(57)【要約】【課題】血清を含有しないウイルスベクターを取得する方法、該方法に使用可能なウイルス産生細胞培養用の無血清培地を提供すること。【解決手段】血清アルブミンが添加された無血清培地を使用してウイルス産生細胞の培養を行うことにより、血清含有培地と同等の状態で前記細胞を培養し、十分な力価のウイルスベクターを製造することができる。また、前記培地で培養したウイルス産生細胞より調製されたウイルスベクターは、従来のベクターに遜色ない遺伝子導入効率を示す。前記の培地は遺伝子治療、ならびにその研究に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス産生細胞の培養に使用される無血清培地であって、血清アルブミンが添加されてなることを特徴とする培地。
【請求項２】
血清アルブミンがヒト血清アルブミンである請求項１記載の培地。
【請求項３】
血清アルブミンを０．０５〜１％（重量比）の濃度で含有する請求項１または２記載の培地。
【請求項４】
インターロイキン−２を含有する請求項１〜３いずれか１項に記載の培地。
【請求項５】
インターロイキン−２を１０〜１０００ＪＲＵ／ｍＬの濃度で含有する請求項４記載の培地。
【請求項６】
カルシウムを１５０〜７００ｍｇ／Ｌの濃度で含む請求項１〜５いずれか１項に記載の培地。
【請求項７】
上皮細胞成長因子を含有する請求項１〜６いずれか１項に記載の培地。
【請求項８】
ウイルス産生細胞が遺伝子組換えレトロウイルスベクター産生細胞である請求項１〜７いずれか１項に記載の培地。
【請求項９】
目的物質の製造方法であって、所望の目的物質を産生する能力を有する細胞を請求項１〜８いずれか１項に記載の培地で培養する工程を含有することを特徴とする目的物質の製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜８いずれか１項に記載の培地に目的物質産生細胞の保存物を接種して培養を開始することを特徴とする請求項９記載の目的物質の製造方法。
【請求項１１】
目的物質が遺伝子組換えレトロウイルスベクターである請求項９または１０に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子治療の研究または臨床における遺伝子治療に使用されるウイルス産生細胞、特に遺伝子組換えレトロウイルスベクターの産生、製造に必要なレトロウイルス産生細胞の培養に有用な新規な組織培養用無血清培地、およびその培地を使用したウイルス、特に遺伝子組換えレトロウイルスベクターの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
先天性遺伝子疾患の治療のほか、癌や感染症の治療を目的としてウイルスベクターを用いた遺伝子治療が開発されていると共に、臨床的に多くの試験が実施されている。特に、レトロウイルスベクターやアデノウイルスベクターを利用した遺伝子治療について多くの試みがなされている。
【０００３】
目的遺伝子を組み込むために使用される遺伝子組換えレトロウイルスベクター作製のために使用されるＤＮＡベクターの例としては、野生型モロニー白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）のゲノムからウイルス粒子構造タンパク質遺伝子（ｇａｇ，  ｐｏｌ，  ｅｎｖ）が除去されたＬＸＳＮ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｍ２８２４８）やＭＦＧ等がある。これらの他にさらに改変したベクターがヒトを対象とした臨床試験に使用されている。
【０００４】
遺伝子組換えレトロウイルスベクターの製造は、目的遺伝子を挿入したＤＮＡベクターのパッケージング細胞（Ｐｓｉ-Ｃｒｉｐ、ＧＰ＋Ｅ８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２、ＰＧ１３等）へのトランスフェクションにより誘導されたプロデューサー細胞を培養し、目的のウイルスベクターを含有する上清を採取することにより実施される。さらに、この上清を再度パッケージング細胞に感染させる等の方法で、感染細胞の中から安定した目的遺伝子発現用のレトロウイルスベクターを安定に産生する産生細胞クローンを選択することも行われる。このような工程で、マスターセルバンク（ＭＣＢ）、そしてワーキングセルバンク（ＷＣＢ）が調製され、遺伝子治療用の遺伝子組換えレトロウイルスベクターが安定して製造される。
【０００５】
レトロウイルス産生を安定して行わせるためには、レトロウイルス産生細胞の培養は極めて重要である。通常、レトロウイルス産生細胞は血清を含有する培地中で培養し、その培養物よりウイルス含有上清の採取が行われるが、馴化という工程で培地中の血清濃度を徐々に減らし、無血清で増殖可能な細胞を選択することにより無血清での培養に成功している例も報告されている。しかし、一般的に無血清培地でのレトロウイルス製造は非常に難しい（非特許文献１）。
【０００６】
