(57)【要約】【課題】ローヤルゼリーが有する有用な生理作用の低下を抑えつつアレルギー性を低減させた低アレルゲン化ローヤルゼリーの製造方法を提供する。【解決手段】アレルギー性が低減されたローヤルゼリーの製造方法であって、生ローヤルゼリーをエンドペプチダーゼ作用とエキソペプチダーゼ作用を有するアルカリ性ペプチダーゼで処理することを特徴とする、方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アレルギー性が低減されたローヤルゼリーの製造方法であって、生ローヤルゼリーをエンドペプチダーゼ作用とエキソペプチダーゼ作用を有するアルカリ性ペプチダーゼで処理することを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記処理をアルカリ性条件下で行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アルカリ性ペプチダーゼが、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）産生ペプチダーゼである、請求項１または２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低アレルゲン化ローヤルゼリーの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生ローヤルゼリーは、有用な天然素材であるが、一方でアレルギー反応を引き起こす場合があることが知られている。
【０００３】
低アレルゲン化ローヤルゼリーとしては、ローヤルゼリーに、糖分解酵素処理及び蛋白質分解酵素処理を施すことにより、実質的に発現されない程度にアレルギー性を低減させた低アレルゲン化ローヤルゼリーが知られている（特許文献１参照）。特許文献2には、エンド型中性ぺプチダーゼを用いてローヤルゼリーのアレルギー性を低減させることが開示されている。しかしながら、これらの方法で酵素処理されたローヤルゼリーは依然としてアレルギー性を有するため、さらにアレルギー性を低減されたローヤルゼリーが求められている。
【０００４】
特許文献３は、食物アレルギーの原因となるタンパク質をエンドペプチダーゼとエキソペプチダーゼの両方で処理することが記載されている。
【特許文献１】特開２００２−１１２７１５号公報
【特許文献２】特開２００５−２８７４１１号公報
【特許文献３】特開２００１−３３３７９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、生ローヤルゼリーが有する有用な生理活性の低下を抑えつつアレルギー性を低減させた低アレルゲン化ローヤルゼリーの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の目的を達成するために検討を重ねた結果、生ローヤルゼリーをエンドペプチダーゼ作用とエキソペプチダーゼ作用の両方の作用を有する１つのアルカリ性ペプチダーゼで一段階酵素処理することにより、意外にも生ローヤルゼリーの有用な生理活性を維持しつつ、アレルギー性をさらに低減させた低アレルゲン化ローヤルゼリーが得られることを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の低アレルゲン化ローヤルゼリーの製造方法を提供するものである。
１．  アレルギー性が低減されたローヤルゼリーの製造方法であって、生ローヤルゼリーをエンドペプチダーゼ作用とエキソペプチダーゼ作用を有するアルカリ性ペプチダーゼで処理することを特徴とする、方法。
２．  前記処理をアルカリ性条件下で行うことを特徴とする、項１に記載の方法。
３．  前記アルカリ性ペプチダーゼが、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）産生ペプチダーゼである、項１または２に記載の方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、生ローヤルゼリーの有用性の維持とアレルギー性の低減という、両立することが困難な課題を解決することができた。
【０００９】
