(57)【要約】【課題】植物における木部の二次肥厚促進剤、及び、木部の二次肥厚が促進される植物の生産方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明の二次肥厚促進剤は、植物における木部の二次肥厚を促進させる二次肥厚促進剤であって、有効成分としてサイトカイニンを含む二次肥厚促進剤である。また、本発明の植物の生産方法は、木部の二次肥厚を促進させる器官に有効量のサイトカイニンを作用させる工程を含む植物の生産方法である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物における木部の二次肥厚を促進させる二次肥厚促進剤であって、有効成分としてサイトカイニンを含むことを特徴とする二次肥厚促進剤。
【請求項２】
前記二次肥厚が、地上茎又は幹の二次肥厚である請求項１記載の二次肥厚促進剤。
【請求項３】
植物の生産方法であって、木部の二次肥厚を促進させる器官に有効量のサイトカイニンを作用させる工程を含むことを特徴とする植物の生産方法。
【請求項４】
前記器官が、前記植物の地上茎又は幹である請求項３記載の植物の生産方法。
【請求項５】
サイトカイニンを作用させる部位が、前記植物の形成層である請求項３又は４に記載の植物の生産方法。
【請求項６】
サイトカイニンを作用させる工程が、サイトカイニンを含む溶液の前記植物への塗布又は散布により行われる請求項３から５のいずれか一項に記載の植物の生産方法。
【請求項７】
サイトカイニンを作用させる工程が、前記形成層に特異的なサイトカイニン合成酵素の発現促進、又は、サイトカイニン分解酵素の発現抑制により行われる請求項５記載の植物の生産方法。
【請求項８】
トランスジェニック植物であって、二次肥厚の形成層においてサイトカイニン合成酵素が発現促進され、又は、サイトカイニン分解酵素が発現抑制されたトランスジェニック植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の二次肥厚促進剤及び二次肥厚が促進される植物の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の幹、茎、根が太くなる過程を一般に、二次肥厚（二次肥大）という。二次肥厚は、分裂組織である形成層の幹細胞の細胞分裂に起因する。この幹細胞の細胞分裂では、一部は形成層の幹細胞として維持されるが、形成層から幹、茎、根の中心側に押し出された細胞は木部細胞と柔細胞とへ分化し、外側に押し出された細胞は師部細胞と柔細胞とへ分化する。二次肥厚が良く起きる植物は、商業用樹木や農作物として優れており、そのような品種が選抜されている。
【０００３】
植物ホルモンの１種であるサイトカイニンは、細胞分裂の促進、細胞周期の調節、老化阻害、腋芽の活性化など、多様な生理活性を有する。しかしながら、これまで二次肥厚とサイトカイニンとの関係については、明らかになっていない。なお、特許第２９１９３１４号（特許文献１）は、サイトカイニンを含む培地において、ワサビの根茎を生育させているが、サイトカイニンと木部の二次肥厚との関係については何ら記載がない。
【０００４】
また、例えば、木本植物においては、二次肥厚の中でも、木部の増大を促進することが産業上重要である。なぜなら、樹木の幹においては、二次肥大により幹の中心部に押し出される木部は蓄積されて幹を太くするのに寄与するが、外側に押し出される師部はいずれ樹皮としてはがれてしまうからである。
【特許文献１】特許第２９１９３１４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、植物における木部の二次肥厚促進剤、及び、木部の二次肥厚が促進される植物の生産方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明の二次肥厚促進剤は、植物における木部の二次肥厚を促進させる二次肥厚促進剤であって、有効成分としてサイトカイニンを含むことを特徴とし、また、本発明の植物の生産方法は、木部の二次肥厚を促進させる器官に有効量のサイトカイニンを作用させる工程を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明者らは、サイトカイニンのシグナル伝達による植物形態形成について鋭意研究を重ね、サイトカイニンを与えて栽培したシロイヌナズナの根が、与えない場合に比べて二次肥厚が促進し、特に、木部の増大が著しいことを見出した。さらに研究を重ねた結果、主要な４つのサイトカイニン合成酵素を破壊したシロイヌナズナの根は、ほとんど二次肥厚しないが、サイトカイニンを与えると二次肥厚が促進され、特に、木部の増大が著しいことを見出し、本発明に到達した。
