(57)【要約】【課題】  ボケを含まない良質の合焦カラー画像を短い時間で効率よく生成できる共焦点顕微鏡及び合焦カラー画像の生成方法を提供する。【解決手段】  共焦点光学系により対物レンズ５の集光位置と試料６との相対位置を変えながら共焦点画像を取得し、これら共焦点画像に基づいて試料６の各点の画素位置ごとに合焦位置の高さ情報を求め、次いで、非共焦点光学系により対物レンズ５の集光位置と試料６との相対位置を変えながらカラー画像を撮像するとともに、これら撮像されたカラー画像の前記試料６の各点の画素位置に対し、該画素位置に対応する高さ情報に基づいて合焦判定を行い、この判定結果から合焦カラー画像を取得し、さらにこれら合焦カラー画像と前記高さ情報を合成して試料６の三次元合焦カラー画像を生成する。【選択図】      図１
2007102102.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料の合焦カラー画像を取得可能とした共焦点顕微鏡に適用される合焦カラー画像生成方法であって、
対物レンズの集光位置と前記試料との相対位置を変えて共焦点画像を取得し、これら共焦点画像に基づいて前記試料の各点の画素位置ごとに合焦位置の高さ情報を求める第１のステップと、
前記対物レンズの集光位置と前記試料との相対位置を変えてカラー画像を撮像する第２のステップと、
前記第２のステップにより撮像されたカラー画像の前記試料の各点の画素位置に対し、該画素位置に対応する前記高さ情報に基づいて合焦判定を行い、この判定結果から合焦カラー画像を取得する第３のステップと、
前記第３のステップにより取得された合焦カラー画像と前記高さ情報を用いて前記試料の三次元カラー画像を生成する第４のステップと、
を具備したことを特徴とする共焦点顕微鏡における合焦カラー画像生成方法。
【請求項２】
前記第３のステップは、前記試料の各点の画素位置について、該画素位置の高さ情報と前記第１のステップで求められた前記画素位置に対応する前記高さ情報に基づいて前記合焦判定の開始を決定することを特徴とする請求項１に記載の合焦カラー画像の生成方法。
【請求項３】
前記第３のステップは、前記試料の各点の画素位置について、前記第1のステップで求められた前記画素位置に対応する高さ情報に基づいて、前記第２のステップで撮像したカラー画像のうち、前記第３のステップの合焦判定に使用する範囲を決定し、該範囲内の複数のカラー画像について合焦判定対象領域を指定するとともに、これら合焦判定対象領域に対して合焦判定を行うことを特徴とする請求項１に配載の合焦カラー画像の生成方法。
【請求項４】
前記第３のステップの合焦判定は、複数の合焦判定対象領域に対してそれぞれ合焦評価値を求め、該合焦評価値の中で値が最大となる合焦判定対象領域の注目画素を合焦位置と判断することを特徴とする請求項３に記載の合焦カラー画像の生成方法。
【請求項５】
光源からの光を試料上に集光する対物レンズと前記試料との相対位置を変えて共焦点画像を取得する共焦点画像取得手段と、
前記複数の共焦点画像に基づいて前記試料の各点の画素位置ごとに合焦位置の高さ情報を求める高さ情報取得手段と、
前記対物レンズの集光位置と前記試料との相対位置を変えてカラー画像を撮像するカラー画像取得手段と、
前記カラー画像取得手段により撮像されたカラー画像の前記試料の各点の画素位置に対し、該画素位置に対応する前記高さ情報に基づいて合焦判定を行い、この判定結果から合焦カラー画像を取得する合焦カラー画像取得手段と、
前記合焦カラー画像取得手段で取得された合焦カラー画像と前記高さ情報を合成して前記試料の三次元カラー画像を生成する三次元カラー画像生成手扱と
を具備したことを特撒とする共焦点顕微鏡。
【請求項６】
前記合焦カラー画像取得手段は、前記試料の各点の画素位置について、該画素位置の高さ情報と、前記高さ情報取得手段で求められた前記画素位置に対応する高さ惰報に基づいて前記合焦判定の開始を決定する合焦判定開始決定手段を有することを特徴とする請求項５に記載の共焦点顕微鏡。
【請求項７】
前記合焦カラー画像取得手段は、前記試料の各点の画素位置について、前記高さ情報取得手段で求められた前記画素位置に対応する高さ情報に基づいて、前記カラー画像取得手段で撮像したカラー画像のうち、前記合焦判定に使用する範囲を決定し、該範囲内の複数のカラー画像について合焦判定対象領域を指定するとともに、これら合焦判定対象領域に対して合焦判定を行う合焦判定手段を有することを特徴とする請求項５に記載の共焦点顕微鏡。
【請求項８】
