(57)【要約】【課題】  アフィニティー精製特性に優れたマレイミド基含有多孔質架橋ポリスチレン粒子及びその製造方法の提供。【解決手段】  体積平均粒子径が１〜１０００μｍであり、細孔の直径が粒子の直径を超えない範囲で且つ１〜１００００ｎｍであるマレイミド基含有多孔質架橋ポリスチレン粒子及びスチレン系モノマーと、架橋剤と、重合開始剤と、前記スチレン系モノマー及び前記架橋剤と重合反応を起こさない希釈剤と、を含むモノマー混合物を水系媒体に分散させて前記スチレン系モノマーと前記架橋剤とを共重合させて希釈剤含有架橋ポリスチレン粒子を得る工程と、前記希釈剤含有架橋ポリスチレン粒子から希釈剤を除去して架橋ポリスチレン粒子を得る工程と、前記架橋ポリスチレン粒子にマレイミド基を導入する工程と、を有するマレイミド基含有多孔質架橋ポリスチレン粒子の製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
体積平均粒子径が１〜１０００μｍであり、細孔の直径が粒子の直径を超えない範囲で且つ１〜１００００ｎｍであるマレイミド基含有多孔質架橋ポリスチレン粒子。
【請求項２】
マレイミド基がスペーサー分子を介してポリスチレン鎖のフェニル基に結合した請求項１に記載のマレイミド基含有多孔質架橋ポリスチレン粒子。
【請求項３】
下記化学式（１）で表される基を有する請求項２に記載のマレイミド基含有多孔質架橋ポリスチレン粒子。
【化１】
2007023120.tif 000006
（化学式（１）中、ｎは１以上の整数を表す。）
【請求項４】
チオール基を含むリガンド分子がマレイミド基と結合した請求項１乃至３のいずれか１項に記載のマレイミド基含有多孔質架橋ポリスチレン粒子。
【請求項５】
前記リガンド分子が、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ及びＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一種である請求項４に記載のマレイミド基含有多孔質架橋ポリスチレン粒子。
【請求項６】
スチレンと、架橋剤と、重合開始剤と、前記スチレン及び前記架橋剤と重合反応を起こさない希釈剤と、を含むモノマー混合物を水系媒体に分散させて前記スチレンと前記架橋剤とを共重合させて希釈剤含有架橋ポリスチレン粒子を得る工程と、
前記希釈剤含有架橋ポリスチレン粒子から希釈剤を除去して架橋ポリスチレン粒子を得る工程と、
前記架橋ポリスチレン粒子にマレイミド基を導入する工程と、
を有するマレイミド基含有多孔質架橋ポリスチレン粒子の製造方法。
【請求項７】
前記希釈剤が、トルエン、ドデカン、ジエチルベンゼン、イソアミルアルコール、ラウリルアルコール及びヘキサデカンからなる群から選択される少なくとも一種である請求項６に記載のマレイミド基含有多孔質架橋ポリスチレン粒子の製造方法。
【請求項８】
前記モノマー混合物中の前記希釈剤の含有量が、前記スチレンと前記架橋剤と前記希釈剤との合計量に対して３０〜８０質量％である請求項６又は７に記載のマレイミド基含有多孔質架橋ポリスチレン粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マレイミド基含有多孔質架橋ポリスチレン粒子及びその製造方法に関し、特にクロマトグラフィ担体、免疫沈降担体、細胞収集用ビーズ、ＤＮＡハイブリ用担体、ＲＮＡハイブリ用担体、検査薬、診断薬等の用途に好適に使用可能なマレイミド基含有多孔質架橋ポリスチレン粒子及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般物質と特定のタンパク質、タンパク質と特定のタンパク質、タンパク質とその抗体、ペプチドとその抗体、互いに相補的なＤＮＡやＲＮＡ等の間には特異的な分子親和力（アフィニティー性）が存在する。この原理を利用して、多くの物質の混合液から目的の生体分子や細胞を精製、収集することが行われている。
【０００３】
それには目的の分子に特異的に結合するリガンド物質を粒子や基板の担体に固定化し、そこに目的の分子を含む混合液を接触させて、目的の分子とリガンドとを結合（カップリング）させる。次に洗浄液で担体上の余計な物質を洗い流した後、溶出液を担体に接触させることにより、リガンドと目的の分子とを解離させる。こうして目的の分子を含む物質を精製回収することができる。
