(57)【要約】      （修正有）【課題】バチルス綱に属する細菌における、ＤＮＡの増殖関与性の評価方法、増殖関与領域の同定方法を提供する。【解決手段】黄色ブドウ球菌等のバチルス綱に属する細菌中で安定に存在するプラスミドを構築するために、プラスミドの安定保持に関与する遺伝子であるｐａｒ遺伝子、複製開始点、及びｒｅｐ遺伝子を有する低コピープラスミドを構築することからなり、構築したプラスミドを用いたプラスミドシャッフリングを利用することにより、黄色ブドウ球菌等のバチルス綱に属する細菌における被検ＤＮＡの増殖関与性を効率的に検証することからなる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検ＤＮＡがバチルス綱に属する細菌の増殖に関与するか否かを評価する方法であって、
（ａ）被検ＤＮＡと第一の選択マーカー遺伝子を発現する第一のプラスミドを前記細菌に導入し、第一の選択マーカー遺伝子依存に増殖する前記細菌を選別する工程、
（ｂ）工程（ａ）で選別された前記細菌において、被検ＤＮＡに対応する染色体上のＤＮＡを第二の選択マーカー遺伝子と置換し、第二の選択マーカー遺伝子依存に増殖する前記細菌を選別する工程、及び、
（ｃ）前記細菌において第一のプラスミドと不和合性を示し、かつ第三の選択マーカー遺伝子を発現する第二のプラスミドを、工程（ｂ）で選別された前記細菌に導入し、第三の選択マーカー遺伝子依存に増殖する前記細菌を検出する工程、を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
バチルス綱に属する細菌の増殖に関与するＤＮＡにおいて、増殖に関与する領域を同定する方法であって、
（ａ）前記ＤＮＡと第一の選択マーカー遺伝子を発現する第一のプラスミドを前記細菌に導入し、第一の選択マーカー遺伝子依存に増殖する前記細菌を選別する工程、
（ｂ）工程（ａ）で選別された前記細菌において、前記ＤＮＡに対応する染色体上の遺伝子を第二の選択マーカー遺伝子と置換し、第二の選択マーカー遺伝子依存に増殖する前記細菌を選別する工程、及び、
（ｃ）前記細菌において第一のプラスミドと不和合性を示し、第三の選択マーカー遺伝子を発現し、かつ、前記ＤＮＡの一部に変異を有した変異ＤＮＡを発現する第二のプラスミドを、工程（ｂ）で選別された前記細菌に導入し、第三の選択マーカー遺伝子依存に増殖する前記細菌を検出する工程、を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
第一のプラスミド及び第二のプラスミドが、ｐａｒ遺伝子、複製開始起点、及び、ｒｅｐ遺伝子を有する請求項１から２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
第一のプラスミド及び第二のプラスミドが、低コピー数で、かつバチルス綱に属する細菌内で安定に保持されるプラスミドである請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ｐａｒ遺伝子、複製開始起点、ｒｅｐ遺伝子、及び、バチルス綱に属する細菌において増殖に関与するか否かを評価したい任意のＤＮＡのクローニング部位を有することを特徴とするプラスミド。
【請求項６】
プラスミドが、低コピー数で、かつバチルス綱に属する細菌内で安定に保持されるプラスミドである請求項５に記載のプラスミド。
【請求項７】
請求項１から４のいずれかに記載の方法に用いるためのキットであって、
（ａ）請求項５から６のいずれかに記載のプラスミド、及び
（ｂ）使用説明書、を含むことを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、黄色ブドウ球菌等のバチルス綱に属する細菌において、被検ＤＮＡが前記細菌の増殖に関与するか否かを評価する方法、前記細菌の増殖に関与するＤＮＡの増殖関与領域を同定する方法、並びに、前記方法に用いられるプラスミド、及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、細菌の遺伝子の増殖必須性を検証する方法としては、様々な方法が知られている。しかし、これらの従来の技術には、同時にまた、それぞれ問題点もあるのが現状である。
例えば、本発明者らは、黄色ブドウ球菌の温度感受性変異株を分離し、相補遺伝子を同定することにより、黄色ブドウ球菌の増殖必須遺伝子の同定を行ってきた（例えば、非特許文献１〜５参照）。しかし、この方法で遺伝子の増殖必須性を検証する場合、遺伝子が高温（例えば、４３℃）での増殖に必須であるか否かは検証することができるが、低温（例えば、３０℃）での増殖に必須であるか否かは分からない。
また、例えば、アンチセンス法、又は、ＲＮＡｉの場合（例えば、非特許文献６〜７参照）には、遺伝子発現の抑制が充分でないために、該遺伝子は増殖に不要であると判断される可能性がある。トランスポゾン挿入法の場合（例えば、非特許文献８参照）には、欠失株が得られないのは単に挿入頻度の問題であったり、挿入効率の悪い染色体の高次構造をとる部分であるためであったり、近傍の遺伝子への作用のためであるかもしれない。ＩＰＴＧによる発現抑制を利用した増殖必須性の検証の場合（例えば、非特許文献９参照）には、発現を抑えたときに、抑制が充分にきかないために増殖に不要と判断される可能性がある。
【０００３】
また、大腸菌においては、プラスミドの不和合性を利用したプラスミドシャッフリングを用いて、遺伝子の増殖必須性を検証する方法が知られている（例えば、非特許文献１０参照）。しかし、このプラスミドシャッフリングを用いた遺伝子の増殖必須性の検証方法は、大腸菌においては既に確立されたシステムであるが、黄色ブドウ球菌等のバチルス綱に属する細菌については開発が全くなされていなかった。
【０００４】
したがって、黄色ブドウ球菌等のバチルス綱に属する細菌において、効率的に遺伝子の増殖関与性を評価することのできる優れた方法は、未だ提供されていないのが現状である。
【０００５】
【非特許文献１】Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００６  Ｊａｎ  ２０；２８１(３)：１７１４−２４．
【非特許文献２】Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００４  Ｍａｙ；２７１（４）：４４７−５７．
【非特許文献３】ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．２００３  Ｍａｙ  １６；２２２（１）：１０７−１３．
【非特許文献４】ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．  ２００２  Ａｐｒ  ２３；２１０（１）：１５７−６４．
【非特許文献５】Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００１  Ｄｅｃ；２６６（４）：５６４−７１．
【非特許文献６】Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００１  Ｓｅｐ  ２１；２９３（５５３８）：２２６６−９．
【非特許文献７】Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００２  Ｍａｒ；４３（６）：１３８７−４００．
【非特許文献８】Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００２  Ｊａｎ  ２２；９９（２）：９６６−７１．
【非特許文献９】Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００３  Ａｐｒ  １５；１００（８）：４６７８−８３．
【非特許文献１０】ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１９９９  Ｊｕｌ  １５；１７６（２）：３５７−６６．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、黄色ブドウ球菌等のバチルス綱に属する細菌において、被検ＤＮＡが前記細菌の増殖に関与するか否かを効率的に評価することのできる方法、前記細菌の増殖に関与するＤＮＡの増殖関与領域を効率的に同定することのできる方法、並びに、前記方法に使用可能な、利用性に優れたプラスミド、及びキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するため、本発明者らは、大腸菌においては既に確立されたシステムであるプラスミドシャッフリングを利用した遺伝子の増殖必須性の検証方法を、黄色ブドウ球菌等のバチルス綱に属する細菌にも適用することに着目した。
【０００８】
しかし、後述する実施例１にも示すように、既存のプラスミドであるｐＫＥ５１５やｐＳＥＱ２４３等を使用して黄色ブドウ球菌におけるプラスミドシャッフリングを行ったところ、プラスミドの交換に非常に時間がかかる、プラスミドの脱落の比率が非常に高い、等の問題があり、これらのプラスミドは前記目的には不適当であった。
【０００９】
