(57)【要約】【課題】  活性酸素産生酵素産生発現抑制剤を提供する。【解決手段】  ブラシニンを含有する活性酸素産生酵素発現抑制剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブラシニン及びその類縁体を含有する活性酸素産生酵素発現抑制剤。
【請求項２】
活性酸素を産生する酵素が、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ又はキサンチンオキシダーゼである請求項１記載の活性酸素産生酵素発現抑制剤。
【請求項３】
ブラシニン及びその類縁体を含有する抗酸化剤。
【請求項４】
ブラシニン及びその類縁体を含有する活性酸素の過剰産生によって誘発又は助長される症状若しくは疾患の予防、改善又は治療剤。
【請求項５】
ブラシニン及びその類縁体を含有する、活性酸素産生酵素発現抑制作用を呈するものであることを特徴とし、生活習慣病の予防又は改善のために用いる旨の表示を付した飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性酸素産生酵素の発現抑制剤を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
日々の生活のなかでは、体内でスーパーオキシドアニオンラジカル、ヒドロキシラジカルのラジカルや過酸化水素、一重項酸素等といった活性酸素種が産生されている。活性酸素は細胞内ではミトコンドリアによる酸化的エネルギー代謝や、薬物代謝等に伴って産生される。一方、白血球、中でも好中球による活性酸素の産生量は生体内で最も大きく、活性酸素は殺菌や異物除去等免疫応答に利用されることが知られている。活性酸素はその性質上、反応性に富み、極めて短時間で他者を酸化して自らは消失する。過剰生産されると酸化による害作用を及ぼすことが知られており、生体は過剰な活性酸素を消去する酵素や生理活性物質を生産することによってこのリスクを回避している。
【０００３】
一方で、活性酸素は、ストレス、紫外線、喫煙、食品添加物、飲酒、激しい運動等によって体内で過剰生産されやすく、さらに個人差や老化により過剰な活性酸素の消去能力が不十分になりやすい。そうなると、反応性に富んだ活性酸素は、細胞膜に含まれる脂質、たとえば酸化されやすい不飽和脂肪酸と反応して過酸化脂質を形成する。過酸化脂質の生成により細胞膜の損傷が進行し、さらに細胞膜を構成する蛋白質を過酸化により変性させ、組織・器官の構造・機能の傷害を惹起する。特に血管は生体外からの影響を受ける機会の多い臓器であるうえに、栄養成分や代謝産物等、生命活動に必須の物質を各器官に搬送して常に物理的化学的刺激を受けている。異物排除の目的で白血球が産生する活性酸素種や、血管を介して転送される生理活性物質に応答して血管内皮等が産生する活性酸素種に暴露される頻度も高い。以上より血管壁には損傷が生じやすく、ひいては血栓形成にいたる危険性を増加させる。
【０００４】
このようなことから、体内で産生された過剰な活性酸素は、悪性腫瘍、心筋梗塞、脳梗塞、糖尿病、アレルギー症状等の生活習慣病のリスクを高め、その進行を早めるものと報告されており（非特許文献１）、食品や医薬品の分野では活性酸素過剰産生によって誘発又は助長される症状及び疾患の予防や治療のために活性酸素の産生抑制剤に関する研究開発が進められている。
【０００５】
活性酸素の産生を抑制する物質としては、フリーラジカルを産生する酵素（例えば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ(NAD(P)H oxidase)、キサンチンオキシダーゼ(Xanthine oxidase)等）を阻害する酵素阻害剤やこれら酵素の発現を抑制する物質が挙げられ、研究も進められている。例えば、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの発現抑制物質として６−シアノ−５−メトキシカルボニル−２−メチル−４−（３−ニトロフェニル）−１，４−ジヒドロピリジン−３−カルボン酸のイソプロピルエステル化合物が知られている（特許文献１）。また、キサンチンオキシダーゼ阻害物質として、ケルセチンおよびその配糖体（特許文献２）が知られている。
【０００６】
一方、ブラシニン及びブラシニンの類縁体は、白菜、キャベツ、ナタネ、からし菜、ブロッコリ、カリフラワー、ケール、コールラビ、はつかだいこん、ターニップ（かぶ）、ルタバガ（カブハボタン）等のアブラナ科植物が産生するインドール誘導体であり、微生物の侵入等のストレスに対抗するためのフィトアレキシンとして知られている（非特許文献２）。ブラシニンの作用として、抗菌作用（非特許文献３）及び抗癌作用（非特許文献４）が知られているが、活性酸素の産生を抑制することは全く知られていない。
