(57)【要約】【課題】ウシ乳房炎に対する発症抵抗性又は感受性に関連するアリルを見出し、かかる抵抗性又は感受性を判定する方法及び手段を提供すること。【解決手段】被験ウシにおいて、ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子におけるＤＱＡ１＊１２０１アリル及び／又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出することを含む、被験ウシにおけるウシ乳房炎に対する発症抵抗性又は感受性を判定する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験ウシにおいて、ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子におけるＤＱＡ１＊１２０１アリル及び／又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出することを含む、被験ウシにおけるウシ乳房炎に対する発症抵抗性又は感受性を判定する方法。
【請求項２】
被験ウシにおけるウシ乳房炎に対する発症抵抗性又は感受性を判定する方法であって、
（ａ）被験ウシからゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを調製するステップ、
（ｂ）ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子のＤＱＡ１＊１２０１アリル及び／又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出するステップ、
を含み、ＤＱＡ１＊１２０１アリルの存在は、該被験ウシがウシ乳房炎に対する発症抵抗性を有することを示し、ＤＱＡ１＊０１０１アリルの存在は、該被験ウシがウシ乳房炎に対する発症感受性を有することを示すものである、上記方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）が、ポリメラーゼ連鎖反応−塩基配列に基づくタイピング法（ＰＣＲ−ＳＢＴ）により行われる、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）が、
（ｂ１）配列番号２７に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号２８に示される塩基配列からなるプライマーを用いた増幅反応を行うステップ、又は
（ｂ２）配列番号２９に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号３０に示される塩基配列からなるプライマーを用いた増幅反応を行うステップ、
あるいは（ｂ１）及び（ｂ２）の両方のステップを含む、請求項２又は３記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｂ）が、
（ｂ３）得られた増幅産物の塩基配列を決定するステップ、
をさらに含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法を用いてウシ乳房炎に対する発症抵抗性を有すると判定されたウシを用いてウシを作出することを特徴とする、ウシ乳房炎に対する発症抵抗性を有するウシの作出方法。
【請求項７】
ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子のＤＱＡ１＊１２０１アリル及び／又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出する手段を含むことを特徴とする、ウシ乳房炎に対する発症抵抗性又は感受性を判定するためのキット。
【請求項８】
ＤＱＡ１遺伝子の第２エクソンを増幅するためのプライマー、及び／又はＤＱＡ１遺伝子の第２エクソンを配列決定するためのプライマーを含む、請求項７記載のキット。
【請求項９】
（ａ）配列番号２７に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号２８に示される塩基配列からなるプライマー、並びに／又は
（ｂ）配列番号２９に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号３０に示される塩基配列からなるプライマー
を含む、請求項７又は８記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウシ乳房炎に対する発症抵抗性又は感受性の判定方法、並びにそのためのキットに関する。また本発明は、ウシ乳房炎に対する抵抗性を有するウシの作出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウシ乳房炎は、５種類の原因菌（黄色ブドウ球菌、無乳性連鎖球菌、表皮ブドウ球菌、環境性連鎖球菌及び大腸菌群）の感染により発症する感染症であり、畜産界に多大な被害をもたらす。その発症には遺伝的要因が関与することが指摘されており、主要組織適合抗原（ＭＨＣ）もその候補として知られている。ＭＨＣは、クラスＩとクラスＩＩがあり、抗原ペプチドをＴ細胞に提示し液性免疫や細胞性免疫応答を引き起こす非常に多型に富む分子である。そして、この高度な多型性が疾患感受性の個体差を生ずる原因となっている。ウシＭＨＣ（ＢｏＬＡ）と乳房炎との相関性が、クラスＩの遺伝子、クラスＩＩのＤＲＢ３アリル及びＤＱＡアリルで報告されている（非特許文献１）。
【０００３】
ウシ乳房炎の診断は、乳中体細胞数の大小によって判定されている。今までに、乳中体細胞数とＢｏＬＡ−ＤＲＢ３遺伝子との相関性が指摘されている（非特許文献２）。また近年、ＤＮＡチップを用いたタイピング法によって、ＢｏＬＡ−ＤＲＢ３遺伝子及びＢｏＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子が乳房炎の発症に関与することが示されている（非特許文献１）。しかしながら、ＤＮＡチップを用いたタイピング法についてはまだ正確性の検証はなされておらず、またこれは海外のホルスタインについての研究であるため、日本のホルスタインに適用可能であるかは不明であった。
【０００４】
日本のホルスタインを用いた乳房炎の原因遺伝子の解明が行われており、その原因遺伝子としてＦＥＺＬ遺伝子（Forebrain embyronic zinc finger-like）の関与が報告され、その遺伝子の変異の検出を利用した乳房炎の発症抵抗性の判定も報告されている（特許文献１）。
【０００５】
