(57)【要約】【課題】  前立腺癌に対する新規治療手段を提供する。【解決手段】  HLA-A2抗原に結合して細胞傷害性Tリンパ球によって認識され得る能力を有し、かつ液性免疫応答によって認識される、前立腺関連抗原由来癌抗原ペプチド、または機能的に同等の性質を有するその誘導体は、前立腺癌の処置または予防に有用であり得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
HLA-A2抗原に結合して細胞傷害性Tリンパ球によって認識され得る能力を有し、かつ液性免疫応答によって認識される前立腺関連抗原由来ペプチド、または機能的に同等の性質を有するその誘導体。
【請求項２】
前立腺関連抗原が前立腺特異的膜抗原または前立腺酸性フォスファターゼである請求項１記載のペプチド、または機能的に同等の性質を有するその誘導体。
【請求項３】
前立腺特異的膜抗原由来ペプチドが配列番号１に示すアミノ酸配列を含む請求項２記載のペプチド、または機能的に同等の性質を有するその誘導体。
【請求項４】
前立腺酸性フォスファターゼ由来ペプチドが配列番号２に示すアミノ酸配列を含む請求項２記載のペプチド、または機能的に同等の性質を有するその誘導体。
【請求項５】
癌抗原ペプチドである、請求項１から４のいずれかに記載のペプチド。
【請求項６】
８から１５アミノ酸残基の長さを有する、請求項５記載のペプチド。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の癌抗原ペプチドまたはその誘導体を少なくとも１つ活性成分として含有する医薬組成物。
【請求項８】
請求項１から６のいずれかに記載のペプチドまたはその誘導体を活性成分として含有する、前立腺癌を処置または予防するための医薬組成物。
【請求項９】
HLA-A2抗原と請求項１から６のいずれかに記載のペプチドまたはその誘導体との複合体を特異的に認識する、細胞傷害性Tリンパ球。
【請求項１０】
請求項９記載の細胞傷害性Tリンパ球を活性成分として含有する、前立腺癌を処置するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、癌抗原ペプチドに関し、具体的には、HLA-A2＋前立腺癌患者において前立腺癌反応性CTLを誘導することができる前立腺関連抗原由来の新規ペプチド、該ペプチドを含有する医薬組成物および癌ワクチン、および、該ペプチドまたは該ペプチドを含有する組成物または癌ワクチンを使用する前立腺癌の処置または予防方法に関する。
【０００２】
［背景技術］
前立腺癌は老齢男性の間で最も一般的な癌の１つである(1)。腫瘍免疫学における進歩ではメラノーマ抗原の研究が先行しているが、前立腺癌は特異的免疫療法にとってもう一つの標的候補である(2)。アンドロゲン遮断療法が前立腺癌に一時的に効果的であるという事実はあるが、再発性ホルモン不応性および転移性前立腺癌に対する有効な治療は存在しない。それ故、新規治療手段を開発する必要があり、特異的免疫療法は候補の１つであろう。
【０００３】
正常前立腺細胞で発現する前立腺組織特異的抗原は、前立腺癌に対する抗癌ワクチンにおいて優れた標的と成り得る(2)。実際、前立腺特異的抗原(PSA)、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、または前立腺酸性フォスファターゼ(PAP)などの前立腺関連抗原に由来する幾つかのエピトープペプチドが同定され、それらを標的とした特異的免疫療法が行われている(3-7)。最近我々も、HLA-A24またはHLA-A2分子陽性前立腺癌患者から前立腺癌反応性細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を誘導できる、幾つかの前立腺関連抗原由来エピトープペプチドを同定した(8-11)。
【０００４】
幾つかの癌タイプに関する我々の臨床試験において、腫瘍反応性CTL誘導能によって元々同定されていた幾つかのCTLエピトープペプチドが、免疫グロブリンG(IgG)によっても認識された(12, 13)。さらに、臨床試験によって、投与ペプチドに反応するIgGの誘導が、幾つかの癌タイプの患者の全体的生存率と正に相関していることが明らかとなった(14-17)。これらの知見から、我々は、液性および細胞性免疫系の両方に認識され得るペプチドは抗癌ワクチンにおいて有用であろう、と考えた。さらに、ペプチド特異的IgGについてのアッセイは、癌患者の末梢血単核細胞(PBMC)からペプチド特異的CTLを誘導するために必要なin vitro感作実験よりも、より簡便である。
【０００５】
［発明の概要］
これまでに、HLA-A2＋前立腺癌患者において前立腺癌反応性CTLを誘導し得る幾つかの前立腺関連抗原由来ペプチドが同定されているが(4, 24, 25)、我々は本研究において、液性免疫応答によって認識され得る能力に基づいた新規エピトープペプチドの同定を試みた。
【０００６】
クラスI結合性腫瘍ペプチドに対する抗体が一部の癌患者および健常ドナーにおいて既に観察されていることから(20, 21)、初めに我々は、2種類の前立腺関連抗原に由来する29個の候補ペプチドに対するIgGが前立腺癌患者の血漿中に検出できるかについて検討した。本研究において、試験した患者の半数以上で、PSMA4-12、PSMA441-450、およびPAP112-120 ペプチドに反応するIgGが検出された。それらの中でPSMA4-12 ペプチドは、前立腺癌反応性CTLを誘導可能なペプチドとして他の研究者によって報告されていた(4)。それ故我々は、PSMA441-450およびPAP112-120ペプチドに焦点を絞り、ワクチン候補としてのそれらの免疫原性を測定した。その結果、これら2つの前立腺関連抗原由来ペプチドは、HLA-A2＋前立腺癌患者から前立腺癌反応性CTLを効果的に誘導することが明らかとなり、本発明が完成された。
【０００７】
［好ましい態様の説明］
本発明は以下のものを提供する:
(1) HLA-A2抗原に結合して細胞傷害性Tリンパ球によって認識され得る能力を有し、かつ液性免疫応答によって認識される前立腺関連抗原由来ペプチド、または機能的に同等の性質を有するその誘導体；好ましくは、前立腺関連抗原が前立腺特異的膜抗原または前立腺酸性フォスファターゼであるペプチドまたは機能的に同等の性質を有するその誘導体；具体的には、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む前立腺特異的膜抗原由来ペプチドまたは機能的に同等の性質を有するその誘導体、あるいは配列番号２に示すアミノ酸配列を含む前立腺酸性フォスファターゼ由来ペプチドまたは機能的に同等の性質を有するその誘導体；より具体的には、癌抗原ペプチドである本発明のペプチドおよび８から１５アミノ酸残基の長さを有する本発明のペプチド；
(2) 活性成分として上記（１）記載の癌抗原ペプチドまたはその誘導体を含有する医薬組成物、具体的には、活性成分として上記（１）記載の癌抗原ペプチドまたはその誘導体を含有する、前立腺癌を処置または予防するための医薬組成物；および、
(3) HLA-A24抗原と上記（１）記載のペプチドまたはその誘導体との複合体を特異的に認識する細胞傷害性Tリンパ球、および活性成分として該細胞傷害性Tリンパ球を含有する前立腺癌を処置するための医薬組成物。
【０００８】
