(57)【要約】      （修正有）【課題】光学活性カルボン酸エステルを効率的に得るための、加水分解酵素を用いた新規な方法の提供。【解決手段】ゲオバチラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌に由来し、特定な配列で示されるアミノ酸配列を有し、分子量約５５，０００であるカルボキシルエステラーゼ、または特定な配列で示されるアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するカルボキシルエステラーゼにより、ラセミ体のカルボン酸エステルを光学分割し、光学活性カルボン酸エステルを得る。【選択図】図１
2007167021.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲオバチラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌に由来し配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し分子量約５５，０００であるカルボキシルエステラーゼ、または、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するカルボキシルエステラーゼにより、ラセミ体のカルボン酸エステルを光学分割することを特徴とする、光学活性カルボン酸エステルの製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、カルボキシルエステラーゼが遺伝子組換え微生物から得られたものであることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法において、カルボキシルエステラーゼが、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１００以下のアミノ酸残基が欠失したもの、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＣ末端から８０以下のアミノ酸残基が欠失したもの、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から３０以下のアミノ酸残基が欠失したものに連続する６つのヒスチジン残基を含む人工的な３０以下のアミノ酸残基がＮ末端に付加したもの、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＣ末端から３０以下のアミノ酸残基が欠失したものに連続する６つのヒスチジン残基を含む人工的な３０以下のアミノ酸残基がＣ末端に付加したもの、またはこれらの組合せであることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１〜３いずれかに記載の方法において、カルボキシルエステラーゼが、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端から１０７番目のグリシン残基がアラニン残基またはプロリン残基に置換されたものであることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１〜４いずれかに記載の方法において、カルボキシルエステラーゼが、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端から４０８番目のシステイン残基がアスパラギン酸残基に置換されたものであることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１〜５いずれかに記載の方法において、カルボキシルエステラーゼが、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端から４９４番目のアラニン残基のＣ末端側に配列番号２のアミノ酸配列が連結したものであることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項２〜６いずれかに記載の方法において、遺伝子組換え微生物が、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属細菌、バチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属細菌、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属糸状菌、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属酵母、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母、およびシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母よりなる群から選ばれるものであることを特徴とする方法。
【請求項８】
・ゲオバチラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌に由来し、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、分子量約５５，０００であるカルボキシルエステラーゼ、または
・配列番号１で示されるアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するカルボキシルエステラーゼを産生しうる遺伝子組換え微生物。
【請求項９】
