(57)【要約】 【課題】アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害作用を有するペプチドの新規な製造方法の提供。【解決手段】水溶液中で微細藻類をタンパク質分解酵素で処理してペプチド類を水溶液中に抽出させる抽出工程（１）と、得られたペプチド類を含有する水溶液を、２０〜６０体積％エタノール水溶液を溶離媒体として吸着樹脂を用いて処理する精製工程（３）と、を有することを特徴とするＡＣＥ阻害作用を有するペプチドの製造方法。抽出工程（１）の後に、抽出工程（１）で用いたものとは作用の仕方が異なるタンパク質分解酵素で微細藻類を処理して、ペプチド類を水溶液中に抽出させる抽出工程（２）を行ってから、精製工程（３）を行っても良い。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶液中で微細藻類をタンパク質分解酵素で処理してペプチド類を水溶液中に抽出させる抽出工程（１）と、得られたペプチド類を含有する水溶液を、２０〜６０体積％エタノール水溶液を溶離媒体として吸着樹脂を用いて処理する精製工程（３）と、を有することを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有するペプチドの製造方法。
【請求項２】
前記抽出工程（１）の後に、抽出工程（１）で用いたものとは作用の仕方が異なるタンパク質分解酵素で微細藻類を処理して、ペプチド類を水溶液中に抽出させる抽出工程（２）を行ってから、前記精製工程を行う請求項１に記載のアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有するペプチドの製造方法。
【請求項３】
前記吸着樹脂が、芳香族環上の水素原子がハロゲン原子で置換されていないポリスチレン系吸着樹脂である請求項１又は２に記載のアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有するペプチドの製造方法。
【請求項４】
カラムに充填された前記吸着樹脂を用いて前記精製工程を行う請求項１〜３のいずれか一項に記載のアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有するペプチドの製造方法。
【請求項５】
前記微細藻類がスピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）である請求項１〜４のいずれか一項に記載のアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有するペプチドの製造方法。
【請求項６】
前記スピルリナが、水、有機溶媒、又は超臨界抽出ガスによる抽出工程を経た後の残渣スピルリナである請求項５に記載のアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有するペプチドの製造方法。
【請求項７】
前記微細藻類がクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）である請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドの製造方法。
【請求項８】
前記クロレラが、水、有機溶媒、又は超臨界抽出ガスによる抽出工程を経た後の残渣クロレラである請求項７に記載のペプチドの製造方法。
【請求項９】
前記微細藻類がヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）である請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドの製造方法。
【請求項１０】
前記ヘマトコッカスが、水、有機溶媒、又は超臨界抽出ガスによる抽出工程を経た後の残渣ヘマトコッカスである請求項９に記載のペプチドの製造方法。
【請求項１１】
前記微細藻類がドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）である請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドの製造方法。
【請求項１２】
前記ドナリエラが、水、有機溶媒、又は超臨界抽出ガスによる抽出工程を経た後の残渣ドナリエラである請求項１１に記載のペプチドの製造方法。
【請求項１３】
前記タンパク質分解酵素が微生物由来のタンパク質分解酵素である請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有するペプチドの製造方法。
【請求項１４】
前記微生物由来のタンパク質分解酵素が、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属由来のタンパク質分解酵素およびバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来のタンパク質分解酵素からなる群から選ばれる１種以上である請求項１３に記載のアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有するペプチドの製造方法。
【請求項１５】
前記タンパク質分解酵素が、動物性消化酵素である請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有するペプチドの製造方法。
【請求項１６】
前記動物性消化酵素がペプシンである請求項１５に記載のアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有するペプチドの製造方法。