【０００４】
これらの担体には粒子がよく用いられ、カラムに詰めたものはアフィニティークロマトグラフィー、チューブに入れてバッチ式で扱う物には免疫沈降担体、細胞収集用ビーズ等がある。また粒子上でのアフィニティー反応を検出することにより、病原物質の存在の有無を確かめる検査薬、診断薬としても用いられる。同様の目的にＤＮＡハイブリ用担体、ＲＮＡハイブリ用担体も用いられている。
【０００５】
粒子担体へのリガンドの結合方法は大きく分けて物理吸着によるものと共有結合によるものがある。後者は前者に比べてリガンドが脱離する可能性が少なく使用環境範囲が広い。共有結合方式にも様々あるが、リガンドに含まれるＳＨ基を利用して単体に固定する方法は有用である。システインはアミノ酸中唯一ＳＨ基を含むが、タンパク質における存在比率は低い。また自然のＤＮＡやＲＮＡの核酸にＳＨ基は含まれていない。したがってこれらの分子やその一部をリガンドとした場合、人工的に所望の位置にＳＨ基を導入することによって、選択的にその部分を担体に結合することができる。例えばあるタンパク質の抗体反応部位であるエピトープとしてのペプチドの末端にシステイン残基を導入することにより、その末端を担体に固定することができる。
【０００６】
ＳＨ基は同じＳＨ基と容易にＳ−Ｓの共有結合を形成するので、この原理を用いたリガンド固定法が一般的に用いられている。アマシャムバイオサイエンス社製チオールセパロース４Ｂは、アガロースゲル粒子にグルタチオンを介してＳＨ基が導入されている。そこにシステイン端末のエピトープペプチドをＳ−Ｓ結合で固定化することができ、対応する抗ペプチド抗体をアフィニティーカップリングすることにより抗ペプチド抗体を精製することができる。しかしＳ−Ｓ結合は容易に還元して他の結合を形成するので、粒子とリガンドとの結合を安定して保持することができない。
【０００７】
一方ＳＨ基と容易に共有結合させることができ、しかも結合を安定して保持するものにマレイミド基がある。担体にマレイミド基を含有させればＳＨ基をもったリガンド物質を容易に、安定に固定化することができると考えられる。すでにマレイミド基を含有するポリスチレン粒子が掲載されている例（例えば、特許文献１参照。）や製品（例えば、非特許文献１参照。）が存在する。
【特許文献１】特開平１１−１０６３９１号公報
【非特許文献１】２００１／２００２製品化カタログ、Ｆｕｌｕｋａ社、９０９ページ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし特許文献１に記載の条件で作製した粒子担体や非特許文献１の製品に、システイン端末のエピトープペプチドを固定して、対応する抗ペプチド抗体をアフィニティーカップリングしてみたところ、精製される抗体量は前出チオールセパロース４Ｂ粒子に比べて極少量で充分なものではなかった。
本発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、リガンド分子のＳＨ基と容易に共有結合させることができ、その結合を安定に保持できるマレイミド基を有し、アフィニティー精製特性に優れたマレイミド基含有多孔質架橋ポリスチレン粒子及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
即ち、本発明は、
＜１＞  体積平均粒子径が１〜１０００μｍであり、細孔の直径が粒子の直径を超えない範囲で且つ１〜１００００ｎｍであるマレイミド基含有多孔質架橋ポリスチレン粒子である。
【００１０】
＜２＞  マレイミド基がスペーサー分子を介してポリスチレン鎖のフェニル基に結合した＜１＞に記載のマレイミド基含有多孔質架橋ポリスチレン粒子である。
【００１１】
＜３＞  下記化学式（１）で表される基を有する＜２＞に記載のマレイミド基含有多孔質架橋ポリスチレン粒子である。
【００１２】
【化１】
2007023120.tif 000002
【００１３】
（化学式（１）中、ｎは１以上の整数を表す。）
【００１４】
＜４＞  チオール基を含むリガンド分子がマレイミド基と結合した＜１＞乃至＜３＞のいずれか１つに記載のマレイミド基含有多孔質架橋ポリスチレン粒子である。
【００１５】
