(57)【要約】【課題】加熱時や保存時の安定性に優れ、着色が抑制されたヘパリン溶液の提供。【解決手段】ヘパリンまたはその塩とクレアチニンおよび／またはトリスヒドロキシメチルアミノメタンまたはその酸付加塩とを含有することを特徴とするヘパリン溶液、その安定化方法および着色抑制方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘパリンまたはその塩とクレアチニンおよび／またはトリスヒドロキシメチルアミノメタンまたはその酸付加塩とを含有することを特徴とするヘパリン溶液。
【請求項２】
ヘパリンの塩がヘパリンカルシウムである請求項１記載のヘパリン溶液。
【請求項３】
ヘパリンまたはその塩の濃度が５０００ないし２５０００国際単位／ｍｌである請求項１または２のいずれかに記載のヘパリン溶液。
【請求項４】
ｐＨが６〜８である請求項１ないし３のいずれかに記載のヘパリン溶液。
【請求項５】
さらに還元性を有する亜硫酸塩類を含有する請求項１ないし４のいずれかに記載のヘパリン溶液。
【請求項６】
保存剤を含有しない請求項１ないし５のいずれかに記載のヘパリン溶液。
【請求項７】
医薬組成物である請求項１ないし６のいずれかに記載のヘパリン溶液。
【請求項８】
ヘパリンまたはその塩とクレアチニンおよび／またはトリスヒドロキシメチルアミノメタンまたはその酸付加塩とを併存させることを特徴とするヘパリン溶液の安定化方法。
【請求項９】
安定化が加熱時および／または保存時のｐＨ低下抑制、ヘパリン活性低下抑制または不溶物形成抑制の少なくとも１つである請求項８に記載の安定化方法。
【請求項１０】
ヘパリンまたはその塩とクレアチニンとを併存させることを特徴とするヘパリン溶液の着色抑制方法。
【請求項１１】
ヘパリンまたはその塩と還元性を有する亜硫酸塩類とを併存させることを特徴とするヘパリン溶液の着色抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヘパリン溶液、その安定化方法および着色抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘパリンは、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−グルクロン酸およびＬ−イズロン酸から成る多糖のＮ−硫酸、Ｎ−アセチルおよびＯ−硫酸置換体であり、はじめイヌの肝から見いだされたが、小腸や肺に多く、皮膚や胸腺その他にも存在する。市販品は腸由来のものが多く、分子量は７０００〜２５０００程度である。臨床的にはヘパリンの抗血液凝固活性と脂血清澄活性が利用されている。
【０００３】
ヘパリンの塩としては、ナトリウム塩、カルシウム塩などが知られており、医薬品として使用されている。ナトリウム塩は日本薬局方品である。ヘパリンナトリウム注射液は１０００単位／ｍｌのヘパリンナトリウムを含有するガラスバイアル注射剤で、無色〜淡黄色澄明の水性のものであり、ｐＨは５．５〜８．０、生理食塩液に対する浸透圧比は約１等の性状を有する。ヘパリンロック用プレフィルドシリンジ製剤は１０または１００単位／ｍｌのヘパリンナトリウムをあらかじめシリンジに充填した製剤で、無色〜淡黄色澄明の水性のものであり、ｐＨは５．５〜８．０、浸透圧比は約１等の性状を有する。透析専用ヘパリン製剤は２５０または５００単位／ｍｌのヘパリンナトリウムを含有するガラスバイアルまたはプレフィルド製剤で、無色〜淡黄色澄明の水性のものであり、ｐＨは５．５〜７．５、浸透圧比は０．９〜１．１等の性状を有する。ヘパリンカルシウム注射液は１０００または２５０００単位／ｍｌのヘパリンカルシウムを含有するガラスバイアルまたはプレフィルド注射剤で、無色〜淡黄色澄明の水性のものであり、ｐＨは６．０〜８．０、浸透圧比は約１等の性状を有する。
