(57)【要約】【課題】  安価で、安全性が高く、機械的に強く、水分散性も良好なリガンド固定化用架橋ポリマー粒子、リガンド結合ポリマー粒子及びそれを用いたアフィニティ精製方法の提供。【解決手段】  リガンドを固定化可能な官能基を含む架橋ポリマー粒子であるリガンド固定化用架橋ポリマー粒子であって、前記架橋ポリマー粒子が（メタ）アクリレート及び／又はスチレン系モノマーの重合体であり、且つ前記架橋ポリマー粒子のシリコーンオイル中での粒子径ｄ１とリン酸緩衝生理食塩水中での粒子径ｄ２とが下記式（１）を満たすリガンド固定化用架橋ポリマー粒子、リガンド結合ポリマー粒子及びそれを用いたアフィニティ精製方法。０．９５  ＜  ｄ２／ｄ１  ＜  １．１５      式（１）【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンドを固定化可能な官能基を含む架橋ポリマー粒子であるリガンド固定化用架橋ポリマー粒子であって、
前記架橋ポリマー粒子が（メタ）アクリレートの重合体であり、且つ前記架橋ポリマー粒子のシリコーンオイル中での粒子径ｄ１とリン酸緩衝生理食塩水中での粒子径ｄ２とが下記式（１）を満たすリガンド固定化用架橋ポリマー粒子。
０．９５  ＜  ｄ２／ｄ１  ＜  １．１５      式（１）
【請求項２】
リガンドを固定化可能な官能基を含む架橋ポリマー粒子であるリガンド固定化用架橋ポリマー粒子であって、
前記架橋ポリマー粒子が（メタ）アクリレートとスチレン系モノマーとの共重合体であり、且つ前記架橋ポリマー粒子のシリコーンオイル中での粒子径ｄ１とリン酸緩衝生理食塩水中での粒子径ｄ２とが下記式（１）を満たすリガンド固定化用架橋ポリマー粒子。
０．９５  ＜  ｄ２／ｄ１  ＜  １．１５      式（１）
【請求項３】
前記官能基が、下記化学式（１）で示されるマレイミジル基である請求項１又は２に記載のリガンド固定化用架橋ポリマー粒子。
【化１】
2007023203.tif 000007
【請求項４】
リガンドを固定化可能な官能基を含む架橋ポリマー粒子であるリガンド固定化用架橋ポリマー粒子であって、
前記官能基が、下記化学式（１）で示されるマレイミジル基であり、前記架橋ポリマー粒子がスチレン系モノマーの重合体であり、且つ前記架橋ポリマー粒子のシリコーンオイル中での粒子径ｄ１とリン酸緩衝生理食塩水中での粒子径ｄ２とが下記式（１）を満たすリガンド固定化用架橋ポリマー粒子。
０．９５  ＜  ｄ２／ｄ１  ＜  １．１５      式（１）
【化２】
2007023203.tif 000008
【請求項５】
前記リガンドが、メルカプト基を有するペプチド及びタンパク質から選択される少なくとも一種である請求項１乃至４のいずれか１項に記載のリガンド固定化用架橋ポリマー粒子。
【請求項６】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載のリガンド固定化用架橋ポリマー粒子にペプチド及びタンパク質から選択される少なくとも一種を固定化して得られたリガンド結合ポリマー粒子。
【請求項７】
請求項６に記載のリガンド結合ポリマー粒子を用いたアフィニティ精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リガンド固定化用架橋ポリマー粒子、リガンド結合ポリマー粒子及びアフィニティ精製方法に関し、特に診断薬および医薬品担体、クロマトグラフィ担体、バイオセンサー、バイオチップ、樹脂成形材料のような用途に好適に使用可能なリガンド固定化用架橋ポリマー粒子、リガンド結合ポリマー粒子及びアフィニティ精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イオン交換樹脂、キレート樹脂のような機能性ポリマー粒子は、種々の化学物質の担体として従来から広く用いられている。このような機能性ポリマー粒子は、不溶性の重合体の表面に種々の反応性基を有する。従来からカルボキシル基、水酸基、および１級および２級アミノ基のような種々の活性水素含有基が導入された機能性ポリマーが種々の用途に用いられてきた。
【０００３】
近年では、核酸やペプチド、抗体のような生体分子あるいは生体分子類似の合成分子を活性を保持したままポリマー粒子に固定し、アフィニティクロマトグラフィや診断薬、検査薬などに用いられるようになった。このようにより選択性の高い担持体粒子として用いる場合は、生体分子あるいは生体分子類似の合成分子中のＳＨ基との間に選択的で安定な結合を形成し確実に担持可能なマレイミジル基を有するものが望まれていた。このような用途では、ポリマー担体は所望量の物質を均一かつ確実に担持する必要があり、かつ、水系溶媒に対する良好な分散性を有する必要がある。
【０００４】
マレイミジル基を有するポリマー粒子の公知例は少ない。例えば、マレイミジル基を含有するリン脂質膜が表面に存在する微粒子が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。