前記合焦判定手段は、複数の合焦判定対象領域に対してそれぞれ合焦評価値を求め、該合焦評価値の中で値が量大となる合焦判定対象領域の注目画素を合焦位置と判断することを特徴とする請求項７に記載の共焦点顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料の合焦カラー画像を取得可能な共焦点顕微鏡及び該共焦点顕微鏡における合焦カラー画像の生成方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、共焦点顕微鏡として、点光源からの光を対物レンズにより標本上に集光させ、その集光点をスキャナを用いて光学的に二次元走査し、標本からの光を対物レンズを通して光検出器で検出することで二次元の画像情報を得るようにした共焦点走査型顕微鏡が知られている。
【０００３】
図７は、このような共焦点走査型顕微鏡の一例の概略構成を示すもので、光源１０１から出射した光束は、ビームスプリッタ１０２を透過した後、ミラー１０５を介して二次元走査機構１０３に入射する。二次元走査機構１０３は、光束を二次元的に走査して出力する。二次元的に走査された光束は、複数のレンズ１０４を介して対物レンズ１０６に導かれる。対物レンズ１０６へ入射した光束は、収束光になって射出し、試料１０７の面上を走査する。試料１０７の表面で反射した光は、再び対物レンズ１０６から二次元走査機構１０３、ミラー１０５を介してビームスプリッタ１０２に導入され、このビームスプリッタ１０２で反射し結像レンズ１０８によってピンホール１０９上に集光する。この場合、対物レンズ１０６による集光位置は、ピンホール１０９と光学的に共役な位置にあるため、試料１０７面上に焦点が合っている試料１０７面からの光はピンホール１０９を通過し、焦点ずれがある試料１０７面からの光はピンホール１０９をほとんど通過しない。これにより、ピンホール１０９を通過した光だけが光検出器１１０によって検出され、この検出光の強度に応じた信号がコンピュータ１１１に出力される。この場合、試料１０７は、Ｚ軸方向に移動可能なＺステージ１１２上に載置されており、このＺステージ１１２によって光軸方向(Ｚ方向)に移動可能となっている。また、二次元走査機構１０３、Ｚステージ１１２及び光検出器１１０は、コンピュータ１１１によって制御されている。
【０００４】
これにより、二次元走査機構１０３によって試料１０７面上の集光点を二次元走査し、光検出器１１０からの出力を二次元走査機構１０３による走査に同期して画像化すれば、試料１０７のある特定の高さのみが画像化され、試料１０７を光学的にスライスした画像(共焦点画像)が得られる。また、この状態から、Ｚステージ１１２により試料１０７を光軸方向(Ｚ方向)に移動させ、各位置において二次元走査機構１０３によって走査して共焦点画像を取得し、試料１０７面上の各点で光検出器１１０の出力が最大になるＺステージ１１２の位置を検出することにより試料１０７の高さ情報も得られる。このようにして得られた試料１０７の表面形状は、色情報が含まれない三次元画像として表示される。
【０００５】
ところで、試料を詳細に観察するには、試料の色情報も重要であることが知られている。このため、従来、試料の色情報も取得可能にした共焦点走査型顕微鏡が考えられている。例えば、特許文献１には、レーザ光により二次元画像を取得する共焦点光学系と白色光により二次元画像を取得する非共焦点光学系を備え、レーザ光を用いて共焦点光学系の受光素子から得られる輝度情報と、白色光を用いて非共焦点光学系の撮像素子(ＣＣＤ)から得られる色情報とからカラー共焦点画像を作成するものが開示されている。
【０００６】
しかしながら、特許文献１のものは、二次元画像を取得する試料１０７上のすべての高さ位置において、レーザ光を駆動するレーザ駆動回路と撮像素子(ＣＣＤ)を駆動するＣＣＤ駆動回路とを交互に駆動し、しかも各高さ位置での撮像素子(ＣＣＤ)による撮像の度にレーザ駆動を停止させるか、またはシャッタ等の遮光手段によりレーザ光を遮光する必要がある。このため光軸方向の撮像枚数が多くなるとともに、撮像動作が煩雑になるという問題を生じる。また、取得されるカラー画像は、各画素ごとに、共焦点光学系からの輝度情報を取得した位置の非共焦点光学系からの色惰報を用いて作成されているが、これら共焦点光学系と非共焦点光学系の色収差の違いによりピントが合う位置がずれている可能性がある。特に、レンズ倍率が高い場合、焦点深度が小さくなるため、各光学系のピントずれの結果に対する影響が無視できないものとなる。そのため、特許文献１の方法により生成されたカラー画像には、ボケが含まれる可能性が生じるという問題がある。
【０００７】
そこで、特許文献２に開示されるように、共焦点光学系により複数のステージ位置における共焦点画像信号を取得した後、ＣＣＤカメラを用いて複数のステージ位置におけるカラー画像データを取得し、これら共焦点画像信号とカラー画像データを用いて着色された三次元画像を生成するものが提案されている。また、特許文献２には、ＣＣＤカメラによる撮像を共焦点画像取得の高さ間隔より広い間隔で行い、撮像枚数を少なくする試みが提案されている。
