(57)【要約】【課題】簡単に試料中の特定成分を正確に測定することができる免疫反応測定方法、免疫反応測定用セル及び免疫反応測定装置を提供する。【解決手段】被測定物質溶液と被測定物質に特異的結合可能な抗体との混合物で、溶液中の被測定物質濃度が異なる複数の混合物についての、被測定物質と抗体との結合に起因する第１の光学特性と被測定物質濃度の関係を用い、被測定物質を含み得る試料と抗体とを混合して第１の混合物を調製し；被測定物質との反応により色が変化する色素と試料とを混合して第２の混合物を調製し；第１の混合物の第１の光学特性を測定し；被測定物質と色素の反応に起因する第２の混合物の第２の光学特性を測定し；第２の光学特性に基づき、被測定物質濃度が第１の関係において第１の光学特性が極値を示すときの被測定物質濃度以下か否かを判定し；判定結果と上記関係とを用いて第１の光学特性を試料中の被測定物質濃度に換算する。【選択図】図２
2007171122.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被測定物質を含む溶液と前記被測定物質に対して特異的に結合可能な抗体との混合物であって、前記溶液中の前記被測定物質の濃度が互いに異なる複数の前記混合物についての、
前記被測定物質と前記抗体との結合に起因する第１の光学特性と、前記溶液における前記被測定物質の濃度との第１の関係を用い、
前記被測定物質を含み得る試料と前記抗体とを混合することによって第１の混合物を調製する工程（ａ）と、
前記試料と、前記被測定物質と反応することにより色が変化する色素とを混合することによって第２の混合物を調製する工程（ｂ）と、
前記第１の混合物の前記第１の光学特性を測定する工程（ｃ）と、
前記被測定物質と前記色素との反応に起因する前記第２の混合物の第２の光学特性を測定する工程（ｄ）と、
前記第２の光学特性に基づいて、前記試料中の前記被測定物質の濃度が、前記第１の関係において前記第１の光学特性が極値を示すときの前記被測定物質の濃度以下であるか否かを判定する工程（ｅ）と、
前記判定の結果に基づき、前記第１の関係を用いて、前記工程（ｃ）において測定された前記第１の光学特性を前記試料中の前記被測定物質の濃度に換算する工程（ｆ）とを含む、試料中の被測定物質の免疫反応測定方法。
【請求項２】
前記色素が、前記被測定物質の濃度が前記抗体の濃度に対して過剰な領域にあるときに、前記被測定物質との反応による色の変化が飽和する色素である請求項１記載の免疫反応測定方法。
【請求項３】
さらに、前記溶液と前記色素との混合物であって、前記溶液中の前記被測定物質の濃度が互いに異なる複数の前記混合物についての前記第２の光学特性と、前記溶液における前記被測定物質の濃度との第２の関係を用い、
前記工程（ｅ）において、前記第１の関係及び前記第２の関係において、前記第１の光学特性が極値を示すときの前記被測定物質の濃度に対応する前記第２の光学特性と、前記工程（ｄ）において測定された前記第２の光学特性とを比較することにより、
前記試料中の前記被測定物質の濃度が、前記第１の関係において前記第１の光学特性が極値を示すときの前記被測定物質の濃度以下であるか否かを判定する、請求項１または２記載の免疫反応測定方法。
【請求項４】
前記色素が、ブロモフェノールブルー、ブロモフェノールブルーの誘導体、テトラブロモスルホンフタレインおよびテトラブロモスルホンフタレインの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種である請求項１〜３のいずれかに記載の免疫反応測定方法。
【請求項５】
試料中の被測定物質の濃度を測定するための免疫反応測定用セルであって、
前記試料を保持する第１の試料保持部と、
前記試料保持部内に設けられ、前記被測定物質に対して特異的に結合可能な抗体を含む第１の試薬保持部と、
前記試料保持部に前記試料を導入するための第１の試料導入口と、
前記試料保持部に光を入射するための第１の光入射部と、
前記試料保持部から光を出射するための第１の光出射部と、
前記試料を保持する第２の試料保持部と、
前記試料保持部内に設けられ、前記被測定物質と反応することにより色が変化する色素を含む第２の試薬保持部と、
前記試料保持部に前記試料を導入するための第２の試料導入口と、
前記試料保持部に光を入射するための第２の光入射部と、
前記試料保持部から光を出射するための第２の光出射部とを備える免疫反応測定用セル。
【請求項６】
請求項５に記載の免疫反応測定用セルと連結するセル連結部と、
光源と、
光検出器と、
前記免疫反応測定用セルに前記試料を吸引するためのポンプと、
前記光検出部から得られた信号を前記被測定物質の濃度に変換するための演算部とを備える免疫反応測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の特定成分の測定を行なう免疫反応測定方法、ならびにこれに用いる免疫反応測定用セルおよび免疫反応測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、試料中の特定成分（被測定物質）を、簡易に測定する方法として、抗体を用いた様々な免疫反応測定方法が提案されている。
免疫反応測定方法の１つに免疫比濁法が知られている。免疫比濁法を用いた測定の際には、まず緩衝液中で試料と抗体溶液とを作用させる。このとき、試料中に抗原が含まれる場合、抗原が抗体と特異的に抗原抗体反応を起こして濁りを生じる。濁りの度合い（濁度）は試料中の抗原濃度に比例するので、濁度を測定することにより試料中の抗原濃度を求めることができる。
