(57)【要約】      （修正有）【課題】ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）類／多環芳香族炭化水素類の酸化分解経路に関与する遺伝子群、酵素群及びこれらの環境浄化分野における利用方法の提供。【解決手段】Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌から、特定のアミノ酸配列を持つ、新規な芳香環ジオキシゲナーゼのα及びβサブユニットをコードする遺伝子、ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、更に芳香環開裂ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子を取得し、これらの遺伝子に由来する酵素タンパク質を用いた、ＰＣＢの分解方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ｉ）又は（ＩＩ）のＤＮＡを含む芳香族化合物酸化分解系オペロン。
（Ｉ）配列表の配列認識番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ＩＩ）配列表の配列認識番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、芳香族化合物に対する酸化分解活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含んで構成される芳香族化合物酸化分解系オペロンを形成するＤＮＡ
【請求項２】
ポリ塩化ビフェニル類及び多環芳香族炭化水素類の少なくともいずれか一方に対する酸化分解活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含んで構成される請求項１に記載の芳香族化合物酸化分解系オペロン。
【請求項３】
下記、（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードする遺伝子。
（Ａ）配列表の配列認識番号３に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列認識番号３に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、芳香環ジオキシゲナーゼのαサブユニットとしての機能を有するタンパク質
【請求項４】
下記、（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列表の配列認識番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列表の配列認識番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、芳香環ジオキシゲナーゼのαサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項５】
ポリ塩化ビフェニル類及び多環芳香族炭化水素類の少なくともいずれか一方に対する分解活性を有する芳香環ジオキシゲナーゼのαサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードする請求項３又は４に記載の遺伝子。
【請求項６】
下記、（Ｃ）又は（Ｄ）に示すタンパク質をコードする遺伝子。
（Ｃ）配列表の配列認識番号５に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列認識番号５に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、芳香環ジオキシゲナーゼのβサブユニットとしての機能を有するタンパク質
【請求項７】
下記、（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ｃ）配列表の配列認識番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列表の配列認識番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、芳香環ジオキシゲナーゼのβサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項８】
ポリ塩化ビフェニル類及び多環芳香族炭化水素類の少なくともいずれか一方に対する分解活性を有する芳香環ジオキシゲナーゼのβサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードする請求項６又は７に記載の遺伝子。
【請求項９】
下記、（Ｅ）又は（Ｆ）に示すタンパク質をコードする遺伝子。
（Ｅ）配列表の配列認識番号９に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列認識番号９に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼとしての機能を有するタンパク質
【請求項１０】
下記、（ｅ）又は（ｆ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ｅ）配列表の配列認識番号８に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｆ）配列表の配列認識番号８に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項１１】
ポリ塩化ビフェニル類及び多環芳香族炭化水素類の少なくともいずれか一方に対する分解活性を有する芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼとしての機能を有するタンパク質をコードする請求項９又は１０に記載の遺伝子。
【請求項１２】
下記、（Ｇ）又は（Ｈ）に示すタンパク質をコードする遺伝子。
（Ｇ）配列表の配列認識番号１１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列表の配列認識番号１１に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、芳香環開裂ジオキシゲナーゼとしての機能を有するタンパク質
【請求項１３】
下記、（ｇ）又は（ｈ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ｇ）配列表の配列認識番号１０に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｈ）配列表の配列認識番号１０に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、芳香環開裂ジオキシゲナーゼとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項１４】
ポリ塩化ビフェニル類及び多環芳香族炭化水素類の少なくともいずれか一方に対する分解活性を有する芳香環開裂ジオキシゲナーゼとしての機能を有するタンパク質をコードする請求項１２又は１３に記載の遺伝子。
【請求項１５】
下記、（Ａ）又は（Ｂ）、及び、（Ｃ）又は（Ｄ）のタンパク質を含んで構成されるタンパク質複合体からなる芳香環ジオキシゲナーゼ。
（Ａ）配列表の配列認識番号３に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列認識番号３に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、芳香環ジオキシゲナーゼのαサブユニットとしての機能を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列認識番号５に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列認識番号５に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、芳香環ジオキシゲナーゼのβサブユニットとしての機能を有するタンパク質
【請求項１６】
ポリ塩化ビフェニル類及び多環芳香族炭化水素類の少なくともいずれか一方に対する分解能を有する請求項１５に記載の芳香環ジオキシゲナーゼ。
【請求項１７】
下記、（Ｅ）又は（Ｆ）のタンパク質からなる芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ。
（Ｅ）配列表の配列認識番号９に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列認識番号９に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼとしての機能を有するタンパク質
【請求項１８】
ポリ塩化ビフェニル類及び多環芳香族炭化水素類の少なくともいずれか一方に対する分解能を有する請求項１７に記載の芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ。
【請求項１９】
下記、（Ｇ）又は（Ｈ）のタンパク質からなる芳香環開裂ジオキシゲナーゼ。
（Ｇ）配列表の配列認識番号１１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列表の配列認識番号１１に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、芳香環開裂ジオキシゲナーゼとしての機能を有するタンパク質
【請求項２０】
ポリ塩化ビフェニル類及び多環芳香族炭化水素類の少なくともいずれか一方に対する分解能を有する請求項１９に記載の芳香環開裂ジオキシゲナーゼ。
【請求項２１】
請求項１５又は１６に記載の芳香環ジオキシゲナーゼ、請求項１７又は１８に記載の芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ、及び請求項１９又は２０に記載の芳香環開裂ジオキシゲナーゼから選択される少なくともいずれか１つと、芳香族化合物を接触させる芳香族化合物の分解方法。
【請求項２２】
配列表の配列認識番号２に示す塩基配列、配列表の配列認識番号４に示す塩基配列、配列認識番号８に示す塩基配列、配列表の配列認識番号１０に示す塩基配列のいずれか少なくとも１つの塩基配列中の一部又は全部の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、又は前記オリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドを用いて、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３６として寄託されているPaenibacillus属ＫＢＣ１０１株を検出する細菌検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリ塩化ビフェニル類／多環芳香族炭化水素類の酸化分解経路に関与する遺伝子群、及びその利用方法に関し、更に詳しくは、ポリ塩化ビフェニル類／多環芳香族炭化水素類分解活性を有する芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ遺伝子、芳香環開裂ジオキシゲナーゼ遺伝子を含んで構成される遺伝子群、及び、これらの遺伝子群によってコードされる酵素群、及び、これらの環境浄化分野における利用方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年の産業発達に伴い、様々な有害化学物質が環境中に放出、漏洩される等して、地球環境の破壊が進行しており、大きな社会問題を招いている。なかでも、有機塩素化合物に分類されるポリ塩化ビフェニル類（以下、「ＰＣＢ」と称する場合がある。）、多環芳香族炭化水素類（以下、「ＰＡＨ」と称する場合がある）等の芳香族系の有害化学物質は、生物体および環境中でも化学的に極めて安定な化合物であり、また、親油性化合物である。このため、土壌から地下水系、海洋へと拡散した場合に、その間に生息する生物体内の脂肪組織に蓄積し、食物連鎖を通して濃縮されていく性質があることから、長期に渡って環境に悪影響をもたらす。また、最近の研究において、内分泌撹乱物質としての毒性が報告され、極微量な汚染についても環境への悪影響が懸念される。このため、ＰＣＢ、及びＰＡＨ等の有害化学物質を分解、無害化する浄化技術を早急に確立することが不可欠であった。
【０００３】
ＰＣＢ、及びＰＡＨ等の有害化学物質の分解浄化技術として、熱処理技術、化学的処理技術、生物処理技術等が開発されてきた。なかでも、生物処理技術は、細菌が有する物質変換能を活用することにより有害化学物質を分解、無害化する技術である。そして、分解に際して有害な分解生成物を産生することなくＰＣＢ、ＰＡＨ等の有害化学物質を低濃度化でき、かつ、コストや処置設備面において有利な条件で処理することが可能であることから、その実用化に向けて研究が進められている。特に、有機塩素化合物であるＰＣＢは、自然界の微生物による分解を受けにくいため、ＰＣＢに対して高い分解能力を発現できる有用微生物、及び有用微生物が産生する酵素の積極的な利用が必要となる。
【０００４】
従来、有害化学物質を分解する生物処理技術として、Pseudomonas pseudoalcaligenesとBurkholderiacepacia由来のジオキシゲナーゼから構築したキメラ酵素（例えば、特許文献１を参照。）、Nocardioides属から単離したベンゼン環水酸化酵素（例えば、特許文献２を参照。）、Terrabacter属から単離したアンギュラージオキシゲナーゼ（例えば、特許文献３を参照。）が報告されている。さらに、Paenibacillus属YK5株からジベンゾフランの酸化分解に関与するタンパク質群をコードする遺伝子群が単離されている（例えば、非特許文献３を参照。）。
