(57)【要約】【課題】  細胞表現型を測定する方法。【解決手段】  本発明は、１番目の未知サンプル材料の表現型状態を表現型状態が既知のサンプル材料と比較するシステム、デバイスおよびキットを提供する。本発明は、また、本システム、デバイスおよびキットの使用方法も提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１番目の未知サンプル材料の表現型状態を表現型状態が既知のサンプル材料と比較するシステム。
【請求項２】
ａ．  表現型マーカーのパネル、および
ｂ．  表現型状態が未知の前記１番目のサンプル材料の中の表現型マーカーの存在を検出する試薬、および
ｃ．  表現型状態が未知の前記１番目のサンプル材料の中に表現型マーカーが存在するか否かを記録する装置、および
ｄ．  表現型状態が既知の前記サンプル材料の中の表現型マーカーの存在を検出する試薬、および
ｅ．  表現型状態が既知の前記サンプル材料の中に表現型マーカーが存在するか否かを記録する装置、および
ｆ．  前記１番目の未知サンプル材料と表現型状態が既知の前記サンプル材料の間の差を報告する装置、
を含んで成る請求項１記載のシステム。
【請求項３】
表現型マーカーの前記パネルが多穴プレートの状態である請求項１記載のシステム。
【請求項４】
表現型マーカーの存在を記録する前記装置が顕微鏡、フローサイトメーター、プレートリーダーおよびゲル電気泳動装置から成る群から選択される請求項１記載のシステム。
【請求項５】
１番目の未知サンプル材料の表現型状態を表現型状態が既知のサンプル材料と比較するデバイス。
【請求項６】
ａ．  表現型マーカーのパネル、および
ｂ．  表現型状態が未知の前記１番目のサンプル材料の中の表現型マーカーの存在を検出する試薬、および
ｃ．  表現型状態が未知の前記１番目のサンプル材料の中に表現型マーカーが存在するか否かを記録する装置、および
ｄ．  表現型状態が既知の前記サンプル材料の中の表現型マーカーの存在を検出する試薬、および
ｅ．  表現型状態が既知の前記サンプル材料の中に表現型マーカーが存在するか否かを記録する装置、および
ｆ．  前記１番目の未知サンプル材料と表現型状態が既知の前記サンプル材料の間の差を報告する装置、
を含んで成る請求項５記載のデバイス。
【請求項７】
表現型マーカーの前記パネルが多穴プレートの状態である請求項５記載のデバイス。
【請求項８】
表現型マーカーの存在を記録する前記装置が顕微鏡、フローサイトメーター、プレートリーダーおよびゲル電気泳動装置から成る群から選択される請求項５記載のデバイス。
【請求項９】
１番目の未知サンプル材料の表現型状態を表現型状態が既知のサンプル材料と比較するキット。
【請求項１０】
ａ．  表現型マーカーのパネル、および
ｂ．  サンプル材料の中の表現型マーカーの存在を検出する試薬、
を含んで成る請求項９記載のキット。
【請求項１１】
前記試薬が多穴プレートの中に入っている請求項１０記載のキット。
【請求項１２】
請求項１記載システムの使用方法であって、
ａ．  １番目の未知サンプル材料を入手し、そして
ｂ．  前記１番目の未知サンプル材料を前記１番目の未知サンプル材料の中の表現型マーカーの存在を検出する試薬と接触させ、そして
ｃ．  前記１番目の未知サンプル材料の中の表現型マーカーの存在を記録し、そして
ｄ．  表現型状態が既知のサンプル材料を入手し、そして
ｅ．  表現型状態が既知の前記サンプル材料を表現型状態が既知の前記サンプル材料の中の表現型マーカーの存在を検出する試薬と接触させ、そして
ｆ．  表現型状態が既知の前記サンプル材料の中の表現型マーカーの存在を記録し、そして
ｇ．  前記未知サンプル材料と表現型状態が既知の前記サンプル材料の間の差を報告する、
段階を含んで成る方法。
【請求項１３】
請求項９記載キットの使用方法であって、
ａ．  １番目の未知サンプル材料を入手し、そして
