(57)【要約】【課題】容器壁内面の広い範囲に補助収容物を容易に収容し易いと共に補助収容物の無駄を抑えることができる閉鎖系細胞培養容器を提供する。【解決手段】少なくとも１つのポート１７、１９を有するとともに、対向する平面状容器壁１１、１２の少なくとも一方が可撓性フィルムからなり、対向する平面状容器壁１１、１２の間に密封状の収容部１３を有する容器本体と、収容部１３に封入され、収容部１３に導入される細胞の足場となるタンパク質及び／又は収容部に導入される細胞を活性化するタンパク質を含む補助収容物とを備え、補助収容物が収容部に面状に存在している。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのポートを有するとともに、対向する平面状容器壁の少なくとも一方が可撓性フィルムからなり、前記対向する平面状容器壁の間に密封状の収容部を有する容器本体と、
前記収容部に封入され、前記収容部に導入される細胞の足場となるタンパク質及び／又は前記収容部に導入される細胞を活性化するタンパク質を含む補助収容物とを備え、
前記補助収容物が前記収容部に面状に存在することを特徴とする閉鎖系細胞培養容器。
【請求項２】
前記対向する平面状容器壁の双方が可撓性フィルムからなることを特徴とする請求項１に記載の閉鎖系細胞培養容器。
【請求項３】
面状に存在する前記補助収容物の平均厚さが１．０ｍｍ以下であることを特徴とする請求項１又は２に記載の閉鎖系細胞培養容器。
【請求項４】
前記補助収容物が、前記収容部に液密状に封入されていることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一に記載の閉鎖系細胞培養容器。
【請求項５】
前記補助収容物には、抗ＣＤ３抗体が含まれていることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一に記載の閉鎖系細胞培養容器。
【請求項６】
前記抗ＣＤ３抗体の少なくとも一部が、前記可撓性フィルムの内面に固相化されていることを特徴とする請求項５に記載の閉鎖系細胞培養容器。
【請求項７】
前記可撓性フィルムの内面に固相化されていない前記抗ＣＤ３抗体の非固相化分が前記容器本体から除去されていることを特徴とする請求項６に記載の閉鎖系細胞培養容器。
【請求項８】
前記非固相化分は、前記容器本体に注入した洗浄液とともに排出されていることを特徴とする請求項７に記載の閉鎖系細胞培養容器。
【請求項９】
前記抗ＣＤ３抗体の封入量が、前記収容部を構成する前記可撓性フィルムの単位面積あたり、０．０２μｇ／ｃｍ２〜４．４μｇ／ｃｍ２であることを特徴とする請求項５乃至８のいずれか一に記載の閉鎖系細胞培養容器。
【請求項１０】
前記抗ＣＤ３抗体の封入量が、前記収容部を構成する前記可撓性フィルムの単位面積あたり、０．１１μｇ／ｃｍ２〜０．４４μｇ／ｃｍ２であることを特徴とする請求項５乃至８のいずれか一に記載の閉鎖系細胞培養容器。
【請求項１１】
前記可撓性フィルムの前記補助収容物と接する面が、ポリエチレンからなることを特徴とする請求項５乃至１０のいずれか一に記載の閉鎖系細胞培養容器。
【請求項１２】
前記容器本体が、ガスバリアー性及び／又は水蒸気バリアー性の高い包装材で包装されたことを特徴とする請求項１乃至１１のいずれか一に記載の閉鎖系細胞培養容器。
【請求項１３】
前記請求項１乃至１２のいずれか一に記載の閉鎖系細胞培養容器と、細胞培養用培地を封入した培地用容器とを備え、前記細胞培養容器と前記培地用容器とが使用時に連通可能な連通手段で接続されていることを特徴とする閉鎖系細胞培養用キット。
【請求項１４】
前記閉鎖系細胞培養容器と前記培地用容器とが、ガスバリアー性及び／又は水蒸気バリアー性の高い包装材で包装されたことを特徴とする請求項１３に記載の閉鎖系細胞培養用キット。
【請求項１５】
少なくとも１つのポートを有するとともに、対向する平面状容器壁の少なくとも一方が可撓性フィルムからなり、前記対向する平面状容器壁の間に密封状の収容部を有する容器本体を準備する工程と、
前記収容部に導入される細胞の足場となるタンパク質及び／又は前記収容部に導入される細胞を活性化するタンパク質を含む補助収容物を前記収容部に封入する工程と、
前記対向する平面状容器壁を外側から厚さ方向に押圧し、及び／又は前記収容部内の気体を吸引して前記収容部を平坦化することにより、前記補助収容物を前記対向する平面状容器壁の少なくとも一方の内面に面状にする工程と、
を備えたことを特徴とする閉鎖系細胞培養容器の製造方法。
【請求項１６】
少なくとも１つのポートを有するとともに、対向する平面状容器壁の少なくとも一方が可撓性フィルムからなり、前記対向する平面状容器壁の間に密封状の収容部を有する容器本体を準備する工程と、
前記収容部に抗ＣＤ３抗体を含む補助収容物を前記収容部に封入する工程と、
前記対向する平面状容器壁を外側から厚さ方向に押圧し、及び／又は前記収容部内の気体を吸引して前記収容部を平坦化することにより、前記補助収容物を前記対向する平面状容器壁の少なくとも一方の内面に面状にすると共に前記抗ＣＤ３抗体を固相化する工程と、
前記収容部に洗浄液を注入し、前記補助収容物に接触させて排出することにより、該洗浄液と共に前記抗ＣＤ３抗体の非固相化分を排出する工程と
を備えたことを特徴とする閉鎖系細胞培養容器の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を無菌状態のまま簡易に培養するのに好適な閉鎖系細胞培養容器、閉鎖系細胞培養用キット、及び閉鎖系細胞培養容器の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体から採取した細胞を体外で培養し、増殖した細胞を再び体内に戻す養子免疫治療において、細胞の伸展、増殖及び分化を促進させる為に、各種タンパク質を予めフラスコやシャーレ等の硬質容器に固相化したものが用いられている。