タンパク質をペプチダーゼ処理する場合、エンドペプチダーゼ作用とエキソペプチダーゼ作用を有するアルカリ性プロテアーゼを用いると、ペプチドの内部と末端の両方で徹底的に切断されることになる。特許文献3のように食物アレルギーの原因タンパク質の抗原性をなくしたい場合、このような方法でタンパク質を処理しても問題はないが、生ローヤルゼリーのような有用物質についてエンドペプチダーゼとエキソペプチダーゼを併用すれば生理活性が大幅に低下あるいは消滅することが考えられる。
【００１０】
ところが、本発明によれば、エンドペプチダーゼ作用とエキソペプチダーゼ作用を有するアルカリ性プロテアーゼにより抗原性が低下できるだけでなく、有用な生理活性を維持するという予測できない結果が得られた。
【００１１】
すなわち、本発明のローヤルゼリー処理物は、後記実験例に示すように、主な生理活性成分といわれているデセン酸含量の損失は見られない上に、降圧作用や抗うつ作用を示し、さらに抗原性が顕著に抑制されている、という優れた作用効果を奏するという特徴を持つものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下において、ローヤルゼリーを「ＲＪ」と略記する。
【００１３】
ＲＪは、蜜蜂のうち日齢３〜１２日の働き蜂が下咽頭腺及び大腮腺から分泌する分泌物を混合して作る乳白色のゼリー状物質である。ＲＪ中の主な生理活性成分としては、例えば、ＲＪに特有な１０−ハイドロキシデセン酸（以下、デセン酸と記載する）等の有機酸類をはじめ、蛋白質、脂質、糖類、ビタミンＢ類や葉酸、ニコチン酸、パントテン酸等のビタミン類、各種ミネラル類等が挙げられる。このＲＪの生理活性や薬理作用としては、抗菌作用、免疫増強作用、抗うつ作用、抗腫瘍作用、抗炎症作用、血流量増加作用等が知られている。また、制癌剤の副作用低減や放射線傷害時の延命効果も報告されている。
【００１４】
低アレルゲン化ＲＪの製造に用いられる原料としては、生ＲＪが使用され得る。ＲＪの産地は、日本、中国、ブラジル、ヨーロッパ諸国、オセアニア諸国、アメリカ等いずれであってもよい。
【００１５】
本発明では、生ＲＪをエンドペプチダーゼ作用とエキソペプチダーゼ作用を有するアルカリ性ペプチダーゼで処理する。
【００１６】
エキソペプチダーゼ活性とエンドペプチダーゼ活性の両方を有する酵素の好ましい例としては、例えばストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）産生ペプチダーゼ（商品名：アクチナーゼAS）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus orizae）産生ペプチダーゼ（商品名：プロテアーゼA、フレーバーザイム）、アスペルギルス・メレウス（Aspergillus melleus）産生ペプチダーゼ（商品名：プロテアーゼP）が挙げられる。
本発明による生ＲＪの酵素処理は、一段階酵素反応で実施できるので、低アレルゲン化効果および操作の簡便性の面から好ましい。エンドペプチダーゼ作用とエキソペプチダーゼの両方の作用によるアルカリ性ペプチダーゼは、十分なエンドペプチダーゼ作用を有することが好ましい。
【００１７】
生ＲＪに対するエンドペプチダーゼ作用とエキソペプチダーゼの作用を有するアルカリ性プロテアーゼの使用量は、生ＲＪ濃度、酵素力価、反応温度及び反応時間により異なるが、一般的には、生ＲＪ蛋白質１ｇ当り５０〜１００００作用単位の割合で酵素を添加することにより加水分解が行われる。尚、酵素の添加は、一度に添加してもよく、少量ずつ分割して添加してもよい。
【００１８】
アルカリ性ペプチダーゼ処理される生ＲＪのｐＨは、使用酵素の至適ｐＨに対応して、ｐＨ7.5〜10、好ましくはｐＨ7.8〜9の範囲から選択される。具体的には、前記ペプチダーゼ溶液に酵素を添加する前に、使用酵素の種類によりｐＨ7.5〜10、好ましくはｐＨ7.8〜9の範囲内でアルカリ剤、あるいは緩衝剤の添加により所望のｐＨに調整することにより実施される。この場合、アルカリ剤としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム等、緩衝剤としては、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤などをそれぞれ例示することができる。
【００１９】
アルカリ性ペプチダーゼ処理の温度は、特に制限はなく、酵素作用の発現する最適温度範囲を含む実用に供せられ得る範囲、即ち、通常３０〜７０℃の範囲から選択される。温度をペプチダーゼの至適温度より低温又は高温、例えば５０〜６０℃の範囲に維持することによりペプチダーゼ処理工程での腐敗を防止することもできる。
