(57)【要約】【課題】酵素による不斉水解法で、光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸（２）等を製造する。【解決手段】３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸エステル（１）の鏡像異性体混合物のうち、一方の鏡像異性体のエステル基を優先的に加水分解する能力を有する下記不斉加水分解酵素、又は該酵素の産生能を有する微生物の培養物若しくはその処理物を用いて不斉加水分解する。2007166908.tif 0000122007166908.tif 000013［式中、Ｒ１は炭素数１〜４のアルキル基、Ｒ２は炭素数１〜６のアルキル基を表す。＊印を付した炭素原子は不斉炭素原子を表す。］［不斉加水分解酵素］  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ属及びＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属からなる群より選ばれる微生物を起源とする加水分解酵素。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式（２）で示される光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸の製造方法であって、下式（１）で示される３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸エステルの鏡像異性体混合物のうち、一方の鏡像異性体のエステル基を優先的に加水分解する能力を有する下記の不斉加水分解酵素、又は該酵素の産生能を有する微生物の培養物若しくはその処理物を用いて不斉加水分解することを特徴とする光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸の製造方法。
2007166908.tif 000009
2007166908.tif 000010
［式中、Ｒ１は炭素数１〜４のアルキル基、Ｒ２は炭素数１〜６のアルキル基を表す。＊印を付した炭素原子は不斉炭素原子を表す。］
［不斉加水分解酵素］
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ属及びＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属からなる群より選ばれる微生物を起源とする加水分解酵素
【請求項２】
下式（３）で示される光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸エステルの製造方法であって、請求項１記載の式（１）で示される３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸エステルの鏡像異性体混合物のうち、一方の鏡像異性体のエステル基を優先的に加水分解する能力を有する下記の不斉加水分解酵素、又は該酵素の産生能を有する微生物の培養物若しくはその処理物を用いて不斉加水分解した後、不斉加水分解反応液における未反応の式（３）で示される残存エステルを不斉加水分解反応生成物である光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸から分離した後、上記未反応の残存エステルを単離することを特徴とする光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸エステルの製造方法。
2007166908.tif 000011
［式中、Ｒ１は炭素数１〜４のアルキル基、Ｒ２は炭素数１〜６のアルキル基を表す。＊印を付した炭素原子は不斉炭素原子を表す。］
［不斉加水分解酵素］
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ属及びＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属からなる群より選ばれる微生物を起源とする加水分解酵素
【請求項３】
請求項１記載の式（２）で示される光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸の製造方法であって、請求項１記載の式（１）で示される３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸エステルの鏡像異性体混合物における一方の鏡像異性体のエステル基を優先的に加水分解する能力を有する下記の不斉加水分解酵素又は該酵素の産生能を有する微生物の培養物若しくはその処理物を用いて不斉加水分解した後、不斉加水分解反応液における未反応の請求項２記載の式（３）で示される残存エステルを不斉加水分解反応生成物である光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸から分離した後、上記未反応の残存エステルを加水分解することを特徴とする光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸の製造方法。
［不斉加水分解酵素］
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ属及びＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属からなる群より選ばれる微生物を起源とする加水分解酵素
【請求項４】
式（１）におけるＲ１が、エチル基である請求項１に記載の光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸の製造方法。
【請求項５】
式（１）および式（３）におけるＲ１が、エチル基である請求項２に記載の光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸エステルの製造方法。
【請求項６】
式（１）および式（３）におけるＲ１が、エチル基である請求項３に記載の光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸の製造方法。
【請求項７】
式（１）および式（２）におけるＲ２が、イソプロピル基である請求項１又は４に記載の光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸の製造方法。
【請求項８】
式（１）、式（２）および式（３）におけるＲ２が、イソプロピル基である請求項２又は５に記載の光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸エステルの製造方法。
【請求項９】
式（１）、式（２）および式（３）におけるＲ２が、イソプロピル基である請求項３又は６に記載の光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸の製造方法。
【請求項１０】
酵素が、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ及びＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓからなる群より選ばれる微生物を起源とする加水分解酵素である請求項１、４又は７のいずれかに記載の光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸の製造方法。
【請求項１１】
酵素が、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ及びＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓからなる群より選ばれる微生物を起源とする加水分解酵素である請求項２、５又は８のいずれかに記載の光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸エステルの製造方法。
【請求項１２】
酵素が、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ及びＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓからなる群より選ばれる微生物を起源とする加水分解酵素である請求項３、６又は９のいずれかに記載の光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸の製造方法。
【請求項１３】
酵素が、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ  ＳＣ−６−９８−２８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３６５８）由来のエステラーゼである請求項１、４又は７のいずれかに記載の光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸の製造方法。
【請求項１４】
