(57)【要約】【課題】微細加工性や製造コストの低廉さに優れ、ＤＮＡなどのバイオ物質の付着性がよく、作業が繁雑となり高価かつ環境汚染等の懸念がある標識部室が不要で、高速簡便なＤＮＡのハイブリダイゼーション検出できる装置を提供する。【解決手段】  印刷によって絶縁体上に形成された、少なくともいずれか一方が炭素を主成分とする少なくとも１対の電極と、前記電極間に溶液を接触保持させる機構と、（A）前記電極間に電圧を印加する電圧印加手段および前記電極の電流を検出する電流検出手段、または、（B）前記電極間の電圧を検出する電圧検出手段と、を備え、前記少なくとも１対の電極の少なくとも一方に、一本鎖標識核酸を固定化してなり、印加電圧または電流が交流を含む信号である。【選択図】図１
2007171134.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
印刷によって絶縁体上に形成された、少なくともいずれか一方が炭素を主成分とする少なくとも１対の電極と、前記電極間に溶液を接触保持させる機構と、（A）前記電極間に電圧を印加する電圧印加手段および前記電極の電流を検出する電流検出手段、または、（B）前記電極間の電圧を検出する電圧検出手段と、を備え、前記少なくとも１対の電極の少なくとも一方に、一本鎖標識核酸を固定化してなり、印加電圧または電流が交流を含む信号であることを特徴とする生体関連物質検出装置。
【請求項２】
前記少なくとも１対の電極の一方が、炭素含有量が50質量％未満である電極材料からなることを特徴とする請求項１記載の生体関連物質検出装置。
【請求項３】
絶縁体上に少なくとも２個以上の壺状構造体を配置し、前記壺状構造体の内面に前記少なくとも１対の電極を備えてなることを特徴とする請求項１または２記載の生体関連物質検出装置。
【請求項４】
第一の絶縁体上に、前記壺状構造体を配置し、前記壺状構造体の内面にいずれか一方の電極をそれぞれ備え、前記壺状構造体の上面を密着被覆してなる第二の絶縁体を備え、前記第二絶縁体上に前記いずれか一方の電極に対向する他方の電極を備えてなり、かつ、前記各他方の電極の少なくとも先端部が、前記壺状構造体中に貯留された溶液中に浸漬されてなり、前記第一の絶縁体または前記第二の絶縁体に一体化して電子回路および該電子回路と電極との接続手段を内包してなることを特徴とする請求項３記載の生体関連物質検出装置。
【請求項５】
各他方の電極は、溶液に接触した状態で前記壺状構造体上面を密着被覆してなる平板にて構成されてなる請求項４記載の生体関連物質検出装置。
【請求項６】
壺状構造体とその一部に形成された少なくとも１対の電極とからなる構造を少なくとも２組以上備え、少なくとも２種類以上の一本鎖標識核酸を該電極に固定化し、生体関連物質を前記壺状構造体に貯溜された溶液に含有させてなり、これらの電極に直流電圧または電流あるいは低周波電圧または電流を印加する手段、前記直流信号または低周波信号と交流信号を時間的に個別に印加する手段、および直流信号または低周波信号と交流信号を混合して印加する手段を備え、前記電極と電圧または電流の印加手段とを切り替える機能を備えてなることを特徴とする請求項３〜５のいずれか１項記載の生体関連物質検出装置。
【請求項７】
印加電圧または電流と、検出した電流値または電圧値とからインピーダンスの虚軸成分および実軸成分を演算する軸成分演算手段と、周波数を可変する周波数可変手段とを備えたことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項記載の生体関連物質検出装置。
【請求項８】
直流信号または低周波信号を印加する第一の信号印加手段と、前記直流信号または低周波信号と交流信号とを時間的に個別に印加する第二の信号印加手段と、前記直流信号または低周波信号と交流信号とを混合して印加する混合印加手段と、を備えたことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項記載の生体関連物質検出装置。
【請求項９】
ランダム信号を発生するランダム信号発生手段と、該ランダム信号によって交流信号を変調する交流信号変調手段と、該ランダム信号によって変調された信号を復調する信号復調手段と、を備えたことを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項記載の生体関連物質検出装置。
【請求項１０】
電極から取り出された導電経路が櫛形状に配列され、電気的コネクタに嵌合可能な形態に母材とともに形成されてなることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項記載の生体関連物質検出装置。
【請求項１１】
周波数を可変させ、周波数に対するインピーダンスに角周波数を乗じ、逆数をとった特性のピーク値およびピーク値の位置する周波数を演算する演算手段を備えてなることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項記載の生体関連物質検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体関連物質、おもにＤＮＡ、ハイブリダイズしたＤＮＡ等の電気的検出・識別に特に好適に用いられる生体関連物質検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、生体関連物質たとえば遺伝子（ＤＮＡ）の検出には、検出すべきＤＮＡと相補的な塩基配列を有するＤＮＡ（一本鎖核酸プローブ）を所定の位置に固定化させたＤＮＡチップを用いる方法が一般的である。この方法では、検体となる複数のＤＮＡ（検体DNA）に蛍光物質や放射性物質等の識別子（マーカー）を付着標識化させた後、前記のＤＮＡチップを検体ＤＮＡが含まれる溶液中で処理する。検体ＤＮＡの遺伝子配列がＤＮＡチップ上の固定化された核酸プローブの配列と一致したとき、検体ＤＮＡとチップ上の一本鎖ＤＮＡとが結合して二本鎖ＤＮＡとなる現象、すなわちハイブリダイゼーションが起こり、二本鎖が形成される。二本鎖となって結合した検体ＤＮＡ、標識化された前記蛍光物質や放射性物質を検出することによって、検体DNAがどの位置の電極にあらかじめ固定化されたどのＤＮＡと同一構造であるかを知ることができる。
