(57)【要約】【課題】パラゴムノキの各種のプレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子群を採取し、各遺伝子の塩基配列を決定することが本発明の課題である。【解決手段】本発明により、パラゴムノキの種々のプレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子群が採取され、それらの遺伝子の塩基配列が決定された。プレニルトランスフェラーゼは天然ゴムのイソプレン骨格の生合成に関与している。よって本発明で得られた遺伝子群で植物を形質転換することにより、ゴムの生産性を向上させることを期待できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする蛋白質。
（ａ）配列表の配列番号２に示す、アミノ酸番号１−３０６で示されるアミノ酸配列。
（ｂ）イソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸を基質としてゲラニル二リン酸を生合成するゲラニル二リン酸合成酵素としての機能を有する、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項２】
請求項１記載の蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項３】
以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号１に示す、塩基番号１２６−１０４３で示される塩基配列。
（ｂ）イソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸を基質としてゲラニル二リン酸を生合成するゲラニル二リン酸合成酵素としての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。
【請求項４】
以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号１に示す、塩基番号１−１０７４で示される塩基配列。
（ｂ）イソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸を基質としてゲラニル二リン酸を生合成するゲラニル二リン酸合成酵素としての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。
【請求項５】
請求項２乃至請求項４のいずれか一つの請求項記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物におけるゴムの生産性を向上させた、形質転換植物。
【請求項６】
請求項２乃至請求項４のいずれか一つの請求項記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物においてゴムの生産性を向上させる方法。
【請求項７】
以下の（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする蛋白質。
（ａ）配列表の配列番号４に示す、アミノ酸番号１−３０６で示されるアミノ酸配列。
（ｂ）イソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸を基質としてゲラニルゲラニル二リン酸を生合成するゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素としての機能を有する、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項８】
請求項７記載の蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項９】
以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号３に示す、塩基番号１８１−１０９８で示される塩基配列。
（ｂ）イソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸を基質としてゲラニルゲラニル二リン酸を生合成するゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素としての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。
【請求項１０】
以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号３に示す、塩基番号１−１６６２で示される塩基配列。
（ｂ）イソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸を基質としてゲラニルゲラニル二リン酸を生合成するゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素としての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。
【請求項１１】
請求項８乃至請求項１０のいずれか一つの請求項記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物におけるゴムの生産性を向上させた、形質転換植物。
【請求項１２】
請求項８乃至請求項１０のいずれか一つの請求項記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物においてゴムの生産性を向上させる方法。
【請求項１３】
以下の（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする蛋白質。
（ａ）配列表の配列番号６に示す、アミノ酸番号１−３３０で示されるアミノ酸配列。
