(57)【要約】【課題】本発明は、気管支喘息、特にアレルギー性炎症によって発症する気管支喘息に対する治療法に対して抵抗性を示す気管支喘息の病態解析および治療法を確立するために好適に利用できる、気管支喘息を発症する気管支喘息発症モデル動物およびその作製方法、並びにその利用を提供する。【解決手段】モデル動物に、アレルゲン非存在下で、ＩＬ−２およびＩＬ−１８を吸入曝露させる。これにより、当該モデル動物に対して、気道感染などによって誘導される非アレルギー性気管支喘息を発症させることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
モデル動物に、アレルゲン非存在下で、インターロイキン−２およびインターロイキン−１８を鼻腔内投与することにより得られることを特徴とする気管支喘息発症モデル動物。
【請求項２】
血清における免疫グロブリンＥの濃度が、インターロイキン−２およびインターロイキン−１８の投与前の上記モデル動物と実質的に同一であることを特徴とする請求項１に記載の気管支喘息発症モデル動物。
【請求項３】
気道粘膜において、好塩基球および肥満細胞の活性を実質的に有しないことを特徴とする請求項１または２に記載の気管支喘息発症モデル動物。
【請求項４】
活性化されたＣＤ４陽性Ｔ細胞を有し、
当該ＣＤ４陽性Ｔ細胞から、インターロイキン−１３が産生されていることを特徴とする１〜３のいずれか１項に記載の気管支喘息発症モデル動物。
【請求項５】
上記ＣＤ４陽性Ｔ細胞からのインターロイキン−１３の産生量が、上記ＣＤ４陽性Ｔ細胞からのインターロイキン４の産生量の３０倍以上であることを特徴とする請求項４に記載の気管支喘息発症モデル動物。
【請求項６】
インターロイキン−１３を中和することのみによって、気管支喘息の発症が阻害されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の気管支喘息発症モデル動物。
【請求項７】
モデル動物に、アレルゲン非存在下で、インターロイキン−２およびインターロイキン−１８を鼻腔内投与することを特徴とする気管支喘息発症モデル動物の作製方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の気管支喘息発症モデル動物に対して、被験物質を投与し、気管支喘息の改善効果を検定することを特徴とする気管支喘息治療剤のスクリーニング方法。
【請求項９】
上記被験物質を投与した気管支喘息発症モデル動物において、少なくともインターロイキン−１３またはインターロイキン−１３をコードする遺伝子の発現強度を測定することを特徴とする請求項８に記載の気管支喘息治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の気管支喘息治療剤のスクリーニング方法により、気管支喘息の改善効果を示すと判定される物質を含有することを特徴とする気管支喘息治療剤。
【請求項１１】
鼻腔内投与されることを特徴とする請求項１０に記載の気管支喘息治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、気管支喘息発症モデル動物およびその作製方法、並びにその利用に関するものであって、特に、アレルゲン非存在下で、気管支喘息を発症する気管支喘息発症モデル動物およびその作製方法、並びにその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
気管支喘息は、気道過敏性（以下、「ＡＨＲ」ともいう）、気道炎症（好酸球および好中球浸潤）、および気道上皮からのムチン産生の亢進、高レベルの免疫グロブリンＥ（以下、「ＩｇＥ」ともいう）を特徴とする慢性炎症性呼吸器疾患である。ＡＨＲおよびムチン産生の亢進は、喘息症状および喘息の発症と関連していることが多い。そのため、現在では、気管支喘息の本態は、気道の慢性炎症に基づくＡＨＲであると考えられている。ＡＨＲは、気道炎症によって引き起こされ、炎症細胞浸潤、気道上皮細胞の障害、サイトカインや各種メディエーターの遊離を起こし、様々な作用機序で気道平滑筋の反応性亢進を示す。
【０００３】
このような気管支喘息の症状を引き起こすメカニズムには、Ｔｈ２細胞が関与していると考えられてきた。具体的には、気管支喘息は、アレルゲン、ＩｇＥ、およびヘルパーＴ２細胞（以下、「Ｔｈ２細胞」ともいう）が産生するサイトカイン（以下、「Ｔｈ２サイトカイン」ともいう）の協調作用によって誘導されるＴｈ２型疾患と考えられてきた。上記Ｔｈ２サイトカインとしては、例えば、インターロイキン（以下、「ＩＬ」ともいう）−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、およびＩＬ−１３が挙げられる。
【０００４】
また、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、およびＩＬ−１３を産生するＣＤ４＋Ｔ細胞は、喘息患者の気管支肺胞洗浄（以下、「ＢＡＬ」ともいう）や気道の生体組織検査で同定された。動物実験において、Ｔｈ２細胞が、気道における好酸球の増加、気道上皮からのムチン産生の亢進を伴う杯細胞の異常増殖、およびＡＨＲを誘導することが明らかとなった。Ｔｈ２サイトカインの中で、ＩＬ−１３は、ＡＨＲおよび気道上皮からのムチン産生の亢進を誘導するのに重要な役割を果たしていることが示唆されている。
【０００５】
事実、モデル動物系において、ＩＬ−１３の阻害は、アレルゲン誘導性のＡＨＲ、好酸球が増加する気道炎症、および杯細胞の異常増殖を顕著に阻害する。さらに、ＩＬ−１３を、ナイーブマウスの鼻腔内に直接投与すると、気道上皮からのムチン産生の亢進、気道の好酸球浸潤およびＡＨＲが誘導される。
【０００６】
一方、Ｔｈ１細胞は、一般に、ＩＦＮ−γを介してＴｈ２細胞の活性を低下させることによって、気管支喘息に対して防御的に作用すると考えられてきた。これに対し、本発明者らは、近年、抗原特異的なＴｈ１細胞を移植したナイーブマウスを、抗原単独ではなく、抗原とＩＬ−１８とによって刺激すると、気管支喘息を発症することを明らかにしている。さらに、本発明者らは、ＩＬ−１３とＩＦＮ−γとを組み合わせて投与すると、抗原刺激とは無関係に、重篤な気道炎症が誘導されることを明らかにしている。
【０００７】
また、気管支喘息の誘導に関しては、それ以外にも、（１）Ｔｈ１細胞は、好中球を遊走・活性化することによって、気管支喘息を誘発するとの報告、（２）気管支喘息患者の中には、Ｔｈ１細胞優位な免疫応答を示す症例も混在するという報告、（３）Ｔｈ１細胞の減少に伴い、Ｔｈ２細胞で誘導されたＡＨＲが緩和するという報告、（４）Ｔｈ１細胞は、好中球の遊走および活性化によって、ＡＨＲを誘導するという報告、（５）アレルゲン特異的Ｔｈ１細胞、および、アレルゲン特異的Ｔｈ２細胞の同時移入は、喘息を誘導するという報告などがある。
【０００８】
上記のような数々の気管支喘息の誘導に関する報告から、気管支喘息の発症メカニズムは、単純なものではなく、いくつかの型があることが明らかとなってきた。そのため、現在では、気管支喘息の１つの分類様式として、Ｔｈ１細胞誘導型喘息（以下、「Ｔｈ１型喘息」ともいう）、Ｔｈ２細胞誘導型喘息（以下、「Ｔｈ２型喘息」ともいう）、および、Ｔｈ１細胞／Ｔｈ２細胞混合誘導型喘息（以下、「混合型喘息」ともいう）の３つのタイプに分類することがなされている。
【０００９】
気管支喘息の治療法、および治療剤は、これら気管支喘息のタイプの違いにより異なる。そのため、各タイプの気管支喘息の治療法や治療剤を開発するためには、気管支喘息のタイプごとに、当該タイプの気管支喘息を発症したモデル動物が求められる。そこで、いくつかのタイプの気管支喘息について、当該気管支喘息を発症したモデル動物の作製方法が提案されている。
【００１０】
例えば、上記Ｔｈ２型喘息を発症したモデル動物の作製方法としては、Ｔｈ２細胞から産生するＩＬ−１３の作用によって、モデル動物において気管支喘息を誘導する方法、およびリポ多糖体（ＬＰＳ）を利用する方法が挙げられる。
【００１１】
具体的には、ＩＬ−１３の作用を利用する方法としては、以下の３つの方法が提案されている。１つ目の方法では、まず、ＯＶＡをアジュバンドと共にマウスに免疫して、ＯＶＡ反応性のＴｈ２細胞を生体内に誘導した感作マウスを作製する。そして、当該感作マウスに、ＯＶＡを投与することによって、Ｔｈ２細胞からＩＬ−１３を産生させる。こうして産生されたＩＬ−１３の作用により、当該マウスにおいて、肺組織内の好酸球の増加と気道過敏性の亢進とを伴った気管支喘息を誘導させることができる。
【００１２】
また、２つ目の方法では、抗原特異的Ｔｈ２細胞を利用して、マウスに気管支喘息を誘導させる。具体的には、当該方法では、まず、抗原特異的Ｔｈ２細胞をマウスに移入し、その直後から抗原を投与する。これにより、Ｔｈ２細胞からＩＬ−１３を産生させる。こうして産生されたＩＬ−１３の作用により、当該マウスにおいて、肺組織内の好酸球の増加と気道過敏性の亢進とを伴った気管支喘息を誘導させることができる。
【００１３】
また、３つ目の方法では、呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳウィルス；respiratory syncytial virus）を利用して、マウスに気管支喘息を誘導させる。具体的には、当該方法では、まず、正常マウスにＲＳウイルスを直接吸入させることにより、ＩＬ−１３の産生を誘導する。そして、当該ＩＬ−１３により気道内杯細胞を刺激し、ムチン産生亢進による気道閉塞を伴った気管支喘息を誘導することができる。
【００１４】
また、リポ多糖体（ＬＰＳ）を利用する方法としては、例えば、マウスにＬＰＳを直接投与して気管支喘息を誘導する方法が提案されている。当該方法では、正常マウスにグラム陰性菌の細胞壁の主成分であるＬＰＳを直接投与して炎症性サイトカイン産生を誘導する。これにより、肺組織内の好中球の増加と気道過敏性の亢進とを伴った喘息を誘導することができる。
【００１５】
さらに、上述した３つのタイプのうち、所望のタイプの気管支喘息を発症するモデル動物を作製する方法として、特許文献１に開示される方法がある。
【００１６】
特許文献１には、抗原特異的Ｔｈ細胞を選択的に刺激することによって、Ｔｈ１型喘息、Ｔｈ２型喘息、および混合型喘息を発症させる方法が開示されている。具体的には、特許文献１の方法では、まず、抗原特異的Ｔｈ１またはＴｈ２細胞を宿主に導入する。次に、宿主に導入したＴ細胞をメモリー型Ｔ細胞（Ｔｈ１細胞またはＴｈ２細胞）に変換する。そして、当該メモリー型ヘルパーＴ細胞を刺激することによって、宿主において、喘息を誘導することができる。
【特許文献１】特開２００５−２１１０１９号公報（平成１７（２００５）年８月１１日公開）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
