(57)【要約】【課題】ドナーから採取した幹細胞を、その多能性と分化能を保持しながら、それを発現させずに長期間維持する方法、さらにはその多能性と分化能を損なわないで増殖させる方法を提供する。【解決手段】幹細胞を、それが沈降せず、培養容器底面に接着せず、かつ浮上しない比重とした液体培地中で培養して、多分化能を保持しながら、未分化を維持する、幹細胞の培養方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を、それが沈降せず、培養容器底面に接着せず、かつ浮上しない比重とした液体培地中で培養し、多分化能を保持しながら、未分化を維持することを特徴とする幹細胞の培養方法。
【請求項２】
前記液体培地の比重が１．０１〜１．０８ｇ／ｍＬである、請求項１に記載の幹細胞の培養方法。
【請求項３】
前記幹細胞が、造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、血管幹細胞又は胚性幹細胞である、請求項１又は２に記載の幹細胞の培養方法。
【請求項４】
前記液体培地の比重を、ポリビニルピロリドンで被覆したコロイドシリカ、又はショ糖とエピクロロヒドリンとの水溶性共重合体を前記液体培地に含有させることにより調整したことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の幹細胞の培養方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の培養方法により得られた、多分化能を維持した幹細胞。
【請求項６】
ポリビニルピロリドンで被覆したコロイドシリカ、又はショ糖とエピクロロヒドリンとの水溶性共重合体を用いて、液体培地の比重を１．０１〜１．０８ｇ／ｍＬとした、幹細胞培養用液体培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞の多能性と分化能を損なわないで所定時間維持しうる幹細胞の培養方法に関し、特に幹細胞を多能性と分化能を損なわないで未分化の状態で長時間維持でき、さらには増殖する培養方法及びこの培養方法により維持もしくは増殖させた幹細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々な細胞に分化できる幹細胞を利用した再生医療が注目されている。例えば、白血病、再生不良性貧血、先天性免疫不全症などの血液疾患の治療においては、骨髄移植は化学療法と並んで重要な位置を占めている。
この骨髄移植に重要な役割を果たす造血幹細胞は、全血球系(白血球、赤血球、血小板)を供給する血球細胞の源である。一個の造血幹細胞が自己複製と分化をしながら全血球系に生育できる。
【０００３】
再生医療は、未分化な幹細胞が持つ分化能力を利用するため、治療に当っては多量の幹細胞を必要とするが、各種組織に含まれる幹細胞は非常に少ない。例えば、白血病などの治療で行われる骨髄移植では、造血幹細胞が重要な役割を果たすが、その数は全骨髄細胞の１／２５０００である。そのため、骨髄移植に当っては、ドナーから大量の骨髄（例えば、患者の体重が６０ｋｇならば６００〜９００ｍＬ）を採取せねばならず、これはドナーに多大な負担をかけ、ドナー登録者が増えない原因の一つとなっている。
また、幹細胞は従来法の培養では長期生存が困難で、分化してしまうので、細胞移植は時間との闘いであり、現代医学のジレンマとなっている。
【０００４】
このような理由から、造血幹細胞の研究発展や臨床応用のため、造血幹細胞の長期間の維持培養もしくは増幅培養の可能性が模索されているが（例えば、非特許文献１または２参照。）、遺伝子導入をおこなうことなく安全に維持・増幅させる技術は開発されていないのが現状である。
【非特許文献１】ウエダ  Ｔ，ツジ  Ｋ，ヨシノ  Ｈ，エビハラ  Ｙ，ヤガサキ  Ｈ，ヒサカワ  Ｈ，ミツイ  Ｔ，マナベ  Ａ，タナカ  Ｒ，コバヤシ  Ｋ，イトウ  Ｍ，ヤスカワ  Ｋ，ナカハタ  Ｔ，“Ueda  T,  Tsuji  K,  Yoshino  H,  Ebihara  Y,  Yagasaki  H,  Hisakawa  H,  Mitsui  T,  Manabe  A,  Tanaka  R,  Kobayashi  K,  Ito  M,  Yasukawa  K,  Nakahata  T.”，エクスパンジョン・オブ・ヒューマン・NOD/SCID-リポピュレーティング・セルズ・バイ・ステム・セル・ファクター，Flk2/Flt3リガンド，トロンボポエチン，IL-6，アンド・ソリューブルIL-6レセプター“Expansion  of  human  NOD/SCID-repopulating  cells  by  stem  cell  factor,  Flk2/Flt3  ligand,  thrombopoietin,  IL-6,  and  soluble  IL-6  receptor.”，ジャーナル・クリニカル・インベスティゲーション“Journal  Clinical  Investigation”，2000年，105号，1013-1021頁
