(57)【要約】  【課題】副作用が比較的少なく、かつ、より簡便な肝障害の予防又は治療方法を提供する。【解決手段】哺乳動物の肝障害を抗原非特異的に治療又は予防する方法であって、（１）哺乳動物から取り出されたリンパ球を特定の抗原で増殖及び活性化させることにより、前記抗原に特異的なリンパ球を調製する第１工程、（２）第１工程で得られた抗原特異的なリンパ球を前記哺乳動物の肝臓に導入する第２工程及び（３）前記哺乳動物に１）前記抗原そのもの及び／又は２）前記抗原と等しい抗原活性を有する物質を経口投与することにより、第２工程で導入された前記リンパ球を抗原刺激し、肝臓組織内においてCD4+FasL+免疫調節性T細胞を誘導する第３工程、を含むことを特徴とする方法に係る。  【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の肝障害を抗原非特異的に治療又は予防する方法であって、
（１）哺乳動物から取り出されたリンパ球を特定の抗原で増殖及び活性化させることにより、前記抗原に特異的なリンパ球を調製する第１工程、
（２）第１工程で得られた抗原特異的なリンパ球を前記哺乳動物の肝臓に導入する第２工程及び
（３）前記哺乳動物に１）前記抗原そのもの及び／又は２）前記抗原と等しい抗原活性を有する物質を経口投与することにより、第２工程で導入された前記リンパ球を抗原刺激し、肝臓組織内においてCD4+FasL+免疫調節性T細胞を誘導する第３工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
第１工程で得られたリンパ球が、CD4陽性T細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第２工程が、前記リンパ球の導入が血液注入及び／又は腹腔内注入により行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
肝障害が、ウイルス性肝炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変及び胆管炎の少なくとも１種を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
特定の抗原がハプテン化タンパクである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
哺乳動物から取り出されたリンパ球を特定の抗原で増殖及び活性化させることにより調製される前記抗原に特異的なリンパ球であって、請求項１に記載の治療又は予防方法に用いるための抗原特異的リンパ球。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝疾患の予防又は治療方法に関する。より具体的には、Ｔ細胞の移入と移入T細胞に特異的な抗原を経口から投与することによって、免疫学的な抗炎症反応を利用して肝障害を予防ないしは治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類、とりわけヒトにおける肝炎等は、肝硬変から肝臓癌、さらには死に至るおそれのある疾患である。ウイルス感染による肝炎だけでなく、肝臓に発現した自己抗原に対する免疫反応によっても肝障害が惹起される。
【０００３】
今日では、ウイルス性肝炎と自己免疫性肝疾患の患者に対しては、例えばインターフェロン、逆転写酵素阻害剤、ステロイドホルモン等の抗ウイルス剤又は免疫抑制剤による治療が行われている。しかし、これらの薬物治療は、肝障害を引き起こす細胞機序に基づいた治療とは必ずしも言えず、しかも治療効果が十分でなく、副作用も無視することができない。
【０００４】
経口から抗原を投与することにより、免疫炎症反応を抑制するＴ細胞（サプレッサーT細胞、調節T細胞）が体内で誘導される。誘導機序としては、大量に抗原が投与された場合は抗原特異的なＴ細胞の除去がなされる（クローン除去説）。一方、少量の抗原が投与された場合は、腸管付属リンパ節（パイエル板）で調節Ｔ細胞が誘導されると考えられている。
【０００５】
一方、肝臓は、門脈を介して肝臓に到達する抗原に対して免疫寛容を誘導することが知られている。また、移植に際しても、肝臓は免疫寛容を誘導し、拒絶反応が比較的起こりにくい臓器としても知られている。
【０００６】
解剖学的な見地から見れば、絶えず食物及び腸の微生物叢から由来する抗原性物質が門脈を介して肝臓に送られることにより成立する門脈性寛容が肝臓の寛容誘導特性に関与している可能性がある(Crispe IN, Dao T, Klugewitz K, Mehal WZ, Metz DP. The liver as a site of T-cell apoptosis: graveyard, or killing field? Immunol Rev 2000; 174:47-62)。この肝臓固有の免疫寛容を誘導しやすいという特性の応用例としては、例えばインシュリン依存性糖尿病の治療における門脈からの膵島移植がある(Shapiro, A.M.et al.,N. Engl.J.Med.343.230(2000))。
