(57)【要約】【課題】二本鎖ＤＮＡの電気化学的検出に有用なインターカレーター及びその製造方法の提供。【解決手段】本発明は二本鎖ＤＮＡの電気化学的検出においてインターカレーターとして有用なＮ−［［４−(３−フェロセンカルボキサミドプロピル)−ピペラジニル］プロピル］−１，８−ナフタレンイミド及び前記化合物の製造方法。
2004522778.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）のＮ−［［４−（３−フェロセンカルボキサミドプロピル）ピペラジニル］プロピル］−１，８−ナフタレンイミド：
【化１】
2004522778.tif 000008
【請求項２】
式（３）の化合物を１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジンと有機溶媒の中で反応させて式（２）の化合物を得、式（２）の化合物を１，８−ナフタル酸無水物と塩基の存在下、有機溶媒の中で反応させる段階を含む、請求項１記載の化合物の製造方法：
【化２】
2004522778.tif 000009
【化３】
2004522778.tif 000010
【請求項３】
請求項２記載の式（２）の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二本鎖ＤＮＡの電気化学的検出に有用なインターカレーター及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡチップは、従来のサザンブロットまたはノーザンブロット法よりもずっと効果的に試料中に含まれたＲＮＡｓまたはＤＮＡｓを検出できるので、大規模のＲＮＡ発現測定、突然変異ゲノムＤＮＡｓの検出、遺伝子診断、薬理ゲノミクス(pharmacogenomics)、医療などのような遺伝子及び分子生物学的研究に非常に幅広く用いられている。
【０００３】
一般的に、ＤＮＡチップは数十万個の特定塩基配列を有するプローブＤＮＡ断片を非常に小さい表面に集積し、プローブＤＮＡを蛍光物質が標識された一本鎖ターゲットＤＮＡと接触させてハイブリダイジェーションを誘導した後、レーザー光を用いてハイブリッド化したＤＮＡを判定することによってターゲットＤＮＡを検出する。
【０００４】
しかし、前記方法はレーザースキャーナーを含む高価な光学器具を用いる必要があり、標識蛍光物質も高価であるという短所がある。また、蛍光強度から試料中のターゲットＤＮＡの量を定量的に検出することが困難である。
【０００５】
従って、かかる問題点を解決するために多くの努力が行われてきた。例えば、クリニカルマイクロセンサス社(Clinical Microsensors Inc.,米国)は遷移金属錯体(transition metal complex)のような酸化還元活性物質(redox-active material)をプローブＤＮＡの特定位置に選択的に結合させ、一本鎖ターゲットＤＮＡを前記プローブＤＮＡと接触させてハイブリダイジェーション化を誘導した後、ハイブリダイジェーションによる電子伝達速度の変化を測定することによってＤＮＡを検出する方法を提案した。また、一本鎖試料ＤＮＡを電気化学的に活性を有するインターカレーター(intercalator)、例えば、Ｎ，Ｎ−ビス［［４−（３−フェロセンカルボキサミノプロピル）ピペラジニル］プロピル］ナフタレン−１，４，５，８−テトラカルボン酸{N-N-bis[[4-(3-ferrocenecarboxaminopropyl)piperazinyl]propyl]naphthalene-1,4,5,8-tetracarboxylic acid}の存在下で電極の表面に固定された一本鎖プローブＤＮＡと反応させてインターカレーターを含むハイブリッド化されたＤＮＡを形成した後、前記インターカレーターに流れる電流を測定することによって試料ＤＮＡの遺伝子を検出する方法が提供されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００６】
しかし、これらの方法は依然として定量的ＤＮＡ検出には十分でない敏感度を示すので、高い敏感度を有するＤＮＡ検出方法に用いられる改善されたインターカレーターの開発が要求されている。
【特許文献１】
特開２０００−１２５８６５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の目的は、非常に高い敏感度で二本鎖ＤＮＡの検出に適した新規インターカレーター化合物を提供することである。
