(57)【要約】【課題】哺乳動物における生殖器異常を定量的に評価すること。特に、外生殖器の外観又は肛門−生殖突起間距離の雌雄差が小さい動物種における生殖器異常の定量的評価方法等を提供可能にすること。【解決手段】哺乳動物における生殖器異常の定量的評価方法であって、（１）哺乳動物の外生殖器における形態学的な特徴に係る指標値を測定する工程、及び、（２）測定された値と対照との量的な数値比較による差異に基づき生殖器異常の程度を定量的に評価する工程、を有することを特徴とする方法等。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における生殖器異常の定量的評価方法であって、
（１）哺乳動物の外生殖器における形態学的な特徴に係る指標値を測定する工程、及び、
（２）測定された値と対照との量的な数値比較による差異に基づき生殖器異常の程度を定量的に評価する工程
を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
外生殖器が亀頭層であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
外生殖器における形態学的な特徴に係る指標値が、外生殖器の断面における亀頭層の直径であることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
外生殖器における形態学的な特徴に係る指標値が、外生殖器の断面における亀頭層の開放率であることを特徴とする請求項１又は２の方法。
【請求項５】
化学物質が有する、哺乳動物における生殖器異常を与える毒性の評価方法であって、
（１）化学物質が投与された妊娠雌の有する胎児又は化学物質が直接投与された児に存在する外生殖器における形態学的な特徴に係る指標値を測定する工程、
（２）測定された値と対照との量的な数値比較による差異に基づき生殖器異常の程度を定量的に評価する工程、及び
（３）定量的に評価された生殖器異常の程度に基づき前記化学物質が有する、前記哺乳動物における生殖器異常を与える毒性を評価する工程
を有することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物における生殖器異常の定量的評価方法及びその利用等に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学物質がヒトや野生生物等の哺乳動物に及ぼす影響を調べる方法としては、例えば、当該化学物質を投与された種々の実験哺乳動物において発現した毒性兆候を解析し、得られた結果からヒトや野生生物等の哺乳動物に及ぼす影響の程度を推定する方法が知られている。そして、これらの方法のうち、生殖性や胎児・新生児の発生等に対する毒性は、総じて生殖・発生毒性と称されている。
医薬品、農業化学品及び他の化学物質においては、その製造・販売に際し、生殖・発生毒性に関する試験を実施し、ヒトや野生生物等の哺乳動物への影響を評価することが求められている。その中で、当該化学物質を哺乳動物にその妊娠期において投与し、当該哺乳動物の胎児に及ぼす形態的な変化の有無及びその程度等を調べる試験を催奇形性試験といい、一般的には、化学物質をラット、マウス、ウサギ、サル等の実験哺乳動物の妊娠雌動物に一定期間投与し、当該実験哺乳動物の胎児の外形、内臓及び骨格等を詳細に観察することにより、当該化学物質が有する胎児に対する毒性の評価を行っている。
哺乳動物の胎児の発生過程における毒性発現に係わる事象は、初期胚の子宮への移動、着床、胎盤形成、胎児期の器官形成、胎児期の組織分化及び成長等と極めて多岐の時期に渡り関係する。それらの時期の中で、中枢神経系、心大血管をはじめ、主要器官の原基が形成される時期を器官形成期といい、短い期間に、器官、組織等を特徴付ける構造タンパク質や酵素等を合成する化学的分化が活発に起こり、細胞の増生、遊走、再構成、組織相互作用の形態形成が、厳密な時間的スケジュールと空間的制御とのもとで進行する。このため、当該器官形成期は、化学物質が哺乳動物の胎児に与える形態異常を惹起する作用（即ち、催奇形性作用）に対する感受性が最も高く、器官レベルの発生異常の大半はこの時期の侵襲によって成立する。
