(57)【要約】【課題】  高感度で癌を検出することができ、安全性が高く、かつブロードな発光を利用して簡易な装置で検出を行うことができる、癌検出用のナノ粒子蛍光体を提供すること。【解決手段】  表面修飾剤により表面修飾され、かつ、発光の半値幅が５０〜２００ｎｍである金属酸化物又は金属硫化物ナノ粒子蛍光体であって、前記表面修飾剤に癌抗原を認識する抗体が結合していることを特徴とするナノ粒子蛍光体。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面修飾剤により表面修飾され、かつ、発光の半値幅が５０〜２００ｎｍである金属酸化物又は金属硫化物ナノ粒子蛍光体であって、前記表面修飾剤に癌抗原を認識する抗体が結合していることを特徴とするナノ粒子蛍光体。
【請求項２】
表面修飾剤が下記一般式Ｉで表される化合物である、請求項１に記載のナノ粒子蛍光体。
一般式Ｉ      Ｍ−（  Ｒ  ）4
（式中、ＭはＳｉ又はＴｉ元素を示す。Ｒは有機性基を示し、Ｒはそれぞれ同じでも異なっていてもよいが、Ｒのうちの少なくとも１つは癌抗原を認識する抗体と反応性を有する基を示す。）
【請求項３】
表面修飾剤が下記一般式IIで表される化合物である、請求項１に記載のナノ粒子蛍光体。
一般式II      ＨＳ−Ｌ−Ｗ
（式中、Ｌは２価の連結基を示す。ＷはＣＯＯＭ又はＮＨ2を示し、ここで、Ｍは水素原子、アルカリ金属原子又はＮＸ4を示し、Ｘは水素原子又はアルキル基を示す。）
【請求項４】
ナノ粒子蛍光体が別の金属イオンを０．０１〜１０原子％含有するドープ型である、請求項１から３の何れかに記載のナノ粒子蛍光体。
【請求項５】
ナノ粒子蛍光体が亜鉛化合物を主成分とすることを特徴とする、請求項１から４の何れかに記載のナノ粒子蛍光体。
【請求項６】
ナノ粒子蛍光体が酸化亜鉛を主成分とすることを特徴とする、請求項５に記載のナノ粒子蛍光体。
【請求項７】
癌抗原を認識する抗体が抗ＥＧＦＲ抗体である、請求項１から６の何れかに記載のナノ粒子蛍光体。
【請求項８】
癌の検出のために使用する、請求項１から７の何れかに記載のナノ粒子蛍光体。
【請求項９】
請求項１から８の何れかに記載のナノ粒子蛍光体からなる癌検出試薬。
【請求項１０】
請求項１から８の何れかに記載のナノ粒子蛍光体が水又は親水性溶媒に分散されている、ナノ粒子蛍光体分散液。
【請求項１１】
請求項１から８の何れかに記載のナノ粒子蛍光体、請求項９に記載の癌検出試薬又は請求項１０に記載のナノ粒子蛍光体分散液を検体と接触させることにより該ナノ粒子蛍光体を癌細胞と結合させる工程、及び励起光を検体に照射して癌細胞と結合したナノ粒子蛍光体の発光を観察する工程を含む、癌細胞の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌検出に用いるための金属酸化物又は金属硫化物ナノ粒子蛍光体、並びに上記ナノ粒子蛍光体を用いた癌の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナノメートルサイズの粒子材料はバルクの材料とは異なる性質を示すことが知られている。例えば半導体であれば、従来材料固有のものと考えられてきたバンドギャップが粒子のサイズによって変化する、いわゆる量子サイズ効果がよく知られている。この効果が顕著になる粒子の大きさは、半導体材料の種類によって異なり、一般的には数十ｎｍ〜数ｎｍである。このため特にシングルナノ粒子は重要である。また、この量子サイズ効果が顕著になると同時に、蛍光の寿命が短くなり、それまで観測されなかった発光が観測できるようになる等の効果が知られている材料もある。このように、ナノサイズ、特にシングルナノサイズの材料は従来知られているバルク材料と異なる性質を有するため、科学的及び工学的に非常に注目されている。
【０００３】
例えば、ＣｄＳｅ／ＣｄＳ（コア／シェル）、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ（コア／シェル）等の半導体ナノ粒子を用い、これらの半導体ナノ粒子により作製したビーズ表面に分子プローブを結合することにより標的分子を検出する半導体ナノ粒子蛍光材料が提案されている。これらの半導体ナノ粒子は、異なる結晶子サイズにすることにより異なる波長で発光を得ることが可能である。また発光波長と発光強度を組み合わせて標識ビーズをコードすることにより同時多重測定も可能である。半導体ナノ粒子蛍光材料は、高感度、低コスト、自動化が容易等の標識材料として優れた特性を有している。そのため、半導体ナノ粒子蛍光材料を標識材料として用いることにより生体内の特定部位、血漿中の物質等を高感度で高速に検出することが可能である。
【０００４】
ナノ粒子を用いた癌の検出方法としては、非特許文献１に、金ナノ粒子を用いる癌の検出方法が記載されている。この方法は、直径約３５ｎｍの金ナノ粒子に抗EGFR抗体を連結させて、癌細胞表面のEpidermal Growth Factor Receptor（EGFR）と反応させ（正常細胞では、EGFRの発現量は少ない）、金ナノ粒子の凝集の違いにより散乱光の強度や色調が異なって観察されることを利用して癌を検出する方法である。しかし、このような金ナノ粒子を用いる癌の検出方法は感度が低いという問題があった。