本発明の他の目的は、前記化合物の製造方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記方法に有用な新規中間体化合物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一実施態様に従って、本発明では下記式（１）のＮ−［［４−３−（フェロセンカルボキサミドプロピル）ピペラジニル］−プロピル］−１，８−ナフタレンイミドが提供される：
【化４】
2004522778.tif 000003
【０００９】
本発明の他の実施態様に従って、本発明の式（３）の化合物を１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジンと有機溶媒の中で反応させて式（２）の化合物を得、式（２）の化合物を１，８−ナフタル酸無水物(naphthalic anhydride)と塩基の存在下で有機溶媒の中で反応させる段階を含む、式（１）の化合物の製造方法が提供される：
【化５】
2004522778.tif 000004
【化６】
2004522778.tif 000005
【００１０】
また、本発明の他の実施態様に従って、本発明では式（２）の中間体化合物が提供される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、Ｎ，Ｎ−ビス［［４−（３−フェロセンカルボキサミドプロピル）ピペラジニル］プロピル］ナフタレン−１，４，５，８−テトラカルボン酸は、二本鎖ＤＮＡの電気化学的検出の敏感度を顕著に高い水準に向上させることができ、特に式４の化合物と混合して用いる際にその水準をさらに増加させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
式（１）の化合物、Ｎ−［［４−（３−フェロセンカルボキサミドプロピル）ピペラジニル］−プロピル］−１，８−ナフタレンイミドは下記反応式（１）によって製造できる：
反応式（１）
【化７】
2004522778.tif 000006
【００１３】
文献(Anal. Biochem., 218,436(1994))に記載された方法によって製造された式（３）の化合物を１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジンとジクロロメタンおよびクロロホルムのような有機溶媒の中で反応させ式（２）の化合物が得られる。前記反応は０〜４０℃、好ましくは２０〜２５℃で５〜１２時間、好ましくは８〜１０時間行われる。
【００１４】
次に、式（２）の化合物をジイソプロピルエチルアミン及びトリエチルアミンのような塩基の存在下、イソプロピルアルコール、ベンゼン、及びトルエンのような有機溶媒の中で１，８−ナフタル酸無水物(naphthalic anhydride)と反応させて本発明による式（１）の化合物が得られる。前記反応は５０〜１１０℃、好ましくは８０〜８５℃で４〜７時間行われる。
【００１５】
本発明の式（１）の化合物は二本鎖ＤＮＡの塩基対の間に選択的にインターカレートされ、このようにインターカレートされた二本鎖ＤＮＡを介した電子移動が、好ましい酸化還元活性を有する前記化合物のフェロセン残基によって容易になる。従って、二本鎖ＤＮＡを電気化学的に検出する方法において本発明の化合物はインターカレーターとして用いられるが、例えば、外部に出力する端子を有する電極の表面に固定され、試料ＤＮＡと混成化され得る一本鎖プローブＤＮＡを含むＤＮＡ検出用キッドと一本鎖ターゲットＤＮＡを接触させてハイブリッド化された二本鎖ＤＮＡを得、前記二本鎖ＤＮＡの間に本発明の化合物をインターカレートした後、電圧が電極に流れる際に形成された電流量を測定することによって試料中のターゲットＤＮＡを高感度で検出できる。
【００１６】
安定した方法によるＤＮＡ検出感度は本発明の式（１）の化合物を式４の化合物と共に用いる場合に顕著に増加する。これは式（１）の化合物（ＩＣ２）がＤＮＡ塩基対当り１つ程度の比率で挿入される反面、化学式４の化合物（ＩＣ１）はＤＮＡ３つ〜５つの塩基対当り一つ程度の比率で挿入されることに起因する。従って、ＩＣ１及びＩＣ２を１：０．１〜１０の比率で混合して用いる場合、ＩＣ２がＩＣ１によって占有されていない部位に挿入され、これらが共に作用して二本鎖ＤＮＡを介した電子伝達過程を向上させるシナジー効果が得られる。さらにＩＣ２は酸化されたＩＣ１の還元のための超感光剤(supersensitizer)として用いられる。
