(57)【要約】【課題】局所的に塗布された活性成分の効能を立証する試験法を提供する。【解決手段】局所的に塗布された活性成分の効能を立証する試験法は、活性成分を含む組成物を皮膚のある領域に局所的に塗布する段階と、吸収性材料をこの皮膚の領域に塗布して、この活性成分の少なくとも一部分をこの皮膚から抽出し、それによって、活性成分の当該一部分を吸収性材料に放出可能に組み入れる段階と、吸収性材料を皮膚から取り除く段階と、活性成分を吸収性材料から抽出する段階と、抽出した活性成分を細胞成長培地と組み合わせる段階と、生物指標を産生するための時間をかけて、培養細胞を持つ細胞成長培地を培養する段階と、生物指標を計測して活性成分の効能を示す段階と、を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
局所的に塗布された活性成分の効能を立証するための方法において、
活性成分を含有する組成物を皮膚のある領域に局所的に塗布する段階と、
吸収性材料を前記皮膚領域に塗布して、前記活性成分の少なくとも一部分を前記皮膚領域から取り除き、それによって、活性成分の前記一部分を前記吸収性材料に放出可能に組み入れる段階と、
前記吸収性材料に組み入れられた活性成分の前記一部分を含む前記吸収性材料を前記皮膚から取り除く段階と、
前記活性成分を前記吸収性材料から抽出する段階と、
前記抽出した活性成分を、培養細胞を含む細胞成長培地と組み合わせる段階と、
生物指標を生じるのに有効な時間をかけて、前記細胞成長培地中の培養細胞を培養する段階と、
前記生物指標を計測して前記活性成分の効能を示す段階と、
を含む、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、
前記活性成分が、レチノール、ジメチルアミノエタノール、テトラヒドロキシプロピル・エチレンジアミン、大豆、ナツシロギク、ヒドロコルチゾン、サリチル酸および過酸化ベンゾイルからなる群から選ばれる、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、
前記吸収性材料が、接着剤、綿棒、粉体、フィルムおよびふき取り繊維（ｗｉｐｅ）からなる群から選ばれる、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、
前記細胞成長培地が、ＲＰＭＩ培地１６４０（ＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ  １６４０）である、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法において、
前記細胞が、マウスの細胞、Ｈａｃａｔケラチノサイト細胞およびジャーカットＴ細胞からなる群から選ばれる、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法において、
前記生物指標が、インターロイキン１、インターロイキン２、インターロイキン６および活性酸素種からなる群から選ばれる、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法において、
前記活性成分を含む組成物を前記皮膚領域に塗布した後１〜２４時間経ってから、前記皮膚領域に前記吸収性材料を塗布する、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法において、
活性成分の前記一部分が、前記細胞成長培地の存在下、前記吸収性材料から抽出される、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法において、
前記細胞が、前記細胞成長培地中、１分〜２４時間かけて培養される、方法。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【０００１】
〔発明の分野〕
本発明は、局所的に塗布された活性成分の効能を立証するための方法に関する。本方法は、時間をベースにした効能の主張を支持するのに有用である。
