(57)【要約】【課題】リファレンスユニットにおける測定結果を用いて、測定ユニットにおける測定結果を補正する際に、リファレンスユニットと測定ユニット間の感度差による影響を低減し、全反射減衰の状態の変化の測定精度を向上する。【解決手段】センシング物質30が固定されている、測定チップ６およびリファレンスチップ６’に、まず溶媒のみを供給し、光ビーム13を各チップの内底面に形成された金属膜12と、その下の誘電体ブロック10との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させ、界面において全反射した光ビーム13をフォトダイオードアレイ17で検出し、該検出結果に基づいて測定ユニット５とリファレンスユニット５’間の感度差を算出する。その後測定チップ６のみに被検体を添加し、同様に測定を行い、リファレンスユニット５’の測定結果を前述の感度差を用いて校正し該校正された測定結果により、測定ユニット５の測定結果を補正する。【選択図】図１
2007057546.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の光ビームを発生させる第１の光源と、
前記第１の光ビームに対して透明な第１の誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成された第１の薄膜層、この薄膜層の表面上に被検体と溶媒からなる試料液を保持する第１の試料液保持機構を備えてなる測定チップと、
前記第１の薄膜層の表面上に配置されている、前記被検体と結合しうるセンシング物質と、
前記第１の光ビームを前記第１の誘電体ブロックに対して、該第１の誘電体ブロックと前記第１の薄膜層との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させる第１の光学系と、
前記第１の誘電体ブロックと前記第１の薄膜層との界面で全反射した第１の光ビームの強度を検出する第１の光検出手段とから構成される測定ユニットと、
第２の光ビームを発生させる第２の光源と、
前記第２の光ビームに対して透明な第２の誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成された第２の薄膜層、この薄膜層の表面上に前記溶媒からなる偽試料液を保持する第２の試料液保持機構を備えてなるリファレンスチップと、
前記第２の薄膜層の表面上に配置されている、前記被検体と結合しうるセンシング物質と、
前記第２の光ビームを前記第２の誘電体ブロックに対して、該第２の誘電体ブロックと前記第２の薄膜層との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させる第２の光学系と、
前記第２の誘電体ブロックと前記第２の薄膜層との界面で全反射した第２の光ビームの強度を検出する第２の光検出手段とから構成されるリファレンスユニットと、
前記第２の光検出手段の検出結果を用いて、前記第１の光検出手段の検出結果を補正し、該補正された第１の光検出手段の検出結果に基づいて全反射減衰の状態の変化を測定する測定手段とを備えた全反射減衰を利用した測定装置を用いて、
前記全反射減衰の状態の変化の測定開始前に、前記測定ユニットおよび前記リファレンスユニット間の感度差を検出し、
前記測定時に、前記感度差に基づいて前記第２の光検出手段の検出結果および前記第１の光検出手段の検出結果のどちらか一方の検出結果を校正し、その後前記第２の光検出手段の検出結果を用いて、前記第１の光検出手段の検出結果を補正することを特徴とする全反射減衰を利用した測定方法。
【請求項２】
第１の光ビームを発生させる第１の光源と、
前記第１の光ビームに対して透明な第１の誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜からなる第１の薄膜層、この薄膜層の表面上に被検体と溶媒からなる試料液を保持する第１の試料液保持機構を備えてなる測定チップと、
前記第１の薄膜層の表面上に配置されている、前記被検体と結合しうるセンシング物質と、
前記第１の光ビームを前記第１の誘電体ブロックに対して、該第１の誘電体ブロックと前記第１の薄膜層との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させる第１の光学系と、
前記第１の誘電体ブロックと前記第１の薄膜層との界面で全反射した第１の光ビームの強度を検出する第１の光検出手段とから構成される測定ユニットと、
第２の光ビームを発生させる第２の光源と、
前記第２の光ビームに対して透明な第２の誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜からなる第２の薄膜層、この薄膜層の表面上に前記溶媒からなる偽試料液を保持する第２の試料液保持機構を備えてなるリファレンスチップと、
前記第２の薄膜層の表面上に配置されている、前記被検体と結合しうるセンシング物質と、
前記第２の光ビームを前記第２の誘電体ブロックに対して、該第２の誘電体ブロックと前記第２の薄膜層との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させる第２の光学系と、
前記第２の誘電体ブロックと前記第２の薄膜層との界面で全反射した第２の光ビームの強度を検出する第２の光検出手段とから構成されるリファレンスユニットと、
前記第２の光検出手段の検出結果を用いて、前記第１の光検出手段の検出結果を補正し、該補正された第１の光検出手段の検出結果に基づいて、表面プラズモン共鳴に伴う全反射減衰の状態の変化を測定する測定手段とを備えた全反射減衰を利用した測定装置を用いて
前記全反射減衰の状態の変化の測定開始前に、前記測定ユニットおよび前記リファレンスユニット間の感度差を検出し、
前記測定時に、前記感度差に基づいて前記第２の光検出手段の検出結果および前記第１の光検出手段の検出結果のどちらか一方の検出結果を校正し、その後前記第２の光検出手段の検出結果を用いて、前記第１の光検出手段の検出結果を補正することを特徴とする全反射減衰を利用した測定方法。
【請求項３】
第１の光ビームを発生させる第１の光源と、
前記第１の光ビームに対して透明な第１の誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層および該クラッド層の上に形成された光導波層からなる第１の薄膜層、この薄膜層の表面上に被検体と溶媒からなる試料液を保持する第１の試料液保持機構を備えてなる測定チップと、
前記第１の薄膜層の表面上に配置されている、前記被検体と結合しうるセンシング物質と、
前記第１の光ビームを前記第１の誘電体ブロックに対して、該第１の誘電体ブロックと前記第１の薄膜層との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させる第１の光学系と、
前記第１の誘電体ブロックと前記第１の薄膜層との界面で全反射した第１の光ビームの強度を検出する第１の光検出手段とから構成される測定ユニットと、
第２の光ビームを発生させる第２の光源と、
前記第２の光ビームに対して透明な第２の誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層および該クラッド層の上に形成された光導波層からなる第２の薄膜層、この薄膜層の表面上に前記溶媒からなる偽試料液を保持する第２の試料液保持機構を備えてなるリファレンスチップと、
前記第２の薄膜層の表面上に配置されている、前記被検体と結合しうるセンシング物質と、
前記第２の光ビームを前記第２の誘電体ブロックに対して、該第２の誘電体ブロックと前記第２の薄膜層との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させる第２の光学系と、
前記第２の誘電体ブロックと前記第２の薄膜層との界面で全反射した第２の光ビームの強度を検出する第２の光検出手段とから構成されるリファレンスユニットと、
前記第２の光検出手段の検出結果を用いて、前記第１の光検出手段の検出結果を補正し、該補正された第１の光検出手段の検出結果に基づいて、前記光導波層での導波モードの励起に伴う全反射減衰の状態の変化を測定する測定手段とを備えた全反射減衰を利用した測定装置用いて
前記全反射減衰の状態の変化の測定開始前に、前記測定ユニットおよび前記リファレンスユニット間の感度差を検出し、
前記測定時に、前記感度差に基づいて前記第２の光検出手段の検出結果および前記第１の光検出手段の検出結果のどちらか一方の検出結果を校正し、その後前記第２の光検出手段の検出結果を用いて、前記第１の光検出手段の検出結果を補正することを特徴とする全反射減衰を利用した測定方法。
【請求項４】