【０００４】
ヘパリン水溶液は空気中の炭酸ガスの吸収等によりｐＨが６よりも低くなると、加水分解によりヘパリンの硫酸基が離脱して、これがさらにｐＨを低下させ加水分解を加速する。ヘパリンの硫酸基が離脱するとその生理活性も低下してしまう。特に、ヘパリンカルシウム注射液の様な高濃度のヘパリン溶液やポリプロピレン、ポリエチレン等のガス透過性のあるプラスチック容器や注射筒にあらかじめヘパリン水溶液を充填したいわゆるプレフィルドタイプの製剤ではｐＨ低下および活性の低下が問題となる。
【０００５】
また、従来のヘパリン水溶液は加熱処理、例えば高圧蒸気滅菌により、ｐＨ低下、活性の低下あるいは着色をおこすため、上記製剤は間歇滅菌あるいはろ過滅菌および／または防腐・保存剤としてベンジルアルコール、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル等の保存剤を添加しているものがある（例えば、ヘパリンナトリウム１０００単位／ｍｌのガラスバイアル製剤であるヘパリンナトリウム注−Ｗｆ（ニプロファーマ（株）製造、三菱ウェルファーマ（株）販売）、ヘパリンナトリウム注「味の素」（味の素ファルマ（株）製造販売））。ベンジルアルコールは、ブチルゴム栓に吸着することからテフロン（登録商標）等で塗被されたゴム栓を使用する必要があり、光により分解されることから遮光下で製剤を保存する必要がある（非特許文献１）。
近年、肺血栓塞栓症／深部静脈血栓症（静脈血栓塞栓症）の予防ガイドライン（非特許文献２）において、深部静脈血栓症の予防に５０００単位のヘパリンを８もしくは１２時間ごとに皮下注射する方法が推奨されている。皮下投与の場合、一般的に１回の投与容量は少ない方が患者に対する苦痛や吸収性の面で良いと考えられていることから、上記予防法に使用するヘパリン製剤は高濃度少容量が望ましい。また、投与準備の手間を省く、誤投与や薬物の汚染を防ぐ目的で、１回使いきりのユニットドーズタイプのプレフィルドシリンジが好ましい。しかしながら、既存製剤がこれらの条件を満足させ、かつ十分な安定性を有するものであるか否かは不明である。
【０００６】
ヘパリンまたはその塩に、クエン酸、リン酸、炭酸あるいはトリスヒドロキシメチルアミノメタン（以下、トリスと略称し、特にことわらない限りその酸付加塩を包含するものとする）またはそれらの塩を配合することにより、上記防腐・保存剤を添加しないで長期保存安定化できる旨の開示があり、実施例として低濃度（１００または１０００単位／ｍｌ）のヘパリンナトリウムにクエン酸ナトリウム、リン酸緩衝液あるいは炭酸水素ナトリウムを１ｍＭの濃度で配合した水溶性製剤が開示されている（特許文献１）。医薬品としては、低濃度（１０〜１０００単位／ｍｌ）のヘパリンナトリウムにクエン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウムあるいは炭酸水素ナトリウムを配合して上記防腐・保存剤を添加していない水溶性製剤が市販されている（例えば、ヘパリンＮａロック１００シリンジ（ニプロファーマ（株）製造、三菱ウェルファーマ（株）販売）、ヘパリンナトリウム注Ｎ「味の素」（味の素ファルマ（株）製造販売）、ペミロック（登録商標）１００単位／ｍＬシリンジ（大洋薬品工業（株）製造、味の素ファルマ（株）販売））。
【０００７】
しかしながら、高濃度（例えば５０００単位／ｍｌ以上）のヘパリン溶液の安定化について具体的な開示はない。また、ヘパリンカルシウムの安定化水溶液およびヘパリンまたはその塩にトリスを添加した安定化水溶液について具体的な開示はない。ヘパリンカルシウムにクエン酸、リン酸あるいは炭酸を添加した場合はそれらのカルシウム塩が生成し、安定化効果が得られなかったり、不溶物として析出・沈殿する可能性があり、実際に使用できるか否か不明である。
