(57)【要約】【課題】本発明は、励起光照射光学系と観測光学系がその光軸を共有しながら、励起光ならびに観測光の光量損失が低減された同軸落射型顕微蛍光観測装置を提供することを目的とする。【解決手段】同軸落射型顕微蛍光観測装置において、ビーム径が拡大されたレーザー光を励起光として用い、ピンホールＰを介して所定のビーム径に調整したレーザー光を集光レンズ１６によって光軸Ｋ１と光軸Ｋ２の交点Ｘに集光させ、折り返し反射部１８の反射面において反射させる。反射光は、対物レンズ２０を透過して再び所定のビーム径を有するレーザー光束となりサンプル３２の全面を照射する。照射されたサンプルが発光する蛍光は、対物レンズ２０、結像レンズ２８等を経て、撮像系３０において鮮明な蛍光像として結像する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザー光を発生する励起光源と、開口部が形成されたピンホール形成部と、第１の光軸を有するレーザー集光レンズと、反射面を有する折り返し反射部と、第２の光軸を有する対物レンズとを含む同軸落射型顕微蛍光観測装置であって、
前記開口部が前記第１の光軸上であって前記励起光源と前記レーザー集光レンズとの間に配置され、
前記反射面が前記第１の光軸と前記第２の光軸の交点を含み、
前記レーザー集光レンズの物体側主点と前記交点の離間距離が、前記レーザー集光レンズの物体側焦点距離に等しく、
前記対物レンズの光源側主点と前記交点の離間距離が前記対物レンズの光源側焦点距離に等しい
同軸落射型顕微蛍光観測装置。
【請求項２】
前記開口部と前記第１の光軸の交点と前記レーザー集光レンズの光源側主点の離間距離が、前記レーザー集光レンズの光源側焦点距離に等しい、
請求項１に記載の同軸落射型顕微蛍光観測装置。
【請求項３】
前記対物レンズの物体側主点と前記レーザー光の照射表面の離間距離が、前記対物レンズの物体側焦点距離に等しい、
請求項１または２のいずれか１項に記載の同軸落射型顕微蛍光観測装置。
【請求項４】
前記励起光源と前記ピンホール形成部との間にさらにビームエクスパンダを備える、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の同軸落射型顕微蛍光観測装置。
【請求項５】
２以上の前記励起光源と前記ピンホール形成部と間にさらにレーザー切替光学系を備える、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の同軸落射型顕微蛍光観測装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微蛍光観測装置に関し、より詳細には、励起光ならびに観測光の光量損失が低減された同軸落射型顕微蛍光観測装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、癌などの遺伝子に起因する病気の検査等においてＤＮＡチップが用いられており、ＤＮＡチップとは、数ｍｍ〜数十ｍｍ四方のガラス等の基板の上に、既知の塩基配列を有するポリヌクレオチドを各スポットごとに固定して形成されるものをいう。ＤＮＡチップを用いた検査においては、まず、検査対象のポリヌクレオチドを蛍光色素でラベルしたのちに、ＤＮＡチップ上に固定されたポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせる。その後、ラベルした蛍光色素の吸収バンドに合致する波長の励起光をＤＮＡチップに対して照射し、その結果発せられる蛍光を観測することによって、所望の遺伝子の発現状態を解析することが可能となる。
【０００３】
