(57)【要約】【課題】  遠心分離などの前処理の必要がなく、簡便な操作で効率よく測定することができ、種々の自動分析装置に適用できるＨＤＬ中のコレステロールの定量法を提供すること。【解決手段】  血清に対し、ポリオキシエチレンアルキレンフェニルエーテル及びポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテルから選ばれる界面活性剤、ならびにコレステロール測定用酵素試薬を添加し、リポタンパク質のうち、ＨＤＬ中のコレステロールが優先的にコレステロール測定用酵素試薬と反応する時間内にそのコレステロールの反応量を測定するＨＤＬコレステロールの定量法および更に血清リポタンパク質中のコレステロールとコレステロール測定用酵素試薬との反応を阻害する効果を有する物質を加えたＨＤＬコレステロールの定量法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の成分（イ）〜（ハ）、
（イ）以下の方法（ａ１）又は（ａ２）、
（ａ１）血清検体３μｌに、１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液（第一試薬；ｐＨ６．５）
３００μｌを添加し、約５分後に、ポリオキシエチレンアルキレンフェニルエー
テル及びポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテルから選ば
れる界面活性剤１％、コレステロールエステラーゼ１Ｕ／ｍｌ、コレステロール
オキシダーゼ１Ｕ／ｍｌ、パーオキシダーゼ５Ｕ／ｍｌ、ジスルフホブチルメタ
トルイジン０．０４％及び４−アミノアンチピリン０．００４％を含む１００ｍ
ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）からなるコレステロール測定試薬（第二試薬）
１００μｌを加え、第二試薬添加直前と添加後５分後の波長６００ｎｍ（副波長
７００ｎｍ）における吸光度を測定し、その差より血清検体中の高比重リポタン
パク質（ＨＤＬ）コレステロール濃度を求める。
（ａ２）血清検体３μｌに、１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液（第一試薬；ｐＨ６．５）
３００μｌを添加し、約５分後に、ポリオキシエチレンアルキレンフェニルエー
テル及びポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテルから選ば
れる界面活性剤１％、コレステロールエステラーゼ１Ｕ／ｍｌ、コレステロール
オキシダーゼ１Ｕ／ｍｌ、パーオキシダーゼ５Ｕ／ｍｌ、ジスルフホブチルメタ
トルイジン０．０４％及び４−アミノアンチピリン０．００４％を含む１００ｍ
ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）からなるコレステロール測定試薬（第二試薬）
１００μｌを加え、第二試薬添加後、１２秒から２４秒までの波長５４６ｎｍ（副
波長６６０ｎｍ）における吸光度変化を測定し、血清検体中のＨＤＬコレステロ
ール濃度を求める。
により測定された検体中のＨＤＬコレステロール濃度と、
以下の沈殿法（ｂ）、
（ｂ）デキストラン硫酸０．３％及び塩化マグネシウム２％を含む水溶液２００μ
ｌを血清検体２００μｌと混和し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った
上清５０μｌと、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００  １％、コレステロール
エステラーゼ１Ｕ／ｍｌ、コレステロールオキシダーゼ１Ｕ／ｍｌ、パーオキシ
ダーゼ５Ｕ／ｍｌ、ジスルフホブチルメタトルイジン０．０４％及び４−アミノ
アンチピリン０．００４％を含む１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）から
なるコレステロール測定試薬３ｍｌと混合し、３７℃で１０分間インキュベート
した後、波長６００ｎｍにおける吸光度を測定し、ＨＤＬコレステロール濃度を
求める。
により測定された検体中のＨＤＬコレステロール濃度を比較したとき、沈殿法（ｂ）
に対する方法（ａ１）又は（ａ２）の測定値の相関係数が０．９２２以上となるポ
リオキシエチレンアルキレンフェニルエーテル及びポリオキシエチレンアルキレン
トリベンジルフェニルエーテルであるエマルゲン（登録商標）Ａ−６０及びエマル
ゲン（登録商標）Ｂ６６から選ばれる界面活性剤、
（ロ）ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニル
エーテル、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物、ポリオキシエチレ
ンアルキルエーテル硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩から選ばれるリポタン
パク質を溶解しない界面活性剤、
及び／又は
ポリアニオン、２価金属イオンを生成する物質若しくはポリアニオンと２価金属イ
オンを生成する物質の組み合わせから選ばれる血清リポタンパク質中のコレステロ
ールとコレステロール測定用酵素試薬との反応を阻害する効果を有する物質、
（ハ）コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの組み合わせ又
はコレステロールエステラーゼ及びコレステロールデヒドロゲナーゼの組み合わせ
