(57)【要約】      （修正有）【課題】基板の内部表面又はその近傍での気泡の発生を抑制する方法。【解決手段】基板と該基板の一部に密着可能なカバーとを含むマイクロアレイであって、該カバーの内側表面が親水性でありかつ該カバーがそれを貫通する少なくとも１つの穴を有し、該基板が複数の凹凸構造を含み、その凸部の上面に選択結合性物質が固定化されていることを特徴とするマイクロアレイ。【選択図】図１
2007171144.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と該基板の一部に密着可能なカバーとを含むマイクロアレイであって、該カバーの内側表面が親水性でありかつ該カバーがそれを貫通する少なくとも１つの穴を有し、該基板が複数の凹凸構造を含み、その凸部の上面に選択結合性物質が固定化されていることを特徴とする、前記マイクロアレイ。
【請求項２】
前記カバーがポリマー製である、請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項３】
前記カバーの内側表面が親水性ポリマーを含む、請求項１又は２に記載のマイクロアレイ。
【請求項４】
前記親水性ポリマーがグラフト重合によって形成される、請求項３に記載のマイクロアレイ。
【請求項５】
カバーの表面に親水性ポリマーを高エネルギー線で共有結合させる請求項４記載のマイクロアレイ。
【請求項６】
前記親水性ポリマーが、ポリアルキレングリコールである請求項３〜５のいずれかに記載のマイクロアレイ。
【請求項７】
前記カバーの内側表面がプラズマ処理によって親水化されている、請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項８】
前記プラズマ処理が酸素プラズマ処理である、請求項７に記載のマイクロアレイ。
【請求項９】
前記カバーの穴が、マイクロアレイ上に被検試料を注入するためのものである、請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項１０】
前記カバーの穴が４個存在する、請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項１１】
前記カバーが前記基板の一部に接着されている、請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項１２】
前記カバーと基板間の空隙に複数の微粒子を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のマイクロアレイ。
【請求項１３】
前記微粒子が直径１０〜５００μｍの大きさを有する、請求項１２に記載のマイクロアレイ。
【請求項１４】
前記微粒子が液の攪拌のためのものである、請求項１２または１３に記載のマイクロアレイ。
【請求項１５】
前記基板の全体又は一部が黒色である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のマイクロアレイ。
【請求項１６】
前記カバーの全体又は一部が透明である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のマイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内部表面が親水性のカバーを有するマイクロアレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロアレイは、数千以上の多数の遺伝子発現を同時に測定するための小型装置であり、ガラス、シリコンなどの基材の基板上にＤＮＡなどの分子を高密度に配置したものである。マイクロアレイを使用することによって各種疾患動物モデルや細胞生物学現象における体系的かつ網羅的な遺伝子発現解析を行うことができる。具体的には、遺伝子の機能を解析することができる。すなわち、遺伝子がコードするタンパク質を明らかにするとともに、タンパク質が発現する時期や作用する場所を特定することが可能になる。生物の細胞又は組織レベルでの遺伝子発現の変動をマイクロアレイによって解析し、生理学的、細胞生物学的、生化学的事象データと組み合わせて遺伝子発現プロファイルデータベースを構築することによって、疾患遺伝子、治療関連遺伝子の検索や治療方法の探索が可能になるだろう。
【０００３】
現在、マイクロアレイには２つの基本的な方法、すなわちＧｅｎｅＣｈｉｐ法及びｃＤＮＡマイクロアレイ法、が採用されている。
【０００４】
ＧｅｎｅＣｈｉｐ法では、フォトリソグラフ法によりガラス板上で２５マー(mer)程度のオリゴＤＮＡを合成し、１つの遺伝子あたり、塩基配列データから１６カ所から２０カ所の２５マーを設定し、２５マーの完全一致と１３塩基目を意図的に違えた１塩基ミスマッチのオリゴマーセットを組にしてプローブとする、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社によって開発された方法である。この方法は、プローブＤＮＡの長さが一定であり、配列が既知なため、ハイブリダイゼーションの強さに影響をあたえるＧＣ含量も一定にすることができるので、発現量の定量的解析には理想的なアレイと考えられている。
【０００５】
ｃＤＮＡマイクロアレイ法は、Ｓｔａｎｆｏｒｄ大学によって開発された方法であり、キャピラリー状のペンでスポッティングする方式、インクジェット方式などの手法を用いてガラス板にＤＮＡを固定する方法である。
【０００６】
上記のいずれの方法も、測定する試料を蛍光標識したのち、マイクロアレイ上のプローブとハイブリダイゼーションにより結合し、スキャナーを用いてその蛍光強度を測定することにより、標的遺伝子の発現を測定するものである。
【０００７】
マイクロアレイデータの解析の１つとして、階層的クラスタリングがある。これは、発現パターンの類似した遺伝子を集めて系統樹を作製することができる方法であり、多数の遺伝子の発現レベルが色で模式的に表示されうる。このようなクラスタリングによって、ある疾患に関連する遺伝子を識別することができる。
【０００８】
マイクロアレイは、ＤＮＡなどの核酸だけでなく、タンパク質や糖類などの検査、解析手段としても利用されるようになってきた。とりわけ、プロテインマイクロアレイでは、抗体、抗原、酵素基質などのタンパク質が基板上に固定される。
【０００９】
本発明者らは先に、一般的なガラスやシリコンを基材とするマイクロアレイではなく、ポリマーを基材とし、かつ凹凸構造を有する特殊な形状のマイクロアレイを開発した（特許文献１）。この方法により、アレイ上に固定化される物質の各スポットのばらつきが小さくなり、その結果、Ｓ／Ｎ比及び検出感度が大きく改善された。固定化物質は凸部の上面に固定される。さらに、凹部の内部に微粒子を存在させることによって、反応液の攪拌効率を増大させることが可能になり、結果として反応促進効果も達成された（非特許文献１）。
【００１０】
【特許文献１】特開２００４−２６４２８９