そこで、本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、臨床分離ＭＲＳＡ株Ｎ３１５に存在するプラスミドｐＮ３１５Ｂを用いて、安定保持に関与する遺伝子であるｐａｒ遺伝子を同定し、ｐａｒ遺伝子、複製開始起点、及びｒｅｐ（複製開始タンパク質）遺伝子を有する低コピープラスミドを、新たに構築した。更に、構築したプラスミドが、黄色ブドウ球菌等のバチルス綱に属する細菌中で安定に保持されること、かつ、一晩程度の短期間でのプラスミドシャッフリングが可能であることを見出した（後述、実施例１参照）。即ち本発明者らは、構築したプラスミドを用いたプラスミドシャッフリングを利用することにより、黄色ブドウ球菌等のバチルス綱に属する細菌における被検ＤＮＡの増殖関与性を効率的に検証できることを見出し、本発明の完成に至った。
【００１０】
本発明は、本発明者らの前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  被検ＤＮＡがバチルス綱に属する細菌の増殖に関与するか否かを評価する方法であって、
（ａ）被検ＤＮＡと第一の選択マーカー遺伝子を発現する第一のプラスミドを前記細菌に導入し、第一の選択マーカー遺伝子依存に増殖する前記細菌を選別する工程、
（ｂ）工程（ａ）で選別された前記細菌において、被検ＤＮＡに対応する染色体上のＤＮＡを第二の選択マーカー遺伝子と置換し、第二の選択マーカー遺伝子依存に増殖する前記細菌を選別する工程、及び、
（ｃ）前記細菌において第一のプラスミドと不和合性を示し、かつ第三の選択マーカー遺伝子を発現する第二のプラスミドを、工程（ｂ）で選別された前記細菌に導入し、第三の選択マーカー遺伝子依存に増殖する前記細菌を検出する工程、を含むことを特徴とする方法である。
＜２＞  バチルス綱に属する細菌の増殖に関与するＤＮＡにおいて、増殖に関与する領域を同定する方法であって、
（ａ）前記ＤＮＡと第一の選択マーカー遺伝子を発現する第一のプラスミドを前記細菌に導入し、第一の選択マーカー遺伝子依存に増殖する前記細菌を選別する工程、
（ｂ）工程（ａ）で選別された前記細菌において、前記ＤＮＡに対応する染色体上の遺伝子を第二の選択マーカー遺伝子と置換し、第二の選択マーカー遺伝子依存に増殖する前記細菌を選別する工程、及び、
（ｃ）前記細菌において第一のプラスミドと不和合性を示し、第三の選択マーカー遺伝子を発現し、かつ、前記ＤＮＡの一部に変異を有した変異ＤＮＡを発現する第二のプラスミドを、工程（ｂ）で選別された前記細菌に導入し、第三の選択マーカー遺伝子依存に増殖する前記細菌を検出する工程、を含むことを特徴とする方法である。
＜３＞  第一のプラスミド及び第二のプラスミドが、ｐａｒ遺伝子、複製開始起点、及び、ｒｅｐ遺伝子を有する前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の方法である。
＜４＞  第一のプラスミド及び第二のプラスミドが、低コピー数で、かつバチルス綱に属する細菌内で安定に保持されるプラスミドである前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の方法である。
＜５＞  ｐａｒ遺伝子、複製開始起点、ｒｅｐ遺伝子、及び、バチルス綱に属する細菌において増殖に関与するか否かを評価したい任意のＤＮＡのクローニング部位を有することを特徴とするプラスミドである。
＜６＞  プラスミドが、低コピー数で、かつバチルス綱に属する細菌内で安定に保持されるプラスミドである前記＜５＞に記載のプラスミドである。
＜７＞  前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の方法に用いるためのキットであって、
（ａ）前記＜５＞から＜６＞のいずれかに記載のプラスミド、及び
（ｂ）使用説明書、を含むことを特徴とするキットである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、黄色ブドウ球菌等のバチルス綱に属する細菌において、被検ＤＮＡが前記細菌の増殖に関与するか否かを効率的に評価することのできる方法、前記細菌の増殖に関与するＤＮＡの増殖関与領域を効率的に同定することのできる方法、並びに、前記方法に使用可能な、利用性に優れたプラスミド、及びキットを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（被検ＤＮＡの増殖関与性の評価方法）
本発明の、被検ＤＮＡがバチルス綱に属する細菌の増殖に関与するか否かを評価する方法（以下、単に「評価方法」と称することがある）は、（ａ）第一のプラスミド導入工程、（ｂ）染色体ＤＮＡの置換工程、及び（ｃ）第二のプラスミド導入（プラスミドシャッフリング）と増殖の検出工程を含み、更に必要に応じてその他の工程を含む。
【００１３】
＜バチルス綱に属する細菌＞
前記バチルス綱（Ｃｌａｓｓ  Ｂａｃｉｌｌｉ）に属する細菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、バチルス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌、スタフィロコックス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）に属する細菌、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、などが挙げられる。
前記バチルス属に属する細菌としては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）などが挙げられ、前記スタフィロコックス属に属する細菌としては、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、腐生ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）などが挙げられる。
これらの中でも、前記評価方法は、前記黄色ブドウ球菌に特に好適である。
【００１４】
＜被検ＤＮＡ＞
前記被検ＤＮＡとしては、前記バチルス綱に属する細菌における増殖関与性を評価したいＤＮＡ領域であり、かつ、前記細菌の染色体外プラスミドにクローニングしてもその機能を発現できるようなＤＮＡ領域であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、タンパク質やＲＮＡをコードするＤＮＡ領域（遺伝子）であってもよいし、タンパク質やＲＮＡをコードしないＤＮＡ領域（非コード領域）であってもよい。具体的には、例えば、タンパク質をコードするＤＮＡ領域；ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｔｍＲＮＡ等の機能性ＲＮＡをコードするＤＮＡ領域；タンパク質やＲＮＡはコードしないが、不必要な複製開始の抑制を通じて増殖に関与しているｄａｔ領域のようなＤＮＡ領域、などが挙げられる。また、前記被検ＤＮＡとしては、前記したようなＤＮＡ領域の全体であってもよいし、一部であってもよい。
【００１５】
＜評価方法＞
以下、前記評価方法の各工程について説明する。
―（ａ）第一のプラスミド導入工程―
工程（ａ）では、前記被検ＤＮＡと第一の選択マーカー遺伝子を発現する第一のプラスミドを前記バチルス綱に属する細菌に導入し、第一の選択マーカー遺伝子依存に増殖する前記細菌を選別する。前記工程（ａ）により、前記被検ＤＮＡは、前記第一のプラスミド上と前記細菌が元来有する染色体上との双方に存在した状態となる。
【００１６】
前記第一のプラスミドとしては、例えば、後述するような本発明のプラスミドであって、クローニング部位に前記被検ＤＮＡが導入されたプラスミドを使用することができる。前記プラスミドの詳細は、本発明のプラスミドの項目に後述する通りであり、ｐａｒ遺伝子、複製開始起点、及びｒｅｐ遺伝子を有し、前記細菌内での自律複製が可能なプラスミドであることが好ましく、また、低コピー数であり、かつ前記細菌内で安定に保持されるプラスミドであることが好ましい。
また、前記第一の選択マーカー遺伝子としても、特に制限はなく、本発明のプラスミドの項目に後述するような選択マーカーを、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、フレオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。
【００１７】
前記第一のプラスミドを前記細菌に導入する方法としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知のプラスミド導入方法を使用することができる。
また、前記第一の選択マーカー遺伝子依存に増殖する前記細菌を選別する方法としても、特に制限はなく、選んだ選択マーカー遺伝子の種類に応じて適宜選択することができ、例えば、前記第一の選択マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を選んだ場合には、前記薬剤耐性遺伝子に対応した薬剤を含有する培養液中で前記細菌を培養し、増殖した前記細菌（前記薬剤に耐性である細菌）を選別する方法、などが挙げられる。
