(57)【要約】【課題】  ＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドの固定化量及び結合強度の高いＤＮＡチップ（遺伝子検出用マイクロアレイ）を製造するための固体支持体を提供すること。【解決手段】  本発明の固体支持体は、担体表面に、下記一般式（１）で表わされる基が共有結合してなる。  −ＮＨ−ＣＯ−Ｘ−ＯＹ      （１）（一般式（１）において、Ｘは、アルキル基で置換されていてもよい、炭素数１〜５０個のアルキレン基を表わすか、又は下記一般式（２）で表わされる基であり、Ｙは水素又はジメトキシトリチル基を表す。）  −（Ｒ１−Ｒ２）ｎ−    （２）（一般式（２）において、Ｒ１はアルキル基で置換されていてもよいメチレン基、Ｏ又はＮＲ３を表わし、Ｒ２はアルキル基で置換されていてもよいメチレン基を表し、Ｒ３は水素又はアルキル基を表し、ｎは１〜２５の整数を表す。）【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体表面に、下記一般式（１）で表わされる基が共有結合してなる固体支持体。
−ＮＨ−ＣＯ−Ｘ−ＯＹ      （１）
（一般式（１）において、Ｘは、アルキル基で置換されていてもよい、炭素数１〜５０個のアルキレン基を表わすか、又は下記一般式（２）で表わされる基であり、Ｙは水素又はジメトキシトリチル基を表す。）
−（Ｒ１−Ｒ２）ｎ−    （２）
（一般式（２）において、Ｒ１はアルキル基で置換されていてもよいメチレン基、Ｏ又はＮＲ３を表わし、Ｒ２はアルキル基で置換されていてもよいメチレン基を表し、Ｒ３は水素又はアルキル基を表し、ｎは１〜２５の整数を表す。）
【請求項２】
担体が微小多孔質ガラスである、請求項１に記載の固体支持体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の固体支持体上の水酸基に、核酸分子が結合してなる、ＤＮＡチップ。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の固体支持体上の水酸基に、核酸分子が結合してなる、遺伝子検出用マイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固体支持体に関するものであり、具体的には、核酸分子を固定化するための固体支持体に関する。特には、核酸分子の固定化量及び結合強度の高い、ＤＮＡチップを製造するための固体支持体に関する。
また、本発明は、上記固体支持体を用いたＤＮＡチップ及び遺伝子検出用マイクロアレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年において、生物の全遺伝子機能を解析するための技術開発等が進んでいる。そのような開発のための解析手段として、ＤＮＡチップが用いられるようになっている。ＤＮＡチップは、通常、スライドガラス等の固体支持体に多数のＤＮＡ断片を固定化させたマイクロアレイの形態にあり、ＤＮＡチップに固定化されているＤＮＡ断片と相補性を有するＤＮＡ断片試料をハイブリダイゼーションによってＤＮＡチップ上に固定化し、検出方法として利用される。形成されたハイブリッドを検出する手段としては、ＤＮＡ断片試料に予め結合させた蛍光標識又は放射性標識を用いる方法、ハイブリッドに取り込ませる蛍光発生基又は導電性基を有するインターカレータを用いる方法等が知られている。
【０００３】
上述したようなＤＮＡチップを用いた技術を実用化するためには、多数のＤＮＡ断片やオリゴヌクレオチドを固体支持体の表面に固定化する技術が必要である。ＤＮＡ断片やオリゴヌクレオチドを固体支持体の表面に固定化する方法としては、例えば、非特許文献１に記載された方法が知られている。
【０００４】
非特許文献１に記載された方法は、エチレングリコールリンカーを含むシランカップリング剤を用いて、固体支持体であるガラスの表面を処理し、このリンカーを足がかりとして、ＤＮＡ断片又はオリゴヌクレオチドを合成する方法である。該非特許文献１に記載された方法により得られるＤＮＡチップに含まれるリンカーでは、ＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）を固定化する際のアンモニア処理の際、又はその後の化学的処理の際に、ＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）の大幅な脱離が起こってしまうという問題があった。