請求項１から７のいずれかに記載の方法により製造されたことを特徴とする、光学活性カルボン酸エステル。
【請求項１０】
請求項９に記載の光学活性カルボン酸エステルにおいて、（Ｓ）体に富む光学活性な３−ブロモ−２−メチルプロピオン酸メチル。
【請求項１１】
請求項９に記載の光学活性カルボン酸エステルにおいて、（Ｒ）体に富む光学活性な２−クロロプロピオン酸メチル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルボキシルエステラーゼを用いてラセミ体のカルボン酸エステルを光学分割することにより、効率よく光学活性カルボン酸エステルを得る方法を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
光学活性なカルボン酸エステルは広くキラルビルディングユニットとして重要な化合物であり、各種医農薬の原料として非常に広い用途がある。これらを製造するには、光学活性な化合物から誘導する、ジアステレオマーに誘導して分別する、別の光学活性な化合物と複合体を形成させて分別する、キラル認識するリガンドを結合させたクロマトグラフィー担体を用いる、などの様々な方法がある。この中でも触媒を用いて片方のエナンチオマーを選択的に加水分解することによって、もう一方のエナンチオマーを得る方法は速度論的光学分割と呼ばれ、リパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）などの加水分解酵素は工業的な速度論的光学分割プロセスにおいて多く使用されている（例えば特許文献１）。速度論的光学分割においては高いエナンチオ選択性を有する酵素を選択することが必要であるが、高いエナンチオ選択性を有する酵素を用いる場合においても、５０％を超える転換率で反応させることによって高い光学純度のカルボン酸エステルを得ることが一般的に行われている。
【０００３】
カルボキシルエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．１）はリパーゼに類縁の加水分解酵素であり、リパーゼと同様の目的で使用されることがあるが、速度論的光学分割に十分な高いエナンチオ選択性を有することが少なく、また一般に有機溶媒に対する耐性がリパーゼほど高くないため、その利用は限定されている。リパーゼはトリアシルグリセロールを加水分解する酵素として定義されているが、カルボキシルエステラーゼの中にはトリアシルグルセロールの加水分解活性を有するものもあり、両者の違いは厳密なものではない。ただしカルボキシルエステラーゼはＣ１２以上の長鎖アシル基を有するトリアシルグリセロールに対してはほとんど活性を示さないことから、例えばトリオレインに対する活性を調べることによりリパーゼとカルボキシルエステラーゼを区別することもある（例えば非特許文献１）。
【０００４】
エナンチオ選択性の高いカルボキシルエステラーゼとしては例えばＰｓｅｕｄｏｍｏａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＳＩＫ  ＷＩ由来酵素があり、この酵素の３−ブロモ−２−メチルプロピオン酸メチルに対するＥ値は１２である（例えば非特許文献２）。さらにこの酵素にアミノ酸置換を導入することによりＥ値は６１にまで上昇することが報告されている（例えば非特許文献３）。しかしながらこの酵素は２−クロロプロピオン酸メチルに対するエナンチオ選択性は低い（Ｅ＝２．２、例えば非特許文献４）。また同酵素は３−ブロモ−２−メチルプロピオン酸メチルについては（Ｓ）体選択的、２−クロロプロピオン酸メチルについては（Ｒ）体選択的に作用し、それぞれ逆のエナンチオマーに対する高い選択性を有するカルボキシルエステラーゼは知られていなかった。
【０００５】
実用的な酵素を選択する上では有機溶媒や高い濃度の基質に対する耐性も重要な因子であり、この観点から耐熱性の酵素や好熱性菌由来の酵素が選ばれることがしばしばある。また常温菌由来の酵素に様々なアミノ酸置換を導入して耐熱性や有機溶媒耐性を上げることも試みられている（例えば非特許文献５）。しかしながら耐熱性のカルボキシルエステラーゼを用いてカルボン酸エステルに対するエナンチオ選択性を調べた報告は数少なく（例えば非特許文献６）、また中度好熱菌であるＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来のカルボキシルエステラーゼ（例えば非特許文献７）は光学活性カルボン酸エステルを得る目的では使用されていない。
【０００６】
【特許文献１】特開平５−２８４９８６号公報
【非特許文献１】Ｒｕｉｚ，Ｃ．ら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００２、２１７巻、（２６３−２６７頁）
【非特許文献２】Ｈｏｒｓｍａｎ，Ｇ．Ｐ．ら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｎａｌ、２００３、９巻、（１９３３−１９３９頁）
【非特許文献３】Ｐａｒｋ，Ｓ．ら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００５、１２巻、（４５−５４頁）
【非特許文献４】Ｍａｎ  Ｆｅｉ  Ｌｉｕ，Ａ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ、２００１、１２巻、（５４５−５５６頁）
【非特許文献５】Ｓｐｉｌｌｅｒ，Ｂ．ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ、１９９９、９６巻、（１２３０５−１２３１０頁）
