(57)【要約】【課題】  FSHβ鎖遺伝子を活性化する物質を提供する。【解決手段】  FSHβ鎖生産能を持つ細胞に、Prx2遺伝子を導入し、発現させることを特徴とするFSHβ鎖高生産性細胞の作製方法、及びこの方法によって作製された細胞、並びにこの細胞を培養し、培養上清又は細胞の破砕物からFSHβ鎖を回収することを特徴とするFSHβ鎖の生産方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
FSHβ鎖生産能を持つ細胞に、Prx2遺伝子を導入し、発現させることを特徴とするFSHβ鎖高生産性細胞の作製方法。
【請求項２】
Prx2遺伝子が、下記の(a)、(b)、又は(c)のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載のFSHβ鎖高生産性細胞の作製方法、
(a)配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質、
(b)配列番号２記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列で表され、FSHβ鎖遺伝子の発現を促進する機能を持つタンパク質、
(c)配列番号１記載の塩基配列で表されるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする動物由来のタンパク質であって、FSHβ鎖遺伝子の発現を促進する機能を持つタンパク質。
【請求項３】
FSHβ鎖生産能を持つ細胞であって、Prx2遺伝子が導入され、発現していることを特徴とするFSHβ鎖高生産性細胞。
【請求項４】
Prx2遺伝子が、下記の(a)、(b)、又は(c)のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項３に記載のFSHβ鎖高生産性細胞、
(a)配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質、
(b)配列番号２記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列で表され、FSHβ鎖遺伝子の発現を促進する機能を持つタンパク質、
(c)配列番号１記載の塩基配列で表されるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする動物由来のタンパク質であって、FSHβ鎖遺伝子の発現を促進する機能を持つタンパク質。
【請求項５】
請求項３又は４に記載のFSHβ鎖高生産性細胞を培養し、培養上清又は細胞の破砕物からFSHβ鎖を回収することを特徴とするFSHβ鎖の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、FSHβ鎖高生産性細胞の作製方法、及びその方法によって作製されたFSHβ鎖高生産性細胞、並びにその細胞を利用したFSHβ鎖の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
家畜や人の生殖や不妊の研究上、精子形成や卵胞発育・成熟を促進する性腺刺激ホルモンの制御は極めて重要である。性腺刺激ホルモンであるFSH（卵胞刺激ホルモン）β鎖の遺伝子を活性化する転写因子は知られていたが（非特許文献１）、その数はわずかで、既知の因子のみから、遺伝子の活性化を制御する機構を解析することは困難で、その制御機構を解明するための新しい因子の発見が求められていた。
【０００３】
【非特許文献１】Aikawa S, Susa T, Kitahara K, Sato T, Ono T, Suzuki K, Nakayama M, Kato T, Kato Y. Prop-1 Activation of Porcine FSHβ Subunit Gene Requires AT-rich Recognition Sites.  Jap. J. Reprod. Endocrinol. 10 (2005) 43-48
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
FSHβ鎖の遺伝子を活性化する新たなタンパク質が見つかれば、それを利用し、FSHβ鎖生産細胞の生産性を向上させることができる。
本発明は、このような技術的背景の下になされたものであり、FSHβ鎖遺伝子の新規な活性化因子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討重ねた結果、骨や筋肉の形成に関与するホメオボックス遺伝子であるPrx2遺伝子（Leussink, B. et al.: Mech. Dev., 52: 51-64, 1995）がコードするタンパク質（Prx2）が、FSHβ鎖遺伝子の上流領域に結合し、FSHβ鎖遺伝子を活性化することを見出し、この知見に基づき本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下の（１）〜（５）を提供するものである。
【０００６】
（１）FSHβ鎖生産能を持つ細胞に、Prx2遺伝子を導入し、発現させることを特徴とするFSHβ鎖高生産性細胞の作製方法。
【０００７】
