(57)【要約】      （修正有）【課題】インフルエンザウイルスをはじめとする各種ウイルス感染、細菌感染、その他の病原体感染に伴う高熱時に使用可能な解熱鎮痛剤を判定する方法を提案することや、安全な解熱鎮痛剤をスクリーニングすること。【解決手段】血管内皮細胞に、インビトロでウイルスを感染させる前後又は同時に、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤を接触させ、あるいは、非ヒト動物に、ウイルスを感染させる前後又は同時に、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤を投与し、１）血管内皮細胞内のウイルスの増殖の程度を測定し、２）血管内皮細胞における血管の透過性の亢進の程度を測定し、又は、３）血液脳関門における血管内皮細胞間のタイトジャンクションを構成するタンパク質の発現量を測定し、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤無添加の場合と比較・評価する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管内皮細胞に、インビトロでウイルスを感染させる前後又は同時に、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤を接触させ、血管内皮細胞内のウイルスの増殖の程度を測定し、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤無添加の場合と比較・評価することを特徴とする薬剤による脳症あるいは脳炎・脳症の発症リスクを判定する方法。
【請求項２】
非ヒト動物に、ウイルスを感染させる前後又は同時に、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤を投与し、血管内皮細胞内のウイルスの増殖の程度を測定し、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤非投与の場合と比較・評価することを特徴とする薬剤による脳症あるいは脳炎・脳症の発症リスクを判定する方法。
【請求項３】
血管内皮細胞内のウイルスタンパク質又はウイルスゲノムの発現量を測定することを特徴とする請求項１又は２記載の薬剤による脳症あるいは脳炎・脳症の発症リスクを判定する方法。
【請求項４】
血管内皮細胞に、インビトロでウイルスを感染させる前後又は同時に、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤を接触させ、血管内皮細胞における血管の透過性の亢進の程度を測定し、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤無添加の場合と比較・評価することを特徴とする薬剤による脳症あるいは脳炎・脳症の発症リスクを判定する方法。
【請求項５】
非ヒト動物に、ウイルスを感染させる前後又は同時に、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤を投与し、血管内皮細胞における血管の透過性の亢進の程度を測定し、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤非投与の場合と比較・評価することを特徴とする薬剤による脳症あるいは脳炎・脳症の発症リスクを判定する方法。
【請求項６】
ＦＩＴＣ-conjugated dextranの透過性を測定することを特徴とする請求項４又は５記載の薬剤による脳症あるいは脳炎・脳症の発症リスクを判定する方法。
【請求項７】
血管内皮細胞に、インビトロでウイルスを感染させる前後又は同時に、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤を接触させ、血液脳関門における血管内皮細胞間のタイトジャンクションを構成するタンパク質の発現量を測定し、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤無添加の場合と比較・評価することを特徴とする薬剤による脳症あるいは脳炎・脳症の発症リスクを判定する方法。
【請求項８】
非ヒト動物に、ウイルスを感染させる前後又は同時に、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤を投与し、血液脳関門における血管内皮細胞間のタイトジャンクションを構成するタンパク質の発現量を測定し、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤非投与の場合と比較・評価することを特徴とする薬剤による脳症あるいは脳炎・脳症の発症リスクを判定する方法。
【請求項９】
タイトジャンクションを構成するタンパク質が、オクルディン若しくはクローディン、又はこれらと結合するＺＯ−１，ＺＯ−２，ＺＯ−３であることを特徴とする請求項７又は８記載の薬剤による脳症あるいは脳炎・脳症の発症リスクを判定する方法。
【請求項１０】
血管内皮細胞が、臍帯静脈内皮細胞又は脳血管内皮細胞であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載の薬剤による脳症あるいは脳炎・脳症の発症リスクを判定する方法。
【請求項１１】
血管内皮細胞が、ヒト血管内皮細胞であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか記載の薬剤による脳症あるいは脳炎・脳症の発症リスクを判定する方法。
【請求項１２】
血管内皮細胞が、樹立細胞であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか記載の薬剤による脳症あるいは脳炎・脳症の発症リスクを判定する方法。
【請求項１３】
ウイルスがインフルエンザウイルスであり、脳症あるいは脳炎・脳症が、インフルエンザ脳症あるいはインフルエンザ脳炎・脳症であることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか記載の薬剤による脳症あるいは脳炎・脳症の発症リスクを判定する方法。
