(57)【要約】【課題】内在遺伝子を含まないヒト２１番染色体断片からなるヒト人工染色体ベクターを提供する。【解決手段】ヒト２１番染色体の長腕遠位がＡＰ００１６５７において、また、短腕遠位がＡＬ１６３２０１において削除されたヒト２１番染色体断片からなり、好ましくは、該断片が１つ以上のＤＮＡ配列挿入部位とレポーター遺伝子およびネガティブ選別遺伝子とを含むことを特徴とするヒト人工染色体ベクター。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト２１番染色体の長腕遠位がＡＰ００１６５７において、また、短腕遠位がＡＬ１６３２０１において削除されたヒト２１番染色体断片からなることを特徴とするヒト人工染色体ベクター。
【請求項２】
１つ以上のＤＮＡ配列挿入部位を含む請求項１記載のヒト人工染色体ベクター。
【請求項３】
複数のＤＮＡ配列挿入部位を含む請求項２記載のヒト人工染色体ベクター。
【請求項４】
ＤＮＡ配列挿入部位が、部位特異的組換え酵素の認識部位である請求項２記載のヒト人工染色体ベクター。
【請求項５】
部位特異的組換え酵素がＣｒｅ酵素である請求項４記載のヒト人工染色体ベクター。
【請求項６】
部位特異的組換え酵素の認識部位がｌｏｘＰ配列である請求項５記載のヒト人工染色体ベクター。
【請求項７】
部位特異的組換え酵素がＦＬＰ酵素である請求項４記載のヒト人工染色体ベクター。
【請求項８】
部位特異的組換え酵素の認識部位がＦＲＴ配列である請求項７記載のヒト人工染色体ベクター。
【請求項９】
部位特異的組換え酵素がφＣ３１インテグレースである請求項４記載のヒト人工染色体ベクター。
【請求項１０】
部位特異的組換え酵素の認識部位がattBおよびattP配列である請求項９記載のヒト人工染色体ベクター。
【請求項１１】
搭載すべきＤＮＡ配列挿入部位を含み、かつ、レポーター遺伝子およびネガティブ選別遺伝子の少なくとも１つが挿入されている請求項３記載のヒト人工染色体ベクター。
【請求項１２】
レポーター遺伝子およびネガティブ選別遺伝子の両方が挿入されている請求項１１記載のヒト人工染色体ベクター。
【請求項１３】
レポーター遺伝子がＧＦＰ遺伝子である請求項１１記載のヒト人工染色体ベクター。
【請求項１４】
ネガティブ選別遺伝子がＨＳＶ−ＴＫ遺伝子である請求項１１記載のヒト人工染色体ベクター。
【請求項１５】
請求項１〜１４いずれか１項記載のヒト人工染色体ベクターを保持する細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内在遺伝子を含まないヒト人工染色体ベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト人工染色体ベクターの利点は、１）宿主染色体に挿入されず独立して維持されることから、宿主遺伝子を破壊しない、２）一定のコピー数で安定に保持され、宿主細胞の生理的発現制御を受けることから、挿入された遺伝子の過剰発現や発現消失が起きない、３）導入可能なＤＮＡサイズに制約がないことから、発現調節領域を含む遺伝子や複数遺伝子／アイソフォームの導入が可能となることが挙げられる。このように、ヒト人工染色体ベクターは、従来のベクター系（ウイルス、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣ、コスミド、プラスミド）にはない利点を有していることから、新たな遺伝子の機能解析のためのベクターやヒト型モデル動物の作製系として、さらに遺伝子治療用ベクターとしても有用であると期待されている（例えば、非特許文献１参照）。
このような事情に鑑み、例えば、特許文献１では、ヒト１４番染色体やヒト２１番染色体を改変し、そのサイズを縮小した染色体の断片からなる、細胞中で安定に保持されるヒト人工染色体ベクターが開示されている。
【特許文献１】国際公開2004/031385号パンフレット
【非特許文献１】Basu J, Willard HF, Artificial and engineered chromosomes: non-integrating vectors for gene therapy, Trends Mol. Med., 2005 May;11 (5):251-8
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記特許文献１に記載のごとく、天然の染色体断片を細胞に移入るすと、目的の遺伝子以外にも移入した染色体断片からその他の多くの遺伝子が同時に発現することになる。このような余分な遺伝子の発現は当該染色体断片を保持する宿主細胞の正常機能（増殖能や分化能など）を妨げることになることがあると考えられるため、余分な遺伝子を取り除くことが必要である。本発明の目的は、ヒト２１番染色体断片からなるヒト人工染色体ベクターにおける内在遺伝子を全て除去し、このような余分な遺伝子発現の問題のない、さらに利用しやすいヒト人工染色体ベクターを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、鋭意研究の結果、ヒト２１番染色体において、長腕遠位をＡＰ００１６５７において、また、短腕遠位をＡＬ１６３２０１において削除することにより、ヒト２番染色体の内在遺伝子を全て除去でき、また、ＤＮＡ配列挿入部位を複数導入し、あらかじめレポーター遺伝子、ネガティブ選別遺伝子を挿入しておくことにより、余分な遺伝子の発現の問題のない、かつ、利用しやすいヒト人工染色体ベクターが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）ヒト２１番染色体の長腕遠位がＡＰ００１６５７において、また、短腕遠位がＡＬ１６３２０１において削除されたヒト２１番染色体断片からなることを特徴とするヒト人工染色体ベクター、
（２）１つ以上のＤＮＡ配列挿入部位を含む上記（１）記載のヒト人工染色体ベクター、
（３）複数のＤＮＡ配列挿入部位を含む上記（２）記載のヒト人工染色体ベクター、
（４）遺伝子挿入部位が、部位特異的組換え酵素の認識部位である上記（２）記載のヒト人工染色体ベクター、
（５）部位特異的組換え酵素がＣｒｅ酵素である上記（４）記載のヒト人工染色体ベクター、
（６）部位特異的組換え酵素の認識部位がｌｏｘＰ配列である上記（５）記載のヒト人工染色体ベクター、
（７）部位特異的組換え酵素がＦＬＰ酵素である上記（４）記載のヒト人工染色体ベクター、
（８）部位特異的組換え酵素の認識部位がＦＲＴ配列である上記（７）記載のヒト人工染色体ベクター、
（９）部位特異的組換え酵素がφＣ３１インテグレースである上記（４）記載のヒト人工染色体ベクター、
（１０）部位特異的組換え酵素の認識部位がattBおよびattP配列である上記（７）記載のヒト人工染色体ベクター、
（１１）搭載すべきＤＮＡ配列挿入部位を含み、かつ、レポーター遺伝子およびネガティブ選別遺伝子の少なくとも１つが挿入されている上記（３）記載のヒト人工染色体ベクター、
（１２）レポーター遺伝子およびネガティブ選別遺伝子の両方が挿入されている上記（１１）記載のヒト人工染色体ベクター、
（１３）レポーター遺伝子がＧＦＰ遺伝子である上記（１１）記載のヒト人工染色体ベクター、
（１４）ネガティブ選別遺伝子がＨＳＶ−ＴＫ遺伝子である上記（１１）記載のヒト人工染色体ベクター、および
（１５）上記（１）〜（１４）いずれか１項記載のヒト人工染色体ベクターを保持する細胞を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のヒト人工染色体ベクターは、内在遺伝子が全て除去されているので、余分な遺伝子発現の問題が解消され、細胞中で安定に保持される。また、ＤＮＡ配列挿入部位を複数設けることにより、複数の遺伝子の相互作用を解析することが可能となり、また、目的とするＤＮＡ配列や、遺伝子と共に、レポーター遺伝子や、ネガティブ選別遺伝子を挿入することができるので、あらかじめヒト人工染色体ベクターの既知領域にレポーター遺伝子を導入しておけば、ベクター導入細胞を可視化でき、同様に、あらかじめネガティブ選別遺伝子を挿入しておけば、ベクターが導入された細胞を選択的に排除することができ、遺伝子治療の際のベクター導入によるがん化の危険を避けることが期待できる（Grimes BR, Monaco ZL. Artificial and engineered chromosomes: developments and prospects for gene therapy. Chromosoma. 2005 Sep; 114(4): 230-41）。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本明細書において、「ヒト人工染色体〔ＨＡＣ（human artificial chromosome）と略称する場合がある〕ベクター」とは、ヒト染色体、特に、本発明においてはヒト２１番染色体から作製された人工染色体を意味し、「ヒト染色体断片」とは、独立染色体として安定に複製および分配が可能な染色体の部分断片を意味する。
「内在遺伝子」とは、天然のヒト２１番染色体に本来的に存在する固有の遺伝子を意味する。
染色体の「腕」とは染色体のセントロメア両側の腕を意味し、その長さにより、長腕（ｑ）および短腕（ｐ）と称する。「遠位」、「近位」とは、それぞれ、セントロメアから遠い領域（テロメア側）、近い領域（セントロメア側）を意味し、長腕遠位は、長腕のＡＰ００１６５７よりもテロメア側、長腕近位は、長腕のＡＰ００１６５７よりもセントロメア側に位置する領域を意味する。短腕遠位は、短腕のＡＬ１６３２０１よりもテロメア側、短腕近位は、短腕のＡＬ１６３２０１よりもセントロメア側に位置する領域を意味する。
「ＤＮＡ配列挿入部位」とは、目的とするＤＮＡまたは遺伝子やＤＮＡ配列を挿入できる部位、例えば、部位特異的組換え酵素の認識部位等を意味する。
「人工テロメア配列」とは、例えば、ＷＯ００／１０３８３に記載されるテロメアトランケーション（テロメア配列の置換）により人工的に付加させたテロメア配列を意味する。染色体の短縮に使用する。
「外来遺伝子」、「外来ＤＮＡ」とは、ベクターの遺伝子挿入部位に挿入する、ベクターに搭載する目的の遺伝子、ＤＮＡ配列であり、対象とする細胞内に本来的には存在しない、対象とする細胞内で発現させるべき遺伝子、ＤＮＡ配列を意味する。
【０００８】
本発明のＨＡＣベクターは、ヒト２１番染色体の長腕遠位がＡＰ００１６５７において、また、短腕遠位がＡＬ１６３２０１において削除されたヒト２１番染色体断片からなることを特徴とする。好ましくは、該断片は、１つ以上のＤＮＡ配列挿入部位とレポーター遺伝子およびネガティブ選別遺伝子とを含む。長腕遠位をＡＰ００１６５７において、また、短腕遠位をＡＬ１６３２０１において削除することにより、内在遺伝子が全て除去される。
ヒト２１番染色体については、長腕および短腕のＤＮＡ配列が解読され、公知であり、相同組換えによって人工テロメア配列やｌｏｘＰ配列などを部位特異的に挿入することが可能である。また、長腕遠位および短腕遠位の削除によって内在遺伝子を含まないＨＡＣベクターが構築できる。