（ｂ）イソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸を基質としてゲラニルゲラニル二リン酸を生合成するゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素としての機能を有する、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項１４】
請求項１３記載の蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項１５】
以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号５に示す、塩基番号５４−１０４３で示される塩基配列。
（ｂ）イソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸を基質としてゲラニルゲラニル二リン酸を生合成するゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素としての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。
【請求項１６】
以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号５に示す、塩基番号１−１２７８で示される塩基配列。
（ｂ）イソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸を基質としてゲラニルゲラニル二リン酸を生合成するゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素としての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。
【請求項１７】
請求項１４乃至請求項１６のいずれか一つの請求項の遺伝子を植物に導入することにより、該植物におけるゴムの生産性を向上させた、形質転換植物。
【請求項１８】
請求項１４乃至請求項１６のいずれか一つの請求項の遺伝子を植物に導入することにより、該植物においてゴムの生産性を向上させる方法。
【請求項１９】
以下の（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする蛋白質。
（ａ）配列表の配列番号８に示す、アミノ酸番号１−３２８で示されるアミノ酸配列。
（ｂ）イソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸を基質としてゲラニルゲラニル二リン酸を生合成するゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素としての機能を有する、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項２０】
請求項１９記載の蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項２１】
以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号７に示す、塩基番号５４−１０３７で示される塩基配列。
（ｂ）イソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸を基質としてゲラニルゲラニル二リン酸を生合成するゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素としての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。
【請求項２２】
以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号７に示す、塩基番号１−１１８１で示される塩基配列。
（ｂ）イソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸を基質としてゲラニルゲラニル二リン酸を生合成するゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素としての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。
【請求項２３】
請求項２０乃至請求項２２のいずれか一つの請求項記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物におけるゴムの生産性を向上させた、形質転換植物。
【請求項２４】
請求項２０乃至請求項２２のいずれか一つの請求項記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物においてゴムの生産性を向上させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はパラゴムノキのプレニルトランスフェラーゼ群、および当該酵素をコードする遺伝子群に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでにパラゴムノキからイソペンテニル二リン酸異性化酵素（IPP isomerase）、ファルネシル二リン酸合成酵素とゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素のトランス型短鎖プレニル二リン酸合成酵素の遺伝子や、シス型プレニル二リン酸合成酵素が単離され、それらの遺伝子がコードする酵素の機能解析が行われている。動物および原核生物由来の幾つかのトランス型プレニル二リン酸合成酵素に関しては、そのアミノ酸配列と生成物 (トランス-プレニル二リン酸) の鎖長との相関関係が明らかとなっている。
【０００３】