【非特許文献６】Ｓｏｍｅｒｓ，Ｎ．Ａ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ、２００４、１５巻、（２９９１−３００４頁）
【非特許文献７】Ｗｏｏｄ，Ａ．Ｎ．Ｐ．ら、Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９５、１７巻、（８１６−８２５頁）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、光学活性カルボン酸エステルを効率的に得るための、加水分解酵素を用いた新規な方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の中度好熱性細菌であるゲオバチラス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＳＭ２２株に由来する分子量約５５，０００の耐熱性カルボキシルエステラーゼを暗号化する遺伝子（Ｅｗｉｓ，Ｈ．Ｅ．ら、Ｇｅｎｅ、２００４、３２９巻、（１８７−１９５頁））を導入した大腸菌およびそれに由来する細胞内容物がエナンチオ選択的なカルボン酸エステル加水分解活性を持つことを見出し、またこのキラル認識がＰｓｅｕｄｏｍｏａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＳＩＫ  ＷＩ由来酵素とは逆であるために、（Ｓ）体に富む３−ブロモ−２−メチルプロピオン酸メチルおよび（Ｒ）体に富む２−クロロプロピオン酸メチルを得る目的で好適に使用できることを見出し本発明に至った。
【０００９】
すなわち本発明は、
・ゲオバチラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌に由来し、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、分子量約５５，０００であるカルボキシルエステラーゼ（以下、Ｅｓｔ５５と表記する）、または
・配列番号１で示されるアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するカルボキシルエステラーゼ
により、ラセミ体のカルボン酸エステルを光学分割することを特徴とする、光学活性カルボン酸エステルの製造方法である。
【００１０】
また本発明は、Ｅｓｔ５５またはそのアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するカルボキシルエステラーゼを産生しうる遺伝子組換え微生物である。
【００１１】
さらに本発明は、上述の方法により製造されたことを特徴とする、光学活性カルボン酸エステルである。以下に本発明をさらに詳細に説明する。
【００１２】
本発明では、Ｅｓｔ５５またはそのアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するＥｓｔ５５の誘導体により、ラセミ体のカルボン酸エステルの光学分割を行うが、その反応条件については基質の非酵素的な分解が生じない範囲である限り特に制限はなく、Ｅｓｔ５５またはその誘導体の特性上、比較的広い温度範囲とｐＨ範囲を選択することができる。具体的には温度範囲として５℃から６５℃、ｐＨ範囲として４から９がより好適に選択される。
【００１３】
反応媒体としては酵素活性を著しく低下させるものでなければ特に制限はないが、基質の溶解度あるいは分散性を向上させるために有機溶媒を緩衝液に添加することが有用であることが多い。例えばＤＭＳＯを１０から２０％濃度含有させることにより好適な結果が得られる。また有機溶媒によっては酵素の基質特異性やキラル選択性に影響を与えることがあるので、適切な有機溶媒を選択することが重要である。
【００１４】
Ｅｓｔ５５またはその誘導体の利用形態には特に制限はないが、ゲオバチラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌には基本特性の異なる複数の耐熱性カルボキシルエステラーゼが共存している（Ｅｗｉｓ，Ｈ．Ｅ．ら、Ｇｅｎｅ、２００４、３２９巻、（１８７−１９５頁））ことから、Ｅｓｔ５５またはその誘導体を暗号化する遺伝子を組み込んで、その活性を増強させた微生物から得られたものを用いることがより好ましい。Ｅｓｔ５５またはその誘導体としては上記組換え微生物の菌培養物、培養上清、濃縮菌体、乾燥菌体、菌破砕物、菌破砕物に由来する活性画分、精製酵素など、目的に合致するものであればいずれを用いても良い。
【００１５】
本発明で用いられるＥｓｔ５５の誘導体としては例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１００以下のアミノ酸残基が欠失したもの、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＣ末端から８０以下のアミノ酸残基が欠失したもの、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から３０以下のアミノ酸残基が欠失したものに連続する６つのヒスチジン残基を含む人工的な３０以下のアミノ酸残基がＮ末端に付加したもの、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＣ末端から３０以下のアミノ酸残基が欠失したものに連続する６つのヒスチジン残基を含む人工的な３０以下のアミノ酸残基がＣ末端に付加したもの、またはこれらの組合せによるものなどが包含される。これらはいずれもＥｓｔ５５の持つ基本的な特性を保持していると期待されるものである。このような誘導体は反応速度、基質特異性、エナンチオ選択性、至適ｐＨ、至適温度、耐熱性、溶媒耐性などにおいて野生型酵素とは幾分異なる性質を示すことが予想される。また６つの連続するヒスチジン残基は亜鉛やニッケルなどの金属と配位結合を形成して、群特異的なアフィニティー・クロマトグラフィーを用いた簡便な精製を可能にする。
