(57)【要約】      （修正有）【課題】  免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドを有効成分として含んでなる感受性疾患剤を提供する。【解決手段】  特定のアミノ酸配列を有し、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドを有効成分として含有し、免疫担当細胞において産生されたインターフェロン−γを介することなく、キラー細胞を活性化して、ウィルス性疾患、細菌感染症、悪性腫瘍及び免疫疾患を治療または予防する感受性疾患剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列又はそれに相同的なアミノ酸配列（ただし、符号「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸は、イソロイシン又はトレオニンを表わすものとする。）を有し、免疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘導するポリペプチドを有効成分とし、免疫担当細胞において産生されたインターフェロン−γを介することなく、キラー細胞に対して直接作用して活性化することを特徴とする、ウイルス性疾患、細菌感染症、悪性腫瘍及び免疫疾患から選ばれる、活性化されたキラー細胞に対して感受性を有する疾患の治療及び／又は予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、免疫担当細胞においてインターフェロン−γ（以下、「ＩＦＮ−γ」と略記する。）の産生を誘導する新規なポリペプチドを有効成分として含んでなる感受性疾患剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＦＮ−γは、抗ウイルス作用、抗腫瘍作用、免疫調節作用を有する蛋白質として知られ、抗原やマイトジェンによる刺激を受けた免疫担当細胞が産生すると云われている。これら生物作用ゆえに、ＩＦＮ−γはその発見当初より抗腫瘍剤としての実用化が鶴首され、現在では脳腫瘍を始めとする悪性腫瘍一般の治療剤として精力的に臨床試験が進められている。現在入手し得るＩＦＮ−γは免疫担当細胞が産生する天然型ＩＦＮ−γと、免疫担当細胞から採取したＩＦＮ−γをコードするＤＮＡを大腸菌に導入してなる形質転換体が産生する組換え型ＩＦＮ−γに大別され、上記臨床試験においては、これらのうちのいずれかが「外来ＩＦＮ−γ」として投与されている。
【０００３】
このうち、天然型ＩＦＮ−γは、通常、培養株化した免疫担当細胞をＩＦＮ−γ誘導剤を含む培養培地で培養し、その培養物を精製することにより製造される。この方法では、ＩＦＮ−γ誘導剤の種類がＩＦＮ−γの産生量や精製のし易さ、さらには、製品の安全性等に多大の影響を及ぼすと云われており、通常、コンカナバリンＡ、レンズ豆レクチン、アメリカヤマゴボウレクチン、エンドトキシン、リポ多糖などのマイトジェンが頻用される。しかしながら、これら物質は、いずれも分子に多様性があり、給源や精製方法に依って品質が変動し易く、誘導能の一定したＩＦＮ−γ誘導剤を所望量入手し難いという問題がある。くわえて、上記物質の多くは生体に投与すると顕著な副作用を示したり、物質に依っては毒性を示すものすらあり、生体に直接投与してＩＦＮ−γの産生を誘導するのが極めて困難な状況にあった。
【０００４】
一方、最近では、ＩＦＮ−γ以外にも、例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、インターロイキン２、インターロイキン１２などのサイトカインを有効成分とする医薬品が実用化されたり、実用化を目指して鋭意研究が進められている。その用途は抗腫瘍剤、抗ウイルス剤、抗菌剤及び免疫調節剤を包含し、必要に応じて他の医薬品と組合せて使用されている。
【０００５】
サイトカインを有効成分とする医薬品の最大の特徴は、合成医薬品と違って、重篤な副作用を惹起することなく、長期間連用できることにある。問題点としては、疾患の種類や症状にも依るものの、一般に奏効率が低く、単独では疾患を緩解又は完治するのが難しい点にある。これにより、悪性腫瘍などの難治性疾患の治療においては、合成医薬品の補助手段としてか、あるいは、単に患者を延命するためだけの手段として用いられているのが実状である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
斯かる状況に鑑み、この発明の目的は、顕著な薬効が期待でき、かつ、重篤な副作用を惹起することなく、長期間連用可能な医薬品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この発明は、上記課題を配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列又はそれに相同的なアミノ酸配列（ただし、符号「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸は、イソロイシン又はトレオニンを表わすものとする。）を有し、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドを有効成分として含んでなる感受性疾患剤により解決するものである。