【０００３】
具体的には、活性化リンパ球療法において、活性化Ｔリンパ球の誘導は、抗ＣＤ３抗体を固相化した培養容器を用いられているが、固相化の方法は、用事、濃度調整された抗ＣＤ３をフラスコ等の容器に封入し、所定時間放置する事で固相化した後、固相化されていない抗ＣＤ３抗体を容器外へ除去し、さらに容器内部をリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）等で洗浄する処理が一般的に行われている。
【０００４】
これらの操作に用いられるフラスコ等の容器は酸素等の通気性を有していない事から、細胞培養時に必要な通気性を確保する為に、容器本体とキャップに隙間をもたせる、若しくは、キャップの一部に通気性フィルターを具備したベント機能を付与する等により通気性を確保している。これらフラスコ等の硬質容器で細胞培養を行う際は、抗ＣＤ３抗体の固相化等、補助収容物を収容した後に、患者から採取した細胞や細胞培地を注入する操作や細胞培養状態を確認するサンプリング等の目的で、フラスコのキャップやシャーレの蓋を開放し、細胞の採取、培地の添加等をピペッティングにより行う必要がある。そのため、細菌やマイコプラズマ等の微生物（以降、細菌等という。）のコンタミネーションを招く危険性があり、また、ベント機構は完全密封系では無い為、該隙間から液漏れを生じることもあり、閉鎖系で処理できる細胞培養容器が求められていた。
【０００５】
上記問題を解決する為に、フラスコを用いた細胞培養を閉鎖系の培養容器としたものが、特開２００５−５８１０３により提案されている。この提案では、ポアサイズ０．０１〜１．２μｍの孔を有している気体透過性シートが保形性を有する材料から構成されたフラスコ等の立体的な容器に配設され、この気体透過性シートを通して細胞の増殖に必要な酸素、二酸化炭素等の気体透過を確保した閉鎖系フラスコが提案されている。更に、該閉鎖系フラスコのネジ蓋を貫通する中空チューブにより、他の培地供給ユニットを繋ぐキット製品も提案されている。
【特許文献１】特開２００５−５８１０３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、閉鎖系の培養容器では、容器内壁面を露出させることができないため、抗ＣＤ３抗体の固相化など、各種の補助収容物を容器内壁面に付着させるような処理を行う場合、補助収容物を容器内に注入して容器壁内面に接触させることにより行なわなければならない。その際、上記特許文献１のような立体的な硬質容器では、容器壁内面のより広い範囲に処理を施すには、付着させる量に比べて大過剰の補助収容物を注入して行なわなければならなかった。そのため補助収容物の無駄が多いと共に、補助収容物の収容に手間を要するという問題点があった。
更に、実際には、気体透過性フィルムのポアサイズ制御や、容器本体と気体透過性シートの異材より成形された部材のシール性を維持する事は難しく、また、実施例に記載のキャップとカテーテル等に用いられるシリコーン製チューブの溶着は製造が非常に難しいなど、容器の製造に著しく手間を要するという問題点も有していた。
【０００７】
そこで、本発明では、容器壁内面の広い範囲に補助収容物を容易に収容し易いと共に補助収容物の無駄を抑えることができる製造容易な閉鎖系細胞培養容器を提供することを課題とすると共に、そのような閉鎖系細胞容器を用いた閉鎖系細胞培養用キットを提供することを他の課題とする。
また、補助収容物を容器壁内面の広い範囲に無駄を抑えて容易に収容できる閉鎖系細胞容器の製造方法を提供することを別の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決する請求項１に記載の発明は、少なくとも１つのポートを有するとともに、対向する平面状容器壁の少なくとも一方が可撓性フィルムからなり、前記対向する平面状容器壁の間に密封状の収容部を有する容器本体と、前記収容部に封入され、前記収容部に導入される細胞の足場となるタンパク質及び／又は前記収容部に導入される細胞を活性化するタンパク質を含む補助収容物とを備え、前記補助収容物が前記収容部に面状に存在することを特徴とする。
【０００９】
ここで、可撓性フィルムとは、収容部内に収容される収容物量に対応して容器壁が変形できる程度の可撓性を有するフィルムである。例えば、可撓性の評価として、フィルムを１％伸ばした時の応力（１％モジュラス）が挙げられる。
可撓性フィルムが単層フィルムの場合は、平行部分の幅が５ｍｍ、標線間距離２０ｍｍのダンベル型の試験片とし、引張速度５０ｍｍ／ｍｉｎの条件で引張試験を行った際の１％モジュラスが２０ＭＰａ以下であり、より好ましくは、１０ＭＰａ以下のものが好適である。
１％モジュラスが２０ＭＰａより大きいと、収容部の容積変化が容易に行なえず、対応する平面状容器壁を外側から厚さ方向に押圧したり、収容部内の気体を吸引して、収容部を平坦化することにより、補助収容物を均一な面状にし難くなる。
また、可撓性フィルムが多層フィルムの場合は、先に記載した単層フィルムと同様の曲げやすさを有しているものが挙げられるが、１％モジュラスは２０ＭＰａ以下に限定されるものではない。
この理由として、多層フィルムはフィルム層を自由に構成する事ができる為、例えば、１％モジュラスが高いフィルムの層間に、柔軟なフィルム層を設ける事で、柔軟なフィルム層の厚さ分だけ変形自由度が増し、曲げやすさを改善する事が出来る事による。
このような可撓性フィルムとしては、低密度ポリエチレン、直鎖状低密度ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン酢酸ビニル共重合体、メチルペンテン樹脂、ポリブタジエン樹脂、スチレンブタジエンスチレンブロック共重合体、塩化ビニル、ＰＥＴ樹脂等の熱可塑性樹脂より成るフィルムが挙げられ、単層フィルムに限定されるものではなく、多層構造のフィルムでも構わない。また、このフィルムは、Tダイやインフレーションフィルム等により形することができる。