【特許文献１】特開２００５−２３２０５９号公報
【特許文献２】特開２００３−１７１２８３号公報
【非特許文献１】板倉弘重、栄養−評価と治療，Vol.19,N0.3,p293-298、2002
【非特許文献２】Soledade C. Pedras, Sabine Montaut et al、J. Org. Chem. Vol. 69, No. 2１, p4471-4476、2004
【非特許文献３】Mitsuo Takasugi, Nobukatsu Katsui and Akira Shirata、J. Chem. Soc.Chem. Commun., 1986, p1077-1078
【非特許文献４】Rajendra G. Metha, et al., Carcinogenesis, Vol.16, No.2, 1995, Feb, p399-404
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、体内の過剰な活性酸素を抑制することができる活性酸素産生酵素発現抑制剤及び抗酸化剤等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、活性酸素の産生酵素発現抑制物質の探索を行ったところ、ブラシニン及びその類縁体に優れた活性酸素産生酵素の発現抑制作用があることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、ブラシニン及びその類縁体を含有する活性酸素産生酵素発現抑制剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、体内の活性酸素の過剰な産生を抑制することができるので、生活習慣病をはじめ、活性酸素の過剰産生によって誘発又は助長される症状若しくは疾患の予防、改善又は治療に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明において、ブラシニン（brassinin、3-S-methyldihiocarbamoyl aminomethyl indole）及びその類縁体とは、下記に示される、白菜、キャベツ、ナタネ、からし菜、ブロッコリ、カリフラワー、ケール、コールラビ、はつかだいこん、ターニップ（かぶ）、ルタバガ（カブハボタン）等のアブラナ科植物が産生するインドール誘導体である。具体的には、ブラシニン（化合物１）、１−メトキシブラシニン（1- methoxybrassinin、 化合物２）、４−メトキシブラシニン（4-methoxybrassinin、化合物３）、ブラシチン（brassitin、化合物４）、４−メトキシジヒドロシクロブラシニン（４−methoxydehydrocyclobrassinin、化合物５）、イサレキシン（isalexin、化合物６）、ブラシカネイトＡ（brassicanate A、化合物７）、ルタレキシン（rutalexin、化合物８）、シクロブラシノン（cyclobrassinone、化合物９）、スピロブラシニン（spirobrassinin、化合物１０）、ブラシカナールＡ（brassicanal A、化合物１１）、ブラシレキシン（burassilexin、化合物１２）等が挙げられ、より好ましくはブラシニンである。
【００１２】
【化１】
2007320859.tif 000002
【００１３】
斯かるブラシニン及びその類縁体は、当該ブラシニン及びその類縁体を含有する天然物やカルス等から公知の抽出方法により得ることができる（非特許文献２、３及び４）。若しくは、ブラシニン及びその類縁体が結合した配糖体、これらの配糖体等の誘導体や前駆体を含有する天然物やカルス等から公知の抽出方法等により得た後、公知の有機化学合成法にてブラシニン及びその類縁体を得てもよい。
ブラシニン及びその類縁体、若しくはこれらの配糖体等の誘導体や前駆体を含有する天然物若しくはカルスとしては、例えば、アブラナ科植物、具体的には白菜やキャベツ白菜、キャベツ、ナタネ、からし菜、ブロッコリ、カリフラワー、ケール、コールラビ、はつかだいこん、ターニップ（かぶ）、ルタバガ（カブハボタン）等が挙げられる。
また、ブラシニン及びその類縁体は、公知の有機化学合成法（非特許文献２及び４）により得ることもできる。
【００１４】
さらに得られた合成物や抽出物を公知の分離精製方法を適宜組み合わせてブラシニン及びその類縁体の純度を高めてもよい。
