(57)【要約】皮膚成分に対する化学的化合物または化合物の混合物の結合をｉｎ  ｖｉｖｏで測定するための、（ａ）被験者の身体に所望の寸法の所望部位を選択する段階と、（ｂ）前記部位を、該部位に対する結合を測定すべき化学的化合物または化合物の混合物に所望の任意の方法によって接触させる段階と、（ｃ）１つまたは複数の化学的化合物に接触させた領域に発光性または光吸収性のプローブ／マーカーを塗布する段階と、（ｄ）皮膚上のプローブ／マーカーの発光スペクトルまたは吸光スペクトルを測定する段階と、（ｅ）接触した身体部位に対する１つまたは複数の化学的化合物の結合を発光スペクトルまたは吸光スペクトルから測定する段階とから成るｉｎ  ｖｉｖｏ測定方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚成分に対する化学的化合物または化合物の混合物の結合をｉｎ  ｖｉｖｏで測定するための、
（ａ）被験者の身体に所望の寸法の所望部位を選択する段階と、
（ｂ）前記部位を、該部位に対する結合を測定すべき化学的化合物または化合物の混合物に所望の任意の方法によって接触させる段階と、
（ｃ）１つまたは複数の化学的化合物に接触させた領域に発光性または光吸収性のプローブ／マーカーを塗布する段階と、
（ｄ）皮膚上のプローブ／マーカーの発光スペクトルまたは吸光スペクトルを測定する段階と、
（ｅ）接触した身体部位に対する１つまたは複数の化学的化合物の結合を発光スペクトルまたは吸光スペクトルから測定する段階とから成るｉｎ  ｖｉｖｏ測定方法。
【請求項２】
測定される化学的化合物が１つまたは複数の界面活性剤であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
測定される皮膚成分が１つまたは複数の皮膚タンパク質であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
段階（ｅ）の結合が、異なる２つの波長で蛍光または吸光度を測定し２つの比の値を測定するかまたはプローブ／マーカーの振幅以外の変化を測定することによって測定されることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
清浄化剤配合物の弱刺激性を測定するために、
（ａ）被験者の身体に所望の寸法の所望の皮膚部位を選択する段階と、
（ｂ）前記皮膚を界面活性組成物または清浄化組成物で洗浄する段階と、
（ｃ）界面活性組成物または清浄化組成物に接触させた領域に発光性または光吸収性のプローブ／マーカーを塗布する段階と、
（ｄ）皮膚上のプローブ／マーカーの発光スペクトルまたは吸光スペクトルを測定する段階と、
（ｅ）接触させた身体部位に対する界面活性組成物または清浄化組成物の結合を発光スペクトルまたは吸光スペクトルから測定する段階とから成る方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚、より特定的には皮膚のタンパク質に対する化学的活性物質、より特定的には界面活性剤の結合を測定するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法に関する。
【０００２】
皮膚に対する化学物質、主として界面活性剤の結合を測定するｉｎ  ｖｉｖｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏの方法は公知である。これらの方法は典型的には、問題の化学的化合物または化合物の混合物の溶液によるトリートメントの前または後に強力な吸光性または発光性のプローブ／マーカーを塗布する段階と、その後に、皮膚の吸光度または発光の強度を測定する段階とから成る。
【背景技術】
【０００３】
“Ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ｏｎ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｈｏｒｎｙ  ｌａｙｅｒｓ：  Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｎｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｋｅｒａｔｉｎ  ｌａｙｅｒｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ”，Ｇ．Ｉｍｏｋａｗａ  ａｎｄ  Ｙ．Ｍｉｓｈｉｍａ，Ｃｏｎｔａｃｔ  Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ３５７：５（１９７９）には、トリートメント後に塗布されたプローブ／マーカーの吸光度が界面活性剤の結合量の測定値であることが示唆されている。トリートメント中に界面活性剤が皮膚に結合すると、プローブ／マーカーに対する潜在的結合可能部位がブロックされることが記述されている。従って、トリートメントを行うことなくプローブ／マーカーを塗布したときに観察されるよりも皮膚に結合するプローブ／マーカーが少なくなり、その結果として色が薄くなる。しかしながら、該文献の著者らは、特定結合部位が何であるか、即ち、プローブ／マーカーが結合する皮膚の成分が何であるかに関しては明記していない。
【０００４】
“Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃｌｅａｎｓｉｎｇ  ｂａｒｓ  ｗｉｔｈ  ｓｔｒａｔｕｍ  ｃｏｒｎｅｕｍ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｓｔｕｄｙ”，Ｓ．Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅら，Ｊ．Ｓｏｃ．Ｃｏｓｍｅｔ．Ｃｈｅｍ．３０１：４６（１９９５）では、種々の界面活性剤溶液によるトリートメントの前に、ｅｘ  ｖｉｖｏのヒト及びブタの皮膚にタンパク質結合性蛍光プローブ／マーカーを塗布する。その後に、プローブ／マーカーの蛍光スペクトルを測定し、皮膚タンパク質のトリプトファン残基の蛍光強度に対するプローブ／マーカーの蛍光強度の比を計算することによってプローブ／マーカーが界面活性剤で置換された割合を算出する。
【０００５】
しかしながら、プローブ／マーカーの蛍光スペクトル自体についてはスペクトルの形状変化は全く観察されていない。即ち、本発明の方法は開示されていない。
