(57)【要約】【課題】本発明の課題は、現存する弱毒化ＰＲＲＳＶウィルス株と比較して異なる弱毒特性の所望の特徴を有するヨーロッパ血清型の生弱毒化ＰＲＲＳウィルス株を提供することにある。さらに本発明の課題は、この種の生弱毒化ＰＲＲＳウィルス株の製造方法を提供することにある。【解決手段】本発明は、マクロファージに対し非感染性である独特の特徴を持ったブタ生殖および呼吸症候群（ＰＲＲＳ）ウィルスのヨーロッパ株である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マクロファージに対し感染性でないことを特徴とするヨーロッパ血清型の生弱毒化ブタ生殖および呼吸症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）。
【請求項２】
コレクション・ナショナーレ・デ・カルチュール・デ・ミクロオルガニスメス（ＣＮＣＭ）・オブ・インスチチュート・パッスール（フランス国、パリ）にＮｏ．Ｉ−１４０１として寄託したハイブリドーマＡ２７により産生されたモノクローナル抗体Ａ２７に対し反応性であるが、インスチチュート・パッスール（フランス国、パリ）にＮｏ．Ｉ−１４０２として寄託したハイブリドーマＡ３５により産生されたモノクローナル抗体Ａ３５に対しては反応性でないことを特徴とする請求項１に記載の生弱毒化ＰＲＲＳＶ。
【請求項３】
インスチチュート・パッスールに受託番号Ｉ−１７５８として寄託された株であることを特徴とする請求項２に記載の生弱毒化ＰＲＲＳＶ。
【請求項４】
ヨーロッパ血清型のＭＡ  １０４増殖ＰＲＲＳＶを非−ＭＡ１０４哺乳動物細胞に適応させることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の生弱毒化ＰＲＲＳＶの製造方法。
【請求項５】
非−ＭＡ  １０４霊長類細胞を非−ＭＡ  １０４哺乳動物細胞として使用することを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ベロ細胞を非−ＭＡ  １０４霊長類細胞として使用することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の生弱毒化ＰＲＲＳＶと医薬上許容しうるキャリヤとからなることを特徴とするＰＲＲＳＶ感染に対しブタを保護するためのワクチン。
【請求項８】
１種もしくはそれ以上の非−ＰＲＲＳＶ弱毒化もしくは失活病原体またはその抗原物質をさらに含むことを特徴とする請求項７に記載のワクチン。
【請求項９】
非−ＰＲＲＳＶ病原体がシュードラビエスウィルス、ブタインフルエンザウィルス、ブタパルボウィルス、伝染性胃腸炎ウィルス、ロタウィルス、エッシェリチア・コリ、エリシペロ・ルシオパチエ、ボルデテラ・ブロンチセプチカ、サルモネラ・コレラスイス、ヘモフィルス・パラスイス、パスツレラ・ムルトシダ、ストレプトコッカス・スイス、ミコプラスマ・ヒオニューモニアエおよびアクチノバチルス・プルーロニューモニアエから選択されることを特徴とする請求項８に記載のワクチン。
【請求項１０】
皮膚内もしくは筋肉内の投与に適するキャリヤを含むことを特徴とする請求項７〜９のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１１】
凍結乾燥型であることを特徴とする請求項７〜１０のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の生弱毒化ＰＲＲＳＶを医薬上許容しうるキャリヤと混合することを特徴とするＰＲＲＳＶに対処するための生弱毒化ワクチンの製造方法。
【請求項１３】
インスチチュート・パッスールに受託番号Ｉ−１７５８として寄託された生弱毒化ＰＲＲＳＶを混合のため使用することを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブタ生殖および呼吸症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）のヨーロッパ血清型の生弱毒株、この種の株の生産方法、それに基づくワクチン、並びにこの種のワクチンの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
１９８７年、当時まで未知であったブタの病気が北米で検出され、その後にそこからカナダまで伝染した［Ｈ．ヒル；プロシーディング・オブ・ミステリー・スワイン・ディジーズ・コミティー・ミーティング、１９９０年１０月６日、デンバー、コロラド、家畜保護協会、マジソン・ウィ、ＵＳＡ：ケファバー等；アメリカン・アソシェーション・スワイン・プラクト・ニュースレター、第１巻、第１〜９頁（１９８９）］。流産および呼吸病の両者を誘発するという事実を特徴とする病気は最初にミステリー・スワイン・ディジーズ（ＭＳＤ）と呼ばれた。現在、米国およびカナダでは、この病気はブタ不妊症および呼吸症候群（ＳＩＲＳ）としても知られる。