気管支喘息の本態と考えられているＡＨＲには、アレルギー性炎症等で誘導されるものと、気道感染症によって誘導されるものとがある。アレルギー性炎症によって誘導されるＡＨＲは、主に、アレルゲンが原因で誘導される。一方、気道感染症によって誘導されるＡＨＲについては、誘導機序およびその制御メカニズムが不明である。このような気道感染症によって発症する気管支喘息は、アレルギー性炎症によって発症する気管支喘息に対する治療法に対して抵抗性を示す。例えば、アレルギー性炎症によって発症する気管支喘息に対して有効なステロイド吸入法は、気道感染症によって発症する気管支喘息では症状を悪化させる可能性が指摘されている。つまり、気道感染症によって発症する気管支喘息の治療は、アレルギー性炎症によって発症する気管支喘息とは異なる方法で行う必要がある。
【００１８】
しかしながら、上述したように、気道感染症によって発症する気管支喘息で見られるＡＨＲの原因は、未だ不明であり、その治療法、および治療剤の開発が十分になされていない。そのため、上記治療法および治療剤を開発するために、気道感染症によって発症する気管支喘息のモデル動物を作製し、その詳細な病態解析を行うことが求められている。
【００１９】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであって、その目的は、気管支喘息、特にアレルギー性炎症によって発症する気管支喘息に対する治療法に対して抵抗性を示す気管支喘息の病態解析および治療法を確立するために好適に利用できる、気管支喘息を発症する気管支喘息発症モデル動物およびその作製方法、並びにその利用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、モデル動物にＩＬ−２およびＩＬ−１８を吸入曝露することにより、抗原刺激の介在しない自然型の気管支喘息を誘導できることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、以下の産業上有用な以下の発明を包含する。
【００２１】
（１）モデル動物に、アレルゲン非存在下で、インターロイキン−２およびインターロイキン−１８を鼻腔内投与することにより得られることを特徴とする気管支喘息発症モデル動物。
【００２２】
（２）血清における免疫グロブリンＥの濃度が、インターロイキン−２およびインターロイキン−１８の投与前の上記モデル動物と実質的に同一であることを特徴とする（１）に記載の気管支喘息発症モデル動物。
【００２３】
（３）気道粘膜において、好塩基球および肥満細胞の活性を実質的に有しないことを特徴とする（１）または（２）に記載の気管支喘息発症モデル動物。
【００２４】
（４）活性化されたＣＤ４陽性Ｔ細胞を有し、当該ＣＤ４陽性Ｔ細胞から、インターロイキン−１３が産生されていることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載の気管支喘息発症モデル動物。
【００２５】
（５）上記ＣＤ４陽性Ｔ細胞からのインターロイキン−１３の産生量が、上記ＣＤ４陽性Ｔ細胞からのインターロイキン−４の産生量の３０倍以上であることを特徴とする（４）に記載の気管支喘息発症モデル動物。
【００２６】
（６）インターロイキン−１３を中和することのみによって、気管支喘息の発症が阻害されることを特徴とする（１）〜（５）のいずれかに記載の気管支喘息発症モデル動物。
【００２７】
（７）モデル動物に、アレルゲン非存在下で、インターロイキン−２およびインターロイキン−１８を鼻腔内投与することを特徴とする気管支喘息発症モデル動物の作製方法。
【００２８】
（８）（１）〜（６）のいずれかに記載の気管支喘息発症モデル動物に対して、被験物質を投与し、気管支喘息の改善効果を検定することを特徴とする気管支喘息治療剤のスクリーニング方法。
【００２９】
（９）上記被験物質を投与した気管支喘息発症モデル動物において、少なくともインターロイキン−１３またはインターロイキン−１３をコードする遺伝子の発現強度を測定することを特徴とする（８）に記載の気管支喘息治療剤のスクリーニング方法。
【００３０】
（１０）（８）または（９）に記載の気管支喘息治療剤のスクリーニング方法により、気管支喘息の改善効果を示すと判定される物質を含有することを特徴とする気管支喘息治療剤。
【００３１】
（１１）鼻腔内投与されることを特徴とする（１０）に記載の気管支喘息治療剤。
【発明の効果】
【００３２】
本発明にかかる気管支喘息発症モデル動物は、アレルゲン非存在下で、インターロイキン−２およびインターロイキン−１８が鼻腔内投与されることにより、非アレルギー性気管支喘息を発症している。それゆえ、本発明にかかる気管支喘息発症モデル動物によれば、非アレルギー性の気管支喘息の治療方法、および治療剤の開発、および当該治療剤のスクリーニングを行えるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明の一実施形態について説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３４】
＜１．本発明を完成させるに至った経緯＞
外因性の気管支喘息をもつ患者は、特定のアレルゲンの刺激を受けると、ＡＨＲを示す。つまり、アレルゲンは、Ｔｈ２型気管支喘息の原因因子として作用する。しかし、気管支喘息患者には、微生物やウィルスの感染に伴って、ＡＨＲを発症する患者がいる。また、マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）やＡ型インフルエンザが非アレルギー患者においても、ＡＨＲのような喘息を誘導することがよく知られている。このような気管支喘息を、以下、「非アレルギー性喘息」とも称する。
【００３５】
非アレルギー性喘息は、難治性喘息であり、アレルギー性炎症によって発症する気管支喘息に対する治療法に対して抵抗性を示す。例えば、ステロイド吸入法は、アレルギー性炎症によって発症する気管支喘息に対しては有効であるが、上記非アレルギー性喘息に対しては、その症状を悪化させる可能性が指摘されている。つまり、上記非アレルギー性喘息は、アレルギー性炎症によって発症する気管支喘息とは、誘導機序およびその制御メカニズムが異なるものである。しかしながら、上記非アレルギー性喘息の誘導機序およびその制御メカニズムは、不明であり、上記非アレルギー性喘息に対して有効な治療方法や治療剤の開発が十分なされていないのが現状である。そのため、微生物やウィルスの感染が、アレルゲンとは無関係に、どのような機序で気管支喘息を悪化させるのかを解明することが求められている。
【００３６】
ところで、インターロイキン（以下、「ＩＬ」ともいう）−１８は、気管支喘息の誘導または悪化に深く関連していることはよく知られている。また、ＩＬ−１８は、様々な感染によって著しく誘導されることが知られている。このように、気管支喘息との関連性がよく知られているＩＬ−１８は、マクロファージや樹状細胞内で前駆体として産生され、Toll-like Receptor（ＴＬＲ）のリガンド刺激を受けることによってカスパーゼ−１（caspase-1）によって活性型となって分泌されるサイトカインである。また、ＩＬ−１８は、発見当初、抗ＣＤ３およびＩＬ−１２存在下、Ｔｈ１細胞からＩＦＮ−γ産生を促進する因子として認識されていた。その後の研究で、ＩＬ−１８は、ユニークなサイトカインであり、Ｔｈ１応答およびＴｈ２応答の両方を制御することが分かってきた。具体的には、ＩＬ−１８は、ＩＬ−１２存在下で、Ｔｈ１やＮＫ細胞に作用して、ＩＦＮ−γの産生を強力に誘導する。なお、ＩＦＮ−γに関して、ＩＬ−１８とＩＬ−１２とは、相乗的に機能する。また、Ｔｈ１やＮＫ細胞上に、Ｆａｓリガンド（アポトーシスを誘導する生体内のタンパク質）の発現を誘導する。このため、生体内でＩＬ−１２とＩＬ−１８とが過剰に産生されると、例えば、腸や肝臓で重篤な臓器障害が惹起され、いわゆるＴｈ１型疾患の原因となる。
【００３７】
また、ＩＬ−１８は、抗原刺激がなくても、ＩＬ−２の存在下でＣＤ４陽性Ｔ細胞（以下、「ＣＤ４＋Ｔ細胞」ともいう）を刺激して、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、およびＩＬ−１３といったＴｈ２サイトカインの産生を誘導する。さらに、このとき、ＣＤ４０リガンドの発現も誘導される。したがって、ＩＬ−２およびＩＬ−１８を全身投与すると、ＩＬ−４、ｓｔａｔ６、およびＣＤ４＋Ｔ細胞依存的に、免疫グロブリンＥ（以下、「ＩｇＥ」ともいう）の産生が誘導される。
【００３８】
さらに、本発明者らのこれまでの研究により、ＩＬ−１８が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、好塩基球および肥満細胞からのＴｈ２サイトカイン産生を促進することが明らかとなった。すなわち、ＩＬ−１８は、ＩＬ−３の存在下において、好塩基球や肥満細胞を直接刺激して、ＩｇＥ非依存的に、これらの細胞から、ヒスタミン、ＩＬ−４、ＩＬ−１３などの産生を誘導する。このため、例えば、皮膚ケラチノサイト特異的カスパーゼ−１トランスジェニックマウスでは、高ＩＬ−１８血症、高ＩｇＥ血症、さらに顕著なアトピー性皮膚炎の症状が認められる。このように、ＩＬ−１８はＩＬ−１２非存在下かつＩＬ−２存在下で、アレルギー反応を誘導する。従って、ＩＬ−１２の産生を伴わないＩＬ−１８の過剰産生は、いわゆるＴｈ２型疾患の原因ともなる。
【００３９】
このように、ＩＬ−１８は、Ｔ細胞からのＴｈ１サイトカインまたはＴｈ２サイトカインの産生を誘導し、肝炎や炎症性腸疾患などのようなＴｈ１型疾患の発症ばかりか、喘息やアトピー性皮膚炎などのようなＴｈ２型疾患の発症にも関与している。一般に、Ｔｈ１細胞またはＴｈ２細胞は、それぞれ、Ｔｈ１サイトカインまたはＴｈ２サイトカインを産生するために、ＴＣＲの関与を必要とする。一方、上述したように、ＩＬ−１８およびＩＬ−１２、または、ＩＬ−１８およびＩＬ−２は、ＴＣＲの関与を必要とすることなく、Ｔ細胞を刺激して、それぞれＴｈ１サイトカインまたはＴｈ２サイトカインを産生することもできる。
【００４０】
これらの知見に基づき、本発明者らは、これまでに、Ｔ細胞の活性化経路には、２つのタイプがあることを提案している。１つのタイプが、ＴＣＲの関与を必要とする、獲得型のＴ細胞の活性化経路（以下、単に「獲得型経路」ともいう）、もう１つが、ＴＣＲの関与を必要としない、Ｔ細胞の自然な活性化経路（以下、単に「自然型経路」ともいう）である。
【００４１】
上記獲得型経路は、獲得性免疫応答、例えば、気管支喘息の発症において、重要な役割を担っていることはよく認知されている。一方、上記自然型経路が、実際に、気管支喘息の発症に関与しているのかという点については、これまで明確にはされていなかった。
【００４２】