【請求項１４】
血管内皮細胞に、インビトロでウイルスを感染させる前後又は同時に、候補薬剤を接触させ、血管内皮細胞内のウイルスの増殖の程度を測定し、候補薬剤無添加の場合と比較・評価することを特徴とする脳症あるいは脳炎・脳症の治療薬剤のスクリーニング方法。
【請求項１５】
非ヒト動物に、ウイルスを感染させる前後又は同時に、候補薬剤を投与し、血管内皮細胞内のウイルスの増殖の程度を測定し、候補薬剤非投与の場合と比較・評価することを特徴とする脳症あるいは脳炎・脳症の治療薬剤のスクリーニング方法。
【請求項１６】
ウイルスタンパク質又はウイルスゲノムの発現量を測定することを特徴とする請求項１４又は１５記載の脳症あるいは脳炎・脳症の治療薬剤のスクリーニング方法。
【請求項１７】
血管内皮細胞に、インビトロでウイルスを感染させる前後又は同時に、候補薬剤を接触させ、血管内皮細胞における血管の透過性の亢進の程度を測定し、候補薬剤無添加の場合と比較・評価することを特徴とする脳症あるいは脳炎・脳症の治療薬剤のスクリーニング方法。
【請求項１８】
非ヒト動物に、ウイルスを感染させる前後又は同時に、候補薬剤を投与し、血管内皮細胞における血管の透過性の亢進の程度を測定し、候補薬剤非投与の場合と比較・評価することを特徴とする脳症あるいは脳炎・脳症の治療薬剤のスクリーニング方法。
【請求項１９】
ＦＩＴＣ-conjugated dextranの透過性を測定することを特徴とする請求項１７又は１８記載の脳症あるいは脳炎・脳症の治療薬剤のスクリーニング方法。
【請求項２０】
血管内皮細胞に、インビトロでウイルスを感染させる前後又は同時に、候補薬剤を接触させ、血液脳関門における血管内皮細胞間のタイトジャンクションを構成するタンパク質の発現量を測定し、候補薬剤無添加の場合と比較・評価することを特徴とする脳症あるいは脳炎・脳症の治療薬剤のスクリーニング方法。
【請求項２１】
非ヒト動物に、ウイルスを感染させる前後又は同時に、候補薬剤を投与し、血液脳関門における血管内皮細胞間のタイトジャンクションを構成するタンパク質の発現量を測定し、候補薬剤非投与の場合と比較・評価することを特徴とする脳症あるいは脳炎・脳症の治療薬剤のスクリーニング方法。
【請求項２２】
タイトジャンクションを構成するタンパク質が、オクルディン若しくはクローディン、又はこれらと結合するＺＯ−１，ＺＯ−２，ＺＯ−３であることを特徴とする請求項２０又は２１記載の脳症あるいは脳炎・脳症の治療薬剤のスクリーニング方法。
【請求項２３】
血管内皮細胞が、臍帯静脈内皮細胞又は脳血管内皮細胞であることを特徴とする請求項１４〜２２のいずれか記載の脳症あるいは脳炎・脳症の治療薬剤のスクリーニング方法。
【請求項２４】
血管内皮細胞が、ヒト血管内皮細胞であることを特徴とする請求項１４〜２３のいずれか記載の脳症あるいは脳炎・脳症の治療薬剤のスクリーニング方法。
【請求項２５】
血管内皮細胞が、樹立細胞であることを特徴とする請求項１４〜２４のいずれか記載の脳症あるいは脳炎・脳症の治療薬剤のスクリーニング方法。
【請求項２６】
ウイルスがインフルエンザウイルスであり、脳症あるいは脳炎・脳症が、インフルエンザ脳症あるいはインフルエンザ脳炎・脳症であることを特徴とする請求項１４〜２５のいずれか記載の脳症あるいは脳炎・脳症の治療薬剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、解熱鎮痛剤及びこれに関連する薬剤を対象とした脳症あるいは脳炎・脳症の発症リスクを判定(決定)する方法、及び、脳症あるいは脳炎・脳症の治療薬剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザ感染に伴って、一部の小児では、意識障害、熱性痙攣、重積痙攣、嘔吐など脳浮腫と脳圧の亢進による中核神経症状が認められ、急速な経過をたどって死に至ることがある。このような患者をインフルエンザ脳症（例えば、非特許文献１及び２参照）と診断している。これ以外に、インフルエンザ感染など、熱を伴う急性感染症時に、ＮＳＡＩＤ（非ステロイド系抗炎症薬）の中で、特にジクロフェナックソジューム（diclophenac sodium）やアスピリン（aspirinTM、アセチルサリチル酸）, メフェナム酸（mefenamic acid）などの解熱剤の服用をきっかけにして脳症が起きる疾患を、特にライ症候群（Reye’s Syndrome）と呼んでいる。これらのインフルエンザ脳症あるいはインフルエンザ脳炎・脳症やライ症候群の原因はいまだに明確にされておらず、従って一つの疾患としてはっきり定義されているものではないことから、医療の現場において高熱を伴う患者にどのような解熱剤を使用したら良いか医師はこれまでの経験に頼るのみで、具体的で論理的な判断基準を持たない。また、該インフルエンザ脳炎・脳症と、ライ症候群あるいは急性壊死性脳症（acute necrotizing encephalopathy;ＡＮＥ）との区別も明確ではない（例えば、非特許文献３及び４参照）。    
【０００３】
他方、インフルエンザ脳症の治療薬としては、セレギリン（化学名：（Ｒ）−（−）−Ｎ，α−ジメチル−Ｎ−２−プロピニル−フェネチルアミン）またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する抗ウイルス剤（例えば、特許文献１参照）や、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン（例えば、特許文献２参照）が提案され、また、インフルエンザ脳症等のウイルス性脳炎・脳症の診断薬としては、チトクロムＣに対する抗体を構成成分とする、体液中のチトクロムＣのサンドイッチ法による定量用のチトクロムＣ測定試薬が提案されている（例えば、特許文献３参照）。そしてまた、本発明者らは、脳炎・脳症の発症が疑われる患者由来の電位依存性陰イオンチャンネル（ＶＤＡＣ）を含む検体を用意し、該検体中のＶＤＡＣ発現レベルを測定し、該発現レベルの増加を指標として脳炎・脳症の発症および発症リスクを検出する方法、脳炎・脳症を誘起するおそれのある薬剤による脳炎・脳症の発症リスクを検定する方法、および脳炎・脳症の処置のための候補薬剤をスクリーニングする方法（例えば、特許文献４参照）を提案している。
