(57)【要約】      （修正有）【課題】不溶性の細胞膜抗原の細胞外ドメインに対して反応するモノクローナル抗体の作製法を提供する。【解決手段】細胞膜抗原を発現する被免疫動物とは他の目に属する動物由来の細胞と遺伝子組換により該抗原を被免疫動物と同目に属する宿主細胞に発現させた細胞とを組み合わせて被免疫動物の免疫感作に用いることにより、該膜抗原の細胞外ドメインの自然な立体構造を認識できる抗体クローンを得る。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数回の免疫感作の少なくとも１回は細胞膜抗原を発現する被免疫動物とは他の目に属する動物由来の細胞を用い、かつ、少なくとも一回は遺伝子組換により該抗原を被免疫動物と同目に属する宿主細胞に発現させた細胞を用いることを特徴とする、該抗原の細胞外ドメインに対する抗体を得るための免疫感作法。
【請求項２】
被免疫動物がげっ歯目の動物であり、被免疫動物と同目に属する宿主細胞がCHO細胞、NSO細胞、SP2/O細胞、またはその他のげっ歯目由来の細胞株である請求項１の免疫感作法。
【請求項３】
細胞外ドメインが生理的条件では不溶性であり、かつ可溶化処理をすることにより立体構造の一部が変化する可能性のあるタンパク又は糖タンパクであることを特徴とする請求項１の免疫感作法。
【請求項４】
請求項１〜３に記載の免疫感作法を用いて細胞膜抗原の細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体を作製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞膜表面抗原（細胞膜抗原の細胞外ドメイン）に対するモノクローナル抗体の作製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカイン、ケモカインあるいは血清中にある可溶性抗原に対する抗体は一般に大腸菌や酵母などを宿主として分子全体が遺伝子組換により調製され、そのうち糖鎖を含有する抗原タンパクについてはCHO細胞、NSO細胞、SP2/O細胞などのげっ歯目由来動物細胞を宿主として遺伝子組換により生産される。一方、受容体や接着分子などの細胞膜上に発現する分子については、不溶性の膜貫通部分を有するため細胞外ドメインのみを遺伝子組換により調製するのが一般的である。(非特許文献１) 
【０００３】
しかしながら、細胞膜抗原の中には膜貫通ドメインばかりでなく細胞外ドメインについても不溶性であるものがある。また、受容体や接着分子はその性状や発現様式により、自然の状態で提示される立体構造の再現が必ずしも容易ではない場合がある。すなわち、細胞膜上に発現する分子は、単量体ではなく複合体を形成することが多く、また他の膜分子と連携して始めてその生物学的機能をもつことも多い。従って、いずれの宿主細胞を用いるにせよ遺伝子組換により細胞外ドメインを調製する方法では細胞膜抗原のナイーブなエピトープを再現できないかも知れない。
【０００４】
例えばヒト白血球抗原の１つであるCD20分子の細胞外ドメインは不溶性であり、これに対して生物学的活性を有する抗体、または高親和性抗体を得ることは非常に難しいとされている(非特許文献２, 非特許文献３, 非特許文献４)。このような場合、一般的には免疫原としては該抗原を発現している細胞そのものを使用する以外にない。リツキサン（商標）はヒトB細胞株であるSB細胞をマウスに免疫して得られたモノクローナル抗体をもとにキメラ化されたものであり、別の市販の抗CD20モノクローナル抗体2H7の作製にはやはりヒトB細胞株である6.16c1.3が用いられている。しかしながら、これらのヒト細胞株は充分な免疫刺激を誘導できるほど該抗原が多量に発現している訳ではなく、かつ被免疫動物（マウスまたはラット）に対して異種細胞であるために細胞全体が抗原性を有することから、該抗原特異的な免疫応答は得られ難い。
【非特許文献１】Francois Baneyx (Editor), Protein Expression Technologies: Current Status and Future Trends, BIOS Scientific Publishers, April 1, 2004. ; Barry Steven Selinsky (Editor), Membrane Protein Protocols: Expression, Purification, and Characterization., Methods in Molecular Biology, V.228, Clifton, N.J., June 1, 2003
【非特許文献２】Julie P.D. et al., Imminol 2002; 107:176-82
【非特許文献３】Maria J. Polyak and Julie P. Deans, Studies of Existing CD Molecules:93-95
