(57)【要約】【課題】薬物の胆汁酸排泄試験において重要な役割を担うイヌを用いた薬物動態・毒性試験データを、ヒトへ有効に外挿することを目的とし、イヌＢｓｅｐ遺伝子を同定し、その遺伝子産物について蛋白質レベルでの基礎的な機能を解析すること。【解決手段】ヒトＢＳＥＰ(bile salt export pump ,ＡＢＣＢ１１)に対応するイヌのオルソログである新規遺伝子、イヌＢｓｅｐの遺伝子をクローニングし、全長塩基配列、主要臓器における遺伝子発現分布及び昆虫細胞バキュロウイルス系による蛋白質レベルでの機能を解析する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表される塩基配列からなる遺伝子ＤＮＡ。
【請求項２】
以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるイヌＢｓｅｐタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつイヌＢｓｅｐによる胆汁酸輸送トランスポーター活性を有するタンパク質
【請求項３】
請求項１又は２記載の遺伝子ＤＮＡが組み込まれ、かつイヌＢｓｅｐによる胆汁酸輸送トランスポーター活性を有するタンパク質を発現しうる組換えベクター。
【請求項４】
請求項３記載の組換えベクターが導入され、かつイヌＢｓｅｐによる胆汁酸輸送トランスポーター活性を有するタンパク質を発現しうる形質転換体。
【請求項５】
請求項３記載の組換えベクターが昆虫細胞に導入されている請求項４記載の形質転換体。
【請求項６】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるイヌＢｓｅｐタンパク質。
【請求項７】
配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつイヌＢｓｅｐによる胆汁酸輸送トランスポーター活性を有するタンパク質。
【請求項８】
請求項６又は７記載のタンパク質を発現せしめた細胞膜。
【請求項９】
請求項６又は７記載のタンパク質を発現しているベシクルの外又は内に胆汁酸を存在させると共に、前記ベシクルの外及び／又は内に被検物質を存在させて、インビトロにおける前記胆汁酸のベシクル内外への輸送の程度を測定し、被検物質の非存在の場合と比較評価することを特徴とする被検物質の肝毒性・肝障害の判定方法。
【請求項１０】
請求項６又は７記載のタンパク質を発現しているベシクルに加えて、さらに、ヒトＢＳＥＰタンパク質を発現しているベシクル及びラットＢｓｅｐタンパク質を発現しているベシクルを用いることを特徴とする請求項９記載の被検物質の肝毒性・肝障害の判定方法。
【請求項１１】
ベシクルが、昆虫細胞膜由来の反転細胞膜ベシクルであり、反転細胞膜ベシクルの外に胆汁酸を存在させることを特徴とする請求項９又は１０記載の被検物質の肝毒性・肝障害の判定方法。
【請求項１２】
胆汁酸が、標識化タウロコール酸であることを特徴とする請求項９〜１１のいずれか記載の被検物質の肝毒性・肝障害の判定方法。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれか記載の被検物質の肝毒性・肝障害の判定方法の結果と、イヌ個体及びラット個体に被検物質を投与した場合における肝毒性・肝障害の結果を比較評価して、ヒト個体における肝毒性・肝障害の程度を予測する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イヌの胆汁酸輸送トランスポーターであるイヌＢｓｅｐや、イヌＢｓｅｐ遺伝子や、イヌＢｓｅｐ発現昆虫細胞や、イヌＢｓｅｐ発現ベシクルを利用した候補薬剤の肝毒性・肝障害の判定方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品開発後期における肝毒性による開発化合物のドロップアウトや、薬剤発売後、薬剤同時投与による当初予測できなかった薬剤相互作用による肝毒性などの問題は、製薬企業において経済的にも倫理的にも最も大きな打撃を与える開発リスクの一つである。肝毒性を医薬品開発初期において、正確に予測することは、その後の開発コスト低減や開発スピードの加速化に大きく寄与すると考えられることから、製薬企業における大きな関心事の一つとなっている。
【０００３】
肝臓において引き起こされる薬剤の副作用の一つとして、薬剤が胆汁酸排泄を阻害することによって起こる胆汁うっ帯が例に挙げられる。肝臓における胆汁酸排泄経路は、コレステロールやホルモンなどの内因性物質及び薬剤などの生体外異物の体外への分泌経路として重要な役割を担っている（例えば、非特許文献１、２参照）。胆汁酸の細胞内蓄積は、細胞毒性を招くため、その合成量や取込／排泄量は生体内において厳密にコントロールされている(例えば、非特許文献３参照。)。１９９１年以降、胆汁酸をＡＴＰ依存的に排泄する機構が肝実質細胞の胆管側膜に発現していることが示唆され、薬剤の引き起こす胆汁うっ帯のメカニズムを明らかにする上でも、胆汁酸排泄に寄与する蛋白質の分子レベルでの同定が強く求められていた(例えば、非特許文献４参照。)。
【０００４】
ＢＳＥＰ(bile salt export pump, ＡＢＣＢ１１)遺伝子は、当初、ＳＰＧＰ( sister of P-glycoprotein)の名前で、Ｐ糖タンパク質(P-glycoprotein，ＭＤＲ１，ＡＢＣＢ１)と非常に相同性の高い遺伝子として、ブタの肝臓からクローニングされた(例えば、非特許文献５参照。)。その後、Gerloffらによりラットの肝臓からＢＳＥＰの全長遺伝子がクローニングされ、続いてバキュロウイルス／Ｓｆ９昆虫細胞発現系により調製されたＢＳＥＰ大量発現細胞膜ベシクルの解析結果から、ＢＳＥＰがＡＴＰ依存的にタウロコール酸などの抱合胆汁酸を細胞外へ排泄するＡＢＣトランスポーター(ATP-binding cassette transporter)であることが明らかになった(例えば、非特許文献６参照。)。ヒト肝臓、マウス肝臓からもＢＳＥＰ遺伝子がクローニングされ、特にヒトＢＳＥＰに関しては、遺伝子欠損や変異などの機能障害による進行性家族性胆汁うっ滞症２型(ＰＦＩＣ２, progressive familial intrahepatic cholestasis type 2)の原因遺伝子であることが判明したことから、生理学上極めて重要な遺伝子であることが明らかになった(例えば、非特許文献７、８参照。)。
【０００５】
一方、TroglitazoneやBosentanなど、ＢＳＥＰと相互作用すると考えられる種々の薬剤が、ＢＳＥＰの胆汁酸排泄を阻害することにより、胆汁うっ帯などの重篤な肝障害を引き起こす可能性のあることが、複数の研究グループから報告された(例えば、非特許文献６、９、１０参照。)。このように、ＢＳＥＰを介した胆汁酸排泄経路は生理学的に重要であるのみならず、薬剤の肝臓における薬物動態・毒性を理解する上でも、必要不可欠な因子であると考えられている。以上の様な背景から、肝障害を引き起こす可能性のある薬剤のin vitroスクリーニングシステムとして、現在、製薬企業を中心とする創薬現場において、ＢＳＥＰの機能解析技術が大きな注目を集めている。
【０００６】
さらに、近年、ＢＳＥＰの蛋白質レベルでの詳細な機能解析結果より、実験動物として用いられる哺乳類動物間でのＢＳＥＰによる基質認識性に関する動物種差の存在が示唆されている(例えば、非特許文献１１、１２参照。)。
【０００７】
【非特許文献１】Trends Mol. Med. 2003 Dec;9(12):558-64.