【非特許文献２】パトリック・スティッフ，ボーハオ・チェン，ウィルバー・フランクリン，デビット・オルデンベルグ，エリック・ハシィ，ロバート・バイエル，エリザベス・シャパル，ジュディー・ドービル，ランキューメル・マンダラム，ディーパック・マルホトラ，トーマス・ミューラー，アール・ドウグラス・アームストロング，アンド  アラン・スミス“Patrick  Stiff,  Bohao  Chen,  Wilbur  Franklin,  David  Oldenberg,  Eric  Hsi,  Robert  Bayer,  Elizabeth  Shpall,  Judy  Douville,  Ramkumar  Mandalam,  Deepak  Malhotra,  Thomas  Muller,  R.  Douglas  Armstrong,  and  Alan  Smith”，オートロガス・トランスプランテーション・オブ・エキソ・ビボ・エクスパンデッド・ボーン・マロー・セルズ・グローウン・フローム・スモール・アリクオーツ・アフター・ハイ-ドース・ケモセラピー・フォア・ブレスト・キャンサー“Autologous  transplantation  of  ex  vivo  expanded  bone  marrow  cells  grown  from  small  aliquots  after  high-dose  chemotherapy  for  breast  cancer.”，ブラッド“Blood”，2000年，95号，2169-2174頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、上述のような問題点を解消するため、ドナーから採取した幹細胞を、その多能性と分化能を保持しながら、それを発現させずに長期間維持する幹細胞の培養方法、さらにはその多能性と分化能を損なわないで増殖させる幹細胞の培養方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、生体から取り出した造血幹細胞等の幹細胞を、培養液を特定の比重とすることで完全に沈降せず、かつ浮上しない条件、即ち、生体内環境と同様の培養環境を創り出すことにより、幹細胞を分化させないで長期間維持ないしは増殖できることを見出した。本発明はこの知見に基づきなされるに至ったものである。
すなわち本発明は、
（１）  幹細胞を、それが沈降せず、培養容器底面に接着せず、かつ浮上しない比重とした液体培地中で培養して、多分化能を保持しながら、未分化を維持することを特徴とする幹細胞の培養方法、
（２）  前記液体培地の比重が１．０１〜１．０８ｇ／ｍＬである、（１）に記載の幹細胞の培養方法、
（３）  前記幹細胞が、造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、血管幹細胞又は胚性幹細胞である、前記（１）又は（２）に記載の幹細胞の培養方法、
（４）  前記液体培地の比重を、ポリビニルピロリドンで被覆したコロイドシリカ、又はショ糖とエピクロロヒドリンとの水溶性共重合体を前記液体培地に含有させることにより調整したことを特徴とする、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の幹細胞の培養方法、
（５）  前記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の培養方法により得られた、多分化能を維持した幹細胞、及び
（６）  ポリビニルピロリドンで被覆したコロイドシリカ、又はショ糖とエピクロロヒドリンとの水溶性共重合体を用いて、液体培地の比重を１．０１〜１．０８ｇ／ｍＬとした、幹細胞培養用液体培地
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の幹細胞の培養方法は、特別な培養装置、煩雑な操作等を要することなく、未分化状態で幹細胞を維持、またはそれを増殖できる。
