(57)【要約】      （修正有）【課題】血管傷害部位の平滑筋細胞、心筋細胞や骨格筋芽細胞に存在するＮ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質、その部位へこのタンパク質を介して特異的に薬物を輸送でき簡便に製造できる薬物輸送剤およびカチオン性樹脂遺伝子複合体を提供する。【解決手段】摘出された細胞に添加されたＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物へその糖鎖基を介して結合している複合タンパク質を、該細胞から抽出後、該糖鎖基を、該複合タンパク質から解離させたものである。薬物輸送剤、カチオン性樹脂遺伝子複合体は、Ｎ−アセチルグルコサミン類を有し、それへこの細胞中の該タンパク質が結合するものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
摘出された細胞に添加されたＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物へその糖鎖基を介して結合している複合タンパク質を、該細胞から抽出後、該糖鎖基を、該複合タンパク質から解離させたものであることを特徴とするＮ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質。
【請求項２】
該化合物が、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有樹脂化合物および／またはＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有ビオチン化合物であることを特徴とする請求項１に記載のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質。
【請求項３】
該化合物が、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有ビオチン化合物であり、該化合物へその糖鎖基を介して結合している該複合タンパク質は、該抽出後に添加されたアビジンコーティングビーズのアビジン基と、このアビジン基に結合する該化合物のビオチン基とを介して、該ビーズと一体化していることを特徴とする請求項１に記載のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質。
【請求項４】
非イオン性界面活性剤により該抽出がなされたことを特徴とする請求項１に記載のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質。
【請求項５】
イオン性界面活性剤により該解離させたことを特徴とする請求項１に記載のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質。
【請求項６】
該解離させた後、電気泳動により精製されたことを特徴とする請求項１に記載のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質。
【請求項７】
コロイド粒子の表面からＮ−アセチルグルコサミン類が露出され、またはコロイド粒子表面にコーティングされたアビジン類を介してＮ−アセチルグルコサミン類が結合されており、該Ｎ−アセチルグルコサミン類へ請求項１に記載の該細胞中の該Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質が結合することを特徴とする薬物輸送剤。
【請求項８】
該コロイド粒子が、生体分解性樹脂粒子、合成樹脂粒子、またはリポソームであることを特徴とする請求項７に記載の薬物輸送剤。
【請求項９】
該コロイド粒子中に、蛍光剤、造影剤または治療剤が含有されていることを特徴とする請求項７に記載の薬物輸送剤。
【請求項１０】
該Ｎ−アセチルグルコサミン類が、Ｎ−アセチルグルコサミン、キトビオース、キトトリオース、キトテトラオース、キトペンタオース、またはキトヘキサオースであることを特徴とする請求項７に記載の薬物輸送剤。
【請求項１１】
Ｎ−アセチルグルコサミン類が結合したカチオン性樹脂と、プラスミドとが並んで複合体を形成しており、それに請求項１に記載の該細胞中の該Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質が結合することを特徴とするカチオン性樹脂遺伝子複合体。
【請求項１２】
該カチオン性樹脂がポリエチレンイミンであることを特徴とする請求項１１に記載のカチオン性樹脂遺伝子複合体。
【請求項１３】
