(57)【要約】【課題】２細胞一対での細胞融合を効率的に行う細胞融合装置とそれを用いた細胞融合方法を提供する。【解決の手段】細胞融合領域内に対向して配置される導電部材からなる一対の電極と、一対の電極間に平板状のスペーサーを介して配置され、かつ対向して配置された電極の方向に貫通した１または複数の微細孔を形成した平板状の絶縁体からなる細胞融合容器と、一対の電極に交流電圧を印加する電源と、を備えた細胞融合装置を用い、細胞融合領域内に第１の細胞を導入し、前記波形を有する交流電圧を印加することで微細孔内に第１の細胞を固定した後、細胞融合領域内に第２の細胞を導入して、前記波形を有する交流電圧を印加することで前記第１の細胞に前記第２の細胞を微細孔の位置において接触させ化学的に細胞を融合する細胞融合方法を用いる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞融合領域内に対向して配置される導電部材からなる一対の電極と、前記一対の電極間に平板状のスペーサーを介して配置され、かつ前記対向して配置された電極の方向に貫通した１または複数の微細孔を形成した平板状の絶縁体からなる細胞融合容器と、前記一対の電極に交流電圧を印加する電源と、を備えた細胞融合装置。
【請求項２】
絶縁体に形成される微細孔が、１つの微細孔につき１つの細胞を固定できる形状であることを特徴とする請求項１に記載の細胞融合装置。
【請求項３】
電源により、１つの微細孔につき１つの細胞を微細孔に固定する波形を有する交流電圧が前記電極間に印加されることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の細胞融合装置。
【請求項４】
電源により、前記微粒子の充電と放電を周期的に繰り返す波形を有する交流電圧が前記電極間に印加されることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞融合装置。
【請求項５】
前記交流電圧の波形が、０以外の値を有する電圧が一定時間変化しない時間を半周期内に少なくとも１以上有する波形であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の細胞融合装置。
【請求項６】
前記交流電圧の波形が、矩形波、台形波、またはこれらを組み合わせた波形であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の細胞融合装置。
【請求項７】
前記交流電圧の波形が、０以外の値を有する電圧が一定時間変化しない時間が細胞の静電容量と細胞を含有する細胞懸濁液の抵抗の積からなる時定数以上であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の細胞融合装置。
【請求項８】
微細孔の平面形状に内接する最大円の直径が、微細孔に固定する細胞の直径の１以上２倍未満の範囲であり、かつ微細孔の深さが、微細孔に固定する細胞の直径以下であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の細胞融合装置。
【請求項９】
絶縁体が、電極のうちどちらか一方の電極の細胞融合領域側の電極面上に配置されている、請求項１〜８のいずれかに記載の細胞融合装置。
【請求項１０】
絶縁体に形成される複数の微細孔が、絶縁体の面において、いずれの微細孔からも隣合う微細孔の位置が同じ位置に形成されていることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の細胞融合装置。
【請求項１１】
絶縁体に形成される複数の微細孔が、絶縁体の面においてアレイ状に形成されていることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の細胞融合装置。
【請求項１２】
微細孔の隣合う間隔が、微細孔に入れる細胞の直径の０．５倍以上６倍以下の範囲であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の細胞融合装置。
【請求項１３】
スペーサーが、細胞融合領域を形成する貫通孔を有することを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の細胞融合装置。
【請求項１４】
スペーサーが、細胞を導入する導入流路および排出する排出流路を有することを特徴とする請求項１〜１３のいずれかに記載の細胞融合装置。
【請求項１５】
前記絶縁体が親水性であることを特徴とする請求項１〜１４のいずれかに記載の細胞融合装置。
【請求項１６】
前記微細孔の平面形状が、１以上の角を有する形状であることを特徴とする請求項１〜１５のいずれかに記載の細胞融合装置。
【請求項１７】
前記微細孔の平面形状が、四辺形であることを特徴とする請求項１６に記載の細胞融合装置。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれかに記載の細胞融合装置を用いた細胞融合方法であって、前記細胞融合領域内に第１の細胞を導入し、交流電圧を印加することで前記微細孔内に前記第１の細胞を固定した後、前記細胞融合領域内に第２の細胞を導入して、交流電圧を印加することで前記第１の細胞に前記第２の細胞を微細孔の位置において接触させ化学的に細胞を融合することを特徴とする細胞融合方法。
【請求項１９】
請求項１８記載の交流電圧が、請求項３〜７のいずれかに記載の波形を有する交流電圧であることを特徴とする請求項１８記載の細胞融合方法。
【請求項２０】
細胞を細胞膜の流動性を高める物質を加えた細胞懸濁液に入れることを特徴とする請求項１８または請求項１９に記載の細胞融合方法。
【請求項２１】
前記細胞膜の流動性を高める物質が、ポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項１８〜２０のいずれかに記載の細胞融合方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞融合を効率的に行うための細胞融合装置とそれを用いた細胞融合方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、異なる細胞同士を融合させ１つの交雑細胞とする細胞融合技術として、主にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる化学的融合法が用いられているが、この方法では（ｉ）ＰＥＧは細胞に対して強い毒性を持っている、（ｉｉ）融合するにあたりＰＥＧの重合度、添加量などの最適な諸条件を見出すのに手間がかかる、（ｉｉｉ）融合に際して高度な技術が要求され、特定の技術に習熟した人にしか使えない、（ｉｖ）２細胞の接触は偶発的であり、２細胞１対での細胞融合の制御が困難なため細胞融合確率が極めて低い、等の解決すべき課題があった。
【０００３】
上記課題を解決するために、ＰＥＧを用いる化学的融合法と、電圧を印加することで細胞を数珠状に整列させて融合させる電気的細胞融合法を組み合わせた方法が報告されている（例えば、特許文献１参照）。電気的細胞融合法は、高度な技術が不要で、簡単に効率よく融合させることができ、細胞に与える毒性がなく、高活性をもったままの状態で細胞を融合させることができるという利点がある。
【０００４】
電気的細胞融合法は、１９８１年西ドイツのＺｉｍｍｅｒｍａｎｎが確立したものであり、その原理は次の通りである。すなわち、平行電極間に交流電圧を印加し、そこに細胞を導入すると、細胞は電流密度の高い方へ引き寄せられ数珠状にならぶ。なお、細胞が数珠状にならんだ状態を一般にパールチェーンと呼ぶ。この状態で数μｓｅｃ〜数十μｓｅｃ単位のパルス電圧を電極間に印加することにより細胞膜の電気伝導度が瞬間的に低下し、脂質二重層により構成される細胞膜の可逆的乱れとその再構成が行われ、その結果細胞融合が起こるものである。特許文献１に記載された方法では、細胞を入れたＰＥＧの溶媒を電極間に導入し、電極間に交流電圧を印加し細胞を数珠状にならべることで、細胞を秩序よく配列させることを試みている。
【０００５】
しかしながら、細胞は数珠状に連なるものの、その順番を制御することができないため、化学的融合法を単独で用いた場合よりは改善されるものの、依然として２細胞の接触は偶発的であり、２細胞１対での細胞融合の確実な制御が難しいという課題があり、さらなる改善が望まれていた。
【０００６】
