(57)【要約】  【課題】プローブ核酸の設計段階において、二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用を考慮することにより、バイオアッセイ時などにおける二本鎖核酸の検出精度、定量性などを向上すること。  【解決手段】遺伝子情報として取得した塩基配列から、プローブ核酸に用いる配列を選択するプローブ核酸設計方法であって、２本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用に関するプロファイルデータに基づいて、所定の塩基配列を有する配列領域を選択範囲から除外する工程、若しくは前記配列領域の重み付けを行う工程を含むプローブ核酸設計方法を提供する。ここで、プロファイルデータは、インターカレーターの蛍光強度、２本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用量などに関する塩基配列ごとのデータである。本発明に基づいてプローブ核酸を設計することにより、バイオアッセイ時などにおける二本鎖核酸の検出精度、定量性などを向上できる。  【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子情報として取得した塩基配列から、プローブ核酸に用いる配列を選択するプローブ核酸設計方法であって、
２本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用に関するプロファイルデータに基づいて、所定の塩基配列を有する配列領域を選択範囲から除外する工程、若しくは前記配列領域の重み付けを行う工程を含むプローブ核酸設計方法。
【請求項２】
前記プロファイルデータは、インターカレーターの蛍光強度、２本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用量、２本鎖核酸とインターカレーターとの結合定数のいずれかに関する塩基配列ごとのデータであることを特徴とする請求項１記載のプローブ核酸設計方法。
【請求項３】
請求項１記載のプローブ核酸配列設計方法により設計されたプローブ核酸。
【請求項４】
請求項３記載のプローブ核酸が保持又は固定された検出表面。
【請求項５】
請求項４記載の検出表面を備えたＤＮＡチップ。
【請求項６】
遺伝子情報として取得された塩基配列から、プローブ核酸に用いる配列を選択するプローブ核酸設計プログラムであって、
予め取得された、２本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用に関するプロファイルデータに基づいて、所定の塩基配列を有する配列領域を選択範囲から除外するステップ、若しくは前記配列領域の重み付けを行うステップに係わる記述を含むプローブ核酸設計プログラム。
【請求項７】
請求項６記載のプローブ核酸設計プログラムが少なくとも格納された情報記憶媒体。
【請求項８】
遺伝子情報として取得した塩基配列から、プローブ核酸に用いる配列を選択するプローブ核酸設計システムであって、
２本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用に関するプロファイルデータに基づいて、所定の塩基配列を有する配列領域を選択範囲から除外する、若しくは前記プロファイルデータに基づいて、前記配列領域の重み付けを行う相互作用条件処理部を少なくとも備えるプローブ核酸設計システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用に関するプロファイルデータに基づいて、遺伝子情報として取得した塩基配列から、プローブ核酸に用いる配列を選択などするプローブ核酸設計方法、及び、それらに関連する核酸プローブ、検出表面、ＤＮＡチップ、プログラム、情報記憶媒体、プローブ核酸設計システムなどに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医学、生理学の分野などにおける遺伝子解析手段などとして、プローブ核酸を用いた技術が広く用いられている。
【０００３】
例えば、ＱＣＭ（水晶発振子マイクロバランス）装置やＳＰＲ（表面プラズモン共鳴バイオセンサ）の検出表面（電極面など）にプローブ核酸を固定などし、そのプローブ核酸と標的核酸との結合（ハイブリダイゼーション）を重量変化として検出する技術が一部実用化されている。
【０００４】
また、例えば、ＤＮＡチップなどのように、多種多数のプローブ核酸を固相基板上に固定などし、それらのプローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションを網羅的に検出する技術が一部実用化されている。
【０００５】
例えば、プローブ核酸を用いて標的核酸を検出などする場合、各プローブ核酸が特異的な配列であり、かつ、各プローブ核酸とそれに対応する標的核酸との反応性が均一であることが好ましい。そこで、プローブ核酸の設計は、一般的に、プローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションにより形成された二本鎖核酸の融解温度、プローブ核酸の鎖長、他のプローブ核酸中における相同配列の有無などを考慮して行う。即ち、プローブ核酸の設計段階において、目的の遺伝子の塩基配列の全体からそれらの条件に適合する配列を選択し、その配列をプローブ核酸として用いる。
【０００６】
ここで、本発明に関連する事項として、インターカレーターについて以下説明する。インターカレーターは、二本鎖核酸の所定部位に結合して蛍光を発する物質である。近年、プローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションによって形成された二本鎖核酸を、インターカレーターを用いて検出する手段が一部実用化されている。