本明細書で用いる「前立腺関連抗原由来ペプチド」なる用語は、前立腺関連抗原の一部を含む部分ペプチドを意味する。前立腺関連抗原には、前立腺特異的抗原(PSA)、前立腺特異的膜抗原(PSMA)および前立腺酸性フォスファターゼ(PAP)が含まれる。前立腺特異的抗原(PSA)はカリクレイン様セリンプロテアーゼであり、PSAのアミノ酸配列は、Henttu, P. and Vihko, P.: cDNA coding for the entire human prostate specific antigen shows high monologies to the human tissue kallikrein genes.  Biochem Biophys Res Commun. 160: 903-910, 1989に開示されている。前立腺特異的膜抗原(PSMA)は膜結合性糖タンパク質であり、PSAのアミノ酸配列は、Israeli RS, Powell CT, Fair WR, et al., :Molecular cloning of a complementary DNA encoding a prostate-specific membrane antigen. Cancer Res., 53; 227-230, 1993に開示されている。前立腺酸性フォスファターゼ(PAP)はポリペプチドであり、PSAのアミノ酸配列は、Yeh LC, Lee AJ, Lee NE. et al., : Molecular cloning of cDNA for human prostatic acid phosphatase. Gene 60: 191-196, 1979に開示されている。
【０００９】
詳細には、本発明のペプチドは、HLA-A2抗原に結合して細胞傷害性Tリンパ球によって認識され得る能力を有し、かつまた液性免疫応答によって認識される癌抗原ペプチドである。本発明の癌抗原ペプチドの同定は、前立腺関連抗原の一部を含む候補ペプチドを合成し、それらが免疫グロブリンG(IgG)によって認識され得るか、およびそれらがペプチド特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を誘導し得るかについてスクリーニングすることによって行うことができる。
ペプチド合成は、ペプチド化学において通常用いられる方法に従い行うことができる。既知の方法の例は、「Peptide Synthesis」, Interscience, New York, 1966；「The Proteins」, vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976；「ペプチド合成」, 丸善株式会社, 1975、などの文献に記載されている。好ましくは、ペプチドは、HLA-A2結合モチーフに基づき合成される。HLA-A2結合モチーフの詳細については、参考文献１８および１９に紹介されている。候補ペプチドがIgGによって認識され得るかについてのスクリーニングは、通常ELISAによって行うことができる。候補ペプチドがペプチド特異的CTLを誘導し得るかについてのスクリーニングは、通常HLA-A2抗原によって提示された該候補ペプチドがCTLにより認識されるか否かを測定するアッセイにより行うことができる。
本発明の癌抗原ペプチドの具体的同定は、以下に示す実施例に従って行うことができる。
【００１０】
本明細書で用いる場合、「機能的に同等の性質を有するペプチド誘導体」または「ペプチド誘導体」なる用語は、そのアミノ酸配列が本発明のペプチドのアミノ酸配列の１個から数個のアミノ酸残基の置換、欠失、および／または付加を含み、かつ癌抗原ペプチドとしての性質を有する、即ちHLA-A2抗原に結合してCTLによって認識され得る能力を有し、かつ液性免疫応答によって認識される変異ペプチドを意味する。
本発明の癌抗原ペプチドまたはその誘導体のアミノ酸配列の好ましい長さは、8から15 アミノ酸残基であり、より好ましくは9から11アミノ酸残基である。
【００１１】
本発明の癌抗原ペプチドまたはその誘導体は、前立腺癌を処置または予防するのに使用可能な医薬組成物に含まれ得る。
本発明の癌抗原ペプチドまたはその誘導体の少なくとも１つ、または２つまたはそれ以上の組み合わせは、要すれば免疫調整剤および化学療法剤のような他の抗癌剤と組み合わせて、患者に投与される。癌抗原ペプチドまたはその誘導体は、投与されると抗原提示細胞のHLA-A2抗原とともに高密度で提示され、それ故提示されたHLA抗原複合体に特異的なCTLが増殖し、癌細胞を破壊する。その結果、患者の癌が処置されるか、あるいは癌の増殖または転移が予防され得る。
本発明のペプチドまたはその誘導体を活性成分として含有する組成物は、細胞性および液性免疫を効果的に成立させるため、アジュバントと共に投与してもよい。投与は、皮内投与、皮下投与、または静脈内注射で行ってよい。投与する製剤中の本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体の量は、例えば処置しようとする疾患の状態、特定の患者の年齢および体重に依存して適宜調節し得るが、通常１週間または２週間毎に0.1 mgから10.0 mg、好ましくは0.5 mgから5.0 mg、より好ましくは1.0 mgから3.0 mgを投与する。
【００１２】
さらに、本発明は、HLA-A2抗原と本発明の癌抗原ペプチドまたはその誘導体との複合体を特異的に認識するCTLを提供し、また、活性成分として該CTLを含有する前立腺癌を処置するための医薬組成物を提供する。該組成物は、好ましくは生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水(PBS)を含有する。それは、例えば静脈内、皮下、または皮内に投与することができる。
【００１３】
［実施例］
本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、本発明はいかなる意味においてもそれらに限定されない。データの統計学的有意差は、両側Student's ｔ検定により測定した。0.05未満のp値を、統計学的に有意と判断した。
【００１４】
（実施例１）
前立腺関連抗原のHLA-A2結合性ペプチドに反応するIgGについてのアッセイ
1.1 患者
本研究における前立腺癌患者10人全員が、試験に入る前にインフォームドコンセントを提出した(以下の表１)。これらの参加者はいずれもHIVに感染していなかった。末梢血液20mlを得て、Ficoll-Conray密度勾配遠心法によりPBMCを調製した。癌患者および健常ドナーのPBMC上のHLA-A2分子の発現はフローサイトメトリーによって測定し、HLA-A2サブタイプは配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ法を用いて決定した。
【００１５】
1.2  ペプチド
29個の前立腺関連抗原由来ペプチド(以下の表１に記載）は全て、HLA-A＊0201結合モチーフ(18, 19)に基づいて調製した。ペプチドは全て純度>90%であり、Biologica Co., Nagoya, Japanより購入した。HLA-A2結合モチーフを有する、インフルエンザ(Flu)ウィルス由来ペプチド(GILGFVFTL)、EBV由来ペプチド(GLCTLVAML)およびHIV由来ペプチド(SLYNTYATL)を対照として使用した。ペプチドは全て、ジメチルスルホキシドを用いて10 mg/mlの量に溶解した。 
【００１６】
1.3 ペプチド特異的IgGの検出
