(57)【要約】【課題】本発明は，ほ乳動物，特にヒトにおける骨実質の喪失を阻止するためおよび／または骨形成を刺激するための方法および組成物を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、骨の疾患を患っている個人における骨実質を増加したりまたは骨損失を予防するための処置であり、その個体に対して骨形成を維持しまた刺激するように治療的に有効な量のモルフォゲンを投与する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の代謝性骨疾患を治療するために全身性に投与される薬剤の製造におけるモルフォゲンの使用であって、該モルフォゲンが、
(a) 配列番号5の残基43〜139に対して少なくとも70％のホモロジーを示すアミノ酸配列；
(b) 配列番号5の残基43〜139に対して60％超の同一性を示すアミノ酸配列；及び
(c) 配列番号29に記載のOPXのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ生体内での骨検査において軟骨形成誘発活性を有する、上記使用。
【請求項２】
代謝性骨疾患が骨粗しょう症または骨軟化症を含む、請求項1の使用。
【請求項３】
骨粗しょう症が閉経後または老人性の骨粗しょう症である、請求項2の使用。
【請求項４】
代謝性骨疾患が骨吸収または骨形成の不均衡に起因する、請求項1の使用。
【請求項５】
代謝性骨疾患がカルシウムまたはリン酸塩の代謝の不均衡に起因する、請求項1の使用。
【請求項６】
代謝性骨疾患が個体におけるビタミンＤの不均衡に起因する、請求項1の使用。
【請求項７】
代謝性骨疾患が栄養性またはホルモン性に誘発される、請求項1の使用。
【請求項８】
モルフォゲンが、配列番号5の残基43〜139に対して少なくとも80％のホモロジーを示すアミノ酸配列を含む、請求項1の使用。
【請求項９】
モルフォゲンが、配列番号5の残基43〜139に対して65％超の同一性を示すアミノ酸配列を含む、請求項1の使用。
【請求項１０】
モルフォゲンが、配列番号5の残基43〜139に記載のアミノ酸配列、その対立遺伝子または種変異遺伝子のアミノ酸配列を含む、請求項1の使用。
【請求項１１】
モルフォゲンが、配列番号1，2，3，4，30または31に記載の一般配列1，2，3，4，5または6のアミノ酸配列を含む、請求項1の使用。
【請求項１２】
モルフォゲンが、配列番号29に記載のOPXのアミノ酸配列を含む、請求項1の使用。
【請求項１３】
哺乳動物が閉経後の雌である、請求項1の使用。
【請求項１４】
哺乳動物が透析を受けている、請求項1の使用。
【請求項１５】
薬剤が経口または非経口投与用の剤型である、請求項1の使用。
【請求項１６】
モルフォゲンの溶解度を高めることができる分子と会合してモルフォゲンを個体に投与する、請求項1の使用。
【請求項１７】
前記分子がカゼイン、またはモルフォゲンのプロドメインの一部もしくは全部を含む、請求項16の使用。
【請求項１８】
前記プロドメインが、配列番号17の残基30〜292に記載のアミノ酸配列の一部もしくは全部を含む、請求項17の使用。
【請求項１９】
モルフォゲンを標的の骨組織に配達することができる分子と会合してモルフォゲンを個体に投与する、請求項1の使用。
【請求項２０】
前記標的化分子が、テトラサイクリン、ジリン酸塩、または骨組織細胞の表面上の分子に特異的に結合する抗体を含む、請求項19の使用。
【請求項２１】
薬剤が、ビタミンD3、カルシトニン、プロスタグランジン、副甲状腺ホルモン、デキサメタゾン、エストロゲン、またはインスリン様成長因子(IGF)を含む、請求項1の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，ほ乳動物における骨実質を増加するおよび／または骨実質の喪失を防止する手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
成人は一生に亘って，骨が骨形成と骨吸収（骨転移）との相互作用サイクルを介して再生され続けている。骨吸収は，概して急激に行われ，骨再生部位において単核食細胞の前駆体細胞によって形成された破骨細胞（骨吸収細胞）が介在している。この過程は，次いで，喪失した骨に取って替わって骨を徐々に形成する造骨細胞（骨形成細胞）の出現と継続されていく。再生過程に関与する種々の細胞型の活性は，相互に作用している全身性要因（例えば，ホルモン，リンホカイン，成長因子，ビタミン類）や局所性要因（例えば，サイトカイン，接着分子，リンホカイン，成長因子類）によって制御されている。この過程が完成することが通常はバランスの取れた骨の置換と再生につながるということは，分子のシグナルと，骨再生に影響を及ぼす事象とが緊密に制御されていることを示している。
【０００３】
骨再生サイクルにおける失調の原因となる数多くの骨成長障害が知られている。これらのうちで主なものとしては，たとえば，骨粗しょう症，オステオプラシア（骨軟化症），慢性腎不全，副甲状線機能こう進症などの代謝性の骨疾患があり，これらの疾患は骨実質の異常なまたは過剰な喪失を惹起する（骨減少症）。その他の骨疾患としては，ページェット病などが挙げられ，これらもまた局在部位における過剰な骨喪失の原因となる。
【０００４】
骨粗しょう症は，骨形成，骨吸収，またはその両方の失調から生じる骨実質の喪失が起因する骨格の構造的劣化であって，骨吸収が骨形成相を支配して病変骨の体重支持能力を減少するものです。健康な成人では，骨形成と骨吸収との割合が緊密に協調し合っていて骨格骨の再生が維持されるようになっている。しかしながら，骨粗しょう症の患者では，これらの骨再生サイクルの不調が進展して，骨実質が喪失しかつ連続した骨格の微小構造に欠損が形成されることになる。これらの骨格欠損は再生連鎖中の不順によって惹起されるが，その欠損が増大して，最終的には骨格構造の統合がひどく破壊されて骨折が起こり易くなってしまう。この不調はほとんどの人が年を取るにつれて徐々に起こるけれども（老人性骨粗しょう症），閉経後の女性ではより激しくかつ急激な割合で発生する。さらに，骨粗しょう症はまた栄養や内分泌の不均衡，遺伝的障害，数多くの悪性変換によって起因する場合もある。
【０００５】
慢性腎不全の患者のほとんどは一般的には骨格の骨実質喪失を患っている（腎性骨ジストロフィー）。腎臓の機能不全が血液中のカルシウムとリン酸の不均衡の原因になっているが，今日では透析によってカルシウムとリン酸を補給しても慢性腎不全の患者の腎性骨ジストロフィーを実質的には阻止できないことが知られている。成人において，腎性骨ジストロフィーの症状はり患状態の重大な原因である。子供においても，腎不全は，骨実質を維持したり，骨実質を増加することができなくなり，しばしば成長障害になる。
【０００６】
骨軟化症（軟化骨）としても知られているオステオプラシアは，骨無機質化における欠損（例えば，不完全無機質化）であり，典型的にはビタミンＤ３欠乏（１，２５ージヒドロキシビタミンＤ３）に関係している。この欠損は，圧迫骨折や，骨実質の減少の原因となるばかりではなく，骨組織の代わりに肥大や増殖性軟骨の領域の拡大の原因にもなる。この欠乏は，栄養欠乏（たとえば，子供におけるくる病），ビタミンＤやカルシウムの吸収不良および／またはビタミンの代謝不良によっても生ずる場合がある。
【０００７】
副甲状線機能こう進症（副甲状線ホルモンの過剰産生）はカルシウムの吸収不良の原因となり，異常な骨喪失を生ずることになる。子供においては副甲状線機能こう進症は成長を阻害し，成人においては骨格の統合が崩れ，肋骨や椎骨の骨折が特徴的に起こり得る。副甲状線ホルモンの失調は典型的には甲状腺腺腫または腺過形成に起因する場合またはステロイド剤を長期間投与することにより起こる場合がある。二次的副甲状線機能こう進症もまた腎性骨ジストロフィーに起因する場合がある。
【０００８】
この疾患の初期段階では，破骨細胞が過剰のホルモンの存在により反応して刺激されて，骨を吸収する。この疾患が進行するにつれて，最終的には小柱骨が吸収されしまい，骨髄が，微小骨折の結果として，線維形成，マクロファージおよび出血領域に取って替わられる。この状態を，臨床的には，線維性骨炎といっている。
ページェット病（変形性骨炎）は，現在では，ビールスが病因であり，局在部位における過剰な骨吸収によって特徴付けられる疾患であり，その部位は発赤し治癒するが，最終的には慢性化し進行性となる。更に悪化して悪性変換となる。この疾患は典型的には２５才以上の成人に発生する。
【０００９】
今日では，骨減少症の治療は，骨吸収が更に進むことを阻止することにその基盤を置いている。その阻止は，例えば，(1)造血性の単核細胞が成熟した破骨細胞に分化することの阻止，（２）破骨細胞が介在した骨吸収の直接的阻止または（３）骨吸収のホルモンでの制御への作用によって行われている。骨粗しょう症の治療に用いられる薬物療法には，カルシウム補給剤，エストローゲン，カルシトニンおよびジリン酸塩が使用されている。カルシウムとリン酸吸収を強化するとして知られているビタミンＤ３とその代謝物もまた試みられている。現在の療法はいずれも新しい骨組織の再生を刺激するものではない。更に，これらの薬剤のすべてが骨再生に対して一時的な効果しか持っていない。したがって，ある場合には，疾患の進行が止まったり，遅くなったりしうるけれども，重大な骨劣化を持つ患者にとっては病状が活性化する危険性が依然として残っていることになる。このような危険性は，早期診断が困難だったり，骨の構造的劣化が稀であるがすでに相当進んでいる骨粗しょう症のような疾患において特に顕著に現れることになる。
【００１０】
本発明の目的は，例えば，骨格の骨実質を減少する疾患を患っている患者において，特にその疾患が骨再生の失調の原因となっている場合には，骨実質の喪失を阻止または予防するためおよび／または骨形成を増加するための方法および組成物を開発することである。本発明の別の目的は，代謝性骨疾患を含む骨障害を患っている子供の骨成長を強化することである。本発明の更なる目的は，閉経後の女性や老人や透析を受けている患者を含む，骨実質喪失の危険性がある個体の骨劣化を予防または阻止することである。本発明の更に別の目的は，骨折の修復を含む，その構造が傷つけられた骨の微小構造の欠損を修復するための方法ならびに組成物を提供することである。したがって，本発明は，できれば期間を延長して，骨形成を刺激しかつ骨実質を増加することを，更にまた，特に骨格の構造的劣化に起因する骨折が新たに発生することを減少させることを目的としている。
【００１１】
本発明のこれらの目的ならびにそのほかの目的および特長を，以下の明細書の記載，図面ならびに請求の範囲によって明かにする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は，ほ乳動物，特にヒトにおける骨実質の喪失を阻止するためおよび／または骨形成を刺激するための方法および組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の第１の態様において，ほ乳動物における骨実質の喪失を予防するためおよび／または骨形成を増加するための療法治療方法および組成物に特長があって，それは，その個体に療法的に有効なモルフォゲンを，その個体において骨実質の喪失を阻止しおよび／またはその骨実質を増加するのに十分な量と期間投与することからなっている。
【００１４】
本発明の別の態様では，ほ乳動物における骨実質の喪失を予防するためおよび／または骨形成を増加するための療法治療方法および組成物に特長があって，それは，そのほ乳動物に，内在性モルフォゲンを，そのほ乳動物の体内において，その個体における骨実質の喪失を阻止しおよび／またはその骨実質を増加するのに十分な，療法的に有効な濃度に体内で刺激する化合物を投与することを含んでいる。これらの化合物は，本明細書では，モルフォゲン刺激剤と指称され，ほ乳動物に投与されたときには，通常は，モルフォゲンを産生しおよび／またはモルフォゲンを分泌する能力を持っているかまたはその産生および／または分泌が可能である組織または臓器に作用しかつモルフォゲンの内在レベルを変化させる物質をも包含するものと理解される。このモルフォゲン刺激剤は，例えば，内在モルフォゲンの発現および／または分泌を刺激することによって作用することもできる。
【００１５】
ここに記載したモルフォゲンは，個体において適当な骨実質を維持するに当たって重要な役割を果たしているものと信じられている。従って，本発明によって，モルフォゲンを，適当な骨実質を維持するのに助けが必要な個体および／または骨再生における失調に苦しんでいる個体に投与することができる。例えば，本発明によって，モルフォゲンまたはモルフォゲン刺激剤は，腎不全を患っている成人に対して，その疾患に関連している骨劣化を予防するために，例えば後期腎不全による骨喪失を補正するために投与することができる。同様に，腎不全を患っている子供にモルフォゲンを投与することは，子供の骨実質の喪失を軽減すると共に，骨形成を刺激し，それにより成長を促すことが期待できる。更に，骨格の微少構造の欠損を患っている個体にモルフォゲンまたはモルフォゲン刺激剤を投与することは，その欠損の修復になると共に，処置された骨の重量支持能力を強化することも期待される。
【００１６】
従って，本発明の別の態様では，本発明に係る療法治療方法および組成物は，骨実質喪失を含む，骨折やその他の骨格の微小構造の欠損の原因となったり，かかる骨折や欠損を生じかつ骨の体重支持能力を傷めるところの骨折やいかなる疾患をも処置するために使用することができる。かかる疾患としては，例えば，慢性腎不全やその他の腎臓疾患，特に透析を必要とするもの；骨軟化症；ビタミンＤ欠乏誘発骨減少症または骨粗しょう症；閉経後もしくは老人性骨粗しょう症；，副甲状線機能こう進症ならびにページェット病などが挙げられる。
【００１７】
本発明の更なる態様において，本発明は，モルフォゲンまたはモルフォゲン刺激剤を予防的に投与することによって骨格の骨実質の喪失または劣化の危険がある個体を保護するための方法と組成物を提供するものである。危険な状態にある個体には，閉経後の女性，老人，特に長期間または慢性的に透析を受けている個人などが含まれる。
【００１８】
本発明の好ましい具体的な態様の１つとして，モルフォゲンまたはモルフォゲン刺激剤は，個体に全身的に経口または非経口によって投与される。本発明の他の具体的な態様では，モルフォゲンは，例えば，骨膜または骨内膜に注射することによって骨に直接投与することができる。直接注射は骨折を含む骨の微小構造の欠損を修復するのに特に有用である。
【００１９】
本発明のいずれの処置法においても，「モルフォゲン投与」という用語はモルフォゲンを単独でまたは他の分子との併用で投与することを意味している。例えば，モルフォゲンの成熟型は，タンパク質の溶解度を高めることが知られている，モルフォゲンの前駆体”プロ”ドメインに関連して与えられる。タンパク質の溶解度を高めることが知られているその他の有用な分子としては，種々の血清タンパク質の他に，カゼインやその他のミルク成分が含まれる。モルフォゲンまたはモルフォゲン刺激剤に関連することができるその他の有用な分子としては，モルフォゲンまたはモルフォゲン刺激剤を骨に導くことができる組織標的分子も含まれる。本発明の処置プロトコルに有用な組織標的分子としては，例えば，テトラサイクリン，ジリン酸塩ならびに抗体または，骨組織細胞上の表面分子と特異的に相互作用するその他の結合タンパク質が含まれる。
【００２０】
更に別の有用な組織標的分子としては，モルフォゲンの前駆体”プロ”ドメイン，特にＯＰ−１，ＢＭＰ２またはＢＭＰ４のそれが含まれる。これらのタンパク質は，天然においては，骨組織に関連しているが，他の組織で合成されており，合成細胞から分泌された後に骨組織を標的としていることが判明している。例えば，主なＯＰ−１合成源は尿管の組織，例えば，腎組織であると考えらているが，そのタンパク質は，後述するように骨組織において活性であることが示されている。更に，そのタンパク質は血清，唾液，種々のミルク中からも同定されている。更にまた，そのタンパク質の分泌型は，完全なモルフォゲンシーケンスのプロドメインに関連する成熟したダイマーからなっている。従って，関連しているモルフォゲンプロドメインが作用して生体内において特異的なモルフォゲンが異なる組織を標的とすることができる。
【００２１】
組織を標的にする関連分子または溶解度を高める関連分子はまた，酸に不安定な結合を含む，標準的な化学的手段を用いて，モルフォゲンに共役結合することができ，その結合は骨再生部位の酸性環境下において容易に切断されるのが好ましい。
【００２２】
モルフォゲンまたはモルフォゲン刺激剤もまた，骨再生に対して有益な効果を及ぼすことが知られているその他の「補因子」と共に投与することができる。かかる補因子としては，例えば，甲状腺ホルモン，ビタミンＤ３，プロスタグランジン，デキサメタゾン，ＩＧＦ（Ｉ，ＩＩ）ならびにそれらの結合タンパク質および造骨細胞活性を強化するその他の薬剤が挙げられる。更にその他の補因子として，カルシトニン，エストローゲン，その他の骨吸収阻害薬剤が含まれる。
【００２３】