【００１０】
また、補助収容物とは、収容部に導入される培養対象の細胞の足場となるタンパク質、収容部に導入される細胞を活性化するタンパク質、若しくはこれらのタンパク質の組合せ、または、これらと他の物質との組合せなどである。
収容部に導入される細胞の足場となるタンパク質としては、例えばコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、マトリゲル等の線維芽細胞等の細胞接着性因子などが挙げられる。
また、収容部に導入される細胞を活性化するタンパク質としては、例えば抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦα、ＴＮＦβ等の細胞刺激因子などが挙げられる。
この補助収容物は、適宜な状態で収容部に面状に収容可能であるが、液等の流体又はゲルなどの半流動体の状態で収容するのが好適である。変形自在であるため面状に存在させ易いからである。流体又は半流動体の状態で収容する場合、補助収容物を注入して収容することの他、注入後に一部の成分を残留させて残部を排出することにより収容することも可能である。
なお、この発明において、補助収容物が面状に存在するとは、少なくとも補助収容物が平面状容器壁に沿って広く、好ましくは略全面に薄膜状に広がった状態をいい、平面状容器壁が折り畳まれていても構わない。
【００１１】
請求項２に記載の発明は、対向する平面状容器壁の双方が可撓性フィルムからなることを特徴とする。
【００１２】
請求項３に記載の発明は、面状に存在する前記補助収容物の平均厚さが１．０ｍｍ以下であることを特徴とする。
ここで言う平均厚さとは、面状にされた補助収容物の膜厚の最大と最小厚さの平均である。
ここで、補助収容物を流体又は半流動体の状態で収容する場合には、面状に存在する補助収容物の平均厚さを０．０５ｍｍ以上とするのが好適である。平均厚さが薄すぎると、補助収容物を平面状容器壁の広い範囲に均一に面状に存在させ難く、培養効果にむらが生じ易いからである。
例えば、平面状容器壁の片面が２００ｃｍ２の場合、容器内部へ補助収容物を１ｃｃ〜２０ｃｃ封入し、平面状容器壁に沿って面状とすると、０．０５ｍｍ以上１．０ｍｍ以下の薄膜を形成する事ができる。
【００１３】
請求項４に記載の発明は、前記補助収容物が、前記収容部に液密状に封入されていることを特徴とする。
ここで液密状とは、収容部から気体が完全に脱気された状態や、収容部の概ねの気体が抜かれている状態であり、容器本体を作製後、先に、収容部の気体を脱気してから補助収容物を封入したり、一旦、気体で膨らませた収容部に補助収容物を充填し、シリンジ等で収容部の気体を吸引する事で、収容部を液密状とする事が出来る。
【００１４】
請求項５に記載の発明は、前記収容部に導入される細胞を活性化するタンパク質が、抗ＣＤ３抗体であることを特徴とする。
ここでは、細胞を活性化するタンパク質として、抗ＣＤ３抗体を容器内に封入するものとして挙げているが、抗ＣＤ３抗体と共に他の細胞活性因子を封入する事により、さらに細胞増殖性をあげることも含む。
【００１５】
請求項６に記載の発明は、前記抗ＣＤ３抗体の少なくとも一部が、前記可撓性フィルムの内面に固相化していることを特徴とする。
ここで言う固相化とは、浮遊状態の抗ＣＤ３抗体が可撓性フィルムの表面に固定または定着した状態をいい、抗ＣＤ３抗体を溶解した溶解液を収容部に封入し、所定時間静置することで、抗ＣＤ３抗体を可撓性フィルム表面に固定または定着させる事ができる。
【００１６】
請求項７に記載の発明は、前記可撓性フィルムの内面に固相化されていない前記抗ＣＤ３抗体の非固相化分が前記容器本体から除去されていることを特徴とする。
【００１７】
請求項８に記載の発明は、前記非固相化分は、前記容器本体に注入した洗浄液とともに排出されていることを特徴とする。
【００１８】
請求項９に記載の発明は、前記抗ＣＤ３抗体の封入量が、前記収容部を構成する前記可撓性フィルムの単位面積あたり、０．０２μｇ／ｃｍ２〜４．４μｇ／ｃｍ２であることを特徴とする。
【００１９】
請求項１０に記載の発明は、前記抗ＣＤ３抗体の封入量が、前記収容部を構性する前記可撓性フィルムの単位面積あたり、０．１１μｇ／ｃｍ２〜０．４４μｇ／ｃｍ２であることを特徴とする。
【００２０】
請求項１１に記載の発明は、前記可撓性フィルムの前記補助収容物と接する面が、ポリエチレンからなることを特徴とする。
【００２１】
請求項１２に記載の発明は、前記容器本体が、ガスバリア性及び／又は水蒸気バリア性の高い包装材で包装されたことを特徴とする。
ガスバリア性及び／又は水蒸気バリア性の高い包装材としては、酸素透過度が２５℃、８０％ＲＨ環境下において、５ｃｃ以下／ｍ２・ｄａｙ・ＡＴＭのものが挙げられ、より好ましくは、１ｃｃ以下／ｍ２・ｄａｙ・ＡＴＭが好適である。また、水蒸気透過度は、４０℃、９０％環境下において、２ｇ以下／ｍ２・ｄａｙのものが挙げられ、より好ましくは、１ｇ以下／ｍ２・ｄａｙが好適である。
ガスバリア性及び／又は水蒸気バリア性の高い包装材の代表的なものとして、エチレンビニルアルコール共重合体（ＥＶＯＨ）フィルム、または、アルミ箔、シリカ蒸着フィルム、若しくはアルミナ蒸着フィルム等によるバリア性フィルム層と熱可塑性樹脂によるシーラント層とより構成された多層フィルムなどが挙げられる。
【００２２】
特に、アルミ箔を用いたラミネートフィルムは、ガスバリア性及び水蒸気バリア性が極めて高く、包装材の外部から内部への酸素透過や、包装材の内部から外部への水蒸気の蒸散を生じない為、好適である。
