(57)【要約】      （修正有）【課題】L-ビニルグリシン誘導体又はその塩を製造する新たな方法、及び、L-ビニルグリシン誘導体又はその塩を分解する新たな方法及びこの方法を利用してラセミ体のビニルグリシン誘導体又はその塩からD-ビニルグリシン誘導体又はその塩を回収する方法、並びに、これらの方法に有用な触媒剤、分解剤、及びキットなどを提供すること。【解決手段】好熱菌Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ由来のL-フェニルアラニンからL-グルタミン酸を生成する酵素活性及びL-ロイシンからL-グルタミン酸を生成する酵素活性がともに３０Ｕ／ｍｇ以上であるアミノトランスフェラーゼは、ビニルグリオキシル酸誘導体からL-ビニルグリシン誘導体への反応を触媒する触媒剤、L-ビニルグリシン誘導体を分解する分解剤、ラセミ体のビニルグリシン誘導体からD-ビニルグリシン誘導体の回収に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式(Ｉ)で表されるビニルグリオキシル酸誘導体又はその塩に、配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列との相同性が４０％以上であり、かつ、L-フェニルアラニンからL-グルタル酸を生成する酵素活性及びL-ロイシンからL-グルタミン酸を生成する酵素活性がともに３０Ｕ／ｍｇ以上であるアミノトランスフェラーゼを作用させることを特徴とする一般式(II)で表されるL-ビニルグリシン誘導体又はその塩の製造方法。
（ここで、それぞれの酵素活性の測定は、４０ｍＭの２-オキソグルタル酸、０．５ｍＭのピリドキサールリン酸、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、および４０ｍＭのL-フェニルアラニンまたはL-ロイシンを含む反応液１９０μｌに、アミノトランスフェラーゼ溶液（０．０５μｇ/μｌ）を１０μｌ加えて酵素反応を行った後、生成したL-グルタミン酸を定量することにより行うものとする。また、１Ｕは１分間に１μmolのL-グルタミン酸を生成する酵素量を示す。）
【化１】
2007295865.tif 000030
【化２】
2007295865.tif 000031
（式(Ｉ)及び(II)中、Ｒ１はＣＲ２Ｒ３であり、Ｒ２及びＲ３は水素、炭素、酸素、窒素、及び硫黄からなるグループから選ばれる１つ以上から構成される原子または基である。）
【請求項２】
アミノトランスフェラーゼが、疎水性アミノ酸アミノトランスフェラーゼ又は芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼであることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
アミノトランスフェラーゼが、配列番号１〜１１のいずれかに示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
前記Ｒ２又はＲ３が、一般式(III)で表される基であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【化３】
2007295865.tif 000032
（式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８はそれぞれ独立に水素、ハロゲン、アルキル基、シクロアルキル基、ハロゲノアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシル基、アルコキシアルキル基、アリール基、ニトロ基、アミノ基、アミノアルキル基、シアノ基、アセチルアミノ基、カルボキシル基、カルボキシアルキル基、メルカプト基、メルカプトアルキル基、アルキルチオ基、アルキルチオアルキル基、ヒドロキシル基、またはヒドロキシアルキル基を示す。ここで、Ｒ４〜Ｒ８において隣接する基がそれぞれ結合して３−７個の炭素、酸素、窒素、または硫黄を含む炭素環または複素環を形成してもよい。）
【請求項５】
ビニルグリオキシル酸誘導体又はその塩に転移するアミノ基がL-アミノ酸から供与されることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
一般式(II)で表されるL-ビニルグリシン誘導体又はその塩に、配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列との相同性が４０％以上であり、かつ、L-フェニルアラニンからL-グルタル酸を生成する酵素活性及びL-ロイシンからL-グルタミン酸を生成する酵素活性がともに３０Ｕ／ｍｇ以上であるアミノトランスフェラーゼを作用させることを特徴とする一般式(II)で表されるL-ビニルグリシン誘導体又はその塩の分解方法。
（ここで、それぞれの酵素活性の測定は、４０ｍＭの２-オキソグルタル酸、０．５ｍＭのピリドキサールリン酸、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、および４０ｍＭのL-フェニルアラニンまたはL-ロイシンを含む反応液１９０μｌに、アミノトランスフェラーゼ溶液（０．０５μｇ/μｌ）を１０μｌ加えて酵素反応を行った後、生成したL-グルタミン酸を定量することにより行うものとする。また、１Ｕは１分間に１μmolのL-グルタミン酸を生成する酵素量を示す。）
【化４】
2007295865.tif 000033
（式中、Ｒ１はＣＲ２Ｒ３であり、Ｒ２及びＲ３は水素、炭素、酸素、窒素、及び硫黄からなるグループから選ばれる１つ以上から構成される原子または基である。）
【請求項７】
アミノトランスフェラーゼが、疎水性アミノ酸アミノトランスフェラーゼ又は芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼであることを特徴とする請求項６に記載の分解方法。
【請求項８】
アミノトランスフェラーゼが、配列番号１〜１１のいずれかに示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項６に記載の分解方法。
【請求項９】
Ｒ２又はＲ３が、下記の一般式(III)で表される基であることを特徴とする請求項６〜８のいずれかに記載の分解方法。
【化５】
2007295865.tif 000034
（式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８はそれぞれ独立に水素、ハロゲン、アルキル基、シクロアルキル基、ハロゲノアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシル基、アルコキシアルキル基、アリール基、ニトロ基、アミノ基、アミノアルキル基、シアノ基、アセチルアミノ基、カルボキシル基、カルボキシアルキル基、メルカプト基、メルカプトアルキル基、アルキルチオ基、アルキルチオアルキル基、ヒドロキシル基、またはヒドロキシアルキル基を示す。ここで、Ｒ４〜Ｒ８において隣接する基がそれぞれ結合して３−７個の炭素、酸素、窒素、または硫黄を含む炭素環または複素環を形成してもよい。）
【請求項１０】
一般式(IV)で表されるビニルグリシン誘導体又はその塩と、配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列との相同性が４０％以上であり、かつ、L-フェニルアラニンからL-グルタル酸を生成する酵素活性及びL-ロイシンからL-グルタミン酸を生成する酵素活性がともに３０Ｕ／ｍｇ以上であるアミノトランスフェラーゼとを反応させることにより生成する一般式(Ｉ)で表されるビニルグリオキシル酸誘導体又はその塩を除去することを特徴とする、一般式(Ｖ)で表されるD-ビニルグリシン誘導体又はその塩の回収方法。
（ここで、それぞれの酵素活性の測定は、４０ｍＭの２-オキソグルタル酸、０．５ｍＭのピリドキサールリン酸、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、および４０ｍＭのL-フェニルアラニンまたはL-ロイシンを含む反応液１９０μｌに、アミノトランスフェラーゼ溶液（０．０５μｇ/μｌ）を１０μｌ加えて酵素反応を行った後、生成したL-グルタミン酸を定量することにより行うものとする。また、１Ｕは１分間に１μmolのL-グルタミン酸を生成する酵素量を示す。）
【化６】
2007295865.tif 000035
【化７】
2007295865.tif 000036
【化８】
2007295865.tif 000037
（式(IV)及び(Ｖ)中、Ｒ１はＣＲ２Ｒ３であり、Ｒ２及びＲ３は水素、炭素、酸素、窒素、及び硫黄からなるグループから選ばれる１つ以上から構成される原子または基である。）
【請求項１１】
アミノトランスフェラーゼが、疎水性アミノ酸アミノトランスフェラーゼ又は芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼであることを特徴とする請求項１０に記載の回収方法。
【請求項１２】
アミノトランスフェラーゼが、配列番号１〜１１のいずれかに示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１０に記載の回収方法。
【請求項１３】
Ｒ２又はＲ３が、下記の一般式(III)で表される基であることを特徴とする請求項１０〜１２のいずれかに記載の回収方法。
【化９】
2007295865.tif 000038
（式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８はそれぞれ独立に水素、ハロゲン、アルキル基、シクロアルキル基、ハロゲノアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシル基、アルコキシアルキル基、アリール基、ニトロ基、アミノ基、アミノアルキル基、シアノ基、アセチルアミノ基、カルボキシル基、カルボキシアルキル基、メルカプト基、メルカプトアルキル基、アルキルチオ基、アルキルチオアルキル基、ヒドロキシル基、またはヒドロキシアルキル基を示す。ここで、Ｒ４〜Ｒ８において隣接する基がそれぞれ結合して３−７個の炭素、酸素、窒素、または硫黄を含む炭素環または複素環を形成してもよい。）
【請求項１４】
一般式(Ｉ)で表されるビニルグリオキシル酸誘導体又はその塩から、一般式(II)で表されるL-ビニルグリシン誘導体又はその塩への反応を触媒する触媒剤であって、配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列との相同性が４０％以上であり、かつ、L-フェニルアラニンからL-グルタル酸を生成する酵素活性及びL-ロイシンからL-グルタミン酸を生成する酵素活性がともに３０Ｕ／ｍｇ以上であるアミノトランスフェラーゼを有効成分として含有することを特徴とする触媒剤。
（ここで、それぞれの酵素活性の測定は、４０ｍＭの２-オキソグルタル酸、０．５ｍＭのピリドキサールリン酸、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、および４０ｍＭのL-フェニルアラニンまたはL-ロイシンを含む反応液１９０μｌに、アミノトランスフェラーゼ溶液（０．０５μｇ/μｌ）を１０μｌ加えて酵素反応を行った後、生成したL-グルタミン酸を定量することにより行うものとする。また、１Ｕは１分間に１μmolのL-グルタミン酸を生成する酵素量を示す。）
【化１０】
2007295865.tif 000039
【化１１】
2007295865.tif 000040
（式(Ｉ)及び(II)中、Ｒ１はＣＲ２Ｒ３であり、Ｒ２及びＲ３は水素、炭素、酸素、窒素、及び硫黄からなるグループから選ばれる１つ以上から構成される原子または基である。）
【請求項１５】