（２）Prx2遺伝子が、下記の(a)、(b)、又は(c)のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする（１）に記載のFSHβ鎖高生産性細胞の作製方法、
(a)配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質、
(b)配列番号２記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列で表され、FSHβ鎖遺伝子の発現を促進する機能を持つタンパク質、
(c)配列番号１記載の塩基配列で表されるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする動物由来のタンパク質であって、FSHβ鎖遺伝子の発現を促進する機能を持つタンパク質。
【０００８】
（３）FSHβ鎖生産能を持つ細胞であって、Prx2遺伝子が導入され、発現していることを特徴とするFSHβ鎖高生産性細胞。
【０００９】
（４）Prx2遺伝子が、下記の(a)、(b)、又は(c)のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする（３）に記載のFSHβ鎖高生産性細胞、
(a)配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質、
(b)配列番号２記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列で表され、FSHβ鎖遺伝子の発現を促進する機能を持つタンパク質、
(c)配列番号１記載の塩基配列で表されるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする動物由来のタンパク質であって、FSHβ鎖遺伝子の発現を促進する機能を持つタンパク質。
【００１０】
（５）（３）又は（４）に記載のFSHβ鎖高生産性細胞を培養し、培養上清又は細胞の破砕物からFSHβ鎖を回収することを特徴とするFSHβ鎖の生産方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のFSHβ鎖高生産性細胞により、動物医薬などとして利用されているFSHを効率的に生産できるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のFSHβ鎖高生産性細胞の作製方法は、FSHβ鎖生産能を持つ細胞に、Prx2遺伝子を導入し、発現させることを特徴とするものである。
FSHβ鎖生産能を持つ細胞は特に限定されず、種々の動物由来の細胞を使用することができる。例えば、ヒト、ブタ、マウス、ラット、ウシ、ヤギ、ヒツジ由来の細胞を使用することができる。また、FSHβ鎖生産能を持つ株化細胞を用いてもよく、例えば、LβT2、LβT4などを用いることができる。
【００１３】
細胞としては、FSHβ鎖生産能を持たない細胞に、FSHβ鎖遺伝子（構造遺伝子だけでなく、上流領域なども含む）を導入し、発現させた細胞を使用してもよい。FSHβ鎖遺伝子については、ヒト（Homo sapiens; Accession No. M54912, M18536, M21219, M38644）、ブタ（Sus scrofa;Accession No.D00621）ラット (Rattus norvegicus; Accession No. M27044)、マウス (Mus musculus; Accession No. MMU12932) 、 ウシ (Bos Taurus; Accession No. M83753, M20185) 、チンパンジー (Pan troglodytes; Accession No. DQ302103) 、ヤギ (Capra hircus; Accession No. AY838283, AY838284) 、ヒツジ（Ovis aries; Accession No. AY853255, AY853254)などで塩基配列が明らかにされているので、それらの遺伝子を使用することができる。
【００１４】
使用するPrx2遺伝子も特に限定されず、種々の動物由来のPrx2遺伝子を使用することができる。例えば、ヒト（Homo sapiens, Accession No. BC014645）、ブタ（配列番号１）、マウス(Mus musculus; Accession No. NM_009116) 、ラット (Rattus norvegicus; Accession No. XM_238327)、チンパンジー (Pan troglodytes; Accession No. XM_520310) 由来の遺伝子を使用することができる。Prx2遺伝子は、宿主細胞中のFSHβ鎖遺伝子と同一の生物のものになるようするのが好ましい。
【００１５】
本発明における「Prx2遺伝子」の中には、(a)配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質、(b)配列番号２記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列で表され、FSHβ鎖遺伝子の発現を促進する機能を持つタンパク質、又は(c)配列番号１記載の塩基配列で表されるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする動物由来のタンパク質であって、FSHβ鎖遺伝子の発現を促進する機能を持つタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。
