(57)【要約】【課題】  ＤＮＡを分離分析するＤＮＡ解析法において、電気泳動速度を遅延させる対象である目的ＤＮＡ毎に流路を用意しなくても１つの流路内で複数の部位から抽出したＤＮＡ断片のＳＮＰｓ判別が可能となるＳＮＰｓ判別法を提供する。【解決手段】  ＤＮＡ群を流路内で電気泳動させ、このＤＮＡ郡中のＤＮＡ断片を分離分析するときに、１つの流路内で複数の部位から抽出したＤＮＡ断片を部位によって分離し、さらに、ＤＮＡコンジュゲート群によってＳＮＰｓ分離を行う。【選択図】  図１
2007105007.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
同一のプライマーによって少なくとも１生体から抽出したＤＮＡをＰＣＲにかけ増幅したＤＮＡ断片を１セットとし、前記ＤＮＡ断片を２セット以上含むＤＮＡ群が流路を泳動するときに、前記ＤＮＡ群に光を照射して前記ＤＮＡ断片を判別するＳＮＰｓ判別法において、
前記ＤＮＡ群に含まれるＤＮＡ断片の分子量を１セットごとに異ならせる第１工程と、
前記第１工程において分子量を異ならせたＤＮＡ断片の１セットごとに対応するＤＮＡプローブを有するＤＮＡコンジュゲート群を含む緩衝液を前記流路に充填する第２工程と、
前記第１工程において分子量を異ならせたＤＮＡ断片を含むＤＮＡ群を、前記第２工程において緩衝液が充填された流路において電気泳動させる第３工程と、を有してなる、ＳＮＰｓ判別法。
【請求項２】
前記ＤＮＡコンジュゲート群に含まれるＤＮＡプローブが、６個以上１２個以下の塩基で構成されてなる、請求項１に記載のＳＮＰｓ判別法。
【請求項３】
前記第１工程において、前記ＤＮＡ群に含まれるＤＮＡ断片の塩基長を変化させて前記ＤＮＡ断片の分子量を異ならせてなる、請求項１に記載のＳＮＰｓ判別法。
【請求項４】
前記第１工程において、前記ＤＮＡ群に含まれるＤＮＡ断片に付加物を付加させて前記ＤＮＡ断片の分子量を異ならせてなる、請求項１に記載のＳＮＰｓ判別法。
【請求項５】
前記付加物が、ガラス、磁気ビーズ、蛍光物質の多量体、リニアポリマーのいずれかである、請求項４に記載のＳＮＰｓ判別法。
【請求項６】
前記リニアポリマーが、アクリルアミドまたはポリエチレングリコールのいずれかである、請求項５に記載のＳＮＰｓ判別法。
【請求項７】
前記付加物がマイナスの電荷を帯びており、該付加物の電荷量を該付加物の分子量で除算したものが、該付加物の結合先であるＤＮＡ断片の電荷量を該ＤＮＡ断片の分子量で除算したものより大きい、請求項４に記載のＳＮＰｓ判別法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡを分離分析するＤＮＡ解析法に関し、特に複数のＤＮＡのＳＮＰｓ判別に好適なＳＮＰｓ判別法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、分子生物学の急速な進展によって、様々な疾患において遺伝子の関与がかなり正確に理解されるようになり、遺伝子をターゲットにした医療に注目が集まるようになってきている。
【０００３】
ＤＮＡに関しては、現在ＳＮＰｓ（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍの略で「１塩基多型」と一般に訳されており、遺伝子における１暗号（１塩基）の違いの総称である。）が注目されている。その理由としては、ＳＮＰｓの分類により、多くの疾患に対する罹患率や各個人の薬剤に対する効果や感受性を予測でき、さらには、地球上に親子兄弟といえども全く同じＳＮＰｓを持つ人間は絶対に存在しないことから個人の完全な特定ができると考えられているからである。
【０００４】
前記ＳＮＰｓを調べる方法として、アフィニティリガンドキャピラリー電気泳動によってＤＮＡを分離する方法がある（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
前記アフィニティリガンドキャピラリー電気泳動は、塩基配列を特異的に認識するアフィニティリガンドとして、被検体ＤＮＡの塩基配列と相補的関係にある１本鎖をキャピラリー壁面に固定し、該キャピラリーに固定されたアフィニティリガンドと被検体ＤＮＡとが相互作用して、該被検体ＤＮＡが前記キャピラリーに吸着されることを利用し、前記被検体ＤＮＡを検出するものである。しかしこの方法だと、前記アフィニティリガンドと前記被検体ＤＮＡとの相互作用がキャピラリー（流路）の壁面近傍に限られてしまうという問題があった。
【０００６】
これを解決するため、前記ＳＮＰｓを調べる一つの方法として、前記アフィニティリガンドをキャピラリー内で擬似的に固定する方法を開発し、その方法を利用して被検体ＤＮＡを分離する遺伝子診断装置と遺伝子診断方法が開示されている（例えば、特許文献２参照）。