アミノトランスフェラーゼが、疎水性アミノ酸アミノトランスフェラーゼ又は芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼであることを特徴とする請求項１４に記載の触媒剤。
【請求項１６】
アミノトランスフェラーゼが、配列番号１〜１１のいずれかに示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１４に記載の触媒剤。
【請求項１７】
Ｒ２又はＲ３が、一般式(III)で表される基であることを特徴とする請求項１４〜１６のいずれかに記載の触媒剤。
【化１２】
2007295865.tif 000041
（式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８はそれぞれ独立に水素、ハロゲン、アルキル基、シクロアルキル基、ハロゲノアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシル基、アルコキシアルキル基、アリール基、ニトロ基、アミノ基、アミノアルキル基、シアノ基、アセチルアミノ基、カルボキシル基、カルボキシアルキル基、メルカプト基、メルカプトアルキル基、アルキルチオ基、アルキルチオアルキル基、ヒドロキシル基、またはヒドロキシアルキル基を示す。ここで、Ｒ４〜Ｒ８において隣接する基がそれぞれ結合して３−７個の炭素、酸素、窒素、または硫黄を含む炭素環または複素環を形成してもよい。）
【請求項１８】
ビニルグリオキシル酸誘導体又はその塩に転移するアミノ基がL-アミノ酸から供与されることを特徴とする請求項１４〜１７のいずれかに記載の触媒剤。
【請求項１９】
一般式(II)で表されるL-ビニルグリシン誘導体又はその塩を分解する分解剤であって、配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列との相同性が４０％以上であり、かつ、L-フェニルアラニンからL-グルタル酸を生成する酵素活性及びL-ロイシンからL-グルタミン酸を生成する酵素活性がともに３０Ｕ／ｍｇ以上であるアミノトランスフェラーゼを有効成分として含有することを特徴とする分解剤。
（ここで、それぞれの酵素活性の測定は、４０ｍＭの２-オキソグルタル酸、０．５ｍＭのピリドキサールリン酸、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、および４０ｍＭのL-フェニルアラニンまたはL-ロイシンを含む反応液１９０μｌに、アミノトランスフェラーゼ溶液（０．０５μｇ/μｌ）を１０μｌ加えて酵素反応を行った後、生成したL-グルタミン酸を定量することにより行うものとする。また、１Ｕは１分間に１μmolのL-グルタミン酸を生成する酵素量を示す。）
【化１３】
2007295865.tif 000042
（式中、Ｒ１はＣＲ２Ｒ３であり、Ｒ２及びＲ３は水素、炭素、酸素、窒素、及び硫黄からなるグループから選ばれる１つ以上から構成される原子または基である。）
【請求項２０】
アミノトランスフェラーゼが、疎水性アミノ酸アミノトランスフェラーゼ又は芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼであることを特徴とする請求項１９に記載の分解剤。
【請求項２１】
アミノトランスフェラーゼが、配列番号１〜１１のいずれかに示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１９に記載の分解剤。
【請求項２２】
Ｒ２又はＲ３が、一般式(III)で表される基であることを特徴とする請求項１９〜２１のいずれかに記載の分解剤。
【化１４】
2007295865.tif 000043
（式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８はそれぞれ独立に水素、ハロゲン、アルキル基、シクロアルキル基、ハロゲノアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシル基、アルコキシアルキル基、アリール基、ニトロ基、アミノ基、アミノアルキル基、シアノ基、アセチルアミノ基、カルボキシル基、カルボキシアルキル基、メルカプト基、メルカプトアルキル基、アルキルチオ基、アルキルチオアルキル基、ヒドロキシル基、またはヒドロキシアルキル基を示す。ここで、Ｒ４〜Ｒ８において隣接する基がそれぞれ結合して３−７個の炭素、酸素、窒素、または硫黄を含む炭素環または複素環を形成してもよい。）
【請求項２３】
一般式(Ｉ)で表されるビニルグリオキシル酸誘導体又はその塩から、一般式(II)で表されるL-ビニルグリシン誘導体又はその塩を製造するためのキットであって、配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列との相同性が４０％以上であり、かつ、L-フェニルアラニンからL-グルタル酸を生成する酵素活性及びL-ロイシンからL-グルタミン酸を生成する酵素活性がともに３０Ｕ／ｍｇ以上であるアミノトランスフェラーゼと、L-アミノ酸又はその塩とを含むことを特徴とするキット。
（ここで、それぞれの酵素活性の測定は、４０ｍＭの２-オキソグルタル酸、０．５ｍＭのピリドキサールリン酸、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、および４０ｍＭのL-フェニルアラニンまたはL-ロイシンを含む反応液１９０μｌに、アミノトランスフェラーゼ溶液（０．０５μｇ/μｌ）を１０μｌ加えて酵素反応を行った後、生成したL-グルタミン酸を定量することにより行うものとする。また、１Ｕは１分間に１μmolのL-グルタミン酸を生成する酵素量を示す。）
【化１５】
2007295865.tif 000044
【化１６】
2007295865.tif 000045
（式(Ｉ)及び(II)中、Ｒ１はＣＲ２Ｒ３であり、Ｒ２及びＲ３は水素、炭素、酸素、窒素、及び硫黄からなるグループから選ばれる１つ以上から構成される原子または基である。）
【請求項２４】
アミノトランスフェラーゼが、疎水性アミノ酸アミノトランスフェラーゼ又は芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼであることを特徴とする請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
アミノトランスフェラーゼが、配列番号１〜１１のいずれかに示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項２３に記載のキット。
【請求項２６】
Ｒ２又はＲ３が、一般式(III)で表される基であることを特徴とする請求項２３〜２５のいずれかに記載のキット。
【化１７】
2007295865.tif 000046
（式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８はそれぞれ独立に水素、ハロゲン、アルキル基、シクロアルキル基、ハロゲノアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシル基、アルコキシアルキル基、アリール基、ニトロ基、アミノ基、アミノアルキル基、シアノ基、アセチルアミノ基、カルボキシル基、カルボキシアルキル基、メルカプト基、メルカプトアルキル基、アルキルチオ基、アルキルチオアルキル基、ヒドロキシル基、またはヒドロキシアルキル基を示す。ここで、Ｒ４〜Ｒ８において隣接する基がそれぞれ結合して３−７個の炭素、酸素、窒素、または硫黄を含む炭素環または複素環を形成してもよい。）
【請求項２７】
一般式(II)で表されるL-ビニルグリシン誘導体又はその塩を分解するためのキットであって、配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列との相同性が４０％以上であり、かつ、L-フェニルアラニンからL-グルタル酸を生成する酵素活性及びL-ロイシンからL-グルタミン酸を生成する酵素活性がともに３０Ｕ／ｍｇ以上であるアミノトランスフェラーゼと、ケト酸又はその塩とを含むことを特徴とするキット。
（ここで、それぞれの酵素活性の測定は、４０ｍＭの２-オキソグルタル酸、０．５ｍＭのピリドキサールリン酸、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、および４０ｍＭのL-フェニルアラニンまたはL-ロイシンを含む反応液１９０μｌに、アミノトランスフェラーゼ溶液（０．０５μｇ/μｌ）を１０μｌ加えて酵素反応を行った後、生成したL-グルタミン酸を定量することにより行うものとする。また、１Ｕは１分間に１μmolのL-グルタミン酸を生成する酵素量を示す。）
【化１８】
2007295865.tif 000047
（式中、Ｒ１はＣＲ２Ｒ３であり、Ｒ２及びＲ３は水素、炭素、酸素、窒素、及び硫黄からなるグループから選ばれる１つ以上から構成される原子または基である。）
【請求項２８】
アミノトランスフェラーゼが、疎水性アミノ酸アミノトランスフェラーゼ又は芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼであることを特徴とする請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
アミノトランスフェラーゼが、配列番号１〜１１のいずれかに示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項２７に記載のキット。
【請求項３０】
Ｒ２又はＲ３が、一般式(III)で表される基であることを特徴とする請求項２７〜２９のいずれかに記載のキット。
【化１９】
2007295865.tif 000048
（式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８はそれぞれ独立に水素、ハロゲン、アルキル基、シクロアルキル基、ハロゲノアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシル基、アルコキシアルキル基、アリール基、ニトロ基、アミノ基、アミノアルキル基、シアノ基、アセチルアミノ基、カルボキシル基、カルボキシアルキル基、メルカプト基、メルカプトアルキル基、アルキルチオ基、アルキルチオアルキル基、ヒドロキシル基、またはヒドロキシアルキル基を示す。ここで、Ｒ４〜Ｒ８において隣接する基がそれぞれ結合して３−７個の炭素、酸素、窒素、または硫黄を含む炭素環または複素環を形成してもよい。）
【請求項３１】
一般式(IV)で表されるビニルグリシン誘導体又はその塩から、一般式(Ｖ)で表されるD-ビニルグリシン誘導体又はその塩を回収するためのキットであって、配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列との相同性が４０％以上であり、かつ、L-フェニルアラニンからL-グルタル酸を生成する酵素活性及びL-ロイシンからL-グルタミン酸を生成する酵素活性がともに３０Ｕ／ｍｇ以上であるアミノトランスフェラーゼと、ケト酸又はその塩とを含むことを特徴とするキット。
（ここで、それぞれの酵素活性の測定は、４０ｍＭの２-オキソグルタル酸、０．５ｍＭのピリドキサールリン酸、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、および４０ｍＭのL-フェニルアラニンまたはL-ロイシンを含む反応液１９０μｌに、アミノトランスフェラーゼ溶液（０．０５μｇ/μｌ）を１０μｌ加えて酵素反応を行った後、生成したL-グルタミン酸を定量することにより行うものとする。また、１Ｕは１分間に１μmolのL-グルタミン酸を生成する酵素量を示す。）
【化２０】
2007295865.tif 000049
【化２１】
2007295865.tif 000050
