(57)【要約】【課題】平均気孔径、気孔間の連通部分の平均直径が傾斜的に変化し、緻密領域と気孔領域を同時かつ一体に作成されるリン酸カルシウム系セラミックス焼結体の製造方法を提供する。【解決手段】本リン酸カルシウム系多孔質焼結体の製造方法は、リン酸カルシウム系粉末および架橋重合により硬化し得る有機物質を溶媒に分散または溶解させたスラリーを調整する工程と、このスラリーに起泡剤を添加し、撹拌および気体導入の少なくとも一方により起泡し、泡沫状態のスラリーとする工程と、泡沫状態のスラリーに架橋剤および架橋開始剤の少なくとも一方を添加して混合し、成形型内に導入し、この導入されたスラリーに消泡剤を含有させた後、架橋重合により硬化して、気孔率が６０％未満１０％以上の領域及び、この率領域に連なり気孔率が連続して傾斜的に増加して分布する領域が一体に作成された成形体とする工程を含む。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸カルシウム系粉末および架橋重合により硬化し得る有機物質を溶媒に分散または溶解させたスラリーを調整する工程と、このスラリーに起泡剤を添加し、撹拌および気体導入の少なくとも一方により起泡し、泡沫状態のスラリーとする工程と、泡沫状態のスラリーに架橋剤および架橋開始剤の少なくとも一方を添加して混合し、成形型内に導入し、この導入されたスラリーに消泡剤を含有させた後、架橋重合により硬化して、気孔率が６０％未満１０％以上の領域及び、この領域に連なり気孔率が連続して傾斜的に増加して分布する領域が一体に作成された成形体とする工程を含むことを特徴とするリン酸カルシウム系多孔質焼結体の製造方法。
【請求項２】
前記消泡剤のスラリーへの含有は、成形型内面に消泡剤含有シートを取り付けて行うことを特徴とする請求項１に記載のリン酸カルシウム系多孔質焼結体の製造方法。
【請求項３】
前記消泡剤のスラリーへの含有は、成形型内面に消泡剤を付着して行うことを特徴とする請求項１に記載のリン酸カルシウム系多孔質焼結体の製造方法。
【請求項４】
前記消泡剤のスラリーへの含有は前記成形型内部に、表面に消泡剤含有シートを取り付け、あるいは消泡剤を付着した抜き型を挿入して行うことを特徴とする請求項２または３に記載のリン酸カルシウム系多孔質焼結体の製造方法。
【請求項５】
前記消泡剤は消泡剤含有シート、成形型内面あるいは、抜き型の表面に０．０００１〜１ｇ／ｃｍ２存在することを特徴とする請求項２ないし４のいずれか１項に記載のリン酸カルシウム系多孔質焼結体の製造方法。
【請求項６】
前記消泡剤のスラリーへの含有は、成形型のスラリーの所望の領域に注入して行なうことを特徴とする請求項１に記載のリン酸カルシウム系多孔質焼結体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は多孔質リン酸カルシウム系セラミックス焼結体の製造方法に係り、特に消泡剤を用いた傾斜構造型の多孔質リン酸カルシウム系セラミックス焼結体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハイドロキシアパタイト等のリン酸カルシウム系セラミックスは生体適合性に優れ、細胞、生体組織等の培養に用いる担体や、人工歯根や骨補強材等の生体材料として利用されている。機械的強度の観点からは、リン酸カルシウム系セラミックスは気孔率が低い程よいが、生体親和性の観点からは多孔質なほど、すなわち気孔率が高いほどよい。このため、従来から多孔質リン酸カルシウム系セラミックスを製造する方法として、発泡剤添加法、熱分解性樹脂ビーズ添加法、スポンジ樹脂含浸法、水溶性高分子ゲル化法等の種々の方法が提案されている。
【０００３】
また、近年、多孔質リン酸カルシウム系セラミックスは、細胞適合性が高いことから、三次元細胞培養担体としても用いられている。この三次元細胞培養担体は、大きくなるにつれて、内側の細胞に栄養分を供給することが困難になり、また、同様にそれらの細胞の分泌する細胞代謝物（有益な生理活性物質と有害となる老廃物）を外側へ放出できなくなる。
