(57)【要約】【課題】  生体内の前立腺癌局在を検出するためのMRI用新規分子イメージング用薬剤を提供する。【解決手段】  本発明は磁気共鳴イメージング（MRI）の造影剤を提供する。この造影剤は前立腺癌細胞の細胞膜に高発現する中性アミノ酸輸送蛋白への親和性を与えることで、従来のガドリニウム系MRI造影剤よりも前立腺癌へのターゲッティング能力が増強された特徴を有する。上記造影剤は、１）造影効果発揮部位、２）中性アミノ酸輸送蛋白親和性部位をその構造中に含む。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
MRI用造影剤に結合させた中性アミノ酸輸送蛋白結合性化合物を含むMRI造影のための結合体。
【請求項２】
請求項１記載の結合体において、前記MRI用造影剤が常磁性金属物質であることを特徴とした結合体。
【請求項３】
請求項２記載の結合体において、前記MRI用造影剤がガドリニウムイオンキレート錯体であることを特徴とした結合体。
【請求項４】
請求項３記載の結合体において、前記MRI用造影剤がガドキセト酸であることを特徴とした結合体。
【請求項５】
請求項１記載の結合体において、前記中性アミノ酸蛋白結合性化合物がチロシンであることを特徴とした結合体。
【請求項６】
中性アミノ酸輸送蛋白を認識する製剤設計を施し、中性アミノ酸輸送蛋白を高発現した前立腺癌細胞を標的とする造影剤を設計することを特徴とした薬学的修飾方法。
【請求項７】
請求項６記載の方法において、前記中性アミノ酸輸送蛋白がLAT1であることを特徴とした薬学的修飾方法。
【請求項８】
請求項６記載の方法において、原発性前立腺癌および転移性前立腺癌を検出することを特徴とした薬学的修飾方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は前立腺癌を可視化するためのMRI用造影剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺癌は他の癌種と比べて増殖速度が穏やかなこともあり患者の自覚症状に乏しく、早期発見が難しい傾向にある。前立腺癌は泌尿器科医による直腸診所見、経直腸超音波検査での低エコー病変、または血清前立腺特異抗原（PSAと呼ばれることがある）などの検査により比較的容易に診断されるが、転移を容易かつ効率的に診断する方法は無い。例えば、前立腺癌の骨転移の画像診断に用いられることがある骨シンチグラム法は、テクネチウム（99mTc）などの放射性同位元素を含む診断薬を体内に投与するため、被験者に対する身体的負荷が大きい。また、骨へは前立腺癌の他、乳癌、肺癌、腎癌、甲状腺癌からの転移があり、原発癌種を同定し難く、併発癌の場合、骨転移巣をたたくための原発癌種に応じた化学療法プロトコルを立て難い。さらに、前立腺癌を特異的に検出する造影剤も市場に存在しない。
【０００３】
生体のMRIにおいては、撮像上の病変部位と非病変部位とのコントラストを強調させるために、生体に造影剤を投与して造影MRI撮像を得る画像診断検査を行うことがある。このときの造影剤は常磁性体を使用することがある。
造影剤に用いる常磁性体としては第１遷移金属元素の金属原子イオン（たとえば鉄イオン、銅イオン、マンガンイオンなど）やランタノイド元素のイオン（たとえばガドリニウムイオンなど）があり、これらは孤立電子をもつことによりMRI撮像に大きな影響を与えることが知られている。
【０００４】
造影MRIでは、造影剤としてガドリニウム、鉄、マンガンなどを使用する方法が提案され、一部はMRI用造影剤の有効成分として臨床で用いられている。ガドリニウムは鉄、マンガンと比べて不対電子数が多く、生体に投与されたとき生体内プロトンの緩和時間短縮効果を強く示す。このように、ガドリニウムは生体内プロトンの縦緩和時間（T1）短縮効果に優れ、T1強調造影剤として広く認められている。
【０００５】
ガドリニウムは毒性などのため単体で生体に使用することはできず、キレート錯体として生体に投与する必要がある。代表的なキレート剤としては、次の式（１）に示すジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）などがある。