【化８】
2004522778.tif 000007
【００１７】
式（２）の化合物は式４の化合物だけではなく式（１）の化合物の製造方法において中間体として用いられる。即ち、式（２）の化合物は塩基の存在下、有機溶媒の中で１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物(naphthaleneteracarboxylic dianhydride)と反応させて式４の化合物を高い収率で得られる。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明を下記実施例によってさらに詳細に説明する。但し、下記実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲はこれらによって限定されない。
［製造例１］  フェロセンカルボン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（式（３）の化合物）の合成
文献(Anal.Biochem,218,436(1994))の方法によって、フェロセンカルボン酸１，０００ｍｇ（４．３５ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド５６０ｍｇ（４．８７ｍｍｏｌ）の混合物を、蒸留した１，４−ジオキサン４０ｍｌに溶解し、蒸留した１，４−ジオキサン１０ｍｌに溶解したジシクロヘキシルカルボジイミド(dicyclohexylcarbodiimide)100mgを添加した後、前記混合物を窒素雰囲気下、室温で１２時間撹拌した。前記反応溶液を濾過し、このようにして得られた沈殿物をＮ−ヘキサンと酢酸エチルの混合物（１：１，Ｒｆ＝０．４０）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、淡黄色固体状の標題化合物１．３９ｇを得た（収率９９％）。
【００１９】
1H NMR (CDCl3; 300MHz) δ2.88 (4H, br s), 4.39 (5H, s), 4.57 (2H, m), 4.95 (2H, m) ppm。
【００２０】
［実施例１］  Ｎ−［［４−（３−フェロセンカルボキサミドプロピル）ピペラジニル］−プロピル］−１，８−ナフタレンイミドの製造（式（１）の化合物）
（段階１）  Ｎ−［３−［４−（３−アミノプロピル）−ピペラジン−１−イル］−プロピル］−フェロセンアミド（式（２）の化合物）の製造
１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン２８４μｌ（１．３７６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン１４ｍｌに溶かした溶液を、製造例１で得られた化合物３００ｍｇ（０．９１７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン１０ｍｌに溶かした溶液に注射器を用いて１０時間徐々に滴下した。続いて、前記反応物を濾過し、得られた沈殿物をメタノールと水酸化アンモニウムの混合物（９：１，Ｒｆ＝０．２３）を用いたシリカゲルクロマトグラフィーで精製して黄色固体状の標題化合物２５５ｍｇを得た（収率６２％）。
【００２１】
1H NMR (CDCl3; 300MHz) δ1.65 - 1.86 (4H, m), 2.35 - 2.80 (14H, m), 2.97 (1H, m), 3.45 (2H, m), 4.20 (5H, s), 4.33 (2H, br s), 4.69 (2H, br s), 6.91 (1H, br m) ppm。
【００２２】
（段階２）Ｎ−［［４−（３−フェロセンカルボキサミドプロピル）ピペラジニル］−プロピル］−１，８−ナフタレンイミド（式（１）の化合物）の製造
