(57)【要約】本発明は、新規のＣＤ４非依存性のＨＩＶエンベロープタンパク質およびそのための用途に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ４非依存性のヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）のｅｎｖ、またはその突然変異体、誘導体もしくはフラグメントをコードする単離された核酸。
【請求項２】
前記核酸が、配列番号４のヌクレオチド配列を有する核酸と最低約９８％の相同性を共有する、請求項１記載の単離された核酸。
【請求項３】
前記核酸が、ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ  ｅｎｖおよびＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ  ８ｘ（８ｘ）ｅｎｖより成る群から選択される、請求項２記載の単離された核酸。
【請求項４】
前記核酸がＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ  ８ｘ  ｅｎｖである、請求項３記載の単離された核酸。
【請求項５】
配列番号４のヌクレオチド配列を有するＣＤ４非依存性のＨＩＶ  ｅｎｖをコードする単離された核酸。
【請求項６】
最低１個のＨＩＶ−１  ｅｎｖクローンにＣＤ４非依存性を賦与するＨＩＶ−１  ｅｎｖ遺伝子の一部分を含んで成る単離された核酸。
【請求項７】
第一部分および第二部分を含んで成り、前記第一部分はＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ  ８ｘ  ｅｎｖコーディング配列の少なくとも一部分をコードし、また、前記第二部分が８ｘ  ｅｎｖでないＨＩＶ−１  ｅｎｖのコーディング配列の少なくとも一部分をコードする、キメラ核酸。
【請求項８】
前記第二部分が、Ｓ１０  ｅｎｖ、ＨＸＢ２  ｅｎｖ、ＢａＬ  ｅｎｖおよびＩＩＩＢ  ｅｎｖより成る群から選択されるｅｎｖコーディング配列である、請求項７記載のキメラ核酸。
【請求項９】
前記第二部分が、ＣＸＣＲ４ケモカイン受容体結合部位およびＣＣＲ５ケモカイン受容体結合部位より成る群から選択されるケモカイン受容体結合部位を含んで成る、請求項７記載のキメラ核酸。
【請求項１０】
前記第二部分が、ＣＸＣＲ４ケモカイン受容体結合部位のＶ３ループおよびＣＣＲ５ケモカイン受容体結合部位のＶ３ループより成る群から選択されるＶ３ループコーディング配列を含んで成る、請求項９記載のキメラ核酸。
【請求項１１】
安定に露出されるケモカイン補助受容体結合部位を含んで成る、単離されたＨＩＶ−１  ｇｐ１２０ポリペプチド。
【請求項１２】
ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ  ８ｘ  Ｅｎｖを含んで成る単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが配列番号３と最低約９８％の相同性を共有する、請求項１２記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号３のアミノ酸配列を含んで成る、請求項１３記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１５】
キメラポリペプチドがＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ  ８ｘ  ｇｐ１２０を含んで成る第一部分を含んで成り、前記キメラポリペプチドが、ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ  ８ｘ以外にＨＩＶ−１からのｇｐ１２０を含んで成る第二部分をさらに含んで成る、ｇｐ１２０ポリペプチドを含んで成る前記キメラＨＩＶ−１  Ｅｎｖポリペプチド。
【請求項１６】
キメラＨＩＶ−１  ＥｎｖポリペプチドがＣＤ４非依存性であり、また、さらに、前記ポリペプチドが、ＣＸＣＲ４ケモカイン受容体結合部位およびＣＣＲ５ケモカイン受容体結合部位より成る群から選択されるケモカイン受容体結合部位を含んで成る、前記キメラＨＩＶ−１  Ｅｎｖポリペプチド。
【請求項１７】
前記第二部分が、ＨＸＢ  Ｖ３ループ、８ｘ  Ｖ３ループ、ＢａＬ  Ｖ３ループ、ＹＵ−２  Ｖ３ループおよび８９．６  Ｖ３ループより成る群から選択されるＶ３ループを含んで成る、請求項１６記載のキメラポリペプチド。
【請求項１８】
ＨＩＶ−１が、安定に露出されるケモカイン受容体結合部位を含まないそれ以外は同一のＨＩＶ−１より抗体中和に対しより感受性である、安定に露出されるケモカイン受容体結合部位を含んで成るｇｐ１２０ポリペプチドを含んで成るＣＤ４非依存性の前記ＨＩＶ−１のＥｎｖを含んで成る組成物。
【請求項１９】
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖタンパク質がケモカイン補助受容体結合部位を安定に露出させる最低１個の突然変異を含んで成る、ＣＤ４非依存性の前記ＨＩＶ−１  Ｅｎｖを含んで成る製薬学的組成物。
【請求項２０】
前記ＨＩＶ−１  ＥｎｖがＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ  ８ｘである、請求項２１記載の組成物。
【請求項２１】
免疫原性の用量のＣＤ４非依存性のＨＩＶ−１  Ｅｎｖを含んで成るワクチン。
【請求項２２】
前記ＨＩＶ−１  Ｅｎｖが、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖポリペプチド、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖをコードする核酸およびＨＩＶ−１  Ｅｎｖを発現する細胞より成る群から選択される、請求項２１記載のワクチン。
【請求項２３】
請求項１記載の単離された核酸を含んで成るベクター。
【請求項２４】
請求項６記載の単離された核酸を含んで成るベクター。
【請求項２５】
請求項７記載の単離された核酸を含んで成るベクター。
【請求項２６】
請求項１記載の単離された核酸を含んで成る細胞。
【請求項２７】
請求項６記載の単離された核酸を含んで成る細胞。
【請求項２８】
請求項７記載の単離された核酸を含んで成る細胞。
【請求項２９】
請求項１１記載の単離されたポリペプチドを含んで成る細胞。
【請求項３０】
請求項１２記載の単離されたポリペプチドを含んで成る細胞。
【請求項３１】
請求項１５記載の単離されたポリペプチドを含んで成る細胞。
【請求項３２】
請求項１６記載の単離されたポリペプチドを含んで成る細胞。
【請求項３３】
請求項１７記載の単離されたポリペプチドを含んで成る細胞。
【請求項３４】
請求項１８記載の組成物を含んで成る細胞。
【請求項３５】
ＣＤ４非依存性であるＥｎｖクローンから完全長のｅｎｖコーディング配列を得ること、および、前記ｅｎｖコーディング配列の少なくとも一部分をＣＤ４依存性であるＥｎｖクローンからのコーディング配列で置き換えてキメラを形成させ、ここで、前記キメラがＣＤ４依存性である場合、それは前記ｅｎｖコーディング配列の前記部分がＣＤ４非依存性に関与することの表示であり、それによりＣＤ４非依存性に関与するアミノ酸残基を同定することを含んで成る、ＣＤ４非依存性に関与するＨＩＶ−１  Ｅｎｖタンパク質のアミノ酸残基の同定方法。
【請求項３６】
哺乳動物に免疫原性の用量のＣＤ４非依存性のＨＩＶ−１  Ｅｎｖタンパク質を投与し、ここで、前記タンパク質は安定に露出されるケモカイン受容体結合部位を含んで成り、それにより前記哺乳動物におけるＨＩＶ−１ケモカイン受容体結合部位に対する免疫応答を導き出すことを含んで成る、哺乳動物におけるＨＩＶ−１ケモカイン受容体結合部位に対する免疫応答を導き出す方法。
【請求項３７】
可溶性のＣＤ４との標識されたｇｐ１２０の前インキュベーションを伴うかもしくは伴わずに、細胞を前記ｇｐ１２０と接触させるのに先立ちもしくはそれと同時発生的に、化合物と前記細胞を接触させること、前記細胞に結合された標識の量を測定すること、および前記化合物と接触された前記細胞に結合された標識の量を、前記化合物と接触されないそれ以外は同一の細胞に結合された標識の量と比較することを含んで成り、ここで、前記化合物と接触されない、前記それ以外は同一の細胞に結合された標識の量と比較した、前記化合物と接触された前記細胞に結合されたより多いもしくは少ない量の標識は、前記化合物がＨＩＶ−１  ｇｐ１２０ケモカイン受容体結合部位の露出に影響を及ぼすことの表示である、前記ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０ケモカイン受容体結合部位の露出に影響を及ぼす化合物の同定方法。
【請求項３８】
可溶性のＣＤ４との標識されたｇｐ１２０の前インキュベーションを伴うかもしくは伴わずに、細胞を前記ｇｐ１２０と接触させるのに先立ちもしくはそれと同時発生的に、小分子と前記細胞を接触させること、前記細胞に結合された標識の量を測定すること、および前記分子と接触された前記細胞に結合された標識の量を、前記分子と接触されないそれ以外は同一の細胞に結合された標識の量と比較することを含んで成り、ここで、前記分子と接触されない、前記それ以外は同一の細胞に結合された標識の量と比較した、前記分子と接触された前記細胞に結合されたより少ない量の標識は、前記分子がそのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのＨＩＶ−１  ｇｐ１２０の結合を阻害することの表示である、前記そのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのＨＩＶ−１  ｇｐ１２０の結合を阻害する小分子の同定方法。
【請求項３９】
ＣＤ４非依存性のＥｎｖクローンの超可変Ｖ３ループを別のＨＩＶ−１のＶ３ループで置き換えることを含んで成り、ここで、別のＨＩＶ−１の前記Ｖ３ループは、前記ＣＤ４非依存性のＥｎｖクローンのものと異なるケモカイン受容体結合部位を含んで成る、可変性のケモカイン受容体結合部位を含んで成るＣＤ４非依存性のキメラＨＩＶ−１  Ｅｎｖクローンの製造方法。
【請求項４０】
前記ＣＤ４非依存性クローンが、ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘおよびＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ  ８ｘより成る群から選択される、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
別のＨＩＶ−１からの前記Ｖ３ループが、ＨＩＶ−１／ＢａｌからのＶ３ループ、ＨＩＶ−１／ＹＵ−２からのＶ３ループ、ＨＩＶ−１／ＡＤＡからのＶ３ループおよびＨＩＶ−１／８９．６からのＶ３ループより成る群から選択される、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
請求項３７の方法を使用して同定された小分子とＨＩＶ−１  ｇｐ１２０を接触させ、それによりそのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのＨＩＶ−１  ｇｐ１２０の結合を阻害することを含んで成る、そのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体への前記ｇｐ１２０の結合の阻害方法。
【請求項４３】
そのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのＨＩＶ−１  ｇｐ１２０の結合を阻害する小分子と細胞を接触させ、ここで、前記小分子は請求項３８の方法を使用して同定され、それにより細胞のＨＩＶ−１感染を阻害することを含んで成る、前記細胞のＨＩＶ−１感染の阻害方法。
【請求項４４】
製薬学的に適する担体中に、ＣＤ４非依存性のＨＩＶ−１  Ｅｎｖ、およびＨＩＶ感染症を治療するのに使用される最低１種の化合物を含んで成る組成物。
【請求項４５】
前記ＨＩＶ−１  Ｅｎｖが、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖポリペプチド、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖをコードする核酸およびＨＩＶ−１  ｅｎｖを発現する細胞より成る群から選択される、請求項４４記載の組成物。
【請求項４６】
ＨＩＶ感染症を治療するのに使用される前記化合物が、プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素ヌクレオシド類似物阻害剤、逆転写酵素非ヌクレオシド類似物阻害剤、インターフェロン、ＡＺＴ、インターロイキン−２およびサイトカインより成る群から選択される、請求項４４記載の組成物。
【請求項４７】
免疫原性の用量のＣＤ４非依存性のＨＩＶ−１  ＥｎｖをＨＩＶ−１に感染したヒトに投与し、それにより前記ヒトにおけるＨＩＶ−１感染症を治療することを含んで成る、ヒトにおけるＨＩＶ−１感染症の治療方法。
【請求項４８】
前記ＨＩＶ−１  Ｅｎｖが、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖポリペプチド、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖをコードする核酸およびＨＩＶ−１  ｅｎｖを発現する細胞より成る群から選択される、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
ＨＩＶ感染症を治療するのに使用される化合物を投与することをさらに含んで成る、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
ＨＩＶ感染症を治療するのに使用される前記化合物が、プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素ヌクレオシド類似物阻害剤、逆転写酵素非ヌクレオシド類似物阻害剤、インターフェロン、ＡＺＴ、インターロイキン−２およびサイトカインより成る群から選択される、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
前記化合物が、前記ＣＤ４非依存性のＨＩＶ−１  Ｅｎｖの投与前、投与の間もしくは投与後に前記ヒトに投与される、請求項５０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
（関連出願の交差引用）
本出願は、１９９９年５月２４日に出願された米国特許出願第０９／３１７，５５６号の一部継続出願である。
【０００１】
（連邦の後援に関する声明）
本発明は、米国政府からの資金（国立保健研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）助成金第ＡＩ４４３０８号および助成金第ＡＩ４０８８０号）により部分的に援助され、そして米国政府は従って本発明においてある種の権利を有することができる。
【０００２】
（発明の背景）
本発明は、ＨＩＶのＣＤ４非依存性の変異体、それらのタンパク質およびそのための用途に関する。
【０００３】
ＨＩＶの進入は、ＣＤ４および細胞のケモカイン受容体とのウイルスエンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）の相互作用を必要とすることが既知である。ＨＩＶのＥｎｖタンパク質は前駆体（ｇｐ１６０）として産生され、これはその後２部分、すなわちＣＤ４およびケモカイン受容体を結合するｇｐ１２０、ならびにウイルス膜中に固定されそして膜融合を媒介するｇｐ４１に切断される。ＨＩＶおよびＳＩＶによるケモカイン受容体の示差的な使用は、多様な単離物の間の向性の差異を主に説明している（Ｂｅｒｇｅｒ、１９９７、ＡＩＤＳ  １１：Ｓ３−Ｓ１６；ＨｏｆｆｍａｎとＤｏｍｓ、１９９８、ＡＩＤＳ  １２：Ｓ１７−Ｓ２６）。多数のケモカイン受容体がＨＩＶもしくはＳＩＶにより利用されることができる（Ｄｅｎｇら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ  ３８８：２９６−３００；Ｃｈｏｅら，１９９６、Ｃｅｌｌ  ８５、１１３５−１１４８；Ｒｕｃｋｅｒら、１９９７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：８９９９−９００７；Ｅｄｉｎｇｅｒら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１４７４２−１４７４７；Ｌｉａｏら、１９９７、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：２０１５−２０２３；Ｆａｒｚａｎら、１９９７、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：４０５−４１１）一方、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４はＨＩＶ−１の主要な補助受容体であるようである（Ｚｈａｎｇら、１９９８、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７２：９３３７−９３４４；Ｚｈａｎｇら、１９９８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９３３７−９３４４）。感染を最初に確立するＨＩＶの単離物は、ＣＣＲ５を使用して血液のリンパ球およびマクロファージに標的を定める（Ａｌｋｈａｔｉｂら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：１９５５−１９５８；Ｄｅｎｇら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  ３８１：６６１−６６６；Ｄｒａｇｉｃら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  ３８１：６６７−６７３；Ｄｏｒａｎｚら、１９９６、Ｃｅｌｌ  ８５：１１４９−１１５８）一方、ＡＩＤＳへの進行に一般に関連しかつインビトロでＴ細胞系を感染させることができるウイルスはＣＸＣＲ４を使用する（Ｃｈｏｅら、１９９６、Ｃｅｌｌ  ８５：１１３５−１１４８；Ｆｅｎｇら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：８７２−８７６；Ｃｏｎｎｏｒら、１９９７、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：６２１−６２８）。