前記工程（ａ）で選別された前記細菌を、以下の工程（ｂ）に供する。
【００１８】
―（ｂ）染色体ＤＮＡの置換工程―
工程（ｂ）では、前記工程（ａ）で選別された前記細菌において、前記被検ＤＮＡに対応する染色体上のＤＮＡを第二の選択マーカー遺伝子と置換し、第二の選択マーカー遺伝子依存に増殖する前記細菌を選別する。前記工程（ｂ）により、前記細菌が元来有する染色体上の被検ＤＮＡは欠失し、前記被検ＤＮＡが前記第一のプラスミド上のみに存在した状態となる。
【００１９】
前記「被検ＤＮＡに対応する染色体上のＤＮＡ」とは、前記細菌が元来有する染色体上における、前記被検ＤＮＡと同一のＤＮＡ領域、又は、前記被検ＤＮＡを少なくとも含むＤＮＡ領域を指す。
前記第二の選択マーカー遺伝子としては、特に制限はなく、例えば、前記第一の選択マーカー遺伝子の場合と同様な薬剤耐性遺伝子などを使用することができるが、前記第二の選択マーカー遺伝子は、前記第一の選択マーカー遺伝子とは異なる種類である必要がある。
【００２０】
前記被検ＤＮＡに対応する染色体上のＤＮＡを前記第二の選択マーカー遺伝子と置換する方法としては、特に制限はなく、公知の方法の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｆａｂｒｅｔら（Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００２  Ｏｃｔ；４６（１）：２５−３６）の手法を参照して行うことができる。
また、前記第二の選択マーカー遺伝子依存に増殖する前記細菌を選別する方法としても、特に制限はなく、例えば、前記工程（ａ）と同様にして行うことができる。
前記工程（ｂ）で選別された前記細菌を、以下の工程（ｃ）に供する。
【００２１】
―（ｃ）第二のプラスミド導入（プラスミドシャッフリング）と増殖の検出工程―
工程（ｃ）では、前記細菌において第一のプラスミドと不和合性を示し、かつ第三の選択マーカー遺伝子を発現する第二のプラスミドを、前記工程（ｂ）で選別された前記細菌に導入し、第三の選択マーカー遺伝子依存に増殖する前記細菌を検出する。前記工程（ｃ）における第二のプラスミド導入により、第一のプラスミドと第二のプラスミドとはプラスミドシャッフリングを起こし、前記被検ＤＮＡを有する第一のプラスミドは、空ベクターである第二のプラスミドに置き換わるため、前記細菌は前記被検ＤＮＡを全く有さない状態となる。
【００２２】
前記第二のプラスミドとしては、前記第一のプラスミドと同様に、後述するような本発明のプラスミドを使用することができるが、ここで、前記第二のプラスミドとしては、クローニング部位に挿入ＤＮＡを有しない、空ベクタープラスミドを使用する。なお、前記プラスミドの詳細は、本発明のプラスミドの項目に後述する通りであり、ｐａｒ遺伝子、複製開始起点、及びｒｅｐ遺伝子を有し、前記細菌内での自律複製が可能なプラスミドであることが好ましく、また、低コピー数であり、かつ前記細菌内で安定に保持されるプラスミドであることが好ましい。
【００２３】
前記第三の選択マーカー遺伝子としては、特に制限はなく、例えば、前記第一の選択マーカー及び前記第二の選択マーカーの場合と同様な薬剤耐性遺伝子などを使用することができるが、前記第三の選択マーカー遺伝子としては、前記第一の選択マーカー及び第二の選択マーカー遺伝子とは異なる種類の選択マーカー遺伝子である必要がある。
また、前記第三の選択マーカー遺伝子依存に増殖する前記細菌を選別する方法としても、特に制限はなく、例えば、前記工程（ａ）及び工程（ｂ）と同様にして行うことができる。
【００２４】
前記増殖の検出としては、特に制限はなく、例えば、第三の選択マーカー遺伝子依存に増殖する前記細菌のコロニー数を、公知の手法を用いてカウントすることにより行うことができる。
前記検出の結果、前記工程（ｃ）で選別された前記細菌が全く増殖しなければ（前記第二のプラスミドで形質転換された形質転換体（以下、「形質転換体」と称することがある）が全く得られなければ）、前記被検ＤＮＡは、前記細菌において、増殖に必須であると判断することができる。また、前記工程（ｃ）で選別された前記細菌が、ある程度は増殖するが、その速度が遅い場合（前記形質転換体は得られるが、その細菌を培養した際の倍加に必要な時間が、前記被検ＤＮＡを有する前記細菌を培養した際と比べて長い場合）には、前記被検ＤＮＡは、増殖の促進に関与すると判断することができる。
【００２５】
また、前記工程（ｃ）において形質転換体を選別する際の温度条件を変えることにより、前記被検ＤＮＡが、温度依存的に増殖に関与しているかどうかを評価することができる。例えば、前記工程（ｃ）で形質転換体を選別する際に、高温（例えば、４３℃）、及び、低温（例えば、３０℃）の各条件下で培養を行い、前記増殖を検出することにより、前記被検ＤＮＡが、いずれの温度での増殖に関与しているかどうかを評価することができる。
【００２６】
更に、前記高温、低温以外にも、所望に応じて、多様な条件下での前記被検ＤＮＡの増殖関与性を評価することができる。前記低温、高温以外の条件としては、例えば、熱、抗菌剤を含む各種の薬剤、バクテリオファージ、プラスミド、微生物や植物や動物由来の二次代謝物、有機物、有機溶媒、無機物、消毒剤、ガス、放射線、富栄養条件、貧栄養条件、飢餓ストレス、過密、高浸透圧、低浸透圧、酸化ストレス、動物の免疫を含む生体防御システム、その構成要素などが挙げられる。これらの条件下での前記被検ＤＮＡの増殖関与性を評価するためには、前記工程（ｃ）において形質転換体を選別する際に、所望の条件下で培養を行い、前記増殖を検出すればよい。
【００２７】
（増殖必須ＤＮＡにおける増殖必須領域の同定方法）
本発明の、バチルス綱に属する細菌の増殖に関与するＤＮＡ（以下、「増殖関与ＤＮＡ」と称することがある）において、増殖に関与する領域（以下、「増殖関与領域」と称することがある）を同定する方法（以下、単に「同定方法」と称することがある）は、（ａ）第一のプラスミド導入工程、（ｂ）染色体ＤＮＡの置換工程、及び（ｃ）第二のプラスミド導入（プラスミドシャッフリング）と増殖の検出工程を含み、更に必要に応じてその他の工程を含む。
【００２８】
＜増殖関与ＤＮＡ＞
前記増殖関与ＤＮＡとしては、前記バチルス綱に属する細菌の増殖に関与するＤＮＡ領域であり、該ＤＮＡ領域中の増殖に関与する領域を更に同定したいＤＮＡ領域であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、公知の増殖関与ＤＮＡ領域であってもよいし、前記本発明の評価方法により増殖に関与すると評価されたＤＮＡ領域であってもよい。
また、前記増殖関与ＤＮＡは、前記評価方法における前記被検ＤＮＡと同様に、タンパク質やＲＮＡをコードするＤＮＡ領域（遺伝子）であってもよいし、タンパク質やＲＮＡをコードしないＤＮＡ領域（非コード領域）であってもよい。具体的には、例えば、タンパク質をコードするＤＮＡ領域；ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｔｍＲＮＡ等の機能性ＲＮＡをコードするＤＮＡ領域；タンパク質やＲＮＡはコードしないが、不必要な複製開始の抑制を通じて増殖に関与しているｄａｔ領域のようなＤＮＡ領域、などが挙げられる。また、前記増殖関与ＤＮＡとしては、前記したようなＤＮＡ領域の全体であってもよいし、一部であってもよい。
【００２９】
＜増殖関与領域＞
前記増殖関与領域とは、前記増殖関与ＤＮＡの中で、特にその機能（増殖関与）に携わっている領域を指し、該領域が変異などにより機能を失った場合には、前記増殖関与ＤＮＡ全体としての増殖関与能力が失われる（又は低減する）領域を指す。
【００３０】
＜同定方法＞
以下、前記同定方法の各工程について説明する。
工程（ａ）、及び工程（ｂ）については、前記評価方法の工程（ａ）及び工程（ｂ）における「被検ＤＮＡ」を「増殖関与ＤＮＡ」とする以外は、それぞれ前記評価方法と同様にして行うことができる。
【００３１】
―（ｃ）第二のプラスミド導入（プラスミドシャッフリング）と増殖の検出工程―
前記（ｃ）工程では、前記細菌において第一のプラスミドと不和合性を示し、第三の選択マーカー遺伝子を発現し、かつ、前記増殖ＤＮＡの一部に変異を有した変異ＤＮＡを発現する第二のプラスミドを、前記工程（ｂ）で選別された前記細菌に導入し、第三の選択マーカー遺伝子依存に増殖する前記細菌を検出する。
【００３２】
前記第二のプラスミドとしては、前記評価方法と同様に、例えば、後述するような本発明のプラスミドを使用することができるが、ここで、前記第二のプラスミドとしては、前記プラスミドのクローニング部位に、前記増殖関与ＤＮＡの一部に変異を有した変異ＤＮＡが導入されたプラスミドを使用する。
前記「増殖関与ＤＮＡの一部に変異を有した変異ＤＮＡ」とは、前記増殖関与領域であるかどうかを調べたい部位に変異を有し、該部位が本来の機能を果たさなくなったり、変化したりしたＤＮＡを指す。前記変異としては、特に制限はなく、例えば、置換、挿入、欠失、などの態様が挙げられる。前記変異ＤＮＡを作出する方法としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記増殖関与ＤＮＡに、公知の手法により部位特異的変異を導入する方法、前記増殖関与ＤＮＡに、エラープローンＰＣＲ法を用いてランダムに変異を導入する方法などが挙げられる。
