(57)【要約】  【課題】  短時間かつ高検出感度で、信頼性に優れた核内受容体のリガンドの分析が可能な分析方法を提供する。  【解決手段】  検体に含まれる核内受容体リガンドを分析するための方法であって、検体を含む培地中で、核内受容体遺伝子およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が発現可能に導入されており、かつ核内受容体リガンドと核内受容体との複合体を認識して前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現し得る形質転換酵母を培養する培養工程と、前記培養工程の後、前記培地中に産生されたβ−ガラクトシダーゼの活性を測定する測定工程とを包含し、前記培地が、炭素源としてガラクトースおよびグルコースを含有する培地を使用する方法である。【選択図】  図１
2007295806.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体に含まれる核内受容体リガンドを分析するための方法であって、
検体を含む培地中で、核内受容体遺伝子およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が発現可能に導入されており、かつ核内受容体リガンドと核内受容体との複合体を認識して前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現し得る形質転換酵母を培養する培養工程と、
前記培養工程の後、前記培地中に産生されたβ−ガラクトシダーゼの活性を測定する測定工程とを包含し、
前記培地が、炭素源としてガラクトースおよびグルコースを含有する、方法。
【請求項２】
前記ガラクトースおよび前記グルコースの合計に対する前記グルコースの重量割合が、０を超え６０重量％以下の範囲である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記形質転換酵母が、グリセロール存在下で保存されていた酵母である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記形質転換酵母が、予め、グルコース単独を炭素源とする培地で培養された酵母である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記形質転換酵母が、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記分析が、検出、定性分析または定量分析のいずれかのために実施される請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記リガンドが、エストロゲンまたはエストロゲン様化学物質であり、前記核内受容体が、エストロゲン受容体（ＥＲα）であり、前記形質転換酵母が、その染色体上に前記エストロゲン受容体（ＥＲα）遺伝子を有し、かつ前記形質転換酵母が、エストロゲン応答（ＥＲＥ）配列および前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子が作動的に組み込まれたプラスミドを有し、前記エストロゲン受容体と前記リガンドとの複合体が前記エストロゲン応答配列に結合して前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現し得る請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記リガンドが、アリールハイドロカーボンであり、前記核内受容体が、アリールハイドロカーボン受容体（ＡｈＲ）であり、前記形質転換酵母が、その染色体上に前記アリールハイドロカーボン受容体（ＡｈＲ）遺伝子およびＡｈＲ核内移行因子（Ａｒｎｔ）遺伝子を有し、かつ前記形質転換酵母が、前記異物応答配列（ＸＲＥ）配列および前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子が作動的に組み込まれたプラスミドを有し、前記アリールハイドロカーボン、前記アリールハイドロカーボン受容体およびＡｈＲ核内移行因子の複合体が前記異物応答配列に結合して前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現し得る請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記アリールハイドロカーボンが、ダイオキシン類、ポリ塩化ジベンゾフラン（ＰＣＤＦ）、ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）、β−ナフトフラボン、３−メチルコラントレン、べンゾピレン、ベンゾイミダゾール、ジベンゾアンスラセン、ペンタクロロフェノール、ジコホール、オクタクロロスチレンおよびこれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの化合物である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
検体の存在下、核内受容体遺伝子およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が発現可能に導入されており、かつ核内受容体リガンドと核内受容体との複合体を認識して前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現し得る形質転換酵母を培養することにより、前記検体に含まれる核内受容体リガンドを分析するために用いられる培地であって、炭素源として、ガラクトースおよびグルコースを含む培地。
【請求項１１】
請求項１から９のいずれか一項に記載の方法に使用する形質転換酵母であって、核内受容体遺伝子およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が発現可能な状態で導入され、かつ前記リガンドと前記核内受容体との複合体を認識して前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現し得る形質転換酵母。
【請求項１２】
検体に含まれる核内受容体リガンドの分析に使用する形質転換酵母であって、
核内受容体遺伝子およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が発現可能に導入されており、核内受容体リガンドと核内受容体との複合体を認識して前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現し得、さらに、応答配列を１つのみ含むレポータプラスミドを含む形質転換酵母。
【請求項１３】
前記応答配列が、５´−ＡＧＧＴＣＡＮＮＮＴＧＡＣＣＴ−３´で表されるコンセンサス配列を有する請求項１２記載の形質転換酵母。
【請求項１４】
前記リガンドがエストロゲンまたはエストロゲン様化学物質であり、
前記核内受容体がエストロゲン受容体（ＥＲα）であり、
前記応答配列が、エストロゲン応答（ＥＲＥ）配列であり、
その染色体上に前記エストロゲン受容体（ＥＲα）遺伝子を有し、かつエストロゲン応答（ＥＲＥ）配列および前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子が作動的に組み込まれたレポータプラスミドを有し、
前記エストロゲン受容体（ＥＲα）と前記リガンドとの複合体が前記エストロゲン応答配列に結合して前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現し得る請求項１２または１３に記載の形質転換酵母。
【請求項１５】
検体に含まれる核内受容体リガンドを分析するためのキットであって、
（ａ）炭素源として、ガラクトースおよびグルコースを含有する培地と、
（ｂ）核内受容体遺伝子およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が発現可能に導入されており、核内受容体リガンドと核内受容体との複合体を認識して前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現し得る形質転換酵母と、
（ｃ）発色基質と
を備える、キット。
【請求項１６】
検体に含まれる核内受容体リガンドを分析するためのキットであって、
（ａ）培地と、
（ｂ）核内受容体遺伝子およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が発現可能に導入されており、核内受容体リガンドと核内受容体との複合体を認識して前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現し得、応答配列を１つのみ含むレポータプラスミドを有する形質転換酵母と、
（Ｃ）発色基質と
を備える、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核内受容体リガンドの分析方法、それに用いる培地、形質転換酵母およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
環境中の化学物質の測定において、従来は機器分析が主流であったが、生物的な影響をも評価できる測定手法として核内受容体遺伝子を宿主細胞に組み込み、その発現の程度で化学物質の分析を行う手法が開発されている。例えば、近年、雌化現象等で注目された環境ホルモン（内分泌撹乱物質）のエストロゲン様活性の測定手法として、ブルーギル由来のエストロゲン受容体遺伝子（特許文献１）、オオマキトカゲ由来エストロゲン受容体遺伝子、（特許文献２）、ワニ由来エストロゲン受容体遺伝子（特許文献３）、ファットヘッドミノー由来エストロゲン受容体遺伝子（特許文献４）等の各種野生動物のエストロゲン受容体遺伝子を酵母に組み込み、その発現を測定するという手法が開発されている（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４）。この他、ヒト由来エストロゲン受容体遺伝子を組み込んだ形質転換酵母を用いてアルキルフェノール化合物のエストロゲン様活性を測定する手法が開発されている（非特許文献１）。また、例えば、ダイオキシン等のアリールハイドロカーボン類を測定するために、モルモット由来のアリールハイドロカーボン受容体遺伝子を組み込んだ形質転換酵母を用いた手法が開発されている（特許文献５）。これらの手法では、各種受容体遺伝子が発現し、測定対象となるリガンド（化学物質等）が前記受容体に結合して複合体を形成し、この複合体がレポータ遺伝子を発現させ、これを検出する。前記レポータ遺伝子としては、β−ガラクトシダーゼ遺伝子が使用されており、β−ガラクトシダーゼの酵素活性を測定することで、遺伝子の発現を測定している。このような各種受容体遺伝子を組み込んだ形質転換酵母を使用した測定手法では、前記形質転換酵母を、測定対象のリガンドの存在下で培養する必要があるが、その培養期間が長期間であるという問題がある。例えば、前述のヒトエストロゲン受容体遺伝子を組み込んだ形質転換酵母では、測定対象の化合物の存在下で８４時間にわたり培養を行っている。仮に培養時間を短縮するとすれば、測定感度が低下し、信頼性に問題が生じる。
