(57)【要約】【課題】  硫黄同化系および硫黄二次代謝系を制御する因子を見出し、それを利用し、新規な植物を作出する。【解決手段】  硫黄同化系および硫黄二次代謝系を制御する転写因子SLIM1/EIL3をコードする遺伝子を植物に導入し、低硫黄環境耐性などの性質を示す植物を作出する。また、植物中の前記遺伝子を破壊するなどし、高硫黄環境耐性、含硫二次代謝物の高蓄積などの性質を示す植物を作出する。【選択図】  なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の(a)、(b)、(c)、(d)、又は(e)のタンパク質をコードする遺伝子若しくはその一部を含むことを特徴とするベクター、
(a)配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質、
(b)配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質とアミノ酸配列の類似性が43％以上であるタンパク質であって、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つタンパク質、
(c)配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質とアミノ酸配列の同一性が34.5％以上であるタンパク質であって、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つタンパク質、
(d)配列番号２記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列で表され、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つタンパク質、
(e)配列番号１記載の塩基配列で表されるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする植物由来のタンパク質であって、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のベクターを植物に導入し、その植物内で(a)、(b)、(c)、(d)、又は(e)のタンパク質をコードする遺伝子若しくはその一部を発現させることを特徴とするトランスジェニック植物の作出方法。
【請求項３】
トランスジェニック植物が、低硫黄環境耐性植物であることを特徴とする請求項２に記載のトランスジェニック植物の作出方法。
【請求項４】
下記の(a)、(b)、(c)、(d)、又は(e)のタンパク質をコードする遺伝子若しくはその一部が導入され、発現しているトランスジェニック植物、
(a)配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質、
(b)配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質とアミノ酸配列の類似性が43％以上であるタンパク質であって、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つタンパク質、
(c)配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質とアミノ酸配列の同一性が34.5％以上であるタンパク質であって、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つタンパク質、
(d)配列番号２記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列で表され、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つタンパク質、
(e)配列番号１記載の塩基配列で表されるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする植物由来のタンパク質であって、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つタンパク質。
【請求項５】
トランスジェニック植物が、低硫黄環境耐性植物であることを特徴とする請求項４に記載のトランスジェニック植物。
【請求項６】
植物中に存在する下記の(a)、(b)、(c)、(d)、又は(e)のタンパク質をコードする遺伝子を破壊又は発現抑制すること、あるいは下記(f)のタンパク質をコードするDNAを導入し、発現させることを特徴とする変異植物の作出方法、
(a)配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質、
(b)配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質とアミノ酸配列の類似性が43％以上であるタンパク質であって、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つタンパク質、
(c)配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質とアミノ酸配列の同一性が34.5％以上であるタンパク質であって、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つタンパク質、
(d)配列番号２記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列で表され、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つタンパク質、
(e)配列番号１記載の塩基配列で表されるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする植物由来のタンパク質であって、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つタンパク質、
(f)配列番号２記載のアミノ酸配列において、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を発揮するのに不可欠なアミノ酸が欠失若しくは置換されたアミノ酸配列又はその一部分のアミノ酸配列で表され、配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質が持つ機能を競争的に阻害する機能を持つタンパク質。
【請求項７】
変異植物が、高硫黄環境耐性植物であること、又は低硫黄環境下において含硫二次代謝物を高蓄積することを特徴とする請求項６に記載の変異植物の作出方法。
【請求項８】
植物中に存在する下記の(a)、(b)、(c)、(d)、又は(e)のタンパク質をコードする遺伝子を破壊又は発現抑制していること、あるいは下記の(f)のタンパク質をコードするDNAが導入され、発現していることを特徴とする変異植物、
(a)配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質、
(b)配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質とアミノ酸配列の類似性が43％以上であるタンパク質であって、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つタンパク質、
(c)配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質とアミノ酸配列の同一性が34.5％以上であるタンパク質であって、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つタンパク質、
(d)配列番号２記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列で表され、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つタンパク質、
(e)配列番号１記載の塩基配列で表されるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする植物由来のタンパク質であって、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つタンパク質。
(f)配列番号２記載のアミノ酸配列において、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を発揮するのに不可欠なアミノ酸が欠失若しくは置換されたアミノ酸配列又はその一部分のアミノ酸配列で表され、配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質が持つ機能を競争的に阻害する機能を持つタンパク質。
【請求項９】
変異植物が、高硫黄環境耐性植物であること、又は低硫黄環境下において含硫二次代謝物を高蓄積することを特徴とする請求項８に記載の変異植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、硫黄同化系制御因子を利用した植物の作出方法、及びその方法によって作出された植物に関する。硫黄同化系制御因子を過剰発現させた植物は、低硫黄環境に対して耐性を示すようになると考えられる。一方、硫黄同化系制御因子の発現を抑制させた植物は、高硫黄環境に対して耐性を示すようになると考えられる。また、硫黄同化系制御因子の発現量を調節することにより、植物体中の含硫化合物の量を調整できると考えられる。
【背景技術】
【０００２】