また、前記第三の選択マーカー遺伝子、前記第二のプラスミドを前記工程（ｂ）で選別された前記細菌に導入する方法、前記第三の選択マーカー遺伝子依存に増殖する前記細菌を選別する方法としては、前記評価方法と同様である。
【００３３】
前記第三の選択マーカー遺伝子依存に前記細菌が全く増殖しなければ（前記第二のプラスミドで形質転換された形質転換体（以下、「形質転換体」と称することがある）が全く得られなければ）、前記変異部位は、前記細菌において、増殖に必須な領域であるとして同定することができる。また、前記工程（ｃ）で選別された前記細菌が、ある程度は増殖するが、その速度が遅い場合（前記形質転換体は得られるが、その細菌を培養した際の倍加に必要な時間が、変異を有さない正常な増殖関与ＤＮＡを有する前記細菌を培養した際と比べて長い場合）には、前記変異部位は、前記細菌において、増殖の促進に関与する領域であるとして同定することができる。
【００３４】
また、前記工程（ｃ）において形質転換体を選別する際の温度条件を変えることにより、温度依存的に増殖に関与する領域を同定することができる。例えば、前記工程（ｃ）で形質転換体を選別する際に、高温（例えば、４３℃）、及び、低温（例えば、３０℃）の各条件下で培養を行い、前記増殖を検出することにより、所望の温度で増殖に関与する領域を同定することができる。
【００３５】
更に、前記高温、低温以外にも、多様な条件下で増殖に関与する領域を同定することができる。なお、前記低温、高温以外の条件の例示としては、前記評価方法と同様である。
【００３６】
（プラスミド）
本発明のプラスミドは、ｐａｒ遺伝子（安定保持に関与する遺伝子）、複製開始起点、及びｒｅｐ（複製開始タンパク質）遺伝子を有し、かつ、バチルス綱に属する細菌において増殖に関与するか否かを検出したい任意のＤＮＡのクローニング部位を有する。
前記プラスミドは、バチルス綱に属する細菌においてプラスミドシャッフリングが可能であり、そのため、前記評価方法及び前記同定方法に、特に好適である。
【００３７】
＜ｐａｒ遺伝子、複製開始起点、ｒｅｐ遺伝子＞
前記ｐａｒ遺伝子は、前記バチルス綱に属する細菌中で前記プラスミドが安定に保持されるために必要な遺伝子であり、その由来に特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、臨床分離ＭＲＳＡ株Ｎ３１５に存在するプラスミド、ｐＮ３１５Ｂのｐａｒ遺伝子（例えば、配列番号１）などが挙げられる。
また、前記複製開始起点（ｏｒｉ）は、前記バチルス綱に属する細菌中で前記プラスミドが増幅する際に必要な複製開始起点であり、その由来に特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、前記ｐＮ３１５Ｂの複製開始起点（例えば、配列番号２）などが挙げられる。
また、前記ｒｅｐ遺伝子は、前記複製開始起点に結合することにより前記プラスミドの複製を開始させる、複製開始タンパク質をコードする遺伝子であり、その由来に特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、前記ｐＮ３１５Ｂのｒｅｐ遺伝子（例えば、配列番号３）、及びＳＡＰ００２遺伝子（例えば、配列番号４）などが挙げられる。
前記ｐａｒ遺伝子、複製開始起点（ｏｒｉ）、及びｒｅｐ遺伝子としては、特に制限はなく、前記ｐａｒ遺伝子、複製開始起点、及びｒｅｐ遺伝子を含む領域（以下、「ｐａｒ−ｏｒｉ−ｒｅｐ領域」と称することがある）を有する前記プラスミドが、前記バチルス綱に属する細菌内で自律複製可能であり、かつ、プラスミドシャッフリングが可能となるように、適宜選択することができる。前記ｐａｒ遺伝子、複製開始起点、及びｒｅｐ遺伝子としては、その由来に特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、臨床分離ＭＲＳＡ株Ｎ３１５に存在するプラスミド、ｐＮ３１５Ｂのｐａｒ−ｏｒｉ−ｒｅｐ領域（例えば、配列番号５）が好適である。
なお、前記ｐＮ３１５Ｂのｐａｒ領域は、本発明において初めて同定された部位である。また、前記ｐａｒ−ｏｒｉ−ｒｅｐ領域を用いた際に前記バチルス綱に属する細菌内でプラスミドシャッフリングが可能となることも、本発明者らによる新たな知見である（後述、実施例１参照）。
【００３８】
＜クローニング部位＞
前記クローニング部位としては、バチルス綱に属する細菌において増殖に関与するか否かを検出したい任意のＤＮＡを前記プラスミドに組み込むことが可能な部位であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、制限酵素認識部位などが挙げられる。中でも、前記クローニング部位は、複数の制限酵素認識部位を有するマルチクローニングサイトであることが好ましく、このようなクローニング部位としては、例えば、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８等のｐＵＣ系プラスミドなどの、マルチクローニングサイトを有する既存のプラスミドを使用することができる。
また、前記バチルス綱に属する細菌において増殖に関与するか否かを検出したい任意のＤＮＡとしては、例えば、前記本発明の評価方法における被検ＤＮＡや、前記本発明の同定方法における増殖関与ＤＮＡ、変異ＤＮＡなどが挙げられる。
【００３９】
このような本発明のプラスミドは、例えば、前記ｐａｒ−ｏｒｉ−ｒｅｐ領域を、マルチクローニングサイトを有するｐＵＣ系プラスミド等につなぎ、構築することができる。これらの中でも、前記プラスミドとしては、臨床分離ＭＲＳＡ株Ｎ３１５に存在するプラスミド、ｐＮ３１５Ｂのｐａｒ−ｏｒｉ−ｒｅｐ領域を、ｐＵＣ系プラスミド等につなぎ、構築したものが好ましい。
【００４０】
＜選択マーカー＞
また、前記プラスミドは、選択マーカー遺伝子を有することが好ましい。前記プラスミドが選択マーカー遺伝子を有することにより、前記プラスミドで形質転換された形質転換体の検出が容易となる点で、好ましい。前記選択マーカーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、フレオマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。また、前記薬剤耐性遺伝子以外にも、例えば、重金属イオン耐性遺伝子、ベータガラクトシダーゼ等の酵素遺伝子、ヘモリシン遺伝子、ＤＮａｓｅ遺伝子、レシチナーゼ遺伝子、コロニーを着色させるような色素合成遺伝子、アミノ酸合成遺伝子などが挙げられる。
前記選択マーカー遺伝子を有するプラスミドで形質転換された形質転換体の検出は、それぞれの選択マーカー遺伝子の種類に応じた公知の手法により行うことができる。
【００４１】
＜低コピー数＞
また、前記プラスミドは、低コピー数のプラスミドであることが好ましい。前記低コピー数のプラスミドとは、前記バチルス綱に属する細菌において１〜１０コピー程度のプラスミドの増幅を起こすプラスミドを指し、該コピー数としては、５〜１０コピー程度が好ましい。前記プラスミドが高コピー数のプラスミドであると、前記方法の工程（ｃ）におけるプラスミドシャッフリング時に、多数回の継代培養が必要であり、したがって、前記方法における効率性が悪くなることから、好ましくない。前記した好ましい範囲内の低コピー数のプラスミドであると、前記プラスミドシャッフリング時のプラスミド交換が一晩（１６時間）程度で可能となるため、有利である。
【００４２】
＜安定保持＞
また、前記プラスミドは、前記バチルス綱に属する細菌内で安定に保持されるという性質を有していることが好ましい。前記安定に保持されるとは、前記バチルス綱に属する細菌において、前記プラスミドによる形質転換後、継代培養を繰り返した後も、前記プラスミドの脱落が起こりづらいことを指し、具体的には、形質転換後、５０世代の培養後に８０％以上の保持率を示すことが好ましい。前記保持率が、８０％未満であると、プラスミド脱落の比率が高く、前記方法の工程（ｂ）における被検ＤＮＡの機能が保てないため、前記方法を安定に行うことができず、好ましくない。前記した好ましい範囲の保持率であると、前記細菌の染色体上の被検ＤＮＡを欠失しても、前記プラスミド上の被検ＤＮＡにより安定に相補されるため、有利である。
【００４３】
＜不和合性＞
また、前記プラスミドは、前記クローニング部位に異なるＤＮＡを有する二種のプラスミドが、互いに不和合性を有し、かつ、比較的短期間でプラスミド交換が可能であるという性質を有していることが好ましい。ここで、前記不和合性とは、同種のプラスミドが、同じ宿主内に共存できない性質を言う。
具体的には、前記プラスミドが、前記クローニング部位に異なるＤＮＡを有する二種のプラスミド（第一のプラスミド、及び、第二のプラスミド）であった場合、前記第一のプラスミドと前記第二のプラスミドとが、互いに不和合性を示し、かつ、第一のプラスミドを保持するバチルス綱に属する細菌に第二のプラスミドを導入し、第二のプラスミドに含まれる選択マーカー遺伝子依存に増殖する前記細菌を選別する工程において、一晩の培養後に、第一のプラスミドを保持する前記細菌数が第二のプラスミドを保持する前記細菌数の１００分の１未満に低下するプラスミドであることが、好ましい。