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【０００６】
（１）
次の式（２）に示すとおり、特許文献１に記載のあるガドリニウムとDTPAとのキレート錯体であるガドペンテト酸（Gd-DTPA）は、MRI用造影剤の薬効成分として広く公知であるが、血中に投与したとき細胞外液への非特異的分布を示すため、生体においてT1短縮効果が得られる臓器に制限がある。
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【０００７】
（２）
また、Gd-DTPAは腎排泄率の占める割合が胆汁排泄率と比べて非常に高い薬剤である。そのため、生体内にとどまり造影効果を発揮する時間が短いという使用上の制限がある。
【０００８】
一方、組織特異性の高いMRI用造影剤としては、GdDTPAに疎水性の高いエトキシベンジル基を付加したガドキセト酸（Gd-EOB-DTPA）が存在する。
【０００９】
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（３）
Gd-EOB-DTPAは疎水性が高いため排泄時間が長く、すなわち生体内にとどまる時間が長い。特に肝滞留性が高いことが特徴的であるが、その理由のひとつとして、Gd-DTPAと異なり、肝細胞膜に発現するトランスポーターOATP1（organic anion transporting polypeptide 1）の基質となることで肝細胞内に取り込まれる性質が挙げられる（非特許文献１）。そのためGd-EOB-DTPAは肝特異的MRI用造影剤と称せられることがあるが、一方で肝以外の臓器に特異性が高いわけではなく、肝細胞癌をはじめとする肝病変のMRI描出の有効性は認められるものの、それ以外の臓器における病変描出能に課題が残る。
【００１０】
【特許文献１】米国特許第4647447号公報
【非特許文献１】J. Pharmacol. Exp. Ther., Vol.290, 153  157, 1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、能動的な前立腺癌細胞内取込みを特徴とするMRI用造影剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、以下の式（２）（３）に示すGd-DTPA、Gd-EOB-DTPAの持つ造影効果上の難点を解決するため、優れた造影効果を示す製剤上の工夫を鋭意検討した。その結果、次の式（４）に示すチロシン（Tyr）化ガドキセト酸（Gd-EOB-DTPA-Tyr）をMRI用造影剤として使用した場合、前立腺癌細胞膜、下部消化管粘膜上皮細胞膜に発現する輸送担体として機能する膜蛋白質への基質認識性が与えられ、造影成分の生体内滞留時間増加、また、前立腺癌組織のコントラスト持続時間の延長、さらに、安全性の向上も実現でき得ることを示した。
【００１３】
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（２）
【００１４】
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（３）
【００１５】
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（４）
すなわち、本発明は、式（３）に示される化合物にチロシンを酸触媒とともに反応させることで、式（５）に示す化合物Gd-EOB-DTPA-Tyrが得られることを記載している。
【００１６】
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（５）
以上、本発明のMRI用造影剤Gd-EOB-DTPA-Tyrは、能動的な前立腺癌細胞内取込みならびに 腸肝循環機能を薬学的に付加したことにより、造影成分の生体内滞留時間増加、また、前立腺癌組織のコントラスト持続時間の延長、さらに、安全性の向上も実現でき得ることを記載している。
【発明の効果】
【００１７】