【０００８】
この発明は、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する新規なポリペプチドの発見に基づくものである。本発明者らが、哺乳類の細胞が産生するサイトカインにつき研究していたところ、コリネバクテリウム死菌体とリポ多糖で予処理したマウスの肝臓中にＩＦＮ−γの産生を誘導する物質が存在することを見出した。カラムクロマトグラフィーを中心とする種々の精製方法を組合せてこの物質を単離し、その性質・性状を調べたところ、その本質は蛋白質であり、次のような理化学的性質を有していることが判明した。
（１）  分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法又はゲル濾過法で測定すると、分子量１９，０００±５，０００ダルトンを示す。
（２）  等電点
クロマトフォーカシング法で測定すると、４．８±１．０に等電点を示す。
（３）  部分アミノ酸配列
配列表における配列番号４及び５に示す部分アミノ酸配列を有する。
（４）  生物作用
免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する。
【０００９】
斯かる理化学的性質を有する蛋白質は未だ知られておらず、新規物質であると判断される。そこで、本発明者が、引続き、マウス肝細胞を鋭意検索したところ、この蛋白質をコードするＤＮＡを単離するのに成功した。解読したところ、このＤＮＡは４７１塩基対からなり、配列表における配列番号６に示すアミノ酸配列をコードしていることが判明した。
【００１０】
これら知見に基づき、ヒト肝細胞を引続き検索したところ、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するさらに別の新規物質をコードするＤＮＡが得られた。この物質の本質はポリペプチドであり、ＤＮＡを解読したところ、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を含んでなることが判明した。その後、このＤＮＡを大腸菌に導入し、発現させたところ、培養物中にポリペプチドが好収量で産生した。以上の知見は、同じ特許出願人による特許文献１及び特許文献２に開示されている。この発明は、この新規ポリペプチドの感受性疾患剤としての用途を提供するものである。
【００１１】
【特許文献１】特願平６−１８４１６２号明細書（特開平８−２７１８９号公報）
【特許文献２】特願平６−３０４２０３号明細書（特開平８−１９３０９８号公報）
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
この発明の感受性疾患剤は、ヒトに投与すると、体内の免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導し、ＩＦＮ−γ感受性疾患の治療・予防に効果を発揮する。ポリペプチドがキラー細胞による細胞障害性の増強又はキラー細胞の生成を誘導する作用を兼備するときには、悪性腫瘍を始めとする難治性疾患の治療に格別の効果を発揮する。
【００１３】
この発明で用いるポリペプチドは、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列又はそれに相同的なアミノ酸配列（ただし、符号「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸は、イソロイシン又はトレオニンを表わすものとする。）を有し、免疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘導する。配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列とは、免疫担当細胞におけるＩＦＮ−γの産生を誘導する性質を実質的に失わない範囲で、その配列番号１のアミノ酸配列におけるアミノ酸の１個又は２個以上を他のアミノ酸で置換したもの、配列番号１のアミノ酸配列におけるＮ末端及び／又はＣ末端にアミノ酸が１又は２個以上付加したもの及びそのＮ末端及び／又はＣ末端のアミノ酸が１個又は２個以上欠失したものを包含する。この発明においては、ポリペプチドが斯かるアミノ酸配列及び性質を有するかぎり、細胞培養法により天然の給源から分離したものであっても、組換えＤＮＡ技術やペプチド合成法により人工的に合成したものであっても構わない。
【００１４】
経済的見地に立てば、組換えＤＮＡ技術による方法が有利であり、斯かる方法においては、通常、微生物又は動植物由来の適宜宿主に上記アミノ酸配列をコードするＤＮＡを導入して形質転換体となし、これを常法により培養後、培養物をサイトカインを精製するための斯界における慣用の方法により精製して目的とするポリペプチドを得る。同じ特許出願人による特願平６−３０４２０３（特開平８−１９３０９８号公報）号明細書には、組換えＤＮＡ技術による当該ポリペプチドの製造方法が詳述されており、また、同じ特許出願人による特願平７−５８２４０号明細書（特開平８−２３１５９８号公報）に開示された精製方法によるときには、高純度のポリペプチドが最少のコストと労力で得られる。
