(57)【要約】【課題】生体適合性および生分解性を有し、石灰化なしに自己組織化および成長を許容する、生体由来の再生医療用スキャフォールの作製方法を提供する。【解決手段】（ａ）生体軟組織をグルタルアルデヒドで部分的に架橋固定するステップ、および（ｂ）部分的に架橋固定化した組織をエラスターゼと共にインキュベートするステップ、を含む、移植用スキャフォールドの作製方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）生体軟組織をグルタルアルデヒドで部分的に架橋固定するステップ、および
（ｂ）部分的に架橋固定化した組織をエラスターゼと共にインキュベートするステップ、
を含む、移植用スキャフォールドの作製方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）は、組織を０．１％またはそれ未満のグルタルアルデヒド水溶液中に５時間以下の期間浸漬することによって実施される請求項１の方法。
【請求項３】
グルタルアルデヒド濃度が０．１％であり、浸漬時間が常温において１時間である請求項２の方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）は、緩衝液中エラスターゼの至適ｐＨにおいて行われる請求項１ないし３のいずれかの方法。
【請求項５】
緩衝液が７．５ないし８．５のｐＨを有するトリス緩衝液である請求項４の方法。
【請求項６】
ステップ（ｂ）の後、組織を洗浄するステップをさらに含んでいる請求項１ないし５のいずれかの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再生医療技術の分野、詳しくは哺乳動物の軟組織から生物由来のスキャフォールドの作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
患者の欠損した器官を再生するため、人工デバイスによる置換、人工または生物由来のスキャフォールドを移植して自己組織化等により、失われた機能を回復させる医療が行われている。例えば、現在我国では、年間１万件を超える心臓弁置換術が行われているが、その約７割は機械弁による置換である。残りの３割はウシ、ブタ等の組織をグルタルアルデヒドで固定化した異種生体弁の移植である。機械弁置換後は継続して抗血栓剤の投与が不可欠であり、患者のクオーリティ・オブ・ライフを損ねる問題がある。移植した異種生体弁は石灰化などによって１５年程度の耐久性しかなく、若年者では再度の移植を必要とする。
【０００３】
グルタルアルデヒドで固定化した異種生体血管による血管置換術では、心臓弁置換術と同様に石灰化などによる耐久性の問題に加えて、生体組織の本来の機械的性質（強度および弾力性）が失われる問題がある。生分解性ポリマー、例えばポリ乳酸を用いた人工血管の移植は小児患者の静脈系で臨床応用されているが、狭窄等の問題も報告されており、また生分解は単純な加水分解によるため動脈系では破断のおそれがある。
【０００４】
生体組織から酵素や界面活性剤を用いて細胞を取り去り、細胞外マトリックスを残し、移植用スキャフォールドを作製する方法も知られている。このスキャフォールドは、そのままでは例えば比較的高圧力に耐える必要のある左心系の大動脈弁では破断に耐えられる強度が不足しており、グルタルアルデヒド架橋等の安定化処理が不可欠である。しかしながらグルタルアルデヒドによる固定化はコラーゲンを主体とするマトリックスの生分解性を消失させ、移植後体内で分解されずに残るので細胞の浸潤が殆んど見られず、自己組織の再生を目的とする再生医療には適さない。
【０００５】
特公昭５４−４３８３３号公報には、ブタ血管をキモトリプリンで消化処理し、次いで得られる消化血管をグルタルアルデヒドなどで固定することよりなる異種代用血管の製法が開示されている。しかしながらこの代用血管は血液透析を受けている患者の血管へのアクセスを提供する動脈−静脈シャントとして移植することを意図しているので、細胞の浸潤による自己組織化は必須条件ではない。