さらに、包装材内部が確認できる様、アルミ箔を用いたラミネートフィルムと透明性を有するシリカ蒸着フィルムを片面づつ貼り合せた包装材でも良い。
フィルム構成の例として、アルミ箔を用いたラミネートフィルムは、最内層（シーラント層）を直鎖状低密度ポリエチレン、中間層（バリア層）をアルミ箔、最外層（保護層）をナイロンフィルムより構成することが出来る。
また、シリカ蒸着フィルムを用いた構成の例として、最内層を直鎖状低密度ポリエチレン、中間層をシリカ蒸着PETフィルム、最外層をナイロンフィルムとしたものが挙げられる。
これらのバリア性の高い包材で包装する際、脱酸素材の同封や、真空包装をする事により、酸素による酸化劣化を押える事が出来て、長期的な保管が可能となる。
【００２３】
請求項１３に記載の発明は、前記請求項１乃至１２のいずれか一に記載の閉鎖系細胞培養容器と、細胞培養用培地を封入した培地用容器とを備え、前記細胞培養容器と前記培地用容器とが使用時に連通可能な連通手段で接続されていることを特徴とする。
連通可能な連通手段としては、閉鎖系細胞培養容器のポート部と培地用容器に設けられたポート部とを、柔軟性のあるチューブにより接続し、ポート部或いはチューブを連通可能に閉塞手段で閉塞したものを適宜使用することができる。例えば、ポートの容器内側端部をクリップチップ等で閉塞する閉塞手段を設けたり、柔軟性のあるチューブにクレンメ等で閉塞する閉塞手段を装着したり、両閉塞手段を併用して、連通可能とすることができる。
柔軟性のあるチューブの材質としては、軟質塩ビニル樹脂、ポリブタジエン樹脂、エチレン酢酸ビニル共重合体、塩素化ポリエチレン樹脂、ポリウレタン系熱可塑性エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー等が挙げられる。
【００２４】
請求項１４に記載の発明は、前記閉鎖系細胞培養容器と前記培地用容器とが、ガスバリア性及び／又は水蒸気バリア性の高い包装材で包装されたことを特徴とする。
培養用培地は、細胞培養容器での培養が終了するまで、酸素及び水蒸気バリア性を有する包装材により包装し、培地の酸化劣化や水蒸気の容器外への蒸散を防止させる。
また、細胞培養容器とバリア性包材で包装された培養用培地を接続したキットは、使用時までバリア性包材に同封若しくは、個別包装されていることが好ましい。
【００２５】
請求項１５に記載の発明は、少なくとも１つのポートを有するとともに、対向する平面状容器壁の少なくとも一方が可撓性フィルムからなり、前記対向する平面状容器壁の間に密封状の収容部を有する容器本体を準備する工程と、前記収容部に導入される細胞の足場となるタンパク質及び／又は前記収容部に導入される細胞を活性化するタンパク質を含む補助収容物を前記収容部に封入する工程と、前記対向する平面状容器壁を外側から厚さ方向に押圧し、及び／又は前記収容部内の気体を吸引して前記収容部を平坦化することにより、前記補助収容物を前記対向する平面状容器壁の少なくとも一方の内面に面状にする工程とを備えたことを特徴とする。
【００２６】
請求項１６に記載の発明は、少なくとも１つのポートを有するとともに、対向する平面状容器壁の少なくとも一方が可撓性フィルムからなり、前記対向する平面状容器壁の間に密封状の収容部を有する容器本体を準備する工程と、前記収容部に抗ＣＤ３抗体を含む補助収容物を前記収容部に封入する工程と、前記対向する平面状容器壁を外側から厚さ方向に押圧し、及び／又は前記収容部の気体を吸引して前記収容部を平坦化することにより、前記補助収容物を前記対向する平面状容器壁の少なくとも一方の内面に面状にすると共に前記抗ＣＤ３抗体を固相化する工程と、前記収容部に洗浄液を注入し、前記補助収容物に接触させて排出することにより、該洗浄液と共に前記抗ＣＤ３抗体の非固相化分を排出する工程とを備えたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２７】
請求項１の記載の発明によれば、少なくとも１つのポートを有する容器本体の密封状の収容部内に、培養される細胞の足場となるタンパク質及び／又は細胞を活性化するタンパク質を含有する補助収容物が封入されているので、大気中に開放する事無く、具備されたポートより培養する細胞を接種することができる為、無菌保障が容易であり、細菌等によるコンタミネーションを生じ難い。
【００２８】
また、その容器本体では、平面状容器壁の少なくとも一方が可撓性フィルムからなるので、容器壁が変形可能であるため、収容部の容積変化が容易である。そのため、各種の補助収容物を収容する際、収容部の容積を小さくして補助収容物を収容したり、平面状容器壁を変形させて収容物を広げれば、より少ない収容量で容器壁内面の広い範囲に容易に接触させることが可能で、補助収容物を収容部に面状に収容させ易い。その結果、無駄を抑えて補助収容物を容易に収容することが可能である。
更に、これにより補助収容物が平面状容器壁に沿って面状にされるため、細胞培養時に収容部に充填される培養混合物の体積に対して補助収容物を広い接触面積で接触させることができ、細胞の培養を促進することが可能である。
【００２９】
請求項２に記載の発明によれば、対向する平面状容器壁の双方を可撓性フィルムとする事で、容積変化がさらに容易となり、無駄を抑えて、より容易に補助収容物を収容することができ、また、大気中の空気を容器内へ入れる事無く、細胞増殖後に行う内容物の排出や他の培養容器への移行が可能である。
【００３０】
請求項３に記載の発明によれば、面状に存在する前記補助収容物の平均厚さを１．０ｍｍ以下とする事で、確実に補助収容物の無駄を抑えることができると共に、過剰な補助収容物による培養への悪影響を抑え易い。
