(57)【要約】本明細書ではレンチウイルスワクチンおよび診断並びに同一物を製造および使用する方法を開示し、これを安全に用いてレンチウイルス、例えばウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）により惹起される感染および／または疾患からの免疫を哺乳動物に効果的に提供することができ、ワクチンにより、ワクチン接種したおよびワクチン接種していないが暴露されている哺乳動物、とりわけウマを区別できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビボでの複製能が欠如しているレンチウイルスキメラを含むレンチウイルスにより惹起される疾患および／または疾患を防御するワクチン。
【請求項２】
レンチウイルスでの遺伝子欠失により、インビボでの複製能が欠如している請求項１のワクチン。
【請求項３】
該レンチウイルスがウマ伝染性貧血ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）からなる群から選択される請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
該遺伝子欠失がカプシド抗原の発現を阻害する１つまたはそれ以上の遺伝子内にある請求項２に記載のワクチン。
【請求項５】
遺伝子欠失がｇａｇ遺伝子の部分、ｇａｇ遺伝子の全ておよびｇａｇ遺伝子の発現を制御する遺伝子からなる群から選択されるメンバーの欠失である請求項４に記載のワクチン。
【請求項６】
該レンチウイルスキメラがさらにインビトロでの複製能が欠如している請求項１に記載のワクチン。
【請求項７】
該レンチウイルスキメラが細胞系をトランスフェクトすることにより大量に産生される請求項１に記載のワクチン。
【請求項８】
レンチウイルスキメラがレンチウイルスにより惹起される疾患および／または感染に対して哺乳動物を安全に免疫し、さらにワクチン接種された、ワクチン接種されていないおよび野生型に暴露された哺乳動物を区別することを可能にする請求項１に記載のワクチン。
【請求項９】
レンチウイルスキメラがＥＩＡＶから誘導され、これがＥＩＡＶにより惹起される疾患および／または感染に対してウマ科動物を安全に免疫し、ここでワクチンがワクチン接種された、ワクチン接種されていないおよび野生型に暴露されたウマ科動物を区別することを可能にする請求項１に記載のワクチン。
【請求項１０】
キメラがｐ２６抗原発現能を欠如するＥＩＡＶから誘導される請求項９に記載のワクチン。
【請求項１１】
ｇａｇ遺伝子における欠失の結果によってｐ２６抗原発現能の欠如がおこる請求項１０のワクチン。
【請求項１２】
遺伝子欠失がｇａｇ遺伝子の部分、ｇａｇ遺伝子の全ておよびｇａｇ遺伝子の発現を制御する遺伝子からなる群から選択されるメンバーの欠失である請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１３】
さらにアジュバントを含む請求項９のワクチン。
【請求項１４】
ＥＩＡＶが不活性化されている請求項９に記載のワクチン。
【請求項１５】
不活性化されたＥＩＡＶおよびアジュバントを含む請求項９に記載のワクチン。
【請求項１６】
ＥＩＡＶレンチウイルスキメラがＥＩＡＶのｇａｇ遺伝子の欠失を含み、さらに欠失された領域に別のレンチウイルスｇａｇ遺伝子の挿入を含む請求項９に記載のワクチン。
【請求項１７】
挿入される遺伝子がｐ３０を発現するビスナウイルスから誘導される請求項１６に記載のワクチン。
【請求項１８】
外来性遺伝子が遺伝子欠失領域に挿入され、該挿入された遺伝子がワクチン接種された哺乳動物において使用するための診断手段を提供し、ここで欠失された遺伝子に対する抗体が野生型ＥＩＡＶに暴露されたウマにおいて見出される、遺伝子欠失ＥＩＡＶマーカーワクチンを含む、ＥＩＡＶにより惹起される疾患および／または感染からウマを感染防御するためのワクチン。
【請求項１９】
請求項１８の遺伝子欠失領域に挿入された外来性遺伝子を検出する診断試験。
【請求項２０】
請求項１６の遺伝子欠失領域に挿入された外来性遺伝子により産生される生成物に対する抗体を検出する診断試験。
【請求項２１】
ウマ科動物が安全にワクチン接種され、コギンズ試験またはｐ２６抗体を測定するいずれか別の試験で抗体陽転しないで疾患および／または感染を防御することを可能にするＥＩＡＶワクチン。
【請求項２２】
ワクチンが遺伝子欠失ＥＩＡＶを含み、該遺伝子欠失ＥＩＡＶによりｐ２６の発現能を欠如しており、これを用いてワクチン接種されたウマ科動物をワクチン接種されていないまたは感染したウマ科動物から区別できる、ＥＩＡＶからウマ科動物を有効におよび安全に免疫するワクチン。
【請求項２３】
ワクチンが、外来性遺伝子が遺伝子欠失の領域に挿入された遺伝子欠失ＥＩＡＶを含有し、ここで挿入された遺伝子がマーカーおよび／またはＥＩＡＶ以外の生物により惹起される疾患からの感染防御を提供する、ＥＩＡＶを含む生物により惹起される疾患および／または感染からウマを感染防御するためのワクチン。
【請求項２４】
さらにアジュバントを含む請求項１のワクチンを哺乳動物に投与することを含む、ＥＩＡＶにより惹起される疾患に対して該哺乳動物を免疫する方法。
【請求項２５】
１）レンチウイルスからｇａｇ遺伝子の全てまたは部分を欠失して、欠失領域を提供すること；
２）異なるレンチウイルスからのｇａｇ遺伝子を、得られた欠失領域に挿入してキメラを作製すること；
３）得られたキメラで組織培養物をトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞培養物を産生すること；
４）トランスフェクトされた細胞培養物を成長させること；
５）トランスフェクトされた細胞培養物を収穫すること；
６）収穫された細胞培養物を場合によって不活性化すること；および
７）収穫された細胞培養物を場合によってアジュバント処理すること；
を含むレンチウイルスワクチンを調製する方法。
【請求項２６】
ｇａｇ遺伝子の全てまたは部分が欠失されているレンチウイルスがＥＩＡＶである請求項２５の方法。
【請求項２７】
異なるレンチウイルスがビスナウイルスである請求項２５の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明はレンチウイルスにより惹起される疾患の臨床上の徴候および／または感染からの免疫を提供するワクチン組成物に関する。より具体的には、本発明はウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）による疾患の臨床上の徴候および／または感染からの免疫を提供するウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）ワクチン組成物に関し、該組成物によりワクチン接種したおよびワクチン未接種で暴露されてまたは疾患を患っている哺乳動物を診断により区別でき、ｐ２６特異的抗体を検出するコギンズ試験またはその他の類似の試験を用いてワクチン接種した動物が陰性であると判断できる。
【０００２】
先行技術の簡単な説明
レンチウイルスはヒト（ＨＩＶ）、ウマ（ＥＩＡ）、ネコ（ＦＩＶ）、ウシ（ＢＩＶ）およびサル（ＳＩＶ）などの多くの型の哺乳動物における持続感染および慢性疾患を引き起こすレトロウイルスのサブファミリーである。その疾患は全て血液感染により伝播する。ＥＩＡＶは全世界的にウマの持続感染および慢性疾患を惹起する。ＥＩＡＶではウイルス粒子を担持するハエおよびその他の昆虫を噛むことによりあるウマから別のウマへと血液感染がおこる。感染したウマの最初の疾患サイクル（臨床症状の発現）は通常ウイルスに暴露された後４２日以内に生じる。最初のサイクルは通常ＥＩＡの急性段階と称され、発熱、血小板減少症、食欲減退、抑うつおよび血漿高レベルのウイルス血症で特定される。貧血は通常この段階では検出されない。この最初の発熱性の症状発現は通常１から５日後に観察され、血漿随伴ウイルス量が劇的に低下することにより起こる。急性段階後、臨床上正常のままの動物もいるが、重篤な貧血により発熱、血小板減少症、浮腫および劇的な体重減少、および死亡を伴う疾病の複合発作を起こす動物もいる。Ｐａｙｎｅら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６１：３２１−３３１（１９８７）（出展明示により本明細書の一部とする）の報告によれば、レンチウイルスによる持続感染の例としてはＥＩＡＶで示されるように、ヌクレオチド配列データがレンチウイルスゲノムの変異率が高いことを示している。ＥＩＶＡ感染では、一般に持続感染中に中和抗体が新規の抗原性ウイルス変異体を選別するのを補助すると考えられている。また、ＥＩＶＡ感染では血清学的に区別されるＥＩＶＡ変異体は恐らく無作為にウイルスゲノム変異を起こす免疫選別強制力により出現する。いずれかの特別な理論に縛られることなく、疾患の臨床徴候をそれ以上示さないウマは、ウイルスおよびその既知の変異体に対して防御可能なほど免疫応答が発達していると考えられている。
【０００３】
レトロウイルスのレンチウイルスサブファミリーのメンバーであるＥＩＡＶは病原性、免疫学、ワクチン学、ＨＩＶの処置および予防のモデルとして有用である。血中抗体試験により測定されるように（コギンズ試験または類似のｐ２６検出試験）ＥＩＶＡへの暴露が示されたウマは屠殺かまたは厳密な隔離のいずれかを必要とするので疾患はそれ自体重要である。コギンズ試験はとりわけ米国に輸入または米国から輸出されるウマの施行試験に全世界的に広く用いられている。従って、有効なＥＩＡＶワクチンはウマをコギンズ試験またはｐ２６を検出するいずれか別の試験で抗体陽転しないことが重大である。従って、ＥＩＡＶに対する感染防御に有用なワクチンではｐ２６を発現する遺伝子の全てもしくは部分を欠失するかまたはレギュレーター遺伝子を欠失するかもしくは停止コドンもしくは外来遺伝子を挿入することによりその発現を阻害することが重要である。本明細書で記載する方法の使用により、有効かつウイルス感染から区別できる免疫応答を引き出すことができるその他のレンチウイルス（ＨＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶおよびＳＶ）のワクチンを提供することができると予測される。
【０００４】
その他のレンチウイルス、例えばＨＩＶ、ＢＩＶ、ＦＩＶおよびＳＩＶと同様ＥＩＡＶの遺伝学的構成ではそれは複合レトロウイルスと分類される。ＥＩＡＶゲノムは全てのレトロウイルスに共通のｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ規定遺伝子および３つのアクセサリー遺伝子（Ｓ１、Ｓ２およびＳ３）を含有する。ｇａｇ遺伝子はマトリックス抗原（ＭＡ）、カプシド抗原（ＣＡ）、ヌクレオカプシド（ＮＣ）およびｐ９として同定されるタンパク質と称されるウイルスのコアタンパク質をコードする。ｅｎｖ遺伝子はウイルスエンベロープタンパク質（ｇｐ９０およびｇｐ４５）をコードする。ｐｏｌ遺伝子はデオキシＵＴＰアーゼ（ＤＵ）、逆転写酵素（ＲＴ）およびインテグラーゼ（ＩＮ）と称する、ウイルスゲノムを複製する酵素をコードする。Ｓ１オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）は、全てのウイルス遺伝子の発現を刺激するウイルス長末端反復（ＬＴＲ）プロモーターエレメントに作用するウイルスＴａｔタンパク質、すなわち転写トランスアクチベーターをコードする。Ｓ３  ＯＲＦは、ウイルス構造遺伝子発現を制御するＲｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）と称するその標的ＲＮＡ配列と相互作用することにより作用する転写後アクチベーターであるＲｅｖタンパク質をコードしてウイルス構造遺伝子発現を制御する。Ｓ２遺伝子はＴａｔの第２のエクソンに直後の、Ｅｎｖタンパク質のアミノ末端と重複するｐｏｌ−ｅｎｖ遺伝子間領域に位置する（図１参照）。これは算定分子量７．２ｋＤａの６５個のアミノ酸タンパク質をコードする。ウイルス複製サイクルの後期でＴａｔ、Ｓ２タンパク質およびＥｎｖタンパク質を各々コードするトリシストロンｍＲＮＡのリボソームリーキースキャニングによりＳ２が合成されるようである。
