(57)【要約】      （修正有）【課題】病理学的状態に関与するＴＮＦに類似したサイトカインを提供する。【解決手段】毒素タンパク質に融合されたニュートロカイン−αタンパク質を含む単離されたタンパク質であって、該ニュートロカイン−αタンパク質は、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたタンパク質：（ａ）特定のアミノ酸残基のアミノ酸配列；（ｂ）前記特定のアミノ酸残基と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列；および（ｃ）前記特定のポリペプチドの一部分のアミノ酸配列であって、該一部分は、少なくとも３０アミノ酸長さであり、Ｂ細胞増殖を刺激することができる、アミノ酸配列。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
毒素タンパク質に融合されたニュートロカイン−αタンパク質を含む単離されたタンパク質であって、該ニュートロカイン−αタンパク質は、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたタンパク質：
（ａ）配列番号２のアミノ酸残基１３４〜２８５のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸残基１３４〜２８５と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列；および
（ｃ）配列番号２のポリペプチドの一部分のアミノ酸配列であって、該一部分は、少なくとも３０アミノ酸長さであり、Ｂ細胞増殖を刺激することができる、アミノ酸配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のサイトカイン（これは、ニュートロカインαタンパク質（「ニュートロカインα」）と称されている）に関する。さらに、ニュートロカインαの見かけのスプライシング改変体が同定され、ニュートロカインαＳＶと名付けられた。特定の実施形態において、本発明は、ニュートロカインαポリペプチドおよびニュートロカインαＳＶポリペプチドをコードする核酸を提供する。さらなる実施形態において、ニュートロカインαポリペプチドおよびニュートロカインαＳＶポリペプチドはまた、ベクター、宿主細胞、およびこれを産生する組換え方法として提供される。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術）
ヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）および（ＴＮＦ−β、またはリンホトキシン）は、ポリペプチドメディエーターの幅広いクラスの関連メンバーであり、このクラスはインターフェロン、インターロイキン、および増殖因子を含み、総称してサイトカインと呼ばれる（Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｂ．およびＣｅｒａｍｉ，Ａ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：６２５−６５５（１９８９））。サイトカインレセプターの配列分析は、以下の膜タンパク質のいくつかのサブファミリーを定義する：（１）Ｉｇスーパーファミリー、（２）ヘマトポエチン（サイトカインレセプタースーパーファミリー）、および（３）腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）／神経成長因子（ＮＧＦ）レセプタースーパーファミリー（ＴＮＦスーパーファミリーの概説については、ＧｒｕｓｓおよびＤｏｗｅｒ，Ｂｌｏｏｄ８５（１２）：３３７８−３４０４（１９９５）、ならびにＡｇｇａｒｗａｌおよびＮａｔａｒａｊａｎ，Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．，７（２）：９３−１２４（１９９６）を参照のこと）。ＴＮＦ／ＮＧＦレセプタースーパーファミリーは、少なくとも１０の異なったタンパク質を含む。ＧｒｕｓｓおよびＤｏｗｅｒ、前出。これらのレセプターのリガンドは同定され、そして少なくとも２つのサイトカインスーパーファミリーに属する。ＧｒｕｓｓおよびＤｏｗｅｒ、前出。
【０００３】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βの混合物）は、もともとその抗腫瘍活性の結果として発見されたが、現在は、いくつかの形質転換細胞株のアポトーシス、細胞の活性化および細胞増殖の媒介を含む、ならびにまた免疫調節および炎症における重要な役割を果たすような、多数の生物学的活性が可能な多面的なサイトカインとして認識されている。
【０００４】
今日まで、ＴＮＦリガンドスーパーファミリーの既知のメンバーには、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β（リンホトキシン−α）、ＬＴ−β、ＯＸ４０Ｌ、Ｆａｓリガンド、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、および４−ＩＢＢＬが含まれる。ＴＮＦリガンドスーパーファミリーのリガンドは、酸性の、細胞外ドメインにおいて約２０％の配列相同性（１２％〜３６％の範囲）を有するＴＮＦ様分子であり、そして三量体／多量体複合体である生物学的活性形態を有する膜結合形態として主に存在する。ＴＮＦリガンドスーパーファミリーの溶解性形態は、これまでＴＮＦ、ＬＴ−β、およびＦａｓリガンドについて同定されているのみであり（一般的な概説として、Ｇｒｕｓｓ，Ｈ．およびＤｏｗｅｒ，Ｓ．Ｋ．，Ｂｌｏｏｄ，  ８５（１２）：３３７８−３４０４（１９９５）を参照のこと、これは、本明細書中でその全体が参考として援用される）。これらのタンパク質は、細胞増殖、活性化および分化の調節（細胞生存またはアポトーシスもしくは細胞傷害性による細胞死の制御を含む）に関与する（Ａｒｍｉｔａｇｅ，Ｒ．Ｊ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：４０７（１９９４）、およびＳｍｉｔｈ，Ｃ．Ａ．，Ｃｅｌｌ  ７５：９５９（１９９４））。
【０００５】
腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα；カケクチンとも称される；本明細書中以下「ＴＮＦ」）は、１７ｋＤタンパク質サブユニットの可溶性ホモ三量体としてエンドトキシンまたは他の刺激の応答して単球およびマクロファージによって主に分泌される（Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：６９５１−６９５４（１９８７））。ＴＮＦの膜結合２６ｋＤ前駆体形態もまた記載されている（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ  ５３：４５−５３（１９８８））。
【０００６】
蓄積した証拠は、ＴＮＦが多面的な生物学的活性を有する調節性サイトカインであることを示す。これらの活性には以下が含まれる：リポタンパク質リパーゼ合成（「カケクチン」活性）の阻害（Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１６：５５２（１９８５））、多形核白血球の活性化（Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ，Ｓ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：４２２０（１９８６）；Ｐｅｒｕｓｓｉａ，Ｂら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：７６５（１９８７））、細胞増殖の阻害または細胞増殖の刺激（Ｖｉｌｃｅｋ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６３：６３２（１９８６）；Ｓｕｇａｒｍａｎ，Ｂ．Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９４３（１９８５）；Ｌａｃｈｍａｎ，Ｌ．Ｂ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：２９１３（１９８７））、特定の形質転換細胞型における細胞傷害性活性（Ｌａｃｈｍａｎ，Ｌ．Ｂ．ら、前出；Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ，Ｚ．ら、Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４４：８３（１９８４））、抗ウイルス活性（Ｋｏｈａｓｅ，Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ  ４５：６５９（１９８６）；Ｗｏｎｇ，Ｇ．Ｈ．Ｗ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２３：８１９（１９８６））、骨再吸収刺激（Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ，Ｄ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１９：５１６（１９８６）；Ｓａｋｌａｔｖａｌａ，Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：５４７（１９８６））、コラゲナーゼおよびプロスタグランジンＥ２産生の刺激（Ｄａｙｅｒ，Ｊ．−Ｍ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６２：２１６３（１９８５））；および免疫調節作用（Ｔ細胞（Ｙｏｋｏｔａ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：５３１（１９８８））、Ｂ細胞（Ｋｅｈｒｌ，Ｊ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：７８６（１９８７））、単球（Ｐｈｉｌｉｐ，Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２３：８６（１９８６））、胸腺細胞（Ｒａｎｇｅｓ，Ｇ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：１４７２（１９８８））の活性化、ならびに主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよびクラスＩＩ分子の細胞表面発現の刺激（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｔ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：４４６（１９８６）；Ｐｕｊｏｌ−Ｂｏｒｒｅｌ，Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２６：３０４（１９８７））を含む）。
【０００７】
ＴＮＦは、以下のような組織傷害を生じるそのプロ炎症性作用について示されている：血管内皮細胞における凝血促進活性の誘導（Ｐｏｂｅｒ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：１６８０（１９８６））、好中球およびリンパ球の増強した接着（Ｐｏｂｅｒ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：３３１９（１９８７））、ならびにマクロファージ、好中球、および血管内皮細胞からの血小板活性化因子の放出の刺激（Ｃａｍｕｓｓｉ，Ｇ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３９０（１９８７））。
【０００８】
最近の証拠は、ＴＮＦを、多くの感染（Ｃｅｒａｍｉ，Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ９：２８（１９８８））、免疫障害、腫瘍性症状（例えば、いくつかの悪性を伴う悪液性における）（Ｏｌｉｆｆ．Ａ．ら、Ｃｅｌｌ  ５０：５５５（１９８７））の病因、ならびに自己免疫症状および移植片対宿主症状（Ｐｉｇｕｅｔ，Ｐ．−Ｆ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１２８０（１９８７））に関連づける。ガンおよび感染症状とのＴＮＦの関連は、しばしば宿主異化状態に相関する。ガン患者の主な問題は体重の減少であり、通常食欲不振と関連する。生じる大規模な衰弱は、「悪液質」として知られる（Ｋｅｒｎ，Ｋ．Ａ．ら、Ｊ．Ｐａｒｅｎｔ．Ｅｎｔｅｒ．Ｎｕｔｒ．１２：２８６−２９８（１９８８））。悪液質は、進行性の体重減少、食欲不振、および悪性増殖の応答における体重の持続性衰退を含む。従って、悪液性状態は顕著な死亡率と関連し、そして多数のガン死亡率の原因である。多数の研究が、ＴＮＦが、ガン、感染症状、および他の異化状態における悪液質の重要なメディエーターであることを示唆している。
【０００９】
ＴＮＦは、発熱、倦怠感、摂食障害、および悪液質を含む、グラム陰性敗血症およびエンドトキシン性ショック（Ｍｉｃｈｉｅ，Ｈ．Ｒ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．７６：６７０−６７１（１９８９）；Ｄｅｂｅｔｓ，Ｊ．Ｍ．Ｈ．ら、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｖｉｅｎｎａ  Ｓｈｏｃｋ  Ｆｏｒｕｍ，４６３−４６６頁（１９８９）；Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｓ．Ｑ．ら、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｃｌｉｎ．５：２７−４７（１９８９））の病理生理学的結果における中心的役割を果たすと考えられている。エンドトキシンは、強力な単球／マクロファージアクチベーターであり、これは、ＴＮＦの産生および分泌（Ｋｏｒｎｂｌｕｔｈ，Ｓ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：２５８５−２５９１（１９８６））、ならびに他のサイトカインを刺激する。ＴＮＦは、エンドトキシンの多くの生物学的効果を模倣し得るので、エンドトキシン関連病の臨床的徴候に応答可能な中心的メディエーターであると結論付けられた。ＴＮＦおよび他の単球誘導性サイトカインは、エンドトキシンに対する代謝性応答および神経ホルモン性応答を媒介する（Ｍｉｃｈｉｅ，Ｈ．Ｒ．ら、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１８：１４８１−１４８６（１９８８））。ヒトボランティアへのエンドトキシンの投与は、発熱、頻脈、代謝速度の上昇、およびストレスホルモン放出を含むインフルエンザ様症状を伴う急病を生じる（Ｒｅｖｈａｕｇ，Ａ．ら、Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ．１２３：１６２−１７０（１９８８））。循環性ＴＮＦの上昇したレベルはまた、グラム陰性敗血症に罹患した患者において見い出されている（Ｗａａｇｅ，Ａ．ら、Ｌａｎｃｅｔ  １：３５５−３５７（１９８７）；Ｈａｍｍｅｒｌｅ，Ａ．Ｆ．ら、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｖｉｅｎｎａ  Ｓｈｏｃｋ  Ｆｏｒｕｍ  ７１５−７１８頁、（１９８９）；Ｄｅｂｅｔｓ，Ｊ．Ｍ．Ｈ．ら、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１７：４８９−４９７（１９８９）；Ｃａｌａｎｄｒａ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．１６１：９８２−９８７（１９９０））。
【００１０】
ＴＮＦの中和に指向される受動的免疫治療は、上記のようにこれらの病理状態における増大したＴＮＦ産生および上昇したＴＮＦレベルに基づく、グラム陰性敗血症および内毒素血症における有益な効果を有し得る。カケクチン（後にＴＮＦと同一であることが見い出された）として特徴付けられた「モジュレーター」物質に対する抗体は、Ｃｅｒａｍｉらによって開示された（欧州特許公開０，２１２，４８９、１９８７年３月４日）。このような抗体は、診断的免疫アッセイにおいて、および細菌性感染におけるショックの治療において有用であるといわれた。Ｒｕｂｉｎら（欧州特許公開０，２１８，８６８、１９８７年４月２２日）は、ヒトＴＮＦに対するモニクローナル抗体、このような抗体を分泌するハイブリドーマ、このような抗体を産生する方法、ならびにＴＮＦの免疫アッセイにおけるこのような抗体の使用を開示した。Ｙｏｎｅら（欧州特許公開０，２８８，０８８、１９８８年１０月２６日）は、抗ＴＮＦ抗体（ｍＡｂを含む）および症状の免疫アッセイ診断における（特に川崎病の症状および細菌感染）それらの有用性を開示した。川崎病の症状を有する患者の体液（小児急性熱病粘膜皮膚リンパ節症候群；Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｔ．，Ａｌｌｅｒｇｙ  １６：１７８（１９６７）；Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｔ．，Ｓｈｏｎｉｃａ（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ）２６：９３５（１９８５））は、症状の進行に関連して上昇したＴＮＦレベルを有するといわれた（Ｙｏｎｅら、前出）。
【００１１】
他の研究者はインビトロでの活性を中和した組換えヒトＴＮＦに特異的なｍＡｂを記載した（Ｌｉａｎｇ，Ｃ−Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１３７；８４７−８５４（１９８６）；Ｍｅａｇｅｒ，Ａ．ら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ６：３０５−３１１（１９８７）；Ｆｅｎｄｌｙら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ６：３５９−３６９（１９８７）；Ｂｒｉｎｇｍａｎ，Ｔ  Ｓら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ６：４８９−５０７（１９８７）；Ｈｉｒａｉ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．９６：５７−６２（１９８７）；Ｍｏｌｌｅｒ，Ａ．ら（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ２：１６２−１６９（１９９０）））。これらのｍＡｂのいくつかは、ヒトＴＮＦのエピトープをマッピングし、酵素免疫アッセイを開発する（Ｆｅｎｄｌｙら、前出；Ｈｉｒａｌら、前出；Ｍｏｌｌｅｒら、前出）ため、および組換えＴＮＦの精製において補助する（Ｂｒｉｎｇｍａｎら、前出）ために使用された。しかし、これらの研究は、免疫原性、特異性の欠除、および／または薬学的適合性に起因して、ヒトにおけるインビボ診断的使用または治療的使用のために使用され得る抗体を中和するＴＮＦを産生するための基礎を提供しない。
【００１２】
中和抗血清またはＴＮＦに対するｍＡｂは、ヒト以外の哺乳動物において、有害な生理学的変化を排除し、そして実験的な内毒症および菌血症における致死的チャレンジ後の死を予防することが示されている。この効果は、例えば、げっ歯類致死率アッセイにおいて、および霊長類病理学モデル系において実証されている（Ｍａｔｈｉｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８１：１９２５−１９３７（１９８８）；Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８６９−８７１（１９８５）；Ｔｒａｃｅｙ，Ｋ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３０：６６２−６６４（１９８７）；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，Ｙ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７：３１１−３１８（１９８８）；Ｓｉｌｖａ，Ａ．Ｔ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６２：４２１−４２７（１９９０）Ｏｐａｌ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６１：１１４８−１１５２（１９９０）；Ｈｉｎｓｈａｗ，Ｌ．Ｂ．ら、Ｃｉｒｃ．Ｓｈｏｃｋ  ６０：２７９−２９２（１９９０））。
【００１３】
今日までに、ヒトにおける抗ＴＮＦ  ｍＡｂ治療の経験は限られているが、有用な治療結果が示されている（例えば、関節炎および敗血症）。例えば、Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ  Ｃｌｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．  ９：６３３−５２（１９９５）；Ｆｅｌｄｍａｎｎ  Ｍら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６６：２７２−８（１９９５）；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｌｌ，Ｔ．ら、Ｓｈｏｃｋ  ３：１−１２（１９９５）；Ｗｈｅｒｒｙら、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ．Ｍｅｄ．２１：Ｓ４３６−４０（１９９３）；Ｔｒａｃｅｙ  Ｋ．Ｊ．ら、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２１：Ｓ４１５−２２（１９９３）を参照のこと。
【００１４】
哺乳動物の発生は、細胞の増殖および分化の両方ならびにアポトーシスの間におこるプログラムされた細胞死に依存する（Ｗａｌｋｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｃｈｉｅｖ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．１３：１８（１９８８））。アポトーシスは、自己抗原を認識する免疫胸腺細胞の破壊において重要な役割を担う。この正常な除去プロセスの失敗は、自己免疫疾患における役割を果たし得る（Ｇａｍｍｏｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １２：１９３（１９９１））。
【００１５】
Ｉｔｏｈら（Ｃｅｌｌ  ６６：２３３（１９９１））は、アポトーシスを媒介し、そしてＴ細胞のクローン性欠失に関与する、細胞表面抗原、Ｆａｓ／ＣＤ２３を記載する。Ｆａｓは、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球に加えて、成体マウスにおける活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球において、ならびに胸腺、肝臓、心臓、および肺ならびに卵巣において、発現される（Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕｎａｇａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１２７４（１９９２））。モノクローナルＡｂがＦａｓに架橋される実験において、アポトーシスは誘導される（Ｙｏｎｅｈａｒａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１７４７（１９８９）；Ｔｒａｕｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５：３０１（１９８９））。さらに、ＦａｓへのモノクローナルＡｂの結合は特定の条件下でＴ細胞に対して刺激性である例がある（Ａｌｄｅｒｓｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：２２３１（１９９３））。
【００１６】
Ｆａｓ抗原は、４５Ｋｄの相対分子量の細胞表面タンパク質である。Ｆａｓのヒトおよびマウス両方の遺伝子は、Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕｎａｇａらによってクローン化されている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１２７４（１９９２）およびＩｔｏｈら（Ｃｅｌｌ  ６６：２３３（１９９１））。これらの遺伝子によってコードされるタンパク質は、神経成長因子／腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリー（２つのＴＮＦレセプター、低親和性神経成長因子レセプター、ならびにＣＤ４０、ＣＤ２７、ＣＤ３０、およびＯＸ４０を含む）に構造的相同性を有する両方の膜貫通タンパク質である。
【００１７】
最近、Ｆａｓリガンドが記載されている（Ｓｕｄａら、Ｃｅｌｌ  ７５：１１６９（１９９３））。このアミノ酸配列は、ＦａｓリガンドがＴＮＦファミリーに属するＩＩ型膜貫通タンパク質であることを示す。従って、Ｆａｓリガンドポリペプチドは、３つの主要ドメインを含む：疎水性膜貫通ドメインによって結合された、アミノ末端での短い細胞内ドメインおよびカルボキシ末端での長い細胞外ドメイン。Ｆａｓリガンドは脾臓細胞および胸腺細胞において発現され、Ｔ細胞媒介性細胞傷害性と一致する。精製Ｆａｓリガンドは４０ｋＤの分子量を有する。
【００１８】
最近では、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド相互作用がＴ細胞の活性化後のアポトーシスに必要とされることが示されている（Ｊｕら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７３：４４４（１９９５）；Ｂｒｕｎｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７３：４４１（１９９５））。Ｔ細胞の活性化は、細胞表面上の両タンパク質を誘導する。リガンドとレセプター間の続く相互作用は、細胞のアポトーシスを生じる。これは、正常な免疫応答の間の、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド相互作用によって誘導されるアポトーシスへの可能な調節的役割を支持する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
従って、病理学的状態に関与するＴＮＦに類似したサイトカインを提供する必要がある。このような新規のサイトカインは、ＴＮＦ様サイトカインに関連した障害の診断および治療のためにこれらのＴＮＦ様サイトカインを結合する新規の抗体または他のアンタゴニストを作成するために使用され得る。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
（発明の要旨）
本発明の１つの実施形態に従って、ニュートロカインαポリペプチドの新規な細胞外ドメインおよびニュートロカインαＳＶポリペプチドの新規な細胞外ドメイン、ならびにそれらの生物学的に活性なかつ診断的または治療的に有用なフラグメント、アナログ、および誘導体が提供される。
【００２１】
本発明の別の実施形態に従って、ヒトのニュートロカインαまたはニュートロカインαＳＶ（ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ならびにそれらのアナログおよび生物学的に活性なかつ診断的または治療的に有用なフラグメント、および誘導体を含む）をコードする単離された核酸分子が提供される。
【００２２】
本発明は、ＴＮＦおよび関連サイトカインに構造的に類似し、そして類似の生物学的効果および活性を有するサイトカインおよび見かけのスプライシング改変体をコードするポリヌクレオチドを含むか、あるいはそれらからなる単離された核酸分子を提供する。このサイトカインは、ニュートロカインαと命名され、そして本発明は、少なくとも図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）におけるアミノ酸配列（配列番号２）または１９９６年１０月２２日に寄託されＡＴＣＣ番号９７７６８を割り当てられたｃＤＮＡクローン（ＨＮＥＤＵ１５）によってコードされるアミノ酸配列の一部を含むニュートロカインαポリペプチドを含む。寄託されたニュートロカインαクローンの配列決定により決定されたヌクレオチド配列（これは、図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号１）に示される）は、Ｎ末端メチオニン、約４６アミノ酸残基の推定細胞内ドメイン、約２６アミノ酸の推定膜貫通ドメイン、約２１３アミノ酸の推定細胞外ドメイン、および約３１ｋＤａの完全タンパク質についての推定分子量を含む２８５アミノ酸残基の完全ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む。他のＩＩ型膜貫通タンパク質について、ニュートロカインαの可溶型は、膜貫通ドメインから切断された細胞外ドメインのすべてまたは一部、および膜貫通ドメインを欠く完全ニュートロカインαポリペプチドを含むポリペプチド（すなわち、細胞内ドメインに結合した細胞外ドメイン）を含む。
【００２３】
ニュートロカインαの見かけのスプライシング改変体は、ニュートロカインαＳＶと名付けられ、そして本発明は、表５Ａおよび表５Ｂ（配列番号１９）におけるアミノ酸配列の少なくとも一部、または１９９８年１２月１０日に寄託されＡＴＣＣ番号２０３５１８を割り当てられたｃＤＮＡクローン（ＨＤＰＭＣ５２）によってコードされるアミノ酸配列を含むか、またはさもなくばそれらの配列からなるニュートロカインαＳＶポリペプチドを含む。寄託されたニュートロカインαＳＶクローンの配列決定により決定されたヌクレオチド配列（これは、図５Ａおよび図５Ｂ（配列番号１８）に示される）は、Ｎ末端メチオニン、約４６アミノ酸残基の推定細胞内ドメイン、約２６アミノ酸の推定膜貫通ドメイン、約１９４アミノ酸の推定細胞外ドメイン、および約２９ｋＤａの完全タンパク質についての推定分子量を含む２６６アミノ酸残基の完全ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む。他のＩＩ型膜貫通タンパク質について、ニュートロカインＳＶαの可溶型は、膜貫通ドメインから切断された細胞外ドメインのすべてまたは一部、および膜貫通ドメインを欠く完全ニュートロカインαＳＶポリペプチドを含むポリペプチド（すなわち、細胞内ドメインに結合した細胞外ドメイン）を含む。
【００２４】
従って、本発明の１つの実施形態は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいはそれらからなる単離された核酸分子を提供する：（ａ）図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）におけるか、またはＡＴＣＣ寄託番号９７７６８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるとおりの完全アミノ酸配列を有する全長ニュートロカインαポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）におけるか、またはＡＴＣＣ寄託番号９７７６８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるとおりのアミノ酸配列７３位〜２８５位を有するニュートロカインαポリペプチドの推定細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）ニュートロカインαの機能的活性（例えば、生物学的活性）を有する（ｂ）のポリペプチドのフラグメントをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）ニュートロカインαの細胞内ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）におけるか、またはＡＴＣＣ寄託番号９７７６８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるとおりの約１〜約４６のアミノ酸残基を構成すると推定される）；（ｅ）ニュートロカインαの膜貫通ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）におけるか、またはＡＴＣＣ寄託番号９７７６８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるとおりの約４７〜約７２のアミノ酸残基を構成すると推定される）；（ｆ）細胞外ドメインおよび細胞内ドメイン有するが膜貫通ドメインを欠く可溶性ニュートロカインαポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および（ｇ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）におけるヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
【００２５】
本発明のさらなる実施形態は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）または（ｇ）におけるヌクレオチド配列のいずれかに対して、少なくとも８０％、８５％、または９０％同一の、およびより好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、あるいは上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）または（ｇ）におけるポリヌクレオチドに対してストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらのヌクレオチドからなる単離された核酸分子を含む。ハイブリダイズするこのポリヌクレオチドは、Ａ残基またはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに対してはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下ではハイブリダイズしない。
【００２６】
本発明の別の実施形態は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいはそれらからなる単離された核酸分子を提供する：（ａ）図５Ａおよび図５Ｂ（配列番号１９）におけるか、またはＡＴＣＣ寄託番号２０３５１８として１９９８年１２月１０日に寄託されたＡＴＣＣ寄託物に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるとおりの完全アミノ酸配列を有する全長ニュートロカインαＳＶポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）におけるか、または１９９８年１２月１０日に寄託されたＡＴＣＣ寄託番号２０３５１８に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるとおりのアミノ酸配列７３位〜２８５位のアミノ酸配列を有するニュートロカインαＳＶポリペプチドの推定細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）ニュートロカインαＳＶの細胞内ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（図５Ａおよび図５Ｂ（配列番号１９）におけるか、または１９９８年１２月１０日に寄託されたＡＴＣＣ番号２０３５１８に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるとおりの約１〜約４６のアミノ酸残基を構成すると推定される）；（ｄ）ニュートロカインαＳＶの膜貫通ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（図５Ａおよび図５Ｂ（配列番号１９）におけるか、または１９９８年１２月１０日に寄託されたＡＴＣＣ番号２０３５１８に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるとおりの約４７〜約７２のアミノ酸残基を構成すると推定される）；（ｅ）細胞外ドメインおよび細胞内ドメイン有するが膜貫通ドメインを欠く可溶性ニュートロカインαＳＶポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および（ｆ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）におけるヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
【００２７】
本発明のさらなる実施形態は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）におけるヌクレオチド配列のいずれかに対して、少なくとも８０％、８５％、または９０％同一の、およびより好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、あるいは上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）におけるポリヌクレオチドに対してストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらのヌクレオチドからなる単離された核酸分子を含む。ハイブリダイズするこのポリヌクレオチドは、Ａ残基またはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに対してはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下ではハイブリダイズしない。
【００２８】
１つの実施形態において、ニュートロカインαの見かけのスプライシング改変体は、図５Ａおよび図５Ｂ（配列番号１９）に示されるか、または１９９８年１２月１０日に寄託され、そしてＡＴＣＣ寄託番号２０３５１８を付与されたｃＤＮＡクローンＨＤＰＭＣ５２によりコードされるＧｌｙ−１４２〜Ｌｅｕ−２６６のアミノ酸配列の少なくとも一部を含むか、あるいはそれらからなる。
【００２９】
さらなる実施形態において、本発明の核酸分子は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｆ）または（ｇ）におけるアミノ酸配列を有するニュートロカインαポリペプチドまたはニュートロカインαＳＶポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むか、あるいはそれからなる。本発明のさらなる核酸の実施形態は、単離された核酸分子に関し、その核酸分子は、ニュートロカインαポリペプチドまたはニュートロカインαＳＶポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むか、またはそれからなり、そのポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸付加、置換、および／または欠失であるが、５０を超えないアミノ酸付加、置換、および／または欠失、なおより好ましくは、４０を超えないアミノ酸付加、置換、および／または欠失、なおさらに好ましくは、３０を超えないアミノ酸付加、置換、および／または欠失、ならびになおさらにより好ましくは、２０を超えないアミノ酸付加、置換、および／または欠失を含む、アミノ酸配列を有する。当然、増加する優先度の順番に、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、もしくは１、または１−１００、１−５０、１−２５、１−２０、１−１５、１−１０、もしくは１−５を超えないアミノ酸付加、置換、および／または欠失を含むアミノ酸配列を有することは、ニュートロカインαポリペプチドまたはニュートロカインαＳＶポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドについて、非常に好ましい。保存性置換が好ましい。
【００３０】
本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクター、およびこの組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにこのようなベクターおよび宿主細胞を作製するための方法ならびに組換え技術によりニュートロカインαポリペプチドの産生のためにこれらを使用する方法に関する。
【００３１】
本発明のさらなる実施形態に従って、組換え技術によってこのようなポリペプチドを産生するためのプロセスが提供され、このプロセスは、上記ポリペプチドの発現および上記ポリペプチドの引き続く回収を促進する条件下で、組換え原核生物宿主細胞および／または組換え真核生物宿主細胞を培養する工程を包含し、これらの宿主細胞は、本発明のニュートロカインαまたはニュートロカインαＳＶの核酸配列を含む。
【００３２】
本発明はさらに、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなる単離されたニュートロカインαポリペプチドを提供する：（ａ）図１Ａおよび図１Ｂ（すなわち、配列番号２の１−２８５位）に示されるか、またはＡＴＣＣ寄託番号９７７６８を有する寄託物中に含まれるｃＤＮＡプラスミドによりコードされるとおりの完全アミノ酸配列を有する完全長ニュートロカインαポリペプチドのアミノ酸配列；（ｂ）Ｎ末端メチオニン以外の配列番号２に示される完全アミノ酸配列を有する全長ニュートロフィンαポリペプチドのアミノ酸配列（すなわち、配列番号２の２位〜２８５位）；（ｃ）ニュートロカインαの機能的活性（例えば、生物学的活性）を有する（ｂ）のポリペプチドのフラグメント；（ｄ）図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）におけるか、ＡＴＣＣ寄託番号９７７６８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡプラスミドによってコードされるとおりの７３位〜２８５位のアミノ酸配列を有するニュートロカインαポリペプチドの推定細胞外ドメインのアミノ酸配列；（ｅ）図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）における１３４位〜２８５位のアミノ酸配列を有するニュートロカインαポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）ニュートロカインα細胞内ドメインのアミノ酸配列（図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）におけるか、ＡＴＣＣ寄託番号９７７６８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡプラスミドによってコードされるとおりのおよそ１位〜およそ４６位のアミノ酸残基を構成すると推定される）；（ｇ）ニュートロカインα膜貫通ドメインのアミノ酸配列（図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）におけるか、ＡＴＣＣ寄託番号９７７６８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡプラスミドによってコードされるとおりのおよそ４７位〜およそ７２位のアミノ酸残基を構成すると推定される）；（ｈ）細胞外ドメインおよび細胞内ドメインを有するが膜貫通ドメインを欠く可溶性ニュートロカインαポリペプチドのアミノ酸配列、ここで、これらのドメインの各々は上記で定義される；および（ｉ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、または（ｈ）のペプチドのフラグメント。本発明のポリペプチドはまた、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、または（ｈ）に記載されるポリペプチドに対して少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％または９０％同一、およびなおより好ましくは、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに上記の配列に対して少なくとも８０％、８５％、または９０％の類似性、およびより好ましくは少なくとも９５％の類似性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。本発明のさらなる実施形態は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、または（ｈ）に記載されるアミノ酸配列を有するニュートロカインαポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなるポリペプチドに関する。本発明のニュートロカインαポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも��、少なくとも８、および好ましくは、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、およびより好ましくは、少なくとも約３０アミノ酸〜約５０のアミノ酸を有するこのようなポリペプチドの部分を含むが、上記の本発明のポリペプチドの全体のアミノ酸配列までの任意の長さでありそしてそれを含むエピトープ保有ペプチドもまた、本発明において含まれる。
【００３３】
本発明の高度に好ましい実施形態は、図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）における１３４位〜２８５位のアミノ酸を有するニュートロカインαポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％同一、およびより好ましくは、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいは、そのポリペプチドからなる、核酸分子に関する。本発明の好ましい実施形態は、図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）における１３４位〜２８５位のアミノ酸配列を有するニュートロカインαポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいは、そのポリヌクレオチドからなる核酸分子に関する。本発明のより好ましい実施形態は、図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）における１３４位〜２８５位のアミノ酸配列を有するニュートロカインαポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも９６％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいは、そのポリヌクレオチドからなる核酸分子に関する。
【００３４】
さらに、本発明のより好ましい実施形態は、図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）における１３４位〜２８５位のアミノ酸配列を有するニュートロカインαポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも９７％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいは、そのポリヌクレオチドからなる核酸分子に関する。さらに、本発明のより好ましい実施形態は、図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）における１３４位〜２８５位のアミノ酸配列を有するニュートロカインαポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいは、そのポリヌクレオチドからなる核酸分子に関する。さらに、本発明のより好ましい実施形態は、図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）における１３４位〜２８５位のアミノ酸配列を有するニュートロカインαポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいは、そのポリヌクレオチドからなる核酸分子に関する。
【００３５】
本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列に融合した上記のポリヌクレオチド配列を含む。これらのポリヌクレオチドおよび核酸分子によってコードされるポリペプチドもまた、本発明に含まれる。
【００３６】
本発明はさらに、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなる単離されたニュートロカインαＳＶポリペプチドを提供する：（ａ）図５Ａおよび図５Ｂ（すなわち、配列番号１９の１位〜２６６位）に示されるか、または１９９８年１２月１０日に寄託されたＡＴＣＣ寄託番号２０３５１８において含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるとおりの完全アミノ酸配列を有する完全長ニュートロカインαＳＶポリペプチドのアミノ酸配列；（ｂ）Ｎ末端メチオニン以外の配列番号１９に示される完全アミノ酸配列を有する完全長ニュートロフィンαＳＶポリペプチドのアミノ酸配列（すなわち、配列番号１９の２位〜２６６位）；（ｃ）図５Ａおよび図５Ｂ（配列番号１９）の７３位〜２６６位のアミノ酸配列、または１９９８年１２月１０日に寄託されたＡＴＣＣ寄託番号２０３５１８において含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるとおりのアミノ酸配列を有するニュートロカインαＳＶポリペプチドの推定細胞外ドメインのアミノ酸配列；（ｄ）ニュートロカインαＳＶの細胞内ドメインのアミノ酸配列（図５Ａおよび図５Ｂ（配列番号１９）のおよそ１位〜およそ４６位のアミノ酸配列、または１９９８年１２月１０日に寄託されたＡＴＣＣ寄託番号２０３５１８において含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるとおりのアミノ酸残基を構成すると推定される）；（ｅ）ニュートロカインαＳＶポリペプチドの膜貫通ドメインのアミノ酸配列（図５Ａおよび図５Ｂ（配列番号１９）のおよそ４７位〜およそ７２位のアミノ酸残基、または１９９８年１２月１０日に寄託されたＡＴＣＣ寄託番号２０３５１８において含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるとおりのアミノ酸残基を構成すると推定される）；（ｆ）細胞外ドメインおよび細胞内ドメインを含むが膜貫通ドメインを欠く可溶性ニュートロカインαＳＶポリペプチドのアミノ酸配列、ここで、これらのドメインの各々は上記で定義される；および（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）のペプチドのフラグメント。本発明のポリペプチドはまた、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）または（ｇ）に記載されるポリペプチドに対して少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％または９０％同一、およびなおより好ましくは、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに上記の配列に対して少なくとも８０％、８５％、または９０％の類似性、およびより好ましくは少なくとも９５％の類似性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。本発明のさらなる実施形態は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、または（ｇ）に記載されるアミノ酸配列を有するニュートロカインαＳＶポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなるポリペプチドに関する。本発明のニュートロカインαＳＶポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、および好ましくは、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、およびより好ましくは、少なくとも約３０アミノ酸〜約５０のアミノ酸を有するこのようなポリペプチドの部分を含むが、上記の本発明のポリペプチドの全体のアミノ酸配列までの任意の長さでありそしてそれを含むエピトープ保有ペプチドもまた、本発明において含まれる。
【００３７】
本発明の特定の非限定的な実施形態は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）または（ｉ）に記載されるアミノ酸配列を有するニュートロカインαポリペプチドまたはニュートロカインαＳＶポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。他の実施形態において、本発明は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）または（ｉ）に記載されるアミノ酸配列を有するニュートロカインαポリペプチドまたはニュートロカインαＳＶポリペプチドに特異的に（すなわち、独特に）結合する単離された抗体を提供する。
【００３８】
本発明はさらに、本明細書中上記のようなアミノ酸配列を有するニュートロカインαポリペプチドまたはニュートロカインαＳＶポリペプチドに特異的に（すなわち、独特に）結合する抗体を単離するための方法を提供する。このような抗体は、以下に記載するように診断的および治療的に有用である。
【００３９】
本発明はまた、可溶性のニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチド（特に、ヒトのニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチド）ならびに／あるいは抗ニュートロカインα抗体および／または抗ニュートロカインαＳＶ抗体を含む薬学的組成物を提供し、これらは、例えば、腫瘍の転移、細菌、ウイルス、および他の寄生体による感染、免疫欠損、炎症性疾患、リンパ節症、自己免疫疾患、対宿主性移植片病を処置、予防、予後判定、および／または診断するために、末梢耐性を刺激するために、いくつかの形質転換した細胞株を破壊するために、細胞の活性化、生存、および増殖を媒介するために、免疫調節および炎症性応答を媒介するために、および免疫応答を増強または阻害するために、使用され得る。
【００４０】
特定の実施形態において、本発明の可溶性ニュートロカインαポリペプチドおよび／または可溶性ニュートロカインαＳＶポリペプチド、あるいはそのアゴニストが、免疫欠損（重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）Ｘ連鎖、ＳＣＩＤ常染色体、アデノシンデアミナーゼ欠損（ＡＤＡ欠損）、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）、ブルートン病、先天性無ガンマグロブリン血症、Ｘ連鎖小児性低ガンマグロブリン血症、後天性無ガンマグロブリン血症、成人発症無ガンマグロブリン血症、遅発性発症無ガンマグロブリン血症、異常ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血症、新生児期の一過性低ガンマグロブリン血症、特定されていない低ガンマグロブリン血症、無ガンマグロブリン血症、分類不能型免疫不全（ＣＶＩＤ）（後天的）、ヴィスコット−オールドリッチ症候群（ＷＡＳ）、過剰のＩｇＭを伴うＸ連鎖免疫不全、過剰のＩｇＭを伴う非Ｘ連鎖免疫不全、選択的ＩｇＡ欠損、ＩｇＧサブクラス欠損（ＩｇＧ欠損を伴うかまたは伴わない）、正常なもしくは上昇したＩｇを伴う抗体欠損、胸腺腫を伴う免疫欠損、Ｉｇ重鎖欠失、κ鎖欠損、Ｂ細胞リンパ増殖性障害（ＢＬＰＤ）、選択的ＩｇＭ免疫不全、劣性無ガンマグロブリン血症（スイス型）、細網発育不全、新生児好中球減少、重症先天性白血球減少症、免疫欠損を伴う胸腺リンパ形成不全症−無形成症または形成異常症、毛細血管拡張性運動失調、短四肢小人症、Ｘ連鎖リンパ増殖症候群（ＸＬＰ）ネゼロフ症候群と組み合わせたＩｇＧを伴う免疫欠損、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ欠損（ＰＮＰ）、ＭＨＣクラスＩＩ欠損（不全リンパ球症候群）および重得な複合型免疫欠損）または免疫欠損に関連する状態。
【００４１】
特定の実施形態において、本発明のニュートロカインαポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、分類不能型免疫不全を処置、予防、予後判定、および／または診断するために投与される。
【００４２】
特定の実施形態において、本発明のニュートロカインαポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症を処置、予防、予後判定、および／または診断するために投与される。
【００４３】
別の特定の実施形態において、本発明のニュートロカインαポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）を処置、予防、予後判定、および／または診断するために投与される。
【００４４】
別の特定の実施形態において、本発明のニュートロカインαポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、ヴィスコット−オールドリッチ症候群を処置、予防、予後判定、および／または診断するために投与される。
【００４５】
別の特定の実施形態において、本発明のニュートロカインαポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、過剰のＩｇＭを伴うＸ連鎖Ｉｇ不全を処置、予防、予後判定、および／または診断するために投与される。
【００４６】
別の実施形態において、ニュートロカインαアンタゴニストおよび／またはニュートロカインαＳＶアンタゴニスト（例えば、抗ニュートロカインα抗体）は、自己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性新生児血小板減少、自己免疫性血球減少症、溶血性貧血、抗リン脂質症候群、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、心筋炎、再発性多発性軟骨炎、リウマチ性心疾患、糸球体腎炎（例えば、ＩｇＡ腎造影法）、多発性硬化症、神経炎、ブドウ膜炎眼結膜炎、多発性内分泌腺症、紫斑（ヘーノホ−シェーンライン紫斑病）、ライター病、スティッフマン症候群、自己免疫肺炎、ギヤン−バレー症候群、インスリン依存性糖尿病、および自己免疫炎症性眼、自己免疫性甲状腺炎、甲状腺機能低下症（すなわち、橋本甲状腺炎、グッドパスチャー症候群、天疱瘡、レセプター自己免疫（例えば、（ａ）グレーヴズ病、（ｂ）重症筋無力症、および（ｃ）インスリン抵抗性、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫血小板減少性紫斑病、抗コラーゲン抗体を伴う強皮症、混合結合組織病、多発性筋炎／皮膚筋炎、悪性貧血、突発性アジソン病、不妊症、一次性糸球体腎炎およびＩｇＡ腎症のような糸球体腎炎、水疱性類天疱瘡、シェーグレン病、糖尿病、およびアドレナリン作用性薬物耐性（喘息または嚢胞性線維症を伴うアドレナリン作用性薬物耐性を含む）、慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、他の内分泌腺不全、白斑、脈管炎、ＭＩ後、心臓切開症候群、じんま疹、アトピー性皮膚炎、喘息、炎症性ミオパシー、および他の炎症性、肉芽腫性、変性性、および萎縮性の障害を含む）または自己免疫疾患と関連する状態を処置、予防、予後判定、および／または診断するために投与される。特定の好ましい実施形態において、本発明の抗ニュートロカインα抗体および／もしくは抗ニュートロカインαＳＶ抗体ならびに／または他のアンタゴニストを使用して、慢性関節リウマチが処置、予防、予後判定、および／または診断される。別の特定の好ましい実施形態において、本発明の抗ニュートロカインα抗体および／もしくは抗ニュートロカインαＳＶ抗体ならびに／または他のアンタゴニストを使用して、全身性エリテマトーデスが処置、予防、予後判定、および／または診断される。別の特定の好ましい実施形態において、本発明の抗ニュートロカインα抗体および／もしくは抗ニュートロカインαＳＶ抗体ならびに／または他のアンタゴニストを使用して、特発性血小板減少性紫斑病が処置、予防、予後判定、および／または診断される。別の特定の好ましい実施形態において、本発明の抗ニュートロカインα抗体および／もしくは抗ニュートロカインαＳＶ抗体ならびに／または他のアンタゴニストを使用して、ＩｇＡ腎症が処置、予防、予後判定、および／または診断される。別の特定の好ましい実施形態において、抗ニュートロカインα抗体および／または抗ニュートロカインαＳＶ抗体を使用して、上記に引用した疾患および障害と関連する自己免疫疾患および障害および／または状態が、処置、予防、予後判定、および／または診断される。
【００４７】
本発明はさらに、細胞にインビトロで、細胞にエキソビボで、および細胞にインビボで、あるいは多細胞生物に投与するための、ニュートロカインαポリヌクレオチドもしくはニュートロカインαＳＶポリヌクレオチド、ニュートロカインαポリペプチドもしくはニュートロカインαポリペプチド、および／または抗ニュートロカインα抗体もしくは抗ニュートロカインαＳＶ抗体を含有する組成物を提供する。好ましい実施形態において、本発明の組成物は、疾患の処置のために、宿主生物中でニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドの発現のために、ニュートロカインαポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリヌクレオチドを含む。最も好ましい実施形態において、本発明の組成物は、免疫不全および／または免疫不全に関連する状態の処置のために、宿主生物中でニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドの発現のために、ニュートロカインαポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリヌクレオチドを含む。この点において、ニュートロカインα遺伝子またはニュートロカインαＳＶ遺伝子の異常な内因性活性に関連する機能不全の処置のためのヒト患者における発現（例えば、Ｂ細胞の数を増大させることまたはＢ細胞の寿命を増加させることによって正常なＢ細胞機能を増強させるための発現）が特に好ましい。
【００４８】
本発明はまた、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶによって誘導される細胞応答を増強または阻害し得る化合物を同定するためのスクリーニング方法を提供する。この方法は、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶを発現する細胞と候補化合物とを接触させる工程、細胞応答をアッセイする工程、および標準細胞応答に対する細胞応答を比較する工程を包含し、接触が候補化合物の非存在下で行われた場合に標準がアッセイされる；それによって、標準よりも高い増加した細胞応答は、その化合物がアゴニストであることを示し、そして標準よりも減少した細胞応答は、その化合物がアンタゴニストであることを示す。
【００４９】
別の実施形態において、ニュートロカインαレセプターおよび／またはニュートロカインαＳＶレセプターを同定するための方法、ならびにこのようなレセプターを使用するアゴニストおよびアンタゴニストについてのスクリーニングアッセイが提供される。このアッセイは、候補化合物が、ニュートロカインαレセプターおよび／またはニュートロカインαＳＶレセプターに結合するニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶに対して有する効果を決定する工程を含む。特に、この方法は、ニュートロカインαレセプターおよび／またはニュートロカインαＳＶレセプターを、本発明のニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドならびに候補化合物と接触させる工程、およびニュートロカインαレセプターおよび／またはニュートロカインαＳＶレセプターに結合するニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドが、候補化合物の存在によって増加したかまたは減少したかを決定する。アンタゴニストは、敗血症性ショック、炎症、大脳マラリア、ＨＩＶウイルスの活性化、移植片宿主拒絶、骨再吸収、慢性関節リウマチ、悪液質（るいそうまたは栄養失調）、免疫系機能、リンパ腫、および自己免疫障害（例えば、慢性関節リウマチおよび全身性エリテマトーデス）を予防するために使用され得る。
【００５０】
本発明者らは、ニュートロカインαが単球系列の細胞においてのみならず、腎臓、肺、末梢白血球、骨髄、Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、活性化Ｔ細胞、胃癌、平滑筋、マクロファージ、および臍帯血組織の細胞においてもまた発現することを見出した。本発明者らはさらに、ニュートロカインαＳＶが、一次樹状細胞においてのみ高度に発現されるらしいことを見出した。これらの組織および細胞の多数の障害について、例えば、腫瘍および腫瘍転移、細菌、ウイルスおよび他の寄生体の感染、免疫不全（例えば、慢性変動性免疫不全）、敗血症性ショック、炎症、大脳マラリア、ＨＩＶウイルスの活性化、移植片宿主拒絶、骨再吸収、慢性関節リウマチ、自己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチおよび全身性エリテマトーデス）、および悪液質（るいそうまたは栄養失調）。有意に高いかまたは低いニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの遺伝子発現のレベルは、「標準」のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの遺伝子発現のレベル（すなわち、そのような障害を有さない個体由来の組織または体液におけるニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの発現レベル）と比較して、そのような障害を有する個体から採られた特定の組織（例えば、骨髄）または体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液、または髄液）において検出され得ると考えられている。従って、本発明は、障害の診断の間に有用である診断方法を提供し、その方法は：（ａ）個体の細胞または体液におけるニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの遺伝子発現のレベルをアッセイする工程；（ｂ）そのニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの遺伝子発現のレベルを、標準のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの遺伝子発現のレベルと比較する工程、それによって標準の発現レベルと比較した、アッセイされたニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの遺伝子発現のレベルにおける増加または減少が、障害の指標である。
【００５１】
本発明のさらなる実施形態は、体内のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの上昇した活性レベルまたは構成的レベルを必要とする個体を処置するための方法であって、治療有効量の、本発明の単離されたニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドあるいはそのアゴニストを含む組成物をそのような個体に投与する工程を包含する方法に関する。
【００５２】
本発明のなおさらなる実施形態は、体内のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの活性レベルの減少を必要とする個体を処置するための方法であって、治療有効量の、ニュートロカインαアンタゴニストおよび／またはニュートロカインαＳＶアンタゴニストを含む組成物をそのような個体に投与する工程を包含する方法に関する。本発明における使用のための好ましいアンタゴニストは、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの特異的抗体である。
【００５３】
本発明はさらに、以下を提供する。
（項目１）  以下からなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子：
（ａ）図１Ａおよび１Ｂ中の完全なアミノ酸配列（配列番号２）を有するニュートロカイン−αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）ＡＴＣＣ寄託番号９７７６８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全なアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）ニュートロカイン−αポリペプチド細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）ニュートロカイン−αポリペプチド膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）ニュートロカイン−αポリペプチ細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列；
（ｆ）細胞外ドメインおよび細胞内ドメインを含むが、膜貫通ドメインを欠く可溶性ニュートロカイン−αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および（ｇ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）に記載の任意のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
（項目２）  前記ポリヌクレオチドが図１Ａおよび１Ｂにおける完全なヌクレオチド配列（配列番号１）を有する、項目１に記載の核酸分子。
（項目３）  前記ポリヌクレオチドが、図１Ａおよび１Ｂにおける完全なアミノ酸配列（配列番号２）を有するニュートロカイン−αポリペプチドをコードする図１Ａおよび１Ｂにおけるヌクレオチド配列（配列番号１）を有する、項目１に記載の核酸分子。
（項目４）  前記ポリヌクレオチドが、図１Ａおよび１Ｂに示される細胞外ドメインを含む可溶性ニュートロカイン−αをコードするヌクレオチド配列（配列番号２）を有する、項目１に記載の核酸分子。
（項目５）  以下からなる群から選択される配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子：
（ａ）配列番号２の残基ｎ〜２８５からなるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでｎは、２〜１９０の範囲の整数である、ヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２の残基１〜ｍからなるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでｍは、２７４〜２８４の範囲の整数である、ヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号２の残基ｎ〜ｍからなるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでｎおよびｍは、それぞれ上記の（ａ）および（ｂ）において定義されるような整数である、ヌクレオチド配列；および
（ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号９７７６８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全なニュートロカイン−αアミノ酸配列の一部からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでその一部は、その完全なアミノ酸配列のアミノ末端から１〜１９０のアミノ酸およびＣ末端から１〜１１のアミノ酸を除外する、ヌクレオチド配列。
（項目６）  前記ポリヌクレオチドが、ＡＴＣＣ寄託番号９７７６８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡクローンの完全なヌクレオチド配列を有する、項目１に記載の核酸分子。
（項目７）  前記ポリヌクレオチドが、ＡＴＣＣ寄託番号９７７６８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全なアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する、項目１に記載の核酸分子。
（項目８）  前記ポリヌクレオチドが、ＡＴＣＣ寄託番号９７７６８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる細胞外ドメインを含む可溶性ニュートロカイン−αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する、項目１に記載の核酸分子。
（項目９）  項目１の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）におけるヌクレオチド配列に同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子であって、ここで、そのハイブリダイズするポリヌクレオチドが、Ａ残基のみまたはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしない、単離された核酸分子。
（項目１０）  項目１の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）におけるアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
（項目１１）  以下からなる群から選択されるニュートロカイン−αポリペプチドのエピトープ保有部分をコードする、項目１０に記載の単離された核酸分子：約Ｐｈｅ−１１５〜約Ｌｅｕ−１４７のアミノ酸残基（配列番号２）を含むポリペプチド；約Ｉｌｅ−１５０〜約Ｔｙｒ−１６３のアミノ酸残基（配列番号２）のアミノ酸残基を含むポリペプチド；約Ｓｅｒ−１７１〜約Ｐｈｅ−１９４のアミノ酸残基（配列番号２）を含むポリペプチド；約Ｇｌｕ−２２３〜約Ｔｙｒ−２４６のアミノ酸残基（配列番号２）を含むポリペプチド；および約Ｓｅｒ−２７１〜約Ｐｈｅ−２７８のアミノ酸残基（配列番号２）を含むポリペプチド。
（項目１２）  項目１に記載の単離された核酸分子を、ベクター中に挿入する工程を包含する、組換えベクターを作製するための方法。
（項目１３）  項目１２に記載の方法によって生成される組換えベクター。
（項目１４）  項目１３に記載の組換えベクターを、宿主細胞に導入する工程を包含する、組換え宿主細胞を作製する方法。
（項目１５）  項目１４に記載の方法によって産生される、組換え宿主細胞。
（項目１６）  ニュートロカイン−αポリペプチドを産生するための組換え方法であって、そのポリペプチドが発現されるような条件下で項目１５に記載の組換え宿主細胞を培養する工程、およびそのポリペプチドを回収する工程を包含する、方法。
（項目１７）  以下からなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたニュートロカイン−αポリペプチド：
（ａ）図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）における完全なアミノ酸配列を有する、ニュートロカイン−αのアミノ酸配列；
（ｂ）ＡＴＣＣ寄託番号９７７６８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全なアミノ酸配列を有する、ニュートロカイン−αのアミノ酸配列；
（ｃ）ニュートロカイン−αポリペプチド細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）ニュートロカイン−αポリペプチド膜貫通ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）ニュートロカイン−αポリペプチド細胞内ドメインのアミノ酸配列
（ｆ）ドメインを含む可溶性ニュートロカイン−αポリペプチドのアミノ酸配列；および
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）のポリペプチドのいずれか１つのエピトープ保有部分のアミノ酸配列。
（項目１８）  ニュートロカイン−αタンパク質のエピトープ保有部分を含む項目１７に記載のポリペプチドであって、ここで、その部分は以下からなる群から選択される：約Ｐｈｅ−１１５〜約Ｌｅｕ−１４７のアミノ酸残基（配列番号２）を含むポリペプチド；約Ｉｌｅ−１５０〜約Ｔｙｒ−１６３のアミノ酸残基（配列番号２）のアミノ酸残基を含むポリペプチド；約Ｓｅｒ−１７１〜約Ｐｈｅ−１９４のアミノ酸残基（配列番号２）を含むポリペプチド；約Ｇｌｕ−２２３〜約Ｔｙｒ−２４６のアミノ酸残基（配列番号２）を含むポリペプチド；約Ｓｅｒ−２７１〜約Ｐｈｅ−２７８のアミノ酸残基（配列番号２）を含むポリペプチド。
（項目１９）  項目１７に記載のニュートロカイン−αポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体。
（項目２０）  項目１７に記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目２１）  改変されたニュートロカイン−αタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、ここで少なくとも１つの保存的なアミノ酸置換を除き、その改変されたペプチドは、以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜２８５；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２〜２８５；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸１〜４６；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸４７〜７２；および
（ｅ）配列番号２のアミノ酸７３〜２８６
からなる群より選択されるメンバーに同一なアミノ酸配列を有する、ポリヌクレオチド。
（項目２２）  改変されたニュートロカイン−αポリペプチド分子であって、ここで少なくとも１つの保存的なアミノ酸置換を除き、その改変されたペプチドは、以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜２８５；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２〜２８５；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸１〜４６；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸４７〜７２；および
（ｅ）配列番号２のアミノ酸７３〜２８６
からなる群より選択されるメンバーに同一なアミノ酸配列を有する、ポリペプチド分子。
（項目２３）  以下からなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一の配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子：
（ａ）配列番号７のヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号８のヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号９のヌクレオチド配列；
（ｄ）図１Ａおよび１Ｂに示される配列（配列番号１）の一部のヌクレオチド配列であって、ここで、その部分は、ヌクレオチド１〜ヌクレオチド２４４２の少なくとの３０の連続したヌクレオチドを含み、ヌクレオチド１３８７〜１４２１の配列、ヌクレオチド９〜３８２の配列、ヌクレオチド１６７４〜１９９６の配列、ヌクレオチド１４０１から１７８４の配列、ヌクレオチド９００〜１２３７の配列、およびこれらの配列内に位置する任意のフラグメントを除外するヌクレオチド配列；および
（ｅ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）におけるヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
（項目２４）  以下からなる群より選択される配列に対して少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子：
（ａ）図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１９）において完全なアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αＳＶポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）ＡＴＣＣ寄託番号２０３５１８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全なアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αＳＶポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）ニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）ニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）ニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列；
（ｆ）細胞外ドメインおよび細胞内ドメインを含むが、膜貫通ドメインを欠く、可溶性ニュートロカイン−αＳＶポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
（ｇ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）におけるヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
（項目２５）  項目１９に記載の単離された抗体であって、ここでその単離された抗体は、配列番号２のタンパク質のニュートロカイン−αレセプターへの結合を阻害する、抗体。
【００５４】
（詳細な説明）
本発明は、ｃＤＮＡクローンを配列決定することによって決定された、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）に示されるアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列は、１９９６年１０月２２日にアメリカンタイプカルチャーコレクション、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０−２２０９に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号９７７６８を割り当てられた、ＨＮＥＤＵ１５クローンの配列決定によって得られた。寄託されたクローンは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に含まれる。
【００５５】
本発明はまた、ｃＤＮＡクローンを配列決定することにより決定された、図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１９）に示されるアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αＳＶをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１８）に示されるヌクレオチド配列は、１９９８年１２月１０日にアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託され、そしてＡＴＣＣ受託番号２０３５１８を割り当てられた、ＨＤＰＭＣ５２クローンを配列決定することにより得られた。寄託されたクローンは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に含まれる。
【００５６】
本発明のニュートロカイン−αおよびニュートロカイン−αＳＶタンパク質は、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＬＴβ、Ｆａｓリガンド、ＡＰＲＩＬ、およびＬＴαのヒトｍＲＮＡの翻訳産物と配列相同性を共有している（図２Ａ、２Ｂ、および７Ａを参照のこと）。上記のように、ＴＮＦαは、細胞傷害性、壊死、アポトーシス、同時刺激、増殖、リンパ節形成、免疫グロブリンクラススイッチ、分化、抗ウイルス活性、ならびに接着分子および他のサイトカインおよび増殖因子の調節において役割を果たす重要なサイトカインであると考えられる。
【００５７】
（核酸分子）
他に示されない限り、本明細書中でＤＮＡ分子を配列決定することによって決定されたすべてのヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡ配列決定機（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡからのＭｏｄｅｌ  ３７３）を用いて決定され、そして本明細書中で決定されるＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチドのすべてのアミノ酸配列は、上記のように決定されるＤＮＡ配列の翻訳によって予測された。従って、この自動化アプローチによって決定された任意のＤＮＡ配列について当該分野において公知のように、本明細書中で決定される任意のヌクレオチド配列はいくらかの誤りを含み得る。自動化によって決定されるヌクレオチド配列は、配列決定されるＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対して、代表的には少なくとも約９０％の同一、より代表的には少なくとも約９５％から少なくとも約９９．９％の同一である。実際の配列は、当該分野において周知の手動ＤＮＡ配列決定方法を含む他のアプローチによってより正確に決定され得る。当該分野においてまた公知のように、実際の配列と比較した、決定されるヌクレオチド配列における単一の挿入または欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳におけるフレームシフトを引き起こし、その結果、決定されるヌクレオチド配列によってコードされる推定アミノ酸配列は、挿入または欠失のような点にて始まる配列決定されるＤＮＡ分子によって実際にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なる。
【００５８】
核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」によって、ＤＮＡ分子またはポリヌクレオチドについてはデオキシリボヌクレオチドの配列が、そしてＲＮＡ分子またはポリヌクレオチドについてはリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＵ）の対応する配列（ここで特定されるデオキシリボヌクレオチド配列における各チミジンデオキシリボヌクレオチド（Ｔ）は、リボヌクレオチドのウリジン（Ｕ）によって置き換えられる）が意図される。
【００５９】
本明細書中で提供される情報（例えば、図１Ａおよび１Ｂのヌクレオチド配列）を用いて、ニュートロカイン−αポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、標準的なクローニングおよびスクリーニング手順（例えば、出発物質としてｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡをクローニングするための手順）を用いて得られ得る。本発明の例として、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）において記載される核酸分子は、好中球由来のｃＤＮＡライブラリー中で発見された。ニュートロカインα  ｃＤＮＡの一部に対応する発現された配列タグもまた、腎臓、肺、末梢白血球、骨髄、Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、活性化Ｔ細胞、胃癌、胃の筋肉、マクロファージ、および臍帯血組織において見出された。さらに図５Ａおよび５Ｂで提供されるヌクレオチド情報を用いて、ニュートロカイン−αＳＶポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、標準的なクローニングおよびスクリーニング手順（例えば、出発物質としてｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡをクローニングするための手順）を用いて得られ得る。本発明の例として、図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１８）において記載される核酸分子は、初代樹状細胞由来のｃＤＮＡライブラリー中で発見された。
【００６０】
ＡＴＣＣ受託番号９７７６８として寄託されたニュートロカイン−αプラスミドＨＮＥＤＵ１５は、約２８５アミノ酸残基（約４６アミノ酸の推定細胞内ドメイン（図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）のほぼ１〜ほぼ４６のアミノ酸残基）、約２６アミノ酸の膜貫通ドメイン（図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）のほぼ４７〜ほぼ７２の下線を付したアミノ酸残基）、約２１３アミノ酸の推定細胞外ドメイン（図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）のほぼ７３〜ほぼ２８５のアミノ酸残基））のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み；そして約３１ｋＤａの推定分子量である。図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）に示されるニュートロカイン−αポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋに登録番号３３９７６４としてアクセスされ得るヒトＴＮＦ−αと約２０％類似しそして約１０％同一である。
【００６１】
ＡＴＣＣ受託番号２０３５１８として寄託されたニュートロカイン−αＳＶプラスミドＨＤＰＭＣ５２は、約２６６アミノ酸残基（約４６アミノ酸の推定細胞内ドメイン（図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１９）のほぼ１〜ほぼ４６のアミノ酸残基）、約２６アミノ酸の推定膜貫通ドメイン（図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１９）のほぼ４７〜ほぼ７２の下線を付したアミノ酸残基）、約１９４アミノ酸の推定細胞外ドメイン（図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１９）のほぼ７３〜ほぼ２６６のアミノ酸残基））のタンパク質をコードする推定オープンリーディングフレームを含み；そして約２９ｋＤａの推定分子量である。図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１９）に示されるニュートロカイン−αＳＶポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋに登録番号３３９７６４としてアクセスされ得るヒトＴＮＦ−αと約３３．９％類似しそして約２２．０％同一である。
【００６２】
当業者が理解するように、上記で議論した配列決定の誤りの可能性に起因して、寄託されたｃＤＮＡによってコードされる実際の完全なニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチド（それぞれ、約２８５のアミノ酸および約２６６アミノ酸を含む）は、いくらかより小さいかもしれない。特に、決定されたニュートロカイン−αおよびニュートロカイン−αＳＶのコード配列は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）のヌクレオチド２１０〜２１２位で、ならびに図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１８）のヌクレオチド６４〜６６位でオープンリーディングフレームの翻訳のための選択的な開始コドンとして役立ち得る共通の第２のメチオニンコドンを含む。より一般的には、実際のオープンリーディングフレームは、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）ならびに図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１８）に示されるＮ末端からの第１または第２のメチオニンコドンのいずれかから予測される、±２０アミノ酸の範囲、より可能性が高いのは±１０アミノ酸の範囲のどこかに存在し得る。本明細書中に記載されるポリペプチドドメインがコンピューター分析により予測され、従って、種々の機能的ドメインを同定するために使用される分析的基準に依存して、ニュートロカインαポリペプチドおよびニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの細胞外ドメイン、細胞内ドメイン、および膜貫通ドメインの正確な「アドレス」は、僅かに異なり得ることがさらに理解される。例えば、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）ならびに図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１９）の、ニュートロカインαおよびニュートロカイン−αニュートロカイン−αＳＶの細胞外ドメインの正確な位置は、ドメインを規定するために使用した基準に依存して、僅かに変化し得る（例えば、アドレスは、約１〜約２０残基、より可能性が高いのは約１〜約５残基「シフト」し得る）。この場合、膜貫通ドメインの末端、および細胞外ドメインの開始部は、図３および６ならびに表Ｉに示されるように、上記の位置における疎水性アミノ酸配列の同定に基づいて予測された。いずれにしても、以下でさらに考察されるように、本発明はさらに、完全なポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端から種々の残基が欠失されたポリペプチド（ニュートロカインαおよびニュートロカイン−αＳＶのポリペプチドの可溶型の細胞外ドメインを構築する、本明細書中に記載の細胞外ドメインのＮ末端から１つ以上のアミノ酸を欠失するポリペプチドを含む）を提供する。
【００６３】
示されるように、本発明の核酸分子およびポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態（例えば、ｍＲＮＡ）、またはＤＮＡの形態（例えば、クローニングによって得られるか、または合成的に生成されるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）であり得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、またはそれは、非コード鎖（アンチセンス鎖ともいわれる）であり得る。
【００６４】
「単離された」核酸分子によって、天然の環境から取り出された核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が意図される。例えば、ベクター中に含まれる組換えＤＮＡ分子は、本発明の目的のために単離されることが意図される。単離されたＤＮＡ分子のさらなる例は、異種の宿主細胞において維持される組換えＤＮＡ分子、または溶液中の（部分的または実質的に）精製されたＤＮＡ分子を含む。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のＤＮＡ分子のインビボまたはインビトロでのＲＮＡ転写物を含む。しかし、細胞または細胞溶解物から単離されるかまたは取り出されたライブラリー（例えば、クローンおよびライブラリーの他のメンバーを含む均質な溶液の形態で）からも染色体からも単離されていないライブラリー（ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー）のメンバーであるクローンに含まれる核酸（例えば、核型のような「染色体スプレッド（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｓｐｒｅａｄ）」）は、本発明の目的では「単離されて」いない。本明細書中でさらに議論されるように、本発明に従って単離された核酸分子は、天然で、組換え的に、または合成的に生成され得る。
【００６５】
本発明の単離された核酸分子は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列の１４７〜１４９位に開始コドンを有するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、あるいはこれからなるＤＮＡ分子を含む。さらに、本発明の単離された核酸分子は、上記の配列と実質的に異なるが、遺伝暗号の縮重に起因してなおニュートロカインαタンパク質をコードする配列を含む、あるいはこれからなるＤＮＡ分子を含む。もちろん、遺伝暗号は当該分野において周知である。従って、上記の縮重改変体を生成することは、当業者にとって慣用的である。別の実施形態において、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号９７７６８を有するプラスミドに含まれるｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を有するニュートロカインαポリペプチドをコードする配列を含む、あるいはそれからなる単離された核酸分子を提供する。好ましくは、この核酸分子は、ＡＴＣＣ受託番号９７７６８を有するプラスミドに含まれるｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドの細胞外ドメインあるいは成熟ポリペプチド配列または可溶性ポリペプチド配列のをコードする配列を含むか、あるいはそれからなる。
【００６６】
本発明の単離される核酸分子はまた、図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１８）に示されるヌクレオチド配列の１〜３位に開始コドンを有するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むＤＮＡ分子を含む。さらに、本発明の単離された核酸分子は、上記の配列と実質的に異なるが、遺伝暗号の縮重に起因してなおニュートロカインαＳＶポリペプチドをコードする配列を含む、あるいはこれからなるＤＮＡ分子を含む。もちろん、遺伝暗号は当該分野において周知である。従って、上記の縮重改変体を生成することは、当業者にとって慣用的である。別の実施形態において、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号２０３５１８を有するプラスミドに含まれるｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を有するニュートロカインαＳＶポリペプチドをコードする配列を含む、あるいはそれからなる単離された核酸分子を提供する。好ましくは、この核酸分子は、ＡＴＣＣ受託番号２０３５１８を有するプラスミドに含まれるｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドの細胞外ドメインまたは成熟可溶性ポリペプチド配列をコードする配列を含むか、あるいはそれからなる。
【００６７】
本発明はさらに、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）において示されるヌクレオチド配列もしくはＡＴＣＣ受託番号９７７６８を有するプラスミドに含まれるニュートロカインα  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、または上記の配列の１つに相補的な配列を有する核酸分子を含むか、あるいはこれらからなる単離された核酸分子を提供する。さらに、本発明は、図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１８）に示されるヌクレオチド配列もしくはＡＴＣＣ受託番号２０３５１８を有するプラスミドに含まれるニュートロカイン−αＳＶ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、または上記の配列の１つに相補的な配列を有する核酸分子を含むか、あるいはこれらからなる単離された核酸分子を提供する。そのような単離される分子、特にＤＮＡ分子は、染色体とのインサイチュハイブリダイゼーションによる遺伝子マッピングのため、および例えばノーザンブロット分析またはウェスタンブロット分析によるヒト組織中のニュートロカインαおよびニュートロカイン−αＳＶの発現を検出するためのプローブとしての（を含むが、これらに限定されない）使用を有する。
【００６８】
１つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号２２に示される配列を含むか、あるいはこれからなる。配列番号２２として提供される配列を、ＧｅｎＢａｎｋから得られるいくつかの重複マウスＥＳＴ配列（ＡＩ１８２４７２、ＡＡ４２２７４９、ＡＡ２５４０４７、およびＡＩ１２２４８５）から構築した。ＥＳＴ配列を整列させて、配列番号２２として提供されるニュートロカイン−α様ポリヌクレオチド配列を作製した。配列番号２２の翻訳から得られたアミノ酸配列は、配列番号２３として提供される。配列番号２２および配列番号２３として提供される配列のフラグメント、改変体および誘導体はまた、本発明により包含される。
【００６９】
別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２７に示される配列ならびに／または配列番号２８に開示されるアミノ酸配列をコードする配列、それらのフラグメント、改変体および誘導体を含むか、あるいはこれらからなる。これらのポリヌクレオチド配列はまた、本発明により包含される。例えば、本発明の特定の実施形態は、配列番号２８のアミノ酸６８〜２１９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチド配列をコードする配列を含むか、あるいはこれらからなるポリヌクレオチドに関する。配列番号２７の翻訳から得られるアミノ酸配列は、配列番号２８として提供される。配列番号２８のアミノ酸配列ならびに配列番号２８として提供される配列のフラグメント、改変体、および誘導体を含むか、あるいはこれからなるポリペプチドはまた、本発明により包含される。例えば、本発明の特定の実施形態は、配列番号２８のアミノ酸６８〜２１９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチド配列を含むか、あるいはこれらからなるポリペプチドに関する。配列番号２７として提供される配列を有する核酸分子を、２つの縮重プライマーを用いてシアノモロガスサル（ｃｙａｎｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）（例えば、Ｍａｃａｃａ  ｉｒｕｓ）ＰＢＭＣからＲＴ−ＰＣＲにより得た。簡潔には、総ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから入手可能）を用いることにより、製造業者のプロトコルに従って、シアノモロガスサルＰＢＭＣから調製した。次いで、一本鎖ｃＤＮＡをオリゴｄＴプライマーとともに標準的な方法を用いて、シアノモロガスサルＰＢＭＣ調製物から合成した。ニュートロカインα特異的プライマーを、マウスニュートロカインαとヒトニュートロカインα分子（それぞれ、配列番号２２および１）との間の保存領域に基づいて設計した。次いで、シアノモロガスサルニュートロカインα核酸分子を、以下の２つの縮重オリゴヌクレオチドプライマーと組み合わせてｃＤＮＡテンプレートを用いてＰＣＲにより生成した。
【００７０】
【化１】
2007277249.tif 000002
縮重プライマー（配列番号３５および３６）の配列において、「Ｉ」は、デオキシイノシンまたはジデオキシイノシンを示す。
【００７１】
別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２９に示される配列ならびに／または配列番号３０に開示されるアミノ酸配列をコードする配列、それらのフラグメント、改変体、および誘導体を含むか、あるいはこれらからなる。これらのポリヌクレオチドはまた、本発明により包含される。例えば、本発明の特定の実施形態は、配列番号３０のアミノ酸６８〜２１９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチド配列をコードする配列を含むか、あるいはこれらからなるポリヌクレオチドに関する。配列番号２９の翻訳から得られるアミノ酸配列は、配列番号３０に提供される。配列番号３０のアミノ酸配列ならびに配列番号２９および配列番号３０として提供される配列のフラグメント、改変体、および誘導体を含むか、あるいはこれからなるポリペプチドはまた、本発明により包含される。例えば、本発明の特定の実施形態は、配列番号３０のアミノ酸６８〜２１９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチド配列を含むか、あるいはこれらからなるポリペプチドに関する。配列番号２９として提供される配列を有する核酸分子を、２つの縮重プライマーを用いてアカゲザルＰＢＭＣからＲＴ−ＰＣＲにより得た。簡潔には、総ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから入手可能）を用いることにより、製造業者のプロトコルに従って、アカゲザルＰＢＭＣから調製した。次いで、一本鎖ｃＤＮＡをオリゴｄＴプライマーとともに標準的な方法を用いて、アカゲザルＰＢＭＣ調製物から合成した。ニュートロカインα特異的プライマーを、マウスニュートロカインαとヒトニュートロカインα分子（それぞれ、配列番号２２および１）との間の保存領域に基づいて設計した。次いで、アカゲザルニュートロカインα核酸分子を、以下の２つの縮重オリゴヌクレオチドプライマーと組み合わせてｃＤＮＡテンプレートを用いてＰＣＲにより生成した。
【００７２】
【化２】
2007277249.tif 000003
縮重プライマー（配列番号３５および３６）の配列において、「Ｉ」は、デオキシイノシンまたはジデオキシイノシンを示す。
【００７３】
本発明はまた、以下の関連するｃＤＮＡクローン：ＨＳＯＡＤ５５（配列番号７）、ＨＳＬＡＨ８４（配列番号８）、およびＨＬＴＢＭ０８（配列番号９）から決定された配列番号１および配列番号１８の広範な部分に関するヌクレオチド配列を有する核酸分子を提供する。
【００７４】
本発明はさらに、本明細書中に記載のヌクレオチド配列の部分をコードする核酸分子、ならびに本明細書中に記載の単離された核酸分子のフラグメントに関する。１つの実施形態において、本発明は、配列番号１の部分を示すヌクレオチド配列（配列番号１の１〜１００１位のヌクレオチドからなる）を示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを提供する。別の実施形態において、本発明は、配列番号１８の１〜７９８位からなる配列番号１８の部分を示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを提供する。
【００７５】
本発明はさらに、本明細書中に記載の核酸分子（例えば、ポリヌクレオチド）のフラグメントに関する。例えば、ＡＴＣＣ受託番号９７７６８を有するプラスミドに含まれるｃＤＮＡのヌクレオチド配列を有する核酸分子のフラグメントによって、ＡＴＣＣ受託番号９７７６８を有するプラスミドに含まれるｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１のヌクレオチド配列、配列番号２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ＡＴＣＣ受託番号２０３５１８を有するプラスミドに含まれるｃＤＮＡのヌクレオチド配列、ＡＴＣＣ受託番号２０３５１８を有するプラスミドに含まれるｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１８のヌクレオチド配列、配列番号２０のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、またはそれらに対する相補鎖は、少なくとも約１５ｎｔ、およびより好ましくは少なくとも約２０ｎｔまたは少なくとも２５ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは少なくとも４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４５０、または５００ｎｔの長さであるフラグメントを意図される。これらのフラグメントは、本明細書中で議論されるように、診断プローブおよびプライマーを含むが、これらに限定されない多くの用途を有する。もちろん、ＡＴＣＣ受託番号９７７６８を有するプラスミドに含まれるｃＤＮＡのヌクレオチド配列、配列番号１のヌクレオチド配列、ＡＴＣＣ受託番号２０３５１８を有するプラスミドに含まれるｃＤＮＡのヌクレオチド配列、および配列番号１８ヌクレオチド配列の、全てではないかもしれないが、大部分に対応するフラグメントのような本発明に従うより大きいフラグメント（例えば、５０１〜１５００ｎｔの長さの配列）もまた、有用である。本発明の好ましい核酸フラグメントは、それぞれ、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）ならびに図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１９）に同定され、そして以下により詳細に記載されるようなニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドのエピトープ保持部分を含むか、またはこれらからなるポリペプチドをコードする核酸分子を含む。これらのポリヌクレオチドフラグメントによりコードされるポリペプチドはまた、本発明により含まれる。
【００７６】
例えば、配列番号２１のヌクレオチド配列、配列番号２２のヌクレオチド配列、配列番号２７のヌクレオチド配列、配列番号２９のヌクレオチド配列、配列番号２３のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号２８のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号３０のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、またはそれらの相補鎖を有する核酸分子のフラグメントによってもまた、少なくとも約１５ｎｔ、およびより好ましくは少なくとも約２０ｎｔまたは少なくとも２５ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは少なくとも４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４５０、または５００ｎｔの長さであるフラグメントを意図される。これらのフラグメントは、本明細書中で議論されるように、診断プローブおよびプライマーを含むが、これらに限定されない多くの用途を有する。もちろん、配列番号２１のヌクレオチド配列、配列番号２２のヌクレオチド配列、配列番号２７のヌクレオチド配列、配列番号２９のヌクレオチド配列、配列番号２３のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号２８のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号３０のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列またはそれらの相補鎖の、全てではないかもしれないが、大部分に対応するフラグメントのような本発明に従うより大きいフラグメント（例えば、５０１〜１５００ｎｔの長さのフラグメント）もまた、有用である。これらのポリヌクレオチドフラグメントによりコードされるポリペプチドもまた、本発明により包含される。
【００７７】
本発明のニュートロカインαポリヌクレオチドフラグメントの代表例としては、例えば、配列番号１のほぼヌクレオチド１〜５０、５１〜１００、１０１〜１４６、１４７〜２００、２０１〜２５０、２５１〜３００、３０１〜３５０、３５１〜４００、４０１〜４５０、４５１〜５００、５０１〜５５０、５５１〜６００、６００〜６５０、６５１〜７００、７０１〜７５０、７５１〜８００、８００〜８５０、８５１〜９００、９０１〜９５０、９５１〜１０００、１００１〜１０５０、および／または１０５１〜１０８２、またはそれらに対する相補鎖、またはＡＴＣＣ受託番号９７７６８を有するプラスミドに含まれるｃＤＮＡの配列を含むか、あるいはこれらからなるフラグメントが挙げられる。この文脈で「ほぼ（約）」は、特に記載された範囲、およびいずれかの末端または両末端でいくつかの（５、４、３、２、または１）ヌクレオチドだけ大きいかまたは小さい範囲を含む。
【００７８】
本発明のニュートロカインαＳＶポリヌクレオチドの代表例としては、例えば、配列番号１８のほぼヌクレオチド１〜５０、５１〜１００、１０１〜１５０、１５１〜２００、２０１〜２５０、２５１〜３００、３０１〜３５０、３５１〜４００、４０１〜４５０、４５１〜５００、５０１〜５５０、５５１〜６００、６００〜６５０、６５１〜７００、７０１〜７５０、７５１〜８００、８００〜８５０および／または８５１〜９００、またはそれらに対する相補鎖、またはＡＴＣＣ受託番号２０３５１８を有するプラスミドに含まれるｃＤＮＡの配列を含むか、あるいはこれらからなるフラグメントが挙げられる。この文脈で「ほぼ（約）」は、特に記載された範囲、およびいずれかの末端または両末端でいくつかの（５、４、３、２、または１）ヌクレオチドだけ大きいかまたは小さい範囲を含む。
【００７９】
特定の好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１の以下のヌクレオチド残基：
【００８０】
【化３】
2007277249.tif 000004
を含むか、あるいはこれらからなる。
【００８１】
特定の他の好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１８の以下のヌクレオチド残基：
【００８２】
【化４】
2007277249.tif 000005
2007277249.tif 000006
2007277249.tif 000007
を含むか、あるいはこれらからなる。
【００８３】
特定のさらなる好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１の以下のヌクレオチド残基：
【００８４】
【化５】
2007277249.tif 000008
を含むか、あるいはこれらからなる。
【００８５】
さらなる好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１の以下のヌクレオチド残基：
【００８６】
【化６】
2007277249.tif 000009
を含むか、あるいはこれらからなる。
【００８７】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの機能的活性を示すポリペプチドをコードする。「機能的活性」を示すポリペプチドによって、全長および／または分泌型のニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドと関連する１つ以上の公知の機能的活性を示し得るポリペプチドを意味される。このような機能的活性としては、生物学的活性（例えば、Ｂ細胞増殖、生存、分化、および／または活性化を刺激する能力）、抗原性［抗ニュートロカインα抗体および／または抗ニュートロカインαＳＶ抗体に結合する能力（またはニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドと結合について競合する能力）］、免疫原性（ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドに結合する抗体を生成する能力）、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドとマルチマーを形成する能力、ならびにニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドについてのレセプターもしくはリガンドに結合する能力が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】
特定のさらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、ニュートロカイン−αの推定細胞内ドメイン（配列番号２のアミノ酸１〜４６）、推定膜貫通ドメイン（配列番号２のアミノ酸４７〜７２）、推定細胞外ドメイン（配列番号２のアミノ酸７３〜２８５）、または推定ＴＮＦα保存ドメイン（配列番号２のアミノ酸１９１〜２８４）を含むか、あるいはこれらからなるポリペプチドをコードする。さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、上記のドメインの１、２、３または４つ全ての任意の組み合わせを含むか、これらからなるポリペプチドをコードする。これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、本発明により包含される。
【００８９】
さらなる特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、ニュートロカイン−αＳＶの推定細胞内ドメイン（配列番号１９のアミノ酸１〜４６）、推定膜貫通ドメイン（配列番号１９のアミノ酸４７〜７２）、推定細胞外ドメイン（配列番号１９のアミノ酸７３〜２６６）、または推定ＴＮＦα保存ドメイン（配列番号１９のアミノ酸１７２〜２６５）を含むか、あるいはこれらからなるポリペプチドをコードする。さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、上記のドメインの１、２、３または４つ全ての任意の組み合わせを含むか、これらからなるポリペプチドをコードする。これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、本発明により包含される。
【００９０】
別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、配列番号２の残基Ｍｅｔ−１〜Ｌｙｓ−１１３、Ｌｅｕ−１１４〜Ｔｈｒ−１４１、Ｉｌｅ−１４２〜Ｌｙｓ−１６０、Ｇｌｙ−１６１〜Ｇｌｎ−１９８、Ｖａｌ−１９９〜Ａｌａ−２４８、およびＧｌｙ−２５０〜Ｌｅｕ−２８５から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらからなる。さらに、これらのアミノ酸配列の２、３、４、または５つ以上の任意の組み合わせをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明により包含される。これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドもまた、本発明により包含される。
【００９１】
別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、配列番号１９の残基Ｍｅｔ−１〜Ｌｙｓ−１１３、Ｌｅｕ−１１４〜Ｔｈｒ−１４１、Ｇｌｙ−１４２〜Ｇｌｎ−１７９、Ｖａｌ−１８０〜Ａｌａ−２２９、およびＧｌｙ−２３０〜Ｌｅｕ−２６６から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらからなる。さらに、これらのアミノ酸配列の２、３、４、または５つ以上の任意の組み合わせをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明により包含される。これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドもまた、本発明により包含される。
【００９２】
別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、配列番号２３の残基Ｍｅｔ−１〜Ｌｙｓ−１０６、Ｌｅｕ−１０７〜Ｔｈｒ−１３４、Ｇｌｕ−１３５〜Ａｓｎ−１６５、Ｉｌｅ−１６７〜Ｌｙｓ−１８４、Ｇｌｙ−１８５〜Ｇｌｎ−２２４、Ｖａｌ−２２５〜Ａｌａ−２７２、およびＧｌｙ−２７３〜Ｌｅｕ−３０９から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらからなる。さらに、これらのアミノ酸配列の２、３、４、または５つ以上の任意の組み合わせをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明により包含される。これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドもまた、本発明により包含される。
【００９３】
別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、配列番号２８の残基Ｔｙｒ−１〜Ｌｙｓ−４７、Ｌｅｕ−４８〜Ｔｈｒ−７５、Ｉｌｅ−７６〜Ｌｙｓ−９４、Ｇｌｙ−９５〜Ｇｌｎ−１３２、Ｖａｌ−１３３〜Ａｌａ−１８２、およびＧｌｙ−１８３〜Ａｌａ−２１９から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらからなる。さらに、これらのアミノ酸配列の２、３、４、または５つ以上の任意の組み合わせをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明により包含される。これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドもまた、本発明により包含される。
【００９４】
別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、配列番号３０の残基Ｔｙｒ−１〜Ｌｙｓ−４７、Ｌｅｕ−４８〜Ｔｈｒ−７５、Ｉｌｅ−７６〜Ｌｙｓ−９４、Ｇｌｙ−９５〜Ｇｌｎ−１３２、Ｖａｌ−１３３〜Ａｌａ−１８２、およびＧｌｙ−１８３〜Ａｌａ−２１９から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらからなる。さらに、これらのアミノ酸配列の２、３、４、または５つ以上の任意の組み合わせをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明により包含される。これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドもまた、本発明により包含される。
【００９５】
別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２１に示される配列を含むか、あるいはこれからなる。配列番号２１として示される配列は、配列番号２として示されるニュートロカインαポリペプチドの残基Ａｌａ−１３４〜Ｌｅｕ−２８５に結合した最初のメチオニン残基からなるポリペプチドをコードする。これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドはまた、本発明により包含される。
【００９６】
さらなる好ましい特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２１の以下；
【００９７】
【化７】
2007277249.tif 000010
2007277249.tif 000011
のヌクレオチド残基を含むか、あるいはこれらから構成される。これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドもまた、本発明に含まれる。
【００９８】
従って、本発明の特定の実施形態は、図７Ａに開示され、かつ実施例６に記載されるβプリーツシート領域Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、またはＨのアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらから構成されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明のさらなる実施形態は、図７Ａに開示され、かつ実施例６に記載されるβプリーツシート領域Ａ−Ｈの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０全ての任意の組み合わせを含むか、あるいはこれらから構成されるニュートロカイン−αポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明のさらなる好ましい実施形態は、図７Ａに開示され、かつ実施例６に記載されるβプリーツシート領域Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、またはＨのニュートロカイン−αアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらから構成されるポリペプチドに関する。本発明のさらなる実施形態は、図７Ａに開示され、かつ実施例６に記載されるβプリーツシート領域Ａ−Ｈの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０全ての任意の組み合わせを含むか、あるいはこれらから構成されるニュートロカイン−αポリペプチドに関する。
【００９９】
特定の他の好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２１のヌクレオチド残基３４−５７、１１８−１２３、１３３−１４、１５１−１５９、１７５−２１６、２３２−２５５、２８０−３１５、３２８−３５７、３７０−３９３、および／または４３０−４５６を含むか、あるいはこれらから構成される。これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドはまた、本発明によって含まれる。これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドフラグメントは、図７Ａに示される推定βプリーツシート領域に対応する。特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、上記のβプリーツシート領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０をコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこれらから構成される。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列と融合される上記のポリヌクレオチド配列を含む。これらのポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドはまた、本発明によって含まれる。別の実施形態において、本発明は、上記の本発明のβプリーツシートポリヌクレオチドの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。本明細書中で使用される場合、熟語「ストリンジェントな条件」の意味は、以下に記載される。
【０１００】
さらなる好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド残基５７６−５９９、６６０−６６５、６７５−６８３、６９３−７０１、７１７−７５８、７７４−８０３、８２２−８５７、８７０−８９９、９１２−９３５、および／または９７２−９９８を含むか、あるいはこれらから構成される。これらのポリヌクレオチドフラグメントによってコードされるポリペプチドはまた、本発明によって含まれる。これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドフラグメントは、図７Ａにおいて示される推定βプリーツシート領域に対応する。
【０１０１】
さらなる好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１８のヌクレオチド残基４５７−４６２、４７２−４８０、４９０−４９８、５１４−５５５、５７１−６００、６１９−６５４、６６７−６９６、６９９−７３２、および／または７６９−７９５を含むか、あるいはこれらから構成される。これらのポリヌクレオチドフラグメントによってコードされるポリペプチドはまた、本発明によって含まれる。これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドフラグメントは、図７Ａにおいて示される推定βプリーツシート領域に対応する。
【０１０２】
さらになお好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２２のヌクレオチド残基１２４−１２９、１３９−１４７、１５７−１６５、１８１−２２２、２３８−２６７、２８６−３２１、３３４−３６３、３７６−３９９、および／または４３６−４６２を含むか、あるいはこれらから構成される。これらのポリヌクレオチドフラグメントによってコードされるポリペプチドはまた、本発明によって含まれる。これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドフラグメントは、図７Ａにおいて示される推定βプリーツシート領域に対応する。ポリペプチドは、本発明によって含まれるこれらの領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または全ての任意の組み合わせのアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらから構成される。
【０１０３】
いくつかのイントロン／エキソン結合の相対位置を、マウスゲノムＤＮＡの配列分析に基づいて、マウスニュートロカイン−α（配列番号２２および配列番号２３）について決定した。マウスニュートロカイン−αゲノムクローン（仮に「Ｅｘｏｎ２」と称する）の５’末端からみかけ上第２のエキソンは、配列番号２３に示される配列のＴｙｒ−１８７〜Ｇｌｎ−２２２からなる。マウスニュートロカイン−αゲノミッククローン（仮に「Ｅｘｏｎ３」と称する）の５’末端からみかけ上第３のエキソンは、配列番号２３に示される配列のＶａｌ−２２３〜Ｇｌｙ−２７３を含む。
【０１０４】
従って、一つの実施形態において、本発明は、配列番号２３の残基Ｔｙｒ−１８７〜Ｇｌｎ−２２２のアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらから構成されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、上記のマウスニュートロカイン−αポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこれらから構成される、核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリペプチド配列に融合される上記ポリヌクレオチド配列を含む。これらの核酸によってコードされるポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド配列はまた、本発明によって含まれる。
【０１０５】
別の実施形態において、本発明は、配列番号２３の残基Ｖａｌ−２２３〜Ｇｌｙ−２７３のアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらから構成される、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、上記のマウスニュートロカイン−αポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこれらから構成される、核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列に融合される上記ポリヌクレオチド配列を含む。これらの核酸によってコードされるポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド配列はまた、本発明によって含まれる。
【０１０６】
さらに、対応するイントロン／エキソン結合の相対位置を、マウスおよびヒトのニュートロカイン−αポリペプチドの配列のアラインメントに基づいてヒトニュートロカイン−α（配列番号１および配列番号２）について決定した。ヒトニュートロカイン−α（また仮に「Ｅｘｏｎ２」と称する）の５’末端からみかけ上第２のエキソンは、配列番号２に示される配列のＴｙｒ−１６３〜Ｇｌｎ−１９８からなる。ヒトニュートロカイン−α（また仮に「Ｅｘｏｎ３」と称する）の５’末端からみかけ上第３のエキソンは、配列番号２に示される配列のＶａｌ−１９９〜Ｇｌｙ−２４９からなる。
【０１０７】
従って、一つの実施形態において、本発明は、配列番号２の残基Ｔｙｒ−１６３〜Ｇｌｎ−１９８のアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらから構成される、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、上記のニュートロカイン−αポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこれらから構成される、核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列に融合される上記ポリヌクレオチド配列を含む。これらの核酸によってコードされるポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド配列はまた、本発明によって含まれる。
【０１０８】
別の実施形態において、本発明は、配列番号２の残基Ｖａｌ−１９９〜Ｇｌｙ−２４９のアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらから構成される、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、上記のニュートロカイン−αポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこれらから構成される、核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列に融合される上記ポリヌクレオチド配列を含む。これらの核酸によってコードされるポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド配列はまた、本発明によって含まれる。
【０１０９】
ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチド、ならびにフラグメント、改変体誘導体、ならびにそれらのアナログの機能活性は、本明細書中に記載され、かつ当該分野において周知である種々の方法によって、アッセイされ得る。
【０１１０】
例えば、一つの実施形態において、ここで、抗ニュートロカイン−α抗体および／または抗ニュートロカイン−αＳＶ抗体との結合またはＢ細胞上のニュートロカイン−αレセプターおよび／またはニュートロカイン−αＳＶレセプターとの結合について、全長ニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドと結合または競合する能力についてアッセイする場合、当該分野において公知の種々の免疫アッセイが使用され得る。これらのアッセイとしては、放射線免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫アッセイ法）、「サンドウィッチ」免疫アッセイ、免疫放射測定アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュ免疫アッセイ（例えば、コロイド状の金、酵素または放射性同位元素標識を使用する）、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなどのような技術を使用する、競合的および非競合的アッセイ系が挙げられるが、これらに限定されない。一つの実施形態において、抗体結合は、一次抗体上の標識を検出することによって、検出される。別の実施形態において、一次抗体は、一次抗体への二次抗体または試薬の結合を検出することによって検出される。さらなる実施形態において、二次抗体が標識される。免疫アッセイにおける結合を検出するための多くの手段が当該分野において公知であり、そして本発明の範囲内である。
【０１１１】
別の実施形態において、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶリガンドが同定されるか、または本発明のポリペプチドフラグメント、改変体また誘導体の多量体化する能力が評価される場合、結合が、例えば、当該分野において周知の手段（例えば、還元および非還元ゲルクロマトグラフィー、タンパク質アフィニティークロマトグラフフィー、およびアフィニティーブロッティング）によって、アッセイされ得る。一般的に、Ｐｈｉｚｉｃｋｙ，Ｅら、１９９５、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９：９４−１２３を参照のこと。別の実施形態において、基質とのニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶ結合の生理学的相関（シグナル伝達）が、アッセイされ得る。
【０１１２】
さらに、本明細書中に記載されるアッセイ（例えば、実施例６および７を参照のこと）および当該分野において公知の別のアッセイが、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドならびにフラグメント、改変体誘導体およびそのアナログがニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶ関連生物学的活性（例えば、Ｂ細胞増殖、分化および／または活性化を刺激すること、あるいは阻害すること（ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶアンタゴニストの場合）ならびに／またはインビトロもしくはインビボでのＢ細胞生存を延長すること）の能力を測定するために慣用的に適用され得る。
【０１１３】
他の方法が、当業者に公知であり、そして本発明の範囲内である。
【０１１４】
さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ニュートロカイン−αおよびニュートロカイン−αＳＶの機能的属性を含むか、あるいはそれらから構成されるポリペプチドをコードする。この点における本発明の好ましい実施形態は、ニュートロカイン−αおよびニュートロカイン−αＳＶポリペプチドのαへリックスおよびαへリックス形成領域（「α領域」）、β−シートおよびβ−シート形成領域（「β−領域」）、ターンおよびターン形成領域（「ターン−領域」）コイルおよびコイル形成領域（「コイル−領域」）、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可撓性領域、表面形成領域および高度抗原性指標領域を含むか、あるいはこれらから構成されるフラグメントを含む。
【０１１５】
図７Ａにおいて開示されるニュートロカイン−αの一つ以上のβプリーツシート領域が、二量体化のためおよびニュートロカイン−αとそのリガンドとの間の相互作用のためにもまた重要であると考えられている。
【０１１６】
この点に関する特定の好ましい領域は、図３（表１）において示される。図３において示されるデータおよび表１において示されるデータは、配列番号２のアミノ酸配列が、ＤＮＡ*ＳＴＡＲコンピュータアルゴリズムのデフォルトパラメータを使用して分析される場合に得られる同じ結果の、異なる形式を単に示す。
【０１１７】
図３および表１に示される上記の好ましい領域としては、図１Ａおよび１Ｂにおいて示されるアミノ酸配列の分析によって同定される上述の型の領域が挙げられるが、これらに限定されない。図３および表１に示されるように、そのような好ましい領域としては、高い抗原性指標のＧａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎα−領域、β−領域、ターン−領域、およびコイル−領域、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎα−領域、β−領域およびコイル−領域、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ親水性領域および疎水性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇα両親媒性領域およびβ両親媒性領域、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ可撓性領域、Ｅｍｉｎｉ表面形成領域ならびにＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ領域が挙げられる。この点に関して非常に好ましいポリヌクレオチドは、いくつかの構造的特徴（例えば、上記に示されるいくつか（例えば、１、２、３または４）の特徴）を組み合わせるニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの領域を含むか、あるいはこれらから構成されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドはまた、本発明によって含まれる。
【０１１８】
さらに、表Ｉの欄ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩおよびＸＩＶに示されるデータを慣用的に使用して、抗原性について高度な潜在能力を示すニュートロカイン−αの領域を決定し得る（表Ｉの欄ＶＩＩＩは、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅに従う親水性を示し；表Ｉの欄ＩＸは、Ｈｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓに従う疎水性を示し；表Ｉの欄ＸＩＩＩは、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆに従う抗原性指標を示し；そして表Ｉの欄ＸＩＶは、Ｅｍｉｎｉに従う表面確率を示す）。高い抗原性の領域は、免疫応答の開始のプロセスにおける抗原認識が生じ得る環境において、ポリペプチドの表面上におそらく曝露されるポリペプチドの領域を示す値を選択することによって、欄ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩおよび／またはＩＶにおいて示されるデータから決定される。図６に示されるデータはまた、デフォルトパラメータを示すＤＮＡ*ＳＴＡＲのモジュールおよびアルゴリズムを使用して、図６（配列番号１９）に開示されるアミノ酸配列を単に試験することによって、類似の表形式で慣用的に示され得る。上記のように、図６に示されるアミノ酸配列を使用してもまた、抗原性についての高度な潜在能力を示す（図（図６におけるように）として示されても、または表（表１におけるように）として示されても）ニュートロカイン−αの領域を決定し得る。
【０１１９】
【表１】
2007277249.tif 000012
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本発明のさらに好ましい核酸フラグメントとしては、ニュートロカイン−αの一つ以上のエピトープ保有部分をコードする配列を含むか、あるいはそれらから構成される核酸分子が挙げられる。特に、本発明のそのような核酸フラグメントとしては、配列番号２のアミノ酸配列のおよそＰｈｅ−１１５〜およそＬｅｕ−１４７、およそＩｌｅ−１５０〜およそＴｙｒ−１６３、およそＳｅｒ−１７１〜およそＰｈｅ−１９４、およそＧｌｕ−２２３〜およそＴｙｒ−２４６、およびおよそＳｅｒ−２７１〜およそＰｈｅ−２７８から選択されるポリペプチドをコードする配列を含むか、あるいはそれらから構成される核酸分子が挙げられる。この文脈において、「およそ（約）」とは、特に列挙された範囲ならびにアミノ末端およびカルボキシ末端のいずれかまたは両方の、いくつかの、少数の、５、４、３、２または１アミノ酸残基だけ大きいかまたは小さい範囲を意味する。これらの核酸分子によってコードされるポリペプチドもまた、本発明によって含まれる。ニュートロカイン−αの抗原性エピトープを保有するポリペプチドフラグメントは、図３に示されるように、上記のＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指標の分析を使用して、当業者によって、容易に決定され得る。ニュートロカイン−αの他のそのようなエピトープ保有部分を決定するための方法が、以下に詳細に記載される。
【０１２０】
本発明のさらなる好ましい核酸フラグメントとしては、ニュートロカイン−αＳＶの一つ以上のエピトープ保有部分をコードする配列を含むか、あるいはそれから構成される核酸分子が挙げられる。特に、本発明のそのような核酸フラグメントは、配列番号１９のアミノ酸配列のおよそＰｒｏ−３２〜およそＬｅｕ−４７、およそＧｌｕ−１１６〜およそＳｅｒ−１４３、およそＰｈｅ−１５３〜およそＴｙｒ−１７３、およそＰｒｏ−２１８〜およそＴｙｒ−２２７、およそＳｅｒ−２５２〜およそＴｙｒ−２５８、およそＡｌａ−２３２〜およそＧｌｎ−２４１；、およそＩｌｅ−２４４〜およそＡｌａ−２４９；および、およそＳｅｒ−２５２〜およそＶａｌ−２５７から選択されるポリペプチドをコードする配列を含むか、あるいはそれらから構成される核酸分子が挙げられる。この文脈において、「およそ（約）」とは、特に列挙された範囲ならびにアミノ末端およびカルボキシ末端のいずれかまたは両方の、いくつかの、少数の、５、４、３、２または１アミノ酸残基だけ大きいかまたは小さい範囲を意味する。これらの核酸分子によってコードされるポリペプチドもまた、本発明によって含まれる。ニュートロカイン−αの抗原性エピトープを保有するポリペプチドフラグメントは、上記のＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指標の分析を使用して、当業者によって、容易に決定され得る。ニュートロカイン−αＳＶの他のそのようなエピトープ保有部分を決定するための方法が、以下に詳細に記載される。
【０１２１】
特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、１００，０００ｋｂ、５０，０００ｋｂ、１０，０００ｋｂ、１，０００ｋｂ、５００ｋｂ、４００ｋｂ、３５０ｋｂ、３００ｋｂ、２５０ｋｂ、２００ｋｂ、１７５ｋｂ、１５０ｋｂ、１２５ｋｂ、１００ｋｂ、７５ｋｂ、５０ｋｂ、４０ｋｂ、３０ｋｂ、２５ｋｂ、２０ｋｂ、１５ｋｂ、１０ｋｂ、７．５ｋｂ、または５ｋｂ長未満である。
【０１２２】
さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ニュートロカイン−αコード配列の少なくとも１５、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも１００、または少なくとも２５０、少なくとも５００、または少なくとも１０００の連続するヌクレオチドを含むが、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）または図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１８）に示される５’または３’コード配列に隣接するゲノムＤＮＡの１０００ｋｂ、５００ｋｂ、２５０ｋｂ、２００ｋｂ、１５０ｋｂ、１００ｋｂ、７５ｋｂ、５０ｋｂ、３０ｋｂ、２５ｋｂ、２０ｋｂ、１５ｋｂ、１０ｋｂ、または５ｋｂ以下からなる。さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ニュートロカイン−αコード配列の少なくとも１５、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも１００、または少なくとも２５０、少なくとも５００、または少なくとも１０００の連続するヌクレオチドを含むが、任意のニュートロカイン−αイントロンの全てまたは一部を含まない。別の実施形態において、ニュートロカイン−αコード配列を含む核酸は、ゲノム隣接遺伝子（すなわち、ゲノムにおけるニュートロカイン−α遺伝子に対して５’または３’）のコード配列を含まない。別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、１０００、５００、２５０、１００、５０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２、または１より多くのゲノム隣接遺伝子のコード配列を含まない。
【０１２３】
別の実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されるように、上記の本発明の核酸分子におけるポリヌクレオチドの一部に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子、例えば、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）に示されるコード配列および／または非コード配列と相補的な配列、ＡＴＣＣ登録番号９７７６８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡクローンの配列、図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１８）に示されるコード配列および／または非コード配列と相補的な配列、ＡＴＣＣ登録番号２０３５１８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡクローンの配列、配列番号２１に示されるコード配列および／または非コード配列（すなわち、転写された、翻訳された）と相補的な配列、配列番号２２に示されるコード配列および／または非コード配列と相補的な配列、配列番号２７に示されるコード配列および／または非コード配列と相補的な配列、配列番号２９またはこれらの配列のフラグメント（例えば、オープンリーディングフレームまたはそのフラグメント）に示されるコード配列および／または非コード配列と相補的な配列を提供する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃にて一晩インキュベーションし、続いて約６５℃において０．１×ＳＳＣでそのフィルターを洗浄することを意図される。
【０１２４】
ポリヌクレオチドの「部分」とハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、およびより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、およびさらにより好ましくは約３０〜７０（例えば、４０、５０、または６０）ヌクレオチド、およびさらにより好ましくは、約３０〜７０または８０〜１５０の任意の整数の範囲のヌクレオチド、または、参照ポリヌクレオチドの全長とハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。これらは、上記および以下に詳細に記載されるような診断プローブおよびプライマーを含むが限定されない用途を有する。「少なくとも２０ヌクレオチド長」のポリヌクレオチドの一部によって、例えば、参照ポリヌクレオチド（例えば、寄託されたｃＤＮＡの一つまたは両方の配列、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列の相補鎖、図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１８）に示されるヌクレオチド配列の相補鎖、配列番号２１に示されるヌクレオチド配列の相補鎖、配列番号２２に示されるヌクレオチド配列の相補鎖、配列番号２７に示されるヌクレオチド配列の相補鎖および／または配列番号２９に示されるヌクレオチド配列の相補鎖）のヌクレオチド配列のいずれかの末端または両末端において、いくつか（すなわち、５、４、３、２、１、または０）のアミノ酸だけ大きいかまたは小さい、特に列挙された範囲を含むことが意図される。もちろん、ポリＡ配列（例えば、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）に示されるニュートロカイン−αｃＤＮＡ３’末端ポリ（Ａ）トラクト（ｔｒａｃｔ）、図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１８）に示されるニュートロカイン−αＳＶｃＤＮＡ３’末端ポリ（Ａ）トラクトまたは配列番号２２に示されるニュートロカイン−αＳＶｃＤＮＡポリ（Ａ）トラクト）あるいはＴ（またはＵ）残基の相補ストレッチにのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部とハイブリダイズさせるために使用される本発明のポリヌクレオチドに含まれない。なぜなら、そのようなポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ストレッチまたはその相補鎖（例えば、特に、プライマーとしてオリゴｄＴを使用して生成された任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）を含む任意の核酸分子とハイブリダイズするためである。
【０１２５】
示されたように、ニュートロカイン−αポリペプチドまたはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドをコードする本発明の核酸分子としては、ポリペプチドのそれぞれの細胞外ドメインのアミノ酸配列を単独でコードするポリヌクレオチド；およびそれぞれのポリペプチドの細胞外ドメインについてのコード配列ならびにさらなる配列（例えば細胞内ドメイン配列および膜貫通ドメイン配列、またはプレタンパク質配列、もしくはプロタンパク質配列もしくはプレプロタンパク質配列）；前述のさらなるコード配列を有するか、または有さない、ポリペプチドのそれぞれの細胞外ドメインのコード配列が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０１２６】
さらなる非コード配列（例えば、転写、ｍＲＮＡプロセシング（スプライシング、およびポリアデニル化シグナルを含む）において役割（例えば、リボソーム結合およびｍＲＮＡの安定性）を果たす転写された非翻訳配列のようなイントロンおよび非コード５’および３’配列が挙げられるが、これらに限定されない）；さらなるアミノ酸（例えば、さらなる機能性を提供するアミノ酸）をコードするさらなるコード配列と共に上記のタンパク質配列がまた、本発明の核酸によってコードされる。
【０１２７】
従って、ポリペプチドをコードする配列は、マーカー配列（例えば、融合ポリペプチドの精製を促進するペプチドをコードする配列）と融合され得る。本発明のこの実施形態の特定の好ましい実施形態において、マーカーアミノ酸配列は、ヘキサヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．，９２５９Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、９１３１１）において提供されるタグ）であり、中でも、これらの多くは商業的に入手可能である。Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されるように、例えば、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する、精製のための有用な別のペプチドであり、これは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７（１９８４）によって記載されている。以下に議論されるように、他のそのような融合タンパク質としては、Ｎ末端またはＣ末端でＦｃと融合されたニュートロカイン−αまたはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドが挙げられる。
【０１２８】
本発明はさらに、本発明の核酸分子の改変体に関し、その改変体は、配列番号２のニュートロカイン−αまたはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの部分、アナログまたは誘導体をコードする。改変体は、例えば、天然の対立遺伝子改変体として天然に存在し得る。「対立遺伝子改変体」によって、生物体の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替形態の中の一つが意図される。Ｇｅｎｅｓ  ＩＩ、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８５）。天然に存在しない改変体は、当該分野で公知の変異誘発技術を使用して作製され得、それらの技術としては、オリゴヌクレオチド媒介変異誘発、アラニンスキャニング、ＰＣＲ変異誘発、部位定方向変異誘発（例えば、Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：４３３１（１９８６）；およびＺｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７（１９８２）を参照のこと）、カセット変異誘発（例えば、Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ  ３４：３１５（１９８５）を参照のこと）、制限選択変異誘発（例えば、Ｗｅｌｌら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  ＳｅｒＡ  ３１７：４１５（１９８６）を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２９】
そのような改変体としては、ヌクレオチド置換、欠失または付加によって産生される改変体が挙げられる。置換、欠失または付加は、一つ以上のヌクレオチドを含み得る。この改変体は、コード領域、非コード領域または両方において変更され得る。コード領域における変更は、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を生じ得る。これらの中で特に好ましいのは、サイレントな置換、付加および欠失であり、これらはニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドまたはそれら部分の特性ならびに活性を変更しない。この点において特に好ましいのは、保存的置換である。
【０１３０】
本発明のさらなる実施形態は、少なくとも一つの保存的アミノ酸置換を含むが、５０個より少ない保存的アミノ酸置換、さらにより好ましくは４０個より少ない保存的アミノ酸置換、またさらにより好ましくは３０個より少ない保存的アミノ酸置換、およびなおまたさらに好ましくは２０個より少ない保存的アミノ酸置換、１０〜２０個の保存的アミノ酸置換、５〜１０個の保存的アミノ酸置換、１〜５個の保存的アミノ酸置換、３〜５個の保存的アミノ酸置換、１〜３個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有する、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチド（例えば、本明細書中に記載される、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドフラグメント）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子に関する。もちろん、優先度が増加する順において、ニュートロカイン−αおよびニュートロカイン−αＳＶポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個よりも少ない保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有することが非常に好ましい。
【０１３１】
さらなる実施形態は、以下：（ａ）図１Ａおよび１Ｂの完全アミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（すなわち、配列番号２の１位〜２８５位）；（ｂ）Ｎ末端メチオニンを除く配列番号２の完全アミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（すなわち、配列番号２の２位〜２８５位）；（ｃ）ニュートロカイン−α機能活性（例えば、抗原性活性または生物学的活性）を有する（ｂ）のポリペプチドのフラグメント；（ｄ）図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）の７３位〜２８５位にてアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドの推定細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；（ｅ）図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）の１３４位〜２８５位にてアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）ＡＴＣＣ登録番号９７７６８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全アミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｇ）ＡＴＣＣ登録番号９７７６８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；および（ｈ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）におけるヌクレオチド配列のいずれかと相補的なヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも８０％、８５％または９０％同一、およびより好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらから構成される単離された核酸分子を含む。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列と融合された上記のポリヌクレオチド配列を含む。これらのポリヌクレオチドおよび核酸分子によってコードされるポリペプチドもまた、本発明によって含まれる。
【０１３２】
本発明の非常に好ましい実施形態は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）における１３４位〜２８５位においてアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％同一、およびより好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらから構成される核酸分子に関する。本発明の好ましい実施形態は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）における１３４位〜２８５位においてアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と、少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらから構成される核酸分子に関する。本発明のさらに好ましい実施形態は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）における１３４位〜２８５位においてアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と、少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらから構成される核酸分子に関する。本発明のさらに好ましい実施形態は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）における１３４位〜２８５位においてアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と、少なくとも９６％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらから構成される核酸分子に関する。
【０１３３】
さらに、本発明のより好ましい実施形態は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）における１３４位〜２８５位においてアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも９７％であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらから構成される核酸分子に関する。さらに、本発明のより好ましい実施形態は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）における１３４位〜２８５位においてアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも９８％であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらから構成される核酸分子に関する。さらに、本発明のより好ましい実施形態は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）における１３４位〜２８５位においてアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と、少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらから構成される核酸分子に関する。
【０１３４】
本発明のさらなる実施形態は、少なくとも一つの保存的アミノ酸置換を含むが、５０個より少ない保存的アミノ酸置換、さらにより好ましくは４０個より少ない保存的アミノ酸置換、またさらにより好ましくは３０個より少ない保存的アミノ酸置換、およびなおまたさらに好ましくは２０個より少ない保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有する、ニュートロカイン−αＳＶポリペプチド（例えば、本明細書中に記載される、ニュートロカイン−αＳＶポリペプチドフラグメント）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子に関する。もちろん、優先度が増加する順において、ニュートロカイン−αポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが、７〜１０、５〜１０、３〜７、３〜５、２〜５、１〜５、１〜３、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個よりも少ない保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有することが非常に好ましい。
【０１３５】
さらなる実施形態は、以下からなる群から選択されるポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、８５％、または９０％同一、そしてより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むかあるいはそれらからなる単離された核酸分子を含む：（ａ）図５Ａおよび５Ｂの完全なアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αＳＶポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１９の１〜２６６位）；（ｂ）Ｎ末端メチオニンを除いて、配列番号１９の完全なアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αＳＶポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（すなわち、配列番号２の２〜２６６位）；（ｃ）図５Ａおよび５Ｂの７３〜２８５位のアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの推定細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列（配列番号１９）；（ｄ）ＡＴＣＣ受託番号２０３５１８を有する寄託物中に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全なアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αＳＶポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｅ）ＡＴＣＣ受託番号２０３５１８を有する寄託物中に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；および（ｆ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）におけるヌクレオチド配列のいずれかに対して相補的なヌクレオチド配列。
【０１３６】
さらに、本発明は、好ましくは上記に列挙された４つのｃＤＮＡクローンから決定されるヌクレオチド配列およびヌクレオチド７９７〜１０８２、８１０〜１０８２、および３４６〜５４２からのヌクレオチド配列を除いた、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）のヌクレオチド１〜ヌクレオチド１０８２の配列中の少なくとも約１０個連続したヌクレオチド、約２０個連続したヌクレオチド、約２５個連続したヌクレオチド、または約３０個連続したヌクレオチド、好ましくは少なくとも約４０個のヌクレオチド、または少なくとも約５０個のヌクレオチドの任意の部分に対して少なくとも９０％または少なくとも９５％同一である配列を含むか、あるいはそれらからなるポリヌクレオチドを含む。本発明はまた、好ましくは上記に列挙された４つのｃＤＮＡクローンから決定されるヌクレオチド配列を除いた、図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１８）の配列中の少なくとも約１０個連続したヌクレオチド、約２０個連続したヌクレオチド、約２５個連続したヌクレオチド、または約３０個連続したヌクレオチド、好ましくは少なくとも約４０個のヌクレオチド、または少なくとも約５０個のヌクレオチドの任意の部分に対して少なくとも９０％または少なくとも９５％同一である配列を含むか、あるいはそれらからなるポリヌクレオチドを含む。本発明はまた、好ましくは上記に列挙された４つのｃＤＮＡクローンから決定されるヌクレオチド配列を除いた、配列番号２１の配列中の少なくとも約１０個連続したヌクレオチド、約２０個連続したヌクレオチド、約２５個連続したヌクレオチド、または約３０個連続したヌクレオチド、好ましくは少なくとも約４０個のヌクレオチド、または少なくとも約５０個のヌクレオチドの任意の部分に対して少なくとも９０％または少なくとも９５％同一である配列を含むか、あるいはそれらからなるポリヌクレオチドを含む。本発明はまた、好ましくは上記に列挙された４つのｃＤＮＡクローンから決定されるヌクレオチド配列を除いた、配列番号２２の配列中の少なくとも約１０個連続したヌクレオチド、約２０個連続したヌクレオチド、約２５個連続したヌクレオチド、または約３０個連続したヌクレオチド、好ましくは少なくとも約４０個のヌクレオチド、または少なくとも約５０個のヌクレオチドの任意の部分に対して少なくとも９０％または少なくとも９５％同一である配列を含むポリヌクレオチドを含む。本発明はまた、好ましくは上記に列挙された４つのｃＤＮＡクローンから決定されるヌクレオチド配列を除いた、配列番号２７の配列中の少なくとも約１０個連続したヌクレオチド、約２０個連続したヌクレオチド、約２５個連続したヌクレオチド、または約３０個連続したヌクレオチド、好ましくは少なくとも約４０個のヌクレオチド、または少なくとも約５０個のヌクレオチドの任意の部分に対して少なくとも９０％または少なくとも９５％同一である配列を含むポリヌクレオチドを含む。本発明はまた、好ましくは上記に列挙された４つのｃＤＮＡクローンから決定されるヌクレオチド配列を除いた、配列番号２９の配列中の少なくとも約１０個連続したヌクレオチド、約２０個連続したヌクレオチド、約２５個連続したヌクレオチド、または約３０個連続したヌクレオチド、好ましくは少なくとも約４０個のヌクレオチド、または少なくとも約５０個のヌクレオチドの任意の部分に対して少なくとも９０％または少なくとも９５％同一である配列を含むポリヌクレオチドを含む。この文脈において「約（おおよそ）」は、特に記載された範囲、いずれかの極値または両方の極値で、数個（すなわち、５、４、３、２、または１個）のアミノ酸だけより大きいかまたはより小さな値を含む。
【０１３７】
ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶのポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、そのポリヌクレオチド配列が、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶのポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５つまでのミスマッチを含み得ることを除いて、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照配列に対して同一であることを意図する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、その参照配列のヌクレオチドの５％までが、欠失され得るかまたは別のヌクレオチドで置換され得、あるいは、その参照配列中の総ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドが、その参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位置において、またはこれらの末端位置の間の任意の位置で、参照配列中のヌクレオチド間で個々に、もしくは参照配列内の１以上の連続した群においての、いずれかで散在して生じ得る。参照（照会（ｑｕｅｒｙ））配列は、それぞれ、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）ならびに図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１８）に示されるようなニュートロカイン−αもしくはニュートロカイン−αＳＶ、あるいは例えば、配列番号２１、２２、２７、もしくは２８として示されるニュートロカイン−αポリヌクレオチドのような任意のニュートロカイン−αをコードするヌクレオチド配列全体、または本明細書中に記載されるような任意のニュートロカイン−αもしくはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドフラグメントであり得る。
【０１３８】
実際問題として、任意の特定の核酸分子が、例えば、図１Ａおよび１Ｂに示されるヌクレオチド配列もしくは図５Ａおよび５Ｂに示されるヌクレオチド配列、または寄託されたｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列に対して、あるいは例えば、配列番号２１、２２、２７、もしくは２８として示されるニュートロカイン−αポリヌクレオチドのような任意のニュートロカイン−αポリヌクレオチド、またはそれらのフラグメントに対して、少なくとも８０％同一、８５％同一、９０％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、または９９％同一であるか否かは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｕｎｉｘ（登録商標）用バージョン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１）のような公知のコンピュータープログラムを使用して従来通りに決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、２つの配列間で相同性の最も高いセグメントを見出すために、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９、１９８１）の局所的相同性アルゴリズムを使用する。特定の配列が本発明に従う参照配列に対して、例えば、９５％同一であるか否かを決定するために、Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列整列プログラムを使用する場合、当然のことながら、同一性のパーセンテージが参照ヌクレオチド配列の全長にわたって計算され、そして参照配列内のヌクレオチドの総数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるようにパラメーターを設定する。
【０１３９】
特定の実施形態では、参照（照会）配列（本発明の配列）と対象配列との間の同一性（全体的な配列整列ともいわれる）は、Ｂｒｕｔｌａｇおよび共同研究者（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定される。配列整列において、照会配列および対象配列は、両方ともにＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、ＵをＴに変換することによって比較され得る。この全体的な配列整列の結果は、同一性パーセントで表される。同一性パーセントを算定するためにＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列において使用される好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ  ０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さ（いずれかより短い方）である。この実施形態に従って、同一性パーセントを計算する場合に、ＦＡＳＴＤＢプログラムが対象配列の５’および３’の短縮を考慮しないという事実を考慮するために、対象配列が、５’または３’欠失のために（内部欠失が理由ではなく）、照会配列より短い場合、手動の補正が結果に対してなされる。照会配列に対して、５’末端または３’末端で短縮化された対象配列について、同一性パーセントは、照会配列の総塩基のパーセントとして、一致／整列されない対象配列の５’および３’である照会配列の塩基の数を計算することによって補正される。ヌクレオチドが一致／整列されるか否かの決定は、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパーセントが、特定のパラメーターを用いて上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定された同一性パーセントから差し引かれ、最終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この補正されたスコアが、本実施形態の目的に使用されるものである。ＦＡＳＴＤＢ整列によって示される場合、照会配列と一致／整列されいていない、対象配列の５’および３’塩基の外側の塩基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的で算定される。例えば、９０塩基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために１００塩基の照会配列に整列される。欠失は、対象配列の５’末端で生じ、従って、ＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端の最初の１０塩基で一致／整列を示さない。１０個の不対合塩基は、配列の１０％（一致していない５’および３’末端での塩基の数／照会配列の塩基の総数）を表し、そのため１０％は、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定される同一性パーセントのスコアから差し引かれる。残りの９０塩基が完全に一致する場合は、最終的な同一性パーセントは９０％である。別の例では、９０塩基の対象配列が、１００塩基の照会配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、その結果、照会と一致／整列しない対象配列の５’または３’の塩基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは手動で補正されない。再び、照会配列と一致���整列しない対象配列の５’および３’の塩基のみが手動で補正される。他の手動の補正は、本実施形態の目的のためにはなされない。
【０１４０】
本願は、本明細書中に開示される核酸配列（すなわち、ポリヌクレオチド）（例えば、図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号１）に開示された核酸配列、または寄託されたｃＤＮＡの核酸配列）に対して、それらがニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの機能的活性（例えば、生物学的活性）を有するポリペプチドをコードするか否かに関わらず、少なくとも８０％同一、８５％同一、９０％同一、９２％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、または９９％同一である核酸分子に関する。さらに、本願は、図５Ａおよび図５Ｂ（配列番号１８）に示された核酸配列に対して、あるいは寄託されたｃＤＮＡの核酸配列に対して、それらがニュートロカイン−αＳＶ活性を有するポリペプチドをコードするか否かに関わらず、少なくとも８０％同一、８５％同一、９０％同一、９２％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、または９９％同一である核酸分子に関する。さらに、本願は、配列番号２１、２２、２７、または２８に示された核酸配列に対して、それらがニュートロカイン−α活性を有するポリペプチドをコードするか否かに関わらず、少なくとも８０％同一、８５％同一、９０％同一、９２％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、または９９％同一である核酸分子に関する。これは、特定の核酸分子がニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶ活性を有するポリペプチドをコードしない場合ですら、当業者はこの核酸分子を使用する方法（例えば、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして）をなお知っているからである。ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶ活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用としては、特に、（１）ｃＤＮＡライブラリー中のニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶ遺伝子またはその対立遺伝子改変体を単離すること；（２）Ｖｅｒｍａら（Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ．Ｙｏｒｋ．（１９８８））に記載されるような、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶ遺伝子の正確な染色体位置を提供するための、分裂中期染色体スプレッド（ｓｐｒｅａｄ）に対するインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、「ＦＩＳＨ」）；および特定の組織におけるニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶのｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット分析が挙げられる。
【０１４１】
しかし、実際に、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの機能的活性（例えば、生物学的活性）を有するポリペプチドをコードする、本明細書中に開示される核酸配列（例えば、図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号１）に示されたヌクレオチド配列、および寄託されたｃＤＮＡの核酸配列、またはそれらのフラグメント）に対して少なくとも８０％同一、８５％同一、９０％同一、９２％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、または９９％同一である配列を有する核酸分子が好ましい。また、実際に、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの機能的活性（例えば、生物学的活性）を有するポリペプチドをコードする、図５Ａおよび図５Ｂ（配列番号１８）に示された核酸配列に対して、あるいは寄託されたｃＤＮＡの核酸配列に対して少なくとも８０％同一、８５％同一、９０％同一、９２％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、または９９％同一である配列を有する核酸分子が好ましい。また、実際に、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの機能的活性（例えば、生物学的活性）を有するポリペプチドをコードする、配列番号２１、２２、２７、または２８に示された核酸配列に対して少なくとも８０％同一、８５％同一、９０％同一、９２％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、または９９％同一である配列を有する核酸分子が好ましい。
【０１４２】
「ニュートロカイン−αポリペプチドの機能的活性を有するポリペプチド」（例えば、生物学的活性）および「ニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの機能的活性を有するポリペプチド」（例えば、生物学的活性）とは、特定の機能アッセイ（例えば、免疫学的または生物学的アッセイ）で測定した場合、本発明のニュートロカイン−αまたはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの細胞外ドメインまたは全長の活性と類似の（しかし、必ずしも同一である必要はない）活性を示すポリペプチドを意図する。例えば、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの機能的活性は、本明細書中に記載されるポリペプチド配列が、完全なニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶあるいはニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの細胞外ドメインとマルチマー（例えば、ホモダイマーおよびホモトリマー）を形成する能力、そしてニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶのリガンドに結合する能力によって測定され得る。ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの機能的活性はまた、本発明のポリペプチドが、リンパ球（例えば、Ｂ細胞）の増殖、分化、または活性化を誘導する能力および／またはＢ細胞生存を延長する能力を決定することによって測定され得る。これらの機能的アッセイは、本明細書中に記載される技術（例えば、実施例６を参照のこと）、および当該分野において公知の他の技術を使用して、慣用的に実施され得る。さらに、本発明のニュートロカイン−αまたはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドは、細胞増殖、細胞傷害性、細胞生存、および細胞死を調節する。特定の細胞に対するタンパク質の影響を測定するためのインビトロ細胞増殖、細胞傷害性、細胞生存、および細胞死のアッセイは、細胞複製および／または細胞死を検出するための当該分野において周知かつ通常利用可能な試薬を使用することによって実施され得る。例えば、ＴＮＦ関連タンパク質の活性についての多数のこのようなアッセイが、本開示における種々の参考文献において記載されている。簡潔には、このようなアッセイの例としては、ヒトまたは動物（例えば、マウス）の細胞を収集する工程、および（１）ニュートロカイン−αタンパク質（または、候補ポリペプチド）を含有するトランスフェクトされた宿主細胞上清、または（２）トランスフェクトされていない宿主細胞上清コントロールと混合する工程、そして特定期間のインキュベーション後に細胞の数または生存率に対する影響を測定する工程を包含する。この型のアッセイにおいて測定され得るような、このような細胞の増殖および／または生存の調節活性は、腫瘍、腫瘍転移、感染、自己免疫疾患、炎症、および他の炎症関連疾患を処置するために有用である。
【０１４３】
ニュートロカイン−αは、上記のアッセイにおいて、用量依存様式において細胞の増殖および分化を調節する。従って、「ニュートロカイン−αポリペプチドの機能的活性を有するポリペプチド」（例えば、生物学的活性）は、用量依存様式において、上記のアッセイにおいて任意の同じ細胞調節（特に、免疫調節）活性も示すポリペプチドを含むことが好ましい。用量依存的活性の程度は、ニュートロカイン−αポリペプチドの活性の程度と同一である必要はないが、好ましくは、「ニュートロカイン−αポリペプチドの機能的活性を有するポリペプチド」は、ニュートロカイン−αポリペプチドと比較して、所定の活性において実質的に類似した用量依存性を示す（すなわち、候補ポリペプチドは、参照ニュートロカイン−αポリペプチドと比較して、より大きな活性を示すか、または約１／２５以上、そして好ましくは約１／１０以上の活性を示す）。
【０１４４】
特定の好ましい実施形態では、「ニュートロカイン−αポリペプチドの機能的活性を有するポリペプチド」（例えば、生物学的活性）および「ニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの機能的活性を有するポリペプチド」（例えば、生物学的活性）は、図８Ａ、８Ｂ、９Ａ、９Ｂ、１０、１１、１２Ａ、および１２Ｂならびに実施例６に記載される、任意の同じＢ細胞（または、他の細胞型）の調節（特に、免疫調節）活性も示すポリペプチドが挙げられる。
【０１４５】
ＴＮＦファミリーの他のメンバーのように、ニュートロカイン−αは、例えば、単球、リンパ球（例えば、Ｂ細胞）、および好中球を含む白血球に対する活性を示す。この理由のために、ニュートロカイン−αは、これらの細胞型の増殖、分化、および動員を指示する際に活性である。このような活性は、免疫増強または抑制、骨髄保護、幹細胞動員、急性および慢性の炎症の制御、ならびに白血病の処置に有用である。このような活性を測定するためのアッセイは、当該分野で公知である。例えば、Ｐｅｔｅｒｓら，Ｉｍｍｕｎ．Ｔｏｄａｙ  １７：２７３（１９９６）；Ｙｏｕｎｇら．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：１１１１（１９９５）；Ｃａｕｘら，Ｎａｔｕｒｅ  ３９０：２５８（１９９２）；およびＳａｎｔｉａｇｏ−Ｓｈｗａｒｚら，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３７８：７（１９９５）を参照のこと。
【０１４６】
当然のことながら、遺伝コードの縮重に起因して、ＡＴＣＣ受託番号９７７６８で寄託したｃＤＮＡクローンに含まれる核酸配列または図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）に示される核酸配列、あるいはそれらのフラグメントに対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を有する多数の核酸分子が「ニュートロカイン−αポリペプチドの機能的活性を有する」ポリペプチド（例えば、生物学的活性）をコードすることを、当業者は直ちに認識する。ＡＴＣＣ受託番号２０３５１８で寄託したｃＤＮＡクローンに含まれる核酸配列または図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１８）に示される核酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を有する多数の核酸分子が「ニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの機能的活性を有する」ポリペプチド（例えば、生物学的活性）をコードすることもまた、当業者は直ちに認識する。実際、これらのヌクレオチド配列の縮重改変体は全て同じポリペプチドをコードするので、このことは上記の比較アッセイを実施しなくとも当業者に明らかである。縮重改変体でない核酸分子についても、妥当な数のものがまたニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶタンパク質活性を有するポリペプチドをコードすることは、当該分野においてさらに認識される。これは、以下にさらに記述するように、タンパク質の機能を顕著にもたらすようであるか、またはもたらさないようであるか（例えば、一つの脂肪族アミノ酸を第二の脂肪族アミノ酸で置換すること）のいずれかのアミノ酸置換を当業者らは十分に承知しているからである。
【０１４７】
同様に、配列番号２のＶ−１４２〜Ｋ−１６０の領域のすべてのまたはいくつかの部分を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ニュートロカイン−αまたはニュートロカイン−αＳＶのポリヌクレオチドのいずれかの発現を検出および／または変更することに関して有益な診断的および治療的ポリヌクレオチドである可能性がある。さらに、配列番号１９に示されるニュートロカイン−αＳＶポリペプチドのアミノ酸残基Ｔ−１４１とＧ−１４２の結合部にわたるポリヌクレオチド（その間に、ニュートロカイン−αのＶ−１４２〜Ｋ−１６０のアミノ酸配列が、明らかに挿入される）もまた、診断的および治療的の両方で有用である可能性がある。このようなＴ−１４１／Ｇ−１４２にわたるポリヌクレオチドは、ニュートロカイン−αポリヌクレオチドとよりもニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションするより高い可能性を示す。本発明のポリヌクレオチドによってコードされるこのようなニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの部分的非制限的非排他的なリストは、以下から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなるポリペプチドが挙げられる：配列番号１９の
【０１４８】
【化８】
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これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドもまた、本発明によって包含される。
【０１４９】
（ベクターおよび宿主細胞）
本発明はまた、本発明の単離されたＤＮＡ分子を含むベクター、この組換えベクターで遺伝子操作された宿主細胞、さもなくば本発明のポリペプチドを産生するように操作された宿主細胞、および組み換え技術または合成技術による、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドあるいはそれらのフラグメントの産生に関する。
【０１５０】
１つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）に連結される。ベクターは、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製コンピテントまたは複製欠損であり得る。後者の場合、ウイルス増殖は、一般的に補完的な宿主細胞においてのみ生じる。ポリヌクレオチドは、宿主における増殖のための選択マーカーを含有するベクターに連結され得る。宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法が挙げられるが、これらに限定されない当該分野において公知の技術よってもたらされ得る。このような方法は、多くの標準的研究室マニュアルに記載されている（例えば、Ｄａｖｉｓら，  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））。
【０１５１】
一般に、組換え発現ベクターは、複製起点および宿主細胞の形質転換を可能とする選択マーカー（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰ１遺伝子）および下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子由来のプロモーターを含有する。そのようなプロモーターは、特に解糖酵素（例えば、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ））、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質などをコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳終結配列、そして好ましくは翻訳されたタンパク質の細胞周辺腔または細胞外培地への分泌を指示し得るリーダー配列と適切な相においてアセンブルされる。必要に応じて、異種配列は、所望の特徴を与えるＮ末端同定ペプチド（例えば、発現された組換え産物の安定化または簡略化された精製）を含む融合タンパク質をコードし得る。
【０１５２】
１つの実施形態では、本発明のＤＮＡは、適切な異種調節エレメント（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）（例えば、いくつか名前を挙げると、ファージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡ、およびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよび後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーター）と作動可能に連結される。他の適切なプロモーターは、当業者に公知である。
【０１５３】
示されたように、この発現ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの選択マーカーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養については、ジヒドロ葉酸レダクターゼ耐性、Ｇ４１８耐性、またはネオマイシン耐性、ならびにＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養については、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代表的な例としては、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；真菌細胞（例えば、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ受託番号２０１１７８）））；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）；ならびに植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。上記した宿主細胞についての適切な培養培地および培養条件は、当該分野で公知である。
【０１５４】
宿主細胞は、高等真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト由来細胞）、または下等真核生物細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、または宿主細胞は、原核生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。挿入された遺伝子配列の発現を調節するか、または所望される特定の様式で遺伝子産物を改変およびプロセスする宿主株が選択され得る。特定のプロモーターからの発現は、特定のインデューサーの存在下で上昇され得る；従って、遺伝子操作されたポリペプチドの発現は制御され得る。さらに、異なる宿主細胞は、特徴的かつ特異的な、タンパク質の翻訳および翻訳後プロセシングおよび改変（例えば、リン酸化、切断）の機構を有する。発現される外来タンパク質の所望の変更およびプロセシングを保証するために、適切な細胞株が選択され得る。宿主細胞における発現のために適切なベクターおよびプロモーターの選択は、周知手順であり、そして発現ベクター構築、宿主内へのベクターの導入、および宿主における発現のために必須の技術は、当該分野の慣用的技術である。
【０１５５】
細菌での使用に有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終結シグナルと共に、機能的なプロモーターを有する作動可能な読みとり相に挿入することにより構築される。ベクターは、ベクターの維持を確実にし、そして所望により宿主内での増幅を提供するために１つ以上の表現型選択マーカー、および複製起点を含有する。形質転換のために適切な原核生物宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内の種々の種を包含するが、他の種もまた選択対象に用いられ得る。代表的な、しかし限定しない例として、細菌での使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ  ３７０１７）の遺伝的エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌性の複製起点を含有し得る。そのような市販のベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ，  ＵＳＡ）を包含する。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部分は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わされる。とりわけ細菌における使用に好ましいベクターとしては、ｐＨＥ４−５（ＡＴＣＣ受託番号２０９３１１；およびその改変体）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、およびｐＱＥ−９（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．（前出）から入手可能）；ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）が挙げられる。酵母系での使用に好ましい発現ベクターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺα、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、およびＰＡＯ８１５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから全て入手可能である）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい真核生物ベクターの中には、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）がある。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかである。
【０１５６】
適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度への宿主株の増殖後に、選択されたプロモーターは、適切な手段（例えば、温度変化または化学誘導）により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養される。細胞は代表的に、遠心分離により収集され、物理的手段または化学的手段により破壊され、そして得られた粗抽出物は、さらなる精製のために保持される。
【０１５７】
タンパク質の発現において使用される微生物細胞は、凍結融解サイクリング、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶剤の使用を含む任意の従来の方法（このような方法は、当業者に周知である）により破壊され得る。
【０１５８】
１つの実施形態において、酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを使用して、真核生物系においてニュートロカイン−αタンパク質を発現させる。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓは、メチオトローフ酵母であり、その唯一の炭素源としてメタノールを代謝し得る。メタノール代謝経路における主な工程は、Ｏ2を使用するホルムアルデヒドへのメタノールの酸化である。この反応は、酵素アルコールオキシダーゼにより触媒される。それの唯一の炭素源としてメタノールを代謝するために、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓは、Ｏ2に対するアルコールオキシダーゼの比較的低い親和性に一部起因して、アルコールオキシダーゼを高レベルで産生しなければならない。従って、主な炭素源としてメタノールに依存する増殖培地において、２つのアルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ１）のうちの１つのプロモーター領域は非常に活性型である。メタノールの存在下で、ＡＯＸ１遺伝子から産生されるアルコールオキシダーゼは、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて全可溶性タンパク質の約３０％までを構成する。Ｅｌｌｉｓ，Ｓ．Ｂら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１１１１−２１（１９８５）；Ｋｏｕｔｚ，Ｐ．Ｊら、Ｙｅａｓｔ  ５：１６７−７７（１９８９）；Ｔｓｃｈｏｐｐ，Ｊ．Ｆ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：３８５９−７６（１９８７）を参照のこと。従って、例えば、全てまたは一部のＡＯＸ１調節配列の転写調節下で、本発明のニュートロカイン−αまたはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドのような異種コード配列は、メタノール存在下で生育されたＰｉｃｈｉａ酵母中において例外的に高レベルで発現される。
【０１５９】
１つの例において、本明細書中に記載されたように、プラスミドベクターｐＰＩＣ９Ｋを使用して、Ｐｉｃｈｉａ酵母系（「Ｐｉｃｈｉａ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｄ．Ｒ．ＨｉｇｇｉｎｓおよびＪ．Ｃｒｅｇｇ編、Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９８に本質的に記載されたような）において本発明のニュートロカイン−αまたはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドをコードするＤＮＡを発現する。この発現ベクターは、マルチクローニング部位の上流に位置するＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓアルカリホスファターゼ（ＰＨＯ）分泌シグナルペプチド（すなわち、リーダー）に連結された強力なＡＯＸ１プロモーターの効果により本発明のニュートロカイン−αまたはニュートロカイン−αＳＶタンパク質の発現および分泌を可能にする。
【０１６０】
多くの他の酵母ベクターが、当業者が容易に理解するように、提案された発現構築物が転写、翻訳、分泌（所望の場合）などについての適切に配置されたシグナル（必要な場合インフレームＡＵＧを含む）を提供する限りは、ｐＰＩＣ９Ｋの代わりに使用され得、そのようなベクターは、例えば、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺα、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、およびＰＡＯ８１５である。
【０１６１】
１つの実施形態において、例えば、本発明のニュートロカイン−αまたはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドのような異種コード配列の高レベル発現は、発現ベクター（例えば、ｐＧＡＰＺまたはｐＧＡＰＺαのような）に本発明の異種ポリヌクレオチドをクローニングすること、ならびにメタノール非存在下での酵母培養物を増殖することにより達成され得る。
【０１６２】
高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増加する。エンハンサーは、ＤＮＡのシス作用エレメントであり、これはプロモーターに対して作用して、その転写を増加する、通常、約１０〜３００ｂｐである。例としては、複製起点の１００〜２７０塩基対後側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
【０１６３】
種々の動物細胞培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために使用され得る。哺乳動物発現系の例としては、Ｇｌｕｚｍａｎ（Ｃｅｌｌ  ２３：１７５（１９８１））により記載されたサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７株および適合性ベクターを発現し得る他の細胞株（例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞株）が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、そしてまた必要な任意のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライシングドナー部位およびスプライシングアクセプター部位、転写終結配列ならびに５’に隣接する非転写配列を含む。ＳＶ４０スプライシング部位、およびポリアデニル化部位から誘導されたＤＮＡ配列を使用して、必要な非転写遺伝子エレメントを提供し得る。
【０１６４】
特定の実施形態では、ニュートロカイン−αの細胞外ドメイン（例えば、アミノ酸残基Ａｌａ−１３４〜Ｌｅｕ−２８５）の一部を発現するように設計された構築物が好ましい。当業者は、このような発現構築物を生成するためのポリヌクレオチドプライマーを設計するために、それぞれ配列番号１および配列番号２、またはそれぞれ配列番号１８および配列番号１９として提供されるポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を使用し得る。
【０１６５】
別の実施形態では、ニュートロカイン−αの推定細胞外ドメイン全体（すなわち、アミノ酸残基Ｇｌｎ−７３〜Ｌｅｕ−２８５）を発現するように設計された構築物が好ましい。当業者は、このような発現構築物を生成するためのポリヌクレオチドプライマーを設計するために、それぞれ配列番号１および配列番号２、またはそれぞれ配列番号１８および配列番号１９として提供されるポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を使用し得る。
【０１６６】
本明細書において議論されるベクター構築物を含む宿主細胞を包含することに加えて、本発明はまた、脊椎動物起源（特に、哺乳動物起源）の一次宿主細胞、二次宿主細胞、および不死化宿主細胞を包含する。これらの宿主細胞は、内因性の遺伝物質（例えば、ニュートロカイン−αコード配列）を欠失または置換するように操作されており、そして／または本発明のニュートロカイン−αポリヌクレオチドと作動可能に連結された遺伝物質（例えば、異種ポリヌクレオチド配列）を含むように操作されており、そして内因性ニュートロカイン−αポリヌクレオチドを活性化、改変、および／または増幅する。例えば、当該分野で公知の技術が、相同組換えを介して、異種制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）および内因性ニュートロカイン−αポリヌクレオチド配列を作動可能に連結するために使用され得る（例えば、１９９７年６月２４日に発行された米国特許第５，６４１，６７０号；１９９６年９月２６日に公開された国際公開第ＷＯ  ９６／２９４１１号；１９９４年８月４日に公開された国際公開第ＷＯ  ９４／１２６５０；Ｋｏｌｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４３５−４３８（１９８９）を参照のこと。これら各々の開示は、それら全体が参考として援用される）。
【０１６７】
下記の宿主細胞は、従来の様式において使用されて、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生し得る。あるいは、無細胞翻訳系もまた、使用して、本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを使用する本発明のポリペプチドを産生し得る。
【０１６８】
本発明のポリペプチドは、改変された形態（例えば、融合タンパク質（（異なるタンパク質の）異種タンパク質配列へのペプチド結合を介して連結されたポリペプチドを含む））で発現または合成され得、そして分泌シグナルのみならず、さらなる異種機能領域をも含み得る。このような融合タンパク質は、当該分野において公知の方法によって、適切な読み取り枠において、本発明のポリヌクレオチドおよび所望のアミノ酸配列をコードする所望の核酸配列を互いに連結させる工程、および当該分野において公知の方法によって、この融合タンパク質産物を発現させる工程により作製され得る。あるいは、このような融合タンパク質は、例えば、ペプチド合成装置を使用することにより、タンパク質合成技術によって作製され得る。従って、例えば、さらなるアミノ酸（特に、荷電アミノ酸）の領域が、精製の間または引き続く取り扱いおよび保存の間の宿主細胞における安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。また、ペプチド部分が、精製を容易にするためにポリペプチドに付加され得る。このような領域は、ポリペプチドの最終的な精製の前に除去され得る。特に、分泌または排泄を生じさせるため、安定性を改善するため、および精製を容易にするためにポリペプチドにペプチド部分を付加することは、当該分野で精通しかつ慣用的な技術である。
【０１６９】
１つの実施形態において、本発明のニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、グラム陰性細菌においてこのようなポリペプチドの発現および精製の効率を増加するためにｐｅｌＢペクチン酸リアーゼシグナル配列に融合され得る。米国特許第５，５７６，１９５号および同第５，８４６，８１８号を参照のこと、これらの内容は、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【０１７０】
好ましい融合タンパク質は、タンパク質の安定化および精製に有用な免疫グロブリン由来の異種領域を含む。例えば、ＥＰ−Ａ−Ｏ  ４６４  ５３３（カナダ国対応出願２０４５８６９）は、別のヒトタンパク質またはその一部とともに免疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分を含む、融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質中のＦｃ部分は、治療および診断における使用に十分に有利であり、従って、例えば改善された薬物動態学的特性を生じる（ＥＰ−Ａ  ０２３２  ２６２）。一方、いくつかの使用について、融合タンパク質が、記載される有利な様式で発現、検出、および精製された後に、Ｆｃ部分が欠失され得ることが望ましい。これは、Ｆｃ部分が、治療および診断における使用の障害であると判明する場合（例えば、融合タンパク質が免疫のための抗原として使用されるべき場合）である。薬物探索において、例えばｈＩＬ−５のようなヒトタンパク質が、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するための高処理能力スクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分と融合されている。Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ８：５２−５８（１９９５）およびＫ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと。
【０１７１】
本発明のポリペプチドは、自然に精製された産物、化学的合成手順の産物、ならびに、例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む、原核生物宿主または真核生物宿主から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において使用される宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されてもまたはグリコシル化されていなくてもよい。さらに、本発明のポリペプチドはまた、宿主媒介プロセスの結果として、いくつかの場合において、最初の修飾されたメチオニン残基を含み得る。
【０１７２】
本発明のポリペプチドは、当該分野で公知の技術を用いて化学合成され得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．，およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．ら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ，３１０：１０５−１１１を参照のこと）。例えば、本発明の完全ニュートロカイン−αまたはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドのフラグメントに対応するペプチドは、ペプチド合成装置の使用により合成され得る。さらに、所望の場合、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸アナログが、置換または付加としてこのニュートロカイン−αまたはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチド配列に導入され得る。非古典的アミノ酸としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：通常のアミノ酸のＤ異性体、２，４−ジアミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ，２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸（ｄｅｓｉｇｎｅｒ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）（例えば、β−メチルアミノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸）、および一般のアミノ酸アナログ。さらにアミノ酸はＤ（右旋性）であってもまたはＬ（左旋性）であってよい。
【０１７３】
本発明は、翻訳の間または翻訳後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解切断、抗体分子または他の細胞性リガンドへの結合などによって示差的に改変されたニュートロカイン−αまたはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドを含む。多数の化学的改変のうちのいずれをも、以下を含むがこれらに限定されない公知の技術によって実施され得る：臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ4による特異的化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝合成；など。
【０１７４】
本発明によって含まれるさらなる翻訳後修飾としては、例えば、以下などが挙げられる：Ｎ結合型もしくはＯ結合型の糖鎖（Ｎ末端またはＣ末端のプロセシング）、アミノ酸骨格への化学部分の結合、Ｎ結合型もしくはＯ結合型の糖鎖の化学修飾、および原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加もしくは欠失。このポリペプチドはまた、検出可能な標識（例えば、酵素標識、蛍光標識、同位体標識または親和性標識）を用いて改変して、このタンパク質の検出および単離を可能にし得る。さらに、本発明のポリペプチドは、ヨウ素化により改変され得る。
【０１７５】
１つの実施形態において、本発明のニュートロカイン−αまたはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドはまた、ビオチンを使用して標識化し得る。他の関連した実施形態において、本発明のビオチン標識化ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドは、例えば、イメージング試薬（ｉｍａｇｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）として、または１つ以上のニュートロカイン−αレセプターおよび／またはニュートロカイン−αＳＶもしくは他のコレセプター分子またはコリガンド分子を同定する手段として、使用され得る。
【０１７６】
本発明によってまた、さらなる利点（例えば、このポリペプチドの溶解度、安定性およびインビボまたはインビトロでの循環時間の増加、または免疫原性の減少）を提供し得る、ニュートロカイン−αまたはニュートロカイン−αＳＶの化学修飾誘導体が提供される（米国特許第４，１７９，３３７号を参照のこと）。誘導体化のための化学部分は、水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなど）から選択され得る。このポリペプチドは、この分子内のランダムな位置でか、またはこの分子内の所定の位置で改変され得、そして１、２、３以上の結合した化学部分を含み得る。
【０１７７】
このポリマーは、任意の分子量のポリマーであり得、そして分枝状であっても非分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールに関しては、好ましい分子量は、取り扱いおよび製造の容易さのために、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間（用語「約（およそ）」は、ポリエチレングリコールの調製において、いくつかの分子は示した分子量よりも重く、いくつかは示した分子量よりも軽いことを示す）である。所望の治療プロフィール（例えば、所望される持続放出の時間、（存在する場合には）生物学的活性に対する効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程度または抗原性の欠如、および治療タンパク質またはアナログに対するポリエチレングリコールの他の公知の効果）に依存して、他のサイズが用いられ得る。例えば、ポリエチレングリコールは、約２００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５００、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，０００、１７，５００、１８，０００、１８、５００、１９，０００、１９，５００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００、または１００，０００ｋＤａの平均分子量を有し得る。
【０１７８】
上記のように、ポリエチレングリコールは、分枝構造を有し得る。分枝ポリエチレングリコールは、例えば、米国特許第５，６４３，５７５号；Ｍｏｒｐｕｒｇｏら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５６：５９−７２（１９９６）；Ｖｏｒｏｂｊｅｖら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １８：２７４５−２７５０（１９９９）；およびＣａｌｉｃｅｔｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：６３８−６４６（１９９９）（これらの各々の開示が、本明細書中で参考として援用される）において記載される。
【０１７９】
ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、このタンパク質の機能的ドメインまたは抗原性ドメインに対する効果を考慮してこのタンパク質に結合されるべきである。当業者に利用可能な多数の結合方法が存在する（例えば、本明細書中に参考として援用される、ＥＰ  ０  ４０１  ３８４（Ｇ−ＣＳＦにＰＥＧを結合する）、Ｍａｌｉｋら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８−１０３５（１９９２）（塩化トレシル（ｔｒｅｓｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）を用いたＧＭ−ＣＳＦのペグ化を報告する）もまた参照のこと）。例えば、ポリエチレングリコールは、反応性基（例えば、遊離のアミノ基またはカルボキシル基）を介してアミノ酸残基により共有結合され得る。反応性基は、活性化ポリエチレングリコール分子が結合し得る基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸残基としては、例えば、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基が挙げられ得る；遊離のカルボキシル基を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基およびＣ末端アミノ酸残基が挙げられ得る。スルフヒドリル残基もまた、ポリエチレングリコール分子を結合するための反応性基として用いられ得る。治療目的のために好ましいのは、アミノ基での結合、例えば、Ｎ末端またはリジン基での結合である。
【０１８０】
上記で示唆されるように、ポリエチレングリコールは、任意の多くのアミノ酸残基への連結を介して、タンパク質に結合され得る。例えば、ポリエチレングリコールは、リジン残基、ヒスチジン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、またはシステイン残基への共有結合を介して、タンパク質に連結され得る。１つ以上の反応化学が使用されて、タンパク質の特定のアミノ酸残基（例えば、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン）またはタンパク質の１より多い型のアミノ酸残基（例えば、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン、およびそれらの組み合わせ）にポリエチレングリコールを結合させ得る。
【０１８１】
Ｎ末端で化学修飾されたタンパク質が特に所望され得る。ポリエチレングリコールを例示として用いて、種々のポリエチレングリコール分子から（分子量、分枝などによって）、反応混合物中でのタンパク質（または、ポリペプチド）分子に対するポリエチレングリコール分子の比、行われるべきペグ化反応の型、および選択されたＮ末端ペグ化タンパク質の獲得方法が選択され得る。Ｎ末端ペグ化調製物の獲得方法（すなわち、必要な場合、この部分を他のモノペグ化部分から分離すること）は、ペグ化タンパク質分子の集団からの、Ｎ末端ペグ化物質の精製により行われ得る。Ｎ末端修飾で化学修飾された選り抜きのタンパク質は、特定のタンパク質における誘導体化に利用可能な異なる型の第１級アミノ基（リジン対Ｎ末端）の示差的反応性を利用する還元的アルキル化によって達成され得る。適切な反応条件下では、カルボニル基含有ポリマーを用いた、Ｎ末端でのタンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。
【０１８２】
上記で示されたように、本発明のタンパク質のペグ化は、かなり多数の手段によって達成され得る。例えば、ポリエチレングリコールは、直接的または介在リンカーによってのいずれかで、タンパク質に結合され得る。タンパク質にポリエチレングリコールを結合させるためのリンカーレス（ｌｉｎｋｅｒｌｅｓｓ）系は、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）；Ｆｒａｎｃｉｓら、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｊ．ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌ．６８：１−１８（１９９８）；米国特許第４，００２，５３１号；米国特許第５，３４９，０５２号；ＷＯ９５／０６０５８；およびＷＯ９８／３２４６６（これらの各々の開示は、本明細書中で参考として援用される）に記載される。
【０１８３】
介在するリンカーを伴わずに、タンパク質のアミノ酸残基に直接的にポリエチレングリコールを結合させる１つの系は、トレシル化（ｔｒｅｓｙｌａｔｅｄ）ＭＰＥＧ（これは、塩化トレシル（ｔｒｅｓｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ）（ＣｌＳＯ2ＣＨ2ＣＦ3）を使用して、一メトキシ（ｍｏｎｍｅｔｈｏｘｙ）ポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）を改変することによって生成される）を使用する。トレシル化ＭＰＥＧとのタンパク質の反応に際して、ポリエチレングリコールは、タンパク質のアミン基に直接結合される。従って、本発明は、本発明のタンパク質と２，２，２−トリフルオロエタン（ｔｒｉｆｌｕｏｒｅｏｔｈａｎｅ）スルホニル（ｓｕｌｐｈｏｎｙｌ）基を有するポリエチレングリコール分子とを反応させることによって生成されるタンパク質−ポリエチレングリコール結合体を含む。
【０１８４】
ポリエチレングリコールはまた、多くの異なる介在リンカーを使用して、タンパク質に結合され得る。例えば、米国特許第５，６１２，４６０号（この開示全体が、本明細書中で参考として援用される）は、タンパク質にポリエチレングリコールを結合させるためのウレタンリンカーを開示する。ポリエチレングリコールが、リンカーによってタンパク質に結合されるタンパク質−ポリエチレングリコール結合体はまた、ＭＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネート（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、１，１'−カルボニルジイミダゾールで活性化されたＭＰＥＧ、ＭＰＥＧ−２，４，５−トリクロロフェニルカルボネート（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｐｅｎｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅ）、ＭＰＥＧ−ｐ−ニトロフェノールカルボネート、および種々のＭＰＥＧ−スクシネート誘導体のような化合物とのタンパク質の反応によって生成され得る。さらなる多くのポリエチレングリコール誘導体およびタンパク質にポリエチレングリコールを結合させるための反応化学が、ＷＯ９８／３２４６６（この開示全体が、本明細書中で参考として援用される）に記載される。本明細書中に示される反応化学を使用して生成されるペグ化タンパク質産物は、本発明の範囲内に含まれる。
【０１８５】
本発明の各タンパク質に結合されたポリエチレングリコール部分の数（すなわち、置換の程度）もまた、変動し得る。例えば、本発明のペグ化タンパク質は、平均して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０またはそれより多いポリエチレングリコール分子を連結し得る。同様に、平均の置換の程度は、タンパク質１分子あたり１〜３、２〜４、３〜５、４〜６、５〜７、６〜８、７〜９、８〜１０、９〜１１、１０〜１２、１１〜１３、１２〜１４、１３〜１５、１４〜１６、１５〜１７、１６〜１８、１７〜１９、または１８〜２０ポリエチレングリコール部分のような範囲内である。置換の程度を決定する方法は、例えば、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）において考察される。
【０１８６】
ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈澱、酸抽出、アニオン交換クロマトグラフィーまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない公知の方法によって、回収および精製され得る。最も好ましくは、精製のために、高性能液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が使用される。
【０１８７】
（ニュートロカイン-αポリペプチド）
本発明のニュートロカイン-αポリペプチドおよび/またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドは、モノマーまたはマルチマー（すなわち、ダイマー、トリマー、テトラマーおよびより高度のマルチマー）であり得る。従って、本発明は、モノマーおよびマルチマーの本発明のニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチド、それらの調製およびそれらを含む組成物（好ましくは治療薬）に関する。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、モノマー、ダイマー、トリマーまたはテトラマーである。さらなる実施形態では、本発明のマルチマーは、少なくともダイマー、少なくともトリマー、または少なくともテトラマーである。
【０１８８】
本発明によって含まれるマルチマーは、ホモマーまたはヘテロマーであり得る。本明細書中で用いられる場合、用語ホモマーは、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチド（本明細書中に記載されるニュートロカイン−αフラグメントおよび／またはニュートロカイン−αＳＶフラグメント、改変体および融合タンパク質を含む）のみを含むマルチマーをいう。これらのホモマーは、同一または異なるアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドを含み得る。特定の実施形態では、本発明のホモマーは、同一のアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドのみを含むマルチマーである。別の特定の実施形態では、本発明のホモマーは、異なるアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドを含むマルチマーである。特定の実施形態では、本発明のマルチマーは、ホモダイマー（例えば、同一または異なるアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドを含む）またはホモトリマー（例えば、同一または異なるアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドを含む）である。好ましい実施形態において、本発明のマルチマーは、ホモトリマーである。さらなる実施形態では、本発明のホモマー性マルチマーは、少なくともホモダイマー、少なくともホモトリマーまたは少なくともホモテトラマーである。
【０１８９】
本明細書中で用いられる場合、用語ヘテロマーとは、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドに加えて異種ポリペプチド（すなわち、異なるタンパク質のポリペプチド）を含むマルチマーをいう。特定の実施形態では、本発明のマルチマーは、ヘテロダイマー、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマーである。さらなる実施形態では、本発明のヘテロマー性マルチマーは、少なくともヘテロダイマー、少なくともヘテロトリマーまたは少なくともヘテロテトラマーである。さらなる非限定的な実施形態では、本発明のヘテロマーは、ＣＤ４０リガンドポリペプチド配列、あるいはその生物学的に活性なフラグメントまたは改変体を含む。
【０１９０】
本発明のマルチマーは、疎水結合、親水結合、イオン結合および／もしくは共有結合的な結合の結果であり得、ならびに／または例えば、リポソーム形成によって間接連結され得る。従って、１つの実施形態では、本発明のマルチマー（例えば、ホモダイマーまたはホモトリマー）は、本発明のポリペプチドが溶液中で互いに接触する場合に形成される。別の実施形態では、本発明のへテロマルチマー（例えば、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマーなど）は、本発明のポリペプチドが、溶液中で本発明のポリペプチドに対する抗体（本発明の融合タンパク質における異種ポリペプチド配列に対する抗体を含む）と接触した場合に形成される。他の実施形態では、本発明のマルチマーは、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドとの、および／または本発明のニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチド間での共有結合によって形成される。このような共有結合は、ポリペプチド配列（例えば、配列番号２または配列番号１９に記載されるかまたは本発明に関連して寄託されたクローンによってコードされるポリペプチドに含まれる、ポリペプチド配列）中に含まれる１以上のアミノ酸残基を含み得る。１例では、この共有結合は、ネイティブ（すなわち、天然に存在する）ポリペプチドにおいて相互作用するポリペプチド配列内に存在するシステイン残基間での架橋である。別の例では、この共有結合は、化学的操作または組換え操作の結果である。あるいは、このような共有結合は、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの融合タンパク質中の異種ポリペプチド配列において含まれる１以上のアミノ酸残基を含み得る。１例では、共有結合は、本発明の融合タンパク質に含まれる異種配列間にある（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の例では、この共有結合は、（本明細書中に記載されるような）本発明のニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの融合タンパク質に含まれる異種配列間にある。別の特定の例では、本発明の融合タンパク質の共有結合は、共有結合したマルチマーを形成し得る別のＴＮＦファミリーリガンド／レセプターメンバー（例えば、オステオプロテゲリン（ｏｓｅｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）など）由来の異種ポリペプチド配列間にある（例えば、国際公開第ＷＯ  ９８／４９３０５号（この内容はその全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。別の実施形態では、本発明の融合タンパク質の共有結合は、ＣＤ４０Ｌ由来の異種ポリペプチド配列間、またはその可溶性フラグメントにある。別の実施形態では、２以上の本発明のニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドは、合成リンカーを通して連結される（例えば、ペプチド、糖類または可溶性ポリマーリンカー）。例としては、米国特許第５，０７３，６２７号（本明細書中に参考として援用される）に記載されるペプチドリンカーが挙げられる。ペプチドリンカーによって隔てられた本発明の複数のニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドを含���タンパク質は、従来の組換えＤＮＡ技術を用いて生成され得る。
【０１９１】
本発明のマルチマーニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドを調製するための別の方法は、ロイシンジッパーポリペプチド配列またはイソロイシンジッパー配列に融合したされた本発明のニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの使用を含む。ロイシンジッパードメインまたはイソロイシンジッパードメインは、そのドメインが見出されるタンパク質のマルチマー形成を促進するポリペプチドである。ロイシンジッパーは元々、いくつかのＤＮＡ結合タンパク質において同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１７５９、（１９８８））、そしてそれ以来、種々の異なるタンパク質において見出されている。公知のロイシンジッパーまたはイソロイシンジッパーの中には、ダイマー形成またはトリマー形成をする、天然に存在するペプチドおよびその誘導体がある。可溶性マルチマーのニュートロカイン−αタンパク質および／またはニュートロカイン−αＳＶタンパク質を生成するために適切なロイシンジッパードメインの例は、本明細書中に参考として援用されるＰＣＴ出願ＷＯ  ９４／１０３０８に記載されるロイシンジッパードメインである。溶液中でダイマー形成またはトリマー形成をするペプチドに融合したされた可溶性ニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドを含む組換え融合タンパク質は、適切な宿主細胞中で発現され、そして得られる可溶性マルチマーのニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶは、当該分野で公知の技術を用いて培養上清から回収される。
【０１９２】
タンパク質のＴＮＦファミリーの特定のメンバーは、トリマー形態で存在すると考えられる（ＢｅｕｔｌｅｒおよびＨｕｆｆｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：６６７、１９４４；Ｂａｎｎｅｒら、Ｃｅｌｌ  ７３：４３１、１９９３）。トリマーのニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶは、増強された生物学的活性という利点を提供し得る。好ましいロイシンジッパー部分は、トリマーを優先的に形成する部分である。１例は、本明細書中に参考として援用されるＨｏｐｐｅら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３４４：１９１，（１９９４））および米国特許出願第０８／４４６，９２２号に記載される通りの肺サーファクタントプロテインＤ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーである。天然に存在するトリマータンパク質由来の他のペプチドは、トリマーニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの調製において用いられ得る。
【０１９３】
別の例では、本発明のタンパク質は、本発明のＦｌａｇ（登録商標）ニュートロカイン−α融合タンパク質またはＦｌａｇ（登録商標）ニュートロカイン−αＳＶ融合タンパク質に含まれるＦｌａｇ（登録商標）ポリペプチド配列間の相互作用によって会合する。さらなる実施形態では、本発明のタンパク質は、本発明のＦｌａｇ（登録商標）ニュートロカイン−α融合タンパク質またはＦｌａｇ（登録商標）ニュートロカイン−αＳＶ融合タンパク質に含まれる異種ポリペプチド配列と抗Ｆｌａｇ（登録商標）抗体との間の相互作用によって会合する。
【０１９４】
本発明のマルチマーは、当該分野で公知の化学技術を用いて生成され得る。例えば、本発明のマルチマーに含まれることが所望されるポリペプチドは、当該分野で公知のリンカー分子およびリンカー分子長最適化技術を用いて化学的に架橋され得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明のマルチマーは、当該分野で公知の技術を用いて生成されて、マルチマーに含まれることが所望されるポリペプチドの配列内に存在するシステイン残基間の１以上の分子間架橋を形成し得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端へのシステインまたはビオチンの付加によって慣用的に改変され得、そして当該分野で公知の技術が、１以上のこれらの改変されたポリペプチドを含むマルチマーを生成するために適用され得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、当該分野で公知の技術は、本発明のマルチマーに含まれることが所望されるポリペプチド成分を含むリポソームを生成するために適用され得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。
【０１９５】
あるいは、本発明のマルチマーは、当該分野で公知の遺伝子操作技術を用いて生成され得る。１つの実施形態では、本発明のマルチマーに含まれるポリペプチドは、本明細書中に記載の融合タンパク質技術または当該分野で公知の他の技術を用いて組換え的に産生される（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の実施形態において、本発明のホモダイマーをコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、逆方向で、本来のＣ末端からＮ末端（リーダー配列を欠く）へと、リンカーポリペプチドをコードする配列に連結し、次いで、さらに、ポリペプチドの翻訳産物をコードする合成ポリヌクレオチドに連結することにより生成される（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。別の実施形態では、本明細書中に記載される組換え技術または当該分野で公知の他の技術は、本発明の組換えポリペプチドを生成するために適用される。この組換えペプチドは、膜貫通ドメイン含み、そして膜再構成技術によりリポソームへ取り込まれ得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。
【０１９６】
１つの実施形態において、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号９７７６８に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列または図１Ａおよび１Ｂ中のアミノ酸配列（配列番号２）を有する、単離されたニュートロカイン−αポリペプチド、あるいは上記のポリペプチドの一部（すなわち、フラグメント）を含むポリペプチドを提供する。別の実施形態では、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号２０３５１８に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列または図５Ａおよび５Ｂ中のアミノ酸配列（配列番号１９）を有する、単離されたニュートロカイン−αＳＶポリペプチド、あるいは上記のポリペプチドの一部（すなわち、フラグメント）を含むポリペプチドを提供する。
【０１９７】
本発明のポリペプチドフラグメントは、以下のアミノ酸配列を含むか、または以下のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む：配列番号２に含まれるアミノ酸配列、ＡＴＣＣ受託番号９７７６８を有するプラスミドに含まれるｃＤＮＡよりコードされるアミノ酸配列、あるいは寄託されたクローンに含まれるヌクレオチド配列、または図１Ａ−Ｂに示されるヌクレオチド配列（配列番号１）の相補鎖に（例えば、本明細書中に記載されるような、ストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズする核酸によコードされるアミノ酸配列。
【０１９８】
さらに、本発明のポリペプチドフラグメントは、以下のアミノ酸配列を含むか、または以下のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む：配列番号１９に含まれるアミノ酸配列、ＡＴＣＣ受託番号２０３５１８を有するプラスミドに含まれるｃＤＮＡよりコードされるアミノ酸配列、あるいは寄託されたクローンに含まれるヌクレオチド配列、または図５Ａ−Ｂに示されるヌクレオチド配列（配列番号１８）の相補鎖に、（例えば、本明細書中に記載されるような、ストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列。
【０１９９】
さらに、本発明のポリペプチドフラグメントは、以下のアミノ酸配列を含むか、または以下のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む：配列番号２１に示されるヌクレオチド配列の相補鎖に（例えば、本明細書中に記載されるような、ストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列。
【０２００】
本発明のポリペプチドフラグメントはまた、以下のアミノ酸配列を含むか、または以下のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む：配列番号２３に含まれるアミノ酸配列、あるいは配列番号２２に示されるヌクレオチド配列の相補鎖に（例えば、本明細書中に記載されるような、ストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列。
【０２０１】
さらに、本発明のポリペプチドフラグメントはまた、以下のアミノ酸配列を含むか、または以下のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む：配列番号２８に含まれるアミノ酸配列、あるいは配列番号２７に示されるヌクレオチド配列の相補鎖に（例えば、本明細書中に記載されるような、ストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列。
【０２０２】
さらに、本発明のポリペプチドフラグメントはまた、以下のアミノ酸配列を含むか、または以下のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む：配列番号３０に含まれるアミノ酸配列、あるいは配列番号２９に示されるヌクレオチド配列の相補鎖に（例えば、本明細書中に記載されるような、ストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列。
【０２０３】
本発明ポリペプチドフラグメントは、以下のアミノ酸配列を含むか、または以下のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む：配列番号２に含まれるアミノ酸配列、寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、あるいは寄託されたクローンに含まれるヌクレオチド配列、または図１Ａおよび１Ｂに示されるヌクレオチド配列（配列番号１）、あるいはそれらに相補的な鎖に、（例えば、本明細書中に記載されるような、ストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列。タンパク質フラグメントは、「自立構造（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」であり得るか、あるいはより大きなポリぺプチド内（このフラグメントが、部分または領域を（最も好ましくは単一の連続した領域として）形成する）に含まれ得る。本発明のポリペプチドフラグメントの代表的な例としては、例えば、以下のおおよそのアミノ酸残基を含むか、または以下のおおよそのアミノ酸残基からなる、フラグメントを含む：配列番号２の１〜５０、５１〜１００、１０１〜１５０、１５１〜２００、２０１〜２５０、および/または２５１〜２８５。さらに、ポリペプチドフラグメントは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１７５または２００アミノ酸長であり得る。
【０２０４】
特定の実施形態において、本発明のポリペプチドフラグメントは、以下のアミノ酸残基を含むか、または以下のアミノ酸残基からなる：図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）に示される１〜４６、３１〜４４、４７〜７２、７３〜２８５、７３〜８３、９４〜１０２、１４８〜１５２、１６６〜１８１、１８５〜２０９、２１０〜２２１、２２６〜２３７、２４４〜２４９、２５３〜２６５、および/または２７７〜２８４。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【０２０５】
ニュートロカイン−αＳＶポリペプチド配列に見出されない１９のアミノ酸残基挿入物（すなわち、図１Ａおよび１Ｂおよび配列番号２に示される配列のＶａｌ１４２〜Ｌｙｓ−１６０のアミノ酸残基）を含む、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドに標的化された変異は、ニュートロカイン−αポリペプチドの観察された生物学的活性に影響し得ることが当業者に理解される。より詳細には、変異のために標的化され得る、ニュートロカイン−αポリペプチド配列のこのような残基の、部分的な、非制限的かつ非限定的リストは、配列番号２に示されるニュートロカイン−αポリペプチド配列の以下のアミノ酸残基含む：Ｖ−１４２；Ｔ−１４３；Ｑ−１４４；Ｄ−１４５；Ｃ−１４６；Ｌ−１４７；Ｑ−１４８；Ｌ−１４９；Ｉ−１５０；Ａ−１５１；Ｄ−１５２；Ｓ−１５３；Ｅ−１５４；Ｔ−１５５；Ｐ−１５６；Ｔ−１５７；Ｉ−１５８；Ｑ−１５９；およびＫ−１６０。配列番号２のＶ−１４２〜Ｋ−１６０の領域の１つ以上の変異を有する、ニュートロカイン−αポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが意図される。これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドもまた、本発明に含まれる。
【０２０６】
ポリペプチドフラグメントは、「自立構造（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」であり得るか、あるいはより大きなポリぺプチド内（このフラグメントが、部分または領域を（最も好ましくは単一の連続した領域として）形成する）に含まれ得る。本発明のポリペプチドフラグメントの代表的な例としては、例えば、以下のおおよそのアミノ酸残基を含むか、または以下のおおよそのアミノ酸残基からなる、フラグメントを含む：配列番号２に開示されるアミノ酸配列の１〜１５、１６〜３０、３１〜４６、４７〜５５、５６〜７２、７３〜１０４、１０５〜１６３、１６３〜１８８、１８６〜２１０、および２１０〜２８４。本発明のポリペプチドフラグメントのさらなる代表的な例としては、例えば、以下のおおよそのアミノ酸残基を含むか、または以下のおおよそのアミノ酸残基からなる、フラグメントを含む：配列番号１９に開示されるアミノ酸配列の１〜１４３、１〜１５０、４７〜１４３、４７〜１５０、７３〜１４３、７３〜１５０、１００〜１５０、１４０〜１４５、１４２〜１４８、１４０〜１５０、１４０〜２００、１４０〜２２５、および１４０〜２６６。さらに、ポリペプチドフラグメントは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１７５または２００アミノ酸長であり得る。この文脈において、「おおよそ（約）」とは、特に記載された範囲、アミノ末端およびカルボキシ末端のいずれかもしくは両方において、これより数個（５、４、３、２、または１）のアミノ酸だけ大きい範囲かまたは小さな範囲を意味する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【０２０７】
さらに好ましい実施形態は、以下を含むか、または以下からなるポリペプチドフラグメントを含み：ニュートロカイン−αの予想される細胞内ドメイン（配列番号２のアミノ酸残基１〜４６）、ニュートロカイン−αの予想される膜貫通ドメイン（配列番号２のアミノ酸残基４７〜７２）、ニュートロカイン−αの予想される細胞外ドメイン（配列番号２のアミノ酸残基７３〜２８５）、ニュートロカイン−αの予想されるＴＮＦ保存ドメイン（配列番号２のアミノ酸残基１９４〜２８４）、かつ以下を含むか、または以下からなるポリペプチドを含む：ニュートロカイン−αの予想される細胞外ドメインに融合したした予想される細胞内ドメイン（配列番号２のアミノ酸残基７３〜２８５に融合したしたアミノ酸残基１〜４６）。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【０２０８】
さらになお好ましい実施形態は、以下を含むか、または以下からなるポリペプチドフラグメントを含み：ニュートロカイン−αＳＶの予想される細胞内ドメイン（配列番号１９のアミノ酸残基１〜４６）、ニュートロカイン−αＳＶの予想される膜貫通ドメイン（配列番号１９のアミノ酸残基４７〜７２）、ニュートロカイン−αＳＶの予想される細胞外ドメイン（配列番号１９のアミノ酸残基７３〜２６６）、ニュートロカイン−αＳＶの予想されるＴＮＦ保存ドメイン（配列番号１９のアミノ酸残基１７２〜２６５）、かつ以下を含むか、または以下からなるポリペプチドを含む：ニュートロカイン−αＳＶの予想される細胞外ドメインに融合したした予想される細胞内ドメイン（配列番号１９のアミノ酸残基７３〜２６６に融合したしたアミノ酸残基１〜４６）。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【０２０９】
本発明の特定のさらなる実施形態は、以下を含むか、または以下からなるポリペプチドフラグメントを含む：図７Ａにおいて同定される予想されるβプリーツシート領域。本発明のポリペプチドフラグメントは、以下のアミノ酸残基を含むか、または以下のアミノ酸残基からなる：配列番号２のＧｌｎ−１４４〜Ａｌａ−１５１、Ｐｈｅ−１７２〜Ｌｙｓ−１７３、Ａｌａ−１７７〜Ｇｌｕ−１７９、Ａｓｎ−１８３〜Ｉｌｅ−１８５、Ｇｌｙ−１９１〜Ｌｙｓ−２０４、Ｈｉｓ−２１０〜Ｖａｌ−２１９、Ｌｅｕ−２２６〜Ｐｒｏ−２３７、Ａｓｎ−２４２〜Ａｌａ−２５１、Ｇｌｙ−２５６〜Ｉｌｅ−２６３および／またはＶａｌ−２７６〜Ｌｅｕ−２８４。別の非限定的実施形態では、本発明のこれらのポリペプチドフラグメントはまた、以下のアミノ酸残基を含むか、または以下のアミノ酸残基からなる：配列番号１９のＰｈｅ−１５３〜Ｌｙｓ−１５４、Ａｌａ−１５８〜Ｇｌｕ−１６０、Ａｓｎ−１６４〜Ｉｌｅ−１６６、Ｇｌｙ−１７２〜Ｌｙｓ１８５、Ｈｉｓ−１９１〜Ｖａｌ−２００、Ｌｅｕ−２０７〜Ｐｒｏ−２１８、Ａｓｎ−２２３〜Ａｌａ−２３２、Ｇｌｙ−２３７〜Ｉｌｅ−２４４および／またはＶａｌ−２５７〜Ｌｅｕ−２６５；ならびに配列番号２３のＰｈｅ−４２〜Ｌｙｓ４３、Ａｌａ−４７〜Ｇｌｕ−４９、Ａｓｎ−５３〜Ｉｌｅ−５５、Ｇｌｙ−６１〜Ｐｒｏ−７４、Ｈｉｓ−８０〜Ｖａｌ−８９、Ｌｅｕ−９６〜Ｐｒｏ−１０７、Ａｓｎ−１１２〜Ａｌａ−１２１、Ｇｌｙ−１２６〜Ｉｌｅ−１３３および／またはＡｓｐ−１４６〜Ｌｅｕ−１５４。さらなる非限定的実施形態では、本発明のこれらのポリペプチドフラグメントはまた、以下のアミノ酸残基を含むか、または以下のアミノ酸残基からなる：配列番号２８のＧｌｎ−７８〜Ａｌａ８５；Ｐｈｅ−１０６〜Ｌｙｓ−１０７、Ａｌａ−１１１〜Ｇｌｕ−１１３、Ａｓｎ−１１７〜Ｉｌｅ−１１９、Ｇｌｙ−１２５〜Ｌｙｓ−１３８、Ｈｉｓ−１４４〜Ｖａｌ−１５３、Ｌｅｕ−１６０〜Ｐｒｏ−１７１、Ａｓｎ−１７６〜Ａｌａ−１８５、Ｇｌｙ−１９０〜Ｉｌｅ−１９７および／またはＶａｌ−２１０〜Ｌｅｕ−２１８；および配列番号３０のＧｌｎ−７８〜Ａｌａ８５；Ｐｈｅ−１０６〜Ｌｙｓ−１０７、Ａｌａ−１１１〜Ｇｌｕ−１１３、Ａｓｎ−１１７〜Ｉｌｅ−１１９、Ｇｌｙ−１２５〜Ｌｙｓ−１３８、Ｈｉｓ−１４４〜Ｖａｌ−１５３、Ｌｅｕ−１６０〜Ｐｒｏ−１７１、Ａｓｎ−１７６〜Ａｌａ−１８５、Ｇｌｙ−１９０〜Ｉｌｅ−１９７および／またはＶａｌ−２１０〜Ｌｅｕ−２１８。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【０２１０】
本発明のアミノ酸配列の組み合わせを含むか、またはこの組み合わせからなる、本発明のポリペプチドの部分的な、非制限的かつ例示的なリストは、例えば、以下を含む：配列番号２の［Ｍｅｔ−１〜Ｌｙｓ−１１３］に融合した［Ｌｅｕ−１１４〜Ｔｈｒ−１４１］に融合した［Ｉｌｅ−１４２〜Ｌｙｓ−１６０］に融合した［Ｇｌｙ−１６１〜Ｇｌｎ−１９８］に融合した［Ｖａｌ−１９９〜Ａｌａ  ２４８］に融合した［Ｇｌｙ−２５０〜Ｌｅｕ−２８５］；配列番号２の［Ｍｅｔ−１〜Ｌｙｓ−１１３］に融合した［Ｉｌｅ１４２〜Ｌｙｓ−１６０］に融合した［Ｇｌｙ−１６１〜Ｇｌｎ−１９８］に融合した［Ｖａｌ−１９９〜Ａｌａ−２４８］に融合した［Ｇｌｙ−２５０〜Ｌｅｕ−２８５］；または配列番号２の［Ｍｅｔ−１〜Ｌｙｓ−１１３］に融合した［Ｌｅｕ−１１４〜Ｔｈｒ−１４１］に融合した［Ｉｌｅ−１４２〜Ｌｙｓ−１６０］に融合した［Ｇｌｙ−１６１〜Ｇｌｎ−１９８］に融合した［Ｇｌｙ−２５０〜Ｌｅｕ−２８５］。他の組み合わせは、上記以外の規則的なポリペプチドフラグメントを含み得る（例えば、配列番号２の［Ｌｅｕ−１１４〜Ｔｈｒ−１４１］に融合した［Ｖａｌ−１９９〜Ａｌａ−２４８］に融合した［Ｇｌｙ−２５０〜Ｌｅｕ−２８５］に融合した［Ｉｌｅ−１４２〜Ｌｙｓ−１６０］）。他の組み合わせはまた、本明細書中に記載されるような異種ポリペプチドフラグメント、および／または本発明の他のポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントを含み得る（例えば、配列番号２の［Ｍｅｔ−１〜Ｌｙｓ−１１３］に融合した［Ｌｅｕ−１１４〜Ｔｈｒ−１４１］に融合した［Ｉｌｅ−１４２〜Ｌｙｓ−１６０］に融合した［Ｇｌｙ−１６１〜Ｇｌｎ−１９８］に融合した［Ｇｌｙ−２５０〜Ｌｅｕ−２８５］に融合したＦＬＡＧタグ）。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【０２１１】
アミノ酸配列の組み合わせを含むか、またはこの組み合わせからなる、本発明のポリペプチドのさらなる部分的な、非制限的かつ例示的なリストは、例えば、以下を含む：配列番号１９の［Ｍｅｔ−１〜Ｌｙｓ−１１３］に融合した［Ｌｅｕ−１１４〜Ｔｈｒ−１４１］に融合した［Ｇｌｙ−１４２〜Ｇｌｎ−１７９］に融合した［Ｖａｌ−１８０〜Ａｌａ−２２９］に融合した［Ｇｌｙ−２３０〜Ｌｅｕ−２６６］；配列番号１９の［Ｍｅｔ−１〜Ｌｙｓ−１１３］に融合した［Ｇｌｙ１４２〜Ｇｌｎ−１７９］に融合した［Ｖａｌ−１８０〜Ａｌａ−２２９］に融合した［Ｇｌｙ−２３０〜Ｌｅｕ−２６６］；または配列番号１９の［Ｍｅｔ−１〜Ｌｙｓ−１１３］に融合した［Ｌｅｕ−１１４〜Ｔｈｒ−１４１］に融合した［Ｇｌｙ１４２〜Ｇｌｎ−１７９］に融合した［Ｇｌｙ−２３０〜Ｌｅｕ−２６６］。他の組み合わせは、上記以外の規則的なポリペプチドフラグメントを含み得る（例えば、配列番号１９の［Ｌｅｕ−１１４〜Ｔｈｒ−１４１］に融合した［Ｖａｌ−１８０〜Ａｌａ−２２９］に融合した［Ｇｌｙ−２３０〜Ｌｅｕ−２６６］に融合した［Ｇｌｙ−１４２〜Ｇｌｎ−１７９］）。他の組み合わせはまた、本明細書中に記載されるような異種ポリペプチドフラグメント、および／または本発明の他のポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントを含み得る（例えば、配列番号１９の［Ｍｅｔ−１〜Ｌｙｓ−１１３］に融合した［Ｌｅｕ−１１４〜Ｔｈｒ−１４１］に融合した［Ｇｌｙ−１４２〜Ｇｌｎ−１７９］に融合した［Ｇｌｙ−２３０〜Ｌｅｕ−２６６］に融合したＦＬＡＧタグ）。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【０２１２】
アミノ酸配列の組み合わせを含むか、またはこの組み合わせからなる、本発明のポリペプチドのさらなる部分的な、非制限的かつ例示的なリストは、例えば、以下を含む：配列番号２３の［Ｍｅｔ−１〜Ｌｙｓ−１０６］に融合した［Ｌｅｕ−１０７〜Ｔｈｒ−１３４］に融合した［Ｉｌｅ−１６７〜Ｌｙｓ−１８４］に融合した［Ｇｌｙ−１８５〜Ｇｌｎ−２２４］に融合した［Ｖａｌ−２２５〜Ａｌａ−２７２］に融合した［Ｇｌｙ−２７３〜Ｌｅｕ−３０９］；配列番号２３の［Ｍｅｔ−１〜Ｌｙｓ−１０６］に融合した［Ｇｌｕ−１３５〜Ａｓｎ−１６５］に融合した［Ｉｌｅ−１６７〜Ｌｙｓ−１８４］に融合した［Ｇｌｙ−１８５〜Ｇｌｎ−２２４］に融合した［Ｖａｌ−２２５〜Ａｌａ−２７２］に融合した［Ｇｌｙ−２７３〜Ｌｅｕ−３０９］；または配列番号２３の［Ｍｅｔ−１〜Ｌｙｓ−１０６］に融合した［Ｌｅｕ−１０７〜Ｔｈｒ−１３４］に融合した［Ｇｌｕ−１３５〜Ａｓｎ−１６５］に融合した［Ｉｌｅ−１６７〜Ｌｙｓ−１８４］に融合した［Ｇｌｙ−１８５〜Ｇｌｎ−２２４］に融合した［Ｇｌｙ−２７３〜Ｌｅｕ−３０９］。他の組み合わせは、上記以外の規則的なポリペプチドフラグメントを含み得る（例えば、配列番号２３の［Ｍｅｔ−１〜Ｌｙｓ−１０６］に融合した［Ｇｌｙ−１８５〜Ｇｌｎ２２４］に融合した［Ｉｌｅ−１６７〜Ｌｙｓ−１８４］に融合した［Ｖａｌ−２２５〜Ａｌａ−２７２］に融合した［Ｌｅｕ−１０７〜Ｔｈｒ−１３４］に融合した［Ｇｌｙ−２７３〜Ｌｅｕ−３０９］）。他の組み合わせはまた、本明細書中に記載されるような異種ポリペプチドフラグメント、および／または本発明の他のポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントを含み得る（例えば、配列番号２３のＭｅｔ−１〜Ｌｙｓ１０６］に融合した［Ｇｌｕ−１３５〜Ａｓｎ−１６５］に融合した［Ｉｌｅ−１６７〜Ｌｙｓ−１８４］に融合した［Ｇｌｙ−１８５〜Ｇｌｎ−２２４］に融合した［Ｖａｌ−２２５〜Ａｌａ−２７２］に融合した［Ｇｌｙ−２７３〜Ｌｅｕ−３０９］に融合したＦＬＡＧタグ）。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【０２１３】
アミノ酸配列の組み合わせを含むか、またはこの組み合わせからなる、本発明のポリペプチドのさらなる部分的な、非制限的かつ例示的なリストは、例えば、以下を含む：配列番号２８の［Ｔｙｒ−１〜Ｌｙｓ−４７］に融合した［Ｌｅｕ−４８〜Ｔｈｒ−７５］に融合した［Ｉｌｅ−７６〜Ｌｙｓ−９４］に融合した［Ｇｌｙ−９５〜Ｇｌｎ−１３２］に融合した［Ｖａｌ−１３３〜Ａｌａ−１８２］に融合した［Ｇｌｙ−１８３〜Ａｌａ−２１９］；配列番号２８の［Ｔｙｒ−１〜Ｌｙｓ−４７］に融合した［Ｌｅｕ−４８〜Ｔｈｒ７５］に融合した［Ｉｌｅ−７６〜Ｌｙｓ−９４］に融合した［Ｖａｌ−１３３〜Ａｌａ−１８２］；または配列番号２８の［Ｔｙｒ−１〜Ｌｙｓ−４７］に融合した［Ｉｌｅ−７６〜Ｌｙｓ−９４］に融合した［Ｖａｌ−１３３〜Ａｌａ−１８２］に融合した［Ｇｌｙ−１８３〜Ａｌａ−２１９］。他の組み合わせは、上記以外の規則的なポリペプチドフラグメントを含み得る（例えば、配列番号２８の［Ｔｙｒ−１〜Ｌｙｓ−４７］に融合した［Ｇｌｙ−１８３〜Ａｌａ−２１９］に融合した［Ｖａｌ−１３３〜Ａｌａ−１８２］に融合した［Ｌｅｕ−４８〜Ｔｈｒ７５］）。他の組み合わせはまた、本明細書中に記載されるような異種ポリペプチドフラグメント、および／または本発明の他のポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントを含み得る（例えば、配列番号２８の［Ｌｅｕ−４８〜Ｔｈｒ−７５］に融合した［Ｉｌｅ−７６〜Ｌｙｓ−９４］に融合した［Ｇｌｙ−９５〜Ｇｌｎ−１３２］に融合した［Ｖａｌ−１３３〜Ａｌａ−１８２］に融合したＦｃレセプタータグ）。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【０２１４】
アミノ酸配列の組み合わせを含むか、またはこの組み合わせからなる、本発明のポリペプチドのさらなる部分的な、非制限的かつ例示的なリストは、例えば、以下を含む：配列番号３０の［Ｔｙｒ−１〜Ｌｙｓ−４７］に融合した［Ｌｅｕ−４８〜Ｔｈｒ−７５］に融合した［Ｉｌｅ−７６〜Ｌｙｓ−９４］に融合した［Ｇｌｙ−９５〜Ｇｌｎ−１３２］に融合した［Ｖａｌ−１３３〜Ａｌａ−１８２］に融合した［Ｇｌｙ−１８３〜Ａｌａ−２１９］；配列番号３０の［Ｔｙｒ−１〜Ｌｙｓ−４７］に融合した［Ｌｅｕ−４８〜Ｔｈｒ７５］に融合した［Ｉｌｅ−７６〜Ｌｙｓ−９４］に融合した［Ｖａｌ−１３３〜Ａｌａ−１８２］；または配列番号３０の［Ｔｙｒ−１〜Ｌｙｓ−４７］に融合した［Ｉｌｅ−７６〜Ｌｙｓ−９４］に融合した［Ｖａｌ−１３３〜Ａｌａ−１８２］に融合した［Ｇｌｙ−１８３〜Ａｌａ−２１９］。他の組み合わせは、上記以外の規則的なポリペプチドフラグメントを含み得る（例えば、配列番号３０の［Ｔｙｒ−１〜Ｌｙｓ−４７］に融合した［Ｇｌｙ−１８３〜Ａｌａ−２１９］に融合した［Ｖａｌ−１３３〜Ａｌａ−１８２］に融合した［Ｌｅｕ−４８〜Ｔｈｒ７５］）。他の組み合わせはまた、本明細書中に記載されるような異種ポリペプチドフラグメント、および／または本発明の他のポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントを含み得る（例えば、配列番号３０の［Ｌｅｕ−４８〜Ｔｈｒ−７５］に融合した［Ｉｌｅ−７６〜Ｌｙｓ−９４］に融合した［Ｇｌｙ−９５〜Ｇｌｎ−１３２］に融合した［Ｖａｌ−１３３〜Ａｌａ−１８２］に融合したＦｃレセプタータグ）。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【０２１５】
本発明のさらなる実施形態は、例えば、以下の本発明のポリペプチドの機能的領域を含むか、または以下の本発明のポリペプチドの機能的領域からなる、ニュートロカイン−αポリペプチドフラグメントおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドフラグメントを含む：図３および６および表Ｉおよび本明細書中に記載される、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎのα−領域、β−領域、ターン領域、およびコイル領域、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎのα−領域、β−領域、およびターン領域、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの親水性領域および疎水性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇのα−両親媒性領域およびβ−両親媒性領域、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚの可撓性領域、Ｅｍｉｎｉの表面形成領域ならびに高い抗原性指標のＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆの領域。好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドフラグメントは、抗原性である。表ＩのＶＩＩＩ欄、ＩＸ欄、ＸＩＩＩ欄、およびＸＩＶ欄に示されるデータは、高い程度の抗原性について能力を示す、ニュートロカイン−αの領域を、慣用的に決定するために用いられ得る。高い抗原性の領域は、ポリペプチドの領域を示す値を選択することにより、ＶＩＩＩ欄、ＩＸ欄、ＸＩＩＩ欄、およびＩＶ欄に示されるデータから決定される。このポリペプチドの領域は、抗原認識が免疫応答の開始のプロセスで生じ得る環境において、ポリペプチドの表面に暴露されるようである。本発明の非常に好ましいポリヌクレオチドの中に、いくつかの構造的特徴（例えば、上記の特徴のいくつか（例えば、１、２、３または４））と組み合わされるニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの領域を含むフラグメントがある。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【０２１６】
別の実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部分を含むか、このエピトープ保有部分からなる、ポリペプチドを提供する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。このポリペプチドのエピトープ部分は、本発明のポリペプチドの免疫原性または抗原性エピロープである。「免疫原性エピトープ」は、タンパク質全体が免疫原である場合、抗体応答を誘発するタンパク質の一部として定義される。一方では、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」と定義され得る。タンパク質の免疫原性エピトープの数は、一般には、抗原性エピトープの数よりも少ない。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３９９８−４００２（１９８３）を参照のこと。
【０２１７】
抗原性エピトープを保有するポリペプチド（すなわち、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域を含む）の選択に関して、タンパク質配列の一部を模倣する比較的短い合成ペプチドが、部分的に模倣されたタンパク質と反応する抗血清を慣用的に誘発し得ることが当該分野で周知である。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．，Ｓｈｉｎｎｉｃｋ，Ｔ．Ｍ．，Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．およびＬｅａｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．（１９８３）「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｈａｔ  ｒｅａｃｔ  ｗｉｔｈ  ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｓｉｔｅｓ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．
Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１９：６６０−６６６」を参照のこと。タンパク質−反応性血清を誘発し得るペプチドは、タンパク質の一次配列に頻繁に存在し、そして単純な化学的法則のセットにより特徴付けられ得、そしてインタクトなタンパク質（すなわち、免疫原性エピトープ）の免疫ドミナント領域にも、アミノ末端またはカルボキシル末端にも、制限されない。本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、それゆえ、本発明のポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む抗体を惹起するのに有用である。例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７−７７８（１９８４）の７７７を参照のこと。
【０２１８】
本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に含まれる、好ましくは、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、より好ましくは、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、そして最も好ましくは約１５〜約３０アミノ酸の配列を含む。免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含む好ましいポリペプチドは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００のアミノ酸の長さである。さらなる非限定的な好ましい抗原性エピトープは、本明細書中に開示される抗原性エピトープ、およびその部分を含む。
【０２１９】
ニュートロカイン−α特異的抗体および／またはニュートロカイン−αＳＶ特異的抗体を産生するために使用され得る、抗原性ポリペプチドまたペプチドの非限定的な例としては以下が挙げられる：図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）の約Ｐｈｅ１１５〜約Ｌｅｕ１４７のアミノ酸残基を含有するか、またはこのアミノ酸残基からなるポリペプチド；図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）の約Ｉｌｅ１５０〜約Ｔｙｒ１６３のアミノ酸残基を含有するか、またはこのアミノ酸残基からなるポリペプチド；図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）の約Ｓｅｒ１７１〜約Ｐｈｅ１９４のアミノ酸残基を含有するか、またはこのアミノ酸残基からなるポリペプチド；図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）の約Ｇｌｕ２２３〜約Ｔｙｒ２４７のアミノ酸残基を含有するか、またはこのアミノ酸残基からなるポリペプチド；ならびに図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）の約Ｓｅｒ２７１〜約Ｌｅｕ２７８のアミノ酸残基を含有するか、またはこのアミノ酸残基からなるポリペプチド。この文脈において、「おおよそ（約）」とは、特に記載された範囲、アミノ末端およびカルボキシ末端のいずれかもしくは両方において、これより数個（５、４、３、２、または１）のアミノ酸だけ大きい範囲かまたは小さな範囲を意味する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。これらのポリペプチドフラグメントは、上記の図３および表Ｉに示されるようなＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指数の分析によってニュートロカインαポリペプチドの抗原性エピトープを保有することが決定された。
【０２２０】
ニュートロカイン−α特異的抗体および／またはニュートロカイン−αＳＶ特異的抗体を産生するために使用され得る、抗原性ポリペプチドまたペプチドの非限定的な例としては以下が挙げられる：図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１９）の約Ｐｒｏ−３２〜約Ｌｅｕ−４７のアミノ酸残基を含有するか、またはこのアミノ酸残基からなるポリペプチド；図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１９）の約Ｇｌｕ−１１６〜約Ｓｅｒ−１４３のアミノ酸残基を含有するか、またはこのアミノ酸残基からなるポリペプチド；図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１９）の約Ｐｈｅ−１５３〜約Ｔｙｒ−１７３のアミノ酸残基を含有するか、またはこのアミノ酸残基からなるポリペプチド；図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１９）の約Ｐｒｏ−２１８〜約Ｔｙｒ−２２７のアミノ酸残基を含有するか、またはこのアミノ酸残基からなるポリペプチド；図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１９）の約Ａｌａ−２３２〜約Ｇｌｎ−２４１のアミノ酸残基を含有するか、またはこのアミノ酸残基からなるポリペプチド；図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１９）の約Ｉｌｅ−２４４〜約Ａｌａ−２４９のアミノ酸残基を含有するか、またはこのアミノ酸残基からなるポリペプチド；ならびに図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１９）の約Ｓｅｒ−２５２〜約Ｖａｌ−２５７のアミノ酸残基を含有するか、またはこのアミノ酸残基からなるポリペプチド。この文脈において、「おおよそ（約）」とは、特に記載された範囲、アミノ末端およびカルボキシ末端のいずれかもしくは両方において、これより数個（５、４、３、２、または１）のアミノ酸だけ大きい範囲かまたは小さな範囲を意味する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。これらのポリペプチドフラグメントは、上記の図６およびＤＮＡ＊ＳＴＡＲコンピュータープログラムＰｒｏｔｅａｎコンポーネントにより生成された図６に示されるデータの表の表示（上に示す）に示されるような、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指数の分析によってニュートロカインαＳＶポリペプチドの抗原性エピトープを保有することが決定された。
【０２２１】
本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、任意の簡便な手段によって産生され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．（１９８５）Ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒａｐｉｄ  ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙ
ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｔ  ｔｈｅ  ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ａｍｉｎｏｓ  ａｃｉｄｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５１３１−５１３５；この「複数ペプチド合成（ＳＭＰＳ）」プロセスは、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、（１９８６）の米国特許第４，６３１，２１１号にさらに記載されている。
【０２２２】
本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、当該分野に周知の方法によって抗体を誘導するための使用を含むが、これに限定されない。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏｎら、前出；Ｃｈｏｗ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと。本発明の免疫原性エピトープ保有ペプチド（すなわち、抗体応答を誘発するタンパク質の部分）は、タンパク質全体が免疫原である場合、当該分野で公知の方法に従って同定される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、前出、を参照のこと。さらになお、Ｇｅｙｓｅｎ（１９９０）の米国特許第５，１９４，３９２号は、目的の抗体の特定のパラトープ（抗原結合部位）に相補的であるエピトープの位相幾何学的等価物（すなわち、「ミモトープ」）であるモノマー（アミノ酸または他の化合物）の配列を検出または決定する一般的な方法を記載する。より一般的には、Ｇｅｙｓｅｎ（１９８９）の米国特許第４，４３３，０９２号は、目的の特定のレセプターのリガンド結合部位に相補的であるリガンドの位相幾何学的等価物であるモノマーの配列を検出または決定する方法を記載する。同様に、Ｐｅｒａｌｋｙｌａｔｅｄ  Ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ  ＭｉｘｔｕｒｅｓにおけるＨｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．ら（１９９６）の米国特許第５，４８０，９７１号は、線状Ｃ１−Ｃ７−アルキル過アルキル化（ｐｅｒａｌｋｙｌａｔｅｄ）オリゴペプチドおよびセットおよびこのようなペプチドのライブラリー、ならびに目的のアクセプター分子に、優先的に結合する過剰アルキル化オリゴペプチドの配列を決定するためにこのようなオリゴペプチドセットおよびライブラリーを使用する方法を開示する。従って、本発明のエピトープ保有ペプチドの非ペプチドアナログはまた、これらの方法により慣用的に作製され得る。
【０２２３】
本発明は、以下を含むか、または以下からなるポリペプチドを含む：配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドのエピトープ、あるいはＡＴＣＣ受託番号９７７６８に含まれるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列のエピトープ、あるいは配列番号１の配列またはＡＴＣＣ受託番号９７７６８に含まれるｃＤＮＡ配列の相補鎖に（例えば、本明細書中に記載されるような、ストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド配列のエピトープ。本発明は、さらに、以下を含むか、または以下からなるポリヌクレオチドを含む：本発明のポリペプチド配列のエピトープをコードする配列（例えば、配列番号１に開示される配列）、本発明のエピトープをコードするポリヌクレオチド配列の相補鎖のポリヌクレオチド配列、および相補鎖に（例えば、本明細書中に記載されるような、ストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズするポリヌクレオチド配列。
【０２２４】
本発明はまた、以下を含むか、または以下からなるポリペプチドを含む：配列番号１９のアミノ酸配列を有するポリペプチドのエピトープ、あるいはＡＴＣＣ受託番号２０３５１８に含まれるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列のエピトープ、あるいは配列番号１８の配列またはＡＴＣＣ受託番号２０３５１８に含まれるｃＤＮＡ配列の相補鎖に（例えば、本明細書中に記載されるような、ストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド配列のエピトープ。本発明は、さらに、以下を含むか、または以下からなるポリヌクレオチドを含む：本発明のポリペプチド配列のエピトープをコードする配列（例えば、配列番号１８に開示される配列）、本発明のエピトープをコードするポリヌクレオチド配列の相補鎖のポリヌクレオチド配列、および相補鎖に（例えば、本明細書中に記載されるような、ストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズするポリヌクレオチド配列。
【０２２５】
本明細書中で用いられる場合、用語「エピトープ」とは、動物（好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒト）において抗原性活性または免疫原性活性を有するポリペプチドの部分をいう。好ましい実施形態において、本発明はエピトープを含むポリペプチド、ならびにこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本明細書中で用いられる場合、「免疫原性エピトープ」は、当該分野の任意方法により（例えば、上記の抗体を生成するための方法により）決定される場合、動物において抗体応答を誘発するタンパク質の部分をいう。（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３９９８〜４００２（１９８３）を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、用語「抗原性エピトープ」は、当該分野で周知の任意の方法（例えば、本明細書中に記載のイムノアッセイによる）によって決定される場合、抗体がその抗原に免疫特異的に結合し得る、タンパク質の一部として定義される。免疫特異的結合は、非特異的結合を除外するが、他の抗原との交叉反応は除外する必要はない。抗原性エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。
【０２２６】
エピトープとして機能するフラグメントは、任意の従来の方法によって産生され得る（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５１３１−５１３５（１９８５）を参照のこと。さらに、米国特許第４，６３１，２１１号に記載される）。
【０２２７】
本発明においては、抗原性エピトープは、好ましくは、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７アミノ酸配列を含み、より好ましくは、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０アミノ酸配列を含み、そして最も好ましくは約１５と約３０との間のアミノ酸配列を含む。免疫原性または抗原性エピトープを含有する好ましいポリペプチドは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００アミノ酸残基の長さである。さらに、本明細書中で開示される抗原性エピトープおよびその一部を含む非排他的に好ましい抗原性エピトープは、好ましい。抗原性エピトープは、有用である（例えば、エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む、抗体を惹起するため）。好ましい抗原性エピトープは、本明細書中で開示される抗原性エピトープ、および２、３、４、５以上のこれらの抗原性エピトープの任意の組合わせを含む。抗原性エピトープは、イムノアッセイにおいて、標的分子として使用され得る。（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら，Ｃｅｌｌ  ３７：７６７−７７８（１９８４）；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１９：６６０−６６６（１９８３）を参照のこと）。
【０２２８】
同様に、免疫原性エピトープを使用して、例えば、当該分野で周知の方法に従う抗体を誘導し得る。（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏｎら，前出；Ｃｈｏｗら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと）。好ましい免疫原性エピトープは、本明細書中に開示される免疫原性エピトープ、およびこれらの免疫原性エピトープの１、２、３、４、５以上の任意の組み合わせを含む。１つ以上の免疫原性エピトープを含むポリペプチドは、キャリアタンパク質（例えば、アルブミン）とともに動物系（例えば、ウサギまたはマウス）に抗体応答を誘発するために提示され得るか、このポリペプチドが十分に長い場合（少なくとも約２５アミノ酸）、このポリペプチドは、キャリアなしで動物系に提示され得る。しかし、８〜１０程度の少なさのアミノ酸を含む免疫原性エピトープは、少なくとも変性ポリペプチド中の直鎖状エピトープに結合し得る抗体を惹起するには十分であることが示されている（例えば、ウェスタンブロッティングにおいて）。
【０２２９】
本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、当該分野で周知の方法に従って抗体を誘導するために使用され得る。これらの周知の方法としては、インビボ免疫、インビトロ免疫、およびファージディスプレイ法が挙げられるが、それらに限定されない。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら，前出；Ｗｉｌｓｏｎら，前出；およびＢｉｔｔｌｅら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと。インビボ免疫を使用する場合、動物を遊離ペプチドを用いて免疫し得る；しかし、抗ペプチド抗体力価は、高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）にペプチドを結合させることによりブーストされ得る。例えば、システイン残基を含むペプチドは、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを用いてキャリアに結合され得る。その一方、他のペプチドは、より一般的な結合剤（例えば、グルタルアルデヒド）を用いてキャリアに結合され得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離のペプチドまたはキャリア結合ペプチドのいずれかを用いて、例えば、エマルジョン（約１００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびフロイントアジュバント、あるいは免疫応答を刺激するための当該分野で公知の他のアジュバントを含む）の腹腔内注射および／または皮内注射により免疫される。いくつかのブースター注射が、抗ペプチド抗体の有用な力価を提供するために、例えば、約２週間の間隔で、必要とされ得る。この力価は、例えば、固体表面に吸着した遊離のペプチドを用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る。免疫した動物由来の血清中の抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択（例えば、当該分野で周知の方法に従う固体支持体上のペプチドの吸着および選択された抗体の溶出による）により上昇し得る。
【０２３０】
当業者に理解されるように、そして上記で考察されるように、免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含む本発明のポリペプチドは、異種ポリペプチド配列に融合され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメインまたはそれらの部分（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、それらの任意の組み合わせ、およびそれらの部分）と融合し得、これがキメラポリペプチドを生じる。これらの融合タンパク質は、精製を容易にし得、そしてインビボにおいて半減期を増加させ得る。これは、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を示した。例えば、ＥＰ  ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３３１：８４〜８６（１９８８）を参照のこと。上皮性関門を横切って免疫系への、抗原の増強された送達は、ＦｃＲｎ結合パートナー（例えば、ＩｇＧフラグメントまたはＦｃフラグメント（例えば、ＰＣＴ公開  ＷＯ９６／２２０２４およびＷＯ  ９９／０４８１３を参照のこと）に結合体化した抗原（例えば、インスリン）について実証されている。ＩｇＧ部分に起因してジスルフィド架橋二量体構造を有するＩｇＧ融合タンパク質はまた、単量体ポリペプチドまたはそれらのフラグメント単独よりも、他の分子の結合および中和においてより効果的であり得る。例えば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：３９５８〜３９６４（１９９５）を参照のこと。上記のエピトープをコードする核酸はまた、エピトープタグ（例えば、血球凝集素（「ＨＡ」）タグまたはフラッグタグ（ｆｌａｇ  ｔａｇ））として目的の遺伝子と組換えられ、発現されたポリペプチドの検出および精製を補助し得る。例えば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔらによって記載された系は、ヒト細胞株において発現される非変性融合タンパク質の前精製を可能にする（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８９７２−８９７）。この系において、目的の遺伝子は、遺伝子の読み取り枠が、６つのヒスチジン残基からなるアミノ末端タグと翻訳的に融合されるように、ワクシニア組換えプラスミド中でサブクローンされる。このタグは、融合タンパク質に対する膜結合ドメインとして働く。組換えワクシニアウイルスに感染した細胞由来の抽出物は、Ｎｉ2+ニトリロ三酢酸酸性アガロースカラムに充填され、そしてヒスチジンタグ化したタンパク質は、イミダゾール含有緩衝液を用いて選択的に溶出され得る。
【０２３１】
別の実施形態では、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドならびにそのエピトープ保有フラグメントは、異種抗原（例えば、ポリペプチド、糖質、リン脂質、または核酸）と融合される。特定の実施形態では、異種抗原は免疫原である。