生殖器官、特に男性の外性器（ペニス）形成に関しては、遺伝的な原因に基づいてアンドロゲンに対する応答性の低下やアンドロゲンの産生能の障害により、アンドロゲンが当該器官形成期に正常に作用しなかった場合には、尿道下裂や停留精巣といった外生殖器官の異常が誘発されることが知られている。そしてラット、霊長類を代表とする哺乳動物において、妊娠期間中にアンドロゲンの作用を阻害する化学物質を投与した場合には、上記のような外生殖器官の異常や、雄胎児の肛門−尿道口間距離の短縮等が誘発されることも確認されている（例えば、非特許文献１及び２等参照）。
【０００３】
【非特許文献１】Clark, L. R., Endopoints of reproductive system development, In: An Evaluation and Interpretation of Reproductive Endpoints for Human Health Risk Assessment (Daston, G. and Kimmel, C. eds), International Life Sciences Institute, New York, 1999
【非特許文献２】Prahalada. S, et al., Effects of finasteride, a type 2 5-alpha reductase inhibitor, on fetal development in the rhesus monkey (Macaca mulatta), Teratology, 55, 119-131, 1997
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、このような哺乳動物における生殖器異常を定量的に評価するには、例えばラットのようなげっ歯類における胎児の肛門−生殖突起間距離を測定し、対照群と化学物質投与群との間でその距離の増減を測定する方法が知られているが、哺乳動物種によっては外生殖器の外観又は肛門−生殖突起間距離の雌雄差が小さく、当該距離を有意に測定することが困難な場合もあった。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は、かかる状況下において鋭意検討した結果、外生殖器における形態学的な特徴に係る指標値が特異的に変化することを突き止め、当該指標値を利用することにより哺乳動物における生殖器異常を定量的に評価することが可能となることを見出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．哺乳動物における生殖器異常の定量的評価方法であって、
（１）哺乳動物の外生殖器における形態学的な特徴に係る指標値を測定する工程、及び、
（２）測定された値と対照との量的な数値比較による差異に基づき生殖器異常の程度を定量的に評価する工程
を有することを特徴とする方法（以下、本発明方法と記すこともある。）；
２．外生殖器が亀頭層であることを特徴とする前項１記載の方法；
３．外生殖器における形態学的な特徴に係る指標値が、外生殖器の断面における亀頭層の直径であることを特徴とする前項１又は２記載の方法；
４．外生殖器における形態学的な特徴に係る指標値が、外生殖器の断面における亀頭層の開放率であることを特徴とする前項１又は２の方法；
５．化学物質が有する、哺乳動物における生殖器異常を与える毒性の評価方法であって、
（１）化学物質が投与された妊娠雌の有する胎児又は化学物質が直接投与された児に存在する外生殖器における形態学的な特徴に係る指標値を測定する工程、
（２）測定された値と対照との量的な数値比較による差異に基づき生殖器異常の程度を定量的に評価する工程、及び
（３）定量的に評価された生殖器異常の程度に基づき前記化学物質が有する、前記哺乳動物における生殖器異常を与える毒性を評価する工程
を有することを特徴とする方法（以下、本発明毒性評価方法と記すこともある。）、
