(57)【要約】      （修正有）【課題】二次元ゲル電気泳動に基づいて複合タンパク質サンプルを分離するためのデバイスが提供される。並行して処理されるより多くのゲルに対してより均質な条件を確立する、つまりより再現性のある比較対照試験のためにより堅牢かつ簡便な方法を提供する。【解決手段】このデバイスにおける分離では、一次元目ストリップ中での等電点に基づいた第１の分離、および二次元目ゲル中での分子サイズに基づいた第２の分離が行われる。該デバイスは、第１の分離のステップのための少なくとも２本のゲルストリップおよび二次元目の分離のための対応するゲルを含む。該２本のゲルストリップは単一の担体上でその片面または両面に配置されている。【効果】少なくとも２本の第１ゲルストリップを有していることによって少なくとも２つの分析プロセスを並行して行うことができる。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
二次元ゲル電気泳動に基づいて複合タンパク質サンプルを分離するためのデバイスであって、該分離では一次元目ストリップ中での等電点に基づいた第１の分離および二次元目ゲル中での分子サイズに基づいた第２の分離が行われる上記デバイスにおいて、第１の分離ステップのための少なくとも２本のゲルストリップおよび二次元目のための対応するゲルが単一の担体上で同じ面かまたは両面に配置されており、少なくとも２つの分析プロセスを並行して行うことができることを特徴とする、上記デバイス。
【請求項２】
前記第１の分離ステップのための少なくとも２本のゲルストリップが、該担体上で平行かつ／または対称に配置されていることを特徴とする、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記少なくとも２本の第１ゲルストリップの上側に少なくとも１枚の向かい合う使い捨ての表面が配置され、かつ分離対象のサンプル混合物の導入の前に、前記少なくとも２本の第１ゲルストリップのそれぞれの上側に、該ストリップと、該向かい合う表面との間の間隙が設けられていることを特徴とする請求項１または２に記載のデバイスにおいて、かかる向かい合う表面が少なくとも該間隙の面において疎水性材料もしくはゲル非付着性材料からできているかまたはそれでコートされており、かつサンプル導入が親水性の誘導によって起こるものである、上記デバイス。
【請求項４】
前記デバイスの使い捨て本体部が、１枚の担体または底部プレートと、少なくとも１枚のカバープレートとから構成され、該カバープレートが移動可能であることにより、該担体または底部プレートと該カバープレートとの間の距離が可変となっていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項５】
前記担体または底部プレートと前記少なくとも１枚のカバープレートとの間に、弾性で圧縮可能なフレームが、例えばＯリング様シーリングの形態で配置され、それにより該担体または底部プレートを該少なくとも１枚のカバープレートに対して移動して、該担体または底部プレートと該カバープレートとの間の距離、および／あるいは該担体または底部プレート上にある第１ゲルストリップとそれぞれの向かい合う表面（１つまたは複数）との間の距離が変わることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項６】
前記第１ゲルストリップに向かい合って配置されているいずれかのカバープレートおよび好ましくは同時に前記担体がＵＶおよび可視光透過性であり、それにより二次元目の分離のためのゲルのＵＶゲル重合と分離されたタンパク質サンプルの像比較ができるようになっており、前記第１ゲルストリップと前記二次元目ゲルがそれぞれ互いに接触して配置されていることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項７】
前記ゲルストリップの周囲にはバルブが配置されていないことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項８】
前記デバイスが、少なくとも１本ずつの第１ゲルストリップが両面に配置されている中心担体または中心プレートを含むサンドイッチ様もしくはミラー様となっており、かつそれぞれの面が、該中心担体の面に平行なカバー表面によって可変距離で密閉されていることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項９】
前記中心担体が、両面がゲル接着特性を有するフォイルであることを特徴とする、請求項８に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記中心担体と前記２枚の向かい合うカバー表面との間の空間が、二次元目の分離のために用意される第２ゲルの形成のための空隙様チャンバーを少なくとも部分的に形成していることを特徴とする、請求項８に記載のデバイス。
【請求項１１】
前記中心担体と前記２枚のカバー表面との間に、弾性で圧縮可能なフレームが、例えば圧縮可能Ｏリング様シーリングの形態で配置されていて、それにより該２枚のカバー表面の中心担体に対する距離および／または第１ゲルストリップとそれぞれの向かい合うカバー表面との間の距離を変えることができることを特徴とする、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項１２】
前記サンドイッチ様またはミラー様デバイスが、２枚の向かい合うカバープレートを中心担体に対して所定位置および所望距離に保持するクランプ様手段を含むカセット様となっており、該カバープレートが同時に、例えば第２のゲルの配合溶液などを導入するための穴、ゲル／バッファー境界面におけるスリット、および好ましくはバッファー槽を含むことを特徴とする、請求項８〜１１のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記中心担体に沿った適切な位置に一連の穴または開口部が配置され、それにより前記２つの空隙様チャンバー間で液体連通が可能となっていることを特徴とする、請求項８〜１２のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項１４】
１枚のフォイル様またはフィルム様担体が２倍の領域を持ち、片面がゲル接着特性を有し、かつ２本の第１ゲルストリップがそれらの間の距離が所定距離で、好ましくは該フィルム様またはフォイル様担体の中心軸から等しい距離で取付および整列されており、該２本の第１ゲルストリップを有する担体が使い捨て本体部のカバー表面によって密閉されており、該担体と該カバー表面との間の距離が、例えば担体とカバー表面との間にＯリング様シーリングのような圧縮可能ガスケットが配置されていることによって電気泳動プロセスの異なるステップとステップの間において可変となっている、請求項１〜７のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記フィルム様またはフォイル様担体が透過性であり、かつその中央部分に凹部または溝様手段を含み、それにより、二次元目の分離の後、使い捨て本体部から剥がされた該フィルム様またはフォイル様担体を前記２本の第１ゲルストリップから等しい距離にある中心線で折り曲げて重ね合わせることで、透かすことにより分離されたサンプルの容易かつ直接的な比較を行うことができることを特徴とする、請求項１４に記載のデバイス。
【請求項１６】
前記使い捨て本体部のカバー表面が、例えば第２のゲルの配合溶液などを導入するための穴、ゲル／バッファー境界面におけるスリット、および好ましくは３つのバッファー槽を含み、該３つのバッファー槽のうち、１つは中央部陽極槽、２つは相向かい合う陰極槽であり、前記２本のストリップのＳＤＳ動電的平衡化と前記２つの二次元目の分離が反対方向に進むことを特徴とする、請求項１４または１５に記載のデバイス。