（式(IV)及び(Ｖ)中、Ｒ１はＣＲ２Ｒ３であり、Ｒ２及びＲ３は水素、炭素、酸素、窒素、及び硫黄からなるグループから選ばれる１つ以上から構成される原子または基である。）
【請求項３２】
アミノトランスフェラーゼが、疎水性アミノ酸アミノトランスフェラーゼ又は芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼであることを特徴とする請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
アミノトランスフェラーゼが、配列番号１〜１１のいずれかに示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項３１に記載のキット。
【請求項３４】
Ｒ２又はＲ３が、一般式(III)で表される基であることを特徴とする請求項３１〜３３のいずれかに記載のキット。
【化２２】
2007295865.tif 000051
（式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８はそれぞれ独立に水素、ハロゲン、アルキル基、シクロアルキル基、ハロゲノアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシル基、アルコキシアルキル基、アリール基、ニトロ基、アミノ基、アミノアルキル基、シアノ基、アセチルアミノ基、カルボキシル基、カルボキシアルキル基、メルカプト基、メルカプトアルキル基、アルキルチオ基、アルキルチオアルキル基、ヒドロキシル基、またはヒドロキシアルキル基を示す。ここで、Ｒ４〜Ｒ８において隣接する基がそれぞれ結合して３−７個の炭素、酸素、窒素、または硫黄を含む炭素環または複素環を形成してもよい。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、L-ビニルグリシン誘導体又はその塩の製造方法、それに用いる触媒剤及びキット、L-ビニルグリシン誘導体又はその塩の分解方法、D-ビニルグリシン誘導体又はその塩の回収方法、それらの方法に用いる分解剤及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ビニルグリシン誘導体の光学異性体であるL-ビニルグリシン誘導体は、酵素阻害剤などに利用されており、D-ビニルグリシン誘導体は、大腸菌Ｂ−アラニンラセマーゼ抑制剤であるD-クロロビニルグリシンやマイトマイシン類似体の製造に利用されている。
【０００３】
従来、L-又はD-ビニルグリシン誘導体の製造方法としては、化学合成法により製造したラセミ体のビニルグリシン誘導体（特許文献１及び２、並びに非特許文献１参照）を、液体クロマトグラフィーなどの分離方法により光学分割する方法が知られている。
【０００４】
しかしながら、その実施にあたっては、ビニルグリシン誘導体の種類により光学分割できる光学分割剤を選択したり、光学分割能を高めるための条件を決定したりする必要があるため、前述の製造方法は煩雑であり、効率よくL-又はD-ビニルグリシン誘導体を製造することができない。そのため、ラセミ体のビニルグリシン誘導体に、リパーゼ、エストラーゼ、プロテアーゼなどの加水分解酵素を作用させて、L-ビニルグリシン誘導体とD-ビニルグリシン誘導体とを分割する方法が開発されている（特許文献３参照）。
【特許文献１】特開昭６２−３０７４３号公報
【特許文献２】特開平６−４９００５号公報
【特許文献３】欧州特許第０５２９６０１号明細書
【非特許文献１】Tetrahedron Letters, Vol.29, No.27, pp 3361-3364, 1988
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、例えば、L-ビニルグリシン誘導体又はその塩を製造する新たな方法、並びに、L-ビニルグリシン誘導体又はその塩を分解する新たな方法及びこの方法を利用してラセミ体のビニルグリシン誘導体又はその塩からD-ビニルグリシン誘導体又はその塩を回収する方法、及び、これらの方法に有用な触媒剤、分解剤、キットなどを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列との相同性が４０％以上であり、かつ、L-フェニルアラニンからL-グルタル酸を生成する酵素活性及びL-ロイシンからL-グルタミン酸を生成する酵素活性がともに３０Ｕ／ｍｇ以上であるアミノトランスフェラーゼ（例えば、ST1411（配列番号１）、TVN0402（配列番号３）、APE0169（配列番号４）、PTO0509（配列番号５）、PAE2315（配列番号６）、TM1131（配列番号７）、PH0207（配列番号８）等の疎水性アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、TTE2440（配列番号９）、TTE0301（配列番号２）、MJ0001（配列番号１０）、PH1371（配列番号１１）等の芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼなど）が、一般式(Ｉ)で表されるビニルグリオキシル酸誘導体から一般式(II)で表されるL-ビニルグリシン誘導体への反応を触媒する作用、及び、一般式(II)で表されるL-ビニルグリシン誘導体から一般式(Ｉ)で表されるビニルグリオキシル酸誘導体への反応を触媒する作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
なお、前記酵素活性は、４０ｍＭの２-オキソグルタル酸、０．５ｍＭのピリドキサールリン酸、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、および４０ｍＭのL-フェニルアラニンまたはL-ロイシンを含む反応液１９０μｌに、アミノトランスフェラーゼ溶液（０．０５μｇ/μｌ）を１０μｌ加えて酵素反応を行った後、生成したL-グルタミン酸を定量することにより求めた。また、「１Ｕ」は１分間に１μmolのL-グルタミン酸を生成する酵素量を示す。
【化１】
2007295865.tif 000002
【化２】
2007295865.tif 000003
【０００７】
本発明は下記のとおりである。
（１）一般式(Ｉ)で表されるビニルグリオキシル酸誘導体又はその塩に、配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列との相同性が４０％以上であり、かつ、L-フェニルアラニンからL-グルタル酸を生成する酵素活性及びL-ロイシンからL-グルタミン酸を生成する酵素活性がともに３０Ｕ／ｍｇ以上であるアミノトランスフェラーゼを作用させることを特徴とする一般式(II)で表されるL-ビニルグリシン誘導体又はその塩の製造方法。
（ここで、それぞれの酵素活性の測定は、４０ｍＭの２-オキソグルタル酸、０．５ｍＭのピリドキサールリン酸、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、および４０ｍＭのL-フェニルアラニンまたはL-ロイシンを含む反応液１９０μｌに、アミノトランスフェラーゼ溶液（０．０５μｇ/μｌ）を１０μｌ加えて酵素反応を行った後、生成したL-グルタミン酸を定量することにより行うものとする。また、１Ｕは１分間に１μmolのL-グルタミン酸を生成する酵素量を示す。）
【化３】
2007295865.tif 000004
【化４】
2007295865.tif 000005
（式(Ｉ)及び(II)中、Ｒ１はＣＲ２Ｒ３であり、Ｒ２及びＲ３は水素、炭素、酸素、窒素、及び硫黄からなるグループから選ばれる１つ以上から構成される原子または基である。）
【０００８】
（２）アミノトランスフェラーゼが、疎水性アミノ酸アミノトランスフェラーゼ又は芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼであることを特徴とする（１）に記載の製造方法。
【０００９】
（３）アミノトランスフェラーゼが、配列番号１〜１１のいずれかに示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする（１）に記載の製造方法。
【００１０】
（４）前記Ｒ２又はＲ３が、一般式(III)で表される基であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載の製造方法。
【化５】
2007295865.tif 000006
（式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８はそれぞれ独立に水素、ハロゲン、アルキル基、シクロアルキル基、ハロゲノアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシル基、アルコキシアルキル基、アリール基、ニトロ基、アミノ基、アミノアルキル基、シアノ基、アセチルアミノ基、カルボキシル基、カルボキシアルキル基、メルカプト基、メルカプトアルキル基、アルキルチオ基、アルキルチオアルキル基、ヒドロキシル基、またはヒドロキシアルキル基を示す。ここで、Ｒ４〜Ｒ８において隣接する基がそれぞれ結合して３−７個の炭素、酸素、窒素、または硫黄を含む炭素環または複素環を形成してもよい。）
【００１１】
（５）ビニルグリオキシル酸誘導体又はその塩に転移するアミノ基がL-アミノ酸から供与されることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載の製造方法。
【００１２】
（６）一般式(II)で表されるL-ビニルグリシン誘導体又はその塩に、配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列との相同性が４０％以上であり、かつ、L-フェニルアラニンからL-グルタル酸を生成する酵素活性及びL-ロイシンからL-グルタミン酸を生成する酵素活性がともに３０Ｕ／ｍｇ以上であるアミノトランスフェラーゼを作用させることを特徴とする一般式(II)で表されるL-ビニルグリシン誘導体又はその塩の分解方法。
（ここで、それぞれの酵素活性の測定は、４０ｍＭの２-オキソグルタル酸、０．５ｍＭのピリドキサールリン酸、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、および４０ｍＭのL-フェニルアラニンまたはL-ロイシンを含む反応液１９０μｌに、アミノトランスフェラーゼ溶液（０．０５μｇ/μｌ）を１０μｌ加えて酵素反応を行った後、生成したL-グルタミン酸を定量することにより行うものとする。また、１Ｕは１分間に１μmolのL-グルタミン酸を生成する酵素量を示す。）
【化６】
2007295865.tif 000007
（式中、Ｒ１はＣＲ２Ｒ３であり、Ｒ２及びＲ３は水素、炭素、酸素、窒素、及び硫黄からなるグループから選ばれる１つ以上から構成される原子または基である。）
【００１３】
（７）アミノトランスフェラーゼが、疎水性アミノ酸アミノトランスフェラーゼ又は芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼであることを特徴とする（６）に記載の分解方法。
【００１４】
（８）アミノトランスフェラーゼが、配列番号１〜１１のいずれかに示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする（６）に記載の分解方法。
【００１５】
（９）Ｒ２又はＲ３が、下記の一般式(III)で表される基であることを特徴とする（６）〜（８）のいずれかに記載の分解方法。
【化７】
2007295865.tif 000008