過去に公表された文献として、パラゴムノキ（Hevea brasiliensis）のIPP isomeraseに関する特許出願や（特開２０００−２００２７６号公報）、パラゴムノキからIPP isomeraseをクローニングした学術論文（Soo Kyung Oh et al., J.Plant Physiol. 157 (2000) 549-557）が知られている。またパラゴムノキからゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素をクローニングした学術論文（A.Takaya et al.,Biochimica et Biophysica Acta 1625 (2003) 214-220）や、パラゴムノキからシス-プレニルトランスフェラーゼをクローニングした学術論文（K.Asawatreratanakul Eur.J.Biochem. 270 (2003) 4671-4680）が知られている。
【０００４】
アリル性基質に順次イソペンテニル二リン酸（IPP）を連結していく反応を触媒する酵素は、イソプレン単位を順次つなげていくという意味からプレニルトランスフェラーゼと総称されてきた。なおプレニルトランスフェラーゼとは、IPPとイソプレニル二リン酸（C5n）（アリル性基質）との間の縮合反応を触媒し、イソプレン単位が１単位増えた新たなイソプレニル二リン酸（C5n+1）を合成する酵素の総称を意味する概念である。
【０００５】
プレニルトランスフェラーゼはイソプレン単位を連結することにより、各テルペノイドの基本的前駆体となるゲラニル二リン酸（GPP:C10）、ファルネシル二リン酸（FPP:C15）、ゲラニルゲラニル二リン酸（GGPP:C20）、ゲラニルファルネシル二リン酸（GFPP:C25）、ヘキサプレニル二リン酸（HPP:C30）などの各種のイソプレニル二リン酸を合成する酵素群であり、テルペンペノイド生合成の主流に位置している。各種のプレニルトランスフェラーゼにより産生されるイソプレニル二リン酸類を図１に示す。なお上記に述べたように、本願明細書においてプレニルトランスフェラーゼとはイソプレン単位が１単位増やす反応を触媒する酵素を包括的に意味するので、ゲラニル二リン酸合成酵素、ファルネシル二リン酸合成酵素、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素、ゲラニルファルネシル二リン酸合成酵素、ヘキサプレニル二リン酸合成酵素などを全て包含するものである。
【０００６】
【特許文献１】特開２０００−２００２７６号公報
【非特許文献１】Soo Kyung Oh et al., J.Plant Physiol. 157 (2000) 549-557
【非特許文献２】A.Takaya et al.,Biochimica et Biophysica Acta 1625 (2003) 214-220
【非特許文献３】K.Asawatreratanakul Eur.J.Biochem. 270 (2003) 4671-4680
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
パラゴムノキにおけるプレニルトランスフェラーゼの遺伝子群に関する解析はまだ不十分であったので、パラゴムノキのプレニルトランスフェラーゼの遺伝子群を単離し、当該遺伝子群を構成する各遺伝子の塩基配列を解析することが、本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
パラゴムノキのEST（Expression Sequence Tags）解析により得た遺伝子断片情報と既知遺伝子データベースとの統合解析により、プレニルトランスフェラーゼ遺伝子群と思われる配列を特定し、全長cDNAクローニングにより、当該遺伝子ホモログを取得した。そして取得した各遺伝子についてその塩基配列を決定した。
【発明の効果】
【０００９】
プレニルトランスフェラーゼをコードする本発明の遺伝子群は、天然ゴムのイソプレン骨格の生合成に関与する酵素群をコードする遺伝子群である。よって本発明で得られた遺伝子群で植物、特にゴム産生植物を形質転換することにより、天然ゴムの産生量が高い実用植物を作製することが可能である。より具体的には、本発明の遺伝子を導入して得られた形質転換したパラゴムノキを作製することにより、天然ゴムの産生量が増加することを期待できる。なお本願明細書において「ゴムの生産性を向上させた」とは、本発明のプレニルトランスフェラーゼの遺伝子を導入することにより、ゴムの生産量が増加することを意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
パラゴムノキ標準木の乳液（Latex）および当年枝の木部組織（Xylem）について、total RNAを抽出し、cDNAライブラリを作製した。これらについて網羅的なワンパスシークエンス解析を行った。乳液、木部組織由来のcDNAライブラリについて、それぞれ16407、16035の精度の高いEST配列が得られた（合計 32442）。得られた部分配列について、配列の類似性に基づいたクラスタリング解析と、既知遺伝子との比較に基づいたアノテーション解析を行い、パラゴムノキESTデータベースを構築した。
【００１１】
得られたESTデータベースにおいて、ゲラニル二リン酸合成酵素、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素をコードすると推定されるEST配列を見出した。これらの配列について3'-RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）により3’末端側の配列を決定し、完全長のcDNAを取得した。
【００１２】
ゲラニル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子を、配列表の配列番号１の塩基番号１から１０７４に示す。配列表の配列番号１の塩基配列において塩基番号１２６から１０４３に対応する部分が読み枠である。そしてその読み枠の塩基配列から得たゲラニル二リン酸合成酵素の推定アミノ酸配列を、配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から３０６に示す。なおゲラニル二リン酸合成酵素は、イソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸を基質としてゲラニル二リン酸を生合成する反応を触媒する酵素である。