【０００６】
従って、宿主に拒絶反応を誘発しないことおよび抗血栓性であることを含む生体適合性を有し、終局的には体内で分解されるが自己組織化されるまでの耐久性を有し、細胞の浸潤を妨げる石灰化なしに自己組織化および成長を許容する、生物由来のスキャフォールドの提供が望まれる。
【発明の開示】
【０００７】
上記の課題は、
（ａ）生態軟組織をグルタルアルデヒドで部分的に架橋固定化するステップ、および
（ｂ）部分的に架橋固定化した組織をエラスターゼと共にインキュベートし、選択的にエラスチンを除去するステップを含む、本発明の移植用スキャフォールドの作製方法によって達成される。
【０００８】
本発明は、生体組織の構造タンパク成分であるエラスチンが石灰化に関与しているとの研究報告を基礎にしている。しかしながら組織からエラスチンを除去しただけでは他の要件特に満足な機械的強度を保つためには不充分であるため、部分的なグルタルアルデヒド固定化を併用する。
【０００９】
一般にグルタルアルデヒドの固定化は、組織がそれ以上グルタルアルデヒド
と反応しなくなるまでグルタルアルデヒド水溶液中に浸漬して行われる。このようにグルタルアルデヒドと完全に反応させた組織内の構造タンパクは不溶性に変性し、生分解性でもなくタンパク分解酵素の基質にもならない。しかしながら構造タンパクに含まれるグルタルアルデヒドと反応し得る官能基の多くを未反応のまま残して反応を停止することにより、組織を部分的に架橋することができる。
【００１０】
エラスチンは高等動物の結合組織、大動脈外皮などを構成する硬タンパクであり、それを構成するアミノ酸の大部分は電荷を持たない非芳香族アミノ酸である。グルタルアルデヒドは主としてリジン残基と反応し、分子間および分子内でタンパク分子を架橋するので、リジン残基を持たないエラスチンにはグルタルアルデヒドが作用しない。そのため酵素の基質特異性を利用してグルタルアルデヒドによって部分架橋された組織から、エラスターゼを作用させてエラスチンを選択的に除去することができる。
【００１１】
グルタルアルデヒドによる架橋の程度は温度が一定の場合グルタルアルデヒドの濃度と反応時間の関数である。哺乳動物組織からスキャフォールドを作製する方法に関する米国特許第４，３７８，２２４号は、最初約０．０５％ないし約０．４ｗｔ％、好ましくは約０．１５ｗｔ％のグルタルアルデヒドで約１２時間ないし約６４時間処理し、次にジアミンとカルボジイミドによりカルボキシル基間の架橋を行うことを開示している。本発明者らの研究によれば、ステップ（ａ）のグルタルアルデヒドによる部分架橋は０．１％グルタルアルデヒド水溶液中に約１時間常温で浸漬するのが最適であることがわかった。しかしながら上で述べたように、架橋の程度はグルタルアルデヒドと浸漬時間の関数であるから、０．１％より高濃度のグルタルアルデヒド水溶液を使用し、１時間より短時間浸漬するか、または０．１％より低濃度で１時間より長い時間浸漬することによっても匹敵する部分架橋を達成することが可能であろう。
【００１２】
部分架橋した組織からのエラスターゼによるエラスチンの選択的除去は、緩衝液中エラスターゼの至適ｐＨにおいて実施される。我々はｐＨ８．０のトリスバッファー中３７℃でインキュベーションを行って満足な結果を得た。勿論トリス以外の緩衝液を用いて特定のエラスターゼ供給者の推奨するｐＨ範囲例えばｐＨ７．５ないし８．５の範囲で実施することも本発明の範囲内である。酵素濃度は一般に３００ないし１０００Ｕ／Ｌ、好ましくは６００Ｕ／Ｌが適当であり、インキュベーション時間は３７℃において１日ないし１週間、好ましくは２ないし７日である。
【００１３】