【００１６】
具体的には、Ｅｓｔ５５の誘導体として、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端から１０７番目のグリシン残基がアラニン残基またはプロリン残基に置換されたもの、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端から４０８番目のシステイン残基がアスパラギン酸残基に置換されたもの、または配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端から４９４番目のアラニン残基のＣ末端側に配列番号２のアミノ酸配列が連結したもの等が例示される。
【００１７】
本発明において、遺伝子組換え微生物を用いる場合、その微生物宿主には特に制限はないが、培養が容易であり、高密度に生育し、遺伝子操作における宿主−ベクター系が整備されているものがより好ましい。そのようなものとして例えばエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属細菌、バチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属細菌、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属糸状菌、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属酵母、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母、およびシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母等を挙げることができる。これらの中でも特に扱いの簡便さからエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌が好ましい。
【００１８】
本発明により、各種の光学活性エステルが得られるが、例えば（Ｓ）体の３−ブロモ−２−メチルプロピオン酸メチルはこれ自体、またこれより誘導される（Ｓ）体の３−ブロモ−２−メチル−１−プロパノールは有用なキラルビルディングブロックである。一方、（Ｒ）体の２−クロロプロピオン酸メチルはアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ阻害作用を有する除草剤の合成原料として使用される。
【発明の効果】
【００１９】
各種の光学活性エステル、特に（Ｓ）体に富む３−ブロモ−２−メチルプロピオン酸メチルおよび（Ｒ）体に富む２−クロロプロピオン酸メチルを効率よく得ることができる。
【実施例】
【００２０】
以下に、発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２１】
実施例１
ゲオバチラス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＳＭ２２株から常法に従ってＤＮＡを抽出し、これを鋳型にして配列番号３で示されるプライマーＥｓｔ５５Ｆ１と配列番号４で示されるプライマーＥｓｔ５５Ｒ１の組み合わせによるポリメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲという）を行った。その結果１．６ｋｂｐの特異的な増幅産物が得られた。これを制限酵素ＳａｃＩとＸｂａＩで処理し、同じくＳａｃＩとＸｂａＩで処理して開環させたプラスミドベクターｐＴｒｃ９９Ａ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅ社製）とＤＮＡリガーゼを用いて連結させた。これを大腸菌ＪＭ１０９に導入することによって組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥｓｔ５５．１を得た。この組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥｓｔ５５．１から抽出・精製することにより、図１に記載のプラスミドｐＥｓｔ５５．１を得た。
【００２２】
実施例２
Ｅｓｔ５５の誘導体を作製するための中間材料であるプラスミドｐＥｓｔ１を以下の手順で作製した。
【００２３】
まず実施例１で得た組換えプラスミドｐＥｓｔ５５．１を制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで処理し、４．４ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により精製した。次にｐＥｓｔ５５．１を鋳型にして配列番号５で示されるプライマーＴｒｃ９９Ａ２３８Ｆと配列番号６で示されるプライマーＥｓｔ５５Ｒ０１の組み合わせによるＰＣＲを行った。その結果０．５ｋｂｐの特異的な増幅産物が得られた。これを制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで処理し、上記４．４ｋｂのＤＮＡとＤＮＡリガーゼを用いて連結させた。これを大腸菌ＪＭ１０９に導入することによって組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥｓｔ１を得た。この組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥｓｔ１から抽出・精製することにより、プラスミドｐＥｓｔ１を得た。