セントロメア領域を含むヒト２１番染色体断片から作製された、内在遺伝子を含まない本発明のＨＡＣベクターは、それを保持する細胞（供与細胞）中でも、移入される細胞（受容細胞）中でも安定に保持される。
【０００９】
以下に本発明のＨＡＣベクターの作製、ＤＮＡ配列の挿入、用途について説明する。
（１）ＨＡＣベクターの作製
本発明のＨＡＣベクターは、以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む方法により行う。
（ａ）ヒト２１番染色体を保持する細胞を得る工程、
（ｂ）ヒト２１番染色体の長腕遠位および／または短腕遠位を削除する工程、および
（ｃ）長腕近位および/または短腕近位に１つ以上のＤＮＡ配列挿入部位を挿入する工程。
工程（ｂ）および（ｃ）の順序は特に特定するものではない。
【００１０】
工程（ａ）
本発明のＨＡＣベクターを作製するには、まず、ヒト２１番染色体を保持する細胞を作製する。例えば、薬剤耐性遺伝子で標識されたヒト単一染色体を保持する公知のマウスＡ９雑種細胞ライブラリー（例、ＷＯ００／１０３８３号）からヒト２１番染色体を保持するクローンを選択し、その染色体を相同組換え率の高い細胞に移入することにより作製することができる。ヒト２１番染色体を保持するマウスＡ９雑種細胞は公知であり、ＪＣＲＢ（Japanese Collection of Research Bioresources）にＪＣＲＢ２２２１（細胞名Ａ９（Hygro21））の登録番号の下に登録されており、入手可能である。相同組換え率の高い細胞としては、例えば、ニワトリＤＴ４０細胞（Dieken et al., Nature Genetics, 12:174-182, 1996）を利用でき、移入は、公知の染色体移入法、例えば、ミクロセル法（Koi et al., Jpn. J. Cancer Res., 80: 413-418, 1973）によって行うことができる。
【００１１】
工程（ｂ）
ヒト２１番染色体を保持する細胞において、ヒト２１番染色体の長腕遠位および／または短腕遠位を削除する。例えば、ＷＯ００／１０３８３号に記載のテロメアトランケーションにより削除することができる。すなわち、ヒト２１番染色体を保持する細胞において、人工テロメア配列を保持するターゲッティングベクターを構築し、相同組換えにより染色体上の所望の位置に人工テロメア配列の挿入されたクローンを取得し、テロメアトランケーションにより欠失変異体が得られる。所望の位置が削除すべき長腕遠位または短腕遠位の切断位置であり、この位置に人工テロメア配列が相同組換えにより置換、挿入されて長腕遠位または短腕遠位が削除される。この位置は、ターゲッティングベクターを構築する際の標的配列の設計により、適宜設定でき、本発明においては、長腕のＡＰ００１６５７（GenBank登録番号）のＤＮＡ配列、短腕のＡＬ１６３２０１（GenBank登録番号）のＤＮＡ配列に基づいて標的配列を設計し、その標的配列よりもテロメア側でテロメトランケーションが起こるように設定する。これにより、内在遺伝子が全て除去されたヒト２１番染色体断片が得られる。
【００１２】
工程（ｃ）
ＤＮＡ配列挿入部位として、部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入する。すなわち、ある種の酵素が特定の認識部位を認識して特異的にその認識部位でＤＮＡの組換えを起こす現象が知られており、本発明のＨＡＣベクターでは、このような酵素と認識部位の系を利用して、目的とする遺伝子やＤＮＡ配列を挿入、搭載できる。このような系として、例えば、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ酵素と、その認識部位であるｌｏｘＰ配列の系（Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系）や、出芽酵母由来のＦＬＰ酵素と 、その認識部位であるＦＲＴ配列の系（Ｆｌｐ／ＦＲＴ系）や、ストレプトミセスファージ由来のφＣ31インテグレースと、その認識部位であるattB/attP配列の系が知られており、本発明のＨＡＣベクターのＤＮＡ配列挿入部位としては、特に限定するものではないが、例えば、これらの系を利用するｌｏｘＰ配列やＦＲＴ配列やattB/attP配列が挙げられる。
このような部位特異的組換え酵素の認識部位の挿入は、公知の方法、例えば、相同組換え法が利用でき、挿入位置および数は、長腕近位および短腕近位内に適宜設定することができる。
本発明においては、１つの種類の認識部位または異なる種類の認識部位を１つ以上、好ましくは複数挿入する。認識部位の設定により、外来遺伝子や外来ＤＮＡの挿入位置を決定できるので、挿入位置が一定となり、位置効果（position effect）を受けることもなくなる。かくして、本発明によれば、ＡＰ００１６５７に挿入されている部位特異的組換え酵素の認識部位ｌｏｘＰ配列において挿入された遺伝子を組織特異的に発現させることもできる。
【００１３】
本発明の、複数のＤＮＡ配列挿入部位を有するＨＡＣベクターには、好ましくは、目的とする遺伝子やＤＮＡ配列についての挿入部位を残して、レポーター遺伝子およびネガティブ選別遺伝子の少なくとも１つ、好ましくは両方を、例えば、部位特異的組換え酵素を利用して、あらかじめ挿入しておく。
レポーター遺伝子としては、特に限定するものではないが、例えば、蛍光タンパク質であるＧＦＰの遺伝子が挙げられる。ネガティブ選別遺伝子としては、例えば、単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子が挙げられる。
ＨＡＣベクターの受容細胞への導入は、通常、ＨＡＣベクターに搭載された薬剤耐性遺伝子によるポジティブ選別で行われるが、ネガティブ選別遺伝子をＨＡＣベクター上に挿入することにより、例えば、ガンシクロビル等の抗ウイルス剤を作用させてＨＡＣベクターを保持する受容細胞を排除することができる。
【００１４】
本発明のＨＡＣベクターにおいては、レポーター遺伝子、ネガティブ選別遺伝子、搭載すべき外来遺伝子、外来ＤＮＡは、相同組換え法によって挿入してもよい。
さらに、本発明のＨＡＣベクターには、プロモーター、薬剤耐性遺伝子など、ベクター構築において一般的に挿入される配列またはエレメントを、例えば、相同組換え法により挿入してもよい。
【００１５】
（２）外来遺伝子、外来ＤＮＡの導入
本発明のＨＡＣベクターには、外来遺伝子、外来ＤＮＡを導入できる。外来遺伝子や外来ＤＮＡは、対象となる細胞にとって外部から導入されるＤＮＡ配列であり、本発明においては、特に限定するものではなく、毛細管拡張性運動失調症の変異（ataxia telangiectasia mutated：ＡＴＭ）遺伝子、デュシャンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）遺伝子等の巨大ヒト遺伝子や、ｐ５３タンパク質遺伝子、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＰＲＴ）、ヒトゲノムライブラリー等も導入可能である。
外来遺伝子の導入は、上記のＤＮＡ配列挿入部位として挿入されている部位特異的組換え酵素の系を利用して行う。例えば、Ｃｒｅ酵素の認識部位であるｌｏｘＰ配列と外来遺伝子を保持するターゲッティングベクターを構築し、本発明のＨＡＣベクターを保持する細胞内でＣｒｅ酵素を発現させることにより、ｌｏｘＰ配列において該ターゲッティングベクターとの部位特異的組換えにより、外来遺伝子を導入できる。
本発明のＨＡＣベクターには、部位特異的組換え酵素の認識部位（ｌｏｘＰ配列）を保持する環状ＤＮＡを挿入することもでき、大腸菌を宿主としたプラスミドや、酵母を宿主とした環状ＹＡＣ等の既存のベクターによりクローン化されたＤＮＡも挿入できる。好適なｌｏｘＰ配列はＰ１ファージに由来する野生の配列であり、Ｃｒｅ酵素によるＨＡＣベクター上のｌｏｘＰ配列への環状インサートの挿入反応は可逆的である。一旦環状インサートが挿入されると、ＨＡＣベクター上に２つのｌｏｘＰ配列が残る。このため再度Ｃｒｅ酵素を発現させると環状インサートを切り出す逆反応が起きる可能性もあり、二次的にインサートを挿入するようなさらなるＨＡＣベクターの改変が困難となる。しかし、塩基置換を行った変異ｌｏｘＰ配列やφＣ31インテグレースの認識部位であるattB/attP配列の組み合わせ等によっては、逆反応を起こさず、複数の環状インサートを逐次挿入する系も構築できる。
【００１６】
（３）ＨＡＣベクターの細胞への移入
本発明のＨＡＣベクターまたは外来遺伝子や外来ＤＮＡを含む本発明のＨＡＣベクターを保持する細胞から、これらのＨＡＣベクターを他の細胞へ移入することができる。他の細胞は特に限定するものではなく、一般に、哺乳動物細胞、例えば、ＥＳ細胞、ＥＧ細胞、ＥＣ細胞、ｍＧＳ細胞、ヒト間葉系幹細胞のような多能性幹細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ヒト正常体細胞等が挙げられる。
ＨＡＣベクターの細胞への移入は上記したミクロセル法によって行うことができる。所望の細胞へ移入は、上記したＨＡＣベクター作製の前、或いは各工程中、または作製後に行うことができる。
【００１７】
（４）ＨＡＣベクターの用途
本発明のＨＡＣベクターは、他のＨＡＣベクターと同様な用途に利用でき、例えば、外来遺伝子の受容細胞への導入、外来遺伝子を発現する細胞の作製、タンパク質の製造、遺伝子機能の解析、ヒトの疾患の治療等に利用できる。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１８】
Ａ）ＨＡＣベクターにおけるヒト２１番染色体の長腕近位ＡＰ００１６５７への５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ−ＴＫ配列の挿入
（１）長腕近位へのｌｏｘＰ配列挿入のためのコンストラクト構築
ｌｏｘＰ配列を挿入するための基本プラスミドにはＶ９０１(Lexicon genetics)を用いた。ｌｏｘＰ挿入部位であるヒト２１番染色体近位のＤＮＡ配列はGenBankデータベースより得た（ＡＰ００１６５７）。相同組換えの２つの標的配列の増幅に用いたプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
＃２１ＣＥＮ＜１＞１Ｌ：acctggaatttcctaccatcccccataa（配列番号１）
＃２１ＣＥＮ＜１＞１Ｒ：atctctccagagggacagcatcataccc（配列番号２）
＃２１ＣＥＮ＜２＞１Ｌ：cctgcaagttatgaccactggggatttt（配列番号３）
＃２１ＣＥＮ＜２＞１Ｒ：ctgcagtgagccgagatcataccactgt（配列番号４）