ペプチダーゼ処理の時間は、使用酵素の種類、反応温度、ｐＨ等の反応条件に依存し、特に限定されない。
【００２０】
ペプチダーゼ処理の停止は、ペプチダーゼを失活又は除去することにより行う。失活操作は加熱処理（例えば、８５℃で１５分間等）により行うことができる。
【実施例】
【００２１】
以下、本発明を実施例に従いより詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことはいうまでもない。
実施例１
生ＲＪ２００ｇを５００ｍｌビーカーに量りとり、イオン交換水１００ｍｌを加えて均一になるまで攪拌してＲＪ希釈液を調製した。2N NaOH水溶液を加えてＲＪ希釈液のpHを8.7〜8.9に調整した。次に、エンドペプチダーゼ作用とエキソペプチダーゼ作用の両方を有するアクチナーゼＡＳ（科研製薬）２ｇをイオン交換水20ｍｌに溶かした溶液をＲＪ希釈液に加え、さらにイオン交換水を、イオン交換水の全量が２００ｍｌになるように加えた。反応混合物をプロペラで撹拌しながら50℃（恒温水槽）で4時間反応させて、加水分解を行った。恒温水槽の温度を80℃に上げて酵素を失活させた後、水冷した。
【００２２】
実施例2
生ＲＪ３ｇを５０ｍｌ三角フラスコに量りとり、イオン交換水１ｍｌを加えて均一になるまで攪拌してＲＪ希釈液を調製した。１０N NaOH水溶液を加えてＲＪ希釈液のpHを7.8〜8.0に調整した。次に、エンドペプチダーゼ作用とエキソペプチダーゼ作用の両方を有するプロテアーゼP（天野エンザイム） 30 mgをＲＪ希釈液に加え、さらにイオン交換水を、イオン交換水の全量が３ｍｌになるように加えた。反応混合物を、恒温水槽で振とうしながら40℃にて16時間反応させて、加水分解を行った。恒温水槽の温度を80℃に上げて酵素を失活させた後、水冷した。
【００２３】
実施例3
酵素として、プロテアーゼPに代えて、エンドペプチダーゼ作用とエキソペプチダーゼ作用の両方を有するプロテアーゼA（天野エンザイム）を使用した以外は、実施例2と同様にして、ＲＪ酵素分解物を得た。
【００２４】
比較例1
生ＲＪ２００ｇを５００ｍｌビーカーに量りとり、イオン交換水１００ｍｌを加えて均一になるまで攪拌してＲＪ希釈液を調製した。2N NaOH水溶液を加えてＲＪ希釈液のpHを8.7〜8.9に調整した。次に、エンドペプチダーゼであるプロテアーゼＮ（天野エンザイム） 3.4 gとβ−マンノシダーゼ（新日本化学工業社製スミチームＡＣＨ） 60 mgをイオン交換水20ｍｌに溶かした溶液をＲＪ希釈液に加え、さらにイオン交換水を、イオン交換水の全量が２００ｍｌになるように加えた。反応混合物をプロペラで撹拌しながら50℃（恒温水槽）で4時間反応させて、加水分解を行った。恒温水槽の温度を80℃に上げて酵素を失活させた後、水冷し、ＲＪ酵素分解物を得た。
【００２５】
比較例2
生RJ 5 gを100 mL三角フラスコに量りとり、イオン交換水5 mLとモルシンF（キッコーマン）50 mgを加えて均一になるまで攪拌してRJ希釈液を調製した。反応混合物をスターラーで撹拌しながら40 ℃（恒温水槽）で16時間および24時間反応させて、加水分解を行った。恒温水槽の温度を80℃に上げて酵素を失活させた後、水冷した。
【００２６】
比較例3
モルシンFをFA-107-1（三共ライフテック）にした以外は、上記と同様の方法で酵素処理を行った。
【００２７】
実験例１
＜Ｉ＞生ローヤルゼリーのペプチダーゼ処理物の抗原タンパク消失の確認
実施例１〜３で得られた分解物について、イムノブロットを行い、抗原タンパク質の消失を確認した。各サンプルを3×サンプルバッファー（187.5 mM トリス塩酸pH 6.8, 6％ SDS, 75％グリセロール, 0.03％ブロモフェノールブルー, 1.5M  2-メルカプトエタノール）にて３倍希釈し、９５℃にて５分間加熱した。その後、１５％アクリルアミドゲルを用いてSDS-PAGEを行なった。分子量マーカーとしてSDS-PAGE Standards, Low Range（BIO RAD社）を用いた。ゲル上に展開したタンパク質を、セミドライ式ブロッティング装置にてPVDFメンブレン（BIO RAD社）に転写し、ブロッキングバッファー (２％ スキムミルク, １０mＭ  トリス塩酸pH 7.5, １００mＭ  塩化ナトリウム, 0.05％  トゥイーン２０) に浸して室温で1時間振とうした。その後、メンブレンを、ブロッキングバッファーにて希釈した患者血清に浸し、４℃に一晩静置した。更にブロッキングバッファーにて希釈した抗ヒトIgE抗体（KPL社）に浸して３７℃に1時間静置した。最後に、ECL plus キット (Amersham LIFE SCIENCE社)を用いて、付属のプロトコールに従い調製した発光液にメンブレンを浸して、ECL Mini-Camera (Amersham LIFE SCIENCE社)にかけて検出した。