【０００７】
なお、例えば、特許文献１には、オリゴヌクレオチド配列の融解温度の差を計算し、その差が０〜７℃となるプローブを選択する段階を含むプローブ設計方法が、特許文献２には、ＤＮＡアレイ向けのプローブ配列決定システムが、それぞれ記載されている。
【特許文献１】特開２００５−３１８８９５号公報
【特許文献２】特開２００３−５２３８５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
プローブ核酸の設計において、二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用に関してはほとんど考慮されていない。そこで、本発明は、プローブ核酸の設計段階において、二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用を考慮することにより、バイオアッセイ時などにおける二本鎖核酸の検出精度、定量性などを向上することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用に関して、インターカレーターの蛍光感度、二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用量、二本鎖核酸とインターカレーターとの結合定数などには、二本鎖核酸の配列によって、それぞれ異なった特性があることを新規に見出した。
【００１０】
そこで、本発明では、遺伝子情報として取得した塩基配列から、プローブ核酸に用いる配列を選択するプローブ核酸設計方法であって、２本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用に関するプロファイルデータに基づいて、所定の塩基配列を有する配列領域を選択範囲から除外する工程、若しくは前記配列領域の重み付けを行う工程を含むプローブ核酸設計方法を提供する。
【００１１】
ここで、プロファイルデータは、インターカレーターの蛍光強度、２本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用量、２本鎖核酸とインターカレーターとの結合定数などに関する塩基配列ごとのデータである。
【００１２】
例えば、バイオアッセイ時などにおいて、インターカレーターの蛍光強度によりハイブリダイゼーションなどを検出する場合、プローブ核酸設計段階において、インターカレーターの蛍光強度に関する塩基配列ごとのプロファイルデータに基づき所定の塩基配列を有する配列領域を選択範囲から除外する。これにより、二本鎖核酸とインターカレーターとが相互作用した際における蛍光感度が均一なプローブ核酸を設計できるため、そのプローブ核酸を用いることにより、バイオアッセイ時などにおいて高精度かつ定量的な検出を行うことができる。
【００１３】
例えば、バイオアッセイ時などにおいて、２本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用量によりハイブリダイゼーションなどを検出する場合、プローブ核酸設計段階において、２本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用量に関する塩基配列ごとのプロファイルデータに基づき所定の塩基配列を有する配列領域を選択範囲から除外する。これにより、二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用量が均一なプローブ核酸を設計できるため、そのプローブ核酸を用いることにより、バイオアッセイ時などにおいて高精度かつ定量的な検出を行うことができる。
【００１４】
例えば、バイオアッセイ時などにおいて、２本鎖核酸とインターカレーターとの結合定数などによりハイブリダイゼーションなどを検出する場合、プローブ核酸設計段階において、２本鎖核酸とインターカレーターとの結合定数に関する塩基配列ごとのプロファイルデータに基づき所定の塩基配列を有する配列領域を選択範囲から除外する。これにより、二本鎖核酸とインターカレーターとが相互作用した際における結合定数などが均一なプローブ核酸を設計できるため、そのプローブ核酸を用いることにより、バイオアッセイ時などにおいて高精度かつ定量的な検出を行うことができる。
【００１５】
以下、本発明に係る技術用語について説明する。
【００１６】
「核酸」は、プリンまたはピリミジン塩基と糖がグリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステルの重合体（ヌクレオチド鎖）を意味し、核酸プローブを含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチオドが重合したＤＮＡ（全長あるいはその断片）、逆転写により得られるｃＤＮＡ（ｃＤＮＡプローブ）、ＲＮＡ、ポリアミドヌクレオチド誘導体（ＰＮＡ）などを広く含む。
【００１７】
「二本鎖核酸」は相補的な核酸同士がハイブリダイズした核酸を全て包含する。例えば、プローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションにより形成された二本鎖核酸又は二本鎖核酸部分なども、本発明に係る二本鎖核酸に包含される。ここで、「プローブ核酸」は、標的核酸を検出するための検出子として機能する核酸（ヌクレオチド鎖）であり、検出表面などに固定などされて存在する。「標的核酸」は、全長又は一部に、検出用の核酸プローブの塩基配列と相補的な配列を有する核酸であり、ハイブリダイゼーションを検出する際などに、反応場に滴下又は供給などされる。
