(57)【要約】【課題】優れた感度でシグナルを検出することができる、高度に平面性を有する選択結合性物質固定化用基板を製造する【解決手段】少なくとも一方の主面に選択結合性物質を固定化する基板の両主面に一対の拘束部材を当接した状態で加熱した後にこの状態で冷却する工程を有する。本発明の製造方法においては、基板を５０℃〜１００℃の温度条件で加熱するとすることが好ましい。また、本発明の製造方法において一対の拘束部材は、基板を挟み込んだ状態で基板を加圧するように付勢することが好ましい。特に、一対の拘束部材は、５〜４００ｇの加重で基板を加圧することがより好ましい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一方の主面に選択結合性物質を固定化する基板の両主面に一対の拘束部材を当接した状態で加熱した後に、この状態で冷却する工程を有する
選択結合性物質固定化用基板の製造方法。
【請求項２】
上記冷却する工程は、金型を用いて上記基板を成形し、当該金型から基板を取り除いた後に行うことを特徴とする請求項１記載の選択結合性物質固定化用基板の製造方法。
【請求項３】
基板を５０℃〜１００℃の温度条件で加熱することを特徴とする請求項１記載の選択結合性物質固定化用基板の製造方法。
【請求項４】
上記一対の拘束部材は、ガラス板又は金属板であることを特徴とする請求項１記載の選択結合性物質固定化用基板の製造方法。
【請求項５】
上記一対の拘束部材は、上記基板を挟み込んだ状態で基板を加圧するように付勢することを特徴とする請求項１記載の選択結合性物質固定化用基板の製造方法。
【請求項６】
上記一対の拘束部材は、５〜４００ｇの加重で基板を加圧すること特徴とする請求項１記載の選択結合性物質固定化用基板の製造方法。
【請求項７】
一対の金型により構成されるキャビティ内に溶融した樹脂を供給する工程と、
上記一対の金型を離間させた後、硬化した基板をキャビティから取り出す工程と、
を更に有する請求項１記載の選択結合性物質固定化用基板の製造方法。
【請求項８】
上記一対の金型のうち少なくとも一方の金型におけるキャビティ構成面には、凹凸加工が形成されており、上記基板の少なくとも一方に、上記凹凸加工を転写してなる凹凸部が形成されることを特徴とする請求項７記載の選択結合性物質固定化用基板の製造方法。
【請求項９】
上記冷却する工程の後、酸溶液又はアルカリ溶液に上記基板を浸漬する工程を更に含むことを特徴とする請求項１記載の選択結合性物質固定化用基板の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検物質と相互作用することができる選択結合性物質を固定する選択結合性物質固定化用基板の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
各種生物に関する遺伝情報解析研究の結果、ヒト遺伝子をはじめとして、多数の生物について遺伝子の塩基配列、遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列及びこれら蛋白質から二次的に作られる糖鎖に関する情報が明らかにされた。今後、これら情報に基づいた更なる研究によって、生体内における遺伝子、蛋白質及び糖鎖の機能が解明されることが予測される。
【０００３】
このような機能解析の研究においては、様々な手法が開発され利用されている処ではあるが、何千種類にも及ぶ遺伝子や蛋白質を網羅的に解析する手法としてマイクロアレイ法（チップ法）が様々な形態で利用されている。なかでも、平面基板の一主面に多数のDNAを固定化したDNAチップは、各種細胞における遺伝子発現解析や、蛋白質と遺伝子との相互作用解析に利用されている。これは、原理的には核酸同士のハイブリダイゼーション（サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーションと同様）、核酸と蛋白質との相互作用（ウェスタンブロッティングと同様）に基づいている。また、蛋白質間の相互作用の原理に基づけば、蛋白質を固定化したマイクロアレイを構築することができる。すなわち、マイクロアレイ法といった場合、平面基板上に固定化される物質はDNAやRNA等の核酸、蛋白質並びに糖鎖等に代表される、検査対象物質との間に特異的な結合を形成できる物質を広く意味する。この意味における物質を「選択結合性物質」と呼ぶこともある。
【０００４】
選択結合性物質としてDNA断片を固定化したマイクロアレイ法の具体的使用法としては、例えば、研究検体細胞の発現遺伝子等を蛍光色素等で標識したサンプルを、平面基板片上に固定化されたDNA断片とハイブリダイゼーションさせ、固定化されたDNA断片とハイブリダイズした標識化サンプルを高解像度解析装置で高速に読みとる。或いは、電気化学反応にもとづく電流値等の応答を検出することによって、固定化されたDNA断片とサンプルとのハイブリダイズを検出する。
【０００５】
マイクロアレイにおいて、核酸を基板上に固定化するための技術としては、例えば、スライドガラス等の平坦な基板の一主面にポリ−Ｌ−リジンやアミノシラン等をコーティングし、核酸固定化用のピンを有するスポッターと呼ばれる点着装置を用い、各核酸を固定化する方法などが開発されている（例えば、特許文献１参照）。このような核酸を固定化する基板としては、一般的にガラスが用いられている。しかし、ガラスは破損しやすく、任意の形状に加工し難いといった問題点がある。この問題点を解決するために、樹脂製の基板が提案されている（例えば、特許文献２参照）。樹脂製の基板は、例えば、射出成型法、射出圧縮成型法、プレス成型法等で所望の形状に成型される。
【０００６】