段階１で得られた化合物４１．２ｍｇ（０．１０ｍｍｏｌ）とジイソプロピルエチルアミン２６μｌ（０．１５０ｍｍｏｌ）をイソプロピルアルコール１０ｍｌに溶解した後、これに１，８−ナフタル酸無水物 １７．８ｍｇ（０．０９ｍｍｏｌ）を添加し、前記混合物を窒素雰囲気下で２時間還流した。この反応液を室温に冷却した後、濾過して褐色固体状の沈殿物を得、冷却イソプロピルアルコール２ｍｌで３回洗浄した。得られた固体産物をプロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）及びガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した結果、式（１）の化合物が９８％以上の純度を有することを確認した。前記固体産物はアセトンで再結晶して精製された黄色固体の標題化合物４９ｍｇ（０．０８３ｍｍｏｌ）を得た（収率８３％）
1H NMR (CDCl3; 300MHz) δ1.71 (2H, m), 1.94 (2H, m), 2.43 (6H, m), 2.53 (6H, m), 3.41 (2H, q, J = 6.0 Hz), 4.15 (5H, s), 4.22 (4H, br m), 4.68 (2H, br s), 7.21 (1H, br m)  7.73 (2H, dd, J = 7.5, 8.1 Hz), 8.19 (2H, d, J = 8.1 Hz), 8.57 (2H, d, J = 7.5 Hz) ppm。
【００２３】
［製造例２］  Ｎ，Ｎ−ビス［［４−（３−フェロセンカルボキサミノプロピル）ピペラジニル］プロピル］ナフタレン−１，４，５，８−テトラカルボン酸（式４の化合物）の製造
実施例１の段階１で得た化合物１１０ｍｇ（０．２６７ｍｍｏｌ）とジイソプロピルエチルアミン５６μｌ（０．３２０ｍｍｏｌ）をイソプロピルアルコール１２ｍｌに溶解した後、これに１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボキシル二無水物２８．６ｍｇ（０．１０７ｍｍｏｌ）を添加した後、前記混合物を窒素雰囲気下で６時間還流した。前記反応液を室温に冷却した後、濾過して褐色沈殿物を得、これを冷却イソプロピルアルコール２ｍｌで３回洗浄した。得られた固体産物をプロトンＮＭＲ及びＧＣで分析した結果、前記化合物が９８％以上の純度を持つことを確認した。前記固体産物をアセトンで再結晶して精製された黄色固体の標題化合物１１０ｍｇ（０．１０４ｍｍｏｌ）を得た（収率９７％）。
【００２４】
1H NMR (CDCl3) δ1.72 (4H, m), 1.96 (4H, m), 2.43 (12H, m), 2.57 (12H, m), 3.44 (4H, m), 4.30 (10H, m), 4.32 (8H, br s), 4.69 (4H, br s), 7.02 (2H, m), 8.78 (4H, s) ppm
［実施例２］  プローブ一本鎖ＤＮＡ−電極の製造
（段階１）  Ａｕ電極のコーティング
２ｍｍ２の面積を有する純金（Ａｕ）電極(MF-2014 AUE gold electrode, BAS, IN, USA)を沸かした２Ｍ ＮａＯＨ溶液中で５分間、濃縮硝酸で５分間洗浄した後、蒸留水で３分間２回超音波処理を行った。基準線（ｂａｓａｌ  ｌｉｎｅ）を決定するために汚染物質による電流量が検出されないまで、電極を０．１Ｍ硫酸水溶液に浸し、ボルタンメトリックアナライザー(voltammetric analyzer(BAS, CV-50W, IN. USA))を用いて０から１．５Ｖまで(vs. Ag/AgCl)100mV/sの速度でサイクルさせた。このようにして得られた裸電極(bare electrode)を１ｍＭ ２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）溶液で２時間処理して２−ＭＥの−ＳＨ官能基とＡｕ電極表面が反応するようにした。得られた純金電極は共有結合された−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ単層でコーティングされ、この時末端−ＯＨ官能基が外部に露出されることになる。
【００２５】
（段階２）  一本鎖ＤＮＡ−電極の製造
