(57)【要約】【課題】処理時間が短く、操作が簡単な移植用生体組織の脱細胞化方法を提供する。【解決手段】移植用生物軟組織を、組織の脱細胞および望ましくない成分の除去が達成されるまで、超臨界二酸化炭素と生理的に許容し得る有機溶媒の混合媒体と接触させることを含む、移植用生物軟組織の処理方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植用生体軟組織を、組織の脱細胞および望ましくない成分の除去が達成されるまで、超臨界二酸化炭素と生理的に許容し得る有機溶媒の混合媒体と接触させることを含む、移植用生体軟組織の処理方法。
【請求項２】
前記有機溶媒は、エタノール、ｎ−プロパノールまたはその組合せである請求項１の方法。
【請求項３】
前記混合媒体中の有機溶媒の割合は、５ないし２０ｗｔ％である請求項１または２の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再生医療技術の分野に関し、詳しくは哺乳動物由来の移植用組織から細胞成分を除去する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
患者の欠損した器官を再生するため、ヒトまたは異種哺乳動物の軟組織から細胞成分を除去し、主としてコラーゲンよりなるマトリックスを再生医療においてスキャフォードとして利用することが広く実施されている。心臓弁置換術、血管移植などがその例である。これまで普通に行われていた脱細胞方法は、大別して界面活性剤などの化学薬品による洗浄、タンパク質分解酵素による消化処理、およびそれらの組合せである。これらの処理は処理剤の溶液中に組織を数日間振とう下浸漬することを要し、その上細胞毒性を有する化学薬品の残留、細胞外マトリックスを構成するタンパク質の劣化、組織深部の細胞の残存などの移植後の組織の耐久性および自己化に悪影響する未解決の問題をかかえている。特にこれらの従来法ではリン脂質の除去が不十分であり、本発明者らの実験によるとリン脂質の含有量は処理後も殆んど処理前と変わらなかった。
【０００３】
そのためこれらの欠点を排除または緩和し得る移植用生体組織の脱細胞処理方法の開発が課題として残っている。
【発明の開示】
【０００４】
上記解題は本発明によって解決し得る。そのため本発明は、移植用生体軟組織を超臨界二酸化炭素と生理的に許容し得る有機溶媒との混合物で処理し、組織から細胞成分を除去することを含む、移植用生体軟組織の処理方法を提供する。
【０００５】
ここで「超臨界二酸化炭素」の用語は、亜臨界状態もしくは近臨界状態の二酸化炭素を含む意味で使用される。
【０００６】
細菌およびウイルスのような感染汚染源および組織処理に使用した化学薬品を移植前の組織から除去するため、および組織の固定化、架橋または活性化のための化学薬品の浸透のために超臨界二酸化炭素を使用する方法は米国特許出願公開Ｎｏ．２００３００７２６６７に開示されている。
【０００７】
また、移植のため骨組織から超臨界二酸化炭素を用いて有機物質を抽出する方法は特開平６−２１８０３６号公報に開示されている。
【０００８】
本発明は、処理の目的が細胞の破壊および除去と、移植後石灰化のような移植した組織の耐久性および自己化に悪影響する細胞成分の除去にある点で、これら先行技術と異なる。また処理媒体として超臨界二酸化炭素をエタノールのような生理学的に許容し得る有機溶媒（エントレーナー）との混合物の形で使用することも先行技術と異なる。
【０００９】
超臨界二酸化炭素と前記有機溶媒（エントレーナー）との混合物は、５ないし２０ｗｔ％、典型的には１８ｗｔ％の有機溶媒を含む。
【００１０】
本発明方法の処理対象は、典型的には異種哺乳類動物の血管、心臓弁膜、角膜、羊膜および硬膜を含む軟組織、および心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脳を含む臓器またはその一部であるが、ヒトドナーからの同種組織または臓器でも良い。
【００１１】