しかしながら、この方法では、Ｎ−（６−マレイミドカプロイロキシ）サクシンイミドのごときマレイミジル基含有化合物をリン脂質と反応させ、カラムクロマトグラフィなどの方法で精製してマレイミジル基含有リン脂質をあらかじめ作製しなければならない。さらに、多段の処理をへてマレイミジル基を含有するリン脂質膜を作製し、これを磁性粒子のごとき核粒子上に形成するので、工程がきわめて複雑で、さらに核粒子とマレイミジル基を含有するリン脂質膜とは化学結合していないので物理的に弱いという欠点がある。
【０００５】
また、マレイミジル基を含有するポリスチレン粒子が掲載されている例がある（例えば、非特許文献１参照。）。しかしながら、マレイミジル基は疎水性が強い官能基で、水性媒体中での分散性が非常に悪いものであった。
さらに、アフィニティ精製によって目的のタンパク質を多量に確保するためには多量のリガンドと多量の固定化担体が必要になり、精製に伴うコストが増大するという問題があった。また、多量の固定化担体から目的タンパク質を溶出させる場合は固定化担体の体積に見合った溶出バッファーを必要とすることから、得られた精製タンパク質の濃度が低くなってしまうため濃縮する工程が必要となった。
【特許文献１】特開平１１−１０６３９１号公報
【非特許文献１】２００１／２００２製品カタログ，Ｆｕｌｋａ社，ｐ．９０９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記従来の問題点に鑑みてなされたものであり、少ない固定化担体量で効率良くタンパク質を精製することが可能で、特殊な原料や反応性官能基を有する単量体を必要とせず、安価で、安全性が高く、機械的に強く、水分散性も良好なリガンド固定化用架橋ポリマー粒子、リガンド結合ポリマー粒子及びそれを用いたアフィニティ精製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、架橋ポリマー粒子のシリコーンオイル中での粒子径とリン酸緩衝生理食塩水中での粒子径との比が所定範囲内にあるリガンド固定化用架橋ポリマー粒子を見出し、さらにこの粒子にリガンドを固定化させたリガンド結合ポリマー粒子及びそれを用いたアフィニティ精製方法を見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
即ち、本発明は、
＜１＞  リガンドを固定化可能な官能基を含む架橋ポリマー粒子であるリガンド固定化用架橋ポリマー粒子であって、前記架橋ポリマー粒子が（メタ）アクリレートの重合体であり、且つ前記架橋ポリマー粒子のシリコーンオイル中での粒子径ｄ１とリン酸緩衝生理食塩水中での粒子径ｄ２とが下記式（１）を満たすリガンド固定化用架橋ポリマー粒子である。
【０００９】
０．９５  ＜  ｄ２／ｄ１  ＜  １．１５      式（１）
【００１０】
＜２＞  リガンドを固定化可能な官能基を含む架橋ポリマー粒子であるリガンド固定化用架橋ポリマー粒子であって、前記架橋ポリマー粒子が（メタ）アクリレートとスチレン系モノマーとの共重合体であり、且つ前記架橋ポリマー粒子のシリコーンオイル中での粒子径ｄ１とリン酸緩衝生理食塩水中での粒子径ｄ２とが下記式（１）を満たすリガンド固定化用架橋ポリマー粒子である。
【００１１】
０．９５  ＜  ｄ２／ｄ１  ＜  １．１５      式（１）
【００１２】
＜３＞  前記官能基が、下記化学式（１）で示されるマレイミジル基である＜１＞又は＜２＞に記載のリガンド固定化用架橋ポリマー粒子である。
【００１３】
【化１】
2007023203.tif 000002
【００１４】
＜４＞  リガンドを固定化可能な官能基を含む架橋ポリマー粒子であるリガンド固定化用架橋ポリマー粒子であって、前記官能基が、下記化学式（１）で示されるマレイミジル基であり、前記架橋ポリマー粒子がスチレン系モノマーの重合体であり、且つ前記架橋ポリマー粒子のシリコーンオイル中での粒子径ｄ１とリン酸緩衝生理食塩水中での粒子径ｄ２とが下記式（１）を満たすリガンド固定化用架橋ポリマー粒子である。
【００１５】
０．９５  ＜  ｄ２／ｄ１  ＜  １．１５      式（１）
【００１６】
【化２】
2007023203.tif 000003
【００１７】
＜５＞  前記リガンドが、メルカプト基を有するペプチド及びタンパク質から選択される少なくとも一種である＜１＞乃至＜４＞のいずれか１つに記載のリガンド固定化用架橋ポリマー粒子である。
【００１８】
＜６＞  ＜１＞乃至＜４＞のいずれか１つに記載のリガンド固定化用架橋ポリマー粒子にペプチド及びタンパク質から選択される少なくとも一種を固定化して得られたリガンド結合ポリマー粒子である。
【００１９】
＜７＞  ＜６＞に記載のリガンド結合ポリマー粒子を用いたアフィニティ精製方法である。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、少ない固定化担体量で効率良くタンパク質を精製することが可能で、特殊な原料や反応性官能基を有する単量体を必要とせず、安価で、安全性が高く、機械的に強く、水分散性も良好なリガンド固定化用架橋ポリマー粒子、リガンド結合ポリマー粒子及びそれを用いたアフィニティ精製方法を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明のリガンド固定化用架橋ポリマー粒子、リガンド結合ポリマー粒子及びアフィニティ精製方法について詳細に説明する。