【０００５】
これらは、分解対象化合物が、単環芳香族化合物、又は多環芳香族化合物に限定されている。一般に、環境汚染サイトは、ＰＣＢ、ＰＡＨ、ダイオキシン、単環芳香族化合物等により複合的に汚染されているため、これら基質特異性が低い酵素では、効率的な浄化を行なうには不十分であった。
【０００６】
一方、ＰＣＢを分解する酵素としてRhodococcus globerulus Ｐ６由来のビフェニルジオキシゲナーゼ（例えば、非特許文献１を参照。）が報告されている。しかし、３塩素以上のＰＣＢの分解に関する知見は報告されておらず、限られた構造のＰＣＢを分解できるのみであった。一般に、ＰＣＢ汚染浄化において問題となるのは、難分解性の５塩素以上の高塩素置換体ＰＣＢであることから、３塩素以上のＰＣＢに対する分解性が報告されてないRhodococcusgloberulus Ｐ６由来のビフェニルジオキシゲナーゼのＰＣＢ汚染浄化分野における実用的価値は限定されたものであった。
【０００７】
更に、ＰＣＢ及びナフタレンを分解する能力を有するBacillus属JF8株が単離されたこと（例えば、特許文献４、非特許文献２を参照。）が報告されている。しかし、Bacillus属JF8株は、ＰＣＢの５塩素置換体に対しては、２０％程度の低い分解能を示すのみであった。また、Bacillus属ＪＦ８株から、ビフェニル、及びＰＣＢ分解に関与するジオキシゲナーゼは特定されていなかった。
【０００８】
したがって、上記したＰＣＢ分解細菌及び該細菌が産生する酵素はいずれもが、塩素置換数の多い（例えば、５塩素置換体以上）高塩素置換体ＰＣＢに対する分解能力が低く、限られた構造のＰＣＢを分解できるのみであった。そのため、高塩素置換体ＰＣＢの分解能の観点から、環境浄化分野への適用においては依然として不十分であり、高塩素置換体ＰＣＢをも効率的に分解可能なＰＣＢ分解細菌の出現が要望されていた。また、従来において既知のＰＣＢ分解細菌及びＰＣＢ分解酵素は、その多くがRhodococcus属、Pseudomonas属であり（図２を参照）、これらの細菌が産生する分解酵素は基質特異性が低いものと考えられた。
【０００９】
以上の問題点を解決すべく、ＰＣＢ及びＰＡＨをも分解できる特性を備えた細菌、Paenibacillus属KBC101株が本発明者らによって単離された（例えば、特許文献５を参照。）。かかる細菌はRhodococcus属、Pseudomonas属とは系統進化学的に異なる細菌であり、Paenibacillus属から初めて単離されたＰＣＢ分解細菌として報告された。そして、従来公知の生物分解処理では分解が困難である塩素置換数が５〜９の高塩素置換体ＰＣＢに対しても４０％程の分解率を有することから、環境浄化分野における実用化が期待されていた。
【００１０】
しかしながら、かかる細菌を実際に汚染浄化の現場に用いる場合には、細菌の特異的モニタリングを行なうことが、効率的な汚染浄化事業の実行のためには不可避である。また、取り扱い、及び効果の制御が容易な酵素剤として利用することが可能となれば、効率的な汚染浄化の実行が可能となる。
【００１１】
【特許文献１】特開２０００−６９９７９号公報
【特許文献２】特開２００２−６５２６８号公報
【特許文献３】特開２００３−２５０５６号公報
【特許文献４】特開平１１−１０１２２号公報
【特許文献５】特開２００５−２４５２８０号公報
【非特許文献１】Heterologous Expression of Biphenyl Dioxygenase-Encoding Gene from a Gram-Positive Broad-Spectrum Polychlorinated Biphenyl Degrader and Characterization of Chlorobiphenyl Oxidation by the gene Products.（グラム陽性広域スペクトルポリ塩化ビフェニル分解細菌由来のビフェニルジオキシゲナーゼコード遺伝子の異種発現及び前記遺伝子産物による塩化ビフェニル酸化の特徴付け）J.Bacteriol., 1997年３月、第1924頁〜第1930頁
【非特許文献２】Isolation and characterization of thermophilic Bacillus sp.ＪＦ８ capable of degrading polychlorinated biphenyls and naphthalene.（ポリ塩化ビフェニル類およびナフタレンを分解する能力を有する好熱性バシラス属ＪＦ８の単離および特徴付け。）、FEMS Microbiology Letters 1999年９月１日、第178巻、第１号、第87頁〜第93頁
【非特許文献３】Isolation and characterization of a gene cluster for dibenzofuran degradation in a new dibenzofuran-utilizing bacterium Paenibacillussp. strain YK5.（新規ジベンゾフラン利用細菌、Paenibacillus属YK5株におけるジベンゾフラン分解のための遺伝子クラスターの単離及び特徴付け。）、Arch Microbiol., 2006年1月号、第184巻、第5号、第305〜第315頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
そこで、本発明は、上記実情を鑑みて、広範囲な基質特異性を有し、ＰＣＢ及びＰＡＨ、更には塩素置換数の多い高塩素置換体ＰＣＢをも分解できる特性を備える分解酵素、及び当該酵素を用いた汚染浄化方法を提供することを目的とする。更には、汚染浄化の効率化のため、広範囲な基質特異性を有し、ＰＣＢ及びＰＡＨ、更には塩素置換数の多い高塩素置換体ＰＣＢをも分解できる特性を備える芳香族化合物分解細菌の遺伝子レベルでの特異的なモニタリングを利用した汚染浄化方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解消すべく、Paenibacillus属に属し、ＰＣＢ及びＰＡＨ分解能、特に塩素置換数の多い高塩素置換体ＰＣＢに対する分解能を有する細菌から、芳香環ジオキシゲナーゼのサブユニットα遺伝子および、サブユニットβ遺伝子、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ遺伝子、芳香環開裂ジオキシゲナーゼ遺伝子をクローニングすることに成功し本発明を完成するに至った。更に、鋭意研究を行った結果、該遺伝子、及び該遺伝子がコードする酵素を利用した効率的な汚染浄化方法を構築するに至り、本発明を完成するに至った。
【００１４】
上記目的を達成するため、本発明は以下の［１］〜［２２］に示すものである。
【００１５】
［１］下記（Ｉ）又は（ＩＩ）のＤＮＡを含む芳香族化合物酸化分解系オペロン。
（Ｉ）配列表の配列認識番号１に示す塩基配列をからなるＤＮＡ
（ＩＩ）配列表の配列認識番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、芳香族化合物に対する酸化分解活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含んで構成される芳香族化合物酸化分解系オペロンを形成するＤＮＡ
［２］ポリ塩化ビフェニル類及び多環芳香族炭化水素類の少なくともいずれか一方に対する酸化分解活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含んで構成される上記［１］の芳香族化合物酸化分解系オペロン。
［３］下記、（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードする遺伝子。
（Ａ）配列表の配列認識番号３に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列認識番号３に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、芳香環ジオキシゲナーゼのαサブユニットとしての機能を有するタンパク質
［４］下記、（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列表の配列認識番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列表の配列認識番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、芳香環ジオキシゲナーゼのαサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
［５］ポリ塩化ビフェニル類及び多環芳香族炭化水素類の少なくともいずれか一方に対する分解活性を有する芳香環ジオキシゲナーゼのαサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードする上記［３］又は［４］の遺伝子。
［６］下記、（Ｃ）又は（Ｄ）に示すタンパク質をコードする遺伝子。
（Ｃ）配列表の配列認識番号５に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列認識番号５に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、芳香環ジオキシゲナーゼのβサブユニットとしての機能を有するタンパク質
［７］下記、（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ｃ）配列表の配列認識番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列表の配列認識番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、芳香環ジオキシゲナーゼのβサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
［８］ポリ塩化ビフェニル類及び多環芳香族炭化水素類の少なくともいずれか一方に対する分解活性を有する芳香環ジオキシゲナーゼのβサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードする上記［６］又は［７］の遺伝子。
［９］下記、（Ｅ）又は（Ｆ）に示すタンパク質をコードする遺伝子。
（Ｅ）配列表の配列認識番号９に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列認識番号９に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼとしての機能を有するタンパク質
［１０］下記、（ｅ）又は（ｆ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ｅ）配列表の配列認識番号８に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｆ）配列表の配列認識番号８に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
［１１］ポリ塩化ビフェニル類及び多環芳香族炭化水素類の少なくともいずれか一方に対する分解活性を有する芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼとしての機能を有するタンパク質をコードする上記［９］又は［１０］の遺伝子。
［１２］下記、（Ｇ）又は（Ｈ）に示すタンパク質をコードする遺伝子。
（Ｇ）配列表の配列認識番号１１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列表の配列認識番号１１に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、芳香環開裂ジオキシゲナーゼとしての機能を有するタンパク質
［１３］下記、（ｇ）又は（ｈ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ｇ）配列表の配列認識番号１０に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｈ）配列表の配列認識番号１０に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、芳香環開裂ジオキシゲナーゼとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
［１４］ポリ塩化ビフェニル類及び多環芳香族炭化水素類の少なくともいずれか一方に対する分解活性を有する芳香環開裂ジオキシゲナーゼとしての機能を有するタンパク質をコードする上記［１２］又は［１３］の遺伝子。
［１５］下記、（Ａ）又は（Ｂ）、及び、（Ｃ）又は（Ｄ）のタンパク質を含んで構成されるタンパク質複合体からなる芳香環ジオキシゲナーゼ。
（Ａ）配列表の配列認識番号３に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列認識番号３に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、芳香環ジオキシゲナーゼのαサブユニットとしての機能を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列認識番号５に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列認識番号５に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、芳香環ジオキシゲナーゼのβサブユニットとしての機能を有するタンパク質
