(57)【要約】      （修正有）【課題】卵巣腫瘍細胞がシスプラチン耐性を有するか否かを判定するシスプラチン耐性マーカーを提供すること。【解決手段】シスプラチン耐性マーカーは、特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドからなる。このマーカーを利用して以下の工程を含む検出方法を行えばシスプラチン耐性であるか否かを評価することが出来る。（１）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドと、シスプラチン耐性マーカーとを結合させる工程。（２）該シスプラチン耐性マーカーに結合した生体試料由来のＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを、該シスプラチン耐性マーカーを指標として測定する工程。（３）該測定の結果に基づいて、シスプラチン耐性卵巣腫瘍であるか否かを判断する工程。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜１１に示される何れか１つの塩基配列を有するポリヌクレオチドからなることを特徴とする卵巣腫瘍のシスプラチン耐性マーカー。
【請求項２】
請求項１記載のポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するポリヌクレオチドからなることを特徴とする卵巣腫瘍のシスプラチン耐性マーカー。
【請求項３】
請求項１記載のポリヌクレオチドの全部または一部の塩基配列と、相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドからなることを特徴とする卵巣腫瘍のシスプラチン耐性マーカー。
【請求項４】
シスプラチン耐性卵巣腫瘍の検出において、プローブとして使用されることを特徴とする請求項１〜請求項３の何れか１項に記載の卵巣腫瘍のシスプラチン耐性マーカー。
【請求項５】
シスプラチン耐性卵巣腫瘍の検出において、プライマーとして使用されることを特徴とする請求項１〜請求項３の何れか１項に記載の卵巣腫瘍のシスプラチン耐性マーカー。
【請求項６】
請求項４記載の卵巣腫瘍のシスプラチン耐性マーカーを含むことを特徴とするシスプラチン耐性卵巣腫瘍検出用マイクロアレイ。
【請求項７】
（１）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドと、請求項４記載の卵巣腫瘍のシスプラチン耐性マーカーとを結合させる工程と、
（２）該シスプラチン耐性マーカーに結合した生体試料由来のＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを、該シスプラチン耐性マーカーを指標として測定する工程と、
（３）該測定の結果に基づいて、シスプラチン耐性卵巣腫瘍であるか否かを判断する工程と、
を含むことを特徴とするシスプラチン耐性卵巣腫瘍の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シスプラチン耐性卵巣腫瘍の診断に有用なマーカーに関し、特にシスプラチン耐性卵巣腫瘍の検出プローブとして有用なマーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
卵巣ガンは、女性の死亡原因となる主要な悪性腫瘍であり、世界的に問題とされている。卵巣ガンの一般的な治療方法として、シスプラチン等の白金をベースとした抗ガン剤を投与する方法が知られている。シスプラチンは、卵巣ガンに対して優れた抗ガン作用を示す。
【０００３】
しかし、卵巣ガンに対してシスプラチンを投与し続けると、卵巣ガンはシスプラチンに対する感受性を示さなくなり、シスプラチンに対する耐性を備えてしまい問題となることが知られている。耐性を備えた卵巣ガンに対して、シスプラチンの投与を続けても治療の効果が無く、かえってシスプラチンの副作用の問題が生じてしまう。その為、このような場合には、他の治療方法の検討が必要となる。なお非特許文献１〜非特許文献４に示されるように、従来より、シスプラチン耐性の卵巣ガンやその治療方法に関する研究が行われている。
【０００４】
【非特許文献１】Tao Zhang, Ming Guan, Hong Yan Jin, Yuan Lu :Reversal of multidrug resistance by small interfering doble-stranded RNAs in ovarian cancer cells. Gynecologic Oncology 2005,97:501-507
【非特許文献２】John K.Chan, Huyen Pham, Xue Juan You, Noelle G. Cloven, Robert A.Burger, G. Scott Rose, Kristi Van Nostrand, Murray Kore, Philip J. DiSaia, and Hung Fan :Suppression if ovarian Cancer Cell Tumorigenicity and Evasion of Cisplatin Resistance Using a Truncated Epidermal Growth Factor Receptor in a Rat Model. Cancer Res 2005,65(8):3242-8
