(57)【要約】【課題】HIV-1の各種サブタイプに対応できるHIV-1プロウイルス定量法を確立すること。【解決手段】5’- AGTRGGGGGACAYCARGCAGCHATGCARAT - 3’で表される塩基配列の一部又は全部を含む１０〜４０ヌクレオチドのプライマーと、5’- TACTAGTAGTTCCTGCTATRTCACTTCC - 3’ で表される塩基配列の一部又は全部を含む１０〜４０ヌクレオチドのプライマーとからなるプライマーセットを用いて、サンプル中のHIV-1プロウイルスを増幅することを含む、HIV-1プロウイルス定量法。HIV-1プロウイルス定量キット、プライマーセットも提供される。【選択図】図９
2007295896.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の塩基配列の一部又は全部を含む１０〜４０ヌクレオチドのプライマーと、配列番号２の塩基配列の一部又は全部を含む１０〜４０ヌクレオチドのプライマーとからなるプライマーセット。
【請求項２】
請求項１記載のプライマーセットを含む、HIV-1プロウイルス定量キット。
【請求項３】
配列番号３の塩基配列の一部又は全部を含む１０〜４０ヌクレオチドの標識されたプローブをさらに含む請求項２記載のHIV-1プロウイルス定量キット。
【請求項４】
請求項１記載のプライマーセットを用いて、サンプル中のHIV-1プロウイルスを増幅することを含む、HIV-1プロウイルス定量法。
【請求項５】
さらに、配列番号３の塩基配列の一部又は全部を含む１０〜４０ヌクレオチドの標識されたプローブを用いて、増幅産物を検出することを含む請求項４記載のHIV-1プロウイルス定量法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＩＶ−１プロウイルス定量法に関する。
【背景技術】
【０００２】
HIV-1感染者の末梢血単核球（PBMC）中のHIV-1プロウイルスは、多剤併用療法の長期的治療効果やそのサルベージ療法の治療効果を予測する指標となりうることが知られており（非特許文献1,2）、その定量法が検討されている（非特許文献3）。今までのプロウイルス定量法のほとんどはサブタイプBを対象としている（非特許文献4,5）が、日本の異性間性行為による感染では特にサブタイプA/Eが増加しており、その他少数ながらもサブタイプAやC等も漸増傾向にある。
【０００３】
【非特許文献１】Pellegrin et al., 2003. Predictive Value of Provirus Load and DNA Human immunodeficiency Virus Genotype for Successful Abacavir-based Simplified Therapy. J. Infect. Dis. 187:38-46.
【非特許文献２】Katzenstein et al., 2003. Virological and Immunological Profiles among Patients with Undetectable Viral Load Followed Prospectively for 24 Months. HIV Medicine 4:53-61.
【非特許文献３】Butler et al., 2001. A Quantitative Assay for HIV DNA Integration in vivo. Nature Medicine 7:631-634.
【非特許文献４】Zhao et al., 2002. Quantification of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Proviral DNA by Using TaqMan Technology. J. Clin. Microb. 40:675-678.