【０００３】
上記のような免疫比濁法は、測定対象物質ごとに結合する抗体を選択することによって、様々な物質を測定することが原理的には可能である。例えば、抗体として、抗ヒトアルブミン抗体を選択すると、試料液中のアルブミン濃度を測定する免疫反応測定用セルを作製することができる。
アルブミンは、血液から血球などの有形成分を除いた残りである血漿中のタンパク質の約５０％を占めるタンパク質である。アルブミンは、血液の浸透圧の維持、イオン、脂肪酸、一部のビタミン、色素および薬物の運搬、および末梢組織へのアミノ酸供給等の作用があることが知られている。しかし、糖尿病の合併症のひとつである糖尿病性腎症などによって腎機能に障害がおこると、アルブミンが尿中に漏出することが知られている。
【０００４】
従って、尿中のアルブミン量を測定すれば、病態スクリーニング、治療効果の確認、予後の判定などが可能となる。このため、尿中のアルブミン量の測定が、糖尿病性腎症の早期発見のため、ならびに糖尿病の予後を診断するための重要な日常検査として近年広く普及している。
アルブミンに対する抗体として、従来からポリクローナル抗体である抗ヒトアルブミン血清が用いられてきた。従来のアルブミンの測定法のほとんどは、抗血清とアルブミンとの凝集反応による沈降線の有無または濁度の増加によってアルブミンを測定するものである。しかし、未精製の抗血清は、血清中の種々の抗原に対する種々の抗体を含むことが多いため、アルブミン以外の抗原に結合する可能性がある。そこで、測定において、アルブミン以外の抗原に誤って結合することを防ぐために、抗血清の精製を行ない、ヒト標準血清においてアルブミン以外の抗原に由来する反応が起こらないようにする。抗血清の精製は、未精製の抗血清中からヒト標準血清中のタンパク質に結合する抗体を取り除くために、通常、アフィニティークロマトグラフィーなどの手法を用いる。
【０００５】
また、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体とを用いる免疫比濁測定用キット（マイクロアルブミン−ＨＡテストワコー、和光純薬製）も市販されている。この測定用キットの構成は、緩衝液（５０ｍＭグッド緩衝液ｐＨ７．４）と抗体溶液とから構成されている。抗体溶液には、ウサギ由来抗ヒトアルブミンポリクローナル抗体（１．５ｍｇＡｂ／ｍｌ）とマウス由来抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体（４．０ｍｇＡｂ／ｍｌ）とが含まれている。
測定の際には、緩衝液中で試料と抗体溶液とを作用させる。このとき、試料中にアルブミンが含まれる場合、アルブミンが抗ヒトアルブミン抗体と特異的に抗原抗体反応を起こして濁りを生じる。濁りの度合い（濁度）は試料中のアルブミン濃度に比例するので、濁度を測定することにより試料中のアルブミン量を求めることができる。
【０００６】
上述の測定用キットで、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体とを同時に用いるのは、前者の「濁度が高くなる」という特徴と、後者の「プロゾーン現象を起こしにくい」という特徴を組み合わせるためであると言われている。つまり、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体とを組み合わせて同時に用いることによって、ポリクローナル抗体のみを利用した免疫比濁法に比べて広い測定範囲を実現している。
しかしながら、上述のような構成の免疫比濁法では、広い測定範囲を実現しているというものの、抗原過剰領域に達すると、濁度が下がり、定量ができなくなる。
【０００７】
図１に、従来の免疫比濁法（レーザーネフェロメトリー）を用いた光学測定における散乱光強度と抗原濃度との関係を示す。図１において、抗原濃度０〜Ｃ0までの間の領域（以下、領域Ａと略称する）では、試料中の抗原濃度に対して散乱光強度が単調に増加している。一方、抗原濃度が極大値Ｃ0を超える領域（以下、領域Ｂと略称する）では、抗体に対して過剰の抗原が試料中に存在しており、散乱光強度が減少する傾向がある。
ここで、抗原濃度がＣ0以下であることがあらかじめわかっている試料を測定する場合は、図１に示すような、散乱光強度と抗原濃度との関係を表すグラフを検量線として参照することにより、測定された散乱光強度から抗原濃度を求めることができる。
【０００８】
ところが、抗原濃度がＣ0を超え得る試料を測定する場合、例えば、図１に示すように測定された散乱光強度Ｓであったとき、図１のグラフを参照すると２つの抗原濃度Ｃ1およびＣ2が得られるため、真の抗原濃度がいずれであるかを判断することができない。
そこで、試料を希釈して希釈倍率の異なる複数の希釈試料を作り、それらについて特性を測定することにより、真の抗原濃度を求めることができる（例えば、特許文献１参照）。
【特許文献１】特開２００１−２４２１７２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、上記特許文献１記載の方法では試料を希釈する工程が必要となるため、工程が煩雑であった。また、この方法を行うためには、複雑な構成の測定装置が必要であった。