【０００３】
前記従来方式の蛍光体や放射性物質を用いたＤＮＡ検出方法では、ひとつのチップ上で検出精度向上や検出するＤＮＡの種類を増すため、微細なピッチで既知のＤＮＡを基板上に配置・固定化するＤＮＡチップ（非特許文献２参照）製造装置、紫外線等の励起光源を照射し３色の蛍光を検出するスキャナと呼ばれる微細検出装置（非特許文献３参照）、さらには多数のＤＮＡのハイブリダイゼーションの検出を解析する演算装置を含むシステムやソフトウェアが必要である。そのため、ＤＮＡチップそのものが高価になるとともに、製造装置や検出装置の大型化、微細精密化、高コスト化が避けられない。また、蛍光物質や放射性物質などの検出のための処理時間、ＤＮＡ解析のための演算時間等処理から検出までのタクトタイムが長く、簡便な検出手法とはいえなかった。
【０００４】
また、ＤＮＡのハイブリダイゼーション等を電気化学的に検出する方法も知られている（特許文献１〜２参照）。これらの方法では、多種のＤＮＡを固定化したものを準備するのではなく、特定の検出したい塩基配列のＤＮＡ一本鎖核酸プローブを電極にあらかじめ固定化させ、検体とハイブリダイゼーションさせ二本鎖となったＤＮＡに特異的に結合する金属錯体等を標識する。この標識インターカレータが可逆的電気化学反応すなわち酸化還元反応を起こすことで繰り返し簡便高速高精度に、二本鎖ＤＮＡを、電気化学的Ｉ−Ｖ特性の変化として捕らえてハイブリダイズ検出を行い特定のＤＮＡの存在を検知することが示されている。
【０００５】
ところが、この方法にあっては、ＤＮＡを固定化する電極の材質が金である必要性がありコストの問題があるほか、重金属錯体によるインターカレータの中心となる金属は、たとえば、亜鉛、ルテニウム、コバルトのような重金属であり発ガン性が報告されている。      
【０００６】
そのうえ、検出後の廃棄処理において対環境汚染の問題があった。さらにインターカレータを二本鎖ＤＮＡに結合させる必要があるなど、測定のいっそうの簡易化・医療衛生現場における普及拡大の観点からも課題があった。また電気化学的手法では、電流スケールがｎＡ単位、電圧が１Ｖ以下程度となりインターカレータ可逆性があったとしても、低周波・直流回路において検出回路には高い耐雑音性が要求されるなどの課題があった。また、一般的な電気化学的手法は、基準電極、作用電極、補助電極の３電極法が用いられ、基準電極と作用電極の電位を測定することが行われており、電解液中に３つの電極を浸して測定を行うため、容器が大きくなり測定数や測定回数・測定結果の観点では明らかに利便性、優位性に欠けるものであった。また、ポテンショスタットなどの電気化学測定器を用いて測定を行う場合も同様であった。
【０００７】
一方、交流インピーダンスによる手法もしられている（特許文献３参照）。この方法は、上記方法と同様に、一本鎖核酸プローブを電極に固定化させ、ハイブリダイズし二本鎖となったときに標識化された分子の電気化学作用による電極間のインピーダンス変化によってハイブリダイズの有無を検知するものし、周波数に対するインピーダンス曲線の変化やインピーダンスの複素平面表示の変化によってこれを判断検知しようとするものである（特許文献１〜３参照）。
【０００８】
上記交流インピーダンス方法は、ハイブリダイゼーションの前後で、電気化学的に活性なレポーターでラベル付けされた標的分子との分子相互作用の有無を交流インピーダンスで検出する方法である。この方法は、いわゆるインターカレータとなる物質の有無によるインピーダンス変化を検出する必要があり、前述の特許文献１および非特許文献２とは方式が異なるが、前述と同様な課題があった。
【０００９】
一方、電極に固定化された一本鎖拡散プローブとハイブリダイズした二本鎖ＤＮＡのインピーダンスの変化を、電気化学的拡散を記述したワールブルグインピーダンスを含むランドルスの等価回路にあてはめて、検出するハイブリダイゼーションの検出方法も知られている（特許文献４参照）。この検出方法は、周波数に対するインピーダンスの変化すなわちボード線図の微細な変化によって検知し、完全一致結合および１塩基違いのミスマッチの差をも検知しようとするもので、標識分子いわゆるインターカレータによる電気化学反応に依存しない交流インピーダンス変化によるＤＮＡハイブリダイゼーションの検出方法である。
【００１０】
さらに、特許文献４に記載された交流インピーダンスを利用する手法においては、標識分子いわゆるインターカレータによる増感を行わない利点がある。すなわち、電極、電極に固定化されたＤＮＡ、溶液、対向する電極の等価回路構成において、電極に固定化されたＤＮＡあるいは検体ＤＮＡとハイブリダイズして二本鎖となったＤＮＡ部分を、界面の静電容量とワールブルグインピーダンスの並列回路、溶液部分を溶液抵抗、対向電極部分を界面の静電容量と抵抗の並列回路として、集中定数等価回路として扱い周波数に対して、界面部分の一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡのキャパシタンスの差による全体のインピーダンスの変化によって、ハイブリダイゼーションの有無のうち塩基配列の完全一致や１塩基ミスマッチまで識別可能としている。
【００１１】
さらに、上記特許文献４の交流インピーダンスを利用する方法では、通常溶液と電極面での電位勾配のある２重層の厚さは数ｎｍとであるとされることから考えると、ＤＮＡの固定化の様相とハイブリダイズ後の様相が、このような電気２重層の厚みや拡散インピーダンスが適用される拡散層の厚みと一致させることは困難であると考えられる。ワールブルグインピーダンスと溶液抵抗の直列接続回路とＤＮＡのキャパシタンスとの並列回路に単純化するのは困難である。
【００１２】