【特許文献１】特開平１１−１４９０７号公報
【特許文献２】特開２００４-２９５３７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ところが、このような特許文献２のものは、ＣＣＤカメラの撮像で取得したすべてのカラー画像データに基づいて、各画素についてカラーデータが最大となるようなカラー情報を作成しているため、例えば、輝度飽和しているような位置について、カラーデータが最大となり、ピントが合った位置と判断する可能性がある。このようにカラーデータが最大になる位置は、必ずピントが合う位置とは言えないにも関わらず、ピントが合う位置と誤判断されることがあり、このため、このような方法を用いてもボケが含まれピントの合ったカラー画像を取得するのが難しいという問題があった。
【０００９】
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、ボケを含まない良質の合焦カラー画像を短い時間で効率よく生成できる共焦点顕微鏡及び合焦カラー画像の生成方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
請求項１記載の発明は、試料の合焦カラー画像を取得可能とした共焦点顕微鏡に適用される合焦カラー画像生成方法であって、対物レンズの集光位置と前記試料との相対位置を変えて共焦点画像を取得し、これら共焦点画像に基づいて前記試料の各点の画素位置ごとに合焦位置の高さ情報を求める第１のステップと、前記対物レンズの集光位置と前記試料との相対位置を変えてカラー画像を撮像する第２のステップと、前記第２のステップにより撮像されたカラー画像の前記試料の各点の画素位置に対し、該画素位置に対応する前記高さ情報に基づいて合焦判定を行い、この判定結果から合焦カラー画像を取得する第３のステップと、前記第３のステップにより取得された合焦カラー画像と前記高さ情報を用いて前記試料の三次元カラー画像を生成する第４のステップと、を具備したことを特徴としている。
【００１１】
請求項２記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記第３のステップは、前記試料の各点の画素位置について、該画素位置の高さ情報と前記第１のステップで求められた前記画素位置に対応する前記高さ情報に基づいて前記合焦判定の開始を決定することを特徴としている。
【００１２】
請求項３記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記第３のステップは、前記試料の各点の画素位置について、前記第1のステップで求められた前記画素位置に対応する高さ情報に基づいて、前記第２のステップで撮像したカラー画像のうち、前記第３のステップの合焦判定に使用する範囲を決定し、該範囲内の複数のカラー画像について合焦判定対象領域を指定するとともに、これら合焦判定対象領域に対して合焦判定を行うことを特徴としている。
【００１３】
請求項４記載の発明は、請求項３記載の発明において、前記第３のステップの合焦判定は、複数の合焦判定対象領域に対してそれぞれ合焦評価値を求め、該合焦評価値の中で値が最大となる合焦判定対象領域の注目画素を合焦位置と判断することを特徴としている。
【００１４】
請求項５記載の発明は、光源からの光を試料上に集光する対物レンズと前記試料との相対位置を変えて共焦点画像を取得する共焦点画像取得手段と、前記複数の共焦点画像に基づいて前記試料の各点の画素位置ごとに合焦位置の高さ情報を求める高さ情報取得手段と、
前記対物レンズの集光位置と前記試料との相対位置を変えてカラー画像を撮像するカラー画像取得手段と、前記カラー画像取得手段により撮像されたカラー画像の前記試料の各点の画素位置に対し、該画素位置に対応する前記高さ情報に基づいて合焦判定を行い、この判定結果から合焦カラー画像を取得する合焦カラー画像取得手段と、前記合焦カラー画像取得手段で取得された合焦カラー画像と前記高さ情報を合成して前記試料の三次元カラー画像を生成する三次元カラー画像生成手扱とを具備したことを特撒としている。
【００１５】
請求項６記載の発明は、請求項５記載の発明において、前記合焦カラー画像取得手段は、前記試料の各点の画素位置について、該画素位置の高さ情報と、前記高さ情報取得手段で求められた前記画素位置に対応する高さ惰報に基づいて前記合焦判定の開始を決定する合焦判定開始決定手段を有することを特徴としている。
【００１６】