【００２８】
試験した全てのサンプルについて、患者血清と反応する抗原タンパク質が消失していることを、目視にて確認した。
【００２９】
なお、血清提供者には本試験内容を記載した説明書を配布し、試験の趣旨及び内容を十分に説明した上で、本人の自由意志により参加する旨の同意書を得た者から得た血清のみ、本試験に用いた。
＜ＩＩ＞生ローヤルゼリーの酸性プロテアーゼ処理物およびアルカリ性プロテアーゼ処理物のイムノブロット＞
比較例2, 3および実施例1で得たRJ酵素分解物についてイムノブロットを上記＜Ｉ＞に従い行った。
結果を表1に示す。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
＊反応時間が16時間であっても24時間であっても、結果は変わらなかった。
表1の結果から、酸性プロテアーゼにより生ローヤルゼリーを処理すると、抗アレルゲン化することはできないことが明らかになった。
【００３２】
実験例２
＜ヒスタミン遊離試験＞
未処理ＲＪ、実施例１、比較例で得たＲＪ酵素分解物、アレルゲンmix（陽性コントロール）、抗IgEレセプター抗体（陽性コントロール）について、CAST法(cellular antigen stimulation test)によって、遊離するヒスタミン量を測定した。
【００３３】
具体的には、生ＲＪに対してアレルギー反応を経験したことのある被験者の血液サンプルに対し、生ＲＪまたはその酵素加水分解物あるいは陽性コントロールを作用させて、遊離するヒスタミン量を測定した。被験者には、本試験内容を記載した説明書を配布し、試験の趣旨及び内容を十分に説明し、被験者本人の自由意志により参加する旨の同意書を得た者に対してのみ、本試験を行った。
【００３４】
遊離ヒスタミンの測定は、市販のELISAキット(Histamine ELISA (IMMUNO-BIOLOGICAL LABORATORIES社製)を用いて行った。なお、アレルゲンmixは下記のアレルゲンを含む。
アレルゲンmix：カモガヤ、ホロハウシノケグサ、ホソムギ、オオアワガエリ、ナガハグサ、シラゲガヤ、ライムギ、シラカンバ、ハシバミ、ヨモギ、ヘラオオバコ、アルテルナリア、ヤケヒョウダニ、コナヒョダニ、ノコジョウヒ、イヌジョウヒ、卵白、ミルク、タラ、ピーナッツ、大豆。
結果を表2及び図1に示す。
【００３５】
【表２】
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【００３６】
表2及び図１中のEＣ50(50 % effective concentration)は、最大値の５０％のヒスタミンを遊離させる試験物質の濃度を意味する。
【００３７】
上記の結果から、エンドペプチダーゼ作用とエキソペプチダーゼ作用を併用することにより、ＲＪの抗原性を有効に低下させ得ることが明らかになった。
【００３８】
実験例３
＜生RJとRJエタノール沈殿物のデセン酸量の比較＞
RJのエタノール沈殿物は、生RJ 100gに、90 %エタノールを300 mL加えた後、室温で約1時間攪拌し、12,000×gで30 min遠心分離してから凍結乾燥して調製した。
【００３９】
生ＲＪとＲＪエタノール沈殿物について、逆相カラムを用いたHPLCにてデセン酸量の測定を行なった。HPLC条件は、カラム；YMC-Pack  ODS-AM（内径4.6mm、長さ150mm）、移動相；10mMリン酸緩衝液とメタノールの混合液（56:44, pH2.6）、流速；1ml/分、検出波長；210nmであった。結果を表3に示す。
【００４０】
【表３】
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【００４１】
エタノール沈殿をすることによって、デセン酸含量は約8分の1になった。
【００４２】
実験例４
＜酵素処理RJの抗うつ作用評価＞
未処理RJおよび実施例１で得たRJ酵素分解物についての抗うつ効果を確認するために、マウスの恐怖条件付誘発無動時間を測定した。
