(57)【要約】 【課題】アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害作用を有するペプチド混合物及びペプチドの新規な製造方法の提供。【解決手段】水溶液中で微細藻類をタンパク質分解酵素で処理して、ペプチド類を水溶液中に抽出させた後、水溶液中の不溶分を除去する工程を有する下記式（１）〜（９）で表されるＬ−アミノ酸配列からなるいずれか１種以上のペプチドを含有するペプチド混合物の製造方法。不溶分除去工程後に、ペプチド類を分画する工程を有する下記式（１）〜（９）で表されるＬ−アミノ酸配列からなるいずれか１種のペプチドの製造方法。［化１］  Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（１）  Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ（２）  Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ（３）  Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（４）  Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ（５）  Ｉｌｅ−Ｔｙｒ        （６）  Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ（７）  Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（８）  Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ（９）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶液中で微細藻類をタンパク質分解酵素で処理して、ペプチド類を水溶液中に抽出させた後、水溶液中の不溶分を除去する工程を有することを特徴とする下記式（１）〜（９）で表されるＬ−アミノ酸配列からなるいずれか１種以上のペプチドを含有するペプチド混合物の製造方法。
［化１］
Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ      （１）
Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ      （２）
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ      （３）
Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ      （４）
Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ      （５）
Ｉｌｅ−Ｔｙｒ              （６）
Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ      （７）
Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ      （８）
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ      （９）
【請求項２】
水溶液中の不溶分を除去する工程に次いで、得られたペプチド類を分画する工程を有する請求項１に記載のペプチド混合物の製造方法。
【請求項３】
前記微細藻類がスピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）である請求項１又は２に記載のペプチド混合物の製造方法。
【請求項４】
前記スピルリナが、水、有機溶媒、又は超臨界抽出ガスによる抽出工程を経た後の残渣スピルリナである請求項３に記載のペプチド混合物の製造方法。
【請求項５】
前記タンパク質分解酵素が微生物由来のタンパク質分解酵素である請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド混合物の製造方法。
【請求項６】
前記微生物由来のタンパク質分解酵素が、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属由来のタンパク質分解酵素およびバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来のタンパク質分解酵素からなる群から選ばれる１種以上である請求項５に記載のペプチド混合物の製造方法。
【請求項７】
前記タンパク質分解酵素が、動物性消化酵素である請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド混合物の製造方法。
【請求項８】
前記動物性消化酵素がペプシンである請求項７に記載のペプチド混合物の製造方法。
【請求項９】
水溶液中で微細藻類をタンパク質分解酵素で処理して、ペプチド類を水溶液中に抽出させた後、水溶液中の不溶分を除去して、得られたペプチド類を下記条件で分画する工程を有することを特徴とする下記式（１）で表されるＬ−アミノ酸配列からなるペプチドの製造方法。
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−５（１０ｍｍ×２５０ｍｍ）、
溶離媒体：水／アセトニトリル＝９７／３（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸０．１体積％（Ａ液）、水／アセトニトリル＝２０／８０（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸０．１体積％（Ｂ液）、
流速：４．０ｍＬ／ｍｉｎ、
溶離条件：Ｂ液の濃度を毎分０．０５２体積％上昇させ、Ｂ液の濃度が３．４〜５．８体積％の時の溶出画分を採取する。
［化２］
Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ      （１）
【請求項１０】
水溶液中で微細藻類をタンパク質分解酵素で処理して、ペプチド類を水溶液中に抽出させた後、水溶液中の不溶分を除去して、得られたペプチド類を下記条件で分画する工程を有することを特徴とする下記式（２）で表されるＬ−アミノ酸配列からなるペプチドの製造方法。
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−５（１０ｍｍ×２５０ｍｍ）、
溶離媒体：水／アセトニトリル＝９７／３（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸０．１体積％（Ａ液）、水／アセトニトリル＝２０／８０（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸０．１体積％（Ｂ液）、
流速：４．０ｍＬ／ｍｉｎ、
溶離条件：Ｂ液の濃度を毎分０．０５２体積％上昇させ、Ｂ液の濃度が３．５〜５．９体積％の時の溶出画分を採取する。
［化３］
Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ      （２）
【請求項１１】
水溶液中で微細藻類をタンパク質分解酵素で処理して、ペプチド類を水溶液中に抽出させた後、水溶液中の不溶分を除去して、得られたペプチド類を下記条件で分画する工程を有することを特徴とする下記式（３）で表されるＬ−アミノ酸配列からなるペプチドの製造方法。
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−５（１０ｍｍ×２５０ｍｍ）、