【０２３２】
より特定の実施形態では、異種抗原は、ＨＩＶのｇｐ１２０タンパク質またはそのフラグメントである。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【０２３３】
別の実施形態では、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチド、ならびにそのエピトープ保有部分は、別のＴＮＦリガンドファミリーメンバーのポリペプチド配列（あるいはその生物学的に活性なフラグメントまたは改変体）と融合される。特定の実施形態では、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドは、ＣＤ４０Ｌポリペプチド配列と融合される。好ましい実施形態では、ＣＤ４０Ｌポリペプチド配列は、可溶性である。
【０２３４】
遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（総称して「ＤＮＡシャッフリング」といわれる）の技術は、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの活性を調節するために用いられ得、それによりニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶのアゴニストおよびアンタゴニストを有効に生成し得る。一般には、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号および同第５，８３７，４５８号、ならびにＰａｔｔｅｎ，Ｐ．Ａ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４−３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６−８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｌ．Ｏ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５−７６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏ，Ｍ．Ｍ．およびＢｌａｓｃｏ，Ｒ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４（２）：３０８−１３（１９９８）（これらの特許および刊行物の各々が参考として援用される）を参照のこと。１つの実施形態において、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶのポリヌクレオチドおよび対応するポリペプチドの改変は、ＤＮＡシャッフリングにより達成され得る。ＤＮＡシャッフリングは、相同組換えまたは部位特異的組換えによる、所望のニュートロカイン−α分子および／またはニュートロカイン−αＳＶ分子への２つ以上のＤＮＡセグメントのアセンブリを含む。別の実施形態において、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶのポリヌクオチドおよび対応するポリペプチドは、組換え前に、誤りがちの（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、ランダムなヌクレオチド挿入または他の方法により、ランダムな変異誘発に供されることによって改変され得る。別の実施形態において、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの１つ以上の成分、モチーフ、区切り（ｓｅｃｔｉｏｎ）、部分、ドメイン、フラグメントなどは、１つ以上の異種分子の１つ以上の成分、モチーフ、区切り（ｓｅｃｔｉｏｎ）、部分、ドメイン、フラグメントなどと組み換えられ得る。好ましい実施形態において、異種分子は、例えば、以下である：ＴＮＦ−α、リンホトキシン−α（ＬＴ−α、ＴＮＦ−βとしても公知）、ＬＴ−β（複合ヘテロトリマーＬＴ−α２−βにおいて見出される）、ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−γ（国際公開番号ＷＯ９６／１４３２８）、ＡＩＭ−Ｉ（国際公開番号ＷＯ９７／３３８９９）、ＡＩＭ−ＩＩ（国際公開番号ＷＯ９７／３４９１１）、エンドカイン（ｅｎｄｏｋｉｎｅ）−α（国際公開番号ＷＯ９８／０７８８０）、ＯＰＧ、ＯＸ４０、および神経成長因子（ＮＧＦ）、ならびに可溶性形態のＦａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＣＤ４０および４−ＩＢＢ、ＴＲ２（国際公開番号ＷＯ９６／３４０９５）、ＤＲ３（国際公開番号ＷＯ９７／３３９０４）、ＤＲ４（国際公開番号ＷＯ９８／３２８５６）、ＴＲ５（国際公開番号ＷＯ９８／３０６９３）、ＴＲ６（国際公開番号ＷＯ９８／３０６９４）、ＴＲ７（国際公開番号ＷＯ９８／４１６２９）、ＴＲＡＮＫ、ＴＲ９（国際公開番号ＷＯ９８／５６８９２）、ＴＲ１０（国際公開番号ＷＯ９８／５４２０２）、３１２Ｃ２（国際公開番号ＷＯ９８／０６８４２）、およびＴＲ１２、ＣＡＤ、およびｖ−ＦＬＩＰ。さらなる実施形態では、異種分子は、ＴＮＦファミリーの任意のメンバーである。
【０２３５】
好ましい実施形態では、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチド（その生物学的に活性なフラグメントまたは改変体を含む）は、可溶性ＣＤ４０Ｌポリペプチド、またはその生物学的に活性なフラグメントまたは改変体と融合される。
【０２３６】
ニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドの特徴を改善または改変するために、タンパク質工学が用いられ得る。当業者に公知の組換えＤＮＡ技術が用いられ、新規な変異タンパク質または「１つもしくは複数のアミノ酸置換、欠失、付加を含むムテインまたは融合タンパク質を作製し得る。このような改変ポリペプチドは、例えば、増強された活性または増大した安定性を示し得る。さらに、それらは、少なくとも特定の精製条件および貯蔵条件下で、対応する天然のポリペプチドよりも、高い収率で精製され得、そしてより良好な溶解度を示す。例えば、多数のタンパク質（分泌タンパク質の細胞外ドメインまたは成熟形態を含む）について、１個以上のアミノ酸が、生物学的機能の実質的な損失を伴わずにＮ末端またはＣ末端から欠失され得ることが当該分野で公知である。例えば、Ｒｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：２９８４−２９８８（１９９３）は、３、８、または２７個のアミノ末端アミノ酸残基が失われたとしてもヘパリン結合活性を有する改変されたＫＧＦタンパク質を報告した。
【０２３７】
この場合、本発明のタンパク質は、ＴＮＦポリペプチドファミリーのメンバーであるので、図１および１Ｂ（配列番号２）の１９１位のＧｌｙ（Ｇ）残基までのＮ末端アミノ酸の欠失は、いくらかの生物学的活性（例えば、リンパ球（例えば、Ｂ細胞）の増殖、分化および／または活性化、ならびに適切な標的細胞に対する細胞障害を刺激する能力）を保持し得る。Ｇｌｙ（Ｇ）残基を含むさらなるＮ末端欠失を有するポリペプチドは、生物学的活性を保持するとは考えられない。なぜなら、この残基は、ＴＮＦ関連ポリペプチドにおいて、生物学的活性に必要とされる保存されたドメインの始まりであることが公知であるからである。しかし、タンパク質のＮ末端からの１個以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質の１つ以上の生物学的機能の喪失の改変をもたらしたとしても、他の機能的活性は依然として保持され得る。従って、タンパク質の完全なまたは細胞外ドメインを認識する抗体、を誘導するかおよび／または結合する短縮化タンパク質の能力は、一般に、タンパク質の完全なまたは細胞外ドメインの大部分よりも少ない残基がＮ末端から除去される場合、保持される。完全なタンパク質のＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドが、このような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書中に記載の慣用的な方法および当該分野で公知の他の慣用的な方法により容易に決定され得る。
【０２３８】
従って、本発明はさらに、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）に示されるニュートロカインαのアミノ酸配列のアミノ末端からアミノ末端からのＧｌｙ１９１残基までの１個以上の残基を欠失するポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。特に、本発明は、配列番号２の残基ｎ1〜２８５のアミノ酸配列を含むか、あるいはこれからなるポリペプチドを提供し、ここで、ｎ1は、配列番号２におけるアミノ酸配列の２〜１９０のアミノ酸残基のアミノ酸位置の範囲の整数である。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、本発明により包含される。より詳細には、本発明は、配列番号２の以下の残基からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいはこれからなるポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを提供する：
【０２３９】
【化９】
2007277249.tif 000018
これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明に包含される。本発明はまた、上記のニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に少なくとも、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこのようなポリヌクレオチド配列からなる核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列に融合した上記のポリヌクレオチド配列を包含する。これらの核酸配列および／またはポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドはまた、上記のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、あるいはこのようなアミノ酸配列からなるポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがそうであるように、本発明により包含される。
【０２４０】
さらに、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドの推定細胞外ドメインは、それ自体生物学的活性を惹起し得るので、このポリペプチドの推定細胞外領域（配列番号２のＧｌｎ−７３〜Ｌｅｕ−２８５の位置にわたる）由来のＮ末端アミノ酸残基およびＣ末端アミノ酸残基の欠失は、いくつかの生物学的活性（例えば、リガンド結合、リンパ球（例えば、Ｂ細胞）の増殖、分化および／または活性化の刺激、ならびに細胞複製の調整または標的細胞活性の調整）を保持し得る。しかし、ニュートロカインαポリペプチドの推定細胞外ドメインのＮ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、ポリペプチドの１つ以上の生物学的機能の喪失を改変するとしても、他の生物学的活性は依然として保持され得る。従って、短縮化ポリペプチドが、このポリペプチドの完全なまたは成熟のまたは細胞外ドメインを認識する抗体を誘導および／または結合する能力は、一般に、このポリペプチドの完全なまたは成熟のまたは細胞外ドメインの大部分よりも少ない残基がＮ末端から除去される場合に保持される。完全なポリペプチドのＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドがこのような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法および当該分野で公知の他の慣用的な方法により容易に決定され得る。
【０２４１】
従って、本発明はさらに、配列番号２に示されるニュートロカインαのアミノ酸配列のアミノ末端から２８０位のグリシン残基までの１個以上の残基を欠失するポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。特に、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列の残基ｎ2〜２８５のアミノ酸配列を含むか、あるいはこれからなるポリペプチドを提供する。ここで、ｎ2は、配列番号２のアミノ酸残基７３〜２８０のアミノ酸位置の範囲の整数である。そして７３は、ニュートロカイン−αポリペプチドの推定細胞外ドメイン（配列番号２に開示）のＮ末端からの最初の残基の位置である。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、本発明により包含される。より詳細には、特定の実施形態において、本発明は、配列番号２の以下の残基からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいはそのアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する：
【０２４２】
【化１０】
2007277249.tif 000019
これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明により包含される。本発明はまた、上記のニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に少なくとも、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこのようなポリヌクレオチド配列からなる核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列に融合した上記のポリヌクレオチド配列を包含する。これらの核酸配列および／またはポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドはまた、上記のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、あるいはこのようなアミノ酸配列からなるポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがそうであるように、本発明により包含される。
【０２４３】
本発明の非常に好ましい実施形態は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）の１３４〜２８５位置のアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％同一であり、そしてより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいはこのようなポリヌクレオチドからなる核酸分子に関する。本発明の好ましい実施形態は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）の１３４〜２８５位置のアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に、少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいはこのようなポリヌクレオチドからなる核酸分子に関する。
【０２４４】
本発明のより好ましい実施形態では、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）の１３４〜２８５位置のアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に、少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいはこのようなポリヌクレオチドからなる核酸分子に関する。本発明のより好ましい実施形態は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）の１３４〜２８５位置のアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に、少なくとも９６％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいはこのようなポリヌクレオチドからなる核酸分子に関する。さらに、本発明の好ましい実施形態は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）の１３４〜２８５位置のアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に、少なくとも９７％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいはこのようなポリヌクレオチドからなる核酸分子に関する。さらに、本発明のより好ましい実施形態は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）の１３４〜２８５位置のアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に、少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいはこのようなポリヌクレオチドからなる核酸分子に関する。さらに、本発明のより好ましい実施形態は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）の１３４〜２８５位置のアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に、少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいはこのようなポリヌクレオチドからなる核酸分子に関する。
【０２４５】
特定の実施形態において、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの、以下のＮ末端欠失ポリペプチドのうちの１つを含むか、あるいはこのようなポリペプチドからなるポリペプチドが好ましい：配列番号２のアミノ酸残基Ａｌａ−７１〜Ｌｅｕ−２８５、アミノ酸残基Ａｌａ−８１〜Ｌｅｕ−２８５、アミノ酸残基Ｌｅｕ−１１２〜Ｌｅｕ−２８５、アミノ酸残基Ａｌａ−１３４〜Ｌｅｕ−２８５、アミノ酸残基Ｌｅｕ−１４７〜Ｌｅｕ−２８５、およびアミノ酸残基Ｇｌｙ−１６１〜Ｌｅｕ−２８５。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、本発明により包含される。
【０２４６】
同様に、生物学的に機能的なＣ末端欠失ムテインの多くの例が公知である。例えば、インターフェロンγは、このタンパク質のカルボキシ末端から８〜１０個のアミノ酸残基を欠失させることにより、１０倍まで高い活性を示す（Ｄｏｂｅｌｉら，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：１９９−２１６（１９８８））。本タンパク質は、ＴＮＦポリペプチドファミリーのメンバーであるので、２８４位のロイシンまでのＣ末端アミノ酸の欠失は、全てではなくても大部分の生物学的活性（例えば、リガンド結合、リンパ球（例えば、Ｂ細胞）の増殖、分化および／または活性化を刺激する能力、ならびに細胞複製の調整）を保持すると考えられる。約１０個までのさらなるＣ末端残基（すなわち、２７４位のグリシン残基まで）の欠失を有するポリペプチドはまた、いくらかの活性（例えば、レセプター結合）を保持し得るが、このようなポリペプチドは、配列番号２のほぼＬｅｕ−２８４に伸びる保存されたＴＮＦドメインの部分を欠く。しかし、タンパク質のＣ末端の１つ以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質の１つ以上の生物学的機能の喪失の改変を生じるとしても、他の生物学的活性は依然として保持され得る。従って、短縮化タンパク質が完全なまたは成熟タンパク質を認識する抗体を誘導および／または結合する能力は、一般に、完全なまたは成熟タンパク質の大多数よりも少ない残基がＣ末端から除去される場合に保持される。完全なタンパク質のＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドがこのような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法および当該分野で公知の他の慣用的な方法により容易に決定され得る。
【０２４７】
従って、本発明はさらに、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）に示されるニュートロカインαポリペプチドのアミノ酸配列のカルボキシ末端から２７４位のグリシン残基（Ｇｌｙ−２７４）までの１個以上を欠失するポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。詳細には、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列の残基１〜ｍ1のアミノ酸残基を含むか、あるいはこれからなるポリペプチドを提供し、ここで、ｍ1は、配列番号２の２７４〜２８４の範囲のアミノ酸位の範囲の任意の整数である。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた本発明によって包含される。より詳細には、本発明は、配列番号２の残基１〜２７４、１〜２７５、１〜２７６、１〜２７７、１〜２７８、１〜２７９、１〜２８０、１〜２８１、１〜２８２、１〜２８３、および１〜２８４の残基からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいはこのようなアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドもまた本発明に包含される。本発明はまた、上記のニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこのようなポリヌクレオチド配列からなる核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列に融合された上記のポリヌクレオチド配列を包含する。これらの核酸および／またはポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドも、上記のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸を含むかまたはこのようなアミノ酸からなるポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがそうであるように、本発明により包含される。
【０２４８】
また、アミノ末端およびカルボキシ末端の両方から１個以上のアミノ酸欠失を含むか、あるいはこれからなるポリペプチドが提供され、これは、一般に、配列番号２の残基ｎ1〜ｍ1を有し得、ここでｎ1およびｍ1は上記のような整数であるとして記載され得る。また、ＡＴＣＣ登録番号９７７６８に含まれる寄託されたｃＤＮＡクローンによりコードされる完全なニュートロカインαアミノ酸配列の一部分を含むか、あるいはこれからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も含まれる。ここでこの部分は、寄託されたプラスミド中のｃＤＮＡクローンによりコードされる完全なアミノ酸配列のアミノ末端からの１〜１９０アミノ酸またはＣ末端からの１〜１１アミノ酸（またはこれらのＮ末端欠失およびＣ末端欠失の任意の組合せ）を排除する。上記の全ての欠失ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが本発明により包含される。
【０２４９】
同様に、配列番号２の７９位のロイシン残基までの、ニュートロカインαの推定細胞外ドメインのＣ末端アミノ酸残基の欠失は、いくつかの生物学的活性（例えば、リガンド結合、リンパ球（例えば、Ｂ細胞）の増殖、分化および／または活性化の刺激、ならびに細胞複製の調整または標的細胞活性の調整）を保持し得る。配列番号２のＬｅｕ−７９を含むさらなるＣ末端欠失を有するポリペプチドは、生物学的活性を保持するとは予期されない。
【０２５０】
しかし、ポリペプチドのＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、ポリペプチドの１つ以上の生物学的機能の喪失を改変するとしても、他の機能的活性は依然として保持され得る。従って、短縮化ポリペプチドがこのポリペプチドの完全な、成熟の、または細胞外形態を認識する抗体を誘導および／または結合する能力は、一般に、このポリペプチドの完全な、成熟の、または細胞外形態の大部分よりも少ない残基がＣ末端から除去される場合に保持される。推定細胞外ドメインのＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドがこのような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法および当該分野で公知の他の慣用的な方法により容易に決定され得る。
【０２５１】
従って、本発明はさらに、配列番号２に示されるニュートロカインαポリペプチドの推定細胞外ドメインのアミノ酸配列のカルボキシ末端からの１個以上の残基より、配列番号２の７９位のロイシン残基まで１つ以上の残基を欠失するポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。詳細には、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列の残基７３〜ｍ2のアミノ酸配列を含むか、あるいはこれからなるポリペプチドを提供し、ここで、ｍ2は、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基７９〜２８５のアミノ酸位の範囲の任意の整数である。そして残基７８は、ニュートロカイン−αポリペプチド（配列番号２に開示される）の推定細胞外ドメインのＣ末端の最初の残基の位置である。これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドもまた本発明に包含される。より詳細には、特定の実施形態において、本発明は、配列番号２の以下の残基からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいはこのようなアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する：
【０２５２】
【化１１】
2007277249.tif 000020
。これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドもまた、本発明に包含される。本発明はまた、上記のニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこのようなポリヌクレオチド配列からなる核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列に融合された上記のポリヌクレオチド配列を包含する。これらの核酸および／またはポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドも、上記のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはこのようなアミノ酸からなるポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがそうであるように、本発明により包含される。
【０２５３】
また、ニュートロカイン−αの推定細胞外ドメインのアミノ末端およびカルボキシ末端の両方から１個以上のアミノ酸欠失を含むポリペプチドが提供され、これは、一般に、配列番号２の残基ｎ2〜ｍ2を有し得、ここでｎ2およびｍ2は上記のような整数であるとして記載され得る。
【０２５４】
別の実施形態において、ＡＴＣＣ登録番号９７７６８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡプラスミドによりコードされるニュートロカインαアミノ酸配列の細胞外ドメインの一部分からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も含まれる。ここでこの部分は、ＡＴＣＣ登録番号９７７６８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡプラスミドによりコードされるアミノ酸配列の細胞外ドメインの全体のうち、ＡＴＣＣ登録番号９７７６８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡプラスミドによりコードされるアミノ酸配列の細胞外ドメインのアミノ末端からの１〜約２０６アミノ酸、またはＡＴＣＣ登録番号９７７６８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡプラスミドによりコードされるアミノ酸配列の細胞外ドメインのカルボキシ末端からの１〜約２０６アミノ酸、または上記のアミノ末端欠失およびカルボキシ末端欠失の任意の組合せを排除する。
【０２５５】
前述のように、ポリペプチドのＮ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、このポリペプチドの１つ以上の機能的活性（例えば、生物学的活性）の喪失を改変するとしても、他の機能または生物学的活性は依然として保持され得る。従って、短縮化ニュートロカイン−αムテインがこのポリペプチドの全長の、または成熟形態、または細胞外ドメインを認識する抗体を誘導および／または結合する能力は、一般に、このポリペプチドの全長の、または成熟の、または細胞外ドメインの大部分よりも少ない残基がＮ末端から除去される場合に保持される。完全なポリペプチドのＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドがこのような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法および当該分野で公知の他の慣用的な方法により容易に決定され得る。多数のＮ末端アミノ酸残基欠失を有するニュートロカインαムテインが、いくつかの機能的活性（例えば、生物学的活性または免疫学的活性）を保持し得るようである。実際、６つ程度の少ないニュートロカインαアミノ酸残基から構成されるペプチドは、しばしば免疫応答を惹起し得る。
【０２５６】
従って、本発明はさらに、配列番号２に示されるニュートロカインαの推定全長アミノ酸配列のアミノ末端からの１個以上の残基より、配列番号２に示される配列の２８０位のグリシン残基までの残基を欠失するポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。詳細には、本発明は、配列番号２に示される配列のうちアミノ酸配列の残基ｎ3−２８５を含むポリペプチドを提供し、ここで、ｎ3は、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜２８０のアミノ酸位のアミノ酸の範囲の整数である。
【０２５７】
より詳細には、本発明は、配列番号２の以下の残基からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいはこのようなアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する：
【０２５８】
【化１２】
2007277249.tif 000021
2007277249.tif 000022
。本出願はまた、上記のニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこのようなポリヌクレオチド配列からなる核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列に融合された上記のポリヌクレオチド配列を包含する。これらの核酸および／またはポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドも、上記のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸を含むポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがそうであるように、本発明により包含される。
【０２５９】
また上記のように、タンパク質のＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、このタンパク質の１つ以上の機能的活性（例えば、生物学的活性）の喪失を改変するとしても、他の機能的活性は依然として保持され得る。従って、短縮化ニュートロカインαムテインがこのポリペプチドの完全な形態、もしくは成熟の形態、または細胞外ドメインを認識する抗体を誘導および／または結合する能力は、一般に、このポリペプチドの完全な形態、もしくは成熟形態、または細胞外ドメインの大部分よりも少ない残基がＣ末端から除去される場合に保持される。完全なポリペプチドのＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドがこのような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法および当該分野で公知の他の慣用的な方法により容易に決定され得る。多数のＣ末端アミノ酸残基欠失を有するニュートロカインαムテインが、いくつかの機能的活性（例えば、生物学的活性または免疫学的活性）を保持し得るようである。実際、６つ程度の少ないニュートロカインαアミノ酸残基から構成されるペプチドは、しばしば免疫応答を惹起し得る。
【０２６０】
従って、本発明はさらに、別の実施形態において、配列番号２に示されるニュートロカインαのアミノ酸配列のカルボキシ末端から６位のグルタミン酸残基まで１つ以上の残基を欠失するポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。詳細には、本発明は、配列番号２の残基１〜ｍ3のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、ここで、ｍ3は、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基６〜２８４のアミノ酸位の範囲の整数である。
【０２６１】
より詳細には、本発明は、配列番号２の以下の残基からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいはこのようなアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する：
【０２６２】
【化１３】
2007277249.tif 000023
2007277249.tif 000024
本出願はまた、上記のニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこれらのポリヌクレオチド配列からなる核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列に融合された上記のポリヌクレオチド配列を包含する。これらの核酸配列および／またはポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドも、上記のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸を含むポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがそうであるように、本発明により包含される。
【０２６３】
本発明はまた、ニュートロカインαポリペプチドのアミノ末端およびカルボキシ末端の両方から１個以上のアミノ酸欠失を含むポリペプチドを提供し、これは、一般に、配列番号２の残基ｎ3〜ｍ3を有し得、ここでｎ3およびｍ3は上記で定義したような整数であるとして記載され得る。
【０２６４】
さらに、本発明のニュートロカインαＳＶポリペプチドの推定細胞外ドメインは、それ自体機能的活性（例えば、生物学的活性）を惹起し得るので、配列番号１９のＧｌｎ−７３〜Ｌｅｕ２６６位でのポリペプチドの推定細胞外領域からのＮ末端アミノ酸残基およびＣ末端アミノ酸残基の欠失は、いくつかの生物学的活性（例えば、リガンド結合、リンパ球（例えば、Ｂ細胞）の増殖、分化および／または活性化の刺激、細胞複製の調整、標的細胞活性の調整、ならびに／あるいは免疫原性）を保持し得る。しかし、ニュートロカインαＳＶポリペプチドの推定細胞外ドメインのＮ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、このポリペプチドの１つ以上の機能的活性の喪失を改変するとしても、他の機能的活性は依然として保持され得る。従って、短縮化ポリペプチドがこのポリペプチドの完全な、または成熟の、または細胞外ドメインを認識する抗体を誘導および／または結合する能力は、一般に、このポリペプチドの完全な、または成熟の、または細胞外ドメインの大部分よりも少ない残基がＮ末端から除去される場合に保持される。完全なポリペプチドのＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドがこのような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法および当該分野で公知の他の慣用的な方法により容易に決定され得る。
【０２６５】
従って、本発明はさらに、配列番号１９に示されるニュートロカインαＳＶのアミノ酸配列のアミノより、２６１位のグリシン残基までの１つ以上の残基を欠失するポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。詳細には、本発明は、配列番号１９のアミノ酸配列の残基ｎ4〜２６６のアミノ酸残基を含むポリペプチドを提供し、ここで、ｎ4は、配列番号１９のアミノ酸配列のアミノ酸残基７３〜２６１のアミノ酸位のアミノ酸位の範囲の整数である。そして２６１は、ニュートロカイン−αＳＶポリペプチド（配列番号１９に示される）の推定細胞外ドメインのＮ末端の最初の残基の位置である。
【０２６６】
より詳細には、特定の実施形態において、本発明は、配列番号１９の以下の残基からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいはこのようなアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する：
【０２６７】
【化１４】
2007277249.tif 000025
。本出願はまた、上記のニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこのようなポリヌクレオチド配列からなる核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列に融合された上記のポリヌクレオチド配列を包含する。これらの核酸配列および／またはポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドも、上記のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがそうであるように、本発明により包含される。
【０２６８】
同様に、ニュートロカインαＳＶの推定細胞外ドメインのＣ末端アミノ酸残基より、配列番号１９の７９位のロイシン残基までの欠失は、いくつかの機能的活性（例えば、リガンド結合、リンパ球（例えば、Ｂ細胞）の増殖、分化および／または活性化の刺激、細胞複製の調整、標的細胞活性の調整、ならびに／あるいは免疫原性）を保持し得る。配列番号１９のＬｅｕ−７９を含むさらなるＣ末端欠失を有するポリペプチドは、生物学的活性を保持するとは期待されない。
【０２６９】
しかし、ポリペプチドのＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、このポリペプチドの１つ以上の機能的活性（例えば、生物学的活性）の喪失を改変するとしても、他の機能的活性は依然として保持され得る。従って、短縮化ポリペプチドがこのポリペプチドの完全な、成熟の、または細胞外形態を認識する抗体を誘導および／または結合する能力は、一般に、このポリペプチドの完全な、成熟の、または細胞外形態の大部分よりも少ない残基がＣ末端から除去される場合に保持される。推定細胞外ドメインのＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドがこのような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法および当該分野で公知の他の慣用的な方法により容易に決定され得る。
【０２７０】
従って、本発明はさらに、配列番号１９に示されるニュートロカインαＳＶのの推定細胞外ドメインのアミノ酸配列のＣ末端より、配列番号１９の７９位のロイシン残基までの１つ以上の残基を有するポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。詳細には、本発明は、配列番号１９のアミノ酸配列の残基７３〜ｍ4のアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供し、ここで、ｍ4は、配列番号１９のアミノ酸配列のアミノ酸残基７９〜２６６のアミノ酸位の範囲の任意の整数である。
【０２７１】
より詳細には、特定の実施形態において、本発明は、配列番号１９の以下の残基からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいはこのようなアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する：
【０２７２】
【化１５】
2007277249.tif 000026
。本出願はまた、上記のニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこのようなポリヌクレオチド配列からなる核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列に融合された上記のポリヌクレオチド配列を包含する。これらの核酸配列および／またはポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドも、上記のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがそうであるように、本発明により包含される。
【０２７３】
本発明はまた、ニュートロカイン−αＳＶの推定細胞外ドメインのアミノ末端およびカルボキシ末端の両方から１つ以上のアミノ酸が欠失されたポリペプチドを提供し、これは配列番号１９の残基ｎ4〜ｍ4を有するものとして一般的に記載され得る。ここで、ｎ5およびｍ5は、上記に定義された整数である。
【０２７４】
別の実施形態において、ニュートロカイン−αＳＶアミノ酸配列の細胞外ドメインの一部分からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＡＴＣＣ登録番号２０３５１８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされ、ここで、この部分は、ＡＴＣＣ登録番号２０３５１８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列の細胞外ドメインのアミノ末端から、１〜およそ２６０アミノ酸を排除するか、またはＡＴＣＣ登録番号２０３５１８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列の細胞外ドメインのカルボキシ末端から、１〜およそ１８７アミノ酸を排除するか、あるいは、ＡＴＣＣ登録番号２０３５１８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列の細胞外ドメイン全体の、上記アミノ末端欠失およびカルボキシ末端欠失の任意の組み合わせを排除する。
【０２７５】
上述のように、ポリペプチドのＮ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、そのポリペプチドの１つ以上の機能的活性（例えば、生物学的活性）の改変または損失を生じるとしても、他の機能的活性はなお保持され得る。従って、このポリペプチドの全長形態または成熟形態、あるいは細胞外ドメインを認識する抗体を誘導する短縮化されたニュートロカイン−αＳＶムテインの能力、および／またはその抗体に結合する能力は、そのポリペプチドの全長または成熟ドメイン、あるいは細胞外ドメインの残基の大部分より少ない残基がＮ末端から除去された場合には、一般に保持される。完全なタンパク質のＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドが、このような免疫原性活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法および当該分野において公知の別の方法によって、容易に決定され得る。多数のＮ末端アミノ酸残基が欠失されたニュートロカイン−αＳＶムテインが、機能的（例えば、免疫学的）活性を保持し得ることはなさそうではない。実際６つ程度の少ないニュートロカイン−αＳＶアミノ酸残基からなるペプチドが、免疫応答をしばしば誘発し得る。
【０２７６】
従って、本発明はさらに、配列番号１９に示されるニュートロカイン−αＳＶの推定全長アミノ酸配列のアミノ末端から、配列番号１９の２６１位のグリシン残基までの１つ以上の残基が欠失されたポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。詳細には、本発明は、配列番号１９に示された残基ｎ5〜２６６のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、ここで、ｎ5は、配列番号１９のアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜２６１のアミノ酸位置の範囲の整数である。
【０２７７】
より詳細には、本発明はまた、配列番号１９の以下の残基；
【０２７８】
【化１６】
2007277249.tif 000027
2007277249.tif 000028
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、または、それらからなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、上記ニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、または、それらからなる核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列と融合した上記のポリヌクレオチド配列を含む。これらの核酸および／またはポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド、同様に、上記のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【０２７９】
上述のように、ポリペプチドのＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、そのポリペプチドの１つ以上の機能的活性（例えば、生物学的活性）の改変または損失を生じるとしても、他の機能的活性はなお保持され得る。従って、このポリペプチドの完全形態または成熟形態、あるいは細胞外ドメインを認識する抗体を誘導する短縮化されたニュートロカイン−αＳＶムテインの能力、および／またはその抗体に結合する能力は、そのポリペプチドの完全形態または成熟形態、あるいは細胞外ドメインの残基の大部分より少ない残基がＣ末端から除去された場合には、一般に保持される。完全なタンパク質のＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドが、このような免疫原性活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法および当該分野において公知の別の方法によって、容易に決定され得る。多数のＣ末端アミノ酸残基が欠失されたニュートロカイン−αＳＶムテインが、機能的（例えば、免疫学的）活性を保持し得ることはなさそうではない。実際６つ程度の少ないニュートロカイン−αＳＶアミノ酸残基からなるペプチドが、免疫応答をしばしば誘発し得る。
【０２８０】
従って、本発明は、別の実施形態において、配列番号１９に示されるニュートロカイン−αＳＶのアミノ酸配列のカルボキシ末端から、６位のグルタミン酸残基までの１つ以上の残基が欠失されたポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。詳細には、本発明は、配列番号１９に示された残基１〜ｍ5のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、ここで、ｍ5は、配列番号１９のアミノ酸配列のアミノ酸残基６〜２６５のアミノ酸位置の範囲の整数である。
【０２８１】
より詳細には、本発明はまた、配列番号１９の以下の残基；
【０２８２】
【化１７】
2007277249.tif 000029
2007277249.tif 000030
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、または、それらからなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、上記ニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、または、それらからなる核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列と融合した上記のポリヌクレオチド配列を含む。これらの核酸および／またはポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド、同様に、上記のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【０２８３】
本発明はまた、ニュートロカイン−αＳＶポリペプチドのアミノ末端およびカルボキシ末端の両方から１つ以上のアミノ酸が欠失されたポリペプチドを提供し、これは配列番号１９の残基ｎ5〜ｍ5を有するものとして一般的に記載され得る。ここで、ｎ5およびｍ5は、上記に定義された整数である。
【０２８４】
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号２の残基１３４〜ｍ6のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、ここで、ｍ6は、配列番号２のアミノ酸残基の位置に対応する、１４０〜２８５の整数である。例えば、本発明は、配列番号２の以下の残基；
【０２８５】
【化１８】
2007277249.tif 000031
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、または、それらからなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本出願はまた、上記ニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、または、それらからなる核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列と融合した上記のポリヌクレオチド配列を含む。これらの核酸および／またはポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド、同様に、上記のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【０２８６】
本発明のさらなる好ましいポリペプチドフラグメントは、配列番号２の以下の残基：
【０２８７】
【化１９】
2007277249.tif 000032
2007277249.tif 000033
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、または、それらからなる。好ましくは、これらのポリペプチドフラグメントは、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの１以上の機能的活性（例えば、生物学的活性、抗原性および免疫原性）を有し、そして例えば、さらに以下に記載されるように、抗体を作製またはスクリーニングするために使用され得る。本発明はまた、上記のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列配列を含むか、または、それらからなるポリペプチドに関する。本発明はまた、本明細書中に記載されるような異種アミノ酸配列と融合した上記アミノ酸配列を含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【０２８８】
本発明のさらなる好ましいポリペプチドフラグメントは、配列番号１９の以下の残基：
【０２８９】
【化２０】
2007277249.tif 000034
2007277249.tif 000035
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、または、それらからなる。好ましくは、これらのポリペプチドフラグメントは、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの１以上の機能的活性（例えば、生物学的活性、抗原性および免疫原性）を有し、そして例えば、さらに以下に記載されるように、抗体を作製またはスクリーニングするために使用され得る。本発明はまた、上記のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列配列を含むか、または、それらからなるポリペプチドに関する。本発明はまた、本明細書中に記載されるような異種アミノ酸配列と融合した上記アミノ酸配列を含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【０２９０】
本発明のさらなる好ましいポリペプチドフラグメントは、配列番号３８の以下の残基：
【０２９１】
【化２１】
2007277249.tif 000036
2007277249.tif 000037
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、または、それらからなる。好ましくは、これらのポリペプチドフラグメントは、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの１以上の機能的活性（例えば、生物学的活性、抗原性および免疫原性）を有し、そして例えば、さらに以下に記載されるように、抗体を作製またはスクリーニングするために使用され得る。本発明はまた、上記のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列配列を含むか、または、それらからなるポリペプチドに関する。本発明はまた、本明細書中に記載されるような異種アミノ酸配列と融合した上記アミノ酸配列を含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【０２９２】
ニュートロカイン−αポリペプチドおよびニュートロカイン−αＳＶポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列が、そのポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく変化され得ることが、当業者に認識される。配列におけるこのような差異が意図される場合、活性を決定するポリペプチド上の重要な領域が存在することを覚えておくべきである。
【０２９３】
従って、本発明は、ニュートロカイン−αポリペプチドの機能的活性（例えば、生物学的活性）を示すか、または本明細書中に記載されるポリペプチドフラグメントのようなニュートロカイン−αポリペプチドの領域を含む、ニュートロカイン−αポリペプチドのバリエーションを含む。本発明はまた、ニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの機能的活性（例えば、生物学的活性）を示すか、または本明細書中に記載されるポリペプチドフラグメントのようなニュートロカイン−αポリペプチドの領域を含む、ニュートロカイン−αＳＶポリペプチドのバリエーションを含む。このような変異体は、当該分野において公知の一般的な規定に従って活性に対してほとんど影響を有さないように選択された、欠失、挿入、逆位、反復、および置換を含む。例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換の作製方法に関する手引きは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｅｓｓａｇｅ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０（１９９０））によって提供される。この手引きにおいて、筆者らは、変化に対するアミノ酸の寛容性を研究するための、２つの主なアプローチがあることを示している。第一の方法は、進化のプロセスに依存し、ここでは、変異が自然選択によって受容されるか、または拒絶されるかのいずれかである。第二のアプローチは、クローン化した遺伝子の特定の部位でアミノ酸変化を導入するための遺伝子操作、および機能性を維持する配列を同定するための選択またはスクリーニングを使用する。
【０２９４】
その筆者らが述べているように、これらの研究により、タンパク質が驚くほどにアミノ酸置換に対して寛容性を示すことが明らかにされた。この著者らはさらに、どのアミノ酸変化が、そのタンパク質の特定の位置で許容されるようであるかを示す。例えば、多くの埋没されたアミノ酸残基は非極性側鎖を必要とするが、表面側鎖の特徴は一般的に保存されない。このような表現型的にサイレンと名置換は、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、前出、および本明細書中に引用される参考文献に記載される。保存的アミノ酸置換として代表的にみなされるのは、脂肪族アミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅ）間の互いの置換；ヒドロキシル残基（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）の交換；酸性残基（例えば、ＡｓｐまたはＧｌｕ）の交換；アミド残基（例えば、ＡｓｎまたはＧｌｎ）間の置換、塩基性残基（例えば、ＬｙｓおよびＡｒｇ）の交換；ならびに芳香族残基（例えば、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、またはＴｒｐ）間の置換である。
【０２９５】
従って、図１ＡおよびＢ（配列番号２）のポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログ、あるいは寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、以下のものであり得る：（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が保存アミノ酸残基もしくは非保存アミノ酸残基（好ましくは、保存アミノ酸残基）で置換されるものであり、このような置換アミノ酸残基は遺伝コードによってコードされるものであってもなくてもよい、または（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または（ｉｉｉ）ポリペプチドの細胞外ドメインが、ポリペプチドの半減期を増加する化合物のような別の化合物（例えば、ポリエチレングリコール）と融合されているもの、または（ｉｖ）さらなるアミノ酸が、ＩｇＧ  Ｆｃ融合領域ペプチドまたはリーダー配列あるいは分泌配列またはポリペプチド細胞外ドメインもしくはプロタンパク質配列の精製のために使用される配列のような、ポリペプチドの細胞外ドメインに融合されるもの。このようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書中の教示から、当業者の範囲内にあるとみなされる。
【０２９６】
さらに、図５Ａおよび図５Ｂ（配列番号１９）のポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログ、あるいは寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、以下のものであり得る：（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が保存アミノ酸残基もしくは非保存アミノ酸残基（好ましくは、保存アミノ酸残基）で置換されるものであり、このような置換アミノ酸残基は遺伝コードによってコードされるものであってもなくてもよい、または（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または（ｉｉｉ）ポリペプチドの細胞外ドメインが、ポリペプチドの半減期を増加する化合物のような別の化合物（例えば、ポリエチレングリコール）と融合されているもの、または（ｉｖ）さらなるアミノ酸が、別のＴＮＦリガンドファミリーメンバー（例えば、ＣＤ４０リガンド）の可溶性の生物学的に活性なフラグメント、ＩｇＧ  Ｆｃ融合領域ペプチドまたはリーダー配列あるいは分泌配列またはポリペプチド細胞外ドメインもしくはプロタンパク質配列の精製のために使用される配列のような、ポリペプチドの細胞外ドメインに融合されるもの。このようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書中の教示から、当業者の範囲内にあるとみなされる。
【０２９７】
従って、本発明の、ニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドは、天然の変異または人為的操作のいずれか由来の、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、または付加を含み得る。示されるように、変化は、好ましくは、タンパク質の折りたたみまたは活性に有意に影響しない保存的アミノ酸置換のような、あまり重要でない性質の変化である（表ＩＩを参照のこと）
【０２９８】
【表２】
2007277249.tif 000038
本発明の１つの実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むが、５０を超えない保存的アミノ酸置換、さらにより好ましくは、４０を超えない保存的アミノ酸置換、なおより好ましくは、３０を超えない保存的アミノ酸置換、そしてなおさらにより好ましくは、２０を超えない保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有する、ニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドのアミノ酸配列を含むか、あるいは、それらからなる。もちろん、好ましくさの増大の順では、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むが、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１を超えない保存的アミノ酸置換を含む、ニュートロカイン−αポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸を有することが、ペプチドまたはポリペプチドに高度に好ましい。
【０２９９】
例えば、ニュートロカイン−α（Ｎｅｕｔｒｏｋｉｎｅ−ａｌｐｈａ）のアミノ酸レベルでの部位特異的変化は、特定のアミノ酸を保存的置換によって置換することにより行われ得る。配列番号２において提供されるニュートロカイン−αアミノ酸配列の好ましい保存的置換変異としては、以下が挙げられる：Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＶで置換されたＭ１；Ｅで置換されたＤ２；Ｅで置換されたＤ３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ５；Ｄで置換されたＥ６；ＨまたはＫで置換されたＲ７；Ｄで置換されたＥ８；Ｎで置換されたＱ９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１０；ＨまたはＫで置換されたＲ１１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ１３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１６；ＨまたはＲで置換されたＫ１７；ＨまたはＲで置換されたＫ１８；ＨまたはＫで置換されたＲ１９；Ｄで置換されたＥ２０；Ｄで置換されたＥ２１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＶで置換されたＭ２２；ＨまたはＲで置換されたＫ２３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２４；ＨまたはＲで置換されたＫ２５；Ｄで置換されたＥ２６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ２８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ２９；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ３０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ３１；ＨまたはＫで置換されたＲ３３；ＨまたはＲで置換されたＫ３４；Ｄで置換されたＥ３５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ３６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ３８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ３９；ＨまたはＫで置換されたＲ４０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ４１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ４２；ＨまたはＲで置換されたＫ４３；Ｅで置換されたＤ４４；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ４５；ＨまたはＲで置換されたＫ４６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ４７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ４８；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ４９；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ５０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ５１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ５２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ５３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ５４；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ５５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ５６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ５７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ５８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ６１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ６２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ６３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ６４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ６５；ＷまたはＹで置換されたＦ６６；ＦまたはＷ��置換されたＹ６７；Ｎで置換されたＱ６８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ６９；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ７０；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ７１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ７２；Ｎで置換されたＱ７３；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ７４；Ｅで置換されたＤ７５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ７６；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ７７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ７８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ７９；ＨまたはＫで置換されたＲ８０；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ８１；Ｄで置換されたＥ８２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ８３；Ｎで置換されたＱ８４；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ８５；ＫまたはＲで置換されたＨ８６；ＫまたはＲで置換されたＨ８７；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ８８；Ｄで置換されたＥ８９；ＨまたはＲで置換されたＫ９０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ９１；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ９３；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ９４；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ９５；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ９６；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ９７；ＨまたはＲで置換されたＫ９９；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１００；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１０１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１０２；Ｄで置換されたＥ１０３；Ｄで置換されたＥ１０４；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１０５；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１０７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ１０８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ１０９；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１１０；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１１１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１１２；ＨまたはＲで置換されたＫ１１３；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ１１４；ＷまたはＹで置換されたＦ１１５；Ｄで置換されたＥ１１６；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１１９；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１２１；Ｄで置換されたＥ１２２；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１２３；Ｑで置換されたＮ１２４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１２５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１２６；Ｎで置換されたＱ１２７；Ｑで置換されたＮ１２８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１２９；ＨまたはＫで置換されたＲ１３０；Ｑで置換されたＮ１３１；ＨまたはＲで置換されたＫ１３２；ＨまたはＫで置換されたＲ１３３；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１３４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ１３５；Ｎで置換されたＱ１３６；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１３７；Ｄで置換されたＥ１３９；Ｄで置換されたＥ１４０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ��Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ１４１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ１４２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ１４３；Ｎで置換されたＱ１４４；Ｅで置換されたＤ１４５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１４７；Ｎで置換されたＱ１４８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１４９；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ１５０；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１５１；Ｅで置換されたＤ１５２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１５３；Ｄで置換されたＥ１５４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ１５５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ１５７；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ１５８；Ｎで置換されたＱ１５９；ＨまたはＲで置換されたＫ１６０；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１６１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１６２；ＦまたはＷで置換されたＹ１６３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ１６４；ＷまたはＹで置換されたＦ１６５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ１６６；ＦまたはＹで置換されたＷ１６８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１６９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１７０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１７１；ＷまたはＹで置換されたＦ１７２；ＨまたはＲで置換されたＫ１７３；ＨまたはＫで置換されたＲ１７４；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１７５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１７６；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１７７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１７８；Ｄで置換されたＥ１７９；Ｄで置換されたＥ１８０；ＨまたはＲで置換されたＫ１８１；Ｄで置換されたＥ１８２；Ｑで置換されたＮ１８３；ＨまたはＲで置換されたＫ１８４；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ１８５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１８６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ１８７；ＨまたはＲで置換されたＫ１８８；Ｄで置換されたＥ１８９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ１９０；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１９１；ＦまたはＷで置換されたＹ１９２；ＷまたはＹで置換されたＦ１９３；ＷまたはＹで置換されたＦ１９４；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ１９５；ＦまたはＷで置換されたＹ１９６；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１９７；Ｎで置換されたＱ１９８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ１９９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２００；ＦまたはＷで置換されたＹ２０１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ２０２；Ｅで置換されたＤ２０３；ＨまたはＲで置換されたＫ２０４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ２０５；ＦまたはＷで置換されたＹ２０６；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ２０７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＶで置換されたＭ２０８；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ２０９；ＫまたはＲで置換��れたＨ２１０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２１１；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ２１２；Ｎで置換されたＱ２１３；ＨまたはＫで置換されたＲ２１４；ＨまたはＲで置換されたＫ２１５；ＨまたはＲで置換されたＫ２１６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ２１７；ＫまたはＲで置換されたＨ２１８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ２１９；ＷまたはＹで置換されたＦ２２０；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ２２１；Ｅで置換されたＤ２２２；Ｄで置換されたＥ２２３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２２４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ２２５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２２６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ２２７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ２２８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２２９；ＷまたはＹで置換されたＦ２３０；ＨまたはＫで置換されたＲ２３１；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ２３３；Ｎで置換されたＱ２３４；Ｑで置換されたＮ２３５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＶで置換されたＭ２３６；Ｄで置換されたＥ２３８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ２３９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２４０；Ｑで置換されたＮ２４２；Ｑで置換されたＮ２４３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ２４４；ＦまたはＷで置換されたＹ２４６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ２４７；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ２４８；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ２４９；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ２５０；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ２５１；ＨまたはＲで置換されたＫ２５２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２５３；Ｄで置換されたＥ２５４；Ｄで置換されたＥ２５５；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ２５６；Ｅで置換されたＤ２５７；Ｄで置換されたＥ２５８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２５９；Ｎで置換されたＱ２６０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２６１；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ２６２；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ２６３；ＨまたはＫで置換されたＲ２６５
；Ｄで置換されたＥ２６６；Ｑで置換されたＮ２６７；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ２６８；Ｎで置換されたＱ２６９；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ２７０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ２７１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２７２；Ｅで置換されたＤ２７３；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ２７４；Ｅで置換されたＤ２７５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ２７６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ２７７；ＷまたはＹで置換されたＦ２７８；ＷまたはＹで置換されたＦ２７９；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ２８０；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ２８１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２８２；ＨまたはＲで置換されたＫ２８３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２８４；および／あるいはＡ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２８５。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明によって包含される。本発明の得られるニュートロカイン−αタンパク質は、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの機能的活性および／または物理的特性（例えば、増強または低減された安定性および／または溶解度など）について慣用的にスクリーニングされ得る。好ましくは、本発明の得られるタンパク質は、増加したおよび／または減少したニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの機能的活性を有する。より好ましくは、本発明の得られるニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶタンパク質は、１より多くの増加したおよび／または減少したニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの機能的活性および／または物理的特性を有する。
【０３００】
別の実施形態では、ニュートロカイン−αＳＶのアミノ酸レベルでの部位特異的変化は、特定のアミノ酸を保存的置換によって置換することによって行われ得る。配列番号１９に提供されるニュートロカイン−αＳＶアミノ酸配列の好ましい保存的置換変異としては、以下が挙げられる：Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＶで置換されたＭ１；Ｅで置換されたＤ２；Ｅで置換されたＤ３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ５；Ｄで置換されたＥ６；ＨまたはＫで置換されたＲ７；Ｄで置換されたＥ８；Ｎで置換されたＱ９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１０；ＨまたはＫで置換されたＲ１１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ１３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１６；ＨまたはＲで置換されたＫ１７；ＨまたはＲで置換されたＫ１８；ＨまたはＫで置換されたＲ１９；Ｄで置換されたＥ２０；Ｄで置換されたＥ２１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＶで置換されたＭ２２；ＨまたはＲで置換されたＫ２３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２４；ＨまたはＲで置換されたＫ２５；Ｄで置換されたＥ２６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ２８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ２９；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ３０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ３１；ＨまたはＫで置換されたＲ３３；ＨまたはＲで置換されたＫ３４；Ｄで置換されたＥ３５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ３６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ３８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ３９；ＨまたはＫで置換されたＲ４０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ４１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ４２；ＨまたはＲで置換されたＫ４３；Ｅで置換されたＤ４４；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ４５；ＨまたはＲで置換されたＫ４６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ４７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ４８；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ４９；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ５０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ５１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ５２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ５３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ５４；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ５５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ５６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ５７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ５８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ６１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ６２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ６３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ６４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ６５；ＷまたはＹで置換されたＦ６６；ＦまたはＷで置換されたＹ６７；��で置換されたＱ６８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ６９；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ７０；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ７１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ７２；Ｎで置換されたＱ７３；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ７４；Ｅで置換されたＤ７５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ７６；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ７７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ７８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ７９；ＨまたはＫで置換されたＲ８０；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ８１；Ｄで置換されたＥ８２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ８３；Ｎで置換されたＱ８４；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ８５；ＫまたはＲで置換されたＨ８６；ＫまたはＲで置換されたＨ８７；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ８８；Ｄで置換されたＥ８９；ＨまたはＲで置換されたＫ９０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ９１；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ９３；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ９４；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ９５；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ９６；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ９７；ＨまたはＲで置換されたＫ９９；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１００；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１０１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１０２；Ｄで置換されたＥ１０３；Ｄで置換されたＥ１０４；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１０５；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１０７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ１０８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ１０９；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１１０；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１１１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１１２；ＨまたはＲで置換されたＫ１１３；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ１１４；ＷまたはＹで置換されたＦ１１５；Ｄで置換されたＥ１１６；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１１９；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１２１；Ｄで置換されたＥ１２２；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１２３；Ｑで置換されたＮ１２４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１２５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１２６；Ｎで置換されたＱ１２７；Ｑで置換されたＮ１２８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１２９；ＨまたはＫで置換されたＲ１３０；Ｑで置換されたＮ１３１；ＨまたはＲで置換されたＫ１３２；ＨまたはＫで置換されたＲ１３３；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１３４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ１３５；Ｎで置換されたＱ１３６；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１３７；Ｄで置換されたＥ１３９；Ｄで置換されたＥ１４０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置��されたＴ１４１；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１４２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１４３；ＦまたはＷで置換されたＹ１４４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ１４５；ＷまたはＹで置換されたＦ１４６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ１４７；ＦまたはＹで置換されたＷ１４９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１５０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１５１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１５２；ＷまたはＹで置換されたＦ１５３；ＨまたはＲで置換されたＫ１５４；ＨまたはＫで置換されたＲ１５５；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１５６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１５７；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１５８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１５９；Ｄで置換されたＥ１６０；Ｄで置換されたＥ１６１；ＨまたはＲで置換されたＫ１６２；Ｄで置換されたＥ１６３；Ｑで置換されたＮ１６４；ＨまたはＲで置換されたＫ１６５；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ１６６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１６７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ１６８；ＨまたはＲで置換されたＫ１６９；Ｄで置換されたＥ１７０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ１７１；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１７２；ＦまたはＷで置換されたＹ１７３；ＷまたはＹで置換されたＦ１７４；ＷまたはＹで置換されたＦ１７５；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ１７６；ＦまたはＷで置換されたＹ１７７；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１７８；Ｎで置換されたＱ１７９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ１８０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１８１；ＦまたはＷで置換されたＹ１８２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ１８３；Ｅで置換されたＤ１８４；ＨまたはＲで置換されたＫ１８５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ１８６；ＦまたはＷで置換されたＹ１８７；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１８８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＶで置換されたＭ１８９；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１９０；ＫまたはＲで置換されたＨ１９１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１９２；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ１９３；Ｎで置換されたＱ１９４；ＨまたはＫで置換されたＲ１９５；ＨまたはＲで置換されたＫ１９６；ＨまたはＲで置換されたＫ１９７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ１９８；ＫまたはＲで置換されたＨ１９９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ２００；ＷまたはＹで置換されたＦ２０１；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ２０２；Ｅで置換されたＤ２０３；Ｄで置換されたＥ２０４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２０５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ２０６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２０７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ２０８；��、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ２０９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２１０；ＷまたはＹで置換されたＦ２１１；ＨまたはＫで置換されたＲ２１２；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ２１４；Ｎで置換されたＱ２１５；Ｑで置換されたＮ２１６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＶで置換されたＭ２１７；Ｄで置換されたＥ２１９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ２２０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２２１；Ｑで置換されたＮ２２３；Ｑで置換されたＮ２２４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ２２５；ＦまたはＷで置換されたＹ２２７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ２２８；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ２２９；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ２３０；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ２３１；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ２３２；ＨまたはＲで置換されたＫ２３３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２３４；Ｄで置換されたＥ２３５；Ｄで置換されたＥ２３６；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ２３７；Ｅで置換されたＤ２３８；Ｄで置換されたＥ２３９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２４０；Ｎで置換されたＱ２４１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２４２；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ２４３；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ２４４；ＨまたはＫで置換されたＲ２４６；Ｄで置換されたＥ２４７；Ｑで置換されたＮ２４８；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ２４９；Ｎで置換されたＱ２５０；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ２５１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ２５２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２５３；Ｅで置換されたＤ２５４；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ２５５；Ｅで置換されたＤ２５６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ２５７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ２５８；ＷまたはＹで置換されたＦ２５９；ＷまたはＹで置換されたＦ２６０；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ２６１；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ２６２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２６３；ＨまたはＲ
で置換されたＫ２６４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２６５；および／あるいはＡ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２６６。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明によって包含される。本発明の得られるニュートロカイン−αタンパク質は、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの機能的活性および／または物理的特性（例えば、増強または低減された安定性および／または溶解度など）について慣用的にスクリーニングされ得る。好ましくは、本発明の得られるタンパク質は、増加したおよび／または減少したニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの機能的活性を有する。より好ましくは、本発明の得られるニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶタンパク質は、１より多くの増加したおよび／または減少したニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの機能的活性および／または物理的特性を有する。
【０３０１】
別の実施形態では、ニュートロカイン−αのアミノ酸レベルでの部位特異的変化は、特定のアミノ酸を保存的置換によって置換することにより行われ得る。配列番号２３に提供されるニュートロカイン−αアミノ酸配列の好ましい保存的置換変異としては、以下が挙げられる：ＨまたはＫで置換されたＲ１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ３；Ｅで置換されたＤ４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ６；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ７；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１３；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１５；ＨまたはＫで置換されたＲ１７；ＫまたはＲで置換されたＨ１８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１９；Ｎで置換されたＱ２０；ＫまたはＲで置換されたＨ２１；Ｅで置換されたＤ２２；Ｅで置換されたＤ２３；Ｑで置換されたＮ２４；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ２５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＶで置換されたＭ２６；Ｑで置換されたＮ２７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２８；ＨまたはＫで置換されたＲ２９；Ｑで置換されたＮ３０；ＨまたはＫで置換されたＲ３１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ３２；ＦまたはＷで置換されたＹ３３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ３４；ＷまたはＹで置換されたＦ３５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ３６；ＦまたはＹで置換されたＷ３８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ３９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ４０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ４１；ＷまたはＹで置換されたＦ４２；ＨまたはＲで置換されたＫ４３；ＨまたはＫで置換されたＲ４４；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ４５；Ｑで置換されたＮ４６；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ４７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ４８；Ｄで置換されたＥ４９；Ｄで置換されたＥ５０；ＨまたはＲで置換されたＫ５１；Ｄで置換されたＥ５２；Ｑで置換されたＮ５３；ＨまたはＲで置換されたＫ５４；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ５５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ５６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ５７；ＨまたはＫで置換されたＲ５８；Ｎで置換されたＱ５９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ６０；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ６１；ＦまたはＷで置換されたＹ６２；ＷまたはＹで置換されたＦ６３；ＷまたはＹで置換されたＦ６４；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ６５；ＦまたはＷで置換されたＹ６６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ６７；Ｎで置換されたＱ６８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ６９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ７０；ＦまたはＷで置換されたＹ７１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ７２；Ｅで置換されたＤ７３；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、��、ＭまたはＶで置換されたＩ７５；ＷまたはＹで置換されたＦ７６；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ７７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＶで置換されたＭ７８；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ７９；ＫまたはＲで置換されたＨ８０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ８１；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ８２；Ｎで置換されたＱ８３；ＨまたはＫで置換されたＲ８４；ＨまたはＲで置換されたＫ８５；ＨまたはＲで置換されたＫ８６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ８７；ＫまたはＲで置換されたＨ８８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ８９；ＷまたはＹで置換されたＦ９０；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ９１；Ｅで置換されたＤ９２；Ｄで置換されたＥ９３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ９４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ９５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ９６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ９７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ９８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ９９；ＷまたはＹで置換されたＦ１００；ＨまたはＫで置換されたＲ１０１；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ１０３；Ｎで置換されたＱ１０４；Ｑで置換されたＮ１０５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＶで置換されたＭ１０６；ＨまたはＲで置換されたＫ１０８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ１０９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１１０；Ｑで置換されたＮ１１２；Ｑで置換されたＮ１１３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１１４；ＦまたはＷで置換されたＹ１１６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１１７；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１１８；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１１９；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ１２０；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１２１；ＨまたはＫで置換されたＲ１２２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１２３；Ｄで置換されたＥ１２４；Ｄで置換されたＥ１２５；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１２６；Ｅで置換されたＤ１２７；Ｄで置換されたＥ１２８；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ１２９；Ｎで置換されたＱ１３０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１３１；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１３２；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ１３３；ＨまたはＫで置換されたＲ１３５；Ｄで置換されたＥ１３６；Ｑで置換されたＮ１３７；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１３８；Ｎで置換されたＱ１３９；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ１４０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１４１；ＨまたはＫで置換されたＲ１４２；Ｑで置換されたＮ１４３；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１４４；Ｅで置換されたＤ１４５；Ｅで置換されたＤ１４６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ１４７；ＷまたはＹで置換されたＦ１４８；ＷまたはＹで��換されたＦ１４９；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１５０；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１５１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１５２；ＨまたはＲで置換されたＫ１５３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１５４；および／あるいはＡ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１５５。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明によって包含される。本発明の得られるニュートロカイン−αタンパク質は、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの機能的活性および／または物理的特性（例えば、増強または低減された安定性および／または溶解度など）について慣用的にスクリーニングされ得る。好ましくは、本発明の得られるタンパク質は、増加したおよび／または減少したニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの機能的活性を有する。より好ましくは、本発明の得られるニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶタンパク質は、１より多くの増加したおよび／または減少したニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの機能的活性および／または物理的特性を有する。
【０３０２】
別の実施形態では、ニュートロカイン−αアミノ酸レベルでの部位特異的変化は、特定のアミノ酸を保存的置換によって置換することにより行われ得る。配列番号３８に提供されるニュートロカイン−αアミノ酸配列の好ましい保存的置換変異としては、以下が挙げられる：Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＶで置換されたＭ１；Ｅで置換されたＤ２；Ｄで置換されたＥ３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ４；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ５；ＨまたはＲで置換されたＫ６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１３；ＷまたはＹで置換されたＦ１５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１７；Ｄで置換されたＥ１８；ＨまたはＲで置換されたＫ１９；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ２０；Ｄで置換されたＥ２１；Ｅで置換されたＤ２２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＶで置換されたＭ２３；ＨまたはＲで置換されたＫ２４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ２５；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ２６；ＦまたはＷで置換されたＹ２７；Ｅで置換されたＤ２８；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ３０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ３１；Ｎで置換されたＱ３３；ＨまたはＲで置換されたＫ３４；Ｄで置換されたＥ３５；Ｄで置換されたＥ３６；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ３７；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ３８；ＦまたはＹで置換されたＷ３９；ＷまたはＹで置換されたＦ４０；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ４１；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ４２；ＨまたはＫで置換されたＲ４４；Ｅで置換されたＤ４５；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ４６；ＨまたはＫで置換されたＲ４７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ４８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ４９；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ５０；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ５１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ５２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ５３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ５４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ５５；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ５６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ５７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ５８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ５９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ６０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ６１；ＷまたはＹで置換されたＦ６２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ６３；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ６４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＶで置換されたＭ６５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ６６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ６７；ＦまたはＷで置換されたＹ６８；Ｎで置換されたＱ６９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ７０��Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ７１；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ７２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ７３；Ｎで置換されたＱ７４；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ７５；Ｅで置換されたＤ７６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ７７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＶで置換されたＭ７８；Ｑで置換されたＮ７９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ８０；ＨまたはＫで置換されたＲ８１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＶで置換されたＭ８２；Ｄで置換されたＥ８３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ８４；Ｎで置換されたＱ８５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ８６；ＦまたはＷで置換されたＹ８７；ＨまたはＫで置換されたＲ８８；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ８９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ９０；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ９１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ９２；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ９４；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ９５；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ９６；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ９７；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ９８；Ｄで置換されたＥ１００；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１０１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ１０２；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１０３；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１０４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ１０５；ＨまたはＲで置換されたＫ１０６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１０７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１０８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ１０９；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１１１；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１１２；ＨまたはＫで置換されたＲ１１４；ＫまたはＲで置換されたＨ１１６；Ｑで置換されたＮ１１７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１１８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１１９；ＨまたはＫで置換されたＲ１２０；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１２１；ＫまたはＲで置換されたＨ１２２；ＨまたはＫで置換されたＲ１２３；Ｑで置換されたＮ１２４；ＨまたはＫで置換されたＲ１２５；ＨまたはＫで置換されたＲ１２６；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１２７；ＷまたはＹで置換されたＦ１２８；Ｎで置換されたＱ１２９；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１３０；Ｄで置換されたＥ１３２；Ｄで置換されたＥ１３３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ１３４；Ｄで置換されたＥ１３５；Ｎで置換されたＱ１３６；Ｅで置換されたＤ１３７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ１３８；Ｅで置換されたＤ１３９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１４０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１４１；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１４２；Ｇ、Ｉ、Ｌ��Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１４５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１４８；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１５０；ＨまたはＫで置換されたＲ１５２；ＫまたはＲで置換されたＨ１５３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１５４；Ｎで置換されたＱ１５５；ＫまたはＲで置換されたＨ１５６；Ｅで置換されたＤ１５７；Ｅで置換されたＤ１５８；Ｑで置換されたＮ１５９；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１６０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＶで置換されたＭ１６１；Ｑで置換されたＮ１６２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１６３；ＨまたはＫで置換されたＲ１６４；Ｑで置換されたＮ１６５；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ１６６；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ１６７；Ｎで置換されたＱ１６８；Ｅで置換されたＤ１６９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１７１；Ｎで置換されたＱ１７２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１７３；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ１７４；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１７５；Ｅで置換されたＤ１７６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１７７；Ｅで置換されたＤ１７８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ１７９；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１８１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１８２；Ｄで置換されたＥ１８３；Ｄで置換されたＥ１８４；ＨまたはＲで置換されたＫ１８５；Ｄで置換されたＥ１８６；Ｑで置換されたＮ１８７；ＨまたはＲで置換されたＫ１８８；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ１８９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ１９０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ１９１；ＨまたはＫで置換されたＲ１９２；Ｎで置換されたＱ１９３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ１９４；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１９５；ＦまたはＷで置換されたＹ１９６；ＷまたはＹで置換されたＦ１９７；ＷまたはＹで置換されたＦ１９８；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ１９９；ＦまたはＷで置換されたＹ２００；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ２０１；Ｎで置換されたＱ２０２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ２０３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２０４；ＦまたはＷで置換されたＹ２０５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ２０６；Ｅで置換されたＤ２０７；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ２０９；ＷまたはＹで置換されたＦ２１０；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ２１１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＶで置換されたＭ２１２；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ２１３；ＫまたはＲで置換されたＨ２１４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ２１５；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ２１６；Ｎで置換されたＱ２１７；ＨまたはＫで置換されたＲ２１８；ＨまたはＲで置換されたＫ２１９；ＨまたはＲで置換されたＫ２２０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔま��はＭで置換されたＶ２２１；ＫまたはＲで置換されたＨ２２２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ２２３；ＷまたはＹで置換されたＦ２２４；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ２２５；Ｅで置換されたＤ２２６；Ｄで置換されたＥ２２７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２２８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ２２９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２３０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ２３１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ２３２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２３３；ＷまたはＹで置換されたＦ２３４；ＨまたはＫで置換されたＲ２３５；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ２３７；Ｎで置換されたＱ２３８；Ｑで置換されたＮ２３９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＶで置換されたＭ２４０；ＨまたはＲで置換されたＫ２４２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ２４３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２４４；Ｑで置換されたＮ２４６；Ｑで置換されたＮ２４７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ２４８；ＦまたはＷで置換されたＹ２５０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ２５１；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ２５２；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ２５３；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ２５４；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ２５５；ＨまたはＫで置換されたＲ２５６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２５７；Ｄで置換されたＥ２５８；Ｄで置換されたＥ２５９；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ２６０；Ｅで置換されたＤ２６１；Ｄで置換されたＥ２６２；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ２６３；Ｎで置換されたＱ２６４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２６５；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ２６６；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ２６７；ＨまたはＫで置換されたＲ２６９；Ｄで置換されたＥ２７０；Ｑで置換されたＮ２７１；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ２７２；Ｎで置換されたＱ２７３；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ２７４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ２７５；ＨまたはＫで置換されたＲ２
７６；Ｑで置換されたＮ２７７；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ２７８；Ｅで置換されたＤ２７９；Ｅで置換されたＤ２８０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ２８１；ＷまたはＹで置換されたＦ２８２；ＷまたはＹで置換されたＦ２８３；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ２８４；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ２８５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２８６；ＨまたはＲで置換されたＫ２８７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２８８；および／あるいはＡ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２８９。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明によって包含される。本発明の得られるニュートロカイン−αタンパク質は、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの機能的活性および／または物理的特性（例えば、増強または低減された安定性および／または溶解度など）について慣用的にスクリーニングされ得る。好ましくは、本発明の得られるタンパク質は、増加したおよび／または減少したニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの機能的活性を有する。より好ましくは、本発明の得られるニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶタンパク質は、１より多くの増加したおよび／または減少したニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの機能的活性および／または物理的特性を有する。
【０３０３】
本発明のニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチド中の機能に必須であるアミノ酸は、当該分野で公知の方法（例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５（１９８９）））によって同定され得る。後者の手順は、単一のアラニン変異をこの分子中のあらゆる残基に導入する。次いで、得られる変異体分子は、例えば、増殖、分化および／または活性化のような機能的活性（例えば、リガンド結合およびリンパ球（例えば、Ｂ細胞）を刺激する能力）について試験される。
【０３０４】
特に興味深いのは、非常に望ましい改善された特徴（例えば、凝集が少ないこと）を有するタンパク質を産生し得る、他の荷電アミノ酸または中性アミノ酸での荷電アミノ酸の置換である。凝集は、活性を減少させ得るだけでなく、薬学的処方物を調製する場合に問題があり得る。なぜなら、凝集物は免疫原性であり得るからである（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３６：８３８−８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １０：３０７−３７７（１９９３）。
【０３０５】
