(57)【要約】【課題】本発明は、大腸がんのリンパ節転移を正確に診断できる新規なマーカーを提供することを課題とする。【解決手段】PIGR、CLDN3、LGALS4、AGR2、TACSTD1、GPX2、RAI3、TSPAN1、CKB、ELF3、FXYD3、CDH1、REG4、GDF 15、CLDN4、OLFM 4、CD9、CDH17、SELENBP、LCN2、TMPRSS4、CFTR、TM4SF3、ID1、CYP2S1、TFF3、EHF、FAT、KLF5、SLC9A3R2、HOXB9、ATP1B1、PCK1、FCGBPからなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡまたはその断片を含む、大腸がんに由来のがん細胞のリンパ節転移の有無を判定するために用いられるリンパ節転移マーカーにより、上記の課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸がん由来のがん細胞のリンパ節転移を検出するためのマーカーであって、
ポリメリックイムノグロブリンレセプター(Polymeric immunoglobulin receptor：PIGR)；
クラウジン３(Claudin 3：CLDN3)；
ガレクチン４(Galectin 4：LGALS4)；
アンテリアグラジエント２(Anterior gradient 2：AGR2)；
腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー１(Tumor-associated calcium signal transducer 1：TACSTD1)；
グルタチオンペルオキシダーゼ２(Glutathione peroxidase 2：GPX2)；
レチノイン酸インデュースド３(Retinoic acid induced 3：RAI3)；
テトラスパン１(Tetraspan 1：TSPAN1)；
クレアチンキナーゼ−ブレイン(Creatin kinase-brain：CKB)；
Ｅ７４様ファクター３(E74-like factor 3：ELF3)；
ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送レギュレータ３(FXYD domain containing ion transport regulator 3：FXYD3)；
カドヘリン１(Cadherin 1：CDH1)；
膵島再生遺伝子ファミリーメンバー４(Regenerating islet-derived family member 4：REG4)；
グロースディファレンシエーションファクター１５(Growth differentiation factor 15：GDF 15)；
クラウジン４(Claudin 4：CLDN4)；
オルファクトメジン(Olfactomedin 4：OLFM 4)；
ＣＤ９抗原(CD9 antigen：CD9)；
カドヘリン１７(Cadherin 17：CDH17)；
セレン結合タンパク質１(Selenium binding protein 1：SELENBP)；
リポカリン２(Lipocalin 2：LCN2)；
トランスメンブレンプロテアーゼセリン４(Transmembrane protease serin 4：TMPRSS4)；
嚢胞性線維症トランスメンブレンコンダクタンスレギュレータＡＴＰ結合カセット(Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator ATP binding cassette：CFTR)；
トランスメンブレン４スーパーファミリーメンバー３(Transmembrane 4 superfamily member 3：TM4SF3)；
ＤＮＡ結合インヒビター１、ドミナントネガティブヘリックス-ループ-ヘリックスタンパク質(Inhibitor of DNA binding 1, dominant negative helix-loop-helix protein：ID1)；
シトクロムＰ４５０、ファミリー２、サブファミリーＳ、ポリペプチド１(Cytochrome P450, family 2, subfamily S, polypeptide 1：CYP2S1)；
トレフォイルファクター３(Trefoil factor 3：TFF3)；
Ｅｔｓホモログファクター(Ets homologous factor：EHF)；
ＦＡＴ腫瘍サプレッサーホモログ１(FAT tumor suppressor homolog 1：FAT)；
クルッペル様ファクター５(Kruppel-like factor 5：KLF5)；
溶質キャリアファミリー９(ナトリウム／水素交換体)、イソフォーム３レギュレータ２(Solute carrier family 9 (sodium/hydrogen exchanger), isoform 3 regulator 2：SLC9A3R2)；
ホメオボックスタンパク質Ｂ９(Homeobox protein B9：HOXB9)；
ＡＴＰアーゼ、Ｎａ+／Ｋ+輸送、β１ポリペプチド(ATPase, Na+/K+ transporting, beta 1 polypeptide：ATP1B1)；
ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ１(Phosphoenolpyruvate carboxykinase 1：PCK1)；および
ＩｇＧ結合タンパク質のＦｃフラグメント(Fc fragment of IgG binding protein：FCGBP)
からなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡまたはその断片を含むマーカー。
【請求項２】
（ａ）配列番号３９〜１０６のいずれかに記載の配列を有するポリヌクレオチド；または
（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドが置換、欠失、挿入または付加された配列を有するポリヌクレオチドであって、請求項１に記載のマーカーに対応するｃＤＮＡにハイブリダイズすることができかつ請求項１記載のマーカーに対応するｃＤＮＡを核酸増幅法で増幅することができるポリヌクレオチド
からなる核酸増幅用プライマ。
【請求項３】
生体から切除されたリンパ節から検出用試料を調製し、
前記検出用試料に含まれる、請求項１に記載のマーカーの少なくとも１種を検出し、
検出結果に基づいて、大腸がん由来のがん細胞の前記リンパ節への転移を検出する
工程を含む大腸がんのリンパ節への転移を検出する方法。
【請求項４】
前記検出工程において、前記検出用試料と、逆転写活性を有する酵素と、ＤＮＡポリメラーゼと、請求項２に記載のプライマとを用いて逆転写反応および核酸増幅反応を行い、増幅されたｃＤＮＡを検出する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記検出結果とこれに対応する閾値とを比較して、大腸がん由来のがん細胞の前記リンパ節への転移を検出する請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記検出結果とこれに対応する閾値とを比較して、大腸がんに由来するがん細胞の前記リンパ節での存在の有無を判定する請求項３または４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸がんのリンパ節転移を判定するためのマーカー、該マーカーに由来するｃＤＮＡを増幅するためのプライマおよび該マーカーを検出することによる大腸がんのリンパ節への転移の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸がんの診断において、リンパ節中のがん細胞を検出すること（リンパ節転移診断）は、手術範囲の決定や術後の化学療法の決定に有益な情報となる。現在、リンパ節転移診断は病理医により、リンパ節組織の凍結切片またはパラフィン切片を用いた組織診（例えば、ＨＥ（ヘマトキシリン−エオジン）染色、ＩＨＣ(免疫組織化学)法など）が行われている。しかし、それら診断結果は、病理医の経験により診断結果が異なり、ときとしてがん細胞を見落としてしまうことがある。
【０００３】
このような現状を受けて、現在、ＬＡＭＰ（loop-mediated isothermal amplification method）法やＰＣＲ（polymerase chain reaction）法などを用いたがんの分子診断の研究が盛んに行われるようになっている。分子診断は、分子マーカー（例えば、がん細胞に特異的に発現するタンパク質、このタンパク質をコードする遺伝子、この遺伝子のｍＲＮＡなど）を検出することにより行うことができる。大腸がんのリンパ節転移を判定するための分子マーカー（以下、単にマーカーともいう）としては、サイトケラチン２０（ＣＫ２０）やヒト胎児性抗原（ＣＥＡ）が報告されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、大腸がんのリンパ節転移診断に用いられる新規なマーカーを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、大腸がん由来のがん細胞のリンパ節転移を検出するためのマーカーであって、
ポリメリックイムノグロブリンレセプター(Polymeric immunoglobulin receptor：PIGR)；
クラウジン３(Claudin 3：CLDN3)；
ガレクチン４(Galectin 4：LGALS4)；
アンテリアグラジエント２(Anterior gradient 2：AGR2)；
腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー１(Tumor-associated calcium signal transducer 1：TACSTD1)；
【０００６】
グルタチオンペルオキシダーゼ２(Glutathione peroxidase 2：GPX2)；
レチノイン酸インデュースド３(Retinoic acid induced 3：RAI3)；
テトラスパン１(Tetraspan 1：TSPAN1)；
クレアチンキナーゼ−ブレイン(Creatin kinase-brain：CKB)；
Ｅ７４様ファクター３(E74-like factor 3：ELF3)；
ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送レギュレータ３(FXYD domain containing ion transport regulator 3：FXYD3)；
カドヘリン１(Cadherin 1：CDH1)；
膵島再生遺伝子ファミリーメンバー４(Regenerating islet-derived family member 4：REG4)；
【０００７】
グロースディファレンシエーションファクター１５(Growth differentiation factor 15：GDF 15)；
クラウジン４(Claudin 4：CLDN4)；
オルファクトメジン(Olfactomedin 4：OLFM 4)；