ｂ．  前記１番目の未知サンプル材料を前記１番目の未知サンプル材料の中の表現型マーカーの存在を検出する試薬が入っているキットと接触させ、そして
ｃ．  前記１番目の未知サンプル材料の中の表現型マーカーの存在を記録し、そして
ｄ．  表現型状態が既知のサンプル材料を入手し、そして
ｅ．  表現型状態が既知の前記サンプル材料を表現型状態が既知の前記サンプル材料の中の表現型マーカーの存在を検出する試薬が入っているキットと接触させ、そして
ｆ．  表現型状態が既知の前記サンプル材料の中の表現型マーカーの存在を記録し、そして
ｇ．  前記未知サンプル材料と表現型状態が既知の前記サンプル材料の間の差を報告する、
段階を含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞の表現型を迅速かつ正確に効率良く測定する方法に向けたものである。詳細には、本発明は、抗体を用いる方法に向けたものである。
【背景技術】
【０００２】
体内のあらゆる細胞の表面は蛋白質で覆われている。そのような細胞表面の蛋白質は数種の機能を果たす。例えば、そのような細胞表面の蛋白質は受容体であり得、それは他の「シグナリング」分子と選択的に結合または接着し得る。別法として、そのような蛋白質は機能的または構造的であり得る。例えば、そのような蛋白質は細胞と基質の接着を助長し得るか、或はそのような蛋白質は分子の分泌を助長し得る。各細胞型、例えば肝臓の細胞などは、他の種類の細胞または細胞系から区別することを可能にする特定の蛋白質組み合わせを表面上に有する。
【０００３】
所定種の細胞上に発現する細胞表面蛋白質の発現はいろいろな要因に応じて変わり得る。それらには、例えば、細胞の増殖、分化、病気、体からの細胞の単離およびインビトロ培養などの結果としてもたらされる変化が含まれ得る。例えば、細胞表面蛋白質は前立腺癌転移の多段階、例えば細胞外マトリクスからの腫瘍細胞の脱離、腫瘍細胞が脱離によって誘発されるアポトーシスに対して示す耐性、腫瘍細胞と内皮細胞の接着および腫瘍の増殖を支援する血管新生などに極めて重要な役割を果たすことが報告されている。前立腺癌転移の個々の過程に重要である上皮および内皮細胞の両方に特殊または差別的に発現する細胞表面蛋白質が存在し得る。
【０００４】
研究者たちは細胞表面蛋白質が示す生物学的特殊性および特定の化合物が細胞に標識または「マーク」を付ける化学的特性を利用してきた。そのような様式でマークを付けた細胞は容易に単離かつ特徴付け可能である。特定の細胞型を同定しようとする時、多くの場合、多数のマーカーの組み合わせが用いられる。
【０００５】
多種多様な分析で抗体が診断具として広範に用いられている。細胞に標識またはマークを付ける時のプローブとしてモノクローナルおよび組換え型抗体を用いることができる。抗体が基になった免疫検定が最も一般的に用いられている種類の診断検定でありかつ更に最も急速に成長している生体分子分析技術の中の１つである。過去１０年の間に診断で日常的に使用されるようになった特に重要な別の例はフローサイトメトリー分析である。フローサイトメトリーは、細胞の成分または構造的特徴を主に光学手段で量化する方法である。それは１個の細胞に関する測定を一度に行う時に用いられるが、それを用いて数千の細胞を数秒間で処理することも可能である。構造的特徴を量化することで異なる細胞型を区別することができることから、ある混合物の中に入っている異なる種類の細胞の数を数えようとする時にフローサイトメトリーを用いることができる。また、細胞表面マーカーの発現を基にして細胞を選択または「分類分け」しようとする時にもフローサイトメトリーを用いることができる。
【０００６】
