(57)【要約】【課題】画像品質が改良され、システム関連の偽信号が回避される走査型顕微鏡を作り出し、且つ、そのような走査型顕微鏡を用いる方法を作り出す。【解決手段】走査型顕微鏡（１）とその走査方法とが開示される。走査型顕微鏡（１）は、照明光ビーム経路に配置されるアウトカップリング要素（６０）を有し、当該アウトカップリング要素は、照明光ビーム（３）の少なくとも一部分を外に連結し、照明光ビームを発生する光源のパルス周波数を検出する検出器（６１）にそれを向ける。前記パルス周波数は、走査器のための基礎クロック周波数として利用される。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
パルス照明光ビーム（３）を放射する光源と、照明光ビーム（３）を顕微鏡光学システム（１３）を通り、被検物（１５）上を又はそれを透過して案内する走査機器（７）と、被検物（１５）から発せられる光を受け取り、検出信号を発生する検出器ユニット（１９）と、を有する走査型顕微鏡において、
照明光ビーム経路（３）にアウトカップリング要素（６０）が配置され、当該アウトカップリング要素は、照明光ビーム（３）の少なくとも一部分を外に連結させ、それを検出器（６１）に向け、当該検出器（６１）は、光源のパルスを検出し、走査機器（７）にパルス信号を送る走査型顕微鏡。
【請求項２】
検出器ユニット（１９）からの信号のためのアナログ／デジタル変換器（６５）をも含むデジタル回路（３０）が、検出器ユニット（１９）の後に配置される、請求項１に記載の走査型顕微鏡。
【請求項３】
走査機器（７）に光源の確認されたパルス鎖をクロック信号として送り、且つ、そこからベースラインクロック周期を導き出すデジタル回路（６８）が、検出器（６１）の後に配置される、請求項１に記載の走査型顕微鏡。
【請求項４】
光源がレーザーである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
【請求項５】
走査機器（７）のクロック周波数をレーザーの可能なパルス周波数範囲に適合させる周波数分割器（６３）が、検出器の後に設けられる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
【請求項６】
レーザーのクロック信号をベースラインクロック周期として選択することができ、及び／又は、レーザーのクロック信号の欠如を自動的に検出することができる装置（６６）を、電子制御システムは含むので、運転が走査機器（７）の内部クロック源（６７）に切り替わることができる、請求項５に記載の走査型顕微鏡。
【請求項７】
遅延回路（６２）が、検出器（６１）と周波数分割器（６３）との間に設けられる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
【請求項８】
遅延回路（６２）が、走査機器（７）に供給されるクロック周期の位相に影響するので、レーザーによって放射される光パルスを完全に用いることができる、請求項７に記載の走査型顕微鏡。
【請求項９】
光源のパルスを確認するための検出器が、感光要素である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の走査柄顕微鏡。
【請求項１０】
デジタル回路（６８）が、可調整スイッチング閾値を有するコンパレータを含む、請求項３〜９のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
【請求項１１】
光源のパルス周波数が、８０〜９０ＭＨｚの範囲に置かれる、請求項１０に記載の走査型顕微鏡。
【請求項１２】
走査機器（７）が、４０〜４５ＭＨｚの範囲のクロック周波数を有する、請求項１０に記載の走査型顕微鏡。
【請求項１３】
パルス照明光ビーム（３）を放射する光源と、照明光ビーム（３）を顕微鏡光学システム（１３）を通り、被検物（１５）上を又はそれを透過して案内する走査機器（７）と、被検物（１５）から発せられる光を受け取り、且つ、検出信号を発生する検出器ユニット（１９）と、を含む走査型顕微鏡を用いる方法において、
アウトカップリング要素で、照明光ビーム（３）の少なくとも一部分を検出器の方に向けるステップと、
光源のパルスを検出するステップと、
パルス信号を走査機器（７）に送るステップと、
によって特徴付けられる方法。
【請求項１４】
