(57)【要約】【課題】腫瘍組織／腫瘍細胞におけるｐ５３遺伝子の病的変異の有無を検出し、又、多種類の癌患者に対して、予後に不要な治療を受ける患者数を減らす等、最適な予後の治療方針を決定することを可能とする高感度な予後を予測する方法等を提供すること。【解決手段】以下の工程： （１）腫瘍組織／腫瘍細胞における表１中の任意の遺伝子群の発現量を測定し、（２）該発現量から得られた遺伝子発現プロファイルと、予め求めたｐ５３遺伝子の病的変異型及び野生型の遺伝子発現プロファイルとの間の相関係数を求め、（３）相関係数のより大きい型の遺伝子発現プロファイルに得られた遺伝子発現プロファイルを帰属させ、（４）病的変異型の遺伝子発現プロファイルの場合には予後が不良であり、野生型の遺伝子発現プロファイルの場合には予後が良好であると決定することから成る、癌の予後の予測方法。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程： 
（１）腫瘍組織／腫瘍細胞における表１中の任意の遺伝子群の発現量を測定し、
（２）該発現量から得られた遺伝子発現プロファイルと、予め求めたｐ５３遺伝子の病的変異型及び野生型の遺伝子発現プロファイルとの間の相関係数を求め、
（３）相関係数のより大きい方の型の遺伝子発現プロファイルに得られた遺伝子発現プロファイルを帰属させることから成る、該腫瘍組織／腫瘍細胞におけるｐ５３遺伝子の病的変異の有無の検出方法。
【請求項２】
表１中の任意の９個以上の遺伝子を使用することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
表１中の任意の１０個以上の遺伝子を使用することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項４】
表１中の任意の２５個以上の遺伝子を使用することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項５】
表１中の任意の３３個以上の遺伝子を使用することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項６】
表１中の任意の４６個以上の遺伝子を使用することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項７】
表１に示す遺伝子の７０個全てを使用することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項８】
使用する全ての遺伝子の病的変異型発現プロファイル及び野生型発現プロファイルにおける発現量の差の有意性を示すＰ値が０．０５より小さいことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
以下の工程： 
（１）腫瘍組織／腫瘍細胞における表１中の任意の遺伝子群の発現量を測定し、
（２）該発現量から得られた遺伝子発現プロファイルと、予め求めたｐ５３遺伝子の病的変異型及び野生型の遺伝子発現プロファイルとの間の相関係数を求め、
（３）相関係数のより大きい方の型の遺伝子発現プロファイルに得られた遺伝子発現プロファイルを帰属させ、
（４）病的変異型の遺伝子発現プロファイルの場合には予後が不良であり、野生型の遺伝子発現プロファイルの場合には予後が良好であると決定することから成る、癌の予後の予測方法。
【請求項１０】
表１中の任意の９個以上の遺伝子を使用することを特徴とする、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
表１中の任意の１０個以上の遺伝子を使用することを特徴とする、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
表１中の任意の２５個以上の遺伝子を使用することを特徴とする、請求項９記載の方法。
【請求項１３】
表１中の任意の３３個以上の遺伝子を使用することを特徴とする、請求項９記載の方法。
【請求項１４】
表１中の任意の４６個以上の遺伝子を使用することを特徴とする、請求項９記載の方法。
【請求項１５】
表１に示す遺伝子の７０個全てを使用することを特徴とする、請求項９記載の方法。
【請求項１６】
使用する全ての遺伝子の病的変異型発現プロファイル及び野生型発現プロファイルにおける発現量の差の有意性を示すＰ値が０．０５より小さいことを特徴とする、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
相関係数の大小により、得られた発現プロファイルが病的変異型発現プロファイル及び野生型発現プロファイルのいずれに属するか決定する工程において、相関係数におけるＰ値が０．０５以上の場合には、癌の予後の予測不可能とする、請求項９〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
癌が乳癌である請求項９〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
表１中の任意の遺伝子群の少なくとも一部の塩基配列から成るポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法に用いることが出来るキット。
【請求項２０】
ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドが標識されていることを特徴とする、請求項１９記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌患者の癌組織サンプルの遺伝子の発現量から得られた遺伝子発現プロファイルに基づいた、該腫瘍組織／腫瘍細胞におけるｐ５３遺伝子の病的変異の有無の検出方法、癌の予後予測方法、及びそれらの方法に使用し得るキット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は遺伝子病であり、各腫瘍型には発がんに関するいくつかの共通な分子機構が存在することが示されている。退院した癌患者の予後について、近年、遺伝子やタンパク質の発現プロフィールの測定に関する研究開発が精力的に行われた結果、癌組織の遺伝子やタンパク質の発現状態を測定することが可能となってきている。これらの測定法を適用して、癌患者の予後を予測する方法は多く報告されているが、これまでのところ、多種類の癌に対して簡便にかつ高精度に予後を予測する方法が報告されていないこともまた周知の通りである。
【０００３】
腫瘍におけるゲノム上の変化は多様であり、個々の腫瘍を遺伝子レベルで解析し、発がんの分子機構の全容を解明することは容易ではない。この複雑ながんの分子機構を解明するためには２つのアプローチがある。１つは培養細胞や動物モデルを用いた単純化モデルによる研究方法である。この方法は発がん初期の分子機構や分子経路の解明には極めて有用であるが、複雑系の全容を把握することは困難であり、また動物モデルの場合はヒトに応用できるとは限らない欠点がある。
【０００４】