【非特許文献１】滝澤聡子ら,  ２００５  ７−８  バイオテクノロジージャーナル４１８〜４２０頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らが開発した凹凸構造のマイクロアレイは、その特殊な構造と微粒子の使用のために、マイクロアレイの上部にカバーを設けることが望ましい。しかし、基板と同様の材質の疎水性ポリマーからなるカバーを使用したときには、マイクロアレイの内部に被検試料等の液を注入するとカバー表面又はその近傍に気泡が発生し、この気泡が測定の妨げとなることが判明した。特に凹凸構造のマイクロアレイに微粒子をあらかじめ封入した場合、カバー表面やその近傍に気泡が生じやすいことが判明した。
【００１２】
本発明の目的は、カバーを有するマイクロアレイにおいて気泡の発生を防止することができるマイクロアレイを提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、そのようなマイクロアレイの使用方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、意外にも、マイクロアレイのカバーの内側表面を親水性にすることによって上記の課題を解決することができることを見出し、本発明を完成させた。
【００１５】
したがって、本発明は、要約すると、以下の特徴を有する。
（１）基板と該基板の一部に密着可能なカバーとを含むマイクロアレイであって、該カバーの内側表面が親水性でありかつ該カバーがそれを貫通する少なくとも１つの穴を有し、該基板が複数の凹凸構造を含み、その凸部の上面に選択結合性物質が固定化されていることを特徴とするマイクロアレイ。
（２）前記カバーがポリマー製である、（１）に記載のマイクロアレイ。
（３）前記カバーの内側表面が親水性ポリマーを含む、（１）又は（２）に記載のマイクロアレイ。
（４）前記親水性ポリマーがグラフト重合によって形成される、（３）に記載のマイクロアレイ。
（５）カバーの表面に親水性ポリマーを高エネルギー線で共有結合させる（４）記載のマイクロアレイ。
（６）前記親水性ポリマーが、ポリアルキレングリコールである（３）〜（５）のいずれかに記載のマイクロアレイ。
（７）前記カバーの内側表面がプラズマ処理によって親水化されている、（１）に記載のマイクロアレイ。
（８）前記プラズマ処理が酸素プラズマ処理である、（７）に記載のマイクロアレイ。
（９）前記カバーの穴が、マイクロアレイ上に被検試料を注入するためのものである、（１）に記載のマイクロアレイ。
（１０）前記カバーの穴が４個存在する、（１）に記載のマイクロアレイ。
（１１）前記カバーが前記基板の一部に接着されている、（１）に記載のマイクロアレイ。
（１２）前記カバーと基板間の空隙に複数の微粒子を含む、（１）〜（１１）のいずれかに記載のマイクロアレイ。
（１３）前記微粒子が直径１０〜５００μｍの大きさを有する、（１２）に記載のマイクロアレイ。
（１４）前記微粒子が液の攪拌のためのものである、（１２）または（１３）に記載のマイクロアレイ。
（１５）前記基板の全体又は一部が黒色である、（１）〜（１４）のいずれかに記載のマイクロアレイ。
（１６）前記カバーの全体又は一部が透明である、（１）〜（１５）のいずれかに記載のマイクロアレイ。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、凹凸構造の基板とカバーとを含むマイクロアレイにおける、カバー表面又はその近傍での気泡の発生を防止することが可能となり、これによって、このようなマイクロアレイが本来的にもつＳ／Ｎ比及び検出感度を改善する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下では、本発明をさらに具体的に説明する。
【００１８】
本発明のマイクロアレイは、図１に示すように基板１と該基板１の一部に密着可能なカバー２とを含むマイクロアレイであって、該カバーの内側表面が親水性でありかつ該カバーがそれを貫通する少なくとも１つの穴４を有し、該基板が複数の凹凸構造を含み、その凸部の上面に選択結合性物質が固定化されていることを特徴とする。従って空隙６は、複数の貫通孔４以外とは外部と連通しない閉じた空間である。
【００１９】
本発明で使用可能な基板は、微細な凹凸構造を有する。
凹部及び凸部の形状は特に限定されないものとし、特に凸部は角柱、円柱などの柱状構造が好ましい。また凸部の上面の形状は、円形又は三〜八角形などの角形が好ましい。凹部又は凸部は完全に又は実質的に同一の構造を有しており、また交互に規則的に配列していることが好ましい。このような規則的な配列の場合、凸部の形状に応じて凹部の形状が決まる。
【００２０】
凸部のサイズは、例えば高さ約１０〜約２００μｍ、幅約５０〜約１５０μｍであるが、このような範囲に限定されない。凸部と凸部の間隔は、例えば約５０〜約６００μｍであるが、好ましくは複数の微粒子が入ることが可能な空間である。また、特開２００４−２６４２８９（特許文献１）に示す理由から、凸部の高さについては、その周りの平坦部と同じ高さであることが好ましい。凸部と平坦部の関係については、図２に示す。
【００２１】
凸部の上面には、図３に示す選択結合性物質８が固定化される。それゆえ、凸部の上面とカバーとの間には、選択結合物質と被検物質とが結合しうるための空間を設ける必要がある。そのような空間のサイズは、例えば約１〜約５００μｍである。これより小さい範囲であると、ハイブリダイゼーション後のシグナルが著しく小さくなるので好ましくない。また、空間サイズが５００μｍを超えると、液量が多く必要であり、微量な検体を用いる場合、その濃度が薄くなってしまい、ハイブリダイゼーション後のシグナルが小さくなりがちである。
【００２２】
基板の材質としては、例えば、ガラス、セラミック、シリコンなどの無機材料、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン、シリコーンゴムなどのポリマーを挙げることができる。好ましくは、成形が容易な合成ポリマー、例えばＰＭＭＡである。
【００２３】
基板の成形としては、ポリマーの場合、射出成形法、ホットエンボス法などの方法、ガラスやセラミックの場合、サンドブラスト法などの方法、シリコンの場合、公知の半導体プロセスで使用される方法が挙げられる。
【００２４】
本発明においては、基板の凸部の上面に選択結合性物質が固定化される。このために、凸部の上面は、選択結合性物質と結合可能な官能基（例えばアミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アルデヒド基、エポキシ基など）を含むことができる。このような官能基の導入のために、例えば該表面をプラズマ処理又は放射線処理（例えばγ線、電子線など）するか、これらの処理の後でさらにグラフト重合処理することによって極性基を導入したり、或いは、ポリカチオン（例えばポリＬ−リシン、シランカップリング剤など）をコートしたりすることができる。
【００２５】
シランカップリング剤の例は、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３-アミノプロピルジエトキシメチルシラン、３-（２-アミノエチルアミノプロピル）トリメトキシシランなどを含む。
【００２６】