また、マイクロアレイ法では、基板に固定化した選択結合性物質と被検物質との特異的なハイブリダイズ（相互作用）を、例えば被検物質に結合させた標識物質を検出することで同定する。標識物質の検出には、例えば、標識物質として蛍光物質を使用した場合には蛍光スキャナーを使用する。ところが、樹脂製の基板を用いたマイクロアレイでは、基板自体の反りの影響により標識物質の検出精度が低下してしまうといった問題がある。より具体的には、基板上に固定化される位置によって、標識物質に由来するシグナルの強度にばらつきが生じ、基板表面の全体に亘ってシグナルを正確に検出できないといった問題がある。
【０００７】
例えば基板の反りがレーザービームの焦点深度以上となると、正確な測定ができなくなるという問題点がある。一般に、レンズでレーザービームを絞った場合、その焦点深度は数十μｍであり、百数十μｍ以上の基板の反りが生じると正確な測定ができなくなる。ところが、樹脂製の基板は、金型の温度むらや、押し出し時の温度環境等により反りや歪みを生じているのが一般的である。このような問題点を解決するために、成型時の金型の温度を制御する方法や、金型内部に保持具を施してアニールし、樹脂内部の残留応力を除去する方法が考えられる（例えば、特許文献３参照）。しかしながら、マイクロアレイ法で使用される基板に求められる高度な平面性を達成できる具体的な技術は何ら開発されていないのが現状である。
【０００８】
【特許文献１】特表平１０−５０３８４１号公報（特許請求の範囲）
【特許文献２】特開２００５−４９３２９号公報（特許請求の範囲）
【特許文献３】特開２００２−２３８５６０号公報（特許請求の範囲）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明は、上述したような実状に鑑み、優れた感度でシグナルを検出することができる、高度に平面性を有する選択結合性物質固定化用基板の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上述した目的を達成した本発明に係る選択結合性物質固定化用基板の製造方法は、少なくとも一方の主面に選択結合性物質を固定化する基板の両主面に一対の拘束部材を当接した状態で加熱した後に、この状態で冷却する工程を有する。
【００１１】
本発明に係る選択結合性物質固定化用基板の製造方法においては、特に、金型を用いて上記基板を成形し、当該金型から基板を取り除いた後に上記冷却する工程を行うことが好ましい。本発明に係る選択結合性物質固定化用基板の製造方法においては、基板を５０℃〜１００℃の温度条件で加熱することが好ましい。また、本発明に係る選択結合性物質固定化用基板の製造方法において上記一対の拘束部材は、ガラス板又は金属板とすることができる。さらに上記一対の拘束部材は、上記基板を挟み込んだ状態で基板を加圧するように付勢することが好ましい。特に、上記一対の拘束部材は、５〜４００ｇの加重で基板を加圧することがより好ましい。
【００１２】
また、本発明には、上述した工程に加えて、一対の金型により構成されるキャビティ内に溶融した樹脂を供給する工程と、上記一対の金型を離間させた後、硬化した基板をキャビティから取り出す工程とをさらに有する選択結合性物質固定化用基板の製造方法も含まれる。この場合、上記一対の金型のうち少なくとも一方の金型におけるキャビティ構成面には凹凸加工が形成されており、上記基板の少なくとも一方に、上記凹凸加工を転写してなる凹凸部が形成される
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係る選択結合性物質固定化用基板の製造方法は、従来にない高度な平面性を有する基板を製造することができる。特に、本発明に係る選択結合性物質固定化用基板の製造方法によれば、例えばマイクロアレイ法に使用しても優れた感度でシグナルを検出することが可能な基板を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明に係る選択結合性物質固定化用基板の製造方法は、平板状の樹脂基板を、その両主面に一対の拘束部材を当接した状態で加熱した後にこの状態で冷却する工程を有している。すなわち、この工程は、例えば、射出成型法、射出圧縮成型法、プレス成型法等で所望の形状に成型された平板状の樹脂基板における残留応力を除去するための、いわゆるアニール処理と言い換えることができる。但し、本発明に係る製造方法においては、一対の拘束部材で処理対象の樹脂基板を拘束した状態でアニール処理している。一般に、アニール処理は、樹脂成形品を所定の温度（軟化点直下）に加熱し、所定の時間この温度を保った後に徐冷する処理を意味する。
【００１５】
アニール処理の一例としては、図１に示すように、処理対象の樹脂基板１の両主面に一対の拘束部材２を当接し、この状態を維持して加熱し、所定時間経過後に徐冷する方法が挙げられる。ここで、一対の拘束部材２としては、特に限定されないが、樹脂基板１との接触面が平面であるガラス板又は金属板を使用することができる。樹脂基板を加熱する方法としては、所望の温度に調節可能なチャンバーを使用する方法、一対の拘束部材２に温度調節機構を備え付けて一対の拘束部材２が樹脂基板１を加熱する方法を挙げることができる。樹脂基板１の温度は、樹脂基板１の組成に応じて適宜設定することができる。具体的には、樹脂基板１の主成分となる樹脂材料（詳細は後述する）のガラス転移温度（Tg）以下となるように、樹脂基板１を加熱する。樹脂材料のガラス転移温度は、公知の手法（ディラトメータによる方法、差動熱量計による方法、動的粘弾性測定装置による方法等）によって測定することができる。更に具体的に、樹脂基板１としてポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ、Tg；１２０℃）を使用する場合、樹脂基板１の温度が５０℃〜１００℃となるように加熱することが好ましい。
【００１６】
