(57)【要約】【課題】  二本鎖核酸に結合するインターカレーターの蛍光強度を増幅することにより、検出感度の向上を達成できる技術を提供する。【解決手段】  二本鎖核酸の相補鎖部位に結合するインターカレーターからの蛍光強度を測定することによって、反応場に存在する相補鎖核酸を検出する方法において、前記反応場へ所定のタンパク質を加えることによって、前記相補鎖核酸に対するインターカレーターの結合量を増加させて検出感度を増強する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖核酸の相補鎖部位に結合するインターカレーターからの蛍光強度を測定することによって、反応場に存在する相補鎖核酸を検出する方法において、
前記反応場へ所定のタンパク質を加えることにより、前記相補鎖核酸に対するインターカレーターの結合量を増加させて検出感度を増強する相補鎖核酸の検出方法。
【請求項２】
前記タンパク質は、前記相補鎖部位に結合する酵素であることを特徴とする請求項１記載の相補鎖核酸の検出方法。
【請求項３】
前記酵素は、二本鎖部位を分解又は切断しないヌクレアーゼであることを特徴とする請求項２記載の相補鎖核酸の検出方法。
【請求項４】
反応場で待ち受けている一本鎖核酸とサンプル中の一本鎖核酸との間のハイブリダイゼーションを進行させて相補鎖核酸を得る第１工程と、
前記相補鎖核酸が存在する反応場に所定のタンパク質を添加する第２工程と、
前記第２工程後に、インターカレーターを前記反応場に加えて、該インターカレーターを前記相補鎖核酸に結合させる第３工程と、
前記相補鎖核酸に結合したインターカレーター由来の蛍光を検出する第４工程と、
を少なくとも行うハイブリダイゼーション検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光性のインターカレーターを用いた相補鎖核酸の検出技術に関する。より詳しくは、前記検出技術における検出感度の向上に寄与する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光物質から発せられる蛍光強度を測定することによって、ハイブリダイゼーションや二本鎖核酸（二本鎖核酸断片）などを検出する技術（以下「蛍光検出技術」と称する。）が、ＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）技術などの分野で既に実用化されている。
【０００３】
前記蛍光検出技術の代表例は、人為的に蛍光標識された標的核酸を含むサンプル溶液を、塩基配列既知のプローブ核酸が固相表面に固定された状態で待ち受けている反応場へ加え、続いて、該反応場をハイブリダイゼーションが進行可能な条件とした後に所定溶液で洗浄し、前記標的核酸由来の蛍光を検出する方法である。この方法により、プローブ核酸の塩基配列と相補的な塩基配列を持つ核酸が前記サンプル溶液中に存在しているか否か、即ち特定遺伝子の発現状況を判断することができる。
【０００４】
近年、二本鎖核酸の相補鎖部位に特異的に結合して蛍光を発する「インターカレーター」と称される蛍光物質が開発され、このインターカレーターを用いるハイブリダイゼーション検出技術が提案されている。この検出技術では、蛍光標識された標的核酸を調製する必要がないなどの利点があるため、今後、前記蛍光検出技術の中の有力な技術となるものと予測される。
【０００５】
ここで、インターカレーターに係る一般的な先行技術を挙げると、まず、特許文献１、２には、インターカレーター性蛍光色素の化合物例が開示されている。特許文献３には、二本鎖ＤＮＡ濃度とインターカレーターの蛍光強度の間の相関性が開示されている。
【特許文献１】特開２００２−３２７１３０号公報。
【特許文献２】特開２００１−２８９８４８号公報。
【特許文献３】特開平１１−１６４７００号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在、上記したようなインターカレーターを用いる蛍光検出技術においては、検出感度を向上させることが重要な技術的課題となっている。特に核酸濃度が低い場合、核酸鎖の鎖長が短い場合、二本鎖がＤＮＡ-ＲＮＡである場合などでは、前記インターカレーター由来の蛍光の信号が弱くなるため、検出感度が低くなる。
【０００７】
そこで、本発明では、検出子となるインターカレーターを二本鎖の相補結合部位に効率良く結合させて蛍光強度を増幅することにより、検出感度の向上を達成できる技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明では、第一に、二本鎖核酸の相補鎖部位に結合するインターカレーターからの蛍光強度を測定することによって、反応場に存在する相補鎖核酸を検出する方法において、該反応場へ所定のタンパク質を加えることにより、前記相補鎖核酸に対するインターカレーターの結合量を増加させて検出感度を増強する相補鎖核酸の検出方法を提供する。
【０００９】