【０００６】
“Ｐｙｒａｎｉｎｅ，ａ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｄｙｅ，ｄｅｔｅｃｔｓ  ｓｕｂｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｊｕｒｙ  ｔｏ  ｓｏｄｉｕｍ  ｌａｕｒｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ”，Ａ．Ｐａｇｎｏｎｉら，Ｊ．Ｃｏｓｍｅｔ．Ｓｃｉ．３３：４９（１９９８）では、トリートメント後に蛍光プローブ／マーカーとして８−ヒドロキシル−１，３，６−ピレン−トリスルホン酸（ピラニン）をｉｎ  ｖｉｖｏ塗布する。アニオン性界面活性剤であるラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）に皮膚を２４時間接触させると、事前のトリートメントを全く行うことなくプローブを塗布したときよりもはるかに強力な蛍光が観察される。
【０００７】
上の文節に引用した文献は以下のような立論を展開している。皮膚にＳＬＳが結合すれば蛍光が減少する筈である。蛍光が減少ではなく増加したという事実は、２４時間のトリートメントが皮膚の障壁機能を低下させ、従って蛍光プローブ／マーカーに対してより大きい結合部位が接触することを示唆する。この理論は、経皮的に失われる水量の測定値によって支持される。
【０００８】
本発明は、皮膚、より特定的には皮膚のタンパク質に対する化学的化合物、特定的には界面活性剤、より特定的には清浄化剤に含まれている界面活性剤の結合を測定するｉｎ  ｖｉｖｏ方法に関する。
【０００９】
本発明はｉｎ  ｖｉｖｏ測定値を得るための１つの特定実施態様を開示している。
【００１０】
本発明の１つの実施態様では、清浄化製品の塗布後に皮膚に結合する界面活性剤の量が、被験者の身体上に所望の場所を選択する段階と、問題の製品で皮膚を洗浄する段階と、所望量の蛍光プローブ／マーカー（例えば、ピラニン）を塗布する段階と、例えば光ファイバ性プローブ／マーカーを使用することによって蛍光性または吸光性のプローブを塗布した領域の蛍光スペクトルを測定する段階と、異なる２つの波長における皮膚のプローブ／マーカーの蛍光強度または吸光度の比を計算する段階とから成る方法によって測定される。
【００１１】
より特定的には本発明は、皮膚、より特定的には皮膚のタンパク質に対する化学物質、より特定的には界面活性剤の結合親和性を測定するｉｎ  ｖｉｖｏ方法に関する。界面活性剤は純粋な界面活性剤でもよく、または清浄化剤配合物に含まれている界面活性剤でもよい。方法は以下の段階から成る：
１．被験者の身体上に典型的には５．０８ｃｍ×１０．１６ｃｍ（２″×４″）の大きさであるがもっと小さくてもまたはもっと大きくてもよい所望の部位を選択する段階；
２．該身体部位を問題の化学物質または配合物に接触させる段階。化学物質の接触は所望の任意の方法で行うことができる。界面活性剤または清浄化剤配合物の場合、接触は典型的には界面活性剤または清浄化剤配合物で皮膚を洗浄することから成る；
３．化学的配合物に接触させた部位の内部の１つの領域にプローブ／マーカーを塗布する段階。該領域は典型的には１．２７ｃｍ（０．５″）直径の円形領域であるが、段階２でトリートメントを行った部位に完全に重なるならばどのような形状でも寸法でもよい；
４．プローブ／マーカーを塗布した皮膚の領域の発光スペクトルまたは吸光スペクトルを測定する段階；
５．異なる２つの波長における蛍光の強度または吸光度の比を計算することによって、または、プローブ／マーカーのスペクトル中の振幅以外の変化を測定することによって、皮膚の特定成分、例えば皮膚タンパク質に対する化学的化合物の結合親和性を判定する段階。
【００１２】
次に、添付図面に基づいて本発明を非限定的に説明する。
【００１３】
本発明は、化学物質、より特定的には界面活性剤、よりいっそう特定的には清浄化剤配合物から塗布された界面活性剤が皮膚の特定成分、例えばタンパク質または脂質に結合する能力をｉｎ  ｖｉｖｏで測定する方法に関する。この方法はｅｘ  ｖｉｖｏでも使用できる。方法は、清浄化剤配合物の弱刺激性を判断するための迅速で容易なアッセイとして使用できる。
【００１４】
より特定的には本発明は、皮膚のタンパク質に結合する化学物質の能力をｉｎ  ｖｉｖｏで測定するための、以下の段階から成る方法を提供する：
１．被験者の身体上に典型的には２″×２″の所望部位を選択する段階；
２．界面活性剤または清浄化剤配合物の場合には典型的には該部位を洗浄することによって問題の化学的化合物を所望の時間だけ該部位に接触させる段階；
３．皮膚内部の微小環境次第で異なる発光スペクトルまたは吸光スペクトルを示す発光性または吸光性のプローブ／マーカー、例えばピラニンまたはその他のプローブ／マーカーを典型的にはエタノールまたは水に溶解させ、典型的には直径約１．２６ｃｍ（０．５″）の円形領域に塗布する段階；
４．例えば光ファイバ性プローブ／マーカーを使用して皮膚のプローブ／マーカーを塗布した領域の発光スペクトルまたは吸光スペクトルを測定する段階；
５．異なる２つの波長における蛍光強度または吸光度の比を計算するか、または、プローブ／マーカーのスペクトル中の振幅以外の何らかの変化を測定することによって、皮膚の特定成分、例えば皮膚タンパク質に対する化学的化合物の結合親和性を判定する段階。
【００１５】
処理段階の各々については以下の記載及び実施例でより詳細に説明する。
【００１６】
上述のように、皮膚の特定成分に対する化学的化合物の結合親和性をｉｎ  ｖｉｖｏ測定する本発明方法の第一段階では、被験者の測定に適した所望の場所を選択する。
【００１７】
方法は、結合を測定すべき化学的化合物でトリートメントを行うことができる身体の任意の部位に使用し得る。選択される部位の寸法の制約となるのは、化学的化合物に対する接触方法だけである。例えば、問題の化合物が界面活性剤であり、該界面活性剤による身体部位の洗浄によって使用されるとき、ほぼ１．２６ｃｍ×１．２６ｃｍ（０．５″×０．５″）よりも小さい寸法の領域を選択することは実際にはできない。しかしながら、接触方法次第では、はるかに小さい寸法の身体部位も選択できる。
【００１８】