樹脂基板１の温度を５０℃未満とした場合には、内部の残留応力を十分に除去できないか、残留応力を十分に除去するのに長時間を要するため好ましくない。一方、樹脂基板１の温度を１００℃より大とした場合には、徐冷に長時間を要することとなり好ましくない。したがって、樹脂基板１の温度が樹脂基板１の温度が５０℃〜１００℃となるように加熱することが好ましい。
【００１７】
また、一対の拘束部材２は、樹脂基板１を挟み込んだ状態で加圧するように付勢されている。すなわち、樹脂基板１は、所定の圧力で加圧されながらアニール処理される。一対の拘束部材２によって樹脂基板１に加圧する際には、一対の拘束部材２を近接する方向に付勢する機構を使用しても良いが、一対の拘束部材２を鉛直下方向に配置して一方の拘束部材２の自重によって加圧しても良い。また、一対の拘束部材２を鉛直下方向に配置して上部の拘束部材２上におもりを載置し、樹脂部材１を加圧しても良い。
【００１８】
このとき、一対の拘束部材２は、５〜４００ｇの加重で樹脂基板１を加圧することが好ましい。樹脂基板１に対する加重が５ｇ未満である場合には、内部の残留応力を十分に除去できないか、残留応力を十分に除去するのに長時間を要する。一方、樹脂基板１に対する加重が４００ｇより大である場合には、処理後の基板の反りが十分に小さくならない場合がある。したがって、樹脂基板１に対する加重は５〜４００ｇとすることが好ましい。
【００１９】
さらに、加熱時間は、１時間以上であることが好ましい。加熱時間が１時間未満である場合には、残留応力を十分に除去できない虞がある。また、加熱時間の上限としては特に規定されず、１０時間程度で残留応力を十分に除去することができる。徐冷速度は、特に限定されないが、遅いほど残留応力を抜くには有利に働くため、例えば１℃／分が好ましい。
【００２０】
本発明に係る製造方法によれば、残留応力が十分に除去され、優れた平面性を有する、選択結合性物質を固定化するための基板、すなわち選択結合性物質固定化用基板を製造することができる。
【００２１】
特に、本発明に係る製造方法によれば、選択結合性物質固定化用基板の反りを低減できるが、処理後の選択結合性物質固定化用基板の反りとしては百数十μｍ以下とすることが好ましい。より具体的には、１５０μｍ以下とすることが好ましく、より好ましい反りとしては、１００μｍ以下である。さらに好ましくは、５０μｍ以下であり、最も好ましくは４０μｍ以下である。選択結合性物質固定化用基板の反りがこの範囲であれば、蛍光スキャナー等により極めて正確な測定が可能である。
【００２２】
本明細書において使用する「選択結合性物質」とは、物質群の中に含まれる特定の物質に対して特異的に相互作用する物質を意味する。特異的な相互作用とは、特定の物質に対する直接的又は間接的な結合であって、選択性を有する結合と言い換えることができる。具体的に選択結合性物質としては、核酸、タンパク質、糖類及び他の抗原性化合物を挙げることができる。ここで核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びＰＮＡを含む意味である。特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、該塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズして結合するので、本発明でいう「選択結合性物質」に該当する。また、タンパク質としては、抗体、Fabフラグメント及びF(ab')2フラグメントのような抗体の抗原結合性断片、並びに種々の抗原を挙げることができる。抗体やその抗原結合性断片は、対応する抗原と選択的に結合し、抗原は対応する抗体と選択的に結合するので、「選択結合性物質」に該当する。また、糖類としては、多糖類が好ましく、種々の抗原を挙げることができる。また、「選択結合性物質」には、タンパク質や糖類以外の抗原性を有する物質も含まれる。選択結合性物質は、市販のものでもよく、また、生細胞などから得られたものでもよい。
【００２３】
「選択結合性物質」として、特に好ましいものは、核酸である。この核酸の中でも、オリゴ核酸と呼ばれる、長さが１０塩基から１００塩基までの核酸は、合成機で容易に人工的に合成が可能であり、また、核酸末端のアミノ基修飾が容易であるため、基板表面への固定化が容易となることから好ましい。さらに、長さが２０塩基未満ではハイブリダイゼーションの安定性が低いという観点から、選択結合性物質としては、長さが２０〜１００塩基のオリゴ核酸を使用することがより好ましい。ハイブリダイゼーションの安定性を保持するため、選択結合性物質としては、特に好ましくは４０〜１００塩基の範囲のオリゴ核酸を使用する。
【００２４】
本明細書において使用する「選択結合性物質固定化用基板」とは、先に定義した選択結合性物質を一主面に固定化できる平板状の基板を意味する。特に、本発明においては、選択結合性物質固定化用基板としては、平板状部材の主成分が樹脂であるものを対象としている。
【００２５】
選択結合性物質固定化用基板を構成する樹脂としては、特に限定されないが、好ましくは、ポリスチレン系樹脂、ジエン系樹脂、ポリアクリル酸エステル系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリオレフィン系樹脂、シリコン樹脂が挙げられる。選択結合性物質固定化基板としては、特に、カルボニル基を有する樹脂、例えばポリアクリル酸エステル系樹脂を使用することが好ましい。この場合、選択結合性物質固定化用基板に対して選択結合性物質を効率よく固定化させることができる。
【００２６】
ポリスチレン系樹脂を構成するスチレン系単位としては、ｏ−メチルスチレン、ｍ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、ｐ−エチルスチレン、ｐ−ｔ−ブチルスチレン、α−メチルスチレン、α−メチル−ｐ−メチルスチレンのようなアルキル置換スチレン、ｏ−クロロスチレン、ｐ−クロロスチレンのようなハロゲン系スチレン類が挙げられる。ポリスチレン系樹脂としては、これらスチレン系単位を２種類以上含むものであっても良い。