すなわち、前述のように界面のインピーダンスとDNAのインピーダンスの単純化を行うには、ＤＮＡの付着密度を高くすることが必要と考えられるが、製造コストからみて固定化させるＤＮＡ密度を高くすることは不利であり、ＤＮＡの存在は、溶液の拡散インピーダンス適用部分や電気２重層部分の限られた位置に存在するとは限らない。
また、電極表面上に這うような形態でハイブリダイズ後の二本鎖ＤＮＡが散在するとも考えられ、等価回路に合致させるには、高密度の固定化ＤＮＡが必要であって廉価普及可能ＤＮＡチップや生体関連物質検出装置を提供する目的には合致しないといわざるを得ない。また、交流インピーダンス実測結果でも、従来より一般的に知られているインピーダンス曲線となり、またインターカレータを有する場合と比べても、顕著な曲線の変化が少なく特性曲線は相似的であり実用化においては自動測定における判定方法や測定確度に課題があると推測される。
【００１３】
また、電極に固定化されたＤＮＡを含む溶液のインピーダンスを、特許文献４と同様なワールブルグインピーダンスを含む集中定数型等価回路で示す方法も開示されている（特許文献７〜８）。その内容は、単分子層抵抗、定位相要素、ワールブルグインピーダンスと反応抵抗の直列回路、の３つを並列接続した回路と溶液抵抗の直列接続で示している。ここでインピーダンスの複素平面表示いわゆるコールコールプロットで、完全な相補的結合に対してミスマッチの位置によってプロットの半径が変化することが報告されている。これらの手法では、電極素材に金電極が使用されておりＤＮＡ検出装置の低コスト化には不適当であった。また、コールコールプロットの曲率判定では、ハイブリダイズによる微小な特性の変化を曲率半径だけで捕らえるには不十分と考えられる。
尚、非特許文献５〜６に参照されるスキャナは、先願特許の特許文献４に従来より用いられるＤＮＡチップ用スキャナとして参考図を記載したものである。
【特許文献１】特許第2573443号公報
【特許文献２】特表2003-516165  核酸反応の電気的検出に関する方法および組成物
【特許文献３】特開2004-177399  ハイブリダイゼーションの検出方法
【特許文献４】特開2005−69728号公報
【非特許文献１】東芝レビュー  ｖｏｌ．５６Ｎｏ．７ｐ．６０−６１、ＤＮＡチップ
【非特許文献２】アジレントDNAマイクロアレイ  インターネットHP<http://www.chem.agilent.com/scripts/generic.asp?lPage=10408&indcol=Y&prodcol=Y>
【非特許文献３】アジレントDNA マイクロアレイスキャナ  インターネットHP<http://www.chem.agilent.com/Scripts/PDSLocal.asp?lPage=398&LL=Y&CountryCode=JP>
【非特許文献４】Biophysical Journal vol.84 May,2003 “AC Impedance Spectroscopy of Native DNA and M-DNA”
【非特許文献５】Analytical Chemistry vol.76,No.14 “Electrochemical Detection of Single-Nucleotide Mismatches: Application of M-DNA”
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、その目的は、簡便・低コストかつ高精度に、DNA等の生体関連物質を検出することのできる生体関連物質検出装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本願発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討した。その結果、ＤＮＡ等の生体関連物質を固体化させる電極に、ＤＮＡに対する付着性に優れ、基材に微細で自在なパターンを廉価で形成することが容易な炭素を主成分とする印刷電極を使用すること、さらには、周波数に対するインピーダンス値を、たとえば等価的にキャパシタンスと見なして実軸や虚軸に分離することなく周波数に対する等価キャパシタンスの演算のみを行い、ピークが表れる周波数およびその変化、ピーク値およびその変化と必要であればコールコールプロットやボード線図をあわせながら前記等価的キャパシタンス特性を主たる判定材料として用いることでＤＮＡの完全な相補的結合によるハイブリダイズおよびミスマッチ結合によるハイブリダイズを選択検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
請求項１に記載の生体関連物質の検出方法および検出装置は、上記の課題を解決するために、印刷によって絶縁体上に形成された、少なくともいずれか一方が炭素を主成分とする少なくとも１対の電極と、前記電極間に溶液を接触保持させる機構と、（A）前記電極間に電圧を印加する電圧印加手段および前記電極の電流を検出する電流検出手段、または、（B）前記電極間の電圧を検出する電圧検出手段と、を備え、前記少なくとも１対の電極の少なくとも一方に、一本鎖標識核酸を固定化してなり、印加電圧または電流が交流を含む信号であることを特徴としている。
【００１７】
上記の構成によれば、あらゆるパターンの電極を微細に形成でき、交流インピーダンス法によってＤＮＡのハイブリダイズを検出することができる。
【００１８】
請求項２に記載の生体関連物質検出装置は、前記少なくとも１対の電極の一方が、炭素含有量が50質量％未満である電極材料からなることを特徴としている。
上記の構成によれば、微細パターンや廉価性、生体関連物質固定の容易さ等が必要でない場合、一方の電極を金属で作成し共通電極としたりフレキシブルな生体関連物質検出装置の設計ができる。
【００１９】
請求項３に記載の生体関連物質の検出方法および検出装置は、上記の課題を解決するために、絶縁体上に少なくとも２行２列以上の壺状構造体を配置し、前記壺状構造体の内面に前記少なくとも１対の電極を備えてなることを特徴としている。