【０００８】
【非特許文献１】医薬品添加物ハンドブック、丸善株式会社、１９８８年、Ｐ３１６
【非特許文献２】肺血栓塞栓症／深部静脈血栓症（静脈血栓塞栓症）の予防ガイドライン  ダイジェスト版、メディカル  フロント  インターナショナル  リミテッド、２００４年、ｐ７
【特許文献１】特開２００２−１０４９７６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、ヘパリンまたはヘパリンの塩の種類にかかわらず、ヘパリンまたはその塩の濃度にかかわらず、また、ヘパリン溶液の容器の材質、形状にかかわらず加熱時や保存時にも安定性に優れ、または着色が抑制されたヘパリン溶液およびその安定化方法および着色抑制方法を提供することにある。
また、本発明の課題は、皮下投与にも使用可能な高濃度少容量の十分安定化および着色抑制されたヘパリン溶液製剤、特に１回使いきりのユニットドーズドタイプのプレフィルドシリンジ製剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、クレアチニンおよび／またはトリスあるいは還元性を有する亜硫酸塩類を配合することにより、ヘパリンまたはヘパリンの塩の種類にかかわらず、ヘパリンまたはその塩の濃度にかかわらず、また、ヘパリン溶液の容器の材質、形状にかかわらず加熱時にも保存時にも安定性に優れ、または着色が抑制されたヘパリン溶液を調製できることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、
（１）少なくともヘパリンまたはその塩とクレアチニンおよび／またはトリスとを含有することを特徴とするヘパリン溶液である。
具体的に、
（２）ヘパリンの塩がヘパリンカルシウムである上記（１）に記載のヘパリン溶液、
（３）ヘパリンまたはその塩の濃度が５０００ないし２５０００国際単位／ｍｌである上記（１）または（２）に記載のヘパリン溶液、
（４）ｐＨが６〜８である上記（１）ないし（３）のいずれかに記載のヘパリン溶液、
（５）さらに還元性を有する亜硫酸塩類を含有する上記（１）ないし（４）のいずれかに記載のヘパリン溶液、
（６）保存剤を含有しない上記（１）ないし（５）のいずれかに記載のヘパリン溶液、
（７）医薬組成物である上記（１）ないし（６）のいずれかに記載のヘパリン溶液である。
また、本発明は、
（８）ヘパリンまたはその塩とクレアチニンおよび／またはトリスとを併存させることを特徴とするヘパリン溶液の安定化方法、
（９）安定化が加熱時および／または保存時のｐＨ低下抑制、ヘパリン活性低下抑制または不溶物形成抑制の少なくとも１つである上記（８）に記載の安定化方法、
（１０）ヘパリンまたはその塩とクレアチニンおよび／またはトリスとを併存させることを特徴とするヘパリン溶液の着色抑制方法、
（１１）ヘパリンまたはその塩と還元性を有する亜硫酸塩類とを併存させることを特徴とするヘパリン溶液の着色抑制方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ヘパリンまたはヘパリンの塩の種類にかかわらず、ヘパリンまたはその塩の濃度にかかわらず、また、ヘパリン溶液の容器の材質、形状にかかわらず加熱時や保存時に安定性に優れ、または着色が抑制されたヘパリン溶液を提供することができる。さらに詳細には、加熱、保存、光、振動等によるヘパリン溶液のｐＨ低下、ヘパリン活性の低下、不溶物の形成あるいは着色の少なくとも１つ以上を抑制することができる。すなわち、加熱滅菌、例えば高圧蒸気滅菌が可能で、従来のヘパリン製剤のように保存剤・防腐剤を配合しなくても、また必ずしも遮光を必要としないで、室温で長期間保存安定な、または着色が抑制されたヘパリン製剤を提供することができる。