本発明では、第二に、（１）反応場で待ち受けている一本鎖核酸とサンプル中の一本鎖核酸との間のハイブリダイゼーションを進行させて相補鎖核酸を得る「第１工程」と、（２）該相補鎖核酸が存在する反応場に所定のタンパク質を添加する「第２工程」と、（３）該第２工程後に、インターカレーターを反応場に加えて、インターカレーターを前記相補鎖核酸に結合させる「第３工程」と、（４）前記相補鎖核酸に結合したインターカレーター由来の蛍光を検出する「第４工程」と、を少なくとも行うハイブリダイゼーション検出方法を提供する。
【００１０】
上記本発明において採用する「タンパク質」は、相補鎖核酸に対するインターカレーターの結合量を増加させる作用（以下「結合量増加作用」という。）を発揮するものであれば適宜採用可能であって狭く解釈されることはない。一具体例を挙げると、相補鎖部位に結合して前記作用を発揮する酵素を採用することができ、さらにその一例を挙げると、二本鎖部位（相補鎖部位）を分解又は切断しないヌクレアーゼを採用することができる。
【００１１】
ここで、本発明に関連する主たる技術用語について説明する。
【００１２】
「核酸鎖」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖がグリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステルの重合体（ヌクレオチド鎖）を意味し、プローブＤＮＡを含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチオドが重合したＤＮＡ（全長あるいはその断片）、逆転写により得られるｃＤＮＡ（ｃプローブＤＮＡ）、ＲＮＡ、ポリアミドヌクレオチド誘導体（ＰＮＡ）等を広く含む。
【００１３】
「ハイブリダイゼーション」は、相補的な塩基配列構造を備える間の相補鎖（二本鎖）形成反応を意味する。
【００１４】
「ヌクレアーゼ」は、核酸を消化分解する酵素を意味する。例えば、「エキソヌクレアーゼ（exonuclease）」は、核酸分解酵素（nuclease）の一種であり、ＤＮＡ鎖やＲＮＡ鎖などのヌクレオチド鎖の一端から３’，５’-ホスホジエステル結合を順次切断して、モノヌクレオチドを生じる酵素であり、「エンドヌクレアーゼ（endonuclease）」は、核酸分解酵素（nuclease）の一種であって、ＤＮＡ鎖やＲＮＡ鎖などのヌクレオチド鎖の内部の３’，５’-ホスホジエステル結合を切断してオリゴポリヌクレオチドを生じる酵素である。本発明では、反応場に存在する相補鎖やハイブリダイゼーションを検出ことが目的であるため、二本鎖部位を分解又は切断しないヌクレアーゼを選択的に用いる。
【００１５】
「インターカレーター」は、二本鎖核酸の相補鎖部位に結合して蛍光を発する物質であって、ハイブリダイゼーション検出に用いられる物質である。例えば、ＰＯＰＯ−１やＴＯＴＯ−３、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８などを挙げることができる。なお、相補鎖部位に対するインターカレーターの結合様式については、特に限定されない。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、ＤＮＡ-ＤＮＡ、ＤＮＡ-ＲＮＡなどの二本鎖核酸の相補鎖部位に対するインターカレーターの結合量を増加させることができ、これにより二本鎖核酸の検出感度を増強させることができる。
【００１７】
以下、本発明に係る実施例について説明する。なお、以下の実施例により本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【実施例１】
【００１８】
＜二本鎖核酸（ＤＮＡ-ＤＮＡ）における蛍光強度増強検証試験＞。
緩衝液（0.1M HEPES Buffer pH7.7 20mM MgCl2）に、２０merのｓｓＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）とその相補鎖であるｓｓＤＮＡを最終濃度が各１０ｎＭになるように添加し、９５℃にて５分加熱後、１０℃まで冷却し、二本鎖含有溶液を調製した。この二本鎖（DNA-DNA）に、１０００倍希釈となるようにEndonucleaseVを添加した後、１０℃にて３０分静置後に１万倍希釈となるようにインターカレーター（SYBRGreenI）を添加し、１０℃・１０分遮光静置後に、温度条件１０℃で蛍光強度を３回測定した。比較例として、EndonucleaseVを添加しないで得られたサンプルを調製し、蛍光強度を上記同様の手法で３回測定した。これらの測定結果を次の「表１」とそれをグラフ化した図１に示す。なお、表１中の「ＥＶ」は、EndonucleaseVを便宜上略記したものである（以下、同様）。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
前掲する「表１」や添付した図１に示された結果からわかるように、EndonucleaseV添加によって、二本鎖（ＤＮＡ−ＤＮＡ）に結合したインターカレーター（SYBRGreenI）の蛍光強度の増加率は、平均１４７％であった。即ち、EndonucleaseVの添加によって、インターカレーター（SYBRGreenI）の二本鎖ＤＮＡに対する結合量が増加し、蛍光強度が増強することを検証できた。
