(57)【要約】【課題】三塩化ビフェニル等の塩素数が少ない低塩素化物ＰＣＢに対する特異性が高く、かつ極性溶媒存在下においてＰＣＢとの結合性が低下することなく、三塩化ビフェニルを多く含むＰＣＢを高感度で定量性に優れた抗ＰＣＢモノクローナル抗体、該抗ＰＣＢモノクローナル抗体の作製方法、及び該抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用いたＰＣＢ測定方法を提供する。【解決手段】下記構造式（１）で表される構造を有する化合物を用いて製造される抗ＰＣＢモノクローナル抗体、及び前記化合物を抗原として得たハイブリドーマを培養することを含む抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用いたＰＣＢ測定方法である。【化１７】2007186488.tif 000023  ただし、前記構造式（１）中、ｎは１〜２０の整数を表し、ｍ１及びｍ２はそれぞれ０〜２の整数を表し、ｍ１とｍ２との和は１〜４であり、Ｘはタンパク質を表す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式（１）で表される構造を有し、抗ＰＣＢモノクローナル抗体の調製に用いられることを特徴とする化合物。
【化１】
2007186488.tif 000018
ただし、前記構造式（１）中、ｎは１〜２０の整数を表し、ｍ１及びｍ２はそれぞれ０〜２の整数を表し、ｍ１とｍ２との和は１〜４であり、Ｘはタンパク質を表す。
【請求項２】
下記構造式（２）で表される構造を有する請求項１に記載の化合物。
【化２】
2007186488.tif 000019
ただし、前記構造式（２）中、ｎは１〜２０の整数を表し、Ｘはタンパク質を表す。
【請求項３】
下記構造式（３）で表される構造を有する請求項１に記載の化合物。
【化３】
2007186488.tif 000020
ただし、前記構造式（３）中、ｎは１〜２０の整数を表し、Ｘはタンパク質を表す。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の化合物を用いることを特徴とする抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項５】
請求項１から３のいずれかに記載の化合物を免疫源としてマウスを免疫し、免疫した前記マウスの脾臓細胞を回収し、該脾臓細胞とミエローマ細胞とを融合して得たハイブリドーマを培養することを含む請求項３に記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項６】
請求項４から５のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法により製造され、ＰＣＢに反応性を有することを特徴とする抗ＰＣＢモノクローナル抗体。
【請求項７】
請求項６に記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を産生することを特徴とするハイブリドーマ。
【請求項８】
下記構造式（４）で表される構造を有する化合物を用いて作製された請求項７に記載のハイブリドーマ。
【化４】
2007186488.tif 000021
ただし、前記構造式（４）中、Ｘはタンパク質を表す。
【請求項９】
受託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−２０７４４である請求項８に記載のハイブリドーマ。
【請求項１０】
下記構造式（５）で表される構造を有する化合物を用いて作製された請求項７に記載のハイブリドーマ。
【化５】
2007186488.tif 000022
ただし、前記構造式（５）中、Ｘはタンパク質を表す。
【請求項１１】
受託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−２０５４７である請求項１０に記載のハイブリドーマ。
【請求項１２】
請求項６に記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用いることを特徴とするＰＣＢ測定方法。
【請求項１３】
請求項６に記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を含むことを特徴とするＰＣＢ測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＰＣＢモノクローナル抗体及びその製造方法、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体の作製に用いられる化合物及びハイブリドーマ、並びに前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用いたＰＣＢ測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＢ（ポリ塩化ビフェニル）は、安定性や絶縁性の高さから、変圧器及びコンデンサー等の電気絶縁材、並びに熱媒体などとして広く使用されてきたが、人体や環境への有害性が確認されたことから製造や使用が禁止された。ＰＣＢは、難分解性で環境中に残留し、食物連鎖を通じて生物に蓄積され、人の健康や生態系に影響を及ぼす性質を有する残留性有機汚染物質の代表的な化学物質として規制されており、ＰＣＢを含む廃棄物は、適正に処理されるまで、生活環境の保全上支障のないように保管することが義務づけられている。
しかし、適正処理が行われずに保管されていたＰＣＢ廃棄物は、保管の長期化により、紛失や漏洩の発生が問題視され、平成１３年に「ポリ塩化ビフェニル廃棄物の適正な処理の推進に関する特別措置法」（ＰＣＢ特措法）が施行された。このＰＣＢ特措法により、１５年以内に全てのＰＣＢ廃棄物の適正処理が義務付けられた。
【０００３】
例えば、絶縁油の場合、保管されている絶縁油以外にも、過去においてＰＣＢを絶縁油として使用していた変圧器において置換された代替絶縁油も、前記変圧器内に微量に残留したＰＣＢに汚染されていることが知られており、このような変圧器中代替絶縁油も含め、大量のＰＣＢ濃度を検査し、迅速に処理の必要性の有無を明確にする必要がある。また、処理を行ったＰＣＢ廃棄物に対し、処理後のＰＣＢ残留濃度、環境中のＰＣＢ濃度を検査することも極めて重要である。
【０００４】
従来のＰＣＢ分析方法としては、例えば、公定法として、高分解能ガスクロマトグラフ−高分解能質量分析（ＨＲＧＣ−ＨＲＭＳ）や、電子捕獲型検出器付きガスクロマトグラフ法（ＧＣ‐ＥＣＤ法）が用いられている（非特許文献１参照）。これらの方法は分解能が高く、また定量下限も低いが、分析に要する時間が長く、分析の妨害となる夾雑成分を除去する試料の操作が煩雑であり、コスト負担が大きいという問題がある。このため、簡便かつ迅速な分析方法で、測定現場で簡易に測定可能な方法が求められていた。
【０００５】
これに対し、簡便かつ迅速な分析方法として、抗原抗体反応を利用した免疫学的測定法（イムノアッセイ）が提案されている。前記免疫学的測定法としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）等があるが、これらいずれの測定方法においても、検出対象であるＰＣＢに対して特異的に反応する抗ＰＣＢ抗体が重要な要素となる。