【非特許文献５】Teo et al., 2002. LightCycler qPCR optimization for Low Copy Number Target DNA. J. Immunol. Methods 270:119-133.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、HIV-1の各種サブタイプに対応できるHIV-1プロウイルス定量法を確立することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、各種HIV-1サブタイプに対応できるプロウイルスHIV-1定量法の開発を目的として、縮重(degenerate)プライマー（deSK145、deSKCC1B）、TaqMan MGBプローブ（deKK-MGBprobe）を用いたReal time PCR法の検討を行い、本発明を完成させるに至った。
本発明の要旨は以下の通りである。
【０００６】
（１）配列番号１の塩基配列の一部又は全部を含む１０〜４０ヌクレオチドのプライマーと、配列番号２の塩基配列の一部又は全部を含む１０〜４０ヌクレオチドのプライマーとからなるプライマーセット。
（２）（１）記載のプライマーセットを含む、HIV-1プロウイルス定量キット。
（３）配列番号３の塩基配列の一部又は全部を含む１０〜４０ヌクレオチドの標識されたプローブをさらに含む（２）記載のHIV-1プロウイルス定量キット。
（４）（１）記載のプライマーセットを用いて、サンプル中のHIV-1プロウイルスを増幅することを含む、HIV-1プロウイルス定量法。
（５）さらに、配列番号３の塩基配列の一部又は全部を含む１０〜４０ヌクレオチドの標識されたプローブを用いて、増幅産物を検出することを含む（４）記載のHIV-1プロウイルス定量法。
【０００７】
既知濃度のHIV-1DNAの希釈系列を用いた検討により、本発明の方法は4〜5000コピーの範囲で良好な直線性（slope:-3.43、R2=0.984）が認められ、定量限界はサブタイプB、A/Eともに４コピー/0.5ugDNAであった。
６種類のHIV-1サブタイプ（B、A/E、A、C、F、G）、19検体のReal time PCR法による定量値は、ポアソン分布法での計算値とほぼ一致しており、両方法の間には非常に良好な相関が認められた（R2=0.988、回帰係数＝0.983）。これら19検体について再現性を検討した結果、実験内変動係数は7.0〜35.3％、実験間変動係数は1.0〜35.9％であった。
以上のことから、本発明の方法は、定量感度、直線性、再現性、正確性に優れており、HIV-1グループＭのプロウイルスの定量に有用であると考えられた。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、サブタイプＢのみならず、それ以外のグループＭ（Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ）の各種サブタイプに対応できる、HIV-1プロウイルス定量法が提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
本発明は、配列番号１の塩基配列の一部又は全部を含む１０〜４０ヌクレオチドのプライマーと、配列番号２の塩基配列の一部又は全部を含む１０〜４０ヌクレオチドのプライマーとからなるプライマーセットを提供する。
配列番号１：5’- AGTRGGGGGACAYCARGCAGCHATGCARAT - 3’（配列中、RはA又はgであり、YはC又はt(u)であり、HはA、c又はt(u)である）
配列番号２：5’- TACTAGTAGTTCCTGCTATRTCACTTCC - 3’（配列中、RはA又はgである）
プライマーの長さは、１０〜４０ヌクレオチドであるとよく、好ましくは２０〜３０ヌクレオチドである。
【００１０】
プライマーを構成するヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡのキメラ分子、それらの誘導体、修飾体などのいずれであってもよい。
本発明のプライマーセットを用いて、サンプル中のHIV-1プロウイルスを増幅することにより、HIV-1プロウイルスを定量することができる。
プライマーが縮重プライマーである場合、縮重プライマー中の各プライマーの割合はいかなる割合であってもよいが、全種類のプライマーが等量で存在することが好ましい。
従って、本発明は、配列番号１の塩基配列の一部又は全部を含む１０〜４０ヌクレオチドのプライマーと、配列番号２の塩基配列の一部又は全部を含む１０〜４０ヌクレオチドのプライマーとからなるプライマーセットを用いて、サンプル中のHIV-1プロウイルスを増幅することを含む、HIV-1プロウイルス定量法も提供する。
【００１１】
