(57)【要約】【課題】本発明は、二本鎖核酸におけるミスマッチを正確に効率よく検出する方法を提供することを課題とする。【解決手段】以下の工程を含む、核酸におけるミスマッチを検出する方法。（ａ）任意の核酸、該核酸を増幅しうるプライマーおよび試薬類、ならびに、ミスマッチ結合タンパク質を接触させて増幅反応溶液を得る工程（ｂ）該プライマーを延伸することにより核酸を増幅する工程（ｃ）核酸が増幅したか否かを検出し核酸の間のミスマッチの有無を判定する工程【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、核酸におけるミスマッチを検出する方法。
（ａ）任意の核酸、該核酸を増幅しうるプライマーおよび試薬類、ならびに、ミスマッチ結合タンパク質を接触させて増幅反応溶液を得る工程
（ｂ）該プライマーを延伸することにより核酸を増幅する工程
（ｃ）核酸が増幅したか否かを検出し核酸の間のミスマッチの有無を判定する工程
【請求項２】
増幅する工程（ｂ）がポリメラーゼ増幅反応による工程である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
増幅する工程（ｂ）がリガーゼ増幅反応による工程である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
増幅する工程（ｂ）がＰＣＲ増幅反応による工程である請求項２に記載の方法。
【請求項５】
増幅する工程（ｂ）が等温増幅反応による工程である請求項２に記載の方法
【請求項６】
増幅する工程（ｂ）がＬＡＭＰ増幅反応による工程である請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミスマッチ結合タンパク質を用いることを特徴とする、二本鎖核酸のミスマッチを検出する方法に関する。本発明の方法によれば、ＤＮＡ塩基配列における一塩基遺伝子多型（ＳＮＰｓ：Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一塩基置換あるいはＳＮＰともいう）を検出することができる。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム配列解析に続いて注目されているのは、遺伝子発現プロフィール分析や遺伝子中のＳＮＰｓの分析である。種々条件下で発現している遺伝子、種々個体の遺伝子変異等の解析により遺伝子機能、遺伝子と疾患あるいは医薬品感受性との関連が調べられている。また、これらの遺伝子に関する知識を用いて疾患の診断などが行われつつある。
核酸配列における変異の検出は、医学遺伝学の分野において非常に重要である。遺伝的変異の検出は、遺伝病における分子生物学的根拠の決定、遺伝的なカウンセリングのためのキャリアー及び出生前診断の提供、医薬における個人別化の促進、並びに遺伝学的研究における多型の同定等において重要である。
【０００３】
ＤＮＡレベルでの遺伝的変異の検出と分析は、核型分類、制限断片長多型（ＲＦＬＰｓ：Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）もしくは可変核酸型多型（ＶＮＴＲｓ：Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ Ｔａｎｄｅｍ Ｒｅｐｅａｔｓ）、さらに近年ではＳＮＰｓ分析により行われてきた（非特許文献１〜５）。これまでに、非常に広範な技術がＳＮＰの検出及び解析のために開発されている（特許文献１〜９）が、より簡便で効率の良い方法の開発が求められている。
一方、特許文献１０には、ヘテロ二本鎖核酸内の隆起ループに特異的に結合する熱安定性蛋白質が開示されている。
【０００４】
【特許文献１】米国特許第5,858,659号
【特許文献２】米国特許第5,633,134号
【特許文献３】米国特許第5,719,028号
【特許文献４】国際公開98/30717号パンフレット
【特許文献５】国際公開97/10366号パンフレット
【特許文献６】国際公開98/44157号パンフレット
【特許文献７】国際公開98/20165号パンフレット