【０００７】
以下、図１０〜図１３を用いて従来方法について説明する。図１０は、特許文献２に記載のキャピラリー電気泳動装置の構成を示す図であり、図１１は、キャピラリー電気泳動装置のキャピラリー内の状態図であり、図１２は、従来におけるＤＮＡ群とＤＮＡコンジュゲートとの関係を示す図である。
【０００８】
図１０に示すように、キャピラリー電気泳動装置１００は、それぞれに正電極１３３，負電極１３４を配置した第１容器１３１と第２容器１３２との間を、リニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤とを含む緩衝液２３を充たしたキャピラリー１３０で連絡している。そして、図１１に示すように、このキャピラリー１３０の緩衝液２３の中に、図１２に示す前記ＤＮＡ群２００に含まれ、電気泳動速度を遅延させる対象である目的ＤＮＡに対し水素結合可能な塩基配列２１２（以下、「ＤＮＡプローブ」と称す。）と、電気泳動時にほとんど泳動しないリニアポリマーなど電気非泳動物質２１１とを結合してなるＤＮＡコンジュゲート２１０を充填した後、続いて被検体であるＤＮＡ群２００を充填する。
【０００９】
その後、両電極１３３，１３４間に可変電源部１３５により電圧を印加して、キャピラリー１３０内の被検体であるＤＮＡ群を電気泳動させ、該ＤＮＡ群に含まれる前記目的ＤＮＡをキャピラリー（流路）内でＤＮＡコンジュゲートと水素結合させることでキャピラリー（流路）内に擬似的に固定し、該ＤＮＡ群中から目的ＤＮＡを分離する。
【００１０】
ここで、図１２を用いて、アフィニティリガンドをキャピラリー内で擬似的に固定する方法についてより詳細に説明する。
【００１１】
ＤＮＡには、二重鎖を形成するものと一重鎖を形成するものとが存在するが、ＤＮＡのもつアデニン（Ａ），チミン（Ｔ），シトシン（Ｃ），グアニン（Ｇ）４つの塩基は互いにＡとＴ、ＧとＣが結合し易くなっており、ＤＮＡの二重鎖においてもＡ−Ｔ，Ｇ−Ｃで対をなしている。
【００１２】
従って、一方のＤＮＡが５’−ＡＴＣＧＣＧＴ−３’と配列されている場合、他方のＤＮＡは３’−ＴＡＧＣＧＣＡ−５’という塩基配列をもっている。
【００１３】
ＤＮＡ群を分離するＤＮＡコンジュゲートは、前述したようなＤＮＡの相補的関係を利用するために、該ＤＮＡコンジュゲートのＤＮＡ部分に、ＤＮＡ群に含まれる目的ＤＮＡと相補的関係をもつＤＮＡ配列を与えている。例えば、目的ＤＮＡがミュータントＤＮＡであるとし、該ミュータントＤＮＡのＤＮＡ配列が５’−ＡＴＣＧＣＧＴ−３’を含み、一方、前記ＤＮＡ群に含まれるワイルドＤＮＡが５’−ＡＴＣＡＣＧＴ−３’を含む場合、下線で示した部分でミュータントＤＮＡとワイルドＤＮＡの塩基が異なっている。
【００１４】
このとき、ＤＮＡコンジュゲート２１０のＤＮＡプローブ２１２の配列を３’−ＴＡＧＣＧＣＡ−５’とすると、ワイルドＤＮＡは下線部においてＤＮＡコンジュゲート２１０のＤＮＡプローブ２１２と相補的ではなくなる。これにより、ＤＮＡコンジュゲートと結合したＤＮＡ群のうち、ミュータントＤＮＡの方がワイルドＤＮＡより該ＤＮＡ群との全体の結合力が大きくなり、電気泳動時にミュータントＤＮＡの方がワイルドＤＮＡより遅延して泳動される。
【００１５】
前記ＤＮＡ群は、血液などから細胞を破砕してＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）などによって目的のＤＮＡ配列を含む部分を増幅して作製する。このとき、増幅する部分の塩基数と塩基配列パターンに応じて、ＤＮＡコンジュゲートの塩基数が決定されるが、ＰＣＲなどで増幅する目的のＤＮＡの塩基数は、約３０億塩基対あるといわれるヒト・ゲノムＤＮＡ中に、同じＤＮＡ配列が存在しないと確率的に考えられる個数は５０個程度である。
【００１６】
ＤＮＡコンジュゲート２１０の作製は、電気非泳動物質２１１が例えばアクリルアミドで作られたリニアポリマーの場合、前記目的ＤＮＡの配列と相補的配列をもつＤＮＡプローブ２１２の５’末端をビニル化して、アクリルアミドモノマーに所定の比率で混入し、さらに、重合開始剤である過硫酸アンモニウムと重合剤であるテトラ・エチレン・ジアミンを混ぜて、２時間振動させて作製する。
また、ＤＮＡコンジュゲートは、ＤＮＡ群との相補的な水素結合による結合力によって、分離性能が決定づけられるため、前記ＤＮＡコンジュゲートのＤＮＡプローブ２１２の塩基配列長さ、あるいは配列パターンによって、該ＤＮＡプローブとＤＮＡ群との結合力が異なる。
【００１７】