血漿中のペプチド特異的IgGレベルは、既報の方法を用いてELISAにより測定した(20, 21)。簡単に説明すると、ペプチド(20 μg/ウェル)固相化プレートをBlock Ace(Yukijirushi, Tokyo, Japan)でブロッキングし、0.05% Tween20-PBSで洗浄し、その後0.05% Tween20-Block Aceで希釈した血漿試料を100 μl/ウェルでプレートに添加した。37℃で2時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、更に1:1000希釈ウサギ抗ヒトIgG抗体(γ鎖特異的)(DAKO, Glostrup, Denmark)と共に2時間インキュベートした。プレートを洗浄し、その後1:100希釈のヤギ抗ウサギIgG抗体結合西洋ワサビペルオキシダーゼ(EnVision; DAKO)100 μlを各ウェルに添加し、プレートを室温で40分間インキュベートした。プレートを一回洗浄した後、テトラメチルベンジジン基質溶液(KPL, Guildford, UK)を100 μl/ウェルで添加し、1 M リン酸を添加して反応を停止させた。値は吸光度(OD) units/mlとして示した。1:100希釈血漿における吸光度(OD)値0.02をELISAにおけるカットオフ値として使用した。示したペプチドに対するIgGの特異性を確認するため、血漿試料を対応ペプチドまたはHIVペプチドのいずれかでコートしたプレートを用いて培養した。その後、得られた上清における対応ペプチド特異的IgGのレベルをELISAにより測定した。結果を表１に示す。
【表１】
2007277092.tif 000002
【００１７】
我々は、表１に示すように、29個の各ペプチドに反応するIgGが前立腺癌患者10人の血漿において検出できるかについて検討した。既報のように(23)、ペプチド特異的IgGはHLAクラスI分子に拘束されないので、これら患者はHLA-A2＋被験者に限定しなかった。ペプチドの一覧には、4個の既報ペプチド(PSMA711-719、PSMA4-12、PSMA27-35およびPAP299-307 ペプチド)を含めた。PSMA由来ペプチドについては、PSMA663-671、PSMA711-719、PSMA4-12またはPSMA441-450 ペプチドに反応するIgGが、それぞれ患者10人のうち4人以上で検出された。PSMA711-719およびPSMA4-12 ペプチドは、抗癌ワクチンの候補として以前に報告されていた(4、24)。PAP由来ペプチドについては、PAP112-120 ペプチドに反応するIgGが、患者10人のうち5人で検出された。PAP299-307 ペプチドは以前に抗癌ワクチンの候補として報告されていたが(25)、そのPAP ペプチドに反応するIgGはいずれの患者においても検出されなかった。患者4、5、9、および10の代表的結果を図１Ａに示す。我々はまた、9個のPSA由来ペプチド(Biologica Co.)を準備し、PSA170-178またはPSA178-187 ペプチドに反応するIgGを、それぞれ患者10人のうち5人において検出した(データ非提示)。興味深いことに、これら2個のPSA ペプチドもまた、HLA-A2＋前立腺癌患者のためのワクチン候補として以前に報告されていた(26, 27)。既報のペプチドに加えて、PSMA441-450およびPAP112-120 ペプチドの両方が液性免疫系によって効果的に認識されることがわかった。PSMA441-450またはPAP112-120 ペプチドのいずれかに反応するIgGのレベルは、対応ペプチドでコートしたプレートにおいてその血漿を培養すると減少したが、無関係なHIVペプチドでコートしたプレート中では減少しなかった(図１Ｂ)。これらの結果は、ELISAシステムがペプチド特異的IgGを抗原特異的に検出したことを示している。
【００１８】
（実施例２）
PBMCにおけるペプチド特異的CTLについてのアッセイ
我々は次に、実施例１で決定された上記2個の候補ペプチドが、HLA-A2＋癌患者のPBMCからペプチド特異的CTLを誘導する能力を有するか否かについて調べた。3個の既報ペプチド、PSMA711-719、PSMA4-12およびPAP299-307 ペプチドを本実験の陽性対照として含めた。さらに、PSMA 26-34およびPAP390-398 ペプチドの両方を、液性免疫系によって認識されないペプチドとして含めた。
PBMCにおけるペプチド特異的CTLを検出するためのアッセイは、既報の方法に従い行った(22)。簡単に説明すると、いくつかのHLA-A2サブタイプの前立腺癌患者10人から得たPBMC(1 X 105細胞/ウェル)を、10 μg/mlの各ペプチドと、U底96穴マイクロカルチャープレート(Nunc, Roskilde, Denmark)において培養培地200 μlでインキュベートした。培養培地は、45% RPMI-1640、45% AIM-V 培地(Gibco BRL)、10% FCS、100 U/ml インターロイキン(IL)-2および0.1 mM MEM非必須アミノ酸溶液 (Gibco, BRL)で構成された。3日毎に、培養培地の半分を取り除き、対応ペプチド(20 μg/ml)を含有する新しい培地に置き換えた。培養15日目に、培養細胞を4ウェルに分け、そのうち2ウェルをペプチドパルスT2細胞(HLA-A＊0201発現細胞株, ATCC: CRL-1992)を刺激するために使用し、他の2ウェルをHIVペプチドパルスT2細胞のために使用した。18時間インキュベートした後、上清を回収し、IFN-γのレベルをELISAにより測定した。
結果は表2に示す。アッセイは4ウェルで行い、100 pg/ml以上のIFN-γ産生およびP＜0.05を示した値を陽性と判断した。4ウェルのうち最良の結果をこの表に示す。
【表２】
2007277092.tif 000003
【００１９】
この結果は、PSMA441-450 ペプチドが、癌患者10人のうち8人においてペプチド特異的CTLを誘導したこと、およびその誘導率は、既報のPSMA711-719およびPSMA4-12 ペプチドと同程度であったことを示す。PAP112-120 ペプチドは、癌患者10人のうち7人においてペプチド特異的CTLを誘導した。一方、液性免疫系によって認識されないPSMA26-34およびPAP390-398 ペプチドの誘導率は比較的低く、それぞれ患者10人のうち2および0人においてのみであった。
【００２０】
（実施例３）
HLA-A2＋癌患者からの前立腺癌反応性CTLの誘導
我々は更に、これらのペプチド刺激PBMCが前立腺癌細胞に対して細胞傷害性を示すか否かについて調べた。HLA-A2拘束性細胞傷害性を検討するため、PC93に対する細胞傷害性のレベルを、そのHLA-A2発現トランスフェクタントであるPC93-A2に対する細胞傷害性のレベルと比較した。
具体的には、PSMA441-450およびPAP112-120 ペプチドでインビトロ刺激後、細胞傷害性アッセイを行うのに十分な数の細胞を得るため、HLA-A2＋前立腺癌患者4人由来の当該ペプチド刺激PBMCを100 U/ml IL-2と96穴丸底プレートで約10日間さらに培養した。その後、これら細胞を、PC93 (HLA-A2陰性前立腺癌細胞株(HLAOA＊6802＋)、大石賢ニ博士（京都大学泌尿器科）により樹立)、PC93-A2 (HLA-A＊0201遺伝子を安定的にトランスフェクトしたサブライン(10))、COLO320 (HLA-A2＋結腸癌, ATCC: CCL-220.1)およびCOLO201 (HLA-A2-結腸癌, ATCC: CCL-224)に対する細胞傷害性について、6時間51Cr放出アッセイにより試験した。96穴丸底プレートにおいて、各ウェルにつき51Cr標識細胞2000個をエフェクター細胞とともに、示したエフェクター/標的（E/T）比率で培養した。
