(57)【要約】【課題】化粧用または外用組成物およびこれらの使用を提供する。【解決手段】金属酸化還元触媒からなる郡と酸化還元酵素からなる群と還元剤からなる郡からなる三郡の中の少なくとも二郡が選択され、その中から少なくとも二種の成分から選択される外用組成物、特に抗しわ、美白、抗にきび用化粧用または外用組成物である。この組成物は、主に、局所使用の際に抗老化反応を制限するのに使用される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属酸化還元触媒からなる郡と酸化還元酵素からなる群と還元剤からなる郡からなる三郡の中の少なくとも二郡が選択され、その中から少なくとも二種の成分から選択される外用組成物。
【請求項２】
金属酸化還元触媒からなる郡と酸化還元酵素からなる群と還元剤からなる郡からなる三郡の中の少なくとも二郡が選択され、その中から少なくとも二種の成分から選択される外用組成物に許容し得る賦形剤に混合された外用組成物。
【請求項３】
前記金属酸化還元触媒が鉄、インジウム、スズ、セリウム、チタン、ジルコニウム、バナジウム、ニオブ、クロム、モリブデン、アルミニウム、ガリウム、マグネシウム、スカンジウム、ニッケル、銅、ネオジム、ロジウム、イリジウム、プラチナ、ルテニウム、パラジウム、から選択される物質またはこれらの物質を含む化合物、またはその酸化物、またはその有機酸金属塩類、またはその誘導体、またはその塩類から選択される少なくともいずれか１つである請求項１及び２記載の外用組成物。
【請求項４】
前記還元剤がアスコルビン酸、アスコルビン酸−２−リン酸、アスコルビン酸−２−グルコシド、アスコルビン酸燐酸パルミチン酸、アスコルビン酸パルミチン酸、アスコルビン酸ステア燐酸、トコフェリル燐酸塩、トコフェリルジメチルグリシン、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、エリソルビン酸、エリソルビン酸ナトリウム、チオジプロピオン酸ジラウリル、トコフェロール、システイン、グルタチオン、還元型ペプチド、トリルビグアナイド、ノルジヒドログアヤレチン酸、カロチン、アスタキサンチン、クリプトキサンチン、カロチノイド類、αリポ酸、コエンザイムＱ１０、コエンザイムＡ、パラヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシアニソール、ジブチルヒドロキシトルエン、ステアリン酸アスコルビル、パルミチン酸アスコルビル、没食子酸オクチル、没食子酸プロピル、カロチノイド、フラボノイド類、カテキン類、ピクノジェノール、フラバンジェノール、還元性芳香族化合物類、タンニン、リグナン、サポニン、Ｆｕｌｌｅｌｅｎｅｓ、水酸化Ｆｕｌｌｅｌｅｎｅｓ、リンゴエキスやチョウジエキス及びこれらの誘導体、及びこれらのＮａ、Ｃａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃｌ等の塩類から選択される少なくともいずれか１つである請求項１及び２記載の外用組成物。
【請求項５】
前記酸化還元酵素が、リパーゼ、酸化還元酵素、カルボヒドラーゼ、プロテアーゼ、サブチリシン、トリプシン、キモトリプシンまたはサーモリシンのようなプロテアーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、α−アミラーゼもしくはβ−アミラーゼまたはグルコアミラーゼのようなアミラーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、セレブロシダーゼ、スーパーオキサイド・ジスムターゼ、ペルオキシダーゼおよびリポキシゲナーゼ、グルコース６リン酸脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素、Ｌ−キシロース還元酵素、グルクロン酸還元酵素、グルクロノラクトン還元酵素、アルドース還元酵素、デヒドロアスコルビン酸還元酵素、酸化型トコフェロール還元酵素およびグリセロール脱水素酵素、２−ニトロプロパンジオキシゲナーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、酸化還元酵素、転写レギュレーター、アシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ、ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼ、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエートオクタプレニル、ｇｍｃ型酸化還元酵素、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ、メチルマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、水銀レダクターゼ、グルタチオンレダクターゼ、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨ、ジヒドロリポアミド、トランスポゼース、プロリンイミノペプチダーゼ、プロリルアミノペプチダーゼ、キノロン流出ポンプ、グリシンベタイントランスポーター、ホスファチジルエタノールアミンＮ−メチルトランスフェラーゼ、カルコンシンターゼ２、スルホトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、フマル酸レダクターゼフラビンタンパク質、８−アミノ−７−オキソノナン酸シンターゼ、アミノトランスフェラーゼクラスＩＩピリドキサールリン酸、バクテリオファージＨＫ９７プロヘッドプロテアーゼ、ペニシリン結合タンパク質、脂肪アシル−ＣｏＡラセマーゼ、ニトリロトリアセテートモノオキシゲナーゼ、ヒスチジンキナーゼ応答レギュレーター、ペプチダーゼ、ＬｙｓＲ転写レギュレーター、除去酵素、オルニチンアミノトランスフェラーゼ、リンゴ酸酸化還元酵素、チオ硫酸結合タンパク質、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、アシル−ＣｏＡシンセターゼ、メチルトランスフェラーゼ、シロヘムシンターゼ、透過酵素、グルタリル７−ａｃａアシラーゼ、ｓｎ−グリセロール−３−リン酸輸送系透過酵素、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ／イソメラーゼ、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、シチジンデアミナーゼ、クロトナーゼ、脂質輸送タンパク質、アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ、アミノトランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、および２−アミノ−４−ヒドロキシ−６−ヒドロキシメチルジヒドロプテリンピロホスホキナーゼからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１及び２記載の外用組成物。