従来、このようなＤＮＡチップの全体の蛍光画像を撮像するために、いわゆる同軸落射顕微鏡が用いられてきた。図６は、一般的な同軸落射顕微鏡５０の光学系を概略的に示す図である。同軸落射顕微鏡５０は、励起光照射光学系と観測光学系とから構成されており、両光学系は光軸Ｋを共有する。励起光照射光学系は、光源５２、照明レンズ５４、ハーフミラー５６、および対物レンズ５８とを含んで構成されており、光源５２から照射された励起光は、照明レンズ５４を透過した後、ハーフミラー５６によって約半分の光が光軸Ｋに沿って光路を変更されて対物レンズ５８を透過し、サンプル６０を照射する。しかし、この際、光源５２から照射された励起光の残りの半分はハーフミラー５６を透過してしまうため、この励起光照射光学系においては、励起光がサンプル６０に到達するまでに光量の約５０％が損失することになる。
【０００４】
一方、観測光学系は、対物レンズ５８、ハーフミラー５６、結像レンズ６２、およびＣＣＤ素子などを備える撮像系６４を含んで構成されており、上述した励起光によって照射されたサンプル６０が発光する蛍光が対物レンズ５８を透過した後、約半分の光がハーフミラー５６を透過して直進し、結像レンズ６２によって集光され撮像系６４にサンプル６０の蛍光像を結像する。しかし、この観測光学系においても、サンプル６０が発光する蛍光の約半分がハーフミラー５６によって反射されてしまい結像レンズ６２に入射することができないため、観測光の光量の約５０％が損失することになる。したがって、同軸落射顕微鏡５０の光学系全体について総合的にみると、光源５２から励起光をサンプル６０を直接照射して観測する場合に比較して、結果的に観測光の光量の約７５％を損失することになる。ＤＮＡチップ上のサンプルが発する蛍光は一般に微弱であり、図６に示した光学系による同軸落射顕微鏡５０では、遺伝子の発現状態を解析するために充分な鮮明度をもってサンプルを撮像することが困難であった。
【０００５】
この点につき、特開２００５−６２０２３号公報（特許文献１）は、励起光および蛍光の損失を抑えて検出精度を向上させることのできる落射型蛍光測定装置を開示する。特許文献１が開示する落射型蛍光測定装置は、サンプルを斜め下方から照射する励起光照射光学系と、該励起光照射光学系とその光軸を異にする観測光学系とを含んで構成されており、上述した励起光ならびに観測光の光量損失の問題は解決するものの、各光学系の光軸が同軸でないため装置構成が複雑であり、また、そのサンプルの形態が下方から照射することができるものに限定され、なにより、サンプルの全面を蛍光像として同時に結像させることができない。
【特許文献１】特開２００５−６２０２３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記従来技術における課題に鑑みてなされたものであり、本発明は、励起光照射光学系と観測光学系がその光軸を共有しながら、励起光ならびに観測光の光量損失が低減された同軸落射型顕微蛍光観測装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上述した技術課題に鑑み、同軸落射型顕微蛍光観測装置の光学系の構成につき鋭意検討した結果、従来、励起光として用いられてきたレーザー光の指向性に着目し、所定のビーム径に調整されたレーザー光を、一旦、レンズ系によって極小領域に集光させた後反射させ、その反射光を再び別のレンズ系を通してサンプルの全面を照射可能な所定のビーム径を有するレーザー光とする構成を採用することにより、励起光ならびに観測光の光量損失の低減を同時に実現しうることを見出し、本発明に至ったのである。
【０００８】
すなわち、本発明によれば、レーザー光を発生する励起光源と、開口部が形成されたピンホール形成部と、第１の光軸を有するレーザー集光レンズと、反射面を有する折り返し反射部と、第２の光軸を有する対物レンズとを含む同軸落射型顕微蛍光観測装置であって、前記開口部が前記第１の光軸上であって前記励起光源と前記レーザー集光レンズとの間に配置され、前記反射面が前記第１の光軸と前記第２の光軸の交点を含み、前記レーザー集光レンズの物体側主点と前記交点の離間距離が、前記レーザー集光レンズの物体側焦点距離に等しく、前記対物レンズの光源側主点と前記交点の離間距離が前記対物レンズの光源側焦点距離に等しい同軸落射型顕微蛍光観測装置が提供される。