【請求項１７】
プレート様またはフォイル様の平坦で薄い担体の片面上で、好ましくは等しい距離で、また好ましくは互いに完全に整列されて平行に配置された複数の第１ゲルストリップを含み、該第１ゲルストリップに平行でまた好ましくはそれぞれのストリップからは等しい距離にある一連のスリットが該担体を貫通して配置されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項１８】
前記第１ゲルストリップのプレート様またはフォイル様担体の周囲部分に圧縮可能ガスケットが用いられており、該ガスケットの頂部には、下側にある第１ゲルストリップに対応して等しい間隔で配置されて立つ、二次元目でのゲル分離のために用意された平行に並んだ垂直なゲル型を含む使い捨て本体部の立体ブロックが取り付けられており、該ゲル型は透過性材料から作られ、かつ前記プレート様またはフォイル様担体に対する該立体ブロックの距離は可変であることを特徴とする、請求項１７に記載のデバイス。
【請求項１９】
前記ゲル型とゲル型との間に溝などの形態の手段が配置され、それにより二次元目の分離ステップの完了時に該ゲル型をそれぞれ個々に使い捨て本体部から容易に分解することができることを特徴とする、請求項１８に記載のデバイス。
【請求項２０】
一次元目の分離が完了するまで、前記プレート様またはフォイル様担体に対して適切な距離にある平坦な密封用カバーをさらに含み、次いでそれが請求項１８に記載の立体ブロックで置き換えられてその後ゲル注入、重合、および二次元目の分離に進められる、請求項１７に記載のデバイス。
【請求項２１】
複合タンパク質サンプルを前分画するための請求項１〜７のいずれか１項に記載のデバイスであって、プレート様またはフォイル様担体上に、広いｐＨ範囲でのサンプルの第１の迅速分離のために用意された１本の一次第１ゲルストリップが取り付けられ、該迅速分離においてはサンプルのタンパク質がその等電点に達する前でいまだ荷電しており、該担体がさらに複数の二次第１ゲルストリップを含み、該二次ゲルストリップは、一次ゲルストリップと１つの辺で接触し、かつそれに対してほぼ直角に、またそれら同士の間がほぼ平行に、すなわち互いの間が等しい距離に配置されており、またそれぞれが、一次ストリップの広いｐＨ範囲内に含まれる狭いｐＨ範囲に対応するｐＨハシゴ段となっており、その結果一次ストリップに由来する区画のそれぞれの二次ストリップへのトランスファーを行うことができ、分解能の向上を実現しうることを特徴とする、上記デバイス。
【請求項２２】
請求項２１に記載のデバイスと、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載のゲル型立体ブロックを組み合せることで得られるデバイス。
【請求項２３】
二次元ゲル電気泳動に基づいて複合タンパク質サンプルを分離するための方法であって、該分離では、等電点に基づいた一次元目ストリップ中での第１の分離および分子サイズに基づいた二次元目ゲル中での第２の分離が行われる上記方法において、単一の担体の同じ面かまたは両面に配置されている少なくとも２本のゲルストリップおよび対応する二次元目ゲル内で少なくとも２つの分析プロセスがそれぞれ並行して行われ、該一次元目ストリップと該二次元目ゲルは接触していることを特徴とする、上記方法。
【請求項２４】
前記一次元目の分離の後、担体と、少なくとも１枚の向かい合う使い捨ての表面との間の距離を増大させることにより、ゲル注入、重合、ＳＤＳ平衡化、二次元目ゲル中へのトランスファーと分離のための最適な条件をもたらすことを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記分析プロセスが、サンプル導入の前のアルキル化とストリップの再水和、親水性サンプル誘導、二次元目ゲルの作製のための高速ＵＶゲル重合、および一次元目で分画されて二次元目ゲルの中に進入する前のサンプルのＳＤＳ動電的平衡化に基づくことを特徴とする、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
特に複合タンパク質サンプルのようなサンプル混合物を分離するための、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のデバイスの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二次元ゲル電気泳動に基づいて分析目的でサンプル混合物を分離するための請求項１により導かれるデバイス、およびゲル電気泳動分析の方法に関し、一体化と自動化の方法を示唆するものである。
【０００２】
詳細には、本発明は、その根底では、既にＥＰ１７１２９０３Ａ１に開示されている、バルブの使用を伴わない高速ＵＶゲル重合、およびＳＤＳ動電的平衡化に基づく方法の範囲を広げることで、並行分析と比較対照試験を行うための簡便で効果的な方法を提供するゲル電気泳動の有利な実施形態に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
二次元スラブゲル電気泳動は、現在、最も用いられているプロテオミクス分析法であり、今もなお存在するいろいろな限界の問題が指摘されているとしても、なお数年は用いられるであろう。実際、二次元スラブゲル電気泳動は、依然として時間がかかり煩雑な方法であって、熟練者を必要とし、結果の品質は主にこの熟練者の腕によって決まるものである。電気泳動の後のステップは高度にロボット化されているが、分離のステップはそれからは程遠く、その結果、制御下に置かれるべき多数のパラメーターにおける変動から、精度と再現性に関する問題が生じうる。そのような問題のいくつかは、例えば、サンプル量、サンプルロス、およびストリップの均質性という点でのサンプルのロードと再水和；損傷と汚染のリスクのあるストリップの取り扱い；不正確でゆっくりとしたストリップのゲルへのカップリング；特に勾配についての均質性、注入スピード、および反応スピードという点でのゲル注入および重合；空気感受性；操作が開始されるまでに要する時間；結果として電場の断絶をも引き起こす気泡トラップのリスク；操作中の温度の上昇；ｐＨの変化と粘度の変化；バッファー能力のロス；である。したがって、許容しうる再現性の欠如（２つのゲル像でちょうど重ね合わせることができるものはないことを意味する）は、ゲルが、多くの場合、例えば実験サンプルペア間におけるタンパク質発現の差異を検出・定量するために作製され比較されるということを考慮した場合、依然として大きな問題である。実際的な言い方をすると、これは、各条件に対してリファレンスマップを構築して一定の確実性に至るためにさらに多くのゲルをつくる必要性があり、このことは、言い換えると、さらに多くの手作業を意味する。
【０００４】