【００２７】
ジエン系樹脂を構成するジエン系単位としては、ブタジエン、２−メチルブタジエン、２，３−ジメチルブタジエン等が挙げられる。ジエン系樹脂としては、これらジエン系単位を２種類以上含むものであっても良い。
【００２８】
ポリアクリル酸エステル系樹脂を構成するアクリル酸エステル系単位としては、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ブチル、アクリル酸シクロヘキシル、アクリル酸フェニル、アクリル酸ベンジル、アクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸２−ヒドロキシエチル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ブチル、メタクリル酸シクロヘキシル、メタクリル酸フェニル、メタクリル酸ベンジル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、メタクリル酸２−ヒドロキシエチルが挙げられる。ポリアクリル酸エステル系樹脂としては、これらポリアクリル酸エステル系単位を２種類以上含むものであっても良い。
【００２９】
ポリカーボネート系樹脂を構成するカーボネート系単位としては、４,４’−ジヒドロキシビフェニル、ビス（４−ヒドロキシフェニル）メタン、１,１−ビス（４−ヒドロキシフェニル）エタン、１,１−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−１−フェニルエタン、２,２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン、２,２−ビス（４−ヒドロキシ−３−メチルフェニル）プロパン、１,１−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−３,３,５−トリメチルシクロヘキサン、２,２−ビス（３−フェニル−４−ヒドロキシフェニル）プロパン、２,２−ビス（４−ヒドロキシ−３−イソプロピルフェニル）プロパン、２,２−ビス（３−t−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）プロパン、２,２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）ブタン、２,２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）オクタン、２,２−ビス（３−ブロモ−４−ヒドロキシフェニル）プロパン、２,２−ビス（３,５−ジブロモ−４−ヒドロキシフェニル）プロパン、２,２−ビス（３,５−ジクロロ−４−ヒドロキシフェニル）プロパン、２,２−ビス（３,５−ジメチル−４−ヒドロキシフェニル）プロパン、２,２−ビス（３−シクロヘキシル−４−ヒドロキシフェニル）プロパン、１,１−ビス（３−シクロヘキシル−４−ヒドロキシフェニル）シクロヘキサン、ビス（４−ヒドロキシフェニル）ジフェニルメタン、９,９−ビス（４−ヒドロキシフェニル）フルオレン、９,９−ビス（４−ヒドロキシ−３−メチルフェニル）フルオレン、１,１−ビス（４−ヒドロキシフェニル）シクロヘキサン、１,１−ビス（４−ヒドロキシフェニル）シクロペンタン、４,４’−ジヒドロキシジフェニルエ−テル、４,４’−ジヒドロキシ−３,３’−ジメチルジフェニルエ−テル、４,４’−ジヒドロキシジフェニルスルホン、４,４’−ジヒドロキシジフェニルスルホキシド、４,４’−ジヒドロキシジフェニルスルフィド、４,４’−ジヒドロキシ−３,３’−ジメチルジフェニルスルホン、４,４’−ジヒドロキシ−３,３’−ジメチルジフェニルスルフィド、４,４’−ジヒドロキシ−３,３’−ジメチルジフェニルスルホキシド、４,４’−ジヒドロキシ−３,３’−ジフェニルジフェニルスルホン、４,４’−ジヒドロキシ−３,３’−ジフェニルジフェニルスルフィド、４,４’−ジヒドロキシ−３,３’−ジフェニルジフェニルスルホキシド、１,３−ビス｛２−（４−ヒドロキシフェニル）プロピル｝ベンゼン、１,４−ビス｛２−（４−ヒドロキシフェニル）プロピル｝ベンゼン等が挙げられる。中でも、２,２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン、２,２−ビス（４−ヒドロキシ−３−メチルフェニル）プロパン、１,１−ビス（４−ヒドロキシフェニル）シクロヘキサン、１,１−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−３,３,５−トリメチルシクロヘキサン、９,９−ビス（４−ヒドロキシ−３−メチルフェニル）フルオレン等を挙げることができる。特に、カーボネート系単位として２,２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン（以下、“ビスフェノ−ルＡ”と略記する場合がある）を含むポリカーボネート系樹脂が好ましい。ポリカーボネート系樹脂としては、これらカーボネート系単位を２種類以上含むものであっても良い。
【００３０】
以上のような樹脂を使用して選択結合性物質固定化用基板を製造する際には、先ず、一対の金型により構成されるキャビティ内に溶融した樹脂を供給する。その後、キャビティ内で樹脂を硬化させ、一対の金型を離間させた後に樹脂基板をキャビティから取り出す。したがって、樹脂基板の形状は、キャビティの形状に依存することとなる。本発明に係る製造方法では、平板状の選択結合性物質固定化用基板を対象としているが、両主面が平坦であることに限定される意味ではない。すなわち、選択結合性物質固定化用基板としては、両主面或いは一主面が平坦である基板、両主面或いは一主面に加工が施された基板、及び両主面或いは一主面に凹凸構造を有する基板（特開２００４−２６４２８９号公報を参照）を例示することができる。
