(57)【要約】【課題】ＰＨＡの効率的商業生産には未だ多くの課題が存在した。本発明の目的は、工業的規模の培養プロセスにおいて、ＰＨＡ、特に広範な用途が期待できるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を高レベルで生産する組換え微生物株を提供すること、およびそれを利用したＰＨＡの製造方法を提供することである。【解決手段】従来用いられてきたＰＨＢ−４株の代わりに、部位特異的変異によってＰ（３ＨＢ）非生産性としたワーテルシア・ユートロファ変異株を種々作製した。これらの変異株を宿主とした形質転換体は従来株よりもＰＨＡを効率よく生産することを見出した。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
部位特異的変異により微生物が本来有しているポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子のみを不活性化した微生物を宿主として用い、外因性のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を導入して得られた形質転換体を培養することを特徴とする生分解性ポリエステルの製造方法。
【請求項２】
生分解性ポリエステルが３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸とのモノマー単位で構成されることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
微生物がワーテルシア・ユートロファである請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
微生物がワーテルシア・ユートロファＨ１６株である請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項５】
宿主が、配列番号２４に示すポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子内部の塩基を欠失、置換又は挿入した変異株である請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項６】
宿主が、配列番号２４に示すポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子内部のＢｇｌＩＩからＢｃｌＩ間を欠失させた株である請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
宿主が、配列番号２４に示すポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子内部のＳａｃＩからＳａｃＩ間を欠失させた株である請求項５に記載の製造方法。
【請求項８】
宿主が、配列番号２４に示すポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子の３１９番目のアミノ酸であるシステインをアラニンに変異させた株である請求項５に記載の製造方法。
【請求項９】
宿主が、配列番号２４に示すポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子の１０７番目のアミノ酸であるトリプトファンをコードするコドンをストップコドンに変異させた株である請求項５に記載の製造方法。
【請求項１０】
宿主が、配列番号２４に示すポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を完全に欠失させた株である請求項５に記載の製造方法。
【請求項１１】
配列番号２４に示すポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子のＢｇｌＩＩからＢｃｌＩ間を欠失させることによって、ポリヒドロキシアルカン酸非生産性となったワーテルシア・ユートロファの変異株。
【請求項１２】
配列番号２４に示すポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子のＳａｃＩからＳａｃＩ間を欠失させることによって、ポリヒドロキシアルカン酸非生産性となったワーテルシア・ユートロファの変異株。
【請求項１３】
配列番号２４に示すポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子の１０７番目のアミノ酸であるトリプトファンをコードするコドンをストップコドンに変異させることによって、ポリヒドロキシアルカン酸非生産性となったワーテルシア・ユートロファの変異株。
【請求項１４】
請求項１１〜１３の何れか１項に記載の変異株を用いて得られた形質転換体。
【請求項１５】
請求項１１〜１３何れか１項に記載の変異株を宿主として用い、外因性のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を導入して得られた形質転換体を培養することを特徴とする生分解性ポリエステルの製造方法。
【請求項１６】
生分解性ポリエステルが３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸をモノマー単位で構成されることを特徴とする請求項１５に記載の生分解性ポリエステルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生分解性ポリエステルであるポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）の商業的生産に有用な、改良された微生物株と、それを利用するＰＨＡの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヒドロキシアルカン酸（以下ＰＨＡと略す）は、広範な微生物によって生成されるポリエステル型有機分子ポリマーである。これらのポリマーは生分解性を有し、熱可塑性高分子であること、また、再生可能資源から産生されることから、環境調和型素材または生体適合型素材として工業的に生産し、多様な産業へ利用する試みが行われている。
【０００３】
このポリエステルを構成するモノマー単位は一般名３−ヒドロキシアルカン酸であって、具体的には３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、あるいはよりアルキル鎖の長い３−ヒドロキシアルカン酸が単独重合もしくは共重合することにより、ポリマー分子が形成されている。３−ヒドロキシ酪酸（以下３ＨＢと略す）のホモポリマーであるポリ−３−ヒドロキシ酪酸（以下、Ｐ（３ＨＢ）と略す）は、１９２５年にバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）で最初に発見されたが、このＰ（３ＨＢ）は結晶性が高いため、硬くて脆い性質を持っており、実用的には応用範囲が限られている。この為、この性質の改良を目的とした研究がなされてきた。
【０００４】
その中で、３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）と３−ヒドロキシ吉草酸（３ＨＶ）とからなる共重合体（以下Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）と略す）の製造方法が開示されている（例えば、特許文献１、特許文献２参照）。このＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）はＰ（３ＨＢ）に比べると柔軟性に富むため、幅広い用途に応用できると考えられた。しかしながら、実際にはＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）は３ＨＶモル分率を増加させても、それに伴う物性の変化が乏しく、特に柔軟性が向上しないため、シャンプーボトルや使い捨て剃刀の取っ手等、硬質成型体の分野にしか利用されなかった。
【０００５】