【非特許文献３】Leigh A. Wilson, Hirotaka Yamamoto, and Gurmit Singh :Role of the transcription factor Ets-1 in cisplatin resistance. Molecular Cancer Therapeutics 2004,3(7):823-32
【非特許文献４】Roohangiz Safaei, Barrett J. Larson, Timothy C. Cheng, Michael A. Gibson, Shinji Otani, Wilturd Naerdemann, Stephen B. Howell :Abnormal lysosomal trafficking and enhanced exosomal export of cisplatin in drug-resistant human ovarian carcinoma cells. Molecular Cancer Therapeutics 2005,4(10):1595-604
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来、卵巣ガン細胞がシスプラチンに対する耐性を備えているか否かの判断は、実際に腫瘍に対してシスプラチンを投与し、腫瘍のシスプラチンに対する感受性の有無を調べることにより行われていた。シスプラチンの投与を行わずに、卵巣ガン細胞がシスプラチン耐性を有しているか否かを調べることが出来なかった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、シスプラチン耐性Ｃ１３腫瘍細胞と、シスプラチン感受性２００８腫瘍細胞とを比較して、シスプラチン耐性Ｃ１３腫瘍細胞に特異的に発現する遺伝子を見出した。更に、シスプラチン耐性Ｃ１３腫瘍細胞に特異的に発現する遺伝子の内、シスプラチン存在下で、発現量が増加する遺伝子（ｃＤＮＡ断片、配列番号１〜１１）を特定した。
【０００７】
本発明者は、上記遺伝子が、卵巣ガン細胞（卵巣腫瘍細胞）において、シスプラチン耐性を備えているか否かの指標となり得る、いわゆるマーカー遺伝子（群）であることを見出した。これらのマーカー遺伝子を、シスプラチン耐性マーカーとすれば、卵巣ガン細胞がシスプラチン耐性であるか否かを容易に判別することが可能となる。本発明は、上記知見を基礎としたものである。
【０００８】
本発明に係る卵巣腫瘍のシスプラチン耐性マーカーは、配列番号１〜１１に示される何れか１つの塩基配列を有するポリヌクレオチドからなることを特徴とする。
【０００９】
また、シスプラチン耐性マーカーは、上記ポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するポリヌクレオチドからなることを特徴とする。
【００１０】
また、シスプラチン耐性マーカーは、上記ポリヌクレオチドの全部または一部の塩基配列と、相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドからなることを特徴とする。
【００１１】
また、上記シスプラチン耐性マーカーは、シスプラチン耐性卵巣腫瘍の検出において、プローブとして使用されることを特徴とする。
【００１２】
また、上記シスプラチン耐性マーカーは、シスプラチン耐性卵巣腫瘍の検出において、プライマーとして使用されることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明に係るシスプラチン耐性卵巣腫瘍検出用マイクロアレイは、上記シスプラチン耐性マーカーを含むことを特徴とする。
【００１４】
また、本発明に係るシスプラチン耐性卵巣腫瘍の検出方法は、（１）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドと、上記シスプラチン耐性マーカーとを結合させる工程と、（２）該シスプラチン耐性マーカーに結合した生体試料由来のＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを、該シスプラチン耐性マーカーを指標として測定する工程と、（３）該測定の結果に基づいて、シスプラチン耐性卵巣腫瘍であるか否かを判断する工程と、を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、シスプラチンを投与すること無く、ヒト卵巣ガンがシスプラチン耐性であるか否かを判別することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本明細書において「遺伝子（ＤＮＡ）」とは、特別な断りがない限り、二本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖という各一本鎖ＤＮＡを包含する趣旨で用いる。なお遺伝子（ＤＮＡ）は、構造遺伝子または調節遺伝子であっても良い。また遺伝子（ＤＮＡ）は、本発明の目的に反しない限り、ヒト遺伝子（ＤＮＡ）以外に、マウス、ラット等の非ヒト遺伝子（ホモログ）をも包含する。