前記測定ユニットおよび前記リファレンスユニット間の感度差の検出は、前記測定チップおよびリファレンスチップ上に、前記溶媒からなる偽試料液を保持したままの状態で、前記光ビームを前記各ユニットの前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記薄膜層との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させ、前記界面で全反射した光ビームの強度に基づいて、全反射減衰の状態の変化を検出し、該検出の結果を各ユニット間で比較することにより行われるものであることを特徴とする請求項１から３いずれか１項記載の全反射減衰を利用した測定方法。
【請求項５】
前記感度差検出時に前記測定チップに前記偽試料液として前記溶媒を保持させ、
前記感度差検出後に、前記測定チップへ、前記被検体を付加することにより前記測定を行うことを特徴とする請求項４項記載の全反射減衰を利用した測定方法。
【請求項６】
前記測定ユニットおよび前記リファレンスユニット間の感度差の検出は、まず、前記測定チップおよび前記リファレンスチップに、高濃度の溶媒を保持させ、その後同時に、前記測定チップおよび前記リファレンスチップに保持されている高濃度の溶媒の濃度を同程度に希釈し、その間、前記光ビームを前記各ユニットの前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記薄膜層との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させ、前記界面で全反射した光ビームの強度に基づいて、全反射減衰の状態の変化を検出し、該検出の結果を各ユニット間で比較することにより行なわれるものである事を特徴とする請求項１から３いずれか１項記載の全反射減衰を利用した測定方法。
【請求項７】
第１の光ビームを発生させる第１の光源と、
前記第１の光ビームに対して透明な第１の誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成された第１の薄膜層、この薄膜層の表面上に被検体と溶媒からなる試料液を保持する第１の試料液保持機構を備えてなる測定チップと、
前記第１の薄膜層の表面上に配置されている、前記被検体と結合しうるセンシング物質と、
前記第１の光ビームを前記第１の誘電体ブロックに対して、該第１の誘電体ブロックと前記第１の薄膜層との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させる第１の光学系と、
前記第１の誘電体ブロックと前記第１の薄膜層との界面で全反射した第１の光ビームの強度を検出する第１の光検出手段とから構成される測定ユニットと、
第２の光ビームを発生させる第２の光源と、
前記第２の光ビームに対して透明な第２の誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成された第２の薄膜層、この薄膜層の表面上に前記溶媒からなる偽試料液を保持する第２の試料液保持機構を備えてなるリファレンスチップと、
前記第２の薄膜層の表面上に配置されている、前記被検体と結合しうるセンシング物質と、
前記第２の光ビームを前記第２の誘電体ブロックに対して、該第２の誘電体ブロックと前記第２の薄膜層との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させる第２の光学系と、
前記第２の誘電体ブロックと前記第２の薄膜層との界面で全反射した第２の光ビームの強度を検出する第２の光検出手段とから構成されるリファレンスユニットと、
前記第２の光検出手段の検出結果を用いて、前記第１の光検出手段の検出結果を補正し、該補正された第１の光検出手段の検出結果に基づいて全反射減衰の状態の変化を測定する測定手段とを備えた全反射減衰を利用した測定装置において、
前記全反射減衰の状態の変化の測定開始前に、前記測定ユニットおよび前記リファレンスユニット間の感度差を検出する感度差検出手段をさらに備え、
前記測定手段が、前記測定時に、前記感度差に基づいて前記第２の光検出手段の検出結果および前記第１の光検出手段の検出結果のどちらか一方の検出結果を校正し、その後前記第２の光検出手段の検出結果を用いて、前記第１の光検出手段の検出結果を補正するものであることを特徴とする全反射減衰を利用した測定装置。
【請求項８】
第１の光ビームを発生させる第１の光源と、
前記第１の光ビームに対して透明な第１の誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜からなる第１の薄膜層、この薄膜層の表面上に被検体と溶媒からなる試料液を保持する第１の試料液保持機構を備えてなる測定チップと、
前記第１の薄膜層の表面上に配置されている、前記被検体と結合しうるセンシング物質と、
前記第１の光ビームを前記第１の誘電体ブロックに対して、該第１の誘電体ブロックと前記第１の薄膜層との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させる第１の光学系と、
前記第１の誘電体ブロックと前記第１の薄膜層との界面で全反射した第１の光ビームの強度を検出する第１の光検出手段とから構成される測定ユニットと、
第２の光ビームを発生させる第２の光源と、
前記第２の光ビームに対して透明な第２の誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜からなる第２の薄膜層、この薄膜層の表面上に前記溶媒からなる偽試料液を保持する第２の試料液保持機構を備えてなるリファレンスチップと、
前記第２の薄膜層の表面上に配置されている、前記被検体と結合しうるセンシング物質と、
前記第２の光ビームを前記第２の誘電体ブロックに対して、該第２の誘電体ブロックと前記第２の薄膜層との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させる第２の光学系と、
前記第２の誘電体ブロックと前記第２の薄膜層との界面で全反射した第２の光ビームの強度を検出する第２の光検出手段とから構成されるリファレンスユニットと、
前記第２の光検出手段の検出結果を用いて、前記第１の光検出手段の検出結果を補正し、該補正された第１の光検出手段の検出結果に基づいて、表面プラズモン共鳴に伴う全反射減衰の状態の変化を測定する測定手段とを備えた全反射減衰を利用した測定装置において、
前記全反射減衰の状態の変化の測定開始前に、前記測定ユニットおよび前記リファレンスユニット間の感度差を検出する感度差検出手段をさらに備え、
前記測定手段が、前記測定時に、前記感度差に基づいて前記第２の光検出手段の検出結果および前記第１の光検出手段の検出結果のどちらか一方の検出結果を校正し、その後前記第２の光検出手段の検出結果を用いて、前記第１の光検出手段の検出結果を補正するものであることを特徴とする全反射減衰を利用した測定装置。
【請求項９】
第１の光ビームを発生させる第１の光源と、
前記第１の光ビームに対して透明な第１の誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層および該クラッド層の上に形成された光導波層からなる第１の薄膜層、この薄膜層の表面上に被検体と溶媒からなる試料液を保持する第１の試料液保持機構を備えてなる測定チップと、
前記第１の薄膜層の表面上に配置されている、前記被検体と結合しうるセンシング物質と、
前記第１の光ビームを前記第１の誘電体ブロックに対して、該第１の誘電体ブロックと前記第１の薄膜層との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させる第１の光学系と、
前記第１の誘電体ブロックと前記第１の薄膜層との界面で全反射した第１の光ビームの強度を検出する第１の光検出手段とから構成される測定ユニットと、
第２の光ビームを発生させる第２の光源と、
前記第２の光ビームに対して透明な第２の誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層および該クラッド層の上に形成された光導波層からなる第２の薄膜層、この薄膜層の表面上に前記溶媒からなる偽試料液を保持する第２の試料液保持機構を備えてなるリファレンスチップと、
前記第２の薄膜層の表面上に配置されている、前記被検体と結合しうるセンシング物質と、
前記第２の光ビームを前記第２の誘電体ブロックに対して、該第２の誘電体ブロックと前記第２の薄膜層との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させる第２の光学系と、
前記第２の誘電体ブロックと前記第２の薄膜層との界面で全反射した第２の光ビームの強度を検出する第２の光検出手段とから構成されるリファレンスユニットと、
