(57)【要約】【課題】利用価値の高いヒュウガトウキを、簡便な方法で迅速に検知するヒュウガトウキの迅速識別キットを提供する。【解決手段】トウキ類のＤＮＡについてＰＣＲ法を用いてＤＮＡ多型を比較し、ヒュウガトウキに特有のＤＮＡマーカーを特定し、その特定したＤＮＡマーカーを増幅するプライマーを設計し得られたプライマーを用いてサンプルＤＮＡからＤＮＡマーカーを直接増幅し、その増幅産物を電気泳動させ特有のバンドの有無からヒュウガトウキの識別する。ＤＮＡマーカーを増幅する設計したプライマーと、ＰＣＲ試薬とでヒュウガトウキの識別用キットが構成される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被識別体であるトウキを抽出して得られたＤＮＡから、該トウキ特有のＤＮＡマーカーを特定して設計し、得られたプライマーセットと、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用試薬とからなるヒュウガトウキの迅速識別キット。
【請求項２】
前記プライマーセットは、配列番号３で表されるプライマーと、配列番号４で表されるプライマーの組合せからなるプライマーのセット、及び配列番号５または配列番号６で表されるプライマーと、配列番号７または配列番号８で表されるプライマーの何れかの組合せからなるプライマーセットで構成されることを特徴とする請求項１記載のヒュウガトウキの迅速識別キット。
【請求項３】
請求項１乃至２に記載の識別キットを用い、非識別体であるトウキをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅産物を検出することにより識別を行なうことを特徴とするヒュウガトウキの迅速識別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、セリ科の多年生草本植物であるヒュウガトウキを、簡便な方法で迅速に識別する識別キット及び識別方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  ヒュウガトウキ（Ａｎｇｅｌｉｃａ  ｆｕｒｃｉｊｕｇａ  Ｋｉｔａｇａｗａ）は宮崎県下にのみ自生するセリ科の多年生草本植物で、日本薬局方の生薬「トウキ」に該当する。古来ヒュウガトウキはトウキの中でも薬郊が高く評価されているが、地域的には交雑もあり、種が多岐にわたっているため市場ではトウキの選別がされずヒュウガトウキはトウキとして扱われされている。【０００３】  従来、これらトウキの識別方法としては、植物体（茎葉）の形質（外観）に基づく識別法が採られていたが、確実性に欠けるという欠点があった。また識別を行なうためには高度な植物分類学的知識や経験を必要としたが、利用価値の高い部位である根に関しては全く識別ができないという欠点を有していた。【０００４】  植物の品種識別法として、ＤＮＡ塩基配列の差異を検出する方法が開発され、例えばＲＡＰＤ法、ＣＡＰＳ法、ＲＦＬＰ法等があるが、ヒュウガトウキと他のトウキとを迅速に識別できる識別キットはいまだ開示されていない。【０００５】  そこで、本発明者らはＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法を用いた系統解析によるヒュウガトウキの系統分類を行ない分子生物学的観点から他のトウキとの系統分類を行なった（非特許文献１参照。）。【０００６】
【非特許文献１】熊本  典晃ら６名、「ヒュウガトウキとイヌトウキのＤＮＡ多型解析による系統分類」、日本土壌肥料学会九州支部秋季例会予講集、平成１７年９月、ｐ６４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  上記非特許文献において、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ）法を用いて得られた多型バンドから系統樹を作成したところ、特定領域においてヒュウガトウキと他のトウキとが異なるバンドパターンを示すことを見出した。【０００８】  そこで本発明者らは、ヒュウガトウキと他のトウキの特定領域において多型解析を行い鋭意研究の結果、当該特定領域の塩基配列から各トウキの特異的なプライマーセットを設計し、該プライマーセットを用いヒュウガトウキと他のトウキとを迅速識別できる識別キットとこの識別キットを用いたヒュウガトウキの迅速識別方法を提供するにいたった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】  このため本発明は、被識別体であるトウキより抽出して得られたＤＮＡから、該トウキ特有のＤＮＡマーカーを特定して設計し、得られたプライマーセットと、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用試薬とからなるヒュウガトウキの迅速識別キットであることを第１の特徴とする。【００１０】  また、前記プライマーセットは、配列番号３で表されるプライマーと、配列番号４で表されるプライマーの組合せからなるプライマーのセット、及び配列番号５または配列番号６で表されるプライマーと、配列番号７または配列番号８で表されるプライマーの何れかの組合せからなるプライマーセットで構成されることを第２の特徴とする。【００１１】  そして、請求項１乃至２に記載の識別キットを用い、非識別体であるトウキをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅産物を検出することにより識別を行なうことを第３の特徴とする。【００１２】  尚、プライマーの設計の際に特定した領域としては、１８Ｓ−２６ＳｒＤＮＡＩＴＳ領域が望ましく、該領域のＤＮＡをサブクローニングしサイクルシークエンスを行なうことによって識別対象であるトウキ特有の塩基配列を見出し、プライマーを設計する。【００１３】  そして、ヒュウガトウキを識別する際には、未確認のトウキサンプルから抽出したＤＮＡを、前記設計したプライマーセットとＰＣＲ試薬からなるプライマーキットによりＰＣＲ増幅を行ない、電気泳動によりヒュウガトウキ特有のバンドパターンの有無を確認する。