【０００７】
最近では、各々の疾患を惹起すると考えられる自己抗原を経口より患者に投与して免疫寛容を誘導することにより炎症を防止する試みが種々なされている。例えば、慢性関節リュウマチ(Trentham, D.E. et al. Science,261:1727(1993))、多発性硬化症(Weiner,H.L.et al.,Science,2589:1321(1993))、2型糖尿病(Lalej-Bennis D et al. Efficacy and tolerance of intranasal insulin administered during 4 months in severely hyperglycaemic Type 2 diabetic patients with oral drug failure: a cross-over study. Diabet Med 2001;18(8):614-8.)、ぶどう膜炎(Thurau SR et al. Oral tolerance for treating uveitis-new hope for an old immunological mechanism. Prog Retin Eye Res 2002;21(6):577-89) 等の患者に対し、自己抗原を経口より投与する治療が行われている。
【０００８】
しかしながら、これらの治療方法では、自己抗原を必要とするが、治療に十分な量の自己抗原を入手・確保することが困難である。
【０００９】
また、これらは免疫寛容機序も様々であるため(Weiner HL. Oral tolerance, an active immunologic process mediated by multiple mechanisms. J Clin Invest 2000;106(8):935-7)、標的臓器に十分な免疫抑制効果をもつ細胞を効率的に誘導することができない。
【００１０】
さらに、これらの方法では、場合によっては、病気をかえって悪化させたり、別の疾病を誘発するおそれがある(Blanas E, Heath WR. Oral administration of antigen can lead to the onset of autoimmune disease. Int Rev Immunol 1999;18(3):217-28)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
このように、進行した肝炎等により重度な肝機能不全に陥った患者に対し、効果的な治療法は肝移植以外にないため、肝炎等の肝障害の新しい治療法ないしは予防方法の開発が望まれている。
【００１２】
従って、本発明の目的は、これらの問題を解決し、副作用が比較的少なく、かつ、より簡便な肝障害の予防又は治療方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、上記のような従来技術の問題点に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、特定の工程からなる方法より上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、下記の肝障害の予防又は治療方法に係る。
【００１５】
１．  哺乳動物の肝障害を抗原非特異的に治療又は予防する方法であって、
（１）哺乳動物から取り出されたリンパ球を特定の抗原で増殖及び活性化させることにより、前記抗原に特異的なリンパ球を調製する第１工程、
（２）第１工程で得られた抗原特異的なリンパ球を前記哺乳動物の肝臓に導入する第２工程及び
（３）前記哺乳動物に１）前記抗原そのもの及び／又は２）前記抗原と等しい抗原活性を有する物質を経口投与することにより、第２工程で導入された前記リンパ球を抗原刺激し、肝臓組織内においてCD4+FasL+免疫調節性T細胞を誘導する第３工程
を含むことを特徴とする方法。
【００１６】
２．  第１工程で得られたリンパ球が、CD4陽性T細胞である、前記項１に記載の方法。
【００１７】
３．  第２工程が、前記リンパ球の導入が血液注入及び／又は腹腔内注入により行われる、前記項１に記載の方法。
【００１８】
４．  肝障害が、ウイルス性肝炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変及び胆管炎の少なくとも１種を含む、前記項１に記載の方法。
【００１９】
５．  特定の抗原がハプテン化タンパクである、前記項１に記載の方法。
【００２０】