【０００９】
本発明においては、前記開口部と前記第１の光軸の交点と前記レーザー集光レンズの光源側主点の離間距離を前記レーザー集光レンズの光源側焦点距離に等しくすることができ、さらに、前記対物レンズの物体側主点と前記レーザー光の照射表面の離間距離を前記対物レンズの物体側焦点距離に等しくすることができる。
【００１０】
また、本発明においては、前記励起光源と前記ピンホール形成部と間にさらにビームエクスパンダを備えることができ、さらに２以上の前記励起光源と前記ピンホール形成部と間にさらにレーザー切替光学系を備えることができる。
【発明の効果】
【００１１】
上述したように、本発明によれば、励起光照射光学系と観測光学系がその光軸を共有しながら、励起光ならびに観測光の光量損失が低減された同軸落射型顕微蛍光観測装置が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を図面に示した実施の形態をもって説明するが、本発明は、図面に示した実施の形態に限定されるものではない。図１は、本発明の顕微蛍光観測光学系を含む顕微蛍光観測装置１０を示す図である。本発明の顕微蛍光観測装置１０は、同軸落射照明を採用するものであり、励起光照射光学系と観測光学系とを含んで構成される。
【００１３】
本発明の顕微蛍光観測装置１０における励起光照射光学系は、光源としてのレーザー装置１２、ピンホール形成部１４、レーザー集光レンズ１６、折り返し反射部１８、対物レンズ２０を含んで構成されている。光源としてのレーザー装置は、検査対象が含有する蛍光物質の吸収バンドに合致した波長のレーザー光を発生させるものであれば、固体レーザー、気体レーザー、半導体レーザーなど公知のレーザー装置を用いることができる。また、図１に示すように、たとえば、Ｈｅ−Ｎｅレーザー１２aとＹＡＧレーザー１２ｂとを同光軸上に配置し、両レーザー装置の間にレーザー切替光学系２２を配置することによって、検査対象によって２種類以上のレーザー光を切替え可能に構成することもできる。なお、レーザー装置１２から発生したレーザー光は、ビームエクスパンダ２４によってそのビーム径を増大させることができ、照射したいサンプルの面積に関連して適宜その倍率を選択することができる。
【００１４】
レーザー装置１２から発生し、ビームエクスパンダ２４によってそのビーム径が増大されたレーザー光は、ピンホール形成部１４に形成された開口部Ｐを通過する際、開口部Ｐの形状と同じ形状の断面を有する光束に調整される。励起光照射光学系におけるピンホール形成部１４のさらに物体側には、Ｋ１を光軸とするレーザー集光レンズ１６が配設され、またそのさらに物体側には光軸Ｋ１と直交する軸を光軸Ｋ２として対物レンズ２０が配設されている。なお、本発明の励起光照射光学系においては、レーザー集光レンズ１６と対物レンズ２０との間に折り返し反射部１８が配設されており、折り返し反射部１８の後述する反射面が光軸Ｋ１と光軸Ｋ２の交点Ｘを含むように構成されている。
【００１５】
本発明の励起光照射光学系におけるレーザー集光レンズ１６および対物レンズ２０は、充分に離れた波長、たとえば青と赤の波長領域における色収差が最小限に抑制されたレンズを用いることが好ましい。すなわち、使用する励起光の波長領域にわたって焦点距離の変化を最小限に抑えるように設計されたレンズを用いることが好ましく、さらに、球面収差を最小限に抑えるように設計されたレンズを用いることが好ましい。本発明におけるレンズ系としては、アクロマティックレンズを用いることができる。
【００１６】