【非特許文献４】M. S. Cragg et al., Studies of Existing CD Molecules:95-97
【非特許文献５】Anderson KC et al., Blood 1984; 63:1424-33, Data Sheet: FITClabeled CD20, Medical & Biological Laboratories Co., Ltd.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、細胞外ドメインが不溶性であり可溶化処理により立体構造が変わう可能性がある細胞膜抗原エピトープに対して結合するモノクローナル抗体の作製法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、不溶性の細胞外ドメインに反応する抗体を作製するために、免疫感作用抗原の調製法及び被免疫動物への感作法について検討を重ねた。その結果、細胞外ドメインのナイーブな立体構造を維持し且つ多量の抗原を提供できる方法を見出した。さらにこれを用いた免疫感作により、細胞外ドメインのさまざまなエピトープに対する抗体が多数誘起されることが判明した。
【０００７】
本発明は、以下のものに関する。
（１）複数回の免疫感作の少なくとも１回は細胞膜抗原を発現する被免疫動物とは他の目に属する動物由来の細胞を用い、かつ、少なくとも一回は遺伝子組換により該抗原を被免疫動物と同目に属する宿主細胞に発現させた細胞を用いることを特徴とする、該抗原の細胞外ドメインに対する抗体を得るための免疫感作法。
（２）被免疫動物がげっ歯目の動物であり、被免疫動物と同目に属する宿主細胞がCHO細胞、NSO細胞、SP2/O細胞、またはその他のげっ歯目由来の細胞株である（１）に記載の免疫感作法。
（３）細胞外ドメインが生理的条件では不溶性であり、かつ可溶化処理をすることにより立体構造の一部が変化する可能性のあるタンパク又は糖タンパクであることを特徴とする（１）に記載の免疫感作法。
（４）（１）〜（３）に記載の免疫感作法を用いて細胞膜抗原の細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体を作製する方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の免疫感作法を用いることにより、本来の立体構造を維持した状態での細胞外ドメインに対して反応する抗体を被免疫動物内に誘起できる。これらの抗体産生B細胞を含む脾臓細胞を取り出してマウスミエローマ細胞と融合させることにより、該抗体を産生するハイブリドーマを効率よく作製することができる。こうして得られたハイブリドーマを培養して繰り返してクロ−ニングすることにより、該細胞外ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体を作製することができる。これらのモノクローナル抗体の中には、細胞外ドメインのさまざまなエピトープに結合する抗体が含まれており、さらに該抗原を有する標的細胞に対して生物学的活性を有する抗体も含まれることになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
＜１＞本発明の抗体産生ハイブリドーマ作製法
被免疫動物に対する免疫感作法として複数回の免疫感作を行うが、そのうち少なくとも１回は細胞膜抗原を発現する被免疫動物とは他の目に属する動物由来の細胞を用い、かつ、少なくとも一回は遺伝子組換により該抗原を被免疫動物と同目に属する宿主細胞に発現させた細胞を用いる。充分な免疫刺激を行ったあと、常法に従い、被免疫動物から脾臓細胞を取り出してそこに含まれるリンパ球とマウスミエローマ細胞と融合させる。この手順は、例えばAilsa M. Campbell (著), 大沢 利昭 (訳) 生化学実験法  モノクローナル抗体、東京化学同人、1989年に記載されている。
【００１０】
被免疫動物は、特に限定されないが、通常はマウス、ラットが用いられる。被免疫動物への免疫は、通常には、免疫感作抗原の注射を複数回行うことにより行われる。免疫の回数、間隔、抗原量などに関する条件設定は通常の方法と同様でよい。３回以上の免疫が行われる場合、一般に最初の免疫を初回免疫、最後の免疫を最終免疫（ブースト）、初回免疫後で最終免疫前の免疫を追加免疫と呼び、それらに適した条件が選択される。
【００１１】
本発明においては、複数回免疫する間に、少なくとも１回は細胞膜抗原を発現する被免疫動物とは他の目に属する動物由来の細胞を用いること、および少なくとも１回は遺伝子
組換により該抗原を被免疫動物と同目に属する宿主細胞に発現させた細胞を用いる。この場合、初回免疫と最終免疫では異なる細胞を用いるのが好ましい。ヒト細胞膜抗原に対するモノクローナル抗体を得ようとする場合には、前者はヒト細胞株であり、後者は該ヒト抗原遺伝子を遺伝子組換により膜表面に発現させたゲッ歯目由来細胞が該当する。ゲッ歯目由来細胞の代表的なものとしては、CHO細胞、NSO細胞、SP2/O細胞などが挙げられる。