６．  哺乳動物から取り出されたリンパ球を特定の抗原で増殖及び活性化させることにより調製される前記抗原に特異的なリンパ球であって、請求項１に記載の治療又は予防方法に用いるための抗原特異的リンパ球。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の方法では、抗原の経口投与により肝臓で誘導されるCD4+FasL+免疫調節性T細胞によって、抗原非特異的に肝障害を抑制することができる。これにより、複数の種類の肝障害に同時に対応することも可能になる。換言すれば、肝障害の種類ごとに大きく異なる治療方法を別途に採る必要がないという点で有利である。また、特に、ヒト肝炎のうち、自己抗原ターゲット、肝炎ウイルスの免疫原性エピトープ等が未だ解明されていないものがあるが、このような状況下にあっても、本発明の方法により肝障害の進行を効果的に抑制することが可能である。すなわち、肝障害を惹起する病原性抗原を特定できなくても、本発明の方法によりその肝障害を抑制することが可能になる。
【００２２】
また、本発明の方法によれば、任意の抗原を用いて肝障害の治療・予防を行うことができる。すなわち、いわゆる第三者抗原を用いることができるので、従来のような自己抗原でなく、大量に入手しやすい抗原を選んで本発明の特定抗原として使用することができる。このため、対象となる患者、肝障害の種類等に見合った適切な治療を行うことができる。
【００２３】
さらに、本発明においては、いったんリンパ球を体内に導入した後は、経口から特定抗原を服用するだけで肝障害を抑制することができる。すなわち、摂取が容易であり、かつ、副作用のおそれも少ないことから、従来の方法に比べて患者の精神的・体力的な負担を大幅に軽減することができる。また、特別な医療器具も必要とせず、在宅治療も可能なことから、経済的な負担も軽減することが可能である。
【００２４】
加えて、未だ肝障害を発症していない段階においても、特定抗原を日常的に服用することによって、発症を事前に防止することも可能であり、肝障害の予防方法としても有効である。
【００２５】
このような特徴を有する本発明の方法は、例えばウイルス性肝炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎等の各種の肝障害の治療に使用することが可能である。これらの中でも、慢性炎症（慢性肝炎）、とりわけTh1型リンパ球の浸潤に基づいて惹起される各種炎症の治療にも好適である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明の方法は、哺乳動物の肝障害を抗原非特異的に治療又は予防する方法であって、
（１）哺乳動物から取り出されたリンパ球を特定の抗原で増殖及び活性化させることにより、当該抗原に特異的なリンパ球を採取する第１工程、
（２）第１工程で得られた抗原特異的なリンパ球を前記哺乳動物に肝臓に導入する第２工程及び
（３）前記哺乳動物に前記抗原を経口投与することにより、第２工程で導入された前記リンパ球をさらに抗原刺激し、肝臓組織内においてCD4+FasL+調整T細胞を誘導する第３工程
を含むことを特徴とする。
【００２７】
第１工程
第１工程では、哺乳動物から取り出されたリンパ球を特定の抗原（以下「特定抗原」ともいう。）で増殖及び活性化させることにより、当該抗原に特異的なリンパ球を調製する。
【００２８】
リンパ球を哺乳動物から取り出す方法は特に限定されず、公知の方法に従えば良い。例えば、末梢血から採取する方法、体内臓器から採取する方法等のいずれであっても良い。特に、患者への負担が少なく、かつ、後記の第２工程において効率的に抗原特異的T細胞を誘導できるという点で、末梢血を採取する方法が望ましい。末梢血を採取するに当たっては、例えば腕の静脈から末梢血を採取すれば良い。採血量は、所定量のリンパ球が得られる程度であれば良く、通常は10〜50mL程度とすれば良い。
【００２９】
採取するリンパ球の数は特に限定されず、上記の採血量等による。例えば10〜15mL程度を採血した場合には、約１千万個のリンパ球を回収することができる。リンパ球の分離・回収は、例えば比重遠心分離法等により実施することができる。
【００３０】
次いで、取り出されたリンパ球を特定抗原で増殖及び活性化させることにより、当該抗原に特異的なリンパ球を採取する。特定抗原により増殖及び活性化させる方法は、公知のリンパ球の培養方法（例えば、Watanabe T, Yoshida M, Shirai Y, Yamori M, Yagita H, Ito T, Chiba T, Kita T, and Wakatsuki Y. Administration of an antigen at a high dose generates regulatory CD4+T cells expressing CD95 ligand and secreting IL-4 in the liver. J Imminol 2002;168:2188-99）等に従って実施することができる。すなわち、特定抗原を含有する培養液等をリンパ球に接触させて刺激すれば良い。この場合、培養液中の特定抗原の濃度は、通常1〜50μg/mL程度の範囲内で適宜調節することができる。また例えば、培養液を段階的に追加しながら、大量のリンパ球を培養する方法を採ることもできる。本発明では、特定抗原により増殖・活性化するに際し、必要に応じて抗CD3抗体、IL-2等を併用して抗原刺激することもできる。
