(57)【要約】【課題】  優れたヒアルロニダーゼ阻害効果を有する、ヒアルロニダーゼ阻害剤を提供すること。【解決手段】  ベルゲニア・リグラータ（学名：Ｂｅｒｇｅｎｉａ  ｌｉｇｕｌａｔａ（Ｗａｌｌ．）Ｅｎｇｌ．）の根茎の溶媒抽出物と分子量２０万以下のγ−ポリグルタミン酸を組み合わせた混合物を有効成分とし、γ−ポリグルタミン酸及びベルゲニア・リグラータの根茎を単独で使用するよりも優れたヒアルロニダーゼ阻害作用を有し、これらを配合した皮膚外用剤を提供することにより、上記の課題を解決し得ることを見出した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベルゲニア・リグラタ（学名：Ｂｅｒｇｅｎｉａ  ｌｉｇｕｌａｔａ（Ｗａｌｌ．）Ｅｎｇｌ．）の溶媒抽出物と分子量２０万以下のγ・ポリグルタミン酸とを併用した外用組成物を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤。
【請求項２】
請求項１記載のヒアルロニダーゼ阻害剤を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、ヒアルロニダーゼ阻害剤及びこれを配合する皮膚外用剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】  ヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸の加水分解酵素であり、動物組織に広く分布している。その基質となるヒアルロン酸は、皮膚・関節液などの組織に多く存在するムコ多糖の一種であり、皮膚では細胞の保護・組織水分の保持・柔軟性の維持等の役割をしている。また、関節液として組織構造・機能の維持や潤滑性の保持等の役割を果たしている。【０００３】  皮膚や関節等における生体中のヒアルロン酸量は、老化等により減少し、皮膚の乾燥・肌荒れ・弾力性の低下、シワの増加、あるいは関節痛等を引き起こす。このような状態に対して、ヒアルロニダーゼ阻害剤は、ヒアルロン酸の分解を抑制し、生体ヒアルロン酸量の維持に寄与する。【０００４】  一方、ヒアルロニダーゼは起炎酵素としても知られており、ヒアルロニダーゼが炎症時に活性化され、結合組織のマトッリクスを破壊し、炎症系の組織への浸潤・血管の透過性を亢進すること、Ｉ型アレルギーにおける肥満細胞からのヒスタミンの遊離の過程に介在している可能性が高いといわれている。従って、抗炎症剤・抗アレルギー剤であるインドメタシン、アスピリン、クロモグリク酸ナトリウム等には高いヒアルロニダーゼ阻害活性が認められている。ヒアルロニダーゼ阻害剤は、近年増加傾向にあるアトピー性皮膚炎やそれに伴うかゆみ、また敏感肌等の皮膚炎症の軽減、花粉症の予防や改善効果が検討されている。【０００５】  また思春期に多く発生するニキビは、皮脂分泌の増加に伴い、アクネ菌が増殖することで起こるが、このアクネ菌はリパーゼ、ヒアルロニダーゼ、プロテアーゼなどの酵素を産生することが知られている。ヒアルロニダーゼにより炎症が惹起されると、丘疹や膿疱などの炎症性のニキビを引き起こす。このことより、ヒアルロニダーゼ活性を抑制することは、炎症反応を防ぎ、ニキビにも有効と考えられている。【０００６】  これまで前記したが、グリチルリチン酸、クロモグリク酸ナトリウム、バイカリン、インドメタシン、アスピリン等に高いヒアルロニダーゼ活性阻害作用が確認され、現在抗炎症剤として使用されている。しかしながら、これらは用途や使用濃度に制限があったり、副作用が認められており問題点を抱えている。一方、このような問題点を克服するため、天然物からヒアルロニダーゼ阻害活性を有する物質の探索も行われており、ヒアルロニダーゼ阻害活性を有するものとしては、ローズマリー、タイム及びメリッサ抽出物（特許文献１）、サルオガセ科地衣類の紅雪茶（特許文献２）、オオウメガサソウ（特許文献３）などが提案されているが、作用や効果は必ずしも十分でなく製品への配合では、有効な結果を得るに至っていない。
【特許文献１】特開平０８−３３３２６７
【特許文献２】特開２００３−２１２７８９
【特許文献３】特開２００５−２９５５６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  本発明は、ヒアルロニダーゼ阻害作用を有する阻害剤を塗布することによって、炎症を抑え、トラブルのない肌に改善することを目的としたヒアルロニダーゼ阻害剤及び皮膚外用剤である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  本発明は、ベルゲニア・リグラータＢｅｒｇｅｎｉａ  ｌｉｇｕｌａｔａ（Ｗａｌｌ．）Ｅｎｇｌ．の根茎の溶媒抽出物とγ−ポリグルタミン酸とを組合わせることにより相乗効果を有するヒアルロニダーゼ阻害剤及びこれらを配合した皮膚外用剤組成物を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】  本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤は、γ−ポリグルタミン酸及びベルゲニア・リグラータを単独で使用するよりも優れたヒアルロニダーゼ阻害作用を有し、これらを配合した皮膚外用剤は、皮膚の炎症を防止、美しい肌の状態を維持することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】  以下本発明の構成について詳述する。