【００１６】
(a)のタンパク質は、ブタ由来のPrx2である。
(b)のタンパク質は、(a)のタンパク質に、FSHβ鎖遺伝子の発現を促進する機能に影響を与えない範囲内で変異が導入されたタンパク質である。このような変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異をも含む。人為的変異を生じさせる手段としては、部位特異的変異誘発法（Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982）などを挙げることができるが、これに限定されるわけではない。変異したアミノ酸の数は、前記した機能を失わせない限り、その個数は制限されないが、通常は、30アミノ酸以内であり、好ましくは20アミノ酸以内であり、更に好ましくは10アミノ酸以内であり、最も好ましくは5アミノ酸以内である。変異を導入したタンパク質がFSHβ鎖遺伝子の発現を促進する機能をもつかどうかは、そのタンパク質をコードする遺伝子をFSHβ鎖産生細胞に導入し、FSHβ鎖の生産が増大するかどうかを調べることにより判断できる。
【００１７】
(c)のタンパク質は、DNA同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られる(a)と同様の機能を持つタンパク質である。(c)のタンパク質における「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、通常、37℃でのハイブリダイゼーション及び1×SSC、0.1％SDSを含む緩衝液による37℃での洗浄処理といった条件であり、好ましくは、42℃でのハイブリダイゼーション及び0.5×SSC、0.1％SDSを含む緩衝液による42℃での洗浄処理といった条件であり、更に好ましくは、65℃でのハイブリダイゼーション及び0.2×SSC、0.1％SDSを含む緩衝液による65℃での洗浄処理といった条件である。ハイブリダイゼーションにより得られるDNAは、配列番号１記載の塩基配列（ブタ由来のPrx2遺伝子の塩基配列）で表されるDNAと通常高い相同性を有する。高い相同性とは、60％以上の相同性、好ましくは75％以上の相同性、更に好ましくは90％以上の相同性を指す。
【００１８】
Prx2遺伝子を細胞に導入する方法は特に限定されず、市販のトランスフェクション試薬などを使って行うことができる。
本発明の方法によって作製されたFSHβ鎖高生産性細胞は、FSHβ鎖の生産に利用できる。具体的な方法は特に限定されず、例えば、本発明のFSHβ鎖高生産性細胞を培養し、培養上清又は細胞の破砕物からFSHβ鎖を回収することにより、FSHβ鎖を生産することができる。
【実施例】
【００１９】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
最初に、実験材料及び実験方法について説明する。
【００２０】
（１）ブタPrx2の組換えタンパク質の作製
ブタPrx2 cDNAをフレーム内に持つpET32a（Novagen, Darmstadt, Germany）クローンを、E. coli BL21（DE3） Codon Plus RP (Stratagene, La Jolla, CA)に導入し、1 mM isopropyl thiogalactosideによって合成を誘導した。タンパク質を回収するために、大腸菌を2×YTメディウム（1L中16gのTrypton、10gのYeast Extract、5gのNaCl、100μg/ml ampicillinを含む）中で前培養した。前培養液200μlを2×YT培地10mlに加え培養を継続した。培養から4時間後、100μlの100ｍM IPTGと100μlの10mg/ml ampicillin（final 100μl/ml）を加えた。さらに3時間培養後、遠心により集菌し使用するまで-20℃で保存した。
【００２１】
回収した大腸菌のペレットからTrx・Tag -His・Tag融合ブタPrx2タンパク質を、Mag extractor-HisTagキット（TOYOBO, Tokyo, Japan）を用いて精製した。まず1mlの大腸菌液から集菌したペレットに、キットに付属の吸着洗浄液10mlにUrea 4.8gを加えHClでpH8.0とした液（6M Urea-吸着洗浄液）570μlと5M NaClを30μl加えた。ピペッティングで菌を分散させ、さらに100％amplitude（Ultrasonic Processor UP50H, Dr.Hielscher）、0.5サイクルで超音波破砕を30秒ずつ3回行った。遠心分離し上清を回収し、付属のMag beads 40μlを加えた。攪拌しながら室温で30秒インキュベートし、Magical Trapperを用いてMag beadsに捕集されたタンパク質を分離し、上清を除いた。再度、6M Urea-吸着洗浄液を500μl加え、攪拌しMag beadsに分離し上清を除いた。これを二回繰り返した後、beadsに6M Urea Elute buffer（10ml Elute bufferに4.8g Ureaを加えてpH7.4に調製した）を加え、攪拌して組換え体タンパク質を含む上清を回収した。