見かけ上、この問題を乗り越えるひとつの方法が、１９９７年に紹介された。すなわち蛍光２Ｄディファレンシャルゲル電気泳動（ＤＩＧＥ）である（Unlu M, Morgan ME, Minden JS. 1997. Difference gel electrophoresis: A single gel method for detecting changes in protein extracts. Electrophoresis 18:2071-2077）。これは、別個の励起・発光スペクトルを有する、質量と電荷がマッチされた蛍光シアニン色素の２種類のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルの誘導体であるＣｙ３とＣｙ５を用いて、２つのタンパク質サンプルのリシン残基を示差的にラベルし、そのサンプルを次に混合して同一のゲル上で泳動することに基づくものである。つまり、マッチングは自動的にまた間違いなく行われ、原理的には単一のゲルだけで十分である。しかしながら、適切な統計的評価を行うためには、少なくとも３〜５枚のゲルがなお必要である。物事を前よりもさらに複雑にするのは、非常に厳密なラベル化条件を守らなければならないという事実である。実際、プレ・ラベル化により、多数の位置異性体と同時に部分的に反応した分子種も生成されて、非常に不均質な結果が生じうることはよく知られている。したがって、可能であればタンパク質分子全体の中の単一のリシン残基への付加を行おうとするので、ラベル化は最小限でなければならない。加えて、過剰反応した分子種は増大した疎水性を獲得した結果として沈殿することも考えられるが、最大の問題は、ＤＩＧＥゲルとその示差的に発現したタンパク質のスポットを次のＭＳ分析のために切り出すことが簡単にできないという事実である。実際、どのリシンに、つまり消化スポットのどのペプチドにその二価の蛍光ラベルが結合するかを予測するすべはなく、その結果ペプチドの同定は問題をはらんでいると思われる。さらに、ゲルが蛍光スキャナーから取り外された後は、スポットはもはや見えなくなり、その結果、電気泳動後の可視化には結果的にＳｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙや他の視覚染色法を用いなければならない。最後に、最大の限界は、ことによるとその装置、ソフトウエア、試薬のコストが非常に高いことに代表されるかもしれない。
【０００５】
機器クロマトグラフィ分析の主な強みは、よりよい再現性に結び付いている自動化である。というのは、サンプルがロードされた後は、それ以上の手作業による介入が必要とされないからである。けれども、これは、同じカラムを使用して、同じ方法でサンプルを次から次へと連続した順序で分析する場合にのみ当てはまる。同一の物質が充填された同一のサイズのカラムでも、カラムの充填状態それ自体が完全には再現性がないので、実際はいろいろな溶出時間を与える可能性がある。例えばモノリスのような新しい材料はそれと一緒に新しい利点をもたらすが、カラムは現在も１個ずつ作成されており、これは、ゲルと同様、並行して分析を行った２つのクロマトグラムを重ね合わせることができる場合はないことを意味する。このほかにも、オンライン検出のような他の固有の利点やＭＳへのダイレクトカップリングの可能性があるにも拘わらず、計測のコストと複雑さからくる限界により、結局はこの方法は、より速いもの、また本当により便利なものとはなっていない。それにひきかえゲルは、容易に並行して分析を行うことができ、最適条件下では優れた分解能を与えることができ、そして像を見ることで直接比較することができる。したがって、もし一体化および自動化、つまりより高い再現性およびスループットがゲルに対しても達成されると、その可能性はさらに非常に大きなものとなり、より多くの比較可能なゲルを、より短い時間で、より少ない作業および削減されたコストで分析することが可能になる。
【０００６】
ＥＰ１７１２９０３Ａ１では、バルブなしの一次元目と、ＳＤＳ動電的平衡化と、高速ＵＶ重合とを組み合せることに基づく一般的な方法の改変が紹介され、これは最終的に、非常にシンプルな一体化・自動化されたシステムおよび先行技術に勝る他の重要な利点をもたらした。その重要な部分を以下に記す。
【０００７】
簡潔化のために、またＥＰ１７１２９０３Ａ１の中で提案されている発明のよりよい理解のために、二次元ゲル電気泳動分析のための種々の方法または処理ステップを、操作の順に説明する。以下はその開発された方法を実施する際に含まれるステップの簡単なリストであり、それぞれに対する考察は後に述べる。
【０００８】
１．  ＩＥＦ（等電点電気泳動）に先立って還元／アルキル化を行う。  
２．  サンプルをロードする。  
３．  後に提案する方法のいずれかによりＩＥＦを実施する。  
４．  ストリップとゲル型の向かい合う表面との間の間隔を広げる。  
５．  二次元目の分離のためにゲル溶液を加え、同時にカップリングさせて重合を行う。  
６．  フォーカスしたタンパク質に対してＳＤＳを動電的に加える。  
７．  ランニング・バッファーを交換し、二次元目を実施する。  
８．  ゲル型を開け、ゲルを取り出す。  
９．  固定および染色を行う。
【０００９】
上記ステップのいくつかについての以下の説明の中では、添付の図１〜７も参照される。それらの図には、ＥＰ１７１２９０３Ａ１による、考えられる実施形態の例および開発されたシステムまたはデバイスの一部が示されている。
【００１０】
ステップ１
還元／アルキル化は、サンプルのロードの直前に、文献（Sebastiano et al. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2003, 17, 2380-2386）に従って行われるサンプル調製の最終ステップとして行う。該方法の若干の改変を伴うが、同じ還元剤およびアルキル化剤、すなわちトリブチルホスフィン（ＴＢＰ）およびビニルピリジン（ＶＰ）を用いるのが好ましい。これまでに、アルキル化反応を起こすのにはサンプル溶液の緩衝は必要でないことが見出されている。つまり、脱塩を行わない限り高電流および長いＩＥＦ時間をもたらす、塩濃度の意味のない増大が回避される。さらに、ＴＢＰとＶＰは互いに反応しうるので、この２つの試薬を、同時ではなく２つの連続するステップで加えることがより効率的であると考えられる。この場合はまた、より短い反応時間（例えば全体で３０分）が必要とされる。タンパク質サンプルを可溶化するのに用いられる典型的な溶液は、一例として以下の構成成分からなる（当然、変形は許される）。
【表１】
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【００１１】
これに、ＴＢＰを、例えば、初めに５ｍＭの濃度で約１０分間加え、次にＶＰを最終濃度２０ｍＭで約２０分間加え、そして再び、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）のような異なる還元剤ではなくＴＢＰを、前の試薬の過剰分を打ち消すのに十分なモル量で加える。
【００１２】
１，２−プロパンジオール（これは、例えばグリセロール、ＰＥＧ、ジエチレングリコールのような他の考えられる添加剤よりも好ましい添加剤である）の機能は、サンプル溶液の粘度を低く保つことと並んでＩＥＦ間のＥＯＦ（電気浸透流）を最小限にすることで
あり、これは、以下にあるとおり、サンプルのロードのステップにとって重要である。
【００１３】
ステップ２
サンプル（例えば上記した溶液中の）を、小さなサンプルウェルに、例えばピペットによりロードする。該サンプルウェルから、サンプルは、ストリップと該ストリップに直接向かい合っている使い捨て本体部内側面とに接触するに至ることができ、そして本発明で提案されているように該内側面と半乾燥ストリップとの間の毛管親水力によって誘導されて、所定の、図１にも示されている空間部を完全に満たすことができる。図１は、長さ方向の断面図で、ＥＰ１７１２９０３Ａ１で提案されている２Ｄゲル電気泳動デバイスまたは使い捨て２Ｄゲル電気泳動デバイス内に配置されている第１ゲルストリップの一部を示すものである。上述したサンプル１はサンプルウェル３にロードされ、そして親水性ゲルストリップ７に沿った毛管空間部５に沿って、矢印で示した方向に誘導される。必ずしも必要ではないが、好ましくは、使い捨て本体部１１の表面９の、ストリップに向かい合っている表面は親水性とし、それ以外の面の少なくとも一部は疎水性か、あるいはゲル非粘着性とする。サンプルの誘導は、単に使い捨て本体部に、その下側に置かれるストリップのサイズに等しい２本の平行な線を引くことによっても促進される可能性がある。この同じカバー平面の、ストリップが取り付けられる部分は、ゲル粘着性となっているのが望ましい。カバー平面は、全て親水性であってもよいし、あるいはゲル接着特性を有していてもよい。カバー平面が例えば、フォイルである場合、その利点は、分析の完了時に、フォイルをゲルと一緒に剥がすことができて、取り扱いがより容易になり、また破損のリスクを最小限にすることができることである。上記ロードを支援するために加圧または真空を用いることもできるが、一般には避けることができる。このように制御された方式により、ストリップを再水和するのに必要とされる量に正確に対応するサンプル容量を導入することができて、無駄を最小限にすることができる。
