(57)【要約】      （修正有）【課題】更年期障害などのエストロゲンの減少によって起きる症状を改善する物質をスクリーニングする手段の提供。【解決手段】基本転写因子として同定されたＴＦＩＩ−Ｉと被験物質とを接触させる工程と、及びＴＦＩＩ−Ｉと結合する被験物質を選択する工程とを含む、エストロゲンの減少によって起きる症状を改善する物質のスクリーニング方法被験物質の選択は、ツーハイブリッド法又はプルダウン法によって行なわれる。【選択図】図１１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
TFII-Iと被験物質とを接触させる工程、及びTFII-Iと結合する被験物質を選択する工程とを含むことを特徴とするエストロゲンの減少によって起きる症状を改善する物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
エストロゲンの減少によって起きる症状が、更年期障害、又は骨粗鬆症であることを特徴とする請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
TFII-Iと結合する被験物質の選択をツーハイブリッド法又はプルダウン法によって行なうことを特徴とする請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
TFII-Iと被験物質とを接触させる工程、及びTFII-Iと結合する被験物質を選択する工程とを含むことを特徴とする肝再生物質のスクリーニング方法。
【請求項５】
TFII-Iと結合する被験物質の選択をツーハイブリッド法又はプルダウン法によって行なうことを特徴とする請求項４に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
TFII-Iを発現する細胞と被験物質とを接触させる工程、及び前記細胞におけるTFII-Iの発現量を増大させる被験物質を選択する工程とを含むことを特徴とする癌の予防又は治療物質のスクリーニング方法。
【請求項７】
癌が、乳癌であることを特徴とする請求項６に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、TFII-Iを利用したスクリーニング方法に関し、より詳しくは、エストロゲンの減少によって起きる症状を改善する物質のスクリーニング方法、肝再生物質のスクリーニング方法、及び癌の予防又は治療物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
TFII-Iは、アデノウィルスの主要後期タンパク質のInrエレメントに結合する基本転写因子として同定された。Inrエレメントは転写開始部位に存在し、ヒトの全遺伝子の約85%に存在すると言われている。これまでの研究から、TFII-Iは様々な遺伝子のInrエレメントや上流のエレメントに結合し転写を活性化する事が明らかとなった。例えば、TFII-IはT細胞受容体Vβ遺伝子のInrエレメントに結合し転写を活性化する事がレポーター遺伝子アッセイから明らかとなった。またTFII-Iは、c-fos遺伝子やGoosecoid遺伝子のプロモーター上流に結合し転写を活性化する事が分かった。さらに、ヒトTFII-Iは染色体の7q11.23に位置し、この欠損はWilliams症候群に関与している。Williams症候群とは、先天性の希な疾患で高カルシウム血症、成育遅滞、心臓及び血管の障害、妖精様顔貌などの症状がある。従って、TFII-Iは様々な遺伝子の転写を制御することで重要な役割をしていると考えられる。
【０００３】
17β-エストラジオール(E2)等のエストロゲンは、卵巣から合成されるホルモンで、女性の生殖器官の生理機能や他の器官の恒常性を維持するのに重要な役割をしている（非特許文献１）。エストロゲンは他に、骨粗鬆症やアルツハイマー、心臓疾患を防ぐ効果があると同時に、乳癌、卵巣癌、子宮癌の発生に関与している。エストロゲンの効果は核内受容体スーパーファミリーに属するエストロゲン受容体α（ERα）、エストロゲン受容体β（ERβ）によって仲介される。受容体にエストロゲンが結合すると、受容体に構造変換が起き、ERが２量体化しコアクチベーター、コリプレッサーと結合する。そして、最終的にはエストロゲン応答遺伝子の転写を活性化または抑制する。作動薬であるE2がERに結合すると、コアクチベーターであるSRC-1やCBP/p300とERが結合し転写を活性化する。拮抗薬であるタモキシフェンがERに結合すると、コリプレッサーであるN-CoR/SMRTやHDACsがERに結合し転写を抑制する。リガンドが結合していないERは一般的に転写制御に関わらないと考えられている。