もう１つの方法はヒト腫瘍を用いて複雑な情報を網羅的に収集し、複雑系から共通の分子機構を抽出する方法である。マイクロアレイのデータ解析の方法としては、Unsupervised analysisとSupervised analysisの大きく２つに分けられる。Unsupervised analysisとはサンプルを遺伝子発現パターンの類似性により分類し、分けられた各群と既知の病理組織学的因子や予後との相関を見いだそうとするものである。Florinらは36例の乳癌についてマイクロアレイを行い、Unsupervised analysis によって、エストロゲンレセプター（ＥＲ）、リンパ節転移、腫瘍径および臨床病期のそれぞれと相関性の高い遺伝子群を見いだした(非特許文献１)。またSorlieらはUnsupervised analysisにより、乳癌が遺伝子発現パターンにより5つのグループに分けられ、それぞれのグループで予後が異なることを示した(非特許文献２)。これに対してSupervised analysisとは、既知の２群の間で統計学的に有意な発現差のある遺伝子を抽出し、この2群を区別できる遺伝子リストを作成する方法である。Supervised analysisを用いたマイクロアレイ解析はＥＲの発現の有無及びヒト上皮細胞成長因子受容体（ＨＥＲ２）発現の有無など多数報告されているが、その中でvan’t Veerらはリンパ節転移陰性の孤発性乳癌78例を用いて5年以内遠隔転移再発の有無によって70遺伝子を抽出した(非特許文献３)。またこの70遺伝子を用いた予後予測により、これまでの臨床病理学的因子による予測よりも精度が高いことを示している(非特許文献４)。
【０００５】
ＤＮＡが損傷した際、その細胞はアポトーシスに向かうこともあれば、修復されることもある。このＤＮＡ修復の過程にエラーが入ることで、その遺伝子に突然変異(mutation)が生じ、突然変異は細胞の癌化を高確率で引き起こす。従って、がん患者の予後を決定する遺伝子の候補として、ＤＮＡ修復遺伝子(ＤＮＡ damage repairgenes)、がん遺伝子(oncogenes、tumor-related genes)、がん抑制遺伝子( tumor suppressor genes)、増殖因子(growth factors)、及び、アポトーシス遺伝子(apoptosis genes)などが挙げられる。
【０００６】
ｐ５３遺伝子は、殆どのヒトの癌で見出されるがん抑制遺伝子であり、細胞周期を止める活性を有する。特に、放射線、薬剤などによる損傷を受けた細胞の周期を停止させたり、アポトーシスを引き起こさせるのに働いていると考えられている。従って、ｐ５３遺伝子に異常があると、損傷を受けた細胞がそのまま増殖し癌が発生すると考えられる。尚、ｐ５３は四量体として機能する転写調節因子であり、細胞周期の制御に関与するＣＤＫ（サイクリン依存性キナーゼ）／サイクリン複合体の阻害タンパク質であるｐ２１等、複数の転写を活性化する。
【０００７】
特許文献１では、遺伝子および／またはタンパク質の発現パターンを、癌が再発した患者および癌が再発していない患者由来のヒト原発腫瘍の遺伝子および／またはタンパク質発現パターンと比較することによって、癌の再発を予測する方法を提案している。
特許文献２では、５６種類の遺伝子の発現状態を測定することにより、乳癌の予後を高い精度で予測できることを示しているが、乳癌に対する予後に限定されている。また、特許文献３では、癌抑制遺伝子であるｐ５３遺伝子により産生されるｐ５３の状態を測定することにより、癌の診断を行うことを提案しているが、予後の予測に関する提案は行っていない。これまでｐ５３遺伝子変異に関して多くの報告があるが、報告された変異には5〜10 %で検出の際のエラーや表記ミスがあるとされている（非特許文献５，６）。従って、ｐ５３遺伝子の変異の有無を予測する遺伝子発現ファイルを作成するためには、ｐ５３遺伝子変異の検出を最大限として、偽陰性と偽陽性を最小限に抑えることが必要である。
【特許文献１】特表2004-536610号
【特許文献２】特開2004-344171号
【特許文献３】特表2001-523441号
【非特許文献１】Selaru, F. M., Yin, J., Olaru, A., Mori, Y., Xu, Y., Epstein, S. H., Sato, F., Deacu, E., Wang, S., Sterian, A., Fulton, A., Abraham, J. M., Shibata, D., Baquet, C., Stass, S. A., and Meltzer, S. J. An unsupervised approach to identify molecular phenotypic components influencing breast cancer features. Cancer Res, 64: 1584-1588, 2004.
【非特許文献２】Sorlie, T., Perou, C. M., Tibshirani, R., Aas, T., Geisler, S., Johnsen, H., Hastie, T., Eisen, M. B., van de Rijn, M., Jeffrey, S. S., Thorsen, T., Quist, H., Matese, J. C., Brown, P. O., Botstein, D., Eystein Lonning, P., and Borresen-Dale, A. L. Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications. Proc Natl Acad Sci U S A, 98: 10869-10874, 2001.
【非特許文献３】van 't Veer, L. J., Dai, H., van de Vijver, M. J., He, Y. D., Hart, A. A., Mao, M., Peterse, H. L., van der Kooy, K., Marton, M. J., Witteveen, A. T., Schreiber, G. J., Kerkhoven, R. M., Roberts, C., Linsley, P. S., Bernards, R., and Friend, S. H. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature, 415: 530-536, 2002.
【非特許文献４】van de Vijver, M. J., He, Y. D., van't Veer, L. J., Dai, H., Hart, A. A., Voskuil, D. W., Schreiber, G. J., Peterse, J. L., Roberts, C., Marton, M. J., Parrish, M., Atsma, D., Witteveen, A., Glas, A., Delahaye, L., van der Velde, T., Bartelink, H., Rodenhuis, S., Rutgers, E. T., Friend, S. H., and Bernards, R. A gene-expression signature as a predictor of survival in breast cancer. N Engl J Med, 347: 1999-2009, 2002.
【非特許文献５】Soussi, T., Kato, S., Levy, P., and Ishioka, C. Reassessment of the TP53 mutation database in human diesase by data mining with a library of TP53 missense mutations. Hum Mutat, 2004.