ＭＣ１−ＴＫ配列を、Ｖ８３０(Lexicon genetics)からＲｓｒＩＩ（ＮＥＢ）により切り出し、Ｖ９０１プラスミドの制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識部位にクローニングした(V901T-1)。次にヒト２１番染色体を保持するＤＴ４０雑種細胞（Kazuki et al. BBRC 2004, DT40(21-2-3)）から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にして標的配列をＰＣＲで増幅した。反応条件は９５℃２分の後、変性９５℃１５秒、アニーリング６８℃４分を３０サイクル行った。それぞれを制限酵素ＥｃｏＲＩ（ニッポンジーン）とＢｇｌＩＩ（ニッポンジーン）ないしＸｈｏＩＩ（プロメガ）で消化して、アガロースゲルにより分離し精製後、Ｖ９０１プラスミドのＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩないしＢｇｌＩＩサイトにクローニングした。さらにＶ９０１プラスミドのＡｓｃＩとＫｐｎＩサイトにＡｓｃＩとＫｐｎＩにより切り出した５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ−ハイグロマイシン（hygromysin）をクローニングした。５’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ−ハイグロマイシンはＶ８２０(Lexicon genetics)のＸｂａＩサイトにオリゴ合成したｌｏｘＰ配列とＰＧＫハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏ）配列（Lyons I博士から分与）をクローニングすることで作製した。最終的なｌｏｘＰ挿入コンストラクトのサイズは１３．５ｋｂである。ターゲティングベクター、標的配列および相同組換えにより生じる染色体アレルを図１に示す。
ＤＴ４０（２１−２−３）細胞は、平成１８年４月２０日から、茨城県つくば市東１−１−１つくばセンター中央第６の独立行政法人  産業技術総合研究所  特許微生物寄託センターに受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０８９４の下で寄託してある。
【００１９】
（２）トランスフェクションおよびハイグロマイシン耐性クローンの単離
上記（１）で作製したコンストラクトをＮｏｔＩ(Takara)消化により線状化し、ヒト２１番染色体を保持するＤＴ４０細胞に導入した。導入条件、培養方法は押村ら（クロマチン・染色体実験プロトコール、羊土社、2005）に従った。ハイグロマイシン選択培養下で２週間培養すると、耐性コロニーが出現し、２０回のトランスフェクションで得た合計２３７個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＤＴ４０（ｋｋ））。
【００２０】
（３）相同組換え体の選別
（３−１）ＰＣＲ解析
組換え体を選別するため以下のプライマーを用いて部位特異的相同組換えが起こっているかを確認した。そのプライマーの位置は図１に示した。その配列を以下に示す。
＃２１ＣＥＮ＜１＞２Ｌ：aaatgcatcaccattctcccagttaccc（配列番号５）
ＰＧＫｒ１：ggagatgaggaagaggagaaca（配列番号６）
部位特異的に組換えが起こったクローンでのみ４．５ｋｂのバンドが検出された。ネガティブコントロールのＤＴ４０およびＤＴ４０（２１−２−３）ではバンドは検出されなかった。その頻度は２３７クローン中４６個で組換え頻度は約２０％であった。
（３−２）蛍光in situeハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析
ＦＩＳＨ解析は松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール、秀潤社、1994）に従い行った。上記（３−１）で組換えを確認したクローンのうち６クローンをヒトｃｏｔ−１ＤＮＡおよびハイグロマイシンをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、ヒト２１番染色体は全てのクローンで宿主染色体に転座することなく、長腕近位にハイグロマイシン由来のシグナルが検出されたことから部位特異的に組換えが起こったことが確かめられた。結果を図２Ａおよび図２Ｂに示す。図２Ａは組み換え前のＤＴ４０（２１−２−３）を示し、図２Ｂは組換え後のＤＴ４０（ｋｋ１３９）を示す。
以上の（１）〜（３）により相同組換えによりヒト２１番染色体近位ＡＰ００１６５７に５’−ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰ−ｈｙｇｒｏ−ＴＫを挿入することが確認できた。
【００２１】
Ｂ）ＨＡＣベクターにおけるヒト２１番染色体の長腕近位ＡＰ００１６５７での部位特異的切断
（１）部位特異的切断コンストラクト作製
長腕近位部位特異的切断用の基本ベクターにはｐＢＳ−ＴＥＬ／ｈｉｓＤコンストラクト（Kuroiwa et al. Nature Biotech 2002）を用いた。GenBankデータベースより得たヒト２１番染色体長腕近位のＤＮＡ配列（ＡＰ００１６５７）から相同組換え標的配列を設計した。これをＰＣＲ増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す。
ｑ１Ｌ：ggagcaacaggacctctcattccttgtt（配列番号７）
ｑ１Ｒ：ccaatgtcaggcactcctgctctaaatg（配列番号８）
ＤＴ４０（２１−２−３）を鋳型にＰＣＲにより相同組換え配列を増幅させＢａｍＨＩ消化ののち、ｐＢＳ−ＴＥＬ／ｈｉｓＤコンストラクトのＢａｍＨＩサイトにクローニングした。最終的な長腕近位部位特異的切断用コンストラクトのサイズは１４．４ｋｂである。ターゲティングベクター、標的配列、および相同組換えにより生じる染色体アレルを図３に示した。
（２）トランスフェクションおよびヒスチジノール（ｈｉｓＤ）耐性クローンの単離
上記（１）で作製したコンストラクトをＳｒｆＩ（TOYOBO）消化により線状化し、上記と同様な導入条件、培養方法で、Ａ）で作製したｌｏｘＰ配列の導入されたヒト２１番染色体を保持するＤＴ４０細胞（ＤＴ４０（ｋｋ１３９））に導入した。ヒスチジノール選択培養下で２週間培養すると、耐性コロニーが出現し、５回のトランスフェクションで得た合計１０５個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＤＴ４０（ｋｋｑ））。
（３）相同組換え体の選別と部位特異的切断の確認
（３−１）ＰＣＲ解析
ヒスチジノール耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として組換え体を選別するため一次スクリーニングとして切断部位よりテロメア側に位置する以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、部位特異的切断が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
ＣＢＲ−Ｌ：gatcctcctgaatgcctg（配列番号９）
ＣＢＲ−Ｒ：gtaaatgccctttggacc（配列番号１０）
ＡＰＰ−Ｌ：ctgggcaatagagcaagacc（配列番号１１）
ＡＰＰ−Ｒ：acccatattatctatggacaattga（配列番号１２）
ＴＴＣ３−Ｌ：tggacaaatataaggcatgttca（配列番号１３）
ＴＴＣ３−Ｒ：gtcaccttcctctgcctttg（配列番号１４）
ＰＣＰ４−Ｌ：gaattcactcatcgtaacttcattt（配列番号１５）
ＰＣＰ４−Ｒ：ccttgtaggaaggtatagacaatgg（配列番号１６）
次に上記プライマーで検出されなかった１０５クローンのうちの１０クローンについて以下のプライマーを用いて部位特異的相同組換えが起こっているかを確認した。そのプライマーの位置を図３に示す。配列は以下のとおりである。
ｑ４Ｌ：ctgcaatctttacctccctggttcaagc（配列番号１７）
ＳＫ２３：ggccgctctagaactagtggatc（配列番号１８）
１０クローンのうち部位特異的に組換えが起こった２クローンでのみ７．５ｋｂのバンドが検出された。ネガティブコントロールのＤＴ４０、ＤＴ４０（２１−２−３）およびＤＴ４０（ｋｋ１３９）ではバンドは検出されなかった。
（３−２）ＦＩＳＨ解析
上記（３−１）で組換えを確認したクローンのうち２クローンをヒトｃｏｔ−１ＤＮＡおよびヒスチジノールをプローブにして上記と同様にしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、ヒト２１番染色体長腕は部位特異的に切断されており、切断部位にはヒスチジノール由来のシグナルが検出されたことから部位特異的に組換えが起こったことが確かめられた。
以上の（１）〜（３）の実験により相同組換えによりヒト２１番染色体近位ＡＰ００１６５７でヒト２１番染色体が部位特異的に切断されたことが確認できた。
【００２２】
Ｃ）ＨＡＣベクターにおけるヒト２１番染色体の短腕近位ＡＬ１６３２０１での部位特異的切断
（１）部位特異的切断コンストラクト作製
短腕近位部位特異的切断用の基本ベクターにはｐＢＳ−ＴＥＬ／ｐｕｒｏコンストラクト（Kuroiwa et al. Nature Biotech 2002）を用いた。GenBankデータベースより得たヒト２１番染色体短腕近位の塩基配列（ＡＬ１６３２０１）から相同組換え標的配列を設計した。これをＰＣＲ増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す。
＃２１ｐ−ＢｓｒＧＩ−ＢａｍＨＩ：acggatcctgtacaatacacagttgactgtctcagtgtg（配列番号１９）
＃２１ｐ−ｌｏｘＰ３Ｒｂ：acggatccaagcccacatattattatgctgtgcttc（配列番号２０）
ＤＴ４０（２１−２−３）を鋳型にＰＣＲにより相同組換え配列を増幅させＢａｍＨＩ消化の後、ｐＢＳ−ＴＥＬ／puroコンストラクトのＢａｍＨＩサイトにクローニングした。最終的な短腕近位部位特異的切断用コンストラクトのサイズは１０．７ｋｂである。ターゲティングベクター、標的配列および相同組換えにより生じる染色体アレルを図４に示す。
（２）トランスフェクションおよびピュロマイシン（puromysin)耐性クローンの単離
上記（１）で作製したコンストラクトをＥｃｏＲＩ(Takara)消化により線状化し、上記と同様な導入条件、培養方法で、実施例１で作製したｌｏｘＰ配列の導入されたヒト２１番染色体を保持するＤＴ４０細胞（ＤＴ４０（ｋｋ１３９））に導入した。ピュロマイシン（puro）選択培養下で２週間培養すると、耐性コロニーが出現し、５回のトランスフェクションで得た合計２０６個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＤＴ４０（ｋｋｐ））。