【００２４】
実施例３
Ｅｓｔ５５のＮ末端から４０８番目に位置するシステイン残基をアスパラギン酸残基に置換した配列を有するｐＥｓｔ０１２０を以下の手順で作製した。
【００２５】
まず実施例２で得た組換えプラスミドｐＥｓｔ１を制限酵素ＰｍａＣＩとＸｈｏＩで処理し、４．９ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により精製した。次にｐＥｓｔ５５．１を鋳型にして配列番号７で示されるプライマーＥｓｔ５５Ｆ０１と配列番号８で示されるプライマーＥｓｔ５５Ｒ２０の組み合わせによるＰＣＲを行った。その結果０．９ｋｂｐの特異的な増幅産物が得られた。これを制限酵素ＳｍａＩとＸｈｏＩで処理し、実施例２で得た４．４ｋｂのＤＮＡとＤＮＡリガーゼを用いて連結させた。これを大腸菌ＪＭ１０９に導入することによって組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥｓｔ０１２０を得た。この組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥｓｔ０１２０から抽出・精製することにより、プラスミドｐＥｓｔ０１２０を得た。
【００２６】
実施例４
Ｅｓｔ５５のＮ末端から１０７番目に位置するグリシン残基をアラニン残基に置換した配列を有するｐＥｓｔ４０００を以下の手順で作製した。
【００２７】
ｐＥｓｔ５５．１を鋳型にして配列番号９で示されるプライマーＥｓｔ５５Ｆ４０と配列番号１０で示されるプライマーＥｓｔ５５Ｒ０３の組み合わせによるＰＣＲを行った。その結果０．９ｋｂｐの特異的な増幅産物が得られた。これを制限酵素ＦｓｐＩとＸｈｏＩで処理し、実施例２で得た４．４ｋｂのＤＮＡとＤＮＡリガーゼを用いて連結させた。これを大腸菌ＪＭ１０９に導入することによって組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥｓｔ４０００を得た。この組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥｓｔ４０００から抽出・精製することにより、プラスミドｐＥｓｔ４０００を得た。
【００２８】
実施例５
Ｅｓｔ５５のＮ末端から１０７番目に位置するグリシン残基をプロリン残基に置換した配列を有するｐＥｓｔ４７００を以下の手順で作製した。
【００２９】
ｐＥｓｔ５５．１を鋳型にして配列番号１１で示されるプライマーＥｓｔ５５Ｆ４７と配列番号１０で示されるプライマーＥｓｔ５５Ｒ０３の組み合わせによるＰＣＲを行った。その結果０．９ｋｂｐの特異的な増幅産物が得られた。これを制限酵素ＳｔｕＩとＸｈｏＩで処理し、実施例２で得た４．４ｋｂのＤＮＡとＤＮＡリガーゼを用いて連結させた。これを大腸菌ＪＭ１０９に導入することによって組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥｓｔ４７００を得た。この組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥｓｔ４７００から抽出・精製することにより、プラスミドｐＥｓｔ４７００を得た。
【００３０】
実施例６
Ｅｓｔ５５のＮ末端から４９４番目のアラニン残基のＣ末端側に配列番号２のアミノ酸配列が連結されたｐＥｓｔ５５ＸＨを以下の手順で作製した。
【００３１】
まず実施例１で得た組換えプラスミドｐＥｓｔ５５．１を制限酵素ＮｃｏＩとＸｂａＩで処理し、４．４ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により精製した（ＤＮＡ−１）。次にｐＥｓｔ５５．１を鋳型にして配列番号５で示されるプライマーＴｒｃ９９Ａ２３８Ｆと配列番号１２で示されるプライマーＥｓｔ５５Ｒ０２の組み合わせによるＰＣＲを行った。その結果１．６ｋｂｐの特異的な増幅産物が得られ、これを制限酵素ＭｆｅＩとＳｐｅＩで処理した（ＤＮＡ−２）。また配列番号１３で示される化学合成オリゴヌクレオチドＸａＨ６Ｆと配列番号１４で示される化学合成オリゴヌクレオチドＸａＨ６Ｒ２を等量混合してアニーリングにより２本鎖を形成させた（ＤＮＡ−３）。これらＤＮＡ−１、ＤＮＡ−２、ＤＮＡ−３の３種類のＤＮＡ断片を混合してＤＮＡリガーゼにより連結させた。これを大腸菌ＪＭ１０９に導入することによって組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥｓｔ５５ＸＨを得た。この組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥｓｔ５５ＸＨから抽出・精製することにより、プラスミドｐＥｓｔ５５ＸＨを得た。
【００３２】
実施例７