【請求項１７】
前記２０〜６０体積％エタノール水溶液が、２０〜３０体積％エタノール水溶液であり、前記吸着樹脂が、芳香族環上の水素原子がハロゲン原子で置換されていないポリスチレン系吸着樹脂である請求項１〜１６のいずれか一項に記載のアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有するペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンジオテンシン変換酵素阻害作用を有するペプチドの新規な製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アンジオテンシンは、腎静脈中に分泌されるレニンが血漿中のα２グロブリン分画に含まれるレニン基質に作用してつくられるポリペプチドであり、まずアンジオテンシンＩがつくられるが、これは生物学的活性を有しない。アンジオテンシンＩは、循環血液中で主に肺循環の間にアンジオテンシン変換酵素（以下ＡＣＥと略記する）の作用により２個のアミノ酸を失いアンジオテンシンＩＩに変換される。
レニンとアンジオテンシンは体内の重要な昇圧系を構成し、レニン−アンジオテンシン系と呼ばれるが、そのおもな作用物質はアンジオテンシンＩＩである。臨床的に最も重要なアンジオテンシンＩＩの作用は血圧上昇作用であり、血管平滑筋を収縮して血圧を上昇させる体内の最も強力な昇圧物質である。その血管収縮作用は細動脈で強いが静脈系で弱く、また、腎・内臓血管領域で強いが四肢、脳、心、肺では弱い特徴を有する。アンジオテンシンＩＩは、生体のナトリウム平衡と血圧維持に重要な役割を果たしており、ナトリウム消失、血圧下降時には、レニン、アンジオテンシンＩＩが上昇し、直接的にはアルドステロン分泌を介して、ナトリウム貯留と血圧上昇にはたらく。また、高血圧疾患では、高血圧の成因ないし維持機構に重要な役割を果たしている（非特許文献１）。
【０００３】
以上のように、ＡＣＥ阻害剤は、アンジオテンシンＩからアンジオテンシンＩＩを生成する変換酵素の作用を阻害することにより、アンジオテンシンＩＩの生成を特異的に抑制し、アンジオテンシンＩＩの血漿濃度を低下させ、降圧作用を示す。
これまで、ＡＣＥ阻害物質としては、天然物又は天然物由来の物質として蛇毒由来のブラデイキニン増強因子（非特許文献２）、ゼラチンのコラゲナーゼ消化物由来の６種類のペプチド（非特許文献３）、牛カゼインのトリプシン消化物由来のペプチド（非特許文献４）、イワシ筋肉由来の５種のヘクサペプチド（特許文献１）、海苔由来のテトラペプチド（特許文献２）、並びにペンタペプチド（特許文献３）、朝鮮人参由来のペンタペプチド（特許文献４）、クロレラ由来のペンタペプチド（特許文献５）が挙げられ、いずれもＡＣＥ阻害剤となり得ることが開示されている。
更に、合成法により得た鎖長の短いジ、トリペプチド（特許文献６、特許文献７）についての提案は行われているが、発見されてから長時間経過しているものの、未だ医薬品としての開発が進んでいるとの報告はない。
【０００４】
近年、健康意識の向上から、当該ＡＣＥ阻害作用を有するペプチドを含有する健康食品も開発されてきている。例えば、わかめから抽出されるペプチドとして、Ｐｈｅ−Ｔｙｒ、もしくはＶａｌ−Ｔｙｒ、又はＩｌｅ−Ｔｙｒ等を含むゼリー食品、Ｖａｌ−Ｐｒｏ、又はＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを含む乳酸飲料等が開発され、販売されている。
しかしながら、微細藻類を原料として用い、効率よくＡＣＥ阻害作用を有するペプチドを得る方法はこれまでに開示されていない。
【０００５】
次に、微細藻類のタンパク質分解酵素による処理方法に関しては、特許文献８に、栄養成分が豊富で、微細藻類特有の味、臭いが少なく、かつ、食品に添加しても沈殿物や不溶物が析出しない微細藻類水抽出液の製造方法に関する記載がある。
しかしながら、これらの従来技術においては、ＡＣＥ阻害作用を有するペプチドを得る方法については、記載も示唆もされてもいなかった。
【非特許文献１】医科学大辞典、９４ページ、１９８２年、講談社
【非特許文献２】Ｓ．Ｈ．Ｆｅｒｒｅｉａ ｅｔ ａｌ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９，３５８３（１９７０）
【非特許文献３】Ｇ．Ｏｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ：Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｓ．Ａｃｔａ，５６６，１２８（１９７９）
【非特許文献４】Ｓ．Ｍａｒｕｙａｍａ ｅｔ ａｌ．：Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４６，１３９３（１９８３）
【特許文献１】特許第２０４６４８３号公報
【特許文献２】特許第２６７８１８０号公報
【特許文献３】特開平１０−３６３９１号公報
【特許文献４】特許第２９２０８２９号公報
【特許文献５】特許第２９９０３５４号公報
【特許文献６】特許第９４８０７１号公報
【特許文献７】特開平６−１６５６８号公報
【特許文献８】特開２００４−２０４０３４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、ＡＣＥ阻害作用を有するペプチドの新規な製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討を行った結果、以下の知見を得た。すなわち、