本発明に有用なモルフォゲンとしては，例えば，元来骨形成タンパク質として同定されたタンパク質，例えば，ＯＰ−１，ＯＰ−２，ＣＢＭＰ２タンパク質や，アミノ酸シーケンス関連タンパク質，例えば，ＤＰＰ（キイロショウジョウバエから），Ｖｇｌ（ツメガエルから），Ｖｇｒ−１（マウスから；アメリカ特許第５０１１６９１号；Oppermann et al.），ＧＤＦ−１（マウスから；Lee:PNAS８８巻，４２５０ー４２５４頁，1991年）などが挙げられる。これらの全てを下表ＩＩに示し，シーケンスＩＤ５ー１４番とする。また最近同定された６０Ａタンパク質（キイロショウジョウバエから：Wharton et al.: PNAS８８巻，９２１４ー９２１８頁，１９９１年；シーケンスＩＤ２４番）も含まれる。このファミリーの構成員には，Ｃ末端領域における実質的なアミノ酸シーケンスホモロジーが共通であるＴＧＦ−βスーパーファミリーのタンパク質の構成員も含まれている。そのタンパク質は，典型的には約30個以下の残基からなるＮ末端シグナルペプチドシーケンスを持つ前駆体として翻訳され，その後に切断されて成熟したシーケンスを生成するプロドメインが続いている。そのシグナルペプチドは，翻訳に際して，ＶｏｎＨｅｉｊｎｅ法（Nucleic Acids Research：14巻４６８３ー４６９１頁，１９８６年）によって所定シーケンスにおける切断部位において，急激に切断される。下表Ｉには，本明細書に使用された命名を含めて，今日まで同定された種々のモルフォゲンの種類，そのシーケンスＩＤ番号およびシーケンス表に含まれていないフルレングスタンパク質のアミノ酸シーケンスの刊行源を記載している。これらの刊行物も本明細書に参照として含まれるものとする。
【００２４】
表Ｉ
【００２５】
ＯＰ−１
ＯＰ−１は，一般的には，ＯＰ−１タンパク質をコードするＤＮＡシーケンスの１部または全てから発現された形態学的に活性なタンパク質のグループを称し，その対立遺伝子ならびにその種変異型を含んでいて，例えば，ヒトＯＰ−１（ｈＯＰ１；シーケンスＩＤ５番：成熟タンパク質アミノ酸シーケンス）またはマウスＯＰ−１（ｍＯＰ１；シーケンスＩＤ６番：成熟タンパク質アミノ酸シーケンス）が含まれる。保存７システイン骨格はシーケンスＩＤ５番と６番の残基３８と１３９によって規定される。フルレングスタンパク質をコードするｃＤＮＡシーケンスおよびアミノ酸は，シーケンスＩＤ１６番と１７番（ｈＯＰ１）とシーケンスＩＤ１８番と１９番（ｍＯＰ１）として示している。成熟タンパク質は残基２９３ー４３１によって（ｈＯＰ１）また残基２９２ー４３０によって（ｍＯＰ１）規定される。成熟した形態学的に活性なタンパク質を切断して生成するタンパク質プロドメインは本質的には残基３０ー２９２（ｈＯＰ１）および残基３０ー２９１（ｍＯＰ１）によって規定される。
【００２６】
ＯＰ−２
ＯＰ−２は，一般的には，ＯＰ−２タンパク質をコードするＤＮＡシーケンスの１部または全てから発現された形態学的に活性なタンパク質のグループを称し，その対立遺伝子ならびにその種変異型を含んでいて，例えば，ヒトＯＰ−２（ｈＯＰ２；シーケンスＩＤ７番：成熟タンパク質アミノ酸シーケンス）またはマウスＯＰ−２（ｍＯＰ２；シーケンスＩＤ８番：成熟タンパク質アミノ酸シーケンス）が含まれる。保存７システイン骨格はシーケンスＩＤ７番と８番の残基３８と１３９によって規定される。フルレングスタンパク質をコードするｃＤＮＡシーケンスおよびアミノ酸は，シーケンスＩＤ２０番と２１番（ｈＯＰ２）ならびにシーケンスＩＤ２２番と２３番（ｍＯＰ２）として示している。成熟タンパク質は本質的には残基２６４ー４０２によって（ｈＯＰ１）また残基２６１ー３９９によって（ｍＯＰ−１）規定される。成熟した形態学的に活性なタンパク質を切断して生成するタンパク質プロドメインは本質的には残基１８ー２６３（ｈＯＰ１）および残基１８ー２６０（ｍＯＰ１）によって規定される。（別の切断部位はまた，両方のＯＰ−２タンパク質において更に上流の残基２１に発生する）。
【００２７】
ＣＢＭＰ２
ＣＢＭＰ２は，一般的には，ＣＢＭＰ２タンパク質をコードするＤＮＡシーケンスから発現された形態学的に活性なタンパク質のグループを称し，その相対遺伝子ならびにその種変異型をも含んでいて，例えば，ヒトＣＢＭＰ２Ａ（ＣＢＭＰ２Ａ（ｆｘ）；シーケンスＩＤ９番）またはヒトＣＢＭＰ２ＢＤＮＡ（ＣＢＭＰ２Ｂ（ｆｘ）；シーケンスＩＤ１０番）が含まれる。文献でＢＭＰ２ＡとＢＭＰ２ＢまたはＢＭＰ２とＢＭＰ４と総称されているフルレングスタンパク質のアミノ酸シーケンスは，Wozney, et al: Science２４２巻，１５２８ー１５３４頁，１９８８年に記載されている。ＢＭＰ２（ＢＭＰ２Ａ）のプロドメインは残基２５ー２４８または残基２５ー２８２を含み，成熟タンパク質は残基２４９ー３９６または２８３ー３９６を含んでいる。ＢＭＰ４（ＢＭＰ２Ｂ）のプロドメインは残基２５ー２５６または残基２５ー２９２を含み，成熟タンパク質は残基２５７ー４０８または２９３ー４０８を含んでいる。
【００２８】
ＤＰＰ（ｆｘ）
ＤＰＰ（ｆｘ）は，キイロショウジョウバエＤＰＰ遺伝子をコードし，保存７システイン骨格を規定するタンパク質シーケンスを示している（シーケンスＩＤ１１番）。フルレングスタンパク質のアミノ酸シーケンスは文献（Padgett, et al: Nature３２５巻８１ー８４頁１９８７年）に記載されている。そのプロドメインはシグナルペプチド切断部位から残基４５６まで延びており，その成熟タンパク質は残基４５７ー５８８によって規定される。
【００２９】
Ｖｇｌ（ｆｘ）    
Ｖｇｌ（ｆｘ）は，ツメカエルＶｇｌ遺伝子をコードし，保存７システイン骨格を規定するタンパク質シーケンスを示している（シーケンスＩＤ１２番）。フルレングスタンパク質のアミノ酸シーケンスは文献（Weeks: Cell ５１巻８６１ー８６７頁1987年)に記載されている。そのプロドメインはシグナルペプチド切断部位から残基２４６まで延びており，その成熟タンパク質は残基２４７ー３６０によって規定される。
【００３０】
Ｖｇｒ−１（ｆｘ）    
Ｖｇｒ−１（ｆｘ）は，マウスＶｇｒ−１遺伝子をコードし，保存７システイン骨格を規定するタンパク質シーケンスを示している（シーケンスＩＤ１３番）。フルレングスタンパク質のアミノ酸シーケンスは文献（Lyons, et al: PNAS８６巻４５５４ー４５５８頁１９８９年）に記載されている。そのプロドメインはシグナルペプチド切断部位から残基２９９まで延びており，その成熟タンパク質は残基３００−４３８によって規定される。
【００３１】
ＧＤＦ−１（ｆｘ）    
ＧＤＦ−１（ｆｘ）は，ヒトＧＤＦ−１遺伝子をコードし，保存７システイン骨格を規定するタンパク質シーケンスを示している（シーケンスＩＤ１４番）。フルレングスタンパク質のｃＤＮＡおよびコードしたアミノ酸シーケンスはシーケンスＩＤ３２番として示されている。そのプロドメインはシグナルペプチド切断部位から残基２１４まで延びており，その成熟タンパク質は残基２１５ー３７２によって規定される。
【００３２】
６０Ａ    
６０Ａは，一般的には，６０Ａタンパク質（シーケンスＩＤ２４番：そのｃＤＮＡおよびそのフルレングスタンパク質がコードされたアミノ酸シーケンスが提供されている）をコードする（キイロショウジョウバエ６０Ａ遺伝子からの）ＤＮＡシーケンスの１部または全部から発現された形態学的に活性なタンパク質類を指称している。「６０Ａ（ｆｘ）」は，その保存７システイン骨格（シーケンスＩＤ２４番の残基３５４ー４５５）を規定するタンパク質シーケンスを指称している。そのプロドメインはシグナルペプチド切断部位から残基３２４まで延びており，その成熟タンパク質は残基３２５−４５５によって規定されている。
【００３３】
ＢＭＰ３（ｆｘ）    
ＢＭＰ３（ｆｘ）は，ヒトＢＭＰ３遺伝子をコードし，保存７システイン骨格を規定するタンパク質シーケンスを指称している（シーケンスＩＤ２６番）。そのフルレングスタンパク質のアミノ酸シーケンスは，Wozney, et al: Science  ２４２巻，１５２８−１５３４頁，１９８８年に記載されている。そのプロドメインはそのシグナルペプチド切断部位から残基２９０まで延びており，その成熟タンパク質は残基２９１−４７２によって規定されている。
【００３４】
ＢＭＰ５（ｆｘ）    
ＢＭＰ５（ｆｘ）は，ヒトＢＭＰ５遺伝子をコードし，保存７システイン骨格を規定するタンパク質シーケンスを指称している（シーケンスＩＤ２７番）。そのフルレングスタンパク質のアミノ酸シーケンスは，Celeste,et al: PNAS ６７巻，９８４３−９８４７頁，１９９１年に記載されている。そのプロドメインはそのシグナルペプチド切断部位から残基３１６まで延びており，その成熟タンパク質は残基３１７ー４５４によって規定されている。
【００３５】
ＢＭＰ６（ｆｘ）    
ＢＭＰ６（ｆｘ）は，ヒトＢＭＰ６遺伝子をコードし，保存７システイン骨格を規定するタンパク質シーケンスを指称している（シーケンスＩＤ２８番）。そのフルレングスタンパク質のアミノ酸シーケンスは，Celeste,et al: PNAS ６７巻，９８４３ー９８４７頁，１９９１年に記載されている。そのプロドメインはそのシグナルペプチド切断部位から残基３７４まで延びており，その成熟タンパク質は残基３７５ー５１３によって規定されている。
【００３６】
ＯＰ−２タンパク質は，このファミリーの他のタンパク質と共通した保存システイン骨格に加えて，この領域においてもう１つのシステイン残基（例えば，シーケンスＩＤ７番と８番の残基４１）を有している。ＧＤＦ−１タンパク質は，保存骨格中に４個のアミノ酸インサート（シーケンスＩＤ１４番の残基４４−４７）を有しているが，このインサートは折り畳まれた構造のシステイン類の関係を干渉していない。加えて，ＣＢＭＰ２タンパク質にはそのシステイン骨格中から１個のアミノ酸残基が抜けている。
【００３７】
モルフォゲンは，還元されると不活性であるが，酸化ホモダイマーとして活性であり，本発明の他のモルフォゲンと組み合わせて酸化すると活性である。従って，ここで定義したように，モルフォゲンは１対のポリペプチド鎖からなるダイマータンパク質であり，その各ポリペプチド鎖は，シーケンスＩＤ５番の残基４３−１３９によって規定されたＣ末端６システイン骨格から少なくとも構成されていて，それにはこれらのシステインの機能的に均等な配置（例えば，シーケンス中のシステインの線状配置は変化させるけれども折り畳まれた構造中の関係は変更しないアミノ酸挿入または除去）は含まれる。そのポリペプチド鎖が折り畳まれているときには，１対のポリペプチド鎖からなるダイマータンパク質スピーシズ（種）は，そのタンパク質が本明細書で定義されたようにモルフォゲンとして作用することができるように鎖内または鎖間での適当なジスルフィド結合を含む適当な３次元構造を有している。更に具体的には，モルフォゲンは一般的には形態学的に許容される環境下において，下記のような生物学的な機能の全てを果たすことが可能である：祖先細胞の増殖の刺激；祖先細胞の分化の刺激；分化細胞の増殖の刺激；および変形細胞の再分化を含む，分化細胞の成長ならびに維持の支援。加えて，これらのモルフォゲンは，適当な環境条件下で始動細胞の再分化を惹起することが可能であることが容易に予測される。
【００３８】
本発明の１つの好ましい態様においては，本発明のモルフォゲンは，２種の一般アミノ酸シーケンスのうちの１つからなっている：一般シーケンス１（シーケンスＩＤ１番）または一般シーケンス２（シーケンスＩＤ２番）。それぞれのシーケンスにおいて，記号Ｘａａは天然に存在するＬ−異性体の２０個のαーアミノ酸またはその誘導体からなっている。一般シーケンス１は保存６システイン骨格からなり，一般シーケンス２は保存６システイン骨格に加えてＯＰ−２において同定されたもう１個のシステイン（シーケンスＩＤ２番の残基３６）からなっている。本発明の別の好ましい態様においては，これらのシーケンスは更にそれらのＮ末端に次のシーケンスを有している：
Ｃｙｓ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ（シーケンスID15番）
１                              ５
【００３９】
前述した一般シーケンス中の好ましいアミノ酸シーケンスは次の通りである：一般シーケンス３（シーケンスＩＤ３番）；一般シーケンス４（シーケンスＩＤ４番）；一般シーケンス５（シーケンスＩＤ３０番）；および一般シーケンス６（シーケンスＩＤ３１番）で，これらは下記にリストされている。これらの一般シーケンスは，表ＩＩで同定したこのモルフォゲンファミリーの種々の好ましい構成員と共通のホモロジーを有する
と共に，シーケンスの間でアミノ酸シーケンスが変化している。
具体的には，一般シーケンス３と４とは，表ＩＩで示されかつシーケンスＩＤ５番ないし１４番と同定された下記のタンパク質の複合アミノ酸シーケンスからなっている：ヒトＯＰ−１（ｈＯＰ−１：シーケンスＩＤ５番および１６ー１７番）；マウスｍＯＰ−１（ｍＯＰ−１：シーケンスＩＤ６番および１８ー１９番）；ヒトおよびマウスＯＰ−２（シーケンスＩＤ７番，８番および２０ー２２番）；ＣＢＭＰ２Ａ（シーケンスＩＤ９番）；ＣＢＭＰ２Ｂ（シーケンスＩＤ１０番）；ＤＰＰ（キイロショウジョウバエから：シーケンスＩＤ１１番）；Ｖｇｌ（ツメガエルから：シーケンスＩＤ１２番）；Ｖｇｒ−１（マウスから：シーケンスＩＤ１３番）；およびＧＤＦ−１（マウスから：シーケンスＩＤ１４番）。これらの一般シーケンスは，表ＩＩに示したシーケンスによって共有されたアミノ酸の同一性と共に，シーケンス中の可変位置において選択できる残基とを包含している。これらの一般シーケンスには，一般シーケンス３または４におけるそれぞれの位置４１または４６においてシステインが存在していてもよく，それによって分子内または分子間のジスルフィド結合を形成することができかつタンパク質の三次構造に影響を及ぼすある種の臨界アミノ酸を含むことができる。
【００４０】
一般シーケンス３
2007197455.tif 000002
【００４１】
上記式において，各Ｘａａは，以下に定める特定のアミノ酸の１個またはそれ以上のグループから独立に選ばれるものを示している：残基４のXaa=(Ser, AspまたはGlu);残基６の Xaa=(Arg, Gln, Ser またはLys); 残基7 のXaa=(AspまたはGlu);
残基8 のXaa=(Leu  またはVal); 残基11のXaa=(Gln, Leu, Asp,His またはAsn); 残基12の Xaa=(Asp, Arg  またはAsn); 残基14のXaa=(IleまたはVal); 残基15のXaa=(IleまたはVal); 残基18の Xaa=Glu, Gln, Leu, Lys, ProまたはArg); 残基20のXaa=(TyrまたはPhe); 残基21のXaa=(Ala, Ser,Asp, Met, His, LeuまたはGln); 残基23のXaa=(Tyr, Asn またはPhe); 残基26のXaa=(Glu, His, Tyr, AspまたはGln); 残基28のXaa=(Glu,Lys,AspまたはGln); 残基30のXaa=(Ala, Ser,Pro またはGln); 残基31のXaa=(Phe, Leu またはTyr); 残基33のXaa=(LeuまたはVal);残基34のXaa=(Asn, Asp, AlaまたはThr); 残基35のXaa=(Ser,Asp, Glu, Leu またはAla); 残基36のXaa=(Tyr, Cys, His, SerまたはIle); 残基37のXaa=(Met, Phe, GlyまたはLeu); 残基38のXaa=(AsnまたはSer); 残基39のXaa=(Ala, Ser またはGly);残基40のXaa=(Thr, LeuまたはSer); 残基44のXaa=(IleまたはVal); 残基45のXaa=(ValまたはLeu); 残基46のXaa=(GlnまたはArg); 残基47のXaa=(Thr, Ala またはSer); 残基49のXaa=(ValまたはMet); 残基50のXaa=(HisまたはAsn); 残基51のXaa=(Phe,Leu, Asn, Ser, AlaまたはVal); 残基52のXaa=(Ile,Met, Asn,Ala またはVal); 残基53のXaa=(Asn, Lys, AlaまたはGlu); 残基54のXaa=(ProまたはSer); 残基55のXaa=(Glu, Asp, AsnまたはGly); 残基56のXaa=(Thr, Ala, Val, Lys, Asp, Tyr, SerまたはAla); 残基57のXaa=(Val, Ala またはIle); 残基58のXaa=(ProまたはAsp); 残基59のXaa=(LysまたはLeu); 残基60のXaa=(ProまたはAla); 残基63のXaa=(AlaまたはVal); 残基65のXaa=(ThrまたはAla); 残基66のXaa=(Gln, Lys, ArgまたはGlu); 残基67のXaa=(Leu, Met またはVal); 残基68のXaa=(Asn, Ser またはAsp); 残基69のXaa=(Ala, Pro またはSer); 残基70の Xaa=(Ile, ThrまたはVal); 残基71のXaa=(SerまたはAla); 残基72のXaa=(ValまたはMet); 残基74のXaa=(TyrまたはPhe); 残基75のXaa=(Phe, Tyr またはLeu); 残基76のXaa=(AspまたはAsn);残基77のXaa=(Asp, Glu, AsnまたはSer); 残基78のXaa=(Ser,