本発明の幹細胞の培養方法によれば、治療等に必要なドナーから採取する幹細胞の量がより少なくて済むため、ドナーにかかる負担を減らすことができるとともに、遠隔地の患者に輸送して移植でき、レシピエントはより安全な細胞移植による再生医療を受けることができるようになる。
本発明の培養方法により得られた幹細胞は、移植ドナー細胞として使用できる。
本発明の幹細胞培養用液体培地は、煩雑な操作等を要することなく、未分化状態で幹細胞を維持、またはそれを増殖できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明の培養方法により培養する幹細胞としては、造血幹細胞をはじめ、間葉系幹細胞、血管幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、胚性幹細胞（Embryonic  stem  cell、いわゆるＥＳ細胞）など他種の細胞に分化する能力を備えた未分化の細胞であれば特に制限なく適用される。
前記造血幹細胞は、白血病などの治療方法として既に確立している骨髄移植に適用可能である。また、前記造血幹細胞及び間葉系幹細胞等の幹細胞は、遺伝子治療の運搬細胞に有用である。
【０００９】
本明細書及び特許請求の範囲において、造血幹細胞とは、あらゆる種類の血球細胞に分化する能力及び造血再構築能とを備えた未分化な細胞をいい、主に骨髄、臍帯血、脾臓及び肝臓に存在し、微量ながら末梢血中にも存在する細胞をいう。より具体的には、マウス由来の細胞であれば、例えば、c-kit、Sca-1などの未分化マーカーをその細胞表面に発現している細胞のことであり、ヒト由来の細胞であれば、例えば、CD34、CD117など未分化マーカーをその細胞表面に発現している細胞のことである。
【００１０】
本発明においては、液体培地の比重を、幹細胞が沈降せず、培養容器底面に接着せず、かつ浮上しない比重とする。
本発明において、「幹細胞が沈降せず、培養容器底面に接着せず、かつ浮上しない比重」とは、幹細胞が沈降して、培養容器底面に細胞接着せず、ないしは前記底面で幹細胞同士が細胞接着せず、かつ前記液体培地の液面に浮上しない比重をいう。
本発明において、比重を調節される液体培地としては、常法の細胞培養に使用されるものであれば特に制限することなく使用することができ、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、最小必須培地（MEM）、RPMI1640などが挙げられる。これらは、通常、比重は１．００ｇ／ｍＬ程度である。
本発明において、上記液体培地の比重を所定の値に調節することが必要である。
本発明において、液体培地の比重は、１．０１ｇ／ｍＬ以上が好ましく、１．０１〜１．０８ｇ／ｍＬがより好ましく、１．０１〜１．０６ｇ／ｍＬがさらに好ましく、１．０４０〜１．０５５ｇ／ｍＬが特に好ましい。
【００１１】
上記液体培地の比重を調節する方法は特に制限はないが、幹細胞に対して不活性で、その浸透圧を変化させることなく、前記のように比重を調節できる物質を上記液体培地に存在させる方法等が挙げられる。
前述の幹細胞の浸透圧を変化させることなく、比重を調節できる物質の具体例としては、パーコール（商品名、ファルマシア社製）等のポリビニルピロリドンで被覆したコロイドシリカ、フィコール（商品名、ファルマシア社製）、フィコール・コンレイ、フィコール・ハイパック（いずれも商品名）等のショ糖とエピクロロヒドリンとの水溶性共重合体等が挙げられる。
本発明の幹細胞培養用液体培地は、前記ポリビニルピロリドンで被覆したコロイドシリカ、又は前記ショ糖とエピクロロヒドリンとの水溶性共重合体を用いて、液体培地の比重を１．０１〜１．０８ｇ／ｍＬとしたことを特徴とし、１．０１〜１．０６ｇ／ｍＬが好ましく、１．０４０〜１．０５５ｇ／ｍＬがより好ましい。
【００１２】
なお、これらの液体培地は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、アミノ酸、ビタミン、ホルモン、抗生物質、脂肪酸、糖などの化学成分に加えて、細胞増殖効果を高めるため、血清や細胞増殖因子（サイトカイン）のような生体成分を含有することもできる。細胞増殖因子としては、具体的にはFlt-3-リガンド、トロンボポイエチン（TPO）、幹細胞因子（SCF）、エリスロポエチン（EPO）、インターロイキン-6（IL-6）などが挙げられ、その濃度は常法の細胞培養で使用される濃度である。ただし、血清や細胞増殖因子などの生体成分を加えることにより、BSE等の感染や細胞が癌化する可能性があるため、できればこれら生体成分は添加しないほうがよい。