【非特許文献２】Pediatr Res. 1998 Aug;44(2):141-7.
【非特許文献３】Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2003 May;284(5):G734-8.
【非特許文献４】Hepatology. 1991 Oct;14(4 Pt 1):655-9.
【非特許文献５】Cancer Res. 1995 May 15;55(10):2029-34.
【非特許文献６】J. Biol. Chem. 1998 Apr 17;273(16):10046-50.
【非特許文献７】Gene. 2000 Jan 4;241(1):117-23.
【非特許文献８】Nat. Genet. 1998 Nov;20(3):233-8.
【非特許文献９】Mol. Pharmacol. 2001 Mar;59(3):627-35.
【非特許文献１０】Clin. Pharmacol. Ther. 2001 Apr;69(4):223-31.
【非特許文献１１】Gastroenterology. 2002 Nov;123(5):1649-58.
【非特許文献１２】Drug Metab. Pharmacokinet. 2003;18(1):16-22.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
今後、実験動物を用いた薬剤の肝毒性試験をヒトに正確に外挿するためには、ヒトのみならず、実験動物由来ＢＳＥＰ蛋白質の分子レベルでの機能解析も必須となると考えられる。しかし、薬物動態及び毒性試験において最も頻繁に使用されるラット、マウス、イヌ、及びサルの４種の実験動物のうち、ラット及びマウスの齧歯類におけるＢＳＥＰ蛋白質の機能解析が比較的進んでいるにもかかわらず、イヌ及びサルＢＳＥＰの分子レベルでの機能実態に関しては、全く明らかでは無かった。本発明の課題は、薬物の胆汁酸排泄試験において重要な役割を担う実験動物であるイヌを用いた薬物動態・毒性試験データを、ヒトへ有効に外挿することを目的とし、イヌＢｓｅｐ遺伝子を同定し、その遺伝子産物について蛋白質レベルでの基礎的な機能を解析することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ヒトＢＳＥＰ(bile salt export pump ,ＡＢＣＢ１１)に対応するイヌのオルソログである新規遺伝子、イヌＢｓｅｐの遺伝子をクローニングし、全長塩基配列、主要臓器における遺伝子発現分布及び昆虫細胞バキュロウイルス系による蛋白質レベルでの機能解析に、世界で初めて成功し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、（１）配列番号１で表される塩基配列からなる遺伝子ＤＮＡや、（２）（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるイヌＢｓｅｐタンパク質又は（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつイヌＢｓｅｐによる胆汁酸輸送トランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡや、（３）上記（１）又は（２）記載の遺伝子ＤＮＡが組み込まれ、かつイヌＢｓｅｐによる胆汁酸輸送トランスポーター活性を有するタンパク質を発現しうる組換えベクターや、（４）上記（３）記載の組換えベクターが導入され、かつイヌＢｓｅｐによる胆汁酸輸送トランスポーター活性を有するタンパク質を発現しうる形質転換体や、（５）上記（３）記載の組換えベクターが昆虫細胞に導入されている上記（４）記載の形質転換体に関する。
【００１１】
また本発明は、（６）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるイヌＢｓｅｐタンパク質や、（７）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつイヌＢｓｅｐによる胆汁酸輸送トランスポーター活性を有するタンパク質や、（８）上記（６）又は（７）記載のタンパク質を発現せしめた細胞膜に関する。
【００１２】
さらに本発明は、（９）上記（６）又は（７）記載のタンパク質を発現しているベシクルの外又は内に胆汁酸を存在させると共に、前記ベシクルの外及び／又は内に被検物質を存在させて、インビトロにおける前記胆汁酸のベシクル内外への輸送の程度を測定し、被検物質の非存在の場合と比較評価することを特徴とする被検物質の肝毒性・肝障害の判定方法や、（１０）上記（６）又は（７）記載のタンパク質を発現しているベシクルに加えて、さらに、ヒトＢｓｅｐタンパク質を発現しているベシクル及びラットＢｓｅｐタンパク質を発現しているベシクルを用いることを特徴とする上記（９）記載の被検物質の肝毒性・肝障害の判定方法。（１１）ベシクルが、昆虫細胞膜由来の反転細胞膜ベシクルであり、反転細胞膜ベシクルの外に胆汁酸を存在させることを特徴とする上記（９）又は（１０）記載の被検物質の肝毒性・肝障害の判定方法や、（１２）胆汁酸が、標識化タウロコール酸であることを特徴とする上記（９）〜（１１）記載の被検物質の肝毒性・肝障害の判定方法や、（１３）上記（１０）〜（１２）のいずれか記載の被検物質の肝毒性・肝障害の判定方法の結果と、イヌ個体及びラット個体に被検物質を投与した場合における肝毒性・肝障害の結果を比較評価して、ヒト個体における肝毒性・肝障害の程度を予測する方法に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によると、イヌＢｓｅｐの遺伝子クローニング、蛋白質発現系構築、及びベシクル輸送実験システムの構築に成功したことにより、イヌＢｓｅｐの蛋白質レベルでの機能解析が初めて可能になった。イヌＢｓｅｐ機能解析システムを応用することにより、蛋白質レベルでイヌ肝臓における薬剤の肝障害を予測し、イヌによる薬物動態・毒性試験結果が効果的にヒトに外挿可能になり、より安全な医薬品開発に寄与する。本発明におけるこの新たな動物実験代替法は、動物実験にかかる費用の低減や医薬品の開発期間の短縮など、様々な産業的価値がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の遺伝子ＤＮＡとしては、配列番号１で表される塩基配列からなるイヌＢｓｅｐ遺伝子ＤＮＡや、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるイヌＢｓｅｐタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡや、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつイヌＢｓｅｐによる胆汁酸輸送トランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡであれば特に制限されず、また、本発明のタンパク質としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるイヌＢｓｅｐタンパク質や、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつイヌＢｓｅｐによる胆汁酸輸送トランスポーター活性を有するタンパク質であれば特に制限されず、本発明において「イヌＢｓｅｐによる胆汁酸輸送トランスポーター活性」とは、イヌ肝細胞に発現するＢｓｅｐによる胆汁酸を輸送するトランスポーター機能やそれと同等な機能を意味し、例えば、イヌＢｓｅｐによる胆汁酸輸送トランスポーター活性とヒト胆汁酸輸送トランスポーター活性とは異なる。
【００１５】