【０００３】
１９９０年以来、この病気はヨーロッパでも見られ、先ず最初にドイツ国で発生し、次いでオランダおよびベルギーでも発生し、さらに病気は現在ではヨーロッパ全体に伝染している。ヨーロッパにおいて、この病気はブタ生殖呼吸症候群（ＰＲＲＳ）として、およびブタ流行流産および呼吸症候群（ＰＥＡＲＳ）として一般に知られている。現在、この病気は世界的にＰＲＲＳと呼ばれる。
【０００４】
その病理学は流産および呼吸病に限定されない。この病気に伴う他の徴候は次の通りである：嘔吐（ｏｆｆ  ｆｅｅｄ）、拒食症、四肢（特に耳）の青色変化。
【０００５】
流産および呼吸病の両者に関する病気の病原作用がクリスチャンソン等によるコンプリヘンシブ・レビューに広範に記載されている［スワイン・ヘルス・アンド・プロダクション、第２巻、第１０〜２８頁（１９９４）］。
【０００６】
現在、この病気の原因は、アルテリビリデー（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）の群に属する小エンベロプドＲＮＡウィルスであることが知られている。
【０００７】
ウェンスボート等によりなされた観察［Ｊ．Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔ、第４巻、第１３４〜１３８頁（１９９２）］およびムルトー等によりなされた観察［アーカイブ・バイロロジー、第１４０巻、第１４５１〜１４６０頁（１９９５）］は、疑う余地なくウィルスの２種の完全に異なる（血清）型、すなわちアメリカ（血清）型およびヨーロッパ（血清）型が存在することを明らかにした。
【０００８】
このウィルスのヨーロッパ型がベンスボート等により記載されている［Ｖｅｔ．Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ、第１３巻、第１２１〜１３０頁（１９９１）］。
【０００９】
「レリースタッドウィルス」（ＬＶ）と呼ばれるこのヨーロッパ型の株がセントラル・ベテリナリー・インスチチュート、レリースタッド、オランダ国によるＰＣＴ  ＷＯ  ９２／２１３７５号と関連してインスチチュート・パッスール（パリ、フランス国）にＮｏ．Ｉ−１１０２として寄託されている。他のヨーロッパ株がＥＰＡ  Ｎｏ．９１，２０２，６４６．５号に記載されており、コレクション・ナショナーレ・デ・カルチュール・デ・ミクロオルガニスメス（ＣＮＣＭ）・オブ・インスチチュート・パッスール（パリ、フランス国）にＮｏ．Ｉ−１１４０として寄託された。最近、このヨーロッパ株がコンツェルマン等により記載されている［バイロロジー、第１９３巻、第３２９〜３３９頁（１９９３）］。
【００１０】
アメリカ型のウィルスはベンフィールド等により記載されている［Ｊ．Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔ、第４巻、第１２７〜１３３頁（１９９２）］。アメリカ型の菌株はＮｏ．ＶＲ−２３３２としてＡＴＣＣに寄託されており、ＰＣＴ  ＷＯ  ９３／０３７６０号およびヨーロッパ特許出願第０，５２９，５８４号に挙げられている。アメリカ血清型の弱毒株はヨーロッパ特許出願第０，５２９，５８４号に記載されている。この株は寄託されたアメリカＶＲ−２３３２株から直接に得られる。したがって、この株がワクチン接種された動物は、ヨーロッパ株による感染に対し効率的保護が得られない。これは、ヨーロッパ血清型に対するワクチンの基礎として使用すべくヨーロッパ血清型の生弱毒株の開発を必要とした。
【００１１】
ヨーロッパ特許出願ＥＰ  ０，６７６，４６７号において、ヨーロッパ血清型の生弱毒株が初めて開示された。ヨーロッパ血清型の弱毒株の例はウィルス株ＰＲＲＳ  ＣおよびＰＲＲＳ  Ｄであって、コレクション・ナショナーレ・デ・カルチュール・デ・ミクロオルガニスメス（ＣＮＣＭ）・オブ・インスチチュート・パッスール（パリ、フランス国）に受託番号Ｉ−１３８７（株Ｄ）および受託番号Ｉ−１３８８（株Ｃ）として寄託されている。
【００１２】