請求項７記載の発明は、請求項５記載の発明において、前記合焦カラー画像取得手段は、前記試料の各点の画素位置について、前記高さ情報取得手段で求められた前記画素位置に対応する高さ情報に基づいて、前記カラー画像取得手段で撮像したカラー画像のうち、前記合焦判定に使用する範囲を決定し、該範囲内の複数のカラー画像について合焦判定対象領域を指定するとともに、これら合焦判定対象領域に対して合焦判定を行う合焦判定手段を有することを特徴としている。
【００１７】
請求項８記載の発明は、請求項７記載の発明において、前記合焦判定手段は、複数の合焦判定対象領域に対してそれぞれ合焦評価値を求め、該合焦評価値の中で値が量大となる合焦判定対象領域の注目画素を合焦位置と判断することを特徴としている。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、ボケを含まない良質の合焦カラー画像を短い時間で効率よく生成ができる共焦点顕微鏡及び合焦カラー画像の生成方法を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。
【００２０】
図１は、本発明の一実施の形態にかかる合焦カラー画像の生成方法が適用される共焦点走査型顕微鏡の概略構成を示している。
【００２１】
図において、１は光源で、この光源１は、例えばレーザ光などの点光源からなっている。光源１からの光の光路上には、シャッタ２を介して二次元走査機構３が配置されている。シャッタ２は、光源１からの光を遮光可能にしたもので、後述する処理装置１０により制御される。二次元走査機構３は、直交する２方向に光を偏向するための不図示の２枚のミラーを有し、これらのミラーにより後述する試料６面上の光を二次元走査するようになっている。
【００２２】
二次元走査機構３から出射される光の光路上には、ビームスプリッタ４が配置されている。このビームスプリッタ４は、光源１の光（レーザ光）を反射し、後述する白色光源１１の光（白色光）を透過するような特性を有している。
【００２３】
ビームスプリッタ４で反射した二次元走査機構３からの光の光路上には、対物レンズ５が配置されている。対物レンズ５は、入射した光を収束し、この収束光を上記二次元走査機構３の動作によって試料６面上で光軸に垂直な面方向(図示Ｘ，Ｙ方向)に二次元走査させる。
【００２４】
試料６は、ステージ７の上に載置されている。ステージ７は、光軸方向（ステージ７面に対して直交する方向）、つまりＺ方向に移動可能になっている。この場合、ステージ７は、処理装置１０により制御され、対物レンズ５に対する試料６の相対位置をＺ軸方向に連続的に可変可能にしている。
【００２５】
試料６からの反射光は、対物レンズ５を透過し、ビームスプリッタ４で再度反射して二次元走査機構３に戻る。二次元走査機構３に戻された反射光の光路上には、ピンホール８を介して光検出器９が配置されている。ピンホール８は、対物レンズ５の焦点と光学的に共役な位置に配置され、試料６から反射される光のうち合焦の成分を通過させるが、非合焦の成分を透過できないようになっている。光検出器９は、フォトマルチプライヤーなどからなるもので、ピンホール８を通過した光を検出し、この光の輝度を電気信号に変換して出力するものである。この場合、光検出器９よって検出される光は、試料６に対して焦点が合ったところでは最大輝度となり、逆に試料６に対して焦点が外れたところでは、輝度の著しく小さいものとなる。
【００２６】
光検出器９には、処理装置１０が接続されている。処理装置１０には、光検出器９で検出された光の輝度に応じた電気信号が入力される。
【００２７】
一方、１１は白色光源で、この白色光源１１は、例えばハロゲンあるいは水銀等の光源が用いられる。白色光源１１からの光の光路上には、ビームスプリッタ１２が配置されている。このビームスプリッタ１２は、白色光源１１からの光（白色光）を反射し、試料６から反射する光（白色光）を透過するような特性を有している。
【００２８】
ビームスプリッタ１２で反射した白色光源１１からの光の光路上には、シャッタ１３を介して上述のビームスプリッタ４が配置されている。シャッタ１３は、白色光源１１からの光を遮光可能にするものである。また、シャッタ１３は、上述したシャッタ２と排他的な関係にあり、シャッタ１３が開いている時にシャッタ２は閉じ、逆にシャッタ２が開いている時にシャッタ１３は閉じているように処理装置１０によって制御される。
【００２９】
シャッタ１３を通過した白色光源１１からの光は、上述のビームスプリッタ４及び対物レンズ５を透過してステージ７上の試料６に照射される。また、試料６から反射された白色光は、対物レンズ５、ビームスプリッタ４、シャッタ１３、ビームスプリッタ１２を透過される。ビームスプリッタ１２を透過した光の光路上には、不図示の結像レンズを介してカラーカメラ１４が配置されている。カラーカメラ１４は、ＣＣＤカメラからなるもので不図示の結像レンズにより結像される試料６のカラー像を撮像する。