結果は図２に示す。これらペプチド刺激PBMCは、HLA-A2＋PC93-A2細胞に対して他の3種類の標的細胞に対してよりも高いレベルの細胞傷害性を示した。これらの結果は、PSMA441-450およびPAP112-120 ペプチドが、HLA-A2＋前立腺癌患者からHLA-A2拘束性かつ前立腺癌反応性CTLを誘導する能力を有することを示している。
【００２１】
（実施例４）
癌患者由来ペプチド刺激PBMCのペプチド特異的かつCD8＋T細胞依存性細胞傷害性
我々はさらに、どのエフェクター細胞がこの細胞傷害性に関与するのかを確認しようと試みた。ある実験においてアッセイの開始時に、抗HLAクラスI (W6/32:マウスIgG2a)、抗HLA-DR (L243:マウスIgG2a)、抗CD4 (NU-TH/I:マウスIgG1)、抗CD8 (NU-TS/C:マウスIgG2a)、または抗CD14 (H14:マウスIgG2a)モノクローナル抗体を、10 μg/mlの量でウェルに添加した。結果を図３に示す。インビトロでPSMA441-450またはPAP112-120 ペプチドのいずれかで刺激した前立腺癌患者4人由来のPBMCの、PC93-A2細胞に対する細胞傷害性は、抗クラスIまたは抗CD8モノクローナル抗体の添加により有意に阻害されたが、抗クラスII、抗CD4、または抗CD14モノクローナル抗体の添加によっては阻害されず、このことは、癌患者由来のペプチド刺激PBMCがクラスI拘束性かつCD8＋T細胞依存性細胞傷害性であることを示している。
【００２２】
さらに、患者4人由来のこれらペプチド刺激PBMCのPC93-A2細胞に対する細胞傷害性を、対応ペプチドまたはHIVペプチドのいずれかを提示させた非標識T2細胞の存在下に試験するコールド阻害アッセイを行い、PSMAまたはPAP ペプチド刺激CTLの特異性を確認した。簡単に説明すると、51Cr標識標的細胞(2 X 103 細胞/ウェル)とコールド標的細胞（2 X 104 細胞）とを、該CTL(4 X 104 細胞/ウェル)と96穴丸底プレートにおいて培養した。HIVペプチドまたは示したペプチドのいずれかで事前にパルスしたT2細胞をコールド標的細胞として使用した。結果は図４に示す。これらのペプチド刺激PBMCのPC93-A2細胞に対する細胞傷害性は、対応ペプチドパルス非標識T2細胞の添加によって有意に抑制されたが、HIVペプチドパルス非標識T2細胞の添加によっては抑制されなかった。
まとめると、これら結果は、これらペプチド刺激PBMCのPC93-A2細胞に対する細胞傷害性は、主にCD8＋かつペプチド特異的T細胞によることを示している。
【００２３】
［発明の効果］
我々の臨床試験から、ペプチドワクチン処置によりしばしば投与したペプチドに反応するIgGが誘導されることがわかっている(12, 14)。投与ペプチドに反応するIgGの誘導は、進行肺癌または胃癌患者の生存期間の延長と正に相関していた(15, 16)。さらに、投与したペプチドに反応するIgGの誘導はまた、再発性婦人科癌患者の間で臨床応答と相関していた(13)。それ故、HLA-A2＋前立腺癌患者へのPSMA441-450およびPAP112-120 ペプチドのワクチン処置は、前立腺癌反応性CTLおよびペプチド特異的IgGの両方を効果的に誘導することができ、その結果良好な臨床応答をもたらすことができる。
【００２４】
［産業上の利用可能性］
白人のほとんどはHLA-A＊2101陽性であるが、表２に示すように、日本人においてはHLA-A2サブタイプはかなり変化に富んでいる。前立腺関連抗原由来ペプチドはHLA-A＊0201分子に対する結合モチーフに基づいて調製したし、T2細胞およびPC93-A2細胞はいずれもHLA-A＊0201分子を発現している。ペプチド特異的CTLは、HLA-A＊0201被験者からだけでなく、HLA-A＊0206および-A＊0207を含むHLA-A2サブタイプの被験者からも誘導された(表２)。我々は以前に、HLA-A＊0201分子に対する結合モチーフに基づいて調製した上皮腫瘍抗原由来ペプチドが、幾つかのHLA-A2サブタイプの患者においても免疫原性があることを報告した(29-31)。それ故、PSMA441-450およびPAP112-120 ペプチドは、幾つかのHLA-A2サブタイプの前立腺癌患者の特異的免疫療法にとって有望な標的分子であり得る。HLA-A2アリルの頻度は世界全体で比較的高い(32)。ここに示された情報は、ペプチド基盤免疫療法を用いてHLA-A2＋前立腺癌患者を処置できる可能性を増大させるであろう。
【００２５】
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【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１Ａは、ELISAによって調べた、患者4、5、9および10由来の血漿中の、示した候補ペプチドに反応するIgGのレベルを示すグラフである。値はOD (吸光度)を表す。図１Ｂは、対応ペプチドでコートしたプレートで培養することにより減少した、PSMA441-450またはPAP112-120 ペプチドのそれぞれに反応するIgGのレベルを示すグラフである。
【図２】図２は、6時間51Cr放出アッセイにより測定した、HLA-A2＋前立腺癌患者4人由来のPSMA441-450 ペプチド刺激またはPAP112-120 ペプチド刺激PBMCのPC93-A2細胞に対する細胞傷害性が、PC93、COLO320およびCOLO201に対するものよりも高いことを示すグラフである。＊P<0.05で統計学的に有意であることを示す。
【図３】図３は、癌患者由来ペプチド刺激PBMCの細胞傷害性に対する、示したモノクローナル抗体の阻害効果を示すグラフである。＊P<0.05で統計学的に有意であることを示す。
【図４】図４は、対応ペプチドパルス非標識T2細胞の添加による、ペプチド刺激PBMCの細胞傷害性の阻害を示すグラフである。＊P<0.05で統計学的に有意であることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【外国語明細書】
TITLE OF THE INVENTION
HLA-A2 binding peptides of prostate-related antigens
TECHNICAL FIELD
The invention relates to cancer antigen peptides, and specifically to prostate-related antigen-derived new peptides having the capacity of inducing prostate cancer-reactive CTLs in HLA-A2＋ prostate cancer patients, pharmaceutical compositions and cancer vaccines comprising the same, and methods for treatment or prevention of prostate cancers using the peptides or the compositions, cancer vaccines comprising the same.  