基板は、その全体又は一部を黒色にすることができる。黒色とは、可視光範囲（波長４００〜８００ｎｍ）において、基板の黒色部分の分光反射率が特定のスペクトルパターンを持たず、一様に低い値、好ましくは７％以下であり、かつ、黒色部分の分光透過率も特定のスペクトルパターンを持たず、一様に低い値、好ましくは２％以下であることを意味する。基板の少なくとも一部を黒色にすることによって、Ｓ／Ｎ比を向上させることができる。黒色にする手段として、基板材料又は絶縁材料に黒色物質、例えばカーボンブラック、グラファイト、チタンブラック、アニリンブラック、金属（Ｒｕ，Ｍｎ，Ｎｉ，Ｃｒ，Ｆｅ，Ｃｏ，Ｃｕなど）の酸化物、Ｓｉ，Ｔｉ，Ｔａ，Ｚｒ，Ｃｒの炭化物、を混入させることにより達成される。
【００２７】
本発明で使用可能な好ましい基板及びその製法は、例えば本出願人による特開２００４−２６４２８９（特許文献１）、滝澤聡子ら,２００５  ７−８  バイオテクノロジージャーナル４１８〜４２０頁（非特許文献１）、などに記載されるものである。
【００２８】
さらにまた、基板とカバーの間の空隙６に微粒子９を含むことができる（図３）。微粒子９が存在することによって、液の効率よい攪拌が可能となり、その結果、反応促進効果がもたらされる。微粒子のサイズは直径数十〜数百μｍであるが、前記基板とカバーの間の空隙に複数個の微粒子が自由に動きうるようなサイズである。微粒子の材質は、例えばガラス、金属又はポリマー、より具体的には、ガラス、セラミック（例えばイットリア安定化ジルコニア）、ステンレス、ナイロンやポリスチレンなどのポリマーなどが挙げられる。この中でも、化学的に安定であり比重も大きいことからセラミックの微粒子が好ましい。このような微粒子をハイブリダイゼーション中に加え、ビーズを移動させることにより液の効率よい撹拌が可能となる。なお、微粒子を動かす手段としては、基板を回転させて重力方向に微粒子を落下させる方法や、振とう機に微粒子を含んだ基板をセットし基板を振とうさせる方法がある。また、磁性微粒子を用いて、磁力により微粒子を移動させてもよい。微粒子の大きさ（直径）については、特に限定されるものではないが、１０μｍ〜５００μｍの範囲が好ましい。これより小さい範囲であると、撹拌の効果が十分得られない場合があるし、これより大きい範囲であると、微粒子を封入するために、後述するカバーと基板との間に大きなスペースが必要となり、結果的に必要な液量が多くなる。また、たとえば、重力によって微粒子を移動させて液を攪拌することを考えると、液やビーズがチップからこぼれてしまわないように基板にカバーを密着させて、それらを保持しておくことが好ましい。また、操作性を考えると、あらかじめ基板とカバーの間に微粒子を封入しておくことが好ましい。さらに、ハイブリダイゼーション後にそのシグナル（蛍光）を測定する際のことを考慮すると、カバーはハイブリダイゼーション後に脱離可能であることが好ましい。
【００２９】
本発明のマイクロアレイは、上記の基板とともに、内部表面が親水性のカバーを含むことを特徴とする。カバー内部表面が、親水性の処理をされていると、上述したように液を基板とカバー間の空間にアプライした場合、液中に泡が残ってしまうことを防ぐことが可能となる。特にあらかじめ微粒子をカバーと基板の間の空間に封入した場合、カバー内部を親水性処理していないと、液中に泡が残存しやすい。しかし、カバー内部表面を親水性処理しておけば、液中の泡を効果的に防ぐことができる。この理由は、静電気が関係しているものと考えられるが、詳細については不明である。
【００３０】
カバーは、基板の凹凸部の周囲に設けた平坦部に密着されるが、そこから脱離可能である。例えば、カバーがギャップ構造を有しているか、スペーサーを介して平坦部とカバーとが貼り付けられていれば、カバーを密着した後凸部の上面との間に空間が生じる。この空間のサイズは上記のとおりである。密着は、基板の平坦部上部に接着剤層３（図１、図３）を設けて、この接着剤層を介してカバーを接着するなどの方法で行うことができる。接着剤層は、合成樹脂などのポリマー同士、ガラス同士、シリコーン同士、ポリマーとガラス、ポリマーとシリコーン、ガラスとシリコーン、などの材質間を接着可能なものであれば特に限定されないが、ハイブリダイゼーション後に脱離可能ということを鑑みると、両面テープや、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）を好ましく用いることができる。
【００３１】
あるいは、上記接着剤層に代えてパッキングを使用することもできる。パッキングは、基板の上記平坦部に例えば接着するか、該平坦部にパッキングの一部を均一に埋め込むなどの形態で配置されうる。パッキングの形状は、限定されないが、その切断断面が角形のもの、円形のものなどを含む。パッキングの材質は、限定されないが、適度の厚さのゴム（例えばシリコーンゴム）などのエラストマーが好ましい。カバーと基板との固定は、限定されないが、例えば突起と受け孔による固定を含む。具体的には、カバーの表面に複数の突起（例えば柱状）を形成し、一方、基板の平坦部上に該突起がぴったり入る適度の深さの受け孔を形成し、パッキングを挟んで上記突起と受け孔とでカバーと基板を固定することができる。このような固定方式のために、基板とカバーとを脱着することも可能である。
【００３２】
カバーの材質は、基板の材質と同じであってもよいし異なっていてもよく、例えば、ガラス、セラミックス、シリコンなどの無機材料、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン、シリコーンゴムなどのポリマーを挙げることができる。特に、後述の貫通孔を容易に形成できることから、カバーの材質としては、ＰＭＭＡやポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレートなどのポリマーを好ましく用いることができる。
【００３３】
上記のようなカバーは、例えば射出成形法、削り出しなどの方法によって製造できるが、量産性を考えると射出成型法が好ましい。
【００３４】
本発明によれば、カバーの内側表面、すなわち基板の凹凸構造に向かい合い面、が親水性である。親水性にすることによって、液をアプライする際のカバーの内側面に付着する気泡の発生が防止される。気泡が存在することによって、感度低下や測定値のばらつきなどが生じるため、正確で信頼性のある測定結果を得ることが難しくなる。親水性は、水になじみやすい性質を意味し、一般に親水性が高くなるにつれて、水滴とカバー表面とで作る接触角が小さくなる。本発明の効果を得るためには、接触角が通常６０度以下、好ましくは５５度以下、より好ましくは５０度以下である。
【００３５】
カバーに親水性を付与するために、カバーの内側表面に親水性ポリマーをコートするか、或いは該表面にグラフト重合によって親水性ポリマーをグラフトするか、カバーの材質が例えばポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）などの場合には強アルカリ下に浸漬することにより側鎖にカルボキシル基などの親水基を生じさせることができる。
【００３６】