具体的に述べると、前述したようにＤＮＡの４つの塩基は、アデニン（Ａ）−チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）−シトシン（Ｃ）で対となるが、アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）の場合は２個の水素結合で結合され（図１３（ａ）参照）、グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）の場合は３個の水素結合で結合されている（図１３（ｂ）参照）。
【００１８】
従って、ＤＮＡプローブ２１２の塩基配列の長さが同じであっても、ＤＮＡ群と前記ＤＮＡプローブとの結合力は、被検体であるＤＮＡ群の配列パターンによって異なってくる。例えば、相補的な結合部分であるＤＮＡプローブ２１２の塩基配列が６個の場合、水素結合が最低１２個（すべてＡ−Ｔの場合）から最高１８個（すべてＣ−Ｇの場合）まで存在することとなり、相補的な結合部分の塩基配列の長さが同じであっても、その結合力はかなり異なる。
【００１９】
そこで、ＤＮＡ群に含まれ、電気泳動速度を遅延させる対象である目的ＤＮＡと、該目的ＤＮＡと相補的な配列をもつＤＮＡプローブとの結合力を適当なものにするため、該目的ＤＮＡの塩基配列に応じて、ＤＮＡコンジュゲートを作製する際に、緩衝液に含有する結合制御剤の量や、リニアポリマーの粘度を調整しておく。
【００２０】
ここで、前記結合制御剤は量が多いほど、また前記リニアポリマーは粘度が高いほど、ＤＮＡ群がＤＮＡコンジュゲート内を通過するスピードが遅くなり、ＤＮＡ群とＤＮＡコンジュゲートとの結合力は増加する。
【００２１】
次に、電気泳動装置のキャピラリーに、緩衝液と作製されたＤＮＡコンジュゲートを充填し、ＤＮＡ群をキャピラリーの一端に注入して電気泳動で第２容器１３２から第１容器１３１へ移動させることにより、ＤＮＡコンジュゲートをキャピラリー内に擬似的に固定でき、ＤＮＡコンジュゲートと被検体ＤＮＡとの相互作用が、キャピラリーの壁面近傍に限らず該キャピラリー内で作用し、該相互作用によりＤＮＡコンジュゲートと結合したＤＮＡ群の移動速度差からＤＮＡ群を前記ワイルドＤＮＡと前記ミュータントＤＮＡとに分離する。
【特許文献１】特開平７−３１１１９８号公報
【特許文献２】特開２００２−３４０８５９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
しかしながら、前記従来の方法では、１つの流路で同時に複数種類のＤＮＡをＳＮＰｓ判別しようとすると、電気泳動装置の検出部で同時に複数種類のＤＮＡ断片が検出され、どの検出波形がどのＤＮＡ断片か特定できなかった。
【００２３】
さらに、電気泳動時の電圧、測定温度、緩衝液に含有する結合制御剤の量、リニアポリマーの粘度などのパラメータ（ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ断片の結合力に左右するパラメータ。以下分離パラメータと呼ぶ。）をＤＮＡコンジュゲートの種類ごとに調節出来なくなる為、分離パラメータがＤＮＡ断片とＤＮＡコンジュゲートの最適な分離条件に合わず、判別できなかった。
【００２４】
そのため、１つの流路で１種類のＤＮＡ断片しかＳＮＰｓ判別することが出来ず、同時に複数種類のＤＮＡ断片をＳＮＰｓ判別する場合はＤＮＡ断片の種類だけ流路が必要になっていた。
【００２５】
そのため、検出部が流路の数だけ必要になり、装置の構成上煩雑になっていた。  
【００２６】
本発明は、前記課題に鑑みてなされたものであり、複数の部位から抽出したＤＮＡ断片を同時にＳＮＰｓ判別する際に、ＤＮＡ断片の種類ごとに流路を用意しなくても、１つの流路で複数種類のＤＮＡ断片をＳＮＰｓ判別できるＳＮＰｓ判別法を提供することを目的とする。
【００２７】
ここで、ＤＮＡ断片の種類は、ＤＮＡ断片を抽出した部位の種類のことであり、
例えば、ＡＴＧＧＣとＡＴＣＧＣは共に第Ａ染色体のＢ遺伝子を持つ部位から抽出したＤＮＡ断片で、塩基配列は１つ異なるが、抽出した部位が同じであるので、同一種類であると定義することにする。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
前記課題を解決するために、本発明は、同一のプライマーによって少なくとも１生体から抽出したＤＮＡをＰＣＲにかけ増幅したＤＮＡ断片を１セットとし、前記ＤＮＡ断片を２セット以上含むＤＮＡ群が流路を泳動するときに、前記ＤＮＡ群に光を照射して前記ＤＮＡ断片を判別するＳＮＰｓ判別法において、
前記ＤＮＡ群に含まれるＤＮＡ断片の分子量を１セットごとに異ならせる第１工程と、
前記第１工程において分子量を異ならせたＤＮＡ断片の１セットごとに対応するＤＮＡプローブを有するＤＮＡコンジュゲート群を含む緩衝液を前記流路に充填する第２工程と、