【０００５】
ｇａｇコード化カプシド抗原（ＣＡ）またはｐ２６タンパク質はウイルスエンベロープに包まれ、ウイルスＲＮＡゲノムを含有するビリオンのカプシドシェルを含む。相同性ＣＡタンパク質はＨＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶおよびＳＩＶに存在し、また各々のｇａｇ遺伝子によりコードされる。前記したように、ｐ２６抗原に対する抗体の検出はコギンズ試験およびウマのＥＩＡを診断するために用いられる特定のその他の市販の試験に基づく。現在の規制ガイドラインに適合させるためにＥＩＡＶ  ｐ２６に対する血清抗体の検出に基づくこれらの診断アッセイではＥＩＡＶワクチンが抗体陽転を引き起こしてはならないことが重大である。ｐ２６抗原は、ワクチンにおける極めて少量のその存在が抗体応答を刺激し、診断アッセイにおいて抗体陽転し得る点で高度に抗原性である。ＥＩＡＶのプールからｐ２６抗原を抽出または削除する試みはワクチン製造には現実的ではなかった。従って、ｐ２６の発現に干渉するｇａｇ遺伝子、ｇａｇ遺伝子のセグメントの排除またはｐ２６の発現を制御する調節遺伝子の欠失もしくは不活性化によりそれを排除できると思われる。しかしながら、ｇａｇ遺伝子またはそのセグメントの欠失によりインビトロ（組織培養）またはインビボで複製できないＥＩＡＶ粒子が生成されることが発明者により決定された。従って、ｐ２６の発現を単純に欠失または阻害することにより、不可能でないにしても非現実的であるワクチン製造のためにＥＩＡＶを成長させる。
【０００６】
エンベロープタンパク質（Ｅｎｖ）は感染中の優性な免疫標的であるので、疾患からの感染防御および感染からの感染防御を提供するのに最適のタンパク質であると考えられる。疾患からの感染防御とはウイルスに暴露された哺乳動物が臨床徴候（発熱、昏睡、貧血、死亡等）を示さないが、その血液中にウイルス粒子を担持し、この粒子は逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応試験（ＲＴ−ＰＣＲ）により検出可能であることを意味する。感染からの感染防御とはウイルスに暴露された哺乳動物がＥＩＡの臨床徴候を示さないが、血液中にＲＴ−ＰＣＲ検出可能なウイルス粒子を含有しないことを意味する。ＥＩＡＶの主要なエンベロープタンパク質はｇｐ９０およびｇｐ４５である。これらはＥＩＡＶの感染防御抗原または感染防御成分と考えられている。感染防御成分なる用語は前記したような疾患からの感染防御または感染からの感染防御のいずれかを生み出す抗原を意味する。従って、いずれかの有効なレンチウイルスワクチンはレンチウイルスにより惹起される疾患から哺乳動物を有効に感染防御するレンチウイルスＥｎｖタンパク質（例えばｇｐ１２０、ｇｐ９０およびｇｐ４５）の量を含有することが重要である。ＥＩＡＶからの感染防御成分には非限定例としてはｇｐ９０およびｇｐ４５などがある。
【０００７】
Ｅｎｖタンパク質、とりわけＥＩＡＶのｇｐ９０およびｇｐ４５の精製によりワクチンを調製できることは明白であると思われる。実際にｇｐ９０およびｇｐ４５がＥＩＡＶから精製されている調製物を含むワクチンが試みられたが、成功には至らなかった。Ｉｓｓｅｌら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３３９８−３４０８、１９９２年６月）はｇｐ９０／ｇｐ４５ワクチンが相同性ＥＩＡＶ（サブユニットを対抗に用いたのと同一のＥＩＡＶ株から誘導した）により引き起こされた感染からポニーを防御したと報告している。しかしながら、これらのサブユニット含有ワクチンは変異性ＥＩＡＶ株に対する疾患または感染のいずれからもウマを防御しなかった。実際に後者では疾患徴候が増強された。サブユニットＥＩＡＶワクチンによる疾患の増強は対抗後に疾患を増強すると思われるＳＩＶおよびＦＩＶサブユニットワクチンでの知見をうらずけるものである。Ｉｓｓｅｒら（前出）は、サブユニット増強効果のためレンチウイルス（例えばＨＩＶ、ＦＩＶ、ＥＩＡ、ＢＩＶおよびＳＩＶ）のサブユニットワクチンを完全なものにすれば明らかに惹起を起こすと結論づけた。
【０００８】
Ｉｓｓｅｌら（前出）はまたウイルス全体のＥＩＡＶワクチンによる感染の予防をも報告している。しかしながら、このワクチンでウマをワクチン接種することによりコギンズ試験陽性（ｐ２６陽性）であるウマが産生する。前記したように、米国で実施されている撲滅計画によりｐ２６に関して試験して陽性であったウマは安楽死させるか厳密に隔離するかのいずれかである。加えて該ワクチンに含まれるウイルス量は１ミリグラムであり、商業的には現実的でない値である。従って、このウイルス全体ワクチンは法的な要求事項または商業化に適合しない。
【０００９】
ロバウイルスワクチンが中国により２０年以上用いられている。このワクチンはロバ白血球弱毒化ＥＩＡＶ感染細胞からの全ＥＩＡＶ遺伝物質および感染したロバからのロバ適合性ＥＩＡＶの末梢血のウイルスからのリボ核酸を用いてワクチンを発達させた（Ｘｉｎｈｕａ  Ｎｅｗｓ  Ａｇｅｎｃｙ、１９９９年５月６日参照）。予想されるように、このワクチンはワクチン接種したウマまたはその他のワクチン接種したウマ科の動物においてｐ２６陽性応答（コギンズ試験陽性）を生み出す。かかるワクチンはウマ科の動物がコギンズアッセイまたはその他のｐ２６特異抗体試験により試験されているこれらの国々では認められていない。加えて多くの国々で動物薬として適用される生ワクチンは認められていない。
【００１０】
レンチウイルスにより惹起される疾患または感染に対して哺乳動物、とりわけＥＩＡに対してウマ科の動物を免疫する有効で安全な方法がないこと、およびレンチウイルス疾患とりわけＨＩＶ、ＦＩＶおよびＥＩＡはこのような世界中に伝播した著名な疾患であるので、長い間かかるワクチンを調製することが必要とされている。
【００１１】
本発明のワクチンはレンチウイルスにより惹起される疾患から哺乳動物を有効におよび安全に免疫するワクチン組成物を提供する。本発明のワクチンはＥＩＡからウマ科の動物を感染防御し、ここでワクチン接種されたウマ科の動物は野生型の感染したウマ科の動物から区別でき、該ウマ科の動物はコギンズ試験で抗体陽転せず、インビボで複製しない。本発明により教示されるワクチンをＨＩＶ，ＦＩＶ、ＢＩＶよびＳＩＶのワクチンなどのいずれかのレンチウイルスワクチンの製造に使用できることは十分に想定される。
【００１２】
（図面の簡単な説明）
図１はＥＩＡＶＵＫと称するＥＩＡＶの概略図マップである。
【００１３】
図２は感染性クローンＥＩＡＶＵＫの環状マップである。
【００１４】
図３ａは分子クローンＥＩＡＶＵＫの直線状概略図である。
【００１５】
図３ｂはＣＭＶプロモーターを有する分子クローンＥＩＡＶＵＫの直線状概略図である。
【００１６】
図３ｃはＣＡ遺伝子を欠失した分子クローンｐＣＭＶＥＩＡＶＵＫの直線状概略図である。
【００１７】
図３ｄはカナマイシン抵抗性遺伝子（Ｋａｎｒ）で置換したアンピシリン抵抗性遺伝子（Ａｍｐｒ）を有する分子クローンｐＣＭＶＥＩＡＶＵＫΔＣＡの直線状概略図である。
【００１８】
図３ｅはｐ２６欠失プロウイルスクローンｐＣＭＶ．ΔＣＡ．ｎｅｏの直線状概略図である。
【００１９】
図４はｐ２６欠失プロウイルスクローンｐＣＭＶ．ΔＣＡ．ｎｅｏの環状マップである。
【００２０】
図５ａはＥＩＡＶＵＫ分子クローンの直線状概略図である。
【００２１】
図５ｂはＣＭＶプロモーターインサートを有するＥＩＡＶＵＫクローン（ＣＭＶＥＩＡＶＵＫ）の概略図である。
【００２２】
図５ｃはｐＣＭＶＥＩＡＶＵＫｖｉｓ２の概略図である。
【００２３】
図５ｄはカナマイシン抵抗性マーカーを含有するプロウイルスクローンの直線状概略図である。
【００２４】
図５ｅは最終的なｐＣＭＶＥＩＡＶＵＫＶｉｓ２．ｎｅｏプロウイル構築物の直線状概略図である。
【００２５】
図６は最終的なｐＣＭＶＥＩＡＶＵＫＶｉｓ２．ｎｅｏプロウイル構築物の環状マップである。
【００２６】
図７はＣＡ遺伝子／ＥＩＡＶ  ｐ２６のヌクレオチドおよびアミノ酸マップである。
【００２７】
図８はＣＡ遺伝子／ビスナ  ｐ３０のヌクレオチドおよびアミノ酸マップである。
【００２８】
図９はＥＩＡＶのｐ２６およびビスナウイルスのｐ３０間の相同性の比較である。
【００２９】
図１０ａはｇｐ９０およびｐ２６モノクローナル抗体をディテクターとして用いるｐ２６欠失クローン、ビスナキメラクローンおよびＥＩＡＶのサブクローンのウェスタンブロットである。
【００３０】
図１０ｂはｐ３０モノクローナル抗体をディテクターとして用いるいくつかのｐ２６欠失クローン、ビスナキメラクローンおよびＥＩＡＶのサブクローンのウェスタンブロットである。
【００３１】
図１１はｐＣＭＶＥＩＡＶＵＫ．Ｖｉｓ２ｎｅｏプロウイル構築物でトランスフェクトされたＥＤ細胞の種々サブクローンの逆転写酵素活性を示すグラフである。
【００３２】
（発明の概要）
本発明はレンチウイルスにより惹起される疾患および／または感染からの免疫を哺乳動物に作製するワクチン組成物を提供し、該組成物はインビボでウイルスの複製を阻害する遺伝子の欠失を含む。より具体的には、本発明はレンチウイルスがインビボでの複製能が欠如するが、レンチウイルス感染防御成分を保持したまま欠失を含むワクチンについて記載する。該ワクチンによりワクチン接種された、およびワクチン接種されていないが暴露されている哺乳動物の区別が可能になりワクチンとして哺乳動物に投与した場合に安全性および免疫を提供する。好ましくは該ワクチンは哺乳動物が安全にワクチン接種できるようにし、野生型レンチウイルスへの暴露からの感染防御を提供するレンチウイルスにおける少なくとも１つの欠失を包含する。本発明はさらにｇａｇ遺伝子における欠失、とりわけレンチウイルスがインビボまたはインビトロでカプシド抗原（ＣＡタンパク質）を発現不能にする欠失を有するレンチウイルスをさらに包含する。レンチウイルスの実例はウマ伝染性貧血ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）である。「安全」なる用語は本発明のワクチンでの哺乳動物のワクチン接種が、ワクチン接種された動物において感染、疾患またはいずれかその他の副作用を起こさないことを意味する。
【００３３】
本発明はまた外来の遺伝子が遺伝子を欠失した領域に挿入され、該挿入遺伝子がワクチン接種された哺乳動物で使用するための診断手段および感染からの外来性疾患からの感染防御能を提供するマーカーワクチンをも包含する。
【００３４】
好ましい実施形態では、本発明は哺乳動物をＥＩＡから効果的および安全に免疫するためのワクチンを包含し、該組成物は、該遺伝子欠失構築物がインビボでウイルス複製を阻害し、ＥＩＡＶ感染防御成分を保持しているがインビボでｐ２６の発現を阻害する遺伝子欠失したＥＩＡＶ構築物を含む。このようにワクチン接種されたウマはＥＩＡＶにより惹起される疾患から感染防御され、コギンズ試験またはｐ２６抗体を測定するいずれか別の試験で血清抗体陽転しない。本明細書で用いるＥＩＡなる用語はウマ伝染性貧血を意味し、ＥＩＡＶなる用語は疾患を引き起こすウマ伝染性貧血ウイルスを意味する。加えて該ＥＩＡＶワクチンは哺乳動物において臨床疾患を惹起することができず、またはウマを含む別の哺乳動物に伝播もしくは拡散することができない。
【００３５】
