(57)【要約】  【課題】インターカレーターを用いて二本鎖核酸を検出する場合における検出精度・定量性などを向上させること。  【解決手段】本発明者らは、二本鎖核酸中、ＡＴ塩基対が連続して存在する部位に加えて、ＧＣ塩基対が一つ又は連続して存在する部位にも相互作用するインターカレーターの場合、一般的なインターカレーターにおける添加量よりも過剰な量を添加しても、所定量までは濃度消光を起こさないこと、及び、従来のインターカレーターにおける添加量よりも過剰な量を添加することにより、蛍光強度を増加できることを新規に見出した。そこで、インターカレーターを用いる二本鎖核酸検出方法であって、二本鎖核酸に対するインターカレーターの飽和相互作用量よりも過剰な量であり、かつ、前記インターカレーターが濃度消光を引き起こさない量のインターカレーターを反応場に投入する二本鎖核酸検出方法を提供する。  【選択図】図１
2007295870.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターカレーターを用いる二本鎖核酸検出方法であって、
前記二本鎖核酸と前記インターカレーターの飽和相互作用量よりも過剰な量であり、かつ、前記インターカレーターが濃度消光を引き起こさない量のインターカレーターを反応場に投入する二本鎖核酸検出方法。
【請求項２】
前記二本鎖核酸中、ＡＴ塩基対が連続して存在する部位に加えて、ＧＣ塩基対が一つ又は連続して存在する部位にも相互作用するインターカレーターを用いることを特徴とする請求項１記載の二本鎖核酸検出方法。
【請求項３】
インターカレーターとしてＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（商標名、以下同じ）を用いる二本鎖核酸検出方法であって、
前記二本鎖核酸１ｍｅｒ当たりの前記ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉの投入量を、「数１」に示す式の条件を満たす量にすることを特徴とする請求項１記載の二本鎖核酸検出方法。
【数１】
2007295870.tif 000005
【請求項４】
インターカレーターを用いて、検出表面に固定された検出用の核酸プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出するハイブリダイゼーション検出方法であって、
前記二本鎖核酸と前記インターカレーターの相互作用量よりも過剰な量であり、かつ、前記インターカレーターが濃度消光を引き起こさない量のインターカレーターを前記検出表面に臨む反応場に投入するハイブリダイゼーション検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターカレーターを用いて二本鎖核酸を検出する反応系に関する技術分野に属し、二本鎖核酸に対するインターカレーターの飽和相互作用量よりも過剰な量であり、かつ、インターカレーターが濃度消光を引き起こさない量インターカレーターを反応場に投入する二本鎖核酸検出方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子解析などの分野において、二本鎖核酸やハイブリダイゼーションなどを、蛍光物質を用いて検出する技術が実用化されている。近年、それらの技術の一つとして、インターカレーターを用いる方法が注目されている。
【０００３】
インターカレーターは、二本鎖核酸部分に特異的に結合する蛍光物質である。例えば、インターカレーターを二本鎖核酸部分に結合させた後、インターカレーターから発せられる蛍光を測定することにより、二本鎖核酸部分を検出できる。そこで、インターカレーターは、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法により増幅した二本鎖核酸の検出、ＤＮＡチップなどにおけるハイブリダイゼーションの検出などへの応用が検討され、それらの領域などにおいて、一部、実用化されている。
【０００４】
インターカレーターなどの蛍光物質に関して、サンプル中における蛍光物質の濃度が比較的低い場合、蛍光強度と濃度が比例することが知られている。一方、蛍光物質の濃度が高い場合、濃度消光が引き起こされ、蛍光強度が逆に減少すると一般的に考えられている。そのため、インターカレーターを用いて二本鎖核酸などを検出する場合も、比較的低濃度のインターカレーターが用いられている。
【０００５】
なお、本発明に関わる先行文献として、例えば、特許文献１には、蛍光インターカレーター及び相補鎖核酸断片の検出方法が、非特許文献１には、インターカレーターの一つであるＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（商標、米モレキュラー  プローブス社製）の構造、機能などに関する研究結果が、それぞれ開示されている。
【特許文献１】特開２００１−２８９８４８号公報
【非特許文献１】Zipper H. et al “Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications.”Nucleic Acids Research, 2004, Vol.32, No.12 e103, Published online July 12, 2004
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
一般的に、インターカレーターは、濃度消光が引き起こされないように、二本鎖核酸とインターカレーターの飽和相互作用量と同等かそれ以下の濃度で用いられている。一方、蛍光強度に基づいて二本鎖核酸を定量的に検出する際におけるインターカレーターの投入濃度の詳細な検討などは、ほとんど行われていない。