上記の構成によれば、同一種類の一本鎖核酸プローブで複数の測定を行い、測定値の偏差を求めることができ、いくつかのミスマッチ結合があったとしても確度の高い測定結果を得ることができる。
【００２０】
請求項４に記載の生体関連物質検出装置は、第一の絶縁体上に、前記壺状構造体を配置し、前記壺状構造体の内面にいずれか一方の電極をそれぞれ備え、前記壺状構造体の上面を密着被覆してなる第二の絶縁体を備え、前記第二絶縁体上に前記いずれか一方の電極に対向する他方の電極を備えてなり、かつ、前記各他方の電極の少なくとも先端部が、前記壺状構造体中に貯留された溶液中に浸漬されてなり、前記第一の絶縁体または前記第二の絶縁体に一体化して電子回路および該電子回路と電極との接続手段を内包してなることを特徴としている。
【００２１】
上記の構成によれば、壺状構造に検体を滴下した後、溢流を防止するための、壺状構造体上面に密着被覆するカバーとして、第二の絶縁体を構成し、かつ測定電子回路の一部を介して電気コネクタに接続するので、検体滴下後、簡易にコネクタに接続しかつ測定電子回路の一部を内包することができる。このため、コネクタを介して全ての測定信号を伝達するのではなく信号処理がされた電気信号を介してコネクタに接続、主たる検出回路へ信号を導くため安定して耐雑音性に優れた特性を得ることができる。また、印刷電極とともに電子回路を一体化することは、印刷技術を用いて可能であり、製造コスト状からも一連の加工製作工程を構築することが容易である。
【００２２】
請求項５に記載の生体関連物質検出装置は、上記の課題を解決するために、各他方の電極は、溶液に接触した状態で前記壺状構造体上面を密着被覆してなる平板にて構成されてなることを特徴としている。  
【００２３】
上記の構成によれば、片側電極は比較的単純な構成とすることができるため、全面大面積でもかまわず製造コスト削減が可能である。また、一本鎖核酸プローブを固定化させる電極が近傍にないので本来一本鎖核酸プローブを付着させたくない片側電極の不要なコンタミネーションを回避することが容易となる。また、片側電極をアース共通にできるので耐雑音性も向上し、櫛形の電極コネクタは、片側の母材のみでよく取り扱いは容易となる。
【００２４】
請求項６に記載の生体関連物質検出装置は、上記の課題を解決するために、壺状構造体とその一部に形成された少なくとも１対の電極とからなる構造を少なくとも２組以上備え、少なくとも２種類以上の一本鎖標識核酸を該電極に固定化し、生体関連物質を前記壺状構造体に貯溜された溶液に含有させてなり、これらの電極に直流電圧または電流あるいは低周波電圧または電流を印加する手段、前記直流信号または低周波信号と交流信号を時間的に個別に印加する手段、および直流信号または低周波信号と交流信号を混合して印加する手段を備え、前記電極と電圧または電流の印加手段とを切り替える機能を備えてなることを特徴としている。
【００２５】
上記の構成によれば、配置された電極に既知のＤＮＡの一本鎖標識核酸（一本鎖プローブ）を固定すれば、検体がどの核酸とハイブリダイズしたかによって、特定のＤＮＡのみならず複数のＤＮＡ診断を行うことも可能となる。いわゆるＤＮＡチップと同様な試験を簡易的に行うことができる。
【００２６】
請求項７に記載の生体関連物質の検出方法および検出装置は、上記の課題を解決するために、印加電圧または電流と、検出した電流値または電圧値とからインピーダンスの虚軸成分および実軸成分を演算する軸成分演算手段と、周波数を可変する周波数可変手段とを備えたことを特徴としている。
【００２７】
上記の構成によれば、従来用いられてきたコールコールプロットすなわちナイキストプロットを描くことができ、その軌跡の半径によってハイブリダイズやミスマッチハイブリダイズを検出することに加えて実軸、虚軸成分から容易にインピーダンスを求めることができるので、ＤＮＡのハイブリダイズを検出することができる。
【００２８】
請求項８に記載の生体関連物質検出装置は、上記の課題を解決するために、直流信号または低周波信号を印加する第一の信号印加手段と、前記直流信号または低周波信号と交流信号とを時間的に個別に印加する第二の信号印加手段と、前記直流信号または低周波信号と交流信号とを混合して印加する混合印加手段と、を備えたことを特徴としている。
【００２９】
上記の構成によれば、交流インピーダンスの測定前に、直流信号を印加することで非可逆的な酸化還元反応を生じさせ、溶液中の電極界面やＤＮＡに不用意に付着している分子の影響をあらかじめ電気化学的に除去し、交流インピーダンス測定時の初期に不要な電流の移動を回避して精密な測定を行うことができる。
【００３０】
請求項９に記載の生体関連物質検出装置は、ランダム信号を発生するランダム信号発生手段と、該ランダム信号によって交流信号を変調する交流信号変調手段と、該ランダム信号によって変調された信号を復調する信号復調手段と、を備えたことを特徴としている。
【００３１】
上記の構成によれば、検出に必要であるとして印加された信号のみを取り出すことができ、検出に不必要な雑音成分を意図的に除去することができ信号レベルが小さい場合でも精度の高い測定が可能である。
【００３２】
請求項１０に記載の生体関連物質の検出方法および検出装置は、上記の課題を解決するために、電極から取り出された導電経路が櫛形状に配列され、電気的コネクタに嵌合可能な形態に母材とともに形成されてなることを特徴としている。
【００３３】
上記の構成によれば、複数の壺状構造を持つＤＮＡチップ状の生体関連物質検出装置であっても、簡単に電気コネクタに接続することができ、簡易な検出装置を提供することができる。
【００３４】
請求項１１記載の生体関連物質検出装置は、上記の課題を解決するために、周波数を可変させ、周波数に対するインピーダンスに角周波数を乗じ、逆数をとった特性のピーク値およびピーク値の位置する周波数を演算する演算手段を備えてなることを特徴としている。
【００３５】