BACKGROUND OF THE INVENTION
Prostate cancer is one of the most common cancers among elderly men (1).  Although advances in tumor immunology have been preceded by studies of melanoma antigens, prostate cancer is another target candidate for specific immunotherapy (2).  Despite the fact that androgen withdrawal therapy is transiently effective for prostate cancer, there is no efficient therapy against recurrent hormone-refractory and metastatic prostate cancer.  Therefore, the development of new therapeutic modalities is needed, and specific immunotherapy might be one candidate.  
Prostate tissue-specific antigens, expressed in normal prostate cells, can be good targets in an anti-cancer vaccine against prostate cancer (2).  Indeed, several epitope peptides derived from prostate-related antigens, including prostate-specific antigen (PSA), prostate-specific membrane antigen (PSMA), or prostatic acid phosphatase (PAP), have been identified, and specific immunotherapy targeting them has been carried out (3-7).  In recent years, we also have identified several epitope peptides derived from prostate-related antigens that are able to generate prostate cancer-reactive cytotoxic T lymphocytes (CTLs) from prostate cancer patients positive for HLA-A24 or HLA-A2 molecules (8-11).  
In our clinical trials involving several types of cancer, several CTL epitope peptides, which had originally been identified by their ability to induce tumor-reactive CTLs, were also recognized by immunoglobulin G (IgG) (12, 13).  In addition, clinical trials revealed that the induction of IgG reactive to the administered peptides was positively correlated with the overall survival of patients with several types of cancers (14-17).  These observations led us to the idea that peptides that can be recognized by both humoral and cellular immune systems might be useful in an anti-cancer vaccine.  Furthermore, the assay for peptide-specific IgG is much easier than the in vitro sensitization experiment needed to induce peptide-specific CTLs from the peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of cancer patients.  
SUMMARY OF THE INVENTION
Although several prostate-related antigen-derived peptides having the capacity to induce prostate cancer-reactive CTLs in HLA-A2＋ prostate cancer patients have been identified to date (4, 24, 25), we in this study attempted to identify new epitope peptides based on their capacity to be recognized by the humoral immune response.  
First, we investigated whether or not IgG against 29 peptide candidates derived from 2 prostate-related antigens would be detectable in the plasma of prostate cancer patients, because antibodies against class I-binding tumor peptides had already been observed in certain cancer patients and healthy donors (20, 21).  In this study, IgG reactive to PSMA4-12, PSMA441-450, and PAP112-120 peptides was detected more than half of patients tested.  Peptide PSMA4-12 other than PSMA441-450 and PAP112-120 peptides was reported by other researchers as a peptide capable of inducing prostate cancer-reactive CTLs (4).  Therefore, we focused on PSMA441-450 and PAP112-120 peptides and determined their immunogenicity as vaccine candidates.  As a result, these 2 prostate-related antigen-derived peptides were found to effectively induce prostate cancer-reactive CTLs from HLA-A2＋ prostate cancer patients, thus accomplishing the present invention. 
BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
Figure 1A is a graph showing the levels of IgG reactive to the indicated peptide candidates in the plasma from patients 4, 5, 9, and 10 as examined by ELISA.  The values represent OD (optical density).  
Figure 1B is a graph showing that the level of IgG reactive to each of PSMA441-450 or PAP112-120 peptide decreased by culturing in corresponding peptide-coated plates.  
Figure 2 is a graph showing that the cytotoxicity of PSMA441-450 peptide-stimulated or PAP112-120 peptide-stimulated PBMCs from 4 HLA-A2＋ prostate cancer patients against PC93-A2 cells by a 6-hr 51Cr-release assay was higher than those against PC93, COLO320 and COLO201.  ＊Statistically significant at P<0.05.  
Figure 3 is a graph showing the inhibitory effect of indicated monoclonal antibodies on the cytotoxicity of the peptides-stimulated PBMCs from cancer patients.  ＊ Statistically significant at P<0.05.  
Figure 4 is a graph showing the inhibition of cytotoxicity of peptides-stimulated PBMCs by the addition of corresponding peptide-pulsed unlabeled T2 cells.  ＊Statistically significant at P<0.05.  
DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS
The present invention provides:
(1)  A peptide derived from a prostate-related antigen that is capable of binding to an HLA-A2 antigen and being recognized by cytotoxic T lymphocytes, and that is recognized by humoral immune response, or a derivative thereof having the functionally equivalent properties; preferably, the peptide wherein the prostate-related antigen is a prostate-specific membrane antigen or a prostatic acid phosphatase, or a derivative thereof having the functionally equivalent properties; specifically, the peptide wherein the peptide derived from a prostate-specific membrane antigen comprises an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or a derivative thereof having the functionally equivalent properties, or the peptide wherein the peptide derived from a prostatic acid phosphatase comprises an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or a derivative thereof having the functionally equivalent properties; more specifically, the peptide according to the present invention wherein the peptide is a cancer antigen peptide, and the peptide according to the present invention wherein the peptide has 8 to 15 amino acid residues in length;  
(2)  A pharmaceutical composition that comprises as an active ingredient the cancer antigen peptide or the derivative thereof according to (1) above, specifically the pharmaceutical composition for treating or preventing a prostate cancer that comprises as an active ingredient the cancer antigen peptide or the derivative thereof according to (1) above; and
(3)  A cytotoxic T lymphocyte that specifically recognizes a complex between an HLA-A24 antigen and the peptide or derivative thereof according to above (1), and a pharmaceutical composition for treating a prostate cancer that comprises as an active ingredient the cytotoxic T lymphocyte.  