別の実施形態では、本発明は、配列番号２に提供されるアミノ酸配列の非保存的置換を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。例えば、配列番号２に提供されるニュートロカイン−αタンパク質配列の非保存的置換としては、以下が挙げられる：Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＭ１；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＤ２；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＤ３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ５；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ６；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ７；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ１０；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ１１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ１２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ１３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ１４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＰで置換されたＣ１５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ１６；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ１７；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ１８；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ１９；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ２０；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ２１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＭ２２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ２３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２４；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ２５；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ２６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＰで置換されたＣ２７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ２８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ２９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＩ３０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、���、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ３１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ３２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ３３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ３４；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ３５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ３６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ３７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ３８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ３９；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ４０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ４１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ４２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ４３；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＤ４４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ４５；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ４６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ４７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ４８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ４９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ５０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ５１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ５２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ５３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ５４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ５５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ５６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ５７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ５８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＰで置換されたＣ５９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＰで置換されたＣ６０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ６１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ６２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ６３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ６４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ６５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、���、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＦ６６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＹ６７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ６８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ６９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ７０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ７１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ７２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ７３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ７４；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＤ７５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ７６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ７７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ７８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ７９；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ８０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ８１；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ８２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ８３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ８４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ８５；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＨ８６；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＨ８７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ８８；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ８９；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ９０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ９１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ９２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ９３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ９４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ９５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ９６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ９７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ９８；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ９９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換さ���たＡ１００；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ１０１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ１０２；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ１０３；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ１０４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ１０５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ１０６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ１０７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ１０８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ１０９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ１１０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ１１１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ１１２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ１１３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＩ１１４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＦ１１５；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ１１６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ１１７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ１１８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ１１９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ１２０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ１２１；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ１２２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ１２３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＮ１２４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ１２５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ１２６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ１２７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＮ１２８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ１２９；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ１３０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＮ１３１；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ１３２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ１３３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ１３４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ１３５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ１３６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ１３７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ１３８；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ１３９；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ１４０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ１４１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ１４２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ１４３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ１４４；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＤ１４５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＰで置換されたＣ１４６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ１４７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ１４８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ１４９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＩ１５０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ１５１；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＤ１５２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ１５３；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ１５４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ１５５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ１５６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ１５７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＩ１５８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ１５９；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ１６０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ１６１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ１６２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＹ１６３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ１６４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＦ１６５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ１６６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ１６７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＷ１６８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ１６９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ１７０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ１７１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＦ１７２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ１７３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ１７４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ１７５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ１７６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ１７７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ１７８；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ１７９；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ１８０；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ１８１；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ１８２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＮ１８３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ１８４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＩ１８５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ１８６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ１８７；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ１８８；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ１８９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ１９０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ１９１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＹ１９２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＦ１９３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＦ１９４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＩ１９５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＹ１９６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ１９７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ１９８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ１９９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２００；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＹ２０１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ２０２；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＤ２０３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ２０４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ２０５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＹ２０６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ２０７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＭ２０８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ２０９；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＨ２１０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２１１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＩ２１２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ２１３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ２１４；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ２１５；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ２１６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ２１７；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＨ２１８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ２１９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＦ２２０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ２２１；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＤ２２２；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ２２３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２２４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ２２５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２２６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ２２７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ２２８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２２９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＦ２３０；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ２３１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＰで置換されたＣ２３２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＩ２３３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ２３４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＮ２３５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＭ２３６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ２３７；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ２３８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ２３９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２４０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ２４１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＮ２４２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＮ２４３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ２４４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＰで置換されたＣ２４５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＹ２４６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
またはＣで置換されたＳ２４７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ２４８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ２４９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＩ２５０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ２５１；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ２５２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２５３；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ２５４；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ２５５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ２５６；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＤ２５７；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ２５８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２５９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ２６０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２６１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ２６２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＩ２６３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ２６４；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ２６５；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ２６６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＮ２６７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ２６８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ２６９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＩ２７０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ２７１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２７２；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＤ２７３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ２７４；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＤ２７５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ２７６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ２７７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＦ２７８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＦ２７９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ２８０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ２８１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２８２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ２８３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２８４；および／あるいはＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２８５。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明によって包含される。本発明の得られるニュートロカイン−αタンパク質は、本明細書を通して記載され、そして当該分野で公知のニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの機能的活性および／または物理的特性（例えば、増強または低減された安定性および／または溶解度など）について慣用的にスクリーニングされ得る。好ましくは、本発明の得られるタンパク質は、増加したおよび／または減少したニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの機能的活性を有する。より好ましくは、本発明の得られるニュートロカインαおよび／またはニュートロカイン−αＳＶタンパク質は、１より多くの増加したおよび／または減少したニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの機能的活性および／または物理的特性を有する。
【０３０６】
さらなる実施形態では、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドは、上記のように（保存的または非保存的のいずれかで）置換されたアミノ酸で置換された、１より多くのアミノ酸（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０および５０）を含むか、あるいはこれらのアミノ酸からなる。
【０３０７】
本発明の別の実施形態では、配列番号１９に提供されるニュートロカイン−αＳＶタンパク質配列の非保存的置換としては、以下が挙げられる：Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＭ１；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＤ２；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＤ３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ５；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ６；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ７；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ１０；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ１１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ１２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ１３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ１４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＰで置換されたＣ１５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ１６；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ１７；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ１８；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ１９；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ２０；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ２１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＭ２２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ２３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２４；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ２５；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ２６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＰで置換されたＣ２７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ２８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ２９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＩ３０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ３１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、���、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ３２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ３３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ３４；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ３５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ３６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ３７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ３８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ３９；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ４０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ４１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ４２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ４３；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＤ４４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ４５；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ４６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ４７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ４８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ４９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ５０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ５１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ５２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ５３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ５４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ５５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ５６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ５７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ５８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＰで置換されたＣ５９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＰで置換されたＣ６０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ６１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ６２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ６３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ６４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ６５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＦ６６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、���またはＣで置換されたＹ６７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ６８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ６９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ７０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ７１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ７２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ７３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ７４；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＤ７５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ７６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ７７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ７８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ７９；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ８０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ８１；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ８２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ８３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ８４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ８５；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＨ８６；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＨ８７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ８８；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ８９；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ９０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ９１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ９２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ９３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ９４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ９５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ９６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ９７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ９８；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ９９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ１００；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ１０１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、���、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ１０２；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ１０３；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ１０４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ１０５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ１０６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ１０７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ１０８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ１０９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ１１０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ１１１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ１１２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ１１３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＩ１１４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＦ１１５；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ１１６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ１１７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ１１８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ１１９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ１２０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ１２１；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ１２２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ１２３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＮ１２４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ１２５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ１
２６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ１２７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＮ１２８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ１２９；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ１３０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＮ１３１；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ１３２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ１３３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ１３４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ１３５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ１３６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ１３７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ１３８；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ１３９；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ１４０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ１４１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ１４２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ１４３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＹ１４４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ１４５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＦ１４６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ１４７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ１４８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＷ１４９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ１５０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ１５１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ１５２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＦ１５３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ１５４；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ１５５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ１５６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ１５７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ１５８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ１５９；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ１６０；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ１６１；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ１６２；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ１６３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＮ１６４；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ１６５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＩ１６６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ１６７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ１６８；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ１６９；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ１７０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ１７１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ１７２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＹ１７３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＦ１７４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＦ１７５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＩ１７６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＹ１７７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ１７８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ１７９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ１８０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ１８１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＹ１８２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ１８３；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＤ１８４；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ１８５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ１８６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＹ１８７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ１８８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＭ１８９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ１９０；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＨ１９１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ１９２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＩ１９３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ１９４；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ１９５；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ１９６；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ１９７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ１９８；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＨ１９９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ２００；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＦ２０１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ２０２；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＤ２０３；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ２０４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２０５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ２０６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２０７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ２０８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ２０９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２１０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＦ２１１；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ２１２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＰで置換されたＣ２１３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＩ２１４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ２１５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＮ２１６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＭ２１７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ２１８；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ２１９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ２２０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２２１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ２２２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＮ２２３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＮ２２４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ２２５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＰで置換されたＣ２２６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＹ２２７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ２２８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ２２９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ２３０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＩ２３１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ２３２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ２３３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２３４；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ２３５；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ２３６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ２３７；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＤ２３８；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ２３９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２４０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ２４１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２４２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ２４３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＩ２４４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ２４５；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ２４６；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ２４７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換
されたＮ２４８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ２４９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ２５０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＩ２５１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ２５２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２５３；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＤ２５４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ２５５；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＤ２５６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ２５７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ２５８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＦ２５９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＦ２６０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ２６１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ２６２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２６３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ２６４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２６５；および／あるいはＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２６６。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に包含される。本発明の得られるニュートロカイン−αタンパク質は、本明細書を通して記載され、そして当該分野で公知のニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの機能的活性および／または物理的特性（例えば、増強または低減された安定性および／または溶解度など）について慣用的にスクリーニングされ得る。好ましくは、本発明の得られるタンパク質は、増加したおよび／または減少したニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの機能的活性を有する。より好ましくは、本発明の得られるニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶタンパク質は、１より多くの増加したおよび／または減少したニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの機能的活性および／または物理的特性を有する。
【０３０８】
さらなる実施形態において、本発明のニュートロカイン−αは、上記のような置換アミノ酸（保存的かまたは非保存的のいずれか）で置換された１つより多くのアミノ酸（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、３０個および５０個）を含むかまたはこれらからなる。
【０３０９】
例えば、配列番号２３に提供されるニュートロカイン−αタンパク質配列の好ましい非保存的置換としては、以下が挙げられる：Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｒ１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｖ２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｖ３；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ａ１０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ１１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換された、Ｃ１２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｌ１３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ１４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｇ１５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換された、Ｃ１６；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｒ１７；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｈ１８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｓ１９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｑ２０；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｈ２１；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｄ２２；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｄ２３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｎ２４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｇ２５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｍ２６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｎ２７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｌ２８；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｒ２９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｎ３０；Ｄ、Ｅ、Ａ���Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｒ３１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｔ３２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換された、Ｙ３３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｔ３４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換された、Ｆ３５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｖ３６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ３７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換された、Ｗ３８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｌ３９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｌ４０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｓ４１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換された、Ｆ４２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｋ４３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ４４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ４５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｎ４６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ４７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ４８；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ４９；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ５０；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｋ５１；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ５２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｎ５３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｋ５４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｉ５５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｖ５６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｖ５７；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ５８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｑ５９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｔ６０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ６１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｙ６２；Ｄ、���、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｆ６３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｆ６４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｉ６５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｙ６６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ６７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｑ６８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｖ６９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ７０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｙ７１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｔ７２；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ７３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ７４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｉ７５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｆ７６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ７７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｍ７８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ７９；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｈ８０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｖ８１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｉ８２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｑ８３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ８４；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｋ８５；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｋ８６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｖ８７；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｈ８８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｖ８９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｆ９０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ９１；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ９２；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ９３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ９４���Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ９５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ９６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｖ９７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｔ９８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ９９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｆ１００；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ１０１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換された、Ｃ１０２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｉ１０３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｑ１０４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｎ１０５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｍ１０６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ１０７；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｋ１０８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｔ１０９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ１１０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ１１１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｎ１１２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｎ１１３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ１１４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換された、Ｃ１１５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｙ１１６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ１１７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ１１８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ１１９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｉ１２０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ１２１；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ１２２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ１２３；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ１２４；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ１２５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ１２６；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ１２７；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ１２８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｉ１２９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｑ１３０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ１３１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ１３２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｉ１３３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ１３４；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ１３５；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ１３６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｎ１３７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ１３８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｑ１３９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｉ１４０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ１４１；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ１４２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｎ１４３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ１４４；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ１４５；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ１４６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｔ１４７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｆ１４８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｆ１４９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ１５０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ１５１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ１５２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｋ１５３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ１５４；ならびに／またはＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ１５５。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明により包含される。生じる本発明のニュートロカイン−αタンパク質は、本明細書中を通して記載されかつ当該分野で公知の、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの、機能的活性および／または物理的特性（例えば、安定性および／または可溶性の、増強または減少）について慣用的にスクリーニングされ得る。好ましくは、本発明の生じたタンパク質は、増加および／または減少した、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの機能的活性を有する。より好ましくは、生じた本発明のニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶのタンパク質は、１つより多くの増大および／または減少した、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの、機能的活性および／または物理的特性を有する。
【０３１０】
さらなる実施形態において、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドは、上記のような置換アミノ酸（保存的または非保存的のいずれか）で置換された、１つより多くのアミノ酸（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、３０個および５０個）を含むかまたはこれらからなる。
【０３１１】
例えば、配列番号３８に提供されるニュートロカイン−αタンパク質配列の好ましい非保存的置換としては、以下が挙げられる：Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｍ１；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ２；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ５；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｋ６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｔ７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ１０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ１１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換された、Ｃ１２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ１３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換された、Ｃ１４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｆ１５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換された、Ｃ１６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ１７；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ１８；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｋ１９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ２０；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ２１；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ２２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｍ２３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｋ２４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｖ２５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ２６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｙ２７；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ２８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ２９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま���はＣで置換された、Ｉ３０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｔ３１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ３２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｑ３３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｋ３４；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ３５；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ３６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ３７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ３８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｗ３９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｆ４０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ４１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｉ４２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換された、Ｃ４３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ４４；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ４５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ４６；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ４７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ４８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ４９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ５０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ５１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｔ５２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ５３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ５４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ５５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ５６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ５７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ５８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ５９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ６０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ６１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換された、Ｆ６２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された���Ｔ６３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ６４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｍ６５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ６６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ６７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｙ６８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｑ６９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ７０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ７１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ７２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ７３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｑ７４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ７５；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ７６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ７７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｍ７８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｎ７９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ８０；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ８１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｍ８２；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ８３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ８４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｑ８５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ８６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｙ８７；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ８８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ８９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ９０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ９１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｔ９２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ９３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ９４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ９５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ９６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ���Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ９７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ９８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ９９；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ１００；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ１０１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｔ１０２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ１０３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ１０４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｖ１０５；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｋ１０６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ１０７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ１０８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｔ１０９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ１１０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ１１１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ１１２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ１１３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ１１４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ１１５；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｈ１１６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｎ１１７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ１１８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ１１９；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ１２０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ１２１；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｈ１２２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ１２３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｎ１２４；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ１２５；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ１２６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ１２７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｆ１２８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｑ１２９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ１３０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ１３１；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ１３２；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ１３３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｔ１３４；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ１３５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｑ１３６；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ１３７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｖ１３８；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ１３９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ１４０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ１４１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ１４２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ１４３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ１４４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ１４５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ１４６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換された、Ｃ１４７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ１４８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ１４９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ１５０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換された、Ｃ１５１；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ１５２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｈ１５３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ１５４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｑ１５５；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｈ１５６；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ１５７；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ１５８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｎ１５９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ１６０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｍ１６１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｎ１６２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ１６３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ１６４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｎ１６５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｉ１６６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｉ１６７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｑ１６８；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ１６９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換された、Ｃ１７０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ１７１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｑ１７２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ１７３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｉ１７４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ１７５；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ１７６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ１７７；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ１７８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｔ１７９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ１８０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ１８１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ１８２；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ１８３；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ１８４；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｋ１８５；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ１８６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｎ１８７；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｋ１８８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｉ１８９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｖ１９０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｖ１９１；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ１９２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｑ１９３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｔ１９４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ１９５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｙ１９６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｆ１９７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｆ１９８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｉ１９９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｙ２００；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ２０１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｑ２０２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｖ２０３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ２０４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｙ２０５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｔ２０６；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ２０７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ２０８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｉ２０９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｆ２１０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ２１１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｍ２１２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ２１３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｈ２１４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｖ２１５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｉ２１６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｑ２１７；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ２１８；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｋ２１９；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｋ２２０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｖ２２１；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｈ２２２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｖ２２３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｆ２２４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ２２５；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ２２６；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ２２７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ２２８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ２２９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ２３０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｖ２３１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｔ２３２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ２３３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｆ２３４；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ２３５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換された、Ｃ２３６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｉ２３７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｑ２３８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｎ２３９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｍ２４０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ２４１；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｋ２４２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｔ２４３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ２４４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ２４５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｎ２４６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｎ２４７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ２４８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換された、Ｃ２４９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｙ２５０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ２５１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ２５２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ２５３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｉ２５４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ２５５；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ２５６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ２５７；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ２５８；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ２５９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ２６０；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ２６１；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ２６２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｉ２６３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｑ２６４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ２６５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ２６６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｉ２６７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ２６８；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ２６９；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ２７０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｎ２７１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ２７２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｑ２７３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｉ２７４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ２７５；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ２７６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｎ２７７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ２７８；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ２７９；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ２８０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｔ２８１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｆ２８２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｆ２８３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ２８４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ２８５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ２８６；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｋ２８７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ２８８；ならびに／またはＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ２８９。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明により包含される。本発明の生じたニュートロカイン−αタンパク質は、本明細書全体にわたって記載されかつ当該分野で公知である、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの、機能的活性および／または物理的特性（例えば、安定性および／または溶解性の、増強または減少）について、慣用的にスクリーニングされ得る。好ましくは、本発明の生じたタンパク質は、増強および／または減少した、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの機能的活性を有する。より好ましくは、本発明の生じるニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶタンパク質は、１つより多くの、増強または減少した、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロ��イン−αＳＶの、機能的活性および／または物理的特性を有する。
【０３１２】
さらなる実施形態において、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドは、上記のような置換アミノ酸（保存的または非保存的のいずれか）で置換された、１つより多くのアミノ酸（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、３０個および５０個）を、含むかまたはそれらからなる。
【０３１３】
アミノ酸の置換はまた、細胞表面レセプターへのリガンドの結合の選択性を変化し得る。例えば、Ｏｓｔａｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６１：２６６〜２６８（１９９３）は、２つの既知の型のＴＮＦレセプターのうちの１つのみへのＴＮＦ−αの選択的結合を生じる特定の変異を記載する。ニュートロカイン−αおよびニュートロカイン−αＳＶは、ＴＮＦポリペプチドファミリーのメンバーであるので、ＴＮＦ−α中の変異に類似する変異は、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶ中で類似の効果を有するようである。
【０３１４】
リガンド−レセプター結合に重要な部位はまた、構造解析（例えば、結晶化、核磁気共鳴または光親和性標識（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９〜９０４（１９９２）およびｄｅ  Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６〜３１２（１９９２））により決定され得る。
【０３１５】
ニュートロカイン−αは、ＴＮＦ関連タンパク質ファミリーのメンバーであるので、ニュートロカイン−αの機能的活性（例えば、生物学的活性）を完全に除去するのではなく調節するためには、変異は、ＴＮＦ保存ドメインのアミノ酸をコードする配列（すなわち、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）のＧｌｙ−１９１〜Ｌｅｕ−２８４位）内に、より好ましくはそのＴＮＦファミリー（例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＬＴ−β、およびＦａｓリガンド）（例えば、図２Ａ〜Ｂを参照のこと）のうちの全て、ほとんどまたはいくつかのメンバーには保存されていない、この領域内の残基に作製される。このような保存アミノ酸が関連するＴＮＦ中に代表的に見出される位置でニュートロカイン−α中に特定の変異を作製することによって、そのニュートロカイン−αムテインは、アンタゴニストとして作用し、これにより、例えば、リンパ球（例えば、Ｂ細胞）の増殖、分化、および／または活性化を阻害する、活性を保有する。従って、本発明のポリペプチドは、ニュートロカイン−α変異体を含む。このようなニュートロカイン−α変異体は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）に示されるニュートロカイン−αアミノ酸配列の全長（または好ましくは細胞外ドメイン）の、フラグメント、改変体または誘導体を、含むかまたはこれらからなる。上記のニュートロカイン−α変異体をコードするポリヌクレオチドもまた、本発明により包含される。
【０３１６】
ニュートロカイン−αＳＶは、ＴＮＦ関連タンパク質ファミリーのメンバーであるので、ニュートロカイン−αＳＶの機能的活性（例えば、生物学的活性）を完全に除去するのではなく調節するためには、変異は、ＴＮＦ保存ドメインのアミノ酸をコードする配列（すなわち、図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１９）のＧｌｙ−１７２〜Ｌｅｕ−２６５位）内に、より好ましくはそのＴＮＦファミリー（例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＬＴ−β、およびＦａｓリガンド）（例えば、図２Ａ〜Ｂを参照のこと）のうちの全て、ほとんどまたはいくつかのメンバーには保存されていない、この領域内の残基に作製される。このような保存アミノ酸が関連するＴＮＦ中に代表的に見出される位置でニュートロカイン−αＳＶ中に特定の変異を作製することによって、そのニュートロカイン−αＳＶムテインは、アンタゴニストとして作用し、これにより、例えば、リンパ球（例えば、Ｂ細胞）の増殖、分化、および／または活性化を阻害する、活性を保有する。従って、本発明のポリペプチドは、ニュートロカイン−αＳＶ変異体を含む。このようなニュートロカイン−αＳＶ変異体は、図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１９）に示されるニュートロカイン−αＳＶアミノ酸配列の全長（または好ましくは細胞外ドメイン）の、フラグメント、改変体または誘導体を、含むかまたはこれらからなる。上記のニュートロカイン−αＳＶ変異体をコードするポリヌクレオチドもまた、本発明により包含される。
【０３１７】
さらに、このニュートロカインαＳＶポリペプチド配列にて見出されない１９個のアミノ酸残基の挿入（すなわち、図１Ａおよび１Ｂならびに配列番号２に示される配列のアミノ酸残基Ｖａｌ−１４２〜Ｌｙｓ−１６０）を含む、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドの領域を標的とする変異が、このニュートロカイン−αポリペプチドの観察される機能的活性（例えば、生物学的活性）に影響し得ることは、当業者に認識される。より詳細には、変異のために標的とされ得るニュートロカイン−αポリペプチド配列のこのような残基の、部分的で、限定的でなくかつ排他的でもない列挙としては、配列番号２において示されるニュートロカイン−αポリペプチド配列の以下のアミノ酸残基が挙げられる：Ｖ−１４２；Ｔ−１４３；Ｑ−１４４；Ｄ−１４５；Ｃ−１４６；Ｌ−１４７；Ｑ−１４８；Ｌ−１４９；Ｉ−１５０；Ａ−１５１；Ｄ−１５２；Ｓ−１５３；Ｅ−１５４；Ｔ−１５５；Ｐ−１５６；Ｔ−１５７；Ｉ−１５８；Ｑ−１５９；およびＫ−１６０。
【０３１８】
当業者に公知の組換えＤＮＡ技術（例えば、前出のＤＮＡシャッフリングを参照のこと）が、新規な変異体タンパク質またはムテイン（単一または複数の、アミノ酸置換、欠失、付加、または融合タンパク質を含む）を作製するために使用され得る。このような改変ポリペプチドは、例えば、増強した活性または増加した安定性を示し得る。さらに、これらは、対応する天然のポリペプチドよりも、少なくとも特定の精製条件および貯蔵条件下で、高い収量で精製され得、かつ良好な可溶性を示し得る。
【０３１９】
従って、本発明はまた、選択された宿主中での発現、スケールアップなどにより良く適するニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドを生成するために欠失、付加または置換された１つ以上のアミノ酸残基を有する、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの誘導体およびアナログも包含する。例えば、システイン残基が、ジスルフィド架橋を除去するために、欠失され得るかまたは別のアミノ酸で置換され得る；Ｎ結合グリコシル化部位が、例えば、Ｎ結合部位を過剰糖化することが公知である酵母宿主からより容易に回収かつ精製される、異種産物の発現を達成するために、変更または除去され得る。この目的のために、本発明のニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチド中のグリコシル化認識配列のうちのいずれか１つ以上での第１のアミノ酸位置または第３のアミノ酸位置のうちの１つまたは両方での種々のアミノ酸置換、ならびに／あるいは任意の１つ以上のこのような認識配列の第２の位置でのアミノ酸欠失は、その改変トリペプチド配列でのそのニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶのグリコシル化を示す（例えば、Ｍｉｙａｊｉｍｏら、ＥＭＢＯ  Ｊ  ５（６）：１１９３〜１１９７を参照のこと）。
【０３２０】
さらに、本発明のポリペプチドの１つ以上のアミノ酸残基（例えば、アルギニン残基およびリジン残基）が、例えば、フューリンまたはケキシンのようなプロテアーゼによる望まれないプロセシングを排除するために、欠失され得るか、または別の残基で置換され得る。このような変異の１つの可能な結果は、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドが切断されず、そして細胞表面から遊離されないことである。
【０３２１】
特定の実施形態において、配列番号２に示されるニュートロカイン−α配列のＬｙｓ−１３２および／またはＡｒｇ−１３３は、ニュートロカイン−αを発現する細胞からの可溶性形態のニュートロカインαの遊離を妨害または低減するために、別のアミノ酸残基へと変異されるか、またはともに欠失される。より特定の実施形態において、配列番号２に示されるニュートロカイン−α配列のＬｙｓ−１３２は、Ａｌａ−１３２へと変異される。別の排他的でない特定の実施形態において、配列番号２に示されるニュートロカイン−α配列のＡｒｇ−１３３は、Ａｌａ−１３３へと変異される。これらの変異したタンパク質、および／またはこれらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、操作された細胞の表面上に保持されるニュートロカイン−αポリペプチドを発現する細胞を操作するために、例えば、エキソビボ治療または遺伝子治療のような用途を有する。
【０３２２】
特定の実施形態において、配列番号２に示されるニュートロカイン−α配列のＣｙｓ−１４６は、発現系（特に、実施例１に記載されるような）にて発現される場合に、例えば、変異体ニュートロカイン−αポリペプチドのオリゴマー化を妨害または低減するのを補助するために、別のアミノ酸残基へと変異されるか、またはともに欠失される。特定の実施形態において、Ｃｙｓ−１４６は、セリンアミノ酸残基で置換される。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明により包含される。
【０３２３】
別の特定の実施形態において、配列番号２に示されるニュートロカイン−α配列のＣｙｓ−２３２は、発現系（特に、実施例１に記載されるような）にて発現される場合に、例えば、変異体ニュートロカイン−αポリペプチドのオリゴマー化を妨害または低減するのを補助するために、別のアミノ酸残基へと変異されるか、またはともに欠失される。特定の実施形態において、Ｃｙｓ−２３２は、セリンアミノ酸残基で置換される。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明により包含される。
【０３２４】
なお別の実施形態において、配列番号２に示されるニュートロカイン−α配列のＣｙｓ−２４５は、発現系（特に、実施例１に記載されるような）にて発現される場合に、例えば、変異体ニュートロカイン−αポリペプチドのオリゴマー化を妨害または低減するのを補助するために、別のアミノ酸残基へと変異されるか、またはともに欠失される。特定の実施形態において、Ｃｙｓ−２４５は、セリンアミノ酸残基で置換される。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明により包含される。
【０３２５】
本発明のポリペプチドは、好ましくは、単離形態で提供され、そして好ましくは実質的に精製されている。ニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの組換え産生型は、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０（１９８８）に記載されるような一工程の方法によって実質的に精製され得る。
【０３２６】
本発明のポリペプチドは、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドの細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞外ドメインを含む、寄託されたｃＤＮＡ（ＡＴＣＣ受託番号９７７６８）によってコードされる完全なポリペプチド；寄託されたｃＤＮＡによりコードされる成熟可溶性ポリペプチド；このタンパク質の細胞内ドメインおよび膜貫通ドメインを引いた細胞外ドメイン；図１Ａおよび１Ｂの完全なポリペプチド（配列番号２のアミノ酸１〜２８５）；図１Ａおよび１Ｂの成熟可溶性ポリペプチド（配列番号２のアミノ酸１３４〜２８５）；細胞内ドメインおよび膜貫通ドメインを引いた図１Ａおよび１Ｂの細胞外ドメイン（配列番号２のアミノ酸残基７３〜２８５）；ならびに上記のポリペプチドと少なくとも８０％、８５％、９０％の類似性、より好ましくは少なくとも９５％の類似性、そしてなおより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の類似性を有するポリペプチドを含む。
【０３２７】
本発明のポリペプチドはまた、寄託されたｃＤＮＡ（ＡＴＣＣ受託番号２０３５１８）によってコードされるポリペプチドの細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞外ドメインを含む、寄託されたｃＤＮＡによってコードされる完全なポリペプチド；この寄託されたｃＤＮＡによりコードされる成熟可溶性ポリペプチド；このタンパク質の細胞内ドメインおよび膜貫通ドメインを引いた細胞外ドメイン；図５Ａおよび５Ｂの完全なポリペプチド（配列番号１９のアミノ酸残基１〜２６６）；細胞内ドメインおよび膜貫通ドメインを引いた図５Ａおよび５Ｂの細胞外ドメイン（配列番号１９のアミノ酸残基７３〜２６６）；ならびに上記のポリペプチドと少なくとも８０％、８５％、９０％の類似性、より好ましくは少なくとも９５％の類似性、そしてなおより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の類似性を有するポリペプチドを含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明により包含される。
【０３２８】
本発明のさらなるポリペプチドは、寄託されたｃＤＮＡ（ＡＴＣＣ受託番号９７７６８）によってコードされるポリペプチドまたは図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）のポリペプチドと、少なくとも８０％または少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％または９５％同一、さらにより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチドを含み、そしてまた、少なくとも３０アミノ酸、およびより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を有するこのようなポリペプチドの部分を含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に包含される。
【０３２９】
本発明のさらなるポリペプチドは、寄託されたｃＤＮＡ（ＡＴＣＣ受託番号２０３５１８）によってコードされるポリペプチドまたは図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１９）のポリペプチドと、少なくとも８０％または少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％または９５％同一、さらにより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチドを含み、そしてまた、少なくとも３０アミノ酸、およびより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を有するこのようなポリペプチドの部分を含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明により包含される。
【０３３０】
２つのポリペプチドについての「類似性％」によって、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１）および類似性を決定するためのデフォールト設定を用いてその２つのポリペプチドのアミノ酸配列を比較することによって生じる、類似性の値が意図される。Ｂｅｓｔｆｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１））の局所的相同性アルゴリズムを、２つの配列間の類似性の最適のセグメントを見出すために使用する。
【０３３１】
ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの参照アミノ酸配列に少なくとも、例えば、９５％「同一な」アミノ酸配列を有するポリペプチドにより、そのポリペプチド配列がニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの参照アミノ酸配列の各１００アミノ酸毎に５つまでのアミノ酸変化を含み得ることを除いて、そのポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列と同一であることが意図される。言い換えれば、参照アミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、その参照配列において５％までのアミノ酸残基が、欠失され得るか、もしくは別のアミノ酸で置換され得るか、またはその参照配列における総アミノ酸残基の５％までの数のアミノ酸が、その参照配列に挿入され得る。これらの参照配列の改変は、その参照アミノ酸配列のアミノ末端位置もしくはカルボキシ末端位置でかまたはそれらの末端位置の間のいずこかで、その参照配列の残基間で個々にかもしくはその参照配列内で１つ以上の連続したグループとしてのいずれかで分散して、起こり得る。
【０３３２】
実際には、任意の特定のポリペプチドが、例えば、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）に示されるアミノ酸配列、寄託されたｃＤＮＡクローンＨＮＥＤＵ１５（ＡＴＣＣ受託番号９７７６８）によりコードされるアミノ酸配列もしくはそのフラグメント、または例えば、図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１９）に示されるアミノ酸配列、寄託されたｃＤＮＡクローンＨＤＰＭＣ５２（ＡＴＣＣ受託番号２０３５１８）によりコードされるアミノ酸配列もしくは例えばそのフラグメントと、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるかどうかは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１）のような公知のコンピュータープログラムを使用して慣習的に決定され得る。特定の配列が、例えば、本発明の参照配列と９５％同一であるかどうかを決定するために、Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを使用する場合、当然、同一性のパーセンテージがその参照アミノ酸配列の全長にわたって計算され、そしてその参照配列内のアミノ酸残基の総数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように、パラメーターが設定される。
【０３３３】
特定の実施形態において、参照（照会）配列（本発明の配列）と対象配列との間の同一性（全体的配列整列ともいわれる）は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定される。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸整列において使用される好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ  ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ
Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ＝配列の長さ、Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ＝５００または対象アミノ酸配列の長さ（どちらかより短い方）である。この実施形態によると、その対象配列が、Ｎ末端またはＣ末端欠失により（内部の欠失のためではなく）照会配列よりも短い場合、このＦＡＳＴＤＢプログラムが、全体的な同一性パーセントを算定する場合に、その対象配列のＮ末端切断およびＣ末端切断を考慮しないという事実を考慮するために、手動の補正が結果に対してなされる。Ｎ末端およびＣ末端で短縮されている対象配列について、照会配列に対して、同一性パーセントは、対応する対象残基と一致／整列しない、対象配列のＮ末端およびＣ末端である照会配列の残基の数をその照会配列の総塩基のパーセントとして計算することによって補正される。残基が一致／整列されているか否かは、そのＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパーセントが、上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって特定のパラメーターを使用して計算された同一性パーセントから差し引かれ、最終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この最終的な同一性パーセントのスコアが、本発明の目的で使用されるものである。照会配列と一致／整列していない対象配列のＮ末端およびＣ末端側の残基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的のために考慮される。すなわち、対象配列の最も遠いＮ末端およびＣ末端残基の外側の照会残基の位置のみである。例えば、９０アミノ酸残基の対象配列が、同一性パーセントを決定するために１００残基の照会配列と整列される。欠失が対象配列のＮ末端で生じ、そしてそれゆえＦＡＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端の最初の１０残基の一致／整列を示さない。１０個の不対合残基は、その配列の１０％（一致していないＮ末端およびＣ末端の残基の数／照会配列中の残基の総数）を表し、その結果ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのスコアから１０％が差し引かれる。残りの９０残基が完全に一致した場合、最終的な同一性パーセントは９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、１００残基の照会配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、そのため照会配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端またはＣ末端の残基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは、手動で補正されない。再び、ＦＡＳＴＤＢ整列において示される、照会配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端およびＣ末端の外側の残基位置のみが手動で補正される。他の手動の補正は、本実施形態の目的のためにはなされない。
【０３３４】