生体関連物質の検出方法は、請求項１〜１１の構成によってインピーダンスＺを求めたとき、これを容量成分に置き換えれば数式１で示されるが、これに基づいて数式２によって等価静電容量Ｃを求め周波数に対してプロットするものである。
【００３６】
【数１】
2007171134.tif 000003
【００３７】
・・・数式１
【００３８】
【数２】
2007171134.tif 000004
【００３９】
・・・数式２
【発明の効果】
【００４０】
本発明の生体関連物質検出装置は、以上のように、印刷によって絶縁体上に形成された、炭素を主成分とする少なくとも１対の電極（炭素印刷電極）と交流インピーダンス計測とを含む構成である。
【００４１】
本発明の構成によれば、ＤＮＡを固定化する電極の材質が金などの高価な材料である必要性がなくコストを低減できるほか、重金属錯体によるインターカレータの発ガン性や廃棄処理における環境汚染の問題がないと言う効果がある。また従来の電気化学的手法では、電流スケールがｎＡ単位、電圧が１Ｖ以下程度となりインターカレータに可逆性があったとしても、高い耐雑音性が要求されたが、本発明の生体関連物質検出装置は、交流インピーダンス法によることができるので、周波数の排他性を利用して耐雑音性を向上することが容易である。また、前述もしたように一般的な電気化学的手法は、基準電極、作用電極、補助電極の３電極法が用いられてきたが本発明では小型化、測定の簡易性において効果がある。さらには、炭素電極は低廉で各種パターンの印刷が容易なため、ＤＮＡセンシング部分を容易にアレイ化して、その測定データを平均化処理して測定確度を向上させたり、固定化するＤＮＡの種類を複数準備して測定データを比較することでデータの有意性を検証したりできるという効果もある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
本発明の一実施形態について、図面に基づいて説明すれば以下のとおりである。
本発明の生体関連物質検出装置は、炭素印刷電極、炭素印刷電極に固定化された生体関連物質、もうひとつの電極、電極間に溶液を保持する機構、電極間に電圧を印加し電流を検出する電流検出手段とを備え、電極間に印可する電圧が交流成分を有し電圧と電流から交流インピーダンスを測定し周波数に対して等価容量を演算してその曲線の形状を判断する構成を有している。
【００４３】
〔実施の形態１〕
図１は、本発明の一実施の形態に係る生体関連物質検出装置の基本的な概略構成を示す説明図である。本実施の形態の生体関連物質検出装置は、絶縁体基板２上に、印刷形成された炭素印刷電極４と、同様に対向する電極５とが形成されている。電極５は、炭素印刷電極であっても、より導電性の高い金属電極であってもかまわない。炭素印刷電極４および電極５は、それぞれ、電極導通パターン１０、１１に電気的に接続されている。この電極導通パターン１０、１１が、それぞれ炭素印刷電極４、電極５と同じ連続した材料のパターンとして提供されても良いことは言うまでもない。
炭素印刷電極４と電極５との間に、溶液７を保持するために、溶液保持側壁８、９が設けられ各電極を取り囲み容器状になっている。溶液７を保持する構造は、電極間に電流の媒体として存在し、容易に溢失しなければ、後述する壺状構造であってもかまわない。図２は、図１の下側面の炭素印刷電極４を含む絶縁体基板２部分のみを取り出した説明図である。ここで、炭素印刷電極４には、一本鎖標識核酸（DNA）６が固定化されている。
【００４４】
図３は、絶縁体上に少なくとも２行２列以上の壺状構造体を配置し、前記壺状構造体の内面に少なくとも１対の電極を備えた構成を示す説明図である。絶縁体基板２にウェル（測定つぼ）１（壺状構造体）が、マトリクス状に配置された様子を示す。図４は、図３のより詳細な拡大構造説明図であり、ウェル（測定つぼ）１の内面に、炭素印刷電極４および電極５が印刷されている様子と、その電極が電極導通パターン１０、１１を介してコネクタ接触金属１２、１３に電気的に接続されている例を示している。ウェル１の形成密度は特に限定されないが、少なくとも２行２列以上で構成されていることがより好ましい。
【００４５】
図５は、図４に示す絶縁体基板２の断面構造を示す説明図である。ウェル１の内面側壁に、炭素印刷電極４と電極５とが形成されている概略構成を示している。電極５は、電極導通パターン１０を介してコネクタ接触金属１２に電気的に接続され、さらに、コネクタのメス型であるコネクタ母材１４の内面のコネクタ接触金属１３に接触して電気的に接続されている。すなわち、絶縁体基板２は、ウェル１や電極導通パターン１０を有する母体でありながら、コネクタのオス型としての機能を兼ねている。絶縁体基板３は、ウェル１の母材である絶縁体基板２に平面的に密着され、溶液が外部に漏れ溢失しない構造となっている。絶縁体基板２が溶液が溢失する区尾製となっている場合は、絶縁体基板３は、不要である。尚、炭素印刷電極４と電極５とは、互いに位置関係が逆転していてもよい。
【００４６】
図６は、図４〜図５に示す絶縁体基板２上の全体的な平面構造を示した説明図である。簡単のため嵌合するメス型コネクタは図示していない。コネクタから接続された電線が切替スイッチ１５（切り替え手段）を介して検出回路１６（電流検出手段）に入力されている様子を示す。切替スイッチ１５により、ウェル1と検出回路１６との接続を切り替えることができるため、ウェルを複数で構成し、検出回路１６は一組とする構成とすることができる。
【００４７】
図７は、対向する1対の電極４，５のいずれか一方が、ウェル１内部の炭素印刷電極であり、もう一方がウェル１の上面に密着する絶縁体基板３（第二の絶縁体）に電気的に連続的に接続された電極導通パターン１１の一部として攻勢され、その先端部がウェル１中の溶液中に浸漬している場合を示している。この形態の場合、溶液が対向する電極対の両方に接触するように充填されているか、または、溶液注入後傾けたり回転させて電極対が溶液に接触するようにする。
【００４８】