硫黄は穀物の収量および農業の生産性に対し重大な意味を持つ必須主要栄養素である（参考文献１−３）。植物は土壌環境に存在する硫黄の酸化型である硫酸イオンを硫黄源として利用する。ヒトを含む動物は硫酸イオンをシステインおよびメチオニンに同化することができないので、硫黄源として含硫アミノ酸およびタンパク質を必要とする。植物の硫酸イオン同化経路の意義は、自然界における硫黄サイクルにおいて動物が持たない代謝的ギャップを埋める能力を植物が有していることにある（参考文献３）。植物体内おける硫酸イオンの代謝は光合成と密接な結びつきがある。すなわち、硫酸イオンの硫化物への還元はATPおよび還元力を供給する補酵素の存在下で生じ、システインおよびメチオニンの炭素骨格は炭素固定経路から提供される（参考文献１−３）。植物由来の硫黄は動物の必須栄養であることに加えて、いくつかの植物代謝物中に存在し、酸化還元調節物質、ビタミン、補酵素、香気成分、昆虫忌避剤、抗炎症剤および抗癌剤等の重要な生物活性を示す（参考文献１−５）。土壌環境に適度の硫酸塩が施肥されない場合、硫黄は植物の成長に対する制限因子となる。このことは農業に悪影響を及ぼし、さらに植物由来の食品の品質や栄養価に影響し得る（参考文献３）。
【０００３】
硫黄欠乏ストレス(-S)条件下では、限られた量の硫黄を根圏から獲得するために、植物は硫酸イオントランスポーターを過剰発現し、硫酸イオンに対する親和性を高め、その吸収速度を速める（参考文献６−９）。過剰の硫酸イオンの大部分は液胞に一時的に蓄積するが、-S条件下では液胞から硫酸イオンを引き出して、硫黄代謝に供することができる（参考文献１０）。また、-S条件下では硫黄源を確保するため、ソース器官とシンク器官、および２次代謝と１次代謝との間の硫黄の再分配が生じ得る（参考文献１１、１２）。すなわち、植物が低硫黄環境に順応する過程では、硫黄の同化と代謝の全ネットワークがバランスし、硫黄取り込み活性および内部硫黄貯蔵量を制御して硫黄使用効率を最大にする必要がある（参考文献１３−１５）。硫黄同化の過程で働くトランスポーターおよび酵素の遺伝子が種々の植物種から単離され、それらの硫黄栄養に対する応答が報告されているが、硫黄栄養の変化からこれらの遺伝子の発現変化に至る情報伝達系は未知のままであり、この代謝経路を制御する転写因子は未だ発見されていない。緑藻類Chlamydomonas reinhardtiiのsac突然変異体についての研究により、光合成生物における硫黄獲得を制御する可能性のある情報伝達因子の存在が示された（参考文献１６、１７）が、維管束植物におけるこのような因子の存在は証明されていない。
【０００４】
本発明者は、高等植物シロイヌナズナにおける硫黄同化系の情報伝達系を制御するタンパク質因子を同定するため、遺伝学的アプローチによる研究を行った。植物の硫黄栄養状態を視覚化する変異体スクリーニング系として、シロイヌナズナの根におけるSULTR1;2硫酸イオントランスポーターの発現をクラゲ緑色蛍光タンパク質(GFP)の蛍光によりモニターする系を確立した（参考文献１８、非特許文献１）。SULTR1;2は根の根毛、表皮および皮層に局在するシロイヌナズナの高親和型硫酸イオントランスポーターであり、環境中からの硫酸イオンの取り込みに主に寄与する（参考文献８、９）。SULTR1;2の発現はプロモーター依存的に硫黄欠乏(-S)によって正に制御され、従って、SULTR1;2硫酸イオントランスポーター遺伝子の2160bpプロモーター領域とGFPのコード領域とで構成される融合遺伝子コンストラクトであるPSULTR1;2-GFPは、植物への硫酸イオンの供給が充分でない場合は顕著な緑色蛍光を与える（参考文献１８、非特許文献１）。
【０００５】
【非特許文献１】A. Maruyama-Nakashita, Y. Nakamura, T. Yamaya, H. Takahashi, Plant J. 38, 779 (2004).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述したように、高等植物においては硫黄同化系を制御する因子はまだ見つかっていない。このような制御因子を同定できれば、それを利用して有用な植物を作出することが可能になる。
本発明は、このような技術的背景の下になされたものであり、硫黄同化系制御因子を植物中より見出し、それを利用した新規な植物を作出することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、エチレンの情報伝達系で働く転写因子であるEIN3(Ethylene Insensitive 3）の類似タンパク質であるEIL3（Ethylene Insensitive 3-Like 3）が、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する因子であることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下の（１）〜（９）を提供するものである。
【０００８】
（１）下記の(a)、(b)、(c)、(d)、又は(e)のタンパク質をコードする遺伝子若しくはその一部を含むことを特徴とするベクター、
(a)配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質、
(b)配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質とアミノ酸配列の類似性が43％以上であるタンパク質であって、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つタンパク質、
(c)配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質とアミノ酸配列の同一性が34.5％以上であるタンパク質であって、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つタンパク質、
(d)配列番号２記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列で表され、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つタンパク質、
(e)配列番号１記載の塩基配列で表されるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする植物由来のタンパク質であって、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つタンパク質。
【０００９】
（２）（１）に記載のベクターを植物に導入し、その植物内で(a)、(b)、(c)、(d)、又は(e)のタンパク質をコードする遺伝子若しくはその一部を発現させることを特徴とするトランスジェニック植物の作出方法。
【００１０】
（３）  トランスジェニック植物が、低硫黄環境耐性植物であることを特徴とする（２）に記載のトランスジェニック植物の作出方法。
【００１１】
（４）下記の(a)、(b)、(c)、(d)、又は(e)のタンパク質をコードする遺伝子若しくはその一部が導入され、発現しているトランスジェニック植物、
(a)配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質、
(b)配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質とアミノ酸配列の類似性が43％以上であるタンパク質であって、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つタンパク質、
(c)配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質とアミノ酸配列の同一性が34.5％以上であるタンパク質であって、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つタンパク質、
(d)配列番号２記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列で表され、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つタンパク質、
(e)配列番号１記載の塩基配列で表されるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする植物由来のタンパク質であって、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つタンパク質。
【００１２】
（５）トランスジェニック植物が、低硫黄環境耐性植物であることを特徴とする（４）に記載のトランスジェニック植物。
【００１３】
（６）植物中に存在する下記の(a)、(b)、(c)、(d)、又は(e)のタンパク質をコードする遺伝子を破壊又は発現抑制すること、あるいは下記(f)のタンパク質をコードするDNAを導入し、発現させることを特徴とする変異植物の作出方法、
(a)配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質、
(b)配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質とアミノ酸配列の類似性が43％以上であるタンパク質であって、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つタンパク質、
(c)配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質とアミノ酸配列の同一性が34.5％以上であるタンパク質であって、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つタンパク質、
(d)配列番号２記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列で表され、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つタンパク質、
(e)配列番号１記載の塩基配列で表されるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする植物由来のタンパク質であって、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つタンパク質、