前記プラスミドが前記好ましい性質を有していると、短期間で効率的に被検ＤＮＡの増殖関与性を評価することができる点で、有利である。
【００４４】
＜シャトルベクター＞
また、前記プラスミドは、バチルス綱に属する細菌内だけでなく、大腸菌内でも複製可能な、大腸菌−バチルス綱に属する細菌のシャトルベクターであることが好ましい。大腸菌でも複製可能であるシャトルベクターとすることは、遺伝子クローニングの作業が容易であるという点で、有利である。
【００４５】
（キット）
本発明のキットは、前記評価方法、及び、前記同定方法の少なくともいずれかに使用されるためのキットであり、前記プラスミド、及び、使用説明書を含み、更に必要に応じて、その他の要素を含む。
前記使用説明書としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記プラスミドを前記バチルス綱に属する細菌に導入する手法等が記載された使用説明書などが挙げられる。また、その他の要素としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記プラスミドを前記バチルス綱に属する細菌に導入する際に使用される試薬、などが挙げられる。
【００４６】
［効果］
前記した本発明の評価方法は、前記バチルス綱に属する細菌における、任意の被検ＤＮＡの増殖関与性を効率的に評価することができ、更に、高温、低温など様々な条件下での被検ＤＮＡの増殖関与性を、個別に評価することができる。
また、前記した本発明の同定方法は、前記バチルス綱に属する細菌の増殖に関与するＤＮＡにおける増殖関与領域を効率的に同定することができ、更に、高温、低温など様々な条件下における増殖関与領域を、個別に同定することができる。
【００４７】
前記評価方法及び前記同定方法は、バチルス綱に属する細菌の増殖に関する機能解明などに有用である他、増殖に関与する遺伝子がコードするタンパク質は抗菌剤のターゲットともなり得るという点で、以下に記すような、バチルス綱に属する細菌を標的とした抗菌剤開発においても有用である。
【００４８】
例えば、前記評価方法及び前記同定方法は、抗菌剤の標的タンパク質としての候補遺伝子が、黄色ブドウ球菌等のバチルス綱に属する細菌の増殖に必須であるか否かを検証する手段として有用である。前記候補遺伝子の欠損により増殖の必須性を検証する方法としては、プラスミドによる相補の過程を経ず、一段階で染色体上の遺伝子の欠損を行う従来の方法もある。しかしながら、その場合には組み換え体が得られる頻度が低いことが、組み換え体が得られなかった原因である可能性が残る。また、見かけ上組み換え体が得られた場合にも、組み換え体を得る培養時間が数日と長いことから、増殖の抑圧変異株として得られている可能性が残る。この点について、本発明のプラスミドシャッフリングを用いた方法では、数千の形質転換体が翌日に得られる条件での増殖の有無を検証することができ、その問題を克服できる。
【００４９】
前記評価方法及び前記同定方法はまた、抗菌剤の開発における二次スクリーニングにも利用可能である。抗菌剤の開発においては、標的タンパク質を定めて、その活性を阻害する化合物をハイスループットスクリーニングにより見出す方法がある。その際には次に、その阻害化合物が対象とする菌の増殖を阻害するか、菌の増殖を阻害する場合にはその阻害化合物が本当に標的としたタンパク質の阻害効果によって菌の増殖を阻害しているかを検証し、阻害剤の特異性を調べる。標的タンパク質特異的な阻害によって菌の増殖が阻害されているかを明らかにする方法の一つは、標的タンパク質の変異によって、その阻害化合物に対し菌が耐性あるいは感受性になるかどうかを試験することである。この際に前記評価方法及び前記同定方法が使用できる。即ち、エラープローンＰＣＲを利用してランダム変異を有する当該遺伝子を含んだプラスミドライブラリーを構築し、これを野生型遺伝子を含むプラスミドを持つ当該遺伝子欠損株に導入してプラスミドシャッフリングを行う。その際に、阻害化合物に対し耐性あるいは感受性となった形質転換体をスクリーニングできる。このようにして、当該遺伝子の変異によって薬剤に耐性あるいは感受性となったことを示すことができれば、それは阻害化合物がそのタンパク質を標的として菌の増殖を阻害しているという、阻害の特異性を示す結果となる。
【００５０】
また、前記評価方法及び前記同定方法は、エラープローンＰＣＲなどを利用して、遺伝子の温度、薬剤、塩濃度、放射線、感染宿主の免疫システムなどに対する条件致死変異株を得る目的にも使用可能である。このような遺伝子の条件致死変異株は、学術研究のツールとして有用である。
【００５１】
また、前記した本発明のプラスミドは、バチルス綱に属する細菌内で安定に保持され、本発明の評価方法、及び同定方法に利用可能である以外にも、発現ベクター、相補プラスミド、低コピープラスミド、バチルス綱に属する細菌−大腸菌シャトルベクタープラスミドとして、有用である。
【実施例】
【００５２】
以下に本発明の実施例について説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００５３】
本実施例では、黄色ブドウ球菌においてプラスミドシャッフリングが可能な本発明のプラスミドを構築し（実施例１）、更に、前記プラスミドを用いた本発明の評価方法により、黄色ブドウ球菌におけるＳＡ０６７４遺伝子の増殖関与性を評価した結果について述べる（実施例２）。
【００５４】
＜材料と方法＞
本実施例に使用した材料及び方法を以下に示す。
―試薬―
制限酵素とライゲーションキットは宝酒造から購入した。ＰＣＲ法に用いたＫＯＤ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはＴＯＹＯＢＯ社から購入した。合成オリゴヌクレオチドはＥｘｉｇｅｎ社から購入した。カナマイシン、クロラムフェニコール、フレオマイシンはＳｉｇｍａ社から購入した。
【００５５】
―細菌とプラスミド―
温度感受性変異株は、既報の論文（参考文献５）に従い、黄色ブドウ球菌ＲＮ４２２０株をエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ，Ｓｉｇｍａ社）処理して得た。大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造）を、ｐＮＤ５０、ｐＫＥ５１５、ｐＳＦ１５１、及び、実施例１で新規構築したプラスミドの調製に用いた。ｐＮＤ５０、ｐＫＥ５１５は、公知の大腸菌と黄色ブドウ球菌のシャトルベクターである（参考文献２）。また、実施例２の表１におけるｐＳＡ０６７４プラスミドとは、黄色ブドウ球菌のゲノムＤＮＡライブラリーからクローニングされたプラスミドで、ＳＡ０６７４遺伝子を含む３，９９１ｂｐがｐＫＥ５１５のＳｍａＩサイトに組込まれたプラスミドである。
【００５６】
―細菌の培養―
黄色ブドウ球菌、及び大腸菌は、ＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％イーストエクストラクト、及び１％ＮａＣｌ）を用いて培養した。形質転換体の培養には必要に応じて、１２．５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、２５μｇ／ｍｌカナマイシン、２０μｇ／ｍｌフレオマイシン、又は５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地で培養した。
【００５７】
―黄色ブドウ球菌の遺伝子工学的取り扱い―
黄色ブドウ球菌の形質転換は、井上らの論文（参考文献５）に従って行った。１００ｎｇのプラスミドＤＮＡを予め調製したコンペテント細胞に、２．５ｋＶ、２５μＦＤ、１００Ｏｈｍｓの条件で０．２−ｃｍのキュベットを用い、ＢｉｏＲａｄ社のＧｅｎｅ  ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩを用いてエレクトロポレーション法により導入した。導入処理を行った細胞を、０．２％グルコースを含むＢＨＩ培地（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）中で３０℃で１時間培養し、１２．５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、又は５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し終夜培養した。ゲノムＤＮＡ及びプラスミドの調製は、松尾らの論文にしたがって行った（参考文献３）。
【００５８】
―ＤＮＡ塩基配列の決定―