【請求項６】
前記金属酸化還元触媒と還元剤又は酸化還元酵素は、結晶化され、かつ架橋された金属酸化還元触媒と還元剤又は酸化還元酵素、または不溶性ポリマー上に接合された金属酸化還元触媒又は酸化還元酵素、または粒子、好ましくはマイクロメーターもしくはナノメーター級の粒子であって、好ましくは球、カプセルまたはスポンジである粒子上に接合された金属酸化還元触媒又は酸化還元酵素であることを特徴とする請求項１及び２記載の外用組成物。
【請求項７】
前記不溶性ポリマーまたは粒子は、それらの表面上に前記金属酸化還元触媒と還元剤又は酸化還元酵素と共有結合を形成するのに使用できる少なくとも一種の修飾可能な化学官能基を有し、例えば前記粒子は一種のセルロース、一種のポリスチレン、一種のアルキルシアノアクリレート、一種のシリカ、一種のナイロン、一種のポリアミド（合成、または天然ポリアミド由来）、一種のポリエステル（合成、または天然ポリエステル由来）、一種のセラミクス、一種のセメント、一種のガラス質またはそれらの混合物の一種を少なくとも含むことを特徴とする請求項１及び２記載の外用組成物。
【請求項８】
前記不溶性ポリマーまたは粒子は、（１）リン酸カルシウムを主成分とするアパタイト型結晶部と、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート等のポリオキシエチレンソルビタンエステル、ポリオキシエチレンアルキルフェニールエーテルよりなる群から選択された非イオン界面活性剤一種、または、前記一種にさらにノナエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル類、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル類よりなる群から選択された非イオン界面活性剤一種を合わせてなる二種類の非イオン界面活性剤またはその加水分解生成物からなる４０〜６０重量％の界面活性剤部から構成され、かつ幅５〜９ｎｍ、長さ５０ｎｍ以上の鎖形超薄片状形態を有することを特徴とするヒドロキシアパタイト／界面活性剤複合体であることを特徴とする請求項１及び２記載の外用組成物。
【請求項９】
前記結晶化され、かつ架橋された金属酸化還元触媒又は酸化還元酵素が０．２〜５０μｍ、好ましくは１〜５μｍの大きさを持つ結晶を形成することを特徴とする請求項１及び２記載の外用組成物。
【請求項１０】
前記賦形剤は、ブチレングリコール、水、ステアレス−２、ステアレス−２１、グリコール−１５・ステアリル・エーテル、セテアリルアルコール、フェノキシエタノール、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、ブチレングリコール、天然トコフェロール、グリセロール、ジヒドロキシセチルナトリウム、イソプロピル・ヒドロキシセチル・エーテル、グリコール・ステアレート、トリイソノナオイン、オクチル・ココエート、ポリアクリルアミド、イソパラフィン、ラウレス−７、カルボマー、プロピレングリコール、グリセロール、ビスアボロール、ジメチコン、水酸化ナトリウム、香料、ＰＥＧ３０−ジポリヒドロキシステアレート、カプリン酸／カプリル酸トリグリセリド、セテアリル・オクタノエート、ジブチル・アジペート、ブドウ種子油、ホホバ油、硫酸マグネシウム、ＥＤＴＡ、シクロメチコン、キサンタンガム、クエン酸、ラウリル硫酸ナトリウム、ミネラルワックスおよび鉱油、イソステアリル・イソステアレート、プロピレングリコール・ジペラルゴネート、プロピレングリコール・イソステアレート、ＰＥＧ８−ミツロウ、水素化ヤシ心材油グリセリド、水素化ヤシ油グリセリド、ラノリン油、ゴマ油、セチル・ラクテート、ラノリンアルコール、ヒマシ油、二酸化チタン、セラミクス、ガラス、着色剤、および顔料からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含むことを特徴とする請求項１及び２記載の外用組成物。
【請求項１１】
前記組成物は、水系または油系である溶液、水系クリームもしくはゲルまたは油系ゲル、特にポットまたはチューブ入りのもの、特にシャワージェル、シャンプー；乳液；エマルジョン、マイクロエマルジョンもしくはナノエマルジョン、特に水中油型もしくは油中水型もしくは複合もしくはシリコーン含有マイクロエマルジョンまたはナノエマルジョン；ローション、特にガラス瓶、プラスチック瓶もしくは計量瓶入りのもの、またはエーロゾルのもの；アンプル；液状石鹸；皮膚科用棒石鹸（ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｂａｒ）；軟膏；フォーム；無水製品、好ましくは液状、ペースト状もしくは固形無水製品、例えばスティックの形態、特にリップスティックの形態のものからなる群から選ばれる形態に配合されていることを特徴とする請求項１及び２記載の外用組成物。
【請求項１２】
前記金属酸化還元触媒又は酸化還元酵素は、水相に不溶性の粒子またはポリマー上に共有結合により接合されていることを特徴とする請求項１及び２記載の外用組成物。
【請求項１３】
前記金属酸化還元触媒又は酸化還元酵素の局所使用の際の抗老化、抗しわ、抗にきび、美白、皮膚バリアー機能を促進するための前記の水系媒質に不溶性である金属酸化還元触媒と還元剤又は酸化還元酵素の使用。
【請求項１４】
酸化損傷を受けた皮膚組織及び生体成分を、還元剤又は酸化還元酵素の存在下、金属酸化還元触媒で、酸化した組織及び生体成分を還元することによって、皮膚の抗老化機能を発揮する請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