前記第２の光検出手段の検出結果を用いて、前記第１の光検出手段の検出結果を補正し、該補正された第１の光検出手段の検出結果に基づいて、前記光導波層での導波モードの励起に伴う全反射減衰の状態の変化を測定する測定手段とを備えた全反射減衰を利用した測定装置において、
前記全反射減衰の状態の変化の測定開始前に、前記測定ユニットおよび前記リファレンスユニット間の感度差を検出する感度差検出手段をさらに備え、
前記測定手段が、前記測定時に、前記感度差に基づいて前記第２の光検出手段の検出結果および前記第１の光検出手段の検出結果のどちらか一方の検出結果を校正し、その後前記第２の光検出手段の検出結果を用いて、前記第１の光検出手段の検出結果を補正するものであることを特徴とする全反射減衰を利用した測定装置。
【請求項１０】
前記感度差検出手段が、前記測定チップおよびリファレンスチップ上に、前記溶媒からなる偽試料液を保持したままの状態で、前記光ビームを前記各ユニットの前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記薄膜層との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させ、前記界面で全反射した光ビームの強度に基づいて、全反射減衰の状態の変化を検出し、該検出の結果を各ユニット間で比較することにより、前記測定ユニットおよび前記リファレンスユニット間の感度差を検出するものであることを特徴とする請求項７から９いずれか１項記載の全反射減衰を利用した測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモンの発生を利用して物質の特性を分析する表面プラズモン測定等の全反射減衰を利用した測定方法および測定装置に関し、特に詳細には、センシング物質と試料液に含まれる被検体との結合作用の状態を測定する全反射減衰を利用した測定方法および測定装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
金属中においては、自由電子が集団的に振動して、プラズマ波と呼ばれる粗密波が生じる。そして、金属表面に生じるこの粗密波を量子化したものは、表面プラズモンと呼ばれている。
【０００３】
従来より、この表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置が種々提案されている。そして、それらの中で特に良く知られているものとして、 Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号参照）。
【０００４】
上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて液体試料などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【０００５】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。
【０００６】
上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【０００７】
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角θｓｐより表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。すなわち表面プラズモンの波数をＫｓｐ、表面プラズモンの角周波数をω、ｃを真空中の光速、εｍとεｓをそれぞれ金属、被測定物質の誘電率とすると、以下の関係がある。
【数１】
2007057546.tif 000003
【０００８】
すなわち、上記反射光強度が低下する入射角である全反射減衰角θｓｐを知ることにより、被測定物質の誘電率εｓ、つまりは屈折率に関連する特性を求めることができる。
【０００９】
なおこの種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角θｓｐを精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。
【００１０】
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。
【００１１】
また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００１２】
上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。
【００１３】
なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。
【００１４】
また、上述した表面プラズモン測定装置や漏洩モード測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモン測定装置の場合は金属膜であり、漏洩モード測定装置の場合はクラッド層および光導波層）上に上記被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角θｓｐの角度を測定している。
【００１５】
試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角θｓｐを測定し、該全反射減衰角θｓｐの角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。具体的には、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体をセンシング物質として測定チップに固定し、ヒトＩgＧ抗体を特定物質として用いることができる。
【００１６】
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰角θｓｐの角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角θｓｐの角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角θｓｐの角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる。（本出願人による特願2000-398309号参照）
このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め形成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角θｓｐの角度変化量の測定を行っている。
【００１７】
上記測定チップに試料液を供給し、センシング物質と被検体とが結合すると、センシング物質の屈折率が変化し、全反射減衰角θｓｐの角度が変化する。しかし、測定チップに試料液を供給した後の全反射減衰角θｓｐの角度変化は、厳密にはセンシング物質と被検体の結合による屈折率の変化のみを反映したものではなく、センシング物質と試料液中の被検体の結合による屈折率の変化と、センシング物質と試料液中の溶媒との作用による屈折率変化の総和を反映したものである。
【００１８】
このため、センシング物質に溶媒からなる偽試料液を供給して測定を行っても、図４に実線で示すように、全反射減衰角θｓｐの角度はわずかに変化し、この全反射減衰角θｓｐの角度変化は測定の際には誤差となる。この誤差を除去するために、出願人らは溶媒からなる偽試料液が供給された測定チップであるリファレンスチップを設け、測定チップにおける全反射減衰角θｓｐの角度変化量からリファレンスチップにおける全反射減衰角θｓｐの角度変化量を差し引いた、補正角度変化量を求め、その補正角度変化量に基づいて、センシング物質と被検体とに結合の有無を判定する判定方法を特願2001-049681において提案している。この判定方法を用いれば、センシング物質と被検体とが結合しない場合には、全反射減衰角θｓｐの補正角度変化量はほぼ０となるため、容易に結合の有無を判定することができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
しかしながら、上記リファレンスチップを用いた判定方法は、センシング物質と被検体とが結合しない場合であっても、全反射減衰角θｓｐの補正角度変化量が完全に０とならないため、被検体の分子量が大きい場合には有効であっても、被検体の分子量が小さい場合には、センシング物質と被検体とが結合の有無の判定精度を向上することができないという問題がある。
【００２０】