該Ｎ−アセチルグルコサミン類が、Ｎ−アセチルグルコサミン、キトビオース、キトトリオース、キトテトラオース、キトペンタオース、またはキトヘキサオースであることを特徴とする請求項１１に記載のカチオン性樹脂遺伝子複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、傷害を受けた血管平滑筋細胞や心筋細胞等の中に存在するＮ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質、このタンパク質に特異的に結合する薬物輸送剤およびカチオン性樹脂遺伝子複合体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
動脈硬化や血栓形成により冠状動脈血管が狭窄している虚血性心疾患の患者に、血管へバルーンやステントを挿入して狭窄部位を押し広げるインターベーション治療が施される。
【０００３】
その際にバルーンやステントが狭窄部分で擦れ血管内皮細胞を剥離させて、傷害を与えてしまう。その結果、血管で炎症を引き起こしたり、その傷害部位の内皮下にある平滑筋細胞や心筋細胞の異常な増殖による内膜肥厚や新たな血栓形成を引き起こして血管を再び狭窄させたりする。そのため、抗炎症や肥厚防止や血栓防止等のための薬物の徐放性製剤が塗布されたコイルを、この部位に挿入して、再狭窄等を防止するという、煩雑で患者の負担の大きな処置を施さなければならない。
【０００４】
このような治療の際に血管傷害部位へ特異的にこれらの薬物を輸送させることができる簡便なシステムが望まれている。薬物輸送システムとして、非特許文献１に、糖鎖導入ドラッグデリバリー材料であるネオ糖タンパク質とリポソームとの複合体が記載され、また非特許文献２に、肝細胞に特異的な遺伝子輸送剤であるポリエチレンイミンとアラビノガラクタンとの複合体が記載されている。しかし、これらは血管傷害部位への特異性がない。
【０００５】
【非特許文献１】Noboru Yamazaki, Yoshifumi Jigami, Hans-Joachim Gabius, and Shuji Kojima, Trends in Glycoscience and Glycotechnology, Vol.13, No.71, pp.319-329 (May 2001)
【非特許文献２】M.Nogawa, T.Ishihara, T.Akaike, and A.Maruyama, S.T.P.Pharma Sciences,Vol.11, No.1, pp97-102 (2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は前記の課題を解決するためになされたもので、血管傷害部位の平滑筋細胞や心筋細胞、骨格筋芽細胞やヘパトーマ細胞に存在するＮ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質、その部位へこのタンパク質を介して特異的に薬物や遺伝子を輸送でき、簡便に製造できる薬物輸送剤およびカチオン性樹脂遺伝子複合体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記の目的を達成するためになされた特許請求の範囲の請求項１に記載のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質は、摘出された細胞に由来しており、該細胞に添加されたＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有化合物へその糖鎖基を介して結合している複合タンパク質を、該細胞から抽出後、該糖鎖基を、該複合タンパク質から解離させたものであることを特徴とする。
【０００８】
このタンパク質は、血管内皮細胞に存在せず、この内皮細胞が剥離された血管傷害部位の内皮下で増殖している平滑筋細胞、心筋細胞、骨格筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）、ヘパトーマ細胞（ＨｅｐＧ２）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ｃｏｓ細胞に存在する。
【０００９】
このタンパク質は、あたかも鍵穴に鍵が嵌まるように、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基を認識して相互作用し、水素結合等により結合する。
【００１０】
請求項２に記載のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質は、該化合物が、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有樹脂化合物および／またはＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有ビオチン化合物であることを特徴とする。
【００１１】
請求項３に記載のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質は、該化合物が、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有ビオチン化合物であり、該化合物へその糖鎖基を介して結合している該複合タンパク質が、該抽出後に添加されたアビジンコーティングビーズのアビジン基と、このアビジン基に結合する該化合物のビオチン基とを介して、該ビーズと一体化していることを特徴とする。