本発明で使用されるベルゲニア・リグラータＢｅｒｇｅｎｉａ  ｌｉｇｕｌａｔａ（Ｗａｌｌ．）Ｅｎｇｌ．とは、ユキノシタ科ヒマラヤユキノシタ属の植物で、ヒマラヤからインド北部に自生する。インドの伝統医学であるアーユルベーダにて、咳、発熱、下痢などの治療に用いられてきた。本発明の使用部位は根茎である。また、以前にベルゲニア・リグラタータの老化防止や活性酸素消去作用等を特許にて報告している。（特開２００４−３１５４９２、特開２００４−３１５４９１）【００１１】  また本発明で使用されるγ−ポリグルタミン酸は、納豆の特徴である糸引き成分・ネバネバ成分の主な要素とされている。このγ−ポリグルタミン酸に関する研究や利用は１０年以上前から行なわれている。保水性が知られており、化粧品等に用いられている。（特開２００４−５１５３３、特開２００２−１４５７２３等）しかし、本発明で用いられるγ−ポリグルタミン酸の分子量は、２０万以下であり、尚且つヒアルロニダーゼ阻害作用は未だ見出されていない。【００１２】  本発明で用いられる抽出物の調製方法は特に限定されないが、例えば種々の溶媒を用い、低温から加温下において抽出する方法があげられる。【００１３】  具体的に抽出溶媒としては、水、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール等の低級一価アルコール、グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の液状多価アルコール、酢酸エチル等の低級アルキルエステル、ベンゼン、ヘキサン、ペンタン等の炭化水素、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジプロピルエーテル、アセトニトリル等のエーテル類が例示され、これらの一種又は二種以上の混合溶媒を用いることができる。【００１４】  本発明で使用する抽出物は、そのまま用いてもよいが、必要に応じてろ過、濃縮してもよい。また、抽出物をカラムクロマト法、向流分配法等により、分画、精製して用いることもできる。【００１５】  更に、上記のものを減圧乾燥又は凍結乾燥した後、粉末又はペースト状に調製し、適宜製剤化して用いることもできる。【００１６】  （製造例１）
ベルゲニア・リグラータの根茎１００ｇに５０ｖｏｌ％エタノール溶液２ｋｇを加え、５０℃にて５時間攪拌抽出を行い、冷後、ろ過し、抽出物約１８００ｇを得る。この抽出物の固形分を１．０％に調製し、抽出物Ａを得る。【００１７】  （製造例２）
蒸留水で１．０％に調製したγ−ポリグルタミン酸を１として、上記抽出物Ａをそれぞれ０．０１、０．１の割合で混合させた混合物Ａ、Ｂを得る。【００１８】  （製造例３）
ベルゲニア・リグラータの根茎２００ｇに精製水３ｋｇを加え、８０℃にて５時間攪拌抽出する。冷後、ろ過し、抽出物Ｂ約２６００ｇを得る。この抽出物Ｂを減圧下約２００ｇまで濃縮した後、合成吸着体ダイヤイオンＨＰ−２０を充填したカラムにて処理し、水洗浄後の１０ｖｏｌ％エタノール溶液溶出液、２０ｖｏｌ％エタノール溶液溶出液及び３０ｖｏｌ％エタノール溶液溶出液を得る。各々の溶出液をそれぞれ５０ｇまで減圧濃縮し、エタノール５０ｇを加え抽出物Ｅ，Ｆ，Ｇとする。【００１９】  （製造例４）
蒸留水で１．０％に調製したγ−ポリグルタミン酸を１として、上記抽出物Ｇをそれぞれ０．０１、０．１の割合で混合させた混合物Ｃ，Ｄを得る。【００２０】  製造例２、４で使用したγ−ポリグルタミン酸の平均分子量を測定した結果、平均分子量は６万であった。測定方法は、ゲルろ過カラムを用いたＨＰＬＣにて分析し、光散乱検出器および示差屈折率計により平均分子量を求めた。【００２１】（分子量測定における諸条件）
ＧＰＣＭＡＬＳ測定
ＧＰＣ−光散乱測定条件
ＧＰＣ装置：ＧＰＣ８０２０シリーズ（東ソー製）
光散乱検出器：ＤＡＷＮＥＯＳ（ＷｙａｔｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）
濃度検出器：示差屈折率計（ＲＩ検出器）
光散乱検出器レーザー波長：６９０ｎｍ
カラム：東ソー製  α−Ｍ（７．８ｍｍＩＤ×３０ｃｍ）×２本
溶離液：５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）＋０．１Ｍ−ＮａＣｌ
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
注入量：１００μｌ
カラム温度：４０℃
検出器温度：４０℃
試料濃度：０．２％