［１６］ポリ塩化ビフェニル類及び多環芳香族炭化水素類の少なくともいずれか一方に対する分解能を有する上記［１５］の芳香環ジオキシゲナーゼ。
［１７］下記、（Ｅ）又は（Ｆ）のタンパク質からなる芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ。
（Ｅ）配列表の配列認識番号９に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列認識番号９に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼとしての機能を有するタンパク質
［１８］ポリ塩化ビフェニル類及び多環芳香族炭化水素類の少なくともいずれか一方に対する分解能を有する上記［１７］の芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ。
［１９］下記、（Ｇ）又は（Ｈ）のタンパク質からなる芳香環開裂ジオキシゲナーゼ。
（Ｇ）配列表の配列認識番号１１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｈ）配列表の配列認識番号１１に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、芳香環開裂ジオキシゲナーゼとしての機能を有するタンパク質
［２０］ポリ塩化ビフェニル類及び多環芳香族炭化水素類の少なくともいずれか一方に対する分解能を有する上記［１９］の芳香環開裂ジオキシゲナーゼ。
【００１６】
上記［１］〜［２０］の構成によれば、ＰＣＢ及びＰＡＨに対する高い分解活性を有する芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環開裂ジオキシゲナーゼ、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼを提供するものである。特には、ＰＣＢ汚染系、ＰＡＨ汚染系、更にはＰＣＢ及びＰＡＨによる複合汚染系の浄化において実用的価値の高い酵素を提供するものである。特に、本発明で提供される酵素は、従来公知の生物分解処理技術によっては分解が困難であった塩素置換数が５以上の高塩素置換体ＰＣＢに対する高い分解能をも有する細菌から取得された新規な酵素であり、高塩素置換体ＰＣＢを含めた広範な基質特異性を有するものと期待される。
更に、本発明の芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環開裂ジオキシゲナーゼ、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼは、ビフェニルを誘導物質とする１のオペロンを形成する遺伝子群によってコードされるものであることが判明している。
また、本発明の芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環開裂ジオキシゲナーゼ、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列、並びに塩基配列が明確になったことから、遺伝子工学的手法を用いて低コストかつ工業的に大量生産することが可能となった。
【００１７】
［２１］上記［１５］又は［１６］の芳香環ジオキシゲナーゼ、上記［１７］又は［１８］の芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ、及び上記［１９］又は［２０］の芳香環開裂ジオキシゲナーゼから選択される少なくともいずれか１つと、芳香族化合物を接触させる芳香族化合物の分解方法。
【００１８】
上記［２１］の構成によれば、ＰＣＢ及びＰＡＨに対する高い分解活性を有する芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ、芳香環開裂ジオキシゲナーゼを利用した芳香族化合物の分解方法提供でき、特にＰＣＢ汚染系、ＰＡＨ汚染系、更にはＰＣＢ及びＰＡＨによる複合汚染系の浄化において実用的価値の高い分解方法を提供できる。また、従来公知の生物分解処理技術によっては分解が困難であった高塩素置換体ＰＣＢをも効率的に分解処理できる分解方法を提供できる。
【００１９】
［２２］配列表の配列認識番号２に示す塩基配列、配列表の配列認識番号４に示す塩基配列、配列認識番号８に示す塩基配列、配列表の配列認識番号１０に示す塩基配列のいずれか少なくとも１つの塩基配列中の一部又は全部の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、又は前記オリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドを用いて、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３６として寄託されているPaenibacillus属ＫＢＣ１０１株を検出する細菌検出方法。
【００２０】
上記［２２］の構成によれば、ＰＣＢ及びＰＡＨに対する高い分解能を有する受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３６として寄託されているPaenibacillus属ＫＢＣ１０１株を検出する細菌検出方法を提供できる。特に、公知の生物分解処理技術によっては分解が困難であった塩素置換数が５以上の高塩素置換体ＰＣＢに対する高い分解能を有するPaenibacillus属ＫＢＣ１０１株の特異的な検出が可能となる。かかる細菌検出方法により、Paenibacillus属ＫＢＣ１０１株の存在及び動態をモニタリングすることが可能となり、検出結果に基づき、高効率的な汚染浄化系の構築、並びに浄化処理時間の短縮化を図ることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の実施の形態について、以下に詳細に説明する。但し、本発明の範囲はこれらの実施の形態により限定的に解釈されるものではない。
【００２２】
〔１〕芳香族化合物の酸化分解機構
まず、芳香族化合物の酸化分解機構を、芳香族化合物に属するビフェニルを例にとって説明する。ビフェニルは、図１に示す通り、ビフェニルジオキシゲナーゼ（以下、「ＢｐｈＡ」と称する場合がある。）、ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ（以下、「ＢｐｈＢ」と称する場合がある。）、2,3-ジヒドロキシビフェニル  1,2-ジオキシゲナーゼ（以下、「ＢｐｈＣ」と称する場合がある。）、２−ヒドロキシ−６−オキソ−６−フェニルヘキサ−２,４−ジエノエート  ヒドロラーゼ（以下、「ＢｐｈＤ」と称する場合がある。）により分解されることが知られている。詳細には、ＢｐｈＡによりビフェニルに隣接する２つの水酸基が導入されｃｉｓ-ビフェニル  ジヒドロジオールが生成される。そして、ＢｐｈＢにより当該ｃｉｓ-ビフェニル  ジヒドロジオールから２つの水素分子が除かれ２,３-ジヒドロキシビフェニルが生成され、続いて、ＢｐｈＣによりメタ開裂して黄色化合物である２-ヒドロキシ-６-オキソ-６-フェニルヘキサ-２,４-ジエン酸(以下、「ＨＯＰＤＡ」を略する場合がある)が生成する。そして、ＢｐｈＤによりＨＯＰＤＡが安息香酸と２-ヒドロキシペンタ-２,４-ジエノエートに分解する。その後、ＢｐｈＥ、ＢｐｈＦ、及びＢｐｈＧと称される酵素群によってアセチルＣｏＡにまで分解される。
【００２３】
ここで、本発明の対象となる芳香環ジオキシゲナーゼとは、分子状酸素を芳香環に取り込む反応を触媒する一群の酵素であり、芳香族化合物の初発酸化を触媒する。具体的には、２原子の分子状酸素を芳香環上に導入し、その結果、隣接する２つの水酸基を芳香環上に導入する反応を触媒する。上記ビフェニルの分解において初発酸化分解を触媒するジオキシゲナーゼは、ビフェニルジオキシゲナーゼと称される。ビフェニルジオキシゲナーゼは、αサブユニット（以下、「ＢｐｈＡ１」と称する場合がある。）、βサブユニット（以下、「ＢｐｈＡ２」と称する場合がある。）、フェレドキシン（以下、「ＢｐｈＡ３」と称する場合がある。）、フェレドキシンリダクターゼ（以下、「ＢｐｈＡ４」と称する場合がある。）から構成される多成分酵素である。そして、図１に示す通り、αサブユニットとβサブユニットとが複合体を形成し、基質との結合及び酸素添加反応を触媒し、フェレドキシンが電子伝達体として機能し、フェレドキシンリダクターゼがＮＡＤ又はＮＡＤＰＨとフェレドキシンの酸化還元反応を触媒する。
【００２４】
また、本発明の対象となる芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼは、芳香族ジヒドロジオール化合物から水素分子を取り除いて芳香族ジオール化合物を生成する脱水素反応を触媒する。
【００２５】
そして、本発明の対象となる芳香環開裂ジオキシゲナーゼは、２原子の分子状酸素を芳香族ジオール化合物上に導入し、その結果、隣接する２つの水酸基を芳香族ジオール化合物上に導入することにより芳香族ジオール化合物をメタ開裂する反応を触媒する。
【００２６】
〔２〕本発明の芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子のクローニング
本発明者は、ＰＣＢ及びＰＡＨ、更には塩素置換数の多い高塩素置換体ＰＣＢをも分解できる特性を備える芳香環ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子を単離するため、Paenibacillus属ＫＢＣ１０１株（受託番号：FERM BP-08636、以下、「ＫＢＣ１０１株」と略する）のゲノムライブラリーをクローニングした。クローニングは、芳香族化合物分解細菌のジオキシゲナーゼのαサブユニット遺伝子において保存されている配列に基づいて設計された縮重プライマーセットを用いて行ない、これにより芳香環ジオキシゲナーゼのαサブユニット遺伝子の部分配列を取得した。かかる部分配列をプローブとしたＫＢＣ１０１株のゲノムライブラリーのコロニーハイブリダイゼーションにより陽性クローンを得た。続いて、クローニングされたＤＮＡ断片の塩基配列決定後、相同性検索により、芳香環ジオキシゲナーゼαサブユニット及びβサブユニット、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ、及び芳香環開裂ジオキシゲナーゼをコードすると推定される遺伝子を同定した。そして、かかる遺伝子によりコードされるアミノ酸配列は、既知の芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ、芳香環開裂ジオキシゲナーゼとは、最大約７０〜８０％程度のアミノ酸レベルで相同性を示した。しかし、本発明で同定された上記酵素群は、従来公知のＰＣＢ分解菌由来の酸化分解酵素とは系統学的に異なる新規の酵素群であることが示唆された。続いて、本発明で同定された遺伝子を含む発現プラスミドを構築し、ビフェニルの変換活性を有することを見出し、これらがビフェニルを含む芳香族化合物の酸化分解経路に関与する機能を有するタンパク質群をコードする遺伝子群であることが確認された。
【００２７】
上記のようにして得られた芳香環ジオキシゲナーゼのαサブユニット、及びβサブユニット、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ、芳香環開裂ジオキシゲナーゼを含むＤＮＡ断片の塩基配列を配列表の配列認識番号１に示す。この配列中には、５つのオープンリーディングフレーム（以下、「ＯＲＦ」と略する。）が存在する。相同性検索より、上流から、ジオキシゲナーゼのαサブユニット、βサブユニット、機能未知、ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ、２，３−ジヒドロキシビフェニル  １，２−ジオキシゲナーゼのコード配列と推定される。各遺伝子の塩基配列を配列表の配列認識番号２、４、６、８及び１０に示し、コードされるアミノ酸配列を配列表の配列認識番号３、５、７、９及び１１に示す。
【００２８】
更に、検討を行った結果、本発明で同定された遺伝子が、クラスター状にまとまった一つのオペロンとして転写調節を受けていることが判明した。また、これらがビフェニルをはじめとする芳香族化合物によって転写調節されていることも判明した。一般に、同一オペロン上には、機能的に関連のある遺伝子群がクラスターを形成していることから、上記機能未知な部位に関しても今後の解析により、芳香族化合物の酸化分解経路に関与する酵素をコードしている可能性が示唆される。
【００２９】
〔３〕本発明の芳香族化合物の酸化分解経路に関与する酵素群
本発明の芳香族化合物の酸化分解経路に関与する酵素群として、芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ、芳香環開裂ジオキシゲナーゼが見出された。これらは、従来公知のＰＣＢ分解菌とは系統学的に相違するPaenibacillus属ＫＢＣ１０１株から見出された新規な酵素である。
【００３０】
芳香環ジオキシゲナーゼは、αサブユニット、βサブユニット、フェレドキシン、フェレドキシンリダクダーゼの４つの構成成分からなるタンパク質複合体である。
【００３１】