上記合成や抽出により得られるブラシニン及びその類縁体は、単数又は複数工程の分離精製等により医薬品上又は食品上許容し得る規格に適合し、本発明の効果を発揮するものであれば、粗精製物であってもよい。
具体的には、抽出としては、水、熱水、アルコール水等の水及び／又は有機溶剤等の極性及び非極性溶剤を用いて行うことが挙げられる。また、分離精製としては、有機溶剤沈殿、遠心分離、限界濾過膜、高速液体クロマトグラフやカラムクロマトグラフ等を用いて行うことが挙げられる。
【００１５】
本発明における活性酸素産生酵素とは、生体内において発生する活性酸素を産生する酵素を意味し、例えば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ（NAD(P)H oxidase）、キサンチンオキシダーゼ（Xanthine oxidase）、リポオキシゲナーゼ（Lipooxygenase）及びシクロオキシゲナーゼ（Cyclooxgenase）等が挙げられ、より好ましくは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ及びキサンチンオキシダーゼである。
本発明における抗酸化とは、活性酸素の過剰産生による細胞・組織傷害を減弱することをいう。
【００１６】
ここで、活性酸素とは、スーパーオキシドアニオンラジカルやヒドロキシラジカル等のラジカル、過酸化水素、一重項酸素、一酸化窒素、二酸化窒素、オゾン、過酸化脂質（ＬＯＯＨ又はＬＯＯ・のラジカル等）、ハロゲン化酸素等が挙げられ、好ましくはラジカルであり、より好ましくはスーパーオキシドアニオンラジカル、ヒドロキシラジカル又は過酸化脂質のラジカルであり、特に好ましくはスーパーオキシドアニオンラジカルである。
また、本発明において、活性酸素の過剰産生の原因としては、ストレス、紫外線、喫煙、食品添加物、飲酒、激しい運動等が挙げられる。
【００１７】
後記実施例で示すとおり、ブラシニンは、活性酸素産生酵素の発現を抑制することができる。従って、ブラシニン及びその類縁体は、これを有効成分とする活性酸素産生酵素発現抑制剤や抗酸化剤及び活性酸素の過剰産生によって誘発又は助長される症状若しくは疾患の予防、改善又は治療剤（以下、活性酸素産生酵素発現抑制剤等とする。）として使用することができ、さらに、活性酸素産生酵素発現抑制剤等を製造するために使用することもできる。また、活性酸素産生酵素発現抑制剤等は、当該症状若しくは疾患を予防、改善又は治療するための飲料・食品、化粧品、医薬部外品、医薬品等として使用可能である。そして、ブラシニン及びその類縁体は、生活習慣病の予防、治療や改善を促進する生理機能をコンセプトとして、生体内の活性酸素産生酵素発現抑制作用を呈し、生活習慣病や老化の改善や予防のために用いる旨の表示を付した飲食品又は化粧品、例えば病者用食品、特定保健用食品等の特別用途飲食品として利用することができる。
【００１８】
活性酸素の過剰産生によって誘発又は助長される疾患としては、例えば、循環器疾患、脳神経系疾患、消化器系疾患、腎疾患、呼吸器疾患、代謝・内分泌疾患、アレルギー疾患、眼疾患、老化・老人性疾患等が挙げられる（非特許文献１）。
ここで、循環器疾患としては、動脈硬化症、虚血性心疾患（不整脈、狭心症、心筋梗塞）、高血圧、脳血管疾患（脳梗塞、脳出血）が挙げられる。脳神経系疾患としては、パーキンソン病、アルツハイマー病、能萎縮性側索硬化症状、外傷性てんかん、老人性痴呆が挙げられる。消化器疾患としては、胃炎、胃潰瘍、小腸炎、潰瘍性大腸炎、過敏性大腸炎、クローン病、薬剤性大腸炎、膀胱炎、肝炎、胆嚢炎が挙げられる。腎疾患は、糸球体腎炎、糖尿病性腎炎、腎不全、薬剤性腎障害が挙げられる。呼吸器疾患としては、気管支喘息、薬剤性肺臓炎、閉塞性肺疾患が挙げられる。代謝・内分泌疾患は、糖尿病、高脂血症、更年期障害が挙げられる。アレルギー疾患としては、慢性間接リュウマチ、全身性エリテマトーデスである。眼疾患としては、白内障、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症が挙げられる。老化・老人性疾患としては、皮膚老化、しみ、そばかすが挙げられる。より好ましくは心血管系障害の循環器疾患や代謝・内分泌疾患であり、特に好ましくは動脈硬化症、虚血性心疾患（不整脈、狭心症、心筋梗塞）、高血圧、脳血管疾患（脳梗塞、脳出血）、糖尿病、高脂血症、アルツハイマー病である。
このうち、循環器系疾患、悪性腫瘍、消化器疾患、代謝・内分泌系疾患は、ストレス、喫煙、飲食、飲酒、激しい運動等と深く関連することから生活習慣病とも言われており、本発明の活性酸素産生酵素発現抑制剤等は当該疾患又はこれらから併発する症状の予防、改善、治療に特に有効である。