選択すべき身体部位の寸法に上限はない。例えば、皮膚に対する清浄化剤配合物の結合を測定することが望まれる場合、被験者の全身を洗浄し、その後に身体の種々の部位で結合を測定できる（第二段階参照）。
【００１９】
本発明の第二段階では、第一段階で選択した身体部位を、その結合を測定すべき化学的化合物または化合物の混合物に接触させる。
【００２０】
化学的化合物を皮膚に接触させる方法または接触の持続時間に関しては、ｉｎ  ｖｉｖｏで適切に使用できるという以外の制約は全くない。方法をｅｘ  ｖｉｖｏで行う場合には、接触の方法または持続時間には全く制約がない。典型的な接触方法は、問題の化合物または化合物の混合物に皮膚を浸漬させ、化合物を皮膚に擦り込み、特に界面活性剤または清浄化剤配合物の場合には皮膚を洗浄する。
【００２１】
本発明の第三段階では、蛍光性または光吸収性のプローブ／マーカーを第二段階で（１つまたは複数の）化学的化合物に接触させた領域に塗布する。
【００２２】
塗布されるプローブ／マーカーは、皮膚内部の微小環境に従属して発光スペクトルまたは吸光スペクトルに振幅以外の差を示すいかなるプローブ／マーカーでもよい。ピラニンは、プロトン化状態及び脱プロトン化状態の双方で蛍光を発生し得る蛍光性プローブ／マーカーである。各状態でそれぞれ異なる波長に蛍光が生じる。プロトン化状態から発生する蛍光は４３０ｎｍ−４６０ｎｍにピークを有しているが、脱プロトン化状態から発生する蛍光は５１０ｎｍにピークを有している。２つの異なる状態から発生する蛍光の強度の比は分子の微小環境に大きく左右される。
【００２３】
例えば、ピラニンの蛍光スペクトルは、実施例１に示すようにピラニンがタンパク質に結合したときに劇的に変化する。このため、ピラニンは実施例３に示すように皮膚タンパク質に対する化学的化合物の結合を測定する好ましいプローブ／マーカーとなる。タンパク質以外の皮膚の成分に対する化学物質の結合を測定するためには別のプローブ／マーカーを使用し得る。例えば、脂質環境に存在するときに発光スペクトルまたは吸光スペクトルの変化を示すプローブ／マーカーは、皮膚の脂質に対する化学物質の結合を測定するために適当であろう。プローブ／マーカーの好ましい微小環境を判断するためにはｉｎ  ｖｉｔｒｏの発光スペクトルまたは吸光スペクトルを測定すればよい（実施例２参照）。
【００２４】
プローブ／マーカーを皮膚に塗布する方法または塗布の持続時間には、ｉｎ  ｖｉｖｏで適切に使用できるという以外の制約は全くない。方法をｅｘ  ｖｉｖｏで行う場合には、接触の方法または持続時間には全く制約がない。典型的には、プローブを溶液、例えばアルコールまたは水に溶解した溶液から、約１．２６ｃｍ（０．５″）直径の円形領域に局所塗布する。プローブ／マーカーを塗布する領域の寸法については、第二段階で化学的化合物に接触させた領域の内部に存在するという以外の制約は全くない。幾つかの場合には、第二段階で比較的大きい領域に接触させるのが望ましい。このような接触は、例えば、前腕全部を洗浄し次いでその後に化学的化合物に接触させた大きい領域の内部の幾つかの小さい領域にプローブ／マーカーを塗布することによって行う。
【００２５】
本発明の第四段階では、皮膚上のプローブ／マーカーの発光スペクトルまたは吸光スペクトルを得る。典型的にはこれらのスペクトルは蛍光計（蛍光性プローブ／マーカーの場合）または分光光度計（吸光性プローブ／マーカーの場合）によって測定される。測定値を採取する皮膚の面積が第三段階でプローブ／マーカーを塗布した皮膚の面積に等しいかまたは小さいことが重要である。これは典型的には、励起光を皮膚に照射し生じた蛍光を収集する光ファイバ性プローブ／マーカーを使用することによって（蛍光性プローブ／マーカーの場合）、または、入射光を作用させ反射光を収集することによって（吸光性プローブ／マーカーの場合）達成できる。
【００２６】
本発明の第五段階では、第二段階で使用された化学的化合物または化合物の混合物の結合を測定するために第四段階で測定されるスペクトルを分析する。この分析は、例えば、スペクトル中の２つの異なる波長の蛍光強度または吸光度の比を測定することによって、または、最大の蛍光強度または吸光度の波長を測定することによって行うことができる。
【００２７】
処理実施例及び比較実施例を除いて、または、別の明白な指示がある場合を除いて、本明細書中で材料の量もしくは比、反応条件、材料の物理的特性及び／または使用に関するすべての数値は“約”という用語で修飾されていると理解されたい。
【００２８】
明細書中に使用された“から成る”という用語が、記述された特徴、整数、段階、成分の存在を含意するが、１つまたは複数の特徴、整数、段階、成分またはその集まりの存在または追加を排除しないことは理解されよう。
【００２９】
以下の実施例の目的は本発明をより詳細に説明することであり、本発明を制限することではない。
【００３０】
異なる指示がない限り、すべてのパーセンテージは重量パーセンテージを意味する。
【００３１】
処理手順
装置
溶液中及び皮膚上のピラニンの蛍光スペクトルをＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ５０Ｂ蛍光計を使用して測定した。皮膚上で測定したスペクトルの場合、光ファイバ性プローブアクセサリーを使用した。
【００３２】
実験手順
Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ実験：
スペクトルはいずれも５０ｍＭのＨｅｐｅｓバッファ中に１．０×１０−８Ｍのピラニン濃度（ｐＨ６．７の水性バッファ溶液）で測定した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）濃度は２．５ｍｇ／ｍｌとした。界面活性剤は重量分率４×１０−５で添加した。
【００３３】
Ｉｎ  Ｖｉｖｏ実験：
前腕内側の約４″×２″の寸法の領域をＤｏｖｅ（Ｒ）またはＩｖｏｒｙ（Ｒ）の固形セッケンで２分間洗浄した。次に皮膚を水道水で１０秒間すすぎ、タオルで叩いて乾かした。洗浄した領域の中央で１．２６ｃｍ（０．５″）直径の円形領域に、エタノール中の１０，０００ｐｐｍのピラニン溶液１００μｌを塗布した。円形領域の中心に光ファイバ性プローブ／マーカーを配置し、蛍光スペクトルを測定した。
【実施例１】
【００３４】
ピラニン蛍光スペクトルの微小環境依存性