本発明の第一のリガンド固定化用架橋ポリマー粒子（以下、「第一の粒子」と称することがある。）は、リガンドを固定化可能な官能基を含む架橋ポリマー粒子であって、前記架橋ポリマー粒子が（メタ）アクリレートの重合体であり、且つ前記架橋ポリマー粒子のシリコーンオイル中での粒子径ｄ１とリン酸緩衝生理食塩水中での粒子径ｄ２とが下記式（１）を満たすものである。
【００２２】
また、本発明の第二のリガンド固定化用架橋ポリマー粒子（以下、「第二の粒子」と称することがある。）は、リガンドを固定化可能な官能基を含む架橋ポリマー粒子であって、前記架橋ポリマー粒子が（メタ）アクリレートとスチレン系モノマーとの共重合体であり、且つ前記架橋ポリマー粒子のシリコーンオイル中での粒子径ｄ１とリン酸緩衝生理食塩水中での粒子径ｄ２とが下記式（１）を満たすものである。
【００２３】
０．９５  ＜  ｄ２／ｄ１  ＜  １．１５      式（１）
【００２４】
第一又は第二の粒子を用いてアフィニティ精製を行えば、ターゲット物質の精製量を向上させることができる。アフィニティ精製による精製量が向上するメカニズムは定かではないが、ｄ２／ｄ１の値が０．９５より高く１．１５未満の範囲内にある場合には、粒子は溶液中でも剛直な状態にあり、リガンドと目的精製物質とのアフィニティカップリングが安定に行われるため、精製量が向上するものと考えられる。
ｄ２／ｄ１の値が０．９５以下の場合には、粒子のリン酸緩衝生理食塩水中へのなじみが悪く粒子が凝集し、リガンドの固定化やアフィニティカップリングがスムーズに行われないので好ましくない。また、ｄ２／ｄ１の値が１．１５以上の場合には、粒子が膨潤して表面が不安定な状態となりアフィニティカップリングが行われにくくなるため好ましくない。ｄ２／ｄ１の値は、好ましくは１．０以上１．１未満である。
【００２５】
本発明において粒子径とは、２００個の粒子の直径の平均値をいう。また、本発明においてｄ１とは、粒子をシリコーンオイル中に分散させた状態で光学顕微鏡を用いて測定された値をいい、ｄ２とは、粒子をリン酸緩衝生理食塩水中に分散させた状態で光学顕微鏡を用いて測定された値をいう。なお、ｄ１を測定する際に用いられるシリコーンオイルとしては、直鎖状シリコーンオイルで例えばジメチルシリコーンオイル等が挙げられる。
【００２６】
第一及び第二の粒子に含まれるリガンドを固定化可能な官能基は特に限定されるものではなく、例えば、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、メルカプト基、アミド基、下記化学式（１）で示されるマレイミジル基等を挙げることができる。
【００２７】
【化３】
2007023203.tif 000004
【００２８】
リガンドとしてメルカプト基を有する分子を用いた場合、リガンドを固定化可能な官能基としてはメルカプト基との間に選択的で安定な結合を形成することが可能な、化学式（１）で示されるマレイミジル基が好ましい。
【００２９】
本発明の第三のリガンド固定化用架橋ポリマー粒子（以下、単に「第三の粒子」と称することがある。）は、リガンドを固定化可能な官能基を含む架橋ポリマー粒子であって、前記官能基が、化学式（１）で示されるマレイミジル基であり、前記架橋ポリマー粒子がスチレン系モノマーの重合体であり、且つ前記架橋ポリマー粒子のシリコーンオイル中での粒子径ｄ１とリン酸緩衝生理食塩水中での粒子径ｄ２とが式（１）を満たすものである。
【００３０】
第三の粒子における粒子径、ｄ１及びｄ２の定義は第一の粒子の場合と同様である。また、ｄ２／ｄ１の値の好ましい範囲も第一の粒子の場合と同様である。
【００３１】
次に、第一、第二及び第三の粒子（以下、これらの粒子を総じて「本発明の粒子」と称することがある。）に係る架橋ポリマー粒子について説明する。
本発明に係る架橋ポリマー粒子において、「（メタ）アクリレート」とは、常用されるように「アクリル酸エステル」および「メタクリル酸エステル」をいい、スチレン系モノマーとしてはスチレンおよびスチレン誘導体をいう。
【００３２】
（メタ）アクリレートにおいて、（メタ）アクリル酸エステルのアルコール残基のアルキル基は、炭素数１〜１８のアルキル基であり、無置換でも置換基を有していても良く、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、ｎ−オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、ベンジル、ヒドロキシエチル、水酸基をジヒドロピラン等の疎水性保護基で保護したヒドロキシエチル、ポリオキシエチレン等が挙げられる。ポリマーを加水分解して（ポリ）エチレングリコールを導入させる場合には、ｔ−ブチル（メタ）アクリレートをその一成分として存在させることが好ましい。
【００３３】
前記スチレン系モノマーとしては、炭素数６〜１２のアリール基を有するビニル基含有モノマーであり、無置換でも置換基を有していても良く、例えば、フェニル、ナフチル、トリル、ｐ−ｎ−オクチルオキシフェニル等が挙げられるが、フェニルが好ましい。