溶離媒体：水／アセトニトリル＝９７／３（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸０．１体積％（Ａ液）、水／アセトニトリル＝２０／８０（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸０．１体積％（Ｂ液）、
流速：４．０ｍＬ／ｍｉｎ、
溶離条件：Ｂ液の濃度を毎分０．０５２体積％上昇させ、Ｂ液の濃度が３．６〜６．０体積％の時の溶出画分を採取する。
［化４］
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ      （３）
【請求項１２】
水溶液中で微細藻類をタンパク質分解酵素で処理して、ペプチド類を水溶液中に抽出させた後、水溶液中の不溶分を除去して、得られたペプチド類を下記条件で分画する工程を有することを特徴とする下記式（４）で表されるＬ−アミノ酸配列からなるペプチドの製造方法。
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−５（１０ｍｍ×２５０ｍｍ）、
溶離媒体：水／アセトニトリル＝９７／３（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸０．１体積％（Ａ液）、水／アセトニトリル＝２０／８０（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸０．１体積％（Ｂ液）、
流速：４．０ｍＬ／ｍｉｎ、
溶離条件：Ｂ液の濃度を毎分０．０５２体積％上昇させ、Ｂ液の濃度が３．６〜６．０体積％の時の溶出画分を採取する。
［化５］
Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ      （４）
【請求項１３】
水溶液中で微細藻類をタンパク質分解酵素で処理して、ペプチド類を水溶液中に抽出させた後、水溶液中の不溶分を除去して、得られたペプチド類を下記条件で分画する工程を有することを特徴とする下記式（５）で表されるＬ−アミノ酸配列からなるペプチドの製造方法。
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−５（１０ｍｍ×２５０ｍｍ）、
溶離媒体：水／アセトニトリル＝９７／３（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸０．１体積％（Ａ液）、水／アセトニトリル＝２０／８０（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸０．１体積％（Ｂ液）、
流速：４．０ｍＬ／ｍｉｎ、
溶離条件：Ｂ液の濃度を毎分０．３８３体積％上昇させ、Ｂ液の濃度が２．７〜４．５体積％の時の溶出画分を採取する。
［化６］
Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ      （５）
【請求項１４】
水溶液中で微細藻類をタンパク質分解酵素で処理して、ペプチド類を水溶液中に抽出させた後、水溶液中の不溶分を除去して、得られたペプチド類を下記条件で分画する工程を有することを特徴とする下記式（６）で表されるＬ−アミノ酸配列からなるペプチドの製造方法。
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−５（１０ｍｍ×２５０ｍｍ）、
溶離媒体：水／アセトニトリル＝９７／３（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸０．１体積％（Ａ液）、水／アセトニトリル＝２０／８０（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸０．１体積％（Ｂ液）、
流速：４．０ｍＬ／ｍｉｎ、
溶離条件：Ｂ液の濃度を毎分０．０５２体積％上昇させ、Ｂ液の濃度が３．７〜６．１体積％の時の溶出画分を採取する。
［化７］
Ｉｌｅ−Ｔｙｒ              （６）
【請求項１５】
水溶液中で微細藻類をタンパク質分解酵素で処理して、ペプチド類を水溶液中に抽出させた後、水溶液中の不溶分を除去して、得られたペプチド類を下記条件で分画する工程を有することを特徴とする下記式（７）で表されるＬ−アミノ酸配列からなるペプチドの製造方法。
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−５（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、
溶離媒体：水／アセトニトリル＝９７／３（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸０．１体積％（Ａ液）、水／アセトニトリル＝２０／８０（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸０．１体積％（Ｂ液）、
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ、
溶離条件：Ｂ液の濃度を毎分０．２３１体積％上昇させ、Ｂ液の濃度が８．２〜１３．８体積％の時の溶出画分を採取する。
［化８］
Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ      （７）
【請求項１６】
水溶液中で微細藻類をタンパク質分解酵素で処理して、ペプチド類を水溶液中に抽出させた後、水溶液中の不溶分を除去して、得られたペプチド類を下記条件で分画する工程を有することを特徴とする下記式（８）で表されるＬ−アミノ酸配列からなるペプチドの製造方法。
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−５（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、
溶離媒体：水／アセトニトリル＝９７／３（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸０．１体積％（Ａ液）、水／アセトニトリル＝２０／８０（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸０．１体積％（Ｂ液）、
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ、
溶離条件：Ｂ液の濃度を毎分０．２３１体積％上昇させ、Ｂ液の濃度が８．６〜１４．４体積％の時の溶出画分を採取する。
［化９］
Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ      （８）
【請求項１７】
水溶液中で微細藻類をタンパク質分解酵素で処理して、ペプチド類を水溶液中に抽出させた後、水溶液中の不溶分を除去して、得られたペプチド類を下記条件で分画する工程を有することを特徴とする下記式（９）で表されるＬ−アミノ酸配列からなるペプチドの製造方法。
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−５（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、
溶離媒体：水／アセトニトリル＝９７／３（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸０．１体積％（Ａ液）、水／アセトニトリル＝２０／８０（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸０．１体積％（Ｂ液）、