Gln, AsnまたはTyr); 残基79のXaa=(Ser, Asn, AspまたはGlu);残基80のXaa=(Asn ThrまたはLys); 残基82のXaa=(IleまたはVal); 残基84のXaa=(LysまたはArg); 残基85のXaa=(Lys, Asn,Gln またはHis); 残基86のXaa=(TyrまたはHis); 残基87のXaa=(Arg, Gln またはGlu); 残基88のXaa=(Asn, Glu またはAsp);残基90のXaa=(Val, Thr またはAla); 残基92のXaa=(Arg, Lys,Val, AspまたはGlu); 残基93のXaa=(Ala, Gly またはGlu); および残基97のXaa=(HisまたはArg)。
【００４２】
一般シーケンス４
2007197455.tif 000003
【００４３】
上記式中において，各Ｘａａは，以下に定める特定のアミノ酸の１個またはそれ以上のグループから独立に選ばれるものを示している：残基2 のXaa=(LysまたはArg); 残基3 のXaa=(LysまたはArg); 残基4 のXaa=(HisまたはArg); 残基5 のXaa=(Glu,Ser, His, Gly, ArgまたはPro); 残基9 のXaa=(Ser, Asp またはGlu); 残基11のXaa=(Arg, Gln, SerまたはLys); 残基12のXaa=(Asp またはGlu); 残基13のXaa=(LeuまたはVal); 残基16のXaa=(Gln, Leu, Asp, HisまたはAsn); 残基17のXaa=(Asp, Arg またはAsn); 残基19のXaa=(IleまたはVal);残基20のXaa=(IleまたはVal); 残基23のXaa=(Glu, Gln, Leu, Lys, ProまたはArg);残基25のXaa=(TyrまたはPhe); 残基26のXaa=(Ala, Ser, Asp,Met, His, Leu またはGln); 残基28のXaa=(Tyr, Asn またはPhe); 残基31のXaa=(Glu, His, Tyr, Asp またはGln); 残基33のXaa=(Glu, Lys, AspまたはGln); 残基35のXaa=(Ala, Ser またはPro); 残基36のXaa=(Phe, Leu またはTyr); 残基38のXaa=(Leu またはVal); 残基39のXaa=(Asn, Asp, AlaまたはThr);残基40のXaa=(Ser,Asp, Glu, LeuまたはAla); 残基41の Xaa=(Tyr,Cys, His, SerまたはIle); 残基42のXaa=(Met, Phe, GlyまたはLeu); 残基44のXaa=(Ala, Ser またはGly); 残基45のXaa=(Thr, LeuまたはSer); 残基49のXaa=(IleまたはVal); 残基50のXaa=(ValまたはLeu);残基51のXaa=(GlnまたはArg);残基52のXaa=(Thr, AlaまたはSer); 残基54のXaa=(ValまたはMet);残基55のXaa=(HisまたはAsn); 残基56のXaa=(Phe, Leu, Asn,Ser, AlaまたはVal); 残基57のXaa=(Ile, Met, Asn, Ala またはVal); 残基58のXaa=(Asn, Lys, AlaまたはGlu); 残基59のXaa=(Pro またはSer); 残基60のXaa=(Glu, Asp またはGly); 残基61のXaa=(Thr, Ala, Val, Lys,Asp, Tyr, Ser またはAla); 残基62のXaa=(Val, Ala またはIle); 残基63の Xaa=(Pro またはAsp); 残基64のXaa=(LysまたはLeu); 残基65のXaa=(ProまたはAla); 残基68のXaa=(AlaまたはVal); 残基70のXaa=(ThrまたはAla); 残基71のXaa=(Gln, Lys, ArgまたはGlu); 残基72のXaa=(Leu, Met またはVal); 残基73のXaa=(Asn, Ser またはAsp);残基74のXaa=(Ala, Pro またはSer); 残基75のXaa=(Ile, ThrまたはVal);残基76のXaa=(SerまたはAla);残基77のXaa=(ValまたはMet); 残基79のXaa=(TyrまたはPhe); 残基80のXaa=(Phe,Tyr またはLeu); 残基81のXaa=(AspまたはAsn); 残基82のXaa=(Asp, Glu, AsnまたはSer); 残基83のXaa=(Ser, Gln, AsnまたはTyr); 残基84のXaa=(Ser, Asn, AspまたはGlu); 残基85のXaa=(Asn, ThrまたはLys); 残基87のXaa=(IleまたはVal); 残基89のXaa=(LysまたはArg); 残基90のXaa=(Lys, Asn, GlnまたはHis); 残基91のXaa=(TyrまたはHis); 残基92のXaa=(Arg, GlnまたはGlu); 残基93のXaa=(Asn, Glu またはAsp); 残基95のXaa=(Val, ThrまたはAla); 残基97のXaa=(Arg, Lys,Val, AspまたはGlu); 残基98のXaa=(Ala, Gly またはGlu); および残基102のXaa=(HisまたはArg)。
【００４４】
同様に，一般シーケンス５（シーケンスＩＤ３０番）と一般シーケンス６（シーケンスＩＤ３１番）とは，表ＩＩで同定したこのモルフォゲンタンパク質ファミリーの全ての構成員と共通のホモロジーを有している。具体的には，一般シーケンス５と６とは，下記のタンパク質の複合アミノ酸シーケンスからなっている：ヒトＯＰ−１（ｈＯＰ−１：シーケンスＩＤ５番および１６ー１７番）；マウスｍＯＰ−１（ｍＯＰ−１：シーケンスＩＤ６番および１８ー１９番）；ヒトおよびマウスＯＰ−２（シーケンスＩＤ７番，８番および２０ー２２番）；ＣＢＭＰ２Ａ（シーケンスＩＤ９番）；ＣＢＭＰ２Ｂ（シーケンスＩＤ１０番）；ＤＰＰ（キイロショウジョウバエから：シーケンスＩＤ１１番）；Ｖｇｌ（ツメガエルから：シーケンスＩＤ１２番）；Ｖｇｒ−１（マウスから：シーケンスＩＤ１３番）；ＧＤＦ−１（マウスから：シーケンスＩＤ１４番および32番);ヒトＢＭＰ３（シーケンスＩＤ２６番）；ヒトＢＭＰ５（シーケンスＩＤ２７番）；ヒトＢＭＰ６（シーケンスＩＤ２８番);および６０Ａ（キイロショウジョウバエから：シーケンスＩＤ２４番）。これらの一般シーケンスは，６個および７個のシステイン骨格（それぞれ一般シーケンス５および６）で規定されたＣ末端ドメイン中のこれらのシーケンスによって共有されたアミノ酸の同一性と共に，シーケンス中の可変位置において選択できる残基とを包含している。一般シーケンス３および４のように，これらの一般シーケンス５および６には，位置４１（一般シーケンス５）および位置４６（一般シーケンス６）にもう１個のシステインが存在していて，それによって分子内または分子間のジスルフィド結合を形成することができかつタンパク質の三次構造に影響を及ぼすある種の臨界アミノ酸を含むことができる。
【００４５】
一般シーケンス５
2007197455.tif 000004
【００４６】
上記式において，各Ｘａａは，以下に定める特定のアミノ酸の１個またはそれ以上のグループから独立に選ばれるものを示している：残基2 のXaa=(TyrまたはLys); 残基3 のXaa=(ValまたはIle); 残基4 のXaa=(Ser, Asp またはGlu); 残基6 のXaa=(Arg, Gln, Ser, Lys またはAla); 残基7 のXaa=(Asp, Glu またはLys); 残基8 のXaa=(Leu, Val またはIle); 残基11のXaa=(Gln, Leu,  Asp, His, Asn またはSer); 残基12のXaa=(Asp,Arg, AsnまたはGlu); 残基14のXaa=(IleまたはVal); 残基15のXaa=(IleまたはVal);残基16のXaa=(AlaまたはSer);残基18のXaa=(Glu, Gln,Leu, Lys, Pro またはArg); 残基19のXaa=(GlyまたはSer); 残基20のXaa=(TyrまたはPhe); 残基21のXaa=(Ala,Ser, Asp, Met, His, Gln, LeuまたはGly); 残基23のXaa=(Tyr,Asn またはPhe); 残基26のXaa=(Glu, His, Tyr, Asp, GlnまたはSer); 残基28のXaa=(Glu, Lys, Asp, Gln またはAla); 残基30のXaa=(Ala, Ser, Pro, Gln またはAsn); 残基31のXaa=(Phe,
Leu またはTyr); 残基33のXaa=(Leu,  ValまたはMet); 残基34のXaa=(Asn, Asp, Ala, Thr またはPro); 残基35のXaa=(Ser,Asp, Glu, Leu, AlaまたはLys); 残基36のXaa=(Tyr, Cys,His,Ser またはIle); 残基37のXaa=(Met, Phe, GlyまたはLeu); 残基38のXaa=(Asn, Ser またはLys); 残基39のXaa=(Ala, Ser, GlyまたはPro); 残基40のXaa=(Thr, Leu またはSer); 残基44のXaa=(Ile, ValまたはThr); 残基45のXaa=(Val, Leu またはIle);残基46のXaa=(GlnまたはARg); 残基47のXaa=(Thr, AlaまたはSer);残基48のXaa=(LeuまたはIle); 残基49のXaa=(ValまたはMet); 残基50のXaa=(His, Asn またはArg); 残基51のXaa=(Phe,Leu, Asn, Ser, AlaまたはVal); 残基52のXaa=(Ile, Met, Asn,Ala, ValまたはLeu); 残基53のXaa=(Asn, Lys, Ala, Glu, GlyまたはPhe); 残基54のXaa=(Pro,SerまたはVal); 残基55のXaa=(Glu, Asp, Asn, Gly, ValまたはLys); 残基56のXaa=(Thr, Ala,Val, Lys, Asp,Tyr, Ser, Ala, ProまたはHis); 残基57のXaa=(Val, Ala またはIle); 残基58のXaa=(ProまたはAsp); 残基59のXaa=(Lys, Leu またはGlu); 残基60のXaa=(ProまたはAla);残基63のXaa=(AlaまたはVal); 残基65のXaa=(Thr, Ala またはGlu); 残基66のXaa=(Gln, Lys, ArgまたはGlu); 残基67のXaa=(Leu, Met またはVal); 残基68のXaa=(Asn, Ser, AspまたはGly); 残基69のXaa=(Ala, Pro またはSer); 残基70のXaa=(Ile,Thr, ValまたはLeu);残基71のXaa=(Ser, AlaまたはPro);残基72のXaa=(Val, MetまたはIle);残基74のXaa=(TyrまたはPhe); 残基75のXaa=(Phe, Tyr, LeuまたはHis); 残基76のXaa=(Asp, Asn またはLeu); 残基77のXaa=(Asp, Glu, AsnまたはSer); 残基78のXaa=(Ser, Gln, Asn, Tyr またはAsp); 残基79のXaa=(Ser, Asn, Asp, Glu またはLys); 残基80のXaa=(Asn,Thr またはLys); 残基82のXaa=(Ile,ValまたはAsn); 残基84のXaa=(LysまたはArg); 残基85のXaa=(Lys, Asn, Gln, His またはVal); 残基86のXaa=(TyrまたはHis); 残基87のXaa=(Arg, Gln, GluまたはPro); 残基88のXaa=(Asn, Glu またはAsp); 残基90のXaa=(Val, Thr, AlaまたはIle); 残基92の Xaa=(Arg, Lys,Val, AspまたはGlu); 残基93のXaa=(Ala, Gly, GluまたはSer);
残基95のXaa=(GlyまたはAla); および残基97のXaa=(HisまたはArg)。
【００４７】
一般シーケンス６
2007197455.tif 000005
【００４８】
上記式において，各Ｘａａは，以下に定める特定のアミノ酸の１個またはそれ以上のグループから独立に選ばれるものを示している：  残基2 のXaa=(Lys, Arg,Ala またはGln); 残基３のXaa=(Lys, Arg またはMet); 残基4 のXaa=(His, Arg またはGln); 残基5 のXaa=(Glu, Ser, His, Gly, Arg, Pro, ThrまたはTyr); 残基7 のXaa=(TyrまたはLys); 残基8 のXaa=(ValまたはIle); 残基9 のXaa=(Ser, Asp またはGlu); 残基11の Xaa=(Arg, Gln, Ser, Lys またはAla); 残基12のXaa=(Asp, Glu またはLys); 残基13のXaa=(Leu, Val またはIle); 残基16のXaa=(Gln, Leu, Asp, His,AsnまたはSer); 残基17のXaa=(Asp,Arg,Asn またはGlu);残基19のXaa=(IleまたはVal);残基20のXaa=(IleまたはVal); 残基21のXaa=(AlaまたはSer); 残基23のXaa=(Glu, Gln, Leu, Lys,  Pro またはArg); 残基24のXaa=(GlyまたはSer); 残基25のXaa=(TyrまたはPhe); 残基26のXaa=(Ala,Ser, Asp, Met, His, Gln,Leu またはGly); 残基28のXaa=(Tyr,Asn またはPhe); 残基31のXaa=(Glu, His, Tyr, Asp, GlnまたはSer); 残基33のXaa=(Glu,Lys, Asp, GlnまたはAla); 残基35のXaa=(Ala,Ser, Pro, GlnまたはAsn); 残基36のXaa=(Phe, LeuまたはTyr); 残基38のXaa=(Leu,ValまたはMet); 残基39のXaa=(Asn, Asp, Ala, Thr またはPro); 残基40のXaa=(Ser, Cys,
His, SerまたはIle); 残基41のXaa=(Tyr, Cys, His, Ser またはIle); 残基42のXaa=(Met, Phe, GlyまたはLeu); 残基43のXaa=(Asn, Ser またはLys); 残基44のXaa=(Ala, Ser, GlyまたはPro);残基45のXaa=(Thr, LeuまたはSer);残基49のXaa=(Ile, Val またはThr); 残基50のXaa=(Val,LeuまたはIle); 残基51のXaa=(GlnまたはArg); 残基52のXaa=(Thr, Ala またはSer); 残基53のXaa=(LeuまたはIle); 残基54のXaa=(ValまたはMet); 残基55のXaa=(His, Asn またはArg); 残基56のXaa=(Phe,Leu, Asn, Ser, AlaまたはVal); 残基57のXaa=(Ile, Met, Asn,Ala,Val またはLeu); 残基58のXaa=(Asn, Lys, Ala, Glu, GlyまたはPhe); 残基59のXaa=(Pro, Ser またはVal); 残基60のXaa= (Glu, Asp,Gly, ValまたはLys); 残基61のXaa=(Thr, Ala,Val, Lys, Asp, Tyr, Ser, Ala, Pro またはHis); 残基62のXaa=(Val, Ala またはIle); 残基63のXaa=(ProまたはAsp);残基64のXaa=(Lys, LeuまたはGlu);残基65のXaa=(ProまたはAla);残基68のXaa=(AlaまたはVal); 残基70のXaa=(Thr,AlaまたはGlu); 残基71のXaa=(Gln, Lys, ArgまたはGlu); 残基72のXaa=(Leu, Met またはVal); 残基73のXaa=(Asn, Ser, AspまたはGly); 残基74のXaa=(Ala, Pro またはSer); 残基75のXaa=(Ile,Thr, ValまたはLeu); 残基76のXaa=(Ser, Ala またはPro); 残基77のXaa=(Val, Met またはIle); 残基79のXaa=(TyrまたはPhe); 残基80のXaa=(Phe, Tyr, LeuまたはHis); 残基81のXaa=(Asp, Asn またはLeu); 残基82のXaa=(Asp, Glu, AsnまたはSer); 残基83のXaa=(Ser, Gln, Asn, Tyr またはAsp); 残基84のXaa=(Ser, Asn, Asp, GluまたはLys);残基85の Xaa=(Asn,ThrまたはLys);残基87のXaa=(Ile, Val またはAsn); 残基89のXaa=(LysまたはArg); 残基90のXaa=(Lys, Asn, Gln, His またはVal); 残基91のXaa=(TyrまたはHis); 残基92のXaa=(Arg,Gln, GluまたはPro); 残基93のXaa=(Asn, Glu またはAsp); 残基95のXaa=(Val, Thr, AlaまたはIle); 残基97の Xaa=(Arg,Lys,Val, AspまたはGlu); 残基98のXaa=(Ala, Gly, GluまたはSer); 残基100 のXaa=(GlyまたはAla); および残基102 のXaa=(HisまたはArg)。