【特許文献１】特開昭６０−９４９０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、かかる従来の実状に鑑みて提案されたものであり、２細胞一対での細胞融合を効率的に行う細胞融合装置とそれを用いた細胞融合方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は上記課題を解決するものとして、細胞融合領域内に対向するように配置された導電部材よりなる一対の電極と、前記一対の電極方向に貫通した微細孔を形成した絶縁体からなり、化学的に細胞を融合する細胞融合容器であって、前記絶縁体の表面が親水性であり、前記絶縁体が前記電極のうちどちらか一方の電極の細胞融合領域側の電極面上に配置されており、前記微細孔の平面形状が少なくとも１以上の角を有する形状である細胞融合容器と、前記一対の電極に交流電圧を印加するための交流電源からなり、前記交流電源により前記電極間に印加する交流電圧の波形が、前記細胞の充電と放電を周期的に繰り返す波形であることを特徴とする細胞融合装置を用いて、前記細胞融合領域内に第１の細胞を導入し、前記波形を有する交流電圧を印加することで前記微細孔内に前記第１の細胞を固定した後、前記細胞融合領域内に第２の細胞を導入して、前記波形を有する交流電圧を印加することで前記第１の細胞に前記第２の細胞を微細孔の位置において接触させ化学的に細胞を融合することを特徴とする細胞融合方法を用いることにより、上記の従来技術の課題を解決することができることを見出し、遂に本発明を完成するに至った。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
本発明は、細胞融合領域内に対向して配置される導電部材からなる一対の電極と、前記一対の電極間に平板状のスペーサーを介して配置され、かつ前記対向して配置された電極の方向に貫通した１または複数の微細孔を形成した平板状の絶縁体からなる細胞融合容器と、前記一対の電極に交流電圧を印加する電源と、を備えた細胞融合装置である。
【００１０】
また本発明は、上記記載の絶縁体に形成される微細孔が、１つの微細孔につき１つの細胞を固定できる形状である細胞融合装置である。
【００１１】
また本発明は、上記記載の電源により、１つの微細孔につき１つの細胞を微細孔に固定する波形を有する交流電圧が前記電極間に印加される細胞融合装置である。
【００１２】
また本発明は、上記記載の電源により、前記微粒子の充電と放電を周期的に繰り返す波形を有する交流電圧が前記電極間に印加される細胞融合装置である。
【００１３】
また本発明は、上記記載の交流電圧の波形が、０以外の値を有する電圧が一定時間変化しない時間を半周期内に少なくとも１以上有する波形である細胞融合装置である。
【００１４】
また本発明は、上記記載の交流電圧の波形が、矩形波、台形波、またはこれらを組み合わせた波形である細胞融合装置である。
【００１５】
また本発明は、上記記載の交流電圧の波形が、０以外の値を有する電圧が一定時間変化しない時間が細胞の静電容量と細胞を含有する細胞懸濁液の抵抗の積からなる時定数以上である細胞融合装置である。
【００１６】
また本発明は、微細孔の平面形状に内接する最大円の直径が、微細孔に固定する細胞の直径の１以上２倍未満の範囲であり、かつ微細孔の深さが、微細孔に固定する細胞の直径の以下である上記記載の細胞融合装置である。
【００１７】
また本発明は、上記記載の絶縁体が、電極のうちどちらか一方の電極の細胞融合領域側の電極面上に配置されている細胞融合装置である。
【００１８】
また本発明は、上記記載の絶縁体に形成される複数の微細孔が、絶縁体の面において、いずれの微細孔からも隣合う微細孔の位置が同じ位置に形成されている細胞融合装置である。
【００１９】
また本発明は、上記記載の絶縁体に形成される複数の微細孔が、絶縁体の面においてアレイ状に形成されている細胞融合装置である。
【００２０】
また本発明は、上記記載の微細孔の隣合う間隔が、微細孔に入れる細胞の直径の０．５倍以上６倍以下の範囲である細胞融合装置である。
【００２１】
また本発明は、上記記載のスペーサーが、細胞融合領域を形成する貫通孔を有する細胞融合装置である。
【００２２】
また本発明は、上記記載のスペーサーが、細胞を導入する導入流路および排出する排出流路を有する細胞融合装置である。
【００２３】
また本発明は、上記記載の絶縁体が親水性であることを特徴とする細胞融合装置である。
また本発明は、上記記載の微細孔の平面形状が、１以上の角を有する形状であることを特徴とする細胞融合装置である。
また本発明は、上記記載の微細孔の平面形状が、四辺形であることを特徴とする細胞融合装置である。
【００２４】
また本発明は、上記記載の細胞融合装置を用いた細胞融合方法であって、細胞融合領域内に第１の細胞を導入し、交流電圧を印加することで微細孔内に前記第１の細胞を固定した後、細胞融合領域内に第２の細胞を導入して、交流電圧を印加することで第１の細胞に第２の細胞を微細孔の位置において接触させ化学的に細胞を融合する細胞融合方法である。
また、本発明は、前記交流電圧の波形が上記記載の波形を有する交流電圧である上記記載の細胞融合方法である。
【００２５】
また本発明は、上記記載の細胞を細胞膜の流動性を高める物質を加えた細胞懸濁液に入れる細胞融合方法である。
【００２６】
また本発明は、上記記載の細胞膜の流動性を高める物質が、ポリエチレングリコールである細胞融合方法である。
【００２７】
以下では、図を用いて本発明の細胞融合装置をさらに詳細に説明する。
【００２８】
本発明の細胞融合装置は、細胞融合領域内に対向して配置される導電部材からなる一対の電極と、前記一対の電極間に平板状のスペーサーを介して配置され、かつ前記対向して配置された電極の方向に貫通した１または複数の微細孔を形成した平板状の絶縁体からなる細胞融合容器と、前記一対の電極に交流電圧を印加する電源と、を備えた細胞融合装置であり、好ましくは細胞融合容器が化学的に細胞を融合する容器を備えた細胞融合装置である。
【００２９】
ここで、化学的に細胞を融合するとは、ポリエチレングリコールのような細胞膜の流動性を高める化学物質を加えた懸濁液に細胞を入れて融合させることを意味し、一般に、細胞膜の流動性が高まった状態で細胞が接触すると膜融合が容易に起こることを利用した細胞融合の一つである。
【００３０】
また本発明は、上記記載の細胞膜の流動性を高める物質が、ポリエチレングリコールである細胞融合方法である。
【００３１】
図１に本発明の細胞融合装置の概念図を示す。本発明の細胞融合装置は大きく分けて、細胞融合容器（１３）と電源（４）から構成される。細胞融合容器は、図１に示すように上部電極（１４）と下部電極（１５）の間に、スペーサー（１６）を配置し、微細孔（９）を形成した絶縁体（８）を下部電極の細胞融合領域側に配置した構造を有する。
【００３２】
上部電極と下部電極の材質は導電部材であって化学的に安定な部材であればとくに制限はなく、白金、金、銅などの金属やステンレスなどの合金及び、ＩＴＯ（Ｉｎｄｉｕｍ  Ｔｉｎ  Ｏｘｉｄｅ：酸化インジウムスズ）等の透明導電性材料を成膜したガラス基板などでもよいが、細胞融合を観察するには、ＩＴＯなどの透明導電性材料を成膜したガラス基板を電極として用いることが好ましい。上部電極と下部電極の面積には特に制限はないが、取り扱いやすいサイズとして、例えば、縦７０ｍｍ×横４０ｍｍ×厚さ１ｍｍ程度のサイズが好ましい。
【００３３】
スペーサーは、上部電極と下部電極が直接接触しないように設けられ、かつ細胞融合容器に細胞懸濁液を入れておくスペースを確保するための細胞融合領域を形成する貫通孔を有しているものであり、その材質は絶縁材料であればよく、例えばガラス、セラミック、樹脂等がある。またスペーサーには、細胞融合容器に細胞を導入、排出するため、細胞を導入する導入流路とそれに連通する導入口（１９）と、細胞を排出する排出流路とそれに連通する排出口（２０）が設けられていてもよい。スペーサーのサイズは上部電極と下部電極が接触しなければ特に制限はないが、前記電極に合わせたサイズが好ましい。例えば、電極サイズが縦７０ｍｍ×横４０ｍｍ程度であれば、スペーサーのサイズは例えば縦４０ｍｍ×横４０ｍｍ程度が好ましい。細胞融合領域（１）を形成するスペーサーの内側の空間と厚みも特に制限はないが、細胞懸濁液を例えば数μＬ〜数ｍＬ程度入れる容量があればよく、例えば、スペーサーのサイズが縦４０ｍｍ×横４０ｍｍ程度の場合、スペーサーの内側の空間は、縦２０ｍｍ×横２０ｍｍ程度であればよく、スペーサーの厚みは０．５〜２．０ｍｍ程度であればよい。
【００３４】
絶縁体（８）には微細孔（９）が形成されている。絶縁体（８）の材質は、例えばガラス、セラミック、樹脂等の絶縁材料であれば特に制限はないが、貫通した微細孔を形成させる必要があることから、樹脂等の比較的加工が容易な材料が好ましい。
【００３５】