酸化した酸化型補酵素を、電子供与体の存在下、酸化還元酵素により還元する請求項１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記電子供与体が、鉄、インジウム、スズ、マグネシウム、セリウム、チタン、ジルコニウム、バナジウム、ニオブ、クロム、モリブデン、アルミニウム、ガリウム、マグネシウム、スカンジウム、ニッケル、銅、ネオジム、ロジウム、イリジウム、プラチナ、ルテニウム、パラジウム、フラーレン、水酸化フラーレン、グルコース６リン酸、イソクエン酸、リンゴ酸、６−ホスホグルコン酸、Ｌ−キシリトール、Ｌ−グロン酸、Ｌ−グロノ−γ−ラクトン、アルジトールおよびグリセロールからなる群から選択された少なくとも一つの物質である請求項１６記載の方法。
【請求項１７】
酸化還元剤及び酸化還元酵素により生態組織及び生理活性成分に対し還元作用を及ぼすことにより生態組織及び生理活性成分の活性を高め又は活性期間を持続させることにより生態組織及び生理活性成分の老化を抑制する請求項１及び２記載の外用組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明は水系媒質に不溶性の金属酸化還元触媒又は酸化還元酵素を、少なくとも一種の化粧組成物または外用組成物に許容し得る賦形剤と混合して含む化粧用または外用組成物およびそれらの使用に関する。【０００２】本発明は、主に上述のような組成物の局所使用中のしわ、抗老化および／またはメラニン生成を制限するための使用に関する。
【背景技術】
【０００３】従来、α−ヒドロキシ酸類（ＡＨＡ）は、化粧品業界では主に「抗しわ」剤として用いられている。【０００４】有効性が非常に高いにもかかわらず、ＡＨＡは強い角質溶解活性を有する他の製品（サリチル酸、果物酸）と同様に、激しい炎症反応を誘発することがあり、有効濃度よりもはるかに低い濃度でこれらの炎症反応が発生する場合がある。（スラビン（Ｓｌａｖｉｎ），「クリニカル・プラスチック・サージャリー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｓｕｒｇｅｒｙ）」，米国，１９９８年，第２５巻，ｐ．４５−５２（非特許文献３）参照）。【０００５】その他の角質溶解活性物としては、プロテアーゼまたはリパーゼのような酵素を使用することである。実際、正常なヒトの皮膚にはタンパク質分解活性を有する二種の酵素が皮膚剥離の過程に関与しており、角質層キモトリプシン酵素（ＳＣＣＥ）および角質層トリプシン酵素（ＳＣＴＥ）が知られている（ルントシュトレーム（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｅｍ）他，「アクタ・デルマトロギア・ベネレオロギカ（Ａｃｔａ  Ｄｅｒｍａｔｏ−Ｖｅｎｅｒｅｏｌｏｇｉｃａ）」，ノルウェー国，１９９１年，第４１巻，ｐ．４７１−４７４（非特許文献４）；エクホルム（Ｅｋｈｏｌｍ）他，「ザ・ジャーナル・オブ・インベスチゲイティブ・ダーマトロジー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ）」，米国，２０００年，第１１４巻，ｐ．５６−６３（非特許文献５）参照）。リパーゼまたはグリコシダーゼのような酵素を使用して脂質または糖類の有機的構造を破壊して皮膚剥離の効果を増大し、最終的にケラチン合成細胞の増殖作用の強化を誘発し、抗しわ効果を誘発するとされている。【０００６】しかしながら、化粧品で酵素類を使用すると、特に水系では不安定で速やかに失活するため使用がきわめて制限されるという問題がある。このために例えばペプチド部位を修飾すること（バラリエイ（Ｖａｒａｌｌｙａｙ），「バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）」，米国，１９９８年，第４巻，第２４３号，ｐ．５６−６０（非特許文献６）；ファン・デン・ブルク（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｕｒｇ），「バイオテクノロジー・アンド・アプライド・バイオケミストリー（Ｂｏｐｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，１９９８年，第２７巻，ｐ．１２５−１３２（非特許文献７）参照）、酵素を溶解性ポリマーと共有結合させることにより酵素を固定化すること（リー（Ｌｅｅ）他，「バイオテクノロジー・プログレス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ）」，米国，１９９８年，第１４巻，第３号，ｐ．５０８−５１６（非特許文献８）参照）、または酵素を疎水性相中に懸濁して水相を酵素から分離すること（米国特許第５，８１１，８１２号明細書（米国特許出願１９９７年第８６６９１６号））（特許文献１）などの方法により酵素の安定化を保持しようとしているがいずれの方法でも十分な安定性は得られていない。【０００７】第二の問題は酵素が、非常に高いアレルギー性を持っている点である（ペプシ（Ｐｅｐｓｙ）他，「クリニカル・アラジー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｌｌｅｒｇｙ）」，英国，１９８５年，第１５巻，ｐ．１０１−１１５（非特許文献９）；ソト−メラ（Ｓｏｔｏ−Ｍｅｒａ）他，「アラジー（Ａｌｌｅｒｇｙ）」，デンマーク国，２０００年，第５５巻，ｐ．９８３−９８４（非特許文献１０）参照）。【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，８１１，８１２号明細書（米国特許出願１９９７年第８６６９１６号）
【非特許文献１】ファン・スコット他（Ｖａｎ  Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．），「ジャーナル・オブ・アメリカン・アカデミー・オブ・ダーマトロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ）」，米国，１９８４年，第１１巻，ｐ．８６７−８７９
【非特許文献２】ズー・ドレロス（Ｚｏｅ  Ｄｒａｅｌｏｓ），「コスメティック・ダーマトロジー（Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ）」，米国，２０００年，第１０巻，ｐ．５１−５７
【非特許文献３】スラビン（Ｓｌａｖｉｎ），「クリニカル・プラスチック・サージャリー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｓｕｒｇｅｒｙ）」，米国，１９９８年，第２５巻，ｐ．４５−５２
【非特許文献４】ルントシュトレーム（Ｌｕｎｄｓｔｒ・ｍ）他，「アクタ・デルマトロギア・ベネレオロギカ（Ａｃｔａ  Ｄｅｒｍａｔｏ−Ｖｅｎｅｒｅｏｌｏｇｉｃａ）」，ノルウェー国，１９９１年，第４１巻，ｐ．４７１−４７４