（１）微細藻類をタンパク質分解酵素で処理することにより、ペプチド類が得られること、
（２）当該ペプチド類を、所定の溶離媒体により吸着樹脂を用いて処理することで、優れたＡＣＥ阻害作用を有するペプチドが得られること
（３）特に、異なる二種類のタンパク質分解酵素で微細藻類を段階的に処理することにより、得られるペプチドのＡＣＥ阻害の総活性が高まること
を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、水溶液中で微細藻類をタンパク質分解酵素で処理してペプチド類を水溶液中に抽出させる抽出工程（１）と、得られたペプチド類を含有する水溶液を、２０〜６０体積％エタノール水溶液を溶離媒体として吸着樹脂を用いて処理する精製工程（３）と、を有することを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有するペプチドの製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ＡＣＥ阻害作用を有するペプチドを効率よく低コストで製造することができ、血圧低下剤、健康食品、食品等の製造に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いられる微細藻類は、水中に生育する微細な藻類であって、光合成をする植物のうち、大きさ数ミクロン〜数百ミクロンの植物プランクトンであり、例えば、スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）属、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、アファニゾメノン（Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ）属、フィッシェレラ（Ｆｉｓｈｅｒｅｌｌａ）属、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）属、ネンジュモ（Ｎｏｓｔｏｃ）属、スイゼンジノリ（Ａｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ）属、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）属、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属等が挙げられるが、工業的規模で生産され、その安全性が確認されているスピルリナ属、クロレラ属、ヘマトコッカス属、ドナリエラ属、セネデスムス属に属するものが好ましく、なかでもスピルリナ属に属するものがより好ましい。
【００１１】
スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）とは、藍藻類（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）に包含され、従来一括してスピルリナ属と呼称されていたアルスロスピラ属（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ）及びスピルリナ属（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）に属する微細な単細胞微生物であり、例えばアルスロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、アルスロスピラ・マキシマ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｍａｘｉｍａ）、アルスロスピラ・ゲイトレリ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｇｅｉｔｌｅｒｉ）、アルスロスピラ・サイアミーゼ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｓｉａｍｅｓｅ）、スピルリナ・メイヤー（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｍａｊｏｒ）、スピルリナ・サブサルサ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｓｕｂｓａｌｓａ）、等が挙げられるが、中でも、人工的に培養でき、入手が容易なことから、アルスロスピラ・プラテンシス、アルスロスピラ・マキシマ、アルスロスピラ・ゲイトレリ、アルスロスピラ・サイアミーゼが好ましい。
【００１２】
クロレラは、クロレラ属の微細藻類であり、入手が容易で、安全性に優れている点で、例えば、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ)、クロレラ ・レギュラリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｒｅｇｕｌａｒｉｓ）、クロレラ・ピレノイドーサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）、クロレラ・エリプソイデア（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｉｄｅａ）等が好ましい。
ヘマトコッカスは、緑藻綱ボルボックス目クラミドモナス科ヘマトコッカス属に属する藻類であり、食品や飼料として付加価値の高いカロチノイド色素であるアスタキサンチン生産藻類として有用である。