【００１５】
前述のとおり、当該ポリペプチドは、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する性質を有する。したがって、この発明の感受性疾患剤は、ヒトに投与すると、体内の免疫担当細胞がＩＦＮ−γを産生し、ＩＦＮ−γ感受性疾患の治療・予防に効果を発揮する。また、例えば、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドのように、ポリペプチドが免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する性質に加えて、ＮＫ細胞やＬＡＫ細胞（リンホカイン活性化キラー細胞）、細胞障害性Ｔ細胞などのキラー細胞による細胞障害性の増強又はキラー細胞の生成を誘導する性質を兼備するときには、キラー細胞も感受性疾患の治療・予防に関与することとなる。したがって、この発明でいう感受性疾患とは、ＩＦＮ−γ感受性疾患を含む、ＩＦＮ−γ及び／又はキラー細胞が直接又は間接に関与して治療及び／又は予防し得る疾患全般を意味するものとし、具体的には、例えば、肝炎、ヘルペス症、尖圭コンジロム、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）などのウイルス性疾患、カンジダ症、マラリヤ症などの細菌感染症、腎細胞癌、菌状息肉腫、慢性肉芽腫などの固形悪性腫瘍、成人Ｔ細胞白血病、慢性骨髄性白血病、悪性リンパ腫などの血球系悪性腫瘍、さらには、アレルギー症、リウマチなどの免疫疾患を挙げることができる。また、インターロイキン３と併用するときには、白血病、骨髄腫、さらには、悪性腫瘍を治療する際の放射線照射や化学療法剤の投与に伴なう白血球減少症や血小板減少症の完治又は緩解にも効果を発揮する。
【００１６】
斯くして、この発明の感受性疾患剤は、上記のごとき感受性疾患を治療・予防するための抗腫瘍剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、免疫疾患剤、血小板増多剤、白血球増多剤などとして多種多様な用途を有することとなる。剤型並びに感受性疾患の種類及び症状にも依るが、この発明の感受性疾患剤は、通常、液状、ペースト状又は固状に調製され、当該ポリペプチドを０．０００００１乃至１００％（ｗ／ｗ）、望ましくは、０．０００１乃至０．１％（ｗ／ｗ）含んでなる。
【００１７】
この発明の感受性疾患剤は当該ポリペプチド単独の形態はもとより、当該ポリペプチドとそれ以外の生理的に許容される、例えば、担体、賦形剤、希釈剤、免疫助成剤、安定剤、さらには、必要に応じて、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン１２、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、カルボコン、シクロホスファミド、アクラルビシン、チオテパ、ブスルファン、アンシタビン、シタラビン、フルオロウラシル、テトラヒドロフリルフルオロウラシル、メトトレキセート、アクチノマイシンＤ、クロモマイシンＡ３、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、Ｌ−アスパラギナーゼ、金コロイド、クレスチン、ピシバニール、レンチナン及び丸山ワクチンを始めとする他の生理活性物質の１種又は２種以上との組成物としての形態をも包含する。このうち、インターロイキン２との併用は、インターロイキン２が、当該ポリペプチドが免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する際の補因子として機能するので特に有利である。天然型又は組換え型ヒトインターロイキン２を併用することにより、当該ポリペプチド単独ではＩＦＮ−γを産生し難い免疫担当産生細胞においても、所期のＩＦＮ−γ産生を誘導することができる。また、インターロイキン１２と併用するときには、当該ポリペプチド又はインターロイキン１２単独では容易に達成し得ない、極めて高レベルのＩＦＮ−γ産生を誘導することができる。しかも、当該ポリペプチドは、ヒト体内におけるインターロイキン１２によるイムノグロブリンＥ抗体の産生阻害を高めるので、イムノグロブリンＥ抗体の産生を主因とする、例えば、アトピー性喘息、アトピー性気管支喘息、枯草熱、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、血管性浮腫、アトピー性消化器異常を始めとするアトピー性疾患を治療するための免疫疾患剤においても極めて有用である。なお、ヒトの体内には、微量ではあるが、インターロイキン１２が存在することがあるので、斯かる場合には、当該ポリペプチドのみを投与すれば所期の治療効果が達成できる。