【００４９】
本発明においてモルフォゲンとして使用するための特に有用なシーケンスとしては，例えば，Ｖｇｌ，Ｖｇｒ−１，ＤＰＰ，ＯＰ−１，ＯＰ−２，ＣＢＭＰ−２Ａ，ＣＢＭＰー２Ｂ，ＧＤＦ−１（表ＩＩ；それぞれシーケンスＩＤ５番ー１４番）のＣ末端９６ー１０２アミノ酸残基を含むＣ末端ドメイン；ならびに６０Ａ，ＢＭＰ３，ＢＭＰ５およびＢＭＰ６（表ＩＩ；それぞれシーケンスＩＤ２４番ー２８番）のＣ末端ドメインからなるタンパク質などが挙げられる。これらの全ては，少なくとも保存６または７システイン骨格を含んでいる。更に，アメリカ特許第５０１１６９１号に記載されているＣＯＰ−１，３−５，７，１６のような一般アミノ酸シーケンスからデザインされた生合成構成物もまた有用である。インヒビン／アクチビンタンパク質も含まれる（アメリカ特許第４９６８５９０号および第５０１１６９１号）。したがって，その他の有用なシーケンスは，上述したいずれのシーケンスとも，少なくとも７０％のアミノ酸シーケンスホモロジーもしくは類似性，好ましくは８０％のアミノ酸シーケンスホモロジーもしくは類似性を有しているものが好ましい。これらのシーケンスは，対立遺伝子および種変異型や突然変異型，さらには生合成突然変異タンパク質ばかりでなく，タンパク質のこの形態形成ファミリーをも含まれることは明らかに予想される。特に，関連タンパク質のファミリーに含まれるものとしては，形態形成活性を示すタンパク質や，好ましいシーケンスからのアミノ酸変換が同類変換（例えば，Dayoff, et al: Atlas of Protein Sequence and Structure; ５巻追補３，３４５ー３６２頁，(M.O. Dayoff, ed., Nat'1 BioMed. Research Fdn., Washington, D.C. 1979) ）を含むものなどが挙げられる。本発明に使用されるものとして潜在的に有用であるシーケンスとしては，ニードルマン法（Needleman, et al: J.Mol. Biol., 48: 443-453 (1970)）を用いて得られた公知のモルフォゲンシーケンスも含まれる。その同一性はアライン（Ａｌｉｇｎ）プログラムによって計算される。本明細書で使用する「ホモロジー」または「類似性」という用語はＤａｙｏｆｆらによって定義されるような許容された同類置換も含まれる。
【００５０】
本発明においてモルフォゲンとして有用な現在もっとも好ましいタンパク質シーケンスは，例えば，ｈＯＰ１の保存６システイン骨格を規定するアミノ酸シーケンス（例えば，シーケンスＩＤ５番の残基４３−１３９）と，例えば，６０％以上の同一性，好ましくは６５％以上の同一性を有するものである。これらのもっとも好ましいシーケンスは，キイロショウジョウバエからの６０Ａタンパク質の他に，ＯＰ−１およびＯＰ−２タンパク質の対立遺伝子と種変異型を含んでいる。したがって，本発明の別の好ましい態様において，有用なモルフォゲンとしては，本明細書で「ＯＰＸ」と指称する一般アミノ酸シーケンスを持つポリペプチド鎖からなる活性タンパク質も含まれる。それはＯＰ−１として同定された種々の種とＯＰ−２（シーケンスＩＤ２９番）として同定された種々の種との間のホモロジーを持っている。
【００５１】
本発明に係る方法，組成物ならびに装置に有用なモルフォゲンとしては，天然の源から単離されたかどうかや組換えＤＮＡもしくはその他の合成技術で作製したかどうかにかかわらず，前述したポリペプチド鎖のいずれからなるタンパク質ばかりでなく，天然もしくは生合成の突然変異株のタンパク質の対立遺伝子ならびに種変異型や，種々の切形の構成物ならびに融合構成物も含まれる。その変更が折り畳まれた構造中のこれらのシステインの関係が機能的に崩壊させない限り，保存Ｃ末端システイン骨格を変更するものであっても，削除または付加突然変種も活性であるといえる。したがって，かかる活性の形態は本明細書に具体的に記載した構成物と均等物であると考えられる。
このタンパク質としては，種々の異なるグリコシレーションパターン形のもの，Ｎ末端，アミノ酸シーケンスホモロジーの領域を有する関連タンパク質ファミリーならびに，ホスト細胞中の組換えＤＮＡの発現によって作製された，天然または生合成のタンパク質の活性切形もしくは変異させた形態のものなどが含まれる。
形態形成タンパク質は，完全なまたは切形のｃＤＮＡからまたは原核細胞または真核細胞中の合成ＤＮＡから発現させることができ，その後精製，切断，再生，二量化して形態形成的に活性な組成物を作成する。現在好ましいホスト細胞としては，Ｅ．ｃｏｌｉや，ＣＨＯ，ＣＯＳもしくはＢＳＣ細胞のようなほ乳動物の細胞が挙げられる。本発明に係る方法ならびに組成物に有用なモルフォゲンについての詳細は，１９９１年８月３０日付けのアメリカ特許出願第７５２７６４号と１９９１年３月１１日付けの同第６６７２７４号に記載されている。これらの記載も本明細書に参照として組み込まれているものとする。
【００５２】
つまり，本明細書の開示から，遺伝子工学の当業者であれば，適当なアミノ酸シーケンスをコードする種々の異なる種のｃＤＮＡもしくは遺伝子ライブラリーから遺伝子を単離することまたオリゴヌクレオチドからＤＮＡを構築することができ，次いで，原核細胞もしくは真核細胞を含む，種々の形式のホスト細胞中に発現させて，人を含むほ乳動物において，骨形成を促進するおよび／または異常な骨劣化を阻止することができ，適当な骨実質を維持しかつ骨再生および成人の骨組織を発達させるのに使用する活性タンパク質を大量に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
本明細書に記載されたタンパク質が，ほ乳動物に対して全身的に付与されたりまたはその骨組織に向けて注入されたときには，骨実質喪失の防止しおよび／または骨形成を刺激するための有効な薬剤であることが見いだされた。前述したように，これらのタンパク質（モルフォゲン）は，骨再生サイクルの失調の原因となったりおよび／または骨格の微小構造の劣化の原因となる代謝性骨疾患ならびにその他の傷害の治療に使用することができる。
【００５４】
本発明は，ほ乳動物における骨組織の形態形成を誘発することができる形態形成タンパク質のファミリーの発見に基づいている。更に詳細には，本発明は，胚形成ばかりではなく，幼若ならびに成長したほ乳動物における骨組織の成長，維持ならびに修復においても重要な役割を果たしていることを見いだしたことに基づいている。
【００５５】
モルフォゲン（ＯＰ−１，ＣＭＢＰ２，ＤＰＰ，６０Ａタンパク質などや，ＣＯＰ５，ＣＯＰ７などの種々の生合成構造物を含む）を，ほ乳動物の皮下部に対して適当なマトリックスと共に移植すれば，アルカリ性ホスファターゼの特異的活性，12日目の移植片のカルシウム含量ならびに組織構造（例えば，アメリカ特許第4,968,590号，第5,011,691号，ＵＳＳＮ第752,857号を参照のこと。なおこれらの内容は本明細書の参照として記載の１部をなしている）によって特定されたように, 完全に機能的に新規な骨の形成につながる一連の細胞事象を誘発する。モルフォゲン含有移植片は近接の間葉の幹細胞を漸増し，それらの分化を軟骨細胞に５ー７日以内に変化させてしまう。毛細管浸入によって，軟骨細胞肥大が石灰化して，結果的には９ー１２日経つと新しく形成された骨によって置換される。無機化した骨はついで大幅に再生され，１４ー２１日までには機能的な骨髄要素で満たされた小骨によって占有されることになる。
【００５６】
前述したように，本明細書に例示したモルフォゲンは，生体外(in vitro)において造骨細胞の増殖，成長ならびに分化を刺激し（実施例２ー７参照），かつ，ほ乳動物に対して会合したマトリックスキャリヤーなしに全身的に付与されたりまたはその骨組織に向けて注入されたときには，生体内(in vivo)で骨粗しょう症の骨組織中での骨形成を誘発することができる（実施例８および９参照）。更に，モルフォゲンは，活性化された初期単核食細胞の多核化を阻止する（実施例１２参照）。さらにまた，内在するモルフォゲン活性の阻止はほ乳動物の通常の骨格発達を阻止する（実施例１３参照）。
【００５７】
実施例１および出願中であるUSSN第752764号ならびに第752861号（これらの記載は本願の記載の１部として引用する）に詳細に記載したように，天然のモルフォゲンは，体内の異なる組織に広く分布している。例えば，ノーザンブロットハイブリダイゼーションによって特定されるように，ＯＰ−１は泌尿管（例えば，腎臓ならびに膀胱組織）中で主に発現される。対照的に，Ｖｇｒ−１，ＢＭＰ３，ＢＭＰ４ならびにＢＭＰ５は心臓や肺で主に発現されているようである。ＧＤＦ−１は脳組織で主に発現されているようである（例えば，Ozkaynak et al: JBC 参照）。更にまた，合成組織は特異的なモルフォゲンの自然の活動部位とは異なっている。例えば，OP−１は腎臓組織にて主に合成されているようであるけれども，このタンパク質は骨組織において活性化されている。さらに，少なくとも１つのモルフォゲン，ＯＰ−１は，唾液，ミルク（ほ乳動物の腺抽出物，初乳や５７日乳を含む）や血清（実施例１１参照）などの数多くの体液中に存在している。したがって，所定の原理に限定されることなく，例示したモルフォゲンは，内分泌因子，例えば，特定の刺激に反応する因子産生組織から分泌されるタンパク質などとして行動し，離れた部位の組織に輸送され作用することができる。これらの発見によって，モルフォゲンが，タンパク質が作用している組織にて産生される局在もしくはオートクリン因子として作用するところのTGF−βタンパク質を含む，その他のＴＧＦ−βスーパーファミリーのその他の構成員と更に区別される。
【００５８】
そのプロドメインは，タンパク質の溶解度を高めたりおよび／または特定の組織に対してモルフォゲンが組織標的とするに際しての助けとなる機能を果たすことができる。例えば，ＯＰ−１の成熟した，活性化された形態は，完全なシーケンスのプロドメインに会合した細胞から分泌されているようである。従って，本明細書で説明するように，本発明において有用なモルフォゲンは，いかなる原理にも限定されることなく，活性なドメイン中に重要なアミノ酸シーケンスホモロジーを有しかつ組織の形態形成を誘発する能力が類似しているけれども，形態形成タンパク質ファミリーの構成員の中でのシーケンスの違いは、自然条件下において特異的な組織内で各モルフォゲンが果たしている異なる特異的な役割を反映していると仮説することができる。例えば，プロドメイン中の重大なシーケンスの変化は，そのタンパク質シーケンスのこれらの領域が特定のモルフォゲンを形態形成活性のための異なる組織に対して標的として作用させることにおいて重要であることを意味しているということができる。
【００５９】
従って，本発明は２つの基本的な態様からなっている。一つの態様においては，本発明の方法ならびに組成物は，個体に投与した場合，その個体における骨実質喪失の防止しおよび／または骨形成を刺激することができるモルフォゲンからなっている。更に別の態様においては，本発明に係る方法ならびに組成物は，個体に投与した場合，その個体における骨実質喪失の防止しおよび／または骨形成を刺激することが可能な程度に治療的に有効な濃度にまで，その個体において十分な内在性モルフォゲンの発現および／または分泌を誘発することができるモルフォゲン刺激剤からなっている。
【００６０】
実施例１４は，モルフォゲン刺激剤の候補を同定するために化合物をスクリーニングするためのアッセイを説明するものである。モルフォゲン刺激剤の候補を同定するために化合物をスクリーニングするための有用なアッセイについての説明もまた本ＵＳＳＮ第７５２８６１号（この記載は本願の記載の１部として引用する）に記載されている。その候補モルフォゲン刺激剤は，その生体内（in vivo)での有効性を，例えば，実施例８および９に記載した骨粗しょう症モデルを使用して試験することができる。
【００６１】
以下に，本発明に係る方法ならびに組成物に有用な適当なモルフォゲンならびにそのモルフォゲンおよび／またはモルフォゲン刺激剤を投与かつ適用するための方法について，詳細に説明する。更に，（１）前述したモルフォゲンならびにモルフォゲン刺激剤がヒトにおける骨実質喪失の防止するためおよび／または骨形成を刺激するための治療剤として適当であることを例示し，かつ，（２）モルフォゲンならびにモルフォゲン刺激剤の候補をその有効性のために試験するアッセイ法を提供する例はこれらに限定されるものではない。
【００６２】
Ｉ．有用なモルフォゲン
前述したように，タンパク質が，最終的には臓器特異的な新しい組織に形成される細胞や分子の事象の発達カスケードを誘発することができ，かつ，少なくとも保存Ｃ末端６システイン骨格またはその機能的均等シーケンスを有するならば，そのタンパク質は形態形成性がある。具体的には，モルフォゲンは，一般的には，形態形成が許容される環境下において以下の生物学的機能の全てを発揮することができる：祖先細胞（プロジェニターセル）の増殖を刺激すること；祖先細胞（プロジェニターセル）の分化を刺激すること；分化した細胞の増殖を刺激すること；ならびに変形した細胞の再分化を含む，分化した細胞の成長ならびに維持を支援すること。いかにかかるモルフォゲンが本発明に係る方法において有用であるかについては，本明細書の始めに説明している。更にまた，いかにしてかかるモルフォゲンが製造され，使用され，形態形成活性の試験されるかについては，１９９１年８月３０日付けのアメリカ特許出願第７５２７６４号と１９９１年３月１１日付けの第６６７２７４号に記載されている。これらの記載も本明細書に参照として組み込まれているものとする。それらに記載されているように，モルフォゲンは，天然源の物質から精製すること，または，それらに記載された遺伝子シーケンスを用いて，原核細胞もしくは真核細胞のホスト細胞から遺伝子組換えによって産生することができる。その他にも，新規なモルフォゲンシーケンスはそれらに記載された以下の手順に従って同定することができる。
【００６３】
特に有用なタンパク質としては，表ＩＩに例示した天然由来のシーケンスからなるものが含まれる。その他の有用なシーケンスとしては，アメリカ特許第５０１１６９１号（この開示も本明細書の記載の１部を構成するするものとする）に記載されているように，生合成構造物（例えば，ＣＯＰ−１，ＣＯＰ−３，ＣＯＰ−４，ＣＯＰ−５，ＣＯＰー７，ＣＯＰ−１６など）が含まれる。
【００６４】
従って，本発明に係る方法ならびに組成物において有用なモルフォゲンはまた，前述されたシーケンスのいずれとも，そのホモロジー（類似性）が７０％，好ましくは８０％のアミノ酸シーケンスを有する形態形成的に活性なタンパク質であると記載することもできる。なお，「ホモロジー」は前述した通りである。
【００６５】
本発明に係る方法において有用なモルフォゲンはまた，本明細書に記載した６個の一般シーケンス（一般シーケンス１，２，３，４，５，６）のいずれによっても記載することができる。一般シーケンス１ならびに２はまた，そのＮ末端が下記のシーケンスを有していてもよい：
【００６６】
Ｃｙｓ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ（シーケンスID15番）
１                              ５
【００６７】
下表ＩＩは，モルフォゲンとして同定された天然タンパク質の活性な領域のアミノ酸シーケンスを比較したものである。かかるモルフォゲンとしては，ヒトＯＰ−１（ｈＯＰ−一：シーケンスＩＤ５番ならびに１６ー１７番）；マウスＯＰ−１（ｍＯＰ−１：シーケンスＩＤ６番ならびに１８ー１９番）；ヒトならびにマウスＯＰ−２（シーケンスＩＤ７番，８番ならびに２０ー２３番）；ＣＢＭＰ２Ａ（シーケンスＩＤ９番）；ＣＢＭＰ２Ｂ（シーケンスＩＤ１０番）；ＢＭＰ３（シーケンスＩＤ２６番），ＤＰＰ（キイロショウジョウバエから：シーケンスＩＤ１１番）；Ｖｇｌ（ツメガエルから：シーケンスＩＤ１２番）；Ｖｇｒ−１（マウスから：シーケンスＩＤ１３番）；ＧＤＦ−１（マウスから：シーケンスＩＤ１４番，３２番ならびに３３番）；６０Ａタンパク質（キイロショウジョウバエから：シーケンスＩＤ２４番ならびに２５番）；ＢＭＰ５（シーケンスＩＤ２７番）およびＢＭＰ６（シーケンスＩＤ２８番）が含まれる。シーケンスは，実質的には，文献の方法（Needleman et al: J. Mol. Biol.  第４８巻，４４３ー４５３頁，１９７０年）に従って調整され，アライン（Ａｌｉｇｎ）プログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ）を用いて算出される。表中において，３つの点からなる記号は，その位置のアミノ酸がｈＯＰ−１におけるアミノ酸と同一であることを示している。３つのダッシュからなる記号は，その位置にはアミノ酸が存在しないことを示しており，ホモロジーを表すために示している。例えば，ＣＢＭＰ−２ＡならびにＣＢＭＰ−２Ｂの残基６０のアミノ酸は抜けている。もちろん，この領域の両方のアミノ酸シーケンスはＡｓｎ−Ｓｅｒ（残基５８，５９）からなっており，またＣＢＭＰ−２ＡはＬｙｓとＩｌｅとからなり，ＣＢＭＰ−２ＢはＳｅｒとＩｌｅからなっている。