【００１３】
ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子を、配列表の配列番号３の塩基番号１から１６６２に示す。配列表の配列番号３の塩基配列において塩基番号１８１から１０９８に対応する部分が読み枠である。そしてその読み枠の塩基配列から得たゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の推定アミノ酸配列を、配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から３０６に示す。なおゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素は、イソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸を基質としてゲラニルゲラニル二リン酸を生合成する反応を触媒する酵素である。
【００１４】
他のクローンから得られたゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子を、配列表の配列番号５の塩基番号１から１２７８に示す。配列表の配列番号５の塩基配列において塩基番号５４から１０４３に対応する部分が読み枠である。そしてその読み枠の塩基配列から得たゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の推定アミノ酸配列を、配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から３３０に示す。なおゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素は、イソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸を基質としてゲラニルゲラニル二リン酸を生合成する反応を触媒する酵素である。
【００１５】
他のクローンから得られたゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子を、配列表の配列番号７の塩基番号１から１１８１に示す。配列表の配列番号７の塩基配列において塩基番号５４から１０３７に対応する部分が読み枠である。そしてその読み枠の塩基配列から得たゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の推定アミノ酸配列を、配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から３２８に示す。なおゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素は、イソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸を基質としてゲラニルゲラニル二リン酸を生合成する反応を触媒する酵素である。
【００１６】
遺伝子組み換え技術によれば、基本となるDNA の特定の部位に、当該DNA の基本的な特性を変化させることなく、あるいはその特性を改善する様に、人為的に変異を起こすことができる。本発明により提供される天然の塩基配列を有する遺伝子、あるいは天然のものとは異なる塩基配列を有する遺伝子に関しても、同様に人為的に挿入、欠失、置換を行う事により、天然の遺伝子と同等のあるいは改善された特性を有するものとすることが可能であり、本発明はそのような変異遺伝子を含むものである。
【００１７】
即ち、配列表の配列番号１に示す遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号１に示す塩基配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換された遺伝子である。また、その様な遺伝子と配列番号１に示す塩基配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な遺伝子も、イソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸を基質としてゲラニル二リン酸を生合成するゲラニル二リン酸合成酵素としての機能を有する蛋白質をコードする限り本発明の範囲内である。また、その様な遺伝子はストリンジェントな条件下で配列表の配列番号１に示す遺伝子とハイブリッドを形成する。
【００１８】
同様に、配列表の配列番号３に示す遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号３に示す塩基配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換された遺伝子である。また、その様な遺伝子と配列番号３に示す塩基配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な遺伝子も、イソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸を基質としてゲラニルゲラニル二リン酸を生合成するゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素としての機能を有する蛋白質をコードする限り本発明の範囲内である。また、その様な遺伝子はストリンジェントな条件下で配列表の配列番号３に示す遺伝子とハイブリッドを形成する。
【００１９】
