参照）由来のヒダントイナーゼの１５２番目のフェニルアラニンをアラニンに、１５９番目のフェニルアラニンをアラニンに置換した変異型ヒダントイナーゼをコードするＤＮＡを上述のｐＵＣＮＴに組み込んだ組換えプラスミドｐＴＨ１０４Ｍ４を用いてエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１を形質転換し、形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＴＨ１０４Ｍ２）又はエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＴＨ１０４Ｍ４）を得ることができる。エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１の菌学的性質は、「BIOCHEMICALS  FOR  LIFE  SCIENCE」（東洋紡績株式会社、1993年、１１６−１１９頁）およびその他種々の公知文献に記載されており当業者に周知である。エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＴＨ１０４Ｍ２）及びエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＴＨ１０４Ｍ４）は、遺伝子組換えによって特定の酵素を産生し得る性質以外は、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１と同様の菌学的性質を有する。
【００２４】
なお、本発明で用いた組換えＤＮＡ技術は当該分野において周知であり、例えば、Molecular Cloning 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)、Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience)に記載されている。
７．形質転換体等の培養
本発明のヒダントイナーゼを生産しうる上記形質転換体等を培養することにより当該酵素を大量に生産することができ、光学活性な５−置換ヒダントイン又は光学活性なＮ−カルバモイルアミノ酸の製造に利用することができる。
【００２５】
微生物の培養は、通常の培地を用いて行えば良い。培養に使用する培地としては、炭素源、窒素源および無機塩類などの栄養素を含む通常の培地で良い。これに、ビタミン、アミノ酸などの有機微量栄養素を添加すると、好ましい結果が得られる場合が多い。炭素源としては、グルコースやシュークロースのような炭水化物、酢酸のような有機酸、アルコール類などが適宜使用される。窒素源としては、アンモニウム塩、アンモニア水、アンモニアガス、尿素、酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカーなどが用いられる。無機塩類としてはリン酸塩、マンガン塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、鉄塩、硫酸塩、塩素などが用いられる。
【００２６】
培養温度は２５℃以上、４０℃以下が好ましく、２５℃以上、３７℃以下がさらに好ましい。また、培養ｐＨはｐＨ４以上、９以下が好ましく、ｐＨ５以上、８以下がさらに好ましい。また、回分式、連続式のいずれの培養方法でもよい。
【００２７】
必要に応じてイソプロピル−１−チオ−β―Ｄ−ガラクトサイド（ＩＰＴＧ）、ラクトース等の添加等の酵素誘導のための処理を行なうこともできる。
８．光学活性な５−置換ヒダントイン又は光学活性なＮ−カルバモイルアミノ酸の製造方法
実施形態で得られるヒダントイナーゼを使用することによる、効率的な光学活性な５−置換ヒダントイン又は光学活性なＮ−カルバモイルアミノ酸の製造方法について説明する。光学活性な５−置換ヒダントイン又は光学活性なＮ−カルバモイルアミノ酸は、５−置換ヒダントインにヒダントイナーゼを作用させ、立体選択的に加水分解することにより得ることができる。５−置換ヒダントインはラセミ体であってもよく、また、Ｌ体あるいはＤ体のような光学活性体であってもよい。ヒダントイナーゼによる立体選択的加水分解反応と、基質の化学的なラセミ化が同時に進行することにより、ラセミ体、Ｌ体、またはＤ体のいずれの５−置換ヒダントインを基質とした場合からでも、すべて対応するＮ−カルバモイル−Ｄ−アミノ酸に変換されうる。
【００２８】
本反応の基質である一般式（１）
【００２９】
【化１】
2007189949.tif 000002
で表される５−置換ヒダントインは本酵素により加水分解されるものであれば特に限定されないが、Ｒで示される置換基としては、例えば、置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、もしくは置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリール基を挙げることができる。上記Ｒにおける置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のアルキル基としては、特に限定されず、例えば、メチル基、イソプロピル基、イソブチル基、１−メチルプロピル基、カルバモイルメチル基、２−カルバモイルエチル基、ヒドロキシメチル基、１−ヒドロキシエチル基、メルカプトメチル基、２−メチルチオエチル基、（１−メルカプト−１−メチル）エチル基、４−アミノブチル基、３−グアニジノプロピル基、４（５）−イミダゾールメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、クロロメチル基、メトキシメチル基、２−ヒドロキシエチル基、３−アミノプロピル基、２−シアノエチル基、３−シアノプロピル基、４−（ベンゾイルアミノ）ブチル基、又は、２−メトキシカルボニルエチル基、などが挙げられる。