また、絶縁体の材質は、細胞を絶縁体に形成した微細孔に引き寄せて固定することから、細胞と親和性のある材質が好ましく、一般的に、細胞の表面が親水性であることから、絶縁体の表面が親水性であることが好ましい。ここで親水性とは、細胞融合を行う際に用いる細胞の懸濁液もしくは純水の親和性が高いことを意味し、一般的には、絶縁体の表面に前記懸濁液もしくは純水を滴下したときに形成される液滴と前記絶縁体の表面との接触角で示される（接触角が小さいほど絶縁体の表面と細胞懸濁液もしくは純水との親和性が高く、すなわち、細胞との親和性が高い）。また、細胞の懸濁液とは、マンニトールやグルコース、スクロース等の糖類の水溶液及びその水溶液に塩化カルシウムや塩化マグネシウムなどの電解質やＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）等のタンパク質と、ポリエチレングリコールのような細胞膜の流動性を高める化学物質を含有した水溶液に融合させる細胞を含有させた懸濁液を意味する。親水性の比較的高い絶縁膜としては、ガラスや酸化チタン等があり、これらの材料を絶縁体として用いればよい。あるいは、樹脂等の親水性の低い材料を前記絶縁体に用いる場合は、親水化処理することにより絶縁体の表面を親水性に改質すればよい。ここで、絶縁体の表面を親水化処理する方法としては、プラズマ処理、化学修飾、タンパク質の物理吸着などによる修飾、或いはこれらの方法を任意に組み合わせた方法などを用いればよい。
【００３６】
ここで、絶縁体の表面のプラズマ処理とは、電子・イオン・ラジカルなどの活性種が存在する電気的に中性な電離気体（プラズマ）を絶縁体の表面に照射することにより、絶縁体の表面における有機汚染物の除去や化学結合状態を変化させ、絶縁体の表面を改質する処理である。プラズマ処理には、非重合性ガス（Ａｒ、Ｏ２など）を用いるプラズマ表面処理と有機モノマーを用いて絶縁体の表面を高分子薄膜でコーティング処理するプラズマ重合がある。プラズマ表面処理は、Ａｒなどの非反応性ガスによる表面架橋層の形成、Ｏ２などの反応性ガスによる官能基の導入などがあり、酸素プラズマ処理により−ＣＯＯＨや−ＣＯを導入し、絶縁体の表面の親水性を向上させることで細胞との親和性を高めることが可能である。
【００３７】
また、絶縁体の表面の化学修飾とは、水酸基やカルボキシル基、アミノ基、スルホン基などの親水基を有する誘導体やシランカップリング剤などを絶縁体の表面へ結合させることで親水化する方法である。シランカップリング剤は有機物とケイ素から構成される化合物であり、分子中に親水性を示す反応基（水酸基、カルボキシル基、アミノ基、スルホン基など）と、疎水性を示す反応基（ビニル基、メチル基、エチル基、プロピル基など）の２種以上の異なった反応基を有している。そのため、シランカップリング剤の希薄溶液に疎水性の絶縁体を浸漬すれば、疎水性を示す反応基が疎水性の絶縁体の表面に化学的に結合し、親水性を示す反応基が絶縁体の表面を覆うため、絶縁体の表面を均一に親水化することが可能である。
【００３８】
さらに、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）などのタンパク質含有溶液に絶縁体を数分〜数時間を浸漬することで、タンパク質を物理吸着させ、絶縁体の表面を親水化することができる。
【００３９】
また親水性の評価方法としては、以下に記載する一般的な手法を用いた。すなわち、絶縁体表面に純水を滴下し、そのときに絶縁体の表面に形成される液滴と絶縁体の表面との接触角を測定することによって絶縁体の表面の親水性を評価した。ここで、一般的に親水性の厳密な定義はないが、本発明における親水性とは、前記接触角が４５°以下、好ましくは３０°以下であると定義する。
【００４０】
樹脂に貫通した微細孔を形成する手段としては、形成する微細孔の位置にレーザーを照射する方法や、微細孔の位置に貫通孔を形成するためのピンを有する金型を用いて成形する方法などの既知の方法を用いればよい。また、絶縁体にＵＶ硬化性樹脂などを用いる場合は、微細孔に相当するパターンを描画した露光用フォトマスクを用いて一般的なフォトリソグラフィー（露光）とエッチング（現像）により貫通した微細孔を形成することができる。絶縁体に複数の微細孔を形成する場合は、絶縁体にＵＶ硬化性樹脂を用いて、一般的なフォトリソグラフィーとエッチングによる方法で微細孔を形成することが好ましい。
【００４１】
なお図２は、図１の細胞融合容器のＡ−Ａ’断面図を示した概略図である。上部電極（１４）、スペーサー（１６）、絶縁体（８）、下部電極（１５）を図２のように張り合わせる手段としては、それぞれを接着剤で張り合わせたり、加圧した状態で過熱して融着させる方法や、スペーサーを表面粘着性のあるＰＤＭＳ（ｐｏｌｙ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）やシリコンシートのような樹脂を用いて作製することで圧着することにより張り合わせる方法など、既知の方法を用いればよい。このようにすることで図２に示した細胞融合領域（１）を形成することができる。
【００４２】
細胞容器の上部電極と下部電極には導電線（３）を介して電源（４）が接続されている。電源（４）は交流電圧の波形を上部電極（１４）と下部電極（１５）の電極間に印加する交流電源から構成されている。
【００４３】
また本発明の細胞融合装置は、前記微細孔の平面形状が、少なくとも１以上の角を有する形状であることを特徴とする細胞融合装置であって、さらには、前記微細孔の平面形状が、四辺形であることを特徴とする細胞融合装置であることが好ましい。また、前記微細孔の平面形状に内接する最大円の直径が、前記微細孔に固定する細胞の直径未満であるか、あるいは、前記微細孔の平面形状に内接する最大円の直径が前記微細孔に固定する細胞の直径の１以上２倍未満の範囲でありかつ前記微細孔の深さが前記微細孔に固定する細胞の直径の以下であることを特徴とする細胞融合装置であり、その際、前記微細孔の隣り合う間隔が、固定する細胞の直径の０．５倍以上６倍以下の範囲である細胞融合装置であることが好ましい。また、絶縁体に形成される複数の微細孔が、絶縁体の面において、いずれの微細孔からも隣合う微細孔の位置が同じ位置に形成されていること、例えば絶縁体の面においてアレイ状に形成されていることが好ましい。
【００４４】
図３には、絶縁体（８）に複数の微細孔（９）をアレイ状に形成した場合の本発明の細胞融合装置の概略図を示す。なお図４は、図３の細胞融合容器のＢ−Ｂ’断面図を示した概略図である。ここでアレイ状とは、微細孔の縦と横の間隔がほぼ等間隔に配置されていることを意味する。微細孔をアレイ状に配置することで、電極間に印加した電圧によって生じる電界がすべての微細孔にほぼ均等に生じる。
【００４５】
また、１つの微細孔に１つの細胞を固定するためには、アレイ状に形成した微細孔の間隔が狭すぎても広すぎても不適当である。微細孔の間隔が狭すぎる場合は、１つの微細孔に複数の細胞が固定される確率が高くなり結果として細胞の入らない微細孔が生じる確率が高くなる。また、微細孔の間隔が広すぎる場合には、微細孔と微細孔の間に細胞が残されてしまい、細胞の入らない微細孔が生じる確率が高くなる。従ってより具体的には、微細孔の隣合う間隔が、微細孔に入れ固定する細胞の直径の０．５倍以上６倍以下の範囲であることが好ましく、さらには微細孔の間隔が固定する細胞の直径の１以上２倍未満程度であることがより好ましい。
【００４６】
以下では、１つの微細孔につき１つの細胞を固定するための交流電圧の波形と微細孔の形状に関して説明する。
【００４７】
本発明の細胞融合装置は、１つの微細孔につき１つの細胞を固定するため、前記交流電源により前記電極間に印加する交流電圧の波形が、電源により、前記細胞の充電と放電を周期的に繰り返す波形である細胞融合装置であって、好ましくは、前記交流電圧の波形が、０以外の値を有する電圧が一定時間変化しない時間を半周期内に少なくとも１以上有する波形であり、例えば、前記交流電圧の波形が、矩形波、台形波、またはこれらを組み合わせた波形であることを特徴とする波形であり、さらに好ましくは、前記交流電圧の波形が、０以外の値を有する電圧が一定時間変化しない時間が細胞の静電容量と細胞を含有する細胞懸濁液の抵抗の積からなる時定数以上であることを特徴とする波形の交流電圧を印加する電源からなる細胞融合装置ある。
【００４８】
また、本発明の細胞融合装置は、前記微細孔の平面形状に内接する最大円の直径が、前期微細孔に固定する細胞の直径の１以上２倍未満の範囲であり、かつ前記微細孔の深さが、前記微細孔に固定する細胞の直径の以下である細胞融合装置あり、さらに前記微細孔の隣り合う間隔が、固定する細胞の直径の０．５倍以上６倍以下の範囲である細胞融合装置である。
【００４９】
上記のような交流電圧の波形を用い、微細孔の形状とすることで、１つの微細孔につき１つの細胞を固定することができ、固定した細胞のさらに上からもう１つの細胞を固定し、２細胞一対を複数の微細孔で接触させることで、一度に複数の微細孔において、２細胞一対での細胞融合を行うことができる。