本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルまたは分子ふるいゲル濾過カラムにおいて分子量マーカーとしての使用を含むが、これらに限定されない用途を有する。さらに、下記に詳細に記載するように、本発明のポリペプチドはまた、下記のようにニュートロカインαおよび／またはニュートロカイン−αＳＶタンパク質の発現を検出するためのアッセイにおいて有用であるか、またはニュートロカインαおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの機能を増強もしくは阻害し得るアゴニストおよびアンタゴニストとして有用である、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を惹起するための使用を含むがこれらに限定されない、用途を有する。本発明のポリペプチドはまた、本明細書中に記載のような治療用途も有する。さらに、このようなポリペプチドは、本発明の候補アゴニストおよびアンタゴニストでもあるニュートロカインαおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの結合タンパク質を「捕獲する」ための酵母ツーハイブリッドシステムにおいて使用され得る。この酵母ツーハイブリッドシステムは、ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−２４６（１９８９）に記載されている。
【０３３５】
（導入遺伝子および「ノックアウト」）
本発明のポリペプチドはまた、トランスジェニック動物中で発現され得る。任意の種（マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ミクロピッグ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ヤギ、ヒツジ、ウシ、および非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、サル、およびチンパンジー）を含むがこれらに限定されない）が、トランスジェニック動物を作製するために使用され得る。特定の実施形態において、本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野公知の技術が、遺伝子治療プロトコルの一部として、ヒトにおいて本発明のポリペプチドを発現するために使用される。
【０３３６】
当該分野で公知の任意の技術が、導入遺伝子（すなわち、本発明のポリヌクレオチド）を動物に導入して、トランスジェニック動物の創始系統を作製するために使用され得る。このような技術としては、前核マイクロインジェクション（Ｐａｔｅｒｓｏｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０：６９１−６９８（１９９４）；Ｃａｒｖｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１１：１２６３−１２７０（１９９３）；Ｗｒｉｇｈｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：８３０−８３４（１９９１）；およびＨｏｐｐｅら、米国特許第４，８７３，１９１号（１９８９））；生殖系列へのレトロウイルス媒介遺伝子移入（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：６１４８−６１５２（１９８５））、胚盤胞または胚へのレトロウイルス媒介遺伝子移入；胚性幹細胞における遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ５６：３１３−３２１（１９８９））；細胞または胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ、１９８３、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３−１８１４（１９８３））；遺伝子銃を用いた（例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５（１９９３）を参照のこと）本発明のポリヌクレオチドの導入；胚性多能性幹細胞への核酸構築物の導入および胚盤胞へのこの幹細胞の再移入；ならびに精子媒介遺伝子移入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、Ｃｅｌｌ  ５７：７１７−７２３（１９８９））；などを含むがこれらに限定されない。このような技術の総説については、本明細書中にその全体が参考として援用される、Ｇｏｒｄｏｎ、「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌｓ」、Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７１−２２９（１９８９）を参照のこと。また、米国特許第５，４６４，７６４号（Ｃａｐｅｃｃｈｉら、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−Ｎａｇａｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｖｅｃｔｏｒｓ）；米国特許第５，６３１，１５３号（Ｃａｐｅｃｃｈｉら、Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｎｏｎ−Ｈｕｍａｎ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｍａｋｉｎｇ  Ｓａｍｅ）；米国特許第４，８７３，８６６号（Ｌｅｄｅｒら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｎｏｎ−Ｈｕｍａｎ  Ａｎｉｍａｌｓ）；ならびに米国特許第４，８７３，１９１号（Ｗａｇｎｅｒら、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｚｙｇｏｔｅｓ）（これらの各々は、その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。
【０３３７】
当該分野で公知の任意の技術が、本発明のポリヌクレオチドを含むトランスジェニッククローンを作製するために使用され得、そのような技術は、例えば、徐核した卵母細胞への、休止期に誘導された培養した、胚性（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ）細胞由来の核、胎児細胞由来の核または成体細胞由来の核の、核移入である（Ｃａｍｐｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：６４〜６６（１９９６）；Ｗｉｌｍｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：８１０〜８１３（１９９７））。
【０３３８】
本発明は、その全ての細胞に導入遺伝子を有するトランスジェニック動物、ならびにいくつかの細胞（しかしその全ての細胞ではない）に導入遺伝子を有する動物（すなわち、モザイクまたはキメラ動物）を提供する。導入遺伝子は、１つの導入遺伝子としてまたはコンカテマー（例えば、頭−頭タンデム型または頭−尾タンデム型）のような複数のコピーとして組み込まれ得る。この導入遺伝子はまた、例えば、Ｌａｓｋｏらの教示（Ｌａｓｋｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６２３２−６２３６（１９９２））に従って特定の細胞型に選択的に導入され得、そして活性化され得る。このような細胞型特異的活性化に必要とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれらは当業者に明らかである。ポリヌクレオチド導入遺伝子が、内在性遺伝子の染色体部位に組み込まれることが所望される場合、遺伝子の標的化が好ましい。手短に言えば、このような技術が利用される場合、内在性遺伝子に対して相同ないくつかのヌクレオチド配列を含むベクターが、染色体配列との相同な組換えを介して内在性遺伝子のヌクレオチド配列に組み込まれ、そのヌクレオチド配列の機能を破壊することを目的として設計される。導入遺伝子はまた、特定の細胞型に選択的に導入され得、従って、例えば、Ｇｕら（Ｇｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：１０３−１０６（１９９４））の教示に従って、導入された細胞型においてのみ内在性遺伝子が不活化される。そのような細胞型特異的不活化に必要とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれらは当業者に明らかである。本発明のポリペプチドのトランスジェニック動物における、遍在または組織特異的な様式での発現に加えて、種々の他の手段によってこのポリペプチドの発現を調節する（例えば、発生的または化学的に調節された発現）構築物を作製することはまた、当業者に慣用である。
【０３３９】
一旦トランスジェニック動物が作製されると、その組換え遺伝子の発現は、標準的な技術を利用してアッセイされ得る。最初のスクリーニングは、サザンブロット分析またはＰＣＲ技術によって達成されて、導入遺伝子の組み込みが起きたことを動物組織の分析により確認し得る。トランスジェニック動物の組織における導入遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルはまた、動物から得た組織サンプルのノーザンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析、逆転写酵素ＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）；およびＴａｑＭａｎ  ＰＣＲを含むがこれらに限定されない技術を用いて評価され得る。トランスジェニック遺伝子発現組織のサンプルはまた、導入遺伝子産物に特異的な抗体を用いて免疫細胞化学的または免疫組織化学的に評価され得る。
【０３４０】
一旦、創始動物が生成されると、それらは、交配され、同系交配され、異系交配されるかまたは交雑されて、特定の動物のコロニーを生成し得る。そのような交配戦略の例は、以下を含むがこれらに限定されない：別の系統を樹立するための１つより多くの組み込み部位を有する創始動物の異系交配；各導入遺伝子の相加的発現効果によって、より高いレベルで導入遺伝子を発現する複合トランスジェニックを生成するための別々の系統の同系交配；発現の増強およびＤＮＡ分析による動物のスクリーニングの必要性の排除の両方のための、所定の組み込み部位に対してホモ接合性の動物を生成するヘテロ接合性トランスジェニック動物の交雑；複合ヘテロ接合性またはホモ接合性系統を生成するための別々のホモ接合系統の交雑；目的の実験モデルに適切な異なるバックグラウンド上に導入遺伝子を配置するための交配；ならびに、異なる導入遺伝子またはノックアウト変異を保有する他の動物へのトランスジェニック動物の交配。
【０３４１】
本発明のトランスジェニックおよび「ノックアウト」動物は、Ｎｅｕｔｒｏｋｉｎｅ−αおよび／またはＮｅｕｔｒｏｋｉｎｅ−αＳＶポリペプチドの生物学的機能の詳述、異常なＮｅｕｔｒｏｋｉｎｅ−αおよび／またはＮｅｕｔｒｏｋｉｎｅ−αＳＶ発現に関連する状態および／または障害の研究、ならびにこのような状態および／または障害の改善に有効な化合物についてのスクリーニングに有用な動物モデル系を含むがこれらに限定されない用途を有する。
【０３４２】
本発明のさらなる実施形態において、本発明のポリペプチドを発現するために遺伝子操作される細胞、あるいは本発明のポリペプチドを発現しないように遺伝子操作された細胞（例えば、ノックアウト）を、インビボで患者に投与する。このような細胞は、患者（すなわち、ヒトを含む動物）またはＭＨＣ適合性ドナーから入手され得、そして線維芽細胞、骨髄細胞、血球（例えば、リンパ球）、脂肪細胞、筋細胞、内皮細胞などを含み得るが、それらに限定されない。この細胞を、例えば、形質導入（ウイルスベクターおよび好ましくは細胞ゲノム中に導入遺伝子を組み込むベクターを使用する）、またはトランスフェクション手順（プラスミド、コスミド、ＹＡＣ、裸のＤＮＡ、エレクトロポレーション、リポソームなどの使用を含むが、これらに限定されない）によって、細胞中に本発明のポリペプチドのコード配列を導入するために、あるいはこのコード配列および／または本発明のポリペプチドに結合している内因性の調節配列を破壊するために、組換えＤＮＡ技術を使用してインビトロで遺伝子操作する。本発明のポリペプチドのコード配列を強力な構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターまたはプロモーター／エンハンサーの制御下に配置し、本発明のポリペプチドの発現および好ましくは分泌を達成し得る。本発明のポリペプチドを発現および好ましくは分泌する操作した細胞を、例えば、循環中において、または腹腔内で患者中へ全身的に導入し得る。
【０３４３】
あるいは、この細胞をマトリックスに組み込み得、そして身体に移植し得る（例えば、遺伝子操作した線維芽細胞を皮膚移植片の一部として移植し得る）；遺伝子操作した内皮細胞をリンパ移植片または脈管移植片の一部として移植し得る（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４９号ならびにＭｕｌｌｉｇａｎおよびＷｉｌｓｏｎ、米国特許第５，４６０，９５９号を参照のこと。これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。
【０３４４】
投与される細胞が非自己または非ＭＨＣ適合性細胞である場合、それらを、この導入細胞に対する宿主免疫応答の発生を妨害する周知の技術を使用して投与し得る。例えば、この細胞をカプセル性の形態で導入し得、この形態は、構成成分と即時の細胞外環境との交換を可能にしつつ、導入細胞が宿主免疫系によって認識されることを可能にしない。
【０３４５】
（抗体）
さらに、本発明のポリペプチドは、（特異的な抗体抗原結合をアッセイするための当該分野で周知のイムノアッセイによって決定されるような）本発明の、ポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、または配列番号２および／もしくは配列番号１９の改変体、および／またはエピトープに免疫特異的に結合する抗体およびＴ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）に関する。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを含むが、限定されない。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子および免疫グロリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、免疫特異的に抗原に結合する抗原結合部位を含む分子をいう。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）または任意のサブクラスであり得る。免疫グロブリンは、重鎖および軽鎖の両方を有し得る。ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ重鎖のアレイは、κ型またはλ型の軽鎖と対であり得る。
【０３４６】
最も好ましくは、この抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり、これには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）ならびにＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメントが挙げられるがこれらに限定されない。単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を単独で、または以下の全体もしくは部分と組み合わせて含み得る：ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン。また、可変領域とヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインとの任意の組み合わせもまた含む抗原結合フラグメントがまた本発明に含まれる。本発明の抗体は、鳥類および哺乳動物を含む任意の動物起点由来であり得る。好ましくは、この抗体は、ヒト、ネズミ（ｍｕｒｉｎｅ）（例えば、マウスおよびウサギ）、ロバ、シップウサギ（ｓｈｉｐ  ｒａｂｂｉｔ）、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリである。本明細書中で使用される場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、そしてヒト免疫グロブリンライブラリーまたは１つ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックであり、そして内因性免疫グロブリンを発現しない動物から単離さた抗体（下に記載のように、そして例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号において記載のような）を含む。
【０３４７】
本発明の抗体は、一重特異的、二重特異的、三重特異的またはより多くの多重特異性の抗体であり得る。多重特異的な抗体は、本発明のポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的であり得るか、または本発明のポリペプチドおよび異種のエピトープ（例えば、異種ポリペプチドもしくは固体支持体物質）、の両方に特異的であり得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ  ９３／１７７１５；同ＷＯ  ９２／０８８０２；同ＷＯ  ９１／００３６０；同ＷＯ  ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第４，４７４，８９３号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号、同第５，５７３，９２０号、同第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。
【０３４８】
本発明の抗体は、これらが認識または特異的に結合する、本発明のポリペプチドのエピトープまたは部分に関して記載または特定化され得る。このエピトープまたはポリペプチドの部分は、例えば、Ｎ末端およびＣ末端位置によって、連続するアミノ酸残基におけるサイズによって本明細書中に記載されるように、または表および図に列挙されるように、特定化され得る。本発明の任意のエピトープまたはポリペプチドに特異的に結合する抗体はまた、排除され得る。従って、本発明は、本発明のポリペプチドを特異的に結合し、そして本発明のポリペプチドの排除を可能にする抗体を含む。
【０３４９】
特定の実施形態において、本発明の抗体は、配列番号２のアミノ酸配列のＰｈｅ−１１５〜Ｌｅｕ−１４７、Ｉｌｅ−１５０〜Ｔｙｒ−１６３、Ｓｅｒ−１７１〜Ｐｈｅ−１９４、Ｇｌｕ−２２３〜Ｔｙｒ−２４６、およびＳｅｒ−２７１〜Ｐｈｅ−２７８を含むポリペプチドに結合する。別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、配列番号２のアミノ酸配列のＰｈｅ−１１５〜Ｌｅｕ−１４７、Ｉｌｅ−１５０〜Ｔｙｒ−１６３、Ｓｅｒ−１７１〜Ｐｈｅ−１９４、Ｇｌｕ−２２３〜Ｔｙｒ−２４６、およびＳｅｒ−２７１〜Ｐｈｅ−２７８からなるポリペプチドに結合する。好ましい実施形態において、本発明の抗体は、配列番号２のＧｌｕ−２２３〜Ｔｙｒ−２４６を含むポリペプチドに結合する。別の好ましい実施形態において、本発明の抗体は、配列番号２のＧｌｕ−２２３〜Ｔｙｒ−２４６からなるポリペプチドに結合する。より好ましい実施形態において、本発明の抗体は、配列番号２のＰｈｅ−２３０〜Ａｓｎ−２４２からなるポリペプチドに結合する。さらに好ましい非排他的な実施形態において、本発明の抗体は、特定の結合を介して本発明のＮｅｕｔｒｏｋｉｎｅ−αおよび／またはＮｅｕｔｒｏｋｉｎｅ−αＳＶポリペプチドの１つ以上の生物学的活性を阻害する。より好ましい実施形態において、本発明の抗体は、Ｎｅｕｔｒｏｋｉｎｅ−αおよび／またはＮｅｕｔｒｏｋｉｎｅ−αＳＶ媒介Ｂ細胞増殖を阻害する。
【０３５０】
本発明の抗体はまた、その交差反応性について記載または特定化され得る。本発明のポリペプチドの任意の他のアナログ、オルソログまたはホモログを結合しない抗体が、含まれる。本発明のポリペプチドに対して少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％および少なくとも５０％の同一性（当該分野で公知の方法および本明細書中に記載される方法を用いて計算されるように）を有するポリペプチドを結合する抗体もまた、本発明に含まれる。特定の実施形態において、本発明の抗体は、ヒトタンパク質の、マウスホモログ、ラットホモログおよび／またはウサギホモログならびに対応するそれらのエピトープと交差反応する。本発明のポリペプチドに対して９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満および５０％未満の同一性（当該分野で公知の方法および本明細書中に記載される方法を用いて計算されるように）を有するポリペプチドを結合しない抗体もまた、本発明に含まれる。特定の実施形態において、上記の交差反応性は、本明細書中に開示された、任意の単一特異的な抗原性または免疫原性ポリペプチド、あるいは２、３、４、５以上の特異的抗原性および／または免疫原生ポリペプチドの組み合わせに関する。さらに、ハイブリダイゼーション条件下（本明細書中で記載されるような）で本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを結合する抗体が、本発明に含まれる。本発明の抗体はまた、本発明のポリペプチドに対するそれらの結合親和性について記載または特定化され得る。好ましい結合親和性としては、５×１０-5Ｍ未満、１０-5Ｍ未満、５×１０-6Ｍ未満、１０-6Ｍ未満、５×１０-7Ｍ未満、１０-7Ｍ未満、５×１０-8Ｍ未満、１０-8Ｍ未満、５×１０-9Ｍ未満、１０-9Ｍ未満、５×１０-10Ｍ未満、１０-10Ｍ未満、５×１０-11Ｍ未満、１０-11Ｍ未満、５×１０-12Ｍ未満、１０-12Ｍ未満、５×１０-13Ｍ未満、１０-13Ｍ未満、５×１０-14Ｍ未満、１０-14Ｍ未満、５×１０-15Ｍ未満または１０-15Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを有する親和性が挙げられる。
【０３５１】
本発明はまた、競合性結合を決定するための当該分野で公知の任意の方法（例えば、本明細書中で記載されるイムノアッセイ）によって決定されるような、本発明のエピトープに対する抗体の結合を競合的に阻害する抗体を提供する。好ましい実施形態において、この抗体は、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％、エピトープへの結合を競合的に阻害する。
【０３５２】
本発明の抗体は、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用し得る。例えば、本発明は、本発明のポリペプチドとのレセプター／リガンド相互作用を部分的または完全にのいずれかで破壊する抗体を含む。好ましくは、本発明の抗体は、本明細書中で開示された抗原性エピトープ、またはその部分を結合する。本発明は、レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の両方の特徴を有する。本発明はまた、リガンド結合を妨害しないがレセプター活性化を妨害するレセプター特異的抗体の特徴を有する。レセプター活性化（すなわち、シグナル伝達）は、本明細書中に記載の技術、そうでなければ、当該分野で公知の技術により決定され得る。例えば、レセプター活性化は、レセプターのリン酸化（例えば、チロシンまたはセリン／トレオニン）、または免疫沈降それに続くウェスタンブロット分析（例えば、上記のような）によってその基質を検出することにより、決定され得る。特定の実施形態において、この抗体の非存在下で、リガンド活性またはレセプター活性を、その活性の少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％阻害する抗体が提供される。
【０３５３】
本発明はまた、リガンド結合およびレセプター活性化の両方を妨げるレセプター特異的抗体、ならびにレセプターリガンド複合体を認識し、そして好ましくは、結合していないレセプターまたは結合していないリガンドを特異的に認識しない抗体の特徴を有する。同様に、本発明は、リガンドと結合し、そしてレセプターへのリガンドの結合を妨げる中和抗体、およびリガントと結合し、それによりレセプター活性化を妨げるが、リガンドがレセプターを結合することを妨げない抗体を含む。さらに、本発明は、レセプターを活性化する抗体を含む。これらの抗体は、レセプターアゴニストとして作用し得、すなわち、例えば、レセプターの二量化を誘発することによってリガンド媒介レセプター活性化の生物学的活性化の全てまたはサブセットのいずれかを増強するかまたは活性化し得る。この抗体は、本明細書中に開示される本発明のペプチドの特異的生物学的活性を含む生物学的活性についてのアゴニスト、アンタゴニストまたは逆アゴニストとして特定化され得る。上記抗体アゴニストは、当該分野で公知の方法を用いて作製され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／４０２８１；米国特許第５，８１１，０９７号；Ｄｅｎｇら、Ｂｌｏｏｄ  ９２（６）：１９８１−１９８８（１９９８）；Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６８−３６７８（１９９８）；Ｈａｒｒｏｐら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８６−１７９４（１９９８）；Ｚｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ：５８（１５）：３２０９−３２１４（１９９８）；Ｙｏｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（７）：３１７０−３１７９（１９９８）；Ｐｒａｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１１（Ｐｔ２）：２３７−２４７（１９９８）；Ｐｉｔａｒｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０５（２）：１７７−１９０（１９９７）；Ｌｉａｕｔａｒｄら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ９（４）：２３３−２４１（１９９７）；Ｃａｒｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１２９５−１１３０１（１９９７）；Ｔａｒｙｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ  １４（４）：７５５−７６２（１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ６（９）：１１５３−１１６７（１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ８（１）：１４−２０（１９９６）（これらは全て、その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。
【０３５４】
本発明の抗体は、例えば、これらに限定されないが、本発明のポリペプチドを精製し、検出し、そして標的化するために使用され得る。これらは、インビトロおよびインビボの両方での診断方法および治療方法を含む。例えば、この抗体は、生物学的サンプルにおける本発明のポリペプチドのレベルを定性的におよび定量的に測定するためのイムノアッセイにおける使用を有す。例えば、Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，第２版，１９８８）（本明細書中でその全体が参照として援用される）を参照のこと。
【０３５５】
以下にさらに詳細に議論されるように、本発明の抗体は、単独または他の化合物との組み合わせのいずれかで使用され得る。この抗体はさらに、ポリペプチドまたは他の化合物へＮ末端でもしくはＣ末端で異種ポリペプチドに組換え的に融合され得るか、または化学的に結合（共有結合および非共有結合を含む）され得る。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な分子および異種ポリペプチド、薬剤、放射性核種、または毒素のようなエフェクター分子へ組換え的に融合または結合され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；および欧州特許第３９６，３８７号を参照のこと。
【０３５６】
本発明の抗体は、改変された（すなわち、共有結合性付着（ｃｏｖａｌｅｎｔ
ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）が、抗体が抗イディオタイプ応答を産生するのを妨げないような、抗体に対する任意の型の分子の共有結合性付着による）誘導体を含む。例えば、制限されないが、抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ぺグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｉｏｎ）、アミド化、既知の保護基／ブロック基（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質への連結などによって改変された抗体が挙げられる。多数の任意の化学的改変が、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などを含むが、これらに制限されない公知の技術によって実行され得る。さらに、誘導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含み得る。
【０３５７】
本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって産生され得る。目的の抗原に対するポリクローナル抗体は、当該分野で周知の種々の手順によって産生され得る。例えば、本発明のポリペプチドが種々の宿主動物（ウサギ、マウス、ラットなどを含むがこれらに限定されない）に投与されて、抗原に対して特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導し得る。種々のアジュバントが、宿主種に依存して、免疫学的応答を増加させるために使用され得、そしてフロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル（ｍｉｎｅｒａｌ  ｇｅｌ）、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）およびｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍのような潜在的に有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない。このようなアジュバントはまた、当該分野で周知である。
【０３５８】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当該分野で公知の広範な種々の技術を用いて調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当該分野で公知の以下に挙げられるハイブリドーマ技術を使用して産生され得、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．１９８１）（上記の参考文献は、その全体が参考として援用される）に教示される。本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ技術を通して生成された抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体をいい、そしてそれが生成される方法に由来する抗体ではない。
【０３５９】
「モノクローナル抗体」は、２つのタンパク質（すなわち、重鎖および軽鎖）を含み得るかまたはこれらからなり得る。
【０３６０】
ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を産生およびスクリーニングする方法は、当該分野で慣用的かつ周知であり、そして実施例に詳細に議論される（例えば、実施例９）。非限定的な実施例において、マウスは、本発明のポリペプチドまたはそのようなペプチドを発現する細胞を用いて免疫され得る。一旦免疫応用が検出される（例えば、抗原に特異的な抗体がマウスの血清中に検出される）と、マウスの脾臓を収集しそして脾細胞を単離する。次に、その脾細胞を周知の技術によって任意の適切な骨髄腫細胞（例えば、ＡＴＣＣから入手可能な細胞株ＳＰ２０由来の細胞）に融合させる。ハイブリドーマを限界希釈によって選択およびクローン化する。次に、ハイブリドーマクローンを、本発明のポリペプチドに結合し得る抗体を分泌する細胞について、当該分野で公知の方法によってアッセイする。一般的に高いレベルの抗体を含む腹水（ａｓｃｉｔｅｓ  ｆｌｕｉｄ）が、陽性ハイブリドーマクローンを用いてマウスを免疫させることによって、産生され得る。
【０３６１】
従って、本発明は、モノクローナル抗体および本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養する工程を包含する方法によって産生される抗体を、生成する方法を提供し、ここで、好ましくは、このハイブリドーマは、骨髄腫細胞と本発明の抗原で免疫したマウスから単離された脾細胞とを融合させ、次いで本発明のポリペプチドと結合し得る抗体を分泌するハイブリドーマクローンについて、融合物から生じるハイブリドーマをスクリーニングすることによって生成される。
【０３６２】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術によって生成され得る。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、（Ｆａｂフラグメントを生成するために）パパインまたは（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生するために）ペプシンのような酵素を使用して、免疫グロブリン分子のタンパク質分解切断によって産生され得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。
【０３６３】
例えば、本発明の抗体はまた、当該分野で公知の種々のファージディスプレイ方法を用いて産生され得る。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面に提示される。特定の実施形態において、そのようなファージは、レパートリー（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）またはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現される抗原結合ドメインを提示するために利用され得る。目的の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて選択または同定され得る（例えば、標識した抗原あるいは固体表面またはビーズに結合または捕捉された抗原を使用する）。これらの方法において用いられるファージは、代表的には、ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質またはファージ遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換え的に融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化されたＦｖの抗体ドメインを有するファージから発現されたｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む糸状ファージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ
ｐｈａｇｅ）である。本発明の抗体を作製するために用いられ得るファージディスプレイ方法の例としては、以下に開示される方法が挙げられる：Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ  １８７  ９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７：１９１−２８０（１９９４）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公開ＷＯ  ９０／０２８０９；ＷＯ  ９１／１０７３７；ＷＯ  ９２／０１０４７；ＷＯ  ９２／１８６１９；ＷＯ  ９３／１１２３６；ＷＯ  ９５／１５９８２；ＷＯ  ９５／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，７３３，７４３号および同第５，９６９，１０８号（これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。
【０３６４】
上記参考文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体をコードする領域は、ヒト抗体を含む抗体の全体または任意の他の所望の抗原結合フラグメントを生成するために単離されかつ用いられ得、そして例えば、以下に詳細が記載されるように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含む任意の所望の宿主において発現され得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換え的に産生するための技術はまた、当該分野で公知の方法を用いて使用され得、このような方法は、以下に開示される：ＰＣＴ公開ＷＯ  ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およびＳａｗａｉら、ＡＪＲＩ  ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３（１９９８）（これらの参考文献は、その全体が参考として援用される）。
【０３６５】
単鎖のＦｖｓおよび抗体を産生するために用いられ得る技術の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：４６−８８（１９９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ  ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；およびＳｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボの使用およびインビトロ検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体の使用が好ましくあり得る。キメラ抗体とは、抗体の異なる部分が、異なる動物種に由来する分子（例えば、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体）である。キメラ抗体を産生するための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２；米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６３９７号を参照のこと（これらはそれらの全体が、参考として本明細書中に援用される）。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望された抗原に結合する非ヒト種抗体由来の抗体分子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域内のフレームワーク残基（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｓｉｄｕｅ）は、抗原結合を変化させるため（好ましくは改善させるために）ＣＤＲドナー抗体由来の対応残基と置換される。これらフレームワークの置換は、当該分野で周知の方法によって同定され、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用のモデリング、ならびに特定の位置における異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較による。（例えば、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）を参照のこと（これらはそれらの全体が参考として本明細書中に援用される）。）抗体は、以下を含む当該分野で公知の種々の技術を用いてヒト化され得る：例えば、ＣＤＲ−移植（欧州特許第２３９，４００号；ＰＣＴ公開ＷＯ  ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号）、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号；同第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）；  Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ  ９１：９６９−９７３（１９９４））、およびチェーンシャッフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）。
【０３６６】
完全なヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置に対して特に所望される。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いた上記のファージディスプレイ法を含む当該分野で公知の種々の方法により作製され得る。米国特許第４，４４４，８８７号および同第４，７１６，１１１号；ならびにＰＣＴ公開ＷＯ  ９８／４６６４５、ＷＯ  ９８／５０４３３、ＷＯ  ９８／２４８９３、ＷＯ  ９８／１６６５４、ＷＯ  ９６／３４０９６、ＷＯ  ９６／３３７３５、およびＷＯ  ９１／１０７４１；（これらの各々はその全体が参考として本明細書中に援用される）もまた参照のこと。
【０３６７】
ヒト抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンの発現は出来ないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを用いて産生され得る。例えば、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子およびヒト軽鎖免疫グロブリン遺伝子の複合体は、無作為にまたは相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導入され得る。あるいは、ヒト可変領域、定常領域および多様性領域（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｒｅｇｉｏｎ）は、ヒト重鎖遺伝子およびヒト軽鎖遺伝子に加えて、マウスの胚性幹細胞に導入され得る。マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子およびマウス軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン座の導入と別々にまたは同時に非機能的にされ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合性の欠失は、内因性抗体の産生を妨げる。改変された胚性幹細胞を拡張させ、そしてキメラマウスを産生するために胚盤胞中に微量注入する。次いで、キメラマウスを、ヒト抗体を発現するホモ接合性の子孫を産生するために繁殖させる。トランスジェニックマウスを、選択された抗原（例えば、本発明のポリペプチドの全体または部分）を用いて通常の様式で免疫する。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を用いた免疫したトランスジェニックマウスから得られ得る。トランスジェニックマウスに保持されたヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化の間に再編成し、そしてその後、クラススイッチングおよび体細胞変異を受ける。従って、そのような技術の使用によって、治療的に有用なＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体およびＩｇＥ抗体の産生が可能である。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概要については、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術のならびにそのような抗体を産生するためのプロトコールの詳細な議論については、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；欧州特許第０  ５９８  ８７７；米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８８５，７９３号；同第５，９１６，７７１号；および同第５，９３９，５９８号を参照のこと（これらはその全体が本明細書中に参考として援用される）。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）およびＧｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のような企業は、上記の技術に類似した技術を用いて選択された抗原に対するヒト抗体を提供することに従事し得る。
【０３６８】
選択されたエピトープを完全に認識するヒト抗体を、「ガイドされた（ｇｕｉｄｅｄ）選択」といわれる技術を用いて産生し得る。このアプローチにおいて、選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）は、同じエピトープを完全に認識するヒト抗体の選択を導くために使用される。（Ｊｅｓｐｅｒｓら、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９−９０３（１９８８））。
【０３６９】
さらに、本発明のポリペプチドに対する抗体は、当業者に周知の技術を用いて本発明のポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイプ抗体を産生するために順々に利用され得る。（例えば、ＧｒｅｅｎｓｐａｎおよびＢｏｎａ、ＦＡＳＥＢ
Ｊ．７（５）：４３７−４４４；（１９８９）およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１）を参照のこと。）例えば、結合し、そしてポリペプチドの多量体化（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）および／またはリガンドに対する本発明のポリペプチドの結合を競合的に阻害する抗体が、ポリペプチドの多量体化ドメインおよび／または結合ドメインを「模倣する」抗イディオタイプを産生するために使用され得、そして結果としてポリペプチドおよび／またはそのリガンドに結合し、そして中和する。このような抗イディオタイプまたはそのような抗イディオタイプのＦａｂフラグメントの中和は、ポリペプチドリガンドを中和するための治療的レジメンに使用され得る。例えば、そのような抗イディオタイプ抗体は、本発明のポリペプチドに結合するためおよび／またはそのリガンド／レセプターに結合するために使用され得、そしてそれによってその生物学的活性がブロックされる。
【０３７０】
（抗体をコードするポリヌクレオチド）
本発明はさらに、本発明の抗体およびそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、ストリンジェントな、またはより低いストリジェンシーなハイブリダイゼーション条件下で（例えば、上記に定義されるような）抗体（好ましくは、本発明のポリペプチドと特異的に結合する、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する抗体）をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。別の好ましい実施形態において、この抗体は、配列番号１９のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する。別の好ましい実施形態において、この抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する。別の好ましい実施形態において、この抗体は、配列番号２８のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する。別の好ましい実施形態において、この抗体は、配列番号３０のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する。
【０３７１】
ポリヌクレオチドが、当該分野で公知の任意の方法によって得られ得、そしてそのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定される。例えば、抗体のヌクレオチド配列が知られている場合、この抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから構築され得（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：２４２（１９９４）に記載されるような）、これは、簡単にいうと、以下の工程を包含する：この抗体をコードする配列の部分を含むオーバーラップするオリゴヌクレオチドの合成、これらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、次いでＰＣＲによる連結されたオリゴヌクレオチドの増幅。
【０３７２】
あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源からの核酸から生成され得る。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンは入手不可能だが、その抗体分子の配列が既知である場合、その免疫グロブリンをコードする核酸は、化学的に合成され得るか、あるいは適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、または抗体を発現する任意の組織もしくは細胞（例えば、本発明の抗体の発現のために選択されたハイブリドーマ細胞）から生成されたｃＤＮＡライブラリー、またはそれから単離された核酸（好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ））から、例えば、その抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローンを同定するために、配列の３’末端および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、または特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって得られ得る。ＰＣＲによって生成された増幅された核酸は、次いで、当該分野で周知の任意の方法を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローニングされ得る。
【０３７３】
一旦、抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作について当該分野で周知の方法（例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹおよびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹに記載の技術を参照のこと。これらは両方がその全体において本明細書に参考として援用される。））を用いて操作され、例えば、アミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を作製するように異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成し得る。
【０３７４】
特定の実施形態において、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列の同定のために、当該分野において周知の方法によって（例えば、配列超可変性の領域を決定するために、他の重鎖、および軽鎖の可変領域を既知のアミノ酸配列と比較することによって）調べられ得る。慣用的な組換えＤＮＡ技術を用いて、１つ以上のＣＤＲが、前述のようにフレームワーク領域内に（例えば、非ヒト抗体をヒト化するために、ヒトフレームワーク領域中に）挿入され得る。このフレームワーク領域は天然に存在し得るか、またはコンセンサスフレームワーク領域であり得、そして好ましくはヒトフレームワーク領域であり得る（例えば、列挙したヒトフレームワーク領域については、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１９９８）を参照のこと）。好ましくは、フレームワーク領域およびＣＤＲの組み合わせによって生成されたポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、上記に議論されるように、１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワーク領域内で作製され得、そして好ましくは、そのアミノ酸置換は、抗体のその抗原への結合を改善する。さらに、このような方法は、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合が欠如した抗体分子を生成するように、鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域のシステイン残基のアミノ酸置換または欠失を作製するために使用され得る。ポリヌクレオチドへの他の変更は、本発明によって、および当該分野の技術において包含される。
【０３７５】
さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングさせることによって、「キメラ抗体」を産生するために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４（１９８５））が使用され得る。上記のように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、このような分子は、マウスｍＡｂおよびヒト免疫グロブリンの定常領域由来の可変領域を有する（例えば、ヒト化抗体）。
【０３７６】
あるいは、単鎖抗体の産生に関する記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５４（１９８９））が、単鎖抗体の産生に適応され得る。単鎖抗体は、Ｆｖ領域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントがアミノ酸架橋を介して連結されれることによって形成され、単鎖ポリペプチドを生じる。Ｅ．ｃｏｌｉにおける機能性Ｆｖフラグメントのアセンブリのための技術もまた、使用され得る（Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。
【０３７７】
（抗体を産生する方法）
本発明の抗体は、抗体を合成するための当該分野で公知の任意の方法によって、特に、化学合成によって、または、好ましくは、組換え発現技術によって産生され得る。
【０３７８】
本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログ（例えば、本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖または本発明の単鎖抗体）の組換え発現は、その抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする。一旦、本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはそれらの部分（好ましくは、重鎖または軽鎖の可変ドメインを含有する）をコードするポリヌクレオチドが得られると、抗体分子の産生のためのベクターは、当該分野で周知の技術を用いる組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。従って、抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドの発現によってタンパク質を調製するための方法は、本明細書に記載される。当業者に周知の方法は、抗体をコードする配列ならびに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターの構築のために使用され得る。これらの方法には、例えば、インビトロの組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボの遺伝子組換えが挙げられる。従って、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体分子、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。このようなベクターは、抗体分子の定常領域（例えば、ＰＣＴ公開  ＷＯ８６／０５８０７；ＰＣＴ公開  ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２，４６４号を参照のこと）をコードするヌクレオチド配列を含み得、そしてこの抗体の可変ドメインは、重鎖または軽鎖の全体の発現のためにこのようなベクターにクローニングされ得る。
【０３７９】
この発現ベクターは、従来技術によって宿主細胞へと移入され、そしてこのトランスフェクトされた細胞は、次いで、本発明の抗体を産生するために、従来技術によって培養される。従って、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または本発明の単鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二重鎖抗体の発現についての好ましい実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは、以下に詳述されるように、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞中に同時発現され得る。
【０３８０】
種々の宿主発現ベクター系は、本発明の抗体分子を発現させるために利用され得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、かつ続いて精製され得るビヒクルを表わすが、また、適切なヌクレオチドをコードする配列で形質転換またはトランスフェクトされる場合に、インサイチュで本発明の抗体分子を発現し得る細胞を表わす。これらには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体をコードする配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような微生物；抗体をコードする配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体をコードする配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した植物細胞系または抗体をコードする配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物のウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）。好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのような細菌細胞、そしてより好ましくは、特に、組換え抗体分子全体の発現のために真核生物細胞が、組換え抗体分子の発現のために使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要最初期遺伝子プロモーターエレメントのようなベクターと組み合わされた、チャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳動物細胞が、抗体のための効果的な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ  ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２（１９９０））。
【０３８１】
細菌系において、多くの発現ベクターが、抗体分子の発現を意図する使用に依存して有利に選択され得る。例えば、多量のこのようなタンパク質が産生される場合、抗体分子の薬学的組成物の生成のために、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を指向するベクターが所望され得る。このようなベクターには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体をコードする配列がｌａｃＺをコードする領域と共にベクターにインフレーム（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）で個別に連結され得、その結果、融合タンパク質が産生されるＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１７９１（１９８３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１９８９））など。ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として、外来性ポリペプチドを発現させるために使用され得る。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、そして溶解した細胞から、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および結合、それに続く遊離グルタチオン存在化での溶出によって容易に精製され得る。このｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、その結果、このクローニングされた標的遺伝子産物は、ＧＳＴ部分から放出され得る。
【０３８２】
昆虫系においては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）は、異種遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。このウィルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞において増殖する。抗体をコードする配列は、このウィルスの非必須の領域（例えばポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングされ得、そしてＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置され得る。
【０３８３】
哺乳動物宿主細胞においては、多数のウィルスに基づく発現系が利用され得る。アデノウィルスが発現ベクターとして使用される場合においては、目的の抗体をコードする配列は、アデノウィルスの転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび３つの部分に分かれるリーダー配列、に連結され得る。次いで、このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボでの組換えによって、アデノウィルスゲノムに挿入され得る。ウィルスのゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１またはＥ３領域）における挿入は、生存可能で、感染した宿主において抗体分子を発現する能力のある組換えウィルスを生じる（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３５５−３５９（１９８４）を参照のこと）。特異的開始シグナルはまた、挿入された抗体をコードする配列の効率的な翻訳のために必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列を含む。さらに、この開始コドンは、挿入部分全体の翻訳を確実にするために、所望されるコード配列のリーディングフレーム（ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）と相が同じでなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、種々の起源、天然および合成の両方であり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーター、などの含有によって高められ得る（Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）を参照のこと）。
【０３８４】
さらに、宿主細胞系統は、選択され得、これは挿入配列の発現を調節し、または、所望される特異的な様式で遺伝子産物を改変し、そしてプロセシングする。タンパク質産物のこのような改変（例えばグリコシル化）およびプロセシング（例えば切断）は、タンパク質の機能のために重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の、翻訳後プロセシングおよび改変のための、特徴的で特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現された外来タンパク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするように選択され得る。この目的のために、遺伝子産物の、第一の転写、グリコシル化、およびリン酸化の正確なプロセシングのための細胞機構を有する、真核生物宿主細胞が、使用され得る。このような哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、そして特に、例えば、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄのような乳癌細胞株、ならびに、例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔのような正常な乳腺細胞株を含むが、これらに限定されない。
【０３８５】
組換えタンパク質の長期間の高収率産生、安定発現が好ましい。例えば、安定に抗体分子を発現する細胞株が操作され得る。ウィルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するよりも、宿主細胞は、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、など）、および選択可能なマーカーによって制御されるＤＮＡで形質転換され得る。外来ＤＮＡの導入に続いて、操作された細胞は、１〜２日間富化培地で増殖させられ得、次いで、選択培地に切り替えられる。組換えプラスミドにおける選択可能マーカーは、選択したものに耐性を与え、そして細胞が、プラスミドをその染色体内に安定に組み込み、そして増殖して、細胞増殖巣を形成し、これを今度はクローニングし得、細胞株に拡張され得ることを可能にする。この方法は、抗体分子を発現する細胞株を操作するために、有利に使用され得る。このような操作された細胞株は、直接的または間接的に抗体分子と相互作用する化合物のスクリーニングおよび評価において、特に有用であり得る。
【０３８６】
多数の選択系が使用され得、この選択系は、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ  １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニン  ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：２０２（１９９２））、およびアデニン  ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ  ２２：８１７（１９８０））の遺伝子を含むが限定されず、これらの遺伝子は、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞においてそれぞれ使用され得る。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子の選択の根拠として使用され得る：ｄｈｆｒ、これはメトトレキサートに対する耐性を与える（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：３５７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１５２７（１９８１））；ｇｐｔ、これはミコフェノール酸にに対する耐性を与える（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２（１９８１））；ｎｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を与える（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；およびＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ
Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；１９９３年５月、ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５）；ならびにｈｙｇｒｏ、これはハイグロマイシンにに対する耐性を与える（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ  ３０：１４７（１９８４））。組換えＤＮＡ技術の分野で周知の方法は、所望の組換えクローンを選択するために、慣用的に適用され得、そしてこのような方法は、以下に記載されている：例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９０）；ならびに１２章および１３章、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）（これらはその全体が本明細書中に参考として援用される）。
【０３８７】
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増大され得る（総説として、ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌ．３．（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７）を参照のこと）。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物に存在するインヒビターのレベルの増加によって、マーカー遺伝子のコピーの数が増加する。増副領域は抗体遺伝子と結合しているので、抗体の産生もまた増加する（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７（１９８３））。
【０３８８】
宿主細胞は、本発明の二つの発現ベクター（重鎖由来のポリペプチドをコードする第一のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第二のベクター）で、同時トランスフェクトされ得る。この二つのベクターは、重鎖および軽鎖のポリペプチドの等しい発現を可能にする、同一の選択可能なマーカーを含み得る。あるいは、単一のベクターが使用され得、これは重鎖および軽鎖両方のポリペプチドをコードし、そして発現することができる。このような状況において、過剰の毒性の遊離重鎖を避けるために、重鎖の前に軽鎖が配置されるべきである（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：２１９７（１９８０））。重鎖および軽鎖のためのコード配列はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る。
【０３８９】
一旦、本発明の抗体分子が、動物、化学合成、または組換え発現によって産生されると、この抗体分子は、免疫グロブリン分子の精製に関する当該分野で公知の任意の方法によって（例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティー（特に、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａの後の特異的抗原へのアフィニティーによる）クロマトグラフィー、およびサイジング（ｓｉｚｉｎｇ）カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、差示的溶解度によって、またはタンパク質の精製に関する他の任意の標準的な技術によって）精製され得る。さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、精製を容易にするために、本明細書に記載されるか、またはそうでなければ当該分野で公知の異種ポリペプチド配列と融合され得る。
【０３９０】
本発明は、融合タンパク質を生成するために、本発明のポリペプチド（またはそれらの一部、好ましくは、ポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００個のアミノ酸）に組換え的に融合されたか、あるいは化学的に結合（共有結合および非共有結合の両方を含む）された抗体を含む。この融合は、必ずしも直接的である必要はないが、リンカー配列を通して起こり得る。この抗体は、本発明のポリペプチド（またはそれらの一部、好ましくは、ポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００個のアミノ酸）以外の抗原に特異的であり得る。例えば、本発明のポリペプチドを、特定の細胞表面レセプターに特異的な抗体に融合させるかまたは結合させることによって、抗体は、インビトロまたはインビボのいずれかで本発明のポリペプチドを特定の細胞型に標的化するために使用され得る。本発明のポリペプチドに融合されたかまたは結合された抗体はまた、当該分野で公知の方法を使用してインビトロイムノアッセイおよび精製方法にて使用され得る。例えば、Ｈａｒｂｏｒら、前出およびＰＣＴ公開ＷＯ  ９３／２１２３２；ＥＰ  ４３９，０９５；Ｎａｒａｍｕｒａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３９：９１−９９（１９９４）；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌｉｅｓら、ＰＮＡＳ  ８９：１４２８−１４３２（１９９２）；Ｆｅｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５２（１９９１）（これらは、それらの全体において参考として援用される）を参照のこと。
【０３９１】
本発明はさらに、可変領域以外の抗体のドメインに融合されたかまたは結合された本発明のポリペプチドから構成される組成物を含む。例えば、本発明のポリペプチドを、抗体のＦｃ領域、あるいはその一部に融合または結合され得る。本発明のポリペプチドに融合された抗体部分は、定常領域、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、あるいはそれらのドメイン全体または部分の任意の組合せを含み得る。このポリペプチドはまた、上記の抗体部分に融合または結合され、多量体を形成し得る。例えば、本発明のポリペプチドに融合されたＦｃ部分は、Ｆｃ部分間のジスルフィド結合を介して二量体を形成し得る。より高次な多量体形態は、このポリペプチドをＩｇＡおよびＩｇＭの部分に融合することにより作製され得る。本発明のポリペプチドを抗体部分に融合または結合するための方法は、当該分野において公知である。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号；同第５，６２２，９２９号；同第５，３５９，０４６号；同第５，３４９，０５３号；同第５，４４７，８５１号；同第５，１１２，９４６号；ＥＰ  ３０７，４３４；ＥＰ  ３６７，１６６；ＰＣＴ公開ＷＯ  ９６／０４３８８；ＷＯ  ９１／０６５７０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１）；Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０−５６００（１９９５）；およびＶｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１１３３７−１１３４１（１９９２）（上記の参考文献は、それらの全体が参考として援用される）を参照のこと。
【０３９２】
上記で議論されたように、配列番号２のポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、または改変体に対応するポリペプチドは、上記の抗体部分に融合または結合され得、このポリペプチドのインビボの半減期を増加するか、または当該分野で公知の方法を使用するイムノアッセイにおいて使用される。さらに、配列番号２に対応するポリペプチドは、精製を容易にするために、上記の抗体部分に融合または結合され得る。また上記で議論されるように、配列番号１９のポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、または改変体に対応するポリペプチドは、上記の抗体部分に融合または結合され得、このポリペプチドのインビボの半減期を増加するか、または当該分野で公知の方法を使用するイムノアッセイにおいて使用される。さらに、配列番号１９に対応するポリペプチドは、上記抗体部分に融合または結合され、精製を容易にし得る。１つの報告された実施例は、ヒトＣＤ４ポリペプチドの第１の２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖もしくは軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載する。（ＥＰ  ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：８４−８６（１９８８））。ジスルフィド連結した二量体構造（ＩｇＧに起因する）を有する抗体に融合または結合された本発明のポリペプチドはまた、単量体分泌タンパク質またはタンパク質フラグメント単独よりも、他の分子との結合および中和においてより効率的であり得る。（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４（１９９５））。多くの場合において、融合タンパク質のＦｃ部分は、治療および診断において有利であり、従って、例えば、改良された薬物動態学的な特性を生じ得る。（ＥＰ  Ａ  ２３２，２６２）。あるいは、融合タンパク質が発現、検出、および精製された後のＦｃ部分の欠損は、所望される。例えば、この融合タンパク質が免疫化のための抗原として使用される場合、このＦｃ部分は、治療および診断を妨げ得る。薬物の発見において、例えば、ヒトタンパク質（例えばｈＩＬ−５）は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するための高スループットスクリーニングアッセイの目的のために、Ｆｃ部分と融合された。（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ８：５２−５８（１９９５）；Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと。）
さらに、本発明の抗体またはそれらのフラグメントは、精製を容易にするペプチドのような、マーカー配列と融合され得る。好ましい実施形態において、このマーカーアミノ酸配列は、とりわけ、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．，９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）において提供されるタグのようなヘキサ−ヒスチジンペプチドであり、それらの多くは市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製に有用な他のペプチドタグには、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７（１９８４））および「ｆｌａｇ」タグが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３９３】
本発明はさらに、診断剤または治療剤に結合される抗体またはそのフラグメントを含む。この抗体は、例えば、臨床試験の手順の一部（例えば、所定の治療レジメンの有効性を決定するための）として、腫瘍の発生または進行をモニターするために診断的に使用され得る。検出は、抗体を検出可能な物質にカップリングすることによって容易にされ得る。検出可能な物質の例には、種々の酵素、補欠分子群、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々の陽子射出断層撮影法を使用する陽電子放射金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。この検出可能な物質は、当該分野で公知の技術を用いて、抗体（または、それらのフラグメント）に直接的にか、または中間体（例えば、当該分野で公知のリンカーなど）を介して間接的にかのいずれかで、カップリングまたは結合され得る。本発明に従う診断剤として使用するための抗体に結合され得る金属イオンについては、例えば、米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子群複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライドまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例には、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ；そして適切な放射性物質の例には、125Ｉ、131Ｉ、111Ｉｎまたは99Ｔｃが挙げられる。
【０３９４】
さらに、抗体またはそのフラグメントは、治療用部分（例えば細胞毒（例えば細胞増殖抑制性もしくは細胞殺傷性の薬剤））、治療剤または放射性金属イオン（例えば、α−放射体（例えば213Ｂｉ））に結合され得る。細胞毒または細胞毒性薬剤は、細胞に対して有害な任意の薬剤を含む。例としては、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｎｔｈｒａｃｉｎ  ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ，１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにそのアナログまたはホモログ、が挙げられる。治療剤は、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、クロルメチン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、チオテパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）（ＡＭＣ））、ならびに有糸分裂阻害剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）、を含むが、それらに限定されない。
【０３９５】
本発明の結合体は、所与の生物学的応答を改変するために使用され得、治療剤または薬物部分は、慣用の化学的治療剤に限定されると解釈されない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリぺプチドであり得る。このようなタンパク質としては、例えば、毒素（例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリアトキシン）；タンパク質（例えば、腫瘍壊死因子、ａ−インターフェロン、β−インターフェロン、神経発育因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲン賦活剤、アポトーシス薬（例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ  Ｉ（国際公開第ＷＯ９７／３３８９９号を参照のこと）、ＡＩＭ  ＩＩ（国際公開第ＷＯ９７／３４９１１号を参照のこと）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１５６７−１５７４（１９９４））、ＶＥＧＩ（国際公開第ＷＯ９９／２３１０５号））、血栓症薬もしくは抗脈管形成薬（例えば、アンジオスタチンもしくはエンドスタチン）；または生物学的応答改変剤（例えばリンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の増殖因子）、が挙げられ得る。
【０３９６】
抗体はまた、固体支持体に付着させられ得、この固体支持体は、標的抗原の免疫アッセイまたは精製に特に有用である。このような固体支持体としては、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレン、が挙げられるがそれらに限定されない。
【０３９７】
このような治療部分を抗体に結合する技術は、周知である、例えば、Ａｒｎｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第二版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ
Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）、およびＴｈｏｒｐｅら、「Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこと。
【０３９８】
あるいは、抗体は、Ｓｅｇａｌにより米国特許第４，６７６，９８０号（その全体が参考として本明細書中で援用される）に記載されるように、第二の抗体に結合され得、抗体ヘテロ結合体を形成する。
【０３９９】
単独または細胞毒因子および／もしくはサイトカインと組合せて投与される抗体（その抗体に結合する治療部分を有するまたは有さない）は、治療として使用され得る。
【０４００】
（免疫表現型決定（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ））
本発明の抗体は、細胞株および生物学的サンプルの免疫表現型決定のために利用され得る。本発明の遺伝子の翻訳産物は、細胞特異的マーカーとして、またより詳細には、特定の型の細胞の分化および／または成熟の種々の段階で、差次的に発現される細胞マーカーとして有用であり得る。特異的なエピトープまたはエピトープの組み合わせに対するモノクローナル抗体は、マーカーを発現する細胞の集団のスクリーニングを可能にする。種々の技術は、マーカーを発現する細胞の集団をスクリーニングするためのモノクローナル抗体を使用して利用され得、そして種々の技術としては、抗体でコートされた磁気的ビーズを使用する磁気的分離、固体マトリックス（すなわちプレート）に付着された抗体を用いる「パニング（ｐａｎｎｉｎｇ）」、およびフローサイトメトリ（例えば、米国特許第５，９８５，６６０号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，９６：７３７−４９（１９９９）を参照のこと）、が挙げられる。
【０４０１】
これらの技術は、細胞（例えば血液学的悪性疾患で見出され得るような細胞（すなわち急性白血病患者における微小残存病変（ＭＲＤ））、および対宿主性移植変病（ＧＶＨＤ）を防ぐための移植における「非自己（ｎｏｎ−ｓｅｌｆ）」細胞）の特定の集団のスクリーニングを可能にする。あるいは、これらの技術は、ヒト臍帯血中に見出され得るような、増殖および／または分化を受ける能力のある造血幹細胞および前駆細胞のスクリーニングを可能にする。
【０４０２】
（抗体結合アッセイ）
本発明の抗体は、免疫特異的結合について、当該分野で公知の任意の方法によってアッセイされ得る。使用され得る免疫アッセイは、競合的および非競合的アッセイ系を含むがこれに限定されない。このアッセイ系は以下のような技術を使用する、少し例を挙げると、ウェスタンブロット、放射性免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射分析アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテインＡ免疫アッセイ。このようなアッセイは、当該分野で、慣習的および周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。これはその全体が本明細書中で参考として援用される）。典型的な免疫アッセイは、以下に簡単に記載される（しかし限定として意図されない）。
【０４０３】
免疫沈降プロトコルは、一般に、ＲＩＰＡ緩衝液（１％ＮＰ−４０またはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１％Ｔｒａｓｙｌｏｌ）のような、タンパク質ホスファターゼおよび／またはプロテアーゼインヒビター（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジウム酸ナトリウム）を補充した溶解緩衝液中で、細胞の集団を溶解する工程、目的の抗体を細胞溶解物に添加する工程、４℃である時間（例えば１〜４時間）インキュベートする工程、プロテインＡおよび／またはプロテインＧのセファロースビーズを細胞溶解物に添加する工程、約１時間以上、４℃でインキュベートする工程、ビーズを溶解緩衝液で洗浄する工程およびビーズをＳＤＳ／サンプル緩衝液中に再懸濁する工程、を包含する。目的の抗体が特定の抗原を免疫沈降する能力は、例えば、ウェスタンブロット分析によって評価され得る。当業者は、抗原に対する抗体の結合を増加し、そしてバックグラウンドを減少する（例えば、セファロースビーズとともに細胞溶解物を予め洗浄する）ように改変され得るパラメータに関して、よく知っている。免役沈降プロトコルに関するさらなる考察については、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１０．１６．１）を参照のこと。
【０４０４】
ウェスタンブロット分析は一般的に、タンパク質サンプルを調製する工程、タンパク質サンプルのポリアクリルアミドゲルでの電気泳動（例えば抗原の分子量によって８％〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、タンパク質サンプルをポリアクリルアミドゲルからメンブレン（例えばニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロン）へ移す工程、ブロッキング溶液（例えば、３％のＢＳＡまたは無脂肪ミルクを含むＰＢＳ）中でメンブレンをブロッキングする工程、メンブレンを洗浄緩衝液（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０）中で洗浄する工程、ブロッキング緩衝液で希釈された１次抗体（目的の抗体）を用いてメンブレンをブロッキングする工程、洗浄緩衝液中でメンブレンを洗浄する工程、ブロッキング緩衝液で希釈された、酵素基質（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ）または放射性分子（例えば32Ｐまたは125Ｉ）に結合した２次抗体（これは１次抗体（例えば抗ヒト抗体）を認識する）でメンブレンをブロッキングする工程、洗浄緩衝液中でメンブレンを洗浄する工程、および抗原の存在を検出する工程、を包含する。当業者は、検出されるシグナルを増加し、そしてバックグランドノイズを減少するように改変され得るパラメータをよく知っている。ウェスタンブロットプロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１０．８．１）を参照のこと。
【０４０５】
ＥＬＩＳＡは、抗原を調製する工程、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルをその抗原でコーティングする工程、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスフォターゼ）のような検出可能な化合物に結合した目的の抗体をそのウェルに添加し、そして一定時間インキュベートする工程、および抗原の存在を検出する工程を含む。ＥＬＩＳＡにおいて、目的の抗体は、検出可能な化合物に結合している必要はない；その代わり、検出可能な化合物に結合した第二の抗体（目的の抗体を認識する）がウェルに添加され得る。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体がウェルにコーティングされ得る。この場合、検出可能な化合物に結合した第二の抗体が、コーティングされたウェルへの目的の抗原の添加に続いて、添加され得る。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように改変され得るパラメータ、および当該分野において公知のＥＬＩＳＡの他のバリエーションに関して、認め得る。ＥＬＩＳＡに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１１．２．１を参照のこと。
【０４０６】
抗体の抗原に対する結合親和性および抗体−抗原相互作用のオフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）が、競合結合アッセイにより決定され得る。競合結合アッセイの一つの例は、ラジオイムノアッセイであり、ラジオイムノアッセイは、標識した抗原（例えば、3Ｈまたは125Ｉ）と、漸増量の非標識抗原の存在下での目的の抗体とのインキュベーション、および標識した抗原に結合した抗体の検出を含む。目的の抗体の、特定の抗原に対する親和性、および結合オフレートは、スキャッチャードプロット分析によるデータから決定され得る。第二の抗体との競合はまた、ラジオイムノアッセイを用いて決定され得る。この場合、抗原は、漸増量の非標識第二抗体の存在下で、標識した化合物（例えば、3Ｈまたは125Ｉ）に結合した目的の抗体とともにインキュベートされる。
【０４０７】
（治療用途）
本発明はさらに、抗体を基礎とした治療に関し、この治療は、本発明の抗体を、１つ以上の開示された疾患、障害、または状態を処置するために、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトの患者に投与する工程を含む。本発明の治療化合物としては、本発明の抗体（本明細書中に記載するような、それらのフラグメント、アナログおよび誘導体を含む）ならびに本発明の抗体をコードする核酸（本明細書中に記載するような、それらのフラグメント、アナログおよび誘導体ならびに抗イディオタイプ抗体を含む）が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾患、障害または状態（本明細書中に記載する任意の１つ以上の疾患、障害、または状態（例えば、このような疾患または障害と関連した自己免疫疾患、障害、または状態であり、以下が挙げられるが、これらに限定されない：自己免疫溶血性貧血、自己免疫新生児血小板減少症、特発性血小板減少症紫斑病、自己免疫性血球減少症、溶血性貧血、抗リン脂質症候群、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、心筋炎、再発性多発性軟骨炎、リウマチ性心疾患、糸球体腎炎（例えば、ＩｇＡ腎症）、多発性硬化症、神経炎、ブドウ膜炎、結膜炎、多発性内分泌腺症、紫斑病（例えば、Ｈｅｎｌｏｃｈ−Ｓｃｏｅｎｌｅｉｎ紫斑病）、ライター病、スティッフマン症候群、自己免疫肺炎症、ギヤン‐バレー症候群、インシュリン依存糖尿病、および自己免疫炎症眼球、自己免疫甲状腺炎、甲状腺機能低下不全症（すなわち、橋本甲状腺炎）、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、天疱瘡、レセプター自己免疫（例えば、（ａ）グレーヴズ病、（ｂ）重症筋無力症、および（ｃ）インスリン抵抗性）、自己免疫溶血性貧血、自己免疫特発性血小板減少性紫斑病、リウマチ様動脈炎、抗コラーゲン抗体を有するｓｃｈｌｅｒｏｄｅｒｍａ、混合結合組織病、多発性筋炎／皮膚筋炎、悪性貧血、特発性アディソン病、不妊症、原発性糸球体腎炎のような糸球体腎炎、およびＩｇＡ腎症、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、糖尿病、およびアドレナリン薬物耐性（喘息または嚢胞性線維症を伴うアドレナリン薬物耐性）、慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、他の内分泌腺不全、白斑、脈管炎、心筋梗塞後、心臓切開症候群、じんま疹、アトピー性皮膚炎、ぜん息、炎症性筋障害、および他の炎症性障害、肉芽腫性障害、変性障害、および萎縮性障害）を含むがこれらに限定されない）を処置、阻害または予防するために使用され得る。
【０４０８】
特定の実施形態において、本発明の抗体は、慢性関節リウマチを処置、抑制、予後判定、診断または予防するために使用される。
【０４０９】
別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、全身性エリテマトーデスを処置、抑制、予後判定、診断または予防するために使用される。
【０４１０】
本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾患、障害または状態の処置および／または予防は、それらの疾患、障害または状態に関連した症状を緩和する工程を含むがこれに限定されない。本発明の抗体はまた、それらの表面上のＮｅｕｔｒｏｋｉｎｅ−αを発現する細胞および／またはそれらの表面に結合されたＮｅｕｔｒｏｋｉｎｅ−αを有する細胞を標的化および殺傷するために使用され得る。本発明の抗体は、当該分野で公知であるか、または本明細書中に記載されるように、薬学的に受容可能な組成物中に提供され得る。
【０４１１】
本発明の抗体が治療的に使用され得る方法の１つの要約は、身体内で局所的にまたは全身的に、あるいは（例えば、補体（ＣＤＣ）により、またはエフェクター細胞（ＡＤＣＣ）により媒介されるような）抗体の直接的細胞傷害性により、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを結合させることを含む。これらのアプローチのいくつかは、より詳細に以下に記載される。本明細書中で提供される教示を与えられれば、当業者は、過度の実験なしに、診断上の目的、モニタリングの目的あるいは治療上の目的のために、本発明の抗体を使用する方法がわかる。
【０４１２】
本発明の抗体は、例えば、抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活性を増加させるために役立つ、他のモノクローナル抗体またはキメラ抗体、あるいはリンホカインまたは造血増殖因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ−７など）と組み合わせて有利に利用され得る。
【０４１３】
本発明の抗体は、単独で、または他の型の処置（例えば、放射線療法、化学療法、ホルモン治療、免疫治療、抗腫瘍剤、抗生物質、および免疫グロブリン）との組み合わせで投与され得る。一般的に、（抗体の場合には）患者の種と同じ種である種起源または種反応性の生成物の投与が好ましい。従って、好ましい実施形態においては、ヒトの抗体、フラグメント誘導体、アナログ、または核酸が、治療または予防のために、ヒトの患者に投与される。
【０４１４】
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（それらのフラグメントを含む）に関するイムノアッセイ、およびそれらに関連した障害の治療の両方のために、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する、高親和性および／または強力な、インビボでの阻害抗体および／または中和抗体、それらのフラグメント、またはその領域を使用することが好ましい。このような抗体、フラグメント、または領域は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（それらのフラグメントを含む）に対して親和性を有する。好ましい結合親和性としては、５×１０-5Ｍ、１０-5Ｍ、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×１０-7Ｍ、１０-7Ｍ、５×１０-8Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×１０-10Ｍ、１０-10Ｍ、５×１０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ、５×１０-13Ｍ、１０-13Ｍ、５×１０-14Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍ、および１０-15Ｍより小さい解離定数すなわちＫｄを有する結合親和性が挙げられる。
【０４１５】
（遺伝子治療）
特定の実施形態において、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含む核酸は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾患または障害を処置、阻害または予防するために、遺伝子治療の目的で投与される。遺伝子治療とは、発現したか、または発現可能な核酸の、被験体への投与により行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。
【０４１６】
当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法は、本発明に従って使用され得る。例示的な方法が以下に記載される。
【０４１７】
遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５（１９９３）；ＷｕおよびＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。使用され得る、組換えＤＮＡ技術分野において一般的に公知である方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記載される。
【０４１８】
好ましい局面において、化合物は抗体をコードする核酸配列を含有し、上記核酸配列は、適切な宿主において、抗体、またはそのフラグメントもしくはキメラタンパク質、あるいはその重鎖もしくは軽鎖を発現する発現ベクターの一部である。特に、このような核酸配列は、抗体コード領域に作動可能に連結したプロモーターを有し、上記プロモーターは誘導性であるかまたは構成性であり、そして必要に応じて組織特異的である。別の特定の実施形態においては、抗体をコードする配列および任意の他の所望の配列がゲノム中の所望の部位での相同組換えを促進する領域に隣接した核酸分子が使用され、それにより抗体をコードする核酸の染色体内の発現を提供する（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４３５−４３８（１９８９））。特定の実施形態において、発現した抗体分子は単鎖抗体であるか；あるいはこの核酸配列は、この抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードする配列またはそのフラグメントを含む。
【０４１９】
核酸の患者への送達は、直接的（この場合、患者は核酸または核酸保有ベクターに直接的に曝される）か、または間接的（この場合、細胞は最初にインビトロで核酸で形質転換され、次いで患者に移植される）のいずれかであり得る。これらの２つのアプローチは、インビボ遺伝子治療として、またはエキソビボ遺伝子治療としてそれぞれ公知である。
【０４２０】
特定の実施形態において、核酸配列はインビボで直接的に投与され、そこで核酸配列は発現されて、コードされた産物を産生する。これは、当該分野で公知の多数の方法などのいずれかにより（例えば、それらを適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、そしてそれを細胞内になるように投与することにより（例えば、欠損性または弱毒化したレトロウイルスまたは他のウイルスベクター（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）を用いた感染により）、あるいは、裸のＤＮＡの直接注射により、あるいは、微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、あるいは脂質もしくは細胞表面のレセプターでコーティングするか、または薬剤をトランスフェクトすることにより、リポソーム、微粒子、もしくはマイクロカプセル中へのカプセル化により、あるいは、それらを核に進入することが公知であるペプチドと結合させて投与することにより、レセプター媒介のエンドサイトーシスを受けるリガンドとそれを結合させて投与することにより（例えば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照のこと）（レセプターを特異的に発現する細胞型を標的にするために用いられ得る）達成され得る。別の実施形態において、核酸−リガンド複合体が形成され得、ここで、このリガンドはエンドソームを破壊するフソジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）ウイルス性ペプチドを含み、核酸がリソソーム分解を回避するようにする。さらに別の実施形態において、核酸は、特異的なレセプターを標的とすることにより、細胞特異的な取り込みおよび発現についてインビボで標的とされ得る（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０６１８０号；同第ＷＯ９２／２２６３５号；同第ＷＯ９２／２０３１６号；同第ＷＯ９３／１４１８８号、同第ＷＯ９３／２０２２１号を参照のこと）。あるいは、核酸は、細胞内に導入され得、そして相同組換えにより、発現のために宿主細胞ＤＮＡ中に組み込まれ得る（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４３５−４３８（１９８９））。
【０４２１】
特定の実施形態において、本発明の抗体をコードする核酸配列を含むウイルスベクターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターが用いられ得る（Ｍｉｌｌｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９（１９９３）を参照のこと）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルス性ゲノムの正確なパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの正確な組込みのために必要な構成要素を含む。遺伝子治療において使用される抗体をコードする核酸配列は、一つ以上のベクター中にクローン化され、これは、患者内への遺伝子の送達を容易にする。レトロウイルスベクターに関するさらなる詳細は、Ｂｏｅｓｅｎら，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ６：２９１−３０２（１９９４）（これは、幹細胞を化学療法に対してより耐性にするために、ｍｄｒＩ遺伝子を造血性幹細胞に送達するための、レトロウイルスベクターの使用を記載する）に見出され得る。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考文献は、以下である。：Ｃｌｏｗｅｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１（１９９４）；Ｋｉｅｍら，Ｂｌｏｏｄ  ８３：１４６７−１４７３（１９９４）；ＳａｌｍｏｎｓおよびＧｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ
４：１２９−１４１（１９９３）；ならびにＧｒｏｓｓｍａｎおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．３：１１０−１１４（１９９３）。
【０４２２】
アデノウイルスは、遺伝子治療において使用され得る他のウイルスベクターである。アデノウイルスは、特に、気道上皮へ遺伝子を送達するための魅力的なビヒクルである。アデノウイルスは、自然に気道上皮に感染し、そこで軽い疾患を起こす。アデノウイルスに基づく送達系の他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染し得るという利点を有する。ＫｏｚａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ３：４９９−５０３（１９９３）は、アデノウイルスに基づく遺伝子治療の概説を示す。Ｂｏｕｔら，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：３−１０（１９９４）は、アカゲザルの気道上皮に遺伝子を移入するためのアデノウイルスベクターの使用を実証した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４（１９９１）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｃｅｌｌ  ６８：１４３−１５５（１９９２）；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２３４（１９９３）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９号；およびＷａｎｇら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：７７５−７８３（１９９５）に見出され得る。好ましい実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。
【０４２３】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はまた、遺伝子治療における使用について提案されてきた（Ｗａｌｓｈら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：２８９−３００（１９９３）；米国特許第５，４３６，１４６号）。
【０４２４】
遺伝子治療への別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染のような方法により、組織培養中の細胞へ遺伝子を移入する工程を含む。通常、移入の方法は、選択マーカーの細胞への移入を含む。次いで、細胞は、移入された遺伝子を取り込みそして発現している細胞を単離するために選沢下に置かれる。それらの細胞は次いで、患者に送達される。
【０４２５】
この実施形態においては、得られた組換え細胞のインビボ投与の前に、核酸が細胞に導入される。このような導入は、当該分野において公知の任意の方法により実施され得、それらの方法としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターでの感染、細胞融合、染色体媒介の遺伝子移入、マイクロセル（ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ）媒介の遺伝子移入、スフェロプラスト融合など。外来遺伝子の細胞への導入については、当該分野において多数の技術が公知であり（例えば、ＬｏｅｆｆｌｅｒおよびＢｅｈｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８（１９９３）；Ｃｏｈｅｎら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４（１９９３）；Ｃｌｉｎｅ，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２ｍ（１９８５）を参照のこと）、そしてレシピエント細胞の必要な発生的および生理学的機能が破壊されない場合、本発明に従って使用され得る。この技術は、核酸の細胞への安定した移入を提供するはずであり、その結果、核酸は、細胞により発現可能であり、そして好ましくは、遺伝性であり、そしてその細胞の子孫により発現可能である。
【０４２６】
得られた組換え細胞は、当該分野において公知の様々な方法により、患者へ送達され得る。組換え血球（例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞）は、好ましくは、静脈内に投与される。使用が考えられる細胞の量は、所望の効果、患者の状態などに依存し、そして当業者により決定され得る。
【０４２７】
遺伝子治療の目的のために核酸が導入され得る細胞は、任意の所望の入手可能な細胞型を包含し、そして以下を含むがそれらに限定されない：上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のような血球；種々の幹細胞または前駆細胞、特に、造血幹細胞または造血前駆細胞（例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児の肝臓などから得られるような細胞）。
【０４２８】
好ましい実施形態において、遺伝子治療に使用される細胞は、患者に対して自己である。
【０４２９】
遺伝子治療において組換え細胞が使用される実施形態において、抗体をコードする核酸配列は、細胞またはそれらの子孫により核酸配列が発現可能であるように細胞に導入され、次いで組換え細胞は、治療的効果のためにインビボで投与される。特定の実施形態において、幹細胞または前駆細胞が用いられる。インビトロで単離され得、そしてインビトロで保存され得る任意の幹細胞および／または前駆細胞は、本発明のこの実施形態に従って潜在的に使用され得る（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０８５９８号：ＳｔｅｍｐｌｅおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃｅｌｌ  ７１：９７３−９８５（１９９２）；Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ，Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．２１Ａ：２２９（１９８０）；ならびにＰｉｔｔｅｌｋｏｗおよびＳｃｏｔｔ，Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｐｒｏｃ．６１：７７１（１９８６）を参照のこと）。
【０４３０】
特定の実施形態において、遺伝子治療の目的で導入される核酸は、コード領域に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含有し、その結果、核酸の発現は、適切な転写誘導因子の存在または非存在を制御することにより制御可能である。
【０４３１】
（治療活性または予防活性の実証）
本発明の化合物または薬学的組成物は、好ましくは、ヒトでの使用の前にインビトロで、次いでインビボで、所望の治療活性または予防活性について試験される。例えば、化合物または薬学的組成物の治療有用性または予防有用性を実証するためのインビトロアッセイとしては、細胞株または患者組織サンプルに対する化合物の効果が挙げられる。細胞株および／または組織サンプルに対する化合物または組成物の効果は、当業者に公知である技術（ロゼット形成アッセイおよび細胞溶解アッセイが挙げられるがこれらに限定されない）を利用して決定され得る。本発明に従って、特定の化合物の投与が示されるかどうかを決定するために用いられ得るインビトロアッセイとしては、インビトロ細胞培養アッセイが挙げられ、このアッセイでは、患者組織サンプルが培養において増殖され、そして化合物に曝されるか、そうでなければ化合物が投与され、そして、組織サンプルに対するそのような化合物の効果が観察される。
【０４３２】
（治療的／予防的な投与および組成物）
本発明は、被験体への有効量の本発明の化合物または薬学的組成物、好ましくは本発明の抗体の投与による処置、阻害および予防の方法を提供する。好ましい実施形態において、化合物は実質的に精製される（例えば、その効果を制限するかまたは望ましくない副作用を生じる物質は実質的にない）。被験体は好ましくは、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれらに限定されない動物であり、そして好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ましくはヒトである。
【０４３３】
化合物が核酸または免疫グロブリンを含む場合に使用され得る処方物および投与方法は、上記に記載され；さらなる適切な処方物および投与経路は、本明細書中で以下に記載されたものの中から選択され得る。
【０４３４】
種々の送達系が公知であり、そして本発明の化合物を投与するために用いられ得る（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル中でのカプセル化、この化合物の発現が可能な組み換え細胞、レセプター媒介エンドサイトーシス（例えば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照のこと）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築など）。導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられるがそれらに限定されない。化合物または組成物は、任意の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を通しての吸収により）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、本発明の薬学的化合物または組成物を、任意の適切な経路（脳室内注射および鞘内注射を包含する；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバのようなリザーバに取り付けられた脳室内カテーテルにより容易にされ得る）により中枢神経系に導入することが望まれ得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアゾール化剤を用いた処方により、肺投与もまた使用され得る。
【０４３５】
特定の実施形態において、本発明の薬学的化合物または組成物を、処置の必要な領域に局所的に投与することが望まれ得る；これは、制限する目的ではないが、例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯との組み合わせて）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラント（このインプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のような膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、またはゼラチン様材料である）により達成され得る。好ましくは、抗体を含む本発明のタンパク質を投与する場合、タンパク質が吸収されない材料を使用するために注意が払われなければならない。
【０４３６】
別の実施形態において、化合物または組成物は、小胞、特に、リポソーム中へ送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同書３１７〜３２７頁を参照のこと；広く同書を参照のこと）。
【０４３７】
さらに別の実施形態において、化合物または組成物は制御された放出システム中で送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇｅｒ，（前出）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。別の実施形態において、高分子材料が用いられ得る（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ
Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）もまた参照のこと）。さらに別の実施形態において、制御された放出システムは、治療標的、即ち、脳の近くに置かれ得、従って、全身用量の一部のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，（前出），第２巻，１１５〜１３８頁（１９８４）を参照のこと）。
【０４３８】
他の制御された放出システムは、Ｌａｎｇｅｒにより総説において議論される（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。
【０４３９】
本発明の化合物がタンパク質をコードする核酸である、具体的な実施形態において、その核酸は、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、そしてそれが細胞内になるように投与することにより（例えば、レトロウイルスベクターの使用により（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）、または直接注射により、または微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、または脂質もしくは細胞表面レセプターもしくはトランスフェクト剤でコーティングすることにより、または核に入ることが公知であるホメオボックス様ペプチドと結合させて投与すること（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８６４−１８６８（１９９１）を参照のこと）などにより、そのコードされたタンパク質の発現を促進するようにインビボで投与され得る。あるいは、核酸は、細胞内に導入され得、そして、発現のために相同組換えにより宿主細胞ＤＮＡ内に組み込まれ得る。
【０４４０】
本発明はまた、薬学的組成物を提供する。このような組成物は、治療有効量の化合物、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。具体的な実施形態において、用語「薬学的に受容可能な」とは、動物における、そしてさらに特にヒトにおける使用のために、連邦規制当局もしくは米国政府により認められたか、または米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に列挙されたことを意味する。用語「キャリア」とは、治療剤とともに投与される、希釈剤、アジュバンド、賦形剤、またはビヒクルをいう。このような薬学的なキャリアは、水および油（石油起源、動物起源、植物起源、または合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油など）を含む）のような滅菌した液体であり得る。水は、薬学的組成物が静脈内に投与される場合に、好ましいキャリアである。生理食塩水溶液、ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液はまた、特に注射可能な溶液のために、液体キャリアとして使用され得る。適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、フラワー、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物はまた、所望されるならば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出処方物などの形態を取り得る。この組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドのようなキャリアとともに、坐剤として処方され得る。経口処方物は、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準キャリアを含み得る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。このような組成物は、治療有効量の化合物を、好ましくは精製された形態で、適切な量のキャリアとともに含んで、患者への適切な投与のための形態を提供する。処方物は、投与形態に適するべきである。
【０４４１】
好ましい実施形態において、組成物は、慣用手順に従って、ヒトへの静脈内投与のために採用された薬学的組成物として、処方される。代表的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤および注射の部位での痛みを緩和するリグノカインのような局部麻酔を含み得る。一般的には、成分は、別々にかまたは単一投薬形態で一緒に混合してのどちらかで、例えば、一定量の活性薬剤を示すアンプルまたは小袋（ｓａｃｈｅｔｔｅ）のような密封された容器中の凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給される。組成物が注入により投与されるべき場合には、組成物は、滅菌した薬学的等級の水または生理食塩水を含む注入ボトルに分配され得る。組成物が注射により投与される場合、成分が投与の前に混合され得るように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【０４４２】
本発明の化合物は、中性のまたは塩の形態として処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するもののようなアニオンとともに形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するもののようなカチオンとともに形成される塩が挙げられる。
【０４４３】
この処置（本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性と関連する疾患または障害の抑制および予防）において効果的である本発明の化合物の量は、標準的な臨床技術により決定され得る。さらに、インビトロアッセイは、必要に応じて、使用して最適な投薬量の範囲を同定するのを助け得る。処方において使用されるべき正確な用量はまた、投与の経路、および疾患または障害の重篤さに依存し、そして開業医の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得られた用量反応曲線から外插され得る。
【０４４４】
抗体に関して、患者に投与される投薬量は、代表的に、患者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ〜１００ｍｇである。好ましくは、患者に投与される投薬量は、患者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇと２０ｍｇとの間であり、より好ましくは、患者の体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｍｇである。一般に、ヒト抗体は、外来ポリペプチドへの免疫応答に起因して、他種由来の抗体よりもヒト体内で長い半減期を有する。従って、ヒト抗体の低い投薬量および頻度の低い投与は、しばしば可能である。さらに、本発明の抗体の投与の投薬量および頻度は、改変（例えば、脂溶化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）のような）による抗体の取り込みおよび組織浸透（例えば、脳への）を増強することにより減少され得る。
【０４４５】
本発明はまた、本発明の薬学的組成物の一つ以上の成分で満たされている一つ以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。薬学的製品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制している政府機関により規定される形式における通告は、このような容器に、必要に応じて伴ない得る。この通告は、ヒトの投与のための製造、使用または販売のこの機関による認可を反映する。
【０４４６】
（診断および画像化）
目的のポリペプチドに特異的に結合する標識化抗体、ならびにその誘導体およびそのアナログは、診断目的のために使用されて、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連する疾患および／または障害を検出、診断またはモニターし得る。本発明は、目的のポリペプチドの異常な発現の検出について提供し、これは、（ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用して、個体の細胞または体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、および（ｂ）この遺伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工程、を包含し、これによって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイされたポリペプチド遺伝子発現レベルの増加または減少が、異常な発現を示す。
【０４４７】
本発明は、障害を診断するための診断アッセイを提供し、このアッセイは、（ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用して、個体の細胞または体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、および（ｂ）この遺伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工程、を包含し、これによって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイされたポリペプチド遺伝子発現レベルの増加または減少が、特定の障害を示す。癌に関して、個体由来の生検組織における比較的高い量の転写物の存在は、疾患の発生のための素因を示し得るか、または実際の臨床症状の出現前に疾患を検出するための手段を提供し得る。この型のより決定的な診断は、保健専門家に予防手段を使用させること、または早期の積極的な処置を可能にし得、これにより、癌の発生またはさらなる進行を予防する。
【０４４８】
本発明の抗体を使用して、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を使用して生物学的サンプル中のタンパク質レベルをアッセイし得る（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７）を参照のこと）。タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な、抗体に基づく他の方法としては、イムノアッセイ（例えば、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫測定法（ＲＩＡ））が挙げられる。適切な抗体アッセイ標識は、当該分野において公知であり、そして酵素標識（例えば、グルコースオキシダーゼ）；放射性同位体（例えば、ヨウ素（131Ｉ、125Ｉ、123Ｉ、121Ｉ）、炭素（14Ｃ）、硫黄（35Ｓ）、トリチウム（3Ｈ）、インジウム（115mＩｎ、113mＩｎ、112Ｉｎ、111Ｉｎ）、およびテクネチウム（99Ｔｃ、99mＴｃ）、タリウム（201Ｔｉ）、ガリウム（68Ｇａ、67Ｇａ）、パラジウム（103Ｐｄ）、モリブデン（99Ｍｏ）、キセノン（133Ｘｅ）、フッ素（18Ｆ）、135Ｓｍ、177Ｌｕ、159Ｇｄ、149Ｐｍ、140Ｌａ、175Ｙｂ、166Ｈｏ、90Ｙ、47Ｓｃ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、142Ｐｒ、105Ｒｈ、97Ｒｕ）；発光標識（例えば、ルミノール）；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、ならびにビオチンが挙げられる。
【０４４９】
当該分野で公知の技術は、本発明の抗体を標識するために適用され得る。このような技術として、二官能性の結合化剤の使用が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、米国特許第５，７５６，０６５号；同第５，７１４，６３１号；同第５，６９６，２３９号；同第５，６５２，３６１号；同第５，５０５，９３１号；同第５，４８９，４２５号；同第５，４３５，９９０号；同第５，４２８，１３９号；同第５，３４２，６０４号；同第５，２７４，１１９号；同第４，９９４，５６０号；および同第５，８０８，００３号（これらは、本明細書において、全体を通して参考として援用される）を参照のこと）。
【０４５０】
本発明の１つの実施形態は、動物（好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ましくはヒト）における目的のポリペプチドの異常な発現に関連する、疾患または障害の検出および診断である。１つの実施形態において、診断は、以下：（ａ）被験体に、目的のポリペプチドに特異的に結合する、有効量の標識分子を投与（例えば、非経口、皮下、または腹腔内）する工程；（ｂ）この投与に続いて、このポリペプチドが発現する被験体の部位において、標識分子が優先的に濃縮することを可能とする時間間隔（および結合していない標識分子がバックグラウンドレベルまで除去されること）を待つ工程；（ｃ）バックグラウンドレベルを決定する工程；および（ｄ）被験体において標識分子を検出する工程であって、その結果、バックグラウンドレベルより上の標識分子の検出が、この被験体が目的のポリペプチドの異常な発現に関連する特定の疾患または障害を有することを示す、工程を包含する。バックグラウンドレベルは、検出した標識分子の量を、特定の系に関して先に決定した標準値と比較することを含む、種々の方法によって、決定され得る。本明細書中に記載されるように、本発明の特定の実施形態は、本発明の抗体を使用して、Ｂ細胞株の細胞または単球株の細胞の濃縮を定量または定性することに関する。
【０４５１】
また本明細書中に記載されるように、本発明の抗体を使用して、免疫欠損を有する個体を、処置、診断、または予後判定し得る。特定の実施形態において、本発明の抗体を使用して、分類不能型免疫不全疾患（ＣＶＩＤ）またはこの疾患のサブセットを有する個体を、処置、診断、および／または予後判定する。別の実施形態において、本発明の抗体を使用して、血清（ｓｅｒｉｕｍ）免疫グロブリン産生の欠損、再発性の感染、および／または免疫系機能不全により特徴付けられる障害を、診断、予後判定、処置または予防する。
【０４５２】
また本明細書中に記載されるように、本発明の抗体を使用して、自己免疫疾患または障害を有する個体を、処置、診断、または予後判定し得る。特定の実施形態において、本発明の抗体を使用して、全身性エリテマトーデス、またはこの疾患のサブセットを有する個体を、処置、診断、および／または予後判定する。別の特定の実施形態において、本発明の抗体を使用して、慢性関節リウマチ、またはこの疾患のサブセットを有する個体を、処置、診断、および／または予後判定する。
【０４５３】
被験体の大きさおよび使用される画像化システムは、診断画像を作成するために必要とされる画像化部分の品質を決定することが、当該分野において理解される。放射性同位体部分の場合には、ヒト被験体に対して、注入される放射能の量は、通常、99ｍＴｃの約５〜２０ミリキュリーの範囲である。次いで、標識された抗体または抗体フラグメントは、優先的に、特定のタンパク質を含む細胞の位置に蓄積する。インビボ腫瘍画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇの第１３章：Ｔｈｅ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、Ｓ．Ｗ．ＢｕｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．（１９８２））に記載される。
【０４５４】
いくつかの変化（使用される標識の型および投与の様式を含む）に依存して、標識分子が優先的に被験体のある部位において濃縮されることを可能にし、かつ結合していない標識分子がバックグラウンドレベルまで排除されるための、投与に続く時間間隔は、６〜４８時間または６〜２４時間または６〜１２時間である。別の実施形態において、投与に続く時間間隔は、５〜２０日間または５〜１０日間である。
【０４５５】
１つの実施形態において、疾患または障害のモニタリングは、その疾患または疾患を診断するための方法を、例えば、最初の診断の１ヵ月後、最初の診断の６ヶ月後、最初の診断の１年後などに、繰り返すことによって、実施される。
【０４５６】
標識分子の存在は、当該分野において公知の方法を使用して、インビボ操作について、患者において検出され得る。これらの方法は、使用される標識の型に依存する。当業者は、特定の標識を検出するための適切な方法を決定し得る。本発明の診断方法において使用され得る方法およびデバイスとしては、コンピュータ連動断層撮影（ＣＴ）、陽電子（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）放射撮像断層（ＰＥＴ）のような全身走査、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）、および超音波検査が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４５７】
特定の実施形態において、分子は放射性同位体で標識され、そして放射応答性の外科用器具を使用して、患者において検出される（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、米国特許第５，４４１，０５０号）。別の実施形態において、分子は蛍光化合物で標識され、そして蛍光応答性の走査機器を使用して、患者において検出される。別の実施形態において、分子は陽電子放射材料で標識され、そして陽電子放射断層撮像法を使用して、患者において検出される。なお別の実施形態において、分子は常磁性標識で標識され、そして磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）を使用して患者において検出される。
【０４５８】
（キット）
本発明は、上記の方法において使用され得るキットを提供する。１つの実施形態において、キットは、１つ以上の容器において、本発明の抗体、好ましくは精製した抗体を備える。特定の実施形態において、本発明のキットは、エピトープを含む実質的に単離されたポリペプチドを備える。このエピトープは、キット中に含まれる抗体と特異的に免疫反応する。好ましくは、本発明のキットは、目的のポリペプチドと反応しないコントロール抗体をさらに備える。別の特定の実施形態において、本発明のキットは、本発明のポリペプチドの同一および／または異なる配列または領域を認識する、２つ以上の抗体（モノクローナルおよび／またはポリクローナル）を備える。別の特定の実施形態において、本発明のキットは、目的のポリペプチドへの抗体の結合を検出するための手段を備える（例えば、この抗体は、検出可能な基質（例えば、蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物もしくは発光化合物）に結合体化され得るか、または一次抗体を認識する二次抗体が、検出可能な基質と結合体化され得る）。
【０４５９】
本発明の別の特定の局面において、キットは、増殖性および／または癌性のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対して特異的な抗体を含む血清のスクリーニングに使用するための診断キットである。このようなキットは、目的のポリペプチドと反応しないコントロール抗体を備え得る。このようなキットは、エピトープを含む実質的に単離されたポリペプチド抗原を備え得る。このエピトープは、少なくとも１つの抗ポリペプチド抗原抗体と特異的に免疫反応する。さらに、このようなキットは、抗原に対する上記の抗体の結合を検出するための手段を備える（例えば、抗体は、蛍光化合物（例えば、フローサイトメトリーにより検出され得るフルオレセインまはたローダミン）と結合体化され得る）。特定の実施形態において、キットは、組換え的に産生されたポリペプチド抗原または化学的に合成されたポリペプチド抗原を備え得る。キットのポリペプチド抗原はまた、固体支持体に付着され得る。
【０４６０】
より特定の実施形態において、上記のキットの検出手段は、上記のポリペプチド抗原が付着する固体支持体を備える。このようなキットはまた、非付着レポーター標識化抗ヒト抗体を備え得る。この実施形態において、ポリペプチド抗原への抗体の結合は、上記のレポーター標識化抗体の結合によって検出され得る。
【０４６１】
さらなる実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドの抗原を含有する血清をスクリーニングする際に使用するための診断用キットを含む。この診断用キットは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド抗原と特異的に免疫反応性である実質的に単離された抗体、およびこの抗体に対するポリヌクレオチドまたはポリペプチド抗原の結合を検出する手段を含む。１つの実施形態では、この抗体は、固体支持体に付着される。特定の実施形態では、この抗体は、モノクローナル抗体であり得る。キットの検出手段は、第二の標識化されたモノクローナル抗体を含み得る。あるいは、またはさらに、この検出手段は、標識化された競合抗原を含み得る。
【０４６２】
１つの診断形態において、試験血清は、本発明の方法により得られる表面結合抗原を有する固相試薬と反応される。試薬への特異的抗原抗体の結合および洗浄による非結合血清成分の除去後、この試薬は、固体支持体上の結合された抗抗原抗体の量に比例してレポーターを試薬に結合するように、レポーター標識抗ヒト抗体と反応される。試薬は、再度、非結合標識抗体を除去するために洗浄され、そして、試薬と会合したレポーターの量が決定される。代表的には、このレポーターは、適切な比蛍光（ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ）基質または比色基質（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の存在下で固相をインキュベートすることにより検出される酵素である。
【０４６３】
上記アッセイにおける固体表面試薬は、固体支持材料（例えば、ポリマー性ビーズ、ディップスティック、９６ウェルプレート、またはフィルター材料）にタンパク質材料を付着するための公知の技術によって調製される。これらの付着方法は、一般に、支持体へのタンパク質の非特異的吸着、または固体支持体上の化学反応基（例えば、活性型カルボキシル基、ヒドロキシル基、またはアルデヒド基）へのタンパク質（代表的には、遊離アミン基を介する）の共有結合を包含する。あるいは、ストレプトアビジンコーティングプレートは、ビオチン化抗原と併用して使用され得る。
【０４６４】
従って、本発明は、本診断方法を実施するためのアッセイ系またはキットを提供する。このキットは、一般に、表面結合された組換え抗原を有する支持体、および表面結合抗抗原抗体を検出するためのレポーター標識抗ヒト抗体を含む。
【０４６５】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する抗体に関する。例えば、本発明は、部分的にまたは完全にのいずれかで、本発明のポリペプチドとのレセプター／リガンド相互作用を破壊する、抗体を含む。レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の両方が含まれる。リガンドの結合を妨げないが、レセプター活性化を妨げるレセプター特異的抗体が含まれる。レセプター活性化（すなわち、信号伝達）は、本明細書中に記載されるかまたは他の当該分野において公知の技術によって、決定され得る。また、リガンドの結合およびレセプター活性化の両方を妨げるレセプター特異的抗体が含まれる。同様に、リガンドに結合し、そしてリガンドのレセプターへの結合を妨げる中和抗体、ならびにリガンドに結合し、それによってレセプター活性化を妨げるが、リガンドがレセプターを結合することは妨げない抗体が含まれる。さらに、レセプターを活性化する抗体が含まれる。これらの抗体は、リガンドにより媒介されるレセプター活性化によって影響を受ける生物学的活性のすべてまたは一部のいずれかに対するアゴニストとして作用し得る。これらの抗体は、本明細書中に開示される特定の活性を含む生物学的活性に対するアゴニストまたはアンタゴニストとして特定化され得る。さらに、ニュートロカインαまたはニュートロカインαＳＶがニュートロカインαレセプターに結合するか否かにかかわらず、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶに結合する抗体が含まれる。これらの抗体は、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの、これらの抗体の存在下でのニュートロカインαレセプターへの結合に応答する、細胞増殖の増加に反映されるように、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのアゴニストとして作用する。上記の抗体アゴニストは、当該分野で公知の方法を用いて作製され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／４０２８１；米国特許第５，８１１，０９７号；Ｄｅｎｇ，Ｂ．ら、Ｂｌｏｏｄ  ９２（６）：１９８１−１９８８（１９９８）；Ｃｈｅｎ，Ｚ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６８−３６７８（１９９８）；Ｈａｒｒｏｐ，Ｊ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８６−１７９４（１９９８）；Ｚｈｕ，Ｚ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ：５８（１５）：３２０９−３２１４（１９９８）；Ｙｏｏｎ，Ｐ．Ｙ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（７）：３１７０−３１７９（１９９８）；Ｐｒａｔ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１１（Ｐｔ２）：２３７−２４７（１９９８）；Ｐｉｔａｒｄ，Ｖ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０５（２）：１７７−１９０（１９９７）；Ｌｉａｕｔａｒｄ，Ｊ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｄｅ  ９（４）：２３３−２４１（１９９７）；Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｎ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１２９５−１１３０１（１９９７）；Ｔａｒｙｍａｎ，Ｒ．Ｅ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ  １４（４）：７５５−７６２（１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒ，Ｙ．Ａ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ６（９）：１１５３−１１６７（１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋ，Ｐ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ８（１）：１４−２０（１９９６）（上記の文献はすべて、その全体が本明細書において参考として援用される）を参照のこと。
【０４６６】
少なくとも１４のモノクローナル抗体が、ニュートロカインαに対して生成された。これらのモノクローナル抗体は、以下のように指定される：１２Ｄ６、２Ｅ５、９Ｂ６、１Ｂ８、５Ｆ４、９Ａ５、１０Ｇ１２、１１Ｇ１２、１６Ｂ４、３Ｄ４、１６Ｃ９、１３Ｄ５、１５Ｃ１０、および１２Ｃ５。これらの抗体の予備分析は、各々が、ウェスタンブロット分析において、およびニュートロカインαタンパク質がＥＬＩＳＡプレートに結合する場合に、ニュートロカインαタンパク質に結合することを示す。しかし、抗体１２Ｄ６、２Ｅ５、９Ｂ６、１Ｂ８、５Ｆ４、９Ａ５、１０Ｇ１２、１１Ｇ１２、および１６Ｂ４のさらなる分析は、１２Ｄ６、９Ｂ６、２Ｅ５、１０Ｇ１２、９Ａ５、および１１Ｇ１２と指定される抗体のみが、ニュートロカインαの膜結合形態を結合することを示す。従って、ニュートロカインαに対して生成するモノクローナル抗体のサブセットは、ニュートロカインαの膜結合形態のみを結合する（すなわち、このサブセットは、配列番号２のアミノ酸１３４〜２８５に対応するニュートロカインαの可溶性形態を結合しない）ことが決定されており、このことは、本明細書中に記載するように、単球および樹状細胞上での発現に主として制限される。