【００１８】
「インターカレーター」は、二本鎖核酸の所定部位に結合して蛍光を発する物質である。
【００１９】
「相互作用」は、２つの物質が相互に結合することである。
【００２０】
「ハイブリダイゼーション」は、核酸（ヌクレオチド鎖）間の相補結合であり、高分子−高分子、高分子−低分子、低分子−低分子の特異的な結合、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡ間の特異的な結合、などを広く含む。
【００２１】
「プロファイルデータ」は、特定の事項に関する、予め取得され蓄積された情報である。
【発明の効果】
【００２２】
本発明に基づいてプローブ核酸を設計することにより、バイオアッセイ時などにおける二本鎖核酸の検出精度、定量性などを向上できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
＜本発明に係るプローブ核酸設計方法について＞
はじめに、図１から図５を用いて、本発明に係るプローブ核酸設計方法の例について、以下説明する。なお、本発明に係るプローブ核酸設計方法は、２本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用に関するプロファイルデータに基づいて、所定の塩基配列を有する配列領域を選択範囲から除外する工程を少なくとも含むものを全て包含する。従って、本発明は、例えば、下記に示す他の工程を含むかどうかなどによって狭く限定されない。
【００２４】
図１Ａ及び図１Ｂは、プローブ核酸設計の一般的な処理工程の例を示すフロー図である。なお、本図は処理工程の概要を示すフロー図であるため、本図では、各処理における条件分岐などを省略している。
【００２５】
まず、遺伝子情報のデータベースから、遺伝子情報を取得し（符号Ｓ１）、情報記憶媒体Ａなどに格納する。遺伝子情報のデータベースとして、例えば、Ｇｅｎ  Ｂａｎｋなどの公共データベースを利用することができる。取得した遺伝子情報は、例えば、Ｆａｓｔａヘッダ情報など、相互参照できるデータ形式で記述されていることが好ましい。
【００２６】
次に、格納した遺伝子情報の中から、特定の遺伝子の塩基配列を取り出し（符号Ｓ３）、その塩基配列について、フィルター処理（符号Ｓ４、Ｓ５）、モチーフ処理（符号Ｓ６）などを行う。
【００２７】
フィルター処理は、特定の遺伝子の塩基配列のうち、プローブ核酸として適さない配列領域をマスクし、選択範囲から除外する処理である。プローブ核酸に用いる配列として適さない配列領域を塩基配列の全体から予め除外することにより、探索処理を省略化できるため、演算時間を短縮できる。
【００２８】
図１Ａ中、フィルター処理１（符号Ｓ４）は、繰り返し配列に対するフィルター処理である。遺伝子情報には、多くの繰り返し配列が存在する。繰り返し配列は多くの遺伝子などに広く存在するため、プローブ核酸に用いる配列には適さない。そこで、フィルター処理工程で、繰り返し出現する配列を選択範囲から除外することにより、探索処理の省略化などを図る。
【００２９】
図１Ａ中、フィルター処理２（符号Ｓ５）は、出現頻度の高い配列領域に対するフィルター処理である。出現頻度の高い配列領域は特異的な配列ではないため、プローブ核酸に用いる配列として適さない。そこで、フィルター処理工程で、出現頻度の高い配列領域を選択範囲から除外することにより、探索処理の省略化などを図る。
【００３０】
モチーフ処理（符号Ｓ６）は、選択すべき領域（モチーフ領域）に目印を付ける処理である。例えば、ある疾患群の鋳型の特定、悪性腫瘍などにおける浸潤・亜型の診断などに用いるプローブ核酸を設計する場合、特有の遺伝子変異部位（スプライシング異常部位、挿入・欠失部位など）を含む配列領域を選択する必要がある。そこで、モチーフ処理で、それらの必須の配列領域に目印を付けることにより、必須の配列領域を含む配列を選択できるようにする。
【００３１】
なお、これらの各処理を行うかどうか、及び、それらの処理の行う順序は目的などに応じて任意に設定できる。
【００３２】
次に、フィルター処理（符号Ｓ４、Ｓ５）及びモチーフ処理（符号Ｓ６）により、選択可能と決定された配列領域から、プローブ核酸に用いる配列を選択する（符号Ｓ７〜Ｓ１５）。
【００３３】
プローブ核酸に用いる配列の選択手順を決定し（符号Ｓ８）、その選択手順に基づいて、選択可能と決定された配列領域から、候補配列を一つ取得する（符号Ｓ９）。その候補配列について、融解温度（Ｔｍ）が所定の範囲内にあるかどうかの検査、安定二次構造を形成するものであるかどうかの検査、相同性検索などを行い、それらの条件に適合するものを、プローブ核酸に用いる配列として取得する。一方、候補配列がそれらの条件に適合しなかった場合、符号９の工程に戻って、別の候補配列を取得し、以下同様の処理を行う。以上の手順（符号Ｓ７〜Ｓ１５）をループさせることにより、特定の塩基配列から、プローブ核酸に用いることができる配列を一つ又は複数取得できる。
【００３４】
融解温度の検査ルーチン（符号Ｓ１０）は、取得した候補配列でプローブ核酸を作成した場合に、その融解温度（Ｔｍ）が所定の範囲内にあるかどうかの検査を行う処理工程である。この処理工程により、各プローブ核酸の融解温度を均一にすることができるため、二本鎖核酸解析時などにおいて、網羅的かつ定量的な解析が可能になる。
【００３５】
二次構造の検査ルーチン（符号Ｓ１１）は、候補配列が安定二次構造を形成するものであるかどうかの検査を行う処理工程である。この処理工程により、設計したプローブ核酸の自己ループ形成などを予め排除することができるため、二本鎖核酸解析時などにおける検出精度を高くできる。