【００５０】
本発明の細胞融合装置に用いる交流電圧の波形は、前記細胞の充電と放電を周期的に繰り返すことが可能であれば特に制限はなく、図５にこの態様の交流電圧の波形の一例を示す。図５の交流電圧の波形の半周期であるＴ／２ごとに前記細胞の充電と放電が繰り返される。なお図５の場合、半周期ごとに電圧の極性の正と負が反転するため、半周期ごとに前記細胞が充電されたときに電荷の極性が正と負に反転する。なお、本発明の細胞融合装置に用いる交流電圧の波形は、直流成分を有しないことが好ましい。これは、直流成分により発生した静電気力により細胞が特定の方向に偏った力を受けて移動するため誘電泳動力により細胞を微細孔に固定することが困難になること、また細胞を含有する懸濁液に含まれるイオンが電極表面で電気反応を生じることで発熱が起こり、それにより細胞が熱運動を起こすため、誘電泳動力により細胞の動きを制御することができなくなり細胞を微細孔に引き寄せることが困難となるためである。
【００５１】
またより具体的には、本発明の細胞融合装置に用いる前記交流電圧の波形は、０以外の値を有する電圧が一定時間変化しない時間を半周期内に少なくとも１以上有する波形である。図５におけるＳ［ｓ］が電圧が一定時間変化しない時間である。本発明では、０以外の値を有する電圧が一定時間変化しない時間Ｓ［ｓ］が細胞の静電容量Ｃ［Ｆ］と細胞を含有する細胞懸濁液の抵抗Ｒ［Ω］の積からなる時定数τ［ｓ］以上であることが好ましいことから、Ｓ＞τ（＝Ｃ×Ｒ）の関係であることが好ましい。なお、本発明における交流電圧の波形は図５に示す波形のみに限定されるものではなく、発明の要旨を逸脱しない範囲で、任意に変更が可能であることは言うまでもない。例えば、交流電圧の波形が、矩形波（図６）、台形波（図７）、またはこれらを組み合わせた波形（図８）であってもよい。
【００５２】
また、印加する電圧値や周波数は、細胞融合容器の電極間距離や、融合対象となる細胞の種類や大きさ、細胞を含有する細胞懸濁液の種類によって適切な値を設定すればよい。例えば、細胞融合容器の面積が２ｃｍ×２ｃｍ程度、電極間距離が１ｍｍ程度、融合対象の細胞が直径１０μｍ程度の細胞、懸濁腋の成分が３００ｍＭのマンニトール水溶液の場合、直径１０μｍ程度の細胞の静電容量は一般に１ｐＦ程度、面積２ｃｍ×２ｃｍ程度、電極間距離１ｍｍ程度の細胞融合容器に３００ｍＭのマンニトール水溶液を入れたときの抵抗値が５ｋΩ程度であることから、細胞の静電容量Ｃ［Ｆ］と細胞を含有する細胞懸濁液の抵抗Ｒ［Ω］の積からなる時定数τ［ｓ］は５ｎｓとなる。従って電極間に印加する交流電圧の波形が、０以外の値を有する電圧が少なくとも５ｎｓだけ変化しない時間を半周期内に少なくとも１以上有する交流電圧波形であることが好ましい。例えば、図６に示した矩形波交流電圧波形を用いた場合、Ｓの時間が５ｎｓより長くなる、すなわち、周波数が１００ＭＨｚ（＝１／（２×５ｎｓ））未満であることが好ましく、さらには電気的な取り扱いのしやすさや市販の信号発生器で容易に扱うことができることを考慮すると、周波数は１〜３ＭＨｚ程度の矩形波交流電圧波形が好ましい。またこの場合の矩形波交流電圧波形の電圧は、微細孔に細胞を引き寄せるのに十分な誘電泳動力を発生させるため、１０〜２０Ｖｐｐ程度であることが好ましい。なお、この例の条件の場合、微細孔に細胞が引き寄せられる時間は１〜５秒程度であり、瞬時に細胞を微細孔に固定することができる。
【００５３】
次に、上記態様の交流電圧の波形と上記態様の微細孔を用いた場合に、１つの微細孔につき１つの細胞が固定される理由を図９〜図１１を用いて説明する。
【００５４】
図９〜図１１には本発明の細胞融合装置において、微細孔に細胞が入る過程の概念図を示した。絶縁体（８）の厚みは細胞Ａ（１０）及び細胞Ｂ（１１）の直径とほぼ等しく、微細孔の内径は細胞Ａ及び細胞Ｂの直径の１以上２倍未満の範囲であり、図１０に示すように微細孔Ａ（１７）に細胞Ａが入った後、図１１に示すように微細孔Ｂ（２１）に細胞Ｂが入る場合を想定している。図１２〜図１４には、それぞれ図９〜図１１を電気的な等価回路で表現した図を示した。細胞を含有する細胞懸濁液は抵抗（抵抗値：５ｋΩ）、細胞はコンデンサー（容量：１ｐＦ）で表現することができる。
【００５５】
図１５に示す、周波数ｆ［Ｈｚ］の矩形波形の交流電圧を図９の上部電極（１４）と下部電極（１５）の電極間に印加すると、図９の微細孔において、微細孔Ａ（１７）の部分に示すように電気力線の集中が生じることで細胞に対して誘電泳動力が発生し、図１０に示すように細胞Ａ（１０）が微細孔Ａ（１７）に引き寄せられ、微細孔Ａに細胞Ａが固定され細胞Ａが微細孔Ａを塞ぐ。なお細胞は誘電泳動力以外にも重力及び電極からの静電気力によっても微細孔に誘導される。細胞Ａで塞がれた微細孔Ａの部分は、図１３に示すようにコンデンサーＡ（２９）と電気的に等価となる。
【００５６】
図１５に示す電圧波形を印加した場合、図１３のコンデンサーＡにおける電圧波形を図１６、電流波形を図１７に示す。図１６のようにコンデンサーＡは細胞Ａの容量Ｃ［Ｆ］と細胞を含む細胞懸濁液の抵抗値Ｒ［Ω］の積で求められる時定数τ［ｓ］（＝Ｃ×Ｒ）の時間を要して充電される。なお、０以外の値を有する電圧が一定時間変化しない時間が細胞の静電容量と細胞を含有する細胞懸濁液の抵抗の積からなる時定数以下が好ましいことから、τ＜１／２ｆを満たす周波数の矩形波交流電圧を用いる事が好ましい。コンデンサーＡが充電されると電流は流れなくなるため、図１７に示すように、コンデンサーＡに流れる電流は、時定数τの時間だけパルス状に電流が流れるものの、その後は電流が流れなくなり絶縁体と電気的に等価になる。このため細胞Ａの入った微細孔Ａでは、電気力線の集中が生じなくなり、微細孔Ａが新たに細胞を引き寄せる確率は低くなる。
【００５７】
一方、微細孔Ｂには電気力線の集中が生じているため、細胞Ｂが誘電泳動力により引き寄せられ微細孔Ｂに細胞Ｂが固定され細胞Ｂが微細孔Ｂを塞ぐ。これを繰り返すことにより、空の微細孔につぎつぎと細胞が入っていくことで、１つの微細孔に１つの細胞を固定することができる。微細孔の内径が細胞の直径より大きいと、細胞は微細孔を十分塞ぐことができず、電気力線の集中が発生し細胞が誘電泳動力により引き寄せられるため、１つの微細孔に２以上の細胞が入る確率が高くなる。２以上の細胞を微細孔に固定した状態で細胞融合を行う場合は、微細孔の直径が微細孔に固定する細胞の直径よりも大きくてもよい。しかしながら、１つの微細孔に１つの細胞を固定した状態で細胞融合を行う場合は、微細孔の平面形状に内接する最大円の直径は、前記微細孔の平面形状に内接する最大円の直径が、微細孔に固定する細胞の直径の１以上２倍未満の範囲であり、かつ前記微細孔の深さが微細孔に固定する細胞の直径の以下であることが好ましく、また微細孔の直径が固定する細胞の直径以下であってもよい。
【００５８】
また、本発明の細胞融合装置は、前記微細孔（９）の平面形状が、少なくとも１以上の角を有する形状であることを特徴とする細胞融合装置であって、さらには、前記微細孔の平面形状が、四辺形であることを特徴とする細胞融合装置である。ここで、角とは微細孔の形状を構成する２辺が鋭角あるいは鈍角で交わる部分であり、角の先端が若干丸みを帯びた形状も含む。図２６に、微細孔の平面形状が少なくとも１以上の角を有する代表的な形状を示した。また、四辺形とは、前記微細孔の形状が前記角を４つ有しており、前記４つの角は、角の先端が若干丸みを帯びた形状なども含む。また、４本の辺は直線であってもよいし、４本全ての辺あるいは４本のうち任意の辺が微細孔の中心あるいは外側に向かって若干湾曲していてもよい。図２７に、本発明における四辺形の微細孔の形状の代表的な例を示した。
【００５９】
上述したように、微細孔の平面形状の一部に角が存在していれば、前記角の部分において電気力線の集中が生じ誘電泳動力が強くなり、より強い誘電泳動力で細胞が引き寄せられる結果、細胞が微細孔に固定される確率が向上する。角は微細孔に少なくとも１箇所存在すればよいが、複数存在していた方がより好ましい。しかしながら、角の形状は鈍角よりも鋭角の方が電気力線の集中が生じやすく誘電泳動力が強いため、五角形以上の多角形よりも四角形以下の多角形の方がより好ましい。また、四角形であれば特に制限はなく、例えば図２７に示すように台形や菱形、平行四辺形などの態様があるが、四辺形の微細孔の形状が４つの角を結ぶ辺の長さが４本ともほぼ等しく、微細孔の中心において９０度の角度で点対称であれば、四辺形の微細孔の４つの辺に生じる誘電泳動力が４つとも等しく、４つの角に生じる誘電泳動力も４つとも等しくなり、微細孔の方向によらず微細孔の誘電泳動力の分布が点対称となるため、微細孔に対する細胞の位置によらず、偏りの少ない誘電泳動力を作用させることが可能となるため、微細孔の形状は図２７の（ａ）〜（ｄ）のような正方形あるいは正方形に近い形状であることがより好ましい。図２８には、微細孔の形状が正方形の場合の、本発明における細胞融合装置の一例を示した。