前処理：測定直前に０．５μｍのセルロースアセテートフィルターでろ過【００２２】  本発明の抽出物は、そのまま利用できるほか、頭髪用剤、皮膚外用剤にも配合できるが、その配合量は特に規定するものではない。配合する製品の種類、性状、品質、期待する効果の程度により異なるが、乾燥固形物に換算して好ましくは、０．００００１〜２．５重量％（以下、単に「％」で示す）、特に０．００１〜１．０％がより好ましい。抽出液を使用する場合は、溶質である乾燥固形分の含有量が上記範囲内であれば、その抽出液濃度等は何ら限定されるものではない。【００２３】  本発明の植物抽出物を頭髪用剤、皮膚外用剤に用いる場合、上記成分に加えて、さらに必要により、本発明の効果を損なわない範囲内で、通常化粧品、医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば界面活性剤、油分、保湿剤、増粘剤、酸化防止剤、紫外線防御剤、アルコール類、粉末成分、色剤、香料、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。【００２４】  さらに、金属イオン封鎖剤、防腐抗菌剤、細胞賦活剤、皮脂分泌調整剤、消炎剤、収斂剤、美白剤、活性酸素抑制剤、抗アレルギー剤、老化防止剤等、さらに生理活性作用を有する植物抽出物、微生物抽出物及びこれらの抽出分画、精製物等も適宜配合することができる。【００２５】  本発明のエストロゲン様作用剤及びこれを配合してなる頭髪用剤、皮膚外用剤は、一般皮膚化粧料に限定されるものではなく、医薬品、医薬部外品、薬用化粧料等を包含するものである。本発明の頭髪用剤、皮膚外用剤の剤型は、可溶化系、乳化系、粉末分散系、粉末系等何れでもよく、用途も、化粧水、乳液、クリーム、パック等の基礎化粧料、ファンデーション等のメークアップ化粧料、ヘアートニック、ヘアクリーム、ヘアリキッド、ヘアローション、ポマード、育毛剤、シャンプー、リンス等の頭髪化粧料、石けん、ボディーシャンプーなどのトイレタリー製品、浴用剤等を問わない。【００２６】  次に実施例をあげて説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。【００２７】    （試験例１）製造例より得られた混合物ＡからＤを試料とした。陽性対照として、阻害活性が既に知られているクロモグリク酸ナトリウム（藤沢薬品工業製）を試験に用いた。試験方法は、Ｍｏｒｇａｎ−Ｅｌｓｏｎ法を応用する方法にて行なった。【００２８】  試料の適当量を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５に調製）にて希釈した溶液０．２ｍＬにヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ社製，ＴｙｐｅＩＶ−Ｓ，最終酵素活性を４００ＮＦｕｎｉｔ／ｍＬ）０．１ｍＬを加え、３７℃にて２０分間で放置後、活性化剤としてｃｏｍｐｏｕｎｄ４８／８０（Ｓｉｇｍａ社製）の酢酸緩衝液溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）０．２ｍＬを加え、更に３７℃にて２０分間放置する。これにヒアルロン酸カリウム（和光純薬工業製）溶液（最終濃度０．４ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬを加え、３７℃にて４０分間放置する。次に、氷上にて０．４Ｎ水酸化ナトリウム溶液０．２ｍＬを加えて反応を停止させた後、ホウ酸溶液（ホウ酸４．９５ｇに水５０ｍＬを加え、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液にてｐＨ９．１に調製した後、水を加えて１００ｍＬとする）０．２ｍＬを加え、混和後沸騰水浴中にて３分間加熱し酵素を失活させる。次に氷上にて室温まで冷却し、ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド試薬（和光純薬工業製、１０ｇに１０Ｎ塩酸溶液１２．５ｍＬ、酢酸８７．５ｍＬを混合溶解し、使用直前に酢酸にて１０倍に希釈する）６ｍＬを加え、３７℃にて２０分間放置した後、５８５ｎｍにて吸光度を測定する。なお、試料溶液の代わりに酢酸緩衝液を入れたものを対照とし、各資料溶液、対照について酵素を入れないものブランクとし、次式により阻害活性率を求め、試料濃度を調整することにより５０％阻害活性濃度（ＩＣ５０）を求めた。
阻害率（％）＝〔１−（試料溶液の吸光度−試料溶液ブランクの吸光度）／（対照溶液の吸光度−対照溶液ブランクの吸光度）〕×１００【００２９】
【表１】
2007320950.tif 000002
【００３０】  （試験結果）
試験結果のごとく単独での阻害作用と比較しても組合わせることで相乗効果がみられ、明らかな高い阻害作用が確認された。【００３１】  以下にさらに、本発明の処方例を示す。【００３２】  （実施例１）クリーム
下記成分（１）〜（１０）、別に下記成分（１１）〜（１５）を７５℃に加温溶解しそれぞれＡ液及びＢ液とする。Ａ液にＢ液を加えて乳化し、攪拌しながら５０℃まで冷却し、成分（１６）を加え、クリームを調製した。
（成分）                                          （重量％）
（１）ホホバ油                                        ３．０％
（２）スクワラン                                      ２．０％
（３）メチルポリシロキサン                            ０．５％