【００３１】
当該抗原に特異的なリンパ球の採取は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、比重遠心分離法等により所望のリンパ球を回収することができる。この抗原特異的なリンパ球は、T細胞（特にCD4陽性T細胞（CD4+T細胞））であることが望ましい。なお、必要に応じて、リンパ球の肝臓への導入に先立ち、回収されたリンパ球に対して無菌試験等を予め実施しても良い。
【００３２】
前記の特定抗原としては、特に限定されず、対象となる哺乳動物が日常的に経口から摂取しないもの（いわゆる疑似抗原）であれば良い。例えば、ヒト以外の哺乳類であれば、卵白アルブミン（オバルブミン；OVA）、ハプテン化タンパク等を用いることができる。また、ヒトであれば、例えばハプテン化タンパクを好適に用いることができる。
【００３３】
ハプテン化タンパクとしては、例えば日常的に食するタンパク（ペプチド）をハプテン化したものが挙げられる。前記タンパクは、動物性タンパク又は植物性タンパクのいずれであっても良い。例えば、大豆タンパク等を好適に用いることができる。
【００３４】
ハプテンの種類は限定的でなく、公知のハプテンから適宜選択することができる。例えば、KLH（Keyhole Limpet hemocyanin）、塩化ピクリル、ニトロフェノール（TNP）、アゾベンゼンアルソネート（ABA）、ジニトロクロールベンゼン（DNCB）等が挙げられる。これらは１種又は２種以上用いることができる。これらを用い、公知の手法に従ってタンパク等をハプテン化すれば良い。また、ハプテン化されたタンパクは、市販品を使用することもできる。
【００３５】
第２工程
第２工程では、第１工程で得られた抗原特異的なリンパ球を前記哺乳動物に肝臓に導入する。
【００３６】
前記リンパ球を導入する方法は限定的ではなく、例えば静脈に注入する方法（点滴）、動脈（肝動脈等）に注入する方法、その他腹腔内に注入する方法等を採用することができる。これらの方法は、肝障害の部位、肝障害の進行度等に応じて適宜決定することができる。特に、患者の負担を軽減できるという点では点滴による方法が好ましい。点滴による方法は、一般的なガンの養子免疫療法等で採用されている方法と同様にすれば良い。
【００３７】
また、前記リンパ球は、例えば市販の培養液に分散させた形態、その他の適当な溶媒又は溶液に分散させた形態のほか、市販の点滴用生理食塩水等に前記リンパ球を分散又は浮遊させた形態であっても良い。この場合、前記リンパ球とともに他のサイトカイン等を導入することもできる。溶媒等を用いる場合の前記リンパ球の濃度は、肝障害の種類等に応じて適宜設定することができる。
【００３８】
リンパ球の導入量（１回当たり）は、肝臓に到達・残留するのに十分な量を導入すれば良い。一般的には、成人（約60kg）では105〜1010個程度、特に106〜109個とすることが望ましい。
【００３９】
前記リンパ球の導入は、１回でも良いし、必要により２回以上実施することもできる。２回以上行う場合には、例えば週１回のリンパ球導入を１クールとし、これを数回にわたり実施することも可能である。これらのスケジュールは、肝障害の種類、進行状況等に応じて適宜設定することができる。
【００４０】
第２工程で静脈等から導入されたリンパ球は、そのほとんどが生理的な機序により所定の臓器（例えば、肝臓、脾臓、肺等）に捕らえられる。リンパ球の一部は、他の臓器にも到達するが、他の臓器は肝臓と比べて抗原と遭遇する機会が極めて乏しいため、通常はアポトーシスにより淘汰されることとなる。
【００４１】
第３工程
第３工程では、前記哺乳動物に１）前記抗原そのもの及び／又は２）前記抗原と等しい抗原活性を有する物質を経口投与することにより、第２工程で導入された前記リンパ球を抗原刺激し、肝臓組織内においてCD4+FasL+免疫調節性T細胞を誘導する。
【００４２】
前記リンパ球が導入された哺乳動物に対して１）前記抗原そのもの及び／又は２）前記抗原と等しい抗原活性を有する物質を経口から投与する。前記抗原と等しい抗原活性を有する物質としては、第２工程で導入された前記リンパ球を抗原刺激し、肝臓組織内においてCD4+FasL+免疫調節性T細胞を誘導するものであれば特に限定されず、抗原自体と同様の抗原活性を有するものを適宜選別して使用することができる。
【００４３】
経口投与に際して、前記リンパ球の導入（複数回にわたって導入した場合は最後の導入時）から経口投与（最初の経口投与時）までの時間は、例えば肝障害の種類、患者の体質等により異なるが、一般的には24〜48時間程度とすれば良い。