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ、
溶離条件：Ｂ液の濃度を毎分０．２３１体積％上昇させ、Ｂ液の濃度が７．３〜１２．３体積％の時の溶出画分を採取する。
［化１０］
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ      （９）
【請求項１８】
前記微細藻類がスピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）である請求項９〜１７のいずれか一項に記載のペプチドの製造方法。
【請求項１９】
前記スピルリナが、水、有機溶媒、又は超臨界抽出ガスによる抽出工程を経た後の残渣スピルリナである請求項１８に記載のペプチドの製造方法。
【請求項２０】
前記タンパク質分解酵素が微生物由来のタンパク質分解酵素である請求項９〜１９のいずれか一項に記載のペプチドの製造方法。
【請求項２１】
前記微生物由来のタンパク質分解酵素が、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属由来のタンパク質分解酵素およびバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来のタンパク質分解酵素からなる群から選ばれる１種以上である請求項２０に記載のペプチドの製造方法。
【請求項２２】
前記タンパク質分解酵素が、動物性消化酵素である請求項９〜１９のいずれか一項に記載のペプチドの製造方法。
【請求項２３】
前記動物性消化酵素がペプシンである請求項２２に記載のペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンジオテンシン変換酵素阻害作用を有するペプチド混合物及びペプチドの新規な製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アンジオテンシンは、腎静脈中に分泌されるレニンが血漿中のα２グロブリン分画に含まれるレニン基質に作用してつくられるポリペプチドであり、まずアンジオテンシンＩがつくられるが、これは生物学的活性を有しない。アンジオテンシンＩは、循環血液中で主に肺循環の間にアンジオテンシン変換酵素（以下ＡＣＥと略記する）の作用により２個のアミノ酸を失いアンジオテンシンＩＩに変換される。
レニンとアンジオテンシンは体内の重要な昇圧系を構成し、レニン−アンジオテンシン系と呼ばれるが、そのおもな作用物質はアンジオテンシンＩＩである。臨床的に最も重要なアンジオテンシンＩＩの作用は血圧上昇作用であり、血管平滑筋を収縮して血圧を上昇させる体内の最も強力な昇圧物質である。その血管収縮作用は細動脈で強いが静脈系で弱く、また、腎・内臓血管領域で強いが四肢、脳、心、肺では弱い特徴を有する。アンジオテンシンＩＩは、生体のナトリウム平衡と血圧維持に重要な役割を果たしており、ナトリウム消失、血圧下降時には、レニン、アンジオテンシンＩＩが上昇し、直接的にはアルドステロン分泌を介して、ナトリウム貯留と血圧上昇にはたらく。また、高血圧疾患では、高血圧の成因ないし維持機構に重要な役割を果たしている（非特許文献１）。
【０００３】
以上のように、ＡＣＥ阻害剤は、アンジオテンシンＩからアンジオテンシンＩＩを生成する変換酵素の作用を阻害することにより、アンジオテンシンＩＩの生成を特異的に抑制し、アンジオテンシンＩＩの血漿濃度を低下させ、降圧作用を示す。
これまで、ＡＣＥ阻害物質としては、天然物又は天然物由来の物質として蛇毒由来のブラデイキニン増強因子（非特許文献２）、ゼラチンのコラゲナーゼ消化物由来の６種類のペプチド（非特許文献３）、牛カゼインのトリプシン消化物由来のペプチド（非特許文献４）、イワシ筋肉由来の５種のヘクサペプチド（特許文献１）、海苔由来のテトラペプチド（特許文献２）、並びにペンタペプチド（特許文献３）、朝鮮人参由来のペンタペプチド（特許文献４）、クロレラ由来のペンタペプチド（特許文献５）が挙げられ、いずれもＡＣＥ阻害剤となり得ることが開示されている。
更に、合成法により得た鎖長の短いジ、トリペプチド（特許文献６、特許文献７）についての提案は行われているが、発見されてから長時間経過しているものの、未だ医薬品としての開発が進んでいるとの報告はない。
【０００４】
近年、健康意識の向上から、当該ＡＣＥ阻害作用を有するペプチドを含有する健康食品も開発されてきている。例えば、わかめから抽出されるペプチドとして、Ｐｈｅ−Ｔｙｒ、もしくはＶａｌ−Ｔｙｒ、又はＩｌｅ−Ｔｙｒ等を含むゼリー食品、Ｖａｌ−Ｐｒｏ、又はＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを含む乳酸飲料等が開発され、販売されている。
しかしながら、微細藻類を原料として用い、効率よくＡＣＥ阻害作用を有する１種以上のペプチドを得る方法はこれまでに開示されていない。
【０００５】
次に、微細藻類のタンパク質分解酵素による処理方法に関しては、特許文献８に、栄養成分が豊富で、微細藻類特有の味、臭いが少なく、かつ、食品に添加しても沈殿物や不溶物が析出しない微細藻類水抽出液の製造方法に関する記載がある。
しかしながら、これらの従来技術においては、ＡＣＥ阻害作用を有するペプチドを得る方法については、記載も示唆もされてもいなかった。
【非特許文献１】医科学大辞典、９４ページ、１９８２年、講談社
【非特許文献２】Ｓ．Ｈ．Ｆｅｒｒｅｉａ ｅｔ ａｌ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９，３５８３（１９７０）
【非特許文献３】Ｇ．Ｏｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ：Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｓ．Ａｃｔａ，５６６，１２８（１９７９）
【非特許文献４】Ｓ．Ｍａｒｕｙａｍａ ｅｔ ａｌ．：Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４６，１３９３（１９８３）
【特許文献１】特許第２０４６４８３号公報
【特許文献２】特許第２６７８１８０号公報
【特許文献３】特開平１０−３６３９１号公報
【特許文献４】特許第２９２０８２９号公報
【特許文献５】特許第２９９０３５４号公報
【特許文献６】特許第９４８０７１号公報
【特許文献７】特開平６−１６５６８号公報
【特許文献８】特開２００４−２０４０３４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、ＡＣＥ阻害作用を有するペプチド混合物及びペプチドの新規な製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討を行った結果、以下の知見を得た。すなわち、
（１）微細藻類をタンパク質分解酵素で処理することにより、ペプチド類が得られること
（２）ペプチド類からの単離同定の結果、下記式（１）〜（９）で表されるＬ−アミノ酸配列からなるペプチドの１種以上が得られること
（３）当該ペプチドは、優れたＡＣＥ阻害作用を有すること
を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
［化１］
Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ      （１）
Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ      （２）
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ      （３）
Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ      （４）
Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ      （５）
Ｉｌｅ−Ｔｙｒ              （６）
Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ      （７）
Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ      （８）
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ      （９）
【０００９】
すなわち、本発明は、水溶液中で微細藻類をタンパク質分解酵素で処理して、ペプチド類を水溶液中に抽出させた後、水溶液中の不溶分を除去する工程を有することを特徴とする下記式（１）〜（９）で表されるＬ−アミノ酸配列からなるいずれか１種以上のペプチドを含有するペプチド混合物の製造方法を提供するものである。
【００１０】
［化２］
Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ      （１）
Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ      （２）
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ      （３）
Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ      （４）
Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ      （５）
Ｉｌｅ−Ｔｙｒ              （６）
Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ      （７）
Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ      （８）
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ      （９）
【００１１】
また、本発明は、水溶液中で微細藻類をタンパク質分解酵素で処理して、ペプチド類を水溶液中に抽出させた後、水溶液中の不溶分を除去して、得られたペプチド類を分画する工程を有することを特徴とする下記式（１）〜（９）で表されるＬ−アミノ酸配列からなるいずれか１種のペプチドの製造方法を提供するものである。
以下に、その分画の条件の一例を記載する。
溶離媒体：水／アセトニトリル＝９７／３（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸０．１体積％（Ａ液）、水／アセトニトリル＝２０／８０（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸０．１体積％（Ｂ液）、
（ｉ）カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−５（１０ｍｍ×２５０ｍｍ）
流速：４．０ｍＬ／ｍｉｎ
溶離条件：Ｂ液の濃度を毎分０．０５２体積％上昇させ、Ｂ液の濃度が下記の時の溶出画分を採取する。
下記式（１）で表されるＬ−アミノ酸配列からなるペプチド；Ｂ液濃度  ３．４〜５．８体積％
下記式（２）で表されるＬ−アミノ酸配列からなるペプチド；Ｂ液濃度  ３．５〜５．９体積％
下記式（３）で表されるＬ−アミノ酸配列からなるペプチド；Ｂ液濃度  ３．６〜６．０体積％
下記式（４）で表されるＬ−アミノ酸配列からなるペプチド；Ｂ液濃度  ３．６〜６．０体積％
下記式（６）で表されるＬ−アミノ酸配列からなるペプチド；Ｂ液濃度  ３．７〜６．１体積％
（ｉｉ）カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−５（１０ｍｍ×２５０ｍｍ）
流速：４．０ｍＬ／ｍｉｎ
溶離条件：Ｂ液の濃度を毎分０．３８３％上昇させ、Ｂ液の濃度が下記の時の溶出画分を採取する。
下記式（５）で表されるＬ−アミノ酸配列からなるペプチド；Ｂ液濃度  ２．７〜４．５体積％
（ｉｉｉ）カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−５（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
溶離条件：Ｂ液の濃度を毎分０．２３１％上昇させ、Ｂ液の濃度が下記の時の溶出画分を採取する。
下記式（７）で表されるＬ−アミノ酸配列からなるペプチド；Ｂ液濃度  ８．２〜１３．８体積％
下記式（８）で表されるＬ−アミノ酸配列からなるペプチド；Ｂ液濃度  ８．６〜１４．４体積％
下記式（９）で表されるＬ−アミノ酸配列からなるペプチド；Ｂ液濃度  ７．３〜１２．３体積％
【００１２】
［化３］
Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ      （１）
Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ      （２）
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ      （３）
Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ      （４）
Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ      （５）
Ｉｌｅ−Ｔｙｒ              （６）
Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ      （７）
Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ      （８）
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ      （９）
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ＡＣＥ阻害作用を有するペプチドを効率よく低コストで製造することができ、血圧低下剤、健康食品、食品等の製造に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いられる微細藻類は、水中に生育する微細な藻類であって、光合成をする植物のうち、大きさ数ミクロン〜数百ミクロンの植物プランクトンであり、例えば、スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）属、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、アファニゾメノン（Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ）属、フィッシェレラ（Ｆｉｓｈｅｒｅｌｌａ）属、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）属、ネンジュモ（Ｎｏｓｔｏｃ）属、スイゼンジノリ（Ａｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ）属、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）属、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属等が挙げられるが、工業的規模で生産され、その安全性が確認されているスピルリナ属、クロレラ属、ヘマトコッカス属、ドナリエラ属、セネデスムス属に属するものが好ましく、なかでもスピルリナ属に属するものがより好ましい。
