(57)【要約】【課題】水分散性を有する粒子において、非特異的な相互作用を排除し、かつ末端官能基を介して生体物質の固定化できる水分散性粒子を提供すること。【解決手段】オリゴエチレングリコール骨格を含み、片方の末端にカルボン酸基を有し、他方の末端に生体物質を固定化できる官能基を有する化合物からなる分散剤で粒子を被覆することにより得られ、ゼータ電位が−１５〜１５ｍＶである水分散性粒子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴエチレングリコール骨格を含み、片方の末端にカルボン酸基を有し、他方の末端に生体物質を固定化できる官能基を有する化合物からなる分散剤で粒子を被覆することにより得られ、ゼータ電位が−１５〜１５ｍＶである水分散性粒子。
【請求項２】
平均粒径１〜５００ｎｍのナノ粒子である、請求項１に記載の粒子。
【請求項３】
無機酸化物粒子である、請求項１又は２に記載の粒子。
【請求項４】
磁性粒子である、請求項１から３の何れかに記載の粒子。
【請求項５】
生体物質を固定化できる官能基が、チオール基、マレイミド基、ビオチン基、活性エステル基、カルボキシヒドラジン基、ヒドラジン基、アミノオキシ基、アミノ基、イソシアネート基、又はイソチオシアナート基、あるいは保護基で保護されている上記の何れかの基である、請求項１から４の何れかに記載の粒子。
【請求項６】
オリゴエチレングリコール骨格におけるエチレングリコール繰り返し単位の数が２〜２０である、請求項１から５の何れかに記載の粒子。
【請求項７】
オリゴエチレングリコール骨格におけるエチレングリコール繰り返し単位の数が２〜１１である、請求項１から６の何れかに記載の粒子。
【請求項８】
分散剤が、下記式（１）で表される分子からなる分散剤である、請求項１から８の何れかに記載の粒子。
Ｘ−Ｌ−（−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−）n−Ｙ        （１）
（式中、Ｘは生体物質を固定化できる官能基を示し、Ｌは連結基又は単結合を示し、Ｙはカルボン酸基を示し、ｎは２から２０の整数を示す）
【請求項９】
オリゴエチレングリコール骨格を含み、片方の末端にカルボン酸基を有し、他方の末端に生体物質を固定化できる官能基を有する化合物からなる分散剤で粒子を被覆することを含む、請求項１から８の何れかに記載の水分散性粒子の製造方法。
【請求項１０】
請求項１から８の何れかに記載の粒子を含む、温熱療法剤。
【請求項１１】
請求項１から８の何れかに記載の粒子を含む、ＭＲＩ造影剤。
【請求項１２】
請求項１から８の何れかに記載の粒子を含む、薬物送達剤。
【請求項１３】
請求項１から８の何れかに記載の粒子を含む、分析診断用プローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水分散性の粒子、特には水分散性の磁性ナノ粒子、及びその製造方法に関する。本発明の粒子は、ライフサイエンス、バイオセンサー、又は無機材料の機能化などの分野において使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
無機微粒子に水分散性を付与するには、電荷反発を利用する場合と、粒子表面における相間立体障害を利用する場合の２つが考えられる。例えば、非特許文献１には、電荷反発を利用してナノ粒子を単分散させることが記載されている。しかし、このような電荷反発を利用した系では、その表面に生体物質を固定化すると、凝集しやすくなるという問題や、静電的相互作用により非特異的な相互作用が働くため、様々な物質が混在する血液サンプルや体内診断には利用することが困難であるという問題があった。
【０００３】
一方、非特許文献２及び３には、相間の立体障害を利用した系が記載されており、高分子量のＰＥＧを使用したＭＲＩプローブが記載されている。しかしながら、使用するＰＥＧの分子量が大きいため有機合成が煩雑になるという問題があった。
【０００４】
【非特許文献１】J. Am. Chem. Soc., 127, 9992, (2005)
【非特許文献２】J. Am. Chem. Soc., 126, 7206, (2004)
【非特許文献３】Nano Letters., 5, 1003, (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、水分散性を有する粒子において、非特異的な相互作用を排除し、かつ末端官能基を介して生体物質の固定化できる水分散性粒子を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のカルボン酸誘導体の末端に生体物質固定化可能な官能基を導入した化合物を分散剤として用いて粒子を被覆することによって、簡便に水分散性粒子を製造できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【０００７】