本発明の顕微蛍光観測装置１０における観測光学系は、対物レンズ２０、干渉フィルター２６、結像レンズ２８、およびＣＣＤ素子などを備える撮像系３０を含んで構成されている。対物レンズ２０と結像レンズ２８は、光軸Ｋ２を共通の光軸としており、対物レンズ２０と結像レンズ２８との間には、干渉フィルター２６が配設されている。本発明においては、干渉フィルター２６を２以上含んで構成することができ、検査対象によって手動または自動にて差替え可能に構成することができる。サンプル３２から発光した蛍光を含む光は、対物レンズ２０を透過し、干渉フィルター２６によって所望の波長成分のみが選択的に透過された後、結像レンズ２８によって集光され撮像系３０において蛍光像が結像するように構成されている。なお、本発明の顕微蛍光観測装置１０は、さらに、ＬＥＤなどによって形成された補助照明３４を設けることができ、また、サンプル３２が固定される手動あるいは電動のＸＹＺ移動ステージを設けることもできる。本発明の顕微蛍光観測装置１０は、上述した光学系の構成を採用することによって、同軸落射照明方式を採用しながらも光量損失を最大限に防止する。以下、その機構を詳細に説明する。
【００１７】
図２は、本発明の顕微蛍光観測装置１０の励起光照射光学系の一部を拡大して示す図である。上述したように、ピンホール形成部１４に形成された開口部Ｐによって、開口部Ｐの形状と同じ形状の断面を有する光束幅に調整されたレーザー光Ｌは、レーザー集光レンズ１６に入射する。レーザー集光レンズ１６は、上述したようにレーザー光Ｌと光軸Ｋ１を共有するものであり、光軸Ｋ１は、対物レンズ２０の光軸Ｋ２と交点Ｘにおいて直交する。
【００１８】
本発明の励起光照射光学系において、レーザー集光レンズ１６の図示しない物体側主点から交点Ｘまでの離間距離が、レーザー集光レンズ１６の物体側焦点距離ｆ２と等しくなるように配置されており、さらに、対物レンズ２０は、対物レンズ２０の図示しない光源側主点から交点Ｘまでの離間距離が、対物レンズ２０の光源側焦点距離ｆ３と等しくなるように配置されている。なお、レーザー光Ｌは、ほとんど平行光線であるが、厳密にはわずかに発散光になっているため、本発明においては、レーザー集光レンズ１６は、ピンホール形成部１４の開口部Ｐと光軸Ｋ１との交点Ｙからレーザー集光レンズ１６の図示しない光源側主点までの離間距離が、レーザー集光レンズ１６の光源側焦点距離ｆ１と等しくなるように配置することが好ましい。このように配置することによって、ピンホール形成部１４に形成された開口部Ｐの像を、サンプル３２の被照射表面において鮮明に結像させることが可能になり、サンプル３２の被照射表面に均一な密度のレーザー光Ｌを照射することが可能になる。
【００１９】
さらに、本発明においては、サンプル３２を、対物レンズ２０の図示しない物体側主点からサンプル３２の被照射表面までの離間距離が、対物レンズ２０の物体側焦点距離ｆ４と等しくなるように配置することが好ましい。このように配置することによって、対物レンズ２０と図示しない結像レンズとの間を平行光線とすることが可能になり、観測光学系の構成の単純化を図ることができる。
【００２０】
加えて、本発明の励起光照射光学系は、レーザー集光レンズ１６と対物レンズ２０との間に折り返し反射部１８を含んで構成される。折り返し反射部１８は、支持体１８ａに固着された反射ロッド１８ｂから構成されており、反射ロッド１８ｂの端面は、反射率の高いミラーなどによって反射面Ｔとして形成され、反射面Ｔが光軸Ｋ１に対して４５°の角度をもって傾斜している。本発明においては、折り返し反射部１８は、光軸Ｋ２が、反射ロッド１８ｂの反射面と光軸Ｋ１との交点Ｘを通って、光軸Ｋ１と直交するように位置決めされ固定される。
【００２１】
なお、本発明においては、光軸Ｋ１、光軸Ｋ２、および反射面Ｔの位置構成は、上述した構成に限定されるものではなく、反射面Ｔが光軸Ｋ１と光軸Ｋ２の交点Ｘを含み、かつ、交点Ｘを通る反射面Ｔの垂線が光軸Ｋ１と光軸Ｋ２によって形成される角の二等分線となるように構成されるものであればよい。すなわち、本発明においては、光軸Ｋ１に沿って反射面Ｔに入射した光線が光軸Ｋ２に沿って反射される光学構成を適宜設計することができる。
【００２２】