からなるコレステロール測定用酵素試薬、
を血清に添加し、リポタンパク質のうち、高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）中のコレステロールが優先的にコレステロール測定用酵素試薬と反応する時間内にそのコレステロールの反応量を測定することを特徴とする高比重リポタンパク質コレステロールの定量法。
【請求項２】
ポリアニオンが、デキストラン硫酸、リンタングステン酸、ヘパリンから選ばれるものである請求項１記載の高比重リポタンパク質コレステロールの定量法。
【請求項３】
２価金属イオンを生成する物質が、２価金属の塩化物及びこれらの水和物から選ばれるものである請求項１記載の高比重リポタンパク質コレステロールの定量法。
【請求項４】
２価金属イオンを生成する物質が、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＮｉＣｌ２、及びこれらの水和物から選ばれるものである請求項１記載の高比重リポタンパク質コレステロールの定量法。
【請求項５】
高比重リポタンパク質中のコレステロールが優先的にコレステロール測定用酵素試薬と反応する時間内が、ＨＤＬ中のコレステロールが反応し、ＨＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールが反応しない時間内である請求項１〜４のいずれか１項に記載の高比重リポタンパク質コレステロールの定量法。
【請求項６】
高比重リポタンパク質中のコレステロールが優先的にコレステロール測定用酵素試薬と反応する時間が、１２−３１２秒である請求項１〜５のいずれか１項に記載の高比重リポタンパク質コレステロールの定量法。
【請求項７】
次の成分（イ）〜（ハ）、
（イ）以下の方法（ａ１）又は（ａ２）、
（ａ１）血清検体３μｌに、１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液（第一試薬；ｐＨ６．５）
３００μｌを添加し、約５分後に、ポリオキシエチレンアルキレンフェニルエー
テル及びポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテルから選ば
れる界面活性剤１％、コレステロールエステラーゼ１Ｕ／ｍｌ、コレステロール
オキシダーゼ１Ｕ／ｍｌ、パーオキシダーゼ５Ｕ／ｍｌ、ジスルフホブチルメタ
トルイジン０．０４％及び４−アミノアンチピリン０．００４％を含む１００ｍ
ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）からなるコレステロール測定試薬（第二試薬）
１００μｌを加え、第二試薬添加直前と添加後５分後の波長６００ｎｍ（副波長
７００ｎｍ）における吸光度を測定し、その差より血清検体中のＨＤＬコレステ
ロール濃度を求める。
（ａ２）血清検体３μｌに、１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液（第一試薬；ｐＨ６．５）
３００μｌを添加し、約５分後に、ポリオキシエチレンアルキレンフェニルエー
テル及びポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテルから選ば
れる界面活性剤１％、コレステロールエステラーゼ１Ｕ／ｍｌ、コレステロール
オキシダーゼ１Ｕ／ｍｌ、パーオキシダーゼ５Ｕ／ｍｌ、ジスルフホブチルメタ
トルイジン０．０４％及び４−アミノアンチピリンを含む１００ｍＭのＭＥＳ緩
衝液（ｐＨ６．５）からなるコレステロール測定試薬（第二試薬）１００μｌを
加え、第二試薬添加後、１２秒から２４秒までの波長５４６ｎｍ（副波長６６０
ｎｍ）における吸光度変化を測定し、血清検体中のＨＤＬコレステロール濃度を
求める。
により測定された検体中のＨＤＬコレステロール濃度と、
以下の沈殿法（ｂ）、
（ｂ）デキストラン硫酸０．３％及び塩化マグネシウム２％を含む水溶液２００μ
ｌを血清検体２００μｌと混和し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った
上清５０μｌと、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００  １％、コレステロール
エステラーゼ１Ｕ／ｍｌ、コレステロールオキシダーゼ１Ｕ／ｍｌ、パーオキシ
ダーゼ５Ｕ／ｍｌ、ジスルフホブチルメタトルイジン０．０４％及び４−アミノ
アンチピリン０．００４％を含む１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）から
なるコレステロール測定試薬３ｍｌと混合し、３７℃で１０分間インキュベート
した後、波長６００ｎｍにおける吸光度を測定し、ＨＤＬコレステロール濃度を
求める。
により測定された検体中のＨＤＬコレステロール濃度を比較したとき、沈殿法（ｂ）
に対する方法（ａ１）又は（ａ２）の測定値の相関係数が０．９２２以上となるポ
リオキシエチレンアルキレンフェニルエーテル及びポリオキシエチレンアルキレン
トリベンジルフェニルエーテルであるエマルゲン（登録商標）Ａ−６０及びエマル
ゲン（登録商標）Ｂ６６から選ばれる界面活性剤
（ロ）ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニル
エーテル、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物、ポリオキシエチレ
ンアルキルエーテル硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩から選ばれるリポタン