走査機器（７）に光源の確認されたパルス鎖をクロック信号として送り、且つ、そこからベースラインクロック周期を導き出すデジタル回路（６８）が、検出器（６１）の後に配置される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
光源がレーザーである、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
走査機器（７）のクロック周波数をレーザーの可能なパルス周波数範囲に適合させる周波数分割器が、検出器の後に設けられる、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
レーザーのクロック信号をベースラインクロック周期として選択することができ、及び／又は、レーザーのクロック信号の欠如を自動的に検出することができる装置を、電子制御システムは含むので、運転が走査機器（７）の内部クロック源に切り替わることができる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
遅延回路が、検出器と周波数分割器との間に設けられる、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
遅延回路が、走査機器（７）に供給されるクロック周期の位相に影響するので、レーザーによって放射される光パルスが完全に利用される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
光源のパルスが、感光要素の助けを借りて確認される、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
光源のパルス周波数が、８０〜９０ＭＨｚの範囲に置かれる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
走査機器（７）が、４０〜４５ＭＨｚの範囲のクロック周波数を有する、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、走査型顕微鏡に関する。本発明は、特に、パルス照明光ビーム（pulsed illuminating light beam）を放射する光源と、走査光学システム及び顕微鏡光学システムを通り、被検物上を又はそれを透過して照明光ビームを案内する走査機器と、被検物から発する光を受け取り、検出信号を発生する検出器ユニットと、を有する走査型顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
【特許文献１】DE10126281A1
【特許文献２】DE19702752A1
【特許文献３】EP0845693A1
【０００３】
検査されるべき試料は、反照検流計の助けを借りてレーザーによってポイント毎に走査される。試料から放射される発光又は蛍光は、光パワーレベルに比例する電子信号を出力する検出器に運ばれる。
【０００４】
多くの適用のために、例えば多光子励起の場合において、短パルスの形態で光を送るレーザーを光源として用いる必要がある。これらの構成のために、これらレーザーのいくつか、例えばダイオードレーザーは、外部のタイミング源に同調化できる。例えば、ファイバレーザー又はＴｉＳａレーザーのような他のレーザーは、同調化できない。
【０００５】
走査機器とパルス光源とが、互いとは無関係に運転されることには問題がある。
【０００６】
さらに、本発明は、走査型顕微鏡を用いた走査方法に関する。
【０００７】
ドイツ未審査特許出願の特許文献１は、ポイント毎に試料を走査するための方法及び装置を開示する。本方法は、各走査位置のための設定値信号を発生するステップと、走査機器に設置値信号を転送するステップとによって特徴付けられる。更なるステップにおいて、各走査位置のために、実際の信号が走査機器の位置から確認される。各走査位置のための少なくとも一つの検出信号の検出、実際の信号及び／又は設定値信号と、検出信号とから表示信号及び画像点位置の計算、及び、画像点位置に対する表示信号の割付け、もまた実施される。
【０００８】