前記置換基としては、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子、アリール基等が挙げられる。
該アルキル基としては、前述のアルキル基の場合と同義である。該アルコキシ基としては、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ等が挙げられ、メトキシ、エトキシが好ましい。
該ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられるが、フッ素原子、塩素原子が好ましい。
該アリール基としては、前述のアリール基の場合と同義である。
【００３４】
本発明に係る架橋ポリマー粒子は、具体的には、前記単量体と、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート、２−（［１’−メチルプロピリデンアミノ］カルボキシアミノ）エチル（メタ）アクリレート等の架橋性を有する単量体（架橋剤）とを共重合することによって得られる架橋ポリマーであり、重合時に架橋構造とするか、重合によるポリマー粒子化した後に架橋させてもよく、架橋剤の添加量を変えることによって、粒子径ｄ１及び粒子径ｄ２をコントロールすることが可能である。
【００３５】
また、本発明に係る架橋ポリマー粒子は、前記単量体以外の他の単量体を共重合させたものであってもよい。
【００３６】
本発明において、架橋ポリマー粒子を得る粒子化には公知の方法が利用でき、例えば、懸濁重合法、乳化重合法、分散重合法、シード重合法等が好適に用いられる。さらに、膜乳化法として知られる乳化方法を使って懸濁重合することもできる。
【００３７】
さらに架橋ポリマー粒子の着色を目的に、公知の染料、顔料、カーボンブラック、磁性粉などを添加することも可能である。
【００３８】
本発明の粒子の粒子径（ｄ１）は、特に限定されるものではなく、種々の用途に応じて選択可能であるが、一般的に１〜１０００μｍであり、中でも、固液分離の容易性の観点から、３〜５００μｍであることが好ましく、特に、５〜１００μｍであることが好ましい。
粒子径（ｄ１）を１〜１０００μｍの範囲とすることにより単位質量当たりの十分な反応量を維持したまま、濾過あるいは遠心分離による固液分離特性を向上させることが可能である。
【００３９】
本発明の粒子にペプチド及びタンパク質から選択される少なくとも一種を固定化することにより本発明のリガンド結合ポリマー粒子が得られる。化学式（１）で示されるマレイミジル基とメルカプト基との間では選択的で安定な結合を形成可能なことから、本発明のリガンド結合ポリマー粒子は、化学式（１）で示されるマレイミジル基を含む本発明の粒子にメルカプト基を有するペプチド及びタンパク質から選択される少なくとも一種を固定化して得られたものが好ましい。
本発明の粒子が化学式（１）で示されるマレイミジル基を含む場合、該マレイミジル基を架橋ポリマー粒子の表面に有しても、また、架橋ポリマー粒子の内部に有しても、また、表面及びその内部の両方に有しても良い。
【００４０】
本発明の粒子が化学式（１）で示されるマレイミジル基を含む場合、該マレイミジル基を０．０００１ｍｍｏｌ／ｇ以上含有することが好ましく、単位質量当たりの反応量をできるだけ多くするという観点から、０．００１ｍｍｏｌ／ｇ以上が更に好ましく、特に、０．００２ｍｍｏｌ／ｇ以上が好ましい。０．００２ｍｍｏｌ／ｇ以上とすることによりリガンドであるＳＨ基含有化合物の粒子への固定化率を高くすることが可能である。
化学式（１）で示されるマレイミジル基は、架橋ポリマー粒子に直接化学結合していてもよいし、スペーサー鎖を介して架橋ポリマー粒子に化学結合していてもよい。スペーサー鎖としては、具体的には、ポリオキシエチレン鎖、ポリオキシプロピレン基、アルキレン鎖、ポリアミノエチレン鎖、ペプチド鎖、ポリエステル鎖等が挙げられる。
【００４１】
スペーサー鎖は、二官能性スペーサー化合物と架橋ポリマー粒子とを反応させて化学的に結合することにより得ることが可能であり、あらかじめスペーサー化合物が導入された（メタ）アクリレートもしくは、その前駆体が導入された（メタ）アクリレートを共重合させて直接導入しても良い。
二官能性スペーサー化合物の官能基としては、架橋ポリマー粒子とスペーサー化合物および、スペーサー化合物とマレイミジル基を有する化合物と反応するものであり、例えば、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００４２】
粒子へのマレイミジル基の導入方法としては、架橋ポリマー粒子もしくは架橋ポリマー粒子上のスペーサーとヒドロキシメチルマレイミドとを反応させる方法が挙げられる。
架橋ポリマー粒子もしくは架橋ポリマー粒子上のスペーサーとヒドロキシメチルマレイミドとの反応は、水１分子が外れて縮合した形態であり、従来公知のエーテル化触媒の存在下での縮合反応によって行うことができるがこれに限定されるものではない。
【００４３】