癌細胞においては、その活発な細胞増殖能のため、細胞内の生化学代謝が亢進している。そのため、細胞外から栄養素を細胞内に取り込む機構が正常細胞と比べて活発となっている。その例として、糖類やアミノ酸類の細胞内取り込みを担う各種輸送蛋白の機能の活発化が見られる。癌細胞は正常細胞よりも優位な栄養状態を獲得するため、複数種の細胞内輸送蛋白を高発現しているものと考えられている。糖類やアミノ酸類の細胞内輸送蛋白はすでに多くの種類が同定されているが、その中で中性アミノ酸輸送蛋白（LAT）は、必須アミノ酸のうち特に中性アミノ酸を基質とする促進拡散型の輸送担体として知られる。
【００１８】
LATにはLAT1、LAT2、LAT3、LAT4のアイソフォームが存在する。このうちLAT1は主に血液脳関門、精巣、大腸に若干発現が認められるが、癌化した組織、具体的には前立腺癌に強く発現が認められる。LAT1は構造化学的にバルキーな側鎖をもつ中性アミノ酸、例としてバリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンなどを基質として細胞内に取り込む機能を有する。LAT2は脳組織、骨格筋、空腸、回腸、精巣などに発現が認められているが、腫瘍組織における発現は認められない。LAT2はLAT1の基質となるアミノ酸類のほか、嵩高い側鎖を持たないグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システインなどの経細胞膜輸送を司る。なお、LAT1及びLAT2はともに生体膜12回貫通型の構造を持つ蛋白であり、輸送機能の維持するためには補助因子として生体膜1回貫通型蛋白である4F2抗原重鎖（4F2hc；CD98とも呼ばれることがある）が必要である。LAT1およびLAT2は4F2hcとジスルフィド結合したヘテロ2量体としてはじめて機能することを特徴とする。その他、LAT3およびLAT4は4F2hcを必要とせずに機能することができる（特許文献２、特許文献３、特許文献４、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。
【００１９】
既記のLATアイソフォーム、すなわちLAT1、LAT2、LAT3、LAT4のうち、前立腺癌組織に発現が認められるのはLAT1のみであることから、LAT1をイメージング標的蛋白としたMRI用造影剤を提供することにより前立腺癌の選択的イメージングが実現できる。
【００２０】
一方、LAT1の基質となる中性アミノ酸のうち、唯一チロシンは分子内に水酸基を有し、Gd-EOB-DTPAの有するカルボキシル基との縮合反応により結合体が形成可能な化合物である。本発明で示すチロシンとGd-EOB-DTPAとの結合体Gd-EOB-DTPA-Tyrを創製することで、前立腺癌組織へのMRI造影成分の取込みが実現できる。
【００２１】
生体においてはGd-EOB-DTPAであれば主として血液コンパートメント肝細胞へ分布であったため造影成分の生体内分布に限定がみられていたが、本発明のMRI用造影剤Gd-EOB-DTPA-Tyrを用いることにより、前立腺癌細胞内へ造影成分が能動的にしかるべき輸送蛋白を介して取り込まれ、前立腺癌組織の造影が実現できる。
【００２２】
また、本発明のMRI用造影剤Gd-EOB-DTPA-Tyrは、既記手法の輸送蛋白を介した効率よいターゲッティングを実現することで、体内への投与量を従来よりも少なく設定することが可能となり、予期せぬ副作用発現の危険性の低減に貢献でき得る。
【００２３】
ここで、肝細胞から排出されて胆汁中に移行した当該MRI用造影剤Gd-EOB-DTPA-Tyrは、空腸から大腸にかけて、特に管腔に面した粘膜上皮細胞に存在するLAT1によって再吸収され、再び血中へと取り込まれる。血中に移行したGd-EOB-DTPA-Tyrは再び肝細胞に取り込まれ、また胆汁中へ排出されるいわゆる腸肝循環が見られる。この腸肝循環は薬学的に広く公知であり、その腸肝循環を保障する成分がチロシンであることも公知である。この現象によっても、見かけ上の滞留時間の維持、ひいては造影効果の発揮時間の延長が実現可能となり得る。
【００２４】
以上、本発明のMRI用造影剤Gd-EOB-DTPA-Tyrは、能動的な前立腺癌細胞内取込みならびに 腸肝循環機能を薬学的に付加したことにより、造影成分の生体内滞留時間増加、また、前立腺癌組織のコントラスト持続時間の延長、さらに、安全性の向上も実現でき得る。