即ち、本発明によれば、オリゴエチレングリコール骨格を含み、片方の末端にカルボン酸基を有し、他方の末端に生体物質を固定化できる官能基を有する化合物からなる分散剤で粒子を被覆することにより得られ、ゼータ電位が−１５〜１５ｍＶである水分散性粒子が提供される。
【０００８】
好ましくは、本発明の粒子は、平均粒径１〜５００ｎｍのナノ粒子である。
好ましくは、本発明の粒子は、無機酸化物粒子である。
好ましくは、本発明の粒子は、磁性粒子である。
【０００９】
好ましくは、生体物質を固定化できる官能基は、チオール基、マレイミド基、ビオチン基、活性エステル基、カルボキシヒドラジン基、ヒドラジン基、アミノオキシ基、アミノ基、イソシアネート基、又はイソチオシアナート基、あるいは保護基で保護されている上記の何れかの基である。
【００１０】
好ましくは、オリゴエチレングリコール骨格におけるエチレングリコール繰り返し単位の数は２〜２０である。
さらに好ましくは、オリゴエチレングリコール骨格におけるエチレングリコール繰り返し単位の数は２〜１１である。
【００１１】
好ましくは、分散剤が、下記式（１）で表される分子からなる分散剤である。
Ｘ−Ｌ−（−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−）n−Ｙ        （１）
（式中、Ｘは生体物質を固定化できる官能基を示し、Ｌは連結基又は単結合を示し、Ｙはカルボン酸基を示し、ｎは２から２０の整数を示す）
【００１２】
本発明の別の側面によれば、オリゴエチレングリコール骨格を含み、片方の末端にカルボン酸基を有し、他方の末端に生体物質を固定化できる官能基を有する化合物からなる分散剤で粒子を被覆することを含む、上記した本発明の水分散性粒子の製造方法が提供される。
【００１３】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の粒子を含む、温熱療法剤が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の粒子を含む、ＭＲＩ造影剤が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の粒子を含む、薬物送達剤が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の粒子を含む、分析診断用プローブが提供される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の水分散性粒子においては、エチレングリコールへの水和を利用して水分散性が獲得され、またエチレングルコール相が立体障害となり粒子同士が安定に分散可能となる。また、本発明の水分散性粒子においては、電荷反発とは異なり非特異的な相互作用を低減できる。また、低分子量のＰＥＧでも磁性ナノ粒子表面を密に被覆することにより高分子量PEGと同等の水分散性を付与することが可能である。即ち、本発明の水分散性粒子は、生体物質を固定化しても安定に水分散性を有し、また検体中の物質と非特異的な相互作用を示さない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の水分散性粒子は、オリゴエチレングリコール骨格を含み、片方の末端にカルボン酸基を有し、他方の末端に生体物質を固定化できる官能基を有する化合物からなる分散剤で粒子を被覆することにより得られる粒子であり、ゼータ電位が−１５〜１５ｍＶであることを特徴とする粒子である。
【００１６】
ゼータ電位は、粒子表面の電位を測定することにより得られる電位で、表面電荷状態を示すものである。本発明の水分散性粒子のゼータ電位は、−１５〜１５ｍＶであり、好ましくは−１０〜１０ｍＶであり、より好ましくは０〜１０ｍＶである。
【００１７】
本発明で言うオリゴエチレングリコール骨格とは、−（−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−）n−で示される骨格を意味する。オリゴエチレングリコール骨格におけるエチレングリコール繰り返し単位の数（上記式中のｎ）は２〜２０であることが好ましく、２〜１１であることが特に好ましい。
【００１８】