【０００６】
抗ＰＣＢ抗体としては、ＰＣＢが水難溶性であるため、ＰＣＢが抽出された有機極性溶媒や、ＰＣＢを水溶液に溶存させるために用いる極性溶媒を含む試料溶液に耐性を有し、抗原認識可能であることが求められており、例えば、５０（ｖ／ｖ）％有機溶媒水溶液中でも抗原認識特性が実質的に低下しない抗モノクローナル抗体（特許文献１参照）等が提案されている。また、多数の異性体が存在するＰＣＢにおいては、交差反応性が制御された特異性の高い抗ＰＣＢ抗体が求められており、例えば、コプラナーＰＣＢの一つである3,3’,5,5’-四塩化ビフェニル（ＰＣＢ８０）に対して特異性を持つ抗体（特許文献２参照）等が提案されている。
【０００７】
一方、ＰＣＢ異性体の中でも、使用禁止までの期間においてコンデンサー、熱媒体、潤滑油、及び蛍光灯安定器等に最も多く含まれ、汎用性が高かった三塩化ビフェニルを多く含むＰＣＢを効率的に検出し、高感度に定量できる抗ＰＣＢ抗体が求められている。
しかしながら、三塩化ビフェニル等の塩素数が少ない低塩素化物ＰＣＢに対する特異性が高く、かつ極性溶媒存在下においてＰＣＢとの結合性が低下することなく、三塩化ビフェニルを多く含むＰＣＢ（例えば、鐘淵化学工業製のカネクロール３００（ＫＣ３００）、及び三菱モンサント（現三菱化学）製のアロクロール１２４２（Ａｒ．１２４２）などに由来するＰＣＢ）を高感度で定量性に優れた抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、未だ満足なものが提供されておらず、改良が求められているのが現状である。
【０００８】
【特許文献１】特開２０００−１９１６９９号公報
【特許文献２】特開２００５−２４７８２２号公報
【非特許文献１】「絶縁油中のポリ塩素化ビフェニル（ＰＣＢ）の分析方法規定」（電気技術基準調査委員会編集、社団法人日本電気協会発行、平成３年９月３０日発行）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は従来における前記問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、三塩化ビフェニル等の塩素数が少ない低塩素化物ＰＣＢに対する特異性が高く、かつ極性溶媒存在下においてＰＣＢとの結合性が低下することなく、三塩化ビフェニルを多く含むＰＣＢ（例えば、鐘淵化学工業製のカネクロール３００（ＫＣ３００）、及び三菱モンサント（現三菱化学）製のアロクロール１２４２（Ａｒ．１２４２）などに由来するＰＣＢ）を高感度で定量性に優れた抗ＰＣＢモノクローナル抗体、該抗ＰＣＢモノクローナル抗体の作製方法、及び該抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用いたＰＣＢ測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するため、本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、四塩化ビフェニル及び三塩化ビフェニルをハプテンとし、該ハプテンを、特定のリンカーを介してキャリアータンパク質に結合した化合物を用いることにより、従来既存の抗ＰＣＢ抗体よりも３塩素化物に対する親和性が極めて高く、低塩素化物の検出下限値が極めて低い抗ＰＣＢモノクローナル抗体が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は、本発明者による前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  下記構造式（１）で表される構造を有し、抗ＰＣＢモノクローナル抗体の調製に用いられることを特徴とする化合物である。
【化６】
2007186488.tif 000002
ただし、前記構造式（１）中、ｎは１〜２０の整数を表し、ｍ１及びｍ２はそれぞれ０〜２の整数を表し、ｍ１とｍ２との和は１〜４であり、Ｘはタンパク質を表す。
＜２＞  下記構造式（２）で表される構造を有する前記＜１＞に記載の化合物である。
【化７】
2007186488.tif 000003
ただし、前記構造式（２）中、ｎは１〜２０の整数を表し、Ｘはタンパク質を表す。
＜３＞  前記構造式（２）中、ｎが５であり、Ｘがヘモシアニンである前記＜２＞に記載の化合物である。
【００１２】
＜４＞  下記構造式（３）で表される構造を有する前記＜１＞に記載の化合物である。
【化８】
2007186488.tif 000004
ただし、前記構造式（３）中、ｎは１〜２０の整数を表し、Ｘはタンパク質を表す。
＜５＞  前記構造式（３）中、ｎが５であり、Ｘがヘモシアニンである前記＜２＞に記載の化合物である。
【００１３】
＜６＞  前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の化合物を用いることを特徴とする抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法である。
＜７＞  前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の化合物を免疫源としてマウスを免疫し、免疫した前記マウスの脾臓細胞を回収し、該脾臓細胞とミエローマ細胞とを融合して得たハイブリドーマを培養することを含む前記＜６＞に記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法である。
【００１４】
＜８＞  前記＜６＞から＜７＞のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法により製造されたことを特徴とする抗ＰＣＢモノクローナル抗体である。
＜９＞  三塩化ビフェニルに対する親和性が、他の塩素数のＰＣＢに対する親和性よりも高い前記＜８＞に記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体である。
【００１５】
＜１０＞  前記＜８＞から＜９＞のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を産生することを特徴とするハイブリドーマである。
＜１１＞  下記構造式（４）で表される構造を有する化合物を用いて作製された前記＜１０＞に記載のハイブリドーマである。
【化９】
2007186488.tif 000005
ただし、前記構造式（４）中、Ｘはタンパク質を表す。
＜１２＞  受託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−２０７４４である前記＜１１＞に記載のハイブリドーマである。
＜１３＞  下記構造式（５）で表される構造を有する化合物を用いて作製された前記＜１０＞に記載のハイブリドーマである。
【化１０】
2007186488.tif 000006
ただし、前記構造式（５）中、Ｘはタンパク質を表す。
＜１４＞  受託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−２０５４７である前記＜１３＞に記載のハイブリドーマである。
【００１６】
＜１５＞  前記＜８＞から＜９＞のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用いることを特徴とするＰＣＢ測定方法である。