本発明の顕微蛍光観測装置１０においては、図示しないレーザー装置から図示しないビームエクスパンダを経てビーム径が拡大されたレーザー光Ｌは、光軸Ｋ１に対し垂直に設置されたピンホール形成部１４に向けて照射される。レーザー光Ｌの一部は、ピンホール形成部１４に形成された開口部Ｐを通過し、開口部Ｐの形状と同じ形状の断面を有する光束となってレーザー集光レンズ１６に入射する。その後、平行光線であるレーザー光Ｌは、レーザー集光レンズ１６によってレーザー集光レンズ１６の物体側焦点、すなわち交点Ｘに集光される。上述したように、交点Ｘは、反射ロッド１８ｂの端面に形成されたミラーである反射面Ｔに位置するため、交点Ｘに集光されたレーザー光Ｌは、反射ロッド１８ｂの反射面Ｔにおいて全反射して光路を９０°変更して対物レンズ２０に入射する。レーザー光Ｌは、対物レンズ２０によって再び集光されＫ２を光軸とする平行光線の光束となってサンプル３２に照射される。上述した機構においては、光源から発せられた励起光がサンプル３２に到達するまでの過程において、反射ロッド１８ｂの反射面Ｔにおける乱反射等に起因する損失以外に励起光の光量を損失することがなく、所定のスポット範囲ＳＡは、高密度のレーザー光Ｌによって均一に照射されることが可能となる。
【００２３】
本発明の顕微蛍光観測装置１０において、励起光は照射されるスポット範囲ＳＡの面積と開口領域ＰＡの面積との関係は、下記式に示す関係にあり、スポット範囲ＳＡの面積は、開口部Ｐの開口領域ＰＡの面積を調整することによって適宜設定することができる。下記式中、ｆ１は、レーザー集光レンズ１６の光源側焦点距離を示し、ｆ４は、対物レンズ２０の物体側焦点距離を示す。本発明の顕微蛍光観測装置１０における像倍率は、ｆ４／ｆ１であり、スポット範囲ＳＡと開口領域ＰＡの面積比は、像倍率の二乗となる。
【００２４】
【数１】
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【００２５】
図３は、本発明の顕微蛍光観測装置１０の観測光学系の一部を拡大して示す図である。上述した励起光照射光学系によってレーザー光Ｌを均一に照射されたサンプル３２は、励起した後、蛍光ＦＬを発光する。蛍光ＦＬは、対物レンズ２０を透過した後、図示しない結像レンズによって集光され、図示しない撮像系にサンプル３２の蛍光像を結像する。本発明においては、対物レンズ２０と結像レンズとの間の光軸Ｋ２上に、折り返し反射部１８が設置されている。折り返し反射部１８の支持体１８ａは、フリントガラスなどに代表される透過性が高く、屈折率の低い材質によって形成されており、蛍光ＦＬの大部分は、支持体１８ａを透過して結像レンズ２８に入射することができる。一方、支持体１８ａには反射面Ｔが形成された反射ロッド１８ｂが固着されており、その反射面Ｔが光軸Ｋ２に対し４５°の角度をもって傾斜するように配置されているため、蛍光ＦＬの一部は、矢印ｆｌが示すように反射ロッド１８ｂによって光路を変更される結果、観測光学系は、観測光の光量の一部を損失する。すなわち、本発明の観測光学系においては、蛍光ＦＬの光路上に存在する反射ロッド１８ｂに起因する光量損失が発生する。
【００２６】
しかしながら、本発明の顕微蛍光観測装置１０においては、その励起光に指向性が高く波長の揃った単色性のレーザー光Ｌを採用しており、さらにそのレンズ系は、球面収差が最小限に抑制されているため、上述した交点Ｘにおいて、レーザー光Ｌを非常に小さい回析限界となるサイズまでに集光することができる。したがって、反射面Ｔについても非常に小さく設計することが可能となり、反射面Ｔの表面積について最適化を図ることにより反射ロッド１８ｂに起因する観測光の光量損失を低減することができる。本発明においては、観測光の光量損失を１０％以下に低減することが可能となる。
【００２７】
上述したように、本発明の顕微蛍光観測装置１０の光学系全体における光量損失は、反射ロッド１８ｂに起因する光量損失に限定されるため、従来のハーフミラーを用いた同軸落射顕微鏡に比較すると、光量損失が好適に低減される。