酵素が、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ  ＳＣ−６−９８−２８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３６５８）由来のエステラーゼである請求項２、５又は８のいずれかに記載の光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸エステルの製造方法。
【請求項１５】
酵素が、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ  ＳＣ−６−９８−２８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３６５８）由来のエステラーゼである請求項３、６又は９のいずれかに記載の光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸の製造方法。
【請求項１６】
酵素が、請求項１０に記載の酵素における特定のアミノ酸が１個以上欠失、付加又は置換されてなる変異型酵素である請求項１、４又は７のいずれかに記載の光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸の製造方法。
【請求項１７】
酵素が、請求項１１又は１４のいずれかに記載の酵素における特定のアミノ酸が１個以上欠失、付加又は置換されてなる変異型酵素である請求項２、５又は８のいずれかに記載の光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸エステルの製造方法。
【請求項１８】
酵素が、請求項１２又は１５のいずれかに記載の酵素における特定のアミノ酸が１個以上欠失、付加又は置換されてなる変異型酵素である請求項３、６又は９のいずれかに記載の光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸や３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸エステルの製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸や３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸エステルの製法としては、例えば、下記特許文献１の方法が公知である。
しかしながら、上記の光学活性化合物を酵素による不斉水解で合成した例は、本発明者の知る限りにおいて、知られていない。
【０００３】
【特許文献１】ＷＯ  ０２／１００８１２号公報［実施例２７９ａ〜２７９ｄ］
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記特許文献１記載の方法では、光学活性化合物を製造するために不斉補助基の導入工程と除去工程が余分に必要となり、工程が長くなるという問題があった。また、反応温度が−７５℃であるので、工業的な製法としては必ずしも有利なものではないという問題があった。
本発明者は、光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸や３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸エステルの工業的にも有利な製法を提供すべく鋭意検討した。その結果、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸エステルを特定の酵素を用いて不斉加水分解すると、上記課題を解決できることを見出して、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
すなわち、本発明は、下式（２）で示される光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸の製造方法であって、下式（１）で示される３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸エステルの鏡像異性体混合物のうち、一方の鏡像異性体のエステル基を優先的に加水分解する能力を有する下記の不斉加水分解酵素、又は該酵素の産生能を有する微生物の培養物若しくはその処理物を用いて不斉加水分解することを特徴とする光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸の製造方法を提供するものである。
【０００６】
2007166908.tif 000002
2007166908.tif 000003
【０００７】
［式中、Ｒ１は炭素数１〜４のアルキル基、Ｒ２は炭素数１〜６のアルキル基を表す。＊印を付した炭素原子は不斉炭素原子を表す。］
［不斉加水分解酵素］
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ属及びＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属からなる群より選ばれる微生物を起源とする加水分解酵素
【０００８】
また、本発明は、下式（３）で示される光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸エステルの製造方法であって、上式（１）で示される３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸エステルの鏡像異性体混合物のうち、一方の鏡像異性体のエステル基を優先的に加水分解する能力を有する下記の不斉加水分解酵素、又は該酵素の産生能を有する微生物の培養物若しくはその処理物を用いて不斉加水分解した後、不斉加水分解反応液における未反応の式（３）で示される残存エステルを不斉加水分解反応生成物である光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸から分離した後、上記未反応の残存エステルを単離することを特徴とする光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸エステルの製造方法を提供するものである。
2007166908.tif 000004
［式中、Ｒ１は炭素数１〜４のアルキル基、Ｒ２は炭素数１〜６のアルキル基を表す。＊印を付した炭素原子は不斉炭素原子を表す。］
［不斉加水分解酵素］
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ属及びＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属からなる群より選ばれる微生物を起源とする加水分解酵素
【０００９】
さらに、本発明は、上式（２）で示される光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸の製造方法であって、上式（１）で示される３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸エステルの鏡像異性体混合物のうち、一方の鏡像異性体のエステル基を優先的に加水分解する能力を有する下記の不斉加水分解酵素、又は該酵素の産生能を有する微生物の培養物若しくはその処理物を用いて不斉加水分解した後、不斉加水分解反応液における未反応の上式（３）で示される残存エステルを不斉加水分解反応生成物である光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸から分離した後、上記未反応の残存エステルを加水分解することを特徴とする光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸の製造方法を提供するものである。
［不斉加水分解酵素］
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ属及びＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属からなる群より選ばれる微生物を起源とする加水分解酵素
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、酵素、又は該酵素の産生能を有する微生物の培養物若しくはその処理物を用いることによって、光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸、及び光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸エステルを、工程数が少なく、且つ常温で反応させることができる。したがって、本発明は、工業的にも有利なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸エステル（１）［以下、基質ということもある］は、例えば、上記の特許文献１（ＷＯ  ０２／１００８１２号公報）の９３頁に記載の方法に準じて、２−アルコキシ酢酸エステルと３−ベンジルオキシベンズアルデヒドの出発物質から３工程を経て製造することができる。
【００１２】
上記の基質は、特許文献１以外の文献記載の方法により製造されたものを使用してもよい。
【００１３】