【０００５】
【非特許文献１】Nucleic Acid Resarch Vol.20, No.7, 1679-1687 (1992)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述したように、従来のＤＮＡチップは、ＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドの固体支持体への固定化量及び結合強度が、必ずしも十分であるとはいえず、ＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドの固定化量がより高く、ＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドの結合強度がより高いＤＮＡチップの開発が望まれていた。
【０００７】
従って、本発明の目的は、ＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドの固定化量及び結合強度の高いＤＮＡチップを製造するための固体支持体を提供することにある。
また、本発明は、ＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドの固定化量及び結合強度の高いＤＮＡチップ及び遺伝子検出用マイクロアレイを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意検討した結果、特定の構造を有する基（リンカー）が共有結合してなる固体支持体が上記目的を達成し得るという知見を得た。
本発明は、上記知見に基づいてなされたものであり、担体表面に、下記一般式（１）で表わされる基が共有結合してなる固体支持体を提供するものである。
−ＮＨ−ＣＯ−Ｘ−ＯＹ      （１）
（一般式（１）において、Ｘは、アルキル基で置換されていてもよい、炭素数１〜５０個のアルキレン基を表わすか、又は下記一般式（２）で表わされる基であり、Ｙは水素又はジメトキシトリチル基を表す。）
−（Ｒ１−Ｒ２）ｎ−    （２）
（一般式（２）において、Ｒ１はアルキル基で置換されていてもよいメチレン基、Ｏ又はＮＲ３を表わし、Ｒ２はアルキル基で置換されていてもよいメチレン基を表し、Ｒ３は水素又はアルキル基を表し、ｎは１〜２５の整数を表す。）
【０００９】
また、本発明は、上記固体支持体上の水酸基に、核酸分子が結合してなるＤＮＡチップ及び遺伝子検出用マイクロアレイを提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドの固定化量及び結合強度の高いＤＮＡチップ及び遺伝子検出用マイクロアレイを製造することのできる固体支持体が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、先ず本発明の固体支持体について説明する。
本発明の固体支持体は、核酸分子を固定化するための固体支持体であり、後述するように、ＤＮＡチップ（遺伝子検出用マイクロアレイ）を製造するために用いることができる。
本発明の固体支持体は、担体表面に、下記一般式（１）で表わされる基が共有結合してなる。
−ＮＨ−ＣＯ−Ｘ−ＯＹ      （１）
上記一般式（１）において、(i)Ｘは、アルキル基で置換されていてもよい、炭素数１〜５０個のアルキレン基を表わすか、又は(ii)下記一般式（２）で表わされる基であり、Ｙは水素又はジメトキシトリチル基を表わす。
【００１２】
まず、上記(i)の場合について説明する。
上記一般式（１）において、Ｘはアルキル基で置換されていてもよい、アルキレン基である。アルキレン基としては、炭素数が１〜５０個のアルキレン基であり、好ましくは炭素数は１０〜２５個である。アルキレン基の炭素数が１個よりも小さいと、ＤＮＡチップ（遺伝子検出用マイクロアレイ）を作成した際に、ＤＮＡ又はオリゴヌクレオチド（以下、本明細書において、単に「核酸」ともいう）の固定化量及び結合強度が低くなり、一方、アルキレン基の炭素数が５０個よりも大きいと、反応資材の入手が困難となる。
【００１３】
また、上記アルキル基としては、例えば、炭素数が１〜５個のアルキル基が挙げられ、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基等が挙げられる。