そして、本発明の芳香環ジオキシゲナーゼのαサブユニットとして、配列表の配列認識番号３のアミノ酸配列を有するものが例示される。
【００３２】
本発明の芳香環ジオキシゲナーゼのβサブユニットとして、配列表の配列認識番号５のアミノ酸配列を有するものが例示される。
【００３３】
フェレドキシン、フェレドキシンリダクダーゼの各構成成分に関しては、当該活性を有するものが、特に制限なく利用することができる。
【００３４】
本発明の芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼとして、配列表の配列認識番号９のアミノ酸配列を有するものが例示される。
【００３５】
本発明の芳香環開裂ジオキシゲナーゼとして、配列表の配列認識番号１１のアミノ酸配列を有するものが例示される。
【００３６】
また、本発明の酵素は、上記各サブユニットのアミノ酸配列において、特定のアミノ酸に改変が生じている改変部位を有するアミノ酸配列を有し、かつ、それぞれの機能又は活性を有するものも含まれる。ここで、改変とは、改変の基礎となるタンパク質のアミノ酸配列のうち、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および付加の少なくとも１つからなる改変が生じていることを意味する。そして、「１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１つからなる改変」とは、改変の基礎となるタンパク質をコードする遺伝子に対する公知のＤＮＡ組換え技術、点変異導入方法等によって、欠失、置換、挿入又は付加することができる程度の数のアミノ酸が、欠失、置換、挿入又は付加されることを意味し、これらの組み合わせをも含む。
【００３７】
このような改変体は自然又は人工の突然変異により生じた突然変異体の中から当該活性を有するタンパク質をスクリーニングすることにより取得できる。
【００３８】
或いは、下記で説明する本発明の遺伝子を用いて改変を施すことによっても取得できる、そのような遺伝子に改変を施す方法としては、特に制限はなく、当業者に公知の改変タンパク質作製のための変異導入技術を利用することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ法等を利用して点変異を導入するＰＣＲ突然誘発法、あるいは、トランスポゾン挿入突然変異誘発法などの公知の変異導入技術を利用することができる。市販の変異導入用キット（例えば、QuikChange（登録商標） Site-directed Mutagenesis Kit（Stratagene社製）等を利用してもよい。また、常法のホスホルアミダイト法等のＤＮＡ合成法を利用して、所望の改変を施した遺伝子を構築することによっても調製することができる。
【００３９】
そして、改変が導入された遺伝子が、所望の機能又は活性を有するタンパク質をコードするか否かは、改変遺伝子に基づいて製造した組換えタンパク質の芳香環ジオキシゲナーゼ活性、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ活性、芳香環開裂ジオキシゲナーゼを、夫々測定することにより評価することができる。例えば、芳香環ジオキシゲナーゼ活性は、他のサブユニット遺伝子と共に発現させることにより評価を行なうことが好ましい。
【００４０】
当業者はアミノ酸配列の改変に際して本発明の酵素活性を保持する改変を容易に予測することができる、具体的には、例えばアミノ酸置換の場合には、タンパク質構造保持の観点から極性、電荷、親水性、若しくは疎水性等の点で置換前のアミノ酸と類似した性質を有するアミノ酸に置換することができる。このような置換は保守的置換として当業者には周知である。また、その後の精製、固相への固定化等の便宜のため、アミノ酸配列のＮ、又はＣ末端にＨｉｓ-ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇ等を付加したものも好適に例示される。
【００４１】
本発明の芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ、芳香環開裂ジオキシゲナーゼは以下のようにして調製することができる。例えば、ＰＣＢ分解能を有するPaenibacillus属に属する細菌、特には、上記したＫＢＣ１０１株の培養物から単離精製することにより製造することができる。本発明の酵素のアミノ酸配列が明確になったことから、かかる配列情報に基づいて大量に製造することができる。例えば、芳香環ジオキシゲナーゼのαサブユニット、及びβサブユニットの製造は、配列認識番号３又は５のアミノ酸配列の一部又は全部をコードする塩基配列を基にして作成したＤＮＡプローブとして用いるハイブリダイゼーション法により、ＰＣＢ分解能を有するPaenibacillus属に属する細菌、特に、好ましくはＫＢＣ１０１株のゲノムＤＮＡから本発明の芳香環ジオキシゲナーゼをコードする核酸分子を調製することができる。また、配列認識番号３又は５のアミノ酸配列をコードする塩基配列の一部をプライマーとして用いるＰＣＲ法によっても同様に本発明の芳香環ジオキシゲナーゼをコードする核酸分子を調製することができる。さらに、常法のホスホルアミダイト法等のＤＮＡ合成法を利用して、本発明の芳香環ジオキシゲナーゼをコードする核酸分子を化学的に合成することができる。そして、上記のようにして得られた芳香環ジオキシゲナーゼをコードする核酸分子を下記で詳細に説明する遺伝子組換え技術により本発明の芳香環ジオキシゲナーゼを製造することができる。芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ活性、芳香環開裂ジオキシゲナーゼについても同様にして製造することができる。
【００４２】
ここで、本発明の酵素の製造において、ＰＣＲ法を利用する場合に用いられるプライマーは常法に基づいて設計及び調製することができる。例えば、下記で説明する実施例にて用いたプライマーを好適に利用することができる。プライマーは、ホスホアミダイト法等に基づく化学合成法、既に標的となる核酸が取得されている場合にはその制限酵素断片等が利用可能である。化学合成法に基づきプライマーを調製する場合には、合成に先立って標的核酸の配列情報に基づいて設計される。プライマーの設計は、所望の領域を増幅するように、例えばプライマー設計支援ソフト等を利用して設計することができる。プライマーは合成後、ＨＰＬＣ等の手段により精製される。また、化学合成を行う場合には市販の自動合成装置を利用することも可能である。ここで、相補的とは、プライマーと標的核酸とが塩基対合則に従って特異的に結合し安定な二重鎖構造を形成できることを意味する。ここで、完全な相補性のみならず、プライマーと標的核酸が互いに安定な二重鎖構造を形成し得るのに十分である限り、いくつかの核酸塩基のみが塩基対合則に沿って適合する部分的な相補性であっても許容される。その塩基数は、標的核酸を特異的に認識するために十分に長くなければならないが、長すぎると逆に非特異的反応を誘発するので好ましくない。したがって、適当な長さはＧＣ含量等の標的核酸の配列情報、並びに、反応温度、反応液中の塩濃度等のハイブリダイゼーション反応条件など多くの因子に依存して決定されるが、好ましくは、１０〜５０塩基長である。
【００４３】
更には、本発明の酵素は、化学的合成技術によっても製造することができる。例えば、配列認識番号３、５、９又は１１に示されるアミノ酸配列の全部、又は一部を、ペプチド合成機を用いて合成し、得られるポリペプチドを適当な条件の下で、再構築することにより調製することができる。
【００４４】
そして、上記のようにして製造したタンパク質が、所望の機能又は活性を有するか否かは、芳香環ジオキシゲナーゼ活性、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ活性、芳香環開裂ジオキシゲナーゼ活性を、夫々測定することにより評価することができる。活性を測定する方法は公知の方法のいずれをも利用することができ、基質と反応させて基質変換反応の有無を検出することにより評価することができる。例えば、ビフェニルの変換活性を測定することにより行なうことができる。芳香環ジオキシゲナーゼ活性を例にとって具体的に説明すると、ビフェニルの変換活性の測定は、例えば、ＢｐｈＢ及びＢｐｈＣの存在下で、ビフェニルの分解産物である、黄色のＨＯＰＤＡの生成を確認することにより行なうことができる。また、芳香族化合物の初発酸化に伴う消費酸素量を検出することによって行なうこともできる。しかし、これに限定されるものではない。
【００４５】
本発明の芳香環ジオキシゲナーゼは、実施例にて実証されている通り、図１に示すビフェニルの分解反応における初発酸化を触媒する。さらに、本発明の芳香環ジオキシゲナーゼは、ビフェニルとの共代謝により分解されるＰＣＢをも分解することが理解される。また、ＰＡＨに対しても分解活性を有する基質特異性の広い酵素である。更に、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ、芳香環開裂ジオキシゲナーゼにより、芳香環開裂物質まで酸化分解される。
【００４６】
ここで、本発明の酵素は、従来公知の生物分解処理技術では分解が困難であった置換塩素数（特には、５塩素置換以上）の多い高塩素置換体ＰＣＢを分解可能なＫＢＣ１０１株からクローニングされたものである。そして、ＰＣＢの分解能は、Paenibacillus属において初めて見出されたものであり、従来公知のＰＣＢ分解細菌由来の酵素とは系統進化的にも相違する新規な酵素であることが判明した（図２）。したがって、従来公知のＰＣＢの分解活性を有する酵素とは、その基質特異性が相違することが予想される。ＫＢＣ１０１株の高いＰＣＢ分解活性を鑑みるに、本発明の酵素は、生物分解処理では困難とされてきた高塩素置換体ＰＣＢの分解をも触媒でき、更には既知の酵素よりも広範な基質特異性を有する酵素であることが理解される。
【００４７】
分解の対象となるＰＣＢとは、ベンゼン環が２個つながったビフェニル骨格の水素が１〜１０個の塩素で置換されたものの総称であり、置換塩素の数と位置によって理論上２０９種の異性体が存在し、そのすべての異性体およびその混合物が含まれる。また、ここで分解の対象となるＰＡＨとは、芳香族環を２個以上有する化合物の総称であり、窒素原子、酸素原子、硫黄原子と複素環を形成する化合物をも含み、具体的には、ジベンゾフラン、キサンテン、フェナントレン、フルオレン等が含まれる。
【００４８】
〔４〕本発明の芳香族化合物酸化分解経路に関与する遺伝子群
本発明の芳香族化合物酸化分解経路に関与する遺伝子群は、上記の本発明の芳香環ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、上記芳香環開裂ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子を含んで構成される。
【００４９】
そして、好ましくは、上記した４つの遺伝子は１つのオペロン上に発現する遺伝子クラスターを形成する。したがって、本発明には、これらの遺伝子の少なくとも１つを含んで構成されるオペロンとしての芳香族化合物酸化分解系オペロンが包含される。更には、上記した本発明の遺伝子を少なくとも１つを含み、他の遺伝子としては上記したものと機能的に同等のものを含むものも含まれる。また、本発明で同定された以外の芳香環化合物の酸化分解経路に関与するタンパク質をコードする遺伝子を含んで構成されたものも含まれる。例えば、フェレドキシン、フェレドキシンリダクターゼをコードする遺伝子を含んで構成されてもよい。本発明の遺伝子群を含む芳香族化合物酸化分解系オペロンとしては、具体的には、配列表の配列認識番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡを含むものが例示される。したがって、本明細書において遺伝子との文言には、特に記載が無い限りにオペロンをも包含する概念として解釈される。
【００５０】
オペロンを構成する各遺伝子群は、上記したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含むものが例示される。特には、本発明の芳香環ジオキシゲナーゼのαサブユニットをコードする遺伝子としては、配列表の配列認識番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡを含むものが例示される。
【００５１】
本発明の芳香環ジオキシゲナーゼのβサブユニットをコードする遺伝子としては、配列表の配列認識番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡを含むものが例示される。
【００５２】
本発明の芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子としては、配列表の配列認識番号８に示す塩基配列からなるＤＮＡを含むものが例示される。
【００５３】
本発明の芳香環開裂ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子としては、配列表の配列認識番号１０に示す塩基配列からなるＤＮＡを含むものが例示される。
【００５４】