【００１４】
ステップ３
留意すべきことは、ストリップ７はその側面でバルブで密閉しなくてもよいという事実である。ゲル型は全ての辺において密閉されているので、またＩＥＦの間、使い捨てゲル型は例えば、冷却プレート上に置かれて温度は好ましくは低温に保たれるので、蒸発は最小限に抑えられる。市販のストリップを用いることもでき、それらは、密閉されたコンパクトな使い捨て本体部中に既に一体化されているか、またはそうでなければ、カバー部（これは、使い捨て主本体部を密閉する）に取り付けられて別個に販売されるものと思われる。ストリップはまた、上記同じ親水性誘導システム（この場合は、両方の面が）を用いてin situで重合してもよく、あるいはそうでなければ、親水性の中性多孔質材料（例えばストリップ形状をしたメンブレン）であってもよい。後者の場合はしかしながら、受動的な再水和の代わりに、能動的なサンプルロードを行うことになるだろう。新規なＩＥＦ媒体も本願明細書中に開示されており、これは、サンプル溶液とプレミックスされ、上記したように誘導されてストリップ形状となり、そして温度を室温よりも少しだけ高く上げるとゲル化することができるものである。このような特性を持っている媒体は、エチレンオキシドとプロピレンオキシドのブロックコポリマーであり、プルロニック(Pluronics[登録商標])と呼ばれるＢＡＳＦ社の市販製品群がそれである。好適と考えられるものは、例えばプルロニック(Pluronic)Ｆ１２７であり、上記で説明したサンプル溶液と同じようなサンプル溶液と混合する場合、約２０％またはそれ以上の濃度で使用される。この製品は、他の販売用途のほかに、既に、オリゴヌクレオチドおよび一部のケースではペプチドのキャピラリー電気泳動において有効な篩媒体として使用されてきたが、タンパク質のＩＥＦには使用されたことはない。このコポリマーを水溶液で臨界濃度に溶解させた場合の標準的な特性は、低温（典型的には＜５℃）では液体であり、室温では一種の液晶質ゲルとなることである。サンプル溶液中に尿素、チオ尿素、両性電解質、および界面活性剤が存在すると、ゲル化点が３０〜３５℃より高くシフトする。つまり、室温では取り扱いおよび誘導が容易な液体（粘稠ではあるが）となる。キャピラリー電気泳動およびストリップ形状での電気泳動のいずれにおいても、図２および３に示されているように、うまくフォーカスされたタンパク質を得ることが可能であった。図２は、等電点フォーカス化を行うステップが終わった後の、離れて位置しているタンパク質成分１７を含んでいるプルロニックストリップ１５を示すものである。図３は、線図の形態で、プルロニックが充填されたキャピラリーでのキャピラリーＩＥＦによる、同じサンプルの分離を示すものである。この場合、線ＣはＩＥＦ中の電流低下を表しており、線Ｐは移動の後のＩＥＦピークを示している。キャピラリー電気泳動における利点は、ポリマー自体の動的コーティング特性により、未コートのキャピラリーを用いることができることである。
【００１５】
ステップ４
少なくとも市販のストリップにおいても経験されるひとつの問題は、ストリップおよび該ストリップと直接接触して重合される二次元目のゲルが同じ厚みを有する場合、二次元目に再現性がないことに代表される。正しい量のサンプルを導入するため、良好な毛管力を期待するため、また良好な一次元目の分析を行うためには、一方では、再水和したストリップの厚みに対応した型のスペーシングが必要である。他方では、ゲルとの適当なカップリングを実現するため、また良好な二次元目の分析を行うためには、ストリップ上には小さな空間が必要である。この問題を解決する、３つの考えられる解決策を図４〜６に模式図で示す。図には、断面図で、分析用使い捨て本体部の第１ゲルストリップ７部分の一部が示されている。１つの方法は、ゲル型については厚みを一定にし、ストリップに対応してのみ厚みを変えることである。例えば、使い捨て本体部１１にスリット２１を設けることができ、この場合、親水性底部２４を有する調整バー２３が、図４ａおよびｂに示されている２つの許される位置で自動的に上げ下げされる。図４ｂは、上げられてストリップ７上に間隙２５を形成している調整バー２３を示すものである。当然他の変形も考えられ、例えば、ストリップが、硬質もしくは弾性の調整バーに取り付けられて移動する。もう１つの方法は、ゲル型全体のスペーシングを２つの許される位置間で変えることである。この目的のためには、図５ａおよび５ｂに示されているように、またこの異なる幾何的配置に対して描きうるように、弾性圧縮可能フレーム２７（「Ｏ」リング様）を、２つの型平面１２および１４間に挿入することができる。図５ａに示すように該フレームを押圧すると、最後には２つの平面１２および１４が互いに接するまでもってくることができ、圧縮可能フレームを膨張させると、図５ｂに示すように、上部モールド平面１２とゲルストリップ７との間に空隙部または間隙２５が形成される。図６に模式図で描かれているように、ストリップ７に対応してストリップと同じ高さをもつ好適な空隙部２５を残すこともできる。図６ａは押圧された圧縮可能フレームを示すものであり、図６ｂは膨張された状態にある圧縮可能フレームを示すものである。サンプルロードのメカニズムは好ましくはなお同じであるが、ストリップの周りの空気体積は少なくなると思われる。
【００１６】
ステップ５
ゲル注入をより制御性よく行うためには、このステップは好ましくは垂直で行う。すなわち該機器は、使い捨て本体部を９０°回転させて操作されることになる。ゲル溶液の導入は適当な接続管または針を介して、底部から頂部に向かって、または頂部から底部に向かってのいずれかで行うことができ、ストリップは、垂直な型に対して４つの辺のいずれに位置していてもよい。このようにして、ゲル溶液は型を完全に満たすことになり、少なくとも部分的にストリップに接触しているか、それを覆っているか、および／またはそれを囲んでおり、そして一次元目の分解能およびストリップ内部でのアクリルアミドの拡散を維持するためには、可能ならばサンプルと架橋させて、重合が迅速に行われるのが好ましい。この理由から、ラジカル重合の開始剤および触媒として過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）をそれぞれ用いる従来の方法は好ましくない。なぜならこれらの試薬は、ゲル注入の時点で直ちに重合を開始するので、これらの試薬は、最後の瞬間に添加、混合しなければならないからであり、またその反応が、完結までに通常１時間より長くかかってゆっくりと進むからである。理想的には、ゲル溶液は、重合用の試薬を既に含んでいて、また貯蔵条件下では安定であることである。同時に重要なのは、一旦反応が開始されると（例えば外部エネルギー源によって）、その従来の篩ゲルの特性を維持しながら反応が迅速に進むことである。これは、例えばＵＶ開始重合により、アクリルアミドゲル溶液中で、波長範囲に開始剤の吸収スペクトルが含まれる光源に曝露されるまで安定である開始剤を選ぶことで達成することができる。したがって、使い捨て本体部には、ＵＶ透過性材料を使用すべきである。これらの化合物は一般的には極性でないので、水溶液にはほとんど溶けないことから、ゲル溶液の改変が必要である。例えば、ジエチレングリコール最大１０％までを、ゲルの性能を損なうことなく用いることができる。好適な開始剤は、例えば、０．０５％またはそれ以下の濃度の２，２’−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン（ＤＭＰＡ）である。これを用いることにより、ゲル型を十分な出力のＵＶＡ光に曝露することで、完全な重合を５分以内に実現することができる。