【００１４】
次に、上記(ii)の場合について説明する。（ii）の場合において、Ｘは下記一般式（２）で表わされる基である。
−（Ｒ１−Ｒ２）ｎ−    （２）
一般式（２）において、Ｒ１はアルキル基で置換されていてもよいメチレン基、Ｏ又はＮＲ３を表わし、Ｒ２はアルキル基で置換されていてもよいメチレン基を表し、Ｒ３は水素又はアルキル基を表し、ｎは１〜２５の整数を表す。
上記一般式（２）におけるアルキル基としては、上述したものが挙げられ、例えば、炭素数が１〜５個のアルキル基が挙げられ、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基等が挙げられる。また、ｎは、１〜２５の整数を表し、好ましくは２〜１０の整数である。ｎが１よりも小さいと、(i)の場合と同様、ＤＮＡチップ（遺伝子検出用マイクロアレイ）を作成した際に、ＤＮＡ又はオリゴヌクレオチド（以下、本明細書において、単に「核酸」ともいう）の固定化量及び結合強度が低くなり、一方、アルキレン基の炭素数が２５個よりも大きいと、反応資材の入手が困難となる。
【００１５】
本発明の固体支持体における一般式（１）で表わされる基としては、例えば以下に示す式（３）で表わされるものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）１５−ＯＨ      （３）
【００１６】
本発明の固体支持体は、上述した一般式（１）で表わされる基が、担体表面に共有結合してなる。用いられる担体としては、従来よりＤＮＡチップ及び遺伝子検出用マイクロアレイを製造するために用いられているものを特に制限なく用いることができる。用いられる担体としては、例えば、シリコン；微小多孔質ガラス、ポーラスガラス等のガラス；金属；フェライトを芯にグリシンメタクリレートで表面を覆った磁性ビーズ；プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、アクリロニトリルブタジエンスチレン樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）等が挙げられる。担体の形状としては、板状（基板状）、ビーズ状、糸状、球状、多角形状、粉末状等、どのような形状のものであってもよい。
【００１７】
上記担体としては、本発明の固体支持体を用いて製造されるＤＮＡチップ（遺伝子検出用マイクロアレイ）をプローブオンキャリア法に用いることができる点から、微小多孔質ガラス（ＣＰＧ）を用いることが好ましい。プローブオンキャリア法とは、プローブ分子を担体から切り離すことなく、担体に結合したＤＮＡプローブを用いて、例えばＳＮＰｓ検出に用いる手法のことを意味するものであり、この方法に用いるのに微小多孔質ガラスは最適である。用いられるＣＰＧのサイズは、好ましくは粒径が５００Åから５，０００Åである。担体として板状のものを用いる場合、通常、幅が０．１〜１００ｍｍ程度であり、長さが０．１〜１００ｍｍ程度であり、厚みが０．０１〜１０ｍｍ程度である。
【００１８】
上記担体は、ダイヤモンドライクカーボンによる表面処理層を形成したものであってもよい。ダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ、Diamond Like Carbon）とは、ダイヤモンドとカーボンとの混合体である不完全ダイヤモンド構造体の総称であり、その混合割合は特に限定されない。ダイヤモンドライクカーボンによる表面処理層を形成する場合、その層の厚みは好ましくは１ｎｍ〜１０μｍである。
【００１９】
また、一般式（１）で表わされる基を担体に共有結合させるためには、担体表面にアミノ基が結合していることが好ましい。従って、担体としては、表面にアミノ基が結合しているか、又はアミノ基を結合することのできるものを用いることが好ましい。
担体にアミノ基を結合する方法としては、特に制限はなく、従来公知の方法が挙げられ、例えば、シランカップリング剤で担体を処理する方法が挙げられる。シランカップリング剤とは、樹脂等の有機化合物と反応し得る有機官能基と、ガラス等の無機化合物とを、シロキサン結合を介して結合し得る部分を併せ持つ化合物のことをいう。
【００２０】