【０００７】
そこで、本発明は、二本鎖核酸を定量的に検出する際における、インターカレーターの濃度と蛍光強度の関係などについて検討し、それらの知見に基づいて、インターカレーターを用いて二本鎖核酸を検出する場合における検出精度・定量性などを向上させることを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、二本鎖核酸中、ＡＴ塩基対が連続して存在する部位に加えて、ＧＣ塩基対が一つ又は連続して存在する部位にも相互作用するインターカレーターの場合、一般的なインターカレーターの添加量よりも過剰な量を添加しても、所定量までは濃度消光を起こさないこと、及び、従来のインターカレーターにおける添加量よりも過剰な量を添加することにより、蛍光強度を増加できることを新規に見出した。
【０００９】
そこで、本発明では、インターカレーターを用いる二本鎖核酸検出方法であって、二本鎖核酸に対するインターカレーターの飽和相互作用量よりも過剰な量であり、かつ、前記インターカレーターが濃度消光を引き起こさない量のインターカレーターを反応場に投入する二本鎖核酸検出方法を提供する。
【００１０】
この方法により、従来のように比較的低濃度でインターカレーターを用いた場合よりも、蛍光強度を増加させることができるため、二本鎖核酸の検出精度及び定量性を向上できる。従って、本発明は、例えば、二本鎖核酸の定量的な検出、検出表面に固定された検出用のプローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションの検出などにも有効である。
【００１１】
本発明において、従来の添加量よりも過剰なインターカレーターを添加しても、所定量までは濃度消光を起こさない理由は、次の通りであると推測する。
【００１２】
二本鎖核酸中、ＡＴ塩基対が連続して存在する部位に加えて、ＧＣ塩基対が一つ又は連続して存在する部位にも相互作用するインターカレーターの場合、二本鎖核酸とインターカレーターの相互作用が飽和状態になると、二本鎖核酸のＧＣ塩基対に結合したインターカレーターに他のインターカレーターが重合的に結合する。そのため、余剰のインターカレーターを反応場に投入しても、反応溶液中のインターカレーターは濃度消光する量にまで達しにくくなる。また、二本鎖核酸には、相互作用したインターカレーター以外に、インターカレーター同士で結合したものも結合するため、蛍光強度も増強される。
【００１３】
なお、一般的なインターカレーター（主に、ＡＴ塩基対が連続して存在する部位に相互作用するインターカレーター）の場合、ＧＣ塩基対に存在するプロトンが二本鎖核酸の副溝に突出し、その部位が立体障害を引き起こすため、ＧＣ塩基対が存在する部位では、二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用が起こりにくい。従って、二本鎖核酸中、ＧＣ塩基対が存在する部位では、二本鎖核酸とインターカレーターの相互作用が少ないため、その部位におけるインターカレーター同士の重合も起こりにくく、比較的低濃度で濃度消光が起きると推測する。
【００１４】
以下、本発明に係る技術用語について説明する。
【００１５】
「核酸」は、プリンまたはピリミジン塩基と糖がグリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステルの重合体（ヌクレオチド鎖）を意味し、核酸プローブを含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチオドが重合したＤＮＡ（全長あるいはその断片）、逆転写により得られるｃＤＮＡ（ｃＤＮＡプローブ）、ＲＮＡ、ポリアミドヌクレオチド誘導体（ＰＮＡ）などを広く含む。
【００１６】
「二本鎖核酸」は相補的な核酸同士がハイブリダイズした核酸を全て包含する。例えば、検出用プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションにより形成された二本鎖核酸又は二本鎖核酸部分なども、本発明に係る二本鎖核酸に包含される。ここで、「プローブ核酸」は、標的核酸を検出するための検出子として機能する核酸（ヌクレオチド鎖）であり、検出表面などに固定されて存在する。「標的核酸」は、全長又は一部に、検出用の核酸プローブの塩基配列と相補的な配列を有する核酸であり、ハイブリダイゼーションを検出する際などに、反応場に滴下又は供給される。
【００１７】
「ＧＣ塩基対」は、相補的な塩基配列を有する二本のヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより形成された二本鎖核酸のうち、一方のヌクレオチドのＧ（グアニン）又はＣ（シトシン）と、他方のヌクレオチドのＣ（シトシン）又はＧ（グアニン）が相補的に水素結合する部位である。なお、「ＡＴ塩基対」は、同様に、一方のヌクレオチドのＡ（アデニン又はＴ（チミン）と、他方のヌクレオチドのＴ（チミン）又はＡ（アデニン）が相補的に水素結合する部位である。
【００１８】
「インターカレーター」は、二本鎖核酸の所定部位に結合して蛍光を発する物質である。
【００１９】
「相互作用」は、２つの物質が相互に結合することである。
【００２０】
「ハイブリダイゼーション」は、核酸（ヌクレオチド鎖）間の相補結合であり、高分子−高分子、高分子−低分子、低分子−低分子の特異的な結合、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡ間の特異的な結合、などを広く含む。
【００２１】