【００３０】
置換基を有していてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基としては、特に限定されず、例えば、ベンジル基、インドリルメチル基、４−ヒドロキシベンジル基、２−フルオロベンジル基、３−フルオロベンジル基、４−フルオロベンジル基、ジフェニルメチル基、２−ナフチルメチル基、又は、３，４−メチレンジオキシベンジル基等が挙げられる。置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリール基としては、フェニル基、４−ヒドロキシフェニル基、１−ナフチル基、又は２−ナフチル基等が挙げられる。置換基としては、アミノ基、ヒドロキシル基、アルキル基、アラルキル基、アリール基、アルカノイル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシル基、又はハロゲン原子等が挙げられる。
【００３１】
また、嵩高い置換基を有する５−置換ヒダントインとしては、例えば前記式（１）で表される５−置換ヒダントインにおいて、Ｒで示される置換基が、置換基を有していてもよい炭素数４〜２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、もしくは置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリール基であるものを挙げることができる。置換基を有していてもよい炭素数４〜２０のアルキル基としては、特に限定されず、例えば、ｎ−ブチル基、イソブチル基、１−メチルプロピル基、４−アミノブチル基、又は４−（ベンゾイルアミノ）ブチル基等が挙げられる。置換基を有していてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基としては、特に限定されず、例えば、ベンジル基、インドリルメチル基、４−ヒドロキシベンジル基、２−フルオロベンジル基、３−フルオロベンジル基、４−フルオロベンジル基、ジフェニルメチル基、２−ナフチルメチル基、又は、３，４−メチレンジオキシベンジル基等が挙げられる。置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリール基としては、特に限定されず、例えば、フェニル基、４−ヒドロキシフェニル基、１−ナフチル基、又は２−ナフチル基等が挙げられる。中でも好ましくは、ベンジル基、４−ヒドロキシベンジル基、４−フルオロベンジル基、ジフェニルメチル基、２−ナフチルメチル基、１−ナフチル基、又は２−ナフチル基が挙げられる。
【００３２】
本加水分解反応は、上記基質に前述のヒダントイナーゼを作用させ、水性溶媒中で反応を行なう。本反応の基質仕込み濃度は好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上、９０％（ｗ／ｖ）以下、さらに好ましくは１％（ｗ／ｖ）以上、６０％（ｗ／ｖ）以下である。基質は溶解または懸濁した状態で反応を行い、反応温度は好ましくは１０℃以上、８０℃以下、さらに好ましくは２０℃以上、６０℃以下の適当な温度で調節し、反応ｐＨは好ましくはｐＨ４以上、１２以下、さらに好ましくはｐＨ６以上、１０以下に保ちつつ暫時静置または攪拌すればよい。また、基質は一括添加してもよいし、分割添加してもよいし、連続的に添加してもよい。また本反応は、バッチ法または連続方式で行い得る。
【００３３】
また、光学活性な５−置換ヒダントイン又は光学活性なＮ−カルバモイルアミノ酸はＮ−カルバモイルアミノ酸にヒダントイナーゼを作用させ、立体選択的に環化することによっても得ることができる。Ｎ−カルバモイルアミノ酸はラセミ体であってもよく、また、Ｌ体あるいはＤ体のような光学活性体であってもよい。
【００３４】
本反応の基質である一般式（２）
【００３５】
【化２】
2007189949.tif 000003
で表されるＮ−カルバモイルアミノ酸は本酵素により環化されるものであれば特に限定されないが、Ｒで示される置換基としては、前記一般式（１）で表される５−置換ヒダントインの説明において示したものと同じものを挙げることができる。
【００３６】
また、嵩高い置換基を有するＮ−カルバモイルアミノ酸としては、例えば前記式（２）で表されるＮ−カルバモイルアミノ酸において、Ｒで示される置換基が、前述の大きな置換基を有する５−置換ヒダントインについて示したものと同じ置換基であるものが挙げられる。
【００３７】