＜１６＞  前記＜８＞から＜９＞のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を含むことを特徴とするＰＣＢ測定用キットである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によると、三塩化ビフェニル等の塩素数が少ない低塩素化物ＰＣＢに対する特異性が高く、かつ極性溶媒存在下においてＰＣＢとの結合性が低下することなく、三塩化ビフェニルを多く含むＰＣＢ（例えば、鐘淵化学工業製のカネクロール３００（ＫＣ３００）、及び三菱モンサント（現三菱化学）製のアロクロール１２４２（Ａｒ．１２４２）などに由来するＰＣＢ）を高感度で定量性に優れた抗ＰＣＢモノクローナル抗体、該抗ＰＣＢモノクローナル抗体の作製方法、及び該抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用いたＰＣＢ測定方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
（抗ＰＣＢモノクローナル抗体）
＜抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法＞
本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、ハプテンとしてＰＣＢと、リンカーと、免疫原性を有する高分子量物質とからなる複合体を用い、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法により製造される。
ＰＣＢは、単独では抗原性を持たないため、ＰＣＢを認識する抗体を作製するために、前記化合物（以下、「抗体調製用化合物」という）を調製し、これを免疫源（抗原）として用い、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を作製する。
【００１９】
＜＜抗体調製用化合物（免疫源）＞＞
本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の調製に用いられる前記抗体調製用化合物は、下記構造式（１）で表される構造を有する化合物である。
【００２０】
【化１１】
2007186488.tif 000007
ただし、前記構造式（１）中、ｎは１〜２０の整数を表し、ｍ１及びｍ２はそれぞれ０〜２の整数を表し、ｍ１とｍ２との和は１〜４であり、Ｘはタンパク質を表す。
【００２１】
前記ハプテンとしてのＰＣＢは、三塩化ビフェニル、及び四塩化ビフェニルのいずれかであることが好ましく、また、少なくとも１つの塩素がオルト位（２位又は６位）に配されたものが好ましく、例えば、下記構造式（２）及び（３）で表される化合物がより好ましく、下記構造式（２）で表される化合物が特に好ましい。
【００２２】
【化１２】
2007186488.tif 000008
ただし、前記構造式（２）中、ｎは１〜２０の整数を表し、Ｘはタンパク質を表す。
【００２３】
【化１３】
2007186488.tif 000009
ただし、前記構造式（３）中、ｎは１〜２０の整数を表し、Ｘはタンパク質を表す。
【００２４】
前記構造式（１）〜（３）中、Ｘで表されるタンパク質（「キャリアータンパク質」ということがある）としては、免疫原性を有し、かつ前記ハプテンとしてのＰＣＢをリンカーを介して連結する際に、該リンカーと結合可能な反応基を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、スカシガイ由来ヘモシアニン（ＫＬＨ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、ヤギ血清アルブミン、ウシガンマグロブリン等が挙げられる。これらの中でも、スカシガイ由来ヘモシアニン（ＫＬＨ）が好ましい。
【００２５】
また、前記リンカーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記構造式（１）〜（３）中、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＮＨ−で表される構造となって前記ハプテンと前記タンパク質とを連結するものが好ましく、ｎは、４〜６が好ましく、５がより好ましい。
【００２６】
本発明の抗体調製用化合物の模式図の一例を、図１に示す。
【００２７】
前記抗体調製用化合物の調製方法としては、特に制限はなく、公知の合成方法により調製することができ、例えば、前記リンカーと前記ハプテンとしてのＰＣＢとからなる化合物を、例えば下記に示す方法により合成し、これを前記タンパク質（キャリアータンパク質）を含む溶液中に添加し、前記リンカーを前記タンパク質に結合させることにより調製する方法が挙げられる。
【００２８】
【化１４】
2007186488.tif 000010
【００２９】
得られた前記抗体調製用化合物は、必要に応じて反応液を免疫源として使用するのに好適な生理的リン酸緩衝液などの中性溶液に置換し、ろ過や透析等の公知の方法により精製することが好ましい。
【００３０】
＜＜ハイブリドーマ＞＞
前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、例えば、前記抗体調製用化合物を免疫源として動物を免疫し、免疫した前記動物の脾臓細胞を回収し、該脾臓細胞とミエローマ細胞とを融合して得たハイブリドーマを培養することにより製造される。
【００３１】
免疫する前記動物としては、マウス、ラット、ウサギ、イヌ等の哺乳動物が好ましく、マウスがより好ましい。
前記動物の免疫方法としては、特に制限はなく、公知の方法から適宜選択することができ、例えば、前記抗体調製用化合物を、アジュバントとともに、皮下、静脈内、腹腔内に注射等により投与する方法が挙げられる。前記抗体調製用化合物は、例えば、最初に投与した後（初回免疫後）２週間程度の間隔で２〜３回投与されることが好ましい。
前記アジュバントとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製の  ＲＩＢＩ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  （ＭＰＬ＋ＴＤＭ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎ）等が好ましい。
【００３２】
前記抗体調製用化合物の最後の投与から数日後から数ヶ月後に、脾臓を摘出し、抗体産生可能な細胞が単離される。前記抗体産生可能な細胞は、ミエローマ細胞と融合され、その後所望の抗体を産生する融合細胞をスクリーニングすることにより、前記ハイブリドーマが得られる。
前記ミエローマ細胞としては、例えば、Ｂｕｌｂ／ｃマウス由来の骨髄腫細胞株、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４等が挙げられる。
前記抗体産生可能な細胞とミエローマ細胞との融合方法としては、特に制限はなく、公知の方法から適宜選択することができるが、例えば、ポリエチレングリコール法が好ましい。
【００３３】