【０００４】
【非特許文献１】Nilsson, S. et al., (2001) Physio. Rev. 81, 1535-1565
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述したように、エストロゲンはERと結合することにより、その機能を発揮する。従って、ERに結合し、作用する化合物は更年期障害等の改善薬として使用することができる。しかし、ERに結合し、直接作用する化合物は様々な副作用を引き起こすことがわかっている。そこで、ER以外を標的とする更年期障害の治療薬の開発が望まれている。
【０００６】
本発明は、以上のような技術的背景の下になされたものであり、更年期障害などのエストロゲンの減少によって起きる症状を改善する物質をスクリーニングする手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、転写因子として知られているTFII-IがDNA上でERと結合し、ERの転写活性を抑制していることを見出し、この知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（７）を提供するものである。
【０００９】
（１）TFII-Iと被験物質とを接触させる工程、及びTFII-Iと結合する被験物質を選択する工程とを含むことを特徴とするエストロゲンの減少によって起きる症状を改善する物質のスクリーニング方法。
【００１０】
（２）エストロゲンの減少によって起きる症状が、更年期障害、又は骨粗鬆症であることを特徴とする（１）に記載のスクリーニング方法。
【００１１】
（３）TFII-Iと結合する被験物質の選択をツーハイブリッド法又はプルダウン法によって行なうことを特徴とする（１）又は（２）に記載のスクリーニング方法。
【００１２】
（４）TFII-Iと被験物質とを接触させる工程、及びTFII-Iと結合する被験物質を選択する工程とを含むことを特徴とする肝再生物質のスクリーニング方法。
【００１３】
（５）TFII-Iと結合する被験物質の選択をツーハイブリッド法又はプルダウン法によって行なうことを特徴とする（４）に記載のスクリーニング方法。
【００１４】
（６）TFII-Iを発現する細胞と被験物質とを接触させる工程、及び前記細胞におけるTFII-Iの発現量を増大させる被験物質を選択する工程とを含むことを特徴とする癌の予防又は治療物質のスクリーニング方法。
【００１５】
（７）癌が、乳癌であることを特徴とする（６）に記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のスクリーニング方法により、エストロゲンの減少によって起きる症状を改善する物質、肝再生物質、癌の予防又は治療物質を得ることができる。これらの物質は、ERを直接の標的としないため、副作用の少ない薬剤として利用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
（１）エストロゲンの減少によって起きる症状を改善する物質のスクリーニング方法
上述したように、TFII-IはDNA上でERと結合し、ERの転写活性を抑制している。TFII-Iと結合する物質は、このTFII-Iの抑制作用を阻害し、ERのエストロゲン応答遺伝子に対する転写活性を増大させ得ると考えられる。即ち、TFII-Iと結合する物質は、ERに直接作用することなく、ERの転写活性を高め、更年期障害などのエストロゲンの減少によって起きる症状を改善できると考えられる。
【００１９】
以上のことから、TFII-Iと被験物質とを接触させ、その後、FII-Iと結合する被験物質を選択することにより、エストロゲンの減少によって起きる症状を改善する物質を得ることができる。
【００２０】
ここで、「エストロゲンの減少によって起きる症状」とは、例えば、更年期障害、骨粗鬆症、心血管系疾患などを挙げることができる。
【００２１】
FII-Iと被験物質が結合するかどうかは、物質間の相互作用を検出するために用いられる一般的な方法、例えば、ツーハイブリッド法、プルダウン法などによって確認することができる。
【００２２】
（２）肝再生物質のスクリーニング方法
エストロゲンには、肝再生を促進する働きがあることが知られている（Francavilla A, et al., Hepatology 1989, 9, 614-620）。従って、上述したエストロゲンの減少によって起きる症状を改善する物質のスクリーニング方法と同様の方法により、肝再生機能を持つ物質のスクリーニングを行うことが可能である。
【００２３】
（３）癌の予防又は治療物質のスクリーニング方法