【００６８】
表II
2007197455.tif 000006
2007197455.tif 000007
2007197455.tif 000008
2007197455.tif 000009
2007197455.tif 000010
2007197455.tif 000011
【００６９】
前述したアミノ酸シーケンスの比較により明らかなように，形態形成活性を保持しながら，一般シーケンス内において重要なアミノ酸の変化をさせることができる。例えば，表ＩＩに示したＧＤＦ−１タンパク質のシーケンスは，記載したｈＯＰ−１のシーケンスとは約５０％しかアミノ酸の同一性はないけれども，ＧＤＦ−１シーケンスはｈＯＰ−１シーケンスとは７０％以上のアミノ酸シーケンスホモロジー（または類似性）を有している。ここで「ホモロジー」または「類似性」とは，文献（Dayoff, et al: Atlas of Protein Sequence and Structure第５巻，追補３，３４５ー３６２頁（M. O. Dayoff, ed., Nat'1 BioMed. Res. Fd'n, Washington D.C. 1979 ）によって定義されているようなシーケンス中における許容された同類アミノ酸の変化をも包含している。
【００７０】
本発明におけるモルフォゲンとして有用な，現在もっとも好ましいタンパク質シーケンスとしては，ｈＯＰ−１の保存６システイン骨格を規定するアミノ酸シーケンスと，その同一性が６０％以上，好ましくは６５％以上であるものが含まれる（例えば，シーケンスＩＤ５番の残基４３ー１３９）。これらのもっとも好ましいシーケンスとしては，キイロショウジョウバエからの６０Ａタンパク質を含むＯＰ−１ならびにＯＰ−２タンパク質の相対遺伝子ならびにそれらの種変異型が含まれる。従って，本発明の更に別の好ましい態様においては，本発明は，７システイン骨格を規定し，またマウスならびにヒトＯＰ−２タンパク質として同定された種種のタンパク質の間での同一性を保有しているところの，本明細書において「ＯＰＸ」と称される一般アミノ酸シーケンスを有するポリペプチドのスピーシーズ（種）からなるモルフォゲンも含まれる。ＯＰＸのシーケンスＩＤは２９番である。前述したように，所定の位置の残基Ｘａａは，マウスまたはヒトOP−１またはＯＰ−２のＣ末端シーケンスにおける対応位置に存在する残基から独立して選択される（シーケンスＩＤ５番ー８番および／またはシーケンスＩＤ１６番ー２３番）。
【００７１】
ＩＩ．治療用薬剤を投与するための配合物ならびに方法
モルフォゲンは，適当な手段，好ましくは直接に，非経口投与または経口投与によって個体に付与される。モルフォゲンは直接的に（例えば，局所的に，注射などによって骨組織部位への投与）または非経口的に例えば，静脈投与，皮下投与，筋肉注射，眼か内投与，点眼投与，心室内投与，頭蓋骨内投与, 腹腔内投与，口腔内投与，直腸内投与，ちつ内投与，鼻腔内投与などのような手段によってまたはエアロゾールなどによって投与することができる。更に，モルフォゲンは水溶液の１部とするのが好ましい。この溶液は生理学的に許容されるので，好ましいモルフォゲンを患者に投与されることに加えて，その溶液は患者の電解質ならびに容量バランスに対して悪影響を及ぼすことはない。従って，モルフォゲンの水溶媒体は通常の生理食塩水（９．８５％ＮａＣｌ，０．１５Ｍ）ｐＨ７−７．４からなっている。モルフォゲンを含有している水溶液は，例えば，ア
セトニトリルの０.１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）または0.１％ＨＣｌ溶液または均等な溶媒を含む５０％エタノール溶液にタンパク質を溶解することによって調製することができる。得られた溶液の１倍量を，例えば，１０倍量のリン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）に添加する。このＰＢＳには更に０．１ー０．２％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が含まれていてもよい。得られた溶液はよく撹判するのが好ましい。所望に応じて，所定のモルフォゲンは，適当な分子と会合させてより溶解性を高めることもできる。例えば，成熟したダイマーをモルフォゲンのプロドメインと会合させると，そのタンパク質の溶解度が著しく増加する。実際に，内在性のタンパク質は，この形態で運搬されていると考えられている。溶解度を高めることができる別の分子，特に経口投与に有用なものとして，カゼインが挙げられる。例えば，０．２％カゼインを添加すると, 成熟した活性な形態のＯＰ−１の溶解度を８０％も増加することができる。ミルクおよび／または種々の血清タンパク質中に見いだされるその他の成分もまた有用である。
【００７２】
経口または非経口投与に有用な溶液は，医薬界ではよく知られている文献（例えば，Remington's Pharmaceutical Sciences (Gennaro, A., ed.) Mack Pub.１９９０年）に記載された方法であればいずれの方法でも調製することができる。配合物には、例えば，ポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコール，植物由来の油脂，水素化ナフタレン類などが含まれていてもよい。直接投与用配合物は，特に，グリセロールならびに高粘度の組成物を含んでいてもよい。例えば，ヒアルロン酸，コラーゲン，トリカルシウムリン酸，ポリブチレート，ラクチド，ラクチド／グリコリドコーポリマーなどの生適合性，好ましくは生吸収性ポリマーは，生体内（in vivo)でのモルフォゲンの放出を制御する有用な賦形剤である。これらのモルフォゲンのための潜在的に有用な非経口デリバリーシステムとしては，エチレンービニル酢酸コポリマー粒子，浸透圧ポンプ，移植可能な注入システム，リポゾームなどが挙げられる。吸入投与用配合物としては，賦形剤として，例えば，ラクトースを含んでいてもよく，また，例えば，ポリオキシエチレンー９ーラウリルエーテル，グリココール酸塩，デオキシコール酸塩などを含んでいてもよい水溶液であっても，鼻腔内点滴での投与用油性溶液であっても，さらには鼻腔内適用されるゲルであってもよい。非経口投与用配合物としてはまた，口腔投与用のグリココール酸塩，肛門投与用のメトキシサリチル酸塩またはちつ投与用のキュトリックアシッド（ｃｕｔｒｉｃ  ａｃｉｄ）を含んでいてもよい。
【００７３】
その他に，本明細書に記載したモルフォゲンは経口でも投与することができる。治療剤としてタンパク質の経口投与は，ほとんどのタンパク質がほ乳動物の消化器官にある消化酵素や酸によって血液中に吸収される前に容易に分解されてしまうので，一般には行われていない。しかしながら，本明細書に記載されたモルフォゲンは，酸に対して安定であり，プロテアーゼに対して抵抗性を持っている（例えば，アメリカ特許第４９６８５９０号）。更に，少なくとも１つのモルフォゲン，ＯＰ−１は、ウシの乳房腺抽出物，初乳ならびにミルク（実施例１０）や唾液の中で同定されている。加えて，乳房腺抽出物から精製されたＯＰ−１は，形態形成的に活性化されていることが示されている。具体的には，このタンパク質は，例えば，アメリカ特許第４９６８５９０号に記載されたような，生体内（in,vivo)での標準的な骨アッセイ法を用いて，適当なマトリックス物質に関連して皮下に移植した場合，ほ乳動物において軟骨細胞形成を誘発することが示されている。更にまた，内在性のモルフォゲンも血流中に検出されている（実施例１１）。これらの知見は，経口ならびに非経口投与が個体に対してモルフォゲンを投与するための有効な手段であることを示している。更に，本明細書に記載したある種のモルフォゲンの成熟した形態は典型的にはほとんど溶解しないのに対して，ミルク（ならびに乳房腺抽出物や初乳）中に見いだされた形態のモルフォゲンは，おそらく成熟した形態形成的に活性化された形態が完全なシーケンスのプロドメインと会合することおよび／または１つまたはそれ以上のミルク成分と会合することによって容易に溶解する。従って，本明細書に示された化合物は，生体外(in vitro)または生体内（in vivo) においてそれらの溶解度を高めることができる分子，例えば，モルフォゲンプロドメインの１部または全てならびにカゼインなどと会合することができる。
【００７４】
また，本明細書に記載した化合物は，モルフォゲンまたはモルフォゲン刺激剤が骨組織を標的とすることができる分子と会合することができる。例えば，テトラサイクリンやジリン酸塩などは，ほ乳動物に対して全身的に付与された場合に，特に骨再生領域で骨の無機物に結合することが知られている。また，骨組織細胞の表面分子と特異的に相互作用する抗体またはその他の結合タンパク質もまた使用することができる。かかる標的分子はまた，当業者であればよく知っている標準的な化学手段を用いて，例えば，Ａｓｐ−Ｐｒｏ結合のような，酸に対して不安定な結合を介してモルフォゲンまたはモルフォゲン刺激剤と共役的に結合することもできる。骨再生部位での局在環境は酸性であるので，かかる酸不安定結合はこれらの部位で好ましくは切断され，所望の部位で活性なモルフォゲンまたはモルフォゲン刺激剤を産生するものと期待される。有用な標的分子は、例えば，アメリカ特許第5,091,513号に開示された単一鎖結合部位技術を用いて，調製することができる。
【００７５】
前述したように，本明細書に記載したモルフォゲンは，Ｃ末端の活性なドメイン中の重要なシーケンスホモロジーを共有している。対照的に，プロドメインを規定しているシーケンス中ではそのシーケンスは分岐している。従って，プロドメインはモルフォゲン特異的である場合がある。前述したように，今日同定されている種々のモルフォゲンは異なる組織中で特異的に発現される。従って，いかなる所定の原理に限定されることなく，体内の自然の条件下では，選択されたモルフォゲンは典型的には所定の組織に作用することは当然にあり得ることである。
【００７６】
従って，溶液中においてモルフォゲンが活性な形態で会合して同定されたプロドメインの１部または全ては，本明細書に記載したモルフォゲンに対して分子を標的とするのに役立つことができる。例えば，プロドメインは標的組織で１つまたはそれ以上のプロドメインと特異的に相互作用して，プロドメインに会合したモルフォゲンをその組織に導くことができる。従って，モルフォゲンを骨組織に標的として導くために有用なその他の標的分子は，モルフォゲンのプロドメインの１部または全部，特にＯＰ−１，ＢＭＰ２またはＢＭＰ４のプロドメインの１部または全部である。これらタンパク質は骨組織と自然では会合して見いだされている。
【００７７】
最後に，本明細書に記載したモルフォゲンまたはモルフォゲン刺激剤は，単独でも，過剰な骨喪失の危険性がある個体において適当な骨再生サイクルを維持することに有用な効果を持っていることが知られているその他の分子と組み合わせて投与することができる。有用な補因子の例としては，ビタミンＤ３，カルシトニン，プロスタグランジン，甲状腺ホルモン，デキサメタゾン，エストローゲン，ＩＧＦなどが挙げられる。
【００７８】
本明細書に記載した化合物は，医薬的に許容される，非毒性の賦形剤や担体と混合して配合することができる。前述したように，かかる組成物は，非経口投与ができるように，特に溶液または懸濁液の形態で，また経口投与ができるように，特に錠剤またはカプセル剤の形態で，さらに鼻腔内投与ができるように，特に点鼻ドロップやエアロゾルの形態で調製することができる。
【００７９】
組成物は，ヒトまたはその他のほ乳動物に対して，非経口または経口投与するために，治療的に有効な分量，例えば，前述したような代謝性骨疾患ならびにその他の骨再生障害を患っている個体に対して，骨実質喪失を阻止しおよび／または骨形成を刺激するのに十分な期間適当な濃度のモルフォゲンを骨組織に付与することができる分量になるように配合することができる。治療的に有効な濃度はまた，骨折や骨格の微小構造における欠損を修復すること，また，骨実質劣化の危険性がある個体を保護することを含めて，幼若者や成人の発達において適当な骨実質の維持を強化することに十分である。
【００８０】
当業者であれば容易に予測されることであるが、治療用組成物中の化合物の濃度は、投与する薬剤の用量、使用する化合物の化学的特徴（例えば、疎水性）、投与経路などの種々の因子によって変えることができる。投与する薬剤の好ましい用量はまた骨喪失ならびに欠損の形式と程度、特定の患者の全体的な健康状態、選択された化合物の相対的な生物学的有効性、賦形剤の化合物の配合ならびに投与ルートに依存する場合がある。一般的にいえば、本発明の化合物は、非経口投与用の化合物を約０. １％ないし１０％ｗ／ｖの割合で含有する生理バッファー溶液として付与することができる。典型的な用量範囲は、１日当たり体重１ｋｇ当たり約１０ｎｇ／ｋｇないし１ｇ／ｋｇであり、好ましくは１日当たり体重１ｋｇ当たり約０．１μｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／ｋｇである。最適には、全ての場合において与えられるモルフォゲンの用量は，患者体重１ｋｇ当たり１日当たりタンパク質が２ー２０μｇ／ｋｇの間である。溶解性モルフォゲンの骨組織に対する局所注射のための現在好ましい用量範囲は，注射１回当たりモルフォゲンが0.1 ー５０μｇ／ｋｇの間である。例えば，成熟したモルフォゲン（例えば，ＯＰ−１を２０μｇ）を２１日間連続して通常の成長しているラットに毎日投与しても，明白なモルフォゲン誘発病理学的症状は誘発されていない。更に，モルフォゲン（例えば，ＯＰ−１）１０μｇを通常の新生マウスに全身的に注射した場合でも何等大きな異常は生じていない。
【００８１】
[実施例１]
モルフォゲン−発現組織の同定
モルフォゲンの組織分布を決定することは、新規の関連するモルフォゲンを同定するためにもまた与えられた組織中に発現された異なったモルフォゲンを同定するためにも用いることが出来るだろう。同様に組織分布はモルフォゲン刺激試薬の同定とスクリーニングに用いるための有用なモルフォゲン−生産組織を同定するのに用いられるだろう。モルフォゲン（あるいはｍＲＮＡ転写産物）は容易に標準的な方法や発現が低い組織において本法のわずかの修飾で同定される。例えば、蛋白質分布は標準的なウエスタンブロット分析あるいは免疫蛍光技術とモルフォゲンあるいはモルフォゲン関連の特異的な抗体を用いて測定される。同様に、モルフォゲン転写産物の分布も標準的ノーサンハイブリダイゼーション法と転写物−特異的プローブを用いて同定されうる。
【００８２】
転写物に特異的にハイブリダイズでき、そして他の関連する転写物と区別できる如何なるプローブも用いることが出来る。ここで述べたモルフォゲンは、Ｃ−末端ドメイン中に高い配列ホモロジーを有していることをここのなかで述べたので、特異的モルフォゲン転写物の組織分布は未成熟蛋白のｐｒｏ領域に対して特異的なプロ−ブを用いるか及び／又は成熟蛋白のＮ−末端領域を用いて同定される。
他の有用な配列は３’非コーデング領域フランキングとそのすぐ後の終末コドンである。これらの部位の配列は本発明のモルフォゲン種間で異なっている、それ故各々の蛋白質に対して特異的である。例えば、特に有用なｖｇｒ−１−特異的プローブ配列はＰｖｕII−ＳａｃＩ断片であって、非翻訳プロ領域の部分と成熟配列のＮ−末端両者をコードする２６５ｂｐからなる（ｃＤＮＡ配列の記述についてはライオンス他 (１９８９)
ＰＮＡＳ  86：４５５４−４５５８を参照）。
【００８３】
同様に、特に有益なｍＯＰ−１- 特異的プローブ配列は、ｍＯＰ−１プロ領域の約２／３をカバーする０．６８Ｋｂの配列であるＢｓｔＸ１−ＢｇｌＩ断片；７−システインドメインのすぐ上流の０．２Ｋｂの配列であるＳｔｕI−ＳｔｕＩ断片；そして３’非翻訳配列の部分を含む0.3 Ｋｂ  断片であるＥａｒ１−Ｐｓｔ１断片である（プロ領域が残基３０−２９１によって実質的に規定されるシーケンス番号１６を参照）。同様のアプローチは例えばｈＯＰ−１（シーケンス番号１６を参照）、あるいは、ヒトもしくはマウスＯＰ−２（シーケンス番号20と２２）に用いられる。
【００８４】