【００４４】
経口投与する場合の１）前記抗原そのもの及び／又は２）前記抗原と等しい抗原活性を有する物質（以下、１）２）を総称して「特定抗原」という。）の投与量は、特定抗原の種類等にもよるが、通常は成人（約60kg程度）で１日当たり1〜100g程度の範囲内で適宜設定することができる。投与量は、肝障害の進行度合等に応じて適宜投与量を変更することができる。
【００４５】
投与期間・投与間隔は、肝障害の進行を十分に抑制できるように設定すれば良い。例えば、毎日であっても良いし、１日おき又は２日以上おきに1〜12ヶ月間継続投与することもできる。
【００４６】
また、経口投与（経口摂取）する場合は、公知の方法に従って前記抗原を製剤化することができる。例えば、錠剤、カプセル剤、懸濁液、水薬等が挙げられる。この場合、必要に応じて、結合剤、賦形剤、香料、甘味料、希釈剤、着色剤等の公知の添加剤を配合することもできる。
【００４７】
＜作用＞
本発明では、抗原特異的なリンパ球を体内に移入した後、別途に経口投与された特定抗原が肝臓に到達することにより、CD4+FasL+免疫調節性T細胞が肝臓組織内に出現する。
【００４８】
より具体的には、抗原特異的なリンパ球の存在下において、当該抗原が経口投与された場合、特定抗原が肝臓に到達し、肝類洞のCD11c陽性細胞により抗原が提示される。そして、移入されたT細胞が特定抗原により刺激されてFasLを表出したCD4陽性細胞が肝臓内に出現する。このときINF-γを産生するCD4陽性細胞は死滅し、IL-10、IL-4、TGF-β等を産生するCD4陽性細胞が生き残る。その結果、CD4+FasL+免疫調節性T細胞は、これらのサイトカインを分泌するとともに、またFasリガンドの作用により、肝炎等の肝障害を効果的に抑制し、ひいては肝硬変、肝臓癌等への進行を未然に防止することができる。
【実施例】
【００４９】
以下に実施例を示し、本発明の特徴とするところをよりいっそう明確にする。ただし、本発明の範囲は、実施例に限定されるものではない。
【００５０】
＜実験手順＞
ａ．実験動物
BALB/cマウスは静岡実験動物研究会（浜松市）から購入した。オバルブミン（OVA）323-329ペプチドフラグメントのためのトランスジェニックCD4+T細胞レセプターを有するD11.10マウスは、KM Murphyより提供されたものを使用した（ワシントン大学医学部 病理・免疫学部）[Murphy KM, Heimberger AB, Loh DY. Induction by antigen of intrathymic apoptosis of CD4+CD8+TCRlo thymocytes in vivo. Science 1990;250:1720-3]。
【００５１】
ｂ．OVA特異的な肝炎の誘導
OVA特異的な肝炎の誘導をNishimura T, Ohta A. A crinical role for antigen-specific Th1 cells in acute liver injury in mice. J.Immunol 1999;162:6503-9の記載に従って実施した。50mg/mlのOVA(Sigma社製)とCoatsome EL-01-A（日本油脂株式会社製）を混合することにより、OVA入りリポソーム抱合体を調製した。生後８週間のDO11.10マウスに一日おきに100mgのOVA又はPBS(リン酸塩緩衝液、Phosphate-buffered saline)を合計５回経口投与した。最後の投与から3日後にOVAリポソーム液を0.2ml静脈注射により投与した。この投与から48時間後にマウスを屠殺し、血清中のアスパルタートアミノトランスフェラーゼ(AST)とアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)の濃度をトランスアミラーゼC2キット（和光純薬工業株式会社製）により測定した。
【００５２】
ｃ．コンカナバリンＡ（Concanavalin A(Con-A)）による肝炎の誘導
前記ｂと同じ生後8週間のDO11.10マウスに一日おきに100mgのOVA又はPBS(リン酸塩緩衝液、Phosphate-buffered saline)を合計5回経口投与した。最後の投与から3日後にCon-Aを0.2ml静脈注射により投与した。この投与から16時間後にマウスを屠殺し、血清中のアスパルタートアミノトランスフェラーゼ(AST)及びアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)の濃度をトランスアミラーゼC2キット（和光純薬工業株式会社製）により測定した。
【００５３】
ｄ．養子移入後のCon-Aによる肝炎の誘導
生後8週間のBALB/cマウスに対し、DO11.10マウスから精製された4.7×107個の脾細胞（OVA特異的なCD4+T細胞を4.5×106個含む。）を養子移入した。前記細胞の調製及び移入は、後記ｅ〜ｆに従って実施した。