「検出表面」は、固相基板などの表面のうち、ハイブリダイゼーションなどの反応場に臨む部分である。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、蛍光強度を増加させることができ、二本鎖核酸又はハイブリダイゼーションの検出精度及び定量性を向上できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
＜二本鎖核酸検出方法について＞
本発明に係る二本鎖核酸検出方法について、以下説明する。
【００２４】
本発明では、二本鎖核酸に対するインターカレーターの飽和相互作用量よりも過剰な量であり、かつ、インターカレーターが濃度消光を引き起こさない量のインターカレーターを反応場に投入し、二本鎖核酸を検出する。
【００２５】
インターカレーターには、二本鎖核酸中、ＡＴ塩基対が連続して存在する部位に加えて、ＧＣ塩基対が一つ又は連続して存在する部位にも相互作用するものを用いる。例えば、ＰＯＰＯ−１、ＴＯＴＯ−３、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（以上、米モレキュラー  プローブス社製）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８などが好適である。
【００２６】
二本鎖核酸に対するインターカレーターの飽和相互作用量（投入するインターカレーター量の下限）は、例えば、以下の手順で取得できる。
【００２７】
インターカレート反応に関して、インターカレーター濃度及び発生熱量（又は蛍光強度など）をプロットすると、ほぼシグモイド型の曲線となる。この曲線においてプラトー状態になり始めた時点のインターカレーター濃度を、投入量の下限として設定する。
【００２８】
具体的には次の通りである。まず、適当な濃度の二本鎖核酸に対して、徐々にインターカレーターを滴下などし、濃度ごとに、発生する熱量又は蛍光強度などを測定する。次に、縦軸に発生する熱量（又は蛍光強度など）を、横軸にインターカレーターの総滴下量（濃度）を、それぞれプロットする。その際、片対数プロット（横軸を対数にしたプロット）にしてもよい。次に、そのプロットより、シグモイド関数式（近似式）を取得する。次に、その関数式に、二本鎖核酸の各濃度を代入し、その縦軸の最大値を取得する。そして、その最大値における二本鎖核酸の濃度を、投入量の下限として設定する。
【００２９】
一方、インターカレーターが濃度消光を引き起こさない量（投入するインターカレーター量の上限）は、例えば、蛍光光度計などによる蛍光スペクトル測定により、実際に蛍光強度が減少する濃度を取得してもよいし、可視・紫外線吸収スペクトル（以下、「ＵＶスペクトル」とする。）の変化を測定することにより取得してもよい。
【００３０】
なお、濃度消光は、反応場の反応溶液中におけるインターカレーター同士のスタッキングにより生じる。インターカレーターのスタッキングは、例えば、ＵＶスペクトルにおいて、スペクトルの乱れなどとして検出できる。
【００３１】
＜ハイブリダイゼーション検出方法について＞
本発明に係る二本鎖核酸検出方法は、所定の検出表面を用いたハイブリダイゼーション検出などにも適用できる。
【００３２】
例えば、所定の検出表面に検出用の核酸プローブを固定し、その検出表面に臨む反応場に、標的核酸を含む試料を滴下又は供給する。そして、検出用の核酸プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションにより形成された二本鎖核酸部分を、インターカレーターを用いて検出する。
【００３３】
その際、二本鎖核酸とインターカレーターの相互作用量よりも過剰な量であり、かつ、インターカレーターが濃度消光を引き起こさない量のインターカレーターを検出表面に臨む反応場に投入することにより、ハイブリダイゼーションの検出精度及び定量性を向上できる。
【００３４】
なお、用いる検出表面は、ＤＮＡチップやセンサーチップなど、公知のものを用いることができる。また、検出表面への核酸プローブの固定手段、アッセイ手順なども、公知のものを採用できる。
【実施例１】
【００３５】
実施例１では、二本鎖核酸に各濃度のインターカレーターを加えた場合における蛍光強度の変化を検証した。
【００３６】
はじめに、二本鎖核酸の調製を行った。まず、配列番号１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び、その相補鎖のオリゴヌクレオチド（配列番号２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド）をそれぞれ準備した。本実施例では、両オリゴヌクレオチドの合成をつくばオリゴサービス株式会社に受託した。次に、０．１Ｍリン酸バッファー（ＮａＣｌ  ２００ｍＭ含有、ｐＨ７．４）に両オリゴヌクレオチドを各１００ｎＭになるように溶解した。次に、その溶液を９５℃に加熱後０℃に冷却して両ヌクレオチドのアニーリングを行い、二本鎖核酸を調製した。
【００３７】
続いて、その二本鎖核酸の溶液にインターカレーターを添加した。本実施例では、インターカレーターとして、「ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（米モレキュラー  プローブス社製、以下同じ）」を用いた。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉの添加量を、それぞれ、最終濃度で０．１９６μＭ、０．２４５μＭ、０．２８０μＭ、０．３９２μＭ、０．７８４μＭ、１．９６μＭ、２．１８μＭ、２．４５μＭ、２．８０μＭ、３．２７μＭ、３．９２μＭ、４．９０μＭ、６．５３μＭ、９．８０μＭ、１９．６μＭにした。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを各量添加後、その溶液を２５℃、１０分間、インキュベートした。
【００３８】