【０００４】
このため培養期間が長くなるに従って、内側の細胞が壊死してしまう。このような問題を解決するための手段として、細胞培養には気孔率の高い担体が用いられている。
【０００５】
気孔率の高いセラミックス多孔体は、気孔率の低いセラミックスに比べて、強度が低く、荷重や機械的または熱的衝撃等により、破損やひび割れ等を生じやすい。特に９０％超の気孔率を有する多孔質リン酸カルシウム系セラミックス焼結体は、機械的強度が不十分なために加工性やハンドリング性に劣る。また、通常の細胞培養操作における細胞の播種方法は、担体上方から細胞を滴下することにより行われるが、その高い気孔率、それに伴う大きい平均気孔径、気孔間の連通部分の平均直径のため、播種した細胞が担体に接着する前に担体周辺に逃げ出すことがあった。
【０００６】
なお、特許文献１には、気孔率が５％以下から８５％以上まで連続して傾斜的に分布するリン酸カルシウム系多孔質焼結体及び遠心力利用あるいは積層法を用いたその製造方法が提案されている。
【特許文献１】特開２００１−２０６７８７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上述した事情を考慮してなされたもので、平均気孔径、気孔間の連通部分の平均直径が傾斜的に変化し、気孔率が６０％未満１０％以上の領域及び、この領域に連なり気孔率が連続して傾斜的に増加して分布する領域が同時かつ一体に作成されるリン酸カルシウム系セラミックス焼結体の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述した目的を達成するため、本発明に係るリン酸カルシウム系多孔質焼結体の製造方法は、リン酸カルシウム系粉末および架橋重合により硬化し得る有機物質を溶媒に分散または溶解させたスラリーを調整する工程と、このスラリーに起泡剤を添加し、撹拌および気体導入の少なくとも一方により起泡し、泡沫状態のスラリーとする工程と、泡沫状態のスラリーに架橋剤および架橋開始剤の少なくとも一方を添加して混合し、成形型内に導入し、この導入されたスラリーに消泡剤を含有させた後、架橋重合により硬化して、気孔率が６０％未満１０％以上の領域及び、この領域に連なり気孔率が連続して傾斜的に増加して分布する領域が一体に作成された成形体とする工程を含むことを特徴とするリン酸カルシウム系多孔質焼結体の製造方法であることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係る多孔質リン酸カルシウム系セラミックス焼結体の製造方法によれば、平均気孔径、気孔間の連通部分の平均直径が傾斜的に変化し、気孔率が６０％未満１０％以上の領域及び、この領域に連なり気孔率が連続して傾斜的に増加して分布する領域が同時かつ一体に作成されるリン酸カルシウム系セラミックス焼結体の製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の一実施形態に係る傾斜構造型多孔質リン酸カルシウム系セラミックス焼結体の製造方法について説明する。
【００１１】
本実施形態に係る多孔質リン酸カルシウム系セラミックス焼結体の製造方法は、リン酸カルシウム系粉末および架橋重合により硬化し得る有機物質を溶媒に分散または溶解させたスラリーを調整し、このスラリーに起泡剤を添加し、撹拌および気体導入の少なくとも一方により起泡し、泡沫状態のスラリーとし、泡沫状態のスラリーに架橋剤および架橋開始剤の少なくとも一方を添加して混合し、成形型内に導入し、この導入されたスラリーに消泡剤を含有させた後、架橋重合により硬化して、気孔率が６０％未満１０％以上の領域、この低気孔率領域に連なり気孔率が連続して傾斜的に増加して分布する領域が一体に作成された成形体とし、この成形体を焼結する。
【００１２】