このような状況下において、本発明者らは、ＩＬ−１８は種々の器官の上皮細胞に大量に蓄積されているとの知見（Cameron, L.A., R.A. Taha, A. Tsicopoulos, M. Kurimoto, R. Olivenstein, B. Wallaert, E.M. Minshall, and Q.A. Hamid. 1999. Airway epithelium expresses interleukin-18. Eur. Respir. J. 14:553-559.）を鑑み、病原菌が気管支の上皮細胞を刺激し、ＩＬ−１８の産生を誘導し、当該ＩＬ−１８が、上記自然型経路によりＴ細胞を活性化する結果、気管支喘息が発症するとの仮説を立てた。上記仮説を立証すべく、本発明者らは、鋭意検討し、ＩＬ−２とＩＬ−１８とをナイーブマウスに鼻腔内投与することにより、抗原非依存性の気管支喘息を発症させることに成功し、本発明を完成させるに至ったのである。
【００４３】
＜２．気管支喘息発症モデル動物＞
本発明にかかる気管支喘息発症モデル動物（以下、「喘息モデル動物」ともいう）は、少なくとも気道炎症、好ましくは気道炎症と気道過敏性（以下、「ＡＨＲ」ともいう）との症状を示すヒト以外の（非ヒト）モデル動物である。さらに、上記の症状に加えて、喘息の症状に特徴付けられる他の症状を示すモデル動物であってもよい。
【００４４】
上記喘息モデル動物における「ＡＨＲ」の程度は、例えば、通常アセチルコリン、メタコリン、ヒスタミンなどの気道収縮作用のある薬剤を、低濃度から順次、当該モデル動物に吸入し、気管支が一定の基準以上に収縮した時の薬剤の最低濃度から判定することができる。なお、後述の実施例では、β−メタコリンを用いてＡＨＲの程度を評価している。
【００４５】
上記喘息モデル動物の対象動物は、ヒト以外の動物であれば特に限定されるものでない。例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどの哺乳動物が例示される。特に、マウスやラット等の齧歯目動物は、実験動物・病態モデル動物として広く用いられており、なかでも近交系が多数作出されており、受精卵の培養、体外受精等の技術が整っているマウスが実験動物・病態モデル動物として好ましく、喘息の病態解析、有効な治療法の確立や、その治療方法の開発などに有用である。
【００４６】
また、気管支喘息は、上述したように、いくつかのタイプに分類することができる。具体的には、Ｔｈ１細胞誘導型喘息（以下、「Ｔｈ１型喘息」ともいう）、Ｔｈ２細胞誘導型喘息（以下、「Ｔｈ２型喘息」ともいう）、および、Ｔｈ１細胞／Ｔｈ２細胞混合誘導型喘息（以下、「混合型喘息」ともいう）の３つのタイプに分類することができる。また、気管支喘息に関与するＴｈ１細胞およびＴｈ２細胞は、上述したように、ＩＬ−１８のＴ細胞の活性化により誘導されるが、Ｔ細胞の活性化経路もまた、獲得型経路と自然型経路とがある。さらに、自然型経路は、ＴＣＲの関与を必要とせず、ＩＬ−１８がＴｈ１サイトカインの産生（Ｔｈ１細胞への分化）を誘導する自然型経路１と、ＴＣＲの関与を必要とせず、ＩＬ−１８がＴｈ２サイトカインの産生（Ｔｈ２細胞への分化）を誘導する自然型経路２とに分類することができる。このように、気管支喘息は、発症の原因となるヘルパーＴ細胞の種類と、そのヘルパーＴ細胞の活性化機序との組み合わせによって分類することができる。本発明にかかる喘息モデル動物においては、当該喘息モデル動物が発症する気管支喘息は、非アレルギー性喘息であって、特に、上記自然型経路２により分化したＴｈ２細胞によって誘導される気管支喘息である。
【００４７】
このように、上記喘息モデル動物は、非アレルギー性喘息を発症するものであればよい。すなわち、遺伝子型が野生型の動物であってもよいし、特定の遺伝子が欠損した遺伝子欠損動物（ノックアウト動物）や、外来遺伝子が導入されたトランスジェニック動物などであってもよい。換言すれば、特定の遺伝子が欠損した遺伝子欠損動物（ノックアウト動物）や、外来遺伝子が導入されたトランスジェニック動物に対して、後述する気管支喘息発症モデル動物の作製方法を用いて、非アレルギー性喘息を発症させた喘息モデル動物であってもよい。
【００４８】
ここで、本発明にかかる喘息モデル動物において、気管支喘息を発症する機序について説明する。
【００４９】
後述する気管支喘息発症モデル動物の作製方法で詳細に説明するが、上記喘息モデル動物は、ＩＬ−２およびＩＬ−１８を鼻腔内投与することにより得られるものである。上記喘息モデル動物では、ＩＬ−２およびＩＬ−１８が鼻腔内に投与されることにより、ＣＤ４＋Ｔ細胞が活性化される。これにより、ＣＤ４＋Ｔ細胞からＩＬ−１３が産生される。このとき、ＩＬ−１３に加えて、ＩＬ−４も産生されるが、その産生量は、ＩＬ−１３のほうが遥かに大きい。こうして産生されたＩＬ−１３は、杯細胞の異常増殖を誘導し、その結果、ムチンが過剰分泌される。また、上記ＩＬ−１３は、ＡＨＲを誘導する。本発明にかかる喘息モデル動物におけるＡＨＲの誘導には、ＩＬ−１３に加えて、ＩＬ−４が関与してもよい。
【００５０】
さらに、産生されたＩＬ−１３は、ＳＴＡＴ６を活性化し、肺におけるエオタキシンおよびエオタキシン−２の発現を上昇させる。なお、上記ＳＴＡＴ６をコードするｓｔａｔ６遺伝子は、ＩＬ−４およびＩＬ−１３のシグナル伝達に必須の遺伝子である。また、上記エオタキシンおよびエオタキシン−２は、好酸球遊走因子である。こうして発現が増加したエオタキシンおよびエオタキシン−２により、気道における好酸球浸潤が誘導される。なお、本発明において、上記気道における好酸球浸潤には、ＩＬ−５およびＩＬ−９が関与しないことが好ましい。
【００５１】
また、本発明にかかる喘息モデル動物では、ＩＬ−１７、並びに、ＧＣＰ−２およびＭＩＰ−２の産生が誘導されている。ＩＬ−１７は、気管支上皮細胞において、ＧＣＰ−２およびＭＩＰ−２を含む数種のＣＸＣケモカインを放出することによって、上記気道における好中球遊走に関与する。したがって、上記喘息モデル動物では、ＩＬ−１７および／またはＣＸＣケモカイン（例えば、ＭＩＰ−２およびＧＣＰ−２）によって、気道の好中球浸潤が誘導される。
【００５２】
以上のような機序により、本発明にかかる喘息モデル動物は気管支喘息を発症する。
【００５３】
したがって、本発明にかかる喘息モデル動物は、以下のような性質を有する。具体的には、上記喘息モデル動物は、非アレルギー性喘息を発症しているモデル動物である。そのため、上記喘息モデル動物では、ＩＬ−２およびＩＬ−１８の投与前と、血清におけるＩｇＥ濃度が実質的に同一である。つまり、ＩＬ−２およびＩＬ−１８を鼻腔内投与する前と、投与した後では、当該モデル動物の血清におけるＩｇＥ濃度は、実質的に同一であることを意味する。さらに言い換えれば、上記喘息モデル動物は、ＩＬ−２およびＩＬ−１８の投与によって、アレルギー反応を実質的に示していないと解釈されるＩｇＥ量であることを意味する、具体的には、上記喘息モデル動物が、ナイーブモデル動物に、ＩＬ−２およびＩＬ−１８を鼻腔内投与して得られたものである場合、当該喘息モデル動物と、上記ナイーブモデル動物とで、血清におけるＩｇＥ濃度が、実質的に同一であることを意味する。
【００５４】
また、上記喘息モデル動物では、気道粘膜において、好塩基球および肥満細胞の活性を実質的に有しない。なお、「好塩基球および肥満細胞の活性を実質的に有しない」とは、アレルギー反応を示す好塩基球および肥満細胞が実質的に存在しないことを意味する。
【００５５】
また、上記喘息モデル動物は、活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞を有する。この活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、少なくとも上記喘息モデル動物の肺に存在し、ＩＬ−１３を産生する。なお、上記喘息モデル動物においては、活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞が、肺だけではなく、末梢組織にも存在していてもよい。
【００５６】
上記活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞では、ＩＬ−１３の産生に加えて、ＩＬ−４が産生されてもよい。その場合、ＩＬ−１３の産生量は、ＩＬ−４の産生量よりも多いことが特徴で、重要なことはＩＬ−１３の産生量が多いことである。これらの病態は、重篤となる。ＩＬ−４も類似した作用を発現するが、産生量が少ないため、ＩＬ−１３の作用で病態が決定されている。具体的には、上記ＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＬ−１３の産生量は、ＩＬ−４の産生量の３０倍以上であることが好ましい。また、上記喘息モデル動物では、肺においても、ＩＬ−１３が産生され、その産生量は、ＩＬ−４の産生量よりも多いことが好ましい。これにより、杯細胞の異常増殖、ＡＨＲ、および気道における好酸球浸潤が誘導される。
【００５７】
さらに、本発明にかかる喘息モデル動物は、ＩＬ−１３を中和することのみによって、気管支喘息の発症が阻害される。つまり、本発明にかかる喘息モデル動物において、気管支喘息の発症はＩＬ−１３に依存している。そのため、ＩＬ−１３を中和することのみによって、気管支喘息の発症、すなわち、気管支喘息の諸症状をほぼ完全に阻害することができる。なお、本明細書において、「ＩＬ−１３を中和する」とは、「ＩＬ−１３の機能を阻害する」との意味のみならず、「ＩＬ−１３を分解する」、および「ＩＬ−１３の産生を阻害する」の意味の包含する。したがって、上記喘息モデル動物のおいて、気管支喘息の発症を阻害する方法としては、ＩＬ−１３に対する抗体の使用、ＩＬ−１３の阻害剤の使用、ＩＬ−１３拮抗剤の使用、およびＩＬ−１３の産生抑制剤の使用が挙げられる。例えば、上記ＩＬ−１３拮抗剤としては、可溶性ＩＬ−１３Ｒα２−ヒトＦｃ融合タンパク質（以下、「ｓＩＬ−１３Ｒ−Ｆｃ」ともいう）等が挙げられる。上記ｓＩＬ−１３Ｒ−Ｆｃは、ＩＬ−１３に選択的に結合し、ＩＬ−１３を中和するものである。つまり、ｓＩＬ−１３Ｒ−Ｆｃは、Ｄｅｃｏｙ ＩＬ−１３Ｒである。
【００５８】
本発明にかかる喘息モデル動物は、上記のような性質を有する。このような喘息モデル動物は、アレルゲン／ＩｇＥの関与しない難治性喘息や、ＩＬ−１８が関与する喘息などの病態解析に有効である。また、現在、的確な治療法がない非アレルギー性喘息の発症メカニズムの解明、非アレルギー性喘息に有効な新規治療薬・治療方法の開発などに好適に用いることができる。
【００５９】
＜３．気管支喘息発症モデル動物の作製方法＞
本発明にかかる気管支喘息発症モデル動物の作製方法（以下、「喘息モデル動物の作製方法」ともいう）は、モデル動物に、アレルゲン非存在下で、ＩＬ−２およびＩＬ−１８を鼻腔内投与することにより、上述した喘息モデル動物を作製するものである。上記のように、ＩＬ−２およびＩＬ−１８を鼻腔内に投与することによって、ＩＬ−２およびＩＬ−１８を全身投与するときとは異なる生理応答が見られる。具体的には、ＩＬ−２およびＩＬ−１８を全身投与すると、上述したように、ＩＬ−４、ｓｔａｔ６、およびＣＤ４＋Ｔ細胞依存的に、ＩｇＥの産生が誘導される。これに対して、本発明では、ＩＬ−２およびＩＬ−１８を鼻腔内投与しているため、投与されたモデル動物では、ＩｇＥ産生が誘導されることなく、非アレルギー性喘息が誘導される。