本発明における親水性ポリマーとは、水溶性ポリマーまたは易水溶性ではないが親水性を有するポリマーを意味する。具体例としては、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、エチレン-ビニルアルコール共重合体、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリα-ヒドロキシビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリα-ヒドロキシアクリル酸、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールやポリプロピレングリコール等のポリアルキレングリコール、馬鈴薯デンプン、とうもろこしデンプン、小麦デンプン等のデンプン、グルコマンナン、絹フィブロイン、絹セリシン、寒天、ゼラチン、卵白たんぱく質およびアルギン酸ナトリウム等が挙げられる。またこれらのスルホン化物も使用できる。
【００３７】
本発明の親水性ポリマーとしては、ポリアルキレングリコールが好ましい。ポリアルキレングリコールとしては、例えばポリエチレングリコールやポリプロピレングリコールに代表される主鎖中に酸素原子を含む鎖状ポリマーであるが、ポリアルキレングリコールがグラフトしたポリマーであっても良い。ポリアルキレングリコールの分子量は、特に限定されるものではなく、数平均分子量で６００〜４００００００のものが好ましく、１００００〜１００００００程度のものが特に好ましく用いられる。
【００３８】
親水性ポリマーのコーティングは、該ポリマーをカバーの内側表面に均一に塗布することによって行うことができる。簡単に説明すると、この方法は、例えば、親水性ポリマーを有機溶媒に溶解した液を、カバーの表面に流し込む、はけ塗りするなどの手法で均一に塗布した後、溶媒を蒸発除去することを含む。
【００３９】
あるいは、グラフト重合を利用して、カバーの表面に親水性ポリマーを形成することができる。簡単に説明すると、放射線（例えば、γ線、電子線など）照射、光照射、プラズマ処理などの方法によってカバーの表面に反応活性種（特に、ラジカル）を形成し、この反応活性種を介して親水性モノマーを重合させて親水性ポリマーをカバーの表面にグラフト化する。
【００４０】
特に、本発明においてカバーの表面に親水性ポリマーを高エネルギー線で共有結合させることが好ましい。例えば、まずカバーを親水性ポリマー、好ましくはポリアルキレングリコールの溶液に浸漬または接触させた後、ガンマ線や電子線などの高エネルギー線を照射する。親水性ポリマーとしてポリアルキレングリコール溶液を用いる場合、ポリアルキレングリコール溶液の温度は特に限定しないが、好ましくは０℃以上３０℃以下、さらに好ましくは１０℃以上２５℃以下が好まれる。また、ポリアルキレングリコール溶液とするための溶媒も特に限定されるものではなく、良溶媒として水、メタノール、エタノール、アセトン等が用いられるが、コスト面、安全面から水が好ましく用いられる。
【００４１】
本発明における高エネルギー線とはある一定のエネルギー量を持つエネルギー線のことで、マイクロ波、赤外線、可視光線、紫外線、エックス線、ガンマ線、電子線、陽子線、中性子線も高エネルギー線に含まれる。そのうちガンマ線とはその波長が１０-12〜１０-15ｍの電磁波を言い、透過性に優れているので、一度に多量のカバーのグラフト処理を行うことが可能となることから好ましい。
【００４２】
高エネルギー線の照射量は特に限定されるものではなく、親水性を付与したいカバーにポリアルキレングリコール鎖が固定化するだけの照射量があれば良く、ガンマ線を用いる場合は吸収エネルギーとして通常１００ｋＧｙ以下、好ましくは４０ｋＧｙ以下、さらに好ましくは樹脂基板の黄変による被験試料検出への影響が少ない１０ｋＧｙ以下が用いられる。
【００４３】
あるいは、カバーの表面をプラズマ処理することによって親水化してもよい。プラズマ処理は、疎水性ポリマーやガラスなどの材料の表面を親水性にする方法として一般的に使用されている。この方法は、２つの電極間に材料を置き、酸素、窒素、空気などの雰囲気中、必要ならば減圧下で、放電を起こすことを含み、これによって、材料の表面に極性基が形成され親水性に改質される。プラズマ発生装置は、種々のタイプが市販されているので、それらを適宜使用することができる。さらに、親水性保持効果を高めるために、メタノールやアセトンなどの極性有機溶媒中で材料を浸漬処理する（吉川光英及び篠田勉,  東京都立産業技術研究所報告第３号１６５〜１６６頁(２０００年)）、あるいは、上記のようにグラフト重合処理により親水性ポリマーをグラフト化することが望ましい。
【００４４】
上記の親水化手段の中でも、カバーをポリアルキレングリコールの溶液に浸漬または接触させた後、ガンマ線や電子線などの高エネルギー線を照射する方法は、コーティング法やプラズマ処理と比較して、蛍光測定の際にノイズの原因となる溶出物がほとんどないことから、特に好ましく用いることができる。
【００４５】
カバーは、その全体又は一部を透明にすることができる。透明にすることによって、被検試料の注入量を視覚的に捕らえることができるし、かつ、微粒子による攪拌状態を確認することが可能になる。そのようにすることができる限り、カバーの全体ではなく一部のみを透明にすることができる。また、透明で基板の内部の状態を確認することができる限り、有色透明であってもよいが、好ましくは無色透明である。
【００４６】
前記カバーは、前記選択結合性物質固定化担体の表面の少なくとも一面の一部を覆い、担体と、カバーとの間に空隙を有するよう接着されることができる。そして、担体は、好ましくはその表面であって前記空隙内に位置する領域上に固定化された選択結合性物質を有する。即ち、好ましくは、前記選択結合性物質が固定化された領域が、当該空隙内に存在するように、前記カバーは前記担体の一部に接着される。前記カバーは、前記空隙が形成される限りにおいて、どのような態様で接着されてもよいが、好ましくは、両面テープ、樹脂組成物等の接着層３を介して接着される。
【００４７】
前記カバーは、前記空隙に連通する１つ以上の貫通孔を有するものとすることができ、複数の貫通孔を有することが好ましい。この穴は、被検試料、結合用バッファなどの液体を注入するためのものであり、また同時に、基板内部の圧力を大気圧に保持するためのものでもある。貫通孔は、一つの空隙に対して複数あることが好ましく、中でも３個から６個とすることにより、検体溶液の充填が容易となるので特に好ましい。なお、後述するように、空隙が、互いに連通しない複数の空間に分かれている場合は、各空間あたりに複数個、より好ましくは３〜６個の貫通孔を有することが好ましい。カバーが複数の貫通孔を有する場合、それらの孔径は、同一でも異なっていてもよいが、複数の貫通孔のうちの一つをアプライ口とし、他の貫通孔を空気の抜け口として機能させる場合、検体溶液のアプライの容易さ及び検体溶液の密閉保持性の点から、アプライ口のみをアプライに必要な広い孔径としその他の貫通孔をより狭い孔径とすることが、好ましい。具体的には、アプライ口の貫通孔サイズは直径０．０１から２．０ｍｍの範囲内とし、その他の貫通孔の直径を０．０１〜１．０ｍｍとすることが好ましい。
【００４８】
貫通孔４は、その少なくとも１つが、その径を変化させて、上端に径の広い部分、いわゆる液面駐止用チャンバー５を備えるものとしても良い（図４）。液面駐止用チャンバーを備えることにより、貫通孔４からアプライされ空隙６に充填された検体溶液の液面の上昇を抑え、貫通孔を封止部材７で封止する際の封止を容易かつ確実に行うことが可能となるとともに、検体溶液の中に多数の気泡が入ったり、検体溶液の流出を防ぐことができるので好ましい。液面駐止用チャンバーの形状は特に限定されるものではなく、円柱形、角柱形、円錐形、角錐形、半球形、又はこれに近似した形状とすることができる。これらのうち、製造の容易さ及び検体溶液の上昇を抑制する効果の高さ等の観点から、円柱形が特に好ましい。