本発明で言う生体物質を固定化できる官能基は、タンパク質、アミノ酸、糖、核酸、脂質などの生体物質を固定化できる官能基であれば特に限定されないが、例えば、チオール基、マレイミド基、ビオチン基、活性エステル基、カルボキシヒドラジン基、ヒドラジン基、アミノオキシ基、アミノ基、イソシアネート基、又はイソチオシアナート基などを挙げることができ、これらの基は保護基で保護されていてもよい。
【００１９】
本発明で用いる分散剤は、好ましくは、下記式（１）で表される分子からなる分散剤である。
Ｘ−Ｌ−（−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−）n−Ｙ        （１）
（式中、Ｘは生体物質を固定化できる官能基を示し、Ｌは連結基又は単結合を示し、Ｙはカルボン酸基を示し、ｎは２から２０の整数を示す）
【００２０】
式（１）において、Ｌが示す連結基としては、炭素数１〜１０のアルキレン基、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、又はこれらの組み合わせを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
本発明で用いることができる分散剤の好ましい例を以下に示す。
【化１】
2007277130.tif 000002
【００２２】
本発明では、上記したようなオリゴエチレングリコール骨格を含み、片方の末端にカルボン酸基を有し、他方の末端に生体物質を固定化できる官能基を有する化合物からなる分散剤で粒子を被覆することによって、水分散性粒子を製造することができる。
【００２３】
本発明において分散剤の被覆の対象となる粒子の種類は特に限定されず、有機粒子又は無機粒子の何れでもよいが、好ましくは無機粒子であり、さらに好ましくは金属粒子である。また粒子サイズも特には限定されず、ナノ粒子、マイクロ粒子、又はミリ粒子の何れでもよいが、好ましくはナノ粒子である。特に好ましくは、本発明の粒子は、平均粒径１〜５００ｎｍのナノ粒子であり、好ましくは平均粒径１〜１００ｎｍのナノ粒子であり、特に好ましくは平均粒径１〜７０ｎｍのナノ粒子である。
【００２４】
金属粒子の一例としては、磁性粒子、特に好ましくは磁性ナノ粒子を用いることができる。磁性ナノ粒子としては、分散剤で被覆することにより、水性媒体に分散又は懸濁することができ、分散液又は懸濁液から磁場の適用により分離することができる粒子であれば任意の粒子を使用することができる。本発明で用いる磁性ナノ粒子としては、例えば、鉄、コバルト又はニッケルの塩、酸化物、ホウ化物又は硫化物；高い磁化率を有する稀土類元素（例えば、ヘマタイト又はフェライト）などが挙げられる。磁性ナノ粒子の具体例としては、例えば、マグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）、ＦｅＰｄ、ＦｅＰｔ、ＣｏＰｔなどの強磁性規則合金を使用することもできる。本発明では好ましい磁性ナノ粒子は、金属酸化物、特に、酸化鉄およびフェライト（Ｆｅ，Ｍ）3Ｏ4からなる群から選択されるものである。ここで酸化鉄には、とりわけマグネタイト、マグヘマイト、またはそれらの混合物が含まれる。前記式中、Ｍは、該鉄イオンと共に用いて磁性金属酸化物を形成することのできる金属イオンであり、典型的には遷移金属の中から選択され、最も好ましくはＺｎ2+、Ｃｏ2+、Ｍｎ2+、Ｃｕ2+、Ｎｉ2+、Ｍｇ2+などであり、Ｍ／Ｆｅのモル比は選択されるフェライトの化学量論的な組成に従って決定される。金属塩は固形でまたは溶液状で供給されるが、塩化物塩、臭化物塩、または硫酸塩であることが好ましい。このうち、安全性の観点から酸化鉄、フェライトが好ましい。特に好ましくは、マグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）である。
【００２５】
分散剤で粒子を被覆する方法は特に限定されず、当業者に公知の方法で行うことができる。例えば、粒子の形成中または形成後に、分散剤を、当該粒子を含む液体に添加して混合することにより、当該粒子を分散剤で被覆することができる。また、粒子は遠心分離やろ過などの常法により洗浄、精製後、分散剤を含有する溶媒に分散させて、粒子を分散剤で被覆してもよい。
【００２６】
例えば、粒子が酸化鉄の場合にが、適量の蒸留水に懸濁させた酸化鉄（例えば、10 mg / mL程度）に、分散剤水溶液（濃度１M程度）を添加して、室温で１〜１０時間程度攪拌することによって、水分散性磁性ナノ粒子を得ることができる。
【００２７】
本発明の方法を用いて、粒子を分散剤で被覆した後に、過剰の分散剤は、透析、ゲルろ過精製で除くことができる。本発明は、基本的に、水を代表とする液相を反応場とするので、任意の溶液中に可溶なもの、もしくは、コロイドとして安定に分散しているものが好ましい。反応溶媒が水であり結合させる物質が、疎水性である場合にも、液相―液相における反応であれば結合体を得ることができる。