【非特許文献６】Soussi, T., Dehouche, K., and Beroud, C. p53 website and analysis of p53 gene mutations in human cancer: forging a link between epidemiology and carcinogenesis. Hum Mutat, 15: 105-113, 2000.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ｐ５３遺伝子の変異の有無を決定する方法として、免疫組織染色法、SSCP法、DNAシークエンス法などがある。免疫組織染色、SSCP法は偽陽性及び偽陰性も多く、変異の信頼性という点でDNAシークエンス法に劣る。予後との相関性に関する報告でも、DNAシークエンス法の優位性は明らかである。しかしながら、臨床上、予後因子としてｐ５３遺伝子の変異の有無を用いようとする場合、DNAシークエンス法は、変異状況を正確に決定するためには全翻訳領域のシークエンスを行う必要があり、非常に多くの手間と時間を要する。また、変異の有無のみでｐ５３遺伝子の変異による影響を決定出来ないことは明らかである。このため、以下に述べる病的変異と非病的変異とを区別するために、見つかった変異体の機能評価も必要であり、DNAシークエンス法を臨床応用することは現実問題として難しいと考えられる。
【０００９】
本発明は、上記の問題点を克服し、腫瘍組織／腫瘍細胞におけるｐ５３遺伝子の病的変異の有無を検出し、又、多種類の癌患者に対して、予後に不要な治療を受ける患者数を減らす等、最適な予後の治療方針を決定することを可能とする高感度な予後を予測する方法等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記の点に鑑みて種々の検討を鋭意行った結果、癌抑制遺伝子であるｐ５３遺伝子の病的変異の有無により発現量に影響を受ける特定の遺伝子の内、特に注目すべき遺伝子群（表１に示した７０個から成る遺伝子群）を見いだし、それらの遺伝子及び／又はタンパク質の発現量変化を測定することによって、広範囲の種類の癌患者について、野生型（ローリスク）群又は病的変異型（ハイリスク）群を検出することが可能であることを見いだした。尚、本発明において、ｐ５３遺伝子の塩基配列における変異であっても、本明細書中の「DNAシークエンシングによるｐ５３遺伝子の変異解析」に示されているような、転写活性が失われるようなミスセンス変異、タンパク切断型変異(ナンセンス変異、フレームシフト変異)及びスプライシング部位の変異のような「病的変異」以外の変異は「非病的変異」とし、このような非病的変異型も本発明の「野生型」に含める。
【００１１】
本発明は、上記の知見に基づいてなされたものであり、以下のとおりである。
即ち、本発明の第一の態様として、以下の工程： 
（１）腫瘍組織／腫瘍細胞における表１中の任意の遺伝子群（「表１中の番号、「Genbank」及び「Common name」で特定された７０個から成る遺伝子群」を意味する。以下、同様）の発現量を測定し、
（２）該発現量から得られた遺伝子発現プロファイルと、予め求めたｐ５３遺伝子の病的変異型及び野生型（以下、「非病的変異型」も含む）の遺伝子発現プロファイルとの間の相関係数を求め、
（３）相関係数のより大きい方の型の遺伝子発現プロファイルに得られた遺伝子発現プロファイルを帰属させることから成る、該腫瘍組織／腫瘍細胞におけるｐ５３遺伝子の病的変異の有無の検出方法に係る。
【００１２】
本発明の第二の態様として、以下の工程： 
（１）腫瘍組織／腫瘍細胞における表１中の任意の遺伝子群の発現量を測定し、
（２）該発現量から得られた遺伝子発現プロファイルと、予め求めたｐ５３遺伝子の病的変異型及び野生型の遺伝子発現プロファイルとの間の相関係数を求め、
（３）相関係数のより大きい方の型の遺伝子発現プロファイルに得られた遺伝子発現プロファイルを帰属させ、
（４）病的変異型の遺伝子発現プロファイルの場合には予後が不良であり、野生型の遺伝子発現プロファイルの場合には予後が良好であると決定することから成る、癌の予後の予測方法に係る。
【００１３】
更に、本発明の第三の態様として、表１中の任意の遺伝子群の少なくとも一部の塩基配列から成るポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを含む、本発明の方法に用いることが出来るキットに係る。
【００１４】
【表１】
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【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、腫瘍組織／腫瘍細胞におけるｐ５３遺伝子の病的変異の有無を、様々な手段を用いて比較的短時間で簡便に、且つ、高い精度で検出することが出来、更に、癌患者の予後の程度を統計学的に有意に予測することが可能となり、それらに基き予後の治療方針を決定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明方法において使用する遺伝子群は、表１に記載された遺伝子（全７０種類）から任意に選択された遺伝子から構成される。選択される遺伝子の数に特に制限はないが、遺伝子群は、好ましくは、例えば、９個以上、１０個以上、２５個以上、３３個以上、若しくは４６個以上、又は７０個全ての遺伝子から構成される。
【００１７】
表１から本発明方法に使用する遺伝子群を構成する各遺伝子の選択方法も任意である。例えば、ランダムに選択することも出来るし、又は、病的変異型発現プロファイル及び野生型発現プロファイルにおける発現量の差の有意性を示すＰ値を基準にして、Ｐ値が０．０５より小さい、又は０．０１より小さい遺伝子の中から選択することも出来る。更に、Ｐ値の大きい順又は小さい順に適当な間隔で適当な数の遺伝子を選択することも可能である。尚、本発明方法で使用される病的変異型発現プロファイル及び野生型発現プロファイルの代表的例として、表７に示されるものを挙げることが出来る。
【００１８】
更に、本発明の癌の予後の予測方法にあっては、相関係数の大小により、得られた発現プロファイルが病的変異型発現プロファイル及び野生型発現プロファイルのいずれに属するか決定する工程において、相関係数におけるＰ値が０．０５以上の場合には、癌の予後の予測不可能とすることによって、その予測精度を一層高めることが出来る。
【００１９】