これらの合成的手法かクローン化配列から得られるであろうモルフォゲン−特異的プローブを用いて、モルフォゲン転写産物は通常の当該分野の熟練研究者が知り得る標準的な方法を用いて哺乳類組織中で同定することができる。主に全ＲＮＡは種々の成熟マウス組織（例  肝、腎、精巣、心臓、脳、甲状腺そして胃）からチョムツアスキー他((１９８７）Anal. Biochem 162;156-159 ）の方法及び以下に述べるような標準的方法によって調製される。ポリ（Ａ）ＲＮＡがオリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィー（例  ファーマシア  ＬＫＢ  バイかオテクノロジー（株）からのＴｐｅ７）を用いて調製される。各々の組織からポリ（Ａ）ＲＮＡ（一般的に１５μｇ）１％アガロース／ホルムアルデヒドゲルを用いて分画されそしてニトラン膜（シュライヒアー＆シュエル）上に移される。移した後、膜は８０℃に加熱しＲＮＡは紫外光の元で架橋形成される（一般に１ｍＷ／ｃｍ２  で３０秒間）。
【００８５】
ハイブリダイゼーション前に適当なプローブを加熱して変性した。ハイブリダイゼーションは，ローラボトル装置で４０％ホルムアミドのハイブリダイゼーションｍｉｘ，５×Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ，５×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳを用いて約１ｒｅｖ／分，３７℃で約１５時間ルーサイトシリンダー中で行った。ハイブリダゼーションに続いて非特異的カウントは５０℃で０．１×ＳＳＰＥ，０．１％ＳＤＳで濾過洗浄した。
【００８６】
発生中のおよび成熟組織におけるＶｇｒ−１，  ＯＰ−１，  ＢＭＰ２，  ＢＭＰ３，  ＢＭＰ４，ＢＭＰ５，ＧＤＦ−１そしてＯＰ−２を含有する種々の組織内分布を開示した実施例が、本文中に参照として取入れられた出願中のＵＳＳＮ  752,７６４とオズカイナク他（１９９１）Biochem. Biophys. Res. Commn. １７９：１１６−１２３およびオズカイナク他(1992)（ＪＢＣ、出版中）示されている。
【００８７】
ここで述べた一般的プローブ化方法、例えば脳、脾臓、肺、心臓、肝臓そして腎臓組織をプローブするため、これらモルフォゲンに対する特異的プローブを用いてノーサンブロットハイブリダイゼーションを実施し、腎臓関連組織がＯＰ−１のプライマリーの発現ソースであって、脳、心臓そして肺組織が２次的なソースであることが示された。肺組織はＶｇｒ−１，  ＢＭＰ５，  ＢＭＰ４そしてＢＭＰ３に対するプライマリーの組織発現ソースであると思われた。低レベルのＶｇｒ−１は同様に腎臓と心臓組織に見られ、そして肝臓はＢＭＰ５の２次的な発現組織であると思われた。脾臓はＢＭＰ４に対して２次的発現ソースであるように思われた。ＧＤＦ−１は脳組織に主として現われる。最近、ＯＰ−２は初期胚組織においてプライマリーに発現されるように思われた。特にマウス胚と誕生後６日目の動物はノーサンブロットによって８日胚において高いＯＰ−２発現を示す。発現は１７日胚で有意に減少し誕生後の動物では検出されない。
【００８８】
[実施例２]
ラットとヒト骨牙細胞におけるモルフォゲンのミトゲン効果
骨牙細胞の増殖を誘導するモルフォゲンの活性が下記の分析法によってインビトロで測定される。骨牙細胞培養を含む本例および全ての実施例において、ラット骨牙細胞の初代培養が好んで用いられた。本培養は個々の細胞が分化の異なったステージにあるという点においてヘテロジェナスであるけれども、培養は、確立された細胞系から得られた骨牙細胞よりもより実質的にインビボでの代謝と骨牙細胞の機能を反映すると信じられている。他に示されていないけれども、全ての使われた化学物質は標準的なもので市販で利用できる試薬であって、シグマ化学（株）．，セントルイス、カルビオケミ（株）．，サンジエゴそしてアルドリッチ化学．，ミルウオーキー等多くの企業より容易に購入できる。
【００８９】
ラットの骨牙細胞に富んだ初代培養が縫合の無い新生児ラットカルバリア（例．，ロングエバンス系の１ー２日例動物、チャールスリバー研、ウイルミントン、マサチュ−セッツ）の段階的コラゲナーゼ消化とそれに続く標準的な方法、例えばワング他（１９７５）ＰＮＡＳ  ７２：３１６７−３１７１に述べられた様な方法によって調製される。ラット単一細胞分散液が次に１０％ＦＢＳ（胎児牛血清）、Ｌーグルタミンとペニシリン／ストレプトマイシンを含むアルファＭＥＭ（修飾イーグル培地、ギブコ（株）．，ロングアイランド）培地中でウエルあたり５０，０００骨牙細胞の濃度でマルチウエルプレート（４８穴プレート）上に移された。細胞は３７℃で２４時間インキュベートされ次に生長培地は１％ＦＢＳを含むアルファＭＥＭ培地で置換されそして細胞はさらに２４時間インキュベートされた。その結果細胞は実験時には無血清生長培地中となった。
【００９０】
細胞培養は続いて３グループに分割された：（１）モルフォゲン０．１，１．０，１０．０，４０そして８０ｎｇを入れたウエル；（２）局所作用性生長因子の０．１，１．０，１０そして４０ｎｇを入れたウエル；そして（３）生長因子を入れないコントロールグループ。この実験において、ＯＰ−１が試験されたモルフォゲンであった、そしてＴＧＦーβは局所作用性生長因子であった。次に細胞は１８時間インキュベートされその後ウエルは  ３Ｈ−チミジンで２μＣｉ／ウエルで標識され６時間インキュベートされた。過剰の標識は次に0.15M ＮａＣｌの低温溶液で洗浄され、１０％トリクロロ酢酸の２５０μｌを各々のウエルに添加しウエルは３０分間室温でインキュベートされた。次に細胞は低温の蒸留水で３回洗浄され、そして３７℃３０分間１％ナトリウムドデシル硫酸（ＳＤＳ）の250 μｌを添加して溶解された。細胞溶解液は次に熟練研究者によって良く知られた標準的な手段を用いて収穫され、そして細胞の分裂能の指標として液体シンチレーションによって細胞ＤＮＡ中への3 Ｈ−チミジンの取り込みを測定した。結果は図１に示した。（四角によって図中に示した）ＯＰ−１はＤＮＡ中への３Ｈ−チミジンの取り込みを刺激する、そして骨牙細胞の増殖を促進する。無血清培地中でのＯＰ−１の４０ｎｇによって刺激された形態形成は１０％血清のみの形態形成効果に等しい。対象的に、（図１にダイアモンド印によって示したように）ＴＧＦーβの効果は一時的で二層性のものであった。高濃度でＴＧＦーβは骨牙細胞増殖に有意の効果をもたらさなかった。この系は細胞増殖におけるこれらの効果に対して他のモルフォゲンを試験するために用いられるであろう。
【００９１】
骨牙細胞増殖におけるモルフォゲンのインビトロ効果がヒト初代骨牙細胞（正常成熟人の骨組織から得、上記の方法で調製された）を得、そして骨芽ザルコーマ誘導細胞上で試験された。全ての場合に細胞増殖を誘導した。加えて、同様の実験がＢＭＰ４（ＢＭＰ２Ｂ）とＢＭＰ３を用いて達成され、これらのモルフォゲンが骨牙細胞増殖と生長を刺激することを同様に示した。（チェン他．，（１９９１）J. Bone and Min. Res. 6:1387-1393 とブキセビック（１９９１）ＰＮＡＳ  ８６：８７９３−８７９７を参照）。
【００９２】
与えられたモルフォゲンの骨細胞生長及び／または発生に対する効果が同様に様々の骨細胞マーカーを用いて試験される：例．，コラーゲン合成、アルカリホスファターゼ活性、副甲状線ホルモン仲介サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）生産、オステオカルシン合成そして骨芽細胞における骨化の石灰化を推測することによって。これらのうち、アルカリフォスファターゼ活性、副甲状線ホルモンー仲介ｃＡＭＰ生産、オステオカルシン合成そして石灰化促進は分化した骨牙細胞表現型の特異的マ−カ−である。コラーゲン合成と同様これらのパラメーターを試験するための実験系は実施例３−７に記述されている。全ての場合にモルフォゲンのみがこれらの表現型ー特異的マーカーの発現を刺激した。実施例３−７において  ＯＰ−１が試験されたモルフォゲンであった。ＢＭＰ４（ＢＭＰ２Ｂ）を用いて行なわれた同様の実験はこのモルフォゲンが同様に骨牙細胞分化を誘導することを示す。（チェン他（1991）T. Bone and Min.Res. 6: 1387-1392 およびブキセヴィック、（1989) ＰＮＡＳ８６：８７９３−８７９７．参照）。
【００９３】
[実施例３]
ラット骨牙細胞のコラーゲン合成におけるモルフォゲンの効果
ラット骨牙細胞のコラーゲン生産におけるインビトロでのモルフォゲンの効果が以下で測定される。
ラット骨牙細胞が調製され実施例２で述べたようにしてマルチウエルプレ−ト中で培養された。この実験において２４ウエルプレートが用いられた。培養細胞は次に３グループに分割された：（１）培地のｍｌ当り１，１０，４０ｎｇのモルフォゲンを受けたウエル；（２）培地のｍｌ当り局所作用性生長因子の１，１０，４０ｎｇを受けたウエル；そして（３）生長因子を受けなかったコントロールグループ。この実施例において、ＯＰ−１が試験されたモルフォゲンであるそしてＴＧＦ−βが局所作用性生長因子であった。
【００９４】
試料は湿潤化されたインキュベーター中で５％ＣＯ２  とともに３７℃で６８時間インキュベートされた。３Ｈプロリンの25μＣｉが各々のウエル中に添加されそして６時間インキュベートされた。細胞は次に−20℃でコラーゲン分析を行なうまで凍らせた。次に細胞は、全コラゲナ−ゼ消化性蛋白質中（ＣＤＰ)に３Ｈ−プロリンの取り込みを検出することによってコラーゲン生成を分析した。結果を図２に示した、ＯＰ−１は、全ＣＤＰ中への３Ｈ−プロリン取り込みによって測定されたようにタイプＩコラーゲン合成を刺激したことを示す。このように，ＯＰ−１は前骨牙細胞と成熟骨牙細胞によるインビトロコラーゲン合成を促進する。
【００９５】
[実施例４]
モルフォゲンによる骨牙細胞のアルカリフォスファターゼ誘導
４．１モルフォゲン−特異的アルカリフォスファターゼ誘導
アルカリフォスファターゼ生産は分化した機能的な骨牙細胞による骨形成の指標であるので、モルフォゲンはこの骨牙細胞マーカーとそれに続くインビトロ試験系を用いて骨牙細胞の能力を測定できるであろう。
【００９６】
ラット骨牙細胞が調製されそして実施例２に述べたようにマルチプレ−ト中で培養された。この実験において２４穴プレートが用いられた。培養された細胞は次に３グループに分割された：（１）モルフォゲンの種々の濃度を受けたウエル；（２）局所作用性生長因子の種々の濃度を受けたウエル；そして生長因子を受けなかったコントロールグループ。この実験に於いてＯＰ−１が試験されたモルフォゲンであって下記の濃度で実施された：0.1, 1.0, 10.0, 40.0, 80.0ｎｇ／ｍｌ培地；そしてＴＧＦーβが局所作用性生長因子として0.1, 1.0,10.0, 40.0,80.0ｎｇ／ｍｌ培地で試験された。次に細胞は７２時間インキュベートされた。インキュベーション期間後細胞層が１％トライトンＸ−１００の０．５ｍｌで抽出された。得られた細胞抽出物は遠心された、抽出物の１００μl が９０μl のパラニトロソフェニルフォスフェート（ＰＮＰＰ) ／グリセリン混合液に加えられ３７℃水槽中で３０分間インキュベートされ、反応は１００μｌ  ＮａＯＨで停止された。次に試料はプレートリーダーで読み（例  ダイナテックＭＲ７００プレートリ−ダ−、標準としてパラニトロフェノールを用いて４００ｎｍで吸収を測定した）アルカリフォスファターゼ活性の存在と量を決定した。蛋白質濃度はバイオラド法によって決定された。アルカリフォスファターゼ活性は単位／μｇ蛋白質で計算された。ここで１単位＝１ｎｍｏｌ  ３７℃で遊離したパラニトロフェノール／３０分間を示す。
【００９７】
図３に示した結果はモルフォゲン単独で骨牙細胞に於いてアルカリフォスファターゼの生産を刺激する、そして骨牙細胞の分化した発現型の生長と発現を促進することを例証する。図中で四角はＯＰ−１濃度を示し、ダイアモンドはＴＧＦーβ濃度を示す。
【００９８】
４．２．ラット骨牙細胞によるアルカリフォスファターゼの生産におけるモルフォゲンの長期の効果
ラット骨牙細胞によるアルカリフォスファターゼの生産におけるモルフォゲンの長期の効果を決定するために、下記の分析が為された。
【００９９】
ラット骨牙細胞が調製されたそして実施例２で述べたようにマルチウエルプレート中で培養された。本実験において２４穴プレートの６セットがウエル当り５０，０００ラット骨牙細胞を移された。各々のプレートのウエルは上記したように調製され、次に３グループに分割された：（１）培地のｍｌ当り１ｎｇのモルフォゲンの１ｎｇを受けたもの；（２）培地のｍｌ当りモルフォゲンの４０ｎｇを受けたもの；（３）培地のｍｌ当りモルフォゲンの８０ｎｇを受けたもの。各々のプレートは次に異なった時間でインキュベートされた：０時間（コントロール時間）、２４時間、４８時間、９６時間、１２０時間そして１４４時間。各々のインキュベーション時間後細胞層は１％トライトンＸ−１００の０．５ｍｌで抽出された。得られた細胞抽出物は遠心され実施例４におけるようにアルカリフォスファターゼ活性がパラニトロソフェニルホスフェート（PNPP) を用いて測定された。結果は図４に示したように、モルフォゲンのみで骨牙細胞におけるアルカリフォスファターゼの生産を刺激する、ＯＰ−１の投与量増大はさらにアルカリフォスファターゼの生産のレベルを増加しそして処置した骨牙細胞におけるアルカリフォスファターゼのモルフォゲンによって刺激され、この上昇したレベルは延長した時間持続する。図中においてマルは１ｎｇ  ＯＰ−１を示す；四角は４０ｎｇ  ＯＰ−１；そしてダイアモンドは８０ｎｇ  ＯＰ−１を示す。
【０１００】
[実施例５]
ラット骨牙細胞におけるモルフォゲン誘導副甲状線ホルモン仲介ｃＡＭＰ生産
インビトロにおいてラット骨牙細胞における副甲状線ホルモン仲介ｃＡＭＰ生産におけるモルフォゲンの効果が下記のように決定された。
【０１０１】
ラット骨牙細胞が調製されたそして実施例２上に記述されたマルチウエル  プレート中で培養された。本実験において２４穴プレートが用いられた。次に培養細胞が３グループに分割された：（１）モルフォゲンの種々濃度を受けたウエル（本実験で、ＯＰ−１は１．０，１０．０そして４０．０ｎｇ／ｍｌ培地）；（２）局所作用性生長因子の種々濃度を受けたウエル（本実験において、ＴＧＦーβは培地当り０．１，１．０，そして５．０ｎｇ／ｍｌ）；そして（３）他の生長因子を受けなかったコントロールグループ。プレートは次にさらに７２時間インキュベートされた。７２時間の終わりに細胞は０．５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）と１ｍＭ  ３ーイソブチル−１−メチル  キサンチンを含む培地で２０分間処理された。その後２００ｎｇ／ｍｌの濃度で１０分間ヒト組み換え副甲状線ホルモン（ｈＰＴＨ, シグマ、セントルイス）のウエルの半分に添加された。細胞層が各々のウエルから１％のトライトンＸ−１００の０．５ｍｌで抽出された。ｃＡＭＰレベルが次にラジオイムノ分析キットを用いて決定された（アマーシャム、アーリントンハイト、イリノイ）。結果は図５に示したようにモルフォゲンのみでＰＴＨ仲介ｃＡＭＰ応答の増加を刺激したそして骨牙細胞の分化発現型の生長と発現を促進した。
【０１０２】
[実施例６]
培養における骨牙細胞による石灰化の速度とオステオカルシン合成に対するモルフォゲンの効果
オステオカルシンは骨牙細胞によって合成される骨特異的蛋白質であってインビボで骨の石灰化の速度に中心的な役割を演ずる。血清中のオステオカルシンの循環レベルはインビボでの骨牙細胞活性と骨形成の指標として用いられる。
富骨牙細胞−培養はインビトロでのモルフォゲン能を分析するために用いられる。
【０１０３】
ラット骨牙細胞が調製され実施例２のようにしてマルチウエルプレート中で培養された。本実験において、細胞は２４穴プレートで培養された。本例において培地は１０％ＦＢＳを用いたそして２日後に細胞は新鮮な１０ｍＭβ−グリセロフォスフェート（シグマ（株））を添加された新鮮培地で培養した。５日目の初めからその後２週間、細胞は最終濃度５０μｇ／ｍｌ培地の濃度で上記全ての成分と新鮮なＬ（＋）アスコルビン酸を含む完全骨化培地中で育てた。次にモルフォゲンが直接にウエルに添加された。本例において、0.1 ％トリフルオロ酢酸（TFA)を含む５０％アセトニトリル（あるいは５０％エタノール）中のＯＰ−１が５μｌ／ｍｌ培地を越えないように添加された。コントロールウエルは溶媒成分のみであった。次に細胞は再培養されコンディション培地試料は標準蛋白阻害剤を含む標準免疫分析緩衝液と１：１に希釈したそしてオステオカルシン分析まで−２０℃で保存した。オステオカルシン合成は次に市販のラット由来オステオカルシン特異的抗体を用いて標準免疫分析によって測定された。
【０１０４】
石灰化は固定細胞層上での修飾フォンコッサ染色法を用いて長期間培養（１３日）によって測定した：細胞を２３℃１０分間、新鮮４％パラフォルムアルデヒド中で固定した、続いて冷0.9 ％ＮａＣｌで洗浄した。固定した細胞は次に市販のキット（シグマ（株））を用いてｐＨ９．５で１０分間内在性アルカリフォスファターゼに対して染色を行なった。
【０１０５】
紫色に染った細胞を次にメタノールで脱水し空気乾燥した。３％ＡｇＮＯ3 中暗黒下で３０分間インキュベーション後、水洗浄試料が黒く銀染色された燐酸ノズルを発生させるため２５４ｎｍ  紫外光で３０秒間露出した。個々の石灰化したものが（少なくとも大きさで20μｍ）解剖顕微鏡下で計数され、ノヅル数／培地として現わされた（図６Ｂ参照）。