ＣＤ９抗原(CD9 antigen：CD9)；
カドヘリン１７(Cadherin 17：CDH17)；
セレン結合タンパク質１(Selenium binding protein 1：SELENBP)；
リポカリン２(Lipocalin 2：LCN2)；
トランスメンブレンプロテアーゼセリン４(Transmembrane protease serin 4：TMPRSS4)；
【０００８】
嚢胞性線維症トランスメンブレンコンダクタンスレギュレータＡＴＰ結合カセット(Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator ATP binding cassette：CFTR)；
トランスメンブレン４スーパーファミリーメンバー３(Transmembrane 4 superfamily member 3：TM4SF3)；
ＤＮＡ結合インヒビター１、ドミナントネガティブヘリックス-ループ-ヘリックスタンパク質(Inhibitor of DNA binding 1, dominant negative helix-loop-helix protein：ID1)；
シトクロムＰ４５０、ファミリー２、サブファミリーＳ、ポリペプチド１(Cytochrome P450, family 2, subfamily S, polypeptide 1：CYP2S1)；
トレフォイルファクター３(Trefoil factor 3：TFF3)；
Ｅｔｓホモログファクター(Ets homologous factor：EHF)；
ＦＡＴ腫瘍サプレッサーホモログ１(FAT tumor suppressor homolog 1：FAT)；
【０００９】
クルッペル様ファクター５(Kruppel-like factor 5：KLF5)；
溶質キャリアファミリー９(ナトリウム／水素交換体)、イソフォーム３レギュレータ２(Solute carrier family 9 (sodium/hydrogen exchanger), isoform 3 regulator 2：SLC9A3R2)；
ホメオボックスタンパク質Ｂ９(Homeobox protein B9：HOXB9)；
ＡＴＰアーゼ、Ｎａ+／Ｋ+輸送、β１ポリペプチド(ATPase, Na+/K+ transporting, beta 1 polypeptide：ATP1B1)；
ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ１(Phosphoenolpyruvate carboxykinase 1：PCK1)；および
ＩｇＧ結合タンパク質のＦｃフラグメント(Fc fragment of IgG binding protein：FCGBP)
からなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡまたはその断片を含むマーカーである。
【００１０】
また、本発明は、（ａ）配列番号３９〜１０６のいずれかに記載の配列を有するポリヌクレオチド；または
（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドが置換、欠失、挿入または付加された配列を有するポリヌクレオチドであって、上記のマーカーに対応するｃＤＮＡにハイブリタイズすることができかつ上記のマーカーに対応するｃＤＮＡを核酸増幅法で増幅することができるポリヌクレオチド
からなる核酸増幅用プライマでもある。
【００１１】
本発明は、生体から切除されたリンパ節から検出用試料を調製し、
前記検出用試料に含まれる、上記のマーカーの少なくとも１種を検出し、
検出結果に基づいて、大腸がん由来のがん細胞の前記リンパ節への転移を検出する
工程を含む大腸がんのリンパ節への転移を検出する方法でもある。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によると、大腸がんのリンパ節転移診断に用いられる新規なマーカーが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本実施形態のマーカーは、大腸がん由来のがん細胞で発現するタンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡまたはこのｍＲＮＡの一部である。このマーカーを検出することにより、リンパ節中のがん細胞が検出される。なお、本明細書では、「検出する」とは、存否を判定することだけでなく、定量することをも含む。「ｍＲＮＡ」とは、成熟したｍＲＮＡだけでなく、ｍＲＮＡの前駆体（転写後のスプライシングやポリアデニル修飾前のｍＲＮＡなど）も含む。
マーカーとしては、正常な細胞よりもがん細胞に多量に存在するものが好ましい。
【００１４】
マーカーを検出するためには、先ず検出用試料が調製される。検出用試料としては、後述の核酸増幅反応の鋳型となるポリヌクレオチドが含まれている試料であれば特に限定されないが、生体から採取されたリンパ節の細胞を可溶化したものを用いることが好ましい。リンパ節の細胞を含む試料としては、リンパ節の細胞を含む試料であれば特に限定されない。例えば、手術により摘出されたリンパ節の細胞を含む細胞塊、生検により採取されたリンパ節の細胞を含む試料などが挙げられる。
【００１５】
検出用試料の調製は、例えば以下のようにして行うことができる。先ず、リンパ節の細胞に可溶化のための試薬（以下、「可溶化液」とする）を添加する。可溶化液中の細胞をホモジナイズなどにより破砕して細胞膜内の分子を溶液中に遊離させる。さらに遠心分離して上清を採取し、これを検出用試料とすることができる。なお、遠心分離前および／または遠心分離後に核酸精製や核酸抽出などの処理を行ってもよい。