遺伝子の発現とは、遺伝子自身がもつ情報をＲＮＡ又はタンパク質という機能を有する遺伝子産物を産生することである。従って、遺伝子の発現量は、遺伝子から転写されたｍＲＮＡ、又は該ｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質の量を測定することによって行うことが出来る。本発明方法においてこのような、腫瘍組織／腫瘍細胞における遺伝子の発現量は、当業者に公知の任意の方法・手段で測定することが出来る。
【００２０】
例えば、発現されたｍＲＮＡ量の測定としては、DNAマイクロアレイ（又は、ＤＮＡチップ）、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ、ノーザンブロッティング（ノーザンハイブリダイゼーション）、インサイチューハイブリダイゼーション、RNA分解酵素プロテクションアッセイ、及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）等を用いることが出来る。一方、タンパク質量の測定としては、ウェスタンブロッティング、ELISAアッセイ、タンパク質アレイ、免疫組織染色、及びイーストツーハイブリッド（Yeast Two Hybrid）等を挙げることができる。 
発現レベルの解析はそうしたシグナル強度の比較によって行う。これには「検査試料中の遺伝子の発現強度」対「対照試料中の遺伝子の発現強度」の比率行列を生成させるのが最善である。
本発明は既存の測定法により得られた発現量を統計的に処理することによって、高精度で癌患者の予後を予測が可能となる特定の遺伝子の発現プロファイルを見いだしたことに基くものである。
遺伝子発現プロファイルはまた、様々な方法で表示することができる。最も一般的な方法は、列が検査試料を、そして行が遺伝子をそれぞれ示すグラフィカル・デンドグラム（graphical dendogram)に、比率行列を配列させる方法である。データは、類似の発現プロファイルを示す遺伝子が互いに近接するように配列される。各遺伝子の発現比率は色で視覚化される。たとえば１未満の比率（下方調節を示す）はスペクトルの青色部分に、また１を超える（上方調節を示す）比率はスペクトルの赤色部分に、それぞれ現れるようにしてもよい。そうしたデータ表示には商業上利用可能なコンピュータソフトウェアたとえばSilicon Genetics, Inc.の“GENESPRING”、およびPartek, Inc.の“DISCOVERY”や“INFER”などを利用できる。
【００２１】
従って、本発明のキットは、腫瘍組織／腫瘍細胞における遺伝子及び／又は該遺伝子がコードするタンパク質の発現量を測定する方法・手段に応じて、適当な構成をとることが出来る。例えば、本発明キットに含まれる表１中の任意の遺伝子の少なくとも一部の塩基配列から成るポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの長さは数十塩基対とすること出来、それらの具体的な部分（塩基配列）は、例えば、表１に記載のデータベース（Genbank）等の各種のデータベースから容易に入手できる情報に基き、当業者が適宜、選択・設計し調製することが出来る。又、それらはＤＮＡチップ又はノーザンブロッティングにおけるプロ−ブ、ＰＣＲにおけるプライマー等の形態で使用することが出来る。更に、必要に応じて、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは放射性物質、蛍光物質、色素等の適当な標識物質によって標識されていても良い。
【００２２】
上記キットには、その構成・使用目的などに応じて、当業者に公知の他の要素又は成分、例えば、各種試薬、酵素、緩衝液、反応プレート（容器）等が含まれる。
【００２３】
本発明において対象となる癌又は腫瘍組織／腫瘍細胞は特段制限されるものではなく、具体的には、頭頚部癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆のう・胆管癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、及び子宮頚癌などの固形癌や、悪性リンパ腫及び白血病などの血液癌を挙げることができる。
【００２４】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。又、特に記載のない場合には、以下の実施例は当業者に公知の標準的な方法で行われ、又、本明細書中に引用された文献の記載内容は本明細書の開示内容の一部を構成するものである。
【実施例１】
【００２５】
（対象）
平成12年3月より平成14年11月までに東北大学医学部付属病院乳腺・内分泌外科で手術を行った浸潤性乳管癌40症例（医学系研究科倫理委員会の承認を受け、本人よりインフォームド・コンセントが得られたもの）を対象とした。患者の全40症例の背景を表２に示す。年齢は30〜78歳 (平均58.45歳) 、閉経前が17例、閉経後が23例であった。ＥＲは陽性30例、陰性10例、プロゲステロンレセプター（ＰＲ）は陽性35例、陰性5例であった。陽性例のうちTotal scoreが5以上 (中等度以上の陽性)となるものはＥＲ、ＰＲともに25例あった。また陰性例のうちTotal scoreが0となるものはＥＲで8例、ＰＲで4例あった。ＨＥＲ２は0+が7例、1+が16例、2+が11例、3+が6例であった。
【００２６】
【表２】
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【００２７】
（方法）
乳癌腫瘍組織の採取・保存
使用した腫瘍組織は、手術にて摘出された腫瘍組織の一部であり、液体窒素にて急速凍結後、-80℃にて保存した。残りの腫瘍組織は病理組織検査用に10%ホルマリン固定し、パラフィンに包埋した。
【００２８】
凍結切片の作成
-80℃にて保存された凍結組織をWhite Tissue-Coat (ユーアイ化成社)に包埋し、ドライアイスを入れて冷却したn-ヘキサン中で凍結させた。包埋した組織を凍結ミクロトームにて厚さ20μmに薄切し、Poly-L-Lysine液 (Sigma社)でコートしたフォイル付きスライドガラス (Leica社) に貼り付けた。氷冷したエタノール／酢酸= 19 : 1 溶液で3分間固定を行った後、氷冷したdiethylpyrocarbonate水 (以下、DEPC水)で1分間洗浄した。氷冷した0.1% Toluidine blue (Chroma社) で3分間染色の後、再び氷冷したDEPC水で2回洗浄し、ドライヤーの冷風にて乾燥させた。作成した凍結組織切片はマイクロダイセクションを行うまで-80℃にて保存した。
【００２９】
マイクロダイセクション