（３）相同組換え体の選別と部位特異的切断の確認
（３−１）ＰＣＲ解析
ピュロマイシン耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として組換え体を選別するため一次スクリーニングとして切断部位よりテロメア側に位置する以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、部位特異的切断が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
Ｄ２１Ｓ１８７−Ｌ：tacatgcaaatgaccaagag（配列番号２１）
Ｄ２１Ｓ１８７−Ｒ：atcagcaatgccttctaagt（配列番号２２）
Ｄ２１Ｓ２７５−Ｌ：tgggccagttatagagacagtg（配列番号２３）
Ｄ２１Ｓ２７５−Ｒ：cagtcttgctctctcgccta（配列番号２４）
ｐＣＨＢ−Ｌ：cgaggtgactctcggtttgc （配列番号２５）
ｐＣＨＢ−Ｒ：tttcgcaagcaggcatttg（配列番号２６）
次に２０６クローンのうちの上記プライマーで検出されなかった８クローンについて以下のプライマーを用いて部位特異的相同組換えが起こっているかを確認した。そのプライマーの位置は図４に示す。その配列は以下のとおりである。
Ｐｃｅｎ１Ｌ：actgctgccatgcagacagttgtgcttt（配列番号２７）
ＰｕｒｏＩ：gagctgcaagaactcttcctcacg（配列番号２８）
８クローンのうち部位特異的に組換えが起こった３クローンでのみ５．９ｋｂのバンドが検出された。ネガティブコントロールのＤＴ４０、ＤＴ４０（２１−２−３）およびＤＴ４０（ｋｋ１３９）ではバンドは検出されなかった。
（３−２）ＦＩＳＨ解析
上記（３−１）で組換えを確認したクローンのうち２クローンをヒトｃｏｔ−１ＤＮＡおよびピュロマイシンをプローブにして上記と同様にＦＩＳＨ解析を行ったところ、ヒト２１番染色体短腕は部位特異的に切断されており、切断部位にはピュロマイシン由来のシグナルが検出されたことから部位特異的に組換えが起こったことが確かめられた。
以上の（１）〜（３）の実験により相同組換えによりヒト２１番染色体近位ＡＬ１６３２０１でヒト２１番染色体が部位特異的に切断されたことが確認できた。
【００２３】
Ｄ）ＨＡＣベクターにおけるヒト２１番染色体の短腕近位ＡＬ１６３２０１および長腕近位ＡＰ００１６５７での部位特異的切断
（１）トランスフェクションおよびｐｕｒｏ／ヒスチジノール耐性クローンの単離
上記Ｂ）で作製したコンストラクト（ＳｒｆＩ線状化）を上記と同様な導入条件、培養方法で、Ｃ）で作製したＤＴ４０（ｋｋｐ１１９）に、Ｃ）で作製したコンストラクト（ＥｃｏＲＩ線状化）を上記と同様な導入条件、培養方法で、Ｂ）で作製したＤＴ４０（ｋｋｑ７９）にそれぞれ導入した。薬剤選択２週間後にそれぞれ、５回のトランスフェクションで得た合計９５個（ヒスチジノール耐性）と３６２個（ピュロマイシン耐性）のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＤＴ４０（ｋｋｐｑ））。
（２）相同組換え体の選別と部位特異的切断の確認
（２−１）ＰＣＲ解析
ヒスチジノール耐性株はＢ）（３−１）の手法で２クローン、ピュロマイシン耐性株はＣ）（３−１）の手法で８クローン得られ、部位特異的切断が起こっていることを確認した。
（２−２）ＦＩＳＨ解析
上記と同様にして、（２−１）で組換えを確認したクローンのうち２クローンと８クローンをヒトｃｏｔ−１ＤＮＡおよびピュロマイシンをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、ヒト２１番染色体短腕は部位特異的に切断されており、切断部位にはピュロマイシン由来のシグナルが検出されたことから部位特異的に組換えが起こったことが確かめられた。結果を図５Ａおよび図５Ｂに示す。図５ＡはＤＴ４０（ｋｋｑ）由来のＤＴ４０（ｋｋｐｑ２２６）を、図５ＢはＤＴ４０（ｋｋｐ）由来のＤＴ４０（ｋｋｐｑ３２０）を示す。
以上の（１）〜（２）の実験により相同組換えによりヒト２１番染色体短腕近位ＡＬ１６３２０１および長腕近位ＡＰ００１６５７でヒト２１番染色体が部位特異的に切断されたことが確認できた。
【実施例２】
【００２４】
ヒト人工染色体ベクターのＣＨＯ細胞への導入と構造解析
（１）  微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として実施例１で得られたヒト人工染色体（ＤＴ４０（ｋｋｐｑ３２０）を用いた。染色体受容細胞としてはＣＨＯ  ｈｐｒｔ欠損細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手、登録番号ＪＣＲＢ０２１８）を用いた。微小核細胞融合および培養方法は押村ら（クロマチン・染色体実験プロトコール、羊土社、2005）に従って行った。ハイグロマイシン選択培養下で１週間培養すると、耐性コロニーが出現し、４回の融合で得た合計３８個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＣＨＯ（ｋｋｐｑ））。
（２）移入染色体の確認
（２−１）ＰＣＲ解析
ハイグロマイシン耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として、実施例１〜３記載のプライマー（配列番号５−６、１７−１８、２７−２８）によりヒト人工染色体ベクターがＣＨＯ細胞に導入されていることを確認した。３８クローン中２２クローンで全てのマーカーを保持していることが確認できた。
（２−２）ＦＩＳＨ解析
上記（２−１）のＰＣＲ解析で確認したクローンのうち１４クローンをヒトｃｏｔ−１ＤＮＡをプローブにして、上記と同様にしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、核型異常を起こさず、ヒト人工染色体を保持するクローンが９クローンあることが確かめられた。
（２−３）サザンブロット解析
パルスフィールド解析、サザンブロット解析を、中村ら（ラボマニュアル  ヒトゲノムマッピング、丸善株式会社、1991）に記された方法に従い行った。上記（２−１）のＰＣＲ解析で確認した２２クローンについて、パルスフィールド電気泳動法を用いて分離後、ａｌｐｈａ２１−１（Ikeno M et al.1994 HMG）由来のプローブを用いてサザンブロット解析を行ったところ、１７クローンについてセントロメア付近の構造異常を認めなかった。代表的な結果を図６に示す。
以上の（１）〜（３）の実験により染色体異常およびセントロメア構造異常をもたないヒト人工染色体（ｋｋｐｑ）を保持するＣＨＯ細胞が９クローン得られたことが確認できた。
【実施例３】
【００２５】
ヒト人工染色体ベクターへのＧＦＰ遺伝子導入
図７にヒト人工染色体ベクター上のｌｏｘＰサイトへＧＦＰ遺伝子をＣｒｅ組換え酵素の発現により導入する方法を示した。
（１）ｌｏｘＰサイトへのＧＦＰ遺伝子挿入コンストラクト作製
３’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰをＶ９０７(Lexicon genetics)のＥｃｏＲＩとＡｓｃＩにクローニングし、これを基本ベクターとした（ベクター名：Ｘ３．１）。３’ＨＰＲＴ−ｌｏｘＰはＶ８２０のＸｂａＩサイトにオリゴ合成したｌｏｘＰ配列をクローニングすることで作製した。Ｘ３．１のＥｃｏＲＩサイトとＳａｌＩサイトにＨＳ４−ＣＡＧ−ＥＧＦＰ−ＨＳ４（京都大、中辻教授より分与）をクローニングし、ＨＰＲＴ再構築系のＧＦＰ挿入コンストラクトとした。最終的なコンストラクトのサイズは９．７ｋｂである。ＧＦＰ挿入ベクター、標的配列、およびＣｒｅ酵素による組換えにより生じる染色体アレルを図７に示す。
（２）トランスフェクションおよびＨＡＴ耐性クローンの単離
遺伝子導入はリポフェクション法を用いて行い、９０％コンフルエント状態になった６ｗｅｌｌの細胞に対して、Ｃｒｅ１μｇとＧＦＰ挿入ベクター２μｇを市販（インビトロジェン）のプロトコールに従い導入した。ＨＡＴ選択培養下で２週間培養すると、耐性コロニーが出現し、２回の導入で得た合計２４個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＣＨＯ（ｋｋｐｑ）ＧＦＰ）。
（３）ＧＦＰ挿入体の確認
（３−１）蛍光顕微鏡観察
クローニングした２４個のコロニーを蛍光顕微鏡下にて観察したところ、全てのクローンにてＧＦＰ陽性細胞が観察され、その陽性率はほぼ１００％であった。
（３−２）ＰＣＲ解析
ＨＡＴ耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として組換え体を選別するため以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、部位特異的にＧＦＰ遺伝子の挿入が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
ＴＲＡＮＳ  Ｌ１：tggaggccataaacaagaagac（配列番号２９）
ＴＲＡＮＳ  Ｒ１：ccccttgacccagaaattcca（配列番号３０）
ＧＦＰ−Ｌ：cgtattaccgccatgcat（配列番号３１）
ＧＦＰ−Ｒ：cacaactagaatgcagtg（配列番号３２）
１２クローンにおいて上記の組み合わせのプライマーでＰＣＲ解析したところ、目的のバンドが検出された。ネガティブコントロールのＣＨＯおよびＣＨＯ（ｋｋｐｑ）ではバンドは検出されなかった。配列番号２９−６の組み合わせでは、ＣＨＯ（ｋｋｐｑ）では５００ｂｐのバンドが検出され、ＧＦＰ挿入体では１０．２ｋｂが検出される。解析した１２クローンのうち１０．２ｋｂのバンドのみが検出されたのは８クローン、１０．２ｋｂ、５００ｂｐの両方のバンドが検出されたのは４クローンであった。
（３−３）ＦＩＳＨ解析
上記（３−２）のＰＣＲ解析で確認した１２クローンをヒトｃｏｔ−１ＤＮＡをプローブにして上記と同様にしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、核型異常を起こさず、ヒト人工染色体を１本保持するクローンが２クローンあることが確かめられた。
以上の（１）〜（３）の実験によりヒト人工染色体（ｋｋｐｑ）上にＧＦＰ遺伝子を搭載することにより、ＧＦＰ発現が観察され、染色体異常をもたないヒト人工染色体（ｋｋｐｑ−ＧＦＰ）を保持するＣＨＯ細胞が２クローン得られたことが確認できた。
【実施例４】
【００２６】
ＨＰＲＴ再構築用ＨＡＣベクターにおけるヒト２１番染色体の長腕近位ＡＰ００１６５７への改変型ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）遺伝子配列の挿入
（１）長腕近位へのＥＧＦＰ配列挿入のためのコンストラクト構築