本発明の粒子に含まれるマレイミジル基量は、粒子に存在するマレイミジル基を過剰量の２−メルカプトエチルアミンと反応させ、反応後に残った２−メルカプトアミンの量を測定することにより、反応前後のメルカプトエチルアミン量の変化量から求めることができる。その具体例としては、例えば、（株）同仁化学研究所の総合カタログ（平成１４年３月２９日発行）第一部プロトコル集の８０ページに記載されている。
【００４４】
本発明の粒子は、粒子を分級処理し粒径をそろえて使用することが望ましく、最終的にはメタノール等の溶媒に希釈分散させ、濾別し、更に水洗及び／又は溶剤洗浄の後、噴霧乾燥、減圧乾燥、凍結乾燥等の通常の手段によって粉体として単離することが可能である。
【００４５】
本発明に用いられるリガンドは、ターゲット物質と相互作用をもつペプチドおよび／またはタンパク質であり、生理活性を有していれば合成物質でも天然物質でもよいが、マレイミジル基と反応するためのメルカプト基を有するペプチド及びタンパク質から選択される少なくとも一種であることが好ましい。
リガンドがペプチドである場合、ペプチドを構成するアミノ酸中にシステインが含まれていれば、システインの構造中にあるメルカプト基を用いて容易にマレイミジル基との反応が可能である。ペプチドにおけるシステインの位置は末端であっても鎖中であっても構わないが、アフィニティ結合性を考慮すると末端に存在している方が好ましい。また、ペプチド中に複数存在しているシステインが結合してジスルフィド結合が生成している場合には、ジスルフィド結合を還元してメルカプト基を作成して用いることが可能である。
【００４６】
リガンドがタンパク質である場合、そのリガンド上にメルカプト基の数を十分に有する場合にはそのまま反応に使用することも可能であるが、リガンドが生理活性物質の場合、一般的に生理活性物質上のメルカプト基の数は少なく、反応性に乏しいため、生理活性物質にメルカプト基を導入する必要がある。この場合、生理活性物質にメルカプト基を導入する方法として、メルカプト基と他の反応性基を併せ持つ化合物を生理活性物質に反応させる方法や、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネートなどの架橋剤を利用してピリジルジスルフィド基を生理活性物質に導入した後、このピリジルジスルフィド基を還元してメルカプト基を導入する方法、あるいは、還元剤によりタンパク質分子内のジスルフィド結合を還元してメルカプト基を生成する方法などがあげられる。
【００４７】
メルカプト基と他の反応性基を併せ持つ化合物としては、２−メルカプトエタノール、６−メルカプト−１−ヘキサノール、メルカプトウンデカノール、２−アミノエタンチオール、メルカプト酢酸、メルカプトプロピオン酸、メルカプトコハク酸、メルカプトウンデカン酸、メルカプト安息香酸、２−メルカプトスルホン酸、メルカプトフェノール、システインなどがあげられる、これら化合物のメルカプト基以外の反応性基を利用してリガンドに反応させれば、メルカプト基をリガンドに導入することができる。また、このような化合物以外にも２−イミノチオランを使用すれば、これがリガンドのアミノ基と反応して、リガンドにメルカプト基を簡単に導入することができる。
また、上記のピリジルジスルフィド基やリガンド内のジスルフィド基を還元する際に使用する還元剤としては、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール、システイン、メルカプトエチルアミン、還元型グルタチオンなどがあげられる。
【００４８】
リガンドのメルカプト基とマレイミジル基との反応は、化学式（１）で示されるマレイミジル基を含む本発明の粒子を、リガンドを含む溶液中に分散させて反応させたり、また、該粒子を分散させた溶液とリガンドを含む溶液とをそれぞれ作成しこれらを常温で混合して反応させたりすることにより容易に行うことができる。さらには、あらかじめカラムに充填した該粒子をリガンド溶液で浸漬して反応させることによっても行うことができるがこれらに限定されるものではない。
このとき、リガンドの粒子への反応を効率よく行うために加温しても良いし、逆に、リガンドの熱変性を防ぐため低温条件下で行っても良く、具体的には４℃以上３７℃以下で行うことが好ましい。
【００４９】
リガンドを含む溶液の溶媒としては、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン−塩酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ハンクス緩衝液など各種緩衝液が好ましく、緩衝液にジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、メタノール、エタノール、アセトンなどの有機溶媒を添加しても良い。さらに、溶液中にはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩のようなキレート剤やドデシル硫酸ナトリウムやポリオキシエチレンアルキルエーテル等の一般的な界面活性剤を添加することも可能である。
【００５０】