また、蛍光プローブを用いて細胞内成分を報告することも可能であり、そのようなプローブには全ＤＮＡ／細胞（細胞周期分析を可能にする）、新しく合成したＤＮＡ、ＤＮＡまたはｍＲＮＡの中の特殊なヌクレオチド配列、フィラメント状のアクチン、および抗体が利用可能な構造物のいずれも含まれる。また、フローサイトメトリーを用いて細胞内の遊離カルシウムの急速な変化、膜電位、ｐＨまたは細胞シグナル伝達経路などを監視することも可能である。例えば、「細胞の複雑な集団の中の細胞内シグナル伝達イベントを分析する強力な道具として燐特異的フローサイトメトリーが現れた、と言うのは、それは表
面マーカー発現を基にして細胞型を区別することと細胞内燐蛋白質の濃度を測定することを同時に実施する能力を有するからである。これは免疫シグナル伝達の細胞特異的および経路特異的性質の新規な洞察を与えるものである」が非特許文献１に記述されている。
【０００７】
モノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリー分析および分類分け検定によって正常および腫瘍細胞集団が有する表面マーカーを特徴付けることができるようになったことから、日常的臨床診断検定の基礎が作り出され、その範囲は、現在では、白血病の分類分けからＨＩＶ病が進行するにつれて起こるＣＤ４  Ｔ細胞損失の監視に及ぶ。
【０００８】
そのようにフローサイトメトリーは汎用性があるが、欠点がいくつか存在する。例えば、フローサイトメトリー用試薬として選択される抗体は最適でない可能性がある。即ち、それらが特異的ではない結果として背景が染色される度合が高い可能性がある。その上、蛍光色素と抗体の結合効率がバッチからバッチで変わる可能性もある。従って、細胞集団と細胞集団の間の比較が更に複雑になる可能性がある。
【０００９】
加うるに、ある細胞集団に関して多数のパラメーターを評価しようとする場合、必要な抗体の購入に要する投資費用は大きい。例えば９０種類の単一パラメーターを分析するには９０種類の個別抗体を購入する必要があり得るが、それは１分析当たり数万ドルになる可能性があり、かつ多数の細胞が必要になる。このことは、細胞の数が限られている場合に問題になる。従って、細胞の表現型検査または分析に有効かつ費用効果的で再現性のある試薬および抗体が大きく必要とされている。
【非特許文献１】Ｋｒｕｔｚｉｋ他（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００５、１７５：２３５７−２３６５）
【発明の開示】
【００１０】
要約
本発明は、また、１番目の未知サンプル材料の表現型状態を表現型状態が既知のサンプル材料と比較する方法も提供する。この方法は、
ａ．  １番目の未知サンプル材料を入手し、そして
ｂ．  前記１番目の未知サンプル材料を前記１番目の未知サンプル材料の中の表現型マーカーの存在を検出する試薬と接触させ、そして
ｃ．  前記１番目の未知サンプル材料の中の表現型マーカーの存在を記録し、そして
ｄ．  表現型状態が既知のサンプル材料を入手し、そして
ｅ．  表現型状態が既知の前記サンプル材料を表現型状態が既知の前記サンプル材料の中の表現型マーカーの存在を検出する試薬と接触させ、そして
ｆ．  表現型状態が既知の前記サンプル材料の中の表現型マーカーの存在を記録し、そして
ｇ．  前記未知サンプル材料と表現型状態が既知の前記サンプル材料の間の差を報告する、
段階を含んで成る。
【００１１】
本発明は、１番目の未知サンプル材料の表現型状態を表現型状態が既知のサンプル材料と比較するシステムを提供する。このシステムは、
ａ．  表現型マーカーのパネル、および
ｂ．  表現型状態が未知の前記１番目のサンプル材料の中の表現型マーカーの存在を検出する試薬、および
ｃ．  表現型状態が未知の前記１番目のサンプル材料の中に表現型マーカーが存在するか否かを記録する装置、および
ｄ．  表現型状態が既知の前記サンプル材料の中の表現型マーカーの存在を検出する試薬、および
ｅ．  表現型状態が既知の前記サンプル材料の中に表現型マーカーが存在するか否かを記録する装置、および
ｆ．  前記１番目の未知サンプル材料と表現型状態が既知の前記サンプル材料の間の差を報告する装置、