これら株はＰＲＲＳＶに対する生弱毒化ワクチンの基礎として効果的である。しかしながら、これらは或る程度の毒力がまだ残留する。したがって、代案の弱毒化ＰＲＲＳＶ株およびこの種のウィルスの製造方法が望まれる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の課題は、現存する弱毒化ＰＲＲＳＶウィルス株と比較して異なる弱毒特性の所望の特徴を有するヨーロッパ血清型の生弱毒化ＰＲＲＳウィルス株を提供することにある。さらに本発明の課題は、この種の生弱毒化ＰＲＲＳウィルス株の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
これら課題は、マクロファージに対し感染性でないと言う独特の特徴を有するヨーロッパ血清型の生弱毒化ＰＲＲＳウィルスを提供する本発明により解決される。これは、この種の株がマクロファージに対しまだ感染性である親株よりも弱毒化した特性をブタにて示す実施例にて示される。
【００１５】
「マクロファージに対し非感染性」という表現は次のように理解せねばならない：本発明による＜１０４組織培養感染性投与量（ＴＣＩＤ）５０の量は、感染の７日後でさえマクロファージ培養物に対し目に見えるＣＰＥを与えない。典型的なマクロファージ感染性ＰＲＲＳＶ野性株は、１  ＴＣＩＤ５０以上の感染粒子投与量にて完全ＣＰＥを与える。
【００１６】
ヨーロッパ血清型のウィルスは、ヨーロッパＰＲＲＳウィルスＬＶ［インスチチュート・パッスールにＩ−１１０２として寄託されたＣＤＩ−ＮＬ−２．９１］に対する抗血清のパネルによる免疫ペルオキシダーゼ  モノレイヤー・アッセイにて、アメリカＰＲＲＳウィルスＳＩＲＳＶ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−２３３２）に対する抗血清のパネルとの反応と比較し、より高い血清タイターを示すことを特徴とする。
【００１７】
本発明の他の特徴は、本発明による生弱毒化ＰＲＲＳ株の製造方法を提供することである。現在、全てのヨーロッパＰＲＲＳＶ株は感染動物のマクロファージから得られ、次いで可能ならばＭＡ  １０４細胞もしくはそのクローンに増殖につき保持される。本発明による方法は、非−ＭＡ  １０４細胞に対するＭＡ  １０４−増殖ＰＲＲＳウィルスの適応に関する。これら非−ＭＡ  １０４細胞は、たとえば限定された寿命期間を有する細胞または確立された不滅細胞ラインとすることができる。一般に、非−ＭＡ  １０４細胞は哺乳動物細胞である。哺乳動物非−ＭＡ  １０４細胞はたとえばＢＨＫ細胞ライン、ＣＲＦＫ細胞ラインおよびマジン・ダルビー・ボビン腎臓細胞ラインのような汎用目的の細胞ラインまたは、たとえばブタ睾丸細胞もしくはブタ腎臓細胞のようなブタ細胞であり、或いはこれらはたとえばベロ細胞のような非−ＭＡ  １０４霊長類細胞とすることができる。天然宿主細胞以外の細胞に対するＰＲＲＳＶの適応は、次のように行いうる標準的方法からなっている：特定ＰＲＲＳウィルス分離物を、ブタ細胞またはウィルスが増殖しうる他の非ブタ起源の感受性細胞（たとえばＭＡ  １０４細胞）を含有する培地で増殖させる。増殖の後、ＰＲＲＳＶを、細胞培養液および／または細胞を集めた後に細胞培養液および／または細胞を適応用の他の細胞型で継代（ｐａｓｓａｇｅ）させて回収する。最初に１種の非−ＭＡ  １０４細胞ラインに適応させた株は、さらに弱毒化すべく他の非−ＭＡ  １０４細胞ラインに適応させることができる。所望ならば、この適応過程をさらに他の非−ＭＡ  １０４細胞で反復することもできる。種々異なる温度での増殖に対する適応は弱毒化過程の１部とすることができる。非−ＭＡ  １０４細胞で継代させた後、非−マクロファージ感染特性が小継代数の後に得られる。５継代数、一般にマスターシードウィルスを得るのに必要な継代数にて、しばしば本発明による非−マクロファージ−感染性ウィルスを得るのに充分である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
好適実施形態において、この方法は適応用の細胞として非−ＭＡ  １０４霊長類細胞を使用する。非−ＭＡ  １０４霊長類細胞への適応の後、さらに他の適応を他の任意の適する細胞で行いうることも明かである。
【００１９】
より好適な実施形態において、この方法は適応用の非−ＭＡ  １０４霊長類細胞としてベロ細胞を使用する。
【００２０】
このようにして得られた生弱毒株の非−マクロファージ感染特性の検査はマクロファージにおける得られたウィルス株のインビトロでの増殖が存在しないことを試験して容易に行うことができる。
【００２１】
マクロファージ培養物の作成およびマクロファージ感染性ウィルスの増殖の両者に関する標準的技術は当業界にて公知であり、たとえばＷＯ  ９３／０７８９８号に記載されている。標準条件下で分離および増殖されたマクロファージに基づく簡単な試験システムは、本発明による生弱毒化ＰＲＲＳ株をまだマクロファージ感染特性を保持する他の生弱毒化ＰＲＲＳウィルスから区別する試験システムと同様である。１つの可能な試験システムを実施例２に説明する。