【００１２】
細胞膜抗原の事例としては白血球分化抗原（CD抗原）があり、例えば CD9, CD20, CD37, CD47などが挙げられる。
【００１３】
被免疫動物と同目に属する動物に由来する細胞株の細胞膜表面における細胞膜抗原の発現密度は、単純に高いことが好ましく、たとえば、FITC標識モノクローナル抗体で発現細胞を染色した場合、本来その抗原を有する細胞と比べて5倍以上の蛍光強度の検出されることが好ましい。
【００１４】
充分な免疫刺激を行ったあとのハイブリドーマ作製は、常法に従い、被免疫動物から脾臓細胞を取り出してそこに含まれるリンパ球とマウスミエローマ細胞と融合させる。融合の環境としては、細胞培養による方法、マウスの腹水として作製するがあるがいずれでも可である。
【００１５】
本発明の効果が得られる理由は、次のように考えられる。すなわち、感作抗原として、被免疫動物物と異種の細胞（該抗原を発現する、被免疫動物とは他の目に属する動物に由来する細胞株）と、同種または近縁種の細胞（遺伝子組換により細胞膜表面上に該抗原を発現させた、被免疫動物と同目に属する動物に由来する細胞株）を組み合わせることによって、標的分子のみの免疫刺激が高められるため、標的分子に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの割合が増加すると思われる。
【００１６】
本発明の方法では、細胞膜抗原分子の立体構造をほぼ本来の状態で得ることが可能と考えられ、特に、細胞外ドメインが不溶性である場合に効果的な方法である。免疫感作用抗原は一般的には、該抗原発現細胞を溶解して分離精製することによるか、または該抗原を遺伝子組換により量産して用いる。本発明では、こうした抗原またはその抗原部位を共有する異なる二種類以上の免疫原を組合せて用いることにより、所望の抗原分子またはその部位に対する免疫刺激を高めることに成功した。
【実施例１】
【００１７】
不溶性膜表面抗原を有するCD20分子に対するモノクローナル抗体の作製法を実施例を参照して説明する。
【００１８】
＜１＞モノクローナル抗体の作製
（１）マウス感作用免疫抗原の準備
まずCD20を発現している代表的なB細胞株であるSB細胞とRaji細胞をin vitroで培養した。次にMultiple Choice cDNA human spleen, Origene Technologies, Inc. 6 Taft Court, Suite 100, Rockville, MD 20850から、CD20の全分子をコードするDNAを特異的なプライマーhCD20-S-GK-Not  aatgcggccgccaccatgacaacacccagaaattc（配列番号１）、及びhCD20-E-Xba gctctagattaaggagagctgtcattttc（配列番号２）を用いてクローニングし、それを哺乳動物細胞用高発現ベクターであるpNOW (特許第3582965 号公報、図１)に組み込み、構築されたベクターをCHO細胞にトランスフェクトした。FACS分析により、細胞表面にCD20分子を高発現している組換CHO細胞（CD20/CHO細胞）を樹立した。なお、FITC標識抗CD20モノクローナル抗体で染色した場合にSB細胞に比べて蛍光強度が5倍以上のものを選択した。
【００１９】
（２）免疫感作抗原の調製
SB細胞またはRaji細胞は10％FCS添加RPMI1640培地を用いて培養を行った。CD20/CHO細胞は、G418を800μg/ml添加したCHO-S-SFM II培地（GIBCO、Cat. No. 12052-098）を用いて培養を行った。これらの培養液を遠心分離（1100rpm、5分）した後、細胞にDulbecco'sPBS(-)を加えて懸濁させ再度遠心分離した。この洗浄操作をもう一度繰り返し、細胞に生理食塩水を加えて調製した懸濁液（1ml当たりの細胞数は1〜3×107である）を免疫に用いた。
【００２０】
（３）免疫
7〜11週令のBalb/c系雌性マウスへ、免疫感作用の各種細胞の調製液をいずれも腹腔内投与した。使用した免疫原の組み合わせは、次の（イ）と（ロ）の組み合わせとし、いずれかの一方をさまざまな日数間隔で2〜3回繰り返して投与した後、最終免疫にはもう一方の細胞を投与した。
（イ）SB細胞またはRaji細胞
（ロ）D20/CHO細胞
投与細胞数は、マウス1匹当たりいずれも1〜3×107個とした。
【００２１】
（４）細胞融合
最終免疫の3日後、2匹のマウスから脾臓細胞を調製し、マウスミエロ−マ(NS-1)との融合反応をPEG-1500の存在下で行なった。方法は、Oi,V.T. and L.A. Herzenberg, 1980, in:Selected Methods in Cellular Immunology, eds. B. Mishell and S.M. Shiigi(Freeman and Co.San Francisco, CA) p.351. に従った。