を含んで成る。
【００１２】
本発明は、１番目の未知サンプル材料の表現型状態を表現型状態が既知のサンプル材料と比較するデバイスを提供する。このデバイスは、
ａ．  表現型マーカーのパネル、および
ｂ．  表現型状態が未知の前記１番目のサンプル材料の中の表現型マーカーの存在を検出する試薬、および
ｃ．  表現型状態が未知の前記１番目のサンプル材料の中に表現型マーカーが存在するか否かを記録する装置、および
ｄ．  表現型状態が既知の前記サンプル材料の中の表現型マーカーの存在を検出する試薬、および
ｅ．  表現型状態が既知の前記サンプル材料の中に表現型マーカーが存在するか否かを記録する装置、および
ｆ．  前記１番目の未知サンプル材料と表現型状態が既知の前記サンプル材料の間の差を報告する装置、
を含んで成る。
【００１３】
本発明は、１番目の未知サンプル材料の表現型状態を表現型状態が既知のサンプル材料と比較するキットを提供する。このキットは、
ａ．  表現型マーカーのパネル、および
ｂ．  サンプル材料の中の表現型マーカーの存在を検出する試薬、
を含んで成る。
【００１４】
以下の章に前記態様およびさらなる態様をより詳細に記述する。
【００１５】
詳細な説明
本発明に従い、細胞の表現型を特徴づける検定用成分および方法を提供する。本分野の通常の技術者が理解するであろうように、本発明は診断検定技術に関して非常に多くの用途を有する。例えば、いろいろなサンプルの特徴、病的状態または反応体のいずれかを検出または選別することができるように試薬を準備することができる。本発明は、いろいろな用途を網羅するように選択した試薬のパネルを提供する。
【００１６】
適切な試薬のパネルには、例えば、前立腺癌、乳癌、血液疾患に関連したエピトープおよび他の適切な腫瘍マーカーを包含する腫瘍マーカーパネル、リウマチ因子用試験および自己免疫病に関連した他のマーカーを包含する自己免疫病パネル、興味の持たれる薬剤治療に関連したバイオマーカー用の試験を包含する治療薬パネルが含まれ得る。
【００１７】
試薬
本発明で用いるに適した試薬は表現型マーカーを認識する抗体であり得る。そのような表現型マーカーは細胞表面上に発現する蛋白質であってもよいか或は細胞内に発現する蛋白質であってもよい。別法として、それらは細胞が分泌する蛋白質であってもよい。また、そのような表現型マーカーは核酸、脂質、多糖または生体分子のいずれであってもよい。
【００１８】
本発明で用いるに適した試薬は、表現型マーカーを特異的に認識する抗体であってもよい。別法として、そのような試薬は表現型マーカーを特異的に認識するオリゴヌクレオチ
ドまたは分子のいずれであってもよい。１つの態様では、そのような試薬に蛍光マーカーによる標識を付ける。別法として、そのような試薬は固有の蛍光を発するものであってもよい。
【００１９】
本発明で用いるに適した抗体は商業源から入手可能であるか或は特定用途ではそれらを生じさせることも可能である。１つの態様では、そのような抗体に蛍光マーカーによる標識を付ける。本発明で用いるに適した抗体および表現型マーカーの例を表１に示す。
【００２０】
興味の持たれる状態の表現型マーカーに相当するか或は無作為に選択され得る抗体を選択してもよい。例えば、そのような表現型マーカーは幹細胞上に典型的に発現する蛋白質であってもよい。別法として、そのような表現型マーカーは病気、例えば癌などに関連したマーカーであってもよい。別法として、そのような表現型マーカーは不均一系、例えば血液などに存在する分子の測定で使用可能なマーカーであってもよい。
【００２１】
試薬のパネル
本発明は、細胞を再現可能様式で分析するに適するように最適にした費用効果的試薬を提供する。１つの態様における試薬はキットの形態であり、そのようなキットは、凍結乾燥状態であるか或は輸送および貯蔵に便利な他の形態の抗体が入っている多穴プレートを含んで成る。そのような多穴プレートに持たせるフォーマットはいろいろであり、例えば６穴、８穴、１２穴、２４穴、９６穴または３８４などであってもよい。実施すべき分析に応じて抗体を選択する。免疫関連エピトープを対象にする抗体を選択してもよい。別法として、癌エピトープまたは幹細胞エピトープを対象にする抗体を選択してもよい。そのような抗体は細胞外分子を認識する抗体または細胞内分子を認識する抗体であってもよい。