また、皮下投与にも使用可能な高濃度少容量の十分安定化および着色抑制されたヘパリン溶液製剤、更には１回使いきりのユニットドーズドタイプのプレフィルドシリンジ製剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明の第一の態様は、少なくともヘパリンまたはその塩とクレアチニンおよび／またはトリスとを含有することを特徴とするヘパリン溶液である。
【００１３】
本発明のヘパリンは公知のものを使用できる。ヘパリンの塩としては、ナトリウム塩、カルシウム塩などが例示される。ヘパリンナトリウムは例えば健康な食用獣の肝、肺、腸粘膜から得たもので、白色〜帯灰褐色の粉末または粒で、においはない、水にやや溶けやすく、エタノールまたはジエチルエーテルにはほとんど溶けない、吸湿性である、等の性状を有するものであればよい。ヘパリンカルシウムは例えば健康なブタの腸粘膜から得たもので、白色〜帯灰褐色の粉末で、においはない、水に溶けやすい、等の性状を有するものであればよい。ヘパリンの調製は公知の方法に準じて行われる。例えば、日本薬局方に開示された方法等が利用できる。ナトリウム塩は日本薬局方収載品として、カルシウム塩はイギリス薬局方収載品あるいは例えば、カーボマー社（CarboMer Inc.）製、煙台東誠生化有限公司（Yantai Dongcheng Biochemicals Co. Ltd.）製として入手可能である。
また、本発明のヘパリンとしては低分子ヘパリンも例示される。このものはウシまたはブタ腸粘膜由来のヘパリンを過酸化水素と硫酸第二銅等により分解して得られた解重合ヘパリンであり、例えば一般名パルナパリン（平均分子量４５００〜６５００）、ダルテパリン（平均分子量約５０００）、ダナパロイド（平均分子量約５５００）、レビパリン（平均分子量約４０００）、エノキサパリン（平均分子量約４５００）およびチンザパリン（平均分子量約５５００〜７５００）等である。
本発明のヘパリン単位は特にことわらない限り国際単位（ＩＵ）で表記している。なお、ＩＵとアメリカのヘパリン単位であるＵＳＰ−Ｕとの関係は、１ＩＵ≒０．８７７ＵＳＰ−Ｕである。
【００１４】
本発明のヘパリン溶液におけるヘパリンまたはその塩の濃度としては１０〜５００００単位／ｍｌ程度、好ましくは１０００〜５００００単位／ｍｌ程度、さらに好ましくは５０００〜２５０００単位／ｍｌが例示される。
溶媒としては水が好ましいが、ヘパリン活性を阻害しない程度の他の溶媒、例えばアルコール等の有機溶媒を添加することもできる。
本発明のヘパリン溶液のｐＨとして好ましくは６〜８程度が例示される。ｐＨ６以上の緩衝能を持たせることにより、本発明のヘパリン溶液の安定性を確保・改善することができる。具体的には、本発明のヘパリン溶液のｐＨを６以上に調整でき、当該ｐＨで緩衝能を有し、かつ、難水溶性のカルシウム塩を形成しない公知の緩衝剤を適当量配合することができる。ヘパリンまたはその塩の濃度が１０〜５００００単位／ｍｌ程度の場合、クレアチニンの添加濃度としては１０〜５００ｍＭ程度、好ましくは５０〜３００ｍＭ、さらに好ましくは１００〜２５０ｍＭ程度が例示される。トリスは、例えばトリス塩酸塩が好ましく、ヘパリンまたはその塩の濃度が１０〜５００００単位／ｍｌ程度の場合、その添加濃度としては２５〜２００ｍＭ程度、好ましくは５０〜１００ｍＭ程度が例示される。
【００１５】
本発明の第二の態様は、ヘパリンまたはその塩とクレアチニンおよび／またはトリスとを併存させることを特徴とするヘパリン溶液の安定化方法である。ヘパリン溶液の安定化とは、加熱、保存、光、振動等によるヘパリン溶液のｐＨ低下、ヘパリン活性の低下あるいは不溶物の形成の少なくとも１つ以上を抑制することである。
【００１６】