図４に、発明者らが測定した溶媒からなる偽試料液が供給された測定チップにおける全反射減衰角θｓｐの角度変化量を実線で、同じく溶媒からなる偽試料液が供給されたリファレンスチップにおける全反射減衰角θｓｐの角度変化量を点線で、測定チップにおける角度変化量からリファレンスチップにおける角度変化量を差し引いた補正角度変化量を一点鎖線で示す。どちらのチップにおいても、センシング物質と被検体の結合は生じていないので、補正角度変化量は０であることが望ましい。しかし一点鎖線で示す補正角度変化量は、１時間経過した時に、分子量換算で900の値を示している。このようにセンシング物質と被検体との結合が生じていない場合、すなわち本来ならば補正角度変化量が０となる場合に、測定される補正角度変化量の値が大きいため、結合の有無の判定精度が悪化している。
【００２１】
上記のように、偽試料液が供給された測定チップにおける角度変化量と、同様に偽試料液が供給されたリファレンスチップにおける角度変化量との間に差が生じる原因のひとつは、リファレンスチップに配設された金属の薄膜層と、測定チップに配設された金属の薄膜層の厚さにバラツキがあることが挙げられる。また、他の原因としてはリファレンスチップに固定されたセンシング物質の層の厚さと、測定チップに固定されたセンシング物質の層の厚さにバラツキがあることが挙げられる。さらに、前述したように、光検出手段で検出した微分値の変化量に基づいて角度変化量を算出しているため、測定ユニットに設けられた光検出手段の検出感度とリファレンスユニットに設けられた光検出手段の検出感度にバラツキが生じている事などが挙げられる。
【００２２】
本発明は上記の事情に鑑みて、測定ユニットとリファレンスユニット間の感度差の影響を低減し、全反射減衰の状態の変化の測定精度を向上させることのできる全反射減衰を利用した測定方法および装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明による全反射減衰を利用した測定方法は、第１の光ビームを発生させる第１の光源と、
前記第１の光ビームに対して透明な第１の誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成された第１の薄膜層、この薄膜層の表面上に被検体と溶媒からなる試料液を保持する第１の試料液保持機構を備えてなる測定チップと、
前記第１の薄膜層の表面上に配置されている、前記被検体と結合しうるセンシング物質と、
前記第１の光ビームを前記第１の誘電体ブロックに対して、該第１の誘電体ブロックと前記第１の薄膜層との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させる第１の光学系と、
前記第１の誘電体ブロックと前記第１の薄膜層との界面で全反射した第１の光ビームの強度を検出する第１の光検出手段とから構成される測定ユニットと、
第２の光ビームを発生させる第２の光源と、
前記第２の光ビームに対して透明な第２の誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成された第２の薄膜層、この薄膜層の表面上に前記溶媒からなる偽試料液を保持する第２の試料液保持機構を備えてなるリファレンスチップと、
前記第２の薄膜層の表面上に配置されている、前記被検体と結合しうるセンシング物質と、
前記第２の光ビームを前記第２の誘電体ブロックに対して、該第２の誘電体ブロックと前記第２の薄膜層との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させる第２の光学系と、
前記第２の誘電体ブロックと前記第２の薄膜層との界面で全反射した第２の光ビームの強度を検出する第２の光検出手段とから構成されるリファレンスユニットと、
前記第２の光検出手段の検出結果を用いて、前記第１の光検出手段の検出結果を補正し、該補正された第１の光検出手段の検出結果に基づいて全反射減衰の状態の変化を測定する測定手段とを備えた全反射減衰を利用した測定装置を用いて、
前記全反射減衰の状態の変化の測定開始前に、前記測定ユニットおよび前記リファレンスユニット間の感度差を検出し、
前記測定時に、前記感度差に基づいて前記第２の光検出手段の検出結果および前記第１の光検出手段の検出結果のどちらか一方の検出結果を校正し、その後前記第２の光検出手段の検出結果を用いて、前記第１の光検出手段の検出結果を補正することを特徴とするものである。
【００２４】
また、本発明による全反射減衰を利用した測定方法は、特に前述の表面プラズモン測定方法を対象とすることもでき、その場合は、
第１の光ビームを発生させる第１の光源と、
前記第１の光ビームに対して透明な第１の誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜からなる第１の薄膜層、この薄膜層の表面上に被検体と溶媒からなる試料液を保持する第１の試料液保持機構を備えてなる測定チップと、
前記第１の薄膜層の表面上に配置されている、前記被検体と結合しうるセンシング物質と、
前記第１の光ビームを前記第１の誘電体ブロックに対して、該第１の誘電体ブロックと前記第１の薄膜層との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させる第１の光学系と、
前記第１の誘電体ブロックと前記第１の薄膜層との界面で全反射した第１の光ビームの強度を検出する第１の光検出手段とから構成される測定ユニットと、
第２の光ビームを発生させる第２の光源と、
前記第２の光ビームに対して透明な第２の誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜からなる第２の薄膜層、この薄膜層の表面上に前記溶媒からなる偽試料液を保持する第２の試料液保持機構を備えてなるリファレンスチップと、
前記第２の薄膜層の表面上に配置されている、前記被検体と結合しうるセンシング物質と、
前記第２の光ビームを前記第２の誘電体ブロックに対して、該第２の誘電体ブロックと前記第２の薄膜層との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させる第２の光学系と、
前記第２の誘電体ブロックと前記第２の薄膜層との界面で全反射した第２の光ビームの強度を検出する第２の光検出手段とから構成されるリファレンスユニットと、
前記第２の光検出手段の検出結果を用いて、前記第１の光検出手段の検出結果を補正し、該補正された第１の光検出手段の検出結果に基づいて、表面プラズモン共鳴に伴う全反射減衰の状態の変化を測定する測定手段とを備えた全反射減衰を利用した測定装置を用いて
前記全反射減衰の状態の変化の測定開始前に、前記測定ユニットおよび前記リファレンスユニット間の感度差を検出し、
前記測定時に、前記感度差に基づいて前記第２の光検出手段の検出結果および前記第１の光検出手段の検出結果のどちらか一方の検出結果を校正し、その後前記第２の光検出手段の検出結果を用いて、前記第１の光検出手段の検出結果を補正することを特徴とするものである。
【００２５】
また、本発明による全反射減衰を利用した測定方法は、特に前述の漏洩モード測定方法を対象とすることもでき、その場合は、
第１の光ビームを発生させる第１の光源と、
前記第１の光ビームに対して透明な第１の誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層および該クラッド層の上に形成された光導波層からなる第１の薄膜層、この薄膜層の表面上に被検体と溶媒からなる試料液を保持する第１の試料液保持機構を備えてなる測定チップと、
前記第１の薄膜層の表面上に配置されている、前記被検体と結合しうるセンシング物質と、
前記第１の光ビームを前記第１の誘電体ブロックに対して、該第１の誘電体ブロックと前記第１の薄膜層との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させる第１の光学系と、
前記第１の誘電体ブロックと前記第１の薄膜層との界面で全反射した第１の光ビームの強度を検出する第１の光検出手段とから構成される測定ユニットと、
第２の光ビームを発生させる第２の光源と、
前記第２の光ビームに対して透明な第２の誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層および該クラッド層の上に形成された光導波層からなる第２の薄膜層、この薄膜層の表面上に前記溶媒からなる偽試料液を保持する第２の試料液保持機構を備えてなるリファレンスチップと、
前記第２の薄膜層の表面上に配置されている、前記被検体と結合しうるセンシング物質と、
前記第２の光ビームを前記第２の誘電体ブロックに対して、該第２の誘電体ブロックと前記第２の薄膜層との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させる第２の光学系と、
前記第２の誘電体ブロックと前記第２の薄膜層との界面で全反射した第２の光ビームの強度を検出する第２の光検出手段とから構成されるリファレンスユニットと、