リン酸カルシウム系粉末としては、ＣａＨＰＯ４、Ｃａ（ＰＯ４）２、Ｃａ（ＰＯ４）３ＯＨ、Ｃａ４Ｏ（ＰＯ４）２、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、Ｃ４Ｏ１１、Ｃａ（ＰＯ３）２、Ｃａ２Ｐ２Ｏ７、Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）２、Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）２・Ｈ２Ｏからなる１群の化合物の１種以上からなるものがあげられ、これら化合物は細胞に対する適合性に優れているので、細胞の接着、増殖に有利に働き培養担体として用いるのに好ましい。より好ましくはＣａ３（ＰＯ４）２、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２である。
【００１３】
消泡材としては、シリコーン油、脂肪酸、アルコール、非イオン性界面活性剤、ワックス等が使用でき、市販品でもよい。金属イオンを含まない消泡剤がより好ましい。
【００１４】
消泡剤の含有量は消泡剤含有シートあるいは成形型内面において、０．０００１〜１ｇ／ｃｍ２とするのが好ましい。消泡剤が１ｇ／ｃｍ２を超えると、消泡の効果が強くなり、気泡が全て消泡されるため多孔体構造でなくなり、また、消泡剤が０．０００１／ｃｍ２未満だと、消泡効果が弱くなり、気孔率が下がらないあるいは、気孔率が６０％未満の外周面の厚さが非常に薄くなり、ハンドリング強度が向上しない。
【００１５】
架橋重合により硬化し得る有機物質は、アミノ基を含む線状、分枝状、またはブロック状の形態を有するポリマーであり、架橋剤がエポキシ基を２以上持つエポキシ化合物であることが好ましい。
【００１６】
架橋重合により硬化し得る有機物質は、ポリアクリルアミド、ポリエチレンイミン、またはポリプロピレンイミンのアミノ基を含む線状、分枝状、またはブロック状の形態を有するポリマーである。
【００１７】
架橋剤の例としては、ソルビトールポリグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、ペンダエリスリトールポリグリシジルエーテル、ジグリセロールポリグリシジルエーテル、グルセロールポリグリシジルエーテル、又はポリメチロールプロパンポリグリシジルエーテルのエポキシ基を２以上持つエポキシ化合物があげられる。
【００１８】
本発明の製造方法は、リン酸カルシウム系セラミックス粉体を含有するスラリーを起泡させ、消泡剤を成形型内に導入してスラリーに含有させ、成形型内でゲル化させ、得られた乾燥体を焼結するので、消泡剤含有位置から外方に向けて傾斜的に気孔率が変化した多孔質リン酸カルシウム系セラミックス焼結体からなる細胞培養担体を製造するに適する。また、セラミックス多孔体の気孔の特性、および、気孔率の低いセラミックスの優れた強度を兼ね備えた部材として優れた機能を発揮することができる。
【００１９】
さらに、気孔率が低い表面からは細胞培養時においても、細胞が担体外へ逃げ出すことはなく、栄養分や酸素の供給を行うことができる。そのため、細胞、生体組織等の培養に用いる担体の製造に好適である。
【００２０】
スラリーに消泡剤を含有させる方法として、以下の諸方法が適する。
【００２１】
（１）図１に示すように、消泡剤のスラリーへの含有は、円筒状の成形型１内面に消泡剤２を含有する消泡剤含有型枠シート３を取り付けて行う。これにより、図２に示すように、円柱状で、外周面は気孔率が６０％未満１０％以上であり、外周面から中心部に向かって気孔率が傾斜的に増加しており、例えば中心部の気孔率が６０％以上に作成された傾斜構造型多孔質リン酸カルシウム系セラミックス焼結体を製造することができる。
【００２２】
この傾斜構造型多孔質リン酸カルシウム系セラミックス焼結体は、外周面の気孔率が低いので、担体としての使用時、培養操作時のハンドリングにより容易に崩れることはない。また、上方から見て円状に見えるように配置された状態で、上方から細胞を中心部に滴下すると、滴下された細胞は、中心部と比較して外周面の気孔率が低いので、担体外に逃げ出すことなく底面部まで侵入し培養することが可能となる。
【００２３】