【００２２】
本発明によるＰＲＲＳＶ株の弱毒特性は、２種の株：Ｉ−１１４０（すなわちオランダ国にて１９９１年に分離された病原性ＰＲＲＳＶ株）およびＩ−１３８７（すなわち低病原性ＰＲＲＳＶ野性株）［両株はコレクション・ナショナーレ・デ・カルチュール・デ・ミクロオルガニスメス（ＣＮＣＭ）・オブ・インスチチュート・パッスール（パリ、フランス国）にその各番号で寄託］から出発して例示することができる。これら親株はマクロファージに対し感染性である。これら親株のうち、本発明による弱毒化された非−マクロファージ−感染性株を実施例１に記載するように作成した。マクロファージ−感染特性を実施例２に記載したように判定した。
【００２３】
次の株を試験用に入手した：
１．  Ｉ−１１４０  ＭＡ  １０４細胞にて第８８継代
２．  Ｉ−１１４０  ベロ細胞にて第６１継代
３．  Ｉ−１３８７  ＭＡ  １０４細胞にて第２０継代
２．  Ｉ−１３８７  ベロ細胞にて第４９継代。
【００２４】
下表は、これら株の感染特性を検査した試験結果を示す。
【００２５】
【表１】
2007320963.tif 000002
【００２６】
さらに本発明による弱毒化につき親株として極めて適するものは、他面（すなわちマクロファージ感染性に関連しない）にて既に弱毒化されたＰＲＲＳウィルスである。この種のウィルスは、上記ヨーロッパ特許出願ＥＰ  ０，６７６，４６７号に記載されている。これらウィルス株はヨーロッパ血清型に属し、これらはコレクション・ナショナーレ・デ・カルチュール・デ・ミクロオルガニスメス（ＣＮＣＭ）・オブ・インスチチュート・パッスール（パリ、フランス国）にＮｏ．Ｉ−１４０１として寄託されたハイブリドーマＡ２７により生産されるモノクローナル抗体Ａ２７に対し反応性であるが、インスチチュート・パッスール（パリ、フランス国）にＮｏ．Ｉ−１４０２として寄託されたハイブリドーマＡ３５により生産されるモノクローナル抗体Ａ３５に対しては反応性でない。この種のウィルスが本発明の方法によりマクロファージに対し非感染性にされれば、これらは一層安全となる。何故なら、その弱毒特性は一方が非−マクロファージ−感染特性である２つもしくはそれ以上の異なる面に依存するからである。したがって本発明の一層好適な実施形態において、本発明による生弱毒化ＰＲＲＳＶはコレクション・ナショナーレ・デ・カルチュール・デ・ミクロオルガニスメス（ＣＮＣＭ）・オブ・インスチチュート・パッスール（パリ、フランス国）にＮｏ．Ｉ−１４０１として寄託されたハイブリドーマＡ２７により生産されるモノクローナル抗体Ａ２７に対し反応性であるが、インスチチュート・パッスール（パリ、フランス国）にＮｏ．Ｉ−１４０２として寄託されたハイブリドーマＡ３５により生産されるモノクローナル抗体Ａ３５に対しては反応性でないという追加特性を有する。
【００２７】
Ｉ−１３８７株から得られた本発明による非−マクロファージ−感染性株はベロ細胞に対し継代した後に高度に弱毒化されるので、この生弱毒株は動物に投与する際に、極めて安全である（実施例２以降参照）。したがって他の一層好適な本発明の実施形態において、生弱毒化ＰＲＲＳＶはコレクション・ナショナーレ・デ・カルチュール・デ・ミクロオルガニスメス・オブ・インスチチュート・パッスール、２５ルー・ド・ドクツール・ルー、７５７２４パリ・セデックス１５に受託番号Ｉ−１７５８としてアクゾ・ノーベルＮＶ社により寄託されたウィルス株である。この株には「ＰＲＲＳＶ株ＤＶ」という同定記号が与えられ、したがって本明細書では株ＤＶとも称する。
【００２８】
本発明による生弱毒化ウィルスは、マクロファージに感染する能力を持たない結果、次の理由でワクチンの極めて適する基礎となる：これら株はマクロファージに対し感染性でない。マクロファージは野性型ＰＲＲＳＶの主たる標的細胞および免疫系の重要細胞の１種である。しかしながら、これらは免疫系を始動させる能力をまだ保持している。したがって、ヨーロッパ特許出願ＥＰ  ０，６７６，４６７号に記載されたヨーロッパ血清型の公知の生弱毒株に基づくワクチンとは異なり、本発明による生弱毒化ウィルスからなるワクチンは免疫系を同時に阻害することなく免疫系を始動させる。
【００２９】
したがって本発明のウィルス株に基づくワクチンは、公知の弱毒株に基づくワクチンとは異なる種類の安全性を与える。
【００３０】
したがって、さらに他の実施形態において本発明は、ＰＲＲＳＶ−感染に対しブタを保護するためのワクチンを提供し、これらワクチンは上記生非−マクロファージ−感染性弱毒化ＰＲＲＳ株に基づくものである。