【００５４】
移入から3日経過した後、これらの移植を受けたマウスに100mgのOVA又はPBS を１日おきに合計５回投与した。このうちいくつかは、DO11.10マウスが上記のように経口により免疫された。最後の投与より３日後、Tiegs et al. に記載されているように2mg/ml のCon-A( Sigma) を0.2ml静脈注射で投与した。投与から16時間後にマウスを屠殺した。
【００５５】
ｅ．肝特異的CD4+T細胞の精製及び養子移入
AutoMACS (Miltenyi Biotech社製)を用いてポジティブセレクション及びネガティブセレクションをそれぞれ行うことにより、肝臓及び脾臓からCD4陽性細胞とCD4陰性細胞をそれぞれ精製した。この方法による純度は90%を超えた。BALB/cマウスにこの細胞の一部（各マウスにつき5×105個）を養子移入した。
【００５６】
ｆ．肝臓内リンパ細胞（IHLs）及び脾細胞の分離
IHLsは、前記Watanabe T et al. (2002) に従って調製した。すなわち、門脈から5mlのPBSを肝臓に灌流した後、0.05%のコラゲナーゼと0.002%のDNA分解酵素（Nacakai tesque社製）を含む無血清のRPMI（Rosewell Park Memorial Institute, 細胞培養液）の中で細胞懸濁液を37℃で40分間消化した。肝細胞は、300rpmで3分間の遠心分離により除去した。メトリザマイド24%を使用し、2000rpmで 20分間の密度勾配遠心分離法によって、IHLsをインターフェースにて採取した。
【００５７】
脾細胞は、Kruisbeek AM. Preparation of cell suspension from spleen, thymus, and lymph node. In: Coligan JE, Kruisbbeek AM, Margulies DH, Shevach EM, Stronger W, eds. Current protocols in Immunology. New York: John Wiery & Sons; 1993. p.3.1.3. に記載の方法に従って調製した。
【００５８】
ｇ．増殖及びサイトカインアッセイ
ConA又はOVA-リポソーム投与を受けたマウスからIHLs及び脾細胞を調製した（前記ｆ）。これらの細胞(1×105/ウェル)は、U字ボトム96ウェル培養プレート（住友ベークライト社製）において、1μg/ml のOVA 323-339ペプチド又は抗CD3抗体(Pharmingen社製)で刺激した。細胞を７２時間培養し、最後の16時間で１μCiの[3H]チミジンを加えた。多検体型細胞採収装置にて細胞を採取した。その後、トップカウントミクロ平板シンチレーション計数機(Packard社製)により、導入チミジン量の測定を行った。培養の上清にみられるIFNγ及びIL-4の分泌は、酵素結合免疫吸収剤検定法(ELISA)により測定した。IFN-γ及びIL-4においては、捕獲及びビオチン化抗体はそれぞれPharmigen社製及びEndogen社製のものを使用した。Petrotec社製の組み替えIFN-γとIL-4とをELISA法のアッセイスタンダードとして用いた。
【００５９】
ｈ．分析
肝臓組織を10%のbuffer formalin phosphate中に固定し、パラフィンに浸けた。その後、試験片を作成し、ヘマトキシリン・エオシン法(H&E)にて染色した。脱パラフィン化した試験片のアポトーシスよる肝細胞死は、アポTACS-DAB In Situ アポトーシス検出キット(Trevingen, Gaithersburg, MD)を用いたTUNEL法（断片化したDNAのターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによるdUTP-ビオチンの末端標識化）にて評価した。
【００６０】
＜参考例１＞
OVA投与されたDO11.10マウスに抗原を経口投与するとCD4+調節T細胞が肝臓に出現することが前記Watanabe T, et al. Administration of an antigen at a high dose generates regulatory CD4+ T cells expressing CD95 ligand and secreting IL-4 in the liver. J Immunol 2002;168(5):2188-99に記載されている。
【００６１】
参考例１では、CD4+調節T細胞が抗原特異的な肝障害の進行を抑制するかどうかを調べた。そのために、前記ｂに示す手順に従い、OVA を含むリポソームを静脈注射することによって得られるOVA特異的肝炎モデルマウスを使用して肝障害の抑制効果を調べた。
【００６２】