【０００３】
【特許文献１】特開２００１−１９７８９０号公報
【特許文献２】特開２００３−２７４号公報
【特許文献３】特開２００２−３６０２７３号公報
【特許文献４】特開２００１−３５２９９２号公報
【特許文献５】特開２００５−８７０７７号公報
【非特許文献１】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．２７２，Ｎｏ．６，Ｆｅｂ．７  ｐｐ．３２８０−３２８８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明の目的は、短時間の分析時間で、検出感度が高く、信頼性に優れる核内受容体リガンドの分析方法、それに用いる培地、形質転換酵母およびキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記目的を達成するために、本発明の核内受容体リガンドの分析方法は、
検体に含まれる核内受容体リガンドを分析するための方法であって、
検体を含む培地中で、核内受容体遺伝子およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が発現可能に導入されており、かつ核内受容体リガンドと核内受容体との複合体を認識して前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現し得る形質転換酵母を培養する培養工程と、
前記培養工程の後、前記培地中に産生されたβ−ガラクトシダーゼの活性を測定する測定工程とを包含し、
前記培地が、炭素源としてガラクトースおよびグルコースを含有する、方法である。
【０００６】
本発明の培地は、検体の存在下、核内受容体遺伝子およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が発現可能に導入されており、かつ核内受容体リガンドと核内受容体との複合体を認識して前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現し得る形質転換酵母を培養することにより、前記検体に含まれる核内受容体リガンドを分析するために用いられる培地であって、炭素源として、ガラクトースおよびグルコースを含む培地である。
【０００７】
本発明の第一の形質転換酵母は、前記本発明の分析方法に使用する形質転換酵母であって、核内受容体遺伝子およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が発現可能な状態で導入され、かつ前記リガンドと前記核内受容体との複合体を認識して前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現し得る形質転換酵母である。
【０００８】
本発明の第二の形質転換酵母は、検体に含まれる核内受容体リガンドの分析に使用する形質転換酵母であって、核内受容体遺伝子およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が発現可能に導入されており、核内受容体リガンドと核内受容体との複合体を認識して前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現し得、さらに、応答配列を１つのみ含むレポータプラスミドを含む形質転換酵母である。
【０００９】
本発明の第一のキットは、検体に含まれる核内受容体リガンドを分析するためのキットであって、
（ａ）炭素源として、ガラクトースおよびグルコースを含有する培地と、
（ｂ）核内受容体遺伝子およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が発現可能に導入されており、核内受容体リガンドと核内受容体との複合体を認識して前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現し得る形質転換酵母と、
（ｃ）発色基質と
を備える、キットである。
【００１０】
本発明の第二のキットは、検体に含まれる核内受容体リガンドを分析するためのキットであって、
（ａ）培地と、
（ｂ）核内受容体遺伝子およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が発現可能に導入されており、核内受容体リガンドと核内受容体との複合体を認識して前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現し得、応答配列を１つのみ含むレポータプラスミドを有する形質転換酵母と、
（Ｃ）発色基質と
を備える、キットである。
【発明の効果】
【００１１】
従来の形質転換酵母の測定用培地には、β−ガラクトシダーゼを測定するために、炭素源として、ガラクトースのみを配合することが常識であった。しかし、本発明では、ガラクトースに加えてグルコースを配合することにより、形質転換酵母の増殖を早めることに成功し、例えば、後述の実施例で示すように、１８時間という短時間で分析可能なまでに形質転換酵母を培養することができるようになる。したがって、本発明の分析方法によれば、短時間かつ高感度で、信頼性に優れた核内受容体のリガンドの分析が可能となる。また、本発明の分析方法は、核内受容体の機能を利用する方法であるため、分析結果は、機器分析と異なり、例えば、化学物質を分析する場合は、その毒性等量（ｔｏｘｉｃ  ｅｑｕｖａｌｅｎｔｓ；ＴＥＱ）を反映しており、生体への影響を知る指標となりうる。そして、本発明の培地、形質転換酵母および分析キットを用いれば、本発明の分析方法を簡単に実施可能となる。さらに、本発明の第二の形質転換酵母若しくは第二のキットを使用すれば、従来よりも短時間かつ高感度で、信頼性に優れた核内受容体リガンドの分析が可能になる。そして、本発明の分析方法に、本発明の第二の形質転換酵母若しくは第二のキットを適用すれば、さらに、短時間かつ高感度で、信頼性に優れた核内受容体リガンドの分析が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の分析方法において、前記ガラクトースおよび前記グルコースの合計に対する前記グルコースの重量割合は、特に制限されないが、例えば、０を超え６０重量％以下の範囲、好ましくは、０を超え４０重量％以下の範囲、より好ましくは、１０〜３０重量％の範囲である。
【００１３】
本発明の分析方法において、前記形質転換酵母が、グリセロール存在下で保存されていた酵母であることが好ましい。前記のグルコース存在下で保存されていた形質転換酵母は、予め、グルコース単独を炭素源とする培地で培養された酵母であることが好ましい。
【００１４】
本発明の分析方法において、前記形質転換酵母は、特に制限されないが、例えば、出芽酵母、分裂酵母、糸状酵母等があるが、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が好ましい。
【００１５】
本発明の分析方法は、例えば、検出、定性分析または定量分析である。また、本発明において、分析は、検出、定性分析および定量分析を含む。
【００１６】
本発明の分析方法において、前記リガンドが、エストロゲンまたはエストロゲン様化学物質であり、前記核内受容体が、エストロゲン受容体（ＥＲα）であり、前記形質転換酵母が、その染色体上に前記エストロゲン受容体（ＥＲα）遺伝子を有し、かつ前記形質転換酵母が、エストロゲン応答（ＥＲＥ）配列および前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子が作動的に組み込まれたプラスミドを有し、前記エストロゲン受容体とエストロゲンとの複合体が前記エストロゲン応答配列に結合して前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現し得るという態様であってもよい。すなわち、この態様は、本発明の分析方法を用いたエストロゲンまたはエストロゲン様化学物質の分析方法となる。
【００１７】
本発明の分析方法において、前記リガンドが、アリールハイドロカーボンであり、前記核内受容体が、アリールハイドロカーボン受容体（ＡｈＲ）であり、前記形質転換酵母が、その染色体上に前記アリールハイドロカーボン受容体（ＡｈＲ）遺伝子およびＡｈＲ核内移行因子（Ａｒｎｔ）遺伝子を有し、かつ前記形質転換酵母が、前記異物応答配列（ＸＲＥ）配列および前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子が作動的に組み込まれたプラスミドを有し、前記アリールハイドロカーボン、前記アリールハイドロカーボン受容体およびＡｈＲ核内移行因子の複合体が前記異物応答配列に結合して前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現し得るという態様であってもよい。すなわち、この態様は、本発明の分析方法を用いたアリールハイドロカーボンの分析方法となる。
【００１８】
前記アリールハイドロカーボンとしては、例えば、ダイオキシン類、ポリ塩化ジベンゾフラン（ＰＣＤＦ）、ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）、β−ナフトフラボン、３−メチルコラントレン、ベンゾピレン、ベンゾイミダゾール、ジベンゾアンスラセン、ペンタクロロフェノール、ジコホール、オクタクロロスチレンおよびこれらの誘導体等がある。なお、前記メチルコラントレン等のように、ポリスチレンに吸着しやすい化合物が被験物に含まれるおそれがある場合には、分析処理操作は、ガラス製の容器、器具を用いることが好ましい。
【００１９】
本発明の第二の形質転換酵母において、前記応答配列が、５´−ＡＧＧＴＣＡＮＮＮＴＧＡＣＣＴ−３´で表されるコンセンサス配列を有することが好ましい。
【００２０】
本発明の第二の形質転換酵母において、
前記リガンドがエストロゲンまたはエストロゲン様化学物質であり、
前記核内受容体がエストロゲン受容体（ＥＲα）であり、
前記応答配列が、エストロゲン応答（ＥＲＥ）配列であり、
その染色体上に前記エストロゲン受容体（ＥＲα）遺伝子を有し、かつエストロゲン応答（ＥＲＥ）配列および前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子が作動的に組み込まれたレポータプラスミドを有し、
前記エストロゲン受容体（ＥＲα）と前記リガンドとの複合体が前記エストロゲン応答配列に結合して前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現し得る、形質転換酵母であってもよい。
【００２１】
つぎに、本発明について詳しく説明する。
【００２２】
本発明において、前記核内受容体および前記核内受容体のリガンドは、特に制限されず、例えば、下記に示す核内受容体および前記受容体に結合可能なリガンドがあげられる。
【００２３】
（１）ＴＲα：Ｔｈｙｒｏｉｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ
（２）ＴＲβ：Ｔｈｙｒｏｉｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ
（３）ＲＡＲα：Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ
（４）ＲＡＲβ：Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ
（５）ＲＡＲγ：Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ
（６）ＰＰＡＲα：Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ  （ＰＰＡＲ−ａｌｐｈａ）
（７）ＰＰＡＲδ：Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｅｌｔａ  （ＰＰＡＲ−ｄｅｌｔａ）  （ＰＰＡＲ−ｂｅｔａ）  （Ｎｕｃｌｅａｒ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １）  （ＮＵＣ１）  （ＮＵＣＩ）
（８）ＰＰＡＲγ１：Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ  （ＰＰＡＲ−ｇａｍｍａ）  １
ＰＰＡＲγ２：Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ  （ＰＰＡＲ−ｇａｍｍａ）  ２
（９）Ｒｅｖ−ｅｒｂα：Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＮＲ１Ｄ１  （Ｖ−ｅｒｂＡ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＥＡＲ−１）  （Ｒｅｖ−  ｅｒｂＡ−ａｌｐｈａ）
（１０）Ｒｅｖ−ｅｒｂβ：Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＮＲ１Ｄ２  （Ｒｅｖ−ｅｒｂ−ｂｅｔａ）  （ＥＡＲ−１Ｒ）  （Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＢＤ７３）
（１１）ＲＯＲα：Ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＲＯＲ−ａｌｐｈａ  （Ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＲＺＲ−ａｌｐｈａ）
（１２）ＲＯＲβ：Ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＲＯＲ−ｂｅｔａ  （Ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＲＺＲ−ｂｅｔａ）
（１３）ＲＯＲγ：Ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＲＯＲ−ｇａｍｍａ  （Ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＲＺＲ−ｇａｍｍａ）
（１４）ＬＸＲβ：Ｏｘｙｓｔｅｒｏｌｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＬＸＲ−ｂｅｔａ  （Ｌｉｖｅｒ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ）  （Ｎｕｃｌｅａｒ  ｏｒｐｈａｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＬＸＲ−ｂｅｔａ）  （Ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓｌｙ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）  （Ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＮＥＲ）
（１５）ＬＸＲα：Ｏｘｙｓｔｅｒｏｌｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＬＸＲ−ａｌｐｈａ  （Ｌｉｖｅｒ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ）  （Ｎｕｃｌｅａｒ  ｏｒｐｈａｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＬＸＲ−ａｌｐｈａ）
（１６）ＦＸＲ：Ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  （Ｆａｒｎｅｓｏｉｄ  Ｘ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）  （Ｆａｒｎｅｓｏｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＨＲＲ−１）  （Ｒｅｔｉｎｏｉｄ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １４）  （ＲＸＲ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １４）
（１７）ＶＤＲ：Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  （ＶＤＲ）  （１，２５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）
（１８）ＰＸＲ−１：    Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＰＸＲ  （Ｐｒｅｇｎａｎｅ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）  （Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＰＡＲ１）  （Ｓｔｅｒｏｉｄ  ａｎｄ  ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）  （ＳＸＲ）  −  １
ＰＸＲ−２：Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＰＸＲ  （Ｐｒｅｇｎａｎｅ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）  （Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＰＡＲ１）  （Ｓｔｅｒｏｉｄ  ａｎｄ  ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）  （ＳＸＲ）  −  ２
（１９）ＣＡＲ：Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＮＲ１Ｉ３  （Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ａｎｄｒｏｓｔａｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）  （ＣＡＲ）  （Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＭＢ６７）
（２０）ＨＮＦ４α：    Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ４−ａｌｐｈａ  （ＨＮＦ−４−ａｌｐｈａ）（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １４）
（２１）ＨＮＦ４γ：    Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ４−ｇａｍｍａ  （ＨＮＦ−４−ｇａｍｍａ）
（２２）ＲＸＲα：Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＲＸＲ−ａｌｐｈａ
（２３）ＲＸＲβ：Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＲＸＲ−ｂｅｔａ
（２４）ＲＸＲγ：Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＲＸＲ−ｇａｍｍａ
（２５）ＴＲ２：Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＴＲ２  （Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＴＲ２）
（２６）ＴＲ４：Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＴＲ４  （Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＴＡＫ１）
（２７）ＴＬＸ：Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＮＲ２Ｅ１  （Ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＴＬＸ）  （Ｔａｉｌｌｅｓｓ  ｈｏｍｏｌｏｇ）  （Ｔｌｌ）  （ｈＴｌｌ）
（２８）ＰＮＲ：Ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  （Ｒｅｔｉｎａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）
（２９）ＣＯＵＰ−ＴＦ  Ｉ：ＣＯＵＰ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １  （ＣＯＵＰ−ＴＦ１）  （ＣＯＵＰ−ＴＦα）  （Ｖ−ＥＲＢＡ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＥＡＲ−３）
（３０）ＣＯＵＰ−ＴＦ  ＩＩ：ＣＯＵＰ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ２  （ＣＯＵＰ−ＴＦ２）  （ＣＯＵＰ−ＴＦβ）  （Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＡＩ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）  （ＡＲＰ−１）
（３１）ＥＡＲ−２：Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＥＡＲ−２  （Ｖ−ｅｒｂＡ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＥＡＲ−２）（ＣＯＵＰ−ＴＦγ）
（３２）ＥＲα：Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  （ＥＲ）  （Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）  （ＥＲ−ａｌｐｈａ）