【００３０】
カラーカメラ１４には、処理装置１０が接続されている。この処理装置１０は、制御部１０ａ、データ保存部１０ｂ及びデータ処理部１０ｃを有している。制御部１０ａは、上述した二次元走査機構３、ステージ７、シャッタ２、１３、カラーカメラ１４を制御する。データ保存部１０ｂは、光検出器９によって検出される試料６からの光の輝度、カラーカメラ１４の撮像画像などのデータを保存する。データ処理部１０ｃは、データ保存部１０ｂに保存されたデータに基づいて輝度情報、高さ情報、合焦カラー画像、三次元合焦カラー画像などを求めるようにしたものである。
【００３１】
処理装置１０には、表示装置１５が接続されている。この表示装置１５は、処理装置１０で求められた各種のデータを表示する。  
次に、このように構成された共焦点走査型顕微鏡による合焦カラー画像の生成までを説明する。なお、以下の説明でステージの移動に関する表現はすべてＺ方向の移動を示している。
【００３２】
まず、共焦点画像の取得について説明する。  
この場合、図２に示すフローチャートが実行される。まず、ステップ２０１で、処理装置１０の制御部１０ａの指示によりシャッタ２を開けシャッタ１３を閉じて動作モードを共焦点光学系による共焦点画像の取得モードに切り替える。次に、ステップ２０２で、ステージ７を予め指定された開始位置に移動する。
【００３３】
次に、ステップ２０３で、指定された開始位置に相当するステージ位置Ｌｍ（ｍ＝０,１,２…）として、最初のステージ位置Ｌｍ（Ｌ０）に対して共焦点画像を取得する。この場合、光源１からの光は、シャッタ２を介して二次元走査機構３に入射する。二次元走査機構３によって二次元に走査された光束は、ビームスプリッタ４で反射し対物レンズ５を透過して収束光となり試料６表面上で光軸に垂直な面方向(図示Ｘ，Ｙ方向)に二次元走査される。試料６からの反射光は、対物レンズ５及びビームスプリッタ４を通って二次元走査機構３に戻り、ピンホール８上に集光し、ピンホール８を通過した光が光検出器９により検出される。光検出器９で検出された光は、データ保存部１０ｂに保存された後、データ処理部１０ｃで画像化される。この画像は、ステージ位置Ｌｍ（Ｌ０）で光学的にスライスした画像(共焦点画像)として取得される。この共焦点画像は、Ｌｉｍａｇｅ_Ｌｍで表わされ、各画素位置（ｉ，ｊ）の輝度値をＬｉｍａｇｅ_Ｌｍ（ｉ，ｊ）としている。つまり、Ｌｉｍａｇｅ_Ｌｍ（ｉ，ｊ）は、ステージ位置Ｌｍ（Ｌ０）での試料６面上の各点の画素位置（ｉ，ｊ）の輝度値を表している。
【００３４】
次に、ステップ２０４で、共焦点画像Ｌｉｍａｇｅ_Ｌｍと処理装置１０のデータ保存部１０ｂに保存されている最大輝度画像ＬＭａｘ（最初は、ＬＭａｘ＝０）とを各画素位置ごとに比較し、ＬＭａｘと高さマップＨｉｇｈＭａｐの更新を行う。具体的に、Ｌｉｍａｇｅ_Ｌｍ（ｉ，ｊ）がＬＭａｘ（ｉ，ｊ）より大きいの場合、ＬＭａｘ（ｉ，ｊ）の値をＬｉｍａｇｅ_Ｌｍ（ｉ，ｊ）に置き換え、高さマップＨｉｇｈＭａｐ（ｉ，ｊ）の値をＬｍ−Ｌ０に置き換える。
【００３５】
次に、ステップ２０５に進み、ステージ７を予め決めた方向へ、予め指定された間隔で移動する。次に、ステップ２０６に進み、ステージ位置は予め指定された終了位置になったかどうかを判断する。ここで、指定された終了位置でなければ、ステップ２０３に戻り、新たに指定されたステージ位置Ｌ１、Ｌ２…Ｌｍについて、上述したと同様に共焦点画像の取得と高さマップＨｉｇｈＭａｐ（ｉ，ｊ）の更新を繰り返す。その後、ステップ２０６で終了位置を判断すると、共焦点画像の取得を終了する。
【００３６】
以上のような一連の動作により、各ステージ位置Ｌｍでの共焦点画像の取得により、試料６上の各点で光検出器９の輝度出力が最大になるステージ７の位置（合焦位置）が検出され、試料６の各点の高さ情報(高さマップＨｉｇｈＭａｐ)としてデータ保存部１０ｂに保存される。
【００３７】
次に、カラー画像取得と合焦カラー画像生成までを説明する。  
この場合、図３に示すフローチャットが実行される。まず、ステップ３０１で、処理装置１０の制御部１０ａの指示によりシャッタ１３を開けてシャッタ２を閉じて動作モードをカラーカメラ１４により撮像を行なう非共焦点画像の取得モードに切換える。
【００３８】
次に、ステップ３０２で、処理装置１０のデータ保存部１０ｂに保存された高さ情報(高さマップＨｉｇｈＭａｐ)をデータ処理部１０ｃに読み込む。次に、ステップ３０３で、ステージ７を予め指定された開始位置に移動する。
【００３９】