パク質を溶解しない界面活性剤、
及び／又は
ポリアニオン、２価金属イオンを生成する物質若しくはポリアニオンと２価金属イ
オンを生成する物質の組み合わせから選ばれる血清リポタンパク質中のコレステロ
ールとコレステロール測定用酵素試薬との反応を阻害する効果を有する物質
（ハ）コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの組み合わせ又
はコレステロールエステラーゼ及びコレステロールデヒドロゲナーゼの組み合わせ
からなるコレステロール測定用酵素試薬
を含有する請求項１に記載の高比重リポタンパク質コレステロールの定量法に用いるための高比重リポタンパク質コレステロール測定用試薬又は試薬キット。
【請求項８】
ポリアニオンが、デキストラン硫酸、リンタングステン酸、ヘパリンから選ばれるものである請求項７記載の高比重リポタンパク質コレステロール測定用試薬又は試薬キット。
【請求項９】
２価金属イオンを生成する物質が、２価金属の塩化物及びこれらの水和物から選ばれるものである請求項７記載の高比重リポタンパク質コレステロール測定用試薬又は試薬キット。
【請求項１０】
２価金属イオンを生成する物質が、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＮｉＣｌ２、及びこれらの水和物から選ばれるものである請求項７記載の高比重リポタンパク質コレステロール測定用試薬又は試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遠心分離などの操作の必要がなく、少ない試料で簡便な操作により効率良く高比重リポタンパク（ＨＤＬ）中のコレステロールとＨＤＬ以外のリポタンパク中のコレステロールとを分離定量する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コレステロール等の脂質は、血清中においてアポタンパクと結合し、リポタンパク質を形成している。リポタンパク質は物理的な性状の違いにより、カイロミクロン、超低比重リポタンパク（ＶＬＤＬ）、低比重リポタンパク（ＬＤＬ）、高比重リポタンパク（ＨＤＬ）等に分類される。これらのリポタンパク質のうち、ＬＤＬは動脈硬化を引き起こす原因物質の一つであり、一方ＨＤＬは抗動脈硬化作用を示す事が知られている。
【０００３】
疫学的には、ＨＤＬ中のコレステロール値は動脈硬化性疾患の発症頻度と逆相関を示す事が知られており、今日では、虚血性心疾患の予防や診断を目的としてＨＤＬ中のコレステロールの測定が広く行われている。ＨＤＬ中のコレステロールの測定法としては、たとえば超遠心分離によってＨＤＬを、他のリポタンパクと分離した後、コレステロール測定に供する方法や、電気泳動によって分離した後に脂質の染色を行って、その発色強度を測定する方法が知られている。しかしながら、これらの方法は、いずれも、操作が煩雑であったり、多数の検体を処理できないなどの問題があり、日常的にほとんど用いられていなかった。
【０００４】
現在臨床検査の領域で一般に広く用いられている、ＨＤＬ中のコレステロールの測定方法は、検体に沈殿剤を加えてＨＤＬ以外のリポタンパクを凝集させ、これを遠心分離によって取り除き、分離されたＨＤＬのみを含む上清中のコレステロールを測定する沈殿法である。 この方法は、超遠心法や電気泳動法に比較して簡便であるものの、沈殿剤を加えて分離する操作を含むために、比較的多量の検体量を要し、又、分析誤差を生じる可能性も高く、全分析工程を完全に自動化することはできなかった。
【０００５】
一方、酵素的にＨＤＬ中のコレステロールを分別定量する方法も検討されている。たとえば、胆汁酸塩及び非イオン系界面活性剤の存在下に、酵素反応を行う方法（特開昭６３−１２６４９８号公報）が知られている。この方法は、反応初期の酵素反応はＬＤＬ濃度に比例し、その後ＨＤＬ中のコレステロール濃度に比例することを利用したものであるが、ＨＤＬ中のコレステロールと他のリポタンパク質の中のコレステロールの反応を完全に分別することはできず、正確性に問題があった。
【０００６】
また、ＨＤＬ以外のリポタンパク質をあらかじめ凝集させておき、ＨＤＬ中のコレステロールのみを酵素的に反応させた後に、酵素を失活させると同時に凝集を再溶解して吸光度を測定するという方法（特開平６−２４２１１０号）が知られている。しかしながら、この方法は少なくとも３回の試薬を添加する操作が必要であるため、限定された自動分析装置にしか適用できず、汎用性の点で問題があった。又、沈殿の再溶解に際しては、高濃度の塩を使う等、分析器機に対するダメージや試薬廃棄の点でも満足できるものではなかった。
【０００７】
更に、特許第２６０００６５号では、通常の沈殿法に用いられる、ＨＤＬ以外のリポタンパクを沈殿させる沈殿試薬と一般的なコレステロール測定試薬を組み合わせて使用し、沈殿しないＨＤＬ中のコレステロールを測定する方法が開示されるが、沈殿剤の効果によって生じる濁りが測定系に妨害を与え、また、一般的なコレステロール試薬では沈殿するＨＤＬ以外のリポタンパク中のコレステロールとも反応してしまうなど、精度の点では不十分な測定法であった。
【特許文献１】特開昭６３−１２６４９８号公報
【特許文献２】特開平６−２４２１１０号公報