続いて、蛍光光度計により蛍光スペクトルを測定した。二本鎖核酸とＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを添加した溶液を装置の試料室に入れ、励起波長を４９７ｎｍに設定し、２５℃条件下で蛍光強度を測定した。
【００３９】
結果を表１及び図１、図２に示す。
【表１】
2007295870.tif 000003
【００４０】
表１は蛍光光度計による測定結果を示す。
【００４１】
表中、「ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ濃度」はＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉの最終濃度（インターカレーターの添加量）を、「ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ／ｄｓＤＮＡ」はＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉの最終濃度を二本鎖核酸の最終濃度で除した値（モル比）を、それぞれ表す。「ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉの希釈率」は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉの最終濃度を原液の濃度で除した値である。なお、この計算は、希釈前のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉの濃度を１９．６ｍＭとして行った（非特許文献１参照）。
【００４２】
表中、「蛍光のピークの高さ」は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを各濃度添加した場合における蛍光スペクトルのうち、ピーク時の蛍光強度（蛍光強度の最大値）を表す。「蛍光ピーク波長」は、ピーク時における蛍光波長を表す。
【００４３】
図１は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを各濃度添加した場合における蛍光スペクトルである。
【００４４】
図１中、横軸は蛍光波長（Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ）を、縦軸は蛍光強度（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を、それぞれ表す。図１中、各スペクトルは、それぞれ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを各濃度（１０種類の濃度）添加した場合における蛍光スペクトルである。
【００４５】
図２は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉの添加量と蛍光ピークの高さとの関係を示すグラフである。
【００４６】
図２中、横軸はＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉの添加量（最終濃度）を、縦軸は蛍光強度（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を、それぞれ表す。
【００４７】
表１、及び、図１、図２に示す通り、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉの添加量が１．９６μＭ〜４．９０μＭの場合、蛍光強度が最も高かった。一方、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉの添加量がそれより少ない場合（例えば、図１、図２中、添加量が０．３９２μＭ及び０．７８４μＭの場合のスペクトルを参照）、及び、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉの添加量がそれより多い場合（例えば、図１、図２中、添加量が９．８μＭ及び１９．６μＭの場合のスペクトルを参照）、蛍光強度はピークよりも低かった。
【００４８】
その他、図１などに示す通り、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉの添加量の増加とともに、蛍光ピーク波長が長波長側にシフトした。
【００４９】
一般的なインターカレーター（主に、ＡＴ塩基対が連続して存在する部位に相互作用するインターカレーター）の場合、インターカレーターを過剰に添加すると、インターカレーター同士がスタッキングして濃度消光を引き起こすことが知られている。一方、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉは、二本鎖核酸中、ＡＴ塩基対が連続して存在する部位に加えて、ＧＣ塩基対が一つ又は連続して存在する部位にも相互作用することが知られている。
【００５０】
これらの事項を勘案すると、本実験結果は、二本鎖核酸中、ＡＴ塩基対が連続して存在する部位に加えて、ＧＣ塩基対が一つ又は連続して存在する部位にも相互作用するインターカレーターの場合、従来の添加量（ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉの場合、１．９６μＭ）よりも過剰なインターカレーターを添加しても、所定量までは濃度消光を起こさないこと、及び、従来の添加量よりも過剰なインターカレーターを添加することにより、蛍光強度を増加できることを示唆する。
【００５１】