ゲノムＤＮＡのＳＡ０６７４遺伝子領域２．２ｋｂｐを、以下に示すプライマーＳＡ０６７４−５とＳＡ０６７４−３を用いてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ産物反応液をアガロースゲル電気泳動で分離後、ゲルを切り出して、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製し、ＳＡ０６７４を含む２．２ＫｂｐのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を鋳型とし、以下の７種のプライマーを用い、ＰＲＩＳＭＲ  Ｂｉｇｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてシークエンス反応を行った。反応産物をＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＲ  ３１００  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で解析した。
【００５９】
ＳＡ０６７４−５，  ５’−ＧＣＡＡＡＴＡＴＧＡＧＴＴＧＴＡＧＣＣＣＡＡＡ−３’（配列番号６）；
ＳＡ０６７４−３，  ５’−ＡＡＣＡＴＡＡＴＡＡＡＡＣＣＣＧＧＡＴＴＧＡ−３’（配列番号７）；
ＳＡ０６７４−Ｍ１，  ５’−ＣＴＡＴＧＧＧＴＧＧＴＧＣＧＧＴＴＡＧＴ−３’（配列番号８）；
ＳＡ０６７４−Ｍ２，  ５’−ＡＴＧＡＡＡＡＧＧＣＡＧＡＡＣＣＴＴＧＣ−３’（配列番号９）；
ＳＡ０６７４−Ｍ３，  ５’−ＧＧＴＧＡＴＧＣＡＡＣＡＧＴＴＧＡＴＧＧ−３’（配列番号１０）；
ＳＡ０６７４−Ｍ４，  ５’−ＴＣＴＴＣＴＴＴＧＣＣＡＣＣＣＣＡＴＡＡ−３’（配列番号１１）；
ＳＡ０６７４−Ｍ５，  ５’−ＡＣＣＡＣＣＡＧＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＧＡ−３’（配列番号１２）；
【００６０】
―シャトルベクターの構築―
――ｐＭ１０１――
臨床分離ＭＲＳＡ株Ｎ３１５から抽出したｐＮ３１５Ｂプラスミドのｐａｒ−ｏｒｉ−ｒｅｐ領域（２，８３１ｂｐ）を、プライマーｍｉｎｉ−Ｐ１：  ５’−ＡＣＧＧＣＡＴＴＴＡＴＧＧＣＴＴＴＴＴＧ−３’（配列番号１３）とｍｉｎｉ−Ｐ２：  ５’−ＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＴＴＴＴＣＴＴＡ−３’（配列番号１４）を用いて増幅した。得られたＰＣＲ産物（２，８３１ｂｐ）とＳｍａＩ制限酵素部位で切断したｐＵＣ系プラスミド：ｐＳＦ１５１（参考文献１６）を連結し、大腸菌ＪＭ１０９に導入した。得られたカナマイシン耐性の形質転換体からアルカリ法によりプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドの構造を確認するためにＥｃｏＲＩ制限酵素により切断し、１％アガロースゲル電気泳動により分離後、０．９Ｋｂと６Ｋｂの２断片が検出できたクローンをｐＭ１０１とした。このプラスミドは、ｒｅｐ遺伝子とカナマイシン耐性遺伝子とが同一方向のプラスミドである。
――ｐＭ１０２――
ＰＣＲで増幅されたｐａｒ−ｏｒｉ−ｒｅｐ領域ＤＮＡ断片をｐＵＣ系プラスミドｐＣＭ（クロラムフェニコール耐性）のＨｉｎｃＩＩサイトに連結し、ｐＭ１０１の場合と同様の方法でプラスミドを得た。制限酵素で切断したＤＮＡのサイズから構造を確認し、クロラムフェニコール耐性遺伝子がｒｅｐ遺伝子とは逆方向に挿入された構造のプラスミドをｐＭ１０２とした。
なお、ｐＣＭプラスミドは、ｐＮＤ５０プラスミドの黄色ブドウ球菌でのレプリコン（ｐＵＢ１１０由来）を除去し、ｐＵＣプラスミド由来のレプリコンとクロラムフェニコール耐性遺伝子を持つものである。まず、ｐＮＤ５０をＡｌｆＩＩとＡｖａＩＩで切断後平滑末端化しセルフライゲーションを行いｐＣＫ２０を得た。更にｐＣＫ２０をプライマー（ｐＣＫ２０−Ｐ１：５’−ＧＡＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＴＡＡＴＡＴＡＡＡＡＡＣＣ−３’（配列番号１５）とｐＣＫ２０−Ｐ２：５’−ＴＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡＡＧＧ−３’（配列番号１６））で増幅して得られたＤＮＡを、セルフライゲーションを行い、大腸菌に形質転換して得たプラスミドをｐＣＭとした。
【００６１】
―ＰＣＲによる染色体上のＳＡ０６７４遺伝子欠損の確認―
黄色ブドウ球菌変異株ＷＭ１１１、及びその親株であるＲＮ４２２０から抽出したゲノムＤＮＡをプライマーＰ１：５’−ＴＴＣＧＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＧＧＡＴＡ−３’（配列番号１７）とＰ４：５’−ＧＣＴＴＴＴＧＣＴＣＴＣＣＡＣＣＡＧＡＴ−３’（配列番号１８）を用いて増幅した。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動により分離後、エチジウムブロマイドで染色し、そのサイズを比較した。
【００６２】
―プラスミド保持率の測定―
エレクトロポレーションによりプラスミド１００ｎｇをコンピテントセル（ＲＮ４２２０）２２μｌに導入し、適当な薬剤添加培地に塗布し３７℃で培養して形質転換体を得た。得られた形質転換体を薬剤添加液体培地で一晩培養した。これを初代培養液とした。初代培養液を１／１００から１／１，０００に希釈し、培養を継続した。世代数は、ダブリングタイムを同時に測定し、培養時間から求めた。各世代ごとにサンプリングし、適当に希釈した培養液を、薬剤添加と非添加の平板培地に塗布し、３７℃で培養しコロニー数をカウントした。
【００６３】
（実施例１：シャッフリング可能なプラスミドの開発）
黄色ブドウ球菌においてプラスミドシャッフリングが可能な、本発明のプラスミドの開発を行った。
本発明者らはまず、黄色ブドウ球菌と大腸菌の多コピーシャトルベクタープラスミドｐＫＥ５１５（参考文献２）を用いて、黄色ブドウ球菌においてシャッフリングによるプラスミドの交換が可能かどうかを検討した。その結果、このｐＫＥ５１５を用いた場合には、シャッフリングによるプラスミド交換に４０世代以上の継代培養が必要であることがわかった（データ示さず）。これは、本目的には、ｐＫＥ５１５は不適当であることを示している。
更に本発明者らは、ｒｅｐ遺伝子と複製開始起点とを含む低コピープラスミドｐＳＥＱ２４３（参考文献１１）を用い、前記ｐＫＥ５１５と同様に検討を行ったが、その結果、プラスミド脱落の比率が高く、１０世代の培養で、保持率は１０％以下に低下した（図１）。この結果から、ｐＳＥＱ２４３も本目的には不適当であることが分かった。
【００６４】
＜プラスミド構築＞
そこで本発明者らは、臨床分離ＭＲＳＡ株Ｎ３１５に存在するプラスミドｐＮ３１５Ｂ（参考文献１２）に着目し、このプラスミドのｒｅｐ遺伝子と複製開始起点、及び、プラスミドの安定性に関わると報告されたｐａｒ遺伝子を含むプラスミドを構築し、本目的に用いることを考えた。プラスミドｐＮ３１５Ｂは全長２４．６Ｋｂｐのプラスミドで、既にゲノムプロジェクトにより全塩基配列が決定されており、複製開始蛋白（ＳＡＰ００１）ｒｅｐが予想されているプラスミドである。しかしながら、このプラスミドの複製と安定保持の領域を用いた時に、プラスミドシャッフリングが可能であるかは不明であった。更に、安定保持に関与する遺伝子ｐａｒ（参考文献１３〜１４）については、未同定のままであった。
【００６５】
黄色ブドウ球菌プラスミドｐＳＫ１のｐａｒ遺伝子のアミノ酸配列をもとに相同検索を行った結果、ｐＮ３１５Ｂのｒｅｐの上流に存在するＳＡＰ０３１に、４５％の同一性があることが分かった（図２Ａ）。特に種々のＰａｒ蛋白間で保存性の高い領域で、相同性が高かった（図２Ａ下線部）。更に、ｐＮ３１５ＢのｒｅｐからＳＡＰ０３１までのＤＮＡ構造がｐＳＫ１のレプリコンの領域と類似している（図２Ｂ）ことから、ＳＡＰ００１からＳＡＰ０３１までの領域がｐＮ３１５Ｂのｐａｒ−ｏｒｉ−ｒｅｐ領域であると推定した。ｒｅｐ（ＳＡＰ００１）遺伝子の３’末端領域には、末端から１０ｂｐを共有して複製関連遺伝子ＳＡＰ００２が存在していることから、このＳＡＰ００２も含めた領域をｐａｒ−ｏｒｉ−ｒｅｐ領域（配列番号５）としてクローン化し、自律複製について検討した。
【００６６】
ｐＮ３１５Ｂのｐａｒ−ｏｒｉ−ｒｅｐ領域をｐＵＣ系プラスミドにつなぎ、大腸菌に形質転換して、プラスミドｐＭ１０１を得た。ｐＭ１０１を黄色ブドウ球菌ＲＮ４２２０株へ導入すると、形質転換体が得られた。したがって、このｐａｒ−ｏｒｉ−ｒｅｐ領域が、黄色ブドウ球菌内での自律複製に十分な領域であることが確認できた。更に、ｐＭ１０１の保持率を調べた結果、５０世代培養後も８０％の保持率を示した（図１）。したがって、このｐａｒ−ｏｒｉ−ｒｅｐ領域が、黄色ブドウ球菌内でのプラスミドの安定的な保持にも十分な領域であることが確認できた。
【００６７】
次に、このプラスミドがシャッフリング可能であるかを検証することとした。始めに同じｐａｒ−ｏｒｉ−ｒｅｐ領域をもつプラスミドで異なる薬剤耐性遺伝子をもつｐＭ１０２を構築した。次に、ｐＭ１０１（カナマイシン耐性）をもつ黄色ブドウ球菌に構築したｐＭ１０２（クロラムフェニコール耐性）を形質転換し、クロラムフェニコール培地で選択した。
【００６８】