【０００２】
〔発明の背景〕
消費者市場は、スキンケアの利点を提供することを意図した、クリーム、ローション、スプレー等で満ちあふれている。目標とされる利点には、加湿、しわの減少、皮膚のスムージング、にきびの治療、炎症の減少および色素脱失が含まれる。これらの利点の多くは、活性成分を含有する組成物の局所的塗布を通じて与えられる。
【０００３】
局所的に塗布された活性成分の効能を立証するための諸試験方法が開発されてきた。これらの試験法では、一般的に、活性成分の存在について分析し、次いで、活性成分の単なる存在から、その効能が推察されている。例えば、米国特許出願第２００２／００１９０５５号は、皮膚の表面における物質の非侵襲性検査方法を開示している。一定の時間、吸収性パッドを皮膚上に置き、取り除き、次いで、検討対象物質について分析を行う。検討対象である化学薬品の抽出と現場での検査の両方を行うために、この吸収性パッドの一部として分析方法を組み込むこともできる。この方法は検体を定量化するものであるが、検体の効能を立証するものではない。それゆえ、局所的に塗布された活性成分の効能を立証する試験法に対するニーズがある。
【０００４】
〔発明の概要〕
本発明により、局所的に塗布された活性成分の効能を立証する方法であって、治療上有効な量の活性成分を含有する組成物を皮膚のある領域に局所的に塗布する段階と、この活性成分の少なくとも一部分を皮膚から抽出するのに有効な時間をかけて、吸収性材料をこの皮膚領域に塗布し、それによって、活性成分の当該一部分をこの吸収性材料に放出可能に組み入れる段階と、組み入れられた活性成分を含む吸収性材料を皮膚領域から取り除く段階と、組み入れられた活性成分を吸収性材料から抽出し、抽出した活性成分を、培養細胞を含む細胞成長培地と組み合わせる段階と、細胞成長培地に生物指標が生じるのに有効な時間をかけて、培養細胞の入ったこの細胞成長培地を培養する段階と、生物指標を計測してこの活性成分の効能を示す段階とを含む方法が提供される。
【０００５】
〔発明の詳細な説明〕
本発明の方法の第一のステップでは、活性成分を含有する組成物が皮膚のある領域に局所的に塗布される。ここで用いられる局所的な塗布とは、手、スプレー、ミスト、アプリケータまたは本技術で公知の任意の手段で組成物を皮膚の表面に塗布することを意味する。適切な組成物には、粉体、溶液、クリーム、ローション、軟膏等が含まれる。本組成物には、治療上有効な量の少なくとも一つの活性成分が含まれる。ここに使用される治療上有効な量とは、本組成物を皮膚領域に塗布する際に求められる治療上の利点を提供するのに要求される量である。適切な活性成分には、加湿、老化防止、皮膚のスムージング、にきびの治療、炎症の減少、かゆみの減少、色素脱失およびこれらの組合せから選ばれる皮膚への利点を提供することを意図するものが含まれる。適切な活性成分には、レチノール、ジメチルアミノエタノール、テトラヒドロキシプロピル・エチレンジアミン、大豆、ナツシロギク（ｆｅｖｅｒｆｅｗ）、ヒドロコルチゾン、サリチル酸、過酸化ベンゾイル等が含まれるが、これらに限られるわけではない。本組成物は、求められる皮膚への利点を与えるのに十分な時間または効能を証明するのに所望される予め決められた時間、皮膚上に残される。たとえば、次のステップへ進む前に、本組成物が、約１〜約１２時間、または、２４時間まで皮膚上に存在し得る。このデータは、規制上の目的またはマーケティング目的のために使用し得る。
【０００６】
本発明の方法における第二のステップでは、更なる効能の分析のために、活性成分の少なくとも一部分を皮膚から抽出するのに有効な時間をかけて、活性成分が塗布されていた皮膚領域に吸収性材料が塗布される。ここで使用される吸収性材料には、活性成分を吸収する材料または、別のやり方で活性成分が付着し得る、または結合し得る材料が含まれる。活性成分が、吸収性材料に、放出可能に結合され得るか、さもなければ放出可能に取り入れられ得る限り、利用される吸収性材料は重要ではない。活性成分は、化学結合または機械的結合により、吸収性材料によって吸収され得るか、または、吸着され得る。適切な吸収性材料の例には、接着剤、粉体、フィルム、綿棒およびふき取り繊維（ｗｉｐｅ）が含まれるが、これらに限られるわけではない。