本発明の第三の態様は、ヘパリンまたはその塩とクレアチニンおよび／またはトリスとを併存させることを特徴とするヘパリン溶液の着色抑制方法である。ヘパリン溶液の着色抑制とは、無色〜淡黄色澄明であれば良く、さらに波長４００ｎｍにおける１ｃｍ長の吸光度（以下、ＯＤ４００ｎｍと略記する）が０．３以下であることが好ましい。
本発明の第二の態様および第三の態様のヘパリン溶液におけるヘパリンまたはその塩の種類・濃度、溶媒、ｐＨ、クレアチニンおよび／またはトリスの添加濃度等の好ましい態様は上記の第一の態様と同様である。
【００１７】
本発明の第四の態様は、ヘパリンまたはその塩と還元性を有する亜硫酸塩類とを併存させることを特徴とするヘパリン溶液の着色抑制方法である。
還元性を有する亜硫酸塩類とは、例えば亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、二亜硫酸塩、チオ硫酸塩等であり、亜硫酸水素塩またはまたはチオ硫酸塩が好ましい。塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、バリウム塩等が例示され、ナトリウム塩またはカリウム塩が好ましい。ヘパリンまたはその塩の濃度が１０〜５００００単位／ｍｌ程度の場合、還元性を有する亜硫酸塩類の添加濃度としては、０．５〜２０ｍＭ程度、好ましくは１〜５ｍＭ程度が例示される。
本発明の第四の態様のヘパリン溶液におけるヘパリンまたはその塩の種類・濃度、溶媒、ｐＨ等の好ましい態様は上記の第一の態様と同様である。また、ヘパリン溶液の着色抑制の態様は上記の第三の態様と同様である。
【００１８】
クレアチニンおよび／またはトリスあるいは還元性を有する亜硫酸塩類はヘパリン粉末と同時に溶解してもよいし、ヘパリン粉末を溶解する前か後かのいずれかに添加してもよい。ヘパリン粉末溶解後にクレアチニンおよび／またはトリスあるいは還元性を有する亜硫酸塩類を添加する場合は、少なくとも加熱滅菌する前でヘパリン溶解後数時間以内、好ましくは１時間以内が例示される。
ヘパリン粉末溶解前あるいは後に溶液のｐＨを水酸化ナトリウムや水酸化カルシウム等のｐＨ調整剤で１０以上に調整した後クレアチニンおよび／またはトリスあるいは還元性を有する亜硫酸塩類を添加し、塩酸等のｐＨ調整剤でｐＨを６〜８程度に調整することもできる。また、調製時には調製液を窒素にてバブリングすることもできる。
【００１９】
本発明のヘパリン溶液およびその安定化方法では、クレアチニンおよび／またはトリスを配合することにより、ヘパリン溶液の安定性を確保・改善することができる。
また、本発明のヘパリン溶液およびその着色抑制方法では、クレアチニンおよび／またはトリスあるいは還元性を有する亜硫酸塩類を配合することにより、ヘパリン溶液の着色を抑制することができる。
【００２０】
本発明のヘパリン溶液には、さらに抗酸化剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、吸着防止剤、防腐剤、保存剤から選ばれる少なくとも１種を含有させることもでき、疼痛抑制剤、局所麻酔剤、組織障害抑制剤の１種以上を含有させてもよい。抗酸化剤の添加は、クレアチニンおよび／またはトリスのヘパリン溶液の着色抑制効果を増強するため好ましい。抗酸化材として、還元性を有する亜硫酸塩類、例えば亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、二亜硫酸塩、チオ硫酸塩のナトリウム塩、カリウム塩が例示される。等張化剤としては、例えば塩化ナトリウム等の塩類やブドウ糖等の糖類を添加してもよい。浸透圧比は生理学的に許容される程度であればよく、好ましくは約０．９〜１．１程度が例示される。クレアチニンは２５０ｍＭ程度配合することにより、塩化ナトリウムを添加しないで浸透圧比を約１とすることができるため、高血圧症や腎機能不全患者等のナトリウム摂取制限のある患者にとって好ましい。ｐＨ調節剤としては、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム、塩酸等を添加してもよい。