別の実施形態では、本明細書はＥＩＡＶにより惹起された疾患から安全および効果的に感染防御されるワクチン接種されたウマをワクチン接種されていないウマから該ワクチンにおける外来性遺伝子発現の検出により区別でき、ワクチン接種された動物において抗体を産生するマーカーワクチンを包含する。この外来性遺伝子または遺伝子産物を検出するための診断試験をも記載する。
【００３６】
本発明のより具体的な実施形態はｇａｇ遺伝子内の１つもしくはそれ以上の遺伝子欠失、ｇａｇＣＡ生成に及ぼす制御効果を有する遺伝子内での１つもしくはそれ以上の欠失、ｇａｇＣＡ遺伝子もしくはＣＡ生成を制御する遺伝子への１つもしくはそれ以上の停止コドンの挿入、またはｇａｇＣＡ遺伝子もしくはＣＡ生成を制御する遺伝子への外来性遺伝子の挿入によりｐ２６抗原発現能が欠如しているワクチンである。外来性遺伝子の挿入とは挿入された遺伝子がＥＩＡＶに随伴される遺伝子ではないことを意味する。該外来性遺伝子はＥＩＡＶ以外の生物から入手される。
【００３７】
加えて、ワクチンのＥＩＡＶは非限定例としてはｐ２６の発現に影響するｇａｇ遺伝子における欠失に限定されずに複数の欠失が含有されるような欠失を作製できると予測される。
【００３８】
最後に、該遺伝子欠失（欠失領域）は複合感染防御ワクチンを製造するために外来遺伝子を挿入するという潜在的な効果を果たしうると予測される。これは外来性遺伝子（例えばインフルエンザヘマグルチン遺伝子）を担持するＥＩＡワクチンでの１回ワクチン接種によりレンチウイルス疾患（例えばＨＩＶまたはＥＩＡ）および挿入した外来性遺伝子に随伴される疾患（例えばヒトまたはウマインフルエンザ）の双方から哺乳動物が感染防御され得ることを意味する。
【００３９】
（発明の詳細な説明）
本発明はＥＩＡＶ、ＨＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶおよびＳＩＶからなる群から選択されるレンチウイルスにより惹起される疾患に対して哺乳動物を有効におよび安全に免疫するためのワクチンを包含し、該組成物は遺伝子欠失レンチウイルス構築物を含む。本発明はインビボでレンチウイルスが複製する能力を欠如させ、レンチウイルス感染防御成分は保持している欠失を含むワクチンを包含する。レンチウイルス感染防御成分とはエンベロープに随伴される感染防御抗原を意味し、該抗原には非限定例としてｇｐ１２０、ｇｐ９０およびｇｐ４５などがある。本発明はカプシド抗原（ＣＡタンパク質）をインビボで発現できないレンチウイルスを包含する。
【００４０】
特異的制限エンドヌクレアーゼを用いて１つまたはそれ以上の遺伝子の全てまたは部分を除去することによりレンチウイルスゲノムに欠失を作ることができる。除去に好ましい遺伝子はカプシド抗原（ＣＡ）をコードする遺伝子である。ＰＣＲ、ライゲーションおよびＰＣＲクローニング（選択された遺伝子配列を欠失するために）を用いてかかる遺伝子欠失を行いうる。レンチウイルスの遺伝子配列および切断すべき遺伝子の配列が分かれば制限エンドヌクレアーゼを用いて遺伝子の特定の部分を除去することもできる。特異的制限エンドヌクレアーゼを用いてｇａｇ遺伝子全体または部分を除去できる。加えて、好ましくは５’末端で停止コドンを遺伝子に挿入でき、そこで停止コドンが遺伝子にそのＣＡタンパク質を発現させないようにする。さらに、別のレンチウイルスまたは非関連ウイルスからの外来性遺伝子を遺伝子欠失領域に挿入して複合感染防御ワクチンを作ることができる。後者の場合、本発明はＥＩＡＶ以外の生物、好ましくはウイルスからの感染防御抗原を発現する遺伝子を挿入するのに十分な大きさのＥＩＡＶゲノムの領域の欠失について記載している。従って、ウマインフルエンザＡ２またはＡ１からのヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子をｇａｇ  ＣＡ領域に挿入して、ＥＩＡＶのｇｐ９０およびｇｐ４５並びにＡ１およびＡ２ウマインフルエンザのＨＡを発現させることができる。これによりＥＩＡＶおよびウマインフルエンザウイルスにより惹起されるウマの疾患から感染防御できるワクチンが提供される。また、１、２および４型ウマヘルペスからの遺伝子をＥＩＡＶ構築物に挿入してＥＩＡＶおよびウマヘルペスウイルスにより惹起されるウマの疾患に対する感染防御を提供することができる。ＥＩＡＶに挿入される感染防御抗原をコードする遺伝子を有し得る別のウマウイルスには、非限定例としてはウマ動脈炎、脳脊髄炎ウイルス（イースタン、ウェスタン、ベネズエラおよびリフトバレー熱ウイルス）などがある。寄生虫（ウマ原虫脳脊髄炎すなわちＥＰＭを引き起こすサルコシスティス・ニューローナ（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ  ｎｅｕｒｏｎａ）、恐らくＥＰＭにも関連するネオスポラ・ヘヒューゲシ（Ｎｅｏｓｐｏｒａ  ｈｅｕｇｅｓｉ）、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）等）からの感染防御抗原をコードする遺伝子をＥＩＡＶ構築物に挿入してこれらの疾患に対して感染防御することもできる。最後に、ウマの細菌性疾患をコードする遺伝子には、非限定例としてはストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉおよびクロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ））などがあり、これをＥＩＡＶ構築物に挿入して多重疾患感染防御を提供することができる。ウイルス構築物により提供される免疫を増強するために免疫刺激タンパク質（免疫変調遺伝子）または糖タンパク質をコードする遺伝子さえも遺伝子欠失領域に挿入することができる。最後にマーカーワクチンを製造するためにウマ以外の遺伝子、例えばビスナウイルスからの遺伝子を欠失遺伝子領域に挿入することができる。該マーカーワクチンはワクチン接種したウマをワクチン接種していないかまたは感染したウマから区別するのに有用である。
【００４１】
広く報告されているように、レンチウイルスの遺伝子（例えばＣＡ遺伝子）の欠失および該ライブラリー遺伝子の挿入の方法はＰＣＲ、ライゲーションの技術およびＰＣＲクローニングの方法を利用する。
【００４２】
ＣＡオープン・リーディグ・フレーム（ＯＲＦ）の上流のプロモーター・レンチウイルスゲノムの領域を増幅するようにプライマーを設計する。さらなるプライマーを用いてＣＡの下流のプロモーター・レンチウイルスゲノムの領域を増幅する。増幅されたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動を用いて精製し、共にライゲーションする。上流フラグメントの５’プライマーおよび下流フラグメントの３’プライマーを用いてＰＣＲの最終ラウンドを実施し、続いてゲル精製する。最終産物はＣＡオープン・リーディグ・フレームの欠失を有する典型的な大きさのｇａｇ遺伝子を含む。ＰＣＲ産物をゲル精製し、特異的制限エンドヌクレアーゼで消化し、同一の制限酵素または同一のブラント末端を作る酵素で消化したプラスミドとライゲーションできるようにする。好ましくはライゲーションされたインサートをプロモーターおよびクローンの選別を可能にする遺伝子（例えば抗生物質抵抗性遺伝子）を含むレンチウイルスクローンに付加し、このようにプロモーター・レンチウイルスクローンを作製する。次いでプロモーター・レンチウイルスクローンをコンピテント細菌細胞に形質転換し、細菌コロニーを遺伝子の挿入に関してスクリーニングする。クローンを遺伝子シークエンスにより、ＣＡ領域が欠失しており、インサートが作られていることを確認できる。
【００４３】
感受性のある組織培養細胞をトランスフェクトし、液体を収穫し、液体をアジュバントと共に処方することにより、遺伝子欠失／遺伝子挿入構築物（本明細書ではキメラとも称する）を商業的に製造（大容量での製造）できる。該収穫された液体を技術分野で既知の失活剤、例えばホルマリン、バイナリー・エチレンイミン、ベータ・プロピオラクトン、チメロサールおよびプソラレンなどで場合によっては不活性化してもよい。遺伝子欠失／遺伝子挿入構築物とは、その欠失された遺伝子または部分が、非限定例としてはレンチウイルスまたはレンチウイルス以外の別のウイルスからの遺伝子により部分的にまたは全体的に置換されたレンチウイルスを意味する。該遺伝子欠失／遺伝子挿入構築物がインビトロで置換されない場合、トランスフェクション促進剤、例えばＤＥＡＥデキストラン、ジーンＰＯＲＴＥＲ（商標）（ジーン・セラピー・システムズ）等を用いて組織培養細胞をトランスフェクトして細胞ＤＮＡに必要なゲノム物質を組み込み、細胞にレンチウイルス抗原を産生させることができる。
【００４４】
トランスフェクション用に組織培養細胞を組織培養容器（例えばプレート）のウェルに播種し、トランスフェクション促進剤の存在下、遺伝子欠失構築物または遺伝子欠失／遺伝子挿入構築物に暴露し、インキュベートしてトランスフェクトさせ、次いで選択培地で積層する。選択培地ではトランスフェクトされていない細胞は生存できないが、トランスフェクトされた細胞の成長を阻止しない成分を含有するいずれかの栄養培地として定義される。このため、一般には該選択培地での成長を可能にするために遺伝子欠失構築物は抵抗性遺伝子のインサートを含有する。選択培地は抗生物質、抗微生物薬および選択的抗生物質を含有できる。一度トランスフェクトされた細胞が選択されて複製されると感染防御抗原の産生および欠失された遺伝子産物が発現しないことに関してこれらを試験する。次いでこれらの特性を示すこれらのクローンを最初の容器から細胞を除去することにより選択培地に広げて希釈し、さらに大きな容器に移し換える。例えば、最初のトランスフェクションを２４ウェル培養プレートで実施できる。クローンの選択の後、生存しているトランスフェクトされた細胞を６ウェルプレート、２５ｃｍ２フラスコ、７５ｃｍ２フラスコ、次いでローラーボトル（１７００ｃｍ２またはそれ以上）に継代する。トランスフェクトされた細胞は持続的にウイルス構築物を産生するが、これは安定したトランスフェクションまたは産生細胞を示している。トランスフェクション細胞クローンが安定であることが示された後、安定してトランスフェクトされたマスター細胞（種々の制御作用により持続的感染した細胞とも称する）をワーキング細胞およびプロダクション細胞に拡張するために調製することができる。ワーキング細胞はプロダクション細胞を調製するために用いられる細胞として定義される。プロダクション細胞はワクチンを製造するために用いられる。マスター細胞、ワーキング細胞およびプロダクション細胞は全て一般にトランスフェクションクローンの生存性および安定性を保持するために液体窒素中に保存される。
【００４５】
本発明の実施において、遺伝子欠失構築物を含むワクチンはインビボで、および恐らくインビトロでの複製能が欠如している。前記により理解されるように、この型の欠失によりインビトロで複製または成長不能となる場合、前記したようなトランスフェクションおよびクローニングが必要となる。
【００４６】
以下はインビボでカプシド抗原タンパク質（ＣＡまたはｐ２６）を発現できないレンチウイルスの説明であるが限定するものではない。ｐ２６が発現されないようなＣＡでの欠失はインビトロまたはインビボで複製できない遺伝子欠失構築物に至ることがＥＩＡＶで決定されている。この理由でかかるＣＡ欠失レンチウイルスが安定したトランスフェクション細胞系において産生されなければならないことが予測される。これは安定したトランスフェクション細胞系を産生するために前記のようにトランスフェクトされなければならないことを意味する。
【００４７】
本発明はさらに具体的にはｐ２６抗原発現能の欠如がｇａｇ遺伝子内の１つもしくはそれ以上の遺伝子欠失またはｇａｇ  ＣＡ産生に制御効果を有する遺伝子内の１つもしくはそれ以上の欠失、または１つまたはそれ以上の停止コドンの挿入または外来性遺伝子の挿入の結果である組成物を包含する。