【０００５】
また、非特許文献２及び３には、ＣｄＳｅナノ粒子を用いる癌の検出方法が記載されている。非特許文献２及び３に記載の方法では、ＣｄＳｅを含むナノ粒子蛍光体を用いて、この蛍光体がシャープな発光スペクトルを示す特性を利用して癌を検出するものである。しかしながら、ＣｄＳｅは有害な物質であるため取り扱いが煩雑であり、またシャープな発光スペクトルを利用して癌を検出するものであることから、検出のために複雑な装置が必要であるという問題があった。
【０００６】
【非特許文献１】Ivan H.El-Sayed et al., NANO LETTERS, 5, (5), 829-834 (2005)
【非特許文献２】Bruchez M. Jr et al., Science, 281, 2013-2015 (1998)
【非特許文献３】Chan W.C. et al., Science, 281, 2016-2018 (1998)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記した従来技術の問題を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、高感度で癌を検出することができ、安全性が高く、かつブロードな発光を利用して簡易な装置で検出を行うことができる、癌検出用のナノ粒子蛍光体を提供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、上記ナノ粒子蛍光体を用いた癌検出試薬及び癌細胞の検出方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、表面修飾剤により表面修飾され、かつ、発光の半値幅が５０〜２００ｎｍである金属酸化物又は金属硫化物ナノ粒子蛍光体であって、前記表面修飾剤に癌抗原を認識する抗体を結合しているナノ粒子蛍光体と癌細胞に接触させ、紫外光を照射して発光を観察することによって癌細胞を感度よく検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明によれば、表面修飾剤により表面修飾され、かつ、発光の半値幅が５０〜２００ｎｍである金属酸化物又は金属硫化物ナノ粒子蛍光体であって、前記表面修飾剤に癌抗原を認識する抗体が結合していることを特徴とするナノ粒子蛍光体が提供される。
【００１０】
好ましくは、表面修飾剤は下記一般式Ｉで表される化合物である。
一般式Ｉ      Ｍ−（  Ｒ  ）4
（式中、ＭはＳｉ又はＴｉ元素を示す。Ｒは有機性基を示し、Ｒはそれぞれ同じでも異なっていてもよいが、Ｒのうちの少なくとも１つは癌抗原を認識する抗体と反応性を有する基を示す。）
【００１１】
好ましくは、表面修飾剤は下記一般式IIで表される化合物である。
一般式II      ＨＳ−Ｌ−Ｗ
（式中、Ｌは２価の連結基を示す。ＷはＣＯＯＭ又はＮＨ2を示し、ここで、Ｍは水素原子、アルカリ金属原子又はＮＸ4を示し、Ｘは水素原子又はアルキル基を示す。）
【００１２】
好ましくは、ナノ粒子蛍光体は別の金属イオンを０．０１〜１０原子％含有するドープ型である。
好ましくは、ナノ粒子蛍光体は亜鉛化合物を主成分とする。
好ましくは、ナノ粒子蛍光体は酸化亜鉛を主成分とする。
【００１３】
好ましくは、癌抗原を認識する抗体は抗ＥＧＦＲ抗体である。
好ましくは、本発明のナノ粒子蛍光体は、癌の検出のために使用される。
【００１４】
本発明の別の側面によれば、上記した本発明のナノ粒子蛍光体からなる癌検出試薬が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のナノ粒子蛍光体が水又は親水性溶媒に分散されている、ナノ粒子蛍光体分散液が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のナノ粒子蛍光体、癌検出試薬又はナノ粒子蛍光体分散液を検体と接触させることにより該ナノ粒子蛍光体を癌細胞と結合させる工程、及び励起光を検体に照射して癌細胞と結合したナノ粒子蛍光体の発光を観察する工程を含む、癌細胞の検出方法が提供される。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のナノ粒子蛍光体及びそれを用いた癌の検出方法によれば、高感度で癌を検出することができ、安全性が高く、かつ簡易な装置で癌の検出を行うことができる、
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
（１）表面修飾剤
本発明の金属酸化物又は金属硫化物のナノ粒子蛍光体は、表面修飾剤により表面修飾されている。本発明において用いる表面修飾剤の種類は、癌抗原を認識する抗体を結合できるようなものであれば特に限定されないが、例えば、下記一般式Ｉで表わされる化合物、又はその分解生成物もしくは部分縮合物、下記一般式IIで表わされる化合物を表面修飾剤として用いることができ、これにより金属酸化物又は金属硫化物のナノ粒子蛍光体を表面修飾することができる。このことによりナノ粒子蛍光体の水や親水性溶媒への分散性が改良でき、体液などによるナノ粒子蛍光体の溶出を防止できるとともに蛍光強度を増大することができる。さらに癌抗原を検出するための抗体を結合しやすくなるという利点も有する。