【特許文献８】国際公開95/12607号パンフレット
【特許文献９】国際公開98/30883号パンフレット
【特許文献１０】公表特許公報平11-511010号広報
【非特許文献１】Lai E., et al., Genomics 1998; 15; 54 (1): p. 31-8
【非特許文献２】Gu Z., et al., Hum Mutat. 1998; 12 (4): p. 221-5
【非特許文献３】Taillon-Miller P., et al., Genome Res. 1998; 8 (7): p.748-54
【非特許文献４】Weiss KM., Genome Res. 1998; 8 (7): p. 691-7
【非特許文献５】Zhao LP., et al., Am J Hum Genet. 1998; 63 (1): p. 225-40.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、二本鎖核酸のミスマッチをより効率よく正確に検出する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、核酸増幅時にミスマッチ結合タンパク質を接触させてることで、ミスマッチが存在する核酸の増幅を選択的に抑制しうることを見出した。本発明はこのような知見に基づいて完成したものである。
【０００７】
すなわち、本発明は下記構成よりなる。
＜１＞
以下の工程を含む、二本鎖核酸におけるミスマッチを検出する方法。
（ａ）任意の二本鎖核酸、該二本鎖核酸を増幅しうるプライマーおよび試薬類、ならびに、ミスマッチ結合タンパク質を接触させて増幅反応溶液を得る工程
（ｂ）該プライマーを延伸することにより核酸を増幅する工程
（ｃ）核酸が増幅したか否かを検出し二本鎖核酸のミスマッチの有無を判定する工程
＜２＞
増幅する工程（ｂ）がポリメラーゼ増幅反応による工程である上記＜１＞に記載の方法。
＜３＞
増幅する工程（ｂ）がリガーゼ増幅反応による工程である上記＜１＞または＜２＞のいずれかに記載の方法。
＜４＞
増幅する工程（ｂ）がＰＣＲ増幅反応による工程である上記＜２＞に記載の方法。
＜５＞
増幅する工程（ｂ）が等温増幅反応による工程である上記＜２＞に記載の方法
＜６＞
増幅する工程（ｂ）がＬＡＭＰ増幅反応による工程である上記＜５＞に記載の方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の方法によれば、ＳＮＰｓ等の二本鎖の核酸が有するミスマッチの有無をより効率よく正確に検出することができる。本発明の方法は、遺伝子診断、感染症診断、ゲノム創薬等の用途に適用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、ミスマッチ結合タンパク質を利用して、二本鎖核酸が有するミスマッチを検出する方法に関する。本発明の方法は、二本鎖核酸におけるミスマッチに対するミスマッチ結合タンパク質の認識能力、および、ミスマッチ結合タンパク質が二本鎖核酸に結合していると核酸複製反応が阻害される現象を利用する方法であり、核酸増幅反応の成否（増幅量）を指標とする。
【００１０】
本発明の方法は、
（ａ）任意の核酸、該標的核酸を増幅しうるプライマーおよび試薬類、ならびに、ミスマッチ結合タンパク質を接触させて増幅反応溶液を得る工程、
（ｂ）該プライマーを延伸することにより核酸を増幅する工程、
（ｃ）核酸が増幅したか否かを検出し対照核酸と標的核酸との間のミスマッチの有無を判定する工程、を含む。
【００１１】
本発明の方法の原理を、以下に説明する。
まず、ミスマッチを有するかどうか判定する対象である核酸を調製する。核酸は、プライマーなどとして人工合成した配列であっても、天然物由来の配列であってもよい。
たとえばＳＮＰｓを検出する場合は、あらかじめ、変異を有することが疑われる標的核酸と対照核酸（変異を有しない核酸）とを調製し、これらを互いにハイブリダイズさせたものを用いる。ハイブリダイズの結果、標的核酸が変異を有すれば、対照核酸とのハイブリダイズによりヘテロ二本鎖核酸（ミスマッチを有する二本鎖核酸）が生じる。一方、標的核酸に変異がなければ、ホモ二本鎖核酸（ミスマッチを有しない二本鎖核酸）のみが生じ、ヘテロ二本鎖核酸は生じない。