【００４８】
加えて、ワクチン組成物中のＥＩＡＶは非限定例としてはｐ２６の発現に影響するｇａｇ遺伝子の欠失などの複数の欠失を含有するように別の欠失を作製できると予測される。最後に、該遺伝子欠失（欠失領域）は、外来性遺伝子を挿入する可能性のある点として提供され、複数の感染防御ワクチンおよび非常に重要なマーカー遺伝子であるＥＩＡＶの特徴を再現できると予測される。ワクチン接種を受ける哺乳動物において抗体を産生する外来性遺伝子を含有するワクチンがマーカーワクチンであり、該抗体は診断試験により検出され、ワクチン接種されたウマをワクチン接種されていないウマから区別する、およびワクチン接種されたウマを感染したウマから区別するのに用いられる。ＥＩＡＶでは、コギンズ試験または同等の試験でｐ２６と交差反応しない異なるレンチウイルスからのＣＡ遺伝子を挿入するのが好ましい。従って、異なるレンチウイルス、例えばビスナウイルスからのｐ３０遺伝子の挿入によりＥＩＡＶワクチンを哺乳動物、好ましくはウマのワクチン接種に使用することが可能になると予測される。該ウマはコギンズ試験またはｐ２６に対する抗体の存在を測定するいずれかその他の試験でｐ２６抗体を示さず、また酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫拡散試験、蛍光抗体試験（ＦＡ）または哺乳動物において抗体を検出するのに用いることができるいずれかその他の試験により検出できるｐ３０に対する抗体を示す。
【００４９】
前記したｇａｇ遺伝子欠失構築物はインビトロでは成長または複製しないと予測される。従って、製造目的で大量に産生するために、クローン化構築物を細菌細胞または哺乳動物細胞（組織培養）のいずれかにより発現できる。形質転換の方法は前記で簡単に記載したが実施例において詳細に記載する。安定してトランスフェクトされた組織培養細胞系（持続的感染したマスター細胞）の産生が好ましく、組織培養においてトランスフェクトされた哺乳動物細胞により達成される。ＥＩＡＶ構築のための好ましい技術は以下の実施例において記載する。
【００５０】
得られたｐ２６欠失構築物をワクチンに使用して効果的で安全にウマをＥＩＡＶから免疫することができ、該ワクチンは遺伝子欠失ＥＩＡＶ構築物を含み、ここで該遺伝子欠失はインビボでｐ２６の発現を阻害する。
【００５１】
本発明のワクチンウイルスをさらに失活剤、例えばホルマリン、ベータ・プロピオラクトン、バイナリー・エチレンイミン、トリメラソールまたは効果的にウイルスを不活性化するいずれかその他のもので処理することができる。かかる作用物質を０．００００１％から０．５％、好ましくは０．００００１％から０．１％、さらに好ましくは０．００００１％から０．０１％にわたる量で用いることができる。
【００５２】
加えて、アジュバントまたは免疫変調物質／免疫刺激物質をワクチンに加えてワクチンにより作られた免疫応答を増強することができる。アジュバントを重合体、例えばカルボポール（登録商標）基盤、ハブロゲン（登録商標）およびポリゲン（登録商標）、阻害共重合体、水中油例えばエムルシゲン（登録商標）またはエムルシゲン（登録商標）プラス、油中水、アルミニウム塩、脂質基盤、リポタンパク質、エンドトキシン基盤、およびその組み合わせからなる群に関して選択できる。免疫変調物質および免疫刺激物質には、非限定例としてはコリネバクテリア・ピオゲネスおよびその抽出物またはサブユニット、パラポックスウイルスおよびその抽出物またはサブユニット、インターフェロン産生を刺激する修飾生ウイルス、並びにサイトカインなどがある。本発明のワクチンをいずれかの経路で投与できる。例えば、これらを筋肉内、皮下、皮内、鼻腔内、経口、静脈内または腹腔内投与できる。ワクチンは筋肉内、皮下、経口、または鼻腔内で投与するのが好ましい。
【００５３】
別の抗原をワクチンに付加して多成分ワクチンを産生できる。このために、別のウイルス、細菌または寄生虫からの抗原をアジュバントまたはその他の賦形剤と共に処方し、次いで本発明のＥＩＡＶ構築物と組み合わせる。従って、本発明はウマインフルエンザ（Ａ１およびＡ２）、ウマヘルペスウイルス（サブタイプ１、２、３または４）、ウマ動脈炎ウイルス、イースタンウマ脳脊髄炎、ウェスタンウマ脳脊髄炎、ベネズエラウマ脳脊髄炎、リフトバレー熱ウイルス、サルコシスティス・ニューローナ（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ  ｎｅｕｒｏｎａ）、ネオスポラ・フゲシ（Ｎｅｏｓｐｏｒａ  ｈｕｇｅｓｉ）、トキソプラズマ・ゴンジ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、ギアルディア・ラムビア（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｉｌｉａ）、ストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｕｉ、）、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、クロストリジウム・ボツリナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）またはいずれかその他のウマ疾患産生物質から選択される抗原と組み合わせたＥＩＡＶ構築物を包含する。クロストリジウム・ボツリナムにはＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅおよび／またはＦ型を含んでよい。
【００５４】
最後に、診断試験を用いて欠失した遺伝子タンパク質に対する、挿入した遺伝子タンパク質に対する、または双方のタンパク質に対する抗体の存在または不在を測定することによりワクチン接種したウマをワクチン接種していないおよび／または感染したウマから区別することができる。また、ＰＣＲ基盤の診断試験を用いてウマからの体液または組織中の遺伝子または遺伝子配列の存在または不在を検出できるため、ウマがＥＩＡＶに感染したかまたは本発明の組成物でワクチン接種したかどうかを検出できる。最適な診断はウマにおけるｐ２６抗体の存在または不在を測定する。加えて、挿入された遺伝子がウマ以外の生物、例えばビスナウイルスに由来する場合にマーカーワクチンのタンパク質産物を測定できる。本明細書に記載する実施例にはビスナウイルスからのｐ３０遺伝子の挿入を含み、ここでｐ３０はワクチン接種されたウマでは検出できるがワクチン接種していないか、またはＥＩＡＶ感染したウマでは存在しない。
【００５５】
診断による区別を技術分野で既知のイムノアッセイ、抗体検出アッセイ（例えば間接的蛍光抗体、免疫拡散、寒天拡散、電気泳動）またはＰＣＲ基盤のアッセイを発展させることにより測定できる。イムノアッセイの実例は、血清、血液または組織中の特異的タンパク質に対する抗体を検出および／または定量する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。ＥＬＩＳＡ技術を用いて血液、血清または組織中のウイルス随伴抗原の存在または不在を検出することもできる。「ウイルス随伴抗原」とは遺伝子発現産物、例えばＥＩＡＶのｐ２６タンパク質またはビスナウイルスのｐ３０タンパク質すなわちｐ２６もしくはｐ３０遺伝子の場合、各々の存在または不在を意味する。ＰＣＲ基盤のアッセイを用いてウマの血液、血清または組織中の遺伝子または遺伝子配列の存在または不在を測定しており、従ってこれはウマが場合によって感染していたか、またはワクチン接種されていたことを示している。この特定の実施形態ではＥＬＩＳＡによりｐ２６またはｐ３０タンパク質に対する抗体の存在が検出される。ｐ２６抗体が試験されたウマに存在した場合、ウマがＥＩＡＶに感染していたことを示す。非機能的ｐ２６遺伝子を含有する遺伝子変異ＥＩＡＶ構築物でワクチン接種されているウマは血清中のｐ２６抗体を含有しない。ｐ３０遺伝子挿入を含む遺伝子変異ＥＩＡＶ構築物でワクチン接種されているウマは血清中のｐ３０抗体を含有する。このようにワクチン接種されたウマを感染したウマから区別できる。ＰＣＲ基盤アッセイを用いてウマの遺伝子配列の存在または不在を検出する。例えば、ウマが野生型ＥＩＡＶで感染している場合、これは野生型ｐ２６の遺伝子配列を含有する。しかしながら、遺伝子変異ＥＩＡＶを含むワクチンで免疫したウマ、とりわけここでｐ２６遺伝子が欠失または特異的変異を含むウマは野生型ｐ２６の遺伝子配列を含有しない。また別にｐ３０遺伝子挿入を含有する、遺伝子欠失ＥＩＡＶ構築物でワクチン接種しているウマはその血清中にｐ３０遺伝子配列を含有する。
【００５６】
本発明のこれらのおよびその他の実施形態を以下の非限定的な実施例によりさらに説明する。実施例および明細書全体で割合は特記しない場合重量である。
【００５７】
実施例１
ｐ２６欠失変異プロウイルスクローンの構築物をｐＣＭＶ．ΔＣＡ．ｎｅｏと称した：ＣＡ遺伝子の全てまたは部分の欠失が可能であるかどうかを決定するためにＥＩＡＶからｐ２６遺伝子全体を欠失することに決定した。Ｃｏｏｋら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７２（２）：１３８３−１３９３（１９９８）（これは出展明示により本明細書の一部とする）に記載されるＥＩＡＶＵＫをプロウイルスの誘導に分子クローン用いた。図２はＥＩＡＶＵＫ分子クローンの環状マップを示す。図３ａはこの実施例に記載される構築物に用いられる方法を示すための直線状概略図を示す。図６はＣＡ遺伝子の特異的配列およびそれがコードするＥＩＡＶのｐ２６のアミノ酸配列を示す。
【００５８】
ｐ２６欠失変異プロウイルスクローン（ｐＣＭＶ．ΔＣＡ．ｎｅｏ）の構築手順は以下のとおりであった。最初にＣＭＶプロモーターをＰＣＲ、ライゲーションおよびＰＣＲクローニングの過程を経て５’ＬＴＲ領域に挿入した。プライマーＣＭＶ３’ブラント（配列番号１）および５’ＣＭＶＢｓｓＨ（配列番号２）を用いてプラスミドｐＲＣ／ＣＭＶ（インビトローゲン）からＣＭＶプロモーターを増幅した。ＰＣＲ条件を薄壁０．５ｍｌＰＣＲチューブ（ＰＧＣサイエンティフィック）中以下のとおり設定した：ｄＨ２Ｏ  ４０．６μｌ、クローン化Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ１０Ｘ反応バッファー  ５μｌ、２５ｍＭ  デオキシ−Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ（ヌクレオチド）トリホスフェート（ｄＮＴＰ）混合物  ０．８μｌ、各プライマー（１００ｎｇ／μｌ）２．５μｌ、鋳型ＤＮＡ（１０ｎｇ／μｌ）１ｌ、クローン化Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μｌ、ストラッタジーン）２．０μｌ。増幅はハイベイドサーモサイクラー中で実施し、９４℃で２０分間、６０℃で２０秒間、７２℃で１分間の３０サイクルから構成された。類似の反応条件でプライマーＬＴＲブラント５’（配列番号３）およびＭＡ３’Ｔｔｈ（配列番号４）を用いてＭＡオープン・リーディグ・フレームを介する末端重複領域（Ｒ領域）の最後の３１塩基対を含むゲノムの部分を包含するＥＩＡＶＵＫクローンの領域を増幅した。ジーン・クリーン（バイオ１０１）を含む０．８％アガロースゲル上で２つのＰＣＲ産物（５０μｌ）をゲル精製した。２つの精製したＰＣＲ産物を個々のキナーゼ反応で以下のとおり設定した：ＤＮＡ  ５μｌ、ＡＴＰ  ２μｌ、１０Ｘ  タンパク質キナーゼバッファー（ニュー・イングランド・バイオラブズ）２μｌ、ｄＨ２Ｏ  １０μｌ、およびタンパク質キナーゼ１μｌ。反応産物を３７℃で２時間インキュベートした。得られたキナーゼ処理産物をクロロホルム抽出により精製し、エタノール沈殿させた。以下の反応混合物中、Ｔ４リガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ）を用いて得られたエタノール産物（３μｌ）を個々のブラント末端で共に一晩（１６℃）ライゲーションした：１０Ｘ  Ｔ４リガーゼバッファー１μｌ、ｄＨ２Ｏ  ２μｌ、およびＴ４リガーゼ  １μｌ。プライマーＣＭＶ５’ＢｓｓＨ（配列番号２）およびＭＡ３’Ｔｔｈ（配列番号４）を用いるＰＣＲの第２ラウンドで最終産物を増幅し、ＥＩＡＶＵＫクローンにクローン化した。反応条件は前記したとおりでありライゲーション混合物１μｌを使用した。この最終ＰＣＲ産物（５０μｌ）を再度０．８％  アガロースゲルでゲル精製した。精製したＰＣＲ産物を制限酵素ＢｓｓＨＩＩおよびＴｔｈ１１１Ｉを用いて以下の様式で消化した：ＰＣＲ産物１７μｌ、ＢｓｓＨＩＩ  １０Ｘバッファー（ＮＥＢ）２μｌ、およびＢｓｓＨＩＩ（ＮＥＢ）２μｌ、５０℃で２時間のインキュベーション、クロロホルム抽出およびエタノール沈殿。以下のように消化を完了させた：ＤＮＡ（ＢｓｓＨＩＩ消化）１６μｌ、１０Ｘ反応バッファー＃４（ＮＥＢ）２μｌ、Ｔｔｈ１１１Ｉ  ２μｌ、６５℃で３時間のインキュベーション。ＥＩＡＶＵＫクローン（５００ｎｇ）をＭＩｕＩ（ニュー・イングランド・バイオラブズ）で部分消化した。これは以下の���応混合物中３７℃で５分間のインキュベーションにより行った：１０Ｘ＃反応バッファー  １μｌ、制限酵素  １μｌ、ｄＨ２Ｏ  ２μｌおよび即座に氷に沈め、続いてゲル精製した。次いで適当な大きさのバンドを１０Ｘ＃４反応バッファー（ＮＥＢ）  １μｌ、制限酵素  １μｌおよびｄＨ２Ｏ  ２μｌからなる反応混合物中Ｔｔｈ１１１Ｉで完全に消化した。得られたフラグメントを０．８％  アガロースゲルでゲル精製した。１０Ｘ  Ｔ４リガーゼバッファー  １μｌ、ｄＨ２Ｏ  ２μｌおよびＴ４リガーゼ１μｌの混合物中Ｔ４リガーゼでプロモーターフラグメント（３μｌ）をＥＩＡＶＵＫクローン（３μｌ）にライゲーションした。得られたライゲーション産物（４μｌ）をコンピテントＤＨ５α細菌細胞（１００μｌ）に形質転換した。形質転換手順は：氷上３０分間のインキュベーション、４２℃で４５秒間の熱ショック、氷上２分間のインキュベーション、ＳＯＣブロス  ９００μｌの添加（２０％  バクト・トリプトン、５％  バクト酵母、０．５％  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  塩化マグネシウムおよび２０ｍＭ  グルコースを含有する培地サプリメント）、３７℃で１時間のインキュベーション、およびＬＢＡｍｐプレート上２００ｌのプレートからなる。クローンをシークエンスして図３ｂに概略を示すような正確なプロモーター整列を確認した。
【００５９】
ＰＣＲ、ライゲーション、クローニングのＰＣＲ法を用いてカプシド抗原（ＣＡ）配列を欠失させた。プライマーｇａｇ４４１（配列番号５）およびＭＡＴ（配列番号６）を用いてＣＡオープン・リーディグ・フレームの上流のＣＭＶＥＩＡＶＵＫゲノムと称する分子的に修飾されたＥＩＡＶの３９８ｂｐ領域を増幅した。ＰＧＣサイエンティフィック薄壁０．５ｍｌＰＣＲチューブ中以下のとおりＰＣＲ条件を設定した：ｄＨ２Ｏ  ４０．６μｌ、クローン化Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ１０Ｘ反応バッファー  ５μｌ、２５ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物  ０．８μｌ、各プライマー（１００ｎｇ／μｌ）２．５μｌ、鋳型ＤＮＡ（１０ｎｇ／μｌ）１μｌ、クローン化Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μｌ、ストラッタジーン）２．０μｌ。増幅はハイベイドサーモサイクラー中で実施した。類似の反応混合物中ＣＡコード化領域の下流のプライマーｐ９ｆ５’（配列番号７）およびｐ９ｆ３’（配列番号８）を用いてＣＭＶＥＩＡＶＵＫゲノムの３５７ｂｐ領域を増幅した。ジーン・クリーン（バイオ１０１）を含む０．８％アガロースゲル上でこれらの２つのＰＣＲ産物（５０μｌ）をゲル精製した。以下の反応混合物中、Ｔ４リガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ）を用いて２つの精製されたＰＣＲ産物（３μｌ）を共に一晩（１６℃）ライゲーションした：１０Ｘ  Ｔ４リガーゼバッファー１μｌ、ｄＨ２Ｏ  ２μｌ、およびＴ４リガーゼ  １μｌ。ｇａｇ４４１プライマー（配列番号５）およびｐ９ｆ３’（配列番号８）を用いてＰＣＲの最終ラウンドを実施した。ライゲーションされた配列は正確な配向にある場合、およそ７５５ｂｐのＰＣＲ産物を生じる。これは塩基対８４６−１５５０（ＥＩＡＶ塩基対相関、プラスミドではない）からのＣＡオープン・リーディグ・フレームを欠失している。ジーン・クリーンを含む０．８％アガロースゲル上でＰＣＲ産物をゲル精製した。以下の様式で精製されたフラグメントをＲｔｈ１１１ＩおよびＢｓｒＧＩで消化した：１５Ｉ  ＰＣＲ産物、２１  ＢＳＡ、１０Ｘバッファー＃２（ＮＥＢ）  ２ｌおよびＢｓｒＧＩ（ＮＥＢ）、３７℃で３時間のインキュベーション、クロロホルム抽出およびエタノール沈殿。以下のように消化を完了させた。ＤＮＡ（ＢｓｒＧＩ消化）１６μｌ、１０Ｘ反応バッファー＃４（ＮＥＢ）２μｌ、Ｔｔｈ１１１Ｉ  ２μｌ、６５℃で３時間のインキュベーションおよび前記したのと同一の様式でゲル精製。ＣＭＥＩＡＶＵＫクローンを同一の制限酵素で消化し、類似の形式でゲル精製した。１０Ｘ  Ｔ４リガーゼバッファー  １μｌ、ｄＨ２Ｏ  ２μｌおよびＴ４リガーゼ１μｌの混合物中Ｔ４リガーゼで２つのフラグメント（各３μｌ）を共にライゲーションし、コンピテントＤＨ５α細菌細胞（１００μｌ）に形質転換した。形質転換手順は：氷上３０分間のインキュベーション、４２℃で４５秒間の熱ショック、氷上２分間のインキュベーション、ＳＯＣブロス  ９００μｌの添加、３７℃で１時間のインキュベーション、およびＬＢＡｍｐプレート上２００μｌのプレートからなる。個々のクローンをインサートに関してスクリーニングした。クローンをシークエンスして図３ｃに概略図を示すようにＣＡ領域が完全に欠失したことを確認した。Δは欠失を同一化した。
【００６０】
元来のプロウイルスＤＮＡはアンピシリン抵抗性マーカー（Ａｍｐｒ）を担持した。これは哺乳動物で用いられるワクチンの理想的なマーカーではなかったので、以下の手順を用いてこれをカナマイシン抵抗性マーカー（Ｋａｎｒ）と置き換えた。プロウイルスＤＮＡをｐＬＧ３３９／ＳＰＯＲＴ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｇｅｎｅ  １２４：９３−９８（１９９３））と称するカナマイシン抵抗性ベクターにサブクローニングした。ベクターを制限酵素ＭＩｕＩおよびＥｃｏＲＩ（ニュー・イングランド・バイオラブズ）で消化した。またプロウイルスクローンをＥｃｏＲＩで十分に消化し、ＭＩｕＩで部分的に消化した。プラスミド（５００ｎｇ）を以下の反応混合物中、別個に３７℃で５分間のインキュベーションにより各々部分的に消化した：１０Ｘ  ＃１反応バッファー  ２μｌ、制限酵素（ＭＩｕＩ）  １μｌ、ｄＨ２Ｏ  １２μｌおよび即座に氷に沈め、続いてゲル精製した。次いで適当な大きさのバンドを１０Ｘ＃２反応バッファー  １μｌ、制限酵素  １μｌおよびｄＨ２Ｏ  ２μｌからなる反応混合物中ＥｃｏＲＩで完全に消化した。望ましいフラグメントをジーン・クリーンを含む０．８％  アガロースゲルでゲル精製した。以下の反応混合物中Ｔ４リガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ）でプロウイルスＤＮＡ（４μｌ）およびベクター（２μｌ）を一晩（１６℃）共にライゲーションした：１０Ｘ  Ｔ４リガーゼバッファー  １μｌ、ｄＨ２Ｏ  ２μｌおよびＴ４リガーゼ１μｌ。ライゲーション産物（４μｌ）をコンピテントＤＨ５α細菌細胞（１００μｌ）に形質転換した。形質転換手順は：氷上３０分間のインキュベーション、４２℃で４５秒間の熱ショック、氷上２分間のインキュベーション、ＳＯＣブロス  ９００μｌの添加、３７℃で１時間のインキュベーション、およびＬＢＫａｎプレート上２００μｌのプレートからなる。個々のクローンを適切なＭＩｕＩ部位へのインサートに関してスクリーニングした。図３ｄはＡｍｐの抵抗性マーカーがＫａｎの抵抗性マーカーにより置換されていることを表すこの構築物の概略図を示す。
【００６１】
真核細胞のクローンの選別を可能にするためにネオマイシン抵抗性マーカーを付加した。制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ（ニュー・イングランド・バイオラブズ）を用いてネオマイシン抵抗性マーカーを市販のベクターｐＲＣ／ＣＭＶ（インビトローゲン）から切除した。ｐＲＣ／ＣＭＶから切除した部分はネオマイシンオープン・リーディグ・フレーム全体およびＳＶ４０プロモーター、複製起点およびＳＶ４０ポリＡ認識配列を包含した。ｐＲＣ／ＣＭＶプラスミドＤＮＡ  ５００ｎｇ、１０Ｘ  ＃２反応バッファー  ２μｌ、ＢＳＡ  ２μｌ、ｄＨ２Ｏ  ２μｌおよび制限酵素各１μｌからなる反応混合物中３７℃で消化を行った。得られたカナマイシン抵抗性プロウイルスクローンを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａＩＩ（ギブコＢＲＬ）で消化した。ＳａＩＩ消化末端をＸｈｏＩ消化末端にライゲーションできる。以下の反応混合物中で消化を実施した：プロウイルスＤＮＡ  １μｇ、１０Ｘ  リアクト６バッファー、ＢＳＡ  ２μｌ、Ｈ２Ｏ  ２μｌ、および制限酵素各１μｌ。消化したネオマイシンフラグメントおよびプロウイルスクローンをジーン・クリーンを含む０．８％  アガロースゲルでゲル精製し、以下の反応混合物中Ｔ４リガーゼで１６℃で一晩共にライゲーションした：精製したプロウイルスＤＮＡ  ４μｌ、精製したネオマイシンインサートＤＮＡ  ３μｌ、１０Ｘ  Ｔ４リガーゼバッファー  １．５μｌ、ｄＨ２Ｏ  ５．５μｌおよびＴ４リガーゼ１μｌ。ライゲーションしたＤＮＡ（６μｌ）をコンピテントＤＨ５細菌細胞（１００μｌ）に形質転換した。形質転換手順は：氷上３０分間のインキュベーション、４２℃で４５秒間の熱ショック、氷上２分間のインキュベーション、ＳＯＣブロス  ９００μｌの添加、３７℃で１時間のインキュベーション、およびＬＢＫａｎプレート上２００μｌのプレートからなる。個々のクローンをインサートに関してスクリーニングした。ｐ２６欠失プロウイルスクローンｐＣＭＶ．ΔＣＡ．ｎｅｏの概略図を図３ｅに示し、環状マップを図４に示す。
【００６２】
実施例２
ビスナキメラプロウイルスクローンの構築物をｐＣＭＶ．Ｖｉｓ２．ｎｅｏと称した：外来性遺伝子をｇａｇ遺伝子のカプシド抗原領域（ＣＡ）に置き換え、恐らくｐ２６欠失を有する複製プロウイルスクローンを作製するために、ビスナウイルス、コギンズ試験で陽性の応答をしない別のレンチウイルスからのｐ３０遺伝子を挿入することに決定した。ＥＩＡＶのｐ２６のメカニズムと置き換えるためにｐ３０を適用できる場合、次いで複製プロウイルスクローンを産生できる。
【００６３】
実施例１のように、欠失したｐ２６領域に挿入したビスナのｐ３０を有するプロウイルスクローンの構築物のバックボーンはＥＩＡＶＵＫであった（Ｃｏｏｋら、前出）。この出発構築物の該略図を図５ａに示す。
【００６４】