同様に、配列表の配列番号５に示す遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号５に示す塩基配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換された遺伝子である。また、その様な遺伝子と配列番号５に示す塩基配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な遺伝子も、イソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸を基質としてゲラニルゲラニル二リン酸を生合成するゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素としての機能を有する蛋白質をコードする限り本発明の範囲内である。また、その様な遺伝子はストリンジェントな条件下で配列表の配列番号５に示す遺伝子とハイブリッドを形成する。
【００２０】
同様に、配列表の配列番号７に示す遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号７に示す塩基配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換された遺伝子である。また、その様な遺伝子と配列番号７に示す塩基配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な遺伝子も、イソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸を基質としてゲラニルゲラニル二リン酸を生合成するゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素としての機能を有する蛋白質をコードする限り本発明の範囲内である。また、その様な遺伝子はストリンジェントな条件下で配列表の配列番号７に示す遺伝子とハイブリッドを形成する。
【００２１】
ハイブリダイゼーションの条件については当業者が適宜選択をすることができるが、具体的には以下の操作によってハイブリダイゼーションを行うことができる。試験すべきDNA またはRNA 分子を転写した膜と標識したプローブを、適用なハイブリダイゼーションバッファー中でハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションバッファーの組成は、例えば、5 ×SSC 、 0.1重量% N-ラウロイルサルコシン、0.02重量% のSDS 、 2重量% の核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬及び50% フォルムアミドから成る。核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬としては、一例として、0.1Mマレイン酸と0.15M 塩化ナトリウムからなる緩衝液(pH7.5) に市販の核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬を10% になるように溶解したものを使用することができる。20×SSC は、３Ｍ塩化ナトリウム、0.3 Ｍクエン酸溶液であり、SSC は、より好ましくは、３〜６×SSC 、更に好ましくは４〜５×SSC の濃度で使用する。
【００２２】
ハイブリダイゼーションの温度は、40〜80℃、より好ましくは50〜70℃、更に好ましくは55〜65℃の範囲であり、数時間から一晩のインキュベーションを行った後、洗浄バッファーで洗浄する。洗浄の温度は、好ましくは室温、より好ましくはハイブリダイゼーション時の温度である。洗浄バッファーの組成は６×SSC ＋０．１重量％SDS 溶液、より好ましくは４×SSC ＋０．１重量％SDS 溶液、更に好ましくは２×SSC ＋０．１重量％SDS 溶液、更に好ましくは１×SSC ＋０．１重量％SDS 溶液、最も好ましくは０．１×SSC ＋０．１重量％SDS 溶液である。このような洗浄バッファーで膜を洗浄し、プローブがハイブリダイズしたDNA 分子またはRNA 分子をプローブに用いた標識を利用して識別することができる。
【００２３】
更に本願明細書において、配列番号２に示すアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加された蛋白質とは、配列番号２に示すアミノ酸配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下のアミノ酸が置換された蛋白質である。また、その様な蛋白質と配列番号２に示すアミノ酸配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な蛋白質も、イソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸を基質としてゲラニル二リン酸を生合成するゲラニル二リン酸合成酵素としての機能を有する限り、本発明の範囲内である。
【００２４】
同様に、配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加された蛋白質とは、配列番号４に示すアミノ酸配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下のアミノ酸が置換された蛋白質である。また、その様な蛋白質と遺伝子と配列番号４に示すアミノ酸配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な蛋白質も、イソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸を基質としてゲラニルゲラニル二リン酸を生合成するゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素としての機能を有する限り本発明の範囲内である。
【００２５】