二本鎖核酸に対し、ミスマッチ結合タンパク質を接触させた場合、ミスマッチ結合タンパク質はミスマッチを有するヘテロ二本鎖核酸には結合するが、ホモ二本鎖核酸には結合しない。
【００１２】
次に、二本鎖核酸の増幅を行う。ミスマッチ結合タンパク質がヘテロ二本鎖核酸に結合した状態で核酸増幅方法を適用すると、増幅反応は抑制される。一方、ミスマッチ結合タンパク質が結合していないホモ二本鎖においては、増幅がおきる。
【００１３】
したがって、二本鎖核酸の増幅の有無を調べることにより、試料の二本鎖核酸がミスマッチを有するか否か判定することができる。ＳＮＰｓの検出においては、標的核酸が変異を有するか否かを判定できる。
また、ミスマッチ結合タンパク質の非存在下および存在下における二本鎖核酸の増幅量を検証することでもミスマッチの有無を判別することができる。
【００１４】
本発明において「ミスマッチ」とは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）（ＲＮＡの場合はウラシル（Ｕ））から選択される一組の塩基対が正常な塩基対（Ａ／ＴまたはＧ／Ｃ）ではないことを指す。本発明において「ミスマッチ」には、1つのミスマッチのみならず、複数の連続したミスマッチ、1または複数の塩基の挿入および／または欠失により生じるミスマッチ、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。
【００１５】
本発明において「ミスマッチ」とは、一組の塩基対が正常な塩基対（ＤＮＡの場合はアデニン（Ａ）／チミン（Ｔ）およびグアニン（Ｇ）／シトシン（Ｃ）、ＲＮＡの場合は（Ａ）／ウラシル（Ｕ）およびグアニン（Ｇ）／シトシン（Ｃ））ではないことを指す。本発明において「ミスマッチ」には、1つのミスマッチのみならず、複数の連続したミスマッチ、１または複数の塩基の挿入および／または欠失により生じるミスマッチ、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。
【００１６】
本発明において「変異」とは、対照核酸と比較した場合における標的核酸中の異なる塩基（二本鎖核酸の場合には塩基対）を指す。
【００１７】
本発明において「核酸」は、特に制限されず、ＤＮＡおよびＲＮＡあるいはその他の人工核酸（所謂ＰＮＡ等）いずれも用いることができ、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ等の天然試料であっても、合成ポリヌクレオチドであってもよい。また二本鎖核酸、並びに直鎖状核酸および環状核酸を含む。１本鎖核酸のＳＮＰｓについても、対照核酸とハイブリダイズさせることで検証できる。
【００１８】
本発明において「対照核酸」とは、変異を有しない核酸を指す。また、「標的核酸」とは、対照核酸とは異なる塩基（変異）を有することが疑われる核酸を指す。標的核酸は、変異を有しなければ対照核酸と同一の核酸であり、変異を有すれば、該変異部位のみ対照核酸と異なる核酸である。例えば、遺伝子病が疑われる患者の遺伝子における変異を検出する場合において変異を有することが疑われる患者の遺伝子は標的核酸であり、この遺伝子に対応する健常者の遺伝子は対照核酸である。
【００１９】
本発明の方法に用いられる標的核酸としては、特に制限はなく、変異を有するか否かを検出したい所望の核酸を用いることができる。また、対照核酸は、標的核酸に対応する核酸であって、仮に標的核酸が変異を有しなければ、標的核酸と同一の核酸を用いる。この同一とは、両者がハイブリダイズする領域において同一の意味であり、長さに相違があってもよいが、可能であれば長さも揃えることが望ましい。標的核酸および対照核酸は、１本鎖であっても二本鎖であってもよいが、両者が１本鎖の場合には、仮に標的核酸が変異を有しなければ、互いに相補鎖である。
【００２０】