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−２９２３９９号公報
【特許文献２】特開２００４−１４３０６８号公報
【特許文献３】国際公開ＷＯ０１／０３５０９３
【特許文献４】特開２００４−２６４０６６号公報
【非特許文献１】加地正英、内科  90巻5号, 5849-853, 2002
【非特許文献２】森島恒雄、厚生省研究班全国調査、小児診療、63: 2065, 2000
【非特許文献３】富樫武弘、「インフルエンザ脳炎・脳症」、日本臨床,58巻,11号,pp.87-92,2002
【非特許文献４】森島恒雄、「インフルエンザ脳炎・脳症の病態と戦略」、綜合臨牀,Vol.49,No.2,pp.300-305,2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
近年、インフルエンザウイルス感染に伴う、あるいはこれに続く脳炎・脳症の報告が増加している。またインフルエンザに感染した患者が解熱鎮痛剤を服用したときに生ずる脳症としてライ症候群が報告されている。しかし、インフルエンザウイルス感染に伴い投与される解熱鎮痛剤等、薬剤に起因するライ症候群の発症リスクを事前に判定する検査法に関するいまだ具体的提案はない。現状では新薬として開発される全ての解熱鎮痛剤は、ライ症候群やインフルエンザ脳症、脳炎の発症リスクを潜在的に有しており、今後これら新薬の発症リスクの測定を可能とする方法の開発が強く望まれている。
【０００６】
本発明の課題は、インフルエンザウイルスをはじめとする各種ウイルス感染、細菌感染、その他の病原体感染に伴う高熱時に使用可能な解熱鎮痛剤を判定する方法を提案することや、安全な解熱鎮痛剤をスクリーニングすることにある。より詳しくは、インフルエンザ脳症をはじめとして、解熱鎮痛剤及びこれに関連する薬剤の服用をきっかけとして生じることが報告されているライ症候群などが、結果として脳の血管内皮細胞の膜透過性の亢進による脳の浮腫を生じることから、脳の血管内皮細胞の膜透過性の亢進に関与しない安全な解熱鎮痛剤をスクリーニングすることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、かねてから、急激な脳浮腫を主要な症状とするインフルエンザ脳症、インフルエンザ脳炎・脳症の発症因子、発症感受性因子乃至発症機序を解明するべく鋭意研究を重ねてきた。さらに病原体の体内侵入時に発生する高熱に対して使用される解熱鎮痛剤の服用をきっかけとして起きる重症な脳浮腫の原因を解明すべく研究を進めてきている。その結果、脳の血管透過性を決めている血液脳関門が、様々な経路によって結果として障害されることが原因となり、浮腫が発症していることを明らかにした。その原因の一つに１）解熱鎮痛剤及びこれに関連する薬剤の中には、脳の血管内皮細胞でのウイルス増殖を促進する効果のある薬剤が見いだされ、ウイルスの細胞内増殖に与える影響を予めヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、あるいはヒトの脳血管内皮細胞を用いて評価することが可能となった。２）脳血管内皮細胞膜の透過性を決定している血液脳血管関門の構成成分の組成の減少を誘導して、脳血管内皮細胞の膜透過性の変化を引き起こす病原体、解熱鎮痛剤及びこれに関連する薬剤のスクリーニングが、fluorescein-5-isothiocyanate (ＦＩＴＣ)-conjugated dextran (Molecular Probes, Eugene, ＯＲ; １０μｇ/ｍｌ, ７０，０００ＭＷ)、あるいはこれに相当する血管透過性指示薬を使用することで可能となった。
【０００８】
より詳しくは、本発明者らは、インフルエンザウイルス感染に解熱鎮痛剤及びこれに関連する薬剤を投与することで、脳血管内皮細胞でのウイルスの増殖を引き起こす解熱鎮痛剤を発見し、ウイルス増殖の亢進した細胞では血液脳血管関門の透過性の亢進が起こることをＦＩＴＣ-conjugated-dextranで証明した。さらに脳血管内皮細胞でのウイルスの増殖を引き起こさない解熱鎮痛剤でも、結果として血液脳血管関門のタイトジャンクションを構成している組成の減少を引き起こし、血液脳血管関門の透過性の亢進の起こることを証明した。以上の知見に基づき、薬剤による脳症あるいは脳炎・脳症の発症リスクを判定する方法や、脳症あるいは脳炎・脳症の治療薬剤のスクリーニング方法に関する発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、（１）血管内皮細胞に、インビトロでウイルスを感染させる前後又は同時に、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤を接触させ、血管内皮細胞内のウイルスの増殖の程度を測定し、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤無添加の場合と比較・評価することを特徴とする薬剤による脳症あるいは脳炎・脳症の発症リスクを判定する方法や、（２）非ヒト動物に、ウイルスを感染させる前後又は同時に、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤を投与し、血管内皮細胞内のウイルスの増殖の程度を測定し、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤非投与の場合と比較・評価することを特徴とする薬剤による脳症あるいは脳炎・脳症の発症リスクを判定する方法や、（３）血管内皮細胞内のウイルスタンパク質又はウイルスゲノムの発現量を測定することを特徴とする上記（１）又は（２）記載の薬剤による脳症あるいは脳炎・脳症の発症リスクを判定する方法に関する。
【００１０】