【００４９】
貫通孔の孔径サイズについては特に限定されるわけではないが、図４に示す縦断面形状の円筒形の貫通孔４及び液面駐止用チャンバー５との組み合わせの場合を例に挙げると、貫通孔４の孔径サイズ（直径）は、０．０１から２．０ｍｍが好ましく、０．３から１．０ｍｍがより好ましい。孔径を０．０１ｍｍ以上とすることにより、検体溶液のアプライを容易に行うことができる。一方、貫通孔４の直径を１．５ｍｍ以下とすることにより、アプライ後封止前の検体溶液の蒸発などをより効果的に抑制することができる。液面駐止用チャンバー５の孔径サイズ（直径）については、１．０ｍｍ以上が好ましい。１．０ｍｍ以上とすることにより、貫通孔４とのサイズの差を十分に得ることができ、十分な液面駐止効果が得られ好ましい。液面駐止用チャンバー５の直径の上限は、特に限定されないが、１０ｍｍ以下とすることができる。また、液面駐止用チャンバー５の深さは、特に限定されないが、０．１〜５ｍｍの範囲内とすることができる。
【００５０】
このようなカバーは、前述の選択結合性物質固定化担体に、脱離可能に接着されていることが好ましい。本発明の分析用チップをＤＮＡチップとして用いる場合、通常、ＤＮＡチップを専用スキャナーで読み取ることが必要であるが、カバーが接着された状態では、専用スキャナーにセットすることが難しく、セットされたとしてもスキャン操作を実施するとカバーとスキャナーの光学系部品が接触し、故障の原因となることがある。また、カバーを介しての読み取りが可能であっても、読み取り値が不正確となりうる。そのため、読み取りの工程においてカバーを取り外せるよう、カバーが脱離可能であることが好ましい。
【００５１】
カバーを選択結合性物質固定化担体に脱離可能に接着する態様は、特に限定されないが、カバーと担体が損傷されることなく脱離することが可能である態様が好ましい。例えば、両面テープ、樹脂組成物等の接着層３を介して接着することができる。
【００５２】
接着層として両面テープを用いる場合、両面で接着力の異なる両面テープを用いることが好ましく、具体的には、該両面テープの接着力の弱い面を担体側に接着し、接着力の強い面をカバー側に接着することが好ましい。このような態様とすることにより、カバーを剥離する際に、両面テープがカバーに接着した状態で同時に担体より脱離し易く、それにより、担体上への接着層の残存による読み取りの工程における不都合を回避することができる。このような両面テープとしては、日東電工株式会社製の製品番号Ｎｏ．５３５Ａ、住友スリーエム株式会社製の製品番号９４１５ＰＣ及び４５９１ＨＬ、並びに株式会社寺岡製作所製の製品番号Ｎｏ．７６９１等が挙げられる。
【００５３】
接着層として樹脂組成物を用いる場合、当該樹脂組成物としては、アクリル系ポリマー、シリコーン系ポリマー、及びこれらの混合物からなる群より選択されるポリマーを含む樹脂組成物等を用いることができる。これらの樹脂組成物を利用することにより、両面テープに比べて密閉性を高めることが可能となるとともに、両面テープに比べて、長期間のインキュベーションに対しても安定であるため、そのような長期間のインキュベーションが必要な分析系においては特に好ましい。特に、接着層としてシリコーン系のエラストマーを用いると、密閉性が良好であり、しかも、容易に脱離が可能な状態でカバーを接着することができる。このようなエラストマーとしては、具体的には、シルガード（シルガードはダウコーニング社の登録商標）や、信越化学工業社製の二液型ＲＴＶゴム（型取り用）を挙げることができる。
【００５４】
上記カバーの形状は、前記選択結合性物質固定化担体の表面の少なくとも一面の一部を覆い、担体と、カバーとの間に空隙を有するよう接着されうるものであれば特に限定されないが、その外周部分において、担体に近い部分より担体に遠い部分において突出した部分を有する構造、すなわちオーバーハング構造が設けられたものとすることができる。オーバーハング構造を設けることにより、担体を損傷せずにカバーを脱離することが容易となるので、好ましい。本発明のマイクロアレイにおいては、基板の凸部上面に選択結合性物質が固定化される。
【００５５】
選択結合性物質とは、被検物質と直接的又は間接的に、選択的に結合しうる物質をいう。その例として、核酸、タンパク質、糖類、又は他の抗原性化合物が挙げられる。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡなどを含む。タンパク質は、抗体、その断片、抗原を、酵素基質を含む。糖類は、オリゴ糖、多糖類を含む。他の抗原性化合物は、ペプチド、小分子を含む。好ましい選択性化合物は、核酸及びタンパク質（特に抗体、抗原など）である。この点で、本発明の好ましいマイクロアレイの例は、ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップともいう）又はプロテインマイクロアレイである。また、このような選択結合性物質は、市販のものでもよいし、或いは、合成するか、生体組織又は細胞などの天然源から調製してもよい。
【００５６】
特性及び一次構造（塩基配列）が明らかな遺伝子などのＤＮＡについては、その配列に基づいてプローブ又はプライマーを作製し、例えば生物組織から調製したｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを選抜することができる。或いは、生物組織から全ＲＮＡを抽出し、オリゴｄＴカラムを使用してポリＡ（＋）ＲＮＡ（すなわち、ｍＲＮＡ）を調製し、ｃＤＮＡクローニングによってｃＤＮＡ、さらにｃＲＮＡを作製することができる。得られた核酸の検出は、サザン又はノザンブロット法、サザン又はノザンハイブリダイゼーション法などの公知の方法、制限酵素による切断及びマップ化、配列決定などの方法で行うことができる。また、得られた核酸の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、遺伝子組換え技術（例えばベクターの使用）などによって行うことができる。或いは、１００マー以下のＤＮＡを、ＤＮＡ合成装置を用いて合成することも可能である。上記の一連の技術は、例えばＡｕｓｂｅｌら，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ＵＳ  （１９９３）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ＵＳ  （１９８９）などを参照することができる。
【００５７】
タンパク質は、天然から文献記載の方法に従って精製するか、或いは、遺伝子組換え技術（ベクター/宿主系）によって合成することができる。タンパク質を抗原として、ウサギ、マウス、ヤギなどの非ヒト哺乳動物を免疫することによって、該タンパク質に対する抗体を作製することができる。また、マウスなどのネズミにおいては、目的の抗原による免疫刺激を受けた脾臓細胞と骨髄腫細胞との融合を含む方法によりモノクローナル抗体を作製することができる。抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗ペプチド抗体などが含まれる。これらの抗体の作製は周知の方法を利用して行うことができる。