一方、本発明者は、ＢｏＬＡのクラスＩＩに存在するアリルを正確かつ迅速にタイピング可能なＰＣＲ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ｔｙｐｉｎｇ（ＳＢＴ）法を開発している（特許文献２及び３）。このＰＣＲ−ＳＢＴ法を利用したウシ白血病の発症抵抗性の判定方法は開発されているが、乳房炎の発症抵抗性についての報告はまだない。
【０００６】
当該技術分野では、より効率的にかつ確実にウシ乳房炎に対する抵抗性を判定する方法が望まれている。
【０００７】
【特許文献１】特開２００６−６７９２８号公報
【特許文献２】特開２００１−１７８４９９号公報
【特許文献３】ＷＯ２００５／０９５６４８号パンフレット
【非特許文献１】Park Y-H, et al. Characterization of lymphocyte subpopulations and major histocompatibility complex haplotypes of mastitis-resistant and susceptible cows. J. Vet. Sci. 第5(1)巻第29〜39頁、2004年
【非特許文献２】Sharif S, et al. Associations of the bovine major histocompatibility complex DRB3 (BoLA-DRB3) alleles with occurrence of disease and milk somatic cell score in Canadian dairy cattle. Anim Genet. 第29(3)巻第185〜193頁、1998年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ウシ乳房炎に対する発症抵抗性又は感受性に関連するアリルを見出し、かかる抵抗性又は感受性を判定する方法及び手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行い、日本全国から無作為に抽出したウシ検体の集団を対照群とし（以下「対照群」という）、当該対照群と乳房炎発症ウシとを用いてＢｏＬＡ−ＤＱＡ１におけるアリルを検出したところ、ＤＱＡ１＊１２０１アリルが対照群において有意に高頻度に存在し、ＤＱＡ１＊０１０１アリルが乳房炎発症ウシ群において有意に高頻度に存在するという知見を得、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（４）である。
（１）被験ウシにおいて、ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子におけるＤＱＡ１＊１２０１アリル及び／又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出することを含む、被験ウシにおけるウシ乳房炎に対する発症抵抗性又は感受性を判定する方法。
【００１１】
（２）被験ウシにおけるウシ乳房炎に対する発症抵抗性又は感受性を判定する方法であって、
（ａ）被験ウシからゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを調製するステップ、
（ｂ）ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子のＤＱＡ１＊１２０１アリル及び／又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出するステップ、
を含み、ＤＱＡ１＊１２０１アリルの存在は、該被験ウシがウシ乳房炎に対する発症抵抗性を有することを示し、ＤＱＡ１＊０１０１アリルの存在は、該被験ウシがウシ乳房炎に対する発症感受性を有することを示すものである、上記方法。
上記方法において、ステップ（ｂ）は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応−塩基配列に基づくタイピング法（ＰＣＲ−ＳＢＴ）により行うことができる。このステップ（ｂ）は、
（ｂ１）配列番号２７に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号２８に示される塩基配列からなるプライマーを用いた増幅反応を行うステップ、又は
（ｂ２）配列番号２９に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号３０に示される塩基配列からなるプライマーを用いた増幅反応を行うステップ、
あるいは（ｂ１）及び（ｂ２）の両方のステップを含むことが好ましい。またステップ（ｂ）は、（ｂ３）得られた増幅産物の塩基配列を決定するステップをさらに含むことが好ましい。
【００１２】
（３）前項（１）又は（２）に記載の方法を用いてウシ乳房炎に対する発症抵抗性を有すると判定されたウシを用いてウシを作出することを特徴とする、ウシ乳房炎に対する発症抵抗性を有するウシの作出方法。
【００１３】
（４）ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子のＤＱＡ１＊１２０１アリル及び／又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出する手段を含むことを特徴とする、ウシ乳房炎に対する発症抵抗性又は感受性を判定するためのキット。
上記キットは、例えばＤＱＡ１遺伝子の第２エクソンを増幅するためのプライマー、及び／又はＤＱＡ１遺伝子の第２エクソンを配列決定するためのプライマーを含む。例えば、上記キットは、
（ａ）配列番号２７に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号２８に示される塩基配列からなるプライマー、並びに／又は
（ｂ）配列番号２９に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号３０に示される塩基配列からなるプライマー
を含むことができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、ウシ乳房炎に対する発症抵抗性又は感受性の判定方法が提供される。該方法は、ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖におけるＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルの存在を検出することにより、被験ウシの発症抵抗性又は感受性を簡便かつ迅速に判定することができるため、ウシの乳房炎発症機構の研究、ウシ乳房炎に対する発症抵抗性を有するウシの作出などに有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．ウシ乳房炎に対する発症抵抗性又は感受性の判定