【００２５】
【特許文献２】特開2000  157286号公報
【特許文献３】特開2000  342270号公報
【特許文献４】特開2005  265531号公報
【非特許文献２】Biochem. Biophys. Acta, Vol. 1514., 291  302, 2001
【非特許文献３】J. Biol. Chem., Vol. 273, 23629  23632, 1998
【非特許文献４】J. Biol. Chem., Vol. 274, 19745  19751, 1999
【非特許文献５】J. Biol. Chem., Vol. 278, 43838  43845, 2003
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明の実施の形態を説明する。ただし、本発明の運用は以下に述べる具体例に限られるものではない。
【実施例１】
【００２７】
本発明では、生体内に存在し中性アミノ酸輸送蛋白１（LAT1）を発現する前立腺癌細胞を検出するための  MRI用造影剤を鋭意研究した。その結果、本発明の次の式（５）に示す化合物をMRI用造影剤としたとき、LAT1への認識性を与えることに成功した。
【００２８】
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（５）
すなわち、本発明は式（３）に示される化合物と式（４）に示される化合物とを脱水を伴う縮合反応させることで、式（５）に示すような化合物が得られることを記載している。
【００２９】
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（３）
【００３０】
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（４）
本発明のチロシン（Tyr）化ガドキセト酸（Gd-EOB-DTPA-Tyr）は、以下のスキーム１に示すルートで製造される。
【００３１】
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（スキーム１）
Gd-EOB-DTPA-Tyr（化合物（５））の製造方法は、エトキシベンジルジエチレントリアミン五酢酸溶液（Gd-EOB-DTPA；化合物（６））に対し、反応１）に示す塩化ガドリニウム（III）の水溶液をモル比として1 : 1 ~ 1 : 10、好ましくは1 : 1 ~ 1 : 5の割合で混和し、ミキサーで5 ~ 60秒間、好ましくは20 ~ 30秒間撹拌することで得られる。反応温度は0 ~ 40oC、好ましくは18 ~ 30oCである。得られた化合物（３）は、次の工程のために水に対して透析を行い、余剰のガドリニウムを除去して精製する。透析時の反応温度は−10 ~ 30oC、好ましくは0 ~ 5oCであり、反応時間は3 ~ 48時間、好ましくは18 ~ 24時間である。
【００３２】
次に化合物（３）をチロシン化する。チロシン化は、適当な溶媒中、硫酸などの酸触媒を用いて脱水を伴う縮合反応を行う。酸触媒は化合物（３）に対して1.5 ~ 20倍当量、好ましくは5 ~ 15倍当量を用いる。溶媒は特に限定はされないが、好ましくは水が用いられる。該溶媒の使用量は化合物（３）に対して5 ~ 100倍容、好ましくは20 ~ 50倍容である。反応温度は 30 ~ 99oC、好ましくは60 ~ 70oCであり、反応時間は1 ~ 30分、好ましくは5 ~ 10分である。反応圧力は特に限定はされないが、好ましくは高圧雰囲気である。チロシン化により得られた本発明の化合物を式（５）に示す。
【００３３】
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（５）
上記ならびに図面１に記載した内容に従い実験を行った例を以下に示す。
【００３４】