【非特許文献１】モレキュラー・バイオテクノロジー（Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、第１５巻、第２４９−２５７頁（２０００）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
動物血清は未知のウイルスを含有する可能性がある等、その使用には多くのリスクがあるため、レトロウイルス産生細胞の培養には無血清培地の使用が望ましい。このため、臨床的にヒトへ投与される組換えレトロウイルスベクターの製造においては、最後のウイルス産生の工程においてのみ、動物血清を含有しない無血清培地が使用されることが多い。さらに、血清のロットにより組換えレトロウイルスベクターの生産性は大きく変動するため、使用する血清のロットの選択は極めて重要である。一方、無血清培地を使用する場合にはそのような生産性の変動を抑えることが可能であり、その必要性は非常に高い。ウイルス産生用の無血清培地にはいくつかの市販品があるが、血清を添加した培地に替わりうるものはない。血清を含有しないレトロウイルスベクターを調製するため、血清添加培地で培養後、ウイルス採取の最終工程で、Ｘ−ＶＩＶＯ１５（キャンブレックス社製）等の無血清培地に変更した培養を行った後にウイルス上清を回収する方法、馴化により無血清で培養可能な細胞を選択する方法、等の工夫が行われているが、十分な効果を上げるには至っていない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは鋭意研究の結果、血清アルブミンを含有させた無血清培地ではレトロウイルス産生細胞が良好な状態で成育しうることを明らかにした。さらに前記培地を使用することにより高力価のレトロウイルス上清を採取できることを見出し、本発明を完成させた。
本発明を概説すれば、本発明は
［１］ウイルス産生細胞の培養に使用される無血清培地であって、血清アルブミンが添加されてなることを特徴とする培地、
［２］血清アルブミンがヒト血清アルブミンである［１］の培地、
［３］血清アルブミンを０．０５〜１％（重量比）の濃度で含有する［１］または［２］の培地、
［４］インターロイキン−２を含有する［１］〜［３］の培地、
［５］インターロイキン−２が１０〜１０００ＪＲＵ／ｍＬの濃度で含有する［４］の培地、
［６］カルシウムを１５０〜７００ｍｇ／Ｌの濃度で含む［１］〜［５］の培地、
［７］上皮細胞成長因子を含有する［１］〜［６］の培地、
［８］ウイルス産生細胞が遺伝子組換えレトロウイルスベクター産生細胞である［１］〜［７］の培地、
［９］目的物質の製造方法であって、所望の目的物質を産生する能力を有する細胞を［１］〜［８］の培地で培養する工程を含有することを特徴とする目的物質の製造方法、
［１０］［１］〜［８］の培地に目的物質産生細胞の保存物を接種して培養を開始することを特徴とする［９］の目的物質の製造方法、
［１１］目的物質が遺伝子組換えレトロウイルスベクターである［９］又は［１０］の製造方法、に関する
【発明の効果】
【０００９】
本発明の培地を使用することにより、血清を含有しない遺伝子組み換えレトロウイルスベクター、ならびに前記ベクターを含有する医療用組成物を容易に調製することが可能となる。前記組成物は遺伝子治療の分野で非常に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の第１の態様は、ウイルス産生細胞の培養に適した無血清培地に関する。
本培地は、ウイルス産生細胞の培養に必要な成分を混合して作製された血清を含有しない基本培地に血清アルブミンが添加されてなるものである。
【００１１】
前記の基本培地の成分としては、アミノ酸、糖類、有機酸のようなエネルギー源、ビタミン類、ｐＨ調整のための緩衝成分、無機塩類等があげられる。また、フェノールレッドのようなｐＨ指示薬を含有していてもよい。このような基本培地として血清を含有しない公知の培地、例えば、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ハムＦ１２培地等を使用してもよく、これらはインビトロジェン社、シグマ社等から市販品として入手することができる。Ｏｐｔｉ−ＰｒｏＳＦＭ、ＶＰ−ＳＦＭ、２９３ＳＦＭＩＩ（いずれもインビトロジェン社製）、ＨｙＱ  ＳＦＭ４ＭｅｇａＶｉｒ（ハイクローン社製）等の市販の無血清培地も使用することができる。
【００１２】