【００１７】
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、特別な断りがない限り、ＤＮＡおよびＲＮＡの何れをも包含する趣旨で用いる。またＤＮＡは、特別な断りがない限り、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡを含み得る趣旨で用いる。またＲＮＡは、特別な断りがない限り、totalＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、合成ＲＮＡの何れをも含み得る趣旨で用いる。
【００１８】
〈ポリヌクレオチド〉
配列番号１〜１１に示されるポリヌクレオチドは、シスプラチン耐性Ｃ１３腫瘍細胞から取得された遺伝子であり、シスプラチン耐性Ｃ１３腫瘍細胞において特異的に発現する遺伝子である。
【００１９】
シスプラチン耐性Ｃ１３腫瘍細胞は、シスプラチン耐性卵巣ガン細胞株（Ｃ１３・５．２５／２００８株、シスプラチン耐性Ｃ１３細胞株）を、ヌードマウスの背部皮下に移植して作成された固形腫瘍（in vivo）から得られたものである。シスプラチン耐性Ｃ１３細胞株は、Andrews PA等の方法に基づいて、シスプラチンの濃度を段階的に上げて、シスプラチン感受性卵巣ガン細胞株（２００８細胞株）を１３ヶ月間、培養し樹立した細胞株である(Andrews PA, et al: Differential potentiation of alkylating and platinating agent cytotoxicity in human ovarian carcinoma cells by glutathione depletion. Cancer Res 15; 6250-6253, 1985)。シスプラチン感受性卵巣ガン細胞株は、DiSaida PJ等により、卵巣ガンのserous cystadenocarcinomaより樹立された細胞株である（DiSaida PJ, et al: Cell-mediated immunity to human malignant cells. Am J Obstet Gynecol 114; 979-989,1972.）。
【００２０】
「特異的に発現する遺伝子」とは、シスプラチン耐性卵巣ガン細胞株をヌードマウスの背部皮下に移植して形成された腫瘍（Ｃ１３腫瘍）から抽出された遺伝子の内、ＨｉＣＥＰ法より得られるピークが、シスプラチン感受性卵巣ガン細胞株をヌードマウスの背部皮下に移植して形成された腫瘍（２００８腫瘍）より抽出された遺伝子のピークよりも３倍以上であって、かつ、リアルタイムＰＣＲにより、発現量が、２００８腫瘍より抽出された遺伝子の２〜５倍以上優位であり、かつ、シスプラチン存在下において、更に発現が上昇する遺伝子である。
【００２１】
配列番号１〜１１に示されるポリヌクレオチドは、以下に示す１次スクリーニング、２次スクリーニングを行い、シスプラチン耐性Ｃ１３腫瘍細胞から取得したものである。なおこれらの配列情報は、それぞれのアクセッションナンバー（ＧｅｎＢａｎｋ）によりアプローチ出来る。それぞれのアクセッションナンバーは以下の通りである。AC091010（配列番号１）、NM_003739（配列番号２）、AC026722（配列番号３）、NM_205845（配列番号４）、AC079136（配列番号５）、BF059583（配列番号６）、BX470629（配列番号７）、AY613922（配列番号８）、NM_001873（配列番号９）、AL034419（配列番号１０）、NM_001266（配列番号１１）。
【００２２】
〈１次スクリーニング〉
ＨｉＣＥＰ（high coverage expression profiling）法により、シスプラチン耐性Ｃ１３腫瘍細胞において特異的に発現する遺伝子を選別し、選別した遺伝子の特定（配列決定）を行った。ＨｉＣＥＰ法は、福村氏等（Fukumura R. et al: A sensitive transcriptome analysis method that can detect unknown transcripts. Nucleic Acids Res. 2003 Aug 15;31(16):e94）により開発された手法である（他の参考文献としては、国際公開０２／０４８３５２号パンフレット、特開２００５−００６５５４号明細書、特開２００５−２５０６１５号明細書がある）。
【００２３】
ＨｉＣＥＰ法によって、シスプラチン耐性Ｃ１３腫瘍細胞において発現するｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）と、シスプラチン感受性２００８腫瘍細胞において発現するｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）とを解析し、双方の解析結果を比較することによって、シスプラチン耐性Ｃ１３腫瘍細胞において特異的に発現する遺伝子を選別した。
【００２４】