【００６０】
さらにまた、１つの微細孔に１つの細胞を固定するためには、微細孔の間隔が狭すぎても広すぎても不適当である。微細孔の間隔が狭すぎる場合は、１つの微細孔に複数の細胞が固定される確率が高くなり結果として細胞の入らない微細孔が生じる確率が高くなる。また、微細孔の間隔が広すぎる場合には、微細孔と微細孔の間に細胞が残されてしまい、細胞の入らない微細孔が生じる確率が高くなる。従って具体的には、微細孔の間隔は、固定する細胞の直径の０．５倍以上６倍以下程度の範囲であることが好ましく、さらには微細孔の間隔が固定する細胞の直径の１以上２倍未満程度であることがより好ましい。
【００６１】
なお、０以外の値を有する電圧が一定時間変化しない時間が細胞の静電容量と細胞を含有する細胞懸濁液の抵抗の積からなる時定数以下である場合、図１３におけるコンデンサーＡが十分充電されないため、コンデンサーＡに電流が流れ続け、細胞Ａが入った微細孔Ａにおいて引き続き電流が流れ電気力線の集中が生じる。よって、細胞Ｂは細胞Ａの入った微細孔Ａに引き寄せられる可能性があるため、１つの微細孔に２以上の細胞が固定される確率が高くなる。
【００６２】
次に、図１８に示す周波数ｆ［Ｈｚ］の正弦波形の交流電圧を印加すると、図９に示した場合と同様に微細孔において電気力線の集中が生じることで細胞に対して誘電泳動力が発生し、図１０に示すように細胞が誘電泳動力により微細孔に引き寄せられ、細胞Ａが微細孔Ａを塞ぐ。細胞Ａが塞いだ微細孔Ａの部分は、図１３に示すようにコンデンサーＡと等価となる。図１８に示す電圧波形を印加した場合、コンデンサーＡにおける電圧波形と電流波形を図１９に示す。図１９に示すように印加する交流電圧の波形が正弦波の場合は、正弦波の位相が９０度すすむだけで、正弦波の波形は変化しないため、細胞Ａが入った微細孔Ａにおいて引き続き電流が流れ、電気力線の集中が生じる。このため、細胞Ｂは細胞Ａの入った微細孔Ａに引き寄せられる可能性があるため、１つの微細孔に２以上の細胞が固定される確率が高くなる。従って、正弦波や三角波のように常に電圧が連続的に変化する交流電圧の波形では、複数の細胞が集中して固定される微細孔と、細胞が全く固定されない微細孔があり、１つの微細孔につき１つの細胞を固定することが難しい。なお、印加する電圧が直流の場合は、細胞を含有する細胞懸濁液に含まれるイオンが電極表面で電気反応を生じることで発熱が起こり、それにより細胞が熱運動を起こすため、誘電泳動力により細胞の動きを制御することができなくなり細胞を微細孔に引き寄せることが困難となる。
【００６３】
以上の理由から、本発明の細胞融合装置は、前記交流電源により前記電極間に印加する交流電圧の波形が、前記細胞の充電と放電を周期的に繰り返すことを特徴とする波形であり、またより具体意的には、前記交流電圧の波形が、０以外の値を有する電圧が一定時間変化しない時間を半周期内に少なくとも１以上有する波形であり、例えば矩形波、台形波、またはこれらを組み合わせた波形であって、さらに好ましくは、０以外の値を有する電圧が一定時間変化しない時間が細胞の静電容量と細胞を含有する細胞懸濁液の抵抗の積からなる時定数以上であることを特徴とする細胞融合装置であって、絶縁体を貫通する微細孔の平面形状に内接する最大円の直径は、微細孔に固定する細胞の直径未満であるか、もしくは、微細孔に固定する細胞の直径の１以上２倍未満の範囲でありかつ微細孔の深さが細胞の直径と同等であり、さらに複数の微細孔の隣り合う間隔が、固定する細胞の直径の０．５倍以上６倍以下の範囲であることで、絶縁体上にアレイ状に形成した複数の微細孔において、１つの微細孔につき１つの細胞を固定することが可能となる。
【００６４】
ところで、本発明の細胞融合方法では、１つの微細孔に第１の細胞を固定した後、固定した第１の細胞のさらに上から第２の細胞を固定する。第２の細胞には誘電泳動力、重力、及び第１の細胞の静電気力が作用し第１の細胞と接触する。しかしながら、前述した理由により、微細孔を第１の細胞が塞いでしまうため電流が流れにくくなることで電気力線の発生が抑制され、第２の細胞に作用する誘電泳動力が弱くなる。従って、第２の細胞を、微細孔に固定した第１の細胞に１つずつ接触させる確率が低下する。しかしながら、第１の細胞の濃度を第２の細胞の濃度よりも高くし、細胞融合領域に過剰に導入することで、第１の細胞と第２の細胞の接触確率を上げることが可能である。
【００６５】
次に、図を用いて本発明における細胞融合方法に関してさらに詳細に説明する。
【００６６】
本発明の細胞融合方法は、前記細胞融合装置を用いた細胞融合方法であって、前記細胞融合領域内に第１の細胞を導入し、交流電圧を印加することで前記微細孔内に前記第１の細胞を固定した後、前記細胞融合領域内に第２の細胞を導入して、交流電圧を印加することで前記第１の細胞に前記第２の細胞を微細孔の位置において接触させ化学的に細胞を融合する細胞融合方法である。なお、前記交流電圧の波形は、上記記載の波形を有する交流電圧であることがより好ましい。ここで、本発明の細胞融合方法の概略図を図２０〜図２２に示す。
【００６７】
図２０〜図２２には、いずれも第１の細胞の直径が第２の細胞の直径よりも小さい例を示している。本発明の細胞融合方法は、第１の細胞の直径が第２の細胞の直径よりも小さいことが好ましいが、本質的には第１の細胞の直径が第２の細胞の直径と等しいか大きくてもよく、また、本発明の細胞融合方法は、第１の細胞と第２の細胞が微細孔表面の近傍で細胞融合することが好ましいが、本質的には微細孔の中で第１の細胞と第２の細胞を融合してもよく、図２０〜図２２に示したいずれの態様以外であっても、発明の要旨を逸脱しない範囲で、任意に変更が可能である。
【００６８】
図２０は、微細孔（９）の直径と深さが、第１の細胞（１８）の直径とほぼ等しく第１の細胞がちょうど微細孔の中に入る程度の場合であり、図２１は、微細孔（９）の直径と深さが、第１の細胞（１８）の直径よりも大きい場合であり、図２２は、微細孔（９）の直径と深さが第１の細胞（１８）の直径よりも小さい場合である。
【００６９】
以下に本発明の融合方法が好ましい理由を説明する。本発明の最良の形態は、図２０に示す細胞融合方法である。まず、第１の細胞（１８）として、直径の小さい細胞を細胞懸濁液（６）とともに細胞融合領域（１）に導入し、前述した波形を有する交流電圧（３４）を印加して１つの微細孔（９）につき第１の細胞１つを固定する。この場合、第１の細胞は主に誘電泳動力、重力、電極からの静電気力によって微細孔に誘導される。微細孔の直径と深さは第１の細胞の直径とほぼ等しく、第１の細胞がちょうど微細孔の中に入る。このようにすることで、微細孔の底面の電極面と第１の細胞に静電気力が発生し、第１の細胞は微細孔に確実に固定される。第１の細胞の数に特に制限はないが、第１の細胞を有効に使用することを考慮すると、微細孔の数と同等であることが好ましい。次に、第２の細胞（２２）として、直径の大きい細胞を細胞懸濁液（６）とともに細胞融合領域（１）に導入する。このとき、第１の細胞（１８）は電極との静電気力で固定されている上、周囲を微細孔（９）で囲まれているため、第２の細胞を送液することにより第１の細胞が微細孔から離脱することはほとんどない。
【００７０】
導入された第２の細胞は、前述した波形を有する交流電圧（３４）を印加することにより、微細孔に固定された第１の細胞の上から接触し固定される。この場合、第２の細胞には、微細孔での誘電泳動力も作用するが、主に重力、第１の細胞からの静電気力によって微細孔に固定された第１の細胞に誘導される。第２の細胞の数に特に制限はないが、第２の細胞を有効に使用することを考慮すると、微細孔の数と同等であることが好ましいが、微細孔の数よりも過剰に導入することで、第１の細胞と第２の細胞の接触確率を上げることが可能である。
【００７１】
また、本発明の細胞融合方法は、前記細胞融合方法において、細胞を細胞膜の流動性を高める物質を加えた細胞懸濁液に入れることを特徴とする細胞融合方法である。細胞膜の流動性が高まった状態で細胞が接触すると膜融合が容易に起こるので、前述したように微細孔において２細胞一対が接触すれば、２細胞一対での細胞融合が生じる。ここで、細胞膜の流動性を高める物質は、接触した細胞同士に膜融合を起こさせる物質であれば特に制限はないが、例えばポリエチレングリコールやリゾチウムなどがあり、特に、ポリエチレングリコールであることが好ましい。またさらに、平均分子量１０００〜６０００程度のポリエチレングリコールが好ましい。
【発明の効果】
【００７２】
本発明によれば、以下の効果を奏することができる。