【０４６７】
抗体９Ｂ６は、ニュートロカインαの膜結合形態に特異的に結合するが、ニュートロカインαの可溶性形態は結合しないことが見出された。
【０４６８】
抗体９Ｂ６のエピトープマッピングは、この抗体が、配列番号２の約Ｓｅｒ−１７１〜約Ｐｈｅ−１９４のアミノ酸残基に含まれるアミノ酸配列に特異的に結合することを示した。より具体的には、エピトープマッピングは、抗体９Ｂ６が、配列番号２のアミノ酸残基Ｌｙｓ−１７３〜Ｌｙｓ−１８８を含むペプチドに特異的に結合することを示した。
【０４６９】
対照的に、抗体１６Ｃ９および１５Ｃ１０は、ニュートロカインαの可溶性形態（配列番号２のアミノ酸１３４〜２８５）を結合し、そしてニュートロカインαにより媒介されるＢ細胞の増殖を阻害することが見出された。例えば、実施例１０を参照のこと。１５Ｃ１０抗体はまた、ニュートロカインαのそのレセプターに対する結合を阻害することが見出された。抗体１５Ｃ１０のエピトープマッピングは、この抗体が、配列番号２の約Ｇｌｕ−２２３〜約Ｔｙｒ−２４６のアミノ酸残基に含まれるアミノ酸配列に特異的に結合することを示した。より具体的には、エピトープマッピングは、抗体１５Ｃ１０が、配列番号２のアミノ酸残基Ｖａｌ−２２７〜Ａｓｎ−２４２を含むペプチドに特異的に結合することを示した。抗体１５Ｃ１０はまた、配列番号２のアミノ酸残基Ｐｈｅ−２３０〜Ｃｙｓ−２４５を含むペプチドに特異的に結合する。
【０４７０】
上述のように、抗ニュートロカインαモノクローナル抗体が、調製された。９Ｂ６および１５Ｃ１０と呼ばれる抗体を産生するハイブリドーマは、ＡＴＣＣに寄託され、そしてそれぞれ寄託番号ＰＴＡ−１１５８およびＰＴＡ−１１５９を登録された。１つの実施形態において、本発明の抗体は、登録番号ＰＴＡ−１１５８またはＰＴＡ−１１５９のもとで寄託されたハイブリドーマ細胞株によって分泌される１つ以上の抗体と同じ１つ以上の生物学的特徴を有する。「生物学的特徴」によって、抗体のインビトロまたはインビボでの活性または特性（例えば、ニュートロカインα（例えば、配列番号２のポリペプチド、ニュートロカインαの成熟形態、ニュートロカインαの膜結合形態、ニュートロカインαの可溶性形態（配列番号２のアミノ酸１３４〜２８５）およびニュートロカインαの抗原領域および／またはエピトープ領域）に結合する能力、ニュートロカインα／ニュートロカインαレセプター結合を実質的にブロックする能力、またはニュートロカインαにより媒介される生物学的活性（例えば、Ｂ細胞増殖および免疫グロブリン産生の刺激）をブロックする能力）を意味する。必要に応じて、本発明の抗体は、本明細書中で特に参照される抗体の少なくとも１つと同じエピトープに結合する。このようなエピトープ結合は、当該分野において公知のアッセイを使用して、慣用的に決定され得る。
【０４７１】
従って、１つの実施形態において、本発明は、ニュートロカインαの膜結合形態を特異的に結合してニュートロカインαの可溶性形態には結合しない、抗体を提供する。これらの抗体は、ニュートロカインαの膜結合形態を発現する単球系列を同定および／または単離するための診断プローブが挙げられるがこれに限定されない用途を有する。例えば、ニュートロカインαの膜結合形態の発現は、活性化単球において上昇し、従って、本発明に含まれる抗体を使用して、活性化単球のレベルを検出および／または定量し得る。さらに、ニュートロカインαの膜結合形態のみを結合する抗体を使用して、腫瘍性細胞、新生物発生前細胞、および／またはニュートロカインαの膜結合形態を発現する他の細胞（例えば、単球および樹状細胞）に対する毒素を標的化し得る。
【０４７２】
別の実施形態において、本発明の抗体は、ニュートロカインαの可溶性形態（配列番号２のアミノ酸１３４〜２８５）のみを特異的に結合する。これらの抗体が有する用途としては、生物学的サンプルにおける可溶性のニュートロカインαをアッセイするための診断プローブ、およびニュートロカインαレセプター（例えば、Ｂ細胞）を発現する細胞に対する毒素を標的化する治療剤、および／またはインビトロもしくはインビボでニュートロカインαにより媒介される生物学的活性（例えば、Ｂ細胞増殖および／または免疫グロブリン産生の刺激）を減少またはブロックするような用途が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４７３】
本発明はまた、膜結合形態および可溶性形態の両方のニュートロカインαを特異的に結合する抗体を提供する。
【０４７４】
上述のように、本発明は、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶが、ニュートロカインαレセプターおよび／またはニュートロカインαＳＶレセプターを、インビトロおよび／またはインビボで結合する能力を、阻害または減少させる抗体を含む。特定の実施形態において、本発明の抗体は、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶが、ニュートロカインαレセプターおよび／またはニュートロカインαＳＶレセプターを、インビトロで結合する能力を、阻害または減少する。別の非排他的な特定の実施形態において、本発明の抗体は、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶが、ニュートロカインαレセプターおよび／またはニュートロカインαＳＶレセプターを、インビボで結合する能力を阻害または減少する。このような阻害は、本明細書中に記載されるかまたは他の当該分野において公知の技術を使用して、アッセイされ得る。
【０４７５】
本発明はまた、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶに特異的に結合するが、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶが、ニュートロカインαレセプターおよび／またはニュートロカインαＳＶレセプターに、インビトロおよび／またはインビボで結合する能力を阻害しない、抗体を含む。特定の実施形態において、本発明の抗体は、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶが、ニュートロカインαレセプターおよび／またはニュートロカインαＳＶレセプターを、インビトロで結合する能力を、阻害または減少しない。別の非排他的な特定の実施形態において、本発明の抗体は、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶが、ニュートロカインαレセプターおよび／またはニュートロカインαＳＶレセプターを、インビボで結合する能力を、阻害または減少しない。
【０４７６】
上述のように、本発明は、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶにより媒介される生物学的活性を、インビトロおよび／またはインビボで阻害または減少する抗体を含む。特定の実施形態において、本発明の抗体は、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶにより媒介されるＢ細胞増殖を、インビトロで阻害または減少する。このような阻害は、本明細書中に記載されるかまたは他の当該分野において公知の、Ｂ細胞増殖アッセイを慣用的に改変することによって、アッセイされ得る。別の非排他的な特定の実施形態において、本発明の抗体は、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶにより媒介されるＢ細胞増殖を、インビボで阻害または減少する。特定の実施形態において、本発明の抗体は、１５Ｃ１０またはそのヒト化形態である。別の好ましい特定の実施形態において、この抗体は、１６Ｃ９またはそのヒト化形態である。従って、本発明の特定の実施形態において、１６Ｃ９抗体および／または１５Ｃ１０抗体、あるいはそのヒト化形態を使用して、可溶性ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶおよび／またはそのアゴニストおよび／またはアンタゴニストを結合し、これによってＢ細胞増殖を阻害する（部分的にかまたは完全にのいずれか）。
【０４７７】
あるいは、本発明はまた、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶに特異的に結合するが、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶにより媒介される生物学的活性（例えば、Ｂ細胞増殖の刺激）を、インビトロおよび／またはインビボで阻害または減少しない、抗体を含む。特定の実施形態において、本発明の抗体は、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶにより媒介される生物学的活性を、インビトロで阻害または減少しない。別の非排他的な実施形態において、本発明の抗体は、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶにより媒介される生物学的活性を、インビボで阻害または減少しない。特定の実施形態において、本発明の抗体は、９Ｂ６またはそのヒト化形態である。
【０４７８】
上述のように、本発明は、インビトロおよび／またはインビボで、本明細書中で特に参照される抗体の少なくとも１つと同じエピトープに特異的に結合する抗体を含む。
【０４７９】
特定の実施形態において、本発明の抗体は、インビトロで、配列番号２の約Ｓｅｒ−１７１〜約Ｐｈｅ−１９４のアミノ酸残基に含まれるアミノ酸配列に特異的に結合する。別の特定の非排他的な実施形態において、本発明の抗体は、インビボで、配列番号２の約Ｓｅｒ−１７１〜約Ｐｈｅ−１９４のアミノ酸残基に含まれるアミノ酸配列に特異的に結合する。別の特定の非排他的な実施形態において、本発明の抗体は、インビトロで、配列番号２のＬｙｓ−１７３〜Ｌｙｓ−１８８のアミノ酸残基に含まれるアミノ酸配列に特異的に結合する。別の特定の非排他的な実施形態において、本発明の抗体は、インビボで、配列番号２のＬｙｓ−１７３〜Ｌｙｓ−１８８のアミノ酸残基に含まれるアミノ酸配列に特異的に結合する。
【０４８０】
さらなる特定の実施形態において、本発明の抗体は、インビトロで、配列番号２の約Ｇｌｕ−２２３〜約Ｔｙｒ−２４６のアミノ酸残基に含まれるアミノ酸配列に特異的に結合する。別の特定の非排他的な実施形態において、本発明の抗体は、インビボで、配列番号２の約Ｇｌｕ−２２３〜約Ｔｙｒ−２４６のアミノ酸残基に含まれるアミノ酸配列を特異的に結合する。別の特定の非排他的な実施形態において、本発明の抗体は、インビトロで、配列番号２のＶａｌ−２２７〜Ａｓｎ−２４２のアミノ酸残基に含まれるアミノ酸配列に特異的に結合する。別の特定の非排他的な実施形態において、本発明の抗体は、インビボで、配列番号２のＶａｌ−２２７〜Ａｓｎ−２４２のアミノ酸残基に含まれるアミノ酸配列を特異的に結合する。別の特定の非排他的な実施形態において、本発明の抗体は、インビトロで、配列番号２のＰｈｅ−２３０〜Ｃｙｓ−２４５のアミノ酸残基に含まれるアミノ酸配列に特異的に結合する。別の特定の非排他的な実施形態において、本発明の抗体は、インビボで、配列番号２のＰｈｅ−２３０〜Ｃｙｓ−２４５のアミノ酸残基に含まれるアミノ酸配列に特異的に結合する。
【０４８１】
本発明はまた、ＰＴＡ−１１５９として寄託されたハイブリドーマにより産生される９Ｂ６モノクローナル抗体の、本発明のポリペプチド、好ましくは配列番号２のポリペプチド、より好ましくは配列番号２の残基Ｓｅｒ−１７１〜Ｐｈｅ−１９４のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する結合を、競合的に阻害する抗体を提供する。競合的な阻害は、当該分野において公知の任意の方法によって、例えば、本明細書中に記載の競合的結合アッセイを使用して、決定され得る。好ましい実施形態において、この抗体は、９Ｂ６モノクローナル抗体の、配列番号２への結合を、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、競合的に阻害するか、またはより好ましくは、このポリペプチドは、配列番号２の残基Ｓｅｒ−１７１〜Ｐｈｅ−１９４のアミノ酸配列を有する。
【０４８２】
本発明はまた、ＰＴＡ−１１５８として寄託されたハイブリドーマにより産生される１５Ｃ１０モノクローナル抗体の、本発明のポリペプチド、好ましくは配列番号２のポリペプチド、より好ましくは配列番号２の残基Ｇｌｕ−２２３〜Ｔｙｒ−２４６のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する結合を、競合的に阻害する抗体を提供する。好ましい実施形態において、この抗体は、１５Ｃ１０モノクローナル抗体の、配列番号２への結合を、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、競合的に阻害するか、またはより好ましくは、このポリペプチドは、配列番号２の残基Ｇｌｕ−２２３〜Ｔｙｒ−２４６のアミノ酸配列を有する。
【０４８３】
本発明のさらなる実施形態は、９Ｂ６抗体およびこの抗体を発現するハイブリドーマ細胞株に関する。抗体９Ｂ６を発現するハイブリドーマ細胞株は、２０００年１月７日にＡＴＣＣに寄託され、そしてＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１１５９を登録された。好ましい実施形態において、抗体９Ｂ６は、ヒト化される。
【０４８４】
本発明のさらなる実施形態は、１５Ｃ１０抗体およびこの抗体を発現するハイブリドーマ細胞株に関する。抗体１５Ｃ１０を発現するハイブリドーマ細胞株は、２０００年１月７日にＡＴＣＣに寄託され、そしてＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１１５８を登録された。好ましい実施形態において、抗体１５Ｃ１０は、ヒト化される。
【０４８５】
特定の実施形態において、上記の特定の抗体は、本明細書中に記載されるかまたは他の当該分野において公知の技術を使用してヒト化され、次いで本明細書中に記載されるような治療薬として使用される。
【０４８６】
別の特定の実施形態において、上に列挙した抗体のいずれかが、可溶性形態で使用される。
【０４８７】
別の特定の実施形態において、上に列挙した抗体のいずれかが、毒素または標識と結合体化される（上述のように）。このような結合体化抗体は、特定の細胞の集団を殺傷するため、または特定の細胞の集団を定量するために使用される。好ましい実施形態において、このような結合体化抗体は、表面でニュートロカインαレセプターを発現するＢ細胞を殺傷するために使用される。別の好ましい実施形態において、このような結合体化抗体は、表面でニュートロカインαレセプターを発現するＢ細胞を定量するために使用される。
【０４８８】
別の特定の実施形態において、上に列挙した抗体のいずれかは、毒素または標識と結合体化される（上述のように）。このような結合体化抗体は、特定の細胞の集団を殺傷するため、または特定の細胞の集団を定量するために使用される。好ましい実施形態において、このような結合体化抗体は、ニュートロカインαの膜結合形態を発現する単核細胞を殺傷するために使用される。別の好ましい実施形態において、このような結合体化抗体は、ニュートロカインαの膜結合形態を発現する単核細胞を定量するために使用される。
【０４８９】
本発明の抗体はまた、治療薬および／または予防薬としての用途を有する。これらとしては、ニュートロカインαの膜結合形態を細胞表面で発現する、単核細胞を活性化するか、または単核細胞をブロックするか、そして／または単核細胞系列を殺傷する際（例えば、骨髄性白血病、単球に基づく白血病およびリンパ腫、単球増加、単球減少、慢性関節リウマチ、ならびに活性化単核細胞に関連する他の疾患または状態を、処置、予防、および／または診断するため）のものが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本発明の抗体は、補体を結合する。他の特定の実施形態において、本明細書中にさらに記載されるように、本発明の抗体（またはそのフラグメント）は、異種ポリペプチドまたは核酸（例えば、内因性細胞傷害性エフェクター系に結合してこれを活性化する化合物、および放射性同位体；ならびに細胞傷害性プロドラッグのような、毒素）と会合する。
【０４９０】
別の実施形態において、１つ以上のモノクローナル抗体が産生され、ここで、これらはニュートロカインαおよび／またはそのムテインを認識または結合するが、ニュートロカインαＳＶおよび／またはそのムテインを認識または結合しない。関連する実施形態において、１つ以上のモノクローナル抗体が産生され、ここでこれらは、ニュートロカインαＳＶおよび／またはそのムテインを認識または結合するが、ニュートロカインαおよび／またはそのムテインを認識または結合しない。
【０４９１】
上記で議論されるように、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドは、次に、当業者に周知の技術を使用して、ニュートロカインαを「模倣する」抗イデオタイプ抗体を生成するために利用される（例えば、ＧｒｅｅｎｓｐａｎおよびＢｏｎａ、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．７（５）：４３７−４４４（１９８９）、ならびにＮｉｓｓｉｎｏｆｆ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１）を参照のこと）。例えば、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶを結合し、そしてニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの多量体化および／またはリガンドへの結合を相補的に阻害する抗体を使用して、ニュートロカインαＴＮＦの多量化および／または結合ドメイン、ならびにつづいて、ニュートロカインαもしくはニュートロカインαＳＶおよび／またはそのリガンドの結合および中和を「模倣する」抗イデオタイプを作製し得る。抗イデオタイプまたはこのような抗イデオタイプのＦａｂフラグメントのこのような中和は、ニュートロカインαリガンドを中和するための治療レジメンにおいて使用され得る。例えば、このような抗イデオタイプ抗体を使用して、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶを結合し得るか、またはニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのレセプターをＢ細胞系統の細胞表面上で結合し得、これによってニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶにより媒介されるＢ細胞の活性化、増殖、および／または分化をブロックし得る。
【０４９２】
（免疫系関連障害の診断）
ニュートロカインαは、腎臓、肺、末梢生白血球、骨髄、Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、活性化Ｔ細胞、胃ガン、平滑筋、マクロファージ、および臍帯血液組織、ならびに特に、単球系列の細胞において、発現される。さらに、ニュートロカインαは、一次樹状細胞において発現される。さらに、ニュートロカインαは、以下の非造血腫瘍細胞株の細胞表面において、発現される。結腸癌ＨＣＴ
１１６（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ−２４７）およびＨＴ−２９（ＡＴＣＣ登録番号ＨＴＢ−３８）、結腸腺癌Ｃａｃｏ−２（ＡＴＣＣ登録番号ＨＴＢ−３７）、ＣＯＬＯ  ２０１（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ−２２４）、およびＷｉＤｒ（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ−２１８）；胸腺癌  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ登録番号ＨＴＢ−２６）；膀胱鱗状癌ＳＣａＢＥＲ（ＡＴＣＣ登録番号ＨＴＢ−３）；膀胱癌ＨＴ−１１９７（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−１４７３）；腎臓癌Ａ−４９８（ＡＴＣＣ登録番号ＨＴＢ−４４）、Ｃａｋｉ−１（ＡＴＣＣ登録番号ＨＴＢ−４６）、およびＣａｋｉ−２（ＡＴＣＣ登録番号ＨＴＧ−４７）；肝臓、ウィルムス腫ＳＫ−ＮＥＰ−１（ＡＴＣＣ登録番号ＨＴＢ−４８）；ならびに副膵癌Ｈｓ  ７６６Ｔ（ＡＴＣＣ登録番号ＨＴＢ−１３４）、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−１４２０）、およびＳＵ．８６．８６（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−１８３７）。多数の免疫系関連障害については、「標準的な」ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶ遺伝子発現レベル（すなわち、障害を有していない個体からの組織または体液におけるニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの発現レベル）と比較して、実質的に変化した（増加または減少）レベルのニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶ遺伝子発現が、免疫系組織または他の細胞もしくは体液（例えば、血清、血漿、尿、関節液、または髄液）において検出され得る。従って、本発明は、障害の診断の間に有用である診断方法を提供し、この方法は、個体由来の免疫系組織または他の細胞もしくは体液において、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを測定すること、ならびにこの測定した遺伝子発現レベルを、標準的なニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶ遺伝子発現レベルと比較することを包含し、これによって、標準と比較した遺伝子発現レベルの増加または減少が、免疫系障害または正常な活性化、増殖、分化、および／もしくは死を指標する。
【０４９３】
特に、免疫系の細胞または組織の癌を有する哺乳動物における、特定の組織は、「標準」レベルと比較した場合に、有意に増加または減少したレベルのニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドならびにニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶをコードするｍＲＮＡを発現すると、考えられる。さらに、増加または減少したレベルのニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶは、癌を有さない同じ種の哺乳動物由来の血清と比較した場合に、このような癌を有する哺乳動物由来の特定の体液（例えば、血清、血漿、尿、および髄液）または細胞もしくは組織において、検出され得ると考えられる。
【０４９４】
例えば、本明細書中に開示されるように、ニュートロカインαは、単核細胞系列の細胞において高度に発現される。従って、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ニュートロカインα  ｍＲＮＡおよび／またはニュートロカインαＳＶ  ｍＲＮＡの全てまたは一部に対して相補的なポリヌクレオチド配列）、ならびに本発明のポリペプチドに対して指向される抗体（および抗体フラグメント）を使用して、細胞表面においてニュートロカインαを発現する単核細胞の系列（例えば、単球性白血病細胞）を定性またはその濃度を定量し得る。これらの抗体は、さらに、ニュートロカインα遺伝子発現のレベルの異常、あるいはニュートロカインαおよび／もしくはニュートロカインαＳＶの構造および／または一次的な、組織の、細胞の、または非細胞の位置の異常を検出する際に、診断的な適用を有する。これらの診断アッセイは、インビボまたはインビトロで（例えば、血液サンプル、生検組織または検死組織において）実施され得る。
【０４９５】
さらに、本明細書中に開示されるように、ニュートロカインαレセプターは、主として、Ｂ細胞系列の細胞において発現される。従って、本発明のニュートロカインαポリペプチド（標識ニュートロカインαおよびニュートロカインα融合タンパク質を含む）、ならびに本発明のポリペプチドに対する抗ニュートロカインα抗体（抗ニュートロカインα抗体フラグメントを含む）を使用して、細胞表面でニュートロカインαレセプターを発現するＢ細胞系列の細胞（例えば、Ｂ細胞関連白血病またはリンパ腫）を定性またはその濃度を定量し得る。これらのニュートロカインαポリペプチドおよび抗体は、さらに、ニュートロカインαレセプター遺伝子発現のレベルの異常、あるいはニュートロカインαレセプターおよび／もしくはニュートロカインαに関連するシグナル伝達経路の診断活性／欠損の、構造および／または一次的な、組織の、細胞の、または非細胞の位置の異常を検出する際に、診断的な適用を有する。これらの診断アッセイは、インビボまたはインビトロで（例えば、血液サンプルまたは生検組織において）、本明細書中に記載されるかまたは他の当該分野において公知の技術を使用して、実施され得る。
【０４９６】
１つの実施形態において、本発明の、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのアゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、抗ニュートロカインα抗体および／または抗ニュートロカインαＳＶ抗体）を、免疫欠損を有する個体を処置、予防、診断、または予後判定するために、使用し得る。
【０４９７】
本発明の、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのアゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、抗ニュートロカインα抗体および／または抗ニュートロカインαＳＶ抗体）を使用して、処置、予防、診断、および／または予後判定し得る免疫欠損としては、以下から選択される１つ以上の免疫欠損が挙げられるが、それに限定されない：重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）−Ｘ連鎖、ＳＣＩＤ−常染色体、アデノシンデアミナーゼ欠損（ＡＤＡ欠損）、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）、Ｂｒｕｔｏｎ病、先天性無ガンマグロブリン血症、Ｘ連鎖乳児無ガンマグロブリン血症、後天性無ガンマグロブリン血症、成体発生無ガンマグロブリン血症、遅発性無ガンマグロブリン血症、異常ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血症、一過性乳児低ガンマグロブリン血症、特定されない低ガンマグロブリン血症、無ガンマグロブリン血症、分類不能型免疫不全（ＣＶＩＤ）（後天性）、ヴィスコット−オールドリッチ症候群（ＷＡＳ）、過剰ＩｇＭを伴うＸ連鎖免疫欠損、過剰ＩｇＭを伴う非Ｘ連鎖免疫欠損、選択的ＩｇＭ欠損、ＩｇＧサブクラス欠損（ＩｇＡ欠損を伴うかまたは伴わない）、正常なまたは上昇したＩｇを伴う抗体欠損、胸腺腫を伴う免疫欠損、Ｉｇ重鎖欠失、κ鎖欠損、Ｂ細胞リンパ増殖障害（ＢＬＰＤ）、選択的ＩｇＭ免疫欠損、劣性無ガンマグロブリン血症（スイス型）、網様発育不全、新生児好中球減少、重篤な先天性白血球減少、胸腺リンパ形成不全（免疫欠損を伴う発育不全または形成異常）、毛細血管拡張性運動失調、短四肢小人症、Ｘ連鎖リンパ増殖症候群（ＸＬＰ）、ネゼロフ症候群（Ｉｇを伴う複合型免疫欠損）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ欠損（ＰＮＰ）、ＭＨＣクラスＩＩ欠損（不全リンパ球症候群）および重症複合型免疫不全。
【０４９８】
本実施形態に従って、免疫不全を有する個体は、免疫不全を有さない個体と比較した場合に、異常に低レベルのニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶを発現する。本明細書中に記載されるかまたは他の当該分野において公知の任意の手段を提供して、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶポリヌクレオチドまたはポリペプチドを検出し（例えば、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドのＦＡＣＳ分析もしくはＥＬＩＳＡ検出、ならびに本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションもしくはＰＣＲ検出）、そして生物学的サンプル中の、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶ、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現プロフィールを決定し得る。
【０４９９】
免疫不全に罹患している人物の生物学的サンプルは、免疫不全を有さない個体において観察されるもの比較した場合に、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの低レベルの発現により、特徴付けられる。従って、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、ならびに／あるいはそのアゴニストまたはアンタゴニストは、本発明の方法に従って、免疫不全の診断および／または予後判定において使用され得る。例えば、免疫不全に罹患していると疑われる人物（「被験体」）から得た生物学的サンプルは、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの相対的な発現レベルに関して、分析され得る。次いで、本発明の１つ以上のこれらの分子の発現レベルが、免疫不全を罹患しないことが既知である人物における発現と同一の本発明の分子の発現レベルと比較される。ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶ、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、ならびに／あるいはそのアゴニストおよび／またはアンタゴニストの発現レベルの、被験体およびコントロールから得たサンプル間の有意な差異は、その被験体が免疫不全に罹患していることを示唆する。
【０５００】
別の実施形態において、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶアゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、抗ニュートロカインα抗体および／または抗ニュートロカインαＳＶ抗体）を使用して、分類不能型免疫不全（「ＣＶＩＤ」；「後天性無ガンマグロブリン血症」および「後天性低ガンマグロブリン血症」としても公知）またはこの疾患のサブセットを有する個体を処置、診断、および／または予後判定する。本実施形態に従って、ＣＶＩＤを有する個体またはＣＶＩＤを有する個体のサブセットは、ＣＶＩＤを有さない個体と比較した場合に、異常なレベルのニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαレセプターを、Ｂ細胞および／または単核細胞上で発現する。本明細書中に記載されるかまたは他の当該分野において公知の任意の手段を適用して、本発明のニュートロカインαポリヌクレオチドまたはポリペプチドおよび／またはニュートロカインαレセプターポリペプチド（例えば、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドのＦＡＣＳ分析もしくはＥＬＩＳＡ検出、ならびに本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションもしくはＰＣＲ検出）を検出し得、そしてニュートロカインα、および／または本発明のニュートロカインαＳＶポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはニュートロカインαレセプターポリペプチドの、少なくともＢ細胞またはその成分（例えば、ＲＮＡ）を含有するサンプルと比較した場合の、少なくとも単核細胞またはいくらかのその成分（例えば、ＲＮＡ）を含有するサンプル中での発現プロフィールの差異を決定し得る。少なくとも単核細胞またはいくらかのその成分（例えば、ＲＮＡ）を含有するサンプルが、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を反映することが決定され、そして少なくともＢ細胞またはその成分（例えば、ＲＮＡ）を含有するサンプルが、正常レベル未満のニュートロカインαレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド発現を反映することが決定される場合には、このサンプルは、ＣＶＩＤ（すなわち、「後天性無ガンマグロブリン血症」または「後天性低ガンマグロブリン血症」）の発生に相関付けられ得る。
【０５０１】
ＣＶＩＤに罹患している人物のサブセットは、ＣＶＩＤを有さない個体において得られるものと比較した場合の、末梢または循環Ｂ細胞における、ニュートロカインαおよびニュートロカインαレセプター（「ＮＡＲ」）の両方の高レベルの発現によって、特徴付けられる。対照的に、ＣＶＩＤを罹患しない人物は、代表的に、末梢または循環Ｂ細胞における低レベルのニュートロカインα発現および高レベルのＮＡＲ発現によって、特徴付けられる。従って、ニュートロカインα、ニュートロカインαＳＶポリペプチド、および／またはＮＡＲポリペプチド、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、および／またはそのアゴニストもしくはアンタゴニストを、本発明の方法に従って、ＣＶＩＤのこのサブセットの差示的診断において、使用し得る。例えば、ＣＶＩＤに罹患していると疑われる人物（「被験体」）から得た末梢Ｂ細胞を含むサンプルは、本発明のニュートロカインα、ニュートロカインαＳＶ、および／またはＮＡＲポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの相対的な発現レベルに関して、分析され得る。次いで、１つ以上のこれらの本発明の分子の発現レベルが、ＣＶＩＤを罹患していないことが基地である人物（「コントロール」）において発現されるものと同じ本発明の分子の発現レベルと比較される。本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶポリヌクレオチドまたはポリペプチド、および／またはＮＡＲポリペプチドおよび／またはＮＡＲポリペプチド、ならびに／あるいはそのアゴニストおよび／またはアンタゴニストの発現レベルの、被験体およびコントロールから得たサンプル間での有意な差異は、この被験体がＣＶＩＤのこのサブセットを罹患していることが示唆される。
【０５０２】
特定の実施形態において、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはそのアゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、抗ニュートロカインα抗体、および／または抗ニュートロカインαＳＶ抗体）を使用して、欠損した血清免疫グロブリン産生、再発性感染、および／または免疫系機能不全により特徴付けられる疾患を、診断、予後判定、処置、または予防する。さらに、ニュートロカインα、および／またはニュートロカインαＳＶポリヌクレオチドまたはポリペプチド、またはそのアゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、抗ニュートロカインα抗体および／または抗ニュートロカインαＳＶ抗体）を使用して、関節、骨、皮膚、および／または耳下腺の感染、血行性の感染（例えば、敗血症、髄膜炎、敗血症網膜炎、および／または骨髄炎）、自己免疫疾患（例えば、本明細書中に開示されるもの）、炎症性疾患、および悪性疾患、ならびに／またはこれらの炎症、疾患、障害および／または悪性疾患に関連する任意の疾患または障害または状態（ＣＶＩＤ、他の初期免疫不全、ＨＩＶ疾患、ＣＬＬ、再発性気管支炎、静脈洞炎、中耳炎、結膜炎、肺炎、肝炎、髄膜炎、帯状疱疹（例えば、重篤な帯状疱疹）、および／またはニューモシスティスカリニが挙げられるが、これらに限定されない）を、診断、予後判定、処置、または予防する。
【０５０３】
別の実施形態において、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたはニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶアゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、抗ニュートロカインα抗体および／または抗ニュートロカインαＳＶ抗体）を使用して、自己免疫疾患または障害を有する個体を、処置、診断、または予後判定する。
【０５０４】
本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたはニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶアゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、抗ニュートロカインα抗体および／または抗ニュートロカインα抗体）を使用して、処置、診断、または予後判定され得る自己免疫疾患または障害としては、以下のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない：自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性新生児血小板減少、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性血球減少症、溶血性貧血、抗リン脂質症候群、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、心筋炎、再発性多発性軟骨炎、リウマチ性心疾患、糸球体腎炎（例えば、ＩｇＡネフロパシー）、多発性硬化症、神経炎、ブドウ膜炎眼炎、多発性内分泌腺症、紫斑（例えば、Ｈｅｎｌｏｃｈ−Ｓｃｏｅｎｌｅｉｎ紫斑）、ライター病、スティッフマン症候群、自己免疫性肺炎症、ギヤン−バレー症候群、インスリン依存性真性糖尿病、および自己免疫炎症目、自己免疫性甲状腺炎（すなわち、橋本甲状腺炎）、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、天疱瘡、レセプター自己免疫（例えば、（ａ）グレーヴズ病、（ｂ）重症筋無力症、および（ｃ）インスリン抵抗性）、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性性血小板減少性紫斑病、慢性関節リウマチ、抗コラーゲン抗体を伴う強皮症（ｓｃｈｌｅｒｏｄｅｒｍａ）、混合結合組織病、多発性筋炎／皮膚筋炎、悪性貧血、突発性アディソン病、不妊症、糸球体腎炎（例えば、一次糸球体腎炎およびＩｇＡネフロパシー）、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、真性糖尿病、およびアドレナリン作用性薬物耐性（喘息または嚢胞性線維症を伴うアドレナリン作用性薬物耐性を含む）、慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、他の内分泌腺不全、白斑、脈管炎、ＭＩ後（ｐｏｓｔ−ＭＩ）、心臓切開症候群、じんま疹、アトピー性皮膚炎、喘息、炎症性ミオパシー、ならびに他の炎症性障害、顆粒性障害、変性障害、および萎縮性障害。
【０５０５】
本実施形態に従って、自己免疫疾患または障害を有する個体は、自己免疫疾患または障害を有さない個体と比較した場合に、異常に高レベルのニュートロカインα、ニュートロカインαＳＶ、および／またはＮＡＲを発現する。本明細書中に記載されるかまたは他の当該分野において公知の任意の手段を適用して、ニュートロカインα、および／または本発明のニュートロカインαＳＶポリヌクレオチドまたはポリペプチド、および／またはＮＡＲポリペプチドを検出し得（例えば、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドの、ＦＡＣＳ分析もしくはＥＬＩＳＡ検出、ならびに本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションもしくはＰＣＲ検出）、そしてニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶ、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、および／またはＮＡＲポリペプチドの、生物学的サンプルにおける発現プロフィールを決定し得る。
【０５０６】
自己免疫疾患または障害に罹患している人物の生物学的サンプルは、自己免疫疾患または障害を有さない個体において観察されるものと比較した場合に、ニュートロカインα、ニュートロカインαＳＶ、および／またはＮＡＲの高レベルの発現によって、特徴付けられる。従って、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、および／またはそのアゴニストもしくはアンタゴニストを、本発明の方法に従って、自己免疫疾患または障害の診断および／または予後判定において使用し得る。例えば、自己免疫疾患または障害に罹患していることが疑われる人物（「被験体」）から得られる生物学的サンプルは、ニュートロカインα、および／または本発明のニュートロカインαＳＶポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドおよび／またはＮＡＲポリペプチドの相対的な発現レベルに関して分析され得る。次いで、本発明の１つ以上のこれらの分子の発現レベルが、自己免疫疾患または障害に罹患していないことが既知である人物において発現されるものと比較される。ニュートロカインα、および／またはニュートロカインαＳＶ、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、および／またはそのアゴニストおよび／またはアンタゴニスト、および／またはＮＡＲポリペプチドの、被験体およびコントロールから得られるサンプル間の発現レベルの有意な差異は、この被験体が自己免疫疾患または障害に罹患していることを示唆する。
【０５０７】
別の実施形態において、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶポリヌクレオチドもしくはポリペプチドあるいはニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶアゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、抗ニュートロカインα抗体および／または抗ニュートロカインαＳＶ抗体）を使用して、全身性エリテマトーデスまたはこの疾患のサブセットを有する個体を、処置、診断、または予後判定する。この実施形態によれば、全身性エリテマトーデスを有する個体または全身性エリテマトーデスを有する個体のサブセットは、全身性エリテマトーデスを有さない個体または全身性エリテマトーデスのサブセットを有さない個体と比較した場合に、異常に高レベルのニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶを発現する。本明細書中に記載されるかまたは他の当該分野において公知の任意の手段を提供して、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶポリヌクレオチドまたはポリペプチドを検出し（例えば、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドのＦＡＣＳ分析もしくはＥＬＩＳＡ検出、ならびに本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションもしくはＰＣＲ検出）、そして生物学的サンプル中の、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶ、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現プロフィールを決定し得る。
【０５０８】
全身性エリテマトーデスに罹患している人物の生物学的サンプルは、全身性エリテマトーデスを有さない個体において観察されるもの比較した場合に、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの低レベルの発現により、特徴付けられる。従って、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、ならびに／あるいはそのアゴニストまたはアンタゴニストは、本発明の方法に従って、全身性エリテマトーデスの診断および／または予後判定において使用され得る。例えば、全身性エリテマトーデスに罹患していると疑われる人物（「被験体」）から得た生物学的サンプルは、ニュートロカインα、ならびに／あるいは本発明のニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの相対的な発現レベルに関して、分析され得る。次いで、本発明の１つ以上のこれらの分子の発現レベルが、全身性エリテマトーデスを罹患しないことが既知である人物における発現と同一の本発明の分子の発現レベルと比較される。ニュートロカインα、および／またはニュートロカインαＳＶ、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、ならびに／あるいはそのアゴニストおよび／またはアンタゴニストの発現レベルの、被験体およびコントロールから得たサンプル間の有意な差異は、その被験体が全身性エリテマトーデスに罹患していることを示唆する。
【０５０９】
さらに、全身性エリテマトーデス、またはこの疾患のサブセットの重症度と本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチド（ＲＮＡ）および／またはポリペプチドの濃度との間に直接の相関がある。従って、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチド、（ＲＮＡ）、ポリペプチドおよび／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、全身性エリテマトーデスまたは全身性エリテマトーデスのサブセットの重症度の予後の判断において、本発明の方法に従って使用され得る。例えば、全身性エリテマトーデスに罹患していると疑われる人（「被験体」）から得られた生物学的サンプルを、本発明のニュートロカインα、および／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの相対的な発現レベルについて分析し得る。次いで、本発明のこれらの分子の１つ以上の発現レベルが、この疾患の重症度における範囲を表すことが既知の人のパネルにおいて発現されるのと同じ本発明の発現レベルと比較される。この方法に従って、パネルの特徴付けられたメンバーとの発現レベルの一致は、疾患の重症度を示す。
【０５１０】
別の実施形態において、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチドまたはポリペプチドあるいはニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのアゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、抗ニュートロカインαおよび／または抗ニュートロカインαＳＶ抗体）は、慢性関節リウマチまたはこの疾患のサブセットを有する個体を処置、診断、または予後の判断をするために使用される。本実施形態に従って、慢性関節リウマチを有する個体または慢性関節リウマチを有する個体のサブセットが、慢性関節リウマチまたは慢性関節リウマチのこのサブセットを有さない個体と比較した場合、異常に高いレベルのニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶを発現する。本明細書中に記載されるかまたはそうでなければ当該分野で公知の任意の手段が適用され得、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチドまたはポリペプチドを検出（例えば、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドのＦＡＣＳ分析またはＥＬＩＳＡ検出ならびに本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ検出）し、そして生物学的サンプル中の本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオドおよび／またはポリペプチドの発現プロフィールを決定する。
【０５１１】
慢性関節リウマチに罹患した人の生物学的サンプルは、慢性関節リウマチを有さない個体で観測されるレベルと比較した場合、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの高い発現レベルによって特徴付けられる。従って、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、ならびに／あるいはそのアゴニストまたはアンタゴニストは、慢性関節リウマチまたは慢性関節リウマチのサブセットの診断および／または予後において本発明の方法に従って使用され得る。例えば、慢性関節リウマチに罹患していると疑われる人（「被験体」）から得られた生物学的サンプルを、本発明のニュートロカインα、および／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの相対的な発現レベルについて分析し得る。次いで、本発明のこれらの分子の１つ以上の発現レベルが、慢性関節リウマチに罹患していないことが既知の人において発現されるのと同じ本発明の分子の発現レベルと比較される。被験体およびコントロールから得られたサンプル間の、本発明のニュートロカインα、および／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、ならびに／あるいはそのアゴニストおよび／またはアンタゴニストの発現レベルの有意な違いは、その被験体が、慢性関節リウマチまたはそのサブセットに罹患していることを示唆する。
【０５１２】
従って、本発明は、免疫系の癌、ならびに免疫不全および／または自己免疫疾患を含む免疫系障害の診断の間に有用な診断方法を提供し、この方法は、個体からの免疫系組織または他の細胞あるいは体液中のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程、ならびに測定された遺伝子発現レベルと標準的なニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの遺伝子発現レベルとを比較する工程を包含し、これによって、標準と比較した遺伝子発現レベルの増加または減少が、免疫系の障害を示す。
【０５１３】
腫瘍の診断、自己免疫不全の診断、および／または自己免疫疾患の診断を含むが、これらには限定されない免疫系の障害の診断が、すでに従来の方法に従ってなされている場合、本発明は、予後のインジケーターとして有用であり、これによって、高められたかまたは抑制されたニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの遺伝子発現を示す患者が、標準的なレベルに近いレベルで遺伝子を発現する患者に対してより悪い臨床的結果を経験する。
【０５１４】
ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを分析または決定することによって、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドのレベルあるいは第１の生物学的サンプル中のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドをコードするｍＲＮＡのレベルを、直接的（例えば、完全なタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルを決定または推定することによって）、または相対的（例えば、第２の生物学的サンプル中のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルを比較することによって）のいずれかで定性的または定量的に測定または推定することが意図される。好ましくは、第１の生物学的サンプル中のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルを測定または推定し、そして標準的なニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルを比較する。標準は、障害を有さない個体から得られた第２の生物学的サンプルからとられるか、または免疫系の障害を有さない個体の集団からの平均レベルによって決定される。当該分野で明らかなように、一旦、標準的なニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルが既知となると、比較のための標準として繰り返し使用され得る。
【０５１５】
「生物学的サンプル」によって、個体、体液、細胞株、組織培養物、あるいはニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドまたはｍＲＮＡを含む他の供給源から得られる任意の生物学的サンプルが意図される。示されるように、生物学的サンプルとしては、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドの遊離した細胞外ドメインを含む体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液、および髄液）、免疫系組織、およびニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶあるいはニュートロカインαのレセプターおよび／またはニュートロカインαＳＶのレセプターの完全なまたは遊離した細胞外ドメインを発現することが見出された他の組織供給源が挙げられる。哺乳動物から組織生検および体液を得るための方法は当該分野で周知である。生物学的サンプルがｍＲＮＡを含む場合、組織生検が好ましい供給源である。
【０５１６】
本発明の化合物は、哺乳動物（好ましくはヒト）における種々の免疫系関連障害の診断、予後の判断または処置に有用である。このような障害としては、腫瘍（例えば、Ｂ細胞および単核細胞の白血病およびリンパ種）、ならびに腫瘍転移、細菌、ウイルスおよび他の寄生生物による感染、免疫不全症、炎症性疾患、リンパ節腫脹、自己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、混合結合組織病、および炎症性筋障害）ならびに対宿主性移植片疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５１７】
全細胞ＲＮＡが、任意の適切な技術（例えば、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９（１９８７）に記載されている一工程のグアニジニウム（ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ）−チオシアネート−フェノール−クロロホルム法）を使用して生物学的サンプルから単離され得る。次いで、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのペプチドをコードするｍＲＮＡのレベルが、任意の適切な方法を用いてアッセイされる。これらは、ノーザンブロット分析、Ｓ１ヌクレアーゼマッピング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）、およびリガーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＬＣＲ）を含む。
【０５１８】
生物学的サンプル中のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドレベルのアッセイは、抗体に基づく技術を用いて起こり得る。例えば、組織におけるニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドの発現は、古典的な免疫組織学的方法で研究され得る（Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７））。ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドの遺伝子発現を検出するための有用な他の抗体に基づく方法としては、イムノアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））が挙げられる。適切な抗体アッセイの標識は、当該分野において公知であり、そしてグルコースオキシダーゼのような酵素標識、ならびに放射性同位元素（例えば、ヨウ素（131Ｉ、125Ｉ、123Ｉ、121Ｉ）、炭素（14Ｃ）、イオウ（35Ｓ）、トリチウム（3Ｈ）、インジウム（115mＩｎ、113mＩｎ、112Ｉｎ、111Ｉｎ）、およびテクネチウム（99Ｔｃ、99mＴｃ）、タリウム（201Ｔｉ）、ガリウム（68Ｇａ、67Ｇａ）、パラジウム（103Ｐｄ）、モリブデン（99Ｍｏ）、キセノン（133Ｘｅ）、フッ素（18Ｆ）、153Ｓｍ、177Ｌｕ、159Ｇｄ、149Ｐｍ、140Ｌａ、175Ｙｂ、166Ｈｏ、90Ｙ、47Ｓｃ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、142Ｐｒ、105Ｒｈ、97Ｒｕ）；発光標識（例えば、ルミノール）；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）ならびにビオチン）が挙げられる。
【０５１９】
当該分野で公知の技術が、本発明の抗体を標識するために適用され得る。このような技術としては、二官能性結合剤の使用（例えば、米国特許第５，７５６，０６５号；同第５，７１４，６３１号；同第５，６９６，２３９号；同第５，６５２，３６１号；同第５，５０５，９３１号；同第５，４８９，４２５号；同第５，４３５，９９０号；同第５，４２８，１３９号；同第５，３４２，６０４号；同第５，２７４，１１９号；同第４，９９４，５６０号；および同第５，８０８，００３号を参照のこと；これら各々の内容は、本明細書によって参考としてその全体が援用される）が挙げられるが、これに限定されない。
【０５２０】
分析される組織または細胞型としては、一般的に、ニュートロカインα遺伝子を発現することが既知かまたは疑われる組織または細胞型（例えば、単核細胞系統の細胞）、あるいはニュートロカインαレセプター遺伝子を発現することが既知かまたは疑われる細胞または組織（例えば、Ｂ細胞系統の細胞および脾臓）が挙げられる。本明細書中で使用されるタンパク質の単離方法は、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．，１９８８，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（これは、本明細書中においてその全体で参考として援用される）に記載されるものであり得る。単離された細胞は、細胞培養物または患者由来であり得る。培養物から採取された細胞の分析は、細胞に基づく遺伝子治療技術の一部として使用され得る細胞の評価において、あるいはニュートロカインα遺伝子またはニュートロカインαレセプター遺伝子の発現に対する化合物の効果を試験するために必要な工程であり得る。
【０５２１】
例えば、本明細書中に記載されるような抗体、または抗体のフラグメントが、ニュートロカインα遺伝子産物または保存的改変体またはそのペプチドフラグメントの存在を定量的または定性的に検出するために使用され得る。例えば、これは、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、または蛍光計検出に接続される蛍光標識された抗体を使用する免疫蛍光技術によって達成され得る。
【０５２２】
本発明の抗体（またはそのフラグメント）またはニュートロカインαのポリペプチドまたはポリペプチドは、さらに、ニュートロカインα遺伝子産物もしくは保存的改変体またはそのペプチドフラグメントのインサイチュで検出のために、あるいはニュートロカインαレセプターに結合するニュートロカインαについてインサイチュで検出するために、免疫蛍光、免疫電子顕微鏡または非免疫学的アッセイとして組織学的に使用され得る。インサイチュ検出は、患者から組織学的試料を取り出し、そしてそこに本発明の標識された抗体またはニュートロカインαポリペプチドを適用することによって達成され得る。抗体（またはフラグメント）またはニュートロカインαポリペプチドは、好ましくは、標識された抗体（またはフラグメント）を生物学的サンプルに重ねることによって適用される。このような手順の使用によって、ニュートロカインα遺伝子産物、または保存的改変体またはペプチドフラグメントの存在、またはニュートロカインαポリペプチドの結合のみだけではなく、試験された組織におけるその分布をも決定し得る。本発明を使用して、当業者は、任意の広範な種々の組織学的方法（例えば、染色手順）がこのようなインサイチュ検出を達成するために改変され得ることを容易に認知する。
【０５２３】
ニュートロカインα遺伝子産物または保存的改変体またはそのペプチドフラグメントのイムノアッセイおよび非イムノアッセイは、代表的に、ニュートロカインα遺伝子産物または保存的改変体またはそのペプチドフラグメントを同定し得る検出可能に標識された抗体の存在下で、サンプル（例えば、生物学的流体、組織抽出物、新鮮に収集された細胞、または細胞培養物中でインキュベートされた細胞の溶解物）をインキュベートする工程、および結合された抗体を当該分野で周知の任意の多くの技術によって検出する工程を包含する。
【０５２４】
ニュートロカインαレセプター遺伝子産物または保存的改変体あるいはそのペプチドフラグメントのイムノアッセイおよび非イムノアッセイは、代表的に、ニュートロカインαレセプター遺伝子産物または保存的改変体あるいはそのペプチドフラグメントを同定し得る検出可能かまたは標識されたニュートロカインαポリペプチドの存在下で、サンプル（例えば、生物学的流体、組織抽出物、新鮮に収集された細胞、または細胞培養物中でインキュベートされた細胞の溶解物）をインキュベートする工程、および結合されたニュートロカインαポリペプチドを当該分野で周知の任意の多くの技術によって検出する工程を包含する。
【０５２５】
生物学的サンプルは、固相支持体またはキャリア（例えばニトロセルロース）、あるいは細胞、細胞粒子または可溶性タンパク質を固定化し得る他の固体支持体に接触され、そして固定化され得る。次いで、この支持体は、適切な緩衝液で洗浄され得、続いて検出可能に標識された抗ニュートロカインα抗体または検出可能なニュートロカインαポリペプチドで処理される。次いで、固相支持体は、結合していない抗体またはポリペプチドを除くために、緩衝液で２回洗浄され得る。必要に応じて、抗体は、続いて標識される。次いで、固体支持体上に結合された標識の量が従来の手段によって検出され得る。
【０５２６】
「固相支持体またはキャリア」によって、抗原または抗体を結合し得る任意の支持体を意図する。周知の支持体またはキャリアには、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、斑レイ岩、および磁鉄鉱が挙げられる。キャリアの性質は、本発明の目的のために、ある程度可溶性であるかまたは不溶性のいずれかであり得る。支持体材料は、結合された分子が抗原または抗体に結合し得る限り、実質的に任意の可能な構造的形状を有し得る。従って、支持体の形状は、球形（ビーズのような）、または円筒形（試験管の内側表面または棒の外側表面のような）であり得る。あるいは、表面は、シート、試験ストリップなどのように平坦であり得る。好ましい支持体には、ポリスチレンビーズが挙げられる。当業者は、抗体または抗原を結合するための多くの他の適切なキャリアを知っているか、または慣用的な実験の使用によってこれを確認し得る。
【０５２７】
所与の多くの抗ニュートロカインα抗体またはニュートロカインαポリペプチドの結合活性は、周知の方法に従って決定され得る。当業者は、慣用的な実験を使用することによって、各決定のために、操作条件および最適のアッセイ条件を決定し得る。
【０５２８】
個体から得られる生物学的サンプルにおけるニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドレベルまたはポリヌクレオチドレベルをアッセイすることに加えて、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドまたはポリヌクレオチドはまた、イメージングによってインビボで検出され得る。例えば、本発明の１つの実施形態において、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドならびに／あるいは抗ニュートロカインα抗体は、Ｂ細胞リンパ種をイメージングするために使用される。別の実施形態において、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドならびに／あるいは抗ニュートロカインα抗体および／またはニュートロカインαポリヌクレオチド（例えば、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのｍＲＮＡの全てまたは一部に相補的なポリヌクレオチド）が、リンパ種（例えば、単核細胞およびＢ細胞リンパ種）をイメージングするために使用される。
【０５２９】
ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドのインビボイメージングのための抗体標識またはマーカーには、Ｘ線ラジオグラフィー、ＮＭＲ、ＭＲＩ、ＣＡＴ走査またはＥＳＲによって検出可能なものが挙げられる。Ｘ線ラジオグラフィーについては、適切な標識は、検出可能な放射線を放射するが、被験体に対して明白には有害ではないバリウムまたはセシウムのような放射性同位体を含む。ＮＭＲおよびＥＳＲに適切なマーカーには、重水素のような検出可能な特徴的なスピンを有するものが含まれ、これは、関連したハイブリドーマのための栄養素を標識することにより抗体に取り込まれ得る。インビボイメージングが、ヒトにおける診断のためにニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドの増加したレベルを検出するために使用される場合、ヒト抗体または「ヒト化」キメラモノクローナル抗体を使用することが好適であり得る。このような抗体は、本明細書中に記載される技術またはそうでなければ当該分野で公知の技術を使用して産生され得る。例えば、キメラ抗体を産生するための方法は、当該分野で公知である。（総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、ＥＰ  １７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ  １７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＷＯ  ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ  ８７０２６７１；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと）。
【０５３０】
さらに、存在が検出され得る任意のニュートロカインαポリペプチドが、投与され得る。例えば、放射線不透過性または他の適切な化合物で標識されたニュートロカインαポリペプチドは、標識化抗体について上で議論したように、インビボで投与され、そして可視化され得る。さらに、このようなニュートロカインαポリペプチドは、インビボ診断手順のために利用され得る。
【０５３１】
放射性同位体（例えば、131Ｉ、112Ｉｎ、99mＴｃ、（131Ｉ、125Ｉ、123Ｉ、121Ｉ）、炭素（14Ｃ）、イオウ（35Ｓ）、トリチウム（3Ｈ）、インジウム（115mＩｎ、113mＩｎ、112Ｉｎ、111Ｉｎ）、およびテクネチウム（99Ｔｃ、99mＴｃ）、タリウム（201Ｔｉ）、ガリウム（68Ｇａ、67Ｇａ）、パラジウム（103Ｐｄ）、モリブデン（99Ｍｏ）、キセノン（133Ｘｅ）、フッ素（18Ｆ）、153Ｓｍ、177Ｌｕ、159Ｇｄ、149Ｐｍ、140Ｌａ、175Ｙｂ、166Ｈｏ、90Ｙ、47Ｓｃ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、142Ｐｒ、105Ｒｈ、97Ｒｕ）、放射線不透過物質、または核磁気共鳴によって検出可能な物質のような、適切な検出可能なイメージング部分で標識された、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドに特異的な抗体または抗体フラグメントが、免疫系障害について試験するために、哺乳動物に（例えば、非経口的に、皮下的に、または腹腔内に）導入される。被験体の大きさおよび使用されるイメージングシステムが、診断的イメージングを生成するために必要とされるイメージング部分の量を決定することが、当該分野で理解される。放射性同位体部分の場合には、ヒト被験体について、注射される放射能の量は、通常、約５〜２０ミリキュリーの99mＴｃの範囲である。次いで、標識された抗体または抗体フラグメントは、ニュートロカインαタンパク質を含む細胞の位置に優先的に蓄積される。インビボ腫瘍イメージングは、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒの第１３章、Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．（１９８２）に記載される。
【０５３２】
抗体に関して、抗ニュートロカインα抗体が検出可能に標識され得る方法の１つは、これを酵素に連結し、そしてエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）における連結産物を使用することによる（Ｖｏｌｌｅｒ，Ａ．，「Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ  （ＥＬＩＳＡ）」，１９７８，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ  ２：１−７，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ；Ｖｏｌｌｅｒら，  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３１：５０７−５２０（１９７８）；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：４８２−５２３（１９８１）；Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ．（編），１９８０，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，；Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｅ．ら，（編），１９８１，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｋｇａｋｕ
Ｓｈｏｉｎ，Ｔｏｋｙｏ）。抗体に結合する酵素は、適切な基質、好ましくは、発色性基質と、例えば、分光測光的手段、蛍光測定的手段、または視覚的手段によって検出可能な化学的部分を生成するような様式で反応する。抗体を検出可能に標識するために使用され得る酵素には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸、デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、この検出は、酵素に対する発色性基質を使用する比色法によって達成され得る。検出はまた、同様に調製された標準との比較における基質の酵素反応の程度についての視覚的比較によって達成され得る。
【０５３３】
検出はまた、任意の種々の他のイムノアッセイを使用して達成され得る。例えば、抗体または抗体フラグメントを放射性標識することによって、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の使用によってニュートロカインαを検出し得る（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆＲａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｈｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，１９８６年３月を参照のこと；これは、本明細書中で参考として援用される）。放射性同位体は、γ線計数器、シンチレーション計数管、またはオートラジオグラフィーを含むが、これらに限定されない手段によって検出され得る。
【０５３４】
蛍光化合物で抗体を標識することがまた可能である。次いで蛍光標識された抗体を適切な波長の光に曝露する場合、その存在が、蛍光に起因して検出され得る。蛍光標識化合物に最も一般的に使用される化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、オプトアルデヒド（ｏｐｈｔａｌｄｅｈｙｄｅ）およびフルオレサミンである。
【０５３５】
抗体はまた、152Ｅｕまたはランタン系列の他のもののような蛍光放射金属を使用して検出可能に標識され得る。これらの金属は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート化基を使用して抗体に接着され得る。
【０５３６】
抗体はまた、化学発光化合物に結合することによって検出可能に標識され得る。次いで、化学発光タグ化抗体の存在は、化学反応の過程の間に生じる発光の存在を検出することによって決定される。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール（ｉｓｏｌｕｍｉｎｏｌ）、セロマティックアクリジニウムエステル（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ  ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｅｓｔｅｒ）、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルがある。
【０５３７】
同様に、生物発光化合物が、本発明の抗体を標識するために使用され得る。生物発光は、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増加する生物学的システムにおいて見出されるタイプの化学発光である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって決定される。標識の目的のために重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンが挙げられるが、これらには限定されない。
【０５３８】
（免疫系関連障害の処置）
上記のように、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびに抗ニュートロカインα抗体は、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの活性の異常に高いかまたは低い発現に関与する状態の診断に有用である。ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶが発現される細胞および組織、ならびにニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶによって調節される活性が与えられると、標準または「正常」レベルと比較して、個体における実質的に変化（増大または減少）したレベルのニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの発現は、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶが発現され、そして/あるいは活性である身体系に関連する病理学的状態を生じることが直ちに明白である。
【０５３９】
本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドはＴＮＦファミリーのメンバーであるので、それぞれのタンパク質の細胞外ドメインが、タンパク質分解性の切断によってニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶを発現する細胞から可溶性形態で放出され得、それゆえ、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチド（特に可溶性形態のそれぞれの細胞外ドメイン）が、個体の細胞、組織または身体に外来性供給源から添加される場合、このポリペプチドは、その個体の標的細胞のいずれかにおいてその調節活性を発揮することもまた当業者に理解される。また、このＩＩ型膜貫通タンパク質を発現する細胞は、個体の細胞、組織または身体に添加され得、それによって、添加された細胞はニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのレセプターを発現する細胞に結合し、それによってニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶを発現する細胞は、レセプター保有標的細胞において作用（例えば、増殖または細胞傷害性）を引き起こし得る。
【０５４０】
１つの実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドを含む組成物（例えば、異種ポリペプチド、異種核酸、毒素、またはプロドラッグに会合するニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドあるいは抗ニュートロカインαおよび／または抗ニュートロカインαＳＶの抗体を含む組成物）を標的細胞（例えば、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのレセプターを発現するＢ細胞、あるいはニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの細胞表面結合形態を発現する単核細胞）に送達する方法を提供する。本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドあるいは抗ニュートロカインαおよび／または抗ニュートロカインαＳＶの抗体は、疎水性相互作用、親水性相互作用、イオン性相互作用および／または共有結合的な相互作用を介して、異種ポリペプチド、異種核酸、毒素、またはプロドラッグと会合され得る。
【０５４１】
１つの実施形態において、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸と会合する本発明のポリペプチド（例えば、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドあるいは抗ニュートロカインαおよび／または抗ニュートロカインαＳＶの抗体）を投与することによって、細胞に本発明の組成物の特異的な送達のための方法を提供する。１つの例において、本発明は、標的細胞への治療的タンパク質を送達するための方法を提供する。別の例では、本発明は、一本鎖核酸（例えば、アンチセンスまたはリボザイム）または二本鎖核酸（例えば、細胞のゲノムへと組み込まれ得るか、またはエピソームにより複製され得、そして転写され得るＤＮＡ）を標的細胞に送達する方法を提供する。
【０５４２】
別の実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチド（例えば、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドあるいは抗ニュートロカインαおよび／または抗ニュートロカインαＳＶの抗体）を、毒素または細胞傷害性プロドラッグと共同して投与することによる、細胞の特異的破壊（例えば、腫瘍細胞の破壊）のための方法を提供する。
【０５４３】
特定の実施形態において、本発明は、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドを、毒素または細胞傷害性プロドラッグと共同して投与することによる、Ｂ細胞系統（例えば、Ｂ細胞関連白血病またはリンパ腫）の細胞の特異的破壊のための方法を提供する。
【０５４４】
別の特定の実施形態において、本発明は、抗ニュートロカインαおよび／または抗ニュートロカインαＳＶの抗体を、毒素または細胞傷害性プロドラッグと共同して投与することによる、単球系統（例えば、単球白血病またはリンパ腫）の細胞の特異的破壊のための方法を提供する。
【０５４５】
「毒素」により、内因性細胞傷害性エフェクター系を結合および活性化させる化合物、放射性同位体、ホロ毒素（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）、改変毒素、毒素の触媒サブユニット、細胞毒（細胞障害性因子）、あるいは、細胞死を引き起こす規定された条件下にある細胞表面内またはその表面上に通常は存在しない任意の分子または酵素を意味する。本発明の方法に従って使用され得る毒素としては、当該分野で公知の放射性同位体、化合物（例えば、固有のもしくは誘導された内因性細胞傷害性エフェクター系を結合する抗体（またはその補体固定含有部分））、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮアーゼ（ＲＮＡｓｅ）、α毒素、リシン、アブリン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ジフテリア毒素、サポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）、モモルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、αサルシン（ｓａｒｃｉｎ）およびコレラ毒素が挙げられるが、これらに限定されない。「毒素」はまた、細胞分裂抑制剤もしくは細胞破壊剤、治療薬または放射性金属イオン（例えば、α−エミッター（例えば、213Ｂｉ））もしくは他の放射性同位体（例えば、103Ｐｄ、133Ｘｅ、131Ｉ、68Ｇｅ、57Ｃｏ、65Ｚｎ、85Ｓｒ、32Ｐ、35Ｓ、90Ｙ、153Ｓｍ、153Ｇｄ、169Ｙｂ、51Ｃｒ、54Ｍｎ、75Ｓｅ、113Ｓｎ、90イットリウム、117スズ、186レニウム、166ホルミウム、および188レニウム）；発光標識（例えば、ルミノール）；および蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、ならびにビオチンを含む。
【０５４６】
当該分野において公知の技術は、本発明の抗体を標識化するために適用され得る。このような技術としては、二官能性結合化剤の使用（例えば、米国特許第５，７５６，０６５号；同第５，７１４，６３１号；同第５，６９６，２３９号；同第５，６５２，３６１号；同第５，５０５，９３１号；同第５，４８９，４２５号；同第５，４３５，９９０号；同第５，４２８，１３９号；同第５，３４２，６０４号；同第５，２７４，１１９号；同第４，９９４，５６０号；および同第５，８０８，００３号を参照のこと；これらの各々の内容は、本明細書によって参考としてその全体が援用される）が挙げられるが、これに限定されない。細胞毒または細胞傷害性薬剤は、細胞に対して有害な任意の薬剤を含む。例としては、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｎｔｈｒａｃｉｎ  ｄｉｏｎｅ）、ミトザントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ，１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびプロマイシン、ならびにそのアナログもしくはホモログ、が挙げられる。治療剤には、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルダカルバジン（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ  ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）、マイトマイシンＣ、ならびにｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）、が挙げられるが、それらに限定されない。
【０５４７】
「細胞傷害性プロドラッグ」により、細胞に通常存在する酵素により細胞傷害性化合物へと変換される非毒性化合物を意味する。本発明の方法に従って使用され得る細胞傷害性プロドラッグには、安息香酸マスタードアルキル化剤のグルタミル誘導体、エトポシドまたはマイトマイシンＣのホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）誘導体、シトシンアラビノシド、ダウノルビシン、およびドキソルビシンのフェノキシアセトアミド誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５４８】
個体におけるニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの活性の標準または正常なレベルにおける減少によって引き起こされる状態（特に、免疫系の障害）は、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチド（可溶性細胞外ドメインまたは完全なタンパク質を発現する細胞の形態）あるいはアゴニストの投与によって処置され得ることが理解される。従って、本発明はまた、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの活性の増大したレベルを必要とする個体の処置の方法を提供する。この方法は、このような個体におけるニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの活性レベルを増大するのに効果的な量の本発明の単離されたニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドあるいはそのアゴニストを含有する薬学組成物をそのような個体に投与する工程を包含する。
【０５４９】
個体におけるニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの活性の標準または正常なレベルにおける減少によって引き起こされる状態（特に、免疫系の障害）は、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチド（可溶性細胞外ドメインまたは完全なタンパク質を発現する細胞の形態）あるいはアンタゴニスト（例えば、抗ニュートロカインα抗体）の投与によって処置され得ることが理解される。従って、本発明はまた、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの活性の減少したレベルを必要とする個体の処置の方法を提供する。この方法は、このような個体におけるニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの活性レベルを減少するのに効果的な量の本発明の単離されたニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドあるいはそのアンタゴニストを含有する薬学組成物をそのような個体に投与する工程を包含する。
【０５５０】
本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチドもしくはポリペプチドあるいはニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのアゴニストは、感染因子の処置に用いられ得る。例えば、免疫応答を上昇させることによって、特にＢ細胞の増殖および分化を増加させることによって、感染性疾患が処置され得る。免疫応答は、既存の免疫応答を上昇させるか、または新たな免疫応答を開始させるかのいずれかにより上昇され得る。あるいは、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのアゴニストはまた、必ずしも免疫応答を誘発することなく、感染因子を直接阻害し得る。
【０５５１】
ウイルスは、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのアゴニストにより処置され得る疾患または症状を引き起こし得る感染因子の一例である。ウイルスの例としては、以下のＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスならびにウイルス科が挙げられるがこれらに限定されない：アルボウイルス、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アルテリウイルス（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓ）、ビルナウイルス科、ブニヤウイルス科、カリシウイルス科、シルコウイルス科、コロナウイルス科、デング熱、ＥＢＶ、ＨＩＶ、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科（肝炎）、ヘルペスウイルス科（例えば、サイトメガロウイルス、単純ヘルペス、帯状疱疹）、モノネガウイルス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒｕｓ）（例えば、パラミクソウイルス科、モルビリウイルス、ラブドウイルス科）、オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、およびパラインフルエンザ）、パピローマウイルス、パポーバウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科（例えば、痘瘡または痘疹）、レオウイルス科（例えば、ロタウイルス）、レトロウイルス科（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、レンチウイルス）、およびトガウイルス科（例えば、ルビウイルス属）。これらの科内に入るウイルスは、以下を含むがこれらに限定されない種々の疾患または症状を引き起こし得る：関節炎、細気管支炎（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｌｉｔｉｓ）、呼吸性シンシチウムウイルス、脳炎、眼性感染症（例えば、結膜炎、角膜炎）、慢性疲労症候群、肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型、慢性活動性、デルタ）、日本脳炎、アルゼンチン出血熱（Ｊｕｎｉｎ）、チンクグニヤ（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ）、リフトバレー熱、黄熱病、髄膜炎、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ）、肺炎、バーキットリンパ腫、水痘、出血熱、麻疹、流行性耳下腺炎、パラインフルエンザ、狂犬病、感冒、ポリオ、白血病、風疹、性感染症、皮膚病（例えば、カポージ、いぼ）、およびウイルス血症。ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、これらの症状または疾患のいずれかが処置、予防、診断および／または検出され得る。特定の実施形態において、ニュートロカインαのポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはアゴニストは、以下の処置、予防、および／または診断に使用される：髄膜炎、デング熱、ＥＢＶおよび／または肝炎（例えば、Ｂ型肝炎）。さらなる特定の実施形態において、ニュートロカインαのポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはアゴニストは、１以上の他の市販の肝炎ワクチンに非応答性の患者を処置するために使用される。さらなる特定の実施形態において、ニュートロカインαのポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはアゴニストは、ＡＩＤＳを処置、予防および／または診断するために使用される。さらなる特定の実施形態において、ニュートロカインαならびに／あるいはニュートロカインαＳＶおよび／ま���はニュートロカインαレセプターのポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアンタゴニストは、クリプトスポリジウム症を有する患者を処置、予防、および／または診断するために使用される。
【０５５２】
同様に、疾患または症状を引き起こし得、かつニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのアゴニストまたはアンタゴニストによって処置され得る細菌性因子または真菌性因子は、以下のグラム陰性細菌および細菌科ならびにグラム陽性細菌および細菌科、ならびに真菌を含むがこれらに限定されない：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ（例えば、Ａｎｔｈｒａｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ（例えば、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、Ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ、Ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅ．ｃｏｌｉおよびＥｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌｏｓｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ（例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｍｅｎｉｇｏｃｏｃｃａｌ）、Ｍｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａの感染症（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ）（例えば、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ（例えば、Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｔｙｐｅ  Ｂ）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ、Ｓｙｐｈｉｌｉｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ、Ｍｅｎｉｎｇｉｏｃｏｃｃａｌ、ＰｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＢ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）。これらの細菌または真菌の科は、以下を含むがこれらに限定されない疾患または症状を引き起こし得る：菌血症、心内膜炎、眼性感染症（結膜炎、結核、ブドウ膜炎）、歯肉炎、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳに関連した感染症）、爪周囲炎、プロテーゼ関連感染症、ライター病、気道感染症（例えば、百日咳または蓄膿症）、敗血症、ライム病、ネコ引っ掻き病、赤痢、パラチフス熱、食中毒、腸チフス、肺炎、淋病、髄膜��（例えば、髄膜炎Ａ型およびＢ型）、クラミジア、梅毒、ジフテリア、ハンセン病、パラ結核、結核、狼瘡、ボツリヌス中毒、壊疽、破傷風、膿痂疹、リウマチ熱、猩紅熱、性感染病、皮膚病（例えば、蜂巣炎、皮膚真菌症（ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ））、毒血症、尿路感染症、創傷感染症。ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのアゴニストまたはアンタゴニストを用いて、これらの症状または疾患のいずれかを処置、予防、診断および／または検出し得る。特定の実施形態において、ニュートロカインαのポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはそのアゴニストは、以下を処置、予防および／または診断するために使用される：破傷風、ジフテリア、ボツリヌス中毒、および／または髄膜炎Ｂ型。
【０５５３】
さらに、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのアゴニストにより処置され得る、寄生生物性因子が引き起こす疾患または症状としては以下のファミリーまたはクラスが挙げられるがこれらに限定されない：アメーバ症、バベシア症、コクシジウム症、クリプトスポリジウム症、二核アメーバ症（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂｉａｓｉｓ）、交疫、外部寄生生物（Ｅｃｔｏｐａｒａｓｉｔｉｃ）、ジアルジア鞭毛虫病、蠕虫病、リーシュマニア症、タイレリア症、トキソプラスマ症、トリパノソーマ症、およびトリコモナス症（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）、ならびに胞子虫症（Ｓｐｏｒｏｚｏａｎ）（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｒａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｉｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅおよびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ）。これらの寄生生物は、以下を含むがこれらに限定されない種々の疾患または症状を引き起こし得る：疥癬、ツツガムシ病、眼性感染症、腸疾患（例えば、赤痢、ジアルジア鞭毛虫症）、肝臓疾患、肺疾患、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ関連）、マラリア、妊娠合併症、およびトキソプラスマ症。ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのアゴニストまたはアンタゴニストを用いて、これらの症状または疾患のいずれかを処置、予防、診断および／または検出し得る。特定の実施形態において、ニュートロカインαのポリヌクレオチド、ポリペプチド、あるいはそのアゴニストは、マラリアの処置、予防、および／または診断のために使用される。
【０５５４】
別の実施形態において、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびに／あるいはそのアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、内耳感染（例えば、中耳炎）、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび他の病原性生物の感染によって特徴付けられる他の感染を処置、予防、および／または診断するために使用される。
【０５５５】
特定の実施形態において、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはそのアゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、抗ニュートロカインα抗体、および／または抗ニュートロカインαＳＶ抗体）は、欠乏した血清免疫グロブリン産生、再発性感染、および／または免疫系機能不全によって特徴付けられる障害を処置またはは予防するために使用される。さらに、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはそのアゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、抗ニュートロカインα抗体、および／または抗ニュートロカインαＳＶ抗体）は、関節、骨、皮膚、および／または耳下腺の感染、血液媒介性感染（例えば、敗血症、髄膜炎、敗血症性関節炎（ｓｅｐｔｉｃ
ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、および／または骨髄炎）、自己免疫疾患（例えば、本明細書中に開示されるもの）、炎症性障害、および悪性疾患、ならびに／あるいはこれらの感染、疾患、障害および／または悪性疾患に関連する任意の疾患または障害または状態（ＣＶＩＤ、他の第一次免疫不全、ＨＩＶ疾患、ＣＬＬ、再発性気管支炎、副鼻腔炎、中耳炎、結膜炎、肺炎、肝炎、髄膜炎、帯状疱疹（例えば、重症帯状疱疹）、およびまたはニューモシスチスカリニ（ｐｈｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｎｉｉ）を含むが、これらに限定されない）を処置または予防するために使用され得る。
【０５５６】
本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはそのアゴニストまたはアンタゴニストは、以下に関連する疾患または障害または状態の１つ以上を診断、予後の判断、処置、または予防するために使用され得る：第１次免疫不全、免疫媒介血小板減少症、川崎病、骨髄移植（例えば、成人または子供における最近の骨髄移植）、慢性Ｂ細胞リンパ性白血病、ＨＩＶ感染（例えば、成人性または小児のＨＩＶ感染）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、および輸血後紫斑病。
【０５５７】
さらに、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはそのアゴニストまたはアンタゴニストは、以下に関連する疾患、障害または状態の１つ以上を診断、予後の判断、処置、または予防するために使用され得る：ギャン−バレー症候群、貧血症（例えば、パルボウイルスＢ１９関連貧血症、感染（例えば、再発性感染）の高い危険にある安定多発性骨髄腫（ｓｔａｂｌｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ）を有する患者、自己免疫溶血性貧血（例えば、温型（ｗａｒｍ−ｔｙｐｅ）自己免疫溶血性貧血）、血小板減少症（例えば、新生児血小板減少症）および免疫媒介好中球減少症）、移植（例えば、サイトメガロウイルス（ｃｙｔａｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）−陽性器官のＣＭＶ−陰性レシピエント）、低ガンマグロブリン血症（例えば、感染または罹患の危険因子を有する低ガンマグロブリン血症新生児）、癲癇（例えば、難治性癲癇）、全身性血管炎症候群（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｖａｓｃｕｌｉｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、重症筋無力症（例えば、重症筋無力症における代償不全）、皮膚筋炎、および多発性筋炎）。
【０５５８】
本発明のさらに好ましい実施形態は、以下の用途におけるニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチド、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチド、ならびにその機能的アゴニストの使用を含むが、これらに限定されない：
１つ以上の抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ）の量の増加を産生するための免疫系をブーストするための、より高い親和性抗体の産生（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ）を誘導するための、そして／または免疫応答を増加させるための、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ミニブタ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ニワトリ、ラクダ、ヤギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ヒト以外の霊長類、およびヒト（最も好ましくはヒト）への投与。特定の非限定的実施形態では、本発明のニュートロカインαポリペプチド、および／またはそのアゴニストは、ＩｇＧの量の増加を産生するための免疫系をブーストするために投与される。別の特定の非限定的な実施形態において、本発明のニュートロカインαポリペプチド、および／またはそのアゴニストは、ＩｇＡの量の増加を産生するための免疫系をブーストするために投与される。別の特定の非限定的な実施形態において、本発明のニュートロカインαポリペプチド、および／またはそのアゴニストは、ＩｇＭの量の増加を産生するための免疫系をブーストするために投与される。
【０５５９】
機能性内因性抗体分子を産生し得るか、またはそうでなければ弱められた内因性免疫系を有し得るが、別の動物から再構成されたかまたは部分的に再構成された免疫系によってヒト免疫グロブリン分子を産生し得る動物（上記に列挙された動物を含むが、これらに限定されず、またトランスジェニック動物を含む）への投与（例えば、公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ９８／２４８９８３、ＷＯ／９６３４０９６、ＷＯ／９６３３７３５、およびＷＯ／９１１０７４１を参照のこと）。
【０５６０】
特定の抗原に対する免疫応答性を高めるワクチンアジュバント。特定の実施形態において、ワクチンアジュバントは、本明細書中に記載されたニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドである。別の特定の実施形態において、ワクチンアジュバントは、本明細書中に記載されたニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチドである（すなわち、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチドが遺伝子ワクチンアジュバントである）。本明細書中に議論されるように、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチドは、リポソーム送達、組換えベクター送達、裸のＤＮＡの注入、および遺伝子銃（ｇｅｎｅ  ｇｕｎ）送達を含むが、これらには限定されない、当該分野で公知の技術を使用して投与され得る。
【０５６１】
腫瘍特異的免疫応答を高めるためのアジュバント。
【０５６２】
抗ウイルス免疫応答を高めるためのアジュバント。アジュバントとして本発明の組成物を使用して高められ得る抗ウイルス免疫応答は、本明細書中に記載されるかまたはそうでなければ当該分野で公知のウイルスおよびウイルス関連疾患または症状を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本発明の組成物は、以下からなる群から選択されるウイルス、疾患、または症状に対する免疫応答を高めるためのアジュバントとして使用される：ＡＩＤＳ、髄膜炎、デング熱、ＥＢＶ、および肝炎（例えば、Ｂ型肝炎）。別の特定の実施形態では、本発明の組成物は、以下からなる群から選択されるウイルス、疾患、または症状に対する免疫応答を高めるためのアジュバントとして使用される：ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、ＲＳウイルス、デング熱、ロタウイルス、インフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型、パラインフルエンザ、麻疹、サイトメガロウイルス、狂犬病、アルゼンチン出血熱（Ｊｕｎｉｎ）、チングニヤ（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ）、リフトバレー熱、単純ヘルペス、および黄熱病。別の特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＨＩＶ  ｇｐ１２０抗原に対する免疫応答を高めるためのアジュバントとして使用される。
【０５６３】
抗細菌免疫応答または抗真菌免疫応答を高めるためのアジュバント。アジュバントとして本発明の組成物を使用して高められ得る抗細菌免疫応答または抗真菌免疫応答は、本明細書中に記載されるかまたはそうでなければ当該分野で公知の細菌または真菌および細菌関連疾患または症状あるいは真菌関連疾患または症状を含む。特定の実施形態において、本発明の組成物は、以下からなる群から選択される細菌または真菌、疾患または症状に対する免疫応答を高めるためのアジュバントとして使用される：破傷風、ジフテリア、ボツリヌス中毒、および髄膜炎Ｂ型。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、以下からなる群から選択される細菌または真菌、疾患または症状に対する免疫応答を高めるためのアジュバントとして使用される：Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ、Ｍｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｂ群ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ
Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ（マラリア）。
【０５６４】
抗寄生生物免疫応答を高めるためのアジュバント。。アジュバントとして本発明の組成物を使用して高められ得る抗寄生生物免疫応答は、本明細書中に記載されるかまたはそうでなければ当該分野で公知の寄生生物および寄生生物関連疾患または症状を含む。特定の実施形態において、本発明の組成物は、寄生生物に対する免疫応答を高めるためのアジュバントとして使用される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ（マラリア）に対する免疫応答を高めるためのアジュバントとして使用される。
【０５６５】
病原体に対するＢ細胞応答の刺激剤として。
【０５６６】
免疫抑制治療を受ける前に個体の免疫状態を高める試薬として。
【０５６７】
より高い親和性の抗体を誘導するための試薬として。
【０５６８】
血清免疫グロブリン濃度を増加するための試薬として。
【０５６９】
免疫無防備状態の個体の回復を促進するための試薬として。
【０５７０】
老齢の集団間の免疫応答性をブーストするための試薬として。
【０５７１】
骨髄移植および／または他の移植の前、その間、またはその後の免疫系エンハンサーとして（例えば、同種器官移植または異種器官移植）。移植に関して本発明の組成物は、移植の前に、移植と同時に、そして／または移植の後に投与され得る。特定の実施形態において、本発明の組成物は、移植の後、Ｔ細胞集団の回復の開始の前に投与される。別の特定の実施形態では、本発明の組成物は、移植の後、Ｔ細胞集団の回復の開始の後で、しかしＢ細胞集団の完全な回復の前に最初に投与される。
【０５７２】
例えば、部分的または完全な脾摘出を受けている個体のようなＢ細胞免疫不全個体間の免疫応答性をブーストするための試薬として。本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドまたはポリヌクレオチド、あるいはそのアゴニストを投与することにより寛解または処置され得るＢ細胞免疫不全には、以下が挙げられるが、これらには限定されない：重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）−Ｘ連鎖性、ＳＣＩＤ−常染色体、アデノシンデアミナーゼ不全（ＡＤＡ不全）Ｘ連鎖性無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）、ブルートン疾患（Ｂｒｕｔｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、先天性無ガンマグロブリン血症、Ｘ連鎖性乳児無ガンマグロブリン血症、後天性無ガンマグロブリン血症、成体発症性無ガンマグロブリン血症、遅発性無ガンマグロブリン血症、異常ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血症、乳児の一過性低ガンマグロブリン血症、特定されない低ガンマグロブリン血症、無ガンマグロブリン血症、分類不能型免疫不全（ＣＶＩＤ）（後天性）、ヴィスコット−オールドリッチ症候群（ＷＡＳ）、過剰ＩｇＭを伴うＸ連鎖性免疫不全、過剰ＩｇＭを伴う非Ｘ連鎖性免疫不全、選択的ＩｇＡ不全、ＩｇＧサブクラス不全（ＩｇＡ不全を伴うまたは伴わない）、正常または増大したＩｇを伴う抗体不全、胸腺腫を伴う免疫不全、Ｉｇ重鎖欠失、κ鎖不全、Ｂ細胞リンパ球増殖性障害（ＢＬＰＤ）、選択的ＩｇＭ免疫不全、劣性無ガンマグロブリン血症（スイス型）、細網発育不全（ｒｅｔｉｃｕｌａｒ  ｄｙｓｇｅｎｅｓｉｓ）、新生児好中球減少症、重症先天性白血球減少症、免疫不全を伴う胸腺リンパ形成不全症−形成不全または異形成、毛細管拡張性運動失調、短肢小人症（ｓｈｏｒｔ  ｌｉｍｂｅｄ  ｄｗａｒｆｉｓｍ）、Ｘ連鎖性リンパ球増殖性症候群（ＸＬＰ）、Ｉｇを伴うネゼロフ症候群複合免疫不全、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ不全（ＰＮＰ）、ＭＨＣクラスＩＩ不全（不全リンパ球症候群）および重症複合免疫不全。
【０５７３】
Ｂ細胞機能の後天的欠損を有する個体の間で免疫応答性をブーストするための因子として。本発明のニュートロカイン−αポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドもしくはポリヌクレオチドあるいはそれらのアゴニストを投与することによって改善または処置され得る、Ｂ細胞機能の後天的欠損を生じる状態としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳ、骨髄移植、およびＢ細胞慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）。
【０５７４】
一時的な免疫不全を有する個体の間で免疫応答性をブーストするための因子として。本発明のニュートロカイン−αポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドもしくはポリヌクレオチドあるいはそれらのアゴニストを投与することによって改善または処置され得る、一時的な免疫不全を生じる状態としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ウイルス感染（例えば、インフルエンザ）からの回復、栄養失調に関連する状態、感染性単核細胞症からの回復、またはストレスに関連する状態、麻疹からの回復、輸血からの回復、手術からの回復。
【０５７５】
単球、樹状細胞および／またはＢ細胞による抗原提示の制御因子として。１つの実施形態においては、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチド（可溶性形態、膜結合形態、または膜貫通形態）またはポリヌクレオチドは、インビボまたはインビトロで抗原提示を増強するかまたは抗原提示をアンタゴナイズする。さらに、関連する実施形態においては、抗原提示のこの増強またはアンタゴナイズは、抗腫瘍処置において、または免疫系を調節するために有用であり得る。
【０５７６】
粘膜免疫応答のメディエーターとして。単球によるニュートロカイン−αの発現およびこの因子へのＢ細胞の応答性は、Ｂ細胞と単球またはそれらの分化型の子孫との間のシグナル交換に関与し得ることを示唆する。この活性は、多くの点で、Ｂ細胞とＴ細胞との間のＣＤ４０−ＣＤ１５４シグナル伝達に類似する。従って、ニュートロカイン−αは、環境病原体に対する、Ｔ細胞と無関係の免疫応答の重要な制御因子である。特に、粘膜部位に関連し、そしてヒトにおける多くの生得的免疫に関与する、非従来型のＢ細胞集団（ＣＤ５＋）は、ニュートロカイン−αに応答し、それによって個体の防護的免疫状態を増強し得る。
【０５７７】
ＴＨ１細胞応答の反対としての体液性応答（すなわち、ＴＨ２）の発生に対する、個体の免疫系を指向する因子として。
【０５７８】
腫瘍増殖を誘導し、それによって抗腫瘍薬剤により感受性にするための手段として。例えば、多発性骨髄腫は、ゆっくり分裂する疾患であり、従って実質的にすべての抗腫瘍レジメンに対して抵抗性である。これらの細胞が、より迅速に増殖することを強いられるならば、それらの感受性プロフィールは変化するようである。
【０５７９】
細胞増殖の特定の活性化因子またはインヒビターが付着し得る、Ｂ細胞特異的結合タンパク質として。この結果は、このような活性化因子またはインヒビターの、正常なＢ細胞集団、疾患したＢ細胞集団、または腫瘍性Ｂ細胞集団への活性に集中する。
【０５８０】
その特異性によって、Ｂ系統細胞を検出する手段として。この適用は、検出手段を与えるために、タンパク質をビオチンまたは他の薬剤（例えば、本明細書中に記載されるような）で標識することを必要とし得る。
【０５８１】
病理（例えば、ＡＩＤＳ、慢性リンパ球性障害および／または分類不能型免疫不全）におけるＢ細胞産生の刺激因子として。
【０５８２】
Ｂ細胞を細胞型の異種混合物から単離するための機能を有するＢ細胞選択デバイスの一部として。ニュートロカイン−αは、次にＢ細胞が特異的に結合する固体支持体に結合し得る。非結合細胞は洗い流され、結合細胞は続けて溶出される。この選択の非限定的使用は、腫瘍細胞を、例えば、骨髄または末梢血から移植の前に一掃することを可能にする。
【０５８３】
手術、外傷または遺伝子欠損の後のリンパ組織の生成および／または再生のための治療として。
【０５８４】
ＳＣＩＤ患者の間で観察されるような免疫不全を生じる、遺伝的に受け継がれた障害のための、遺伝子に基づく治療として。
【０５８５】
ニュートロカイン−α媒介応答を阻害または増強する抗体の産生のための抗原として。
【０５８６】
単球（例えば、Ｌｅｓｈｍａｎｉａ）をもたらす寄生虫症を防御するために、単球／マクロファージを活性化する手段として。
【０５８７】
移植の前の骨髄サンプルの前処理として。このような処理は、Ｂ細胞提示を増加させ、従って回復を促進する。
【０５８８】
ニュートロカイン−αによって誘発される、分泌サイトカインを調節する手段として。
【０５８９】
本発明のニュートロカイン−αポリペプチドもしくはポリヌクレオチドまたはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、あるいはアゴニストを使用して、インビボまたはインビトロでＩｇＥ濃度を調節し得る。
【０５９０】
さらに、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストを使用して、ＩｇＥ媒介アレルギー反応を処置、予防および／または診断し得る。このようなアレルギー反応としては、喘息、鼻炎、および湿疹が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５９１】
特定の実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、選択的ＩｇＡ欠損を処置、予防、診断、および／または改善するために投与される。
【０５９２】
別の特定の実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、毛細管拡張性運動疾患を処置、予防、診断、および／または改善するために投与される。
【０５９３】
別の特定の実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、分類不能型免疫不全を処置、予防、診断、および／または改善するために投与される。
【０５９４】
別の特定の実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症を処置、予防、診断、および／または改善するために投与される。
【０５９５】
別の特定の実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）を処置、予防、診断、および／または改善するために投与される。
【０５９６】
別の特定の実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、ヴィスコット−オールドリッチ症候群を処置、予防、診断、および／または改善するために投与される。
【０５９７】
別の特定の実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、過剰ＩｇＭを伴うＸ連鎖Ｉｇ欠損を処置、予防、診断、および／または改善するために投与される。
【０５９８】
別の特定の実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、抗ニュートロカイン−α抗体）は、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、白血病、組織球性白血病、単球性白血病（例えば、急性単球性白血病）、白血病性細網症、Ｓｈｉｌｌｉｎｇ型単球性白血病、ならびに／あるいは単球および／または単球細胞および／または組織から誘導される他の白血病を処置、予防、診断、および／または改善するために投与される。
【０５９９】
別の特定の実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、例えば、結核と共に見られるような単球性類白血病反応を処置、予防、診断、および／または改善するために投与される。
【０６００】
別の特定の実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、単球性白血球増加症、単球性白血球減少症、単球減少症、および／または単球増加症を処置、予防、診断、および／または改善するために投与される。
【０６０１】
別の特定の実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびに／あるいは抗ニュートロカイン−α抗体および／またはそれらのアゴニストもしくはアンタゴニストを使用して、原発性Ｂリンパ球障害および／もしくは疾患、ならびに／またはそれに付随する状態を処置、予防、検出および／または診断する。１つの実施形態においては、このような原発性Ｂリンパ球障害、疾患および／または状態は、体液性免疫の完全な欠失または部分的な欠失によって特徴付けられる。体液性免疫の完全な欠失または部分的な欠失によって特徴付けられ、そして本発明の組成物を用いて予防、処置、検出および／または診断され得る、原発性Ｂリンパ球障害、疾患、および／またはそれに付随する状態としては、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）、および選択的ＩｇＡ欠損が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６０２】
好ましい実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、ならびに／あるいはそれらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストを使用して、身体の任意の１以上の種々の粘膜に影響する疾患もしくは障害または身体の任意の１以上の種々の粘膜に関連する状態を処置、予防、および／または診断する。このような疾患または障害としては、例えば、以下が挙げられるが、これらに限定されない：粘膜炎（ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ）、粘膜破壊、粘膜性結腸炎、粘膜性リーシュマニア症（例えば、アメリカリーシュマニア症、皮膚フランベシア、鼻咽頭リーシュマニア症、および新世界リーシュマニア症）、粘膜皮膚リンパ節症候群（例えば、川崎病）、小腸粘膜炎、粘膜性類表皮癌、粘膜性類上皮腫、粘膜上皮形成異常、ムコイド腺癌、ムコイド変性、ミクソイド変性；粘膜腫変性；粘膜腫症、ムコイド中膜変性（例えば、嚢胞性中膜壊死）、ムコリピドーシス（例えば、ムコリピドーシスＩ、ムコリピドーシスＩＩ、ムコリピドーシスＩＩＩ、ムコリピドーシスＩＶを含む）、粘液溶解障害、粘液性膜性腸炎、小腸粘膜炎、ムコ多糖体沈着症（例えば、Ｉ型ムコ多糖体沈着症（すなわち、ハーラー症候群）、ＩＳ型ムコ多糖体沈着症（すなわち、シャイエ症候群またはＶ型ムコ多糖体沈着症）、ＩＩ型ムコ多糖体沈着症（すなわち、ハンター症候群）、ＩＩＩ型ムコ多糖体沈着症（すなわち、サンフィリポ症候群）、ＩＶ型ムコ多糖体沈着症（すなわち、モルキオ症候群）、ＶＩ型ムコ多糖体沈着症（すなわち、マロトー−ラミー症候群）、ＶＩＩ型ムコ多糖体沈着症（すなわち、βグルクロニダーゼ欠損に起因するムコ多糖体沈着症）、およびムコスルファチドーシス）、ムコ多糖尿、粘液膿性結膜炎、膿様粘液、ムコール症（すなわち、接合真菌症、粘膜病（すなわち、ウシウイルス性下痢）、粘液性大腸炎（例えば、粘液性結腸炎および粘膜性大腸炎）、ならびにムコビシドーシス（例えば、嚢胞性線維症、膵嚢胞性線維症、クラーク−ハッドフィールド症候群、膵臓の線維嚢胞病、ムコビシドーシス、および粘液過剰症）。非常に好ましい実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、ならびに／あるいはそれらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストを使用して、粘膜炎（特に化学療法に関連するような）を処置、予防、および／または診断する。
【０６０３】
好ましい実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、ならびに／あるいはそれらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストを使用して、静脈洞炎に影響する疾患もしくは障害または静脈洞炎に関連する状態を、処置、予防、および／または診断する。
【０６０４】
ニュートロカイン−αポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、あるいはニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶのアゴニストによって処置、予防、および／または診断され得る、さらなる状態、疾患または症状は、骨髄炎である。
【０６０５】
ニュートロカイン−αポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、あるいはニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶのアゴニストによって処置、予防、および／または診断され得る、さらなる状態、疾患または症状は、心内膜炎である。
【０６０６】
上記のすべての適用は、獣医学に適用され得る。
【０６０７】
ニュートロカイン−αのアンタゴニストは、結合抗体および／または阻害抗体、アンチセンス核酸、リボザイム、ならびに本発明のニュートロカイン−αポリペプチドを含む。これらは、上記のリガンドならびに以下のような臨床適用または実用的適用を見出されたリガンドの多くの活性を逆転させることが予想される：
種々の局面の外来因子または自己に対する免疫応答をブロックする手段。例としては、自己免疫障害（例えば、ループス）、および関節炎、ならびに皮膚アレルギーに対する免疫応答性、炎症、腸疾患、障害および病原体が挙げられる。本発明者らの現在のデータは、Ｂ細胞および単球関連病理におけるニュートロカイン−αの潜在的役割を直接言及するが、他の細胞型がニュートロカイン−αに対する発現または応答性を獲得し得ることは可能なままである。従って、ニュートロカイン−αは、（ＣＤ４０およびそのリガンドのように）免疫系および細胞が位置する微小環境の状態によって調節され得る。
【０６０８】
Ｂ細胞増殖および自己免疫疾患（例えば、特発性血小板減少性紫斑病、全身性エリテマトーデスおよびＭＳ）に関連するＩｇ選択を予防するための治療。
【０６０９】
対宿主性移植片病または移植拒絶のインヒビター。
【０６１０】
Ｂ細胞悪性疾患（例えば、ＡＬＬ、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、プラズマ細胞腫、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫、およびＥＢＶ形質転換病）のための治療。
【０６１１】
非定量有意性の単一クローン性高ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）、ヴァルデンストレーム病、関連特発性単一クローン性高ガンマグロブリン血症、およびプラズマ細胞腫などの疾患において明らかな、慢性高ガンマグロブリン血症のための治療。
【０６１２】
ラージＢ細胞リンパ腫の細胞増殖を減少させるための治療。
【０６１３】
慢性骨髄性白血病に関連するＢ細胞およびＩｇの関与を減少させるための手段。
【０６１４】
免疫抑制剤。
【０６１５】
本発明のニュートロカイン−αポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、あるいはアンタゴニストを使用して、インビトロまたはインビボにおけるＩｇＥ濃度を調節し得る。
【０６１６】
別の実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、あるいはそれらのアンタゴニストの投与を使用して、ＩｇＥ媒介性アレルギー反応（喘息、鼻炎、および湿疹が挙げられるが、これらに限定されない）を処置、予防、および／または診断し得る。
【０６１７】
ニュートロカイン−α誘導Ｂ細胞活性化に関連しているＥＲＫ１、ＣＯＸ２およびサイクリンＤ２を含むシグナル伝達経路のインヒビター。
【０６１８】
上記に列挙した適用は、広範な種々の宿主における使用を有する。このような宿主としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、ミニブタ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ニワトリ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、およびヒト。特定の実施形態においては、宿主は、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ニワトリ、ラット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、イヌまたはネコである。好ましい実施形態においては、宿主は哺乳動物である。最も好ましい実施形態においては、宿主はヒトである。
【０６１９】
アゴニストおよびアンタゴニストは、薬学的に受容可能なキャリア（例えば、本明細書中で記載されるような）と共に、組成物中で使用され得る。
【０６２０】
アンタゴニストは、例えば、ニュートロカイン−α媒介走化作用および／またはニュートロカイン−αＳＶ媒介走化作用を阻害するため、ならびにマクロファージおよびそれらの前駆体の活性化、ならびに好中球、好塩基球、Ｂリンパ球、および特定の自己免疫および慢性炎症および感染症におけるいくつかのＴ細胞サブセット（例えば、活性化およびＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞ならびにナチュラルキラー細胞）の活性化を阻害するために利用され得る。自己免疫疾患の例としては、多発性硬化症、およびインスリン依存性糖尿病が挙げられる。アンタゴニストはまた、単球食細胞の補充および活性化を妨げることによって、感染症（ケイ肺症、類肉腫症、特発性肺線維症を含む）を処置、予防、および／または診断するために使用され得る。これらはまた、好酸球産生および好酸球移動を妨げることによって、特発性好酸球過剰症候群を処置、予防、および／または診断するために使用され得る。内毒素ショックもまた、マクロファージの移動ならびにそれらの本発明のニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの産生を妨げることにより、このアンタゴニストによって処置され得る。このアンタゴニストはまた、動脈壁への単球の浸潤を妨げることによって、アテローム性動脈硬化症を処置するために使用され得る。このアンタゴニストはまた、ケモカイン誘導マスト細胞および好塩基性脱顆粒およびヒスタミン放出を阻害することによって、ヒスタミン媒介性アレルギー反応および免疫学的障害（後期アレルギー反応、慢性じんま疹、およびアトピー性皮膚炎を含む）を処置、予防、および／または診断するために使用され得る。ＩｇＥ媒介性アレルギー反応（例えば、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、およびアレルギー性湿疹）もまた処置され得る。このアンタゴニストはまた、単球の創傷部位への誘引を妨げることによって、慢性炎症および急性炎症を処置、予防、および／または診断するために使用され得る。これらはまた、正常な肺マクロファージ集団を調節するために使用され得る。なぜなら、慢性炎症性肺疾患および急性炎症性肺疾患は、肺における単球食細胞の壊死巣分離に関連するからである。アンタゴニストはまた、患者の関節における滑液への単球の誘引を妨げることによって、慢性関節リウマチを処置、予防、および／または診断するために使用され得る。単球の流入および活性化は、変性関節症および炎症性関節症の両方の病原において、重要な役割を果たす。このアンタゴニストは、主にＩＬ−１およびＴＮＦに起因する有害なカスケードを妨害するために使用され得、これは、他の炎症性サイトカインの生合成を妨げる。このように、このアンタゴニストは、炎症を予防するために使用され得る。このアンタゴニストはまた、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶによって誘導される、プロスタグランジン非依存性の発熱を阻害するために使用され得る。このアンタゴニストはまた、骨髄不全の症状（例えば、再生不良性貧血および脊髄形成異常症候群）を処置、予防、および／または診断するために使用され得る。このアンタゴニストはまた、肺における好酸球蓄積を妨げることによって、喘息およびアレルギーを処置、予防、および／または診断するために使用され得る。このアンタゴニストはまた、喘息の肺の顕著な特徴である、上皮下基底膜線維症を処置、予防、および／または診断するために使用され得る。このアンタゴニストはまた、リンパ腫（例えば、本明細書中に提供されたリンパ腫の広範な（しかし、限定されない）リストのうちの１つ以上）を処置、予防、および／または診断するために使用され得る。
【０６２１】
上記の適用のすべては、獣医学に適用され得る。さらに、本明細書中に記載されたすべての適用はまた、獣医学に適用され得る。
【０６２２】
本発明のニュートロカイン−αポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびに／あるいはそれらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストを使用して、哺乳動物（好ましくは、ヒト）における種々の免疫系関連障害および／またはこれらの障害に関連する状態を、処置、予防、および／または診断し得る。多くの自己免疫障害は、免疫細胞による、自己を外来物質とみなす不適切な認識によって生じる。この不適切な認識は、宿主細胞の破壊を引き起こす免疫応答を生じる。従って、免疫応答（特に、Ｂ細胞の増殖および／または免疫グロブリンの産生）を阻害し得る本発明のニュートロカイン−αポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびに／あるいはそれらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストの投与は、自己免疫障害の処置および／または予防における効果的な治療であり得る。従って、好ましい実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αアンタゴニストおよび／またはニュートロカイン−αＳＶアンタゴニスト（例えば、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶのポリペプチドフラグメントならびに抗ニュートロカイン−α抗体）を使用して、自己免疫障害を治療、予防、および／または診断し得る。
【０６２３】
本発明のニュートロカイン−αポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／またはアンタゴニスト（例えば、抗ニュートロカイン−α抗体）を用いて処置、予防、および／または診断され得る、自己免疫障害およびこれらの障害に関連する状態としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性新生児血小板減少、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性血球減少症、溶血性貧血、抗リン脂質症候群、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、心筋炎、再発性多発性軟骨炎、リウマチ性心疾患、糸球体腎炎（例えば、ＩｇＡ腎症）、多発性硬化症、神経炎、ブドウ膜炎性眼炎、多発性内分泌腺症、紫斑病（例えば、ヘンノッホ−シェーンライン紫斑病）、ライター病、スティッフマン症候群、自己免疫性肺炎、ギャン−バレー症候群、インスリン依存性糖尿病、および自己免疫性炎症性眼病。
【０６２４】
本発明の組成物を用いて処置、予防、および／または診断され得る、さらなる自己免疫性障害（これらは非常にあり得る）としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：自己免疫性甲状腺炎、甲状腺機能低下症（すなわち、橋本甲状腺炎）（例えば、細胞媒介性および体液性甲状腺細胞障害性によってしばしば特徴付けられる）、全身性エリテマトーデス（例えば、循環および局所的に産生される免疫複合体によってしばしば特徴付けられる）、グッドパスチャー症候群（例えば、抗基底膜抗体によってしばしば特徴付けられる）、天疱瘡（例えば、表皮棘融解抗体によってしばしば特徴付けられる）、レセプター自己免疫（例えば、（ａ）グレーブス病（例えば、ＴＳＨレセプター抗体によってしばしば特徴付けられる）、（ｂ）重症筋無力症（例えば、アセチルコリンレセプター抗体によってしばしば特徴付けられる）、および（ｃ）インスリン抵抗性（例えば、インスリンレセプター抗体によってしばしば特徴付けられる））、自己免疫性溶血性貧血（例えば、抗体感受性ＲＢＣの食作用によってしばしば特徴付けられる）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（例えば、抗体感受性血小板の食作用によってしばしば特徴付けられる）。
【０６２５】
本発明の組成物を用いて処置、予防、および／または診断され得る、さらなる自己免疫性障害（これらはあり得る）としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：慢性関節リウマチ（例えば、関節における免疫複合体によってしばしば特徴付けられる）、抗コラーゲン抗体を伴う強皮症（ｓｃｈｌｅｒｏｄｅｒｍａ）（例えば、核小体抗体および他の核抗体によってしばしば特徴付けられる）、混合結合組織病（例えば、可溶性核抗原（例えば、リボ核タンパク質）に対する抗体によってしばしば特徴付けられる）、多発性筋症／皮膚筋炎（例えば、非ヒストンＡＮＡによってしばしば特徴付けられる）、悪性貧血（例えば、抗壁細胞、ミクロソーム、および内因子抗体によってしばしば特徴付けられる）、特発性アジソン病（例えば、体液および細胞媒介性副腎細胞傷害性によってしばしば特徴付けられる）、不妊症（例えば、抗精子抗体によってしばしば特徴付けられる）、糸球体腎炎（例えば、原発性糸球体腎炎およびＩｇＡ腎症）（例えば、糸球体基底膜抗体または免疫複合体によってしばしば特徴付けられる）、水疱性類天疱瘡（例えば、基底膜中のＩｇＧおよび補体によってしばしば特徴付けられる）、シェーグレン症候群（例えば、多重組織抗体、および／または特定の非ヒストンＡＮＡ（ＳＳ−Ｂ）によってしばしば特徴付けられる）、糖尿病（例えば、細胞媒介性および体液性島細胞抗体によってしばしば特徴付けられる）、ならびにアドレナリン作動性薬剤抵抗性（喘息または嚢胞性線維症を伴うアドレナリン作動性薬剤抵抗性を含む）（例えば、βアドレナリンレセプター抗体によってしばしば特徴付けられる）。
【０６２６】
本発明の組成物を用いて処置、予防、および／または診断され得る、さらなる自己免疫性障害（これらはあり得る）としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：慢性活性肝炎（例えば、平滑筋抗体によってしばしば特徴付けられる）、原発性胆汁性肝硬変（例えば、ミトコンドリア抗体によってしばしば特徴付けられる）、他の内分泌腺不全（例えば、いくつかの場合は、特定の組織抗体によってしばしば特徴付けられる）、白斑（例えば、メラノサイト抗体によってしばしば特徴付けられる）、脈管炎（例えば、脈管壁におけるＩｇおよび補体ならびに／または低血清補体によってしばしば特徴付けられる）、ＭＩ後（例えば、心筋抗体によってしばしば特徴付けられる）、心臓切開症候群（例えば、心筋抗体によってしばしば特徴付けられる）、じんま疹（例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体によってしばしば特徴付けられる）、アトピー性皮膚炎（例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体によってしばしば特徴付けられる）、喘息（例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体によってしばしば特徴付けられる）、炎症性筋障害、ならびに多くの他の炎症性障害、肉芽種性障害、変性障害、および萎縮性障害。
【０６２７】
好ましい実施形態においては、自己免疫性疾患および障害ならびに／または上記に列挙された疾患および障害に関連する状態は、抗ニュートロカイン−α抗体および／または抗ニュートロカイン−αＳＶを用いて、処置、予防、および／または診断される。
【０６２８】
特定の好ましい実施形態においては、抗ニュートロカイン−α抗体および／もしくは抗ニュートロカイン−αＳＶ抗体ならびに／または他の本発明のアンタゴニストを用いて、慢性関節リウマチが処置、予防、および／または診断される。
【０６２９】
特定の好ましい実施形態においては、抗ニュートロカイン−α抗体および／もしくは抗ニュートロカイン−αＳＶ抗体ならびに／または他の本発明のアンタゴニストを用いて、ループスが処置、予防、および／または診断される。
【０６３０】
特定の好ましい実施形態においては、抗ニュートロカイン−α抗体および／もしくは抗ニュートロカイン−αＳＶ抗体ならびに／または他の本発明のアンタゴニストを用いて、ループスに関連する腎炎が処置、予防、および／または診断される。
【０６３１】
特定の好ましい実施形態においては、ニュートロカイン−αポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、あるいはそれらのアンタゴニスト（例えば、抗ニュートロカイン−α抗体および／もしくは抗ニュートロカイン−αＳＶ抗体）を使用して、全身性エリテマトーデスおよび／またはそれに関連する疾患、障害もしくは状態を処置または予防する。本発明のニュートロカイン−αポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、あるいはアンタゴニストを用いて処置または予防され得るループスに関連する疾患、障害または状態としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：血液学的障害（例えば、溶血性貧血、白血球減少症、リンパ球減少症、および血小板減少症）、免疫学的障害（例えば、抗ＤＮＡ抗体、および抗Ｓｍ抗体）、発疹、羞明、口内炎、関節炎、発熱、疲労、体重減少、漿膜炎（例えば、胸膜炎）、腎障害（例えば、腎炎）、神経学的障害（例えば、発作、末梢神経障害、ＣＮＳ関連障害）、胃腸障害、レーノー現象、および心膜炎。好ましい実施形態においては、ニュートロカイン−αポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、あるいはそれらのアンタゴニスト（例えば、抗ニュートロカイン−α抗体および／もしくは抗ニュートロカイン−αＳＶ抗体）を使用して、全身性エリテマトーデスに関連する腎臓障害を処置または予防する。最も好ましい実施形態においては、ニュートロカイン−αポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、あるいはそれらのアンタゴニスト（例えば、抗ニュートロカイン−α抗体および／もしくは抗ニュートロカイン−αＳＶ抗体）を使用して、全身性エリテマトーデスに関連する腎炎を処置または予防する。
【０６３２】
同様に、アレルギー反応および状態（例えば、喘息（特にアレルギー性喘息）または他の呼吸性の問題）もまた、本発明のニュートロカイン−αポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびに／あるいはそれらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストによって処置され得る。さらに、これらの分子を使用して、アナフィラキシー、抗原性分子に対する過敏症、または血液型不適合を処置、予防、および／または診断し得る。
【０６３３】
本発明のニュートロカイン−αポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびに／あるいはそれらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストをまた使用して、器官拒絶または対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）および／またはそれに関連する状態を処置、予防、および／または診断し得る。器官拒絶は、免疫応答を通した移植された組織の宿主免疫細胞破壊によって起こる。同様に、免疫応答もまた、ＧＶＨＤに関与するが、この場合、外来性の移植された免疫細胞は、宿主組織を破壊する。本発明のニュートロカイン−αポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびに／あるいはそれらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストの投与（これは、免疫応答（特にＴ細胞の増殖、分化、または走化性）を阻害する）は、器官拒絶またはＧＶＨＤの予防における効果的な治療であり得る。
【０６３４】
同様に、本発明のニュートロカイン−αポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびに／あるいはそれらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストをまた使用して、炎症を調節し得る。例えば、本発明のニュートロカイン−αポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびに／あるいはそれらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、炎症性応答に関与する細胞の増殖および分化を阻害し得る。これらの分子を使用して、炎症状態（慢性状態および急性状態の両方）を処置、予防、および／または診断し得、これらの炎症状態としては以下が挙げられる：慢性前立腺炎、肉芽種性前立腺炎およびマラコプラキア、感染に関連する炎症（例えば、敗血症性ショック、敗血症、または全身性炎症性応答症候群（ＳＩＲＳ））、虚血再灌流障害、エンドトキシン致死性、関節炎、補体媒介性超急性拒絶、腎炎、サイトカインまたはケモカイン誘導性肺損傷、炎症性腸疾患、クローン病、またはサイトカインの過剰産生の結果（例えば、ＴＮＦまたはＩＬ−１）。
【０６３５】
特定の実施形態においては、本発明の抗ニュートロカイン−α抗体および／もしくは抗ニュートロカイン−αＳＶ抗体を使用して、炎症を処置、予防、調節、検出、および／または診断する。
【０６３６】
特定の実施形態においては、本発明の抗ニュートロカイン−α抗体および／もしくは抗ニュートロカイン−αＳＶ抗体を使用して、炎症性障害を処置、予防、調節、検出、および／または診断する。
【０６３７】
別の特定の実施形態においては、本発明の抗ニュートロカイン−α抗体および／もしくは抗ニュートロカイン−αＳＶ抗体を使用して、アレルギーおよび／または過敏症を処置、予防、調節、検出、および／または診断する。
【０６３８】
ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶに対する抗体を、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶに結合し、そしてその活性を阻害するために使用して、損傷後の肺への好中球の侵入を妨げることによって、ＡＲＤＳを処置、予防、および／または診断し得る。本発明のアゴニストおよびアンタゴニストは、薬学的に受容可能なキャリア（例えば、本明細書中以下に記載されるような）との組成物中で使用され得る。
【０６３９】
本発明のニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶおよび／またはニュートロカイン−αレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチドならびに／あるいはそれらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストを使用して、肺系（例えば、気管支）の疾患および障害（例えば、洞肺および気管支の感染）、ならびにこのような疾患および障害ならびに他の呼吸器疾患および障害に関連する状態を処置、予防、および／または診断する。特定の実施形態においては、このような疾患および障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：気管支腺腫、気管支喘息、肺炎（例えば、気管支の肺炎、気管支肺炎、および結核性気管支肺炎）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気管支ポリープ、気管支拡張症（例えば、乾性気管支拡張症、円柱状気管支拡張症、および嚢胞状気管支拡張症）、細気管支腺癌、細気管支癌、細気管支炎（例えば、滲出性細気管支炎、閉塞性線維性細気管支炎、および増殖性細気管支炎）、細気管支癌、気管支炎性喘息、気管支炎（例えば、喘息性気管支炎、カステラーニ気管支炎、慢性気管支炎、クループ性気管支炎、線維素性気管支炎、出血性気管支炎、鳥類の伝染性気管支炎、閉塞性気管支炎、形成性気管支炎、偽膜性気管支炎、腐敗性気管支炎、および寄生虫性気管支炎）、気管支中心性肉芽腫症、気管支浮腫、気管食道瘻、気管支原生癌、気管支性嚢胞、気管支結石症、気管支軟化症、気管支真菌症（例えば、気管支肺アスペルギルス症）、気管支肺スピロヘータ症、出血性気管支炎、気管支漏、気管支痙攣、気管支出血、気管支狭窄、ビオー呼吸、気管支呼吸、クスマウル呼吸、クスマウル−キーン呼吸、呼吸性アシドーシス、呼吸性アルカローシス、新生児呼吸窮迫症候群、呼吸不全、上気道硬化症、ＲＳウイルス、など。
【０６４０】
特定の実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドもしくはポリペプチドならびに／あるいはそれらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストを使用して、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を処置、予防、および／または診断する。
【０６４１】
別の実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドもしくはポリペプチドならびに／あるいはそれらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストを使用して、線維症および線維症に関連する状態（例えば、嚢胞性線維症（膵臓の嚢胞性線維症、クラーク−ハッドフィールド症候群、膵線維嚢胞症、ムコビシドーシス、および粘液過剰症のような線維症を含む）、心内膜心筋線維症、特発性腹膜後線維症、軟膜線維症、縦隔線維症、結節性表皮下線維組織増殖症、中心静脈周囲線維化、筋周囲線維化、パイプ軸線維症、置換性線維形成、外膜下線維症、シンマーズ陶製パイプ柄状線維症があるが、これらに限定されない）を、処置、予防、および／または診断する。
【０６４２】
ＴＮＦファミリーのリガンドは、多数の細胞応答（細胞傷害性、抗ウイルス活性、免疫調節活性、およびいくつかの遺伝子の転写調節を含む）を含む、大部分の多面的なサイトカインの間にあることが知られている（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌら、「Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒｓ：Ｇｅｎｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ」、Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：５９７−６０９（１９８６）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ；Ｂ．Ｂｅｕｔｌｅｒ  ａｎｄ  Ａ．Ｃｅｒａｍｉ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：５０５−５１８（１９８８）；Ｌ．Ｊ．Ｏｌｄ、Ｓｃｉ．Ａｍ．２５８：５９−７５（１９８８）；Ｗ．Ｆｉｅｒｓ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２８５：１９９−２２４（１９９１））。ＴＮＦファミリーのリガンド（本発明のニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶを含む）は、ＴＮＦファミリーのレセプターに結合することによって、このような種々の細胞応答を誘導する。ニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドは、強力な細胞応答（細胞、細胞株、組織、組織培養物または患者に対する、任意の遺伝子型の変化、表現型の変化、および／または形態的変化を含む）を誘発すると考えられている。示されるように、このような細胞応答は、ＴＮＦファミリーのリガンドに対する正常な生理学的応答だけでなく、増加したアポトーシスまたはアポトーシスの阻害に関連する疾患をも含む。アポトーシスをプログラムされた細胞死は、免疫系の末梢Ｂリンパ球および／または末梢Ｔリンパ球の欠失に関与する生理学的メカニズムであり、その調節不全は、多くの異なる病原性のプロセスを導き得る（Ｊ．Ｃ．Ａｍｅｉｓｅｎ、ＡＩＤＳ  ８：１１９７−１２１３（１９９４）；Ｐ．Ｈ．Ｋｒａｍｍｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｏｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２７９−２８９（１９９４））。
【０６４３】
本発明のニュートロカイン−αポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにそれらのアゴニストおよびアンタゴニストを用いて、診断、処置、または予防され得る、増加した細胞生存またはアポトーシスの阻害に関連する疾患としては、以下が挙げられる：癌（例えば、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を伴う癌、およびホルモン依存性腫瘍（大腸癌、心臓腫瘍、膵臓癌、黒色腫、網膜芽細胞腫、神経膠芽細胞腫、肺癌、腸癌、精巣癌、胃癌、神経芽細胞腫、粘液腫、筋腫、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌、前立腺癌、カポジ肉腫および卵巣癌が挙げられるが、これらに限定されない））；自己免疫障害（例えば、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎性慢性関節リウマチ）；ウイルス感染（例えば、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイルス）；炎症；対宿主性移植片病；急性移植片拒絶および慢性移植片拒絶。従って、好ましい実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびに／あるいはそれらのアゴニストまたはアンタゴニストは、自己免疫疾患を処置、予防、および／または診断するため、ならびに／あるいは癌の増殖、進行、および／または転移を阻害するために使用され、このような癌としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：本明細書中に記載された癌（例えば、リンパ球性白血病（例えば、ＭＬＬおよび慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を含む）および濾胞性リンパ腫）。別の実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドもしくはポリペプチドを使用して、癌細胞または癌組織（例えば、Ｂ細胞系関連癌（例えば、ＣＬＬおよびＭＬＬ）、リンパ球性白血病、またはリンパ腫）を活性化、分化または増殖させ、そしてそれによって細胞を、癌治療（例えば、化学療法または放射線療法）に対してより脆弱にする。
【０６４４】
さらに、他の実施形態において、本発明のニュートロカイン−αポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドもしくはポリペプチドあるいはそれらのアゴニストまたはアンタゴニストを使用して、以下のような悪性腫瘍および関連する障害の増殖、進行、および／または転移を阻害する：白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、および赤白血病を含む））、および慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病）を含む）、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクロ大グロブリン血症、Ｈ鎖病、および固形腫瘍（肉腫および癌腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、頸部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫。
【０６４５】
本発明のニュートロカイン−αポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにそれらのアゴニストおよびアンタゴニストを用いて診断、処置、または予防され得る、増加したアポトーシスに関連する疾患としては、以下が挙げられる：ＡＩＤＳ；神経変性障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性）；脊髄形成異常性症候群（例えば、再生不良性貧血）、虚血性障害（例えば、心筋梗塞、発作および再灌流障害によって引き起こされる障害）、毒素誘導性肝疾患（例えば、アルコールによって引き起こされる障害）、敗血症性ショック、悪液質および食欲不振。従って、好ましい実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドもしくはポリペプチドならびに／あるいはそれらのアゴニストまたはアンタゴニストを使用して、上記に列挙される疾患および障害を処置、予防、および／または診断する。
【０６４６】
好ましい実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドおよび／もしくはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドならびに／またはそれらのアゴニストもしくはアンタゴニスト（例えば、抗ニュートロカイン−α抗体）は、用量依存性様式でヒト細網肉腫  Ｕ−９３７細胞の増殖を阻害する。さらなる好ましい実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドおよび／もしくはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドならびに／またはそれらのアゴニストもしくはアンタゴニスト（例えば、抗ニュートロカイン−α抗体）は、ＰＣ−３細胞、ＨＴ−２９細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＣＦ−７細胞、およびＡ２９３細胞の増殖を阻害する。非常に好ましい実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドおよび／もしくはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドならびに／またはそれらのアゴニストもしくはアンタゴニスト（例えば、抗ニュートロカイン−α抗体）を使用して、前立腺癌、大腸癌、頸部癌、および乳癌の増殖、進行、および／または転移を阻害する。
【０６４７】
従って、さらなる好ましい実施形態においては、本発明は、ＴＮＦファミリーのリガンドによって誘導されるアポトーシスを増強させるための方法に関し、この方法は、ニュートロカイン−αレセプターおよび／またはニュートロカイン−αＳＶレセプターを発現する細胞に、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶ媒介シグナル伝達を増加または減少させ得るに有効な量の、ニュートロカイン−αおよび／もしくはニュートロカイン−αＳＶ、またはそれらのアゴニストもしくはアンタゴニストを投与する工程を包含する。好ましくは、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶ媒介シグナル伝達は、減少したアポトーシスまたは減少したサイトカインおよび接着分子発現が提示される疾患を、処置、予防、および／または診断するために増加または減少される。アゴニストまたはアンタゴニストは、可溶形態のニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶ、ならびにニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドを指向するモノクロナール抗体を含み得る。
【０６４８】
さらなる局面においては、本発明は、ＴＮＦ−ファミリーのリガンドによって誘導されるアポトーシスを阻害するための方法に関し、この方法は、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶ媒介シグナル伝達を増加または減少させ得るに有効な量の、アゴニストまたはアンタゴニストを、ニュートロカイン−αレセプターおよび／またはニュートロカイン−αＳＶレセプターを発現する細胞に投与する工程を包含する。好ましくは、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶ媒介シグナル伝達は、増加したアポトーシスまたはＮＦ−κＢ発現が提示される疾患を、処置、予防、および／または診断するために増加または減少される。アゴニストまたはアンタゴニストは、可溶形態のニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶ、ならびにニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドを指向するモノクロナール抗体を含み得る。
【０６４９】
ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶは、ＴＮＦスーパーファミリーに属するので、このポリペプチドもまた、新脈管形成を調節するはずである。さらに、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶは、免疫細胞の機能を阻害するので、このポリペプチドは、広範囲の抗炎症活性を有する。ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶを抗新生血管形成剤として使用して、宿主防御細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージ）の侵入および活性化を刺激することによって、そして腫瘍の新脈管形成を阻害することによって、固形腫瘍を処置、予防、および／または診断し得る。当業者は、血管増殖が望ましくない、癌以外の他の適応症を認識する。これらはまた、抵抗性の慢性感染および急性感染（例えば、殺菌性白血球の誘引および活性化を介する筋細菌性感染）に対する宿主防御を増強するために使用され得る。ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶはまた、Ｔ細胞媒介性の自己免疫性疾患およびリンパ球性白血病（例えば、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を含む）の処置のために、ＩＬ−２生合成の阻害によってＴ細胞増殖を阻害するために使用され得る。ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶはまた、壊死組織片クリーニングおよび結合組織促進炎症細胞の両方の補充によって、創傷治癒を刺激するために使用され得る。この同様の様式において、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶはまた、他の線維症障害（肝硬変、変形性関節症および肺線維症を含む）を処置、予防、および／または診断するために使用され得る。ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶはまた、組織に侵入する寄生虫の幼生（住血吸虫症、旋毛虫症および回虫症におけるように）を殺す独特の機能を有する好酸球の存在を増加させる。これらをまた使用して、例えば、化学療法の後に骨髄から成熟白血球を放出する（すなわち、幹細胞流動）ために、種々の造血前駆細胞の活性化および分化を調節することによって、造血を調節し得る。ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶはまた、敗血症を処置、予防、および／または診断するために使用され得る。
【０６５０】
本発明のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチドならびに／またはそれらのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、広範囲の疾患および／または状態の診断および処置または予防において有用である。このような疾患および状態としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：癌（例えば、免疫細胞間連癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、濾胞性リンパ腫、ｐ５３の変異または変化に関連する癌、脳腫瘍、膀胱癌、子宮頸部癌、大腸癌、結腸直腸癌、肺の非小細胞癌、肺の小細胞癌、胃癌など）、リンパ増殖性障害（例えば、リンパ節症）、微生物（例えば、ウイルス、細菌など）感染（例えば、ＨＩＶ−１感染、ＨＩＶ−２感染、ヘルペスウイルス感染（ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＣＭＶ、ＶＺＶ、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７、ＥＢＶを含むが、これらに限定されない）、アデノウイルス感染、ポックスウイルス感染、ヒトパピローマウイルス感染、肝炎ウイルス（例えば、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶなど）、ヘリコバクターピロリ感染、侵襲性ブドウ球菌感染など）、寄生生物感染、腎炎、骨疾患（例えば、骨粗鬆症）、アテローム性動脈硬化症、疼痛、心臓血管障害（例えば、新生血管形成、低脈管形成または減少した循環（例えば、虚血性疾患（例えば、心筋梗塞、発作など））、ＡＩＤＳ、アレルギー、炎症、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜症、小脳変性など）、移植片拒絶（急性および慢性）、対宿主性移植片病、骨髄形成異常による疾患（例えば、再生不良性貧血など）、リウマチにおける関節組織破壊、肝疾患（例えば、急性肝炎および慢性肝炎、肝傷害ならびに肝硬変）、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、免疫複合体性糸球体腎炎、自己免疫性糖尿病、自己免疫性血小板減少性紫斑病、グレーヴス病、橋本甲状腺炎など）、心筋症（例えば、拡張型心筋症）、糖尿病、糖尿病合併症（例えば、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症）、インフルエンザ、喘息、乾癬、糸球体腎炎、敗血症性ショック、ならびに潰瘍性大腸炎。
【０６５１】
本発明のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチドならびに／またはそれらのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、新脈管形成の促進、創傷治癒（例えば、傷、火傷、および骨折）において有用である。本発明のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチドならびに／またはそれらのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストはまた、特定の抗原、抗ウイルス性免疫応答に対する免疫応答性を増強するためのアジュバントとして有用である。
【０６５２】
より一般的には、本発明のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチドならびに／またはそれらのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、免疫応答の調節（すなわち、増強および減少）において有用である。例えば、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、手術、外傷、放射線療法、化学療法、および移植の準備または手術、外傷、放射線療法、化学療法、および移植からの回復において有用であり得るか、あるいは高齢者および免疫無防備状態の個体における免疫応答および／または免疫回復をブーストするために使用され得る。あるいは、本発明のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチドならびに／またはそれらのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、例えば、自己免疫性障害の処置または予防における、免疫抑制剤として有用である。特定の実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、慢性炎症、アレルギーまたは自己免疫状態（例えば、本明細書中に記載されるか、そうでなければ、当該分野において公知の自己免疫状態）を処置または予防するために使用され得る。
【０６５３】
好ましくは、ニュートロカイン−αポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびに／あるいはニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶのアゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、抗ニュートロカイン−α抗体）を用いる処置は、有効量の本発明のニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチド、あるいはそれらのアゴニストまたはアンタゴニストを、患者に投与することによるか、あるいは患者から細胞を取り除き、ニュートロカイン−αポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドをその細胞に供給し、そして操作した細胞を患者に戻す（エキソビボ治療）ことによるかのいずれかであり得る。さらに、本明細書中でさらに考察されるように、ニュートロカイン−αポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドもしくはポリヌクレオチドは、感染性疾患に対する免疫応答を生じるためのワクチンにおけるアジュバントとして使用され得る。
【０６５４】
（処方および投与）
ニュートロカイン−αポリペプチド組成物および／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチド組成物（好ましくは、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶ細胞外ドメインの可溶形態であるポリペプチドを含有する）は、良好な医療行為に合った様式で、個体患者の臨床的状態（特に、ニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドを単独で用いる処置の副作用）、ニュートロカイン−αポリペプチド組成物および／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチド組成物の送達部位、投与方法、投与スケジュール、ならびに医師が公知の他の要因を考慮して、処方および服用される。従って、本明細書中の目的のための、ニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの「有効量」は、このような要件によって決定される。
【０６５５】
一般的な提案として、非経口的に投与されるニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの、用量当たりの総薬学的有効量は、約１マイクログラム／ｋｇ患者体重／日〜１０ｍｇ／ｋｇ患者体重／日の範囲内であるが、上記のように、これは治療的裁量に供される。より好ましくは、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ患者体重／日であり、そしてヒトについて最も好ましくは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日と１ｍｇ／ｋｇ／日との間である。
【０６５６】
別の実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドは、０．０００１ｍｇ／ｋｇ／日と０．０４５ｍｇ／ｋｇ／日との間の用量で、好ましくは、０．００４５ｍｇ／ｋｇ／日と０．０４５ｍｇ／ｋｇ／日との間の用量で、ヒトに投与され、そしてより好ましくは、ヒトにおいて約４５マイクログラム／ｋｇ／日の用量；マウスにおいて約３ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。
【０６５７】
継続的に与えられた場合、ニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドは、代表的に、約１マイクログラム／ｋｇ／時間から約５０μｇ／ｋｇ／時間の用量速度で、１日あたり１回から４回の注射によってか、または継続的な皮下注入（例えば、ミニポンプを用いて）によってのいずれかで、投与される。静脈内バッグ溶液もまた、使用され得る。
【０６５８】
変化を観察するのに必要とされる処置の長さおよび応答が生じる処置後の間隔は、所望の効果に依存して変更するようである。
【０６５９】
特定の実施形態において、用量あたりの非経口的に投与される総薬学的有効量のニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドは、患者の体重の約０．１μｇ／ｋｇ／日〜４５μｇ／ｋｇ／日の範囲であるが、上記のように、これは、治療上の自由裁量に従う。より好ましくは、この用量は、少なくとも０．１μｇ／ｋｇ／日、および最も好ましくは、ヒトに対して、このタンパク質について約０．０１と５０μｇ／ｋｇ／日の間である。ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶは、継続的な注入、１日あたり複数の慎重な（ｄｉｃｒｅｅｔ）注射（例えば、毎日３回以上、または毎日２回）、１日あたり１回の注射として、または断続的に与えられる慎重な注射（例えば、毎日２回、毎日１回、１日おきに、毎週２回、毎週、各週、毎月、隔月、および年４回）として投与され得る。継続的に与えられる場合、ニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドは、代表的に、約０．００１〜１０μｇ／ｋｇ／時間まで、約５０μｇ／ｋｇ／時間までの用量速度で、１日あたり１〜４回の注射によってか、または継続的な皮下の注入（例えば、ミニポンプを使用して）によってのいずれかで投与される。
【０６６０】
投与される本発明の組成物の有効な投与量は、生物学的半減期、バイオアベイラビリティー、および毒性のようなこのようなパラメータを提出する、当業者に周知の手順を介して、決定され得る。このような決定は、特に本明細書中に提供される詳細な開示を考慮して、当業者の能力の範囲内で十分である。
【０６６１】
治療の間のニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドに対する生物体の生体暴露はまた、治療的有効量養成法および／または薬学的有効量養成法を決定することにおいて重要な役割を果たす。相対的に長期間での、ニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドの相対的少用量の反復投与のような種々の用量は、相対的に短期間でニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドの相対的高用量の反復投与を用いて達成された用量と、治療的および／または薬学的に識別可能な効果を有し得る。例えば、実施例６に示される血清免疫グロブリンレベル実験を参照のこと。
【０６６２】
Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ，Ｅ．Ｊ．ら、（Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ５０（４）：２１９−４４（１９６６））によって供給される等表面投薬転換係数（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｒｅａ  ｄｏｓａｇｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）を使用して、当業者は、所与の実験系におけるニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドの使用により得られるデータを、別の実験系において１用量あたり投与されるニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドの正確な推定値の薬学的有効量に転換し得る。マウス中へのニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドの投与を介して得られた実験データ（例えば、実施例６を参照のこと）は、ラット、サル、イヌ、およびヒトにおけるニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドの薬学的有効量を正確な見積るために、Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈらによって供給される転換係数を介して転換され得る。以下の転換表（表ＩＩＩ）はＦｒｅｉｒｅｉｃｈらにより提供されたデータの概要である。表ＩＩＩは、ある種の、ｍｇ／ｋｇにより表現される用量を、表にした別の種において、ｍｇ／ｋｇとして表現される等表面積用量へ転換するためにおよその係数を所与する。
【０６６３】
【表３】
2007277249.tif 000039
従って、例えば、表ＩＩＩに示される転換係数を用いて、マウスにおける５０ｍｇ／ｋｇの用量は、（５０ｍｇ／ｋｇ）×（１／４）＝１２．５ｍｇ／ｋｇにより、サルにおいて適切な用量の１２．５ｍｇ／ｋｇへ転換する。さらなる実施例のように、マウスにおける０．０２、０．０８、０．８、２および８ｍｇ／ｋｇの用量は、ヒトにおいて、それぞれ１．６６７μｇ／ｋｇ、６．６７μｇ／ｋｇ、６６．７μｇ／ｋｇ、１６６．７μｇ／ｋｇおよび０．６６７ｍｇ／ｋｇの有効量に等しい。
【０６６４】
本発明のニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドを含む薬学的組成物を、経口的、直腸内、非経口的、皮下、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内あるいは経口または鼻腔スプレー（例えば、蒸気または粉剤の吸入を介して）として投与し得る。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または任意の型の製剤補助剤を意味する。１つの実施形態において、「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または任意の型の製剤補助剤を意味する。特定の実施形態において、「薬学的に受容可能」とは、合衆国もしくは州政府の管理機関により認可されている、または米国薬局方においてもしくは動物、およびさらに好適にはヒトにおいて使用するために一般的に認識されている他の薬局方において収載されていることを意味する。本実施形態に従う適切な薬学的キャリアの非限定な例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」により提供され、そして水および油のような、石油、動物、野菜、または合成起源（例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ごま油など）を含む、無菌（ｓｔｅｒｉｌｅ）液を含む。薬学的組成物を静脈内に投与する場合、水が好ましいキャリアである。生理食塩水および水溶性ブドウ糖ならびにグリセロール溶液を、液体キャリアとして、特に注入溶液のために使用し得る。所望される場合、この組成物はまた、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸剤、カプセル、粉剤、徐放性処方などの形態を取り得る。
【０６６５】
本明細書中で使用される用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
【０６６６】
好ましい実施形態において、本発明のニュートロカインα組成物および／またはニュートロカインαＳＶ組成物（ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および抗体、ならびにそれらのアゴニストおよび／アンタゴニストを含む）は、皮下に投与される。
【０６６７】
別の好ましい実施形態において、本発明のニュートロカインα組成物および／またはニュートロカインαＳＶ組成物（ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および抗体、ならびにそれらのアゴニストおよび／アンタゴニストを含む）は、静脈に投与される。
【０６６８】
本発明のニュートロカインα組成物および／またはニュートロカインαＳＶ組成物はまた、徐放性の系により、適切に投与される。徐放性組成物の適切な例としては、適切なポリマー材料（例えば、成形品の形態の半透過性ポリマーマトリックス（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）のような）、適切な疎水性材料（例えば、受容可能な油における乳剤として）またはイオン交換樹脂、および控えめに（ｓｐａｒｉｎｇｌｙ）可溶性の誘導体（例えば、控えめに可溶性な塩のような）が挙げられる。
【０６６９】
徐放性マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ，Ｕら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）およびＲ．Ｌａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら、同書）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられる。
【０６７０】
徐放性組成物はまた、リポソームに封入された本発明の組成物（一般に、Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ、Ｌｏｐｅｚ  ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編）、Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、３１７−３２７頁および３５３−３６５頁（１９８９）を参照のこと）を包含する。ニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドを含有するリポソームは、それ自体が公知である方法により調製される（ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号；ならびにＥＰ１０２，３２４）。通常、リポソームは、小さな（約２００〜８００Å）ユニラメラ型であり、そこでは、脂質含有量は、約３０モル％コレステロールよりも多く、選択された比率が、最適なニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチド治療のために調整される。
【０６７１】
別の実施形態において、本発明の徐放性組成物は、当該分野で公知の結晶処方物を含む。
【０６７２】
さらに別の実施形態において、本発明の徐放性組成物は、ポンプの方法によって送達される。（Ｌａｎｇｅｒ，（前出）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。
【０６７３】
他の制御された放出システムは、Ｌａｎｇｅｒにより総説において議論される（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。
【０６７４】
非経口投与のために、１つの実施形態において、一般に、ニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドは、それを所望の程度の純度で、薬学的に受容可能なキャリア（すなわち用いる投薬量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、かつ処方物の他の成分と適合するキャリア）と、単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で混合することにより処方される。例えば、この処方物は、好ましくは、酸化剤、およびポリペプチドに対して有害であることが知られている他の化合物を含まない。
【０６７５】
一般に、ニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドを液体キャリアまたは微細分割固体キャリアあるいはその両方と均一および緊密に接触させて処方物を調製する。次に、必要であれば、生成物を所望の処方物に成形する。好ましくは、キャリアは、非経口的キャリア、より好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャリアビヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液が挙げられる。不揮発性油およびオレイン酸エチルのような非水性ビヒクルもまた、リポソームと同様に本明細書において有用である。
【０６７６】
キャリアは、等張性および化学安定性を高める物質のような微量の添加剤を適切に含有する。このような物質は、用いる投薬量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、このような物質としては、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸および他の有機酸またはその塩類のような緩衝剤；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド（例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸；セルロースまたはその誘導体、ブドウ糖、マンノース、スクロースまたはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；クレゾール、フェノール、クロロブタノール、ベンジルアルコールおよびパラベンのような保存薬、ならびに／またはポリソルベート、ポロキサマーもしくはＰＥＧのような非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０６７７】
ニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドは、代表的には、約０．００１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、または約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、約３〜１０、または３〜８、より好ましくは５〜８、もっとも好ましくは６〜７のｐＨで、このようなビヒクル中に処方される。前記の特定の賦形剤、キャリアまたは安定化剤を使用することにより、ニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチド塩の形成を生じることが理解される。
【０６７８】
治療的投与に用いられるニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドは無菌状態でなけらばならない。無菌状態は、滅菌濾過膜（例えば０．２ミクロンメンブレン）を通す濾過により、容易に達成される。一般に、治療的ニュートロカインαポリペプチド組成物および／またはニュートロカインαＳＶポリペプチド組成物は、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下用注射針で穿刺可能なストッパー付の静脈内用溶液バッグまたはバイアルに配置される。
【０６７９】
ニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドは、通常、単位用量または複数用量の容器、例えば、密封アンプルまたはバイアルに、水溶液または再構成のための凍結乾燥処方物として貯蔵される。凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌのバイアルに、滅菌濾過した１％（ｗ／ｖ）ニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチド水溶液５ｍｌを充填し、そして得られる混合物を凍結乾燥する。凍結乾燥したニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドを、注射用静菌水を用いて再構成して注入溶液を調製する。
【０６８０】
あるいは、ニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドは、凍結乾燥形態において、単位用量の容器に貯蔵される。注入選択は、注射のための滅菌キャリアを用いて再構成される。
【０６８１】
本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分を充填した一つ以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に必要に応じて付属し得、この通知は、ヒトへの投与のための製造、使用または販売に関する政府機関による承認を反映する。さらに、本発明のポリペプチドを他の治療用化合物と組み合わせて使用され得る。
【０６８２】
本発明の組成物を単独でまたは他の補助剤と組み合わせて投与し得る。本発明の組成物と共に投与され得る補助剤は、ミョウバン、ミョウバンおよびデオキシコール酸（ＩｍｍｕｎｏＡｇ）、ＭＴＰ−ＰＥ（Ｂｉｏｃｉｎｅ  Ｃｏｒｐ．）、ＱＳ２１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、ＢＣＧ、およびＭＰＬを含み得るが、これに限定されない。特定の実施形態において、本発明の組成物をミョウバンと組み合わせて投与する。別の特定の実施形態において、本発明の組成物をＱＳ−２１と組み合わせて投与する。本発明の組成物と共に投与され得るさらなる補助剤は、モノホスホリル液体免疫調節物質、ＡｄｊｕＶａｘ  １００ａ、ＱＳ−２１、ＱＳ−１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム塩、ＭＦ−５９、およびＶｉｒｏｓｏｍａｌアジュバント技術を含むが、これらに限定されない。本発明の組成物と共に投与され得るワクチンは、ＭＭＲ（はしか、おたふくかぜ、風疹）、ポリオ、水痘、破傷風／ジフテリア、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｂ型インフルエンザ菌、百日咳、肺炎、インフルエンザ、ライム病、ロタウイルス、コレラ、黄熱病、日本脳炎、ポリオ、狂犬病、腸チフス、および百日咳に対する防御へ指向されるワクチン、ならびに／またはＰＮＥＵＭＯＶＡＸ−２３TMを含むがこれらに限定されない。同時に（例えば、混合剤として）、別々であるが同時もしくは並行して；または経時的にのいずれかの配合物を投与し得る。これは、組み合わせた薬剤を治療混合剤として共に投与する提示、また組み合わせ剤を別々であるが、同時に（例えば、別々の静脈内ラインを個々の同じ静脈ラインへ通すように）投与する手順を含む。さらに、「組み合わせての」投与は、化合物の１つの別々の投与または、所与の第１の、続いて第２の薬剤の投与を含む。
【０６８３】
別の特定の実形態において、本発明の組成物は、ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ−２３TMと組み合わせて使用され、それらと関連する、感染および／または任意の疾患、障害、および／または状態を処置、予防、および／または診断する。１つの実施形態において、本発明の組成物は、ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ−２３TMと組み合わされて使用され、それらと関連する、任意のグラム陽性細菌感染および／または任意の疾患、障害、および／または状態を、処置、予防、そして／または診断する。別の実施形態において、本発明の組成物は、ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ−２３TMと組み合わされて使用され、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属および／またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の１つ以上のメンバーと関連する、感染および／または任意の疾患、障害、および／または状態を、処置、予防、および／または診断する。別の実施形態において、本発明の組成物は、ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ−２３TMと任意に組み合わされて使用され、Ｂ群連鎖球菌の一つ以上のメンバーと関連する感染および／または任意の疾患、障害、および／または状態を、処置、予防、および／または診断する。別の実施形態において、本発明の組成物は、ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ−２３TMと組み合わされて使用され、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅと関連する、感染および／または任意の疾患、障害、および／または状態を、処置、予防、および／または診断する。
【０６８４】
本発明の組成物は、単独または他の治療剤（化学療法剤、抗生物質、抗ウイルス薬剤、ステロイド系抗炎症剤および非ステロイド系抗炎症剤、従来の免疫治療剤ならびにサイトカイン）と組み合わせて投与され得る。付随して（例えば、混合剤として）、別々であるが同時もしくは並行して、；または経時的にのいずれかで組み合わせ剤を投与し得る。これは、組み合わせ剤を治療混合剤として共に投与する提示、およびまた組み合わせ剤を別々であるが、同時に（例えば、別々の静脈内ラインを個々の同じ静脈ラインへ通すように）投与する手順を含む。さらに、「組み合わせの」投与は、化合物の１つの別々の投与または、所与の第１の、続いて第２の薬剤の投与を含む。
【０６８５】
１つの実施形態において、本発明の組成物を、ＴＮＦファミリーの他のメンバーと組み合わせて投与する。本発明の組成物と共に投与され得る、ＴＮＦ、ＴＮＦ関連またはＴＮＦ様の分子は、以下を含むが、これらに限定されない：可溶形態のＴＮＦ−α、リンホトキシン−α（ＬＴ−α、ＴＮＦ−βとしても公知）、ＬＴ−β（ＬＴ−α２−βのヘテロトリマー複合体において見出される）、ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−γ（国際公開第ＷＯ  ９６／１４３２８号）、ＡＩＭ−Ｉ（国際公開第ＷＯ  ９７／３３８９９号）、ＡＩＭ−ＩＩ（国際公開第ＷＯ
９７／３４９１１号）、ＡＰＲＩＬ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８（６）：１１８５−１１９０）、エンドカイン（ｅｎｄｏｋｉｎｅ）−α（国際公開第ＷＯ
９８／０７８８０号）、ＴＲ６（国際公開第ＷＯ  ９８／３０６９４号）、ＯＰＧおよびニュートロカイン（ｎｅｕｔｒｏｋｉｎｅ）−α（国際公開第ＷＯ  ９８／１８９２１号）、ＯＸ４０および神経成長因子（ＮＧＦ）およびＦａｓの可溶形態、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＣＤ４０および４−ＩＢＢ、ＴＲ２（国際公開第ＷＯ  ９６／３４０９５号）、ＤＲ３（国際公開第ＷＯ  ９７／３３９０４号）、ＤＲ４（国際公開第ＷＯ  ９８／３２８５６号）、ＴＲ５（国際公開第ＷＯ
９８／３０６９３号）、ＴＲ６（国際公開第ＷＯ  ９８／３０６９４号）、ＴＲ７（国際公開第ＷＯ  ９８／４１６２９号）、ＴＲＡＮＫ、ＴＲ９（国際公開第ＷＯ  ９８／５６８９２号）、ＴＲ１０（国際公開第ＷＯ  ９８／５４２０２号）、３１２Ｃ２（国際公開第ＷＯ  ９８／０６８４２号）、およびＴＲ１２。
【０６８６】
好ましい実施形態において、本発明の組成物は、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、可溶性形態のＣＤ４０Ｌ（例えば、ＡＶＲＥＮＤTM）、ＣＤ４０Ｌの生物学的に活性なフラグメント、改変体、もしくは誘導体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体（例えば、アゴニスト抗体、またはアンタゴニスト抗体）、および／または抗ＣＤ４０抗体（例えば、アゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体）と組み合わされて投与される。
【０６８７】
特定の実施形態において、本発明の組成物を、抗レトロウイルス剤、ヌクレオシド逆転写阻害剤、非ヌクレオシド逆転写阻害剤、および／またはプロテアーゼ阻害剤と組み合わせて投与する。本発明の組成物と組み合わせて投与され得るヌクレオシド逆転写阻害剤は、ＲＥＴＲＯＶＩＲTM（ジドブジン／ＡＺＴ）、ＶＩＤＥＸTM（ジダノシン／ｄｄＩ）、ＨＩＶＩＤTM（ザルシタビン（ｚａｌｃｉｔａｂｉｎｅ／ｄｄＣ）／ｄｄＣ）、ＺＥＲＩＴTM（スタブジン（ｓｔａｖｕｄｉｎｅ）／ｄ４Ｔ）、ＥＰＩＶＩＲTM（ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）／３ＴＣ）、およびＣＯＭＢＩＶＩＲTM（ジドブジン／ラミブジン）を含むが、限定されない。本発明の組成物と組み合わされて投与し得る非ヌクレオシド逆転写阻害剤は、ＶＩＲＡＭＵＮＥTM（ネビラピン（ｎｅｖｉｒａｐｉｎ））、ＲＥＳＣＲＩＰＴＯＲTM（デラビルジン（ｄｅｌａｖｉｒｄｉｎｅ））、およびＳＵＳＴＩＶＡTM（エファビレンツ（ｅｆａｖｉｒｅｎｚ））を含むが、これらに限定されない。本発明の組成物と組み合わせて投与され得るタンパク質阻害剤は、ＣＲＩＸＩＶＡＮTM（インジナビル（ｉｎｄｉｎａｖｉｒ））、ＮＯＲＶＩＲTM（リトナビル（ｒｉｔｏｎａｖｉｒ））、ＩＮＶＩＲＡＳＥTM（サキナビル（ｓａｑｕｉｎａｖｉｒ）、およびＶＩＲＡＣＥＰＴTM（ネルフィナビル（ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ））を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、抗レトロウイルス剤、ヌクレオシド逆転写阻害剤、非ヌクレオシド逆転写阻害剤、および／またはプロテアーゼ阻害剤は、本発明の組成物と任意に組み合わせて、使用され、ＡＩＤＳを処置、防止、および／もしくは診断し得、ならびに／またはＨＩＶ感染を処置、防止、および／もしくは診断し得る。
【０６８８】
他の実施形態において、本発明の組成物を抗日和見性感染剤と組み合わせて投与し得る。本発明の組成物と組み合わせて投与され得る抗日和見性剤は、ＴＲＩＭＥＴＨＯＰＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥTM、ＤＡＰＳＯＮＥTM、ＰＥＮＴＡＭＩＤＩＮＥTM、ＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥTM、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤTM、ＲＩＦＡＭＰＩＮTM、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥTM、ＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬTM、ＲＩＦＡＢＵＴＩＮTM、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮTM、ＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮTM、ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲTM、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴTM、ＣＩＤＯＦＯＶＩＲTM、ＦＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥTM、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥTM、ＫＥＴＯＣＯＮＡＺＯＬＥTM、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲTM、ＦＡＭＣＩＣＯＬＶＩＲTM、ＰＹＲＩＭＥＴＨＡＭＩＮＥTM、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮTM、ＮＥＵＰＯＧＥＮTM（フィルグラスティム／Ｇ−ＣＳＦ）、およびＬＥＵＫＩＮＥTM（サーグラモスティム（ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｍ／ＧＭ−ＣＳＦ）を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＴＲＩＭＥＴＨＯＰＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥTM、ＤＡＰＳＯＮＥTM、ＰＥＮＴＡＭＩＤＩＮＥTM、および／またはＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥTMと任意に組み合わせて使用され、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ肺炎感染を予防的に処置し、予防し、および／または診断し得る。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤTM、ＲＩＦＡＭＰＩＮTM、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥTM、および／またはＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬTMと任意に組み合わせて使用され、日和見性Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ菌複合感染を予防的に処置し、予防し、および／または診断し得る。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＲＩＦＡＢＵＴＩＮTM、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮTM、および／またはＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮTM、と任意に組み合わせて使用され、日和見性Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染を予防的に処置、予防、および／または診断し得る。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲTM、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴTM、および／またはＣＩＤＯＦＯＶＩＲTMと任意に組み合わせて使用され、日和見性サイトメガロウイルス感染を予防的に処置、予防、および／または診断し得る。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＦＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥTM、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥTM、および／またはＫＥＴＯＣＯＮＡＺＯＬＥTMと任意に組み合わせて使用され、日和見性真菌感染を予防的に処置、予防、および／または診断し得る。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲTM、および／またはＦＡＭＣＩＣＯＬＶＩＲTMと任意に組み合わせて使用され、日和見性単純ヘルペスウイルス型Ｉ感染および／または単純ヘルペスウイルス型ＩＩ感染を予防的に処置、予防、および／または診断し得る。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＰＹＲＩＭＥＴＨＡＭＩＮＥTMおよび／またはＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮTMと任意に組み合わせて使用され、日和見性Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ感染を予防的に処置し、予防し、および／または診断し得る。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮTMおよび／またはＮＥＵＰＯＧＥＮTMと任意に組み合わせて使用され、日和見性細菌感染を予防的に処置し、予防し、および／または診断し得る。
【０６８９】
さらなる実施形態において、本発明の組成物を、抗ウイルス剤と組み合わせて投与する。本発明の組成物と共に投与され得る抗ウイルス剤は、アシクロビル、リバビリン、アマンタジン、およびレマンチジン（ｒｅｍａｎｔｉｄｉｎｅ）を含むが、これらに限定されない。
【０６９０】
さらなる実施形態において、本発明の組成物を抗生物質剤と組み合わせて投与する。本発明の組成物と共に投与され得る抗生物質剤は、アモキシリン、アミノ酸糖体、β−ラクタム（糖ペプチド）、β−ラクタマーゼ、クリンダマイシン、クロラムフェニコール、セファロスポリン、シプロフロキサシン、エリトロマイシン、フルオロキノロン類、マクロライド系抗生物質、メトロニダゾル、ペニシリン類、キノロン類、リファンピン、ストレプトマイシン、スルホンアミド、テトラサイクリン、トリペトプリム、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、およびバンコマイシンを含むが、これらに限定されない。
【０６９１】
本発明の組成物と組み合わせて投与され得る、従来の非特定の免疫抑制剤は、ステロイド、シクロスポリン、シクロスポリンアナログ、シクロホスファミド、シクロホスファミドＩＶ、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、アザチオプリン、ＦＫ−５０６、１５−デオキシスパーグアリン（ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）、およびＴ細胞に応答する機能を抑制することにより作用する他の免疫抑制剤を含むが、これらに限定されない。
【０６９２】
特定の実施形態において、本発明の組成物を、免疫抑制薬と組み合わせて投与する。本発明の組成物と共に投与され得る免疫抑制薬製剤は、ＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥTM（ＯＫＴ３）、ＳＡＮＤＩＭＭＵＮＥTM／ＮＥＯＲＡＬTM／ＳＡＮＧＤＹＡTM（シクロスポリン）、ＰＲＯＧＲＡＦTM（タクロリムス）、ＣＥＬＬＣＥＰＴTM（マイコフェノレート（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ））、アザチオプリン、グルコルチコステロイド（ｇｌｕｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ）、およびＲＡＰＡＭＵＮＥTM（シロリマス（ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ））を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、免疫抑制剤は、器官または骨髄移植の拒絶を妨ぐために使用され得る。
【０６９３】
好ましい実施形態において、本発明の組成物は、ステロイド治療と組み合わせて投与される。本発明の組成物と組み合わせて投与され得るステロイドとしては、オーラル（ｏｒａｌ）コルチコステロイド、プレドニゾン、およびメチルプレドニゾロン（例えば、ＩＶメチルプレドニゾロン）が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態において、本発明の組成物は、プレドニゾンと組み合わせて投与される。さらに特定の実施形態において、本発明の組成物は、プレドニゾンおよび免疫抑制剤と組み合わせて投与される。本発明の組成物およびプレドニゾンと投与され得る免疫抑制剤は、本明細書中に記載される免疫抑制剤であり、アザチオプリン、シクロホスファミド、およびシクロホスファミドＩＶが挙げられるがこれらに限定されない。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、メチルプレドニゾロンと組み合わせて投与される。さらなる特定の実施形態において、本発明の組成物は、メチルプレドニゾロンと組み合わせて投与される。さらに特定の実施形態において、本発明の組成物は、メチルプレドニゾロンおよび免疫抑制剤と組み合わせて投与される。本発明の組成物およびメチルプレドニゾロンの組成物と共に投与され得る免疫抑制剤は、本明細書中に記載される免疫抑制剤であり、そしてアザチオプリン、シクロホスファミド、およびシクロホスファミドＩＶが挙げられるがこれらに限定されない。
【０６９４】
好ましい実施形態において、本発明の組成物は、抗マラリア薬と組み合わせて投与される。本発明の組成物と共に投与され得る抗マラリア薬としては、ヒドロキシクロロキン、および／またはキナクリンが挙げられるがこれらに限定されない。
【０６９５】
好ましい実施形態において、本発明の組成物は、ＮＳＡＩＤと組み合わせて投与される。
【０６９６】
非独占的な実施形態において、本発明の組成物は、１、２、３、４、５、１０、またはそれ以上の、以下の薬物と組み合わせて投与される：ＮＲＤ−１０１（Ｈｏｅｃｈｓｔ  Ｍａｒｉｏｎ  Ｒｏｕｓｓｅｌ）、ジクロフェナク（Ｄｉｍｅｔｈａｉｄ）、オキサプロジンカリウム（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）、メカセルミン（ｍｅｃａｓｅｒｍｉｎ）（Ｃｈｉｒｏｎ）、Ｔ−６１４（Ｔｏｙａｍａ）、ペメトレクスト二ナトリウム（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ  ｄｉｓｏｄｉｕｍ）（Ｅｌｉ
Ｌｉｌｌｙ）、オトレルートン（ａｔｒｅｌｅｕｔｏｎ）（Ａｂｂｏｔｔ）ヴァルデコキシブ（ｖａｌｄｅｃｏｘｉｂ）（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）、エルテナク（Ｂｙｋ  Ｇｕｌｄｅｎ）、カンパッチ（ｃａｍｐａｔｈ）、ＡＧＭ−１４７０（Ｔａｋｅｄａ）、ＣＤＰ−５７１（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ  Ｃｈｉｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＭ−１０１（ＣａｒｂｏＭｅｄ）、ＭＬ−３０００（Ｍｅｒｃｋｌｅ）、ＣＢ−２４３１（ＫＳ  Ｂｉｏｍｅｄｉｘ）、ＣＢＦ−ＢＳ２（ＫＳ  Ｂｉｏｍｅｄｉｘ）、ＩＬ−１Ｒａ遺伝子治療（ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）（Ｖａｌｅｎｔｉｓ）、ＪＴＥ−５２２（Ｊａｐａｎ  Ｔｏｂａｃｃｏ）、パクリタキセル（Ａｎｇｉｏｔｅｃｈ）、ＤＷ−１６６ＨＣ（Ｄｏｎｇ  Ｗｈａ）、ダルブフェロンメシレート（ｄａｒｂｕｆｅｌｏｎｅ  ｍｅｓｙｌａｔｅ）（Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ）、可溶性ＴＮＦレセプター１（ｓｙｎｅｒｇｅｎ；Ａｍｇｅｎ）、ＩＰＲ−６００１（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、トロケード（ｔｒｏｃａｄｅ）（Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ）、ＥＦ−５（Ｓｃｏｔｉａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＢＩＩＬ−２８４（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、ＢＩＩＦ−１１４９（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、ＬｅｕｋｏＶａｘ（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｃｓ）、ＭＫ−６６３（Ｍｅｒｃｋ）、ＳＴ−１４８２（Ｓｉｇｍａ−Ｔａｕ）およびブチソコートプロピオネート（ｂｕｔｉｘｏｃｏｒｔ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）（ＷａｒｎｅｒＬａｍｂｅｒｔ）。
【０６９７】
好ましい実施形態において、本発明の組成物は、１、２、３、４、５、１０、またはそれ以上の、以下の薬物と組み合わせて投与される：メトトレキセート、スルファサラジン、金チオリンゴ酸ナトリウム、オーラノフィン、シクロスポリン、ペニシラミン、アザチオプリン、抗マラリア薬（例えば、上記のような）、シクロホスファミド、クロラムブシル、金、ＥＭＢＲＥＬTM（Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）、抗ＴＮＦ抗体、およびプレドニゾロン。
【０６９８】
より好ましい実施形態において、本発明の組成物は、抗マラリア薬、メトトレキセート、抗ＴＮＦ抗体、ＥＭＢＲＥＬTMおよび／またはスルファサラジンと組み合わせて投与される。１つの実施形態において、本発明の組成物は、メトトレキセートと組み合わせて投与される。別の実施形態において、本発明の組成物は、抗ＴＮＦ抗体と組み合わせて投与される。別の実施形態において、本発明の組成物は、メトトレキセートおよび抗ＴＮＦ抗体と組み合わせて投与される。別の実施形態において、本発明の組成物は、スルファサラジンと組み合わせて投与される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、メトトレキセート、抗ＴＮＦ抗体、およびスルファサラジンと組み合わせて投与される。別の実施形態において、本発明の組成物は、ＥＭＢＲＥＬTMと組み合わせて投与される。別の実施形態において、本発明の組成物は、ＥＭＢＲＥＬTMおよびメトトレキセートと組み合わせて投与される。別の実施形態において、本発明の組成物は、ＥＭＢＲＥＬTM、メトトレキセートおよびスルファサラジンと組み合わせて投与される。別の実施形態において、本発明の組成物は、ＥＭＢＲＥＬTM、メトトレキセートおよびスルファサラジンと組み合わせて投与される。他の実施形態において、１つ以上の抗マラリア薬は、上記に列挙された組み合わせ剤の１つと組み合わせられる。特定の実施形態において、本発明の組成物は、抗マラリア薬（例えば、ヒドロキシクロロキン）、ＥＭＢＲＥＬTM、メトトレキセートおよびスルファサラジンと組み合わせて投与される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、抗マラリア薬（例えば、ヒドロキシクロロキン）、スルファサラジン、抗ＴＮＦ抗体、およびメトトレキセートと組み合わせて投与される。
【０６９９】
さらなる実施形態において、本発明の組成物は、単独でかまたは１以上の静脈内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。本発明の組成物と組み合わせて投与され得る静脈内免疫グロブリン調製物としては、ＧＡＭＭＡＲTM、ＩＶＥＥＧＡＭTM、ＳＡＮＤＯＧＬＯＢＵＬＩＮTM、ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ  Ｓ／ＤTMおよびＧＡＭＩＭＵＮＥTMが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本発明の治療剤は、移植治療（例えば、骨髄移植）において静脈内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。
【０７００】
ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ４０Ｌの可溶性形態（例えば、ＡＶＲＥＮＤTM）、ＣＤ４０Ｌの、生物学的活性フラグメント、改変体、もしくは誘導体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体（例えば、アゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体）、および／または抗ＣＤ４０抗体（例えば、アゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体）
さらなる実施形態において、本発明の組成物は、単独でかまたは抗炎症剤と組み合わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得る抗炎症剤としては、グルココルチコイドおよび非ステロイド抗炎症剤、アミノアリールカルボン酸誘導体、アリール酢酸誘導体、アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、アリールプロピオン酸誘導体、ピラゾール類、ピラゾロン類、サリチル酸誘導体、チアジンカルボキサミド類、ｅ−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン（ａｍｉｘｅｔｒｉｎｅ）、ベンダザック、ベンジダミン、ブコローム、ジフェンピラミド、ジタゾール、エモルファゾン、グアイアズレン、ナブメトン、ニメスリド、オルゴテイン、オキサセプロール、パラニリン（ｐａｒａｎｙｌｉｎｅ）、ペリソキサール、ピフオキシム、プロカゾン、プロキサゾール、およびテニダプが挙げられるが、これらに限定されない。
【０７０１】
別の実施形態において、本発明の組成物は、化学療法剤と組み合わせて投与される。本発明の治療剤とともに投与され得る化学療法剤としては、抗生物質誘導体（例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、およびダクチノマイシン）；抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）；抗代謝物（例えば、フルオロウラシル、５−ＦＵ、メトトレキサート、フロクスウリジン、インターフェロンα−２ｂ、グルタミン酸、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、メルカプトプリン、および６−チオグアニン）；細胞傷害剤（例えば、カルムスチン、ＢＣＮＵ、ロムスチン、ＣＣＮＵ、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、エストラムスチン、ヒドロキシウレア、プロカルバジン、マイトマイシン、ブスルファン、シス−プラチン、および硫酸ビンクリスチン）；ホルモン（例えば、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エチニルエストラジオール、エストラジオール、酢酸メゲストロール、メチルテストステロン、ジエチルスチルベストロールジホスフェート、クロロトリアニセン、およびテストラクトン）；ナイトロジェンマスタード誘導体（例えば、メファレン（ｍｅｐｈａｌｅｎ）、クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）およびチオテパ）；ステロイド類および組み合わせ（例えば、ベタメタゾンリン酸ナトリウム）；ならびにその他（例えば、ジカルバジン（ｄｉｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アスパラギナーゼ、ミトーテン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、およびエトポシド）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７０２】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＣＨＯＰ（シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）と組み合わせて投与されるか、ＣＨＯＰの成分の任意の組み合わせで投与される。別の実施形態において、本発明の組成物は、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂと組み合わせて投与される。さらなる実施形態において、本発明の組成物は、ＲｉｔｕｘｍａｂおよびＣＨＯＰと共に、またはＲｉｔｕｘｍａｂおよびＣＨＯＰの成分の任意の組み合わせと共に投与される。
【０７０３】
さらなる実施形態において、本発明の組成物は、サイトカインと組み合わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得るサイトカインとしては、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１５、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態において、本発明の治療剤は、任意のインターロイキン（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、およびＩＬ−２２を含むが、これらに限定されない）と共に投与され得る。好ましい実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ４およびＩＬ１０と組み合わせて投与される。ＩＬ４およびＩＬ１０の両方が、ニューロカインα媒介Ｂ細胞増殖を増加させることが、本発明者らによって観察された。
【０７０４】
さらなる実施形態において、本発明の組成物を、ケモカインと共に投与する。別の実施形態において、本発明の組成物を、ケモカインβ−８、ケモカインβ−１、および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−４と共に投与する。好ましい実施形態において、本発明の組成物を、ケモカインβー８と共に投与する。
【０７０５】
さらなる実施形態において、本発明の組成物をＩＬ−４アンタゴニストと組み合わせて投与する。本発明の組成物と共に投与され得るＩＬ−４アンタゴニストは、可溶性ＩＬ−４レセプターポリペプチド、可溶性ＩＬ−４レセプターポリペプチドの多量体の形態；ＩＬ−４により誘発される生物学的シグナルを形質導入することなしに、ＩＬ−４レセプターに結合する抗ＩＬ−４レセプター抗体、１つ以上のＩＬ−４レセプターへＩＬ−４を結合させることをブロックする抗ＩＬ−４抗体、およびＩＬ−４レセプターを結合するがＩＬ−４により誘発される生物学的シグナルを形質転換しないＩＬ−４のムテインを含むが、これらに限定されない。好ましくは、この方法に従って使用される抗体は、モノクロ−ナル抗体（例えば、本明細書中に記載される抗体フラグメントのような抗体フラグメントを含む）である。
【０７０６】
さらなる実施形態において、本発明の組成物を造血増殖因子と組み合わせて投与する。本発明の組成物と共に投与され得る造血増殖因子は、ＬＥＵＫＩＮＥTM（ＳＡＲＧＲＡＭＯＳＴＩＭTM）およびＮＥＵＰＯＧＥＮTM（ＦＩＬＧＲＡＳＴＩＭTM）を含むが、これらに限定されない。
【０７０７】
さらなる実施形態において、本発明の組成物を線維芽細胞増殖因子と組み合わせて投与する。本発明の組成物と共に投与され得る線維芽細胞増殖因子は、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、およびＦＧＦ−１５を含むが、これらに限定されない。
【０７０８】
さらに、本発明の組成物を、単独または他の治療養生法と組み合わせて投与し得、この治療養生法は放射療法を含むが、これに限定されない。このような組合せ治療を経時的におよび／または同時に投与し得る。
【０７０９】
（アゴニストおよびアンタゴニスト−アッセイならびに分子）
本発明は、細胞に対するニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドの作用（例えば、レセプター分子のようなニュートロカインα結合分子および／またはニュートロカインαＳＶ結合分子との相互作用）を増強し、またはブロックする化合物を同定するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。アゴニストは、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの天然の生物学的機能を増加させるか、またはニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶと類似の様式で機能する化合物であり、一方、アンタゴニストはこのような機能を減少または除去する。
【０７１０】
別の実施形態において、本発明は、ニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドへ特異的に結合する、レセプタータンパク質または他のリガンド結合タンパク質を同定するための方法を提供する。例えば、細胞の区画（例えば、その膜または調製物）をニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶに結合する分子を発現する細胞から調製し得る。この調製を、標識したニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶを用いてインキュベートし、そしてレセプターまたは他の結合タンパク質に結合したニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの複合体を、慣用的な当業者に公知の方法により、単離し、そして特徴づける。あるいは、細胞から可溶化された結合分子をカラムへ結合させ、次いで慣用的な方法に従って溶出しそして特徴付けるためにニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドを、固体支持体へ結合させ得る。
【０７１１】
アゴニストまたはアンタゴニストについての本発明のアッセイにおいて、細胞区画（例えば、膜または膜の調製物）は、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶに結合する分子（例えば、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶによって調節されるシグナル経路または調節経路の分子）を発現する細胞から調製され得る。その調製物は、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶアゴニストもしくはニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶアンタゴニストであり得る候補分子の非存在下または存在下で、標識されたニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶと共にインキュベートされる。候補分子の、結合分子に結合する能力は、標識されたリガンド結合の減少に反映される。無償で（ｇｒａｔｕｉｔｏｕｓｌｙ）結合する分子、すなわち、ニュートロカインα結合分子および／またはニュートロカインαＳＶ結合分子に結合する場合にニュートロカインαの効果を誘導することを伴わない分子は、最も、優良なアンタゴニストである可能性が高い。うまく結合し、そしてニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶと同じまたは密接に関連した効果を誘発する分子は、アゴニストである。
【０７１２】
潜在的アゴニストおよびアンタゴニストのニュートロカインα様の効果および／またはニュートロカインαＳＶ様の効果は、例えば、細胞または適切な細胞調製物との候補分子の相互作用に続くセカンドメッセンジャー系の活性を決定することにより、およびその効果をニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの効果もしくはニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶと同じような効果を誘発する分子の効果と比較することにより測定され得る。これに関して有用であり得るセカンドメッセンジャー系としては、ＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャネル、またはホスホイノシチド加水分解セカンドメッセンジャー系が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７１３】
ニュートロカインαアンタゴニストおよび／またはニュートロカインαＳＶアンタゴニストについてのアッセイの別の例は、競合アッセイである。このアッセイは、競合的阻害アッセイについての適切な条件下で、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶおよび潜在的アンタゴニストと、膜結合レセプター分子または組換えニュートロカインαレセプター分子および／またはニュートロカインαＳＶレセプター分子を組み合わせる。ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶは、例えば、放射性活性によって標識され得、その結果、レセプター分子に結合したニュートロカインα分子および／またはニュートロカインαＳＶ分子の数が、潜在的アンタゴニストの有効性を評価するために正確に決定され得る。
【０７１４】
潜在的アンタゴニストとしては、本発明のポリペプチドに結合し、そしてそれによってその活性を阻害または無効にする有機低分子、ペプチド、ポリペプチド（例えば、ＩＬ−１３）および抗体が挙げられる。潜在的アンタゴニストはまた、ニュートロカインα誘導性活性および／またはニュートロカインαＳＶ誘導性活性を誘導することなく、結合分子（例えば、レセプター分子）上の同じ部位に結合し、それによって結合からニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶを除外することによりニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの作用を妨げる、密接に関連したタンパク質または抗体のような有機低分子、ペプチド、ポリペプチドであり得る。
【０７１５】
他の潜在的アンタゴニストとしては、アンチセンス分子が挙げられる。アンチセンス技術は、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを通して、または三重鎖ヘリックス形成を通して遺伝子発現を制御するために使用され得る。アンチセンス技術は、例えば、Ｏｋａｎｏ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；「Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、ＣＲＣ
Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒｏｔａｎ、ＦＬ（１９８８）において議論される。アンチセンス技術は、アンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡを介して、または三重鎖へリックス形成を介して、遺伝子発現を制御するために使用され得る。アンチセンス技術は、例えば、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；「Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒｏｔａｎ、ＦＬ（１９８８）において議論される。三重鎖ヘリックス形成は、例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３６０（１９９１）において議論される。この方法は、相補的ＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチドの細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチドの５’コード部分は、長さが約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するために使用され得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設計され、それによって転写およびニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの産生を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドへの翻訳をブロックする。上記のオリゴヌクレオチドはまた、細胞に送達され得、その結果アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡは、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの産生を阻害するようにインビボで発現され得る。
【０７１６】
１つの実施形態において、本発明のニュートロカインαアンチセンス核酸および／またはニュートロカインαＳＶアンチセンス核酸は、外因性配列からの転写によって細胞内で産生される。例えば、ベクターまたはその部分は、転写され、本発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を生じる。このようなベクターは、ニュートロカインαアンチセンス核酸および／またはニュートロカインαＳＶアンチセンス核酸をコードする配列を含む。このようなベクターは、所望のアンチセンスＲＮＡを産生するように転写され得る限り、エピソーム性のままであり得るか、または染色体に組み込まれ得る。このようなベクターは、当該分野で標準的な組換えＤＮＡ技術方法によって構築され得る。ベクターは、脊椎動物細胞における複製および発現に使用される、プラスミド、ウイルスまたは当該分野において公知の他の物であり得る。ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶをコードする配列、またはそのフラグメントの発現は、脊椎動物細胞（好ましくは、ヒト細胞）において作用する、当該分野において公知の任意のプロモーターによってであり得る。このようなプロモーターは、誘導性または構成的であり得る。このようなプロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２９：３０４〜３１０（１９８１）、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ、２２：７８７〜７９７（１９８０）、ヘルペスチミジンプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、７８：１４４１〜１４４５（１９８１）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２９６：３９〜４２（１９８２））などが挙げられるがこれらに限定されない。
【０７１７】
本発明のアンチセンス核酸は、ニュートロカインα遺伝子および／またはニュートロカインαＳＶ遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的な配列を含む。しかし、完全な相補性が好まれるが、必要とはされない。本明細書中でいわれる「ＲＮＡの少なくとも一部に相補的な」配列とは、ＲＮＡとハイブリダイズし、安定な二重鎖を形成し得るに十分な相補性を有する配列を意味する；二本鎖ニュートロカインαアンチセンス核酸および／またはニュートロカインαＳＶアンチセンス核酸の場合、従って、二重鎖ＤＮＡの一本鎖が、試験され得るか、または三重鎖形成がアッセイされ得る。ハイブリダイズする能力は、アンチセンス核酸の相補性および長さの両方の程度に依存する。一般に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、ニュートロカインα  ＲＮＡおよび／またはニュートロカインαＳＶ  ＲＮＡとの塩基のミスマッチはより多いが、これは、安定な二重鎖（または場合によっては三重鎖）を含み、そしてなおこれを形成し得る。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を決定するための標準的な手順の使用によって、ミスマッチの耐容可能な程度を確認し得る。
【０７１８】
メッセージの５’末端（例えば、ＡＵＧ開始コドンまでの、およびこれを含む５’非翻訳配列）に相補的なオリゴヌクレオチドは、翻訳を阻害する際に最も効率的に作用するはずである。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的な配列も同様に、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する際に効果的であることが示されている。一般的には、Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：３３３〜３３５を参照のこと。従って、図１Ａ〜Ｂに示されるニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの５’または３’の翻訳されない非コード領域のいずれかに相補的なオリゴヌクレオチドおよび５Ａ−Ｂのそれぞれは、アンチセンスアプローチにおいて内因性ニュートロカインα  ｍＲＮＡおよび／またはニュートロカインαＳＶ  ｍＲＮＡの翻訳を阻害するために使用され得る。このｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補物を含むはずである。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、翻訳のより非効率的なインヒビターであるが、本発明に従って使用され得る。ニュートロカインα  ｍＲＮＡおよび／またはニュートロカインαＳＶ  ｍＲＮＡの５’領域、３’領域またはコード領域にハイブリダイズするように設計されるにせよ、アンチセンス核酸は、少なくとも６個のヌクレオチドの長さであるべきであり、そして好ましくは、６〜約５０個のヌクレオチドの長さの範囲のオリゴヌクレオチドである。特定の局面において、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０個のヌクレオチド、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも２５個のヌクレオチドまたは少なくとも５０個のヌクレオチドである。
【０７１９】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡあるいはそれらのキメラ混合物または誘導体または改変バージョンの一本鎖または二本鎖であり得る。このオリゴヌクレオチドは、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを改善するために、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格にて改変され得る。このオリゴヌクレオチドは、ペプチドのような他の付加された基（例えば、インビボで宿主細胞のレセプターを標的とするため）、または細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３〜６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８〜６５２（１９８７）；ＰＣＴ公開番号：ＷＯ８８／０９８１０（１９８８年１２月１５日に公開）を参照のこと）もしくは血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号：ＷＯ８９／１０１３４（１９８８年４月２５日に公開）を参照のこと）を横切る輸送を容易にする薬剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：９５８〜９７６（１９８８）を参照のこと）またはインターカレート剤（例えば、Ｚｏｎ、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９〜５４９（１９８８）を参照のこと）を含み得る。この目的のために、このオリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発（ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ）切断剤など）に結合体化され得る。
【０７２０】
このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下を含むがこれらに限定されない群から選択される、少なくとも１つの改変された塩基部分を含み得る：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、クエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。
【０７２１】
このアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソースを含むが、これらに限定されない群から選択される少なくとも１つの改変糖部分を含み得る。
【０７２２】
なお別の実施形態では、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタール、またはそれらのアナログを含むが、これらに限定されない群から選択される少なくとも１つの改変リン酸骨格を含む。
【０７２３】
なお別の実施形態では、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、α−アノマーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的なＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、ここでは、通常のβ−単位とは反対に、鎖は、互いに対して平行に進行する（Ｇａｕｔｉｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１（１９８７））。このオリゴヌクレオチドは、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１５：６１３１−６１４８（１９８７））、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、２１５：３２７−３３０（１９９７））である。
【０７２４】
本発明のポリヌクレオチドは、当該分野で公知の標準的な方法（例えば、自動化ＤＮＡ合成装置（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから市販される）の使用による）によって合成され得る。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドがＳｔｅｉｎらの方法によって合成され得（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１６：３２０９（１９８８））、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドが制御孔ガラスポリマー支持体（Ｓａｒｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５：７４４８−７４５１（１９８８））などの使用によって調製され得る。
【０７２５】
ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶコード領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドが使用され得るが、転写された非翻訳領域に対して相補的なアンチセンスヌクレオチドが最も好ましい。
【０７２６】
本発明による可能なアンタゴニストはまた、触媒性ＲＮＡ、すなわちリボザイムを含む（例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１１３６４（１９９０年１０月４日公開；Ｓａｒｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１２２２−１２２５（１９９０）を参照のこと）。部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザイムがニュートロカインαｍＲＮＡおよび／またはニュートロカインαＳＶｍＲＮＡを破壊するために使用され得るが、ハンマーヘッドリボザイムの使用が好ましい。ハンマーへッドリボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成する隣接領域によって決定される位置でｍＲＮＡを切断する。ただ１つの要件は、標的ｍＲＮＡが以下の２塩基配列５’−ＵＧ−３’を有することである。ハンマーヘッドリボザイムの構築および生成は、当該分野で周知であり、そしてＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ、３３４：５８５−５９１（１９８８）においてより十分に記載されている。ニュートロカインαおよびニュートロカインαＳＶのヌクレオチド配列中には、多数の可能なハンマーヘッドリボザイム切断部位が存在する（図１Ａ〜Ｂ）。好ましくは、このリボザイムは、切断認識部位がニュートロカインαｍＲＮＡおよび／またはニュートロカインαＳＶｍＲＮＡの５’末端近傍に位置するように、すなわち、効率を増大させ、そして非機能的ｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積を最小化するように、操作される。
【０７２７】
アンチセンスアプローチにおけるように、本発明のリボザイムは、改変オリゴヌクレオチド（例えば、安定性の改善、標的化などのため）で構成され得、そしてインビボでニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶを発現する細胞に送達されるはずである。このリボザイムをコードするＤＮＡ構築物は、ＤＮＡをコードするアンチセンスの導入について上述したのと同じ様式で、細胞に導入され得る。好ましい送達方法は、強い構成的プロモーター（例えば、ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターまたはｐｏｌ  ＩＩプロモーターのような）の制御下で、このリボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物を使用し、トランスフェクト細胞が、内因性のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのメッセージを破壊し、そして翻訳を阻害するのに十分な量のリボザイムを生成することを包含する。リボザイムは、アンチセンス分子とは異なり触媒性であるので、より低い細胞内濃度が効率化のために必要とされる。
【０７２８】
内因性遺伝子発現はまた、標的化された相同組換えを用いてニュートロカインα遺伝子および／もしくはニュートロカインαＳＶ遺伝子ならびに／またはそのプロモーターを不活化するか、または「ノックアウトする」ことにより減少され得る（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１７：２３０〜２３４（１９８５）；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ  ５１：５０３〜５１２（１９８７）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ５：３１３〜３２１（１９８９）を参照のこと；これらの各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される）。例えば、内因性ポリヌクレオチド配列（遺伝子のコード領域もしくは調節領域のいずれか）に相同なＤＮＡに隣接する本発明の変異ポリヌクレオチド、非機能的ポリヌクレオチド（または完全に関連しないＤＮＡ配列）を選択マーカーおよび／またはネガティブ選択マーカーありもしくはなしで使用して、インビボで本発明のポリペプチドを発現する細胞にトランスフェクトし得る。別の実施形態において、当該分野で公知の技術を使用して、目的の遺伝子を含むが、これを発現しない細胞中でノックアウトを生成する。ＤＮＡ構築物の挿入は、標的化された相同組換えを介して、標的化された遺伝子の不活化を生じる。このようなアプローチは、研究分野および圃場において個々に合わせられ、ここで、胚幹細胞に対する改変を用いて、不活性な標的化遺伝子を有する動物子孫を生成する（例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ  １９８７およびＴｈｏｍｐｓｏｎ  １９８９（前出）を参照のこと）。しかし、このアプローチは、ヒトにおける使用については慣用的に適合され得る（但し、組換えＤＮＡ構築物が、当業者に明らかな適切なウイルスベクターを用いてインビボで必要な部位に直接投与されるか、または標的化される条件で）。この段落に記載される文書の各内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０７２９】
他の実施形態において、本発明に従うアンタゴニストは、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの可溶性形態（例えば、リガンド結合ドメイン、ＴＮＦ保存ドメイン、ならびに／またはニュートロカインαおよび／もしくはニュートロカインαＳＶの細胞外ドメインを含む図１Ａ〜Ｂに示されるニュートロカインαのフラグメントおよびリガント結合ドメイン、ＴＮＦ保存ドメイン、ならびに／またはニュートロカインαおよび／もしくはニュートロカインαＳＶの細胞外ドメインを含む図５Ａ〜Ｂに示されるニュートロカインαＳＶのフラグメント）を含む。このようなニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの可溶性形態は、天然に存在するか、または合成であり得、ニュートロカインαレセプターおよび／またはニュートロカインαＳＶレセプター（例えば、ＤＲ５（国際公開第ＷＯ  ９８／４１６２９を参照のこと）、ＴＲ１０（国際公開第ＷＯ  ９８／５４２０２を参照のこと）、３１２Ｃ２（国際公開第ＷＯ  ９８／０６８４２を参照のこと）、ならびにＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２（例えば、米国特許出願第０９／１７６，２００号を参照のこと））に結合するための天然のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶと競合することにより、および／またはレセプターと結合し得るかまたは結合し得ないが、シグナル導入を誘発し得ないマルチマーを形成することによって、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶ媒介シグナル伝達と拮抗する。好ましくは、これらのアンタゴニストは、リンパ球（例えば、Ｂ細胞）の増殖、分化、および／または活性化のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶ媒介刺激を阻害する。本発明のアンタゴニストはまた、ＴＮＦ−ファミリーリガンド（例えば、ＣＤ３０）ならびにニュートロカインα−Ｆｃ融合タンパク質および／またはニュートロカインαＳＶ−Ｆｃ融合タンパク質に対して特異的な抗体を含む。
【０７３０】
「ＴＮＦ−ファミリーリガンド」とは、ＴＮＦレセプターファミリーのメンバーに結合し、そしてリガンド／レセプターシグナル伝達経路を誘導および／またはブロックし得る、天然に存在するリガンド、組換えリガンド、および合成リガンドを意図する。ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーとしては、ＴＮＦ−α、リンホトキシン−α（ＬＴ−α、ＴＮＦ−βとしても知られる）、ＬＴ−β（ＬＴ−α２−βのヘテロトリマー複合体において見出される）、ＦａｓＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦ−γ（国際公開第ＷＯ  ９６／１４３２８号）、ＡＩＭ−Ｉ（国際公開第ＷＯ  ９７／３３８９９号）、ＡＩＭ−ＩＩ（国際公開第ＷＯ  ９７／３４９１１号）、ＡＰＲＩＬ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８（６）：１１８５−１１９０）、エンドカイン（ｅｎｄｏｋｉｎｅ）−α（国際公開第ＷＯ  ９８／０７８８０号）、ニュートロカイン（ｎｅｕｔｒｏｋｉｎｅ）−α（国際公開第ＷＯ  ９８／１８９２１号）、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、４−ｌＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、および神経成長因子（ＮＧＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、本発明のニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカインαＳＶ  ＴＮＦ−ファミリーリガンドは、ＤＲ５（国際公開第ＷＯ  ９８／４１６２９を参照のこと）、ＴＲ１０（国際公開第  ＷＯ９８／５４２０２）、３１２Ｃ２（国際公開第  ＷＯ９８／０６８４２を参照のこと）およびＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、およびＴＲ１１ＳＶ２（米国特許出願第０９／１７６，２００を参照のこと）である。
【０７３１】
本発明のアンタゴニストはまた、ＴＮＦ−ファミリーレセプターまたは本発明のニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドに対して特異的な抗体を含む。本発明に従う抗体は、本発明のニュートロカインαイムノゲンおよび／またはニュートロカインαＳＶイムノゲンを使用する種々の標準的な方法のいずれかによって調製され得る。示されたように、このようなニュートロカインαイムノゲンおよび／またはニュートロカインαＳＶイムノゲンとしては、それぞれ、図１Ａ〜Ｂ（配列番号２）および図５Ａ〜Ｂ（配列番号１９）に示された完全なニュートロカインαポリペプチドおよびニュートロカインαＳＶポリペプチド（リーダー配列を含んでもいいし、含まなくてもいい）ならびに例えば、リガント結合ドメイン、ＴＮＦ−保存ドメイン、細胞外ドメイン膜貫通ドメイン、および／または細胞内ドメイン、あるいはその任意の組み合わせを含むニュートロカインαポリペプチドフラグメントおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドフラグメントが挙げられる。
【０７３２】
本発明によるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のアゴニストまたはアンタゴニストは、ＴａｒｔａｇｌｉａおよびＧｏｅｄｄｅｌ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（７）：４３０４−４３０７（１９９２）；Ｔａｒｔａｇｌｉａら、Ｃｅｌｌ  ７３：２１３−２１６（１９９３）、ならびにＰＣＴ出願第ＷＯ９４／０９１３７に開示される方法に従って、惹起され得、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列を有する本発明のポリぺプチドに対して特異的（すなわち唯一それに結合する）である。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、抗原に結合し得る、インタクトな分子ならびにそのフラグメント（例えば、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）フラグメント）を含むことを意味する。Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’
フラグメントおよびＦ（ａｂ’）フラグメントは、Ｆｃフラグメントのインタクトな抗体を欠き、循環からより速く無くなり、そしてインタクトな抗体のより少ない非特異的な組織結合性を有し得る（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、２４：３１６−３２５（１９８３））。
【０７３３】
好ましい方法では、本発明に従う抗体は、ｍＡｂである。このようなｍＡｂは、ハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７（１９７５）および米国特許第４，３７６，１１０号；Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９９８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ
Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９８０；Ｃａｍｂｅｌｌ、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ１３（Ｂｕｒｄｏｎら、編）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８４））、を使用して調製され得る。
【０７３４】
ニュートロカインαドメインおよび／またはニュートロカインαＳＶドメインに結合するタンパク質およびその他の化合物はまた、本発明による候補アゴニストおよびアンタゴニストでもある。このような結合化合物は、酵母ツーハイブリッド系を使用し、「捕捉」され得る（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５〜２４６（１９８９））。この酵母ツーハイブリッド系の改変された説明が、Ｒｏｇｅｒ  Ｂｒｅｎｔおよびその共同研究者らによって記載されている（Ｇｙｕｒｉｓ、Ｃｅｌｌ  ７５：７９１−８０３（１９９３）；Ｚｅｒｖｏｓら、Ｃｅｌｌ  ７２：２２３−２３２（１９９３））。好ましくは、この酵母ツーハイブリッド系は、本発明により使用され、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのリガンド結合ドメイン、細胞外ドメイン、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、および死ドメイン（ｄｅａｔｈ  ｄｏｍａｉｎ）に結合する化合物を捕捉する。このような化合物は、本発明の良好な候補アゴニストおよびアンタゴニストである。
【０７３５】
例えば、上記のツーハイブリッドアッセイを使用して、ニュートロカインαレセプターおよび／またはニュートロカインαＳＶレセプターの細胞外ドメインまたは細胞内ドメイン、あるいはその一部を使用して、インビボでニュートロカインαレセプターおよび／またはニュートロカインαＳＶレセプターと相互作用する細胞タンパク質を同定し得る。このようなアッセイを使用して、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのレセプターの機能の潜在的なアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有するリガンドもまた同定され得る。このスクリーニングアッセイを先に使用して、ムテインＴＮＦ−ＲＩＩの細胞質ドメインと相互作用するタンパク質を同定し、そして２つのレセプターに関連するタンパク質を同定することにつながる。Ｒｏｔｈｅら、Ｃｅｌｌ  ７８：６８１（１９９４）ニュートロカインαレセプターおよび／またはニュートロカインαＳＶレセプターの細胞質ドメインに結合するこのようなタンパク質およびアミノ酸配列は、本発明の良好な候補アゴニストおよびアンタゴニストである。
【０７３６】
その他のスクリーニング技術は、レセプター活性化によって引き起こされる細胞外ｐＨ変化を測定するシステム（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１８１−２９６（１９８９）に記載されるような）において、本発明のポリぺプチドを発現する細胞（例えば、トランスフェクトＣＨＯ細胞）の使用を含む。別の実施例では、潜在的アゴニストまたはアンタゴニストが、本発明のポリぺプチドを発現する細胞と接触され得、そしてセカンドメッセンジャー応答（例えば、シグナル変換）が、潜在的アンタゴニストまたはアゴニストが有効か否かを決定するために測定され得る。
【０７３７】
本発明によるアゴニストは、天然に存在する化合物および合成化合物（例えば、ＴＮＦファミリーリガンドペプチドフラグメント、形質転換増殖因子、神経伝達物質（例えばグルタメート、ドーパミン、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート）、腫瘍サプレッサー（ｐ５３）、細胞融解Ｔ細胞および代謝拮抗物質）を含む。好ましいアゴニストは、化学療法薬（例えば、シスプラチン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、シトシンアラビノシド、ナイトロジェンマスタード、メトトレキセートおよびビンクリスチン）を含む。その他のものとしては、エタノールおよび−アミロイドペプチドが挙げられる（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：１４５７−１４５８（１９９５））。
【０７３８】
好ましいアゴニストは、本発明のニュートロカインαポリぺプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリぺプチドのフラグメントであり、これは、リンパ球（例えばＢ細胞）の増殖、分化および／または活性化を刺激する。さらなる好ましいアゴニストは、本発明のニュートロカインαポリぺプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリぺプチドに対して惹起されたポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、またはそのフラグメントを含む。ＴＮＦ−ファミリーレセプターに対して惹起されたこのようなアゴニスト抗体は、以下に開示される：Ｔａｒｔａｇｌｉａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：９２９２−９２９６（１９９１）；およびＴａｒｔａｇｌｉａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：４３０４−４３０７（１９９２）。また、ＰＣＴ出願第ＷＯ９４／０９１３７号も参照のこと。
【０７３９】
さらなる実施形態では、免役調節分子（例えば、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１５、抗−ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αのような）が、本発明のニュートロカインαポリぺプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリぺプチドのアゴニストとして使用され得、このアゴニストはリンパ球（例えば、Ｂ細胞）の増殖、分化および／または活性化を刺激する。特定の実施形態において、ＩＬ４および／またはＩＬ１０を使用して、Ｂ細胞のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの媒介性増殖を増強する。
【０７４０】
本発明のさらなる実施形態において、本発明のポリぺプチドを発現するように遺伝子操作される細胞、あるいは、本発明のタンパク質を発現しないように遺伝子操作された細胞（例えば、ノックアウト）が、インビボで患者に投与される。このような細胞は、患者（すなわち、動物（ヒトを含む））またはＭＨＣ適合性ドナーから得られ得、そして、線維芽細胞、骨髄細胞、血球（例えば、リンパ球）、脂肪細胞、筋肉細胞、内皮細胞などを含み得るが、これらに限定されない。この細胞は、本発明のポリペプチドのコード配列をこの細胞に導入するために、あるいは、コード配列および／または本発明のポリペプチドに関連する内因性の調節配列を破壊するために（例えば、形質導入（ウイルスベクター、および好ましくは細胞ゲノムに導入遺伝子を組み込むベクターを使用する）、またはトランスフェクション手順（プラスミド、コスミド、ＹＡＣ、裸のＤＮＡ、エレクトロポレーション、リポソームなどの使用を含むがこれらに限定されない）によって）、組換えＤＮＡ技術を用いてインビトロで遺伝子操作される。本発明のポリペプチドのコード配列は、強力な構成プロモーターまたは誘導プロモーターまたはプロモーター／エンハンサーの制御下に配置されて、本発明のポリペプチドの発現、および好ましくは分泌を達成し得る。本発明のポリペプチドを発現および好ましくは分泌するこの操作された細胞は、例えば循環中で、または腹腔内で、全身的に患者に導入され得る。
【０７４１】
あるいは、この細胞をマトリックスに組み込み得、そして身体に移植し得る（例えば、遺伝子操作した線維芽細胞を皮膚移植片の一部として移植し得る；遺伝子操作した内皮細胞をリンパ移植片または脈管移植片の一部として移植し得る）（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４９号；およびＭｕｌｌｉｇａｎおよびＷｉｌｓｏｎ、米国特許第５，４６０，９５９号を参照のこと：これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。
【０７４２】
投与される細胞が非自己または非ＭＨＣ適合性細胞である場合、それらを、この導入細胞に対する宿主免疫応答の発生を妨害する周知の技術を使用して投与し得る。例えば、この細胞を被包性の形態で導入し得、この形態は、構成成分の即時の細胞外環境との交換が可能である間は、導入細胞が宿主免疫系によって認識され得ない。
【０７４３】
本発明のさらに別の実施形態では、ニュートロカインαポリぺプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリぺプチドの活性は、「ドミナントネガティブ（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ）」を使用して減少させられ得る。この目的のために、欠損ニュートロカインαポリぺプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリぺプチド（例えば、ＴＮＦ保存ドメインの全てまたは一部を欠く変異体のような）をコードする構築物は、適切な標的細胞に対するニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの活性を減少させるための遺伝子治療アプローチにおいて使用され得る。例えば、ニュートロカインαポリぺプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリぺプチド（ＴＮＦ保存ドメインの全てまたは一部が改変されるかまたは欠けている）の宿主細胞発現を導くヌクレオチド配列は、単球細胞もしくはその他の細胞または組織内に導入され得る（本明細書中に記載されるかまたは別に当該分野で公知の、インビボまたはエキソビボの遺伝子治療の方法のいずれかによって）。あるいは、標的相同組換えは、このような欠失または変異を、単球中の被験体の内因性ニュートロカインα遺伝子および／またはニュートロカインαＳＶ遺伝子に導入するために使用され得る。この操作された細胞は、非機能性ニュートロカインαポリぺプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリぺプチド（すなわち、結合し得るが、シグナル変換を誘発し得ないリガンド（例えばマルチマー））を発現する。
【０７４４】
（染色体アッセイ）
本発明の核酸分子はまた、染色体同定のために役立つ。配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置に特異的に標的化され、そしてそれとハイブリダイズし得る。さらに、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要性が存在する。実際の配列データ（反復多型性）に基づく染色体マーキング試薬は現在、染色体位置をマークすることについてほとんど利用可能ではない。本発明による、ＤＮＡの染色体へのマッピングは、これらの配列を、疾患に関連する遺伝子に相関させることにおける重要な最初の工程である。
【０７４５】
これに関しての特定の好ましい実施形態において、本明細書中に開示されるｃＤＮＡまたはポリヌクレオチドは、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの遺伝子のゲノムＤＮＡをクローン化するために使用される。これは、種々の周知の技術およびライブラリー（これは一般に市販されている）を使用して達成され得る。次いで、ゲノムＤＮＡは、インサイチュ染色体マッピングのために、この目的のために周知の技術を使用して、用いられる。
【０７４６】
さらに、いくつかの場合には、配列は、ｃＤＮＡからＰＣＲプライマー（好ましくは１５〜２５ｂｐ）を調製することによって、染色体にマッピングされ得る。この遺伝子の３’非翻訳領域のコンピューター解析が、ゲノムＤＮＡにおいて１つより多いエキソンにまたがらず、従って増幅プロセスを複雑にしないプライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために使用される。ｃＤＮＡクローンの分裂中期染色体展開物への蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（「ＦＩＳＨ」）は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使用され得る。この技術は、５０または６０  ｂｐほど短いｃＤＮＡ由来のプローブとともに使用され得る（この技術の総説については、Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  Ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８８）を参照のこと）。
【０７４７】
一旦配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上の配列の物理的位置は、遺伝子地図データと相関付けられ得る。そのようなデータは、例えば、Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｗｅｌｃｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙを通じてオンラインで利用可能であるＶ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  Ｉｎ  Ｍａｎ）に見出される。次いで、遺伝子と、同じ染色体領域にマッピングされている疾患との間の関係は、連鎖解析（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）を通して同定される。
【０７４８】
次に、罹患個体と非罹患個体との間のｃＤＮＡまたはゲノム配列における差異を決定することが必要である。変異が、いくらかのまたは全ての罹患個体においては観察されるが、いかなる正常個体においても観察されない場合、この変異は、疾患の原因である可能性が高い。
【０７４９】
物理的なマッピング技術および遺伝的なマッピング技術の最新の解明に関して、疾患に関連する染色体領域に正確に位置付けられたｃＤＮＡは、５０と５００との間の潜在的な原因遺伝子のうちの１つであり得る（これは、１メガベースマッピング解明および２０ｋｂあたり１つの遺伝子と仮定する）。
【０７５０】
上記の技術を利用して、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの染色体位置が、体細胞ハイブリッドおよび放射線ハイブリッドの組み合わせを使用して、染色体位置１３ｑ３４に高い信頼性とともに決定された。
【実施例】
【０７５１】
（実施例）
本発明を一般的に記載してきたが、本発明は、以下の実施例を参照することによってより容易に理解される。これらは、説明のために提供されるものであり、限定することを意図しない。多くの以下の実施例が、本発明のニュートロカインαポリヌクレオチドおよびポリペプチドを具体的に記載する。各々の例はまた、本発明のニュートロカインαＳＶポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを生成および／または調査するために行われ得る。当業者は、以下の実施例をニュートロカインαＳＶに対して容易に指向し得る。
【０７５２】
（実施例１ａ：Ｅ．ｃｏｌｉにおける「Ｈｉｓタグ化」ニュートロカインαの発現および精製）
細菌発現ベクターであるｐＱＥ９（ｐＤ１０）を、本実施例における細菌発現に用い得る（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，前出）。ｐＱＥ９は、アンピシリン抗生物質耐性（「Ａｍｐr」）をコードし、そして細菌の複製起点（「ｏｒｉ」）、ＩＰＴＧ誘導性プロモーター、リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、ＱＩＡＧＥＮ，ＩＮｃ．，前出のニッケル−ニトリロ−三酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフィニティ樹脂固体を使用してアフィニティ精製が可能である、ヒスチジン残基をコードする６個のコドン、ならびに適切な1つの制限酵素切断部位をコードする。これらのエレメントを、ポリペプチドをコードする挿入されたＤＮＡフラグメントが、このポリペプチドのアミノ末端に共有結合された６個のＨｉｓ残基（すなわち、「６Ｘ  Ｈｉｓタグ」）を有するポリペプチドを発現するように配置する。
【０７５３】
ニュートロカインαタンパク質の所望の部分をコードするＤＮＡ配列を、寄託されたｃＤＮＡクローンから、このタンパク質の所望の部分のアミノ末端配列にアニーリングするＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー、およびこの寄託構築物中のｃＤＮＡコード配列の３’側の配列にアニールするＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、増幅する。ｐＱＥ９ベクターへのクローニングを容易にするための制限部位を含む、さらなるヌクレオチドを、５’プライマー配列および３’プライマー配列にそれぞれ付加する。
【０７５４】
このタンパク質の細胞外ドメインをクローニングするために、５’プライマーは、配列
【０７５５】
【化２２】
2007277249.tif 000040
を有し、この配列は、下線部のＢａｍＨＩ制限部位に続いて、図１Ａおよび１Ｂの配列の細胞外ドメインのアミノ末端コード配列の１８ヌクレオチドを含む。もちろん、当業者は、５’プライマーが開始するタンパク質コード配列の点が、この形態の細胞外ドメインよりも、より短いかまたはより長い完全ニュートロカインタンパク質の任意の所望の部分をコードするＤＮＡセグメントを増幅するように改変され得る、ことを理解する。３’プライマーは、配列
【０７５６】
【化２３】
2007277249.tif 000041
を有し、この配列は、下線部のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に続いて、図１Ａおよび１ＢのこのＤＮＡ配列のコード配列の３’末端に相補的な１８ヌクレオチドを含む。
【０７５７】
増幅したＤＮＡフラグメントおよびベクターｐＱＥ９を、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、次いで消化したＤＮＡを互いに連結する。このＤＮＡの制限ｐＱＥ９ベクターへの挿入は、ＩＰＴＧ誘導プロモーターから下流にかつ開始ＡＵＧおよび６つのヒスチジンコドンとインフレームに、このタンパク質コード領域を配置する。
【０７５８】
この連結混合物を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に記載されるような標準的手順を用いて、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換する。プラスミドｐＲＥＰ４（ｌａｃリプレッサーを発現しそしてカナマイシン耐性（「Ｋａｎr」）を与える）の複数のコピーを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４を、本明細書中に記載される例証的な実施例を実行するのに用いる。この株（これは、タンパク質を発現するのに適している多くの１つにすぎない）は、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，前出から市販されている。形質転換体を、アンピシリンおよびカナマイシンの存在下のＬＢプレート上で増殖する能力によって同定する。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単離し、そしてクローニングしたＤＮＡの正体を、制限分析、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定によって確認する。所望の構築物を含むクローンを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（２５μｌ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地中の液体培養物において一晩（「Ｏ／Ｎ」）増殖する。Ｏ／Ｎ培養物を用いて、約１：２５から１：２５０の希釈度で、大規模培養に接種する。細胞を、６００ｎｍ（「ＯＤ６００」）で０．４〜０．６の光学密度まで増殖させる。次いで、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を、１ｍＭの最終濃度まで添加し、ｌａｃＩリプレッサーを不活性にすることによって、ｌａｃリプレッサー感受性プロモーターからの転写を誘発する。続いて、細胞を、さらに３〜４時間インキュベートする。次いで、細胞を遠心分離によって収集する。
【０７５９】
次いで、この細胞を、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ（ｐＨ８）中で、４℃にて３〜４時間攪拌する。その細胞破片を遠心分離によって取り除き、そしてこのタンパク質を含有する上清を、ニッケル−ニトリロ−三酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフィニティー樹脂カラム（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、前出）にロードする。６×Ｈｉｓ  ｔａｇを有するタンパク質は、高親和性でＮｉ−ＴＮＡ樹脂に結合し、そして単純な一工程手順で精製し得る（詳細については、Ｔｈｅ  ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ，１９９５、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．（前出）を参照のこと）。簡単に述べると、この上清を６Ｍグアニジン−ＨＣｌ（ｐＨ８）中のカラムにロードし、このカラムをまず１０容量の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ（ｐＨ８）で洗浄し、次いで、１０容量の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ（ｐＨ６）で洗浄し、そして最後に、ニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドを、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ（ｐＨ５）で溶出する。
【０７６０】
次いで、この精製したタンパク質を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）または５０ｍＭ  Ｎａ−酢酸塩（ｐＨ６）緩衝液＋２００ｍＭ  ＮａＣｌに対して透析することによって再生させる。あるいは、このタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡカラムに固定化する間に、首尾良く再折り畳みさせ得る。推奨される条件は、以下の通りである：プロテアーゼインヒビターを含有する、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％グリセロール、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７，４）中の、６Ｍ〜１Ｍ尿素直線勾配を使用する再生。この再生は、１．５時間以上かけて行われるべきである。再生の後、このタンパク質を、２５０ｍＭ  イミダゾールの添加によって溶出し得る。イミダゾールを、ＰＢＳまたは５０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ６）緩衝液＋２００ｍＭ  ＮａＣｌに対する最終透析工程によって取り除く。この精製したタンパク質を、４℃で保存するか、または−８０℃で凍結させる。
【０７６１】
（実施例１ｂ：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるニュートロカインαの発現および精製）
この細菌発現ベクターｐＱＥ６０は、本実施例における細菌発現のために使用される（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）。ｐＱＥ６０は、アンピシリン抗生物質耐性（「Ａｍｐr」）をコードし、そして細菌の複製起点（「ｏｒｉ」）、ＩＰＴＧ誘導性プロモーター、リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、ＱＩＡＧＥＮ，ＩＮｃ．，（前出）のニッケル−ニトリロ−三酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフィニティ樹脂固体を使用してアフィニティ精製が可能である、ヒスチジン残基をコードする６個のコドン、ならびに適切な1つの制限酵素切断部位をコードする。これらのエレメントを、ポリペプチドをコードする挿入されたＤＮＡフラグメントが、このポリペプチドのアミノ末端に共有結合された６個のＨｉｓ残基（すなわち、「６Ｘ  Ｈｉｓタグ」）を有するポリペプチドを発現するように配置する。しかし、本実施例においては、このポリペプチドコード配列は、６個のＨｉｓコドンの翻訳を防ぐように挿入し、従って、このポリペプチドを、６×Ｈｉｓタグを有しないように産生される。
【０７６２】
細胞外ドメイン配列を含むタンパク質の所望の部分をコードするＤＮＡ配列を、寄託されたｃＤＮＡクローンから、このタンパク質の所望の部分のアミノ末端配列にアニーリングするＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー、およびこの寄託構築物中のｃＤＮＡコード配列の３’側の配列にアニールするＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、増幅する。ｐＱＥ６０ベクターへのクローニングを容易にするための制限部位を含む、さらなるヌクレオチドを、５’配列および３’配列にそれぞれ付加する。
【０７６３】
このタンパク質の細胞外ドメインをクローニングするために、５’プライマーは、配列
【０７６４】
【化２４】
2007277249.tif 000042
を有し、この配列は、下線部のＢｓｐＨＩ制限部位に続いて、図１Ａおよび１Ｂの配列の細胞外ドメインのアミノ末端コード配列の１７ヌクレオチドを含む。もちろん、当業者は、５’プライマーが開始するタンパク質コード配列の点が、この形態の細胞外ドメインよりも、より短いかまたはより長い完全タンパク質の所望の部分を増幅するように改変され得る、ことを理解する。３’プライマーは、配列
【０７６５】
【化２５】
2007277249.tif 000043
を有し、この配列は、下線部のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に続いて、図１Ａおよび１ＢのこのＤＮＡ配列のコード配列の３’末端に相補的な１８ヌクレオチドを含む。
【０７６６】
増幅したＤＮＡフラグメントおよびベクターｐＱＥ６０を、ＢｓｐＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、次いで消化したＤＮＡを互いに連結する。このＤＮＡの制限ｐＱＥ６０ベクターへの挿入は、ＩＰＴＧ誘導プロモーターから下流にかつ開始ＡＵＧとインフレームに、これの付随する終止コドンを含むこのタンパク質コード領域を配置する。この付随する終止コドンは、この挿入位置の下流の６個のヒスチジンコドンの翻訳を防ぐ。
【０７６７】
この連結混合物を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に記載されるような標準的手順を用いて、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換する。プラスミドｐＲＥＰ４（ｌａｃリプレッサーを発現しそしてカナマイシン耐性（「Ｋａｎr」）を与える）の複数のコピーを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４を、本明細書中に記載される例証的な実施例を実行するのに用いる。この株（これは、タンパク質を発現するのに適している多くの１つにすぎない）は、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，前出から市販されている。形質転換体を、アンピシリンおよびカナマイシンの存在下のＬＢプレート上で増殖する能力によって同定する。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単離し、そしてクローニングしたＤＮＡの正体を、制限分析、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定によって確認する。
【０７６８】
当業者は、いくらかの細菌発現ベクターのいずれかが、本実施例において示された発現プロトコルにおいてｐＱＥ９およびｐＱＥ６０の代わりに有用であり得る。例えば、細菌発現ベクターの新規のｐＨＥ４シリーズ、特にｐＨＥ４−５ベクターは、本実施例における細菌発現に有用であり得る（ＡＴＣＣ受託番号２０９３１１；およびその改変体）。このＡＴＣＣ寄託番号２０９３１１においてｐＨＥ４−５／ＭＰＩＦＤ２３と称されたプラスミドＤＮＡは、別のＯＲＦをコードする挿入物を含むプラスミドＤＮＡである。この構成物は、Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０−２２０９に、１９９７年９月３０日に寄託された。関連のないＭＰＩＦ
ＯＲＦ挿入物に隣接するＮｄｅＩおよびＡｓｐ７１８制限部位を使用して、当業者は、ｐＨＥ４−５ベクターにおける関連のないＯＲＦを、本発明のニュートロカインαＯＲＦと置換するための、現在の分子生物学技術を容易に使用し得る。
【０７６９】
ｐＨＥ４−５細菌発現ベクターは、選択のためのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、Ｔ５ファージプロモーター配列、２つのｌａｃオペレーター配列、Ｓｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列、およびラクトースオペロンリプレッサー遺伝子（ｌａｃＩｑ）を含む。これらのエレメントを配置し、その結果、ポリペプチドをコードする挿入されたＤＮＡフラグメントが、このポリペプチドのアミノ末端に共有結合された６個のＨｉｓ残基（すなわち、「６×Ｈｉｓタグ」）を有するこのポリペプチドを発現する。ｐＨＥ４−５ベクターのプロモーターおよびオペレーター配列は、合成的に作製された。核酸配列の合成生成物は、当該分野で周知である（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ９５／９６Ｃａｔａｌｏｇ、２１５−２１６頁、ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ、１０２０Ｅａｓｔ  Ｍｅａｄｏｗ  Ｃｉｒｃｌｅ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ９４３０３）。
【０７７０】
所望のニュートロカインα構築物を含むクローンを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（２５μｌ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地中の液体培養物において一晩（「Ｏ／Ｎ」）増殖する。Ｏ／Ｎ培養物を用いて、約１：２５から１：２５０の希釈度で、大規模培養に接種する。細胞を、６００ｎｍ（「ＯＤ６００」）で０．４と０．６との間の光学密度まで増殖させる。次いで、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を、１ｍＭの最終濃度まで添加し、ｌａｃＩリプレッサーを不活性にすることによって、ｌａｃリプレッサー感受性プロモーターからの転写を誘発する。続いて、細胞を、さらに３〜４時間インキュベートする。次いで、細胞を遠心分離によって収集する。
【０７７１】
次いで、この細胞を、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ（ｐＨ８）中で、４℃にて３〜４時間攪拌する。その細胞破片を遠心分離によって取り除き、そしてニュートロカインαを含有する上清を、２００ｍＭ  ＮａＣｌを補充した５０ｍＭ  Ｎａ−ａｃｅｔａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ６に対して透析する。あるいは、このタンパク質を、プロテアーゼインヒビターを含む５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％グリセロール、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．４に対して透析することによって首尾よく再折り畳みし得る。再生の後、このタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって精製し得る。あるいは、アフィニティクロマトグラフィー工程（例えば、抗体カラム）を使用して、純粋タンパク質を得ることができる。この精製したタンパク質を４℃で保存するか、または−８０℃で凍結する。
【０７７２】
特定の実施形態において、ニュートロカインαポリペプチド配列における３つのシステイン残基の１つ以上を変異させるように、本実施例において詳述したように発現構築物を生成することが好ましい。ニュートロカインαポリペプチド配列におけるシステイン残基は、配列番号２において示されるように１４７位、２３２位、および２４５位、ならびに配列番号１９において示されるようにニュートロカインαポリペプチド配列の２１３位および２２６位に位置する（ニュートロカインαポリペプチド配列においてＣｙｓ−１４７に対応するニュートロカインαＳＶポリペプチド配列のシステインは、存在しない。なぜなら、ニュートロカインαポリペプチド配列のアミノ酸残基１４３〜１６０は、ニュートロカインαＳＶポリペプチド配列において存在しないからである）。
【０７７３】
（実施例２：バキュロウイルス発現系におけるニュートロカインαタンパク質のクローニング、発現および精製）
この例示的な実施例において、プラスミドシャトルベクターｐＡ２ＧＰを使用して、このタンパク質の細胞外ドメインをコードするクローン化ＤＮＡ（その天然で会合した分泌シグナル（リーダー）配列を欠く）をバキュロウイルスに挿入して、ニュートロカインαタンパク質の細胞外ドメインを発現させる。Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｐｒｏｓｅｄｕｒｅｓ，  Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７））によって記載されるような標準的な方法を用いる。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーター、続いてバキュロウイルスｇｐ６７の分泌シグナルペプチド（リーダー）ならびに簡便な制限部位（例えば、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＡｓｐ７１８）を含む。シミアンウイルス４０（「ＳＶ４０」）のポリアデニル化部位を、効果的なポリアデニル化のために使用する。組換えウイルスの容易な選択のために、プラスミドは、弱いＤｒｏｓｏｐｈｉｌａプロモーターの制御下で、同じ配向でＥ．ｃｏｌｉ由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、続いて、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを含む。この挿入遺伝子を、野生型ウイルスＤＮＡとの細胞媒介性相同組換えのためのウイルス配列によって、両側に隣接させて、クローン化ポリヌクレオチドを発現する生存可能ウイルスを生成する。
【０７７４】
当業者が容易に理解するように、その構築物が転写、翻訳、分泌などのために適切に配置されたシグナル（シグナルペプチドおよび必要な場合はインフレームＡＵＧを含む）を提供する限りは、多くの他のバキュロウイルスベクターは、上記のベクター（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１およびｐＡｃＩＭＩ）の代わりに使用され得る。このようなベクターは、例えば、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９（１９８９）によって記載される。
【０７７５】
寄託されたクローン（ＡＵＧ開始コドン、天然に会合した細胞内ドメイン配列および膜貫通ドメイン配列、ならびに図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）において示されるアミノ酸Ｇｌｎ−７３からＬｅｕ−７９を欠く）におけるニュートロカインαタンパク質の細胞外ドメインのＭ末端欠失形態をコードするｃＤＮＡ配列を、この遺伝子の５’配列および３’配列に相補的なＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅する。この５’プライマーは、配列
【０７７６】
【化２６】
2007277249.tif 000044
を有し、下線部のＢａｍＨＩ制限酵素部位、続いて、図１Ａおよび１Ｂに示されるニュートロカインαタンパク質の細胞外ドメインの配列の１８ヌクレオチド（このタンパク質の細胞外ドメインの示されたＮ末端で開始する）を含む。この３’プライマーは、配列
【０７７７】
【化２７】
2007277249.tif 000045
を有し、下線部のＢａｍＨＩ制限部位、続いて、２つの終止コドンならびに図１Ａおよび１Ｂの３’コード配列に相補的な１８ヌクレオチドを含む。
【０７７８】
特定の実施形態において、ニュートロカインαの完全推定細胞外ドメイン（すなわち、アミノ酸残基Ｇｌｎ−７３〜Ｌｅｕ−２８５）を発現するために設計された構築物は、好ましい。当業者は、配列番号１および配列番号２として、それぞれ提供されるポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を使用して、このようなクローンを生成するためのポリヌクレオチドプライマーを設計し得る。
【０７７９】
さらなる好ましい実施形態において、ｐＡ２ＧＰ発現構築物は、配列番号２として示されるニュートロカインαポリペプチド配列のアミノ酸残基Ｌｅｕ−１１２〜Ｌｅｕ−２８５をコードする。