特に、タンパク質を含有する液を用いて固相化させる場合には、その含有量が少量であることから、固相化されずに排出されるタンパク質量を削減できる。また、タンパク質が固相化され易いため、固相化のための時間を短縮できる。
【００３１】
請求項４に記載の発明によれば、補助収容物が収容部に液密状に封入されている事から、閉鎖系細胞培養容器の作製時には、収容部に封入された補助収容物が平面状容器壁の両内面に接触することができるため、容易に両内面に補助収容物を面状に存在させることができる。更に、細胞の足場となるタンパク質や、細胞を活性化するタンパク質を対向する可撓性フィルムの両面に接触して固定化等の処理を行う際にも、対向する平面状容器壁の両内面に存在させ易い。
また、使用の際には、両内面に補助収容物を面状に存在するため、収容部に収容されている培養混合物が対向する平面状容器壁の両内面に存在する補助収容物と接触することができる。そのため、フラスコやシャーレ等のように片面で補助収容物に接触させて培養する場合に比べ、細胞の伸展、増殖及び分化の促進効率が良好である。
【００３２】
請求項５乃至１０に記載の発明によれば、養子免疫治療の中でも特に頻度が高い活性化リンパ球療法では増殖した細胞を人体へ戻す事から、抗ＣＤ３抗体との接触を含めた一連操作の無菌保証が必須であるが、本発明の容器を使用して収容部に導入される細胞を活性化するタンパク質を抗ＣＤ３抗体とすることにより、無菌保証のための煩雑な操作を解消する事ができ、活性化リンパ球療法に好適に使用することができる。
【００３３】
特に、請求項９及び１０に記載の発明によれば、容器に封入される溶液中の抗ＣＤ３抗体の総量を特定の範囲とするので、抗ＣＤ３抗体の存在量が少なくてＴリンパ球が活性化されないこと防止できると同時に、抗ＣＤ３抗体の存在量が多くて細胞に対し毒性を生じ、細胞増殖が低下することを防止し易い。
【００３４】
請求項１１に記載の発明によれば、容器本体の補助収容物と接する面がポリエチレンからなるので、シーラント層である可撓性フィルムの内面をポリエチレンとする事ができ、容器本体のシール強度、例えばフィルムとフィルム、フィルムとポートのシール強度が良好で、耐衝撃強度等を向上できる。特に、抗ＣＤ３抗体を用いる場合、２〜８℃の冷蔵庫保管が必要である為、低温時の耐衝撃性にも優れているポリエチレンを選択することで液漏れしにくい容器とすることができる。更に、添加剤を極力控えたポリマーグレードを選定する事により、細胞に対して安全性の高い容器を作製することができる。
【００３５】
請求項１２に記載の発明によれば、容器本体がガスバリア性及び／又は水蒸気バリア性の高い包装材で包装される事により、容器本体の収容部の酸素濃度や湿度を長期的に安定させる事が出来る。
【００３６】
請求項１３に記載の発明によれば、細胞培養容器と細胞培養用培地を封入した培地用容器が接続されており、使用時に連通可能である事から、大気に触れる事無く、無菌的な操作で一部の培地を容易に移行することができ、無菌保証を確保し易い。
【００３７】
請求項１４に記載の発明によれば、閉鎖系細胞培養容器と培地用容器とがガスバリア性及び／又は水蒸気バリア性の高い包装材で包装される事により、容器本体の収容部や培地用容器内の酸素濃度や湿度を長期的に安定させる事が出来る。
【００３８】
請求項１５に記載の発明によれば、容器本体の収容部に補助収容物を封入し、対向する平面状容器壁を外側から厚さ方向に押圧したり、収容部内の気体を吸引して収容部を平坦化することにより、補助収容物を対向する平面状容器壁の少なくとも一方の内面に面状にするので、少ない量の補助収容物で収容部の内面の広い範囲に補助収容物を面状にすることが可能である。そのため、収容部に導入される細胞の足場となるタンパク質や収容部に導入される細胞を活性化するタンパク質などの無駄を十分に抑制することができる。
【００３９】
請求項１６に記載の発明によれば、  容器本体の収容部に抗ＣＤ３抗体を含む補助収容物を封入し、対向する平面状容器壁を外側から厚さ方向に押圧したり、収容部内の気体を吸引して収容部を平坦化することにより、補助収容物を対向する平面状容器壁の少なくとも一方の内面に面状にすると共に抗ＣＤ３抗体を固相化し、洗浄液を注入して抗ＣＤ３抗体の非固相化分を排出するので、抗ＣＤ３抗体を含む補助収容物を少ない量で使用して、収容部の内面の広い範囲に抗ＣＤ３抗体を固相化することが可能である。そのため、固相化後に、洗浄液で排出される抗ＣＤ３抗体の量を少なく抑えることができ、抗ＣＤ３抗体の無駄を抑制することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
以下、この発明の実施の形態について説明する。
［実施の形態１］
図１（ａ）、（ｂ）に、本実施の形態１の閉鎖系細胞培養容器としての抗ＣＤ３抗体封入容器（以下、本容器）を示す。
図において、符号１０は容器本体であり、一対の対向する平面状容器壁１１、１２間に密封状の収容部１３が形成され、上端に本容器を吊るす為の懸垂孔１５が設けられると共に、下端に収容部１３の内外を連通可能な２つのポート１７、１９が設けられている。
【００４１】
この実施の形態では、収容部１３は可撓性フィルムからなる一対の平面状容器壁１１、１２から形成されており、図１（ｂ）に示されるように、一対の平面状容器壁１１、１２が略全面において接するように対向配置されて、周縁で接合されている。
本容器で使用する可撓性フィルムは、ポリエチレン、ポリプロピレン、塩化ビニル、エチレン―酢酸ビニル共重合体等の熱可塑性樹脂よりなり、内容物の増減により変形できるフィルムであれば任意に使用可能であるが、細胞培養時の酸素を確保する為に、酸素透過度が２５℃環境下において２０００ｃｃ以上／ｍ２・ｄａｙ・ＡＴＭのフィルムが好ましい。本実施の形態では、ガス透過性を有するポリエチレンを用いている。
【００４２】