図８は、対向する１対の電極が電気的に接続された電極導通パターンの別実施形態を示す断面図である。電極は、絶縁体基板３の外部上面で接続する構造で絶縁体基板３を貫通して、ウェル１の溶液中に漬かる構造体になっている。このような構成とすることにより、電極をウェル内の溶液に浸漬させるために基板全体を傾斜させるなどの動作が不要となる。
【００４９】
図９は、電極導通パターンの他の実施形態を示す断面図である。この形態では、電極５は、ウェルの存在部分全面を被覆する連続した一面のパターンとして構成されている。この場合、図７に示す電極導通パターン１１のように複雑に形成する必要がないというメリットがある。
【００５０】
図１０は、本発明の生体関連物質検出装置をより単純化し、実験用として簡易に構成した場合の説明図である。炭素印刷電極４と電極５とをサンドイッチ構造に対向させ、その間に溶液７を保持するようにし、各電極を検出回路１７へ接続してある。
【００５１】
本発明の生体関連物質検出装置は、一体型の信号処理装置またはコネクタ等により接続される信号処理装置をさらに備える構成であってもよい。前記信号処理装置の出力コネクタは、例えば、各種メモリコネクタに接続可能な形態とし、前記メモリコネクタを介して読み取れる信号形式に変換する変換手段をさらに備えていてもよい。
【００５２】
図４〜９、図１５に示した生体関連物質検出装置は、コネクタ部分をパーソナルコンピュータやデジタルカメラ、家電機器などでも用いられるフラッシュメモリのコネクタに機械的に接続可能な形態に設計してもよい。また、測定回路装置が組み込まれた中継装置を介して前記フラッシュメモリに電気信号として記録するように中継装置の出力コネクタを構成し、中継装置すなわち測定回路装置を直接パーソナルコンピュータ本体に付属させたり、パーソナルコンピュータに接続されるフラッシュメモリのリーダライタに接続し、生体関連物質検出装置の信号がパーソナルコンピュータに取り込まれるように構成にしてもよい。これによって、既存のＣＤＲやＤＶＤドライブでＤＮＡチップの情報を読み取り、医療機関に送信する代わりに、本発明の交流法によるＤＮＡ測定結果を、フラッシュメモリ読み取り部分から読み取り、医療機関に送信したり新たなＤＮＡ検出装置を購入したりする医療システムと結合できる。
【００５３】
図１６は、本発明の生体関連物質検出装置をそのような医療システムに組み込んだ場合の概略構成を示す説明図である。インターネット接続環境にある、家庭や事務所・小規模医療機関の領域２３，２３’では、検体３１を、本発明の生体関連物質検出装置の一部を構成するバイオセンシング電極機構３３にアプライする。該電極機構３３は、本発明の生体関連物質検出装置の一部を構成する電気回路３０と接続されている。該電気回路３０を通じて、検体３１に関する生体関連情報の検出結果が、パーソナルコンピュータ28上のメモリーリーダライター３２により読み取られ、データとして格納できるようになっている。
【００５４】
パーソナルコンピュータ28に格納されたデータは、 患者自身が、家庭用プリンタ２９により印刷することもできる。該データは、インターネット通信網（携帯電話通信網等）２７上にアップロードされる。また、アップロードされた生体関連情報は、医療機関・検査機関２６に送られ、各家庭や事務所・小規模医療機関の領域２３には、前記インターネット通信網（携帯電話通信網等）２７を通じて、前記医療機関・検査機関２６から、診断データ、家庭治療指示事項等をダウンロードして購入できるようになっている。パーソナルコンピュータ28に格納されたデータや、前記診断データ等は、 患者自身が、家庭用プリンタ２９により印刷することもできる。
【００５５】
医療機関・検査機関２６は、診断、データ蓄積を行うほか、バイオ関連解析を自身で、または、外部機関に委託する等して行い、解析情報をフィードバックする。医療機関・検査機関２６は、患者が必要な情報を購入した対価として診断費用等を患者の口座やクレジットカードで構成される取引窓口２４から診断費用等を引き落とすことが可能である。
【００５６】
本発明の生体関連物質検出装置は、ランダム信号を発生するランダム信号発生手段と、該ランダム信号によって交流信号を変調する交流信号変調手段と、該ランダム信号によって変調された信号を復調する信号復調手段と、をさらに備えた構成であってもよい。図１７は、そのようなランダム信号を発生するランダム信号発生手段により、繰り返し信号波形をランダムに欠損させて同期検波する概略構成を示す説明図である。このような構成を採用することにより、検出に必要な信号のみを取り出すことができ、検出に不必要な雑音成分を意図的に除去することができる。これにより、信号レベルが小さい場合でも、より精度の高い測定が可能となる。図１７では、変調された信号を正弦波１波長として記載してあるが実際には、ランダム信号のパルス幅の期間に多数波長の正弦波すなわちランダム信号の周波数より高い周波数の正弦波信号を変調するケースが考えられる。
【００５７】
以下に本発明の、生体関連物質の検出装置の他の実施の形態について詳細に説明する。
【００５８】
〔実施の形態２〕
本実施の形態では、炭素電極上へのオリゴDNAの固定化を以下のように行う。まず、炭素電極を0.5 M酢酸緩衝液（pH 5）に浸漬し、銀/塩化銀電極を対極として1.5V、1分間電圧を印加し、炭素電極を活性化する。オリゴDNA（レジオネラDNA、レジオネラ菌の16S rRNAの遺伝子配列より作製） 10ppmを含む0.2 M燐酸緩衝液（pH7）に炭素電極を浸漬し、銀/塩化銀電極を対極として0.5V、3分間電圧を印加し、オリゴDNAを炭素電極上に固定化する。固定化に用いたオリゴDNA（本実施の形態では、レジオネラDNA）の塩基配列は以下の通りである。
オリゴDNA（レジオネラDNA）=TTGGACATCCCTGCCAGT