HIV-1プロウイルスを含むサンプルとしては、HIV-1感染が確認されている感染者もしくは患者、または抗HIV-1治療を受けている患者などの被験者からの血液、リンパ液、髄液、精液、リンパ節などを挙げることができる。
HIV-1プロウイルス定量法の一例を簡単に説明する。まず、被験者から血液サンプルを採取する。採取したサンプルから、Pharmacia社のFicoll-Paque密度勾配遠心を用いて単核球を分離した後、QIAamp DNA mini kit（キアーゲン）を用いてプロウイルスDNAを抽出する。次いで、この核酸をＰＣＲ、好ましくは、Real time PCRにかけて、プロウイルス濃度を測定する。
【００１２】
本発明のHIV-1プロウイルス定量法においては、さらに、配列番号３の塩基配列の一部又は全部を含む１０〜４０ヌクレオチドの標識されたプローブを用いて、増幅産物を検出するとよい。
配列番号３：5’- ATCAATGARGARGCTGCAGAATGGGA - 3’ （配列中、RはA又はgである）
プローブの長さは、１０〜４０ヌクレオチドであるとよく、好ましくは２０〜３０ヌクレオチドである。
【００１３】
プローブを構成するヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡのキメラ分子、それらの誘導体、修飾体などのいずれであってもよい。
プローブが縮重プローブである場合、縮重プロ−ブ中の各プローブの割合はいかなる割合であってもよいが、全種類のプローブが等量で存在することが好ましい。
Real time PCRを行う場合には、定量PCR試薬としてTaqMan PCR core reagents kit (アプライドバイオシステムズ)を用い、定量PCR装置としてABI PRISMR 7900HT（アプライドバイオシステムズ）を使用し、50℃ 2分、95℃ 10分の反応後、95℃ 15秒、60℃ 1分の２ステップ反応を45サイクル行うとよい。但し、これらの条件は、実験が再現できる限り、適宜変更できる。その変更した条件で発明が実施される場合も、本発明の範囲に含まれるものとする。
【００１４】
Real time PCRでは、段階希釈した既知量のDNAを定量標準としてPCRを行う。定量標準のDNAとしては、HIV-1のDNAクローンpNL432 (Adachi et al., 1987. Productive, persistent infection of human colorectal cell lines with human immunodeficiency virus. J Virol. 61:209-213.)（足立博士より供与)を用いるとよい。定量標準のDNAについて、増幅が指数関数的に起こる量の範囲内で、任意の閾値にPCR産物が到達した時のPCRサイクル数（threshold cycle (Ct)）を縦軸に、鋳型DNA量を横軸にプロットし、検量線を作成する。目的のDNA(濃度未知)についても、同じ条件下でPCRを行い、Ct値を求める。この値と検量線から、目的のDNA量を決定する。PCR産物の生成量の測定は蛍光試薬を用いて行うことができる。通常、インターカレーター、蛍光標識したプローブなどを利用する。例えば、配列番号３の塩基配列の一部又は全部を含む１０〜４０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドの５’末端に蛍光物質FAMを、３’末端にNFQ(Non Fluorescent Quencher)とTmエンハンサーであるMGB（Minor Groove Binder）を修飾した、TaqMan MGBプローブを蛍光試薬として用いることができる。
【００１５】
本発明は、また、配列番号１の塩基配列の一部又は全部を含む１０〜４０ヌクレオチドのプライマーと、配列番号２の塩基配列の一部又は全部を含む１０〜４０ヌクレオチドのプライマーとからなるプライマーセットを含む、HIV-1プロウイルス定量キットを提供する。本発明のキットは、配列番号３の塩基配列の一部又は全部を含む１０〜４０ヌクレオチドの標識されたプローブをさらに含んでもよい。キットには、さらに、HIV-1プロウイルスの定量に必要なその他の試薬一式、緩衝液、取扱説明書などが含まれてもよい。取扱説明書には、キットの使用方法の説明の他、検量線、HIV-1プロウイルス濃度からHIV-1感染者に対する治療効果、病態進行度、治療中断時期などを予測するための判定基準、注意書きなども記載しておくとよい。
【００１６】
なお、本明細書中の塩基配列及びその説明において、A及びaはアデニン、C及びcはシトシン、G及びgはグアニン、T及びtはチミン、U及びuはウラシルを表す。
【実施例】
【００１７】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１８】
〔実施例1〕
実験方法
１）プライマーおよびTaqMan MGBプローブの作製（図１、図２）