エトキシベンジルジエチレントリアミン五酢酸溶液（EOB-DTPA）は予め調製した塩化ガドリニウム（III）水溶液をモル比として1 : 1の割合で混和し、ミキサーで20 秒間撹拌することで得た。このときの反応温度は20oCで行った。得られた10mM Gd-EOB-DTPA（濃度はGd3+当量）は水に対して4oC、24時間透析を行い、余剰のガドリニウムを除去して精製した。次に精製したGd-EOB-DTPAをGd3+当量として10mM、10mLの溶液に調製してビーカーに移し、100mM Tyrを添加した後10倍当量硫酸を使用して、60oCに保温した水浴中にて10分間反応させてGd-EOB-DTPA-Tyrを得た。このとき、ビーカー内は窒素置換して高圧雰囲気下とした。
【００３５】
癌細胞においては、その活発な細胞増殖能のため、細胞内の生化学代謝が亢進している。そのため、細胞外から栄養素を細胞内に取り込む機構が正常細胞と比べて活発となっている。その例として、糖類やアミノ酸類の細胞内取り込みを担う各種輸送蛋白の機能の活発化が見られる。癌細胞は正常細胞よりも優位な栄養状態を獲得するため、複数種の細胞内輸送蛋白を高発現しているものと考えられている。糖類やアミノ酸類の細胞内輸送蛋白はすでに多くの種類が同定されているが、その中で中性アミノ酸輸送蛋白（LAT）は、必須アミノ酸のうち特に中性アミノ酸を基質とする促進拡散型の輸送担体として知られる。
【００３６】
LATにはLAT1、LAT2、LAT3、LAT4のアイソフォームが存在する。このうちLAT1は主に血液脳関門、精巣、大腸に若干発現が認められるが、癌化した組織、具体的には前立腺癌に強く発現が認められる。LAT1は構造化学的にバルキーな側鎖をもつ中性アミノ酸、例としてバリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンなどを基質として細胞内に取り込む機能を有する。LAT2は脳組織、骨格筋、空腸、回腸、精巣などに発現が認められているが、腫瘍組織における発現は認められない。LAT2はLAT1の基質となるアミノ酸類のほか、嵩高い側鎖を持たないグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システインなどの経細胞膜輸送を司る。なお、LAT1及びLAT2はともに生体膜12回貫通型の構造を持つ蛋白であり、輸送機能の維持するためには補助因子として生体膜1回貫通型蛋白である4F2抗原重鎖（4F2hc；CD98とも呼ばれることがある）が必要である。LAT1およびLAT2は4F2hcとジスルフィド結合したヘテロ2量体としてはじめて機能することを特徴とする。その他、LAT3およびLAT4は4F2hcを必要とせずに機能することができる（特許文献２、特許文献３、特許文献４、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。
【００３７】
既記のLATアイソフォーム、すなわちLAT1、LAT2、LAT3、LAT4のうち、前立腺癌組織に発現が認められるのはLAT1のみであることから、LAT1をイメージング標的蛋白としたMRI用造影剤を提供することにより前立腺癌の選択的イメージングが実現できる。
【００３８】
一方、LAT1の基質となる中性アミノ酸のうち、唯一チロシンは分子内に水酸基を有し、Gd-EOB-DTPAの有するカルボキシル基との縮合反応により結合体が形成可能な化合物である。本発明で示すチロシンとGd-EOB-DTPAとの結合体Gd-EOB-DTPA-Tyrを創製することで、前立腺癌組織へのMRI造影成分の取込みが実現できる。
【００３９】
生体においてはGd-EOB-DTPAであれば主として血液コンパートメント肝細胞へ分布であったため造影成分の生体内分布に限定がみられていたが、本発明のMRI用造影剤Gd-EOB-DTPA-Tyrを用いることにより、前立腺癌細胞内へ造影成分が能動的にしかるべき輸送蛋白を介して取り込まれ、前立腺癌組織の造影が実現できる。
【００４０】
また、本発明のMRI用造影剤Gd-EOB-DTPA-Tyrは、既記手法の輸送蛋白を介した効率よいターゲッティングを実現することで、体内への投与量を従来よりも少なく設定することが可能となり、予期せぬ副作用発現の危険性の低減に貢献でき得る。
【００４１】