【００１２】
このタンパク質が含まれる細胞は、ラットやヒトのような哺乳類から摘出されたものであることが好ましい。
【００１３】
このタンパク質が含まれる細胞は、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基を含有する樹脂化合物が含まれた培地で予め培養されていることが好ましい。この樹脂化合物は、糖鎖基を介して前記タンパク質へ相互作用して結合する結果、生成した複合タンパク質を有する細胞のみが培地に粘着する。それ以外の細胞は、洗浄によって培地から除去される。また、細胞の培養によって、細胞中のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質も増加するので、純粋なこのタンパク質を、大量かつ簡便に得ることができるようになる。
【００１４】
これらの細胞は、引き続き、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有ビオチン化合物が含まれた培地で培養されていることが好ましい。このビオチン化合物も糖鎖基を介して前記複合タンパク質へ相互作用して結合する。細胞から複合タンパク質を抽出した後に添加されるアビジンコーティングビーズのアビジン基と、この化合物のビオチン基とが結合する結果、複合タンパク質をビーズに固定することができる。ビーズは濾別により取出される。ビーズに固定された複合タンパク質から糖鎖基を解離させると、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質が簡便に得られる。
【００１５】
前記のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基は、Ｎ−アセチルグルコサミン基や、それが２〜６個結合したキトポリオース基が挙げられる。
【００１６】
請求項４に記載のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質は、非イオン性界面活性剤により該抽出がなされたことを特徴とする。
【００１７】
非イオン性界面活性剤は、例えばＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ａｌｄｒｉｃｈ社製；登録商標）、ＮＰ−４０（株式会社同人化学研究所製；商品名）が挙げられる。
【００１８】
請求項５に記載のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質は、イオン性界面活性剤により該解離させたことを特徴とする。
【００１９】
イオン性界面活性剤は、例えばドデシル硫酸ナトリウムが挙げられる。
【００２０】
請求項６に記載のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質は、該解離させた後、電気泳動により精製されたことを特徴とする。
【００２１】
単離されたＮ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質の分子量は、約７５ｋダルトンである。
【００２２】
同じく前記の目的を達成するためになされた請求項７に記載の薬物輸送剤は、コロイド粒子の表面からＮ−アセチルグルコサミン類が露出され、またはコロイド粒子表面にコーティングされたアビジン類を介してＮ−アセチルグルコサミン類が結合されており、該Ｎ−アセチルグルコサミン類へ請求項１に記載の該細胞中の該Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質が結合することを特徴とする。
【００２３】
この薬物輸送剤は、それに含まれるＮ−アセチルグルコサミン類と、平滑筋細胞等に存在するＮ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質とが、相互作用して水素結合等により結合する結果、これらの細胞に特異的に集積される。しかし、このタンパク質は、例えばラット肝細胞に存在しないので、この薬物輸送剤はこの細胞に集積されない。
【００２４】
請求項８に記載の薬物輸送剤は、該コロイド粒子が、生体分解性樹脂粒子、合成樹脂粒子、またはリポソームであることを特徴とする。
【００２５】
薬物輸送剤は、このコロイド粒子を０．５〜２．０％含有していることが好ましい。
【００２６】
コロイド粒子は、粒子径５〜５００ｎｍのいわゆるナノ粒子であることが好ましい。５ｎｍ未満であると、生体中で速やかに排泄されてしまい、一方５００ｎｍを超えると生体中の異物として排除されてしまう。約２００ｎｍであると、特に血管傷害部位の細胞間に生じた間隙や血管内で露出した平滑筋細胞に取り込まれ易い。
【００２７】