(f)配列番号２記載のアミノ酸配列において、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を発揮するのに不可欠なアミノ酸が欠失若しくは置換されたアミノ酸配列又はその一部分のアミノ酸配列で表され、配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質が持つ機能を競争的に阻害する機能を持つタンパク質。
【００１４】
（７）変異植物が、高硫黄環境耐性植物であること、又は低硫黄環境下において含硫二次代謝物を高蓄積することを特徴とする（６）に記載の変異植物の作出方法。
【００１５】
（８）植物中に存在する下記の(a)、(b)、(c)、(d)、又は(e)のタンパク質をコードする遺伝子を破壊又は発現抑制していること、あるいは下記の(f)のタンパク質をコードするDNAが導入され、発現していることを特徴とする変異植物、
(a)配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質、
(b)配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質とアミノ酸配列の類似性が43％以上であるタンパク質であって、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つタンパク質、
(c)配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質とアミノ酸配列の同一性が34.5％以上であるタンパク質であって、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つタンパク質、
(d)配列番号２記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列で表され、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つタンパク質、
(e)配列番号１記載の塩基配列で表されるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする植物由来のタンパク質であって、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つタンパク質。
(f)配列番号２記載のアミノ酸配列において、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を発揮するのに不可欠なアミノ酸が欠失若しくは置換されたアミノ酸配列又はその一部分のアミノ酸配列で表され、配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質が持つ機能を競争的に阻害する機能を持つタンパク質。
【００１６】
（９）  変異植物が、高硫黄環境耐性植物であること、又は低硫黄環境下において含硫二次代謝物を高蓄積することを特徴とする（８）に記載の変異植物。
【発明の効果】
【００１７】
本発明は、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する因子を利用した植物の作出手段を提供する。この制御因子をコードする遺伝子を過剰に発現させる、又は遺伝子の発現を抑制することにより、低硫黄環境又は高硫黄環境に対して耐性を持つ植物を作出できると考えられる。また、同様の手段により植物中の含硫化合物の量を調整した植物も作出できると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のベクターは、  下記の(a)、(b)、(c)、(d)、又は(e)のタンパク質をコードする遺伝子（以下、これらの遺伝子を「本遺伝子」という場合がある。）を含むことを特徴とするものである。
【００１９】
(a)配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質、
(b)配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質とアミノ酸配列の類似性が43％以上であるタンパク質であって、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つタンパク質、
(c)配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質とアミノ酸配列の同一性が34.5％以上であるタンパク質であって、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つタンパク質、
(d)配列番号２記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列で表され、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つタンパク質、
(e)配列番号１記載の塩基配列で表されるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする植物由来のタンパク質であって、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つタンパク質。
【００２０】
(a)のタンパク質は、MIPSコードが「At1g73730」であるシロイヌナズナ由来の遺伝子（塩基配列は配列番号１に示す通りである。）がコードするタンパク質である。
【００２１】
(b)のタンパク質は、(a)のタンパク質とアミノ酸配列において43％以上の類似性を示すタンパク質である。硫黄同化系の制御に関与することが確認されているOs08g39830及びOs09g31400は、(a)のタンパク質とアミノ酸配列においてそれぞれ43％及び45％の類似性を示す（図２Ｄ及び図４）。一方、硫黄同化系の制御に関与することが確認できていないAt3g20770(EIN3)、At2g27050(EIL1)、At5g21120(EIL2)、At5g10120(EIL4)、及びAt5g65100(EIL5)の類似性は、それぞれ40.1％、39.2％、34.6％、34.2％、及び35.2％である（図２Ｄ及び図４）。このことから、(a)のタンパク質とアミノ酸配列において43％以上の類似性を示すタンパク質は、(a)のタンパク質と同様に、硫黄同化系を正に制御する機能を持つ可能性が高い。(a)のタンパク質とアミノ酸配列において43％以上の類似性を示すタンパク質としては、上述したOs08g39830及びOs09g31400のほか、Fagus sylvatica（ヨーロッパブナ）由来のCAC09582（類似性：55.1％）を例示できる。
【００２２】
(c)のタンパク質は、(a)のタンパク質とアミノ酸配列において34.5％以上の同一性を示すタンパク質である。硫黄同化系の制御に関与することが確認されているOs08g39830及びOs09g31400は、(a)のタンパク質とアミノ酸配列においてそれぞれ34.5％及び38％の同一性を示す（図２Ｄ及び図４）。一方、硫黄同化系の制御に関与することが確認できていないAt3g20770(EIN3)、At2g27050(EIL1)、At5g21120(EIL2)、At5g10120(EIL4)、及びAt5g65100(EIL5)の同一性は、それぞれ31.2％、30.7％、24.5％、27.1％、及び27％である（図２Ｄ及び図４）。このことから、(a)のタンパク質とアミノ酸配列において34.5％以上の同一性を示すタンパク質は、(a)のタンパク質と同様に、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つ可能性が高い。(a)のタンパク質とアミノ酸配列において34.5％以上の同一性を示すタンパク質としては、上述したOs08g39830及びOs09g31400のほか、Fagus sylvatica由来のCAC09582（同一性：47.4％）を例示できる。
【００２３】
なお、本発明において「類似性」とは、数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメントにおける、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸（物理化学的性質において類似したアミノ酸）の割合（％）を意味し、「同一性」とは、同じアラインメントにおける同一アミノ酸の割合（％）を意味する。本発明における、「アミノ酸の類似性が４３％以上」又は「アミノ酸の同一性が３１．５％以上」とは、例えば、DNA Data Bank of Japan  (DDBJ)(http://www.ddbj.nig.ac.jp./search/clustalw-j.html)のClustalWプログラムで、下記条件
MATRIX （アミノ酸配列の置換行列表）：blosum
Gap 開始時の Gap penalty：10.0
Gap 継続時の Gap penalty： 0.2
Gap 間の距離： 8
MAXDIV： 40
end gaps：無視しない
residue-specific gaps：無視しない
hydrophilic gaps：無視しない
にて２つのアミノ酸配列をアラインした場合に、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸の割合が４３％以上であるときに、「アミノ酸の類似性が４３％以上」であるものとし、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸の割合が３１．５％以上であるときに「アミノ酸の同一性が３１．５％以上」であるものとする。
【００２４】