【００１７】
光重合それ自体は新規なものではないが、本発明者の知る限りにおいては、これが二次元ゲルに基づいたプロテオミクスに適用されたことはない。
【００１８】
ステップ６および７
この時点で、ストリップはゲルにカップリングされており、タンパク質がストリップ内でその等電点においてバンド状にフォーカスされている。しかしながら、これは、タンパク質の正味の電荷がゼロであるので、二次元目の分析のためにそれらをゲルにトランスファーできないことを意味する。実際、タンパク質はそれまでにアルキル化されているが、まだ、タンパク質に正味の負の電荷を与え、またドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）とは複合体化していない。ＳＤＳは、タンパク質に一定比率で結合して次にタンパク質をゲル篩マトリックスの中でサイズによって分離させることを可能にするものである。ＳＤＳをタンパク質まで運ぶ１つの方法は、陰極用バッファー槽から動電的に運ぶことである。しかしながら、ランニングバッファー中に存在するＳＤＳの濃度よりも高いＳＤＳ濃度が必要である（例えば２％に対して０．１または０％）。このことは２つの意味を有する。第一には、陰極におけるバッファーは、動電的平衡に達した後は取り替えるかまたは希釈する必要があり、第二には、バッファーからのストリップの距離は、ゲルに入って行く高ＳＤＳ濃度の領域を最小限にするために、好ましくは小さくあるべきだということである（例えば＜５ｍｍ）。結果として得られる効果はしかしながら、標準的な方法よりも優れている。ＳＤＳがゲルの中に移行してタンパク質バンドと出会うと、タンパク質バンドは尾部から移動し始め、頭部ではそのまま残る。バンドがゲル内部を移行して分離を始める前に、バンドがストリップの反対側のところで徐々に圧縮されるスタッキング効果が得られる。これは言い換えると、分解能の向上を意味する。この点で、図７は、大腸菌溶解産物の２Ｄ分離（この場合、総サンプル量１５０μｇを、７ｃｍ、ｐＨ範囲４〜７のＩＥＦストリップにロードし、二次元目の分離は、本発明の方法に従ったＳＤＳ動電的平衡化に基づいて実施した）の結果を示すものである。図７に示されている達成分解能は、当業者に明らかなものであり、質量分光分析によっても確かめられた（これにより、人工産物がないことも分かった）。タンパク質が一旦ＳＤＳと複合体化すると、その相互作用は十分強く、その結果ＳＤＳは、実際、もはやゲル溶液中に存在している必要がない。このようにして、ＳＤＳが、ゲル溶液からストリップの中に拡散してタンパク質の部分的複合体化を引き起こし、上述したスタッキング効果を潜在的に乱すことがないことも確認する。第一のバッファーによるＳＤＳの動電的平衡化は、好ましくは分離条件よりも弱い電場で行う。例えば約５〜６ｖ／ｃｍまたはそれ以下の電場を用いる。このステップは概ね５〜１０分を要し、これは、ＳＤＳがストリップを通過するのに必要な時間であり、この後、操作を、例えばバッファーを取り替えるのに必要な時間中断し（少なめの容量から出発した場合は陰極のバッファーを取り替えるかまたは希釈する）、そして熱を効率的な冷却によって発散させながら、迅速分離のためのより強い電場で操作を再開する。このより強い電場の強度はそのシステムによって決まるもので、好ましくは、例えば約２０ボルト／センチメーターより強いものとする。より強い電場が用いられる場合は、システムの冷却能力はより高いもの���用いなければならない。好ましくは、ゲル型は、例えば、上記図５および６で説明した押圧可能フレームによって、２枚の平面の間において全ての辺で密閉されている。バッファーは、型の２つの向かい合う端部で、かつ同じ平面上で、２つの平行スリット（ひとつは、ストリップとひとつの端部との間に配置されている）を介して、そして上記理由からストリップにできるだけ近く、ゲルに接触している。スリットはまた、ストリップからの蒸発と乾燥をより効率よく防ぐために、またゲル溶液の漏出を防ぐためにも、垂直位置での注入中は閉じておくのが好ましい。スリットは、例えば必要な時点で必要な場所にのみ、使い捨て本体部の物理的一体部分である、例えば射出成形によって作られた薄いライニングに、（機器部に一体化されているブレード機能を用いて）切り込みを入れることによって設けてもよい。そうでなければスリットは、正しい厚みと多孔率を備え、かつ注入の際のゲルの押出し圧力には耐えるが、その後ＳＤＳ含有バッファーで湿らされてゲルと電気的接触を確立する多孔性メンブレン（例えばポリエチレン、ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）、ポリプロピレン、またはＰＥＴ）で密封されていてもよい。テープや接着性つまみの使用は、自動化の観点から、避けるのが好ましい。
【００１９】
ＳＤＳを、フォーカスしたタンパク質まで動電的に移動させるという方法は新規でない。これまでに公表された研究が１つあり、そこではタンパク質が先ず微小流動チャネル中でフォーカスされ、この場合、動電的に導入されるＳＤＳは、サイドのチャネルへと別個の領域に注入することが必要であるという違うシステムが記載されている。本明細書では、そうではなく、二次元ゲル電気泳動への最初の適用が開示され、また、このストリップとゲル間のスタッキング効果が初めて記載される。
【００２０】
ステップ８および９
サンプルのロードからここまで、全てのステップが自動化可能である。二次元目の操作が終わったら、ユーザーは、使い捨て本体部を機器部から手作業で取り出すことができ、そしてゲルを外すことができる。好ましくは、より容易な取り扱いのためには、ゲルは、型の表面の一方（使い捨て本体部かカバー表面のどちらか［カバー表面は、硬い板状部材（例えばガラスやポリマー）またはより柔軟性のある重合体フォイルのいずれからなっていてもよい］）に付いたままにしておく。ゲルが接着している表面は、当然、重合プロセスが化学的にアクセス可能となっていなければならず、他の表面は、ラジカル重合に関して化学的に不活性となっていなければならない。担持されたゲルは、この後、固定および染色についての従来からの手順に従って処理することができる。
【００２１】
平衡化のステップ６および７の際のスタッキング効果の結果として、二次元目の分解能が増大する。前以って行われるアルキル化とＳＤＳ動電的平衡化は、同時に、一次元目と二次元目の合間にストリップを平衡化溶液で処理する必要性をなくす。これは、ストリップを取り扱いまたは移動あるいはストリップをバルブで密閉することが回避されるということ、余分なバッファーが必要でないということ、カップリング用アガロースまたは他のスタッキングゲルの使用が回避されるということ、手作業であれ自動であれ、操作の複雑さが低減されるということ、時間が節約されるということを意味し、これはまた拡散によってバンドが広がることが最小限になることを意味し、したがって第１の分離に対しても分解能が増大することを意味する。最後に、平衡化溶液を用いる場合に起こりうるタンパク質のウォッシュアウトはもはや問題とならない。素早く重合することができかつ外的な光源が照射されない限り安定であるゲル形成液を使用することによって、ゲル調製に伴う問題が回避され、ＩＥＦの前にゲルを予め重合させてそれをストリップから隔壁を用いて分離することの必要性も回避され、そして待ち時間が長くなって、結果としてストリップ内での分解能が失われることも回避される。
【特許文献１】ＥＰ  １ ７１２ ９０３  Ａ１
【非特許文献１】Unlu M, Morgan ME, Minden JS. 1997. Difference gel electrophoresis: A single gel method for detecting changes in protein extracts. Electrophoresis 18:2071-2077.