次に、オリゴDNAプローブとオリゴDNA結合炭素電極とのハイブリダイゼーション処理およびインピーダンス測定を説明する。前記オリゴDNAを図２に示した電極導通パターン１０上に固定化された一本鎖標識核酸６とした図１０の簡易な生体関連物質検出装置として構成する。前述の通りレジオネラＤＮＡが固定化されている炭素印刷電極４を用い、銀/塩化銀電極を一方の対向電極５とし、両電極を40 ppmオリゴDNAプローブ、すなわち前記レジオネラDNAと相補的な配列を有するＤＮＡ、を含む0.02 M燐酸（pH7）-0.3M NaCl緩衝液中に浸漬する。次いで、両電極間に42℃、10分間0.5Vの電圧を印加することにより、ハイブリダイゼーション処理を行う。オリゴDNAプローブの塩基配列（前記レジオネラDNAと相補的な配列である。）は以下の通りである。
オリゴDNAプローブ=AACCTGTAGGGACGGTCA
前記ハイブリダイゼーション処理をした後に、10mM Tris-HCl pH 7.0でハイブリダイゼーション処理後の炭素印刷電極４および電極５を2回洗浄し、周波数を100 HZから15 MHZまで自動掃引しながらインピーダンスを測定した。交流インピーダンス測定装置にはヒューレットパッカード社製の4914Aインピーダンス/ゲインアナライザーを用いた。
【００５９】
測定結果を図１３に示す。図１３中横軸はインピーダンスの実数成分、縦軸はインピーダンスの虚数成分を示す。○はレジオネラDNAを炭素印刷電極４に固定化させた場合（レジオネラ電極のみ）、△は前記レジオネラ電極にポリCプローブをハイブリダイズさせた場合、□は前記レジオネラ電極にレジオネラDNAプローブをハイブリダイズさせた場合を示す。Cole Cole plotのパターンは、いずれも2つの円弧からなり、ハイブリダイズ処理することにより、100〜300Ω平行移動し、右側の円弧の傾きが緩やかになる。このプロット変化が、DNAハイブリダイゼーションを示し、Cole Cole plotのパターン変化によりハイブリダイズの有無を判定することができる。
【００６０】
異なる測定結果を図１１、１２に示す。図中横軸はインピーダンス測定時の周波数、縦軸は周波数に対するインピーダンスに角周波数を乗じ、逆数をとった値すなわちインピーダンスの等価容量を示している。図１１は、レジオネラDNA結合炭素電極に異なる配列のオリゴDNA(polyCオリゴDNA、塩基配列はCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC)が結合した場合の結果を、図１２は、レジオネラDNA結合炭素電極に相補鎖DNAが結合した場合の結果を示す。図１１に示すように相補的でない配列同士のハイブリダイズ処理ではキャパシタンス成分は減少するがピーク周波数の変化は見られない。図１２に示すように相補的なオリゴDNA間でのハイブリダイズ処理では、140Hz付近に見られるキャパシタンスのピークが120Hｚ付近にシフトし、且つ減少した。これらの結果から明らかであるようにハイブリダイズしない場合とハイブリダイズする場合とではインピーダンスに角周波数を乗じ、逆数をとった値（回路のキャパシタンス）のピーク周波数が異なり、ハイブリダイズの有無を判定することができる。
【００６１】
図１４は、本発明の一実施の形態に係る生体関連物質検出装置に用いる等価回路図である。図１５は、本発明の一実施の形態に係る生体関連物質検出装置に用いる簡易等価回路図である。等価回路の模式図を示す。ここで、静電容量２０a~cは、溶液と電極界面の静電容量とを、静電容量１９a~cは、標識ＤＮＡの静電容量成分を、静電容量１８a~cは、ハイブリダイズしたＤＮＡすなわち検体の静電容量成分をそれぞれ示す。静電容量２１は、溶液全体の静電容量を、抵抗器２２は、溶液全体の抵抗を示す。静電容量２０a~cには、並列に抵抗成分が接続されることが物理的に考えられるが静電容量の増分を問題にするため記載していない、実際の現象においては、このように単純化することが可能かどうか現在の研究レベルでは微視的な挙動、すなわちＤＮＡが末端で電極に結合して溶液中に藻草のように漂っているのか、はたまた長い構造であるＤＮＡが、折れ曲がった複数の箇所で電極などの基材に結合しているのかが明らかにされていない。しかしながら、少なくとも個体として静電容量を有するＤＮＡがハイブリダイズして結合した部分は容量が増加するはずである。ここで記載した集中定数の等価回路はこのような前提に基づいており、かつ基本的な結合部分の一要素を取り出して図示したので、実際にはＤＮＡの数量だけ図示した等価回路がメッシュ状に結合されてなることは容易に想像できる。
【００６２】
図１８は、本発明の一実施の形態に係る生体関連物質検出装置の概略構成を示す説明図である。発振器４０と直流電源３７の出力をスイッチ３６ａおよびスイッチ３６ｂで切り替えて炭素電極によるＤＮＡセンサー部分３５に電流を供給するようになっている、一方炭素電極によるＤＮＡセンサー部分３５の両端の電圧の検出は、電極の近傍でいわゆる４端子法によって電線その他のインピーダンスを含まないように電圧検出端子３４ａと３４ｂの間で行う。電流検出は、電流検出器３８によって行う。図には記載していないが、スイッチ３６ａと３６ｂのオンオフや、供給する直流電圧や交流電圧の大きさや周波数は、電気回路３０によって総合的に制御される。直流電圧を印可するのは、ＤＮＡのインピーダンスによる検出の前に、直流電圧で酸化あるいは還元反応等の不可逆的な電気化学反応を促進させてしまい、電極面の付着物や溶液を清浄化あるいは安定化させる意味をもっている。増幅器またはゲイン調節器３９は、ＤＮＡを含んだ溶液に微少電流を流したときインピーダンスによる電源電圧の降下がないような十分な供給能力をもったオペアンプ等の増幅器機能と、電圧をＤＮＡを含んだ溶液の種類や状態に応じて適正な大きさに調節するゲイン調節の役割を持っている。
【００６３】
図１９は、絶縁体基板２上の炭素印刷電極４に固定化された標識ＤＮＡ４３a，４３bと等価回路における静電容量変化の対応を示した説明図である。図１９（a）において、絶縁体基板２には、炭素印刷電極４に標識ＤＮＡ４３ａ、４３ｂが固定化されており、等価回路で基板部分に相当する静電容量４５に対して、標識ＤＮＡ４３ａに相当する静電容量４６が並列接続された模式図である。ここで基板部分に相当する静電容量４５は、基板と溶液を含むＤＮＡが固定された近傍の静電容量であると考えてよい。図１９（b）は、検体ＤＮＡ４２が、標識ＤＮＡ４３ｂにハイブリダイズする様子を示した模式図である。ここでは、相補的な配列のＤＮＡが結合することになる。