【特許文献３】特許第２６０００６５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明の目的は、遠心分離などの前処理の必要がなく、簡便な操作で効率よく測定することができ、種々の自動分析装置に適用できるＨＤＬ中のコレステロールの定量法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は血清中のリポタンパク中のコレステロールの測定について種々検討していたところ、リポタンパクを溶解する特定の界面活性剤の存在下で血清とコレステロール測定用酵素試薬との反応を行えば、まず最初にＨＤＬコレステロールのみが反応し、次いでＨＤＬの反応に遅れてＶＬＤＬ中のコレステロールが反応し、最後にかなり遅れてＬＤＬ中のコレステロールが反応することを知った。
【００１０】
そして、更に研究を行った結果、最初のＨＤＬコレステロール濃度に依存する反応を測定できるよう測定ポイントを適宜選択することにより、ＨＤＬコレステロールのみを測定できること、および系内に血清リポタンパク内のコレステロールとコレステロール測定用酵素との反応を阻害する物質を存在せしめることにより、ＨＤＬコレステロールの濃度のみに依存した反応を長時間にわたって維持できること、更にこれらの方法は自動分析装置にも適用できることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、血清に対し、ポリオキシエチレンアルキレンフェニルエーテル及びポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテルから選ばれる界面活性剤、ならびにコレステロール測定用酵素試薬を添加し、リポタンパク質のうち、ＨＤＬ中のコレステロールが優先的にコレステロール測定用酵素試薬と反応する時間内にそのコレステロールの反応量を測定することを特徴とするＨＤＬコレステロールの定量法を提供するものである。
【００１２】
また、本発明は、上記ＨＤＬコレステロールの定量法において、更に血清リポタンパク質中のコレステロールとコレステロール測定用酵素試薬との反応を阻害する効果を有する物質を加えた方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、遠心分離などの前処理の必要がなく、簡便な操作で効率良くＨＤＬ中のコレステロールを定量する事ができる。 また、少ない試料で、簡便な操作により、特異的な測定が可能であるため、種々の自動分析装置に適用でき、臨床検査の領域において極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明方法で用いられるポリオキシエチレンアルキレンフェニルエーテル及びポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテルから選ばれる界面活性剤（以下、「溶解促進性活性剤」という）は、リポタンパク質を溶解する作用を有する界面活性剤である。 このうち前者の市販品の例としてはエマルゲンＡ−６０（花王社製）などが、後者の市販品の例としてはエマルゲンＢ６６（花王社製）等があげられる。 かかる界面活性剤は、単独で又は２種以上を組み合わせて用いる事ができる。 またその使用量は化合物によって異なり、特に制限されるものではないが、試薬を適用すべき分析装置毎に、望ましい測定時間内にＨＤＬコレステロールが検出できる感度となるよう、実験的に定めることができ、通常は０.０１−５重量％の濃度にて使用するのが好ましい。
【００１５】
また、本発明の測定方法においては、血清リポタンパク質のコレステロールとコレステロール測定用酵素試薬との反応を阻害する効果を有する物質（以下、「反応阻害物質」）の存在下で行うことが好ましく、そうすることにより存在しない場合に比較して、より長時間ＨＤＬコレステロールの濃度のみに依存した反応を維持することができる。
【００１６】
本発明で用いられる反応阻害物質としては、リポタンパク質に結合親和性を示す物質やリポタンパク質を溶解しない界面活性剤が挙げられ、それぞれ単独であるいは複数の物質を組み合わせて用いることができる。
【００１７】
リポタンパク質に結合親和性を示す物質（以下、「結合性物質」という）の例としては、ポリアニオンと２価金属塩を生成する物質の組み合わせを挙げることができるが、これはＨＤＬとも結合し沈殿を生じるような物質であってもかまわない。 具体的なポリアニオンの例としては、デキストラン硫酸、リンタングステン酸、ヘパリン等が、２価金属塩を生成する物質の例としては、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＮｉＣｌ２等の２価金属の塩化物やこれらの水和物等が挙げられる。 これらの結合性物質は、単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができ、またその使用量は物質の種類によって異なり、特に限定されるものではないが、反応終濃度として、ポリアニオンの場合には０.００２−１０重量％、２価金属塩を生成する物質の場合には０.０１−５重量％となる範囲で用いるのが望ましい。
【００１８】
また、リポタンパク質を溶解しない界面活性剤（以下、「溶解阻害性活性剤」という）としては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルーテル、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩等から選ばれる界面活性剤が挙げられる。
【００１９】