図１は水性バッファ中に溶解したとき、タンパク質（ＢＳＡ）を加えた同じ水性バッファ中に溶解したとき、及び、ｉｎ  ｖｉｖｏのヒトの皮膚上に配置されたときの３つの異なる環境中のピラニンの蛍光スペクトルを示す。
【００３５】
水性バッファ中のスペクトルは約５１０ｎｍに集中した強いバンドを示す。このバンドは前述したような脱プロトン化状態に対応する。更に、プロトン化状態から生じた小さいバンドが約４２５ｎｍに観察できる。ＢＳＡを添加すると、スペクトル中に同じバンドが観察されるが相対強度が大きく違っている。２つのバンドの相対強度の変化はピラニンがタンパク質に結合した結果として生じる。
【００３６】
この異なる微小環境では、ピラニンの脱プロトン化形態に起因する蛍光は基底溶液（ｆｒｅｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中よりも発生し難い。皮膚上のピラニンの蛍光スペクトルもまた明らかに多重バンドを示す。プロトン化状態に起因する蛍光は基底溶液のスペクトルに比べて赤にシフトしており、明らかにより強い。脱プロトン化状態に起因する蛍光は基底溶液のスペクトルに比べて有意にシフトしなかったと考えられる。プロトン化状態に起因する蛍光の相対強度が高くなったことは、局所塗布されたピラニンが皮膚タンパク質に結合したことを示唆する。
【実施例２】
【００３７】
タンパク質溶液中のピラニンのスペクトルに対する界面活性剤の影響
タンパク質に対する界面活性剤の結合をモニターするためのピラニン蛍光の使用適性を試験するために、出願人らは、ピラニン及びＢＳＡの水溶液の蛍光スペクトルに対する界面活性剤添加の効果を試験した。図２は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の添加が脱プロトン化状態に起因する蛍光の相対強度をどの程度有意に増加させたかを示す。この効果は、ＢＳＡに結合したピラニン分子がＳＤＳ分子によって置換されると基底溶液中のピラニン濃度が増加し従って脱プロトン化状態に起因する蛍光の強度が相対的に増加するのであると説明できる。脱プロトン化部位の蛍光強度とプロトン化部位の蛍光強度との比がＢＳＡ結合部位からピラニンを排除する界面活性剤の能力を表す。以下の表１は、幾つかの界面活性剤について等しい重量分率でピラニン／ＢＳＡ溶液に添加したときに得られた上記の比を示す。
【００３８】
表１によれば、皮膚に強刺激性であることがよく知られたＳＤＳのような界面活性剤は、アルキルポリグリコシド（ＡＰＧ）のような公知の弱刺激性の界面活性剤よりも高い比を有していることが明らかであり、これは、界面活性剤の強刺激性／弱刺激性の少なくとも一部がタンパク質結合部位に対する界面活性剤の親和性によって決定されることを示唆する。
【００３９】
【表１】
2004530876.tif 000002
【実施例３】
【００４０】
皮膚上のピラニンの蛍光スペクトルに対するセッケン洗浄の影響
図３は皮膚上のピラニンの２つの蛍光スペクトルを示す。１つは事前のトリートメントを全く行うことなくピラニンを塗布した場合であり、１つは強刺激性固形セッケンで腕を２分間洗浄後にピラニンを塗布した場合である。セッケントリートメントによって蛍光スペクトルは有意に変化し、最も顕著な変化は約４５０ｎｍのバンドの強度低下である。プロトン化状態に起因する蛍光の強度低下の最も有力な原因は、固形セッケン中の界面活性剤が皮膚のタンパク質結合部位に結合したことであると考えられる。
【００４１】
セッケン洗浄後にピラニンを塗布するとき、潜在的な結合可能部位のある程度が界面活性剤分子によって既に占拠され、従ってプローブ分子の一部が実質的な結合をしないのでプロトン化状態に起因する蛍光が減少する。図４に示すように弱刺激性の固形合成洗剤を使用するときはこの効果が有意に減少する。図４では強刺激性の固形セッケンで洗浄後及び弱刺激性の固形合成洗剤で洗浄後の双方のスペクトルを示す。
【００４２】
皮膚上のピラニンの蛍光スペクトルに対するセッケン洗浄の影響は、ピーク高さの蛍光強度と４６０ｎｍの強度との比を測定し、次いで固形セッケンによる洗浄前及び洗浄後のこの比の差を計算することによって定量できる。図５は、パイロット臨床試験の結果を示しており、この結果は強刺激性固形セッケンの場合に全体的な影響が大きいことを示す。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ピラニンの蛍光スペクトルを、５０ｍＭのＨｅｐｅｓバッファ中、該バッファが２．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有するとき（鎖線）；及び、ヒト皮膚の表層に塗布したとき（点線）のそれぞれの場合について示す。
【図２】ピラニンの蛍光スペクトルを、５０ｍＭのＨｅｐｅｓバッファ中（実線）；２．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ含有Ｈｅｐｅｓバッファ中（鎖線）；及び２．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡと４×１０−５重量分率のＳＤＳとを含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓバッファ中（点線）のそれぞれの場合について示す。
【図３】事前のトリートメントをしないで皮膚の表層に塗布したピラニンの蛍光スペクトル（実線）及び強刺激性の固形セッケンで２分間洗浄した後のピラニンの蛍光スペクトル（点線）を示す。
【図４】弱刺激性の固形合成洗剤で洗浄した後（実線）及び強刺激性の固形セッケンで洗浄した後（点線）のそれぞれの場合に皮膚に局所塗布したピラニンの蛍光スペクトルを示す。
【図５】パイロット臨床試験の結果を示す。基底値の蛍光スペクトル（トリートメントなし）とセッケンによる洗浄後のスペクトルとの差が、最大蛍光強度と４６０ｎｍの強度との比の差によって表されている。棒グラフの各々は被験者の人数を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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2004530876.tif 000028
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【手続補正書】