本発明のアフィニティ精製方法は、本発明のリガンド結合ポリマー粒子を用いて行われる。本発明のリガンド結合ポリマー粒子を用いることにより、リガンドと相互作用するターゲット物質の捕捉が可能となり、さらにターゲット物質を粒子から脱離させることによってターゲット物質の回収、精製が可能になる。
ターゲット物質を捕捉あるいは回収する際に使用する溶媒として、様々なｐＨ値のリン酸、酢酸、クエン酸などの緩衝液をもちいることができ、さらに緩衝液の中にウシ血清アルブミンや抗体などのタンパク質あるいはカチオン性、アニオン性などのポリマーなどを含有していても良い。
【００５１】
ターゲット物質は、ターゲット物質を補足したリガンド結合ポリマー粒子を捕捉時の条件と異なる溶液にさらすことで粒子から脱離させることにより回収可能である。ターゲット物質の脱離条件としては、緩衝液の化学種、塩濃度、ｐＨを変える方法が挙げられるがこれに限定されるものではない。
本発明のリガンド結合ポリマー粒子を用いた精製方法としては、リガンド結合ポリマー粒子をマイクロチューブ等の容器内で分散と遠心分離を繰り返して行う免疫沈降法や、リガンド結合ポリマー粒子をカラム内に充填して行うオープンカラム法、リガンド結合ポリマー粒子を基材に固定化する方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５２】
リガンド結合ポリマー粒子をカラム内に充填して精製を行う方法としては、高圧、中圧、低圧カラムクロマトグラフィ法、オープンカラムクロマトグラフィ法、スピンカラム法、バキュームカラム法等が挙げられ、ターゲット物質の回収性が優れる点で中圧、低圧カラムクロマトグラフィ法、オープンカラムクロマトグラフィ法が好ましいがこれらに限定されるものではない。
リガンド結合ポリマー粒子を基材に固定化する方法としては、平膜状、中空糸状、繊維状、カットファイバーへの固定化等特に限定されるものではないが、特に平膜状、繊維状、が好ましく、粒子を固定化した基盤をスピンカラムやマニホールドバキュームカラムの底辺に固定化して用いることができるがこれに限定されるものではない。
【００５３】
本発明のリガンド結合ポリマー粒子を用いて精製されたターゲット物質の検出と定量は、ターゲット物質を含む溶液の波長２８０ｎｍの吸光度を測定する方法、ニンヒドリン法、ブラッドフォード法、ローリー法等のタンパク質の定量法、ターゲット物質を含む溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥのバンドによる確認、リガンドを固定化したプレートを用いたＥＬＩＳＡ法による定量法が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００５４】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、実施例中、部は質量部を示す。
【００５５】
（架橋ポリマー粒子１の合成）
スチレン（和光純薬（株）製）                          ３５部
ｔ−ブチルメタクリレート（和光純薬（株）製）          ４７部
ジビニルベンゼン（純度５５％）（和光純薬（株）製）      ６部
Ｖ−６０１（和光純薬（株）製）                          ２部
上記の組成で懸濁重合を行い、洗浄／乾燥後、エタノールでソックスレー抽出を１０時間行った後、分級操作を施し平均粒径５５μｍの架橋ポリマー粒子を得た。得られた粒子をイオン交換水及び溶剤で洗浄後、単離乾燥して架橋ポリマー粒子１を得た。
【００５６】
（架橋ポリマー粒子２の合成）
スチレン（和光純薬（株）製）                          ３５部
ｔ−ブチルメタクリレート（和光純薬（株）製）          ４７部
ジビニルベンゼン（純度５５％）（和光純薬（株）製）      ２部
Ｖ−６０１（和光純薬（株）製）                          ２部
上記の組成で架橋ポリマー粒子１の合成の場合と同様な操作を行い、平均粒径５５μｍの架橋ポリマー粒子を得た。得られた粒子をイオン交換水及び溶剤で洗浄後、単離乾燥して架橋ポリマー粒子２を得た。
【００５７】
（架橋ポリマー粒子３の合成）
スチレン（和光純薬（株）製）                            ８２部
ジビニルベンゼン（純度５５％）（和光純薬（株）製）        ６部
Ｖ−６０１（和光純薬（株）製）                        １．５部
上記の組成で架橋ポリマー粒子１の合成の場合と同様な操作を行い、平均粒径５５μｍの架橋ポリマー粒子を得た。得られた粒子をイオン交換水及び溶剤で洗浄後、単離乾燥して架橋ポリマー粒子３を得た。
【００５８】
（架橋ポリマー粒子４の合成）
スチレン（和光純薬（株）製）                            ８２部
ジビニルベンゼン（純度５５％）（和光純薬（株）製）      ４０部
Ｖ−６０１（和光純薬（株）製）                        １．５部
上記の組成で架橋ポリマー粒子１の合成の場合と同様な操作を行い、平均粒径５５μｍの架橋ポリマー粒子を得た。得られた粒子をイオン交換水及び溶剤で洗浄後、単離乾燥して架橋ポリマー粒子４を得た。