ＥＧＦＰ配列（Clontech）を挿入するための基本プラスミドにはｐＣＭＶ／Ｂｓｄ（インビトロジェン）を用いた。ＥＧＦＰ配列挿入部位であるヒト２１番染色体遠近位のＤＮＡ配列はGenBankデータベースより得た（ＡＰ００１６５７）。相同組換えの２つの標的配列の増幅に用いたプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す:
＃２１ｃｅｎＧ１Ｌ： gtgaaggcattgccagtgttttcttctg（配列番号３３）
＃２１ｃｅｎＧ１Ｒ： tttgccgtagtcagtgggtgaatcatct（配列番号３４）
＃２１ｃｅｎＧ３Ｌ： gtttgagaggacatgcaacaccctgaat（配列番号３５）
＃２１ｃｅｎＧ３Ｒ： tttagatgcaggggcatactgtgagcat（配列番号３６）
ＤＴ４０（２１−２−３）から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にして標的配列をＰＣＲにより増幅した。反応条件は９５℃２分の後、変性９５℃１５秒、アニーリング６８℃４分を３０サイクル行った。それぞれを制限酵素ＡｐａＩ（ニッポンジーン）ないしＸｂａＩ（ニッポンジーン）で消化して、アガロースゲルにより分離し精製後、ｐＣＭＶ／ＢｓｄプラスミドのＡｐａＩないしＸｂａＩサイトにクローニングした。さらにｐＣＭＶ／ＢｓｄプラスミドのＮｏｔＩとＸｈｏＩサイトにＨＳ４−ＣＡＧ−ＥＧＦＰ−ＨＳ４（京都大、中辻教授より分与）をクローニングした。最終的なｌｏｘＰ挿入コンストラクトのサイズは１５．５ｋｂである。ターゲティングベクター、標的配列、および相同組換えにより生じる染色体アレルを図８に示す。
（２）トランスフェクションおよびブラストサイジン（ＢＳ）耐性クローンの単離
上記（１）で作製したコンストラクトをＳａｌＩ(ニッポンジーン)消化により線状化し、上記と同様な導入条件、培養方法で、実施例１で作製した内在遺伝子を含まないＨＡＣベクターを保持するＤＴ４０細胞（ＤＴ４０（ｋｋｐｑ３２０））に導入した。ＢＳ選択培養下で２週間培養すると、耐性コロニーが出現し、５回のトランスフェクションで得た合計４７個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＤＴ４０（ｋｋｐｑＧ））。
（３）相同組換え体の選別
（３−１）ＰＣＲ解析
組換え体を選別するため以下のプライマーを用いて部位特異的相同組換えが起こっているかを確認した。そのプライマーの位置は図８に示す。その配列は以下のとおりである。
ｂｓｄＦ：caacagcatccccatctctg（配列番号３７）
＃２１ｃｅｎＧ６Ｒ：cccggccagattcagatttttattaggg（配列番号３８）
部位特異的に組換えが起こったクローンでのみ３．６ｋｂのバンドが検出された。ネガティブコントロールのＤＴ４０、ＤＴ４０（２１−２−３）およびＤＴ４０（ｋｋｐｑ３２０）ではバンドは検出されなかった。その頻度は４７クローン中１１個で組換え頻度は２３．４％であった。
（３−２）ＦＩＳＨ解析
上記と同様にして、（３−１）で組換えを確認したクローンのうち４クローンをヒトｃｏｔ−１ＤＮＡおよびＢＳをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、ヒト人工染色体ベクターは全てのクローンで宿主染色体に転座することなく、長腕近位にＢＳ由来のシグナルが検出されたことから部位特異的に組換えが起こったことが確かめられた。
（４）ＦＡＣＳ解析
（３−２）で確認されたうちの２クローンについてフローサイトメーターによるＧＦＰ陽性細胞の割合を計測したところ、２クローンとも９９％以上でＧＦＰ陽性を示した。ネガティブコントロールのＤＴ４０細胞ではＧＦＰ陽性率は０％であった。また、（３−２）で得られたＦＩＳＨ解析の結果から得られたＨＡＣの保持率と比較したところ、ほぼ同等の値を示した。結果を表１に示す。
【表１】
2007295860.tif 000002
以上の（１）〜（４）の実験により相同組換えによりヒト２１番染色体近位ＡＰ００１６５７にＨＳ４−ＣＡＧ−ＥＧＦＰ−ＨＳ４を挿入することが確認できた。
【実施例５】
【００２７】
ＧＦＰ挿入型ヒト人工染色体ベクターのＣＨＯ細胞への導入と構造解析
（１）  微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として実施例４で得られたヒト人工染色体（ＤＴ４０（ｋｋｐｑＧ１）を用い、染色体受容細胞としてはＣＨＯ  ｈｐｒｔ欠損細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手、登録番号ＪＣＲＢ０２１８）を用い、上記と同様に微小核細胞融合および培養を行った。ＢＳ選択培養下で１週間培養すると、耐性コロニーが出現し、４回の融合で得た合計４４個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＣＨＯ（ｋｋｐｑＧ））。
（２）移入染色体の確認
（２−１）ＰＣＲ解析
ＢＳ耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として、実施例１〜４記載のプライマー（配列番号５−６、１７−１８、２７−２８、３７−３８）によりヒト人工染色体ベクターがＣＨＯ細胞に導入されていることを確認した。４４クローン中３２クローンで全てのマーカーを保持していることが確認できた。
（２−２）ＦＩＳＨ解析
上記と同様にして、（２−１）のＰＣＲ解析で確認したクローンのうち１２クローンをヒトｃｏｔ−１ＤＮＡをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、核型異常を起こさず、ヒト人工染色体を保持するクローンが８クローンあることが確かめられた。
（３）サザンブロット解析
上記と同様にして、（２−２）のＦＩＳＨ解析を行った１２クローンについて、パルスフィールド電気泳動法を用いて分離後、ａｌｐｈａ２１−１由来のプローブを用いてサザンブロット解析を行ったところ、１１クローンについてセントロメア付近の構造異常を認めなかった。
（４）ＦＡＣＳ解析
（２−２）で確認されたうちの２クローンについてフローサイトメーターによるＧＦＰ陽性細胞の割合を計測したところ、２クローンとも９５％以上でＧＦＰ陽性を示した。ネガティブコントロールのＣＨＯ細胞ではＧＦＰ陽性率は０％であった。また、（２−２）で得られたＦＩＳＨ解析の結果から得られたヒト人工染色体の保持率と比較したところ、ほぼ同等の値を示した。結果を表２に示す。
【表２】
2007295860.tif 000003
以上の（１）〜（４）の実験により染色体異常およびセントロメア構造異常をもたないＧＦＰ挿入型ヒト人工染色体を保持するＣＨＯ細胞が８クローン得られたことが確認できた。
【実施例６】
【００２８】
ＧＦＰ挿入型ヒト人工染色体ベクターのＨＴ１０８０細胞への導入と長期培養後の安定性
（１）微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として実施例５で得られたヒト人工染色体（ＣＨＯ（ｋｋｐｑＧ４）を用い、染色体受容細胞としてはＨＴ１０８０欠損細胞（ＡＴＣＣより入手、登録番号ＣＣＬ−１２１）を用い、上記と同様にして微小核細胞融合および培養を行った。ＢＳ選択培養下で１週間培養すると、耐性コロニーが出現し、４回の融合で得た合計４２個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＨＴ１０８０（ｋｋｐｑＧ））。
（２）移入染色体の確認
（２−１）ＰＣＲ解析
ＢＳ耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として、実施例１〜４記載のプライマー（配列番号−６、１７−１８、２７−２８、３７−３８）によりヒト人工染色体ベクターがＨＴ１０８０細胞に導入されていることを確認した。４２クローン中３５クローンで全てのマーカーを保持していることが確認できた。
（２−２）蛍光顕微鏡観察
クローニングした４４個のコロニーを蛍光顕微鏡下にて観察したところ、全てのクローンにてＧＦＰ陽性細胞が観察され、その陽性率は５０−１００％であった。
（２−３）ＦＩＳＨ解析
上記と同様にして、（２−２）の蛍光顕微鏡観察でＧＦＰ陽性率９０％以上を確認したクローンのうち１１クローンをヒトａｌｐｈａ２１−１をプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、核型異常を起こさず、ヒト人工染色体を保持するクローンが８クローンあることが確かめられた。
（３）長期培養後のＦＡＣＳ解析
（２−３）で確認されたうちの３クローンについて０〜１００ＰＤＬ後、フローサイトメーターによるＧＦＰ陽性細胞の割合を計測した結果、１００ＰＤＬにおいても９０％以上の陽性率であった。ネガティブコントロールのＨＴ１０８０細胞ではＧＦＰ陽性率は０％であった。
以上の（１）〜（３）の実験により染色体異常をもたないＧＦＰ挿入型ヒト人工染色体を保持するＨＴ１０８０細胞が８クローン得られ、そのうちの少なくとも３クローンは長期培養後も安定に維持されていることが確認できた。
【実施例７】
【００２９】
ＧＦＰ挿入型ヒト人工染色体ベクターのｈｉＭＳＣ細胞への導入と長期培養後の安定性および分化誘導
（１）微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として実施例５で得られたヒト人工染色体（ＣＨＯ（ｋｋｐｑＧ４）を用い、染色体受容細胞としては不死化ヒト骨髄間葉系幹細胞であるｈｉＭＳＣ細胞（京都大、戸口田教授より入手）を用い、上記と同様にして微小核細胞融合および培養を行った。ＢＳ選択培養下で１週間培養すると、耐性コロニーが出現し、２回の融合で得た合計１０個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ｈｉＭＳＣ（ｋｋｐｑＧ））。
（２）移入染色体の確認
（２−１）ＰＣＲ解析
ＢＳ耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として、実施例１〜４記載のプライマー（配列番号−６、１７−１８、２７−２８、３７−３８）によりヒト人工染色体ベクターがｈｉＭＳＣ細胞に導入されていることを確認した。１０クローン中４クローンで全てのマーカーを保持していることが確認できた。
（２−２）蛍光顕微鏡観察
クローニングした４個のコロニーを蛍光顕微鏡下にて観察したところ、全てのクローンにてＧＦＰ陽性細胞が観察され、その陽性率は５０−１００％であった。
（２−３）ＦＩＳＨ解析
上記と同様にして、（２−１）のＰＣＲ解析で確認した４クローンをヒトａｌｐｈａ２１−１をプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、核型異常を起こさず、ヒト人工染色体を保持するクローンが３クローンあることが確かめられた。
（３）長期培養後のＦＡＣＳ解析