【０００４】
ＣＤ４へのＥｎｖの結合は、ｇｐ１２０がケモカイン受容体に結合することを可能にしそしてウイルスおよび細胞膜の融合につながる、不十分に理解されたコンホメーション変化を開始させる（Ｊｏｎｅｓら、１９９８、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７３：４０４−４０９；Ｍｏｏｒｅら、１９９４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：４６９−４８４；Ｗｙａｔｔ、１９９２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：６９９７−７００４；Ｗｕら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  ３８４：１７９−１８３）。免疫学的および突然変異誘発のアプローチは、これらの変化が、ｇｐ１２０上のＶ１／Ｖ２およびＶ３超可変ループの動きを必要とすることを示し（Ｍｏｏｒｅら、１９９４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：４６９−４８４；Ｗｙａｔｔら、１９９２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：６９９７−７００４；Ｗｕら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  ３８４：１７９−１８３）、これは、ケモカイン受容体の利用の特異性において決定的に重要な役割を演じている（Ｃｈｏｅら、１９９６、Ｃｅｌｌ  ８５：１１３５−１１４８；Ｃｏｃｃｈｉら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  ２：１２４４−１２４７；Ｃｈｏら、１９９８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２５０９−２５１５；Ｓｐｅｃｋら、１９９７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：７１３６−７１３９；Ｒｏｓｓら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：７６８２−７６８６；Ｈｏｆｆｍａｎら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：１１３６０−１１３６５）。ＣＤ４に結合されたｇｐ１２０コアの構造の最近の結晶学的解像は、ケモカイン受容体の付加的な接触部位として作用することができる、ｇｐ１２０の内側ドメインと外側ドメインとの間の介入するβシート（「架橋シート」）を示した（ＷｙａｔｔとＳｏｄｒｏｓｋｉ、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１８８４−１８８８；Ｒｉｚｚｕｔｏら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１９４９−１９５３）。
【０００５】
ＣＤ４は、一般に、ｇｐ１２０がケモカイン受容体と会合するのに必要とされるが、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびＳＩＶのＣＤ４非依存性の単離物の同定は、ケモカイン受容体との機能的相互作用がＣＤ４の相互作用の非存在下で発生する可能性があることを立証した（Ｅｄｉｎｇｅｒら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１４７４２−１４７４７；ＲｅｅｖｅｓとＳｃｈｕｌｚ、１９９６、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１４５３−１４６５；Ｅｎｄｒｅｓら、１９９６、Ｃｅｌｌ  ８７：７４５−７５６；Ｄｕｍｏｎｃｅａｕｘら、１９９８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５１２−５１９）。ＣＤ４非依存性の表現型の決定子はウイルスのｅｎｖ遺伝子に位置づけられているが、しかし、この表現型の根底にある機構は未知である。ｅｎｖ中の突然変異はｇｐ１２０上のケモカイン受容体結合部位の露出および／もしくは親和性を増大させることができ、かようにＣＤ４に対する必要性を回避することが提案されている（Ｅｎｄｒｅｓら、１９９６、Ｃｅｌｌ  ８７：７４５−７５６）。
【０００６】
生化学的アッセイは、突然変異されたもしくは脱グリコシル化された組換えｇｐ１２０がケモカイン受容体に直接結合することができることもまた示しており、通常はＣＤ４により活性化されるドメインを人工的に露出させることができることを示唆している（Ｈｅｓｓｅｌｇｅｓｓｅｒら、１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．７：１１２−１２１；Ｍａｒｔｉｎら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：１４７０−１４７３；Ｂａｎｄｒｅｓら、１９９８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２５００−２５０４；Ｍｉｓｓｅら、１９９８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：７２８０−７２８８）。ＣＤ４非依存性の原因である決定子のより大きな理解は、ケモカイン受容体とのＥｎｖの相互作用を媒介かつ調節し、そして最終的にウイルスの進入を支配するＥｎｖドメインへの洞察を提供するはずである。
【０００７】
今日まで、免疫系をのがれるＨＩＶ−１の能力は、この重要なヒトの病原体に対する効果的なワクチンの開発を妨げてきた。従って、ヒトにおけるＨＩＶ−１感染症のための有効なワクチンおよび治療様式の開発に対する、長いあいだ痛切に感じられかつ満たされていない必要性が存在する。本発明はそれらの必要性にかなう。
【０００８】
（発明の簡単な要約）
本発明は、ＣＤ４非依存性のヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）のｅｎｖ、またはその突然変異体、誘導体もしくはフラグメントをコードする単離された核酸を包含する。一局面において、単離された核酸は、配列番号４のヌクレオチド配列を有する核酸と最低約９８％の相同性を共有する。
【０００９】
別の局面おいて、核酸は、ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ  ｅｎｖおよびＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ  ８ｘ（８ｘ）ｅｎｖより成る群から選択される。
【００１０】
なお別の局面において、核酸はＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ  ８ｘ  ｅｎｖである。
【００１１】
本発明は、配列番号４のヌクレオチド配列を有するＣＤ４非依存性のＨＩＶ  ｅｎｖをコードする単離された核酸もまた包含する。
【００１２】
本発明は、最低１個のＨＩＶ−１  ｅｎｖクローンにＣＤ４非依存性を賦与するＨＩＶ−１  ｅｎｖ遺伝子の一部分を含んで成る単離された核酸を包含する。
【００１３】
本発明は、第一部分および第二部分を含んで成るキメラ核酸をさらに包含し、第一部分はＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ  ８ｘ  ｅｎｖコーディング配列の少なくとも一部分をコードし、また、第二部分は８ｘ  ｅｎｖでないＨＩＶ−１  ｅｎｖコーディング配列の少なくとも一部分をコードする。
【００１４】
一局面において、第二部分は、Ｓ１０  ｅｎｖ、ＨＸＢ２  ｅｎｖ、ＢａＬ  ｅｎｖおよびＩＩＩＢ  ｅｎｖより成る群から選択されるｅｎｖコーディング配列である。
【００１５】
別の局面において、第二部分は、ＣＸＣＲ４ケモカイン受容体結合部位およびＣＣＲ５ケモカイン受容体結合部位より成る群から選択されるケモカイン受容体結合部位を含んで成る。
【００１６】
なお別の局面において、第二部分は、ＣＸＣＲ４ケモカイン受容体結合部位のＶ３ループおよびＣＣＲ５ケモカイン受容体結合部位のＶ３ループより成る群から選択されるＶ３ループのコーディング配列を含んで成る。
【００１７】
本発明は、安定に露出されるケモカイン補助受容体結合部位を含んで成る単離されたＨＩＶ−１  ｇｐ１２０ポリペプチドを包含する。
【００１８】
本発明は、ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ  ８ｘ  Ｅｎｖを含んで成る単離されたポリペプチドもまた包含する。一局面において、該ポリペプチドは配列番号３と最低約９８％の相同性を共有する。
【００１９】
別の局面において、単離されたポリペプチドは配列番号３のアミノ酸配列を含んで成る。
【００２０】
本発明は、ｇｐ１２０ポリペプチドを含んで成るキメラのＨＩＶ−１  Ｅｎｖポリペプチドを包含し、ここで、キメラポリペプチドは、ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ  ８ｘ  ｇｐ１２０を含んで成る第一部分を含んで成り、該キメラポリペプチドは、ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ  ８ｘ以外のＨＩＶ−１からのｇｐ１２０を含んで成る第二部分をさらに含んで成る。
【００２１】
本発明は、ポリペプチドがＣＤ４非依存性であり、また、さらに、ポリペプチドがＣＸＣＲ４ケモカイン受容体結合部位およびＣＣＲ５ケモカイン受容体結合部位より成る群から選択されるケモカイン受容体結合部位を含んで成る、キメラのＨＩＶ−１  Ｅｎｖポリペプチドをさらに包含する。
【００２２】
一局面において、第二部分は、ＨＸＢ  Ｖ３ループ、８ｘ  Ｖ３ループ、ＢａＬ  Ｖ３ループ、ＹＵ−２  Ｖ３ループおよび８９．６  Ｖ３ループより成る群から選択されるＶ３ループを含んで成る。
【００２３】
本発明は、安定に露出されるケモカイン受容体結合部位を含んで成るｇｐ１２０ポリペプチドを含んで成るＣＤ４非依存性のＨＩＶ−１  Ｅｎｖを含んで成る組成物を包含し、ここで、ＨＩＶ−１は、安定に露出されるケモカイン受容体結合部位を含まないそれ以外は同一のＨＩＶ−１よりも抗体中和に対しより感受性である。
【００２４】
本発明は、ＣＤ４非依存性のＨＩＶ−１  Ｅｎｖタンパク質を含んで成る製薬学的組成物もまた包含し、ここで、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖはケモカイン補助受容体結合部位を安定に露出させる最低１個の突然変異を含んで成る。
【００２５】
一局面において、ＨＩＶ−１  ＥｎｖはＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ  ８ｘである。
【００２６】
本発明は、免疫原性の用量のＣＤ４非依存性のＨＩＶ−１  Ｅｎｖを含んで成るワクチンを包含する。
【００２７】
一局面において、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖは、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖポリペプチド、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖをコードする核酸およびＨＩＶ−１  Ｅｎｖを発現する細胞より成る群から選択される。
【００２８】
本発明は、ＣＤ４非依存性のヒトＨＩＶ−１  ｅｎｖ、またはその突然変異体、誘導体もしくはフラグメントをコードする単離された核酸を含んで成るベクターを包含する。
【００２９】
本発明は、最低１個のＨＩＶ−１  ｅｎｖクローンにＣＤ４非依存性を賦与するＨＩＶ−１  ｅｎｖ遺伝子の一部分を含んで成る単離された核酸を含んで成るベクターもまた包含する。
【００３０】
本発明は、第一部分および第二部分を含んで成るキメラ核酸を含んで成るベクターを包含し、第一部分はＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ  ８ｘ  ｅｎｖコーディング配列の少なくとも一部分をコードし、また、第二部分は８ｘ  ｅｎｖでないＨＩＶ−１  ｅｎｖコーディング配列の少なくとも一部分をコードする。
【００３１】
本発明は、ＣＤ非依存性のヒトＨＩＶ−１  ｅｎｖ、またはその突然変異体、誘導体もしくはフラグメントをコードする単離された核酸を含んで成る細胞を包含する。
【００３２】
本発明は、最低１個のＨＩＶ−１  ｅｎｖクローンにＣＤ４非依存性を賦与するＨＩＶ−１  ｅｎｖ遺伝子の一部分を含んで成る単離された核酸を含んで成る細胞もまた包含する。
【００３３】
本発明は、第一部分および第二部分を含んで成るキメラ核酸を含んで成る細胞をさらに包含し、第一部分はＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ  ８ｘ  ｅｎｖコーディング配列の少なくとも一部分をコードし、また、第二部分は８ｘ  ｅｎｖでないＨＩＶ−１  ｅｎｖコーディング配列の少なくとも一部分をコードする。
【００３４】
本発明は、安定に露出されるケモカイン受容体結合部位を含んで成る単離されたＨＩＶ−１  ｇｐ１２０ポリペプチドを含んで成る細胞を包含する。
【００３５】
本発明は、ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ  ８ｘ  Ｅｎｖを含んで成る単離されたポリペプチドを含んで成る細胞もまた包含する。
【００３６】
本発明は、ｇｐ１２０ポリペプチドを含んで成るキメラのＨＩＶ−１  Ｅｎｖポリペプチドを含んで成る細胞を包含し、キメラポリペプチドはＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ  ８ｘ  ｇｐ１２０を含んで成る第一部分を含んで成り、該キメラポリペプチドは、ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ  ８ｘ以外のＨＩＶ−１からのｇｐ１２０を含んで成る第二部分をさらに含んで成る。
【００３７】
本発明は、ポリペプチドがＣＤ４非依存性であり、また、さらに、ポリペプチドがＣＸＣＲ４ケモカイン受容体結合部位およびＣＣＲ５ケモカイン受容体結合部位より成る群から選択されるケモカイン受容体結合部位を含んで成る、キメラのＨＩＶ−１  Ｅｎｖポリペプチドを含んで成る細胞もまた包含する。
【００３８】
一局面において、第二部分は、ＨＸＢ  Ｖ３ループ、８ｘ  Ｖ３ループ、ＢａＬ  Ｖ３ループ、ＹＵ−２  Ｖ３ループおよび８９．６  Ｖ３ループより成る群から選択されるＶ３ループを含んで成る。
【００３９】
本発明は、安定に露出されるケモカイン受容体結合部位を含んで成るｇｐ１２０ポリペプチドを含んで成るＣＤ４非依存性のＨＩＶ−１  Ｅｎｖを含んで成る組成物を含んで成る細胞を包含し、ここで、ＨＩＶ−１は、安定に露出されるケモカイン受容体結合部位を含まないそれ以外は同一のＨＩＶ−１より抗体中和に対しより感受性である。
【００４０】