【００５９】
（架橋ポリマー粒子５の合成）
スチレン（和光純薬（株）製）                          ３５部
ｔ−ブチルメタクリレート（和光純薬（株）製）          ４７部
ジビニルベンゼン（純度５５％）（和光純薬（株）製）      ４部
Ｖ−６０１（和光純薬（株）製）                          ２部
上記の組成で架橋ポリマー粒子１の合成の場合と同様な操作を行い、平均粒径５５μｍの架橋ポリマー粒子を得た。得られた粒子をイオン交換水及び溶剤で洗浄後、単離乾燥して架橋ポリマー粒子５を得た。
【００６０】
（架橋ポリマー粒子６の合成）
スチレン（和光純薬（株）製）                            ８２部
ジビニルベンゼン（純度５５％）（和光純薬（株）製）      １４部
Ｖ−６０１（和光純薬（株）製）                        １．５部
上記の組成で架橋ポリマー粒子１の合成の場合と同様な操作を行い、平均粒径５５μｍの架橋ポリマー粒子を得た。得られた粒子をイオン交換水及び溶剤で洗浄後、単離乾燥して架橋ポリマー粒子６を得た。
【００６１】
（ヒドロキシメチルマレイミドの合成）
マレイミド（アルドリッチ（株）製）                    ２４部
３５％ホルムアルデヒド（和光純薬（株）製）            ２１部
５％水酸化ナトリウム水溶液                                 ０．７部
上記の組成で４０℃で２時間反応させたところ、ヒドロキシメチルマレイミドの白色結晶が析出した。結晶を減圧濾過後、常温で真空乾燥しヒドロキシメチルマレイミドの粗結晶を得た。このようにして得たヒドロキシメチルマレイミドの粗結晶を酢酸エチルで再結晶し、２２部のヒドロキシメチルマレイミドを得た。
【００６２】
（ポリメタクリル酸含有担体粒子）
架橋ポリマー粒子１、２及び５に対して、下記の方法でカルボキシル基化を行った。
架橋ポリマー粒子                                      １０部
塩酸（和光純薬（株）製）                              ７５部
上記の組成で架橋ポリマー粒子を分散させた後、ジオキサン（和光純薬（株）製）１５０部を加え、８０℃で６時間反応させた。得られた粒子をメタノールに分散／洗浄しさらにイオン交換水及びエタノールで洗浄後、単離乾燥して架橋ポリマー粒子１、２及び５由来のポリメタクリル酸含有担体粒子を得た。
【００６３】
（ポリオキシエチレン鎖導入架橋ポリマー粒子）
ポリメタクリル酸含有担体粒子                            １０部
ポリエチレングリコール２００（和光純薬（株）製）      １５０部
硫酸（和光純薬（株）製）                                １５部
トルエン（和光純薬（株）製）                            ５０部
上記の組成で混合して、トルエンとの共沸を利用して、生成してくる水を系外に除去しながら、１２０℃で５時間反応させた。得られた粒子をエタノール、アセトン、メタノール、イオン交換水で洗浄後、単離乾燥して架橋ポリマー粒子にポリオキシエチレン鎖を導入した架橋ポリマー粒子１、２及び５由来のポリオキシエチレン鎖導入架橋ポリマー粒子１、２及び５を得た。
【００６４】
（クロロメチル化ポリスチレン含有担体粒子）
架橋ポリマー粒子３、４及び６に対して下記の方法で官能基の導入を行った。
架橋ポリマー粒子                                        １０部
トリオキサン（和光純薬（株）製）                          ９部
クロロホルム       （和光純薬（株）製）                      １５０部
クロロトリメチルシラン（和光純薬（株）製）              ３３部
上記の組成で０℃で分散させた後、触媒に塩化スズ（ＩＶ）を１１部加え、２５℃で２時間反応させた。得られた粒子をメタノールに分散／洗浄しさらにイオン交換水及びエタノールで洗浄後、単離乾燥して架橋ポリマー粒子３、４及び６由来のクロロメチル化ポリスチレン含有担体粒子３、４及び６を得た。
【００６５】
（ポリオキシエチレン鎖導入架橋ポリマー粒子）
クロロメチル化ポリスチレン含有担体粒子                  １０部
ポリエチレングリコール２００                            ４５部
ナトリウムメトキシド（和光純薬（株）製）                       １５部
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（和光純薬（株）製）      ３３０部
上記の組成で混合して、８０℃で６時間反応させた。得られた粒子をメタノール、ジオキサン、イオン交換水で洗浄後、単離乾燥して架橋ポリマー粒子にポリオキシエチレン鎖を導入した架橋ポリマー粒子３、４及び６由来のポリオキシエチレン鎖導入架橋ポリマー粒子３、４及び６を得た。