（２−３）で確認されたうちの３クローンについて０〜１００ＰＤＬ後のフローサイトメーターによるＧＦＰ陽性細胞の割合を計測した結果、１００ＰＤＬにおいても８０％以上の陽性率であった。ネガティブコントロールのｈｉＭＳＣ細胞ではＧＦＰ陽性率は０％であった。
（４）インビトロ分化誘導
Okamotoら(BBRC, 295:354, 2002)の手法に従い、骨、軟骨、脂肪細胞へ分化誘導を行い、ＧＦＰ挿入型ヒト人工染色体ベクターを導入したｈｉＭＳＣ細胞が分化能を維持しているかを確認したところ、調べた３つのクローン全てで親株と同等の分可能を維持していることが確認された。
以上の（１）〜（４）の実験により染色体異常をもたないＧＦＰ挿入型ヒト人工染色体を保持するｈｉＭＳＣ細胞が３クローン得られ、分化能を維持し、長期培養後も安定に維持されていることが確認できた。
【実施例８】
【００３０】
ＧＦＰ挿入型ヒト人工染色体ベクターのマウスＥＳ細胞への導入と長期培養後の安定性
（１）微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として実施例５で得られたヒト人工染色体（ＣＨＯ（ｋｋｐｑＧ４）を用い、染色体受容細胞としてはｈｐｒｔ欠損型マウスＥＳ細胞であるＥ１４ｔｇ２ａ細胞（丹羽仁史博士、理化学研究所より入手）を用い、上記と同様にして微小核細胞融合および培養を行った。ＢＳ選択培養下で１週間培養すると、耐性コロニーが出現し、２回の融合で得た合計５個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：Ｅ１４ｔｇ２ａ（ｋｋｐｑＧ））。
（２）移入染色体の確認
（２−１）ＰＣＲ解析
ＢＳ耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として、実施例１〜７記載のプライマー（配列番号５−６、１７−１８、２７−２８、３７−３８）によりヒト人工染色体ベクターがＥ１４ｔｇ２ａ細胞に導入されていることを確認した。５クローン中３クローンで全てのマーカーを保持していることが確認できた。
（２−２）蛍光顕微鏡観察
（２−１）でマーカー陽性の３個のコロニーを蛍光顕微鏡下にて観察したところ、全てのクローンにてＧＦＰ陽性細胞が観察され、その陽性率はほぼ１００％であった。
（２−３）ＦＩＳＨ解析
上記と同様にして、（２−１）のＰＣＲ解析で確認した３クローンをヒトｃｏｔ−１ＤＮＡをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、核型異常を起こさず、ヒト人工染色体を保持するクローンが３クローンあることが確かめられた。
（３）長期培養後のＦＡＣＳ解析
（２−２）で確認されたうちの３クローンについて０〜１００ＰＤＬ後のフローサイトメーターによるＧＦＰ陽性細胞の割合を計測した結果、１００ＰＤＬにおいても８０％以上の陽性率であった。ネガティブコントロールのＥ１４ｔｇ２ａ細胞ではＧＦＰ陽性率は０％であった。
（４）キメラマウスの作製と子孫伝達個体での保持率解析
（４−１）キメラマウス作製
上記（２−２）で確認された３クローンを用いて相沢ら（ジーンターゲティング、実験医学、1995）の手法に従い、キメラマウスを作製したこところ、毛色から１０〜７０％のキメラマウスが出生したことが判明した。
（４−２）子孫伝達個体作製
キメラマウスからMizutaniら（Genesis,43:34-42, 2005）に従いＧＦＰ陽性部位の精管から精子を取り出し顕微受精を行ったところ、３６匹中５匹でＧＦＰ陽性個体を得ることができた。
（４−３）子孫伝達個体各組織におけるＦＩＳＨ解析
上記と同様にして、（４−２）で得られた個体のうち２匹について、脳、胸腺、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、小腸、精巣において、ヒトｃｏｔ−１ＤＮＡをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、８０〜１００％でＧＦＰ挿入型ヒト人工染色体を保持することが確かめられた。
以上の（１）〜（４）の実験により染色体異常をもたないＧＦＰ挿入型ヒト人工染色体を保持するＥ１４ｔｇ２ａ細胞が３クローン得られ、長期培養後も安定に維持されていること、子孫伝達が可能であり個体組織においても安定に維持されることが確認できた。
【実施例９】
【００３１】
マウスＥＳ細胞に保持されたＧＦＰ挿入型ヒト人工染色体ベクターへのアルブミンプロモーターエンハンサーＲＦＰ遺伝子導入
図９にヒト人工染色体ベクター上のｌｏｘＰサイトへアルブミンプロモーターエンハンサーＲＦＰ遺伝子（Ａｌｂ−ＲＦＰ：インスレーターなし、Ｉ−Ａｌｂ−ＲＦＰ−Ｉ：インスレーターあり）をＣｒｅ組換え酵素の発現により導入する方法を示した。
（１）ｌｏｘＰサイトへのＡｌｂ−ＲＦＰおよびＩ−Ａｌｂ−ＲＦＰ−Ｉ遺伝子挿入コンストラクト作製
実施例３で作製したＸ３．１のＳａｃＩＩおよびＫｐｎＩサイトにＡｌｂ−ＲＦＰ（京都大、中辻教授より分与）を、ＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩサイトにＩ−Ａｌｂ−ＲＦＰ−Ｉ（京都大、中辻教授より分与）をクローニングし、ＨＰＲＴ再構築系のアルブミンプロモーターエンハンサーＲＦＰ遺伝子挿入用のコンストラクトとした。最終的なコンストラクトのサイズはＸ３．１Ａｌｂ−ＲＦＰは７．５ｋｂ、Ｘ３．１Ｉ−Ａｌｂ−ＲＦＰ−Ｉは９．９ｋｂである。Ａｌｂ−ＲＦＰおよびＩ−Ａｌｂ−ＲＦＰ−Ｉ挿入ベクター、標的配列、およびＣｒｅ酵素による組換えにより生じる染色体アレルを図９に示した。
（２）トランスフェクションおよびＨＡＴ耐性クローンの単離
遺伝子導入はリポフェクション法を用いて行い、９０％コンフルエント状態になった６ｗｅｌｌのＥ１４ｔｇ２ａ（ｋｋｐｑＧ）細胞に対して、Ｃｒｅ１μｇとＡｌｂ−ＲＦＰ挿入ベクター（もしくはＩ−Ａｌｂ−ＲＦＰ−Ｉ挿入ベクター）２μｇを市販（インビトロジェン）のプロトコールに従い導入した。ＨＡＴ選択培養下で２週間培養すると、耐性コロニーが出現し、１０回の導入で得た合計のクローン数はＥ１４ｔｇ２ａ（ｋｋｐｑＧ）＋Ａｌｂ−ＲＦＰでは１０個、Ｅ１４ｔｇ２ａ（ｋｋｐｑＧ）＋Ｉ−Ａｌｂ−ＲＦＰ−Ｉでは９１個であり、コロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った。
（３）Ａｌｂ−ＲＦＰおよびＩ−Ａｌｂ−ＲＦＰ−Ｉ遺伝子挿入体の確認
（３−１）ＰＣＲ解析
ＨＡＴ耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として組換え体を選別するため以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、部位特異的にＡｌｂ−ＲＦＰおよびＩ−Ａｌｂ−ＲＦＰ−Ｉ遺伝子の挿入が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
ＲＦＰ３Ｌ：tccgtgaacggccactactt（配列番号３９）
ＲＦＰ３Ｒ：tgcttcacgtaggccttgga（配列番号４０）
配列番号３９−４０（４５０ｂｐ）、２９−３０、２９−６の組み合わせの全てで目的のバンドに検出されたクローンはＥ１４ｔｇ２ａ（ｋｋｐｑＧ）＋Ａｌｂ−ＲＦＰでは５個、Ｅ１４ｔｇ２ａ（ｋｋｐｑＧ）＋Ｉ−Ａｌｂ−ＲＦＰ−Ｉでは４９個であった。ネガティブコントロールのＥ１４ｔｇ２ａおよびＥ１４ｔｇ２ａ（ｋｋｐｑＧ）ではバンドは検出されなかった。配列番号２９−６の組み合わせでは、Ｅ１４ｔｇ２ａ（ｋｋｐｑＧ）では５００ｂｐのバンドが検出され、Ａｌｂ−ＲＦＰ挿入体では約８ｋｂ、Ｉ−Ａｌｂ−ＲＦＰ−Ｉ挿入体では１０．４ｋｂが検出された。
（３−２）ＦＩＳＨ解析
上記と同様にして、（３−１）のＰＣＲ解析で確認したＥ１４ｔｇ２ａ（ｋｋｐｑＧ）＋Ａｌｂ−ＲＦＰでは５個、Ｅ１４ｔｇ２ａ（ｋｋｐｑＧ）＋Ｉ−Ａｌｂ−ＲＦＰ−Ｉでは１２個をヒトｃｏｔ−１ＤＮＡをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、核型異常を起こさず、ヒト人工染色体を１本保持するクローンがＥ１４ｔｇ２ａ（ｋｋｐｑＧ）＋Ａｌｂ−ＲＦＰでは４個、Ｅ１４ｔｇ２ａ（ｋｋｐｑＧ）＋Ｉ−Ａｌｂ−ＲＦＰ−Ｉでは６個あることが確かめられた。
以上の（１）〜（３）の実験によりＡｌｂ−ＲＦＰおよびＩ−Ａｌｂ−ＲＦＰ−Ｉ遺伝子を搭載したヒト人工染色体を保持し、染色体異常をもたないＥ１４ｔｇ２ａ細胞が得られたことが確認できた。
【実施例１０】
【００３２】
アルブミンプロモーターエンハンサーＲＦＰ遺伝子が搭載されたＧＦＰ挿入型ヒト人工染色体ベクターを保持するマウスＥＳ細胞からのキメラマウスの作製
（１）キメラマウスの作製
実施例９で確認されたＥ１４ｔｇ２ａ（ｋｋｐｑＧ）＋Ａｌｂ−ＲＦＰについて２クローン、Ｅ１４ｔｇ２ａ（ｋｋｐｑＧ）＋Ｉ−Ａｌｂ−ＲＦＰ−Ｉについて２クローンを用いて相沢ら（ジーンターゲティング、実験医学、1995）の手法に従い、キメラマウスを作製したこところ、毛色から１０〜７０％のキメラマウスが出生したことが判明した。
（２）キメラマウスにおける発現解析
（２−１）ゲノムＰＣＲ解析
上記（１）で得られたキメラマウスの脳、胸腺、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、小腸、精巣からのゲノムを鋳型として、上記配列番号５−６、１７−１８、２７−２８、３７−３８のプライマーにより全ての臓器でＨＡＣベクターを検出した。また、配列番号３９−４０、２９−３０、２９−６のプライマーによりＡｌｂ−ＲＦＰ−ＨＡＣ、Ｉ−Ａｌｂ−ＲＦＰ−Ｉ−ＨＡＣを全ての臓器で検出した。
（２−２）蛍光顕微鏡観察
上記（１）で得られたキメラマウスの脳、胸腺、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、小腸、精巣を取り出し蛍光顕微鏡下で観察したところ、全ての臓器で緑色の蛍光が５０％〜７０％程度で観察され、Ａｌｂ−ＲＦＰ−ＨＡＣを保持するマウスとＩ−Ａｌｂ−ＲＦＰ−Ｉ−ＨＡＣを保持するマウスの双方で肝臓でのみ上記の緑色蛍光部位と一致して赤色の蛍光を観察することが出来た。
（２−３）ＲＴ−ＰＣＲ解析
上記（１）で得られたキメラマウスの脳、胸腺、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、小腸、精巣からのトータルＲＮＡを市販のプロトコール（QIAGEN）に従い抽出後、中山広樹（バイオ実験イラストレイテッド、秀潤社、1996）に従い、ｃＤＮＡ合成を行い、それを鋳型としてＰＣＲを行い、ＲＦＰの発現を検出した。そのプライマー配列を以下に示す。
ＲＦＰ４Ｌ：ggccccgtaatgcagaagaa（配列番号４１）
ＲＦＰ４Ｒ：acgggcttcttggccttgta（配列番号４２）
その結果Ａｌｂ−ＲＦＰ−ＨＡＣを保持するマウスとＩ−Ａｌｂ−ＲＦＰ−Ｉ−ＨＡＣを保持するマウスの双方で肝臓でのみ発現を検出できた。
（３）キメラマウスにおけるＦＩＳＨ解析