（３３）ＥＲβ：Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ  （ＥＲ−ｂｅｔａ）
（３４）ＥＲＲα：Ｓｔｅｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＥＲＲ１  （Ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，  ａｌｐｈａ）  （ＥＲＲ−ａｌｐｈａ）  （Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ  １）
（３５）ＥＲＲβ：Ｓｔｅｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＥＲＲ２  （Ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，  ｂｅｔａ）  （ＥＲＲ−ｂｅｔａ）  （Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ２）  （ＥＲＲ  ｂｅｔａ−２）
（３６）ＥＲＲγ：Ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ  （Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３）  （ＥＲＲ  ｇａｍｍａ−２）
（３７）ＧＲα：Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ
ＧＲβ：Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ
（３８）ＭＲ：Ｍｉｎｅｒａｌｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  （ＭＲ）
（３９）ＰＲα：Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ
ＰＲβ：Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ
（４０）ＡＲ：Ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  （Ｄｉｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）
（４１）ＮＧＦＩ−Ｂα：Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＨＭＲ  （Ｅａｒｌｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＮＡＫ１）  （ＴＲ３  ｏｒｐｈａｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）
（４２）ＮＧＦＩ−Ｂβ：Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＮＵＲＲ１  （Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＮＯＴ）  （Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）
（４３）ＮＧＦＩ−Ｂγ：Ｎｕｃｌｅａｒ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＮＯＲ−１  （Ｎｅｕｒｏｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｏｒｐｈａｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １）  （Ｍｉｔｏｇｅｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｏｒｐｈａｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）
（４４）ＳＦ−１：Ｓｔｅｒｏｉｄｏｇｅｎｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  １  （ＳＴＦ−１）  （ＳＦ−１）  （Ｓｔｅｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＡＤ４ＢＰ）  （Ｆｕｓｈｉ  ｔａｒａｚｕ  ｆａｃｔｏｒ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １）（ＦＴＺ−ＦＩα）
（４５）ＬＲＨ−１：Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＮＲ５Ａ２  （Ａｌｐｈａ−１−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）  （Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）  （Ｂ１−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）  （ｈＢ１Ｆ）  （ＣＹＰ７Ａ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）（ＦＴＺ−ＦＩβ  ）
（４６）ＧＣＮＦ：Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＮＲ６Ａ１  （Ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ）  （ＧＣＮＦ）  （Ｒｅｔｉｎｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｅｓｔｉｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）  （ＲＴＲ）
（４７）ＤＡＸ１：Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＤＡＸ−１
（４８）ＳＨＰ：Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＳＨＰ  （Ｓｍａｌｌ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  ｐａｒｔｎｅｒ）
【００２４】
これらの核内受容体の中で、例えば、エストロゲン受容体（ＥＲα）若しくはアリールハイドロカーボン受容体（ＡｈＲ）の態様がある。
【００２５】
まず、ＥＲαとしては、特に制限されないが、背景技術の欄に記載した、ブルーギル由来ＥＲα、オオマキトカゲ由来ＥＲα、ワニ由来ＥＲα、ファットヘッドミノー由来ＥＲα等の各種野生動物のものがある。また、ＥＲαは、ヒト由来ＥＲαがある。なお、ＥＲαは、リガンド（エストロゲン若しくは化学物質）と複合体を形成し、これがＥＲＥ配列を認識して結合し、これにより、ＥＲＥ配列の下流に存在する遺伝子（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）が発現する。
【００２６】
前記ヒト由来ＥＲαとしては、例えば、下記（ａ）または（ｂ）のタンパク質があげられる。なお、下記配列番号１のアミノ酸配列は、公知であり、例えば、登録番号ＡＹ８９１０６４（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ）を参照できる。下記（ｂ）のタンパク質は、下記（ａ）のタンパク質との相同性が、例えば、９８％以上であって、好ましくは、９８．５％以上であり、より好ましくは、９９％以上であり、さらに好ましくは、９９．５％以上である。また、下記（ｂ）のタンパク質において、置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸残基の数は、例えば、１〜１１であって、好ましくは、１〜８であり、より好ましくは、１〜５であり、さらに好ましくは、１〜２である。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸残基が置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ヒト由来ＥＲαとして機能するタンパク質。
【００２７】
前記ヒト由来ＥＲαを酵母で発現させるためには、例えば、ヒト由来ＥＲα遺伝子を前記酵母の染色体遺伝子内に導入すればよい。
【００２８】
前記ヒト由来ＥＲα遺伝子としては、例えば、下記（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましく、または、下記（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子が好ましい。なお、下記配列番号２の塩基配列は公知であり、例えば、登録番号ＡＹ８９１０６４（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ）を参照できる。下記（ｄ）のポリヌクレオチドは、下記（ｃ）のポリヌクレオチドとの相同性が、例えば、９０％以上であって、好ましくは、９３％以上であり、より好ましくは、９５％以上であり、さらに好ましくは、９８％以上である。また、下記（ｄ）のポリヌクレオチドにおいて、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基の数は、例えば、１〜１７８であって、好ましくは、１〜１２５であり、より好ましくは、１〜８９であり、さらに好ましくは、１〜３５である。
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列の少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒト由来のＥＲαとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００２９】
前記ＥＲα遺伝子は、配列番号２の塩基配列に基づいて、ヒトのトータルＲＮＡ等を使用してクローニングしてもよく、また、ホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）法を利用して化学的にＤＮＡ合成してもよい。前記クローニングの方法は、特に制限されず、例えば、市販のクローニングキット等を利用して実施できる。
【００３０】
エストロゲン受容体リガンドおよびＥＲαの二者の複合体は、前述のようにゲノム上の前記複合体認識配列（ＥＲＥ）を認識して結合し、この下流にある遺伝子（本発明ではβ―ガラクトシダーゼ遺伝子）を発現させる。前記複合体認識配列（ＥＲＥ）としては、形質転換酵母内で発現させるヒト由来の複合体との親和性が高い複合体認識配列（ＥＲＥ）であることが好ましく、より好ましくは、ヒト由来の複合体認識配列（ＥＲＥ）である。前記ＥＲＥのコンセンサス配列としては、例えば５’―ＡＧＧＴＣＡＮＮＮＴＧＡＣＣＴ―３’（配列番号２０）等があげられ、前記レポーター遺伝子の発現制御のため、前記ＥＲＥ配列は１回のみのの繰り返し配列にすることが好ましい。なお、Ｎは、Ａ，Ｔ，Ｃ又はＧである。