（２）図３に示すように、消泡剤のスラリーへの含有は、円筒状の成形型１内面に消泡剤２を塗布あるいはスプレーにより行う。図２に示すように、消泡剤含有型枠シートを用いる場合と同様、気孔率が６０％未満１０％以上の外周面から中心部に向かって傾斜的に増加しており、中心部の気孔率が例えば６０％以上に作成された傾斜構造型多孔質リン酸カルシウム系セラミックス焼結体を製造することができる。
【００２４】
（３）図４に示すように、消泡剤のスラリーへの含有は、内面に消泡剤含有型枠シートが取り付けられ、あるいは消泡剤２が付着された成形型１内部に、表面に消泡剤含有型枠シートを取り付けるか、あるいは消泡剤２を塗布した抜き型４を挿入して行う。図５に示すように、製造された焼結体は、ドーナツ状であり、気孔率が６０％未満１０％以上の外周面と内周面から各々他周面の間に向かって気孔率が傾斜的に増加し、両周面間の気孔率が例えば６０％以上である。
【００２５】
外周面及び内周面の気孔率は低いので、担体としての使用時、培養操作時のハンドリングにより容易に崩れることはない。また、上方から見てリング状に見えるように配置された状態で、上方から細胞を外周面と内周面の間に滴下すると、滴下された細胞は外周面と内周面の気孔率が低いので、培養担体から逃げ出すことなく底面部まで侵入し培養することが可能となる。また中心部に人工血管などを通すことにより、栄養成分を担体の内周面から提供することが可能となる。
【００２６】
（４）図６に示すように、消泡剤のスラリーへの含有は直方体形状の成形型１内部の１面以上５面以下に、消泡剤含有シートを取り付ける、あるいは消泡剤２を付着して行う。図７に示すように、製造された焼結体は、気孔率が６０％未満１０％以上の面が１面以上５面以下であり、他面に向かって気孔率が傾斜的に増加しており、ブロック状であり、気孔率が６０％未満１０％以上の面が１面以上５面以下であり、他面に向かって気孔率が傾斜的に増加しており、他面の気孔率が例えば６０％以上である。１面以上５面以下の面の気孔率が低いので、培養操作時のハンドリングにより容易に崩れることはない。また、気孔率が高い面に細胞を滴下すると、滴下された細胞は気孔率が低いため、培養担体から逃げ出すことなく培養することが可能となる。
【００２７】
（５）図８に示すように、消泡剤のスラリーへの含有は、成形型１内のスラリーＳの所望の領域に注入器５を用いて注入して行う。
【００２８】
これにより、図９に示すように、製造された焼結体は、所望の位置から、放射状に外方に向かって気孔率が傾斜的に増加しており、気孔率が６０％未満１０％以上の所望の領域から、この領域に連なる例えば気孔率６０％以上の領域が作成された傾斜構造型多孔質リン酸カルシウム系セラミックス焼結体を製造することができる。
【００２９】
上記のような本発明のリン酸カルシウム系多孔質焼結体の製造方法により製造される多孔質焼結体は、気孔率が６０％以上の領域における球状の気孔が、ほぼ全体にわたって連通し、平均気孔径が６０μｍ以上であり、かつ気孔間の連通部分の平均直径が３０μｍ以上とすることが可能であり、細胞の増殖に適した空間を有した気孔径の気孔が担体内にあり、この連通部分の気孔径は細胞の侵入が可能な大きさであるため、連通孔を通じて担体内部にまで細胞が侵入し、増殖させることができる。
【００３０】
また、気孔率６０％未満１０％以上の領域における球状の気孔がほぼ全体にわたって連通しており、平均気孔径が６０μｍ未満１０μｍ以上で、かつ気孔間の連通部分の平均直径が３０μｍ未満１μｍ以上にすると、連通部分の平均直径及び気孔径が細胞の侵入及び増殖に適したサイズより小さいため、細胞の侵入はないが、担体外と担体内の培地の循環は可能である。
【００３１】
本傾斜構造型多孔質リン酸カルシウム系セラミックス焼結体の気孔径は以下の方法で測定する。
【００３２】