（１）本発明の細胞融合装置においては、微細孔を形成した絶縁体を細胞融合領域側の電極面上に配置することで、微細孔に細胞を確実に固定し、微細孔近傍にある２細胞一対を選択的に細胞融合させることができ、２細胞一対での化学的な細胞の融合を効率的に行うことが可能となる。
（２）本発明の細胞融合装置においては、微細孔の平面形状に内接する最大円の直径が、微細孔に固定する細胞の直径の１以上２倍未満の範囲であり、かつ微細孔の深さが、微細孔に固定する細胞の直径の以下である細胞融合装置であり、このようにすることで、微細孔に確実に細胞を固定することができる。
（３）本発明の細胞融合装置においては、微細孔が絶縁体上に複数個、アレイ状に形成されており、このようにすることで、複数の微細孔に固定した２細胞一対の細胞を同時に細胞融合させることが可能となり、２細胞一対での化学的な細胞の融合を効率的に行うことが可能となる。
（４）本発明の細胞融合装置においては、微細孔の隣り合う間隔が、微細孔に入れる細胞の直径の０．５倍以上６倍以下の範囲であることを特徴とする細胞融合装置であり、このようにすることで、１つの微細孔に１つの細胞を固定する確率を高めることができ、微細孔において２細胞を一対で接触させる確率を上げることが可能になる。
（５）本発明の細胞融合装置においては、交流電源により電極間に印加する交流電圧の波形を制御することで、１つの微細孔に１つの細胞を固定することが可能となる。
（６）本発明の細胞融合装置においては、細胞融合領域側の電極面上に配置した微細孔を形成した絶縁体の表面を親水化処理することで、１つの微細孔に１つの細胞を固定する確率をより高めることができ、微細孔において２細胞を一対で接触させる確率を上げることが可能になる。
（７）本発明の細胞融合装置においては、微細孔の平面形状が角を有することで、角部において電気力線の集中が生じ、誘電泳動力が高められることにより１つの微細孔に１つの細胞を固定する確率をさらに高めることができ、微細孔において２細胞を一対で接触させる確率を上げることが可能になる。
（８）本発明の細胞融合方法は、上記記載の細胞融合装置を用いた細胞融合方法であって、細胞融合領域内に第１の細胞を導入し、交流電圧を印加することで微細孔内に第１の細胞を固定した後、細胞を導入して、前述した波形を有する交流電圧を印加することで第１の細胞に第２の細胞を微細孔の位置において接触させ化学的に細胞を融合する細胞融合方法であり、交流電圧の波形は、上記記載の波形を有する交流電圧であることがより好ましく、ポリエチレングリコール等の細胞を細胞膜の流動性を高める物質を加えた細胞懸濁液に入れる細胞融合方法である。このようにすることで、微細孔近傍にある２細胞一対を選択的に細胞融合させることができ、２細胞一対での細胞融合を効率的に行うことが可能となる。なお、前記交流電圧は、２細胞一対を微細孔に固定するために使用するが、２細胞一対を微細孔に固定した後も前記交流電圧を印加しつづけることで、接触した２細胞が誘電泳動力と静電気力及び重力により押し付けられるので、２細胞一対がさらに細胞融合しやすくなる。
【実施例】
【００７３】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。なお本発明は、これらの実施例のみに限定されるものではなく、発明の要旨を逸脱しない範囲で、任意に変更が可能であることは言うまでもない。
【００７４】
（実施例１）
図３に実施例１に用いた細胞融合装置の概念図を示す。細胞融合装置は大きく分けて、細胞融合容器（１３）と電源（４）から構成される。細胞融合容器は、図３に示すように上部電極（１４）と下部電極（１５）の間に、スペーサー（１６）を配置し、複数の微細孔をアレイ状に形成した絶縁体（８）をスペーサーと下部電極で挟んだ構造を有する。
【００７５】
なお、本実施例では、後述するように一般的なフォトリソグラフィーとエッチングにより、下部電極（１５）と複数の微細孔をアレイ状に形成した絶縁体を一体形成した微細孔付き絶縁体一体型下部電極（２８）を用いた。
【００７６】
上部電極と下部電極は、縦７０ｍｍ×横４０ｍｍ×厚さ１ｍｍのパイレックス（登録商標）基板に、ＩＴＯを成膜（膜厚１５０ｎｍ）したものを用いた。スペーサーは、縦４０ｍｍ×横４０ｍｍ×厚さ１．５ｍｍのシリコンシートの中央を縦２０ｍｍ×横２０ｍｍにくりぬいた形状にして用いた。
【００７７】
また、図３に示すように、細胞が含有した細胞懸濁液を導入、排出するための導入口（１９）と排出口（２０）を設けた。複数の微細孔を有する絶縁体（８）は、図２３に示すフォトリソグラフィーとエッチングによる方法により下部電極に一体形成することで作製した。
【００７８】
まずはじめにＩＴＯ（２３）を成膜したパイレックス（登録商標）ガラス（２４）のＩＴＯ成膜面にレジスト（２５）を２．５μｍの膜厚になるようスピンコーターを用いて塗布し、４５分自然乾燥後、ホットプレートを用いてプリベーク（８０℃、１５分）を行った。レジストにはキシレン系のネガタイプレジストを用いた。次に、縦３０ｍｍ×横３０ｍｍのエリアに、微細孔と微細孔の縦と横の間隔が３０μｍで、縦１０００個×横１０００個のアレイ状に並べた直径φ７μｍの微細孔パターンを描いた露光用フォトマスク（２６）を用いて、ＵＶ露光機にてレジストを露光（２７）し、現像液（７）で現像した。露光時間と現像時間は、微細孔の深さがレジストの膜厚と等しい２．５μｍになるように調整し、微細孔の底面にＩＴＯが露出するようにした。現像後、ホットプレートを用いてポストベーク（１１５℃、３０分）を行いレジストを固めた。このようにして作製した上部電極（１４）、スペーサー（１６）、微細孔付き絶縁体一体型下部電極（２８）を図４のように積層し圧着した。図４は、図３に示した細胞融合容器のＢ−Ｂ’断面図である。シリコンシートの表面は粘着性があり、圧着することで各部品は密着し、細胞を含有した細胞懸濁液を漏れなく細胞融合容器の中に入れることができた。スペーサーをくりぬいた面積が縦２０ｍｍ×横２０ｍｍであることから、この空間に存在する微細孔の数は約４０万個である。また、電極間に電圧を印加する電源は、交流電源として信号発生器（エヌエフ回路設計ブロック製、ＷＦ１９６６）を導電線（３）を介して接続した。
【００７９】
細胞は、マウス抗体産生細胞（φ５μｍ）とマウスミエローマ細胞（φ１０μｍ）を用いた。両方の細胞を培地から取り出し、遠心分離で細胞と培地を分離し、取り出した細胞をそれぞれ分子量４０００のポリエチレングリコール５０％水溶液に懸濁させ、０．７×１０６個／ｍＬの密度になるように細胞懸濁液を調整した。
【００８０】
まずはじめに、上記マウス抗体産生細胞の細胞懸濁液６００μＬ（マウス抗体産生細胞数：約４０万個）をスペーサーの導入口よりシリンジを用いて注入し、交流電源により電圧１０Ｖｐｐ、周波数３ＭＨｚの矩形波交流電圧を電極間に印加したところ、２〜３秒程度の極めて短い時間でアレイ状に形成した複数の微細孔に１つずつ、１〜２個ののマウス抗体産生細胞を固定することができ、複数の細胞をアレイ状に配置させることができた。このときの、１つの微細孔に１つのマウス抗体産生細胞が入る確率は３５％であった。ここで細胞固定率とは、顕微鏡の視野に縦１５個×横１５個の２２５個の微細孔が見えるようにし、細胞を導入して固定したときの、１〜２個の細胞が入った微細孔数を２２５個の微細孔数で割った値で定義した。なお、以下の実施例２及び比較例での細胞固定率も同じ定義である。
【００８１】
続いて、交流電源により電圧１０Ｖｐｐ、周波数３ＭＨｚの矩形波交流電圧を電極間に印加したまま、上記マウスミエローマ細胞の細胞懸濁液６００μＬ（マウスミエローマ細胞数：約４０万個）をスペーサーの導入口よりシリンジを用いて注入したところ、２〜３秒程度の極めて短い時間でアレイ状に形成した複数の微細孔に１つずつ、１つのマウスミエローマ細胞を固定することができ、複数の細胞をアレイ状に配置させることができた。このときの、１つの微細孔に１〜２個のマウスミエローマ細胞が入る確率は５５％であった。マウスミエローマ細胞を導入する際に、先に入れたマウス抗体産生細胞が微細孔から脱離する様子はほとんど観察されなかったことから、微細孔においてマウス抗体産生細胞とマウスミエローマ細胞が２細胞一対で接触している確立は、約２０％（＝３５％×５５％）であると推定される。
【００８２】
次に、この状態のまま１分間静置したあと細胞融合容器内の細胞懸濁液を取り出し培地で希釈後、遠心分離で細胞と細胞懸濁液を分離し、取り出した細胞をＨＡＴ培地（Ｈ：ヒポキサンチン（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ）、Ａ：アミノプテリン（ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎｅ）、Ｔ：チミジン（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）を成分とする培地）に入れ、融合細胞の培養を行った。なお、ＨＡＴ培地は、融合細胞のみを選択的に増殖させる培地である。細胞懸濁液を入れたＨＡＴ培地をＣＯ２インキュベータに入れて細胞培養を行い６日後に融合細胞をカウントした結果、２０個の融合細胞を確認することができ、全マウス抗体産生細胞４０万個に対して０．５／１００００の融合確率を得られた。これは、比較例１に示したポリエチレングリコールを用いた通常の細胞融合における融合確率０．１２／１００００の約４倍の融合確率であり、効率的な２細胞一対での融合を確認することができた。