生体分解性樹脂粒子は、例えば懸濁させたポリ乳酸粒子が挙げられる。合成樹脂粒子は、平均粒径約２００ｎｍのポリスチレンビーズが挙げられる。リポソームは、例えば脂肪やリン脂質でできた直径５０〜２００ｎｍのものが挙げられる。
【００２８】
請求項９に記載の薬物輸送剤は、該コロイド粒子中に、蛍光剤、造影剤または治療剤が含有されていることを特徴とする。
【００２９】
例えば薬物輸送剤は、投与されると、血液循環により血管傷害部位に到達する。すると薬物輸送剤が有するＮ−アセチルグルコサミン類と、血管傷害部位に露出した血管平滑筋細胞中のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質とが相互作用して引き寄せあい、この細胞に付着したり侵入したりする。その後、蛍光剤、造影剤または治療剤が薬物輸送剤のコロイド粒子表面から滲出して放出され、細胞に吸収され、蛍光させたり造影させたり薬効を発現したりする。
【００３０】
蛍光剤は、例えば生細胞染色用色素Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（株式会社同人化学研究所製；商品名）が挙げられる。造影剤は、例えば核磁気共鳴画像診断用ガドリニウム化合物が挙げられる。治療剤は、例えば血管内皮細胞増殖促進剤、血管平滑筋細胞増殖抑制剤、抗炎症剤、抗癌剤、抗リウマチ剤が挙げられる。
【００３１】
請求項１０に記載の薬物輸送剤は、該Ｎ−アセチルグルコサミン類が、Ｎ−アセチルグルコサミン、キトビオース、キトトリオース、キトテトラオース、キトペンタオース、またはキトヘキサオースであることを特徴とする。
【００３２】
同じく前記の目的を達成するためになされた請求項１１に記載のカチオン性樹脂遺伝子複合体は、Ｎ−アセチルグルコサミン類が結合したカチオン性樹脂と、プラスミドとが並んで複合体を形成しており、それに請求項１に記載の該細胞中の該Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質が結合することを特徴とする。
【００３３】
このカチオン性樹脂遺伝子複合体は、プラスミドのＤＮＡ二重螺旋構造が有するアニオン部位に、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基を有するカチオン性樹脂のカチオン部位が静電的に相互作用し、互いに並んだものである。
【００３４】
この複合体は、Ｎ−アセチルグルコサミン類の存在により、細胞中のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質と相互作用し、これらの細胞へ取り込まれ易くなっている。
【００３５】
プラスミドは、例えば傷害を受けた血管内皮の増殖を促進したり、血管平滑筋細胞の増殖を抑制したりする因子のＤＮＡであり、より具体的には市販のＬａｃＺ遺伝子であるβ−ガラクトシダーゼプラスミド（クロンテック社製）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）プラスミド、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）プラスミドが挙げられる。
【００３６】
請求項１２に記載のカチオン性樹脂遺伝子複合体は、該カチオン性樹脂がポリエチレンイミンであることを特徴とする。
【００３７】
請求項１３に記載のカチオン性樹脂遺伝子複合体は、該Ｎ−アセチルグルコサミン類が、Ｎ−アセチルグルコサミン、キトビオース、キトトリオース、キトテトラオース、キトペンタオース、またはキトヘキサオースであることを特徴とする。
【００３８】
Ｎ−アセチルグルコサミン類は、水素化シアノホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）存在下、還元的アミノ化反応により、ポリエチレンイミンへ結合させたものである。
【発明の効果】
【００３９】
本発明のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質は、平滑筋細胞、心筋細胞、骨格筋芽細胞、ヘパトーマ細胞等に特異的に存在する。
【００４０】
本発明の薬物輸送剤や遺伝子複合体は、Ｎ−アセチルグルコサミン基を有しているので、このタンパク質を有する細胞へ選択的に集積させることができる。そのため、血管傷害部位、感染症や悪性腫瘍や動脈硬化やリウマチ等の血管病変部位、細胞再生部位へ集中的に薬物を到達させたり遺伝子を導入させたりすることができ、薬効の増強や、副作用の軽減を図ることができる。また薬物輸送剤は徐放性を有するので、薬効を長期間持続させることができる。薬物輸送剤や遺伝子複合体は、生体適合性が高く安全である。
【実施例】
【００４１】
以下、本発明の実施例を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４２】
実施例１に、本発明を適用するＮ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質を単離、同定した例を示す。