本発明の遺伝子ＤＮＡの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列番号１に示されるアミノ酸配列又は塩基配列情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いて当該遺伝子が存在することが予測されるイヌｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的の遺伝子を単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。例えば、細胞又は組織からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。本発明の遺伝子をｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法は、例えば、Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989に記載の方法等、当業者により常用されている方法を挙げることができる。
【００１６】
本発明のタンパク質の取得・調製方法は特に限定されず、天然由来のタンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組換え技術により作製した組み換えタンパク質の何れでもよい。天然由来のタンパク質を取得する場合には、かかるタンパク質を発現している肝細胞からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせることにより、本発明のタンパク質を取得することができる。化学合成によりタンパク質を調製する場合には、例えば、Ｆｍｏｃ法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って本発明のタンパク質を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタンパク質を合成することもできる。遺伝子組換え技術によりタンパク質を調製する場合には、該タンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡを好適な発現系に導入することにより本発明のタンパク質を調製することができる。これらの中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術による調製が好ましい。
【００１７】
例えば、遺伝子組換え技術によって、本発明のタンパク質を調製する場合、かかるタンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記本発明のタンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらのタンパク質の精製物を得ることができる。また、本発明のタンパク質が細胞膜に発現している場合は、細胞膜分解酵素を作用させた後、上記の精製処理を行うことにより精製標品を得ることができる。
【００１８】
また、本発明のタンパク質をマーカータンパク質やペプチドタグと結合させることもできる。マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、ＨＲＰ等の酵素、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰ等の蛍光物質などを具体的に挙げることができ、また本発明におけるペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合ペプチドは、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した本発明のタンパク質の精製や、本発明のタンパク質の検出や、本発明のタンパク質に対する抗体の定量や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００１９】
本発明のイヌＢｓｅｐタンパク質に特異的に結合する抗体として、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を作製することもでき、これらは上記本発明のイヌＢｓｅｐタンパク質を抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の本発明のイヌＢｓｅｐタンパク質に特異的に結合する抗体は、例えば、本発明のイヌＢｓｅｐタンパク質の分子機構等を明らかにする上で有用である。かかるイヌＢｓｅｐタンパク質に対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に本発明のイヌＢｓｅｐタンパク質又は該タンパク質を膜表面に発現した細胞を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）など任意の方法を用いることができる。
【００２０】
本発明の組換えベクターとしては、前記本発明の遺伝子ＤＮＡを含み、かつ前記本発明のタンパク質を発現することができる組換えベクターであれば特に制限されず、また、本発明の形質転換体としては、上記本発明の組換えベクターが宿主細胞に導入され、かつイヌＢｓｅｐによる胆汁酸輸送トランスポーター活性を有するタンパク質を発現しうる形質転換体であれば特に制限されず、上記宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真核細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー(W. H. Freeman and Company)、ニューヨーク(New York)、(1992)〕、ＨｉＦｉｖｅ(インビトロジェン社製)等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞、卵母細胞等の動物細胞や植物細胞などを挙げることができるが、動物細胞、特に昆虫細胞が好ましい。
【００２１】
本発明の組換えベクターは、本発明の遺伝子を発現ベクターに適切にインテグレイトすることにより構築することができる。かかる発現ベクターとしては、宿主細胞において自律複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本発明の遺伝子を発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。
【００２２】
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクター及びバキュロウイルスの遺伝情報を有したゲノム断片などを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる（例えば、Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manua1；及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載）。遺伝子導入ベクターとしては、例えば、pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII等を用いることができる。バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの遺伝情報を有したゲノム断片などの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
【００２３】