そこで、本発明は、上記従来の問題点を鑑みてなされたものであり、簡単な工程で試料中の特定成分を正確に測定することができる免疫反応測定方法および簡易な構成で試料中の特定成分を正確に測定することができる免疫反応測定用セルおよび免疫反応測定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記従来の課題を解決するために、本発明は、被測定物質を含む溶液と前記被測定物質に対して特異的に結合可能な抗体との混合物であって、前記溶液中の前記被測定物質の濃度が互いに異なる複数の前記混合物についての、前記被測定物質と前記抗体との結合に起因する第１の光学特性と、前記溶液における前記被測定物質の濃度との第１の関係を用い、前記被測定物質を含み得る試料と前記抗体とを混合することによって第１の混合物を調製する工程（ａ）と、前記試料と、前記被測定物質と反応することにより色が変化する色素とを混合することによって第２の混合物を調製する工程（ｂ）と、前記第１の混合物の前記第１の光学特性を測定する工程（ｃ）と、前記被測定物質と前記色素との反応に起因する前記第２の混合物の第２の光学特性を測定する工程（ｄ）と、前記第２の光学特性に基づいて、前記試料中の前記被測定物質の濃度が、前記第１の関係において前記第１の光学特性が極値を示すときの前記被測定物質の濃度以下であるか否かを判定する工程（ｅ）と、前記判定の結果に基づき、前記第１の関係を用いて、前記工程（ｃ）において測定された前記第１の光学特性を前記試料中の前記被測定物質の濃度に換算する工程（ｆ）とを含む免疫反応測定方法を提供する。
【００１１】
また、本発明は、前記試料を保持する第１の試料保持部と、前記試料保持部内に設けられ、前記被測定物質に対して特異的に結合可能な抗体を含む第１の試薬保持部と、前記試料保持部に前記試料を導入するための第１の試料導入口と、前記試料保持部に光を入射するための第１の光入射部と、前記試料保持部から光を出射するための第１の光出射部と、前記試料を保持する第２の試料保持部と、前記試料保持部内に設けられ、前記被測定物質と反応することにより色が変化する色素を含む第２の試薬保持部と、前記試料保持部に前記試料を導入するための第２の試料導入口と、前記試料保持部に光を入射するための第２の光入射部と、前記試料保持部から光を出射するための第２の光出射部とを備える免疫反応測定用セルを提供する。
【００１２】
また、本発明の免疫反応測定装置は、上記免疫反応測定用セルと連結するセル連結部と、光源と、光検出器と、前記免疫反応測定用セルに前記試料を吸引するためのポンプと、前記光検出部から得られた信号を前記被測定物質の濃度に変換するための演算部とを備える。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、簡単な工程で試料中の特定成分を正確に測定可能な免疫反応測定方法および簡易な構成で試料中の特定成分を正確に測定可能な免疫反応測定用セルおよび免疫反応測定装置を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の免疫反応測定方法は、被測定物質を含む溶液と前記被測定物質に対して特異的に結合可能な抗体との混合物であって、前記溶液中の前記被測定物質の濃度が互いに異なる複数の前記混合物についての、前記被測定物質と前記抗体との結合に起因する第１の光学特性と、前記溶液における前記被測定物質の濃度との第１の関係を用い、前記被測定物質を含み得る試料と前記抗体とを混合することによって第１の混合物を調製する工程（ａ）と、前記試料と、前記被測定物質と反応することにより色が変化する色素とを混合することによって第２の混合物を調製する工程（ｂ）と、前記第１の混合物の前記第１の光学特性を測定する工程（ｃ）と、前記被測定物質と前記色素との反応に起因する前記第２の混合物の第２の光学特性を測定する工程（ｄ）と、前記第２の光学特性に基づいて、前記試料中の前記被測定物質の濃度が、前記第１の関係において前記第１の光学特性が極値を示すときの前記被測定物質の濃度以下であるか否かを判定する工程（ｅ）と、前記判定の結果に基づき、前記第１の関係を用いて、前記工程（ｃ）において測定された前記第１の光学特性を前記試料中の前記被測定物質の濃度に換算する工程（ｆ）とを含む。
【００１５】
図２に、本発明の免疫反応測定方法における、第１の光学特性である散乱光強度と、被測定物質である抗原を含む溶液における抗原濃度との関係、および第２の光学特性である透過光強度と抗原濃度との関係を示す。散乱光強度と抗原濃度との関係は、本発明における第１の関係に相当し、透過光強度と抗原濃度との関係は、本発明における第２の関係に相当する。これらの関係は、既知の濃度の被測定物質を含む試料を溶液として用い、互いに濃度の異なる複数の溶液について、その溶液と抗体との混合物における第１の光学特性、及びその溶液と色素との混合物における第２の光学特性を測定することにより求めることができる。ここで、溶液として、被測定物質を含む水溶液を用いてもよい。
被測定物質である抗原と反応することにより色が変化する色素は、反応による色の変化の度合いを色変化度とすると、溶液中の抗原濃度に依存して色変化度が増大し、ある抗原濃度で色変化度が飽和状態となる。さらに、過剰な抗原が存在しても色変化度は減少することなく飽和状態のまま維持される。