【００１９】
本発明の活性酸素産生酵素発現抑制剤等を飲料・食品として使用する場合、例えば、果汁飲料、炭酸飲料、茶系飲料、乳飲料、アルコール飲料、清涼飲料等の飲料、ゼリー状食品や各種スナック類、焼き菓子、ケーキ類、チョコレート、ガム、飴、スープ類等、あらゆる飲料・食品形態とすることができる。
【００２０】
また、本発明の活性酸素産生酵素発現抑制剤等は、医薬品として使用する場合、例えば、錠剤、顆粒剤等の経口用固形成形剤、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤として利用することができる。また、軟膏等の薬用皮膚外用剤や化粧用皮膚外用剤の形態、具体的には、乳化化粧料、クリーム、乳液、ローション、ジェル等の種々の形態で用いることができる。
【００２１】
斯かるブラシニン及びその類縁体を含有する活性酸素産生酵素発現抑制剤等は、それぞれ一般的な製造法により、直接又は製剤上許容し得る担体とともに混合、分散した後、所望の形態に加工することによって得ることができる。この場合、本発明に用いられるブラシニン及びその類縁体の他に、かかる形態に一般的に用いられる植物油、動物油等の油性基剤、鎮痛消炎剤、鎮痛剤、殺菌消毒剤、収斂剤、皮膚軟化剤、ホルモン剤、ビタミン類、保湿剤、紫外線吸収剤、アルコール類、キレート剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、増粘剤、色素、香料等を本発明の効果を妨害しない範囲で適宜配合することができる。
【００２２】
本発明の上記製剤におけるブラシン及びその類縁体の総配合量は、乾燥物として通常全組成の０．００００１〜２０質量％、特に０．００００２〜５質量％が好ましい。
【実施例】
【００２３】
実施例１：ブラシニンの活性酸素産生抑制効果
動物はＳＤラット（１０〜１２週齢、雄）を使用した。セボフレン麻酔下で、頚静脈より採血を行い、１ｍＬの１０μＭ ブラシニンＰＢＳ溶液もしくはコントロール溶液（ＰＢＳ）を１ｍＬの血液に添加し、血球分離用試薬に重層して遠心分離した後、白血球画分を回収した。回収した白血球に再び１ｍＬの１０μＭ ブラシニンＰＢＳ溶液又はコントロール溶液（ＰＢＳ）を加え、室温で１時間反応させた後、蛍光試薬５，６−ＣＭ−Ｈ2ＤＣＦＤＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１０μＭを添加し、室温で２０分反応させた。さらに固定試薬（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ）を１０％（v/v）添加し室温で２０分反応させた後、白血球内の活性酸素量をフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて測定した。
【００２４】
図１に示すようにブラシニン添加群はコントロール群に比べて白血球が産生する活性酸素産生量が３５％有意に低下した。
従って、ブラシニンは、体内で産生される活性酸素を抑制することができ、抗酸化作用を有していると考えられる。
【００２５】
実施例２：ブラシニンのＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ及びキサンチンオキシダーゼ発現抑制効果
白血球のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ遺伝子発現量は、ＴａｑＭａｎプローブを用いた定量的ＰＣＲ法によって測定した。
実施例１で得られたブラシニン添加群とコントロール群の白血球より、発現ｍＲＮＡを精製してこれを鋳型に逆転写ＰＣＲを行い、ｃＤＮＡを作成した。このｃＤＮＡを用いて定量的ＰＣＲを行った。
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼのサブユニットであるｇｐ９１ｐｈｏｘ及びｐ４７ｐｈｏｘのそれぞれに特異的なプライマーとＴａｑＭａｎプローブ（アプライドバイオシステムズ）を用いそれぞれの発現量を測定した。発現量はＧＡＰＤＨの発現量で補正し、コントロール群を１００％とした時の相対値で表した。
また、キサンチンオキシダーゼについてもＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼのサブユニットに代えて同様の方法で行った。
【００２６】
図２に示すように、ブラシニン添加群はコントロール群に比べて、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼのｇｐ９１ｐｈｏｘ及びｐ４７ｐｈｏｘの発現ｍＲＮＡ量並びにキサンチンオキシダーゼの発現ｍＲＮＡ量がそれぞれ４４％、５３％及び６５％有意に低下した。