また本発明は、（４）血管内皮細胞に、インビトロでウイルスを感染させる前後又は同時に、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤を接触させ、血管内皮細胞における血管の透過性の亢進の程度を測定し、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤無添加の場合と比較・評価することを特徴とする薬剤による脳症あるいは脳炎・脳症の発症リスクを判定する方法や、（５）非ヒト動物に、ウイルスを感染させる前後又は同時に、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤を投与し、血管内皮細胞における血管の透過性の亢進の程度を測定し、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤非投与の場合と比較・評価することを特徴とする薬剤による脳症あるいは脳炎・脳症の発症リスクを判定する方法や、（６）ＦＩＴＣ-conjugated dextranの透過性を測定することを特徴とする上記（４）又は（５）記載の薬剤による脳症あるいは脳炎・脳症の発症リスクを判定する方法に関する。
【００１１】
また本発明は、（７）血管内皮細胞に、インビトロでウイルスを感染させる前後又は同時に、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤を接触させ、血液脳関門における血管内皮細胞間のタイトジャンクションを構成するタンパク質の発現量を測定し、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤無添加の場合と比較・評価することを特徴とする薬剤による脳症あるいは脳炎・脳症の発症リスクを判定する方法や、（８）非ヒト動物に、ウイルスを感染させる前後又は同時に、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤を投与し、血液脳関門における血管内皮細胞間のタイトジャンクションを構成するタンパク質の発現量を測定し、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤非投与の場合と比較・評価することを特徴とする薬剤による脳症あるいは脳炎・脳症の発症リスクを判定する方法や、（９）タイトジャンクションを構成するタンパク質が、オクルディン若しくはクローディン、又はこれらと結合するＺＯ−１，ＺＯ−２，ＺＯ−３であることを特徴とする上記（７）又は（８）記載の薬剤による脳症あるいは脳炎・脳症の発症リスクを判定する方法に関する。
【００１２】
また本発明は、（１０）血管内皮細胞が、臍帯静脈内皮細胞又は脳血管内皮細胞であることを特徴とする上記（１）〜（９）のいずれか記載の薬剤による脳症あるいは脳炎・脳症の発症リスクを判定する方法や、（１１）血管内皮細胞が、ヒト血管内皮細胞であることを特徴とする上記（１）〜（１０）のいずれか記載の薬剤による脳症あるいは脳炎・脳症の発症リスクを判定する方法や、（１２）血管内皮細胞が、樹立細胞であることを特徴とする上記（１）〜（１１）のいずれか記載の薬剤による脳症あるいは脳炎・脳症の発症リスクを判定する方法や、（１３）ウイルスがインフルエンザウイルスであり、脳症あるいは脳炎・脳症が、インフルエンザ脳症あるいはインフルエンザ脳炎・脳症であることを特徴とする上記（１）〜（１２）のいずれか記載の薬剤による脳症あるいは脳炎・脳症の発症リスクを判定する方法に関する。
【００１３】
さらに本発明は、（１４）血管内皮細胞に、インビトロでウイルスを感染させる前後又は同時に、候補薬剤を接触させ、血管内皮細胞内のウイルスの増殖の程度を測定し、候補薬剤無添加の場合と比較・評価することを特徴とする脳症あるいは脳炎・脳症の治療薬剤のスクリーニング方法や、（１５）非ヒト動物に、ウイルスを感染させる前後又は同時に、候補薬剤を投与し、血管内皮細胞内のウイルスの増殖の程度を測定し、候補薬剤非投与の場合と比較・評価することを特徴とする脳症あるいは脳炎・脳症の治療薬剤のスクリーニング方法や、（１６）ウイルスタンパク質又はウイルスゲノムの発現量を測定することを特徴とする上記（１４）又は（１５）記載の脳症あるいは脳炎・脳症の治療薬剤のスクリーニング方法に関する。
【００１４】
また本発明は、（１７）血管内皮細胞に、インビトロでウイルスを感染させる前後又は同時に、候補薬剤を接触させ、血管内皮細胞における血管の透過性の亢進の程度を測定し、候補薬剤無添加の場合と比較・評価することを特徴とする脳症あるいは脳炎・脳症の治療薬剤のスクリーニング方法や、（１８）非ヒト動物に、ウイルスを感染させる前後又は同時に、候補薬剤を投与し、血管内皮細胞における血管の透過性の亢進の程度を測定し、候補薬剤非投与の場合と比較・評価することを特徴とする脳症あるいは脳炎・脳症の治療薬剤のスクリーニング方法や、（１９）ＦＩＴＣ-conjugated dextranの透過性を測定することを特徴とする上記（１７）又は（１８）記載の脳症あるいは脳炎・脳症の治療薬剤のスクリーニング方法に関する。
【００１５】
また本発明は、（２０）血管内皮細胞に、インビトロでウイルスを感染させる前後又は同時に、候補薬剤を接触させ、血液脳関門における血管内皮細胞間のタイトジャンクションを構成するタンパク質の発現量を測定し、候補薬剤無添加の場合と比較・評価することを特徴とする脳症あるいは脳炎・脳症の治療薬剤のスクリーニング方法や、（２１）非ヒト動物に、ウイルスを感染させる前後又は同時に、候補薬剤を投与し、血液脳関門における血管内皮細胞間のタイトジャンクションを構成するタンパク質の発現量を測定し、候補薬剤非投与の場合と比較・評価することを特徴とする脳症あるいは脳炎・脳症の治療薬剤のスクリーニング方法や、（２２）タイトジャンクションを構成するタンパク質が、オクルディン若しくはクローディン、又はこれらと結合するＺＯ−１，ＺＯ−２，ＺＯ−３であることを特徴とする上記（２０）又は（２１）記載の脳症あるいは脳炎・脳症の治療薬剤のスクリーニング方法に関する。
【００１６】