【００１５】
スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）とは、藍藻類（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）に包含され、従来一括してスピルリナ属と呼称されていたアルスロスピラ属（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ）及びスピルリナ属（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）に属する微細な単細胞微生物であり、例えばアルスロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、アルスロスピラ・マキシマ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｍａｘｉｍａ）、アルスロスピラ・ゲイトレリ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｇｅｉｔｌｅｒｉ）、アルスロスピラ・サイアミーゼ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｓｉａｍｅｓｅ）、スピルリナ・メイヤー（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｍａｊｏｒ）、スピルリナ・サブサルサ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｓｕｂｓａｌｓａ）、等が挙げられるが、中でも、人工的に培養でき、入手が容易なことから、アルスロスピラ・プラテンシス、アルスロスピラ・マキシマ、アルスロスピラ・ゲイトレリ、アルスロスピラ・サイアミーゼが好ましい。
【００１６】
クロレラは、クロレラ属の微細藻類であり、入手が容易で、安全性に優れている点で、例えば、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ)、クロレラ ・レギュラリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｒｅｇｕｌａｒｉｓ）、クロレラ・ピレノイドーサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）、クロレラ・エリプソイデア（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｉｄｅａ）等が好ましい。
ヘマトコッカスは、緑藻綱ボルボックス目クラミドモナス科ヘマトコッカス属に属する藻類であり、食品や飼料として付加価値の高いカロチノイド色素であるアスタキサンチン生産藻類として有用である。
ドナリエラは、イスラエルの死海で発見された微細藻類であり、抗酸化作用を有するカロチノイドを豊富に含んだ微細藻類で、特にβ‐カロチンの生産藻類として有用である。
セネデスムスは、セネデスムス属に属する緑藻であり、和名「イカダモ」と呼ばれ、例えば、セネデスムス・アクタス（Ｓ．ａｃｕｔｕｓ）、セネデスムス・バシレンシス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ）、セネデスムス・ビジュガ（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｂｉｊｕｇａ）、セネデスムス・クロレロイド（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｃｈｌｏｒｅｌｌｏｉｄｅｓ）、セネデスムス・コスタラタス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｃｏｓｔｕｌａｔｕｓ）、セネデスムス・ナヌス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ ｎａｎｕｓ）、セネデスムス・オブリカス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｏｂｌｉｑｕｕｓ）等の藻類が知られている。
【００１７】
本発明で用いられる微細藻類としては、生の微細藻類、乾燥処理を施した微細藻類、微細藻類の由来成分等が挙げられる。生の微細藻類は、例えば、水中で培養された微細藻類を遠心分離、濾過等の方法により収穫して得られる。生の微細藻類は、培養池から収穫後そのままの状態で使用することもできるが、水もしくは生理食塩水で洗浄するのが好ましい。乾燥処理を施した微細藻類は、例えば、前記方法で得られた生の微細藻類を凍結乾燥処理やスプレー乾燥処理したもの等が挙げられる。微細藻類由来成分としては、超音波照射やホモゲナイズ等の機械的処理を微細藻類に施して得られたものや、酵素処理等の化学的な処理を微細藻類に施して得られたもの等が挙げられる。
【００１８】
さらに、本発明では、残渣微細藻類を、ペプチドの製造原料として用いることができる。ここでいう残渣微細藻類とは、抽出媒体にて微細藻類に含まれる、前記式（１）〜（９）で表されるペプチド、該ペプチドが由来するポリペプチド、タンパク質以外の有用な成分を抽出した後に得られる微細藻類をいう。
抽出は水、熱水、有機溶媒、又は超臨界抽出ガス等によって行うことができ、これらを単独で、或いは組み合わせて用いることができる。用いられる有機溶媒は、例えば、エタノール等のアルコール系溶媒、ヘキサン等の炭化水素系溶媒、アセトン等のケトン系溶媒を挙げることができる。
実施の一例を挙げるとすれば、例えば、室温時含水エタノール、エタノール、アセトンもしくはこれらを２種以上混合したもので抽出することが可能である。
また、超臨界抽出に用いられる炭酸ガス等によっても抽出操作を行うことが可能である。
抽出する温度は、目的とする有用物が最も効果的に抽出し得る温度であればよいが、一般的には室温から媒体の沸点程度の温度を挙げることができる。
これらの抽出操作を行って得られる残渣微細藻類を原料に用いて抽出を行った際にも、得られるペプチド類のＡＣＥ阻害作用は低減されることなく、該ＡＣＥ阻害剤の有効成分が前記式（１）〜（９）で表される１種以上のペプチドである場合にも、これらペプチドのいずれもＡＣＥ阻害作用は低減されることがない。このように、製造原料として残渣スピルリナを好適に用いることができ、原料藻類の有効活用に寄与することから工業上好ましい。
例えば、微細藻類がスピルリナの場合、含有されるフィコシアニンは、青色色素として有用であるが、従来フィコシアニンを水により抽出を行った後の残渣は廃棄されていた。しかし、本発明によれば、フィコシアニンを抽出した後の残渣スピルリナを原料として酵素処理を行っても、得られた前記式（１）〜（９）で表されるペプチドのＡＣＥ阻害作用は低下せず、好適に用いることができる。また同様に、スピルリナエキス抽出残渣も原料として用いることができる。
例えば、微細藻類がクロレラの場合、含有されるクロロフィルは、緑色色素、或いは健康食品として有用であるが、クロロフィルを水により抽出した後の残渣クロレラを用いても、ＡＣＥ阻害作用を有する前記式（１）〜（９）で表されるペプチドを得ることができる。