As used herein, the term ”a peptide derived from a prostate-related antigen” refers to a partial peptide that comprises a part of a prostate-related antigen.  Prostate-related antigens include a prostate-specific antigen (PSA), a prostate-specific membrane antigen (PSMA), and prostatic acid phosphatase (PAP).  Prostate-specific antigen (PSA) is a kallikrein-like serine protease, and the amino acid sequence of PSA is disclosed in Henttu, P. and Vihko, P.: cDNA coding for the entire human prostate specific antigen shows high monologies to the human tissue kallikrein genes. Biochem Biophys Res Commun. 160: 903-910, 1989.  Prostate-specific membrane antigen (PSMA) is a membrane-bound glycoprotein, and the amino acid sequence of PSA is disclosed in Israeli RS, Powell CT, Fair WR, et al., :Molecular cloning of a complementary DNA encoding a prostate-specific membrane antigen. Cancer Res., 53; 227-230, 1993.  Prostatic acid phosphatase (PAP) is a polypeptide, and the amino acid sequence of PSA is disclosed in Yeh LC, Lee AJ, Lee NE. et al., : Molecular cloning of cDNA for human prostatic acid phosphatase. Gene 60: 191-196, 1979.  
Specifically, the peptide of the present invention is a cancer antigen peptide, which is capable of binding to an HLA-A2 antigen and being recognized by cytotoxic T lymphocytes, and further which is recognized by humoral immune response.  Cancer antigen peptides of the present invention can be identified by synthesizing a candidate peptide which comprises a part of a prostate-related antigen, and screening for their ability to be recognized by immunoglobulin G (IgG), and for their ability to induce peptide-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs).  Synthesis of peptides may be conducted according to a method usually used in peptide chemistry.  Examples of the known methods are those described in the literatures including ”Peptide Synthesis”, Interscience, New York, 1966; ”The Proteins”, vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976; ”Pepuchido-Gosei”, Maruzen Co. Ltd., 1975.  Preferably, the peptides are synthesized based on the HLA-A2 binding motif.  Details of the HLA-A2 binding motif are reviewed in references 18 and 19.  Screening of peptide candidates for their ability to be recognized by IgG usually may be conducted by ELISA.  Screening of peptide candidates for their ability to induce peptide-specific CTLs usually may be conducted by an assay for determining whether or not the candidate peptide presented by an HLA-A2 antigen is recognized by CTL.  
Specific identification of cancer antigen peptides of the present invention can be conducted according to the working examples hereinafter.  
As used herein, the term ”derivative of a peptide having the functionally equivalent properties” or ”derivative of a peptide” means an altered peptide of which the amino acid sequence contains a substitution, deletion and/or addition of one to several amino acid residues of an amino acid sequence of a peptide of the present invention, and which has the properties as a cancer antigen peptide, i.e., are to be capable of binding to an HLA-A2 antigen and being recognized by CTL, and to be recognized by humoral immune response.  
Preferred length of the amino acid sequence of a cancer antigen peptide or its derivative of the present invention is 8 to 15 amino acid residues, and more preferably 9 to 11 amino acid residues. 
A cancer antigen peptide or its derivative of the present invention can be comprised in a pharmaceutical composition, which may be used to treat or prevent a prostate cancer.  
At least one of, or a combination of two or more of, cancer antigen peptides or their derivatives of the present invention is (are) administered to a patient, if necessary, in combination with other anti-agents such as immunomodulators and chemotherapeutics.  When administered, the cancer antigen peptide or derivative thereof is presented at a high density with an HLA-A2 antigen of antigen-presenting cells, and therefore, CTLs specific for the presented HLA antigen complex proliferates and destroys the cancer cells.  As a result, the cancers of the patient may be treated, or proliferation or metastasis of the cancer may be prevented.  
The composition comprising as an active ingredient a peptide or its derivative of the present invention may be administered along with an adjuvant in order to effectively establish the cellular and humoral immunity.  Administration may be conducted intradermally, hypodermically, or by intravenous injection.  Although the amount of a tumor antigen peptide or its derivative of the present invention in the formulation to be administered may be adjusted as appropriate depending on, for example, the condition of the disease to be treated, the age and the body weight of the particular patient, it is usually preferred to administered 0.1 mg to 10.0 mg, preferably 0.5 mg to 5.0 mg, more preferably 1.0 mg to 3.0 mg weekly or biweekly.  
Additionally, the present invention provides CTLs that specifically recognize a complex between a HLA-2 antigen and the cancer antigen peptide or derivative thereof, and also provides a pharmaceutical composition for treating a prostate cancer which comprises the CTLs as an active ingredient.  The compositions preferably contain a physiological saline or a phosphate buffered saline (PBS).  It may be administered, for example, intravenously, subcutaneously, or intradermally.  
EXAMPLES
The present invention is further illustrated by the following examples, but is not limited by them in any respect.  The statistical significance of the data was determined using a two-tailed Student’s t-test.  A p value of less than 0.05 was considered to be statistically significant.  
Example 1
Assay for IgG reactive to HLA-A2 binding peptides of prostate-related antigens  
1.1  Patients
All 10 prostate cancer patients in this study provided their informed consent before enrollment (Table 1 hereinafter).  None of these participants were infected with HIV.  Twenty milliliters of peripheral blood was obtained, and the PBMCs were prepared by Ficoll-Conray density gradient centrifugation.  The expression of HLA-A2 molecules on the PBMCs of cancer patients and healthy donors was determined by flow cytometry, and the HLA-A2 subtypes were determined using the sequence-specific oligonucleotide probe method.  
1.2  Peptides
All 29 prostate-related antigen-derived peptides (listed in Table 1 hereinafter) were prepared based on the HLA-A＊0201 binding motif (18, 19).  All peptides were of >90% purity and were purchased from Biologica Co., Nagoya, Japan.  Influenza (Flu) virus-derived (GILGFVFTL), EBVderived (GLCTLVAML), and HIVderived peptides (SLYNTYATL) with the HLA-A2 binding motif were used as controls.  All peptides were dissolved with dimethyl sulfoxide at a dose of 10 mg/ml.  