次に、ステップ３０４で、指定された開始位置に相当するステージ位置Ｃｎ（ｎ＝０,１,２…）として、最初のステージ位置Ｃ０に対してカラーカメラ１４による撮像を行なう。この場合、白色光源１１からの光は、ビームスプリッタ１２で反射し、シャッタ１３、ビームスプリッタ４及び対物レンズ５を介して試料６に照射される。また、試料６から反射された白色光は、対物レンズ５、ビームスプリッタ４、シャッタ１３、ビームスプリッタ１２を透過し、不図示の結像レンズを介してカラーカメラ１４の撮像面に結像され撮像される。この撮像されたカラー画像は、Ｃｉｍａｇｅ_Ｃ０として、データ保存部１０ｂに保存される。
【００４０】
次に、ステップ３０５で、ステップ３０４により取得したカラー画像について、高さ情報(高さマップＨｉｇｈＭａｐ)を参考にしながら、後述の合焦判定方法により各画素の合焦判定を行なう。次に、ステップ３０６で、ステージ７を予め決めた方向へ、予め指定された間隔で移動する。次に、ステップ３０７に進み、ステージ位置は予め指定された終了位置になったかどうかを判断する。ここで、指定された終了位置でなければ、ステップ３０４に戻り、新たに指定されたステージ位置Ｃ１、Ｃ２…Ｃｎについて、上述したと同様にカラー画像の取得と高さマップＨｉｇｈＭａｐを参考にし、各画素の合焦判定を繰り返す。その後、ステップ３０７で終了位置を判断すると、ステップ３０８で、今までの各画素の合焦判定結果を用いて一枚の合焦カラー画像を作成し、処理を終了する。
【００４１】
次に、合焦カラー画像の取得方法にいて、さらに説明する。  
この場合、図４は、共焦点画像の取得からカラー画像の取得までの流れを説明するもので、まず、ステージ７を予め指定された開始位置Ｌ０から一定間隔ずつ上へ移動しながら共焦点画像を取得し、終了位置に達したところで、開始位置Ｌ０へ戻り、今度は、開始位置Ｌ０に相当するステージ位置Ｃ０からステージ７を一定間隔ずつ上へ移動しながらカラー画像を取得する。ここで、図面中の試料６上の点ａは、各共焦点画像と各カラー画像の共通の画素位置（ｕ，ｖ）に対応している。
【００４２】
そして、共焦点画像の取得により、画素位置（ｕ，ｖ）の高さマップＨｉｇｈ（ｕ，ｖ）を求める。このマップＨｉｇｈ（ｕ，ｖ）は、図４に示すＬ０とＬｍの間の距離Ｌｍ−Ｌ０であり、この時の画素位置（ｕ，ｖ）は、開始位置Ｌ０から相対距離Ｈｉｇｈ（ｕ，ｖ）離れたステージ位置Ｌｍで表わされる。
【００４３】
前述した特許文献１では、共焦点画像を撮影したステージ位置Ｌｍと同じステージ位置Ｌｍで撮影したカラー画像の色情報を用いて各画素の合焦カラーデータを作成するようにしている。しかし、色収差などの影響により共焦点光学系と非共焦点光学系でピントが合う位置がずれることがある。例えば、図４の場合、非共焦点光学系の画素位置（ｕ，ｖ）の合焦位置は、共焦点光学系で得られたＬ０から相対距離Ｈｉｇｈ（ｕ，ｖ）のところのＬｍでなく、Ｌ０（Ｃ０）から相対距離Ｃｎ−Ｌ０（Ｃ０）のところのＣｎと考えられる。このような場合、特許文献１に開示される方法で作成した合焦カラーデータにはボケが含まれることになる。
【００４４】
これに対して、本発明では、共焦点画像により画素位置（ｕ，ｖ）の高さマップＨｉｇｈ（ｕ，ｖ）を求め、こののち、非共焦点光学系によりカラー画像を取得しながら試料６の各画素ごとの合焦判定を行い、この合焦判定から得られた各画素の合焦情報から一枚の合焦カラー画像を生成する。これらの処理は、上述した図３のステップ３０５、３０８で行われる。
【００４５】
図５は、上述した図３のステップ３０５での処理を、さらに詳しく説明するもので、ここでは、試料６上の点aに対応する画素位置（ｕ，ｖ）を説明対象としている。この場合、点ａの画素位置（ｕ，ｖ）の合焦判定には、取得したすべてのカラー画像を使用してもよいが、図６に示すようにステージ位置が［Ｌ０＋Ｈｉｇｈ（ｕ，ｖ）−α］から［Ｌ０＋Ｈｉｇｈ（ｕ，ｖ）＋α］までの範囲内で取得した複数枚のカラー画像だけを使用してもよい。そして、この範囲内の複数のカラー画像ごとに、点ａの画素位置（ｕ，ｖ）を中心とした３×３の画素領域を抽出し、これら領域Ａ１、Ａ２、…Ａｋをａ点の画素位置（ｕ，ｖ）の合焦判定の対象とする。
【００４６】
ここで、αは共焦点光学系と非共焦点光学系との色収差、ステージ移動の機械的な誤差を考慮して予め定めた値である。そして、このαの値によって、［Ｌ０＋Ｈｉｇｈ（ｕ，ｖ）−α］がステージのカラー画像取得の開始位置より小さい値になる場合は、合焦判定範囲をステージのカラー画像取得の開始位置からとし、［Ｌ０＋Ｈｉｇｈ（ｕ，ｖ）＋α］がカラー画像取得の終了位置より大きい値になる場合は、合焦判定範囲をステージのカラー画像取得の終了位置までとする。なお、前述の画素領域のサイズの３×３は、これに限定する必要はなく、任意に変更可能である。また、αの値は、非共焦点光学系の焦点深度の範囲内で設定することができる。