【００４３】
（実施例１）
(1)Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有樹脂化合物として、キトビオースがＮ−アセチルグルコサミン末端で結合したビニル系樹脂ＰＶ−ＧｌｃＮＡｃ（生化学工業株式会社製；商品名）を用いた。これの１００μｇ／ｍＬを培地９６穴プレート（グライナー社製；商品名）にコートし、その上にラット血管平滑筋細胞またはラット胎仔心筋細胞を播種し、４℃で６０分間インキュベーションを行なった。この樹脂と、それのキトビオース基を介してＮ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質とが結合する結果、このタンパク質を有する細胞が、培地に接着した。この培地を生理食塩水またはリン酸緩衝液で洗浄すると、このタンパク質を有しないために培地に接着できなかった細胞が取り除かれた。この培地をテトラゾリウム塩で染色し、イソプロパノールで過剰の色素を溶出させて脱色すると、生細胞が黄色から青色へ着色された。それの吸光度を５７０ｎｍで測定したところ、図１に示すように極めて高い値を示し、ＰＶ−ＧｌｃＮＡｃが、血管平滑筋細胞と心筋細胞とのいずれのタンパク質にも結合していると確認できた。
【００４４】
なお、このことは、血管平滑筋細胞へのＰＶ−ＧｌｃＮＡｃの接着が、０．１〜１．０ＭのＮ−アセチルグルコサミンの添加によって濃度に依存して阻害されたことからも明らかである。また、血管平滑筋細胞へのＰＶ−ＧｌｃＮＡｃの接着は、Ｃａ２＋の添加によっても阻害されないことからカルシウム非依存性であることが確認された。
【００４５】
(2)Ｎ−アセチルグルコサミンとビオチンとをＨｙｄｒａｚｉｄｅ存在下反応させた。得られたＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基含有ビオチン化合物を直ちに、細胞が接着している前記の培地へ加え、１〜２時間放置した。これにより細胞中で、この化合物のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基がさらに結合した複合タンパク質が形成された。
【００４６】
非イオン性界面活性剤として４％ＮＰ−４０を含む細胞溶解液に細胞を溶解することにより、複合タンパク質を、細胞から抽出した。
【００４７】
アビジンコーティングビーズとしてアビジン−アガロース（シグマ社製；Avidin agarose）を添加して攪拌した。そのアビジン基を介し複合タンパク質中のビオチン基に結合することによって複合タンパク質と一体化しているビーズを、濾別して取出した。
【００４８】
一体化したビーズに、イオン性界面活性剤として２％ドデシル硫酸ナトリウム（和光純薬社；Sodium Dodecylsulfate）を添加して攪拌すると、複合タンパク質からＮ−アセチルグルコサミン糖鎖基が解離し、遊離の粗Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質が得られた。
【００４９】
この粗タンパク質の一部について、７．５％ドデシルドデシル硫酸ナトリウム−アクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行い、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色すると、その電気泳動パターン写真を示す図２のように主スポットが認められた。
【００５０】
そのスポットの位置に相当する電気泳動ゲルのバンドを切出し、抽出処理することにより、精製されたＮ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質が単離された。
【００５１】
飛行時間型質量分析法（ＴＯＦ−ＭＳ）により、このタンパク質の分子量を測定したところ、７５ｋダルトン（ｋＤ）であった。
【００５２】
次に、Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖以外の糖鎖の認識タンパク質について検討した例を比較例１に示す。
【００５３】
（比較例１）
実施例１のＰＶ−ＧｌｃＮＡｃに代えて、ラクトースがガラクトース末端で結合したビニル系樹脂ＰＶ−ＬＡ、マンノビオースがマンノース末端で結合したビニル系樹脂ＰＶ−Ｍａｎ、カルボキシル化ラクトースが結合したビニル系樹脂ＰＶ−ＬＡＣＯＯＨ、グルコースが結合したビニル系樹脂ＰＶ−Ｇ、マルトースがグルコース末端で結合したビニル系樹脂ＰＶ−ＭＡ、ラミナリビオースがグルコース末端で結合したビニル系樹脂ＰＶ−Ｌａｍ、メリビオースがガラクトース末端で結合したビニル系樹脂ＰＶ−ＭＥＡ、セロビオースがグルコース末端で結合したビニル系樹脂ＰＶ−ＣＡ、開環グルコースが結合したビニル系樹脂ＰＶ−ＧＡ（いずれも生化学工業株式会社製；商品名）を用いたこと以外は、実施例１の(1)と同様にして、吸光度を測定したところ、図１に示すように、いずれも極めて低い値を示し細胞中のタンパク質に結合していないことが確認された。