このＥＩＡＶ構築物の調製手順は以下のとおりであった：前記で参照したとおり、ＰＣＲ、ライゲーション、ＰＣＲクローニングの方法によりＣＭＶプロモーターをＥＩＡＶＵＫの５’ＬＴＲ領域に挿入した。プライマーＣＭＶ３’ブラント（配列番号１）および５’ＣＭＶＢｓｓＨ（配列番号２）を用いてプラスミドｐＲＣ／ＣＭＶ（インビトローゲン）からＣＭＶプロモーターを増幅した。ＰＣＲ条件は薄壁０．５ｍｌＰＣＲチューブ中以下のとおり設定した：ｄＨ２Ｏ  ４０．６μｌ、クローン化Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ１０Ｘ反応バッファー  ５μｌ、２５ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物  ０．８μｌ、各プライマー（１００ｎｇ／μｌ）２．５μｌ、鋳型ＤＮＡ（１０ｎｇ／μｌ）１μｌ、クローン化Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μｌ、ストラッタジーン）２．０μｌ。増幅はハイベイドサーモサイクラー中で実施し、９４℃で２０分間、６０℃で２０秒間、７２℃で１分間の３０サイクルから構成された。類似の反応条件でプライマーＬＴＲブラント５’（配列番号３）およびＭＡ３’Ｔｔｈ（配列番号４）を用いてマトリックスオープン・リーディグ・フレームを介する部分的Ｒ領域を含むゲノムの部分を包含するＥＩＡＶＵＫクローンの領域を増幅した。ジーン・クリーン（バイオ１０１）を含む０．８％アガロースゲル上でＰＣＲ産物（５０μｌ）をゲル精製した。２つの精製されたＰＣＲ産物を個々のキナーゼ反応で以下のとおり設定した：ＤＮＡ  ５μｌ、ＡＴＰ  ２μｌ、１０Ｘ  タンパク質キナーゼバッファー（ニュー・イングランド・バイオラブズ）２μｌ、ｄＨ２Ｏ  １０μｌ、およびタンパク質キナーゼ１μｌ。反応産物を３７℃で２時間インキュベートした。キナーゼ処理産物をクロロホルム抽出により精製し、エタノール沈殿させた。以下の反応混合物中、Ｔ４リガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ）を用いて得られた産物（３μｌ）を共に一晩（１６℃）ライゲーションした：１０Ｘ  Ｔ４リガーゼバッファー１μｌ、ｄＨ２Ｏ  ２μｌ、およびＴ４リガーゼ  １μｌ。プライマーＣＭＶ５’ＢｓｓＨ（配列番号２）およびＭＡ３’Ｔｔｈ（配列番号４）を用いるＰＣＲの第２ラウンドで最終産物を増幅し、ＥＩＡＶＵＫクローンにクローン化した。反応条件は前記したとおりであり、ライゲーション反応物１μｌを使用した。
【００６５】
この最終ＰＣＲ産物（５０μｌ）を再度０．８％  アガロースゲルでゲル精製した。精製したＰＣＲ産物を制限酵素ＢｓｓＨＩＩおよびＴｔｈ１１１Ｉを用いて以下の様式で消化した：ＰＣＲ産物１７μｌ、ＢｓｓＨＩＩ  １０Ｘバッファー（ＮＥＢ）２μｌ、およびＢｓｓＨＩＩ（ＮＥＢ）２μｌ、５０℃で２時間のインキュベーション、クロロホルム抽出およびエタノール沈殿。以下のように消化を完了させた：ＤＮＡ（ＢｓｓＨＩＩ消化）１６μｌ、１０Ｘ反応バッファー＃４（ＮＥＢ）２μｌ、Ｔｔｈ１１１Ｉ  ２μｌ、６５℃で３時間のインキュベーション。ＥＩＡＶＵＫクローン（５００ｎｇ）をＭＩｕＩ（ニュー・イングランド・バイオラブズ）で部分消化した。これは以下の反応混合物中３７℃で５分間のインキュベーションにより行った：１０Ｘ＃反応バッファー  １μｌ、制限酵素  １μｌ、ｄＨ２Ｏ  ２μｌおよび即座に氷に沈め、続いてゲル精製した。次いで適当な大きさのバンドを１０Ｘ＃反応バッファー  １μｌ、制限酵素  １μｌおよびｄＨ２Ｏ  ２μｌからなる反応混合物中Ｔｔｈ１１１Ｉで完全に消化した。フラグメントを０．８％  アガロースゲルでゲル精製した。１０Ｘ  Ｔ４リガーゼバッファー  １μｌ、ｄＨ２Ｏ  ２μｌおよびＴ４リガーゼ１μｌの混合物中Ｔ４リガーゼでプロモーター（３μｌ）をＥＩＡＶＵＫクローン（３μｌ）にライゲーションした。ライゲーション産物（４μｌ）をコンピテントＤＨ５α細菌細胞（１００μｌ）に形質転換した。形質転換手順は：氷上３０分間のインキュベーション、４２℃で４５秒間の熱ショック、氷上２分間のインキュベーション、ＳＯＣブロス  ９００μｌの添加、３７℃で１時間のインキュベーション、およびＬＢＡｍｐプレート上２００μｌのプレートからなる。クローンをシークエンスして正確なプロモーター整列を確認した。図５ｂはＣＭＶプロモーターインサートを有するＥＩＡＶＵＫクローン（ＣＭＶＥＩＡＶＵＫ）の概略図である。
【００６６】
ビスナｐ３０カプシド配列の供給源はｐビスナクローンｐｕｃ９−４．９Ｖ２（Ｂｒａｕｎ，ＭＪら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１（１２）：４０４６−４０５４（１９８７））であった。以下の反応で制限酵素ＡｐａＩおよびＴｈ１１１Ｉを用いてビスナｐ３０（１μｇを含有する７μｌ）をクローンから切除した：ｄＨ２Ｏ  ４μｌ、１０Ｘ  ＃４反応バッファー（ＮＥＢ）  １．５μｌ、ＡｐａＩおよびＴｔｈ１１１Ｉ（ＮＥＢ）５μｌ、６５℃で２時間のインキュベーション；ＡｐａＩをさらに０．５μｌ反応混合物に添加し、室温で一晩（２５℃）インキュベートした。望ましいフラグメントをジーン・クリーンを含む０．８％  アガロースゲルでゲル精製した。以下の反応混合物中ＣＭＶＥＩＡＶＵＫクローン（１μｇを含有する５μｌ）をＢＩｐＩ（Ｂｐｕ１１０２ＩのＮＥＢ酵素）およびＴｔｈ１１１Ｉ（ＮＥＢ）で消化した：１０Ｘ  ＃４バッファー（ＮＥＢ）  １．５μｌ、およびＢｓｒＧＩ（ＮＥＢ）  １μｌ、ｄＨ２Ｏ  ７．５μｌ、３７℃で３時間のインキュベーション、クロロホルム抽出、およびエタノール沈殿。以下のとおり消化を完了した：（ＢＩｐＩ消化）１５μｌ、１０Ｘ反応バッファー＃４（ＮＥＢ）２μｌ、Ｔｔｈ１１１Ｉ  ２μｌ、ｄＨ２Ｏ  ２μｌ、６５℃で３時間のインキュベーション。消化したフラグメントをジーン・クリーンを含む０．８％  アガロースゲルでゲル精製した。以下の混合物中Ｔ４リガーゼで２つのフラグメントをライゲーションした：１０Ｘ  Ｔ４リガーゼバッファー  １μｌ、ｄＨ２Ｏ  ２μｌおよびＴ４リガーゼ１μｌの混合物中ＤＮＡフラグメント（各３μｌ）をＴ４リガーゼで共にライゲーションした。ライゲーション産物（４μｌ）をコンピテントＤＨ５α細菌細胞（１００μｌ）に形質転換した。形質転換手順は：氷上３０分間のインキュベーション、４２℃で４５秒間の熱ショック、氷上２分間のインキュベーション、ＳＯＣブロス  ９００μｌの添加、３７℃で１時間のインキュベーション、およびＬＢＡｍｐプレート上２００μｌのプレートからなる。個々のクローンをインサートに関してスクリーニングし、ジデオキシシークエンスおよびＡＢＩ自動シークエンサーを用いてシークエンスし、ビスナｐ３０オープン・リーディグ・フレーム全体がプロウイルスクローンに正確におよびフレーム内に挿入されたことを確認した。図５ｃはＣＭＶＥＩＡＶＵＫ．ｖｉｓ２の概略図を示す。
【００６７】
プロウイルスＤＮＡをｐＬＧ３３９／ＳＰＯＲＴ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｇｅｎｅ  １２４：９３−９８（１９９３））（出展明示により本明細書の一部とする）と称するカナマイシン抵抗性ベクターにサブクローニングした。ベクターをＭＩｕＩで部分的に、およびＥｃｏＲＩ（ニュー・イングランド・バイオラブズ）で十分に消化した。またプロウイルスクローンをＥｃｏＲＩで十分に、およびＭＩｕＩで部分的に消化した。プラスミド（５００ｎｇ）を以下の反応混合物中、別個に３７℃で５分間のインキュベーションにより各々部分的に消化した：１０Ｘ  ＃２反応バッファー  ２μｌ、制限酵素  １μｌ、ｄＨ２Ｏ  １２μｌおよび即座に氷に沈め、続いてゲル精製した。次いで適当な大きさのバンドを１０Ｘ＃２反応バッファー  １μｌ、制限酵素  １μｌおよびｄＨ２Ｏ  ２μｌからなる反応混合物中ＥｃｏＲＩで完全に消化した。望ましいフラグメントをジーン・クリーンを含む０．８％  アガロースゲルでゲル精製した。以下の反応混合物中Ｔ４リガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ）でプロウイルスＤＮＡ（４μｌ）およびベクター（２μｌ）を一晩（１６℃）共にライゲーションした：１０Ｘ  Ｔ４リガーゼバッファー  １μｌ、ｄＨ２Ｏ  ２μｌおよびＴ４リガーゼ１μｌ。ライゲーション産物（４μｌ）をコンピテントＤＨ５α細菌細胞（１００μｌ）に形質転換した。形質転換手順は：氷上３０分間のインキュベーション、４２℃で４５秒間の熱ショック、氷上２分間のインキュベーション、ＳＯＣブロス  ９００μｌの添加、３７℃で１時間のインキュベーション、およびＬＢＫａｎプレート上２００μｌのプレートからなる。個々のクローンを適切なＭＩｕＩ部位へのインサートに関してスクリーニングした。図５ｄはＫａｎの抵抗性マーカーを含有するプロウイルスクローンの概略図を示す。
【００６８】
ＥＩＡＶプロウイルス構築物をさらに市販により入手しやすくするために、カナマイシン抵抗性マーカーをネオマイシン抵抗性マーカーと置き換えた。制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩを用いて市販のベクターｐＲＣ／ＣＭＶ（インビトローゲン）からネオマイシン抵抗性マーカーを切除した。これははネオマイシンオープン・リーディグ・フレーム全体およびＳＶ４０プロモーター（配列番号９）、複製起点（配列番号１０）およびＳＶ４０ポリＡ認識配列（配列番号１１）を包含した。ｐＲＣ／ＣＭＶプラスミドＤＮＡ  ５００ｎｇ、１０Ｘ  ＃２反応バッファー  ２μｌ、ＢＳＡ  ２μｌ、ｄＨ２Ｏ  ２μｌおよび制限酵素各１μｌからなる反応混合物中３７℃で消化を行った。新規のカナマイシン抵抗性プロウイルスクローンを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａＩＩ（ギブコＢＲＬ）で消化した。ＳａＩＩ消化末端をＸｈｏＩ消化末端にライゲーションできる。以下の反応混合物中で消化を実施した：プロウイルスＤＮＡ  １μｇ、１０Ｘ  リアクト６バッファー、ＢＳＡ  ２μｌ、Ｈ２Ｏ  ２μｌ、および制限酵素各１μｌ。消化したネオマイシンフラグメントおよびプロウイルスクローンをジーン・クリーンを含む０．８％  アガロースゲルでゲル精製し、以下の反応混合物中Ｔ４リガーゼで１６℃で一晩共にライゲーションした：精製したプロウイルスＤＮＡ  ４μｌ、精製したネオマイシンインサートＤＮＡ  ３μｌ、１０Ｘ  Ｔ４リガーゼバッファー  １．５μｌ、ｄＨ２Ｏ  ５．５μｌおよびＴ４リガーゼ１μｌ。ライゲーションしたＤＮＡ（６μｌ）をコンピテントＤＨ５α細菌細胞（１００μｌ）に形質転換した。形質転換手順は：氷上３０分間のインキュベーション、４２℃で４５秒間の熱ショック、氷上２分間のインキュベーション、ＳＯＣブロス  ９００μｌの添加、３７℃で１時間のインキュベーション、およびＬＢＫａｎプレート上２００μｌのプレートからなる。個々のクローンをインサートに関してスクリーニングした。図５ｅはｐＣＭＶＥＩＡＶＵＫ．Ｖｉｓ２．ｎｅｏプロウイルス構築物（本明細書後記ではｐＣＭＶ．Ｖｉｓ２．ｎｅｏと称する）の概略図を示し、図６はこの構築物の最終環状マップを示す。
【００６９】
実施例１に記載する標準的な複製アッセイを用いてｐＣＭＶ．Ｖｉｓ２．ｎｅｏプロウイルス構築物をそのインビトロ複製能力に関して試験した。プロウイルスクローンｐＣＭＶ．ΔＣＡ．ｎｅｏと同様、このｐＣＭＶ．Ｖｉｓ２．ｎｅｏプロウイルス構築物はインビトロで複製せず、インビボで複製しないと予測された。従って、トランスフェクション細胞系（持続的感染細胞系）を開発することに決定した。
【００７０】
実施例３
細胞系のトランスフェクションおよび選別：ウマ皮膚細胞系のトランスフェクション
ｐ２６欠失プロウイルスクローンｐＣＭＶ．ΔＣＡ．ｎｅｏおよびプロウイルス構築物ｐＣＭＶ．Ｖｉｓ２．ｎｅｏを用いて野生型ＥＩＡＶＵＫ．に類似の様式で細胞をトランスフェクトする能力を評価した。手順は以下のとおりであった。