【００２２】
（５）1次、2次スクリーニング
Raji細胞、CD20/CHO細胞またはCHO細胞（親株）を付着させた96ウエルプレートを用いてCell ELISAを行い、CD20に特異的に反応する抗体を産生しているウエルを選択した。さらに同じCD20/CHO細胞を付着させた96ウエルプレートを用い、市販の抗CD20モノクローナル抗体リツキサンとの競合反応を行って、リツキサンのエピトープと類似したところに反応する抗体（ウエル）を選択した。
【００２３】
（６）Cell ELISA
Poly-L-Lysineコート96ウエルプレート（旭テクノグラス、Cat.No.11-023-018）に付着させたRaji細胞、CD20/CHO細胞またはCHO細胞（親株）をCell ELISAに用いた。その各ウエルにブロッキング液（0.2%-Gelatine, 0.5%BSAのPBS溶液）を150μl入れて37℃で1時間静置した。150mM-NaCl, 0.05%-Tween20水溶液を用いてプレートを5回洗浄した後、サンプル（培養上清の希釈液）を各ウエルに100μl入れて1次反応を37℃で1時間行なった。洗浄後、標識抗体の希釈液〔HRP標識抗マウスIgG(H+L) ウサギ抗体（Jackson Lab. Code No. 315-035-003）、またはHRP標識抗マウスIgG(Fcγ) ウサギ抗体（Jackson Lab. Code No. 315-035-008）〕〕〕を各ウエルに100μl入れて2次反応を37℃で1時間行なった。1次、2次の反応液の調製には、ブロッキング液と同じものを用いた。洗浄後、発色液（OPD）を各ウエルに100μl入れ30分後に4N-H2SO4を50μl加えて反応を停止し、A492を測定した。
【００２４】
（７）Cell ELISAでの競合反応
サンプル（培養上清の希釈液）とキメラ抗体（10〜40ng/ml）の混合溶液を調製した。
上記のCell ELISAと同様にブロッキング反応をしたあと、この混合溶液を各ウエルに100μl入れて1次反応を37℃で1時間行なった。洗浄後、標識抗体の希釈液〔HRP標識抗ヒトIgG(H+L) ウサギ抗体（Jackson Lab. Code No. 309-035-082）〕  を各ウエルに100μl入れて2次反応を37℃で1時間行なった。洗浄後、発色液（OPD）を各ウエルに100μl入れ30分後に4N-H2SO4を50μl加えて反応を停止し、A492を測定した。
【００２５】
標識抗体はキメラ抗体のみに反応するので、1次反応で添加したサンプル中の抗体がキメラ抗体と競合すれば、測定値の低下が認められた。
【００２６】
（８）クローニング
限界希釈法で行った。細胞を96ウエルプレートに撒いて培養後、１コロニーのウエルの培養上清についてCell ELISAを行い、特異抗体の産生クローンを選択した。
【００２７】
（９）精製抗体の調製
特異抗体の産生クローンを10%FCS添加RPMI1640培地で培養し、細胞密度が5×105/ml前後になった時点で無血清培地ASF-104N（味の素）に培地を交換して培養を行った。その2〜4日後に培養液を遠心分離して培養上清を回収したあと、プロテインＧカラムを用いて精製を行い、溶出されたモノクローナル抗体溶液を150mM-NaClに対して透析した。0.2 μｍのフィルターでろ過滅菌を行ない、試験抗体（抗ヒトCD20マウスモノクローナル抗体）とした。
【００２８】
＜結果＞
免疫感作方法と、得られた脾臓細胞とマウスミエローマ細胞を融合することにより得られたハイブリドーマをスクリーニングした結果、およびリツキサンとの競合反応性試験の結果を表１に示す。
【００２９】
【表１】
2007044035.tif 000002
【００３０】
得られたハイブリドーマクローンをさらに繰り返し継代培養して選別することにより、CD20陽性のB細胞株に高い反応性を有するクローンが得られた。Raji細胞を付着させたCell EISAとSB細胞を付着させたCell ELISAにおけるこれらの抗体クローンの結合性の結果を図２に示す。陰性コントロールとしてのCell ELISAには、宿主細胞であるCHO細胞を付着させたものを用いた。陽性コントロール抗体にはリツキサンの可変領域を有するマウス抗体、陰性コントロール抗体にはヒトCD3抗原に対するマウスモノクローナル抗体(BD PharMingen社)を用いた。
【００３１】
【表２】
2007044035.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】タンパク発現用ベクター pNOWの構造を示す。
【図１】
2007044035.tif 000004
【配列表】
2007044035000001.app