本発明において、培養容器は特に制限はないが、培養フラスコ、ディッシュ、プレート等が挙げられ、インキュベーション方法も特に制限はないが、振とう培養、静置培養、攪拌培養等が挙げられる。
インキュベーション温度は、通常の哺乳類細胞のインキュベーション温度と同様でよいが、３５〜３８℃が好ましく、３７℃がより好ましい。
本発明の培養方法により得られた幹細胞は、細胞表面マーカーによる確認試験、移植確認試験による機能評価等により幹細胞であることを確認することができる。
【００１３】
前述のようにして得られた幹細胞は、骨髄移植などの血液疾患や臓器の再生などに、例えば点滴により、患者に移植される。なお、移植に先立って、組織適合性を検査しなければならないのは、従来の幹細胞に対するものと同様である。
【００１４】
次に、本発明の幹細胞の培養方法により、幹細胞が長期間分化することなく維持・増殖する機構については本発明者らの研究により次のように考えている。
液体培地の比重を、幹細胞が沈降せず、かつ浮上しない比重とすることにより細胞接着（アドへレンスジャンクション）が抑制され、接着分子カドヘリンと細胞骨格との相互作用に働くβ‐カテニンが幹細胞内に蓄積することを確認した（実施例１中（１−４）参照。）。これにより蓄積したβ‐カテニンが幹細胞の自己複製に関与すると考えられる。
上記アドへレンスジャンクションは脊椎動物細胞に普遍的に存在し、特に個体発生段階における各種幹細胞（例えば、胚性幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞）の細胞層の分離、区画化、細胞群の結合等、いわゆるソーティング・アウト（sorting  out）に重要な役割を担っている（例えば、Settleman  J.  Tension  precedes  commitment-even  for  a  stem  cell.  Mol  Cell.  2004  Apr  23;14(2):148-50.、矢原一郎編、井出利憲、月田承一郎ら共著「細胞工学」（丸善株式会社、平成３年３月２０日発行）２０５〜２２２頁参照。）。
【実施例】
【００１５】
次に、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
下記のように採取したマウス骨髄細胞を7日間培養した。
マウス（C57BL／6、6週令以上、日本クレア社製）を頚椎脱臼させ70%アルコール液中に全身を浸して消毒したのち、大腿骨と脛骨を無菌的に取り出し、骨周囲の筋組織をできるだけ除去して両側骨端部を切除し、リン酸緩衝液を満たしたシャーレに入れた。リン酸緩衝液を吸引しておいた針付きのシリンジで骨髄組織を押し流して骨髄細胞浮遊液を回収した。回収した骨髄細胞浮遊液を遠心（1,500rpm、5分）して骨髄細胞を採取した。
【００１６】
前記骨髄細胞の培養として、基本培養液には、ダルベッコ改変イーグル・メディウム（DMEM）を用い、20ng／mlヒトflt-3-リガンド、20ng／mlヒトトロンボポイエチンを添加した。培養容器24穴プレート中の培養液１mLに骨髄細胞1x106個を37℃で培養した。高比重培養液として、基本培養液にパーコール（商品名、ファルマシア社製）を含有させ、比重1.004g／mL〜1.065g／mLの範囲の６条件で検討した。
培養３日、7日後に細胞数および造血幹細胞の分画とされる分化マーカー（Lineageマーカー：CD4、CD8、B220、Mac1、Gr1、TER119）陰性、Sca-1抗原陽性かつc-Kit陽性細胞(以下、単にLSK細胞という。)を下記抗体染色法によりフローサイトメーター（商品名FACSCalibur、ベクトン・ディッキンソン社製）で測定し、機能的評価としてコロニー形成能およびマウスへの骨髄移植実験を行った。
【００１７】
＜抗体染色法＞
各培養液を回収して、遠心分離機により細胞を分離し、リン酸緩衝液に再懸濁した後、前記ビオチン化Lineage抗体（CD4、CD8、B220、Mac1、Gr1、TER119）を細胞浮遊液と反応させ、その後にストレプトアビジン−ＰｅｒＣＰ（ペリジニンクロロフィン複合体タンパク質）で染色した。
さらに、リン酸緩衝液にアロフィコシアニン（ＡＰＣ）で標識した抗c-kit抗体（ファーミンゲン社製）及びフィコエリスリン（ＰＥ）で標識した抗Sca-1抗体（ファーミンゲン社製）を添加して抗体染色液を作製した。
このようにして抗体染色した細胞数を前記フローサイトメーターを使用して計測した。なお、前記フローサイトメーターの使用方法は添付のマニュアルに従って行った。