同様に、配列表の配列番号６に示すアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加された蛋白質とは、配列番号６に示すアミノ酸配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下のアミノ酸が置換された蛋白質である。また、その様な蛋白質と遺伝子と配列番号６に示すアミノ酸配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な蛋白質も、イソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸を基質としてゲラニルゲラニル二リン酸を生合成するゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素としての機能を有する限り本発明の範囲内である。
【００２６】
同様に、配列表の配列番号８に示すアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加された蛋白質とは、配列番号８に示すアミノ酸配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下のアミノ酸が置換された蛋白質である。また、その様な蛋白質と遺伝子と配列番号８に示すアミノ酸配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な蛋白質も、イソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸を基質としてゲラニルゲラニル二リン酸を生合成するゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素としての機能を有する限り本発明の範囲内である。
【００２７】
プレニルトランスフェラーゼをコードする本発明の遺伝子群を、ゴムノキなどの植物に遺伝子導入してその発現を増強することにより、プレニルトランスフェラーゼの遺伝子産物の発現量を該植物において増加させることができる。各種のプレニルトランスフェラーゼが関与する経路は、天然ゴムのイソプレン骨格を付加する反応を触媒することにより、天然ゴムの産生に関与することが知られている。よってプレニルトランスフェラーゼの遺伝子により形質転換したゴムノキを作製することにより、該ゴムノキにおいてゴムの産生量が増強することを期待できる。
【００２８】
なお本発明の遺伝子を導入する植物の例としては、パラゴムノキの他、グアユール、キャッサバ、ヒマワリ、レタス、インドゴムノキなどを挙げることができるが、形質転換を行う対象の植物はそれらの植物に限定されるものではなく、種々の植物において本発明の遺伝子を導入した形質転換体を作成することができる。中でもパラゴムノキなどのゴム産出植物を用いて形質転換を行い、該ゴム産出植物から得られるゴムの品質を向上させることは、本発明において好適な態様である。なおゴム産出植物は、キク科、クワ科、トウダイグサ科、ガガイモ科、キョウチクトウ科など多種の科に渡ることが知られている。
【００２９】
形質転換体の作製方法としては、本技術分野において知られている通常の方法を用いる事ができる。導入された遺伝子を活性化するために有用ばプロモーターとして、例えば、本技術分野で汎用されているカリフラワーモザイクウイルス35S プロモーターを用いて、形質導入するべき本発明の遺伝子の上流に配置することができる。導入された外来遺伝子を十分に発現させるためには、多くの場合には何らかのプロモーターが必要とされるが、好適なプロモーターはカリフラワーモザイクウイルス35S プロモーターに限定されるものではなく、本技術分野において汎用されている種々のプロモーターを用いることも可能である。なおゴムの増産には乳管特異的なプロモーターを使用することが好適である。
【００３０】
また、本発明において使用可能なベクターとして、例えば、pIG121-Hm、pBI12、pBI221、pBIN19、pCC22、pGA482、pPCV001、pCGN1547、pJJ1881、pPZP111、pGreen0029、pBI101、pBI121、pYLTAC7などを挙げることができる。しかし使用できるベクターはそれらに限定されるものではない。そのようなベクターを、例えばアグロバクテリウム菌に導入して、カルス又は幼植物に感染させることにより、形質転換植物を作製する事が可能であり、更に、そのような形質転換植物に由来する種子を得る事が可能である。また、本発明の植物遺伝子を植物に導入する形質転換法は、アグロバクテリウム法に限定されるものではなく、パーティクルガン法、電気穿孔法等の、本技術分野において公知の種々の方法を用いる事も可能である。なおゴムノキにおいて外来遺伝子を導入して形質転換を行った例が、特開平８−１１６９７７号公報において開示されている。よって本技術分野の当業者は、例えば特開平８−１１６９７７号公報の記載を参考にして適宜工夫をして、本発明の遺伝子を導入した形質転換植物を作製することができる。
【実施例】
【００３１】
（材料）
植物体試料として、Indonesia Cikaｍpekで栽培されているパラゴムノキ Hevea brasiliensis RRIM600標準木より採取した乳液および、当年枝の木部組織を用いた。乳液は採取後、直ちに等量の2×サンプリングバッファー（0.1M Tris-HCl, 0.3M LiCl, 0.01M EDTA, 10% SDS）に懸濁した。酵母の変異株は、市販の YKO Heterozygous Essential Strain Collection-Glycerol Stocks (Open Biosystems社) を使用した。
【００３２】
（パラゴムノキからの RNA 抽出）