【非特許文献２】Sebastiano et al. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2003, 17, 2380-2386.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明の課題は、上述したＥＰ１７１２９０３Ａ１の特許出願にある方法のなかの、ステップの範囲を広げ、それに価値を加えることにある。
【００２３】
既に開示されているこの方法は、実際、一連の新規な実施形態に非常に適したものであり、並行して処理されるより多くのゲルに対してより均質な条件を確立する、つまりより再現性のある比較対照試験のためにより堅牢かつ簡便な方法を提供するものであり、これら全てを、その上、削減されたコストと最小限の手作業時間で、使い捨て方式において行う。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明により、分析目的でサンプル混合物を二次元ゲル電気泳動に基づいて分離するためのデバイスが提案される。該デバイスは、第１の分離のステップのための少なくとも２本のゲルストリップと二次元目のための対応するゲルが配置されていて、それぞれに少なくとも２つの分析プロセスを並行して行うことができるようになっていることを特徴としている。１つの考えられる実施形態によれば、少なくとも２本の平行な第１ゲルストリップが、好ましくは単一の担体上で同じ面かまたは両面に対称に配置されている。
【００２５】
本発明のデバイスのさらなる考えられる実施形態は、特許請求の範囲にある従属クレーム中に記載されているかまたは添付の図面を参照にした以下の実施例中に詳細に記載されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下に、模式図によって図示されている、また簡潔に「ミラーゲル」、「対称ゲル」、および「平行ゲル」（これは、三次元分析に拡大可能である）と称される新規な発明のコンセプトを開示し、その相対的利点の要点を述べる。本発明の説明はしたがって主に新規な実施形態の説明であって、根底にあるその方法は、ＥＰ１７１２９０３Ａ１の特許出願から派生し、これに開示されたのと同じであるという事実を強調しておく。つまり、この後、例えばサンプルのロード、再水和、ＩＥＦ、平衡化、および二次元目ゲル電気泳動を行うやり方については、既に他のどこかかまたは上記で説明されているので、説明は省略する。本発明の一部は、しかしながら、最初のものから派生した別の新規な方法でもあり、そこではバルブを使用することなく、三次元目ゲル電気泳動へのカップリングに先立つ前分画ステップとして、二次元ＩＥＦを行うことができる。
【００２７】
図８は、本発明の一例として、いわゆる「ミラーゲル」の形態にある一つの考えられる実施形態を示すものである。
【００２８】
図８に示されているこの実施形態は、２枚の外側カバー表面３５および３７間でサンドイッチ配置３３にある中心または中間フォイル３１を有し、この２枚のカバー表面間の距離は変えられるようになっており、その結果、これらの表面のそれぞれと、中間にあるフォイルとの間の距離が、該表面に外部圧力が加えられているかまたは該表面にクランプシステム３９および４１が用いられているために、例えば、（ＥＰ１７１２９０３Ａ１中に既に開示されているように）フォイル３１のそれぞれの面に配置されている圧縮可能ガスケットシステム４３および４５によって、約０．７ｍｍか約１ｍｍのいずれかの値をとることができるようになっている。このように形成された電気泳動カセット様配置３３は、図８の図に図示されているバッファー槽４７および４９も含めて、光および／またはＵＶ透過性材料を用いて射出成型することができ、またその全てもしくは一部を使い捨てとすることができる。この光またはＵＶ透過性は、二次元目の分離のためのゲルの形成にＵＶまたは光開始重合が用いられ、該重合は中心部フォイル３１と２枚のカバー表面３５および３７との間に形成される２つのチャンバー３２および３４内で行われるという理由から、重要である。
【００２９】
２本の同じ第１ゲルストリップまたはＩＰＧストリップ５１は、好ましくは中央部フォイル３１の両面に、互いに対応する正確な位置に取り付けられて整列されている。該中央部フォイルの一つの特徴は、両面がゲル接着特性を有していることである。この第１ゲルストリップは、好ましくは、ＥＰ１７１２９０３Ａ１に沿って上記に開示されているステップ２のステップ２内に記載・提案されているように、親水性ゲル材料から作成する。ミラー配置では、さらに、外側プレート３５および３７上にはゲル／バッファー境界面にスリット５３がある。該境界面に対しては、前に開示されているのと同じ理由で、例えばメンブレンを用いることができる。フォイルのもう一つの特徴は、フォイルのそれぞれの面にある２つのチャンバー３２および３４の間の液体連通を可能にする機能を有する、２つのストリップに平行な線に沿ったゲル型の２つの端部にある一連の穴５５および５７である。このように、２つのチャンバー３２および３４は、ゲル溶液を注入する際に同時かつ均質に満たすことができ、また上記したステップ５中に提案されているように、適切な波長と出力の、例えば、ＵＶ光を両面から短時間照射することで重合もまた同時に行わせることができる。これは、勾配ゲルを注入する場合の利点と同じでもある。
【００３０】
図８に示されている実施形態は、その一般法がもっている全ての利点以外にも、比較対象の２つのタンパク質サンプルについての二次元電気泳動のその２つの分離ステップを、ＤＩＧＥ法におけるのと同じように、しかしプレ・ラベル化を必要とすることなしに、あたかもその２つのステップが単一のゲルにおいて泳動されているかのように、ほぼ同一の条件下で分析を行うことを可能にするものである。タンパク質スポットは、理論的には、透明フォイル３１の両面で２Ｄミラーパターンを形成することになり、可視化染色の後、続いてこの透明フォイルを通して該２つのパターンを直接的に比較することができる。２つのサンプルの異なる組み合せ、例えばサンプル１とサンプル２との組み合せ以外に、サンプル１とサンプル１との組み合せ、サンプル２とサンプル２との組み合せで、より多くの実験を対照として行うことも考えられる。
【００３１】
本発明のさらなる考えられる例としての別の実施形態が、いわゆる「対称ゲル」の形態で、図９ａおよび９ｂに示されている。
【００３２】
図９ａは、一次元目および二次元目のサンプル分離の最中にある本発明によるデバイスを縦断面図で示すものであり、図９ｂは、分離が終わった後の、分析目的でその２つのサンプルの分離を同時に比較するという可能性を有するゲルストリップを示すものである。
【００３３】