【０１０６】
図６Ａに見られるように、ＯＰ−１は骨牙細胞培養においてオステオカルシン合成を刺激する。ＯＰ−１に応答するオステオカルシン増大は投与量依存性である、そしてインキュベーション１３日後２５ｎｇのＯＰ−１／１０ｍｌ培地を用いると基礎レベルから５倍の上昇を示した。増大したオステオカルシン合成は同様にラットオステオカルシン特異的プローブを用いてオステオカルシンｍＲＮＡの上昇（２０倍上昇）を検出することによっても確認できる。加えて、オステオカルシン合成増加は長期間の骨牙細胞培養における石灰化の増大とも関連する。このことはミネラルノズルの出現によって決定される（図６Ａと６Ｂの比較）。ＯＰ−１は未処理群に比べて約２０倍初期石灰化速度を増加させる。ＴＧＦーβを用いて行なわれた同様の実験ではＴＧＦ−βはオステオカルシン合成を誘導しないしあるいは石灰化工程を促進しないことを示す。このように、モルフォゲンのみが骨牙細胞の分化発現型の生長と発現を促進する。実施例７．インビトロ骨由来生長因子誘導におけるモルフォゲンの効果  ＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−IIは骨再生サイクルにおいて骨置換における骨架橋形成に関与している。これらの因子およびＴＧＦーβを含む他の骨由来生長因子の生産におけるモルフォゲンの効果が下記の手段を用いて評価される。
【０１０７】
ラットあるいはヒト骨牙細胞が調製された、そして実施例２におけるようにマルチウェルプレートで培養された。プレートのウェル穴はモルフォゲンの異なった濃度を加えた（例 0, 1,10, 100 ng) グループに分割した。本実験において、ＯＰ−１がモルフォゲンとして用いられた。次にプレートは先に述べた時間インキュベートした、例えば７２時間  そしてＩＧＦのレベルが検出された、例えばＩＧＦに対する特異的な市販の抗体を用いて免疫局所化法によって検出された。ＯＰ−１はＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−IIのレベルを有意に誘発する６倍以上のＩＧＦ−Ｉと２倍以上のＩＧＦ−IIが100 ｎｇＯＰ−１／ｍｌに露出によって誘導された。加えて、ＯＰ−１はＩＧＦ−Ｉ刺激因子、ＢＰ３（ＩＧＦ−Ｉ結合蛋白３）を刺激した。
【０１０８】
[実施例８]
卵巣切除（ＯＶＸ）ラットの梁骨におけるモルフォゲンの効果
上述したように、血清アルカリフォスファターゼとオステオカルシンのレベルは個体内の骨形成の指標である。インビボでの骨生産におけるモルフォゲンの効果を測定するために、これらのパラメーターが骨形成を促進する条件下で測定された、例  ここで骨粗鬆症はラットにおいて卵巣除去によって誘導される。
【０１０９】
各々約２００ｇの重さの４０日齢エバンスラット（チャ−ルスリバ−  研究所ウイルミントン）が標準的手段を用いて卵巣切除（ＯＶＸ）されたそして１０匹のラットは偽手術（シャム)
された。ラットの卵巣切除はエストロゲン生産減少の結果としてラットに骨粗鬆症状態をもたらす。食物と水は任意に供給した。卵巣切除後８日目に上記に述べたように調製されたラットは５グループに分割された：（Ａ）１０匹の偽手術（シャム）ラット；（Ｂ）尾静脈から１ｍｌのリン酸生食緩衝液（ＰＢＳ)を静注した１０匹の卵巣切除ラット；（Ｃ）尾静脈より約１ｍｇの１７βＥ２（１７ーβ−エストラジオール）を静注した10匹の卵巣切除ラット；（Ｄ）２２日間尾静脈より約２μｇのモルフォゲンを毎日静注した９匹の卵巣切除ラット；そして（Ｅ)２２日間尾静脈より約２０μｇのモルフォゲンを毎日静注した９匹の卵巣切除ラット。本実験において、ＯＰ−１が試験されたモルフォゲンであった。
【０１１０】
試験の１５日目と２１日目に、各々のラットは５ｍｇのテトラサイクリンを投与したそして２２日目にラットは屠殺された。体重、卵巣重量、血清アルカリフォスファターゼレベル、血清カルシウムレベルそして血清オステオカルシンレベルが各々のラットについて測定された。結果は表IIIとIVに示した。
【０１１１】
表III
2007197455.tif 000012
【０１１２】
表IV
2007197455.tif 000013
【０１１３】
表IIIと表IVに示した結果は卵巣切除ラットへのモルフォゲンの静注は血清アルカリフォスファターゼと血清オステオカルシンレベルの有意の増加をもたらし、モルフォゲンの全身性投与は骨粗鬆症中の骨に対して骨形成を刺激することを現わす。
[実施例９]
【０１１４】
卵巣切除（ＯＶＸ）ラットの脛長骨におけるモルフォゲンの組織学的分析
重さ約１６０ｇの１５匹のロングエバンズラット（チャ−ルスリバー研究所、ウイルミントン、マサチュウセッツ）が骨粗鬆症状態をもたらすために卵巣切除（ＯＶＸ）された。５匹のラットは実施例８でのべたように偽手術された。食物と水は任意に供給された。卵巣除去２２日後ラットは４グループに分割された：（Ａ）偽手術された５匹のラット（尾静脈からの静注によってＰＢＳの１ｍｌを投与）；（Ｂ）ＯＶＸ、何も投与されない、５匹のラット；（Ｃ）ＯＶＸ、尾静脈からの静注によって約１ｍｇの１７βＥ２を投与そして（Ｄ）ＯＶＸ、尾静脈からの静注によって約１μｇのモルフォゲンを投与された５匹のラット。本実験においてＯＰ−１がモルフォゲンとして試験された。
【０１１５】
ラットは７日間記載されたようにして、１３日間何も投与されない群を除いて毎日投与された。次にラットは１９日目に屠殺された。脛長骨が次に取り出され、エタノールで固定され組織形態学的分析が熟練者に良く知られている標準的方法を用いて行なわれた。結果は表Ｖに示す。
【０１１６】
表Ｖ
2007197455.tif 000014
【０１１７】
表Ｖに現わした結果は実施例８の結果を確認する、つまり卵巣切除ラットへのＯＰ−１の静注は個々のラットのエストロゲン減少によって失われた骨の生長を刺激する。特に、ＯＶＸラットにおいて海綿骨体積阻害が全身性に供給されたモルフォゲンによって修復された。加えて、モルフォゲン処理ラットにおいて、標識海綿骨ペリメーターと無機物沈殿速度がコンロトロールつまり偽手術されたラットにおいて測定されたレベルに戻っている。さらに、モルフォゲン処置はエストロゲンと違って骨身長の生長を阻害しない、エストロゲンは有意に骨生長を阻害するように思われる。従って、治療レベルで効果的濃度でのモルフォゲンの全身性投与は効果的に自然の骨形成を阻害することなしに哺乳動物における骨の喪失を阻害する。
[実施例10]
【０１１８】
体液中でのモルフォゲンの存在の測定
ＯＰ−１は唾液、ヒト血清並びに哺乳腺抽出物、初乳そして５７日後の牛ミルク等の種々のミルク中に同定された。さらに下記に述べたように、蛋白質を抽出した体液がモルフォゲン活性をもっている。モルフォゲンが天然にミルク中に存在していて成熟した活性ＯＰ−１が酸に安定で蛋白質分解酵素抵抗性であるという既知のデータは、哺乳類へのモルフォゲンの治療的投与に対する有益な経路として経口投与があげられることを示す。典型的な経口投与は予防的治療のための形態の好ましい方法である。加えて、初乳を含む全てのミルク形におけるモルフォゲンの同定は、蛋白質が若年性の骨発育を含む組織発達に重要な役割を演じていることを示す（下記の実施例１３参照）。
【０１１９】
１０．１ミルク中でのモルフォゲン検出
ＯＰ−１はラット哺乳動物腺抽出物と牛初乳そして５７日目のミルクからクロマトグラフィーカラムシリーズからの通過物より：（例  カチオンー交換、アフィニテイーそして逆層）部分的に精製された。各々のステップで流出物は分画として集められ、そして標準的なイムノブロットによってＯＰ−１の存在が試験された。次に免疫反応性分画が集められ、さらに精製された。最後に部分的に精製された産物がＯＰ−１特異的抗体を用いてウエスタンブロット分析によってＯＰ−１の存在に対してテストされた。そしてインビボとインビトロ活性を同様に試験した。  異なるミルクソースから精製されたＯＰ−１は、ＯＰ−１とＢＭＰ２に対する抗体を用いてウエスタンブロットによって特徴づけられた。抗体は実施例１４に一般的に述べたようにそして熟練者によって良く知られている標準的な免疫プロトコールを用いて抗原としてフルレングスの大腸菌生産のＯＰ−１とＢＭＰ２を用いて調製された。
【０１２０】
図７に示したように、初乳から精製したＯＰ−１は抗ＢＭＰ２抗体とは反応せず、抗ＯＰ−１抗体と反応する。図７において、レーン１は遺伝子組み換によって生産され精製され還元されたＯＰ−１を含む；レーン２は精製ウシ初乳からのＯＰ−１を含む、そしてレーン３は還元されたＣＯＰ−１６を含む、ＣＯＰ−１６は生合成構築物であってモルフォゲン活性を有しここで述べた蛋白質上にモデル化されたアミノ酸配列を有するがしかしＢＭＰ２と最も高いアミノ酸配列ホモロジーを有している（ＣＯＰ−１６アミノ酸配列、ＵＳＳＮ５，０１１，６９１を参照）。
【０１２１】
図７Ａにおいて、ゲルは抗ＯＰ−１抗体でプローブ化された；図１７Ｂにおいて、ゲルは抗ーＢＭＰ２抗体でプローブ化された。図に見られたように、抗ＯＰ−１抗体のみがレーン１と２における蛋白質とハイブリダイズする、しかし３とはしない；そして抗−ＢＭＰ２抗体はレーン３とのみハイブリダイズする。
カラム精製哺乳動物腺抽出物と５７日目のミルクが同様に抗ＯＰ−１と特異的に反応する、抗ＯＰ−１としては全長の（フルレングス）大腸菌ＯＰ−１、全長の哺乳類生産ＯＰ−１そしてＯＰ−１  Ｓｅｒ−１７−Ｃｙｓペプチド（例：ＯＰ−１のＮ末端の１７個のアミノ酸）に対する抗体を含む。
【０１２２】
哺乳腺抽出物から精製されたＯＰ−１のモルフォゲン活性はインビボで次のように評価された。試料は哺乳腺抽出物由来ＯＰ−１最終産物の各々のＯＰ−１免疫反応分画から該分画の一部（３３％）を凍結乾燥しそして５０％アセトニトリル／0.1％ＴＦＡの２２０μｌに再分散することによって調製された。撹拌後、コラーゲンマトリックスの２５ｍｇを添加した。試料は１昼夜凍結乾燥された。ロングエバンズラット中に移植された（チャールスリバー研、ウイルミントン、マサチュウセッツ、２８ー３５日齢）。各々の分画は２回づつ行なわれた。コラーゲンマトリックス移植法の詳細は例えばＵＳＳＮ４，９６８，５９０を参照する。１２日後、移植物は取り出されそして組織学的観察によって新生骨形成を評価した。
【０１２３】
結果は図８Ａに現わされた、ここで”％活性”は組織試料中の骨によって覆われた骨形成／全領域の％として表示された。図において、四角の棒は哺乳腺抽出物ー由来ＯＰ−１を用いる移植のものを現わす、各々精製産物の免疫反応分画に対応する棒、分画数はＸ軸に示されている。斜線の棒は組み換え型生産ＯＰ−１（６００ｎｇ）を用いる移植を現わす。図に見られるように全ての免疫反応分画は骨形成能を有している。同様に、乳腺抽出物から精製されたＯＰ−１のモルフォゲン活性は、次の分析法でインビトロでアルカリフォスファターゼ活性を測定することによってインビボで評価された。試験試料は最終産物から集められた個々の免疫反応性分画の１５ー２０％を用いてインビボ分析のために調製された。アルカリフォスファターゼ活性は実施例４のようにして試験された。図８Ｂに現わされた結果は免疫反応性分画はインビトロでアルカリフォスファターゼ活性を刺激できることを示す。さらに本活性は高度に精製された組み換え型ＯＰ−１によって生産されるものと良く相関する。図８Ｂ四角の棒は乳腺精製ＯＰ−１で行なわれた分析を示す、各々の棒カラム精製ＯＰ−１の免疫反応性分画に対応する。分画数はＸ軸に示されている；斜線の棒は精製された組み換え型ＯＰ−１（１００ｎｇ）で為された分析を現わす；そしてクロスした斜線の棒はバックグラウンドを示す。
【０１２４】
１０．２血清中でのモルフォゲンの検出
モルフォゲンはモルフォゲン特異的抗体を用いて検出されるであろう。本分析はどの標準的免疫分析を用いても達成されるであろう。例えば、ウエスタンブロット（免疫ブロット）のような。好ましくは、分析はモルフォゲン特異的抗体が結合し次に試料である血清が通過されると関連するモルフォゲンを選択的に溶出できるアフィニテイーカラムを用いて達成される。次にモルフォゲンが溶出される。適切な溶出緩衝液は、初めコントロール分画（例  精製組み換えモルフォゲン）を用いて経験的に適切な結合および溶出条件を決定する、次に標準的な免疫ブロットとＮ−末端配列の確認結果を用いてモルフォゲンの存在を試験する。好ましくは、アフィニテイーカラムはモノクローナル抗体を使用して調製する。血清あるいは他の液体試料中のモルフォゲンの濃度が次に分光光度計による吸光度測定あるいは結合した抗体の定量等を含む標準的蛋白質定量法を用いて決定される。
【０１２５】
血清中のＯＰ−１を同定するための試料プロトコールが下記に示されている。本一般的方法に従って他のモルフォゲン類も血清を含む体液から検出されるであろう。
【０１２６】
血清中でのモルフォゲンの同定は、固体へのモルフォゲンの治療濃度を達成するための全身性投与が適切な手段であることを示す。そしてモルフォゲンは好ましくは内在性因子様因子として全身性に作用する。最後に本プロトコールを用いて内在性モルフォゲンのレベルにおける振れを検出できる。そしてこれらの変化したレベルは骨組織の失調の指標として用いられるだろう。他に、モルフォゲンレベルの振れは、実施例１に述べたように標準的ノーサンブロット分析、あるいは実施例１に一般的に述べたような熟練研究者によって述べられた標準的なRNAハイブリダイゼーションプロトコールとモルフォゲンＲＮＡへ特異的にハイブリダイズできる標識プローブをもちいるインサイチユーによるハイブリダイゼーションのいずれかによって評価される。
【０１２７】
ＯＰ−１は下記の分析によってヒト血清中に検出される。一般的に実施例１４に述べられ熟練研究者に良く述べられる標準的免疫技術を用いて哺乳動物からの組み換え体から生産されたＯＰ−１に対して作成されたモノクローナル抗体がアガロース活性化ゲル上を抗体を通過させることによって固定化された
【０１２８】
［例：次の方法に従って調製されたアフィゲルＴＭ、  バイオラッド研究所、  リッチモンド、カリフォルニア］そして血清からＯＰ−１を精製するために用いた。ヒト血清が次にカラム上を通過され、そして３ＭＫーチオシアネートで溶出した。Ｋーチオシアネート分画が次に６Ｍ尿素、２０ｍＭ  ＰＯ4 、pH７．０中で透析し、Ｃ８ＨＰＬＣカラムに乗せられ、２０分間２５ー５０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ勾配で溶出された。成熟した組み換えによって生産されたＯＰー１ホモダイマー抽出物は２０−２２分間に溶出した。分画は次に集められ、そして実施例１０ＡのようにＯＰ−１特異的抗体を用いて標準イムノブロットによってＯＰー１の存在を試験した。図９は還元および酸化条件下でのヒト血清中のＯＰ−１を示すイムノブロットである。図中でレーン１と４はＯＰ−１標準である、レーン１は酸化状態でのそしてレーン４は還元状態でのそれである。レーン５は１７、２７そして３９ＫＤａの分子量マーカーを示す。レーン２と３はヒト血清ＯＰ−１、レーン２は酸化条件レーン３は還元条件でのものを示す。
【０１２９】
モルフォゲンは、骨組織の状態における変化を示す体液モルフォゲンレベルにおける振れを利用して、前もって決定された参照値を用いる体液資料中に存在するモルフォゲンの量を比較することによって診断的用途に用いられるだろう。なお、内在性モルフォゲン抗体のレベルの振れは内在性モルフォゲン抗体と特異的に相互作用できる抗体あるいは他の結合蛋白を用いて、最も好ましくは血清中で本法によって検出される。内在性抗体レベルで検出された振れは組織状態の変化の指標として用いられるだろう。
【０１３０】
[実施例11]
モルフォゲン誘導骨膜と骨内層形成
骨組織吸収−誘導骨再吸収は最初に骨組織の骨内層表面で起きる。従って、骨再生失調症において骨髄腔が不自然に大きく残っている骨の力を与える重さに脆くなっている。
【０１３１】
下記の実施例は、哺乳類における骨内層と骨膜実質を増加させる、ここで述べたモルフォゲンの能力を評価する手段を提供する。本実施例において、骨膜と骨内層骨形成両者とも、骨組織に直接に、生体適合性溶液にモルフォゲンを入れて投与することによって誘導される。下記に述べたように、モルフォゲンは新規骨の形成を誘導できるそして直接投与によって骨に供給されたとき骨表面で骨実質を増加させる。直接の投与は、増大した骨髄腔の減少と／または振れを修復し骨組織の微細構造のダメージを効果的濃度で治療するために好ましい投与方法であろう。
【０１３２】
モルフォゲンが、個々に単回投与によってラット大腿骨の骨膜（骨表面外面あるいは表面）と骨内層（内側の骨表面  例  髄腔に沿った表面）に供給された。
特にモルフォゲン（例  ＯＰ−１，２−２０μｇ）がリン酸生理食塩緩衝液中でコロイド状分散液として骨組織に供給された。骨内層への投与は手動の整形外科用ドリルを使って微細孔を通して行なわれた。７日後、処置骨は取り出されそしてＵＳＰＮｏ．４，９６８，５９０に述べたようにして組織的に評価するために調製された。２μｇモルフォゲン程の少量が４−７日以内に投与部位に新骨形成を誘導するために充分である。加えて、骨誘導は投与量依存性である。顕微鏡で見た組織は図１０に示されている。図において、”ｏｂ”は古い骨を意味する。”ｂｍ”は骨髄を意味する。”ｎｂ”は新しい骨を意味する、そして”ｍ”は筋肉を意味する。図１０Ａは骨内層表面にモルフォゲンの投与を行なった新しく形成された骨を示す。図に見られるように、新しい骨は骨髄腔内に形成され、腔の表面を覆っている。図10Ｂは骨膜表面にモルフォゲンを投与して正常に存在する筋肉に置換して新しく形成された骨を示す。