また、動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐＥＧＦＰ-Ｃ１（Clontech社製）、ｐＧＢＴ−９(Clontech社製)、ｐｃＤＮＡＩ（フナコシ社製）、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７（Cytotechnology, 3, 133, 1990）、ｐＣＤＭ８（Nature, 329, 840, 1987）、ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍＰ（Invitrogen社製）、ｐＲＥＰ４（Invitrogen社製）、ｐＡＧＥ１０３（J.Blochem., 101, 1307, 1987）、ｐＡＧＥ２１０等を例示することができる。動物細胞用のプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等を挙げることができる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であれば、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を挙げることができる。
【００２４】
本発明の細胞膜としては、前記本発明のタンパク質を人為的に発現せしめた細胞膜であれば特に制限されず、本発明の細胞膜には前記本発明のタンパク質を人為的に発現せしめた細胞膜画分も含まれ、動物細胞膜（画分）、中でも昆虫細胞膜（画分）が好ましい。本発明の細胞膜（画分）は、後述する本発明の被検物質の肝毒性・肝障害の判定方法に有利に用いることができる。例えば、前記本発明のタンパク質を人為的に発現せしめた昆虫細胞を破砕した後、例えば、後述する実施例４記載の方法等により作製した反転昆虫細胞膜ベシクル等の反転細胞膜ベシクルや、本発明の細胞膜画分あるいは細胞膜から界面活性剤などにより抽出および精製を行った膜蛋白質画分と合成又は人工の膜標品（リポソーム、ミセルその他同種のものを含む）とを融合させて、その表面にトポロジーを異にして前記本発明のタンパク質を発現させている人工ベシクルを好適に例示することができる。
【００２５】
本発明の被検物質の肝毒性・肝障害の判定方法としては、前記本発明のタンパク質を発現しているベシクルの外又は内に胆汁酸とＡＴＰを存在させると共に、前記ベシクルの外及び／又は内に被検物質を存在させて、インビトロにおける前記胆汁酸のベシクル内外への輸送の程度を測定し、被検物質の非存在の場合と比較評価する方法であれば特に制限されず、上記被検物質としては候補薬剤を好適に例示することができ、候補薬剤を用いることにより、イヌ肝臓における薬物動態を調べることが可能になる。上記ベシクルとしては、前記の反転昆虫細胞膜ベシクルや人工ベシクル、中でも反転昆虫細胞膜ベシクルを好適に例示することができる。天然のものとトポロジーを逆にした反転昆虫細胞膜ベシクルを用いる場合、反転昆虫細胞膜ベシクルの外部に胆汁酸とＡＴＰを存在させ、胆汁酸の取込量を調べることにより、イヌＢｓｅｐによる胆汁酸輸送トランスポーター活性を調べることが可能となる。
【００２６】
また、上記胆汁酸としては、コール酸、コール酸とグリシンとの抱合胆汁酸であるグリココール酸、コール酸とタウリンとの抱合胆汁酸であるタウロコール酸の他、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、リトコール酸等を挙げることができ、これら胆汁酸としては、標識化胆汁酸を有利に用いることができる。標識物質としては、酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジン、放射性同位体等を挙げることができ、具体的には、ペルオキシダーゼ（例えば、horseradish peroxidase）、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ−ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、３Ｈ 、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、アビジン、化学発光物質などを例示することができる。
【００２７】
上記反転細胞膜ベシクルや、この反転細胞膜ベシクルと同じトポロジーの人工ベシクルを用いる本発明の被検物質の肝毒性・肝障害の判定方法の具体的態様としては、ベシクル外部に標識化胆汁酸とＡＴＰと被検物質を存在させて、ベシクル内部への標識化胆汁酸の取込量を測定し、被検物質の非存在下の場合と比較して、取込量が変わらないときや取込量が増えたとき、被検物質は胆汁酸排泄阻害機構に基づいた肝毒性・肝障害作用を引き起こす可能性が低いと評価し、取込量が減少したとき被検物質は胆汁酸排泄阻害機構に基づいた肝毒性・肝障害作用を引き起こす可能性が高いと評価する。この判定方法においては、被検物質をベシクル外部及び内部に存在させても、ベシクル内部にのみ存在させることもできるが、上記のように、ベシクル外部に存在させることが好ましい。
【００２８】
上記と反対に、天然の細胞膜ベシクルや、この細胞膜ベシクルと同じトポロジーの人工ベシクルを用いる本発明の被検物質の肝毒性・肝障害の判定方法の具体的態様としては、ベシクル内部に標識化胆汁酸とＡＴＰと被検物質を存在させて、ベシクル外部への標識化胆汁酸の排出量を測定し、被検物質の非存在下の場合と比較して、排出量が変わらないときや排出量が増えたとき、被検物質は胆汁酸排泄阻害機構に基づいた肝毒性・肝障害作用を引き起こす可能性が低いと評価し、排出量が減少したとき被検物質は胆汁酸排泄阻害機構に基づいた肝毒性・肝障害作用を引き起こす可能性が高いと評価する。この判定方法においては、被検物質をベシクル外部及び内部に存在させても、ベシクル外部にのみ存在させることもできるが、上記のように、ベシクル内部に存在させることが好ましい。
【００２９】
本発明の被検物質の肝毒性・肝障害の判定方法においては、イヌＢｓｅｐタンパク質を発現しているベシクルに加えて、さらに、ヒトＢＳＥＰタンパク質を発現しているベシクル及びラットＢｓｅｐタンパク質を発現しているベシクルを用いることが好ましく、かかる３種のベシクルを用いることにより、化学物質（被検候補薬剤）のヒト、イヌ、ラットの各ＢＳＥＰに対する応答（インビトロ）を個別に調べることができる。他方、イヌ個体及びラット個体に同一の化学物質（被検候補薬剤）を投与した場合における肝毒性・肝障害（インビボ）のデータを得ることができるが、ヒト個体における肝毒性・肝障害（インビボ）のデータを得ることは事実上できない。そこで、ラットＢｓｅｐタンパク質発現ベシクルを用いたときのインビトロデータとラット個体を用いたときのインビボデータとの比較評価、及び、イヌＢｓｅｐタンパク質発現ベシクルを用いたときのインビトロデータとイヌ個体を用いたときのインビボデータとの比較評価、並びに、ヒトＢＳＥＰタンパク質発現ベシクルを用いたときのインビトロデータから、ヒト個体を用いたときにおける肝毒性・肝障害（インビボ）の程度を予測することが可能となる。
【００３０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
＜材料と方法＞
［イヌＢｓｅｐのｃＤＮＡクローニングと塩基配列の決定］
ＮＣＢＩゲノムデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）およびＵＣＳＣゲノムデータベース(http://genome.cse.ucsc.edu/)を参考に、ヒトＢＳＥＰ ｃＤＮＡ塩基配列(ＮＭ＿００３７４２)と相同性の高いエキソン領域を含むイヌゲノムの部分塩基配列を取得し解析を行った。イヌゲノム配列は、まだ完全に配列決定が終了していないため、イヌＢｓｅｐの蛋白質コード領域であるＯｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）を正確に予想することが困難であったため、不完全な推測領域からランダムにＰＣＲプライマーを２０セット作製し、ＰＣＲを行った結果、約３５００塩基のイヌＢｓｅｐ由来の推定ｃＤＮＡ配列を得ることに成功した。得られたイヌＢＳＥＰのｃＤＮＡ推定配列を参考に、正確なイヌＢｓｅｐ遺伝子配列の確認と発現ベクターへの構築のため、イヌＢｓｅｐ遺伝子の全長塩基配列の内、５’側と３’側の２断片に分けてＰＣＲ用プライマーを再設計し、再度、ＰＣＲクローニングを試みた。逆転写反応は、５μｇのビーグル犬肝臓由来total ＲＮＡ(ユニーテック)をテンプレートに、SuperScriptFirst-Strand Synthesis System for ＲＴ−ＰＣＲ(Invitrogen)を用いて、製品添付の取扱説明書に従って行った。次に、逆転写によって得られたビーグル犬肝臓由来ｃＤＮＡ １０ｎｇを鋳型としてイヌＢｓｅｐ遺伝子の５’側と３’側をBlend-Taq(東洋紡)を用いたＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ装置はＰＣ−３２０（ＡＳＴＥＣ社）を用い、９４℃,２ｍｉｎ→（９４℃,１５ｓｅｃ→５２℃, ３０ｓｅｃ→７２℃，３ｍｉｎ）３０Ｃｙｃｌｅｓ→７２度，３ｍｉｎというサイクルで行った。５’側の増幅に用いたＰＣＲプライマー配列は、Forward：５’-TTGCAATTACCATGTCTGATGCAGTAATTCTTCGC-３’（配列番号３）、Reverse：５’-GAAGGCAATGATCATGGCCACAGTGACGTT- ３’（配列番号４）、３’側の増幅に用いたＰＣＲプライマー配列は、Forward：５’-GGAGGATTCTGAAATTCAATGCTCCAGAGT-３’（配列番号５）、Reverse：５’-TCAACTGATGGGGGCTCCTGTGGTAACTAG-３’（配列番号６）とした。各ＰＣＲ反応液におけるプライマーの終濃度は０．３μＭとした。
【００３２】
次に、得られたイヌＢｓｅｐ遺伝子の２つのＰＣＲ産物におけるｃＤＮＡ配列は、Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzerを用いたダイレクトシークエンス解析により決定された。ダイレクトシークエンスに用いたプライマー配列は、５’-TCCTATTGGGATTTTACCAG-３’（配列番号７）、５’-GAGCACAGCCCTGCAGCTTA-３’（配列番号８）、５’-TGTTGTAGATCATAAGTCTA-３’（配列番号９）、５’-GGAGGATTCTGAAATTCAATGCTCCAGAGT-３’（配列番号１０）、５’-ATCGGGAGCCTTACAGACCA-３’（配列番号１１）、５’-AAGCAGTGGATGTGGCAAAA-３’（配列番号１２）、５’- CTTTCAACCTCTTTTTTCTCACCACCAAAA-３’（配列番号１
３）である。決定したイヌＢｓｅｐ全長ｃＤＮＡ配列は、ＮＣＢＩデータバンクに登録を行った(Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿００１００３０８１)。
【実施例２】
【００３３】
［イヌＢｓｅｐのアミノ酸配列の解析］
イヌＢｓｅｐ ｃＤＮＡ配列と、既に公開されている各動物種のＢＳＥＰ（ＡＢＣＢ１１）、及びＡＢＣＢファミリーのアミノ酸配列情報を元に、日本ＤＮＡデータバンク(http://www.ddbj.nig.ac.jp) のClustalW解析サービスを利用して分子系統樹を作成した。分子系統樹の作成に用いた各遺伝子のアミノ酸配列のＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．を表１に示した。
【００３４】
【表１】
2007295929.tif 000002
【実施例３】
【００３５】
［リアルタイムＰＣＲ法による遺伝子の発現解析］
リアルタイムＰＣＲ法を用いて、イヌＢｓｅｐ遺伝子のイヌ各組織における発現量の定量を行った。実験条件は、以下の通りである。使用したプライマー配列は、Dog Bsep Forward： ５’-CCCTGGAAAAGCGTGTGTAAA-３’（配列番号１４）及びDog Bsep Reverse： ５’-TAAGGGAGCTGTTGACCAGACTA-３’（配列番号１５）を用いた。またＰＣＲ反応の内部標準として、イヌＧＡＰＤＨ増幅用のＰＣＲプライマーを用いた。イヌＧＡＰＤＨのＰＣＲプライマー配列は、Forward： ５’-TCAACGGATTTGGCCGTATTGG-３’（配列番号１６）及びReverse： ５’-TGAAGGGGTCATTGATGGCG-３’（配列番号１７）を用いた。テンプレートには、ユニーテック株式会社より購入したイヌ各組織由来のtotal ＲＮＡから逆転写反応を行い作製したｃＤＮＡを用いた。逆転写反応は、５μｇのビーグル犬肝臓由来total ＲＮＡ(ユニーテック)をテンプレートに、SuperScriptFirst-Strand Synthesis System for ＲＴ−ＰＣＲ (Invitrogen)を用いて、製品添付の取扱説明書に従って行った。リアルタイムＰＣＲ用反応液の調製は、SYBR Green ＰＣＲ Master Mix（ＡＢＩ）の取扱い説明書に従って作製した。ＰＣＲ反応は、９４℃,１５秒、６０℃,１分の２ステップで４０サイクルとし、ABI PRISM 7000(ＡＢＩ)を用いて解析した。イヌの各臓器におけるＢＳＥＰ遺伝子の発現はＧＡＰＤＨを内部標準とした相対発現量２(-ΔＣＴ)として算出した。（但し、ΔＣＴ= ＣＴtarget − ＣＴGAPDHとし、ＣＴtarget は、イヌＢｓｅｐの蛍光強度が閾値に達したサイクル数、ＣＴGAPDHは、イヌＧＡＰＤＨの蛍光強度が閾値に達したサイクル数とした。）
【実施例４】
【００３６】
［Ｂｓｅｐ発現昆虫細胞Ｓｆ９細胞膜の調製］
実施例１で増幅した２断片のイヌＢｓｅｐ遺伝子ＰＣＲ増幅産物を、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔII-ＴＯＰＯベクター(東洋紡)を用いてサブクローニングした。それぞれのクローンをＳｍａＩサイトで連結して、バキュロウイルス作製用ベクターｐＶＬ１３９２（Pharmingen）マルチクローニングサイト内のＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩサイトへ挿入し、ポリヘドリンプロモーターの下流にイヌＢｓｅｐ遺伝子の全長ｃＤＮＡを含むベクターｐＶＬ１３９３-ｄｏｇＢｓｅｐを完成した（図１)。
【００３７】
次に、ｐＶＬ１３９３-ｄｏｇＢｓｅｐベクターから、BaculoGoldTM Baculovirus Expression Vector System (Pharmingen)を使用して組換えバキュロウイルスを作製した。作製したバキュロウイルスをＳｆ９昆虫細胞に感染させ、３日後に感染細胞を遠心分離により回収した。バキュロウイルス感染Ｓｆ９昆虫細胞は、ＴＢＳバッファー(１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ(ｐＨ７．４),１５０ｍＭ ＮａＣｌ，３ｍＭ ＣａＣｌ２, ２ｍＭ ＭｇＣｌ２)で懸濁し、窒素キャビテーション法で破砕後に、２６００×ｇ, １０ｍｉｎ、遠心した。遠心して得られた上清を１．２Ｍショ糖密度勾配超遠心法(１００，０００×ｇ, ３０ｍｉｎ)で細胞膜画分を回収し、保存バッファー(５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ-Ｔｒｉｓ(ｐＨ７．４),１００ｍＭ ＫＮＯ３, ５０ｍＭ Sucrose)で懸濁することで、イヌＢｓｅｐ発現細胞膜を得た。さらにこの発現細胞膜を注射筒にて約１５回から２０回、出し入れして圧力をかけることにより、反転昆虫細胞膜ベシクルを得た。イヌＢｓｅｐとの機能比較のために用いたヒトＢＳＥＰ及びラットＢｓｅｐ発現昆虫細胞Ｓｆ９細胞膜は、市販のABC Transporter Vesicles（株式会社ジェノメンブレン社製）を使用した。
【実施例５】
【００３８】
［ウエスタンブロット法による解析］