前記の血清を含有しない培地に、血清アルブミンを添加し、本発明の培地を作製することができる。特に本発明を限定するものではないが、本発明には、好ましくは血漿分画物であるヒト血清アルブミン、例えばヒトアルブミン製剤が使用される。前記血清アルブミンの添加濃度としては、最終０．０５−１％、好ましくは０．１−０．３％である。市販のヒト血清アルブミン製剤には安定化剤として、Ｎ−アセチルトリプトファンナトリウム及びカプリル酸ナトリウムが添加されているものがあり、本発明を特に限定するものではないが、これらが無血清培地に含有されていてもよい。その含有量としては、Ｎ−アセチルトリプトファンナトリウムは１０−２００ｍｇ／Ｌ、好ましくは、４０−５０ｍｇ／Ｌであり、カプリル酸ナトリウムは１０−１００ｍｇ／Ｌ、好ましくは２５−３０ｍｇ／Ｌである。さらに、本発明の培地としてはインターロイキン２、好ましくは、遺伝子組換えヒトインターロイキン２が添加されていることが好ましい。インターロイキン２の添加濃度としては、最終１０−１０００ＪＲＵ／ｍＬ、好ましくは５０−５００ＪＲＵ／ｍＬである。さらに、本発明の培地には、カルシウムを塩化カルシウム相当として１５０−７００ｍｇ／Ｌ、好ましくは３００−５００ｍｇ／Ｌの濃度で含有させることができる。
【００１３】
本発明の培地にはトランスフェリン、インシュリン、上皮細胞成長因子等の精製タンパク質（天然型又は組換え型）、オレイン酸、プロゲステロン等を加えることにより細胞の生育性および／または産生されるウイルスの力価を向上させることもできる。上皮細胞成長因子の場合、２−３０ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは５−２０ｍｇ／Ｌとなるように培地に添加される。
【００１４】
本発明の培地により培養されるウイルス産生細胞には特に限定はないが、好適にはレトロウイルスベクター産生細胞の培養に本発明の培地が使用される。
【００１５】
本発明の第２の態様は、目的物質、例えばウイルスベクターの製造方法に関する。本発明の好適な態様では、遺伝子組換えウイルスベクターを産生させるためのウイルス産生細胞のＭＣＢやＷＣＢのような凍結保存物を適切な手段で解凍後、本発明の無血清培地に直接植えて培養を開始し、前記細胞を増殖させることができる。組換えウイルスベクターの大量調製のためには、本発明の無血清培地にウイルス産生細胞を適応させる工程を加えることが好ましい。前記の工程は、例えば１０％血清を含む培地で培養されていた細胞を無血清培地に適応させるために、無血清培地に血清を５％となるように添加し培養を行う。２回から４回細胞の植え継ぎを行い馴化した後、今度は血清を２％に落とした無血清培地を用いて同様の馴化培養を行う。このように段階的に血清濃度を減らし、最終無血清培地に適応させていく。
【００１６】
本発明により製造されるウイルスベクターに特に限定はないが、特に好適にはレトロウイルスベクター、すなわち遺伝子組み換えレトロウイルスベクターが例示される。
【００１７】
本発明により製造されるレトロウイルスベクターには特に限定はない。通常、無制限な感染、遺伝子導入を防止された複製能欠損レトロウイルスベクターが本発明に使用される。公知の複製能欠損レトロウイルスベクターとしては、ＭＦＧベクターやα−ＳＧＣベクター（国際公開第９２／０７９４３号パンフレット）、ｐＢａｂｅ［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第１８巻、第３５８７〜３５９６頁（１９９０）］、ｐＬＸＩＮ（クロンテック社製）、ｐＤＯＮ−ＡＩ（タカラバイオ社製）等のレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター［ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来ベクター、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）由来ベクター等］あるいはこれらを改変したベクターが例示される。
【００１８】
前記のレトロウイルスベクターには任意の外来遺伝子、例えばポリペプチド（酵素、成長因子、サイトカイン、レセプター、構造タンパク質等）、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、デコイ、ＲＮＡ干渉を起こすＲＮＡ等をコードする遺伝子を保持させることができる。前記の外来遺伝子の発現の制御のため、適当なプロモーター、エンハンサー、ターミネーターやその他の転写調節要素がベクターに挿入されていてもよい。
【００１９】
本発明では、前記のレトロウイルスベクターをコードするＤＮＡをレトロウイルスパッケージング細胞株に導入して作製されたレトロウイルス産生細胞を本発明の培地中で培養し、レトロウイルスベクターの製造が実施される。
【００２０】
前記のパッケージング細胞株には特に限定はなく、公知のパッケージング細胞株、例えばＰＧ１３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０６８６）、ＰＡ３１７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０７８）、ＧＰ＋Ｅ−８６やＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２（米国特許第５，２７８，０５６号）、Ｐｓｉ−Ｃｒｉｐ［Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、第８５巻、第６４６０〜６４６４頁（１９８８）］等を使用することができる。また、トランスフェクション効率の高い２９３細胞や２９３Ｔ細胞にレトロウイルス粒子産生に必要な遺伝子が搭載されたパッケージングプラスミド（レトロウイルスパッケージングキット：タカラバイオ社製、等）を導入してレトロウイルス産生細胞を作製することもできる。