前記第１工程において分子量を異ならせたＤＮＡ断片を含むＤＮＡ群を前記第２工程において緩衝液が充填された流路において電気泳動させる第３工程と、を有してなる。
【００２９】
さらに、本発明は、前記ＤＮＡコンジュゲート群に含まれるＤＮＡプローブが、６個以上１２個以下の塩基で構成されてなる。
【００３０】
さらに、本発明は、前記第１工程において、前記ＤＮＡ群に含まれるＤＮＡ断片の塩基長を変化させて前記ＤＮＡ断片の分子量を異ならせてなる。
【００３１】
さらに、本発明は、前記第１工程において、前記ＤＮＡ群に含まれるＤＮＡ断片に付加物を付加させて前記ＤＮＡ断片の分子量を異ならせてなる。
【００３２】
さらに、本発明は、前記付加物が、ガラス、磁気ビーズ、蛍光物質の多量体、リニアポリマーのいずれかである。
【００３３】
さらに、本発明は、前記リニアポリマーが、アクリルアミドまたはポリエチレングリコールのいずれかである。
【００３４】
さらに、本発明は、前記付加物がマイナスの電荷を帯びており、該付加物の電荷量を該付加物の分子量で除算したものが、該付加物の結合先であるＤＮＡ断片の電荷量を該ＤＮＡ断片の分子量で除算したものより大きい。
【発明の効果】
【００３５】
以上のように、請求項１に記載の発明によれば、複数種類のＤＮＡ断片を１つの流路でＳＮＰｓ判別することができ、従来にくらべ流路の数と検出部の数を節約することができるので、装置の構成を簡単にすることが可能になる。
【００３６】
また、従来までは、分子量によるふるいわけの技術、塩基配列によるふるいわけの技術が単独で行われていたが、請求項１に記載の発明によれば、二つの技術を足し合わせることにより、分子量によってＤＮＡ断片の種類ごとにＤＮＡ断片がふるいわけされ、さらに塩基配列（ＳＮＰｓ）によって同一の分子量のＤＮＡ断片がふるいわけされる。これにより、複数種類のＤＮＡ断片が検出部で重なることなくＳＮＰｓ分離される。
【００３７】
また、請求項１に記載の発明によれば、マイナスに帯電した付加物を電気泳動させるＤＮＡ断片に結合させることによって、各ＤＮＡ断片の電気泳動速度を調節することが出来る。
これにより、電荷量によってＤＮＡ断片の種類ごとにふるいわけされ、さらに塩基配列（ＳＮＰｓ）によって同一の分子量のＤＮＡ断片がふるいわけされる。これにより、複数種類のＤＮＡ断片が検出部で重なることなくＳＮＰｓ分離される。
【００３８】
さらに、１流路内で同じ分離パラメータであっても、前記ＤＮＡコンジュゲート群のＤＮＡプローブの種類ごとに６個の塩基から１２個の塩基の範囲内で塩基長を調節することで、複数種類のＤＮＡ断片と複数種類のＤＮＡプローブの結合力が最適なものとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
以下に、本発明のＳＮＰｓ判別法の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
【実施例１】
【００４０】
以下、図１〜図６を用いて、本実施例１のＳＮＰｓ判別法について説明する。
【００４１】
本実施例のＳＮＰｓ判別法は、種類の異なる２種類のＤＮＡの塩基長を種類ごとに異ならせることで各種類のＤＮＡ断片の泳動速度を調節し、さらに同一種類のＤＮＡ断片をＤＮＡコンジュゲートでＳＮＰｓによって分離するものである。
【００４２】
図１は本実施例１を行う手順を示す。図１の手順に従って、本実施例１の実施方法を説明する。
【００４３】
ＤＮＡ群を作製するステップ１では、ＤＮＡ群の作製を行う。ここで、本実施例１のＤＮＡ群１６の作製手順を図２に示す。本願における被検体のＤＮＡ断片は、従来と同様、血液などから細胞を破砕してＤＮＡを抽出し、ＰＣＲなどによってＤＮＡ断片の塩基配列を含む部分を増幅して作製される。また、前記ＰＣＲ時に、前記被検体のＤＮＡ断片には、蛍光色素や別の標識となりうるタグが付加される。ただし、本実施例１は、モデル実験として行ったもので、被検体ＤＮＡ断片は合成オリゴ品を用いている。
【００４４】
本実施例１では、ＤＮＡプローブ９との結合型ＤＮＡ（図５中、ＤＮＡ１２）として、ＦＩＴＣ−５’−ＣＧＧＣＴＧＧＧＧＧＣＴＧＡ−３’（１４塩基）を、ＤＮＡプローブ９との非結合型ＤＮＡ（図５中、ＤＮＡ１４）として、ＦＩＴＣ−５’−ＣＧＧＴＴＧＧＧＧＡＣＴＧＡ−３’（１４塩基）を、ＤＮＡプローブ１０との結合型ＤＮＡ（図５中ＤＮＡ１３）として、ＦＩＴＣ−５’−ＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧＣＣＴＴＧＡＣＧＡＴＡ−３’（６０塩基）を、ＤＮＡプローブ１０との非結合型ＤＮＡ（図５中、ＤＮＡ１５）として、ＦＩＴＣ−５’−ＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＴＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧＣＣＴＴＧＡＣＧＡＴＡ−３’（６０塩基）を用いた。