図９ａに図示されているデバイス６１は、２倍の領域をもち、かつ片面だけがゲル接着特性を有するフォイル６３を備える。２本の第１ゲルストリップ６５が、その２本の間の距離が所定距離となり、かつゲルデバイス６１の中心軸Ａからは等しい距離となるところに平行に取り付けられて整列されており、それにより該デバイスは完全に対称的な形状をとっている。そして、射出成型された好ましくはＵＶ透過性の使い捨て本体部６４に一体化された、２つのゲル、２つの陽極、および１つの共通の陰極のための３つの異なるバッファー槽６７、６９、および７１がある。別の形態として、該バッファー槽を外部に存在させて、代わりに機器部に一体化させ、そしてバッファーを再循環させることも考えられる。フォイル６３と、使い捨て本体部６４の内側面６２との間の距離は、このケースでも、圧縮可能ガスケット６８が配置されていることによって、異なるステップの間で変えられるようになっている。図９ａ中の矢印７３は、上記に開示したステップ６で提案されている中央部スリットを通しての動電的平衡化の間のＳＤＳの移動の方向を示すものであり、また二次元目の２つのゲルのための２つのチャンバー６６内での二次元目泳動の反対方向を示すものでもある。二次元目泳動の後、フォイル６３を剥がし、染色し、そして２本のゲルストリップから等しい距離のところにある中間線で曲げて、図９ｂに示されているように、透かして簡単に直接的な比較を行うことができる。これは、例えば、フォイル６３の中央に凹部または溝７２を設けることで達成することができる。
【００３４】
このケースでも均質な条件は保証されるので、その利点は実質的に上記したのと同じである。一つの好ましくない差異点は、この実施形態は、勾配ゲルを注入するのには適していないという点である。一つの好ましい差異点は、おそらく、デザインがより単純であることであり、従って製造コストがさらに低くなり、確かに２つの別個の単一のゲル使い捨て品に対するよりも低くなる。
【００３５】
再び、本発明のさらなる例としての別の実施形態を、図１０に、いわゆる「平行ゲル」の形態で示す。
【００３６】
この実施形態に関しては、多数の第１のゲルストリップ８１（＞２）が、平坦で薄い担体８３上で、等しい距離で平行にかつ互いには完全に整列されて配置されており、該担体を貫通して、外部バッファー(図示されていない）との境界面に、ストリップに平行でありかつ各ストリップから等しい距離にある一連のスリット８５も配置されている。ストリップは、異なるサンプルまたは同じサンプルの複製を並行して分析を行うために同じものであってもよいし、または例えば、前分画のステップの後のより限定された範囲の分離のために異なるｐＨ範囲を有するものであってもよい。ストリップ担体の縁部には、圧縮可能ガスケット８８が用いられており、このガスケット上には、例えば、二次元目の分離のための第２のゲルを配置するための、下側の第１ゲルストリップ８１に対応して等しく間隔を置いて立っている平行で垂直なゲル型８９（例えば１ｍｍの間隔で）を構成している立体ブロック８７が固定される。ゲル型間の空間は空洞部となり、ゲル型が覆われるまで陽極ランニングバッファーで満たされることになる。このブロックは、光またはＵＶ透過性材料から射出成型された単品ブロックであるが、バッファー空洞部の端部に沿って挿し込まれた構造物であって、その結果、分析が終わった時点において手で軽くねじることでブロックを容易に分解することができるようになっていて、個々のゲル型８９を開いてゲルを取り出せるようになっている。図にある矢印９１は、電場の形、動電的平衡化の間のＳＤＳの移動の方向を示しており、スタッキングは各ストリップの中央部の方へ、またその後のタンパク質のトランスファーおよび移動は垂直ゲルの中へと進む。これについても、ＥＰ１７１２９０３Ａ１に既に開示されているステップを参照されたい。
【００３７】
個々に行う単一のゲルの分析に対する主な利点は、ここでも、より均質な条件をいくつものゲルに対して同時に有するということであり、その結果、ゲル間により高い再現性を期待することができる。また、単一のストリップと単一のゲルをハンドリングするのと比べて、システムおよび操作の複雑さの著しい低減が図られ、ストリップをトレイ中で二次元目の分離にカップリングさせるための非常に簡便で単純な方法を提供するものである。また、注目に値するのは、この図１０の実施形態は、例えばミネラルオイル中で一次元目と二次元目との間でストリップを標準平衡化溶液と平衡化させるという古典的なＩＥＦの実行方法にも修正可能であるという点である。
【００３８】
最後に、図１１ａおよび１１ｂに示すように、さらなる実施形態により、二次元分析から三次元分析への拡大が可能になる。これまでの実施形態とは対照的に、図１１ａおよび１１ｂに示されているデバイスでは、複数のサンプル分画が可能となるか、または提案されているということはなく、分画が改善されて、例えば、タンパク質サンプルのようなサンプルの分離でのよりよい分解能が得られるものである。図１１ａは、一次元目の分離についての実施形態を断面図で示すものであり、図１１ｂは、第１の分離についての実施形態を上から見た図で示すものである。
【００３９】
ストリップの再水和およびフォーカス化をバルブまたは隔壁手段なしでも行うことができるという事実は、異なるストリップとストリップとをカップリングして、例えば、図１１にあるように広いｐＨ範囲のＩＰＧストリップから狭いｐＨ範囲のＩＰＧストリップにまたぐようにすることを可能にするものである。実際、第１ストリップ１０３に対してはＩＥＦを十分長い時間行って、そのｐＨ範囲にわたって前フォーカス化およびタンパク質分布を行わせることも可能であるし、またＩＥＦを十分短い時間行ってその等電点に到達するまではなお荷電させておくということが可能である。このように、ｐＨ範囲ハシゴ段の順番に従って並べられた平行ストリップ、例えば、１０４〜１１１にカップリングさせた後は、タンパク質は直角に移動させて分離することができる。つまり、一次元目での分画および二次元目の分解能の向上が得られる。
【００４０】
従って、高速重合および好ましくはＳＤＳ動電的平衡化により、図１１ａおよび１１ｂに示されている実施形態は、ここで、図１０の実施形態と組み合せることができる。この実施形態では、符号８９で示されているいくつかのゲル型の各々は、平行ストリップ１０４〜１１１のうちの１つの上に配置され、三次元目（これまでは二次元目であった）の分離を行うことができるようになる。
【００４１】
図８〜１１に示されている実施形態は、単に、本発明を説明するための、また本発明をよりよく理解するための例にすぎない。ＥＰ１７１２９０３Ａ１中に提案されているゲル電気泳動使い捨て品と比較すると、該特許出願において、バルブの配置を必要としない使い捨ての本体部を用いた、自動化の対象となるより単純でより良い電気泳動分離法が提案されていることから、本発明によって、分析混合物の同時の２つまたはそれ以上の分離が可能である。
【００４２】
本発明は、当然、図８〜１１に示されている実施形態に全く限定されるものではなく、少なくとも２本の第１のゲルストリップを使用することを提案しかつそれぞれ電気泳動を用いて少なくとも２つのサンプルに対して少なくとも２つの分離プロセスを並行して行うという可能性を有する、ＥＰ１７１２９０３Ａ１に基づいたいかなる展開も、本発明の範囲内に包含される。
【００４３】
参照文献
［１］Unlu M, Morgan ME, Minden JS. 1997. Difference gel electrophoresis: A single gel method for detecting changes in protein extracts. Electrophoresis 18:2071-2077.