【００４７】
図５において、まず、ステップ５０１で、点ａの画素位置（ｕ，ｖ）の高さ情報、つまりステージ位置Ｃｎ（対物レンズ５と試料６との相対位置）と、この画素位置（ｕ，ｖ）に対応する高さマップＨｉｇｈを用いて、点ａの画素の合焦判定が開始できるかどうかについて判断する。この場合、図６に示すように、点ａの画素位置（ｕ，ｖ）の高さを表わすステージ７の現在位置、つまりステージ位置Ｃｎが［Ｌ０＋Ｈｉｇｈ（ｕ，ｖ）＋α］又は終了位置に到達したかどうかを判定する。この条件を満たさない場合は、点ａの画素の合焦判定が開始できないと判断し、ステップ５０６に進む。ステップ５０６では、ステージ７の現在位置において、点ａ以外の画素で、合焦判定の開始ができるかの判断を行ったかどうかを判断する。ここで、他の画素で、合焦判定の開始ができるかの判断がされていない場合は、ステップ５０１に戻り、判断がされていない画素に対して、同様な処理を繰り返す。
【００４８】
一方、ステップ５０１で、処理開始の条件を満たす場含、ステップ５０２へ進み、この画素について含焦判定の計算を開始する。この場合、図６に示す［Ｌ０＋Ｈｉｇｈ（ｕ，ｖ）−α］から［Ｌ０＋Ｈｉｇｈ（ｕ，ｖ）＋α］までの範囲内で既に取得された複数のカラー画像から、画素位置（ｕ，ｖ）を中心とした３×３の画素領域Ａ１、Ａ２、…Ａｋを抽出し、処理装置１０のデータ処理部１０ｃに読み込む。
【００４９】
次に、ステップ５０３で、最初の領域Ａ１について、各画素のＲ、Ｇ、Ｂ信号から輝度信号を分離する。そして、この輝度信号の情報を用いて合焦判定ための合焦評価値を求める。具体的には、この輝度情報を用いて、画素位置（ｕ，ｖ）を中心にラプラシアンフィルタ処理を行い、この画素位置（ｕ，ｖ）におけるラプラシアンフィルタ処理結果を領域Ａ１の合焦評価値とする。なお、ラプラシアンフィルタ処理とは、注目画素（上記記載の画素位置（ｕ，ｖ））と、これに隣接する画素に基づいて注目画素の値(上記記載の合焦評価値)を決定する方法で、一般的な画像処理で行われている技術である。ここでは、合焦評価値を求めるのに、ラプラシアンフィルタ処理を用いているが、これ以外の処理方法として、例えば一次微分フィルタ処理、Ｓｏｂｅｌフィルタ処理、フーリエ変換法などを用いてもよい。
【００５０】
同様にして、他の領域Ａ２、…Ａｋについても、それぞれの評価用の合焦評価値を求める。このようにして求められた合焦評価値は、画素位置（ｕ，ｖ）に関するコントラスト値と考えることができ、このコントラスト値が大きいほど、焦点が合っている位置と考えられる。
【００５１】
次に、ステップ５０４では、複数の領域Ａ１，Ａ２，…Ａｋのそれぞれの合焦評価値の中で量大のコントラスト値を示す領域を合焦位置と判断し、ステップ５０５では、ここで求めた合焦位置の画素のカラー情報を、この画素位置のカラー情報として保存する。なお、既にカラー情報が決定された画素を合焦判定済み画素とする。
【００５２】
そして、ステップ５０６に進み、他の画素で、合焦判定の開始ができるかの判断がされているかどうかの判断が行われ、他の画素で、合焦判定の開始ができるかの判断がされていない場合は、ステップ５０１に戻リ、判断がされていない画素に対して、合焦判定の開始が可能かどうか判断し、以後、同様な処理を繰り返す。このような一連の動作により、ステージ７の現在位置に対応する各画素の合焦判定が行われ、合焦判定された合焦判定済み画素は、データ保存部１０ｂに保存される。また、これら処理の終了後には、図３に示すフローチャートに戻ってステップ３０６以降の動作を実行し、ステージ７の移動ごとに、各ステージ位置Ｃｎに対応する合焦判定済みでない画素のカラー情報を取得する。
【００５３】
その後、データ保存部１０ｂに保存された各画素のカラー情報を用いて一枚の合焦カラー画像を作成する。そして、この合焦カラー画像は、データ処理部１０ｃにより高さ情報(高さマッブＨｉｇｈＭａｐ)と合成され、試料６の三次元のカラー画像が生成され、表示装置１５に表示される。
【００５４】
なお、前述の共焦点画像取得の際のステージ７の開始位置、終了位置及び移動間隔は、それぞれカラー画像取得の際のステージ７の開始位置、終了位置及び移動間隔と一致する必要はない。例えば、共焦点光学系の対物レンズ５の焦点深度に比べて非共焦点光学系の対物レンズ５の焦点深度は大きいので、カラー画像取得の際のステージ移動間隔を共焦点画像取得の際のステージ移動間隔より大きくできる。この場合、ステージ移動間隔を非共焦点光学系の対物レンズ５の焦点深度より小さい値に設定してもよい。このようにすれば、カラー画像取得時間が短縮できる。また、共焦点画像取得の際のステージ移動方向とカラー画像取得の際のステージ移動方向を逆にすれば、ステージ移動が１往復のみで済み、全体の動作時間が短締できる。