これらのうち、ポリオキシエチレンアルキルエーテルとしては、ポリオキシエチレンセチルエーテル（市販品としてはエマルゲン２２０（花王社製）等）が；ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルとしては、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（市販品としてはエマルゲン９１３（花王社製）等）が；ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物としてはプルロニックＦ−８８（旭電化社製）が；ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩としてはポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム（市販品としてはエマール２０Ｃ（花王社製）等）が；アルキルベンゼンスルホン酸塩としてはドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムが好ましい。
【００２０】
これらの溶解阻害性活性剤は、１種又は２種以上を組み合わせて用いる事ができ、その使用量は特に限定されないが、試料と混合したときの濃度が０.０１−５重量％、特に０.０５−１重量％になるような範囲で用いるのが望ましい。
【００２１】
溶解促進性活性剤とコレステロール測定用酵素試薬（以下、「コレステロール試薬」という）を検体である血清へ添加するに際しては、それぞれを別途添加しても、また混合物として同時に添加してもよい。 また、反応阻害物質は、溶解促進性活性剤とコレステロール試薬のいずれかまたはこれらの混合物に添加して用いることができる。更に、複数の反応阻害物質を使用する場合は、混合して単独の場合と同様に用いられるほか、溶解促進性活性剤とコレステロール試薬にそれぞれ別に添加して用いてもよい。
【００２２】
本発明のコレステロールの測定のために用いるコレステロール試薬としては、公知の酵素試薬、例えばコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの組み合わせ、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールデヒドロゲナーゼの組み合わせ等が挙げられる。これらのうち、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの組み合わせが好ましい。
【００２３】
更に、これらのコレステロール試薬を添加した後、最終的にコレステロールの反応量を測定するために用いる方法は特に制限されず、例えばパーオキシダーゼと色原体をさらに組み合わせて行う吸光度分析、補酵素や過酸化水素を直接検出する方法等が挙げられる。
【００２４】
本発明方法においては、ＨＤＬのコレステロールが優先的にコレステロール測定用酵素試薬と反応する時間内にその反応を検出する必要があるが、そのためには溶解促進性活性剤とコレステロール試薬と試料とを混合した後の、進行する反応を動力学的にモニターする方法や、ＨＤＬコレステロールの反応を反応終末点法で測定してブランク値にて補正する方法（２ポイント法）等を用いることができる。また、ＨＤＬの反応をより長くモニターする必要がある場合には、反応阻害物質を添加し、コレステロールの検出反応を遅延させる事によって、ＨＤＬコレステロール濃度のみに依存する反応を延長させることができる。
【００２５】
本発明方法を有利に実施するために利用される試薬ないし試薬キットとしては、例えば次のものを挙げることができる。 
（１）次の２成分（イ）および（ロ）を含有するもの。
（イ）溶解促進性活性剤
（ロ）コレステロール試薬
（２）次の成分（イ）〜（ハ）、
（イ）溶解促進性活性剤
（ロ）反応阻害物質（結合性物質、溶解阻害性活性剤）
（ハ）コレステロール試薬
【００２６】
このような試薬や試薬キットには、前記の溶解促進性活性剤、コレステロール試薬（コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ等）、反応阻害物質（結合性物質、溶解阻害性活性剤）、パーオキシダーゼ、色原体、補酵素等の他、適当なｐＨ緩衝剤、酸化防止剤、担体等を組み合わせることができる。 また、試薬や試薬キットの形状としても、液体状のものの他、これを凍結乾燥したもの等が利用できる。
【実施例】
【００２７】
次に、実施例を挙げて本発明をさらに説明するが、本発明はこれに何ら制約されるものではない。
【００２８】
実 施 例  １
リポタンパク質を含む５０例の血清検体について、以下の本発明方法及び従来の沈殿法により、ＨＤＬ中のコレステロールを定量し、これらの測定値を比較した。
本発明方法は、各血清検体３μｌに、１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液（第一試薬；ｐＨ６.５）３００μｌを添加し、約５分後に、エマルゲンＢ−６６ １％、コレステロールエステラーゼ １Ｕ／ｍｌ、コレステロールオキシダーゼ １Ｕ／ｍｌ、パーオキシダーゼ ５Ｕ／ｍｌ及びジスルフホブチルメタトルイジン ０.０４％、４−アミノアンチピリン ０.００４％を含む１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６.５）からなるコレステロール測定試薬（第二試薬）１００μｌを加え、第二試薬直前と添加後５分後の６００ｎｍ（副波長 ７００ｎｍ）における吸光度を測定し、その差より血清検体中のＨＤＬコレステロール濃度を求めた（２ポイント法）。 また、較正用物質として濃度既知のコントロール血清を用いた。 なお、以上の操作は、日立７１５０型自動分析装置を用いて行った。
【００２９】