ドイツ未審査特許出願の特許文献２は、走査器のためのトリガシステム、特に、振動鏡を駆動するための振動モータを有するレーザー走査型顕微鏡のためのトリガシステムに関する。当該振動鏡は、直線的に振動する光束の偏差のために用いられる。トリガユニットは、トリガ周波数、周波数曲線及び振幅に関して調節可能な励起電流を振動モータに供給するために設けられる。トリガユニットに接続される関数発生器と、振動鏡の偏向位置に関する一連のデータを得るための測定値変換器とで、トリガが達成される。測定値変換器は、励起電流用の補正値を確認するための論理演算装置を介して関数発生器に連結される。それによって、論理演算装置の助けを借りて補正値を確認することが、振動鏡の実際の偏向位置に関する、測定値変換器から利用可能にされた情報の評価で可能になる。偏差が最小化されるか又は完全に除去されるように、前記値を、今度は、関数発生器によって出力されるトリガ周波数に影響するために用いることができる。
【０００９】
ヨーロッパ特許出願の特許文献３は、共焦点顕微鏡と前記顕微鏡を用いて三次元画像を発生させるための方法とを開示する。検査されるべき試料は、二次元で走査される。三次元画像を発生させるために、試料台と被検物とは、互いに対して動かされる。
【００１０】
特に多光子励起との関連で画像獲得のために重要である同調化できないレーザーのパルス周波数は、好ましくは、８０ＭＨｚ〜９０ＭＨｚまでの範囲である。走査システムの走査周波数は、４０ＭＨｚ〜４５ＭＨｚまでの範囲におくことができる。
【００１１】
しかしながら、レーザーのパルス周波数は、１００ＭＨｚ以上にすることもできるし、走査システムの走査周波数は、４０ＭＨｚを大きく下回ることもできる。アナログ／デジタル変換器までの検出器回路の入力回路を見ると、回路はローパス挙動（low-pass behavior）を呈する。その際、時定数ＴＬを有する光パルスが検出されるときに、信号は、ローパス端部で最初上昇し、その後、再び降下する（図２ａ参照）。同一のパルス形状及びパルス高さにも関わらず、アナログ／デジタル変換器が、その入力で時定数Ｔｉを備えた電圧値を変換する時間乃至時点（point in time）次第で、変換器は、異なる測定結果を受け取る。これらの誤差は、試料の実際の画像輝度信号に重ねられ、画像において、縞模様としてそれら自身をはっきりと示す（図３参照）。これらの偽信号乃至不自然な結果（artifacts）は、特定の規則性を有するので、それらは、検査されている構造の輝度においてジッタとして観測者に特に明らかである。
【００１２】
加えて、試料又は被検物のストロボスコープ状照明のために、試料における特定位置での輝度データだけが、検出器に送られる。アナログ／デジタル変換器のサンプリングの瞬間に対するこの観測の瞬間の変動は、走査位置が二つのアナログ／デジタル変換器サンプリング事象間で動く領域において、構造の明らかな移行（migration）を引き起こす。したがって、観測者は、検査される構造の位置におけるジッタに気が付く。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、画像品質が改良される走査型顕微鏡を作り出すことであり、システム関連の偽信号が回避される。
【００１４】
本目的は、請求項１の特徴を含む走査型顕微鏡によって達成される。
【００１５】
本発明の目的は、画像品質が改良され、システム関連の偽信号が回避される走査型顕微鏡を用いる方法を作り出すことである。
【００１６】
本目的は、請求項１３の特徴を含む方法によって達成される。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明にしたがって、照明光ビームの少なくとも一部分を外へ連結し、それを検出器に向けるアウトカップリング要素（outcoupling element）が、照明光ビーム経路に配置され、照明光ビームを発生する光源のパルスは、評価電子機器（evaluation electronics）によって確認される。
【００１８】
デジタルユニットが、検出器ユニットの後に配置され、当該デジタルユニットは、可調整スイッチング閾値（adjustable switching threshold）を有するコンパレータの助けを借りて、光源の検出パルス信号を調整し、基準クロック周期として走査機器にそれを送る。
【００１９】
本発明の更なる実施形態において、周波数分割器が、検出器と電気制御システムとの間に設けられ、当該周波数分割器は、レーザーのパルス周波数を走査機器の可能な入力周波数範囲に適合させる。走査機器のクロック周波数は、これに関連して、光源のパルス周波数に適合可能となる。
【００２０】