【０００７】
吸収性材料には、活性成分を溶解して皮膚から抽出するための溶媒が含まれ得る。この溶媒は、有機溶媒、水性溶媒またはこれらの混合物であり得る。好ましくは、皮膚から活性成分を取り除くために接着剤を使用する。適切な接着剤には、水性ベースの接着剤、溶液ベースの接着剤およびホットメルト接着剤が含まれる。適切な接着剤の例には、ＨＢ−Ｆｕｌｌｅｒ  Ｃｏ．（セントポール，ミネソタ州）から入手可能なＨＬ−１４９１、ＡＴＯ−Ｆｉｎｄｌｅｙ（Ｗａｗａｔａｕｓａ、ウイスコンシン州）から入手可能なＨ−２５４３および、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｒｃｈ  ＆  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ブリッジウォーター、ニュージャージー州）から入手可能なＲｅｓｙｎ  ３４−５５３４等のスチレンブロックコポリマーと粘着性レジンをベースとするものが含まれるが、これらに限られるわけではない。エチレン酢酸ビニルコポリマーを含む、エチレンコポリマーも接着剤として有用である。
【０００８】
適切な接着剤には、アクリルベースの接着剤、デキストリンベースの接着剤およびウレタンベースの接着剤、ならびに、天然および合成のエラストマーも含まれる。本接着剤には、非晶質ポリプロピレン（amorphous polypropylene）、例えばＨＢ  Ｆｕｌｌｅｒから入手可能なＨＬ−１３０８またはＨｕｎｔｓｍａｎ（Ｏｄｅｓｓｓａ、テキサス州）から入手可能なＲｅｘｔａｃ  ＲＴ２３７３、を含む非晶質ポリオレフィンも含まれ得る。本接着剤は、Ｋｒａｔｏｎ（登録商標）ブランド合成エラストマーまたは天然ゴムをベースにし得る。これらの接着剤には、本技術で公知の、粘着付与剤、抗酸化剤、プロセスオイル等も含まれ得る。
【０００９】
一実施形態では、接着剤を、紙またはポリマーフィルム（例えばテープ）等の基質の上にコーティングし、次いで皮膚に塗布し得る。このテープは、活性成分を皮膚から抽出するのに十分な時間、皮膚上に残される。テープが皮膚の上に残される時間量は、接着剤および活性成分に依存するが、一般的に１秒〜１時間の範囲に入り得る。
【００１０】
本発明の第三のステップでは、放出可能に取り入れられた活性成分の一部分を含む吸収性材料が皮膚から取り除かれる。吸収性材料は、典型的には、本技術で公知のやり方で皮膚から剥がされる。
【００１１】
本発明の第四のステップでは、吸収性材料に放出可能に取り入れられた活性成分の全てまたは一部分を吸収性材料から抽出し、分析のために細胞成長培地と組み合わせる。活性成分は、抽出される特定の活性成分の抽出のために適切な溶媒を使用して抽出し得る。当業者ならば、一旦本開示の恩恵に浴せば、特定の活性成分に適した溶媒を容易に確認できるであろう。選択された溶媒は、また、本発明の方法で使用される細胞に対し細胞傷害性を有しないものでなければならない。特定の実施形態では、吸収性材料が細胞成長培地中に置かれ、この成長培地の存在下、活性成分が抽出され得る。生細胞を支持する任意の成長培地を使用し得る。このような成長培地の一つにＲＰＭＩ培地１６４０（ＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ  １６４０）がある。
【００１２】
本発明の第五のステップでは、皮膚から取り除いた時点の活性成分の効能を決めるための生物指標を生じるのに有効な時間をかけて、細胞成長培地の培養細胞を培養する。この生細胞は種々の細胞タイプのものであり得る。本発明のプロセスに有用な生細胞の適切な例には、マウスの細胞およびヒト由来の細胞（例えばＨａｃａｔ  ケラチノサイト細胞およびジャーカットＴ細胞（Jurkat T-cells））が含まれるが、これらに限られるわけではない。培養の期間は、計測される生物指標に依存して変わり得るが、典型的には、１分〜２４時間の間のどれか（例えば８時間または１６時間）である。