【００２１】
レトロウイルス産生細胞の培養は、通常の培養条件で行うことができる。例えば湿度９５％、ＣＯ２濃度５％での培養が例示されるが、本発明はこのような条件に限定されるものではない。培養は、例えば３０〜３７℃で実施できるが、所望の細胞の増殖、レトロウイルスベクターの産生が達成できる範囲で前記の範囲以外の温度で実施してもよい。本発明では、こうして得られる培養液より上清を採取し、レトロウイルスの製造が実施される。レトロウイルスベクターは前記の上清のまま、フィルターろ過されたろ液、公知の方法により濃縮もしくは精製されたレトロウイルスベクターとして製造され、適切な方法、例えば凍結して使用するまで保存される。上記の、本発明の培地を用いたレトロウイルス産生細胞の培養により、従来より高タイターのレトロウイルスベクターを得ることができる。
【実施例】
【００２２】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２３】
実施例１  培地の調製
市販のＧＴ−Ｔ５０３培地（タカラバイオ社製）１Ｌに、２５％ヒト血清アルブミン（ブミネート２５％；バクスター社製）を８ｍＬ（ヒト血清アルブミン２ｇ、Ｎ−アセチルトリプトファンナトリウム４２．９２ｍｇ、カプリル酸ナトリウム２６．６ｍｇを含有）添加して、培地Ａを作製した。さらに、培地Ａにインターロイキン２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ；Ｃｈｉｒｏｎ社製）を最終濃度１７５ＪＲＵ／ｍＬになるように添加して、培地Ｂを作製した。
【００２４】
実施例２
１．レトロウイルス  プロデューサー細胞の培養
細胞内領域欠損ヒト低親和性神経成長因子受容体（ΔＬＮＧＦＲ）遺伝子発現マウスレトロウイルス産生細胞（ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２をパッケージング細胞とした）のワーキングセルバンク（ＷＣＢ）を３７℃のウォーターバスにて融解した。細胞融解液を１５ｍＬ遠心チューブに移し、さらに完全培地（１０％ウシ胎児血清（ジェイアールエッチ（ＪＲＨ）社製）を含むＤＭＥＭ培地（キャンブレックス（Ｃａｍｂｒｅｘ）社製））を１０ｍＬ加え遠心処理（５００×ｇ、５分間、２０℃）を行った。遠心後、上清を除去し完全培地（１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地）に懸濁しセルカウントを行った。セルカウント後、１５ｍＬ遠心チューブに１×１０６の細胞数となるように分注し再び遠心処理（５００×ｇ、５分間、２０℃）を行った。遠心して上清を除去後、培地Ａに懸濁し、細胞培養用のＴ２５フラスコ（ＣＥＬＬＢＩＮＤ、コーニング社製）を用いてＣＯ２インキュベーター（３７℃、湿度９５％、ＣＯ２濃度５％）にて培養を行った。このとき比較対照として完全培地を用いた培養を行った。細胞の継代に関しては、完全培地及び培地Ａ共に継代間隔を３日とし、播種細胞密度は２×１０４／ｃｍ２とした。この条件で３継代行った。
【００２５】
２．レトロウイルス上清液の回収
３回目の継代後３日間培養した細胞を、これまでと同様にレトロウイルス回収用に植え継ぎを行った。播種細胞密度は４×１０４／ｃｍ２とし、培養０日目から培養１日目はＣＯ２インキュベーター（３７℃、湿度９５％、ＣＯ２濃度５％）にて培養を行った。培養１日目に、完全培地及び培地Ａを取り除き、新しい培地にそれぞれ交換した。液量はウイルス回収用に０．１ｍＬ／ｃｍ２にあわせ、ＣＯ２インキュベーターの温度を３３℃に下げて培養を行った。培養２日目に、各培養フラスコより上清液を回収し再び完全培地及び培地Ａをそれぞれ補充し培養を行った。上記の回収を３日間連続で行った。回収した培養上清液（１日目、２日目、３日目）は、０．２２μｍのポアサイズのフィルター（ミリポア社製）でろ過し、レトロウイルス上清液として小分け分注後−８０℃保存した。
【００２６】
３．レトロウイルス上清液の遺伝子導入評価
上記のように完全培地及び培地Ａを用いて培養及び回収したレトロウイルス上清液について遺伝子導入効率の測定を行った。完全培地及び培地Ａを用いて回収したレトロウイルス上清液それぞれについて原液、４倍及び８倍希釈液を調製し、さらにそれぞれ最終濃度４μｇ／ｍＬとなるようにプロタミン（持田製薬社製）を添加した。このとき希釈にはそれぞれ完全培地及び培地Ａを用いた。希釈液５００μＬにヒト白血病細胞ＣＥＭ（０．５×１０６細胞）を加え懸濁し、２４穴細胞培養用プレート（旭テクノグラス社製）に移した。その２４穴細胞培養用プレートを遠心処理（３２℃、１０００×ｇ、２時間）した。遠心後、各穴より上清を取り除きＣＥＭ用の培地（１０％血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地「キャンブレックス社（Ｃａｍｂｒｅｘ）」）をそれぞれ加えた。懸濁後、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、湿度９５％、ＣＯ２濃度５％）にて３日間培養を行った。