［２］Sebastiano et al. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2003, 17, 2380-2386.
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】先行技術による２Ｄゲル電気泳動デバイスまたは２Ｄゲル電気泳動使い捨て品中に配置されている第１ゲルストリップの一部を縦断面図で示す。
【図２】タンパク質成分１７が離れて位置している、先行技術による等電点電気泳動ステップの後のプルロニックストリップ１５を示す。
【図３】図２のサンプルと同じサンプルの、プルロニック充填キャピラリー中でのキャピラリーＩＥＦによる分離を線図で示す。
【図４】第１ゲルストリップ７部分における先行技術の分析使い捨て品の一部を断面図で模式的に示す。
【図５】第１ゲルストリップ７部分における先行技術の分析使い捨て品の一部を断面図で模式的に示す。
【図６】第１ゲルストリップ７部分における先行技術の分析使い捨て品の一部を断面図で模式的に示す。
【図７】先行技術による大腸菌溶解産物の２Ｄ分離の結果を示す。
【図８】本発明の「ミラーゲル」の実施形態を示す。
【図９】本発明の「対称ゲル」の実施形態を示す。
【図１０】本発明の「平行ゲル」の実施形態を示す。
【図１１】二次元分析から三次元分析への拡大を可能にする本発明の実施形態を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年2月2日(2007.2.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二次元ゲル電気泳動に基づいて複合タンパク質サンプルを分離するためのデバイスであって、該分離では一次元目ストリップ中での等電点に基づいた第１の分離および二次元目ゲル中での分子サイズに基づいた第２の分離が行われる上記デバイスにおいて、第１の分離ステップのための少なくとも２本のゲルストリップおよび二次元目のための対応するゲルが単一の担体上で同じ面かまたは両面に配置されており、少なくとも２つの分析プロセスを並行して行うことができることを特徴とする、上記デバイス。
【請求項２】
前記第１の分離ステップのための少なくとも２本のゲルストリップが、該担体上で平行かつ／または対称に配置されていることを特徴とする、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記担体または底部プレートと前記少なくとも１枚のカバープレートとの間に、弾性で圧縮可能なフレームが配置され、それにより該担体または底部プレートを該少なくとも１枚のカバープレートに対して移動して、該担体または底部プレートと該カバープレートとの間の距離、および／あるいは該担体または底部プレート上にある第１ゲルストリップとそれぞれの向かい合う表面（１つまたは複数）との間の距離が変わることを特徴とする、請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項４】
前記デバイスが、少なくとも１本ずつの第１ゲルストリップが両面に配置されている中心担体または中心プレートを含むサンドイッチ様もしくはミラー様となっており、かつそれぞれの面が、該中心担体の面に平行なカバー表面によって可変距離で密閉されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項５】
前記中心担体と前記２枚の向かい合うカバー表面との間の空間が、二次元目の分離のために用意される第２ゲルの形成のための空隙様チャンバーを少なくとも部分的に形成していることを特徴とする、請求項４に記載のデバイス。
【請求項６】
１枚のフォイル様またはフィルム様担体が２倍の領域を持ち、片面がゲル接着特性を有し、かつ２本の第１ゲルストリップがそれらの間の距離が所定距離で、該フィルム様またはフォイル様担体の中心軸から等しい距離で取付および整列されており、該２本の第１ゲルストリップを有する担体が使い捨て本体部のカバー表面によって密閉されており、該担体と該カバー表面との間の距離が、担体とカバー表面との間に圧縮可能ガスケットが配置されていることによって電気泳動プロセスの異なるステップとステップの間において可変となっている、請求項１〜３のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項７】
前記フィルム様またはフォイル様担体が透過性であり、かつその中央部分に凹部または溝様手段を含み、それにより、二次元目の分離の後、使い捨て本体部から剥がされた該フィルム様またはフォイル様担体を前記２本の第１ゲルストリップから等しい距離にある中心線で折り曲げて重ね合わせることで、透かすことにより分離されたサンプルの容易かつ直接的な比較を行うことができることを特徴とする、請求項６に記載のデバイス。
【請求項８】
プレート様またはフォイル様の平坦で薄い担体の片面上で、等しい距離で、また互いに完全に整列されて平行に配置された複数の第１ゲルストリップを含み、該第１ゲルストリップに平行でまたそれぞれのストリップからは等しい距離にある一連のスリットが該担体を貫通して配置されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項９】
複合タンパク質サンプルを前分画するための請求項１〜３のいずれか１項に記載のデバイスであって、プレート様またはフォイル様担体上に、広いｐＨ範囲でのサンプルの第１の迅速分離のために用意された１本の一次第１ゲルストリップが取り付けられ、該迅速分離においてはサンプルのタンパク質がその等電点に達する前でいまだ荷電しており、該担体がさらに複数の二次第１ゲルストリップを含み、該二次ゲルストリップは、一次ゲルストリップと１つの辺で接触し、かつそれに対して直角に、またそれら同士の間が平行に、すなわち互いの間が等しい距離に配置されており、またそれぞれが、一次ストリップの広いｐＨ範囲内に含まれる狭いｐＨ範囲に対応するｐＨハシゴ段となっており、その結果一次ストリップに由来する区画のそれぞれの二次ストリップへのトランスファーを行うことができ、分解能の向上を実現しうることを特徴とする、上記デバイス。
【請求項１０】
請求項９に記載のデバイスと、ゲル型立体ブロックとを組み合せることで得られるデバイスであって、該立体ブロックは第１ゲルストリップ担体の周囲部分に備えられた圧縮可能ガスケットの頂部に取り付けられ、かつ下側にある二次第１ゲルストリップに対応して等しい間隔で配置されて立つ、三次元目でのゲル分離のために用意された平行に並んだ垂直なゲル型を含み、該ゲル型は透過性材料より作られ、また該立体ブロックの該担体に対する距離が可変となっている、上記デバイス。
【請求項１１】
二次元ゲル電気泳動に基づいて複合タンパク質サンプルを分離するための方法であって、該分離では、等電点に基づいた一次元目ストリップ中での第１の分離および分子サイズに基づいた二次元目ゲル中での第２の分離が行われる上記方法において、単一の担体の同じ面かまたは両面に配置されている少なくとも２本のゲルストリップおよび対応する二次元目ゲル内で少なくとも２つの分析プロセスがそれぞれ並行して行われ、該一次元目ストリップと該二次元目ゲルは接触していることを特徴とする、上記方法。
【請求項１２】
複合タンパク質サンプルを分離するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のデバイスの使用。
【外国語明細書】
2007171194000001.pdf