【００３６】
相同性検索１（符号Ｓ１２）は、符号Ｓ３の処理工程で取り出した特定の遺伝子の塩基配列の全体と、プローブ核酸の候補配列との相同性を検索する工程である。例えば、プローブ核酸を用いたバイオアッセイなどの際に、その目的の遺伝子の塩基配列の中に、プローブ核酸の配列と相同性を有する部分が複数箇所存在すると、ハイブリダイゼーション検出などの際における精度、定量性が低下する。それに対し、この処理工程で、特定の遺伝子の塩基配列の複数箇所と相同性を有する配列を、プローブ核酸の候補から除外することにより、それらの弊害を除去できる。
【００３７】
相同性検索２（符号Ｓ１３）は、符号Ｓ１の工程で取得した遺伝情報とプローブ核酸の候補配列との相同性を検索する工程である。例えば、その候補配列が、他の遺伝子の塩基配列と相同性を有する場合、それらがハイブリダイズする可能性がある。そこで、この処理工程により、他の遺伝子の塩基配列と相同性を有する配列を、プローブ核酸の候補から除外する。
【００３８】
以上、符号Ｓ３〜Ｓ１６の工程をループさせることにより、遺伝子の塩基配列のそれぞれについて、プローブ核酸に用いることができる配列を、一つ又は複数取得できる。
【００３９】
なお、各工程における演算処理のアルゴニズムなどは、公知のものを用いることができる。
【００４０】
図２は、本発明に係るプローブ核酸設計方法において、採用するバイオアッセイ方法の選択を行う工程を示す図である。
【００４１】
プローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションなどを、インターカレーターを用いて定量的に検出するバイオアッセイ方法として、例えば、（ａ）インターカレーターからの蛍光強度によりハイブリダイゼーション量を取得する方法、（ｂ）二本鎖核酸に対するインターカレーターの相互作用量を取得することによりハイブリダイゼーション量を取得する方法、（ｃ）インターカレート反応の熱力学的測定によりハイブリダイゼーション量を取得する方法、などがある。
【００４２】
そこで、採用するバイオアッセイ方法に適合したプローブ核酸を設計するため、本発明に係るプローブ核酸設計方法では、図２に示す通り、図１中の（i）又は（ii）のいずれかの段階に、採用するバイオアッセイ方法の選択を行う工程を追加する。
【００４３】
図３は、インターカレーターからの蛍光強度によりハイブリダイゼーション量を取得するバイオアッセイ方法に用いるプローブ核酸を設計する場合（図２において（ａ）を選択した場合）における追加フローの例を示す図である。
【００４４】
図２で（ａ）を選択した場合、図３に示すフローを、図１中の（vii）、（viii）、（ix）のいずれかの段階に追加する。
【００４５】
例えば、バイオアッセイ時にインターカレーターとして「ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（米モレキュラー  プローブ社製、以下同じ）」を用いる場合、二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用における蛍光強度は、二本鎖核酸のＧＣ含量が比較的高い部分、及び、ＧＣ対とＡＴ対がランダムに並ぶ部分で高く、ＡＴ含量の比較的高い部分で低い。
【００４６】
そこで、図３に示す通り、それ以前の処理工程で残った候補配列の中から、ＧＣ含量が所定の範囲であり、かつ、ＡＴ部位が所定個数以上連続しないものをプローブ核酸の候補配列として残し、それらの候補配列については、それ以降の処理工程を続行する。一方、それらの条件を満たさなかった場合、その配列をプローブ核酸の配列の候補から除外し、候補配列の取得（図１中の符号Ｓ９）の工程に戻って次の候補配列を取得し、その候補配列について、各処理工程を行う。その他、この処理工程において、配列領域の重み付けを行い、以下の処理工程を続行してもよい。
【００４７】
なお、ＧＣ含量に関する数値（Ｘ１、Ｘ２）、及び、ＡＴ部位が連続する個数（ｍｅｒ数）は、予め取得した、２本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用に関するプロファイルデータに基づいて設定する。
【００４８】
図４は、二本鎖核酸に対するインターカレーターの相互作用量を取得することによりハイブリダイゼーション量を取得する方法に用いるプローブ核酸を設計する場合（図２において（ｂ）を選択した場合）における追加フローの例を示す図である。
【００４９】
図２で（ｂ）を選択した場合、図４に示すフローを、図１中の（vii）、（viii）、（ix）のいずれかの段階に追加する。
【００５０】
例えば、バイオアッセイ時にインターカレーターとして「ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（米モレキュラー  プローブ社製、以下同じ）」を用いる場合、二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用量（結合量）は、二本鎖核酸のＧＣ対が連続する部分では少なく、ＡＴ含量の比較的高い部分、及び、ＧＣ対とＡＴ対がランダムに並ぶ部分で多い。
【００５１】
そこで、図４に示す通り、それ以前の処理工程で残った候補配列の中から、ＡＴ含量が所定の範囲であり、かつＡＴ部位が所定個数以上連続しないものをプローブ核酸の候補配列として残し、それらの候補配列については、それ以降の処理工程を続行する。一方、それらの条件を満たさなかった場合、前記と同様、その配列をプローブ核酸の配列の候補から除外し、候補配列の取得（図１中の符号Ｓ９）の工程に戻って次の候補配列を取得し、その候補配列について、各処理工程を行う。その他、前記と同様、この処理工程において、配列領域の重み付けを行い、以下の処理工程を続行してもよい。