乳液および木部組織からそれぞれ下記の手順でRNAを抽出した。採取後、直ちに等量の2×サンプリングバッファー（0.1M Tris-HCl, 0.3M LiCl, 0.01M EDTA, 10% SDS）に懸濁したSample（乳液25 ml相当）を遠心分離し、上層のゴム層を取り除いた。さらに1.5倍量の2×CTAB溶液(2% ヘキサデシルトリメチルアンモニウム・ブロマイド(CTAB), 1% 2-メルカプトエタノール、0.1 M Tris-HCl (pH9.5), 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA )を加え、65℃で10 min インキュベートした後、クロロホルム/イソアミルアルコール 処理を行った (2 回くり返す) 。回収した水層に 1/4 量の10 M LiCl を加え混合し -20℃で 2 時間インキュベートした (RNA の選択的沈殿)。これを遠心分離し、沈殿を適量の TE に溶解し、遠心し、上清を回収して多糖類を排除した。この画分について フェノール処理、フェノール/クロロホルム処理、クロロホルム/イソアミルアルコール処理を行った後、再度LiCl によるRNA の選択的沈殿を行った。沈殿を 70% エタノールで洗浄、減圧乾燥後 DEPC 処理水に溶解し、乳液由来total RNAを得た。
【００３３】
また、当年枝からメスを用いて師部組織を剥離して得られた木部組織約1gを液体窒素で冷却しつつ乳鉢・乳棒で破砕し、RNeasy Plant Mini Kit（登録商標、QIAGEN社）を使用して、木部組織由来total RNAを得た。
【００３４】
得られた RNA 溶液について吸光度測定による定量と電気泳動による確認を行った。乳液 25mlから450μg、木部組織1gから110μgのRNAが得られた。
【００３５】
（パラゴムノキcDNAライブラリの作製）
パラゴムノキ乳液および木部組織由来 RNA 試料について、日立計測器サービス (株) にてG-キャッピング法により cDNA ライブラリを作製した。なおG-キャッピング法は cDNA 完全長率の高い手法である。
【００３６】
乳液由来のcDNAライブラリのライブラリサイズは、1.7×105、インサート率は71% (24 サンプル/アガロースゲル電気泳動)、完全長率はインサートのあるクローンに対して82%であった。木部組織由来のcDNAライブラリのライブラリサイズは、2.9×105、インサート率は80% (24 サンプル/アガロースゲル電気泳動)、完全長率はインサートのあるクローンに対して87%であった。
【００３７】
（EST配列のシークエンス解析とクラスタリング解析およびアノテーション解析）
北里大学北里生命科学研究所ゲノム情報学研究室にて、パラゴムノキ乳液および木部組織由来 cDNA ライブラリそれぞれ約2万クローンについて網羅的なワンパスシークエンス解析を行った。シークエンス解析により得られた配列情報からインサートを保持しないクローン、シークエンスが読めていないものを除去し、精度の高い配列情報を得た。乳液、木部組織のライブラリについてそれぞれ16407、16035の精度の高い EST 配列が合計 32442個得られた。
【００３８】
得られた部分配列について、配列の類似性に基づいたクラスタリング解析と、既知遺伝子との比較に基づいたアノテーション解析を行い、パラゴムノキESTデータベースを構築した。クラスタリング解析には、NTT ソフトウェア の VISUALBIO clustering を使用した。アノテーション解析は、NCBI BLAST を使用した相同性検索により行った。検索の際に使用したデータベースは nr (All non-redundant GenBank CDS translations + PDB + SwissProt + PIR (Peptide Sequence Database)) である。
【００３９】
得られたESTデータベースにおいて、プレニル二リン酸合成酵素、およびプレニルプレニル二リン酸合成酵素をコードすると推定されるEST配列を見出した。
【００４０】
（3'-RACE による 3'末端側の配列決定）
上記の解析により得られた各配列について 3'-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE) により 3' 末端側の配列を決定し、完全長の cDNA を取得した。3'-RACE には 3’-Full RACE Core Set （タカラバイオ (株)）を使用した。逆転写反応には oligo-dT primer を使用した。PCR による増幅には oligo-dT primer と 既知配列の一部と同じ配列の sense primer を使用した。逆転写反応、PCR により得られた増幅断片を pT7Blue vector に TA クローニングした後シークエンス解析を行った。
【００４１】
そのようにして得られた配列が、(1)ゲラニル二リン酸合成酵素の遺伝子の塩基配列（配列表の配列番号１）、(2)ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の遺伝子の塩基配列（配列番号３）、(3)他にクローン由来するゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の遺伝子の塩基配列（配列表の配列番号５）、(4)他にクローン由来するゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の遺伝子の塩基配列（配列表の配列番号７）である。
【００４２】
そしてそれらの塩基配列の読み枠から得られた蛋白質の推定アミノ酸配列が、(1)ゲラニル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列（配列表の配列番号２）、(2)ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列（配列表の配列番号４）、(3)他にクローン由来するゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列（配列表の配列番号６）、(4)他にクローン由来するゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列（配列表の配列番号８）である。