精製したイヌＢｓｅｐ発現昆虫細胞Ｓｆ９細胞膜２０μｇを２×ＳＤＳ Sample buffer（ナカライテスク）で可溶化し、ミニプロティアン電気泳動システム(BioRad)により、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。泳動バッファーは、１０×Ｔｒｉｓ/Gricine/ＳＤＳ(BioRad)を１０倍希釈して作製した。電気泳動は、７．５％ポリアクリルアミドゲル(BioRad)を用いて行い、続いてトランスブロットＳＤシステム(BioRad)を用いてＨｙｂｏｎｄ−Ｐメンブレン(Amersham)に蛋白質を転写し、ブロッキングワン(ナカライテスク)でＨｙｂｏｎｄ−Ｐメンブレンを１時間、ブロッキング操作を行った。抗体との反応は、ブロッキングワン（ナカライテスク）をＰＢＳ(１４０ｍＭ ＮａＣｌ;４０ｍＭ ＫＣｌ;１０．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４;１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４)で１０倍希釈した緩衝液を使用した。タンパク質を固定したＨｙｂｏｎｄ−Ｐメンブレンは、１００倍希釈したgoat anti-ＢＳＥＰ(Ｎ１６) antibody (SantaCruz)により一次抗体反応を行った後、ＰＢＳＴ(１４０ｍＭ ＮａＣｌ;４０ｍＭ ＫＣｌ;１０．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４;１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４;０．５％ Ｔｗｅｅｎ)による洗浄を１０分×３回行った。次に、二次抗体反応として蛋白質固定メンブレンを１０００倍希釈したdonkey anti-goat antibody(SantaCruz)により１時間処理した後、ＰＢＳＴによる洗浄を１０分×３回行い、発光検出試薬としてケミルミワン(ナカライテスク)を使用し、発光検出装置としてLAS1000UV(富士フィルム)を用いてＢＳＥＰ由来の特異的な発光シグナルの検出を行った。
【００３９】
［ＢＳＥＰベシクル輸送実験］
ヒトＢＳＥＰ、ラットＢｓｅｐ、イヌＢｓｅｐ発現昆虫細胞Ｓｆ９細胞膜から得られた反転細胞膜ベシクルを使用して迅速ろ過法による輸送実験を行った(非特許文献６参照)。５０μｇのＢｓｅｐ発現反転細胞膜ベシクルと、２μＣｉの[3Ｈ]-taurocholate（PerkinElmer）、及びSodium taurocholate(SIGMA)を基質として反応バッファー(１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ-Ｔｒｉｓ(ｐＨ７．４), １００ｍＭ ＫＮＯ３, １０ｍＭ Ｍｇ(ＮＯ３)2, ５０ｍＭ Sucrose) に添加後、３７℃，５分間のプレインキュベーションを行った。次に、ＭｇＡＴＰ又はＭｇＡＭＰ（陰性対照）を終濃度４ｍＭとなるように添加して反応を開始した。反応液の全量を６０μｌとして、３７℃，０〜１０分の反応後、２００μｌの氷冷した停止バッファー(１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ-Ｔｒｉｓ(ｐＨ７．４), １００ｍＭ ＫＮＯ３, ５０ｍＭ Sucrose, １００μＭ Taurocholate)を反応液に添加した。停止した反応液は、９６穴グラスフィルタープレート(Millipore)で吸引濾過し、続いて各ウェルに２００μｌの停止バッファーを５回添加することで、フィルターの洗浄を行った。洗浄後の９６穴グラスフィルタープレートから、各フィルターを取り外してＰｏｌｙＱバイアル（PerkinElmer）に添加し、さらに液体シンチレーションカクテルＵＬＴＩＭＡ ＧＯＬＤ（PerkinElmer）を添加した。各フィルターサンプルの放射活性は液体シンチレーションカウンター(ALOKA)で測定した。
【００４０】
［薬剤によるＢＳＥＰ発現膜のタウロコール酸輸送阻害作用比較実験］
ヒトＢＳＥＰ、ラットＢｓｅｐ、イヌＢｓｅｐ発現昆虫細胞Ｓｆ９細胞膜から得られた反転細胞膜ベシクル５０μｇを使用して迅速ろ過法による輸送実験を行った。ＡＴＰの存在下、各種薬剤を含む上記反応バッファー（ｐＨ７．４）中、１．４μＭの[3Ｈ]-taurocholic acidの取込み量を３７℃で２分間測定した。
【００４１】
＜結果＞
［イヌＢｓｅｐのクローニング及びアミノ酸配列の解析］
イヌＢｓｅｐ推定塩基配列を参考に設計したＰＣＲプライマーによるＲＴ−ＰＣＲの結果、イヌＢｓｅｐの全長塩基配列をカバーする、５’側と３’側の２つのＢｓｅｐに由来する特異的なＰＣＲ産物を検出することができた(図２)。それぞれのＰＣＲ産物の塩基配列を解析した結果、イヌＢｓｅｐのＯＲＦは全長３９８０塩基から構成されることが明らかになった。塩基配列を配列番号１、アミノ酸配列を配列番号２に示す。イヌＢｓｅｐのｃＤＮＡ塩基配列から予想されるアミノ酸配列は１３２５残基であり、１２ヶ所の膜貫通領域と、２組のWalker A、Walker B、及びＡＢＣトランスポーターファミリーシグネイチャーの存在が示唆された(図３、４)。
【００４２】
ＮＣＢＩデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)に登録されている他の哺乳類動物種のイヌＢＳＥＰとのアミノ酸配列の相同性を調べた結果、イヌＢｓｅｐと相同性が最も高かったのはヒトの８９％であり、続いてウサギの８６％、ラット、マウスの７９％の順となった。また、イヌＢｓｅｐとヒトＡＢＣＢファミリーに対するアミノ酸配列の相同性において、ヒトＢＳＥＰ(ＡＢＣＢ１１)との相同性８９％と最も高く、続いてＭＤＲ１（ＡＢＣＢ１）の５０％，ＡＢＣＢ４の４８％となり、それ以外のＡＢＣＢファミリーに対する相同性は４０％未満と低い結果となった。イヌＢｓｅｐ及びヒト、ウサギ、マウス、ラットＢＳＥＰのアミノ酸配列を用いて、日本ＤＮＡデータバンクのＣｌｕｓｔａｌＷ解析サービスを利用し、分子系統樹を作成した。この結果、イヌＢｓｅｐは、分子進化上、他の哺乳類４種のＢＳＥＰから最も遠い位置に存在することが示唆された(図５)。また、ヒトのＡＢＣＢファミリー(Ｂ１〜Ｂ１１)、及びイヌＡＢＣＢ１と共に同様の方法で分子系統樹を作成したところ、イヌＢｓｅｐは、ヒトＢＳＥＰ(ＡＢＣＢ１１)と最も近縁であることが示された(図６)。
【００４３】
［リアルタイム定量ＰＣＲ法によるＢＳＥＰ遺伝子の発現解析］
イヌ由来、小腸、大腸、骨格筋、腎臓、精巣、心臓、肺、胃、脾臓、肝臓の１０組織におけるイヌＢｓｅｐ遺伝子の発現を確認するために、リアルタイム定量ＰＣＲ法による遺伝子の発現解析を行った(図７)。この結果、イヌＢｓｅｐがイヌ肝臓で特異的に高い発現を示す遺伝子であることが明らかとなった。
【００４４】
［ウエスタンブロット法によるＢＳＥＰの発現検出］
イヌ、ヒト、ラットのＢＳＥＰ発現昆虫細胞膜を、それぞれ２０μｇ用い、抗ＢＳＥＰ抗体を用いてウエスタンブロット法により解析を行った(図８)。この結果、ＢＳＥＰ発現膜からＳｆ９細胞のコントロール細胞膜には存在しない約１６０ｋｂの特異的なシグナルを検出することに成功した。本解析に用いた一次抗体は、ヒトＢＳＥＰアミノ酸配列のエピトープに対して作製されたポリクローナル抗体であるが、ヒトＢＳＥＰだけでなく、ラットＢｓｅｐ、イヌＢｓｅｐに対しても交叉性が認められることが明らかになった。ウエスタンブロットによって検出されたシグナルの位置から、ラットＢｓｅｐのシグナルがヒトＢＳＥＰ、イヌＢｓｅｐよりもわずかに分子量の小さい位置に検出されることが明らかになった。
【００４５】
［ＢＳＥＰ発現膜によるタウロコール酸輸送実験］
イヌ、ヒト、ラット三種のＢＳＥＰ発現膜を利用して、反転細胞膜ベシクルによる輸送実験を行った。ヒト、マウス、ラットのＢＳＥＰにおいて典型的な基質とされているタウロコール酸のラジオアイソトープ標識体、[3Ｈ]-taurocholate（PerkinElmer）を基質として、３７℃，２分間の反応におけるイヌＢｓｅｐ発現反転細胞膜ベシクル５０μｇに対する取込み量を、ヒト及びイヌＢＳＥＰ発現反転細胞膜ベシクルとＳｆ９細胞にバキュロウイルスのみを感染させたコントロールベシクルとの間で比較した(図９)。この結果、コントロールベシクルにおいては、ＡＴＰ依存的な[3Ｈ]-taurocholateの取込みがほとんど見られなかったのに対し、ヒトＢＳＥＰ及びイヌＢｓｅｐ発現膜ベシクルにおいては、タウロコール酸の顕著な取込み量上昇が確認された。