傾斜構造型多孔質リン酸カルシウム系セラミックス焼結体を樹脂中に包埋し、これを研磨して顕微鏡で観察し、画像解析によりほぼ球状の気孔面積を求める。ここで測定する気孔数は精度上多いほどよいが、一般に３００個以上の気孔について測定を行えばよい。ここで求められる気孔面積はほぼ球状の気孔の一部を通過する平面での断面であり、気孔の直径ではないために、三次元的な補正を行う。補正の方法として、Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｓａｌｔｋｏｖ法を用いる。このＪｏｈｎｓｏｎ−Ｓａｌｔｋｏｖ法では、観測される気孔の面積から、直接気孔の直径分布が得られるが、平均気孔径としては、気孔体積の累積分布において総気孔体積の５０％を占める気孔径を算出する。
【００３３】
また、傾斜構造型多孔質リン酸カルシウム系セラミックス焼結体の気孔間の連通部の平均直径は水銀圧入法で測定する。連通部分の平均直径としてはモード値とする。連通部の直径が大きすぎて水銀圧入法を適用できない場合、多孔質焼結体の断面部を顕微鏡で観察し連通部の直径を観測して、気孔間の連通部の平均直径を面積平均法として算出する。
【００３４】
本発明に係るリン酸カルシウム系多孔質焼結体の製造方法によれば、平均気孔径、気孔間の連通部分の平均直径が傾斜的に変化し、緻密領域と気孔領域を同時かつ一体に作成されるリン酸カルシウム系セラミックス焼結体の製造方法が実現し、さらに、緻密領域と気孔領域が同時かつ一体に作成されるので、容易かつ安価に、細胞培養に適する担体として使用可能な傾斜構造型焼結体を製造することができる。
【実施例】
【００３５】
（１）ハイドロキシアパタイト粉末のスラリーに、気泡剤として界面活性剤を添加し、撹拌して起泡させ、さらに架橋剤を添加した。シリコーン油系消泡剤が型枠シートに０．１ｇ／ｃｍ２となるよう均一にコーティングし、円柱状（直径１５ｍｍ×高さ４５ｍｍ）消泡剤含有型枠シートを作製した。
【００３６】
この消泡剤含有型枠シートを用いて成形型を作製し、スラリーを流し込みゲル化させた。得られたゲルを２０℃で２４時間保持した後、４０℃で２４時間温風乾燥した。その後、消泡剤含有型枠シートからゲルを取り出し、傾斜構造型多孔質ハイドロキシアパタイトゲルを得た。傾斜構造型多孔質ハイドロキシアパタイトゲルの消泡剤含有型枠シートと接触していた面は、緻密質であり、接触していない面は多孔質であった。
【００３７】
傾斜構造型多孔質ハイドロキシアパタイトゲルを大気中で室温から１２００℃まで昇温し、この温度で１時間焼成した後、室温まで冷却した。この焼結工程により傾斜構造型多孔質ハイドロキシアパタイト焼結体を得た。得られた焼結体の中心部と消泡剤含有型枠シートに接触していた面の気孔率を測定した。中心部の気孔率は約９０％であり、消泡剤含有型枠シートに接触していた面の気孔率は約１５％であった。
【００３８】
得られた傾斜構造型多孔質ハイドロキシアパタイト焼結体の顕微鏡観察を行ったところ、中心部から消泡剤含有型枠シートに接触していた面に向けて傾斜的に気孔が減少していた。
【００３９】
（２）上記（１）の製造方法と同様にして、型枠シートヘの消泡剤の保持量を変化させて傾斜構造型多孔質ハイドロキシアパタイト焼結体を作製した。得られた傾斜構造型多孔質ハイドロキシアパタイト焼結体を中心部と外周部に分けて、それぞれの気孔率を水銀ポロシメーターにより測定した。中心部は中心から直径の２０％までの範囲とした。外周部は外周から直径の２０％までの範囲とした。さらに傾斜構造型多孔質ハイドロキシアパタイト焼結体のハンドリング強度を評価した。評価方法は、傾斜構造型多孔質ハイドロキシアパタイト焼結体を、ウェルプレート内のウェルに入れ、ステンレス製ピンセットにより隣接したウェルに移し、これを複数回繰り返し、傾斜構造型多孔質ハイドロキシアパタイト焼結体が崩れ始めるまでの回数を計測した。
【００４０】
気孔率及びハンドリング強度について表１に示す。
【００４１】
表１から明らかなように傾斜構造型多孔質ハイドロキシアパタイト焼結体の中心部の気孔率は９０％であり、外周部の気孔率は消泡剤の保持量に反比例して減少しているのが分かる。ハンドリング強度は消泡剤保持量を増やすことで上がっているのが分かった。
【表１】
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【００４２】