【００２２】
その選択した抗体を表２および３に示す配置に従って多穴プレートの中に分配してもよい。そのような配置は特定の表現型マーカーパネルに特殊な配置である。そのような多穴プレートの中の各穴に入れる抗体は単一の抗体または複数の抗体であってもよい。その選択した抗体を多量に準備しそしてサンプルとサンプルの間の変動が低くなるように多数のプレートの中に分配する。分析を行うまで、前記抗体を溶液の状態でプレートの中に貯蔵してもよい。別法として、そのような抗体を凍結乾燥状態で貯蔵しそして分析前に再構成させてもよい。
【００２３】
方法
本発明の方法は、１つの態様において、表現型状態が未知のサンプル材料を集めかつ表現型状態が既知のサンプル材料を集める段階を実施するシステムを含んで成る。そのようなサンプル材料には、例えば細胞、血液または生物学的サンプルのいずれも含まれ得る。本システムを用いて前記サンプル材料を分析することで、表現型状態が未知のサンプル材料と比較する材料として用いる表現型状態が既知のサンプル材料の中に入っているエピトープマーカーのパターンを識別する。前記識別するパターンのエピトープの同定は既知であってもよい。別法として、その識別するパターンの中の未知のエピトープは２種以上であってもよい。本発明の方法の概略を図１に示す。
【００２４】
本発明の方法は、例えば品質管理の目的で使用可能である。この場合、表現型状態が既知のサンプル材料を対照集団の細胞から得てもよい。次に、そのサンプル材料を表現型状態が未知のサンプル材料（これを生産工程から得た細胞集団で構成させる）と比較する材料として用いることができる。表現型が既知のサンプル材料の中に入っているエピトープマーカーのパターンの変化を用いて生産工程が合格または不合格であるかを決めることができる。この例を実施例１に示す。
【００２５】
別法として、ある因子または薬剤で処置した後の細胞集団の中に入っているエピトープマーカーのパターンの変化を報告する目的で本発明を用いることも可能である。これの例を実施例２に示す。別法として、個々別々の細胞集団と集団の間のエピトープマーカーのパターンの変化を報告する目的で本発明を用いることも可能である。その例を実施例３に示す。
【００２６】
１つの態様では、本発明を用いて、また、全血の中の個々別々の細胞集団の中に入っているエピトープマーカーのパターンの変化を報告することも可能である。そのような細胞集団はある患者から採取した血液サンプルから得たものであってもよい。別法として、より多い数の患者から採取したサンプルを用いることも可能である。
【００２７】
本発明の方法は１種類のサンプルを分析する目的でか或は別法として２種以上のサンプルを分析する目的で使用可能である。１つの態様では、多数のサンプルの高処理量分析を実施することができる。本発明の方法の段階は手動で実施可能である。別法として、少なくとも１段階を自動化してもよい。表現型マーカー試薬プレートのコピーを複数作成してサンプルの分析で用いてもよい。
【００２８】
そのようなサンプルの分析を実施する時に用いるプラットフォームは、本分野の通常の技術者に公知の適切な如何なるプラットフォームであってもよい。そのようなプラットフォームには、例えばフローサイトメトリー装置、質量分析装置または蛍光顕微鏡などが含まれ得る。
【００２９】