【実施例２】
【００２１】
＜二本鎖核酸（ＤＮＡ-ＲＮＡ）における蛍光強度増強検証試験＞。
緩衝液（0.1M HEPES Buffer pH7.7 20mM MgCl2）に、２０merのｓｓＤＮＡとその相補鎖ｓｓＲＮＡ（一本鎖ＲＮＡ）を最終濃度が各１０ｎＭになるように添加し、９０℃にて３分加熱後、１０℃まで急冷し、二本鎖含有溶液を調整した。そして、このＤＮＡ-ＲＮＡ二本鎖に１０００倍希釈となるようにEndonucleaseVを添加後、１０℃にて３０分静置後に１万倍希釈になるようにSYBRGreenIを添加し、１０℃、１０分遮光静置後に、温度条件１０℃で蛍光強度を３回測定した。比較例として、EndonucleaseVを添加しないサンプルを調製し、上記同様の測定手法で３回測定した。本実験の結果を次の「表２」とそれをグラフ化した図２に示す。
【００２２】
【表２】
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【００２３】
前掲する「表１」や添付した図１に示された結果からわかるように、EndonucleaseV添加によって、二本鎖（ＤＮＡ−ＲＮＡ）に結合したインターカレーター（SYBRGreenI）の蛍光強度の増加率は、平均２７６％であった。即ち、EndonucleaseVの添加によって、インターカレーター（SYBRGreenI）の二本鎖ＤＮＡ-ＲＮＡに対する結合量が増加し、蛍光強度が増強することを検証できた。
【実施例３】
【００２４】
＜温度上昇に伴う蛍光強度低下の緩和に関する検証実験＞。
緩衝液（0.1M HEPES Buffer pH7.7 20mM MgCl2）に、６０merのｓｓＤＮＡ（配列番号４１）とその相補鎖であるｓｓＤＮＡ（配列番号４２)を最終濃度が各１０ｎＭになるように添加し、９５℃にて５分加熱後、１０℃まで急冷し、二本鎖含有溶液を調整した。この二本鎖核酸（ＤＮＡ-ＤＮＡ）に１０００倍希釈となるようにEndonucleaseVを添加し、各温度で３０分静置後に１万倍希釈になるようにSYBRGreenIを添加し、各温度で１０分遮光静置後にその温度下で蛍光強度を２回測定した。比較例として、EndonucleaseVを添加しないサンプルをそれぞれ調製し、同様の測定法で２回測定した。これらの測定結果を以下の「表３」と図３に示す。なお、図３中の％はEndonucleaseV添加していないサンプルの蛍光値に対するEndonucleaseV添加サンプルの蛍光値の割合を示し、図３中の式は直線回帰式、図中の％はEndonucleaseV添加による蛍光値の上昇率をそれぞれ示している。
【００２５】
【表３】
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【００２６】
本実験の結果によれば、１０℃でEndonucleaseVを添加したことによる蛍光値の上昇が１２４％あったのに対し、４０℃では１６７％であった。また、EndonucleaseVを添加していない反応系の二本鎖ＤＮＡでは、温度１℃上昇につき蛍光強度は平均１．３％低下するのに対し、EndonucleaseV添加した場合は、温度１℃上昇につき蛍光強度の低下率は平均０.７％にまで抑えられた。
【００２７】
一般に、蛍光物質は、その反応溶液の温度上昇によってその蛍光強度が低下することが知られている。この蛍光物質の温度依存性は、蛍光強度測定の感度に対して影響を及ぼす。本実験の結果から、EndonucleaseV添加によって、温度上昇に伴う（蛍光物質である）インターカレーターの蛍光強度の低下の程度が緩和できることを検証できた。
【００２８】
従って、反応場における二本鎖核酸をインターカレーターを用いて検出する方法において、該反応場にEndonucleaseVを添加することによって、二本鎖核酸に対するインターカレーターの結合量を増加させて蛍光強度を増幅させることができるとともに（実施例１、実施例２参照）、反応場の温度上昇に伴う前記インターカレーターの蛍光強度低下の程度を緩和できることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明は、蛍光性のインターカレーターを用いた相補鎖核酸（二本鎖核酸）の検出するための技術、例えば、反応場におけるハイブリダイゼーションを検出する技術として利用できる。特に、これらの検出技術における検出感度の向上のための技術として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】実施例１の結果を表す図（図面代用グラフ）である。
【図２】実施例２の結果を表す図（図面代用グラフ）である。
【図３】実施例３の結果を表す図（図面代用グラフ）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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