【００１７】
以下、本発明に用いられる表面修飾剤について説明する。本発明に用いる表面修飾剤は下記一般式Ｉ又はその分解生成物もしくは部分縮合物、又は一般式IIで表される化合物である。
【００１８】
一般式Ｉ          Ｍ−（  Ｒ  ）4 
（式中、ＭはＳｉ又はＴｉ原子を示す。Ｒは有機性基を示し、Ｒはそれぞれ同一でも異なっていてもよいが、Ｒのうちの少なくとも１つは癌抗原を認識する抗体と反応性を有する基を示す。）
【００１９】
Ｒで表わされる有機性基中、癌抗原を認識する抗体と反応性を有する基としては、連結基を介して、末端にビニル基、アリルオキシ基、アクリロイル基、メタクリロイル基、イソシアナト基、ホルミル基、エポキシ基、マレイミド基、メルカプト基、アミノ基、カルボキシル基、ハロゲンなどが結合したものである。これらの反応性を有する基の中で特に好ましくは末端にアミノ基を有するものである。
【００２０】
連結基としては、例えば、アルキレン基（例：メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ヘキサメチレン基、プロピレン基、エチルエチレン基、シクロヘキシレン基など炭素数が１〜１０、好ましくは１〜８の鎖状または環状のもの）が挙げられる。
【００２１】
また、連結基は不飽和結合を有していてもよい。不飽和基としては、アルケニレン基（例：ビニレン基、プロペニレン基、１−ブテニレン基、２−ブテニレン基、２−ペンテニレン基、８−ヘキサデセニレン基、１，３−ブタンジエニレン基、シクロヘキセニレン基など炭素数が１〜１０、好ましくは１〜８の鎖状または環状のもの）、アリーレン基（例えば、フェニレン基、ナフチレン基、など炭素数が６〜１０、好ましくは６のフェニレン基）が挙げられる。
【００２２】
連結基は１個又は２個以上のヘテロ原子（窒素原子、酸素原子、硫黄原子などの炭素原子以外の任意の原子を意味する）を有していてもよい。へテロ原子は酸素原子又は硫黄原子が好ましく、酸素原子がもっとも好ましい。ヘテロ原子の数は特に規定されないが５個以下であることが好ましく、より好ましくは３個以下である。
【００２３】
連結基は上記ヘテロ原子と隣接する炭素原子を含む官能基を部分構造として含んでいてもよい。該官能基としてはエステル基（カルボン酸エステル、炭酸エステル、スルホン酸エステル、スルフィン酸エステルを含む）、アミド基（カルボン酸アミド、ウレタン、スルホン酸アミド、スルフィン酸アミドを含む）、エーテル基、チオエーテル基、ジスルフィド基、アミノ基、イミド基などが挙げられる。上記の官能基はさらに置換基を有していても良く、これらの官能基は連結基にそれぞれ複数個存在してもよい。複数個存在する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。
【００２４】
官能基として好ましくは、エステル基、アミド基、エーテル基、チオエーテル基、ジスルフィド基又はアミノ基であり、さらに好ましくはアルケニル基、エステル基、エーテル基である。
【００２５】
Ｒで表わされるその他の有機性基としては、任意の基が挙げられるが、好ましくはメトキシ基、エトキシ基、イソプロポキシ基、ｎ-プロポキシ基、ｔ-ブトキシ基、ｎ-ブトキシ基などのアルコキシ基及びフェノキシ基である。これらのアルコキシ基及びフェノキシ基はさらに置換基を有していてもよいが、合計の炭素数が８以下のものが望ましい。
【００２６】
一般式Ｉで表される表面修飾剤は、アミノ基、カルボキシル基などが、酸又は塩基と塩を形成したものでもよい。
【００２７】
一般式Ｉで表される化合物の分解生成物もしくは部分縮合物とは、アルコキシ基が加水分解した水酸化物、水酸基同士間の脱水縮合反応により生成した低分子量のオリゴマー（これはリニア構造、環状構造、架橋構造などいずれであってもよい）、水酸基と未加水分解のアルコキシ基による脱アルコール縮合反応生成物、これらがさらに脱水縮合反応して形成したゾル、及びゲルをいう。
【００２８】
一般式Ｉで表される表面修飾剤の具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。
Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、アミノフェニルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、ビス（トリメトキシシリルプロピル）アミン、Ｎ−（３−アミノプロピル）−ベンズアミドトリメトキシシラン、３−ヒドラジドプロピルトリメトキシシラン、３−マレイミドプロピルトリメトキシシラン、（ｐ−カルボキシ）フェニルトリメトキシシラン、３−カルボキシプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルチタニウムトリプロポキシド、３−アミノプロピルメトキシエチルチタニウムジエトキシド、３−カルボキシプロピルチタニウムトリメトキシドなど。