また、本発明の遺伝子には、上記した塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、上述した夫々の芳香族化合物酸化分解系酵素としての機能又は活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む改変遺伝子も本発明に含まれる。このような改変遺伝子は、公知の変異導入技術を利用することにより作製できる。例えば、部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ法等を利用して点変異を導入するＰＣＲ突然誘発法、あるいは、トランスポゾン挿入突然変異誘発法などの公知の変異導入技術を利用することができる。市販の変異導入用キット（例えば、QuikChange（登録商標）Site-directed Mutagenesis Kit（Stratagene社製）等を利用してもよい。また、常法のホスホルアミダイト法等のＤＮＡの化学合成法を利用して、所望の改変を施したＤＮＡを合成することによっても構築することができる。もしくは、配列認識番号１、特には配列認識番号２、４、８、又は１０に示す塩基配列からなるＤＮＡに対してエキソヌクレアーゼを作用させることによって取得することができる。また、このような改変遺伝子としては、配列認識番号１、特には配列認識番号２、４、８、又は１０に示す塩基配列において、１または複数の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入されたものを含む遺伝子も含まれる。
【００５５】
ここで、ストリンジェントな条件とは、塩基配列において、６０％以上、好ましくは７０％、より好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上の同一性を有するＤＮＡがハイブリダイズし得る条件をいう。ストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーションの反応や洗浄の際の塩濃度及び温度を適宜変化させることによって当業者は好適に調整することができる。例えば、Molecular Cloning：A Laboratory Manual  第２版（Sambrook他、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989年）に記載のサザンハイブリダイゼーションのための条件等が挙げられる。
【００５６】
より具体的には、好ましくは１５０〜１０００ｍＭ、より好ましくは７００〜９００ｍＭの塩化ナトリウムの存在下、好ましくは６０〜６８℃、より好ましくは６５℃でのハイブリダイゼーションを行なった後、好ましくは０.１〜２×ＳＳＣ中での６０〜６８℃、より好ましくは６５℃での洗浄を意味するが、これに限定するものではない。
【００５７】
また、本発明において、その塩基配列が明確になったことから、かかる配列情報に基づいて、本発明の遺伝子を作成することができる。例えば、配列認識番号２又は４に示す塩基配列の一部又は全部の配列を基にして作成したＤＮＡプローブを用いるハイブリダイゼーション法により、ＰＣＢ分解能を有するPaenibacillus属に属する細菌、特に、好ましくはＫＢＣ１０１株のゲノムＤＮＡから本発明のポリヌクレオチドを調製することができる。また、配列認識番号１、特には配列認識番号２、４、８、又は１０に示す塩基配列の一部の配列を基にして作成したプライマーを用いるＰＣＲ法によっても同様に調製することができる。このとき用いられるプライマーの設計、及び調製は上記したように常法に基づいて行なうことができる。例えば、下記で説明する実施例にて用いたプライマーを好適に利用することができる。
【００５８】
さらに、常法のホスホルアミダイト法等のＤＮＡ合成法を利用して、本発明の遺伝子を化学的に合成することができる。
【００５９】
上記のようにして製造した遺伝子が、所望の機能又は活性を有するタンパク質をコードするか否かは、当該遺伝子に基づいて製造したタンパク質の活性を測定することにより行なうことができる。このとき、好ましくは他のサブユニット遺伝子と共に発現させて芳香環ジオキシゲナーゼ活性、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ活性、芳香環開裂ジオキシゲナーゼ活性を測定することにより行う。
【００６０】
〔５〕本発明の組換えベクター
そして、本発明の組換えベクターは、適当なベクターに上記した本発明の遺伝子の少なくとも１つ、若しくはオペロンとして組み込むことによって取得することができる。また、オペロン上の適当な任意の領域を組み込むことによっても取得することができる。利用可能なベクターとしては、外来ＤＮＡを組み込め、かつ宿主細胞中で自律的に複製可能なものであれば特に制限はない。したがって、ベクターは、本発明の遺伝子を挿入できる少なくとも１つの制限酵素部位の配列を含むものである。例えば、プラスミドベクター（ｐＥＸ系、ｐＵＣ系、及びｐＢＲ系等）、ファージベクター（Charomid、λgt10、λgt11、及びλZAP等）、コスミドベクター、ウイルスベクター（ワクシニアウイルス、及びバキュロウイルス等）等が包含される。また、ｐＨＹ３００ＰＬＫ等のシャトルベクターを使用することができる。
【００６１】
そして、本発明の組換えベクターは、本発明の遺伝子がその機能を発現できるように組み込まれてある。例えば、本発明の組換えベクターは、本発明の芳香環ジオキシゲナーゼのαサブユニット遺伝子及びβサブユニット遺伝子を含めた、芳香環ジオキシゲナーゼの上記した４つの構成要素が宿主中で発現できるよう構築される。その順序は任意でよく、また、その方向も任意である。フェレドキシン及びフェレドキシンリダクターゼに関しては、フェレドキシン及びフェレドキシンリダクターゼをコードする遺伝子であれば特に制限はない。また、宿主由来のものも利用でき、組換えベクター上に含まれなくともよい。また、遺伝子の機能の発現に必要な他の公知の塩基配列が含まれていてもよい。例えば、プロモータ配列、リーダー配列、シグナル配列、並びにリボソーム結合配列等が挙げられる。プロモータ配列としては、例えば、宿主が大腸菌の場合にはｌａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ等が好適に例示される。しかしながら、これに限定するものではなく公知のプロモータ配列を利用できる。更に、本発明の組換えベクターには、宿主において表現型選択を付与することが可能なマーキング配列等をも含ませることができる。このようなマーキング配列としては、薬剤耐性、栄養要求性などの遺伝子をコードする配列等が例示される。具体的には、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子等が例示される。
【００６２】
ベクターへの本発明の遺伝子等の挿入は、例えば、適当な制限酵素で本発明の遺伝子を切断し、適当なベクターの制限酵素部位、又はマルチクローニング部位に挿入して連結する方法などを用いることができるが、これに限定されない。連結に際しては、ＤＮＡリガーゼを用いる方法等、公知の方法を利用できる。また、DNA Ligation Kit（Takara-bio社）等の市販のライゲーションキットを利用することもできる。
【００６３】
〔６〕本発明の形質転換体
本発明の形質転換体は、本発明の遺伝子を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞である。ここで、宿主細胞としては、本発明の芳香環ジオキシゲナーゼを効率的に発現できる宿主細胞であれば、特に制限はない。原核生物を好適に利用でき、特には大腸菌を利用することができる。その他、枯草菌、バシラス属細菌、シュードモナス属細菌等をも利用できる。大腸菌としては、例えば、E. coli DH5α、E. coliBL21、E. coli JM109等を利用できる。更に、原核生物に限定されず真核生物細胞を利用することが可能である。例えば、Saccharomycescerevisiae等の酵母、Ｓｆ９細胞等の昆虫細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞等の動物細胞等を利用することも可能である。形質転換法としては、エレクトロポレーション法、塩化カルシウム法、リポソームフェクション法、マイクロインジェクション法等の公知の方法を利用することができる。また、ファージベクターを用いる場合には、本発明の遺伝子とファージベクターＤＮＡとのライゲーションの後、ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングによりファージタンパク質と折りたたんで成熟ファージの頭部外殻に封入した後、ファージ感染系を利用して、本発明の遺伝子を宿主細胞に導入することができる。
【００６４】
〔７〕本発明の形質転換体を利用した本発明の酵素の製造方法
本発明の形質転換体を利用した本発明の芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ、芳香環開裂ジオキシゲナーゼ活性の製造方法は、上記本発明の形質転換体を培養し、得られた培養物から芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ活性、芳香環開裂ジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質を採取することにより行なう。即ち、上記本発明の形質転換体を培養する培養工程と、前記培養工程で発現した前記タンパク質を回収する回収工程とを備える。このように、適当な宿主で発現させることによって、本発明の酵素の低コストかつ大量生産が可能となる。
【００６５】
培養工程は、本発明の形質転換体を適当な培地に接種し、常法に準じて培養することにより行なわれる。本発明の形質転換体の培養は、宿主細胞の栄養生理学的性質を勘案して、培養条件を選択すればよい。使用される培地としては、宿主細胞が資化し得る栄養素を含み、形質転換体におけるタンパク質の発現を効率的に行えるものであれば特に制限はない。したがって、宿主細胞の生育に必要な炭素源、窒素源その他必須の栄養素を含む培地であることが好ましく、天然培地、合成培地の別を問わない。例えば、炭素源として、グルコース、デキストラン、デンプン等が、また、窒素源としては、アンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、ペプトン、カゼイン等が挙げられる。他の栄養素としては、所望により、無機塩類、ビタミン類、抗生物質等とを含ませることができる。宿主細胞が大腸菌の場合には、ＬＢ培地、Ｍ９培地等が好適利用できる。また、培養形態についても特に制限はないが、大量培養の観点から液体培地が好適に利用できる。
【００６６】
本発明の組換えベクターを保持する宿主細胞の選別は、例えば、マーキング配列の発現の有無により行なうことができる。例えば、マーキング配列として薬剤耐性遺伝子を利用する場合には、薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤含有培地で培養することによって行うことができる。
【００６７】
精製工程は、上記で培養工程において得られた形質転換体の培養物からの本発明の芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ、芳香環開裂ジオキシゲナーゼを回収、即ち、単離精製することによって行えばよい。つまり、本発明の芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ、芳香環開裂ジオキシゲナーゼの存在する画分に応じて、一般的なタンパク質の単離精製方法に準じた手法を適用すればよい。具体的には、本発明の酵素が宿主細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離、濾過等の手段により宿主細胞を除去して培養上清を得る。続いて、培養上清に、公知のタンパク質精製方法を適宜選択することにより、本発明の酵素を単離精製することができる。例えば、硫酸アンモニウム沈殿、透析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動、ゲル濾過、疎水、陰イオン、陽イオン、アフィニティークロマトグラフィ等の各種クロマトグラフィ等の公知の単離精製技術を単独、又は適宜組み合わせて適用することができる。また、本発明の酵素が宿主細胞内で産生される場合には、培養物を遠心分離、濾過等の手段により宿主細胞を回収する。続いて、リゾチーム処理などの酵素的破砕方法、又は超音波処理、凍結融解、浸透圧ショック等の物理的破砕方法等により、宿主細胞を破砕する。破砕後、遠心分離、濾過等の手段により可溶化画分を収集する。得られた可溶化画分を、上記の細胞外に生産できる場合と同様に処理することにより単離精製することができる。
【００６８】
単離精製されたタンパク質の性能確認は、芳香環ジオキシゲナーゼ活性、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ活性、芳香環開裂ジオキシゲナーゼ活性を、夫々測定することにより行なうことができる。活性を測定する方法は公知の方法のいずれをも利用することができ、基質と反応させて基質変換反応の有無を検出することにより評価することができる。例えば、上記したようにビフェニルの変換活性を測定することにより行なうことができる。
【００６９】
〔８〕本発明の芳香族化合物の分解剤
また、本発明の芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ、芳香環開裂ジオキシゲナーゼの少なくとも１つを活性成分として含有する芳香族化合物の分解剤として提供することができる。好ましくは、上記３つの酵素すべてを、活性成分として含んで構成される。ここで、活性成分としては、精製酵素の他、粗製のままの酵素も用いることができる。また、粗製酵素としては、精製工程の途中で得られる各種の中間精製物の他、遺伝子工学的手法により製造した際の上記形質転換体の培養物等も適宜利用可能である。また、本発明の芳香環ジオキシゲナーゼに対して、凍結乾燥等の適当な処理を施したものも利用可能である。また、活性成分濃度は、適当な濃度に調製することができ、特に限定されるものではない。