フローサイトメトリー装置を用いて調査下の細胞が示す１つ以上の特徴を測定しようとする時、それは細胞または他の粒子が液流れの中で示す流れに頼っている。その上、フローサイトメトリー装置は、興味の持たれる特定の細胞または粒子の存在を識別しようとする時にも有用であり、そのような細胞または粒子の数を数えようとする時に有用であり、そしてある場合には、興味の持たれる細胞または粒子を集めることができるように分類分けする能力をそれに持たせることも可能である。典型的なフローサイトメトリー装置では、細胞が入っている流体サンプルを迅速に動く液体流れの状態でフローサイトメトリー装置の中に向かわせることで各細胞が検出領域の中を連続的かつ実質的に１個ずつ通るようにする。各細胞が前記検出領域の中を通る時に起こる電気インピーダンスの変化を利用して細胞の体積を測定することができる。同様に、入射光線を前記検出領域に向かわせると、その通る細胞がその中を通る時に前記光を散乱させる。そのようにして散乱した光が細胞の形状および大きさ、屈折率、不透明度、粗さなどの関数として働く。その上、標識を付けておいた細胞または自己蛍光性細胞が前記入射光線の励起エネルギーの中を通る結果として励起したそれらが発する蛍光を検出することで蛍光特性を有する細胞を識別することも可能である。フローサイトメトリー装置を用いて細胞の分析を実施した後、所望の特性を有するとして識別された細胞を分類分けすることができる（そのような能力を持つように装置を設計した場合には）。
【００３０】
代表的なフローサイトメトリー装置が米国特許第３，８２６，３６４号および４，２８４，４１２号、そしてＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇ他による出版物である「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ」、Ｓｃｉ．Ａｍ．２３４（３）：１０８、１９７６に記述されている。
【００３１】
以下の実施例で本発明を更に例示するが、それに限定するものでない。
【実施例１】
【００３２】
品質管理；放出基準
マスタープレート調製：
生産と拡大実験の間の細胞産物の一貫性を確立する目的で多様なエピトープに渡る発現の変化を監視する抗体テンプレートを考案した。抗体を選択しそして表２に示す配置に従って多穴プレートに分配した。抗体を表１に示す給源から購入した。抗体をＰＢＳで希釈して９６穴マスタープレートに入れた後、分析を実施するまで冷蔵庫に入れて貯蔵した。各検定毎に前記マスタープレートからマスター抗体溶液を１０μｌの量で新しい９６穴プレートに移すことでコピーを作成した。そのアレイに穴１個当たり１個の特定マーカーに対するフィコエリトリンフルオレセイン標識付き抗体を入れた。それによって機械を補う必要がなくなり、検定が簡潔になりかつ作業者による偏向の度合が低下した。加うるに、染色プロトコルも検定に要する細胞の数が最小限になりかつ洗浄などの如き段階（これは誤差の原因になり得る）がなくなるように考案した。
【００３３】
検定：
一瓶の細胞を解凍させ、ＰＢＳで洗浄した後、最終的にＰＢＳで１ｍｌ当たりの細胞数が２ｘ１０５になるように希釈した後、希釈抗体を入れておいた各穴（２０，０００個の細胞／穴）にサンプルを１００μｌ移した。そのプレートを４℃で３０分間インキュベートした。次に、固着用緩衝液（Ｃｙｔｏｆｉｘ、ＢＤカタログ番号５５４６５５）を１００μｌ添加して１５分間放置した。高処理量システムが備わっているＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ機を分析用として組み立てた後、穴１個当たりに１０，０００個のイベントを取得した。
【００３４】
データ分析：
この検定では、その取得したデータを分析ソフトウエアプログラムに送って、各サンプル穴毎の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を評価した。各サンプルのＭＦＩから未染色サンプルのＭＦＩを差し引いた後、このデータのＭＦＩを各エピトープ毎にプロットした。これを独立した実験で８回繰り返すことで、我々の細胞産物に関する平均発現パターンを作成した。
【００３５】
結果：