【非特許文献５】エクホルム（Ｅｋｈｏｌｍ）他，「ザ・ジャーナル・オブ・インベスチゲイティブ・ダーマトロジー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ）」，米国，２０００年，第１１４巻，ｐ．５６−６３
【非特許文献６】バラリエイ（Ｖａｒａｌｌｙａｙ），「バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）」，米国，１９９８年，第４巻，第２４３号，ｐ．５６−６０
【非特許文献７】ファン・デン・ブルク（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｕｒｇ），「バイオテクノロジー・アンド・アプライド・バイオケミストリー（Ｂｏｐｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，１９９８年，第２７巻，ｐ．１２５−１３２
【非特許文献８】リー（Ｌｅｅ）他，「バイオテクノロジー・プログレス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ）」，米国，１９９８年，第１４巻，第３号，ｐ．５０８−５１６
【非特許文献９】ペプシ（Ｐｅｐｓｙ）他，「クリニカル・アラジー（Ｃｌｎｉｃａｌ  Ａｌｌｅｒｇｙ）」，英国，１９８５年，第１５巻，ｐ．１０１−１１５
【非特許文献１０】ソト−メラ（Ｓｏｔｏ−Ｍｅｒａ）他，「アラジー（Ａｌｌｅｒｇｙ）」，デンマーク国，２０００年，第５５巻，ｐ．９８３−９８４
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】本発明の主な目的は金属酸化還元触媒又は酸化還元酵素を含む安全で安定なそしてきわめて大きな効果のある抗老化、抗しわ、美白、抗ニキビの外用組成物を提供することである。
【００１０】本発明の他の目的は金属酸化還元触媒からなる郡と酸化還元酵素からなる群と還元剤からなる郡からなる三郡の中の少なくとも二郡が選択され、その中から少なくとも二種の成分から選択される外用組成物を提供することにより上記の問題を解決することである。
【００１１】本発明の他の目的は、老化した生体組織又は酸化した生態成分に対して金属酸化還元触媒からなる郡と酸化還元酵素からなる群と還元剤からなる郡からなる三郡の中の少なくとも二郡が選択され、その中から少なくとも二種の成分から選択される外用組成物による強力な酸化及び還元作用を発揮してこれらの組織や成分に対して強力な抗老化及び抗酸化作用を与え組織を健全な形で保持し生体成分を活性化させ又は活性力を持続させることである。
【００１２】本発明の他の目的は、シワを抑制し、メラニン生成を抑制して美白し、アクネを改善し、皮膚の老化を抑制し、ケラチン合成細胞の増殖作用の強化し、皮膚バリアーの再構築を促進する、金属酸化還元触媒からなる郡と酸化還元酵素からなる群と還元剤からなる郡からなる三郡の中の少なくとも二郡が選択され、その中から少なくとも二種の成分から選択される外用組成物を提供することからなる新規な技術的課題を解決することである。
【００１３】さらに、本発明の他の目的は、乾燥肌または油性肌の治療を可能にする、金属酸化還元触媒からなる郡と酸化還元酵素からなる群と還元剤からなる郡からなる三郡の中の少なくとも二郡が選択され、その中から少なくとも二種の成分から選択される外用組成物を提供することからなる新規な技術的課題を解決することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】これらの技術的課題のすべてが本発明によりはじめて同時に解決される。
【００１５】このように、本発明では、水系媒質に不溶性の金属酸化還元触媒又は酸化還元酵素類が化粧用または外用組成物に特にアレルギーの問題なしに安全にしかも安定に使用できることが発見された。
【００１６】従って、第一の態様において、本発明は水系媒質に不溶性である少なくとも一種の金属酸化還元触媒からなる郡と酸化還元酵素からなる群と還元剤からなる郡からなる三郡の中の少なくとも二郡が選択され、その中から少なくとも二種の成分から選択される外用組成物に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】「賦形剤」とは、本発明者によれば、不溶性の形態の金属酸化還元触媒又は酸化還元酵素である有効成分以外の成分のすべてを意味する。【００１８】本発明の金属酸化還元触媒とは、たとえば、鉄、チタン（Ｔｉ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、バナジウム（Ｖ）、ニオブ（Ｎｂ）、クロム（Ｃｒ）、モリブデン（Ｍｏ）、アルミニウム（Ａｌ）、ロジウム（Ｒｈ）、イリジウム（Ｉｒ）、プラチナ（Ｐｔ）、ルテニウム（Ｒｕ）、パラジウム（Ｐｄ）、ガリウム（Ｇａ）、マグネシウム（Ｍｇ）、スカンジウム（Ｓｃ）、ニッケル（Ｎｉ）、銅（Ｃｕ）、ネオジム（Ｎｄ）及び活性炭上のパラジウムを用いることができる。適切な触媒は活性炭上のパラジウム及びシリカ／アルミナ上のニッケルである。前記鉄としては、鋳鉄粉、還元鉄粉、電解鉄粉、アトマイズ鉄粉の少なくともいずれかひとつの純鉄粉を用いることもできる。本発明の金属酸化還元触媒は、鉄、インジウム、スズ、マグネシウム、セリウム、チタン、ジルコニウム、バナジウム、ニオブ、クロム、モリブデン、アルミニウム、ガリウム、マグネシウム、スカンジウム、ニッケル、銅、ネオジム、ロジウム、イリジウム、プラチナ、ルテニウム、パラジウム、フラーレン、グルコース６リン酸、イソクエン酸、リンゴ酸、６−ホスホグルコン酸、Ｌ−キシリトール、Ｌ−グロン酸、Ｌ−グロノ−γ−ラクトン、アルジトールおよびグリセロール等の電子供与体から選択されるのが好ましい。