【００３１】
前記ＡｈＲとしては、特に制限されず、ヒト由来ＡｈＲ、マウス由来ＡｈＲおよびモルモット由来ＡｈＲ等がある。この中で、アリールハイドロキシカーボンへの感受性が高いという理由から、モルモット由来ＡｈＲが好ましい。また、前記ＡｈＲ受容体が発現可能な形質転換酵母では、前述のように、前記ＡｈＲに加えて、Ａｒｎｔが発現可能なようにする。すなわち、形質転換酵母において、ＡｈＲが発現し、これと、リガンドとＡｒｎｔの三者の複合体が、異物応答配列（ＸＲＥ配列）に結合し、これによりβ−ガラクトシダーゼが発現する。
【００３２】
前記モルモット由来ＡｈＲとしては、例えば、下記（ｅ）または（ｆ）のタンパク質が好ましい。なお、下記配列番号７のアミノ酸配列は、公知であり、例えば、登録番号ＡＹ０２８９４７（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ）を参照できる。下記（ｆ）のタンパク質は、下記（ｅ）のタンパク質との相同性が、例えば、９８％以上であって、好ましくは、９８．５％以上であり、より好ましくは、９９％以上であり、さらに好ましくは、９９．５％以上である。また、下記（ｆ）のタンパク質において、置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸残基の数は、例えば、１〜１６であって、好ましくは、１〜１２であり、より好ましくは、１〜８であり、さらに好ましくは、１〜４である。
（ｅ）配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｆ）配列番号７に記載のアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸残基が置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質であって、モルモット由来のＡｈＲとして機能するタンパク質。
【００３３】
一方、前記モルモット由来のＡｒｎｔとしては、例えば、下記（ｇ）または（ｈ）のタンパク質が好ましい。下記（ｈ）のタンパク質は、下記（ｇ）のタンパク質との相同性が、例えば、９８．５％以上であって、好ましくは、９９．０％以上であり、より好ましくは、９９．２％以上であり、さらに好ましくは、９９．５％以上である。また、下記（ｈ）のタンパク質において、置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸残基の数は、例えば、１〜１２であって、好ましくは、１〜８であり、より好ましくは、１〜６であり、さらに好ましくは、１〜４である。
（ｇ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｈ）配列番号８に記載のアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸残基が置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質であって、モルモット由来のＡｒｎｔとして機能するタンパク質。
【００３４】
前記ＡｈＲおよびＡｒｎｔを細胞内で発現させるためには、例えば、モルモット由来のＡｈＲ遺伝子およびＡｒｎｔ遺伝子を前記細胞内に導入すればよい。
【００３５】
前記モルモット由来のＡｈＲ遺伝子としては、例えば、下記（ｉ）または（ｊ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましく、または、下記（ｉ）または（ｊ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子が好ましい。なお、下記配列番号９の塩基配列は公知であり、例えば、登録番号ＡＹ０２８９４７（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ）を参照できる。下記（ｊ）のポリヌクレオチドは、下記（ｉ）のポリヌクレオチドとの相同性が、例えば、９０％以上であって、好ましくは、９３％以上であり、より好ましくは、９５％以上であり、さらに好ましくは、９８％以上である。また、下記（ｊ）のポリヌクレオチドにおいて、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基の数は、例えば、１〜２５０であって、好ましくは、１〜２００であり、より好ましくは、１〜１４０であり、さらに好ましくは、１〜６０である。
（ｉ）配列番号９に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｊ）配列番号９記載の塩基配列の少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、モルモット由来のＡｈＲとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００３６】
一方、前記モルモット由来のＡｒｎｔ遺伝子としては、例えば、下記（ｍ）または（ｎ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましく、または、下記（ｍ）または（ｎ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子が好ましい。下記（ｎ）のポリヌクレオチドは、下記（ｍ）のポリヌクレオチドとの相同性が、例えば、９５％以上であって、好ましくは、９７％以上であり、より好ましくは、９８％以上であり、さらに好ましくは、９９％以上である。また、下記（ｎ）のポリヌクレオチドにおいて、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基の数は、例えば、１〜１２０であって、好ましくは、１〜７０であり、より好ましくは、１〜４０であり、さらに好ましくは、１〜２０である。
（ｍ）配列番号１０に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｎ）配列番号１０記載の塩基配列の少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、モルモット由来のＡｒｎｔとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００３７】
前記ＡｈＲ遺伝子およびＡｒｎｔ遺伝子は、配列番号９および配列番号１０の塩基配列に基づいて、モルモットのトータルＲＮＡ等を使用してクローニングしてもよく、また、ホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）法を利用して化学的にＤＮＡ合成してもよい。前記クローニングの方法は、特に制限されず、例えば、市販のクローニングキット等を利用して行える。
【００３８】
前記アリールハイドロカーボン、ＡｈＲおよびＡｒｎｔの三者の複合体は、前述のように、ゲノム上の前記複合体認識配列（ＸＲＥ）を認識して結合し、この下流にある遺伝子（本発明ではβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を発現させる。記複合体認識配列（ＸＲＥ）としては、形質転換酵母内で発現されるモルモット由来の複合体との親和性が高い複合体認識配列（ＸＲＥ）であることが好ましく、より好ましくは、モルモット由来の複合体認識配列（ＸＲＥ）である。前記ＸＲＥのコンセンサス配列としては、例えば、５´−ＧＣＧＴＧ−３´等があげられ、前記レポーター遺伝子の発現制御のために、前記ＸＲＥ配列は、１〜６回の繰り返し配列とすることが好ましく、より好ましくは、２〜５回であって、さらに好ましくは、２〜３回である。
【００３９】
本発明の遺伝子組換え細胞の宿主細胞は、酵母であり、好ましいのは、出芽酵母であることは、前述のとおりである。
【００４０】
前記酵母内に、前記核内受容体遺伝子を導入する方法としては、特に制限されず、従来公知の遺伝子導入方法により行うことができる。前記遺伝子導入方法としては、例えば、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポソームを用いた方法、エレクトロポレーション、ウイルスベクターを用いる方法、マイクロピペットインジェクション法等があげられる。本発明における核内受容体遺伝子の導入は、そのリガンドの分析に用いることが可能であれば、一過性型の導入でもよく、または、宿主染色体への組込み型もしくは自律複製・分配可能な人工染色体もしくはプラスミド型の導入でもよい。取扱いや保存の容易性およびリガンドの分析の迅速性、正確性、簡便性からは、宿主染色体への遺伝子導入方法が好ましい。
【００４１】
前記酵母内に導入する前記核内受容体遺伝子は、酵母内で恒常的または任意に発現するように、必要な調節配列と作動的に連結されていることが好ましい。前記調節配列とは、宿主細胞内において、作動的に連結された前記遺伝子の発現に必要な塩基配列であって、例えば、真核細胞に適した調節配列としては、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、エンハンサー等があげられる。前記作動的に連結とは、各構成要素が機能を果たすことができるように並置していることを意味する。
【００４２】
本発明において、前記核内受容体とリガンドの複合体を検出するためのレポーター遺伝子として、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を使用する。前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子は、その上流に、前記複合体が認識して結合する転写調節配列と作動的に結合している。前記転写調節配列しては、ＥＲαの場合は、ＥＲＥ配列であり、ＡｈＲの場合は、ＸＲＥであることは、前述のとおりである。これらの転写調節配列およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子は、プラスミドに組み込まれて形質転換酵母に導入されていることが好ましい。
【００４３】
つぎに、本発明の分析方法の一例を示す。
【００４４】
まず、所定の核内受容体遺伝子、前記転写調節配列およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を導入した形質転換酵母を準備する。そして、この形質転換酵母のグリセロールストックを調製することが好ましい。グリセロールストックを調製するために使用する培地は、特に制限されず、例えば、窒素源、炭素源、アミノ酸、核酸、ビタミン類等を含む培地があげられる。グリセロールストックを調製する培地組成の例を、下記表Ａに示す。
【００４５】
（表Ａ）
成分                                      配合量  
ドロップアウトパウダー  （注１）                  １．３ｇ
窒素源                  （注２）                  １．７ｇ
（ＮＨ４）２ＳＯ４                                  ５ｇ
炭素源（グルコースまたはガラクトース）          ２０ｇ