用いられるシランカップリング剤としては、例えば、γ−アミノプロピルトキメトキシシラン、Ｎ−β（アミノエチル）γ−アミノプロピルトリアルコキシシラン、Ｎ−β（アミノエチル）γ−アミノプロピルメチルジアルコキシシラン、γ−アミノプロピルトリアルコキシシラン、γ−アミノプロピルメチルジアルコキシシラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルトリアルコキシシラン、Ｎ−メチルアミノプロピルトリアルコキシシラン、Ｎ−フェニル−γ−アミノプロピルトリアルコキシシラン等が挙げられる。
【００２１】
担体表面をシランカップリング剤で処理する際には、担体を予め洗浄しておくことが好ましい。担体の洗浄方法としては、例えば、水による洗浄、薬液による洗浄、プラズマによる洗浄、ＵＶオゾンによる洗浄等多くの方法が知られているが、簡易的に、かつ均一に洗浄する方法としては、薬液による洗浄が好ましい。担体の種類によっても適当な洗浄方法は異なるが、例えば、担体としてガラスを用いる場合は、所定濃度の水酸化ナトリウム水溶液を用いる洗浄方法が好ましい。
【００２２】
担体をシランカップリング剤で処理する方法としては、特に制限はないが、例えば、浸漬法（ディッピング法）、スピンコート法、スプレーコート法、水面キャスト法等の方法が挙げられるが、特に簡便かつ均一に処理することが可能な浸漬法が好ましい。この場合、濃度が０．０５〜２質量％程度のシランカップリング剤の溶液に、担体を浸漬し、反応終了後に余分なシランカップリング剤を含む溶液を洗い流すことにより処理することが好ましい。濃度やコーティング方法は、これらに限定されるものではない。
【００２３】
次に、本発明の固体支持体の製造方法について説明する。本発明の固体支持体の製造方法に特に制限はないが、以下の方法により製造することが好ましい。
上述したようにして得られた、表面にアミノ基を結合させた担体にリンカーである、一般式（１）で表わされる基のアミノ基を除いた部分を結合させる。具体的には、下記一般式（４）で表わされる化合物を、トリエチルアミン及び４，４’−ジメトキシトリチルクロリドと反応させ、下記一般式（５）で表わされる化合物を得る。
ＨＯ−ＣＯ−Ｘ−ＯＹ      （４）
上記一般式（４）において、Ｘ及びＹは一般式（１）と同様である。
Ｅｔ３Ｎ＋ＨＯ−ＣＯ−Ｘ−Ｏ−ＤＭＴｒ      （５）
上記一般式（５）において、Ｘは一般式（１）と同様であり、Ｅｔはエチル基を表し、ＤＭＴｒはジメトキシトリメチル基を表す。
【００２４】
上記反応は、例えばピリジン等の溶媒中で、室温（約２５℃程度の温度）で４〜１０時間程度撹拌しながら実施することができる。上記反応により得られる一般式（５）で表わされる化合物は、例えば、カラムクロマトグラフィー、再結晶、昇華等の精製方法により精製することができる。
【００２５】
次いで、上述のようにして得られた一般式（５）で表わされる化合物を担体表面に共有結合させる。一般式（５）で表わされる化合物を担体表面に結合させるには、一般式（５）で表わされる化合物を、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、N，N−ジメチルホルムアミド等の溶媒溶解し、この溶媒に担体を浸漬して、室温（約２５℃程度の温度）で８〜２４時間程度撹拌することにより実施することができる。
一般式（５）で表わされる化合物を担体表面に結合させた後、ジメチルトリメチル基を除去することにより、Ｙが水素である本発明の固体支持体を得ることができる。ジメチルトリメチル基を除去する方法に特に制限はなく、従来公知の方法により実施することができる。
【００２６】
次に、本発明のＤＮＡチップ（又は遺伝子検出用マイクロアレイ）について説明する。本発明のＤＮＡチップ（又は遺伝子検出用マイクロアレイ）は、上述した本発明の固体支持体上の水酸基に、核酸分子が結合してなる。核酸分子としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の何れも核酸分子であってもよく、目的に応じてその種類を選択することができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡ断片、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを選択することが好ましい。用いられるポリヌクレオチドとしては、その機能が未知のものを用いてもよいが、データベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブラリー、ゲノムのライブラリー又は全ゲノムをテンプレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製したものであってもよい。遺伝子の変異や多型を調べるには、標準となる既知の配列を基にして、変異や多型に対応する種々のオリゴヌクレオチドを合成し、これを使用してもよい。