【００６０】
上記喘息モデル動物の作製方法は、具体的には、モデル動物に、ＩＬ−２およびＩＬ−１８を鼻腔内投与する工程（以下、「投与工程」ともいう）を含んでいればよく、その他具体的な構成、使用器具、使用装置などは特に限定されるものではない。
【００６１】
例えば、上記投与工程で、上記モデル動物に投与するＩＬ−２および／またはＩＬ−１８を取得する工程（以下、「取得工程」）をさらに含んでいてもよい。また、上記投与工程の後のモデル動物が気管支喘息を発症していることを検出する工程（以下、「発症検出工程」ともいう）を含んでいてもよい。
【００６２】
ここで、上記投与工程、取得工程、および発症検出工程について説明する。
【００６３】
（３−１．投与工程）
上記投与工程では、モデル動物に、ＩＬ−２およびＩＬ−１８を鼻腔内投与する。
【００６４】
上記モデル動物は、非感作性動物（ナイーブ動物）であればよく、その種類は特に限定されるものではない。例えば、＜１．気管支喘息発症モデル動物＞に例示した対象動物の非感作性動物（ナイーブ動物）を用いることができる。
【００６５】
上記アレルゲンとは、上記モデル動物に対して、アレルギーの原因となる抗原物質を意味する。本発明では、上記モデル動物に、アレルゲン非存在下で、ＩＬ−２およびＩＬ−１８を投与する。したがって、上記ＩＬ−２およびＩＬ−１８は、上記モデル動物に投与したときに、アレルゲンとならないものである。具体的には、上記ＩＬ−２およびＩＬ−１８は、上記モデル動物由来のＩＬ−２およびＩＬ−１８であることが好ましい。また、上記ＩＬ−２およびＩＬ−１８は、投与するモデル動物においてアレルゲンとならないものであれば、ＩＬ−２およびＩＬ−１８としての機能を有し、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を用いることもできる。例えば、上記モデル動物がマウスである場合、上記ＩＬ−２およびＩＬ−１８としては、マウス由来のＩＬ−２およびＩＬ−１８、またはマウス由来のＩＬ−２およびＩＬ−１８と同等の機能を有し、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、換言すれば、ＩＬ−２およびＩＬ−１８の変異タンパク質を用いることができる。本明細書において、「１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により置換、欠失、挿入、および／または付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されることを意味する。なお、上記投与工程で用いるＩＬ−２およびＩＬ−１８は、市販品を適宜購入して用いることもできるし、後述する取得工程で取得したものを用いることもできる。
【００６６】
上記投与工程において、上記ＩＬ−２およびＩＬ−１８を上記モデル動物に鼻腔内投与する方法は特に限定されるものではない。アレルゲンを混入させることなく、上記モデル動物の鼻腔内に上記ＩＬ−２およびＩＬ−１８を投与できる方法であればよく、従来公知の方法を用いることができる。
【００６７】
また、上記投与工程において、上記モデル動物に投与する、ＩＬ−２およびＩＬ−１８の投与量、および投与期間は、上記モデル動物の種類や、体重、年齢等にあわせて、適宜設定すればよい。例えば、上記モデル動物がマウスである場合、ＩＬ−２の投与量は、１日につき、２００〜５００Ｕであることが好ましい。また、ＩＬ−１８の投与量は、１日につき、０．５〜１．０μｇであることが好ましい。さらに、上記モデル動物がマウスである場合、ＩＬ−２およびＩＬ−１８の投与期間は、３〜４日間であることが好ましい。上記範囲内とすれば、当該マウスに気管支喘息を発症させることができる。
【００６８】
（３−２．取得工程）
上述したように、ＩＬ−２およびＩＬ−１８は、投与対象であるモデル動物の種類に応じて適宜選択されるものである。上記取得工程では、上述した投与工程で用いるＩＬ−２および／またはＩＬ−１８を取得する。
【００６９】
具体的には、例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−１８を含有する生物学的試料（例えば、細胞、組織、生物個体等）などから単純精製することによって、ＩＬ−２およびＩＬ−１８をすることができる。このとき、ＩＬ−２またはＩＬ−１８を精製する方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法で細胞や組織から細胞抽出液を調製し、この細胞抽出液を公知の方法、例えばカラム等を用いて精製すればよい。より具体的には、細胞または組織より抽出した粗タンパク質画分を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供し、ＩＬ−２またはＩＬ−１８の精製・分離を行うことができる。なお、ＩＬ−２と、ＩＬ−１８とは、同一の生物学的試料に含有されていてもよい。
【００７０】
また、その他のＩＬ−２およびＩＬ−１８を取得する方法として、従来公知の遺伝子組み換え技術等を用いる方法も挙げられる。この場合、例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−１８をコードする遺伝子をベクターなどに組み込んだ後、公知の方法により、発現可能に宿主細胞に導入し、細胞内で翻訳されて得られる上記ＩＬ−２またはＩＬ−１８を精製するという方法などを採用することができる。
【００７１】
なお、このように宿主に外来遺伝子を導入する場合、外来遺伝子の発現のため宿主内で機能するプロモーターを組み入れた発現ベクター、および宿主には様々なものが存在するので、目的に応じたものを選択すればよい。産生されたＩＬ−２またはＩＬ−１８を精製する方法は、用いた宿主、タンパク質の性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のタンパク質を精製することが可能である。つまり、本発明に用いるＩＬ−２およびＩＬ−１８は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。
【００７２】
ＩＬ−２および／またはＩＬ−１８の変異タンパク質を作製する方法についても、特に限定されるものではない。例えば、部位特異的突然変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, Gene 152,271-275(1995)他）、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し変異タンパク質を作製する方法、あるいはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異タンパク質作製法を用いることができる。これら方法を用いることによって、ＩＬ−２またはＩＬ−１８をコードするｃＤＮＡの塩基配列において、１または数個の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加されるように改変を加えることによって作製することができる。また、変異タンパク質の作製には、市販のキットを利用してもよい。
【００７３】
ＩＬ−２およびＩＬ−１８の取得方法は、上記に限定されるものではなく、例えば、市販されているペプチド合成器等を用いて化学合成されたものであってもよい。また、その他の例としては、無細胞系のタンパク質合成液を利用して、本発明にかかる遺伝子から本発明にかかるペプチドを合成してもよい。さらには、市販品を購入して用いることができる。
【００７４】
（３−３．発症検出工程）
上記発症検出工程では、上記投与工程に供した上記モデル動物において、気管支喘息が発症していることを検出する。上記発症検出工程において、当該モデル動物において気管支喘息を発症していることを検出する方法は、特に限定されるものではない。具体的には、当該モデル動物が非アレルギー性喘息を発症していることを検出することができればよい。例えば、血清ＩｇＥ値の上昇の有無を検証することによって、非アレルギー性喘息の発症を検出することができる。具体的には、血清ＩｇＥ値の上昇が見られなければ、当該モデル動物は、非アレルギー性の気管支喘息を発症していると判定することができる。血清中のＩｇＥの検出（定量）方法は、特に限定されるものではなく、ＥＬＩＳＡなどの従来公知の方法を用いて検出（定量）することができる。
【００７５】
また、上記投与工程に供した上記モデル動物の気管支肺胞洗浄液を用いて、好酸球および／または好中球浸潤を検出することによって、当該モデル動物が気管支喘息を発症していることを検出することができる。好酸球および／または好中球浸潤を検出する方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。例えば、後述の実施例で用いる方法で検出することができる。
【００７６】
さらに、上記投与工程に供した上記モデル動物の気管支肺胞洗浄液や、気道の生体組織から採取したＣＤ４＋Ｔ細胞を用いて、ＩＬ−１３の産生誘導を検出することによって、当該モデル動物における気管支喘息の発症を検出することができる。ＩＬ−１３の産生誘導を検出する方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法、例えば後述の実施例で用いる方法によって検出することができる。
【００７７】
また、上記投与工程に供した上記モデル動物にアセチルコリンを吸入させ、ＡＨＲの上昇をモニタリングすることによって、当該モデル動物における気管支喘息の発症を検出することができる。つまり、アセチルコリン吸入によりＡＨＲが上昇すれば、当該モデル動物は、気管支喘息を発症していると判定することができる。
【００７８】
なお、上記発症検出工程では、上記例示したような気管支喘息発症の検出方法を、全て実施してもよいし、一部のみを実施してもよい。
【００７９】
＜４．気管支喘息治療剤のスクリーニング方法＞
本発明にかかる気管支喘息治療剤（以下、「喘息治療剤」ともいう）のスクリーニング方法は、上述の本発明にかかる喘息モデル動物に対して、被験物質を投与し、気管支喘息の改善効果を検定するものである。具体的には、上記スクリーニング方法は、上記喘息モデル動物に被験物質を投与する工程（以下、「被験物質投与工程」ともいう）と、上記被験物質の気管支喘息の改善効果を検定する工程（以下、「検定工程」ともいう）を含んでいればよく、その他の具体的な構成は特に限定されるものではない。以下、上記被験物質投与工程および検定工程について説明する。
【００８０】
（４−１．被験物質投与工程）