即ち、本実験結果は、二本鎖核酸中、ＡＴ塩基対が連続して存在する部位に加えて、ＧＣ塩基対が一つ又は連続して存在する部位にも相互作用するインターカレーターの場合、従来よりも過剰な量のインターカレーターを反応場に添加することにより、二本鎖核酸の検出精度及び定量性を向上できることを示唆する。
【実施例２】
【００５２】
実施例２では、二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用を、ＩＴＣ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ；等温適定カロリメトリー、以下同じ）により、熱力学的に検証した。
【００５３】
物質間の反応などの際には、熱の発生又は吸収がおこる。その熱量を測定することにより、物質間の反応の結合定数（ＫＢ）、反応の結合比（ｎ）、エンタルピー変化（ΔＨ）、エントロピー変化（ΔＳ）などに関する知見を得られる。そこで、ＩＴＣにより、二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用に関する熱学的プロファイルを取得し、その内容を検証した。
【００５４】
本実施例では、ＩＴＣ装置には「ＶＰ−ＩＴＣ（米ＭｉｃｒｏＣａｌ社製）」を、同装置の制御及びデータ解析には「Ｏｒｉｇｉｎ  ｖｅｒ７．０（米ＭｉｃｒｏＣａｌ社製）」を用いた。
【００５５】
手順の概要を以下に示す。
【００５６】
まず、実施例１と同様の相補的なオリゴヌクレオチドを用いて、同様の手順により、二本鎖核酸を調製した。
【００５７】
次に、０．１Ｍリン酸バッファー（ＮａＣｌ  ２００ｍＭ含有、ｐＨ７．４）に二本鎖核酸９μＭを入れ、その中にＤＭＳＯを濃度が８．７５％になるように混合し、その溶液を、ＩＴＣ装置の試料室に入れた。
【００５８】
次に、０．１Ｍリン酸バッファー（ＮａＣｌ  ２００ｍＭ含有、ｐＨ７．４）にインターカレーターを１．７５ｍＭになるように溶解した後、シリンジを用いて、そのインターカレーター溶液を６分ごとに６μＬずつ、ＩＴＣ装置の試料室に滴下した。インターカレーターには、実施例１などと同様、「ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ」を用いた。
【００５９】
そして、そのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ溶液を滴下しながら、ＩＴＣ装置を用いて熱量（反応熱）の変化を測定した。本実施例では、ＩＴＣによる測定を、２５℃、３００ｒｐｍの撹拌条件下で実施した。
【００６０】
また、対照として、希釈熱の測定を行った。０．１Ｍリン酸バッファー（ＮａＣｌ  ２００ｍＭ含有、ｐＨ７．４）にＤＭＳＯを濃度が８．７５％になるように混合し、その対照溶液を、インターカレーター溶液の代わりに、ＩＴＣ装置の試料室に滴下した。そして、インターカレーター溶液を滴下した場合における熱量（反応熱）から、その対照溶液を滴下した場合における熱量（希釈熱）を除した値をデータ解析などに用いた。
【００６１】
結果を図３に示す。
【００６２】
図３は、ＩＴＣによる測定結果を表すグラフである。このグラフは、インターカレーター溶液を滴下した場合における熱量（反応熱）から、その対照溶液を滴下した場合における熱量（希釈熱）を除した値、即ち、二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用における熱量を表す。グラフの横軸は滴下した総インターカレーター量（Ｍｏｌａｒ  Ｒａｔｉｏ；試料室中における二本鎖核酸（定量）とインターカレーターのモル比）を、縦軸は滴下したインターカレーター１ｍｏｌ当たりに換算した熱量（ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ  ｏｆ  ｉｎｊｅｃｔａｎｔ）を、それぞれ表す。
【００６３】
図３中、矢印は、それぞれの地点におけるＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉの添加量を原液に対する希釈率で示している。なお、希釈率の算定は、実施例１と同様、希釈前のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉの濃度を１９．６ｍＭとして行った。
【００６４】
図３中、「Ｍｏｄｅｌ：ＴｗｏＳｉｔｅｓ」はＩＴＣにより得られた測定結果について、ｔｗｏ  ｓｉｔｅ  ｍｏｄｅｌ（２相モデル）を用いて解析を行ったことを示し、「Ｎ１」、「Ｋ１」、「ΔＨ１」、「ΔＳ１」は第一の結合サイトにおける解析値を、「Ｎ２」、「Ｋ２」、「ΔＨ２」、「ΔＳ２」は第二の結合サイトにおける解析値を、それぞれ示す。
【００６５】
ここで、「Ｎ１」及び「Ｎ２」は二本鎖核酸に存在する各結合サイトにおけるインターカレーターの結合数を、「Ｋ１」及び「Ｋ２」は二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用における結合定数ＫＢを、「ΔＨ１」及び「ΔＨ２」はエンタルピー変化（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を、「ΔＳ１」及び「ΔＳ２」はエントロピー変化（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を、それぞれ表す。
【００６６】
また、この解析結果は、二本鎖核酸に存在する各結合サイトのうち、二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用比が、第一の結合サイトでは１：約６．５５、第二の結合サイトでは１：約１１．７、合計では、１：約１８．２５であること、即ち、二本鎖核酸１モルに対し、両結合サイトを合わせ、インターカレーターの結合量は約１８．２５モルであることを示す。
【００６７】