（３）上記（２）で得られた柱状の傾斜構造型多孔質ハイドロキシアパタイト焼結体を直径１５ｍｍ×高さ２ｍｍとなるよう加工し、細胞培養担体として用いウェルプレート内で骨芽細胞の培養を行った。細胞は円柱の中心部に滴下した。培地にＭＥＭ、ＦＢＳの他にデキサメタゾンを混合して１週間培養した。その後、細胞の固定化、凍結乾燥を行い、担体断面の顕微鏡観察を行った。
【００４３】
１ｍｍ２内に観察された細胞数を表２に示す。
【００４４】
表２から明らかなように、外周部の気孔率が８０％、９０％の担体ではウェルプレート上に多く細胞が見られ、担体内部には細胞がほとんど見られなかった。外周部の気孔率が６０％未満の担体ではウェルプレート上には細胞はほとんど見られなかった。担体内部には細胞が多く見られた。外周部の気孔率が２％の担体では担体内部の細胞が少し見られた。
【表２】
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【００４５】
（４）中心部の気孔率が異なる傾斜構造型多孔質ハイドロキシアパタイト焼結体を作製し、上記と同様の条件により骨芽細胞の培養を行った。１ｍｍ２内に観察された細胞数を表３に示す。
【００４６】
表３から明らかなように、中心部の気孔率が６０％以上の担体では中心部に多く細胞が見られ、ウェルプレート上には細胞がほとんど見られなかった。中心部の気孔率が６０％未満の担体では中心部及びウェルプレート上には細胞はほとんど見られなかった。
【表３】
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【００４７】
（５）中心部の平均気孔径と連通部分の平均直径が異なる傾斜構造型多孔質ハイドロキシアパタイト焼結体を作製し、上記と同様の条件により骨芽細胞の培養を行った。１ｍｍ２内に観察された細胞数を表４に示す。表４から明らかなように、平均気孔径が６０μｍ以上、連通部分の平均直径が３０μｍ以上の担体では、担体中心部に多くの細胞が見られた。平均気孔径が３０μｍ、連通部分の平均直径が２０μｍの担体では、細胞はわずかに見られ、平均気孔径が３０μｍ未満、連通部分の平均直径が２０μｍ未満の担体では、細胞はほとんど見られなかった。
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本発明の一実施形態に係る多孔質リン酸カルシウム系セラミックス焼結体の製造方法の説明図。
【図２】本発明の一実施形態に係る多孔質リン酸カルシウム系セラミックス焼結体の製造方法により製造されるセラミックス焼結体の斜視図。
【図３】本発明の他の実施形態に係る多孔質リン酸カルシウム系セラミックス焼結体の製造方法の説明図。
【図４】本発明の他の実施形態に係る多孔質リン酸カルシウム系セラミックス焼結体の製造方法の説明図。
【図５】本発明の他の実施形態に係る多孔質リン酸カルシウム系セラミックス焼結体の製造方法により製造されるセラミックス焼結体の斜視図。
【図６】本発明の他の実施形態に係る多孔質リン酸カルシウム系セラミックス焼結体の製造方法の説明図。
【図７】本発明の他の実施形態に係る多孔質リン酸カルシウム系セラミックス焼結体の製造方法により製造されるセラミックス焼結体の斜視図。
【図８】本発明の他の実施形態に係る傾斜構造型多孔質リン酸カルシウム系セラミックス焼結体の製造方法を説明する縦断面図。
【図９】本発明の他の実施形態に係る多孔質リン酸カルシウム系セラミックス焼結体の製造方法により製造されるセラミックス焼結体の縦断面図。
【符号の説明】
【００４９】
１  成形型
２  消泡剤含有型枠シート
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2007320800.tif 000013
【図８】
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【図９】
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