ここで、本発明における色素は、被測定物質の濃度が抗体の濃度に対して過剰な領域にあるときに、被測定物質との反応による色の変化が飽和することが好ましい。つまり、図２の例では、色変化度の飽和する抗原濃度が、抗体に対して抗原過剰な領域にある、すなわち図２中のＣ0濃度より大きいものを使用することが好ましい。このような色素を用いると、抗体に対して過剰な抗原が試料中に存在しても、色変化度は減少することなく飽和状態のまま維持される。そのため、過剰の抗原が存在した場合に、免疫比濁反応による散乱光強度が減少しても色変化度は減少しない。
【００１６】
図２を用いて本発明の免疫反応測定方法の原理を説明する。図２において、実線は、第１の光学特性である散乱光強度と被測定物質である抗原の濃度との関係（第１の関係）を示すグラフであり、破線は、第２の光学特性である透過光強度と被測定物質である抗原の濃度との関係（第２の関係）を示すグラフである。工程（ｃ）において測定された第１の光学特性である散乱光強度をＳ、第１の光学特性である散乱光強度と被測定物質である抗原の濃度との関係を示すグラフにおいて、散乱光強度Ｓに対応する２つの抗原濃度をＣ1およびＣ2、第１の光学特性である散乱光強度がピークとなるときの抗原濃度をＣ0、抗原濃度がＣ0のときの第２の光学特性である透過光強度をＴ0とする。
【００１７】
ここで、工程（ｄ）において測定された透過光強度がＴ1の場合、工程（ｅ）においてＴ0とＴ1とを比較する。比較の結果、Ｔ1はＴ0以下であることから、試料中の抗原濃度が、抗原濃度に対して第１の光学特性である散乱光強度が単調に増加する領域、すなわち図２の領域Ａに含まれると判定される。したがって、試料中の抗原濃度は、抗原濃度と散乱光強度との関係（第１の関係）において散乱光強度が極値を示すときの濃度Ｃ0以下であると判定される。この判定の結果から、工程（ｆ）において、抗原濃度はＣ2ではなくＣ1であると求めることができる。
【００１８】
一方、工程（ｄ）において測定された透過光強度がＴ2の場合、工程（ｅ）においてＴ0とＴ2とを比較する。比較の結果、Ｔ2はＴ0より大きいことから、試料中の抗原濃度が、抗原濃度に対して第１の光学特性である散乱光強度が単調に増加する領域、すなわち図２の領域Ａには含まれず、抗体に対して抗原が過剰である領域Ｂに含まれると判定される。したがって、試料中の抗原濃度は、抗原濃度と散乱光強度との関係（第１の関係）において散乱光強度が極値を示すときの濃度Ｃ0より大きいと判定される。この判定の結果から、工程（ｆ）において、抗原濃度はＣ1ではなくＣ2であると求めることができる。ここで、工程（ｆ）において、抗原濃度がＣ2と定量せずに、抗原濃度がＣ0より大きいとの判定のみを行ってもよい。
【００１９】
なお、図２の例においては、第１の光学特性として散乱光強度を用い、散乱光強度が極大値を示すときの抗原濃度をＣ0としたが、第１の光学特性として透過光強度または反射光強度を用いてもよい。
第１の光学特性として反射光強度を用いる場合、散乱光強度を用いる場合と同様に、図２の領域Ａに対応する領域においては、第１の光学特性である反射光強度は単調に増加し、抗原濃度Ｃ0において極大値を示し、領域Ｂに対応する領域においては単調に減少する。
一方、第１の光学特性として透過光強度を用いる場合は、散乱光強度を用いる場合と異なり、図２の領域Ａに対応する領域においては、第１の光学特性である透過光強度は単調に減少し、抗原濃度Ｃ0において極小値を示し、領域Ｂに対応する領域においては単調に増加する。
【００２０】
以上のように、本発明の免疫反応測定方法によると、被測定物質と抗体との結合に起因する光学特性に加えて、被測定物質と色素との反応に起因する光学特性を測定することにより、希釈等の煩雑な工程を行うことなく、簡単な工程で試料中の特定成分を正確に測定することができる。
ここで、色素の色変化が測定される最低の抗原濃度が図２におけるＣ0、すなわち色素が抗原濃度Ｃ0の感度を有していることが好ましい。この場合、試料と色素とを混合することによって得られた第２の混合物において色の変化がない場合には、抗原濃度が領域Ａにあると判定することができる。また逆に、第２の混合物において色の変化が認められる場合には、抗原濃度がＣ0より大きく、抗原濃度は抗原過剰領域（領域Ｂ）であることがわかる。したがって、工程（ｅ）において、目視により判定することが可能となる。
【００２１】
本発明における試料としては、特に限定されないが、種々の疾病の診断を行うための試料として、尿、血液、排泄物、唾液などが挙げられる。在宅での日常の健康管理を目的として本発明の免疫反応測定方法を実施する場合、測定は非侵襲であることが好ましいため、試料としては尿が好ましい。
また、被測定物質としては、例えばアルブミン、ｈＣＧ、ＬＨ、ＣＲＰおよびＩｇＧなどが挙げられる。
【００２２】
また、本発明において用いる色素としては、試料中に含まれ得る被測定物質との反応によって色変化を起こすものであればよい。
なかでも、前記色素は、ブロモフェノールブルー、ブロモフェノールブルーの誘導体、テトラブロモスルホンフタレインおよびテトラブロモスルホンフタレインの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。これらの色素は、色変化のみられる抗原濃度の範囲が通常の免疫反応の測定濃度範囲よりも２〜５０倍広く、さらに、色変化のみられる最低の抗原濃度（感度）が通常の免疫反応の測定濃度範囲内にあるため好ましい。
【００２３】
本発明において用いる抗体としては、ポリクローナル抗体、２種類以上のモノクローナル抗体を組み合わせたもの、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体とを組み合わせたもの、１種類のみのモノクローナル抗体が挙げられる。