【００１８】
＜結果＞
（１）細胞数の変化
（１−１）総骨髄細胞数の推移
図１のａは、ビルケルチュルク計算盤を用いてカウントした、各比重培養液における総骨髄細胞数の推移を示す図である。
図１のａ中０日の棒グラフが示すように、実験開始時の骨髄細胞1x106個は、すでに分化している細胞がほとんどである。そのため、図１のａ中３及び７日における比重１．００４ｇ／ｍＬの棒グラフが示すように培養すると細胞数は減少する。
しかし、図１のａ中３及び７日における比重１．０５３ｇ／ｍＬの棒グラフが示すように、培養液比重１．０５３g／mLで培養すると、７日後の細胞数減少は比較的少なかった。
（１−２）LSK細胞が有する造血幹細胞表面マーカーの推移
図１のｂは、前記フローサイトメーターを用いてカウントした、各比重培養液における造血幹細胞表面マーカー数の推移を示す図である。
図１のｂから明らかなように、培養細胞中のLSK細胞が有する造血幹細胞表面マーカーを評価すると、培養液比重が１．０５３ｇ／mLの条件では７日後にLSK細胞が増幅していたことが分かる。
【００１９】
（１−３）コロニー形成細胞数の推移
リン酸緩衝液に懸濁した骨髄細胞（培養０日、７日）の細胞数をカウントし、元の細胞当り105〜106cells／ｍＬになるようにいくつか濃度をふって、リン酸緩衝液で希釈した。そして、この細胞懸濁液をコロニーアッセイ用のメチルセルロース培地（商品名METHOCULT  GFM3434、STEMCELL  TECHNOLOGIS社製）に1/10量加え、よく振って混和したのち(104〜105cells／ｍＬ)、96穴培養皿に100μＬずつ分注した(103〜104cells／ウェル)。分注した骨髄細胞を1週間培養し、各ウェルにできたコロニーの数を数え、骨髄細胞１０００個当りのコロニー形成細胞数を算出した。
図１のｃは、各比重培養液における、１０００個骨髄細胞当りのコロニー形成細胞数を示す図である。
図１のｃから明らかなように、機能的評価としてのコロニー形成能も培養液比重が１．０５３ｇ／mLの条件では３日後にLSK細胞に基づくコロニー形成細胞数が増幅していた。
【００２０】
（１−４）β‐カテニンの細胞内増加
図２は、培養７日後の各比重培養液における、幹細胞内β‐カテニンのバンドを示す電気泳動図である。
図２から明らかなように、培養液比重１．０５３ｇ／mLのレーンでは、９０ｋＤａ付近のβ‐カテニンのバンドが最も濃く現れ、幹細胞内にβ‐カテニンが最も蓄積していたことが分かる。
このことは前記蓄積したβ‐カテニンが幹細胞を分化することなく維持・増幅するように作用していることを示している。
【００２１】
（２）純化造血幹細胞での検討
図３のａ−１、ｂ−１、ｃ−１は、それぞれ、純化直後、培養７日後（比重１．００４）、培養７日後（比重１．０５３）における、分化（Lineage）マーカー陰性強度に対するカウント数のヒストグラムである。
図３のａ−２、ｂ−２、ｃ−２は、それぞれ、ａ−３、ｂ−３、ｃ−３を展開した、純化直後、培養７日後（比重１．００４）、培養７日後（比重１．０５３）における、前記フローサイトメーターを用いて計測したc-kitとSca-1との発現パターンを示す２次元プロットである。
認識ゲートａ−３かつａ−４、ｂ−３かつｂ−４、ｃ−３かつｃ−４が、それぞれLSK細胞に対応する。
【００２２】
前記フローサイトメーターを用いて、造血幹細胞表面マーカーを有するLSK細胞を純化した。純度は９５％以上のものを用いた。具体的には、認識ゲートａ−３に示したLineageマーカー陰性細胞を分取し、純化造血幹細胞１００個を得た。
図３のｂ−１及びｂ−２から明らかなように、培養液比重１．００４ｇ／ｍＬで培養すると、７日後には細胞がほとんど残っていなかった。
一方、図３のｃ−１及びｃ−２から明らかなように、培養液比重を１．０５３ｇ／ｍＬにすると、７日後に細胞数は６００〜１２５０個、すなわち約10倍となり、そのほとんどがLSK細胞であった。
【００２３】
（３）造血幹細胞移植試験
本移植試験において、ドナー細胞としては、ＧＦＰ（グリーン蛍光タンパク質）トランスジェニックマウスの造血幹細胞を用いた。
培養7日後の増殖した造血幹細胞の分化能が損なわれていないことを確認するため、放射線照射（3Gy）により造血機能を低下させたマウスに、培養７日後の細胞をドナー細胞として移植した。
移植１２週後のマウス末梢血を採取し、前記フローサイトメーターで生着細胞の有無を確認した。
【００２４】