【００５２】
なお、ＡＴ含量に関する数値（Ｘ３、Ｘ４）、及び、ＡＴ部位が連続する個数（ｍｅｒ数）は、前記と同様、予め取得した、２本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用に関するプロファイルデータに基づいて設定する。
【００５３】
図５は、インターカレート反応の熱力学的測定によりハイブリダイゼーション量を取得する方法に用いるプローブ核酸を設計する場合（図２において（ｃ）を選択した場合）における追加フローの例を示す図である。
【００５４】
図２で（ｃ）を選択した場合、図５に示すフローを、図１中の（iii）、（iv）、（v）、（vi）のいずれかの段階に追加する。なお、演算時間、演算処理のアルゴリズムなどの観点から、図５に示すフローを（vi）の段階に追加することが最も好適であり、（v）の段階に追加することが好適である。なお、図５に示すフローを（iii）又は（iv）の段階に追加した場合の演算処理効率などは、ほぼ同等である。
【００５５】
例えば、バイオアッセイ時にインターカレーターとして「ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（米モレキュラー  プローブ社製、以下同じ）」を用いる場合、二本鎖核酸とインターカレーターとの結合定数は、二本鎖核酸中、ＧＣ対を含む副溝、及び、ＡＴ対のみからなる副溝（但し、ポリＡ又はポリＴではない）が含まれる場合に高く、ＡＴ対を含む副溝、及び、ポリＡ又はポリＴ配列部位で低い。
【００５６】
そこで、図５に示す通り、それ以前の処理工程で選択範囲から除外されなかった配列領域のうち、隣接する１０塩基対中におけるＧＣ対の含有個数が２以上であり、かつ、ＧＣ対を含有する１０塩基対の二つの領域が５塩基対以上離れていない領域を、プローブ核酸の候補配列として選択可能な領域とし、それ以降の処理工程を続行する。一方、それらの条件を満たさなかったものは、選択範囲から除外し（マスクし）、それ以降の処理工程を続行する。その他、前記と同様、この処理工程において、配列領域の重み付けを行い、以下の処理工程を続行してもよい。
【００５７】
以上の各工程により、プローブ核酸に用いることができる配列、特に、２本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用を考慮した配列を取得できる。その取得した配列を用いてプローブ核酸を設計する。
【００５８】
＜本発明に係るプローブ核酸、検出表面、ＤＮＡチップなどについて＞
本発明に係るプローブ核酸、検出表面、ＤＮＡチップなどについて、以下説明する。
【００５９】
プローブ核酸は、上述のプローブ核酸設計方法に基づいて、公知方法などにより合成などできる。また、目的、用途などに応じて、合成などしたプローブ核酸に、ビオチン化、リンカー修飾など、所定の処理を施してもよい。なお、リンカーは、所定の鎖長を有し、検出表面とプローブ核酸とを連結するスペーサー分子であり、原則として、連結したプローブ核酸以外の核酸やインターカレーターとは相互作用しない分子である。
【００６０】
それらのプローブ核酸は、所定の検出表面に保持又は固定させることにより、センサーチップ、ＤＮＡチップなどへの適用が可能である。
【００６１】
例えば、ＱＣＭ（水晶発振子マイクロバランス）装置やＳＰＲ（表面プラズモン共鳴バイオセンサ）の検出表面（電極面など）にプローブ核酸を固定などして反応領域に浸した後、標的核酸及びインターカレーターをその反応領域に順次滴下する。これにより、プローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーション、及び、そのハイブリダイゼーションにより形成された二本鎖核酸とインターカレーターの相互作用を、重量変化として検出できる。
【００６２】
また、例えば、多種・多数のプローブ核酸を、固相基板上のそれぞれの検出表面に集積して固定などすることにより、ＤＮＡチップとして用いることができる。
【００６３】
プローブ核酸の検出表面への保持又は固定は、公知の手段を用いることができ、特に限定されない。例えば、検出表面をアビジン処理し、プローブ核酸の一端をビオチン化し、アビジン−ビオチン結合により、プローブ核酸を検出表面に保持又は固定する手段を採用できる。
【００６４】
＜本発明に係るプログラム、情報記憶媒体、システムなどについて＞
本発明に係るプログラム、情報記憶媒体、システムなどについて、以下説明する。
【００６５】
上述のプローブ核酸設計方法は、プログラムとして記述することにより、自動処理化できる。また、例えば、そのプログラムを情報記憶媒体に格納することにより、プローブ核酸設計システムを構築できる。
【００６６】
図６は、本発明に係るプローブ核酸設計システムの例を示す図である。
【００６７】
図６に示すプローブ核酸設計システムは、遺伝子情報のデータベースから取得した遺伝子情報を格納する遺伝子情報記憶部１、入力した設定事項（設計するプローブ核酸の鎖長など）を記憶するプローブ核酸設定事項記憶部１１、その遺伝子情報の中から取り出された特定の遺伝子の塩基配列を記憶する対象遺伝子塩基配列記憶部２１、繰り返し配列に対するフィルター処理を行う繰り返し配列フィルター部２２、出現頻度の高い配列領域に対するフィルター処理を行う出現頻度フィルター部２３、モチーフ処理を行うモチーフ処理部２４、プローブ核酸に用いる配列の選択手順の決定を行う選択手順決定部３１、融解温度の検査ルーチンを行う融解温度条件検査部３２、二次構造の検査ルーチンを行う二次構造条件検査部３３、相同性検索を行う相同性検索処理部３４などを備える。