TFII-Iを過剰発現させることにより、癌細胞の一種であるMCF-7細胞の増殖を抑制することができる。従って、細胞内のTFII-Iの発現量を増大させる物質は、癌の予防又は治療薬の候補となり得る。
【００２４】
以上のことから、TFII-Iを発現する細胞と被験物質とを接触させ、その後前記細胞におけるTFII-Iの発現量を増大させる物質を選択することにより、癌の予防又は治療作用を持つ物質を得ることができる。
【００２５】
予防又は治療対象とする癌としては、乳癌、子宮癌をはじめとするエストロゲン依存的な癌を例示できる。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
【００２７】
〔実験方法〕
（１）プラスミドの作製
pHygTFII-I：まずTFII-Iのopen reding flame (ORF:読みとり枠)をpET11d-II-Iから単離し、pCMV-tag2Aに組み込んだ。pCMV-Tag2A-TFII-IからFLAG-TFII-IをPCRにより増幅しpHygEF2に組み込んだものをpHygTFII-Iとした。
【００２８】
TFII-I欠損変異体：1-780,1-355,300-957,751-957アミノ酸はpCMV-Tag2A-TFII-IからPCRにより増幅しpCMV-Tag2Bに組み込んだ。
【００２９】
pcDNA-ERα：ERαのORFをpSG5-ERaから単離し、pcDNA3.1(+)に組み込んだ。
【００３０】
ERa欠損変異体：1-282,178-595アミノ酸はpcDNA-ERαからPCRで増幅しpcDNA-Mycに組み込んだ。
【００３１】
（２）細胞培養
HeLa,293FT,MCF-7細胞はダルベッコ改変イーグル培地DMEM（１０％ウシ胎仔血清、100μg/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン）で培養した。細胞数のカウントのために、まず1wellあたり10000個の細胞を播種した。培地はDMEM（フェノールレッド不含、5%活性炭-dextran処理済みウシ胎仔血清）にコントロール細胞はエタノールのみ、エストロゲン処理はE2  100nM（Wako）で行った。細胞数はナカライテスク社の生細胞測定試薬SFを用いた。
【００３２】
（３）siRNAを用いたノックダウン
ノックダウンは合成siRNAを細胞に導入する、またはshRNA発現レンチウイルスを感染させることにより行った。どちらとも同じ結果が得られている。合成siRNAを導入するためにリポフェクトアミン2000（invitrogen）を用いた。リコンビナントレンチウイルスを感染させるために、293FT細胞にVirapower packaging mix（invitrogen）とpLenti-U6-shRNAを同時導入した。感染したHeLa細胞、MCF-7細胞はマニュアルに従って選択した。
【００３３】
siRNAの配列は以下の通りである。
【００３４】
TFII-I：5’-AAGTTACTCAGCCAAGAACGA-3’（配列番号１）
EGFP  ：5’-GAACGGCATCAAGGTGAAC-3’（配列番号２）
（４）定量RT-PCR
Total RNAはセパゾール（ナカライテスク）を用いて行った。Superscript III  reverse transcriptase (invitrogen)、oligo-dTプライマーを用いて逆転写しcDNAを合成した。それから、SYBR Green real-time PCR master mix（東洋紡）、ABI PRISM 5700 sequence detection system (Applied Biosystems)を用いて、定量PCRを行った。
【００３５】
定量PCRに使用したプライマーの配列は以下の通りである。
【００３６】
pS2：5’-GAATGGCCACCATGGAGAACAAGG-3’（配列番号３）
5’-GCGGATCCACGAACGGTGTCGTCGAA-3’（配列番号４）
GREB1:5’-GTCTTCCTCAGATGTGTCGTC-3’（配列番号５）
5’-GCTGCTGTACCTCTGTGACTC-3’（配列番号６）
Amphiregulin:5’-TGAAGGAGAAGCTGAGGAACG-3’（配列番号７）
5’-CACTGGAAAGAGGACCGACTC-3’（配列番号８）
Cyclin D1：5’-AGTGCAAGGCCTGAACCTGAGGAG-3’（配列番号９）
5’-TCAGATGTCCACGTCCCGCACGTC-3’（配列番号１０）
β-actin：5’-TCCTTCCTGGGCATGGAGTCC-3’（配列番号１１）
5’-GAGGAGCAATGATCTTGATCTTC-3’（配列番号１２）