【００１８】
さらに、この発明の感受性疾患剤は、投薬単位形態の薬剤をも包含し、その投薬単位形態の薬剤とは、当該ポリペプチドを、例えば、１回当りの用量又はその整数倍（４倍まで）若しくはその約数（１／４０まで）に相当する量を含んでなり、投薬に適する物理的に分離した一体の剤型にある薬剤を意味する。このような投薬形態の薬剤としては、注射剤、液剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、舌下剤、点眼剤、点鼻剤、坐剤などが挙げられる。
【００１９】
この発明の感受性疾患剤は経口的に投与しても非経口的に投与しても、また、以下に述べるように抗腫瘍細胞などを体外で活性化させる場合に用いてもよく、いずれの場合にも、感受性疾患の治療・予防に効果を発揮する。感受性疾患の種類や症状に依るが、具体的には、患者の症状や投与後の経過を観察しながら、成人当たり約０．１μｇ乃至５０ｍｇ／回、望ましくは、約１μｇ乃至１ｍｇ／回のポリペプチドを１乃至４回／日又は１乃至５回／週の用量で１日乃至１年間に亙って経口投与するか、皮内、皮下、筋肉内又は静脈内に非経口投与すればよい。
【００２０】
この発明の感受性疾患剤は、インターロイキン２を用いる、いわゆる「抗腫瘍免疫療法」にも有用である。抗腫瘍免疫療法は、一般に、（ｉ）悪性腫瘍患者の体内に直接インターロイキン２を投与する方法と、（ｉｉ）インターロイキン２により生体外で活性化させた抗腫瘍細胞を患者の体内に移入する方法（養子免疫療法）に大別されるが、当該ポリペプチドを併用するときには、その効果を有意に高めることができる。具体的には、前記（ｉ）の方法の場合、患者にインターロイキン２を投与するのと同時又は事前に当該ポリペプチドを成人当たり約０．１μｇ乃至１ｍｇ／回の用量で１乃至１０回投与する。インターロイキン２の投与量は、悪性腫瘍の種類、患者の症状及びポリペプチドの用量にも依るが、通常、成人当たり約１０，０００乃至１，０００，０００単位／回とする。一方、前記（ｉｉ）の方法の場合には、悪性腫瘍患者から採取した単核球又はリンパ球をインターロイキン２の存在下で培養するに当たり、それら血球１×１０６個当たり当該ポリペプチドを約１ｎｇ乃至１ｍｇ共存させておく。そして、一定時間培養後、培養物からＮＫ細胞又はＬＡＫ細胞を採取し、これを元の患者に移入するのである。この発明による抗腫瘍免疫療法の対象となり得る疾患としては、例えば、結腸癌、直腸癌、大腸癌、胃癌、甲状腺癌、舌癌、膀胱癌、絨毛癌、肝癌、前立腺癌、子宮癌、喉頭癌、肺癌、乳癌、悪性黒色腫、カポジ肉腫、脳腫瘍、神経芽細胞腫、卵巣腫瘍、睾丸腫瘍、骨肉腫、膵臓癌、腎癌、副腎腫、血管内皮腫などの固形悪性腫瘍や白血病、悪性リンパ腫などの血球系悪性腫瘍が挙げられる。
【００２１】
つぎの実験例では、組換えＤＮＡ技術により当該ポリペプチドを調製し、その生物作用と毒性について試験する。
【００２２】
＜実験例１  ポリペプチドの調製＞
【００２３】
＜実験例１−１  形質転換体ＫＧＦＨＨ２の作製＞
０．５ｍｌ容反応管に２５ｍＭ塩化マグネシウムを８μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液を１０μｌ、２５ｍＭ  ｄＮＴＰミックスを１μｌ、２．５単位／μｌアンプリタックＤＮＡポリメラーゼを１μｌ、特願平６−３０４２０３号明細書（特開平８−１９３０９８号公報）に記載された方法にしたがってファージＤＮＡクローンから調製した配列表における配列番号２に示す塩基配列を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを１ｎｇ、配列表の配列番号１におけるＮ末端及びＣ末端付近のアミノ酸配列に基づき化学合成した５´−ＡＴＡＧＡＡＴＴＣＡＡＡＴＧＴＡＣＴＴＴＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＣ−３´及び５´−ＡＴＡＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＴＣＴＴＣＧＴＴＴＴＧＡＡＣ−３´で表わされる塩基配列のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの適量を加え、滅菌蒸留水で１００μｌとした。常法により、この混合物を９４℃で１分間、４３℃で１分間、７２℃で１分間、この順序でインキュベートするサイクルを３回繰返した後、さらに、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間、この順序でインキュベートするサイクルを４０回繰返してＰＣＲ反応させた。
【００２４】