一方、沈殿法によりＨＤＬ中のコレステロールを測定するには、デキストラン硫酸 ０.３％及び塩化マグネシウム ２％を含む水溶液 ２００μｌを検体 ２００μｌと混和し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った。 この上清５０μｌを採取し、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ １％、コレステロールエステラーゼ １Ｕ／ｍｌ、コレステロールオキシダーゼ １Ｕ／ｍｌ、パーオキシダーゼ ５Ｕ／ｍｌ及びジスルフホブチルメタトルイジン ０.０４％、４−アミノアンチピリン ０.００４％を含む１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６.５）からなるコレステロール測定試薬３ｍｌと混合し、３７℃で１０分間インキュベートした後、６００ｎｍにおける吸光度を測定し、ＨＤＬ中のコレステロール濃度を求めた。
【００３０】
本発明法と沈殿法による結果の相関図を図１に示すが、本発明方法は簡便な操作であるにもかかわらず、従来の沈殿法と極めて良好な相関を示していた。
【００３１】
実 施 例  ２
第二試薬中のエマルゲンＢ−６６の代わりにエマルゲンＡ−６０ １％を添加した以外は実施例１と同一の試薬を用い、同一の方法でリポタンパク質を含む５０例の血清検体について、ＨＤＬ中のコレステロールを定量した。
即ち、検体３μｌに第一試薬３００μｌを添加し、約５分後、第二試薬１００μｌを加えた。 第２試薬添加後、１２秒後から２４秒後までの５４６ｎｍ（副波長 ６６０ｎｍ）における吸光度変化を測定し、血清検体中のＨＤＬコレステロール濃度を求めた。 また、較正用物質としては濃度既知の２種類のコントロール血清（低濃度と高濃度）を使用した。 なお、以上の操作は、日立７１５０型自動分析装置を用いて行った。
また、同じ検体について、従来の沈殿法で実施例１と同様に、ＨＤＬ中のコレステロールを定量し、これらの測定値を比較した。 この結果を図２に示す。
【００３２】
図２の結果から、本発明方法は簡便な操作であるにもかかわらず、従来の沈殿法と良好な相関を示した。
【００３３】
実 施 例  ３
実施例２において用いたのと同一の第二試薬と、下記の第一試薬を用い、リポタンパク質を含む５０例の血清検体について、本発明方法及び従来の沈殿法により、ＨＤＬ中のコレステロールを定量し、これらの測定値を比較した。 なお、第一試薬Ａ（実施例２と同じ）は対照として加えた。
【００３４】
［  第一試薬  ］
第一試薬Ａ：
１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６.５）
第一試薬Ｂ：
プルロニックＦ−８８（旭電化社製）０.２％水溶液
第一試薬Ｃ：
リンタングステン酸ナトリウム ０.２％及び塩化マグネシウム １００ｍＭ
を含む水溶液（ｐＨ６.４）
第一試薬Ｄ：
プルロニックＦ−８８ ０.２％、リンタングステン酸ナトリウム ０.２％及
び塩化マグネシウム １００ｍＭを含む水溶液（ｐＨ６.４）
【００３５】
吸光度の測定は、反応阻害物質の添加の効果を確認するため、日立７１５０を用いて第二試薬添加後１２秒から２４秒後、１２秒後から１６８秒後及び１２秒後から３１２秒後のそれぞれ異なる測光時間を用いて測定を行った。
一方、沈殿法によるＨＤＬの測定は実施例１と同様に行い、各条件での本発明方法との相関関係を調べた。 この相関係数を表１に示す。
【００３６】
【表１】
2007295935.tif 000002
【００３７】
この結果に示されるように、反応阻害物質を含まない第一試薬では、反応初期の吸光度測定でのみ良好な結果を示した。 一方、反応阻害物質を含むプルロニックＦ−８８（旭電化社製）０.２％水溶液、リンタングステン酸ナトリウム ０.２％及び塩化マグネシウム １００ｍＭを含む水溶液（ｐＨ６.４）並びにプルロニックＦ−８８ ０.２％、リンタングステン酸ナトリウム ０.２％及び塩化マグネシウム １００ｍＭを含む水溶液（ｐＨ６.４）をそれぞれ第一試薬として用いた測定結果では、長時間の測定でいずれも良好な相関（１に近いほど相関性が高い）を示し、反応阻害物質が、ＨＤＬコレステロール量に依存する反応を延長する効果があることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】実施例１における本発明方法と沈殿法の分析値の相関関係を示す図面
【図２】実施例２における本発明方法と沈殿法の分析値の相関関係を示す図面                                                       以    上
【図１】
2007295935.tif 000003
【図２】
2007295935.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成19年8月30日(2007.8.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の成分（イ）〜（ハ）、
（イ）以下の方法（ａ１）又は（ａ２）、
（ａ１）血清検体３μｌに、１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液（第一試薬；ｐＨ６．５）
３００μｌを添加し、約５分後に、ポリオキシエチレンアルキレンフェニルエー
テル及びポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテルから選ば
れる界面活性剤１％、コレステロールエステラーゼ１Ｕ／ｍｌ、コレステロール
オキシダーゼ１Ｕ／ｍｌ、パーオキシダーゼ５Ｕ／ｍｌ、ジスルフホブチルメタ