例えば、微細藻類がヘマトコッカスの場合、含有されるアスタキサンチンを有機溶媒にて抽出した後の残渣ヘマトコッカスを用いても、ＡＣＥ阻害作用を有する前記式（１）〜（９）で表されるペプチドを得ることができる。有機溶媒としては、例えば、室温時含水エタノール、エタノール、アセトンもしくはこれらを２種以上混合したもので抽出することが可能である。
例えば、微細藻類がドナリエラの場合、含有されるβ-カロチンを有機溶媒にて抽出した後の残渣ドナリエラを用いても、ＡＣＥ阻害作用を有する前記式（１）〜（９）で表されるペプチドを得ることができる。有機溶媒としては、例えば、室温時含水エタノール、エタノール、アセトンもしくはこれらを２種以上混合したもので抽出することが可能である。
【００１９】
本発明で用いるタンパク質分解酵素としては、ｐＨ２．０〜９．０においてタンパク質の加水分解を行う酵素であれば特に制限なく用いることができ、精製されていてもされていなくてもよい。タンパク質分解酵素としては、例えば、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ等の動物消化器系由来のタンパク質分解酵素（消化酵素）、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属由来のタンパク質分解酵素、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来のタンパク質分解酵素、クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属由来のタンパク質分解酵素、アオカビ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属由来のタンパク質分解酵素、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）属由来のタンパク質分解酵素等の微生物由来のタンパク質分解酵素、パパイン、ブロメレイン、フィシン等の植物由来のタンパク質分解酵素等が挙げられる。タンパク質分解酵素としては微生物由来のタンパク質分解酵素、動物性由来のタンパク質分解酵素が好ましく、コウジカビ属由来のタンパク質分解酵素、バチルス属由来のタンパク質分解酵素、ペプシンがより好ましい。
【００２０】
また、本発明にいうペプチド類とは、微細藻類をタンパク質分解酵素で処理することにより得られる、ペプチド、アミノ酸、及びタンパク質を含有するタンパク質分解酵素処理物をいうが、微細藻類に酵素処理前から含まれるペプチドを含んでもよい。
当該ペプチド類は、溶液状であっても、懸濁液状であっても、媒体を留去させた乾燥物状であってもよい。
本発明において、微細藻類のタンパク質分解酵素による処理は、例えば、
（１）微細藻類の水懸濁液に粉末状または液体状のタンパク質分解酵素を加える
（２）乾燥させた微細藻類と粉末状のタンパク質分解酵素に水を加える
（３）乾燥させた微細藻類に水とタンパク質分解酵素を加える
等の方法により行うことができる。
【００２１】
処理工程における微細藻類の濃度としては、タンパク質分解酵素の作用効率が良く、後工程の処理も容易な濃度が好ましく、微細藻類固形分濃度で１〜３０質量％が好ましく、５〜２０質量％がより好ましい。
タンパク質分解酵素の使用量としては、微細藻類固形分１ｇに対して１〜１０００００ユニット（Ｕ）が好ましく、１０〜５００００Ｕがより好ましい。ここで１ユニットは、株式会社学会出版センター発行の「生物化学実験法３１ 蛋白質分解酵素ＩＩ 鶴大典・船津勝編 １９９３年」の１４６〜１４７頁に記載された方法で測定した。具体的には、１Ｕは、基質として熱変性カゼインを用い、タンパク質分解酵素を添加した濃度１質量％の基質水溶液を１ｍｌ調製し、この基質水溶液の２８０ｎｍにおける吸光度を測定したとき、１分間に吸光度を０．００１上昇させる酵素量である。
【００２２】
当該処理のｐＨは、２．０〜９．０に調整することが好ましい。ｐＨが９．０をこえると得られる水抽出液に微細藻類特有の味、臭いが残り、例えば、得られたペプチドを食品等に配合して用いた場合に、食品の香味が悪化するばかりでなく、清涼飲料水等の酸性領域の食品中で沈殿物や浮遊物等の水不溶性成分が生じ易い為に好ましくない。ｐＨを調整するには、通常の食品の製造で用いる化合物、例えば、水酸化ナトリウムや塩酸等を用いればよい。
処理は、静置して行っても攪拌して行ってもよいが、攪拌するのが好ましい。処理温度は、タンパク質分解酵素の作用効率が良好なことから３０〜７５℃が好ましく、３５〜６０℃がより好ましい。
処理時間は、１〜３６時間が好ましく、２〜２４時間がより好ましい。
【００２３】
水可溶性ペプチド類を水溶液中に抽出させた後、後述する不溶物の除去工程を行うが、その前に必要に応じてタンパク質分解酵素を失活させてもよい。失活させるには、例えば、７０〜９５℃の環境下に５〜２０分間静置すればよい。
水可溶性ペプチド類を水溶液中に抽出させた後、水溶液中の不溶物を除去する。不溶物を除去する方法としては、固液分離できる手段であれば制限は無く、例えば、ろ紙やろ布等のろ材を用いたろ過方法や、上澄を回収するデカンテーション法、フィルタープレス法、遠心分離法等が挙げられる。なかでも、工業的に大量処理の可能な遠心分離法、フィルタープレス法等の上澄を回収する方法が好ましく、特に遠心分離法が好ましい。
遠心分離は、処理液から不溶分を除去できる条件であればよいが、重力加速度が１，０００〜３０，０００Ｇで１０秒〜２時間の条件が好ましく、重力加速度が３，０００〜１５，０００Ｇで１〜３０分間の条件がより好ましい。遠心分離機としては、ディスラッジ型遠心分離機、アルファ型遠心分離機、シャープレス型遠心分離機があるが、作業性が向上することから、ディスラッジ型遠心分離機とアルファ型遠心分離機の組み合わせによる連続遠心分離が好ましい。
【００２４】
前記式（１）〜（９）で表されるいずれか１種以上のペプチドを含有するペプチド混合物は、上記の不溶物除去工程の後、公知の方法で分画を行って得ても良い。
例えば、イオンクロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー法や、膜分離処理などのペプチドの分離手段として通常使用されている方法を、単独で或いは任意の順序で組み合わせて行う。
また、上記の不溶物除去工程の後に得られたペプチド混合物を、通常の高速液体クロマトグラフィーによって分画することにより、前記式（１）〜（９）で表されるいずれか１種のペプチドを製造することができる。
使用されるカラム担体は逆相カラムクロマトグラフィーで使用可能なオクタデシル基結合シリカゲルが好ましい。このようなオクタデシル基結合シリカゲルとしては、市販のものを用いることができ、例えば、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ（商標名）ＯＤＳ、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ（商標名）ＯＤＳ等のカラム担体を挙げることができる。
分画条件の一例を挙げると、例えば、Ｂ液の濃度が以下の時の溶出画分をそれぞれ採取することで、前記式（１）〜（９）で表されるいずれか１種のペプチドを得ることができる。
（分画条件）
溶離媒体：水／アセトニトリル＝９７／３（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸０．１体積％（Ａ液）、水／アセトニトリル＝２０／８０（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸０．１体積％（Ｂ液）、
（ｉ）カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−５（１０ｍｍ×２５０ｍｍ）