基質（１）におけるＲ１は炭素数１〜４のアルキル基を表す。該アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基又はｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられる。
基質（１）におけるＲ１としては、メチル基又はエチル基が好ましく、エチル基が特に好ましい。
【００１４】
基質（１）におけるＲ２は炭素数１〜６のアルキル基を表す。該アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、シクロペンチル基、ｎ−ヘキシル基、イソへキシル基、ｓｅｃ−ヘキシル基、ｔｅｒｔ−ヘキシル基又はシクロヘキシル基等が挙げられる。
基質（１）におけるＲ２としては、エチル基又はイソプロピル基が好ましく、イソプロピル基が特に好ましい。
【００１５】
基質（１）としては、例えば、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−メトキシプロパン酸メチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−メトキシプロパン酸エチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−メトキシプロパン酸ｎ−プロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−メトキシプロパン酸イソプロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−メトキシプロパン酸ｎ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−メトキシプロパン酸イソブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−メトキシプロパン酸ｓｅｃ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−メトキシプロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−エトキシプロパン酸メチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−エトキシプロパン酸エチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−エトキシプロパン酸ｎ−プロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−エトキシプロパン酸イソプロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−エトキシプロパン酸ｎ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−エトキシプロパン酸イソブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−エトキシプロパン酸ｓｅｃ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−エトキシプロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−プロポキシプロパン酸メチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−プロポキシプロパン酸エチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−プロポキシプロパン酸ｎ−プロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−プロポキシプロパン酸イソプロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−プロポキシプロパン酸ｎ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−プロポキシプロパン酸イソブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−プロポキシプロパン酸ｓｅｃ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−プロポキシプロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソプロポキシプロパン酸メチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソプロポキシプロパン酸エチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソプロポキシプロパン酸ｎ−プロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソプロポキシプロパン酸イソプロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソプロポキシプロパン酸ｎ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソプロポキシプロパン酸イソブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソプロポキシプロパン酸ｓｅｃ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソプロポキシプロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロプロポキシプロパン酸メチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロプロポキシプロパン酸エチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロプロポキシプロパン酸ｎ−プロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロプロポキシプロパン酸イソプロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロプロポキシプロパン酸ｎ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロプロポキシプロパン酸イソブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロプロポキシプロパン酸ｓｅｃ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロプロポキシプロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−ブトキシプロパン酸メチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−ブトキシプロパン酸エチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−ブトキシプロパン酸ｎ−プロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−ブトキシプロパン酸イソプロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−ブトキシプロパン酸ｎ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−ブトキシプロパン酸イソブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−ブトキシプロパン酸ｓｅｃ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−ブトキシプロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソブトキシプロパン酸メチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソブトキシプロパン酸エチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソブトキシプロパン酸ｎ−プロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソブトキシプロパン酸イソプロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソブトキシプロパン酸ｎ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソブトキシプロパン酸イソブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソブトキシプロパン酸ｓｅｃ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソブトキシプロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｓｅｃ−ブトキシプロパン酸メチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｓｅｃ−ブトキシプロパン酸エチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｓｅｃ−ブトキシプロパン酸ｎ−プロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｓｅｃ−ブトキシプロパン酸イソプロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｓｅｃ−ブトキシプロパン酸ｎ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｓｅｃ−ブトキシプロパン酸イソブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｓｅｃ−ブトキシプロパン酸ｓｅｃ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｓｅｃ−ブトキシプロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシプロパン酸メチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシプロパン酸エチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシプロパン酸ｎ−プロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシプロパン酸イソプロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシプロパン酸ｎ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシプロパン酸イソブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシプロパン酸ｓｅｃ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシプロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロブトキシプロパン酸メチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロブトキシプロパン酸エチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロブトキシプロパン酸ｎ−プロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロブトキシプロパン酸イソプロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロブトキシプロパン酸ｎ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロブトキシプロパン酸イソブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロブトキシプロパン酸ｓｅｃ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロブトキシプロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−ペントキシプロパン酸メチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−ペントキシプロパン酸エチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−ペントキシプロパン酸ｎ−プロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−ペントキシプロパン酸イソプロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−ペントキシプロパン酸ｎ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−ペントキシプロパン酸イソブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−ペントキシプロパン酸ｓｅｃ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−ペントキシプロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソペントキシプロパン酸メチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソペントキシプロパン酸エチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソペントキシプロパン酸ｎ−プロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソペントキシプロパン酸イソプロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソペントキシプロパン酸ｎ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソペントキシプロパン酸イソブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソペントキシプロパン酸ｓｅｃ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソペントキシプロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｓｅｃ−ペントキシプロパン酸メチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｓｅｃ−ペントキシプロパン酸エチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｓｅｃ−ペントキシプロパン酸ｎ−プロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｓｅｃ−ペントキシプロパン酸イソプロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｓｅｃ−ペントキシプロパン酸ｎ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｓｅｃ−ペントキシプロパン酸イソブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｓｅｃ−ペントキシプロパン酸ｓｅｃ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｓｅｃ−ペントキシプロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｔｅｒｔ−ペントキシプロパン酸メチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｔｅｒｔ−ペントキシプロパン酸エチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｔｅｒｔ−ペントキシプロパン酸ｎ−プロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｔｅｒｔ−ペントキシプロパン酸イソプロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｔｅｒｔ−ペントキシプロパン酸ｎ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｔｅｒｔ−ペントキシプロパン酸イソブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｔｅｒｔ−ペントキシプロパン酸ｓｅｃ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｔｅｒｔ−ペントキシプロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロペントキシプロパン酸メチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロペントキシプロパン酸エチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロペントキシプロパン酸ｎ−プロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロペントキシプロパン酸イソプロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロペントキシプロパン酸ｎ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロペントキシプロパン酸イソブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロペントキシプロパン酸ｓｅｃ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロペントキシプロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−ヘキソキシプロパン酸メチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−ヘキソキシプロパン酸エチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−ヘキソキシプロパン酸ｎ−プロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−ヘキソキシプロパン酸イソプロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−ヘキソキシプロパン酸ｎ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−ヘキソキシプロパン酸イソブチルエステル、３−（３−ヒド
ロキシフェニル）−２−ｎ−ヘキソキシプロパン酸ｓｅｃ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−ヘキソキシプロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソヘキソキシプロパン酸メチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソヘキソキシプロパン酸エチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソヘキソキシプロパン酸ｎ−プロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソヘキソキシプロパン酸イソプロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソヘキソキシプロパン酸ｎ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソヘキソキシプロパン酸イソブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソヘキソキシプロパン酸ｓｅｃ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソヘキソキシプロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｓｅｃ−ヘキソキシプロパン酸メチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｓｅｃ−ヘキソキシプロパン酸エチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｓｅｃ−ヘキソキシプロパン酸ｎ−プロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｓｅｃ−ヘキソキシプロパン酸イソプロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｓｅｃ−ヘキソキシプロパン酸ｎ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｓｅｃ−ヘキソキシプロパン酸イソブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｓｅｃ−ヘキソキシプロパン酸ｓｅｃ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｓｅｃ−ヘキソキシプロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｔｅｒｔ−ヘキソキシプロパン酸メチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｔｅｒｔ−ヘキソキシプロパン酸エチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｔｅｒｔ−ヘキソキシプロパン酸ｎ−プロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｔｅｒｔ−ヘキソキシプロパン酸イソプロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｔｅｒｔ−ヘキソキシプロパン酸ｎ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｔｅｒｔ−ヘキソキシプロパン酸イソブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｔｅｒｔ−ヘキソキシプロパン酸ｓｅｃ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｔｅｒｔ−ヘキソキシプロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロヘキソキシプロパン酸メチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロヘキソキシプロパン酸エチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロヘキソキシプロパン酸ｎ−プロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロヘキソキシプロパン酸イソプロピルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロヘキソキシプロパン酸ｎ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロヘキソキシプロパン酸イソブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロヘキソキシプロパン酸ｓｅｃ−ブチルエステル、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロヘキソキシプロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル等が挙げられる。
【００１６】
鏡像異性体混合物である基質（１）のうち、一方の鏡像異性体のエステル基を優先的に加水分解する能力を有する酵素としては、例えば、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ属及びＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属からなる群より選ばれる微生物を起源とする加水分解酵素が挙げられる。
上記加水分解酵素としては、例えば、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ又はＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ等の微生物を起源とする加水分解酵素を挙げることができる。
【００１７】
上記微生物を起源とする加水分解酵素としては、例えばアルスロバクター・グロビフォルミス  ＳＣ−６−９８−２８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３６５８）由来の酵素（エステラーゼ又はリパーゼ）や、次の市販酵素が挙げられる。
プロテアーゼＢ「アマノ」［Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ由来；天野エンザイム社製］、ＣＨＥ’Ａｍａｎｏ’２［Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．由来；天野エンザイム社製］、Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ  Ｌ−６［Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．由来；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製］、ＬＩＰＯＳＡＭ［Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．由来；昭和電工社製］、及びＬｉｐａｓｅ  ６２２９１［Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ由来；Ｆｌｕｋａ社製］等を挙げることができる。
【００１８】