ポリクローナル抗体はモノクローナル抗体と比較して、作製するのが容易である。一方、モノクローナル抗体は、一旦、抗体産生細胞を入手すれば、永久的に同じ抗体が得られるので、ポリクローナル抗体と比較して再現性の高い測定を行うことができる。
また、本発明において測定する光学特性としては、散乱光強度、透過光強度、および反射光強度が挙げられる。
【００２４】
本発明の免疫反応測定用セルは、前記試料を保持する第１の試料保持部と、前記試料保持部内に設けられ、前記被測定物質に対して特異的に結合可能な抗体を含む第１の試薬保持部と、前記試料保持部に前記試料を導入するための第１の試料導入口と、前記試料保持部に光を入射するための第１の光入射部と、前記試料保持部から光を出射するための第１の光出射部と、前記試料を保持する第２の試料保持部と、前記試料保持部内に設けられ、前記被測定物質と反応することにより色が変化する色素を含む第２の試薬保持部と、前記試料保持部に前記試料を導入するための第２の試料導入口と、前記試料保持部に光を入射するための第２の光入射部と、前記試料保持部から光を出射するための第２の光出射部とを備える。
【００２５】
さらに、ポンプと接続され、ポンプを用いて第１の試料保持部内を減圧状態にすることにより第１の試料導入口を通して第１の試料保持部内に試料を吸引するための第１の吸引口と、ポンプと接続され、ポンプを用いて第２の試料保持部内を減圧状態にすることにより第２の試料導入口を通して第２の試料保持部内に試料を吸引するための第２の吸引口とを備えることが好ましい。
ここで、第１の吸引口および第２の吸引口は、それぞれ第１の試料保持部または第２の試料保持部の一方の端部に設けられていることが好ましい。また、第１の試料導入口および第２の試料導入口は、それぞれ他方の端部に設けられていることが好ましい。
【００２６】
第１の試薬保持部および第２の試薬保持部は、ガラス繊維または濾紙などで構成された多孔性の担体に、試薬である抗体または色素を含む溶液を含浸させ、乾燥することにより試薬を担持し、得られた担体を、試料保持部を構成する壁面に貼付することにより形成することができる。
また、試料保持部を構成する壁面に、試薬を含む溶液を直接塗布し、乾燥することにより試薬保持部を形成してもよい。第１の試薬保持部および第２の試薬保持部の位置は、それぞれ第１の試料保持部または第２の試料保持部の、第１の試料導入口または第２の試料導入口が設けられた端部近傍に設けられていることが好ましい。さらに吸引部と対向する底面部に設けられていることが好ましい。
【００２７】
セルの材質は、可視光を実質的に透過するものであることが好ましい。コスト削減および作製工程の簡易化という観点から、単一の材料で免疫反応測定用セル全体を構成するのが好ましい。また、免疫反応測定用セルを使い捨てにする場合には、ポリスチレン、メタクリル樹脂などのプラスティック性の材料を用いることが好ましい。
試料導入口から供給された試料が試料保持部内を流れる方向において、光入射部および光出射部が、試薬保持部と略同じ位置かまたは試薬保持部よりも下流側に位置することが好ましい。このようにすると、光学測定のために用いる試薬が試料保持部内に供給された試料に溶解した後、その試薬を含む試料が光入射部および光出射部に到達するので、試料保持部内を強制的に攪拌しなくても、光学測定を迅速に行うことができる。
【００２８】
また、本発明の免疫反応測定装置は、上記免疫反応測定用セルと連結するセル連結部と、光源と、光検出器と、前記免疫反応測定用セルに前記試料を吸引するためのポンプと、前記光検出部から得られた信号を前記被測定物質の濃度に変換するための演算部とを備える。
ここで、免疫反応測定用セルは測定装置に着脱可能な状態で取付けられることが好ましい。さらに、前記光源、前記光検出器および前記ポンプを制御するための制御部を備えることが好ましく、前記演算部は制御部を兼ねていてもよい。
光源としては、可視光を発する発光ダイオードやレーザが挙げられる。
【００２９】
光検出器としては、可視光領域を検出できるものであればよい。可視光領域を検出できる光検出器としては、例えば、シリコンを材料とした光検出器が挙げられる。免疫比濁を検出する場合に利用される散乱光を検出する光検出器には、光源が発する光のスペクトルと同じパターンの光検出スペクトルを有する検出器であることがより望ましい。
一方、色素による色変化を検出する場合に利用される透過光を検出する光検出器には、反応後の色素が有する光吸収スペクトルと同じパターンの光検出スペクトルを有する検出器であることがより望ましい。
【００３０】
第１の光入射部に入射する光と第２の光入射部に入射する光とは、１つの光源から照射されてもよく、２つの光源から別々に照射されてもよい。１つの光源を用いる場合には、光源と免疫反応測定用セルとの間に分光器（ビームスプリッター）が配置されていることが好ましい。
また、第１の光出射部から出射した光と第２の光出射部から出射した光とを、１つの光検出器で検出してもよく、２つの光検出器を用いて別々に検出してもよい。１つの光検出器を用いる場合には、免疫反応測定用セルと光検出器との間に分光器（ビームスプリッター）が配置されていることが好ましい。
また、光源と光検出器の位置関係は、散乱光を測定する場合の光検出器は、光源に対する角度が１０〜１８０度であることが好ましい。さらに、１０〜９０度であることが好ましい。一方、透過光を測定する場合の光検出器は、光源に対する角度が１８０度±２０度であることが好ましい。