【００２１】
こうして調製された本発明のヘパリン溶液は、加熱時（例えば高圧蒸気滅菌）、長期保存（例えば室温で３年間保存）時、光被爆（例えば非遮光で３年間）時、振動（例えば数時間〜数ヶ月の輸送）時等の安定性、または難着色性に優れている。
【００２２】
本発明のヘパリン溶液では加熱滅菌処理を施すことが可能となり、無菌性の保証された安全な製剤を提供することができ、保存剤・防腐剤を配合しないで室温長期保存が可能となる。加熱滅菌処理の具体的な方法としては、高圧蒸気滅菌などが挙げられる。高圧蒸気滅菌時の安定性または難着色性については、上記の安定化剤または着色抑制剤の配合により確保されている。高圧蒸気滅菌の好適条件としては、温度１０５〜１３０℃、時間１〜６０分間程度が例示される。
従来のヘパリン製剤で配合されている保存剤・防腐剤、例えばベンジルアルコール、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル等の添加量を減じるあるいは非添加で医薬品として使用することができる。
また、本発明のヘパリン溶液は室温での長期保存安定性および光被爆に対する安定性または難着色性があるため、遮光せずに室温で少なくとも３年間安定に、または着色せずに保存することができる。
【００２３】
本発明のヘパリン溶液の医薬品の効能効果としては、汎発性血管内血液凝固症候群の治療、血液透析・人工心肺その他の体外循環装置使用時の血液凝固の防止、血管カテーテル挿入時の血液凝固の防止、輸血及び血液検査の際の血液凝固の防止、血栓塞栓症（静脈血栓症、心筋梗塞症、肺塞栓症、脳塞栓症、四肢動脈血栓塞栓症、手術中・術後の血栓塞栓症等）の治療及び予防、血液体外循環時における灌流血液の凝固防止（人工腎臓及び人工心肺等）、血管カテーテル挿入時の血液凝固の防止、輸血及び血液検査の際の血液凝固の防止、静脈内留置ルート内の血液凝固の防止、静脈血栓症の予防治療等が挙げられる。
【００２４】
本発明のヘパリン溶液の医薬品の使用方法は、すでに市販されているヘパリンナトリウムあるいはヘパリンカルシウム製剤の添付文書あるいはガイドライン（非特許文献２）に記載された用法・用量に準じて行うことができ、適用、症例、症状、年齢、性別等により適宜変更することもできる。例えば用時、そのままあるいはブドウ糖注射液、生理食塩液、リンゲル液等で１０〜３０単位／ｍＬ程度に希釈して、静脈内、皮下、筋肉内に注射する。深部静脈血栓の予防には、５０００単位を８もしくは１２時間ごとに皮下投与する。また、手術後または心筋梗塞などに続発する静脈血栓症の予防には、５０００単位を１２時間ごとに７〜１０日間皮下投与する。皮下投与および筋肉内投与する場合の１回の投与容量は５ｍｌ以下、好ましくは０．１〜１ｍｌ、さらに好ましくは０．２ｍｌが例示される。
【００２５】
製剤の剤形としては、既存のガラスバイアル、ガラスあるいはプラスチック製のシリンジ、あるいはユニジェクト（登録商標）（日本ベクトン・ディッキンソン（株））等のプラスチック製簡易型注射用キットに充填した注射剤とすることができる。用時調製時の手間を軽減するため、また調整時の希釈ミスや薬剤取り違えのミス、分割使用・保存による細菌汚染や活性の低下等を防ぐために、使用濃度・量であらかじめ充填されたいわゆるプレフィルド・ユニットドーズタイプの製剤が好ましい。容器の容量、材質および形状は、ヘパリン溶液の充填量と使い易さの観点で適宜選択できる。充填時に空隙の気体を少なくする、あるいは窒素置換するとさらに安定性または難着色性が改善されるため好ましい。
【００２６】