本発明で使用できる酸化還元酵素は、リパーゼ、酸化還元酵素、カルボヒドラーゼ、プロテアーゼ、サブチリシン、トリプシン、キモトリプシンまたはサーモリシンのようなプロテアーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、α−アミラーゼもしくはβ−アミラーゼまたはグルコアミラーゼのようなアミラーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、セレブロシダーゼ、スーパーオキサイド・ジスムターゼ、ペルオキシダーゼおよびリポキシゲナーゼ、グルコース６リン酸脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素、Ｌ−キシロース還元酵素、グルクロン酸還元酵素、グルクロノラクトン還元酵素、アルドース還元酵素、デヒドロアスコルビン酸還元酵素、酸化型トコフェロール還元酵素およびグリセロール脱水素酵素、２−ニトロプロパンジオキシゲナーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、酸化還元酵素、転写レギュレーター、アシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ、ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼ、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエートオクタプレニル、ｇｍｃ型酸化還元酵素、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ、メチルマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、水銀レダクターゼ、グルタチオンレダクターゼ、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨ、ジヒドロリポアミド、トランスポゼース、プロリンイミノペプチダーゼ、プロリルアミノペプチダーゼ、キノロン流出ポンプ、グリシンベタイントランスポーター、ホスファチジルエタノールアミンＮ−メチルトランスフェラーゼ、カルコンシンターゼ２、スルホトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、フマル酸レダクターゼフラビンタンパク質、８−アミノ−７−オキソノナン酸シンターゼ、アミノトランスフェラーゼクラスＩＩピリドキサールリン酸、バクテリオファージＨＫ９７プロヘッドプロテアーゼ、ペニシリン結合タンパク質、脂肪アシル−ＣｏＡラセマーゼ、ニトリロトリアセテートモノオキシゲナーゼ、ヒスチジンキナーゼ応答レギュレーター、ペプチダーゼ、ＬｙｓＲ転写レギュレーター、除去酵素、オルニチンアミノトランスフェラーゼ、リンゴ酸酸化還元酵素、チオ硫酸結合タンパク質、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、アシル−ＣｏＡシンセターゼ、メチルトランスフェラーゼ、シロヘムシンターゼ、透過酵素、グルタリル７−ａｃａアシラーゼ、ｓｎ−グリセロール−３−リン酸輸送系透過酵素、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ／イソメラーゼ、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、シチジンデアミナーゼ、クロトナーゼ、脂質輸送タンパク質、アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ、アミノトランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、および２−アミノ−４−ヒドロキシ−６−ヒドロキシメチルジヒドロプテリンピロホスホキナーゼからなる群から選ばれるのが好適である。この酸化還元酵素は還元酵素からなる群から選ばれるのが好適である。【００１９】本発明で使用できる還元剤は、アスコルビン酸、アスコルビン酸−２−リン酸、アスコルビン酸−２−グルコシド、アスコルビン酸燐酸パルミチン酸、アスコルビン酸パルミチン酸、アスコルビン酸ステア燐酸、トコフェリル燐酸���、トコフェリルジメチルグリシン、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、エリソルビン酸、エリソルビン酸ナトリウム、チオジプロピオン酸ジラウリル、トコフェロール、システイン、グルタチオン、還元型ペプチド、トリルビグアナイド、ノルジヒドログアヤレチン酸、カロチン、アスタキサンチン、クリプトキサンチン、カロチノイド類、αリポ酸、コエンザイムＱ１０、コエンザイムＡ、パラヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシアニソール、ジブチルヒドロキシトルエン、ステアリン酸アスコルビル、パルミチン酸アスコルビル、没食子酸オクチル、没食子酸プロピル、カロチノイド、フラボノイド類、カテキン類、ピクノジェノール、フラバンジェノール、フラーレンＣ６０、水酸化フラーレンＣ６０、フラーレンＣ７０、水酸化フラーレンＣ７０、還元性芳香族化合物類、タンニン、リグナン、サポニン、リンゴエキスやチョウジエキス及びこれらの誘導体、及びこれらのＮａ、Ｃａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃｌ等の塩類から選択される少なくともいずれか１つであるからなる郡から選ばれるのが好適である。【００２０】本発明が網羅する実施形態のすべてのうちから、本発明者は以下の本発明の３つの特定の実施形態を推奨する：
−第１の好適な実施形態は、金属酸化還元触媒からなる郡と酸化還元酵素からなる群又は還元剤からなる郡を結晶化して不溶性タンパク質結晶を形成し、ついでこれらの結晶を例えばグルタルアルデヒドにより化学的に架橋してこれらの粒子を不溶化し、かつそれらを水系媒質に不溶性にすることからなる。
−第２の好適な実施形態は、金属酸化還元触媒からなる郡と酸化還元酵素からなる群又は還元剤からなる郡を水系媒質に不溶性であるように選ばれたポリマー上に接合することからなる。