【提出日】平成15年3月28日(2003.3.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚成分に対する界面活性剤または界面活性化合物の混合物の結合をｉｎ  ｖｉｖｏで測定するための、
（ａ）被験者の身体に所望の寸法の所望部位を選択する段階と、
（ｂ）前記部位を、該部位に対する結合を測定すべき界面活性剤または界面活性化合物の混合物に所望の任意の方法によって接触させる段階と、
（ｃ）１つまたは複数の化学的化合物に接触させた領域に発光性または光吸収性のプローブ／マーカーを塗布する段階と、
（ｄ）皮膚上のプローブ／マーカーの発光スペクトルまたは吸光スペクトルを測定する段階と、
（ｅ）発光スペクトルまたは吸光スペクトルの形状の変化を測定し、その後異なる２つの波長における蛍光の強度または吸光度の比を計算することにより当該形状の変化を定量化することにより、接触した身体部位に対する１つまたは複数の界面活性剤の結合を発光スペクトルまたは吸光スペクトルから測定する段階とから成るｉｎ  ｖｉｖｏ測定方法。
【請求項２】
測定される皮膚成分が１つまたは複数の皮膚タンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
清浄化剤配合物の弱刺激性を測定するために、
（ａ）被験者の身体に所望の寸法の所望の皮膚部位を選択する段階と、
（ｂ）前記皮膚を界面活性組成物または清浄化組成物で洗浄する段階と、
（ｃ）界面活性組成物または清浄化組成物に接触させた領域に発光性または光吸収性のプローブ／マーカーを塗布する段階と、
（ｄ）皮膚上のプローブ／マーカーの発光スペクトルまたは吸光スペクトルを測定する段階と、
（ｅ）接触させた身体部位に対する界面活性組成物または清浄化組成物の結合を発光スペクトルまたは吸光スペクトルから測定する段階とから成る方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚、より特定的には皮膚のタンパク質に対する化学的活性物質、より特定的には界面活性剤の結合を測定するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法に関する。
【０００２】
皮膚に対する化学物質、主として界面活性剤の結合を測定するｉｎ  ｖｉｖｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏの方法は公知である。これらの方法は典型的には、問題の化学的化合物または化合物の混合物の溶液によるトリートメントの前または後に強力な吸光性または発光性のプローブ／マーカーを塗布する段階と、その後に、皮膚の吸光度または発光の強度を測定する段階とから成る。
【背景技術】
【０００３】
“Ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ｏｎ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｈｏｒｎｙ  ｌａｙｅｒｓ：  Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｎｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｋｅｒａｔｉｎ  ｌａｙｅｒｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ”，Ｇ．Ｉｍｏｋａｗａ  ａｎｄ  Ｙ．Ｍｉｓｈｉｍａ，Ｃｏｎｔａｃｔ  Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ５（６）３５７−３６６頁（１９７９）には、トリートメント後に塗布されたプローブ／マーカーの吸光度が界面活性剤の結合量の測定値であることが示唆されている。トリートメント中に界面活性剤が皮膚に結合すると、プローブ／マーカーに対する潜在的結合可能部位がブロックされることが記述されている。従って、トリートメントを行うことなくプローブ／マーカーを塗布したときに観察されるよりも皮膚に結合するプローブ／マーカーが少なくなり、その結果として色が薄くなる。しかしながら、該文献の著者らは、特定結合部位が何であるか、即ち、プローブ／マーカーが結合する皮膚の成分が何であるかに関しては明記していない。
【０００４】
“Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃｌｅａｎｓｉｎｇ  ｂａｒｓ  ｗｉｔｈ  ｓｔｒａｔｕｍ  ｃｏｒｎｅｕｍ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｓｔｕｄｙ”，Ｓ．Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅら，Ｊ．Ｓｏｃ．Ｃｏｓｍｅｔ．Ｃｈｅｍ．４６（１９９５）３０１−３２０頁では、種々の界面活性剤溶液によるトリートメントの前に、ｅｘ  ｖｉｖｏのヒト及びブタの皮膚にタンパク質結合性蛍光プローブ／マーカーを塗布する。その後に、プローブ／マーカーの蛍光スペクトルを測定し、皮膚タンパク質のトリプトファン残基の蛍光強度に対するプローブ／マーカーの蛍光強度の比を計算することによってプローブ／マーカーが界面活性剤で置換された割合を算出する。
【０００５】
しかしながら、プローブ／マーカーの蛍光スペクトル自体についてはスペクトルの形状変化は全く観察されていない。即ち、本発明の方法は開示されていない。
【０００６】
“Ｐｙｒａｎｉｎｅ，ａ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｄｙｅ，ｄｅｔｅｃｔｓ  ｓｕｂｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｊｕｒｙ  ｔｏ  ｓｏｄｉｕｍ  ｌａｕｒｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ”，Ａ．Ｐａｇｎｏｎｉら，Ｊ．Ｃｏｓｍｅｔ．Ｓｃｉ．４９（１９９８）３３−３８頁では、トリートメント後に蛍光プローブ／マーカーとして８−ヒドロキシル−１，３，６−ピレン−トリスルホン酸（ピラニン）をｉｎ  ｖｉｖｏ塗布する。アニオン性界面活性剤であるラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）に皮膚を２４時間接触させると、事前のトリートメントを全く行うことなくプローブを塗布したときよりもはるかに強力な蛍光が観察される。