【００７１】
プロウイルスクローンまたはプロウイルス構築物ＤＮＡ１μｇを用いてウマ皮膚（ＥＤ）細胞系（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ６２８８）をトランスフェクトした。１０％  ウシ胎児血清、ペニシリン１００単位／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン（ギブコＢＲＬ  １５１４０−１２２）および２ｍｍ  Ｌ−グルタミン（ギブコＢＲＬ  ２５０３０−０８１）を加えたアール塩を含む完全成長最小必須培地（ＥＭＥＭ）２ｍｌ中ウェルあたり２から４×１０５ＥＤ細胞を播種した６ウェル組織培養プレート中でＥＤ細胞系を成長させた。プレートをＣＯ２インキュベーター中３７℃でおよそ１６から２４時間、細胞が全面成長の５０から８０％になるまでインキュベートした。各々のトランスフェクションに関してＤＮＡ  １μｇをＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ還元血清培地（ギブコＢＲＬ  １８３２４−０１２）１００μｌに希釈し、リポフェクタミン試薬（ギブコＢＲＬ  １８３２４−０１２）１０μｌをＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ還元血清培地（ＯＰＴＩ−ＭＥＭ  ＲＳＭ）１００μｌに添加した。２つの溶液を穏やかに混合し、室温で３０分間インキュベートしてＤＮＡリポソーム複合体を形成させた。この間にＥＤ細胞培養物をＯＰＴＩ−ＭＥＭ  ＲＳＭ（ギブコＢＲＬ）２ｍｌで１回すすいだ。各々のトランスフェクションに関して、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ  ＲＳＭ  ０．８ｍｌをＤＮＡリポソーム複合体が入ったチューブに加え、チューブを穏やかに混合し、内容物をすすいだ細胞に積層した。トランスフェクションの間に抗生物質は加えなかった。ＤＮＡリポソーム／組織培養物をＣＯ２インキュベーター中３７℃で５時間インキュベートした。インキュベーションの後、トランスフェクション混合物を除去せずに、通常の２倍濃度の血清を含有する完全成長培地ＭＥＭ  １ｍｌを細胞培養に加えた。トランスフェクションの開始後２４時間に培地を新鮮な完全成長培地（ＥＭＥＭ）で置換した。トランスフェクション後４８時に開始し、７２時まで定期的な間隔で組織培養上澄のアリコートを採取し、標準的な逆転写酵素（ＲＴ）アッセイを用いてウイルス産生の測定として分析した。Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎら（１９９５）に記載されるように、ＲＴ活性に至る上澄を細胞ＥＬＩＳＡの読みに基づく感染性アッセイで力価測定した。ｐＣＭＶ．ΔＣＡ．ｎｅｏおよびプロウイルス構築物ｐＣＭＶ．Ｖｉｓ２．ｎｅｏは共に組織培養で複製しなかった。ＲＴレベルは、トランスフェクトされた細胞からの培養培地に暴露したＥＩＡＶで正常に感染できる組織培養細胞の陰性対照のレベルに満たないかまたは同等であった。従って、ｐ２６欠失がインビトロまたはインビボで複製できない欠損ウイルス粒子を製造することが決定された。大容量ワクチン製造のための粒子を得るために、プロウイルスクローンｐＣＭＶ．ΔＣＡ．ｎｅｏおよびプロウイルス構築物ｐＣＭＶ．Ｖｉｓ２．ｎｅｏを有する持続的感染した細胞系を製造することを決定した。
【００７２】
ＣＯＳ細胞のトランスフェクション
サル細胞系ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５０）においてトランスフェクトされたプロウイルスクローンｐＣＭＶ．ΔＣＡ．ｎｅｏおよびプロウイルス構築物ｐＣＭＶ．Ｖｉｓ２．ｎｅｏを用いてウイルス粒子を製造した。トランスフェクションの２４時間前に６０ｍｍプレート（ファルコン）に全面成長のおよそ５０％で細胞をプレートした。デキストラン法を用いてプロウイルスクローンＤＮＡ（ｐＣＭＶ．ΔＣＡ．ｎｅｏまたはｐＣＭＶ．Ｖｉｓ２．ｎｅｏ）およそ１μｇを細胞にトランスフェクトした。簡単には、ＤＥＡＥデキストランの５０ｍｇ／ｍｌ溶液をＤＮＡと共にトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中１：５０（最終濃度１ｍｇ／ｍｌ）で希釈し、血清不含培地（ＤＭＥＭ）中で細胞に添加した。５％  ＣＯ２の存在下、１５分毎に振盪しながら３７℃で１時間、ＤＮＡ溶液を細胞上でインキュベートした。通常の成長培地をこの時点で置換した。トランスフェクションの４８時間後に上澄をＲＴ活性に関して検定した。マイクロ逆転写酵素アッセイ（Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎら、前出）を用いて細胞不含上澄サンプルにおいてＲＴ活性を検出した。ウェスタンブロット分析手順を用いてタンパク質含量を検出した。この手順に関しては、超遠心（ベックマンＳＷ４１Ｔｉローター）で５００００ｘｇで４５分間、２０％  グリセロールクッション上の細胞不含上澄１０ｍｌからウイルス粒子をペレット化した。１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  デオキシコリン酸（ＤＯＣ）、０．１％  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、２５ｍＭ  トリスＨＣｌおよび１％  トリトンＸ−１００を含有する溶解溶液  １００μｌ中でペレットを溶解し、１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移した。溶解後、６Ｘ  ＳＤＳゲル負荷バッファー  ２０μｌ中でサンプルを煮沸し、１２％  ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに負荷した。グラジエント精製したＥＩＡＶＰＶ（１μｇ）をもゲルに負荷してウイルスタンパク質のマーカーとして提供した。およそ１０ｍＡで一晩冷却しながら電気泳動を実施した。２５ｍＭ  トリス、１９２ｍＭ  グリシン、２０％  メタノールおよび０．０５％  ＳＤＳを含有するバッファー中バイオラッドタンパク質移動細胞系を用いてタンパク質をミリポア膜に移した。冷却しながら４００ｍＡで３時間の後、移動を完了した。モノクローナル抗体を用いてＥＩＡＶタンパク質を検出した。抗体インキュベーションの前に５％  ブロトー（１Ｘ  ＰＢＳ中５％  粉乳、５％  ＦＢＳおよび０．２５％  トゥイーン２０）中室温で１時間ブロットを阻害した。５％  ブロトー中室温で１時間マウスモノクローナルα−ｇｐ９０およびα−ｐ２６を共に使用した。西洋ワサビペルオキシダーゼで抱合した２次抗体α−マウスＩｇＧ（シグマ・ロット＃１１５Ｈ８９９５）を室温で１時間インキュベートした。１次および２次抗体インキュベーションの間に１Ｘ  ＰＢＳ／０．０２５％  トゥイーン２０中３から５分間ブロットを洗浄した。化学ルミネサンス基質スーパーシグナル（ピヤース・ロット＃ＡＥ４００２７）を室温で１分間インキュベートした後、２次抗体インキュベーションの後に最終洗浄を行った。ブロットのフィルムへの暴露によりｇｐ９０およびｐ２６の双方がＥＩＡＶＰＶ陽性対照で検出できることが示された；しかしｇｐ９０のみがプロウイルスクローンｐＣＭＶ．ΔＣＡ．ｎｅｏおよびプロウイルス構築物ｐＣＭＶ．Ｖｉｓ２．ｎｅｏで検出できた。双方のＲＴ活性からおよびウェスタンブロット分析によりウイルス粒子の産生が観察された。
【００７３】
ＣＨＯ、Ｃ−３３ＡおよびＥＤ−ＭＣＳ細胞系における安定したトランスフェクション
３つの細胞系においてウイルス粒子の安定した産生が試みられた；ヒト細胞系Ｃ−３３Ａ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３１）、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９６１８）、およびウマ細胞系ＥＤ−ＭＣＳ。トランスフェクションは全て２検定ずつで実施した。細胞を持続的にインキュベーター中５％  ＣＯ２を伴って３７℃で維持した。トランスフェクションの２４時間前にサルステットおよびファルコンにより製造された１０ｍｍプレートに以下の密度で細胞系を播種した：ＣＨＯおよびＣ−３３Ａ  １×１０６セル／プレート、ＥＤ−ＭＣＳ  ３．５×１０５セル／プレート。血清不含ＤＭＥＭ（ギブコ）中ジーン・ポーター（商標）（ジーン・セラピー・システムズ）試薬５５μｌを用いてプロウイルスクローンｐＣＭＶ．Ｖｉｓ２．ｎｅｏおよびｐＣＭＶ．ΔＣＡ．ｎｅｏ（２０μｇ／プレート）を細胞にトランスフェクトした。製造者の指示書は以下のとおりであった。トランスフェクションの後２４時間に培地をトランスフェクション培地から８００ｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８（ゲネチシン、ギブコＢＲＬ）および１０％  ＦＢＳ（ハイクローン）を含有する選択培地（ＤＭＥＭ）に交換した。トランスフェクトしなかったプレートを同一培地中で選択するための対照として担持した。一度対照プレートに生存細胞が存在せず、選択されたプレートがコロニー形成を示すと、細胞をバルク培養としてＴ７５フラスコ（ファルコン）に移した。ＥＤ−ＭＣＳ細胞のＧ−４１８のレベルは急速な成長のために１０００μｇ／ｍｌまで増加した。選択期間中ＲＴ活性に関して上澄を分析し、個々の時点でウェスタンブロット分析によりタンパク質含量を検定した。ヒトおよびマウス細胞系においてＲＴ活性は最初最も高い産生を示した。ウマ皮膚細胞系が長期間の産生の間に最も安定した構築物を発達させ、選択後１５０日には最も高レベルを連続的に産生することが判明した。この実験により、組織培養細胞をｐ２６欠失クローンによりおよびビスナウイルス（ｐ３０）からの外来性遺伝子がｐ２６領域に挿入されたキメラによりトランスフェクトすることができることが判明した。これらのトランスフェクトされた細胞からの逆転写酵素活性は組織培養液１０μｌあたり１００００ＣＰＭほどの高レベルに到達した。これは組織培養物にトランスフェクトされた場合、野生型ＥＩＡＶにより生み出されたＲＴ活性と等価である。第２のウェスタンブロットを以前と同一の様式で実施した以外は、前記したようにウェスタンブロット分析を行い、膜をヤギα−ビスナｐ３０で再プロービングしてビスナキメラタンパク質を検出した。２次抗体はα−ヤギＩｇＧ  ＨＲＰ分子全体（シグマ・ロット＃１１７Ｈ４８３１）であった。ビスナｐ３０タンパク質をビスナキメラプロウイルス構築物ｐＣＭＶ．Ｖｉｓ２．ｎｅｏで検出した（図１０ｂ参照）。
【００７４】
ウェスタンブロット分析