また、アルキル鎖の炭素数が６〜１６の３−ヒドロキシアルカン酸で構成される中鎖ＰＨＡはＰ（３ＨＢ）やＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）よりも結晶性が低く、弾力に富むことが知られており（非特許文献１参照）、異なる分野への用途が期待されている。中鎖ＰＨＡの製造研究はシュードモナス属のＰＨＡ合成酵素遺伝子を、シュードモナス属、ラルストニア属、大腸菌に導入することによって行われてきたが、いずれも生産性が低く工業生産に適したものではなかった（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４参照）。
【０００６】
近年、３ＨＢと３−ヒドロキシヘキサン酸（以下、３ＨＨと略す）との２成分共重合ポリエステル（以下Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）と略す）およびその製造方法について研究がなされている（特許文献３、特許文献４参照）。前記先行文献におけるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の製造方法は、土壌より単離されたアエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）を用いてオレイン酸等の脂肪酸やオリーブオイル等の油脂から発酵生産するものであった。また、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の性質に関する研究もなされている（非特許文献５参照）。前記先行文献では炭素数が１２個以上の脂肪酸を唯一の炭素源としてアエロモナス・キャビエを培養し、３ＨＨ組成が１１〜１９ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を発酵生産している。このＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は３ＨＨ組成の増加にしたがって、Ｐ（３ＨＢ）の硬くて脆い性質から次第に柔軟な性質を示すようになり、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）を上回る柔軟性を示すことが明らかにされた。すなわちＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は３ＨＨ組成を変えることで、硬質ポリエステルから軟質ポリエステルまで応用可能な幅広い物性を持つため、テレビの筐体等のように硬さを要求されるものからフィルム等のように柔軟性を要求されるものまで、幅広い分野への応用が期待できる。しかしながら、本製造方法では菌体生産量４ｇ／Ｌ、ポリエステル含量３０％とポリエステル生産性は低いものであり、本ポリエステルの実用化に向けた生産方法としては未だ不十分と言わざるを得なかったため、実用化に向けて更に高い生産性が得られる方法が探索されてきた。
【０００７】
Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の工業生産を目指した取組みもなされている。アエロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）を用いた培養では、オレイン酸を炭素源とした４３時間の流加培養において、菌体生産量９５．７ｇ／Ｌ、ポリエステル含量４５．２％、３ＨＨ組成１７％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）が生産された（非特許文献６参照）。また、アエロモナス・ハイドロフィラを炭素源としてグルコース及びラウリン酸を用いて培養し、菌体生産量５０ｇ／Ｌ、ポリエステル含量５０％を達成した（非特許文献７参照）。しかしながら、アエロモナス・ハイドロフィラはヒトに対して病原性を有することから（非特許文献８参照）、工業生産に適した種とはいえない。また、これらの培養生産では高価な炭素源を使用するため、製造コストの観点より安価な炭素源の利用も求められている。
【０００８】
このため、安全な宿主での生産及び生産性の向上を目指した取組みが行なわれた。アエロモナス・キャビエよりポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）合成酵素遺伝子がクローニングされた（特許文献５、非特許文献９参照）。本遺伝子をワーテルシア・ユートロファ（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ、旧ラルストニア・ユートロファ）に導入した形質転換体を用いてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産を行った結果、菌体生産性は４ｇ／Ｌ、ポリエステル含量は３０％であった。更に本形質転換体を炭素源として植物油脂を用いて培養した結果、菌体生産量４ｇ／Ｌ、ポリエステル含量８０％が達成された（非特許文献１０参照）。更に培養条件の改善により、菌体生産量４５ｇ／Ｌ、ポリエステル含量６２．５％、３ＨＨ組成８．１％にまで向上したように、培養方法に関する研究もなされている（特許文献６参照）。
また、フラクトースを炭素源としてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産できるワーテルシア・ユートロファも構築されたが、本菌株のポリエステル生産性は低く、実生産に適しているとはいえなかった（非特許文献１１参照）。
【０００９】
大腸菌を宿主としたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）生産株も構築された。アエロモナス属のＰＨＡ合成酵素遺伝子及びワーテルシア・ユートロファのＮＡＤＰ−アセトアセチルＣｏ―Ａ還元酵素遺伝子等を大腸菌に導入した株が構築された。ドデカンを炭素源として同大腸菌を培養した結果、４０．８時間の培養で菌体量７９ｇ／Ｌ、ポリエステル含量２７．２％、３ＨＨ組成１０．８％という生産性であった（非特許文献１２参照）。
【００１０】
Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産性向上並びに３ＨＨ組成制御を目指して、ＰＨＡ合成酵素の人為的な改変が行なわれた。アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素変異体のなかで、１４９番目のアミノ酸アスパラギンがセリンに置換された変異体酵素や、１７１番目のアスパラギン酸がグリシンに置換された変異体酵素は、大腸菌内でのＰＨＡ合成酵素活性や３ＨＨ組成が向上していることが示された（非特許文献１３参照）。また、同酵素の５１８番目のフェニルアラニンがイソロイシンに置換された変異体酵素や２１４番目のバリンがグリシンに置換された変異体酵素は大腸菌でのＰＨＡ合成酵素活性やポリエステル含量が向上したことが報告されている（非特許文献１４参照）。しかし、これらは宿主として特殊な大腸菌を用いており未だポリエステル含量は低い。
【００１１】
実用的物性に優れたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を大腸菌に産生させるためには基質モノマー供給のための遺伝子をさらに共存させる必要や、または高価な脂肪酸などを培地へ供給させる必要があり、なお、高い生産効率を達成するための妨げになっている。
Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を高生産性で商業生産するためには、安全性、モノマー基質供給量や原材料の観点から宿主としてワーテルシア・ユートロファのＰ（３ＨＢ）非生産株、すなわちＰＨＢ−４株を宿主として使用することがより合理的であると考えられてきたが、更なる生産性向上が求められていた。
【特許文献１】特開昭５７−１５０３９３号公報
【特許文献２】特開昭５９−２２０１９２号公報
【特許文献３】特開平５−９３０４９号公報
【特許文献４】特開平７−２６５０６５号公報