前記所望の抗体を産生する融合細胞をスクリーニングする方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、標識を用いた方法が挙げられ、具体的には、担体に固定化した抗原（抗体調製用化合物）に前記ハイブリドーマ培養上清を添加し、前記抗原に結合した前記抗体を、標識した二次抗体を用いて蛍光センサーで検出する一次スクリーニング、及び、前記ハイブリドーマ培養上清に過剰量の抗原（ＰＣＢ）を添加して平衡化した後、前記抗原と結合しなかった前記抗体について、前記担体に固定化した前記抗原（抗体調製用化合物）との結合を測定する二次スクリーニングからなり、前記一次スクリーニングと前記二次スクリーニングとの差から、所望の抗原と結合する抗体を特定する方法等が挙げられる。
【００３４】
以下、Ｂｕｌｂ／ｃマウスを用いた本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の作製方法の例を説明する。
【００３５】
−マウスの免疫−
前記抗体調製用化合物（タンパク質量にして約０．３ｍｇ）をＣｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製の  ＲＩＢＩ  Ａｄｊｕｖａｎｔ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎ）に混合し、Ｂｕｌｂ／ｃマウス（メス、５週齢）に対し皮下注射により免疫する。初回免疫の２週間後と４週間後に、初回と同量の前記抗体調製用化合物をＣｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製の  ＲＩＢＩ  Ａｄｊｕｖａｎｔ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎ）に混合後、皮下注射する。更に１週間以上経過した後、同量の前記抗体調製用化合物を、腹腔又は尾部静脈に注射し、その４〜５日後に脾臓を摘出する。
【００３６】
−ハイブリドーマの作製−
前記脾臓由来の細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した後、ポリエチレングリコール溶液中でミエローマ細胞と２分間混合することにより、融合反応を行う。
前記ミエローマ細胞としては、例えば、凍結保存されていたものを細胞融合実験の約１０日前に解凍し、１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養したものが好ましい。また、状態の良いミエローマ細胞を調製するために、細胞融合を行う前日には必ず培地交換を行うことが好ましい。
【００３７】
融合反応後、得られた融合細胞は、例えば、２０％牛胎児血清を含むＨＡＴ培地（Ｈｙｐｏｘａｎｔｉｎ  Ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ  Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ培地）に懸濁後、９６穴マイクロプレート等に分注する。融合反応の翌日及び５日後に、培養液を新しいＨＡＴ培地（含２０％牛胎児血清）に交換し、以後、ほぼ４日に１度の頻度で培養液を新しいＨＴ培地（含１０％牛胎児血清）に交換することが好ましい。
【００３８】
−ハイブリドーマのスクリーニング−
ハイブリドーマのスクリーニングは、細胞融合して得た融合細胞の培養上清を分析することにより行うことができる。具体的には、細胞融合から２週間以上経過したハイブリドーマの培養上清を分析し、所望の抗体を分泌するハイブリドーマを選択することが好ましい。以下に分析方法の一例として、蛍光標識した二次抗体を用い、蛍光光度計により分析する方法を説明するが、該分析方法に限定されるものではない。
二次抗体の標識としては、例えば、ペルオキシダーゼ、ビオチン、金コロイドなどが好適に挙げられる。
【００３９】
−−抗体分析−−
（１）抗原ビーズの作製
図１に示す前記抗体調製用化合物におけるリンカーと同じリンカーと、ハプテン（例えば、二塩化フェノール）とを有する化合物を合成し、キャリアータンパク質（例えば、卵白アルブミン）と結合させて複合体としたハイブリドーマスクリーニング用抗原を調製し、これをビーズ（例えば、アガロースビーズ等）に固定化する。
前記ビーズに対し、前記ハイブリドーマスクリーニング用抗原を固定化した後、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を用いて、前記ハイブリドーマスクリーニング用抗原が結合されていない前記ビーズの表面をブロッキングする。
【００４０】
（２）蛍光光度計による測定
蛍光光度計による測定としては、例えば、前記（１）で調製した前記抗原ビーズに、前記ハイブリドーマの培養上清を作用させた後、前記抗原ビーズをＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ）緩衝液によって洗浄し、蛍光物質にて標識した二次抗体を作用させ、次いで、ＰＢＳ緩衝液により洗浄したビーズの蛍光強度を測定することにより行うことができる。
前記二次抗体には前記蛍光物質が結合されているため、洗浄後、前記抗原ビーズ上に残った蛍光の強度から、前記ハイブリドーマ培養上清中の所望の抗体の有無を判断することができる。前記蛍光強度は、蛍光光度計等を適宜用いて測定することができる。
【００４１】
前記ハイブリドーマとしては、ＰＣＢを認識する本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を産生する限り、特に限定されないが、上記の方法により作製され、樹立されたものが好ましく、具体的にはＳｋ３Ａ１１株、及びＳｚｋ２Ｅ４株がより好ましく、Ｓｋ３Ａ１１株が特に好ましい。
【００４２】
前記Ｓｋ３Ａ１１株は、下記構造式（４）、具体的には図１に示す抗体調製用化合物を用いて作製されたハイブリドーマであり、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに平成１７年１２月２２日付で、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７４４として寄託されている。
【化１５】
2007186488.tif 000011
ただし、前記構造式（４）中、Ｘはタンパク質を表す。
【００４３】
前記Ｓｚｋ２Ｅ４株は、下記構造式（５）に示す抗体調製用化合物を用いて作製されたハイブリドーマであり、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに平成１７年５月２６日付で、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５４７として寄託されている。
【００４４】
【化１６】
2007186488.tif 000012
ただし、前記構造式（５）中、Ｘはタンパク質を表す。
【００４５】
＜＜抗ＰＣＢモノクローナル抗体の産生及び精製＞＞
前記ハイブリドーマを、培地（例えば、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ等）を用いて培養し、得られた培養液の上清を、抗ＰＣＢモノクローナル抗体溶液とすることができる。