HSP70：5’-ACAGTGGTGCCTACCAAGAAG-3’（配列番号１３）
5’-CTTGTCTTCAGCTGTCACTCG-3’（配列番号１４）
（５）クロマチン免疫沈降法
アップステイト社が公開している方法に従って行った。
【００３７】
まず、MCF-7細胞を15cmプレートに播種し、DMEM（フェノールレッド不含、5%活性炭dextran処理済みウシ胎仔血清）で5日培養した。それから、E2  100nMで処理し45分後に回収した。細胞は1%ホルムアルデヒド、37℃、10分処理し、細胞溶解バッファーを加えて超音波破砕した。この細胞溶解液にそれぞれの抗体を加えて、一晩撹拌した。目的のタンパク質と共沈殿してきたゲノムDNAは精製しPCRによって増幅した。PCRにはTaq polymeraseを使用した。
【００３８】
使用したプライマーの配列は以下の通りである。
【００３９】
pS2 promoter：5’-GGCCATCTCTCACTATGAATCACTTCTGC-3’（配列番号１５）
5’-GGCAGGCTCTGTTTGCTTAAAGAAGCG-3’（配列番号１６）
pS2 upstream：5’-TGAGCATTTGTGGATTTTGGCATC-3’（配列番号１７）
5’-CTGGAAACAGGGAAAGAAGGAAGG-3’（配列番号１８）
GREB1 promoter：5’-GAGGGTGCAGTATGAGCAAAG-3’（配列番号１９）
5’-CAGAGGAGAGCCCTTCCTATG-3’（配列番号２０）
GREB1 ERE：5’-AGCAGTGAAAAAAAGTGTGGCAAC-3’（配列番号２１）
5’-CGACCCACAGAAATGAAAAGGCAG-3’（配列番号２２）
〔実験結果〕
（１）TFII-IはMCF-7細胞の細胞増殖の抑制因子である。
【００４０】
TFII-Iの機能を解析するためにHeLa細胞、MCF-7細胞のTFII-Iタンパク質の量をsiRNAを用いて下げることを行った。ウエスタンブロットを行った結果、TFII-Iのタンパク質量はコントロールに比べて90%以上減少していることが分かった。TFII-Iは転写反応に重要だと思われているがノックダウンしてもHeLa細胞ではほとんど細胞増殖に影響がなかった（図１）。MCF-7細胞はE2の存在にかかわらず、TFII-Iをノックダウンすると細胞増殖が促進した（図２）。FACS分析を行ったところTFII-IをノックダウンするとS期が増加している事が分かった(図３)。次に、ノックダウンとは逆にハイグロマイシン耐性酵素を含むプラスミドに組み込んであるFLAG-TFII-IをMCF-7細胞に導入し過剰発現させ、ハイグロマイシンで耐性細胞を選択した。コントロールに比べて、TFII-Iを過剰発現させるとハイグロマイシン耐性のコロニーの数が有意に減少した（図４）。これらの結果から、一般的な細胞の生存にTFII-Iは重要ではなく、むしろMCF-7細胞では細胞増殖を阻害することが明らかとなった。
【００４１】
（２）TFII-IはInrエレメントに結合しエストロゲン応答遺伝子の転写を抑制する。
【００４２】
MCF-7細胞の細胞増殖はエストロゲン依存的だと考えられている。そこで、TFII-Iはエストロゲン応答遺伝子の制御によって増殖を制御しているかもしれないと考えた。この考えを検証するために、様々な時間E2処理したMCF-7細胞で、発現しているいくつかの遺伝子のmRNA量を定量RT-PCRにより定量した。pS2, cyclinD1, GREB1, amphiregulinはエストロゲンに応答し、β-actin, HSP70は応答しない遺伝子である。pS2,cyclinD1, amphiregulin, β-actinはInrエレメントを持っていて、GREB1, HSP70はInrエレメントを持っていない遺伝子である。TFII-IをノックダウンするとInrエレメントを持ち、エストロゲン依存的なpS2,cyclinD1, amphiregulinは量に差はあるがbasal level（エタノール処理時のレベル）、E2刺激時共にmRNAの量が増加している（図５）。しかし、Inrエレメントを持たないGREB1とエストロゲン非依存的なβ-actin、HSP70は影響が見られなかった（図５）。HeLa細胞ではTFII-Iをノックダウンしてもこれらの遺伝子のmRNA量に影響はなかった（図６）。これらの結果から、TFII-IはInrエレメントを持つエストロゲン応答遺伝子を抑制的に制御していることがわかった。
【００４３】
使用しているsiRNAがTFII-I特異的に作用しているか調べるために、TFII-Iに対するsiRNAを他に２つデザインした。このsiRNAが発現するレンチウイルスをMCF-7細胞に感染させ、ウエスタンブロットしてみると、どのsiRNAもTFII-Iを90%以上減少させることができた。さらに、pS2のmRNAを見ると増加していた。