本発明は、ＣＤ４非依存性に関与するＨＩＶ−１  Ｅｎｖタンパク質のアミノ酸残基の同定方法を包含する。該方法は、ＣＤ４非依存性であるＥｎｖクローンから完全長のｅｎｖコーディング配列を得ること、および前記ｅｎｖコーディング配列の少なくとも一部分を、ＣＤ４依存性であるＥｎｖクローンからのコーディング配列で置き換えてキメラを形成させ、ここで、キメラがＣＤ４依存性である場合、それは、ｅｎｖコーディング配列の該部分がＣＤ４非依存性に関与することの表示であり、それによりＣＤ４非依存性に関与するアミノ酸残基を同定することを含んで成る。
【００４１】
本発明は、哺乳動物におけるＨＩＶ−１ケモカイン受容体結合部位に対する免疫応答を導き出す方法もまた包含する。該方法は、免疫原性の用量のＣＤ４非依存性のＨＩＶ−１  Ｅｎｖタンパク質を哺乳動物に投与し、ここで、該タンパク質は安定に露出されるケモカイン受容体結合部位を含んで成り、それにより哺乳動物におけるＨＩＶ−１ケモカイン受容体結合部位に対する免疫応答を導き出すことを含んで成る。
【００４２】
本発明は、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０ケモカイン受容体結合部位の露出に影響を及ぼす化合物の同定方法もまた包含する。該方法は、可溶性のＣＤ４との標識されたｇｐ１２０の前インキュベーションを伴うかもしくは伴わずに、細胞を該ｇｐ１２０と接触させるのに先立ちもしくはそれと同時発生的に、該化合物と細胞を接触させること、細胞に結合された標識の量を測定すること、および化合物と接触された細胞に結合された標識の量を、化合物と接触されないそれ以外は同一の細胞に結合された標識の量と比較することを含んで成り、ここで、化合物と接触されないそれ以外は同一の細胞に結合された標識の量と比較した、化合物と接触された細胞に結合されたより多いもしくは少ない量の標識は、化合物がＨＩＶ−１  ｇｐ１２０ケモカイン受容体結合部位の露出に影響を及ぼすことの表示である。
【００４３】
本発明は、そのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのＨＩＶ−１  ｇｐ１２０の結合を阻害する小分子の同定方法を包含する。該方法は、可溶性のＣＤ４との標識されたｇｐ１２０の前インキュベーションを伴うかもしくは伴わずに、細胞を前記ｇｐ１２０と接触させるのに先立ちもしくはそれと同時発生的に分子と細胞を接触させること、細胞に結合された標識の量を測定すること、および分子と接触された細胞に結合された標識の量を、分子と接触されないそれ以外は同一の細胞に結合された標識の量と比較することを含んで成り、ここで、分子と接触されないそれ以外は同一の細胞に結合された標識の量と比較した、分子と接触された細胞に結合されたより少ない量の標識は、該分子が、そのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのＨＩＶ−１  ｇｐ１２０の結合を阻害することの表示である。
【００４４】
本発明は、可変性のケモカイン受容体結合部位を含んで成るＣＤ４非依存性のキメラＨＩＶ−１  Ｅｎｖクローンの製造方法を包含する。該方法は、ＣＤ４非依存性のＥｎｖクローンの超可変Ｖ３ループを別のＨＩＶ−１のＶ３ループで置き換えることを含んで成り、ここで、別のＨＩＶ−１のＶ３ループは、ＣＤ４非依存性のＥｎｖクローンのものと異なるケモカイン受容体結合部位を含んで成る。
【００４５】
一局面において、ＣＤ４非依存性クローンは、ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘおよびＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ  ８ｘより成る群から選択される。
【００４６】
別の局面において、別のＨＩＶ−１からのＶ３ループは、ＨＩＶ−１／ＢａＬからのＶ３ループ、ＨＩＶ−１／ＹＵ−２からのＶ３ループ、ＨＩＶ−１／ＡＤＡからのＶ３ループおよびＨＩＶ−１／８９．６からのＶ３ループより成る群から選択される。
【００４７】
本発明は、そのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのＨＩＶ−１  ｇｐ１２０の結合の阻害方法もまた包含する。該方法は、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０ケモカイン受容体結合部位の露出に影響を及ぼす化合物の同定方法［該方法は、可溶性のＣＤ４との標識されたｇｐ１２０の前インキュベーションを伴うかもしくは伴わずに、細胞を該ｇｐ１２０と接触させるのに先立ちもしくはそれと同時発生的に、化合物と細胞を接触させること、細胞に結合された標識の量を測定すること、および化合物と接触された細胞に結合された標識の量を、化合物と接触されない、それ以外は同一の細胞に結合された標識の量と比較することを含んで成り、ここで、化合物と接触されないそれ以外は同一の細胞に結合された標識の量と比較した、化合物と接触された細胞に結合されたより多いもしくは少ない量の標識は、該化合物がＨＩＶ−１  ｇｐ１２０ケモカイン受容体結合部位の露出に影響を及ぼすことの表示である］により同定された小分子と前記ｇｐ１２０を接触させ、それによりそのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのＨＩＶ−１  ｇｐ１２０の結合を阻害することを含んで成る。
【００４８】
本発明は、細胞のＨＩＶ−１感染の阻害方法を包含する。該方法は、そのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのＨＩＶ−１  ｇｐ１２０の結合を阻害する小分子と細胞を接触させ［ここで、小分子は、そのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのＨＩＶ−１  ｇｐ１２０の結合を阻害する小分子の同定方法を使用して同定され、該方法は、可溶性のＣＤ４との標識されたｇｐ１２０の前インキュベーションを伴うかもしくは伴わずに、細胞を前記ｇｐ１２０と接触させるのに先立ちもしくはそれと同時発生的に、分子と細胞を接触させること、細胞に結合された標識の量を測定すること、および分子と接触された細胞に結合された標識の量を、分子と接触されないそれ以外は同一の細胞に結合された標識の量と比較することを含んで成り、ここで、分子と接触されないそれ以外は同一の細胞に結合された標識の量と比較した、分子と接触された細胞に結合されたより少ない量の標識は、該分子が、そのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのＨＩＶ−１  ｇｐ１２０の結合を阻害することの表示である］、それにより細胞のＨＩＶ−１感染を阻害することを含んで成る。
【００４９】
本発明は、製薬学的に適する担体中に、ＣＤ４非依存性のＨＩＶ−１  Ｅｎｖ、およびＨＩＶ感染症を治療するのに使用される最低１種の化合物を含んで成る組成物を包含する。
【００５０】
一局面において、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖは、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖポリペプチド、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖをコードする核酸およびＨＩＶ−１  ｅｎｖを発現する細胞より成る群から選択される。
【００５１】
別の局面において、ＨＩＶ感染症を治療するのに使用される化合物は、プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素ヌクレオシド類似物阻害剤、逆転写酵素非ヌクレオシド類似物阻害剤、インターフェロン、ＡＺＴ、インターロイキン−２およびサイトカインより成る群から選択される。
【００５２】
本発明は、ヒトにおけるＨＩＶ−１感染症の治療方法を包含する。該方法は、免疫原性の用量のＣＤ４非依存性のＨＩＶ−１  ＥｎｖをＨＩＶ−１に感染したヒトに投与し、それによりヒトにおけるＨＩＶ−１感染症を治療することを含んで成る。
【００５３】
一局面において、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖは、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖポリペプチド、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖをコードする核酸およびＨＩＶ−１  ｅｎｖを発現する細胞より成る群から選択される。
【００５４】
別の局面において、該方法は、ＨＩＶ感染症を治療するのに使用される化合物を投与することをさらに含んで成る。
【００５５】
なお別の局面において、ＨＩＶ感染症を治療するのに使用される化合物は、プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素ヌクレオシド類似物阻害剤、逆転写酵素非ヌクレオシド類似物阻害剤、インターフェロン、ＡＺＴ、インターロイキン−２およびサイトカインより成る群から選択される。
【００５６】
さらなる一局面において、該化合物は、前記ＣＤ４非依存性ＨＩＶ−１  Ｅｎｖの投与前、投与の間もしくは投与後に前記ヒトに投与される。
【００５７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ（ＩＩＩＢｘ）と呼称されるＨＩＶ−１／ＩＩＩＢのＣＤ非依存性の変異体、および、細胞受容体タンパク質を必要とする宿主細胞のウイルス感染の機構の研究を可能にするＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ．８（８ｘ）と命名されるそれからの機能的な完全長のｅｎｖクローンの発見に基づく。さらに、本発明は、別のＨＩＶ−１ウイルスからのｅｎｖの一部分をコードする最低１種の核酸に共有結合された８ｘ  ｅｎｖをコードする核酸の部分を含んで成るキメラの構築に関する。従って、該キメラは、８ｘ  ＨＩＶ−１  ｅｎｖ配列のどの部分（１種もしくは複数）がＣＤ４非依存性に関与しているかのさらなる発見につながる、他のビリオンのｅｎｖコーディング配列の部分と、８ｘ  ｅｎｖコーディング配列の部分を組み合わせることにより生じられる。
【００５８】
ＣＤ４非依存性は、それが、ｇｐ１２０のケモカイン結合部位がウイルスエンベロープ上に安定に露出されかつＣＤ４へのｇｐ１２０の前もっての結合なしに細胞のケモカイン受容体結合タンパク質に結合することが可能であることの指標であるため、重要である。典型的には、ケモカイン結合部位は、ＣＤ４へのこうした結合が、該部位を露出させかつ宿主細胞上のケモカイン受容体タンパク質に結合することが可能な「誘導された（ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ）」コンホメーションをもたらすコンホメーション変化を引き起こすまで、隠されている。従って、ＣＤ４非依存性のｇｐ１２０は、とりわけケモカイン受容体タンパク質へのｇｐ１２０の結合に関与するタンパク質の決定子を同定するため、ｇｐ１２０のケモカイン受容体結合部位を認識することが可能な中和抗体を産生させるため、およびｇｐ１２０とケモカイン受容体の結合を封鎖することができる小分子の阻害剤を同定するために使用することができる、安定な中間の配置を代表する。
【００５９】
従って、Ｅｎｖのどの部分が細胞タンパク質へのウイルス結合に関与しているかを理解すること、およびそれにより宿主細胞受容体へのＨＩＶ−１ウイルスの結合に関与するタンパク質の決定子をマッピングすることは、ウイルス感染に決定的に重要なウイルスタンパク質ドメインに対する有効な抗ウイルスワクチンの開発で重要である。こうしたドメインは、高度に保存されるが、しかし保護免疫応答がこうしたタンパク質ドメインに対し装備されないように免疫系からいくぶん「カムフラージュされる」と考えられている。従って、これらのタンパク質ドメインの同定、および免疫応答がＨＩＶ−１に対し生じられるように免疫系にそれらを提示する能力は、この重要なヒトの病原体に対するワクチン開発の重要な一最終目標である。
【００６０】
さらに、キメラの産生は、ＣＤ４依存性の特質およびケモカイン受容体の選択が機能的に分離できる特質であるという発見につながった。当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、こうしたキメラはｅｎｖをコードする核酸およびそれによりコードされるＥｎｖタンパク質の多様な構造的および機能的要素のマッピングに有用であることの真価をみとめるとみられる。従って、多様な特性（例えば、ＣＤ４依存性もしくは非依存性、および／または多様なケモカイン受容体に対する多様な親和性）を有する多様なウイルスの多様な部分を組み合わせることにより、Ｅｎｖタンパク質の多様な機能的要素を検査かつ同定することができる。
【００６１】
一態様において、ＣＤ４の非存在下でＣＸＣＲ４ケモカイン受容体を結合する８ｘ  ｇｐ１２０のＶ３ループ部分を、ＣＤ４依存性でありかつＣＣＲ５ケモカイン補助受容体を結合するウイルス株であるＨＩＶ−１／ＢａＬのＶ３ループで置き換えることは、キメラのｇｐ１２０  ８ｘ／Ｖ３−ＢａＬをＣＤ４非依存性のままであるＣＣＲ５結合タンパク質に転化する。これはさらに、ＣＤ４非依存性が、ｇｐ１２０によるＣＤ４結合の先行する段階がケモカイン受容体の選択に関係なくもはや必要とされないように、ケモカイン受容体結合ドメインを露出させることを立証する。これらのデータは、ケモカイン受容体結合部位が遺伝子的に互いに異なるケモカイン受容体（すなわちＣＸＣＲ４およびＣＣＲ５）と相互作用することが可能であるｇｐ１２０上に存在し、そしてこの部位が機能的でありかつＣＤ４非依存性のウイルス上に露出されていることがありそうであることもまた示唆する。
【００６２】
加えて、本発明は、ＣＤ４非依存性のｇｐ１２０タンパク質が安定な部分的に「誘導された」状態で存在することを教示し、ここで、ケモカイン補助受容体結合部位は、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０分子のＣＤ４依存性のコンホメーションにおいてよりもＣＤ４非依存性のｇｐ１２０タンパク質においてより露出されている。これは、ＣＤ４非依存性のウイルスを、マウス、ヒトおよびウサギからの抗ＨＩＶ−１抗体による中和に対しより影響を受けやすくするという効果を有する。従って、本発明はＨＩＶ−１の治療薬の開発に重要な意味を有する。なぜなら、免疫検出を逃れるようそれ以外はカムフラージュされることができる安定に露出された高度に保存されたケモカイン受容体結合部位の利用可能性が、体液性および／もしくは細胞性免疫応答の発生、ならびにこのウイルス−宿主タンパク質相互作用を封鎖しそれによりＨＩＶ−１感染を予防する小分子阻害剤の開発を助長するはずであるからである。
【００６３】
本発明は、２つの成分すなわちｇｐ１２０をコードする部分およびｇｐ４１をコードする部分より構成されるＣＤ４非依存性のＨＩＶ  ｅｎｖコーディング配列をコードする単離された核酸を包含する。一態様において、ＣＤ４非依存性のＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘの完全長のｅｎｖクローン（すなわち８ｘ）が単離されている（配列番号３および配列番号４；図３ならびにそれぞれ１４Ａおよび１４Ｂを参照されたい）。さらに、８ｘクローン中の突然変異をＨＸＢｃ２の既知のｅｎｖコーディング配列（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号第ＡＦ０３８３９９号）（配列番号１１）に関し同定し、そして図４に開示する。しかしながら、本発明は、ＣＤ４非依存性のＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ変異体の完全長のｅｎｖクローンに限定されると解釈されるべきでない。むしろ、本発明は部分的ｅｎｖクローンを包含すると解釈されるべきである。事実、本明細書に開示されるデータは、８ｘの完全なｅｎｖコーディング配列がＣＤ４非依存性に必要とされないことを立証する。従って、８ｘ  ｅｎｖコーディング配列中に存在する最低１個の突然変異が８ｘにＣＤ４非依存性を賦与するが、しかし、クローン中の全部の突然変異が本発明の目的上必要とされるわけでない。さらに、ｇｐ１２０の完全に別個の突然変異もまたＣＤ４非依存性を賦与する可能性がある。
【００６４】
下の実施例に開示される実験は、逆転写酵素活性アッセイ（図１Ａ）により立証されるとおり、ＣＤ４＋  ＳｕｐＴ１細胞およびＳｕｐＴ１変異体、ＣＤ４−  ＢＣ７細胞の双方を感染させることが可能であった本発明のＣＤ４非依存性株（ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ）の単離を開示する。しかしながら、本発明は、ＨＩＶ−１によるＢＣ７もしくはＳｕｐＴ１細胞の感染にのみ限定されない。むしろ、本発明の「ＣＤ４非依存性」は、ＣＤ４を発現しないいかなる細胞型のＨＩＶ−１による感染も包含する。さらに、本明細書で既に論考されたとおり、ＣＤ４非依存性のＨＩＶ−１株はＣＤ４＋である細胞も感染させることができるが、とは言えＣＤ４とｇｐ１２０の相互作用はＣＤ４非依存性のＨＩＶ−１によるこれらの細胞の感染に必要とされない。さらに、ＣＤ４非依存性のＨＩＶ−１株はすべてのＣＤ４−細胞型を感染させる必要はない。むしろ、ＨＩＶ−１株は、最低１種のＣＤ４−細胞型を感染させることが可能であることのみが必要である一方、それからクローンを得たそのそれ以外は同一の親株は、その細胞型を感染させることができない。