上記被験物質投与工程では、本発明にかかる喘息モデル動物に被験物質を投与する。上記被験物質は特に限定されるものではなく、上記喘息モデル動物が発症する気管支喘息に有効と考えられる物質を用いればよい。例えば、上記喘息モデル動物は、上述したように、ＩＬ−１３の中和により、気管支喘息の発症が阻害される。したがって、ＩＬ−１３を中和することが期待される物質を被験物質とすればよい。具体的には、ＩＬ−１３に対する抗体、ＩＬ−１３の阻害剤、ＩＬ−１３の拮抗剤、およびＩＬ−１３の産生阻害剤などが例示できる。
【００８１】
また、上記被験物質の上記喘息モデル動物への投与方法は、特に限定されるものではなく、上記被験物質の性質などによって、適宜選択して行えばよい。例えば、経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、関節内、皮下、脊髄腔内、脳室内、または経口的に行うことができる。本発明では、スクリーニングされた喘息治療剤の実用化の観点から、鼻腔内的に投与することが好ましい。
【００８２】
（４−２．検定工程）
上記検定工程では、上記被験物質の気管支喘息の改善効果を検定する。上記気管支喘息の改善効果の検定方法は特に限定されるものではないが、例えば、以下の（ａ）〜（ｆ）項目を検証することによって、非アレルギー性喘息の発症を検出することができる。なお、これらの検証項目は、全てを実施してもよいし、一部のみを実施するだけでもよい。
【００８３】
（ａ）ムチン産生の亢進の有無
（ｂ）好酸球および／または好中球浸潤の有無
（ｃ）ＡＨＲの亢進の有無
（ｄ）杯細胞の異常増殖の有無
（ｅ）ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ−１３産生の有無
（ｆ）サイトカインおよび／またはケモカインの肺における発現解析
上記項目（ａ）〜（ｆ）と気管支喘息との関係について、以下説明する。
【００８４】
上記項目（ａ）〜（ｄ）では、気管支喘息の一般的な症状を検出するものである。これらの症状が見られなければ、当該被験物質には、気管支喘息の改善効果があると判定することができる。上記項目（ａ）〜（ｄ）の検証方法としては、従来公知の方法を用いればよく、例えば、後述の実施例にある方法で検証することができる。
【００８５】
上記項目（ｅ）において、当該モデル動物のＣＤ４＋Ｔ細胞において、ＩＬ−１３の産生誘導が見られなければ、当該被験物質には、気管支喘息の改善効果があると判定することができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ−１３の産生誘導を検出する方法は、特に限定されないが、例えば、後述の実施例の方法で検出することができる。
【００８６】
上記項目（ｆ）は、非アレルギー性喘息に特徴的な、肺におけるサイトカインおよび／またはケモカインの発現を検出することにより、当該被験物質には、気管支喘息の改善効果を検定することができる。上記サイトカインとしては、例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、およびＩＬ−１７を挙げることができる。また、上記ケモカインとしては、例えば、ＭＩＰ−２、ＧＣＰ−２、エオタキシン、およびエオタキシン−２を挙げることができる。
【００８７】
上記項目（ｆ）において、サイトカインおよび／またはケモカインの発現を解析する方法は、特に限定されるものではない。例えば、（Ａ）上記サイトカインおよび／またはケモカインのｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いて、上記サイトカインおよび／またはケモカインの発現を解析する方法、（Ｂ）上記サイトカインおよび／またはケモカインのタンパク質を用いて、上記サイトカインおよび／またはケモカインの発現を解析する方法を挙げることができる。また、上記（Ａ）および（Ｂ）の両方の方法を併用して、上記サイトカインおよび／またはケモカインの発現を解析してもよい。これにより、上記サイトカインおよび／またはケモカインの発現をより正確に解析することができる。ここでは、上記（Ａ）および（Ｂ）の方法について、以下、説明する。
【００８８】
（Ａ）ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いる方法
ｍＲＮＡを利用する場合、例えば、上記被験物質を投与した喘息モデル動物から採取した試料より抽出したｍＲＮＡまたは全ＲＮＡを用いて、ノザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイを用いた方法などにより、上記サイトカインおよび／またはケモカインのｍＲＮＡを定量することができる。さらには、ＲＴ−ＰＣＲ法等の遺伝子増幅技術を利用することができる。ＲＴ−ＰＣＲ法においては、遺伝子の増幅過程においてＰＣＲ増幅モニター法を用いることにより、上記サイトカインおよび／またはケモカインのｍＲＮＡの発現について、より定量的な解析を行うことが可能である。
【００８９】
上記ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法においては、両端に互いの蛍光を打ち消し合うことができる異なる蛍光色素で標識したプライマーを用い、検出対象（ＤＮＡもしくはＲＮＡの逆転写産物）にハイブリダイズさせる。ＰＣＲが進んでＴａｑポリメラーゼの５’−３’エクソヌクレアーゼ（exonuclease）活性により上記プライマーが分解されると２つの蛍光色素が離れ、蛍光が検出されるようになる。この蛍光の検出をリアルタイムに行う。上記検出対象についてコピー数の明らかな標準試料についても同時に測定することにより、ＰＣＲ増幅の直線性のあるサイクル数で目的試料中の検出対象のコピー数を決定する（Holland,P.M.et al.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7276-7280;Livak,K.J.et al.,1995,PCR Methods and Applications 4(6):357-362;Heid,C.A.et al.,Genome Research 6:986-994;Gibson,E.M.U.et al.,1996,Genome Research 6:995-1001を参照）。これにより、検出対象を定量することができる。ＰＣＲ増幅モニター法においては、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００（ＰＥバイオシステムズ社）を用いることができる。
【００９０】
上記プライマーは、特に限定されるものではなく、上記サイトカインおよび／またはケモカインのｍＲＮＡの塩基配列を利用して、従来公知の方法で設計すればよい。
【００９１】
上記試料からｍＲＮＡまたは全ＲＮＡを抽出する方法は、特に限定されるものではなく、上記サイトカインおよび／またはケモカインのｍＲＮＡを発現する生物学的試料（例えば、細胞、組織、生物個体等）などから、従来公知の方法を用いてｍＲＮＡまたは全ＲＮＡを抽出することができる。上記生物学的試料としては、具体的には、肺、および肺内ＣＤ４＋Ｔ細胞を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００９２】
また、上記ＲＴ−ＰＣＲに用いるプライマーや、ノザンハイブリダイゼーション法やドットブロット法に用いるプローブを蛍光色素などにより標識する場合、その標識方法は特に限定されるものではない。例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩを用いるニックトランスレーション法、ポリヌクレオチドキナーゼを用いる末端標識法、クレノーフラグメントによるフィルイン末端標識法（Berger SL,Kimmel AR.(1987)Guide to Molecular Cloning Techniques,Method in Enzymology,Academic Press;Hames BD,Higgins SJ(1985)Genes Probes:A Practical Approach.IRL Press;Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.(1989)Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2nd Edn.Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照）、ＲＮＡポリメラーゼを用いる転写による標識法（Melton DA,Krieg,PA,Rebagkiati MR,Maniatis T,Zinn K,Green MR.(1984)Nucleic Acid Res.,12,7035−7056を参照）、放射性同位体を用いない修飾ヌクレオチドをＤＮＡに取り込ませる方法（Krick a LJ.(1992)Nonisotopic DNA Probing Techniques.Academic Pressを参照）などを用いることができる。
【００９３】
（Ｂ）タンパク質を用いる方法
上記被験物質を投与した喘息モデル動物から採取した試料より抽出したタンパク質を用いる場合、分析対象となる上記サイトカインおよび／またはケモカインに特異的に結合する抗体を用いて、ウェスタンブロット法やＥＬＩＳＡ法などの従来公知の免疫化学的手法により上記サイトカインおよび／またはケモカインを定量することができる。また、本発明はこれに限定されず、上記サイトカインおよび／またはケモカインの検出、定量方法として、従来公知のあらゆる手法を用いて、上記サイトカインおよび／またはケモカインを定量することができる。
【００９４】
また、上記試料からタンパク質を抽出する方法は、特に限定されるものではなく、上記サイトカインおよび／またはケモカインを含有する生物学的試料（例えば、細胞、組織、生物個体等）などから、上記サイトカインおよび／またはケモカインが分解されない条件下で、従来公知の緩衝液および装置、キット等を用いてタンパク質を抽出することができる。上記生物学的試料としては、具体的には、肺、および肺内ＣＤ４＋Ｔ細胞を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００９５】
上記抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。また、上記抗体の取得方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。例えば、ポリクローナル抗体は、抗原を感作した哺乳動物 の血液を取り出し、この血液から公知の方法により血清を分離することにより取得することができる。また、ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用することができる。さらに、必要に応じてこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離してもよい。
【００９６】