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、外生殖器の外観又は肛門−生殖突起間距離の雌雄差が小さい動物種における生殖器異常の定量的評価方法等が提供可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明方法は、哺乳動物における生殖器異常の定量的評価方法であって、（１）哺乳動物の外生殖器における形態的な特徴に係る指標値を測定する工程、及び、（２）測定された値と対照との量的な数値比較による差異に基づき生殖器異常の程度を定量的に評価する工程を有することを特徴とする方法であり、当該方法は、哺乳動物の雌雄の胎児または児から摘出された外生殖器において、雌に比較し、雄では外生殖器の断面における亀頭層の直径が減少し、外生殖器の断面における亀頭層の開放間距離又は外生殖器の断面における亀頭層の開放率は増加するという新規な知見を突き止め、生殖器異常の程度が当該増減量の大きさに基づいたものであるとその量的関係を明らかにすることにより見出されたものである。
本発明は、上記の知見や当該知見に基づいた本発明方法等を利用する種々の発明（例えば、化学物質が有する、哺乳動物における生殖器異常を与える毒性の評価方法等）を包含している。
本発明における「定量的評価（方法）」、「定量的に評価する」とは、指標値等における量的な数値比較による差異に基づいて、生殖器異常の程度の量的関係又は順位若しくは段階付けを明らかにする目的で行なわれる評定（方法）を意味する。
【０００８】
本発明において対象となる哺乳動物としては、例えば、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ハムスター、フェレット、ミニブタ、イヌ、サル等を好ましいものとして挙げることができる。より好ましいものとしては、例えば、ウサギ等を挙げることができる。尚、これら動物、例えばウサギは北山ラベス（株）等から商業的に入手することができる。
【０００９】
哺乳動物の胎児又は児に存在する「外生殖器」とは、胎児期又は新生児にある哺乳動物が有する生殖結節から肛門周囲までの組織・器官を意味する。当該外生殖器は、器官培養等により哺乳動物の外生殖器の形成時期における当該器官が有する性質を維持しながら培養されているような器官であってもよいが、好ましくは妊娠雌の哺乳動物から摘出された直後の器官や、適当な固定液において固定し管理されていた当該器官等を挙げることができる。
上記の外生殖器を得るには、例えば、妊娠雌の哺乳動物から通常の方法に従って、胎児の外生殖器を摘出すればよい。
【００１０】
哺乳動物の外生殖器は、包皮、海綿体、神経、血管、尿道等からなり、このうち亀頭層は尿道を包含するような環状の形態を呈している。当該「外生殖器における形態学的な特徴に係る指標値」とは、具体的には例えば、外生殖器の断面における亀頭層の直径、外生殖器の断面における亀頭層の開放間距離、外生殖器の断面における亀頭層の面積、尿道の長径等を挙げることができる。本発明方法における好ましい「外生殖器における形態学的な特徴に係る指標値」としては、例えば、外生殖器の断面における亀頭層の直径、及び、外生殖器の断面における亀頭層の開放率等を挙げることができる。
【００１１】
哺乳動物の外生殖器における形態学的な特徴に係る指標値を測定するには、当該形態学的な特徴に係る指標値に応じた通常の方法を用いて測定すればよい。
【００１２】
例えば、当該形態学的な特徴に係る指標値が、外生殖器の断面における亀頭層の直径、又は、外生殖器の断面における亀頭層の開放間距離の場合には、例えば、外生殖器の横断切片を作製し、実態顕微鏡下でその距離を測定すればよい。外生殖器の断面における亀頭層の開放率の場合には、例えば、外生殖器の断面における亀頭層の開放間距離と外生殖器の断面における亀頭層の直径との比率を算出し、さらに具体的には例えば、外生殖器の断面における亀頭層の開放間距離を外生殖器の断面における亀頭層の直径で除し、１００を乗じて算出すればよい。
（具体的には）
外生殖器の断面における亀頭層の開放率＝外生殖器の断面における亀頭層の開放間距離／外生殖器の断面における亀頭層の直径×１００
【００１３】
次に、このようにして測定された値と対照との量的な数値比較による差異に基づき生殖器異常の程度を定量的に評価する。
ここで「対照」とは、上記の測定された値の技術的意味を理解するに際して基準となり得るような値であって、実測値であってもよく、文献記載の値であってもよい。さらにまた、陽性対照であっても陰性対照であってもよい。陽性対照の代表的な例としては、すでに作用が存在することが知られている公知の化学物質（即ち、生殖器異常の「有」程度が定量的に評価可能な化学物質）の測定値等を挙げることができる。一方、陰性対照としては、前記陽性対照の説明に記載される化学物質を無存在とした場合やすでに作用が存在しないことが知られている公知の化学物質（即ち、生殖器異常の「無」程度が定量的に評価可能な化学物質）の測定値等を挙げることができる。