【００６８】
加えて、本システムは、採用するバイオアッセイ方法の選択を行うバイオアッセイ方法選択部４１、２本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用に関するプロファイルデータに基づいてフィルター処理を行う相互作用条件フィルター部４２、２本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用に関するプロファイルデータに基づいて配列の検査ルーチンを行う相互作用条件検査部４３などを備える構成にしてもよい。これにより、採用するバイオアッセイ方法に適合するプローブ核酸の設計が可能になり、また、２本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用を考慮したプローブ核酸の設計が可能になる。なお、相互作用条件フィルター部４２は、図２中の（ｃ）のフローなどを実行する相互作用条件処理部であり、相互作用条件検査部４３は、図２中の（ａ）又は（ｂ）などのフローを実行する相互作用条件処理部である。
【００６９】
その他、本システムは、各プログラムの実行や装置の制御を行うＣＰＵ（中演算処理装置）５１、演算処理に必要なデータを記憶するＲＡＭ５２、入力装置５３、出力装置５４、インターネットなどを介して外部の公共データベースなどと接続できるようにするモデム５５などを備える構成にする。
【００７０】
なお、本システムは、パーソナルコンピュータ、ワークステーションなどに実装可能である。
【実施例１】
【００７１】
実施例１では、二本鎖核酸の塩基配列とインターカレーターの蛍光強度との関係を検証した。
【００７２】
はじめに、二本鎖核酸の調製を行った。まず、配列番号１から配列番号４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び、その相補鎖のオリゴヌクレオチドをそれぞれ準備した。本実施例では、両オリゴヌクレオチドの合成をつくばオリゴサービス株式会社に受託した。次に、０．１Ｍリン酸バッファー（ＮａＣｌ  ２００ｍＭ含有、ｐＨ７．４）に両オリゴヌクレオチドを各１００ｎＭになるように溶解した。次に、その溶液を９５℃に加熱後０℃に冷却して両ヌクレオチドのアニーリングを行い、二本鎖核酸を調製した。
【００７３】
なお、本実施例では、配列番号１に示す塩基配列を、ポリＡ又はポリＴを含有する配列を想定して設計した。同様に、配列番号２に示す塩基配列を、ＡＴ対を多く含有する配列を想定して、配列番号３に示す塩基配列を、ＧＣ対を多く含有する配列を想定して、配列番号４に示す塩基配列を、ＧＣ対とＡＴ対がランダムに並ぶ配列を想定して、それぞれ設計した。
【００７４】
続いて、その二本鎖核酸の溶液にインターカレーターを最終濃度で１．９６μＭ添加した。本実施例では、インターカレーターとして、「ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（米モレキュラー  プローブス社製、以下同じ）」を用いた。そして、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを添加後、その溶液を２５℃、１０分間、インキュベートした。
【００７５】
続いて、蛍光光度計により蛍光スペクトルを測定した。二本鎖核酸とＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを添加した溶液を装置の試料室に入れ、励起波長を４９７ｎｍに設定し、２５℃条件下で蛍光強度を測定した。
【００７６】
結果を図７に示す。図７は、蛍光光度計によるピーク時の蛍光強度を示すグラフである。
【００７７】
図７中、横軸は用いた二本鎖核酸の配列番号を、縦軸はピーク時の蛍光強度（蛍光強度の最大値）を表す。
【００７８】
図７に示す通り、配列番号２に示す塩基配列を有する二本鎖核酸では、蛍光強度が低かったのに対し、配列番号３及び配列番号４に示す塩基配列を有する二本鎖核酸では、蛍光強度が高かった。この結果は、二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用における蛍光強度が、二本鎖核酸のＧＣ含量が比較的高い部分、及び、ＧＣ対とＡＴ対がランダムに並ぶ部分で高く、ＡＴ含量が比較的高い部分で低いことを示す。
【実施例２】
【００７９】
実施例２では、二本鎖核酸の塩基配列と、二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用との関係を、ＱＣＭ（水晶発振子マイクロバランス）装置を用いて検証した。
【００８０】
本実施例では、ＱＣＭ装置に「ＡｆｆｉｎｉｘＱ（「Ａｆｆｉｎｉｘ」は登録商標、株式会社イニシアム製）」を用いた。この装置に付属するセンサーチップは、Ａｕ電極（直径２．５ｍｍ）と水晶発振子（直径８ｍｍ）とを備える。Ａｕ電極に物質が付着すると、水晶発振子の発振周波数が、物質の付着重量に比例して変化する。従って、発振周波数の変化（ΔＦ）をＱＣＭ装置で測定することにより、Ａｕ電極への物質の付着重量を測定できる。なお、本実施例において、発振周波数１Ｈｚの変化は、０．６２ｎｇ／ｃｍ２の重量変化に相当する。
【００８１】
実験手順の概要を以下に示す。
【００８２】
はじめに、配列番号２から配列番号４に示す塩基配列を有する二本鎖核酸の調製を行った。二本鎖核酸の調製は、実施例１と同様に行った。また、各二本鎖核酸について、付属プロトコルに従い、その一端のビオチン化を行った。