【００３１】
非−マクロファージ−感染性ウィルスの安全性により、これらウィルスに基づくワクチンは典型的には１０３〜１０１０個の生ウィルス粒子を含有しうる。
【００３２】
本発明によるワクチンは医薬上許容しうるキャリヤを含みうる。１種の可能なキャリヤは生理学的食塩溶液である。他の医薬上許容しうるキャリヤは、たとえば細胞増殖を維持すべく使用される組織培養液であり、そこでウィルスが感染細胞から遊離される。
【００３３】
アジュバントおよび必要に応じ１種もしくはそれ以上の乳化剤（たとえばツイーン（登録商標）およびスパン（登録商標））も本発明による生弱毒化ワクチンに混入することができる。適するアジュバントは、たとえばビタミン−Ｅ酢酸塩溶解物、水酸化アルミニウム、燐酸アルミニウムもしくはアルミニウム酸化物、（鉱物）油エマルジョン（たとえばバイオール（登録商標）およびマルコール５２（登録商標））、並びにサポニンである。イスコムにおける抗原の混入も可能なアジュバントの形成法（ａｄｊｕｖａｔｉｏｎ）である。
【００３４】
本発明によるワクチンは好ましくは凍結乾燥型で製造される。特に生ウィルスの乾燥組成物を凍結乾燥により作成する場合は、安定化剤を生弱毒化ウィルスに添加するのが有利である。適する安定化剤はたとえばＳＰＧＡ［ボバルニク等、ジャーナル・バクテリオロジー、第５９巻、第５０９頁（１９５０）］、炭水化物（たとえばソルビトール、マニトール、トレハロース、澱粉、蔗糖、デキストランもしくはグルコーズ）、蛋白質（たとえばアルブミンもしくはカゼイン）、またはその分解生成物、並びに緩衝剤（たとえばアルカリ金属燐酸塩）である。所望ならば、上記アジュバント活性を有する１種もしくはそれ以上の化合物も添加することができる。
【００３５】
本発明によるワクチンは筋肉内もしくは皮下注射または鼻腔内、気管内、経口、皮膚（ｃｕｔａｎｅ）、経皮／皮膚内又は皮膚内の各投与により投与することができる。極めて便利な投与ルートは皮膚内もしくは筋肉内投与である。したがって、好適具体例において本発明によるワクチンは皮膚内もしくは筋肉内投与に適するキャリヤを含む。生理学的食塩溶液が皮膚内もしくは筋肉内投与のための簡単かつ適するキャリヤである。
【００３６】
本発明によるワクチンは１週令、３週令、６週令もしくは１０週令の雌ブタ、または交配前および／または分娩の６週間前までの雌ブタ（ブースターワクチン接種）、或いはそれぞれ半年の雄ブタ（ブースター）のワクチン接種履歴に応じてブタに投与することができる。
【００３７】
好適実施形態において本発明のワクチンは生弱毒化ＰＲＲＳウィルスの他に、他の無関係（すなわち非−ＰＲＲＳＶ−）の弱毒化もしくは失活病原体または他の病原体からの抗原性物質をも含む。この種の病原体はたとえば細菌もしくは寄生虫としうるが、ウィルス起源であってもよい。一般に、無関係の病原体またはその抗原物質はブタ病原体である。
【００３８】
この種の追加の弱毒化もしくは失活病原体または他の病原体からの抗原性物質をも含む本発明によるワクチンは、数種の感染に対する保護を同時に誘起するという利点を有する。抗原性物質は、免疫反応を誘発しうる物質であると理解される。抗原性物質の例は蛋白質、多糖類およびリポ多糖類である。
【００３９】
より好適な実施形態において病原体はシュードラビエスウィルス、ブタインフルエンザウィルス、ブタパルボウィルス、伝染性胃腸炎ウィルス、ロタウィルス、エッシェリチア・コリ、エリシペロ・ルシオパチエ、ボルデテラ・ブロンチセプチカ、サルモネラ・コレラスイス、ヘモフィルス・パラスイス、パスツレラ・ムルトシダ、ストレプトコッカス・スイス、ミコプラスマ・ヒオニュモニアエおよびアクチノバチルス・プルーロニウモニアエの群から選択される。
【００４０】
本発明によるワクチンは、本発明によればヨーロッパ血清型の任意の生弱毒化ＰＲＲＳウィルス分離物から得ることができる。本発明による方法を用いて開発された寄託ＰＲＲＳＶ株ＤＶは、極めて適するワクチン株になる全ての特性を有する。したがって好適実施形態において、ワクチンはインスチチュート・パッスールに受託番号Ｉ−１７５８として寄託されたＰＲＲＳＶ株ＤＶから得られる。
【００４１】
さらに他の実施形態において、本発明はＰＲＲＳに対処するための生弱毒化ワクチンの製造方法をも提供する。本発明による生弱毒化ＰＲＲＳＶに基づくワクチンを得る便利な方法は、適量の本発明によるウィルスを医薬上許容しうるキャリヤと混合することからなっている。
【００４２】
さらに、たとえば上記したアジュバント、乳化剤および安定化剤のような他の物質を添加してワクチンの性能および安定性を向上させることもできる。
【実施例１】
【００４３】
適応実験