これらの対照と前記の測定値とを量的に数値比較して、当該対照が陰性対照である場合において差異が存在する場合には生殖器異常の程度が前記差異の大きさに基づいたものであるとその量的関係を明らかにできる（本発明では、生殖器異常が発生する確率を定量的に評価する場合も含む。）。一方、当該差異が存在しない場合には生殖器異常の程度が同等なものであると順位・段階付けを明らかにできる（本発明では、生殖器異常が発生しない確率を定量的に評価する場合も含む。）。また、当該対照が陽性対照である場合において差異が存在しない場合には生殖器異常の程度が同等なものであると順位・段階付けを明らかにできる。
このようにして、本発明方法では、哺乳動物における生殖器異常の定量的評価を行なえばよい。
【００１４】
上述の投与量を代えた試験等を行うことにより、化学物質の有毒に関する基準濃度を境界として低濃度では無毒又は毒性が低い、高濃度では有毒と定量的に評価された場合には、当該化学物質の毒性の強さを知ることができ、化学物質を選別することが可能となる。
【００１５】
このように、哺乳動物の外生殖器における形態学的な特徴に係る指標値は、哺乳動物における生殖器異常を定量的に評価するために大いに利用することができる。
さらに当該利用を応用することにより、例えば、哺乳動物における生殖器の発生制御のために、哺乳動物の外生殖器における当該器官における形態学的な特徴に係る指標値は、当該器官における形態学的な特徴に係る指標値に作用する薬剤の投与及び／又は外生殖器の発生過程に関与する遺伝子の発現促進若しくは抑制に基づき人工的に制御する工程を有する方法も提供することが可能となる。
【００１６】
次に、本発明毒性評価方法について説明する。
本発明毒性評価方法は、化学物質が有する、哺乳動物における生殖器異常を与える毒性の評価方法であって、
（１）化学物質が投与された妊娠雌の哺乳動物が有する胎児又は化学物質が直接投与された児に存在する外生殖器における形態学的な特徴に係る指標値を測定する工程、
（２）測定された値と対照との量的な数値比較による差異に基づき生殖器異常の程度を定量的に評価する工程、及び
（３）定量的に評価された生殖器異常の程度に基づき前記化学物質が有する、前記哺乳動物における生殖器異常を与える毒性を評価する工程
を有することを特徴とする方法である。
【００１７】
本発明毒性評価方法において用いられる化学物質としては、いかなる化学物質であってもよいが、例えば、催奇形性物質等を挙げることができる。また一般的に環境ホルモンと呼ばれるような内分泌撹乱物質、特にアンドロゲンの作用を攪乱するような化学物質等がより適する対象化合物としてあげられる。具体的には例えば、アンドロゲンの生合成阻害作用を有する化学物質（例えば、フタル酸エステル類、ケトコナゾール等の殺菌剤等）、アンドロゲンのレセプターへの結合阻害作用を有する化学物質（例えば、酢酸シプロテロン、フルタミド等）、アンドロゲンの活性代謝物の産生阻害作用を有する化学物質（例えば、フィナステリド等）等を挙げることができる。
上記の化学物質は、通常の方法に従って合成してもよいし、商業的に入手してもよい。
このような化学物質を妊娠雌の哺乳動物に対する投与に際しては、当該化学物質を生理食塩液等の溶液にて適当な濃度に希釈し、これを投与（好ましくは経口投与）すればよい。投与量は、例えば、酢酸シプロテロンであれば、１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重等とすればよい。
当該化学物質の投与におけるスケジュールは、例えば、哺乳動物の妊娠期間中又は児の哺育期間中であればよく、哺乳動物の種類、投与形態等によって適宜調整すればよい。また適当な方法を用いて児に直接投与しても良い。具体的には例えば、ウサギであれば、人工授精実施日を妊娠０日とした場合、妊娠１３〜２４日の間を挙げることができる。
【００１８】
このような条件下で化学物質を投与しながら妊娠雌の哺乳動物を飼育することにより、所望の哺乳動物を作製する。尚、前述の飼育方法は、通常の哺乳動物の飼育方法に従えばよい。
哺乳動物の外生殖器における当該器官を調製するには、例えば、妊娠雌の哺乳動物から通常の方法に従って、胎児の外生殖器を摘出すればよい。