本発明は、ウシ乳房炎に対する発症抵抗性又は感受性を判定する方法である。本発明の方法は、ウシ主要組織適合抗原（ＢｏＬＡ）のＤＱ分子のＤＱＡ１＊１２０１アリルをホモ又はヘテロに有するウシ個体が乳房炎の発症に対して抵抗性を示し、ＤＱＡ１＊０１０１アリルをホモ又はヘテロに有するウシ個体が乳房炎の発症に対して感受性を示すという知見に基づくものである。
【００１６】
ウシ主要組織適合抗原（ＢｏＬＡ）とは、移植片や細菌、ウイルスなどの外来抗原ペプチドと結合してＴ細胞に提示する膜タンパク質であり、一般には主要組織適合性遺伝子複合体（Major histocompatibity complex；ＭＨＣ）分子と呼ばれるものである。ＢｏＬＡには、多くのアリルが存在することが知られており、これらの情報については、例えばＢｏＬＡ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ Ｗｅｂ ｓｉｔｅ（インターネットサイトhttp://www.projects.roslin.ac.uk/bola/bolahome.html）において公開されている。
【００１７】
ウシ主要組織適合抗原（ＢｏＬＡ）のＤＱ分子のα鎖は、ＤＱＡ１〜５によりコードされている。ＤＱ分子のα鎖のアミノ酸配列及びα鎖をコードする塩基配列は、それぞれアクセッション番号ＢＡＡ０９０４５．１及びＤ５０４５４として登録されている。α鎖をコードする遺伝子の第２エクソンの代表的なアリルの塩基配列を図１Ａ〜Ｃ（配列番号１〜２６及び３３〜３８）に、アミノ酸配列とそのアライメントを図１Ｄに示す。なお、ＤＱＡ１遺伝子の第２エクソンは、ＤＱ分子のα鎖の第６アミノ酸から第８７アミノ酸までをコードしている。
【００１８】
本明細書において記載する「ＤＱＡ１＊１２０１アリル」とは、このＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１の第２エクソンのアリルの１種であり、ＤＱＡ１＊１２０１１アリル及びＤＱＡ１＊１２０１２アリルを含む（図１Ａ）。ＤＱＡ１＊１２０１１アリル及びＤＱＡ１＊１２０１２アリルは、それぞれ配列番号１及び３に示される塩基配列を有するが、ＤＱＡ１＊１２０１１アリル及びＤＱＡ１＊１２０１２アリルによってコードされるα鎖のアミノ酸配列は同じであり、それぞれ配列番号２及び４示される。また、本明細書において記載する別のＤＱＡ１の第２エクソンのアリルの１種である「ＤＱＡ１＊０１０１アリル」は、配列番号５に示される塩基配列及び配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するものである（図１Ａ）。
【００１９】
従って、本発明においては、被験ウシにおいてＢｏＬＡ−ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子におけるＤＱＡ１＊１２０１アリル及び／又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出する。そして、その判定結果（検出結果）に基づいて該被験ウシがウシ乳房炎に対する発症抵抗性又は感受性を示すか否かを判定する。ここで、本明細書においては、「ＤＱＡ１＊１２０１アリルの検出」とは、被験ウシが配列番号１又は３に示される塩基配列を有するＤＱＡ１を有するか否か、及び配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列を含むＤＱ分子α鎖を発現するか否かを判定することを意味し、「ＤＱＡ１＊０１０１アリルの検出」とは、被験ウシが配列番号５に示される塩基配列を有するＤＱＡ１を有するか否か、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＤＱ分子α鎖を発現するか否かを判定することを意味する。また「発症抵抗性」とは、ウシ乳房炎への罹りにくさ（抵抗性）を意味し、「抵抗性を有する」とは、他の被験ウシと比較して、ウシ乳房炎を発症する確率が低いことを意味する。一方、「発症感受性」とは、ウシ乳房炎への罹りやすさ（感受性）を意味し、「感受性を有する」とは、他の被験ウシと比較して、ウシ乳房炎を発症する確率が高いことを意味する。
【００２０】
本発明において、被験ウシにおけるＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルの検出は、遺伝子レベル又はタンパク質レベルで行うことができる。例えば、被験ウシからゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを調製し、塩基配列に基づいて、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出することができる。また、被験ウシからウシ主要組織適合抗原（ＢｏＬＡ）のＤＱ分子タンパク質を調製し、例えば抗体などを用いてＤＱ分子におけるＤＱＡ１＊１２０１アリル及び／又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出することができる。これらの方法について、以下簡単に説明する。
【００２１】
（１）被験ウシからのゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ調製
本発明の方法では、ウシ乳房炎発症に対する抵抗性または感受性を判定しようとするウシ（被験ウシ）からゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを調製する。ゲノムＤＮＡの調製は、公知の方法、例えばフェノール／クロロホルム法、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）法などにより調製することができる。また、ｍＲＮＡの調製は、公知の方法、例えばグアニジンイソチオシアネート法などにより調製することができる。ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを調製するためのキットも市販されており、ゲノムＤＮＡの調製用には例えばWizard Genomic DNA Purification Kit（Promega）など、ｍＲＮＡの調製用には例えばNucleoTrap(登録商標)mRNA Kit（Clontech）などを使用することができる。