また、モノクローナル抗体は、例えば、抗原を感作した哺乳動物から免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞などと細胞融合させて得られたハイブリドーマをクローニングして、その培養物から抗体を回収することにより取得することができる。
【００９７】
上記項目（ｆ）では、上記（Ａ）および／または（Ｂ）に例示したような方法で、上記被験物質を投与した喘息モデル動物と、上記被験物質投与前の喘息モデル動物とにおいて、サイトカインおよび／またはケモカインの肺における発現を解析する。その後、両者の間で有意な相違が見られた場合、当該被験物質には、気管支喘息の改善効果があると判定することができる。
【００９８】
ここで、上記例示したサイトカインおよびケモカインのｍＲＮＡを用いて、上記検定工程における気管支喘息の改善効果を検定する方法について具体的に説明する。本発明にかかる喘息モデル動物では、ＳＴＡＴ６の活性化により、エオタキシンおよびエオタキシン−２のｍＲＮＡレベルを上昇させる。したがって、被験物質の投与により、エオタキシンおよびエオタキシン−２のｍＲＮＡレベルの低下が見られれば、気管支喘息の改善効果があると判定することができる。
【００９９】
また、本発明にかかる喘息モデル動物の肺やＣＤ４＋Ｔ細胞では、ＩＬ−１３の産生が誘導されている。したがって、被験物質の投与により、ＩＬ−１３のｍＲＮＡレベルの低下が見られれば、気管支喘息の改善効果があると判定することができる。
【０１００】
以上のように、本発明にかかる気管支喘息治療剤のスクリーニング方法によれば、気管支喘息、特に、非アレルギー性気管支喘息のための治療剤のスクリーニングができる。また、本発明には、上記気管支喘息治療剤のスクリーニング方法により喘息の改善効果を示すと判定される物質を含有する気管支喘息治療剤も含まれる。
【０１０１】
なお本発明は、以上例示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術範囲に含まれる。
【実施例】
【０１０２】
本発明について、実施例、および図１〜図４に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。
【０１０３】
＜１．実験材料と実験方法＞
〔動物および試薬〕
Jackson Laboratoryから特定病原体未感染（ＳＰＦ）雌ＢＡＬＢ／ｃマウス、およびＳＴＡＴ６欠損マウス（ＳＴＡＴ６−／−；遺伝的背景ＢＡＬＢ／ｃ）を購入した。ＢＡＬＢ／ｃ  ＩＬ−４欠損マウス（ＩＬ−４−／−；遺伝的背景ＢＡＬＢ／ｃ）およびＲａｇ−２欠損マウス（Ｒａｇ−２−／−；遺伝的背景ＢＡＬＢ／ｃ）を、タコニック（Taconic, Germantown, NY）から取得した。また、兵庫医科大学（西宮、日本）の動物施設で、全てのマウスをＳＰＦ条件下で飼育し、８〜１０週齢のものを使用した。動物実験は、兵庫医科大学の動物実験ガイドラインに沿って行った。組み換えヒトＩＬ−２は、味の素株式会社（川崎、日本）から入手した。組み換えマウスＩＬ−５、ＩＬ−１３、およびＩＬ−１８は、Genetics Institute Inc. (Cambridge, MA)およびＭＢＬ（名古屋、日本）からそれぞれ購入した。組み換えマウスＩＬ−４は、組み換えバキュロウイルス（ＡｃＭＮＰＶ．ＩＬ−４）から精製し、取得した。
【０１０４】
〔マウスのIn vivoにおけるマウスのサイトカイン処理〕
５０μｌのＰＢＳに溶解したＩＬ−１８（０〜１μｇ／日）およびＩＬ−２（５００Ｕ／日）を様々に組み合わせて、１〜４日間まで、毎日、上記の様々なマウスの鼻腔内に曝露させた。また、コントロールマウスには、ＰＢＳを曝露させた。ＰＢＳのみ、またはサイトカインに最後に曝露させてから、２４時間後に、マウスの解析を行った。
【０１０５】
〔ＡＨＲの測定〕
Ｐｕｌｍｏｓ−Ｉ（ＭＩＰＳ、大阪、日本）のハードウェアおよびソフトウェアを用いて、マウスのβ−メタコリン（以下、「Ｍｃｈ」ともいう）吸入に対するＡＨＲを測定した。チャンバーにマウスを置き、最初に、生理食塩水のエアロゾル（ベースライン）に暴露し、次いで、濃度を増加したメタコリン（５、１０、および２０ｍｇ／ｍｌ）に暴露した。それぞれ、２分間の暴露後、増強された圧力波形状および呼吸時間の振幅の変化を反映する指数を３分間測定した。
【０１０６】
〔気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）〕
１匹のマウス当たり、１．０ｍＬのＰＢＳを３回に分けて、ＢＡＬを行い、全細胞数を数えた。ＢＡＬ液（以下、「ＢＡＬＦ」ともいう）を遠心後、Ｄｉｆ−Ｑｕｉｋ染色法（Baxter Healthcare Corp,Miami,FL）で染色し、形態学および染色特性に基づいて区別した。
【０１０７】
〔組織病理学的解析〕
上記の方法でサイトカイン処理したマウス（サイトカイン処理５日目のマウス）の肺組織に、右心室を介して、１０ｍｌのＰＢＳを注入した。次に、この肺組織を、１０％緩衝化ホルマリンに固定し、３μｍの断片とし、ヘマトキシリンおよびエオシン（ヘマトキシリン・エオシン染色）、または分解されやすくした過ヨウ素酸シッフ（predigested periodic acid Schiff）（ＰＡＳ染色）で染色した。なお、各グループにつき、６〜８匹のマウスを使用した。
【０１０８】
〔胚繊維芽細胞の調製〕
マウス胚繊維芽細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスから発生したＥ１４胚から調製した。迅速に、当該マウスの頭部を切断し、カーカスを、はさみを用いて、細かく切り刻んだ。そして、０．１％トリプシン（GIBCO-BRL, Grand Island, NY）、および０．０２％ＥＤＴＡ（ナカライテスク、京都、日本）を含むＰＢＳ中で、３７℃で２０分間、インキュベーションすることにより、消化した。１０％  ＦＢＳ、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭを用いて上記細胞を２回洗浄することによって、トリプシンを失活させた。そして、上記細胞を、組織培養皿状に置いた。３〜４日後、繊維芽細胞の増殖が落ち着いた時に、胚断片を除去した。胚繊維芽細胞は、単層培養で維持し、そうして得られた細胞を用いた。
【０１０９】
〔in vitro培養〕
MicroBeads（抗マウスＣＤ４クローンＲＭ４−５、Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany）を用いて、ＢＡＬＢ／ｃマウスから脾臓のＣＤ４＋Ｔ細胞を調製した。こうして濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞（１０５／０．２ｍｌ／ウェル）を１０％  ＦＢＳ、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０のみ、または、ＩＬ−２（２００ｐＭ）およびＩＬ−１８（５０ｎｇ／ｍｌ）を様々に組み合わせて添加した上記ＲＰＭＩ１６４０で培養した。培養後、上清を採取し、ＥＬＩＳＡにより、ＩＬ−４およびＩＬ−１３の含量を測定した。
【０１１０】
また、マウス胚繊維芽細胞（５×１０４／０．２ｍｌ／ウェル）を１０％  ＦＢＳ、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ、または、ＩＬ−４（１０３Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−１３（１０ｎｇ／ｍｌ）またはＩＬ−５（１０ｎｇ／ｍｌ）を様々に組み合わせて添加した上記ＤＭＥＭで、２日間培養した。培養後、上清を採取し、ＥＬＩＳＡにより、エオタキシン含量を測定した。
【０１１１】
〔肺のホモジネーション〕
ＩＬ−１８およびＩＬ−２をそれぞれ、１日につき、１μｇおよび５００Ｕずつ、１〜４日間、毎日、ＢＡＬＢ／ｃマウスの鼻腔内に曝露させた。ＩＬ−２およびＩＬ−１８の最後の曝露後、８時間で、肺を摘出した。そして、当該肺を、Bead Smash 12（和研薬、京都、日本）を用いて、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、２μｇ／ｍｌロイペプチンを含む０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で、１分間ホモジナイズした。その後、１００００ｒｐｍ、４℃で、５分間遠心分離した。得られた上清について、ＥＬＩＳＡにより、ＩＬ−４およびＩＬ−１３の含量を測定した。
【０１１２】
〔ＲＴ−ＰＣＲ解析〕
５０μｌのＰＢＳに溶解したＩＬ−１８およびＩＬ−２をそれぞれ、１日につき、１μｇおよび５００Ｕずつ、１〜４日間、毎日、動物の鼻腔内に曝露させた。ＩＬ−２およびＩＬ−１８の最後の曝露後、４時間で、肺を摘出した。そして、当該肺から、トリゾール試薬を用いて、全ＲＮＡを抽出した。当該全ＲＮＡをＤＮａｓｅＩで処理し、Superscript II RTおよびoligo (dT)12-18プライマー（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いて逆転写した。ＩＬ−４およびＩＬ−１３のｃＤＮＡを増幅するために、９４℃で２分間、変性処理した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、６８℃で１分間の条件で、３４サイクル、ＰＣＲを行った。最後に、６８℃で７分間の伸張反応を行った。ＩＬ−９のｃＤＮＡを増幅するためには、９４℃で１分間、５８℃で１分間、６８℃で１分間の条件で、３４サイクル、ＰＣＲを行った。また、ＩＬ−５、ＭＩＰ−２、エオタキシン−２、ＲＡＮＴＥＳおよびＧＣＰ−２のｃＤＮＡを増幅するためには、９４℃で１分間、６０℃で１分間、６８℃で１分間の条件で３４サイクル、ＰＣＲを行った。さらに、エオタキシンおよびβ−アクチンのｃＤＮＡを増幅するためには、９４℃で１分間、６２℃で１分間、６８℃で１分間の条件で、３０サイクル、ＰＣＲを行った。また、ＩＬ−１７のｃＤＮＡを増幅するためには、９４℃で１５秒間、５８℃で３０秒間、６８℃で１分間の条件で、３４サイクル、ＰＣＲを行った。上記のとおり、ＰＣＲを行った後、解析するまで、当該試料を４℃で保存した。上記のようにして得られたＰＣＲ産物を、１．７％アガロースゲルを用いた電気泳動により分離し、ＵＶ照射により可視化した。上記ＰＣＲに用いたプライマーセットは、以下の通りである。
ＩＬ−４ｃＤＮＡ検出用プライマーセット
forward primer；5’-GAA TGT ACC AGG AGC CAT ATC-3’（配列番号１）
reverse primer；5’-CTC AGT ACT ACG AGT AAT CCA-3’（配列番号２）
ＩＬ−５ｃＤＮＡ検出用プライマーセット
forward primer；5’-ATG GAG ATT CCC ATG AGC AC-3’（配列番号３）