このＰＣＲ産物とストラタジーン製プラスミドベクター『ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ  （＋）』を常法にしたがってＤＮＡリガーゼにより連結して組換えＤＮＡとし、これをコンピテントセル法によりストラタジーン製大腸菌株『ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ´Ｋａｎ』に導入して形質転換した。形質転換体を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に接種し、３７℃で１８時間振盪培養した後、培養物を遠心分離して形質転換体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法を適用して組換えＤＮＡを単離した。この組換えＤＮＡの一部をとり、ジデオキシ法により分析したところ、配列表の配列番号２に示す塩基配列における５´末端及び３´末端にそれぞれＥｃｏ  ＲＩ切断部位及びＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を、また、その配列番号２に併記したアミノ酸配列におけるＮ末端及びＣ末端のそれぞれ直前及び直後に対応する部位にポリペプチド合成開始のためのメチオニンコドン及びポリペプチド合成終止のためのＴＡＧコドンを有するＤＮＡを含んでいた。
【００２５】
そこで、常法にしたがって残りの組換えＤＮＡを制限酵素Ｅｃｏ  ＲＩ及びＨｉｎｄ  ＩＩＩで切断後、宝酒造製ＤＮＡライゲーションキット『ＤＮＡライゲーション・キット・バージョン２』を使用して、得られたＥｃｏ  ＲＩ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  ＤＮＡ断片０．１μｇと予め同じ制限酵素で切断しておいたファルマシア製プラスミドベクター『ｐＫＫ２２３−３』１０ｎｇを１６℃で３０分間反応させて連結して複製可能な組換えＤＮＡ『ｐＫＧＦＨＨ２』を得た。コンピテントセル法により、この組換えＤＮＡ  ｐＫＧＦＨＨ２で大腸菌Ｙ１０９０株（ＡＴＣＣ３７１９７）を形質転換し、得られた形質転換体『ＫＧＦＨＨ２』を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に接種し、３７℃で１８時間振盪培養した。培養物を遠心分離して形質転換体を採取し、その一部に通常のＳＤＳ−アルカリ法を適用して組換えＤＮＡ  ｐＫＧＦＨＨ２を抽出した。ジデオキシ法により分析したところ、図１に示すように、組換えＤＮＡｐＫＧＦＨＨ２においては、配列表における配列番号２に示す塩基配列を含むＫＧＦＨＨ２  ｃＤＮＡがＴａｃプロモータの下流に連結されていた。
【００２６】
＜実験例１−２：形質転換体ＫＧＦＨＨ２によるポリペプチドの産生と精製＞
オートクレーブによりアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）を滅菌し、３７℃に冷却後、実験例１−１で作製した形質転換体ＫＧＦＨＨ２を接種し、振盪下、同じ温度で１８時間種培養した。２０ｌ容ジャーファーメンタに新鮮な同一培地を１８ｌとり、同様に滅菌し、３７℃に冷却後、上記で得た種培養物を１％（ｖ／ｖ）接種し、同じ温度で８時間通気撹拌培養した。培養物を遠心分離して菌体を採取し、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１６ｍＭ燐酸水素二ナトリウム及び４ｍＭ燐酸二水素ナトリウムを含む混液（ｐＨ７．３）に浮遊させ、超音波破砕後、遠心分離により菌体破砕物を除去し、上清を採取した。
【００２７】
この上清に氷冷下で硫酸アンモニウムを４０％（ｗ／ｖ）まで加え、均一に溶解し、暫時静置し、遠心分離後、上清を採取した。この上清を予め１．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．６）により平衡化しておいたファルマシア製『フェニル・セファロース』のカラムに負荷し、カラムを新鮮な同一緩衝液で洗浄後、１．５Ｍから０Ｍに下降する硫酸アンモニウムの濃度勾配下、１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．６）を通液した。
【００２８】
別途、同じ特許出願人による特願平７−５８２４０号明細書（特開平８−２３１５９８号公報）に記載された方法にしたがってイムノアフィニティークロマトグラフィー用ゲルを調製し、プラスチック製円筒管内部にカラム状に充填し、燐酸食塩緩衝液（以下、「ＰＢＳ」と云う。）で洗浄後、上記カラムクロマトグラフィーにおいて硫酸アンモニウム濃度１．０Ｍ付近で溶出した画分１０ｍｌを負荷した。新鮮なＰＢＳで洗浄後、カラムに１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）を通液し、ＩＦＮ−γ誘導能ある画分を採取した。採取した画分をプールし、ＰＢＳに対して４℃で一晩透析し、濃縮後、ＩＦＮ−γ誘導活性及び蛋白質含量を測定したところ、純度９５％以上の精製ポリペプチドが、培養液１ｌ当たり、約２５ｍｇの収量で得られていた。
【００２９】