【００４５】
ここで、本明細書のＤＮＡ断片の種類の定義においては、ＤＮＡ１２とＤＮＡ１４はＳＮＰｓ部分の塩基が異なる同一種類のＤＮＡ断片であり、ＤＮＡ１３とＤＮＡ１５はＳＮＰｓ部分の塩基が異なる同一種類のＤＮＡ断片となる。
【００４６】
ＤＮＡコンジュゲート群を作製するステップ２では、ＤＮＡコンジュゲート群の作製を行う。本実施例１におけるＤＮＡコンジュゲート群１０の作成手順は図３に、構成は図４に示す。図４において、本実施例１のＤＮＡコンジュゲート群１１は、電気非泳動物質７と、ＤＮＡプローブ９、電気非泳動物質８とＤＮＡプローブ１０からなり、該ＤＮＡプローブ９は、図５中のＤＮＡ１２に含まれる特定の塩基配列と相補的な配列を有するものであり、該ＤＮＡプローブ１０は、図５中のＤＮＡ１３に含まれる特定の塩基配列と相補的な配列を有するものである。本実施例１においては、ＤＮＡプローブ９としてｐｏｌｙＡＡｍ−５’−ＣＣＡＧＣＣ−３’を、ＤＮＡプローブ１０としてｐｏｌｙＡＡｍ−５’−ＡＣＣＡＧＣ−３’を用いた。
【００４７】
ここで、前記電気非泳動物質７、電気非泳動物質８は、電気泳動時のＤＮＡ群の電気泳動速度に対して無視できるほど遅い速度で電気泳動する物質で構成されている。本願でいう「ＤＮＡ群の電気泳動速度に対して無視できるほど遅い速度で電気泳動する」とは、例えば内径が７５μｍ、距離３８センチメートルのキャピラリー内を電気泳動する場合、ＤＮＡ群が８分で移動するのに対して、前記ＤＮＡコンジュゲート群１１は６０分以上で移動するというレベルを意味し、電気泳動時にほとんど泳動しないといえるものである。
【００４８】
前記電気非泳動物質は、電気泳動時にほとんど泳動しない物質であればよく、例えば、ポリマーやガラス、磁気ビーズなどが例として挙げられる。本実施例１では、前記電気非泳動物質７、電気非泳動物質８が、一般的に使用されるリニアポリマーである、アクリルアミドである場合を例に挙げて説明する。
【００４９】
前記ＤＮＡプローブ９とＤＮＡプローブ１０の塩基配列は、６塩基以上１２塩基以下が良い。これは、これまでの実験から６塩基より少ないＤＮＡプローブでは、被検体であるＤＮＡ断片の意図する箇所以外にも結合してしまうことが確認され、１２塩基より多いＤＡＮプローブでは、被検体であるＤＮＡ断片との結合が強すぎて、ＤＮＡプローブと被検体であるＤＮＡ断片が結合したままになるということが確認されているからである。
【００５０】
次に、通常の測定温度、及び印加電圧の条件では、ＤＮＡ群とＤＮＡコンジュゲート群１１とは緩衝液中で電気泳動しており、該緩衝液中には結合制御剤である塩化マグネシウムの陽イオンが含まれているため、ＤＮＡ群１６に含まれるＤＮＡ１２、ＤＮＡ１３、ＤＮＡ１４、ＤＮＡ１５とＤＮＡコンジュゲート群１１のＤＮＡプローブ９、ＤＮＡプローブ１０は、前記塩化マグネシウム陽イオンに近づいて、相補的な関係の場合に結合するという性質を持っている。
【００５１】
従って、ＤＮＡ群１６に含まれるＤＮＡ断片の塩基配列に応じて、ＤＮＡプローブ９とＤＮＡプローブ１０の塩基配列の長さをそれぞれ制御することで、ＤＮＡ１２とＤＮＡプローブ９、ＤＮＡ１３とＤＮＡプローブ１０の結合力をコントロールすることが可能となる。この結果、結合制御剤の量、リニアポリマーの粘度の量が流路内で一定であっても、ＤＮＡ１２をＤＮＡ１４より、ＤＮＡ１３をＤＮＡ１５より、ＳＮＰｓによって遅延させることが可能となる。
【００５２】
具体的な制御としては、ＤＮＡプローブ９の塩基配列のＧＣ含量やＴＭ値（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）から、ＤＮＡ１２とＤＮＡプローブ９との結合が強すぎると判断される場合は、ＤＮＡプローブ９の塩基配列を短くし、ＤＮＡプローブ１０の塩基配列のＧＣ含量やＴＭ値から、ＤＮＡ１３とＤＮＡプローブ１０との結合力が強すぎると判断される場合は、ＤＮＡプローブ１０の塩基配列を短くしたＤＮＡコンジュゲート群１１を作製する。
【００５３】
逆に、ＤＮＡプローブ９の塩基配列のＧＣ含量やＴＭ値からＤＮＡ１２とＤＮＡプローブ９との結合が弱すぎると判断される場合は、ＤＮＡプローブ９の塩基配列を長くし、ＤＮＡプローブ１０の塩基配列のＧＣ含量やＴＭ値からＤＮＡ１３とＤＮＡプローブ１０との結合力が弱すぎると判断される場合は、ＤＮＡプローブ１０の塩基配列を長くしたＤＮＡコンジュゲート群１１を作製する。
【００５４】