ドナリエラは、イスラエルの死海で発見された微細藻類であり、抗酸化作用を有するカロチノイドを豊富に含んだ微細藻類で、特にβ‐カロチンの生産藻類として有用である。
セネデスムスは、セネデスムス属に属する緑藻であり、和名「イカダモ」と呼ばれ、例えば、セネデスムス・アクタス（Ｓ．ａｃｕｔｕｓ）、セネデスムス・バシレンシス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ）、セネデスムス・ビジュガ（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｂｉｊｕｇａ）、セネデスムス・クロレロイド（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｃｈｌｏｒｅｌｌｏｉｄｅｓ）、セネデスムス・コスタラタス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｃｏｓｔｕｌａｔｕｓ）、セネデスムス・ナヌス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ ｎａｎｕｓ）、セネデスムス・オブリカス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｏｂｌｉｑｕｕｓ）等の藻類が知られている。
【００１３】
本発明で用いられる微細藻類としては、生の微細藻類、乾燥処理を施した微細藻類、微細藻類の由来成分等が挙げられる。生の微細藻類は、例えば、水中で培養された微細藻類を遠心分離、濾過等の方法により収穫して得られる。生の微細藻類は、培養池から収穫後そのままの状態で使用することもできるが、水もしくは生理食塩水で洗浄するのが好ましい。乾燥処理を施した微細藻類は、例えば、前記方法で得られた生の微細藻類を凍結乾燥処理やスプレー乾燥処理したもの等が挙げられる。微細藻類由来成分としては、超音波照射やホモゲナイズ等の機械的処理を微細藻類に施して得られたものや、酵素処理等の化学的な処理を微細藻類に施して得られたもの等が挙げられる。
【００１４】
さらに、本発明では、残渣微細藻類を、ペプチドの製造原料として用いることができる。ここでいう残渣微細藻類とは、抽出媒体にて微細藻類に含まれる、ＡＣＥ阻害作用を有するペプチド、該ペプチドが由来するポリペプチド、タンパク質以外の有用な成分を抽出した後に得られる微細藻類をいう。
抽出は水、熱水、有機溶媒、又は超臨界抽出ガス等によって行うことができ、これらを単独で、或いは組み合わせて用いることができる。用いられる有機溶媒は、例えば、エタノール等のアルコール系溶媒、ヘキサン等の炭化水素系溶媒、アセトン等のケトン系溶媒を挙げることができる。
実施の一例を挙げるとすれば、例えば、室温時含水エタノール、エタノール、アセトンもしくはこれらを２種以上混合したもので抽出することが可能である。
また、超臨界抽出に用いられる炭酸ガス等によっても抽出操作を行うことが可能である。
抽出する温度は、目的とする有用物が最も効果的に抽出し得る温度であればよいが、一般的には室温から媒体の沸点程度の温度を挙げることができる。
これらの抽出操作を行って得られる残渣微細藻類を原料に用いて抽出を行った際にも、得られるペプチド類のＡＣＥ阻害作用は低減されることなく、好適に用いることができ、原料藻類の有効活用に寄与することから工業上好ましい。
例えば、微細藻類がスピルリナの場合、含有されるフィコシアニンは、青色色素として有用であるが、従来フィコシアニンを水により抽出を行った後の残渣は廃棄されていた。しかし、本発明によれば、フィコシアニンを抽出した後の残渣スピルリナを原料として酵素処理を行っても、得られるペプチドのＡＣＥ阻害作用は低下せず、好適に用いることができる。また同様に、スピルリナエキス抽出残渣も原料として用いることができる。
例えば、微細藻類がクロレラの場合、含有されるクロロフィルは、緑色色素、或いは健康食品として有用であるが、同様にクロロフィルを水により抽出した後の残渣クロレラを用いても、ＡＣＥ阻害作用を有するペプチドを得ることができる。
例えば、微細藻類がヘマトコッカスの場合、含有されるアスタキサンチンを有機溶媒にて抽出した後の残渣ヘマトコッカスを用いても、ＡＣＥ阻害作用を有するペプチドを得ることができる。有機溶媒としては、例えば、室温時含水エタノール、エタノール、アセトンもしくはこれらを２種以上混合したもので抽出することが可能である。
例えば、微細藻類がドナリエラの場合、含有されるβ-カロチンを有機溶媒にて抽出した後の残渣ドナリエラを用いても、ＡＣＥ阻害作用を有するペプチドを得ることができる。有機溶媒としては、例えば、室温時含水エタノール、エタノール、アセトンもしくはこれらを２種以上混合したもので抽出することが可能である。
【００１５】
本発明で用いるタンパク質分解酵素としては、ｐＨ２．０〜９．０においてタンパク質の加水分解を行う酵素であれば特に制限なく用いることができ、精製されていてもされていなくてもよい。タンパク質分解酵素としては、例えば、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ等の動物消化器系由来のタンパク質分解酵素（消化酵素）、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属由来のタンパク質分解酵素、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来のタンパク質分解酵素、クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属由来のタンパク質分解酵素、アオカビ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属由来のタンパク質分解酵素、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）属由来のタンパク質分解酵素等の微生物由来のタンパク質分解酵素、パパイン、ブロメレイン、フィシン等の植物由来のタンパク質分解酵素等が挙げられる。タンパク質分解酵素としては微生物由来のタンパク質分解酵素、動物性由来のタンパク質分解酵素が好ましく、コウジカビ属由来のタンパク質分解酵素、バチルス属由来のタンパク質分解酵素、ペプシンがより好ましい。