トルイジン０．０４％及び４−アミノアンチピリン０．００４％を含む１００ｍ
ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）からなるコレステロール測定試薬（第二試薬）
１００μｌを加え、第二試薬添加直前と添加後５分後の波長６００ｎｍ（副波長
７００ｎｍ）における吸光度を測定し、その差より血清検体中の高比重リポタン
パク質（ＨＤＬ）コレステロール濃度を求める。
（ａ２）血清検体３μｌに、１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液（第一試薬；ｐＨ６．５）
３００μｌを添加し、約５分後に、ポリオキシエチレンアルキレンフェニルエー
テル及びポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテルから選ば
れる界面活性剤１％、コレステロールエステラーゼ１Ｕ／ｍｌ、コレステロール
オキシダーゼ１Ｕ／ｍｌ、パーオキシダーゼ５Ｕ／ｍｌ、ジスルフホブチルメタ
トルイジン０．０４％及び４−アミノアンチピリン０．００４％を含む１００ｍ
ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）からなるコレステロール測定試薬（第二試薬）
１００μｌを加え、第二試薬添加後、１２秒から２４秒までの波長５４６ｎｍ（副
波長６６０ｎｍ）における吸光度変化を測定し、血清検体中のＨＤＬコレステロ
ール濃度を求める。
により測定された検体中のＨＤＬコレステロール濃度と、
以下の沈殿法（ｂ）、
（ｂ）デキストラン硫酸０．３％及び塩化マグネシウム２％を含む水溶液２００μ
ｌを血清検体２００μｌと混和し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った
上清５０μｌと、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００  １％、コレステロール
エステラーゼ１Ｕ／ｍｌ、コレステロールオキシダーゼ１Ｕ／ｍｌ、パーオキシ
ダーゼ５Ｕ／ｍｌ、ジスルフホブチルメタトルイジン０．０４％及び４−アミノ
アンチピリン０．００４％を含む１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）から
なるコレステロール測定試薬３ｍｌと混合し、３７℃で１０分間インキュベート
した後、波長６００ｎｍにおける吸光度を測定し、ＨＤＬコレステロール濃度を
求める。
により測定された検体中のＨＤＬコレステロール濃度を比較したとき、沈殿法（ｂ）
に対する方法（ａ１）又は（ａ２）の測定値の相関係数が０．９２２以上となるポ
リオキシエチレンアルキレンフェニルエーテル及びポリオキシエチレンアルキレン
トリベンジルフェニルエーテルであるエマルゲン（登録商標）Ａ−６０及びエマル
ゲン（登録商標）Ｂ６６から選ばれる界面活性剤、
（ロ）ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニル
エーテル、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物、ポリオキシエチレ
ンアルキルエーテル硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩から選ばれるリポタン
パク質を溶解しない界面活性剤、
及び／又は
ポリアニオン、２価金属イオンを生成する物質若しくはポリアニオンと２価金属イ
オンを生成する物質の組み合わせから選ばれる血清リポタンパク質中のコレステロ
ールとコレステロール測定用酵素試薬との反応を阻害する効果を有する物質、
（ハ）コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの組み合わせ又
はコレステロールエステラーゼ及びコレステロールデヒドロゲナーゼの組み合わせ
からなるコレステロール測定用酵素試薬、
を血清に添加し、リポタンパク質のうち、高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）中のコレステロールが優先的にコレステロール測定用酵素試薬と反応する時間内にそのコレステロールの反応量を測定することを特徴とする高比重リポタンパク質コレステロールの定量法。
【請求項２】
ポリアニオンが、デキストラン硫酸、リンタングステン酸、ヘパリンから選ばれるものである請求項１記載の高比重リポタンパク質コレステロールの定量法。
【請求項３】
２価金属イオンを生成する物質が、２価金属の塩化物及びこれらの水和物から選ばれるものである請求項１記載の高比重リポタンパク質コレステロールの定量法。
【請求項４】
２価金属イオンを生成する物質が、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＮｉＣｌ２、及びこれらの水和物から選ばれるものである請求項１記載の高比重リポタンパク質コレステロールの定量法。
【請求項５】
高比重リポタンパク質中のコレステロールが優先的にコレステロール測定用酵素試薬と反応する時間内が、ＨＤＬ中のコレステロールが反応し、ＨＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールが反応しない時間内である請求項１〜４のいずれか１項に記載の高比重リポタンパク質コレステロールの定量法。
【請求項６】
高比重リポタンパク質中のコレステロールが優先的にコレステロール測定用酵素試薬と反応する時間が、１２−３１２秒である請求項１〜５のいずれか１項に記載の高比重リポタンパク質コレステロールの定量法。