本発明の有利な実施形態が、従属請求項から推測されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明のサブジェクトマターが、図面に概略的に示され、且つ、図に関連して以下に記述される。
【００２２】
図１は、本発明にしたがう装置を実現することができる共焦点走査型顕微鏡１の概略構成を示す。走査型顕微鏡１は、様々な実施形態で構成することが可能な検出器１９を含む。少なくとも一つの照明システム２からくる照明光ビーム３は、ビームスプリッタ又は適した偏向手段５によって走査機器７に向けられる。多くの試験のために、照明システム２における光源としてレーザーを用いることが必要である。レーザーは、好ましくは、短パルスの形態で光を放射することができる。照明光ビーム３が偏向手段５に衝突する前に、それは照明ピンホール６を通過する。走査機器７は、少なくとも一つの走査鏡９を含み、当該走査鏡は、照明光ビーム３を走査光学システム１２と顕微鏡光学システム１３を通って、被検物１５上を又はそれを透過して案内する。走査モータ９をモータ（図示せず）を介して駆動させることが可能である。トーションバー乃至ねじり棒を付加的に設けることが可能であり、当該トーションバーで、走査鏡９を共振走査鏡９として駆動可能でもある。非透明な被検物１５の場合、照明光ビーム３は被検物表面上を案内される。生物学上の被検物（標本）１５又は透明な被検物では、照明光ビーム３を被検物１５を透過して案内することもできる。これらの目的のために、非反射の被検物は、適切な染料を適用されて準備される（確立された既存技術なので示さず）。被検物１５に与えられる染料は、照明光ビーム３により、例えば、蛍光発光して励起させられ、それらに特有のスペクトルの特性領域で光を発する。被検物１５から発せられるこの発光又は蛍光は、検出光ビーム１７を規定する。検出光ビームは、顕微鏡光学システム１３と走査光学システム１２とを通り、走査モジュール７を介して偏向手段５まで進み、偏向手段を横切って、検出ピンホール１８を介して検出器ユニット１９上へ進む。検出器ユニット１９は、少なくとも一つの光電子増倍管からなることができる。同様に、検出器ユニット１９が光電子増倍管アレイ、ＣＣＤチップ、ＥＭＣＣＤチップ、又は、ＡＰＤアレイからなることが考えられる。被検物１５から発せられるか又は被検物１５によって規定される検出光ビーム１７は、図１で点線として示される。被検物１５から発せられる光の出力レベルに比例する電気検出信号は、検出器ユニット１９で発生させられる。上記で既述のように、単に一つの波長だけではない光が被検物１５から発せられるので、検出器ユニット１９の前に分散要素２０を設けることが有用である。分散要素２０は、検出光ビームをスペクトル的に分割するので、検出光の個々の波長は、空間的に、スペクトル的に分離される。検出光ビーム１７を広げ、それを平行にさせるレンズ２１が分散要素２０の前に置かれる。検出光ビーム１７のスペクトル的に分離されたビーム２４、２５を検出器ユニット１９上に集束するさらなるレンズ２２が、分散要素２０の後に置かれる。スペクトル的に分離されビーム２４、２５は、波長に関して異なり、かくして検出器要素（例えば光電子増倍管）に衝突するか、又は、検出器１９がチップとして構成される場合は、チップの異なった領域に衝突する。検出器ユニット１９によって供給された信号は、デジタル回路３０に運ばれ、そこで検出器信号の収集が行われる。さらに、デジタル回路３０を、例えば画像データを表示することができるディスプレイ４８に付随するコンピューター４２に接続することができる。
【００２３】
図５に示されるように、照明システム２のレーザーパルスは、感光性要素、例えば光ダイオードの助けを借りて抜き取られ、必要な場合には、このパルス鎖（pulse chain）は、周波数分割器を用いて、走査器の可能な入力周波数範囲に適合させられる。走査器は、このクロック信号をベースラインクロック周期として選択することを可能にする装置を保有する。外部クロック信号が全く無い場合は、この事実を検出可能でなければならないので、運転は、スキャナー内部のクロック源に切り替わることができる。
【００２４】
レーザーから発せられる光パルスの最適利用を可能にするために、走査器に供給されるクロック周期の位相に影響するための装置もまた設けられる。
【００２５】