超遠心ＳＷ４１Ｔｉローター（ベックマン）中の２０％  グリセロールクッション上で細胞不含上澄１０ｍｌからウイルス粒子をペレット化した。１０ｍＭ  塩化ナトリウム、１％  ＤＯＣ、０．１％  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、２５ｍＭ  トリスＨＣｌおよび１％  トリトンＸ−１００を含有する溶解溶液１００μｌ中でペレットを溶解し、１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移した。溶解後、６Ｘ  ＳＤＳバッファーゲル負荷バッファー  ２０μｌ中でサンプルを煮沸し、１２％  ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに負荷した。グラジエント精製したポニーウイルス  １μｇをもゲルに負荷してウイルスタンパク質のマーカーとして提供した。およそ１０ｍＡで一晩冷却しながら電気泳動を実施した。２５ｍＭ  トリス、１９２ｍＭ  グリシン、２０％  メタノールおよび０．０５％  ＳＤＳを含有するバッファー中バイオラッドタンパク質移動細胞系を用いてタンパク質をミリポア膜に移した。冷却しながら４００ｍＡで３時間の後、移動を完了した。モノクローナル抗体を用いてＥＩＡＶタンパク質を検出した。抗体インキュベーションの前に５％  ブロトー（１Ｘ  ＰＢＳ中５％  粉乳、５％  ＦＢＳおよび０．２５％  トゥイーン２０）中室温で１時間ブロットを阻害した。５％  ブロトー中室温で１時間マウスモノクローナルα−ｇｐ９０およびα−ｐ２６を共に使用した。西洋ワサビペルオキシダーゼで抱合した２次抗体マウスＩｇＧ（シグマ・ロット＃１１５Ｈ８９９５）を室温で１時間インキュベートした。１次および２次抗体インキュベーションの間に１Ｘ  ＰＢＳ／０．０２５％  トゥイーン２０中３から５分間ブロットを洗浄した。化学ルミネサンス基質スーパーシグナル（ピヤース・ロット＃ＡＥ４００２７）を室温で１分間インキュベートした後、２次抗体インキュベーションの後に最終洗浄を行った。ブロットのフィルムへの暴露によりｇｐ９０およびｐ２６の双方がＰＶ陽性対照で検出できることが示された；しかし図１０ａで示すように、ｇｐ９０のみがプロウイルスクローン（ｐＣＭＶ．Ｖｉｓ２．ｎｅｏおよびｐＣＭＶ．ΔＣＡ．ｎｅｏ）で検出できた。グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．３）バッファー（０．０５Ｍ  グリシン、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）中４５分間インキュベートすることにより膜を取り除いた。膜を同一の洗浄バッファー中７から５分間洗浄し、５％  ブロトー中２時間阻害した。第２のウェスタンは以前と同一の様式で行い、膜をヤギα−ビスナｐ３０で再プロービングしてビスナキメラタンパク質を検出した。２次抗体はα−ヤギＩｇＧ  ＨＲＰ分子全体（シグマ・ロット＃１１７Ｈ４８３１）であった。ビスナｐ３０タンパク質をビスナキメラプロウイルス構築物（ｐＣＭＶ．Ｖｉｓ２．ｎｅｏ）で検出した（図１０ｂ参照）。
【００７５】
ｇｐ９０の存在は、これらのｐ２６欠失構築物が感染防御抗原を産生することを示している。キメラ（ｐＣＭＶ．Ｖｉｓ２．ｎｅｏ）もまたビスナｐ３０抗原を産生することから、後者から調製されたワクチンをマーカーワクチンとして定義できるということを意味する。これらは動物においてｐ２６抗体産生能を欠如させるだけではなく、これらでワクチン接種された動物にｐ３０に対する抗体を産生させる。ウマにおけるｐ３０の存在はウマがワクチン接種されていることを示す。このｐ３０抗体の存在を検出するアッセイを発展させて、本発明のワクチンでワクチン接種されたウマをワクチン接種されていないウマ、または野生型ＥＩＡＶに感染したウマから区別することができる。加えて、ｐ３０遺伝子配列またはｐ３０タンパク質の全てまたは部分を検出する診断を診断手段として同様に用いることができる。
【００７６】
実施例４
サブクローニング−安定したトランスフェクションの単一細胞クローニング
選別の４０日に再凍結された安定して選別されるビスナ（ｐＣＭＶ．Ｖｉｓ２．ｎｅｏ）トランスフェクトＥＤ−ＭＣＳ細胞を３７℃で溶融し、Ｔ７５フラスコの通常の成長培地（Ｇ−４１８不含）中に播種した。クローニングのためにプレートする前に、細胞を５％  ＣＯ２を伴って、Ｇ−４１８陰性培地中３７℃で４８時間成長させた。Ｔ７５フラスコから細胞をトリプソン処理し、計数し、プレートあたりおよそ１００セルの密度で１００ｍｍファルコンプレートにプレートした。８００μｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８を含有する培地中で細胞を選別した。およそ４日毎に培地を交換し、可視的なクローンが形成されるまで細胞をプレートで成長させた。クローニングシリンダーの使用により個々のコロニーをプレートから別個にトリプソン処理し、ファルコン２４ウェルプレートの別個の細胞に播種した。これらはまた８００μｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８を含有する培地中でも選別した。移動後およそ７日間、細胞上澄をＲＴ活性に関して検定した。以下のとおり実施した：
検定すべき細胞不含上澄のサンプル各１０μｌに以下のものを加える：
３Ｈ−ＴＴＰ（４０Ｃｉ／ミリモル）      １．５μｌ
スピードバックで乾燥し、以下の容量の水で容量を補う
１００ｍＭ  ＥＧＴＡ                    ５．０μｌ
１０Ｘ塩                                ５．０μｌ
（２Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２Ｍ  ＫＣｌ、１Ｍ  ＭｇＣｌ２、１Ｍ  ＤＴＴ、２０％  ＮＰ−４０、脱イオン水）
ポリ（ｒＡ）．ｐ（ｄＴ）１２−１３            ２．０μｌ
（５単位／ｍｌから．２５ｍｇ／ｍｌ）
ミリポア水                              ３８．０μｌ
５０．０μｌ
【００７７】
上澄の混合物（サンプル）および反応混合物を共に混合し、３７℃で１．５から２．０時間インキュベートする。全容量（〜６０μｌ）をＤＥＡＥコーティングした濾紙にピペッティングし、完全に乾燥させる。次いで濾紙を各々１Ｘ  ＳＳＣ中３Ｘ  １５分間洗浄し、再度完全に乾燥させる。次いで濾紙をシンチレーション液に浸漬し、組み込まれた活性を測定する。このＲＴアッセイの使用の結果として、最高のＲＴ活性を有する１２個の「サブクローン」をトリプソン処理し、６ウェルプレート（ファルコン）に継代し、なお８００μｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８中選別した。６ウェルプレート中の４日間の選別の後、上澄をＲＴ活性に関して分析した。最高のＲＴ活性を有する８個のサブクローンをトリプソン処理し、Ｔ７５フラスコ（ファルコン）に継代し、なお８００μｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８中選別した。フラスコ中の７日間の選別の後、上澄をＲＴ活性に関して分析した。Ｇ−４１８量はこの継代点で６００μｇ／ｍｌに減少した。さらに４日間選別を実施し、ＲＴ活性を分析し、Ｇ−４１８のレベルは再度４００μｇ／ｍｌに低下した。７日間の選別の後、別のＲＴアッセイを８個のサブクローンで実施し、選別をモニター観察した。さらに７日間の選別に続いて別のＲＴアッセイを実施した。４個の最高の産生細胞系を再度継代し、Ｇ−４１８のレベルを２００μｇ／ｍｌまで低下させた（別の４個は再凍結させた）。最高の産生サブクローン、Ｆ−１Ｖ２．２３（Ｖ２．２３とも称する）は高レベルのＲＴ活性を生み出した（図１１に示すように、組織培養液１０μｌあたり４０００から５００００ＣＰＭの間）。図１２はウイルス様粒子を産生するｐＣＭＶ．ｖｉｓ２．ｎｅｏプロウイルス構築物で形質転換したＥＤ  ＭＣＳ細胞のこのサブクローンの電子顕微鏡写真を示す。電子顕微鏡写真の上図は放出されたウイルス様粒子を表し、一方電子顕微鏡写真の下図は細胞から出芽するウイルス様粒子を示す。この結果は、本発明の構築物が細胞から出芽し、典型的なレンチウイルスの様に見えるウイルス様粒子を産生することを示している。これは、ウイルス様粒子がＲＴ活性を有し、ｇｐ９０を発現し、ｇｐ３０を発現し、ｐ２６を発現しないという事実と組み合わせて、市販により入手可能なＥＩＡＶワクチンを製造でき、ウマを疾患および／または感染から感染防御すると予測されることを示している。
【００７８】
本発明の構築物がＥＩＡＶ  ｇｐ９０感染防御成分の存在を示すことができ、著明なＥＩＡＶ  ＲＴ活性を示し、電子顕微鏡写真（出芽および物理学的外観）により典型的なレンチウイルスに見えるという事実は、本発明に従って調製されたワクチンが動物をレンチウイルスに由来する疾患および／または感染から、とりわけＥＩＡＶにより惹起される疾患および感染から動物を感染防御するのに有用であるということを保証する。加えて、該ワクチンがｐ２６に対する抗体を刺激する能力を欠如し、ｐ３０に対する抗体を産生し、それによりワクチン接種された動物を感染したまたは暴露されていない動物から区別することができることが示されている。最も重要なことに、ＥＩＡＶゲノムへの外来性遺伝子の、該外来性遺伝子が発現されるような挿入は、複数の遺伝子を挿入できるベクターとしてまたはウイルス構築物としてのこのレンチウイルスの有用性を示している。かかる複数の遺伝子挿入により複数の疾患から感染防御するＥＩＡワクチンが提供される。
【００７９】
本発明を説明の目的で前記で詳細に記載したが、かかる詳細な記載は単にその目的であり、請求の範囲により限定され得る以外は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく当業者によりそこに変更を加えることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＥＩＡＶＵＫと称するＥＩＡＶの概略図マップである。
【図２】
感染性クローンＥＩＡＶＵＫの環状マップである。
【図３ａ】
分子クローンＥＩＡＶＵＫの直線状概略図である。
【図３ｂ】
ＣＭＶプロモーターを有する分子クローンＥＩＡＶＵＫの直線状概略図である。
【図３ｃ】
ＣＡ遺伝子を欠失した分子クローンｐＣＭＶＥＩＡＶＵＫの直線状概略図である。
【図３ｄ】
カナマイシン抵抗性遺伝子（Ｋａｎｒ）で置換したアンピシリン抵抗性遺伝子（Ａｍｐｒ）を有する分子クローンｐＣＭＶＥＩＡＶＵＫΔＣＡの直線状概略図である。
【図３ｅ】
ｐ２６欠失プロウイルスクローンｐＣＭＶ．ΔＣＡ．ｎｅｏの直線状概略図である。
【図４】
ｐ２６欠失プロウイルスクローンｐＣＭＶ．ΔＣＡ．ｎｅｏの環状マップである。
【図５ａ】
ＥＩＡＶＵＫ分子クローンの直線状概略図である。
【図５ｂ】
ＣＭＶプロモーターインサートを有するＥＩＡＶＵＫクローン（ＣＭＶＥＩＡＶＵＫ）の概略図である。
【図５ｃ】
ｐＣＭＶＥＩＡＶＵＫｖｉｓ２の概略図である。
【図５ｄ】
カナマイシン抵抗性マーカーを含有するプロウイルスクローンの直線状概略図である。
【図５ｅ】
最終的なｐＣＭＶＥＩＡＶＵＫＶｉｓ２．ｎｅｏプロウイル構築物の直線状概略図である。
【図６】
最終的なｐＣＭＶＥＩＡＶＵＫＶｉｓ２．ｎｅｏプロウイル構築物の環状マップである。
【図７】
ＣＡ遺伝子／ＥＩＡＶ  ｐ２６のヌクレオチドおよびアミノ酸マップである。
【図８】
ＣＡ遺伝子／ビスナ  ｐ３０のヌクレオチドおよびアミノ酸マップである。
【図９】
ＥＩＡＶのｐ２６およびビスナウイルスのｐ３０間の相同性の比較である。
【図１０ａ】
ｇｐ９０およびｐ２６モノクローナル抗体をディテクターとして用いるｐ２６欠失クローン、ビスナキメラクローンおよびＥＩＡＶのサブクローンのウェスタンブロットである。
【図１０ｂ】
ｐ３０モノクローナル抗体をディテクターとして用いるいくつかのｐ２６欠失クローン、ビスナキメラクローンおよびＥＩＡＶのサブクローンのウェスタンブロットである。
【図１１】
ｐＣＭＶＥＩＡＶＵＫ．Ｖｉｓ２ｎｅｏプロウイル構築物でトランスフェクトされたＥＤ細胞の種々サブクローンの逆転写酵素活性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図５ｅ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004522697.tif 000081
【国際調査報告】
2004522697.tif 000082
2004522697.tif 000083
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