特願平６−３０４２０３号明細書（特開平８−１９３０９８号公報）に記載した方法に準じて分析したところ、精製ポリペプチドは次のような理化学的性質を有していた。すなわち、非還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動すると、分子量１８，５００±３，０００ダルトンに相当する位置にＩＦＮ−γ誘導能ある主たるバンドを示す一方、クロマトフォーカシングすると、４．９±１．０に等電点を示した。また、そのＮ末端は、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＮ末端にメチオニンが結合した配列番号３に示すアミノ酸配列を有していた。
【００３０】
＜実験例２  生物作用＞
【００３１】
＜実験例２−１  免疫担当細胞におけるＩＦＮ−γの産生＞
ヘパリン加注射器により健常者から血液を採取し、血清無含有のＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）により２倍希釈した。血液をフィコール上に重層し、遠心分離して採取したリンパ球を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）により洗浄した後、新鮮な同一培地に細胞密度５×１０６個／ｍｌになるように浮遊させ、９６ウェルマイクロプレートに０．１５ｍｌ／ウェルずつ分注した。
【００３２】
別途、実験例１−２の方法により得たポリペプチドを１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）により適宜濃度に希釈して上記マイクロプレートに０．０５ｍｌ／ウェルずつ分注し、２．５μｇ／ｍｌコンカナバリンＡ又は５０単位／ｍｌ組換え型ヒトインターロイキン２を含むか含まない新鮮な上記と同一培地を０．０５ｍｌ／ウェル加えた後、５％ＣＯ２インキュベータ中、３７℃で２４時間培養した。培養後、各ウェルから培養上清を０．１ｍｌずつ採取し、通常の酵素免疫測定法によりＩＦＮ−γ含量を測定した。同時に、ポリペプチドのみを省略した系を設け、上記と同様に処置して対照とした。結果を表１に示す。なお、表１中のＩＦＮ−γ含量は、米国国立公衆衛生研究所から入手したＩＦＮ−γ標品（Ｇｇ２３−９０１−５３０）に基づき国際単位（ＩＵ）に換算している。
【００３３】
【表１】
2007197452.tif 000002
【００３４】
表１の結果は、当該ポリペプチドを作用させると、免疫担当細胞としてのリンパ球がＩＦＮ−γを産生したことを示している。また、表１の結果に見られるように、このＩＦＮ−γ産生は、補因子としてインターロイキン２又はコンカナバリンＡを共存させると、一段と高まる。
【００３５】
＜実験例２−２  ＮＫ細胞による細胞障害性の増強＞
ヘパリン加注射器により健常者から血液を採取し、１４０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．４）により２倍希釈した。血液をパコール上に重層し、遠心分離後、パコール勾配遠心分離して高密度リンパ球を得た。
【００３６】
このリンパ球を細胞密度１×１０６個／ｍｌになるように１０μｇ／ｍｌカナマイシン、５×１０−５Ｍ  ２−メルカプトエタノール及び１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）に浮遊させ、１２ウェルマイクロプレートに０．５ｍｌ／ウェルずつ分注した。そして、実験例１−２の方法により得たポリペプチドを新鮮な上記と同一培地に適宜希釈してマイクロプレートに１．５ｍｌ／ウェルずつ加えた後、さらに５０単位／ｍｌ組換え型ヒトインターロイキン２を含むか含まない同培地を０．５ｍｌ／ウェル加えた後、５％ＣＯ２インキュベータ中、３７℃で２４時間培養し、１４０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄して効果細胞としてのＮＫ細胞を含む培養リンパ球を得た。
【００３７】
別途、常法により５１Ｃｒ標識したＮＫ細胞感受性標的細胞としてのヒト慢性骨髄性白血病由来のＫ−５６２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２４３）を９６ウェルマイクロプレートに１×１０４個／ウェルずつとり、上記で調製した効果細胞を効果細胞／標的細胞比で２．５：１、５：１又は１０：１の割合で加え、５％ＣＯ２インキュベータ中、３７℃で４時間培養した後、常法にしたがって培養上清の放射能を測定して死滅標的細胞数を求めた。そして、各々の系につき、試験に供した標的細胞数に対する死滅標的細胞数の百分率（％）を計算し、細胞障害性の目安とした。結果を表２に示す。
【００３８】
【表２】
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【００３９】
表２の結果は、当該ポリペプチドに、ＮＫ細胞による細胞障害性を増強する性質のあることを示している。また、表２の結果に見られるように、この細胞障害性の増強は、インターロイキン２が共存すると、一段と増強される。
【００４０】
＜実験例２−３  ＬＡＫ細胞の生成誘導＞