例えば、前述の形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＴＨ１０４Ｍ２）又はエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＴＨ１０４Ｍ４）を、嵩高い置換基であるベンジル基、４−ヒドロキシベンジル基、４−フルオロベンジル基、ジフェニルメチル基、２−ナフチルメチル基、１−ナフチル基、又は２−ナフチル基を有するＮ−カルバモイル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸に作用させることにより、野生型の酵素を用いた場合と比べて１．３倍から最高で約３倍の反応速度で、対応するＤ体ヒダントインを９０、９５、さらには９７％ｅｅ以上の高い光学純度で得ることができる（置換基がベンジル基である場合の例として、後述の実施例５参照）。
【００３８】
本環化反応は、上記基質に前述のヒダントイナーゼを作用させ、水性溶媒中にて反応を行なう。本反応の基質仕込み濃度は好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上、９０％（ｗ／ｖ）以下、さらに好ましくは１％（ｗ／ｖ）以上、６０％（ｗ／ｖ）以下である。基質は溶解または懸濁した状態で反応を行い、反応温度は好ましくは１０℃以上、８０℃以下、さらに好ましくは２０℃以上、６０℃以下の適当な温度で調節し、反応ｐＨは好ましくはｐＨ４以上、１２以下、さらに好ましくはｐＨ５以上、８以下に保ちつつ暫時静置または攪拌すればよい。また、基質は一括添加してもよいし、分割添加してもよいし、連続的に添加してもよい。また本反応は、バッチ法または連続方式で行い得る。
【００３９】
上記加水分解反応又は環化反応は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。水性媒体としては、水、緩衝液、これらにエタノールのような水溶性有機溶媒を含む水性媒体、あるいは、水に溶解しにくい有機溶媒、たとえば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサンなどの有機溶媒を含む水性媒体との２層系などの適当な溶媒を用いることができる。さらに必用に応じて、抗酸化剤、界面活性剤、補酵素、金属などを添加することもできる。金属としては、特に限定されないが、マンガン、コバルト、ニッケル、亜鉛、鉄、マグネシウム、カルシウム、または、銅等、あるいはそれらの塩が挙げられ、好ましくは、ニッケル、マンガン、またはコバルトの金属あるいはそれらの塩が挙げられ、さらに好ましくはコバルトの金属あるいはその塩が挙げられる。これらの金属は単独で用いてもよいし、２種類以上の金属を組み合わせて用いてもよい。
９．生成物の単離
生成した５−置換ヒダントイン又はＮ−カルバモイルアミノ酸の単離は、常套分離方法、例えば、抽出、濃縮、晶析、またはカラムクロマトグラフィーなどの分離方法や、それらの組み合わせにより分離、精製することができる。また、上記記載の方法にて得られた５−置換ヒダントイン又はＮ−カルバモイルアミノ酸は、化学的、または酵素的手法により、容易に対応するアミノ酸に変換することができる。
【実施例】
【００４０】
以下に本発明の具体的な実施例を示す。しかし、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００４１】
（実施例１）変異型ヒダントイナーゼＭ２を発現する組換えプラスミドの作成
バチルス・エスピー（Bacillus sp.）ＫＮＫ２４５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６３）由来のヒダントイナーゼ遺伝子を有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＴＨ１０４）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６４）（国際公開第ＷＯ９６／２０２７５号参照）を、試験管内にて滅菌した６ｍｌの培地Ａ（トリプトン１０ｇ、イーストエキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、アンピシリン１００ｍｇ、脱イオン水にて１ｌにメスアップ、滅菌前ｐＨ７．０、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する）に植菌し、３７℃にて２４時間、好気的に振とう培養した。培養終了後、遠心分離により菌体を集菌し、プラスミドｐＴＨ１０４を取得した。得られたプラスミドを鋳型として、ヒダントイナーゼ遺伝子のＮ末端に制限酵素ＮｄｅＩの切断部位を結合させたプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−１：配列表の配列番号５）及び、ヒダントイナーゼの１５２残基目のフェニルアラニンをアラニンに置換するように設計したプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−２：配列表の配列番号６）を用いてＰＣＲによるＤＮＡ増幅を行ない、約０．５ＫｂｐのＮ末側ＤＮＡ断片を得た。
【００４２】