また、前記ハイブリドーマを培養して得た培地から、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を精製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて公知の方法から適宜選択することができ、例えば、限外ろ過、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の濃縮方法や精製方法により精製することができる。
【００４６】
＜抗ＰＣＢモノクローナル抗体の評価＞
前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、ＰＣＢとの親和性、特に塩素数の異なるＰＣＢの間で異なる親和性を比較することにより、ＰＣＢに対する親和性、及び反応の特異性（交差反応性）を評価することができる。
前記親和性は、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体のＰＣＢとの結合を５０％阻害する抗原濃度（ＩＣ５０値）により評価することができる。
前記特異性（交差反応性）は、例えば、３塩素化物ＰＣＢに対するＩＣ５０値と、４〜６塩素化物ＰＣＢに対するＩＣ５０値とを比較することにより、具体的にはそれぞれのＩＣ５０値の比を求めることにより評価することができる。
【００４７】
前記ＩＣ５０値の算出方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、蛍光光度計による測定データを、下記式（１）で表される近似式に当てはめて求めることにより解析することができる。
【００４８】
【数１】
2007186488.tif 000013
前記式（１）中、ｙは、抗原を加えなかったときの蛍光強度の値を１００％とした時の相対的な蛍光強度を表し、ｘは、抗原濃度を表し、Ｐ１とＰ２は、近似のパラメータを表す。
【００４９】
測定データは、抗原を加えなかったときの蛍光強度の値を１００％として相対値に変換した後、グラフ作成ソフトウェアOrigin  version  6.0（OriginLab製）を用いて最適なＰ１及びＰ２を決定する。
このようにして得られた近似式を、前記抗体と前記抗原との結合曲線とし、ｙ＝５０％となるときのｘの値(＝Ｐ１)をＩＣ５０値とする。
なお、ＩＣ５０値に対して抗体濃度が十分に小さい時（例えば、１０分の１以下の時）、ＩＣ５０値と平衡解離定数（Ｋｄ）がほぼ一致することが知られている。
【００５０】
前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体の塩素数の異なるＰＣＢに対する特異性は、例えば、カネクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００、ＫＣ−１０００）を標準試料として評価することができる。
前記カネクロールは、それぞれ下記表１に示す比率で異なる塩素数のＰＣＢを含有しているため、例えば、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、三塩化ビフェニルに高い特異性を示すため、カネクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００、ＫＣ−１０００）の中でもＫＣ−３００に対して最も高い特異性を示す。
【００５１】
【表１】
2007186488.tif 000014
（出典：高菅卓三ら、「各種クリーンアップ法とＨＲＧＣ／ＨＲＭＳを用いたポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢｓ）の全異性体詳細分析方法」，環境化学，Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．３，ｐｐ.６４７−６７５，１９９５）
【００５２】
（ＰＣＢ測定方法）
本発明のＰＣＢ測定方法は、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用いる方法であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用い、試料中のＰＣＢを免疫学的に検出、定量する方法、具体的には、免疫クロマトグラフィー、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、免疫発光測定法、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）、ラテックス免疫比濁法（ＬＴＩＡ）、蛍光センサー法等が挙げられる。
【００５３】
測定対象のＰＣＢは低分子化合物であるため、競合法により測定することが好ましく、前記競合法としては、担体（例えば、マイクロプレートのウェル、ビーズ、チューブ等）に抗原を固定化する間接競合法（間接競合ＥＬＩＳＡ法）、前記担体に抗体を固定化する直接競合法（直接競合ＥＬＩＳＡ法）が挙げられる。同様に、結合平衡除外法も好ましく、前記結合平衡除外法としては、前記担体に前記抗原を固定化する方法が挙げられる。
【００５４】
前記間接競合法及び前記結合平衡除外法において、前記担体に固定化する抗原（以下、「固定化抗原」という）は、前記抗体調製用抗原のハプテンとは異なるハプテンを有するものが好ましく、該固定化抗原のハプテンとしては、例えば、二塩化フェノールが挙げられる。
前記間接競合法及び前記結合平衡除外法は、前記固定化抗原を前記担体上に固定化し、前記担体の前記固定化抗原が結合していない部分をブロッキング剤でブロッキングする。次いで、該担体に試料と前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体とを加え、前記固定化抗原と前記試料中のＰＣＢとを前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体に対して前記間接競合法においては競合反応させ、前記結合平衡除外法においては結合平衡除外化反応させる。
前記固定化担体と結合しなかった前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を洗浄除去した後、二次抗体として標識した抗体を加え、前記固定化抗原と結合した抗ＰＣＢモノクローナル抗体と結合させ、洗浄を行った後、前記標識の発色又は発光を測定する。得られた吸光度や光強度について、試料を添加しない場合の値に対する減少率を求め、これを阻害率とし、既知の濃度のＰＣＢを添加したときの阻害率からあらかじめ求めておいた検量線を用い、前記試料中のＰＣＢ濃度を算出することができる。
【００５５】
前記直接競合法においても、前記試料中のＰＣＢと競合させる標識抗原は、前記抗体調製用抗原のハプテンとは異なるハプテンを有する化合物と酵素とを結合してなるものが好ましく、該標識抗原のハプテンとしては、例えば、二塩化フェノールが挙げられる。
前記直接競合法は、前記担体に前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を固定化し、結合していない部分をブロッキング剤でブロッキングする。次いで、試料と前記標識抗原とを加え、前記試料中のＰＣＢと前記標識抗原とを競合反応させる。前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体と結合しなかった前記標識抗原を洗浄除去した後、反応生成物の発色又は発光を測定する。得られた吸光度や光強度について、試料を添加しない場合の値に対する減少率を求め、これを阻害率とし、既知の濃度のＰＣＢを添加したときの阻害率からあらかじめ求めておいた検量線を用い、前記試料中のＰＣＢ濃度を算出することができる。