【００４３】
（酵素活性による機能確認）
上記の手順で得られた配列のうち、配列表の配列番号３に示すゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の候補遺伝子について、その遺伝子から組換え蛋白質を作製してその組換え蛋白質を使用して酵素反応を行い、その反応生成物を分析することによって機能を確認した。
【００４４】
（組み換え蛋白質の発現）
まず、パラゴムノキのゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の候補遺伝子をpColdI vector（Takara）にインフレームで挿入し、発現用プラスミドを作製した。なお発現用プラスミドとして、pColdI vector以外にも、pGEX、pETなどの様々な市販の発現用プラスミドが使用可能である。発現用プラスミドで大腸菌 E. coli BL21(DE3)株を形質転換し、アンピシリンを含む選択培地プレート上で形質転換体を選択した。なお、組換えタンパクを発現させる大腸菌として、Novagen社のOrigami、Rosetta、Rosetta-gamiなどの様々な市販の発現用大腸菌株が使用可能である。形質転換した大腸菌を、50μg/mlのアンピシリンを含むLB培地に植菌し、37℃で振盪培養した。OD600が0.4となった時点で培養液を15℃に冷却し、30分間放置した。終濃度が0.1mMになるようにIPTGを添加し、さらに15℃で24時間振盪培養した。なお、大腸菌の培養温度やIPTGの濃度などの誘導条件は、様々に振ることができる。培養後、菌体を回収・破砕し、可溶性の組換えタンパク質を得た。
【００４５】
あるいはパラゴムノキのゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の候補遺伝子を昆虫でのバキュロウイルスを用いた蛋白質発現用pVL1393(Takara)トランスファーベクターにインフレームで挿入し、発現用プラスミドを作製した。なおpVL1393ベクター以外にも、pAcAB3などの様々な市販のトランスファーベクターが使用可能である。Sf-9などの昆虫細胞2.5×106cellsを25cm2細胞培養フラスコに播種し、室温で30分間静置し、細胞がフラスコに接着したのを確認した後、1mlの無血清培地に交換した。ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の候補遺伝子を挿入したトランスファーベクターとバキュロウイルスゲノムDNAをリポフェクション法によりSf-9細胞にトランスフェクトした。定期的に振盪しながら、DNAを細胞に室温で１時間吸着させた後、5%ウシ胎児血清を含む培地5mlを加え、28℃で4日間培養した。培養終了後、ウイルスを含む上清を回収し、ウイルスストックとした。これには非形質転換体も含まれるため、ウイルスストックをプラークアッセイにより純化した。2.5×106cellsのSf-9細胞に対して、純化した組み換えウイルスを感染させ、28℃で72時間、浮遊培養した。培養終了後、細胞を回収・破砕し、可溶性の組み換え蛋白質を得た。
【００４６】
そのようにして得られた可溶性タンパク質を用いて、文献（Oh, (2000) J.Plant Physiology, 157, p535）に述べられた方法でゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の活性を測定した。具体的には、50mM リン酸Buffer（pH7.4）、5mM MgCl2、5mM KF、5mM ヨードアセトアミド、0.1%（w/v）Triton X-100、10μMの14C-IPP、5μMのFPPを含む反応溶液に適量の可溶性組換え蛋白質を加え、30℃で4時間反応させた。
【００４７】
反応生成物をブタノールで抽出したあと、ポテトの酸フォスファターゼ（potato acid phosphatase(Sigma)）で37℃一晩インキュベートし、加水分解した。加水分解した反応生成物をヘキサンで抽出し、逆相TLCプレート上でアセトン：H2O = 9：1の展開溶媒を用いて展開した。TLCプレートをイメージプレートに露光し、BAS1500 image analyser (Fuji)で放射活性を分析した。放射性の反応生成物は、ヨウ素で可視化した標品（ファルネソール、ゲラニルゲラニオールなど）と比較して、同定した。
【００４８】
このように候補遺伝子の組換えタンパク質を発現させ、14CラベルされたIPPを用いてプレニルトランスフェラーゼとしての活性を測定し、更に反応生成物の分析を行うことによって、配列表の配列番号３に示す遺伝子の機能の確認を試みた。その結果、パラゴムノキEST配列のうち、配列表の配列番号３に示すゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の遺伝子について、その酵素活性により遺伝子の機能を特定することができた。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明により、パラゴムノキの種々のプレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子群が採取され、それらの遺伝子の塩基配列が決定された。プレニルトランスフェラーゼは天然ゴムのイソプレン骨格の生合成に関与している。よって本発明で得られた遺伝子群で植物を形質転換することにより、ゴムの生産性を向上させることを期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は各種のプレニルトランスフェラーゼにより産生されるイソプレニル二リン酸類を示す図である。
【図１】
2007105032.tif 000002
【配列表】
2007105032000001.app