血栓塞栓症の治療および予防用には、ヘパリンナトリウムまたはヘパリンカルシウムを５０００単位／０．２ｍｌ、１００００単位／０．４ｍｌまたは１５０００単位／０．６ｍｌ充填したプレフィルドシリンジが好ましい。特に、手術後または心筋梗塞などに続発する静脈血栓の予防には、ヘパリンカルシウムを５０００単位／０．２ｍｌを充填したプレフィルドシリンジが好ましい。
【実施例】
【００２７】
本発明をさらに詳細に説明するための実施例および実験例を挙げるが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【００２８】
実施例１
ヘパリンカルシウム粉末２５０万単位を約８０ｍｌの水に溶解し、これにｐＨが１０以上になるまで１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を加えた。次に、クレアチニン（和光純薬工業（株）製）またはクレアチニンと亜硫酸水素ナトリウム（和光純薬工業（株）製）を所定量加えた後、ｐＨが７．５付近になるまで１Ｍの塩酸水溶液を滴下した。ｐＨ調整した溶液に水を加え１００ｍｌとし、表１に示す組成のクレアチニン添加ヘパリンカルシウム溶液を調製した。なお、溶液調製時には調製液を窒素にてバブリングした。
【表１】
2007100055.tif 000002
【００２９】
実施例２
クレアチニンに代えてトリスまたはクエン酸・１水和物を用い、実施例１の製法に準じて表２に示す組成のヘパリンカルシウム溶液を調製した。
【表２】
2007100055.tif 000003
【００３０】
実施例３
水酸化カルシウム６０ｍｇを約８０ｍｌの水に溶解しｐＨを１０以上とし、これにヘパリンカルシウム粉末２５０万単位を溶解した。次に、ｐＨが７．５付近になるまで１Ｍの塩酸水溶液を滴下した。ｐＨ調整した溶液に水を加え１００ｍｌとし、ヘパリンカルシウム溶液とした。なお、溶液調製時には調製液を窒素にてバブリングした。
【００３１】
比較例３
ヘパリンカルシウム粉末２５０万単位を約８０ｍｌの水に溶解した。次にこれに、ｐＨが７．５付近になるまで１Ｍの塩酸水溶液もしくは１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を滴下した。ｐＨ調整した溶液に水を加え１００ｍｌとし、ヘパリンカルシウム溶液とした。なお、溶液調製時には調製液を窒素にてバブリングした。
【００３２】
実験例１
実施例１および２で作製したヘパリンカルシウム溶液を０．２２μｍの無菌フィルター（ミリポア社製）にてろ過して５ｍｌのポリプロピレン製シリンジに１ｍｌ充填したもの、および同シリンジに１ｍｌ充填した後１１５℃×３０分高圧蒸気滅菌したものをそれぞれ調製した。ただし、実施例２−４は０．２ｍｌをユニジェクト（登録商標）に、実施例２−５は１ｍｌをガラスバイアルに充填した。これらのプレフィルドシリンジを表３に示す条件で保存した。保存前後でのヘパリンカルシウム溶液のｐＨを測定した。結果を表３に示す。
【００３３】
【表３】
2007100055.tif 000004
【００３４】
ろ過滅菌試料では、保存前のｐＨはいずれも７以上であった。対照（試料番号１）、トリス１０ｍＭ以下添加（試料番号６、７）およびクエン酸添加（試料番号１１、１２）では保存後のｐＨが６未満に低下した。クレアチニン添加（試料番号２〜５）およびトリス２５ｍＭ以上添加（試料番号８〜１０）では保存後のｐＨは６以上であった。
高圧蒸気滅菌試料では、対照（試料番号１３）、トリス１ｍＭ添加（試料番号１８）およびクエン酸添加（試料番号２２、２３）では保存前のｐＨが６未満であり、保存後はさらにｐＨが低下した。すなわち、高圧蒸気滅菌によりｐＨが６未満に低下し、保存によりさらにｐＨが低下したことになる。クレアチニン添加（試料番号１４〜１７）およびトリス５０ｍＭ添加（試料番号２０、２１）では保存前および保存後いずれもｐＨは６以上であった。トリス１０ｍＭ添加（試料番号１９）では保存前はｐＨ６以上であったが、保存後は６未満に低下した。