（４）ステアリルアルコール                            ０．５％
（５）セチルアルコール                                ０．５％
（６）トリ（カプリル・カプリン酸）グリセリル        １２．５％
（７）モノステアリン酸グリセリル                      ５．０％
（８）モノステアリン酸ジグリセリル                    １．５％
（９）モノステアリン酸デカグリセリル                  ３．０％
（１０）パラオキシ安息香酸プロピル                      ０．１％
（１１）キサンタンガム                                  ０．１％
（１２）混合物Ｂ                                        ２．５％
（１３）１，３−ブチレングリコール                      ２．５％
（１４）パラオキシ安息香酸メチル                        ０．２％
（１５）精製水                                        ６６．０％
（１６）香料                                            ０．１％【００３３】  （実施例２）化粧水
下記成分（５）〜（８）を混合溶解させＡ液とし、これとは別に下記成分（１）〜（４）及び（９）を混合溶解させてＢ液とし、Ａ液とＢ液を均等に混合し、化粧水を調整した。
（成分）                                          （重量％）
（１）グリセリン                                      ３．０％
（２）１，３−ブチレングリコール                      ５．０％
（３）混合物Ａ                                      １０．０％
（４）ポリオキシエチレンソルビタンラウリン酸エステル  １．２％
（５）エチルアルコール                                ３．０％
（６）パラオキシ安息香酸メチル                        ０．２％
（７）香料                                            ０．１％
（８）精製水                                        ７７．５％【００３４】  （実施例３）乳液
下記成分（１）〜（１０）、別に（１１）〜（１４）及び（１６）を７５℃で加熱溶解させてそれぞれＡ液及びＢ液とし、Ａ液にＢ液を加えて乳化し、攪拌しながら５０℃まで冷却し、成分（１５）を加え、乳液を調製した。
（成分）                                          （重量％）
（１）ホホバ油                                        １．０％
（２）スクワラン                                      ２．０％
（３）ベヘニルアルコール                              １．０％
（４）トリ（カプリル・カプリン酸）グリセリル          ２．０％
（５）テトラグリセリン縮合シリノレイン酸              ０．１％
（６）モノオレイン酸プロピレングリコール              ０．５％
（７）モノステアリン酸グリセリン                      １．０％
（８）モノミリスチン酸ヘキサグリセリル                １．０％
（９）モノミリスチン酸デカグリセリル                  ０．５％
（１０）パラオキシ安息香酸プロピル                      ０．１％
（１１）混合物Ｃ                                        ３．０％
（１２）１，３−ブチレングリコール                      ３．０％
（１３）パラオキシ安息香酸メチル                        ０．１％
（１４）香料                                            ０．１％
（１５）精製水                                        ８４．６％【００３５】  （実施例４）クレンジングジェル
下記成分（１）〜（３）、別に（４）〜（６）及び（８）を７０℃で加熱溶解させてそれぞれＡ液及びＢ液とし、Ａ液にＢ液を加えて均一になるまで攪拌する。攪拌しながら、５０℃まで冷却し、成分（７）を加え、クレンジングジェルを調製した。
（成分）                                          （重量％）
（１）モノミリスチン酸ヘキサグリセリル              ２０．０％
（２）流動パラフィン                                ５９．７％
（３）パラオキシ安息香酸エステル                      ０．３％