従って、ブラシニンが活性酸素（ＮＡＤＰＨオキシダーゼ及びキサンチンオキシダーゼ）の産生発現を抑制することができる。このことは、すなわち、体内で産生されるスーパーオキシドアニオンラジカルの産生を抑制することができ、さらにこれを起点に生ずる一連の活性酸素種の産生を抑制することができることが考えられる。
また、サブユニットであるｇｐ９１ｐｈｏｘ及びｐ４７ｐｈｏｘを抑制することから、双方を構成分子とするＮＡＤ（Ｐ）Ｈの機能についても産生を抑制することできることが考えられる。
【００２７】
配合例
（１）コーヒー飲料
ブラシニン及びその類縁体      ０．００００２  質量％
コーヒー豆                    ５．５          質量％
牛乳                          ７．０          質量％
砂糖                          ６．０          質量％
香料                          若干量
重曹                      （ｐＨ６．５に調整）
水                            残分
（２）果汁飲料
ブラシニン及びその類縁体      ０．０００２  質量％
野菜汁                        ４０          質量％
（にんじん、レモン、パセリ、ブロッコリの単独又は混合物）
果汁                          ４０          質量％
（りんご、みかん、バレンシアオレンジの単独又は混合物）
酸味料                        適量
香料                          適量
ビタミンＣ                    適量
（３）キャンデー
ブラシニン及びその類縁体    ０．００２  質量％
ショ糖エステル（乳化剤）    ０．２      質量％
水飴                      ３５          質量％
砂糖                      ３５          質量％
小麦粉                      ５          質量％
練乳                      １７          質量％
ミルク                      ６          質量％
バター                      ２          質量％
香料                      適量
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ＳＤラットにおける、コントロールを１００％としたときの、ブラシニンの白血球中の活性酸素の産生量を示す。
【図２】コントロールを１００％としたときの活性酸素産生酵素のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ（ｇｐ９１ｐｈｏｘ及びｐ４７ｐｈｏｘ）及びキサンチンオキシダーゼのｃＤＮＡ発現量を示す。
【図１】
2007320859.tif 000003
【図２】
2007320859.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成19年6月18日(2007.6.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブラシニン及び／又はその類縁体を含有する活性酸素産生酵素発現抑制剤。
【請求項２】
活性酸素を産生する酵素が、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ又はキサンチンオキシダーゼである請求項１記載の活性酸素産生酵素発現抑制剤。
【請求項３】
ブラシニン及び／又はその類縁体を含有する抗酸化剤。
【請求項４】
ブラシニン及び／又はその類縁体を含有する活性酸素の過剰産生によって誘発又は助長される症状若しくは疾患の予防、改善又は治療剤。
【請求項５】
ブラシニン及び／又はその類縁体を含有する、活性酸素産生酵素発現抑制作用を呈するものであることを特徴とし、生活習慣病の予防又は改善のために用いる旨の表示を付した飲食品。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
すなわち、本発明は、ブラシニン及び／又はその類縁体を含有する活性酸素産生酵素発現抑制剤、抗酸化剤等を提供するものである。