【００８３】
続いて、二本鎖核酸をＡｕ電極基板上に固定した。まず、予め、装置付属プロトコルに従い、センサーチップのＡｕ表面をアビジンで被覆しておいた。アビジンは、和光純薬工業株式会社製のもの（製品名「アビジン」）を用いた。また、装置内の反応槽に、調製した二本鎖核酸のバッファー溶液を入れた。そして、反応槽にセンサーチップを浸し、アビジン−ビオチン結合により、二本鎖核酸をＡｕ電極基板上に結合させ、固定した。
【００８４】
続いて、反応槽をインターカレーター溶液が入ったものに取り替え、その中に、センサーチップを浸し、ＱＣＭ装置により、発振振動数の変動を測定した。インターカレーターには、実施例１と同様、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを用いた。
【００８５】
そして、取得した測定値（発振振動数の変動）から、二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用量、及び、その結合定数Ｋａを取得した。
【００８６】
結果を表１に示す。
【表１】
2007295872.tif 000003
【００８７】
表１に示す通り、配列番号２に示す塩基配列を有する二本鎖核酸では、二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用量及びその結合定数が大きかったのに対し、配列番号３及び配列番号４に示す塩基配列を有する二本鎖核酸では、相互作用量及びその結合定数が小さかった。これらの結果は、二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用量及び結合定数が、二本鎖核酸のＡＴ含量が比較的高い部分で大きく、ＧＣ含量が比較的高い部分、及び、ＧＣ対とＡＴ対がランダムに並ぶ部分で小さいことを示す。
【実施例３】
【００８８】
実施例３では、二本鎖核酸の塩基配列と、二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用との関係を、ＩＴＣ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ；等温適定カロリメトリー、以下同じ）により、熱力学的に検証した。
【００８９】
物質間の反応などの際には、熱の発生又は吸収がおこる。その熱量を測定することにより、物質間の反応の結合定数、結合比、エンタルピー変化、エントロピー変化などに関する知見を得られる。そこで、ＩＴＣにより、二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用に関する熱学的プロファイルを取得し、その内容を検証した。
【００９０】
本実施例では、ＩＴＣ装置には「ＶＰ−ＩＴＣ（米ＭｉｃｒｏＣａｌ社製）」を、同装置の制御及びデータ解析には「Ｏｒｉｇｉｎ  ｖｅｒ７．０（米ＭｉｃｒｏＣａｌ社製）」を用いた。
【００９１】
手順の概要を以下に示す。
【００９２】
はじめに、配列番号１から配列番号４に示す塩基配列を有する二本鎖核酸の調製を行った。二本鎖核酸の調製は、実施例１と同様に行った。
【００９３】
次に、０．１Ｍリン酸バッファー（ＮａＣｌ  ２００ｍＭ含有、ｐＨ７．４）に二本鎖核酸９μＭを入れ、その中にＤＭＳＯを濃度が８．７５％になるように混合し、その溶液を、ＩＴＣ装置のセルに入れた。
【００９４】
次に、０．１Ｍリン酸バッファー（ＮａＣｌ  ２００ｍＭ含有、ｐＨ７．４）にインターカレーターを１．７５ｍＭになるように溶解した後、シリンジを用いて、そのインターカレーター溶液を６分ごとに６μＬずつ、ＩＴＣ装置のセルに滴下した。インターカレーターには、実施例１などと同様、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを用いた。
【００９５】
そして、インターカレーター溶液を滴下しながら、ＩＴＣ装置を用いて熱量（反応熱）の変化を測定した。本実施例では、ＩＴＣによる測定を、２５℃、３００ｒｐｍの撹拌条件下で実施した。
【００９６】
また、対照として、希釈熱の測定を行った。０．１Ｍリン酸バッファー（ＮａＣｌ  ２００ｍＭ含有、ｐＨ７．４）にＤＭＳＯを濃度が８．７５％になるように混合し、その対照溶液を、インターカレーター溶液の代わりに、ＩＴＣ装置のセルに滴下した。そして、インターカレーター溶液を滴下した場合における熱量（反応熱）から、その対照溶液を滴下した場合における熱量（希釈熱）を除した値をデータ解析などに用いた。
【００９７】
そして、ＩＴＣにより得られた測定結果について、ｔｗｏ  ｓｉｔｅ  ｍｏｄｅｌ（２相モデル）を用いて解析を行い、熱力学的プロファイルを取得した。
【００９８】
結果を表２及び図８（図８Ａ〜図８Ｄ）に示す。
【表２】
2007295872.tif 000004
【００９９】
表２中、「Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｅｐ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」及び「Ｓｅｃｏｎｄ  Ｓｔｅｐ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」は、それぞれ、２相モデルにおける第一反応及び第二反応の解析結果を表す。表中、「ｎ」は二本鎖核酸に対する各相のインターカレーターの結合数を、「Ｋａ（×１０６Ｍ）」は二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用における各相の結合定数を、「ΔＨ（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）」は各相のエンタルピー変化を、「ＴΔＳ（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）」はエントロピー変化を、「ΔＧ（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）」は各相の自由エネルギー変化を、それぞれ表す。