エラスターゼ処理が終った組織は、純水、生理食塩水、緩衝液などを用いてリンスし、移植に使用されるまでＰＢＳその他の保存液中で保存される。
【実施例】
【００１４】
以下の実験は、（株）ジャパンファームから購入したブタ大動脈を用い、条件を変えてグルタルアルデヒド（ＧＡと略す。）で処理し、処理後の組織をエラスターゼ（３．８５Ｕ／ｍｇ、フナコシ）１５０ｍｇ／Ｌ（５７７．５Ｕ／Ｌ）を添加した０．０１Ｍトリスバッファー（ｐＨ８．０）中で３７℃４日間の一定条件でインキュベートした。なお％は重量基準による。
【００１５】
実施例１
ＧＡ未処理、０．０１％ＧＡ，０．１％ＧＡ，１％ＧＡおよび２５％ＧＡに常温でそれぞれ１時間浸漬し、上の一定条件でエラスチンを分解処理した。図１の下列は輪切したブタ大動脈の外観を示し、上列はヘマトキシリン−エオジン染色した後の組織の拡大光学顕微鏡写真である。見られるように、ＧＡ未処理およびＧＡ０．０１％処理のものはエラスチンの酵素分解除去により組織が過度に弛緩し、原形を保っていないが、１％および２５％ＧＡ処理したものはＧＡがエラスチンにも作用し、酵素分解後も組織内にエラスチンが残留している様子が観察された。０．１％ＧＡでは組織の原形が保たれたまま、エラスチンがほぼ完全に除去され、ドナー由来細胞の脱核も観察される。
【００１６】
実施例２
実施例１と同様に、ＧＡ無処理，０．１％ＧＡ，１％ＧＡおよび１０％ＧＡ処理後エラスターゼ処理したブタ大動脈のヘマトキシリン−エオジン染色した組織を異なる倍率で光学顕微鏡写真撮影した。結果を図２に示す。見られるようにＧＡ未処理のものは過度の弛緩が認められ、ＧＡ１％および１０％の処理では暗色のヒモ状部分として見えるエラスチンおよびドナー由来細胞核の残留が多く認められる。
【００１７】
実施例３
実施例２と同じ条件で処理したブタ大動脈組織をエラスチカ・ワンギーソン染色法により染色し、拡大光学顕微鏡写真撮影した。結果を図３に示す。この染色法はエラスチン線維を黒紫色に、コラーゼン線維を赤色に染め分ける染色法である。モノクロム写真ではエラスチン線維がより濃暗色に写るので、見られるようにＧＡ濃度が高くなるにつれ、エラスチン線維が多く残留することが見られる。
【００１８】
ＧＡによる部分固定化、次いでエラスターゼによるエラスチンの酵素分解処理を受けた組織が生体内で分解可能であることを確認するため、実施例２の０．１％ＧＡ処理後エラスターゼ処理した組織をコラゲナーゼ（２２８Ｕ／ｍｇ，和光純薬）のトリスバッファー溶液に浸漬処理し、分解溶液を分光学的に分析したところ、２８０ｎｍ付近に芳香族アミノ酸に起因する吸収が観察され、本発明方法によって作製されたスキャフォールドは生分解性であることが推察された。
【００１９】
以上の実験の結果、ＧＡによる適度の部分固定化、次いでエラスターゼによるエラスチンの酵素分解は、処理すべき生体組織の物理的形状を保持しつつ柔軟性を有し、細胞の浸潤を助ける多孔質構造の再生医療用スキャフォールドの作製に利用できることが確かめられた。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】未処理および濃度を変えてＧＡ水溶液で部分的に固定化処理し、次いでエラスターゼでエラスチンを酵素分解したブタ大動脈の外観および組織の写真。
【図２】未処理および濃度を変えてＧＡ水溶液で部分的に固定化処理し、次いでエラスターゼでエラスチンを酵素分解したブタ大動脈の組織をヘマトキリシン−エオジン染色した後の拡大光学顕微鏡写真。
【図３】未処理および濃度を変えてＧＡ水溶液で部分的に固定化処理し、次いでエラスターゼでエラスチンを酵素分解し、エラスチカ・ワンギーソン法により染色したブタ大動脈組織の拡大光学顕微鏡写真。
【図１】
2007105265.tif 000002
【図２】
2007105265.tif 000003
【図３】
2007105265.tif 000004