実施例１、３、４、５で得られたプラスミドをエレクトロポレーション法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥｓｔ５５．１、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥｓｔ０１２０、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥｓｔ４０００、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥｓｔ４７００を得た。これら４種の組換え大腸菌をそれぞれ２００ｍｌの２ｘＹＴ培地（組成：１Ｌ中に１６ｇ  Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎ、１０ｇ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ  ＮａＣｌ、５ｍｌ  １Ｎ  ＮａＯＨを含む）中で３７℃、１６時間振とう培養した。この培養物を８，０００ｒｐｍ、２０分間の遠心にかけて菌体のペレットを得た。菌体ペレットは５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）の組成よりなる緩衝液（以下緩衝液Ａという）６０ｍｌに懸濁した後、８，０００ｒｐｍ、２０分間の遠心にかけて再度菌体のペレットを得た。この懸濁と遠心の操作をもう一度繰り返した後、菌体ペレットを２５ｍｌの緩衝液Ａに懸濁し、Ｋｕｂｏｔａ  Ｉｎｓｏｎａｔｏｒ  ２０１Ｍ（久保田製作所製）を用いて１５分間、３回の超音波処理を施すことにより、菌体を破砕した。
【００３３】
この破砕物を１２，０００ｒｐｍ、２０分間の遠心にかけて上清を回収し、これを６０℃の湯浴に２０分間浸した。次に回収した上清の１／１５容量の６０ｍｇ／ｍｌプロタミン硫酸を添加し、３０分間４℃で静置した。これを１２，０００ｒｐｍ、２０分間の遠心にかけて上清を回収した。
【００３４】
上記操作によって回収した上清の７／３容量の飽和硫安水溶液を添加した後、４℃で一晩静置した。これを８，０００ｒｐｍ、２０分間の遠心にかけ、沈殿物を回収し、２．５ｍｌの緩衝液Ａを用いて沈殿を溶解させた。この溶液を２Ｌの緩衝液Ａに対して透析することにより硫安を除去し、それぞれの粗酵素、即ちＥｓｔ５５、Ｅｓｔ０１２０、Ｅｓｔ４０００、Ｅｓｔ４７００の粗酵素約５ｍｌを得た。
【００３５】
実施例８
実施例７によって得られたＥｓｔ５５（野生型（ＷＴ））とＥｓｔ０１２０の粗酵素を用いて３−ブロモ−２−メチルプロピオン酸メチル（以下ＭＢＭＰと表記する）および２−クロロプロピオン酸メチル（以下Ｍ２ＣＰと表記する）を基質とした加水分解反応を行った。
【００３６】
反応液組成は０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、２０％  ＤＭＳＯ、１％  エステル基質とし、粗酵素をＭＢＭＰに対しては０．２ｍｌ、Ｍ２ＣＰに対しては０．０１ｍｌ添加して、全量を８ｍｌに調整し２５℃で反応させた。適当な反応時間後に０．４ｍｌをサンプリングし、これを１．５ｍＭ  ｎ−オクタンを含有する０．８ｍｌの酢酸エチルで抽出し、ガスクロマトグラフィーで分析した。定量分析にはＨＰ−５カラム（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ社製）を装着したＨＰ５８９０（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ社製）を用い、４０℃から２００℃までの直線温度勾配（２０℃／分）をかけて成分を分離させた。光学純度（エナンチオ過剰率、ｅｅ）を測定するためにはＧ−ＴＡカラム（Ａｓｔｅｃ社製）を装着したＧＣ−１４（島津製作所社製）を用い、カラム温度を９０℃に保って分析した。
【００３７】
光学純度（エナンチオ過剰率、ｅｅ）とエナンチオ選択性（Ｅ）は以下の式に従って算出した。その結果表１に示すようにＥｓｔ５５（野生型（ＷＴ））あるいはＥｓｔ０１２０を用いることで光学純度９９％以上の（Ｓ）体に富むＭＢＭＰを得ることができた。一方両酵素はＭ２ＣＰに対する活性は高いもののエナンチオ選択性は相対的に低かった。
【００３８】
【数１】
2007167021.tif 000003
【００３９】
【数２】
2007167021.tif 000004
【００４０】
【数３】
2007167021.tif 000005
【００４１】
【数４】
2007167021.tif 000006
【００４２】
【表１】
2007167021.tif 000007
実施例９
実施例８に示したと同様の方法を用い、Ｅｓｔ５５（野生型（ＷＴ））、Ｅｓｔ０１２０、Ｅｓｔ４０００、Ｅｓｔ４７００の粗酵素を用いてＭ２ＣＰを基質とした加水分解反応を行った。また反応液全量を６ｍｌとし、ＷＴ、Ｅｓｔ０１２０については０．０１ｍｌ、Ｅｓｔ４０００、Ｅｓｔ４７００については０．０５ｍｌ用いて反応を行った。
【００４３】
その結果表２に示すようにＥｓｔ４０００、Ｅｓｔ４７００はＷＴ、Ｅｓｔ０１２０に比べて活性は低いもののエナンチオ選択性が高く、光学純度９７％以上の（Ｒ）体に富むＭ２ＣＰを得ることができた。
【００４４】
【表２】
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実施例１０
実施例８に示したと同様の方法を用い、Ｅｓｔ５５（野生型（ＷＴ））とＥｓｔ０１２０の粗酵素を用いてＭＢＭＰとＭ２ＣＰを基質とした加水分解反応を１０℃で行った。反応液全量は６ｍｌとし、粗酵素はＭＢＭＰに対して０．１ｍｌ、Ｍ２ＣＰに対して０．０１ｍｌ用いた。
【００４５】
その結果表３に示すようにＷＴとＥｓｔ０１２０の両者においてＭＢＭＰに対するエナンチオ選択性が２５℃での反応（表１）に比べて上昇し、一方Ｍ２ＣＰに対するエナンチオ選択性には大きな変化が見られなかった。
【００４６】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】実施例１で得られたプラスミドｐＥｓｔ５５．１の制限酵素地図である。
【図１】
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【配列表】
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