【００５５】
したがって、このようにすれば、共焦点光学系により対物レンズ５の集光位置と試料６との相対位置を変えながら共焦点画像を取得し、これら共焦点画像に基づいて試料６の各点の画素位置ごとに合焦位置の高さ情報を求め、次いで、非共焦点光学系により対物レンズ５の集光位置と試料６との相対位置を変えながらカラー画像を撮像するとともに、これら撮像されたカラー画像の前記試料６の各点の画素位置について該画素位置に対応する高さ情報に基づいて合焦判定を行い、この判定結果から合焦カラー情報を取得し、さらにこれら合焦カラー情報と前記高さ情報を合成して試料６の三次元のカラー画像を生成するようにした。これにより、非共焦点光学系により撮像される各画素位置について合焦判定が行われ、これら合焦判定の結果から取得される合焦カラー情報に基づいて合焦カラー画像が生成されるので、厳密な合焦カラー画像、いわゆるボケを含まない良質のカラー画像を生成することができる。
【００５６】
また、複数のカラー画像の合焦判定では、高さ情報を参照データとしてカラー画像の使用範囲を決定し、この範囲内で撮像される複数のカラー画像について合焦判定のための評価を行なうようにしているので、合焦判定のために所定範囲内のデータのみを使用することで処理データ量を最小限にでき、これにより処理時間を短縮でき、合焦カラー画像を短い時間で効率よく生成することができる。
【００５７】
さらに、カラー画像を撮像しながら、合焦判定処理を行なうことができるので、例えばステージ移動が終了した時点で、データ処理をほぼ完了するようになり、システム全体についても高速化を実現できる。
【００５８】
なお、上述した実施の形態では、共焦点顕微鏡における合焦カラー画像生成方法について述べているが、かかる合焦カラー画像生成方法を適用した共焦点顕微鏡では、共焦点画像を取得する共焦点画像取得手段、共焦点画像に基づいて試料６の各点の画素位置ごとに合焦位置の高さ情報を求める高さ情報取得手段、カラー画像を取得するカラー画像取得手段、カラー画像中の試料６の各点の画素位置に対し該画素位置に対応する前記高さ情報に基づいて合焦判定を行い、この判定結果から合焦カラー画像を取得する合焦カラー画像取得手段、合焦カラー画像取得手段で取得された合焦カラー画像と高さ情報を合成して試料の三次元合焦カラー画像を生成する合焦カラー画像生成手段、試料６の各点の画素位置について該画素位置の高さ情報と高さ情報取得手段で求められた画素位置に対応する高さ情報に基づいて合焦判定の開始を決定する合焦判定開始決定手段、さらには試料６の各点の画素位置について前記高さ情報取得手段で求められた画素位置に対応する高さ情報に基づいて、カラー画像取得手段で撮像したカラー画像のうち合焦判定に使用する範囲を決定し、該範囲内の複数のカラー画像について合焦判定対象領域を指定するとともに、これら合焦判定対象領域に対して合焦判定を行なう合焦判定手段、複数の合焦判定対象領域に対してそれぞれ合焦評価値を求め、該合焦評価値の中で値が最大となる合焦判定対象領域の注目画素を合焦位置と判断する手段などが設けられている。
【００５９】
その他、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。
【００６０】
さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】本発明の一実施の形態にかかる合焦カラー画像の生成方法が適用される共焦点走査型顕微鏡の概略構成を示す図。
【図２】一実施の形態の共焦点画像の取得手順を示すフローチャート。
【図３】一実施の形態のカラー画像と合焦カラー画像生成手順を示すフローチャート。
【図４】一実施の形態の共焦点画像とカラー画像との合焦位置のずれの例を示す図。
【図５】一実施の形態の合焦カラー画像を求める手順を示すフローチャート。
【図６】一実施の形態の合焦判定を説明するための図。
【図７】従来の共焦点顕微鏡の概略的構成を示す図。
【符号の説明】
【００６２】
１…光源、２…シャッタ
３…二次元走査機構、４…ビームスプリッタ
５…対物レンズ、６…試料
７…ステージ、８…ピンホール
９…光検出器、１０…処理装置
１０ａ…制御部、１０ｂ…データ保存部
１０ｃ…データ処理部、１１…白色光源
１２…ビームスプリッタ、１３…シャッタ
１４…カラーカメラ、１５…表示装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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