（注１）
ドロップアウトパウダー組成                                        
アデニン                ２．５ｇ  Ｌ−メチオニン          １．２ｇ
Ｌ−アルギニン          １．２ｇ  Ｌ−フェニルアラニン    ３    ｇ
Ｌ−アスパラギン酸      ６    ｇ  Ｌ−セリン            ２２．５ｇ
Ｌ−グルタミン酸        ６    ｇ  Ｌ−スレオニン        １２    ｇ
Ｌ−ヒスチジン          １．２ｇ  Ｌ−チロシン          １．８  ｇ
Ｌ−ロイシン            ３．６ｇ  Ｌ−バリン            ９      ｇ
Ｌ−リジン              １．８ｇ  ウラシル              １．２  ｇ
（注２）
Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｗ／Ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  ＆  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ  （Ｄｉｆｃｏ社製）
【００４６】
前記グリセロールストックを調製するための培養は、前記のような培地で継続的に培養された状態のものを利用する場合には、例えば、培養液を５０μＬ分取し、前記表Ａの培地５０００μＬ中に加え、３０℃で１２〜２４時間程度振とう培養することによって実施する。一方、形質転換酵母として凍結乾燥菌体を利用してグリセロールストックを調製するための培養を行う場合には、例えば、ＹＰＤ培地等の栄養培地を加え、３０℃で２４時間培養した培養液を５０μＬ分取し、前記と同様に前記表Ａに示す培地５０００μＬに加え、３０℃で１２〜２４時間程度振とう培養する。
【００４７】
前記グリセロールストックを調製するための培養により、菌体が十分増殖したら、得られた培養液から１０倍濃縮グリセロールストック液を作製する。このグリセロールストック液の組成は、例えば培養液８０％、グリセロール２０％から成り、−８０℃での保存も可能である。そして、このグリセロールストック液から本培養を実施する。前記本培養に使用する培地としては、例えば、前記表１に示す培地において、炭素源として、ガラクトースおよびグルコースを含むものを使用する。ガラクトースとグルコースの比率は、前述のとおりである。また、本培養においては、培地中に、化学物質等の被険物質を添加して行う。前記本培養の温度は、例えば、２８〜３０℃であり、前記本培養時間は、例えば、１０〜４８時間、好ましくは、１５〜３６時間、より好ましくは１８〜２４時間である。すなわち、本発明では、本培養における前記形質転換酵母の増殖を促進させることができるので、短時間の本培養で、被険物質を高感度かつ高信頼性で分析可能である。また、本培養は、振とう培養でもよいし、静置培養でもよい。なお、前記被験物が固体の場合には、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の形質転換酵母に対して毒性を示さない溶媒を用いて前記被験物を溶解してから前記培地と混合することが好ましい。
【００４８】
つぎに、本培養後の前記形質転換酵母を、公知の手法により溶菌させる。この溶菌には、例えば、下記に示すような、Ｚバッファーに界面活性剤（サルコシル）を添加した溶菌液等が使用できる。
【００４９】
（溶菌液）
成分                                        配合量（最終濃度）
Ｎａ２ＨＰＯ４                                      ６０ｍＭ
ＮａＨ２ＳＯ４                                      ４０ｍＭ
ＭｇＣｌ２                                          １  ｍＭ
ＫＣｌ                                            １０ｍＭ
ジチオスレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）  ２ｍＭ
サルコシル（Ｓａｒｃｏｓｉｌ）                  ０．２０％  
【００５０】
そして、前記溶菌液を適量採取し、産生されたβ−ガラクトシダーゼの酵素活性を測定する。β−ガラクトシダーゼの活性は、例えば、ＯＮＰＧ（オルソニトロフェニルガラクトピラノシド）やＣＰＲＧ（クロロフェノールレッドガラクトピラノシド）等の発色試薬（発色基質）を作用させ、その吸光度を測定すればよい。この測定において、予め、標準物質を用いて検量線を作成しておくことが好ましく、前記検量線は、被験物の測定と同時に作成することが好ましい。さらに、測定に際しては、用量作用関係の範囲内に納まるように被験物を適宜希釈することが好ましい。このような分析方法であれば、吸光度を測定するだけでよく、簡便かつ迅速に分析できる。
【００５１】
本発明の分析用キットは、本発明の分析方法を簡単に実施するためのキットであって、本発明の前記培地を含むキットである。このようなキットには、その他に、例えば、本発明の前記形質転換酵母、β−ガラクトシダーゼ活性測定のための試薬（例えば、ＯＮＰＧやＣＰＲＧ等）、検量線作成のための標準物質等を含んでいても良い。前記形質転換酵母は、凍結乾燥させて粉末状にしてもよい。
【００５２】
つぎに、本発明の実施例について比較例と併せて説明する。ただし、本発明は、下記の実施例および比較例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５３】
本実施例では、下記の手順によりヒトＥＲα遺伝子を組み込んだ形質転換酵母を作製し、エストラジオールの分析を行った。
【００５４】
（両方向プロモーターを有するプラスミドへのヒトＥＲα遺伝子のクローニング）
ヒト乳がん由来細胞ＭＣＦ−７細胞を約３０〜３５ｍｇ採取し、キット（商品名：Ｒｎａａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＲＮＡを抽出し、このＲＮＡとキット（商品名：ＲＮＡ  ＬＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＡＭＶ）  Ｖｅｒ：１．１、タカラバイオ社製）を用いてＲＴ−ＰＣＲを下記条件で行った。
【００５５】
ＲＴ−ＰＣＲ条件：  ３０℃  １０分、４２℃  ３０分、９９℃  ５分
【００５６】
前記ＲＴ−ＰＣＲで得られた試料を基に、さらに下記条件のＰＣＲを行い、ＥＲαｃＤＮＡ断片を得た。
【００５７】
フォワードプライマー：ｇｇｇｇｔａｃｃａｔｇａｃｃａｔｇａｃｃｃｔｃｃａｃａｃ（配列番号３）
リバーズプライマー：ｃｇｇａａｔｔｃｔｃａｇａｃｔｇｔｇｇｃａｇｇｇａａａｃ（配列番号４）
ＰＣＲ条件：  ９４℃  ２分  １サイクル
９４℃  ３０秒、５５℃  １５秒、６８℃  １分３０秒  ３０サイクル
【００５８】
こうして得られた断片をＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩにより制限酵素処理し、両方向プロモーター領域Ｇａｌ１、１０を持つプラスミドＹＥｐｌａｃＧａｌ１、１０（ＧｅｎｅＢａｎｋ、ｐＭＣ２６２）の前記両プロモーターの下流に位置するＫｐｎＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位に挿入し、ＥＲα遺伝子を有し、その上流にプロモーターが介在したプラスミドＹＥｐｌａｃを得た。なお、クローニングには大腸菌ＨＢ１０１株を使用した。
【００５９】
（染色体組込み型シャトルベクターへのクローニング）
前記ＥＲα遺伝子を有し、その上流にプロモーターが介在したプラスミドＹＥｐｌａｃをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩにより制限酵素処理し、続いてＴ４ポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて平滑末端化し、酵母染色体組込み型シャトルベクターｐＡＵＲ１０１（タカラバイオ社製）のＳｍａＩ部位に挿入し、ｐＡＵＲ１０１ＥＲαを得た。なお、クローニングには大腸菌ＨＢ１０１株を使用した。
【００６０】
（形質転換酵母の作製）
前記ｐＡＵＲ１０１ＥＲαを、制限酵素ＥｃｏＯ６５Ｉで処理して直鎖状とし、以下のように酢酸リチウム法にて宿主となる酵母へ導入し、さらに、染色体への組込みを行った。宿主株として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｗ３０３ａ株を使用した。
【００６１】
まず、前記宿主となる酵母を、３０℃でＯＤ６６０が１〜２になるまでＹＰＤ培地中で培養し、ソリューションＡ（０．１  Ｍ  Ｌｉｔｈｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ，  １０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５），  １  ｍＭ  ＥＤＴＡ  いずれも最終濃度）で洗浄後、ＯＤ６６０＝１５０となるようにソリューションＡに再懸濁し、１．５ｍｌマイクロチューブに１００μｌずつ分注して、３０℃で１時間インキュベートした。その後、直鎖状のｐＡＵＲ１０１ｇＡｈＲ／Ａｒｎｔ  ５μｇと、キャリアーＤＮＡ（商品名：ＳＡＬＭＯＮ  ＴＥＳＴＥＳ  ＤＮＡ  ｆｏｒ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＳＩＧＭＡ社製）１５０μｇ（合計２０μｌ）を加え、さらに、ソリューションＢ（ソリューションＡ１００ｍｌにポリエチレングリコール４０００を溶解したもの）を８５０μｌ添加し、緩やかに混合した。
【００６２】
つぎに、前記混合液を３０℃で３０分インキュベートして４２℃で１５分熱処理した後、さらに、１０分室温に放置してから、５０００ｒｐｍ１分間の遠心分離で集菌し、それらを５〜１０ｍｌのＹＰＤ培地に懸濁し、３０℃で一晩培養した。そして、培養後集菌して洗浄した酵母を、０．９％ＮａＣｌ溶液に懸濁し、ＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎＡ（０．５ｇ／ｍｌ）を含むＹＰＤ選択プレートに１００μずつ塗布して培養した。そして、ＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎＡ耐性株をＧａｌ１プロモーターとＥＲαｃＤＮＡ領域が染色体上に組込まれた形質転換酵母として選択した。
【００６３】
（レポータープラスミドの導入）