【００１６】
本発明では、前記タンパク質分解酵素として、作用の仕方が異なる二種類のものを段階的に用いて前記微細藻類の処理を行うことで、ＡＣＥ阻害の総活性がより高いペプチドが得られる。すなわち、抽出工程（１）で微細藻類の第一段階のタンパク質分解酵素による処理を行い、続く抽出工程（２）で、抽出工程（１）で用いたものとは作用の仕方が異なるタンパク質分解酵素による第二段階目の微細藻類の処理を行うことが好ましい。このように、二段階処理を行うことで、得られるペプチドのＡＣＥ阻害の総活性は、単独処理の場合よりも１．２〜１．５倍程度高くなることがある。ここで、作用の仕方が異なるとは、酵素が作用する至適条件が異なること、あるいはタンパク質の作用部位が異なること等を指す。
微細藻類のタンパク質分解酵素による二段階処理を行う場合には、組み合わせる二種類の酵素は、目的に応じて適宜選択すれば良いが、微生物由来のタンパク質分解酵素と動物性由来のタンパク質分解酵素との組み合わせが好ましい。また、第一段階で用いる酵素は、得られるペプチドのＡＣＥ阻害の総活性がより高くなるように、適宜選択すれば良い。
なお、本発明で得られるＡＣＥ阻害作用を有するペプチドは、必ずしも１種ではなく、２種以上の場合もある。そこで、含まれるペプチドの種類に関わりなく画分の活性を比較するために、本発明では、ＡＣＥ阻害総活性を以下のように式（１）で定義し、活性の評価を行った。
ＡＣＥ阻害総活性＝サンプル重量（ｍｇ）／サンプルＩＣ５０値（ｍｇ／ｍＬ）  （１）
ここで、サンプルＩＣ５０値は、サンプルのＩＣ５０の測定値（ｍｇ／ｍＬ）、サンプル重量は、そのＩＣ５０を示すサンプル量（ｍｇ）を示す。
【００１７】
また、本発明にいうペプチド類とは、微細藻類をタンパク質分解酵素で処理することにより得られる、ペプチド、アミノ酸、及びタンパク質を含有するタンパク質分解酵素処理物をいうが、微細藻類に酵素処理前から含まれるペプチドを含んでもよい。
当該ペプチド類は、溶液状であっても、懸濁液状であっても、媒体を留去させた乾燥物状であってもよい。
本発明において、微細藻類のタンパク質分解酵素による処理は、例えば、
（１）微細藻類の水懸濁液に粉末状または液体状のタンパク質分解酵素を加える
（２）乾燥させた微細藻類と粉末状のタンパク質分解酵素に水を加える
（３）乾燥させた微細藻類に水とタンパク質分解酵素を加える
等の方法により行うことができる。
【００１８】
処理工程における微細藻類の濃度としては、タンパク質分解酵素の作用効率が良く、後工程の処理も容易な濃度が好ましく、微細藻類固形分濃度で１〜３０質量％が好ましく、５〜２０質量％がより好ましい。
タンパク質分解酵素の使用量としては、微細藻類固形分１ｇに対して１〜１００，０００ユニット（Ｕ）が好ましく、１０〜５０，０００Ｕがより好ましい。ここで１ユニットは、株式会社学会出版センター発行の「生物化学実験法３１ 蛋白質分解酵素ＩＩ 鶴大典・船津勝編 １９９３年」の１４６〜１４７頁に記載された方法で測定した。具体的には、１Ｕは、基質として熱変性カゼインを用い、タンパク質分解酵素を添加した濃度１質量％の基質水溶液を１ｍｌ調製し、この基質水溶液の２８０ｎｍにおける吸光度を測定したとき、１分間に吸光度を０．００１上昇させる酵素量である。
【００１９】
当該処理のｐＨは、２．０〜９．０に調整することが好ましい。ｐＨが９．０をこえると得られる水抽出液に微細藻類特有の味、臭いが残り、例えば、得られたペプチドを食品等に配合して用いた場合に、食品の香味が悪化するばかりでなく、清涼飲料水等の酸性領域の食品中で沈殿物や浮遊物等の水不溶性成分が生じ易い為に好ましくない。ｐＨを調整するには、通常の食品の製造で用いる化合物、例えば、水酸化ナトリウムや塩酸等を用いればよい。
処理は、静置して行っても攪拌して行ってもよいが、攪拌するのが好ましい。処理温度は、タンパク質分解酵素の作用効率が良好なことから３０〜７５℃が好ましく、３５〜６０℃がより好ましい。
処理時間は、１〜３６時間が好ましく、２〜２４時間がより好ましい。
【００２０】
水可溶性ペプチド類を水溶液中に抽出させた後、後述する精製工程を行う前に、不溶物の除去工程を行ってもよく、さらに必要に応じてタンパク質分解酵素を失活させてもよい。
水可溶性ペプチド類を水溶液中に抽出させた後、不溶物を除去する方法としては、固液分離できる手段であれば制限は無く、例えば、ろ紙やろ布等のろ材を用いたろ過方法や、上澄を回収するデカンテーション法、フィルタープレス法、遠心分離法等が挙げられる。なかでも、工業的に大量処理の可能な遠心分離法、フィルタープレス法等の上澄を回収する方法が好ましく、特に遠心分離法が好ましい。
遠心分離は、処理液から不溶分を除去できる条件であればよいが、重力加速度が１，０００〜３０，０００Ｇで１０秒〜２時間の条件が好ましく、重力加速度が３，０００〜１５，０００Ｇで１〜３０分間の条件がより好ましい。遠心分離機としては、ディスラッジ型遠心分離機、アルファ型遠心分離機、シャープレス型遠心分離機があるが、作業性が向上することから、ディスラッジ型遠心分離機とアルファ型遠心分離機の組み合わせによる連続遠心分離が好ましい。