ＨｉＣＥＰ法の手順は、図１において示されるように、主として８つの工程からなる。先ず第１工程（Ｓ１）において、シスプラチン耐性Ｃ１３腫瘍細胞と、シスプラチン感受性２００８腫瘍細胞とからそれぞれtotalＲＮＡ（Ｃ１３totalＲＮＡ、２００８totalＲＮＡ）の抽出を行った。
【００２５】
腫瘍細胞からのtotalＲＮＡの調製は、常法により行うことが出来る。本実施形態においては、totalＲＮＡの調製は、先ず、それぞれ２００８細胞およびＣ１３細胞を移植して腫瘍を形成したヌードマウスから腫瘍（２００８腫瘍、Ｃ１３腫瘍）を摘出し、摘出した腫瘍からライセートを調製した。なお２００８腫瘍は、培養した２００８細胞を、ヌードマウスの背部皮下に３×１０６個（１匹当たり）移植し、３週間成長させたものである。Ｃ１３腫瘍は、培養したＣ１３細胞を、ヌードマウスの背部皮下に５×１０６個（１匹当たり）移植し、８週間成長させたものである。得られたライセートから、市販の専用キット（RNeasy Mini Kit（株式会社キアゲン製、cat. No. 74104））を用いて、totalＲＮＡを調製した。なおその際、ライセートを完全にホモジナイズする際に、QIAshredder（株式会社キアゲン製、cat. No. 79654）を用い、またゲノムＤＮＡのコンタミを取り除く為に、RNase-Free DNase Set（株式会社キアゲン製、cat.79254）を用いた。totalＲＮＡの調製の手順は、キットに付属する説明書に従った。
【００２６】
第２工程（Ｓ２）は、第１工程で得られたtotalＲＮＡからｃＤＮＡ（二本鎖）を合成する工程である。先ず、ビオチンラベル化されたポリｄＴオリゴマーをプライマーとして用い、totalＲＮＡ中のｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡ（一本鎖ｃＤＮＡ）の合成を行った。その後、一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、引き続き、ＤＮＡ polymerase、E. coli ligase、RNaseHを用い、標準的な方法で、相補鎖の合成を行い、二本鎖ｃＤＮＡを得た。
【００２７】
第３工程（図１中のＳ３）は、第２工程で得られたｃＤＮＡを、第１の制限酵素（制限酵素１）で切断する工程である。本実施形態においては、制限酵素１として、ＭｓｐＩ（認識配列：ＣＣＧＧ）を使用した。
【００２８】
第４工程（図１中のＳ４）は、制限酵素１により切断されたｃＤＮＡに、第１のアダプタ（アダプタ１）を結合（ライゲーション）する工程である。本実施形態においては、アダプタ１として、ＭｓｐＩ−アダプタを用いた。
【００２９】
ＭｓｐＩ−アダプタの塩基配列は、以下の通りである。
5'-aatggctacacgaactcggttcatgaca-3'（配列番号１２）および
5'-cgtgtcatgaaccgagttcgtgtagccatt-3'（配列番号１３）
【００３０】
ＭｓｐＩにより切断されたｃＤＮＡと、ＭｓｐＩ−アダプタとを、Ｔ４リガーゼによりライゲーションした。なおこの工程において、ビオチンラベル化されたｃＤＮＡを、Streptavidin磁気ビーズに結合して、ビオチンラベル化されたｃＤＮＡのみを回収した。
【００３１】
第５工程（図１中のＳ５）は、第４工程で得られたｃＤＮＡを、第２の制限酵素（制限酵素２）で切断する工程である。本実施形態においては、制限酵素２として、ＭｓｅＩ（認識配列：ＴＴＡＡ）を使用した。なお第５工程において、Streptavidin磁気ビーズに結合していたｃＤＮＡがＭｓｅＩにより切断される。この工程では、ＭｓｅＩで切断後、当該磁気ビーズから遊離したｃＤＮＡ断片を回収した。
【００３２】
第６工程（図１中のＳ６）は、制限酵素２により切断されたｃＤＮＡに、第２のアダプタ（アダプタ２）を結合（ライゲーション）する工程である。本実施形態においては、アダプタ２として、ＭｓｅＩ−アダプタを用いた。
【００３３】
ＭｓｅＩ−アダプタの塩基配列は、以下の通りである。
5'-aagtatcgtcacgaggcgtcctactgcg-3'（配列番号１４）および
5'-tacgcagtaggacgcctcgtgacgatactt-3'（配列番号１５）
【００３４】
ＭｓｅＩにより切断されたｃＤＮＡと、ＭｓｅＩ−アダプタとをＴ４リガーゼによりライゲーションした。このようにして一端にＭｓｐＩ−アダプタ、他端にＭｓｅＩ−アダプタを有するｃＤＮＡ（ｃＤＮＡｓ）を得ることが出来た。
【００３５】
第７工程（図１中のＳ７）は、第６工程で得られた一端にＭｓｐＩ−アダプタ、他端にＭｓｅＩ−アダプタを有するｃＤＮＡ（ｃＤＮＡｓ）をＰＣＲで増幅する為に必要なプライマー（セット）を設計する工程である。本実施形態においては、ＭｓｐＩ−アダプタと相補的な塩基配列を有するプライマー（第１プライマー）と、ＭｓｅＩ−アダプタと相補的な塩基配列を有するプライマー（第２プライマー）とを、常法により調製した。なお、第１プライマーにのみ蛍光ラベル（例えば、6-carboxyfluorescein, FAM）されている。したがって、第６工程において、副生成物として両端にＭｓｅＩ−アダプタを結合するｃＤＮＡが含まれていたとしても、ＰＣＲにおいて、この副生成物は、検出されない。