その結果、クロラムフェニコール平板培地から得られたいずれの形質転換体もカナマイシン感受性を示した（図３Ａ、Ｋｍ、♯１〜♯７）。この結果は、ｐＭ１０１プラスミドがｐＭ１０２プラスミドと速やかに置き換わったことを示唆している。更に、ＳＡ０６７４遺伝子に変異をもつ高温感受性変異株ＴＳ８６４３に、野性型ＳＡ０６７４遺伝子をｐＭ１０１に組込んで得たプラスミドｐＭ１０１−ＳＡ０６７４を導入すると、温度感受性を相補した（図３Ｂ、上段）。この株にベクタープラスミドｐＭ１０２を導入すると、３０℃では形質転換体が得られたが、４３℃では得られなかった（図３Ｂ、下段）。
この結果は、得られたプラスミドを用いたプラスミドシャッフリング系を用いて、形質転換体が得られないことをもって増殖に必須であると判断し得ることを示唆している。
したがって、以上の結果は、黄色ブドウ球菌においてプラスミドシャッフリングが可能で、かつ被検ＤＮＡの増殖関与性の評価が可能なプラスミド系を構築できたことを示している。
【００６９】
以下に、図１〜図３Ｂをより具体的に説明する。
図１は、ｐＭ１０１プラスミドの黄色ブドウ球菌での保持率を示すグラフである。
ｐＭ１０１、ｐＮＤ５０、ｐＳＥＱ２４３の各プラスミドを黄色ブドウ球菌ＲＮ４２２０株に導入し、薬剤添加培地で選択して得られた形質転換体を、薬剤添加液体培地で一晩培養した。この培養液を初代とし、薬剤非添加の液体培地で１００倍希釈し、３７℃で９時間培養後、１，０００倍希釈し１４時間培養を繰り返す継代培養を行った。各世代の培養液を薬剤添加と非添加の平板培地に塗布し、３７℃で培養後、コロニー数をカウントした。保持率は、薬剤非添加培地でのコロニー数に対する薬剤添加培地でのコロニー数の値で示した。
【００７０】
図２Ａは、ｐＮ３１５ＢプラスミドのＳＡＰ０３１（ｐＮ３１５Ｂプラスミドのｐａｒ：配列番号１）と、ｐＳＫ１プラスミドのｐａｒ（配列番号１９）とのアミノ酸配列を比較した図である。
ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）から得たｐＮ３１５ＢのＳＡＰ０３１のアミノ酸配列と、Ｐａｒ（参考文献１３）のアミノ酸配列を、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ（１．８３）を用いて比較した。下段に示した（＊）、（：）と（．）はそれぞれ「完全一致」、「強い保存性」、又は「弱い保存性」をもつアミノ酸残基を示す。下線部は、種々のＰａｒで保存されている領域を示す。
図２Ｂは、ｐＮ３１５ＢプラスミドのＳＡＰ０３１とｐＳＫ１プラスミドのｐａｒとのレプリコンの構造を比較した図である。ｐＮ３１５ＢとｐＳＦ１のｒｅｐからｐａｒ遺伝子間の構造を図で示した。黒矢印（左向き）はｐａｒ遺伝子を、ドット矢印（右向き）はｒｅｐ遺伝子を示す。ｐＮ３１５Ｂには、ｒｅｐと推定されているＳＡＰ００１と重なってＳＡＰ００２遺伝子が存在する。これも配列から複製関連遺伝子と推定されたため、並記した。
【００７１】
図３Ａ及び図３Ｂは、ｐＭ１０１とｐＭ１０２との不和合性を利用したプラスミド交換が可能であり、かつ被検ＤＮＡの増殖関与性の評価が可能であることを示す図である。
図３Ａでは、ｐＭ１０１（カナマイシン耐性）をもつ黄色ブドウ球菌ＲＮ４２２０株にｐＭ１０２（クロラムフェニコール耐性）を導入して得られるクロラムフェニコール耐性の形質転換体を独立に７クローン（図３Ａ中、♯１〜♯７）ひろい、クロラムフェニコール耐性試験及びカナマイシン感受性試験を行った。対照として、ｐＭ１０１をもつＲＮ４２２０株についても、同様に試験を行った（図３Ａ中、ＲＮ４２２０／ｐＭ１０１）。図中のＣｍはクロラムフェニコール含有培地、Ｋｍはカナマイシン含有培地を用いたことを示す。Ｄｒｕｇ（−）は薬剤非添加培地を用いたことを示す。
図３Ｂの上段では、ＳＡ０６７４遺伝子に変異を有する高温感受性変異株ＴＳ８６４３に、ｐＭ１０１（カナマイシン耐性）にＳＡ０６７４遺伝子をクローニングしたプラスミド（ｐＭ１０１−ＳＡ０６７４）を形質転換してカナマイシン含有培地に塗布後、３０℃と４３℃で２４時間培養した。図３Ｂの下段では、上段で得られた形質転換体ＴＳ８６４３／ｐＭ１０１−ＳＡ０６７４に、空ベクターｐＭ１０２（クロラムフェニコール耐性）を形質転換してクロラムフェニコール含有培地に塗布後、３０℃と４３℃で４８時間培養した。
【００７２】
（実施例２：ＳＡ０６７４遺伝子の増殖関与性の評価）
次に本発明者らは、実施例１で得られたプラスミド、ｐＭ１０１とｐＭ１０２によるシャッフリング系が、本発明における被検ＤＮＡの増殖関与性の評価に用いることができるかどうかを調べた。前記被検ＤＮＡとしては、黄色ブドウ球菌ＳＡ０６７４遺伝子を選んだ。
【００７３】
本発明者らは今までに、増殖必須遺伝子の同定を目的として、黄色ブドウ球菌高温感受性変異株を分離してきた（参考文献１〜５）。その過程で、機能未知ＳＡ０６７４遺伝子により相補される変異株が、６株見出された（表１）。各変異株の染色体上のＳＡ０６７４の塩基配列を決定した結果、ＴＳ０６８１、ＴＳ２６１８、ＴＳ８６４３の３株については、Ｃ８８９Ｔ、Ｇ１５２６Ａ、Ｇ１０６２Ａ変異が、それぞれ終止コドンｏｃｈｅｒ（Ｑ２９７）、ａｍｂｅｒ（Ｗ５０９）、ｏｐａｌ（Ｗ３５４）の挿入を引き起こす変異であった。これらのことから、ＳＡ０６７４遺伝子が低温で増殖に必要であるのかどうか、疑いが生じていた。
【００７４】
以下表１は、ＳＡ０６７４遺伝子による各変異株の高温感受性の相補、及び、各変異株の変異部位を示す表である。各変異株の高温感受性の相補の検討方法としては、各変異株から調製したコンピテントセル２２μｌに、１００ｎｇのｐＳＡ０６７４プラスミド、又は空ベクターであるｐＫＥ５１５プラスミドを導入し、薬剤添加培地に塗布し、４３℃と３０℃で２４時間培養後、コロニー数をカウントした。なお、ｐＳＡ０６７４プラスミドは、黄色ブドウ球菌のゲノムＤＮＡライブラリーからクローニングされたプラスミドで、ＳＡ０６７４遺伝子を含む３９９１ｂｐがｐＫＥ５１５のＳｍａＩサイトに組込まれたプラスミドである。
【００７５】
【表１】
2007295883.tif 000002
【００７６】
＜ＳＡ０６７４遺伝子の増殖関与性の評価＞
前記結果を受け、本発明者らは、ＳＡ０６７４遺伝子に注目し、黄色ブドウ球菌における該遺伝子の低温及び高温での増殖関与性について、本発明の評価方法を使用して評価した。
【００７７】
まず、ｐＭ１０２（クロラムフェニコール耐性）に野性型ＳＡ０６７４遺伝子を連結し、黄色ブドウ球菌ＲＮ４２２０株に導入した（図４、工程（ａ））。
【００７８】
次に、この株の染色体上のＳＡ０６７４遺伝子を薬剤耐性遺伝子（フレオマイシン耐性）で置き換えた欠失株を得た（図４、工程（ｂ））。方法は、Ｆａｂｒｅｔら（参考文献１５）の方法に従い、ＳＡ０６７４の上流と下流のそれぞれ約１．５Ｋｂｐの領域とフレオマイシン耐性遺伝子を、上流相同領域−フレオマイシン耐性遺伝子−下流相同領域の順につなぎ、自殺ベクターｐＳＦ１５１に連結したプラスミドを導入した。フレオマイシン耐性、カナマイシン感受性、クロラムフェニコール耐性を選択して、染色体上のＳＡ０６７４の上流と下流域で、２回組換えをおこしたＳＡ０６７４欠失株（ＷＭ１１１）を分離した。
このＷＭ１１１株の染色体上のＳＡ０６７４遺伝子がフレオマイシン耐性遺伝子で置き換えられ、実際染色体上のＳＡ０６７４が欠失していることは、ＳＡ０６７４の上流と下流領域に設計したプライマーＰ１とＰ４を用い、ＰＣＲにより増幅された産物の長さにより確認した（図５）。１％アガロースゲル電気泳動後エチジウムブロマイドで染色してＰＣＲ産物を検出すると、親株のＲＮ４２２０では５．４ＫｂｐのＤＮＡ断片が検出され、ＷＭ１１１株では３．４Ｋｂｐの断片が検出され、５．４ＫｂｐのＤＮＡ断片は検出されなかった。これは理論値と一致する値であった。
【００７９】
得られたＷＭ１１１株に空ベクターｐＭ１０１（カナマイシン耐性）を導入した（図４、工程（ｃ））。カナマイシン添加培地で一晩培養し、プラスミドシャッフリングを引き起こし、ｐＭ１０２がｐＭ１０１に置き換わって得られる形質転換体の増殖の有無を調べた。
【００８０】
結果、３０℃で培養した場合は形質転換体が得られ、４３℃では得られなかった（図６Ａ）。更に、３０℃で得られた形質転換体の高温感受性を試験すると、調べた６株全ての形質転換体が温度感受性を示した（図６Ｂ、♯１〜♯６）。したがって、ＳＡ０６７４遺伝子は黄色ブドウ球菌において増殖に関与する遺伝子であり、該遺伝子は低温では増殖に不要であるが、高温での増殖には必須であることを評価することができた。
【００８１】
以下に、図４〜図６Ｂをより具体的に説明する。
図４は、実施例２におけるＳＡ０６７４遺伝子の増殖関与性の評価方法を示す工程図である。
工程（ａ）では、黄色ブドウ球菌における増殖関与性を調べたいＳＡ０６７４遺伝子をｐＭ１０２プラスミド（クロラムフェニコール耐性）にクローニングして相補させる。この株はクロラムフェニコール耐性である。工程（ｂ）では、染色体上のＳＡ０６７４遺伝子をフレオマイシン（ｐｈｌｅｏ）耐性遺伝子と相同組換え法により欠失させる。この株はクロラムフェニコール耐性かつフレオマイシン耐性である。工程（ｃ）では、空ベクターｐＭ１０１（カナマイシン耐性）を導入して、ｐＭ１０２−ＳＡ０６７４プラスミドとｐＭ１０１プラスミドとのプラスミドシャッフリングを行う。次いで、カナマイシン耐性かつフレオマイシン耐性の形質転換体がカナマイシン添加培地で増殖できるかどうかで増殖関与性を判断する。
【００８２】