【００４４】
（３）TFII-Iはエストロゲン非依存的にERαと結合する。
【００４５】
これまでの結果から、TFII-IとERαが結合している可能性がある。このことを確かめるために、ヒト腎臓由来293FT細胞にFLAG-TFII-IとビタミンＤ受容体(VDR)、レチノイン受容体(RXRα)、アンドロゲン受容体(AR)、ERαをそれぞれの核内受容体を同時導入した。それから、FLAG-TFII-Iを抗FLAG抗体を用いて免疫沈降を行った。使用した核内受容体では、ERαのみがTFII-Iとリガンド非依存的に結合することが分かった（図７）。次に、ERαのどこにTFII-Iが結合するか調べるためにERαのN末端にあるA/Bドメイン、C末端にあるE/Fドメインをそれぞれ欠損した変異体を作製した（図８Ａ）。TFII-IはA/Bドメインがない変異体に結合することから（図８Ｂ）、TFII-IとERαの結合にERαのA/Bドメインは重要ではないことが分かった。次に、ERαがTFII-Iのどこに結合するのか調べるために、TFII-Iの欠損変異体（1-780,1-355,300-957,751-957アミノ酸）を作製した（図９Ａ）。その結果、TFII-Iの300-780と751-957の部分が結合に重要である事が明らかとなった（図９Ｂ）。この結合が直接であることを調べるために大腸菌で組み換えタンパク質を作製しGST-pull down assayを行った結果、TFII-IとERαは直接結合することが分かった。
【００４６】
（４）TFII-IはpS2プロモーター上にERαとコリプレッサーを誘導することでRNAポリメラーゼIIがプロモーターに結合することを阻害している。
【００４７】
TFII-Iがどのようにエストロゲン応答遺伝子の発現を抑制しているか調べるために、クロマチン免疫沈降法をMCF-7細胞中のpS2遺伝子プロモーターとGREB1遺伝子プロモーター上で行った。pS2プロモーター上にTFII-Iはエストロゲンにかかわらず多く存在するが、GREB1プロモーター上には存在しない事がわかった（図１０）。これまでの報告によると、少量のERαはエストロゲン刺激がなくともプロモーターに結合しており、エストロゲン刺激を受けるとさらにERαがプロモーターに結合する事が分かっている。RNAポリメラーゼIIは最初ほとんど結合していなく、エストロゲン刺激を受けるとプロモーターに結合する量が増加する。TFII-IをノックダウンするとERαはpS2プロモーター上から少なくなり、逆にRNAポリメラーゼIIはエストロゲン刺激がなくとも増加することが分かった。一方、GREB1プロモーター上では、RNAポリメラーゼIIとERαへのTFII-Iをノックダウンした影響は見られなかった。これらの結果から、TFII-IはERαと共にコリプレッサーをプロモーター上へ誘導することにより、転写を抑制しているのではないかと考えた。コリプレッサーであるSMRTとHDAC1を調べてみると、非刺激時にプロモーター上に存在し、エストロゲン刺激時にはプロモーター上から減少することが分かった。TFII-Iをノックダウンすると非刺激時、エストロゲン刺激時共に減少していることが分かった。これらの結果から、TFII-IはERαとコリプレッサーをプロモーター上に誘導することでエストロゲン応答遺伝子の一部の転写を抑制している事が明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】TFII-IノックダウンHeLa細胞の増殖性を示す図。siRNAをHeLa細胞に導入した。siRNAを導入してから２週間後、細胞抽出液を調製し、ウエスタンブロットを行った（図１Ａ）。同じ細胞をエストロゲン存在下、非存在下で培養し毎日細胞数を計測した（図１Ｂ）。結果は３回独立した実験の平均と標準偏差で表した。
【図２】TFII-IノックダウンMCF-7細胞の増殖性を示す図。siRNAをMCF-7細胞に導入した。siRNAを導入してから2日後、細胞抽出液を調製しウエスタンブロットを行った（図２Ａ）。同じ細胞をエストロゲン存在下、非存在下で培養し毎日細胞数を計測した（図２Ｂ）。結果は３回独立した実験の平均と標準偏差で表した。
【図３】TFII-IノックダウンMCF-7細胞の細胞周期を示す図。細胞周期は、FACSCalibur (Beckton Dickinson)を用いて調べた。
【図４】TFII-Iを過剰発現させたMCF-7細胞のコロニーの写真。MCF-7細胞にpHyg-EF2かpHyg-EF2/TFII-Iをそれぞれ導入し、ハイグロマイシンB 400 μg/mlを含有した培地で２週間培養した。そして耐性のコロニーはクリスタルバイオレットで染色し可視化した。DNAを導入してから２日後にTFII-Iの発現レベルをウエスタンブロットで評価した。実験は３回行ったうちの一つを示した。