【００２９】
一般式Ｉで表される表面修飾剤は、末端のＮＨ2基又はＣＯＯＨ基が、酸又は塩基と塩を形成したものであってもよい。
一般式Ｉで表される表面修飾剤は、ナノ粒子蛍光体の表面全体を被覆していても、その一部に結合していてもよい。また、本発明において表面修飾剤は、単独で用いても複数併用してもよい。
【００３０】
本発明においては、上記表面修飾剤に加えて、公知の表面修飾剤（例えば、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン（１）ラウリルエーテルリン酸、ラウリルエーテルリン酸、トリオクチルホスフィン、トリオクチルホスフィンオキシド、ポリリン酸ナトリウム、ビス（２−エチルヘキシル）スルホコハク酸ナトリウムなど）がナノ粒子合成時、あるいは合成後共存させてもよい。
【００３１】
本発明においては、下記一般式IIで表わされる化合物を表面修飾剤として用いることもできる。
【００３２】
一般式II      ＨＳ−Ｌ−Ｗ
【００３３】
式中、Lは2価の連結基を表わし、ＷはＣＯＯＭ又はＮＨ2を表す。ここで、Ｍは水素原子、アルカリ金属原子又はＮＸ4を表し、Ｘは水素原子又はアルキル基を表す。
【００３４】
連結基としてはアルキレン基（例：メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ヘキサメチレン基、プロピレン基、エチルエチレン基、シクロヘキシレン基など炭素数が１〜２０、好ましくは１〜１８の鎖状又は環状のもの）が挙げられる。
【００３５】
連結基は不飽和結合を有していてもよい。不飽和基としては、アルケニレン基（例：ビニレン基、プロペニレン基、１−ブテニレン基、２−ブテニレン基、２−ペンテニレン基、８−ヘキサデセニレン基、１，３−ブタンジエニレン基、シクロヘキセニレン基など炭素数が１〜２０、好ましくは１〜１８の鎖状又は環状のもの）、アルキニレン基（例：エチニレン基、プロキニレン基、など炭素数が１〜２０、好ましくは１〜１８のもの）、アリーレン基（例：フェニレン基、ナフチレン基、アントリレン基、など炭素数が６〜１４、好ましくは６のフェニレン基）が挙げられる。
【００３６】
連結基は少なくとも１個のヘテロ原子（窒素原子、酸素原子、硫黄原子などの炭素原子以外の任意の原子を意味する）を有していてもよい。へテロ原子は酸素原子又は硫黄原子が好ましく、酸素原子がもっとも好ましい。ヘテロ原子の数は特に規定されないが５個以下であることが好ましく、より好ましくは３個以下である。
【００３７】
連結基は上記ヘテロ原子と隣接する炭素原子を含む官能基を部分構造として含んでいてもよい。該官能基としてはエステル基（カルボン酸エステル、炭酸エステル、スルホン酸エステル、スルフィン酸エステルを含む）、アミド基（カルボン酸アミド、ウレタン、スルホン酸アミド、スルフィン酸アミドを含む）、エーテル基、チオエーテル基、ジスルフィド基、アミノ基、イミド基などが挙げられる。上記の官能基はさらに置換基を有していてもよく、これらの官能基はＬにそれぞれ複数個存在してもよい。複数個存在する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。
【００３８】
官能基として好ましくは、エステル基、アミド基、エーテル基、チオエーテル基、ジスルフィド基又はアミノ基であり、さらに好ましくはアルケニル基、エステル基、エーテル基である。
【００３９】
ＷがＮＨ2の場合、塩酸、硫酸、硝酸、燐酸、スルホン酸などの塩を形成していてもよい。Ｍで表されるアルカリ金属原子としては、リチウム（Ｌｉ）、ナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）などが挙げられ、Ｘで表されるアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｔ-ブチル基、オクチル基、セチル基など炭素数が
１〜２０、好ましくは１〜１８の鎖状のものが挙げられる。４個のＸは同一でも異なっていてもよい。
【００４０】
一般式IIで表わされる表面修飾剤の具体例としては、メルカプト酢酸、２−メルカプトプロピオン酸、３−メルカプトプロピオン酸、２−メルカプト酪酸、４−メルカプト酪酸、８−メルカプトオクタン酸、１１−メルカプトウンデカン酸、１８−メルカプトステアリン酸、３−メルカプトアクリル酸、メルカプトメタクリル酸、４−メルカプトクロトン酸、１８−メルカプトオレイン酸、チオリンゴ酸、メルカプトプロピオール酸、４−メルカプトフェニルヒドロケイ皮酸、２−メルカプトエチルアミン、２−メルカプトプロピルアミン、３−メルカプトプロピルアミン、３−メルカプト-ｎ-ブチルアミン、４−メルカプト-ｎ-ブチルアミン、２−メルカプト-ｔ-ブチルアミン、８−メルカプトオクチルアミン、１１−メルカプトウンデシルアミン、１８−メルカプトステアリルアミン、１８−メルカプトオレイルアミン、５−アミノペンタノイックアシッド（２−メルカプト−エチル）−アミド、６−アミノヘキサノイックアシッド（２−メルカプト−エチル）−アミド、１１−アミノウンデカノイックアシッド（２−メルカプト−エチル）−アミド、５−アミノペンタノイックアシッド−３−メルカプト−プロピルエステル、１１−アミノーウンデカノイックアシッド−３−メルカプトプロピルエステル、３−（１１−アミノ−ウンデシルオキシ）−プロパン−１−チオール、（２−メルカプトーエチルアミノ）−アセティックアシッド−２−[２−（２−アミノアセトキシ）−エトキシ]−エチルエステルなどが挙げられる。また、アミノ基を有する化合物は、前述のように酸と塩を形成したものでもよい。本発明においてはこれらのものに限定されるものではない。