（４）混合物Ｄ                                        ５．０％
（５）濃グリセリン                                    ５．０％
（６）ソルビトール                                    ５．０％
（７）香料                                            ０．１％
（８）精製水                                          ４．９％【００３６】  （実施例５）パック剤
Ａ相、Ｂ相、Ｃ相をそれぞれ均一に溶解し、Ａ相にＢ相を加えて可溶化し、次いでＣ相を加えて均一に溶解し、製する。
（成分）                                          （重量％）
（Ａ相）ジプロピレングリコール                            ５．０％
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油                    ５．０％
（Ｂ相）オリーブ油                                        ５．０％
酢酸トコフェノール                                ０．２％
パラオキシ安息香酸エステル                        ０．２％
（Ｃ相）亜硫酸水素ナトリウム                              ０．０３％
ポリビニルアルコール                            １３．０％
混合物Ａ                                          １．０％
エタノール                                        ７．０％
精製水                                          ６３．７７％【００３７】  （実施例６）乳化型ファンデーション
下記成分（１）〜（６）を充分に混合粉砕した粉末部をＡとし、（７）（８）をＢ液、（９）〜（１２）及び（１４）をＣ液とする。Ｃ液を加熱攪拌後、Ａを添加しホモミキサー処理し、さらに過熱混合したＢ液を加えてホモミキサー処理する。攪拌しながら５０℃まで冷却し、（１３）を加え、さらに室温まで冷却して製する。
（成分）                                          （重量％）
（１）二酸化チタン                                  １０．３％
（２）セリサイト                                      ５．４％
（３）カオリン                                        ３．０％
（４）黄色酸化鉄                                      ０．７％
（５）ベンガラ                                        ０．４％
（６）黒色酸化鉄                                      ０．２％
（７）デカメチルシクロペンタシロキサン              １１．５％
（８）流動パラフィン                                  ８．５％
（９）セスキオレイン酸ソルビタン                      ３．０％
（１０）混合物Ｂ                                        １．５％
（１１）１，３−ブチレングリコール                      ５．０％
（１２）パラオキシ安息香酸エステル                      ０．２％
（１３）香料                                            ０．２％
（１４）精製水                                        ５０．１％【００３８】  （実施例７）固形ファンデーション
下記成分（１）〜（７）をブレンダーで均一に混合し、これに（８）〜（１４）を加え、よく混練して製する。
（成分）                                          （重量％）
（１）タルク                                        ４１．９％
（２）カオリン                                      １８．５％
（３）セリサイト                                    １４．０％
（４）二酸化チタン                                    ３．８％
（５）黄色酸化鉄                                      ２．９％
（６）ベンガラ                                        ０．５％
（７）黒色酸化鉄                                      ０．２％