また、タンパク質分解酵素を失活させるには、例えば、７０〜９５℃の環境下に５〜２０分間静置すればよい。
これら不溶物除去工程および酵素失活工程をいずれも行う場合には、酵素失活工程を先に行うことが好ましい。
【００２１】
ペプチド類を水溶液中に抽出させた後は、該水溶液を吸着樹脂に供給し、溶離媒体を用いて処理する精製工程（３）を行う。
吸着樹脂は、ペプチドの分画を行うことができるものであれば各種のものを用いることができるが、芳香族系、アクリル系等の合成吸着樹脂が好ましく、芳香族系の合成吸着樹脂がより好ましい。芳香族系の合成吸着樹脂としては、例えば、ポリスチレン系の吸着樹脂を挙げることができ、アクリル系の合成吸着樹脂としては、例えば、メタクリル酸エステル重合体を骨格とする吸着樹脂を挙げることができる。なかでも、芳香族環上の水素原子が臭素等のハロゲン原子で置換されていないポリスチレン系の吸着樹脂が特に好ましく、ＡＣＥ阻害の総活性がより高いペプチドを、より高収率で得られる。このような特に好ましい吸着樹脂として、具体的な市販品としては、例えば、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰ２０（商品名、三菱化学社製）を挙げることができる。
また、吸着樹脂の使用量は、抽出工程で得られたペプチド類を含有する水溶液の種類、目標とするペプチドの純度等を勘案し、適宜選択すれば良い。
【００２２】
精製工程（３）においては、溶離媒体として２０〜６０体積％のエタノール水溶液を用いる。具体的には、抽出工程で得たペプチド類を含有する水溶液を、前記吸着樹脂に供給して目的とするＡＣＥ阻害作用を有するペプチドを吸着樹脂に吸着させた後、溶離媒体を吸着樹脂に供給して、溶離媒体中のエタノール濃度が２０〜６０体積％の時の溶出画分を回収することで、目的とするペプチドを不純物から分離して得ることができる。目的とするペプチドをより高い純度で得るためには、一方向に通液可能なカラムに吸着樹脂をあらかじめ充填しておき、ペプチド類を含有する水溶液を吸着樹脂に供給して目的とするペプチドを吸着樹脂に吸着させた後、溶離媒体をカラムの一方から他方へ継続的に通液する方法が好ましい。溶離媒体中のエタノール濃度は、吸着樹脂への供給当初から２０〜６０体積％とするよりも、供給当初は、例えば０体積％としておき、吸着樹脂へ吸着されにくい不純物をあらかじめ除去しておいてから、２０〜６０体積％に上げる方が好ましい。
なかでも本発明において、特に好ましいエタノール水溶液は、２０〜３０体積％エタノール水溶液である。
【００２３】
上記で得られたＡＣＥ阻害作用を有するペプチドは、エタノール水溶液に含有されているため、例えば濃縮等によりエタノールを除去する必要がある。そしてエタノールを除去すれば、そのまま飲料等に使用することもできるが、濾過等によって精製してもよい。また、必要であれば、更に殺菌後、乾燥して食品に供してもよい。更に粉末化することもできる。乾燥方法としては、凍結乾燥法、噴霧乾燥法等があるが、経済的なことから噴霧乾燥法が好ましい。また乾燥する時に、微細藻類抽出液にデキストリン等を加えて乾燥して、粉末物性を整えることも可能である。
【００２４】
得られたペプチドのアミノ酸配列の分析は、通常公知のエドマン（Ｅｄｍａｎ）法により行うことができる。本法の概要を説明すると、まず、ペプチドに、Ｎ末端の遊離のアミノ基としか共有結合しない化学試薬を加え、次に、弱い酸を加えて、この試薬を活性化し、Ｎ末端のペプチド結合だけを切断し、切断されたアミノ酸をクロマトグラフィーで同定する。続いて、アミノ酸１つ分だけ短くなったペプチドに対して同じ操作を順次繰り返し、ペプチド中のアミノ酸配列を決定する。本発明においても、当該法により、得られたペプチドのアミノ酸配列の決定を行った。
【００２５】
得られたペプチドのＡＣＥ阻害作用測定には、通常公知の、例えば、ＣｕｓｈｍａｎとＣｈｅｕｎｇらの開発した方法が簡便であり、広く用いられている。測定は、ＡＣＥを作用させる基質として、例えば、Ｈｉｐ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ（Ｈｉｐは馬尿酸残基）を用い、ＡＣＥ処理を行った後の遊離した馬尿酸を測定し、酵素阻害作用を評価する。例えば、試験管中に試料溶液、基質を入れ、恒温槽中に保持し、ＡＣＥ溶液を添加、攪拌し、反応させる。塩酸を添加し、反応を停止させた後、酢酸エチルを添加し遊離した馬尿酸を回収する。酢酸エチルを留去後、水を加え、馬尿酸を溶解した後、分光光度計により、吸光度を測定する。
ＡＣＥ阻害活性は以下の式（２）に従って計算する。
阻害率（％）＝｛（ＥＣ−ＥＳ）／（ＥＣ−ＥＢ）｝×１００      （２）
ここで、ＥＳは試料溶液を添加したときの吸光度、ＥＣは試料溶液の代わりに蒸留水を加えたときの吸光度、ＥＢは、予め１Ｎ塩酸を加えて反応させたときの吸光度を示す。阻害率５０％を示すときの反応液中の試料濃度をＩＣ５０値とする。
【００２６】
本発明の製造方法により得られるペプチドは、ＡＣＥ阻害作用を有するため、これらを有効成分として含有するＡＣＥ阻害剤に好適である。そして、かかるＡＣＥ阻害剤は、血圧降下作用、ブラデイキニン不活化抑制作用を示す。従って、本態性高血圧、腎性高血圧、副腎性高血圧等の高血圧症の予防、治療剤、これらうっ血性心不全に対する臓器循環の正常化と長期予後の改善（延命効果）作用を有し、心不全の治療剤として有用である。
また、健康食品又は食品とする場合は、かかるペプチドを当該食品の原料に配合し、当該食品の通常の製造方法に従って製造することができる。