【００６５】
加えて、本発明の目的上、ＨＩＶ−１株の変異体は、それが培養物中の影響を受けやすい細胞の最低約５％を感染させることが可能である場合にＣＤ４非依存性と考えられるか、もしくは、感染のレベルはバックグラウンドのレベルに比較して約２ないし３倍である。
【００６６】
ＨＩＶ−１株のＣＤ４非依存性の単離物は、最初にＣＤ４＋細胞中で成長されたＣＤ４依存性のＨＩＶ−１遊走群を、ＣＤ４−である細胞上で継代することにより得ることができることが、本明細書で提供される開示に基づき、当業者により真価をみとめられるであろう。本明細書の実施例１に記述される実験で開示されるとおり、ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘは、ＣＤ４＋  ＳｕｐＴ１細胞中でウイルスを継代すること、次いでＣＤ４−のほかそれ以外は同一のＢＣ７細胞上でウイルスを継代することにより得た。しかしながら、本発明はこれらの特定の細胞型に限定されると解釈されるべきでない。代わりに、本発明は、限定されるものでないが２９３、Ｃｆ２ＴＨ、ＣＣＣ＋Ｌ−およびＱＴ６細胞を挙げることができる多様なＣＤ４＋およびＣＤ４−細胞、ならびにＣＤ４の存在もしくは非存在下で組換えケモカイン受容体を発現する安定にトランスフェクションされた細胞（Ｕ８７、ＨｅＬａ、ＨＯＳ）を包含する。
【００６７】
他の関係する局面において、本発明は、ＨＩＶ−１  ｅｎｖの最低一部分を含んで成るこうした単離された核酸（そしてその単離された核酸は好ましくは該核酸によりコードされるタンパク質の発現を指図することが可能である）を含有するベクター；ならびにこうしたベクターを含有するビリオン、プロウイルスおよび／もしくは細胞を包含する。
【００６８】
本実験的実施例が立証するとおり、Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸は多様なプラスミドベクター中にクローン化することができる。しかしながら、本発明は、これらのプラスミドもしくはいかなる特定のベクターにも限定されると解釈されるべきでない。代わりに、本発明は、容易に入手可能かつ／もしくは当該技術分野で公知である夥しい量のベクターを包含すると解釈されるべきである。従って、一態様において完全長のｅｎｖコーディング領域をＰＣＲにより増幅しかつプラスミドｐＣＤＮＡ３にクローン化し、そして挿入物をその後ｐＮＬ４−３の３’半ゲノム（ｈｅｍｉｇｅｎｏｍｅ）にサブクローニングしたが、本発明はこれらもしくはいずれかの他の特定のベクターに限定されると解釈されるべきでない。
【００６９】
本発明の単離された核酸は、本発明のＥｎｖタンパク質をコードするＲＮＡもしくはＤＮＡ配列、およびそれが細胞を含まない場合もしくはそれが細胞を伴う場合に該ヌクレオチド配列をより安定にするＤＮＡもしくはＲＮＡの化学修飾を包含するそれらのいずれかの改変された形態を包含すると解釈されるべきである。ヌクレオチドの化学修飾は、ヌクレオチド配列が細胞により取り込まれる効率もしくはそれが細胞中で発現される効率を高めるのにもまた使用することができる。ヌクレオチド配列の修飾のいずれかのおよび全部の組み合わせを本発明で企図する。
【００７０】
本発明は、ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ  ８ｘのアミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペプチドもまた包含する。
【００７１】
本発明は、本明細書に開示されるようなｇｐ１２０タンパク質を含んで成るタンパク質もしくはペプチドの類似物もまた提供する。類似物は、保存的アミノ酸配列の差異、もしくは配列に影響を及ぼさない修飾、または双方により、天然に存在するタンパク質もしくはペプチドと異なることができる。例えば、それらが該タンパク質もしくはペプチドの一次配列を変えるが通常はその機能を変えない保存的アミノ酸変化を作成することができる。保存的アミノ酸置換は、以下の群、すなわち
グリシン、アラニン；
バリン、イソロイシン、ロイシン；
アスパラギン酸、グルタミン酸；
アスパラギン、グルタミン；
セリン、トレオニン；
リシン、アルギニン；
フェニルアラニン、チロシン
内での置換を典型的に包含する。（通常は一次配列を変えない）修飾は、ポリペプチドのインビボもしくはインビトロの化学的誘導体化（例えば、アセチル化、カルボキシル化もしくはビオチニル化）を包含する。グリコシル化（例えば、その合成およびプロセシングの間にポリペプチドのグリコシル化パターンを改変させることにより、またはさらなるプロセシング段階において；例えば、グリコシル化に影響を及ぼす酵素（例えば哺乳動物のグリコシル化もしくは脱グリコシル化酵素）にポリペプチドを曝露させることによりなされるもの）の修飾もまた包含する。リン酸化されたアミノ酸残基（例えばホスホチロシン、ホスホセリンもしくはホスホトレオニン）を有する配列もまた包含する。
【００７２】
タンパク質分解性の分解に対するそれらの抵抗性を向上させる、もしくは溶解性の特性を至適化する、もしくはそれらを治療薬としてより適するようにするように、通常の分子生物学の技術を使用して改変されたポリペプチドもまた包含する。こうしたポリペプチドの類似物は、天然に存在するＬ−アミノ酸以外の残基（例えばＤ−アミノ酸もしくは天然に存在しない合成アミノ酸）を含有するものを包含する。本発明のペプチドは、本明細書に列挙される特定の例示的方法のいずれかの産物に限定されない。
【００７３】
さらに、本発明は、ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ  ８ｘ  ｅｎｖ配列の天然に存在する変異体もしくは組換え的に生じられた突然変異体を包含すると解釈されるべきであり、これらの変異体もしくは突然変異体は、それによりコードされるタンパク質を、本発明の完全長の８ｘ  ｅｎｖクローンより大きく、より小さく、もしくはそれと正に同じくらいのいずれか、生物学的に活性にする。
【００７４】
加えて、本発明は、変えられたケモカイン受容体結合部位を含んで成る８ｘ  ｇｐ１２０の突然変異体もしくは変異体を包含する。本明細書の別の場所で既に論考されたとおり、ｇｐ１２０タンパク質は多様な細胞のケモカイン受容体タンパク質へのｇｐ１２０の結合を媒介するケモカイン受容体結合ドメインを含んで成り、この結合は、典型的にはＣＤ４へのｇｐ１２０の結合後に発生する。この節に続く実験の結果にて開示されるとおり、８ｘ  ｇｐ１２０はＣＸＣＲ４ケモカイン受容体に結合し、そしてそうする前にＣＤ４への結合を必要としない。さらに、本明細書の別の場所に開示されるデータは、８ｘ  ｇｐ１２０のコーディング配列へのＨＩＶ−１／ＢａＬ  ｇｐ１２０の一部分をコードする核酸の一部分の導入が、もはやＣＸＣＲ４に結合しないキメラタンパク質を生じさせることを立証する。代わりに該キメラｇｐ１２０は今やＣＣＲ５を結合する。こうした突然変異体は、ＨＩＶ−１ウイルス感染におけるｇｐ１２０とケモカイン受容体タンパク質の相互作用の役割の研究のため、本発明の方法で有用である。本発明は、８ｘ  ｇｐ１２０をコードする核酸の一部分がＢａＬ  ｇｐ１２０をコードする核酸の一部分を置き換えたキメラｇｐ１２０に単に限定されると解釈されるべきでない。代わりに、本発明は、８ｘ  ｇｐ１２０をコードする核酸のいずれかの部分（１種もしくは複数）を、いずれかの他のＨＩＶ−１株、好ましくはＣＣＲ５を補助受容体として使用するＨＩＶ（もしくはＳＩＶ）の株からのｇｐ１２０をコードする核酸の最低１部分により置き換えることができる、他のキメラを包含すると解釈されるべきである。さらに、こうした部分は、ｇｐ１２０のいずれかの特定のドメインに限定されると解釈されるべきでなく、しかし、むしろ、置換されたｇｐ１２０の部分は、該タンパク質をコードする配列のいずれかの部分からであることができる。従って、生じるキメラ核酸およびそれから発現されるタンパク質は、可能ないずれかの組み合わせの、数種のＨＩＶ−１株からの多様なｇｐ１２０より構成されるキメラであることができる。
【００７５】
本明細書の別の場所でより具体的に示されるとおり、それにより推定のケモカイン受容体結合部位のもしくはその近くのアミノ酸が変えられる、またはそれによりＥｎｖの短縮された細胞質の尾が生じられる、挿入、欠失もしくは置換を含んで成るｇｐ１２０タンパク質をコードする突然変異体のｇｐ１２０遺伝子が、宿主細胞のケモカイン受容体タンパク質とのｇｐ１２０の会合の研究で有用である。事実、下述される実験で開示されるとおり、いくつかのこうした突然変異体が本明細書で発見された（表１および図３を参照されたい）。しかしながら、本発明は、これらの突然変異体のみに限定されると解釈されるべきでなく；むしろ、本発明は、野性型ｇｐ１２０に比較してケモカイン受容体タンパク質への変えられた結合を立証しかつその突然変異体がＣＤ４非依存性を立証する、欠失、置換および点突然変異を含んで成る他の突然変異体を包含する。
【００７６】
本発明はまた、生物学的活性を保持してももしくはしなくてもよいＨＩＶ−１  Ｅｎｖの変異体をコードするＤＮＡを包含すると解釈されるべきである。こうした変異体（すなわちｇｐ１２０、ｇｐ４１（ＴＭともまた称される）のタンパク質もしくはポリペプチドの類似物）は、該タンパク質もしくはポリペプチドが、本明細書に記述される方法での使用に対するその適合性を高める付加的な特性（例えば、限定されるものでないが露出されたケモカイン受容体結合部位の高められた安定性、ＣＤ４、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５などへの高められた特異的結合を賦与する変異体）を所有するような組換えＤＮＡ技術を使用して改変されているかもしくは改変することができるタンパク質もしくはポリペプチドを包含する。
【００７７】
本発明は８ｘ  Ｅｎｖタンパク質の類似物を包含する。類似物は、保存的アミノ酸配列の差異もしくは配列に影響を及ぼさない修飾、またはその双方により、天然に存在するタンパク質もしくはペプチドと異なることができる。例えば、それらがタンパク質もしくはペプチドの一次配列を変えるが通常はその機能を変えない、保存的アミノ酸変化を作成することができる。
【００７８】
好ましくは、８ｘ  Ｅｎｖ類似物のアミノ酸配列は、本明細書に図４に開示される８ｘ  ｅｎｖのアミノ酸配列（配列番号３）に約７０％相同、より好ましくは約８０％相同、なおより好ましくは約９０％相同、より好ましくは約９５％相同、そして最も好ましくは最低約９９％相同である。
【００７９】
本発明は、本明細書に開示されるＤＮＡおよびアミノ酸配列にのみ限定されると解釈されるべきでない。本発明で武装されれば、本明細書に開示されるＣＤ４非依存性のＥｎｖをコードする８ｘ  ｅｎｖ核酸（配列番号４）の単離についての実験の詳細の節で本明細書に記述される手順に従うことにより、ＨＩＶ−１の他のＣＤ４非依存性のｅｎｖクローンを得ることができることが当業者に容易に明らかである。
【００８０】
本発明は、従って、いずれかのおよび全部の、ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ  ８ｘ  Ｅｎｖをコードする核酸配列、ならびに、本明細書に開示される８ｘ  ｅｎｖをコードする核酸（配列番号４）に対する実質的な相同性を有するアミノ酸配列および図４に示されるアミノ酸配列（配列番号３）を包含すると解釈されるべきである。好ましくは、実質的に相同であるＤＮＡは、本明細書に開示される８ｘ  ｅｎｖ配列（配列番号４）に約５０％相同、より好ましくは約７０％相同、なおより好ましくは約８０％相同、そして最も好ましくは約９０％相同である。好ましくは、実質的に相同であるアミノ酸配列は、図４に示される８ｘ  Ｅｎｖのアミノ酸配列（配列番号３）に約５０％相同、より好ましくは約７０％相同、なおより好ましくは約８０％相同、そして最も好ましくは約９０％相同である。
【００８１】
いずれかの数の手順を８ｘ  ｅｎｖの突然変異体もしくは変異体の形態の生成に使用することができる。例えば、ＣＤ４非依存性でない８ｘの突然変異体の形態の生成は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー  プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、グリーン  アンド  ワイリー（Ｇｒｅｅｎ  ＆  Ｗｉｌｅｙ）、ニューヨーク）に記述されるような当該技術分野で公知の組換えＤＮＡの方法論を使用して、ＣＤ依存性であったウイルスからのｅｎｖをコードする核酸の部分を導入することにより、本明細書で達成した。そのように生成された突然変異体のＥｎｖを発現させ、そして生じるタンパク質を、本明細書に記述されるもののような実時間バイオセンサーアッセイでＣＤ４を結合するその能力について評価する。その後、ＣＤ４非依存性の様式でケモカイン受容体タンパク質を結合する突然変異体タンパク質を、ＲＴ、融合活性、実時間結合／解離の動力学および他のこうしたアッセイにより検査した。
【００８２】
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を変えることによるタンパク質もしくはポリペプチド中のアミノ酸変化の導入のための手順は当該技術分野で公知であり、かつ、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９、上記）；Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９７、上記）にもまた記述される。
【００８３】
本発明は、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖをコードする核酸（配列番号４）の一部分もしくは全部に対し相補的である核酸配列を有する単離された核酸もまた包含する。
【００８４】
本明細書で使用されるところの、核酸に適用されるところの「フラグメント」という用語は、通常長さが最低約１００ヌクレオチド、典型的には最低約２００ヌクレオチド、より典型的には約３００から約６００ヌクレオチドまで、典型的には最低約７００ないし約１０００ヌクレオチド、好ましくは最低約１０００ないし約１４００ヌクレオチド、なおより好ましくは最低約１６００ヌクレオチドないし約２０００ヌクレオチドであることができ、そして最も好ましくは、核酸フラグメントは長さが約２４００ヌクレオチドより大きいことができる。
【００８５】
本発明は目的の核酸を含んで成る細胞をさらに包含する。該核酸は、細胞ゲノム中に組み込まれることも必要でなく、また、それらは細胞中で発現されることも必要としない。さらに、細胞は原核生物もしくは真核生物細胞であることができ、そして本発明はいずれかの特定の細胞系もしくは型に限定されると解釈されるべきでない。
【００８６】
本発明はｇｐ１２０もしくはその一部分のケモカイン受容体結合部位に特異的な抗体もまた包含し、この抗体はモノクローナル抗体を含んで成る。
【００８７】
一態様において、抗体は、そのエピトープがケモカイン受容体結合部位と重なり合うｇｐ１２０に対するマウスモノクローナル抗体（１７ｂ）、ならびに４８ｄと称されるｇｐ１２０に対するマウスモノクローナル抗体（Ｔｈａｌｉら、１９９３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３９７８−３９８８）である。しかしながら、本発明はこれらの抗体にのみ限定されると解釈されるべきでないが、しかしむしろ、Ｅｎｖもしくはその部分に対する他の抗体（その用語が本明細書で定義されるところの）を包含すると解釈されるべきであり、この抗体は、とりわけ該抗体がｇｐ１２０ケモカイン受容体結合部位に結合するため、本明細書に記述されるものに実質的に類似の様式で機能し、そしてそれらはＲＴ活性および細胞融合活性により測定されるとおりＨＩＶ−１感染を阻害することが可能である。
【００８８】
本発明は８ｘ  Ｅｎｖタンパク質のアミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペプチド、ならびにその突然変異体、変異体およびフラグメントもまた含んで成る。
【００８９】
本発明のペプチドは実質的に純粋であることができる。実質的に純粋なペプチドはタンパク質精製のための既知の手順に従うことにより精製され、ここで、該手順の各段階で純度をモニターするのに免疫学的、酵素的もしくは他のアッセイを使用する。タンパク質精製法は当該技術分野で公知であり、そして例えばＤｅｕｔｓｃｈｅｒら（１９９０、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ハーコート  ブレース  ジョヴァノヴィッチ（Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ  Ｊｏｖａｎｏｖｉｃｈ）中、サンディエゴ）に記述される。