また本発明は、（２３）血管内皮細胞が、臍帯静脈内皮細胞又は脳血管内皮細胞であることを特徴とする上記（１４）〜（２２）のいずれか記載の脳症あるいは脳炎・脳症の治療薬剤のスクリーニング方法や、（２４）血管内皮細胞が、ヒト血管内皮細胞であることを特徴とする上記（１４）〜（２３）のいずれか記載の脳症あるいは脳炎・脳症の治療薬剤のスクリーニング方法や、（２５）血管内皮細胞が、樹立細胞であることを特徴とする上記（１４）〜（２４）のいずれか記載の脳症あるいは脳炎・脳症の治療薬剤のスクリーニング方法や、（２６）ウイルスがインフルエンザウイルスであり、脳症あるいは脳炎・脳症が、インフルエンザ脳症あるいはインフルエンザ脳炎・脳症であることを特徴とする上記（１４）〜（２５）のいずれか記載の脳症あるいは脳炎・脳症の治療薬剤のスクリーニング方法に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によると、既存の解熱鎮痛剤の評価と今後開発される解熱鎮痛剤及びこれに関連する薬剤の安全性の評価をすることや、脳炎・脳症の治療薬のスクリーニングが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の薬剤による脳症あるいは脳炎・脳症の発症リスクを判定する方法としては、血管内皮細胞に、インビトロでウイルスを感染させる前後又は同時に、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤を接触させ、１）血管内皮細胞内のウイルスの増殖の程度を測定し、２）血管内皮細胞における血管の透過性の亢進の程度を測定し、又は、３）血液脳関門における血管内皮細胞間のタイトジャンクションを構成するタンパク質の発現量を測定し、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤無添加の場合と比較・評価する方法や、非ヒト動物に、ウイルスを感染させる前後又は同時に、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤を投与し、１）血管内皮細胞内のウイルスの増殖の程度を測定し、２）血管内皮細胞における血管の透過性の亢進の程度を測定し、又は、３）血液脳関門における血管内皮細胞間のタイトジャンクションを構成するタンパク質の発現量を測定し、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤非投与の場合と比較・評価する方法であれば特に制限されず、本発明によると、既知の解熱鎮痛剤や新規な解熱鎮痛候補薬剤が、その投与によって患者に脳症あるいは脳炎・脳症を発症させるリスクを有するか否か、また、そのリスクの程度を判定することができ、脳症あるいは脳炎・脳症の発症に関する薬剤安全性を検査 (安全性検査)することができる。そして、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤の存在（投与）下と非存在（非投与）下において、ウイルスの増殖の程度、血管の透過性の亢進の程度、タイトジャンクションを構成するタンパク質の発現量を対比して、少なくとも増加しないこと(その差がゼロ若しくはマイナスであること)をもって、脳炎・脳症を発症するリスクが少ないと判断できる。
【００１９】
また、本発明の脳症あるいは脳炎・脳症の治療薬剤のスクリーニング方法としては、血管内皮細胞に、インビトロでウイルスを感染させる前後又は同時に、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤を接触させ、１）血管内皮細胞内のウイルスの増殖の程度を測定し、２）血管内皮細胞における血管の透過性の亢進の程度を測定し、又は、３）血液脳関門における血管内皮細胞間のタイトジャンクションを構成するタンパク質の発現量を測定し、候補薬剤無添加の場合と比較・評価する方法や、非ヒト動物に、ウイルスを感染させる前後又は同時に、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤を投与し、１）血管内皮細胞内のウイルスの増殖の程度を測定し、２）血管内皮細胞における血管の透過性の亢進の程度を測定し、又は、３）血液脳関門における血管内皮細胞間のタイトジャンクションを構成するタンパク質の発現量を測定し、候補薬剤無添加の場合と比較・評価する方法であれば特に制限されず、本発明によると、脳症あるいは脳炎・脳症の治療薬剤ばかりでなく、有力な候補薬剤をもスクリーニングすることができる。そして、候補薬剤の存在（投与）下と非存在（非投与）下において、ウイルスの増殖の程度、血管の透過性の亢進の程度、タイトジャンクションを構成するタンパク質の発現量を対比して、少なくとも増加しないこと(その差がゼロ若しくはマイナスであること)をもって、脳症あるいは脳炎・脳症の治療用の候補薬剤として選別することができる。
【００２０】
上記血管内皮細胞としては臍帯静脈内皮細胞又は脳（毛細）血管内皮細胞を好適に例示することができ、また、その由来としては特に制限されず、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ヒツジ、サル、ウサギ、ウマ、ウシ、トリ等を例示することができるが、ヒト由来の血管内皮細胞が好ましく、さらに、これらの樹立した細胞（株化した細胞）も有利に用いることができる。また、上記非ヒト動物としては、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ヒツジ、サル、ウサギ、ウマ、ウシ、トリ等を例示することができる。
【００２１】
上記ウイルスとしては、インフルエンザウイルス、ラウス肉腫ウイルス、アデノウイルス、麻疹ウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、日本脳炎ウイルス、コロナウイルス、免疫不全ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス等を例示することができ、中でもインフルエンザウイルスを好適に挙げることができる。これらウイルスは、上記血管内皮細胞や非ヒト動物に感染しうる種類を用いることが好ましい。
【００２２】