【０００８】
木本植物と草木植物の二次肥厚は、基本的に同じ仕組みで行われるから、本発明の二次肥厚促進剤によれば、すべての高等植物において木部の二次肥厚を促進でき、例えば、最も利用価値が高いバイオマスである樹木の幹の肥厚速度を向上できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の二次肥厚促進剤において、前記二次肥厚は、好ましくは、地上茎又は幹の二次肥厚である。
【００１０】
本発明の植物の生産方法において、サイトカイニンを作用させる器官は、前記植物の地上茎又は幹であることが好ましい。また、サイトカイニンを作用させる部位は、前記植物の形成層であることが好ましい。
【００１１】
本発明の植物の生産方法において、サイトカイニンを作用させる工程は、サイトカイニンを含む溶液の前記植物への塗布又は散布により行われることが好ましい。
【００１２】
本発明の植物の生産方法において、サイトカイニンを作用させる工程は、前記形成層に特異的なサイトカイニン合成酵素の発現促進、又は、サイトカイニン分解酵素の発現抑制により行われることが好ましい。
【００１３】
本発明のトランスジェニック植物は、二次肥厚の形成層においてサイトカイニン合成酵素が発現促進され、又は、サイトカイニン分解酵素が発現抑制されたトランスジェニック植物である。
【００１４】
本発明において、「二次肥厚」とは、上述したとおり、植物の幹、茎、根が太くなる過程であって、形成層において幹細胞が分裂することで、新たな木部、師部及び柔細胞が生み出されることをいう。
【００１５】
本発明において、「植物」とは、特に制限されず、例えば、食糧用、飼料用、観賞用、環境用、実験用および資源用等に用いられる植物を含む。また、本発明における「植物」は、木本植物であってもよく、草木植物であってもよい。これらの中でも、本発明における「植物」は、二次肥厚をする植物であることが好ましい。
【００１６】
本発明において、「木部」とは、前記植物の器官における分化した組織である維管束の構成要素であって、導管・仮導管が集まる部分をいい、当該技術分野の当業者であれば、公知の方法、例えば、徒手切片法及びサルラニン染色法などにより、容易に観察し確認できる。
【００１７】
本発明において、「サイトカイニン」とは、上述したとおり、植物ホルモンであって、天然サイトカイニン、合成サイトカイニン、及び、サイトカイニンに類似する活性を示す化合物を含む。本発明における「サイトカイニン」としては、特に制限されないが、例えば、チジアズロン（ＴＤＺ）、フルフリルアミノプリン（カイネチン）、６−ベンジルアミノプリン（ＢＡ）、２−クロロ−４−ピリジル−フェニルウレア（ＣＰＰＵ）、イソペンテニルアデニン（２ｉＰ）及びゼアチンなどが挙げられ、これらを使用する場合、それを単独でまたは２種類以上を組み合わせて使用することができる。
【００１８】
次に、本発明の二次肥厚促進剤について説明する。本発明の二次肥厚促進剤の剤形は、特に制限されず、例えば、溶液であってよい。本発明の二次肥厚促進剤の組成は、サイトカイニンを含む以外は特に制限されず、例えば、有機塩、無機塩、栄養素、糖、緩衝剤、培地などを含んでいてもよい。このような本発明の二次肥厚促進剤は、当該技術分野の当業者であれば、製造することができる。
【００１９】
本発明の二次肥厚促進剤の使用方法は、例えば、後述する本発明の植物の生産方法において使用できる。すなわち、例えば、本発明の二次肥厚促進剤を、二次肥厚を促進させたい器官に作用させるように直接投与することで使用できる。具体的には、根や地下茎の場合、本発明の二次肥厚促進剤を培地や土壌に含ませて使用でき、また、地上茎や幹の場合、直接本発明の二次肥厚促進剤を散布・塗布したり、本発明の二次肥厚促進剤を浸み込ませた布などで前記茎や幹を包み込んだりして使用できる。
【００２０】
本発明の二次肥厚促進剤を溶液の剤形で使用する場合、サイトカイニンの含有量は、適用する植物に応じて適宜調節できるが、例えば、トランスゼアチンや同等の作用を持つ用量の他のサイトカイニンの場合、０．０１ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌである。上述のとおり、サイトカイニンは、単独で使用してもよく、２種類以上を組み合わせて使用してもよい。