【００５８】
モノクローナル抗体については、例えばＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：  Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  ＵＳ  （１９８０）；岩崎辰夫ら,単クローン抗体  ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ,講談社サイエンティフィク（１９８７）など、また、ポリクローナル抗体については、例えば松橋直ら,  免疫学実験入門（生物化学実験法１５）,学会出版センター（１９８２）を参照することができる。
【００５９】
抗ペプチド抗体については、例えばタカラバイオ（京都）などが合成委託をしているのでそれを利用して入手することも可能である。簡単に説明すると、タンパク質の一次配列について可動予測、親水・疎水性予測、二次構造予測、極性予測などを行い、タンパク質表面に位置する部位を予測するとともに、免疫動物が本来もたない配列であることをホモロジー検索（ＤＮＡＳＩＳソフト）によって予測し、ペプチド配列を決定する；次いで、その配列に基づいて、ペプチド合成によりペプチドを合成し；ウサギなどの動物に免疫し；血液から抗ペプチド抗体を分離し、親和性カラムなどを用いて精製する。
【００６０】
糖類は、化学的に合成するか、或いは、糖タンパク質からグリコシダーゼにより切り出すことによって得ることができる。
【００６１】
選択結合性物質を基板に固定化するには、例えばキャピラリー状のペンでスポッティングする方式、インクジェット方式などの公知の手法を利用することができる。
【００６２】
スポッティング方式は、スポッターまたはアレイヤーと呼ばれる高密度分注機を用いて選択結合性物質をスポットする方法である。具体的には、例えば多数のウエルをもつプレートの各ウエルに異なる溶液を入れておき、この溶液をピン（針）で取り上げて基板上に順番にスポットする。
【００６３】
インクジェット方式は、ノズルから微少な液滴を圧電素子などにより噴射し、選択結合性物質を基板に吹き付ける方法である。具体的には、ノズルより遺伝子を噴射し、基板上に高速度で選択結合性物質を整列配置する。
【００６４】
或いは、選択結合性物質が核酸の場合、フォトリソグラフ法により基板上で順次ヌクレオチド合成を行うことができる。
【００６５】
本発明はさらに、上で説明した本発明のマイクロアレイの、それに固定化された選択結合性物質と直接的又は間接的に結合しうる被検試料中の物質の存在又は量の測定への使用方法を提供する。
【００６６】
選択結合性物質は、上記の核酸、タンパク質、糖類又は他の抗原性化合物である。
被検試料は生物学的試料である。生物学的試料は、例えば植物や動物由来の生物学的試料、ヒトを含む哺乳動物由来の組織、細胞、体液などの生物学的試料などを含む。具体的には、例えばヒト疾患関連遺伝子、その発現産物（タンパク質）などである。さらに、生物学的試料には、細菌などの原核生物、酵母、担子菌、藻類、昆虫などの上記以外の真核生物由来の生物学的試料、ウイルス由来の試料などが含まれる。
【００６７】
測定は、基板上に固定化された選択結合性物質と、被検試料中の物質との結合を検出することを含む。選択結合性物質が核酸の場合、測定はＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーション又はＲＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーションに基づく。また、選択結合性物質がタンパク質の場合、測定は抗原-抗体反応、すなわち免疫学的反応に基づく。反応温度、時間、バッファなどの条件は、ハイブリダイズさせる核酸の種類や鎖長、免疫反応に関与する抗原及び/又は抗体の種類などに応じて適宜選択される。
【００６８】
ハイブリダイゼーションは、一般にはストリンジェントな条件下で行われる。そのような条件は、限定されないが、例えば３０〜５０℃で、３〜４×ＳＳＣ、０．１〜０．５％ＳＤＳ中で１〜２４時間のハイブリダイゼーション、その後の２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを含む溶液による洗浄を含むことができる。ここで、１×ＳＳＣは、１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び１５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む溶液（ｐＨ７．２）である。
【００６９】
ＤＮＡマイクロアレイでは、生物の細胞又は組織から抽出されたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡをＣｙ染料で標識したのち、これを試料として基板上のＤＮＡとハイブリダイゼーションを行うことができる。
【００７０】
免疫学的反応は、例えば基板上に固定化された抗体と、被検試料中の抗原との反応である。検出は、抗体と抗原との免疫複合体を、例えば分光学的方法を用いて測定することによって行われる。測定としては、例えば酵素免疫測定法（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法、蛍光抗体法などの酵素、放射性同位元素又は発蛍光剤を標識とする方法が望ましいだろう。例えば、基板上の抗体と試料中の抗原とを結合させたのち、形成された免疫複合体の抗原と結合可能な標識抗体（すなわち二次抗体）を作用させることによって、標識の強度に基づいて、目的抗原の量又は存在を測定することができる。基板には、抗体ではなく抗原を予め固定化することも可能である。
【００７１】
上記のハイブリダイゼーションや免疫反応後、マイクロアレイ上をスキャナーを用いてスキャンし、標識が発する蛍光などのシグナルの強度又は存在を測定する。必要に応じて、データをコンピュータで解析する。
【００７２】
本発明のマイクロアレイは、カバー表面又はその近傍での気泡の発生が実質的にないため、凹凸構造をもつ基板を特徴とするマイクロアレイが本来的にもつ良好なＳ／Ｎ比、高検出感度などの特性を維持し、測定値のばらつきを改善し、正確で信頼性の高い測定を可能にする。
【実施例】
【００７３】
本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００７４】
実施例１
（ＤＮＡ固定化担体の作製）