上記のアルスロバクター・グロビフォルミス  ＳＣ−６−９８−２８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３６５８）由来の酵素等は、前記微生物から突然変異剤又は紫外線等の処理により産生された突然変異体由来の酵素であってもよく、該微生物が有する本酵素をコードする遺伝子が導入されて形質転換された組換え微生物により産生された酵素であってもよい。
また、遺伝子工学的手法により、酵素のアミノ酸配列中における特定のアミノ酸が１個〜数個欠失、付加又は置換されてなる変異型酵素であってもよい。
【００１９】
酵素をコードする遺伝子が導入されて形質転換された組換え微生物を作製する方法としては、例えばＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著；モレキュラー  クローニング  第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｅｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）や、１９８９年発行のコールドスプリングハーバー  ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂａｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）等に記載の通常の遺伝子工学的手法に準じた方法を挙げることができる。より具体的には、特開平７−１６３３６４号公報に記載の方法を挙げることができる。
【００２０】
遺伝子工学的手法による変異型酵素の作製方法としては、例えばＯｌｆｅｒｔ  Ｌａｎｄｔ（Ｇｅｎｅ  ９６  １２５−１２８  １９９０）らの方法を挙げることができる。より具体的には、特開２０００−７８９８８号公報や特開平７−２１３２８０号公報に記載の方法に準じた方法を挙げることができる。このようにして作製することのできる変異型酵素の例としては、アルスロバクター・グロビフォルミス  ＳＣ−６−９８−２８株由来のエステラーゼから作製される変異型のエステラーゼ又は変異型のリパーゼ等を挙げることができる。
【００２１】
酵素を産生する微生物は、いずれも通常の方法によって液体培養することができる。培地としては、通常の微生物培養に使用される炭素源、窒素源や無機物等を適宜含む各種の培地を使用することができる。
例えば、炭素源としては、グルコース、グリセリン、有機酸や糖蜜等を挙げることができる。窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーンスティープリカー、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウムや尿素等を挙げることができる。
無機物としては、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルトや亜鉛等の金属の塩酸塩、上記金属の硫酸塩及び前記金属のリン酸塩等が挙げられる。具体的には、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、リン酸カリウムやリン酸ナトリウム等を使用することができる。また、上記微生物の不斉水解能を高めるために、適宜、オリーブ油若しくはトリブチリン等のトリグリセリド又は上述した基質を培地に添加してもよい。
【００２２】
培養は、通常は、好気的雰囲気で行うのがよく、振とう培養又は通気撹拌培養が好ましい。培養温度は、通常２０〜４０℃程度、好ましくは２５〜３５℃程度であり、ｐＨは６〜８程度が好ましい。培養時間は、種々の条件によって異なるが、１〜７日間程度が好ましい。また、上記基質の不斉水解能を有する微生物菌体が得られる方法であれば、固体培養法も採用することができる。
【００２３】
上述した酵素を、上記のようにして培養された微生物培養物から精製するには、酵素の精製において一般に使用されている方法に従えばよい。
例えば、先ず、超音波処理、ダイノミル処理又はフレンチプレス処理等の方法により、微生物培養物中の菌体を破砕する。次に、得られた破砕液から遠心分離等により不溶物を除去した後、通常酵素の精製に使用される陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水カラムクロマトグラフィー及びゲル濾過カラムクロマトグラフィー等の一つ又は二つ以上を適宜組合せることによって、目的とする酵素を精製することができる。これらのカラムクロマトグラフィーに使用する担体の一例としては、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔｆｌｏｗ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）や、Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｓ（東ソー株式会社製）等を挙げることができる。
【００２４】
酵素は、精製酵素、粗酵素、微生物培養物、菌体、及びこれらを処理したもの等の種々の形態で用いることができる。上記の処理したものとは、例えば、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、菌体摩砕物、菌体の自己消化物、菌体の超音波処理物、菌体抽出物又は菌体のアルカリ処理物等をいう。さらに、上記のような種々の純度又は形態の酵素を、例えば、シリカゲルやセラミックス等の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂等への吸着法、ポリアクリルアミド法、カラギーナンゲル法のような含硫多糖ゲル法、アルギン酸ゲル法、及び寒天ゲル法等の公知の方法により固定化して用いてもよい。
【００２５】
酵素の使用量は反応時間の遅延や選択性の低下が起こらないように適宜選択される。
例えば精製酵素や粗酵素を用いる場合、その使用量は上記の基質に対して、通常は０．００１〜２重量倍程度、好ましくは０．００２〜０．５重量倍程度である。
また、微生物培養物、菌体及びそれらの処理物を用いる場合の使用量は、前記基質に対して、通常は０．０１〜２００重量倍程度であり、好ましくは０．１〜５０重量倍程度である。
【００２６】
不斉加水分解反応に用いられる水は、緩衝水溶液であってもよい。緩衝水溶液としては、例えばリン酸ナトリウム水溶液、リン酸カリウム水溶液等といったリン酸アルカリ金属塩水溶液等の無機酸塩の緩衝水溶液、酢酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム水溶液等といった酢酸アルカリ金属塩等の有機酸塩の緩衝水溶液等が挙げられる。
水の使用量は、通常は基質に対して０．５モル倍〜２００重量倍の範囲である。
【００２７】
本発明における不斉加水分解反応は、疎水性有機溶媒や親水性有機溶媒等の有機溶媒の存在下に行ってもよい。
疎水性有機溶媒としては、例えばｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルやジイソプロピルエーテル等の脂肪族エーテル類や、トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、オクタンやイソオクタン等の炭化水素類等が用いられる。
また、親水性有機溶媒としては、例えばｔｅｒｔ−ブタノール、メタノール、エタノール、イソプロパノール、イソブタノールやｎ−ブタノール等のアルコール類、テトラヒドロフラン等の脂環式エーテル類、ジメチルスルホキサイド等のスルホキサイド類、アセトン等のケトン類、アセトニトリル等のニトリル類や、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等のアミド類等が挙げられる。
これらの疎水性有機溶媒や親水性有機溶媒は、それぞれ単独で、又は２種以上を混合して用いられる。また、疎水性有機溶媒と親水性有機溶媒とを混合して用いてもよい。
【００２８】
上記の有機溶媒を用いる場合の使用量は、基質に対して、通常は２００重量倍以下、好ましくは０．１〜１００重量倍の範囲である。
【００２９】
不斉加水分解反応は、例えば、水、基質及び酵素を混合する方法により行われる。また、有機溶媒を用いる場合には、該有機溶媒、水、基質及び酵素を混合すればよい。
【００３０】
反応系のｐＨは、酵素による不斉加水分解反応が選択性よく進行する値が適宜選択される。反応系のｐＨは、通常４〜１０程度、好ましくは６〜８程度の範囲である。反応中、塩基を加えることにより、ｐＨを上記範囲内に調整してもよい。
上記の塩基としては、例えば水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物、炭酸ナトリウムや炭酸カリウム等のアルカリ金属の炭酸塩、炭酸カルシウム等のアルカリ土類金属の炭酸塩、炭酸水素ナトリウムや炭酸水素カリウム等のアルカリ金属重炭酸塩、リン酸２水素ナトリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸２水素カリウムやリン酸水素２カリウム等のリン酸塩、トリエチルアミンやピリジン等の有機塩基、及びアンモニア等が使用される。