ベロ細胞に対するＰＲＲＳＶ分離物Ｉ−１１４０の適応：
１９９１年にオランダ国で分離された病原性ＰＲＲＳＶ株Ｉ−１１４０［上記した通りであって、コレクション・ナショナーレ・デ・カルチュール・デ・ミクロオルガニスメス（ＣＮＣＭ）・オブ・インスチチュート・パッスール（パリ、フランス国）にこの番号にて寄託］を先ず最初にブタ肺マクロファージで培養し、次いで次のようにＭＡ  １０４細胞にて増殖させた。
【００４４】
ＭＡ  １０４細胞の半密集（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）モノレイヤー（７０ｃｍ２）に、１のＭＯＩを有する８０％密集にてＰＲＲＳＶ株を接種した。先ず最初に組織培養培地を取出して接種を行い、次いで１ｍＬのＰＲＲＳＶウィルスを添加し、モノレイヤー上に少なくとも２時間にわたり３７℃にて放置した。この時間の後、新たな組織培養培地を添加し、細胞をさらに湿潤ＣＯ２（５％ＣＯ２）中で３７℃にて培養した。ＣＰＥが観察された際、上澄液を集めて細胞を３回にわたり凍結および解凍させ、２０００ｒｐｍにて１０分間にわたり遠心分離して上澄液を集めた。次いで両上澄液をプールし、これを使用して同じ細胞の新たなモノレイヤーに接種した。次いで、この過程をウィルスが細胞ラインに充分適応すると共にマクロファージ培養物に匹敵するタイターがこの細胞ラインにて得られるまで反復した。この過程に際し、ウィルスの同定を免疫蛍光分析（ＩＦＡ）によりＰＲＲＳＶ特異性ポリクローナル血清およびＰＲＲＳＶ特異性モノクローナル抗体の両者を用いて決定した。
【００４５】
ＭＡ  １０４細胞におけるＩ−１１４０の第５継代を用いて次の方法によりＣＶ１（アフリカ  ミドリザル腎臓）細胞に感染させた：
ＣＶ１細胞を標準細胞増殖条件下で増殖させた。
【００４６】
７０〜８０％密集にて培地をＣＶ１モノレイヤーから取出した。ＭＡ  １０４細胞の感染モノレイヤーから最大ＣＰＥにて得られた上澄液を先ず最初に０．２μｍフィルタで濾過し、次いでＣＶ１モノレイヤーに載せた。３７℃および５％ＣＯ２で１日間培養した後、培地を新たな組織培養培地で置換した。細胞をさらに３７℃および５％ＣＯ２にて７日間にわたり培養した。この期間に際し毎日顕微鏡検査した。７日間の後、細胞を３回凍結および解凍させ、上澄液を遠心分離により回収すると共に０．２μｍフィルタで濾過した。濾過された材料を次いで上記したように新たなＣＶ１細胞のモノレイヤーを培養すべく用いた。この過程を３回行い、第３回の後、回収されかつ濾過された上澄液をＭＡ  １０４細胞での上澄液の培養によりＰＲＲＳＶの存在につき検査した。ＰＲＲＳＶの存在は、ＰＲＲＳＶ特異性モノクローナル抗体Ｉ−１４０１を用いてＰＲＲＳＶ特異性蛍光の存在により示した［モノクローナル抗体Ｉ−１４０１はコレクション・ナショナーレ・デ・カルチュール・デ・ミクロオルガニスメス（ＣＮＣＭ）・オブ・インスチチュート・パッスール（パリ、フランス国）にこの番号で寄託した］。
【００４７】
６．６  ＴＣＩＤ５０／ｍＬのＰＲＲＳＶタイターがＣＶ１細胞の上澄液に見られた。ＣＶ１細胞におけるＩ−１１４０の第１３継代を上記方法によりベロ細胞で行った。今回は、３回の盲検継代の後にＰＲＲＳＶがベロ細胞の上澄液に検出された。このウィルスをさらにベロ細胞における第６１継代を行ってさらに適応させた。
【００４８】
比較のため、ＭＡ  １０４細胞における親株Ｉ−１１４０の第８８継代（したがって非−ＭＡ  １０４細胞に適応していない）を表１に対照として使用し、ここで各種のウィルス株のマクロファージ感染性を比較した。
【００４９】
ベロ細胞に対するＰＲＲＳＶ分離物Ｉ−１３８７の適応
分離物Ｉ−１３８７を先ず最初にブタ肺マクロファージで培養した。次いでＩ−１３８７の第５継代を上記方法によりＭＡ  １０４細胞に載せた。
【００５０】
ＭＡ  １０４細胞におけるＩ−１３８７の第３８継代を用いて、上記方法によりベロ細胞に感染させた。
【００５１】
ＰＲＲＳＶがベロ細胞の上澄液に検出された。この分離物をさらにこれら細胞での第４９継代を行ってベロ細胞に適応させた。
【００５２】
このウィルス株を安全性実験およびワクチン接種実験に用い、これを実施例２および３で説明する。
【００５３】
比較のため、ＭＡ  １０４細胞における親株Ｉ−１３８７の第２０継代（したがって非−ＭＡ  １０４細胞に対し適応していない）を表１に対照として用い、ここで各種の株のマクロファージ感染性を比較した。
【実施例２】
【００５４】
マクロファージ感染性試験システム
この試験において、表１に挙げた４種のウィルス株（上記）を次のようにマクロファージ感染性につき検査した：