【００５４】
実施例２に、本発明を適用するＮ−アセチルグルコサミン類を有するポリ乳酸コロイド粒子である薬物輸送剤の調製例を示す。また比較例２に、本発明を適用外のガラクトースを有するポリ乳酸コロイド粒子である薬物輸送剤の例を示す。
【００５５】
（実施例２）
ポリ乳酸１０ｍｇと、ＰＶ−ＧｌｃＮＡｃの２ｍｇと、蛍光剤Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭの０．２５ｍｇとを水中で懸濁し、表面からＮ−アセチルグルコサミン類が露出しＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭが含有されているポリ乳酸コロイド粒子を含むコロイドを調製した。これを、ラット心筋株化細胞（Ｈ９Ｃ２ａ）およびラット心筋細胞に夫々添加してから培養した後、蛍光顕微鏡で観察したところ、何れの細胞にも蛍光発光が認められ、細胞に薬物輸送剤が到達していると確認された。
【００５６】
（比較例２）
比較のため、実施例２のＰＶ−ＧｌｃＮＡｃに代えてＰＶ−ＬＡを用いたこと以外は実施例２と同様にしてラクトースでコートされた薬物輸送剤を調製した。しかし、蛍光顕微鏡で観察してもラット心筋株化細胞およびラット心筋細胞のいずれにも蛍光発光が認められず、細胞に薬物輸送剤が到達していないと確認された。
【００５７】
実施例３および４に、本発明を適用するＮ−アセチルグルコサミン類を有するポリスチレンビーズの薬物輸送剤の例を示す。また、比較例３に本発明を適用外のラクトースを有するポリスチレンビーズの薬物輸送剤の例を示す。
【００５８】
（実施例３）
キトビオースとビオチンとをＨｙｄｒａｚｉｄｅ存在下、反応させてキトビオース−ビオチン結合体を合成した。これと、アビジンがコーティングされ蛍光剤のフルオロセイン  イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）が含有された直径２００ｎｍのポリスチレンビーズFluoSphheres Neutrr Avidin labeled microspheres（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製；商品名）とを攪拌して、キトビオース−ビオチン結合体のビオチン基にビーズのアビジン基が結合してできた薬物輸送剤のコロイドを調製した。このコロイド２０μＬにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）０．２ｍＬを加え懸濁液を得た。
【００５９】
マウスの右大腿動脈にワイヤーを挿入して機械的に血管内膜に傷害を与えることにより、内皮細胞が剥れて平滑筋細胞が血管内腔に露出している血管傷害モデルを作製した。このモデルは、傷害を受けたままマウスを飼育すると、平滑筋細胞が異常増殖し、血管が再狭窄するというものである。
【００６０】
傷害を与えた直後に、この懸濁液を、尾静注により投与した。投与後、２４時間経過してからその血管を摘出し、蛍光顕微鏡で観察したところ、傷害部位の血管平滑筋細胞に蛍光発光が認められ、この細胞に薬物輸送剤が到達していると確認された。
【００６１】
なお、ワイヤーにより傷害を受けていないマウスを対照として用い、同様に観察したが、血管内の細胞に蛍光発光が認められず、細胞へ薬物輸送剤が到達していないと確認された。
【００６２】
（実施例４）
キトビオースに代えてキトヘキサノースを用いたこと以外は、実施例３と同様にして薬物輸送剤のコロイドを調製し、マウスに投与したところ、実施例３と同様に血管の平滑筋細胞に蛍光発光が認められ、この細胞に薬物輸送剤が到達していると確認された。
【００６３】
（比較例３）
比較のため、実施例３のようなＮ−アセチルグルコサミンの二糖であるキトビオースに代えて、ガラクトースとグルコースとの二糖であるラクトースを用いたこと以外は、実施例３と同様にして薬物輸送剤を調製し、マウスに投与したところ、血管の平滑筋細胞に蛍光発光が認められず、細胞に薬物輸送剤が到達していないと確認された。
【００６４】
実施例５に、本発明を適用する別なＮ−アセチルグルコサミン類である五糖のキトペンタオースを有するポリスチレンビーズの薬物輸送剤の例を示す。また、比較例４に本発明を適用外の五糖のマルトペンタオースを有するポリスチレンビーズの薬物輸送剤の例を示す。
【００６５】
（実施例５）
実施例３のキトビオースに代えてキトペンタオースを用いたこと以外は、実施例３と同様にして薬物輸送剤のコロイドの懸濁液を調製した。マウスの心臓の冠動脈にバルーンカテーテルを挿入し、冠動脈をバルーンカテーテルごと結紮し、３０分間の虚血後、結紮を解き、再灌流を行ない、バルーンカテーテルで血管を押し広げる心筋梗塞モデルとして、虚血再灌流モデルを作製した。虚血再灌流直後に、この懸濁液を尾静注により投与した。投与後、２４時間経過してからその血管を摘出し、蛍光顕微鏡で観察したところ、傷害部位の血管平滑筋細胞に蛍光発光が認められ、この細胞に薬物輸送剤が到達していると確認された。