【０１００】
図８Ａ〜図８Ｄは、ＩＴＣによる測定結果を表すグラフである。図８Ａは配列番号１に示す塩基配列を有する二本鎖核酸を用いた場合の測定結果を、図８Ｂは配列番号２に示す塩基配列を有する二本鎖核酸を用いた場合の測定結果を、図８Ｃは配列番号３に示す塩基配列を有する二本鎖核酸を用いた場合の測定結果を、図８Ｄは配列番号４に示す塩基配列を有する二本鎖核酸を用いた場合の測定結果を、それぞれ示す。
【０１０１】
図８Ａ〜図８Ｄの各図において、上段のグラフは、インターカレーター溶液を滴下した場合における熱量（反応熱）の変化を表す。グラフの横軸はインターカレーター溶液を滴下した時間（ｍｉｎ）を、縦軸は１秒間の熱量（反応熱）の変化（μｃａｌ／ｓｅｃ）を、それぞれ表す。時間経過とともに値が減少した場合が吸熱反応、値が増加した場合が発熱反応である。
【０１０２】
図８Ａ〜図８Ｄの各図において、下段のグラフは、インターカレーター溶液を滴下した場合における熱量（反応熱）から、その対照溶液を滴下した場合における熱量（希釈熱）を除した値、即ち、二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用における熱量を表す。グラフの横軸は滴下した総インターカレーター量（Ｍｏｌａｒ  Ｒａｔｉｏ；試料室中における二本鎖核酸（定量）とインターカレーターのモル比）を、縦軸は滴下したインターカレーター１ｍｏｌにおける熱量（ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ  ｏｆ  ｉｎｊｅｃｔａｎｔ）を、それぞれ表す。
【０１０３】
表２及び図８（図８Ａ〜図８Ｄ）に示す通り、配列番号２に示す塩基配列を有する二本鎖核酸では、二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用が二段階の反応である、結合定数が高い、などの特徴があった。一方、配列番号３及び配列番号４に示す塩基配列を有する二本鎖核酸では、二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用が一段階の反応である、結合定数が低い、などの特徴があった。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明により、例えば、プローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションをインターカレーターで検出するバイオアッセイ系などにおいて、その検出精度及び定量性を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１Ａ】プローブ核酸設計の一般的な処理工程の例を示すフロー図。
【図１Ｂ】プローブ核酸設計の一般的な処理工程の例を示すフロー図（続き）。
【図２】本発明に係るプローブ核酸設計方法において、採用するバイオアッセイ方法の選択を行う工程を示す図。
【図３】インターカレーターからの蛍光強度によりハイブリダイゼーション量を取得するバイオアッセイ方法に用いるプローブ核酸を設計する場合（図２において（ａ）を選択した場合）における追加フローの例を示す図。
【図４】二本鎖核酸に対するインターカレーターの相互作用量を取得することによりハイブリダイゼーション量を取得する方法に用いるプローブ核酸を設計する場合（図２において（ｂ）を選択した場合）における追加フローの例を示す図。
【図５】インターカレート反応の熱力学的測定によりハイブリダイゼーション量を取得する方法に用いるプローブ核酸を設計する場合（図２において（ｃ）を選択した場合）における追加フローの例を示す図。
【図６】本発明に係るプローブ核酸設計システムの例を示す図。
【図７】実施例１において、蛍光光度計によるピーク時の蛍光強度を示すグラフ。
【図８Ａ】実施例３において、配列番号１に示す塩基配列を有する二本鎖核酸を用いた場合のＩＴＣによる測定結果を表すグラフ。
【図８Ｂ】実施例３において、配列番号２に示す塩基配列を有する二本鎖核酸を用いた場合のＩＴＣによる測定結果を表すグラフ。
【図８Ｃ】実施例３において、配列番号３に示す塩基配列を有する二本鎖核酸を用いた場合のＩＴＣによる測定結果を表すグラフ。
【図８Ｄ】実施例３において、配列番号４に示す塩基配列を有する二本鎖核酸を用いた場合のＩＴＣによる測定結果を表すグラフ。
【図１Ａ】
2007295872.tif 000005
【図１Ｂ】
2007295872.tif 000006
【図２】
2007295872.tif 000007
【図３】
2007295872.tif 000008
【図４】
2007295872.tif 000009
【図５】
2007295872.tif 000010
【図６】
2007295872.tif 000011
【図７】
2007295872.tif 000012
【図８Ａ】
2007295872.tif 000013
【図８Ｂ】
2007295872.tif 000014
【図８Ｃ】
2007295872.tif 000015
【図８Ｄ】
2007295872.tif 000016
【配列表】
2007295872000001.app