1.3 Detection of peptide specific IgG
Peptide-specific IgG levels in the plasma were measured by ELISA using a previously reported method (20, 21).  In brief, peptide (20 μg/well)-immobilized plates were blocked with Block Ace (Yukijirushi, Tokyo, Japan) and washed with 0.05% Tween20-PBS, after which 100 μl/well of plasma sample diluted with 0.05% Tween20-Block Ace was added to the plates.  After a 2-hr incubation at 37oC, the plates were washed and further incubated for 2 hr with a 1:1000-diluted rabbit anti-human IgG (γ-chain-specific) (DAKO, Glostrup, Denmark).  The plates were washed, and then 100 μl of 1:100-diluted goat anti-rabbit IgG-conjugated horseradish peroxidase (EnVision; DAKO) was added to each well, and the plates were incubated at room temperature for 40 min.  After the plates were washed once, 100 μl/well of tetramethyl benzidine substrate solution (KPL, Guildford, UK) was added, and the reaction was stopped by the addition of 1 M phosphoric acid.  The values are shown as optical density (OD) units/ml.  The optical density (OD) value 0.02 in a 1:100-diluted plasma was used as a cut-off value in the ELISA.  To confirm the specificity of IgG to the indicated peptide, sample plasma was cultured with plates coated with either the corresponding peptide or an HIV peptide.  Thereafter, the levels of corresponding peptide-specific IgG in the resulting supernatant were determined by ELISA.  The results are shown in Table 1.  
Table 1
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As shown in Table 1, we investigated whether IgG reactive to each of 29 peptides could be detected in the plasma of 10 prostate cancer patients.  These patients were not limited to the HLA-A2＋ subjects, because peptide-specific IgG was not restricted to HLA class I molecules, as reported previously (23).  Four reported peptides (PSMA711-719, PSMA4-12, PSMA27-35 and PAP299-307 peptides) were included in the list.  In regards to PSMA-derived peptides, IgG reactive to either the PSMA663-671, PSMA711-719, PSMA4-12 or PSMA441-450 peptide was detected in more than 4 of 10 patients.  The PSMA711-719 and PSMA4-12 peptides were previously reported as candidates for anti-cancer vaccine (4, 24).  In regards to PAP-derived peptides, IgG reactive to the PAP112-120 peptide was detected in 5 of 10 patients.  Although the PAP299-307 peptide was previously reported as a candidate for anti-cancer vaccine (25), IgG reactive to the PAP peptide was not detected in any patients.  The representative results of patients 4, 5, 9, and 10 are shown in Figure 1A.  We also prepared 9 peptide derived from PSA (Biologica Co.), and IgG reactive to either the PSA170-178 or PSA178-187 peptide was detected in 5 of 10 patients (data not shown).  Interestingly, these 2 PSA peptides were also previously reported as vaccine candidates for HLA-A2＋ prostate cancer patients (26, 27).  Besides the previously reported peptides, both the PSAM441-450 and PAP112-120 peptides were found to be effectively recognized by the humoral system.  The level of IgG reactive to either PSMA441-450 or PAP112-120 peptide decreased as a result of culturing the plasma in corresponding peptide-coated plates, but not in irrelevant HIV peptide-coated plates (Figure 1B).  These results indicate that the ELISA system detected peptide-specific IgG in an antigen-specific manner.  
Example 2
Assay for peptide-specific CTLs in PBMCs
We next determined whether or not these 2 peptide candidates as determined in Example 1 have the potential to generate peptide-specific CTLs from the PBMCs of HLA-A2＋ cancer patients.  Three reported peptides of PSMA711-719, PSMA4-12, and PAP299-307 peptides were included as positive controls in this experiment.  In addition, both PSMA 26-34 and PAP390-398 peptides were included as peptides that were not recognized by the humoral immune system.  
The assay for the detection of peptide-specific CTLs in PBMCs was performed according to a previously reported method (22).  In brief, PBMCs (1 X 105 cells/well) from 10 prostate cancer patients with several HLA-A2 subtypes were incubated with 10 μg/ml of each peptide in a U-bottom-type 96-well microculture plate (Nunc, Roskilde, Denmark) at a volume of 200 μl of culture medium.  The culture medium consisted of 45% RPMI-1640, 45% AIM-V medium (Gibco BRL), 10% FCS, 100 U/ml of interleukin (IL)-2, and 0.1 mM MEM nonessential amino acid solution (Gibco, BRL).  Half of the culture medium was removed and replaced with a new medium containing a corresponding peptide (20 μg/ml) every 3 days.  On the 15th day of the culture, the cultured cells were separated into 4 wells, two of which were used for stimulating peptide-pulsed T2 cells (HLA-A＊0201-expressing cell line, ATCC: CRL-1992), and the other two of which were used for the HIV peptide-pulsed T2 cells.  After an 18-hr incubation period, the supernatants were collected, and the level of IFN-γ was determined by ELISA.  
The results are shown in Table 2.  The assay was carried out in 4 wells, and the values that showed more than 100 pg/ml IFN-γ production and P＜0.05 were judged to be positive.  The best results among the 4 wells are shown in this table.  
Table 2
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The result shows that PSMA441-450 peptide induced peptide-specific CTLs in 8 of 10 cancer patients, and that the induction ratio was comparable with those of the reported PSMA711-719 and PSMA4-12 peptides.  PAP112-120 peptide induced peptide-specific CTLs in 7 of 10 cancer patients.  On the other hand, the induction ratio of the PSMA26-34 and PAP390-398 peptides that were not recognized by the humoral immune system was relatively low in even 2 and 0 of 10 patients, respectively.  
Example 3
Induction of prostate cancer-reactive CTLs from HLA-A2＋ cancer patients  
We further determined whether or not these peptide-stimulated PBMCs showed any cytotoxicity against prostate cancer cells.  To investigate HLA-A2-restricted cytotoxicity, the level of cytotoxicity against the PC93 was compared with the level of cytotoxicity against its HLA-A2-expressing transfectant, PC93-A2.  
Specifically, after in vitro stimulation with PSMA441-450 and PAP112-120 peptides, the peptide-stimulated PBMCs from 4 HLA-A2＋ prostate cancer patients were additionally cultured with 100 U/ml IL-2 for approximately 10 days in 96-round-well plates in order to obtain a sufficient number of cells to carry out a cytotoxicity assay.  Then, these cells were tested for cytotoxicity against PC93 (an HLA-A2-negative prostate cancer cell line (HLA0A＊6802＋) that was established by Dr. K. Ohishi (Department of Urology, Kyoto University, Japan)), PC93-A2 (a subline which was stably transfected with the HLA-A＊0201 gene (10)), COLO320 (HLA-A2＋ colon carcinomas, ATCC: CCL-220.1) and COLO201 (HLA-A2- colon carcinomas, ATCC: CCL-224) by a 6-hr 51Cr-release assay.  Two thousand 51Cr-labeled cells per well were cultured with effector cells in 96-round-well plates at the indicated effector/target ratios.  