【００８３】
（実施例２）
実施例１に用いた微細孔付き絶縁体の親水性を評価するために、絶縁体表面に純水を滴下し、そのときに絶縁体の表面に形成される液滴と絶縁体の表面との接触角を測定したところ、接触角は約４７°であった。そこで、微細孔付き絶縁体を親水化するために、微細孔付き絶縁体一体型下部電極をＢＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ）含有の３００ｍＭ濃度のマンニトール水溶液に約１時間浸し、絶縁体表面にＢＳＡを物理吸着させた。ＢＳＡを物理吸着させた後、同様に、絶縁体表面に純水を滴下し、そのときに絶縁体の表面に形成される液滴と絶縁体の表面との接触角を測定したところ、接触角は約２７°であり、親水性が向上したことを確認した。
【００８４】
このように親水化処理した微細孔付き絶縁体一体型下部電極を用いて、実施例１と同様に組み立てた細胞融合装置を用いて下記に示したように細胞融合を実施した。
【００８５】
細胞は、マウス抗体産生細胞（φ５μｍ）とマウスミエローマ細胞（φ１０μｍ）を用いた。両方の細胞を培地から取り出し、遠心分離で細胞と培地を分離し、取り出した細胞をそれぞれ分子量４０００のポリエチレングリコール５０％水溶液に懸濁させ、０．７×１０６個／ｍＬの密度になるように細胞懸濁液を調整した。
【００８６】
まずはじめに、上記マウス抗体産生細胞の細胞懸濁液６００μＬ（マウス抗体産生細胞数：約４０万個）をスペーサーの導入口よりシリンジを用いて注入し、交流電源により電圧１０Ｖｐｐ、周波数３ＭＨｚの矩形波交流電圧を電極間に印加したところ、２〜３秒程度の極めて短い時間でアレイ状に形成した複数の微細孔に１つずつ、１つのマウス抗体産生細胞を固定することができ、複数の細胞をアレイ状に配置させることができた。このときの、１つの微細孔に１〜２個のマウス抗体産生細胞が入る確率は７０％であった。この結果から、微細孔付絶縁膜を親水化したことにより、微細孔への細胞固定確率が実施例１よりも向上したことがわかった。
【００８７】
続いて、交流電源により電圧１０Ｖｐｐ、周波数３ＭＨｚの矩形波交流電圧を電極間に印加したまま、上記マウスミエローマ細胞の細胞懸濁液６００μＬ（マウスミエローマ細胞数：約４０万個）をスペーサーの導入口よりシリンジを用いて注入したところ、２〜３秒程度の極めて短い時間でアレイ状に形成した複数の微細孔に１つずつ、１つのマウスミエローマ細胞を固定することができ、複数の細胞をアレイ状に配置させることができた。このときの、１つの微細孔に１つのマウスミエローマ細胞が入る確率は６５％であった。この結果から、微細孔付絶縁膜を親水化したことにより、微細孔への細胞固定確率が実施例１よりも向上したことがわかった。
【００８８】
マウスミエローマ細胞を導入する際に、先に入れたマウス抗体産生細胞が微細孔から脱離する様子はほとんど観察されなかったことから、微細孔においてマウス抗体産生細胞とマウスミエローマ細胞が２細胞一対で接触している確立は、約４６％（＝７０％×６５％）であると推定される。
【００８９】
次に、この状態のまま１分間静置したあと細胞融合容器内の細胞懸濁液を取り出し培地で希釈後、遠心分離で細胞と細胞懸濁液を分離し、取り出した細胞をＨＡＴ培地（Ｈ：ヒポキサンチン（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ）、Ａ：アミノプテリン（ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎｅ）、Ｔ：チミジン（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）を成分とする培地）に入れ、融合細胞の培養を行った。なお、ＨＡＴ培地は、融合細胞のみを選択的に増殖させる培地である。細胞懸濁液を入れたＨＡＴ培地をＣＯ２インキュベータに入れて細胞培養を行い６日後に融合細胞をカウントした結果、３０個の融合細胞を確認することができ、全マウス抗体産生細胞４０万個に対して０．７５／１００００の融合確率を得られた。これは、比較例１に示したポリエチレングリコールを用いた通常の細胞融合における融合確率０．１２／１００００の約６倍の融合確率であり、効率的な２細胞一対での融合を確認することができた。
【００９０】
（実施例３）
図２８に実施例３に用いた細胞融合装置を示した。微細孔の形状が、一辺が１０μｍの正方形の微細孔パターンとなっている以外は、実施例２に用いた細胞融合装置と同じである。
【００９１】
細胞は、マウス抗体産生細胞（φ５μｍ）とマウスミエローマ細胞（φ１０μｍ）を用いた。両方の細胞を培地から取り出し、遠心分離で細胞と培地を分離し、取り出した細胞をそれぞれ分子量４０００のポリエチレングリコール５０％水溶液に懸濁させ、０．７×１０６個／ｍＬの密度になるように細胞懸濁液を調整した。
【００９２】
まずはじめに、上記マウス抗体産生細胞の細胞懸濁液６００μＬ（マウス抗体産生細胞数：約４０万個）をスペーサーの導入口よりシリンジを用いて注入し、交流電源により電圧１０Ｖｐｐ、周波数３ＭＨｚの矩形波交流電圧を電極間に印加したところ、２〜３秒程度の極めて短い時間でアレイ状に形成した複数の微細孔に１つずつ、１つのマウス抗体産生細胞を固定することができ、複数の細胞をアレイ状に配置させることができた。このときの、１つの微細孔に１つのマウス抗体産生細胞が入る確率は７５％であった。この結果から、微細孔の平面形状が角を有することで、角部において電気力線の集中が生じ、誘電泳動力が高められるとともに、微細孔付絶縁膜を親水化したことにより、微細孔への細胞固定確率が実施例１さらには実施例２よりもさらに向上したことがわかった。
【００９３】
続いて、交流電源により電圧１０Ｖｐｐ、周波数３ＭＨｚの矩形波交流電圧を電極間に印加したまま、上記マウスミエローマ細胞の細胞懸濁液６００μＬ（マウスミエローマ細胞数：約４０万個）をスペーサーの導入口よりシリンジを用いて注入したところ、２〜３秒程度の極めて短い時間でアレイ状に形成した複数の微細孔に１つずつ、１つのマウスミエローマ細胞を固定することができ、複数の細胞をアレイ状に配置させることができた。このときの、１つの微細孔に１つのマウスミエローマ細胞が入る確率は７０％であった。この結果から、微細孔の平面形状が角を有することで、角部において電気力線の集中が生じ、誘電泳動力が高められるとともに、微細孔付絶縁膜を親水化したことにより、微細孔への細胞固定確率が実施例１さらには実施例２よりもさらに向上したことがわかった。
【００９４】
マウスミエローマ細胞を導入する際に、先に入れたマウス抗体産生細胞が微細孔から脱離する様子はほとんど観察されなかったことから、微細孔においてマウス抗体産生細胞とマウスミエローマ細胞が２細胞一対で接触している確立は、約５３％（＝７５％×７０％）であると推定される。
【００９５】
次に、この状態のまま１分間静置したあと細胞融合容器内の細胞懸濁液を取り出し培地で希釈後、遠心分離で細胞と細胞懸濁液を分離し、取り出した細胞をＨＡＴ培地（Ｈ：ヒポキサンチン（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ）、Ａ：アミノプテリン（ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎｅ）、Ｔ：チミジン（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）を成分とする培地）に入れ、融合細胞の培養を行った。なお、ＨＡＴ培地は、融合細胞のみを選択的に増殖させる培地である。細胞懸濁液を入れたＨＡＴ培地をＣＯ２インキュベータに入れて細胞培養を行い６日後に融合細胞をカウントした結果、３０個の融合細胞を確認することができ、全マウス抗体産生細胞４０万個に対して０．９／１００００の融合確率を得られた。これは、比較例１に示したポリエチレングリコールを用いた通常の細胞融合における融合確率０．１２／１００００の約７．５倍の融合確率であり、効率的な２細胞一対での融合を確認することができた。
【００９６】
（比較例１）