【００７０】
そして、本発明の分解剤の調製に当たっては、本発明の芳香環ジオキシゲナーゼを活性成分として、錠剤、粉剤、顆粒剤、液剤、水和剤等、種々の形態に調製することができる。公知の製剤化技術にしたがって製剤することができ、適当な賦形剤、安定化剤等を適宜含ませることができる。また、適当な不溶化担体に固定化した形態で提供することができる。固定化担体としては、本発明の芳香環ジオキシゲナーゼの生物活性を保持して固定化できるものであれば、いずれをも使用できる。固定化の方法は、当業者に公知の方法を利用できる。例えば、共有結合、イオン結合および物理的吸着による担体結合法、架橋法、包括法等その形態は問わない。具体的には、ＤＥＡＥセルロース、シリカ、酸化チタン吸着による担体結合、グルタルアルデヒドによる架橋、光触媒性樹脂プレポリマーによる包括等が挙げられる。
【００７１】
本発明の芳香族化合物の分解剤は、基質特異性の広い酵素である本発明の芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ、芳香環開裂ジオキシゲナーゼを活性成分として含有することから、ＰＣＢ及びＰＡＨ他、種々の芳香族化合物の分解処理に適用することができ、置換塩素数（特には、５塩素置換以上）の多い高塩素置換体ＰＣＢの分解処理にも好適に利用できる。また、ＰＣＢ及びＰＡＨを同時に分解処理可能である。したがって、本発明の分解剤は特に、環境汚染浄化処理に特に好適に利用でき、複合汚染系に対して有効に利用することができる。
【００７２】
〔９〕本発明の芳香族化合物の分解方法
本発明の芳香族化合物の分解処理は、本発明の芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ、芳香環開裂ジオキシゲナーゼの少なくとも１つと分解対象となる芳香族化合物を接触させることにより、芳香族化合物を生物分解処理するものである。ここで、芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ、芳香環開裂ジオキシゲナーゼは、上記した分解剤の形態での利用が好ましく、特に好ましくは、適当な不溶化担体に固定化される。
【００７３】
また、本発明の分解方法において、好ましくは、本発明の芳香環ジオキシゲナーゼを、本発明の芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ、芳香環開裂ジオキシゲナーゼと同時に、又は一定時間を空けて、芳香族化合物に接触するようにして行なわれる。
【００７４】
本発明の芳香族化合物の分解方法の対象となる芳香族化合物は、ＰＣＢ及びＰＡＨ他、種々の芳香族化合物である。そして、置換塩素数（特には、５塩素置換以上）の多い高塩素置換体ＰＣＢをも好適に分解処理することができる。
【００７５】
また、本発明の分解対象となる芳香族化合物が、当該芳香族化合物によって汚染土壌又は汚染水中に含まれる場合にも好適に利用できる。ここで、汚染土壌又は汚染水は、特に制限されるものではなく、土壌、底質、地下水、河川水、湖沼水、工場等からの排水等を含むものであり、本発明の分解方法は、これらに好適に利用可能である。また、ＰＣＢ及びＰＡＨを同時に分解処理可能であることから、ＰＣＢ及びＰＡＨの複合汚染系に対して有効に利用することができる。
【００７６】
本発明の酵素と汚染土壌又は汚染水中の芳香族化合物との接触は、本発明の酵素が、ＰＣＢ、ＰＡＨをはじめとする芳香族化合物の分解能を発揮し得る条件下であれば、いずれをも採用することが可能である。例えば、汚染土壌中の芳香族化合物の分解処理の場合には、現場で掘削を伴わないで汚染土壌等の修復処理を行う原位置バイオレメディエーション法、汚染土壌等を掘削してオンサイト若しくはオフサイトの土壌処理プラントで修復処理を行うオンサイト／オフサイトバイオレメディエーション法、スラリーリアクター法を含む、一般的なバイオレメディエーション技術のいずれのケースにおいても適用可能である。本発明の芳香環ジオキシゲナーゼの投入形態としては、例えば、上記原位置バイオレメディエーション法を採用して浄化する場合、例えば、地下汚染箇所の近傍の飽和層に２本以上の井戸を掘削し、地下水流の下流側に掘削された揚水井戸から揚水した地下水の少なくとも一部に本発明の芳香環ジオキシゲナーゼを投入し、これを上流側に掘削された注入井戸に注入し循環する方法、また、オンサイト／オフサイトバイオレメディエーション法を採用する場合、例えば、本発明の芳香環ジオキシゲナーゼを、土壌に直接散布する方法、土壌中に埋設した配管を通して投入する方法等、当該分野において公知の投入方法のいずれをも好適に利用できる。
【００７７】
また、汚染水中の芳香族化合物の分解処理の場合には、例えば、通水可能なリアクターを構築して、該リアクター内で汚染水と本発明の芳香環ジオキシゲナーゼを接触させる。また、リアクターの形態に関しても特に制限はなく、バッチ方式、連続方式、いずれをも採用することが可能である。
【００７８】
酵素投入量は汚染土壌及び汚染水の汚染度合い、汚染媒体の種類等によって適宜設定されるものであるが、汚染土壌又は汚染水当たり０．０１〜１０％程度の本発明の酵素を投与することが好ましく、任意の汚染レベルに低減するまで処理を継続することが好ましい。
【００７９】
また、処理温度は、本発明の酵素の生物活性を保持できる限り、特に制限はないが、好ましくは、２０〜３７℃である。
【００８０】
〔１０〕本発明の芳香族化合物分解細菌の検出方法
本発明の芳香族化合物分解細菌の検出方法は、本発明の芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ、芳香環開裂ジオキシゲナーゼを指標として、芳香族化合物分解能を有する細菌を検出するものである。
【００８１】
ここで、検出の対象となる芳香族化合物分解能を有する細菌は、好ましくはＰＣＢ分解能を有するPaenibacillus属に属する細菌であり、特に好ましくは上記したＫＢＣ１０１株を特異的に検出するものである。即ち、本発明の酵素は、上記したＫＢＣ１０１株から単離された新規な酵素であることから、本発明の芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ、芳香環開裂ジオキシゲナーゼを指標としてＫＢＣ１０１株を特異的に検出することができる。
【００８２】
また、ＫＢＣ１０１株に限らず、本発明の酵素と相同性の高い酵素を発現する細菌の検出に利用することができる。このような芳香環ジオキシゲナーゼを発現する細菌は、本発明の芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ、芳香環開裂ジオキシゲナーゼと類似の活性を有する酵素を保有していることが理解される。したがって、このような細菌は、ＫＢＣ１０１株と同様、高塩素置換体ＰＣＢをも含むＰＣＢ及びＰＡＨ等、広範な芳香族化合物を分解可能であることが理解される。
【００８３】
本発明の芳香族化合物分解細菌の検出方法は、好ましくは、本発明の芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ遺伝子、芳香環開裂ジオキシゲナーゼ遺伝子の発現を指標として、芳香族化合物分解能を有する細菌を検出するものである。具体的には、本発明の遺伝子の一部又は全部の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、又は該オリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドを利用することにより、本発明の遺伝子を検出するものである。そして、本発明の検出方法は、被検試料と当該オリゴヌクレオチドを接触させることにより、試料中に含まれるＫＢＣ１０１株に由来する本発明の遺伝子を検出することにより行なわれる。例えば、前記オリゴヌクレオチドをプローブとして用いてハイブリダイゼーション法により行なうことができる。また、前記オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用してＰＣＲ法により行なうことができる。
【００８４】
本発明の検出方法の被検試料としては、例えば、水、土壌等の環境試料、当該環境試料から分離された菌体、又は当該環境試料又は菌体から調製された核酸が挙げられる。環境試料から調製される核酸としては、例えば、ゲノムＤＮＡ、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡが挙げられる。環境試料からの核酸の調製は、公知の方法に基づいて行うことができる。
【００８５】
本発明の検出方法の使用のために好適なオリゴヌクレオチドは、配列認識番号１、特には配列認識番号２、４、８又は１０に示す塩基配列中の一部又は全部の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、又は該オリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドを好適に利用することができる。
【００８６】
ここで、相補的とは、検出対象となる本発明の遺伝子と当該オリゴヌクレオチドとが、塩基対合則に従って特異的に結合し安定な二重鎖構造を形成できることを意味する。ここで、完全な相補性のみならず、検出対象となる本発明の遺伝子と当該オリゴヌクレオチドとが互いに安定な二重鎖構造を形成し得るのに十分である限り、いくつかの核酸塩基のみが塩基対合則に沿って適合する部分的な相補性であっても許容される。したがって、塩基配列間で、７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の塩基が塩基対合則に沿って適合することをいう。
【００８７】
前記オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡの制限はないが、好ましくはＤＮＡである。また、前記オリゴヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖の制限はないが、好ましくは一本鎖である。
【００８８】
更に、前記オリゴヌクレオチドは、天然に存在するものであっても、化学合成されたものの別を問わない。したがって、自然界より公知のクローニング方法により単離した本発明の遺伝子断片、若しくは検出の対象となる本発明の遺伝子が既に自然界より取得されている場合には、物理的手段若しくは制限酵素消化により切断された断片であっても良い。また、化学合成する場合には、ホスホアミダイト法等を利用することができ、市販の自動合成装置を利用することが可能である。化学合成する場合には、配列情報に基づいて予め設計されるが、当業者であれば容易に行うことができる。必要があれば、プライマー設計支援ソフトウェアを利用することも可能である。
【００８９】
また、当該オリゴヌクレオチドの大きさは、検出方法に応じて適宜選択される。当該オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション反応に用いるプローブとして用いる場合には、特に限定するものではないが、非特異的なハイブリダイゼーションを避けるべく一定の塩基長を有することが必要である。好ましくは１０〜１００ｂｐ、より好ましくは２０〜５０ｂｐである。また、当該オリゴヌクレオチドを核酸増幅反応に用いるプライマーとして用いる場合には、本発明の遺伝子の特徴的な配列を増幅可能であれば特に限定するものではないが、好ましくは１０〜５０ｂｐ、より好ましくは１５〜３０ｂｐである。
【００９０】
当該オリゴヌクレオチドは、検出感度を高めるべく、好ましくは標識される。
標識の種類は特に限定するものではないが、例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、及びテキサスレッド等の蛍光標識、３２Ｐ、及び３Ｈ等の放射線同位体元素標識、ビオチン、及びジゴギシゲニン等のハプテン標識、アルカリフォスファターゼ、及びペルオキシダーゼ等の酵素標識等が挙げられる。
【００９１】
ハイブリダイゼーションによって検出する場合、例えば、試料と当該オリゴヌクレオチドプローブとをストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせ、当該ハイブリダイゼーションの有無、及び強度により、対象試料中の芳香族化合物分解細菌、特にはＫＢＣ１０１株の存在の有無を検出し、或いは存在量を定量的に検出する。ハイブリダイゼーションそれ自体は公知の方法により行うことができる。例えば、サザン、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、及びプラークハイブリダイゼーション等が挙げられる。ここで、ストリンジェントな条件としては、上記したような条件が例示される。
【００９２】
核酸増幅法によって検出する場合、例えば、対象試料とオリゴヌクレオチドプライマーを接触させ、核酸増幅反応を行い、特異的な増幅産物の有無、及び強度により、対象試料中の芳香族化合物分解細菌、特にはＫＢＣ１０１株の存在の有無を検出し、或いは存在量を定量的に検出する。核酸増幅法は、それ自体は公知の方法により行うことができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）等が挙げられる。ＰＣＲ法によって増幅反応を行なう場合、その温度設定、時間、サイクル数は、対象となる鋳型ＤＮＡの量、プライマー対によって適宜選択される。また、ＰＣＲ反応におけるアニーリング温度は、上記ストリンジェントな条件に適合されることが好ましい。