【００２１】
本発明の二次肥厚促進剤によれば、幹、茎、根などの二次肥厚を促進できる。とりわけ、木部の増大を促進できるから、例えば、樹木などの資源用植物などに有用である。
【００２２】
次に、本発明の植物の生産方法について説明する。本発明の植物の生産方法は、木部の二次肥厚を促進させる器官に有効量のサイトカイニンを作用させる工程を含む方法である。木部の二次肥厚を促進させる器官としては、上述した植物における器官であれば特に制限されず、例えば、上述した植物における二次肥厚する器官が挙げられる。その具体例として、茎、幹、根などが挙げられる。これらの器官にサイトカイニンを作用させる場合、サイトカイニンは、前記器官の形成層に作用させることが好ましい。上述したとおり、木部の細胞は、形成層における幹細胞に由来するからである。
【００２３】
本発明の植物の生産方法により生産される植物は、植物個体、その子孫及びクローン、並びに、これらから得られる繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を含む。
【００２４】
サイトカイニンを作用させる方法としては、特に制限されないが、例えば、直接サイトカイニンを作用させる方法や、遺伝子工学手法及び分子育種を用いた方法が挙げられる。前記直接サイトカイニンを作用させる方法としては、例えば、本発明の二次肥厚促進剤を用いる方法が挙げられ、その具体的な方法は、上述のとおりである。また、前記遺伝子工学手法を用いた方法としては、例えば、サイトカイニン合成酵素やサイトカイニンの情報伝達系の促進因子の遺伝子を発現促進させたトランスジェニック植物を利用する方法、サイトカイニン分解酵素を発現抑制させたトランスジェニック植物を利用する方法などが挙げられる。分子育種の方法としては、サイトカイニン分解因子やサイトカイニン情報伝達系において抑制的に働く調節因子の遺伝子の突然変異体をスクリーニングする方法が挙げられる。
【００２５】
前記サイトカイニン合成酵素を発現促進させたトランスジェニック植物を製造する方法としては、特に制限されないが、例えば、まず、第１段階として、転写調節配列の下流にサイトカイニン合成酵素遺伝子を転写可能に連結した外来遺伝子を植物に導入し、第２段階として、前記外来遺伝子が導入された宿主細胞を選別し、個体へ再分化させることを含む方法が挙げられる。植物に外来遺伝子を導入する方法としては、例えば、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法（ＰＥＧ法）、エレクトロポレーション法などのような物理的に植物細胞の一部に穴を空け、この穴から植物細胞に遺伝子を導入する直接的・物理的方法や、例えば、アグロバクテリウム法、ウイルスベクター法などのような微生物やウイルスの遺伝子導入能力を利用した間接的・生物的方法が挙げられる。
【００２６】
前記発現促進は、木部の二次肥厚を促進させる器官に特異的であることが好ましい。あるいは、前記発現促進は、例えば、植物の維管束、又は、形成層、柔組織、木部及び師部に特異的であることが好ましく、より好ましくは、形成層、柔組織及び木部に特異的であって、さらに好ましくは、形成層及び木部に特異的であって、さらにより好ましくは、形成層に特異的である。前記サイトカイニン合成酵素の遺伝子としては、本発明における植物のサイトカイニン合成酵素遺伝子を利用できる。一例として、シロイヌナズナのサイトカイニン合成酵素としては、ＡｔＩＰＴ１、３〜８の計７個が知られている。したがって、サイトカイニン合成酵素遺伝子が公知となっていない植物においても、例えば、これらの遺伝子との相同性などからサイトカイニン合成酵素（すなわち、オーソログ）を得ることができる。また、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａなどのアデニレートイソペンテニルトランスフェラーゼ（adenylate isopentenyl transferase）遺伝子も、植物内で発現させるとサイトカイニンを合成できるので、前記サイトカイニン合成酵素の遺伝子として使用できる。発現させるサイトカイニン合成酵素遺伝子は、１種類であってもよく、２種類以上の組み合せであってもよい。サイトカイニン合成酵素遺伝子を、例えば、器官や形成層などに特異的に発現させる方法としては、特に制限されないが、例えば、器官や形成層に特異的な転写調節配列の下流にサイトカイニン合成遺伝子を転写可能に連結した遺伝子を導入する方法などが挙げられる。