いろいろな生産／拡大実験で得た細胞に９６穴プレートアレイを用いた常規染色を受けさせた後、ＭＦＩをプロットし、そして表現型状態が既知のサンプル材料から得たエピトープマーカーのパターンと比較した。その結果を図２に示す。
【実施例２】
【００３６】
解離試薬の比較
方法：
この検定で用いる方法および試薬パネルは実施例１に記述したそれらと同じである。細胞を３個の個別培養用フラスコの中で同じ条件下で増殖させた。各々に異なる解離酵素混合物を用いて培養物を収穫した。次に、その細胞に９６穴方法を用いた染色を受けさせた後、各パラメーター毎に平均蛍光強度を測定し、そして表現型状態が既知のサンプル材料から得たエピトープマーカーのパターンと比較した。
【００３７】
結果：
各酵素混合物が示した結果は、それを表現型状態が既知のサンプル材料から得たエピトープマーカーが示したパターンと比較した時、異なっていた。混合物Ｃ（アクターゼ（Ａｃｃｕｔａｓｅ））が特定の表現型マーカーの発現に対して示す影響の方が標準的な混合物Ａ（トリプシン）およびＢ（ＴｒｉｐｌＥ）が示すそれよりも高いと思われる。例えば、接着マーカーＣＤ４９ｆおよびシグナル伝達分子ＣＤ６３が示す発現レベルは収穫操作（これは細胞産物の機能に影響を与え得る）後の方が低い。結果を図３に示す。
【００３８】
結論：
この方法を用いると、細胞表面上に発現する多様な蛋白質を迅速に評価することができる。この方法を用いると、酵素を用いた処理を行った後に起こる可能性がある表現型状態の変化を容易に評価することができる。マスタープレートを利用することができるようになれば、細胞を処理することが原因で起こる多様な表現型マーカーに渡る表現型の変化を迅速に評価することが可能になる。
【実施例３】
【００３９】
個々別々の２細胞集団の表現型状態の比較
方法：
この検定で用いる方法および試薬パネルは実施例１に記述したそれらと同じである。この検定では異なる均一な細胞培養物を用いてエピトープが示す発現レベルをマスタープレートで試験した。興味の持たれる細胞培養物を密集状態になるまで増殖させた後、我々の標準的プロトコルに従って収穫した。次に、両方の細胞培養物に染色を９６穴マスタープレート中で受けさせた後、この上に記述した方法に従って分析を実施した。細胞集団が示す表現型状態を比較することで鍵となる差を識別した。
【００４０】
結果：
両方の細胞型とも例えばＣＤ１１ａおよびＣＤ５４を除く大部分のエピトープに関して同様な発現レベルを示す。そのようなエピトープの発現は差別的であった。我々は、表現型状態が既知のサンプル材料と比較した時のデルタが２５ＭＦＩである時に有意であるとして任意カットオフを選択した。その結果を図４に示す。
【００４１】
結論：
我々は、２種類の細胞型が我々のパネルの中で示す発現に差があることを確認した。そのような差を更に調査することも可能でありかつさらなる研究の重要な出発点になる可能性がある（特に表現型マーカーの変化を生体内効力の差に関連付けることができるならば）。
【実施例４】
【００４２】
全血の表現型分析
方法：
この検定で用いる方法および試薬パネルは実施例１に記述したそれらと同じである。健康な志願者からヘパリン化抹消血液を得た後、白血球を単離した。その白血球をＰＢＳで洗浄した後、それに入れて懸濁させ、それを９６穴染色用プレートに移し（穴１個当たり５０，０００個の細胞）た後、標準的プロトコルに従ってデータを取得した。しかしながら、そのサンプルには各々が各エピトープ毎に特定の発現パターンを示す複数の細胞集団が入っていることから、データ分析を異ならせる。細胞をバルクとして分析するとそのような効果が不明瞭になる可能性がある。従って、大きさおよび粒度を基にして３主集団を選択して、各々にゲート（ｇａｔｅ）内の正イベント（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｅｖｅｎｔｓ）のパーセントおよび試験を受けさせた各エピトープ毎の発現レベルに関する分析を受けさせた（図５Ａ、ＢおよびＣ）。