−第３の好適な実施形態は、金属酸化還元触媒からなる郡と酸化還元酵素からなる群又は還元剤からなる郡を粒子、好ましくはマイクロメーターまたはナノメーター級の粒子であって、好ましくは球、カプセルまたはスポンジであり、すべて水系媒質に不溶性である粒子上に接合することからなる。【００２１】これらのポリマーまたはこれらの粒子は、水系媒質に不溶性であり、それらの表面上に少なくとも一種の修飾可能な化学官能基を有し、この官能基が金属酸化還元触媒又は酸化還元酵素と共有結合を形成するのに使用できるのが好適である。例えば、これらのポリマーまたはこれらの粒子は下記のものの少なくとも一種：すなわち、一種のセルロース、一種のポリスチレン、一種のアルキルシアノアクリレート、一種のシリカ、一種のナイロン、一種のポリアミド（合成、または天然ポリアミド由来）、一種のポリエステル（合成、または天然ポリエステル由来）、またはそれらの混合物の一種を含む。【００２２】本発明の文脈において、球は、米国特許第５，３９５，６２０号明細書、フランス国特許第２，６８３，１５９号（米国特許第６，３０３，１５０号）明細書、国際公開第９４／０４２６１号（米国特許第号５，６９１，０６０号）明細書、米国特許第５，９１２，０１６号明細書、フランス国特許第２，７８０，９０１号（米国特許第６，１９７，７５７号）明細書、フランス国特許第２，７０３，９２７号（米国特許第５，６３５，６０９号）明細書に記載されているような球であり得る。【００２３】上記第１の実施形態について、結晶化され、かつ架橋された金属酸化還元触媒又は酸化還元酵素は結晶の形態である。これらの結晶は０．２〜５０μｍ、好ましくは１〜５μｍの大きさを持つ。これらの結晶は特に針状または卵形の形態を有し、上記の大きさはそれらの最大の大きさに相当する。【００２４】これらの結晶は、特に架橋による金属酸化還元触媒からなる郡と酸化還元酵素からなる群又は還元剤からなる郡の結晶の不溶化技術により、他の点に関しては文献に記載されているように形成される（「架橋金属酸化還元触媒又は酸化還元酵素結晶」、「トレンズ・イン・バイオテクノロジー（ＴＩＢＴＥＣＨ）」，１９９６年，第１４巻，第７（１５０）号，ｐ．２１９−２５９）。【００２５】これらの結晶はゲル、特に皮膚および／または頭皮、および／または毛髪に対して許容し得るゲル中に希釈して化粧用または外用組成物を調製するのが好ましい。【００２６】本発明に使用可能な好適な賦形剤は、ブチレングリコール、水、ステアレス−２、ステアレス−２１、グリコール−１５・ステアリル・エーテル、セテアリルアルコール、フェノキシエタノール、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、ブチレングリコール、天然トコフェロール、グリセロール、ジヒドロキシセチルナトリウム、イソプロピル・ヒドロキシセチル・エーテル、グリコール・ステアレート、トリイソノナオイン、オクチル・ココエート、ポリアクリルアミド、イソパラフィン、ラウレス−７、カルボマー、プロピレングリコール、グリセロール・ビスアボロール、ジメチコン、水酸化ナトリウム、香料、ＰＥＧ３０−ジポリヒドロキシステアレート、カプリン酸／カプリ��酸トリグリセリド、セテアリル・オクタノエート、ジブチル・アジペート、ブドウ種子油、ホホバ油、硫酸マグネシウム、ＥＤＴＡ、シクロメチコン、キサンタンガム、クエン酸、ラウリル硫酸ナトリウム、ミネラルワックスおよび鉱油、イソステアリル・イソステアレート、プロピレングリコール・ジペラルゴネート、プロピレングリコール・イソステアレート、ＰＥＧ８−ミツロウ、水素化ヤシ心材油グリセリド、水素化ヤシ油グリセリド、ラノリン油、ゴマ油、セチル・ラクテート、ラノリンアルコール、ヒマシ油、二酸化チタン、着色剤、および顔料からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む。【００２７】好適には、上記の組成物は、水系または油系である溶液、水系クリームもしくはゲルまたは油系ゲル、特にポットまたはチューブ入りのもの、特にシャワージェル、シャンプー；乳液；エマルジョン、マイクロエマルジョンもしくはナノエマルジョン、特に水中油型もしくは油中水型もしくは複合もしくはシリコーン含有マイクロエマルジョンまたはナノエマルジョン；ローション、特にガラス瓶、プラスチック瓶もしくは計量瓶入りのもの、またはエーロゾルのもの；アンプル；液状石鹸；皮膚科用棒石鹸（ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｂａｒ）；軟膏；フォーム；無水製品、好ましくは液状、ペースト状もしくは固形無水製品、例えばスティックの形態、特にリップスティックの形態のものからなる群から選ばれる形態に配合される。【００２８】好適には、金属酸化還元触媒からなる郡と酸化還元酵素からなる群又は還元剤からなる郡は水相に不溶性の粒子またはポリマー上に共有結合により接合される。【００２９】好適には、金属酸化還元触媒からなる郡と酸化還元酵素からなる群又は還元剤からなる郡は、カルボジイミドのような二官能性剤で活性化することにより接合すべき金属酸化還元触媒又は酸化還元酵素と反応するように調製されている球上に接合される。【００３０】一般に、これらの粒子上に金属酸化還元触媒からなる郡と酸化還元酵素からなる群又は還元剤からなる郡を接合する際に用いられるポリマーまたは粒子は、活性化剤により活性化することができる。この活性化は主にポリマーまたは粒子の外表面上に存在する化学的機能を活性化することからなる。【００３１】好適には、結晶化され、架橋された金属酸化還元触媒からなる郡と酸化還元酵素からなる群又は還元剤からなる郡はグルタルアルデヒドで架橋されている。【００３２】一般に、かつ意外にも、本発明者は本発明を実現する際に、金属酸化還元触媒からなる郡と酸化還元酵素からなる群又は還元剤からなる郡の不溶化時に精製工程が得られること、および可溶性の形態で使用されるアレルゲン性金属酸化還元触媒からなる郡と酸化還元酵素からなる群又は還元剤からなる郡がひとたび不溶性の形態で使用されると全く低アレルゲン性になることをも示した。【００３３】さらに、金属酸化還元触媒からなる郡と酸化還元酵素からなる群又は還元剤からなる郡を不溶性の形態で使用すると金属酸化還元触媒からなる郡と酸化還元酵素からなる群又は還元剤からなる郡を安定化することが可能となり、かつこれによりそれらの化粧用途および皮膚薬用途における使用を予想することができる。【００３４】水系媒質に不溶性にした金属酸化還元触媒又は酸化還元酵素は、皮膚の耐性の系統的な改善を可能にする。【００３５】又、これらの金属酸化還元触媒又は酸化還元酵素を化粧用または皮膚薬用配合剤、特に通常はそれらが用いられない低アレルゲン性の化粧品または皮膚薬剤において使用することが可能となる。【００３６】本発明は、第二の態様として、好ましくは上述のような化粧用または外用組成物を形成するように化粧組成物または外用組成物に許容し得る賦形剤と混合した、水系媒質に不溶性である金属酸化還元触媒からなる郡と酸化還元酵素からなる群と還元剤からなる郡からなる三郡の中の少なくとも二郡が選択され、その中から少なくとも二種の成分から選択される外用組成物は、化粧組成物または外用組成物ケアを行うために使用することができる。【００３７】有利なことに、この金属酸化還元触媒からなる郡と酸化還元酵素からなる群と還元剤からなる郡からなる三郡の中の少なくとも二郡が選択され、その中から少なくとも二種の成分から選択される外用組成物は、化粧用または外用組成物を形成するために混合したものであるのが好ましく、局所使用の際の抗老化および／またはメラニン生成を制限するのに使用できる。