また、発現促進させるサイトカイニン情報伝達系因子としては、Ｂ−タイプレスポンスレギュレータ遺伝子が利用できる。前記Ｂ−タイプレスポンスレギュレータ遺伝子のなかでも、ＡＲＲ１、ＡＲＲ２、ＡＲＲ１０及びＡＲＲ２１は、植物内で過剰発現するとサイトカイニン応答を引き起こすことができる。特に、タイプＢレスポンスレギュレーターのレシーバードメインを除いた領域を発現させると強いサイトカイニン応答を引き起こすことが知られているので、ＡＲＲ１、ＡＲＲ２、ＡＲＲ１０及びＡＲＲ２１の遺伝子全体、あるいは、これらからレシーバードメインをコードする領域を除いた遺伝子も利用できる。また、サイトカイニン受容体遺伝子に類似のＣＫＩ１遺伝子も過剰発現させると、植物にサイトカイニン応答を引き起こすことが知られており、この遺伝子も利用できる。
【００２７】
前記サイトカイニン分解酵素を発現抑制させたトランスジェニック植物を製造する方法としては、特に制限されないが、例えば、サイトカイニン分解酵素遺伝子の遺伝子配列に置換・欠失・付加等の変異を導入して完全なタンパク質の合成を阻害する方法、転写促進因子を阻害若しくは転写抑制因子を活性化することで前記遺伝子の転写を阻害する方法、ＲＮＡ干渉を利用してタンパク質の合成を阻害する方法、前記遺伝子産物のドミナントネガティブ変異体を過剰発現させる方法等が挙げられる。前記遺伝子配列に変異を導入する方法としては、例えば、宿主植物にＴ−ＤＮＡやトランスポゾンが挿入されたトランスジェニック植物ライブラリーを作製し、あるいは、既存の変異体ライブラリーをスクリーニングし、目的とする遺伝子座に前記Ｔ−ＤＮＡやトランスポゾンが挿入された変異体をスクリーニングする方法、又は、塩基置換、塩基挿入、塩基決失による変異体をｔｉｌｌｉｎｇ法でスクリーニングする方法が挙げられる。前記ＲＮＡ干渉の方法としては、例えば、アンチセンスＲＮＡ、短い阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等を利用する方法が挙げられる。
【００２８】
前記発現抑制は、木部の二次肥厚を促進させる器官に特異的であることが好ましい。あるいは、前記発現抑制は、例えば、植物の維管束、又は、形成層、柔組織、木部及び師部に特異的であることが好ましく、より好ましくは、形成層、柔組織及び木部に特異的であって、さらに好ましくは、形成層及び木部に特異的であって、さらにより好ましくは、形成層に特異的である。前記サイトカイニン分解酵素遺伝子としては、本発明における植物のサイトカイニン分解酵素遺伝子を利用できる。一例として、シロイヌナズナのサイトカイニン分解酵素遺伝子としては、サイトカイニンオキシダーゼ／デハイドロゲナーゼ（ＡｔＣＫＸ）遺伝子が知られている。したがって、サイトカイニン分解酵素遺伝子が公知となっていない植物においても、例えば、これらの遺伝子との相同性などからサイトカイニン分解酵素遺伝子を得ることができる。発現抑制するサイトカイニン分解酵素は、例えば、二次肥厚を促進させる器官に発現しているすべての種類のサイトカイニン分解酵素であることが好ましい。
【００２９】
本発明の植物の生産方法において、サイトカイニンを作用させる「有効量」とは、例えば、上述したサイトカイニンを作用させる工程により少なくとも二次肥厚が促進される量であって、当該技術分野の当業者であれば、適宜定めうる。
【００３０】
次に、本発明のトランスジェニック植物について説明する。本発明のトランスジェニック植物は、二次肥厚の形成層においてサイトカイニン合成酵素が発現促進され、又は、サイトカイニン分解酵素が発現抑制若しくは機能阻害されたトランスジェニック植物である。ここで、本発明において、「トランスジェニック植物」とは、遺伝子導入により植物のゲノムに組み込まれた外来遺伝子を保持する植物細胞、植物組織又は植物個体をいい、そのトランスジェニック植物の子孫、クローン、並びに、これらから得られる繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を含む。
【００３１】
本発明のトランスジェニック植物において、サイトカイニン合成酵素が発現促進され、又は、サイトカイニン分解酵素が発現抑制される領域は、少なくとも二次肥厚の形成層を含み、木部の二次肥厚を促進させる器官に特異的であることが好ましく、あるいは、植物の維管束、又は、形成層、柔組織、木部及び師部に特異的であることが好ましく、より好ましくは、形成層、柔組織及び木部に特異的であって、さらに好ましくは、形成層及び木部に特異的であって、さらにより好ましくは、形成層に特異的である。サイトカイニン合成酵素が発現促進され、又は、サイトカイニン分解酵素が発現抑制されたトランスジェニック植物の製造方法は、上述したとおりである。