【００４３】
結果：
我々は、９６穴プレートフォームを用いることで抹消血液中の個別の３集団に関して我々のエピトープアレイの発現レベルを迅速に評価することができる（図５）。
【００４４】
結論：
また、そのような９６穴プレートを不均一細胞集団で用いることも可能である。しかしながら、データ処理および検索は有意により複雑になる。そのような分析を簡潔にする新規な分析方法が開発下にあり、これは特に本方法を多色フローサイトメトリーに拡張しよ
うとする時に重要である。そのような方法を用いて健康（病気ではない表現型）な人の容易に入手可能な抹消血液サンプルの中に入っているエピトープマーカーのパターンを測定することができかつそれを個々の病気にかかっている人から得た細胞と比較する材料として用いることができる。これらに限定するものでないが、診断法の開発、薬剤効率の測定および治療計画の選択の目的で差を有効に利用することができる。
【００４５】
【表１】
2007181462.tif 000002
【００４６】
【表２】
2007181462.tif 000003
【００４７】
【表３】
2007181462.tif 000004
【００４８】
【表４】
2007181462.tif 000005
【００４９】
【表５】
2007181462.tif 000006
【００５０】
【表６】
2007181462.tif 000007
【００５１】
【表７】
2007181462.tif 000008
【００５２】
【表８】
2007181462.tif 000009
【００５３】
【表９】
2007181462.tif 000010
【００５４】
【表１０】
2007181462.tif 000011
【００５５】
【表１１】
2007181462.tif 000012
【００５６】
【表１２】
2007181462.tif 000013
【００５７】
【表１３】
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【００５８】
本資料全体に渡って引用した出版物は引用することによって全体が本明細書に組み入れられる。この上に実施例および態様を言及することで本発明のいろいろな面を説明してきたが、本発明の範囲をこの上で行った説明で限定するものでなく、特許法の原則下で適切に解釈されるべき本請求項で本発明の範囲を限定することは理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】本発明の方法の概略
【図２】表２に示すマーカー試薬アレイを用いて細胞集団の表現型状態を分析
【図３】表２に示すマーカー試薬アレイを用いて細胞集団Ｘのいろいろなサンプルの表現型状態に対して酵素処理が示す効果の分析
【図４】表２に示すマーカー試薬アレイを用いたヒト皮膚線維芽細胞サンプルと細胞Ｘサンプルの表現型状態の比較
【図５Ａ】全血の表現型分析。不均一細胞サンプルの中の選択したエピトープの発現レベルを示す。大きさおよび粒度を基にして白血球、単球および顆粒球集団を選択した。選択した細胞集団の全部に関して試験を受けさせる各エピトープ毎に正イベントのパーセントおよび平均蛍光強度を評価した。一例として、選択した細胞集団全部に関するＣＤ６３の発現レベルを示す。
【図５Ｂ】全血の表現型分析。示した表面エピトープのアレイ毎の白血球、単球および顆粒球の正イベントパーセントおよび発現レベルを示す。健康な３供与体から得た細胞集団を選択しそして１１個の個別試験で分析した（平均±ＳＥＭ）。
【図５Ｃ】全血の表現型分析。健康な個人から採取した白血球集団に関して表１に示した試薬アレイの中のエピトープの発現レベルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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