【００２７】
固体支持体上の水酸基又はジメトキシトリチル基に核酸分子を結合させる方法としては、予め調製したＤＮＡを結合させる方法、及び固体支持体上で直接合成する方法が挙げられる。固体支持体上でＤＮＡを直接合成する方法としては、ホスホロアミダイト法が挙げられる。ＤＮＡチップ（遺伝子検出用マイクロアレイ）を作成するた際の担体表面へのＤＮＡのスポット径には特に制限はないが、通常は５０〜２００μｍ程度である。
【００２８】
本発明のＤＮＡチップ（遺伝子検出用マイクロアレイ）は、試料中の核酸の同定方法等に用いることができる。
方法としては、まず、試料と、本発明のＤＮＡチップ（遺伝子検出用マイクロアレイ）とをハイブリダイズさせる。ハイブリダイズに際しては、ＤＮＡチップ（遺伝子検出用マイクロアレイ）に固定された核酸に対し、試料を例えば０．１μＭ〜１００μＭ程度添加することができる。また、ハイブリダイズの条件は、核酸の種類によって異なるが、例えば、０〜６０℃の温度で、例えば１〜３０分程度である。
【００２９】
ハイブリダイズが終了した後は、ＤＮＡチップ（遺伝子検出用マイクロアレイ）の種類に適した洗浄液で２〜５回洗浄を行う。このように、本発明のＤＮＡチップ（遺伝子検出用マイクロアレイ）は、核酸の同定や遺伝子の検出に用いることができる。遺伝子検出の手法としては、上述した、ＤＮＡチップ、遺伝子検出用マイクロアレイに加え、リアルタイムＰＣＲ等が挙げられ、本発明のＤＮＡチップ（遺伝子検出用マイクロアレイ）は、上述した手法に用いることができる。
上述した方法に用いられる試料としては、特に制限はないが、例えば、細胞抽出液、血液等の体液、ＰＣＲ産物、オリゴヌクレオチド等が挙げられる。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。なお、本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。
実施例１
１６−Ｏ− (4,4’-ジメトキシトリチル)ヘキサドデカン酸トリエチルアンモニウムの合成
１６−ヒドロキシヘキサドデカン酸（10 mmol, 2.7 g）を溶解させたピリジン（100ml）に、トリエチルアミン（11 mmol, 1.5 mL）を加え、次いで ４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（11 mmol, 3.7 g）を加え、室温で6時間撹拌した。次いで、メタノール（10ml）を加えて5分間撹拌を行ったのち、酢酸エチル（500ml）で反応液を希釈した後、飽和食塩水500mlで３回抽出操作を行った。次いで、有機相を回収し、回収した有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し濾過を行った後、溶媒を減圧下留去し、粗生成物を得た。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン、酢酸エチル、1%トリエチルアミン）により精製を行い、１６−Ｏ− (4,4’-ジメトキシトリチル)ヘキサドデカン酸トリエチルアンモニウムを95%の収率で得た。
1H NMR (CDCl３): 1.14 (t, 9H, J = 7.3 Hz), 1.21-1.45 (m, 28H), 2.21 (t, 2H, J= 7.6 Hz), 2.87 (dd, 6H, J = 7.3 Hz, 14.6 Hz), 3.01 (t, 2H, J = 8.9 Hz), 7.90 (d, 2H, J = 8.9 Hz),
【００３１】
実施例２
２０００Åの細孔径を有する微小多孔質ガラス（ＣＰＧ）を減圧下で、２５０℃で１時間加熱した。系内をアルゴンガスで置換した後、無水トルエン（９９ｍＬ）、γ−アミノプロピルトリメトキシシラン（０．１ｍＬ）、ｎ−ブタノール（０．９ｍＬ）の混合溶媒を加えた。次いで、加熱還流を１５分間行い、混合溶媒をデカンテーションにより除去してＣＰＧを無水トルエンで２回洗浄した。再度、無水トルエン（１００ｍＬ）を加えて加熱還流を１２時間行い、次いでＣＰＧを吸引ろ過して減圧下、乾燥することによりアミノプロピルＣＰＧ固相担体を得た。