＜５＞  前記リガンド分子が、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ及びＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一種である＜４＞に記載のマレイミド基含有多孔質架橋ポリスチレン粒子である。
【００１６】
＜６＞  スチレンと、架橋剤と、重合開始剤と、前記スチレン及び前記架橋剤と重合反応を起こさない希釈剤と、を含むモノマー混合物を水系媒体に分散させて前記スチレンと前記架橋剤とを共重合させて希釈剤含有架橋ポリスチレン粒子を得る工程と、前記希釈剤含有架橋ポリスチレン粒子から希釈剤を除去して架橋ポリスチレン粒子を得る工程と、前記架橋ポリスチレン粒子にマレイミド基を導入する工程と、を有するマレイミド基含有多孔質架橋ポリスチレン粒子の製造方法である。
【００１７】
＜７＞  前記希釈剤が、トルエン、ドデカン、ジエチルベンゼン、イソアミルアルコール、ラウリルアルコール及びヘキサデカンからなる群から選択される少なくとも一種である＜６＞に記載のマレイミド基含有多孔質架橋ポリスチレン粒子の製造方法である。
【００１８】
＜８＞  前記モノマー混合物中の前記希釈剤の含有量が、前記スチレンと前記架橋剤と前記希釈剤との合計量に対して３０〜８０質量％である＜６＞又は＜７＞に記載のマレイミド基含有多孔質架橋ポリスチレン粒子の製造方法である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、マレイミド基を有しアフィニティー精製特性に優れたマレイミド基含有多孔質架橋ポリスチレン粒子及びその製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明のマレイミド基含有多孔質架橋ポリスチレン粒子及びその製造方法について詳細に説明する。
＜マレイミド基含有多孔質架橋ポリスチレン粒子＞
本発明のマレイミド基含有多孔質架橋ポリスチレン粒子（以下「本発明の粒子」と称することがある。）は、体積平均粒子径が１〜１０００μｍであり、細孔の直径が粒子の直径を超えない範囲で且つ１〜１００００ｎｍのものである。
本発明の粒子はスチレンと架橋剤との共重合体である架橋ポリスチレンを含む。架橋剤にはジビニルベンゼンが主に用いられるが、他にエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート、２−（［１’−メチルプロピリデンアミノ］カルボキシアミノ）エチル（メタ）アクリレート等を用いることも可能である。
架橋剤の含有量は粒子の用途に応じて様々に調整するが、スチレンと架橋剤との合計量を１００質量部としたときに、０．１から５０質量部、好ましくは０．５から２５質量部、さらに好ましくは１から１０質量部が良い。
架橋剤含有量が低すぎると本発明の粒子の耐溶剤性が低下して、造粒後の化学修飾時やアフィニティー粒子としての使用時に粒子が溶解してしまう。また架橋剤含有量が高すぎると機械的にもろくなり粒子が割れてしまう事が多くなる。
【００２１】
本発明の粒子の体積平均粒子径は使用用途に応じて調整されるが、１〜１０００μｍであることが必要であり、好ましくは１０〜１００μｍである。体積平均粒子径が１μｍ未満であるとクロマトグラフィーでは粒子と粒子の隙間が小さくて試料液の通過性が悪くなることがある。また免疫沈降等のバッチ法においても粒子が沈降集合し難くなってしまう。一方体積平均粒子径が１０００μｍよりも大きいと粒子間の隙間が大きすぎて、試料液が充分本発明の粒子に接触できなくなり、アフィニティー精製能が低下してしまう。
粒子の形状は用途に応じて、球形、楕球形、多面体形、針状、平板状等が１種類もしくは２種類以上混合して用いられる。
本発明の粒子の体積平均粒子径は下記方法により測定された値をいう。
個々の粒子の直径は光学顕微鏡、電子顕微鏡、細孔電気抵抗法等で計測することができる。測定されたn個の粒子径をそれぞれd1,d2,・・・・dnとすると、それぞれの体積V1,V2,・・・・Vnが算出できる。体積平均径粒子径MVは、
MV=(d1・V1+d2・V2+・・・・dn・Vn)/(V1+V2+・・・・Vn)
で算出された値である。
【００２２】
本発明の粒子は粒子の直径を超えない範囲で且つ直径が１〜１００００ｎｍの細孔を有する多孔質の粒子である。粒子を多孔質にすることで表面積が増え、試料液と粒子との接触機会が上がり、アフィニティー精製能が向上する。細孔の直径は、好ましくは１０ｎｍ〜５０００ｎｍである。