【００１６】
得られた検出用試料に、マーカーを検出するためのプライマ、逆転写活性を有する酵素、ＤＮＡポリメラーゼを添加して反応液を調製し、核酸増幅を行う。核酸増幅法としては、特に限定されないが、例えばＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＬＣＲ法など、公知の方法を用いることができる。マーカーはＲＮＡであるため、核酸増幅反応の前に逆転写反応を含む核酸増幅法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法やＲＴ−ＬＡＭＰ法など）を用いることができる。このような核酸増幅法を用いることによってマーカーのｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡが増幅される。
【００１７】
逆転写反応および核酸増幅反応は、鋳型である本発明のマーカーに対応するｃＤＮＡの配列およびプライマの配列に応じて適宜条件を変更することができる。逆転写反応および核酸増幅反応の条件は、例えばSambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載されたものを用いることができる。
【００１８】
マーカーを検出するためのプライマとしては、マーカーに対応するｃＤＮＡを増幅することができるポリヌクレオチドであれば、その配列は特に限定されない。プライマの長さは５〜５０ヌクレオチドが好ましく、１０〜４０ヌクレオチドがより好ましい。プライマは、当該技術において公知の核酸合成方法により製造することができる。
【００１９】
上記のプライマは、プライマ機能を有していれば一つ以上のヌクレオチドの変異（置換、欠失、挿入、付加など）を有していてもよい。「プライマ機能」とは、マーカーに対応するｃＤＮＡ（マーカーから逆転写されたｃＤＮＡ又はこのｃＤＮＡの相補鎖）にハイブリダイズし、核酸増幅における伸長反応の基点となる機能のことである。変異を有するポリヌクレオチドは、マーカーから転写されたｃＤＮＡ配列中のポリヌクレオチドがハイブリダイズする領域に対して、６０％以上の相補性を有することが好ましく、８０％以上の相補性を有することがより好ましい。また、このポリヌクレオチドがプライマとして機能するために、ポリヌクレオチドの３’末端側の３塩基が完全に相補的であることが好ましく、３’末端側の５塩基が完全に相補的であることがより好ましい。
【００２０】
また、上記のプライマは、本発明のマーカーに対応するｃＤＮＡを核酸増幅法で増幅することができる第一プライマと第二プライマ（フォワードプライマとリバースプライマ）の組み合わせからなるプライマセットとして用いることもできる。
【００２１】
上記のプライマは、当該技術において通常用いられる技術により修飾されていてもよい。上記プライマの標識は、放射活性元素または非放射活性分子を用いて行うことができる。用いられる放射活性同位体としては、32P、33P、35S、3Hまたは125Iを挙げることができる。非放射活性物質は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたはジゴキシゲニンのようなリガンド、ハプテン、色素および放射線発光性、化学発光性、生物発光性、蛍光またはリン光性の試薬のような発光性試薬から選択される。
【００２２】
逆転写活性を有する酵素およびＤＮＡポリメラーゼは、当該技術においてよく知られたものを用いることができる。逆転写活性を有する酵素としては、AMV (Avian Myeloblastosis Virus) 逆転写酵素、M-MLV (Molony Murine Leukemia Virus) 逆転写酵素などが挙げられる。また、ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼなどを用いることができる。
【００２３】
増幅されたｃＤＮＡの検出は、反応液とエチジウムブロマイド、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎなどの蛍光インターカレーターとを混合して反応液中のｃＤＮＡを蛍光染色し、反応液の蛍光強度を測定することにより行うことができる。また、反応液に予め上記のような蛍光インターカレーターを加えておき、反応液の蛍光強度をリアルタイムで測定することにより、マーカーを定量することができる。
【００２４】
また、ｃＤＮＡの増幅に伴い副産物としてピロリン酸マグネシウムが生成される場合、これを検出することによりｃＤＮＡを検出してもよい。このピロリン酸マグネシウムは不溶性であるため、ピロリン酸マグネシウムの増加に伴って反応液が白濁する。よって、反応液を光学的に測定（例えば、濁度測定、吸光度測定など）することによってｃＤＮＡを検出することもできる。また、リアルタイムで光学的測定を行うことにより、マーカーを定量することができる。
【００２５】
本実施形態のマーカーのなかには、がん細胞だけでなく正常な細胞でも少量の存在が認められるものも含まれている。このような場合、マーカーを定量し、その結果と所定の閾値とを比較することにより、リンパ節転移を検出することが好ましい。
例えばＲＴ−ＰＣＲを用いてリアルタイムでマーカーを定量する場合、所定の蛍光強度や濁度に達するまでのＰＣＲサイクル数を、対応する閾値と比較することにより、リンパ節転移を検出することもできる。また、所定のサイクル数における蛍光強度や濁度を、対応する閾値と比較することにより、リンパ節転移を検出することもできる。
【００２６】