【請求項７】
次の成分（イ）〜（ハ）、
（イ）以下の方法（ａ１）又は（ａ２）、
（ａ１）血清検体３μｌに、１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液（第一試薬；ｐＨ６．５）
３００μｌを添加し、約５分後に、ポリオキシエチレンアルキレンフェニルエー
テル及びポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテルから選ば
れる界面活性剤１％、コレステロールエステラーゼ１Ｕ／ｍｌ、コレステロール
オキシダーゼ１Ｕ／ｍｌ、パーオキシダーゼ５Ｕ／ｍｌ、ジスルフホブチルメタ
トルイジン０．０４％及び４−アミノアンチピリン０．００４％を含む１００ｍ
ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）からなるコレステロール測定試薬（第二試薬）
１００μｌを加え、第二試薬添加直前と添加後５分後の波長６００ｎｍ（副波長
７００ｎｍ）における吸光度を測定し、その差より血清検体中のＨＤＬコレステ
ロール濃度を求める。
（ａ２）血清検体３μｌに、１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液（第一試薬；ｐＨ６．５）
３００μｌを添加し、約５分後に、ポリオキシエチレンアルキレンフェニルエー
テル及びポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテルから選ば
れる界面活性剤１％、コレステロールエステラーゼ１Ｕ／ｍｌ、コレステロール
オキシダーゼ１Ｕ／ｍｌ、パーオキシダーゼ５Ｕ／ｍｌ、ジスルフホブチルメタ
トルイジン０．０４％及び４−アミノアンチピリンを含む１００ｍＭのＭＥＳ緩
衝液（ｐＨ６．５）からなるコレステロール測定試薬（第二試薬）１００μｌを
加え、第二試薬添加後、１２秒から２４秒までの波長５４６ｎｍ（副波長６６０
ｎｍ）における吸光度変化を測定し、血清検体中のＨＤＬコレステロール濃度を
求める。
により測定された検体中のＨＤＬコレステロール濃度と、
以下の沈殿法（ｂ）、
（ｂ）デキストラン硫酸０．３％及び塩化マグネシウム２％を含む水溶液２００μ
ｌを血清検体２００μｌと混和し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った
上清５０μｌと、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００  １％、コレステロール
エステラーゼ１Ｕ／ｍｌ、コレステロールオキシダーゼ１Ｕ／ｍｌ、パーオキシ
ダーゼ５Ｕ／ｍｌ、ジスルフホブチルメタトルイジン０．０４％及び４−アミノ
アンチピリン０．００４％を含む１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）から
なるコレステロール測定試薬３ｍｌと混合し、３７℃で１０分間インキュベート
した後、波長６００ｎｍにおける吸光度を測定し、ＨＤＬコレステロール濃度を
求める。
により測定された検体中のＨＤＬコレステロール濃度を比較したとき、沈殿法（ｂ）
に対する方法（ａ１）又は（ａ２）の測定値の相関係数が０．９２２以上となるポ
リオキシエチレンアルキレンフェニルエーテル及びポリオキシエチレンアルキレン
トリベンジルフェニルエーテルであるエマルゲン（登録商標）Ａ−６０及びエマル
ゲン（登録商標）Ｂ６６から選ばれる界面活性剤
（ロ）ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニル
エーテル、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物、ポリオキシエチレ
ンアルキルエーテル硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩から選ばれるリポタン
パク質を溶解しない界面活性剤、
及び／又は
ポリアニオン、２価金属イオンを生成する物質若しくはポリアニオンと２価金属イ
オンを生成する物質の組み合わせから選ばれる血清リポタンパク質中のコレステロ
ールとコレステロール測定用酵素試薬との反応を阻害する効果を有する物質
（ハ）コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの組み合わせ又
はコレステロールエステラーゼ及びコレステロールデヒドロゲナーゼの組み合わせ
からなるコレステロール測定用酵素試薬
を含有する高比重リポタンパク質コレステロール測定用試薬又は試薬キット。
【請求項８】
請求項１に記載の高比重リポタンパク質コレステロールの定量法に用いるためのものである請求項７記載の高比重リポタンパク質コレステロール測定用試薬又は試薬キット。
【請求項９】
ポリアニオンが、デキストラン硫酸、リンタングステン酸、ヘパリンから選ばれるものである請求項７記載の高比重リポタンパク質コレステロール測定用試薬又は試薬キット。
【請求項１０】
２価金属イオンを生成する物質が、２価金属の塩化物及びこれらの水和物から選ばれるものである請求項７記載の高比重リポタンパク質コレステロール測定用試薬又は試薬キット。
【請求項１１】
２価金属イオンを生成する物質が、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＮｉＣｌ２、及びこれらの水和物から選ばれるものである請求項７記載の高比重リポタンパク質コレステロール測定用試薬又は試薬キット。