【００９３】
プライマーセットは、増幅すべき標的配列のその両端に相補的な塩基配列を有するものであることが好ましい。また、プライマーとして、本発明の遺伝子の異なる領域を増幅できる複数種類のプライマーを用いて複数回の増幅反応に供することにより、検出精度をより高めることができる。
【００９４】
また、本発明の検出方法につき、定量的に検出する場合には、コントロールとして、例えば、検出対象となる芳香族化合物分解細菌、特にはＫＢＣ１０１株のゲノムＤＮＡ標準試料を同時に用いることができる。コントロールのＤＮＡ試料を用いて得られたハイブリダイゼーション強度又は特異的核酸増幅産物の量等と検出対象試料を用いて得られたハイブリダイゼーション強度又は特異的核酸増幅産物の量等とを比較して、対象中の分解細菌の菌体量を算出することができる。
【００９５】
上記の本発明の芳香族化合物分解細菌の検出方法をバイオレメディエーションによる汚染浄化系に応用することができる。つまり、上記の検出方法によりＰＣＢ及びＰＡＨ分解能を有する芳香族化合物分解細菌、特にはＫＢＣ１０１株の検出を行なうことにより、ＰＣＢ及びＰＡＨの浄化に適したバイオレメディエーション条件を設定することができる。
【００９６】
例えば、ＰＣＢ及びＰＡＨに汚染された汚染現場において、本発明の芳香族化合物分解細菌の検出方法を利用して、ＰＣＢ及びＰＡＨ分解能を有する芳香族化合物分解細菌、特にはＫＢＣ１０１株の検出を行なう。かかる検出結果により、ＰＣＢ及びＰＡＨ分解能を有する芳香族化合物分解細菌の生息が確認された場合には、バイオスティムレーションを適用し、ＰＣＢ及びＰＡＨ分解能を有する芳香族化合物分解細菌の至適生育条件を構築する。したがって、本発明の芳香族化合物分解細菌の検出方法は、バイオスティムレーションの可否の判断に有効に利用することができる。一方、検出結果により、ＰＣＢ及びＰＡＨ分解能を有する芳香族化合物分解細菌、特にはＫＢＣ１０１株を検出できない、又は、生息量が少ない場合には、バイオオーグメンテーションを適用し、ＰＣＢ及びＰＡＨ分解能を有する芳香族化合物分解細菌、特にはＫＢＣ１０１株を添加する。
【００９７】
更に、バイオスティムレーション及びバイオオーグメンテーションいずれの適用場面においても、分解細菌の挙動並びに消長等を把握するのに本発明の検出方法が有用である。また、細菌が十分な浄化活性、即ち、十分な芳香環ジオキシゲナーゼ活性、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ活性、芳香環開裂ジオキシゲナーゼ活性を発現しているか否かの把握を行うためにも本発明の検出方法が有用である。そして、検出結果に基づいて、分解細菌が最大の浄化能力を発揮できるよう、浄化現場の環境の調整をすることができる。例えば、浄化過程における分解細菌の動態をモニタリングし、かかるモニタリング結果に基づいて栄養源投与量、細菌投与量、温度、ｐＨ等の制御に例示される汚染浄化系の制御を行なうことが可能となる。つまり、高効率的な環境汚染浄化系を構築することができ、浄化処理時間の短縮化を図ることが可能となる。
【００９８】
また、上記方法を用いて得られる情報を含めた汚染浄化に関する様々な情報をデータベース化し、かかるデータベースを用いることにより汚染現場の状況に適した浄化系を構築することができる。例えば、汚染現場における汚染物質の種類、及び汚染物質量を含めた汚染状況、及び汚染現場の物理学的性質などの情報に基づき、分解細菌の最適投入量を設定し、設定された投入量を汚染現場に適用する。これにより、高効率的な環境汚染浄化系を構築することができ、浄化処理時間の短縮化を図ることが可能となる。
【００９９】
また、本発明の芳香族化合物分解細菌の検出方法は、本発明の芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ、芳香環開裂ジオキシゲナーゼに特異的に反応する抗体を用いることによっても行なうことができる。例えば、本発明の酵素に特異的な抗体を常法に基づいて作製し、試料に対して蛍光抗体法などに基づいて検出することができる。ここで、用いられる抗体は、前記本発明の酵素に特異的に結合する能力を有するものであれば、特に限定はなく、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれであってもよい。また、公知技術により修飾された抗体や抗体の誘導体、例えばＦａｂフラグメント、単鎖抗体等をも使用することができる。
【０１００】
〔１１〕本発明の芳香族化合物分解細菌検出用バイオセンサー
上記本発明の芳香族化合物分解細菌の検出方法は、バイオセンサーを利用することにより行なうことができる。本発明のバイオセンサーとしては、支持体に上記した本発明のハイブリダイゼーションプローブを固定化したセンサーを用いることができる。そして、本発明のバイオセンサーは、ＤＮＡマイクロアレイとして構成することができる。
【０１０１】
本発明の芳香族化合物分解細菌の検出は、例えば、被検試料由来の標識された核酸を、本発明の芳香族化合物分解細菌検出用バイオセンサーに接触させてハイブリダイゼーションを行なって得られたハイブリダイゼーションパターンを解析することにより、ＰＣＢ及びＰＡＨ分解能を有する芳香族化合物分解細菌、特にはＫＢＣ１０１株の存在量を算出する。
【０１０２】
ハイブリダイゼーション条件等は、上記のものを用いることができる。また、コントロールとして、例えば、ＫＢＣ１０１株のゲノムＤＮＡ標準試料を同時に支持体に固定することより定量的な検出が可能となる。
【０１０３】
前記支持体としては、例えば、ガラス板、石英板、シリコンウェハ等が利用できる。支持体への核酸分子の固定化方法は、固定化される核酸分子の種類及び担体の種類に応じて適当な方法が選択される。例えば、核酸分子がＤＮＡである場合には、ＤＮＡの荷電を利用して、ポリリジン、ポリエチレンイミン等のポリ陽イオンで表面処理した固相担体に静電結合させる方法、アミノ基、アルデヒド基等を導入した支持体表面に、アミン基、アルデヒド基、ＳＨ基等の修飾基を導入した核酸分子を共有結合させる方法等が利用できる。
【０１０４】
〔１２〕本発明の芳香族化合物の検出方法
本発明の芳香族化合物の検出方法は、本発明の芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ、芳香環開裂ジオキシゲナーゼの基質変換反応を指標として芳香族化合物の存在を検出するものである。
【０１０５】
本発明の芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ、及び芳香環開裂ジオキシゲナーゼは、下記で説明する実施例９、１０において実証された通り、ビフェニルが特に例示される芳香族化合物の存在下で１つのオペロンとして発現する誘導性の酵素である。したがって、検出の対象としては、芳香族化合物、特にはＰＣＢ及びＰＡＨが例示される。
【０１０６】
芳香族化合物に対する基質変換能は、例えば、上記した芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ、及び芳香環開裂ジオキシゲナーゼの少なくともいずれか１つと、試料とを接触させ、その基質変換反応により生成される物質を検出することにより行なうことができる。例えば、ビフェニルの分解に起因する黄色のＨＯＰＤＡの生成を検出することにより行なうことができる。これにより、被検試料中におけるビフェニル並びにＰＣＢの存在を検出することができる。また、例えば本発明の芳香環ジオキシゲナーゼの初発酸化に伴う消費酸素を検出することによって行なうことができる。しかし、これらに限定されるものでない。
【０１０７】
ここで、被検試料としては、芳香族化合物の混入が疑われる試料であれば、特に制限なく適用することができる。例えば、水、土壌等の環境試料が挙げられる。したがって、本発明の芳香族化合物の検出方法は、環境汚染分野における汚染物質のセンシングに利用することができ、検出結果を、当業者は汚染処理方法の選択材料として利用することが可能となる。また、芳香族化合物の汚染浄化処理過程における浄化状況のモニタリングに利用することができる。これにより、高効率な汚染浄化系を構築することが可能となる。
【０１０８】
〔１３〕本発明の芳香族化合物検出用バイオセンサー
上記本発明の芳香族化合物の検出方法は、バイオセンサーを利用することにより行なうことができる。例えば、本発明の芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ、及び芳香環開裂ジオキシゲナーゼを適当な支持体に固定化したものを利用することができる。
【０１０９】
ここで、支持体としては特に制限はなく、また固定化方法についても特に制限はなく、上記したものの他、公知のものをいずれをも利用することができる。また、固定化酵素をカラムに充填した酵素カラムとして利用することもできる。検出に際しては、酸素電極、または光ファイバーやフォトダイオード等を利用することができる。
【実施例】
【０１１０】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定的に解釈されるものではない。
【０１１１】
(実施例１)
Paenibacillus属ＫＢＣ１０１株のゲノムライブラリーの作製
Paenibacillus属ＫＢＣ１０１株（受託番号：FERM BP-08636）を、５ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、３０℃で２日間培養した。培養後、菌体を集菌し、ＫＢＣ１０１株のゲノムＤＮＡを調製した。調製したＫＢＣ１０１株のゲノムＤＮＡ  ５０ｍｇに、２５０ユニットの制限酵素Ｓａｕ３ＡＩを添加して３７℃で３０分間反応させて部分消化を行い、アガロースゲル電気泳動により切断状態を確認した。次いで、得られたＳａｕ３ＡＩ部分切断断片を、制限酵素ＢａｍＨＩで切断したCharomid9-36（ニッポンジーン社製）に連結した。連結に際しては、TaKaRa ligation kit Ver.2（タカラバイオ社製）を用いた。連結後、in vitro packaging kit LAMBDA INN (ニッポンジーン社製)を用いてパッケージングを行った後、大腸菌ＤＨ５株に感染させて得られた形質転換体をＫＢＣ１０１株のゲノムライブラリーとした。
【０１１２】
（実施例２）
芳香族化合物の初発酸化酵素のαサブユニット遺伝子断片のクローニング
既知の芳香族化合物分解細菌の初発酸化酵素のαサブユニットのアミノ酸配列のアライメントから、このグループのタンパク質間で高度に保存された領域を特定し、その領域のアミノ酸配列を基に、以下の縮重プライマーを設計し、合成した。
【０１１３】
プライマーＤＯ−１ａ：
5’-TG(TC)AG(TC)T(AT)(TC)CA(TC)GG(GATC)TGG-3’  （配列認識番号１２）
プライマーＤＯ−１ｓ：
5’-TC(GATC)(GA)C(GATC)GC(AG)AA(TC)TTCCA(AG)TT-3’  （配列認識番号１３）
【０１１４】
プライマーＤＯ−１ａは、αサブユニットのＮ末端近傍の鉄−硫黄クラスター形成に関与すると考えられるシステイン残基とヒスチジン残基を含む領域のアミノ酸配列を基に設計された１８ｍｅｒのプライマーである。プライマーＤＯ−１ｓはαサブユニットの中央部の相同領域のアミノ酸配列を基に設計された２０ｍｅｒのプライマーである。
【０１１５】
上記実施例１で調製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、Ex Taq Premix (タカラバイオ社製)を用いて製造業者の指示に従ってＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ反応の結果、予想された約３００ｂｐに相当するＤＮＡ断片が増幅された。増幅されたＤＮＡ断片をpGEM-T Easy vector system I（プロメガ社製）を用いてpGEM-T Easy vectorに製造業者の指示に従ってクローニングした。
【０１１６】
クローニングされた増幅断片の塩基配列を決定するため、ベクター中のインサートＤＮＡの外側の塩基配列を基に、以下のプライマーを設計し、合成した。
【０１１７】
プライマーＵＰ−１ｓ：
5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3’  （配列認識番号１４）
プライマーＵＰ−２ｓｒ：
5’-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3’  （配列認識番号１５）
【０１１８】
上記プライマーを用いてインサートＤＮＡの塩基配列を決定した。塩基配列の決定は、ダイターミネーター法に基づきＰＲＩＳＭ-３１００, ３７００（Applied Biosystems社製）を用いて行った。決定された塩基配列を基にアミノ酸配列を推定し、推定アミノ酸配列の相同性検索を行なった。相同性検索の結果、芳香族化合物分解細菌に由来する初発酸化酵素のαサブユニットのアミノ酸配列の一部に有意な相同性を示した。したがって、上記で得られた増幅ＤＮＡ断片は、芳香族初発酸化酵素αサブユニット遺伝子の部分断片であると示唆された。
【０１１９】
（実施例３）
芳香族化合物の初発酸化酵素αサブユニットのコード配列を含むクローンの同定
上記実施例１で得られたＫＢＣ１０１株のゲノムライブラリーのコロニーに、上記実施例２で得られたαサブユニット遺伝子の一部と考えられる増幅断片をプローブとしてハイブリダイゼーションを行った。その結果、1つの陽性クローンを得た。なお、プローブの標識、ハイブリダイゼーション、及び標識からのシグナルの検出には、DIG DNA labeling and detection kit(ロシュ社製)を用いた。