例えばＲＴ−ＬＡＭＰを用いてリアルタイムでマーカーを定量する場合、所定の蛍光強度や濁度に達するまでの時間を、対応する閾値と比較することにより、リンパ節転移を検出することもできる。また、所定の時間が経過した時点での蛍光強度や濁度を、対応する閾値と比較することにより、リンパ節転移を検出することもできる。また、複数の閾値を設定することにより、例えば「強陽性」、「陽性」、「陰性」など多段階にがん細胞のリンパ節転移を検出することも可能である。
【００２７】
閾値は、がん細胞が含まれることが確認された生体試料（陽性試料）に含まれるマーカー量以下であり、且つがん細胞が含まれないことが確認された生体試料（陰性試料）に含まれるマーカー量よりも高い値に設定することができる。閾値は、複数の陽性試料のマーカー量と、複数の陰性試料のマーカー量とを測定し、最も高確率に陽性試料と陰性試料とを区別できる値とすることが好ましい。
【００２８】
また、上記のマーカーを検出するためにマイクロアレイ技術を用いることもできる。具体的には、先ず固相にマーカーに対応するｃＤＮＡに相補的なポリヌクレオチドプローブ（以下、単にプローブともいう）を固定する。この固相に前記ｃＤＮＡを含む試料を添加して、プローブにｃＤＮＡを捕捉させる。ここに蛍光インターカレーターを添加してプローブとｃＤＮＡとのハイブリッドを蛍光染色し、蛍光強度を検出する。蛍光強度の検出結果から、マーカーの定量や存否の判定を行うことができる。プローブがｃＤＮＡよりも短い場合は、プローブがハイブリダイズしていないｃＤＮＡの領域にハイブリダイズするプローブを添加することにより、蛍光シグナルを増強することができる。
【００２９】
なお、固相にマーカーに対応するプローブを固定し、マーカーとプローブとのハイブリッドを形成させて、このハイブリッドを検出することによりマーカーを検出してもよい。
【００３０】
該プローブは、上記のプライマについて説明したのと同様の方法により設計および製造することができる。該プローブとしては、上記のプライマと同様の配列を有するものを用いることができる。
【００３１】
本実施形態のマーカーを検出するために必要な試薬等を試薬キットとして提供することができる。該キットは、少なくとも上述のプライマ、逆転写活性を有する酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓを含む。また、このキットは、酵素反応に好適な条件を与える緩衝剤を含むことが好ましい。
【００３２】
なお、本明細書において「マーカーを検出する」とは、マーカーであるｍＲＮＡの全領域を検出することだけでなく、一部の領域を検出することをも含む。本実施形態では、マーカーの一部の領域に対応するｃＤＮＡを増幅し、これを検出することが好ましい。この場合、検出されるｃＤＮＡの領域の長さは、プライマの長さよりも１〜５００ヌクレオチド長いことが好ましく、５０〜５００ヌクレオチド長いことがより好ましい。また、上記のプライマセットを用いる場合、増幅されるｃＤＮＡの領域の長さは、第一プライマの長さと第二プライマの長さとの和よりも１〜５００ヌクレオチド長いことが好ましく、５０〜５００ヌクレオチド長いことがより好ましい。
【実施例１】
【００３３】
本発明者らは、大腸がんのリンパ節への転移を検出できるマーカーを探索した。まず、公共データベースに登録されているヒト遺伝子発現ライブラリから大腸関連の遺伝子発現ライブラリを選択し、このデータベースから、大腸での発現量が高く、リンパ節での発現量が低い遺伝子を、大腸での発現量の高い順に上位から９８種選択した。これらの遺伝子に対応するタンパク質を以下の表１に示す。次いで、これら９８種のタンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡ（以下、これら９８種のｍＲＮＡをマーカー候補と呼ぶ）を検出できるプライマを９８組設計した。
【００３４】
上記の９８組のプライマを用い、組織学的にリンパ節への転移が認められたリンパ節５個と、組織学的にリンパ節への転移が認められないリンパ節５個から抽出したＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲを行なった。
【００３５】
まず、各リンパ節(約１００〜３００ｍｇ／個)に可溶化液(２００ｍＭグリシン−ＨＣｌ、５％  Ｂｒｉｊ３５(ポリオキシエチレン(３５)ラウリルエーテル)、２０％  ＤＭＳＯ、および０．０５％  ＫＳ−５３８ (信越化学工業) を含む）４ｍＬを添加し、ブレンダーでホモジナイズした。得られたホモジネートを10,000×ｇ、室温で１分間遠心分離し、上清４００μＬからRNeasy Miniキット(キアゲン社製、カタログ番号74014)を用いてＲＮＡを抽出・精製してＲＮＡ溶液を得た。このＲＮＡ溶液の吸光度(λ＝２８０ｎｍ)を測定して濃度を確認した後、それぞれ１０ｎｇ／μＬの濃度に調整した。得られたＲＮＡ溶液を、陽性５検体について混合した試料(以下、「陽性検体」という)、および陰性５検体について混合した試料(以下、「陰性検体」という)を得た。
【００３６】
上記のようにして得られた陽性検体および陰性検体と、上記の９８組のプライマを用いて、ＡＢＩリアルタイムＰＣＲ装置（Prism 7000）を用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行ない、９８種のｍＲＮＡの検出を行なった。
【００３７】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、定量ＲＴ−ＰＣＲキットであるQuanti Tect SYBR Green ＲＴ−ＰＣＲキット(キアゲン社製、カタログ番号204245)を用い、その使用説明書に従って行なった。反応液の組成および反応条件は、以下のとおりである。