ここで、肝細胞から排出されて胆汁中に移行した当該MRI用造影剤Gd-EOB-DTPA-Tyrは、空腸から大腸にかけて、特に管腔に面した粘膜上皮細胞に存在するLAT1によって再吸収され、再び血中へと取り込まれる。血中に移行したGd-EOB-DTPA-Tyrは再び肝細胞に取り込まれ、また胆汁中へ排出されるいわゆる腸肝循環が見られる。この腸肝循環は薬学的に広く公知であり、その腸肝循環を保障する成分がチロシンであることも公知である。この現象によっても、見かけ上の滞留時間の維持、ひいては造影効果の発揮時間の延長が実現可能となり得る。
【００４２】
以上、本発明のMRI用造影剤Gd-EOB-DTPA-Tyrは、能動的な前立腺癌細胞内取込みならびに 腸肝循環機能を薬学的に付加したことにより、造影成分の生体内滞留時間増加、また、前立腺癌組織のコントラスト持続時間の延長、さらに、安全性の向上も実現でき得る。
【実施例２】
【００４３】
本発明では、生体内に存在し中性アミノ酸輸送蛋白１（LAT1）を発現する前立腺癌細胞を検出するための  MRI用造影剤を鋭意研究した。その結果、本発明の次の式（５）に示す化合物をMRI用造影剤としたとき、LAT1への認識性を与えることに成功した。
【００４４】
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（５）
すなわち、本発明は式（３）に示される化合物と式（４）に示される化合物とを脱水を伴う縮合反応させることで、式（５）に示すような化合物が得られることを記載している。
【００４５】
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（３）
【００４６】
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（４）
本発明のチロシン（Tyr）化ガドキセト酸（Gd-EOB-DTPA-Tyr）は、以下のスキーム１に示すルートで製造される。
【００４７】
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（スキーム１）
Gd-EOB-DTPA-Tyr（化合物（５））の製造方法は、エトキシベンジルジエチレントリアミン五酢酸溶液（Gd-EOB-DTPA；化合物（６））に対し、反応１）に示す塩化ガドリニウム（III）の水溶液をモル比として1 : 1 ~ 1 : 10、好ましくは1 : 1 ~ 1 : 5の割合で混和し、ミキサーで5 ~ 60秒間、好ましくは20 ~ 30秒間撹拌することで得られる。反応温度は0 ~ 40oC、好ましくは18 ~ 30oCである。得られた化合物（３）は、次の工程のために水に対して透析を行い、余剰のガドリニウムを除去して精製する。透析時の反応温度は−10 ~ 30oC、好ましくは0 ~ 5oCであり、反応時間は3 ~ 48時間、好ましくは18 ~ 24時間である。
【００４８】
次に化合物（３）をチロシン化する。チロシン化は、適当な溶媒中、硫酸などの酸触媒を用いて脱水を伴う縮合反応を行う。酸触媒は化合物（３）に対して1.5 ~ 20倍当量、好ましくは5 ~ 15倍当量を用いる。溶媒は特に限定はされないが、好ましくは水が用いられる。該溶媒の使用量は化合物（３）に対して5 ~ 100倍容、好ましくは20 ~ 50倍容である。反応温度は 30 ~ 99oC、好ましくは60 ~ 70oCであり、反応時間は1 ~ 30分、好ましくは5 ~ 10分である。反応圧力は特に限定はされないが、好ましくは高圧雰囲気である。チロシン化により得られた本発明の化合物を式（５）に示す。
【００４９】
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（５）
上記ならびに図面２に記載した内容に従い実験を行った例を以下に示す。
【００５０】
エトキシベンジルジエチレントリアミン五酢酸溶液（EOB-DTPA）は予め調製した塩化ガドリニウム（III）水溶液をモル比として1 : 1の割合で混和し、ミキサーで20 秒間撹拌することで得た。このときの反応温度は20oCで行った。得られた10mM Gd-EOB-DTPA（濃度はGd3+当量）は水に対して4oC、24時間透析を行い、余剰のガドリニウムを除去して精製した。次に精製したGd-EOB-DTPAをGd3+当量として10mM、10mLの溶液に調製してビーカーに移し、100mM Tyrを添加した後10倍当量硫酸を使用して、60oCに保温した水浴中にて10分間反応させてGd-EOB-DTPA-Tyrを得た。このとき、ビーカー内は窒素置換して高圧雰囲気下とした。