次のようにブタ肺胞マクロファージを得た：ＳＰＦブタを殺し、その肺を剔出して３０００ｍＬのＰＢＳで洗浄した。細胞を遠心分離により集め、ＭＥＭ−培地（ギブコ）＋１０％ＦＣＳに０．３×１０６細胞／ｍＬの濃度まで再懸濁させた。最後に細胞を２２５μＬ細胞懸濁物／ウェルにて９６ウェル微小培養プレートにシーディングすると共にプレートをＣＯ２培養器にて４日間貯蔵した。
【００５５】
滴定の直前に、ミクロタイタープレートを空け、新たな培地を再充填した。試験すべきウィルスの１０４ＭＡ  １０４−感染性ウィルス粒子を含む２５μＬの試料をウェルに施し、１０倍シリーズ希釈物を作成した。最後に、プレートをＣＯ２培養器にて７日間培養した。
【００５６】
ＣＰＥにより測定されるマクロファージにおける増殖は非−ＭＡ  １０４−細胞に適応した株につき検出されなかったのに対し、非適応の対照株は予想通りマクロファージに対し感染性であった。その結果を表１に示す（上記参照）。
【実施例３】
【００５７】
弱毒化試験
これら細胞に対するウィルスの適応が毒力の積極的弱毒化を誘発したかどうかを試験するため、全てのウィルス株を次の方法により妊娠雌ブタにて試験した：ＰＲＲＳウィルスおよびＰＲＲＳＶ特異性抗体に対し陰性である雌ブタに上記ＰＲＲＳＶ株の１種を妊娠の約９０日にて感染させた。上記株の毒力を測定するため、流産した小ブタおよび１週間以内に死亡した小ブタの頭数を測定した。次の結果が得られた：
【００５８】
【表２】
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【００５９】
上記表２から結論しうるように、マクロファージ感染性を喪失したＰＲＲＳＶ株は好適な弱毒特性を示す。
【００６０】
Ｉ−１１４０につき、顕著に少ない死亡小ブタが非−マクロファージ感染株での雌ブタの感染後に見られた。親Ｉ−１１４０株と対比してベロ細胞に適応したＩ−１１４０の投与量における３００倍の増加量を投与したという事実のため、毒力における極めて著しい減少が確認された。
【００６１】
同様な結果が、Ｉ−１３８７を雌ブタに投与した実験でも観察される。１０７．５ＴＣＩＤ５０の投与量はまだ顕著な頭数の死亡小ブタをもたらした。しかしながら、非−マクロファージ感染株を用いれば毒力における顕著な低下が観察された。極めて多い投与量（１０７．５ＴＣＩＤ５０の投与量に対し１０倍の増加）で投与したが、顕著に低い頭数の小ブタが死亡すると判明した。
【実施例４】
【００６２】
安全性実験
（Ｉ）５〜６週令の小ブタにおける株ＤＶの安全性、単一投与および高投与
３種の実験は標的動物（すなわち若い小ブタ）のワクチン接種を含んだ。これら実験の設定を表３に要約する。
【００６３】
安全性試験のため、各動物をワクチン接種に寄与しうる可能な臨床的徴候につきスクリーニングした。
【００６４】
【表３】
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【００６５】
結果：
これら実験において、ワクチン接種の後にはワクチン接種に起因する臨床的徴候は認められなかった。
【００６６】
結論：
本発明によるウィルス株は標的動物、すなわち若い小ブタに対し完全に安全である。
【００６７】
（ＩＩ）妊娠雌ブタに対する安全性
妊娠雌ブタを安全性試験のための最も敏感な動物と見なす。何故なら、妊娠の約９０日にてＰＲＲＳウィルスでの感染が高比率の流産およびミイラ化（３０〜１００％）並びに生存出産小ブタの出産第１週後における高比率の死亡をもたらすからである。
【００６８】
この安全性試験にて、各雌ブタには妊娠の９４日にて筋肉内および皮膚内の両者で注射部位１ケ所につき１０８．３ＴＣＩＤ５０の大投与量を接種した。
【００６９】
各試験は次の項目を含んだ：
−各雌ブタにおける局部的および全身的反応
−ワクチンの「取入れ」を示す出産時の雌ブタにおける抗体レベル
−雌ブタの生殖性能
−出産日に採取した小ブタの血清試料からのウィルス再分離物。
【００７０】
結果：
免疫蛍光分析で測定した抗体レベルは全ての雌ブタにて＞８（ｌｏｇ２）であり、これはウィルスが採取されたことを示す。ワクチン接種の後、５日間にわたり温度を監視すると共に１４日間にわたり臨床観察を行って全身的反応が観察されなかった。筋肉内ワクチン接種後の７日における１頭のブタでのみ僅かな局部的反応が観察された。皮膚内投与の１週間後に局部的皮膚反応が見られた：赤色化、発熱、触診しうる斑点、および幾つかの病巣。これら局部的皮膚反応は急速に消失し、もはや第２週目には見られなかった。
【００７１】
生殖性能の結果を表４に要約する：
【００７２】
【表４】
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【００７３】