reverse primer；5’-GTC TCT CCT CGC CAC ACT TC-3’（配列番号４）
ＩＬ−９ｃＤＮＡ検出用プライマーセット
forward primer；5’-TAC ATC CTT GCC TCT GTT TT-3’（配列番号５）
reverse primer；5’-CAG AAA TGA CAG TGT GTT GC-3’（配列番号６）
ＩＬ−１３ｃＤＮＡ検出用プライマーセット
forward primer；5’-ACA GCT CCC TGG TTC TCT CA-3’（配列番号７）
reverse primer；5’-GCT ACT TCG ATT TTG GTA TCG G-3’（配列番号８）
ＩＬ−１７ｃＤＮＡ検出用プライマーセット
forward primer；5’-TCT CAT CCA GCA AGA GAT CC-3’（配列番号９）
reverse primer；5’-AGT TTG GGA CCC CTT TAC AC-3’（配列番号１０）
エオタキシンｃＤＮＡ検出用プライマーセット
forward primer；5’-CTC CAC AGC GCT TCT ATT CC-3’（配列番号１１）
reverse primer；5’-CTT CTT CTT GGG GTC AGC AC-3’（配列番号１２）
ＧＣＰ−２ｃＤＮＡ検出用プライマーセット
forward primer；5’-CCA CCC ACG GAT TTT CTT TA-3’（配列番号１３）
reverse primer；5’-GGT CCC CAT TTC ATG AGA GA-3’（配列番号１４）
エオタキシン−２ｃＤＮＡ検出用プライマーセット
forward primer；5’-CTG TGA CCA TCC CCT CAT CT-3’（配列番号１５）
reverse primer；5’-TAT GTG CCT CTG AAC CCA CA-3’（配列番号１６）
ＲＡＮＴＥＳｃＤＮＡ検出用プライマーセット
forward primer；5’-GTG CCC ACG TCA AGG AGT AT-3’（配列番号１７）
reverse primer；5’-ATT TCT TGG GTT TGC TGT GC-3’（配列番号１８）
ＭＩＰ−２ｃＤＮＡ検出用プライマーセット
forward primer；5’-GAA GTC ATA GCC ACT CTC AAG GGG C-3’（配列番号１９）
reverse primer；5’-CAA CTC ACC CTC TCC CCA GAA AC-3’（配列番号２０）
β−アクチンｃＤＮＡ検出用プライマーセット
forward primer；5’-GTA CGA CCA GAG GCA TAC AGG-3’（配列番号２１）
reverse primer；5’-GAT GAC GAT ATC GCT GCG CTG-3’（配列番号２２）
〔実施例１：ＩＬ−２およびＩＬ−１８によるムチン産生亢進、気道炎症、およびＡＨＲの誘発〕
上記の方法でサイトカイン処理をしたマウスの肺について、上記の方法で組織病理学的解析を行った。その結果、図１（ａ）および（ｂ）に示すように、１日につき、１μｇのＩＬ−１８と５００ＵのＩＬ−２とを投与したマウスでは、気管支周囲(peribronchial)および細静脈周囲（perivenular）に好酸球および単核球が、顕著に浸潤していた。さらに、これらのマウスでは、気道でのムチンの過剰分泌を伴った杯細胞の異常増殖が誘導されていた。一方、ＩＬ−２およびＩＬ−１８の一方のみを投与したマウスでは、図１（ａ）に示すように、上記症状は見られないか、またはその症状は軽かった。
【０１１３】
また、１日につき５００ＵのＩＬ−２を投与したマウスでは、ＩＬ−１８の１日あたりの投与量が増加するにつれて、投与量依存的に気道炎症およびムチン産生が誘導された（図１（ａ））。また、１日につき、１μｇのＩＬ−１８と５００ＵのＩＬ−２とを、１日または２日間投与しただけでは、気道炎症や胚細胞の異常増殖は、十分に誘導されなかった。一方、上記投与を３日間または４日間行ったマウスでは、気道炎症や胚細胞の異常増殖が、十分に誘導された。
【０１１４】
さらに、上記の方法でサイトカイン処理をしたマウスについて、上記の方法でＡＨＲ測定を行った。その結果、図１（ｃ）に示すように、３日間以上、ＩＬ−２およびＩＬ−８を鼻腔内投与されたマウスでは、ＡＨＲが顕著に亢進された。一方、ＰＢＳを投与したマウスや、ＩＬ−２およびＩＬ−１８の一方のみを投与したマウスは、ＡＨＲを示さなかった。
【０１１５】
以上の結果から、ＩＬ−２およびＩＬ−１８の両方を鼻腔内投与することによって、ナイーブマウスに対して、ムチンの過剰分泌、気道炎症、およびＡＨＲを誘導させることができることが分かった。
【０１１６】
次に、ＩＬ−２およびＩＬ−１８の投与によって、ＡＨＲが誘導される機序を調べるために、上記の方法でサイトカイン処理をしたマウスの肺組織に浸潤した炎症細胞の数を評価するため、上記の方法で調製したＢＡＬＦについて解析を行った。その結果、図１（ｄ）に示すように、ＩＬ−２およびＩＬ−１８の両方を投与したマウスでは、好酸球および好中球の数が顕著に増加していた。これは、ＩＬ−２およびＩＬ−１８によって、好酸球および好中球の浸潤が誘導されることを示すものである。つまり、これらの結果から、ＩＬ−２およびＩＬ−１８を鼻腔内投与することにより、ムチンの過剰分泌、好酸球および好中球による気道炎症、およびＡＨＲが誘導されることが明らかとなった。これらの症状は、いずれも、気管支喘息において、顕著な病理学的、生理学的特徴である。すなわち、本実施例において、ＩＬ−２およびＩＬ−１８を鼻腔内投与することにより、マウスにおいて、気管支喘息を誘導（発症）させることが可能なことが分かった。
【０１１７】
つまり、野生型マウスにＩＬ−２およびＩＬ−１８を点鼻投与すると、β−メタコリン吸入に対するＡＨＲの著明な亢進、肺組織とＢＡＬＦ中の好酸球および好中球の強い浸潤、更に気道上皮内ムチン産生細胞の増加など、気管支喘息に特徴的な症状を誘導できることが分かった。
【０１１８】
一方、ＩＬ−２およびＩＬ−１８を投与したマウスにおいて、血清ＩｇＥ値、並びに気道粘膜における好塩基球およびマスト細胞の活性を測定した。その結果、当該マウスにおいて、血清ＩｇＥ値の上昇、気道粘膜における好塩基球およびマスト細胞の活性は認められなかった。つまり、ＩＬ−２およびＩＬ−１８の刺激によって誘導される気管支喘息は、アレルギー性炎症等で誘導される気管支喘息ではなく、抗原刺激が全く関与しない気管支喘息であった。これらの結果から、ＩＬ−２およびＩＬ−１８を点鼻投与するだけで、抗原刺激が全く関与しない気管支喘息を誘導できることが明らかとなった。
【０１１９】
〔実施例２：ＩＬ−２およびＩＬ−１８吸引マウスにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞依存性気管支喘息〕
ＣＤ４＋Ｔ細胞を除去した野生型マウス、およびＲＡＧ２欠損マウスに対して、上記の方法でサイトカイン処理を行った。上記ＣＤ４＋Ｔ細胞を除去した野生型マウスは、なお、マウスから、ＣＤ４＋Ｔ細胞を除去するために、ＢＡＬＢ／ｃ野生型マウスに対して、ＣＤ４に対するモノクローナル抗体を４回（上述したサイトカイン処理の１４日前、１０日前、７日前、および４日前）、腹腔内に注射することにより得た。また、上記Ｒａｇ２欠損マウスは、Ｔ細胞とＢ細胞との両方を欠損するマウスである。
【０１２０】
これらサイトカイン処理したマウスを用いて、ＩＬ−２およびＩＬ−１８によって誘導される気管支喘息におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の関与を調べた。
【０１２１】
その結果、図２（ａ）マウスを抗ＣＤ４抗体で処理することによって、ＩＬ−２およびＩＬ−１８によって誘導される、ムチン産生による杯細胞の異常増殖が見られなくなった。また、図２（ｂ）に示すように、Ｍｃｈ投与によるＡＨＲも見られなかった。さらに、図２（ｃ）に示すように、ＢＡＬＦにおける好酸球および好中球の増加も見られなかった。また、Ｒａｇ２欠損マウスでも、同様に、ムチン産生を伴った杯細胞の異常増殖、Ｍｃｈ投与によるＡＨＲ、およびＢＡＬＦにおける好酸球および好中球の増加といった喘息症状は誘導されなかった。これらの結果から、ＩＬ−２およびＩＬ−１８の刺激によって誘導される気管支喘息は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化によるものであることが明らかとなった。
【０１２２】
つまり、ＩＬ−２およびＩＬ−１８吸引マウスにおける気管支喘息誘導の機序として、ＩＬ−２およびＩＬ−１８の刺激を受けたＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＩＬ−１３を大量に産生するため、ＡＨＲの亢進、好酸球浸潤およびムチン産生亢進がＩＬ−１３の作用で誘導されることが示唆された。
【０１２３】
〔実施例３：ＩＬ−１３によるムチン産生亢進、気道炎症、およびＡＨＲの誘発〕
モデル動物として、ＳＴＡＴ６欠損マウス、ＩＬ−４欠損マウス、およびｓＩＬ−１３Ｒ−Ｆｃを与えたＢＡＬＢ／ｃ野生型マウスを用いた。これらのモデル動物に対して、上記の方法で、サイトカイン処理を行った。また、ｓＩＬ−１３Ｒ−Ｆｃ処理は、２０μｇのｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ、または２０μｇのコントロールヒトＩｇＧ（Genentics Institute Inc. Cambridge, MA）を、ＩＬ−２およびＩＬ−１８と混合する形で、４日間、毎日、鼻腔内に投与することにより行った。このようなｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処理マウスは、in vivoにおいてＩＬ−１３が阻害される。さらに、ＳＴＡＴ６欠損マウスでは、ＩＬ−４およびＩＬ−１３のシグナル伝達に必須であるｓｔａｔ６遺伝子が欠損している。
【０１２４】
上記モデル動物に対してサイトカイン処理を行った結果、図３（ａ）〜（ｃ）に示すように、ＳＴＡＴ６欠損マウスでは、ＢＡＬＦ中の好中球浸潤は認められたが、その他の喘息所見は全く認められなかった。このことから、ＩＬ−２およびＩＬ−１８によって誘導される気管支喘息には、ＩＬ−４およびＩＬ−１３が大きく関与していることが分かった。
【０１２５】
一方、ＩＬ−４欠損マウスでは、図３（ａ）に示すように、実施例１と同様、杯細胞の異常増殖が見られた。また、ｓＩＬ−１３Ｒ−Ｆｃで処理した野生型マウスでは、図３（ａ）に示すように、杯細胞の異常増殖は見られなかった。これらの結果から、ムチンの過剰産生の誘導には、ＩＬ−１３が不可欠であることが明らかとなった。
【０１２６】