【００３６】
第１プライマーとして、ＭｓｐＩプライマー、第２プライマーとして、ＭｓｅＩプライマーを用いた。それぞれの塩基配列は、以下の通りである。
ＭｓｐＩプライマー：5'-label-actcggttcatgacacggnn-3'（配列番号１６）
ＭｓｅＩプライマー：5'-aggcgtcctactgcgtaann-3'（配列番号１７）
【００３７】
第８工程（図１中のＳ８）は、第６工程で得られたｃＤＮＡと、第７工程で得られたプライマーのセットとを用いて、ＰＣＲを行う工程である。この工程において、発現頻度の高いｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ）を解析することが出来る。
【００３８】
ＨｉＣＥＰ法に得られた結果を基にして、シスプラチン感受性２００８腫瘍細胞において発現するｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ）と、シスプラチン耐性Ｃ１３腫瘍細胞において発現するｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ）とを比較し、シスプラチン耐性Ｃ１３腫瘍細胞において特異的に発現する７１個のｃＤＮＡを取得した。
【００３９】
なお得られた７１個のｃＤＮＡの塩基配列を解析する為に、以下の操作を行った。上記ＨｉＣＥＰ法で用いた同じ試料を、スラブ形のシーケンス用のアクリルアミドゲル（ゲル濃度：４％ゲル（３００ｂｐ以上のバンドの場合）、６％（１３０〜３００ｂｐのバンドの場合）、１０％（１３０以下のバンドの場合））にて電気泳動を行った。その後、このゲルを蛍光スキャナーで読み取り、その印刷映像とゲルとを重ね合わせて、ＨｉＣＥＰ法で目的としたバンドを切り出した。その後、ＨｉＣＥＰ法と同様なＰＣＲプライマーにより、切り出したバンド（ＤＮＡ）をＰＣＲ増幅し、その産物を、ダイレクトシーケンス法（ＡＢＩ３１００、Applied Biosystem社製）により、各７１個のｃＤＮＡの塩基配列を特定した。
【００４０】
〈２次スクリーニング〉
２次スクリーニングにおいて、１次スクリーニングにより特定された７１個の遺伝子の内から、シスプラチン非存在下と比較して、シスプラチン存在下で発現量が増加する遺伝子を特定した。これはシスプラチン存在下で発現量が増加する遺伝子が、シスプラチン耐性Ｃ１３腫瘍細胞において、真に、特異的に発現する遺伝子であるとの知見に基づくものである。以下、２次スクリーニングの手順に従い説明する。
【００４１】
シスプラチン耐性Ｃ１３細胞をヌードマウスの背部皮下に移植（１匹当たり５×１０６個）して形成された腫瘍（８週間成長後、生理食塩水を腹腔へ投与）より得られたシスプラチン耐性Ｃ１３腫瘍細胞（以下、Ｃ１３（−））と、シスプラチン耐性Ｃ１３細胞をヌードマウスの背部皮下に移植して形成され、かつシスプラチンを投与（８週間後に、マウスの体重１ｇ当たり１５μｇを腹腔に投与）された腫瘍より得られたシスプラチン耐性Ｃ１３腫瘍細胞（以下、Ｃ１３（＋））とを用意し、これらよりtotalＲＮＡを抽出した（Ｃ１３（−）のtotalＲＮＡおよびＣ１３（＋）のtotalＲＮＡ）。これらのtotalＲＮＡの抽出方法は、上記において示したtotalＲＮＡの抽出方法と基本的に同様である。なお参考として、シスプラチン感受性２００８細胞をヌードマウスの背部皮下に移植（１匹当たり３×１０６個）して形成された腫瘍（３週間成長後、生理食塩水を腹腔へ投与）より得られたシスプラチン感受性２００８腫瘍細胞（以下、２００８（−））由来のtotalＲＮＡと、シスプラチン感受性２００８腫瘍細胞であって、シスプラチンを投与（３週間後に、マウスの体重１ｇ当たり１５μｇを腹腔に投与）した腫瘍細胞（以下、２００８（＋））由来のtotalＲＮＡとを同様にして用意した。
【００４２】
上記Ｃ１３（−）のtotalＲＮＡ、Ｃ１３（＋）のtotalＲＮＡ、２００８（−）のtotalＲＮＡ、２００８（＋）のtotalＲＮＡのそれぞれから、市販の専用キット（invitrogen社製、SuperScriptIII First-Strand Synthesis for RT-PCRキット、Cat.No.:18080-51）を用いて、それぞれのｃDNA溶液を調製した。以下、調製の手順を示す。
【００４３】
それぞれのtotalＲＮＡについて、totalＲＮＡを５μｇ、５０μＭのoligo(dT)20を１μｌ、10mMdNTP Mixを１μｌ用意し、それらをキットの所定容器に入れ、更に全体が１０μｌとなるようにＤＥＰＣ水を所定容器へ入れた。その後、６５℃で５分間インキュベートし、その後、氷上で急冷した（１分間）。急冷後、以下の組成からなる混合液を添加した。
【００４４】
〈混合液の組成〉
10×RT  buffer                                               ２μｌ
25mM    MgCl2                                                ４μｌ