本発明の方法においては、標的核酸と対照核酸をハイブリダイズさせる（但し、二本鎖である場合は、変性して一本鎖に解離させて、両者をハイブリダイズさせる）。これにより、二本鎖核酸を形成させる（二本鎖核酸は標的核酸に変異がある場合には、ヘテロ二本鎖核酸とホモ二本鎖核酸の混合物となり、標的核酸に変異がない場合には、ホモ二本鎖核酸のみとなる）。
【００２１】
二本鎖核酸の変性方法としては、例えば、溶液のｐＨを酸性またはアルカリ性にする方法と、溶液を高温にする方法が挙げられる。ｐＨを変化させる方法としは、例えば ０．１Ｍ ＮａＯＨ、０．１Ｍ ＨＣｌ溶液に置換する方法が挙げられる。また、温度を上げる方法は、核酸の融解温度（Ｔｍ）以上にすればよいが、通常、９５℃程度が用いられる。
【００２２】
二本の一本鎖核酸のハイブリダイズは、溶液のｐＨを中性に戻すこと、または温度を徐々に下げ Ｔｍ以下にすることにより容易に行うことができる。ハイブリダイズにより二本鎖核酸を形成させる過程で一本鎖核酸が残っていると予想される場合には、例えばカラムで１本鎖核酸を除去するか、または予め大腸菌ＳＳＢタンパク質などで１本鎖核酸をブロックすることが好ましい。
【００２３】
本発明の方法は、単一のミスマッチ塩基対、複数の連続したミスマッチ、1塩基対複数塩基のミスマッチ、さらには二本鎖核酸の少なくとも片側の鎖における１または複数の塩基の欠失および/または挿入によって生じるミスマッチの検出に好適に適用することができる。
【００２４】
本発明の方法に用いられるミスマッチ結合タンパク質は、二本鎖核酸におけるミスマッチを認識、結合するタンパク質であり、例えばＭｕｔＳ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６が好適に挙げられるが、二本鎖核酸中のミスマッチを認識しうる限りその由来に制限はない。また、二本鎖核酸中のミスマッチを認識しうる限り、これらタンパク質の部分ペプチドであってもよい。さらにまた、ミスマッチ結合タンパク質はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ等、他のタンパク質との融合タンパク質等であってもよい。
【００２５】
また、ミスマッチ結合タンパク質は、二本鎖核酸中のミスマッチを認識しうる限り、天然型のタンパク質のアミノ酸配列中、１つ若しくは複数のアミノ酸を置換、欠失、付加、および／または挿入したアミノ酸配列からなるタンパク質（変異体）であってもよい。このような変異体は、自然界において生じることもあるが、公知の方法を適宜利用して人為的に調製することも可能である。
【００２６】
ミスマッチ結合タンパク質は、天然のタンパク質として、または組換えタンパク質として、陰イオン交換カラム、陽イオン交換カラム、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー、硫酸アンモニウム分画等の公知の方法を適宜組み合わせて調製することが可能である。また、組換えタンパク質で発現量が多い場合には、陽イオン交換カラムおよびゲル濾過カラムを用いたクロマトグラフィーのみにより容易に調製することも可能である。ミスマッチ結合タンパク質は市販品も利用することができる。
ミスマッチ結合タンパク質の使用量は、通常、試料の核酸１μｇに対して０．１μｇ〜１００μｇ、好ましくは１μｇ〜１０μｇである。
【００２７】
二本鎖核酸を増幅しうるプライマーおよび試薬としては、ＬＡＭＰ増幅反応やＲＣＡ（Rolling Circle Amplification）法、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法等の等温増幅反応や一般的なＰＣＲ増幅反応等のポリメラーゼ増幅反応、ＬＣＲ等のリガーゼ増幅反応など、公知の核酸増幅法に用いるものが利用できる。
具体的には、各方法に適したように設計されたプライマーの核酸と、ポリメラーゼ及び／あるいはリガーゼ（好ましくはＴａｑポリメラーゼ等の耐熱酵素）、核酸基質（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ（ｄＵＴＰ）／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰのｄＮＴＰ）、それらに適した緩衝液（たとえばＴｒｉｓ−ＳＯ4など）と安定化剤（たとえばＭｇＣｌ2）や副反応の阻害剤（たとえばＲＮＡｓｅ）などであり、従来の核酸増幅と同様の種類、量および方法で用いることができる。市販の核酸増幅キット等を用いることもできる。