また、脳症あるいは脳炎・脳症としては、インフルエンザウイルス脳症、エイズ脳症等のウイルス性脳症や、サイトメガロウイルス脳炎、日本脳炎等のウイルス性脳炎を挙げることができ、中でもインフルエンザ脳症あるいはインフルエンザ脳炎・脳症やライ症候群を好適に例示することができる。ここで、「インフルエンザ脳症」あるいは「インフルエンザ脳炎・脳症」とは、インフルエンザウイルス感染をきっかけとして発熱・痙攣と早期の意識障害が発症し、時にＣＴで脳浮腫、両側視床病変を伴う疾患をいう。かかるインフルエンザ脳症あるいはインフルエンザ脳炎・脳症は、インフルエンザ感染に伴って、脳浮腫、あるいは脳浮腫を伴う中枢神経障害を認める全ての脳炎・脳症を包含する。また、該インフルエンザ脳症あるいはインフルエンザ脳炎・脳症には、これまで一般的に定義されてきたライ症候群、急性壊死性脳症、出血性ショックを伴うＨＳＥＳ（hemorrhagic shock and encephalopathy syndrome）などの疾患も含まれる場合がある。更に、インフルエンザウイルス感染以外にその他の病原体の感染を契機として脳浮腫、並びに中枢神経障害を伴う脳炎・脳症も包含される。上記「脳症」あるいは「脳炎・脳症」は、上記インフルエンザ脳炎・脳症を初めとして、発症因子としてＶＤＡＣ発現レベルの上昇が認められる各種の脳炎・脳症を包含する。即ち、ウイルス並びに薬剤に関わりなく、血液脳関門の障害による脳浮腫のリスクがあると想定される場合は、上記脳症あるいは脳炎・脳症に含まれる対象疾患とする。
【００２３】
血管内皮細胞にインビトロでウイルスを感染させる方法としては、血管内皮細胞が死滅しない培養条件下でウイルスと接触させればよく、また、非ヒト動物にウイルスを感染させる方法としては、接触感染、飛沫感染、血液感染、経口感染、経皮感染、血液感染等各ウイルスの通常の感染ルートにより感染させることができる。
【００２４】
解熱鎮痛剤としては、アセトアミノフェン、アスピリン、アスピリンアルミニウム、エテンザミド、サザピリン、サリチルアミド、ラクチルフェネチジン、イブプロフェン、ジクロフェナックソジューム、プラノプロフェン等を挙げることができる。また、候補薬剤としては特に制限されず、核酸、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物、天然物（エキス）など、解熱鎮痛剤として開発予定の候補物質を挙げることができる。
【００２５】
血管内皮細胞内のウイルスの増殖の程度を測定する方法としては、キャプシドタンパク質、コアタンパク質等のウイルスタンパク質の発現量をウエスタンブロット法により測定する方法や、ウイルスゲノムの発現量をreal time PCR法により測定する方法を挙げることができる。例えば、ウエスタンブロット法は後述する実施例１記載の方法により、real time ＰＣＲ法は後述する実施例２記載の方法により実施することができる。
【００２６】
血管内皮細胞における血管の透過性の亢進の程度を測定する方法としては、ＦＩＴＣ-conjugated dextran、あるいはこれに相当する血管透過性指示薬の存在下、細胞が死滅しない条件 (温度、ｐＨ、培地組成など)で透過性を測定する方法を挙げることができる。例えば、透過性試験は後述する実施例４記載の方法により実施することができる。
【００２７】
血液脳関門における血管内皮細胞間のタイトジャンクションを構成するタンパク質の発現量を測定する方法としては、タイトジャンクションを構成するタンパク質であるオクルディン（Occludin）若しくはクローディン（claudin）、又はこれらと結合するＺＯ−１，ＺＯ−２，ＺＯ−３の発現量をウエスタンブロット法により半定量する方法を挙げることができる。例えば、血管内皮細胞間のタイトジャンクションを構成するタンパク質の発現量を測定する方法は、後述する実施例２記載の方法により実施することができる。
【００２８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２９】
（血管内皮細胞内のウイルスタンパク質ＨＡの増加）
市販されているヒト臍帯静脈内皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial cells , ＨＵＶＥＣ）を添付されているＥＧＭ−２基礎培養液に２％牛胎児血清(ＦＣＳ)、添加因子を加えた培養液で培養したものを供試細胞として用いた。供試細胞を６×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2で播種し、２日間培養した。０〜１００μＭのジクロフェナックソジュームを添加し、１２時間後に細胞をＥＧＭ−２基礎培養液で洗い、インフルエンザウイルス（Ａ/ＷＳＮ/３３）をｍｏｉ ４で感染させた。感染１時間後、０〜１００μＭのジクロフェナックソジュームを加えた培養用の培養液に交換し、その後５時間培養した。生理食塩水で細胞を洗い、ＲＩＰＡ buffer (５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ, ｐＨ ８.０; １５０ｍＭ ＮａＣｌ; １％ ＮＰ−４０; ０．５％ sodium deoxycholate and ０．１％ sodium dodecyl sulfate；ＳＤＳ)と１０μｇ／ｍｌ phenylmethyl sulfonyl fluoridesを加え、３０分間氷上で静置した。 スクレーパーで細胞を採り、遠心して上清を回収した。それぞれの上清タンパク質１０μｇをＳＤＳ−polyacrilamide電気泳動法で解析した。またウエスタンブロット法は以前報告されている方法（JBC vol. 277, No. 44, 42224-42232, 2002）で行った。抗ヘマグルチニン（ＨＡ）抗体(gifted by Dr. Ouchi; 1 : 2000 dilution)で反応させ、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）付加した特異的な二次抗体を用いて検出した。結果を図１に示す。
【００３０】
図１（上段）のウエスタンブロットの結果が示すように、インフルエンザウイルスを感染させたヒト臍帯静脈内皮細胞内で産生されるインフルエンザウイルスの膜タンパク質ＨＡが、ジクロフェナックソジュームの濃度を０から１０μＭ, １００μＭと増加させるにつれて増えているのがわかる。図１（下段）は同じ細胞由来の８０ｋＤａ内部標準タンパク質をＣＢＢ (Coomassie Brilliant Blue)で染色した結果を示し、その他の細胞内タンパク質に大きな変動のないことを示す。  