【００２２】
また、後述するアリルの検出のため、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成してもよい。ｃＤＮＡの合成方法は当技術分野で公知であり、例えば、ＲＮＡから、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によりランダムプライマー又はポリＴプライマーを使用してｃＤＮＡを合成することができる。
【００２３】
ＤＮＡ又はＲＮＡを調製する供与源もまた特に限定されるものではなく、細胞又は組織、血液、唾液、鼻腔粘膜からこすりとった細胞などを用いることができる。
【００２４】
被験ウシは、反芻類に属するウシ（Bos Taurus、Bos indicus）であればその種は特に限定されるものではない。例えば、エアーシア（Ayrshire）、ブリティッシュフリージアン（British Friesian）、デンマーク黒肢（Danish Black Pied）、デンマーク赤毛（Danish Red）、ヘレフォード（Hereford）、ホルスタインフリージアン（Holstein Friesian）、ジャージー（Jersey）、リムーザン（Limousin）、黒毛和種、日本短角、及びそれらの混血種などが挙げられる。好ましくは、被験ウシは、ホルスタイン又はホルスタインの混血種である。
【００２５】
（２）ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるアリルの検出
ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルの検出は、例えば、当技術分野で公知の遺伝子多型検出手段により行うことができ、限定するものではないが、直接配列決定法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用した方法、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）を利用した方法、ハイブリダイゼーション法を利用した方法、プライマー伸長反応を利用する方法、質量分光法などが挙げられる。これらの方法はいずれも当業者に周知である。以下にその概要を説明する。
【００２６】
（２−１）直接配列決定法
ＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルは、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを用いて直接配列決定法により検出することができる。直接配列決定法においては、最初に、被験ウシからゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを調製し、検出対象となるＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを含む領域をベクターにクローニングし、宿主細胞（例えば細菌）において増幅させる。あるいは、検出対象のＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを含む領域内のＤＮＡをＰＣＲにより増幅することも可能である。増幅後、検出対象領域内のＤＮＡを配列決定する。配列決定法としては、限定されるものではないが、手動式配列決定法又は自動配列決定法が挙げられる。手動配列決定法としては、例えば放射性マーカーヌクレオチドを使用する方法などが挙げられ、自動配列決定法としては、ダイターミネーターを使用する方法などが挙げられる。配列決定の結果に基づいて、被験ウシがＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを有するか否かを判定する。
【００２７】
本発明においては、特に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用してＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを含む領域を増幅した後、得られた増幅産物の塩基配列決定を行う、ポリメラーゼ連鎖反応−塩基配列に基づくタイピング法（ＰＣＲ−ＳＢＴ）を利用することが好ましい。ＰＣＲ−ＳＢＴ法によりＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出する方法について、以下詳述する。
【００２８】
最初に、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソンを増幅可能なプライマーを用いて、調製したゲノムＤＮＡを鋳型とした増幅反応を行い、第２エクソンの塩基配列を有する核酸断片を増幅する。ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソンを増幅可能なプライマーは、第２エクソンの全領域を増幅できることが好ましい。従って、第２エクソンの両側に位置するイントロンの配列に基づいてプライマーを設計することができる。あるいは、イントロンとエクソンとの境界領域の配列に基づいてプライマーを設計することもできる。
【００２９】
プライマーの設計手法は当技術分野で周知であり、本発明において使用可能なプライマーは、特異的なアニーリングが可能な条件を満たす、例えば特異的なアニーリングが可能な長さ及び塩基組成（融解温度）を有するように設計される。例えば、プライマーとしての機能を有する長さとしては、１０塩基以上が好ましく、さらに好ましくは１６〜５０塩基であり、さらに好ましくは２０〜３０塩基である。また設計の際には、プライマーの融解温度（Ｔｍ）を確認することが好ましい。Ｔｍとは、任意の核酸鎖の５０％がその相補鎖とハイブリッドを形成する温度を意味し、鋳型となるＤＮＡとプライマーとが二本鎖を形成してアニーリングするためには、アニーリングの温度を最適化する必要がある。一方、この温度を下げすぎると非特異的な反応が起こるため、温度は可能な限り高いことが望ましい。Ｔｍの確認には、公知のプライマー設計用ソフトウエアを利用することができる。設計されたプライマーは、公知のオリゴヌクレオチド合成手法により化学合成することができるが、通常は、市販の化学合成装置を使用して合成される。
【００３０】
本発明において使用可能な、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソンを増幅することができるプライマーセットとしては、限定するものではないが、以下の（ａ）及び（ｂ）が挙げられる：