前記第２の光検出手段の検出結果を用いて、前記第１の光検出手段の検出結果を補正し、該補正された第１の光検出手段の検出結果に基づいて、前記光導波層での導波モードの励起に伴う全反射減衰の状態の変化を測定する測定手段とを備えた全反射減衰を利用した測定装置用いて
前記全反射減衰の状態の変化の測定開始前に、前記測定ユニットおよび前記リファレンスユニット間の感度差を検出し、
前記測定時に、前記感度差に基づいて前記第２の光検出手段の検出結果および前記第１の光検出手段の検出結果のどちらか一方の検出結果を校正し、その後前記第２の光検出手段の検出結果を用いて、前記第１の光検出手段の検出結果を補正することを特徴とするものである。
【００２６】
上記各種の全反射減衰を利用した測定方法において、前記測定ユニットおよび前記リファレンスユニット間の感度差の検出は、前記測定チップおよびリファレンスチップ上に、前記溶媒からなる偽試料液を保持したままの状態で、前記光ビームを前記各ユニットの前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記薄膜層との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させ、前記界面で全反射した光ビームの強度に基づいて、全反射減衰の状態の変化を検出し、該検出の結果を各ユニット間で比較することにより行われるものであってもよい。
【００２７】
前記感度差検出時に前記測定チップに前記偽試料液として前記溶媒を保持させる場合であれば、前記感度差検出後に、前記測定チップへ、前記被検体を付加することにより前記測定を行なってもよい。
【００２８】
また、前記測定ユニットおよび前記リファレンスユニット間の感度差の検出は、まず、前記測定チップおよび前記リファレンスチップに、高濃度の溶媒を保持させ、その後同時に、前記測定チップおよび前記リファレンスチップに保持されている高濃度の溶媒の濃度を同程度に希釈し、その間、前記光ビームを前記各ユニットの前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記薄膜層との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させ、前記界面で全反射した光ビームの強度に基づいて、全反射減衰の状態の変化を検出し、該検出の結果を各ユニット間で比較することにより行なわれるものであってもよい。
【００２９】
本発明による全反射減衰を利用した測定装置においては、
第１の光ビームを発生させる第１の光源と、
前記第１の光ビームに対して透明な第１の誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成された第１の薄膜層、この薄膜層の表面上に被検体と溶媒からなる試料液を保持する第１の試料液保持機構を備えてなる測定チップと、
前記第１の薄膜層の表面上に配置されている、前記被検体と結合しうるセンシング物質と、
前記第１の光ビームを前記第１の誘電体ブロックに対して、該第１の誘電体ブロックと前記第１の薄膜層との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させる第１の光学系と、
前記第１の誘電体ブロックと前記第１の薄膜層との界面で全反射した第１の光ビームの強度を検出する第１の光検出手段とから構成される測定ユニットと、
第２の光ビームを発生させる第２の光源と、
前記第２の光ビームに対して透明な第２の誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成された第２の薄膜層、この薄膜層の表面上に前記溶媒からなる偽試料液を保持する第２の試料液保持機構を備えてなるリファレンスチップと、
前記第２の薄膜層の表面上に配置されている、前記被検体と結合しうるセンシング物質と、
前記第２の光ビームを前記第２の誘電体ブロックに対して、該第２の誘電体ブロックと前記第２の薄膜層との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させる第２の光学系と、
前記第２の誘電体ブロックと前記第２の薄膜層との界面で全反射した第２の光ビームの強度を検出する第２の光検出手段とから構成されるリファレンスユニットと、
前記第２の光検出手段の検出結果を用いて、前記第１の光検出手段の検出結果を補正し、該補正された第１の光検出手段の検出結果に基づいて全反射減衰の状態の変化を測定する測定手段とを備えた全反射減衰を利用した測定装置において、
前記全反射減衰の状態の変化の測定開始前に、前記測定ユニットおよび前記リファレンスユニット間の感度差を検出する感度差検出手段をさらに備え、
前記測定手段が、前記測定時に、前記感度差に基づいて前記第２の光検出手段の検出結果および前記第１の光検出手段の検出結果のどちらか一方の検出結果を校正し、その後前記第２の光検出手段の検出結果を用いて、前記第１の光検出手段の検出結果を補正するものであることを特徴とするものである。
【００３０】
また、本発明による全反射減衰を利用した測定装置は、特に前述の表面プラズモン測定装置として構成されたものを対象とすることもでき、その場合は、
第１の光ビームを発生させる第１の光源と、
前記第１の光ビームに対して透明な第１の誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜からなる第１の薄膜層、この薄膜層の表面上に被検体と溶媒からなる試料液を保持する第１の試料液保持機構を備えてなる測定チップと、
前記第１の薄膜層の表面上に配置されている、前記被検体と結合しうるセンシング物質と、
前記第１の光ビームを前記第１の誘電体ブロックに対して、該第１の誘電体ブロックと前記第１の薄膜層との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させる第１の光学系と、
前記第１の誘電体ブロックと前記第１の薄膜層との界面で全反射した第１の光ビームの強度を検出する第１の光検出手段とから構成される測定ユニットと、
第２の光ビームを発生させる第２の光源と、
前記第２の光ビームに対して透明な第２の誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜からなる第２の薄膜層、この薄膜層の表面上に前記溶媒からなる偽試料液を保持する第２の試料液保持機構を備えてなるリファレンスチップと、
前記第２の薄膜層の表面上に配置されている、前記被検体と結合しうるセンシング物質と、
前記第２の光ビームを前記第２の誘電体ブロックに対して、該第２の誘電体ブロックと前記第２の薄膜層との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させる第２の光学系と、
前記第２の誘電体ブロックと前記第２の薄膜層との界面で全反射した第２の光ビームの強度を検出する第２の光検出手段とから構成されるリファレンスユニットと、
前記第２の光検出手段の検出結果を用いて、前記第１の光検出手段の検出結果を補正し、該補正された第１の光検出手段の検出結果に基づいて、表面プラズモン共鳴に伴う全反射減衰の状態の変化を測定する測定手段とを備えた全反射減衰を利用した測定装置において、
前記全反射減衰の状態の変化の測定開始前に、前記測定ユニットおよび前記リファレンスユニット間の感度差を検出する感度差検出手段をさらに備え、
前記測定手段が、前記測定時に、前記感度差に基づいて前記第２の光検出手段の検出結果および前記第１の光検出手段の検出結果のどちらか一方の検出結果を校正し、その後前記第２の光検出手段の検出結果を用いて、前記第１の光検出手段の検出結果を補正するものであることを特徴とするものである。
【００３１】
また、本発明による全反射減衰を利用した測定装置は、特に前述の漏洩モード測定装置として構成されたものを対象とすることもでき、その場合は、
第１の光ビームを発生させる第１の光源と、
前記第１の光ビームに対して透明な第１の誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層および該クラッド層の上に形成された光導波層からなる第１の薄膜層、この薄膜層の表面上に被検体と溶媒からなる試料液を保持する第１の試料液保持機構を備えてなる測定チップと、
前記第１の薄膜層の表面上に配置されている、前記被検体と結合しうるセンシング物質と、
前記第１の光ビームを前記第１の誘電体ブロックに対して、該第１の誘電体ブロックと前記第１の薄膜層との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させる第１の光学系と、
前記第１の誘電体ブロックと前記第１の薄膜層との界面で全反射した第１の光ビームの強度を検出する第１の光検出手段とから構成される測定ユニットと、
第２の光ビームを発生させる第２の光源と、