【００３８】有利なことに、この金属酸化還元触媒からなる郡と酸化還元酵素からなる群と還元剤からなる郡からなる三郡の中の少なくとも二郡が選択され、その中から少なくとも二種の成分から選択される外用組成物はそれを含む化粧用もしくは外用組成物の使用は、特に皮膚および／または毛髪のケラチンのケラチン合成細胞の増殖作用の強化を行うことを可能とし、特に皮膚を明色化することができ、この酸化還元酵素はプロテアーゼであるのが好ましい。【００３９】有利なことに、この金属酸化還元触媒からなる郡と酸化還元酵素からなる群と還元剤からなる郡からなる三郡の中の少なくとも二郡が選択され、その中から少なくとも二種の成分から選択される外用組成物は、抗しわ効果を奏するために使用することができる。【００４０】有利なことに、この金属酸化還元触媒からなる郡と酸化還元酵素からなる群と還元剤からなる郡からなる三郡の中の少なくとも二郡が選択され、その中から少なくとも二種の成分から選択される外用組成物は、皮膚バリアーを再構築してバリアー効果を得るのに用いることができ、この酸化還元酵素はリパーゼまたはアミラーゼであるのが好ましい。【００４１】有利なことに、この金属酸化還元触媒からなる郡と酸化還元酵素からなる群と還元剤からなる郡からなる三郡の中の少なくとも二郡が選択され、その中から少なくとも二種の成分から選択される外用組成物は、油性肌に局所適用することにより過剰な皮脂を除去し、皮膚が光る効果を消失させることができ、この金属酸化還元触媒又は酸化還元酵素はリパーゼであるのが好ましい。【００４２】有利なことに、この金属酸化還元触媒からなる郡と酸化還元酵素からなる群と還元剤からなる郡からなる三郡の中の少なくとも二郡が選択され、その中から少なくとも二種の成分から選択される外用組成物は、鱗屑の消失を可能とし、乾燥肌に局所適用することにより正常な状態への復帰を可能とし、この酸化還元酵素はプロテアーゼまたはアミラーゼであるのが好ましい。【００４３】有利なことに、この金属酸化還元触媒からなる郡と酸化還元酵素からなる群と還元剤からなる郡からなる三郡の中の少なくとも二郡が選択され、その中から少なくとも二種の成分から選択される外用組成物（不溶性形態のこの金属酸化還元触媒又は酸化還元酵素以外）を含む化粧用もしくは外用組成物は、この組成物中に含まれる少なくともこの有効成分の経皮浸透を増加させることができる。【００４４】第３の態様として、本発明は上記のような金属酸化還元触媒からなる郡と酸化還元酵素からなる群と還元剤からなる郡からなる三郡の中の少なくとも二郡が選択され、その中から少なくとも二種の成分から選択される外用組成物を局所適用することを含む化粧組成物ケア方法に関する。【００４５】第４の態様として、本発明は上記のような金属酸化還元触媒からなる郡と酸化還元酵素からなる群と還元剤からなる郡からなる三郡の中の少なくとも二郡が選択され、その中から少なくとも二種の成分から選択される外用組成物を局所適用することを含む外用組成物ケア方法に関する。【００４６】特に、本発明のすべての態様について、この局所適用は特に皮膚および／または頭皮、および／または毛髪への外部適用に関する。【００４７】本発明の他の目的、特徴および利点は、単に説明のために示され本発明の範囲を何ら限定しない実施例を参照して詳細な説明を読む際に当業者には明白であろう。【００４８】実施例は本発明の一部分を成し、実施例を含む説明全体から従来の技術水準に対して新規であると思われるいかなる特徴も、その機能および一般性において本発明の一部分を成す。【００４９】従って、すべての実施例は包括的な範囲を有する。【００５０】さらに、実施例において、特に指示しない限り％はすべて重量により、周囲温度は特に指示しない限り℃であり、圧力は特に指示しない限り気圧である。
【実施例】
【００５１】実施例１：不溶性結晶化形態のプロテアーゼ
まず、サブチリシンを結晶化すると、不純物を除去することができ、ついでこの結晶形態をグルタルアルデヒドによりタンパク質を架橋することにより安定化する。使用した技法は「トレンズ・イン・バイオテクノロジー（ＴＩＢＴＥＣＨ）」，１９９６年，第１４巻，第７（１５０）号，ｐ．２１９−２５９のような種々の刊行物に記載されているものである。【００５２】このようにして得られたタンパク質の結晶は水系媒質に完全に不溶性である。この方法により、酸化還元酵素分子それ自体の間の相互作用が低減され、酸化還元酵素の活性部位により認識される開裂部位の数が減少する。このようにしてプロテアーゼの自己溶解は低減され、従ってそれにより水系媒質中で非常に良好な酸化還元酵素の安定性を得ることができる。【００５３】このようにして得られた結晶は、０．２〜５０μｍの大きさを持ち、そのため皮膚組織の深い層に浸透することができず、それにより従来、遊離酵素を使用したときに観察される不耐性の反応が制限または除去される。【００５４】ゲルは、上記結晶と白金コロイド中でｐＨ＝５．８に予備緩衝（１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ＣａＣｌ２２０ｍＭ）した０．５％キサンタンゲル中で上記結晶が１０％の濃度、白金コロイドが０．１％重量濃度になるように希釈することにより形成する。全体を１０分間機械撹拌し、次いで３％Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸エステル−６−パルミテートと１％フラーレンＣ６０及び２％の防腐剤を添加して生成物を細菌学的に安定化した本発明の外用組成物を得た。【００５５】本発明の有効性をまず第一にＤＨＡを用いた試験により評価し、一般に用いられているα−ヒドロキシ酸、グリコール酸と比較した。手短にいうと、この試験の原理は次の通りである。２４人のボランティアの前腕の４つの領域をＤＨＡ５％を含む化粧品を用いて１日２回３日間処置した。ＤＨＡと皮膚のタンパク質との反応の結果強い着色が誘発される。種々の角質溶解配合剤を毎日適用の下、消失するこの着色を彩度測定法（ｃｈｒｏｍａｍｅｔｒｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ）（ミノルタ・クロマメーター（Ｍｉｎｏｌｔａ  Ｃｈｒｏｍａｍｅｔｅｒ））を用いて追跡し、比較することができる。【００５６】上記ゲル２％を含む配合剤を使用すると、対照領域に対してメラニン指数を１５％低下させることができる。この低下はプラセボ・クリームで処置した後に観察されたものよりも１９１％大きく、グリコール酸３％を含むクリームで処置した後に観察されたものよりも１３５％大きい。本発明のゲルを含む配合剤は、従って、落屑性を有することで周知である角質溶解活性物であるグリコール酸３％を含む配合に対して２倍有効である。【００５７】このように上述の角質溶解効果から必然的に生じる抗しわ効果を、第２のシリーズの実験において評価した。実施例１で調製したゲル２％を含む配合剤を２８日間２４人のボランティアに適用した後、外観としわの発展を「ケノポジウム」油中のシリコーン型により検討したところ、プラセボ配合剤を施した対照領域に比べて大きく低下した（１５日間処置後−３０％）。【００５８】モルモットにおける皮膚感作能力の評価