0.1M    DTT                                                  ２μｌ
RNaseOUT(40U/μl)                                            １μｌ
SuperScriptIII RT(200U/μl)                                  １μｌ
【００４５】
上記組成の混合液を添加後、５０℃で６０分間インキュベートし、更に８５℃で５分間インキュベートした。その後、RNase H(１μｌ)を加え、３７℃で２０分間インキュベートして、ｃＤＮＡ溶液を得た（−２０℃で保存）。
【００４６】
上記のようにして得られた４種のｃＤＮＡ溶液について、リアルタイムＰＣＲ（ApplideBiosystems(ABI)社製 7500Fast Real Time PCR System; 7700Fast Real Time PCR System）を用いて解析を行った。解析の際、使用した混合液の組成を以下に示す。
【００４７】
〈リアルタイムＰＣＲ用混合液の組成〉
SYBR Green PCR Master Mix（ABI社製、品番4309155）         １０μｌ
Forward Primer (10pmol/μl)                              １．８μｌ
Reverse Primer (10pmol/μl)                              １．８μｌ
蒸留水                                                   ４．４μｌ
cDNA溶液                                                    １μｌ
【００４８】
解析に用いたForward Primer（以下、FP）およびReverse Primer（以下、RP）の配列は以下の通りである。
【００４９】
〈配列番号１用〉
ＦＰ(s2-2f): cggattggagtgtcttaacg（配列番号１８）
ＲＰ(s2-2r): cagccaccatagcaggaaca（配列番号１９）
【００５０】
〈配列番号２用〉
ＦＰ(s8-2f): ttccagttgactgcagagga（配列番号２０）
ＲＰ(s8-1r): tcgctaaacaggacggattt（配列番号２１）
【００５１】
〈配列番号３用〉
ＦＰ(s19-2f): tgtagatggcaggttgatgg（配列番号２２）
ＲＰ(s19-2r): ggttaggggtctgatgagca（配列番号２３）
【００５２】
〈配列番号４用〉
ＦＰ(b7-1f): cttactgaagtcgccaagca（配列番号２４）
ＲＰ(b7-1r): tgtgcgatatttgacccttg（配列番号２５）
【００５３】
〈配列番号５用〉
ＦＰ(s22-2f): cggagctgcaatctagtcct（配列番号２６）
ＲＰ(s22-2r): attcgccacagcttttcaat（配列番号２７）
【００５４】
〈配列番号６用〉
ＦＰ(s24n-2f): atgctgctgtgaaagtgtgc（配列番号２８）
ＲＰ(s24n-2r): caggctgggtttcttctctg（配列番号２９）
【００５５】
〈配列番号７用〉
ＦＰ(s43-1f): ggcaggaatgaaacaggaaa（配列番号３０）
ＲＰ(s43-1r): gatttcgttgaccccatcac（配列番号３１）
【００５６】
〈配列番号８用〉
ＦＰ(s47a-1f): ccgacctgaaaccatctctg（配列番号３２）
ＲＰ(s47a-1r): aagggctttctctcaatcct（配列番号３３）
【００５７】
〈配列番号９用〉
ＦＰ(s65-5f): gctcctggtcatcgagctgt（配列番号３４）
ＲＰ(s65-5r): ttgtctcgttccccttctgg（配列番号３５）
【００５８】
〈配列番号１０用〉
ＦＰ(b49-2f): tggagaagaaggtccctcaa（配列番号３６）
ＲＰ(b49-1r): gggcagggattagagtctcc（配列番号３７）
【００５９】
〈配列番号１１用〉
ＦＰ(b50-3f): ctatcactgctgggtgcaaa（配列番号３８）
ＲＰ(b50-3r): catcccatcaatcacagtgc（配列番号３９）
【００６０】
内部標準遺伝子として、ヒト型グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)と、ヒトβ−アクチン遺伝子を用いた。これらのリアルタイムＰＣＲ用プライマーの配列は、以下に示す通りである。
【００６１】
GAPDH（ＦＰ）：cggctactagcggttttacg（配列番号４０）
GAPDH（ＲＰ）：aagaagatgcggctgactgt（配列番号４１）
β−アクチン（ＦＰ）：aaaactggaacggtgaaggtg（配列番号４２）
β−アクチン（ＲＰ）：tgtgtggacttgggagagga（配列番号４３）
【００６２】