作成した凍結組織切片をレーザーマイクロダイセクションシステム (ライカAS LMDシステム: Leica社) にてマイクロダイセクションを行った。切片中で間質、炎症性細胞が少ない腫瘍細胞の集塊の部分をレーザーにて切り抜き、RNA抽出用はRNeasy Micro Kit (Qiagen社) のbuffer RLT (2-Melcaptoethanol 1%を含む) 50μlに、DNA抽出用はDNeasy Tissue Kit (Qiagen社) のBuffer ATL 50μlに回収した。
【００３０】
RNA抽出
RNeasy Micro Kit (Qiagen社) を用いてマイクロダイセクションした腫瘍組織 (約2 x 104〜5細胞) よりtotal RNAを抽出した。抽出したRNAは、すべてバイオアナラザ (Agilent社) を用いて18s、28sのribosomal RNAのピークの面積比により分解のないことを確認した。
【００３１】
DNA抽出
RNA同様に、マイクロダイセクションした腫瘍組織 (5 x 103〜4細胞) よりDNeasy Tissue Kit (Qiagen社) を用いて腫瘍細胞のgenomic DNAを抽出した。各検体20〜200ng程度のgenomic DNAを抽出した。
【００３２】
DNAシークエンシングによるｐ５３遺伝子の変異解析
マイクロダイセクションにて抽出した腫瘍細胞のgenomic DNAを用いてｐ５３遺伝子のエクソン4からエクソン8のシークエンス解析を行った。エクソン4内のコドン72の多型を評価後、それ以外の塩基配列変化がある場合は病的変異の種類によって次のように評価した。すなわち、ミスセンス病的変異が見つかった場合はその病的意義を既知の転写機能評価データベース(Kato, S., Han, S. Y., Liu, W., Otsuka, K., Shibata, H., Kanamaru, R., and Ishioka, C. Understanding the function-structure and function-mutation relationships of p53 tumor suppressor protein by high-resolution missense mutation analysis. Proc Natl Acad Sci U S A, 100: 8424-8429, 2003)に基づき評価し、転写活性が失われている場合は「病的変異」とした。タンパク切断型病的変異(ナンセンス病的変異、フレームシフト病的変異)とスプライシング部位の病的変異は翻訳された場合、ｐ５３がDNA結合ドメインやオリゴマー形成ドメインを欠くことが予測されるので、これらの変異も「病的変異」とした。
【００３３】
エクソン4〜8に病的変異が見つからなかった症例は、全翻訳領域をカバーするため、さらにエクソン2、3、9〜11のシークエンス解析を追加した。各検体の2〜10ng genomic DNAを使用し、反応液の組成は250nM各プライマー、250μM dNTP、1.5U Ex Taq (TaKaRa社) 、25mM TAPS Buffer、50mM KCl、2mM MgCl2、1mM 2-Melcaptoethanol、計30μlでPCR反応を行った。エクソン2、3、10、11は、PCR反応を行った後、PCR反応液の1μlをnested PCR法により再度増幅した (使用した各プライマーは表３、反応時間、反応温度、サイクル数は表４に示した)。
【００３４】
PCR反応後、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Bioscience社) を用いて精製を行った後、シークエンス反応を行った。シークエンス反応は、0.5μMのプライマー、4.0μl のDTCS Quick Start Master Mix （CEQTM  DTCS-Quick Start Kit、Beckman Coulter社）、PCR増幅後のDNA100〜300ngを加えて10μlの反応系を作成し、PCR System 9700 (Biosystems社) を用いて96℃×30秒の熱変性に続いて、熱変性：96℃×20秒、アニーリング：50℃×20秒、伸長反応：60℃×4分を合計40サイクル行った。自動蛍光DNAシークエンサーはCEQTM2000XL DNA Analysis system (Beckman Coulter社) を使用した。
【００３５】
【表３】
2007167058.tif 000005
【００３６】
【表４】
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【００３７】
免疫組織染色
パラフィン固定した腫瘍組織に対して、Monoclonal Mouse Anti-Human p53 Protein (Biomeda社)を用いて p53の免疫組織染色を実施した。各標本から厚さ1.5μmの切片を作成し、キシレンにて脱パラフィン後、内因性ペルオキシダーゼ処理 (10%H2O2メタノール溶液)し、蒸留水にて洗浄後、p53は電子レンジで、その他はオートクレーブで前処理した。共にクエン酸buffer (10mMクエン酸、pH6.0) を用いて、電子レンジで15分、オートクレーブでは121℃で５分間加熱した。その後PBSにて洗浄、非特異的反応阻止の後、各1次抗体と4℃、over nightで反応した。1次抗体反応後、PBSにて洗浄 (5分を3回)し、2次抗体と30分の反応を行った。2次抗体はヒストファインキット (ニチレイ社) が使用したが、PR (Chenicon社)のみはENVISION+ (Dako社)を用いた後 (ヒストファインキットでは2次抗体に10%ヒト血清を加えて反応を行った後、PBSにて洗浄 (5分を3回) 後、ストレプトアビジンに30分間反応が行われた。)、再びPBSにて洗浄 (5分を3回)後、発色 (DAB 30mg + 10%アジ化ナトリウム 667μl + 50mM Tris Buffer (pH7.6))した。その後PBSで洗浄、ヘマトキシリン液にて核染色した。Hercep Testは付属のマニュアルに従って行った。
【００３８】