【００３１】
例えば、一対の金型のうち少なくとも一方の金型におけるキャビティ構成面に凹凸加工が形成されていると、この凹凸加工が基板の主面に転写される。この方法によって、両主面或いは一主面に凹凸構造を有する選択結合性物質固定化用基板を成型することができる。そして、本発明に係る製造方法では、一主面に凹凸構造を有する選択結合性物質固定化用基板であっても、上述したアニール処理を施すことで残留応力を除去することができ、反りの発生を防止できる。
【００３２】
また、選択結合性物質固定化用基板の厚さは、特に限定されないが、通常０．１ｍｍ〜２０ｍｍ程度であるが、好ましくは０．１ｍｍ〜２０ｍｍ程度である。選択結合性物質固定化基板の厚さが薄いほど反りの問題が生じやすいが、本発明によれば、０．１ｍｍ程度の厚さの選択結合性物質固定化基板であっても、反りの発生を確実に防止することができる。
【００３３】
さらに、上述したアニール処理の前に或いはアニール処理の後に、選択結合性物質固定化基板の両主面或いは一主面に表面処理を施してもよい。表面処理としては、特に限定されず、以下を例示することができる。一例として、選択結合性物質固定化基板として、カルボニル基を有する樹脂、例えばポリアクリル酸エステル系樹脂を用いた場合には、少なくとも、選択結合性物質を固定化する一主面におけるエステルを加水分解によりカルボン酸に変換させることが好ましい。これにより、選択結合性物質である核酸をより効率よく固定化させることができる。この表面処理の手段としては、例えば、アルカリ、酸などで対象の表面を処理する方法、温中で超音波処理する方法、酸素プラズマを照射する方法、アルゴンプラズマを照射する方法、放射線を照射する方法を挙げられ、これらの方法を単独或いは適宜組み合わせて使用することができる。これらの方法の中でも、担体の損傷が少なく、また、容易に実施できるという点から、温度を上げたアルカリ、もしくは酸に樹脂部材を浸漬する方法が好ましい。より具体的には、水酸化ナトリウムや硫酸の水溶液（好ましい濃度は、１Ｎ〜２０Ｎ）に樹脂部材を浸漬し、好ましくは３０〜８０℃の温度に維持して、１〜１００時間の間保持すればよい。また、容易に実施できるという点から、温度を上げたアルカリ、もしくは酸に選択結合性物質固定化用基板を浸漬する方法が好ましい。
【００３４】
表面処理を行う酸・アルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、塩酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、硫酸の水溶液が好ましく、より好ましくは水酸化ナトリウム水溶液（好ましい濃度は１Ｎ〜２０Ｎ）、水酸化カリウム水溶液（好ましい濃度は１Ｎ〜２０Ｎ）、水酸化リチウム水溶液（好ましい濃度は１Ｎ〜２０Ｎ）、塩酸水溶液（好ましい濃度は１Ｎ〜１２Ｎ）が挙げられる。これらの水溶液に選択結合性物質固定化用基板を浸漬し、好ましくは５０〜８０℃の温度に維持して、１〜１００時間の間保持すればよい。このような処理を施す場合、選択結合性物質固定化用基板の材料として、好適なものはポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）が挙げられる。
【００３５】
酸・アルカリ溶液で表面処理を行う場合、酸・アルカリ溶液への浸漬時の温度が５０〜８０℃であると、加水分解などの表面反応が促進されるので好適であるが、上述したアニール処理を施さない場合、この処理後に選択結合性物質固定化用基板が大きく反ってしまう場合がある。これは、選択結合性物質固定化用基板の残留応力が、アルカリ、酸に当該基板を浸漬して温度を上昇させることで解放され、反ってしまうと考えられる。しかしながら、上述したアニール処理を施すことによって製造された選択結合性物質固定化用基板においては、残留応力が十分に低減されているため、酸・アルカリ溶液を用いた表面処理を実施した場合であっても反りの発生を確実に防止することができる。また、酸・アルカリ溶液による表面処理を実施する場合には、上述した反りの発生メカニズムを考慮すると、樹脂基板に対する加重は５〜４００ｇであることが好ましく、２０〜３００ｇであることがより好ましい。
【００３６】
これらいずれの方法でも、カルボキシル基が一表面に生成したかどうかは、ＸＰＳ（Ｘ線光電子分光法）にて確認できる。具体的には、フッ素を含むラベル化試薬（例えばトリフルオロエタノール）を用いてカルボキシル基をフッ素でラベル化する。そして、ラベル化後の試料でのＣ１ｓ、Ｆ１ｓピーク面積強度に反応率を考慮して官能基量を推定することが可能である。さらに精度を上げるためには、トリフルオロエタノールで標識化された試料の表面のフッ素分布をＴＯＦ−ＳＩＭＳ（飛行時間型二次イオン質量分析法）で観察することにより、カルボキシル基が樹脂部材の一主面に生成しているかどうかを確認すればよい。
【００３７】
このようにカルボキシル基を一主面に生成すれば、これを足がかりに、基板側をビオチン若しくはアビチン修飾し、選択結合性物質をアビチン若しくはビオチン修飾して、アビチン・ビオチン相互作用にて選択結合性物質を基板の一主面に固定化することができる。または、基板の一主面をエチレンジアミン等のリンカーと反応させて、さらにこのリンカーと選択結合性物質とを反応させ固定化することもできる。しかし、これらの方法では、２段階の反応を行うため、反応収率の関係から、基板に固定化できる選択結合性物質が少なくなる場合も生じる。したがって、基板の一主面におけるカルボキシル基と選択結合性物質の官能基とを直接反応させ、選択結合性物質を固定化することが最も好ましい固定化方法である。すなわち、基板の一主面に形成されたカルボキシル基と選択結合性物質のアミノ基や水酸基とを共有結合により固定化することが好ましい。