【００９０】
従って、本発明は、所望のタンパク質をコードする核酸および所望のポリペプチドをコードする核酸のフラグメントを包含すると解釈されるべきである。
【００９１】
本発明は、第一部分および第二部分を含んで成るキメラタンパク質をコードする単離された核酸を包含する。一態様において、キメラ核酸は、８ｘ  ｅｎｖをコードする第一部分、およびＳ１０、ＩＩＩＢもしくはＨＸＢ２からのｅｎｖをコードする第二部分を含んで成る。これらのキメラは、８ｘのどの領域がＣＤ４非依存性に必要とされるかのマッピングで有用であったが、本発明はこれらのキメラに限定されると解釈されるべきでない。むしろ、本発明は、８ｘのいかなる部分、およびいかなるＨＩＶ−１ウイルス株もしくはその変異体も含んで構築することができるｅｎｖコーディング領域中のいかなるキメラも包含すると解釈されるべきである。
【００９２】
さらに、別の態様において、キメラは、８ｘ  ｅｎｖコーディング領域の一部分、およびＣＣＲ５向性のＨＩＶ−１株ＢａＬのｅｎｖコーディング領域の一部分を含んだ。より具体的には、該態様は、ＢａＬのＶ３ループをコードする核酸部分を伴う８ｘ  ｅｎｖクローンを含んで成る。しかしながら、本発明は、ｅｎｖコーディング領域のこの特定の部分もしくはＨＩＶ−１のこの特定の株に限定されると解釈されるべきでない。むしろ、本明細書の別の場所で既に論考されたとおり、本発明は、最低１種の他のＨＩＶ−１株もしくは変異体のｅｎｖコーディング配列の一部分での、８ｘ  ｅｎｖコーディング配列のいずれかの部分の置換、およびそのいずれかの可能な並べ換えを包含する。従って、核酸およびそれから発現されるアミノ酸の双方のキメラは、２種もしくはそれ以上の目的のＨＩＶ−１  ｅｎｖコーディング領域からの組み合わせを包含する。従って、本明細書に提供される開示で武装されれば、本明細書で開示される予測される効果をもつキメラのほとんど無限の組み合わせの産生が当業者に明らかであろう。
【００９３】
本発明は、ＣＤ４非依存性に関与するＨＩＶ−１  Ｅｎｖタンパク質のアミノ酸残基の同定方法もまた包含する。該方法は、ＣＤ４非依存性のＥｎｖクローンからの最低１部分および少なくともＣＤ４依存性のＥｎｖクローンからの第二の部分を含んで成るキメラタンパク質を産生させることを含んで成る。その後、生じるキメラを検査して、本明細書の別の場所に開示されるような多様なアッセイにより、ＣＤ４非依存性の感染を媒介するキメラタンパク質の能力を決定する。本明細書で既に論考されたとおり、８ｘ  ｅｎｖコーディング配列の部分を数種のＣＤ４依存性のＨＩＶ−１株（例えばＳ１０およびＨＸＢｃ２）のｅｎｖコーディング配列の多様な部分と組み合わせた、好ましい一態様が開示される。また本明細書で既に示されたとおり、本発明はこれらの特定の組み合わせもしくはこれらの特定の株に限定されない。むしろ、当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、ＣＤ４依存性および非依存性のｅｎｖコーディング配列のいかなる組み合わせも検査して、ＣＤ４非依存性の決定子をマッピングすることができることの真価をみとめるであろう。さらに、ＣＤ４非依存性は、また本明細書の別の場所で既に記述されたような多様な哺乳動物細胞系で多様なアッセイを使用して検査することができる。
【００９４】
本発明は、安定に露出されたケモカイン受容体結合部位を含んで成る単離されたｇｐ１２０タンパク質もまた包含する。一態様において、バイオセンサー実験において多様なタンパク質の実時間結合動力学を、また、抗ＨＩＶ抗体によるウイルスの高められた中和を測定することにより、ならびに結晶学的分析により、ケモカイン受容体結合部位の増大された露出が決定された。しかしながら、本発明はこれらの特定のアッセイに限定されると解釈されるべきでない。むしろ、当該技術分野で公知の、もしくはタンパク質−タンパク質相互作用の研究のため開発されるべき他のアッセイを使用して、目的のｇｐ１２０もしくはＥｎｖタンパク質のケモカイン受容体結合部位の露出を測定することができる。
【００９５】
本発明は、ＨＩＶ−１ケモカイン受容体結合部位に対する免疫応答を導き出す方法を包含する。該方法は、免疫原性の用量のＣＤ４非依存性のＨＩＶ−１  Ｅｎｖタンパク質を哺乳動物に投与することを含んで成り、ここで該タンパク質は安定に露出されたケモカイン受容体結合部位を含んで成る。
【００９６】
加えて、該核酸がベクター（例えばプラスミドもしくはウイルス）中にある場合、または該核酸がいずれかの他の核酸と会合しない裸の（ｎａｋｅｄ）核酸を含んで成る場合の、免疫応答を生じさせるための精製された核酸の使用は、当該技術分野で公知である。例えば、核酸ワクチンの構築方法は、Ｂｕｒｇｅｒら（１９９１、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：３５９−３６７）に記述され、そして当該技術分野で公知である。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー  プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、グリーン  アンド  ワイリー（Ｇｒｅｅｎ  ＆  Ｗｉｌｅｙ）、ニューヨークもまた参照されたい。
【００９７】
さらに、選択すべきＨＩＶ−１  Ｅｎｖタンパク質を発現する細胞を使用して、ＨＩＶ−１ケモカイン受容体結合部位に対する免疫応答を生じさせることもまたできる。
【００９８】
Ｅｎｖ免疫原に対する免疫応答は、ＥＬＩＳＡもしくはウェスタンブロッティングのような標準的免疫学的技術、および当該技術分野で公知もしくは今後開発されるべき他のこうした技術により測定する。多様なイムノアッセイの形式を使用して、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を選択することができる。例えば、特異的免疫反応性を決定するのに使用することができるイムノアッセイの形式および条件の記述については、ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ（１９８８、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、コールド  スプリング  ハーバー  パブリケーションズ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、ニューヨーク）を参照されたい。
【００９９】
本発明のＣＤ４非依存性のＨＩＶ−１  Ｅｎｖタンパク質は、ヒトもしくは家畜の患者への該タンパク質の投与に適する製薬学的組成物に処方することができる。正確な処方および投薬量は、限定されるものでないが治療されるべき疾患の型および重症度、投与経路、個体の齢および全体的健康状態、Ｅｎｖタンパク質の性質などを挙げることができるいずれかの数に因子に依存して変動することができることが真価をみとめられるであろう。しかしながら、適切なｐＨ、等張性、安定性および他の特徴を有する製薬学的に許容できる組成物の製造は、当該技術の熟練内である。製薬学的組成物は、当該技術分野で、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８５、Ｇｅｎａｒｏ編、マック  パブリッシング  カンパニー（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）、フィラデルフィア州イーストン）に記述される。
【０１００】
投与されるＣＤ４非依存性のＥｎｖの量は、それがタンパク質として投与されようと、もしくは核酸として投与されようと、もしくはＨＩＶ  ｅｎｖを発現する細胞として投与されようと、ＨＩＶ−１ケモカイン受容体結合部位に対する免疫応答を導き出すのに十分である。本発明の実施に有用な製薬学的組成物は、患者の体重１ｋｇあたり約１ｎｇと約１００ｍｇとの間の用量を送達するように投与することができる。投与に適するＣＤ４非依存性のＥｎｖタンパク質の量は、付随する副作用を伴わずに所望の効果を有するのに十分多い用量を包含する。ＣＤ４非依存性のＥｎｖがタンパク質もしくはペプチドである場合、好ましい投薬量範囲は、患者の体重１ｋｇあたり約１０から約１０００μｇまでのタンパク質もしくはペプチドである。ＣＤ４非依存性のＥｎｖを、組換えウイルスベクター内に含有されるそれをコードするＤＮＡの形態で投与する場合、患者の体重１ｋｇあたり約１０２と約１０１１プラーク形成単位との間のウイルスの投薬量を使用することができる。ＣＤ４非依存性のＥｎｖをコードする裸のＤＮＡを製薬学的組成物として投与するべきである場合、患者の体重１ｋｇあたり約１０μｇないし約数ｍｇの間のＤＮＡの投薬量を使用することができる。
【０１０１】
本発明の方法の実務において、ＣＤ４非依存性のＥｎｖタンパク質を含有する組成物は、該個体におけるＨＩＶ−１感染症を治療、予防もしくは緩和するのに十分な量で患者に投与する。
【０１０２】
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、Ｅｎｖタンパク質／Ｅｎｖをコードする核酸を患者に投与して、ウイルスのケモカイン受容体結合部位を使用する適切なケモカイン受容体へのウイルスの結合を妨害し、そしてそれにより感染を予防することにより、ＨＩＶ感染症を予防することができることの真価をみとめるであろう。さらに、Ｅｎｖタンパク質／ｅｎｖをコードする核酸はまた、人における免疫応答を増大させることにより既に感染した個体の病状を治療もしくは緩和することもでき、それは、順に、抗レトロウイルスの薬理学的治療への添加物（ａｄｊｕｎｃｔ）として有益である可能性がある。すなわち、免疫原はウイルスのケモカイン受容体結合部位に対する免疫応答を増大させ、それにより、ウイルスのケモカイン受容体結合部位と標的細胞のケモカイン受容体との間の必須の相互作用を封鎖する抗体を生じさせることができる。
【０１０３】
患者へのＣＤ４非依存性のＥｎｖタンパク質の投与の頻度は、限定されるものでないが治療されるべきウイルス感染症の型および重症度、投与経路、個体の齢および全体的健康状態、Ｅｎｖタンパク質の性質などを挙げることができるいくつかの因子に依存してもまた変動することができる。患者へのＥｎｖタンパク質の投与の頻度は数ヶ月ごとに約１回から、１ヶ月に約１回、１週間に約１回、１日あたり約１回、１日に約数回まで変動することができることが企図される。
【０１０４】
本発明の方法で有用である製薬学的組成物は、非経口の、経口の固体および液体製剤、眼の、坐剤、エアゾル、局所のもしくは他の類似の製剤で全身に投与することができる。適切なＥｎｖタンパク質もしくはそれをコードする核酸に加え、これらの製薬学的組成物は、製薬学的に許容できる担体、および薬物投与を高めかつ助長することが既知の他の成分を含有することができる。従って、こうした組成物は、場合によっては、アジュバント（例えば水酸化アルミニウムおよびマグネシウムの水性懸濁液）のような他の成分、ならびに／もしくは生理的食塩水のような他の製薬学的に許容できる担体を含有することができる。ナノ粒子、リポソーム、再封止赤血球（ｒｅｓｅａｌｅｄ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）および免疫学的に基づく系のような他の可能な製剤もまた、本発明の方法に従って適切なＥｎｖタンパク質もしくはそれをコードする核酸を患者に投与するのに使用することができる。
【０１０５】
好ましくは、本発明の組成物は非経口もしくは静脈内の経路によりヒトに投与する。
【０１０６】
Ｅｎｖタンパク質および／もしくはＥｎｖをコードする核酸は、ＨＩＶ感染症を治療するのに使用する他の化合物とともに投与することができる。こうした化合物は、限定されるものでないがプロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤（ヌクレオシドおよび非ヌクレオシド類似物）、ＡＺＴ、インターフェロン、インターロイキン−２、他のサイトカインなどを挙げることができる。投与する付加的化合物の選択は、Ｅｎｖタンパク質もしくはそれをコードする核酸の投薬量および投与頻度の選択を支配するいずれかの数の同一の型の因子に依存して変動することができる。本発明の方法の実施のための、Ｅｎｖタンパク質とともにの使用のためのこれらの型の化合物の選択は、当業者の熟練内に十分にある。
【０１０７】
本発明は、免疫原性の用量のＣＤ４非依存性のＨＩＶ−１  Ｅｎｖタンパク質を含んで成るワクチンもまた包含する。本明細書の別の場所で既に論考されたとおり、ウイルスのケモカイン受容体結合部位に対する免疫応答の生成は、宿主のケモカイン受容体リガンドへのこのウイルス部位の相互作用を封鎖し、それによりＨＩＶ感染に必要とされる必須のウイルス／宿主細胞の相互作用を妨害および／もしくは阻害するはずである。
【０１０８】
加えて、本発明は、ｇｐ１２０タンパク質のケモカイン受容体結合部位の露出に影響を及ぼす化合物の同定方法を包含する。該方法は、細胞を化合物と接触させること、および細胞に特異的に結合された標識されたｇｐ１２０の量を、該化合物と接触されないそれ以外は同一の細胞に結合された標識されたケモカインの量と比較することを含んで成る。一態様において、目的のｇｐ１２０を１２５Ｉ標識し、そして可溶性ＣＤ４の存在もしくは非存在下に多様なケモカイン受容体を発現する細胞に結合した。しかしながら、本発明は、放射ヨウ素化、もしくはいずれかの特定のｇｐ１２０、もしくはこれらのケモカイン受容体のみの発現に限定されると解釈されるべきでない。むしろ、本発明は、目的のｇｐ１２０の結合を定量することができるような多様なタンパク質標識を包含すると解釈されるべきである。こうした方法は当該技術分野で公知であり、そして限定されるものでないがビオチニル化、ならびに３５Ｓ−ｃｙｓおよび３５Ｓ−ｍｅｔを挙げることができる。
【０１０９】
本発明は、そのケモカイン受容体結合部位を使用するＨＩＶ−１  ｇｐ１２０によるケモカイン受容体の結合を阻害する小分子の同定方法もまた包含する。該方法は、可溶性のＣＤ４とのｇｐ１２０の前インキュベーションを伴いもしくは伴わずに、標識されたｇｐ１２０と細胞を接触させる前もしくはそれと同時発生的に、細胞を小分子と接触させることを含んで成る。その後、細胞に結合された標識の量を測定し、それにより細胞に結合された標識されたｇｐ１２０の量を検出する。小分子と接触された細胞に結合された、結合されたｇｐ１２０の量を、小分子と接触されない細胞に結合されたｇｐ１２０の量と比較する。小分子と接触されなかった細胞に結合されたｇｐ１２０の量に比較して、より少ない量のｇｐ１２０が小分子と接触された細胞に結合される場合は、これは、小分子と細胞を接触させることがそのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのＨＩＶ−１  ｇｐ１２０の結合を阻害することの表示である。
【０１１０】
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、こうした小分子は標的細胞のウイルス感染に必要な必須のＨＩＶ−１  ｇｐ１２０とケモカイン受容体の相互作用を阻害するとみられるため、こうした小分子は細胞のＨＩＶ−１感染を阻害する有用な治療薬であることの真価をみとめるであろう。さらに、従来技術は、ケモカイン受容体に特異的に結合しかつケモカイン受容体へのｇｐ１２０の結合を封鎖する抗体およびケモカインが、しばしばＨＩＶ感染もまた封鎖することを教示する（Ｌｅｅら、１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、印刷中；Ｏｌｓｏｎら、１９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、印刷中；Ｗｕら、１９９７、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）。従って、本発明の方法を使用して同定される、ケモカイン受容体へのｇｐ１２０の結合の小分子阻害剤は、ＨＩＶ感染の有用な阻害剤である。
【０１１１】
さらに、当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、本発明の方法を使用して同定される、そのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのｇｐ１２０の結合の小分子阻害剤は、その受容体へのケモカインの結合およびその受容体の活性化の有用な阻害剤であることの真価をみとめるであろう。すなわち、小分子阻害剤は、ＨＩＶ感染におけるケモカイン受容体の役割に関係しないケモカイン受容体の本来の機能を阻害するのに有用であることができる。従って、本明細書で同定される小分子阻害剤は、とりわけいかなるＨＩＶに感染していないヒトにおける免疫系の治療、炎症、および発症のための潜在的用途を有する有用な治療薬である。
【０１１２】