【００３５】
以上より、クレアチニン添加により、ヘパリンカルシウム溶液の高圧蒸気滅菌および保存によるｐＨの低下が抑制された。また、トリス１０または５０ｍＭ添加により、ヘパリンカルシウム溶液の高圧蒸気滅菌によるｐＨの低下が抑制され、さらにトリス２５ｍＭ以上添加により、ヘパリンカルシウム溶液の保存によるｐＨの低下が抑制された。
本発明製剤は、７０℃で６日間あるいは５０℃で４週間安定であり、上記結果から少なくとも室温で３年間は安定であると予測することができる。
【００３６】
実験例２
実験例１に準じて、表４および５に示したヘパリンカルシウム溶液を充填したプレフィルドシリンジを作製した。実施例２−５は１ｍｌをガラスバイアルに充填し、窒素置換して封じた後１１５℃×３０分高圧蒸気滅菌した。これらの試料を５０℃、２週間保存した。保存前後でヘパリンカルシウム溶液の着色度の指標としてＯＤ４００ｎｍを測定した。各試料の保存前後のＯＤ４００ｎｍの差を算出して保存による着色度とした。対照（試料番号２１および２５）の保存による着色度に対する各試料の抑制率を、[（対照の保存前後のＯＤ４００ｎｍの差）−（各試料の保存前後のＯＤ４００ｎｍの差）]／（対照の保存前後のＯＤ４００ｎｍの差）Ｘ１００％の式で算出した。また、ろ過滅菌および高圧蒸気滅菌後のＯＤ４００ｎｍを測定した。各々の結果を表４および表５に示す。
【００３７】
【表４】
2007100055.tif 000005
【表５】
2007100055.tif 000006
【００３８】
ろ過滅菌試料では、対照（試料番号２４）のＯＤ４００ｎｍは保存前の０．０２５から保存後に０．０９０へと０．０６５上昇した。クレアチニン添加試料（試料番号２５〜２７）のＯＤ４００ｎｍの保存前後の差は対照より小さく、着色の抑制率はクレアチニン添加濃度に依存して９．２〜２６．２％と増加した。高圧蒸気滅菌試料では、（試料番号２８）のＯＤ４００ｎｍは保存前の０．１３７から保存後に０．２１３へと０．０７６上昇した。クレアチニン添加試料（試料番号２９〜３１）のＯＤ４００ｎｍの保存前後の差は対照より小さく、着色の抑制率はクレアチニン添加濃度に依存して２６．３〜１００．０％と増加した。トリス添加試料（試料番号３２〜３４）のＯＤ４００ｎｍの保存前後の差は対照より小さかった。
【００３９】
以上より、高圧蒸気滅菌の対照試料（試料番号２８）では保存により着色度が増加し、室温３年間保存した場合のＯＤ４００ｎｍは０．３を超えることが推定され、医薬品として好ましくない。これに対しクレアチニンまたはトリス添加により、ヘパリンカルシウム溶液の保存による着色は抑制された。
【００４０】
対照（試料番号２４）のろ過滅菌後のＯＤ４００ｎｍは０．０２５であるのに対し、高圧蒸気滅菌後（試料番号２８）には０．１３７に増加した。亜硫酸水素ナトリウム２.１ｍＭまたは４．８ｍＭを添加した試料（試料番号３６、３５）では高圧蒸気滅菌後のＯＤ４００ｎｍは０.０４７または０．０４３であった。
【００４１】
以上より、加熱によりヘパリンカルシウム溶液の着色度は増加したが、亜硫酸水素ナトリウム添加によりこの着色は抑制された。
上記結果より、還元性を有する亜硫酸塩類を添加することによりヘパリン溶液の着色を抑制できることが予測される。
【００４２】
実験例３
実施例３および比較例３で製造したヘパリンカルシウム溶液１ｍｌを２ｍｌのガラスバイアルに充填して封じ、このバイアルを５０℃、２週間保存した。保存前後のヘパリンカルシウム溶液のｐＨを測定した。結果を表６に示す。
【表６】
2007100055.tif 000007
実施例３および比較例３いずれも保存前のｐＨは７以上であったが、保存後のｐＨは実施例３では６以上であったが、比較例３では６未満に低下した。