図１には、OVAを投与されたDO11.10マウスのOVA特異的肝炎の進行の抑制効果を示す。 (A)は、血清中のAST及びALTのレベルを示す。(B)は、肝臓標本のH&E染色した結果である。PBSを投与したマウスの肝臓の門脈周辺において単核細胞の顕著な浸潤が認められた（矢印部分）。(C)は、IHLs及び脾細胞における増殖反応、IFN-γ及びIL-4分泌のレベルを示す。これらの測定は、前記ｆ及びｇの方法に従った。その結果を平均±SDで示す。これらは、２つの独立した実験結果として示す。
【００６３】
図１Ａ及びＢに示されているように、PBS投与を受けたDO11.10マウスへのOVAリポソームの接種により、血清中でのAST 及びALTの顕著な上昇のほか、肝臓中の門脈周囲領域の単核細胞の浸潤が広範囲にわたり引き起こされた。これに対し、OVA投与を受けた後にOVAリポソームの接種を受けたDO11.10マウスでは、血清トランスアミジナーゼ及び細胞浸潤は認められなかった。このように、OVAリポソーム接種前にOVA経口投与することにより、ほぼ完全に肝障害の進行を阻止できることがわかる。
【００６４】
図１Ｃには、これらのマウスから精製したIHLs肝臓内リンパ細胞のサイトカイン産生について評価した結果を示す。図１Ｃに示すように、OVA経口投与されたマウスのIHLsでは、OVAペプチドに特異的な増殖反応又は抗CD3抗体に特異的な増殖反応が著しく抑制されていた。また、IFN-γ分泌の顕著な抑制とIL-4の顕著な増加とが認められた。このような変化は、脾臓では認められなかった。これにより、OVAの経口投与によってOVA特異的な肝炎の進行を抑制できることがわかる。
【００６５】
＜参考例２＞
OVA投与を受けたマウスの肝臓にあるCD4＋調節T細胞は、抗原非特異的にT細胞の増殖を抑制する（前出Watanabe et al.,2002）。また、前記のように、OVA経口投与を受けたマウスのIHLsの増殖反応も抗原非特異的に抑制された。
【００６６】
参考例２では、DO11.10マウスに対してなされたOVA経口投与が、Con-Aにより誘導された抗原非特異的な肝炎の進行を抑制できるかどうか調べた。これは、前記ｃの手順に従って行った。
【００６７】
図２には、OVAを投与されたDO11.10マウスのCon-A特異的肝炎の進行の抑制効果を示す。 (A)は、血清中におけるAST及びALTのレベルを示す。(B)は、肝臓標本をH&E染色及びTUNEL法による観察結果である。PBSを投与したマウスの肝臓標本のTUNEL法による観察結果によれば、肝細胞死による多数の病巣が確認された（矢印部分）。(C)は、IHLs及び脾細胞における増殖反応、IFN-γ分泌及びIL-4分泌のレベルを示す。これらの測定は、前記ｆ及びｇの方法に従った。その結果を平均±SDで示す。これらは、２つの独立した実験結果として示す。
【００６８】
図２Ａ及びＢに示すように、Con-Aの接種前のOVA経口投与により、血清でのALT及びASTの上昇を大幅に抑制した。PBSの経口投与を受けたマウスの肝臓では、肝細胞の大量死がH&E染色又はTUNEL法により確認された。これに対し、OVA経口投与を受けたマウスの肝臓では、TUNEL+細胞は僅かしか認められなかった。このことから、組織学的にも肝炎による肝細胞障害が阻止できることがわかる。
【００６９】
図２Ｃに示すように、OVA経口投与を受けたマウスでは、IHLsによる増殖反応とIFN-γの分泌は著しく減少するとともにIL-4分泌の増加が認められた。このように、Con-Aにより誘導される肝炎は、OVAの経口投与により抑制できることがわかる。
【００７０】
＜参考例３＞
参考例３では、肝臓へのCD4+T細胞の養子移入によってCon-A誘発肝炎を抑えることができるかどうかを調べた。OVA経口投与を受けたDO11.10マウスの肝臓及び脾臓からCD4+T細胞を精製し、BALB/cマウスに移入した後、Con-A接種を行った。これは、前記ｄの手順に従って行った。
【００７１】
図３には、OVAを投与したDO11.10マウスからCD4+T細胞を受けたBALB/cマウスのCon-A誘導肝炎の進行を抑制することを示す。 (A)は、血清中のAST及びALTのレベルを示す。(B)は、肝臓標本のH&E染色及びTUNEL法による観察結果である。PBSを投与したDO11.10マウスからCD4+T肝細胞を移入したマウスにおける肝臓標本のTUNEL法による結果によれば、肝細胞死による多数の病巣が確認された（矢印部分）。(C)は、IHLs及び脾細胞における増殖反応、IFN-γ分泌及びIL-4分泌のレベルを示す。これらの測定は、前記ｆ及びｇの方法に従った。その結果を平均±SDで示す。これらは、２つの独立した実験結果として示す。
【００７２】
図３Ａ及びＢに示すように、OVA経口投与を受けたDO11.10マウスの肝臓のCD4+T細胞を受けたBALB/cマウスにおいてのみCon-A誘発肝炎が著しく抑えられていた。他のグループのマウスには、血清中のAST とALTの上昇と肝細胞の大量死とが観察された。養子移入したCD4+調節T細胞による抑制効果は、局所のTh2反応と関連していた。