（式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８はそれぞれ独立に水素、ハロゲン、アルキル基、シクロアルキル基、ハロゲノアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシル基、アルコキシアルキル基、アリール基、ニトロ基、アミノ基、アミノアルキル基、シアノ基、アセチルアミノ基、カルボキシル基、カルボキシアルキル基、メルカプト基、メルカプトアルキル基、アルキルチオ基、アルキルチオアルキル基、ヒドロキシル基、またはヒドロキシアルキル基を示す。ここで、Ｒ４〜Ｒ８において隣接する基がそれぞれ結合して３−７個の炭素、酸素、窒素、または硫黄を含む炭素環または複素環を形成してもよい。）
【００１６】
（１０）一般式(IV)で表されるビニルグリシン誘導体又はその塩と、配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列との相同性が４０％以上であり、かつ、L-フェニルアラニンからL-グルタル酸を生成する酵素活性及びL-ロイシンからL-グルタミン酸を生成する酵素活性がともに３０Ｕ／ｍｇ以上であるアミノトランスフェラーゼとを反応させることにより生成する一般式(Ｉ)で表されるビニルグリオキシル酸誘導体又はその塩を除去することを特徴とする、一般式(Ｖ)で表されるD-ビニルグリシン誘導体又はその塩の回収方法。
（ここで、それぞれの酵素活性の測定は、４０ｍＭの２-オキソグルタル酸、０．５ｍＭのピリドキサールリン酸、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、および４０ｍＭのL-フェニルアラニンまたはL-ロイシンを含む反応液１９０μｌに、アミノトランスフェラーゼ溶液（０．０５μｇ/μｌ）を１０μｌ加えて酵素反応を行った後、生成したL-グルタミン酸を定量することにより行うものとする。また、１Ｕは１分間に１μmolのL-グルタミン酸を生成する酵素量を示す。）
【化８】
2007295865.tif 000009
【化９】
2007295865.tif 000010
【化１０】
2007295865.tif 000011
（式(IV)及び(Ｖ)中、Ｒ１はＣＲ２Ｒ３であり、Ｒ２及びＲ３は水素、炭素、酸素、窒素、及び硫黄からなるグループから選ばれる１つ以上から構成される原子または基である。）
【００１７】
（１１）アミノトランスフェラーゼが、疎水性アミノ酸アミノトランスフェラーゼ又は芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼであることを特徴とする（１０）に記載の回収方法。
【００１８】
（１２）アミノトランスフェラーゼが、配列番号１〜１１のいずれかに示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする（１０）に記載の回収方法。
【００１９】
（１３）Ｒ２又はＲ３が、下記の一般式(III)で表される基であることを特徴とする（１０）〜（１２）のいずれかに記載の回収方法。
【化１１】
2007295865.tif 000012
（式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８はそれぞれ独立に水素、ハロゲン、アルキル基、シクロアルキル基、ハロゲノアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシル基、アルコキシアルキル基、アリール基、ニトロ基、アミノ基、アミノアルキル基、シアノ基、アセチルアミノ基、カルボキシル基、カルボキシアルキル基、メルカプト基、メルカプトアルキル基、アルキルチオ基、アルキルチオアルキル基、ヒドロキシル基、またはヒドロキシアルキル基を示す。ここで、Ｒ４〜Ｒ８において隣接する基がそれぞれ結合して３−７個の炭素、酸素、窒素、または硫黄を含む炭素環または複素環を形成してもよい。）
【００２０】
（１４）一般式(Ｉ)で表されるビニルグリオキシル酸誘導体又はその塩から、一般式(II)で表されるL-ビニルグリシン誘導体又はその塩への反応を触媒する触媒剤であって、配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列との相同性が４０％以上であり、かつ、L-フェニルアラニンからL-グルタル酸を生成する酵素活性及びL-ロイシンからL-グルタミン酸を生成する酵素活性がともに３０Ｕ／ｍｇ以上であるアミノトランスフェラーゼを有効成分として含有することを特徴とする触媒剤。
（ここで、それぞれの酵素活性の測定は、４０ｍＭの２-オキソグルタル酸、０．５ｍＭのピリドキサールリン酸、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、および４０ｍＭのL-フェニルアラニンまたはL-ロイシンを含む反応液１９０μｌに、アミノトランスフェラーゼ溶液（０．０５μｇ/μｌ）を１０μｌ加えて酵素反応を行った後、生成したL-グルタミン酸を定量することにより行うものとする。また、１Ｕは１分間に１μmolのL-グルタミン酸を生成する酵素量を示す。）
【化１２】
2007295865.tif 000013
【化１３】
2007295865.tif 000014
（式(Ｉ)及び(II)中、Ｒ１はＣＲ２Ｒ３であり、Ｒ２及びＲ３は水素、炭素、酸素、窒素、及び硫黄からなるグループから選ばれる１つ以上から構成される原子または基である。）
【００２１】
（１５）アミノトランスフェラーゼが、疎水性アミノ酸アミノトランスフェラーゼ又は芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼであることを特徴とする（１４）に記載の触媒剤。
【００２２】
（１６）アミノトランスフェラーゼが、配列番号１〜１１のいずれかに示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする（１４）に記載の触媒剤。
【００２３】
（１７）Ｒ２又はＲ３が、一般式(III)で表される基であることを特徴とする（１４）〜（１６）のいずれかに記載の触媒剤。
【化１４】
2007295865.tif 000015
（式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８はそれぞれ独立に水素、ハロゲン、アルキル基、シクロアルキル基、ハロゲノアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシル基、アルコキシアルキル基、アリール基、ニトロ基、アミノ基、アミノアルキル基、シアノ基、アセチルアミノ基、カルボキシル基、カルボキシアルキル基、メルカプト基、メルカプトアルキル基、アルキルチオ基、アルキルチオアルキル基、ヒドロキシル基、またはヒドロキシアルキル基を示す。ここで、Ｒ４〜Ｒ８において隣接する基がそれぞれ結合して３−７個の炭素、酸素、窒素、または硫黄を含む炭素環または複素環を形成してもよい。）
【００２４】
（１８）ビニルグリオキシル酸誘導体又はその塩に転移するアミノ基がL-アミノ酸から供与されることを特徴とする（１４）〜（１７）のいずれかに記載の触媒剤。
【００２５】
（１９）一般式(II)で表されるL-ビニルグリシン誘導体又はその塩を分解する分解剤であって、配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列との相同性が４０％以上であり、かつ、L-フェニルアラニンからL-グルタル酸を生成する酵素活性及びL-ロイシンからL-グルタミン酸を生成する酵素活性がともに３０Ｕ／ｍｇ以上であるアミノトランスフェラーゼを有効成分として含有することを特徴とする分解剤。
（ここで、それぞれの酵素活性の測定は、４０ｍＭの２-オキソグルタル酸、０．５ｍＭのピリドキサールリン酸、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、および４０ｍＭのL-フェニルアラニンまたはL-ロイシンを含む反応液１９０μｌに、アミノトランスフェラーゼ溶液（０．０５μｇ/μｌ）を１０μｌ加えて酵素反応を行った後、生成したL-グルタミン酸を定量することにより行うものとする。また、１Ｕは１分間に１μmolのL-グルタミン酸を生成する酵素量を示す。）
【化１５】
2007295865.tif 000016
（式中、Ｒ１はＣＲ２Ｒ３であり、Ｒ２及びＲ３は水素、炭素、酸素、窒素、及び硫黄からなるグループから選ばれる１つ以上から構成される原子または基である。）
【００２６】
（２０）アミノトランスフェラーゼが、疎水性アミノ酸アミノトランスフェラーゼ又は芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼであることを特徴とする（１９）に記載の分解剤。
【００２７】
（２１）アミノトランスフェラーゼが、配列番号１〜１１のいずれかに示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする（１９）に記載の分解剤。
【００２８】
（２２）Ｒ２又はＲ３が、一般式(III)で表される基であることを特徴とする（１９）〜（２１）のいずれかに記載の分解剤。
【化１６】
2007295865.tif 000017
（式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８はそれぞれ独立に水素、ハロゲン、アルキル基、シクロアルキル基、ハロゲノアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシル基、アルコキシアルキル基、アリール基、ニトロ基、アミノ基、アミノアルキル基、シアノ基、アセチルアミノ基、カルボキシル基、カルボキシアルキル基、メルカプト基、メルカプトアルキル基、アルキルチオ基、アルキルチオアルキル基、ヒドロキシル基、またはヒドロキシアルキル基を示す。ここで、Ｒ４〜Ｒ８において隣接する基がそれぞれ結合して３−７個の炭素、酸素、窒素、または硫黄を含む炭素環または複素環を形成してもよい。）
【００２９】
（２３）一般式(Ｉ)で表されるビニルグリオキシル酸誘導体又はその塩から、一般式(II)で表されるL-ビニルグリシン誘導体又はその塩を製造するためのキットであって、配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列との相同性が４０％以上であり、かつ、L-フェニルアラニンからL-グルタル酸を生成する酵素活性及びL-ロイシンからL-グルタミン酸を生成する酵素活性がともに３０Ｕ／ｍｇ以上であるアミノトランスフェラーゼと、L-アミノ酸又はその塩とを含むことを特徴とするキット。
（ここで、それぞれの酵素活性の測定は、４０ｍＭの２-オキソグルタル酸、０．５ｍＭのピリドキサールリン酸、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、および４０ｍＭのL-フェニルアラニンまたはL-ロイシンを含む反応液１９０μｌに、アミノトランスフェラーゼ溶液（０．０５μｇ/μｌ）を１０μｌ加えて酵素反応を行った後、生成したL-グルタミン酸を定量することにより行うものとする。また、１Ｕは１分間に１μmolのL-グルタミン酸を生成する酵素量を示す。）
【化１７】
2007295865.tif 000018
【化１８】
2007295865.tif 000019
（式(Ｉ)及び(II)中、Ｒ１はＣＲ２Ｒ３であり、Ｒ２及びＲ３は水素、炭素、酸素、窒素、及び硫黄からなるグループから選ばれる１つ以上から構成される原子または基である。）
【００３０】
アミノトランスフェラーゼが、疎水性アミノ酸アミノトランスフェラーゼ又は芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼであることを特徴とする（２３）に記載のキット。
【００３１】
（２５）アミノトランスフェラーゼが、配列番号１〜１１のいずれかに示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする（２３）に記載のキット。
【００３２】