【図５】MCF-7細胞で発現している遺伝子のmRNA量の測定結果を示す図。MCF-7細胞にコントロールまたはTFII-I siRNAを導入し、100nM E2、エタノールで図に示した時間処理した。全RNAは実験方法に示した方法で調製し、定量RT-PCRを行った。コントロールsiRNAを導入しエタノールで0時間処理したRNAレベルを1としてそれぞれのサンプルを相対値で評価した。結果は３回独立した実験の平均と標準偏差で表した。
【図６】HeLa細胞で発現している遺伝子のmRNA量の測定結果を示す図。HeLa細胞にコントロールまたはTFII-I siRNAを導入し、図に示した時間処理した。全RNAは実験方法に示した方法で調製し、定量RT-PCRを行った。コントロールsiRNAを導入しエタノールで0時間処理したRNAレベルを1としてそれぞれのサンプルを相対値で評価した。結果は３回独立した実験の平均と標準偏差で表した。
【図７】FLAG-TFII-Iと核内受容体を導入した細胞を用いた免疫沈降実験の結果を示す図。FLAG-TFII-Iは核内受容体の１つと293FT細胞に同時導入した。NP-40 lysis buffer(50 mM Tri-HCl(pH8.0), 1% NP-40, 150mM NaCl, プロテアーゼ阻害剤カクテル(ナカライテスク))で細胞抽出液を調製し、免疫沈降は抗FLAG M2アガロース(Sigma)を用いた。共沈殿物は抗VDR抗体（H-81）、抗AR抗体（C-19）、又は抗RXRα抗体（D-20）を用いたウエスタンブロット法で検出した。
【図８】FLAG-TFII-IとERα又はERα欠損変異体を導入した細胞を用いた免疫沈降実験の結果を示す図。FLAG-TFII-IはERα等と293FT細胞に同時導入した。細胞を回収する前に100nM E2またはエタノールで１時間処理した。続いて、NP-40 lysis buffer(50 mM Tri-HCl(pH8.0), 1% NP-40, 150mM NaCl, プロテアーゼ阻害剤カクテル(ナカライテスク))で細胞抽出液を調製し、免疫沈降は抗FLAG M2アガロース(Sigma)を用いた。ERαは、抗ER抗体（H-184）を用いたウエスタンブロット法で、ERα欠損変異体はMyc抗体（D-20）を用いたウエスタンブロット法で検出した。
【図９】FLAG-TFII-I又はFLAG-TFII-I欠損変異体とERαを導入した細胞を用いた免疫沈降実験の結果を示す図。FLAG-TFII-I等はERαと293FT細胞に同時導入した。NP-40 lysis buffer(50 mM Tri-HCl(pH8.0), 1% NP-40, 150mM NaCl, プロテアーゼ阻害剤カクテル(ナカライテスク))で細胞抽出液を調製し、免疫沈降は抗FLAG M2アガロース(Sigma)を用いた。共沈殿物は抗ER抗体（H-184）を用いたウエスタンブロット法で検出した。
【図１０】pS2遺伝子プロモーターとGREB1遺伝子プロモーターについてのクロマチン免疫沈降実験の結果を示す図。コントロールとTFII-I siRNAを導入したMCF-7細胞をエタノールまたはE2 100nMで４５分処理した。目的のDNA配列はPCRで増幅しアガロースゲルで電気泳動後、エチヂウムブロマイドで可視化した（図１０Ｂ）。pS2プロモーター領域は定量PCRで定量し、バーグラフで示した（図１０Ｃ）。グラフ中の１、２、３、及び４は、それぞれコントロールE2非存在下、コントロールE2存在下、TFII-I siRNA導入E2非存在下、及びTFII-I siRNA導入E2存在下における定量値を示している。pS2、GREB1プロモーターの構造を示した（図１０Ａ）。矢印は使用したPCRプライマーの位置を表している。
【図１１】TFII-I転写抑制機構を模式的に表した図。Inrエレメントを持つエストロゲン応答遺伝子のInrエレメントにTFII-Iが結合しERα（ERα46）とコリプレッサーをプロモーター上に誘導し、ヒストン脱アセチル化酵素が転写を抑制している（図１１Ａ）。この誘導はTFII-IとERαまたはHDAC1との結合が関与しているかもしれない。Inrに結合したTFII-Iは物理的にRNAポリメラーゼIIのプロモーターへの結合を阻害している（図１１Ｂ）。
【図３】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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