【０００７】
上の文節に引用した文献は以下のような立論を展開している。皮膚にＳＬＳが結合すれば蛍光が減少する筈である。蛍光が減少ではなく増加したという事実は、２４時間のトリートメントが皮膚の障壁機能を低下させ、従って蛍光プローブ／マーカーに対してより大きい結合部位が接触することを示唆する。この理論は、経皮的に失われる水量の測定値によって支持される。
【０００８】
“Ｃｉｅｎｃｉａ  Ｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ”，Ｄｅｌ  Ｐｏｚｏら（１１（３）（２００１）１４０−１４４頁）は、まず問題の界面活性剤を皮膚に塗布し、それからピラニンでトリートメントし、３６５ｎｍで照射した蛍光を視覚化・測定することにより、界面活性剤の弱刺激性／強刺激性を測定するためのｉｎ−ｖｉｖｏ方法を開示する。
【０００９】
“Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｓｏｃ．  Ｃｏｓｍｅｔ．  Ｃｈｅｍ．”，Ｓａｕｅｒｍａｎｎら（３７（５），（１９８６）３０９−３２７頁）は、界面活性剤又は固形セッケンを塗布した後にカチオン性色素の吸収を測定することによりセッケンの刺激を評価するためのｉｎ−ｖｉｖｏ方法を開示する。
【００１０】
“Ｊｏｕｒａｎａｌ  ｏｆ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ”，Ｐａｇｏｎｉら（１０８（４），（１９９７），６７４頁）は、洗剤による皮膚の損傷を評価するためにピラニンを蛍光色素としてｉｎ−ｖｉｖｏで使用することを開示する。皮膚の損傷は、特定の蛍光写真をとることで視覚化される。
【００１１】
本発明は、皮膚、より特定的には皮膚のタンパク質に対する化学的化合物、特定的には界面活性剤、より特定的には清浄化剤に含まれている界面活性剤の結合を測定するｉｎ  ｖｉｖｏ方法に関する。
【００１２】
本発明はｉｎ  ｖｉｖｏ測定値を得るための１つの特定実施態様を開示している。
【００１３】
本発明の１つの実施態様では、清浄化製品の塗布後に皮膚に結合する界面活性剤の量が、被験者の身体上に所望の場所を選択する段階と、問題の製品で皮膚を洗浄する段階と、所望量の蛍光プローブ／マーカー（例えば、ピラニン）を塗布する段階と、例えば光ファイバ性プローブ／マーカーを使用することによって蛍光性または吸光性のプローブを塗布した領域の蛍光スペクトルを測定する段階と、異なる２つの波長における皮膚のプローブ／マーカーの蛍光強度または吸光度の比を計算する段階とから成る方法によって測定される。
【００１４】
より特定的には本発明は、皮膚、より特定的には皮膚のタンパク質に対する化学物質、より特定的には界面活性剤の結合親和性を測定するｉｎ  ｖｉｖｏ方法に関する。界面活性剤は純粋な界面活性剤でもよく、または清浄化剤配合物に含まれている界面活性剤でもよい。方法は以下の段階から成る：
１．被験者の身体上に典型的には５．０８ｃｍ×１０．１６ｃｍ（２″×４″）の大きさであるがもっと小さくてもまたはもっと大きくてもよい所望の部位を選択する段階；
２．該身体部位を問題の化学物質または配合物に接触させる段階。化学物質の接触は所望の任意の方法で行うことができる。界面活性剤または清浄化剤配合物の場合、接触は典型的には界面活性剤または清浄化剤配合物で皮膚を洗浄することから成る；
３．化学的配合物に接触させた部位の内部の１つの領域にプローブ／マーカーを塗布する段階。該領域は典型的には１．２７ｃｍ（０．５″）直径の円形領域であるが、段階２でトリートメントを行った部位に完全に重なるならばどのような形状でも寸法でもよい；
４．プローブ／マーカーを塗布した皮膚の領域の発光スペクトルまたは吸光スペクトルを測定する段階；
５．異なる２つの波長における蛍光の強度または吸光度の比を計算することによって、または、プローブ／マーカーのスペクトル中の振幅以外の変化を測定することによって、皮膚の特定成分、例えば皮膚タンパク質に対する化学的化合物の結合親和性を判定する段階。
【００１５】
次に、添付図面に基づいて本発明を非限定的に説明する。
【００１６】
本発明は、化学物質、より特定的には界面活性剤、よりいっそう特定的には清浄化剤配合物から塗布された界面活性剤が皮膚の特定成分、例えばタンパク質または脂質に結合する能力をｉｎ  ｖｉｖｏで測定する方法に関する。方法はｅｘ  ｖｉｖｏでも使用できる。この方法は、清浄化剤配合物の弱刺激性を判断するための迅速で容易なアッセイとして使用できる。
【００１７】
より特定的には本発明は、皮膚のタンパク質に結合する化学物質の能力をｉｎ  ｖｉｖｏで測定するための、以下の段階から成る方法を提供する：
１．被験者の身体上に典型的には２″×２″の所望部位を選択する段階；
２．界面活性剤または清浄化剤配合物の場合には典型的には該部位を洗浄することによって問題の化学的化合物を所望の時間だけ該部位に接触させる段階；
３．皮膚内部の微小環境次第で異なる発光スペクトルまたは吸光スペクトルを示す発光性または吸光性のプローブ／マーカー、例えばピラニンまたはその他のプローブ／マーカーを典型的にはエタノールまたは水に溶解させ、典型的には直径約１．２６ｃｍ（０．５″）の円形領域に塗布する段階；
４．例えば光ファイバ性プローブ／マーカーを使用して皮膚のプローブ／マーカーを塗布した領域の発光スペクトルまたは吸光スペクトルを測定する段階；
５．異なる２つの波長における蛍光強度または吸光度の比を計算するか、または、プローブ／マーカーのスペクトル中の振幅以外の何らかの変化を測定することによって、皮膚の特定成分、例えば皮膚タンパク質に対する化学的化合物の結合親和性を判定する段階。
【００１８】
処理段階の各々については以下の記載及び実施例でより詳細に説明する。
【００１９】
上述のように、皮膚の特定成分に対する化学的化合物の結合親和性をｉｎ  ｖｉｖｏ測定する本発明方法の第一段階では、被験者の測定に適した所望の場所を選択する。
【００２０】
方法は、結合を測定すべき化学的化合物でトリートメントを行うことができる身体の任意の部位に使用し得る。選択される部位の寸法の制約となるのは、化学的化合物に対する接触方法だけである。例えば、問題の化合物が界面活性剤であり、該界面活性剤による身体部位の洗浄によって使用されるとき、ほぼ１．２６ｃｍ×１．２６ｃｍ（０．５″×０．５″）よりも小さい寸法の領域を選択することは実際にはできない。しかしながら、接触方法次第では、はるかに小さい寸法の身体部位も選択できる。