【００２２】
（２）ゲルシフトアッセイ（EMSA; electrophoretic mobility shift assay）
組換えPrx2とFd2 DNAフラグメントが特異的に結合することを証明するために、ゲルシフトアッセイを行った。 FAM標識したDNAフラグメントはFAM標識のオリゴヌクレオチドを5′プライマーとしてPCRを行うことによって得た。結合反応は、 10μl中に10mM Hepes buffer pH 7.9（0.4mM MgCl2、0.4mM DTT、50mM NaCl、4% glycerolを含む）、10 fmol FAM標識したプローブDNA （1ng）、ブタ組換えPrx2タンパク質200ng(図1の１，２）、 100ng(図1の３，４）、又は50ng(図1の５，６）とpoly(dI-dC) 250ngを含んでおり、30℃で30分インキュベートを行った。
【００２３】
結合反応後のサンプルは、4%ポリアクリルアミドゲル（10ml水溶液中、30％ acrylamide 1.33ml, 2% bis-acrylamide 0.67ml, 50% glycerol 500μl, 1×TBE 2.5ml, 10% APS 60ml, 6μl TEMED）を用いて0.25×TBE Buffer（22.5mM Tris-Borate, 0.5 mM EDTA）中、10 mAの電気泳動により分析を行った。分離後、Fluor-S Max（Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA）でFAMを検出した。
【００２４】
（３）DNase Iフットプリンティング
5’末端ラベルしたDNA、2ngを組換えブタPrx2、400ngと共に、binding buffer中でEMSAと同じ条件でインキュベートした。30℃で20分インキュベートした後、0.1もしくは0.2UのDNase I（RQ1 RNase-Free DNase, Promega, Madison, WI）を加え、反応液を25℃で15分インキュベートした。最終濃度65mMになるようにEDTAを加えて反応を止め、phenol-chloroform抽出によりタンパク質を除去した。分子量のサイズマーカーとして、GeneScan 500 ROX Size Standard（Applied Biosystems）1μlを加え10μlホルムアミドに溶解した。これをABI PRISM 310に搭載されているGeneScan analyzerで分析した。
【００２５】
（４）発現ベクターとレポーターベクターの構築
初めに発現ベクターと分泌型アルカリフォスファターゼ（secreted alkaline phosphatase;  SEAP）レポーターベクターを構築した。ブタPrx2 cDNAはPrx2-pAD-GAL4のプラスミドからEcoRIとXhoIで切り出し、哺乳類細胞の発現ベクターであるpcDNA3.1/Zeo+ (Clontech)のEcoRI-XhoI サイトに連結した。レポーター遺伝子のコンストラクトはFSHβ鎖遺伝子の上流をpSEAP2-Basic vector (Clontech)（Fβ3-basic: -985/+10, ΔFβ3-basic:Fβ3-basicから -745/-104bpを除いたもの、Fβ5-basic: -238/+10）とpSEAP2-Promoter vector (Clontech) （ (Fd2-promoter: Fd2, -852/-746)に連結することによって構築した。
【００２６】
（５）細胞培養、DNAトランスフェクション、レポーターアッセイ
Chinese hamster ovary （CHO）細胞は10% fetal bovine serum （CELLect Gold FBS, ICN, Aurora, OH）とANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC SOLUTION STABILISED（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を添加したF12 medium（Invitrogen, Carlsbad, CA）中で培養した。
トランスフェクションに用いるプラスミドベクターはE. coli XL1-Blue MRF'から調製するため、100 mg/L ampicilinを含む2.5 % LURIA BROTH BASE中で一晩、37 ℃で培養した。Nucleobond AX（MACHERY-NAGEL GmbH & Co., Duren, Germany）を使い、添付の操作手順に従ってトランスフェクション用の純度にプラスミドDNAを抽出・精製した。吸光度260nmを測定しDNA濃度を算出した。
【００２７】
トランスフェクションは、96ウェルプレートにおよそ1×104cells/100μl/wellで播いてから、24時間後に行った。CHO細胞はFuGENE6 (Roche Diagnostic, Indianapolis, IN) を20ng DNA/0.3μl FuGENE 6/wellの量を用いて行った。その後、細胞は24時間5% CO2-95% 空気中、37℃の条件下で培養した。1well当たり培養液5μlを回収し、Phospha-Light Reporter Gene Assay System (Applied Biosystems)を用いてアルカリフォスファターゼ活性を測定した。得られた値から、4well間の平均値とその標準偏差を求めた。