培養後、レトロウイルスによる遺伝子導入効率を調べるために、レトロウイルスベクターのマーカー遺伝子であるヒト低親和性神経成長因子受容体（ΔＬＮＧＦＲ）の発現を蛍光ラベルされたＬＮＧＦＲ認識抗体を用いて調べた。感染培養後の細胞０．５×１０６をエッペンチューブに移し、遠心処理（４℃、５００×ｇ、５分間）にて細胞を沈殿させた。上清を取り除いた後、沈殿した細胞に１次抗体としてΔＬＮＧＦＲを認識するモノクローナル抗体（ケミコン社製）を０．５μｇ含む１００μＬのＰＢＳ溶液を添加して懸濁後、氷上にて２０分間放置した。この時、非特異的結合（バックグラウンド）を調べるために、アイソタイプコントロールとしてマウスＩｇＧ（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）社製）を用いたサンプル調製も行った。放置後、予め冷やしておいたリン酸バッファー溶液（ＰＢＳ：ギブコ社製）を９００μＬ加え、遠心処理（４℃、５００×ｇ、５分間）にて細胞を沈殿させた。上清を取り除いた後、沈殿した細胞に、１次抗体を認識する２次抗体としてフィコエリトリン（ＰＥ：Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）標識された抗マウスＩｇＧ溶液（ダコ社製）を１００μＬ添加して懸濁後、氷上にて２０分間放置した。放置後、予め冷やしておいたリン酸バッファー液（ＰＢＳ：ギブコ社製）を９００μＬ加え、遠心処理（４℃、５００×ｇ、５分間）にて細胞を沈殿させた。上清を取り除いた後、沈殿した細胞に、３％ホルムアルデヒド液を添加し固定化処理した。固定化後、フローサイトメトリー解析（ＦＣＭ）を行った。
【００２７】
フローサイトメトリー解析はＦＡＣＳキャリバー（ベクトン・ディッキンソン社製）を用いて機器指示書に従い行った。ΔＬＮＧＦＲの発現率の求め方は、ＰＥ検出パラメーターのヒストグラム（ｘ軸：ＰＥの蛍光強度、ｙ軸：細胞数を示す）上で、アイソタイプコントロールによりΔＬＮＧＦＲ非発現細胞の蛍光強度領域を確認後、その領域を含まないΔＬＮＧＦＲ発現細胞の蛍光強度領域を定め、その割合（％）を測定した。測定後、導入効率（ＧＴ％：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）は、下記の数式により求めた。
【００２８】
ＧＴ％  ＝  各サンプルの測定値  −  アイソタイプコントロールの測定値（バックグラウンド）
【００２９】
遺伝子導入効率の測定結果を図１に示す。
図１に示されるように、培地Ａを用いて培養及び回収したレトロウイルス上清液の導入効率は、すべての回収日において完全培地と同等以上の遺伝子導入効率を示した。すなわち、完全培地よりも高タイターのウイルスが得られることが分かった。これらの結果よりワーキングセルバンクから馴化を経ないで培養を行っても、十分に継代及びウイルス回収出来ることが示された。
【００３０】
実施例３
１．レトロウイルスベクターの調製
レトロウイルスベクタープラスミドｐＤＯＧ−ｐｏｌＩＩは以下の手順で作製した。まずｒｓＧＦＰ発現ベクターｐＱＢＩ２５（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．社製）を制限酵素ＮｈｅＩ及びＮｏｔＩで切断し、７７５ｂｐのＧＦＰ遺伝子断片を得た。次にｐＱＢＩ  ｐｏｌＩＩ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．社製）を制限酵素ＮｈｅＩ及びＮｏｔＩで切断してｒｓＧＦＰ−ＮｅｏＲ融合遺伝子を除去し、先に得た７７５ｂｐのｒｓＧＦＰ遺伝子断片を挿入しｐｏｌＩＩプロモーター制御下でｒｓＧＦＰ遺伝子が発現するベクターｐＱＢＩ  ｐｏｌＩＩ（ｎｅｏ−）を得た。ｐＱＢＩ  ｐｏｌＩＩ（ｎｅｏ−）を制限酵素ＸｈｏＩで消化し、ｐｏｌＩＩプロモーター制御下ＧＦＰ発現ユニットを含むＤＮＡ断片を得、その末端をＤＮＡ  ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて平滑化した。レトロウイルスベクタープラスミドｐＤＯＮ−ＡＩ（タカラバイオ社製）を制限酵素ＸｈｏＩとＳｐｈＩで消化して得られたベクター断片４．５８ｋｂｐの末端をＤＮＡ  ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて平滑化したのち、アルカリフォスファターゼ（タカラバイオ社製）を用いて脱リン酸化した。この平滑化したベクターに先の平滑化したｐｏｌＩＩプロモーター制御下ｒｓＧＦＰ発現ユニットを含むＤＮＡ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて挿入し、ｒｓＧＦＰ発現組換えレトロウイルスベクターｐＤＯＧ−ｐｏｌＩＩを得た。