図５は、ＰＣＲによりＷＭ１１１株におけるＳＡ０６７４遺伝子の欠失を確認した電気泳動像である。
３０℃で増殖させたＷＭ１１１株とＲＮ４２２０株から抽出した染色体ＤＮＡをテンプレートにして、前記したプライマーＰ１（配列番号１７）とＰ４（配列番号１８）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動により分離後、ＥｔＢｒで染色した。
レーン１はＷＭ１１１株（ＳＡ０６７４欠失株）を、レーン２はＲＮ４２２０株を、レーン３は１Ｋｂラダーサイズマーカーを示す。
【００８３】
図６Ａ及び図６Ｂは、ＳＡ０６７４遺伝子が高温の増殖には必須であるが、低温の増殖には必須でないことを示した図である。
図６Ａでは、ＷＭ１１１株（ｐＭ１０２−ＳＡ０６７４を導入したＳＡ０６７４欠失変異株）にＳＡ０６７４をクローニングしたプラスミドｐＭ１０１−ＳＡ０６７４（上段）、又は空ベクターｐＭ１０１（下段）を導入して、カナマイシン含有平板培地に塗布後、３０℃と４３℃で２４時間培養した。
図６Ｂでは、ＷＭ１１１株にｐＭ１０１を導入して得られた３０℃のカナマイシン耐性の形質転換体を独立に６クローン（♯１〜♯６）ひろい、カナマイシン含有平板培地で３０℃と４３℃で２４時間培養した。
【００８４】
［考察］
本実施例では、臨床分離ＭＲＳＡ株Ｎ３１５に保持される２４．７ＫｂｐのプラスミドｐＮ３１５Ｂのｐａｒ−ｏｒｉ−ｒｅｐ領域を用いた大腸菌−黄色ブドウ球菌のシャトルベクターｐＭ１０１及びｐＭ１０２を構築した。本プラスミドは、黄色ブドウ球菌内で安定に保持された。薬剤耐性マーカーの異なるｐＭ１０１及びｐＭ１０２は、その不和合性によって形質転換後速やかに交換された。
黄色ブドウ球菌ＳＡ０６７４遺伝子の染色体上の遺伝子を、ｐＭ１０２プラスミドを用いてＳＡ０６７４遺伝子を相補した状態で欠損させ、これをｐＭ１０１プラスミドベクターで置き換えると、形質転換体が高温では得られないが、低温では得られた。したがってＳＡ０６７４遺伝子は低温での増殖には不要で、高温での増殖には必須であることが示唆された。
以上の本実施例の結果は、本発明において構築されたプラスミドのもつ不和合性を用いて、黄色ブドウ球菌における被検ＤＮＡの増殖関与性を評価することができることを示している。
【００８５】
黄色ブドウ球菌プラスミドの多くは、近縁の枯草菌、乳酸菌、連鎖球菌で複製が可能であることが知られている。したがって、本プラスミドを用いた系は、黄色ブドウ球菌以外にも近縁のグラム陽性の病原菌や産業上重要な菌の広範な菌種で利用できることが推測される。
【００８６】
また、本実施例では、構築したプラスミドのシャッフリングを利用して、ＳＡ０６７４遺伝子の欠失変異株を作出し、ＳＡ０６７４遺伝子の増殖必須性について検討した。得られた結果は、ＳＡ０６７４遺伝子は黄色ブドウ球菌の低温での増殖には不要であり、高温での増殖に必須であることを示唆するものであった。黄色ブドウ球菌において低温での細胞増殖には不要で、高温では必要とされる遺伝子の報告は本遺伝子が初めてである。この遺伝子の分子機構を明らかにしていくことにより、黄色ブドウ球菌のこれまでに知られていない生理を解明できると期待される。
【００８７】
［参考文献］
本実施例における参考文献番号は、以下に対応する。
参考文献１：Ｎｉｓｈｉｄａ  Ｓ，Ｋｕｒｏｋａｗａ  Ｋ，Ｍａｔｓｕｏ  Ｍ，Ｓａｋａｍｏｔｏ  Ｋ，Ｕｅｎｏ  Ｋ，Ｋｉｔａ  Ｋ，Ｓｅｋｉｍｉｚｕ  Ｋ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ＵＤＰ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｅｎｏｌｐｙｒｕｖｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  （ＭｕｒＢ）  ｆｒｏｍ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００６  Ｊａｎ  ２０；２８１(３)：１７１４−２４．
参考文献２：Ｌｉ  Ｙ，Ｋｕｒｏｋａｗａ  Ｋ，Ｍａｔｓｕｏ  Ｍ，Ｆｕｋｕｈａｒａ  Ｎ，Ｍｕｒａｋａｍｉ  Ｋ，Ｓｅｋｉｍｉｚｕ  Ｋ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｄｎａＤ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．  ２００４  Ｍａｙ；２７１（４）：４４７−５７．
参考文献３：Ｍａｔｓｕｏ  Ｍ，Ｋｕｒｏｋａｗａ  Ｋ，Ｎｉｓｈｉｄａ  Ｓ，Ｌｉ  Ｙ，Ｔａｋｉｍｕｒａ  Ｈ，Ｋａｉｔｏ  Ｃ，Ｆｕｋｕｈａｒａ  Ｎ，Ｍａｋｉ  Ｈ，Ｍｉｕｒａ  Ｋ，Ｍｕｒａｋａｍｉ  Ｋ，Ｓｅｋｉｍｉｚｕ  Ｋ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｕｒＢ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．  ２００３  Ｍａｙ  １６；２２２（１）：１０７−１３．
参考文献４：Ｋａｉｔｏ  Ｃ，Ｋｕｒｏｋａｗａ  Ｋ，Ｈｏｓｓａｉｎ  ＭＳ，Ａｋｉｍｉｔｓｕ  Ｎ，Ｓｅｋｉｍｉｚｕ  Ｋ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｄｎａＣ  ｇｅｎｅ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．  ２００２  Ａｐｒ  ２３；２１０（１）：１５７−６４．
参考文献５：Ｉｎｏｕｅ  Ｒ，Ｋａｉｔｏ  Ｃ，Ｔａｎａｂｅ  Ｍ，Ｋａｍｕｒａ  Ｋ，Ａｋｉｍｉｔｓｕ  Ｎ，Ｓｅｋｉｍｉｚｕ  Ｋ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ，  ＤｎａＥ  ａｎｄ  ＰｏｌＣ，  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ．Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．  ２００１  Ｄｅｃ；２６６（４）：５６４−７１．
参考文献６：Ｊｉ  Ｙ，Ｚｈａｎｇ  Ｂ，Ｖａｎ  ＳＦ，Ｈｏｒｎ，Ｗａｒｒｅｎ  Ｐ，Ｗｏｏｄｎｕｔｔ  Ｇ，Ｂｕｒｎｈａｍ  ＭＫ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  Ｍ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２００１  Ｓｅｐ  ２１；２９３（５５３８）：２２６６−９．
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【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明の評価方法及び本発明の同定方法は、バチルス綱に属する細菌の増殖に関する機能解明などに有用である他、増殖に関与する遺伝子がコードするタンパク質は抗菌剤のターゲットともなり得るという点で、バチルス綱に属する細菌を標的とした抗菌剤開発においても有用である。また、本発明のプラスミドは、バチルス綱に属する細菌内で安定に保持され、本発明の評価方法及び同定方法に利用可能である以外にも、発現ベクター、相補プラスミド、低コピープラスミド、バチルス綱に属する細菌−大腸菌シャトルベクタープラスミドとして、有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は、各種プラスミドの黄色ブドウ球菌での保持率を示すグラフである。
【図２Ａ】図２Ａは、ｐＮ３１５ＢプラスミドのＳＡＰ０３１と、ｐＳＫ１プラスミドのｐａｒとのアミノ酸配列を比較した図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ｐＮ３１５ＢプラスミドのＳＡＰ０３１と、ｐＳＫ１プラスミドのｐａｒとのレプリコンの構造を比較した図である。
【図３Ａ】図３Ａは、ｐＭ１０１プラスミドとｐＭ１０２プラスミドとのプラスミド交換が可能であることを示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ｐＭ１０１プラスミドとｐＭ１０２プラスミドとのプラスミド交換によって遺伝子の増殖への寄与を評価することが可能であることを示す図である。
【図４】図４は、ＳＡ０６７４遺伝子の増殖関与性の評価方法を示す工程図である。
【図５】図５は、ＰＣＲによりＷＭ１１１株におけるＳＡ０６７４遺伝子の欠失を確認した電気泳動像である。
【図６Ａ】図６Ａは、ＳＡ０６７４遺伝子が高温の増殖には必須であるが、低温の増殖には必須でないことを示した図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＳＡ０６７４遺伝子が高温の増殖には必須であるが、低温の増殖には必須でないことを示した図である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【配列表】
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