（ａ）配列番号２７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号２８に示す塩基配列からなるプライマー
5’-CAC AAA TGA AGC CCA CAA TG-3’（配列番号２７）
5’-CCC TAG GGA AAA GGG AGT GA-3’（配列番号２８）
（ｂ）配列番号２９に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号３０に示す塩基配列からなるプライマー
5’-GCC CAC AAT GTT TGA TAG TC-3’（配列番号２９）
5’-GGG RAC ACA TAC TGT TGG T-3’（配列番号３０）
（配列中、ＲはＡ又はＧを表す）。
【００３１】
増幅反応は、特に限定されないが、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により行う。
【００３２】
また、増幅の特異性を高めるために、２組以上のプライマーを用いて２回以上増幅反応を行うことが好ましい。具体的には、最初に、被験ウシに由来するゲノムＤＮＡを鋳型として、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソンの塩基配列を含む核酸断片を増幅する。次いで、増幅された核酸断片を鋳型として、さらにＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソンの塩基配列を含む核酸断片を増幅する。このように２回以上増幅反応を行う場合には、各増幅反応で使用するプライマーを、同じ位置に設計してもよいし、あるいは、最初の増幅におけるプライマーの位置よりも内側に設計することができる。
【００３３】
ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１のＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出するために２回増幅反応を行う場合のプライマーセットの例としては、限定するものではないが、被験ウシに由来するゲノムＤＮＡを鋳型とした増幅反応において以下の（ａ）のプライマーセットを用い、増幅された核酸断片を鋳型とした増幅反応において以下の（ｂ）のプライマーセットを用いることができる：
（ａ）配列番号２７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号２８に示す塩基配列からなるプライマー
（ｂ）配列番号２９に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号３０に示す塩基配列からなるプライマー。
【００３４】
上述のようにして、被験ウシに由来するゲノムＤＮＡを鋳型として、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソンの塩基配列を含む核酸断片を特異的に増幅することができる。
【００３５】
続いて、増幅した核酸断片の塩基配列を決定し、決定した塩基配列と、既知のＤＱＡ１＊１２０１アリルの塩基配列（配列番号１及び３）又はＤＱＡ１＊０１０１アリルの塩基配列（配列番号５）とを比較する。これにより、被験ウシのＢｏＬＡ−ＤＱＡ１がＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを有するかを決定することができる。
【００３６】
配列決定法は当技術分野で周知であり、任意の方法を使用することができる。例えば限定されるものではないが、増幅した核酸断片をベクターにクローニングすることなく配列を決定することができるダイレクト・シーケンス法が挙げられる。かかる配列決定法は、市販のキット、例えばCEQTMDTCS Quick Start Kit（BECKMAN）、BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit ABI310（Applied Biosystems）などを用いて簡便に行うことができる。
【００３７】
ダイレクト・シーケンス法を行う場合には、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソンを特異的に配列決定することが可能なプライマーを用いることが好ましい。
【００３８】
本発明の方法において、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１第２エクソンの塩基配列を決定するために使用可能なプライマーとしては、限定するものではないが、以下の（ｃ）のプライマーセットが挙げられる：
（ｃ）配列番号３１に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号３２に示す塩基配列からなるプライマー
5’-ACA ATG TTT GAT AGT CAA TTT C-3’（配列番号３１）
5’-GGG RAC ACA TAC TGT TGG TAG-3’（配列番号３２）
（配列中、ＲはＡ又はＧを表す）。
【００３９】
核酸断片の塩基配列（すなわち第２エクソンの塩基配列）を決定した後、その塩基配列と、ＤＱＡ１＊１２０１アリルの塩基配列（配列番号１及び３）又はＤＱＡ１＊０１０１アリルの塩基配列（配列番号５）を比較する。
【００４０】
（２−２）ＰＣＲ法
ＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルは、ＰＣＲ法を利用して検出することもできる。ＰＣＲは、ＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを有する配列又は他のアリルを有する配列にのみハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを利用して行う。そのＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリル用及びその他のアリル用の両方のプライマーセットを使用して被験ウシ由来のゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを増幅する。ＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリル用プライマーのみがＰＣＲ産物を生成した場合には、被験ウシはＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルをホモで有し、ＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリル用プライマーと他のアリル用プライマーからのＰＣＲ産物が生成された場合には、被験ウシはＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルをヘテロで有することになる。他のアリル用プライマーのみがＰＣＲ産物を生成した場合には、被験ウシはＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを有しない。