（２６）Ｒ２又はＲ３が、一般式(III)で表される基であることを特徴とする（２３）〜（２５）のいずれかに記載のキット。
【化１９】
2007295865.tif 000020
（式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８はそれぞれ独立に水素、ハロゲン、アルキル基、シクロアルキル基、ハロゲノアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシル基、アルコキシアルキル基、アリール基、ニトロ基、アミノ基、アミノアルキル基、シアノ基、アセチルアミノ基、カルボキシル基、カルボキシアルキル基、メルカプト基、メルカプトアルキル基、アルキルチオ基、アルキルチオアルキル基、ヒドロキシル基、またはヒドロキシアルキル基を示す。ここで、Ｒ４〜Ｒ８において隣接する基がそれぞれ結合して３−７個の炭素、酸素、窒素、または硫黄を含む炭素環または複素環を形成してもよい。）
【００３３】
（２７）一般式(II)で表されるL-ビニルグリシン誘導体又はその塩を分解するためのキットであって、配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列との相同性が４０％以上であり、かつ、L-フェニルアラニンからL-グルタル酸を生成する酵素活性及びL-ロイシンからL-グルタミン酸を生成する酵素活性がともに３０Ｕ／ｍｇ以上であるアミノトランスフェラーゼと、ケト酸又はその塩とを含むことを特徴とするキット。
（ここで、それぞれの酵素活性の測定は、４０ｍＭの２-オキソグルタル酸、０．５ｍＭのピリドキサールリン酸、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、および４０ｍＭのL-フェニルアラニンまたはL-ロイシンを含む反応液１９０μｌに、アミノトランスフェラーゼ溶液（０．０５μｇ/μｌ）を１０μｌ加えて酵素反応を行った後、生成したL-グルタミン酸を定量することにより行うものとする。また、１Ｕは１分間に１μmolのL-グルタミン酸を生成する酵素量を示す。）
【化２０】
2007295865.tif 000021
（式中、Ｒ１はＣＲ２Ｒ３であり、Ｒ２及びＲ３は水素、炭素、酸素、窒素、及び硫黄からなるグループから選ばれる１つ以上から構成される原子または基である。）
【００３４】
（２８）アミノトランスフェラーゼが、疎水性アミノ酸アミノトランスフェラーゼ又は芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼであることを特徴とする（２７）に記載のキット。
【００３５】
（２９）アミノトランスフェラーゼが、配列番号１〜１１のいずれかに示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする（２７）に記載のキット。
【００３６】
（３０）Ｒ２又はＲ３が、一般式(III)で表される基であることを特徴とする（２７）〜（２９）のいずれかに記載のキット。
【化２１】
2007295865.tif 000022
（式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８はそれぞれ独立に水素、ハロゲン、アルキル基、シクロアルキル基、ハロゲノアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシル基、アルコキシアルキル基、アリール基、ニトロ基、アミノ基、アミノアルキル基、シアノ基、アセチルアミノ基、カルボキシル基、カルボキシアルキル基、メルカプト基、メルカプトアルキル基、アルキルチオ基、アルキルチオアルキル基、ヒドロキシル基、またはヒドロキシアルキル基を示す。ここで、Ｒ４〜Ｒ８において隣接する基がそれぞれ結合して３−７個の炭素、酸素、窒素、または硫黄を含む炭素環または複素環を形成してもよい。）
【００３７】
（３１）一般式(IV)で表されるビニルグリシン誘導体又はその塩から、一般式(Ｖ)で表されるD-ビニルグリシン誘導体又はその塩を回収するためのキットであって、
配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列との相同性が４０％以上であり、かつ、L-フェニルアラニンからL-グルタル酸を生成する酵素活性及びL-ロイシンからL-グルタミン酸を生成する酵素活性がともに３０Ｕ／ｍｇ以上であるアミノトランスフェラーゼと、ケト酸又はその塩とを含むことを特徴とするキット。
（ここで、それぞれの酵素活性の測定は、４０ｍＭの２-オキソグルタル酸、０．５ｍＭのピリドキサールリン酸、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、および４０ｍＭのL-フェニルアラニンまたはL-ロイシンを含む反応液１９０μｌに、アミノトランスフェラーゼ溶液（０．０５μｇ/μｌ）を１０μｌ加えて酵素反応を行った後、生成したL-グルタミン酸を定量することにより行うものとする。また、１Ｕは１分間に１μmolのL-グルタミン酸を生成する酵素量を示す。）
【化２２】
2007295865.tif 000023
【化２３】
2007295865.tif 000024
（式(IV)及び(Ｖ)中、Ｒ１はＣＲ２Ｒ３であり、Ｒ２及びＲ３は水素、炭素、酸素、窒素、及び硫黄からなるグループから選ばれる１つ以上から構成される原子または基である。）
【００３８】
（３２）アミノトランスフェラーゼが、疎水性アミノ酸アミノトランスフェラーゼ又は芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼであることを特徴とする（３１）に記載のキット。
【００３９】
（３３）アミノトランスフェラーゼが、配列番号１〜１１のいずれかに示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする（３１）に記載のキット。
【００４０】
（３４）Ｒ２又はＲ３が、一般式(III)で表される基であることを特徴とする（３１）〜（３３）のいずれかに記載のキット。
【化２４】
2007295865.tif 000025
（式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８はそれぞれ独立に水素、ハロゲン、アルキル基、シクロアルキル基、ハロゲノアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシル基、アルコキシアルキル基、アリール基、ニトロ基、アミノ基、アミノアルキル基、シアノ基、アセチルアミノ基、カルボキシル基、カルボキシアルキル基、メルカプト基、メルカプトアルキル基、アルキルチオ基、アルキルチオアルキル基、ヒドロキシル基、またはヒドロキシアルキル基を示す。ここで、Ｒ４〜Ｒ８において隣接する基がそれぞれ結合して３−７個の炭素、酸素、窒素、または硫黄を含む炭素環または複素環を形成してもよい。）
【発明の効果】
【００４１】
本発明によれば、例えば、L-ビニルグリシン誘導体又はその塩を製造する新たな方法、並びに、L-ビニルグリシン誘導体又はその塩を分解する新たな方法及びこの方法を利用してラセミ体のビニルグリシン誘導体又はその塩からD-ビニルグリシン誘導体又はその塩を回収する方法、及び、これらの方法に有用な触媒剤、分解剤、キットなどを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００４３】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００４４】
配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列との相同性が４０％以上であり、かつ、４０ｍＭの２-オキソグルタル酸、０．５ｍＭのピリドキサールリン酸、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、および４０ｍＭのL-フェニルアラニンまたはL-ロイシンを含む反応液１９０μｌに、アミノトランスフェラーゼ溶液（０．０５μｇ/μｌ）を１０μｌ加えて酵素反応を行った後、生成したL-グルタミン酸を定量した結果、L-フェニルアラニンからL-グルタミン酸を生成する酵素活性及びL-ロイシンからL-グルタミン酸を生成する酵素活性がともに３０Ｕ／ｍｇ（１Ｕは１分間に１μmolのL-グルタミン酸を生成する酵素量を示す。）以上であるアミノトランスフェラーゼ（以下、「ＡＴｓ」と称する。）を、アミノ基供与体の存在下において、式(１)、式(２)、又は式(３)で表される化合物（以下、それぞれを化合物(１)、化合物(２)、又は化合物(３)と称する。）に作用させると、それぞれ式(４)、式(５)、は下式(６)で表される化合物（以下、それぞれを化合物(４)、化合物(５)、又は化合物(６)と称する。）を製造できる。
【化２５】
2007295865.tif 000026
【００４５】
すなわちＡＴｓは、化合物(１)〜(３)におけるカルボニル基以外の二重結合には作用しないで、当該カルボニル基に作用してオキソ基をアミノ基供与体から供与されたアミノ基に置換する反応を触媒する作用を有する。従ってＡＴｓは、化合物(１)〜(３)から化合物(４)〜(６)への反応を触媒する触媒剤として有用であり、化合物(１)〜(３)から化合物(４)〜(６)を製造するのに有用である。
【００４６】
また、ＡＴｓは、上述のように、カルボニル基以外の二重結合には作用しないことから、一般式(Ｉ)で表されるビニルグリオキシル誘導体又はその塩から一般式(II)で表されるL-ビニルグリシン誘導体又はその塩への反応を触媒する触媒剤として有用であり、一般式(II)で表されるL-ビニルグリシン誘導体又はその塩の製造や製造キットに有用である。
【００４７】
ところで、生体由来の酵素であり、L-アミノ酸を基質とする天然アミノトランスフェラーゼは、天然型−ケト酸（α−ケト酸）の存在下において、L-アミノ酸を分解する作用を有することが知られている。実際、超好熱性古細菌パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）やアエロピルム・ペルニクス（Aeropyrum pernix）から産生される天然アミノトランスフェラーゼは、天然型−ケト酸の存在下において、L-アリールグリシン誘導体を分解する作用を有することが報告されている（特開２００３−２１９８９６号公報）。これらのことから、ケト酸又はその塩の存在下において、一般式(IV)で表されるビニルグリシン誘導体のラセミ体と、ＡＴｓを反応させることにより、一般式(II)で表されるL-ビニルグリシン誘導体が特異的に分解されて一般式(Ｉ)で表されるビニルグリオキシル酸誘導体が生成し、この生成した一般式(Ｉ)で表されるビニルグリオキシル酸誘導体を反応系から除去することにより、反応せずに残った一般式(Ｖ)で表されるD-ビニルグリシン誘導体のみを回収することができる。
【００４８】
従ってＡＴｓは、一般式(II)で表されるL-ビニルグリシン誘導体の分解剤として、あるいは分解キットに有用であり、また、一般式(IV)で表されるビニルグリシン誘導体のラセミ体から一般式(Ｖ)で表されるD-ビニルグリシン誘導体の回収や回収キットに有用である。
【００４９】
なお、一般式(Ｉ)、（II）、(IV)、又は(Ｖ)で表される化合物中のＲ１はＣＲ２Ｒ３であり、Ｒ２及びＲ３は水素、炭素、酸素、窒素、及び硫黄からなるグループから選ばれる１つ以上から構成される原子または基であればどのようなものでもよく、例えば、Ｒ１におけるＲ２又はＲ３が、一般式(III)で表される基である化合物を挙げることができる。この場合において、一般式(III)中のＲ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８はそれぞれ独立に水素、ハロゲン、アルキル基、シクロアルキル基、ハロゲノアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシル基、アルコキシアルキル基、アリール基、ニトロ基、アミノ基、アミノアルキル基、シアノ基、アセチルアミノ基、カルボキシル基、カルボキシアルキル基、メルカプト基、メルカプトアルキル基、アルキルチオ基、アルキルチオアルキル基、ヒドロキシル基、またはヒドロキシアルキル基を示す。ここで、Ｒ４〜Ｒ８において隣接する基がそれぞれ結合して３−７個の炭素、酸素、窒素、または硫黄を含む炭素環または複素環を形成してもよい。