常法により５１Ｃｒ標識したＮＫ細胞非感受性標的細胞としてのヒトバーキットリンパ腫由来のＲａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８６）を９６ウェルマイクロプレートに１×１０４個／ウェルずつとり、７２時間培養した以外は実験例２−２と同様にして調製した効果細胞としてのＬＡＫ細胞を含む培養リンパ球を効果細胞／標的細胞比で５：１、１０：１又は２０：１の割合で加え、５％ＣＯ２インキュベータ中、３７℃で４時間培養した後、常法にしたがって培養上清の放射能を測定した。その後、実験例２−２と同様にして細胞障害性（％）を計算した。結果を表３に示す。
【００４１】
【表３】
2007197452.tif 000004
【００４２】
表３の結果は、当該ポリペプチドに、ＬＡＫ細胞の生成を誘導する性質のあることを示している。また、表３の結果に見られるように、この誘導は、インターロイキン２が共存すると、一段と増強される。
【００４３】
＜実験例３  急性毒性試験＞
常法にしたがって、８週齢のマウスに実験例１−２の方法により得た精製ポリペプチドを経皮、経口又は腹腔内に注射投与した。その結果、精製ポリペプチドのＬＤ５０は、いずれの投与経路によっても約１ｍｇ／ｋｇ以上であった。このことは、当該ポリペプチドがヒトへの投与を前提とする医薬品に配合して安全であることを裏付けている。
【００４４】
周知のように、ＩＦＮ−γはウイルス、細菌などに対する感染防御、悪性腫瘍の増殖抑制、免疫機能の調節作用を通じてヒトの生体防御、さらには、イムノグロブリンＥ抗体の産生阻害に多大の関与をしている。前述のとおり、ＩＦＮ−γはヒトの感受性疾患剤としてすでに実用化されており、その対象疾患、用量、用法及び安全性はほぼ確立している。一方、フランセス・アール・バークウィル著、渡部好彦訳、『サイトカインとがん治療』、１９９１年、東京化学同人発行などにも記載されているように、ＮＫ細胞及びＬＡＫ細胞などのキラー細胞を利用する療法は、抗腫瘍免疫療法を始めとして、多種多様のヒト疾患において試みられ、総じて良好な成果が報告されている。最近では、サイトカインを用いるキラー細胞による細胞障害性の増強又はキラー細胞の生成の誘導と治療効果との関連性が注目されており、例えば、ティー・フジオカら『ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ユーロロジー』、第７３巻、第１号、２３乃至３１頁（１９９４年）には、ＬＡＫ細胞とインターロイキン２を併用する抗腫瘍免疫療法において、インターロイキン２がＬＡＫ細胞の生成を顕著に誘導し、重篤な毒性や副作用を惹起することなく、ヒトの転移癌に格別の効果を発揮したことが報告されている。
【００４５】
このように、多種多様のヒト疾患の治療・予防にＩＦＮ−γやキラー細胞が深く関わり、その完治又は緩解への多大の寄与が明らかになっている。斯かる状況において、実験例２乃至３の結果に見られるように、当該ポリペプチドが、顕著な毒性を示すことなく、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するとともに、ＮＫ細胞による細胞障害性の増強又はＬＡＫ細胞の生成を誘導したことは、この発明の感受性疾患剤が、重篤な副作用を惹起することなくヒトに長期間連用でき、ＩＦＮ−γ及び／又はキラー細胞が関与する疾患の治療・予防に効果を発揮することを示している。
【００４６】
以下、実施例に基づき、この発明の感受性疾患剤を説明する。
【実施例１】
【００４７】
＜液剤＞
安定剤として１％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミンを含む生理食塩水に実験例１−２の方法により得たポリペプチドを１ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、常法にしたがって精密濾過により滅菌して液剤を得た。
【００４８】
安定性に優れた本品は、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、細菌感染症及び免疫疾患を含む感受性疾患を治療・予防するための注射剤、点眼剤及び点鼻剤として有用である。
【実施例２】
【００４９】
＜乾燥注射剤＞
安定剤として１％（ｗ／ｖ）精製ゼラチンを含む生理食塩水１００ｍｌに実験例１−２の方法により得たポリペプチドを１００ｍｇ溶解し、常法にしたがって精密濾過により滅菌し、バイアル瓶に１ｍｌずつ分注し、凍結乾燥後、密栓した。
【００５０】
安定性に優れた本品は、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、細菌感染症及び免疫疾患を含む感受性疾患を治療・予防するための乾燥注射剤として有用である。
【実施例３】
【００５１】
＜軟膏剤＞
滅菌蒸留水に和光純薬工業製カルボキシビニルポリマー『ハイビスワコー１０４』と高純度トレハロースをそれぞれ濃度１．４％（ｗ／ｗ）及び２．０％（ｗ／ｗ）になるように溶解し、実験例１−２の方法により得たポリペプチドを均一に混合後、ｐＨ７．２に調整して、１ｇ当たりポリペプチドを約１ｍｇ含むペースト状物を得た。
【００５２】