流速：４．０ｍＬ／ｍｉｎ
溶離条件：Ｂ液の濃度を毎分０．０５２体積％上昇させ、Ｂ液の濃度が下記の時の溶出画分を採取する。
下記式（１）で表されるＬ−アミノ酸配列からなるペプチド；Ｂ液濃度  ３．４〜５．８体積％、好ましくは４．６体積％
下記式（２）で表されるＬ−アミノ酸配列からなるペプチド；Ｂ液濃度  ３．５〜５．９体積％、好ましくは４．７体積％
下記式（３）で表されるＬ−アミノ酸配列からなるペプチド；Ｂ液濃度  ３．６〜６．０体積％、好ましくは４．８体積％
下記式（４）で表されるＬ−アミノ酸配列からなるペプチド；Ｂ液濃度  ３．６〜６．０体積％、好ましくは４．８体積％
下記式（６）で表されるＬ−アミノ酸配列からなるペプチド；Ｂ液濃度  ３．７〜６．１体積％、好ましくは４．９体積％
（ｉｉ）カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−５（１０ｍｍ×２５０ｍｍ）
流速：４．０ｍＬ／ｍｉｎ
溶離条件：Ｂ液の濃度を毎分０．３８３体積％上昇させ、Ｂ液の濃度が下記の時の溶出画分を採取する。
下記式（５）で表されるＬ−アミノ酸配列からなるペプチド；Ｂ液濃度  ２．７〜４．５体積％、好ましくは３．６体積％
（ｉｉｉ）カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−５（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
溶離条件：Ｂ液の濃度を毎分０．２３１体積％上昇させ、Ｂ液の濃度が下記の時の溶出画分を採取する。
下記式（７）で表されるＬ−アミノ酸配列からなるペプチド；Ｂ液濃度  ８．２〜１３．８体積％、好ましくは１１．０体積％
下記式（８）で表されるＬ−アミノ酸配列からなるペプチド；Ｂ液濃度  ８．６〜１４．４体積％、好ましくは１１．５体積％
下記式（９）で表されるＬ−アミノ酸配列からなるペプチド；Ｂ液濃度  ７．３〜１２．３体積％、好ましくは９．８体積％
このようにすることで、より純度の高いペプチドを得ることができる。
【００２５】
［化４］
Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ      （１）
Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ      （２）
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ      （３）
Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ      （４）
Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ      （５）
Ｉｌｅ−Ｔｙｒ              （６）
Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ      （７）
Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ      （８）
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ      （９）
【００２６】
上記で得られたＡＣＥ阻害作用を有するペプチド混合物又はペプチドは、必要に応じて濃縮等の後処理を行い、そのまま飲料等に使用することもできるが、濾過等によって精製してもよい。また、必要であれば、更に殺菌後、乾燥して食品に供してもよい。更に粉末化することもできる。乾燥方法としては、凍結乾燥法、噴霧乾燥法等があるが、経済的なことから噴霧乾燥法が好ましい。また乾燥する時に、微細藻類抽出液にデキストリン等を加えて乾燥して、粉末物性を整えることも可能である。
【００２７】
得られたペプチドのアミノ酸配列の分析は、通常公知のエドマン（Ｅｄｍａｎ）法により行うことができる。本法の概要を説明すると、まず、ペプチドに、Ｎ末端の遊離のアミノ基としか共有結合しない化学試薬を加え、次に、弱い酸を加えて、この試薬を活性化し、Ｎ末端のペプチド結合だけを切断し、切断されたアミノ酸をクロマトグラフィーで同定する。続いて、アミノ酸１つ分だけ短くなったペプチドに対して同じ操作を順次繰り返し、ペプチド中のアミノ酸配列を決定する。本発明においても、当該法により、得られたペプチドのアミノ酸配列の決定を行った。
【００２８】
得られたペプチドのＡＣＥ阻害作用測定には、通常公知の、例えば、ＣｕｓｈｍａｎとＣｈｅｕｎｇらの開発した方法が簡便であり、広く用いられている。測定は、ＡＣＥを作用させる基質として、例えば、Ｈｉｐ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ（Ｈｉｐは馬尿酸残基）を用い、ＡＣＥ処理を行った後の遊離した馬尿酸を測定し、酵素阻害作用を評価する。例えば、試験管中に試料溶液、基質を入れ、恒温槽中に保持し、ＡＣＥ溶液を添加、攪拌し、反応させる。塩酸を添加し、反応を停止させた後、酢酸エチルを添加し遊離した馬尿酸を回収する。酢酸エチルを留去後、水を加え、馬尿酸を溶解した後、分光光度計により、吸光度を測定する。
ＡＣＥ阻害活性は以下の式に従って計算する。阻害率（％）＝｛（ＥＣ−ＥＳ）／（ＥＣ−ＥＢ）｝×１００。ここで、ＥＳは試料溶液を添加したときの吸光度、ＥＣは試料溶液の代わりに蒸留水を加えたときの吸光度、ＥＢは、予め１Ｎ塩酸を加えて反応させたときの吸光度を示す。阻害率５０％を示すときの反応液中の試料濃度をＩＣ５０値とする。
【００２９】
本発明の製造方法により得られる、前記式（１）〜（９）で表されるペプチドはいずれも、ＡＣＥ阻害作用を有するため、これらを有効成分として含有するＡＣＥ阻害剤は、血圧降下作用、ブラデイキニン不活化抑制作用を示す。従って、本態性高血圧、腎性高血圧、副腎性高血圧等の高血圧症の予防、治療剤、これらうっ血性心不全に対する臓器循環の正常化と長期予後の改善（延命効果）作用を有し、心不全の治療剤として有用である。
また、前記式（１）〜（９）で表されるペプチドは、Ｌ−アミノ酸のみの配列構造からなり、投与後、生体内のプロテアーゼにより徐々に分解される為、毒性は極めて低く、安全性は極めて高い（ＬＤ５０＞２０００ｍｇ／ｋｇ；ラット経口投与）。
【００３０】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、以下において、単位「Ｍ」は「ｍｏｌ／Ｌ」を示す。
【実施例１】
【００３１】
（ペプチドの製造）
スピルリナ粉末１ｇに蒸留水１０ｍＬを加え、スピルリナ懸濁液を得た。この懸濁液を１Ｍ水酸化カリウムにてｐＨ６．５〜７．４に調整し、９５℃、３０分間煮沸した。放冷後、プロテアーゼＮ（天野エンザイム社製、製品名「アマノ」Ｇ）０．０１ｇを添加し、５５℃、１８時間撹拌しながら加水分解を行った。分解反応液を９５℃、３０分間煮沸放冷後、遠心分離（１０，０００Ｇ、１時間）にて沈殿を除去し、上清を凍結乾燥してペプチド混合物（１）を０．５０ｇ得た。