【００５６】
前記標識としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酵素としてペルオキシダーゼを用い、基質に過酸化水素、発色剤にｏ−フェニレンジアミンやテトラメチルベンジジンを使用する場合、及び酵素としてアルカリホスファターゼを用い、基質にｐ−ニトロフェニルリン酸を使用する場合には、発色を吸光度で測定することができる。一方、基質の反応生成物が蛍光である場合や、蛍光物質を用いて標識されている場合には、蛍光光度計等を用いて蛍光を測定することができる。また、化学発光物質を用いる場合には、発光を化学発光測定器等により測定することができ、金コロイドを用いる場合には、透過光度等を透過光量測定器等により測定することができる。
【００５７】
前記試料としては、例えば、被験物質中のＰＣＢを極性溶媒で液液抽出してなる試料、及び前記被験物質中のＰＣＢを極性溶媒で液液抽出し、抽出された前記ＰＣＢを含む前記極性溶媒を吸着剤で固相抽出し、前記吸着剤に吸着した成分を所望の溶媒に転溶させてなる試料などが挙げられる。
【００５８】
前記極性溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、スルホラン、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン等が挙げられ、これらの中でも、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が好ましい。
【００５９】
前記液液抽出において、前記被験物質と前記極性溶媒との混合比（質量比）としては、（前記被験物質）：（前記極性溶媒）＝１：１〜：１：１０が好ましい。
【００６０】
前記被験物質としては、少なくともＰＣＢを含む可能性がある物質（ＰＣＢ汚染物）であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、絶縁油、絶縁油以外の油（例えば、植物油、動物油、合成油、鉱物油等）、工場排水、土壌、排ガス、動物の血液や体液、絶縁油の処理作業等において使用した部材等の廃棄物などが挙げられる。これらの中でも、絶縁油が好適に挙げられる。
前記絶縁油としては、脱塩素化処理等のＰＣＢ分解処理を行った後の絶縁油も好適に挙げられる。
【００６１】
前記試料中の極性溶媒の濃度としては、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体のＰＣＢに対する前記親和性が著しく劣化しない限り、特に制限はなく、例えば、１〜２０質量％であることが好ましく、１０〜２０質量％であることがより好ましい。
なお、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、２０質量％の極性溶媒を含む試料溶液中において、７０〜９０％の親和性を有する。
【００６２】
（ＰＣＢ測定用キット）
本発明のＰＣＢ測定用キットは、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を含み、試料中のＰＣＢを検出可能である限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体、標識された前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体に対する二次抗体、標識された抗原（ハプテン）としてのＰＣＢ、緩衝液、検出試薬、及び標準試料（例えば、カネクロール）等を含む。前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、標識されていてもよい。
また、前記ＰＣＢ測定用キットとしては、例えば、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を含め、必用な試薬がフィルター等の担体に吸着されてなる免疫クロマトグラフィー用試験紙の形態であってもよい。
【実施例】
【００６３】
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこの実施例に何ら限定されるものではない。
【００６４】
（実施例１）
（１）抗体調製用化合物の合成
免疫原を有する前記抗体調製用化合物として、ハプテンとして３塩素化物ＰＣＢ（三塩化ビフェニル）を、リンカーを介してキャリアータンパク質（スカシガイ由来のヘモシアニン（以下、「ＫＬＨ」と表す））に結合したものを以下の方法により合成した。該抗体調製用化合物の模式図は、図１に示すとおりである。
【００６５】
前記３塩素化物ＰＣＢと、前記リンカーとからなる化合物（以下、「Ｓ３分子」という）を水酸化ビフェニルへの塩素付加反応後、さらにＢｒ（ＣＨ２）５ＣＯＯＣ２Ｈ５を反応させ、さらに加水分解し、さらに活性エステル化することにより合成した。
得られた前記Ｓ３分子１ｍｇを１００μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した。これを３ｍｇのＫＬＨを含む９ｍＬの１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．８）と混合し、これを一晩放置して、Ｓ３分子とＫＬＨとの複合体を作製した。次いで、未反応のＳ３分子を除くとともに、反応溶液をマウスの免疫に適した中性溶液にするために、脱塩カラム（エコノパック１０ＤＧカラム、日本バイオ・ラッド社製）を用いてＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に置換した。こうして前記抗体調製用化合物溶液を得た。
【００６６】
（２）マウスの免疫
前記（１）で調製した前記抗体調製用化合物を抗原として、マウス（Ｂｕｌｂ／ｃ、メス、５週齢）に免疫した。
初回免疫は、前記抗体調製用化合物（タンパク質量として約０．３ｍｇ）をＣｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製の  ＲＩＢＩ  Ａｄｊｕｖａｎｔ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎ）に混合後、皮下注射した。該初回免疫の２週間後と４週間後に、同量の前記抗体調製用化合物を、Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製の  ＲＩＢＩ  Ａｄｊｕｖａｎｔ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎ）に混合後、皮下注射した。その後、１週間以上経過した後、同量の前記抗体調製用化合物を、腹腔又は尾部静脈に注射し、その４〜５日後に脾臓を摘出した。
【００６７】
（３）ハイブリドーマの作製