【００３８】
反応液：
ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  Ｈ2Ｏ                                 ２２．００μＬ
２×Ｍｉｘ                                                  ２５．００μＬ
１００ｎＭフォワードプライマ(最終濃度５００μＭ)              ０．２５μＬ
１００ｎＭリバースプライマ(最終濃度５００μＭ)                ０．２５μＬ
Quanti Tect RTミックス                                        ０．５０μＬ
陽性検体または陰性検体                                        ２．００μＬ
合計                                                        ５０．００μＬ
【００３９】
反応条件
５０℃、３０分
９５℃、１５分
ＰＣＲ：以下の工程を４０サイクル；
９４℃、１５秒、
５３℃、３０秒、
７２℃、３０秒。
【００４０】
上記の条件でＲＴ−ＰＣＲを行ない、陰性検体を用いてある特定の蛍光強度に到達するまでのＰＣＲサイクル数(陰性検体ＰＣＲサイクル数)と、陽性検体を用いてある特定の蛍光強度に到達するまでのＰＣＲサイクル数(陽性検体ＰＣＲサイクル数)とを測定し、これらの差((陰性検体ＰＣＲサイクル数)−(陽性検体ＰＣＲサイクル数))を算出した。このＰＣＲサイクル数の差が大きいほど、その遺伝子が陰性検体中での発現量が少なく、陽性検体中での発現量が多い、すなわちその遺伝子が、転移が起こったリンパ節で特異的に発現量が多いことを意味する。
【００４１】
この結果を、以下の表１ならびに図１および２に示す。表１は、陽性検体に含まれるマーカー候補９８種のそれぞれに対応するｃＤＮＡを増幅させてある特定の蛍光強度に到達するまでのＰＣＲサイクル数（Ａ）と、陰性検体に含まれるマーカー候補９８種のそれぞれに対応するｃＤＮＡが増幅してある特定の蛍光強度に到達するまでのＰＣＲサイクル数（Ｂ）と、これらの差（Ｂ−Ａ）の値とを示した表である。図１および２は、Ｂ−Ａを縦軸にとり、Ｂを横軸にとったグラフである。縦軸の値が大きいほど、陰性検体での存在量が少なく、陽性検体の存在量が多いことを示し、即ち、特異性が高いことを示す。横軸のサイクル数が大きいほど、その遺伝子は、大腸がんが転移していないリンパ節で発現量が少ないことを意味する。
したがって、このＰＣＲサイクル数の差が大きいマーカー候補は、大腸がんのリンパ節への転移を検出するためのマーカーとして有用であるということができる。
【００４２】
なお、対照として用いたβ−アクチン(ＡＣＴＢ)は、ハウスキーピング遺伝子のタンパク質として知られており、多くの細胞において多量に発現しているものである。よって、陰性ＲＮＡ試料でのサイクル数と陽性ＲＮＡ試料でのサイクル数とに差が見られない。
また、従来からリンパ節転移マーカーとして知られていたＣＫ２０やＣＥＡのｍＲＮＡは、上記のＰＣＲサイクル数の差が比較的大きく、リンパ節転移が起こった組織で特異的に発現量が多いことがわかる。
【００４３】
【表１−１】
2007175021.tif 000002
【００４４】
【表１−２】
2007175021.tif 000003
【００４５】
以上の結果から、以下の表２に示す３４種のタンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡが、リンパ節転移マーカーとして新たに同定された。表２において、「配列番号」の列には、３４種のタンパク質をそれぞれコードする遺伝子のｍＲＮＡの配列番号を示す。これらのｍＲＮＡの配列は、配列番号１〜３８に示すとおりである。配列番号１〜３８の配列は、ｍＲＮＡ配列中のＵ（ウラシル）をＴ（チミン）に置換して表記したものである。これらの配列は、Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html)からも以下のアクセッション番号で入手できる。なお、本明細書における「リンパ節転移マーカー」とは、配列番号１〜３８に示すｍＲＮＡの全長配列を有するポリヌクレオチドまたはその部分配列を有するポリヌクレオチドである。
【００４６】
【表２】
2007175021.tif 000004
【００４７】
上記のマーカーを検出した際に用いたプライマおよび対応する配列番号を以下の表３に記載する。これらのプライマは、左から右に５′→３′の方向で記載している。
【００４８】
【表３】
2007175021.tif 000005
【実施例２】
【００４９】
６人の患者から採取した組織学的にリンパ節への転移が認められたリンパ節から抽出したＲＮＡ溶液(検体番号８、１０、２１、２９、３７および５９：陽性試料)および２４人の患者から採取した組織学的にリンパ節への転移が認められないリンパ節から抽出したＲＮＡ溶液（検体番号１，３，４，５，６，１２，１３，１５，１６，１８，１９，２０，２２，２３，２４，２６，２７，２８，２９，３０，３２，３４，３５および３８：陰性試料）を用いて、それぞれリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行ない、以下の表４に示す１２種の本実施形態のマーカー（ＰＩＧＲ，ＣＬＤＮ３，ＬＧＡＬＳ４，ＡＧＲ２，ＴＳＰＡＮ−１，ＦＸＹＤ３，ＣＬＤＮ４，ＯＬＦＭ４，ＣＤＨ１７，ＬＣＮ２，ＴＭＰＲＳＳ４，およびＣＦＴＲ）と、ＣＫ２０のｍＲＮＡと、ＡＣＴＢのｍＲＮＡとを検出した。ＲＮＡ溶液の調製方法およびＲＴ−ＰＣＲの条件については、実施例１と同様である。なお、ＲＮＡを含む検体ではなく、純水を混合した反応液をネガティブコントロール（ＮＴＣ）として上記と同様にＲＴ−ＰＣＲを行った。また、上記の実験を２回行った。ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマは、下記表４の通りである。