細孔の直径が１ｎｍ未満であると、粒子に固定するリガンド分子や被精製分子が細孔の中に入れないので、細孔の効果がなくなる。また細孔の直径が１００００ｎｍよりも大きいと粒子の機械的強度が低下し壊れやすくなる。
本発明の粒子の細孔の直径は下記方法により測定された値をいう。
細孔測定法には様々な方法が存在するが、本発明においては水銀圧入法と窒素ガス吸着法を採用している。前者は多孔質試料を水銀中に入れてから加圧し、水銀が細孔に進入する時の全体の体積変化を計測するもので、数ｎｍから数１００μｍまでの測定が可能である。後者は多孔質試料を窒素ガス中に入れて吸着させた後、ガスを抜きながら試料より窒素を離脱させる。この時のガスの供給-回収量と圧力の関係を測定することにより細孔径が算出される。窒素ガス吸着法では１ｎｍから数１０ｎｍの細孔が測定できる。この２つの方法により１〜１００００ｎｍの細孔測定が可能である。
【００２３】
本発明の粒子はマレイミド基を含有する。マレイミド基は粒子の表面及び細孔の内面に分布している。マレイミド基の含有量は用途に応じて調整されるが、粒子１ｇ中に０．０００１ｍｍｏｌから１０ｍｍｏｌ、好ましくは０．００１ｍｍｏｌから１ｍｍｏｌである。マレイミド基量が０．０００１ｍｍｏｌ未満であると、粒子上にＳＨ基を含むリガンド分子を充分な量固定できず精製能が上がらないことがある。またマレイミド基量が多すぎると、余分なマレイミド基がアフィニティー結合を阻害し、精製特性が低下することがある。
【００２４】
マレイミド基の結合形態は用途により様々であるが、直接にまたはスペーサーとなる分子を介して、ポリスチレン鎖のフェニル基に共有結合させることができる。
本発明においては、マレイミド基がスペーサー分子を介してポリスチレン鎖のフェニル基に結合していることが好ましい。スペーサー分子はポリスチレン鎖とマレイミド基の間の距離を大きくするために挿入する。これによりマレイミド基に固定されたリガンド分子をポリスチレン鎖から離すことができる。したがってリガンド分子とアフィニティー特性のある分子とが、ポリスチレン鎖を立体障害とすることなく、容易に結合することができるようになる。
【００２５】
スペーサー分子は粒子の用途、リガンド分子や被精製分子の種類によって様々なものが用いられる。特にエチレングリコール、ポリエチレングリコール、パラキシレンジオール、メタキシレンジオール、グルタチオン、デキストラン、チオジエタノール、ビス［４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル］スルホン等をポリスチレン鎖と化学結合して用いる。
ポリエチレングリコールは様々な分子量のものがあるが、主に平均分子量１００から１０００のものが好適に用いられる。
【００２６】
本発明の粒子においては、下記化学式（１）で表される基を有することがさらに好ましい。下記化学式（１）においては、マレイミド基がスペーサー分子である（ポリ）エチレングリコールを介してポリスチレン鎖のフェニル基に結合する。なお、（ポリ）エチレングリコールとはエチレングリコールおよびポリエチレングリコールをいう。
【００２７】
【化２】
2007023120.tif 000003
【００２８】
化学式（１）において、ｎは１以上の整数を表す。
【００２９】
本発明の粒子には、チオール基（ＳＨ基）を含むリガンド分子を固定することができる。リガンド分子にはペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖類、脂肪類等の天然物質の他に、錯体、顔料、金属、金属酸化物等の、合成無機分子や合成有機分子が用いられる。これらの中でも、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ及びＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一種が好ましい。
ペプチドはアミノ酸数が２個から４０個、好ましくは５個から２０個のものを用いることができる。ペプチドはＳＨ基を持つシステインを含み、通常はどちらかの末端に１つだけ含むのが好ましい。