また、図３（ｂ）および（ｃ）に示すように、ＩＬ−４欠損マウスでは、好酸球および好中球浸潤、ムチン産生の亢進は認められたが、ＡＨＲの亢進は軽度であった。一方、ｓＩＬ−１３Ｒ−Ｆｃで処理した野生型マウスでは、ＡＨＲ、および気道における好酸球浸潤が見られなかった。つまり、ＩＬ−１３の中和により、ＡＨＲ、および気道における好酸球浸潤は抑制された。これらの結果から、気管支喘息の発症要因として、ＩＬ−１３が重要であることが分かった。つまり、ＩＬ−２およびＩＬ−１８による刺激は、ＩＬ−１３を誘導することにより、杯細胞の異常増殖および気道における好酸球浸潤を誘導することが明らかとなった。
【０１２７】
次に、上記の方法で、野生型マウスから調製した脾臓のＣＤ４＋Ｔ細胞に対して、in vitroにおいて、ＩＬ−２およびＩＬ−１８で刺激した。その結果、図３（ｄ）に示すように、ＩＬ−２およびＩＬ−１８で刺激されたＴ細胞は、２９．８±６．８ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１３を産生したのに対して、９４．５±７．５ｐｇ／ｍｌのＩＬ−４しか産生しなかった。さらに、上記の方法で、ＩＬ−２およびＩＬ−１８処理した野生型マウスから摘出した肺を用いて、ＩＬ−４およびＩＬ−１３の含量を測定した。その結果、図３（ｅ）に示すように、肺においても、ＩＬ−２およびＩＬ−１８の刺激によって、ＩＬ−４よりも、ＩＬ−１３のほうがより強く誘導された。これらの結果から、ＩＬ−２およびＩＬ−１８によって誘導される気管支喘息において、ＩＬ−４は、ＡＨＲ誘導には関与しているが、その他の喘息症状への関与は軽度であることが分かった。つまり、ＩＬ−２およびＩＬ−１８による刺激は、ＩＬ−４よりも、ＩＬ−１３を強く誘導することによって、杯細胞の異常増殖、ＡＨＲ、および好酸球浸潤を誘導することが明らかとなった。
【０１２８】
〔実施例４：ＩＬ−２およびＩＬ−１８処理マウス肺内におけるサイトカインおよびケモカインｃＤＮＡの発現〕
ＩＬ−２およびＩＬ−１８によって誘導される気道における好酸球および好中球浸潤を制御するサイトカインおよびケモカインを調べるために、ＳＴＡＴ６欠損マウス、およびＢＡＬＢ／ｃ野生型マウスに対して上記の方法でサイトカイン処理をし、マウスの肺におけるサイトカインおよびケモカインのｍＲＮＡの発現を経時的に解析した。上記サイトカインとしては、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、およびＩＬ−１７について解析した。また、上記ケモカインとしては、ＭＩＰ−２、ＧＣＰ−２、エオタキシン、およびエオタキシン−２について解析した。上記サイトカインおよびケモカインのｍＲＮＡ量は、上記の方法に従い、ＲＴ−ＰＣＲ法によって解析した。
【０１２９】
その結果、図４に示すように、ＳＴＡＴ６欠損マウス、およびＢＡＬＢ／ｃ野生型マウスのいずれにおいても、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、およびＩＬ−１３のｍＲＮＡは、ＩＬ−２およびＩＬ−１８の投与１日目で検出できた。そして、その後、徐々に、それらのｍＲＮＡの発現量は増加した。このように、ＳＴＡＴ６欠損マウスでは、ＩＬ−５およびＩＬ−９のｍＲＮＡが明らかに発現していたにもかかわらず、これらのマウスでは、図３（ｂ）および（ｃ）に示すように、ＡＨＲ、および気道における好酸球浸潤が見られなかった。これらの結果から、ＩＬ−２およびＩＬ−１８によって誘導される気管支喘息には、ＩＬ−５およびＩＬ−９は関与しないことが明らかとなった。
【０１３０】
また、ＳＴＡＴ６欠損マウス、およびＢＡＬＢ／ｃ野生型マウスのいずれにおいても、ＩＬ−１７、並びにＣＸＣケモカインであるＭＩＰ−２およびＧＣＰ−２のｍＲＮＡは、ＩＬ−２およびＩＬ−１８の投与１日目で検出でき、その発現レベルが４日目まで維持された。ＭＩＰ−２およびＧＣＰ−２は、好中球の強力な化学誘引物質である。また、ＩＬ−１７は、原則的にＣＤ４＋Ｔ細胞によって産生される。そして、ＩＬ−１７は、気管支上皮細胞において、ＧＣＰ−２およびＭＩＰ−２を含む数種のＣＸＣケモカインを放出することによって、上記気道における好中球遊走に関与する。
【０１３１】
したがって、ＩＬ−２およびＩＬ−１８によって誘導される気道の好中球浸潤は、ＳＴＡＴ６欠損マウスにおいても見られることから、ＩＬ−１７および／またはＣＸＣケモカイン（ＭＩＰ−２およびＧＣＰ−２）によるものと考えられる。
【０１３２】
本解析において、ＳＴＡＴ６欠損マウスとＢＡＬＢ／ｃ野生型マウスとの間で最も顕著に異なったのは、エオタキシンの発現パターンであった。なお、上記エオタキシンは、最も強力な好酸球遊走因子である。図４に示すように、ＢＡＬＢ／ｃ野生型マウスでは、エオタキシンのｍＲＮＡの発現は、ＩＬ−２およびＩＬ−１８の投与１日目で検出できるようになった。そして、その発現レベルは、４日目まで経時的に上昇した。一方、ＳＴＡＴ６欠損マウスでは、エオタキシンのｍＲＮＡは増加しなかった。これらの結果から、ＩＬ−２およびＩＬ−１８による刺激は、ＳＴＡＴ６の活性化により、エオタキシンのｍＲＮＡレベルを上昇させることが分かった。
【０１３３】
さらに、エオタキシンに加えて、エオタキシン同様、好酸球遊走因子であるエオタキシン−２、および好酸球誘導因子であるＲＡＮＴＥＳのｍＲＮＡについても測定した。エオタキシンと同様、エオタキシン−２についても、ｍＲＮＡの発現が、迅速に、かつＳＴＡＴ６依存的に誘導された（図４を参照）。そして、その発現レベルは、４日目まで経時的に上昇した。一方、ＲＡＮＴＥＳのｍＲＮＡは、図４に示すように、ナイーブマウスの肺において、恒常的に発現していた。つまり、ＩＬ−２およびＩＬ−１８処理によってアップレギュレートされることはなかった。
【０１３４】
これらの結果、および実施例３の結果から分かるように、ＳＴＡＴ６欠損マウスでは、ＩＬ−１３の産生が認められた。一方、エオタキシンおよびエオタキシン−２のｍＲＮＡの発現は認められず、また、好酸球浸潤も認められなかった。したがって、ＩＬ−２およびＩＬ−１８の刺激により野生型マウスにおけるエオタキシンおよびエオタキシン−２の発現が上昇するのは、ＩＬ−１３の刺激がｓｔａｔ６依存的に伝達された結果であることが明らかとなった。また、ＩＬ−２およびＩＬ−１８によって処理されたＳＴＡＴ６欠損マウスの肺では、ＩＬ−５のｍＲＮＡが発現していたが、当該ＳＴＡＴ６欠損マウスでは、気道における好酸球浸潤が認められなかったことから、ＩＬ−５は好酸球浸潤に関与しないと考えられる。
【０１３５】
次に、上記の方法に従い、培養繊維芽細胞において、ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３がエオタキシンの発現を誘導する活性を測定した。その結果、ＩＬ−４およびＩＬ−１３は、培養繊維芽細胞のエオタキシン誘導に関して、同等の効果を示した。しかし、その効果は、付加的な誘導効果に過ぎなかった。一方、ＩＬ−５は、培養繊維芽細胞におけるエオタキシンの発現を誘導しなかった。これらの結果から、ＩＬ−２およびＩＬ−１８の刺激は、肺に浸潤するＣＤ４＋Ｔ細胞において、ＩＬ−４よりも、ＩＬ−１３を強く誘導することによって、肺における好酸球浸潤を誘導することがより確証づけられた。
【０１３６】
ＩＬ−１８は気道上皮細胞に豊富に蓄えられ、病原性微生物成分の刺激で分泌産生される。したがって、この知見と、上記実施例１〜４とから、上記実施例１〜４から、感染に伴い、ＩＬ−１８が、気道上皮から分泌されると、ＩＬ−１３依存性に好酸球増加、ムチン産生亢進等、アレルギー性炎症に類似した病理像が誘導されることが明らかとなった。さらに、上記実施例１〜４の結果から、ＩＬ−１８の機能を抑制することで、気管支喘息の発症が制御できることが明らかとなった。したがって、本発明は、ＩＬ−１８の制御を通じた感染誘導性喘息の治療法の開発に非常に有効に用いることが可能である。
【０１３７】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１３８】
以上のように、本発明は、感染によって誘発される気道過敏症に代表される気管支喘息を、モデル動物で発症させることを可能にするものである。したがって、本発明は、現在、的確な治療法がない非アレルギー性喘息の発症メカニズムの解明、非アレルギー性喘息に有効な新規治療薬・治療方法の開発などに好適に用いることができる。すなわち、本発明は、医療分野、医薬品分野をはじめ、幅広い分野に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】図１（ａ）〜（ｄ）は、ＩＬ−２およびＩＬ−１８処理した野生型マウスにおける気管支喘息の誘導を解析した結果を示す図である。図１（ａ）および（ｂ）は、上記マウス肺の組織病理学的解析の結果を示す図である。図１（ａ）は、過ヨウ素酸シッフ反応により染色した結果を示す図であり、図１（ｂ）は、ヘマトキシリン・エオシン染色した結果を示す図である。図１（ｃ）は、上記マウスについて、β−メタコリン吸入に対するＡＨＲを測定した結果を示す図である。図１（ｄ）は、上記マウスのＢＡＬＦのＤｉｆ−Ｑｕｉｋ染色の結果を示す図である。
【図２】図２（ａ）〜（ｃ）は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を除去した野生型マウス、およびＲＡＧ２欠損マウスをＩＬ−２およびＩＬ−１８処理し、当該マウスにおける気管支喘息の誘導を解析した結果を示す図である。図２（ａ）は、上記マウス肺の組織病理学的解析（過ヨウ素酸シッフ反応）の結果を示す図である。図２（ｂ）は、上記マウスについて、β−メタコリン吸入に対するＡＨＲを測定した結果を示す図である。図２（ｃ）は、上記マウスのＢＡＬＦのＤｉｆ−Ｑｕｉｋ染色の結果を示す図である。
【図３】図３（ａ）〜（ｃ）は、ＩＬ−２およびＩＬ−１８処理された、ＳＴＡＴ６欠損マウス、ＩＬ−４欠損マウス、およびｓＩＬ−１３Ｒ−Ｆｃ処理マウスにおける気管支喘息の誘導を解析した結果を示す図である。図３（ａ）は、上記マウス肺の組織病理学的解析（過ヨウ素酸シッフ反応）の結果を示す図である。図３（ｂ）は、上記マウスについて、β−メタコリン吸入に対するＡＨＲを測定した結果を示す図である。図３（ｃ）は、上記マウスのＢＡＬＦのＤｉｆ−Ｑｕｉｋ染色の結果を示す図である。図３（ｄ）は、野生型マウスから採取した脾臓のＣＤ４＋Ｔ細胞をＩＬ−２およびＩＬ−１８で刺激したときのＩＬ−４およびＩＬ−１３の産生誘導を解析した結果を示す図である。図３（ｅ）は、ＩＬ−２およびＩＬ−１８処理した野生型マウスの肺におけるＩＬ−４およびＩＬ−１３の産生誘導を解析した結果を示す図である。
【図４】図４は、ＩＬ−２およびＩＬ−１８処理した、野生型マウスおよびＳＴＡＴ６欠損マウスの肺におけるサイトカインおよびケモカインのｃＤＮＡの発現を解析した結果を示す図である。
【図１】
2007295808.tif 000002
【図２】
2007295808.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【配列表】
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