本発明は、そのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのＨＩＶ−１  ｇｐ１２０の結合の阻害方法を包含する。該方法は、ケモカイン受容体へのｇｐ１２０の結合がウイルスのｇｐ１２０タンパク質のケモカイン受容体結合部位により媒介される場合にこうした結合を阻害する小分子とｇｐ１２０を接触させることを含んで成る。小分子は本明細書の別の場所に既に開示されたとおり同定する。小分子の結合阻害剤とｇｐ１２０を接触させることは、細胞のケモカイン受容体とのｇｐ１２０の結合を阻害する。
【０１１３】
本発明は細胞のＨＩＶ−１感染の阻害方法もまた包含する。該方法は、本明細書の別の場所に既に記述されたとおり同定された小分子と細胞を接触させることを含んで成る。そのように同定された小分子は、ウイルスのｇｐ１２０のケモカイン受容体結合部位により媒介される、細胞のケモカイン受容体へのＨＩＶ−１  ｇｐ１２０の結合を阻害する。小分子は、必須のｇｐ１２０とケモカイン受容体との相互作用（１種もしくは複数）を妨害することにより、それにより細胞のＨＩＶ−１感染を阻害する。事実、ケモカイン受容体へのｇｐ１２０の結合を封鎖する抗体およびケモカインがしばしばＨＩＶ感染もまた封鎖することが既に立証されている（Ｌｅｅら、１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、印刷中；Ｏｌｓｏｎら、１９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、印刷中；Ｗｕら、１９９７、Ｊ．Ｅｘｐ、Ｍｅｄ．）。従って、本発明は、ｇｐ１２０のケモカイン受容体結合部位を使用する細胞のケモカイン受容体へのｇｐ１２０の結合の小分子阻害剤を使用する、標的細胞のＨＩＶ−１感染に必要とされる受容体とリガンドの相互作用を妨害することによる、ＨＩＶ−１感染の阻害方法を包含する。
【０１１４】
本発明は、製薬学的に適する担体中にＣＤ４非依存性のＨＩＶ−１  ＥｎｖおよびＨＩＶ感染症を治療するのに使用される最低１種の化合物を含んで成る組成物もまた包含する。本明細書の別の場所に記述されるとおり、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖは、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖポリペプチド、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖをコードする核酸、および／もしくはＨＩＶ−１  ｅｎｖを発現する細胞であることができる。さらに、本明細書の別の場所に既に開示されたとおり、本発明は、例えば限定されるものでないがプロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、逆転写構造阻害剤類（ヌクレオシドおよび非ヌクレオシド双方の類似物を包含する）、インターフェロン、ＡＺＴ、インターロイキン−２およびサイトカインのような、ＨＩＶ感染症を治療するのに使用される化合物を包含すると解釈されるべきである。
【０１１５】
本発明はヒトにおけるＨＩＶ−１感染症の治療方法を包含する。該方法は、免疫原性の用量のＣＤ４非依存性のＨＩＶ−１  ＥｎｖをＨＩＶ−１に感染したヒトに投与することを含んで成る。こうしたＣＤ４非依存性のＨＩＶ−１  Ｅｎｖの投与は、ｇｐ１２０の安定に露出されたケモカイン受容体結合部位に対する抗体の産生を誘導する。従って、ＣＤ４非依存性のＨＩＶ−１  Ｅｎｖの投与は、宿主細胞のＨＩＶ−１感染に必要とされるｇｐ１２０とケモカイン受容体の相互作用（１種もしくは複数）を封鎖する潜在的中和抗体の産生を引き起こす。これは、本明細書の別の場所に開示される、ＣＤ４非依存性のｇｐ１２０は、安定に露出されたケモカイン受容体結合部位を含まないそれ以外は同一のＣＤ４依存性のｇｐ１２０よりも、中和抗体に対しより感受性であるという事実により示唆される。さらに、Ｅｎｖとケモカイン受容体の相互作用を封鎖する抗体はＨＩＶ−１を中和することができる（Ｗｕら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  ３８４：１７９−１８３；Ｔｒｋｏｌａら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  ３８４：１８４−１８７）。従って、ケモカイン受容体結合部位の増大された露出はこの保存された領域に対する抗体の産生を高めることができ、この抗体は必須のｇｐ１２０とケモカイン受容体の相互作用を阻害する。従って、ＣＤ４非依存性のＥｎｖでヒトを免疫化することは、安定に露出されたケモカイン受容体結合部位に対する抗体の産生を引き起こし、この抗体は感染に必要とされる必須のＥｎｖとケモカイン受容体の相互作用を封鎖して、それによりヒトにおけるＨＩＶ−１感染症を治療する。
【０１１６】
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、免疫原性の用量のＣＤ４非依存性のＨＩＶ−１  Ｅｎｖが、ＨＩＶ−１ウイルスへの曝露の前および後双方のヒトにおけるＨＩＶ−１感染を治療および／もしくは緩和するのに有用な治療薬であることができることの真価をみとめるであろう。すなわち、免疫原性の用量は、ＨＩＶ−１によるヒトの感染の前、その間もしくは後に投与することができる。それがいつ投与されるかに関係なく、免疫原は、とりわけｇｐ１２０の安定に露出されたケモカイン受容体結合部位に対するヒトにおける応答を導き出し、それによりケモカイン受容体へのウイルスのｇｐ１２０の結合を阻害する応答を誘導する。この阻害は既に感染した個体ならびに未感染の人の双方で生じられる。ＨＩＶ−１に既に感染した個体において、免疫原は該個体中に既に存在するいずれかの免疫応答に加えて免疫応答を生じさせ、そして従ってその個体におけるウイルス負荷の低下を媒介する。従って、ＣＤ４非依存性のＨＩＶ−１  Ｅｎｖは、ＨＩＶ−１ウイルスにより既に感染したヒトにおける治療的ワクチンとして有用である。
【０１１７】
本明細書の別の場所に既に開示されたとおり、当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、免疫原性の用量のＣＤ４非依存性のＨＩＶ−１  Ｅｎｖはタンパク質、核酸（ベクターもしくは裸のＤＮＡを含んで成る）および／またはＣＤ４非依存性のｅｎｖをコードする核酸を発現する細胞として投与することができることの真価をみとめるであろう。
【０１１８】
別の局面において、ヒトにおけるＨＩＶ−１感染症の治療方法は、ＨＩＶ感染症を治療するために使用される化合物をさらに投与することを含んで成る。本明細書の別の場所に既に開示されたとおり、こうした化合物は、限定されるものでないが、プロテアーゼ阻害剤、１種の逆転写酵素阻害剤、１種の逆転写酵素阻害剤（ヌクレオシドおよび非ヌクレオシド双方の類似物を包含する）、インターフェロン、ＡＺＴ、インターロイキン−２およびサイトカインを挙げることができる。化合物は、免疫原性の用量のＣＤ４非依存性のＨＩＶ−１  Ｅｎｖの投与前、その間もしくは後に投与することができる。
【０１１９】
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、免疫原性の用量のＣＤ４非依存性のＨＩＶ−１  Ｅｎｖに関する化合物の時間的調節が、ＨＩＶ−１  ＥｎｖおよびＥｎｖ免疫原とともに投与される特定の化合物（１種もしくは複数）、ならびに患者の健康および齢ならびに疾患過程の重症度および段階に関する免疫感作レジメンに依存することができることの真価をみとめるであろう。
【０１２０】
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ免疫原（１種もしくは複数）および／または本明細書に記述される方法のいずれかを使用して同定される化合物は、今や記述されるとおりに処方しかつＨＩＶ感染症の治療および／もしくは予防のため哺乳動物に投与することができる。
【０１２１】
本発明は、有効成分としてＨＩＶ感染症の治療に有用な化合物を含んで成る製薬学的組成物の製造法および使用を包含する。こうした製薬学的組成物は、被験体への投与に適する形態の、最低１種の有効成分の組み合わせ剤（例えば、免疫原性の用量のＣＤ４非依存性のＨＩＶ−１  Ｅｎｖおよびインターロイキン−２のようなＨＩＶ感染症を治療するのに使用される化合物）として有効成分単独より成ることができるか、あるいは、製薬学的組成物は、有効成分、および１種もしくはそれ以上の製薬学的に許容できる担体、１種もしくはそれ以上の付加的成分、またはこれらの数種の組み合わせを含むことができる。有効成分は、当該技術分野で公知であるように、生理学的に許容できる陽イオンもしくは陰イオンとの組み合わせでのような生理学的に許容できるエステルもしくは塩の形態で製薬学的組成物中に存在することができる。
【０１２２】
本明細書で使用されるところの「製薬学的に許容できる担体」という用語は、それと有効成分を組み合わせることができかつ被験体に有効成分を投与するのに組み合わせの後に使用することができる化学的組成物を意味する。
【０１２３】
本明細書で使用されるところの「生理学的に許容できる」エステルもしくは塩という用語は、エステルもしくは塩の形態の有効成分を意味し、これは製薬学的組成物のいかなる他の成分とも適合性であり、それは該組成物を投与すべきである被験体に対し有害でない。
【０１２４】
本明細書に記述される製薬学的組成物の製剤は、既知のもしくは薬理学の技術分野で将来開発されるいずれかの方法により製造することができる。一般に、こうした予備的（ｐｒｅｐａｒａｔｏｒｙ）方法は、有効成分を担体または１種もしくはそれ以上の他の補助成分と連合させること、およびその後、必要もしくは所望の場合は、生成物を所望の単一もしくは複数用量の単位に造形もしくは包装することの段階を包含する。
【０１２５】
本明細書に提供される製薬学的組成物の記述は、主としてヒトへの倫理的投与に適する製薬学的組成物に向けられるとは言え、こうした組成物は一般に全部の種類の動物への投与に適することが当業者により理解されるであろう。製薬学的組成物を多様な動物への投与に適するようにするための、ヒトへの投与に適する該組成物の改変は十分に理解されており、そして通常の熟練を積んだ家畜の薬理学者は、単に通常の（あれば）実験を用いてこうした改変を設計かつ実施することができる。本発明の製薬学的組成物の投与が企図される被験体は、限定されるものでないがヒトおよび他の霊長類、非ヒトの霊長類、畜牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコおよびイヌのような商業的に関連のある哺乳動物を包含する哺乳動物、ニワトリ、アヒル、ガチョウおよびシチメンチョウのような商業的に関連のある鳥を包含する鳥類、養殖された（ｆａｒｍ−ｒａｉｓｅｄ）魚および養魚池の魚を包含する魚、ならびに養殖された貝のような甲殻類を挙げることができる。
【０１２６】
本発明の方法で有用である製薬学的組成物は、経口、直腸、膣、非経口、局所、肺、鼻内、口腔内、眼、もしくは別の投与経路に適する製剤で製造、包装もしくは販売することができる。他の企図される製剤は、射出されたナノ粒子、リポソーム製剤、有効成分を含有する再封止赤血球、および免疫学的に基づく製剤を包含する。
【０１２７】
本発明の製薬学的組成物は、単一単位用量としてもしくは複数の単一単位用量として、バルクで製造、包装もしくは販売することができる。本明細書で使用されるところの「単位用量」は、予め決められた量の有効成分を含んで成る製薬学的組成物の別個の量である。有効成分の量は、一般に、被験体に投与されることができる有効成分の投薬量、または例えばこうした投薬量の半分もしくは１／３のようなこうした投薬量の便宜的な画分に等しい。
【０１２８】
本発明の製薬学的組成物中の有効成分、製薬学的に許容できる担体およびいずれかの付加的成分の相対量は、治療される被験体の正体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、大きさおよび病状に依存して、またさらに組成物が投与されるはずである経路に依存して、変動することができる。例として、組成物は０．１％と１００％（ｗ／ｗ）との間の有効成分を含むことができる。
【０１２９】
本発明の製薬学的組成物は、有効成分に加え、１種もしくはそれ以上の付加的な製薬学的有効成分をさらに含むことができる。とりわけ企図される付加的成分は、抗吐薬、ならびにシアニドおよびシアン酸塩スカベンジャーのようなスカベンジャー、ならびにＡＺＴ、プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、インターロイキン−２、インターフェロン、サイトカインなどを包含する。
【０１３０】
本発明の製薬学的組成物の制御もしくは持続性放出製剤は、慣習的技術を使用して作成することができる。
【０１３１】
経口投与に適する本発明の製薬学的組成物の製剤は、限定されるものでないが錠剤、硬もしくは軟カプセル剤、カシェ剤、トローチ剤または舐剤を挙げることができる別個の固体の用量単位の形態で製造、包装もしくは販売することができ、それぞれは予め決められた量の有効成分を含有する。経口投与に適する他の製剤は、限定されるものでないが粉末状もしくは顆粒状製剤、水性もしくは油性の懸濁剤、水性もしくは油性の溶液、または乳剤を挙げることができる。
【０１３２】
本明細書で使用されるところの「油性」の液体は、炭素を含有する液体分子を含んで成りかつ水より小さい極性の特徴を表すものである。
【０１３３】
有効成分を含んで成る錠剤は、例えば、場合によっては１種もしくはそれ以上の付加的成分とともに、有効成分を圧縮もしくは成形することにより作成することができる。圧縮錠剤は、場合によっては結合剤、滑沢剤、賦形剤、界面活性剤および分散助剤の１種もしくはそれ以上と混合された粉末状もしくは顆粒状の調製物のような、自由に流動する形態の有効成分を適する装置中で圧縮することにより製造することができる。成形錠剤は、有効成分、製薬学的に許容できる担体、および混合物を湿らせるのに少なくとも十分な液体の混合物を、適する装置中で成形することにより作成することができる。錠剤の製造で使用される製薬学的に許容できる賦形剤は、限定されるものでないが不活性希釈剤、顆粒化および崩壊剤、結合剤、ならびに滑沢剤を挙げることができる。既知の分散助剤は、限定されるものでないがバレイショデンプンおよびデンプングリコール酸ナトリウムを挙げることができる。既知の界面活性剤は、限定されるものでないがラウリル硫酸ナトリウムを挙げることができる。既知の希釈剤は、限定されるものでないが炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖、微晶質セルロース、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウムおよびリン酸ナトリウムを挙げることができる。既知の顆粒化および崩壊剤は、限定されるものでないがトウモロコシデンプンおよびアルギン酸を挙げることができる。既知の結合剤は、限定されるものでないがゼラチン、アラビアゴム、前ゼラチン化された（ｐｒｅ−ｇｅｌａｔｉｎｉｚｅｄ）トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースを挙げることができる。既知の滑沢剤は、限定されるものでないがステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シリカおよびタルクを挙げることができる。
【０１３４】
錠剤は、コーティングされなくてよいか、もしくは、それらは被験体の消化管における遅延した崩壊を達成するために既知の方法を使用してコーティングすることができ、それにより有効成分の持続性の放出および吸収を提供する。例として、グリセリルモノステアレートもしくはグリセリルジステアレートのような素材を、錠剤をコーティングするのに使用することができる。さらなる例として、錠剤は、浸透圧で制御される放出錠剤を形成するために、米国特許第４，２５６，１０８号；同第４，１６０，４５２号；および同第４，２６５，８７４号明細書に記述される方法を使用してコーティングすることができる。錠剤は、製薬学的に上質のかつ味のよい製剤を提供するために、甘味料、香味料、着色料、保存剤もしくはこれらの数種の組み合わせをさらに含むことができる。
【０１３５】
有効成分を含んで成る硬カプセル剤は、ゼラチンのような生理学的に分解可能な組成物を使用して作成することができる。こうした硬カプセル剤は有効成分を含んで成り、また、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムもしくはカオリンのような不活性の固体の希釈剤を包含する付加的成分をさらに含むことができる。
【０１３６】
有効成分を含んで成る軟ゼラチンカプセル剤は、ゼラチンのような生理学的に分解可能な組成物を使用して作成することができる。こうした軟カプセル剤は、水、またはラッカセイ油、流動パラフィンもしくはオリーブ油のような油媒体と混合することができる有効成分を含んで成る。
【０１３７】
経口投与に適する本発明の製薬学的組成物の液体製剤は、液体の形態で、または使用前に水もしくは別の適するベヒクルを用いる再構成に意図される乾燥生成物の形態のいずれかで製造、包装および販売することができる。