（８）スクワラン                                      ８．０％
（９）イソステアリン酸                                  ４．０％
（１０）モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン      ３．０％
（１１）オクタン酸イソセチル                            ２．０％
（１２）混合物Ｄ                                        １．０％
（１３）パラオキシ安息香酸エステル                      ０．１％
（１４）香料                                            ０．１％【００３９】  （実施例８）ヘアートニック
下記成分（５）に（１）〜（４）及び（７）を加え、攪拌溶解した後、（６）及び（８）を加えてさらに攪拌して製する。
（成分）                                          （重量％）
（１）グリセリン                                      ３．０％
（２）Ｌ−メントール                                  ０．１％
（３）センブリエキス                                  ２．０％
（４）混合物Ｃ                                        ５．０％
（５）エタノール                                    ５３．０％
（６）香料                                            ０．２％
（８）精製水                                        ３６．７％【００４０】  （実施例９）シャンプー
下記成分を加温均一に混合し製する。
（成分）                                          （重量％）
（１）Ｎ−ヤシ油脂肪酸グルタミン酸トリエタノール    ２５．０％
アミン
（２）ラウリン酸ジエタノールアミド                    ５．０％
（３）ミリスチン酸カリウム                            ５．０％
（４）ジステアリン酸エチレングリコール                ２．０％
（５）ポリエチレングリコール４００                  １５．０％
（６）ホホバ油                                        １．０％
（７）混合物Ｄ                                        ３．０％
（８）クロルキシレノール                              ０．１％
（９）ビタミンＥ                                      ０．１％
（１０）パラオキシ安息香酸エステル                      ０．２％
（１１）香料                                            ０．３％
（１２）精製水                                        ４３．３％【００４１】  （実施例１０）浴用剤
（成分）                                          （重量％）
（１）乾燥硫酸ナトリウム                            ４０．０％
（２）炭酸水素ナトリウム                            ５７．５％
（３）オリーブ油                                      ０．２％
（４）混合物Ｃ                                        ０．１％
（５）軽質無水ケイ酸                                  ０．３％
（６）香料                                            １．７％
（７）黄色２０２号の（１）                            ０．２％【００４２】  （試験例２）使用効果試験
本発明の皮膚外用剤を使用した場合の効果試験を行った。使用テストは、乾燥、シワ、つや・張りのない肌で悩む女性２０名（２１〜４３歳）をパネラーとして、毎日朝夕の２回、洗顔後に１０名には実施例３の乳液適量を３ケ月間塗布した。また対照として１０名には、混合物Ｃを精製水に置き換えたものを使用した。評価方法は、下記の基準で行い、結果を表２に記載した。使用期間中に皮膚の異常を訴えた者はなかった。【００４３】  「キメ細かさ」
有効              ：ファンデーションののりが良くなった
やや有効          ：ファンデーションののりがやや良くなった
無効または不明    ：使用前と変化なし、またはわからない【００４４】
【表２】
2007320950.tif 000003