【００４１】
（２−３）ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法
ＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルは、制限酵素断片長多型（Restriction Fragment Length Polymorphism；ＲＦＬＰ）を利用して検出することもできる。まず、検出対象のＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを含む領域をＰＣＲで増幅する。続いてこのＰＣＲ産物を、ＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルに独特な長さの断片を生じることが知られている制限酵素で切断する。制限酵素により消化されたＰＣＲ産物は、一般的にはゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイド染色により可視化する。断片の長さを、分子量マーカー、並びに他のアリル及びＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルの対照により生じた断片の長さと比較することによって、被験ウシにおけるＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出することができる。
【００４２】
（２−４）ハイブリダイゼーション法
ＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルは、ハイブリダイゼーションを利用して検出することもできる。ハイブリダイゼーション法は、被験ウシ由来のゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡが、それに対し相補的なＤＮＡ分子（例えばオリゴヌクレオチドプローブ）とハイブリダイズする能力に基づいて、ＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルの有無を決定する方法である。ハイブリダイゼーション及び検出のための種々の技術を利用してこのハイブリダイゼーション法を行うことができる。
【００４３】
プローブが検出対象のＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルに対しハイブリダイズしたか否かは、その結合したプローブを可視化することにより直接検出することができる。これは、例えば、ノーザン又はサザンアッセイとして知られている（例えば、Ausabel et al. (編), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1991)参照）。サザンアッセイの場合にはゲノムＤＮＡを、ノーザンアッセイの場合にはＲＮＡを被験ウシから単離する。続いて、単離したＤＮＡ又はＲＮＡを、一連の制限酵素群で切断する。次に、ＤＮＡ又はＲＮＡを分離し、膜に転写する。この分離操作は、例えばアガロースゲル上で行うことができる。膜への転写は、標識化プローブ、又は検出対象のＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルに特異的なプローブを、好適なストリンジェンシー条件下で膜に転写して行う。標識は、例えば放射性ヌクレオチドを導入することにより行うことができる。未結合のプローブを除去した後、標識化プローブを可視化することにより、結合の存在を検出することができ、その結合の有無により、ＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを有するか否かについて判断しうる。
【００４４】
あるいは、ハイブリダイゼーションはＤＮＡチップを利用して検出することもできる。この方法においては、オリゴヌクレオチドプローブを固相支持体に貼り付ける。このプローブは、ＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルに特異的なものとなるように設計する。被験ウシ由来のＤＮＡサンプルをＤＮＡチップと接触させ、ハイブリダイゼーションを検出する。
【００４５】
（２−５）タンパク質レベルでの検出
本発明の方法においては、タンパク質レベルでＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出することも可能である。具体的には、ＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを有するＤＱ分子のα鎖を特異的に認識することができる抗体を用いることにより、ＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出することができる。
【００４６】
ＤＱＡ１＊０１０１アリルを有するＤＱ分子のα鎖を特異的に認識することができる抗体は、配列番号１２に示すアミノ酸配列において、７５番目のアミノ酸残基を含み、かつ少なくとも５個の連続するアミノ酸残基、好ましくは６〜１０個の連続するアミノ酸残基からなるペプチドを抗原として動物の免疫に用いることにより、作製することができる。
【００４７】
抗体の作製方法、及び抗体を用いたＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを有するＤＱ分子のα鎖の検出方法は、当技術分野で公知の方法を用いて行うことができる。
【００４８】
（３）ウシ乳房炎に対する発症抵抗性又は感受性の判定
ＤＱＡ１＊１２０１アリルの存在は、該被験ウシがウシ乳房炎に対する発症抵抗性を有する可能性を示し、ＤＱＡ１＊０１０１アリルの存在は、該被験ウシがウシ乳房炎に対する発症感受性を有する可能性を示すものである。このＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルの存在は、ホモ又はヘテロのいずれでもよい。