プライマーは、検出する対象のミスマッチの近傍またはミスマッチを含むように設計することが好ましく、より好ましくはミスマッチがプライマーに含まれるように、さらに好ましくはプライマーの３’末端近傍（好ましくは３’末端から１〜５塩基以内）にミスマッチが含まれるようにプライマーを設計する。
【００２８】
本発明の方法における二本鎖核酸とミスマッチ結合タンパク質との接触は、該タンパク質が該二本鎖核酸中のミスマッチ領域に結合しうる条件（例えば、適当なｐＨ、溶媒、イオン環境、温度）で行なわれる。反応温度や塩濃度、イオンの種類、バッファーのｐＨ等の詳細な条件は適宜調整することができる。
【００２９】
核酸が増幅したか否かを検出する手段としては、エチジウムブロマイドやインターカレーター蛍光色素等の各種染色、ＵＶ吸収、ラジオアイソトープ、ピロリン酸の検出、標識プローブによる検出等を用いた通常の方法を用いることができる。適当な濃度や感度などの条件を設定して有無を判別することも簡便なため公的であり、また濃度を求めることも正確さを期す上で好ましい。
核酸の間のミスマッチの有無を判定するにあたり、ミスマッチを含むことが判っている系（ネガティブコントロール）やミスマッチを含まないことが判っている系（ポジティブコントロール）と、試料の核酸における系を対比して判定することがより好ましい。
【００３０】
本発明の方法は、遺伝子病患者の罹病が疑われる患者において特定の遺伝子が変異を有するか否かを調べるため、患者由来の遺伝子と健常者の遺伝子が同一の塩基配列を有するか否かを調べることに利用することができる。本発明の方法においては、標的遺伝子のいかなる位置に変異が存在しても検出することが可能であり、検査対象となる遺伝子の変異部位や変異の種類が既知である必要はない点でも優れている。
さらには、プライマーやプローブとして人工的に合成された配列に本発明の方法を適用することで、その配列の精度をより向上させることができる。
【実施例】
【００３１】
＜実施例１＞  アルデヒド脱水素酵素遺伝子（ＡＬＤＨ２遺伝子）関連部位の１塩基多型（ＳＮＰｓ）検出
(一塩基多型に対応する部分をプライマーの３'末端付近に設定した例)
（１）核酸試料液の調製
予め塩基配列のシーケンシングにより、ＡＬＤＨ２遺伝子関連部位の特定の１塩基種が異なることにより、ＡＬＤＨ２活性型（ホモジニアス）、ＡＬＤＨ２不活性型（ホモジニアス）であることが既知である、各々１人から採取した血液試料のそれぞれから、市販の核酸抽出、精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社製、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）を用いて抽出、精製したゲノミック核酸断片を１ｍＬの精製蒸留水中に回収することで、ターゲット核酸断片を含む核酸試料液を調製した。
(２) 増幅反応溶液の調整、および核酸増幅（ＰＣＲ法）
上記（１）で、ＡＬＤＨ２活性型（ホモジニアス）またはＡＬＤＨ２不活性型（ホモジニアス）それぞれのヒト全血試料から抽出・精製して得たタ−ゲット核酸断片を含む核酸試料液をそのまま用いて、以下の条件でＰＣＲ増幅を行った。
【００３２】
＜プライマー＞
プライマーは、１２番染色体上のＡＬＤＨ２遺伝子関連部位のなかに、共通のプライマー(ｕｐｐｅｒ)と、ＡＬＤＨ２の活性を決定する１塩基多型に対応する部分を３'末端付近に設定(lower-1とlower-2に記載のプライマー塩基配列の下線部分)した、ＡＬＤＨ２活性型および不活性型に対応する、２種のプライマ−（ｌｏｗｅｒ−１）および、プライマ−（ｌｏｗｅｒ−２）のセットを使用した。なお。ｌｏｗｅｒプライマーの1塩基多型に対応する配列の1塩基分５‘上流の塩基を変え（Ｔ→Ａ）、人為的にミスマッチを作り出した.