生存した小ブタの頭数は少なくとも公称平均数（ハンドブック・ボア・デ・バーケンショウデリジＩＳＢＮ  ９０−８００９９９−３−７にしたがい＞＝１０．０８）であると思われる。これは、これら同じ雌ブタにて従来見られた生殖性能に完全に一致する。
【００７４】
結論：
この実験にて流産を誘発する妊娠の最適時点における極めて高い投与量にて投与したが、ＰＲＲＳウィルス感染の臨床徴候は観察されなかった。
【実施例５】
【００７５】
ワクチン接種−チャレンジ実験
２回のワクチン接種−チャレンジ実験にて、本発明によるＰＲＲＳウィルスでワクチン接種した保護特性につき検査した。両実験にて１０頭のＰＲＲＳ抗体フリーの小ブタの群に５〜６週令にて１０３．５〜１０６．９ＴＣＩＤ５０の範囲で変化するタイターにてワクチン株ＤＶ  ＰＲＲＳウィルスをワクチン接種した（表２参照：群１３１および１３５）。これら実験において、安全性および伝染性の面も検査した。ワクチン接種の４週間後、これら小ブタには鼻腔内にて１０５ＴＣＩＤ５０の異質野性型ＰＲＲＳウィルスを接種した。ワクチン接種およびウィルス接種の後、血清学的反応をワクチン接種動物にて監視すると共に、ワクチン接種動物と直接接触させたセンチネル動物および同じ建物内であるが物理的に分離した場所（異なるブタ小屋）に入れた対照についても監視した。
【００７６】
ワクチンの保護特性を判定する主たる基準は、チャレンジ後の種々の時間で得られた血清からの再分離されたチャレンジ株の量である。再分離は２種の異なるパラメータで判定した：チャレンジウィルスが再分離されうる時間、および再分離の時点におけるウィルスのタイターを測定した。
【００７７】
結果
血清学的反応
ワクチン接種およびチャレンジの後にｌｏｇ２単位にてＩＦＡで測定した抗体タイターをワクチン接種体、センチネルおよび対照につき表５に示す。
【００７８】
【表５】
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【００７９】
最高の抗体タイターが実験１３１にて見られた。この実験は、明瞭な抗体反応が既にワクチン接種の２週間後に検出されうることを示した。両実験にて、ワクチン接種動物におけるタイターは対照におけるよりもずっと高く、同様にチャレンジ後も同様であった。これは特に実験１３１の場合であった。筋肉内および皮膚内投与後の実験１３５で測定された血清学的反応も匹敵するものであった。恐らく、観察された最低のタイターおよび最も遅いブースター反応は１０３．５ＴＣＩＤ５０の投与量でワクチン接種した群に見られたが、試験したこの最低の投与量でも顕著なタイターが得られた。センチネル：４頭の動物のうち２頭が実験１３１にて血清変化し、実験１３５では１２頭のうち１頭であった。両実験にて、ワクチン接種体と同じ区域に保たれたが物理的に分離された対照では血清変化が見られなかった。
【００８０】
再分離（チャレンジ）ウィルス
血清に見られた平均ＰＲＲＳＶタイター（ｌｏｇ１０）（各群につき平均）をワクチン接種体、センチネルおよび対照につき表６に示す。
【００８１】
【表６】
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【００８２】
実験１３１にて、チャレンジウィルスはワクチン接種動物から再分離されなかった。実験１３５において、再分離割合および再分離の期間における顕著な低下が、非ワクチン接種対照と対比して全ての群で見られた。１０３．５ＴＣＩＤ５０の投与量にて筋肉内ワクチン接種した群における低下率に関する効果は他の群におけるよりも僅かに低かった。
【００８３】
実験１３１における４頭のセンチネルのうち２頭のみがワクチン接種後に血清変化し、実験１３５では１２頭の動物のうち１頭のみが血清変化した。同じ群の他の１頭のセンチネル動物（ｉ．ｍ．１０４．５）にて、ＰＲＲＳウィルスがチャレンジの時点で分離され、これは恐らくワクチンウィルスであった。
【００８４】
結論：
明瞭な抗体反応がワクチン接種の２週間後に既に検出でき、これは高タイターである。
【００８５】
筋肉内および皮膚内投与の後の血清学的反応は匹敵するものである。１０３．５ＴＣＩＤ５０の投与量でさえ顕著なタイターが得られる。非ワクチン接種対照と対比し、全ての群にて再分離は見られず或いは顕著に減少した再分離割合および再分離の期間が見られた。ウィルスは極めて低い割合でのみ直接対照に伝染する。この伝染割合にて、ワクチンウィルスは数回の複製にて明確となり、これは本発明によるウィルス株の弱毒化特性を示す。
【外国語明細書】
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