前記の塩基は単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。塩基は通常は水溶液として添加されるが、有機溶媒と水の混合物の溶液として添加してもよい。上記の有機溶媒は反応で使用する溶媒と同じものを使用することもできる。さらに、塩基は固体として添加してもよいし、懸濁液として添加してもよい。
【００３１】
不斉加水分解の反応温度は、高すぎると酵素の安定性が低下する傾向にあり、低すぎると反応速度が低下する傾向にある。反応温度は、通常は５〜６５℃程度の範囲であり、好ましくは１０〜５０℃程度の範囲である。
【００３２】
かくして、光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸（２）［以下、不斉加水分解カルボン酸ということもある］を含む反応液が得られるが、反応で使用した酵素や緩衝剤、又は残存する基質［以下、残存エステルということもある］等と分離するために、さらに後処理操作を行ってもよい。後処理操作としては、例えば、反応液中の溶媒を留去した後、シリカゲルクロマトグラフィーを用いて分離精製する方法や、分液操作により分離精製する方法等が挙げられる。
【００３３】
分液操作により分離精製する際に、反応時に水と疎水性有機溶媒のいずれにも溶解する有機溶媒を用いた場合は、この水と疎水性有機溶媒のいずれにも溶解する溶媒を留去により除去した後、分液操作を行ってもよい。
また、不斉加水分解カルボン酸を含む液に不溶の酵素や固定化担体等が存在する場合は、これらの酵素や固定化担体を濾過により除去してもよい。
【００３４】
不斉加水分解反応液中に含まれる残存エステルの分離は、該残存エステルを疎水性有機溶媒によって抽出後、水層と分液すればよい。
上記の抽出に用いる疎水性有機溶媒としては、例えばｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルやイソプロピルエーテル等の脂肪族エーテル類；トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、オクタンやイソオクタン等の炭化水素類；ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、クロロベンゼンやオルトジクロロベンゼン等のハロゲン化炭化水素類；酢酸メチル、酢酸エチルや酢酸ブチル等のエステル類が挙げられる。
不斉加水分解反応時に上記例示の疎水性有機溶媒を使用した場合は、そのまま分液操作を行うこともできる。また、不斉加水分解反応時に疎水性有機溶媒を用いなかった場合や、疎水性有機溶媒又は水の使用量が少ないために容易に分液できない場合には、疎水性有機溶媒及び／又は水を適宜添加した後、静置して分液すればよい。
上記の疎水性有機溶媒の使用量は特に限定されるものではないが、基質に対して、通常は０．１〜２００重量倍、好ましくは０．２〜１００重量倍程度の範囲である。
上述した抽出や分液操作時のｐＨは、通常６〜１２程度の範囲、好ましくは７〜１０程度の範囲である。
【００３５】
不斉加水分解カルボン酸と残存エステルを分離する際には、液のｐＨを上記範囲に調整するために、適宜、酸や塩基を使用することもできる。上記の酸としては例えば、塩化水素、臭化水素、硫酸やリン酸等の無機酸、該無機酸と金属との酸性塩、酢酸、クエン酸やメタンスルホン酸等の有機酸、及び該有機酸と金属との酸性塩等が挙げられる。また、上記の塩基としては反応時のｐＨ調整に用いたものと同様の塩基が使用可能である。
不斉加水分解カルボン酸と残存エステルとの分離が不十分な場合は、上述した抽出や分液の操作を複数回繰り返してもよい。
上記の抽出により、不斉加水分解物であるカルボン酸と分離された残存エステルは、油層中の有機溶媒を留去することにより単離することができる。
上記の油層中の有機溶媒を留去することにより単離された残存エステルは、さらにカラムクロマトグラフィー等によって精製されてもよい。
上記操作により得られた残存エステルは、例えばアルカリの存在下に加水分解することによって、光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸に誘導することができる。この光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸は、さらにカラムクロマトグラフィーや再結晶等によって精製してもよい。
【００３６】
不斉加水分解カルボン酸は、上記の抽出操作において水層に存在する。水層に存在する不斉加水分解カルボン酸を酵素や緩衝剤等の水溶性成分と分離するには、疎水性有機溶媒を用いて有機層に抽出後、水層と分液すればよい。上記の抽出時に使用する疎水性有機溶媒としては、前述した残存エステルを抽出する際に用いた溶媒と同じ溶媒を用いることができる。該疎水性有機溶媒の使用量は、基質に対して、通常は０．１〜２００重量倍程度の範囲であり、好ましくは０．２〜１００重量倍程度の範囲である。
不斉加水分解カルボン酸の抽出時のｐＨは、通常は１〜７程度の範囲、好ましくは２〜５程度の範囲である。抽出時の液性を上記ｐＨ範囲に調整するため、酸及び塩基を適宜使用することもできる。かかる酸及び塩基としては、上述した残存エステルと分離する際の分液操作時に用いた酸及び塩基と同じものを用いることができる。
不斉加水分解カルボン酸の水層からの抽出量が少ない場合は、抽出操作と分液操作とを、複数回繰り返してもよい。
【００３７】
不斉加水分解カルボン酸は、上述の方法で得た油層中の疎水性有機溶媒を留去することにより、単離することができる。不斉加水分解カルボン酸は、さらにカラムクロマトグラフィーや再結晶等によって精製されてもよい。
【００３８】
本発明によって得られる不斉加水分解カルボン酸（２）としては、次の化合物が挙げられる。
（Ｓ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−メトキシプロパン酸、（Ｓ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−エトキシプロパン酸、（Ｓ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−プロポキシプロパン酸、（Ｓ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソプロポキシプロパン酸、（Ｓ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロプロポキシプロパン酸、（Ｓ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−ブトキシプロパン酸、（Ｓ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソブトキシプロパン酸、（Ｓ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｓｅｃ−ブトキシプロパン酸、（Ｓ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシプロパン酸、（Ｓ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロブトキシプロパン酸、（Ｓ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−ペントキシプロパン酸、（Ｓ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソペントキシプロパン酸、（Ｓ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｓｅｃ−ペントキシプロパン酸、（Ｓ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｔｅｒｔ−ペントキシプロパン酸、（Ｓ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロペントキシプロパン酸、（Ｓ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−ヘキソキシプロパン酸、（Ｓ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソヘキソキシプロパン酸、（Ｓ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｓｅｃ−ヘキソキシプロパン酸、（Ｓ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｔｅｒｔ−ヘキソキシプロパン酸、（Ｓ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロヘキソキシプロパン酸、（Ｒ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−メトキシプロパン酸、（Ｒ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−エトキシプロパン酸、（Ｒ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−プロポキシプロパン酸、（Ｒ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソプロポキシプロパン酸、（Ｒ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロプロポキシプロパン酸、（Ｒ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−ブトキシプロパン酸、（Ｒ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソブトキシプロパン酸、（Ｒ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｓｅｃ−ブトキシプロパン酸、（Ｒ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシプロパン酸、（Ｒ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロブトキシプロパン酸、（Ｒ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−ペントキシプロパン酸、（Ｒ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソペントキシプロパン酸、（Ｒ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｓｅｃ−ペントキシプロパン酸、（Ｒ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｔｅｒｔ−ペントキシプロパン酸、（Ｒ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロペントキシプロパン酸、（Ｒ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｎ−ヘキソキシプロパン酸、（Ｒ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソヘキソキシプロパン酸、（Ｒ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｓｅｃ−ヘキソキシプロパン酸、（Ｒ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ｔｅｒｔ−ヘキソキシプロパン酸、（Ｒ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−シクロヘキソキシプロパン酸等。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例等により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。
【００４０】
実施例１〜６
光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソプロポキシプロパン酸、及び光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソプロポキシプロパン酸エチルエステルの製造例
【００４１】
リン酸水素２ナトリウム１．７０ｇ、リン酸２水素ナトリウム０．９６ｇを水２００ｇに溶解させ、バッファー水溶液を調製した。別途、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソプロポキシプロパン酸エチルエステル１０．０９ｇを含むｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（以下、ＭＴＢＥという）溶液１００ｍｌを調製した。
【００４２】
下記の表１に示した種々の酵素を、それぞれ秤取り（秤取量は下記の表２参照）、これにバッファー水溶液５ｍｌと、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソプロポキシプロパン酸エチルエステルのＭＴＢＥ溶液０．５ｍｌを加えた。次に、２５℃で２１時間攪拌後、ＭＴＢＥ１０ｍｌ及び５％リン酸水溶液１ｍｌを加えて混合した。分液後に得た油層を、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）［カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｃｋ  ＡＤ−Ｈ，４．６ｍｍφ×２５ｃｍ（ダイセル社製）］にて分析して、光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソプロポキシプロパン酸への転化率と不斉加水分解カルボン酸及び残存エステルの鏡像体過剰率とを求めた。結果を表２に示す。
【００４３】
【表１】
2007166908.tif 000005
【００４４】
＃・・特開平５−５６７８７号公報記載の方法に準じて作製した。
【００４５】
【表２】
2007166908.tif 000006
【００４６】
実施例７
（Ｓ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソプロポキシプロパン酸及び（Ｒ）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソプロポキシプロパン酸エチルエステルの製造例
【００４７】
３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソプロポキシプロパン酸エチルエステル４．００ｇ（０．０１５９ｍｏｌ）とＭＴＢＥ２９ｇより成る溶液を調製した。
リン酸水素２ナトリウム０．８４ｇ、リン酸２水素ナトリウム０．４８ｇを水９６ｇに溶解させ、プロテアーゼ Ｂ アマノ０．０８ｇ、及び３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソプロポキシプロパン酸エチルエステルのＭＴＢＥ溶液を加えた。これを２５℃で５時間、さらに４０℃で２０時間攪拌後、ＭＴＢＥで２回洗浄抽出して残存エステルをＭＴＢＥ層に分離し、水層に、酢酸エチル、１０％塩酸、ラジオライトを加えて不斉加水分解カルボン酸を油層に抽出し、濾過後、分液して油層を得た。水層を酢酸エチルでさらに抽出し、混合した油層を水で洗浄分液した。この油層を減圧下に濃縮して溶媒を留去した。淡黄色油状物の濃縮残分（１．９８ｇ）の含量を定量したところ、８５．０％であった（収率４７％）。また、ＨＰＬＣ［カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｃｋ  ＡＤ−Ｈ，４．６ｍｍφ×２５ｃｍ（ダイセル社製）］にて鏡像体過剰率を分析したところ、＞９９％ｅｅ（Ｓ）であった。
ＭＴＢＥ層中の残存エステル含量を定量したところ、収率は４２％であった。また、ＨＰＬＣ［カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｃｋ  ＡＤ−Ｈ，４．６ｍｍφ×２５ｃｍ（ダイセル社製）］にて鏡像体過剰率を分析したところ、９４％ｅｅ（Ｒ）であった。
【００４８】
比較例１〜５
別の酵素を用いた比較実験
【００４９】
リン酸水素２ナトリウム１．７０ｇ、リン酸２水素ナトリウム０．９６ｇを水２００ｇに溶解させ、バッファー水溶液を調製した。別途、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソプロポキシプロパン酸エチルエステル１０．０９ｇを含むＭＴＢＥ溶液１００ｍｌを調製した。
【００５０】
下記の表３に示した種々の酵素を、それぞれ秤取り（秤取量は下記の表４参照）、これにバッファー水溶液５ｍｌと、３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソプロポキシプロパン酸エチルエステルのＭＴＢＥ溶液０．５ｍｌを加えた。次に、２５℃で２１時間攪拌後、ＭＴＢＥ１０ｍｌ及び５％リン酸水溶液１ｍｌを加えて混合した。分液後に得た油層を、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）［カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｃｋ  ＡＤ−Ｈ，４．６ｍｍφ×２５ｃｍ（ダイセル社製）］にて分析して、光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−イソプロポキシプロパン酸への転化率と鏡像体過剰率とを求めた。結果を表４に示す。
【００５１】
【表３】
2007166908.tif 000007
【００５２】
【表４】
2007166908.tif 000008
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明の光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸及び光学活性な３−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アルコキシプロパン酸エステルは、糖尿病治療薬の合成用中間体化合物等として有用である（例えば、ＷＯ  ０２／１００８１２号公報を参照）。