【００５１】
Gd-EOB-DTPA-Tyrの経細胞膜輸送は以下のように測定される。培養細胞実験系に使用する細胞はあらかじめ既述のLAT1蛋白を強制発現させておく。用いられる細胞は特に限定はされないが、アフリカツメガエル卵母細胞、MDCK-II株、Caco-2株、OK株等が挙げられ、好ましくはアフリカツメガエル卵母細胞である。培養液中にGd-EOB-DTPAもしくはGd-EOB-DTPA-Tyrを添加して、所定時間経過後の細胞内に取り込まれた薬剤量をそれぞれ定量することで、Gd-EOB-DTPAあるいはGd-EOB-DTPA-TyrのLAT1による経細胞輸送量を測定し得る。このときの薬剤濃度は0.05 ~ 5mM、好ましくは0.1 ~ 2mM、さらに好ましくは0.5 ~ 1mMである。また、測定時間は0 ~ 6時間、好ましくは0 ~ 2時間である。測定温度は25 ~ 37oC、好ましくは30 ~ 37oC、さらに好ましくは35 ~ 37oCである。
【００５２】
上記ならびに図面２に記載した内容に従い実験を行った例を以下に示す。
【００５３】
アフリカツメガエル卵母細胞にヒトLAT1 cRNAおよびヒト4F2hc cRNA、ヒトLAT2 cRNAおよびヒト4F2hc cRNA、ヒト4F2hc単独のいずれかの組み合わせにて導入し、ヒトLAT1を細胞膜に強制発現させたヒトLAT1/4F2hc細胞発現系、ヒトLAT2/4F2hc細胞発現系、ヒト4F2hc細胞発現系を構築した。対照群のアフリカツメガエル卵母細胞には、同量の精製水を注入した。これらの細胞実験系は、薬剤の経細胞輸送を測定可能なin vitro実験系として活用できる。培養液中に1mM Gd-EOB-DTPAもしくはGd-EOB-DTPA-Tyrを添加して120分後、培養液を氷冷したバッファーにてすばやく5回ウォッシュアウトした。取り出した細胞は可溶化剤として10% ドデシル硫酸ナトリウム溶液400μＬに室温にて24時間以上浸し細胞を完全に溶解させて、細胞内に取り込まれたGd-EOB-DTPAもしくはGd-EOB-DTPA-Tyr量を測定した。実験の結果、図１に示すとおり、ヒトLAT1/4F2hc細胞発現系において、被検物質添加後120分ではGd-EOB-DTPAとGd-EOB-DTPA-Tyrとの細胞内取込み量の比が約13となり、LAT1を介した本発明で示すGd-EOB-DTPA-Tyrの細胞内取込みはGd-EOB-DTPAより優れていることが認められた。また、図2に示すとおり、ヒトLAT1/4F2hc細胞発現系、ヒトLAT2/4F2hc細胞発現系、ヒト4F2hc細胞発現系において、1mM Gd-EOB-DTPA-Tyr添加後120分でGd-EOB-DTPA-TyrはヒトLAT1/4F2hc発現細胞への細胞内取込みが顕著に高いことが認められた。
【００５４】
癌細胞においては、その活発な細胞増殖能のため、細胞内の生化学代謝が亢進している。そのため、細胞外から栄養素を細胞内に取り込む機構が正常細胞と比べて活発となっている。その例として、糖類やアミノ酸類の細胞内取り込みを担う各種輸送蛋白の機能の活発化が見られる。癌細胞は正常細胞よりも優位な栄養状態を獲得するため、複数種の細胞内輸送蛋白を高発現しているものと考えられている。糖類やアミノ酸類の細胞内輸送蛋白はすでに多くの種類が同定されているが、その中で中性アミノ酸輸送蛋白（LAT）は、必須アミノ酸のうち特に中性アミノ酸を基質とする促進拡散型の輸送担体として知られる。
【００５５】