【００３１】
ポンプとしては、ペリスタポンプ、シリンジポンプ、水流ポンプ等が挙げられる。この中で、吸引容量精度が優れるという観点から、シリンジポンプがより好ましい。ここでポンプの吸引速度は、３３〜１１４０μｌ／秒であることが好ましく、さらに８００〜１１４０μｌ／秒であることが好ましい。
シリンジポンプの場合、ピストンをモーターで作動させるものでもよい。モーターとしては、ステップモーター、直流モーター等がある。ステップモーターは入力された１パルス信号あたりに特定の回転角を回転するモーターであり、パルス数で回転角度を決定できるため、位置決めのためのエンコーダーを必要としない。
【００３２】
すなわち、入力パルス数により、ピストンの動作距離を制御できる。モーターの回転運動は、歯車機構と、雄ネジと雌ネジを組み合わせた直進機構等を用いて直進運動へ変換することにより、ピストンを作動させる。直流モーターの場合も回転運動を直進運動へ変換する方法は同様であるが、直流モーターの場合は、ピストンの動作距離を制御するために、モーターの回転位置を検出するエンコーダーが必要となる。
また、リニア型のステップモーターもあり、このタイプのモーターは、モーター内に雄ネジと雌ネジを組み合わせた直進機構が組み入れられており、入力パルス数に依存して、棒状の可動部が直進運動するように構成されている。このため、この棒に直接ピストンを連結すれば良く、構成が簡単となる。
【００３３】
演算部は、被測定物質と抗体との結合に起因する光学特性結果と被測定物質と色素との反応に起因する光学特性結果に基づいて正確な被測定物質濃度を演算処理できるものであればよく、たとえばＣＰＵなどが利用できる。
さらに、演算部により換算された被測定物質の濃度や工程（ｅ）における判定結果を表示するための表示部を備えることが好ましい。表示部としては、文字やグラフ等を表示するディスプレイが挙げられる。
【００３４】
さらに、上記演算部は、上述した本発明の免疫反応測定方法を実施し得る機能を有するものであるのが好ましい。そのため、本発明の免疫測定装置は、例えば少なくとも上記第１の関係を記憶しており、より好ましくは上記第２の関係をも記憶している記憶媒体等を備えた第１の記憶部を有しているのが好ましい。
この場合、上記演算部は、上記工程（ａ）〜上記工程（ｄ）において得られた前記第２の光学特性に基づいて、前記試料中の前記被測定物質の濃度が、前記第１の関係において前記第１の光学特性が極値を示すときの前記被測定物質の濃度以下であるか否かを判定する第１の判定部と、前記判定の結果に基づき、前記第１の関係を用いて、上記工程（ｃ）において測定された前記第１の光学特性を前記試料中の前記被測定物質の濃度に換算する換算部と、を具備する。
【００３５】
また、上記演算部は、前記第１の関係及び前記第２の関係において、前記第１の光学特性が極値を示すときの前記被測定物質の濃度に対応する前記第２の光学特性と、前記工程（ｄ）において測定された前記第２の光学特性とを比較する比較部と、前記試料中の前記被測定物質の濃度が、前記第１の関係において前記第１の光学特性が極値を示すときの前記被測定物質の濃度以下であるか否かを判定する第２の判定部と、を具備するのが好ましい。
なお、上記第１の判定部が上記第２の判定部の機能を有していてもよく、逆に上記第２の判定部が上記第１の判定部の機能を有していてもよい。
【００３６】
また、本発明の免疫反応測定装置は、演算部において得られた試料中の被検物質の濃度を記憶媒体に記録するための記録部を備えていてもよい。このような構成によれば、測定した結果を取り外し可能な記憶媒体に保存することができ、前記結果を測定装置から容易に取り出すことができる。したがって、前記記憶媒体を分析専門業者に持参したり郵送したりして容易に分析を依頼することができる。
また、本発明の免疫反応測定装置は、演算部において試料中の被検物質の濃度を測定した時間を計時するための計時部、および前記演算部において得られた試料中の被検物質の濃度を、計時部において計時した測定時間と関連付けて記憶するための第２の記憶部を備えていてもよい。このような構成によれば、試料中の被検物質を測定した結果が、測定した時間とともに第２の記憶部に保存されているため、経時的な分析を行うことができる。なお、上記第１の記憶部が上記第２の記憶部の機能を有していてもよく、逆に、上記第２の記憶部が上記第２の記憶部の機能を有していてもよい。
【００３７】
さらに、本発明の測定装置は、演算部において得られた試料中の被検物質の濃度を、測定装置外に送信するための送信部を備えていてもよい。このような構成によれば、試料中の被検物質を測定した結果を、病院内の分析関連部門または分析関連業者などに送信し、それを前記分析関連部門または分析関連業者等において分析することができる。したがって、測定から分析までの時間を短縮することができる。
加えて、本発明の測定装置は、前記分析関連部門または分析関連業者等において分析した結果を受信するための受信部を備えていることができる。このような構成によれば、分析結果を迅速に被験者にフィードバックすることができる。
以下、図面を参照しながら本発明の代表的な実施の形態をより詳細に説明する。
【００３８】
１．免疫反応測定用セル
本発明の免疫反応測定用セルの一実施の形態の構成を、図３および４を用いて説明する。図３は、本実施の形態に係る免疫反応測定用セルの斜視図であり、図４は、図３におけるＡ−Ａ線断面図である。