【００４１】
本発明に用いられる表面修飾剤の中で、分散溶媒が水の場合にはＬの炭素数は１〜５が好ましく、１〜４がより好ましい。また、分散溶媒が有機溶媒の場合にはＬの炭素数は６〜２０が好ましく、６〜１８がより好ましい。また、公知の表面修飾剤（例えば、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン（１）ラウリルエーテルリン酸、ラウリルエーテルリン酸、トリオクチルホスフィン、トリオクチルホスフィンオキシド、ポリリン酸ナトリウム、ビス（２−エチルヘキシル）スルホコハク酸ナトリウムなど）がナノ粒子合成時、あるいは合成後共存していてもよい。なお、一般式Iで表わされる表面修飾剤は金属酸化物、金属硫化物のどちらのナノ粒子蛍光体にも使用できるが、一般式IIで表わされる表面修飾剤は金属硫化物ナノ粒子蛍光体に用いることが好ましい。
【００４２】
本発明における金属酸化物又は金属硫化物のナノ粒子蛍光体は、半値幅が５０〜２００ｎｍの蛍光を発するものであれば特に限定されないが、該金属酸化物又は金属硫化物を構成する金属としては、例えば、Ｚｎなどの１２族、Ｙ、Ｅｕ、Ｔｂなどの３族、Ｇａ、Ｉｎなどの１３族、Ｚｒ、Ｈｆなどの４族、Ｓｉ、Ｇｅなどの１４族、Ｖ、Ｎｂなどの５族、Ｍｏ、Ｗなどの６族などが挙げられる。これらの中で生体にやさしいＺｎが特に好ましい。また、Ｚｎ2ＳｉＯ4、ＣａＳｉＯ3、ＭｇＷＯ4、ＹＶＯ4、Ｙ2ＳｉＯ5などの複合金属酸化物であってもよい。さらにこれらの金属酸化物又は金属硫化物のナノ粒子蛍光体は、構成する金属酸化物又は金属硫化物中の金属とは異なる金属イオンを少量含有せしめることも好ましい。該金属イオンとしてはＭｎ、Ｃｕ、Ｅｕ、Ｔｂ、Ｔｍ、Ｃｅ、Ａｌ、Ａｇなどの金属イオンが挙げられる。これらの金属イオンは、塩化物イオンやフッ化物イオンを組み合わせた化合物としてドープされることも好ましい。ドープする金属イオンは１種類の原子も、複数種類の原子からなるものでもよい。ドープする金属イオンによって発光波長は異なり、例えば硫化亜鉛（ＺｎＳ）にマンガン（Ｍｎ）をドープした場合（以下、「ＺｎＳ：Ｍｎ」と表記する。）はオレンジ色、ユウロピウム（Ｅｕ）の場合は赤色である。該金属イオンの濃度は、ナノ粒子蛍光体を構成する金属および、その種類によって最適量が異なるが、０．００１〜１０原子％の範囲が好ましく、０．０１〜１０原子％の範囲がより好ましい。
【００４３】
本発明の金属酸化物又は金属硫化物のナノ粒子蛍光体は、発光の半値幅が５０〜２００ｎｍであるが、簡易な装置で高感度に発光を検出するためには、６０〜１８０ｎｍであることが好ましい。更に、蛍光標識材料としては、発光ピーク波長と吸収ピーク波長が異なることが必要で、高感度に発光を検出するためには、本発明の金属酸化物又は金属硫化物のナノ粒子蛍光体は、その発光ピーク波長が吸収端波長と２０ｎｍ以上離れていることが好ましく、５０ｎｍ以上離れていることがより好ましい。また、蛍光励起波長域が３００ｎｍ以上、好ましくは３５０ｎｍ以上の近紫外域ないし可視域にあることが生体の損傷を少なくする観点から好ましい。このような発光のピーク波長および半値幅を持つナノ粒子蛍光体は、金属酸化物又は金属硫化物のナノ粒子蛍光体であって、上記のように、構成する金属等を選択することで得ることができる。
【００４４】
本発明の金属酸化物又は金属硫化物のナノ粒子蛍光体は、さらに、本発明に用いられる表面修飾剤との被覆性に優れた金属酸化物のナノ粒子蛍光体が好ましい。
【００４５】
本発明のナノ粒子蛍光体の数平均粒径は、好ましくは０．５〜１００ｎｍであり、より好ましくは０．５〜５０ｎｍであり、さらに好ましくは１〜１０ｎｍである。蛍光体ナノ粒子の粒径分布は、変動係数で好ましくは０〜５０％、より好ましくは０〜２０％、さらに好ましくは０〜１０％である。なお、変動係数は、算術標準偏差を数平均粒径で除し、これを百分率で表した値（算術標準偏差×１００／数平均粒径）を意味する。ナノ粒子蛍光体の粒径はＸＲＤやＴＥＭなどの公知の方法で測定することができる。
【００４６】
（２）ナノ粒子蛍光体およびその分散液の製造方法