【００５０】
また、一般式(Ｉ)で表されるビニルグリオキシル酸誘導体は、市販のものを用いても、一般的な化学合成法により製造してもよいが、酵素及び当該酵素の作用により前記ビニルグリオキシル酸誘導体に変換する前駆物質を用いて酵素合成法により製造してもよい。酵素と前駆物質との組み合わせとしては、例えば、1-ハイドロキシ-2-ナフトエ酸 ジオキシゲナーゼと1-ハイドロキシ-2-ナフトエ酸との組み合わせ（(3E)-4-(2-カルボキシフェニル)-2-オキシブタ-3-エン酸の製造；J Bacteriol (1983) 154(1): 113-7）、2’-カルボキシベンザルピルベート アルドラーゼと2-カルボキシベンズアルデヒドとピルベートとの組み合わせ（(3E)-4-(2-カルボキシフェニル)-2-オキシブタ-3-エン酸の製造；J Bacteriol (1983) 154(1): 113-7）、2-ハイドロキシ-2H-ベンゾ[h]クロモン-2-カルボキシレート イソメラーゼと2-ヒドロキシ-2H-ベンゾ[h]クロモン-2-カルボキシレートとの組み合わせ（トランス-4-(1’-ハイドロキシナフト-2’-イル)-2-オキシブタ-3-エン酸の製造；J Bacteriol (1994) 176(8): 2439-43）を挙げることができる。
【００５１】
その他、2-カルボキシ-2-ハイドロキシ-8-カルボキシクロモン イソメラーゼと2-カルボキシ-2-ハイドロキシ-8-カルボキシクロモンとの組み合わせ（2-ハイドロキシ-3-カルボキシベンザルピルビン酸塩の製造；Arch Microbiol (1995) 163(1): 42-7）、2-ハイドロキシ-8-メチルクロモン-2-カルボキシレート イソメラーゼと2-ハイドロキシ-8-メチルクロモン-2-カルボキシレートとの組み合わせ（2-ハイドロキシ-3-メチルベンザルピルビン酸塩の製造；Arch Microbiol (1994) 161(5): 425-33）、シス-4-［2-(3-ハイドロキシ)-チオナフトエニル］-2-オキソ-3-ブタエン酸 イソメラーゼとシス-4-［2-(3-ハイドロキシ)-チオナフトエニル］-2-オキソ-3-ブタエン酸との組み合わせ（トランス-4-［2-(3-ハイドロキシ)-チオナフトエニル］-2-オキソ-3-ブタエン酸の製造；J Bacteriol (1993) 175(21): 6890-901）、1-ハイドロキシ-2-ナフトエ酸 ジオキシゲナーゼと1-ハイドロキシ-2-ナフトエ酸との組み合わせ（トランス-2’-カルボキシベンザルピルビン酸塩の製造；Journal of General Microbiology (1978) 105: 69-75及びJournal of Bacteriology (1994) 176(8): 2439-2443）、2-ハイドロキシクロモン-2-カルボキシレート イソメラーゼと6-アミノ-2-ハイドロキシクロモン-2-カルボキシレートとの組み合わせ（(3E)-4-(5-アミノ-2-ハイドロキシ-フェニル)-2-オキソブタ-3-エン酸の製造；Appl Environ Microbiol (1991) 57(11): 3144-9）等を挙げることができる。
【００５２】
また、2-ハイドロキシ-7-ハイドロキシメチルクロモン-2-カルボキシレート イソメラーゼと2-ハイドロキシ-7-ハイドロキシメチルクロモン-2-カルボキシレートとの組み合わせ（2-ハイドロキシ-4-ハイドロキシメチルベンザルピルベートの製造；Arch Microbiol (1994) 161(5): 425-33）、2-ハイドロキシクロモン-2-カルボキシレート イソメラーゼと2-ハイドロキシクロモン-2-カルボキシレートとの組み合わせ（トランス-o-ハイドロキシベンジリデンピルベートの製造；J Bacteriol (1992) 174(23): 7542-54）、1,2-ジハイドロキシナフタレン-6-サルホネート 1,8a-ジオキシゲナーゼと1,2-ジハイドロキシナフタレン-6-サルホネートとの組み合わせ（(Z)-4-(2-ハイドロキシ-5-スルホナトフェニル)-2-オキソ-3-ブタエン酸の製造；Appl Environ Microbiol (1988) 54(7): 1842-7）、トランス-ACOHDA ヒドロラーゼとトランス-4-アミノ-6-カルボキシ-2-オキソ-ヘキサ-3,5-ジエン酸との組み合わせ（フマリルピルベートの製造；J Gen Microbiol (1993) 139 (Pt 5): 1019-25）、5-アミノサリチラート ジオキシゲナーゼと5-アミノサリチラートとの組み合わせ（シス-4-アミノ-6-カルボキシ-2-オキソ-ヘキサ-3,5-ジエン酸の製造；J Gen Microbiol (1993) 139 (Pt 5): 1019-25）等を挙げることができる。
【００５３】
一般式(Ｉ)、（II）、(IV)、又は(Ｖ)で表される化合物の塩、例えば、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（マグネシウム塩、カルシウム塩など）、その他の金属塩（アルミニウム塩など）、無機塩（塩酸塩、アンモニウム塩、アミン類など）、有機塩（グルコサミン塩など）は、常法に従って製造することができる。
【００５４】
ＡＴｓとしては、配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列との相同性が４０％以上であり、かつ、４０ｍＭの２-オキソグルタル酸、０．５ｍＭのピリドキサールリン酸、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、および４０ｍＭのL-フェニルアラニンまたはL-ロイシンを含む反応液１９０μｌに、アミノトランスフェラーゼ溶液（０．０５μｇ/μｌ）を１０μｌ加えて酵素反応を行った後、生成したL-グルタミン酸を定量した結果、L-フェニルアラニン及びL-ロイシンからL-グルタミン酸を生成する酵素活性がともに３０Ｕ／ｍｇ（１Ｕは１分間に１μmolのL-グルタミン酸を生成する酵素量を示す。）以上であるものであれば特に制限されるものではない。具体的には、配列番号１又は３〜８のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する疎水性アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、配列番号２又は９〜１１のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、これらのアミノトランスフェラーゼを産生する微生物以外の微生物に由来する、配列番号１〜１１のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するアミノトランスフェラーゼのホモログを用いることができる。
【００５５】
なお、本発明に用いられるＡＴｓは、配列番号１〜１１のいずれかに示されるアミノ酸配列または前記ホモログのアミノ酸配列を有し、上述の触媒作用、分解作用などを有するタンパク質であればどのようなものでもよく、例えば、配列番号１〜１１のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるアミノトランスフェラーゼにHisタグなどのタグが結合したタンパク質やGSTなどとの融合タンパク質などでもよい。
【００５６】
以上のタンパク質は、ＡＴｓを産生する微生物から生化学的に抽出してもよいし、その配列情報に基づいて有機化学的に合成してもよい。
【００５７】
また、適切なエンハンサー／プロモーターをもつ発現ベクターに、ＡＴｓをコードするポリヌクレオチド（例えば配列番号１２〜２２のいずれかに示される塩基配列を有するポリヌクレオチド）を挿入し、この組換えベクターを大腸菌、サルモネラ菌等の菌や、イースト、動物細胞などに導入し、発現させ、生成したタンパク質を常法により精製して得ることもできる。また、この組換えベクターをin vitroで転写させて得られたmRNAを、ウサギ網状赤血球抽出液、大腸菌Ｓ３０抽出液、麦芽抽出液、小麦胚抽出液などを用いたインビトロ翻訳システムにより翻訳させて、合成されたタンパク質を精製して得ることもできる。
【００５８】
上述のタグが結合したタンパク質や融合タンパク質は、発現ベクターを作製する際、ＡＴｓをコードするポリヌクレオチドと、タグをコードするポリヌクレオチド又は融合させるポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドをベクターに挿入し、タンパク質として発現させることにより得ることができる。なお、タグ等の配列はベクターに由来するものでもよい。このように、タグ等を利用することにより目的のタンパク質を容易に精製することが可能になる。また、タグ等は、最終段階で特異的なプロテアーゼ等によって除去し、HPLC（high-performance(-speed) liquid chromatography）などでＡＴｓだけを精製することもできる。
【００５９】
なお、ＡＴｓを細胞外に分泌させるため、シグナルペプチドを付加してもよい。このような融合タンパク質を発現することのできる組換えベクターは、上述のように、適切なエンハンサー／プロモーターをもつ発現ベクターに、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することで作製することができる。
【００６０】
また、前記組換えベクターの菌、イースト、動物細胞などへの導入は、例えば、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、アデノウイルス、レトロウイルス等のウイルスベクターなどを用いたウイルス感染法、又はカルシウムを用いたトランスフェクション法等によって行うことができる。
【００６１】
本発明に係る、L-ビニルグリシン誘導体若しくはその塩の製造又分解、D-ビニルグリシン誘導体又はその塩の回収においては、ＡＴｓを単離精製して用いてもよいが、ＡＴｓを合成する菌を浸透圧ショック、超音波処理、フレンチプレス処理、或いはマントン・ゴーリン・ホモジナイザー処理等の公知の方法で破砕することにより得られる菌体抽出液を用いてもよく、ＡＴｓを生産する菌体そのものを用いてもよい。
【００６２】
ＡＴｓは、オキソ基をアミノ基に、あるいは、アミノ基をオキソ基に置換する酵素であり、アミノ基供与体としては、例えば、L-アミノ酸又はその塩を用いることができるが、食品添加物として世界中で大量に生産されているL-グルタミン酸又はそのナトリウム塩を用いることが経済性・水溶性の点で好ましく、さらにL-グルタミン酸−１ナトリウム塩を用いることが緩衝液としての作用を有する点でより好ましい。また、本発明においてL-グルタミン酸−１ナトリウム塩を用いることにより、他の緩衝液を用いたり、アルカリや酸を用いたりしてｐＨを調整することなく、ＡＴｓによる反応を行わせる反応溶液のｐＨを６〜９付近に維持させることが可能となる。このようにｐＨを維持させることによりＡＴｓを安定させ、ＡＴｓによる反応を効率よく行うことができるようになる。なお、L-アミノ酸としては、L-グルタミン酸以外に、L-アラニン、L-フェニルアラニン、L-チロシン、L-トリプトファン、L-ロイシン、L-イソロイシン、L-アスパラギン酸、L-トレオニン、L-アスパラギン、L-グルタミン、L-リジン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L-システイン、L-メチオニン、L-バリン等の適当な天然アミノ酸を用いることができる。