【００３２】
上述のようにして得られたアミノプロピルＣＰＧ固相担体(500 mg 52μmol)を十分に乾燥させた。十分に乾燥させたアミノプロピル微小多孔質ガラス（ＣＰＧ）固相担体、 実施例１で得られた１６−Ｏ−(4,4’-ジメトキシトリチル)ヘキサドデカン酸トリエチルアンモニウム(175 mg,260μmol)及びジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC、268 mg, 1.3mmol) をジクロロメタン (5 mL)に溶解し、室温で１２時間撹拌を行い反応を行った。反応終了後、固相担体をろ過し、アセトニトリルを用いて洗浄した後、乾燥し、無水酢酸 (0.5ml)及びDMAP (5 mg) をピリジン (4.5 mL) に溶解した溶液に加えた。次いで、溶液を室温（２５℃）で３時間撹拌を行った後、固相担体を再度ろ過し、アセトニトリルを用いて洗浄を行い、固体支持体を得た。固体支持体へのリンカーの導入量をトリチル基の比色定量より求めたところ、リンカーの導入量は、２１μmol/gであった。また、得られた固体支持体のジメトキシトリメチル基の密度をＤＭＴｒカチオンアッセイにより測定したところ、１４．４μｍｏｌ／ｇであった。
【００３３】
比較例１
非特許文献１に記載された方法に従ってＳｏｕｔｈｅｒｎ型リンカーを介して導入し、その後、ＤＭｔｒ基を導入し、固体支持体を得た。固相担体に導入されたリンカーは、下記式（６）で表される基である。
-O-Si(R) ２CH２CH２CH２OCH２CH(OH)CH２-(OCH２CH２)ｎ-ODMTr          （６）
上記式（６）において、Ｒはメトキシ基であり、ｎは６である。
得られた固体支持体中のジメトキシトリメチル基の密度を、ＤＭＴｒカチオンアッセイにより測定したところ、ＤＭＴｒ基の密度は１０μｍｏｌ／ｇであった。
【００３４】
実施例３
実施例２及び比較例１で得られた固体支持体を、それぞれ２８％アンモニア水に浸漬し、室温（２５℃）で８時間放置した。８時間経過した後、固体支持体をアンモニア水から取り出し、それぞれについてジメトキシトリメチル基の密度を測定した。実施例２で得られた固体支持体においては、ジメトキシトリメチル基の密度の減少、すなわち脱離は４％であったのに対し、比較例１で得られた固体支持体においてはジメトキシトリメチル基の密度の減少（脱離）は９６％であった。この結果より、本発明の固体支持体はアンモニア水による処理によってもリンカーの脱離し難いものである、すなわち本発明の固体支持体は核酸分子の固定化量及び結合強度の高いものであることがわかる。そのため、化学処理によってもオリゴヌクレオチドの脱離が最小限に抑制されるので、ＤＮＡチップ（遺伝子検出用マイクロアレイ）等の遺伝子解析装置に適用した場合、従来のものよりも、正確性を大幅に向上することができ、また、より質の高い品質管理が可能になる。
【００３５】
実施例４
実施例２で得られた固体支持体に、ヘキサエチレングリコールリンカーを介して、ホスホロアミダイト法により、１４量体のＤＮＡオリゴマー（ＤＮＡプローブ）を結合させ、ＤＮＡプローブが結合したＣＰＧ（ＤＮＡチップ）を得た。塩基部のアミノ基の保護基としては、アデニンについてはフェノキシアセチル基、シトシンについてはアセチル基、グアニンについては４−イソプロピルフェノキシアセチル基を用い、鎖伸長過程においては、ＡＢＩ３９２のスタンダード合成サイクルを使用した。
【００３６】
合成したＤＮＡプローブは以下の通りである。
プローブWild：5’-d(GCCTCCGGTTCAT)（配列番号：１）
プローブHSC-4：5’-d(GCCTCTGGTTCAT) （配列番号：２）
プローブCa-9：5’-d(GCCTCCAGTTCAT) （配列番号：３）
得られたプローブを図式化したものを、下記式（７）に示す。
【００３７】
【化１】
2007078399.tif 000002
【００３８】
実施例５
以下の配列番号：４〜６で表わされる３種類の蛍光オリゴヌクレオチドを常法に従い作製した。なお、配列番号：４〜６で表わされる蛍光オリゴヌクレオチドは、全て３’末端にフルオレセインが結合したものである。