方法
フェアードコンディション計測装置（Acti Metrics社）にてマウスに電気刺激負荷を行なった後、試験検体を7日間投与した。投与後、再びフェアードコンディション計測装置の中に入れ、電気刺激無しの条件で4分間の無動時間を測定した。結果を表4及び図２に示す。
【００４３】
【表４】
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【００４４】
媒体対照群は媒体対照(電気刺激無し)群に対して、0〜240秒の全てにおいて無動時間の有意な延長がみられた。また、未処理および実施例１処理RJは、媒体対照群に対して無動時間の有意な短縮がみられた。さらに、酵素処理による作用の低下は認められなかった。
【００４５】
実験例5
＜酵素処理RJによるACE阻害＞
実施例1および比較例で得たRJ酵素分解物について、ACE阻害作用を測定した。
○ 試薬の調製
ホウ酸緩衝液（pH8.3）：200 ｍM ホウ酸（H3BO3）、50 mM 四ホウ酸ナトリウム（Na2B4O7）
基質溶解液：200 ｍM ホウ酸（H3BO3）、50 mM 四ホウ酸ナトリウム（Na2B4O7）、1 M 塩化ナトリウム（NaCl）
基質溶液：Bz-Gly-His-Leu・H2O（ペプチド研究所）を基質溶解液に溶解して12.5 ｍMとした。
酵素溶液：ウサギ肺由来のアンジオテンシン変換酵素（Sigma）をホウ酸緩衝液に溶解して25 mU/mLとした。
○ 実験操作
試料溶液25 μL に酵素溶液を50 μL加えて撹拌し、37 ℃にて5分間静置した。更に基質溶液を50 μL 加えて撹拌し、37 ℃にて1時間静置した。この液に0.5 N 塩酸溶液を125 μL 加えて撹拌し、反応を停止させたものを試験液とした。一方、試料溶液25 μL 、酵素溶液50 μL、 0.5 N 塩酸溶液125 μLを混合して37 ℃に5分間静置した後、基質溶液を50 μL 加えて撹拌し、37 ℃にて1時間静置したものをブランク液とした。その後、試験液およびブランク液に酢酸エチルをそれぞれ750 μLずつ加え、ボルテックスを用いて15秒間激しく撹拌した後、遠心分離（室温、2,000 rpmにて10分間）し、上層（酢酸エチル層）をそれぞれ250 μL ずつ分取した。減圧加熱乾燥法により酢酸エチルを完全に除去した後、析出物を1 M塩化ナトリウム溶液500 μLに溶解した。別に、試料溶液の代わりに精製水を用いて同様に操作した液を対照液とした。これらの液につき、紫外可視吸光光度測定法にて波長228 nm における吸光度を測定した。
・  ACE阻害率の算出
【００４６】
【数１】
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【００４７】
Ac：試料溶液の代わりに水を加えて操作した液の吸光度
As：試料溶液の吸光度
Abc：試料溶液の代わりに水を加えて操作した液のブランク液の吸光度
Abs：試料溶液のブランク液の吸光度
結果を表5及び図3に示す。
【００４８】
【表５】
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【００４９】
実施例１処理RJは、比較例処理RJよりも高いACE阻害作用が認められた。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】酵素処理RJによるヒスタミン遊離の試験結果
【図２】酵素処理RJの抗うつ作用評価
【図３】酵素処理RJによるACE阻害作用の比較
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年3月16日(2007.3.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アレルギー性が低減されたローヤルゼリーの製造方法であって、生ローヤルゼリーを、ストレプトマイセス・グリセウスまたはアスペルギルス・オリゼー由来のエンドペプチダーゼ作用とエキソペプチダーゼ作用を有するアルカリ性ペプチダーゼを用い、pH 7.8〜9、40〜50℃の反応条件で処理することを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記アルカリ性ペプチダーゼが、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）産生ペプチダーゼである、請求項１に記載の方法。