【００２１】
選択すべき身体部位の寸法に上限はない。例えば、皮膚に対する清浄化剤配合物の結合を測定することが望まれる場合、被験者の全身を洗浄し、その後に身体の種々の部位で結合を測定できる（第二段階参照）。
【００２２】
本発明の第二段階では、第一段階で選択した身体部位を、その結合を測定すべき化学的化合物または化合物の混合物に接触させる。
【００２３】
化学的化合物を皮膚に接触させる方法または接触の持続時間に関しては、ｉｎ  ｖｉｖｏで適切に使用できるという以外の制約は全くない。方法をｅｘ  ｖｉｖｏで行う場合には、接触の方法または持続時間には全く制約がない。典型的な接触方法は、問題の化合物または化合物の混合物に皮膚を浸漬させ、化合物を皮膚に擦り込み、特に界面活性剤または清浄化剤配合物の場合には皮膚を洗浄する。
【００２４】
本発明の第三段階では、蛍光性または光吸収性のプローブ／マーカーを第二段階で（１つまたは複数の）化学的化合物に接触させた領域に塗布する。
【００２５】
塗布されるプローブ／マーカーは、皮膚内部の微小環境に従属して発光スペクトルまたは吸光スペクトルに振幅以外の差を示すいかなるプローブ／マーカーでもよい。ピラニンは、プロトン化状態及び脱プロトン化状態の双方で蛍光を発生し得る蛍光性プローブ／マーカーである。各状態でそれぞれ異なる波長に蛍光が生じる。プロトン化状態から発生する蛍光は４３０ｎｍ−４６０ｎｍにピークを有しているが、脱プロトン化状態から発生する蛍光は５１０ｎｍにピークを有している。２つの異なる状態から発生する蛍光の強度の比は分子の微小環境に大きく左右される。
【００２６】
例えば、ピラニンの蛍光スペクトルは、実施例１に示すようにピラニンがタンパク質に結合したときに劇的に変化する。このため、ピラニンは実施例３に示すように皮膚タンパク質に対する化学的化合物の結合を測定する好ましいプローブ／マーカーとなる。タンパク質以外の皮膚の成分に対する化学物質の結合を測定するためには別のプローブ／マーカーを使用し得る。例えば、脂質環境に存在するときに発光スペクトルまたは吸光スペクトルの変化を示すプローブ／マーカーは、皮膚の脂質に対する化学物質の結合を測定するために適当であろう。プローブ／マーカーの好ましい微小環境を判断するためにはｉｎ  ｖｉｔｒｏの発光スペクトルまたは吸光スペクトルを測定すればよい（実施例２参照）。
【００２７】
プローブ／マーカーを皮膚に塗布する方法または塗布の持続時間には、ｉｎ  ｖｉｖｏで適切に使用できるという以外の制約は全くない。方法をｅｘ  ｖｉｖｏで行う場合には、接触の方法または持続時間には全く制約がない。典型的には、プローブを溶液、例えばアルコールまたは水に溶解した溶液から、約１．２６ｃｍ（０．５″）直径の円形領域に局所塗布する。プローブ／マーカーを塗布する領域の寸法については、第二段階で化学的化合物に接触させた領域の内部に存在するという以外の制約は全くない。幾つかの場合には、第二段階で比較的大きい領域に接触させるのが望ましい。このような接触は、例えば、前腕全部を洗浄し次いでその後に化学的化合物に接触させた大きい領域の内部の幾つかの小さい領域にプローブ／マーカーを塗布することによって行う。
【００２８】
本発明の第四段階では、皮膚上のプローブ／マーカーの発光スペクトルまたは吸光スペクトルを得る。典型的にはこれらのスペクトルは蛍光計（蛍光性プローブ／マーカーの場合）または分光光度計（吸光性プローブ／マーカーの場合）によって測定される。測定値を採取する皮膚の面積が第三段階でプローブ／マーカーを塗布した皮膚の面積に等しいかまたは小さいことが重要である。これは典型的には、励起光を皮膚に照射し生じた蛍光を収集する光ファイバ性プローブ／マーカーを使用することによって（蛍光性プローブ／マーカーの場合）、または、入射光を作用させ反射光を収集することによって（吸光性プローブ／マーカーの場合）達成できる。
【００２９】
本発明の第五段階では、第二段階で使用された化学的化合物または化合物の混合物の結合を測定するために第四段階で測定されるスペクトルを分析する。この分析は、例えば、スペクトル中の２つの異なる波長の蛍光強度または吸光度の比を測定することによって、または、最大の蛍光強度または吸光度の波長を測定することによって行うことができる。
【００３０】
処理実施例及び比較実施例を除いて、または、別の明白な指示がある場合を除いて、本明細書中で材料の量もしくは比、反応条件、材料の物理的特性及び／または使用に関するすべての数値は“約”という用語で修飾されていると理解されたい。
【００３１】
明細書中に使用された“から成る”という用語が、記述された特徴、整数、段階、成分の存在を含意するが、１つまたは複数の特徴、整数、段階、成分またはその集まりの存在または追加を排除しないことは理解されよう。
【００３２】
以下の実施例の目的は本発明をより詳細に説明することであり、本発明を制限することではない。
【００３３】
異なる指示がない限り、すべてのパーセンテージは重量パーセンテージを意味する。
【００３４】
処理手順
装置
溶液中及び皮膚上のピラニンの蛍光スペクトルをＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ５０Ｂ蛍光計を使用して測定した。皮膚上で測定したスペクトルの場合、光ファイバ性プローブアクセサリーを使用した。
【００３５】
実験手順
Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ実験：
スペクトルはいずれも５０ｍＭのＨｅｐｅｓバッファ中に１．０×１０−８Ｍのピラニン濃度（ｐＨ６．７の水性バッファ溶液）で測定した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）濃度は２．５ｍｇ／ｍｌとした。界面活性剤は重量分率４×１０−５で添加した。
【００３６】
Ｉｎ  Ｖｉｖｏ実験：
前腕内側の約４″×２″の寸法の領域をＤｏｖｅ（Ｒ）またはＩｖｏｒｙ（Ｒ）の固形セッケンで２分間洗浄した。次に皮膚を水道水で１０秒間すすぎ、タオルで叩いて乾かした。洗浄した領域の中央で１．２６ｃｍ（０．５″）直径の円形領域に、エタノール中の１０，０００ｐｐｍのピラニン溶液１００μｌを塗布した。円形領域の中心に光ファイバ性プローブ／マーカーを配置し、蛍光スペクトルを測定した。