【発明の効果】
【００１４】  本発明に係るヒュウガトウキの迅速識別キット及び識別法によれば、ＤＮＡ多型分析によってに薬効の高いヒュウガトウキを確実に識別できると共に、生薬市場での差別化がはかれ品質保証となるという優れた効果を有する。【００１５】  また、トウキ特有の塩基配列から各トウキ識別用のプライマーセットを設計することによって、当該トウキの識別が迅速にできるプライマーキットを提供できるという効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】  以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明が本実施例に限定されないことは言うまでもない。本発明において、識別するトウキとしては、ヒュウガトウキ（Ａｎｇｅｌｉｃａ  ｆｕｒｃｉｊｕｇａ  Ｋｉｔａｇａｗａ）、ニホントウキ（Ａｎｇｅｌｉｃａ  ａｃｕｔｉｌｏｂａ  ＫＩｔａｇａｗａ）、イヌトウキ（Ａｎｇｅｌｉｃａ  ｓｈｉｋｏｋｉａｎａ  Ｍａｋｉｎｏ）などが挙げられ、各トウキの新葉約０．０５ｇからＤＮＡ抽出キットＩＳＯＰＬＡＮＴＩＩ（ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ製）を用いてＤＮＡを抽出した。そして各トウキのＤＮＡの１８Ｓ−２６ＳｒＤＮＡＩＴＳ領域のシーケンスを行い塩基配列を決定し、得られた塩基配列から各トウキ特有のプライマーセットを設計する。尚、本実施例においては、ＤＮＡのサブクローニングを行った試料についてシークエンスを行なった。またニホントウキに関しては、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）を用いて塩基配列データを取得した。
【実施例】
【００１７】  （ＤＮＡの精製）
１８Ｓ−２６ＳｒＤＮＡＩＴＳ領域のＤＮＡサンプルは、各トウキＤＮＡをＰＣＲ増幅した１８Ｓ−２６ＳｒＤＮＡＩＴＳ領域のＤＮＡを電気泳動し、ＵＶトランスイルミネータ上で得られたバンドゲルを切り出し、精製したものを使用する。すなわち、ＰＣＲ増幅した１８Ｓ−２６ＳｒＤＮＡＩＴＳ領域のＤＮＡを電気泳動し、エチジウムブロマイドにて染色し、ＵＶトランスイルミネータ上で得られたバンドゲルを切り出し、蓋と底に穴を設けた０．５ｍｌＰＣＲチューブに入れ１．５ｍｌマイクロチューブに重ね、８，０００ｒｐｍで５分間遠心する。そしてゲルが下段のマイクロチューブに落下後、等量の平衡化中性フェノールを加え内容物をよく混合し−８０℃の冷蔵庫内で３０分間放置する。その後室温にて融解し１５，０００ｒｐｍで５分間遠心し分画された水層を新しいマイクロチューブに移し、等量のＰＣＩ（平衡化フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコール）を加えボルテックスにかけ、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心する。次に水層（上層）を新しいマイクロチューブに移し、１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム、等量のイソプロパノールを加え４℃、１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心しＤＮＡをペレットとする。さらに上清を捨て、７０％エタノールを１ｍｌ加えボルテックスにて攪拌しペレットの洗浄を行い、４℃、１５，０００ｒｐｍで２分間遠心し、上精をマイクロピペットにて捨て減圧乾燥で水分を完全に取り除き、乾燥後１０μｌのＴＥに溶解しＤＮＡサンプルとする。【００１８】  （ＤＮＡサンプルのサブクローニング）
上記で精製したＤＮＡサンプルのサブクローニングを行い、さらにサイクルシークエンスを行なう。まずＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（ＴａＫａＲａ製）を用いてＴ−ｖｅｃｔｏｒ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋））と上記精製したサンプルＤＮＡのライゲーションを行なった。マイクロチューブにＴ−ｖｅｃｔｏｒを１μｌ、サンプルＤＮＡを４μｌ、ＳｏｌｕｔｉｏｎＩを５μｌ加えピペッティングし１６℃で一晩インキュベートし、さらにＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩＩを加えｌｉｇｅｔｉｏｎ  ＤＮＡとした。次に１００μｌのコンピテントセルをｌｉｇａｔｉｏｎ  ＤＮＡに加え氷上で３０分間静置した後４２℃にて２分間ヒートショックを与え、トランスフォーメーションを行なった。そして２分間氷上に静置した後ｍｏｄｅｆｉｅｄ  ＬＢ  ｍｅｄｉｕｍ（ＬＢ  ｍｅｄｉｕｍ１ｍｌ、１Ｍ  Ｇｌｕｃｏｒｓｅ２０μｌ、１Ｍ  ＭｇＳＯ４１０μｌ、１０Ｍ  ＭｇＣｌ２１０μｌ）中で３７℃にて１時間振とう培養した。培養後１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し上層を除き１００μｌの菌体を得た。この菌体を２０ｍｇ／ｍｌのＡｍｐｉｃｉｌｌｉｎ１００μｌ、０．１Ｍ  ＩＰＴＧ５０μｌ、２０ｍｇ／ｍｌ  Ｘ−ｇａｌ５０μｌをそれぞれスプレッドしたＬＢプレート培地にスプレッドし、３７℃にて一晩インキュベートしてホワイトシングルコロニーを選抜した。次に菌体のベクターに確実にサンプルＤＮＡがインサートされているかチェックしたのちインサートが確認できたものをプラスミド抽出しサイクルシークエンスを行なう。【００１９】  （インサートチェック及びプラスミド抽出）
選抜したホワイトコロニーを滅菌爪楊枝にてピックアップし、ＰＣＲ反応液（１０×ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰｍｉｘ、ＥＸＴａｑ、ｐｒｉｍｅｒ  Ｔ３及びＴ７、純水）の入ったＰＣＲチューブですすぎコロニーＰＣＲを行なう。得られたＰＣＲ増幅物をアガロースゲルで電気泳動しエチジウムブロマイド染色後ＵＶトランスイルミネーター上でバンドチェックを行い、精製したＤＮＡがベクターにインサートされているかをチェックする（インサートがされたものは１ｋｂｐ付近にバンドが現れる）。次にインサートが確認された菌を１．６ｍｌのＬＢ液体培地（１００ｐｐｍ  Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）に植菌し、３７℃で一晩振とう培養する。培養後の液体培地全量をマイクロチューブに移し１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄みを除き集菌する。これにプラスミドバッファー１（０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０２Ｍ  ＥＤＴＡ）を１００μｌ加えボルテックスしよく混和させ、次いでプラスミドバッファー２（０．４Ｎ  ＮａＯＨ、２％ＳＤＳ）を２００μｌ加えボルテックスしよく混和させる。そして室温で５分間静置した後プラスミドバッファー３（３Ｍ酢酸カリウム）を１５０μｌ加え、クロロホルムを一滴添加しボルテックスし１２，０００ｒｐｍで５分間遠心する。遠心後マイクロピペットにて水層を新しいマイクロチューブに移し、等量のＰＣＩ（平衡化フェノール、クロロフォルム、イソアミルアルコール）を加えボルテックスする。１２，０００ｒｐｍで５分間遠心した後水層を新しいマイクロチューブに移し、１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウムと等量のイソプロパノールを加えボルテックスし、１５，０００ｒｐｍ、２５℃で３０分間遠心する。遠心後上澄みを捨て減圧乾燥しＴＥ１００μｌに溶解する。これにＲＮａｓｅＡ（１ｍｇ／ｍｌ）を５μｌ加え３７℃で３０分間インキュベートしてＲＮＡを除去し、ＴＥを３００μｌとＰＣ（フェノール：クロロホルム＝１：１）を等量加えボルテックスし完全に混和する。そして１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、水層を新しいマイクロチューブに移し水層の１／１０量のプラアスミドバッファー３、水層と等量のイソプロパノールをそれぞれ加えボルテックスし、−２０℃にて３０分間インキュベートする。インキュベート後４℃、１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心し、上澄みを除き、８０％エタノールを５００μｌ加え４℃、１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心し洗浄する。上澄みを捨て減圧乾燥した後、ＴＥ２０μｌに溶解したものについてサイクルシークエンスを行なう。【００２０】  （サイクルシークエンス）
サイクルシークエンスにはＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｙｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。ＰＣＲチューブに上記で得られたサンプルＤＮＡを約２０ｎｇ、ＲＥａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎ  Ｐｒｅｍｉｘを２μｌ、ＢｉｇＤｙｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒを３μｌ、ｐｒｉｍｅｒ（Ｔ３、Ｔ７）を３．２ｐｍｏｌ加え、純水で２０μｌにしピペッティングし混和した。そしてＰＣＲ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒを用いてサイクルシークエンス反応を行なった。反応液をマイクロチューブに移し、１２５ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液を５μｌ、９９．