【０１３８】
液体の懸濁剤は、水性もしくは油性のベヒクル中の有効成分の懸濁剤を達成する慣習的方法を使用して製造することができる。水性ベヒクルは、例えば水および等張の生理的食塩水を包含する。油性ベヒクルは、例えば扁桃油、油性エステル、エチルアルコール、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油もしくはココナツ油のような植物油、分別された（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ）植物油、および流動パラフィンのような鉱物油を包含する。液体の懸濁剤は、限定されるものでないが、懸濁化剤、分散もしくは湿潤剤、乳化剤、粘滑剤、保存剤、緩衝剤、塩、香味料、着色料および甘味料を挙げることができる１種もしくはそれ以上の付加的成分をさらに含むことができる。油性の懸濁剤は増粘剤をさらに含むことができる。既知の懸濁化剤は、限定されるものでないがソルビトールシロップ、水素化可食脂肪、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム、アラビアゴム、およびカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなセルロース誘導体を挙げることができる。既知の分散もしくは湿潤剤は、限定されるものでないが、レシチンのような天然に存在するホスファチド、脂肪酸、長鎖脂肪族アルコール、脂肪酸およびヘキシトール由来の部分的エステル、もしくは脂肪酸およびヘキシトール無水物由来の部分的エステルとのアルキレンオキシドの縮合生成物（例えば、それぞれ、ポリオキシエチレンステアレート、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートおよびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）を挙げることができる。既知の乳化剤は限定されるものでないがレシチンおよびアラビアゴムを挙げることができる。既知の保存剤は、限定されるものでないが、パラヒドロキシ安息香酸メチル、エチルもしくはｎ−プロピル、アスコルビン酸およびソルビン酸を挙げることができる。既知の甘味料は、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、ショ糖およびサッカリンを包含する。油性懸濁剤のための既知の増粘剤は、例えばミツロウ、硬質パラフィンおよびセチルアルコールを包含する。
【０１３９】
水性もしくは油性の溶媒中の有効成分の液体の溶液は、液体の懸濁剤と実質的に同一の様式で製造することができ、主な差異は、有効成分を溶媒中に懸濁するよりはむしろ溶解することである。本発明の製薬学的組成物の液体の溶液は、液体の懸濁剤に関して記述された成分のそれぞれを含むことができ、懸濁化剤は溶媒中の有効成分の溶解を必ずしも補助しないことができることが理解される。水性溶媒は、例えば水および等張の生理的食塩水を包含する。油性の溶媒は、例えば、扁桃油、油性エステル、エチルアルコール、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油もしくはココナツ油のような植物油、分別された植物油、および流動パラフィンのような鉱物油を包含する。
【０１４０】
本発明の製薬学的製剤の粉末状および顆粒状の製剤は既知の方法を使用して製造することができる。こうした製剤は、被験体に直接投与することができ、例えば錠剤を形成する、カプセルを充填する、またはそれへの水性もしくは油性のベヒクルの添加により水性もしくは油性の懸濁剤もしくは溶液を製造するのに使用することができる。これらの製剤のそれぞれは、分散もしくは湿潤剤、懸濁化剤および保存剤の１種もしくはそれ以上をさらに含むことができる。増量剤および甘味料、香味料もしくは着色料のような付加的な賦形剤もまたこれらの製剤中に包含することができる。
【０１４１】
本発明の製薬学的組成物は、水中油乳剤もしくは油中水乳剤の形態で製造、包装もしくは販売することもまたできる。油相は、オリーブ油もしくはラッカセイ油のような植物油、流動パラフィンのような鉱物油、またはこれらの組み合わせであることができる。こうした組成物は、アラビアゴムもしくはトラガカントガムのような天然に存在するガム、ダイズもしくはレシチンのホスファチドのような天然に存在するホスファチド、ソルビタンモノオレエートのような脂肪酸およびヘキシトール無水物の組み合わせ由来のエステルもしくは部分的エステル、ならびにポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートのようなエチレンオキシドとのこうした部分的エステルの縮合生成物のような１種もしくはそれ以上の乳化剤をさらに含むことができる。これらの乳剤は、例えば甘味料もしくは香味料を包含する付加的成分もまた含有することができる。
【０１４２】
本発明の製薬学的組成物は、直腸投与に適する製剤で製造、包装もしくは販売することができる。こうした組成物は例えば坐剤、保持浣腸製剤、および直腸もしくは結腸の灌注のための溶液の形態であることができる。
【０１４３】
坐剤製剤は、通常の室温（すなわち約２０℃）で固体でありかつ被験体の直腸温（すなわち健康なヒトで約３７℃）で液体である非刺激性の製薬学的に許容できる賦形剤と有効成分を組み合わせることにより作成することができる。適する製薬学的に許容できる賦形剤は、限定されるものでないがカカオバター、ポリエチレングリコールおよび多様なグリセリドを挙げることができる。坐剤製剤は、限定されるものでないが抗酸化剤および保存剤を挙げることができる多様な付加的成分をさらに含むことができる。
【０１４４】
保持浣腸製剤、または直腸もしくは結腸の灌注のための溶液は、有効成分を製薬学的に許容できる液体の担体と組み合わせることにより作成することができる。当該技術分野で公知であるとおり、浣腸製剤は、被験体の直腸の解剖学的構造に適合された送達装置を使用して投与することができ、かつ、それ内に包装することができる。浣腸製剤は、限定されるものでないが抗酸化剤および保存剤を挙げることができる多様な付加的成分をさらに含むことができる。
【０１４５】
本発明の製薬学的組成物は、膣投与に適する製剤で製造、包装もしくは販売することができる。こうした組成物は、例えば坐剤、タンポンのような含浸もしくは被覆された膣に挿入可能な素材、ビデ製剤、またはゲルもしくはクリーム、または膣灌注のための溶液の形態にあることができる。
【０１４６】
化学的組成物で素材を含浸もしくはコーティングするための方法は当該技術分野で既知であり、そして、限定されるものでないが表面上に化学的組成物を沈殿もしくは結合する方法、化学的組成物を素材の合成（すなわち生理学的に分解可能な素材を用いるような）の間に素材の構造中に組み込む方法、およびその後の乾燥を伴いもしくは伴わずに吸収体素材に水性もしくは油性の溶液もしくは懸濁剤を吸収させる方法を挙げることができる。
【０１４７】
膣灌注のためのビデ製剤もしくは溶液は、有効成分を製薬学的に許容できる液体の担体と組み合わせることにより作成することができる。当該技術分野で公知であるとおり、ビデ製剤は、被験体の膣の解剖学的構造に適合された送達装置を使用して投与することができ、かつ、それ内に包装することができる。ビデ製剤は、限定されるものでないが抗酸化剤、抗生物質、抗真菌剤および保存剤を挙げることができる多様な付加的成分をさらに含むことができる。
【０１４８】
本明細書で使用されるところの、製薬学的組成物の「非経口投与」は、被験体の組織の物理的破壊を特徴とするいずれかの投与経路、および組織中の破壊による製薬学的組成物の投与を包含する。従って、非経口投与は、限定されるものでないが、組成物の注入、外科的切開による組成物の適用、組織を浸透する非外科的創傷による組成物の適用などによる製薬学的組成物の投与を挙げることができる。とりわけ、非経口投与は、限定されるものでないが、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内注入、および腎透析注入技術を挙げることができることが企図される。
【０１４９】
非経口投与に適する製薬学的組成物の製剤は、滅菌水もしくは滅菌の等張の生理学的食塩水のような製薬学的に許容できる担体と組み合わせられた有効成分を含んで成る。こうした製剤は、ボーラス投与もしくは連続的投与に適する形態で製造、包装もしくは販売することができる。注入可能な製剤は、アンプル、もしくは保存剤を含有する複数用量の容器中のような単位投与剤形で製造、包装もしくは販売することができる。非経口投与のための製剤は、限定されるものでないが、油性もしくは水性ベヒクル中の懸濁剤、溶液、乳剤、パスタ剤および埋込可能な持続性放出もしくは生物分解可能な製剤を挙げることができる。こうした製剤は、限定されるものでないが、懸濁化剤、安定剤もしくは分散助剤を挙げることができる１種もしくはそれ以上の付加的成分をさらに含むことができる。非経口投与のための製剤の一態様において、有効成分は、再構成された組成物の非経口投与に先立ち適するベヒクル（例えば、滅菌の発熱性物質を含まない水）での再構成のための乾燥した（すなわち粉末もしくは顆粒の）形態で提供される。
【０１５０】
製薬学的組成物は、滅菌の注入可能な水性もしくは油性の懸濁剤もしくは溶液の形態で製造、包装もしくは販売することができる。この懸濁剤もしくは溶液は、既知技術に従って製造することができ、そして、有効成分に加えて、本明細書に記述される分散助剤、湿潤剤もしくは懸濁化剤のような付加的成分を含むことができる。こうした滅菌の注入可能な製剤は、例えば水もしくは１，３−ブタンジオールのような非毒性の非経口で許容できる希釈剤もしくは溶媒を使用して製造することができる。他の許容できる希釈剤および溶媒は、限定されるものでないがリンゲル溶液、等張の塩化ナトリウム溶液、および合成のモノもしくはジグリセリドのような固定油を挙げることができる。有用である他の非経口で投与可能な製剤は、微晶質の形態で、リポソーム製剤中に、もしくは生物分解可能なポリマー系の成分として有効成分を含んで成るものを包含する。持続性の放出もしくは埋込のための組成物は、乳剤、イオン交換樹脂、わずかに可溶性のポリマーもしくはわずかに可溶性の塩のような製薬学的に許容できるポリマー性もしくは疎水性の素材を含むことができる。
【０１５１】
局所投与に適する製剤は、限定されるものでないが、リニメント剤、ローション剤、クリーム剤、軟膏剤もしくはパスタ剤のような水中油もしくは油中水乳剤、および溶液もしくは懸濁剤のような液体もしくは半液体の製剤を挙げることができる。局所で投与可能な製剤は、例えば約１％から約１０％（ｗ／ｗ）までの有効成分を含んで成ることができるとは言え、有効成分の濃度は溶媒中での有効成分の溶解性の限界と同じくらい高いことができる。局所投与のための製剤は、本明細書に記述される付加的成分の１種もしくはそれ以上をさらに含むことができる。
【０１５２】
本発明の製薬学的組成物は、口腔を介する肺投与に適する製剤で製造、包装もしくは販売することができる。こうした製剤は、有効成分を含んで成りかつ約０．５から約７ナノメートルまで、および好ましくは約１から約６ナノメートルまでの範囲の直径を有する乾燥粒子を含むことができる。こうした組成物は、便宜的に、粉末を分散するよう噴射剤の流れをそれに向けることができる乾燥粉末溜めを含んで成る装置を使用する、または、封止された容器中の低沸点噴射剤中に溶解もしくは懸濁された有効成分を含んで成る装置のような自己噴射溶媒／粉末分注容器を使用する投与のための乾燥粉末の形態にある。好ましくは、こうした粉末は、重量で粒子の最低９８％が０．５ナノメートルより大きい直径を有しかつ数で粒子の最低９５％が７ナノメートル未満の直径を有する粒子を含んで成る。より好ましくは、重量で粒子の最低９５％が１ナノメートルより大きい直径を有し、かつ、数で粒子の最低９０％が６ナノメートル未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は、好ましくは、糖のような固体の微細な粉末希釈剤を包含し、また、便宜的には単位投与剤形で提供される。
【０１５３】
低沸点噴射剤は、一般に、大気圧で６５°Ｆより下の沸点を有する液体噴射剤を包含する。一般に、噴射剤は組成物の５０ないし９９．９％（ｗ／ｗ）を構成することができ、そして有効成分は組成物の０．１ないし２０％（ｗ／ｗ）を構成することができる。噴射剤は、液体の非イオン性もしくは固体の陰イオン性界面活性剤、または固体の希釈剤（好ましくは、有効成分を含んで成る粒子と同一の桁の粒子径を有する）のような付加的成分をさらに含むことができる。
【０１５４】
肺送達のため処方される本発明の製薬学的組成物は、有効成分を溶液もしくは懸濁剤の小滴の形態でもまた提供することができる。こうした製剤は、場合によっては滅菌の、有効成分を含んで成る水性もしくは希アルコール性の溶液もしくは懸濁剤として製造、包装もしくは販売することができ、かつ、便宜的には、いずれかの噴霧（ｎｅｂｕｌｉｚａｔｉｏｎ）もしくは噴霧（ａｔｏｍｉｚａｔｉｏｎ）装置を使用して投与することができる。こうした製剤は、限定されるものでないが、サッカリンナトリウムのような香味料、揮発性油、緩衝剤、界面活性剤、もしくはヒドロキシ安息香酸メチルのような保存剤を挙げることができる１種もしくはそれ以上の付加的成分をさらに含むことができる。この投与経路により提供される小滴は、好ましくは、約０．１から約２００ナノメートルまでの範囲の平均直径を有する。
【０１５５】
肺送達に有用であるとして本明細書に記述される製剤は、本発明の製薬学的組成物の鼻内送達にもまた有用である。
【０１５６】
鼻内投与に適する別の製剤は、有効成分を含んで成りかつ約０．２から５００マイクロメートルまでの平均粒子を有する粗い粉末である。こうした製剤は、嗅剤が摂取される様式で、すなわち鼻孔近くに保持される粉末の容器からの鼻の通過による迅速吸入により投与する。
【０１５７】
鼻投与に適する製剤は、例えば、０．１％（ｗ／ｗ）と同じくらいから、そして１００％（ｗ／ｗ）と同じくらいの有効成分を含んで成り、そして本明細書に記述される付加的成分の１種もしくはそれ以上をさらに含むことができる。
【０１５８】
本発明の製薬学的組成物は、口腔内投与に適する製剤で製造、包装もしくは販売することができる。こうした製剤は、例えば慣習的方法を使用して作成された錠剤もしくは舐剤の形態であることができ、そして、例えば、０．１ないし２０％（ｗ／ｗ）の有効成分であることができ、均衡は、経口で溶解可能もしくは分解可能な組成物および場合によっては本明細書に記述される付加的成分の１種もしくはそれ以上を含んで成る。あるいは、口腔内投与に適する製剤は、有効成分を含んで成る散剤またはエアゾル化もしくは噴霧される溶液もしくは懸濁剤を含むことができる。こうした粉末状、エアゾル化もしくはエアゾル化された製剤は、分散される場合に、好ましくは約０．１から約２００ナノメートルまでの範囲の平均粒子もしくは小滴径を有し、また、本明細書に記述される付加的成分の１種もしくはそれ以上をさらに含むことができる。
【０１５９】
本発明の製薬学的組成物は、眼投与に適する製剤で製造、包装もしくは販売することができる。こうした製剤は、例えば、例えば水性もしくは油性の液体担体中に０．１〜１．０％（ｗ／ｗ）の有効成分の溶液もしくは懸濁液を包含する点眼薬の形態であることができる。こうした点眼薬は、緩衝剤、塩、または本明細書に記述される付加的成分の１種もしくはそれ以上の他者をさらに含むことができる。有用である他の眼に（ｏｐｈｔｈａｌｍａｌｍｉｃａｌｌｙ）投与可能な製剤は、微晶質の形態でもしくはリポソーム製剤中に有効成分を含んで成るものを包含する。
【０１６０】
本明細書で使用されるところの「付加的成分」は、限定されるものでないが以下すなわち賦形剤；界面活性剤；分散助剤；不活性希釈剤；顆粒化および崩壊剤；結合剤；滑沢剤；甘味料；香味料；着色料；保存剤；ゼラチンのような生理学的に分解可能な組成物；水性のベヒクルおよび溶媒；油性のベヒクルおよび溶媒；懸濁化剤；分散もしくは湿潤剤；乳化剤、粘滑剤；緩衝剤；塩；増粘剤；増量剤；乳化剤；抗酸化剤；抗生物質；抗真菌剤；安定剤；ならびに製薬学的に許容できるポリマー性もしくは疎水性物質の１種もしくはそれ以上を挙げることができる。本発明の製薬学的組成物に包含することができる他の「付加的成分」は当該技術分野で既知であり、そして例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８５、Ｇｅｎａｒｏ編、マック  パブリッシング  カンパニー（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）、フィラデルフィア州イーストン）（引用により本明細書に組み込まれる）に記述される。
【０１６１】
典型的には、動物、好ましくはヒトに投与することができる本発明の化合物の投薬量は、動物の体重１キログラムあたり１μｇから約１００ｇまでの量の範囲にわたる。一方、投与される正確な投薬量は、限定されるものでないが動物の型および治療されている疾患状態の型、動物の齢および投与経路を挙げることができるいずれかの数の因子に依存して変動することができる。好ましくは、化合物の投薬量は、動物の体重１キログラムあたり約１ｍｇから約１０ｇまで変動することができる。より好ましくは、投薬量は動物の体重１キログラムあたり約１０ｍｇから約１ｇまで変動することができる。