【特許文献５】米国特許第６１４３５１８号明細書
【特許文献６】米国特許第４７６００２２号明細書
【非特許文献１】Ｍａｄｉｓｏｎ等、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，６３：２１−５３（１９９９）
【非特許文献２】Ｍａｔｓｕｓａｋｉ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８０：６４５９−６４６７（１９９８）
【非特許文献３】Ｍａｔｓｕｓａｋｉ等、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３：４０１−４０９（２０００）
【非特許文献４】Ｌａｎｇｅｎｂａｃｈ等、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１５０：３０３−３０９（１９９７）
【非特許文献５】Ｄｏｉ等、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２８：４８２２−４８２８（１９９５）
【非特許文献６】Ｌｅｅ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，６７：２４０−２４４（２０００）
【非特許文献７】Ｃｈｅｎ等、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５７：５０−５５（２００１）
【非特許文献８】国立感染症研究所  病原体等安全管理規定  別表１付表１（１９９９）
【非特許文献９】Ｆｕｋｕｉ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９：４８２１−４８３０（１９９７）
【非特許文献１０】Ｆｕｋｕｉ等、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ．，４９：３３３―３３６（１９９８）
【非特許文献１１】Ｆｕｋｕｉ等、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，３：６１８−６２４（２００２）
【非特許文献１２】Ｐａｒｋ等、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２：２４８−２５４（２００１）
【非特許文献１３】Ｋｉｃｈｉｓｅ等、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６８：２４１１−２４１９（２００２）
【非特許文献１４】Ａｍａｒａ等、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５９：４７７−４８２（２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
以上のように、ＰＨＡの効率的商業生産には未だ多くの課題が存在した。そこで本発明では、工業的規模の培養プロセスにおいて、ＰＨＡ、特に広範な用途が期待できるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を高レベルで生産する組換え微生物株を提供すること、およびそれを利用したＰＨＡの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らはＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を商業的に高生産する方法を鋭意研究した結果、従来用いられてきたＰＨＢ−４株の代わりに、部位特異的変異によってＰＨＡ非生産性とした微生物を宿主として使用することにより、ＰＨＡの生産性を向上させることが可能であることを見出した。
これまでの遺伝子組換えを利用したＰＨＡ生産では、代表的なＰ（３ＨＢ）非生産株であるワーテルシア・ユートロファＰＨＢ−４株（ＤＳＭ  Ｎｏ．５４１，以下ＰＨＢ−４株）がその宿主として多く用いられてきた。ＰＨＢ−４株は、１９７０年にワーテルシア・ユートロファ（当時名ハイドロゲノモナス）の野生株であるＨ１６株（ＤＳＭ  Ｎｏ．４２８、以下Ｈ１６株）から変異剤を用いた突然変異処理によって作製された菌株である（Ｈ．Ｇ．Ｓｃｈｌｅｇｅｌ等、Ａｒｃｈ．Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ．７１：２８３−２９４，（１９７０））。非特異的な変異剤によって処理された株であるため、目的としたＰ（３ＨＢ）非生産という点だけでなく、その他の遺伝子にも変異が導入されている可能性を否定できない。事実、Ｈ．Ｇ．Ｓｃｈｌｅｇｅｌ等によると、ＰＨＢ−４株は親株Ｈ１６株と比べて増殖能力やある種の生物活性が劣っており、ＰＨＡ生産用宿主株として最高の生産能力を発揮できているかどうか不明であった。
【００１４】
ワーテルシア・ユートロファにおける染色体遺伝子の部位特異的変異は、Ｙｏｒｋ等、Ｐｏｔｔｅｒ等（Ｙｏｒｋ等、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１８０（１）：５９−６６（２００２）、Ｐｏｔｔｅｒ等、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１５１：８２５（２００５））によっても開示されている。しかし、この報告では、ワーテルシア・ユートロファｐｈｂＣ遺伝子破壊株や不活性株をＰＨＡ合成酵素遺伝子発現ベクターの宿主株として用いてはおらず、その生産性等は、ＰＨＢ−４株を宿主とした場合との優劣が不明であった。
【００１５】
そこで本発明者等は、ワーテルシア・ユートロファ  Ｈ１６株の染色体上に存在するＰ（３ＨＢ）合成酵素遺伝子ｐｈｂＣを塩基配列の相同組換えを用いて部位特異的に破壊し、Ｐ（３ＨＢ）非生産という性質のみが野生株と異なる宿主用株を種々作製した。
これらのｐｈｂＣ遺伝子破壊株を宿主とし、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）合成酵素遺伝子発現プラスミドを導入することにより、従来よりも飛躍的に生産性が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
即ち、第一の本発明は、
（１）部位特異的変異により微生物が本来有しているポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子のみを不活性化した微生物を宿主として用い、外因性のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を導入して得られた形質転換体を培養することを特徴とする生分解性ポリエステルの製造方法、
（２）生分解性ポリエステルが３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸とのモノマー単位で構成されることを特徴とする上記記載の製造方法、
（３）微生物がワーテルシア・ユートロファである上記記載の製造方法、
（４）微生物がワーテルシア・ユートロファ  Ｈ１６株である上記記載の製造方法、
（５）宿主が配列番号２４に示すポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子内部の塩基を欠失、置換又は挿入した変異株である上記記載の製造方法、
（６）宿主が配列番号２４に示すポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子内部のＢｇｌＩＩからＢｃｌＩ間を欠失させた株である上記記載の製造方法、
（７）宿主が配列番号２４に示すポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子内部のＳａｃＩからＳａｃＩ間を欠失させた株である上記記載の製造方法、
（８）宿主が配列番号２４に示すポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子の３１９番目のアミノ酸であるシステインをアラニンに変異させた株である上記記載の製造方法、