【００２８】
上記のようにして得られる分散剤で被覆された水分散性粒子が、磁性ナノ粒子である場合には、当該磁性ナノ粒子は、例えば、腫瘍などの温熱療法剤として使用することができる。磁性ナノ粒子を用いて腫瘍の温熱療法を行う場合、磁性ナノ粒子を患者に投与し、電磁波を照射することによって温熱療法を行うことができる。磁性ナノ粒子の投与方法は、特に限定されず、経口投与でも非経口投与でもよいが、好ましくは非経口投与であり、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉投与、皮下投与など任意の投与経路を選択することができる。磁性ナノ粒子の投与量は、患者の体重、疾患の状態などに応じて適宜設定することができるが、一般的には、１回の投与につき、１０μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ程度を投与することができ、好ましくは、２０μｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ程度を投与することができる。磁性ナノ粒子を投与してから一定時間後に、電磁波を照射することにより温熱療法を行うことができる。即ち、本発明の磁性体ナノ粒子を体内に注入し、腫瘍箇所に凝集させた後、電磁波をかけることにより局所的に加熱することが可能である。電磁波としては、高周波磁場を用いることが特に好ましく、特に電磁波としては、周波数が、1KHz〜1MHzの高周波磁場であることが好ましい。1KHzより高い周波数の高周波磁場が好ましい理由は、磁気ヒステリシス加熱の効率が高いからであり、1MHzより低い周波数の高周波磁場が好ましい理由は、誘導電流による生体の発熱を生起させることなく磁性微粒子を加熱することができるからである。前記高周波磁場の周波数は、なかでも5KHz〜200KHzの範囲が好適である。
【００２９】
磁性ナノ粒子は、磁性を有するため、磁力により所定の部位に誘導することができる。即ち、分散剤で被覆された磁性ナノ粒子は体内に投与し、磁力により疾患部位に誘導することができる、また上記のようにして疾患部位に誘導された磁性ナノ粒子は、ＭＲＩ造影により確認することができる。即ち、分散剤で被覆された磁性ナノ粒子は、ＭＲＩ用造影剤として有用である。
【００３０】
本発明の分散剤で被覆された磁性ナノ粒子には、所望により薬物（薬学的活性成分）をさらに含ませてもよい。このような磁性ナノ粒子は、上記の方法に従って疾患部位に誘導した後、高周波をあてて加熱し、ナノ粒子に内包した薬学的活性成分を放出させることができる。即ち、本発明の磁性ナノ粒子は、薬物送達剤として有用である。
【００３１】
さらに本発明の分散剤で被覆された磁性ナノ粒子は、分析診断用プローブとして使用することもできる。具体的には、具体的には、粒子表面に様々な生体物質（DNA, タンパク質、抗体など）を固定化可能なので、以下のような解析においてハイスループットなスクリーニングが可能になると期待される。１）薬剤レセプターの単離・同定、２）レセプターの機能解析、３）生体反応制御ネットワークの解析などである。
【００３２】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００３３】
実施例１：
10 mLの蒸留水に懸濁させた酸化鉄（10 mg / mL程度）に、MAL-dPEG2 acid（Quanta Biodesign社：構造を以下に示す）水溶液（濃度1M程度、体積1 mL）を添加して、室温で３〜５時間激しく攪拌することで水分散性の磁性ナノ粒子を得た。
【００３４】
【化２】
2007277130.tif 000003
【００３５】
実施例２：
10 mLの蒸留水に懸濁させた酸化鉄（10 mg / mL程度）に、dPEG4-biotin acid（Quanta Biodesign社：構造を以下に示す）水溶液（濃度1M程度、体積1 mL）を添加して、室温で３〜５時間激しく攪拌することで水分散性の磁性ナノ粒子を得た。
【００３６】
【化３】
2007277130.tif 000004
【００３７】
試験例１：
実施例１（マレイミドタイプ）と実施例２（ビオチンタイプ）で調製した粒子のゼータ電位測定を行った結果を図１に示す。粒子表面の電位を測定することで、表面電荷状態の情報を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、実施例１及び実施例２で調製した粒子のゼータ電位測定を行った結果を示す。
【図１】
2007277130.tif 000005