【００３１】
ｐＤＯＧ−ｐｏｌＩＩベクターとＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｅｃｏ（タカラバイオ社製）を用いた一過性のウイルス産生を行い、エコトロピックＤＯＧ−ｐｏｌＩＩウイルスを獲得した。こうして得られたエコトロピックＤＯＧ−ｐｏｌＩＩウイルスを、ＧａＬＶレトロウイルスパッケージング細胞ＰＧ１３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０６８６）にレトロネクチン（タカラバイオ社製）存在下に感染させ、遺伝子導入細胞ＰＧ１３／ＤＯＧ−ｐｏｌＩＩを獲得した。
【００３２】
２．レトロウイルベクター産生能の評価
ＰＧ１３／ＤＯＧ−ｐｏｌＩＩ細胞を培地Ａ又は完全培地を用いて実施例２と同様の方法で培養し、レトロウイルス上清液を調製した。得られたレトロウイルス上清液を用いてヒト繊維芽肉種細胞ＨＴ１０８０に遺伝子導入を行った。
【００３３】
完全培地及び培地Ａを用いて培養３日目に回収したレトロウイルス上清液について原液、４倍、２０倍及び１００倍希釈液を調製し、最終濃度４μｇ／ｍＬとなるようにプロタミン（持田製薬社製）を添加した。このとき希釈にはそれぞれ完全培地及び培地Ａを用いた。希釈液１ｍＬを予め感染前日に撒いておいたヒト繊維芽肉種細胞ＨＴ１０８０（１×１０５細胞）に培養液を除いた後に加え、６時間、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、湿度９５％、ＣＯ２濃度５％）にて放置した。この時、陰性対照として培地のみを加えたサンプルを用意した。放置後、各穴よりウイルス上清液を取り除きＨＴ１０８０細胞用の培地（１０％血清を含むＤＭＥＭ培地）をそれぞれ加え３日間培養を行った。
【００３４】
培養後、レトロウイルスの導入効率を調べるために、細胞内のｒｓＧＦＰの発現をフローサイトメトリー（ＦＣＭ）にて測定した。フローサイトメトリー解析はＦＡＣＳキャリバーを用いて機器指示書に従って行った。ｒｓＧＦＰの発現率の求め方は、ＦＩＴＣ検出パラメーターのヒストグラム（ｘ軸：ｒｓＧＦＰの蛍光強度、ｙ軸：細胞数を示す）上で、陰性対照によりｒｓＧＦＰ非発現細胞の蛍光強度領域を確認後、その領域を含まないｒｓＧＦＰ発現細胞の蛍光強度領域を定め、その割合（％）を測定した。測定後、導入効率は、下記の数式により求めた。
【００３５】
ＧＴ％  ＝  各サンプルの測定値  −  陰性対照の測定値（バックグラウンド）
【００３６】
遺伝子導入効率の測定結果を図２に示す。
図２よりテナガザル（Ｇｉｂｂｏｎ  ａｐｅ）レトロウイルス産生細胞においても、培地Ａを用いた培養物より回収したレトロウイルス上清液の導入効率は、完全培地と匹敵する導入効率を示した。このことよりワーキングセルバンクから馴化を経ないで直接無血清培地での培養を行っても、十分に継代及びウイルス回収出来ることが示された。
【００３７】
実施例４
実施例２と同様に、ΔＬＮＧＦＲ遺伝子発現マウスレトロウイルス産生細胞を用いてウイルス上清液の調製を行った。このとき、前記の培地Ａ及び培地ＡにＩＬ−２を６００ＪＲＵ／ｍＬ添加した培地Ｂを用いて行った。培養については継代数が５回である以外、実施例２−１と同様に行った。ウイルス回収では、播種細胞密度を６×１０４／ｃｍ２とした以外は実施例２−２と同様に行った。遺伝子導入効率の評価では、ＣＥＭ細胞に加えて、ヒト末梢血単核球（Ｈｕｍａｎ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌ：ＰＢＭＣ）についてもＣＥＭ細胞と同様に遺伝子導入を行い、ＦＡＣＳ測定した。
【００３８】
細胞増殖倍率の結果を表１に示す。培地Ａ及び培地Ｂ共にＰ０（継代数０、以下同様）及びＰ１では、徐々に馴化しているためか増殖率は３倍程度であるが、Ｐ３以降は５倍以上の増殖率を示した。培地間では、ＩＬ−２の添加された培地Ｂの方が培地Ａの５２２８倍（Ｐ０からＰ５）に比べて７４６９倍（Ｐ０からＰ５）と増殖性が良かった。
【００３９】
【表１】
2007105033.tif 000002
【００４０】
レトロウイルス上清液が原液のときの遺伝子導入効率の結果を図３及び４に示す。ＣＥＭ細胞への遺伝子導入（図３）及びヒトＰＢＭＣへの遺伝子導入（図４）ともに、培地Ａと培地Ｂでは同等の遺伝子導入効率を示した。
【００４１】
実施例５  市販無血清培地との比較
実施例２と同様に、ΔＬＮＧＦＲ遺伝子発現マウスレトロウイルス産生細胞を用いて本発明の培地Ａと市販の各種無血清培地との比較を行った。培養については、下記に示す直接馴化、間接馴化の２通りで行った。
（１）直接馴化：ワーキングセルバンクを完全培地で２継代培養した後、直接、培地Ａ及び市販の無血清培地にそれぞれ切り替えて培養を行った。継代は４回行った。