一般的には、これらの結合の反応を助長するため、ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３’−スルホナートなどの様々な縮合剤が用いられている。これらの中でも、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(ＥＤＣ)は、毒性が少ないことや、反応系からの除去が比較的容易なことから、選択結合性物質と基板の一主面に形成されたカルボキシル基との縮合反応には最も有効な縮合剤の１つである。その他、縮合剤としては、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチル−モルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）を好適に使用することができる。これらＥＤＣなどの縮合剤は、選択結合性物質の溶液と混ぜて使用しても良いし、カルボキシル基が表面に形成された基板を予めＥＤＣの溶液に浸漬しておき、表面のカルボキシル基を活性化するように使用しても良い。
【００３８】
このような縮合剤を用い、基板の一表面に形成されたカルボキシル基と選択結合性物質のアミノ基とを反応させた場合は、基板の一表面に対して選択結合性物質がアミド結合により固定化されることになる。また、基板の一表面に形成されたカルボキシル基と選択結合性物質の水酸基とを反応させた場合は、基板の一表面と選択結合性物質とがエステル結合により固定化されることになる。選択結合性物質を含む試料を基板の一主面に作用させる際の温度は、５〜９５℃が好ましく、１５〜６５℃が更に好ましい。処理時間は通常５分〜２４時間であり、１時間以上が好ましい。
【００３９】
これらの方法により基板の一主面に選択結合性物質を固定化することによって、基板の一表面において、選択結合性物質を固定化した部分以外は、マイナス電荷のカルボキシル基が存在している。したがって、選択結合性物質を固定化した部分以外への被検物質（代表的にはＤＮＡ）の非特異的な吸着を抑えることができる。さらに、これらの方法によれば、基板の一主面に対して選択結合性物質を共有結合によって強固に、且つ、高密度に固定化することができる。さらにまた、ガラスからなる基板に選択結合性物質を固定化する場合に比べて、樹脂部材からなる基板に選択結合性物質を固定化した場合には、選択結合性物質の空間的な自由度が高いという推定理由のために、被検物質とのハイブリダイゼーション効率が高い選択結合性物質固定化基板を得ることができる。空間的な自由度が高い利点は、特に固定化されている選択結合性物質がオリゴＤＮＡである場合に、被検物質とのハイブリダイゼーション効率が非常に向上するという優れた特性を与える。
【００４０】
一方、選択結合性物質固定化基板は、選択結合性物質を固定した後、適当な処理を施したものであっても良い。例えば、熱処理、アルカリ処理、界面活性剤処理などを行うことにより、固定された選択結合性物質を変性させることもできる。
【００４１】
また、選択結合性物質固定化基板は、上述した樹脂からなる構成に限定されず、上述した樹脂の他に他の成分を混合したような構成であってもよい。例えば、他の成分としては、選択結合性物質固定化基板からの自家発光を抑制する物質を挙げることができる。すなわち、蛍光標識化された被検物質と選択結合性物質との相互作用を、スキャナーと呼ばれる検出装置で蛍光を読みとることで検出する場合、基板自体からの発光（自家発光）が検出感度を低下させるおそれがある。よって、自家発光を抑制する物質を選択結合性物質固定化基板に含ませることによって、検出感度の低下を防止することができる。
【００４２】
より詳細に、スキャナーは励起光であるレーザー光を対物レンズで絞り込み、レーザー光を選択結合性物質固定化基板の一主面に集光し、蛍光標識からの発光をCCDカメラ等の検出手段によって検出している。しかし、基板の一主面から自家蛍光が生じる場合、その発光がノイズとなり検出手段による検出感度の低下に繋がることがある。そこで、自家発光を抑制する物質を樹脂に混合した基板、例えば黒色を呈する基板を使用することによって、基板の自家蛍光を低減させることができ。検出感度の低下を防止することができる。その結果、検出の際のノイズが小さく、すなちＳ／Ｎを向上させることができる。
【００４３】
ここで、黒色とは、可視光（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）範囲において、分光反射率が特定のスペクトルパターン（特定のピークなど）を持たず、一様に低い値であり、且つ、分光透過率も特定のスペクトルパターンを持たず、一様に低い値であることをいう。この分光反射率及び分光透過率の値としては、可視光（波長が４００〜８００ｎｍ）の範囲の分光反射率が７％以下であり、同波長範囲での分光透過率が２％以下であることが好ましい。なお、ここでいう分光反射率は、ＪＩＳ Ｚ ８７２２条件Ｃに適合した、照明・受光光学系で、基板からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率をいう。
【００４４】
自家発光を抑制する物質としては、黒色物質を挙げることができる。黒色物質としては、カーボンブラック、グラファイト、チタンブラック、アニリンブラック、Ｒｕ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｃｏ及びＣｕの酸化物、Ｓｉ、Ｔｉ、Ｔａ、Ｚｒ及びＣｒの炭化物等を例示することができる。これらの黒色物質は、単独で含有させても良いし、２種類以上を混合して含有させることもできる。黒色物質の中でも、特に、カーボンブラック、グラファイト、チタンブラックを使用することが好ましい。特に、カーボンブラックは樹脂材料に対する分散性に優れるため好ましく用いることができる。
【００４５】