超臨界流体の強い溶媒和力を利用する有機化合物の抽出法は、例えばコーヒーからカフェインを抽出するなど食品、医薬品等の分野において多数の用途が存在する。二酸化炭素の臨界温度は約３１℃と低いので熱的に不安定な物質の抽出に効果的であり、また超臨界抽出は抽出した物質を抽出媒体から分離するため圧力を臨界圧力以下に下げ、抽出媒体を気化することにより簡単に行うことができる。同様な理由で生体組織の脱細胞がマトリックスタンパク質の変性なしで、簡単な操作により行うことができる。その際処理温度および処理圧力を二酸化炭素の臨界温度３１．１℃および臨界圧力７．３８ＭＰａ以上に少なくとも３０分間維持することにより、移植後の免疫反応や石灰化に密接に関連あると考えられるＤＮＡおよびリン脂質を許容レベル以下へ減らすことができる。しかしながら超臨界流体の溶媒和力は処理圧力の上昇につれて高まるので、残存リン脂質の量をできるだけ減らすため処理圧力を１５ＭＰａ付近に設定するのが好ましい。処理圧力をこれ以上に上げても残存リン脂質量に大きな差は見られなかった。
【実施例】
【００１２】
超臨界抽出のためのシステムは良く知られており、実験のために用いたシステムの概略図を図１に示す。
【００１３】
処理した生体組織中のリン脂質量（ｍｇ／ｇ）は、澤田らの方法（澤田和也ら、平成１７年繊維学会秋季研究発表会要旨集）を使用し、化学分析によって決定した。ＤＮＡ残存は組織染色法により評価した。エントレーナーとして使用したエタノールは、図１の圧力容器ｅ内に、生体組織と共に混合物の１８ｗｔ％に相当する量であらかじめ導入した。
【００１４】
実験は、（株）ジャパンファームから購入したブタ大動脈をあらかじめエタノールと共に図のシステムの圧力容器ｅに導入し、二酸化炭素ボンベａから供給された液体二酸化炭素をポンプｂを用いて所定圧力に到達するまで圧力容器ｅに導入した。容器ｅ内を所定の圧力および温度に維持しながら容器ｅを所定時間振とうした。その後排気バルブｇを開いて圧力容器ｅから二酸化炭素を気化させて除去し、中から処理した生体組織を取出して評価した。
【００１５】
実施例１
上の実験において、残留リン脂質量に対する処理圧力の影響を見るため、処理温度３７℃、処理時間６０分を一定とし、処理圧力を変化させた。結果を図２のグラフに示す。図２に見られるように、二酸化炭素圧力の上昇に伴って、処理後の組織内残留リン脂質量に顕著な低下が認められるが、およそ１５ＭＰａ以上では脱リン脂質効果に大きな差は見られない。
【００１６】
図５は、この実施例において３０ＭＰａで処理し、ヘマトキシリン−エオシン染色した後の組織の拡大光学顕微鏡写真である。見られるように核の存在は認められず、組織は殆んど完全に脱細胞化されてマトリックスがヒモ状に残存していることが見られる。
【００１７】
実施例２
次に残留リン脂質量に対する処理時間の影響を見るため、処理温度３７℃および処理圧力３０ＭＰａを一定とし、処理時間を変化させた。結果を図３のグラフに示す。見られるように、処理時間３０分以上では残留リン脂質量に殆んど変化が見られなかった。
【００１８】
実施例３
残留リン脂質量に対する処理温度の影響を調べるため、処理圧力３０ＭＰａおよび処理時間６０分を一定とし、処理温度を変化させた。結果を図４のグラフに示す。見られるように３７℃の処理温度が最も効果的であるが、亜臨界状態もしくは近臨界状態（２８℃）においてもほぼ匹敵する脱リン脂質効果が認められた。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の超臨界二酸化炭素処理に使用し得るシステムの一例の概略図。
【図２】残留リン脂質量に対する処理圧力の影響を示す。
【図３】残留リン脂質量に対する処理時間の影響を示す。
【図４】残留リン脂質量に対する処理温度の影響を示す。
【図５】超臨界二酸化炭素で脱細胞化した生体組織（ブタ大動脈）の拡大光学顕微鏡写真。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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