β―ガラクトシダーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＴＸＲＥ５−Ｚ（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．；Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １６０，２９７−３０３（１９９９））からＳａｌＩとＳｐｅＩにより制限酵素処理して、ＸＲＥ配列を抜き出し、そこにヒト由来ＥＲＥ配列を挿入し、レポータープラスミドを作製した。ヒト由来ＥＲＥ配列は、ヒト由来ＥＲＥ配列作製プライマーフォワード（配列番号５）とヒト由来ＥＲＥ配列作製プライマーリバース（配列番号６）を水溶液に溶解させ、９９℃で３０秒処理して、室温になるまで放置し、それぞれをハイブリダイズさせて作製した。このプラスミドを酢酸リチウム法により前記形質転換酵母に導入し、Ｇａｌ１プロモーターとＥＲαｃＤＮＡ領域が染色体上に組込まれ、さらに、前記レポータープラスミドが導入された形質転換酵母を作製した。
【００６４】
（形質転換酵母の前培養）
前記形質転換酵母を、下記に示すグリセロールストック調製用の培地にて２４時間前培養を行った。得られた培養液から、１０倍濃縮グリセロールストック液（培養液８０％、グリセロール２０％）を作製した。このストック液は、−８０℃での保存が可能である。
【００６５】
前培養の培地                      
ドロップアウトパウダー        １．３ｇ
窒素源                        １．７ｇ
（ＮＨ４）２ＳＯ４              ５ｇ
ウラシル                      ０．０２ｇ
グルコース                    ２０ｇ
水                            １Ｌ
【００６６】
（形質転換酵母の本培養）
前記ストック液５０μＬを、下記の本培養培地（１）および（２）５ｍＬに加えて本培養溶液を調製した。また、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１μＬに、各種の濃度（１ｎＭ，１０ｎＭ，０．１μＭ，１μＭ，０．０１ｍＭ，０．１ｍＭおよび１ｍＭ）に溶解させたエストラジオール溶液を調製した。前記本培養溶液２００μＬと前記エストラジオール溶液１μＬとを混合し、３０℃で１８時間静置して培養した。一方、前記本培養培地に代えて、下記の比較例１の培地を用いた以外は、本実施例と同様にして本培養を行ったものを比較例１とした。
【００６７】
本培養の培地（１）                
ドロップアウトパウダー        １．３ｇ
窒素源                        １．７ｇ
（ＮＨ４）２ＳＯ４              ５ｇ
ウラシル                      ０．０２ｇ
グルコース                    ３．５ｇ
ガラクトース                  １６．５ｇ
水                            １Ｌ
【００６８】
本培養の培地（２）                
ドロップアウトパウダー        １．３ｇ
窒素源                        １．７ｇ
（ＮＨ４）２ＳＯ４              ５ｇ
ウラシル                      ０．０２ｇ
グルコース                    ２ｇ
ガラクトース                  １８ｇ
水                            １Ｌ
【００６９】
比較例１の本培養の培地            
ドロップアウトパウダー        １．３ｇ
窒素源                        １．７ｇ
（ＮＨ４）２ＳＯ４              ５ｇ
ウラシル                      ０．０２ｇ
ガラクトース                  ２０ｇ
水                            １Ｌ
【００７０】
（β−ガラクトシダーゼ活性の測定）
前記本培養の培養液をよく混合し、５９５ｎｍの吸光度を測定した。さらに、前記培養液１００μＬに下記の測定試薬液を１００μＬ加え、３７℃で１．５時間静置した後、よく混合してから５４０ｎｍの吸光度を測定した。β−ガラクトシダーゼ活性は、５４０ｎｍの吸光度／５９５ｎｍの吸光度の比で評価した。その結果を、図１のグラフに示す。同図において、培地（１）および培地（２）が本実施例の結果である。
【００７１】
測定試薬液                                
ＮａＨ２ＨＰＯ４                  ６０ｍＭ
ＮａＨ２ＰＯ４                    ４０ｍＭ
ＭｇＣｌ２                          １ｍＭ
ＫＣｌ                            １０ｍＭ
ジチオスレイトール                  ２ｍＭ
サルコシル                      ０．２０％
ＣＰＲＧ                  ０．１ｍｇ／ｍＬ
【００７２】
図１のグラフに示すように、本実施例では、エストラジオールの濃度に応じてβ−ガラクトシダーゼの活性が向上した。これに対し、比較例１では、エストラジオールの濃度が変化してもβ−ガラクトシダーゼの活性は、ほぼ一定であった。
【００７３】
つぎに、前記形質転換酵母を種々のグルコース濃度で本培養を実施した場合のβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。
【００７４】
前記本培養の培地（１）若しくは（２）において、ガラクトースとグルコースの合計に対するガラクトースの濃度を、０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％に設定した８種類の培地を準備した。この中で、０％および１００％の培地は、比較例２となる。また、ＤＭＳＯにエストラジオールを、０μＭ（コントロール），０．１μＭおよび１μＭの各種の濃度で溶解したエストラジオール溶液を準備した。前記各種濃度の培地１．５ｍＬに、前記ストック液３．７５μＬを添加して混合して培養液を調製した。そして、マイクロプレートに、前記エストラジオール溶液１μＬおよび前記培養液２００μＬを分注し、３０℃で一晩静置培養した。前記マイクロプレートをよく攪拌して５９５ｎｍの吸光度を測定した。その後、前記培養液１００μＬを新しいマイクロプレートに移して、下記の染色液１００μＬを添加した後、３７℃でインキュベートし、９０分後および２１０分後に５４０ｎｍの吸光度を測定した。β−ガラクトシダーゼ活性は、５４０ｎｍの吸光度／５９５ｎｍの吸光度の比で評価した。また、これらの測定は、各培地について３回実施し、その平均を求めた。これらの結果を、下記の表１（９０分後）および表２（２１０分後）に示す。
【００７５】
（表１）：９０分後の吸光度
ガラクトース濃度      コントロール      エストラジオール濃度        
（％）              （ＤＭＳＯ）        ０．１μＭ        １μＭ      
１００              ０．６４９          ０．６８６        ０．６３８
９０                ０．２８６          ０．４４５        ０．８０７
８０                ０．３０６          ０．４６８        ０．５３１
７０                ０．３１１          ０．４７９        ０．５７２
６０                ０．２７７          ０．４２３        ０．４８４
５０                ０．２５５          ０．３９０        ０．３９３
４０                ０．２５４          ０．３０７        ０．３３０
０                  ０．２８９          ０．２７５        ０．２６７
【００７６】
（表２）：２１０分後の吸光度
ガラクトース濃度      コントロール      エストラジオール濃度        
（％）              （ＤＭＳＯ）        ０．１μＭ        １μＭ      
１００              ０．６３５          ０．６８６        ０．６４３
９０                ０．２５５          ０．４９７        ０．９４３
８０                ０．２６７          ０．４７２        ０．５６７
７０                ０．２６９          ０．４７５        ０．５９４
６０                ０．２５５          ０．４３４        ０．５０８
５０                ０．２３６          ０．４０８        ０．４０１
４０                ０．２３４          ０．３１２        ０．３４０
０                  ０．２６６          ０．２５３        ０．２４７
【００７７】
前記表１および表２から分かるように、グルコースとガラクトースの双方を用いた培地では、エストラジオールの濃度に応じたβ−ガラクトシダーゼの活性を得ることができた。
【実施例２】
【００７８】
本実施例では、下記の手順によりモルモットＡｈＲ遺伝子を組み込んだ形質転換酵母を作製し、β−ナフトフラボン（β−ＮＦ）の分析を行った。
【００７９】
（モルモットＡｒｎｔ遺伝子のクローニング）
モルモット（ＳＴＤ：Ｈａｒｔｌｅｙ）の肺組織を約３０〜３５ｍｇ採取し、キット（商品名：Ｒｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＲＮＡを抽出し、このＲＮＡとキット（商品名：ＲＮＡ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（ＡＭＶ）  Ｖｅｒ：２．１、ＴａＫａＲａ社製）を用いてＲＴ−ＰＣＲを下記条件で行った。
【００８０】
フォワードプライマー：配列番号１１、リバースプライマー：配列番号１２
ＲＴ条件      ５５℃  ３０ｍｉｎ、９９℃  ５ｍｉｎ、５℃  ５ｍｉｎ
ＰＣＲ条件    ９４℃  ２ｍｉｎ  １サイクル
９４℃  ３０ｓｅｃ、４９℃  ３０ｓｅｃ、７２℃  ３ｍｉｎ  ５０サイクル
【００８１】
前記ＲＴ−ＰＣＲ後にゲル電気泳動を行い、約２．４ｋｂのＡｒｎｔｃＤＮＡ断片を確認し、前記ＲＴ−ＰＣＲで得られた試料を基に、さらに、下記条件のＰＣＲを行い、ＡｒｎｔｃＤＮＡ断片を得た。
【００８２】
ＰＣＲ条件  ９４℃  ２ｍｉｎ  １サイクル
９４℃  ３０ｓｅｃ、４９℃  ３０ｓｅｃ、６８℃  ３ｍｉｎ  ３０サイクル
６８℃  ５ｍｉｎ  １サイクル
【００８３】