電気非泳動物質７とＤＮＡプローブ９、電気非泳動物質７とＤＮＡプローブ１０の結合は、例えば、前記電気非泳動物質がアクリルアミドで作られたリニアポリマーの場合は、ＤＮＡプローブ９、ＤＮＡプローブ１０の５’末端をビニル化した後、該ビニル化したＤＮＡプローブ９、ＤＮＡプローブ１０を、アクリルアミドモノマーに所定の比率で混入し、前記ＤＮＡプローブ９、ＤＮＡプローブ１０が混入されたアクリルアミドモノマーに、重合開始剤である過硫酸アンモニウムと、重合剤であるテトラ・エチレン・ジアミンとを混ぜて２時間振動させて結合させる。
【００５５】
以上のようにしてＤＮＡコンジュゲート群１１の作製を行う
次に、緩衝液作製後、緩衝液を密閉流路内に充填するステップ３では緩衝液２３を作製し、作製した緩衝液２３をキャピラリー電気泳動装置の密閉流路内に充填する。本実施例１で用いるキャピラリー電気泳動装置としては、図１０を用いて既に説明した一般的なキャピラリー電気泳動装置１００を用いる。
【００５６】
キャピラリー電気泳動装置１００は、ＤＮＡ群を分離するためのカラムであるキャピラリー１３０と、ｐＨを特定の値に調整し、且つ緩衝作用を有し、さらに支持電解質も有している緩衝液２３を保持する第１，第２の容器１３１，１３２と、前記キャピラリー１３０の両端に電圧を印加する陽電極１３３，陰電極１３４と、その両電極１３３，１３４に電圧を印加する可変電源部１３５と、ＤＮＡ群に含まれる被検体のＤＮＡ断片を検出する検出部１５０と、前記可変電源部１３５の電圧印加、あるいは前記検出部１５０を制御する制御部１４０とで構成される。
【００５７】
そして、前記検出部１５０は、キャピラリー１３０内のＤＮＡ群に含まれる被検体のＤＮＡ断片に付加されている蛍光色素への励起光を発生するレーザー１５１と、前記蛍光色素の発光をみるために、光の量を制御するスリット１５２と、該スリット１５２を通過してきた光のうち励起光をカットするフィルター１５３と、該フィルター１５３を通過してきた光を検出するフォトマルチプライヤー１５４と、前記フォトマルチプライヤー１５４で検出された検出信号を電気的に増幅するプリアンプ１５５と、アナログ信号をデジタル信号に変換するＡ／Ｄコンバータ１５６とを備える。
【００５８】
緩衝液２３の作製は、図４に示すようにＤＮＡプローブ９、ＤＮＡプローブ１０が６塩基であるＤＮＡコンジュゲート群１１を、ＤＮＡ濃度５０μＭ、ＴＢ（トリスボーレート）バッファ５０ｍＭ、塩化マグネシウム０．５μＭを混合して調製する。そして、作製した緩衝液は、図１１に示すような内径１００μＭの全長４０センチメートルのキャピラリー１３０中に充填する。
【００５９】
ＤＮＡ群を密閉流路の一端に注入するステップ４ではＤＮＡ群４を第２の容器１３２側の密閉流路の一端に注入する。詳しくは、図５に示すＤＮＡ１２、ＤＮＡ１３、ＤＮＡ１４、ＤＮＡ１５をそれぞれＤＮＡ濃度１μＭで混合して、前記キャピラリー１３０の端部に圧力０．５ｐｓｉで１０秒間注入する。
【００６０】
密閉流路の両極端に電圧を印加するステップ５では密閉流路の両極端に電圧を印加する。詳しくは、ＴＢ（トリスボーレート）バッファ５０ｍＭ、塩化マグネシウム０．５μＭに調整した緩衝液２３に前記キャピラリー１３０の両端部を浸し、更に陽電極１３３，陰電極１３４を緩衝液２３に浸す。
【００６１】
次に、可変電源部１３５より、印加電圧５ｋＶを陽電極１３３と陰電極１３４間に印加して、測定温度２５℃で、ＤＮＡ群４を電気泳動させる。
【００６２】
ＤＮＡ断片の移動度を検出するステップ６ではＤＮＡ断片の移動度を検出する。ここで、図５中のＤＮＡ１２、ＤＮＡ１３、ＤＮＡ１４、ＤＮＡ１５には、ＦＩＴＣの蛍光色素が付加されているため、レーザー１５１より４８８ｎｍの励起光を出力して、該ＤＮＡ群に光を照射すると、５２０ｎｍの蛍光を発する。
【００６３】
従って、スリット１５２で光量制御を行い、フィルター１５３で前記４８８ｎｍの励起光をカットして、ＤＮＡ１２、ＤＮＡ１３、ＤＮＡ１４、ＤＮＡ１５から発生した５２０ｎｍの蛍光をフォトマルチプライヤー１５４で検出し、プリアンプ１５５で増幅して、Ａ／Ｄコンバータ１５６で信号をデジタル変換して制御部１４０に取り込めば、図６のような検出波形を得ることができる。
【００６４】
以上のように、本実施例１においては、ＤＮＡ１２、ＤＮＡ１４に対して、ＤＮＡ１３、ＤＮＡ１５の塩基長を長くすることでＤＮＡ１３、ＤＮＡ１５の泳動速度をＤＮＡ１２、ＤＮＡ１４より遅延させ、検出部で２種類のＤＮＡ断片が重なることなく検出される。
【００６５】
さらに、本実施例１において、ＤＮＡコンジュゲート群１１に含まれるＤＮＡプローブ９によってＤＮＡ１２をＤＮＡ１４より遅延させ、ＤＮＡコンジュゲート群１１に含まれるＤＮＡプローブ１０によって、ＤＮＡ１３をＤＮＡ１５より遅延させ、図６の検出波形を得ることが出来る。
【実施例２】
【００６６】