【実施例１】
【００３７】
ピラニン蛍光スペクトルの微小環境依存性
図１は水性バッファ中に溶解したとき、タンパク質（ＢＳＡ）を加えた同じ水性バッファ中に溶解したとき、及び、ｉｎ  ｖｉｖｏのヒトの皮膚上に配置されたときの３つの異なる環境中のピラニンの蛍光スペクトルを示す。
【００３８】
水性バッファ中のスペクトルは約５１０ｎｍに集中した強いバンドを示す。このバンドは前述したような脱プロトン化状態に対応する。更に、プロトン化状態から生じた小さいバンドが約４２５ｎｍに観察できる。ＢＳＡを添加すると、スペクトル中に同じバンドが観察されるが相対強度が大きく違っている。２つのバンドの相対強度の変化はピラニンがタンパク質に結合した結果として生じる。
【００３９】
この異なる微小環境では、ピラニンの脱プロトン化形態に起因する蛍光は基底溶液（ｆｒｅｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中よりも発生し難い。皮膚上のピラニンの蛍光スペクトルもまた明らかに多重バンドを示す。プロトン化状態に起因する蛍光は基底溶液のスペクトルに比べて赤にシフトしており、明らかにより強い。脱プロトン化状態に起因する蛍光は基底溶液のスペクトルに比べて有意にシフトしなかったと考えられる。プロトン化状態に起因する蛍光の相対強度が高くなったことは、局所塗布されたピラニンが皮膚タンパク質に結合したことを示唆する。
【実施例２】
【００４０】
タンパク質溶液中のピラニンのスペクトルに対する界面活性剤の影響
タンパク質に対する界面活性剤の結合をモニターするためのピラニン蛍光の使用適性を試験するために、出願人らは、ピラニン及びＢＳＡの水溶液の蛍光スペクトルに対する界面活性剤添加の効果を試験した。図２は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の添加が脱プロトン化状態に起因する蛍光の相対強度をどの程度有意に増加させたかを示す。この効果は、ＢＳＡに結合したピラニン分子がＳＤＳ分子によって置換されると基底溶液中のピラニン濃度が増加し従って脱プロトン化状態に起因する蛍光の強度が相対的に増加するのであると説明できる。脱プロトン化部位の蛍光強度とプロトン化部位の蛍光強度との比がＢＳＡ結合部位からピラニンを排除する界面活性剤の能力を表す。以下の表１は、幾つかの界面活性剤について等しい重量分率でピラニン／ＢＳＡ溶液に添加したときに得られた上記の比を示す。
【００４１】
表１によれば、皮膚に強刺激性であることがよく知られたＳＤＳのような界面活性剤は、アルキルポリグリコシド（ＡＰＧ）のような公知の弱刺激性の界面活性剤よりも高い比を有していることが明らかであり、これは、界面活性剤の強刺激性／弱刺激性の少なくとも一部がタンパク質結合部位に対する界面活性剤の親和性によって決定されることを示唆する。
【００４２】
【表１】
2004530876.tif 000030
【実施例３】
【００４３】
皮膚上のピラニンの蛍光スペクトルに対するセッケン洗浄の影響
図３は皮膚上のピラニンの２つの蛍光スペクトルを示す。１つは事前のトリートメントを全く行うことなくピラニンを塗布した場合であり、１つは強刺激性固形セッケンで腕を２分間洗浄後にピラニンを塗布した場合である。セッケントリートメントによって蛍光スペクトルは有意に変化し、最も顕著な変化は約４５０ｎｍのバンドの強度低下である。プロトン化状態に起因する蛍光の強度低下の最も有力な原因は、固形セッケン中の界面活性剤が皮膚のタンパク質結合部位に結合したことであると考えられる。
【００４４】
セッケン洗浄後にピラニンを塗布するとき、潜在的な結合可能部位のある程度が界面活性剤分子によって既に占拠され、従ってプローブ分子の一部が実質的な結合をしないのでプロトン化状態に起因する蛍光が減少する。図４に示すように弱刺激性の固形合成洗剤を使用するときはこの効果が有意に減少する。図４では強刺激性の固形セッケンで洗浄後及び弱刺激性の固形合成洗剤で洗浄後の双方のスペクトルを示す。
【００４５】
皮膚上のピラニンの蛍光スペクトルに対するセッケン洗浄の影響は、ピーク高さの蛍光強度と４６０ｎｍの強度との比を測定し、次いで固形セッケンによる洗浄前及び洗浄後のこの比の差を計算することによって定量できる。図５は、パイロット臨床試験の結果を示しており、この結果は強刺激性固形セッケンの場合に全体的な影響が大きいことを示す。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】ピラニンの蛍光スペクトルを、５０ｍＭのＨｅｐｅｓバッファ中、該バッファが２．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有するとき（鎖線）；及び、ヒト皮膚の表層に塗布したとき（点線）のそれぞれの場合について示す。
【図２】ピラニンの蛍光スペクトルを、５０ｍＭのＨｅｐｅｓバッファ中（実線）；２．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ含有Ｈｅｐｅｓバッファ中（鎖線）；及び２．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡと４×１０−５重量分率のＳＤＳとを含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓバッファ中（点線）のそれぞれの場合について示す。
【図３】事前のトリートメントをしないで皮膚の表層に塗布したピラニンの蛍光スペクトル（実線）及び強刺激性の固形セッケンで２分間洗浄した後のピラニンの蛍光スペクトル（点線）を示す。
【図４】弱刺激性の固形合成洗剤で洗浄した後（実線）及び強刺激性の固形セッケンで洗浄した後（点線）のそれぞれの場合に皮膚に局所塗布したピラニンの蛍光スペクトルを示す。
【図５】パイロット臨床試験の結果を示す。基底値の蛍光スペクトル（トリートメントなし）とセッケンによる洗浄後のスペクトルとの差が、最大蛍光強度と４６０ｎｍの強度との比の差によって表されている。棒グラフの各々は被験者の人数を表す。




【国際調査報告】
2004530876.tif 000031
2004530876.tif 000032
2004530876.tif 000033
2004530876.tif 000034