上記（１）で得られたキメラマウスの脳、胸腺、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、小腸、精巣において、ヒトｃｏｔ−１ＤＮＡをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、５０％〜７０％でどの組織においてもＡｌｂ−ＲＦＰ−ＨＡＣまたはＩ−Ａｌｂ−ＲＦＰ−Ｉ−ＨＡＣを保持することが確かめられた。
以上の（１）〜（３）の実験によりヒト人工染色体ベクター上の長腕近位ｌｏｘＰサイトに遺伝子を挿入したとき、インスレーターあり・なしに関わらず、導入遺伝子が組織特異的に発現することが個体レベルで確認できた。
【実施例１１】
【００３３】
ＨＡＣベクター保持細胞の選択的除去
（１）ガンシクロビルによる選択培養
実施例６で得られたＨＴ１０８０（ｋｋｐｑＧ）１１および実施例８で得られたＥ１４ｔｇ２ａ（ｋｋｐｑＧ）１を用いて、６ｕｇ／ｍｌでガンシクロビル添加を行って培養したところ、１週間後にはＨＴ１０８０（ｋｋｐｑＧ）１１では全ての細胞が死滅し、Ｅ１４ｔｇ２ａ（ｋｋｐｑＧ）１では６ｗｅｌｌにつき６５個の耐性コロニーが出現した。このうちの６クローンについてコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った。
（２）蛍光顕微鏡観察
クローニングした６個のコロニーを蛍光顕微鏡下にて観察したところ、全てのクローンにてＧＦＰ陽性細胞は観察されなかった。
（３）ＦＩＳＨ解析
上記と同様にして、（１）で増殖させた６クローンについてヒトｃｏｔ−１ＤＮＡをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、コントロールのＥ１４ｔｇ２ａ（ｋｋｐｑＧ）1ではヒト人工染色体が検出されたのに対し、６クローン全てでヒト人工染色体は検出されなかった。また、全てのクローンで染色体異常は観察されず、核型は正常であった。
以上の（１）〜（３）の結果よりガンシクロビル添加によりＨＡＣ導入細胞を選択的に死滅させることが可能であり、ガンシクロビル投与によって染色体異常は引き起こさないことが確かめられた。
【実施例１２】
【００３４】
ＨＡＣベクターにおけるヒト２１番染色体の長腕近位ＡＰ００１６５７への３’ｎｅｏ−ｌｏｘＰ-ＢＳ−ＴＫ配列の挿入
（１）長腕近位への３’ｎｅｏ−ｌｏｘＰ配列挿入のためのコンストラクト構築
３’ｎｅｏ−ｌｏｘＰ配列を挿入するための基本プラスミドには実施例１で作製したＶ９０１Ｔ−１を用いた。Ｖ９０１Ｔ−１プラスミドのＡｓｃＩとＫｐｎＩサイトに３’ｎｅｏ−ｌｏｘＰ−ＢＳをクローニングした。３’ｎｅｏ−ｌｏｘＰ−ＢＳはｐＳＦ１プラスミド（ライフテック）のＸｈｏＩサイトにｐＣＭＶ／Ｂｓｄ（インビトロジェン）からＳａｌＩとＸｈｏＩで切り出したＢＳ配列をクローニングすることで作製した。最終的な３’ｎｅｏ−ｌｏｘＰ-ＴＫ配列挿入コンストラクトのサイズは１３．５ｋｂである。ターゲティングベクター、標的配列、および相同組換えにより生じる染色体アレルを図１０に示した。
（２）トランスフェクションおよびＢＳ耐性クローンの単離
上記（１）で作製したコンストラクトをＮｏｔＩ(Takara) 消化により線状化し、ＤＴ４０（ｋｋｐｑ３２０）細胞に、上記と同様な導入条件、培養方法で導入した。ＢＳ選択培養下で２週間培養すると、耐性コロニーが出現し、５回のトランスフェクションで得た合計５８個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＤＴ４０（ｋｋｐｑＮ））。
（３）相同組換え体の選別
（３−１）ＰＣＲ解析
組換え体を選別するため以下のプライマーを用いて部位特異的相同組換えが起こっているかを確認した。そのプライマーの位置は図１０に示した。その配列を以下に示す：
ＫＪｎｅｏ：catcgccttctatcgccttcttgacg（配列番号４３）
配列番号５−４３の組み合わせのＰＣＲにより、部位特異的に組換えが起こったクローンでのみ４．５ｋｂのバンドが検出された。ネガティブコントロールのＤＴ４０、ＤＴ４０（２１−２−３）およびＤＴ４０（ｋｋｐｑ３２０）ではバンドは検出されなかった。その頻度は５８クローン中１８個で組換え頻度は約３１％であった。
（３−２）ＦＩＳＨ解析
上記と同様にして、（３−１）で組換えを確認したクローンのうち６クローンをヒトｃｏｔ−１ＤＮＡをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、ヒト２１番染色体は全てのクローンで宿主染色体に転座することなく、部位特異的に組換えが起こったことが確かめられた。
以上の（１）〜（３）の実験により相同組換えによりヒト２１番染色体近位ＡＰ００１６５７に３’ｎｅｏ−ｌｏｘＰ−ＢＳ−ＴＫ配列を挿入することが確認できた。
【実施例１３】
【００３５】
３’ｎｅｏ−ｌｏｘＰ配列挿入型ヒト人工染色体ベクターのＣＨＯ細胞への導入および構造解析
（１）微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として実施例１２で得られたヒト人工染色体（ＤＴ４０（ｋｋｐｑＮ１７および２２）を用い、染色体受容細胞としてはＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣより入手、登録番号ＪＣＲＢ９０１８）を用いて、上記と同様にして微小核細胞融合および培養を行った。ＢＳ選択培養下で１週間培養すると、耐性コロニーが出現し、４回の融合で得た合計２０個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＣＨＯ（ｋｋｐｑＮ））。
（２）移入染色体の確認
（２−１）ＰＣＲ解析
ＢＳ耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として、実施例１〜１２記載のプライマー（配列番号５−４３、１７−１８、２７−２８）によりヒト人工染色体ベクターがＣＨＯ細胞に導入されていることを確認した。２０クローン中１５クローンで全てのマーカーを保持していることが確認できた。
（２−２）ＦＩＳＨ解析
上記と同様にして、（２−１）のＰＣＲ解析で確認したクローンのうち１０クローンをヒトｃｏｔ−１ＤＮＡをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、核型異常を起こさず、ヒト人工染色体を保持するクローンが８クローンあることが確かめられた。
（３）サザンブロット解析
上記と同様にして、（２−１）のＰＣＲ解析で確認した１５クローンをについて、パルスフィールド電気泳動法を用いて分離後、ａｌｐｈａ２１−１由来のプローブを用いてサザンブロット解析を行ったところ、５クローンについてセントロメア付近の構造異常を認めなかった。
以上の（１）〜（３）の実験により染色体異常およびセントロメア構造異常をもたない３’ｎｅｏ−ｌｏｘＰ−ＢＳ−ＴＫ配列挿入型ヒト人工染色体を保持するＣＨＯ細胞が５クローン得られたことが確認できた。
【実施例１４】
【００３６】
ｎｅｏ再構築型ＨＡＣベクターにおけるヒト２１番染色体の長腕近位ＡＰ００１６５７へのＥＧＦＰ遺伝子配列の挿入
（１）長腕近位へのＥＧＦＰ配列挿入のためのコンストラクト構築
ＥＧＦＰ配列を挿入するための基本プラスミドにはｐＣＭＶ／Ｂｓｄ（インビトロジェン）を用いた。ＥＧＦＰ配列挿入部位であるヒト２１番染色体近位の塩基配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースより得た（ＡＰ００１６５７）。相同組換えの２つの標的配列の増幅に用いたプライマーオリゴヌクレオチドは（配列番号３３−３４）および（配列番号３５−３６）を用いた。ＤＴ４０（２１−２−３）から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にして標的配列をＰＣＲにより増幅した。反応条件は９５℃２分の後、変性９５℃１５秒、アニーリング６８℃４分を３０サイクル行った。それぞれを制限酵素ＡｐａＩ（ニッポンジーン）ないしＸｂａＩ（ニッポンジーン）で消化して、アガロースゲルにより分離し精製後、ｐＣＭＶ／ＢｓｄプラスミドのＡｐａＩないしＸｂａＩサイトにクローニングした。さらにｐＣＭＶ／ＢｓｄプラスミドのＥｃｏＲＩとＸｈｏＩサイトにＰＧＫハイグロマイシン（ｈｙｇ）配列をクローニングしてＢＳとｈｙｇを入れ換えた。さらにそのプラスミドのＮｏｔＩとＸｈｏＩサイトにＨＳ４−ＣＡＧ−ＥＧＦＰ−ＨＳ４（京都大、中辻教授より分与）をクローニングした。最終的なＥＧＦＰ挿入コンストラクトのサイズは１６ｋｂである。ターゲティングベクター、標的配列、および相同組換えにより生じる染色体アレルを図１１に示した。
（２）トランスフェクションおよびｈｙｇ耐性クローンの単離
上記（１）で作製したコンストラクトをＳａｌＩ（ニッポンジーン）消化により線状化し、実施例１２で作製した内在遺伝子を含まないヒト人工染色体ベクターを保持するＤＴ４０細胞（ＤＴ４０（ｋｋｐｑＮ））に、上記と同様な導入条件、培養方法で導入した。ｈｙｇｒｏ選択培養下で２週間培養すると、耐性コロニーが出現し、５回のトランスフェクションで得た合計４７個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＤＴ４０（ｋｋｐｑＮＧ））。
（３）相同組換え体の選別
（３−１）ＰＣＲ解析
組換え体を選別するため配列番号６−３８のプライマーを用いて部位特異的相同組換えが起こっているかを確認した。そのプライマーはで、その位置は図１１に示した。
部位特異的に組換えが起こったクローンでのみ３．６ｋｂのバンドが検出された。ネガティブコントロールのＤＴ４０、ＤＴ４０（２１−２−３）およびＤＴ４０（ｋｋｐｑＮ）ではバンドは検出されなかった。その頻度は３０クローン中８個で組換え頻度は２６．６％であった。
（３−２）ＦＩＳＨ解析
上記と同様に、（３−１）で組換えを確認したクローンのうち４クローンをヒトｃｏｔ−１ＤＮＡおよびｈｙｇをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、ヒト人工染色体ベクターは全てのクローンで宿主染色体に転座することなく、長腕近位にｈｙｇ由来のシグナルが検出されたことから部位特異的に組換えが起こったことが確かめられた。
以上の（１）〜（３）の実験により相同組換えによりヒト２１番染色体近位ＡＰ００１６５７にＨＳ４−ＣＡＧ−ＥＧＦＰ−ｈｙｇ−ＨＳ４を挿入することが確認できた。
【実施例１５】
【００３７】
３’ｎｅｏ−ｌｏｘＰ配列およびＧＦＰ配列挿入型ヒト人工染色体ベクターのＣＨＯ細胞への導入と構造解析
（１）微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として実施例１４で得られたヒト人工染色体（ＤＴ４０（ｋｋｐｑＮＧ５７）を用い、染色体受容細胞としてはＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣより入手、登録番号ＪＣＲＢ９０１８）を用いて微小核細胞融合および培養を行った。ハイグロマイシン選択培養下で１週間培養すると、耐性コロニーが出現し、２回の融合で得た合計３２個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＣＨＯ（ｋｋｐｑＮＧ））。