【００４６】
イヌＢｓｅｐによるタウロコール酸輸送の分子機構を詳細に検討するため、イヌＢｓｅｐ発現反転細胞膜ベシクルのＡＴＰ依存的なタウロコール酸輸送量の経時変化を検討した(図１０)。この結果、イヌＢｓｅｐによるタウロコール酸取込は、試験開始後２分まで反応時間に比例したタウロコール酸輸送量の上昇を示すことが明らかになった。
次に、イヌ、ヒト、ラットのＢＳＥＰによるタウロコール酸取込における濃度依存性を検討した(図１１)。取込量の測定は、すべて３７℃、２分の条件で行った。この結果、イヌ、ヒト、ラット三種類のＢＳＥＰすべてにおいて、タウロコール酸濃度が約１０μＭまでは、タウロコール酸の濃度に依存して輸送速度が上昇していることが明らかになった。本測定結果をミカエリス・メンテン式( ｖ=Ｖmax/(１+(Ｋｍ/[Ｓ])))により解析し、Ｋｍ値及びＶmax値を算出した(表２)。決定されたＫｍ値はイヌ＞ラット＞ヒトの順に高かった。
【００４７】
【表２】
2007295929.tif 000003
【００４８】
［薬剤によるＢＳＥＰ発現膜のタウロコール酸輸送阻害作用比較実験］
各種化合物添加時のイヌ、ヒト及びラットのＢＳＥＰのタウロコール酸輸送阻害を、上記の[3Ｈ]-taurocholic acidの取込み量を測定し、無添加の場合と比較した。結果を表３に示す。各数値はｎ＝４の平均と標準偏差を表し、各データは、ＢＳＥＰ発現膜ベシクルによる取込み量からモック発現膜ベシクルによる取込み量を減じることにより得られたものである。この結果、終濃度で１００μＭのグリベンクラミド(Glibenclamide)、５００μＭのビンブラスチン(vinblastine)、５００μＭのビンクリスチン(vincristine)、１００μＭのシクロスポリンＡ(cyclosporin A)、１００μＭのタウロリトコール酸(taurolithocholic acid;TLCA)、５００μＭのリファンピシン(refampicin)、１００μＭのトログリタゾン(troglitazon)を添加した場合は、イヌ、ヒト、ラットの全てのＢＳＥＰで阻害作用が認められ、プラバスタチン(pravastatin)を終濃度１００μＭ添加した場合は、ラットを除き、イヌおよびヒトのＢＳＥＰのみで阻害作用が見られた。これに対して、ｐ−アミノ馬尿酸（p-aminohippuric acid ;PAH）、エストラジオール−１７β−グルクロニド（estradiol-17b-glucuronide;E217βG）、テトラエチルアンモニウム（tetraethylammonium;TEA）、グルタチオン（glutathione;GSH）、グリココール酸（glycocholic acid;GCH）を終濃度５００μＭ添加した場合でも阻害作用が見られなかった。
【００４９】
【表３】
2007295929.tif 000004
【００５０】
ＢＳＥＰによるタウロコール酸輸送に対する、プラバスタチン及びトログリタゾンの阻害効果の濃度依存性を検討した。イヌ、ヒト及びラットにおけるＩＣ５０は、プラバスタチンについて４４１μＭ、２４０μＭ、１０００μＭ以上、トログリタゾンについて５０μＭ、２８μＭ、９５μＭをそれぞれ示した。ヒトＢＳＥＰにおけるプラバスタチン及びトログリタゾンのＩＣ５０は、ラットＢｓｅｐにおける値と比較し、イヌＢｓｅｐにおける値により近いことが判明した(図１２)。
【００５１】
＜考察＞
本報告ではヒトＢＳＥＰ(bile salt export pump ,ＡＢＣＢ１１)に対応するイヌのオルソログである新規遺伝子、イヌＢｓｅｐの遺伝子をクローニングし、全長塩基配列、主要臓器における遺伝子発現分布及び昆虫細胞バキュロウイルス系による蛋白質レベルでの機能解析に、世界で初めて成功することができた。本報告において決定した新規遺伝子イヌＢｓｅｐの全長塩基配列は、”Canis ATP-binding cassette protein Ｂ１１(Ｂｓｅｐ)ｍＲＮＡ, complete cds.”（ＮＭ＿ＤＱ１５７４３１）としてＮＣＢＩ データベース(http://www.ncbi.nlm.nih. gov)に登録した。
【００５２】
分子系統樹を作成することによりイヌ及びヒト、マウス、ラット、ウサギでのＢｓｅｐオルソログのアミノ酸配列を解析した結果、イヌＢｓｅｐはヒト、マウス、ラット、ウサギから最も遠縁であることが示された。しかし、前述の動物種の中で最も遠縁であったマウス、及びラットでもアミノ酸相同性は７９％であることから、ＢＳＥＰ遺伝子の配列はこれらの動物種の間で非常に高い相同性が保持されている生理学的に重要な遺伝子であると推察される。イヌＢｓｅｐのアミノ酸配列解析から、イヌＢｓｅｐ蛋白質には膜貫通ドメイン(１２ヶ所)、Walker A、Walker B、ＡＢＣトランスポーターファミリーシグネイチャー(各２ヶ所)が存在すると予想されることから、ヒト、ウサギ、マウス、ラットＢｓｅｐと同様に典型的なＡＢＣトランスポーターであり、イヌにおける胆汁酸輸送トランスポーターであると予測された。
【００５３】
リアルタイム定量ＰＣＲ法により、イヌＢｓｅｐ遺伝子の発現分布を検討した結果、ヒト(非特許文献７)やラット(非特許文献６)のＢＳＥＰで報告されている結果と同様に、イヌ肝臓でのみ特異的に高発現している遺伝子であることが分かった。さらに、イヌＢｓｅｐ発現Ｓｆ９細胞膜から作製された反転細胞膜ベシクル輸送実験の結果、イヌＢｓｅｐはヒトＢＳＥＰやラットＢｓｅｐと同様に、タウロコール酸をＡＴＰ依存的に輸送することが明らかになり、肝臓に特異的に発現しＡＢＣＢファミリーに属する胆汁酸排泄型ＡＢＣトランスポーターであることが同定された。
【００５４】
ＢＳＥＰ発現細胞膜ベシクルを用いたタウロコール酸輸送における濃度依存性の測定結果を、ミカエリス・メンテン式により解析した結果、各動物種におけるＢＳＥＰのタウロコール酸に対する親和性を示すＫｍ値は、ヒトＢＳＥＰ：１９．９μＭ、ラットＢｓｅｐ：２２．２μＭ、イヌＢｓｅｐ：３３．７μＭであり、比較近似の測定値が得られている(表２)。しかし、ヒトとイヌではＫｍ値で約１．５倍の差が見られていることから、このタウロコール酸に対する親和性の差は、動物間でのアミノ酸配列レベルでの差異(１０〜２０％程度)により引き起こされている可能性が高いと推測された。すなわち、動物間でのアミノ酸配列の差異がＢＳＥＰの基質特異性を変化させることで、胆汁酸排泄及び薬剤とＢＳＥＰ間のDrug-Protein Interactionの動物種差に、大きな影響を与えている可能性が高い。事実、ヒト及びラットＢＳＥＰでは８２．３％と非常に高いアミノ酸相同性を保持しているにも関わらず、ヒト及びラットＢＳＥＰのタウロリトコール酸硫酸抱合体(ＴＬＣ−Ｓ)に対する基質認識性が異なる可能性を示す報告がなされている(Biochim. Biophys. Acta. 2005 Nov 15参照)。よって、今後このようなＢＳＥＰの各実験動物間における分子レベルでの胆汁酸輸送活性及び阻害活性結果が、薬剤の肝毒性を医薬品の開発初期に予測するための重要なデータになるだけではなく、実験動物の薬物動態データをヒトに外挿する場合の判断基準（動物種差の問題解決の手段）として、極めて重要になってくるであろうと考えられる。
【００５５】