【００１９】
本発明毒性評価方法における「外生殖器における形態学的な特徴に係る指標値を測定する」には、前述の本発明方法における測定方法と同様な方法を用いればよい。
本発明毒性評価方法における「測定された値と対照との量的な数値比較による差異に基づき生殖器異常の程度を定量的に評価する」には、前述の本発明方法における定量的に評価する方法と同様な方法を用いればよい。
このようにして定量的に評価された生殖器異常の程度に基づき前記化学物質が有する、前記哺乳動物における生殖器異常を与える毒性を評価する。
具体的には例えば、化学物質の妊娠雌の哺乳動物への投与により、雄胎児由来の外生殖器において、当該外生殖器の断面における亀頭層の直径が対照（化学物質の妊娠雌の哺乳動物への非投与系での雄胎児由来の当該外生殖器の断面における亀頭層の直径）との量的な数値比較において減少すれば、又は、雄胎児由来の外生殖器において、当該外生殖器の断面における亀頭層の開放間距離若しくは当該外生殖器の断面における亀頭層の開放率が対照（化学物質の妊娠雌の哺乳動物への非投与系での雄胎児由来の当該外生殖器の断面における亀頭層の開放間距離若しくは当該外生殖器の断面における亀頭層の開放率）との量的な数値比較において増加すれば、正常な雄型の外生殖器の発生に対して当該増減量の大きさに基づいた影響が及ぼされていると生殖器異常の定量的評価ができ、その結果として当該化学物質は前記哺乳動物における生殖器異常を与える毒性を有すると評価することができる。
一方、化学物質の妊娠雌の哺乳動物への投与により、雌胎児由来の外生殖器において、当該外生殖器の断面における亀頭層の直径が対照（化学物質の妊娠雌の哺乳動物への非投与系での雌胎児由来の当該外生殖器の断面における亀頭層の直径）との量的な数値比較において増加すれば、又は、雌胎児由来の外生殖器において、当該外生殖器の断面における亀頭層の開放間距離若しくは当該外生殖器の断面における亀頭層の開放率が対照（化学物質の妊娠雌の哺乳動物への非投与系での雌胎児由来の当該外生殖器の断面における亀頭層の開放間距離若しくは当該外生殖器の断面における亀頭層の開放率）との量的な数値比較において減少すれば、正常な雌型の外生殖器の発生に対して当該増減量の大きさに基づいた影響が及ぼされていると生殖器異常の定量的評価ができ、その結果として当該化学物質は前記哺乳動物における生殖器異常を与える毒性を有すると評価することができる。
【実施例】
【００２０】
以下、本発明をより詳細に説明するため、実施例を挙げて説明するが本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００２１】
実施例１  （試験材料の調製）
１）妊娠雌の哺乳動物が有する外生殖器の摘出
雌ウサギ（Ｋｂｌ：ＮＺＷ種）を同系の雄ウサギから得た精子を用いて人工授精することにより、妊娠雌ウサギ（人工授精日＝妊娠０日）を得た。この妊娠雌ウサギのうち一部ものは、化学物質非投与対照群としてそのまま飼育を継続した。残りの妊娠雌ウサギは、陽性対照群として妊娠１３日から２４日の間、抗アンドロゲン剤である酢酸シプロテロンを、妊娠６日の体重を基準にして、１０  ｍｇ／ｋｇ・ｂｗの投与量で筋肉内投与しながら飼育を継続した。化学物質投与群及び化学物質非投与群の両系の妊娠雌ウサギから、妊娠２９日に胎児を摘出した。
摘出された胎児は、内生殖器（精巣又は卵巣）の存在確認により雌雄判別を行った後、外生殖器部分を切り出し、１０％中性緩衝ホルマリン液で固定した。固定した外生殖器から薄切切片（横断）を作製し（図１参照）、常法に従いトルジンンブルー−リン酸緩衝液で染色し、観察標本とした。
【００２２】
２）外生殖器における形態学的な特徴に係る指標値の測定
各観察標本は、測微計（オリンパス光学工業（株））を装着した実体顕微鏡を用いて、外生殖器の断面における亀頭層の直径、及び、外生殖器の断面における亀頭層の開放間距離を測定した（図２参照）。また、外生殖器の断面における亀頭層の開放率は、外生殖器の断面における亀頭層の開放間距離を、外生殖器の断面における亀頭層の直径で除し、１００を乗じて算出した。