(d)のタンパク質は、(a)のタンパク質に、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能に影響を与えない範囲内で変異が導入されたタンパク質である。ここで、「硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する」とは、(a)のタンパク質（シロイヌナズナ由来EIL3）が持つ機能のことをいい、より具体的には、後述する実施例に示すクラスＡの遺伝子の全部又は一部の発現量を増大させ、クラスＣの遺伝子の全部又は一部の発現量を減少させる機能をいう。(d)のタンパク質における変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異をも含む。人為的変異を生じさせる手段としては、部位特異的変異誘発法（Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982）などを挙げることができるが、これに限定されるわけではない。変異したアミノ酸の数は、前記した機能を失わせない限り、その個数は制限されないが、通常は、30アミノ酸以内であり、好ましくは20アミノ酸以内であり、更に好ましくは10アミノ酸以内であり、最も好ましくは5アミノ酸以内である。配列番号２記載のアミノ酸配列における115番目のGly（Gly115）、131番目のGlu（Glu131）、242番目のVal（Val242）、269番目のAla（Ala269）は、(a)のタンパク質がその機能を発揮するのに不可欠なアミノ酸である。従って、(d)のタンパク質は、これらのアミノ酸が欠失若しくは置換されていないものであることが好ましい。変異を導入したタンパク質が硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つかどうかは、(a)のタンパク質の機能を失わせ、表現型を変化させた植物に、変異を導入したタンパク質をコードする遺伝子を導入し、それにより表現型が回復するかどうかを調べることにより判断できる。
【００２５】
(e)のタンパク質は、DNA同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られる(a)と同様の機能を持つタンパク質である。(e)のタンパク質における「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、通常、37℃でのハイブリダイゼーション及び1×SSC、0.1％SDSを含む緩衝液による37℃での洗浄処理といった条件であり、好ましくは、42℃でのハイブリダイゼーション及び0.5×SSC、0.1％SDSを含む緩衝液による42℃での洗浄処理といった条件であり、更に好ましくは、65℃でのハイブリダイゼーション及び0.2×SSC、0.1％SDSを含む緩衝液による65℃での洗浄処理といった条件である。
【００２６】
本発明のベクターは、本遺伝子を含んでいればよいが、適当なプロモーター等も含み、植物内で本遺伝子を発現できるものであることが好ましい。この際、使用するプロモーターとしては、実施例中で使用しているカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターを例示できるが、それ以外にもユビキチンプロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター、リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ(RuBisCO)プロモーターなども使用できる。
【００２７】
本発明のベクターは、本遺伝子を含むが、必ずしも本遺伝子の全長を含む必要はなく、本遺伝子の一部だけを含むものであってもよい。ここで、「本遺伝子の一部」とは、本遺伝子の機能（硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つタンパク質を発現させる機能）を持つDNA断片のことである。前述したGly115、Glu131、Val242、Ala269のアミノ酸をすべて含むタンパク質は、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つと考えられるので、このタンパク質をコードするDNAは、「本遺伝子の一部」に含まれる。
【００２８】
本発明のトランスジェニック植物は、本発明のベクターを導入し、植物内で本遺伝子を発現させることにより、作出できる。なお、ここでいう「植物」には、個体としての植物だけでなく、植物由来の培養物、例えば、毛状根、カルスや懸濁培養細胞なども含まれる。
【００２９】
本遺伝子がコードするタンパク質は、低硫黄環境に応答して硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つので、本遺伝子を過剰発現させたトランスジェニック植物は、低硫黄環境に対して耐性を示すと考えられる。また、このようなトランスジェニック植物は、野生型の植物よりも含硫一次代謝物（例えば、システイン、メチオニン、グルタチオン）を多く含むものと考えられる。
【００３０】
本発明のベクターを植物に導入する方法としては、アグロバクテリウムを用いた方法を例示できるが、それ以外にも、遺伝子銃、エレクトロポレーション、ウイルスベクターなどによっても、導入することができる。
【００３１】
作出対象とする植物は特に限定されず、単子葉植物、双子葉植物のいずれも対象とすることができ、例えば、アブラナ科、イネ科、マメ科、ナス科、ブナ科、ユリ科、アカザ科、フトモモ科、ヤナギ科、ヤシ科などを作出対象とすることができる。より具体的には、シロイヌナズナ、西洋アブラナ、ブロッコリー、カリフラワー、キャベツ、ハクサイ、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、ダイズ、トマト、ナス、ジャガイモ、ネギ、タマネギ、ニンニク、ホウレンソウ、ユーカリ、ポプラ、アブラヤシ、ワサビ、ニラなどを作出対象とすることができる。
【００３２】
EIL3は、シロイヌナズナだけでなく、他の多くの植物においても存在が確認されている。それらの植物におけるEIL3は、シロイヌナズナの場合と同様に、硫黄同化系の制御因子として機能していると考えられる。従って、本遺伝子を導入し、発現させることにより、シロイヌナズナだけでなく、広範な植物に対して低硫黄環境耐性などの性質を付与できると考えられる。
本発明の変異植物は、植物中に存在する本遺伝子を破壊、又は発現抑制することにより、作出できる。
【００３３】
本遺伝子がコードするタンパク質は、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を持つので、本遺伝子を破壊等した変異植物は、硫黄の取り込み能が低く、このため、高硫黄環境に対して耐性を示すと考えられる。また、このような変異植物は、低硫黄環境下で栽培した場合、野生型の植物よりも含硫二次代謝物を多く含むと考えられる。ここでいう含硫二次代謝物とは、例えば、グルコシノレート（インドール-3-イルメチルグルコシノレート、1-メトキシインドール-3-イルメチルグルコシノレート、4-メチルスルフィニルブチルグルコシノレート、5-メチルスルフィニルペンチルグルコシノレート、6-メチルスルフィニルヘキシルグルコシノレート、7-メチルスルフィニルヘプチルグルコシノレート、8-メチルスルフィニルオクチルグルコシノレート、4-メチルチオブチルグルコシノレート、5-メチルチオペンチルグルコシノレート、6-メチルチオヘキシルグルコシノレート、7-メチルチオヘプチルグルコシノレート、8-メチルチオオクチルグルコシノレートなど）、カマレキシン、アリシン、S-メチルメチオニン、メチルスルフォニルメタンなどである。
【００３４】
本遺伝子を破壊又は発現抑制する手段は特に限定されず、例えば、遺伝子を破壊する手段としては、T-DNAやトランスポゾンを本遺伝子に挿入する手段を例示でき、遺伝子を発現抑制する手段としては、Tilling法、アンチセンス法やRNAi法などの手段を例示できる。
【００３５】
本発明の変異植物は、本遺伝子の変異型やリプレッサードメイン付加型、即ち、配列番号２記載のアミノ酸配列において、硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を発揮するのに不可欠なアミノ酸が欠失若しくは置換されたアミノ酸配列又はその一部分のアミノ酸配列で表され、配列番号２記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質が持つ機能を競争的に阻害する機能を持つタンパク質をコードするDNAを導入し、発現させることによっても、作出できる。ここで、「硫黄同化系を正に、硫黄二次代謝系を負に制御する機能を発揮するのに不可欠なアミノ酸」とは、前述したGly115、Glu131、Val242、Ala269などを例示できる。
【００３６】
変異植物の作出対象とする植物は特に限定されず、トランスジェニック植物の作出対象植物と同様の植物を対象とすることができる。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
最初に本実施例において使用した実験材料及び実験方法について説明する。
【００３８】
〔材料と方法〕
植物の生育
シロイヌナズナ(Col-0)を22℃で16時間/8時間の明暗サイクルで生育させた。1％スクロースを含む無機養分培地（参考文献２９）で植物を生育させた。寒天培地を調製するため、寒天を１Lの脱イオン水で2回洗い、減圧濾過した。植物の水平および垂直成長のための寒天濃度はそれぞれ0.5％および0.8％とした。MgSO4をMgCl2に完全に置換したS0寒天培地は、約10μMの寒天由来の硫酸塩を含んでいる。S0培地に1500、300、100、30および15μMの異なった濃度のMgSO4をそれぞれ添加してS1500、S300、S100、S30およびS15寒天培地を調製し、MgCl2を添加してMg濃度を1,500μMに調節した。他の無機元素濃度は（参考文献２９）に記載されている。
【００３９】
slim1の単離