【００６６】
（マレイミジル基の導入）
ポリオキシエチレン鎖導入架橋ポリマー粒子               １０部
ヒドロキシメチルマレイミド                           ３．０部
トルエン                                      ３５０部
上記の組成で６０〜７０℃に加熱撹拌したのち、触媒のｐ−トルエンスルホン酸一水和物を０．５部入れ、温度を上げて６時間還流下反応させた。得られた粒子をメタノールに分散／洗浄しさらに、エタノールで８時間ソックスレー抽出を行った。濾過した後、イオン交換水及びエタノールで再度洗浄後、単離乾燥してマレイミジル基含有ポリマー粒子１、２、３、４、５、６を得て、それぞれをリガンド固定化用架橋ポリマー粒子１、２、３、４、５、６とした。このようにして得られたマレイミジル基含有ポリマー粒子について、２−メルカプトエチルアミン溶液中に粒子を分散させた前後での２−メルカプトエチルアミン量の変化からマレイミジル基の有無を確認したところ、全ての粒子で５μｍｏｌ／ｇ以上マレイミジル基が含有されていることが確認できた。
【００６７】
（粒子径の測定）
リガンド固定化用架橋ポリマー粒子１、２、３、４、５、６を、シリコーンオイルＫＦ−９６Ｌ（信越シリコーン（株）製）中およびリン酸緩衝生理食塩水（りん酸緩衝生理食塩粉末（和光純薬（株）製）を純水に溶解したもの）中に分散し、光学顕微鏡を用いて粒子の写真を撮影し、顕微鏡法に基づいて粒子径ｄ１、ｄ２の測定を行った。粒子径の測定結果およびｄ２／ｄ１を表１に示した。
【００６８】
【表１】
2007023203.tif 000005
【００６９】
本評価によると、リガンド固定化用架橋ポリマー粒子１、３、５及び６は本発明のリガンド固定化用架橋ポリマー粒子の範囲であることからそれぞれ実施例１、２、３、４とし、リガンド固定化用架橋ポリマー粒子２および４は本発明のリガンド固定化用架橋ポリマー粒子に該当しないことからそれぞれ比較例１、２とした。
【００７０】
（アフィニティ精製）
−リガンドの固定化−
実施例１、２、３、４および比較例１、２に係る粒子を、キャップ付きマイクロチューブに１００ｍｇ秤量し、あらかじめ調製したＶ５ペプチド（シグマ社製）１００μｇを含むｐＨ６．５のリン酸緩衝溶液を１ｍｌ加え、室温で穏やかに攪拌して１２時間反応させた。粒子を遠心分離したのち反応前後での上澄み溶液の波長２８０ｎｍの吸光度から下記式（２）に従ってリガンドの結合率Ｌ（％）を求めた。ここで、Ａｆは反応後の吸光度、Ａｉは初期の吸光度を示す。
【００７１】
Ｌ＝（１−Ａｆ／Ａｉ）×１００            （２）
【００７２】
上記の結果、全てのリガンド固定化用架橋ポリマー粒子にリガンドが固定化されたことが確認できたが、特に実施例１、２、３、４および比較例１の粒子はリガンド結合率が高いものであった。一方、比較例２の粒子は実施例と比較すると、リガンド固定化率がやや低いものであった。
【００７３】
−ターゲット物質の捕捉と評価−
上記の操作をした実施例１、２、３、４および比較例１、２に係る粒子を、リン酸緩衝生理食塩水で分散と遠心分離を繰り返して洗浄した後、抗Ｖ５ペプチド抗体ウサギ（シグマ社製）を１０μｇ含むリン酸緩衝生理食塩水を１ｍｌ加え３７℃で穏やかに攪拌して１時間アフィニティカップリング反応させた。粒子を遠心分離し、上澄みを取り除いた後、リン酸緩衝生理食塩水で分散と遠心分離を繰り返して洗浄し、ｐＨ２のグリシン塩酸塩緩衝溶液１ｍｌを加えて抗Ｖ５抗体を脱離させ、それぞれの粒子からターゲット物質捕捉液１、２、３、４、５、６を得た。
あらかじめＶ５ペプチドを固定化したＥＬＩＳＡプレートに、Ｖ５抗体を補足したターゲット物質捕捉液１、２、３、４、５、６をそれぞれ指定倍率に希釈して各ウエルにアプライし、ターゲット物質捕捉液中の抗体をプレートに結合させた。二次抗体にＨＲＰ結合抗ウサギ抗体ヤギ（和光純薬（株）製）を、発色基質にＴＭＢ溶液（和光純薬（株）製）を用い、波長４５０ｎｍの吸光度（Ａ４５０）をマイクロプレートリーダー（ＭＴＰ−３００  コロナ電気（株）製）を用いて測定した。
測定結果及びリガンド固定化用架橋ポリマー粒子の操作性を表２および図１に示す。
なお、非特許文献１に記載のマレイミジル基を含有するポリスチレン粒子のｄ２／ｄ１の値は、発明者による測定によるとｄ２／ｄ１＝０．９４であった。
【００７４】
【表２】
2007023203.tif 000006
【００７５】
上記の結果、実施例１，２、３、４に係る粒子の抗体捕捉量は比較例１，２と比較して高いものであった。さらに実施例１、２、３の粒子はマイクロチューブ中の、操作性としての粒子の分散および遠心分離性が良好でリガンド結合率も良好なものであった。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】実施例、比較例におけるターゲット物質捕捉液のＥＬＩＳＡ評価結果であり、縦軸はマイクロプレートリーダーでの波長４５０ｎｍにおける吸光度（Ａ４５０）を、横軸はサンプル溶液の希釈倍率を示す。
【図１】
2007023203.tif 000009