本発明の金属酸化物ナノ粒子蛍光体は、該金属のアルコキシド、アセチルアセトナートなどの有機金属化合物を加水分解するゾル−ゲル法、該金属の塩の水溶液にアルカリを加えて水酸化物として沈降させた後、脱水、アニールする水酸化物沈殿法、該金属の上記プレカーサーの溶液を用いて、超音波を照射する超音波分解法、マイクロ波を照射するマイクロ波加熱法、高温高圧下で分解反応を行なうソルボサーマル法、高温下に噴霧するスプレーパイロリシスなどの液相合成法により得ることができる。また、有機金属化合物を用いる熱ＣＶＤ法やプラズマＣＶＤ法、該金属または該金属酸化物のターゲットを用いるスパッタ法やレーザーアブレーション法などの気相合成法によっても得ることができる。
【００４７】
本発明の金属硫化物ナノ粒子蛍光体は、該金属のジエチルジチオカルバメート化合物などの熱分解性金属化合物をトリアルキルホスフィンオキシド類、トリアルキルホスフィン類、ω−アミノアルカン類などの高沸点有機溶媒中で結晶成長させるホットソープ法、該金属の塩の溶液に硫化ナトリウムや硫化アンモニウムなどの硫化物溶液を添加して結晶成長させる共沈法、界面活性剤を含む上記原料水溶液をアルカン類、エーテル類、芳香族炭化水素などの非極性有機溶媒中に逆ミセルとして存在させ該逆ミセル中で結晶成長させる逆ミセル法などの液相合成法により得ることができる。また、前記金属酸化物ナノ粒子蛍光体の場合と同様の気相合成法によっても得ることができる。
【００４８】
本発明に用いられる表面修飾剤は、ナノ粒子蛍光体の合成時に添加することもできるが、好ましくは合成後に添加し、該ナノ粒子蛍光体と結合して、ナノ粒子の表面の少なくとも一部を被覆（表面修飾）させる。一般式Ｉで表される表面修飾剤は、その少なくとも一部が加水分解した状態でナノ粒子蛍光体と結合していてもよい。なお、ナノ粒子蛍光体は遠心分離やろ過などの常法により洗浄、精製後、本発明に用いられる表面修飾剤を含有する溶媒（好ましくはメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、２−エトキシエタノールなどの親水性有機溶媒）に分散させて被覆してもよい。
【００４９】
本発明に用いられる表面修飾剤の添加量は、蛍光体の粒子サイズ、粒子の濃度、表面修飾剤の種類（大きさ、構造）等により変動するが、金属酸化物又は金属硫化物に対し、好ましくは０．００１〜１０倍モル、さらに好ましくは０．０１〜２倍モルである。
【００５０】
本発明においては、一般式Ｉ又はIIで表される表面修飾剤以外に前述のように公知の表面修飾剤を併用することができる。公知の表面修飾剤の添加量は特に制限はないが、好ましくは０．０１〜１００倍モル、さらに好ましくは０．０５〜１０倍モルである。なお、過剰の表面修飾剤はゲルろ過や限外ろ過で除去することができる。
【００５１】
表面修飾剤が結合したナノ粒子蛍光体の分散液において、ナノ粒子の濃度は、蛍光強度によって異なるので特に限定されないが、０．０１ｍＭ〜１０００ｍＭが好ましく、より好ましくは０．１ｍＭ〜１００ｍＭである。分散媒としては、上記アルコール類の他、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＴＨＦなどの親水性有機溶媒や水が好ましい。
【００５２】
なお、ナノ粒子蛍光体の表面が表面修飾剤で被覆されていることは、ＦＥ−ＴＥＭ等の高分解性ＴＥＭで観察した際に粒子間に一定の間隔が認められること、および化学分析により確認することができる。
【００５３】
（３）癌抗原を認識する抗体
本発明のナノ粒子蛍光体においては、表面修飾剤に癌抗原を認識する抗体が結合している。癌抗原としては、癌の診断に適した抗原であればその種類は限定されないが、好ましくは、遊離抗原を使用することができる。癌抗原の具体例としては、上皮増殖因子受容体（Epidermal Growth Factor Receptor；ＥＧＦＲ）、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰｇＲ）などが挙げられ、特に好ましくは、ＥＧＦＲである。
【００５４】
上記した癌抗原を認識する抗体は当業者であれば容易に入手可能であり、例えば、市販品を使用してもよいし、又は上記抗原又はその部分ペプチドを免疫原として公知の抗体作製法により適宜作製して使用することもできる。また、使用する抗体はモノクローナル抗体でもよいし、ポリクローナル抗体でもよい。
【００５５】
表面修飾剤で被覆されたナノ粒子蛍光体は、その表面修飾剤の末端基であるアミノ基やカルボキシル基などを反応基とし、アミド化反応によるペプチド結合の形成などにより、癌抗原を認識する抗体と結合させることができる。
【００５６】
アミド化反応は、カルボキシル基またはその誘導基（エステル、酸無水物、酸ハロゲン化物など）とアミノ基の縮合により行なわれる。酸無水物や酸ハロゲン化物を用いる場合には塩基を共存させることが望ましい。カルボン酸のメチルエステルやエチルエステルなどのエステルを用いる場合には、生成するアルコールを除去するために加熱や減圧を行なうことが望ましい。カルボキシル基を直接アミド化する場合には、ＤＣＣ、Ｍｏｒｐｈｏ−ＣＤＩ、ＷＳＣなどのアミド化試薬、ＨＢＴなどの縮合添加剤、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ｐ−ニトロフェニルトリフルオロアセテート、２，４，５−トリクロロフェノールなどの活性エステル剤などのアミド化反応を促進する物質を共存させたり、予め反応させておいてもよい。また、アミド化反応時、アミド化により結合させる親和性分子のアミノ基又はカルボキシル基のいずれかを常法にしたがって適当な保護基で保護し、反応後脱保護することが望ましい。