判定は以下のように行った。ｐ５３は切片中にある腫瘍全体の10%以上の核に染まるものを陽性とした(Kandioler-Eckersberger, D., Ludwig, C., Rudas, M., Kappel, S., Janschek, E., Wenzel, C., Schlagbauer-Wadl, H., Mittlbock, M., Gnant, M., Steger, G., and Jakesz, R. TP53 mutation and p53 overexpression for prediction of response to neoadjuvant treatment in breast cancer patients. Clin Cancer Res, 6: 50-56, 2000; 及び Stal, O., Stenmark Askmalm, M., Wingren, S., Rutqvist, L. E., Skoog, L., Ferraud, L., Sullivan, S., Carstensen, J., and Nordenskjold, B. p53 expression and the result of adjuvant therapy of breast cancer. Acta Oncol, 34: 767-770, 1995)。 
【００３９】
ノーザンハイブリダイゼーション
(1) 対照RNAプールの作成
各検体から抽出したtotal RNAを等量ずつ混合して対照RNAプールを作成した。
(2) 遺伝子プローブのラベリング
各遺伝子プローブはRediprime II DNA labeling system (Amersham Bioscience社) を用いて32P-dCTPにてラベリングを行った。
(3) ハイブリダイゼーション
対象RNAプールと各検体から抽出したtotal RNAを2.2Mホルムアルデヒド、50%ホルムアミド、1x MOPS buffer液にて65℃、15分加熱した後、1%アガロースゲル(2.2M ホルムアルデヒド、1x MOPS buffer)にて電気泳動を行った。50mM NaOH溶液中で25分間震盪し、200mM 酢酸ナトリウム液にて20分間震盪を2度繰り返した後、Hydrobond N+ (Amersham Bioscience社)に12時間転写を行った。50mM NaOH溶液を含ませた濾紙上に5分静置してアルカリ固定を行い、2x SSC溶液で洗浄を行った。その後、80℃で2時間乾燥させ、トランスイルミネーターを用いてUVクロスリンクを行った。
転写を行ったメンブランをプレハイブリダイゼーション溶液 (5x SSPE、50%ホルムアミド、5x Denhalt’solution、0.5% SDS、20μg/ml salmon sperm DNA) に浸し、60℃にて1時間プレハイブリダイゼーションを行った。その後、熱変性を行ったラベル化プローブを入れ、60℃で17時間ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーションの後、一次洗浄液 (2x SSPE、0.1% SDS)にて10分間 (室温)、二次洗浄液 (1x SSPE、0.1% SDS) にて20分間 (60℃)の洗浄をそれぞれ2回ずつ行った。三次洗浄液 (0.1x SSPE、0.1% SDS) にて20分間 (60℃) 洗浄を行った後、-80℃にてオートラジオグラフィーを行った。オートラジオグラフィーの結果をデンシトメーターにて数値化した。
【００４０】
（結果）
ｐ５３遺伝子変異の検出
ｐ５３遺伝子のエクソン4〜8でシークエンス解析を行った結果、全40例中20例 (50%) で病的変異が見つかった (表５)。病的変異の見つかった20例はミスセンス病的変異12種類、計13例(内2例はヘテロ接合性)、ナンセンス病的変異3例、フレームシフト病的変異 (2塩基欠失) 2例、スプライシング部位の病的変異2例であった。エクソン4〜8に病的変異の見つからなかった検体にはさらにエクソン2、3、9〜11のシークエンス解析を追加したが、新たに病的変異は見つからなかった。病的変異は全てDNA結合ドメインにマップされた。病的変異の見つかったエクソンと症例数は、エクソン4に1例、エクソン5に6例、エクソン6に5例、エクソン7に7例、エクソン8に1例であった。
【００４１】
ミスセンス病的変異12種類は網羅的ミスセンス病的変異ライブラリーの転写機能評価データベース(上掲)を参照し、全て転写活性化能を失う機能喪失型変異（病的変異）であることを確認した。タンパク切断型変異 (ナンセンス変異、フレームシフト変異) はC末端の4量体形成ドメインとDNA結合ドメインの一部を欠くため明らかに機能喪失型変異である。またスプライシング部位変異の2例は、それぞれエクソン6、エクソン7をスキップする病的変異と予測された。これらのエクソンはDNA結合ドメインの一部をコードすることから機能喪失型変異（病的変異）であると判断した。
【００４２】
【表５】
2007167058.tif 000007
【００４３】
ｐ５３の免疫組織染色
免疫染色によりｐ５３遺伝子における変異解析の結果をタンパクの発現レベルから確認する目的でｐ５３の免疫染色を行った。切片中にある腫瘍全体の10%以上の核に染まるものを陽性として判定した結果、陽性14例、陰性25例であった (表６及び図１、計39例の結果。野生型の1例でデータ得られず。)。この中でミスセンス変異例ではすべて陽性、非ミスセンス変異例ではすべて陰性であった。
【００４４】
通常、ｐ５３の発現量は主に転写や翻訳によってではなく、分解によって制御されているとされ、細胞が通常の状態（非ストレス下）では作られてもどんどん分解されるために、野生型ｐ５３はほとんど発現が認められない。細胞がストレス下におかれることで初めて、ｐ５３の分解が抑制され、タンパク質として発現が認められるようになる。又、ミスセンス変異型ｐ５３は分解を受けにくくなることによって細胞内に蓄積し、この結果が免疫染色上陽性として認められる。一方、非ストレス下の野生型ｐ５３、タンパク切断型変異などで抗ｐ５３抗体に反応しなくなった病的変異型ｐ５３（非ミスセンス病的変異：細胞内にタンパク質としては存在するものの、抗体に認識されないため、陰性となる）は陰性を示すものと予想される。
【００４５】
従って、上記のDNAシークエンス解析によって同定されたミスセンス変異、非ミスセンス変異と予想される免疫染色の結果が完全に一致することが確認された。
【００４６】
【表６】
2007167058.tif 000008
【００４７】
ｐ５３遺伝子の病的変異の有無を検出する遺伝子発現プロファイル
解析対象とした70遺伝子を表７に示した。
GAPDH（グリセルアルデヒドリン酸脱水素酵素）を内部標準として、各検体間の遺伝子発現量の標準化を行った。各遺伝子の発現は対照RNAプールの発現量を基準とし、各検体ごとに発現量の比として算出した。検体を遺伝子発現プロファイル作成のためのlearning set (26例) 検証のためのtest set (12例) の2群に分けた。なお、ヘテロ接合性ミスセンス変異の２例は癌細胞のp53の機能が残存している可能性があるので解析対象から除外した。leaning set（病的変異型症例12例、野生型症例14例）を用いて各型の発現値の平均を算出し、これを病的変異型、野生型それぞれの遺伝子発現プロファイルとした。leaning setにおける病的変異型発現プロファイルとして病的変異型群発現比を、野生型遺伝子発現プロファイルとして野生型群発現比を表７に示した。