本発明の実施例２においても、本発明の実施例１と同様に図１の手順で実施を行う。ここで、本発明の実施例１と異なるところは、ＤＮＡ群を作製するステップ１のＤＮＡ群の作製である。図７に本発明の実施例２のＤＮＡ群１６の作製手順を、図８に本発明の実施例２のＤＮＡ群の構成を示す。図８において、１１、１２、１３、１４は実施例１で用いたＤＮＡ１２、ＤＮＡ１３、ＤＮＡ１４、ＤＮＡ１５であり、付加物２１はＤＮＡ１３に付加する付加物であり、付加物２２はＤＮＡ１５に付加する付加物で、分子量が同一のものである。
【００６７】
このように実施例１とはＤＮＡ１３に付加物２１、ＤＮＡ１５に付加物２２を付加したところが異なる。前記付加物２１、付加物２２は、ガラス、磁気ビーズ、ポリエチレングリコール、アクリルアミド、蛍光物質の多量体、オリゴペプチドなど、ＤＮＡ断片に付加することによって該ＤＮＡ断片の移動度を変えるものであればよく、本実施例２では、前記付加物が蛍光物質の多量体である場合の例を示す。
【００６８】
ここで、ＤＮＡ断片と結合させる一般的な傾向標識にはＦＩＴＣ，ＣＹ３，ＣＹ５などがあるが、本発明の実施例２においては、ＦＩＴＣを用いる。ＦＩＴＣの多量体を作製し、ＰＣＲでＤＮＡ１３、ＤＮＡ１５を増幅させるために設計したプライマーへ前記ＦＩＴＣの多量体を結合させる手順は次のようになる。
【００６９】
三量体リジンを蒸留水に溶解させて０．３６ｍＭに調製し、これを２２０μＬ（７９．２ｎｍｏｌ）採取し、アルミホイルで遮光した容器に入れ、さらに、０．３９Ｍトリエチルアミン水溶液を１μＬ（３９６ｎｍｏｌ）添加し、穏やかに撹拌させる。
【００７０】
次に、ＦＩＴＣの末端をアミノ基で修飾したもの（以降、ＦＩＴＣ−ＯＳｕと省略する）をＤＭＳＯに溶解させ、１．５９ｍＭに調製した溶液２５０μＬ（３９６ｎｍｏｌ）、蒸留水で調製した０．１ＭのＷＳＣを４μＬ（０．４μｍｏｌ），蒸留水で調製した１ＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を２μＬ（２μｍｏｌ）添加し、３日間、室温で穏やかに撹拌させる。
【００７１】
反応後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製し、ＦＩＴＣ−ＯＳｕが４個結合したフラクションのみを採取し、移動相の溶液を留去して化合物Ａを得る（収率５３．６％）。
【００７２】
次に、化合物Ａ９７．６μｇ（３９．６ｎｍｏｌ）をＤＭＳＯ：蒸留水＝２：１の溶液３００μＬに溶解させ、蒸留水に溶解した１ｍＭのＳｕｌｆｏ−ＮＨＳを２００μＬ（０．２μｍｏｌ）、蒸留水で調製した０．１ＭのＷＳＣを４０μＬ（４μｍｏｌ）それぞれ添加する。この溶液を、５´末端をアミノ基で修飾したＰＣＲでＤＮＡ１３、ＤＮＡ１５を増幅させるために設計したプライマー（２０．８ｎｍｏｌ）に滴下し、さらに０．３９Ｍのトリエチルアミン水溶液を０．１μＬ（３０．９ｎｍｏｌ）添加し、３日間室温で撹拌させる。
【００７３】
反応後、ＨＰＬＣで蛍光剤が結合したプローブを採取し、移動相の溶液を留去して目的物を得る（収率３８．５％）。
【００７４】
ＤＮＡコンジュゲート群を作製するステップ２以下の手順は本発明の実施例１と同じになるので省略する。
【００７５】
以上のように本実施例２においては、ＤＮＡ群に付加物を形成させることで、ＤＮＡ断片の種類ごとに電気泳動速度を異ならせ、検出部で２つの種類のＤＮＡ断片の波形が重ならないようにすることが出来る。
【００７６】
さらに、本実施例２において、６塩基長のＤＮＡプローブ９、ＤＮＡプローブ１０を含むＤＮＡコンジュゲート群１１を１流路内に充填することにより、ＤＮＡ１２をＤＮＡ１４より遅延させ、ＤＮＡ１３をＤＮＡ１５より遅延させて、ＳＮＰｓ判別するのに最適な検出波形を得ることが出来る。
【実施例３】
【００７７】
本発明の実施例３は、本発明の実施例２の別の実施例である。本発明の実施例３においては、付加物にマイナスの電荷を帯びたものを用いる。ここで、図９に本発明の実施例３のＤＮＡ群１６の作製手順を、図８に本発明の実施例３のＤＮＡ群の構成を示す。図８において、１１、１２、１３、１４は実施例１で用いたＤＮＡ１２、ＤＮＡ１３、ＤＮＡ１４、ＤＮＡ１５であり、２０はＤＮＡ１３に付加する付加物２２はＤＮＡ１５に付加する付加物で、電荷量が同一のものである。
【００７８】
前記付加物２１、付加物２２は、マイナスの電荷を持っており、電荷量を分子量で除算したものが、結合先であるＤＮＡの電荷量を該ＤＮＡの分子量で除算したものより大きいものであればよく、本発明の実施例３においては付加物がオリゴペプチドである場合の例を示す。ＰＣＲでＤＮＡ１３とＤＮＡ１５を増幅させるためのプライマーと蛍光物質とオリゴペプチドの合成手順は次のようになる。
【００７９】