【００４９】
２．キット
本発明のキットは、ウシ乳房炎に対する発症抵抗性又は感受性を判定するために用いることができ、ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖におけるＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出する手段を含むものである。
【００５０】
ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖におけるＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出する手段としては、例えば限定されるものではないが、ＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを含む領域を増幅することができるプライマー、ＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを含む領域を配列決定することができるプライマー、ＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルに特異的に結合することができるプライマー又はプローブ、ＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを含むＢｏＬＡ−ＤＱ分子に対して特異的に結合することができる抗体、などが含まれる。
【００５１】
ＰＣＲ−ＳＢＴ法によりＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出する場合には、本発明のキットは、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソンを増幅するためのプライマーセットとして、以下の（ａ）又は（ｂ）の少なくとも１つのプライマーセットを含むことが好ましく、また、（ａ）及び（ｂ）の両方のプライマーセットを含むことがさらに好ましい：
（ａ）配列番号２７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号２８に示す塩基配列からなるプライマー
（ｂ）配列番号２９に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号３０に示す塩基配列からなるプライマー。
さらに本発明のキットは、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソンを配列決定するためのプライマーセットとして、以下の（ｃ）のプライマーセットを含むことが好ましい：
（ｃ）配列番号３１に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号３２に示す塩基配列からなるプライマー。
【００５２】
本発明のキットは、特定のアリルを検出する手段のほか、さらに、反応液を構成するバッファー、ｄＮＴＰ混合物、酵素類（ポリメラーゼなど）などを含んでもよい。
【００５３】
３．ウシ乳房炎に対する発症抵抗性を有するウシの作出
上述のように、ＤＱＡ１＊１２０１アリルを検出することにより、ウシ乳房炎に対する発症抵抗性を判定することができるため、この判定結果を利用して、ウシ乳房炎に対する発症抵抗性を有するウシを作出することができる。
【００５４】
例えば、ウシの受精卵においてＤＱＡ１＊１２０１アリルを検出し、ＤＱＡ１＊１２０１アリルを有する受精卵を選択して雌ウシの子宮に移植することによって、ウシ乳房炎に対する発症抵抗性を有するウシを作出することができる。また、ウシ乳房炎に対する発症抵抗性を有すると判定された雄ウシ及び雌ウシ由来の精子及び卵子を用いることによって、ウシ乳房炎に対する発症抵抗性を有するウシを作出することも可能である。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５５】
本実施例においては、ウシのＤＱＡ１アリルを検出した。
（１）供試ウシ血液
千葉県下の４地区に飼育されている乳牛（ホルスタイン種）について、採血前に各個体の乳房の望診と触診による臨床診断、並びに乳汁の培養と染色による細菌同定検査によって乳房炎と判断された発症ウシ１９５頭を用いた。各個体の尾静脈より凝固防止剤を用いて採血されたものを供試血液とした。供試血液はＤＮＡを抽出するまで−２０℃で冷凍保存した。
対照群として、全国から無作為に抽出したウシ１０５頭（ホルスタイン種）のＤＮＡを家畜改良事業団から分与された。
【００５６】
（２）ＤＮＡ抽出
ＤＮＡ抽出は、凍結血液（１ｍｌ）より、Blood Cell Lysis Buffer（ｐＨ７．５）を用いて有核細胞を選別し、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ−バッファー（ｐＨ８．０）、プロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ）、１０％ＳＤＳ混合液によるタンパク質分解、並びにフェノール・クロロホルム法によるタンパク質除去を行い、エタノール塩析法によって、ゲノムＤＮＡを抽出及び精製した。ＤＮＡの濃度及び純度は分光高度計により測定した。その後、４℃で保存した。
【００５７】
（３）遺伝子のタイピング法
乳房炎発症ウシ及び対照群のウシのＢｏＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子を、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１ ＰＣＲ−ＳＢＴ法（特許文献３）を用いてタイピングした。
（３−１）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１  １ｓｔＰＣＲ
１２０μＭの各ｄＮＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、４００ｎＭのプライマー、及び１．２５ユニットのｒＴａｑ  ＤＮＡ伸長酵素（TOYOBO）、１μｌのゲノムを含む２５μｌの1×rTaq緩衝液を９４℃で２分間の変性処理後、９４℃で２０秒；６０℃で２０秒、及び７２℃で４０秒の処理を１サイクルとして１５サイクルの処理の後、７２℃で４分間伸長させた。プライマーは、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１第２エクソンをＰＣＲ法により特異的に増幅できる配列番号２７及び２８を用いた。