（９）宿主が配列番号２４に示すポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子の１０７番目のアミノ酸であるトリプトファンをコードするコドンをストップコドンに変異させた株である上記記載の製造方法、
（１０）宿主が配列番号２４に示すポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を完全に欠失させた株である上記記載の製造方法、
に関する。
第二の本発明は、
（１１）配列番号２４に示すポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子のＢｇｌＩＩからＢｃｌＩ間を欠失させることによってポリヒドロキシアルカン酸非生産性となった変異株、
（１２）配列番号２４に示すポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子のＳａｃＩからＳａｃＩ間を欠失させることによってポリヒドロキシアルカン酸非生産性となった変異株、
（１３）配列番号２４に示すポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子の１０７番目のアミノ酸であるトリプトファンをコードするコドンをストップコドンに変異させることによってポリヒドロキシアルカン酸非生産性となった変異株、
（１４）上記記載の変異株を用いて得られた形質転換体、
に関する。
第三の本発明は、
（１５）上記記載の変異株を宿主として用い、外因性のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を導入して得られた形質転換体を培養することを特徴とする生分解性ポリエステルの製造方法、
（１６）生分解性ポリエステルが３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸をモノマー単位で構成されることを特徴とする上記記載の生分解性ポリエステルの製造方法、
に関する。
【００１７】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明における生分解性ポリエステルとは、以下の一般式：
【００１８】
【化１】
2007259708.tif 000002
【００１９】
（式中、Ｒ１及びＲ２は炭素数１以上であるアルキル基を表し、ポリマー中同一でも異なっていてもよい。ｍおよびｎは該ポリマーを構成するモノマー単位数を表し、１以上の整数である）で表される３−ヒドロキシアルカン酸をモノマー単位とする重合体であり、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシヘプタン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシノナン酸、３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシウンデカン酸、３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシトリデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシペンタデカン酸、３−ヒドロキシヘキサデカン酸からなる群より選択されるモノマー単位の２種以上から構成される共重合ポリマーが好ましい。より好ましくは、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸とのモノマー単位で構成される共重合ポリマーであるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）である。
【００２０】
本発明で用いる宿主用微生物は、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を生物種として原初的にその染色体ＤＮＡ等に有する微生物であれば特に制限なく使用することができ、別の炭素源が利用できるように改変された微生物、基質モノマーの生成や取り込み能が改変された微生物、または生産を増大するように改変された微生物を含む。例としては、Ｗａｕｔｅｒｓｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ（分類学上、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒと同一）、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ等の細菌類が含まれる。安全性及び生産性の観点から好ましくはＷａｕｔｅｒｓｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａであり、より好ましくはＷａｕｔｅｒｓｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株である。
【００２１】
染色体上の遺伝子を部位特異的に変異する方法は当業者に周知である。代表的な方法としてはトランスポゾンと相同組換えの機構を利用した方法（Ｏｈｍａｎ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６２：１０６８−１０７４（１９８５））や相同組換えの機構によって起こる部位特異的な組み込みと第二段階の相同組換えによる脱落を原理とした方法（Ｎｏｔｉ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４：１９７−２１７（１９８７））などがあり、また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｓａｃＢ遺伝子を共存させて、第二段階の相同組換えによって遺伝子が脱落した微生物株をシュークロース耐性株として容易に単離する方法（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６：１１９５−１２０４（１９９２）、Ｌｅｎｚ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７６：４３８５−４３９３（１９９４））も利用することができるが、染色体上のＰＨＡ合成酵素遺伝子を不活性化できればその方法は特に制限されない。
【００２２】
以下に、ＰＨＡ合成酵素遺伝子（ｐｈｂＣ）を特異的に不活性化する方法を、Ｗａｕｔｅｒｓｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株を例に挙げてより具体的に例示する。
まず、変異断片を作製する。Ｗａｕｔｅｒｓｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株のＰＨＡ合成酵素遺伝子はこれまで多数の研究者により解析され、その３１９番目のアミノ酸であるシステイン残基（以下Ｃ３１９）が活性中心であることが明らかになっている（Ｙｏｒｋ等、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１８０（１）：５９−６６（２００２））。従って、このＰＨＡ合成酵素遺伝子を不活性化するには、配列番号２４に示すポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子内部の塩基を欠失、置換又は挿入すること、より具体的には、Ｃ３１９を含む適当な遺伝子断片を欠失させること、塩基の挿入や欠失によって以後のアミノ酸配列を変化させるフレームシフトを起こさせること、又は３１９番目のアミノ酸であるシステインを別のアミノ酸に変異させること（例えば、システインをアラニンに変異させるＣ３１９Ａ変異）等、ＰＨＡ合成酵素活性発現に重要なアミノ酸残基を置換させること等が挙げられる。すなわち、例えばＰＨＡ合成酵素活性中心部分の塩基配列を含まないＤＮＡ断片との置換や、配列番号２４で示すＤＮＡの制限酵素ＢｇｌＩＩ部位−ＢｃｌＩ部位間の欠失、制限酵素ＳａｃＩ部位間の欠失、或いはストップコドンの導入や配列番号２４の完全な欠失等によりＰＨＡ合成酵素遺伝子を不活性化することができる。また、染色体上に存在する配列番号２４の約１０塩基上流のリボソーム結合配列（ＳＤ配列）を改変することによってもＰＨＡ合成酵素遺伝子の不活性化は可能である。