PSULTR1;2-GFPコンストラクト（参考文献３０）を有するホモ接合体トランスジェニック植物の種子（約15,000粒）にエチルメタンスルホン酸(0.3％EMS、16時間)で突然変異を誘発させ、6個のトレイの土壌に直接播種した。M2種子をM1ファミリー（36プール）として別に収穫した。各プールから約2000粒のM2種子（合計72,000粒）を用いて、S0寒天培地上のGFP蛍光の変化でスクリーニングを行った。S0寒天培地を含む１枚のプラスチックプレートに117粒の種子を相互に9mm離して播種し、播種後11日でGFP蛍光を検出した。GFP蛍光が減少した幼苗を突然変異体の候補として選び、生育を回復させるためにS1500寒天培地に移した。2〜3週間後、植物を土壌に移し、Ｍ３種子を得た。２次スクリーニングとして、209の独立株由来のM３種子をS0またはS1500寒天培地上で11日間生育した。各株由来の16粒の種子を直径4cmのプラスチックプレート上に播種した。この２次スクリーニングからGFP蛍光が減少した80株を選び、親株であるPSULTR1;2-GFPトランスジェニック植物と戻し交配した。２次スクリーニングと同じ条件で、戻し交配株のF2世代でGFPレベルを解析し、最終的に硫黄欠乏応答欠損突然変異株として６０株を選んだ。戻し交配により対立遺伝子の突然変異と判定された変異株のファミリーをslim1と名付け、以下の実験で分析した。slim1-1およびslim1-2植物をPSULTR1;2-GFPトランスジェニック植物と3回戻し交配し、表現型の解析に使用した。
【００４０】
SLIM1の位置同定
Landsberg erectaとの交配のより得られたslim1-1およびslim1-2のF2種子をマップベースクローニングに使用した。F2植物を10μMのカナマイシン(Km)を含むS0寒天培地上で11日間生育させ、Ｋｍ耐性を示しGFP蛍光が有意に減少した幼苗を選び、栄養源を全て含む寒天培地に移して成長を-Sストレスから回復させた。MagAttract96DNA Plant Coreキット（QIAGEN製）を用いて選択した植物からゲノムDNAを調製した。SLIM1を含む染色体を遺伝子マーカー(nga68、nga111、nga361、nga162、nga6、nga8およびnga139)を用いて決定した。SLIM1をnaga111とATPASEマーカーとの間にマッピングした。nga11またはATPASEマーカーにより異型接合パターンを示すDNAをGenomiPhi（商標）DNA増幅キット(Amersham、Bioscineces)で増幅し、Inplanta Innovations社(Yokohama、Japan)製のSNPマーカーを用いてSLIM1の位置をBACクローンT9L24とF1M20との間に狭めた（参考文献３１）。SLIM1遺伝子を同定するため、本発明者は図１１にまとめた分子マーカーを作製した。これらのマーカーを使用し、SLIM1をAt1g73660とAt1g73850との間の位置にマッピングした。At1g73660とAt1g73850との間に存在する21個の遺伝子について配列決定することにより、At1g73730上で生じたslim1-1およびslim1-2の突然変異を同定した。
【００４１】
トランスジェニック植物
標準プロトコールに従って分子生物学実験を行った（参考文献３２）。植物形質転換ベクターの構築に使用したプライマー配列を図１２にまとめる。KOD-Plus DNAポリメラーゼ(Toyobo、Japan)を全てのDNAフラグメントのPCR増幅に使用した。
【００４２】
pSMAH621ベクター中のカリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35Sプロモーターの下流にSLIM1コード領域をクローニングし、SLIM1過剰発現コンストラクト(P35S-SLIM)を作製した（参考文献３３）。二段階ＰＣＲにより、Col-0 シロイヌナズナゲノムDNAから全長SLIM1コード領域を増幅した。イントロンを除去するため、35bp長の第１エクソンと第２エクソンの5’末端領域21bp長からなる56bpのフォワードプライマーとリバースプライマーを用いてPCR増幅を行った。このPCRの生成物を鋳型として用い、SLIM1コード領域をPCRで再増幅した。pSMAH621ベクター（参考文献３３）をXbaIおよびSacIで直線化し、In-Fusion（商標）PCRクローニングキット(Clontech)を用いてCaMV35Sプロモーターの下流にSLIM1フラグメントをクローニングした。
【００４３】
SLIM1プロモーター-GFPコンストラクト(PSLIM1-GPF)を以下の様に作製した。SLIM1プロモーターフラグメント(2087bp)をCol-0シロイヌナズナゲノムDNAからPCRで増幅し、XbalおよびBamHIで直線化したpBI101-sGFPベクター（参考文献３４）中にクローニングした。pBI101-sGFPはプロモーター分析のために以前に作製した植物形質転換用バイナリーベクターであり、元のpBI101(Clontech)のβ-グルクロニダーゼ部分がsGFPで置換されている（参考文献３５）。SLIM1プロモーター配列のクローニングのためにIn-Fusion（商標）PCRクローニングキット(Clontech)を使用した。
【００４４】
SLIM1タンパク質(P35S-GFP-SLIM1)の細胞内局在性解析用のGFP-SLIM1コンストラクトを以下の様に作製した。XbaIおよびBamHI認識配列を末端にもつプライマーを用いてsGFPフラグメントをPCRによりpTH2（参考文献３５）から増幅し（図１２）、BamHIおよびNotI認識配列を末端にもつプライマーを用いてSLIM1コード領域をP35S-SLIM1プラスミドからPCRで増幅した。PCR増幅フラグメントをpCR-BluntII-TOPO(Invitrogen社製)中にクローニングし、配列決定した。SLIM1のフラグメントをpTH2中のBamHI-NotIサイトにクローニングし（参考文献３５）、ノパリンシンターゼターミネーター(TNOS)と融合させた。得られたSLIM1-TNOSフラグメントをBamHI-EcoRI末端フラグメントとしてこのプラスミドから切り出し、sGFPのXbaI-BamHI末端フラグメントと共に、pBI121(Clontech)のXbaI-EcoRI部位間にクローニングし、CaMV35SプロモーターによるGFP-SLIM1融合タンパク質の過剰発現ベクターとした。
【００４５】
EIN3/EILファミリー遺伝子およびOsSLIM1遺伝子の過剰発現のためのコンストラクトを、Gateway技術(Invitrogen)を用いて調製した。EIN3、EIL2、EIL4およびEIL5のコード配列をCol-0シロイヌナズナゲノムDNAからPCRで増幅し、OsSLIM1;1およびOsSLIM1;2のコード配列をイネの根(Oryza sativa L.cv Sasanishiki)から調製したcDNAからPCRで増幅した。増幅されたDNAフラグメントをpENTR（商標）/D-TOPOベクター(Invitrogen)中にクローニングし配列決定した。次いでコード配列を、pSMAH621上にCaMV35Sプロモーターと同配向のGatewayカセットを有するバイナリーベクターであるpH35GS（参考文献３３）中に、Gateway LRクロナーゼ（商標）酵素ミックス(Invitrogen)を用いてクローニングした。
【００４６】
凍結解凍法で全てのバイナリープラスミドをAgrobacterium tumefaciens GV3101(pMP90)（参考文献３６）中に形質移入した（参考文献３７）。シロイヌナズナをフローラルディップ法により形質転換した（参考文献３８）。トランスジェニック植物を50mg/Lのカナマイシン硫酸（pBIコンストラクト用）または25mg/Lのハイグロマイシン（pSMAH621およびpH35GSコンストラクト用）を含むGM培地（参考文献３９）上で選択した。カナマイシン耐性またはハイグロマイシン耐性T2世代を解析に用いた。
【００４７】
定量的RT-PCR
RNeasyプラントミニキット(Qiagen)を用いて全RNAを単離し、DNaseI(Invitrogen)で処理した。オリゴ−d(T)12-18とSuperscript II逆転写酵素(Invitrogen)を用いて逆転写を行った。SYBR Green Perfectリアルタイムキット(Takara、Japan)およびGeneAmp5700配列検出システム(Applied Biosystems)を用いてリアルタイムPCRを行った。使用した遺伝子特異性プライマーペアは以下の通りである：SULTR1;2に対し1854F(5’-GGATCCAGAGATGGCTACATGA-3’、配列番号３）および1956R(5’-TCGATGTCCGTAACAGGTGAC-3’、配列番号４）；GFPに対し204F(5’-AGTGCTTCAGCCGCTACCC-3’、配列番号５）および345R(5’-CCCTCGAACTTCACCTCGG-3’、配列番号６） SLIM1/EIL3に対し-48F(5’-GGCGCTTCAGATTATCGTTGTTT-3’、配列番号７）および55R(5’-CATCAGGCTCATTCTCCATCCTG-3’、配列番号８）；およびUBQ2に対し144F(5’-CCAAGATCCAGGACAAAGAAGGA-3’、配列番号９）および372R(5’-TGGAGACGAGCATAACACTTGC-3’、配列番号１０）。ユビキチン(UBQ2、Accession No.J05508)を内部標準として用いてmRNA含有量の計算を行った。
【００４８】
GeneChipハイブリダイゼーションおよびデータ解析
硫黄充分（S1500培地；硫酸塩1500μM）および硫黄欠乏（S15培地；15μM）条件で生育したPSULTR1;2-GFP、slim1-1およびslim1-2植物の根からRNAを調製した。RNA調製とATH-1 GeneChipアレー（Affymetrix社、Santa Clara、CA製）のハイブリダイゼーションは、それぞれの条件について２回行った。GeneChipハイブリダイゼーションとデータ解析とを先に報告したように行った（参考文献４０）。データ解析にはMicroarray Suite5.0(Affymetrix社製)、GeneSpring7.2(SiliconGenetics社製)およびExcel2003(Microsoft社製)プログラムを使用した。各遺伝子の発現量をチップ上の全ての測定値の中間値で標準化した。発現強度の変化の倍数を標準化データから計算した。