【００１３】
本発明の最後のステップでは、所望の効能を表示する特定の生物指標について培養細胞が分析される。適切な生物指標には、サイトカイン、例えばインターロイキン１、インターロイキン２（「ＩＬ−２」）またはインターロイキン６、および活性酸素種、例えばアルコール類および過酸化物、が含まれるが、これらに限られるわけではない。この細胞によって生じた生物指標は、たとえば高性能液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、酵素連結型免疫学的検定等の本技術で公知の方法で定量し得る。
【００１４】
本発明の本質およびそれを実行する方法を更に例証するために、以下にいくつかの例について説明する。しかしながら、本発明は、これらの詳細に限定されるものと考えるべきではない。
【００１５】
〔実施例〕
ｉ．Ｃｌｅａｎ  ＆  Ｃｌｅａｒ  Ｐｅｒｓａ−Ｇｅｌ（登録商標）１０（１０％の過酸化ベンゾイル局所用クリーム）の〜４ｍｇ／ｃｍ2の局所的塗布１時間後、Ｓｅｂｕｔａｐｅをこの皮膚領域に塗布した。Ｈａｃａｔ（ケラチノサイト）細胞を、このテープ細片からの抽出物で処理し、次いで、過酸化水素の検出を終点として、活性酸素種（「ＲＯＳ」）について評価した。細胞は、Ｐｅｒｓａ−Ｇｅｌ軟膏の１：１０００希釈物および３０％過酸化水素の１：１０００希釈物でも処理された。未処理の細胞（１２５Ｍ．Ｆ．Ｕ．過酸化水素）との比較において、抽出されたテープ片（４００Ｍ．Ｆ．Ｕ．過酸化水素）からの過酸化物種の検出が、軟膏（３５０Ｍ．Ｆ．Ｕ．過酸化水素）による１：１０００処理に比肩していた。したがって、この方法により、皮膚テープからの抽出後に、皮膚に局所的に塗布された抗にきび薬剤の存在および生体外での活性が検出された。
【００１６】
ｉｉ．ヒドロコルチゾンクリームの経時的効能を立証するためのテストに３人のパネリストが選ばれた。それぞれのパネリストの掌側の前腕内に四つの矩形のマークを付けた。第一の正方形の外縁を肘の折り目から約１２．７ｍｍ（半インチ）の所に置いた。ついで、角箱の内角の上に不鮮明にならない（non-smearable）インクを付けて、皮膚にマークを付けた。この矩形のほぼ中央に均一の細線で１％のヒドロコルチゾンを含む製品を、最上部から最低部まで塗布した（３２μＬ／矩形）。ついで、それぞれの製品を、約１０秒かけて円を描くようにして、矩形領域のみに注意深くすりこんだ。
【００１７】
製品の塗布後指示された時間経ってから、適当な皮膚の場所にＳｅｂｕｔａｐｅ（登録商標）の細片を貼り付けた。手袋をした手で、細片をピンセットでシートから取り除き、皮膚の矩形の中央に貼り付け、しっかりと圧迫し、１分後にピンセットで取り外した。ついで、テープを、適切に標識した小びん中に、皮膚側を下にして置いた。最後に、５００μＬの細胞成長培地ＲＰＭＩ  １６４０をそれぞれの小びんに添加し、その小びんを、ＩＬ−２評価の時まで、−８０℃のフリーザーに置いた。
【００１８】
小びんを氷上で解凍し、次いで、氷上で１５分間超音波で分解した。ジャーカット細胞を、９６ウエルの丸底皿上に、１００μＬ中１００，０００細胞／ウエルの割合で置いた。次いで、細胞に、ホルボールミリスチン酸アセテート（「ＰＭＡ」、２００ｎｇ／ｍＬ）およびフィトヘマグルチニン（「ＰＨＡ」、１６μｇ／ｍＬ）の５０μＬ混合物を添加して、ＩＬ−２を産生するよう刺激した。次いで、１０秒間ボルテックス処理の後のサンプル小びんからの５０μＬの培地で、指定されたサンプルウエルを処理した。二つのウエルを処理するために各サンプルを使用した。刺激用のみのために指定されたウエルに対し、５０μＬのＲＰＭＩ細胞成長培地＋１０％のウシの胎児の血清（「ＦＢＳ」）成長培地を添加した。プレートを、３７℃と５％のＣＯ2下、夜間に約１６時間かけて培養した。
【００１９】