同様にヒダントイナーゼのＣ末端部分に制限酵素ＨｉｎｄIIIの切断部位を結合させた配列を持つプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−３：配列表の配列番号７）及び、ヒダントイナーゼの１５２残基目のフェニルアラニンをアラニンに置換するように設計したプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−４：配列表の配列番号８）を用いて、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅を行ない、約１ＫｂｐのＣ末側ＤＮＡ断片を得た。上記Ｎ末側ＤＮＡ断片とＣ末側ＤＮＡ断片を混合したものを鋳型として、Ｐｒｉｍｅｒ−１及びＰｒｉｍｅｒ−３を用いたＰＣＲによるＤＮＡ増幅を行ない、配列表の配列番号９に示されるＤＮＡ断片を取得した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄIIIで切断し、同酵素で切断したベクタープラスミドｐＵＣＮＴ（国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号公報参照）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合することで、もとのヒダントイナーゼの１５２残基目のフェニルアラニンがアラニンに置換された変異型ヒダントイナーゼＭ２を大量に発現できるように設計されたプラスミドｐＴＨ１０４Ｍ２を取得した。
（実施例２）変異型ヒダントイナーゼＭ２遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを用いた形質転換体の作成
実施例１で得られたプラスミドｐＴＨ１０４Ｍ２をエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１のコンピテントセルと混合することで形質転換を行い、寒天培地Ｂ（トリプトン１０ｇ、イーストエキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、寒天１５ｇ、アンピシリン１００ｍｇ、脱イオン水にて１ｌにメスアップ、滅菌前ｐＨ７．０、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する）にプレーティングして、変異型ヒダントイナーゼＭ２遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを含有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＴＨ１０４Ｍ２）をコロニーとして取得した。
（実施例３）変異型ヒダントイナーゼＭ４を発現する組換えプラスミドの作成
バチルス・エスピー（Bacillus sp.）ＫＮＫ２４５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６３）由来のヒダントイナーゼ遺伝子を有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＴＨ１０４）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６４）（国際公開第ＷＯ９６／２０２７５号公報参照）を、試験管内にて滅菌した６ｍｌの培地Ａ（トリプトン１０ｇ、イーストエキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、アンピシリン１００ｍｇ、脱イオン水にて１ｌにメスアップ、滅菌前ｐＨ７．０、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する）に植菌し、３７℃にて２４時間、好気的に振とう培養した。培養終了後、遠心分離により菌体を集菌し、プラスミドｐＴＨ１０４を取得した。得られたプラスミドを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄIIIで切断し、同酵素で切断したベクタープラスミドｐＫＦ１８ｋ−２（タカラバイオ株式会社製Mutan-super Express Km kit参照）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合した後、同変異導入キットと、ヒダントイナーゼの１５９残基目のフェニルアラニンをアラニンに置換するように設計したプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−５：配列表の配列番号１０）とを用いて、もとのヒダントイナーゼの１５９残基目のフェニルアラニンがアラニンに置換された変異型ヒダントイナーゼＭ１をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＫＦ１８−ＨＭ１を得た。
【００４３】
次いで得られたプラスミドｐＫＦ１８−ＨＭ１を鋳型として、ヒダントイナーゼ遺伝子のＮ末端に制限酵素ＮｄｅＩの切断部位を結合させたプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−１：配列表の配列番号５）及び、ヒダントイナーゼの１５２残基目のフェニルアラニンをアラニンに置換するように設計したプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−２：配列表の配列番号６）を用いてＰＣＲによるＤＮＡ増幅を行ない、約０．５ＫｂｐのＮ末側ＤＮＡ断片を得た。