【００４９】
GFPのイメージング
無処理の植物中のGFPを488nmのレーザーで励起し、イメージアナライザーFluorImager595(Molecular Dynamics、Sunnyvale、CA)を用いて視覚化した。GFPおよび植物の自己蛍光を530DF30および610RGフィルターをそれぞれ用いて検出した。GFPの相対強度はImageQuantソフトウエア(Molecular Dynamics)を用いて定量した。GFP発現の顕微鏡分析のため、GFPAフィルターを備えたSZX12蛍光顕微鏡(Olympus、Japan)を植物全体のイメージングに用いた。488nm Arレーザーと505〜525nmの蛍光波長を透過検出するフィルターセットとを備えたFluoview500レーザー走査型共焦点顕微鏡システム(Olympus)を共焦点イメージングに用いた。
【００５０】
SLIM1依存性および非依存性遺伝子の選択手順
植物を1500μM(S1500)または15μM(S15)硫酸塩寒天培地上で垂直に10日間生育させ、Affymetrix ATH-1 GeneChipアレーの分析用に使用した。-S誘導性または-S抑制性遺伝子を集めるため、PSULTR1;2-GFP植物に対する４回の実験（S1500とS15それぞれ2回の実験）中、少なくとも1回の実験におけるシグナル値が「P」（Present Call）または「M」(Marginal Call)の判定を有するアレー要素を選び、全４回の可能な比較においてS1500とS15との間で1.5倍より大きい差（すなわちS15/S1500またはS1500/S15信号比＞1.5）を示す要素を抽出した。次いでそれらの値から計算されるS15/S1500比またはS1500/S15比の平均値が２より大きい要素を集めた。これらが図１Ｂおよび図９中で「-S誘導性遺伝子（108遺伝子）」および「-S抑制性遺伝子（101遺伝子）」として表されるアレー要素である。
【００５１】
さらにSLIM1依存性遺伝子を分類するため、親株(PSULTR1;2-GFP)の場合と同様にS15/S1500比およびS1500/S15比を各突然変異体について計算した。全ての可能な組み合わせについてPSULTR1;2-GFPとslim1突然変異体との間でS15/S1500比を比較し、PSULTR1;2-GFPのS15/S1500値をslim1のPSULTR1;2-GFPのS15/S1500値で割って-S誘導性遺伝子のSLIM1依存性を評価した。-S抑制性遺伝子のS1500/S15値に対しても同様な計算を行った。これにより、PSULTR1;2-GFP試料とslim1試料との間の比較から各アレー要素に対するSLIM1依存率について16の異なった値が得られ、PSULTR1;2-GFPとslim1-2との比較から別な16の値が得られる。全体で32通りの比較のうち、すべてにおいて1.5より大きいSLIM1依存率を示すものを、２つの突然変異体間で整合性を有し、実験的変動を除外したものとして抽出した。32通りのSLIM1依存率の平均が２より大きい値を有する要素を「SLIM1依存性」遺伝子として抽出し、最終的に44個の「-S誘導性SLIM1依存性」遺伝子（クラスＡ）及び１２個の「-S抑制性SLIM1依存性」遺伝子（クラスＣ）を得た（図１Ｂ、図７、図８及び図９）。
【００５２】
-S応答性がslim1中で変化しなかったSLIM1非依存性遺伝子を集めるため、「-S誘導性遺伝子（108遺伝子）」または「-S抑制性遺伝子（101遺伝子）」の中から、まずPSULTR1;2-GFP試料とslim1突然変異体試料との間で可能な32通りのSLIM1依存率すべてにおいて２より小さい値を有するアレー要素を集めた。次にそれらのうち32通りのSLIM1依存率の平均が0.677以上、1.5以下を示すアレー要素を抽出し、最終的に３個の「-S誘導性SLIM1非依存性」遺伝子（クラスＢ）及び１６個の「-S抑制性SLIM1非依存性」遺伝子（クラスＤ）を得た（図１Ｂ、図７、図８及び図９）。
【００５３】
代謝物の測定
植物サンプルを取得し、2mLのエッペンドルフチューブに入れ秤量した後、液体窒素で凍らせた。各エッペンドルフチューブに5倍量の（100mg 生重量あたり500μL）抽出液（80％ メタノール：20％ milliQ水）を加え、mixer mill MM300 (Retsch)を用いて4℃で破砕した。3分間の破砕の後、遠心により細胞残渣を取り除いた。抽出液300μLを真空乾燥後、100μL milliQ水に溶解し、NANOSEP MF GHP 0.45μm (PALL Life Sciences) を用いて限外濾過を行い、濾過後の標品を代謝物の測定に用いた。
【００５４】
グルコシノレートの測定は、Mellonらの方法(参考文献４２)を改良し、液体クロマトグラフィー-マススペクトロメトリーを用いて行った。標品10μLをAcquity UPLC システム (Waters) に添加し、SunFire C18カラム (2.1 x 150-mm 直径；Waters)を用いて分離した。分離は溶液A (0.1% trifluoroacetic acid in H2O)と 溶液B (0.1% trifluoroacetic acid in methanol)を用いて、0から2% 溶液B (8分), 2から30% 溶液 B (12分), 30から100% 溶液B (18分), 100% 溶液B (7分), 100% 溶液A (5分)の直線的濃度勾配により行った。溶出は、毎分0.2 mL、30℃で行った。代謝物は、紫外線吸収(210-400 nm)により検出し、グルコシノレート特異的な[M-H]- イオンは Q-Tof Premier time-of-flight (TOF) mass analyzer (Micromass)を用いて検出した。電子スプレイによる検出は2.8 kVで行った。 4-メチルスルフィニルブチルグルコシノレート及び4-メチルチオブチルグルコシノレートのピークは、標準標品の溶出時間、紫外線吸収、m/z 値及びマスのフラグメンテーションパターンにより決定した。他のメチルスルフィニルアルキルグルコシノレート、メチルチオアルキルグルコシノレートは、紫外線吸収、m/z 値及びマスのフラグメンテーションパターンにより決定した。グルコシノレートの定量は、シニグリンの[M-H]- イオンの値を標準値として計算した。
【００５５】
システイン及びグルタチオンの測定は、標品をDTTで還元した後、チオール基（SH基）をモノブロモビマン(Molecular Probes)でラベルする方法で行った。ラベル化したサンプルをHPLCでSymmetry C18 column (直径4.6 mm × 150 mm, Waters)により分離し、scanning fluorescence detector 474 (Waters)を用いて390 nmの励起光下でチオール-ビマン結合体の蛍光482 nmをスキャンすることにより検出した。メチオニン及びo-アセチルセリンの測定は、キャピラリー電気泳動 -マススペクトロメトリーを用いて行った(Agilent Technologies) (参考文献４３)。硫酸イオンの測定は、キャピラリー電気泳動-フォトダイオードアレイ  デテクションシステムを用いて、付属の説明書に従って行った(Agilent Technologies)。
【００５６】
〔実験結果〕
トランスジェニックシロイヌナズナ(PSULTR1;2-GFP)を変異処理の親株として使用した。種子をエチルメタンスルホン酸処理し、突然変異M2種子を収穫した。M2種子を-S培養条件に播種し、GFP蛍光の変化がみられる幼苗をスクリーニングした。GFP蛍光の減少を示すM2幼苗を突然変異体の候補として単離した。GFP蛍光が有意に減少する幼苗をM3世代の植物で再度選抜し、親PSULTR1;2-GFP植物と交配することにより、F2種子を得た。GFP蛍光の減少を劣性形質として分離する突然変異体ファミリーの１つを選び、硫黄欠乏(sulfur limitation)応答欠損の表現型に因んでsulfur limitation 1 (sliml)と名付けた。slim1-1およびslim1-2突然変異体では、-S時に親植物であれば通常は観察されるはずのGFPの蛍光信号がほとんど完全に失われていた（図１Ａ）。GFPレポーター発現の異常と同様に、SULTR1;2 mRNAの-S誘導が両方の突然変異体で失われていた（図１Ａ）。
【００５７】
トランスクリプトーム解析による遺伝子発現プロファイルから、slim1-1およびslim1-2突然変異体では、-S誘導性遺伝子の硫黄欠乏応答性が全般的に低下していることがわかった（図１Ｂ）。slim1突然変異体のトランスクリプトームの変化は、低硫黄条件下のシロイヌナズナの根において、SLIM1遺伝子が広い範囲の硫黄栄養応答性遺伝子を制御することを示唆している。-S条件下の親株中で顕著に誘導された遺伝子のうち、その発現が明らかにSLIM1に依存しているものが44個見出された（図１Ｂ、図７及び図８、クラスＡ）。クラスＡ遺伝子の−Ｓ誘導性（図７及び図８、S15/S1500比）は、親株中でslim1突然変異体中より２倍以上高かった。これらには硫酸イオントランスポーター（SULTR1;1、SULTR1;2およびSULTR4;2）（参考文献６）、セリンアセチルトランスフェラーゼ（Serat3;1）（参考文献２）および異化的硫黄再利用のための酵素群（推定チオグルコシダーゼ、推定メチオニン／シスタチオンガンマリアーゼ）が含まれ、-S条件下での硫黄の利用の最適化に重要な役割を演じる。例外として、硫黄同化系で中心的な役割を演じる5’-アデニリル硫酸還元酵素（APR2およびAPR3）があり（参考文献１９）、これらは、slim1突然変異体と親株との間で-S誘導に有意な差がない、-S誘導性SLIM1非依存性遺伝子として分類された（図１Ｂ、図７及び図８、クラスＢ）。
【００５８】