本実施の形態の免疫反応測定用セルは、被測定物質と抗体との結合に起因する第１の混合物の第１の光学特性を、散乱光を用いた免疫比濁反応により測定し、被測定物質と色素との反応に起因する第２の混合物の第２の光学特性（色素の色調変化）を、透過光を用いて測定するように構成されている。
【００３９】
図３に示すように、本実施の形態の免疫反応測定用セル１は、中央部に隔壁を備えた無底中空形状の四角柱（縦×横×高さ：１．１ｍｍ×１．１ｍｍ×７０ｍｍ、外壁の厚み：１．０ｍｍ、隔壁の厚み：２．０ｍｍ）と底板１０（縦×横：１．１ｍｍ×１．１ｍｍ、厚み：１．０ｍｍ）とから構成されている。
上記四角柱の内部には、互いに隔壁で隔てられた第１の試料保持部２００と第２の試料保持部２０１とを有している。また、上記四角柱の外壁には、底板１０の近傍の端部に第１の試料導入口２０２と第２の試薬導入口２０３とが設けられている。
【００４０】
上記四角柱の開放端が、第１の吸引口２１０および第２の吸引口２１１として機能する。また、第１の試料保持部２００および第２の試料保持部２０１の内部には、底板１０上に、それぞれ第１の試薬保持部２０４および第２の試薬保持部２０５が設けられている。
第１の試薬保持部２０４には抗体として４００μｇの抗アルブミン抗体が、第２の試薬保持部２０５には色素として１．０ｍｇのテトラブロモスルホンフタレンがそれぞれ担持されている。
【００４１】
次に、免疫反応測定用セル１の製造方法について説明する。まず、射出成形により作製したポリスチレン製の無底中空形状の四角柱（縦×横×高さ：１．１ｍｍ×０．５５ｍｍ×７０ｍｍ、厚み：１．０ｍｍ）の一面の端部に、掘削により孔（直径：２ｍｍ）を開ける。
この四角柱を２つ用いて（第１のセル２０および第２のセル３０）、２つの孔が外側に向くように接着剤により第１のセル２０および第２のセル３０を貼り合わせる。これらの孔が第１の試料導入口２０２および第２の試料導入口２０３となる。
【００４２】
一方、ポリスチレン製の底板１０に、第１の試薬保持部２０４を形成するための第１試薬液（１６０ｍＭフタレン酸と８ｍｇ／ｍｌ抗アルブミン抗体とを含む水溶液）５０μｌと、第２の試薬保持部２０５を形成するための第２試薬液（２０ｍｇ／ｍｌテトラブロモスルホンフタレン水溶液）５０μｌとを互いに混ざらない位置にそれぞれ滴下する。
その後、各試薬液を５０℃で３０分間風乾により乾燥させる。このように作製した第１の試薬保持部２０４および第２の試薬保持部２０５を形成した底板１０を、互いに貼り合わされた第１のセル２０および第２のセル３０の試料導入口２０２、２０３に近い方の開放端を塞ぐ位置に接着することにより、免疫反応測定用セル１を作製する。
【００４３】
ここで、第１のセル２０を構成する４つの外壁面のうち、第１の試料導入口２０２が設けられた面および第２のセル３０と貼り合わされた面を除く２つの互いに対向する面の一方が第１の光入射部２０６、第１の試料導入口２０２が設けられた面が第１の光出射部２０８として機能する。
同様に、第２のセル３０を構成する４つの外壁面のうち、第２の試料導入口２０３が設けられた面および第１のセル２０と貼り合わされた面を除く２つの互いに対向する面の一方が第２の光入射部２０７、他方が第２の光出射部２０９として機能する。
【００４４】
２．免疫反応測定装置
次に、本発明の免疫反応測定装置の一実施の形態の構成について説明する。図５は、本実施の形態に係る免疫反応測定装置の透視図であり、図６は図５に示す免疫反応測定装置の斜視図である。
図５に示すように、免疫反応測定装置２は、免疫反応測定用セル１と連結するためのセル連結部（例えばゴムやシリコーン樹脂製）３１１、第１ＬＥＤ光源３０８、第２ＬＥＤ光源３１４、第１光検出器３０５および第２光検出器３０６を備えている。凹状のセル連結部３１１の内面には、図示しないが、例えばテフロン（登録商標）やイソプレンゴム製の封止リングが配置されている。
【００４５】
免疫反応測定用セル１を免疫反応測定装置２に連結したときに、第１ＬＥＤ光源３０８の光出射面と免疫反応測定用セル１の第１の光入射部２０６、第１光検出器３０５の受光面と免疫反応測定用セル１の第１の光出射部２０８、第２ＬＥＤ光源３１４の光出射面と免疫反応測定用セル１の第２の光入射部２０７、第２光検出器３０６の受光面と免疫反応測定用セル１の第２の光出射部２０９が、それぞれ互いに対向するように配置されている。
免疫反応測定装置２は、シリンジ３１０、シリンジ３１０内を動くことができるように配置されたプランジャー３０９、およびプランジャー３０９を動作させるためのステッピングモータ３１３をさらに備え、シリンジ３１０とプランジャー３０９とステッピングモータ３１３とが組み合わされて本発明のポンプとして機能する。
【００４６】
また、免疫反応測定装置２は、演算部３０１、制御部３１２、表示部３０７であるディスプレイ、第１ＬＥＤ光源３０８および第２ＬＥＤ光源３１４を作動させるための電源ボタン３０４、ステッピングモータ３１３を作動させて免疫反応測定用セル１内に試料を導入するための導入開始ボタン３０２、およびステッピングモータ３１３を停止させて免疫反応測定用セル１内への試料の導入を停止するための導入停止ボタン３０３をさらに備えている。なお、第１ＬＥＤ光源３０８および第２ＬＥＤ光源３１４のいずれか一方と、分光器とを用いても構わない。
【００４７】
ここで、演算部３０１はメモリを備えており、そのメモリには、図２における領域Ａと領域Ｂの境界となる被測定物質の濃度Ｃ0に対応する第２の光学特性である透過光強度Ｔ0と、第１の光学特性である散乱光強度と被測定物質の濃度との関係を示す検量線データとが格納されている。