【００５７】
アミド化反応により癌抗原を認識する抗体を結合したナノ粒子蛍光体は、ゲルろ過などの常法により洗浄、精製後、水及び／又は親水性溶媒（好ましくはメタノール、エタノール、イソプロパノール、２−エトキシエタノールなど）に分散させて使用することができる。この分散液中のナノ粒子蛍光体の濃度は、蛍光強度によって異なるので特に限定されないが、１０-1Ｍ〜１０-10Ｍが好ましく、より好ましくは１０-2Ｍ〜１０-6Ｍである。
【００５８】
（４）癌の診断
表面修飾剤に癌抗原を認識する抗体が結合していることを特徴とする本発明のナノ粒子蛍光体は、癌の診断に用いることができる。即ち、本発明のナノ粒子蛍光体は、癌検出試薬として使用することができる。
【００５９】
本発明において検出の対象となる癌の種類は、ナノ粒子蛍光体に結合している抗体が認識する癌抗原を発現している癌であればよく、その種類は特には限定されない。癌の具体例としては、悪性黒色腫、悪性リンパ腫、消化器癌、肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、尿管腫瘍、胆嚢癌、胆管癌、胆道癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、睾丸腫瘍、上顎癌、舌癌、口唇癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、甲状腺癌、脳腫瘍、カポジ肉腫、血管腫、白血病、真性多血症、神経芽腫、網膜芽腫、骨髄腫、膀胱腫、肉腫、骨肉腫、筋肉腫、皮膚癌、基底細胞癌、皮膚付属器癌、皮膚転移癌、皮膚黒色腫などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６０】
本発明はさらに、本発明のナノ粒子蛍光体又は癌検出試薬を用いて癌細胞を検出する方法に関する。癌細胞の検出は、本発明のナノ粒子蛍光体を含む分散液を検体と接触させることにより該ナノ粒子蛍光体を癌細胞と結合させ、過剰の該ナノ粒子蛍光体を洗浄除去し、次いで、励起光を検体に照射して癌細胞と結合したナノ粒子蛍光体の発光を観察することによって行うことができる。
【００６１】
具体的には、癌細胞を含む検体に、例えば１．０×１０-9mol/L以上、一般的には１．０×１０-9mol/L〜１．０×１０-3mol/l程度の濃度になるように癌抗原を認識する抗体が結合している本発明のナノ粒子蛍光体を添加し、細胞を培養する。細胞を洗浄後、常法により固定し、顕微鏡観察を行う。顕微鏡としては、落射蛍光顕微鏡を用いることができる。例えば、酸化亜鉛ナノ粒子に基づく蛍光(λmax 540nm)は、光源：超高圧水銀ランプ、励起フィルター：330-385、励起波長：365/366、吸収フィルター：420、ミラーフィルター：400、NDフィルター：なし、といった条件で測定することができる。
【００６２】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００６３】
実施例１
（ZnOナノ粒子蛍光体分散液の調製）
酢酸亜鉛２水和物８．８ｇを脱水エタノール４００ｍｌに溶解し、９３℃で２時間還流しながら２４０ｍｌを留去した。脱水エタノール２４０ｍｌを加えて室温まで冷却した。水酸化テトラメチルアンモニウムの２５質量％メタノール溶液１８ｍｌを添加し３０分攪拌した。３−アミノプロピルトリメトキシシラン７．２ｍｌおよび水２．２ｍｌを添加して６０℃で４時間攪拌した。生成した白色沈殿を濾別し、エタノールで洗浄後乾燥した。
沈殿物はＸＲＤ、ＴＥＭ、元素分析、ＩＲ分光吸収測定法の解析から平均粒子径約８ｎｍで、表面にＳｉおよびアミノプロピル基が結合したＺｎＯナノ粒子であることがわかった。沈殿物に水を添加して２質量％水分散液を調製した。この分散液に３７０ｎｍの光を照射したときの蛍光スペクトルは、ピーク波長５４０ｎｍ、半値幅１６０ｎｍのブロードで強い蛍光を示すことがわかった。
【００６４】
（ZnOナノ粒子と抗EGFR抗体の連結）
通常のヒンジ法（「酵素免疫測定法第３版」；石川栄治等編、医学書院）により酸化亜鉛ナノ粒子への抗体Fab'の導入を行った。
平均直径3nmの酸化亜鉛粒子表面をアミノプロピルシランで被覆したナノ粒子（約8nm)を、濃度14mg/mlで0.1Ｍ HEPES(pH8.0)緩衝液に分散する。ナノ粒子分散液1mlにSulfo−GMBS(同仁化学）0.6mgを添加し室温で1時間反応させ、PD-10カラム（ファルマシアバイオサイエンス）で精製しマレイミド化酸化亜鉛ナノ粒子溶液を得る。
抗EGFRモノクローナル抗体（Sigma社製）からペプシン処理、メルカプトエチルアミン還元により精製したFab’分画を、0.1M HEPES(pH7.4)緩衝液に溶解し濃度を1mg/mlとする。マレイミド化酸化亜鉛ナノ粒子溶液（1mg/ml 0.1M HEPES(pH7.4))と等容量混合し、4℃で一晩攪拌した後SephadexG100(pH7.4  0.1M HEPES緩衝液で溶離）でゲルろ過により精製、抗体連結酸化亜鉛ナノ粒子を得た。