The results are shown in Figure 2.  These peptide-stimulated PBMCs exhibited higher levels of cytotoxicity against the HLA-A2＋ PC93-A2 cells than against the other 3 target cells.  These results indicated that PSMA441-450 and PAP112-120 peptides have the potential to induce HLA-A2-restricted and prostate cancer-reactive CTLs from HLA-A2＋ prostate cancer patients.  
Example 4
Peptide-specific and CD8＋ T cell-dependent cytotoxicity of peptide-stimulated PBMCs from cancer patients
We further tried to confirm which effector cells were responsible for the cytotoxicity.  In some experiments, either anti-HLA class I (W6/32: mouse IgG2a), anti-HLA-DR (L243: mouse IgG2a), anti-CD4 (NU-TH/I: mouse IgG1), anti-CD8 (NU-TS/C: mouse IgG2a), or anti-CD14 (H14: mouse IgG2a) mAb was added to the wells at a dose of 10 μg/ml at the start of the assay.  The results are shown in Figure 3.  The cytotoxicity of the PBMCs from 4 prostate cancer patients, which were stimulated in vitro with either PSMA441-450 or PAP112-120 peptide, against the PC93-A2 cells was significantly inhibited by the addition of anti-class I or anti-CD8 mAb, but not by the addition of anti-class II, anti-CD4, or anti-CD14 mAb, showing class I-restricted and CD8＋ T cell-dependent cytotoxicity of peptides-stimulated PBMCs from cancer patients.  
In addition, the specificity of PSMA or PAP peptide-stimulated CTLs was confirmed by a cold inhibition assay to test these peptide-stimulated PBMCs from 4 patients for their cytotoxicity against the PC93-A2 cells in the presence of unlabeled T2 cells, which were pre-loaded with either the corresponding peptide or the HIV peptide.  In brief, 51Cr-labeled target cells (2 X 103 cells/well) were cultured with the CTLs (4 X 104 cells/well) in 96-round-well plates with 2 X 104 cold target cells.  T2 cells that were pre-pulsed with either the HIV peptide or the indicated peptide were used as cold targets.  The results are shown in Figure 4.  The cytotoxicity of these peptide-stimulated PBMCs against the PC93-A2 cells was significantly suppressed by the addition of the relevant peptide-pulsed unlabeled T2 cells, but not by the addition of the HIV peptide-pulsed unlabeled T2 cells.  
Collectively, these results indicate that the cytotoxicity of these peptide-stimulated PBMCs against PC93-A2 cells was mainly ascribed to CD8＋ and peptide-specific T cells.  
EFFECTS OF THE INVENTIONS
Our clinical trials revealed that peptide vaccination frequently resulted in the induction of IgG reactive to the administered peptides (12, 14).  The induction of IgG reactive to the vaccinated peptides was positively correlated with longer survival in patients with advanced lung or gastric cancer (15, 16).  In addition, the induction of IgG reactive to the administered peptides was also correlated with a clinical response among patients with recurrent gynecologic cancer (13).  Therefore, vaccination of the PSAM441-450 and PAP112-120 peptides into HLA-A2＋ prostate cancer patients could efficiently elicit the induction of both prostate cancer-reactive CTLs and peptide-specific IgG, and could subsequently lead to good clinical responses.  
INDUSTRIAL APPLICABILITY
Most Caucasians are HLA-A＊2101 positive, but HLA-A2 subtypes vary considerably in Japanese, as shown in Table 2.  Prostate-related antigen-derived peptides were prepared based on the binding motif to HLA-A＊0201 molecules, and both the T2 cells and PC93-A2 cells express HLA-A＊0201 molecules.  Peptide-specific CTLs were induced not only from the HLA-A＊0201 participants, but also from participants with the HLA-A2 subtypes, including HLA-A＊0206 and -A＊0207 (Table 2).  We have previously reported that epithelial tumor antigen-derived peptides, which were prepared based on the binding motif to HLA-A＊0201 molecules, are also immunogenic in patients with several HLA-A2 subtypes (29-31).  Therefore, PSMA441-450 and PAP112-120 peptides can be promising target molecules for specific immunotherapy of prostate cancer patients with several HLA-A2 subtypes.  The frequency of the HLA-A2 allele is relatively high throughout the world (32).  The information provided here might increase the possibility of treating HLA-A2＋ prostate cancer patients using peptide-based immunotherapy.  
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SEQUENCE LISTING
<110> Kurume University
<120> HLA-A2 binding peptides of prostate-related antigens
<130> 194112
<160> 2
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> PSMA441-450 peptide
<400> 1
Leu Leu Gln Glu Arg Gly Val Ala Tyr Ile
5                  10
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> PAP112-120 peptide
<400> 2
Thr Leu Met Ser Ala Met Thr Asn Leu
5
WHAT IS CLAIMED IS
1.  A peptide derived from a prostate-related antigen that is capable of binding to an HLA-A2 antigen and being recognized by cytotoxic T lymphocytes, and that is recognized by humoral immune response, or a derivative thereof having the functionally equivalent properties.  
2.  The peptide according to claim 1, wherein the prostate-related antigen is a prostate-specific membrane antigen or a prostatic acid phosphatase, or a derivative thereof having the functionally equivalent properties.  
3.  The peptide according to claim 2, wherein the peptide derived from a prostate-specific membrane antigen comprises an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or a derivative thereof having the functionally equivalent properties.  
4.  The peptide according to claim 2, wherein the peptide derived from a prostatic acid phosphatase comprises an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or a derivative thereof having the functionally equivalent properties.  
5.  The peptide according to any one of claims 1 to 4, wherein the peptide is a cancer antigen peptide.  
6.  The peptide according to claim 5, wherein the peptide has 8 to 15 amino acid residues in length.  
7.  A pharmaceutical composition, that comprises as an active ingredient at least one of the cancer antigen peptides or the derivatives thereof according to any one of claims 1 to 6.  
8.  A pharmaceutical composition for treating or preventing a prostate cancer, that comprises as an active ingredient the peptide or the derivative thereof according to any one of claims 1 to 6.  
9.  A cytotoxic T lymphocyte that specifically recognizes a complex between an HLA-A2 antigen and the peptide or the derivative thereof according to any one of claims 1 to 6.  
10.  A pharmaceutical composition for treating a prostate cancer, that comprises as an active ingredient the cytotoxic T lymphocyte of claim 9.  
Abstract
New therapeutic modalities for prostate cancers are provided.  
A cancer antigen peptide derived from a prostate-related antigen that is capable of binding to an HLA-A2 antigen and being recognized by cytotoxic T lymphocytes, and that is recognized by humoral immune response, or a derivative thereof having the functionally equivalent properties can be useful for treatment and prevention of prostate cancers.  
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