比較例１として、ポリエチレングリコールを用いた通常の細胞融合を行った。細胞は、マウス抗体産生細胞（φ５μｍ）とマウスミエローマ細胞（φ１０μｍ）を用いた。マウス抗体産生細胞とマウスミエローマ細胞を１０：１で混合し、両方の細胞を培地から取り出し、遠心分離で細胞と培地を分離し、取り出した細胞をそれぞれ分子量４０００のポリエチレングリコール５０％水溶液に懸濁させ、１．７×１０７個／ｍＬの密度になるように細胞懸濁液を調整した。
【００９７】
上記細胞懸濁液４０μＬ（マウス抗体産生細胞数：約６０万個、マウスミエローマ細胞数：６万個）を試験管に入れ、１分間かけて試験管の底を軽くたたいた。その後、約１分静置したあと試験管内の細胞懸濁液をＨＡＴ培地に入れた。細胞懸濁液を入れたＨＡＴ培地をＣＯ２インキュベータに入れて細胞培養を行い６日後に融合細胞をカウントした結果、７個の融合細胞を確認することができ、全マウス抗体産生細胞６０万個に対して０．１２／１００００の融合確率を得られた。
【００９８】
（比較例２）
実施例と同じ細胞融合装置を用いて、実施例と同じマウス抗体産生細胞の細胞懸濁液６００μＬ（抗体産生細胞数：約４０万個）をスペーサーの導入口よりシリンジを用いて注入し、交流電源により電圧１０Ｖｐｐ、周波数３ＭＨｚの正弦波交流電圧を電極間に印加したところ、マウス抗体産生細胞が複数個数珠状に集まる微細孔と細胞が全く固定されない微細孔が生じ、マウス抗体産生細胞をアレイ状に配置させることができなかった。この状態で、交流電源により電圧１０Ｖｐｐ、周波数３ＭＨｚの正弦波交流電圧を電極間に印加したまま、実施例と同じマウスミエローマ細胞の細胞懸濁液６００μＬ（マウスミエローマ細胞数：約４０万個）をスペーサーの導入口よりシリンジを用いて注入した。
【００９９】
次に、この状態のまま１分間静置したあと細胞融合容器内の細胞懸濁液を取り出し培地で希釈後、遠心分離で細胞と細胞懸濁液を分離し、取り出した細胞をＨＡＴ培地に入れ、融合細胞の培養を行った。細胞懸濁液を入れたＨＡＴ培地をＣＯ２インキュベータに入れて細胞培養を行い６日後に融合細胞をカウントした結果、融合細胞を確認することはできなかった。
【０１００】
（比較例３）
図２４に比較例３に用いた細胞融合装置の概念図を示す。細胞融合装置は大きく分けて、細胞融合容器（１３）と電源（４）から構成される。細胞融合容器は、図２４に示すように上部電極（１４）と下部電極（１５）の間に、スペーサー（１６）を２枚配置し、複数の微細孔をアレイ状に形成した絶縁体（８）を２枚のスペーサー間に挟んだ構造を有する。
【０１０１】
上部電極と下部電極は、縦７０ｍｍ×横４０ｍｍ×厚さ１ｍｍのパイレックス（登録商標）基板に、ＩＴＯを成膜（膜厚１５０ｎｍ）したものを用いた。スペーサーは、縦４０ｍｍ×横４０ｍｍ×厚さ１ｍｍのシリコンシートの中央を縦２０ｍｍ×横２０ｍｍにくりぬいた形状にして用いた。また、図２４に示すように、細胞が含有した細胞懸濁液を導入、排出するための導入口（１９）と排出口（２０）を設けた。複数の微細孔を有する絶縁体（８）は、縦４０ｍｍ×横４０ｍｍ×膜厚２５μｍのポリイミドフィルムに、フォトリソグラフィーとエッチングによる方法により、中央の縦３０ｍｍ×横３０ｍｍのエリアに、微細孔と微細孔の縦と横の間隔が５０μｍで、縦３００個×横３００個のアレイ状に並べた直径φ２０μｍの微細孔を形成し製作した。
【０１０２】
このようにして作製した上部電極（１４）、スペーサー（１６）、微細孔付き絶縁体（３６）、下部電極（１５）を図２５のように積層し圧着した。図２５は、図２４に示した細胞融合容器のＣＣ’断面図である。シリコンシートの表面は粘着性があり、圧着することで各部品は密着し、細胞を含有した細胞懸濁液を漏れなく細胞融合容器の中に入れることができた。スペーサーをくりぬいた面積が縦２０ｍｍ×横２０ｍｍであることから、この空間に存在する微細孔の数は約４万個である。また、電極間に電圧を印加する電源は、交流電源として信号発生器（エヌエフ回路設計ブロック製、ＷＦ１９６６）を導電線（３）を介して接続し、交流電源とパルス電源は切り換えスイッチにより電極への接続を切り換えられるようにした。
【０１０３】
細胞は、マウス抗体産生細胞（φ５μｍ）とマウスミエローマ細胞（φ１０μｍ）を用いた。両方の細胞を培地から取り出し、遠心分離で細胞と培地を分離し、取り出した細胞をそれぞれ分子量４０００のポリエチレングリコール５０％水溶液に懸濁させ、０．７×１０６個／ｍＬの密度になるように細胞懸濁液を調整した。
【０１０４】
まずはじめに、上記マウス抗体産生細胞の細胞懸濁液６００μＬ（マウス抗体産生細胞数：約４０万個）をスペーサーの導入口よりシリンジを用いて注入し、矩形波交流電圧により電圧１５Ｖｐｐ、周波数３ＭＨｚの矩形波交流電圧を電極間に印加したところ、２〜３秒程度の極めて短い時間でアレイ状に形成した微細孔にマウス抗体産生細胞を固定することがでた。ただし、１つの微細孔に複数のマウス抗体産生細胞が固定されている微細孔や、マウス抗体産生細胞が全く固定されていない微細孔があり、複数の微細孔１つずつに１つのマウス抗体産生細胞が固定されている微細孔はほとんど確認できなかった。
【０１０５】
続いて、交流電源により電圧１５Ｖｐｐ、周波数３ＭＨｚの矩形波交流電圧を電極間に印加したまま、上記マウスミエローマ細胞の細胞懸濁液６００μＬ（マウスミエローマ細胞数：約４０万個）をスペーサーの導入口よりシリンジを用いて注入したところ、先に微細孔に固定されていたマウス抗体産生細胞が微細孔からほとんど脱離してしまい、マウス抗体産生細胞とマウスミエローマ細胞を微細孔において細胞融合させることはできなかった。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】本発明の細胞融合装置の一例を示す概念図である。
【図２】図５に示した細胞融合容器のＡＡ’断面図である。
【図３】本発明の細胞融合装置の一例及び、実施例で用いた細胞融合装置の概念図である。
【図４】図７に示した細胞融合容器のＢＢ’断面図である。
【図５】本発明に用いる交流電圧の波形の一例である。
【図６】本発明に用いる交流電圧の波形の一例として、矩形波を示した図である。
【図７】本発明に用いる交流電圧の波形の一例として、台形波を示した図である。
【図８】本発明に用いる交流電圧の波形の一例として、矩形波と台形波を組み合わせた波形を示した図である。
【図９】本発明の細胞操作方法を説明する第１の図である。
【図１０】本発明の細胞操作方法を説明する第２の図である。
【図１１】本発明の細胞操作方法を説明する第３の図である。
【図１２】図９を電気的な等価回路で表した図である。
【図１３】図１０を電気的な等価回路で表した図である。
【図１４】図１１を電気的な等価回路で表した図である。
【図１５】周波数ｆ［Ｈｚ］の矩形波交流電圧の波形を示す図である。
【図１６】図１５に示した周波数ｆ［Ｈｚ］の矩形波交流電圧の波形を電極間に印加した場合の、図１３のコンデンサーＡにおける電圧波形を示す図である。
【図１７】図１５に示した周波数ｆ［Ｈｚ］の矩形波交流電圧の波形を電極間に印加した場合の、図１３のコンデンサーＡにおける電流波形を示す図である。
【図１８】周波数ｆ［Ｈｚ］の正弦波交流電圧の波形を示す図である。
【図１９】図１８に示した周波数ｆ［Ｈｚ］の正弦波交流電圧の波形を電極間に印加した場合の、図１３のコンデンサーＡにおける電圧波形または電流波形を示す図である。
【図２０】本発明の細胞融合方法の第１の例を示す図である。
【図２１】本発明の細胞融合方法の第２の例を示す図である。
【図２２】本発明の細胞融合方法の第３の例を示す図である。
【図２３】一般的なフォトリソグラフィーとエッチング方法の概略図である。
【図２４】本発明の比較例３で用いた細胞融合装置の概念図である。
【図２５】図２９に示した細胞融合容器のＣＣ’断面図である。
【図２６】本発明における微細孔形状例の第１の図である。
【図２７】本発明における微細孔形状例の第２の図である。
【図２８】本発明における微細孔の形状が正方形の場合の細胞融合装置の一例を示す図である。
【符号の説明】
【０１０７】
１：細胞融合領域
２：電極
３：導電線
４：電源
５：交流電源
６：細胞懸濁液
７：現像液
８：絶縁体
９：微細孔
１０：細胞Ａ
１１：細胞Ｂ
１２：電気力線
１３：細胞融合容器
１４：上部電極
１５：下部電極
１６：スペーサー
１７：微細孔Ａ
１８：第１の細胞
１９：導入口
２０：排出口
２１：微細孔Ｂ
２２：第２の細胞
２３：ＩＴＯ
２４：パイレックス（登録商標）ガラス
２５：レジスト
２６：露光用フォトマスク
２７：露光
２８：微細孔付き絶縁体一体型下部電極
２９：コンデンサーＡ
３０：コンデンサーＢ
３１：抵抗
３２：融合細胞
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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