【００２８】
〔実施例１〕  ゲルシフトアッセイ
Prx2が、FSHβ鎖遺伝子の上流領域に存在するFd2と特異的に結合することを証明するため、ゲルシフトアッセイを行った。この結果を図１に示す。サンプル中のPrx2の量は、200ng（レーン１及び２）、100ng（レーン３及び４）、50ng（レーン５及び６）の３通りとした。また、プローブDNA（標識Fd2断片）の50倍量の非標識Fd2断片（50×cold DNA）を加えたサンプルも調製した（レーン２、４、６）。
【００２９】
Prx2を加えない場合、プローブDNAはゲルの下方まで移動したが（レーン７）、Prx2を加えた場合には、移動度は小さくなり、プローブDNAのバンドはゲルの上方で検出された（レーン１、３、５）。また、Prx2を加えた場合であっても、非標識Fd2断片も加えた場合には、ゲルの下方にもプローブDNAのバンドが検出された。これは、非標識Fd2断片が、プローブDNAとPrx2の結合を競合的に阻害し、Prx2と結合しないプローブDNAが生じたためであると考えられる。以上の結果からPrx2はFd2と特異的に結合するものと考えられる。
【００３０】
〔実施例２〕  フットプリンティング
Fd2を含む領域（FSHβ鎖遺伝子の-850〜-750領域）のDNaseIフットプリンティングを行った。この結果を図２に示す。フットプリンティングは、Prx2を添加する場合（図２中段）のほか、Prx2を添加しない場合（図２上段）、Prx2の代わりにProp-1を添加した場合について行った。
【００３１】
-840〜-830付近の領域及び-825〜-815付近の領域（図２中の黒色のバーで示した領域）で切断される断片の量が少ないことから、Prx2はこれらの領域に結合しているものと推定される。また、-810〜-800付近の領域（図２中の灰色のバーで示した領域）で切断される断片の量も少ないことから、この領域もPrx2の結合に関与するものと推定される。
【００３２】
〔実施例３〕  レポーターアッセイ（１）
FSHβ鎖遺伝子の上流領域の下流に分泌型アルカリフォスファターゼ遺伝子を配置したレポーターベクターを構築し、これをPrx2発現ベクターと共に、CHO細胞に導入し、レポーター遺伝子（分泌型アルカリフォスファターゼ遺伝子）の発現量を調べた。この結果を図３に示す。
【００３３】
レポーターベクターとしては、長さの異なる６種類のFSHβ鎖遺伝子上流領域を含むベクターとFSHβ鎖遺伝子上流領域を含まないベクター（Basic）の７種類作製した（図３上）。レポーター遺伝子の発現量の測定は、Prx2発現ベクターを導入する場合（Prx2）のほか、Prop-1発現ベクターを導入する場合（Prop-1）、Prx2発現ベクターとProp-1発現ベクターを導入する場合（Prx2+Prop-1）、いずれの発現ベクターも導入しない場合（Zeo）の４条件で行った。
【００３４】
Prx2を細胞中で発現させることにより、レポータ遺伝子の発現量が増大した。この発現促進効果は、-985より上流の領域を切除した場合には大きな変化はなかったが（FSHβ-1、FSHβ-2、FSHβ-3）、-596より上流の領域を切除することにより、大幅に減退した（FSHβ-4、FSHβ-5）。-985〜-596の領域にはFd2（-853〜-745の領域）が含まれており、この結果は、Prx2がFd2と特異的に結合することを示す実施例１の結果と合致する。
また、Prop-1の発現促進効果が5倍程度であるのに対し、Prx2の発現促進効果は10〜15倍程度であり、FSHβ鎖遺伝子に対する発現促進効果は、Prop-1よりもPrx2の方が大きいと考えられる。
【００３５】
〔実施例４〕  レポーターアッセイ（２）
Prx2発現ベクターの導入量を変えて、実施例３と同様にレポーター遺伝子の発現量を調べた。この結果を図４に示す。
【００３６】
導入量は、5ng、10ng、20ngとした。また、使用したFSHβ鎖遺伝子の上流領域は、Fd2を含むFSHβ-1及びFSHβ-3とした。
FSHβ-1、FSHβ-3のいずれを使用した場合も、レポータ遺伝子の発現量は、Prx2発現ベクターの導入量に依存して増大した。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】実施例１のゲルシフトアッセイの結果を示す図。
【図２】実施例２のDNaseIフットプリンティングの結果を示す図。
【図３】実施例３のレポーターアッセイの結果を示す図。
【図４】実施例４のレポーターアッセイの結果を示す図。
【図１】
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【図２】
2007295814.tif 000003
【図３】
2007295814.tif 000004
【図４】
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【配列表】
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