公知の方法であるＬＩＧＡ（Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｅ  Ｇａｌｖａｎｏｆｏｒｍｕｎｇ  Ａｂｆｏｒｍｕｎｇ）プロセスを用いて、射出成形用の型を作製し、射出成型法により後述するような形状を有するＰＭＭＡ製の担体を得た。なお、この実施例で用いたＰＭＭＡの平均分子量は５万であり、ＰＭＭＡ中には１重量％の割合で、カーボンブラック（三菱化学製＃３０５０Ｂ）を含有させており、担体は黒色である。この黒色担体の分光反射率と分光透過率を測定したところ、分光反射率は、可視光領域（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）のいずれの波長でも５％以下であり、また、同範囲の波長で、透過率は０．５％以下であった。分光反射率、分光透過率とも、可視光領域において特定のスペクトルパターン（ピークなど）はなく、スペクトルは一様にフラットであった。なお、分光反射率は、ＪＩＳ  Ｚ  ８７２２の条件Ｃに適合した照明・受光光学系を搭載した装置（ミノルタカメラ製、ＣＭ−２００２）を用いて、担体からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率を測定した。
【００７５】
担体の形状は、大きさが縦７６ｍｍ、横２６ｍｍ、厚み１ｍｍであり、担体の中央部分を除き表面は平坦であった。担体の中央に、縦・横２２ｍｍ、深さ０．１５ｍｍの凹んだ部分が設けてあり、この凹みの中に、直径０．１５ｍｍ、高さ０．１５ｍｍの凸部を１２９６（３６×３６）箇所設けた。凹凸部分の凸部上面の高さ（１２９６箇所の凸部の高さの平均値）と平坦部分との高さの差を測定したところ、３μｍ以下であった。また、１２９６個の凸部上面の高さのばらつき（最も高い凸部上面の高さと最も低い凸部上面との高さの差）、さらには、凸部上面の高さの平均値と平坦部上面の高さの差を測定したところそれぞれ３μｍ以下であった。さらに、凹凸部凸部のピッチ（凸部中央部から隣接した凸部中央部までの距離）は０．５ｍｍであった。
【００７６】
上記のＰＭＭＡ担体を１０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に７０℃で１２時間浸漬した。これを、純水、０．１ＮのＨＣｌ水溶液、純水の順で洗浄し、担体表面にカルボキシル基を生成した。
【００７７】
（プローブＤＮＡの固定化）
配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ（６０塩基、５’末端アミノ化）を合成した。このＤＮＡは５’末端がアミノ化されている。
【００７８】
このＤＮＡを、純水に０．３ｎｍｏｌ／μｌの濃度で溶かして、ストックソリューションとした。担体に点着する際は、ＰＢＳ（ＮａＣｌを８ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏを２．９ｇ、ＫＣｌを０．２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を０．２ｇ純水に溶かし１ｌにメスアップしたものにｐＨ調整用の塩酸を加えたもの、ｐＨ５．５）でプローブＤＮＡの終濃度を０．０３ｎｍｏｌ／μｌとし、かつ、担体表面のカルボン酸とプローブＤＮＡの末端のアミノ基とを縮合させるため、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を加え、この終濃度を５０ｍｇ／ｍｌとした。そして、これらの混合溶液をアレイヤー（日本レーザー電子製；Ｇｅｎｅ  Ｓｔａｍｐ―ＩＩ）で担体凸部上面の全てにスポットした。次いで、担体を密閉したプラスチック容器入れて、３７℃、湿度１００％の条件で２０時間程度インキュベートして、純水で洗浄した。
【００７９】
（検体ＤＮＡの調製）
検体ＤＮＡとして、上記ＤＮＡ固定化担体に固定化されたプローブＤＮＡとハイブリダイズ可能な配列番号４で表される塩基配列を持つＤＮＡ（９６８塩基、以下、配列番号４のＤＮＡともいう）を用いた。調製方法を以下に示す。
【００８０】
配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、配列番号２のＤＮＡともいう）と配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、配列番号３のＤＮＡともいう）を合成した。これを純水に溶かして濃度を１００μＭとした。次いで、ｐＫＦ３  プラスミドＤＮＡ（タカラバイオ（株）製品番号；３１００）（配列番号５で表される塩基配列を有するＤＮＡ：２２６４塩基）を用意して、これをテンプレートとし、配列番号２および配列番号３のＤＮＡをプライマーとして、ＰＣＲ反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により増幅を行った。
【００８１】
ＰＣＲの条件は以下の通りである。すなわち、ＥｘＴａｑ２μｌ、１０×ＥｘＢｕｆｆｅｒ４０μｌ、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ３２μｌ（以上はタカラバイオ（株）製  製品番号ＲＲ００１Ａに付属）、配列番号２のＤＮＡの溶液を２μｌ、配列番号３のＤＮＡの溶液を２μｌ、テンプレート（配列番号５で表される塩基配列を有するＤＮＡ）を０．２μｌ加え、純水によりトータル４００μｌにメスアップした。これらの混合液を、４つのマイクロチューブに分け、サーマルサイクラーを用いてＰＣＲ反応を行った。これを、エタノール沈殿により精製し、４０μｌの純水に溶解した。ＰＣＲ反応後の溶液の一部をとり電気泳動で確認したところ、増幅したＤＮＡの塩基長は、およそ９６０塩基であり配列番号４のＤＮＡ（９６８塩基）が増幅されていることを確認した。
【００８２】
次いで、９塩基のランダムプライマー（タカラバイオ（株）製；製品番号３８０２）を６ｍｇ／ｍｌの濃度に溶かし、上記のＰＣＲ反応後精製したＤＮＡ溶液に２μｌ加えた。この溶液を１００℃に加熱した後、氷上で急冷した。これらにＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ（株）製；製品番号２１４０ＡＫ）付属のバッファーを５μｌ、ｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰの濃度はそれぞれ２．５ｍＭ、ｄＣＴＰの濃度は４００μＭ）を２．５μｌ加えた。さらに、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ（アマシャムファルマシアバイオテク製；製品番号ＰＡ５３０２１）を２μｌ加えた。この溶液に１０ＵのＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔを加え、３７℃で２０時間インキュベートし、Ｃｙ３で標識された検体ＤＮＡを得た。なお、標識の際ランダムプライマーを用いたので検体ＤＮＡの長さには、ばらつきがある。最も長い検体ＤＮＡは配列番号４のＤＮＡ（９６８塩基）となる。なお、検体ＤＮＡの溶液を取り出して、電気泳動で確認したところ、９６０塩基に相当する付近にもっとも強いバンドが現れ、それより短い塩基長に対応する領域に薄くスメアがかかった状態であった。そして、これをエタノール沈殿により精製し、乾燥した。
【００８３】
この標識化された検体ＤＮＡを、１重量％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、５×ＳＳＣ（５×ＳＳＣとは、２０×ＳＳＣ（シグマ製）を純水にて４倍に希釈したもの。また、２０×ＳＳＣを純水で２倍に希釈したものを１０×ＳＳＣと表記し、２０×ＳＳＣの２倍希釈液を１０×ＳＳＣ、１００倍希釈液を０．２×ＳＳＣと表記する。）、０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．０１重量％サケ精子ＤＮＡの溶液（各濃度はいずれも終濃度）、４００μｌに溶解し、ハイブリダイゼーション用のストック溶液とした。