LATにはLAT1、LAT2、LAT3、LAT4のアイソフォームが存在する。このうちLAT1は主に血液脳関門、精巣、大腸に若干発現が認められるが、癌化した組織、具体的には前立腺癌に強く発現が認められる。LAT1は構造化学的にバルキーな側鎖をもつ中性アミノ酸、例としてバリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンなどを基質として細胞内に取り込む機能を有する。LAT2は脳組織、骨格筋、空腸、回腸、精巣などに発現が認められているが、腫瘍組織における発現は認められない。LAT2はLAT1の基質となるアミノ酸類のほか、嵩高い側鎖を持たないグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システインなどの経細胞膜輸送を司る。なお、LAT1及びLAT2はともに生体膜12回貫通型の構造を持つ蛋白であり、輸送機能の維持するためには補助因子として生体膜1回貫通型蛋白である4F2抗原重鎖（4F2hc；CD98とも呼ばれることがある）が必要である。LAT1およびLAT2は4F2hcとジスルフィド結合したヘテロ2量体としてはじめて機能することを特徴とする。その他、LAT3およびLAT4は4F2hcを必要とせずに機能することができる（特許文献２、特許文献３、特許文献４、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。
【００５６】
既記のLATアイソフォーム、すなわちLAT1、LAT2、LAT3、LAT4のうち、前立腺癌組織に発現が認められるのはLAT1のみであることから、LAT1をイメージング標的蛋白としたMRI用造影剤を提供することにより前立腺癌の選択的イメージングが実現できる。
【００５７】
一方、LAT1の基質となる中性アミノ酸のうち、唯一チロシンは分子内に水酸基を有し、Gd-EOB-DTPAの有するカルボキシル基との縮合反応により結合体が形成可能な化合物である。本発明で示すチロシンとGd-EOB-DTPAとの結合体Gd-EOB-DTPA-Tyrを創製することで、前立腺癌組織へのMRI造影成分の取込みが実現できる。
【００５８】
生体においてはGd-EOB-DTPAであれば主として血液コンパートメント肝細胞へ分布であったため造影成分の生体内分布に限定がみられていたが、本発明のMRI用造影剤Gd-EOB-DTPA-Tyrを用いることにより、前立腺癌細胞内へ造影成分が能動的にしかるべき輸送蛋白を介して取り込まれ、前立腺癌組織の造影が実現できる。
【００５９】
また、本発明のMRI用造影剤Gd-EOB-DTPA-Tyrは、既記手法の輸送蛋白を介した効率よいターゲッティングを実現することで、体内への投与量を従来よりも少なく設定することが可能となり、予期せぬ副作用発現の危険性の低減に貢献でき得る。
ここで、肝細胞から排出されて胆汁中に移行した当該MRI用造影剤Gd-EOB-DTPA-Tyrは、空腸から大腸にかけて、特に管腔に面した粘膜上皮細胞に存在するLAT1によって再吸収され、再び血中へと取り込まれる。血中に移行したGd-EOB-DTPA-Tyrは再び肝細胞に取り込まれ、また胆汁中へ排出されるいわゆる腸肝循環が見られる。この腸肝循環は薬学的に広く公知であり、その腸肝循環を保障する成分がチロシンであることも公知である。この現象によっても、見かけ上の滞留時間の維持、ひいては造影効果の発揮時間の延長が実現可能となり得る。
【００６０】
以上、本発明のMRI用造影剤Gd-EOB-DTPA-Tyrは、能動的な前立腺癌細胞内取込みならびに 腸肝循環機能を薬学的に付加したことにより、造影成分の生体内滞留時間増加、また、前立腺癌組織のコントラスト持続時間の延長、さらに、安全性の向上も実現でき得る。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ヒトLAT1 / 4F2hcを強制発現させた細胞において、本発明のGd-EOB-DTPA-Tyrもしくは対照としてのGd-EOB-DTPAの細胞内取込み量を測定して比較した結果を示す。
【図２】ヒトLAT1 / 4F2hc、ヒトLAT2 / 4F2hc、ヒト4F2hcのいずれかを強制発現させた細胞において、本発明のGd-EOB-DTPA-Tyrの細胞内取込み量を測定して比較した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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