【実施例２】
【００３１】
（血管内皮細胞内のウイルスゲノムの増加）
ジクロフェナックソジュームによるインフルエンザウイルスの増殖促進効果をさらに確認するために、ＨＡタンパク質以外に、インフルエンザウイルスタンパク質であるＮＳ１をコードする遺伝子の細胞内の量を定量した。実施例１と同様に、１００μＭのジクロフェナックソジュームをあらかじめ添加した後でウイルス感染させた細胞を、感染０〜１２時間後にRNeasy mini kit (Qiagen, Hilden, Germany)を用いてＲＮＡを抽出した。インフルエンザウイルスタンパク質であるＮＳ１のコード領域を認識するウイルスゲノム特異的プライマーを用いて逆転写した。SYBR Green PCR kit及びABI 7700 systemを用いてReal time polymerase chain reaction (ＰＣＲ)を行った（Ping Cui et, al,. BBRC 315, 1004, 782-787）。ジクロフェナックソジュームの存在下と非存在下間での有意差検定はunpaired t-testをStatview 4.0 softwareを用いて行った。結果を図２に示す。図２において、縦軸は細胞内の１８Ｓ ｒＲＮＡの量を分母にしたときのウイルスＲＮＡを表し、＃：Ｐ＜０．００５, ＃＃：Ｐ＜０．００１, ＃＃＃：Ｐ＜０．０００５を示す。
【００３２】
図２に示すように、細胞内ウイルスＲＮＡ遺伝子は感染後３時間目から増加を始め、６〜９時間をピークにウイルスゲノムの複製が認められた。この条件下において、ジクロフェナックソジュームを添加したグループでは、明らかにウイルスＲＮＡの増加が認められ、実施例１に示すウイルスタンパク質以外にウイルスゲノムの増加も確認された。
【実施例３】
【００３３】
（血管内皮細胞間のタイトジャンクションを構成するタンパク質の崩壊）
実施例１と同様に、１００μＭジクロフェナックソジュームをあらかじめ添加してウイルス感染させた細胞を、感染６時間後ＮＰ−４０ buffer （２５ ｍＭ N-2-hydroxyethyhlpiperazine-N’-2- ethane-sulfonic acid [ＨＥＰＥＳ], ｐＨ ７．４; １５０ ｍＭ ＮａＣｌ; ４ｍＭ ethylenediamine -tetraacetic acid [ＥＤＴＡ]; １％  ＮＰ−４０; ２５ ｍＭ ＮａＦ, and １ｍＭ Ｎａ3Ｖ4）と１０ μｇ/ｍｌ phenylmethyl sulfonyl fluoridesで溶解した。遠心後、上清をＮＰ−４０ soluble fractionとして回収し、ペレットはＳＤＳ buffer (２５ ｍＭ ＨＥＰＥＳ; ４ｍＭ ＥＤＴＡ; １％ ＳＤＳ; ２５ ｍＭ ＮａＦ; and １ ｍＭ Ｎａ3Ｖ4) で再懸濁し、ＮＰ−４０ insoluble fractionとして回収した。それぞれのサンプル１０μｇをＳＤＳ-polyacrilamide電気泳動法で解析した。ウエスタンブロット法は実施例１と同様の方法で行った。マウス抗-ＺＯ-１抗体(Zymed Laboratories, South San Francisco, CA; １:２５０ dilution), マウス抗オクルディン抗体(Zymed Laboratories; １: ３００ dilution)と反応させ、ＨＲＰ付加した特異的な二次抗体を用いて検出した。結果を図３Ａに示す。図３ＡでＮＰ−４０ soluble fractionとＮＰ-４０ insoluble fractionにおいて、レーン１とレーン３は、１００μＭジクロフェナックソジュームを添加しない場合で、レーン２とレーン４はジクロフェナックソジュームを添加した場合を示し、レーン１とレーン２はウイルス感染無し、レーン３とレーン４はウイルス感染有りを示す。
【００３４】
図３Ａに示すように、血液脳関門のタイトジャンクションを構成するオクルディンは、ウイルス感染によって、ＮＰ−４０insoluble fractionから一部ＮＰ−４０ soluble fractionへ移動しており、タイトジャンクションの崩壊が始まっているが、これにさらにジクロフェナックソジュームを添加した場合、ＮＰ−４０ insoluble fractionのオクルディンが大量に消えて、タイトジャンクションの崩壊が増強されたことがわかる。また、タイトジャンクションを構成する細胞内成分のＺＯ-１は、ＮＰ-４０ insoluble fractionとＮＰ−４０ soluble fractionにおいて、ウイルス感染とジクロフェナックソジューム添加が重なった場合に、共にその量を減少させて、タイトジャンクションの崩壊が増強されたことがわかる。
【００３５】
実施例１と同様に、１００μＭジクロフェナックソジュームをあらかじめ添加してウイルス感染させた細胞を、感染６時間後４％パロホルムアルデヒドで固定した。０．１％ トライトンＸ―１００入り生理食塩水を入れて透過処理し、５％ skim milkでブロッキングした。ウサギ抗ヘマグルチニン(ＨＡ)抗体 (Takara Bio, Shiga, Japan)、抗ＺＯ-１抗体を反応させ、ＦＩＴＣ、テキサスレッド（Texas red） を付加した二次抗体を反応させて、蛍光顕微鏡を用いて観察した。結果を図３Ｂに示す。
【００３６】
緑色に染まるＦＩＴＣ標識抗ＺＯ-１抗体は細胞間のタイトジャンクションを構成するＺＯ-１を染色している。ＺＯ-１は、インフルエンザウイルスＷＳＮ株を感染させることで減少傾向にあるが、さらにジクロフェナックソジュームを添加することで減少はさらに加速された。さらに、赤色で示すウイルスタンパク質ＨＡは、ジクロフェナックソジュームを添加することで明らかに増加しており感染している細胞の数とウイルス量が増えているのがわかる。このようにジクロフェナックソジュームは、ウイルスに感染している細胞数を増やすだけでなくタイトジャンクションを構成するＺＯ-１の崩壊も促進している。
【実施例４】
【００３７】
（血管内皮細胞における血管の透過性の亢進）