配列番号２４で示すＤＮＡにおいて、制限酵素ＢｇｌＩＩ部位は１９５番目のアミノ酸辺りに、ＢｃｌＩ部位は５１３番目のアミノ酸辺りに存在する。また、ＳａｃＩ部位は２６０番目のアミノ酸辺りと４５０番目のアミノ酸辺りに存在する。
上記ストップコドンの導入は、例えば、配列番号２４で示すアミノ酸配列の１０７番目のアミノ酸であるトリプトファンをコードするコドンをストップコドンに変異させること（Ｗ１０７＊変異）等が挙げられる。
【００２３】
変異断片の上流配列と下流配列は、染色体上の遺伝子と相同組換えを起こすために必要な相同配列であって、一般的にはその長さが長いほど組換え頻度は高くなるが、相同組換えさえ起こればよく、その長さは任意に設定できる。上記相同配列は、通常５０ｂｐ以上、好ましくは５００ｂｐ以上あればよい。
【００２４】
変異断片には遺伝子置換の際に選択マーカーとなる遺伝子を付加することができる。選択マーカーとなる遺伝子は例えばカナマイシン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、アンピシリン等の抗生物質の耐性遺伝子や各種の栄養要求性を相補する遺伝子等が使用できる。Ｗａｕｔｅｒｓｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株で行う場合にはカナマイシンの耐性遺伝子が好適である。
さらにそれらに加えて、第二段階の相同組み換えによってマーカー遺伝子が脱落した微生物株の選択を容易にするための遺伝子が付加できる。そのような遺伝子としてはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｓａｃＢ遺伝子が例示できる（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６：１１９５−１２０４（１９９２））。この遺伝子が発現している微生物株はシュークロースを含む培地で生育できないことが知られており、シュークロースを含む培地での生育により、第二段階の相同的組換えによってこの遺伝子を失った株を選択することが容易となる。
【００２５】
これらで構成された変異断片は、宿主微生物株中で自律複製不可能なベクターに接続することによって遺伝子変異用のプラスミドが作製される。ワーテルシア属やシュードモナス属等で利用できるこのようなベクターには、例えば、ｐＵＣベクター、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＢＲ３２２ベクターあるいはそれらと同じ複製起点を持つベクター等が挙げられる。さらには、接合伝達を可能にするｍｏｂ、ｏｒｉＴなどのＤＮＡ配列を共存させることも可能である。
【００２６】
このような構成で作製された遺伝子変異用のプラスミドは、エレクトロポレーション法や接合伝達法などの公知の方法によりＷａｕｔｅｒｓｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株に導入することができる。
次に、相同組換えによって染色体上にプラスミドが挿入された株の選択を行う。選択は遺伝子変異用プラスミドに共存させた選択用の遺伝子に基づいた方法によって行うことができる。カナマイシン耐性遺伝子を用いた場合にはカナマイシンを含む培地で生育してきた株から選ぶことができる。
【００２７】
次の段階で第二の相同組換えによって染色体上からマーカー遺伝子を含む領域が脱落した株を選択する。挿入時に利用した選択用の遺伝子に基づいて、例えばカナマイシンを含む培地で生育できなくなった株を選択してもよいが、ｓａｃＢ遺伝子を遺伝子変異用プラスミドに共存させている場合は、シュークロースを含む培地で生育してくる株から容易に選択できる。遺伝子が変異していることの確認には、ＰＨＡ生産能の有無を簡易的に調べるＮｉｌｅｒｅｄ染色法、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ＤＮＡ塩基配列の決定など、公知の方法が使用できる。以上のようにしてＷａｕｔｅｒｓｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株のＰＨＡ合成酵素遺伝子（ｐｈｂＣ）が不活性化された株を取得することができる。
【００２８】
次に、上記の方法等により作製した宿主用株にＰＨＡ合成酵素発現プラスミドを導入する方法を説明する。
本発明で用いる外因性のＰＨＡ合成酵素遺伝子は各種のＰＨＡ蓄積生物に由来する遺伝子のうち生分解性ポリエステルを蓄積させるものであればどのようなものでもよい。そのような遺伝子としては例えば、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ（非特許文献９）、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｃｏｒａｌｌｉｎａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０１９９６４）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｔｉｍｍ  等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０９：１５−３０（１９９２））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ（Ｈｕｉｓｍａｎ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：２１９１−２１９８（１９９１））、Ｔｈｉｏｃｙｓｔｉｓ  ｖｉｏｌａｃｅａｅ（Ｌｉｅｂｅｒｇｅｓｅｌｌ等、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３８：４９３−５０１（１９９３））などから単離されているＰＨＡ合成酵素遺伝子がある。
【００２９】
また、目的とする酵素活性が失われない範囲内でアミノ酸配列が改変するように、ＰＨＡ合成酵素遺伝子の塩基配列の一部を改変したものも使用することができる。例えば、非特許文献１３に記載されている、１４９番目のアミノ酸のアスパラギンがセリンに置換されたアエロモナス・キャビエ由来であるＰＨＡ合成酵素遺伝子（Ｎ１４９Ｓ変異体遺伝子）、１７１番目のアミノ酸のアスパラギン酸がグリシンに置換されたアエロモナス・キャビエ由来であるＰＨＡ合成酵素遺伝子（Ｄ１７１Ｇ変異体遺伝子）、または、上記の２つのアミノ酸置換が組み合わされたアエロモナス・キャビエ由来であるＰＨＡ合成酵素遺伝子等を好ましく用いることができる。上記の遺伝子はプロモーターおよび／またはリボソーム結合部位を有し得るが、必ずしも必要ではない。
【００３０】
ＰＨＡ合成酵素遺伝子を発現させるベクターはそれぞれ宿主内で自律的複製が可能なベクターであれば、どのようなベクターであっても使用することができる。例えば広宿主域ベクターであるｐＪＲＤ２１５やｐＢＢＲ１やそれらの誘導体を用いることができる。
本発明において、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を発現させるベクターが宿主内で安定して保持されるように、ｐａｒ領域を含有させてもよい。
また、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を発現ベクターで導入する代わりに、ｐｈｂＣ遺伝子を不活性化した株の染色体、メガプラスミド等に前述の相同組換えの機構を利用して外因性のＰＨＡ合成酵素遺伝子を組み込むことも可能である。
【００３１】
発現ベクターは、エレクトロポレーション法や接合伝達法などの公知の方法により宿主用株に導入することができる。