こうして得られたモルモットＡｒｎｔｃＤＮＡ断片の末端を、Ｔ４ＰｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＫｉｎａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いてリン酸化した。この断片を、プラスミドｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）のＳｍａＩ部位に挿入し、モルモットＡｒｎｔ遺伝子をクローニングした（ｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ−ＡｒｎｔｃＤＮＡの完成）。このｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ−ＡｒｎｔｃＤＮＡ上のＡｒｎｔ遺伝子の配列は、ＤＮＡシーケンサーにより配列決定した（配列番号１０）。なお、クローニングには、大腸菌ＤＨ５α株を使用した。
【００８４】
（両方向プロモーターを有するプラスミドへのモルモットＡｈＲおよびＡｒｎｔ遺伝子のクローニング）
両方向プロモーター領域Ｇａｌ１，１０を持つプラスミドＹＥｐｌａｃ  Ｇａｌ１，１０  （ＧｅｎＢａｎｋ，ｐＭＣ２６２）の前記両プロモーターの下流に位置するＢｓｉＷＩ／ＭｆｅＩ部位およびＸｂａＩ／ＳｂｆＩ部位に、それぞれ、ＡｈＲ断片およびＡｒｎｔ断片を挿入し、ＡｈＲおよびＡｒｎｔ遺伝子を有し、それらの間に両方向プロモーターが介在したプラスミドＹＥｐｌａｃを得た。なお、クローニングには、大腸菌ＤＨ５α株を使用した。
【００８５】
前記ＡｈＲ断片は、前記モルモットの肺から抽出したＲＮＡと、キット（商品名：Ｒｅｖｅｒ  Ｔｒａ  Ｄａｓｈ、ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、下記条件のＲＴ−ＰＣＲを行い、その増幅産物をＭｆｅＩおよびＢｓｉＷＩにより制限酵素処理して作製した。
【００８６】
フォワードプライマー：配列番号１３、リバースプライマー  ：配列番号１４
ＲＴ条件  ４２℃  ２０ｍｉｎ、９９℃  ５ｍｉｎ、４℃  ５ｍｉｎ
ＰＣＲ条件  ９８℃  １０ｓｅｃ、６０℃  ２ｓｅｃ、７２℃  ３ｍｉｎ  ３０サイクル
【００８７】
一方、前記Ａｒｎｔ断片は、前記ｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ−ＡｒｎｔｃＤＮＡとＫＯＤ  ｐｌｕｓポリメラーゼを用いて、下記条件のＰＣＲを行い、その増幅産物をＸｂａＩおよびＳｂｆＩにより制限酵素処理して作製した。
【００８８】
フォワードプライマー：配列番号１５、リバースプライマー：配列番号１６
ＰＣＲ条件  ９４℃  ２ｍｉｎ  １サイクル
９４℃  １５ｓｅｃ、５２℃  ３０ｓｅｃ、６８℃  ３ｍｉｎ  ３０サイクル
６８℃  ５ｍｉｎ  １サイクル
【００８９】
（染色体組込み型シャトルベクターへのクローニング）
前記ＡｈＲおよびＡｒｎｔ遺伝子を有し、それらの間に両方向プロモーターが介在したプラスミドＹＥｐｌａｃのＡｈＲ  ｃＤＮＡ−Ｇａｌ１．１０ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ａｒｎｔ  ｃＤＮＡ  領域を下記条件のＰＣＲにより増幅し、その増幅産物をＳｓｅ８３８７Ｉで処理し、酵母染色体組込み型シャトルベクターｐＡＵＲ１０１（ＴａＫａＲａ社製）のＳｍａＩ／Ｓｓｅ８３８７Ｉ部位に挿入し、ｐＡＵＲ１０１ｇＡｈＲ／Ａｒｎｔ（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４９６）を得た。なお、クローニングには、大腸菌ＤＨ５α株を使用した。
【００９０】
フォワードプライマー：配列番号１７、リバースプライマー  ：配列番号１８
ＰＣＲ条件  ９４℃  ２ｍｉｎ  １サイクル
９４℃  １５ｓｅｃ、５２℃  ３０ｓｅｃ、６８℃  ３ｍｉｎ  ３０サイクル
６８℃  ５ｍｉｎ  １サイクル
【００９１】
（形質転換酵母の作製）
前記ｐＡＵＲ１０１ｇＡｈＲ／Ａｒｎｔを、制限酵素ＢｓｉＷＩで処理して直鎖状とし、以下のように酢酸リチウム法にて宿主となる酵母へ導入し、さらに、染色体への組込みを行った。宿主株として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｗ３０３ａ株を使用した。
【００９２】
まず、前記宿主となる酵母を、３０℃でＯＤ６６０が１〜２になるまでＹＰＤ培地中で培養し、ソリューションＡ（０．１  Ｍ  Ｌｉｔｈｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ，  １０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５），  １  ｍＭ  ＥＤＴＡ  いずれも最終濃度）で洗浄後、ＯＤ６６０＝１５０となるようにソリューションＡに再懸濁し、１．５ｍｌマイクロチューブに１００μｌずつ分注して、３０℃で１時間インキュベートした。その後、直鎖状のｐＡＵＲ１０１ｇＡｈＲ／Ａｒｎｔ  ５μｇと、キャリアーＤＮＡ（商品名：ＳＡＬＭＯＮ  ＴＥＳＴＥＳ  ＤＮＡ  ｆｏｒ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＳＩＧＭＡ社製）１５０μｇ（合計２０μｌ）を加え、さらに、ソリューションＢ（ソリューションＡ１００ｍｌにポリエチレングリコール４０００を溶解したもの）を８５０μｌ添加し、緩やかに混合した。
【００９３】
つぎに、前記混合液を３０℃で３０分インキュベートして４２℃で１５分熱処理した後、さらに、１０分室温に放置してから、５０００ｒｐｍ１分間の遠心分離で集菌し、それらを５〜１０ｍｌのＹＰＤ培地に懸濁し、３０℃で一晩培養した。そして、培養後集菌して洗浄した酵母を、０．９％ＮａＣｌ溶液に懸濁し、ＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎＡ（０．５ｇ／ｍｌ）を含むＹＰＤ選択プレートに１００μlずつ塗布して培養した。ＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎＡ耐性株をＡｈＲ  ｃＤＮＡ−Ｇａｌ１．１０ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ａｒｎｔ  ｃＤＮＡ  領域が染色体上に組込まれた形質転換酵母として選択した。
【００９４】
（レポータープラスミドの導入）
β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＲＷ９５−３（Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．  ；  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２０，  ５６８−５７３  （１９９６））のＢａｍＨＩ／ＸｍａＩ部位に、ヒト由来のＸＲＥ配列（配列番号１９）を挿入し、レポータープラスミドを作製した。このプラスミドを酢酸リチウム法により前記形質転換酵母に導入し、ＡｈＲ  ｃＤＮＡ−Ｇａｌ１．１０ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ａｒｎｔ  ｃＤＮＡ  領域が染色体上に組込まれ、さらに、前記レポータープラスミドが導入された形質転換酵母を作製した。このようにして作製された形質転換酵母の一例が、ＯＰＵ−Ｇ１１株（受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４９７）である。
【００９５】
（β−ガラクトシダーゼ活性の測定）
前記実施例１と同様に、前記形質転換酵母のグリセロールストックからを本培養して、β−ガラクトシダーゼ活性を測定した。なお、用いたリガンドは、β−ＮＦであり、その濃度は、０．０１ｎＭ，１ｎＭおよび１００ｎＭとした。β−ガラクトシダーゼ活性時のインキュベーション時間は、２時間とした。また、前記比較例１の培地を用いて本培養したものを、比較例３とした。この結果を、下記表３に示す。
【００９６】
（表３）
コントロール              β−ＮＦ濃度
（ＤＭＳＯ）        ０．０１ｎＭ      １ｎＭ      
培地（１）    ０．３０            ０．２７          ０．４０    
培地（２）    ０．３５            ０．３６          ０．４２    
比較例３      ０．２２            ０．１８          ０．２２    
【００９７】
前記表３に示すように、比較例３では、β―ＮＦの濃度１ｎＭとコントロールの測定結果が同じであり、β―ＮＦの濃度１ｎＭを検出することはできなかったが、本実施例｛培地（１）、（２）｝では、β―ＮＦの濃度１ｎＭの測定結果とコントロールの測定結果に差が認められ、β―ＮＦの濃度１ｎＭを検出することはでき、β―ＮＦの濃度検出限界を下げることができた。
【００９８】
つぎに、実施例１と同様にして、前記形質転換酵母を種々のグルコース濃度で本培養を実施した場合のβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。なお、β−ガラクトシダーゼの活性測定におけるインキュベーション時間は、３０分にした。この結果を、下記の表４に示す。
【００９９】
（表４）：３０分後の吸光度
ガラクトース濃度      コントロール              β−ＮＦ濃度        
（％）              （ＤＭＳＯ）        ０．１μＭ        １μＭ      
１００              ０．１９２          ０．２６２        ０．６０５
９０                ０．３０５          ０．５１１        １．０９７
８０                ０．４２１          ０．７５５        １．４７２
７０                ０．４０８          ０．４９６        ０．９９７
６０                ０．３６６          ０．５４７        ０．７６８
０                  ０．１９１          ０．１９３        ０．１７６
【０１００】
前記表４から分かるように、グルコースとガラクトースの双方を用いた培地では、β−ＮＦの濃度に応じたβ−ガラクトシダーゼの活性を得ることができた。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
以上のように、本発明の分析方法によれば、短時間かつ高検出感度で、信頼性に優れた核内受容体のリガンドの分析が可能となる。したがって、本発明の分析方法は、化学物質やタンパク質等のリガンドの分析の分野において有用な方法であり、その用途は制限されず広い。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】図１は、本発明の一実施例におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図１】
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【配列表】
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