１２ウェルプレートに膜透過性検定のためのインサート装置を入れ、その中に培養細胞を播種し、２日間培養した。実施例１と同様に、あらかじめ１００μＭ ジクロフェナックソジューム添加し、インフルエンザウイルスを感染させた。感染６時間後ＦＩＴＣ-conjugated dextran (Molecular Probes, Eugene, ＯＲ; １０μｇ/ｍｌ, ７０，０００ＭＷ)を加え、３７℃で３０分間静置した。インサートから漏れ出た培養液中のＦＩＴＣ-conjugated dextranを、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて測定した。各々の条件における膜透過性を、ウイルス感染もジクロフェナックソジューム添加もしていないときの自然状態でのＦＩＴＣ-conjugated dextranの透過率と比べて、有意差を検定した。結果を図４に示す。図４の縦軸はシステムに加えたＦＩＴＣ-conjugated dextranの中で、漏れ出たＦＩＴＣ-conjugated dextranの割合を示す。また、＊ｐ＜０．０５, ＊＊ｐ＜  ０．００１を表す。ウイルスに感染するだけで、膜透過性は有意に増加しているが、これにさらに１００μＭ ジクロフェナックソジュームが添加されると、膜透過性はさらに亢進した。
【実施例５】
【００３８】
（感染インフルエンザウイルス量の影響）
１００μＭジクロフェナックソジュームをあらかじめ添加し、ｍｏｉ ０〜４０でインフルエンザウイルスを感染させた。感染１２時間後に、実施例１と同様の方法でサンプルを回収し、インフルエンザウイルスタンパク質のＨＡと、タイトジャンクションを構成するＺＯ-１タンパク質の細胞内含量をウエスタンブロット法で測定した。結果を図５に示す。図５から、ヒト臍帯静脈内皮細胞内に感染するインフルエンザウイルス量を、ｍｏｉ０, ０．４, ４，４０と増加させるにつれて、細胞内のウイルスタンパク質のＨＡ含量は増加したが、ｍｏｉ ４以上において急激に増加した。これに伴って、ｍｏｉ ４以上においてタイトジャンクションを構成するＺＯ-１タンパク質の有意な減少が確認された。
【実施例６】
【００３９】
（ジクロフェナックソジュームとＣＯＸ阻害剤との作用点の相違）
実施例１と同様に培養した細胞に、０．４μＭのＣＯＸ(cyclooxygenase)１阻害剤であるフルルビプロフェン（Flurbiprofen）、又は１００μＭのＣＯＸ２阻害剤であるＮＳ３９８をそれぞれ添加し、インフルエンザウイルスを感染させた。感染１時間後、０．４μＭのフルルビプロフェン、１００μＭのＮＳ３９８を加えたそれぞれの培養用の培養液に交換し、その後５時間培養して細胞を回収した。実施例１と同様に、ウエスタンブロット法でインフルエンザウイルスタンパク質ＨＡの細胞内の量と、タイトジャンクションを構成するＺＯ-１タンパク質の細胞内含量の測定を行った。結果を図６に示す。図６中、レーン１とレーン３は、１００μＭジクロフェナックソジュームを添加しない場合で、レーン２とレーン４はジクロフェナックソジュームを添加した場合を示し、レーン１とレーン２はウイルス感染無し、レーン３とレーン４はウイルス感染有りを示す。
【００４０】
実施例３に示したように、ウイルスを感染させ、ジクロフェナックソジュームを添加することで、細胞内のインフルエンザウイルスのＨＡタンパク質は増加し、タイトジャンクションを構成するＺＯ-１タンパク質の細胞内含量は明らかに減少した。これまでジクロフェナックソジュームの抗炎症作用は、ＣＯＸ１とＣＯＸ２への阻害効果として説明されていた。そこで主にＣＯＸ１阻害剤として評価されているフルルビプロフェンと、主にＣＯＸ２阻害剤として評価されているＮＳ３９８のインフルエンザウイルスの細胞内増殖促進効果と、ＺＯ-１タンパク質の細胞内含量減少効果を検討した。その結果、ＣＯＸ阻害剤のフルルビプロフェンとＮＳ３９８は、共にジクロフェナックソジュームのようなインフルエンザウイルスの細胞内増殖促進効果と、ＺＯ-１タンパク質の細胞内含量減少効果を示さなかった。このことは、ジクロフェナックソジュームにこれまでに明らかにされていないＣＯＸ-１，ＣＯＸ-２ 以外の作用点があり、この作用点が細胞内のウイルス増殖促進作用とＺＯ-１タンパク質の細胞内含量の減少を引き起こしていると推定された。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ジクロフェナックソジューム存在下又は非存在下に、インフルエンザウイルスを感染させたヒト臍帯静脈内皮細胞内のインフルエンザウイルスの膜タンパク質ヘマグルチニン（ＨＡ）のウエスタンブロットによる測定結果を示す図である。
【図２】ジクロフェナックソジューム存在下又は非存在下に、インフルエンザウイルスを感染させたヒト臍帯静脈内皮細胞内のインフルエンザウイルスタンパク質ＮＳ１をコードする遺伝子のリアルタイムＰＣＲによる測定結果を示す図である。
【図３】ジクロフェナックソジューム存在下又は非存在下に、インフルエンザウイルス感染又は未感染のヒト臍帯静脈内皮細胞間のタイトジャンクションを構成するタンパク質オクルディン及びＺＯ-１の崩壊を示す図である。
【図４】ジクロフェナックソジューム存在下又は非存在下に、インフルエンザウイルスを感染させたヒト臍帯静脈内皮細胞と、ＦＩＴＣ-conjugated dextranとを用いて、血管の透過性の亢進を測定した結果を示す図である。
【図５】ジクロフェナックソジューム存在下に、インフルエンザウイルス感染又は未感染のヒト臍帯静脈内皮細胞内のインフルエンザウイルスの膜タンパク質ヘマグルチニン（ＨＡ）及びタイトジャンクションを構成するタンパク質ＺＯ-１のウエスタンブロットによる測定結果を示す図である。
【図６】ジクロフェナックソジューム存在下又は非存在下、あるいはＣＯＸ阻害剤存在下又は非存在下に、インフルエンザウイルス感染又は未感染のヒト臍帯静脈内皮細胞内のインフルエンザウイルスの膜タンパク質ヘマグルチニン（ＨＡ）及びタイトジャンクションを構成するタンパク質ＺＯ-１のウエスタンブロットによる測定結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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