システインを含まないタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖類、脂肪類については、化学的にＳＨ基を含む分子を導入して用いることができる。
チオール基を含むリガンド分子は、下記化学式（２）に示すようにしてマレイミド基と結合すると考えられる。
【００３０】
【化３】
2007023120.tif 000004
【００３１】
化学式（２）中、Ｒ−Ｓ−はリガンド分子残基を示す。
【００３２】
チオール基を含むリガンド分子がマレイミド基と結合した本発明の粒子は、アフィニティー精製等に好適に用いられる。
【００３３】
＜マレイミド基含有多孔質架橋ポリスチレン粒子の製造方法＞
本発明の粒子の製造方法は特に限定されるものではないが、例えば、スチレンと、架橋剤と、重合開始剤と、前記スチレン及び前記架橋剤と重合反応を起こさない希釈剤と、を含むモノマー混合物を水系媒体に分散させて前記スチレンと前記架橋剤とを共重合させて希釈剤含有架橋ポリスチレン粒子を得る工程と、前記希釈剤含有架橋ポリスチレン粒子から希釈剤を除去して架橋ポリスチレン粒子を得る工程と、前記架橋ポリスチレン粒子にマレイミド基を導入する工程と、を経て本発明の粒子を得ることができる。
【００３４】
−希釈剤含有架橋ポリスチレン粒子の製造−
希釈剤含有架橋ポリスチレン粒子は、例えば、スチレンと架橋剤と重合開始剤とスチレン及び架橋剤と重合反応を起こさない希釈剤とを所望の割合で含むモノマー混合物を、水系溶媒の中で高速攪拌することにより分散粒子とした後に加熱してスチレンと架橋剤とを共重合させることにより得ることができる。希釈剤含有架橋ポリスチレン粒子の製造には、懸濁重合法、乳化重合法、分散重合法、シード重合法等、膜乳化法等が用いられる。
【００３５】
希釈剤にはスチレン及び架橋剤と重合反応を起こさない物質（共重合反応に関与しない物質）が用いられる。希釈剤には常温で固体のものと液体のものがある。希釈剤は１種類単独で、もしくは２種類以上混合して用いられる。具体的にはトルエン、ドデカン、ジエチルベンゼン、イソアミルアルコール、ラウリルアルコール、ヘキサデカン、ベンゼン、キシレン、クロロベンゼン、シクロヘキサン、イソオクタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、ジブチルフタレート等が使用できる。これらの中でも、トルエン、ドデカン、ジエチルベンゼン、イソアミルアルコール、ラウリルアルコール及びヘキサデカンからなる群から選択される少なくとも一種を用いることが好適なアフィニティー特性を得る上で好ましい。
【００３６】
重合開始剤には、ジアシルパーオキサイド、ケトンパーオキサイドおよびアルキルハイドロパーオキサイドのような有機過酸化物、過酸化水素およびオゾンのような無機過酸化物およびアゾビスバレロニトリル（ＡＩＢＮ；和光純薬社よりＶ−６０として入手可能）、ジメチル２，２’−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）（和光純薬工業よりＶ−６
０１として入手可能）、２，２’−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）（和光純薬社
よりＶ−５９として入手可能）および２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニト
リル）（和光純薬社よりＶ−６５として入手可能）のような油溶性アゾ系有機化合物、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）二酸
塩（和光純薬社よりＶ−５０として入手可能）、２，２’−アゾビス［２−メチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシエチル）プロピオンアミド］（和光純薬社よりＶＡ−０８６として入手可能）および２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］二酸
塩（和光純薬社よりＶＡ−０４４として入手可能）のような水溶性アゾ系有機化合物がある。重合開始剤は重合が良好に開始されるのに充分な量で用いられ、スチレン、架橋剤、希釈剤を足し算した油分重量の０．１〜５．０質量％が好ましい。
【００３７】
−希釈剤の除去−