解析において用いた全てのプライマーは、合成ＤＮＡプライマー（日清紡績株式会社製）である。またリアルタイムＰＣＲの温度サイクルは、ステップ１：５０℃、２分間、ステップ２：９５℃、１０分間、ステップ３：９５℃、１５秒間、ステップ４：６０℃、１分間、ステップ５：ステップ３〜ステップ４を４０サイクル、である。
【００６３】
上記のようにして取得された遺伝子（配列番号１〜１１で示されるｃＤＮＡ）のリアルタイムＰＣＲの結果を図２〜図１２に示した。なお各図に示されるグラフにおいて、Ｃ１３Ｍは、Ｃ１３（−）であり、Ｃ１３Ｐは、Ｃ１３（＋）であり、２００８Ｍは、２００８（−）であり、２００８Ｐは、２００８（＋）である。何れの結果においても、遺伝子（配列番号１〜１１で示されるｃＤＮＡ）は、シスプラチン耐性卵巣腫瘍において特異的に発現する遺伝子であることが確認出来る。
【００６４】
本発明に係るシスプラチン耐性マーカーには、配列番号１〜１１に示される何れか１つの塩基配列を有するポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するポリヌクレオチドをも含む。ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、３７℃〜８０℃、０．０５〜５×ＳＳＣ及び０．１〜１０％ＳＤＳの条件、好ましくは５０〜７２℃、０．１〜２×ＳＳＣおよび０．２〜５％ＳＤＳの条件が挙げられる。
【００６５】
また本発明に係るシスプラチン耐性マーカーには、配列番号１〜１１に示される何れか１つの塩基配列を有するポリヌクレオチドの全部または一部の塩基配列と、相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドをも含む。ここで「相補的」とは、完全な相補配列を有する場合に限られず、少なくとも７０％以上、好ましくは少なくとも８０％以上、より好ましくは少なくとも９０％以上、さらに好ましくは少なくとも９５％以上の塩基配列上の相同性を有するものであれば良い。
【００６６】
〈シスプラチン耐性マーカー〉
本明細書において、シスプラチン耐性マーカーは、卵巣腫瘍がシスプラチン耐性であるか否かを診断するためのツールとして利用することが出来る。当該マーカーとしては、配列番号１〜１１に示される各塩基配列からなるポリヌクレオチドを使用しても良く、またそれらの相補配列からなるポリヌクレオチドを使用しても良い。当該マーカーとしては、各ポリヌクレオチドを一本鎖の形態で利用しても良く、また二本鎖の形態で利用しても良い。また配列番号１〜１１で示されるポリヌクレオチドを、一組のシスプラチン耐性卵巣腫瘍マーカー（群）として使用してもよい。また、配列番号１〜１１で示されるポリヌクレオチドの内、任意に複数個のポリヌクレオチドを選択し、それらを一組のシスプラチン耐性マーカー（群）として利用しても良い。
【００６７】
本発明において、シスプラチン耐性の診断は、被験者の生体組織、培養細胞等における配列番号１〜１１に示される少なくとも１つの遺伝子の発現の有無、または発現量（発現レベル）を評価することによって行われる。本発明に係るマーカーは、上記遺伝子の発現により生じるＲＮＡまたはそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に認識し増幅するためにプライマーとして、あるいは特異的に認識し、検出するプローブとして利用することが出来る。
【００６８】
本発明に係るポリヌクレオチドを、プライマーとして利用する場合には、通常、１５ｂｐ〜１００ｂｐ塩基、好ましくは１５ｂｐ〜５０ｂｐ、より好ましくは１５ｂｐ〜３５ｂｐ塩基の鎖長を有する。プローブとして用いる場合には、本発明に係るポリヌクレオチドの少なくとも一部または全部の配列を有するものであり、少なくとも１５ｂｐ〜全配列の塩基数の鎖長を有する。なおプローブとして用いる場合には、適宜、蛍光ラベル、放射線ラベル等のラベルが施されてもよい。ラベルの導入方法も公知の手法により行うことができる。
【００６９】
本発明に係るマーカーは、ノーザンブロット法、in situ ハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣＲ法等の特定の遺伝子を特異的に検出する公知の方法において、プライマーまたはプローブとして使用することが出来る。これらにおいて、本発明に係る遺伝子の発現の有無、または発現量を評価することが出来る。測定対象となる試料は、被験者の生体組織、培養細胞等から常法により採取したtotalＲＮＡであっても良いし、該ＲＮＡを基に調製される各種ポリヌクレオチドであっても良い。
【００７０】
本発明に係るマーカーを、マイクロアレイ（ＤＮＡチップ）と組み合わせることにより、シスプラチン耐性の評価を行うことが出来る。具体的には、本発明に係るマーカー（ポリヌクレオチド）を、プローブ（例えば、２５ｂｐの長さのプローブ）として用いることにより、上記評価を行うことができる。つまり、マイクロアレイに固定されたプローブに、生体組織等から採取したＲＮＡを基に調製される標識ＤＮＡまたはＲＮＡをハイブリダイズさせ、該ハイブリダイズによって形成された上記プローブ（本発明に係るマーカー）と標識ＤＮＡまたはＲＮＡとの複合体を、該標識ＤＮＡまたはＲＮＡの、標識を指標として検出することにより、生体組織等において、シスプラチン耐性に係る遺伝子の発現の有無または発現レベルを評価することができる。