５％エタノールを６０μｌ加え転倒混和し１５分間静置した後、１５，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心した。上精を捨て７０％エタノールを５００μｌ加え洗浄し、１５，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心しエタノールを取り除き減圧乾燥させ、ＴＳＲを１５μｌ加えボルテックスした。さらに９５℃で２分間インキュベートした後２０分間氷上に静置した。そしてシークエンスチューブに全量を移して蓋をし、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＲＩＳＭ  ３１０  ＡＢＩ社製）を使用しシークエンスを行なった。得られた１８Ｓ−２６ＳｒＤＮＡＩＴＳ領域の塩基配列の結果を配列番号１及び配列番号２に示す。【００２１】  （プライマーの設計）
上記のシークエンスにより得られた塩基配列から、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ  ｖｅｒ１０．１（ジェネティックス社製）を使用して他のＡｎｇｅｌｉｃａ属の塩基配列と比較し、ヒュウガトウキ及びイヌトウキが持つ特異的な塩基配列をプライマーの３′末端に指定してプライマーを設計した。その結果を配列番号３から配列番号９に示す。また得られたプライマーはトウキごとにＨｙｕ（ヒュウガトウキ）、Ｉｎｕ（イヌトウキ）と表される（表１参照。）。そしてプライマーの合成はＳｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＪａｐａｎ社に委託した。【００２２】
【表１】
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【００２３】  （キットの作製）
ヒュウガトウキの識別用として、以下の構成によって識別用キットを作製した。
１．ヒュウガトウキ、イヌトウキのプライマーペア
２．ＰＣＲに必要な試薬（Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、１０×ｂｕｆｆｅｒ、２．５ｍＭｄＮＴＰ）
各プライマーペアは表１に示される各プライマーのＦ、Ｒの何れかの組合せが選択され、識別する未知のトウキから目的のトウキの識別に最適なものが採用される。尚、本実施例においてはヒュウガトウキとイヌトウキのプライマーペアによるキットを作製しているが、他のトウキ（例えばニホントウキ）が含まれたものであってもかまわない。以下に本キットの使用方法とその結果を示す。【００２４】  （ヒュウガトウキとイヌトウキの識別）
まずヒュウガトウキ或いはイヌトウキと識別できない未知のトウキからＤＮＡを定法に従い抽出を行なう。そして、得られたＤＮＡサンプルをヒュウガトウキ及びイヌトウキのプライマーペアを含むキットを用いてＰＣＲ増幅（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ）を行なう。ＰＣＲ増幅にて得られた副産物をアガロースゲルで電気泳動し、ヒュウガトウキ及びイヌトウキ特有のバンドの有無を確認する。本実施例においては、まずヒュウガトウキとイヌトウキのプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ、Ｒｅｖｅｒｓｅ）キットを混合してヒュウガトウキＤＮＡ、とイヌトウキＤＮＡ、ヒュウガトウキ及びイヌトウキＤＮＡミックスそれぞれについてＰＣＲ増幅した後、アガロースゲル電気泳動を行った。結果を図１に示す。【００２５】  図において１、４、７はヒュウガトウキＤＮＡのみ、２、５、８はイヌトウキのみ、３、６、９はヒュウガトウキ及びイヌトウキの混合ＤＮＡである。１、２、４、５、７、８はそれぞれの植物のＤＮＡが増幅されており、ヒュウガトウキは５００ｂｐ付近に特有のバンドが現れ、イヌトウキは３５０ｂｐ付近に特有のバンドが現れている。そして３、６、９は両植物のＤＮＡが増幅されており、前記二つの分子量と同じ位置にそれぞれの植物特有のバンドが現れている。尚、１０、１１、１２も上記と同様のＤＮＡを使用した例であるがイヌトウキＤＮＡのみの場合５００ｂｐ付近に余分なバンドが生じており、これに使用したプライマーキットの組合せは不適合であった。【００２６】  以上のように、本発明によるヒュウガトウキの迅速識別キットによれば、識別を行なうための高度な植物分類学的知識や経験を必要とせず、確実にしかも短時間で未知のトウキからヒュウガトウキの識別が可能となる。しかも該トウキが粉末等に加工された後であっても容易に識別することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００２７】  本発明によるヒュウガトウキの迅速識別キットによれば、健康食品及び漢方医薬品分野において、ヒュウガトウキの品質保証技術として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明に係るヒュウガトウキの迅速識別キットによるヒュウガトウキとイヌトウキの識別を示す写真である。
【図１】
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【配列表】
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