共重合反応により希釈剤含有架橋ポリスチレン粒子が得られる。その後、希釈剤含有架橋ポリスチレン粒子から希釈剤が除去され、架橋ポリスチレン粒子が得られる。希釈剤を除去する方法としては、例えば、希釈剤を溶解する溶媒中で架橋ポリスチレン粒子を洗浄する、過熱により希釈剤を蒸発させる、気圧を下げることにより希釈剤を蒸発させる、等の方法を単独でもしくは組み合わせて用いることができる。ソックスレー抽出を利用した洗浄を用いることも可能である。洗浄溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、トルエン等が使用できる。
【００３８】
希釈剤を用いずに架橋ポリスチレン粒子を製造する方法もある。具体的には最終目標の粒子径よりも小さい微小粒子を造粒しておき、それらの微小粒子を会合させることにより多孔質な粒子を得る。この方法については、例えば、特表平４−５００７２６号公報１３頁左下欄１〜６行に記載がある
共重合前に磁性物質を添加して架橋ポリスチレン粒子を磁性粒子にしたり、所望の色の顔料を添加して着色粒子としたりすることも可能である。
【００３９】
−分級、乾燥−
架橋ポリスチレン粒子の造粒後次の反応工程を行う前に、粒子を分級して所望の大きさのものに分別したり、乾燥させたりすることも可能である。分級にはメッシュによるもの、風等流体力によるもの、重力によるもの等が利用可能である。また気体中で行う乾式、溶媒中で行う湿式が利用可能である。湿式で用いる溶媒は様々なものが利用可能であるが、溶媒中で粒子の分散が良好であるものが好ましい。例えば水、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、その他のアルコール、アセトン等を単独でまたは２種類以上混合して用いることができる。
【００４０】
−スペーサー分子の導入−
造粒された架橋ポリスチレン粒子には、必要に応じてスペーサー分子を付加する。これには化学的に可能な様々な方法が適用可能であるが、ポリスチレン鎖のフェニル基をクロロメチル化後（後述実施例参照）、ＯＨ基を有するリガンドをＣｌ脱離エーテル化反応させる方法がある。この方法は、例えば、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８１，４６，３４３３−３４３６に詳しい。ここでＯＨ基を２個有するジオール化合物をスペーサー分子とすれば、反応後はＯＨ基含有ポリスチレン粒子にすることができ、次反応に好適である。
【００４１】
−分級、乾燥−
スペーサー分子付加反応後、次の反応工程を行う前に、粒子を分級して所望の大きさのものに分別したり、乾燥させたりすることも可能である。
【００４２】
−マレイミド基の導入−
以上のようにして製造された架橋ポリスチレン粒子にマレイミド基を導入するには、化学的に可能なあらゆる方法が利用できる。
そのなかにヒドロキシメチルマレイミドを反応させる方法は有効である。
すなはち、スペーサー分子無しの場合は、ポリスチレン鎖のフェニル基をクロロメチル化した状態で、ヒドロキシメチルマレイミドのＯＨ基を、Ｃｌ交換エーテル化反応させる方法がある。
またＯＨ基含有スペーサーが有る場合は、ヒドロキシメチルマレイミドのＯＨ基と、脱水縮合エーテル化反応で容易に結合させることができる。この反応には酸性あるいは塩基性の公知のエーテル化触媒が使用できる。例えば、塩基性の触媒としては、アルカリ金属やアルカリ土類金属の水酸化物、酸化物、炭酸塩、重炭酸塩等が使用でき、単独又は２種類以上混合して使用できる。酸性の触媒としては、硫酸、塩酸、硝酸、リン酸等の無機酸やｐ−トルエンスルホン酸、トリクロロ酢酸、酢酸等の有機酸が使用でき、これらは水和物の形態でもよい。また、ハイドロタルサイト類の固体触媒でも使用が可能である。
架橋ポリスチレン粒子にマレイミド基を導入する工程は、該粒子にスペーサー分子を導入する場合は上述した「スペーサー分子の導入」と「マレイミド基の導入」とを含むものであり、該粒子にスペーサー分子を導入しない場合には上述の「マレイミド基の導入」を含むものである。
【００４３】
−分級、乾燥−
マレイミド基導入反応後、次の反応工程を行う前に、粒子を分級して所望の大きさのものに分別したり、乾燥させたりすることも可能である。
【００４４】
−リガンド分子の結合−
上記の様にして作製された本発明の粒子のマレイミド基には、ＳＨ基を含むリガンド分子を容易に結合させることができる。反応は通常リガンド分子が溶解可能な溶媒中で、本発明の粒子とリガンド分子とを接触させることにより行われる。溶媒としては水、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン−塩酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ハンクス緩衝液等が使用可能である。溶媒には、ジメチルアセトアミド、メタノール、エタノール、アセトン等の有機溶媒、エチレンジアミン４酢酸２ナトリウム塩等のキレート剤、ドデシル硫酸ナトリウムやポリオキシエチレンアルキルエーテル等の界面活性剤、ＥＤＴＡ等を添加することも可能である。
【００４５】
本発明の粒子は、ＳＨ基を含むリガンド分子を容易に、安定的に固定することができる。そして大きさを、１〜１０００μｍ、好ましくは１０〜１００μｍとしていることで、カラムへ充填しても十分な通液性を確保することができる。さらに細孔の直径が粒子の直径を超えない範囲で且つ１〜１００００ｎｍ、好ましくは１０ｎｍ〜５０００ｎｍの多孔質にして粒子表面積をかせぐことにより、アフィニティー反応を行うことがでる。また化学式（１）に示されるようなスペーサー分子を介してポリスチレン鎖にマレイミド基を配置することにより、さらに良好なアフィニティー精製特性を実現できる。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明を実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明は下記実施例により限定されるものではない。
【００４７】
（実施例１）
スチレン３７．５質量部、ジビニルベンゼン（純度５５％品）１２．５質量部、希釈剤としてジエチルベンゼン２５質量部とイソアミルアルコール５０質量部、重合開始剤としてジメチル２，２’−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）２．０質量部を混合溶解し
た。全油分に占める希釈剤の割合は、ジエチルベンゼン２０％、イソアミルアルコール４０％となる。この混合物を、炭酸カルシウム粉末１０質量部、塩化ナトリウム５０質量部、水２００質量部の均一分散溶液の中に投入した。ミキサーで６０００ｒｐｍ、３分間乳化を行った後、窒素雰囲気下７０℃で２０時間重合反応を行った。その後塩酸を投入して炭酸カルシウムを分解後水洗浄を行い、次に希釈剤を除去するためにエタノールで洗浄した。
さらに湿式分級して平均径５０μｍ粒子を選別し、１００℃で１２時間真空乾燥を行った。
上記で作製した架橋多孔質ポリスチレン粒子１０質量部に、トリオキサン９．０質量部、クロロホルム１００質量部、クロロトリメチルシラン３３質量部を混合したものを作製して氷冷した。これに四塩化すず１０質量部をクロロホルム５質量部に溶解した液を滴下し、スチレンのクロロメチル化反応を氷上で１時間、室温にして２時間行った。メタノールを注入して反応停止後、有機溶剤、蒸留水で洗浄、加温真空乾燥した。
上記で得られたクロロメチル化ポリスチレン粒子３．０質量部を、ジメチルアセトアミド１００質量部、ポリエチレングリコール２００を１４質量部、ナトリウムメトキシド３．５質量部、を加えてよく攪拌しながら、８０℃で６時間反応させて、ポリスチレン鎖へポリエチレングリコール２００を付加した。反応後の粒子を有機溶剤で複数回洗浄し、加温真空乾燥を行った。
上記で得られたポリエチレングリコール付加ポリスチレン粒子１．０質量部に、トルエン３３質量部、ヒドロキシメチルマレイミド１．０質量部、パラトルエンスルホン酸一水和物０．３０質量部を加えた。これを攪拌しながら１２５℃で７時間反応させ、マレイミド基含有ポリスチレン粒子１（本発明の粒子）を得た。
【００４８】
（実施例２）
スチレンモノマー４５質量部、ジビニルベンゼン（純度５５％品）７．５質量部、希釈剤としてラウリルアルコール４０質量部、重合開始剤としてジメチル２，２’−アゾビス
（２−メチルブチロニトリル）２．０質量部を混合溶解した。全油分に占める希釈剤の量は４５％となる。この混合物を実施例１と同じ条件で懸濁重合造粒を行い、以下の工程も実施例１と同じに行って、マレイミド基含有ポリスチレン粒子２（本発明の粒子）を作製した。