【００５０】
【表４】
2007175021.tif 000006
【００５１】
このリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにおいて、ある特定の蛍光強度に到達するまでのＰＣＲのサイクル数(Ｃｔ)を測定した結果を、図３〜１６に示す。図３は、いずれの組織でも発現しているβ−アクチン(ＡＣＴＢ)、図４は従来のマーカーであるＣＫ２０についてそれぞれＲＴ−ＰＣＲを行なった結果を示す。図５〜１６は、本発明のリンパ節転移マーカーについての検出結果を示す。
【００５２】
ＡＣＴＢのｍＲＮＡの検出実験では、ＮＴＣ以外の全ての検体において、ｍＲＮＡから転写されたｃＤＮＡがある一定量まで増幅されるのに必要なサイクル数が少なく、よってｍＲＮＡが多量に検出されたことがわかる。
ＣＫ２０のｍＲＮＡおよび１２種類の本実施形態のマーカーの検出実験では、リンパ節への転移が組織学的に確認されている試料において少ないサイクル数で増幅され、リンパ節への転移が確認されない試料では増幅に必要なサイクル数が多かった。したがって、本実施形態のリンパ節転移マーカーは、がん細胞のリンパ節への転移を検出するのに好適に用いることができる
【００５３】
また、これらの結果より、ＰＩＧＲのｍＲＮＡの検出の際に、サイクル数２９を閾値として設定することにより、本実施例で用いた全ての陽性試料を陽性と判定することができ、全ての陰性試料を陰性と判定することができる。
ＣＬＤＮ３のｍＲＮＡの検出の際には、サイクル数２４〜２６の範囲で閾値を設定することにより、本実施例で用いた全ての陽性試料を陽性と判定することができ、全ての陰性試料を陰性と判定することができる。
ＬＧＡＬＳ４のｍＲＮＡの検出の際には、サイクル数２６を閾値として設定することにより、本実施例で用いた陽性試料のうち高確率で陽性試料を陽性と判定することができ、全ての陰性試料を陰性と判定することができる。
【００５４】
ＡＧＲ２のｍＲＮＡの検出の際には、サイクル数２５〜２８の範囲で閾値を設定することにより、本実施例で用いた全ての陽性試料を陽性と判定することができ、全ての陰性試料を陰性と判定することができる。
ＴＳＰＡＮ−１のｍＲＮＡの検出の際には、サイクル数３０〜３１の範囲で閾値を設定することにより、本実施例で用いた全ての陽性試料を陽性と判定することができ、全ての陰性試料を陰性と判定することができる。
ＦＸＹＤ３のｍＲＮＡの検出の際には、サイクル数２５〜２７の範囲で閾値を設定することにより、本実施例で用いた全ての陽性試料を陽性と判定することができ、全ての陰性試料を陰性と判定することができる。
ＣＬＤＮ４のｍＲＮＡの検出の際には、サイクル数２５〜２６の範囲で閾値を設定することにより、本実施例で用いた全ての陽性試料を陽性と判定することができ、全ての陰性試料を陰性と判定することができる。
【００５５】
ＯＬＦＭ４のｍＲＮＡの検出の際には、サイクル数３２を閾値として設定することにより、本実施例で用いた陽性試料のうち高確率で陽性試料を陽性と判定することができ、高確率での陰性試料を陰性と判定することができる。
ＣＤＨ１７のｍＲＮＡの検出の際には、サイクル数２７〜２８の範囲で閾値を設定することにより、本実施例で用いた全ての陽性試料を陽性と判定することができ、全ての陰性試料を陰性と判定することができる。
ＬＣＮ２のｍＲＮＡの検出の際には、サイクル数２８〜３０の範囲で閾値を設定することにより、本実施例で用いた全ての陽性試料を陽性と判定することができ、全ての陰性試料を陰性と判定することができる。
【００５６】
ＴＭＰＲＳＳ４のｍＲＮＡの検出の際には、サイクル数２８〜３０の範囲で閾値を設定することにより、本実施例で用いた全ての陽性試料を陽性と判定することができ、全ての陰性試料を陰性と判定することができる。
ＣＦＴＲのｍＲＮＡの検出の際には、サイクル数２７〜３０の範囲で閾値を設定することにより、本実施例で用いた全ての陽性試料を陽性と判定することができ、高確率で陰性試料を陰性と判定することができる。
【００５７】
また、上記の１２種類のマーカーの検出結果のうち２つ以上を組み合わせることにより、より精度の高いリンパ節転移検出を行うことも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】表１に示す結果のグラフである。
【図２】表１に示す結果のグラフである。
【図３】リンパ節への転移が確認された患者のリンパ節からの試料および転移が認められない患者のリンパ節からの試料においてβ−アクチンのｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより増幅させたときに、ある特定の蛍光強度に達するまでのＰＣＲのサイクル数(Ｃｔ)を示す。
【図４】リンパ節への転移が確認された患者のリンパ節からの試料および転移が認められない患者のリンパ節からの試料においてＣＫ２０のｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより増幅させたときに、ある特定の蛍光強度に達するまでのＰＣＲのサイクル数(Ｃｔ)を示す。