【００７１】
〈シスプラチン耐性卵巣腫瘍の検出方法（診断方法）〉
本発明に係る検出方法は、被験者の生体組織、培養細胞等から常法により、試料を採取し、本発明に係るシスプラチン耐性の遺伝子の発現の有無、発現量（レベル）を検出し、検出結果に基づいて卵巣腫瘍（細胞）のシスプラチン耐性（感受性）の診断を行うものである。なお試料としては、totalＲＮＡであっても良いし、該ＲＮＡを基に調製される各種ポリヌクレオチドであっても良い。
【００７２】
本発明に係る検出方法（診断方法）は、以下に示す工程を含む。（１）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドと、本発明に係るシスプラチン耐性卵巣腫瘍マーカーとを結合させる工程。（２）該シスプラチン耐性卵巣腫瘍マーカーに結合した生体試料由来のＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを、該シスプラチン耐性卵巣腫瘍マーカーを指標として測定する工程。（３）該測定の結果に基づいて、シスプラチン耐性卵巣腫瘍であるか否かを判断する工程。
【００７３】
ここで、工程（２）で用いられるマーカーとしては、配列番号１〜１１に示される塩基配列の内、少なくとも１つのポリヌクレオチドおよび／または該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを基にして設計されるプライマーまたはプローブが利用される。
【００７４】
例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法を利用して検出する場合には、本発明に係るマーカーをプライマーとして利用することになる。この方法によれば、本発明に係るシスプラチン耐性の遺伝子の発現の有無や発現量を検出、測定することができる。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明のシスプラチン耐性マーカーは、ヒト卵巣ガンがシスプラチン耐性であるか否かの判断を可能とする。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】ＨｉＣＥＰ法の手順を示すフローチャートである。
【図２】リアルタイムＰＣＲにおける配列番号１の遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図３】リアルタイムＰＣＲにおける配列番号２の遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図４】リアルタイムＰＣＲにおける配列番号３の遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図５】リアルタイムＰＣＲにおける配列番号４の遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図６】リアルタイムＰＣＲにおける配列番号５の遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図７】リアルタイムＰＣＲにおける配列番号６の遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図８】リアルタイムＰＣＲにおける配列番号７の遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図９】リアルタイムＰＣＲにおける配列番号８の遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図１０】リアルタイムＰＣＲにおける配列番号９遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図１１】リアルタイムＰＣＲにおける配列番号１０の遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図１２】リアルタイムＰＣＲにおける配列番号１１の遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図１】
2007295822.tif 000002
【図２】
2007295822.tif 000003
【図３】
2007295822.tif 000004
【図４】
2007295822.tif 000005
【図５】
2007295822.tif 000006
【図６】
2007295822.tif 000007
【図７】
2007295822.tif 000008
【図８】
2007295822.tif 000009
【図９】
2007295822.tif 000010
【図１０】
2007295822.tif 000011
【図１１】
2007295822.tif 000012
【図１２】
2007295822.tif 000013
【配列表】
2007295822000001.app