【００６６】
（比較例４）
比較のため、実施例５のようなＮ−アセチルグルコサミンの五糖であるキトペンタオースに代えて、同じく五糖であるがＮ−アセチルグルコサミン糖鎖を有しないマルトペンタオースを用いたこと以外は、実施例５と同様にして薬物輸送剤を調製し、マウスに投与したところ、血管の平滑筋細胞に蛍光発光が認められず、細胞に薬物輸送剤が到達していないと確認された。
【００６７】
実施例６に、本発明を適用するカチオン性樹脂遺伝子複合体の例を示す。
【００６８】
（実施例６）
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）(シグマ社；polyethrenimine)と、キトビオースとを、非特許文献２に記載の方法に準じ、ＮａＢＨ３ＣＮ存在下、還元的アミノ化反応をさせて、キトビオース結合ポリエチレンイミン（ＰＥＩ−ＧｌｃＮＡｃ-ＧｌｃＮＡｃ）を合成した。
【００６９】
トランスファクションさせる前に、予めラット心筋細胞またはラット心筋株化細胞（Ｈ９Ｃ２）を培地に播種した。
【００７０】
ＬａｃＺ遺伝子であるβ−ガラクトシダーゼプラスミドの１μｇと、カチオン性キャリアであるキトビオース結合ポリエチレンイミンとのモル比１：２の混合物を、ｐＨ７．４の１０ｍＭのN-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid]（Ｈｅｐｅｓ）と５％グルコースとの10 mM Hepes buffer, 5% glucose（ＨＢＧ）液の１０μＬに加えた。混合物を、最終濃度１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有培養液で１００μＬに希釈してから、細胞に添加した。１時間インキュベートした後、新たな１０％ＦＢＳ含有培養液に替え、さらに３日間インキュベートし、細胞へカチオン性樹脂遺伝子複合体を導入した。これにＸｇａｌ染色を施し、Chlorophenol red-β-galactopyranoside (CPRG)を基質とするβ−ガラクトシダーゼアッセイによりβ−ガラクトシダーゼ発現量を測定した。その結果を図３に示す。なお、図３の縦軸のβ−ガラクトシダーゼ発現量は、吸光度で示されている。
【００７１】
（比較例５）
比較のため、実施例６のキトビオース結合ポリエチレンイミンに代えて、その原料であるポリエチレンイミンを用いたこと以外は、実施例５と同様にして、細胞へカチオン性樹脂遺伝子複合体を導入し、β−ガラクトシダーゼ発現量を測定した。その結果を図３に示す。
【００７２】
図３から明らかな通り、実施例６のキトビオース基を有するカチオン性樹脂遺伝子複合体が導入された細胞は、キトビオース基を有しないカチオン性樹脂遺伝子複合体が導入された細胞よりも、β−ガラクトシダーゼ発現量が約２倍も多くなっていた。Ｎ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質と相互作用して引き寄せられた結果、細胞中に多量に取り込まれたからであると推察される。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明のＮ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質は、平滑筋細胞、心筋細胞、骨格筋芽細胞、ヘパトーマ細胞に特異的に存在するので、これらの細胞への選択的な薬物輸送の薬剤の探索やメカニズムの解明に有用である。
【００７４】
本発明の薬物輸送剤は任意の形態での投与が可能な医薬品として、また遺伝子複合体はトランスフェクション試薬として、虚血性心疾患治療に対するインターベーション治療後の血管傷害部位、心筋梗塞部位、感染症等の血管病変部位、細胞再生部位の細胞近傍へ集中的かつ安全に、薬物を輸送したり遺伝子を導入したりするために用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】本発明を適用するＮ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質と、各種糖鎖含有ビニル系樹脂との結合の有無を示すグラフである。
【００７６】
【図２】本発明を適用するＮ−アセチルグルコサミン糖鎖認識タンパク質の電気泳動パターン写真である。
【００７７】
【図３】本発明を適用するＮ−アセチルグルコサミン類が結合したカチオン性樹脂遺伝子複合体が導入された細胞と、Ｎ−アセチルグルコサミン類が結合していないカチオン性樹脂遺伝子複合体が導入された細胞とのβ−ガラクトシダーゼ発現量を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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