【００４８】
【表７】
2007167058.tif 000009
【００４９】
病的変異の有無での発現差の有意性を Wilcoxon rank sum testにより検討したところ、P値は全て0.1より小さい値を取ることが示された。これら70遺伝子について、(a) 全遺伝子(70遺伝子)、(b) P値が0.05より小さい遺伝子(33遺伝子)、(c) P値が0.01より小さい遺伝子(10遺伝子)、(d) P値が0.05以上の遺伝子(37遺伝子)、(e) P値の順に5個おきに選択した14遺伝子、(f) P値の大きい方から10遺伝子、(g) P値の順に7個おきに選択した10遺伝子、(h)病的変異型群において発現量の大きい順に7個おきに選択した10遺伝子、(i)ランダムに選択した10遺伝子の9種類の遺伝子セットについて、各症例ごとに病的変異型、野生型それぞれの遺伝子発現プロファイルとの相関係数（Peason's correlation coefficient）を算出し、相関係数の大きさに基づいて、病的変異型か野生型かを判定した。
全ての遺伝子セットについて、leaning setの予測的中率は100％であった。また全ての遺伝子セットについて、test setの予測的中率は75.0 %以上であった。特に(g)〜(h)以外の遺伝子セットの予測的中率は88.3%であった。
この結果より、表１中の70遺伝子中から選択した任意の遺伝子群の発現量を測定することにより、ｐ５３遺伝子における病的変異を75.0%以上の精度で検出（予測）できることが確認された(表８)。
【００５０】
【表８】
2007167058.tif 000010
【実施例２】
【００５１】
検出されたｐ５３遺伝子の病的変異の有無と予後との相関性の検討
（１）実施例１の症例について、本発明の予後予測の正確性を検討した。すなわち、表２の乳癌患者のうち、病期I〜IIBの早期乳癌患者２９名（３２名のうち、他病死した１名とヘテロ接合性変異の２名を除外した）を表８(b)の33遺伝子の発現パターンに基づき、野生型予測群（ローリスク群）１５名と病的変異型予測群（ハイリスク群）１４名に分け、経過観察をおこない、その無再発生存（Recuurence free survival）期間に関するカプランマイヤー曲線を作成した（図２）。これまでのところ、再発例は全てハイリスク群であり、ローリスク群からの再発例はない。また、ローリスク群とハイリスク群とにほぼ二等分されており、理想的に層別されている。さらに５年足らずの短期間にもかかわらず、P値として0.0322と非常に小さい値を示しており、予後予測の精度の高さを示している。
【００５２】
（２）一般に遺伝子発現パターンによる予後などの予測方法は、検体における細胞組成のばらつき、検体の前処理段階におけるばらつきなどから、第三者が追試しても再現できないというケースが少なくない。
本予測方法の再現性を第三者のマイクロアレイデータを用いて検証することにした。即ち、Van’t Veerらは、78症例の早期乳癌患者を対象にしたマイクロアレイデータを公開している（非特許文献３）。公開されている約24,000遺伝子の発現データには、表２の70遺伝子のうち、46遺伝子（表９(a)で「○」付された遺伝子）が含まれている。
【００５３】
【表９】
2007167058.tif 000011
【００５４】
そこで、彼らのデータを用いて、各症例がハイリスク群（病的変異型）又はローリスク群（野生型）のいずれの遺伝子発現プロファイルに属するか判定し、その型ごとに無遠隔転移再発生存期間（metastasis free survival）に関するカプランマイヤー（Kaplan-Meier）曲線を作成した(図３Ａ、Ｂ)。
遺伝子セットには表９に示したようにそれぞれ(a)46個、(b)25個、(c)9個、(d)21個、(e)7個、(f)10個、(g)10個、(h)10個の８種類の遺伝子セットを用いた。この結果、(a)、(c)、(f)、(g)、(h)では予測されたｐ５３遺伝子の病的変異の有無によって予後に統計学的に有意な差が認められた。また(b)、(d)、(e)でも統計学的には有意とは言えないものの、P値として0.0532〜0.0754と非常に小さい値となった。第三者のデータを用いているにもかかわらず、優れた再現性を示していると言える。
【００５５】
また、さらに、予測に用いた相関係数でP≧0.05となるものを統計学的に有意でないと考え、not predictとした場合の結果を図３Ｃに示す。この結果、カプランマイヤー曲線においてnot predictの群が病的変異型予測群と野生型予測群の中間に位置し、より予後が明確に分かれる傾向が認められた。(a)、(b)ではそれぞれP=0.0036、0.0024となり、統計学的にも非常に有意な結果であった。(c)、(d)でも(a)、(b)と同様の傾向が認められたがP値として統計学的に有意な値は得られなかった。これは予測に用いる遺伝子数が少ないことより、予測に用いた相関係数のP値が大きくなってしまい、not predictとなる症例が多くなって、病的変異型予測群、野生型予測群の症例が少なくなってしまったためと考えられた。同様の理由により、(e)では予測が不能であった。
【００５６】
図３Ａ−Ｃにおいて、横軸は月数、縦軸が遠隔転移再発を来していない患者の割合（無遠隔転移再発率）を示している。又、これらの図中に示されるＰ値は２つの群の無遠隔転移再発率の差をログランク検定にて検定したものであり、Ｐ値が0.05より小さい場合に統計学的に有意に差があると見なされる。尚、カプランマイヤー曲線は、一般的には生存曲線と呼ばれ（通常”死亡”をイベントとすることが多いため）、カプランマイヤー法を用いて作成される（http://www.medical-tribune.co.jp/BENRI/survival2.htm等参照）。尚、図３の各図における「mt-predict」及び「wt-predict」は、夫々、病的変異型予測群及び野生型予測群を示す。尚、各予測方法に使用された病例の数は以下のとおりである。
【００５７】
図３Ａ：(a)mt 42  wt 36、(b)mt 48  wt 30、(c)mt 44  wt 34、(d)mt 38  wt 40
図３Ｂ：(e)mt 43  wt 35、(f)mt 36  wt 42、(g)mt 39  wt 39、(h)mt 42  wt 36
図３Ｃ：(a)mt 18  wt 29  np 31、(b)mt 15  wt 29  np 34、(c)mt 3  wt 6  np 69、(d)mt 12  wt 8  np 58