【図５】リンパ節への転移が確認された患者のリンパ節からの試料および転移が認められない患者のリンパ節からの試料においてＰＩＧＲのｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより増幅させたときに、ある特定の蛍光強度に達するまでのＰＣＲのサイクル数(Ｃｔ)を示す。
【図６】リンパ節への転移が確認された患者のリンパ節からの試料および転移が認められない患者のリンパ節からの試料においてＣＬＤＮ３のｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより増幅させたときに、ある特定の蛍光強度に達するまでのＰＣＲのサイクル数(Ｃｔ)を示す。
【図７】リンパ節への転移が確認された患者のリンパ節からの試料および転移が認められない患者のリンパ節からの試料においてＬＧＡＬＳ４のｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより増幅させたときに、ある特定の蛍光強度に達するまでのＰＣＲのサイクル数(Ｃｔ)を示す。
【図８】リンパ節への転移が確認された患者のリンパ節からの試料および転移が認められない患者のリンパ節からの試料においてＡＧＲ２のｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより増幅させたときに、ある特定の蛍光強度に達するまでのＰＣＲのサイクル数(Ｃｔ)を示す。
【図９】リンパ節への転移が確認された患者のリンパ節からの試料および転移が認められない患者のリンパ節からの試料においてＴＳＰＡＮ−１のｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより増幅させたときに、ある特定の蛍光強度に達するまでのＰＣＲのサイクル数(Ｃｔ)を示す。
【図１０】リンパ節への転移が確認された患者のリンパ節からの試料および転移が認められない患者のリンパ節からの試料においてＦＸＹＤ３のｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより増幅させたときに、ある特定の蛍光強度に達するまでのＰＣＲのサイクル数(Ｃｔ)を示す。
【図１１】リンパ節への転移が確認された患者のリンパ節からの試料および転移が認められない患者のリンパ節からの試料においてＣＬＤＮ４のｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより増幅させたときに、ある特定の蛍光強度に達するまでのＰＣＲのサイクル数(Ｃｔ)を示す。
【図１２】リンパ節への転移が確認された患者のリンパ節からの試料および転移が認められない患者のリンパ節からの試料においてＯＬＦＭ４のｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより増幅させたときに、ある特定の蛍光強度に達するまでのＰＣＲのサイクル数(Ｃｔ)を示す。
【図１３】リンパ節への転移が確認された患者のリンパ節からの試料および転移が認められない患者のリンパ節からの試料においてＣＤＨ１７のｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより増幅させたときに、ある特定の蛍光強度に達するまでのＰＣＲのサイクル数(Ｃｔ)を示す。
【図１４】リンパ節への転移が確認された患者のリンパ節からの試料および転移が認められない患者のリンパ節からの試料においてＬＣＮ２のｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより増幅させたときに、ある特定の蛍光強度に達するまでのＰＣＲのサイクル数(Ｃｔ)を示す。
【図１５】リンパ節への転移が確認された患者のリンパ節からの試料および転移が認められない患者のリンパ節からの試料においてＴＭＰＲＳＳ４のｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより増幅させたときに、ある特定の蛍光強度に達するまでのＰＣＲのサイクル数(Ｃｔ)を示す。
【図１６】リンパ節への転移が確認された患者のリンパ節からの試料および転移が認められない患者のリンパ節からの試料においてＣＦＴＲのｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより増幅させたときに、ある特定の蛍光強度に達するまでのＰＣＲのサイクル数(Ｃｔ)を示す。
【図３】
2007175021.tif 000007
【図４】
2007175021.tif 000008
【図５】
2007175021.tif 000009
【図６】
2007175021.tif 000010
【図７】
2007175021.tif 000011
【図８】
2007175021.tif 000012
【図９】
2007175021.tif 000013
【図１０】
2007175021.tif 000014
【図１１】
2007175021.tif 000015
【図１２】
2007175021.tif 000016
【図１３】
2007175021.tif 000017
【図１４】
2007175021.tif 000018
【図１５】
2007175021.tif 000019
【図１６】
2007175021.tif 000020
【図１】
2007175021.tif 000021
【図２】
2007175021.tif 000022
【配列表】
2007175021000001.app