【００８４】
以下の実施例、比較例において、ハイブリダイゼーションの際の検体溶液は、特に断りのない限り、上記で調製したストック溶液を、１重量％ＢＳＡ、５×ＳＳＣ、０．０１重量％サケ精子ＤＮＡ、０．１重量％ＳＤＳの溶液（各濃度はいずれも終濃度）で２００倍に希釈したものを用いた。なお、この溶液の検体ＤＮＡの濃度を測定したところ、１．５ｎｇ／μＬであった
【００８５】
（カバーの作製）
射出成型法により図１に示す貫通孔を４つ有するカバー（外周部にオーバーハング構造有り）を作製した。
これを分子量５００００，１０００ｐｐｍのポリエチレングリコール水溶液に浸漬して密封し、ガンマ線を照射した。ガンマ線を照射したカバーを乾燥し、両面テープ（日東電工（株）製、Ｎｏ．５３５Ａ）を用いてプローブＤＮＡ固定化領域に被さるように担体と接着した。このときのカバーと水との接触角は５０度であった。
【００８６】
（ハイブリダイゼーション）
上記で得られたプローブＤＮＡを固定化した担体に上記検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせた。具体的には、あらかじめカバーの貫通孔から直径１８０μｍのジルコニアビーズ（東ソー（株）製；ＴＺＢ１８０）を５０ｍｇ装填した。次いで、マイクロピペットを用いてハイブリダイゼーション用の溶液１００μｌを貫通孔より注入する。その後、カプトンテープ（アズワン５−５０１８−０１）で貫通孔を塞ぎ、これをマイクロチューブローテーター（アズワン製、商品番号：１−４０９６−０１）の回転面に設けたプラスチック容器内に固定し、４２℃、１６時間インキュベートした。その際、ローテーターの回転数は３ｒｐｍとし、ローテーターの回転面は、水平面と直角となるようにした。さらに担体のプローブＤＮＡ固定化面は、ローテーターの回転面に対し直角となるようにした。以上のようにすることでガラスビーズが重力方向に移動し続けることになり、検体溶液を攪拌しながらハイブリダイゼーションを行うことができる。インキュベート後、担体からカバーと両面テープを脱離後に担体を洗浄、乾燥した。
【００８７】
（測定）
ＤＮＡチップ用のスキャナー（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂ）に上記処理後の担体をセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を５００にした状態で測定を行った。ここで、蛍光強度とはスポット内の蛍光強度の平均値であり、バックグラウンドノイズとは、プローブＤＮＡを固定化していない凸部の蛍光強度である。結果を表１に示す。十分な蛍光シグナルが得られ、バックグラウンドノイズも低く抑えられた。２０枚のＤＮＡチップを使用したが、操作も簡便であって、気泡が残ることは全くなかった。
【００８８】
比較例１
グラフト重合を行っていないカバーを担体に接着した場合の実験を行った。切削加工により作製した図２に示すカバーをなにも処理をせずに単体に接着する以外は全て実施例１と同様に実験を行った。この時のカバーの水との接触角は、６６度であった。結果を表１に示す。
【００８９】
検体溶液を注入する際に、２０枚中１３枚のプローブＤＮＡ固定化領域に気泡が残り、気泡が生じた担体ではハイブリダイゼーション後のシグナルにむらが生じた。
【００９０】
実施例２
酸素プラズマ処理を行ったカバーを用いて実験を行った。カバー表面を、エタノールで洗浄して乾燥した後、リアクティブイオンエッチング装置（サムコ（株）製：ＲＩＥ−１０ＮＲ）の真空チャンバー中にセットした。ついで、高真空（３×１０−３Ｐａ）まで排気した後、酸素ガス流量１００ｓｃｃｍ、投入電力１００Ｗ、チャンバー内圧力１０Ｐａの条件で酸素プラズマ処理を２０秒間施した。実験手順は、カバーの処理方法以外は実施例１と同様に行った。この時のカバーの水との接触角は、５２度であった。結果を表１に示す。十分な蛍光シグナルが得られたが、バックグラウンドノイズが上昇した。バックグラウンドノイズが上昇した理由は、カバー表面の酸素と反応した樹脂が液中に溶出したものと考えられる。実施例１と同様２０枚のＤＮＡチップを使用したが、操作も簡便であって、気泡が残ることは全くなかった。
【００９１】
比較例２
処理を行っていないカバーを担体に接着し、ビーズを充填していないこと以外は、実施例１と同様の実験を行った。結果を表１に示す。検体溶液を注入する際に、２０枚中２枚にプローブＤＮＡ固定化領域に気泡が残った。ただし、気泡を生じていない担体でも、ハイブリダイゼーション後のシグナルにむらが生じた。一方、ハイブリダイゼーション後の蛍光シグナルはビーズを装填した場合に比べて著しく低かった。
【００９２】
【表１】
2007171144.tif 000003
【００９３】
本発明において、ハイブリダイゼーション後のシグナル強度を十分に得るため、またシグナルを均一にするためには、ハイブリダイゼーション反応中のビーズによる攪拌が不可欠であった。
【００９４】
なお、表１中、ＣＶ値は、シグナル強度のばらつきの程度を示す指標であり、下記の式：
ＣＶ値（％）＝（シグナル強度の標準偏差／シグナル強度の平均）×１００
で表される。ＣＶ値が小さいほど高品質なＤＮＡチップであるといえる。比較例では、気泡発生のため、ＣＶ値が大きくなる結果となった。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明により、本発明のマイクロアレイは、カバー表面又はその近傍での気泡の発生が実質的にないため、凹凸構造をもつ基板を特徴とするマイクロアレイが本来的にもつ良好なＳ／Ｎ比、高検出感度などの特性を維持し、測定値のばらつきを改善し、正確で信頼性の高い測定を可能にする。このため、生物学、医学、微生物学などの分野で多用されているマイクロアレイの精度向上が可能となり、産業上、非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】基板とカバーとを含む本発明のマイクロアレイの概略図及び断面図。
【図２】本発明のマイクロアレイを構成する基板の概略図及び断面図。
【図３】本発明のマイクロアレイの一例を概略的に示す縦断面図。
【図４】本発明のマイクロアレイを構成するカバーにおける貫通孔及び液面駐止チャンバーの一例を示す部分断面図。
【符号の説明】
【００９７】
１  基板
２  カバー
３  接着層
４  貫通孔
５  液面駐止チャンバー
６  空隙
７  封止部材
８  基板に固定化された選択結合性物質
９  微粒子（ビーズ）
【配列表フリーテキスト】
【００９８】
配列番号１：プラスミドｐＫＦ３  ＤＮＡ
配列番号２：プラスミドｐＫＦ３  ＤＮＡの増幅用プライマー
配列番号３：プラスミドｐＫＦ３  ＤＮＡの増幅用プライマー
配列番号４：プラスミドｐＫＦ３  ＤＮＡ
配列番号５：プラスミドｐＫＦ３  ＤＮＡ
【図１】
2007171144.tif 000004
【図２】
2007171144.tif 000005
【図３】
2007171144.tif 000006
【図４】
2007171144.tif 000007
【配列表】
2007171144000001.app