【００６３】
また、ＡＴｓによるオキソ基からのアミノ基の転移は、例えば、ケト酸又はその塩をアミノ基の受容体として用いることで行うことができる。その際に用いるケト酸又はその塩としては、その入手しやすさや溶解性の観点からピルビン酸や２−ケトグルタル酸を用いることが好ましい。
【００６４】
なお、一般式(II)で表されるL-ビニルグリシン誘導体若しくはその塩の製造、分解などの反応温度は、特に制限されるものではないが、酵素反応に用いられる物質の安定性や溶解性、及び酵素の安定性等の観点から２５〜１００℃の範囲内であることが好ましい。
【００６５】
また、前記反応はどのようなｐＨで行ってもよいが、当該反応に用いられる物質の溶解性の観点からｐＨ６以上で行うことが好ましく、ＡＴｓの十分な活性を得る目的からｐＨ７〜９の範囲内で行うことがより好ましい。
【００６６】
また、一般式(Ｉ)で表されるビニルグリオキシル酸誘導体、一般式(II)で表されるL-ビニルグリシン誘導体、一般式(IV)で表されるビニルグリシン誘導体などが難溶性である場合には、それらを、ＤＭＳＯ、アルコール、酢酸エチル、クロロホルムなどの溶媒に溶解することにより上記反応を行うことができる。
【００６７】
なお、上述のようにして製造された、一般式(II)で表されるL-ビニルグリシン誘導体又はその塩、及び、一般式(IV)で表されるビニルグリシン誘導体又はその塩中の一般式(II)で表されるL-ビニルグリシン誘導体又はその塩を分解することにより得られた、一般式(Ｖ)で表されるD-ビニルグリシン誘導体又はその塩は、イオン交換カラムクロマトグラフィー法、アフィニティーカラムクロマトグラフィー法等の常法により分離精製して回収することができる。
【００６８】
本発明に係る製造キットは、ＡＴｓ、及び、L-アミノ酸又はその塩を含んでいればどのようなものでもよいが、その他に、一般式(Ｉ)で表されるビニルグリオキシル酸誘導体又はその塩から、一般式(II)で表されるL-ビニルグリシン誘導体又はその塩を製造するための試薬（例えば、ピリドキサール-5’-リン酸（補酵素）、緩衝液など）又は器具が含まれていてもよい。
【００６９】
また、本発明に係る分解キットは、ＡＴｓ、及び、ケト酸又はその塩を含んでいればどのようなものでもよいが、その他に、一般式(II)で表されるL-ビニルグリシン誘導体又はその塩を分解するための試薬（例えば、ピリドキサール-5’-リン酸（補酵素）、緩衝液など）又は器具が含まれていてもよい。
【００７０】
さらに本発明に係る回収キットは、ＡＴｓ、及び、ケト酸又はその塩を含んでいればどのようなものでもよいが、その他に、一般式(IV)で表されるビニルグリシン誘導体又はその塩から、一般式(Ｖ)で表されるD-ビニルグリシン誘導体又はその塩を回収するための試薬（例えば、ピリドキサール-5’-リン酸（補酵素）、緩衝液など）又は器具（例えば、一般式(Ｉ)で表されるビニルグリオキシル酸誘導体若しくはその塩を分離・除去できる液体クロマトグラフィー用分離カラム又はその充填剤（シリカゲルなど））が含まれていてもよい。
【実施例】
【００７１】
以下、実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、実施例において、核磁気共鳴スペクトル（1H-NMR）はJNM-GSX400（日本電子株式会社（JEOL）製）を用いて測定した。
【００７２】
［実施例１］アミノトランスフェラーゼ（ST1411）溶液の調製
高等度好熱菌スルホロバス・トコダイイ（Sulfolobus  tokodaii str.7）のゲノムを鋳型として、KOD plus polymerase（東洋紡績株式会社製）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行い、His-tagをコードする塩基配列が付加された以下のプライマーを用い、アミノトランスフェラーゼ遺伝子（ST1411；配列番号１２）を増幅し、カラム精製後0.1μg/μlのDNA溶液を得た。PCR装置としては、Robocycler (Stratagene社製)を用いた。なお、プライマーは、5’-CCCAAACCATATGTTCGAAAGATTTCTTTCAAAAGACG-3’（配列番号２３）及び5’-CCAACCTCGAGTTTAAGAAAATCTAATATAGTATTTCCTAG-3’（配列番号２４）を用い、反応は、94℃×35秒間（変性）、52℃×50秒間（アニーリング）、及び68℃×2分間（伸長）で15サイクル行った。
【００７３】
次に、制限酵素Xho I 1μl、Nde I 1μl、10×H Buffer 5μl（以上、タカラバイオ株式会社製）及び上述のDNA溶液 43μlを混合し、37℃で一晩消化した。また、pET21a(+)（0.5μg/μl；Novagen製）2μl、Xho I 1μl、Nde I 1μl及び10×H Buffer 5μl（以上、タカラバイオ株式会社製）を混合し、37℃で一晩消化した。消化したＤＮＡをアガロースゲルで電気泳動し、GFX PCR and Gel Band Purification Kit（Amersham製）を用いて精製した。精製後、イソプロパノールで沈殿させ、70％ エタノールでリンスし、乾燥させたDNA断片を5 μlの滅菌水に溶解した。このDNA溶液に対し、DNA Ligation Kit ver.2 sol I（タカラバイオ株式会社製）を用いてライゲーションし、フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコールなどを用いて精製した。
【００７４】
精製したプラスミドを大腸菌JM109株にエレクトロポレーション法により形質転換し、50μg/ml アンピシリンを含むLB平板寒天培地（1L中にトリプトン 10g、酵母エキス 5g、NaCl 10gを含む）に播種して37℃で一晩培養した。寒天培地上に形成されたシングルコロニーの中から、コロニーを無作為にいくつか選択し、選択した各コロニーを直接反応溶液に懸濁し、コロニーダイレクトPCRを行うことで目的の断片をもつクローンのスクリーニングを行った。なお、コロニーダイレクトPCRは以下の手順に従い行った。
【００７５】
Ex Taqポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製）            0.5 μl
緩衝液（10×Ex Taq Buffer、タカラバイオ株式会社製）       5 μl
dNTP（各2.5mM、タカラバイオ株式会社製）                   4 μl
各プライマー（各100 pmol/μl）                        各0.5 μl
各コロニー中の大腸菌                                      微量
を混合し、水を加えて全量50 μlに調整した。なお、プライマーとしては、5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’（配列番号２５）及び5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’（配列番号２６）を用いた。
【００７６】
次に、94℃で3分間恒温し、＜94℃×60秒間→56℃×60秒間→72℃×140秒間＞のサイクルを25回繰り返してPCRを行い、1％アガロース電気泳動により目的の断片が増幅されていることを確認して陽性コロニーを選択し、インサートの塩基配列を決定して、目的の形質転換体を得た。
【００７７】
上述のようにして得られた組換えプラスミドを用いて、Rosetta（DE3）株の形質転換を行い、形質転換した大腸菌を、50μg/mlのアンピシリンと34μg/mlのクロラムフェニコールを含むLB平板寒天培地に植菌して37℃で培養し、さらに、50μg/ml アンピシリンと34μg/ml クロラムフェニコールを含むLB培地に植菌して37℃で培養した。培養後、遠心分離により集菌した菌体を超音波で破砕し、80℃で30分間熱処理して大腸菌由来のアミノトランスフェラーゼを失活させた。続いて、遠心分離により不溶物を沈殿させ、上清を粗酵素液として回収し、Protino Ni2000（Macherey-Nagel）を用いて精製することによりHis-tagとアミノトランスフェラーゼ（ST1411）との融合タンパク質の酵素溶液を得た。
【００７８】
［実施例２］ビニルグリシン誘導体の製造
実施例１で得られたアミノトランスフェラーゼ（ST1411）溶液を用いて、一般式(Ｉ)で表されるビニルグリオキシル酸誘導体から、一般式(II)で表されるL-ビニルグリシン誘導体を製造できることを確認した。なお、出発原料としては、文献（Eur．J．Inorg．Chem, 2001, 1019-1029）に記載の方法に準じて合成した、2-オキソ-4-p-トルイルブタ-3-エン酸（化合物(１)）、2-オキソ-4-o-メトキシフェニルブタ-3-エン酸（化合物(２)）、及び2-オキソ-4-m-クロロフェニルブタ-3-エン酸（化合物(３)）を用いた。
【００７９】
（ａ）2-アミノ-4-p-トルイルブタ-3-エン酸の合成（１）
100mM リン酸緩衝液（pH8.0）、20mM 2-オキソ-4-p-トルイルブタ-3-エン酸、80mM L-アラニン、0.2 mM ピリドキサール-5’-リン酸、及び8μg/mlのα-アミノトランスフェラーゼ（ST1411）を含む反応液 5 mlを調製し、80℃で30分間反応させた。なお、反応液は1M 水酸化ナトリウム水溶液で、pH8.0に調整した。
【００８０】
反応終了後、反応液を放冷して1M 塩酸でpH4.5に調整し、メンブレンフィルター（ADVANTEC DISMIC-25AS、孔径0.2μm）でろ過した後、フラッシュカラム（Biotage社 SP-1）により精製し、2-アミノ-4-p-トルイルブタ-3-エン酸を得た（収量4.1mg）。
1H NMR（D2O）δ 7.30（2H、ArH）、7.13（2H、ArH）、6.74（d、J=16Hz、1H、Ar-CH=CH）、6.13（1H、Ar-CH=CH）、4.50（1H、CH）、2.19（s、3H、CH3）
【００８１】
（ｂ）2-アミノ-4-o-メトキシフェニルブタ-3-エン酸の合成
2-オキソ-4-p-トルイルブタ-3-エン酸（化合物(１)）の代わりに2-オキソ-4-o-メトキシフェニルブタ-3-エン酸（化合物(２)）を用いる他は（ａ）の方法に準じて反応を行い、フラッシュカラムにより精製し、2-アミノ-4-o-メトキシフェニルブタ-3-エン酸を得た（収量2.5mg）。
1H NMR（D2O）δ 7.37（d、J=8Hz、1H、ArH）、7.24（dd、J=8、8Hz、1H、ArH）、7.00（d、J=16Hz、1H、Ar-CH=CH）、6.94（d、J=8Hz、1H、ArH）、6.90（dd、J=8、8Hz、1H、ArH）、6.19（dd、J=16、8Hz、1H、Ar-CH=CH）、4.50（d、J=8Hz、1H、CH）、3.73（s、3H、OCH3）
【００８２】
（ｃ）2-アミノ-4-m-クロロフェニルブタ-3-エン酸の合成
2-オキソ-4-p-トルイルブタ-3-エン酸（化合物(１)）の代わりに2-オキソ-4-m-クロロフェニルブタ-3-エン酸（化合物(３)）を用いる他は（ａ）の方法に準じて反応を行った。反応終了後、反応液を放冷して1M 塩酸でpH4.5に調整し、析出した結晶を濾過し、水洗して減圧乾燥して2-アミノ-4-m-クロロフェニルブタ-3-エン酸を得た（収量2.6mg）。
1H NMR（DMSO-d6）δ 7.32-7.45（m、4H、ArH）、6.63（d、J=16Hz、1H、Ar-CH=CH）、6.36（dd、J=16、4Hz、1H、Ar-CH=CH）、4.15（d、J=4Hz、1H、CH）；［α］26Ｄ＝＋４４．７（ｃ＝１．００３、DMF/5 M HCl=10/1）。