【０１３３】
[実施例12]
骨吸収におけるモルフォゲンの効果
骨吸収におけるモルフォゲンの効果が、モルフォゲン存在下と非存在下で牛骨片上でラット溶骨細胞をもちいて、そして膜孔にけるモルフォゲンの効果（吸収の指標）を評価される。標準的条件下でラット溶骨細胞は骨組織を吸収し骨片表面に膜孔形成を引き起こす。本実験に於いて、ＯＰ−１が試験されたモルフォゲンであって０，５，１０，２０，４０，５０そして１００ｎｇ／ｍｌで使われた。
【０１３４】
結果は図１１に現わされている、ここで吸収の指標はコントロールの存在下で％として計算された（例  モルフォゲン非存在下での骨吸収）、与えられた切片表面領域当りの膜孔の数として計算される。４０ｎｇ以下で、骨吸収が増大された；40ｎｇ以上ではＯＰ−１は骨吸収に対して明らかな効果がなかった。本結果は骨再生においてモルフォゲンが演じる不可欠な役割のうちのハイライトである。ＯＰ−１はインビボで骨組織に蓄えられる。正常骨再生サイクルにおいて、表面でのＯＰ−１の局所濃度は溶骨細胞が骨を吸収し始めた時低い、そしてその低濃度は骨吸収を増加および／または刺激するだろう。吸収が続くとき、表面でのＯＰ−１の局所濃度は、溶骨細胞の効果がなくなるまで濃度が増加する、しかし骨生長を刺激する骨牙細胞の生長と活性への影響は続く（実施例２−７参照）。
【０１３５】
加えて、モルフォゲンは単核ファゴサイト細胞が正常に活性化される条件下で同細胞の多核化を阻害できる。例えば、モルフォゲンの無い条件下で、例えば、チタニウム酸化物、あるいは他の全ての基質のような多核巨大細胞形成をもたらすセラミック，石灰化骨からなる移植基質物質（例  皮下に移植）はすぐに多核巨大細胞によって囲まれる、例えば外来産物に応答しそれを壊すために刺激される活性化食細胞である。しかしながら、モルフォゲンの存在下で、新規細胞は単核の前駆体形のままであって、マトリックス物は壊されない。図１２はモルフォゲンのこれらの効果を、皮下に移植したチタニウム酸化物基質の組織学的結果の図視的表現によって例証する。図中で、”ｍｇ”は多核巨大細胞を意味し、”ｏｂ”は骨牙細胞を意味する。図１２Ｂに現わされた基質はモルフォゲン（ＯＰ−１）と一緒に移植されたそして新しく形成された骨牙細胞は明らかに基質を取囲んでいる。対照的に、モルフォゲン無しに移植された図１２Ａに示した基質は多くの多核巨大細胞形成が基質を取囲んで起きているのは明らかであった。
【０１３６】
従って、哺乳動物における過剰の骨実質の喪失を阻害することにおけるモルフォゲンの効果が同様にこれらの細胞における活性化を阻害しているのかもしれない。
【０１３７】
[実施例13]
骨生長におけるモルフォゲン中和の効果
発生中の哺乳類における骨生長のここで述べたモルフォゲンの効果が、骨発生におけるこれらに対する抗体の効果を調べることによって、特にモルフォゲンに対する特異的な抗体で中和することによって評価できるだろう。特に抗モルフォゲンモノクローナル  そして／またはポリクローナル抗体が下記実施例１４に述べたプロトコールを含む標準的方法で調製されるだろう。
【０１３８】
精製抗体は次に新生児マウスに定期的に投与される、例  10−１００μｇ／投与／日を１０から１５日。１０から２１日で、マウスは屠殺されそして骨発生におけるモルフォゲンの効果が体重、大まかな視覚観察と組織的観察によって為された。本実験において、抗ＯＰ−１抗体が用いられた。モルフォゲン中和は体重の減少によって示されたように有意に骨生長を含む体重増加を妨げた、そして処置哺乳類の骨長をも減少させた。  同様に、モルフォゲン活性は下記分析を用いるマウスモデルの胎児発生を決定した。モルフォゲンー特異的抗体の１０−１００μｇ／投与からなる単回の口唇投与が処置とコントロールマウスでの妊娠期間と骨発生のそれぞれの日に妊娠雌マウスに投与しそして誕生時に標準的組織形態学的分析を行なった。同様に口唇投与は若年時のあるいは成熟マウスにも投与される（例  １０−１００μｇ）が長い時間（例  １０−１５日間）骨生長における効果と骨蓄積そして骨粗鬆症の程度を評価するため投与された。抗体は、発生中の胚において、骨生長と骨発生を含む組織モルフォゲンを阻害することが予想された。
【０１３９】
[実施例14]
内在性モルフォゲンレベルを変えると予想される化合物に対するスクリーニング分析
与えられたモルフォゲンのレベルに影響を与えるために投与される予想化合物が次のスクリーニン分析を用いて見出されうる。ここで、モルフォゲンの測定できうるレベルを生産する細胞型によるモルフォゲン生産のレベルが化合物との培地中で細胞を、細胞での化合物の効果を推定するためにインキュベートし、およびインキュベート無しで決定される。これは蛋白質あるいはＲＮＡレベルのいずれかでモルフォゲンを検出することによって達成される。詳細な記述は同様に参照によって上記に記入された米国特許７５２、８６１に見出されるだろう。
【０１４０】
１４．１培地での細胞の生長
腎臓、副腎、ぼうこう、脳、あるいは他の器官の細胞培養が広く文献に記述されたように調製される。例えば、腎臓は胎児あるいは新生児あるいは若いまたは成熟げっし類（マウスあるいはラット）から移植されるそして全あるいは切片（１−４mm)組織として器官培養に用いられる。腎臓、副腎、房腔、脳、乳腺あるいは他の組織から由来する初代組織培養と確立された細胞系が通常の細胞培養技術に従ってマルチウエルプレート（６穴または２４穴）で確立されるだろう、そして一定期間（１−７日間）血清の存在あるいは非存在下で培養される。細胞は例えば望ましくは血清（例，仔牛血清１−１０％）含むダルベッコ修飾イーグル培地（ギブコ、ロングアイランド、ニューヨーク）無血清培地あるいは限定培地（例  インスリン、トランスフェリン、グルコース、アルブミンあるいは他の生長因子を含む）中で培養される。
【０１４１】
モルフォゲン生産のレベルを試験するための試料は培養上清あるいは細胞溶解物を含み、定期的に集められそしてイムノブロット分析（サムブロック他  編１９８８、分子クローニング、コールドスプリングハーバー印刷、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク）によるモルフォゲン生産を測定される、あるいは細胞培養の一部が定期的に集められ、そしてＲＮＡ分析のためにポリＡ＋ＲＮＡを調製される。デノボモルフォゲン合成をモニターするため、幾つかの培養は６−２４時間３５Ｓーメチオニン／３５Ｓーシステイン混合物とともに通常の方法に従って標識され、そして通常の免疫沈殿  法によってモルフォゲンの蛋白質合成に対して評価された。
【０１４２】
１４．２モルフォゲンのレベルの測定
細胞型によるモルフォゲン蛋白質の生産を定量するために、免疫分析が該蛋白質に対する特異的なポリクローナルあるいはモノクローナル抗体を用いてモルフォゲンを検出するために行なわれた。例えば、ＯＰ−１が下記のようにＥＬＩＳＡにおいてＯＰ−１に対する特異的なポリクローナル抗体をもちいて検出されうる。
【０１４３】
ＯＰ−１に特異的なアフィニテイー精製したポリクローナルウサギＩｇＧ抗体の１μｇ／１００μｌが９６ウエルプレートのそれぞれのウエルに添加されそして３７℃で１時間インキュベートされた。ウエルは０．１％トイーン２０を含む０．１５Ｍ  ＮａＣｌと０．１６７Ｍナトリウムホウ酸緩衝液ｐＨ８．２［ＢＳＢ］で４回洗浄された。非特異的結合を最小限にするため、ウエルは１％牛血清アルブミンを含むＢＳＢで完全に覆うことによってブロックしたそして３７℃で１時間インキュベートした。ウエルは次に０．１％トイーン２０を含むＢＳＢで４回洗浄した。細胞培養上清の試験試料の各々の適切な希釈した１００μｌ部分がトリプリケートに各ウエルに加えられ３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、１００μｌのビオチニル化したウサギ抗ＯＰ−１血清（保存溶液は１ｍｇ／ｍｌである、使用前に１％ＢＳＡを含むＢＳＢで４００倍に希釈される）を各ウエルに添加され３７℃で３０分間インキュベートされる。ウエルは次に０．１％トイーン２０を含むＢＳＢで４回洗浄される。１００μｌストレパビジンーアルカリン（サイサーンバイオテクノロジーアソシエート（株）、バーミンガム、アラバマ、使用前に０．１％トイーン２０を含むＢＳＢで２０００倍に希釈される。）が各ウエルに添加されそして３７℃で３０分間インキュベートされた。各プレートは０．５Ｍトリス食塩緩衝液ｐＨ７．２（ＴＢＳ）で４回洗浄した。５０μｌの基質が（ELISA 増幅システムキット、ライフテクノロジー（株）ベセスダ、ＭＤ）が各ウエルに添加され１５分間室温でインキュベートされた。次に５０μｌ増幅剤（同じ増幅システムキット）が添加され室温でさらに１５分間インキュベートされた。反応は５０μｌの０．３Ｍ硫酸の添加によって停止された。各ウエルの溶液の４９０ｎｍでの吸収が記録された。培養溶液中のＯＰ−１を定量するためＯＰ−１スタンダード曲線が試験試料と一緒に行なわれた。
【０１４４】
ポリクローナル抗体は下記のように調製された。各ウサギは、500 μｌ完全フロイントアジュバントと混合された0.1 ％ＳＤＳ中で初期免疫用に１００μｇ／５００μｌ大腸菌生産ＯＰ−１モノマー（アミノ酸シーケンス NO:5 ）を与えられた。抗原は動物の背部および側腹部の皮下で多数の場所に投与された。ウサギは不完全フロイントアジュバントをもちいて同様の方法で１ヶ月後ブウス化された。試験血液は７日後耳静脈から採血された。２回の付加的ブーストと試験採血がＯＰ−１に対する抗体がＥＬＩＳＡ分析で血清中に検出されるまで１ケ月間隔で行なわれた。次にウサギは１００μｇの抗原で月々にブーストされそして７−１０回のブーステイング後に採血（１５mlづつ）された。
【０１４５】
与えられたモルフォゲンに特異的なモノクローナル抗体は下記のように調製される。マウスが大腸菌生産ＯＰ−１モノマーの２回の投与を受ける。最初の投与は完全フロイントアジュバント中にＯＰ−１の１００μｇを含むそして皮下に投与される。第２回目は不完全フロイントアジュバント中の５０μｇのＯＰ−１を含み腹腔に投与される。次にマウスは８ヵ月以上の様々な期間に４回の腹腔投与に全量230 μｇのＯＰ−１（アミノ酸307 −４３１  シーケンスＩＤ5 ）を受ける。融合１週間前、両マウスはＯＰ−１の１００μｇとＳＭＣＣ架橋結合試薬とともに牛血清アルブミンに添加システインを通じて結合したＮ−末端ペプチド（Ｓｅｒ２９３−Ａｓｎ３０９−Ｃｙｓ）の３０μｇで腹腔にブーストされた。このブーストは融合前５日間（ＩＰ）、４日間（ＩＰ）、３日間（ＩＰ）そして１日間（IV)繰り返された。マウス脾臓細胞が次に市販の利用できるミエローマ細胞とＰＥＧ１５００（ベーリンガーマンハイム、ドイツ)を用いて１：１の割合で融合された。細胞融合はプレート中に入れられ、抗原としてＯＰ−１（３０７−４３１）を用いてOP−１特異的抗体を選別した。細胞融合とモノクローナル抗体の選別は当該技術分野に広く利用される標準的テキストに記載されている標準的な良く述べられた方法にしたがって行なわれた。
【０１４６】
他の実施例
本発明は本精神と本質的特徴から離れることなしに他の特異的形で実施されうる。本実施例はそれ故、例証的であって限定的なものとしてでなく全ての観点が考慮される。先の説明によってよりもむしろ従属請求項によって示される本発明のスコープと等しい請求項間の意味と領域内におきる全ての変化もそれ故包括的にそれらに含まれる本発明の他の実施例は下記請求項内にある。
[配列表]
2007197455.tif 000015
2007197455.tif 000016
2007197455.tif 000017
2007197455.tif 000018
2007197455.tif 000019
2007197455.tif 000020
2007197455.tif 000021
2007197455.tif 000022
2007197455.tif 000023
2007197455.tif 000024
2007197455.tif 000025
2007197455.tif 000026
2007197455.tif 000027
2007197455.tif 000028
2007197455.tif 000029
2007197455.tif 000030
2007197455.tif 000031
2007197455.tif 000032
2007197455.tif 000033
2007197455.tif 000034
2007197455.tif 000035
2007197455.tif 000036
2007197455.tif 000037
2007197455.tif 000038
2007197455.tif 000039
2007197455.tif 000040
2007197455.tif 000041
2007197455.tif 000042
2007197455.tif 000043
2007197455.tif 000044
2007197455.tif 000045
2007197455.tif 000046
2007197455.tif 000047
2007197455.tif 000048
2007197455.tif 000049
2007197455.tif 000050
2007197455.tif 000051
2007197455.tif 000052
2007197455.tif 000053
2007197455.tif 000054
2007197455.tif 000055
2007197455.tif 000056
2007197455.tif 000057
2007197455.tif 000058
2007197455.tif 000059
2007197455.tif 000060
2007197455.tif 000061
2007197455.tif 000062
2007197455.tif 000063
2007197455.tif 000064
2007197455.tif 000065
2007197455.tif 000066
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
本発明の上記ならびにその他の目的ならびに特長ばかりでなく、本発明そのものも，添付図面とともに読めば，その記載からより完全に理解することができる。
【０１４８】
【図１】図１は，ラット造骨細胞に対するｈＯＰ−１とＴＧＦーβの分裂促進効果を比較した図である。
【図２】図２は，造骨細胞のコラーゲン合成に対するヒト骨形成タンパク質ー１（ｈＯＰ−１）の効果を示している。
【図３】図３は，ラット造骨細胞に対するｈＯＰ−１とＴＧＦーβのアルカリ性リン酸塩誘発効果を比較した図である。
【図４】図４は，ラット造骨細胞によるアルカリ性リン酸産生に対するｈＯＰ−１の長期効果を示している。
【図５】図５は，培地中のラット造骨細胞を用いての甲状腺ホルモン介在ＣＡＭＰ産生に対するｈＯＰ−１の効果を示している。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは，オステオカルシン合成に対するモルフォゲンの効果を示すグラフ（Ａ）であり，また無機質化の割合に対するモルフォゲンの効果（Ｂ）を示すグラフである。
【図７】図７は，ＯＰ−１およびＢＭＰ２特異性抗体を用いたウシ初乳のウエスタンブロット合成を示している。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは，乳房腺抽出物を精製したＯＰ−１をそれぞれ生体内(in vivo) 及び生体外(in   vitro)で活性アッセイをした結果を示す。
【図９】図９は，血清中のＯＰ−１の存在を示すイムノブロットの光学顕微鏡図を示す。
【図１０】図10（ＡおよびＢ）は，（Ａ）骨内膜表面へのモルフォゲン注入に続く新規な骨内膜形成ならびに（Ｂ）骨膜表面へのモルフォゲン注入に続く新規な骨膜形成を示す光学顕微鏡酢を示す。
【図１１】図11は，骨吸収に対するモルフォゲンの薬剤依存効果を示すグラフである。
【図１２】図12（ＡおよびＢ）は，生体内での初期単核食細胞の細胞多核化のモルフォゲン阻止を示す略図である。
【図１】
2007197455.tif 000067
【図３】
2007197455.tif 000068
【図４】
2007197455.tif 000069
【図５】
2007197455.tif 000070
【図６】
2007197455.tif 000071
【図７】
2007197455.tif 000072
【図８】
2007197455.tif 000073
【図９】
2007197455.tif 000074
【図１０】
2007197455.tif 000075
【図１１】
2007197455.tif 000076
【図１２】
2007197455.tif 000077
【図２】
2007197455.tif 000078