図１９（ｃ）は、標識ＤＮＡ４３ａ、４３ｂのいずれにもハイブリダイズされ、ハイブリダイズ後のDNA４４a、４４bとなった状態を示す模式図である。同図は、ハイブリダイズによって付加された静電容量４７が、標識ＤＮＡ４３ａに相当する静電容量４６にさらに並列接続された等価回路を示している。ここで等価回路は、一組のＤＮＡのハイブリダイズを模擬したもので実際に全体の等価回路は、電極面でこの等価回路が並列に接続されさらに対向する電極へ向かう溶液抵抗や溶液静電容量が直列接続される。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明の生体関連物質の検出装置の用途としては、例えば、レジオネラ菌やサルモネラ菌など、重要な感染性細菌ではなくかつ存在そのものが重度の生命存亡の危機に関わらない細菌の検出、すなわち検出精度が高度に要求されないが存在の有無が検査等により必要とされる用途に用いられる。すなわち、本発明の生体関連物質検出装置はインターカレータ等の標識物質を利用しない電気的方式であるので簡便で利用価値が高い。具体的には、公衆浴場や温泉地において毎日容易にレジオネラ菌の存在確認検出を実施することができるようになる。さらに、精度を求めるためには、既存のバイオチップのようにマトリクス状に電極対を配置してその結果を平均化しても良いし、それぞれの測定つぼの電極に多少異なったＤＮＡを固定化させて、検出値の差異によってキャリブレーションを行うことも容易にできるので、前記の公衆浴場や温泉地など以外の医療用途にも十分利用可能性は高いものと考える。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】本発明の一実施の形態に係る生体関連物質検出装置の基本的な概略構成を示す説明図である。
【図２】本発明の一実施の形態に係る生体関連物質検出装置の構造図１の一部の立体図である。
【図３】本発明の一実施の形態に係る生体関連物質検出装置の平面図である。
【図４】本発明の一実施の形態に係る生体関連物質検出装置平面図の拡大詳細図である。
【図５】本発明の一実施の形態に係る生体関連物質検出装置の断面図である。
【図６】本発明の一実施の形態に係る生体関連物質検出装置平面図全体の拡大図である。
【図７】本発明の一実施の形態に係る生体関連物質検出装置平面図の拡大詳細図である。
【図８】本発明の一実施の形態に係る生体関連物質検出装置の断面図である。
【図９】本発明の一実施の形態に係る生体関連物質検出装置の断面図である。
【図１０】インピーダンス測定セル（炭素電極と銅電極の複合セル）の模式図である。
【図１１】レジオネラ電極を固定化した電極にレジオネラDNAプローブをハイブリダイズした場合の状態変化を示すグラフである。
【図１２】レジオネラDNAを固定化した炭素印刷電極に対しハイブリダイゼーションが行われていない状態（電極ミスマッチ）を示すグラフである。
【図１３】コールコールプロットによる測定結果を示すグラフである。
【図１４】本発明の一実施の形態に係る生体関連物質検出装置に用いる等価回路図である。
【図１５】本発明の一実施の形態に係る生体関連物質検出装置に用いる簡易等価回路図である。
【図１６】本発明の生体関連物質検出装置を用いたビジネスモデルの概念例を示す説明図である。
【図１７】繰り返し信号波形をランダムに欠損させて同期検波する概略構成を示す説明図である。
【図１８】本発明の一実施の形態に係る生体関連物質検出装置の概略構成を示す説明図である。
【図１９】ＤＮＡのハイブリダイゼーションと静電容量との関係を示す模式図である。
【符号の説明】
【００６６】
１      ウェル（測定つぼ）  
２      絶縁体基板（絶縁体，第一の絶縁体）
３      絶縁体基板（絶縁体，第二の絶縁体）
４      炭素印刷電極
５      電極
６      一本鎖標識核酸（DNA）
７      溶液
８      溶液保持側壁
９      溶液保持側壁
１０    電極導通パターン
１１    電極導通パターン
１２    コネクタ接触金属
１３    コネクタ接触金属
１４    コネクタ母材
１５    切替スイッチ
１６    検出回路
１７    測定装置
１８ａ  静電容量
１８ｂ  静電容量
１８ｃ  静電容量
１９ａ  静電容量
１９ｂ  静電容量
１９ｃ  静電容量
２０ａ  静電容量
２０ｂ  静電容量
２０ｃ  静電容量
２１    静電容量
２２    溶液全体の抵抗成分
２３，２３’   家庭や事務所・小規模医療機関の領域
２４  取引窓口
２５  バイオ関連解析（バイオ診断情報）
２６  医療・研究機関、検査機関
２７  インターネット
２８  パーソンナルコンピュータ
２９  家庭用プリンタ
３０  電気回路
３１  検体
３２  メモリーリーダライター
３３  バイオセンシング電極機構
３４ａ、３４ｂ  電圧検出端子
３５  炭素印刷電極によるＤＮＡセンサー部分
３６ａ、３６ｂ  スイッチ
３７  直流電源
３８  電流検出器
３９  増幅器またはゲイン調節器
４０  発振器
４１  信号処理・検出測定部
４２  検体ＤＮＡ
４３ａ、４３ｂ  電極に固定化された標識ＤＮＡ
４４ａ、４４ｂ  ハイブリダイズした後のＤＮＡ
４５  静電容量
４６  静電容量
４７  静電容量の増分
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2007171134.tif 000019
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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