続いて、得られたペプチド混合物（１）４００ｍｇを２ｍＬの０．１体積％トリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡと略記する）水溶液に溶解した後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行った。カラムとしては野村化学社製  商標名：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−５（１０ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ）を使用し、移動相としては（Ａ液）；０．１体積％ＴＦＡ水溶液／アセトニトリル＝９７／３（ｖ／ｖ）、（Ｂ液）；０．１体積％ＴＦＡ水溶液／アセトニトリル＝２０／８０（ｖ／ｖ）を用い、Ａ液中のＢ液濃度を０〜６体積％まで濃度勾配をかけながら、流速４．０ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長２１５ｎｍでクロマトグラフィーを行った。その結果、溶出時間；３２．１分、Ｂ液濃度４．６体積％にＡＣＥ阻害活性の高いペプチドフラグメントのピークを得た。このＨＰＬＣ分析の結果は図１に示す。
このようにして得たペプチドフラグメントのアミノ酸分析を行ったところ、Ｐｒｏ；１．００、Ａｌａ；０．８４、及びＩｌｅ；０．８８であった。
当該ペプチドフラグメントのアミノ酸配列は、ヒューレットパッカード社製のプロテインシークエンサーＧＩ０００ＡおよびＰＴＨアナライザーＩ０９０型を用いて決定した。その結果、得られたペプチドは、前記式（１）で表されるＬ体のアミノ酸配列からなるペプチドであることが確認された。
なお、当該ペプチドの常温における性状は白色の粉末であった。
同様にして、ペプチド（１）〜（６）について分画、及び確認を行った。その結果を図１に示す。横軸はＨＰＬＣによる溶出時間、縦軸は２１５nmにおけるピーク値を示す。
【００３２】
[試験例１]
（合成ペプチドとの比較）
島津製作所社製の多種品目同時固相法自動ペプチド合成装置ＰＳＳＭ−８型を用いて、９−フルオレニルメトキシカルボニル（以下、Ｆ−ｍｏｃと略記する）法によって、常法どおり、そのＣ末端側のＰｒｏから前記式（１）で表されるペプチドを合成した。
得られた未精製の合成ペプチドは蒸留水に溶解した後、ジーエルサイエンス社製  商標名：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＰＲＥＰ  ＯＤＳ（４．５ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ）を用いたＨＰＬＣにより精製した。移動相として（Ａ）０．１体積％ＴＦＡ含有蒸留水、（Ｂ）０．１体積％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使用し、（Ｂ）液が３０分間で５→６５体積％の濃度勾配法により流速１．５ｍｌ／ｍｉｎでクロマトグラフィーを行った。紫外部波長２２０ｎｍで検出し、最大の吸収を示した溶出画分を分取し、これを凍結乾燥することによって目的とするペプチドを得た。
本試験例により得られた合成ペプチドは、実施例１により単離されたペプチドと同一のＨＰＬＣ条件にて分析を行った結果、同一の保持時間を有した。
【実施例２】
【００３３】
（ペプチドの分離・同定、合成ペプチドとの比較）
図１において、実施例１と同様の方法で、ＡＣＥ阻害活性の高いピークのペプチドフラグメントを順に単離後、ヒューレットパッカード社製のプロテインシークエンサーＧＩ０００ＡおよびＰＴＨアナライザーＩ０９０型を用いてアミノ酸配列を決定した。その結果、得られたペプチドはそれぞれ、前記式（２）〜（６）で表されるＬ体のアミノ酸配列からなるペプチドであることが判明した。各々のペプチドを試験例１に記載した方法と同様にして合成し、単離したペプチドと同一のＨＰＬＣ条件で同一の保持時間であることを確認した。
【実施例３】
【００３４】
プロテアーゼＮの代わりに、ペプシン（メルク社製、酵素番号ＥＣ３．４．２３．１）を用いたこと以外は実施例１と同様にしてペプチドの製造を行い、ペプチド（７）〜（９）を得た。
図２は、ペプチド（７）〜（９）に関し、横軸はＨＰＬＣによる溶出時間、縦軸は２１５nmにおけるピーク値を示す。
（ＨＰＬＣ条件）
ジーエルサイエンス社製  商標名：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＰＲＥＰ  ＯＤＳ（４．５ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ）を用いたＨＰＬＣにより精製した。移動相として（Ａ）０．１体積％ＴＦＡ含有蒸留水、（Ｂ）０．１体積％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使用し、（Ｂ）液が３０分間で５→６５体積％の濃度勾配法により流速１．５ｍｌ／ｍｉｎでクロマトグラフィーを行った。
各々のペプチドを試験例１に記載した方法と同様にして合成し、単離したペプチドと同一のＨＰＬＣ条件で同一の保持時間であることを確認した。
【実施例４】
【００３５】
（青色色素抽出残渣の処理）
スピルリナ粉末１０ｇに１％塩化カルシウム２水和物溶液３００ｍＬを加え、２５℃、１６時間静置、スピルリナ青色素を抽出した。得られた抽出液にリン酸水素２ナトリウム１２水和物５ｇを添加、よく撹拌し、遠心分離（１０，０００Ｇ、１時間）を行った。その結果、スピルリナ青色色素抽出残渣１１．７ｇ（無機塩を含む）を得た。こうして得られた残渣１ｇに蒸留水１０ｍＬを加え、スピルリナ懸濁液を得た。この懸濁液を１Ｍ水酸化カリウムにてｐＨ６．５〜７．４に調整し、９５℃、３０分間煮沸した。放冷後、プロテアーゼＮ（天野エンザイム社製、製品名「アマノ」Ｇ）０．０１ｇを添加し、５５℃、３時間撹拌しながら加水分解を行った。分解反応液を９５℃、３０分間煮沸放冷後、遠心分離（１０，０００Ｇ、１時間）にて沈殿を除去し、上清を凍結乾燥してペプチド混合物（２）を０．２０ｇ得た。
【実施例５】
【００３６】
（スピルリナエキス抽出残渣の処理）
スピルリナ粉末１０ｇに蒸留水１００ｍＬを加え、１２１℃、１時間、スピルリナエキスを抽出した。放冷後、抽出液のｐＨをクエン酸にて４に調整し、遠心分離（１０，０００Ｇ、１時間）を行った。その結果、スピルリナエキス抽出残渣８．７ｇを得た。こうして得られた残渣１ｇに蒸留水１０ｍＬを加え、スピルリナ懸濁液を得た。この懸濁液を１Ｍ水酸化カリウムにてｐＨ６．５〜７．４に調整し、９５℃、３０分間煮沸した。放冷後、プロテアーゼＮ（天野エンザイム社製、製品名「アマノ」Ｇ）０．０１ｇを添加し、５５℃、３時間撹拌しながら加水分解を行った。分解反応液を９５℃、３０分間煮沸放冷後、遠心分離（１０，０００Ｇ、１時間）にて沈殿を除去し、上清を凍結乾燥してペプチド混合物（３）を０．４３ｇ得た。
【００３７】
[試験例２]
（ＡＣＥ阻害活性の測定）
ＡＣＥ（シグマ社製、酵素番号ＥＣ３．４．１５．１）１．５ｍＵ、合成基質Ｈｉｐ-Ｈｉｓ-Ｌｅｕ（シグマ社製）６．５ｍＭを用い、通常公知の方法に準じて測定した。即ち、生成した馬尿酸を酢酸エチルにて抽出し２２８ｎｍの吸光度で測定した。被検液での吸光度をＥｓ、被検液の代わりに緩衝液を加えた時の値をＥｃ、予め反応停止液を加えて反応させた時の値をＥｂとして次式から阻害率を求めた。
阻害率（％）＝（Ｅｃ−Ｅｓ）／（Ｅｃ−Ｅｂ）×１００
先に得たペプチド混合物（１）、（２）及び（３）を蒸留水にて０．０９（ｗ／ｖ）％に調整後、各々の阻害率を測定したところ、５０％、４７％、５０％であった。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明は、高血圧患者のための血圧低下剤の製造等に利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】実施例１で得られたペプチドをＨＰＬＣで分析した結果を示す。
【図２】実施例３で得られたペプチドをＨＰＬＣで分析した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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