血中HIV-1・RNA定量キット、アンプリコアHIV-1モニターver.1.5（ロシュ・ダイアグノスティックス）で使用しているプライマー（SK145、SKCC1B）およびプローブ（SK102）領域について、Los AlamosのHIVデータベース検索を行い、HIV-1グループＭに対応できるよう数箇所の塩基をdegenerateにしたプライマー（deSK145、deSKCC1B）、プローブ（deKK-probe) を作製した。
deKK-probeは５’末端に蛍光物質FAMを、３’末端にTmエンハンサーであるMGB（Minor Groove Binder）を修飾し、TaqMan MGBプローブ（deKK-MGBprobe）とした。
【００１９】
２）試料
患者PBMCより分離した19のHIV-1分離株（サブタイプＢ 7株、サブタイプA/E 5株、サブタイプＡ 3株、F 2株、C、G１株ずつ）を検討用サンプルとして用いた。これら分離株をHIV-1非感染者のPBMCと７日間共培養し、７日後の培養細胞からプロウイルスDNAをQIAamp DNA mini kit（キアーゲン）を用いて抽出した。これらプロウイルスDNAをTE溶液でDNA濃度50ng/ulに調整し、試料とした。
【００２０】
３）試薬の調整およびPCR条件
定量PCR試薬にはTaqMan PCR core reagentキット（アプライドバイオシステムズ）を用いた。反応チューブあたりDNA500ngを用い、50ulボリュームでPCR反応を行った。
定量PCR装置はABI PRISMR 7900HT（アプライドバイオシステムズ）を使用し、50℃ 2分、95℃ 10分の反応後、95℃ 15秒、60℃ 1分の２ステップ反応を45サイクル行った。
【００２１】
４）標準HIV-1DNAを用いた標準曲線の作製
クローン化した既知濃度のpNL432（79000 copies/ul：サブタイプＢ）を標準HIV-1DNAコントロールとして用い、500、250、50、10、2、0.4コピー/ulの希釈系列を作製し、各々10ulを鋳型 DNAとし、標準曲線を作製した。
標準HIV-1 DNAの希釈にはHIV非感染者のプールPBMCから抽出したDNAを用い、最終DNA濃度50ng/ulに調整した。
【００２２】
５）定量感度および特異性の検討
サブタイプＢ標準株IIIBの培養細胞から抽出したHIV-1DNAおよびサブタイプA/Eのクローン化HIV-1DNA（p93JP-NH1）の希釈系列を用いて、定量感度について検討した。
また、HIV非感染者40例のPBMCより抽出したDNAを用いて特異性の検討を行った。
【００２３】
６）限界希釈法によるプロウイルスの定量（ポアソン分布法）
19検体のHIV-1DNAをそれぞれ限界希釈し、gag p24領域をターゲットとしたnested PCR法で測定した後、ポアソン分布法に従いコピー数を算出し、Real time PCR法での測定値と比較した。nested PCRの一回目のPCRのプライマー対は配列番号１と２を用いた。二回目のプライマー対の配列は次の通りである。
配列番号７：5’- GAGGAAGCTGCAGAATGGGA - 3’
配列番号８：5’- GTTCTCTCATCTGGCCTGGTG - 3’
（倫理面への配慮）
患者同意の上、HIV検査依頼のあった症例より提供されたサンプルを用いて研究を行っており、プライバシーの流出防止など患者の人権保護に十分配慮した。本研究は神奈川県衛生研究所の倫理委員会で承認されている。
【００２４】
結果および考察
縮重プライマー（deSK145、deSKCC1B）、deKK-MGB probeを用いたReal time PCR法によるHIV-1DNA定量法について基礎的検討を行った。
標準HIV-1DNAコントロールpNL432の希釈系列を用いて標準曲線を作製した結果、4〜5000コピー/0.5ug DNA の範囲で良好な直線性が得られた（slope:-3.43、R2=0.984、図3）。
サブタイプＢの標準株IIIBのプロウイルスDNAおよびクローン化したサブタイプA/EのプロウイルスDNA、p93JP-NH1の希釈系列を用いて定量限界を検討したところ、サブタイプB、A/Eいずれも4コピー/0.5ug DNA以上で定量が可能であった（図4、図5）。
【００２５】
HIV非感染者40例のPBMCから得られたDNAはすべて検出限界以下であった。
19の臨床分離株培養細胞（サブタイプB 7検体、A/E  5検体、A 3検体、F 2検体、C、G各１検体ずつ）から得られたHIV-1DNA量をReal time PCRで測定し、ポアソン分布法での計算値と比較した（表1）。
【００２６】
【表１】
2007295896.tif 000003
Real time PCR法での測定値は19検体全てポアソン分布法での値とほぼ一致していた。しかし、19検体中４検体（サブタイプA/E ５検体中２検体、サブタイプA ３検体中２検体）はアンプリコア型プライマー（SK145、SKCC1B）での測定値が著しく低い値となった。