【００３３】
活性型検出用プライマー
プライマー(upper)（配列番号１）：
５’−ＡＡＣＧＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＡＴＧＡ−３’
プライマー(lower-1) （配列番号２）:
５’−ＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＡＣＡＣＡＧＡ−３’
不活性型検出用プライマー
プライマ−(upper) （配列番号３）：
５’−ＡＡＣＧＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＡＴＧＡ−３’
プライマ−(lower-2) （配列番号４）:
５’−ＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＡＣＡＣＡＡＡ−３’
【００３４】
以下に示す反応液の組成で、[変性：９４℃・２０秒、アニーリング：６０℃・３０秒、ポリメラーゼ伸長反応：７２℃・１分３０秒]を３５サイクル繰り返すことでＰＣＲ増幅を実施した。
【００３５】
＜実施例1のＰＣＲ反応液の組成＞
Ｔａｑ−ＭｕｔＳ（日本ジーン製、１μｇ／ｍｌ）      １μＬ    
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ                                ５μＬ
５μＭ  プライマ−(ｕｐｐｅｒ)                      ２μＬ
５μＭ  プライマ−(ｌｏｗｅｒ−１または−２)        ２μＬ
Ｅｘ  Ｔａｑ  （５Ｕ／μｌ）※                      ０．５μＬ
１０×ＰＣＲバッファ−※                            ５μＬ
（１）で得た核酸試料液                              ０．５μＬ
精製水                                            ３４μＬ
（※ともにＴＡＫＡＲＡバイオ製  Ｅｘ  Ｔａｑ  キット）
【００３６】
比較例1）として、下記に示す反応液の組成にて、それ以外は実施例1）と同条件で反応を行った。（Ｔａｑ-ＭｕｔＳ  を入れない）
【００３７】
＜比較例1のＰＣＲ反応液の組成＞
１０×ＰＣＲバッファ−                              ５μＬ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ                                ５μＬ
５μＭ  プライマ−(ｕｐｐｅｒ)                      ２μＬ
５μＭ  プライマ−(ｌｏｗｅｒ−１または−２)        ２μＬ
Ｔａｑ                                              ０．５μＬ
（１）で得た核酸断片試料液                          ０．５μＬ
精製水                                              ３５μＬ
【００３８】
実施例１の増幅産物１μｌをアガロースゲル電気泳動しエチジウムブロマイドにより染色し、紫外線で観察た結果を図１、比較例１の結果を図２に示す。
【００３９】
実施例１、比較例１の結果より、本発明においては試料中の既知であるＡＬＤＨ２の活性型すなわちアルデヒド脱水素酵素遺伝子（ＡＬＤＨ２遺伝子）関連部位の一塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出できていることがわかる。
【００４０】
＜実施例２＞  ＬＡＭＰ法によるβアクチン遺伝子関連部位の１塩基多型（ＳＮＰｓ）検出
(一塩基多型に対応する部分をＬＡＭＰ  Ｆプライマーの末端付近に設定した例)
【００４１】
（１）ターゲット核酸断片を含む核酸試料液の調製
βアクチンの任意の遺伝子部分をプラスミドに組み込み野生型サンプルとした。
また、選択した１つの塩基配列をＧからＴに組み替えたものを作成し、変異型サンプルとした。
【００４２】
(２)  ＬＡＭＰ増幅
上記（１）で、野生型、変異型各サンプルから抽出・精製して得たタ−ゲット核酸断片を含む核酸試料液をそのまま用いて、以下の条件でＬＡＭＰ増幅を行った。
【００４３】
＜プライマー＞
プライマーは、βアクチン遺伝子関連部位の任意の部分を認識する４つのプライマー(Ｕ1、Ｌ１、Ｕ2、Ｌ２、)と、ループ部分と相補的なプライマー（ｌｐ）計５種のプライマ−を用いた。
【００４４】
Ｕ１（配列番号５）  
ＣＴＣＴＧＧＧＣＣＴＣＧＴＣＧＣＴＴＴＴＧＧＧＣＡＴＧＧＧＴＣＡＧＡＡＧＧＡＴＴ
Ｌ１（配列番号６）  
ＴＡＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＣＡＣＧＧＴＴＴＴＣＡＴＧＴＣＧＴＣＣＣＡＧＴＴＧＧＴＧＡ
Ｕ２（配列番号７）  
ＧＧＧＣＴＴＣＴＴＧＴＣＣＴＴＴＣＣＴＴＣ
Ｌ２（配列番号８）
ＣＣＡＣＡＣＧＣＡＧＣＴＣＡＴＴＧＴＡＧ
ｌｐ（配列番号９）    
ＣＴＣＴＧＧＧＣＣＴＣＧＴＣＧＣ
【００４５】
以下に示す反応液の組成で、６０℃で３０分間、ＬＡＭＰ法による増幅反応を行った。
【００４６】
＜反応液の組成＞
Ｔａｑ−ＭｕｔＳ（日本ジーン製、１μｇ／ｍｌ）      １μＬ
１００ｍＭ  ＭｇＳＯ4                               １．５μＬ
１０％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０                      ０．２５μＬ
１００％  ＤＭＳＯ                                  １．２５μＬ
２５ｍＭ  ｄＮＴＰ                                  １．４μＬ
Ｕ１  プライマ−(ｕｐｐｅｒ)                        １．６μＬ
Ｌ１  プライマ−(ｕｐｐｅｒ)                        １．６μＬ
Ｕ２  プライマ−(ｕｐｐｅｒ)                        １．６μＬ
Ｌ２  プライマ−(ｕｐｐｅｒ)                        １．６μＬ
ｌｐ    プライマ−(ｕｐｐｅｒ)                      １．６μＬ
Ｂｓｔ．Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （ＮＥＢ社製、１０Ｕ／μｌ）  
１．０μＬ
１０×Ｂｓｔ  バッファ−（20ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ8.8）、10ｍＭ  ＫＣＬ、10ｍＭ  硫酸アンモニウム  2ｍＭ  硫酸マグネシュウム）
２．５μＬ
（１）で得た核酸試料液                              ０．５μＬ
精製水                                            １０．２μＬ
【００４７】
比較例２）として、下記に示す反応液の組成にて、それ以外は実施例２）と同条件で反応を行った。（Ｔａｑ-ＭｕｔＳ  を入れない）
【００４８】
＜反応液の組成＞
１０×Ｂｓｔ  バッファ−                            ２．５μＬ
１００ｍＭ  ＭｇＳＯ4                               １．５μＬ
１０％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０                      ０．２５μＬ
１００％  ＤＭＳＯ                                  １．２５μＬ
２５ｍＭ  ｄＮＴＰ                                  １．４μＬ
Ｕ１  プライマ−(ｕｐｐｅｒ)                        １．６μＬ
Ｌ１  プライマ−(ｕｐｐｅｒ)                        １．６μＬ
Ｕ２  プライマ−(ｕｐｐｅｒ)                        １．６μＬ
Ｌ２  プライマ−(ｕｐｐｅｒ)                        １．６μＬ
ｌｐ    プライマ−(ｕｐｐｅｒ)                      １．６μＬ
Ｂｓｔ．Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ                        １．０μＬ
（１）で得た核酸断片試料液                          ０．５μＬ
精製水                                              ９．２μＬ
【００４９】
実施例２、比較例２の増幅産物をアガロースゲル電気泳動した結果を図３に示す。
実施例２、比較例２の結果より、実施例２においては野生型と変異型との判別が明らかにできるようになったことがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】実施例１の結果を示す図である。
【図２】比較例１の結果を示す図である。
【図３】実施例２および比較例２の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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