図２ａは、照明システム２のパルス運転との関連における信号サンプリングを図によって示す。検出ユニット１９のアナログ／デジタル信号変換のためのシステムは、ローパス挙動を呈する。時間は横座標４０にプロットされ、測定信号は縦座標４１にプロットされる。両矢印ｓは、光パルスの信号高さを示す。個々の光パルスは、時定数ＴＬで検出される。回路のローパス挙動のために、信号４２は、最初、上昇し、その後、再び減少する。検出ユニット１９からの信号の集積は、デジタル回路３０で実行される。デジタル回路３０は、検出ユニット１９の後に置かれ（図１参照）、当該デジタル回路は、定期的にピクセルＰｘ，ｙ内部に検出信号を応答させ、例えば、そこから平均を計算する。
【００２６】
図２ｂは、デジタル回路３０の構成を示す。デジタル回路３０は、ピクセルPｘ，ｙ（図３参照）範囲内で多重周期検出信号（multiple periodic detected signals）を合計する加算要素３１を含む。さらに、デジタル回路３０は、それぞれのピクセルPｘ，ｙ内で合計された多数の検出信号によって、多重検出信号の合計を分割する分割要素３２を含む。発明の更なる実施形態において、倍増要素３３が、デジタル回路３０内で加算要素３１と分割器３２との前に配置される。デジタル逓倍（加算要素３１と次の分割要素３２との前で）を用いて、信号増幅を達成することもでき、それによって、数値精度が増加する。デジタル集積化の結果として、検出ユニット１９の出力値、故に画像輝度は、走査速度と走査形式とから独立している。さらに、平均化は、出力データにおけるノイズを減少し、デジタル化誤差（異常値）をも最小限にする。例えば、アナログ構成部品のパラメータドリフトのような干渉要素（温度、エージング、構成部品の許容誤差に起因する）は、デジタル化の結果として取り除かれるか又は減少させられる。
【００２７】
Ｔｉは、時間又は時定数を示し、それで、アナログ／デジタル変換器は、検出ユニット１９からの電圧値をその入力において変換する。図２ａに示されるように、同じパルス形状且つパルス高さにもかかわらず、毎回、異なった測定結果Ｍ１又はＭ２が得られる。
【００２８】
これらの誤差は、試料又は被検物１５の実際の画像輝度信号に重ね合わされ、ディスプレイ４８上に現れる画像において縞模様のパターンとしてそれら自身が現れる。図３は、誤差信号の重ね合わせの結果として、移行することも可能であるパターン１５１、１５２の生成を視覚的に示す。デジタル回路３０のローパス挙動のために、時定数ＴＬを備えたレーザーパルスの検出の後に結果として生じるのは、間隔Ｔｉ内での異なるサンプリング瞬間に起因するデジタル化された結果の変動幅ｓである（図２参照）。
【００２９】
これらの偽信号は、特定の規則性を有するため、それらは、検査されている構造の輝度におけるジッターとして観測者には特に明らかである。
【００３０】
加えて、試料１５のストロボスコープ状の照明のために、試料１５における特定の位置での輝度データだけが、検出器１９に送られる。アナログ／デジタル変換器のサンプリング瞬間に対するこの観測瞬間の変動は、走査された位置が二つのアナログ／デジタル変換器サンプリング事象の間に動く領域における構造の明らかな移行を生じさせる。言い換えれば、対応するジッターが、検査されている構造の位置においてまた生じる。
【００３１】
図４は、試料又は被検物１５の発光特性の変化で、位置に関する測定誤差の生成を視覚的に示す。時間は横軸５０にプロットされ、測定信号は縦軸５１にプロットされる。測定信号５２は、例えば、輝度ジャンプ（brightness jump）（明るさから暗さまで）を示し、当該輝度ジャンプを位置に応じて試料１５の発光挙動によって引き起こすことができる。レーザーパルスが間隔ＴＬでいつ生じるか次第で、強い強度又は弱い強度が、アナログ／デジタル変換器６５のサンプリング間隔Ｔｉで検出される。
【００３２】
図５は、被検物１５を走査する走査機器７を含む走査型顕微鏡１を概略的に示し、当該走査型顕微鏡で、パルス周波数とサンプリング周波数との間の同調化が達成される。走査機器７は、レーザーのクロック周期から送られる基本クロック周期を有する。照明システム２若しくは用いられるレーザーの周波数と、走査機器７の周波数とは、こうして、同調化される。
【００３３】
この目的のために、照明光ビーム３内にアウトカップリング要素６０が配置され、当該要素は、少なくとも照明光ビーム３の一部分を外へ連結し、検出器６１へそれを向ける。照明光ビーム３を発生する光源のパルス周波数は、検出器６１を介して確認される。アウトカップリング要素６０は、例えば、ビームスプリッタとすることができ、検出器６１は、感光性要素、例えば光ダイオードとすることができる。デジタル回路３０は、検出ユニット１９の後に配置される。デジタル回路３０もまた、検出ユニット１９の信号のためのアナログ／デジタル変換器６５を含む。