前記（２）で摘出した脾臓から調製した脾臓細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培地(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製)で洗浄した後、ミエローマ細胞ＮＳ０株（理化学研究所）とともにポリエチレングリコール（重合度１，５００、日本ロシュ社製）溶液中で２分間混合し、細胞融合を行った。前記ミエローマ細胞は、凍結保存されていたものを細胞融合実験の約１０日前に解凍し、１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を約４０ｍＬ添加して培養し、細胞融合の前日に培地交換を行った。
【００６８】
融合反応後の融合細胞を、２０％牛胎児血清を含むＨＡＴ培地約１２０ｍＬに懸濁後、９６穴マイクロプレート６枚に２００μＬずつ分注した。
細胞融合の翌日及び５日後に１００μＬの培養液を、２０％牛胎児血清を含む新しいＨＡＴ培地に交換した。以後、ほぼ４日に１度の頻度で１００μＬの培養液を、１０％牛胎児血清を含む新しいＨＡＴ培地に交換した。
【００６９】
（４）ハイブリドーマのスクリーニング
(a)産生抗体分析用抗原ビーズの作製
図１に示す前記抗体調製用化合物と同じリンカーを有する二塩化フェノールを合成し、卵白アルブミン（ＯＶＡ）との複合体を調製した。得られた複合体を、アガロースビーズ（ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に固定化し、産生抗体分析用抗原ビーズを調製した。前記産生抗体分析用抗原ビーズ約１ｍＬに、前記複合体約０．１ｍｇを固定化した後、１０ｍｇ／ｍＬの牛血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液１ｍＬを用い、前記複合体が結合していないビーズ表面をブロッキングした。
【００７０】
(b)蛍光光度計による測定
前記産生抗体分析用抗原ビーズに対し、０．２５ｍＬ／分の流速で２分間（合計０．５ｍＬ）の前記ハイブリドーマ培養上清を作用させた。前記ハイブリドーマの培養上清は、細胞融合から２週間以上経過したものを用いた。
前記産生抗体分析用抗原ビーズを、０．２５ｍＬ／分の流速で０．５分間、ＰＢＳ緩衝液によって洗浄した後、蛍光物質Ｃｙ５にて標識した二次抗体５ｎＭ（ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体、Jackson  Immunoresearch社製）を、０．２５ｍＬ／分の流速で９６秒間（計０．４ｍＬ）作用させた。
続いて、前記産生抗体分析用抗原ビーズをＰＢＳ緩衝液によって、０．２５ｍＬ／分の流速で０．５分間、さらに１．５ｍＬ／分の流速で１．５分間洗浄した。
洗浄後、前記産生抗体分析用抗原ビーズ上に残った蛍光の強度を蛍光光度計（Ｓａｐｉｄｙｎｅ社製、ＫｉｎＥｘＡ  ３０００）を用いて測定し、前記ハイブリドーマ培養上清中、所望の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の有無を判断した。
【００７１】
測定の結果、抗ＰＣＢモノクローナル抗体を産生する安定なハイブリドーマが得られ、これをＳｋ３Ａ１１株とした。
前記Ｓｋ３Ａ１１株細胞は、メチルセルロース培地を用いて単一の細胞に由来するコロニーを形成させた後、該コロニーを液体培地に移し、培養を続けた。
【００７２】
（５）抗ＰＣＢモノクローナル抗体の作製
前記（４）で樹立したハイブリドーマＳｋ３Ａ１１株のコロニーを、２４穴プレート上のＲＰＭＩ１６４０培地を基本とするＨＡＴ培地に移し４日間培養した後、培養液の一部を１０ｍｌの前記ＨＡＴ培地を入れた５０ｍｌの角形フラスコに移し、コンフルエントに達する直前まで培養し、Ｓｋ３Ａ１１株によって分泌された抗体を培養上清からプロテインＡを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって精製し、抗ＰＣＢモノクローナル抗体（以下、「Ｓｋ３Ａ１１抗体」という）を得た。
【００７３】
（６）抗ＰＣＢモノクローナル抗体の評価
前記（５）で得た抗ＰＣＢモノクローナル抗体（Ｓｋ３Ａ１１抗体）０．３ｍｇ／ｍＬは、５０倍希釈したものを抗体溶液とし、ＰＣＢの測定に用いた。
また、比較対象として、市販の抗ＰＣＢ抗体（ＲＤＩ社製、ＰＣＢ３５、以下「ＲＤＩ抗体」という）を用いた。前記ＲＤＩ抗体は、０．１％ＢＳＡを含むＰＣＢ緩衝液を用いて２，０００倍に希釈したものを抗体溶液とし、ＰＣＢの測定に用いた。
【００７４】
ＰＣＢの標準試料として、カネクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００）を測定対象とした。前記カネクロールはＤＭＳＯを用いて希釈し、２％ＤＭＳＯで測定を行う場合には、前記カネクロールを含むＤＭＳＯ溶液２０μＬと、ＰＢＳ緩衝液４８０μＬとを混合したものに、前記抗体溶液５００μＬを加えて１ｍＬとした測定試料を調製した。
【００７５】
該測定試料を、抗原を固定化したビーズ（以下、「抗原ビーズ」という）に供給し、前記（４）と同様にして蛍光光度計（Ｓａｐｉｄｙｎｅ社製、ＫｉｎＥｘＡ  ３０００）を用いて測定し、親和性、交差反応性を評価した。
なお、蛍光標識以外の標識由来の信号強度を測定することによっても、得られた値から以下の方法により親和性及び交差反応性を求め、定量することができる。
具体的には、前記標識が金コロイドの場合には、前記担体の透過光量を信号強度とし、透過光量測定装置（例えば、柴田科学社製、Ｉｍｎｙ等）を用いて測定することができる。
【００７６】
（i）親和性の測定
前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体について、異なる塩素数のＰＣＢを含む各カネクロールとの親和性を比較するために、蛍光光度計による測定データを近似式に当てはめ、ＩＣ５０値を求めた。前記近似式として、下記式（１）を用いた。
【００７７】
【数１】
2007186488.tif 000015
前記式（１）中、ｙは、試料中に抗原（ＰＣＢ）を加えなかったときの蛍光強度の値を１００％とした時の相対的な蛍光強度を表し、ｘは、抗原濃度を表し、Ｐ１とＰ２は、近似のパラメータを表す。
【００７８】
なお、ＩＣ５０値に対して抗体濃度が十分に小さい時（例えば、１０分の１以下の時）、ＩＣ５０値と平衡解離定数（Ｋｄ）とがほぼ一致することが知られているため、親和性の評価として、該平衡解離定数（Ｋｄ）を用いた。
【００７９】
カネクロールを含まない２％ＤＭＳＯ溶液中の前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体と、前記抗原ビーズとの結合量を１００として、濃度を変えたカネクロールを含む２％ＤＭＳＯ溶液中の前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体と、前記抗原ビーズとの結合量の測定結果を、図２〜５に示す。また、図２〜５の結果から求めた平衡解離定数（Ｋｄ値）を、下記表２に示す。
【００８０】
（ii）交差反応性
交差反応性は、それぞれ、下記式により算出した。結果を下記表２に示す。
Ｓｋ３Ａ１１の交差反応性（％）＝（ＫＣ３００のＩＣ５０値／試料のＩＣ５０値）
…式（２）
ＲＤＩの交差反応性（％）＝（ＫＣ３００のＩＣ５０値／試料のＩＣ５０値）
…式（３）
【００８１】
【表２】
2007186488.tif 000016
【００８２】