培養後、上澄を取り除き、低結合性の（ｌｏｗ−ｂｉｎｄｉｎｇ）９６ウエルプレートへ移した。上澄は、ＲＭＰＩ成長培地中１：５に希釈し、Ｕｐｓｔａｔｅキットを使用し、メーカープロトコルに従って、ＩＬ−２濃度を評価し、Ｌｕｍｉｎｅｘ  １００マルチ検体探知器（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ、オースティン、テキサス州）で分析した。Ｌｕｍｉｎｅｘの値は、プレートに含まれた既知のＩＬ−２濃度からの標準曲線を使用して、実際のＩＬ−２濃度値と相関させた。刺激されたウエル中の平均濃度が、基準のＩＬ−２放出として決定された。
【００２０】
この基準値の抑制率を計算するために、処理されたウエル中の濃度の計算値が用いられた。それぞれのプレートには一組の刺激されたウエルが含まれ、それぞれのプレートに対しこの計算が独立に行われた。それぞれの時点でそれぞれの製品の結果を比較するためにパネリストの結果が編集された。グループ間の差異の有意性を評価するために、不対スチューデントｔ−検定（Ｕｎｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  Ｔ−Ｔｅｓｔｓ）が行われた。全ての試験セットの有意水準は、＜０．０５の値であった。
【００２１】
これらの結果により、ヒドロコルチゾンで処理された皮膚が、１時間、７時間および１２時間で、ＩＬ−２の産生を抑制することが立証された。平均的なＩＬ−２抑制率は、１時間で６６、７時間で６１および、１２時間で６７であった。このデータは、これらの時間で試験されたヒドロコルチゾンクリームの効能を支持するものである。
【００２２】
本発明の好ましい実施態様は以下の通りである。
（１）  局所的に塗布された活性成分の効能を立証するための方法において、
活性成分を含有する組成物を皮膚のある領域に局所的に塗布する段階と、
吸収性材料を前記皮膚領域に塗布して、前記活性成分の少なくとも一部分を前記皮膚領域から取り除き、それによって、活性成分の前記一部分を前記吸収性材料に放出可能に組み入れる段階と、
前記吸収性材料に組み入れられた活性成分の前記一部分を含む前記吸収性材料を前記皮膚から取り除く段階と、
前記活性成分を前記吸収性材料から抽出する段階と、
前記抽出した活性成分を、培養細胞を含む細胞成長培地と組み合わせる段階と、
生物指標を生じるのに有効な時間をかけて、前記細胞成長培地中の培養細胞を培養する段階と、
前記生物指標を計測して前記活性成分の効能を示す段階と、
を含む、方法。
（２）  実施態様１に記載の方法において、
前記活性成分が、レチノール、ジメチルアミノエタノール、テトラヒドロキシプロピル・エチレンジアミン、大豆、ナツシロギク、ヒドロコルチゾン、サリチル酸および過酸化ベンゾイルからなる群から選ばれる、方法。
（３）  実施態様１に記載の方法において、
前記吸収性材料が、接着剤、綿棒、粉体、フィルムおよびふき取り繊維（ｗｉｐｅ）からなる群から選ばれる、方法。
（４）  実施態様１に記載の方法において、
前記細胞成長培地が、ＲＰＭＩ培地１６４０（ＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ  １６４０）である、方法。
（５）  実施態様１に記載の方法において、
前記細胞が、マウスの細胞、Ｈａｃａｔケラチノサイト細胞およびジャーカットＴ細胞からなる群から選ばれる、方法。
（６）  実施態様１に記載の方法において、
前記生物指標が、インターロイキン１、インターロイキン２、インターロイキン６および活性酸素種からなる群から選ばれる、方法。
（７）  実施態様１に記載の方法において、
前記活性成分を含む組成物を前記皮膚領域に塗布した後１〜２４時間経ってから、前記皮膚領域に前記吸収性材料を塗布する、方法。
（８）  実施態様１に記載の方法において、
活性成分の前記一部分が、前記細胞成長培地の存在下、前記吸収性材料から抽出される、方法。
（９）  実施態様１に記載の方法において、
前記細胞が、前記細胞成長培地中、１分〜２４時間かけて培養される、方法。
【外国語明細書】
2007105034000001.pdf