オリゴヌクレオチド合成機を用いて配列番号：１及び２のセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを製造した後、センスオリゴヌクレオチドの５’末端にリン酸基を結合させた。４０ｍＭ ２−[Ｎ−モルホリノ]エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝溶液（ｐＨ４．５）に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロライド（ＥＤＡＣ）及びセンスオリゴヌクレオチド（ｓｓＤＮＡ）をそれぞれ１μｇ／μｌおよび１ｍＭの濃度で溶解した後、段階１で製造されたコーティングされた電極を前記溶液で２４時間処理して電極表面の−ＯＨ官能基に結合された一本鎖ＤＮＡのリン酸基を有する一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）−電極を得た。
【００２６】
［実施例３］  ＤＮＡ検出
（段階１）  ハイブリッド化ＤＮＡの形成
配列番号：２のアンチセンスＤＮＡ（ａｓＤＮＡ）試料１μｌ（１ｎｍｏｌ／μｌ）を３０μｌの混成化溶液（０．０９μｇ／μｌ鮭精子ＤＮＡ、０．５μｇ／μｌアセチル化された牛血清アルブミン、27mM MES(free acid), 74mM MES(sodium salt)、 0.89M NaCl、 0.01％ツイーン２０、２０ｍＭ ＥＤＴＡ，最終濃度）に加えた後、実施例２で作製した一本鎖ＤＮＡ−電極を前記溶液と共に３７℃で２４時間反応させハイブリッドＤＮＡを形成させた。これを洗浄溶液（27mM MES(free acid)、74mM MES(sodium salt)、26mM NaCl、0.01%ツイーン20，最終濃度）で３７℃で１５分間ずつ洗浄し、この過程を３回繰返して電極に二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）が結合された二本鎖ＤＮＡ電極を得た（ｄｓＤＮＡ−電極）。このような二本鎖ＤＮＡ電極の製造過程を図１に示した。
【００２７】
（段階２）  二本鎖ＤＮＡ及びインターカレーターの混合
式４のＮ，Ｎ−ビス［［４−（３−フェロセンカルボキサミドプロピル）ピペラジニル］プロピル］ナフタレン−１，４，５，８−テトラカルボン酸（ＩＣ１）と式（１）のＮ−［［４−（３−フェロセンカルボキサミドプロピル）ピペラジニル］プロピル］−１，８−ナフタレンイミド（ＩＣ２）をそれぞれ４０μＭ濃度で蒸留水に溶解した後、前記段階１で作製されたｄｓＤＮＡ−電極を前記溶液で１０分間室温で処理してＩＣ１及びＩＣ２化合物の両方ともインターカレーターとしてｄｓＤＮＡに挿入された二本鎖ＤＮＡを得た。比較のため、ＩＣ１のみが挿入された他のｄｓＤＮＡ−電極を同じような方法で作製した。
【００２８】
作製されたｄｓＤＮＡ−電極の中１つを作業電極(working electrode)に、Ａｇ／ＡｇＣｌを基準電極(reference electrode)に、Ｐｔ線(wire)を相対電極(counter electrode)にした三電極系(tri-electrode system)に電圧を印可し、電解質溶液（０．１  Ｍ  ＫＣｌ）中に印加された電圧によって誘導された酸化還元反応過程で発生される電流をボルタンメトリックアナライザー（ＢＡＳ，ＣＶ−５０Ｗ，ＵＫ）で測定した。この場合、電流はＩＣ１とＩＣ２、またはＩＣ１のみを経て電極に伝達され、電流量はサイクリックボルタンメトリ(cyclic voltammetry)から得られた（図２参照）。
【００２９】
図３に示されたように、通常のインターカレーター、例えばＩＣ１のみを含むシステムから得たピーク電流は本発明の混合インターカレーター（ＩＣ１とＩＣ２）を用いた２つの場合から得られる電流より非常に低かった。前記図面において、Ｂは実施例２の段階１で言及された基準線を；Ｓは一本鎖ＤＮＡ−電極を；およびＤは二本鎖ＤＮＡ−電極（２つの個別的な場合）を意味する。本発明の二本鎖ＤＮＡ−電極から得られる顕著に高い電流密度はＩＣ１が接近できない部位を占有しているＩＣ２の作用に起因したものである。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の好ましい一実施態様に従ってｄｓＤＮＡ−電極を製造する概略的な過程を示す。
【図２】インターカレーター層を介した電子移動およびこれより得られた典型的なサイクリック電流−電圧曲線の概略的な説明を示す。
【図３】本発明のインターカレーターとインターカレーター混合物を用いて得られたピーク電流値を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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