測定値のデータ解析では、外生殖器の断面における亀頭層の直径、外生殖器の断面における亀頭層の開放間距離、及び、外生殖器の断面における亀頭層の開放率について、雌雄別に１腹毎の平均値を算出して、これを１単位として化学物質非投与群の妊娠雌ウサギから摘出された雄胎児に対する統計学的解析に用いた。また、外生殖器の断面における亀頭層の直径、及び、外生殖器の断面における亀頭層の開放間距離について、各々の胎児体重の三乗根で除した体重比の値を算出した。算出した体重比の外生殖器の断面における亀頭層の直径、及び、体重比の外生殖器の断面における亀頭層の開放間距離について、雌雄別に１腹毎の平均値を算出して、これを１単位として化学物質非投与群の妊娠雌ウサギから摘出された雄胎児に対する統計学的解析に用いた。
上記の統計学的解析では、まずＦ検定（有意水準：２５％）で等分散検定を実施し、等分散であればｔ検定を、不等分散であればＷｅｌｃｈ検定を実施した。有意水準は５又は１％に設定した。
結果を表１及び表２に示す。
【００２３】
表１は、外生殖器の断面における亀頭層の直径、外生殖器の断面における亀頭層の開放間距離、及び、外生殖器の断面における亀頭層の開放率を化学物質非投与群の雄胎児、化学物質非投与群の雌胎児及び化学物質（CA:酢酸シプロテロン）投与群の雄胎児について、その平均値を示す表である。表中の「＊＊」は、対照群雄に対して１％で有意差有りということを意味する。
【００２４】
【表１】
2007078550.tif 000002
【００２５】
また表２は、体重比の外生殖器の断面における亀頭層の直径、及び、体重比の外生殖器の断面における亀頭層の開放間距離を化学物質非投与群の雄胎児、化学物質非投与群の雌胎児及び化学物質（CA:酢酸シプロテロン）投与群の雄胎児について、その平均値を示す表である。表中の「＊＊」は、対照群雄に対して１％で有意差有りということを意味する。尚、表中の「体重比の亀頭層の開放率 (%) ***」は、表１に記載される亀頭層の開放率 (%)と同一値となるので、表２以降では「体重比の亀頭層の開放率 (%)」についての記載を省略することもある。その場合には、「体重比の亀頭層の開放率 (%)」についての記載を参照すればよい。
【００２６】
【表２】
2007078550.tif 000003
【００２７】
外生殖器の断面における亀頭層の直径に関して、化学物質非投与群の妊娠雌ウサギから摘出された雌胎児の値に対し、化学物質非投与群の妊娠雌ウサギから摘出された雄胎児の値は約１１９％であり、統計学的に有意な高値であった。また、化学物質非投与群の妊娠雌ウサギから摘出された雄胎児の値に対し、酢酸シプロテロン投与群の妊娠雌ウサギから摘出された雄胎児の値は約８５％であり、統計学的に有意な低値であった（表１参照）。一方、体重比の外生殖器の断面における亀頭層の直径に関して、化学物質非投与群の妊娠雌ウサギから摘出された雌胎児の値に対し、化学物質非投与群の妊娠雌ウサギから摘出された雄胎児の値は約１１６％であり、統計学的に有意な高値であった。また、化学物質非投与群の妊娠雌ウサギから摘出された雄胎児の値に対し、酢酸シプロテロン投与群の妊娠雌ウサギから摘出された雄胎児の値は約９６％であり、統計学的に有意な差はみられなかったが、低い値を示した（表２参照）。
外生殖器の断面における亀頭層の開放間距離に関して、化学物質非投与群の妊娠雌ウサギから摘出された雌胎児の値に対し、化学物質非投与群の妊娠雌ウサギから摘出された雄胎児の値は約６％であり、統計学的に有意な低値であった。また、化学物質非投与群の妊娠雌ウサギから摘出された雄胎児の値に対し、酢酸シプロテロン投与群の妊娠雌ウサギから摘出された雄胎児の値は約１２２３％であり、統計学的に有意な高値であった（表１参照）。一方、体重比の外生殖器の断面における亀頭層の開放間距離に関して、化学物質非投与群の妊娠雌ウサギから摘出された雌胎児の値に対し、化学物質非投与群の妊娠雌ウサギから摘出された雄胎児の値は約６％であり、統計学的に有意な低値であった。また、化学物質非投与群の妊娠雌ウサギから摘出された雄胎児の値に対し、酢酸シプロテロン投与群の妊娠雌ウサギから摘出された雄胎児の値は約１４２９％であり、統計学的に有意な高値であった（表２参照）。
外生殖器の断面における亀頭層の開放率に関して、化学物質非投与群の妊娠雌ウサギから摘出された雌胎児の値に対し、化学物質非投与群の妊娠雌ウサギから摘出された雄胎児の値は約５％であり、統計学的に有意な低値であった。また、化学物質非投与群の妊娠雌ウサギから摘出された雄胎児の値に対し、酢酸シプロテロン投与群の妊娠雌ウサギから摘出された雄胎児の値は約１４１２％であり、統計学的に有意な高値であった（表１参照）。