ヒト、マウス、ラットのＢＳＥＰに関しては、シクロスポリンＡ、グリベンクラミド、リファンピシン、トログリタゾンなど、ＢＳＥＰによるタウロコール酸輸送を直接阻害する薬剤が複数、報告されている(Hepatology. 2001 May;33(5):1223-31.、Gastroenterology. 2000 Feb;118(2):422-30.、Mol. Pharmacol. 2001 Mar;59(3):627-35.参照。)。また、プラバスタチンやパクリタキセルなどの薬物そのものがＢＳＥＰの基質となって、タウロコール酸輸送を競争的に阻害する可能性を示す報告もなされている(J Pharmacol. Exp. Ther.. 2005 Aug;314(2):876-82.,18、Cancer Res. 1998 Sep 15;58(18):4160-7.参照。)。
【００５６】
上記実施例において、ヒト、マウス、ラットのＢＳＥＰ発現細胞膜のタウロコール酸輸送が、シクロスポリンＡ、グリベンクラミド、リファンピシン、トログリタゾンにより強く阻害されることが確認され、上記の報告の結果と合致した。特にプラバスタチンについては、イヌＢｓｅｐ及びヒトＢＳＥＰに対し、ラットＢｓｅｐに対しては見られない高度に特異的な阻害作用が確認された。また、トログリタゾンは、ヒトＢＳＥＰを最も強く阻害し、続いてイヌＢｓｅｐ、ラットＢｓｅｐの順に阻害作用を示すことが判明した。
【００５７】
ＢＳＥＰによるタウロコール酸排泄の阻害は、肝細胞内の胆汁酸濃度上昇を引き起こすため、胆汁うっ滞の原因になり得る。また、肝細胞内の胆汁酸濃度や組成の変化に応じて、核内レセプターＦＸＲを活性化してタウロコール酸を胆管に排泄するＢＳＥＰ遺伝子や、タウロコール酸を血中に戻すＭＲＰ３、ＭＲＰ４遺伝子の転写を調節する制御機構の存在も示唆されている(Physiol. Rev. 2003 Apr;83(2):633-71.参照。)。このような薬物トランスポーターの転写制御機構はＢＳＥＰやＭＲＰをはじめとするＡＢＣトランスポーターのみならず、取込型のＳＬＣトランスポーターや薬物代謝酵素などにおいても確認されており、薬剤投与によるこれらの遺伝子の発現量を転写レベルで調べることは、生体の防御機構や薬剤の肝毒性を予測する上で、今後、極めて重要となってくるであろうと考えられる。また、転写および翻訳後のラットＢｓｅｐとＭｒｐ２の細胞膜への移行が、Ｅ2１７βＧにより抑制されるなどの報告がある(Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 288: G327-G336, 2005.、Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2003 Aug;285(2):G449-59.参照。)。ＢＳＥＰは進行性家族性胆汁うっ滞の原因遺伝子として複数のＳＮＰが存在し、これらのＳＮＰはＢＳＥＰの輸送機能や膜移行能の低下を招いて胆汁うっ滞を引き起こすと考えられている（Hepatology. 2005 Apr;41(4):916-24.、J. Hepatol. 2005 Sep;43(3):536-43.参照。)。
【００５８】
ヒト、イヌ及びラットＢＳＥＰは、基質特異性、親和性等の機能において動物間種差を有することが明らかになっているが、本発明に係るイヌＢｓｅｐは、プラバスタチンやトログリタゾンに対する応答が、ラットＢｓｅｐと比較してよりヒトＢＳＥＰに近似している。よって、本発明に係るイヌＢｓｅｐを用いることにより、医薬品開発の初期段階における、ヒトに対する毒性の予測がより適切に行われる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】本発明のイヌＢｓｅｐのｐＶＬ１３９２ベクターへの全長クローニングストラテジーを示す図である。
【図２】本発明のイヌ肝臓におけるＢｓｅｐ遺伝子の検出を示す図である。マーカー：１ｋｂＤラダー(東洋紡) レーン１：５’側ＰＣＲ産物(２７０６塩基) レーン２：３’側ＰＣＲ産物(１７４３塩基)
【図３】本発明の新規イヌＢｓｅｐと他動物種Ｂｓｅｐのアミノ酸アライメントを示す図である。予測される膜貫通ドメイン(１２ヶ所)、Walker A、Walker B、ＡＢＣトランスポーターファミリーシグネイチャー(各２ヶ所)をそれぞれＴＭ１〜１２、ＷＡ、ＷＢ、ＡＢＣで示した。また、全てのＢｓｅｐに共通なアミノ酸部位の下に*を示した。
【図４】本発明の予想されるイヌＢｓｅｐの膜トポロジーを示す図である。図３の解析結果から予測されるイヌＢｓｅｐの膜トポロジーを示した。１〜１２は膜貫通ドメイン、ＷＡ、ＷＢ、ＡＢＣはそれぞれWalker A、Walker B、ＡＢＣトランスポーターファミリーシグネイチャーを示す。
【図５】本発明の各動物種におけるＢＳＥＰ(ＡＢＣＢ１１)系統樹を示す図である。各動物種間におけるＢＳＥＰ(ＡＢＣＢ１１)のアミノ酸相同性に基づいて作成した。詳細な作成方法は、材料及び方法に示した。
【図６】本発明のイヌＢｓｅｐを含むＡＢＣＢファミリーの系統樹を示す図である。イヌＢｓｅｐを含むＡＢＣＢファミリーの系統樹を作成した。詳細な作成方法は、材料及び方法に示した。
【図７】本発明のイヌＢｓｅｐの遺伝子発現解析を示す図である。イヌＢｓｅｐ遺伝子の相対発現量(縦軸)をΔCT=CT target - CT GAPDHとした場合の２(-ΔCT)として算出した。(CT targetはイヌＢｓｅｐ蛍光強度が閾値に達したサイクル数、CT GAPDHはイヌGAPDH蛍光強度が閾値に達したサイクル数)
【図８】本発明のＢＳＥＰ発現昆虫細胞膜のウエスタンブロット解析を示す図である。１次抗体：sc-17292(ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ)、２次抗体：sc2020(ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ)、Control：ＢＳＥＰ非発現Ｓｆ９細胞膜、Human：ヒトＢＳＥＰ発現Ｓｆ９細胞膜、Rat：ラットＢｓｅｐ発現Ｓｆ９細胞膜、Dog：イヌＢｓｅｐ発現Ｓｆ９細胞膜である。
【図９】本発明のＢＳＥＰ発現反転細胞膜ベシクルのタウロコール酸輸送実験を示す図である。ＡＴＰ添加時の取込み量とＡＭＰ添加時の反転細胞膜ベシクルにおける取込み量を比較した。各レーン左側のバーがＡＴＰ添加時、右側のバーがＡＭＰ添加時のタウロコール酸取込み量を示す。反応条件：１．４μＭ [3Ｈ]-taurocholate、反応温度:３７℃、反応時間：２分、１反応当りの反転細胞膜ベシクル５０μｇ。Control：Ｂｓｅｐ非発現反転細胞膜ベシクル、Human：ヒトＢＳＥＰ発現反転細胞膜ベシクル、Dog：イヌＢｓｅｐ発現反転細胞膜ベシクルである。
【図１０】本発明のＢＳＥＰ発現反転細胞膜ベシクルのタウロコール酸輸送実験おける輸送量の経時変化を示す図である。ＡＴＰ添加時の取込み速度とＡＭＰ添加時の発現細胞膜ベシクルにおける取込み速度の差をＡＴＰ依存的輸送速度としてプロットした。基質濃度：６．４μＭタウロコール酸、反応条件：３７℃、０〜５分、１反応当りの反転細胞膜ベシクルは５０μｇであった。
【図１１】本発明のＢＳＥＰ発現反転細胞膜ベシクルのタウロコール酸輸送実験おける輸送速度の濃度依存性を示す図である。ＡＴＰ添加時の取込み速度とＡＭＰ添加時の膜ベシクルにおける取込み速度の差をＡＴＰ依存的輸送速度としてプロットした。基質濃度：１.４〜５１.４μＭタウロコール酸、反応条件：３７℃、２分。１反応当りの反転細胞膜ベシクルは５０μｇであった。
【図１２】本発明のＢＳＥＰ発現反転細胞膜ベシクルのタウロコール酸輸送実験おけるプラバスタチン及びトログリタゾンの阻害効果を示す図である。タウロコール酸のラジオアイソトープ標識体、[3Ｈ]-taurocholate（PerkinElmer）を基質として、プラバスタチン及びトログリタゾン添加時の３７℃，２分間の反応におけるイヌＢｓｅｐ発現反転細胞膜ベシクルに対する取込み量の減少を、ヒト及びラットＢＳＥＰ発現反転細胞膜ベシクルとの間で比較した。
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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