蛍光オリゴヌクレオチドWild：GGCATGAACCGGAGGCCCAT（配列番号：４）
蛍光オリゴヌクレオチドHSC-4：GGCATGAACCAGAGGCCCAT（配列番号：５）
蛍光オリゴヌクレオチドCa-9：GGCATGAACTGGAGGCCCAT（配列番号：６）
【００３９】
上記配列番号：４〜６で表わされる塩基配列を有する蛍光オリゴヌクレオチドの溶液（２５０ｎＭ  オリゴヌクレオチド、１００ｍＭリン酸バッファー、１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０）を作製した。次いで、実施例４で得られたＤＮＡプローブが結合したＣＰＧを十分に乾燥させた後、そのＣＰＧを上記蛍光オリゴヌクレオチド溶液０．２５ｍＬに浸漬した。蛍光オリゴヌクレオチド溶液を５０℃の温度で１０時間撹拌した後、蛍光オリゴヌクレオチド溶液を除去し、リン酸バッファー（１００ｍＭリン酸バッファー、１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０）０．２５ｍＬにＣＰＧを添加し、５０℃の温度で１時間撹拌して洗浄を行った。洗浄終了後、リン酸バッファーを除去し、ＣＰＧの蛍光測定を行った。
【００４０】
なお、配列番号：１で表わされる塩基配列を有するＤＮＡプローブと配列番号：４を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせ、配列番号：２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡプローブと配列番号：５を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせ、配列番号：３で表わされる塩基配列を有するＤＮＡプローブと配列番号：６を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせは、両者が完全にマッチし、配列番号：１で表わされる塩基配列を有するＤＮＡプローブと配列番号：５を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせはＣ−Ａミスマッチ、配列番号：１で表わされる塩基配列を有するＤＮＡプローブと配列番号：６を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせはＧ−Ｔミスマッチ、配列番号：２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡプローブと配列番号：４を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせはＴ−Ｇミスマッチ、配列番号：２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡプローブと配列番号：６を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせはＴ−Ｇ、Ｇ−Ｔミスマッチ、配列番号：３で表わされる塩基配列を有するＤＮＡプローブと配列番号：４を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせはＡ−Ｃミスマッチ、配列番号：３で表わされる塩基配列を有するＤＮＡプローブと配列番号：５を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせはＡ−Ｃ、Ｃ−Ａミスマッチを示す。
【００４１】
測定結果を図１に示す。図１は、蛍光測定の結果を示すグラフであり、横軸は相対蛍光輝度を表す。左側には、用いたＤＮＡプローブの種類を示し、それぞれ、配列番号：４〜６で表わされる塩基配列を有する蛍光オリゴヌクレオチドとの蛍光測定の結果を示す。図１から明らかなように、完全にマッチする組み合わせにおいては蛍光輝度が高く、ミスマッチの場合、完全にマッチする場合よりも蛍光輝度が低いことがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】蛍光測定の結果を示すグラフである。
【図１】
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【配列表】
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