【００２７】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、以下において、単位「Ｍ」は「ｍｏｌ／Ｌ」を示す。
【実施例１】
【００２８】
（スピルリナのプロテアーゼＮ処理によるペプチドの製造）
スピルリナ粉末１０ｇに蒸留水１００ｍＬを加え、スピルリナ懸濁液を得た。この懸濁液を１Ｍ水酸化カリウムにてｐＨ６．５〜７．４に調整し、９５℃、３０分間煮沸した。放冷後、プロテアーゼＮ（天野エンザイム社製、製品名「アマノ」Ｇ）０．１ｇを添加し、５５℃、３時間撹拌しながら加水分解を行った。分解反応液を９５℃、３０分間煮沸放冷後、遠心分離（１０，０００Ｇ、１時間）にて沈殿を除去し、上清を凍結乾燥して酵素処理物を５．２ｇ得た。
このようにして得られた酵素処理物１ｇに、蒸留水１０ｍＬを加えてペプチド類を含有する水溶液を調製し、これをカラムに充填した合成吸着樹脂（三菱化学社製、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰ２０）１００ｍＬに供給した。続いて、溶離媒体として蒸留水３００ｍＬ、２０体積％エタノール水溶液３００ｍＬ、５０体積％エタノール水溶液３００ｍＬ、９９．５体積％エタノール水溶液３００ｍＬを順に前記カラムの上部より供給してペプチドの分画を行い、蒸留水３００ｍＬ供給時の画分Ｆ０、２０体積％エタノール水溶液供給時の画分Ｆ２０、５０体積％エタノール水溶液供給時の画分Ｆ５０、９９．５体積％エタノール水溶液供給時の画分Ｆ９９．５をそれぞれ回収した。この時の溶離媒体の供給量を横軸に、溶出物の吸光度を縦軸にとってプロットしたグラフを図１に示す。そして、Ｆ０、Ｆ２０、Ｆ５０、Ｆ９９．５をそれぞれ濃縮後凍結乾燥し粉体を得た。得られた粉体の量、酵素処理物からの回収率、ＩＣ５０及びＡＣＥ阻害の総活性を以下に示す。Ｆ２０から得られた粉体が最も高い総活性を示し、この粉体中には、ＡＣＥ阻害作用を有するペプチドとして、Ｉｌｅ−Ｔｙｒが３５２μｇ、Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏが５０μｇ含有されていることが確認された。
（粉体量）Ｆ０：５５０ｍｇ、Ｆ２０：３６０ｍｇ、Ｆ５０：９０ｍｇ、Ｆ９９．５：１０ｍｇ
（回収率）Ｆ０：５５．０％、Ｆ２０：３６．０％、Ｆ５０：９．０％、Ｆ９９．５：１．０％
（ＩＣ５０）Ｆ０：０．４７、Ｆ２０：０．０２８、Ｆ５０：０．０４６
（総活性）Ｆ０：１１７０、Ｆ２０：１２８５７、Ｆ５０：１９５７
【実施例２】
【００２９】
（残渣スピルリナのプロテアーゼＮ処理によるペプチドの製造）
スピルリナ粉末１０ｇに１％塩化カルシウム２水和物溶液３００ｍＬを加え、２５℃、１６時間静置、スピルリナ青色素を抽出した。得られた抽出液にリン酸水素２ナトリウム１２水和物５ｇを添加、よく撹拌し、遠心分離（１０，０００Ｇ、１時間）を行った。その結果、スピルリナ青色色素抽出残渣１１．７ｇ（無機塩を含む）を得た。こうして得られた残渣５ｇに蒸留水９０ｍＬを加え、スピルリナ懸濁液を得た。この懸濁液を水酸化カルシウム０．１３gにてｐＨ８．５に調整し、９５℃、３０分間煮沸した。放冷後、水酸化カルシウム飽和水溶液１０ｍＬにてｐＨ７．０に調整し、プロテアーゼＮ（天野エンザイム株社製、製品名「アマノ」Ｇ）０．０５ｇを添加し、５５℃、３０分撹拌して水酸化カルシウム飽和水溶液１０ｍＬにてｐＨを６．２５から６．７へ調整し、さらに５５℃、２．５時間撹拌しながら加水分解を行った。分解反応液を９５℃、３０分間煮沸放冷後、遠心分離（１０，０００Ｇ、１５分間）にて沈殿を除去し、上清を凍結乾燥して酵素処理物を４．１７ｇ得た。
このようにして得られた酵素処理物１ｇに、蒸留水１０ｍＬを加えてペプチド類を含有する水溶液を調製し、以下、実施例１と同様の方法でＦ０、Ｆ２０、Ｆ５０、Ｆ９９．５をそれぞれ回収した。この時の溶離媒体の供給量を横軸に、溶出物の吸光度を縦軸にとってプロットしたグラフを図２に示す。そして、Ｆ０、Ｆ２０、Ｆ５０、Ｆ９９．５をそれぞれ濃縮後凍結乾燥して粉体を得た。得られた粉体の量、酵素処理物からの回収率、ＩＣ５０及びＡＣＥ阻害の総活性を以下に示す。Ｆ２０から得られた粉体が最も高い総活性を示し、この粉体中には、ＡＣＥ阻害作用を有するペプチドとして、Ｉｌｅ−Ｔｙｒが４７９μｇ、Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏが７３μｇ含有されていることが確認された。
（粉体量）Ｆ０：５５８ｍｇ、Ｆ２０：３９５ｍｇ、Ｆ５０：６３ｍｇ、Ｆ９９．５：１ｍｇ
（回収率）Ｆ０：５５．８％、Ｆ２０：３９．５％、Ｆ５０：６．３％、Ｆ９９．５：１．０％
（ＩＣ５０）Ｆ０：０．１６５、Ｆ２０：０．０３１、Ｆ５０：０．０２０
（総活性）Ｆ０：３３８２、Ｆ２０：１２７４２、Ｆ５０：３１５０
【実施例３】
【００３０】
（スピルリナのプロテアーゼＮ及びペプシン処理によるペプチドの製造）
スピルリナ粉末１０ｇに蒸留水１００ｍＬを加え、スピルリナ懸濁液を得た。この懸濁液を１Ｍ水酸化カリウムにてｐＨ６．５〜７．４に調整し、９５℃、３０分間煮沸した。放冷後、プロテアーゼＮ（天野エンザイム社製、製品名「アマノ」Ｇ）０．１ｇを添加し、５５℃、３時間撹拌しながら加水分解を行った。分解反応液を９５℃、３０分間煮沸放冷後、１Ｍ塩酸にてｐＨ２．０に調整し、続いてペプシン（Ｓｉｇｍａ社製、試薬）０．１ｇを添加し、３７℃、２２時間撹拌しながら加水分解を行い、分解反応液を９５℃、３０分間煮沸放冷後、１Ｍ水酸化カリウムにてｐＨ７．０に調整した。続いて遠心分離（１０，０００Ｇ、１時間）にて沈殿を除去し、上清を凍結乾燥して酵素処理物を８７０ｍｇ得た。