（２）間接馴化：ワーキングセルバンクを完全培地で２継代培養した後、ウシ胎児血清濃度を段階的（ウシ胎児血清濃度６．６％→３．３％→１．５％→０％）に下げて馴化培養を行った。
用いた培地４種類を以下に示す。
１  培地Ａ  
２  ＡＩＭ−Ｖ（インビトロジェン社製：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
３  ＨｙＱ  ＳＦＭ４ＭｅｇａＶｉｒ（ハイクローン社製：Ｈｙｃｌｏｎｅ）
４  Ｏｐｔｉ−ＰｒｏＳＦＭ（インビトロジェン社製：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
なお、培地３，４についてはグルタミンを推奨量添加して使用した。
ウイルス回収は実施例２−２と同様に行った。遺伝子導入はＣＥＭ細胞を用いて行った。遺伝子導入効率の評価は実施例２−３と同様に行った。
【００４２】
（１）直接馴化では、培地Ａ及びＯｐｔｉ−ＰｒｏＳＦＭにおいてのみ４継代培養することができたが、特に４継代目では培地Ａの方が細胞の増殖が優れていた。他の市販無血清培地では細胞を培養することが出来ず、ＡＩＭ−Ｖ培地及びＨｙＱ  ＳＦＭ４ＭｅｇａＶｉｒ培地は継代２回目にて終了した。
【００４３】
（２）間接馴化では、培地Ａ及びＯｐｔｉ−ＰｒｏＳＦＭにおいて０％までウシ胎児血清濃度を落とすことができた。ＡＩＭ−Ｖ培地では１．５％まで、ＨｙＱ  ＳＦＭ４ＭｅｇａＶｉｒ培地では、６．６％までにしかウシ胎児血清濃度を下げることができず、無血清での培養はできなかった。
【００４４】
次に、間接馴化でウイルス回収の出来た培地Ａ及びＯｐｔｉ−ＰｒｏＳＦＭについて遺伝子導入効率の評価を行った。結果を表２に示す。培地ＡがＯｐｔｉ−ＰｒｏＳＦＭに比べて約２倍の高い遺伝子導入効率を与えた。
これらの結果より、本発明のＡ培地は、市販の無血清培地に比べて、レトロウイルス産生細胞の培養において優れており、レトロウイルス産生を明らかに効率よく行えることが確認された。
【００４５】
【表２】
2007105033.tif 000003
【００４６】
実施例６  血清アルブミンの添加による細胞増殖の改善
実施例２と同様に、ΔＬＮＧＦＲ遺伝子発現マウスレトロウイルス産生細胞を用いて細胞培養を行った。培地Ａにて細胞培養を開始した後、継代１回目より培地Ａに加えて市販のＧＴ−Ｔ５０３培地（タカラバイオ社製）を用いて細胞培養を開始した。さらにもう１代それぞれの培地で継代し細胞増殖率を比較した。
【００４７】
細胞増殖倍率の結果を表３に示す。ＧＴ−Ｔ５０３培地と比較して、ヒト血清アルブミンを添加した培地Ａの細胞増殖倍率は２倍程度高かった。さらにＧＴ−Ｔ５０３培地では、細胞の凝集及び浮遊細胞が数多くみられ状態として悪かった。
【００４８】
【表３】
2007105033.tif 000004
【００４９】
実施例７  市販無血清培地での血清アルブミンの添加効果の評価
実施例２と同様に、ΔＬＮＧＦＲ遺伝子発現マウスレトロウイルス産生細胞を用いてウイルス上清液の調製を行った。本実施例では、市販無血清培地Ｏｐｔｉ−ＰｒｏＳＦＭ（インビトロジェン社製：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＯｐｔｉ−ＰｒｏＳＦＭに最終濃度０．２％（重量比）となるように２５％ヒト血清アルブミン（ブミネート２５％（ＨＳＡ）；バクスター社製）を添加した培地を用いて行った。なお、Ｏｐｔｉ−ＰｒｏＳＦＭにはグルタミンを推奨量添加して使用した。
培養については継代数が５回である以外、実施例２−１と同様に行った。ウイルス回収操作は、実施例２−２と同様に行った。また、４日目の回収も実施例２−２と同様に行った。
遺伝子導入はＣＥＭ細胞を用いて行い、遺伝子導入効率の評価は、実施例２−３と同様に行った。
【００５０】
レトロウイルス上清液の希釈倍率が４倍のときの遺伝子導入効率の結果を図５に示す。
図５に示されるように、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を添加することでウイルス力価が上がった。
【００５１】
実施例８  培地中のカルシウム濃度の検討
実施例２と同様に、ΔＬＮＧＦＲ遺伝子発現マウスレトロウイルス産生細胞を用いてウイルス上清液の調製を行った。本実施例では、前記の培地Ａよりトランスフェリンを除いた培地Ｉ及び培地Ｉのカルシウム濃度、ここでは当初から含まれている塩化カルシウム濃度を１６５ｍｇ／Ｌから、日局塩化カルシウムを加えて３３０ｍｇ／Ｌに調整した培地ＩＩ及び４９５ｍｇ／Ｌに調整した培地ＩＩＩを用いた。培養については継代数が５回である以外、実施例２−１と同様に行った。ウイルス回収操作は、実施例２−２と同様に行った。遺伝子導入はＣＥＭ細胞を用いて行い、遺伝子導入効率の評価は、実施例２−３と同様に行った。
【００５２】