図４のａは、培養前の骨髄細胞を移植した結果を示す図であり、図４のｂは、培養液比重１．００４ｇ／ｍＬで培養７日後の細胞を移植した結果を示す図であり、図４のｃは、培養液比重１．０５３ｇ／ｍＬで培養７日後の細胞を移植した結果を示す図である。図４のｃ中、横軸の103以上のカウントは生着細胞由来のＧＦＰのカウントを示す。
図４のａ及びｂから明らかなように、培養前の細胞や培養液比重が１．００４ｇ／ｍＬで培養した細胞は、ほとんど生着しなかった。
一方、図４のｃのＧＦＰ陽性細胞の検出結果から明らかなように、培養液比重が１．０５３ｇ／ｍＬで培養した細胞は生着したことから、この条件において、造血幹細胞が増幅していたことが確認できた。
実施例１の結果から、培養液の比重を特定の範囲とし、造血幹細胞が完全に、沈降ないしは浮上のいずれもしない条件、即ち、生体環境と同様の培養環境を創り出すことにより、骨髄細胞中に少なく存在する、造血幹細胞を長期間その分化能を保持して培養でき、かつ目的の幹細胞を選択的に増幅することができることが分かる。
【００２５】
（実施例２）
ヒト間葉系幹細胞（human  Mesenchymal  Stem  Cells：以下単にhMSCsという。）（商品名PT-2501，Cambrex  Bio  Sciences  Walkersville,Inc.社製）を７日間培養した。基本培養液には、最小必須培地（MEM）を用い、10％ウシ胎児血清（FBS）を添加した。培養液１mL中に細胞数1 x105個を培養した。高比重培養液として、基本培養液にパーコールを含有させ、比重１．００４ｇ／ｍＬ〜１．０５３ｇ／ｍＬの範囲の５条件で検討した。
培養７日後に細胞数およびhMSCsの分画とされるCD14、CD34、CD45陰性、CD29陽性かつCD44陽性細胞（すなわち、hMSCs表面マーカーを有する細胞）を前記フローサイトメーターで測定した。
図５のａは、培養７日後、各比重培養液における総細胞数を示すグラフである。図５のｂは、前記フローサイトメーターを用いて、前記hMSCs表面マーカーを有する細胞数を示すグラフである。
実験開始時の細胞1 x105個は、培養すると細胞数は減少する。
しかし、図５のａから明らかなように、培養液比重１．０１７ｇ／ｍＬで培養すると、7日後の細胞数減少は抑えられた。
図５のｂから明らかなように、前記フローサイトメーターを用いて、培養細胞中のhMSCs表面マーカーを評価すると、培養液比重が１．０１７ｇ／ｍＬの条件では7日後のhMSCs数が他に比べて多かった。
使用した市販のhMSCsは、通常の増殖培地を使用して培養しても、７日後には細胞が減少してしまう。
しかし、実施例２で示したように培養液の比重を特定の範囲とするとその減少が抑えられ、hMSCs数も多かった。哺乳類間葉系幹細胞も、培養液の比重を特定の範囲とすることにより実施例１で示した哺乳類造血幹細胞と同様に長期間分化させずに維持・増幅できることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１のａは、各比重培養液における総骨髄細胞数の推移を示す図である。  図１のｂは、各比重培養液における造血幹細胞表面マーカー数の推移を示す図である。  図１のｃは、各比重培養液における、１０００個骨髄細胞当りのコロニー形成細胞数を示す図である。
【図２】図２は、各比重培養液における幹細胞内β‐カテニンのバンド（９０ＫＤａ）を示す電気泳動図である。
【図３】図３のａ−１、ｂ−１、ｃ−１は、それぞれ、純化直後、培養７日後（比重１．００４）、培養７日後（比重１．０５３）における、分化（Lineage）マーカー陰性強度に対するカウント数のヒストグラムである。  図３のａ−２、ｂ−２、ｃ−２は、それぞれ、ａ−３、ｂ−３、ｃ−３で展開した、純化直後、培養７日後（比重１．００４）、培養７日後（比重１．０５３）における、前記フローサイトメーターを用いて計測したc-kitとSca-1との発現パターンを示す２次元プロットである。
【図４】図４のａは、培養前の骨髄細胞を移植した結果を示す図であり、図４のｂは、培養液比重１．００４ｇ／ｍＬで培養７日後の細胞を移植した結果を示す図であり、図４のｃは、培養液比重１．０５３ｇ／ｍＬで培養７日後の細胞を移植した結果を示す図である。
【図５】図５のａは、培養７日後、各比重培養液における総細胞数を示すグラフである。  図５のｂは、前記フローサイトメーターを用いて、前記hMSCs表面マーカーを有する細胞数を示すグラフである。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図２】
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