また、本発明において選択結合性物質固定化用基板は、選択結合性物質を一主面に固定化する固定化層と、この固定化層における他主面に接合される支持体層とから構成されるものであってもよい。この場合、固定化層及び支持体層を接着した後に上述したアニール処理を行うことが好ましいが、それぞれ別個にアニール処理された固定化層及び支持体層を接着しても良い。ここで、支持体層としては、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリアミドなどの比較的高温に耐えられる樹脂などを用いても良い。また、この支持体層と固定化層との密着性を良くするため、支持体層の表面を、アルゴン、酸素、窒素ガスでのプラズマ処理やシランカップリング剤での処理を施すことが好ましい。このようなシランカップリング剤としては３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルジエトキシメチルシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリメトキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）ジメトキシメチルシラン、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、ジメトキシ−３−メルカプトプロピルメチルシランなどが挙げられる。支持体層の上に固定化層を設ける手段としては、ポリマーを有機溶媒に溶解し、スピンコートやディッピングなどの公知の手段を用いることができる。より簡単には、支持体層に接着剤で貼り付けることもできる。
【００４６】
以上のように、本発明に係る製造方法で製造された選択結合性物質固定化用基板は、選択結合性物質が固定された後に使用される。具体的には、固定された選択結合性物質に対する被検物質の相互作用を検出する際に、当該選択結合性物質が固定化された基板部材の一主面に被検物質を含有する溶液が供給される。当該溶液と基板との接触状態を所定の時間（核酸同士のハイブリダイゼーションの場合には例えば１２〜２４時間）維持した後、選択結合性物質と相互作用しなかった被検物質を基板の一主面から除去する。その後、スキャナー等によって被検物質に結合した標識物質を検出することによって、選択結合性物質と被検物質との相互作用を検出することができる。
【００４７】
本発明において被検物質としては、選択結合性物質に対して選択的に相互作用する物質であれば特に限定されず、選択結合性物質の種類に応じてあらゆる物質を含む意味である。具体的には、DNA、RNA及びPNA等の核酸、抗原や抗体等のタンパク質、糖鎖、その他の高分子化合物、及び低分子化合物を挙げることができる。さらに、被検物質としては、例えば、測定すべき核酸、例えば、病原菌やウイルス等の遺伝子や、遺伝病の原因遺伝子等並びにその一部分、抗原性を有する各種生体成分、病原菌やウイルス等に対する抗体等を挙げることができる。また、これらの被検物質を含む溶液としては、血液、血清、血漿、尿、便、髄液、唾液、各種組織液等の体液や、各種飲食物並びにそれらの希釈物等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、被検物質として核酸を対象とする場合には、血液や細胞から常法により抽出した核酸を標識してもよいし、該核酸を鋳型として、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって増幅したものであってもよい。後者の場合には、測定感度を大幅に向上させることが可能である。
【００４８】
核酸増幅産物を被検物質とする場合には、蛍光物質等で標識したヌクレオチド三リン酸の存在下で増幅を行うことにより、増幅後の核酸を標識することが可能である。また、被検物質が抗原又は抗体の場合には、被検物質である抗原や抗体を常法により直接標識してもよいし、被検物質である抗原又は抗体を選択結合性物質と結合させた後、選択結合性物質固定化基板を洗浄し、該抗原又は抗体と抗原抗体反応する標識した抗体又は抗原を反応させ、当該基板に結合した標識を測定することもできる。
【００４９】
選択結合性物質と被検物質とを相互作用させる工程は、従来と全く同様に行うことができる。反応温度及び時間は、ハイブリダイズさせる核酸の鎖長や、免疫反応に関与する抗原及び／又は抗体の種類等に応じて適宜選択されるが、核酸のハイブリダイゼーションの場合、通常、５０℃〜７０℃程度で１分間〜十数時間、免疫反応の場合には、通常、室温〜４０℃程度で１分間〜数時間程度である。また、被検物質を含む溶液を選択結合性物質固定化基板の一主面に供給した後、カバーガラスで一主面を覆うようにすれば、当該溶液の蒸発を防止することができる。
【００５０】
本発明に係る製造方法により製造された選択結合性物質固定化用基板によれば、反りの発生が防止され高度な平面性を有するため、上述したような被検物質の検出において優れた検出感度を達成することができる。特に、被検物質を定量する場合など高精度な検出が要求されたとしても、本発明に係る製造方法によれば、その要求を満足するレベルの平面性を有する選択結合性物質固定化用基板を製造することができる。例えば、光ディスクといった他の樹脂成形品において要求される平面性は、溶融樹脂を用いた成型に引き続きキャビティ内でアニール処理することで容易に達成される。しかし、上述した被検物質の検出といった系においては、キャビティ内でアニール処理したとしても、樹脂基板を離型する際に加わる力によって当該系で要求される平面性を達成することはできない。これに対して、本発明に係る製造方法によれば、成型に引き続いてキャビティ内でアニール処理する手法とは異なり、如何なる検出系でも満足できる平面性に優れた選択結合性物質固定化用基板を製造することができる。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５２】