上述のゲルを、ＯＥＣＤの第４０６号指令に従ったプロトコルであるマグヌッソン（Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ）およびクリーグマン（Ｋｌｉｇｍａｎｎ）により記載された最大化試験にかけた結果、比較例の酵素単体はアレルゲン性が高かったにもかかわらず本発明の実施例１の外用組成物のアレルゲン性は極めて低かった。【００５９】実施例２
不溶性架橋結晶化サブチリシン（以下、「サブチリシン結晶」と呼ぶ）を含む実施例１のゲルと、市販のサブチリシン（バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）から抽出）を含むゲルを４℃、２０℃、および４５℃に置く。
プロテアーゼ活性の測定は上述の技法により行う。【００６０】得られた結果は、測定活性値対Ｔ＝０における当初活性値の％で与えられるが、それらは室温で１年経過後に活性が測定された結果、実施例１の本発明の外用組成物は９０％以上の安定性を有していたのに対して、市販のサブチリシンの酵素活性は５０％以下であった。従って、本発明は、非常に高い酵素安定性を有する。【００６１】実施例３：その他の架橋結晶化酸化還元酵素
本発明の白金コロイド０．１％重量とフラーレンＣ６０、１％重量の２種の組み合わせ、及び白金コロイド０．１％重量とＬ−アスコルビン酸リン酸Ｎａ５％重量の組み合わせ、及びフラーレンＣ６０とトコトリエノールと酸化マグネシウムによりそれぞれ本発明の外用組成物を得た。【００６２】上記のような本発明の化合物は化粧用途に使用することが可能であった。【００６３】実施例４：水相に不溶性の粒子上へのスーパーオキサイド・ジスムターゼの接合
実施例４：  スーパーオキサイド・ジスムターゼ（Ｓｉｇｍａ）を下記の３段階を含むプロトコルにより不溶性粒子に接合した。
−コレティカ社の米国特許第５，３９５，６２０号明細書の記載に従って調製される不溶性粒子の調製のために使用するタンパク質のカルボキシル官能基を活性化する段階。この工程は、１０ｍＭヘペス（ｈｅｐｅｓ）緩衝液、ｐＨ７．５に溶解した１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（Ｓｉｇｍａ）０．４ｇを栓子（ｐｌｕｇ）としてのマイクロスフェアー１００ｇに添加することにより行った。この溶液を周囲温度で１時間撹拌し、次いで球を２，３００ｒｐｍで３分間遠心して回収した。この栓子を１０ｍＭヘペス緩衝液、ｐＨ７．５で３回洗浄した。
−金属酸化還元触媒と結合する段階、ここではスーパーオキサイド・ジスムターゼを０．１Ｍ白金コロイド溶液、ｐＨ８．５に０．０４％の白金コロイド及びＬ−アスコルビン酸−２−リン酸Ｍｇ含有量で添加溶解する。
−この溶液を周囲温度で１時間撹拌する。
−洗浄段階、遊離金属酸化還元触媒又は酸化還元酵素を除去する目的：溶液を２，３００ｒｐｍで３分間遠心し、次いで上清を除去する。金属酸化還元触媒を接合した球を０．１Ｍ酢酸塩緩衝液、ｐＨ６．２で３回洗浄する。
この洗浄した接合された球を０．１Ｍ酢酸塩緩衝媒質、ｐＨ６．２に含有量が２０％となるように溶解した。【００６４】接合による金属触媒と酵素の安定化の証明
実施例４から得た生成物をスーパーオキサイド・ジスムターゼ活性について測定し、室温においてスーパーオキサイド・ジスムターゼの経時安定性を検討した。市販の遊離スーパーオキサイド・ジスムターゼを０．１Ｍ酢酸塩緩衝液、ｐＨ６．２に同じ濃度で溶解することにより構成されるサンプルを調製し、室温で安定性を試験した。
この結果本発明の実施例４から得たスーパーオキサイド・ジスムターゼを含有する外用組成物の活性は室温で一年間保存された結果本発明の外用組成物は市販の遊離スーパーオキサイド・ジスムターゼに比較し約１０倍の安定性を保っていた。【００６５】以下に外用組成物の実施例を示すが、以下に記載された本発明の製品とは上記実施例１から４に示された本発明の外用組成物のいずれでも良い。
実施例６：水中油型エマルジョンの化粧用または皮膚薬用配合剤における本発明の製品の使用
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【００６７】
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【００６８】
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【００６９】本発明の実施例７：油中水型配合剤における本発明の製品の使用
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【００７０】本発明の実施例８：シャンプーまたはシャワージェル型の配合剤における本発明の製品の使用
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【００９５】本発明の実施例９：リップスティック型その他の無水製品の配合剤における本発明の製品の使用
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【００７２】本発明の実施例１０：水性ジェルの配合剤における本発明の製品の使用（眼の周囲、減量者等）
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【００７３】実施例１１：本発明の外用組成物の安定性の評価
実施例１により得られた化合物についてウサギにおける眼刺激試験、ラットにおける単独経口投与急性毒性試験、およびモルモットにおける感作性毒性試験を行ったが全てに対して異常が認められなかった。
次いで、ヒトのボランティアに対するアレルゲン性試験の検討を、実施例１に記載の化合物を０．４５％カルボポールゲル、ｐＨ５．８に１０％に希釈した標品を用いて行ったが人に対するアレルゲン性は認められなかった。