【０１２０】
（実施例４）
芳香環初発酸化酵素をコードする遺伝子群の塩基配列の決定
上記結果から、クローニングされたＤＮＡ断片の塩基配列を決定するため、ベクター中のインサートＤＮＡの外側のマルチクローニングサイトの配列を基に、以下のプライマーを設計、合成した。
【０１２１】
プライマーＥｃｏＲＩ−Ｒ：
5’-AAAATAGGCGTATCACGAGG-3’  （配列認識番号１６）
プライマーＸｂａＩ−Ｆ：
5’-TGACAGCTTGTATGTTTCTG-3’  （配列認識番号１７）
【０１２２】
上記プライマーを用いてＤＮＡインサートの塩基配列決定を上記実施例２に記載の手順に準じて行なった。塩基配列の解析が進むに従って、順次新たなプライマーを設計、それに続いてプライマーを合成して塩基配列の解析を進め、約４．５ｋｂ領域の塩基配列を決定した。配列認識番号１として、その塩基配列を示す。解析の結果、５つのＯＲＦが見出された。ＯＲＦの塩基配列を基にアミノ酸配列を推定し、推定アミノ酸配列に基づいて相同性検索を行なった。相同性検索の結果、５つのＯＲＦは、夫々、芳香族化合物分解細菌由来の初発酸化酵素のαサブユニット、βサブユニット、機能未知なＯＲＦ、ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ、２,３-ジヒドロキシビフェニル  １,２-ジオキシゲナーゼに有意な相同性を示した。そこで、これらのＯＲＦをそれぞれｂｐｈＡ１、ｂｐｈＡ２、ｏｒｆ３、ｂｐｈＢ、ｂｐｈＣと命名し、それぞれの塩基配列を配列表の配列認識番号２、４、６、８及び１０に示すと共に、これらの遺伝子群をｂｐｈ遺伝子群と称する。そして、４．５ｋｂ領域の情報化部位を図３に図示する。なお、矢印は転写方向を示す。また、上記ＯＲＦがコードするタンパク質をそれぞれＢｐｈＡ１、ＢｐｈＡ２、ＯＲＦ３、ＢｐｈＢ、ＢｐｈＣと称すると共に、推定アミノ酸配列を配列表の配列認識番号３、５、７、９及び１１に示す。
【０１２３】
（実施例５）
相同性検索
上記実施例４にて確認されたＯＲＦの推定アミノ酸配列に基づいて、既知のタンパク質と相同性検索を行なった。相同性検索ツールとしては、Ｂｌａｓｔを使用した。
【０１２４】
結果を表１に示す。
【０１２５】
【表１】
2007295803.tif 000002
【０１２６】
相同性検索の結果、ＢｐｈＡ１、ＢｐｈＡ２、ＢｐｈＢ及びＢｐｈＣは、夫々既知のＢｐｈＡ１、ＢｐｈＡ２、ＢｐｈＢ及びＢｐｈＣと、約７０〜８０％程度のアミノ酸レベルで相同性を示した。このことから、上記実施例で取得された遺伝子群が、芳香族化合物、特にはビフェニルに対する酸化分解に関与する酵素をコードすることが示唆された。また、Paenibacillus属において初めて見出されたＰＣＢをも分解可能な酵素であり、従来公知のＰＣＢ分解菌の酸化分解系酵素とは、系統学的に異なる新規の酸化分解系酵素であることも同時に判明した。
【０１２７】
（実施例６）
ｂｐｈＡ１Ａ２、ｂｐｈＢ、ｂｐｈＣ領域をそれぞれ含む発現プラスミドの構築
上記実施例４で同定された遺伝子領域を含むプラスミドを構築するために、以下のプライマーを設計し、合成した。
【０１２８】
ｂｐｈＡ１Ａ２領域増幅用プライマー
プライマーｂｐｈＡ１Ｆ-ＳａｌＩ：
5’-ACGCGTCGACGGTGTACACCATGACTCAGC-3’  （配列認識番号１８）
プライマーｂｐｈＡ２Ｒ-ＸｂａＩ：
5’-CTAGTCTAGAAACCATGGCAAACTCGTTG-3’  （配列認識番号１９）
【０１２９】
ｂｐｈＢ領域増幅用プライマー
プライマーｂｐｈＢＦ-ＥｃｏＲＩ：
5’-GGAATTCCTGGATCAGACTACCTTGG-3’  （配列認識番号２０）
プライマーｂｐｈＢＲ-ＢａｍＨＩ：
5’-CGGGATCCCTCCATGTTAGGCGTGACG-3’  （配列認識番号２１）
【０１３０】
ｂｐｈＣ領域増幅用プライマー
プライマーｂｐｈＣＦ-ＥｃｏＲＩ：
5’-GGAATTCGCCTGGGCTTATGTGTACC-3’  （配列認識番号２２）
プライマーｂｐｈＣＲ-ＢａｍＨＩ：
5’-CGGGATCCATCCTTCAAGCTCTCCAGG-3’  （配列認識番号２３）
【０１３１】
なお、プライマー配列中にある下線部は制限酵素サイトを示す。
【０１３２】
上記実施例１で調製したＫＢＣ１０１株のゲノムＤＮＡを鋳型にして、上記のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、夫々の全領域を含む増幅断片を得た。ＰＣＲ反応は上記実施例２の手順と同様にして行なった。得られた増幅断片を制限酵素によって切断した。詳細には、ｂｐｈＡ領域の増幅断片はＳａｌＩとＸｂａＩで、ｂｐｈＢ、及びｂｐｈＣ領域の増幅断片はＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで、夫々切断して制限酵素切断断片を得た。得られた切断断片を、対応の各制限酵素で切断されたｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ社製）に連結し、発現プラスミドを構築した。なお、ｐＨＹ３００ＰＬＫは、E. coli-Bacillusのシャトルベクターである。ここで、ｂｐｈＡ１Ａ２、ｂｐｈＢ、ｂｐｈＣ領域を含むプラスミドを、夫々ｐＡＡ１、ｐＡＢ１、ｐＡＣ１と称する。
【０１３３】
（実施例７）
発現プラスミドのPaenibacillus validus JCM9077株への導入
上記実施例６で調製したｂｐｈＡ１Ａ２、ｂｐｈＢ、ｂｐｈＣ遺伝子を含む発現プラスミドであるｐＡＡ１、ｐＡＢ１、ｐＡＣ１を、ビフェニル分解能を持たないPaenibacillus validus JCM9077株にエレクトロポレーションにより導入し、形質転換体を得た。ここで、エレクトロポレーションの条件は、２００Ω、２５μＦで行った。
【０１３４】
（実施例８）
ｂｐｈＡ遺伝子産物の酵素活性
ｂｐｈＡ遺伝子産物の活性は、ｂｐｈＢ、及びｂｐｈＣ遺伝子産物とのカップリングアッセイによりビフェニルから生じる黄色のＨＯＰＤＡを目視で確認することにより行った。詳細には、上記実施例７で調製した各遺伝子を含む形質転換体を、５ｍｇ/Ｌのテトラサイクリンを含む５ｍＬのＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養を行なった。培養後、菌体を集菌し、５００μＬの５０ｍＭリン酸バッファーに懸濁して休止菌体を調製した。調製した休止菌体と適量のビフェニルを混合し、ＨＯＰＤＡの形成を確認した。なお、コントロールとして、ｂｐｈＡ遺伝子産物を含まないサンプルについても同様にＨＯＰＤＡの形成を確認した。
【０１３５】
結果を表２に示す。
【表２】
2007295803.tif 000003
【０１３６】
表２の結果より、ｂｐｈＡ、ｂｐｈＢ、及びｂｐｈＣの各遺伝子産物を含んだ場合のみ、ＨＯＰＤＡに由来する黄色物質の蓄積が確認された。つまり、ｂｐｈＡに由来する酵素活性が確認された。
【０１３７】
以上の結果より、ｂｐｈＡが、ビフェニルに対してジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であることが確認された。
【０１３８】
（実施例９）
ＫＢＣ１０１株のｂｐｈ遺伝子群のＲＴ−ＰＣＲ解析
上記実施例にて取得したｂｐｈ遺伝子群がビフェニル分解に関与しているのか、或いは関与している場合には、これらの遺伝子群が一連のオペロンとして転写されているかを調べるために、ＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。
【０１３９】
ＲＴ−ＰＣＲ反応は、TaKaRa RNA PCR kit（AMV）ver3.0（タカラバイオ社製）を用いて、添付のマニュアルに従って行なった。具体的には、２段階で反応を行った。まず、第一段階としてビフェニル添加培地およびＬＢ培地にて培養したＫＢＣ１０１株からtotal ＲＮＡを調製し、続いて、調製したＲＮＡを鋳型として逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。total ＲＮＡの調製はSepasol-RNA I kit（ナカライテスク社製、京都、日本）を用いて、添付のマニュアルに従って行なった。第二段階として、第一段階で合成したｃＤＮＡを鋳型としてｂｐｈＡ１からｂｐｈＡ２およびｂｐｈＡ２からｂｐｈＢ(ｏｒｆ３も含む)そしてｂｐｈＢからｂｐｈＣ領域を増幅するべくＰＣＲ反応を行った。増幅反応終了後、ＰＣＲ産物の一部をアガロースゲル電気泳動に供し、増幅断片を確認した。ここで、ＰＣＲ反応は、９４℃にて３０秒の熱変性、５５℃にて３０秒のアニーリング反応、７２℃にて６０秒の伸長反応を、１サイクルとした反応を３０サイクル繰り返すことで行なった。ＰＣＲ増幅に用いたプライマーを表３に示す。
【０１４０】
【表３】
2007295803.tif 000004
【０１４１】
コントロールとして、上記で調製したＲＮＡ中にゲノムＤＮＡがコンタミしていないか確認するために、逆転写酵素を除いた系についても同様にＲＴ−ＰＣＲ反応を行なった。
【０１４２】
結果を図３に示す。
レーン１〜３は、ｂｐｈＡ１からｂｐｈＡ２領域の増幅結果を示し、レーン１はコントロール、レーン２はＬＢ培地での培養時、レーン３はビフェニル添加培地での培養時、の結果を示す。
レーン４〜６は、ｂｐｈＡ２からｂｐｈＢ領域（ｏｒｆ３も含む）の増幅結果を示し、レーン４はコントロール、レーン５はＬＢ培地での培養時、レーン６はビフェニル添加培地での培養時、の結果を示す。
レーン７〜９は、ｂｐｈＢからｂｐｈＣ領域の増幅結果を示し、レーン７はコントロール、レーン８はＬＢ培地での培養時、レーン９はビフェニル添加培地での培養時、の結果を示す。
【０１４３】
図３の結果より、ビフェニル添加培地での培養時のみ各遺伝子間の予想サイズの増幅断片が認められた（レーン３、６、９と他のレーンとの比較）。以上のことからＫＢＣ１０１株においてｂｐｈＡ１からｂｐｈＣまでの遺伝子領域は誘導的に1つのオペロンとして発現していることが確認された。更に、ビフェニルにより発現制御されていることも判明した。つまり、本発明のｂｐｈ遺伝子群の発現はビフェニルの不在下では抑制され、ビフェニルの添加により脱抑制されることが示唆された。
【０１４４】
（実施例１０）
ＫＢＣ1０１株のｂｐｈ遺伝子群のプライマー伸長反応解析
上記実施例９で、オペロン構造を確認したＲＮＡの５’末端構造を確認するためにプライマー伸長反応解析を行った。プライマー伸長反応は、実施例９にて調製したＲＮＡを鋳型として、Kulakovらに記載の方法（Web-Type Evolution of Rhodococcus Gene Clusters Associated with Utilization of Naphthalene、Applied and Environmental Microbiology、2005年４月、第71巻、第４号、第1754〜第1764頁)に準じて行なった。ここで、用いた試薬を以下に示す。いずれもInvitrogen社製のものを用いた。
【０１４５】
Superscript III RNaseH Reverse transcriptase
５×First strand buffer
dNTP mix
Ribonuclease inhibitor（RNase out）：組換型
【０１４６】
プライマーは、５’側をWell Red Dyeで標識した
5’-CTGCCCGCGATAATTTGCTTTCGTCCG-3’（配列認識番号３０）を用いた。なお、標識はプロリゴ社に外注した。
【０１４７】
結果を図４に示す。
図４（Ａ）は、ビフェニル添加培地での培養時、図４（Ｂ）は、ＬＢ培地での培養時の結果を示す。
【０１４８】
図４の結果、KBC101株をビフェニル添加培地にて培養した場合に、ｂｐｈＡ１の開始コドンから190bp上流（図５）にｂｐｈ遺伝子群の転写開始点が確認された（図４（Ａ））。一方、ＬＢ培地での培養時には、ｂｐｈ遺伝子群の転写開始点を確認することができなかった（図４（Ｂ））。かかる結果は、実施例９の結果と合致するものであり、本発明で取得した一連のｂｐｈ遺伝子群がビフェニルにより発現制御されていることを強く示唆する結果が得られた。
【０１４９】
また、転写開始点が決定されたことから転写調節に関与する領域の解析のための重要な情報となり、芳香族化合物酸化分解経路に関与する酵素群をコードする遺伝子群の転写制御様式の解明を進めることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】ビフェニルの酸化分解経路を示す図
【図２】芳香環ジオキシゲナーゼの進化系統樹
【図３】４．５ｋｂのＤＮＡ断片上の芳香環酸化分解系酵素遺伝子の情報化構造図及び、ＫＢＣ１０１株のｂｐｈ遺伝子群のＲＴ−ＰＣＲ解析を行なった実施例９の結果を示す電気泳動図
【図４】（Ａ）ＫＢＣ１０１株のｂｐｈ遺伝子群のプライマー伸長反応解析を行なった実施例１０の結果（ビフェニル添加培地）を示す図，（Ｂ）ＫＢＣ１０１株のｂｐｈ遺伝子群のプライマー伸長反応解析を行なった実施例１０の結果（ＬＢ培地）を示す図
【図５】ＫＢＣ１０１株のｂｐｈ遺伝子群のプライマー伸長反応解析を行なった実施例１０によって同定された転写開始点を示す配列図
【図１】
2007295803.tif 000005
【図２】
2007295803.tif 000006
【図４】
2007295803.tif 000007
【図５】
2007295803.tif 000008
【図３】
2007295803.tif 000009
【配列表】
2007295803000001.app