前記第２の光ビームに対して透明な第２の誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層および該クラッド層の上に形成された光導波層からなる第２の薄膜層、この薄膜層の表面上に前記溶媒からなる偽試料液を保持する第２の試料液保持機構を備えてなるリファレンスチップと、
前記第２の薄膜層の表面上に配置されている、前記被検体と結合しうるセンシング物質と、
前記第２の光ビームを前記第２の誘電体ブロックに対して、該第２の誘電体ブロックと前記第２の薄膜層との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させる第２の光学系と、
前記第２の誘電体ブロックと前記第２の薄膜層との界面で全反射した第２の光ビームの強度を検出する第２の光検出手段とから構成されるリファレンスユニットと、
前記第２の光検出手段の検出結果を用いて、前記第１の光検出手段の検出結果を補正し、該補正された第１の光検出手段の検出結果に基づいて、前記光導波層での導波モードの励起に伴う全反射減衰の状態の変化を測定する測定手段とを備えた全反射減衰を利用した測定装置において、
前記全反射減衰の状態の変化の測定開始前に、前記測定ユニットおよび前記リファレンスユニット間の感度差を検出する感度差検出手段をさらに備え、
前記測定手段が、前記測定時に、前記感度差に基づいて前記第２の光検出手段の検出結果および前記第１の光検出手段の検出結果のどちらか一方の検出結果を校正し、その後前記第２の光検出手段の検出結果を用いて、前記第１の光検出手段の検出結果を補正するものであることを特徴とするものである。
【００３２】
上記各種の全反射減衰を利用した測定装置において、前記感度差検出手段は、前記測定チップおよびリファレンスチップ上に、前記溶媒からなる偽試料液を保持したままの状態で、前記光ビームを前記各ユニットの前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記薄膜層との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させ、前記界面で全反射した光ビームの強度に基づいて、全反射減衰の状態の変化を検出し、該検出の結果を各ユニット間で比較することにより、前記測定ユニットおよび前記リファレンスユニット間の感度差を検出するものであってもよい。
【００３３】
なお、上記「前記溶媒からなる偽試料液」としては、試料液に使用される溶媒が好ましいが、これに限定されるものではなく、センシング物質との作用特性や光学特性などが、試料液に使用される溶媒と略同一の液体であれば、上記偽試料液として使用することができる。
【００３４】
また、上記「結合」には、タンパク質−タンパク質相互作用、ＤＮＡ−タンパク質相互作用、糖−タンパク質相互作用、タンパク質−ペプチド相互作用、脂質−タンパク質相互作用や化学物質の化学物質の結合等が含まれている。
【００３５】
なお、上記第１の光源および第２の光源は別個に設けられるものであってもよいし、単一の光源であってもよい。第１の光学系および第２の光学系は別個に設けられるものであってもよいし、単一の光学系であってもよい。また第１の光検出手段および第２の光検出手段は別個に設けられるものであってもよいし、単一の光検出手段であってもよい。
【発明の効果】
【００３６】
本発明による全反射減衰を利用した測定方法および測定装置においては、
前記全反射減衰の状態の変化の測定開始前に、前記測定ユニットおよび前記リファレンスユニット間の感度差を検出し、前記測定時に、前記感度差に基づいて前記第２の光検出手段の検出結果および前記第１の光検出手段の検出結果のどちらか一方の検出結果を校正し、その後前記第２の光検出手段の検出結果を用いて、前記第１の光検出手段の検出結果を補正するため、リファレンスチップに配設された金属の薄膜層と、測定チップに配設された金属の薄膜層の厚さのバラツキや、リファレンスチップに固定されたセンシング物質の層の厚さと、測定チップに固定されたセンシング物質の層の厚さとのバラツキ、あるいは測定ユニットに設けられた光検出手段の検出感度とリファレンスユニットに設けられた光検出手段の検出感度のバラツキ等に起因する測定ユニットとリファレンスユニット間の感度差の影響を低減し、全反射減衰の状態の変化の測定精度を向上させることができる。
【００３７】
上記前記測定ユニットおよび前記リファレンスユニット間の感度差の検出を、前記測定チップおよびリファレンスチップ上に、前記溶媒からなる偽試料液を保持したままの状態で、前記光ビームを前記各ユニットの前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記薄膜層との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させ、前記界面で全反射した光ビームの強度に基づいて、全反射減衰の状態の変化を検出し、該検出の結果を各ユニット間で比較することにより行ったため、溶媒からなる偽試料液を保持したままの状態、すなわち一旦測定チップおよびリファレンスチップへ偽試料液を保持させた後は、それらの偽試料液を保持し続けることにより、測定ユニットとリファレンスユニットとの間の感度差を検出することができるため、容易に感度差を検出することができる。
【００３８】
また、測定チップへ溶媒を保持したままの状態で測定ユニットとリファレンスユニットとの間の感度差を検出し、その後測定チップへ被検体を付与することにより測定を行うことにより、容易に測定を開始することができる。
【００３９】
さらに、測定チップおよびリファレンスチップに高濃度の溶媒を保持させ、該高濃度の溶媒を希釈することを用いて、測定ユニットとリファレンスユニットとの間の感度差を検出する場合には、容易かつ短時間に感度差を検出することができる。また、感度差を検出後に測定チップへ被検体を付加することにより測定を行うことができるので、容易に測定を開始することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を詳細に説明する。図１は、本発明の第１の実施形態による表面プラズモン測定装置の側面形状を示すものである。この表面プラズモン測定装置においては、まず、センシング物質が固定されている、測定チップおよびリファレンスチップに、前記溶媒からなる偽試料液を供給し、表面プラズモン共鳴による全反射減衰角θｓｐの角度変化量を測定することにより、測定ユニットとリファレンスユニット間の感度差を求める感度差測定を行い、その後測定チップのみに被検体を添加して、センシング物質と被検体の結合の有無を測定する実測定を行い、被検体が特定物質であるか否かを判定するものであり、判定時には、実測定により取得したデータを感度差測定により取得したデータにより校正した後に判定を行うものである。
【００４１】
図１に示すように、この表面プラズモン測定装置は、測定ユニット５と、リファレンスユニット５’と、各ユニットの測定結果を受けるコンピュータシステム等からなり、測定手段としての信号処理部20と、この信号処理部20に接続された表示手段21とを備えている。
【００４２】
測定ユニット５は、概略四角錐の一部が切り取られた形状とされた誘電体ブロック10と、この誘電体ブロック10の一面（図中の上面）に形成された、例えば金、銀、銅、アルミニウム等からなる金属膜12とからなる使い切りの測定チップ６を有している。
【００４３】
誘電体ブロック10は例えば透明樹脂等からなり、金属膜12が形成された部分の周囲が嵩上げされた形とされ、この嵩上げされた部分10ａは試料液11を貯える試料保持部として機能する。なお本例では、金属膜12の上にセンシング媒体30が固定されるが、このセンシング媒体30については後述する。
【００４４】
測定チップ６は、例えばテーブル31に設けられたチップ保持孔31ａに嵌合固定される。測定ユニット５は、上記測定チップ６に加えてさらに、１本の光ビーム13を発生させる半導体レーザ等からなるレーザ光源14と、上記光ビーム13を誘電体ブロック10に通し、該誘電体ブロック10と金属膜12との界面10ｂに対して、種々の入射角が得られるように入射させる光学系15と、上記界面10ｂで全反射した光ビーム13を平行光化するコリメーターレンズ16と、この平行光化された光ビーム13を検出する光検出手段であるフォトダイオードアレイ17と、このフォトダイオードアレイ17に接続された微分手段として差動アンプアレイ18と、測定手段としてのドライバ19とを備えている。
【００４５】