【００４８】
３．免疫反応測定方法
次に、本実施の形態に係る免疫反応測定用セルと免疫反応測定装置とを用いた免疫反応測定方法について説明する。
免疫反応測定用セル１の第１の吸引口２１０および第２の吸引口２１１が、セル連結部３１１に挿入されて連結されるように免疫反応測定用セル１を免疫反応測定装置２に装着した後に、免疫反応測定用セル１の第１の試料導入口２０２および第２の試料導入口２０３を、予め紙コップ等のカップ内に採尿しておいた尿に浸す。
【００４９】
その状態で導入開始ボタン３０２を押してステッピングモータ３１３を作動させることにより、１１４０μｌ／秒の速度で、第１の試料導入口２０２および第２の試料導入口２０３を通して第１の試料保持部２００および第２の試料保持部２０１内にそれぞれ３ｍｌの尿を導入する。
第１の試料保持部２００内では、第１の試薬保持部２０４に担持された抗アルブミン抗体とフタレン酸とが導入された尿中に溶解し、第１の混合物が調整される。同様に、第２の試料保持部２０１内では、第２の試薬保持部２０５に担持された色素であるテトラブロモスルホンフタレンが導入された尿中に溶解し、第２の混合物が調整される。
【００５０】
導入後、電源ボタン３０４を押すことにより第１ＬＥＤ光源３０８（スタンレー社製、波長：６３０ｎｍ、輝度：３６００ｍｃｄ）および第２ＬＥＤ光源３１４（スタンレー社製、波長：６３０ｎｍ、輝度：３６００ｍｃｄ）を作動させて、それぞれ第１の光入射部２０６および第２の光入射部２０７に測定光を照射する。
演算部３０１は、透過光測定用光検出器である第２光検出器３０６（浜松ホトニクス社製、シリコンフォトダイオード）を用いて、第２の試料保持部２０１内で調整された第２の混合物におけるテトラブロモスルホンフタレインとアルブミンとの呈色反応を測定する。具体的には、演算部３０１が、領域Ａと領域Ｂの境界となるアルブミンの濃度Ｃ0に対応する透過光強度Ｔ0をメモリから読み出して、第２光検出器３０６により測定された透過光強度と比較することにより、尿中のアルブミン濃度が領域Ａにあるか領域Ｂにあるかを判定する。
【００５１】
さらに、演算部３０１は、散乱光測定用光検出器である第１光検出器３０５（浜松ホトニクス社製、シリコンフォトダイオード）を用いて、抗アルブミン抗体とアルブミンとの免疫比濁反応を測定する。
具体的には、演算部３０１が、メモリに格納されている散乱光強度とアルブミンの濃度との関係を示す検量線データを参照して、第１光検出器３０５により測定された散乱光強度をアルブミン濃度に換算する。
【００５２】
このとき２つの異なるアルブミン濃度が得られるが、透過光強度に基づく判定結果を参照して、尿中のアルブミン濃度が領域Ａにあると判定されている場合は、２つの異なるアルブミン濃度のうち低い方のアルブミン濃度が尿中のアルブミン濃度である判定する。
一方、尿中のアルブミン濃度が領域Ｂにあると判定されている場合は、２つの異なるアルブミン濃度のうち高い方のアルブミン濃度が尿中のアルブミン濃度である判定する。求められた尿中のアルブミン濃度は、表示部３０７上に表示される。
【００５３】
このように免疫比濁反応と色素による呈色反応を利用することにより、過剰の被測定物質（抗原）が存在した場合にも、容易かつ正確に試料中の被測定物質の濃度を測定することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明に係る免疫反応測定方法、免疫反応測定用セルおよび免疫反応測定装置は、試料中の特定成分、特に生体試料中の抗原濃度の測定として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】従来の免疫比濁法を用いた光学測定における散乱光強度と抗原濃度との関係を示す図である。
【図２】本発明の免疫反応測定方法における、第１の光学特性である散乱光強度と被測定物質である抗原の濃度との関係および第２の光学特性である透過光強度と抗原濃度との関係を示す図である。
【図３】本発明の免疫反応測定用セルの一実施の形態の斜視図である。
【図４】図３におけるＡ−Ａ線断面図である。
【図５】本発明の免疫反応測定装置の一実施の形態の透過図である。
【図６】図５に示す免疫反応測定装置の斜視図である。
【符号の説明】
【００５６】
１  免疫反応測定用セル
２  免疫反応測定装置
１０  底板
２０  第１のセル
３０  第２のセル
２００  第１の試料保持部
２０１  第２の試料保持部
２０２  第１の試料導入口
２０３  第２の試薬導入口
２０４  第１の試薬保持部
２０５  第２の試薬保持部
２０６  第１の光入射部
２０７  第２の光入射部
２０８  第１の光出射部
２０９  第２の光出射部
２１０  第１の吸引口
２１１  第２の吸引口
３０１  演算部
３０２  導入開始ボタン
３０３  導入停止ボタン
３０４  電源ボタン
３０５  第１光検出器
３０６  第２光検出器
３０７  表示部
３０８  第１ＬＥＤ光源
３０９  プランジャー
３１０  シリンジ
３１１  セル連結部
３１２  制御部
３１３  ステッピングモータ
３１４  第２ＬＥＤ光源
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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