【００７３】
図３Ｃに示すように、OVA経口投与されたDO11.10マウスの肝臓のCD4+T細胞を受けたマウスのみIFN-γ分泌及び増殖反応の顕著な抑制が観察された。これに対し、IHLsによるIL-4分泌は著しく増加した。これらの抑制効果は、CD4陰性細胞を養子移入した後にCon-A接種を受けたマウスには見られなかった。
【００７４】
＜実施例１＞
本発明者は、DO11.10マウスを用い、OVA経口投与することによりOVA特異的ナイーブCD4+T細胞がFasL+調節T細胞に分化することを先に示している。
【００７５】
実施例１では、OVAの経口投与により、一定量のOVA特異的CD4+T細胞が存在する場合にCon-A誘導肝炎の進行を抑制できるかどうか調べた。DO11.10マウスは、前記ｂに準じてPBS又はOVAを一日おきに５回与えられた。次いで、前記ｅに従って、BALB/cマウスに対し、DO11.10マウスから精製された4.7×107脾細胞（OVA特異的CD4+細胞を4.5×106含む）を養子移入した。この移入から3日後にこれらのマウスに2mg/mlのCon-Aを0.2ml静脈より接種した。Con-A接種から16時間後にマウスを屠殺した。
【００７６】
図４には、ナイーブDO11.10マウスからOVA特異的CD4+T細胞を移入され、OVAが経口投与されたBALB/cマウスにおいて、Con-Aにより誘導された肝炎の進行の抑制効果を示す。 (A)は、AST及びALTの血清レベルを示す。(B)は、肝臓標本のH&E染色及びTUNNEL 法による観察結果を示す。PBSが投与されたマウスの肝臓標本の多数の領域でリンパ細胞死が認められた。(C)は、IHLs及び脾細胞における増殖反応、IFN-γ及びIL-4のレベルを示す。これらの測定は、前記ｆ及びｇの方法に従った。結果は、平均±SDとして示す。これらは、独立した実験結果として示す。
【００７７】
図４Ａ及びＢに示すように、OVAの経口投与によりAST とALTの上昇を抑制するとともに、肝細胞の大量死が抑制されていることがわかる。
【００７８】
図４Ｃに示すように、OVA特異的CD4+T細胞を移入された後、OVAを経口投与したマウスでは、IFN-γ分泌及び増殖反応の抑制とともに、IL-4の分泌増加が確認された。
【００７９】
このように、特定の抗原（ここではOVA）に特異的なCD4+T細胞を移入した後、その抗原を経口から摂取することによって、前記抗原と異なる抗原による肝炎（すなわち、Con-Aにより誘導された肝炎）も抑制できることがわかる。すなわち、特定抗原のの経口投与によってCD4+調節T細胞を発生させ、この細胞が抗原非特異的に肝障害の発生を抑制できることがわかる。
【００８０】
これらの結果より、予め患者の末梢血からリンパ球を採取し、抗原特異的なＴ細胞をin vitroで作成した後、これを患者の体内に戻し、さらに前記と同様の抗原を食することにより、肝炎等の治療又は予防が可能となることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１は、OVAを投与されたDO11.10マウスのOVA特異的肝炎の進行の抑制を示す。 (A)は、AST及びALTの血清レベルを示す。(B)は、肝臓標本のH&E染色した結果である。(C)は、IHLs及び脾細胞における増殖反応、IFN-γ分泌及びIL-4分泌のレベルを示す。
【図２】図２は、OVAを投与されたDO11.10マウスのCon-A特異的肝炎の進行の抑制を示す。 (A)は、血清中のAST及びALTのレベルを示す。(B)は、肝臓標本のH&E染色及びTUNEL法による観察結果である。(C)は、IHLs及び脾細胞における増殖反応、IFN-γ分泌及びIL-4分泌のレベルを示す。
【図３】図３は、OVAを投与したDO11.10マウスからCD4+T細胞を受けたBALB/cマウスのCon-A誘導肝炎の進行を抑制することを示す。 (A)は、血清中のAST及びALTのレベルを示す。(B)は、肝臓標本のH&E染色及びTUNEL法による観察結果である。(C)は、IHLs及び脾細胞における増殖反応、IFN-γ分泌及びIL-4分泌のレベルを示す。
【図４】図４は、ナイーブDO11.10マウスからOVA特異的CD4+T細胞を移入され、OVAが経口投与されたBALB/cマウスにおいて、Con-Aにより誘導された肝炎の進行を抑制することを示す。 (A)は、血清中のAST及びALTのレベルを示す。(B)は、肝臓標本のH&E染色及びTUNEL 法による観察結果を示す。(C)は、IHLs及び脾細胞の増殖反応、IFN-γ分泌及びIL-4分泌のレベルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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