〔実施例１〕
（ＤＮＡ固定化基板の作製及び処理）
本実施例では、選択結合性物質として既知の塩基配列を有するプローブＤＮＡを固定化したＤＮＡ固定化基板を準備した。公知の方法であるLIGA(Lithographie Galvanoformung Abformung)プロセスを用いて、射出成形用の型を作製し、射出成型法により後述するような形状を有するポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）製の基板（以下、ＰＭＭＡ基板と称する）を得た。なお、この実施例で用いたＰＭＭＡの平均分子量は１５万であり、ＰＭＭＡ中には１重量％の割合で、カーボンブラック（三菱化学製  ＃３０５０Ｂ）を含有させており、基板は黒色である。この黒色基板の分光反射率と分光透過率を測定したところ、分光反射率は、可視光領域（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）のいずれの波長でも５％以下であり、また、同範囲の波長で、透過率は０．５％以下であった。分光反射率、分光透過率とも、可視光領域において特定のスペクトルパターン（ピークなど）はなく、スペクトルは一様にフラットであった。なお、分光反射率は、ＪＩＳ  Ｚ  ８７２２の条件Ｃに適合した照明・受光光学系を搭載した装置（ミノルタカメラ製、ＣＭ−２００２）を用いて、担体からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率を測定した。
【００５３】
ＰＭＭＡ基板の形状は、大きさが縦７６ｍｍ、横２６ｍｍ、厚み１ｍｍであり、ＰＭＭＡ基板の中央部分を除き表面は平坦であった。ＰＭＭＡ基板の中央部分には、１００μｍの凹部が形成されるとともに、当該凹部内に直径５０μｍ、高さ１００μｍの凸部が９０００個形成されている。
【００５４】
以上のように成型して得られたＰＭＭＡ基板をガラス板で挟み、その状態で室温から８２℃の温度設定にし、１０時間維持し、上記状態で室温まで１℃／分の速度で徐冷した（アニール処理）。本実施例では、ガラス板は厚さ２．５ｍｍ、大きさ１２５ｍｍ×７５ｍｍで重さ（Ａ）１７０グラム、（Ｂ）３４０グラム、（Ｃ）６８０グラムの３種類を使用した。アニール後のＰＭＭＡ基板の反り度をレーザー変位計（キーエンスＬＫ−２０１０）を用いて測定した。基板の中央部を長軸方向に沿って測定を行った。基板全体で高低差の最大値を反り値の定義とした。
【００５５】
アニール前のＰＭＭＡ基板の反り値は３００マイクロメートルであった。アニールの結果、ガラス板の重さを（Ａ）１７０グラムで挟んだ時は反りが１マイクロメートル以下であったのに対し、（Ｂ）３４０グラムでは５０マイクロメートル、（Ｃ）６８０グラムでは１００マイクロメートルの反り値が得られた。その反り値の結果を表１に示す。
【００５６】
【表１】
2007171168.tif 000003
【００５７】
以上の結果から分かるように、３種類のガラス板を使用したところ全ての場合において反りが低減されていることが明らかとなった。特に、１７０グラムのガラス板で挟んでアニールを行った場合、反りが大幅に低減していることがわかる。
【００５８】
〔実施例２〕
本実施例でＰＭＭＡ基板は、実施例１とは、別の条件で射出成形して作製したものを用いた。基板は、大きさが縦７６ｍｍ、横２６ｍｍ、厚み１ｍｍであり、ＰＭＭＡ基板の中央部分を除き表面は平坦であった。ＰＭＭＡ基板の中央部分には大きさ３９．５ｍｍ×１９．８ｍｍ、深さ１００μｍの凹部が形成されるとともに、当該凹部内に直径５０μｍ、高さ１００μｍの凸部が９２４８個形成されている。
【００５９】
以上のように成型して得られたＰＭＭＡ基板をガラス板で挟み、その状態で室温から７０℃の温度設定にし、１０時間維持し、上記状態で室温まで１℃／分の速度で徐冷した（アニール処理）。本実施例では、上面に載せるガラス板の重さを（Ａ）５グラム、（Ｂ）２０グラム、（Ｃ）５０グラム、（Ｄ）１００グラム、（Ｅ）３００グラム、（Ｆ）４００グラム、（Ｇ）４５０グラム、（Ｈ）５００グラムを使用した。アニール処理後のＰＭＭＡ基板の反り度をレーザー変位計（キーエンスＬＫ−２０１０）を用いて測定した。基板の中央部を長軸方向に沿って測定を行った。基板全体で高低差の最大値を反り値の定義とした。その反り値の結果を表２に示す。
【００６０】
さらに、上記の方法にて処理した基板の表面にカルボキシル基を生成することを目的に、１０Ｎの水酸化ナトリウムに浸漬し、７０℃で１６時間保持した。その後、水酸化ナトリウムから基板を取り出し洗浄を行った後、同様にレーザー変位計を用いて反り度を測定した。表２に、その結果を併せて示す。
【００６１】
〔比較例１〕
実施例２と同じ基板をアニール処理せず１０Ｎの水酸化ナトリウムに浸漬し、実施例２と同様に７０℃で１０時間保持した。その後水酸化ナトリウムから基板を取り出し、洗浄を行った後、レーザー変位計を用いて反り度を測定した。その結果を表２に併せて示す。
【００６２】
【表２】
2007171168.tif 000004
【００６３】
以上からわかるように、アニール処理を行うことにより、反りが低減される。特に、アニール処理後に７０℃の水酸化ナトリウムに浸漬した後の反りは、アニール処理なしの場合と比較し大きく低減される。７０℃の水酸化ナトリウムに浸漬後の反りを考慮すると、加重の好ましい範囲としては、５ｇから４００ｇ（浸漬後の最終的な反りは５０μｍ以下）であり、特に好ましくは、２０ｇから３００ｇ（浸漬後の最終的な反りは４０μｍ以下）であることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】アニール処理の一例として示す模式図である。
【符号の説明】
【００６５】
１…選択結合性物質固定化用基板、２…拘束部材
【図１】
2007171168.tif 000005