【００２７】
これら４検体のforwardプライマー領域にはSK145と比べ、4〜5塩基のミスマッチが認められたが、縮重プライマーdeSK145ではミスマッチ箇所が０〜２塩基に減少した（図6）。reverseプライマー領域においてはアンプリコア型プライマーSKCC1Bの中の最も変異の頻度の高い1塩基をR（G or A）に縮重したプライマーdeSKCC1Bを用いた（図７）。プローブ領域においてはアンプリコア型プライマーSK102から変異の多い３‘末端および５’末端の9塩基を削除し、かつ2塩基を縮重したプローブdeKK-probeを作製することにより、最大で5塩基存在したミスマッチが2塩基に減少した（図８）。
【００２８】
縮重プライマーを用いてプライマーとのミスマッチを減らすことにより、ポアソン分布法による計算値に近似したより正確な測定値が得られたと考えられた。
縮重プライマー、deSK145、deSKCC1BおよびdeKK-MGBprobeを用いた本Real time PCR法はHIV-1グループＭに対応可能な有用な方法であると考えられた。
19検体の縮重 プライマー、プローブでの測定値とポアソン分布法での値には非常に良好な相関性が認められた（R2=0.988、回帰係数＝0.983、図9）。
これら19検体を各々３本ずつ３回測定し、再現性の検討を行った（表2）。分散分析解析の結果、実験内変動係数が7.0〜35.3％、実験間変動係数が1.0〜35.9％と良好な再現性が得られた。
【００２９】
【表２】
2007295896.tif 000004
結語
縮重プライマー（deSK145、deSKCC1B）およびdeKK-MGBprobeを用いたReal time PCR法によるHIV-1プロウイルス定量系を確立した。
【００３０】
６種類のHIV-1サブタイプ（B、A/E、A、C、F、G）、19検体の定量値とポアソン分布法による計算値の間には非常に良好な相関が認められた（R2=0.988、回帰係数＝0.983）。
本法は定量感度、直線性、再現性、正確性に優れており、HIV-1グループＭのプロウイルスの定量に有用であると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明のHIV-1プロウイルス定量法は、HIV-1感染者に対する治療効果や病態の進行度の予測に有用である。また、HIV-1抗体価が陽性の場合の確認診断にも利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】Real time PCR用のプライマー及びプローブ設計の概念を示す。
【図２】プライマー及びプローブ領域の塩基配列の比較を示す。
【図３】標準サンプル（pNL432）の標準曲線を示す。
【図４】Real time PCR法の検出感度を示す（サブタイプＢ）。
【図５】Real time PCR法の検出感度を示す（サブタイプＡ／Ｅ）。
【図６】フォワードプライマー領域の塩基配列の比較を示す。
【図７】リバースプライマー領域の塩基配列の比較を示す。
【図８】プローブ領域の塩基配列の比較を示す。
【図９】Real time PCRと限界希釈法(ポアソン分布法）との相関を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００３３】
＜配列番号１＞
配列番号１は、縮重フォワードプライマーdeSK145の塩基配列を示す。
＜配列番号２＞
配列番号２は、縮重リバースプライマーdeSKCC1Bの塩基配列を示す。
＜配列番号３＞
配列番号３は、縮重プローブdeKK-probeの塩基配列を示す。
＜配列番号４＞
配列番号４は、フォワードプライマーSK145の塩基配列を示す。
＜配列番号５＞
配列番号５は、リバースプライマーSKCC1Bの塩基配列を示す。
＜配列番号６＞
配列番号６は、プローブSK102の塩基配列を示す。
＜配列番号７＞
配列番号７は、実施例１で行ったnested PCRの二回目のPCRのプライマーの塩基配列を示す。
＜配列番号８＞
配列番号８は、実施例１で行ったnested PCRの二回目のPCRのプライマーの塩基配列を示す。
【図１】
2007295896.tif 000005
【図２】
2007295896.tif 000006
【図３】
2007295896.tif 000007
【図４】
2007295896.tif 000008
【図５】
2007295896.tif 000009
【図６】
2007295896.tif 000010
【図７】
2007295896.tif 000011
【図８】
2007295896.tif 000012
【図９】
2007295896.tif 000013
【配列表】
2007295896000001.app