【００６５】
実施例２
（ZnS:Mnナノ粒子蛍光体分散液の調製）
酢酸亜鉛２水和物１５ｇ及び酢酸マンガン４水和物０．５ｇを水６０ｍｌに溶解して溶液１を調製した。また、硫化ナトリウム９水和物１２．４ｇを水６０ｍｌに溶解して溶液２を調製した。３００ｍｌビーカーに水８０ｍｌを入れ強く攪拌しながらこの中に上記溶液１及び溶液２を同時に１０ｍｌ／分の速度で添加した。白い沈殿を生成したが、３０２ｎｍの紫外光を照射すると強いオレンジの蛍光を示した。この中に２−メルカプトプロピオン酸を２０ｇ添加し３０分攪拌した。その後、静置して上澄み液を０．２μｍのフィルターでろ過した。ろ液に３３０ｎｍの紫外光を照射すると強いオレンジの蛍光を示した。ろ液を分画１００００のフィルターを用いて限外ろ過し、さらに水を加えて洗浄・限外ろ過を繰り返すことにより、塩と過剰の２−メルカプトプロピオン酸を除去してZnS:Mnコロイド分散液を精製した。このコロイド分散液を０．２μｍのフィルターでろ過し、励起波長３２６ｎｍでろ液の蛍光スペクトルを測定した。５８０ｎｍ付近に極大を有する半値幅６５ｎｍのオレンジ色の発光を観測した。ろ液中のナノ粒子濃度は１６ｍＭであった。生成したZnS:Mnの平均結晶子サイズはＸＲＤ測定より２．８ｎｍであった。
【００６６】
（硫化亜鉛ナノ粒子と抗EGFR抗体の連結）
硫化亜鉛ナノ粒子表面のカルボン酸と抗体のアミノ基をアミドで連結し、抗EGFR抗体連結硫化亜鉛ナノ粒子を合成した。平均直径2.8nmの硫化亜鉛粒子表面を3-メルカプトプロピオン酸で被覆したナノ粒子を、濃度１mg/mlで0.1Ｍ MES(pH6.0)緩衝液に分散する。ナノ粒子分散液200μLに水溶性カルボジイミド(同仁化学)0.2mg、ヒドロキシスクシンイミド0.2mgを添加、これに抗EGFRモノクローナル抗体（Sigma社製）の0.1Ｍ MES(pH6.0)緩衝液(1mg/ml)200μLを加えて4℃で一晩攪拌した。SephadexG100(pH7.4 0.1M HEPES緩衝液で溶離)でゲルろ過により精製、抗体連結硫化亜鉛ナノ粒子を得た。
【００６７】
実施例３．セルラインの培養と顕微鏡観察
ヒト口部類表皮癌細胞（KB細胞）の培養口部類表皮癌から誘導されたKB腫瘍セルラインはAmerican Type Tissue Culture Collectionから入手した。KB細胞  、10％ウシ胎児血清を補なつたDulbeccoの修飾Eagle培地中で37℃、５％ CＯ2雰囲気下72時間で培養した。
【００６８】
ＫＢ  0.4×10-4個/mlを1mlカルチャー・スライド(FALCON No.354112)に播種し、37℃、5％CO2で72時間培養。これに、培地中の濃度が2.0x10-6mol/lとなるように抗体連結酸化亜鉛ナノ粒子を添加し、37℃、5％CO2で24時間培養した。生理食塩水で3回洗浄し、10％ホルマリン溶液で15分間室温固定した。流水で洗浄の後風乾し顕微鏡観察を行った。
落射蛍光顕微鏡（オリンパス  IX71）を用い以下の条件で観察した結果、KB細胞の表面に集積した酸化亜鉛ナノ粒子に基づく蛍光(λmax 540nm)を観察することが出来た。(図１の（１））
【００６９】
光源：超高圧水銀ランプ、励起フィルター：330-385、励起波長：365/366、吸収フィルター：420、ミラーフィルター：400、NDフィルター：なし
【００７０】
また、正常細胞の例としてCHL細胞（チャイニーズ・ハムスター培養細胞）を用いた。CHL/IU（大日本製薬）をEMEM＋10％BSA培地を用い35mmシャーレで37℃、72時間培養する。次いで、CHL/IU 0.4x10-4個/mlを1mlカルチャー・スライド(FALCON No.354112)に播種し、37℃、5％CO2で72時間培養後、KB細胞と同様の条件で固定化処理を行い蛍光顕微鏡観察を行った。（図１の（２））
【００７１】
KB細胞表面は蛍光が明確に観察されるのに対し、CHLの場合はほとんど観察されず、癌細胞に高発現しているEGFRの表面密度差を反映しているものと考えられる。
【００７２】
実施例４．セルラインの培養と顕微鏡観察
同様に、抗体連結硫化亜鉛ナノ粒子を用い、KB細胞とCHL/IUを蛍光顕微鏡で観察した。その結果、実施例３と同様に硫化亜鉛ナノ粒子に基づく蛍光（λmax 580nm）は、KB細胞表面（図２の（１））では明瞭に観察されたが、CHL/IU細胞（図２の（２））では微弱な蛍光が観察されたのみであった。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】抗体連結酸化亜鉛ナノ粒子を添加して培養したKB細胞とCHL/IU細胞を蛍光顕微鏡で観察した結果を示す。
【図２】抗体連結硫化亜鉛ナノ粒子を添加して培養したKB細胞とCHL/IU細胞を蛍光顕微鏡で観察した結果を示す。
【図１】
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【図２】
2007023058.tif 000003