【００５８】
（３−２）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１  ２ｎｄＰＣＲ
１ｓｔＰＣＲ産物のうち１μｌを１２０μＭの各ｄＮＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、４００ｎＭのプライマー、及び０．５ユニットのAmpliTaq Gold TM DNA伸長酵素（Applied Biosystems）を含む２４μｌのGene AmpR Gold緩衝液を９５℃で１０分間の変性処理後、９４℃で２０秒；６０℃で２０秒、及び７２℃で４０秒の処理を１サイクルとして３０サイクルの処理の後、７２℃で４分間伸長させた。プライマーは、さらに内側を特異的に増幅できる配列番号２９及び３０を用いた。これによって、３５５ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。ＰＣＲ産物をエチヂウムブロマイド入り２％アガロースゲルで電気泳動をして、ＤＮＡが増幅されているか確認した。
【００５９】
（３−３）ダイレクト・シーケンス法
シーケンスプライマーとして配列番号３１及び３２を用いた。CEQTMDTCS Quick Start Kit（BECKMAN）をシーケンス反応に用いた。１μｌのＰＣＲ産物、２μｌの１０ｐｍｏｌ／μｌプライマー、４μｌのDTCS Quick Start Mix（BECKMAN）、４μｌの2.5×Sequencing Buffer（Edge Biosystems）、及び滅菌水９μｌを混和し、９５℃で２０秒；５０℃で２０秒；６０℃で４分間の処理を１サイクルとして３０サイクルの処理を行った。シーケンスＰＣＲ産物は、説明書に従ってCENTRI-SEP COLUMNS（PRINCETON SEPARATIONS）を用いて精製し、その後CEQTM 2000XL DNA Analysis Systemシーケンサー（BECKMAN COULTER）用のSample Loading Solution（BECKMAN）２０μｌに溶解し、CEQTM2000XL DNA Analysis System（BECKMAN COULTER）でシーケンスを行った。決定された塩基配列からプライマー部位を除去し、National Center for Biotechnology Information上のホモロジー検索プログラム、ＢＬＡＳＴを使用してアリルの塩基配列をデータベースに登録されている塩基配列と照合し、アリルを決定した。
その結果、全てのサンプルにおいてＤＱＡ１の増幅が確認できた。また、図２に示すようなアリルが検出された。
【実施例２】
【００６０】
本実施例においては、ウシが有するアリルの比較を行った。実施例１の結果、乳房炎発症ウシ１９５頭及び対照群のウシ１０５頭のアリルの検出に成功し、ＤＱＡ１の既知アリル３１種類のうち、乳房炎発症ウシで１２種類、対照群のウシでも１２種類が検出された（図２）。これらの２つの群に特異的なアリルが２種類ずつ見出された（図２中下線で示す）。
【００６１】
続いて、検出されたアリルの頻度を、乳房炎発症ウシと対照群のウシとで比較した（図３）。その結果、ＤＱＡ１＊１２０１アリル及びＤＱＡ１＊１２０３アリルが、対照群のウシと比較して乳房炎発症ウシにおいて有意に低下していることが明らかとなった（図３）。特に、ＤＱＡ１＊１２０１アリルの頻度は強い相関が見られた（ｐ＝０．００９）。
【００６２】
次に、検出された全てのＤＱＡ１アリルについて、そのアリルをホモ又はヘテロで有する個体の頻度を、乳房発症ウシと対照群のウシとで比較した（図４）。その結果、ＤＱＡ１＊０１０１アリルを有する個体は、対照群のウシよりも乳房発症ウシにおいて有意に高く（ｐ＝０．０３）、ＤＱＡ１＊０１０１アリルが乳房炎に対して感受性アリルである可能性が示された（図４）。また、ＤＱＡ１＊１２０１アリルを有する個体の頻度は対照群のウシで有意に高く（ｐ＝０．０１６）、ＤＱＡ１＊１２０１アリルが乳房炎に対する抵抗性アリルである可能性が示された（図４）。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明により、ウシ乳房炎に対する発症抵抗性又は感受性の判定方法が提供される。該方法は、ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖におけるＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルの存在を検出することにより、被験ウシの発症抵抗性又は感受性を簡便かつ迅速に判定することができるため、ウシの乳房炎発症機構の研究、ウシ乳房炎に対する発症抵抗性を有するウシの作出などに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１Ａ】ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子の代表的なアリルの塩基配列を示す。
【図１Ｂ】ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子の代表的なアリルの塩基配列を示す。
【図１Ｃ】ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子の代表的なアリルの塩基配列を示す。
【図１Ｄ】ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子の代表的なアリルのアミノ酸配列とそのアライメントを示す。
【図２】対照群のウシ及び乳房炎発症ウシにおけるＤＱＡ１アリルの分布を示す。
【図３】対照群のウシ及び乳房炎発症ウシにおける各ＤＱＡ１アリルの存在頻度を示す。
【図４】対照群のウシ及び乳房炎発症ウシにおける各ＤＱＡ１アリルを有する個体の頻度を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００６５】
配列番号２７〜３２：プライマー（配列中、ＲはＡ又はＧを表す）
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
2007295844.tif 000004
【図１Ｄ】
2007295844.tif 000005
【図２】
2007295844.tif 000006
【図３】
2007295844.tif 000007
【図４】
2007295844.tif 000008
【配列表】
2007295844000001.app