図３に示す通り、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを１０，０００希釈（１．９６μＭ）よりも過剰に添加した場合に、グラフの曲線がプラトー状態に達した。従って、本実験結果は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを用いた場合、二本鎖核酸の鎖長が２０ｍｅｒの時における飽和相互作用量（添加量の下限）が１．９６μＭであることを示唆する。
【実施例３】
【００６８】
実施例３では、二本鎖核酸に各濃度のインターカレーターを加えた場合におけるＵＶスペクトルの変化を検証した。
【００６９】
はじめに、二本鎖核酸の調製を行った。実施例１と同様の相補的なオリゴヌクレオチドを用いて、同様の手順により、二本鎖核酸を調製した。
【００７０】
続いて、その二本鎖核酸の溶液にインターカレーターを各濃度添加した。本実施例では、実施例１などと同様、インターカレーターとして、「ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（米モレキュラー  プローブス社製、以下同じ）」を用いた。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉの添加量を、それぞれ、最終濃度で１．９６μＭ、２．１３μＭ、２．４５μＭ、２．８０μＭ、３．２７μＭ、３．９２μＭ、４．９０μＭ、６．５３μＭ、９．８０μＭ、１９．６μＭになるようにした。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ添加後、その溶液を２５℃、１０分間、インキュベートした。
【００７１】
続いて、ＵＶスペクトルを測定した。二本鎖核酸とＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを添加した溶液をＵＶスペクトル測定装置の試料室に入れ、２５℃条件下でＵＶスペクトルを測定した。
【００７２】
結果を図４に示す。
【００７３】
図４は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを各濃度添加した場合におけるＵＶスペクトルである。
【００７４】
図４中、横軸は測定波長（Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ）を、縦軸は吸光度（Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）をそれぞれ表す。図４中、各スペクトルは、それぞれ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを各濃度（１０種類の濃度）添加した場合におけるＵＶスペクトルである。
【００７５】
図４では、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉの添加量を１．９６μＭ〜４．９μＭにした場合、スペクトルの乱れはほとんど生じなかったのに対し、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉの添加量を６．５３μＭ以上にした場合、スペクトルに大幅な乱れが生じた。
【００７６】
このスペクトルの乱れは、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉの添加量を６．５３μＭ以上にした場合、インターカレーター同士のスタッキングが生じ、それにより濃度消光が引き起こされるためであると推測する。
【００７７】
従って、本実験結果は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを用いた場合、二本鎖核酸の鎖長が２０ｍｅｒの時における濃度消光を引き起こさない上限の添加量が４．９μＭであることを示唆する。
【００７８】
従って、実施例１から実施例３の結果を勘案すると、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉの好適な投入量は、二本鎖核酸１ｍｅｒ当たりに換算すると、「数１」に示す式の通りになる。
【数１】
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【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明は、遺伝子解析などの分野、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法により増幅した二本鎖核酸の検出、ＤＮＡチップなどにおけるハイブリダイゼーションの検出などに利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】実施例１において、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを各濃度添加した場合における蛍光スペクトル。
【図２】実施例１において、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉの添加量と蛍光ピークの高さとの関係を示すグラフ。
【図３】実施例２において、ＩＴＣによる測定結果を表すグラフ。
【図４】実施例３において、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを各濃度添加した場合におけるＵＶスペクトル。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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