一方のポート１７は、充填ポートとして使用されるもので、充填チューブ構成体２１が装着されている。この充填チューブ構成体２１には、ポート１７と接続する為の接続口２３と、培養する細胞及び培地を含む培養混合物を導入したり、他バッグと連結する為の連結チューブ２４及びその端部の連結口２５と、収容部１３へ抗ＣＤ３抗体含有液を注入する為等の注入チューブ２７及びその端部の注入口２９とを有している。連結口２５は使用可能に閉塞されると共に剥離可能なフィルム等の保護部材３１により密封されている。注入チューブ２７は溶断して密封可能な熱可塑性樹脂からなり、連結口２５は密封されていれば、特に制限されず、輸液、血液バッグ等で使用されているものが使用可能である。
【００４３】
他方のポート１９は、培養状態を確認する為のサンプリングポートとして使用される。このサンプリングポート１９は連結口２５と同様に密封されていれば、特に制限されず、輸液、血液バッグ等で使用されているものが使用可能である。例えば、ゴムにより形成された封止栓とキャップとからなり封止栓をポートとキャップで挟み密封状態としたものが挙げられる。
これらのポート１７、１９は、可撓性フィルムと溶着されるため、ポリエチレン、ポリプロピレン等の熱可塑性樹脂により成形されており、該可撓性フィルムと同一素材が好ましく、本実施形態では、ポリエチレンにより成形されたポートを使用している。
【００４４】
本容器は、このような容器本体１０の収容部１３に補助収容物を収容して面状に存在させた状態で構成されている。本実施形態では、補助収容物として、収容部に導入される細胞を活性化するタンパク質である抗ＣＤ３抗体が一対の平面状容器壁１１、１２の両内面に固相化されて面状に収容されている。ここでは、対向する平面状容器壁１１、１２間が全面において略接触して配置されているため、収容部１３から気体が完全に脱気された状態、或いは、収容部１３の概ねの気体が抜かれている状態となっており、抗ＣＤ３抗体含有液は収容部１３に液密状に封入されている。
【００４５】
このような抗ＣＤ３抗体封入容器を製造するには、上記のような容器本体１０を準備した後、抗ＣＤ３抗体を含有する溶液またはゲルを注入口２９から収容部１３に注入し、必要により、注入口２９から気体を導入して、注入チューブ２７内に残留する抗ＣＤ３抗体含有液を収容部１３内に押出し、その後、対向する平面状容器壁１１、１２を外側から厚さ方向に押圧したり、収容部１３内の気体を吸引するなどにより、収容部１３を平坦化する。これにより、抗ＣＤ３抗体を含有する溶液またはゲルを対向する平面状容器壁１１、１２の内面に面状にする。必要により静置して抗ＣＤ３抗体の固相化を促進する。
そして、注入口２９から収容部１３に、リン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）等の洗浄液を注入し、抗ＣＤ３抗体を含有する溶液と接触、混合して注入口２９から排出することにより、収容部１３内に固相化されずに浮遊している抗ＣＤ３抗体の非固相化分を排出して除去する。その後、必要により収容部１３内の気体を吸引し、注入チューブ２７を溶断部３０で溶断密封することにより、抗ＣＤ３抗体を封入して本容器を製造する。
この製造においては、抗ＣＤ３抗体を含有する溶液またはゲルを対向する平面状容器壁１１、１２の内面に面状にすることにより、抗ＣＤ３抗体の固相化のための静置や非固相化分の排出の処理を行うことなく、抗ＣＤ３抗体封入容器を製造してもよい。その場合、抗ＣＤ３抗体封入容器の製造後から使用時までの間に抗ＣＤ３抗体が固相化されることができ、製造を容易にできる。必要により使用前に上記のような洗浄を行うことも可能である。
【００４６】
このような抗ＣＤ３抗体封入容器を使用して細胞を培養するには、抗ＣＤ３抗体が固相化された状態で、培地にＴリンパ球等の培養対象となる細胞が混合された培養混合物を連結口２５から収容部１３内に導入し、その培養混合物を収容部１３に収容した状態のまま所定の培養条件下で静置することにより行う。
このとき、この実施形態では、収容部１３には気体が実質的に存在せず、対向する平面状容器壁１１、１２の両内面に培養混合物が接触した状態で培養が行われる。また、培養期間中には、適宜連結口等から培地が補充されてもよい。そして、所定期間経過後に培養を完了する。
【００４７】
以上のような本容器では、ポート１７、１９を有する容器本体１０の密封状の収容部１３内に、抗ＣＤ３抗体が封入されているので、大気中に開放する事無く、ポート１７より培養する細胞を接種することができ、無菌保障が容易であり、細菌等によるコンタミネーションを生じ難い。
また、容器本体１０が、平面状容器壁１１、１２が可撓性フィルムからなるので、容器壁１１、１２が変形自在であり、収容部１３の容積変化が容易である。そのため、抗ＣＤ３抗体を固相化する際、容器壁１１、１２を押圧して収容部１３の容積を小さくするように変形させれば、収容部１３内の抗ＣＤ３抗体を含有する溶液を移動させて、平面状容器壁１１、１２の広い範囲に接触させることができ、より少ない収容量で平面状容器壁１１、１２内面の広い範囲に容易に接触させることが可能で、面状に収容させることが容易である。その結果、使用する抗ＣＤ３抗体の量、特に、洗浄液と共に排出される抗ＣＤ３抗体の量を少なく抑えることができ、無駄を抑えて容易に収容することが可能である。
【００４８】
更に、これにより抗ＣＤ３抗体が平面状容器壁１１、１２に沿って面状に広い範囲に配置されるため、細胞培養時に収容部１３に充填される培養混合物の体積に対して補助収容物を広い接触面積で接触させることが可能で、細胞の培養を促進することができる。
しかも、抗ＣＤ３抗体が収容部１３に液密状に封入されており、対向する平面状容器壁１１、１２の両内面に存在するから、培養時には、培養液等の培養混合物が対向する平面状容器壁１１、１２の両内面に存在する抗ＣＤ３抗体に接触することができ、フラスコやシャーレ等のように片面で補助収容物に接触させて培養する場合に比べ、細胞の伸展、増殖及び分化の促進効率が良好である。