リファレンスユニット５’は、測定ユニット５と同様に構成され、誘電体ブロック10と、金属膜12とからなる使い切りのリファレンスチップ６’を有している。なお、リファレンスチップ６’には、試料液11の溶媒からなる偽試料液11’が供給されている。図２は、この測定ユニット５およびリファレンスユニット５’の電気的構成を示すブロック図である。図示の通り上記ドライバ19は、差動アンプアレイ18の各差動アンプ18ａ、18ｂ、18ｃ……の出力をサンプルホールドするサンプルホールド回路22ａ、22ｂ、22ｃ……、これらのサンプルホールド回路22ａ、22ｂ、22ｃ……の各出力が入力されるマルチプレクサ23、このマルチプレクサ23の出力をデジタル化して信号処理部20に入力するＡ／Ｄ変換器24、マルチプレクサ23とサンプルホールド回路22ａ、22ｂ、22ｃ……とを駆動する駆動回路25、信号処理部20からの指示に基づいて駆動回路25の動作を制御するコントローラ26から構成されている。
【００４６】
信号処理部20は、測定ユニット５とリファレンスユニット５’間の感度差を求める感度差測定を行い、ユニット間の感度差を記憶する感度差検出部４を有し、実測定を行い、被検体が特定物質であるか否かを判定する際には、実測定により取得した測定結果を感度差検出部４に記憶されてユニット間の感度差を用いて校正した後に判定を行うものである。
【００４７】
ここで、まず実際の測定動作を説明する前に、測定原理の詳細を説明する。図１に示す通り、レーザ光源14から発散光状態で出射した光ビーム13は、光学系15の作用により、誘電体ブロック10と金属膜12との界面10ｂ上で集束する。したがって光ビーム13は、界面10ｂに対して種々の入射角θで入射する成分を含むことになる。なおこの入射角θは、全反射角以上の角度とされる。そこで、光ビーム13は界面10ｂで全反射し、この反射した光ビーム13には、種々の反射角で反射する成分が含まれることになる。
【００４８】
なお光ビーム13は、界面10ｂに対してｐ偏光で入射させる。そのようにするためには、予めレーザ光源14をその偏光方向が所定方向となるように配設すればよい。その他、波長板や偏光板で光ビーム13の偏光の向きを制御してもよい。
【００４９】
界面10ｂで全反射した後、コリメーターレンズ16によって平行光化された光ビーム13は、フォトダイオードアレイ17により検出される。本例におけるフォトダイオードアレイ17は、複数のフォトダイオード17ａ、17ｂ、17ｃ……が１列に並設されてなり、各フォトダイオード17ａ、17ｂ、17ｃ……は図１の図示面内において、平行光化された光ビーム13の進行方向に対してフォトダイオード並設方向がほぼ直角となる向きに配設されている。したがって、上記界面10ｂにおいて種々の反射角で全反射した光ビーム13の各成分を、それぞれ異なるフォトダイオード17ａ、17ｂ、17ｃ……が受光することになる。
【００５０】
上記フォトダイオード17ａ、17ｂ、17ｃ……の各出力は、差動アンプアレイ18の各差動アンプ18ａ、18ｂ、18ｃ……に入力される。この際、互いに隣接する２つのフォトダイオードの出力が、共通の差動アンプに入力される。したがって各差動アンプ18ａ、18ｂ、18ｃ……の出力は、複数のフォトダイオード17ａ、17ｂ、17ｃ……が出力する光検出信号を、それらの並設方向に関して微分したものと考えることができる。
【００５１】
まず、各差動アンプ18ａ、18ｂ、18ｃ……の出力は、それぞれサンプルホールド回路22ａ、22ｂ、22ｃ……により所定のタイミングでサンプルホールドされ、マルチプレクサ23に入力される。マルチプレクサ23は、サンプルホールドされた各差動アンプ18ａ、18ｂ、18ｃ……の出力を、所定の順序に従って出力され、Ａ／Ｄ変換器24に入力する。Ａ／Ｄ変換器24はこれらの出力をデジタル化して信号処理部20に入力する。
【００５２】
図３は、界面10ｂで全反射した光ビーム13の入射角θ毎の光強度と、差動アンプ18ａ、18ｂ、18ｃ……の出力との関係を説明するものである。ここで、光ビーム13の界面10ｂへの入射角θと上記光強度Ｉとの関係は、同図（１）のグラフに示すようなものであるとする。
【００５３】
界面10ｂにある特定の入射角θｓｐで入射した光は、金属膜12と試料11との界面に表面プラズモンを励起させるので、この光については反射光強度Ｉが鋭く低下する。つまりθｓｐが全反射減衰角であり、この角度θｓｐにおいて反射光強度Ｉは最小値を取る。この反射光強度Ｉの低下は、図１にＤで示すように、反射光中の暗線として観察される。
【００５４】
また図３の（２）は、フォトダイオード17ａ、17ｂ、17ｃ……の並設方向を示しており、先に説明した通り、これらのフォトダイオード17ａ、17ｂ、17ｃ……の並設方向位置は上記入射角θと一義的に対応している。
【００５５】
そしてフォトダイオード17ａ、17ｂ、17ｃ……の並設方向位置、つまりは入射角θと、差動アンプ18ａ、18ｂ、18ｃ……の出力Ｉ’（反射光強度Ｉの微分値）との関係は、同図（３）に示すようなものとなる。
【００５６】
測定に先立って、まず信号処理部20は微分値Ｉ’の初期値Ｉ’ｒの設定処理を行う。信号処理部20は、Ａ／Ｄ変換器24から入力された微分値Ｉ’の値に基づいて、差動アンプ18ａ、18ｂ、18ｃ……の中から、反射光強度Ｉの変化が減少から増加へ転ずる点近傍、すなわち全反射減衰角θｓｐに対応する微分値Ｉ’＝０に最も近い微分値Ｉ’minが得られている差動アンプを選択する。図３の例では差動アンプ18ｅとなる。
【００５７】
信号処理部20には、差動アンプ18ｅから出力された微分値Ｉ’minが入力され、不図示の記憶部に記憶される。以後所定時間間隔で、差動アンプ18ｅから出力された微分値Ｉ’minが測定され、微分値Ｉ’minから初期値Ｉ’ｒが減算された微分値の変化量ΔＩ’を算出する。最初の測定時には、差動アンプ18ｅが出力する微分値Ｉ’の大小にかかわらず、微分値の変化量ΔＩ’はほぼ０となる。以後所定時間が経過する毎に、最初に微分値を測定したときから測定時までの間の微分値の変化量ΔＩ’が算出される。
【００５８】
微分値Ｉ’は、測定チップの金属膜12（図１参照）に接している物質の誘電率つまりは屈折率が変化して、図３（１）に示す曲線が左右方向に移動する形で変化すると、それに応じて上下する。したがって、この微分値Ｉ’の変化量ΔＩ’を時間の経過とともに測定し続けることにより、全反射減衰角θｓｐの角度変化量を測定することができ、この角度変化量に基づいて、金属膜12に接しているセンシング物質30の屈折率変化を調べることができる。
【００５９】
すなわち、金属膜12上に固定されている、センシング物質30が試料液中の特定物質（被検体）と結合するものであれば、センシング物質30と、被検体との結合状態に応じてセンシング媒体30の屈折率が変化するので、上記微分値の変化量ΔＩ’を測定し続けることにより、この結合状態の変化の様子を調べることができる。
【００６０】
次に感度差測定および実測定の動作について説明する。まず感度差測定として、センシング物質が固定されている、測定チップ６およびリファレンスチップ６’に、それぞれ溶媒からなる偽試料液を供給し、各ユニットにおける表面プラズモン共鳴による全反射減衰角θｓｐの角度変化量、すなわち上記微分値の変化量ΔＩ’を１時間の間所定時間間隔で測定する。感度差検出部４では、感度差測定による測定結果から測定ユニット５とリファレンスユニット５’との間の感度差を算出し、記憶する。例えば、感度差検出によるリファレンスユニット５’の測定結果が、図４の点線に示すようなもので、また感度差検出による測定ユニット５の測定結果が図４の実線で示すようなものであれば、測定ユニット５の感度は、リファレンスユニット５’の感度の1.６倍であるとみなし、その値を記憶する。なお、図４は微分値の変化量ΔＩ’から求めた全反射減衰角θｓｐの角度変化量（被検体の分子量換算）を示す図である。
【００６１】
次に、実測定として、被検体を少量の溶媒に溶かした試料液を測定チップ６に滴下供給する。この際、測定チップ６に供給した量と同量でかつ同温度の溶媒をリファレンスチップ６’にも滴下供給する。その後、再度各ユニットにおける被検体供給後の微分値の変化量ΔＩ’を所定時間間隔で測定する。
【００６２】
信号処理部20では、まずリファレンスユニット５’において測定された微分値の変化量ΔＩ’、すなわち全反射減衰角θｓｐの角度変化量を感度差検出部４に記憶された感度差１．６で乗算することにより、まずリファレンスチップ６’と測定チップ’５間の感度差の校正を行う。次に測定ユニット５において測定された角度変化量から校正したリファレンユニット５’の角度変化量を差し引き、補正された角度変化量を求める。
【００６３】