ポリ−Ｌ−セリン（１〜５ｋＤ）１ｍｇをＤＭＳＯ：蒸留水＝１：１の溶液５００μＬに溶解させ、ＦＩＴＣ−ＯＳｕを１ｍｇ（１．６μｍｏｌ）、１ＭのＮＨＳ水溶液を８μＬ（８μｍｏｌ）、ＷＳＣ３０ｍｇ（０．１６ｍｍｏｌ）を添加し、３日間、室温で穏やかに撹拌させる。反応後、ＧＰＣカラムで目的物のフラクションを採取し、移動相を濃縮させる。
【００８０】
蛍光剤を標識したオリゴペプチドは、再度蒸留水３００μＬで溶解させる。この溶液に１ＭのＮＨＳ水溶液を８μＬ（８μｍｏｌ）、ＷＳＣ３０ｍｇ（０．１６ｍｍｏｌ）を添加し、５´末端をアミノ基で修飾したＰＣＲでＤＮＡ１３とＤＮＡ１５を増幅させるためのプライマー（２４．８ｎｍｏｌ）へ加え、さらに０．３９Ｍのトリエチルアミン水溶液を０．２μＬ（６１．８ｎｍｏｌ）添加し、５日間室温で穏やかに撹拌させる。反応後、ＧＰＣカラムで蛍光剤が結合したプローブを採取し、移動相の溶液を留去して目的物を得る。
【００８１】
ＤＮＡコンジュゲート群を作製するステップ２以下の手順は本発明の実施例１と同じになるので省略する。
【００８２】
以上のように本実施例３においては、ＤＮＡ群にマイナスの電荷を持つ付加物を形成させることで、ＤＮＡ断片の種類ごとに電気泳動速度を異ならせ、検出部で２つの種類のＤＮＡ断片の波形が重ならないようにすることが出来る。
【００８３】
さらに、本実施例３において、６塩基長のＤＮＡプローブ９、ＤＮＡプローブ１０を含むＤＮＡコンジュゲート群１１を１流路内に充填することにより、ＤＮＡ１２をＤＮＡ１４より遅延させ、ＤＮＡ１３をＤＮＡ１５より遅延させて、ＳＮＰｓ判別するのに最適な検出波形を得ることが出来る。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明ＳＮＰｓ判別法は、生体物質の状態を電気泳動で調査する際に、複数種類のＤＮＡ断片を１流路内で同時にＳＮＰｓ判別することができ、ＳＮＰｓ判別の効率化、使用流路の節約を図るものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】本発明の実施例１、実施例２、実施例３における処理手順を示すフローチャート
【図２】本発明の実施例１におけるＤＮＡ群１６の作製手順を示すフローチャート
【図３】本発明の実施例１、実施例２、実施例３におけるＤＮＡコンジュゲート群１１の作製手順を示すフローチャート
【図４】本発明の実施例１、実施例２、実施例３におけるＤＮＡコンジュゲート群１１の構成を示す図
【図５】本発明の実施例１におけるＤＮＡコンジュゲート群１１とＤＮＡ群１６との相関図
【図６】本発明の実施例１における検出波形を示す図
【図７】本発明の実施例２におけるＤＮＡ群１６の作製手順を示すフローチャート
【図８】本発明の実施例２、実施例３におけるＤＮＡ群の構成を示す図
【図９】本発明の実施例３におけるＤＮＡ群１６の作製手順を示すフローチャート
【図１０】特許文献２に記載のキャピラリー電気泳動装置の構成を示す図
【図１１】キャピラリー電気泳動装置のキャピラリー内の状態図
【図１２】従来のＤＮＡコンジュゲートにより、ＤＮＡ群が分離される状態を示す図
【図１３】チミンＴとアデニンＡ（図（ａ））、シトシンＣとグアニンＧ（図（ｂ））の水素結合の状態を示す図
【符号の説明】
【００８６】
１  ＤＮＡ群を作製するステップ
２  ＤＮＡコンジュゲート群を作製するステップ
３  緩衝液作製後、緩衝液を密閉流路内に充填するステップ
４  ＤＮＡ群を密閉流路の一端に注入するステップ
５  密閉流路の両極端に電圧を印加するステップ
６  ＤＮＡの移動度を検出するステップ
７、８  電気非泳動物質
９、１０  ＤＮＡプローブ
１１  ＤＮＡコンジュゲート群
１２、１３、１４、１５  ＤＮＡ
１６  ＤＮＡ群
１７  １４塩基非結合型ＤＮＡ
１８  １４塩基結合型ＤＮＡ
１９  ６０塩基非結合型ＤＮＡ
２０  ６０塩基結合型ＤＮＡ
２１、２２  付加物
２３  緩衝液
１００  キャピラリー電気泳動装置
１３０  キャピラリー
１３１  第１の容器
１３２  第２の容器
１３３  陽電極
１３４  陰電極
１３５  可変電源部
１４０  制御部
１５０  検出部
１５１  レーザー
１５２  スリット
１５３  フィルター
１５４  フォトマルチプライヤー
１５５  プリアンプ
１５６  Ａ／Ｄコンバータ
２００  ＤＮＡ群
２１０  ＤＮＡコンジュゲート
２１１  電気非泳動物質
２１２  ＤＮＡプローブ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2007105007.tif 000013
【図１２】
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【図１３】
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