選択マーカーとしては例えばカナマイシン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、アンピシリン等の抗生物質の耐性遺伝子や各種の栄養要求性を相補する遺伝子等が使用できる。ｐＪＲＤ２１５やｐＢＢＲ１を用いた発現ベクターをＷａｕｔｅｒｓｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａに導入する場合には、カナマイシンの耐性遺伝子が好適である。
ポリエステル生産確認の簡易法としては、Ｎｉｌｅｒｅｄを用いた染色法を利用できる。すなわち、組換え菌が生育する寒天培地にＮｉｌｅｒｅｄを加え、組換え菌を１〜７日間培養し、組換え菌が赤変するか否かを観察することにより、ポリエステル生産の有無を確認できる。
【００３２】
本発明において、本発明の微生物を炭素源存在下で増殖させることにより、微生物体内に生分解性ポリエステルを蓄積させることができる。炭素源としては、糖、油脂または脂肪酸等を用いることができる。炭素源以外の栄養源として、窒素源、無機塩類、そのほかの有機栄養源を任意に用いることができる。
糖としては、例えばシュークロース、フラクトース等の炭水化物が挙げられる。油脂としては、炭素数が１０以上である飽和・不飽和脂肪酸を多く含む油脂、例えばヤシ油、パーム油、パーム核油等が挙げられる。脂肪酸としては、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸等の飽和・不飽和脂肪酸、あるいはこれら脂肪酸のエステルや塩等の脂肪酸誘導体が挙げられる。
窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。
無機塩類としては、例えばリン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。
そのほかの有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸；ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。
【００３３】
培養温度は、その菌が生育可能な温度であればよいが、２０℃から４０℃が好ましい。培養時間は、特に制限はないが、１〜１０日間程度で良い。
得られた該培養菌体に蓄積されたポリエステルは公知の方法により回収することができる。例えば次のような方法により行うことができる。培養終了後、培養液から遠心分離器等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてＰＨＡを抽出する。このＰＨＡを含んだ有機溶剤溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてＰＨＡを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてＰＨＡを回収することができる。
【発明の効果】
【００３４】
本発明によれば、産業用発酵課程においてポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）を高生産できる組換え微生物株が提供され、高純度のポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）が簡便かつ大量に、しかも安価に製造することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
以下に実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら制限されるものではない。なお全体的な遺伝子操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８９））に記載されているように行うことができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主等は、市場の供給者から購入し、その説明に従い使用することができる。なお、酵素としては、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。
【００３６】
（実施例１）遺伝子置換用プラスミドの作製
ｐＵＣ１９に新たに制限酵素部位を付与するため、配列番号１の合成ＤＮＡを用いてＨｉｎｄＩＩＩ部位をＮｏｔＩ部位に、更に配列番号２と配列番号３の合成ＤＮＡを用いてＳａｃＩ部位をＳｗａＩに変換したベクターｐＮＳ２Ｘを作製した。続いて、プラスミドｐＭＴ５０７１（Ｔｓｕｄａ、ＧＥＮＥ，２０７：３３−４１（１９９８））を制限酵素ＢａｍＨＩで処理してクロラムフェニコール耐性遺伝子を除去し、代わりにｐＪＲＤ２１５由来のカナマイシン耐性遺伝子を配列番号４と配列番号５を用いてＢａｍＨＩ断片としてＰＣＲ増幅させた断片を挿入してｐＭＴ５０７１−Ｋｍを得た。このプラスミドをＮｏｔＩで切断し、ｏｒｉＴ＋Ｋｍ＋ｓａｃＢ遺伝子を含む約５．７ｋｂのＤＮＡ断片を単離し、ｐＮＳ２ＸのＮｏｔＩ部位に挿入してｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢを作製した。
【００３７】
（実施例２）ｐｈｂＣ遺伝子を含む断片のクローニング
Ｗａｕｔｅｒｓｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株の染色体上のｐｈｂＣ遺伝子を不活性化させるため、まずその上流（プロモーター側）及び下流（ｐｈｂＡ側）遺伝子を含むｐｈｂＣＡ（Ｓｗａ）断片３．１ｋｂをクローニングした。染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号６と配列番号７で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ条件は（１）９５℃で２分、（２）９６℃で１０秒、（３）５５℃で１０秒、（４）６８℃で３分、（２）から（４）を２５サイクル、（５）６８℃で５分であり、ポリメラーゼとしてはＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ製）を用いた。得られた断片をｐＮＳ２ＸのＳｗａＩ部位にサブクローニングしｐＮＳ２Ｘ−ｐｈｂＣＡ（Ｓｗａ）を作製した。
【００３８】
（実施例３）ｐｈｂＣ不活性化断片の調製
前述したようにｐｈｂＣ酵素の活性中心は３１９番目のアミノ酸であるシステインとされている。従って不活性化は、１）ＢｇｌＩＩからＢｃｌＩ間の欠失、２）ＳａｃＩ間の欠失、３）Ｃ３１９Ａ変異導入、４）Ｗ１０７＊変異導入、５）ｐｈｂＣ遺伝子の完全欠失、の５種類で行った。以下にそれぞれの作製方法を示す。
１）ＢｇｌＩＩ及びＢｃｌＩ間の欠失
ｐｈｂＣ遺伝子の中で、ＢｇｌＩＩ部位は１９５番目のアミノ酸辺りに、またＢｃｌＩ部位は５１３番目のアミノ酸辺りに存在する。従って実施例２のｐＮＳ２Ｘ−ｐｈｂＣＡ（Ｓｗａ）をＢｇｌＩＩ及びＢｃｌＩで切断し、そのまま連結反応を行って中間部分が欠失したクローンｐＮＳ２Ｘ−ｐｈｂＣＡ（ΔＢ）を得た。
２）ＳａｃＩ間の欠失
ｐｈｂＣ遺伝子の中でＳａｃＩ部位は２６０番目のアミノ酸辺りと４５０番目のアミノ酸辺りに存在する。従って実施例２のｐＮＳ２Ｘ−ｐｈｂＣＡ（Ｓｗａ）をＳａｃＩで切断し、そのまま連結反応を行って中間部分が欠失したクローンｐＮＳ２Ｘ−ｐｈｂＣＡ（ΔＳ）を得た。
３）Ｃ３１９Ａ変異導入
Ｙｏｒｋ等によれば、３１９番目のアミノ酸であるシステインをアラニンに変換するとｐｈｂＣ酵素活性が消失する。従って、配列番号６と配列番号８を用いてｐｈｂＣＡ（Ｓｗａ）の前半部分を増幅させ、配列番号９と配列番号７を用いてｐｈｂＣＡ（Ｓｗａ）の後半部分を増幅させた。その後、２つの増幅断片を混合し、オーバーラップＰＣＲを行った。増幅した断片をＳｗａＩで切断し、ｐＮＳ２ＸのＳｗａＩ部位に挿入してｐＮＳ２Ｘ−ｐｈｂＣＡ（Ｃ３１９Ａ）を得た。
４）Ｗ１０７＊変異導入
Ｗａｕｔｅｒｓｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａのＰ（３ＨＢ）非生産変異株であるＰＨＢ−４株のｐｈｂＣ遺伝子の塩基配列を決定したところ、１０７番目のアミノ酸であるトリプトファン（ＴＧＧ）がストップコドン（ＴＡＧ）に置換されており、その後の蛋白合成が行われていない可能性が高いことが分かった。従ってこの変異と同じ変異を導入することによってｐｈｂＣ遺伝子の不活性化を行った。すなわち、ＰＨＢ−４株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号６と配列番号７で示したプライマーを用いてＰＣＲを行った。鋳型が異なる点以外は実施例２と同条件である。その後、ＳｗａＩで切断し、ｐＮＳ２ＸのＳｗａＩ部位に挿入してｐＮＳ２Ｘ−ｐｈｂＣＡ（Ｗ１０７＊）を得た。
５）ｐｈｂＣ遺伝子の完全欠失
ｐｈｂＣ遺伝子のＡＴＧコドンから下流側ｐｈｂＡ遺伝子のＡＴＧコドン直前までを正確に欠失させた変異体断片は以下のようにして作製した。配列番号６と配列番号１０でプロモーターを含む断片をＰＣＲで増幅させた。また配列番号１１と配列番号７でｐｈｂＡ遺伝子のＡＴＧコドンからの一部をＰＣＲで増幅させた。それぞれの断片をＳｗａＩ及びＢｓｐＨＩで切断後、ｐＮＳ２ＸのＳｗａＩ部位に挿入してｐＮＳ２Ｘ−ｐｈｂＣＡ（ｄ−ｐｈｂＣ）を得た。
【００３９】
（実施例４）変異ｐｈｂＣ遺伝子導入用プラスミドの構築
実施例３で構築したｐＮＳ２Ｘ−ｐｈｂＣＡ（ΔＢ）、ｐＮＳ２Ｘ−ｐｈｂＣＡ（ΔＳ）、ｐＮＳ２Ｘ−ｐｈｂＣＡ（Ｃ３１９Ａ）、ｐＮＳ２Ｘ−ｐｈｂＣＡ（Ｗ１０７＊）、ｐＮＳ２Ｘ−ｐｈｂＣＡ（ｄ−ｐｈｂＣ）をそれぞれＳｗａＩで処理し、それぞれから変異導入ＳｗａＩ断片を調製した。その断片を実施例１で作製したｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢのＳｗａＩに挿入し、ｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ−ｐｈｂＣＡ（ΔＢ）、ｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ−ｐｈｂＣＡ（ΔＳ）、ｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ−ｐｈｂＣＡ（Ｃ３１９Ａ）、ｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ−ｐｈｂＣＡ（Ｗ１０７＊）、ｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ−ｐｈｂＣＡ（ｄ−ｐｈｂＣ）をそれぞれ構築した。
【００４０】
（実施例５）変異ｐｈｂＣ遺伝子導入株の作製
実施例４で構築した５種類の変異ｐｈｂＣ遺伝子導入用プラスミドで大腸菌Ｓ１７−１株（ＡＴＣＣ４７００５）を形質転換し、Ｗａｕｔｅｒｓｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株とＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。
２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ／Ｌ、リン酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがＷａｕｔｅｒｓｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をカナマイシンを含まないＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株を選択してカナマイシン感受性且つＰ（３ＨＢ）非生産株を取得した。さらにＰＣＲ或いは塩基配列の解析を行い、ｐｈｂＣ遺伝子が目的通り変異導入されていることを確認した。これにより、ＢｇｌＩＩ及びＢｃｌＩ間の欠失変異株としてΔＢ１１３３株、ＳａｃＩ間の欠失変異株としてΔＳ１３１２３株、Ｃ３１９Ａ変異株としてＣ７株、Ｗ１０７＊変異株としてＰ３株、ｐｈｂＣ遺伝子の完全欠失変異株としてｄ１株をそれぞれ作製した。
【００４１】
（実施例６）プラスミドベクターｐＣＵＰ２の作製
本実施例において、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を導入するプラスミドベクターとしては、Ｗａｕｔｅｒｓｉａ属細菌にて使用可能なものであれば特に制限はない。本実施例にて作製したプラスミドベクターは、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ  ＣＨ３４株が保有するメガプラスミド（ｐＭＯＬ２８）の複製開始領域（配列番号１２）及び配列番号１３に記載のｐａｒ領域を含んでいる。
具体的な作製手順としては、まず、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ  ＣＨ３４株からＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を使用し、メガプラスミドを含むＤＮＡを調製、このＤＮＡを鋳型に、配列番号１４及び１５に記載のプライマーを用いてＰＣＲ法によって約４ｋｂｐの配列番号１２及び１３の配列を含むＤＮＡ領域を増幅した。ＰＣＲ条件は（１）９８℃で２分、（２）９８℃で３０秒、（３）５５℃で３０秒、（４）７２℃で５分、（２）から（４）を３０サイクル、（５）７２℃で５分であり、ポリメラーゼとしてはＴａＫａＲａ  Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いた。増幅断片を大腸菌用のクローニングベクターｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ２−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。
【００４２】
次に、配列番号１６及び１７に記載のプライマーを用いてＰＣＲ法によってｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ２−ＴＯＰＯベクターの２０６１ｂｐ−２７０２ｂｐ領域の両端より外側に向かって増幅反応を行い、ＤＮＡリガーゼキット（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））で連結することにより６４１ｂｐを欠失させたベクターｐＣＵＰを作製した（図１）。ＰＣＲ条件は（１）９８℃で２分、（２）９８℃で３０秒、（３）５５℃で３０秒、（４）７２℃で７分、（２）から（４）を３０サイクル、（５）７２℃で７分であり、ポリメラーゼとしてはＴａＫａＲａ  Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いた。
更にプラスミドベクターへの遺伝子挿入を容易にするため、得られたｐＣＵＰに制限酵素ＭｕｎＩサイトを導入した。具体的な作製手順としては、まず配列番号１８及び１９に記載のプライマーを用いてｐＣＵＰを鋳型にしてＰＣＲを行い、増幅断片をＤＮＡリガーゼキット（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））で連結し、図２に示されるｐＣＵＰ２を作製した。ＰＣＲ条件は（１）９８℃で２分、（２）９８℃で３０秒、（３）５５℃で３０秒、（４）７２℃で５分、（２）から（４）を３０サイクル、である。ポリメラーゼとしてはＴａＫａＲａ  Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いた。このようにして、配列番号１２で示されるＤＮＡ領域及び配列番号１３で示されるＤＮＡ領域を含有し、ｍｏｂ遺伝子群及びｏｒｉＴ配列など接合伝達に関与する遺伝子を含有しないプラスミドベクターｐＣＵＰ２を作製した。
【００４３】
（実施例７）Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）合成酵素発現ベクターの構築