ウイルス回収３日目の細胞の形態の写真を図６に示す。さらに遺伝子導入効率の測定結果を図７に示す。予備的な試験において、培地Ｉおよび培地Ｉのカルシウム濃度を塩化カルシウム相当として６４０ｍｇ／Ｌに調整した培地を用いて同等な遺伝子導入効率が示された。カルシウム濃度を当初から含まれている１６５ｍｇ／Ｌから３３０もしくは４９５ｍｇ／Ｌに上げることで、ΔＬＮＧＦＲ遺伝子発現マウスレトロウイルス産生細胞の凝集・遊離細胞数が軽減され（図６）、３日間連続でウイルス回収が可能となった。ウイルス力価も細胞の状態を反映して、培地Ｉはウイルス回収１日目、２日目、３日目と低下傾向にあったが、培地ＩＩおよび培地ＩＩＩは増加傾向にあった（図７）。すなわち、カルシウム濃度を上げることによりレトロウイルス回収に必要な連続回収ができるようになった。また、ウイルス上清中の浮遊細胞が低減され、その後のフィルター処理において目詰まりが見られなくなり、処理が容易になった。
【００５３】
実施例９  上皮細胞成長因子の添加効果の評価
実施例２と同様に、ΔＬＮＧＦＲ遺伝子発現マウスレトロウイルス産生細胞を用いてウイルス上清液の調製を行った。本実施例では、前記の培地Ａよりトランスフェリンを除いた培地Ｉ及び培地Ｉに上皮細胞成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：和光純薬工業社製）を最終濃度１０ｍｇ／Ｌとなるように添加した培地ＩＶを用いた。培養については継代数が５回である以外、実施例２−１と同様に行った。ウイルス回収操作は、実施例２−２と同様に行った。遺伝子導入はＣＥＭ細胞を用いて行い、遺伝子導入効率の評価は、実施例２−３と同様に行った。
【００５４】
遺伝子導入効率の測定結果を図８に示す。
図８に示されるように、上皮細胞成長因子を添加することによってウイルス力価が上がった。
【００５５】
実施例１０  カルシウム濃度の改変及び上皮細胞成長因子の添加による相乗効果の評価
実施例２と同様に、ΔＬＮＧＦＲ遺伝子発現マウスレトロウイルス産生細胞を用いてウイルス上清液の調製を行った。本実施例では、前記の培地Ａ及び培地Ａのカルシウム濃度、ここでは当初から含まれている塩化カルシウム濃度を１６５ｍｇ／Ｌ から、日局塩化カルシウムを加えて３３０ｍｇ／Ｌに調整し、さらに上皮細胞成長因子を最終濃度１０ｍｇ／Ｌとなるように添加した培地Ｖを用いた。培養については継代数が５回である以外、実施例２−１と同様に行った。ウイルス回収操作は、実施例２−２と同様に行った。遺伝子導入はＣＥＭ細胞を用いて行い、遺伝子導入効率の評価は、実施例２−３と同様に行った。
【００５６】
遺伝子導入効率の測定結果を図９に示す。カルシウム濃度を当初から含まれている１６５ｍｇ／Ｌから３３０ｍｇ／Ｌに改変すること、及び上皮細胞成長因子を添加することによって、ウイルス力価は３倍程度上昇した。また、レトロウイルス回収に必要な連続回収ができるようになった。さらに、ウイルス上清中の浮遊細胞が低減され、その後のフィルター処理において目詰まりが見られなくなり容易になった。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
００
本発明により、ウイルス産生細胞の培養に適した無血清培地が提供される。本発明の培地によれば、無血清条件でのウイルス産生細胞の培養を効率よく実施することができ、従来に比べ簡便な操作で血清を含有しないウイルスベクターを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】完全培地または培地Ａを使用して得られたレトロウイルスでの、ＣＥＭ細胞への遺伝子導入効率を示す図である。
【図２】完全培地または培地Ａを使用して得られたレトロウイルスでの、ＨＴ１０８０細胞への遺伝子導入効率を示す図である。
【図３】培地Ａまたは培地Ｂを使用して得られたレトロウイルスでの、ＣＥＭ細胞への遺伝子導入効率を示す図である。
【図４】培地Ａまたは培地Ｂを使用して得られたレトロウイルスでの、ヒトＰＢＭＣへの遺伝子導入効率を示す図である。
【図５】Ｏｐｔｉ−ＰｒｏＳＦＭまたはＯｐｔｉ−ＰｒｏＳＦＭ＋ＨＳＡ（最終濃度０．２％）を使用して得られたレトロウイルスでの、ＣＥＭ細胞への遺伝子導入効率を示す図である。
【図６】ウイルス回収３日目の細胞の形態を示す図である。
【図７】培地Ｉ、培地ＩＩまたは培地ＩＩＩを使用して得られたレトロウイルスでの、ＣＥＭ細胞への遺伝子導入効率を示す図である。
【図８】培地Ｉまたは培地ＩＶを使用して得られたレトロウイルスでの、ＣＥＭ細胞への遺伝子導入効率を示す図である。
【図９】培地Ａまたは培地Ｖを使用して得られたレトロウイルスでの、ＣＥＭ細胞への遺伝子導入効率を示す図である。
【図１】
2007105033.tif 000005
【図２】
2007105033.tif 000006
【図３】
2007105033.tif 000007
【図４】
2007105033.tif 000008
【図５】
2007105033.tif 000009
【図６】
2007105033.tif 000010
【図７】
2007105033.tif 000011
【図８】
2007105033.tif 000012
【図９】
2007105033.tif 000013