延展性と安定性に優れた本品は、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、細菌感染症及び免疫疾患を含む感受性疾患の治療・予防するための軟膏として有用である。
【実施例４】
【００５３】
＜錠剤＞
林原製無水結晶α−マルトース粉末『ファイントース』に実験例１−２の方法により得たポリペプチドと細胞賦活剤としてのルミンを均一に混合し、得られる混合物を常法により打錠して製品１錠（約２００ｍｇ）当たりポリペプチド及びルミンをそれぞれ約１ｍｇ含む錠剤を得た。
【００５４】
摂取性、安定性に優れ、細胞賦活作用も有する本品は、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、細菌感染症及び免疫疾患を含む感受性疾患を治療・予防するための錠剤として有用である。
【実施例５】
【００５５】
＜養子免疫療法剤＞
悪性リンパ腫患者の末梢血から単核球を単離し、３７℃に予温した１０％（ｖ／ｖ）ヒトＡＢ血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）に細胞密度約１×１０６個／ｍｌになるように浮遊させ、実験例１−２の方法により得たポリペプチドを約１．０μｇ／ｍｌと組換え型ヒトインターロイキン２を約１００単位／ｍｌ加え、５％ＣＯ２インキュベータ中、３７℃で１週間培養した後、遠心分離によりＬＡＫ細胞を採取した。
【００５６】
このＬＡＫ細胞は、元の悪性リンパ腫患者の体内に移入すると、リンパ腫細胞に顕著な細胞障害性を示し、インターロイキン２のみ用いる養子免疫療法と比較して有意に高い治療効果を発揮する。なお、ヒト単核球に代えて腫瘍組織浸潤リンパ球を同様に処置して得られる細胞障害性Ｔ細胞も、元の患者体内に移入すると、ＬＡＫ細胞と同様の効果を発揮する。本例の養子免疫療法剤は、悪性リンパ腫以外に、例えば、腎癌、悪性黒色腫、大腸癌、肺癌などの固形悪性腫瘍にも有利に適用できる。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
以上説明したように、この発明の感受性疾患剤は、ヒトに投与すると、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、細菌感染症及び免疫疾患を含む感受性疾患の治療・予防に効果を発揮する。また、キラー細胞による細胞障害性の増強又はキラー細胞の生成を誘導する性質を兼備するポリペプチドを有効成分とする感受性疾患剤は、悪性腫瘍などの難治性疾患の治療に格別の効果を発揮する。
【００５８】
この発明は、斯くも顕著な作用効果を発揮するものであり、斯界に貢献すること誠に多大な意義のある発明であると云える。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】組換えＤＮＡ  ｐＫＧＦＨＨ２の構造を示す図である。
【符号の説明】
【００６０】
ＫＧＦＨＨ２  ｃＤＮＡ      ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ
Ｐｔａｃ                   
ｔａｃプロモータ
ｒｒｎＢＴ１Ｔ２            リボゾームＲＮＡオペロンの転写終止領域
ＡｍｐＲ              
アンピシリン耐性遺伝子
ｐＢＲ３２２ｏｒｉ          大腸菌における複製開始点
【図１】
2007197452.tif 000005
【配列表】
2007197452000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年3月2日(2007.3.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列又はそれに相同的なアミノ酸配列（ただし、符号「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸は、イソロイシン又はトレオニンを表わすものとする。）を有し、免疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘導するポリペプチドを有効成分とし、免疫担当細胞において産生されたインターフェロン−γを介することなく、キラー細胞に対して直接作用して活性化することを特徴とする、ウイルス性疾患、細菌感染症、悪性腫瘍及び免疫疾患から選ばれる、活性化されたキラー細胞に対して感受性を有する疾患の治療及び／又は予防剤。
【請求項２】
化学療法剤を併用することを特徴とする請求項１に記載の治療及び／又は予防剤。
【請求項３】
配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列又はそれに相同的なアミノ酸配列（ただし、符号「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸は、イソロイシン又はトレオニンを表わすものとする。）を有し、免疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘導するポリペプチドを有効成分とする、キラー細胞の細胞障害性の増強剤。