【００３４】
加えて、検出器６１によって確認される、照明システム２又は用いられるレーザーのパルス周波数は、周波数分割器６３によって走査機器７の可能な入力周波数範囲に適合させることができる。確認された光源のパルス鎖をクロック信号として走査機器７に送り、そこからベースラインクロック周期を導き出すデジタル回路６８は、検出器６１の後に配置される。電子制御システム６４は、レーザーのクロック信号をベースラインクロック周期として選択することができる装置６６を含む。レーザークロック信号が全く無い場合は、この事実を装置６６によって自動的に検出することができるので、運転は、走査機器７の内部クロック源６７に切り替わる。
【００３５】
検出器６１と周波数分割器６３との間に、遅延回路６２をさらに設けることができる。遅延回路６２は、走査機器７に供給されるクロック周期の位相に影響するので、レーザーによって放射される光パルスが完全に使用可能となる。
【００３６】
走査機器７のための電子制御システム６４は、検出要素３０の検出信号と検出器６１の測定信号との両方を受け取る。二つの信号は、デジタル回路６８と電子制御システム６４との助けを借りて同調化される。これは、コンピューター４２を介して制御することができる。
【００３７】
照明システム２のパルスを確認するための検出器６１を感光性要素、例えば光ダイオードとすることができる。照明システム２のパルス周波数は、走査機器７のクロック周波数のおよそ２倍であるのが好ましい。
【００３８】
レーザーのパルス周波数は、８０ＭＨｚから９０ＭＨｚの範囲にあるのが好ましいが、実質的により高くすることもできる。走査機器７の走査周波数は、４０ＭＨｚから４５ＭＨｚの範囲におくことができ、標準的な周波数は、４０ＭＨｚである。しかしながら、この周波数は、実質的により低くすることもできる。アナログ／デジタル変換器６５までのデジタル回路３０の入力回路を見ると、回路は、ローパス挙動を呈する。走査型顕微鏡１における走査機器７の同調化は、付加された電子制御システムで達成される。試料又は被検物１５は、反照検流計を含む走査機器７を介してパルスレーザービーム又は照明光ビーム３で走査される。試料１５から発せられる光は、検出ユニット１９の助けを借りてピクセル毎に感知される。レーザーのパルスは、機器によって感知され、測定信号は、基準周波数として走査機器７に送られる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】被検物を走査する走査機器を含む走査型顕微鏡を概略的に示す。
【図２】ａ）は、検出器（１９）でのアナログ／デジタル変換システムが、ローパス挙動を呈する場合において、パルス運転との関連における信号サンプリングを視覚的に示し、ｂ）は、デジタル回路の構成を示す。
【図３】誤差信号の重ね合わせの結果として、（移行することもできる）パターンの生成を視覚的に示す。
【図４】試料又は被検物１５の発光特性の変化で、位置に関する測定誤差の生成を視覚的に示す。
【図５】被検物を走査する走査機器を含む走査型顕微鏡であって、パルス周波数とサンプリング周波数との間の同調化が達成される走査型顕微鏡を概略的に示す。
【符号の説明】
【００４０】
３    照明光ビーム
７    走査機器
１３  顕微鏡光学系
１５  被検物
１９  検出器ユニット
３０  デジタル回路
６０  アウトカップリング要素
６１  検出器
６２  遅延回路
６３  周波数分割器
６５  アナログ／デジタル変換器
６６  装置
６７  内部クロック源
６８  デジタル回路
【図１】
2007102235.tif 000003
【図２】
2007102235.tif 000004
【図４】
2007102235.tif 000005
【図５】
2007102235.tif 000006
【図３】
2007102235.tif 000007
【外国語明細書】
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2007102235000002.pdf
2007102235000003.pdf
2007102235000004.pdf