図２〜５、及び表２の結果から、Ｓｋ３Ａ１１抗体は、３塩素化物ＰＣＢを最も多く含有するＫＣ−３００に対して最も強い親和性を示し、その親和性の強さはＲＤＩ抗体の約２５倍であった。ＫＣ−４００に対する親和性もＳｋ３Ａ１１抗体の方がＲＤＩ抗体よりも約３．３倍強かった。一方、ＫＣ−５００とＫＣ−６００に対する親和性は、ＲＤＩ抗体の方がＳｋ３Ａ１１抗体よりも強く、特にＫＣ−６００に対しては、ＲＤＩ抗体の方がＳｋ３Ａ１１抗体よりも約２４倍強いことがわかった。
【００８３】
また、図２に示されたように、ＲＤＩ抗体は、ＫＣ−３００濃度１ｐｐｂ以下では、ＫＣ−３００を全く含まない試料と同じ相対信号値１００％を示しているのに対し、Ｓｋ３Ａ１１抗体は、１ｐｐｂのＫＣ−３００に対して相対信号値約５０％を示しており、かつ０．１ｐｐｍを下回る濃度においても相対信号値の変化がみられる。このことは、ＲＤＩ抗体では１ｐｐｂ以下のＫＣ−３００を測定できないのに対し、Ｓｋ３Ａ１１抗体は、０．１〜１ｐｐｂ以下のＫＣ−３００を測定できることを示している。
これらの結果から、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体（Ｓｋ３Ａ１１抗体）は、従来の抗ＰＣＢ抗体において検出が困難であった３塩素化物ＰＣＢを高感度に測定可能な抗体として有用であることがわかった。
【００８４】
（実施例２）
前記免疫原を有する前記抗体調製用化合物として、ハプテンとして四塩化ビフェニルを用い、ハイブリドーマＳｚｋ２Ｅ４株を得て、これを培養して抗体を作製した以外は、実施例１と同様にして抗ＰＣＢモノクローナル抗体を作製し、得られた抗ＰＣＢモノクローナル抗体（以下、「Ｓｚｋ２Ｅ４抗体」という）を用いて、カネクロールに対する親和性及び交差反応性を評価した。
また、実施例１と同様に、比較対象として、ＲＤＩ抗体を用いた。結果を図６〜８、及び表３に示す。
【００８５】
【表３】
2007186488.tif 000017
【００８６】
−ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に対する耐性−
Ｓｚｋ２Ｅ４抗体とＲＤＩ抗体のＤＭＳＯに対する耐性を比較した。
ＤＭＳＯ濃度の異なる抗体の溶液を調製し、実施例１と同様にして前記抗原ビーズに供給し、該抗原ビーズに固定された抗原に対する結合性を測定した。
ＲＤＩ抗体は、６％以上のＤＭＳＯが存在する溶液中において前記抗原に対する結合性が低下し、２０％ＤＭＳＯ存在下では測定に利用できなかったのに対し、Ｓｚｋ１２Ｅ４抗体は、２０％のＤＭＳＯが存在する溶液中においても、前記抗原に対する結合性を保っていた。結果を図９に示す。
【００８７】
図６〜８の結果から、Ｓｚｋ２Ｅ４抗体は、３塩素化物ＰＣＢを最も多く含有するＫＣ−３００に対して最も強い親和性を示し、その親和性がＲＤＩ抗体よりも強いことがわかり、さらに図９の結果から、Ｓｚｋ２Ｅ４抗体は、極性溶媒に対する高い耐性を示すことがわかった。また、表３の結果からも、塩素数の少ないＰＣＢにより強い親和性を示すことが明らかとなり、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体（Ｓｚｋ２Ｅ４抗体）は、従来の抗ＰＣＢ抗体において検出が困難であった三塩化ビフェニル等の塩素数が少ない低塩素化物ＰＣＢを高感度に測定可能な抗体として有用であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、三塩化ビフェニル等の塩素数が少ない低塩素化物ＰＣＢに対する特異性が高く、かつ極性溶媒存在下においてＰＣＢとの結合性が低下することなく、三塩化ビフェニルを多く含むＰＣＢ（例えば、鐘淵化学工業製のカネクロール３００（ＫＣ３００）、及び三菱モンサント（現三菱化学）製のアロクロール１２４２（Ａｒ．１２４２）などに由来するＰＣＢ）を高感度で定量であるため、組成が未知の絶縁油等、特に低塩素化物ＰＣＢを多量に含有する可能性のある検査対象を、最小限の誤差で高感度に検出、定量することができ、廃棄物処理後のＰＣＢ残留濃度、環境中のＰＣＢ濃度等の検査に好適に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の作製に用いられる抗原の一例を示す概略図である。
【図２】図２は、実施例１で測定したＫＣ−３００に対する本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体（Ｓｋ３Ａ１１、○印）、及び他の抗ＰＣＢモノクローナル抗体（ＲＤＩ、■印）の結合曲線である。
【図３】図３は、実施例１で測定したＫＣ−４００に対する本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体（Ｓｋ３Ａ１１、○印）、及び他の抗ＰＣＢモノクローナル抗体（ＲＤＩ、■印）の結合曲線である。
【図４】図４は、実施例１で測定したＫＣ−５００に対する本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体（Ｓｋ３Ａ１１、○印）、及び他の抗ＰＣＢモノクローナル抗体（ＲＤＩ、■印）の結合曲線である。
【図５】図５は、実施例１で測定したＫＣ−６００に対する本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体（Ｓｋ３Ａ１１、○印）、及び他の抗ＰＣＢモノクローナル抗体（ＲＤＩ、■印）の結合曲線である。
【図６】図６は、実施例２で測定したＫＣ−３００に対する本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体（Ｓｚｋ２Ｅ４、○印）、及び他の抗ＰＣＢモノクローナル抗体（ＲＤＩ、■印）の結合曲線である。
【図７】図７は、実施例２で測定したＫＣ−４００に対する本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体（Ｓｚｋ２Ｅ４、○印）、及び他の抗ＰＣＢモノクローナル抗体（ＲＤＩ、■印）の結合曲線である。
【図８】図８は、実施例２で測定したＫＣ−４００に対する本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体（Ｓｚｋ２Ｅ４、○印）、及び他の抗ＰＣＢモノクローナル抗体（ＲＤＩ、■印）の結合曲線である。
【図９】図９は、実施例２で測定したジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に対する耐性の結果を示すグラフである。ＤＭＳＯが抗体と抗原の結合に与える影響を蛍光光度計によって測定した。ＤＭＳＯを含まない溶液中の抗体と抗原ビーズの結合量を１００％として、横軸濃度のＤＭＳＯを含む溶液中の抗体と抗原ビーズの結合量をグラフに示した。
【図１】
2007186488.tif 000024
【図９】
2007186488.tif 000025
【図２】
2007186488.tif 000026
【図３】
2007186488.tif 000027
【図４】
2007186488.tif 000028
【図５】
2007186488.tif 000029
【図６】
2007186488.tif 000030
【図７】
2007186488.tif 000031
【図８】
2007186488.tif 000032