【００５８】
これらの結果から、ｐ５３遺伝子における病的変異の有無を検出し、ハイリスク群（病的変異型）とされた群では、ローリスク群（野生型）と予測された群と比較して明らかに予後が不良であることを示された。このように、表１から任意に選択した遺伝子群を用いて癌の予後の予測が可能であることが実証された。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
実施例１では、遺伝子発現プロファイルによるｐ５３遺伝子における病的変異の検出をノーザンハイブリダイゼーションにより実施したが、既に記載したように、他の任意の方法、例えば、van’t Veerらと同様にマイクロアレイを使用することが可能である。マイクロアレイでは一度の実験でｐ５３遺伝子における病的変異の検出が可能であり、必要とする時間も検体の採取から結果が得られるまで数日以内と考えられる。免疫組織染色でも最低２日間を要することを考慮すると十分に臨床応用が可能であると考えられる。また、ノーザンハイブリダイゼーション、マイクロアレイ以外にも定量的RT-PCR法などのRNAの半定量を行える方法であればどんな方法でも利用が可能であり、汎用性が高いと考えられる。
【００６０】
更に、本発明の遺伝子発現プロファイルによるｐ５３遺伝子における病的変異の検出は、ｐ５３遺伝子における変異の有無のみでなく、その病的意義の評価も同時に行うことが可能であり、他の方法と比較しても非常に有用であると考えられる。本発明により、ｐ５３遺伝子における病的変異の有無の検出に加えて、遺伝子発現プロファイルによって、予後予測が行うことが可能であることが示され、臨床上有用なデータとなると考えられる。
【００６１】
ｐ５３遺伝子における変異と治療に対する感受性についても多数報告されている。Jassonらはｐ５３遺伝子における変異を調べ、変異型では放射線療法により予後の改善が認められるが、野生型では予後の改善が認められないことを報告している（Jansson, T., Inganas, M., Sjogren, S., Norberg, T., Lindgren, A., Holmberg, L., and Bergh, J. p53 Status predicts survival in breast cancer patients treated with or without postoperative radiotherapy: a novel hypothesis based on clinical findings. J Clin Oncol, 13: 2745-2751, 1995）。また、変異型では乳癌の治療に一般的に使用される抗癌剤であるタモキシフェンやパクリタキセル、更には、一般的に行われているレジメンであるCEF療法に対して感受性が低いことが複数報告されている（Kandioler-Eckersberger, D., Ludwig, C., Rudas, M., Kappel, S., Janschek, E., Wenzel, C., Schlagbauer-Wadl, H., Mittlbock, M., Gnant, M., Steger, G., and Jakesz, R. TP53 mutation and p53 overexpression for prediction of response to neoadjuvant treatment in breast cancer patients. Clin Cancer Res, 6: 50-56, 2000; Berns, E. M., Foekens, J. A., Vossen, R., Look, M. P., Devilee, P., Henzen-Logmans, S. C., van Staveren, I. L., van Putten, W. L., Inganas, M., Meijer-van Gelder, M. E., Cornelisse, C., Claassen, C. J., Portengen, H., Bakker, B., and Klijn, J. G. Complete sequencing of TP53 predicts poor response to systemic therapy of advanced breast cancer. Cancer Res, 60: 2155-2162, 2000; Geisler, S., Lonning, P. E., Aas, T., Johnsen, H., Fluge, O., Haugen, D. F., Lillehaug, J. R., Akslen, L. A., and Borresen-Dale, A. L. Influence of TP53 gene alterations and c-erbB-2 expression on the response to treatment with doxorubicin in locally advanced breast cancer. Cancer Res, 61: 2505-2512, 2001.）。しかしながら、抗癌剤や放射線による治療は癌細胞のみならず、正常細胞に対しても少なからず障害作用を有し、さまざまな副作用を伴う。現在のところ、臨床病期、病理組織学的診断により治療法が決定されるが、予後予測の精度が低いことから、現在では術後再発が起こらない患者にも過剰な治療を行わざるを得ない状況にある。また、治療の必要な患者でも効果の期待できない治療を行うことは避けるべきであり、本発明を用いることにより、予後の治療方針を正確かつ迅速に決定することが可能となり、臨床上非常に有用であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】実施例１における免疫組織染色図（写真）である。
【図２】実施例２（１）におけるカプランマイヤー曲線を示す図である。
【図３Ａ】実施例２（２）におけるカプランマイヤー曲線を示す図である。
【図３Ｂ】実施例２（２）におけるカプランマイヤー曲線を示す図である。
【図３Ｃ】実施例２（２）におけるカプランマイヤー曲線を示す図である。
【図１】
2007167058.tif 000012
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2007167058.tif 000015
【図３Ｃ】
2007167058.tif 000016
【配列表】
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