このようにして得られた酵素処理物１ｇに、蒸留水１０ｍＬを加えてペプチド類を含有する水溶液を調製し、以下、実施例１と同様の方法でＦ０、Ｆ２０、Ｆ５０、Ｆ９９．５をそれぞれ回収した。そして、Ｆ０、Ｆ２０、Ｆ５０、Ｆ９９．５をそれぞれ濃縮後凍結乾燥して粉体を得た。得られた粉体の量、酵素処理物からの回収率、ＩＣ５０を以下に示す。Ｆ２０から得られた粉体が最も高い総活性を示し、この粉体中には、ＡＣＥ阻害作用を有するペプチドとして、Ｉｌｅ−Ｔｙｒが４１１μｇ、Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏが６３μｇ含有されていることが確認された。
（粉体量）Ｆ０：５７２ｍｇ、Ｆ２０：３３７ｍｇ、Ｆ５０：８８ｍｇ、Ｆ９９．５：５ｍｇ
（回収率）Ｆ０：５７．２％、Ｆ２０：３３．７％、Ｆ５０：８．８％、Ｆ９９．５：０．５％
（ＩＣ５０）Ｆ０：０．６１、Ｆ２０：０．０２２、Ｆ５０：０．０３３
（総活性）Ｆ０：９３８、Ｆ２０：１５３１８、Ｆ５０：２６６７
【実施例４】
【００３１】
（スピルリナのペプシン、プロテアーゼＮ処理によるペプチドの製造）
スピルリナ粉末１０ｇに蒸留水１００ｍＬを加え、スピルリナ懸濁液を得た。この懸濁液を１Ｍ塩酸にてｐＨ２．０に調整し、９５℃、３０分間煮沸した。放冷後、ペプシン（Ｓｉｇｍａ社製、試薬）０．１ｇを添加し、３７℃、２２時間撹拌しながら加水分解を行った。分解反応液を９５℃、３０分間煮沸放冷後、１Ｍ水酸化カリウムにてｐＨ７．０に調整した。続いてプロテアーゼＮ（天野エンザイム社製、製品名「アマノ」Ｇ）０．１ｇを添加し、５５℃、３時間撹拌しながら加水分解を行い、分解反応液を９５℃、３０分間煮沸放冷後、続いて遠心分離（１０，０００Ｇ、１時間）にて沈殿を除去し、上清を凍結乾燥して酵素処理物を８４８ｍｇ得た。
このようにして得られた酵素処理物１ｇに、蒸留水１０ｍＬを加えてペプチド類を含有する水溶液を調製し、以下、実施例１と同様の方法でＦ０、Ｆ２０、Ｆ５０、Ｆ９９．５をそれぞれ回収した。そして、Ｆ０、Ｆ２０、Ｆ５０、Ｆ９９．５をそれぞれ濃縮後凍結乾燥して粉体を得た。得られた粉体の量、酵素処理物からの回収率、ＩＣ５０を以下に示す。Ｆ２０から得られた粉体が最も高い総活性を示し、この粉体中には、ＡＣＥ阻害作用を有するペプチドとして、Ｉｌｅ−Ｔｙｒが４００μｇ、Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏが５２μｇ含有されていることが確認された。
（粉体量）Ｆ０：５５４ｍｇ、Ｆ２０：３４８ｍｇ、Ｆ５０：８０ｍｇ、Ｆ９９．５：６ｍｇ
（回収率）Ｆ０：５５．４％、Ｆ２０：３４．８％、Ｆ５０：８．０％、Ｆ９９．５：０．６％
（ＩＣ５０）Ｆ０：０．２３、Ｆ２０：０．０１９、Ｆ５０：０．０２８
（総活性）Ｆ０：２４０９、Ｆ２０：１８３１６、Ｆ５０：２８５７
【００３２】
[比較例１]
合成吸着樹脂を、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰ２０から、ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ  ＳＰ２０７（三菱化学社製、商品名）に変更したこと以外は実施例１と同様にして、ペプチドの製造を行った。図３には、この時の溶離媒体の供給量を横軸に、溶出物の吸光度を縦軸にとってプロットしたグラフを示す。本比較例で用いたＳＥＰＡＢＥＡＤＳ  ＳＰ２０７は、芳香族環上の水素原子が臭素等のハロゲン原子で置換されたポリスチレン系の吸着樹脂である。
【００３３】
実施例１及び比較例１の結果のうち、表１には、ＩＣ５０及び回収率（％）の比較を、表２には、ＡＣＥ阻害総活性の比較を示す。
【００３４】
【表１】
2007295842.tif 000002
【００３５】
【表２】
2007295842.tif 000003
【００３６】
本結果から、ＨＰ２０を用いた場合（実施例１：芳香族環上の水素原子が臭素等のハロゲン原子で置換されていないポリスチレン系の吸着樹脂を使用）の方が、ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ  ＳＰ２０７を用いた場合（比較例１：芳香族環上の水素原子が臭素等のハロゲン原子で置換されたポリスチレン系の吸着樹脂を使用）に比較し、高活性の画分が高い回収率で得られることが確認され、芳香族環上の水素原子が臭素等のハロゲン原子で置換されていないポリスチレン系の吸着樹脂の方が、選択的に高活性成分が得られることが明らかである。
【００３７】
また、以下の表３には、作用の仕方が異なるタンパク質分解酵素で処理しない場合（実施例１）と、処理した場合（実施例３及び４）のＡＣＥ阻害総活性の比較を示すが、作用の異なるタンパク質分解酵素で処理した場合の方が、総活性が高いことが明らかである。
【００３８】
【表３】
2007295842.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明は、高血圧患者のための血圧低下剤の製造等に利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】実施例１における溶出物の吸光度を示すグラフである。
【図２】実施例２における溶出物の吸光度を示すグラフである。
【図３】比較例１における溶出物の吸光度を示すグラフである。
【図１】
2007295842.tif 000005
【図２】
2007295842.tif 000006
【図３】
2007295842.tif 000007