例えば、実測定によるリファレンスユニット５’の角度変化量が、図５の点線に示すようなもので、また感度差検出による測定ユニット５の角度変化量が図５の実線で示すようなものであれば、校正されたリファレンユニット５’の角度変化量は、図５に２点鎖線で示すようなものとなり、補正された角度変化量は図５に一点鎖線で示すものとなる。信号処理部20では、この補正された角度変化量に基づいて、センシング物質と被検体の結合状態を判定する。なお、上記実測定において、測定チップ６に追加供給した試料液の温度が、予め測定チップ６に供給されている溶媒の温度と異なる場合には、温度変化が生じて、そのために微分値の変化量ΔＩ’に変化が生じる場合がある。本実施の形態においては、リファレンスチップ６’にも、測定チップ６に供給した試料液と同量でかつ同温度の溶媒をリファレンスチップ６’にも供給することにより、温度変化により微分値の変化量ΔＩ’に変化が生じても、補正の際に相殺されるので、測定精度に影響を与えることはない。また環境温度などの変化により微分値の変化量ΔＩ’に変化が生じても、やはり補正により相殺される。
【００６４】
以上の説明から明かなように本実施形態では、全反射減衰の状態の変化の測定開始前に、測定ユニット５およびリファレンスユニット５’間の感度差を検出し、実測定に基づいて判定を行う際には、測定ユニット５において測定された角度変化量から、上記感度差に基づいて校正されたリファレンスユニット５’において測定された角度変化量を差し引いた補正角度変化量に基づいて、全反射減衰の状態の変化を測定しているため、測定ユニットとリファレンスユニット間の感度差の影響を低減し、センシング物質と被検体との結合状態の測定精度を向上させることができる。
【００６５】
また、測定ユニット５およびリファレンスユニット５’間の感度差の検出を、センシング物質が固定されている、測定チップ６およびリファレンスチップ６’上に、前記溶媒からなる偽試料液を保持した状態で、全反射減衰の状態の変化を検出し、該検出の結果を各ユニット間で比較することにより行ったため、測定チップ６とリファレンスチップ６’の金属膜12の厚さのバラツキに起因する感度差や、測定チップ６とリファレンスチップ６’とに固定されたセンシング物質30の層の厚さのバラツキに起因する感度差、あるいは測定ユニット５に設けられたフォトダイオードアレイ17の検出感度とリファレンスユニット５’に設けられたフォトダイオードアレイ17の検出感度との感度差等による影響を低減することができ、全反射減衰の状態の変化の測定精度を向上させることでき、センシング物質と被検体との結合状態の測定を精度よく行うことができる。
【００６６】
また、本実施の形態の変型例として、偽試料液そのものの屈折率を変化させて、測定ユニット５およびリファレンスユニット５’間の感度差の検出を行う方法も考えられる。例えば実測定において、溶媒として１％のＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）が含まれるＰＢＳ（リン酸バッファ液）を使用する場合の感度差検出方法を簡単に説明する。まず、センシング物質14が固定されている、測定チップ６およびリファレンスチップ６’に所定量の２％ＤＭＳＯが含まれるＰＢＳを供給し、初回の測定を行い、次に最初に供給した液量と同量のＰＢＳを測定チップ６およびリファレンスチップ６’に供給して、２回目の測定を行う。
【００６７】
２回目の測定時には、各チップに入っている偽試料液は希釈されて１％のＤＭＳＯが含まれるＰＢＳとなっているため、１回目の測定時と、２回目の測定時とでは、偽試料液の屈折率に変化が生じている。このため全反射減衰角θｓｐにも変化が生じることとなる。１回目の測定と２回目の測定間の各ユニットにおける表面プラズモン共鳴による全反射減衰角θｓｐの角度変化量、すなわち微分値の変化量ΔＩ’を測定することにより、測定ユニット５とリファレンスユニット５’との間の感度差を算出することができる。また、感度差検出が終了した時点では、１％ＤＭＳＯが含まれるＰＢＳが各チップに供給されているため、その後直ぐに実測定を行うことができる。
【００６８】
このように、偽試料液の濃度を変化させて、感度差を検出する場合には、短時間で感度差測定を行うことができる。
【００６９】
次に、図６を参照して本発明の第２の実施形態について説明する。なおこの図６において、図１中の要素と同等の要素には同番号を付してあり、それらについての説明は特に必要の無い限り省略する。
【００７０】
この第２の実施形態の全反射減衰を利用した測定装置は、先に説明した漏洩モード測定装置であり、測定チップ９が配設された測定ユニット８およびリファレンスチップ９’が配設されたリファレンスユニット８’を用いるように構成されている。この測定チップ９およびリファレンスチップ９’の誘電体ブロック10の一面（図中の上面）にはクラッド層40が形成され、さらにその上には光導波層41が形成されている。
【００７１】
誘電体ブロック10は、例えば合成樹脂やＢＫ７等の光学ガラスを用いて形成されている。一方クラッド層40は、誘電体ブロック10よりも低屈折率の誘電体や、金等の金属を用いて薄膜状に形成されている。また光導波層41は、クラッド層40よりも高屈折率の誘電体、例えばＰＭＭＡを用いてこれも薄膜状に形成されている。クラッド層40の膜厚は、例えば金薄膜から形成する場合で36.5ｎｍ、光導波層41の膜厚は、例えばＰＭＭＡから形成する場合で700ｎｍ程度とされる。
【００７２】
上記構成の漏洩モード測定装置において、レーザ光源14から出射した光ビーム13を誘電体ブロック10を通してクラッド層40に対して全反射角以上の入射角で入射させると、該光ビーム13が誘電体ブロック10とクラッド層40との界面10ｂで全反射するが、クラッド層40を透過して光導波層41に特定入射角で入射した特定波数の光は、該光導波層41を導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層41に取り込まれるので、上記界面10ｂで全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。
【００７３】
光導波層41における導波光の波数は、該光導波層41の上のセンシング物質30の屈折率に依存するので、差動アンプアレイ18の各差動アンプが出力する微分値Ｉ’に基づいてセンシング物質30の屈折率を測定することができる。
【００７４】
本実施形態でも、信号処理部20において、感度差測定および実測定が行われ、第１実施形態における校正処理および補正処理と同様の処理がなされ、まず、リファレンスユニット８’により測定された測定結果を感度差に基づいて校正し、該校正された測定結果を用いて、測定ユニット８による測定結果の補正を行い、該補正された測定結果に基づいて全反射減衰の変化の状態を検出しているので、測定ユニットとリファレンスユニット間の感度差の影響を低減し、センシング物質と被検体との結合状態の測定精度を向上させることができる。
【００７５】
なお、各実施の形態においては、測定ユニットに偽試料液を用いて感度差測定を行った後に、この偽試料液に被検体を追加供給したが、これに限られるものではなく、例えば感度差測定を終了後に測定チップに入っている偽試料液を一旦廃棄し、新たに被検体を含む試料液を供給して実測定を行ってもよい。なおこのような場合には、リファレンスユニットにおいても、一旦偽試料液を廃棄し、新たな偽試料液を供給することが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本発明の第１の実施形態による表面プラズモン測定装置の側面図
【図２】上記表面プラズモン測定装置の電気的構成を示すブロック図
【図３】上記表面プラズモン測定装置における光ビーム入射角と検出光強度との関係、並びに光ビーム入射角と光強度検出信号の微分値との関係を示す概略図
【図４】経過時間と角度変化量の関係を示すグラフ
【図５】経過時間と角度変化量の関係を示すグラフ
【図６】本発明の第２の実施形態による漏洩モード測定装置の側面図
【符号の説明】
【００７７】
４    感度差検出部
５，８      測定ユニット
５’,８’   リファレンスユニット
６，９      測定チップ
６’,９’   リファレンスチップ
10    誘電体ブロック
10ａ  誘電体ブロックの試料保持部
10ｂ  誘電体ブロックと金属膜との界面
11    試料液
11’  偽試料液
12    金属膜
13    光ビーム
14    レーザ光源
15    光学系
16    コリメーターレンズ
17    フォトダイオードアレイ
17ａ、17ｂ、17ｃ……    フォトダイオード
18    差動アンプアレイ
18ａ、18ｂ、18ｃ……    差動アンプ
19    ドライバ
20    信号処理部
21    表示手段
22ａ、22ｂ、22ｃ……サンプルホールド回路
23    マルチプレクサ
24    Ａ／Ｄ変換器
25    駆動回路
26    コントローラ
30    センシング媒体
31    テーブル
40    クラッド層
41    光導波層
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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