-S抑制性遺伝子として分類された遺伝子群の特徴として、グルコシノレート生合成（参考文献２０、２１）に関わる遺伝子の多くがslim1突然変異体では適切に制御されていないことがわかった（図１Ｂ、図７及び図８、クラスＣ）。クラスＣ遺伝子の-S抑制性（図７及び図８、S1500/S15比）は、slim1突然変異体より親株で２倍以上高い。これらにはメチル（チオ）アルキルマレートシンターゼ(MAMおよびMAML)、およびメチオニン鎖長延長に関わると推定される分枝アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、およびメチオニンおよびトリプトファン由来のグルコシノレート合成に関わるCYP79チロクロームP450が含まれる（参考文献２０、２１）。同じくクラスＣに属するアデニリル硫酸リン酸化酵素(AKN2)は、硫酸転移反応における硫黄供与体である3’-ホスフォアデノシン-5’-ホスフォサルフェートの生成に寄与していることが示唆されている（参考文献１、２）。硫黄同化酵素であるATPスルフリラーゼ(APS4)もクラスＣに属するが、このアイソフォームの役割は明らかでない。-Sにより抑制されるが、それらの発現がSLIM1依存性を示さないものとしては、デスルフォグルコシノレート硫酸転移酵素(SOT18)およびホモシステインメチルトランスフェラーゼ(HMT-3)を含む遺伝子群が見出された（図７及び図８、クラスＤ）。
【００５９】
本発明者は遺伝子地図に基づくマップベースクローニングを行い、slim1変異の原因遺伝子であるSLIM1遺伝子を同定した。slim1-1およびslim1-2では、ETHYLENE INSENSITIVE3-LIKE3(EIL3)遺伝子(At1g73730)のコード領域中に、それぞれ１個の単一塩基置換が認められ、ミスセンス突然変異G115DおよびE131K（図５）の原因となっていた。EIL3は、EIN3/EILファミリーに属する転写因子であり、その機能はまだ実証されていなかった（参考文献２２）。さらに解析を行うことにより、EIN3/EILタンパク質のDNA結合部位であるBD III(225-236)およびBD IV(251-161)の近くに位置するアミノ酸に変異が生じた2つの突然変異体slim1-3(V242M)およびslim1-4(A269V:図５)を同定した（参考文献２３、２４）。本発明者はさらに、SLIM1の過剰発現がslim1-1およびslim1-2突然変異体の硫黄欠乏応答欠損の表現型を相補することを確認した。slim1-1およびslim1-2突然変異体におけるGFPの-S誘導はSLIM1の過剰発現で回復した（図２Ａ）。根の長さが３０％減少したことからもわかる様に、slim1-1およびslim1-2突然変異体の成長は低硫黄条件で阻害される（図２、ＢおよびＣ）。この成長阻害についてもSLIM1の過剰発現で回復した（図２、ＢおよびＣ）。
【００６０】
シロイヌナズナゲノム中には６個のEIN3/EILファミリー遺伝子(EIN3およびEIL1〜5)が存在する（図４および図５、参考文献２２）。EIN3はエチレン応答性遺伝子の発現を制御する植物に特有の転写因子である（参考文献２２、２３、２５）。EIN3に対して最も相同性が高いEIL1およびEIL2は、ein3突然変異体を相補することが可能で、特にEIN3とEIL1については機能的重複性が遺伝学的にも証明されている（参考文献２３、２６）。一方、EIL3(SLIM1)、EIL4およびEIL5の機能は実証されていない（参考文献２２）。硫黄応答について、SLIM1様の機能を他のEIN3/EILファミリータンパク質が有しているかどうかを評価するため、シロイヌナズナ由来の他のEIN3/EILファミリータンパク質(EIN3、EIL2、EIL4およびEIL5)をslim1突然変異体で過剰発現した。しかしながら、slim1バックグラウンド中ではそれらのいずれもがPSULTR1;2硫黄インディケーターの-S誘導を回復し得なかった（図２Ｄ）。EIN3/EILファミリータンパク質の配列から分子系統樹を作製すると、イネ由来のOs08g39830(OsSLIM1;1)およびOs09g31400(OsSLM1;2)がSLIM1相同タンパク質としてグループ化され、これらのタンパク質はEIN3グループメンバーとは独立したグループを構成していることがわかった（図４）。シロイヌナズナのSILM1と同様に、イネのOsSLIM1;1およびOsSLIM1;2はslim1-1およびslim1-2突然変異体の硫黄欠乏応答欠損の表現型を回復することが可能であった（図２Ｄ）。この結果から、EIN3/EILファミリー中では、SLIM1タンパク質のみが植物の硫黄応答性に重要な役割を果たすことがわかった。また、SLIM1の相同タンパク質が種を超えて硫黄欠乏応答を制御する機能を有することが明らかとなった。
【００６１】
EIL3のDNA結合ドメインIIIおよびIVを含むSer162〜Gln288領域とエチレン応答因子のDNA結合配列であるAYGWAYCT（参考文献２７）が相互作用し得ることが、最近の研究で報告されている（参考文献２４）。本発明者は、図７及び図８に分類される硫黄応答性遺伝子セットの上流域におけるこの結合配列の有無を探索した。AYGWAYCT配列は-S誘導性SLIM1依存性遺伝子中に最も頻繁に見られ（図９、クラスＡ）、その出現率は-S抑制性SLIM1依存性遺伝子（クラスＣ）中よりもかなり高かった。この結合配列はクラスＡ遺伝子の10個の上流域中に見いだされたが（図１０）、SULTR1;2およびSULTR1;1上流域中には存在しなかった。この結果から、SLIM1が転写活性化因子として機能し、その役割は-S誘導に限られることが示唆される。しかしながら、SLIM1の下流で働く何らかの因子により、これらの硫酸イオントランスポーター、およびSLIM1依存性を示す他の遺伝子の発現変化が制御される可能性が示唆される。
【００６２】
SLIM1発現の組織分布を決定するため、SLIM1プロモーターの制御下にGFPを発現するトランスジェニックシロイヌナズナ(PSLIM1-GFP)を作製した。GFPの発現は主に根の維管束組織中で認められ（図３Ａ）、根においては特に内鞘および木部柔組織中で発現していた（図３Ｂ）。SLIM1の転写因子としての機能から期待される様に、GFP-SLIM1融合タンパク質は核に局在した（図３Ｃ）。また、GFPの蛍光強度は硫黄条件の変化に影響されず（参考文献２８）、SLIM1 mRNAのレベルも-Sにより調節されなかった（図６）。SLIM1が維管束組織に局在していることから、少なくともSLIM1が媒介する遺伝子発現制御では、SULTR1;2硫酸イオントランスポーターが存在し且つ土壌環境と直接接触している根の表面でなく、植物の中心部分における硫黄状態がまず検知されることが示唆された（参考文献８）。このことは、SULTR1;2のプロモーター領域上に推定SLIM1結合配列が存在しないこととも符合するが（図１０）、SLIM1が維管束で直接制御する標的遺伝子、すなわち維管束から表皮へ-Sシグナルを伝達すると推定される下流のシグナル伝達因子の同定には、さらなる研究が必要である。
【００６３】
SLIM1が硫黄の同化・代謝を制御することを、代謝物の測定を行うことにより明らかにした。親植物及びslim1 変異体をS15条件(15 μM硫酸イオン)またはS1500条件(1500 μM硫酸イオン)で生育させ、植物中の硫酸イオン、システイン、グルタチオン、メチオニン及びo-アセチルセリン量を測定した(図１３)。最も顕著な差は、地上部におけるo-アセチルセリンとグルタチオン量について認められた。すなわち、S15条件で生育したslim1 変異体では、親植物と比較し、o-アセチルセリンが過剰に蓄積し、グルタチオン量が著しく減少していた (図１３)。同様にS15条件では、slim1 変異による硫酸イオンの減少が地上部において、硫酸イオンの増加が地下部において認められた。また、S15条件で生育したslim1 変異体の地上部では、システイン量が減少し、メチオニン量が増加していた。
【００６４】
硫黄二次代謝系に対するSLIM1の影響を、グルコシノレート量を測定することにより解析した (図１４)。マスクロマトグラムで示すように、親植物においては、硫黄欠乏によってメチルスルフィニルアルキルグルコシノレート量が著しく減少する(図１４A)。これに対してslim1 変異体では、これらメチオニン由来のグルコシノレート量がS15条件においても蓄積していた(図１４A)。この傾向は根においても同様であった (図１４B)。 メチルチオアルキルグルコシノレート量もメチルスルフィニルアルキルグルコシノレートと同様、親植物においてはS15条件で著しく減少するが、slim1 変異体においては減少の度合いが緩和されていた (図１４B, MTX)。インドールグルコシノレート量も、根においてはメチオニン由来のグルコシノレートと同様のSLIM1依存性を示した (図１４B)。
【００６５】
〔図の説明〕
図１：slim1変異体では植物の硫黄欠乏応答が低下する。（Ａ）PSULTR1;2-GFP、slim1-1およびslim1-2植物を、1500、300、100または30μMの硫酸イオン(S1500、S300、S100およびS30)を添加した、または硫酸イオンを加えないS0寒天培地(S0)上で11日間生育させた。S0培地は寒天由来の約10μMの残存硫酸塩を含む。左側：「材料と方法」の欄に記載されたイメージアナライザーを用い、GFPの蛍光を488nmのレーザーによる励起で視覚化した（上のパネル）。明視野イメージを蛍光イメージの下に示す（下のパネル）。プレートはそれぞれ16個体の植物を含む。右側：左のパネル上に示される植物根中のSULTR1;2およびGFPのmRNA含有量。ユビキチンを内部標準としてmRNA含有量を計算した。（Ｂ）slim1突然変異体の遺伝子発現プロファイル。植物を1500μM（S1500）または15μM(S15)硫酸塩寒天培地上で垂直に10日間生育させ、根のRNA試料をAffymetrix ATH-1 GeneChipアレーの解析に用いた。それぞれの条件について２回実験を行った。上のパネル、左から右へ向かって：親株中の-S誘導性遺伝子（109遺伝子）、-S誘導性SLIM1依存性遺伝子（クラスＡ、44遺伝子）、および-S誘導性SLIM1非依存性遺伝子（クラスＢ、3遺伝子）。下のパネル、左から右へ向かって：親株中の-S抑制性遺伝子（101遺伝子）、-S抑制性SLIM1依存性遺伝子（クラスＣ、12遺伝子）、および-S抑制性SLIM1非依存性遺伝子（クラスＤ、16遺伝子）。「材料と方法」の欄に記載に従って遺伝子を分類した。アレー要素の注釈は図７及び図８に記載した。