【００２８】
実施例２  （試験材料の調製）
１）妊娠雌の哺乳動物が有する外生殖器の摘出
雌ウサギ（Ｋｂｌ：ＮＺＷ種）を同系の雄ウサギから得た精子を用いて人工授精することにより、妊娠雌ウサギ（人工授精日＝妊娠０日）を得た。この妊娠雌ウサギは、陽性対照群として妊娠２０日、２１日、２２日、２３日又は２４日のいずれか１日に、抗アンドロゲン剤である酢酸シプロテロンを、妊娠６日の体重を基準にして、２．５  ｍｇ／ｋｇ・ｂｗの投与量で筋肉内投与しながら飼育を継続した。化学物質投与群の妊娠雌ウサギから、妊娠２９日に胎児を摘出した。
摘出された胎児は、内生殖器（精巣又は卵巣）の存在確認により雌雄判別を行った後、外生殖器部分を切り出し、１０％中性緩衝ホルマリン液で固定した。固定した外生殖器から薄切切片（横断）を作製し（図１参照）、常法に従いトルジンンブルー−リン酸緩衝液で染色し、観察標本とした。
【００２９】
２）外生殖器における形態学的な特徴に係る指標値の測定
各観察標本は、測微計（オリンパス光学工業（株））を装着した実体顕微鏡を用いて、外生殖器の断面における亀頭層の直径、及び、外生殖器の断面における亀頭層の開放間距離を測定した（図２参照）。また、外生殖器の断面における亀頭層の開放率は、外生殖器の断面における亀頭層の開放間距離を、外生殖器の断面における亀頭層の直径で除し、１００を乗じて算出した。
測定値のデータ解析では、外生殖器の断面における亀頭層の直径、外生殖器の断面における亀頭層の開放間距離、及び、外生殖器の断面における亀頭層の開放率について、１胎児を１単位として化学物質非投与群の妊娠雌ウサギから摘出された雄胎児に対する統計学的解析に用いた。化学物質非投与群の妊娠雌ウサギから摘出された雄胎児の測定値は実施例１のものを使用した。また、外生殖器の断面における亀頭層の直径、及び、外生殖器の断面における亀頭層の開放間距離について、各々の胎児体重の三乗根で除した体重比の値を算出した。算出した体重比の外生殖器の断面における亀頭層の直径、及び、体重比の外生殖器の断面における亀頭層の開放間距離について、１胎児を１単位として化学物質非投与群の妊娠雌ウサギから摘出された雄胎児に対する統計学的解析に用いた。
上記の統計学的解析では、まずＢａｒｔｌｅｔｔの等分散検定で等分散検定を実施し、等分散であればＤｕｎｎｅｔｔ型多重比較を、不等分散であればＳｔｅｅｌ型多重比較を実施した。有意水準は５又は１％に設定した。
結果を図３、図４、図５、図６及び図７に示す。
【００３０】
外生殖器の断面における亀頭層の直径に関して、化学物質非投与群の妊娠雌ウサギから摘出された雄胎児の値に対し、酢酸シプロテロン投与群の妊娠雌ウサギから摘出された雄胎児の値は約８３〜９２％であり、このうち妊娠２１日、２２日、２３日又は２４日に投与した群において、統計学的に有意な低値であった（図３参照）。一方、体重比の外生殖器の断面における亀頭層の直径に関して、化学物質非投与群の妊娠雌ウサギから摘出された雄胎児の値に対し、酢酸シプロテロン投与群の妊娠雌ウサギから摘出された雄胎児の値は約９５〜１０７％であり、統計学的に有意な差はみられなかった（図４参照）。
外生殖器の断面における亀頭層の開放間距離に関して、化学物質非投与群の妊娠雌ウサギから摘出された雄胎児の値に対し、酢酸シプロテロン投与群の妊娠雌ウサギから摘出された雄胎児の値は約１４８〜２９２％であり、このうち妊娠２１日又は２２日に投与した群において、統計学的に有意な高値であった（図５参照）。一方、外生殖器の断面における亀頭層の開放間距離に関して、化学物質非投与群の妊娠雌ウサギから摘出された雄胎児の値に対し、酢酸シプロテロン投与群の妊娠雌ウサギから摘出された雄胎児の値は約１７１〜３５７％であり、このうち妊娠２０日、２１日、２２日又は２３日に投与した群において、統計学的に有意な高値であった（図６参照）。
外生殖器の断面における亀頭層の開放率に関して、化学物質非投与群の妊娠雌ウサギから摘出された雄胎児の値に対し、酢酸シプロテロン投与群の妊娠雌ウサギから摘出された雄胎児の値は約１６４〜３４０％であり、このうち妊娠２０日、２１日、２２日又は２３日に投与した群において、統計学的に有意な高値であった（図７参照）。
【００３１】
実施例３  （試験材料の調製）