【００４９】
［実施の形態２］
図２に、抗ＣＤ３抗体封入容器を有する閉鎖系細胞培養用キットを示す。
この細胞培養用キットは、３つのポート１７、１８、１９を有する他は図１と同様の抗ＣＤ３抗体封入容器２０と、細胞培養用培地を封入した培地用容器４０とを備え、抗ＣＤ３抗体封入容器２０と培地用容器４０とが使用時に連通可能な連通チューブ３７で接続されている。
抗ＣＤ３抗体封入容器２０は、図１と同じく充填用のポート１７及びサンプリング用のポート１９の他に、培地を封入した培地用容器４０を連結する為の連結用のポート１８を別に備えている。この連結用のポート１８の収容部１３側の端部には破断により開封可能なクリックチップ１８ａが備えられている。その他は、図１の容器と同一の符号を付している。
培地用容器４０は、可撓性容器壁４１、４２間に密封状の培地収容部４３が形成され、内部に培地が封入されている。また、上端には懸垂孔４５が設けられ、下端には培地収容部４３の内外を連通可能な２つのポート４７、４９が設けられている。
可撓性容器壁４１、４２及びポート４７、４９は、抗ＣＤ３抗体封入容器２０の平面状容器壁１１、１２及びポート１７、１９と同一の材料により形成することができる。
【００５０】
ポート４７は抗ＣＤ３抗体封入容器２０と連結する連結ポートであり、ポート４９は必要により使用されるポートである。連結ポート４７には、収容部４３内の端部に破断により開封可能なクリックチップ４７ａが設けられている。また、この連結ポート４７と抗ＣＤ３抗体封入容器２０の連結ポート１８との間は、連結チューブ３７により無菌的に連結されて、一時的に流路を閉塞することが可能なクレンメ６３が取付けられている。
【００５１】
更に、この実施形態では、抗ＣＤ３抗体封入容器２０と培地用容器４０とは、それぞれバリア性包材６５、６７により密封被覆されている。バリア性包材６５及び６７は、酸素バリア性及び水蒸気バリア性の高い包装材からなる。なお、細胞培養用キット全体が、包材６９により密封被覆されていてもよい。
【００５２】
このような細胞培養用キットを使用して細胞を培養するには、バリア性包材６７を開封せずに、バリア性包材６５を開封して抗ＣＤ３抗体封入容器２０を露出させる。
その後、クリックチップ１８ａ及び４７ａを開封して、連結チューブ３７により両容器２０、４０間を連通させ、培地用容器４０から所望量の培地を抗ＣＤ３抗体封入容器２０に導入し、クレンメ６３により連結チューブ３７を閉塞する。このとき、実施の形態１と同様に、抗ＣＤ３抗体封入容器２０は既に抗ＣＤ３抗体が固相化された状態となっている。
そして、Ｔリンパ球等の培養対象となる細胞が混合された培養混合物を連結口２５から収容部１３内に導入し、その培養混合物を収容部１３に収容した状態のまま所定の培養条件下で静置することにより培養を行う。このとき、実施の形態１と同様に、対向する平面状容器壁１１、１２の両内面に培養混合物が接触した状態で培養が行われる。
所定期間経過後に、クレンメ６３を開放することにより、培地を補充し、再びクレンメ６３により閉塞して、更に、培養を継続する。
このような操作を繰返して、所定期間経過後に培養を完了する。
【００５３】
このような細胞培養用キットでは、図１と同様の抗ＣＤ３抗体封入容器２０を用いているので、同様の効果が得られる。
それと共に、抗ＣＤ３抗体封入容器２０と培地用容器４０が接続されており、使用時にクレンメ６３を外せば連通可能である事から、大気に触れる事無く、無菌的な操作で一部の培地を容易に移行することができ、確実な無菌保証を実現できる。
その際、抗ＣＤ３抗体封入容器２０の収容部１３に抗ＣＤ３抗体が密封状に封入されていると共に、培地用容器４０に培地が密封状に収容されていると、培地を移行させても、抗ＣＤ３抗体封入容器２０の収容部１３内で、培養混合物を平行状容器壁１１、１２の両内面に接触させておくことができ、抗ＣＤ３抗体との接触面積を維持することができる。
また、各容器２０、４０がバリア性包材６５、６７で包装されているので、抗ＣＤ３抗体封入容器２０収容部１３や培地用容器４０の収容部４３内の抗ＣＤ３抗体や培地を酸素や湿度による劣化から長期的に安定に保持する事が出来る。
特に、各容器２０、４０毎にバリア性包材６５、６７で包装していると、抗ＣＤ３抗体封入容器２０を使用して培養開始後にも、培地用容器４０に収容された培地を安定に保持することが可能である。
【００５４】
なお、本発明は、上記実施の形態１、２に限定されることなく適宜変更可能であり、例えば、上記では、容器２０の収容部１３に抗ＣＤ３抗体を固相化して封入したが、固相化のための処理を行うことなく、抗ＣＤ３抗体を含有する液、ゲル等を面状に封入してもよい。このようにすると、容器本体１０に液又はゲルが面状に封入された状態で保管されるため、使用時までに静置等の特別な処理を施すことなく平面状容器壁１１、１２の内面に抗ＣＤ３抗体を固相化することができ、好ましい。その一方で、補助収容物を収容部に流体状態又はゲルのような半流動体状態で多量に存在させず、湿潤状態乃至は乾燥状態で存在させることも可能である。
また、収容部１３に導入される細胞を活性化できる他のタンパク質や収容部１３に導入される細胞の足場となるタンパク質を固相化して、或いは固相化することなく面状に封入して用いることも可能である。その際、ゲル状の場合であっても、抗ＣＤ３抗体を含有する溶液を収容部１３に供給した後、平面状容器壁１１、１２の広い範囲に広げたのと同様に、平面状容器壁１１、１２を外側から押圧して容積変化させることにより、容器壁１１、１２のより広い範囲に広げることが可能である。
さらに、タンパク質に限らず、培養する細胞についても、閉鎖系細胞培養容器内で培養できれば、当然に選択可能である。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例について説明する。