アエロモナス・キャビエ由来のＮ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ変異体遺伝子断片は、国際公開第２００５／０９８００１号パンフレットに記載されているようにＰＣＲ法により作製した。次にプロモーター領域の変換を行った。すなわち、Ｈ１６株の染色体を鋳型とし、配列番号２０と配列番号２１とでＰＣＲを行い、ｐｈｂオペロンプロモーター断片（約４６０ｂｐ）を得た。また、Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ断片を鋳型に配列番号２２と配列番号２３とでＰＣＲを行い、増幅断片を得た。それぞれの断片をＥｃｏＲＩ及びＢｓｐＴ１０４Ｉで切断し、ｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部位に挿入してＥＥＲＥＰ１４９ＮＳ／１７１ＤＧ断片を得た。この断片を実施例６で作製したｐＣＵＰ２をＭｕｎＩで切断した部位に挿入して図３に示す発現ベクターｐＣＵＰ２ＥＥＲＥＰ１４９ＮＳ／１７１ＤＧを構築した。
【００４４】
（実施例８）形質転換体の作製
実施例７で得られた発現ベクターを導入した各種ｐｈｂＣ遺伝子変異株（５種）の形質転換体を電気パルス法により作製した。つまり、遺伝子導入装置はＢｉｏｒａｄ社製のジーンパルサーを用い、キュベットは同じくＢｉｏｒａｄ社製のｇａｐ０．２ｃｍのものを用いた。キュベットに、コンピテント細胞４００μｌと発現ベクター２０μｌを注入してパルス装置にセットし、静電容量２５μＦ、電圧１．５ｋＶ、抵抗値８００Ωの条件で電気パルスをかけた。パルス後、キュベット内の菌液をＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ培地（ＤＩＦＣＯ社製）で３０℃、３時間振とう培養し、選択プレート（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地（ＤＩＦＣＯ社製）、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌ）で、３０℃にて２日間培養して、形質転換体を取得した。
【００４５】
（実施例９）Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産と精製
種母培地の組成は１ｗ／ｖ％  Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％  Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．２ｗ／ｖ％  Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．８とした。
前培養培地の組成は１．１ｗ／ｖ％  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％  ＫＨ２ＰＯ４、１．２９ｗ／ｖ％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．５ｗ／ｖ％パームＷオレイン油、０．５ｖ／ｖ％微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％  ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの。）、５×１０−６ｗ／ｖ％  カナマイシンとした。
【００４６】
ポリエステル生産培地の組成は０．３８５ｗ／ｖ％  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．０６７ｗ／ｖ％  ＫＨ２ＰＯ４、０・２９１ｗ／ｖ％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％  微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％  ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの。）、０．０５ｗ／ｖ％ＢＩＯＳＰＵＲＥＸ２００Ｋ（消泡剤：コグニスジャパン製）、５×１０−６ｗ／ｖ％  カナマイシンとした。炭素源はパーム核油を分別した低融点画分であるパーム核油オレインを単一炭素源として用い、培養全般を通じ、比基質供給速度が０．０８〜０．１（ｇ油脂）×（ｇ正味乾燥菌体重量）−１×（ｈ）−１となるように流加した。
【００４７】
実施例８で作製した各種形質転換株のグリセロールストック（５０μｌ）を種母培地（１０ｍｌ）に接種して２４時間培養し、１．８Ｌの前培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ−３００型）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３０℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７〜６．８の間でコントロールしながら２８時間培養した。ｐＨコントロールには７％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。
ポリエステル生産培養は６Ｌの生産培地を入れた１０Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ−１０００型）に前培養種母を５．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度２８℃、攪拌速度４００ｒｐｍ、通気量３．６Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７から６．８の間でコントロールした。ｐＨコントロールには７％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。培養は約６５時間行い、培養終了後、遠心分離によって菌体を回収、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。
得られた乾燥菌体約１ｇに１００ｍｌのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のポリエステルを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が約３０ｍｌになるまで濃縮後、約９０ｍｌのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置した。析出したポリエステルをろ別後、５０℃で３時間真空乾燥した。乾燥ポリエステルの重量を測定し、ポリエステル生産量を算出した。その結果を表１に示す。
【００４８】
【表１】
2007259708.tif 000003
【００４９】
（比較例１）
従来の菌株であるＰＨＢ−４株を宿主とし、発現ベクターｐＪＲＤ１４９ＮＳ／１７１ＤＧ（国際公開第２００５／０９８００１号パンフレット）を導入した形質転換体を同様の方法にて培養した。また、同発現ベクターをΔＢ１１３３株及びΔＳ１３１２３株に導入した形質転換体も同様の方法にて培養した。結果を表２に示す。
【００５０】
【表２】
2007259708.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明は、生分解性ポリエステルであるポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）の商業的生産に有用な、改良された微生物株と、それを利用するＰＨＡの製造方法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】ｐＣＵＰの遺伝子及び制限酵素地図。
【図２】ｐＣＵＰ２の遺伝子及び制限酵素地図。
【図３】ｐＣＵＰ２ＥＥＲＥＰ１４９ＮＳ／１７１ＤＧの遺伝子及び制限酵素地図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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