【００３２】
以下の実施例を用いて本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【実施例１】
【００３３】
サイトカイニン含有培地における野生型シロイヌナズナの栽培
野生型シロイヌナズナを１１日間栽培した後、サイトカイニン（トランスゼアチン）を含有する培地（２０００ｎｇ／ｍｌ）と、サイトカイニンを含まない培地とに移し、さらに２週間栽培した。栽培後に、両方の根を回収して観察した。その結果、サイトカイニンを含有する培地で培養した根の方が、サイトカイニンを含まない培地で培養した根よりも肥厚していた。また、これらの根を徒手切片法で観察した結果の一例を図１−Ａ、Ｂに示す。図１−Ａが、サイトカイニンを含まない培地で培養した根の写真であり、図１−Ｂが、サイトカイニンを含む培地で培養した根の写真である。なお、図１−Ａ及びＢは、同率縮尺である。これらに図示するとおり、サイトカイニンを含有することにより二次肥厚が促進されており、とりわけ、木部の細胞数が増加し、木部が増大していた。
【実施例２】
【００３４】
サイトカイニン含有培地におけるサイトカイニン合成酵素破壊変異体の栽培
次に、シロイヌナズナの主要な４つのサイトカイニン合成酵素遺伝子を破壊した変異体を作成して、サイトカイニンの二次肥厚に対する影響を確認した。前記変異体は、主要な４つのサイトカイニン合成酵素遺伝子ＡｔＩＰＴ１、ＡｔＩＰＴ３、ＡｔＩＰＴ５及びＡｔＩＰＴ７を破壊した４重変異体（ａｔｉｐｔ１ ３ ５ ７）である。この４重変異体を用いて、実施例１と同様に栽培して、サイトカイニンの影響を確認した。その結果を図２−Ａ、Ｂに示す。図２−Ａが、サイトカイニンを含まない培地で培養した根の写真であり、図２−Ｂが、サイトカイニンを含む培地で培養した根の写真である。なお、図２−Ａ及びＢは、同率縮尺である。これらに図示するとおり、前記４重変異体は、サイトカイニンを含まない培地のみで栽培した場合、その根は、ほとんど二次肥厚を示さなかった。一方、サイトカイニンを含む培地で栽培した場合、木部、師部とも増大し、二次肥厚の促進を示し、とりわけ、木部は著しい増大を示した。
【実施例３】
【００３５】
野生型とサイトカイニン合成酵素破壊変異体とにおける花茎の比較
次に、野生型のシロイヌナズナと、実施例２と同様のサイトカイニン合成酵素遺伝子４重変異体とを使用して、播種後２５日目の花茎の大きさを比較した。その結果の一例を図３−Ａ、Ｂに示す。図３−Ａが、野生型の花茎の写真であり、図３−Ｂが、４重変異体の花茎の写真である。これらに図示するとおり、サイトカイニン合成酵素が欠失すると、花茎の二次肥厚が抑制された。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
以上、説明したとおり、本発明によれば、植物の木部の二次肥厚を促進できるから、例えば、幹や茎、根をより早く太らせることができ、分子育種、農業、林業の分野で有用である。さらに、利用価値の高いバイオマスである樹木に適用できるから、例えば、環境保全などの分野においても有用ある。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１−Ａは、野生型シロイヌナズナをサイトカイニンを含まない培地で栽培した場合における根の切片観察写真の一例であり、図１−Ｂは、前記シロイヌナズナをサイトカイニンを含む培地で栽培した場合における根の切片観察写真の一例である（実施例１）。
【図２】図２−Ａは、シロイヌナズナの４重変異体をサイトカイニンを含まない培地で栽培した場合における根の切片観察写真の一例であり、図２−Ｂは、前記４重変異体をサイトカイニンを含む培地で栽培した場合における根の切片観察写真の一例である（実施例２）。
【図３】図３−Ａは、野生型シロイヌナズナの花茎の切片観察写真の一例であり、図３−Ｂは、シロイヌナズナ４重変異体の花茎の切片観察写真の一例である（実施例３）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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