【０７８０】
別の好ましい実施形態において、ｐＡ２ＧＰ発現構築物は、配列番号２として示されるニュートロカインαポリペプチド配列のアミノ酸残基Ｓｅｒ−７８〜Ｌｅｕ−２８５をコードする。
【０７８１】
増幅したフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ  １０１  Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を使用して、１％アガロースゲルから単離する。次いで、このフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で消化し、そして再度、１％アガロースゲル上で精製する。このフラグメントを、本明細書中でＦ１と称す。
【０７８２】
このプラスミドを、当該分野で公知の慣用的な手順を使用して、制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、そして必要に応じて、ウシ腸ホスファターゼを使用して脱リン酸化し得る。次いで、このＤＮＡを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ  １０１  Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を使用して、１％アガロースゲルから単離する。このベクターＤＮＡを、本明細書中で「Ｖ１」と称す。
【０７８３】
フラグメントＦ１および脱リン酸化プラスミドＶ１を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで互いに連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１または他の適切なＥ．ｃｏｌｉ宿主（例えば、ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ（Ｓｔａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）細胞）を、連結混合物で形質転換し、そして培養プレートに塗布する。ヒト遺伝子を有するプラスミドを含む細菌を、ＢａｍＨＩを用いて個々のコロニーからのＤＮＡを消化し、次いでゲル電気泳動によって消化産物を分析することによって同定する。このクローン化フラグメントの配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認する。このプラスミドを、本明細書中でｐＡ２ＧＰ−ニュートロカインαと称す。
【０７８４】
５μｇのプラスミドｐＡ２ＧＰ−ニュートロカインαを、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７（１９８７）によって記載されるリポフェクチン法を使用して、１．０μｇの市販の線状化バキュロウイルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTMバキュロウイルスＤＮＡ」、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と同時トランスフェクトする。１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTMウイルスＤＮＡおよび５μｇのプラスミドｐＡ２ＧＰニュートロカインαを、５０μｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含むマイクロタイタープレートの滅菌ウェル中で混合する。その後、１０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎおよび９０μｌのグレース培地を添加し、混合し、そして１５分間室温にてインキュベートする。次いで、トランスフェクション混合物を、Ｓｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７１１）に滴下して添加し、１ｍｌのグレース培地（血清なし）を含む３５ｍｍ組織培養プレートに播種する。次いで、このプレートを２７℃にて５時間インキュベートする。次いで、このトランスフェクション溶液を、プレートから除去し、そして１０％仔ウシ血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加する。次いで、培養を、２７℃にて４日間続ける。
【０７８５】
４日後に、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）によって記載されると通りに、その上清を回収し、プラークアッセイを行う。「Ｂｌｕｅ  Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を含むアガロースゲルを使用して、ｇａｌ発現クローン（これは、青色に染まったプラークを産生する）の容易な同定および単離を可能にする。（このタイプの「プラークアッセイ」の詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄによって配布される昆虫細胞培養およびバキュロウイルス学のための使用者ガイドの９〜１０頁に見出され得る）。適切なインキュベーションの後、青色に染まったプラークを、マイクロピペット（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）のチップで拾う。次いで、組換えウイルスを含有する寒天を、２００μｌのグレース培地を含む微量遠心分離管中に再懸濁し、そしてこの組換えバキュロウイルスを含有する懸濁物を使用して、３５ｍｍディッシュに播種したＳｆ９細胞を感染させる。４日後、これらの培養ディッシュの懸濁物を収集し、次いでそれらを４℃にて保存する。この組換えウイルスを、Ｖ−ニュートロカインαと呼ぶ。
【０７８６】
ニュートロカインα遺伝子の発現を確認するために、Ｓｆ９細胞を、１０％熱非働化ＦＢＳを補充したグレース培地中で増殖させる。この細胞を、約２の感染多重度（「ＭＯＩ」）で、組換えバキュロウイルスＶ−ニュートロカインαに感染させる。放射性標識したタンパク質が所望される場合、６時間後に、この培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを含まないＳＦ９００ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤより入手可能）と置き換える。４２時間後、５μＣｉの35Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉの35Ｓ−システイン（Ａｍｅｒｓｈａｍより入手可能）を添加する。この細胞を、１６時間さらにインキュベートし、次いで遠心分離によって収集する。上清中のタンパク質および細胞内タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてオートラジオグラフィー（放射性標識した場合）によって分析する。
【０７８７】
精製したタンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列の微量配列決定を使用して、このタンパク質の細胞外ドメインのアミノ末端配列（従ってこの分泌シグナルペプチドの切断位置および長さ）を決定し得る。
【０７８８】
特定の実験的な例において、組換えニュートロカインαを、以下のようにバキュロウイルスで感染したＳｆ９細胞上清から精製した。この昆虫細胞を１％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清を含むＥＸＣＥＬ４０１培地（ＪＲＨ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において増殖させた。感染から９２時間後、収集された上清を、１８，０００×ｇで遠心分離し、続いて０．４５ｍ深層濾過によって清澄した。脱脂質濾過工程をまた、使用して、脂質夾雑物を除去し、次にニュートロカインαタンパク質の最初の捕獲（ｃａｐｔｕｒｉｎｇ）を向上し得る。
【０７８９】
この上清をタンデム様式においてＰｏｒｏｓ  ＨＳ−５０／ＨＱ−５０のセットにロードした。代替として、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＱＡＥ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｓｕｐｅｒ  Ｑ（Ｔｏｓｏｈａｓｓ）、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）およびその等価な樹脂が使用され得る。この工程をネガティブ精製工程として使用し、強アニオン結合夾雑物質を除去する。ＨＳ／ＨＱフロースルー物質を１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８でｐＨ７．５に調整し、等量の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８で希釈し、そしてｐｏｒｏｓＰＩ−２０カラムまたはＰＩ−５０カラムにロードした。このＰＩカラムを、まずカラムの４倍容量の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中７５ｍＭ塩化ナトリウムで洗浄し、次いでカラムの３〜５倍容量の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５中３００ｍＭ、７５０ｍＭ、１５００ｍＭの塩化ナトリウムの段階的濃度勾配を使用して溶出した。ニュートロカインαタンパク質は、還元化ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で１７ＫＤのバンドとして現れ、そして０．７５Ｍ〜１．５Ｍの塩化ナトリウム画分に存在する。
【０７９０】
ＰＩ画分を０．１５Ｍ  塩化ナトリウム、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６）で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ１００ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）サイズ排除カラムを通してさらに精製した。Ｓ２００画分を終濃度３Ｍになるように塩化ナトリウムと混合し、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｈｅｘｙｌ  ６５０Ｃ（Ｔｏｓｏｈａｓｓ）カラムにロードした。Ｈｅｘｙｌカラムを、５〜１５倍カラム容量の５０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ６）中３Ｍ〜０．０５Ｍの塩化ナトリウムの直線濃度勾配を用いて溶出した。この塩化ナトリウム濃度勾配をまた、Ｈｅｘｙｌクロマトグラフィー工程において５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６）中１Ｍ〜０Ｍの硫酸アンモニウム濃度勾配によって置換した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された精製されたニュートロカインα含有画分を一緒にして、そして１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、５０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ６）を含む緩衝液に対して透析した。
【０７９１】
本明細書において例示した、最終的に精製されたバキュロウイルス系において発現されたニュートロカインαタンパク質は、配列番号２のアミノ酸残基Ａｌａ−１３４で開始するＮ末端配列を有する。ＲＰ−ＨＰＬＣ分析は、９５％の純度より高い単一のピークを示す。エンドトキシンレベルは、ＬＡＬアッセイにおいて検出限界未満であった。
【０７９２】
別の実施例において、組換えニュートロカインαを、以下のように０．２５％のウシ血清を含むバキュロウイルス感染したＳｆ９細胞上清から精製した。
【０７９３】
Ｓｆ９上清を１８，０００×ｇで遠心分離によって収集した。次いで、この上清を、わずかにアルカリ状態で１０ｍＭ塩化カルシウムで１０〜１５分間処理し、続いて、遠心分離、次いで０．２２μｍ深層濾過を行った。次いで、得られたＳｆ−９細胞上清を、２倍に希釈して、そしてＰｏｒｏｓ  ＰＩ−５０カラム（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能）にロードした。このカラムを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ＝７．４）で平衡化した。このＰＩ−５０カラムを１ＣＶの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ＝７．４）で洗浄し、次いで３ＣＶより多くの５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ＝６）中１．５Ｍ  ＮａＣｌで溶出した。ＰＩ画分を５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ＝６）、１２５ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ２００カラムにロードした。このＳ２００画分を、塩と混合し、最終濃度を０．７Ｍ  硫酸アンモニウムおよび０．６Ｍ  ＮａＣｌにし、そして５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ＝６）中０．６Ｍ  ＮａＣｌ、０．７Ｍ  硫酸アンモニウムを含む緩衝液で平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｈｅｘｙｌ  ６５０Ｃカラム（Ｔｏｓｏ  Ｈａａｓから入手可能）にロードした。次いで、このカラムを、２ＣＶの同一の緩衝液で洗浄した。次いで、組換えニュートロカインαを３ＣＶの５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ＝６）、続いて２ＣＶの２０％エタノール洗浄で段階的に溶出した。次いで、この組換えニュートロカインαタンパク質を、最後に硫酸アンモニウム（０．３〜０Ｍ塩）濃度勾配で溶出した。この適切な画分をプールし、そして５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ＝６）を含む緩衝液に対して透析し、次いでＰｏｒｏｓ  ５０ＨＱカラムに通した。このＨＱフロースルーを４ｍｓに希釈し、そしてＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＤＥＡＤ  ６５０Ｍ  カラムにロードし、次いで２５ｍＭクエン酸ナトリウム、１２５ｍＭ  ＮａＣｌで溶出した。
【０７９４】
別の実施例では、組換えニュートロカイン−αを、Ｓｆ＋昆虫細胞におけるバキュロウイルスベクター系を使用して発現し、そして精製した。
【０７９５】
始めに、図１Ａおよび１Ｂに示すニュートロカイン−αポリペプチド配列のアミノ酸残基（Ｓｅｒ−７８〜Ｌｅｕ−２８５）をコードするポリヌクレオチド（これは、配列番号２に示すニュートロカイン−αポリペプチド配列のアミノ酸残基（Ｓｅｒ−７８〜Ｌｅｕ−２８５）と正確に同一である）をバキュロウイルス移入構築物ＰＳＣ中にサブクローニングし、バキュロウイルス発現プラスミドを作製した。ｐＡ２ＧＰ移入ベクター（ｐＶＬ９４１由来）は、ｇｐ６７シグナルペプチド、改変された多重クローニング部位、および青いプラークの選択のためのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ熱ショックプロモーターの下流にクローン化されたｌａｃＺ遺伝子を含む。ニュートロカイン−α（配列番号２）の配列およびｐＡ２ＧＰベクターの配列を使用して、クローニングストラテジーを、ＰＳＣシグナルペプチドコード配列をＡｌａ−１３４でニュートロカイン−αコード配列（配列番号２ならびに図１Ａおよび図Ｂ１）にシームレス（ｓｅａｍｌｅｓｓｌｙ）で融合し、そしてこれをＰＳＣバキュロウイルス移入プラスミド中に挿入するするために設計した。このストラテジーは、２段階のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手順の使用を含む。始めに、プライマーを、ニュートロカイン−α配列を増幅するために設計した。５’プライマーは、ＰＳＣシグナルペプチドＣ末端をコードする配列の後のＡｌａ−１３４をコードする配列および以下の残基（５’−ＧＧＴ  ＣＧＣ  ＣＧＴ  ＴＴＣ  ＴＡＡ  ＣＧＣ  ＧＧＣ  ＣＧＴ  ＴＣＡ  ＧＧＧ  ＴＣＣ  ＡＧＡ  ＡＧ−３’；配列番号３１）からなる。３’プライマー（５’−ＣＴＧ  ＧＴＴ  ＣＧＧ  ＣＣＣ  ＡＡＧ  ＧＴＡ  ＣＣＡ  ＡＧＣ  ＴＴＧ  ＴＡＣ  ＣＴＴ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＣＴＡ  ＧＡＴ  Ｃ−３’；配列番号３２）は、ＫｐｎＩ制限エンドヌクレアーゼ部位およびスペーサー配列（ＫｎｐＩにより増加される切断効率のために）の後の、ニュートロカイン−αコード配列からすぐ下流のｐＡ２ＧＰベクター配列の逆相補体からなる。ＰＣＲを、ニュートロカイン−αプラスミド（鋳型）を含むｐＡ２ＧＰおよびプライマー（Ｏ−１８８７およびＯ−１８８８）を用いて行い、そして得られたＰＣＲ産物を標準技術を使用して精製した。
【０７９６】
さらなるＰＣＲ反応を、鋳型としてＰＳＣバキュロウイルス移入プラスミドｐＭＧＳ１２を使用して行った。このｐＭＧＳ１２プラスミドは、ＰＳＣシグナルペプチドで置換されたＡＴＧ開始コドンの後のポリヘドリンコード配列およびポリリンカー部位を有するｐＵＣ８中に挿入されたＡｃＮＰＶ  ＥｃｏＲＩ「Ｉ」フラグメントからなる。ＰＣＲ反応は、鋳型としてｐＭＧＳ１２、独特のＮｇｏＭ  ＩＶおよびＥｃｏＲ  Ｖ部位の上流のＡｃＮＰＶ  ＯＲＦ６０３においてアニーリングした５’プライマー（５’−ＣＴＧ  ＧＴＡ  ＧＴＴ  ＣＴＴ  ＣＧＧ  ＡＧＴ  ＧＴＧ−３’；配列番号３３）およびＰＳＣシグナルペプチドをコードしている配列の３’末端にアニーリングした３’プライマー（５’−ＣＧＣ
ＧＴＴ  ＡＧＡ  ＡＡＣ  ＧＧＣ  ＧＡＣ  Ｃ−３’；配列番号３４）を使用した。
【０７９７】
ＰＳＣシグナルペプチドがニュートロカイン−αコード配列のＡｌａ−１３４にシームレスに融合されているＰＣＲ産物を産生するために、ＰＳＣシグナルペプチド−ポリヘドリンの上流領域と組み合わせ、そしてＰＣＲ産物をさらなる回のＰＣＲに供した。ＰＳＣシグナルペプチドのＰＣＲ産物（ｐＭＧＳ１２／Ｏ−９５９／Ｏ−１０４４）の３’末端は、プライマー（Ｏ−１８８７／Ｏ−１８８８）を用いて調製したニュートロカイン−αのＰＣＲ産物の５’末端に重複するので、２つのＰＣＲ産物を合せ、そしてプライマー（Ｏ−９５９およびＯ−１８８８）を使用するＰＣＲにより重複−伸長した（ｏｖｅｒｌａｐ−ｅｘｔｅｎｄ）。
【０７９８】
ニュートロカイン−α配列に融合したＰＳＣシグナルペプチドを含む、得られた重複−伸長ＰＣＲ産物を、続いてバキュロウイルス移入プラスミドｐＭＧＳ１２中に挿入した。ＰＣＲ産物をＮｇｏＭ  ＩＶおよびＫｐｎＩを用いて消化し、そしてフラグメントを精製し、そしてＮｇｏＭ  ＩＶ−ＫｐｎＩ切断したｐＭＧＳ１２中に連結した。連結混合物でコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞を形質転換した後、コロニーを拾い、そしてプラスミドＤＮＡミニプレップを調製した。各連結物からの数個の陽性クローンをプラスミドＤＮＡの制限消化分析により同定し、そして３つのクローン（ｐＡｃＣ９６６９、ｐＡｃＣ９６７１およびｐＡｃＣ９６７２）を大量プラスミド精製のために選択した。得られたプラスミドＤＮＡをＤＮＡ配列分析に供し、ニュートロカイン−α挿入物を確認しそして配列決定配列決定した。
【０７９９】
以下の工程は、Ｓｆ＋昆虫細胞由来の組換えニュートロカイン−αの回収プロセスおよび精製プロセスを記載する。他に言及されないかぎり、このプロセスは、２〜８℃で行われる。
【０８００】
（回収）
（工程１．ＣａＣｌ2処理）
Ｓｆ＋細胞の上清を、８，０００×ｇの遠心分離により収集した。回収緩衝液−１（１Ｍ  ＣａＣｌ2）を、ＣａＣｌ2の最終濃度が１０ｍＭになるように上清に添加した。（さらに好ましい実施形態では、１Ｍ  ＣａＣｌ2の代わりに１Ｍ
ＺｎＣｌ2が使用される。）溶液のｐＨを、回収緩衝液−２（１Ｍ  Ｔｒｉｓ
ｐＨ８（±０．２））で７．７±に調整した。この溶液を１５分間インキュベーションし、次いで８，０００×ｇで遠心分離した。
【０８０１】
（精製）
（工程１．Ｐｏｒｏｓ  ＰＩ−５０カラム上でのクロマトグラフィー）
Ｓｆ＋細胞の上清を、Ｐｏｒｏｓ  ＰＩ−５０カラム（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）上にロードした。このカラムをＰＩ−Ｉ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４（±０．２））中で平衡化した。このＰＩ−５０カラムを１〜２ＣＶのＰＩ−１緩衝液で洗浄し、次いで、３ＣＶを超える直線勾配のＰＩ−２緩衝液（５０ｍＭ  クエン酸Ｎａ  ｐＨ６（±０．２））で溶出した。この溶出物を、２８０ｎｍで紫外（ＵＶ）吸光度によりモニターした。画分を溶出ピークにわたって収集し、そしてＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析した。適切な画分をプールした。
【０８０２】
（工程２．Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｈｅｘｙｌ  ６５０Ｃカラム上でのクロマトグラフィー）
ＰＩプールを、最終濃度０．７Ｍ  （ＮＨ4）2ＳＯ4まで塩と混合し、そしてＨＩＣ−１緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、０．６Ｍ  ＮａＣｌ，０．７Ｍ  （ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ６（±０．２））中で平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｈｅｘｙｌ  ６５０Ｃ（Ｔｏｓｏ  Ｈａａｓ）カラム上にロードした。次いで、このカラムを２ＣＶのＨＩＣ−１緩衝液で洗浄した。続いて、組換えニュートロカイン−αを、３〜５ＣＶのＨＩＣ−２緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ  ｐＨ６．０（±０．２））続いて２ＣＶの２０％エタノール洗浄で段階的に溶出した。この溶出物を２８０ｎｍでのＵＶ吸光度および伝導率によりモニターした。画分を溶出ピークにわたり収集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。次いで、適切な画分をプールした。
【０８０３】
（工程３．ＳＰ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ上でのクロマトグラフィー）
Ｈｅｘｙｌ画分を透析し、そしてＳＰ−１緩衝液（５０ｍＭ  酢酸ナトリウム
ｐＨ４．５（±０．２））でｐＨ４．５に調整し、４ｍｓに希釈し、そしてＳＰ−１緩衝液（５０ｍＭ  酢酸ナトリウム  ｐＨ４．５（±０．２））で平衡化したＳＰ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  （陽イオン交換、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムにロードした。次いで、組換えニュートロカイン−αタンパク質を、ｐＨ５．５でＳＰ−２緩衝液（５０ｍＭ  酢酸ナトリウム  ｐＨ５．５（±０．２））でＳＰカラムから溶出した。次いで、この溶出物を２８０ｎｍで紫外（ＵＶ）吸光度によりモニターした。画分を溶出ピークにわたり収集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。適切な画分をプールした。
【０８０４】
（工程４．組換えニュートロカイン−αの透析）
ＳＰ画分を６〜８ｋｄカットオフ膜デバイス中に置き、次いで一晩Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１４０ｍＭ  塩化ナトリウム  ｐＨ６（±０．２））中へ透析またはダイアフィルトレーションした。
【０８０５】
（工程５．濾過および充填）
工程６由来の組換えニュートロカイン−α溶液のタンパク質濃度を、ビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）（ＢＣＡ）タンパク質アッセイにより決定した。組換えニュートロカイン−α処方物を適切な緩衝液で最終タンパク質濃度に調整し、そして制御条件下で濾過した。濾過物（バルク物質）を−２０℃未満で適切な滅菌容器中で保存した。
【０８０６】
特定の実施形態では、以下に記載されるように生成された本発明のニュートロカイン−αタンパク質を、１〜５ｍｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度に調整し、そして１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１４０ｍＭ  塩化ナトリウム、ｐＨ＝６．０±（０．４）中で緩衝化し、そしてＴｙｐｅ１ガラスバイアル中で−２０℃以下で保存した。
【０８０７】
クロマトグラフィーを実施している間、プロセスを２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によりモニターする。適用可能である場合、処理中のクロマトグラフィー中間体物を、伝導率、ｐＨについて試験し、そしてＳＤＳおよび／またはＲＰ−ＨＰＬＣによりモニターする。
【０８０８】
カラムおよび精製機器は、０．２Ｍまたは０．５Ｍ  ＮａＯＨ、続いて脱イオン水、次いで０．１Ｍまたは０．５Ｍ  酢酸で洗浄し、消毒される。このカラムおよび精製機器を、脱イオン水でリンスし、そして必要であれば、適切な保存溶液中で保存する。使用前に、この機器を、（本明細書中に記載するようにか、または当該分野で周知であるように）適切な緩衝液で平衡化する。
【０８０９】
さらに好ましい実施形態では、上記の回収の節の工程１において、１Ｍ  ＺｎＣｌ2を１Ｍ  ＣａＣｌ2の代わりに使用する。また、本実施形態では、ＺｎＣｌ2およびＣａＣｌ2の組み合わせを、使用し得る。０．１Ｍ  ＺｎＣｌ2および０．９Ｍ  ＣａＣｌ2の多くの組み合わせを組換えニュートロカイン−αタンパク質の回収プロセスにおいて使用し得、例えば、以下の組み合わせを使用し得るがこれらに限定されない：０．１Ｍ  ＺｎＣｌ2および０．９Ｍ  ＣａＣｌ2、０．２Ｍ  ＺｎＣｌ2および０．８Ｍ  ＣａＣｌ2、０．３Ｍ  ＺｎＣｌ2および０．７Ｍ  ＣａＣｌ2、０．４Ｍ  ＺｎＣｌ2および０．６Ｍ  ＣａＣｌ2、０．５Ｍ
ＺｎＣｌ2および０．５Ｍ  ＣａＣｌ2、０．６Ｍ  ＺｎＣｌ2および０．４Ｍ
ＣａＣｌ2、０．７Ｍ  ＺｎＣｌ2および０．３Ｍ  ＣａＣｌ2、０．８Ｍ  ＺｎＣｌ2および０．２Ｍ  ＣａＣｌ2、０．９Ｍ  ＺｎＣｌ2および０．１Ｍ  ＣａＣｌ2など。しかし、ＥＤＴＡの存在は、回収プロセスを阻害する。さらに、回収緩衝液−１中のＺｎＣｌ2および／またはＣａＣｌ2の存在は、大量の高分子量（または分子質量）のニュートロカイン−αマルチマーの形成を誘導する。
【０８１０】
（実施例３：哺乳動物細胞におけるニュートロカイン−αのクローニングおよび発現）
典型的な哺乳動物発現ベクターは、プロモーターエレメントを含み、このプロモーターエレメントは、ｍＲＮＡ、タンパク質コード配列および転写の終結および転写物のポリアデニル化に必要とされるシグナルの転写の開始を媒介する。エンハンサー、Ｋｏｚａｋ配列および介在配列を含む更なるエレメントは、ＲＮＡスプライシングのためのドナーおよびアクセプター部位に隣接する。高効率な転写は、ＳＶ４０由来の初期プロモーターおよび後期プロモーター、レトロウイルス（例えば、ＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩ）由来の長い末端反復（ＬＴＲ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターを用いて達成し得る。しかし、細胞要素（例えば、ヒトアクチンプロモーター）をまた、使用し得る。本発明の実施における使用のための適切な発現ベクターとしては、例えば、ｐＳＶＬおよびｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣ  ３７１５２），ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ  ３７１４６）およびｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ  ６７１０９）が挙げられる。使用され得る哺乳動物宿主細胞としては、ヒトＨｅＬａ、２９３、Ｈ９およびＪｕｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３、Ｃ１２７細胞、Ｃｏｓ１、Ｃｏｓ７およびＣＶ１、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞ならびにＨＥＫ２９３細胞が挙げられる。
【０８１１】
あるいは、遺伝子を、染色体中に組み込んだ遺伝子を含む適切な細胞株において発現し得る。選択マーカー（例えば、ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン、ハイグロマイシン）との同時トランスフェクションは、トランスフェクトされた細胞の同定および単離を可能にする。
【０８１２】
トランスフェクトした遺伝子をまた、増幅し、大量のコードされたタンパク質を発現し得る。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカーは、目的の遺伝子の数百または数千ものコピーを保有する細胞株を開発するのに有用である。別の有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２２７：２７７−２７９（１９９１）；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６９−１７５（１９９２））。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を、選択培地中で増殖し、そして、最も高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は、染色体へ組み込まれた増幅した遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびＮＳＯ細胞を、タンパク質の産生のためにしばしば使用する。
【０８１３】
発現ベクターｐＣ１およびｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーター（ＬＴＲ）（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、４３８−４４７（１９８５年３月））およびＣＭＶ−エンハンサーのフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ  ４１：５２１−５３０（１９８５））を含む。例えば、制限酵素切断部位ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＡｓｐ７１８を有する多重クローニングサイトは、目的の遺伝子のクローニングを容易にする。ベクターは、３’イントロンに加え、ラットプレプロインスリン遺伝子のポリアデニル化および終結シグナルを含む。
【０８１４】
（実施例３（ａ）：ＣＯＳ細胞におけるクローニングおよび発現）
発現プラスミドであるｐニュートロカイン−α−ＨＡを、発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐまたはｐｃＤＮＡＩＩＩ（これらは、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．から入手され得る）に、タンパク質の細胞外ドメインをコードする寄託したｃＤＮＡの部分をクローニングすることにより作製する。ポリペプチドの可溶性分泌形態を生成するために、細胞外ドメインをヒトＩＬ−６遺伝子の分泌リーダー配列へ融合する。
【０８１５】
発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐは、以下を含む：（１）Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の原核生物細胞における増殖に有効なＥ．ｃｏｌｉの複製起点；（２）プラスミドを含む原核生物細胞の選択のためのアンピシリン耐性遺伝子；（３）原核生物細胞における増殖のためのＳＶ４０複製起点；（４）ＣＭＶプロモーター、ポリリンカー、ＳＶ４０イントロン；（５）ｃＤＮＡが、ＣＭＶプロモーターの発現制御下に都合よく配置され得、そしてポリリンカーにおける制限部位により、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化シグナルに作動可能に連結され得るように配列された終結コドンおよびポリアデニル化シグナルの前のヘマグルチニンフラグメント（すなわち、精製を容易にするための「ＨＡ」タグ）をコードするいくつかのコドン。ＨＡタグは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７（１９８４）により記載されるインフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応する。標的タンパク質へのＨＡタグの融合は、ＨＡエピトープを認識する抗体を用いる組換えタンパク質の検出および回収を簡単にする。ｐｃＤＮＡＩＩＩは、さらに、選択ネオマイシンマーカーを含む。
【０８１６】
ニュートロカイン−αポリペプチドの細胞外ドメインをコードするＤＮＡフラグメントは、ベクターのポリリンカー領域内にクローン化され、その結果、組換えタンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターに指示される。プラスミド構築ストラテジーは以下である。寄託したクローンのニュートロカイン−α  ｃＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ中のニュートロカイン−αの発現のためのベクターの構築について上記で記載されたのと同様に、都合のよい制限部位を含むプライマーを使用して増幅する。適切なプライマーとしては以下が挙げられ、このプライマーは本実施例において使用される。下線を付したＢａｍＨＩ部位、Ｋｏｚａｋ配列、ＡＵＧ開始コドン、ヒトＩＬ−６遺伝子由来の分泌リーダー配列をコードする配列、およびニュートロカイン−αタンパク質の細胞外ドメインの５’コード領域の１８ヌクレオチドを含む５’プライマーは、以下：
【０８１７】
【化２８】
2007277249.tif 000046
の配列を有する。下線を付したＢａｍＨＩ制限部位および終止コドンの直前の３’コード配列に相補的な１８個のヌクレオチドを含む３’プライマーは、以下：
【０８１８】
【化２９】
2007277249.tif 000047
の配列を有する。
【０８１９】
ＰＣＲ増幅したＤＮＡフラグメントおよびベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐを、ＢａｍＨＩで消化し、次いで連結する。連結混合物をＥ．ｃｏｌｉ株であるＳＵＲＥ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１１０９９  Ｎｏｒｔｈ  Ｔｏｒｒｅｙ  Ｐｉｎｅｓ  Ｒｏａｄ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ  ９２０３７から入手可能である）に形質転換し、そして形質転換した培養物をアンピシリン培地プレートにプレーティングし、次いでこれをインキュベートし、アンピシリン耐性コロニーを増殖させる。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単離し、そしてニュートロカイン−α細胞外ドメインをコードしているフラグメントの存在について、制限分析または他の手段により試験する。
【０８２０】
組換えニュートロカイン−αの発現について、ＣＯＳ細胞を、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）に記載されるように、ＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮを使用して、上記に記載するように発現ベクターでトランスフェクトする。細胞をベクターによるニュートロカイン−αの発現のための条件下でインキュベートする。
【０８２１】
ニュートロカイン−α−ＨＡ融合タンパク質の発現を、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載される方法を使用して放射性標識化および免疫沈降により検出する。この目的のために、トランスフェクションの２日後、細胞を、８時間35Ｓ−システインを含む培地中でインキュベーションすることにより標識する。この細胞および培地を収集し、そして細胞を洗浄し、そして上記で引用されるＷｉｌｓｏｎらにより記載されるように、界面化性剤を含むＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、０．５％ＤＯＣ、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、ｐＨ７．５）で溶解する。タンパク質を、ＨＡ−特異的モノクローナル抗体を使用して、細胞溶解産物および培養培地から沈殿させる。次いで、沈殿させたタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより分析する。ネガティブコントロールには見られない、予想したサイズの発現産物が細胞溶解産物において見出される。
【０８２２】
（実施例３（ｂ）：ＣＨＯ細胞におけるクローニングおよび発現）
ベクターｐＣ４をニュートロカイン−αタンパク質の発現に使用する。プラスミドｐＣ４は、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒの誘導体である（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）。ニュートロカイン−αポリペプチドの可溶性の分泌形態を産生するために、細胞外ドメインをコードする、寄託したｃＤＮＡの部分をヒトＩＬ−６遺伝子の分離リーダー配列に融合する。ベクタープラスミドは、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下のマウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。これらのプラスミドでトランスフェクトされるジヒドロ葉酸活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣細胞または他の細胞を、化学療法剤であるメトトレキサートを補充した選択培地（αマイナスＭＥＮ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で細胞を増殖することにより選択し得る。メトトレキサート（ＭＴＸ）に対して耐性の細胞におけるＤＨＦＲ遺伝子の増幅は、十分に証明されている（例えば、Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．、Ｋｅｌｌｅｍｓ，Ｒ．Ｍ．、Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ．Ｒ．およびＳｃｈｉｍｋｅ，Ｒ．Ｔ．１９７８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７−１３７０、Ｈａｍｌｉｎ，Ｊ．Ｌ．およびＭａ，Ｃ．１９９０、Ｂｉｏｃｈｍ．ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０９７：１０７−１４３、Ｐａｇｅ，Ｍ．Ｊ．およびＳｙｄｅｎｈａｍ，Ｍ．Ａ．１９９１、Ｂｉｏｔｈｃｅｎｏｌｏｇｙ  ９：６４−６８を参照のこと）。ＭＴＸの増加濃度における細胞増殖は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅の結果として標的酵素であるＤＨＦＲを過剰産生することにより薬物に対する耐性を発現する。第二の遺伝子をＤＨＦＲ遺伝子に連結する場合、その遺伝子は通常、同時に増殖され、そして過剰発現される。このアプローチが１，０００を超えるコピーの増幅された遺伝子を保有する細胞株を開発するために使用され得ることは当該分野において公知である。続いて、メトトレキサートを取り除く場合、宿主細胞の１つ以上の染色体中に組み込まれた増幅された遺伝子を含む細胞株が得られる。
【０８２３】
プラスミドｐＣ４は、目的の遺伝子を発現するために、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）の強力なプロモーター（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９８５年３月：４３８−４４７）およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の最初期遺伝子のエンハンサーから単離されたフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ  ４１：５２１−５３０（１９８５））を含む。プロモーターの下流は、遺伝子の組み込みを可能にする、以下の単一の制限酵素切断部位である：ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＡｓｐ７１８。このプラスミドは、これらのクローニング部位の後に、ラットプレプロインスリン遺伝子の３’イントロンおよびポリアデニル化部位を含む。他の高効率のプロモーター（例えば、ヒトβアクチンプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターもしくはＳＶ４０後期プロモーター、または他のレトロウイルス（例えば、ＨＩＶおよびＨＴＬＶＩ）由来の長い末端反復）をまた、発現のために使用し得る。ＣｌｏｎｔｅｃｈのＴｅｔ−ＯｆｆおよびＴｅｔ−Ｏｎ遺伝子発現系および類似の系を、哺乳動物細胞において調節された方法で、ニュートロカイン−αを発現するために使用し得る（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．およびＢｕｊａｒｄ，Ｈ．１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７−５５５１）。ｍＲＮＡのポリアデニル化について、例えば、ヒト成長ホルモンまたはグロビン遺伝子由来の他のシグナルが、同様に使用され得る。染色体に組み込まれた目的の遺伝子を保有する安定な細胞株をまた、ｇｐｔ、Ｇ４１８またはハイグロマイシンのような選択マーカーとの同時トランスフェクションの際に、選択し得る。開始において１つを超える選択マーカー（例えば、Ｇ４１８およびメトトレキサート）を使用することは、都合がよい。
【０８２４】
プラスミドｐＣ４を、制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、次いで当該分野で公知の手順により仔ウシ腸ホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を使用して脱リン酸化する。次いで、ベクターを１％アガロースゲルから単離する。
【０８２５】
ニュートロカイン−αタンパク質の細胞外ドメインをコードするＤＮＡ配列を、この遺伝子の５’配列および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅する。下線を付したＢａｍＨＩ部位、Ｋｏｚａｋ配列、ＡＵＧ開始コドン、ヒトＩＬ−６遺伝子由来の分泌リーダーペプチドをコードする配列、およびニュートロカイン−αタンパク質の細胞外ドメインの５’コード領域の１８ヌクレオチドを含む５’プライマーは、以下；
【０８２６】
【化３０】
2007277249.tif 000048
の配列を有する。下線を付したＢａｍＨＩおよび終止コドンの直前に３’コード配列に相補的な１８個のヌクレオチドを有する３’プライマーは、以下：
【０８２７】
【化３１】
2007277249.tif 000049
の配列を有する。
【０８２８】
増幅したフラグメントをエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで消化し、次いで、１％アガロースゲル上で再度精製する。次いで単離したフラグメントおよび脱リン酸化したベクターをＴ４  ＤＮＡリガーゼで連結する。次いでＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１またはＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞を形質転換し、そして例えば、制限酵素分析を使用して、プラスミドｐＣ４へ挿入したフラグメントを含む細菌を同定する。
【０８２９】
活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠くチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トランスフェクションに使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ４を、リポフェクション（Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）を使用して、０．５μｇのプラスミドｐＳＶｎｅｏと同時トランスフェクトする。このプラスミドｐＳＶｎｅｏは、優性の選択マーカーである、Ｇ４１８を含む抗生物質の群に対して耐性を与える酵素をコードするＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子を含む。この細胞を、１ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を補充したαマイナスＭＥＭ中に播種する。２日後、細胞をトリプシン処理し、そしてハイブリドーマクローニングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中の１０、２５または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサートおよび１ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を補充したαマイナスＭＥＭ中に播種する。約１０〜１４日後、単一のクローンをトリプシン処理し、次いで異なる濃度（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）のメトトレキサートを使用して、６ウェルペトリ皿または１０ｍｌフラスコに播種する。次いで、最高濃度のメトトレキサートで増殖したクローンを、さらに高い濃度（１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ）のメトトレキサートを含む新たな６ウェルプレートに移す。同じ手順を１００〜２００μＭの濃度で増殖するクローンを得るまで繰り返す。所望の遺伝子産物の発現を、例えばＳＤＳ−ＲＡＧＥおよびウェスタンブロットによるかまたは逆相ＨＰＬＣ分析により分析する。
【０８３０】
少なくとも、６個のニュートロカイン−α発現構築物を、本明細書中の発明により作製し、いくつかの系におけるいくつかのサイズのニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの産生を促進した。発現構築物は以下である：（１）ｐＮａ．Ａ７１−Ｌ２８５（アミノ酸残基Ａｌａ−７１〜Ｌｅｕ−２８５を発現する）、（２）ｐＮａ．Ａ８１−Ｌ２８５（アミノ酸残基Ａｌａ−８１〜Ｌｅｕ−２８５を発現する）、（３）ｐＮａ．Ｌ１１２−Ｌ２８５（アミノ酸残基Ｌｅｕ−１１２〜Ｌｅｕ−２８５を発現する）、（４）ｐＮａ．Ｌ１３４−Ｌ２８５（アミノ酸残基Ａｌａ−１３４〜Ｌｅｕ−２８５を発現する）、（５）ｐＮａ．Ｌ１４７−Ｌ２８５（アミノ酸残基Ｌｅｕ−１４７〜Ｌｅｕ−２８５を発現する）、（６）ｐＮａ．Ｇ１６１−Ｌ２８５（アミノ酸残基Ｇｌｙ−１６１〜Ｌｅｕ−２８５を発現する）。
【０８３１】
好ましい実施形態では、発現構築物を、細菌系、バキュロウイルス系および哺乳動物系由来の種々のニュートロカイン−αムテインを発現するために使用する。
【０８３２】
特定のさらなる好ましい実施形態では、構築物は、Ｎ末端および／またはＣ末端で異種ポリペプチド（例えば、ヒトＩＬ−６由来のシグナルペプチド、ＣＫ−β８由来のシグナルペプチド（公開されたＰＣＴ出願  ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９０５８に開示されるＣＫ−β８配列のアミノ酸−２１〜−１）またはヒトＩｇＧ
Ｆｃ領域）に融合したニュートロカイン−αポリペプチドフラグメントを発現する。当業者に公知の他の配列を、使用し得る。
【０８３３】
（実施例４：ニュートロカイン−α  ｍＲＮＡ発現の組織分布）
ノーザンブロット分析を、特にＳａｍｂｒｏｏｋら（上記引用）により記載される方法を使用して、ヒト組織におけるニュートロカイン−α遺伝子発現を試験するために行った。ニュートロカイン−αタンパク質（配列番号１）の全ヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡプローブを、製造業者の使用説明書に従い、ｒｅｄｉｐｒｉｍｅTMＤＮＡ標識システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、32Ｐで標識する。標識後、プローブを、製造業者のプロトコール番号ＰＴ１２００−１に従い、ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ−１００TMカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を使用して精製する。次いで精製した標識プローブを使用し、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−α  ｍＲＮＡについて種々のヒト組織を試験する。
【０８３４】
種々のヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（ＩＭ）を含む多重組織ノーザン（ＭＴＮ）ブロットをＣｌｏｎｔｅｃｈから入手し、そして製造業者のプロトコール番号ＰＴ１１９０−１に従い、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂTMハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、標識プローブで試験する。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の後、そのブロットをマウントし、そして−７０℃にて一晩フィルムに曝し、そしてフィルムを標準手順に従い現像した。
【０８３５】
ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−α発現のパターンを決定するために、多重組織ノーザーンブロットのパネルをプロービングした。これは、末梢血液白血球、脾臓、リンパ節および骨髄における単一の２．６ｋｂのｍＲＮＡの優勢な発現、および胎盤、心臓、肺、胎児肝臓、胸腺および膵臓における検出可能な発現を明らかにした。細胞株のパネルの分析は、ＨＬ６０細胞におけるニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αの高い発現、Ｋ５６２における検出可能な発現を実証したが、Ｒａｊｉ細胞、ＨｅＬａ細胞またはＭＯＬＴ−４細胞における発現は示されなかった。全体的に、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−α  ｍＲＮＡの発現は、免疫系において豊富であるようである。
【０８３６】
（実施例５：内因性ニュートロカイン−α遺伝子を使用する遺伝子治療）
本発明に従う遺伝子治療の別の方法は、本発明の内因性ニュートロカイン−α配列を、例えば、米国特許番号５，６４１，６７０（１９９７年６月２４日発行）；国際公開番号ＷＯ  ９６／２９４１１（１９９６年９月２６日公開）；国際公開番号ＷＯ  ９４／１２６５０（１９９４年８月４日公開）；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：８９３２〜８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ，３４２：４３５〜４３８（１９８９）に記載されるように、相同組換えを介してプロモーターに作動可能に結合する工程を包含する。この方法は、その標的細胞中に存在するが、その細胞中では発現されないかまたは所望されるよりも低いレベルで発現される、遺伝子の活性化を包含する。プロモーターおよび標的化配列を含むポリヌクレオチド構築物を作製する。この標的配列は、プロモーターに隣接する、内因性ニュートロカイン−αの５’非コード配列に相同である。この標的化配列は、このニュートロカイン−αの５’末端に十分に近く、その結果、このプロモーターは、相同組換えの際にこの内因性配列に作動可能に連結される。このプロモーターおよび標的化配列を、ＰＣＲを使用して増幅し得る。好ましくは、この増幅したプロモーターは、５’末端および３’末端上に異なる制限酵素部位を含む。好ましくは、第１の標的化配列の３’末端は、増幅したプロモーターの５’末端と同じ制限酵素部位を含み、そして第２の標的化配列の５’末端は、増幅したプロモーターの３’末端と同じ制限部位を含む。
【０８３７】
この増幅したプロモーターおよび増幅した標的化配列を、適切な制限酵素で消化し、続いてウシ腸ホスファターゼで処理する。消化したプロモーターおよび消化した標的化配列を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの存在下でともに加える。生じた混合物を、これら２つのフラグメントの連結に適切な条件下で維持する。この構築物をアガロースゲル上でサイズ分画し、次いでフェノール抽出およびエタノール沈殿により精製する。
【０８３８】
この実施例において、このポリヌクレオチド構築物を、エレクトロポレーションを介して裸のポリヌクレオチドとして投与する。しかし、このポリヌクレオチド構築物はまた、トランスフェクション促進剤（例えば、リポソーム、ウイルス配列、ウイルス粒子、沈殿剤など）とともに投与され得る。送達のこのような方法は、当該分野で公知である。
【０８３９】
一旦、細胞をトランスフェクトすると、相同組換えが生じて、このプロモーターがこの内因性ニュートロカイン−α配列に作動可能に連結される。これは、この細胞中におけるニュートロカイン−αの発現を生じる。発現は、免疫学的染色または当該分野で公知の他の任意の方法により、検出され得る。
【０８４０】
線維芽細胞を、皮膚生検により被験者から得る。得られた組織を、ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎仔血清中に置く。対数増殖期または定常期初期の線維芽細胞を、トリプシン処理し、そしてプラスチックの表面から栄養培地でリンスする。細胞懸濁液のアリコートを、計数のために取り出し、そして残りの細胞を遠心分離に供する。上清を吸引し、そしてペレットを５ｍｌのエレクトロポレーション緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．３、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、０．７ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、６ｍＭデキストロース）に再懸濁する。この細胞を再遠心分離し、上清を吸引し、そして細胞をアセチル化ウシ血清アルブミン１ｍｇ／ｍｌを含むエレクトロポレーション緩衝液に再懸濁する。この最終細胞懸濁物は、約３×１０6細胞／ｍｌを含む。エレクトロポレーションを、再懸濁直後に実施すべきである。
【０８４１】
プラスミドＤＮＡを、標準的技術に従って調製する。例えば、ニュートロカイン−αの遺伝子座に標的化するためのプラスミドを構築するために、プラスミドｐＵＣ１８（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ａｍｈｅｒｓｔ、ＮＹ）をＨｉｎｄＩＩＩで消化する。ＣＭＶプロモーターを、５’末端にＸｂａＩ部位および３’末端にＢａｍＨＩ部位を備えてＰＣＲにより増幅する。２つのニュートロカイン−α非コード配列をＰＣＲを介して増幅する：一方のニュートロカイン−α非コード配列（ニュートロカイン−αフラグメント１）を、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位および３’末端にＸｂａ部位を備えて増幅する；他方のニュートロカイン−α非コード配列（ニュートロカイン−αフラグメント２）を、５’末端にＢａｍＨＩ部位および３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を備えて増幅する。このＣＭＶプロモーターおよびこれらのニュートロカイン−αフラグメント（１および２）を、適切な酵素（ＣＭＶプロモーター−ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ；ニュートロカイン−αフラグメント１−ＸｂａＩ；ニュートロカイン−αフラグメント２−ＢａｍＨＩ）で消化し、そしてともに連結する。生じた連結生成物をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＵＣ１８プラスミドと連結する。
【０８４２】
プラスミドＤＮＡを、０．４ｃｍの電極ギャップを備える滅菌キュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に添加する。最終ＤＮＡ濃度は、一般的に、少なくとも１２０μｇ／ｍｌである。次いで、この細胞懸濁液の０．５ｍｌ（約１．５×１０6細胞を含む）をこのキュベットに添加し、そしてこの細胞懸濁液およびＤＮＡ溶液を、穏やかに混合する。エレクトロポレーションを、Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて実施する。キャパシタンスおよび電圧を、それぞれ、９６０μＦおよび２５０〜３００Ｖに設定する。電圧が増加すると、細胞の生存が減少するが、導入されたＤＮＡをそのゲノム中に安定に組込む生存細胞の割合が劇的に増加する。これらのパラメーターを考えると、パルス時間約１４〜２０ｍＳｅｃが観察されるはずである。
【０８４３】
エレクトロポレーションした細胞を、室温で約５分間維持し、次いで、このキュベットの中身を、滅菌した移動ピペットを用いて穏やかに取り出す。この細胞を、１０ｃｍのディッシュ中の、予め温めた栄養培地（１５％ウシ血清を含むＤＭＥＭ）１０ｍｌに直接加え、そして３７℃でインキュベートする。翌日、この培地を吸引し、そして１０ｍｌの新鮮な培地で置換し、そしてさらに１６〜２４時間インキュベートする。
【０８４４】
次いで、操作された線維芽細胞を、宿主中に、単独か、またはサイトデックス（ｃｙｔｏｄｅｘ）３マイクロキャリア（ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ）ビーズ上でコンフルエントになるまで増殖させた後かのいずれかで、注入する。ここで、この線維芽細胞は、タンパク質産物を生成する。次いで、この線維芽細胞を、上記のような患者に導入し得る。
【０８４５】
（実施例６：Ｂリンパ球刺激物質として機能する腫瘍壊死因子リガンドファミリーの新規メンバーである、ニュートロカイン−α）
２８５個のアミノ酸タンパク質をＡＰＲＩＬ（２８．７％）（Ｈａｈｎｅ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８、１１８５−１１９０（１９８８））、ＴＮＦ−α（１６．２％）（Ｐｅｎｎｉｃａ，Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２、７２４−７２９（１９８４））およびＬＴ−α（１４．１％）（Ｇａｒｙ、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２、７２１−７２４（１９８４））に対するその推定細胞外レセプター−リガンド結合ドメイン内で有意な相同性を共有するヒト好中球／単球由来ｃＤＮＡライブラリーにおいて同定した（図７Ａ）。本発明者は、このサイトカインであるニュートロカイン−αを設計した（著者らはまた、この分子をその生物学的活性に基づいてＢ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ（ＢＬｙＳ）として設計した）。ニュートロカイン−αタンパク質配列の疎水性分析は、ニュートロカイン−αが、ＴＮＦリガンドファミリーの他のメンバーと同様に、ＩＩ型膜結合タンパク質である（Ｃｏｓｍａｎ，Ｄ．Ｓｔｅｍ．Ｃｅｌｌｓ．１２：４４０−５５（１９９４））ことを示唆する非疎水性アミノ酸の後のアミノ酸残基４７と７３との間の潜在的な膜貫通ドメインを明らかにした。哺乳動物細胞（ＨＥＫ２９３およびチャイニーズハムスター卵巣）およびＳｆ９昆虫細胞におけるこのｃＤＮＡの発現により、アミノ酸１３４におけるアラニン残基で始まるＮ末端配列を有する、この１５２アミノ酸可溶性形態を同定した。電荷に対する質量比の再構築により、１７，０３８ダルトン（この値は、一つのジスルフィド結合を有する、この１５２アミノ酸タンパク質について推定された値（１７０３７．５ダルトン）と一致する）のニュートロカイン−αについての質量を規定した。
【０８４６】
ヒト／ハムスターの体細胞ハイブリッドおよび照射ハイブリッドマッピングパネルを使用して、ニュートロカイン−αをコードする遺伝子を、ＴＮＦスーパーファミリーの遺伝子の任意の他のメンバーと以前は関連付けられていなかった領域である（Ｃｏｓｍａｎ，Ｄ．Ｓｔｅｍ．Ｃｅｌｌｓ．１２：４４０−５５（１９９４））ヒト染色体１３ｑ３４に位置するマーカーＳＨＧＣ−３６１７１に結合されて見出された。
【０８４７】
ニュートロカイン−αの発現プロフィールを、ノーザンブロット（図７Ｂ）およびフローサイトメトリー分析（表Ｖおよび図８）により評価した。ニュートロカイン−αは、末梢血白血球、脾臓、リンパ節および骨髄において高レベルで見出される単一の２．６ｋｂのｍＲＮＡによりコードされる。より低い発現レベルを胎盤、心臓、肺、胎児肝臓、胸腺および膵臓において検出した。細胞株のパネルの間で、ニュートロカイン−αのｍＲＮＡを、ＨＬ−６０およびＫ５６２において検出したが、Ｒａｊｉ、ＨｅＬａまたはＭＯＬＴ−４細胞では検出しなかった。これらの結果を、ニュートロカイン−α特異的ｍＡｂ  ２Ｅ５を使用するフローサイトメトリー分析により確認した。表Ｖに示されるように、ニュートロカイン−α発現は、さらなるＴまたはＢ系列細胞では検出されず、骨髄起源における細胞に制限される。正常な血液型の分析は、３日間にわたるＩＦＮ−γ（１００Ｕ／ｍＬ）への細胞の曝露後、約４倍に上方制御された休止単球における有意な発現を実証する（図８Ａ）。ニュートロカイン−α特異的ｍＲＮＡにおける同時の増加をまた、検出した（図８Ｂ）。対照的に、ニュートロカイン−αは、新たに単離された末梢血の顆粒球、Ｔ細胞、Ｂ細胞またはＮＫ細胞では発現されなかった。
【０８４８】
精製された組換えニュートロカイン−α（「ｒニュートロカイン−α」）を、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球、ＮＫ細胞、造血前駆細胞、および種々の内皮起源および上皮起源の細胞型を含む、多数の細胞ベースのアッセイにおける活性化、増殖または死を誘導するその能力について評価した。これらのアッセイの中で、精製した扁桃Ｂ細胞を、プライミング剤（ｐｒｉｍｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）としてホルマリン固定したＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｃｏｗａｎ  Ｉ（ＳＡＣ）または固定した抗ヒトＩｇＭのいずれかの存在下で培養する標準的な同時刺激アッセイ（Ｓｉｅｃｋｍａｎｎ，Ｄ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４７：８１４−２９（１９７８）；Ｒｉｎｇｄｅｎ，Ｏ．ら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１１５９−６９（１９７７））において、ニュートロカイン−αがＢ細胞増を増加することを特に見出した。図９Ａに示されるように、組換えニュートロカイン−αは、扁桃Ｂ細胞の用量依存的増殖を誘発する。この応答は、０．１〜１０，０００ｎｇ／ｍＬの範囲の用量に対するｒＩＬ２の応答に類似した。ニュートロカイン−αはまた、固定した抗ＩｇＭで同時刺激された細胞と共に培養した場合、Ｂ細胞増殖を誘発した（図９Ａ）。架橋剤の量が、固定濃度のＩＬ２またはｒニュートロカイン−αのいずれかの存在下で増加するので、用量依存性応答が容易に観察される。
【０８４９】
Ｂ細胞に特異的な生物学的活性とレセプター発現とを相関付けるために、精製したニュートロカイン−αをビオチン化した。得られたビオチン−ニュートロカイン−αタンパク質は、標準的なＢ細胞増殖アッセイにおいて生化学的機能を保持した。全ヒト末梢血細胞の系列特異的分析は、それぞれＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ５６およびＣＤ６６ｂにより評価した場合に、ビオチン化されたニュートロカイン−αの結合がＴ細胞、単球、ＮＫ細胞および顆粒球において検出不可能であったことを示した（図１０Ａ）。対照的に、ビオチン化されたニュートロカイン−αは、末梢ＣＤ２０+Ｂ細胞に結合した。レセプター発現もまた、Ｂ細胞腫瘍株ＲＥＨ、ＡＲＨ−７７、Ｒａｊｉ、Ｎａｍａｌｗａ、ＲＰＭＩ  ８２２６およびＩＭ−９において検出したが、ＴＨＰ−１、ＨＬ−６０、Ｋ−５６２およびＵ−９３７を含む試験された骨髄由来の株のいずれにおいても検出しなかった。骨髄細胞株ＩＭ−９および組織球株Ｕ−９３７についての代表的なフローサイトメトリープロフィールを、図１０Ｂに示す。同様の結果をまた、化学的に修飾されたビオチン−ニュートロカイン−αの代わりに、生物学的に活性なＦＬＡＧ−タグ化ニュートロカイン−αタンパク質を使用して得た。まとめると、これらの結果は、ニュートロカイン−αがそのレセプター分布および生物学的活性の両方において明確なＢ細胞向性を示すことを確証した。細胞の活性化が末梢血細胞、他の正常な細胞型または確立された細胞株においてニュートロカイン−αレセプターの発現を増加し得るか否かは、いまだ示されていない。
【０８５０】
ニュートロカイン−αの種特異性を試験するために、マウス脾臓Ｂ細胞を、ヒトニュートロカイン−αおよびＳＡＣの存在下で培養した。結果は、ｒニュートロカイン−αがマウス脾臓Ｂ細胞のインビトロ増殖を誘導し、そしてこれらの細胞上の細胞表面レセプターに結合したことを実証した。興味深いことに、マウス骨髄から単離された未成熟の表面ＩｇネガティブＢ細胞前駆体は、ニュートロカイン−αに応答して増殖もせず、またリガンドに結合もしなかった。
【０８５１】
ｒニュートロカイン−αのインビボ活性を評価するために、ＢＡＬＢ／ｃマウス（３匹／群）に、緩衝液のみ、または０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇまたは８ｍｇ／ｋｇのｒニュートロカイン−αを１日２回注射（ｉ．ｐ．）した。マウスにこの処置を４日間連続して与え、この時点でそれらを屠殺し、そして分析のために種々の組織および血清を収集した。代替的な実施形態では、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の任意の量のｒニュートロカイン−αを１日２回注射（ｉ．ｐ．）する。好ましい実施形態では、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ（この実施形態における特に好ましい例示的な投与量としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．１ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．３ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、２．６ｍｇ／ｋｇ、２．７ｍｇ／ｋｇ、２．８ｍｇ／ｋｇ、２．９ｍｇ／ｋｇおよび３．０ｍｇ／ｋｇ）の範囲の任意の量のｒニュートロカイン−αを１日２回注射（ｉ．ｐ．）する。さらに好ましい実施形態では、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、０．０２ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇ（この実施形態における特に好ましい例示的な投与量としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇおよび２．０ｍｇ／ｋｇ）の範囲の任意の量のｒニュートロカイン−αを１日２回注射（ｉ．ｐ．）する。
【０８５２】
微視的に、ニュートロカイン−α投与の効果は、慣用的なヘマトキシリンおよびエオシン（ＨおよびＥ）、ならびにＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）に特異的なｍＡｂで免疫組織化学的に染色した脾臓の切片において明白である（図１１Ａ）。正常な脾臓の構築（ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）を、白脾髄周辺帯の劇的な拡大および赤脾髄の細胞性における異なる増加における劇的な発現により変化させた（図１１Ａ）。周辺帯の拡大は、Ｂ細胞マーカーＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）を発現する増加した数のリンパ球の結果であるようである。さらに、Ｔ細胞の高密度な動脈周辺リンパ性鞘（ｐｅｒｉａｒｔｅｒｉｏｌａｒ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｓｈｅａｔｈ）（ＰＡＬＳ）領域をまた、中程度の数のＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）ポジティブ細胞により、浸潤させた。このことは、白脾髄の変化がＢ細胞の増加した数に起因したことを示唆する。赤脾髄の空間を頻繁に満たした高密度に詰められた細胞集団は、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）で染色されなかった。さらなる実験が、関与する全ての細胞型を特徴付け、そしてニュートロカイン−αが脾臓構築を変化させる機構をさらに規定するために必要とされる。
【０８５３】
ニュートロカイン−α処理した、２ｍｇ／ｋｇで処置したマウス由来の脾臓のフローサイトメトリー分析は、ニュートロカイン−αが、コントロールマウスにおいて観察された約１０倍を超える成熟（ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）dull、ＴｈＢbright）Ｂ細胞の割合を増加したことを示す（図１１Ｂ）。マウスを、緩衝液、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇまたは８ｍｇ／ｋｇのニュートロカイン−αで処理した、さらに実施した分析は、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇが各々成熟（ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）dull、ＴｈＢbright）Ｂ細胞の割合をコントロールマウスにおいて観察された割合の約１０倍を超えて増加したことを示したが、緩衝液および８ｍｇ／ｋｇは、およそ等しい割合の成熟Ｂ細胞を生成した。表ＩＶを参照のこと。
【０８５４】
【表４】
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増加した成熟Ｂ細胞のインビボでの提示の潜在的な結果は、血清ＩｇＧ力価における相対的な増加である。従って、血清のＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭレベルを、緩衝液処置したマウスとニュートロカイン−α処置したマウスとの間で比較した（図１１Ｃ）。ニュートロカイン−α投与は、それぞれＩｇＡおよびＩｇＭの血清レベルにおける２倍および５倍の増加を生じた。興味深いことに、ＩｇＧの循環レベルは、増加しなかった。
【０８５５】
さらに、用量依存性応答を、４日間にわたり、種々の量のニュートロカイン−αで処置したマウスの血清のＩｇＡ力価において観察したが、見かけ上の量依存性は、２日間にわたる同じ量のニュートロカイン−αの投与によっては、観察されなかった。４日間にわたる投与の場合、８、２、０．８、０．０８および０ｍｇ／ｋｇのニュートロカイン−αの投与は、約８００μｇ／ｍｌ、約７００μｇ／ｍｌ、約４００μｇ／ｍｌ、約２００μｇ／ｍｌおよび約２００μｇ／ｍｌの血清のＩｇＡ力価を生じた。すなわち、４日間にわたる８、２、０．８、０．０８ｍｇ／ｋｇのニュートロカイン−αの投与は、それぞれ、緩衝液のみの投与により観察したバックグラウンドまたは基底レベルに対して約４倍、３．７５倍、２倍および最小倍のＩｇＡ血清レベルにおける増加を生じた。代替的な実施形態では、これらの実験は、０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の任意の量のｒニュートロカイン−αを用いて実施され得る。好ましい実施形態では、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ（この実施形態における特に好ましい例示的な投与量としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．１ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．３ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、２．６ｍｇ／ｋｇ、２．７ｍｇ／ｋｇ、２．８ｍｇ／ｋｇ、２．９ｍｇ／ｋｇおよび３．０ｍｇ／ｋｇ）の範囲のニュートロカイン−αを投与する。さらに好ましい実施形態では、０．０２ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇ（この実施形態における特に好ましい例示的な投与量としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇおよび２．０ｍｇ／ｋｇ）の範囲のニュートロカイン−αを投与する。
【０８５６】
本明細書中に提示されるデータは、ニュートロカイン−αを、インビボおよびインビトロでＢ細胞増殖および分化の両方を誘導するＴＮＦ−リガンドスーパーファミリーの新規メンバーとして規定する。ニュートロカイン−αは、他のＢ細胞増殖因子または分化因子（例えば、ＩＬ２（Ｍｅｔｚｇｅｒ，Ｄ．Ｗ．ら．，Ｒｅｓ．ｌｍｍｕｎｏｌ．１４６：４９９−５０５（１９９５））、ＩＬ４（Ａｒｍｉｔａｇｅ，Ｒ．Ｊ．ら．，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２９２：１２１−３０（１９９１）；Ｙｏｋｏｔａ，Ｔ．ら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：５８９４−９８（１９８６））、ＩＬ５（Ｔａｋａｔｓｕ，Ｋ．ら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：４２３４−３８（１９８７）；Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ，Ｊ．Ｎ．ら．，Ｅｕｒ．Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ．２３：３９８−４０２（１９９３））、ＩＬ６（Ｐｏｕｐａｒｔ，Ｐ．ら．，ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１２１９−２４（１９８７）；Ｈｉｒａｎｏ，Ｔ．ら．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：７３−７６（１９８６））、ＩＬ７（Ｇｏｏｄｗｉｎ，Ｒ．Ｇ．ら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：３０２−０６（１９８９）；Ｎａｍｅｎ，Ａ．Ｅ．ら．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３３：５７１−７３（１９８８））、ＩＬ１３（Ｐｕｎｎｏｎｅｎ，Ｊ．ら．，Ａｌｌｅｒｇｙ．４９：５７６−８６（１９９４））、ＩＬ１５（Ａｒｍｉｔａｇｅ，Ｒ．Ｊ．ら．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：４８３−９０（１９９５））、ＣＤ４０Ｌ（Ａｒｍｉｔａｇｅ，Ｒ．Ｊ．ら．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：８０−８２（１９９２）；Ｖａｎ  Ｋｏｏｔｅｎ，Ｃ．およびＢａｎｃｈｅｒｅａｕ，Ｊ．Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ．ｌｍｍｕｎｏｌ．１１３：３９３−９９（１９９７））またはＣＤ２７Ｌ（ＣＤ７０）（Ｏｓｈｉｍａ，Ｈ．ら．，Ｉｎｔ．ｌｍｍｕｎｏｌ．１０：５１７−２６（１９９８）；Ｌｅｎｓ，Ｓ．Ｍ．ら．，Ｓｅｍｉｎ．ｌｍｍｕｎｏｌ．１０：４９１−９９（１９９８）））とは、単球特異的な遺伝子／タンパク質発現パターンならびにその特異的なレセプター分布およびＢリンパ球に対する生物学的活性により区別される。まとめると、これらのデータは、ニュートロカイン−αがＢ細胞と単球またはそれらの分化した子孫との間のシグナルの交換に関与するようであることを示唆する。全てのＢ細胞は、このシグナル伝達の様式を利用し得るが、制限された発現パターンおよびＩｇ分泌は、ＣＤ５+または「非従来的な」Ｂ細胞応答の活性化におけるニュートロカイン−αの役割を示唆する。これらのＢ細胞は、重要な成分を固有の免疫系に提供し、そして多反応性（ｐｏｌｙｒｅａｃｔｉｖｅ）ＩｇＭおよびＩｇＡ抗体の分泌を介して周囲の病原体からの保護を提供する（Ｐｅｎｎｅｌｌ，Ｃ．Ａ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ．１９：１２８９−９５（１９８９）；Ｈａｙａｋａｗａ，Ｋ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：２４９４−９８（１９８４））。あるいは、ニュートロカイン−αは、Ｔ細胞依存性抗原活性化におけるＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌの調節因子に類似の様式でＴ細胞依存性応答の調節因子として機能し得る（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｅｒｔｗｅｇｈ，Ａ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：１５５５−６５（１９９３）；Ｇｒａｂｓｔｅｉｎ，Ｋ．Ｈ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：３１４１−４７（１９９３））。ニュートロカイン−αに関して、そのレセプターまたは関連するアンタゴニストは、自己免疫、新生物および／または免疫不全症候群に関連するＢ細胞の障害の処置における有用性を有する。
【０８５７】
（方法）
（マウス）ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣＲ（６〜８週齢）を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から購入し、そして推薦される標準（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃａｒｅ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｉｍａｌｓ（１９９９））に従って、再生紙を敷いたマイクロアイソレーターケージ中で維持し（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、そしてペレット化したげっ歯類の食餌（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．）を与え、そして適宜飲用水をボトルに与えた。この研究で使用された動物プロトコールは、ＨＧＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより検閲されかつ認可された。
【０８５８】
（全長ニュートロカイン−α  ｃＤＮＡの単離）ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、ＴＮＦファミリーのレセプター結合ドメインに対する相同性を有する配列についてＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースを検索した。全長ニュートロカイン−αクローンを、同定し、配列決定し、そしてＧｅｎＢａｎｋ（登録番号ＡＦ１３２６００）に提出した。ニュートロカイン−αオープンリーディングフレームを、推定開始コドンでアニーリングする５’プライマー（５’−ＣＡＧ  ＡＣＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＴＣＣ  ＡＣＡ  ＧＡＡ  ＡＧ−３’）および推定された下流の終止コドンでアニーリングするように設計した３’プライマー（５’−ＣＡＧ  ＡＣＴ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＧＴＣ  ＣＴＧ  ＣＧＴ  ＧＣＡ  ＣＴＡ  ＣＡＴ  ＧＧＣ−３’）を使用してＰＣＲ増幅した。得られた単位複製配列をＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８制限部位を末端に有し、そして哺乳動物発現ベクターへサブクローニングした。ニュートロカイン−αをまた、ｐ−ＣＭＶ−１（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で発現した。
【０８５９】
（組換えヒトニュートロカイン−αの精製）ニュートロカイン−αをコードする全長ｃＤＮＡを、バキュロウイルス発現ベクターｐＡ２にサブクローニングし、そしてＳｆ９昆虫細胞へトランスフェクトした（Ｐａｔｅｌ，Ｖ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１１６３−７２（１９９７））。組換えニュートロカイン−αを、陰イオン交換カラム、サイズ排除カラムおよび疎水性相互作用カラムの組み合わせを使用して、感染の９２時間後に細胞上清から精製した。精製したタンパク質を０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＯＡｃを含む緩衝液（ｐＨ６）中に処方し、濾過滅菌し、そして必要とされるまで４℃で保存した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣ分析の両方は、ｒニュートロカイン−αが９５％より高い純度であることを示した。エンドトキシンレベルは、ＬＡＬアッセイ（Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ，Ｆａｌｍｏｕｔｈ，ＭＡの提携）における検出限界未満であった。最終的に精製されたニュートロカイン−αタンパク質は、Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＰｒｏのＮ末端配列を有する。これはは、全長ニュートロカイン−α遺伝子で安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株由来の可溶性ニュートロカイン−αの配列と完全に一致する。
【０８６０】
モノクローナル抗体産生。ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣＲマウスを、完全なＦｒｅｕｎｄのアジュバント中に懸濁された５０μｇのＨｉｓＴａｇニュートロカイン−αで免疫し、続いて不完全なＦｒｅｕｎｄのアジュバントで２回チャレンジした。ハイブリドーマおよびモノクーナル抗体を（Ｇｅｆｔｅｒ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｓｏｍａｔｉｃ．Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．３：２３１−３６（１９７７）；Ａｋｅｒｓｔｒｏｍ，Ｂ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：２５８９−９２（１９８５））に記載されるように調製した。
【０８６１】
細胞株。すべてのヒト細胞株を、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）より購入した。
【０８６２】
ＦＡＣＳ分析。ニュートロカイン−αの発現を、ヒト細胞株（新たに単離された正常末梢血有核細胞）、およびインビトロで培養された単球において評価した。マウス抗ヒトニュートロカイン−α  Ａｂ  ２Ｅ５（ＩｇＧ１）、続いてマウスＩｇＧ（ＣＡＬＴＡＧ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）に対するＰＥ結合Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗体を用いて使用した。死んだ細胞を除外するためにヨウ化プロピジウムを用いたＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して細胞を分析した。ニュートロカイン−αの結合を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）でのｒニュートロカイン−αビオチン化を使用して評価し、続いてＰＥ結合ストレプトアビジン（Ｄａｋｏ  Ｃｏｒｐ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して評価した。
【０８６３】
染色体マッピング。ニュートロカイン−α遺伝子の染色体位置を決定するために、個々の染色体を保持するモノ染色体体細胞ハイブリッドのパネル（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｎａｄａ）を、ニュートロカイン−α特異的プライマー（５’プライマー：５’−ＴＧＧＴＧＴＣＴＴＴＣＴＡＣＣＡＧＧＴＧＧ−３’および３’プライマー：５’−ＴＴＴＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＣＴＧＡＡＣＧＧ−３’）を使用するＰＣＲによってスクリーニングした。予期された２３３ｂｐのＰＣＲ産物をヒト第１３染色体ハイブリッドにおいてのみ検出した。８３の放射ハイブリッドのパネル（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびＳｔａｎｆｏｒｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｄａｔａｂａｓｅ，（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｈｇｃ．ｓｔａｎｄｏｒｄ．ｅｄｕ．ＲＨ／ｒｈｓｅｒｖｅｒ）を使用。第１３染色体上のＳＨＧＣ−３６１７１マーカーに連結したニュートロカイン−αを見出した。このマップを、ヒト第１３染色体の細胞遺伝学マップに重ねることは、染色体上のバンド１３ｑ３４に対するヒトニュートロカイン−αの同定を可能にした。
【０８６４】
Ｂリンパ球の増殖アッセイ。ヒト扁桃Ｂ細胞を、ＣＤ３陽性細胞の磁性ビーズ（ＭＡＣＳ）の減少によって精製した。得られる細胞集団は、ＣＤ１９およびＣＤ２０の発現によって評価された９５％Ｂ細胞より慣習的に高かった。ヒトｒニュートロカイン−αまたはコントロールタンパク質組み替えヒトＩＬ２の種々の希釈物を、９６ウェルプレートの個々のウェルに置いた。そのウェルに、培養培地（１０％ＦＢＳ、５×１０-5Ｍ  ２ＭＥ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１０-5希釈のパンソルビン（Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ）（ＳＡＣ）または抗ＩｇＭを含むＲＰＭＩ  １６４０））に懸濁された１０5のＢ細胞を１５０μｌの合計量で添加した。因子の添加７２時間後に始まる、増殖を、3Ｈチミジン（６．７Ｃｉ／ｍＭ）の２０時間のパルス（１μＣｉ／ウェル）によって定量した。
【０８６５】
組織学的分析。脾臓を、１０％の中性緩衝化されたホルマリンに固定し、パラフィンに包理し、５μｍで切片化し、ガラススライド上にマウントし、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで染色するか、またはＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）について酵素標識された直接法免疫組織化学によって染色した（Ｈｉｌｂｅｒｔ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：２４１２〜１８（１９９３））。
【０８６６】
（表Ｖ．ニュートロカイン−αの細胞表面の発現）
細胞株          細胞形態学                          ニュートロカイン−αの
細胞表面の発現      単球系統
Ｕ−９３７      リンパ腫、組織球性／マクロファージ                  ＋
ＢＬ−６０      白血病、急性前骨髄球性                              ＋
（ａｃｕｔｅｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ）
Ｋ−５６２      白血病、慢性骨髄形成                                ＋
（ｃｈｒｏｎｌｃｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）
ＴＨＰ−１      白血病、急性単球                                    ＋
（ａｃｕｔｅｍｏｎｏｃｙｔｉｃ）                Ｔ系統
ジャーカット    白血病、Ｔリンパ球                                  −
ＳＵＰ−Ｔ１３  白血病、Ｔリンパ球                                  −
ＭＯＬＴ−４    白血病、Ｔリンパ球                                  −  Ｂ系統
Ｄａｕｄｉ      バーキット、リンパ芽球                              −
Ｎａｍａｌｗａ  バーキット、リンパ球                                −
Ｒａｊｉ        バーキット、リンパ球                                −
Ｒｅｈ          白血病、リンパ球                                    −
ＡＲＨ−７７    白血病、プラズマ細胞                                −
ＩＭ９          骨髄腫                                              −
ＲＰＭＩ８２２６  骨髄腫                                          −
（実施例７：Ｂ細胞の増殖および分化の刺激または阻害を検出するためのアッセイ）
機能的体液性免疫応答の産生は、Ｂ系統細胞とその微小環境の間の可溶性および同族のシグナル伝達の両方を必要とする。シグナルは、Ｂ系統細胞がそのプログラムされた発達を続けることを可能にする陽性の刺激、または細胞がその現在の発達経路を阻止することを可能にする陰性の刺激を与え得る。現在まで、Ｂ細胞応答性に影響する多数の刺激および阻害シグナルが見出され、それらは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ−７、ＩＬ１０、ＩＬ−１３、ＩＬ１４およびＩＬ１５を含む。興味深いことに、これらのシグナルは、それ自体、弱いエフェクターであるが、種々の共刺激タンパク質と組み合わされて、Ｂ細胞の集団において活性化、増殖、分化、ホーミング、耐性および死を誘導し得る。
Ｂ細胞共刺激タンパク質の最もよく研究されたクラスの１つは、ＴＮＦスーパーファミリーである。それぞれのリガンド、ＣＤ１５４、ＣＤ７０およびＣＤ１５３に従って、このファミリーに含まれるＣＤ４０、ＣＤ２７およびＣＤ３０は、種々の免疫応答を制御することが見出された。これらＢ細胞の集団およびその前駆体の増殖および分化の検出および／または観察を可能にするアッセイは、増殖および分化の点で、これらのＢ細胞の集団に対して種々のタンパク質が有し得る影響を決定する際に有用なツールである。以下に列挙されるのは、Ｂ細胞の集団およびその前駆体の分化、増殖、または阻害の検出が可能であるように設計された２つのアッセイである。
【０８６７】
インビトロアッセイ。精製されたニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶタンパク質または、その切断された形態を、Ｂ細胞の集団およびその前駆体における活性化、増殖、分化または阻害および／または死を誘導するその能力について評価する。０．１〜１０，０００ｎｇ／ｍＬの用量範囲にわたって定量的に測定された、精製ヒト扁桃Ｂ細胞におけるニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶタンパク質の活性を、標準Ｂリンパ球共刺激アッセイにおいて評価した。このアッセイにおいて、精製扁桃Ｂ細胞を、１次因子としてホルマリン固定Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ
Ｃｏｗａｎ  Ｉ（ＳＡＣ）または固定化抗ヒトＩｇＭ抗体のいずれかの存在下で培養する。第２のシグナル（例えば、ＩＬ−２およびＩＬ−５）は、トリチウム化したチミジンの取り込みによって測定されるＢ細胞の増殖を誘発するためにＳＡＣおよびＩｇＭ架橋を与える。新規のシナジー因子は、このアッセイを使用して容易に同定され得る。このアッセイは、ＣＤ３陽性細胞の磁気性ビーズ（ＭＡＣＳ）の損失によってヒト扁桃Ｂ細胞を単離することを含む。得られる細胞集団は、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）の発現によって評価された９５％のＢ細胞より多い。各サンプルの種々の希釈剤を、１５０μｌの総量で培養培地（１０％ＦＢＳ、５×１０-5Ｍ  ２ＭＥ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１０-5のＳＡＣの希釈剤を含むＲＰＭＩ１６４０）に懸濁された１０5Ｂ細胞が添加される９６ウェルプレートの個々のウェルに配置する。増殖または阻害は、因子の添加、７２時間後に開始する3Ｈチミジン（６．７Ｃｉ／ｍＭ）での２０時間のパルス（１ｕＣｉ／ウェル）によって定量化される。陽性および陰性コントロールは、それぞれＩＬ２および培地である。
【０８６８】
アゴニスト（ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドフラグメントが挙げられる）は、同じ数のＢ細胞の増殖が、同じ濃度の刺激因子に接触された場合に観察される増殖と比較した場合、増加したＢ細胞の増殖を実証する。本発明に従うアンタゴニストは、同じ数のＢ細胞、同じ濃度の刺激因子、および同じ濃度の可溶性形態のニュートロカイン−α（アゴニストの非存在下でＢ細胞の増殖活性における増加を誘発する（例えば、配列番号２に示されるニュートロカイン−αポリペプチドの７１〜２８５、８１〜２８５、１１２〜２８５、または１３４〜２８５））を含むコントロールに比較した場合、減少したＢ細胞の増殖を示す。
【０８６９】
インビボアッセイ。ＢＡＬＢ／ｃマウスに緩衝液のみか、または２ｍｇ／Ｋｇのニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶタンパク質、またはその切断形態を、１日に２度、（腹腔内）注射した。連続して４日間、この処置を受けたマウスを４日目に屠殺し、種々の組織および血清を分析のために収集する。正常脾臓およびニュートロカイン−α処理した脾臓および／またはニュートロカイン−αＳＶタンパク質処理した脾臓由来のＨ＆Ｍの比較は、脾臓細胞におけるニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶタンパク質（例えば、動脈周囲（ｐｅｒｉ−ａｒｔｅｒｉａｌ）リンパ鞘の拡散）の活性の結果、および／または有核細胞性の赤色脾髄領域（Ｂ細胞の集団の分化および増殖の活性化を示し得る）における有意な増加を同定する。Ｂ細胞マーカー、抗ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）を使用する免疫組織学的研究は、脾臓細胞の任意の生理的な変化（例えば、脾臓組織崩壊）は、確立されたＴ細胞の領域を浸潤する大まかに定義されたＢ細胞の区域で増加されたＢ細胞の提示に起因するか否かを決定するために使用される。
【０８７０】
ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶタンパク質処理されたマウス由来の脾臓のフローサイトメトリー分析は、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶタンパク質が、コントロールマウスにおいて観察される割合においてＴｈＢ＋、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）ｄｕｌｌ  Ｂ細胞の割合を特異的に増加するか否かを示すために使用される。
【０８７１】
同様に、インビボにおいて増加した成熟Ｂ細胞の提示の予期された結果は、血清Ｉｇタイターにおいて相対的に増加した。従って、血清ＩｇＭおよびＩｇＡのレベルは、緩衝液とニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶタンパク質処置マウスの間で比較される。
【０８７２】
（実施例８：マウスのリンパ萎縮症および発育不全に関連する対宿主性移植片病の処置におけるニュートロカイン−αおよびそのアゴニストの効果）
対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）に関連するリンパ萎縮症／発育不全の処置、予防、および／または診断のためのニュートロカイン−α使用の分析を、（ＢＡＬＢ／ｃ  Ｘ  Ｃ５７ＢＬ／６）Ｆ１（ＣＢＦ１）マウスモデルへのＣ５７ＢＬ／６親の使用を介して行う。Ｆ１マウスモデルへの、この親はよく特徴付けられており、そして骨髄移植患者における生殖可能なＧＶＨＤの動物モデルである。この親は、当業者には周知である（例えば、Ｇｌｅｉｃｈｅｍａｎｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ５：３２４，１９８４）。可溶性ニュートロカイン−αは、Ｂリンパ球の増殖および分化を誘導し、そしてＧＶＨＤのこの動物モデルにおいて観察されるリンパ萎縮症および発育不全を矯正すると予期される（Ｐｉｇｕｅｔ，ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１２８０（１９８７）；Ｈａｔｔｏｒｉ，ら、Ｂｌｏｏｄ  ９０：５４２（１９９７））。
【０８７３】
ＧＶＨＤ条件の開始は、（ＢＡＬＢ／ｃ  Ｘ  Ｃ５７ＢＬ／６）Ｆ１マウスへのＣ５７ＢＬ／６マウス由来の約１〜５×１０8の脾臓細胞の静脈内注射によって誘導される（両方は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅより入手可能である）。６〜８匹のマウスの群は、０．１〜５．０ｍｇ／ｋｇのニュートロカイン−αまたは緩衝液コントロールのいずれかを、腹腔内、筋内または皮内に毎日受ける。それは親細胞の注入の後、リンパ萎縮症および発育不全が軽症（約５日）、中程度（約１２日）、または重症（約２０日）である日より始まる。リンパ萎縮症および脾臓の発育不全におけるニュートロカイン−αの効果は、１０〜３０日の間の複数の時点（３〜４）でＦＡＣＳおよび組織病理学よって分析される。簡単には、脾細胞は、正常ＣＢＦ１、ＧＶＨＤ、またはニュートロカイン−α処理されたマウスより調製され、そしてフルオレセインフィコエリトリン結合抗Ｈ−２Ｋｂ、ビオチン結合抗Ｈ−２Ｋｄ、およびＦＩＴＣ結合抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、または抗Ｂ２２０、続いてＣｙＣｈｒｏｍｅ結合アビジンで染色される。これらの結合抗体のすべては、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）より購入され得る。次いで細胞をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で分析する。受容者およびドナーのリンパ球を、それぞれＨ−２Ｋｂ＋Ｋｄ＋およびＨ−２Ｋｂ＋Ｋｄ−細胞として同定する。受容者またはドナー起源のＣＤ＋４Ｔ、ＣＤ８＋ＴおよびＢ２２０＋Ｂ細胞の細胞数は、回復された脾細胞の総数から計算し、そして各々の亜集団の百分率は、３色分析によって決定される。他のＧＶＨＤ関連器官（肝臓、皮膚、および腸）組織損傷の相対的な程度の組織学的評価は、動物を屠殺した後、行われ得る。
【０８７４】
最後に、ニュートロカイン−αおよび緩衝処理された動物は、悪液質、体重、および死亡率を評価するために１日おきに臨床的評価を受ける。
【０８７５】
ニュートロカイン−αアゴニストおよびアンタゴニストは、この急性ＧＶＨＤマウスモデルにおいて試験され得る。
【０８７６】
（実施例９．ｓｃＦｖｓのライブラリー由来のニュートロカイン−αポリペプチドに対する抗体フラグメントの単離）
ヒトＰＢＬから単離された天然に生じるＶ遺伝子は、抗体フラグメントの大きなライブラリー内に構築された。この抗体フラグメントは、ドナーが曝露されても、されなくてもよいニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶに対する反応性を含む（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される米国特許第５，８８５，７９３を参照のこと）。
【０８７７】
（ライブラリーのレスキュー）
ｓｃＦｖｓのライブラリーは、ＷＯ９２／０１０４７（本明細書中にその全体が参考として援用される）に記載されるヒトＰＢＬのＲＮＡより構築される。ファージディスプレイ抗体フラグメントをレスキューするために、ファージミドを含む約１０9のＥ．ｃｏｌｉを使用して、１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリン（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）を含む５０ｍｌの２×ＴＹに播種し、振とうしながら０．８のＯ．Ｄ．まで増殖させる。５ｍｌのこの培地を使用して、５０ｍｌの２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵに播種し、２×１０8ＴＵのΔ遺伝子３ヘルパー（Ｍ３Δ遺伝子ＩＩＩ、ＷＯ９２／０１０４７を参照のこと）を添加し、そして培養物を３７℃で４５分間、振とうしないで培養し、次いで３７℃で４５分間振とうしながら培養する。培養物を、４０００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間遠心分離し、そしてペレットを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２リットルの２×ＴＹに再懸濁し、一晩増殖させる。ＷＯ９２／０１０４７に記載されるようにファージを調製した。
【０８７８】
Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩを以下のように調製する：Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩヘルパーファージは、遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードせず、それ故、抗体フラグメントを示すファージ（ミド）は、抗体への結合のより大きな結合活性を有する。感染性Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ粒子を、ファージ形態形成の間、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質を供給するｐＵＣ１９誘導体を有する細胞内にヘルパーファージを増殖させることによって作製する。培養物を、１時間３７℃で振とうしないで培養し、次いでさらに１時間３７で振とうして培養する。細胞をスピンダウン（ＩＥＣ−Ｃｅｎｔｒａ８，４００回転／分で１０分）し、１００μｇアンピシリン／ｍｌ、および２５μｇカナマイシン／ｍｌの両方を含む３００ｍｌの２×ＴＹ（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＫＡＮ）に再懸濁し、３７℃で振とうしながら一晩培養する。ファージ粒子を、２回のＰＥＧ沈澱によって培養培地より精製し、そして濃縮し（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０）、２ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、そして０．４５μｍフィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ  ＮＭＬ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通過させ、約１０13形質転換ｕｎｉｔ／ｍｌの最終濃度（アンピシリン耐性クローン）を得る。
【０８７９】
（ライブラリーパニング）
Ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅｓ（Ｎｕｎｃ）を、本発明のポリペプチドの１００μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌのいずれかの４ｍｌを用いてＰＢＳ中で一晩被膜する。チューブを２％Ｍａｒｖｅｌ−ＰＢＳを用いて３７℃で２時間ブロックし、次いでＰＢＳ中で３回洗浄する。約１０13ＴＵのファージをチューブに適用し、そして、回転盤で上下に傾けながら室温で３０分間インキュベートし、次いでさらに１．５時間静置しておく。チューブをＰＢＳ０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で１０回、そしてＰＢＳで１０回洗浄する。１ｍｌの１００ｍＭトリエチルアミンを添加し、そして回転盤上で１５分間上下に回転させることによりファージを溶出し、その後この溶液を０．５ｍｌの１．０Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４で直ちに中和する。次いで、溶出したファージを細菌とともに３７℃で３０分間インキュベートすることにより、ファージを用いて、１０ｍｌの対数増殖中期のＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１に感染させる。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉを１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＴＹＥプレート上にプレートする。次いで、得られる細菌ライブラリーを、上記のようにΔ遺伝子３ヘルパーファージでレスキューし、次の回の選択のためのファージを調製する。次いで、このプロセスを、アフィニティー精製の全４回について反復し、３回目および４回目にはチューブ洗浄をＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で２０倍、そしてＰＢＳで２０倍に増加する。
【０８８０】
（結合剤の特徴付け）
第３回目および４回目の選択から溶出したファージを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ  ２１５１を感染させ、そして可溶性ｓｃＦｖをアッセイのために単一コロニーから生成する（Ｍａｒｋｓら、１９９１）。５０ｍＭ炭酸水素塩、ｐＨ９．６中の本発明のポリペプチドの１０ピコグラム／ｍｌのいずれかで被膜したマイクロタイタープレートを用いてＥＬＩＳＡを実行する。ＥＬＩＳＡ中の陽性クローンをＰＣＲフィンガープリンティング（例えば、ＷＯ９２／０１０４７を参照のこと）、次に配列決定することによりさらに特徴付ける。
【０８８１】
（実施例１０．抗ニュートロカイン−αモノクローナル抗体でのニュートロカイン−α／ニュートロカイン−αレセプター相互作用の中和）
以下の方法に従ってニュートロカイン−αタンパク質に対するモノクローナル抗体を産生した。簡単には、マウスに、１００μｌの完全Ｆｒｅｕｎｄｓアジュバント中に乳化された１００μｌのＰＢＳにおいて、実施例２の方法によって生成される５０μｇのＨｉｓタグ化ニュートロカイン−αタンパク質の皮下注射を行った（背側の前面部分）。不完全Ｆｒｅｕｎｄｓアジュバントにおける２５μｇのニュートロカイン−αの３回のさらなる皮下注射を２週間の間隔で与えた。この動物を１ヶ月間休ませ、その後この動物は、ＰＢＳ中の２５μｇのニュートロカイン−αの最後の腹腔内ブーストを受けた。４日後、マウスを屠殺し、そして融合のために脾細胞を摘出した。
【０８８２】
「融合」のプロセスは、１つの脾臓由来の脾細胞を融合させることによって達成され、上記の方法の製造者による改変に従い、ＰＥＧ１５００（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｔｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用する２×１０Ｅ７  Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３プラズマ細胞腫細胞を用いた。（Ｇｅｇｔｅｒ，Ｍ．Ｌ．らＳｏｎａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ  ３：２３１〜３６（１９７７）；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ＰＥＧ  １５００（カタログ番号７８３６４１）製品に関する文書を参照のこと。）
融合後、細胞を、２０％ＦＢＳおよび４％Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）補充した４００ｍｌのＨＡＴ培地に再懸濁し、９６ウェルプレートに、ウエルあたり２００μｌの密度で分散した。融合後７日で、１００μｌの培地を吸引し、そして１００μｌの新鮮な培地で置換した。融合後１４日で、ハイブリドーマを抗体産生のためにスクリーニングした。
【０８８３】
ハイブリドーマ上清を、ＥＬＩＳＡによってプレートに固定化されたニュートロカイン−αタンパク質の結合についてスクリーニングした。１ｍｌあたり２μｇの濃度で、ウェルあたり１００μｌのニュートロカイン−α（ＰＢＳ中）の一晩の培養によってニュートロカイン−αで、プレートをコーティングした。ＰＢＳで１：１０に希釈したハイブリドーマ上清を、ニュートロカイン−αでコーティングされたプレートの個々のウェルに置き、そして４℃で一晩培養した。次の日に、プレートを、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、抗マウスＩｇＧ  ＡＢＣ系（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して発達させる。色の発達反応を、２５ｍｌ／ウェルの２Ｍ  Ｈ2ＳＯ4の添加を用いて停止させた。次いでそのプレートを４５０ｎｍで読んだ。
【０８８４】
ハイブリドーマ上清を、Ｉｓｏｓｔｒｉｐｓを用いてＩｇアイソタイプについて調べた。クローニングを、ＨＴ培地の限界希釈の方法によって行った。０．９ｍｌのＨＢＳＳ中の約３×１０Ｅ６の細胞は、プリスタンで初回刺激されたマウスに注射された。７〜９日後、１９ｇ針を使用して腹水を収集した。すべての抗体を、Ａｃｔａ  ＦＰＬＣシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用するタンパク質Ｇアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
【０８８５】
第１および第２の連続する腹腔内注射の後、３匹のマウスのすべては、強い免疫応答を発達した；ニュートロカイン−αでコーティングされたプレートにおけるＥＬＩＳＡによって評価された血清タイターは、１０Ｅ−７であった。
【０８８６】
１つの実施形態において、陽性マウス由来の脾細胞を使用して、１０００以上の第１のハイブリドーマを生成した。それらの９１７を、抗ニュートロカイン−α抗体の産生のためにスクリーニングした。スクリーニングを、すべての陽性クローンを検出するために１：１希釈上清を使用して実行した。スクリーニングされた９１７のハイブリドーマの７６が、陽性であることが見出され、そしてそれらの１７が、ＩｇＧプロデューサーであると見出された。アフィニティー試験およびクローニングの後、それらの９を、さらなる拡大および精製のために選択した。
【０８８７】
精製されたモノクローナル抗体のすべては、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡの両方において異なる形態のニュートロカイン−α（Ｈｉｓタグ化およびバキュロウイルス系からのタンパク質生成を含む（実施例２参照のこと））に結合可能であった。９のクローンのうちの６はまた、ＴＨＰ−１細胞の表面上のニュートロカイン−αに結合可能であった。しかし、試験された抗体のどれもが、溶液からニュートロカイン−αを捕獲不可能であった。
【０８８８】
細胞表面上に発現されたニュートロカイン−αを認識するが、溶液中のニュートロカイン−αは認識しない、産生された高アフィニティー抗ニュートロカイン−αモノクローナル抗体は、インビボでの中和研究、およびインビトロでの単球ならびにＢ細胞のアッセイにおいて使用され得る。これらの抗体はまた、ウェスタンブロットにおけるニュートロカイン−α感受性の検出について有用である。
【０８８９】
独立した実験において、陽性マウス由来の脾細胞を使用して、１０００以上の第１ハイブリドーマを生成した。ついで第１のハイブリドーマの７２９を、抗ニュートロカイン−αの抗体の産生についてスクリーニングした。スクリーニングを、高アフィニティーのクローンのみを得るために１：１０の希釈上清を使用してストリンジェントな条件下で行った。スクリーニングされた７２９のハイブリドーマの２３は、陽性であり、１６のＩｇＭおよび７のＩｇＧプロデューサーを含んだ（後者の間で、４は強いＩｇＭバックグラウンドを得た）。この実験において、ＩｇＧ抗体のアイソタイプ分布は、ＩｇＧ２サブクラスに偏った。７のＩｇＧハイブリドーマの３は、ＩｇＧ２サブクラスの抗体を産生し、そして２は、ＩｇＧ２ｂサブクラスの抗体を産生し、一方で残りの２は、ＩｇＧ１プロデューサーであった。
【０８９０】
第２の実験において生成されたすべての陽性ハイブリドーマ由来の上清を、Ｂ細胞のニュートロカイン−α媒介性増殖を阻害する能力について試験した。第１のスクリーニング実験において、ＩｇＧ中和抗体を産生する２つのハイブリドーマが、検出された（これらは、抗体１６Ｃ９および１２Ｃ５であった）。さらなる実験において、ハイブリドーマ（すなわち、１６Ｃ９および１２Ｃ５）のＩｇＧ中和活性を確認し、そしてハイブリドーマ１５Ｃ１０および４Ａ６由来の２つのさらなる強い中和上清を同定した。
【０８９１】
３つのクローンを引き続いて、インビボで拡大し（１つのクローン（すなわち、１５Ｃ１０）はまたホローファイバー系で拡大した）、そして抗体をアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。３つのクローンすべては、ＴＨＰ−１細胞の表面上のニュートロカイン−αに結合可能であり、そして溶液よりニュートロカイン−αを結合（すなわち「捕獲」）可能であった。
【０８９２】
具体的には、抗体がニュートロカイン−α／ニュートロカイン−αレセプターの結合を中和するか否かを決定するために上記の第２の実験において記載される抗ニュートロカイン−αモノクローナル抗体を使用して実験を行った。簡単には、ニュートロカイン−αタンパク質を、ＥＺ結合Ｔ  ＮＨＳビオチン試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用してビオチン化した。次いでビオチン化ニュートロカイン−αを、ニュートロカイン−αに結合する細胞表面タンパク質を同定するために使用した。予備的な実験は、ニュートロカイン−αがＢリンパ球上のレセプターに結合することを実証した。
【０８９３】
上記の第２の実験において産生される抗ニュートロカイン−α抗体の封入は、ニュートロカイン−αレセプターへのニュートロカイン−αの結合を中和した。特定の実施形態において、抗ニュートロカイン−α抗体１５Ｃ１０は、ニュートロカイン−αのニュートロカイン−αレセプターへの結合を中和した。
【０８９４】
従って、上記の第２の実験において産生された抗ニュートロカイン−αモノクローナル抗体（特に、抗体１５Ｃ１０）は、膜結合ニュートロカイン−αタンパク質および可溶性ニュートロカイン−αタンパク質の両方を認識し、そして結合し、ならびにニュートロカイン−α／ニュートロカイン−αレセプターのインビトロでの結合を中和する。
【０８９５】
本発明が、上記説明および実施例に特に記載したものとは別のやり方で実施され得ることは明らかである。本発明の多くの改変および変更が、上記の教示に照らして可能であり、それゆえ添付の請求の範囲内にある。
【０８９６】
本明細書中で引用された全ての刊行物（特許、特許出願、雑誌文献、研究室マニュアル、本、または他の文献を含む）の開示が、本明細書中に参考として援用される。
【０８９７】
さらに、本明細書と共に提出された配列表、および同時係属出願の出願番号９０９／００５，８７４（１９９８年１月１２日提出）、ＵＳ６０／０３６，１００（１９９７年１月１４日提出）、およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１７９５７（１９９６年１０月２５日）において提出された配列表は、各々の場合コンピューターおよび紙の形式の両方で、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０８９８】
【表５】
2007277249.tif 000051
ＡＴＣＣ受託番号９７７６８。
【０８９９】
（カナダ）
出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料のサンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければならない。
【０９００】
（ノルウェー）
出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９０１】
（オーストラリア）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ  ａｄｄｒｅｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国特許法第３．２５（３）号規定）。
【０９０２】
（フィンランド）
出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。
【０９０３】
（英国）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。
【０９０４】
（デンマーク）
出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９０５】
（スウェーデン）
出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ  Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ  ＧｕｉｄｅのＶｏｌｕｍｅ  Ｉのａｎｎｅｘ  Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９０６】
（オランダ）
出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０９０７】
【表６】
2007277249.tif 000052
ＡＴＣＣ受託番号２０３５１８。
【０９０８】
（カナダ）
出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料のサンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければならない。
【０９０９】
（ノルウェー）
出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９１０】
（オーストラリア）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ  ａｄｄｒｅｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国特許法第３．２５（３）号規定）。
【０９１１】
（フィンランド）
出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。
【０９１２】
（英国）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。
【０９１３】
（デンマーク）
出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９１４】
（スウェーデン）
出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ  Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ  ＧｕｉｄｅのＶｏｌｕｍｅ  Ｉのａｎｎｅｘ  Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９１５】
（オランダ）
出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０９１６】
【表７】
2007277249.tif 000053
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１５８
（カナダ）
出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料のサンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければならない。
【０９１７】
（ノルウェー）
出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９１８】
（オーストラリア）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ  ａｄｄｒｅｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国特許法第３．２５（３）号規定）。
【０９１９】
（フィンランド）
出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。
【０９２０】
（英国）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。
【０９２１】
（デンマーク）
出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９２２】
（スウェーデン）
出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ  Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ  ＧｕｉｄｅのＶｏｌｕｍｅ  Ｉのａｎｎｅｘ  Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９２３】
（オランダ）
出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０９２４】
【表８】
2007277249.tif 000054
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１５９
（カナダ）
出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料のサンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければならない。
【０９２５】
（ノルウェー）
出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９２６】
（オーストラリア）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ  ａｄｄｒｅｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国特許法第３．２５（３）号規定）。
【０９２７】
（フィンランド）
出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。
【０９２８】
（英国）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。
【０９２９】
（デンマーク）
出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９３０】
（スウェーデン）
出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ  Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ  ＧｕｉｄｅのＶｏｌｕｍｅ  Ｉのａｎｎｅｘ  Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９３１】
（オランダ）
出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０９３２】
以下の図面は、本発明の実施形態の例示であり、特許請求の範囲に含まれる本発明の範囲を限定することを意味しない。
【図１Ａ】図１Ａは、ニュートロカイン−αのヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。アミノ酸１〜４６は、推定細胞内ドメインを、アミノ酸４７〜７２は推定膜貫通ドメイン（二重下線を引いた配列）を、およびアミノ酸７３〜２８５は推定細胞外ドメイン（残りの配列）を表す。潜在的なアスパラギン結合型グリコシル化部位は、図１Ａおよび１Ｂのニュートロカイン−αアミノ酸配列中のアスパラギンの記号（Ｎ）を太字にし、そしてニュートロカイン−αヌクレオチド配列中のアスパラギン残基をコードする最初のヌクレオチド上にボールドにしたポンド記号（＃）で印を付けている。潜在的なＮ結合型グリコシル化配列は、ニュートロカイン−αアミノ酸配列中の以下の位置で見出される：Ｎ１２４〜Ｑ１２７（Ｎ−１２４、Ｓ−１２５、Ｓ−１２６、Ｑ−１２７）およびＮ−２４２〜Ｃ−２４５（Ｎ−２４２、Ｎ−２４３、Ｓ−２４４、Ｃ−２４５）。  ニュートロカイン−αと、ニュートロカイン−αＳＶと、ＴＮＦ−αと、ＴＮＦ−βと、ＬＴ−βと、最も密接に関連したＦａｓリガンド（これらの配列の整列を図２に示す）との間の高い同一性の領域は、図１Ａおよび１Ｂにおいて下線を付している。これらの領域は、限定されず、そして図１Ａおよび１Ｂにおいて保存ドメイン（ＣＤ）−１、ＣＤ−ＩＩ、ＣＤ−ＩＩＩ、ＣＤ−ＩＶ、ＣＤ−Ｖ、ＣＤ−ＶＩ、ＣＤ−ＶＩＩ、ＣＤ−ＶＩＩＩ、ＣＤ−ＩＸ、ＣＤ−Ｘ、およびＣＤ−ＸＩとして表示されている。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ニュートロカイン−αのヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。アミノ酸１〜４６は、推定細胞内ドメインを、アミノ酸４７〜７２は推定膜貫通ドメイン（二重下線を引いた配列）を、およびアミノ酸７３〜２８５は推定細胞外ドメイン（残りの配列）を表す。潜在的なアスパラギン結合型グリコシル化部位は、図１Ａおよび１Ｂのニュートロカイン−αアミノ酸配列中のアスパラギンの記号（Ｎ）を太字にし、そしてニュートロカイン−αヌクレオチド配列中のアスパラギン残基をコードする最初のヌクレオチド上にボールドにしたポンド記号（＃）で印を付けている。潜在的なＮ結合型グリコシル化配列は、ニュートロカイン−αアミノ酸配列中の以下の位置で見出される：Ｎ１２４〜Ｑ１２７（Ｎ−１２４、Ｓ−１２５、Ｓ−１２６、Ｑ−１２７）およびＮ−２４２〜Ｃ−２４５（Ｎ−２４２、Ｎ−２４３、Ｓ−２４４、Ｃ−２４５）。  ニュートロカイン−αと、ニュートロカイン−αＳＶと、ＴＮＦ−αと、ＴＮＦ−βと、ＬＴ−βと、最も密接に関連したＦａｓリガンド（これらの配列の整列を図２に示す）との間の高い同一性の領域は、図１Ａおよび１Ｂにおいて下線を付している。これらの領域は、限定されず、そして図１Ａおよび１Ｂにおいて保存ドメイン（ＣＤ）−１、ＣＤ−ＩＩ、ＣＤ−ＩＩＩ、ＣＤ−ＩＶ、ＣＤ−Ｖ、ＣＤ−ＶＩ、ＣＤ−ＶＩＩ、ＣＤ−ＶＩＩＩ、ＣＤ−ＩＸ、ＣＤ−Ｘ、およびＣＤ−ＸＩとして表示されている。
【図２Ａ】図２Ａは、「ＭｅｇＡｌｉｇｎ」ルーチン（「ＤＮＡ＊Ｓｔａｒ」と呼ばれるコンピュータープログラムの部分である）により決定された、ニュートロカイン−α（配列番号２）およびニュートロカイン−αＳＶ（配列番号１９）、ならびにＴＮＦ−α（図２Ａおよび２Ｂ中の「ＴＮＦα」；ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｚ１５０２６；配列番号３）、ＴＮＦ−β（図２Ａおよび２Ｂ中の「ＴＮＦβ」；ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｚ１５０２６；配列番号４）、リンホトキシン−β（図２Ａおよび２Ｂ中の「ＬＴβ」；ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｌ１１０１６；配列番号５）およびＦＡＳリガンド（図２Ａおよび２Ｂ中の「ＦＡＳＬ」；ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｕ１１８２１；配列番号６）のアミノ酸配列間の同一性の領域を示す。コンセンサスと適合する残基には、影を付けている。
【図２Ｂ】図２Ｂは、「ＭｅｇＡｌｉｇｎ」ルーチン（「ＤＮＡ＊Ｓｔａｒ」と呼ばれるコンピュータープログラムの部分である）により決定された、ニュートロカイン−α（配列番号２）およびニュートロカイン−αＳＶ（配列番号１９）、ならびにＴＮＦ−α（図２Ａおよび２Ｂ中の「ＴＮＦα」；ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｚ１５０２６；配列番号３）、ＴＮＦ−β（図２Ａおよび２Ｂ中の「ＴＮＦβ」；ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｚ１５０２６；配列番号４）、リンホトキシン−β（図２Ａおよび２Ｂ中の「ＬＴβ」；ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｌ１１０１６；配列番号５）およびＦＡＳリガンド（図２Ａおよび２Ｂ中の「ＦＡＳＬ」；ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｕ１１８２１；配列番号６）のアミノ酸配列間の同一性の領域を示す。コンセンサスと適合する残基には、影を付けている。
【図３】図３は、ニュートロカインαアミノ酸配列の分析を示す。記載されたコンピュータープログラムのデフォルトパラメーターを用いて配列番号２のアミノ酸配列について予測される、α、β、ターンおよびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指標および表面確率を示す。「抗原性指標−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」グラフは、ニュートロカインαの高度に抗原性の領域の位置、すなわち、本発明のエピトープ保有ペプチドが得られ得る領域を示す。抗原性ポリペプチドとしては、配列番号２のアミノ酸配列の約Ｐｈｅ−１１５〜約Ｌｅｕ−１４７、約Ｉｌｅ−１５０〜約Ｔｙｒ−１６３、約Ｓｅｒ−１７１〜約Ｐｈｅ−１９４、約Ｇｌｕ−２２３〜約Ｔｙｒ−２４６、および約Ｓｅｒ−２７１〜約Ｐｈｅ−２７８が挙げられる。  図３に示されるデータはまた、表形態で表１に示される。この列には、「残基」、「位置」、およびローマ数字でＩ〜ＸＩＶと表示している。この列の見出しは、図３および表１に示されるアミノ酸配列の以下の特徴をいう：「残基」：配列番号２ならびに図１Ａおよび１Ｂのアミノ酸残基；「位置」：配列番号２ならびに図１Ａおよび１Ｂ内の対応する残基の位置；Ｉ：α領域−Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ；ＩＩ：α領域−Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ；ＩＩＩ：β領域−Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ；ＩＶ：β領域−Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ；Ｖ：ターン領域−Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ；ＶＩ：ターン領域−Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ；ＶＩＩ：コイル領域−Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ；ＶＩＩＩ：親水性プロット−Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ；ＩＸ：疎水性プロット−Ｈｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓ；Ｘ：α両親媒性領域−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ；ＸＩ：β両親媒性領域−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ；ＸＩＩ：可撓性領域−Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ；ＸＩＩＩ：抗原性指標−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ；およびＸＩＶ：表面確率プロット−Ｅｍｉｎｉ。
【図４Ａ】図４Ａは、ＡＴＣＣ番号９７７６８で寄託されたヒトｃＤＮＡから決定されたニュートロカイン−αヌクレオチド配列と、ＨＳＯＡＤ５５（配列番号７）、ＨＳＬＡＨ８４（配列番号８）およびＨＬＴＢＭ０８（配列番号９）と指定された本発明の関連ヒトｃＤＮＡクローンとの整列を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＡＴＣＣ番号９７７６８で寄託されたヒトｃＤＮＡから決定されたニュートロカイン−αヌクレオチド配列と、ＨＳＯＡＤ５５（配列番号７）、ＨＳＬＡＨ８４（配列番号８）およびＨＬＴＢＭ０８（配列番号９）と指定された本発明の関連ヒトｃＤＮＡクローンとの整列を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＡＴＣＣ番号９７７６８で寄託されたヒトｃＤＮＡから決定されたニュートロカイン−αヌクレオチド配列と、ＨＳＯＡＤ５５（配列番号７）、ＨＳＬＡＨ８４（配列番号８）およびＨＬＴＢＭ０８（配列番号９）と指定された本発明の関連ヒトｃＤＮＡクローンとの整列を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、ニュートロカイン−αＳＶタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号１８）および推定アミノ酸配列（配列番号１９）を示す。アミノ酸１〜４６は推定細胞内ドメインを、アミノ酸４７〜７２は推定膜貫通ドメイン（二重下線を引いた配列）を、およびアミノ酸７３〜２６６は推定細胞外ドメイン（残りの配列）を表す。潜在的なアスパラギン結合型グリコシル化部位は、図５Ａおよび５Ｂのニュートロカイン−αＳＶアミノ酸配列中のアスパラギンの記号（Ｎ）を太字にし、そしてニュートロカイン−αＳＶヌクレオチド配列中のアスパラギン残基をコードする最初のヌクレオチド上にボールドにしたポンド記号（＃）で印を付けている。潜在的なＮ結合型グリコシル化配列は、ニュートロカイン−αＳＶアミノ酸配列中の以下の位置で見出される：Ｎ−１２４〜Ｑ−１２７（Ｎ−１２４、Ｓ−１２５、Ｓ−１２６、Ｑ−１２７）およびＮ−２２３〜Ｃ−２２６（Ｎ−２２３、Ｎ−２２４、Ｓ−２２５、Ｃ−２２６）。抗原性ポリペプチドとしては、配列番号１９のアミノ酸配列の約Ｐｒｏ−３２〜約Ｌｅｕ−４７、約Ｇｌｕ−１１６〜約Ｓｅｒ−１４３、約Ｐｈｅ−１５３〜約Ｔｙｒ−１７３、約Ｐｒｏ−２１８〜約Ｔｙｒ−２２７、約Ａｌａ−２３２〜約Ｇｌｎ−２４１、約Ｉｌｅ−２４４〜約Ａｌａ−２４９、および約Ｓｅｒ−２５２〜約Ｖａｌ−２５７が挙げられる。  ニュートロカイン−αと、ニュートロカイン−αＳＶと、ＴＮＦ−αと、ＴＮＦ−βと、ＬＴ−βと、最も密接に関連したＦａｓリガンド（これらの配列の整列を図２に示す）との間の高い同一性の領域は、図１Ａおよび１Ｂにおいて下線を付している。（ニュートロカイン−αおよびニュートロカイン−αＳＶの）これらの保存された領域は、図５Ａおよび５Ｂにおいて保存ドメイン（ＣＤ）−１、ＣＤ−ＩＩ、ＣＤ−ＩＩＩ、ＣＤ−Ｖ、ＣＤ−ＶＩ、ＣＤ−ＶＩＩ、ＣＤ−ＶＩＩＩ、ＣＤ−ＩＸ、ＣＤ−Ｘ、およびＣＤ−ＸＩとして表示されている。ニュートロカイン−αＳＶは、図１Ａおよび１Ｂの凡例に記載されるＣＤ−ＩＶの配列を含まない。  ニュートロカイン−αポリペプチド配列（配列番号２）とＡＰＲＩＬ、ＴＮＦαとＬＴαとのさらなる整列を図７Ａに示す。図７Ａにおいて、βシート領域を図７Ａの凡例において以下に記載するように示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ニュートロカイン−αＳＶタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号１８）および推定アミノ酸配列（配列番号１９）を示す。アミノ酸１〜４６は推定細胞内ドメインを、アミノ酸４７〜７２は推定膜貫通ドメイン（二重下線を引いた配列）を、およびアミノ酸７３〜２６６は推定細胞外ドメイン（残りの配列）を表す。潜在的なアスパラギン結合型グリコシル化部位は、図５Ａおよび５Ｂのニュートロカイン−αＳＶアミノ酸配列中のアスパラギンの記号（Ｎ）を太字にし、そしてニュートロカイン−αＳＶヌクレオチド配列中のアスパラギン残基をコードする最初のヌクレオチド上にボールドにしたポンド記号（＃）で印を付けている。潜在的なＮ結合型グリコシル化配列は、ニュートロカイン−αＳＶアミノ酸配列中の以下の位置で見出される：Ｎ−１２４〜Ｑ−１２７（Ｎ−１２４、Ｓ−１２５、Ｓ−１２６、Ｑ−１２７）およびＮ−２２３〜Ｃ−２２６（Ｎ−２２３、Ｎ−２２４、Ｓ−２２５、Ｃ−２２６）。抗原性ポリペプチドとしては、配列番号１９のアミノ酸配列の約Ｐｒｏ−３２〜約Ｌｅｕ−４７、約Ｇｌｕ−１１６〜約Ｓｅｒ−１４３、約Ｐｈｅ−１５３〜約Ｔｙｒ−１７３、約Ｐｒｏ−２１８〜約Ｔｙｒ−２２７、約Ａｌａ−２３２〜約Ｇｌｎ−２４１、約Ｉｌｅ−２４４〜約Ａｌａ−２４９、および約Ｓｅｒ−２５２〜約Ｖａｌ−２５７が挙げられる。  ニュートロカイン−αと、ニュートロカイン−αＳＶと、ＴＮＦ−αと、ＴＮＦ−βと、ＬＴ−βと、最も密接に関連したＦａｓリガンド（これらの配列の整列を図２に示す）との間の高い同一性の領域は、図１Ａおよび１Ｂにおいて下線を付している。（ニュートロカイン−αおよびニュートロカイン−αＳＶの）これらの保存された領域は、図５Ａおよび５Ｂにおいて保存ドメイン（ＣＤ）−１、ＣＤ−ＩＩ、ＣＤ−ＩＩＩ、ＣＤ−Ｖ、ＣＤ−ＶＩ、ＣＤ−ＶＩＩ、ＣＤ−ＶＩＩＩ、ＣＤ−ＩＸ、ＣＤ−Ｘ、およびＣＤ−ＸＩとして表示されている。ニュートロカイン−αＳＶは、図１Ａおよび１Ｂの凡例に記載されるＣＤ−ＩＶの配列を含まない。  ニュートロカイン−αポリペプチド配列（配列番号２）とＡＰＲＩＬ、ＴＮＦαとＬＴαとのさらなる整列を図７Ａに示す。図７Ａにおいて、βシート領域を図７Ａの凡例において以下に記載するように示す。
【図６】図６は、ニュートロカイン−αＳＶアミノ酸配列の分析を示す。記載されたコンピュータープログラムのデフォルトパラメーターを用いて配列番号１９のアミノ酸配列について予測される、α、β、ターンおよびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指標および表面確率を示す。ニュートロカインαタンパク質の高度に抗原性の領域の位置、すなわち、本発明のエピトープ保有ペプチドが得られ得る領域を、「抗原性指標−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」グラフに示す。抗原性ポリペプチドとしては、配列番号１９のアミノ酸配列の約Ｐｒｏ−３２〜約Ｌｅｕ−４７、約Ｇｌｕ−１１６〜約Ｓｅｒ−１４３、約Ｐｈｅ−１５３〜約Ｔｙｒ−１７３、約Ｐｒｏ−２１８〜約Ｔｙｒ−２２７、約Ｓｅｒ−２５２〜約Ｔｈｒ−２５８、約Ａｌａ−２３２〜約Ｇｌｎ−２４１；約Ｉｌｅ−２４４〜約Ａｌａ−２４９および約Ｓｅｒ−２５２〜約Ｖａｌ−２５７からのアミノ酸残基を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。  図６に示されるデータは、表Ｉに示されるデータと類似の表形式で容易に示され得る。図６に開示された正確なデータをこのような表で表すことは、デフォルトパラメーターに設定されたＤＮＡ＊ＳＴＡＲコンピューター配列分析パッケージのＭｅｇＡｌｉｇｎコンポーネントを使用して行われ得る。これは、本出願の図３および６を作成するために使用したプログラムと同一である。
【図７】図７Ａ。ニュートロカイン−αのアミノ酸配列、ならびにその推定リガンド結合ドメインと、ＡＰＲＩＬ、ＴＮＦ−αおよびＬＴ−α（具体的には、ヒトＡＰＲＩＬポリペプチド（配列番号２０；ＡＴＣＣ受託番号ＡＦ０４６８８８）のアミノ酸残基１１５〜２５０）、ＴＮＦα（配列番号３；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号２１５０２６）のアミノ酸残基８８〜２３３、ならびにＬＴα（（ＴＮＦβとも指定される）配列番号４のアミノ酸残基６２〜２０５；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ１５０２６））の推定リガンド結合ドメインとの整列。ニュートロカイン−αの推定の膜にまたがる領域（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｐａｎｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）が示され、そしてニュートロカイン−αの切断部位が矢印で示される。線を引いた重複する領域（ＡからＨ）は、β−プリーツシート領域を示す。  図７Ｂ。ニュートロカイン−α  ｍＲＮＡの発現。ニュートロカイン−αのｏｒｆをプローブとして用いて、ヒト組織型のスペクトルおよび癌細部株の選択からポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のブロットに対してノーザンハイブリダイゼーションブロット分析を行った。２．６ｋｂのニュートロカイン−α  ｍＲＮＡを、胎盤、心臓、肺、胎児肝臓、胸腺および膵臓において高レベルで検出した。２．６ｋｂのニュートロカイン−α  ｍＲＮＡは、ＨＬ−６０およびＫ５６２細胞株においても検出された。
【図８】ニュートロカイン−α発現は、ＩＦＮ−γによるヒト単球の活性化後に増加する。図８Ａ。インビトロ培養した単球に対するニュートロカイン−αタンパク質発現のフローサイトメトリー分析。精製単球をＩＦＮ−γ（１００Ｕ／ｍｌ）の存在下または非存在下で３日間培養した。次いで、細胞をニュートロカイン−α特異的ｍＡｂ（２Ｅ５）（実線）またはアイソタイプ適合コントロール（ＩｇＧ１）（破線）で染色した。これらの独立した実験において３名の異なるドナーから精製された単球で匹敵する結果が観察された。  図８Ｂ。ニュートロカイン−α特異的ＴａｑＭａｎプライマーを調製し、そしてこれを用いて、非刺激およびＩＦＮ−γ（１００Ｕ／ｍｌ）処理単球における相対的ニュートロカイン−α  ｍＲＮＡの発現レベルを評価した。ＴａｑＭａｎプライマーのヌクレオチド配列は、以下のとおりである：（ａ）プローブ：
【化３２】
2007277249.tif 000055
（配列番号２４）；
（ｂ）５’増幅プライマー：
【化３３】
2007277249.tif 000056
（配列番号２５）；および
（ｃ）３’増幅プライマー：
【化３４】
2007277249.tif 000057
（配列番号２６）。
【図９】ニュートロカイン−αは、強力なＢリンパ球刺激剤である。図９Ａ。ニュートロカイン−αの生物学的活性を、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｃｏｗａｎ  １  ＳＡＣを感作因子として利用して、標準的Ｂリンパ球同時刺激アッセイにおいて評価した。ＳＡＣ単独では、１４２７＋／−３１６のバックグラウンド数を得た。三連のウェルの平均＋／−標準偏差として値を報告する。同様の結果を安定なＣＨＯトランスフェクタントおよび一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞から精製した組換えニュートロカイン−αを用いて得た。  図９Ｂ。ニュートロカイン−αに対する扁桃Ｂ細胞の増殖、および抗ＩｇＭとの同時刺激に対する扁桃Ｂ細胞の増殖。個々のウェルをＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌでヤギ抗ヒトＩｇＭ抗体で予めコーティングしたことを除いて、ＳＡＣについて記載したように、バイオアッセイを行った。
【図１０】正常ヒト末梢血単球および腫瘍細胞株の中でのニュートロカイン−αレセプター発現。図１０Ａ。ヒト末梢血有核細胞を正常ヒトボランティアから得、そして密度勾配遠心分離により単離した。細胞をビオチン化ニュートロカイン−α、次いでＣＤ３、ＣＤ２０、ＣＤ１４、ＣＤ５６、およびＣＤ６６に対して特異的なＰＥ結合体化ストレプトアビジンおよびＦＩＴＣまたはＰｅｒＣＰカップリングｍＡＢで染色した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎで細胞を分析した。データは、４つの独立した実験のうちの１つを示す。  図１０Ｂ。細胞肉腫（ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｉｃ）細胞株Ｕ−９３７および骨髄腫株ＩＭ−９に結合するニュートロカイン−α。
【図１１】ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣＲマウスにおけるニュートロカイン−α投与のインビボでの効果。図１１Ａ。ホルマリン固定した脾臓をパラフィンに包埋し、そして５μｍ切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した（上パネル）。下パネルは、同じ動物から採取した切片であり、抗ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）ｍＡｂで染色し、西洋ワサビペルオキシダーゼカップリングウサギ抗ラットＩｇ（マウス吸収）および基質ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（ＤＡＢ）で発色させた。スライドをＭａｙｅｒのヘマトキシリンで対比染色した。ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）発現細胞は褐色に見える。  図１１Ｂ。ＰＥ−ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）およびＦＩＴＣ−ＴｈＢ（Ｌｙ６Ｄ）で染色した、正常（左パネル）およびニュートロカイン−α処理（右パネル）のフローサイトメトリー分析。  図１１Ｃ。正常およびニュートロカイン−α処理マウスにおける血清ＩｇＭ、ＩｇＧ、およびＩｇＡレベル。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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