［実施例１］
（閉鎖系容器の準備）
図１に示す抗ＣＤ３抗体封入容器の容器本体１０を用いた。
（抗ＣＤ３抗体溶解液の注入）
オルソクーロンＯＫＴ３注（ヤンセンファーマ株式会社製）をダルベッコりん酸緩衝生理食塩水溶液（以下、ＰＢＳ（−））で２５μｇ／ｍＬに調整し、２ｍＬをシリンジで抜き取り、注入口２９より本容器内部へ注入し、同様に、シリンジを用いて、２０ｃｃの空気を注入口２９より注入し、チューブ２７内に残る抗ＣＤ３抗体を本容器内部へ押し出した。
【００５６】
（抗ＣＤ３抗体の封入）
注入口２９を本容器より高い状態に位置し、シリンジで本容器内部のエアーをゆっくり抜き取り、抜き取った時点で、注入口２９の先端部付近を折り曲げ、一時的に気密状態とした後、シリンジを注入口２９から外し、溶断部３０にて溶断することにより、注入チューブ３０を密封した。
【００５７】
（抗ＣＤ３抗体の固相化）
対向する平面状容器壁１１、１２を数回なぞり、本容器内部へ充填された抗ＣＤ３抗体溶液を本容器内部の全面に延ばし、薄膜とした後、室温で１時間静置した。
【００５８】
（リンパ球の培養）
健常者の末梢血から分離した末梢血単核球（５×１０６ｃｅｌｌｓ）に培養培地（コージンバイオ社製、ＫＢＭ５４０、ＩＬ２含有、以下ＫＢＭ５４０という）と１％自己血清とを添加し、５０ｍＬとした後、シリンジを用いて、抗ＣＤ３抗体を固相化した本容器内へ連結口２５より接種し、インキュベータ内で、５％炭酸ガス、３７℃、飽和湿度下で培養を行った。
【００５９】
さらに３日及び５日後に培養培地ＫＢＭ５４０を各５０ｍＬづつ加え、培養を行い、７日後の容器内の細胞数量は、６３×１０６ｃｅｌｌｓであった。また、比較で行った開放系フラスコの培養方法では、５５×１０６ｃｅｌｌｓであった。
この実施例１により、開放系のフラスコに比べて細胞増殖性良好で、且つ、微生物等に汚染される事無い、操作が容易な閉鎖系細胞培養容器を得た。
【００６０】
［実施例２］
実施例１の（閉鎖系容器の準備）から（抗ＣＤ３抗体の固相化）まで、同様の操作を行い、下記の操作を行った。
（容器内部の洗浄）
処理後の固相化しない抗ＣＤ３抗体溶解液を抜き取った後、ＰＢＳ（―）で２回洗浄した。
（リンパ球の培養）
実施例１の（リンパ球の培養）と同一操作を行い、培養した細胞数量を確認したところ、培養開始後７日後の容器内の細胞数量は、８９×１０６ｃｅｌｌｓであった。比較で行った開放系のフラスコの培養方法では、５５×１０６ｃｅｌｌｓであった。
この実施例２により、抗ＣＤ３抗体を固相化処理した後の抗ＣＤ３抗体溶解液を除去する事で、細胞増殖性がさらに向上する事を確認した。
【００６１】
［実施例３］
次に、図２に示す抗ＣＤ３抗体封入容器２０と培地（ＫＢＭ５４０）が封入された培地用容器４０とを組合せたキット品を準備した。
【００６２】
健常者の末梢血から分離した末梢血単核球と１％自己血清をシリンジに充填し、包材６９及びバリア性包材６５を脱離した後、抗ＣＤ３抗体封入容器２０のサンプリングポート１９から容器内部へ接種し、また、抗ＣＤ３抗体封入容器２０の閉塞部であるクリックチップ１８ａ及び培地用容器４０の閉塞部であるクリックチップ４７ａを連通した後、クレンメ６３を開口し、培地用容器４０内の培地を培養容器へ約５０ｃｃ移行した後、クレンメ６３を閉塞し、両容器２０、４０を連結させたまま、インキュベータ内で、５％炭酸ガス、３７℃、飽和湿度下で７日間培養を行った。
【００６３】
７日後、培地用容器４０を被覆しているバリア性包材６７を脱離した後、抗ＣＤ３抗体封入容器２０と培地用容器４０を閉塞しているクレンメ６３を開口し、抗ＣＤ３抗体封入容器２０内に封入されている培養して増殖した細胞を含む培養混合物全てを培地用容器４０へ移行させた後、再度クレンメ６３で閉塞し、インキュベータ内で、５％炭酸ガス、３７℃、飽和湿度下で数日間培養を続け、さらに、細胞を増殖させる事が出来た。
【００６４】
［実施例４］
実施例３では、抗ＣＤ３抗体封入容器２０で行う初期の培養に必要な培地を、連結している培地用容器４０より一部移行させた初期培養を行うが、実施例４として、初期培養に必要な培地は、他で準備し、包材６９及びバリア性包材６５を脱離した後、末梢血単核球、１％自己血清、ＫＢＭ５４０の混合液５０ｍＬをシリンジで連結口２５から抗ＣＤ３抗体封入容器２０内へ接種した後、７日間培養後、培地用容器４０のバリア性包材６７を脱離し、培地用容器４０の連結ポート４７の閉塞部のクリックチップ４７ａを開口した。
抗ＣＤ３抗体封入容器２０内部の含む培養混合物全てを培地用容器４０へ移行させた後、クレンメ６３で閉塞し、インキュベータ内で、５％炭酸ガス、３７℃、飽和湿度下で数日間培養を続け、細胞を増殖させる事が出来た。
実施例３及び４では、抗ＣＤ３抗体により活性化した細胞を微生物等で汚染される事無く、無菌状態のまま、培地へ移行する事ができるだけでなく、培地用容器４０をバリア性フィルム６７で被覆する事により、抗ＣＤ３抗体封入容器２０内部で細胞培養を行っている期間の酸素による培地劣化を防止する事ができた。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】本発明の実施の形態１の閉鎖系細胞培養容器としての抗ＣＤ３抗体封入容器を示し、（ａ）は正面図、（ｂ）は（ａ）のＡ−Ａ断面模式図である。
【図２】本発明の実施の形態２の閉鎖系細胞培養用キットを示す正面図である。
【符号の説明】
【００６６】
１０  容器本体
１１、１２  平面状容器壁
１３  収容部
１７、１８、１９  ポート
２０  抗ＣＤ３抗体封入容器
３７  連結チューブ
４０  培地用容器
【図１】
2007175028.tif 000003
【図２】
2007175028.tif 000004