同様にヒダントイナーゼのＣ末端部分に制限酵素ＨｉｎｄIIIの切断部位を結合させた配列を持つプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−３：配列表の配列番号７）及び、ヒダントイナーゼの１５２残基目のフェニルアラニンをアラニンに置換するように設計したプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−４：配列表の配列番号８）を用いて、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅を行ない、約１ＫｂｐのＣ末側ＤＮＡ断片を得た。上記Ｎ末側ＤＮＡ断片とＣ末側ＤＮＡ断片を混合したものを鋳型として、Ｐｒｉｍｅｒ−１及びＰｒｉｍｅｒ−３を用いたＰＣＲによるＤＮＡ増幅を行ない、配列表の配列番号１１に示されるＤＮＡ断片を取得した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄIIIで切断し、同酵素で切断したベクタープラスミドｐＵＣＮＴ（国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号公報参照）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合することで、もとのヒダントイナーゼの１５２残基目と１５９残基目のフェニルアラニンがいずれもアラニンに置換された変異型ヒダントイナーゼＭ４を大量に発現できるように設計されたプラスミドｐＴＨ１０４Ｍ４を取得した。
（実施例４）変異型ヒダントイナーゼＭ４遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを用いた形質転換体の作成
実施例３で得られたプラスミドｐＴＨ１０４Ｍ４をエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１のコンピテントセルと混合することで形質転換を行い、寒天培地Ｂ（トリプトン１０ｇ、イーストエキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、寒天１５ｇ、アンピシリン１００ｍｇ、脱イオン水にて１ｌにメスアップ、滅菌前ｐＨ７．０、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する）にプレーティングして、変異型ヒダントイナーゼＭ４遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを含有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＴＨ１０４Ｍ４）をコロニーとして取得した。
（実施例５）遺伝子形質転換体の生産する変異型ヒダントイナーゼの環化活性測定
実施例２で得たエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＴＨ１０４Ｍ２）（変異型ヒダントイナーゼＭ２遺伝子を含む形質転換体）、及び、比較例としてエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＴＨ１０４）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６４）（国際公開第ＷＯ９６／２０２７５号公報参照）（野生型ヒダントイナーゼ遺伝子を含有する形質転換体）のそれぞれを、試験管内にて滅菌した６ｍｌの培地Ｃ（トリプトン１６ｇ、イーストエキス１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、塩化マンガン４００ｍｇ、アンピシリン１００ｍｇ、脱イオン水にて１ｌにメスアップ、滅菌前ｐＨ７．０、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する）に植菌後、３７℃で２２時間、好気的に振とう培養した。培養液から遠心分離により菌体を集菌し、０．１ｍＭ  硫酸マンガン、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁して超音波により菌体を破砕後、遠心分離し、上清を粗酵素液として回収した。得られた粗酵素液１００μlに、１５ｍＭ  Ｎ−カルバモイル−Ｄ−フェニルアラニン、０．１ｍＭ  塩化コバルト、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）４ｍｌを加え、４０℃で１５分間反応させた後、アセトニトリルを４ｍｌ添加して反応を停止した。次いで、反応液を遠心分離して得られた上清をＨＰＬＣにて分析し、予め作成した検量線に基づき５−ベンジルヒダントインの生成量を測定した。
【００４４】
表１は、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＴＨ１０４）の培養液当たりの活性値を１００％としたときの相対活性値を示す。
（ＨＰＬＣ分析条件）カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８ＡＲ（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、ナカライテスク社製）、移動相：１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．０）／アセトニトリル＝９／１、流速：１．０ｍｌ／分、カラム温度：４０℃、検出：２１０ｎｍ
（表１：相対活性値）
【００４５】
【表１】
2007189949.tif 000004
【配列表】
2007189949000001.app