【００２８】
図４は、本発明の顕微蛍光観測装置１０の光学系における光路図を示す。なお、説明の便宜のため、図４（ａ）は、励起光照射光学系におけるレーザー光Ｌの光路のみを示し、図４（ｂ）は、観測光学系における蛍光ＦＬの光路のみを示す。図４（ａ）に示されるように、ピンホール形成部１４の開口部Ｐを通過したレーザー光Ｌは、Ｋ１を光軸とする所定の断面積を有する光束となってレーザー集光レンズ１６に入射した後、交点Ｘに集光する。交点Ｘに集光したレーザー光Ｌは、折り返し反射部１８の反射ロッド１８ｂの端面に形成された図示しない反射ミラーによって光路を９０°変更されて拡散し、対物レンズ２０に入射する。レーザー光Ｌは、対物レンズ２０によって集光されて再びＫ２を光軸とする平行光線となり、サンプル３２を照射する。
【００２９】
図４（ｂ）に示されるように、サンプル３２から発光された蛍光ＦＬは、対物レンズ２０を透過したのち、折り返し反射部１８の透過性の支持体１８ａを透過し、干渉フィルター２６によって所望の波長成分のみが選択的に透過された後、結像レンズ２８によって集光され、撮像系３０の撮像素子３１に蛍光像を結像する。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明の顕微蛍光観測装置１０について、実施例を用いてより具体的に説明を行なうが、本発明は、後述する実施例に限定されるものではない。図５は、３ｍｍ×３ｍｍのサンプル３２を、８ｍｍ×８ｍｍの受光面を備える撮像素子３１によって撮像する場合、すなわち、本発明の顕微蛍光観測装置１０において、観測系像倍率が２．５倍の光学設計を示す図である。図５に示す顕微蛍光観測装置１０においては、上述したのと共通する構成については同じ符合を付す。顕微蛍光観測装置１０を構成する各部材のスペックについては下記表に示す。
【００３１】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【００３２】
以上、説明したように、本発明によれば、励起光照射光学系と観測光学系がその光軸を共有しながら、励起光ならびに観測光の光量損失が低減された同軸落射型顕微蛍光観測装置が提供される。本発明の顕微蛍光観測装置１０においては、従来型に比べて観測光の光量の増加が見込まれるため、ＤＮＡチップなどに代表される蛍光発光性のサンプルを充分な鮮明度をもって撮像することが可能になり、種々の解析精度の向上に資することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明の顕微蛍光観測装置１０を示す図。
【図２】本発明の顕微蛍光観測装置１０の励起光照射光学系の一部を拡大して示す図。
【図３】本発明の顕微蛍光観測装置１０の観測光学系の一部を拡大して示す図。
【図４】本発明の顕微蛍光観測装置１０の光学系における光路図を示す図。
【図５】本発明の顕微蛍光観測装置１０において、観測系像倍率が２．５倍の光学設計を示す図。
【図６】一般的な同軸落射顕微鏡５０の光学系を概略的に示す図。
【符号の説明】
【００３４】
１０…顕微蛍光観測装置、１２…レーザー装置、１４…ピンホール形成部、１６…集光レンズ、１８…折り返し反射部、１８ａ…支持体、１８ｂ…反射ロッド、２０…対物レンズ、２２…レーザー切替光学系、２４…ビームエクスパンダ、２６…干渉フィルター、２８…結像レンズ、３０…撮像系、３１…撮像素子、３２…サンプル、３４…補助照明、５０…同軸落射顕微鏡、５２…光源、５４…照明レンズ、５６…ハーフミラー、５８…対物レンズ、６０…サンプル、６２…結像レンズ、６４…撮像系
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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