１）妊娠雌の哺乳動物が有する外生殖器の摘出
雌ウサギ（Ｋｂｌ：ＮＺＷ種）を同系の雄ウサギから得た精子を用いて人工授精することにより、妊娠雌ウサギ（人工授精日＝妊娠０日）を得た。この妊娠雌ウサギから、妊娠21.25日、21.50日、22.00日、23.00日、24.25日、25.00日又は28.00日のいずれかで雄胎児及び雌胎児を摘出した。
摘出された胎児は、内生殖器（精巣又は卵巣）の存在確認により雌雄判別を行った後、外生殖器部分を切り出し、１０％中性緩衝ホルマリン液で固定した。固定した外生殖器は常法に従いパラフィンに包埋し、薄切切片（矢状断）を作製した。薄切した切片は市販のスライドグラスに付着させ、常法に従いヘマトキシリン−エオジンで染色し、観察標本とした。
【００３２】
２）外生殖器の発生の経時的変化に関する観察
各観察標本は、外生殖器、特に亀頭層の形態変化について着目し観察を実施した。
妊娠雌ウサギから摘出された胎児の外生殖器のヘマトキシリン−エオジン染色を施した薄切切片に関して、妊娠21.50日頃から亀頭層の形成が認められた。妊娠22.00日には、亀頭層の形成は著明となった。外生殖器の断面における亀頭層の開放間距離は、雄胎児の方が雌胎児に比較し、やや短い傾向がみられた。妊娠23.00日は、尿道の位置が、雄では亀頭層の内部に押し込まれるようになるのに対し、雌胎児では、亀頭層の開放部から外部にまで開口していた。また、外生殖器の断面における亀頭層の開放間距離は、雄胎児の方が雌胎児に比較し、短かった。妊娠24.25日以降は、妊娠23.00日にみられた雌雄差がより著明となった。（図８参照）。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明により、外生殖器の外観又は肛門−生殖突起間距離の雌雄差が小さい動物種における生殖器異常の定量的評価方法等が提供可能となり、しかも前記生殖器異常の形成過程を効率的にモニターすることも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、ウサギ胎児における外生殖器の薄切切片の作製部位を示す図である。
【図２】図２は、ウサギ胎児における外生殖器の薄切切片における、外生殖器の断面における亀頭層の直径、及び、外生殖器の断面における亀頭層の開放間距離の測定部位を、顕微鏡写真によって示す図である。
【図３】図３は、外生殖器の断面における亀頭層の直径について、酢酸シプロテロンの投与日による測定値の変化を化学物質非投与群の雄胎児及び化学物質（酢酸シプロテロン）投与群の雄胎児について、その平均値を示す図である。（＊：５％で有意差有りということを意味する。＊＊：１％で有意差有りということを意味する。）
【図４】図４は、体重比の外生殖器の断面における亀頭層の直径について、酢酸シプロテロンの投与日による測定値の変化を化学物質非投与群の雄胎児及び化学物質（酢酸シプロテロン）投与群の雄胎児について、その平均値を示す図である。
【図５】図５は、外生殖器の断面における亀頭層の開放間距離について、酢酸シプロテロンの投与日による測定値の変化を化学物質非投与群の雄胎児及び化学物質（酢酸シプロテロン）投与群の雄胎児について、その平均値を示す図である。（＊＊：１％で有意差有りということを意味する。）
【図６】図６は、体重比の外生殖器の断面における亀頭層の開放間距離について、酢酸シプロテロンの投与日による測定値の変化を化学物質非投与群の雄胎児及び化学物質（酢酸シプロテロン）投与群の雄胎児について、その平均値を示す図である。（＊：５％で有意差有りということを意味する。＊＊：１％で有意差有りということを意味する。）
【図７】図７は、外生殖器の断面における亀頭層の開放率について、酢酸シプロテロンの投与日による測定値の変化を化学物質非投与群の雄胎児及び化学物質（酢酸シプロテロン）投与群の雄胎児について、その平均値を示す図である。（＊：５％で有意差有りということを意味する。＊＊：１％で有意差有りということを意味する。）
【図８】図８は、ウサギ胎児における外生殖器の発生の経時的変化を、化学物質非投与群の雄胎児及び雌胎児について、顕微鏡写真によって示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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