（２）移入染色体の確認
（２−１）ＰＣＲ解析
ハイグロマイシン耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として、上記配列番号６−３８、１７−１８、２７−２８のプライマーによりヒト人工染色体ベクターがＣＨＯ細胞に導入されていることを確認した。３２クローン中２０クローンで全てのマーカーを保持していることが確認できた。
（２−２）ＦＩＳＨ解析
上記と同様にして、（２−１）のＰＣＲ解析で確認したクローンのうち１２クローンをヒトｃｏｔ−１ＤＮＡをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、核型異常を起こさず、ヒト人工染色体を保持するクローンが９クローンあることが確かめられた。
（２−３）サザンブロット解析
上記と同様にして、（２−１）のＰＣＲ解析で確認したうちの１２クローンについて、パルスフィールド電気泳動法を用いて分離後、ａｌｐｈａ２１−１由来のプローブを用いてサザンブロット解析を行ったところ、７クローンについてセントロメア付近の構造異常を認めなかった。
以上の（１）〜（２）の実験により染色体異常およびセントロメア構造異常をもたない３’ｎｅｏ−ｌｏｘＰ−ＢＳ−ＴＫ配列およびＧＦＰ配列挿入型ヒト人工染色体を保持するＣＨＯ細胞が７クローン得られたことが確認できた。
【実施例１６】
【００３８】
複数挿入部位をもつヒト人工染色体ベクターの作製
（１）短腕近位へのＦＲＴ配列挿入のためのコンストラクト構築
ＦＲＴ配列を挿入するための基本プラスミドにはＶ９０１を用いた。ＦＲＴ挿入部位であるヒト２１番染色体短腕近位の塩基配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースより得た（ＡＬ１６３２０１）。相同組換えの２つの標的配列の増幅に用いたプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す。
＃２１ｐ−ＦＲＴ１Ｌ：cgcgaattcatacacagttgactgtctcagtgtg（配列番号４４）
＃２１ｐ−ＦＲＴ２Ｒｅ：gcggaattctgatgtgagccctctgtcagttctgtgt（配列番号４５）
＃２１ｐ−ＦＲＴ３Ｌｂ：ataggatccaccaagtgttggagagaatctggagcaa（配列番号４６）
＃２１ｐ−ＦＲＴ３Ｒｂ：acggatccaagcccacatattattatgctgtgcttc（配列番号４７）
ＤＴ４０（２１−２−３）から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にして標的配列をＰＣＲにより増幅した。反応条件は９５℃２分の後、変性９５℃１５秒、アニーリング６８℃４分を３０サイクル行った。それぞれを制限酵素ＥｃｏＲＩ（ニッポンジーン）ないしＢａｍＨＩ（ニッポンジーン）で消化して、アガロースゲルにより分離し精製後、Ｖ９０１プラスミドのＥｃｏＲＩないしＢｇｌＩＩサイトにクローニングした。さらにＶ９０１プラスミドのＨｉｎｄＩＩＩとＫｐｎＩサイトにＨｉｎｄＩＩＩとＫｐｎＩにより切り出したＦＲＴ−３’Ｚｅｏをクローニングし、ＸｈｏＩサイトにＸｈｏＩにより切り出したｐＧＫｎｅｏ配列（多田高志博士より分与）をクローニングした。ＦＲＴ−３’ＺｅｏはＣＡＧＧＳ−ＥＧＦＰプラスミド（大阪大学、岡部勝教授より分与）のＸｂａＩサイトにオリゴ合成したＦＲＴ配列を、ＥｃｏＲＩサイトにＺｅｏｃｉｎ配列（インビトロジェン）をクローニングすることにより作製した。最終的なＦＲＴ挿入コンストラクトのサイズは９ｋｂである。ターゲティングベクター、標的配列、および相同組換えにより生じる染色体アレルを図１２に示した。
（２）トランスフェクションおよびneo耐性クローンの単離
上記（１）で作製したコンストラクトをＮｏｔＩ(Takara) 消化により線状化し、実施例４で作製したＤＴ４０（ｋｋｐｑＧ）１細胞に、上記と同様の導入条件、培養方法で導入した。ネオマイシン選択培養下で２週間培養すると、耐性コロニーが出現し、１０回のトランスフェクションで得た合計５３個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＤＴ４０（ｋｋｐｑＧＦ））。
（３）相同組換え体の選別
（３−１）ＰＣＲ解析
組換え体を選別するため配列番号６４８のプライマーを用いて部位特異的相同組換えが起こっているかを確認した。そのプライマーの位置は図１２に示す。その配列を以下に示す。
＃２１ＦＲＴ４Ｌ：ggctccctgcactattatgcctaattt（配列番号４８）
部位特異的に組換えが起こったクローンでのみ３．０ｋｂのバンドが検出された。ネガティブコントロールのＤＴ４０、ＤＴ４０（２１−２−３）およびＤＴ４０（ｋｋｐｑＧ）ではバンドは検出されなかった。その頻度は５３クローン中２０個で組換え頻度は約３７．７％であった。
（３−２）ＦＩＳＨ解析
上記と同様にして、（３−１）で組換えを確認したクローンのうち６クローンをヒトｃｏｔ−１ＤＮＡおよびネオマイシンをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、ヒト２１番染色体は全てのクローンで宿主染色体に転座することなく、短腕近位にネオマイシン由来のシグナルが検出されたことから部位特異的に組換えが起こったことが確かめられた。
以上の（１）〜（３）の実験により相同組換えによりヒト２１番染色体短腕近位ＡＬ１６３２０１にｎｅｏ−ＦＲＴ−３’Ｚｅｏを挿入することが確認できた。
【実施例１７】
【００３９】
複数挿入部位をもつヒト人工染色体ベクターのＣＨＯ細胞への移入
（１）微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として実施例１６で得られたヒト人工染色体（ＤＴ４０（ｋｋｐｑＧＦ５）を用い、染色体受容細胞としてはＣＨＯ  ｈｐｒｔ欠損細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手、登録番号ＪＣＲＢ０２１８）を用いて、上記と同様に、微小核細胞融合および培養を行った。ＢＳ選択培養下で１週間培養すると、耐性コロニーが出現し、４回の融合で得た合計３４個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＣＨＯ（ｋｋｐｑＧＦ））。
（２）移入染色体の確認
（２−１）ＰＣＲ解析
ＢＳ耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として、上記配列番号５−６、１７−１８、２７−２８、３７−３８、６−４８のプライマーによりヒト人工染色体ベクターがＣＨＯ細胞に導入されていることを確認した。３４クローン中２２クローンで全てのマーカーを保持していることが確認できた。
（２−２）ＦＩＳＨ解析
上記と同様にして、（２−１）のＰＣＲ解析で確認したクローンのうち１２クローンをヒトｃｏｔ−１ＤＮＡをプローブにしてＦＩＳＨ解析を行ったところ、核型異常を起こさず、ヒト人工染色体を保持するクローンが７クローンあることが確かめられた。
（３）サザンブロット解析
上記と同様に、（２−２）のＦＩＳＨ解析を行った１２クローンをについて、パルスフィールド電気泳動法を用いて分離後、ａｌｐｈａ２１−１由来のプローブを用いてサザンブロット解析を行ったところ、１１クローンについてセントロメア付近の構造異常を認めなかった。
以上の（１）〜（３）の実験により染色体異常およびセントロメア構造異常をもたない複数挿入部位をもつＨＡＣを保持するＣＨＯ細胞が７クローン得られたことが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
以上記載したごとく、本発明によれば、内在遺伝子を全て除去した、利用しやすい改良されたＨＡＣが提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ヒト２１番染色体上の長腕ＡＰ００１６５７においてｌｏｘＰ配列を挿入する方法の概略を示した図である。
【図２】図２Ａは、ＦＩＳＨ解析の結果を示す写真で、ＤＴ４０細胞に保持されている完全長ヒト２１番染色体を示す。また、図２Ｂは、ヒト２１番染色体上の長腕ＡＰ００１６５７においてｌｏｘＰ配列が導入されたことを示すＦＩＳＨ解析の結果を示す写真で、ｌｏｘＰ配列を挿入したヒト２１番染色体を示す。
【図３】ヒト２１番染色体上の長腕ＡＰ００１６５７において部位特異的切断を行う方法の概略を示した図である。
【図４】ヒト２１番染色体上の短腕ＡＬ１６３２０１において部位特異的切断を行う方法の概略を示した図である。
【図５】図５Ａは、ヒト２１番染色体の長腕ＡＰ００１６５７および短腕ＡＬ１６３２０１において部位特異的切断が行われたことを示すＦＩＳＨ解析の結果を示す写真で、長腕ＡＰ００１６５７で切断されたヒト２１番染色体が短腕ＡＬ１６３２０１において切断された写真である。また、図５Ｂは、ヒト２１番染色体の長腕ＡＰ００１６５７および短腕ＡＬ１６３２０１において部位特異的切断が行われたことを示すＦＩＳＨ解析の結果を示す写真で、短腕ＡＬ１６３２０１において切断されたヒト２１番染色体が長腕ＡＰ００１６５７で切断された写真である。
【図６】内在遺伝子の存在しないヒト人工染色体ベクター（ｋｋｐｑ）がＤＴ４０細胞、ＣＨＯ  ＨＰＲＴ欠損細胞においてセントロメア領域の構造が正常であることを示すサザンブロット解析の結果を示す図である。
【図７】ＣＨＯＨＰＲＴ欠損株においてヒト人工染色体ベクター（ｋｋｐｑ）上にＧＦＰ遺伝子を導入する方法の概略を示した図である
【図８】ＨＰＲＴ再構築型のヒト人工染色体ベクターにおいて、ヒト２１番染色体上の長腕ＡＰ００１６５７においてＧＦＰ配列を挿入する方法の概略を示した図である。
【図９】マウスＥＳ細胞においてＧＦＰを挿入したヒト人工染色体ベクター（ｋｋｐｑＧ）上にインスレーターあり・なしのアルブミンエンハンサー・プロモーターＲＦＰコンストラクトを導入する方法の概略を示した図である。
【図１０】ヒト２１番染色体上の長腕ＡＰ００１６５７においてネオマイシン再構築のためのｌｏｘＰ配列を挿入する方法の概略を示した図である。
【図１１】ネオマイシン再構築型のヒト人工染色体ベクターにおいてヒト２１番染色体上の長腕ＡＰ００１６５７においてＧＦＰ配列を挿入する方法の概略を示した図である。
【図１２】ヒト人工染色体ベクター上のヒト２１番染色体短腕ＡＬ１６３２０１においてＦＲＴ配列を挿入する方法の概略を示した図である。
【図１】
2007295860.tif 000004
【図２】
2007295860.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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