【００６６】
図２：slim1表現型のSLIM1過剰発現による相補。（Ａ）SULTR1;2発現の-Sによる誘導がCaMV 35SプロモーターによるSLIM1の過剰発現により回復した。PSULTR1;2-GFP、slim1-1、P35S-SLIM1/slim1-1、slim1-2およびP35S-SLIM1/slim1-2植物を、1500μM(S1500)または15μM(S15)を添加した、または硫酸塩を加えない(S0)S0寒天培地上で11日間生育させた。イメージアナライザーを用いてGFPの蛍光を視覚化した。右に植物体の写真を示す。（Ｂ）および（Ｃ）では、S0寒天培地上で植物を垂直に11日間生育した。slim1-1およびslim1-2の根の伸長は、SLIM1過剰発現により回復した。（Ｂ）植物の明視野像。星印は根の先端の位置を示す。（Ｃ）植物の根の長さ(n=25〜30)。星印は各バックグラウンドに対するslim1突然変異体とSLIM1過剰発現株との間に統計的に有意な差が存在することを示す。過剰発現株２、５および８に対するバックグラウンドはslim1-1、過剰発現株株１および６に対するバックグラウンドはslim1-2である。（Ｄ）SLIM1およびEIN3/EILファミリータンパク質は機能重複性を持たない。GFP蛍光の-S誘導はシロイヌナズナ SLIM1、およびそのイネ相同タンパク質であるOsSLIM1;1およびOsSLIM1;2のCaMV35Sプロモーターによる過剰発現により回復したが、EIN3および他のEILファミリーメンバーでは回復しなかった。７日齢トランスジェニック植物をS0またはS1500寒天培地に移し、移植後4日目にGFP蛍光を検出した。各カラムは各突然変異体バックグラウンドでの１個体のトランスジェニック株のGFP蛍光の定量値を示す。
【００６７】
図３：SLIM1の組織および細胞分布。（Ａ）および（Ｂ）では、PSLIM1-GFP植物を硫黄充分条件(1500μM)下で6日間生育した。（Ａ）全体像、バー=1cm、（Ｂ）根の縦軸方向の像、バー=50μm、ep:表皮、c:皮層、en:内皮、p:内鞘、x:木部。（Ｃ）GFP-SLIM1融合タンパク質のP35S-GFP-SLIM1植物における核局在化。バー=100μm。（Ｄ）Ｃパネルの対照としてのP35S-GFP植物の根の組織。バー=100μm
【００６８】
図４：SLIM1およびEIN3/EILファミリータンパク質の系統関係。
シロイヌナズナおよびイネゲノム上、およびデータベースに登録された他の植物タンパク質からSLIM1およびEIN3の相同タンパク質を検索するため、The Arabidopsis Information Resources(TAIR)(hhtp://www.arabidopsis.org/Blast/)、The Institute for Genomic Research (TIGR) (http://tigrblast.tigr.org/euk-blast/index.cgi?project=osal)、およびNational Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)でBLASTPプログラムを使用した。タンパク質の配列をデータベースからダウンロードし、DNA Data Bank of Japan(DDBJ)(http://www.ddbj.nig.ac.jp./search/clustalw-j.html)のClustalWプログラムを用いて整列した。整列情報を基にTreeViewプログラム（http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html)を用いて無根系統樹を作成した。AtおよびOsで始まるシロイヌナズナおよびイネ遺伝子それぞれの遺伝子座番号はTAIRおよびTIGRデータベース由来である。残りのメンバーは、植物種の名前とタンパク質配列のAccession No.で示した。
【００６９】
図５：シロイヌナズナ中のSLIM1およびEIN3/EILファミリータンパク質。
図４に記す様に整列を行った。予想されるDNA結合ドメイン(BDI〜BDV)に下線が引かれている。アミノ酸残基、及びこれらと類似性を有するアミノ酸残基の背景を灰色にしている。各slim1変異体において変異が検出されたアミノ酸残基（Gly115、Glu131、Val242、Ala269）の上に変異体名（slim1-1, slim1-2, slim1-3, slim1-4）及び変異によるアミノ酸置換を示す。
【００７０】
図６：SLIM1およびEIN3ファミリー遺伝子の転写レベル。
（Ａ）PSULTR1;2-GPF、slim1-1およびslim1-2植物中のSLIM1転写レベル:S1500またはS0寒天培地上で11日間、植物を垂直に生育した。根の試料中のSLIM1 mRNAをリアルタイムRT-PCRで検出し、ユビキチンを内部標準として用いてmRNAの相対含有量を計算した。（Ｂ）SLIM1およびEIN3/EILファミリー遺伝子の転写レベル：標準化したシグナル値およびGeneChipデータ由来の判定フラグ(absolute call flag)を示した。S15/S1500およびS1500/S15比の平均と標準誤差を図７及び図８に記すものと同じフォーマットで示した。
【００７１】
図１３：slim1 変異体における硫酸イオン及び硫黄一次代謝物の蓄積。
S15条件(15 μM硫酸イオン)またはS1500条件(1500 μM硫酸イオン)で10日間生育させた植物を用いて代謝物を測定した。3回の繰り返し実験による平均値と標準誤差を示す。slim1 変異体と親植物の間に有意な差があるものにアスタリスクを付した(P <0.05)。
【００７２】
図１４：slim1 変異体におけるグルコシノレートの蓄積。
（Ａ）液体クロマトグラフィー-マススペクトロメトリーで測定したメチルスルフィニルアルキルグルコシノレートの分離パターン。図はslim1 変異体と親植物の地上部における結果を示す。植物はS15条件(15 μM硫酸イオン)またはS1500条件(1500 μM硫酸イオン)で10日間生育させた。各メチルスルフィニルアルキルグルコシノレートの[M-H]- イオンのマスクロマトグラム｛4-メチルスルフィニルブチルグルコシノレート(4MSOB; mass-to-charge ratio [m/z]=436)、5-メチルスルフィニルペンチルグルコシノレート(5MSOP; m/z = 450)、6-メチルスルフィニルヘキシルグルコシノレート(6MSOH; m/z = 464)、7-メチルスルフィニルヘプチルグルコシノレート(7MSOH; m/z = 478)、8-メチルスルフィニルオクチルグルコシノレート(8MSOO; m/z = 492)｝を重ね合わせて表示した。4MSOB、5MSOP、6MSOH、7MSOH、8MSOOのピーク位置を赤矢印で示した。
【００７３】
（Ｂ）slim1 変異体におけるメチルスルフィニルアルキルグルコシノレート（MSOX）、メチルスルチオアルキルグルコシノレート（MTX）、トリプトファン由来インドールグルコシノレートの蓄積。植物の生育条件は（Ａ）に同じ。3回の繰り返し実験による平均値と標準誤差を示す。slim1 変異体と親植物の間に有意な差があるものには、各グルコシノレート毎にカラムの右側にアスタリスクを付した(P <0.05)。I3M,インドール-3-イルメチルグルコシノレート; 1MI, 1-メトキシインドール-3-イルメチルグルコシノレート; 4MSOB, 4-メチルスルフィニルブチルグルコシノレート;  5MSOP, 5-メチルスルフィニルペンチルグルコシノレート; 6MSOH, 6-メチルスルフィニルヘキシルグルコシノレート; 7MSOH, 7-メチルスルフィニルヘプチルグルコシノレート; 8MSOO, 8-メチルスルフィニルオクチルグルコシノレート; 4MTB, 4-メチルチオブチルグルコシノレート; 5MTP, 5-メチルチオペンチルグルコシノレート; 6MTH, 6-メチルチオヘキシルグルコシノレート; 7MTH, 7-メチルチオヘプチルグルコシノレート; 8MTO, 8-メチルチオオクチルグルコシノレート。
【００７４】
〔参考文献〕
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【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】slim1変異体の硫黄欠乏応答に関する実験結果を示す図。
【図２】SLIM1を過剰発現させたslim1変異体の硫黄欠乏応答に関する実験結果を示す図。
【図３】SLIM1の組織及び細胞における分布状況を示す図。
【図４】SLIM1及びEIN3/EILファミリータンパク質の系統関係を示す図。
【図５】シロイヌナズナSLIM1及びEIN3/EILファミリータンパク質のアミノ酸配列を整列させた図。
【図６】SLIM1及びEIN3Lファミリー遺伝子の転写レベルを示す図。
【図７】硫黄栄養とSLIM1によって制御される遺伝子を示す図（１）。
【図８】硫黄栄養とSLIM1によって制御される遺伝子を示す図（２）。
【図９】クラスA〜D遺伝子群の上流域におけるSLIM1結合配列の存在頻度を示す図。
【図１０】上流域にSLIM1結合配列が存在するクラスA遺伝子を示す図。
【図１１】SLIM1の位置同定のための分子マーカーを示す図。
【図１２】SLIM1遺伝子導入植物の作製のために使用したプライマーの配列を示す図。
【図１３】slim1 変異体における硫酸イオン及び硫黄一次代謝物の蓄積量を示す図。
【図１４】slim1 変異体におけるグルコシノレートの蓄積を示す図。
【図９】
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【図１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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