【００８３】
なお、反応に用いたα-アミノトランスフェラーゼ（ST1411）はアミノドナーとしてL-アミノ酸を認識すること、及び、文献（Tetrahedron, Vol. 53, pp.8295-8306, 1997）においてD-2-アミノ-4-フェニルブタ-3-エン酸の旋光度が［α］Ｄ＝−７７であることから、本実施例で合成した2-アミノ-4-m-クロロフェニルブタ-3-エン酸はL体であると考えた。
【００８４】
以上のように合成された2-アミノ-4-p-トルイルブタ-3-エン酸、2-アミノ-4-o-メトキシフェニルブタ-3-エン酸、及び2-アミノ-4-m-クロロフェニルブタ-3-エン酸は、L-アミノ酸を基質とする生体由来の酵素を用いて製造しているのでL体の化合物（化合物(４)〜(６)）であると考えられる。
【００８５】
［実施例３］各種アミノトランスフェラーゼ溶液の調製
表１に示す、外来遺伝子としての各種α−アミノトランスフェラーゼ遺伝子、プライマー、並びに、PCR産物及びベクターの消化用制限酵素を用い、TVN0402、PTO0509、及びPAE2315の遺伝子においてはpET21a(+)の代わりにpET21dを用いた他は、実施例１に記載の方法に準じてHis-tagと各種アミノトランスフェラーゼとの融合タンパク質を含むアミノトランスフェラーゼ溶液を得た。なお、PH0207遺伝子においては、配列番号３７及び３８に示されるプライマーを用いて一回目のPCRを行い、配列番号３７及び３９に示されるプライマーを用いて二回目のPCRを行った。
【００８６】
【表１】
2007295865.tif 000027
【００８７】
［実施例４］
次に、実施例３で得られた各種アミノトランスフェラーゼ溶液を用いることにより、実施例１で得られたアミノトランスフェラーゼ（ST1411）溶液と同様に、一般式(Ｉ)で表されるビニルグリオキシル酸誘導体から、一般式(II)で表されるL-ビニルグリシン誘導体を製造できるかどうかを調べた。
【００８８】
１０ｍＭのビニルグリオキシル酸誘導体（化合物(１)〜(３)）、０．５ｍＭのピリドキサールリン酸、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、および４０ｍＭのL-グルタミン酸を含む反応液１９０μｌに、各種アミノトランスフェラーゼ溶液（０．０５μｇ/μｌ）を１０μｌ加えて、ST1411、APE0169、PAE2315、PH0207、MJ0001、及びPH1371は８０℃、PTO0509、TM1131、TTHA0411、TTE2440、TTE0301、及びTTE1206は７０℃、TVN0402は６０℃、PP3590は３５℃でそれぞれ２−５分間酵素反応を行った。
【００８９】
反応終了後、３０％トリクロロ酢酸水溶液５０μｌを加えて反応を停止し、反応系中に生成した目的のL-ビニルグリシン誘導体（化合物(４)〜(６)）を、Ｍａｒｆｅｙ’ｓ試薬を用いて誘導体化した。その後、XTerra MS C18 IS 3.5 μm (4.6 mmφ x 20 mm, Waters)カラムを用いたHPLCで測定し、目的のL-ビニルグリシン誘導体（化合物(４)〜(６)）が生成されたかどうかを調べた。その結果を表２に示す。なお、表２中の「○」は、目的のL-ビニルグリシン誘導体の生成が確認されたことを意味する。
【００９０】
【表２】
2007295865.tif 000028
【００９１】
表２に示すように、ST1411、TVN0402、APE0169、PTO0509、PAE2315、TM1131、PH0207等の疎水性アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、TTE2440、TTE0301、MJ0001、PH1371等の芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼなどは、一般式(Ｉ)で表されるビニルグリオキシル酸誘導体から、一般式(II)で表されるL-ビニルグリシン誘導体への反応を触媒する作用を有していることが明らかになった。これに対して、TTHA0411、TTE1206、及びPP3590などのアミノトランスフェラーゼを用いても一般式(Ｉ)で表されるビニルグリオキシル酸誘導体から、上述の一般式(II)で表されるL-ビニルグリシン誘導体を得ることができないことが明らかになった。
【００９２】
［実施例５］
次に、一般式(Ｉ)で表されるビニルグリオキシル酸誘導体から、上述の一般式(II)で表されるL-ビニルグリシン誘導体への反応を触媒する作用を有するアミノトランスフェラーゼと、前記作用を有しないアミノトランスフェラーゼとの違いを調べるため、各アミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列情報を用いて相同性検索を行った。なお、相同性検索は、NCBIのAlign two sequences (bl2seq；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi)を用いて行った。表３にST1411及びTTE0301に対する相同性検索結果を示す。
【００９３】
【表３】
2007295865.tif 000029
【００９４】
また、各種アミノトランスフェラーゼの天然型アミノ酸に対する酵素活性の違いを調べるために、以下の実験を行った。４０ｍＭの２-オキソグルタル酸、０．５ｍＭのピリドキサールリン酸、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、および４０ｍＭの各種天然型アミノ酸を含む各反応液１９０μｌに、各種アミノトランスフェラーゼ溶液（０．０５μｇ/μｌ）を１０μｌ加えて８０℃で２から５分間酵素反応を行った。なお、PP3590においては、３５℃で５分間酵素反応を行った。
【００９５】
反応終了後、３０％トリクロロ酢酸水溶液５０μｌを加えて反応を停止し、反応系中に生成したL-グルタミン酸をＭａｒｆｅｙ’ｓ試薬を用いて誘導体化した。その後、XTerra MS C18 IS 3.5 μm (4.6 mmφ x 20 mm, Waters)カラムを用いたＨＰＬＣで定量した。その結果を図１〜１４に示す。
【００９６】
表３及び図１〜７に示すように、ST1411、TVN0402、APE0169、PTO0509、PAE2315、TM1131、及びPH0207は、ST1411との相同性が４０％以上であり、L-フェニルアラニン及びL-ロイシンに対する活性が３０Ｕ／ｍｇ以上であることが明らかになった。また、表３及び図８〜１１に示すように、TTE2440、TTE0301、MJ0001、及びPH1371は、TTE0301との相同性が４０％以上であり、L-フェニルアラニン及びL-ロイシンに対する活性が３０Ｕ／ｍｇ以上であることが明らかになった。
【００９７】
これに対して、表３及び図１２に示すように、TTHA0411はL-フェニルアラニン及びL-ロイシンに対する活性が３０Ｕ／ｍｇ以上であるが、ST1411及びTTE0301との相同性が共に４０％未満であることがわかった。また、表３及び図１３に示すように、TTE1206はTTE0301との相同性が４０％以上であるが、L-フェニルアラニン及びL-ロイシンに対する活性が３０Ｕ／ｍｇ以下であり、表３及び図１４に示すように、PP3590はST1411及びTTE0301との相同性が共に４０％未満で、L-フェニルアラニンに対する活性が３０Ｕ／ｍｇ以上であるが、L-ロイシンに対する活性は３０Ｕ／ｍｇ未満であることが明らかになった。
【００９８】
以上のことから、配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列との相同性が４０％以上であり、かつ、L-フェニルアラニン及びL-ロイシンからL-グルタミン酸を生成する酵素活性がともに３０Ｕ／ｍｇ以上であるアミノトランスフェラーゼ（例えば、ST1411、TVN0402、APE0169、PTO0509、PAE2315、TM1131、PH0207等の疎水性アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、あるいは、TTE2440、TTE0301、MJ0001、PH1371等の芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼ）（ここで、酵素活性の測定は、４０ｍＭの２-オキソグルタル酸、０．５ｍＭのピリドキサールリン酸、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、および４０ｍＭのL-フェニルアラニンまたはL-ロイシンを含む反応液１９０μｌに、上記タンパク質（０．０５μｇ/μｌ）を１０μｌ加えて酵素反応を行った後、生成したL-グルタミン酸を定量することにより行うものとする。また、１Ｕは１分間に１μmolのL-グルタミン酸を生成する酵素量を示す。）は、一般式(Ｉ)で表されるビニルグリオキシル酸誘導体から一般式(II)で表されるL-ビニルグリシン誘導体への反応を触媒する作用、及び、一般式(II)で表されるL-ビニルグリシン誘導体から一般式(Ｉ)で表されるビニルグリオキシル酸誘導体への反応を触媒する作用を有することがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】本発明の一実施例において、アミノトランスフェラーゼ（ST1411）の天然型アミノ酸に対する酵素活性を調べた結果を示す図である。
【図２】本発明の一実施例において、アミノトランスフェラーゼ（TVN0402）の天然型アミノ酸に対する酵素活性を調べた結果を示す図である。
【図３】本発明の一実施例において、アミノトランスフェラーゼ（APE0169）の天然型アミノ酸に対する酵素活性を調べた結果を示す図である。
【図４】本発明の一実施例において、アミノトランスフェラーゼ（PTO0509）の天然型アミノ酸に対する酵素活性を調べた結果を示す図である。
【図５】本発明の一実施例において、アミノトランスフェラーゼ（PAE2315）の天然型アミノ酸に対する酵素活性を調べた結果を示す図である。
【図６】本発明の一実施例において、アミノトランスフェラーゼ（TM1131）の天然型アミノ酸に対する酵素活性を調べた結果を示す図である。
【図７】本発明の一実施例において、アミノトランスフェラーゼ（PH0207）の天然型アミノ酸に対する酵素活性を調べた結果を示す図である。
【図８】本発明の一実施例において、アミノトランスフェラーゼ（TTE2440）の天然型アミノ酸に対する酵素活性を調べた結果を示す図である。
【図９】本発明の一実施例において、アミノトランスフェラーゼ（TTE0301）の天然型アミノ酸に対する酵素活性を調べた結果を示す図である。
【図１０】本発明の一実施例において、アミノトランスフェラーゼ（MJ0001）の天然型アミノ酸に対する酵素活性を調べた結果を示す図である。
【図１１】本発明の一実施例において、アミノトランスフェラーゼ（PH1371）の天然型アミノ酸に対する酵素活性を調べた結果を示す図である。
【図１２】本発明の一実施例において、アミノトランスフェラーゼ（TTHA0411）の天然型アミノ酸に対する酵素活性を調べた結果を示す図である。
【図１３】本発明の一実施例において、アミノトランスフェラーゼ（TTE1206）の天然型アミノ酸に対する酵素活性を調べた結果を示す図である。
【図１４】本発明の一実施例において、アミノトランスフェラーゼ（PP3590）の天然型アミノ酸に対する酵素活性を調べた結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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