【００４９】
（比較例１）
希釈剤を入れなかった他は全て実施例１と同様にしてマレイミド基含有ポリスチレン粒子３を作製した。
（比較例２）
スチレンモノマー３７.５質量部、ジビニルベンゼン（純度５５％品）１２.５質量部、希釈剤としてジエチルベンゼン２５質量部とイソアミルアルコール５０質量部を混合後よく溶解した物を作成した。重合開始剤の過硫酸カリウム０.２５質量部、ＮａＨ2ＰＯ4０.１質量部、オレイン酸ナトリウム２質量部を、良く酸素を除いた水２００質量部に溶解したものを作成した。２つの液を混合してミキサーにて６０００ｒｐｍで３分間攪拌して乳化した。その後７０℃で２０時間重合を行った。粒子径が０．８μｍであるのを確認してから、水とエタノールで洗浄後、１００℃で１２時間真空乾燥を行った。
上記で作製した架橋多孔質ポリスチレン粒子を用い、実施例１と同様に以下の操作を行い、マレイミド基含有ポリスチレン粒子４を作製した。
【００５０】
（比較例３）
比較サンプルとしてアマシャムバイオサイエンス社製チオールセパロース４Ｂ（アガロース系粒子）を用いた。
【００５１】
＜体積平均粒子径の測定＞
以上の粒子の体積平均粒子径を、光学顕微鏡観察により写真をとり１００個の粒子の直径を測ることにより算出した。得られた結果を表１に示す。
【００５２】
＜細孔径の測定＞
以上の粒子の細孔の直径を、実施例１及び２並びに比較例２及び３に係る粒子については水銀圧入法（ＭＩＣＲＯＭＥＲＩＴＩＣＳ社製オートポアIII９４２０）により、比較例１に係る粒子については窒素吸着法（カンタクローム社製ＡＵＴＯＳＯＲＢ-1ＭＰ）により測定した。得られた結果を表１に示す。
【００５３】
＜アフィニティー精製特性の評価＞
１３残基のペプチドＰｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｃｙｓと、これをウサギの体内に入れてできた抗体血清とを入手した。
まず各粒子をｐＨ６．５のリン酸緩衝液に念入りに分散した。それらをバイオラッド社製マイクロスピンカラムにベッドヴォリューム０．５ｍｌになるように充填した。ここに上記のペプチド１００μｇを含むリン酸緩衝液１ｍｌを加え上部のキャップをしめて、室温で振とうさせながら１２時間反応させて、リガンドであるペプチド分子の固定を行った。カラム上部および下部のキャップを外して液を抜いた。
この際比較例２の０．８μｍ粒子を充填したカラム下部からは液が抜けず、スポイトのゴム部で上部から圧力をかけたりしたが液は粒子部を通過しなかった。
残りの各カラム上部からリン酸緩衝液を５ｍｌ流し、未反応リガンド分子を洗い流した。
次に抗体血清を１ｍｌづつ上部から注ぎカラムを通過させ、粒子上に固定されたペプチドと血清に含まれる抗体の間でアフィニティー結合を生じさせた。
再び各カラム上部からリン酸緩衝液を５ｍｌ流し、未結合の血清内容物を洗い流した。
その後ｐＨ２．３のグリシン塩酸緩衝液を１ｍｌづつ上部から注ぎ、抗体を溶出して、カラムを通過した液を回収した。
また実施例１と実施例２及び比較例３のサンプルについては、抗体血清添加、洗浄、抗体溶出の操作を繰り返して、２０回目の抗体溶出液も採取した。
以上収集した各液をリン酸緩衝液で１００倍に希釈して、あらかじめ上記１３残基のペプチド分子を固定化したＥＬＩＳＡプレートに注いだ。注いだ液中に抗体があればプレートのペプチドと結合するはずである。プレートを洗浄後、２次抗体にＨＲＰ結合抗ウサギ抗体ヤギを、発色基質にＴＭＢ溶液を用いて発色させた。これをマイクロプレートリーダー（コロナ電機（株）製  ＭＴＰ−３００）により４５０ｎｍの吸光度を測定した。測定結果を表１に示す。
【００５４】
【表１】
2007023120.tif 000005
【００５５】
表１から、実施例１、２の吸光度が高くアフィニティー精製能が優れていたのに対して、細孔がない比較例１は吸光度が低くアフィニティー精製能が低いことがわかる。また比較例３の粒子の精製能は１回目の溶出では優れているが、２０回後は低下しているのに対して、実施例１、２は２０回後も性能が低下しないことがわかる。
【手続補正書】
【提出日】平成17年8月22日(2005.8.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
【化３】
2007023120.tif 000007