【０１６２】
化合物は１日に数回と同じくらい頻繁に動物に投与することができるか、あるいは、それは、１日１回、週１回、２週間ごとに１回、月１回のような、より少なく頻繁に、あるいは数ヶ月ごとに１回または年１回もしくはより少なくさえのような、なおより少なく頻繁に投与することができる。投与の頻度は当業者に容易に明らかであることができ、そして、限定されるものでないが治療されている疾患の型および重症度、動物の型および齢などのようないずれかの数の因子に依存することができる。
【０１６３】
ＨＩＶ感染症を治療するのに使用される化合物は、免疫原性の用量のＣＤ４非依存性のＨＩＶ−１  Ｅｎｖと共投与することができる。あるいは、化合物（１種もしくは複数）を、免疫原性の用量（１個もしくは複数）のＨＩＶ−１  Ｅｎｖに先だって１時間、１日、１週間、１ヶ月もしくはなおより以上、またはそのいずれかの順序変更（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）で投与することができる。さらに、化合物（１種もしくは複数）は、免疫原性の用量（１個もしくは複数）のＨＩＶ−１  Ｅｎｖの後１時間、１日、１週間もしくはなおより以上、またはそのいずれかの順序変更で投与することができる。頻度および投与レジメンは当業者に容易に明らかであることができ、そして、限定されるものでないが治療されている疾患の型および重症度、動物の齢および健康状態、投与されている化合物もしくは化合物類の正体、多様な化合物およびＨＩＶ−１  Ｅｎｖの投与経路などのようないずれかの数の因子に依存することができる。
【０１６４】
本発明は、以下の実験的実施例への引用により詳細にさらに記述する。これらの実施例は具体的説明のみの目的上提供され、そして別の方法で明記されない限り制限であることを意図していない。従って、本発明は、以下の実施例に制限されると決して解釈されるべきでないが、しかしむしろ、本明細書に提供される教示の結果として明らかになるいずれかのおよび全部の変形物を包含すると解釈されるべきである。
定義
本明細書で使用されるところの以下の用語のそれぞれは、本節でそれに関連した意味を有する。
【０１６５】
冠詞「ａ」および「ａｎ」（ひとつの）は、該冠詞の文法上の目的語の１つもしくは１つ以上（すなわち最低１つ）を指すために本明細書で使用する。例として、「１つの要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は１個の要素もしくは１個以上の要素を意味する。
【０１６６】
本明細書で使用されるところの、ＨＩＶ−１感染症を「緩和する」ことは、該疾患もしくは障害の症状の重症度を低下させることを意味する。
【０１６７】
本明細書で使用されるところの「抗体」という用語は、抗原上の特定のエピトープに特異的に結合することが可能である免疫グロブリン分子を指す。抗体は、天然の供給源から、もしくは組換えの供給源から生じられた無傷の免疫グロブリンであることができ、また、無傷の免疫グロブリンの免疫反応性部分であることができる。抗体は、典型的には免疫グロブリン分子の四量体である。本発明の抗体は、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２、ならびに一本鎖抗体および人化抗体を包含する多様な形態で存在することができる（Ｈａｒｌｏｗら、１９８８、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー中；Ｈｏｕｓｔｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６）。
【０１６８】
本明細書で使用されるところの「合成抗体」という用語により、例えば本明細書に記述されるようなバクテリオファージにより発現される抗体のような、組換えＤＮＡ技術を使用して生じられる抗体を意味する。該用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成により生じられた抗体を意味すると解釈されるべきであり、そしてこのＤＮＡ分子は抗体タンパク質もしくは抗体を特定するアミノ酸配列を発現し、ここでＤＮＡもしくはアミノ酸配列は、利用可能かつ当該技術分野で公知である合成ＤＮＡもしくはアミノ酸配列の技術を使用して得られている。
【０１６９】
該用語が本明細書で使用されるところの「生物学的活性」により、タンパク質がその会合されたタンパク質（１種もしくは複数）と相互作用しかつ細胞内でおよび／もしくはＨＩＶ−１感染に関してその正常の機能（１種もしくは複数）を実施する能力を有することを意味する。一態様において、８ｘ  ｇｐ１２０は、該タンパク質がＣＸＣＲ４ケモカイン受容体タンパク質に結合するためおよび宿主細胞膜とのウイルスエンベロープの融合を媒介するためにＣＤ４との相互作用を必要としないため、その生物学的活性を保持する。さらに、それがＥｎｖのいずれかの形態もしくはフラグメントを指すところの生物学的活性は、該ポリペプチドが、それがＣＤ４にもまた結合するという要件なしにケモカイン受容体タンパク質に結合する能力を有することを意味する。
【０１７０】
該用語が本明細書で使用されるところの「ケモカイン受容体結合部位」により、限定されるものでないがＣＸＣＲ４もしくはＣＣＲ５のようなヒトケモカイン受容体タンパク質を特異的に結合するウイルスのｇｐ１２０の部分を意味する。従って、ＣＸＣＲ４ケモカイン受容体結合部位は、ＣＸＣＲ４ケモカイン受容体に特異的に結合するがしかしＣＣＲ５のような別のケモカイン受容体に実質的に結合しないＨＩＶ−１  ｇｐ１２０分子の一部分を意味する。同様に、ＣＣＲ５ケモカイン受容体結合部位は、ＣＣＲ５に特異的に結合するがしかしＣＸＣＲ４などのような別のケモカイン受容体を包含するいずれかの他の分子に有意に結合しないＨＩＶ−１  ｇｐ１２０分子の一部分を意味する。
【０１７１】
該用語が本明細書で使用されるところの「ＣＤ４非依存性」という用語により、ＨＩＶ−１株が、ＣＤ４タンパク質を発現しない細胞を感染させることが可能であり、かつ／もしくはＣＤ４に誘導されるコンホメーション変化（１種もしくは複数）の非存在下でそのｇｐ１２０が補助受容体に結合することができることを意味する。しかしながら、ＣＤ４非依存性のＨＩＶ−１はＣＤ４および適切なケモカイン受容体（これは必要とされないが）を発現する細胞もまた感染させることができる。
【０１７２】
本明細書で使用されるところの「キメラ」という用語により、異なるＨＩＶ−１株からのｅｎｖの一部分をコードする最低１種の核酸に共有結合されたｅｎｖの少なくとも一部分をコードする８ｘ核酸の一部分を含んで成る、ｅｎｖをコードする核酸を意味する。
【０１７３】
その用語が本明細書で使用されるところの「Ｅｎｖクローン」という用語により、ｇｐ１２０およびｇｐ４１を含んで成るＥｎｖタンパク質ｇｐ１６０をコードするｅｎｖ核酸を意味する。完全長のＥｎｖクローンは完全なＥｎｖタンパク質ｇｐ１６０をコードする一方、部分的クローンは、８ｘに特異的である突然変異を含むことができる８ｘ  Ｅｎｖのより小さい部分を構築するのに使用することができる完全長のクローンのフラグメント（１種もしくは複数）を包含する。
【０１７４】
本明細書で使用されるところの「相補性」は、２種の核酸（例えば２個のＤＮＡ分子）の間のサブユニット配列の相補性の広範な概念を指す。分子の双方のあるヌクレオチド位置が相互と塩基対形成することが通常は可能なヌクレオチドにより占有される場合には、該核酸はこの位置で相互に対し相補性であると考えられる。従って、分子のそれぞれの実質的な数（最低５０％）の対応する位置が通常相互と塩基対形成する（例えばＡ：ＴおよびＧ：Ｃヌクレオチド対）ヌクレオチドにより占有される場合に、２種の核酸は相互に対し相補性である。本明細書で定義されるところのアンチセンス配列は、タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の配列に対し相補性である。アンチセンス配列がＤＮＡ分子のコーディング鎖のコーディング部分に対してのみ相補性であることは必要ではない。アンチセンス配列は、タンパク質をコードするＤＮＡ分子のコーディング鎖上で明記された調節配列に対し相補性であることができ、この調節配列はコーディング配列の発現を制御する。
【０１７５】
「をコードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）核酸」もしくは「をコードする（ｃｏｄｉｎｇ）核酸」という用語の使用は、所望のタンパク質、および実際のコーディング配列に付随するいかなる必要な５’もしくは３’非翻訳領域もコードするＲＮＡもしくはＤＮＡ配列を包含すると解釈されるべきである。
【０１７６】
これらの用語が本明細書で使用されるところの「コードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」および「コードする（ｃｏｄｉｎｇ）」という用語により、核酸のヌクレオチド配列が目的の特定のポリペプチドを特定することが可能であることを意味する。すなわち、該核酸が転写および／もしくは翻訳されてポリペプチドを産生することができる。従って、例えば、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖをコードする核酸は、転写および／もしくは翻訳されてＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を産生することが可能である。
【０１７７】
本明細書で使用されるところの、ポリペプチドに適用されるところの「フラグメント」という用語は、通常、最低約７個の連続するアミノ酸、典型的には最低約１５個の連続するアミノ酸、より典型的には最低約３０個の連続するアミノ酸、典型的には最低約４０個の連続するアミノ酸、好ましくは最低約５０個のアミノ酸、なおより好ましくは最低約６０個のアミノ酸であることができ、そして最も好ましくは、ペプチドフラグメントは長さが約６０より長い連続するアミノ酸であることができる。
【０１７８】
本明細書で使用されるところの「相同な」は、２種のポリマー分子の間（例えば２種の核酸分子（例えば２種のＤＮＡ分子もしくは２種のＲＮＡ分子）の間、または２種のポリペプチド分子の間）のサブユニット配列の類似性を指す。２種の分子の双方のあるサブユニット位置が同一の単量体サブユニットにより占有される場合（例えば２種のＤＮＡ分子のそれぞれのある位置がアデニンにより占有される場合）には、それらはその位置で相同である。２種の配列の間の相同性は、適合するもしくは相同な位置の数の直接の関数であり、例えば、２種の化合物の配列の位置の半分（例えば長さが１０サブユニットのポリマーの５個の位置）が相同である場合には、該２配列は５０％相同であり、位置の９０％（例えば１０個のうち９個）が合致しているもしくは相同である場合は、該２配列は９０％の相同性を共有する。例として、ＤＮＡ配列３’ＡＴＴＧＣＣ５’および３’ＴＡＴＧＣＧ５’は５０％の相同性を共有する。
【０１７９】
さらに、目的の２種の核酸もしくは２種のタンパク質の間の相同性パーセントを計算するのにアルゴリズムを使用することができ、そしてこれらは当該技術分野で公知である。
【０１８０】
該用語が本明細書で使用されるところの「免疫原性の用量」という用語により、タンパク質（それがタンパク質として投与されようと核酸として投与されようと）が投与されないそれ以外は同一の哺乳動物の免疫応答に比較して、該タンパク質に対する検出可能な体液性および／もしくは細胞性免疫応答を生じさせるタンパク質の量を意味する。一局面において、該用量はＥｎｖタンパク質もしくはそのフラグメントとして投与する。別の局面において、該用量は核酸として投与する。
【０１８１】
本明細書で使用されるところの「単離された核酸」という用語により、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から分離されている核酸配列もしくはそのフラグメント（例えば、該フラグメントに通常隣接する配列（例えばそれが天然に存在するゲノム中で該フラグメントに隣接する配列）から取り出されているＤＮＡフラグメント）を意味する。該用語は、細胞中でそれに天然に付随する、核酸（例えばＲＮＡもしくはＤＮＡ）またはタンパク質に天然に付随する他の成分から実質的に精製されている核酸にもまた当てはまる。従って、該用語は、例えば、ベクター中；自律性に複製するプラスミドもしくはウイルス中；または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に組込まれる；あるいは他の配列に依存せず別個の分子として（例えばｃＤＮＡ、またはＰＣＲもしくは制限酵素消化により生じられるゲノムもしくはｃＤＮＡのフラグメントとして）存在する組換えＤＮＡを包含する。それは、付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡもまた包含する。
【０１８２】
本明細書で使用されるところの「単離されたペプチド」、「単離されたポリペプチド」もしくは「単離されたタンパク質」という用語により、細胞中で該タンパク質もしくはペプチドに天然に付随する成分（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、他のタンパク質およびペプチド、炭水化物ならびに脂質）から実質的に分離されているペプチドもしくはタンパク質を意味する。単離されたペプチドおよびタンパク質という用語は、単離された核酸を含んで成る細胞から発現および／もしくは分泌されるペプチドもしくはタンパク質を包含すると解釈することができる。
【０１８３】
本発明のペプチド（もしくはそれをコードするＤＮＡ）の「突然変異体」、「誘導体」および「変異体」は、該ペプチド（もしくはＤＮＡ）が本明細書に再引用される配列に同一でないように１個もしくはそれ以上のアミノ酸（または１個もしくはそれ以上の塩基対）で変えることができるが、しかし該ペプチドがＣＤ４非依存性の様式でケモカイン受容体タンパク質に結合するという特性を有するため本明細書に開示されるペプチドと同一の特性を有するペプチドである。
【０１８４】
本明細書で使用されるところの「製薬学的に許容できる担体」という用語は、適切なＥｎｖタンパク質をそれと組み合わせることができかつ組み合わせ後に患者に該タンパク質を投与するのに使用することができる化学的組成物を意味する。
【０１８５】
本明細書で使用されるところの「特異的に結合する」という用語により、例えばＣＸＣＲ４ポリペプチドを認識かつ結合するがしかしサンプル中の他の分子を実質的に認識もしくは結合しないケモカイン受容体結合部位を意味する。同様に、ケモカイン受容体結合部位は、該結合部位がサンプル中のＣＸＣＲ４を認識かつ結合するがしかしサンプル中の他の分子（例えばＣＣＲ５）を実質的に認識もしくは結合しない場合に「ＣＸＣＲ４を特異的に結合する」。同様に、ケモカイン受容体結合部位はＣＣＲ５を特異的に結合することができ、そして従ってＣＸＣＲ４のような他の分子を結合しないとみられる。
【０１８６】
遊走群は、感染した細胞からのＨＩＶのクローン化されないストックを指す。こうしたストックは、創始体（ｆｏｕｎｄｅｒ）もしくは親のウイルスの多くの遺伝子的に別個の変異体を含有することが既知であり、これゆえに「遊走群」という用語である。
【０１８７】
本明細書で使用されるところの「安定に露出されたケモカイン受容体結合部位」という用語は、典型的にケモカイン受容体タンパク質のｇｐ１２０結合に前もって必要であるＣＤ４とのｇｐ１２０の相互作用に対する必要性なしに、ケモカイン受容体タンパク質に結合するのにｇｐ１２０ケモカイン受容体結合部位が利用可能であることを意味する。本明細書に開示されるデータにより立証されるとおり、ｇｐ１２０のケモカイン受容体結合部位は、ＣＤ４の結合前のそれ以外は同一のＣＤ４依存性のｇｐ１２０よりも抗体中和に対しより感受性である、安定な露出された配置で存在することができる。安定に露出された形態のケモカイン結合部位は、最低約３ヶ月の期間の間および／もしくは無期限に溶液中で存在することができる。
【０１８８】
本明細書で使用されるところの「実質的に純粋な」という用語は、天然にそれに不随する成分から分離されている化合物（例えば核酸、タンパク質もしくはポリペプチド）を記述する。典型的には、サンプル中の総物質の最低約１０％、好ましくは最低約２０％、より好ましくは最低約５０％、さらにより好ましくは最低約７５％、なおより好ましくは最低約９０％、そして最も好ましくは最低約９９％（容積で、湿もしくは乾燥重量で、またはモルパーセントもしくはモル画分で）が目的の化合物である場合に、化合物は実質的に純粋である。純度は、いずれかの適切な方法により、例えばカラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動もしくはＨＰＬＣ分析により測定することができる。
【０１８９】
化合物（例えば核酸、タンパク質もしくはポリペプチド）は、それが天然に関連する成分を本質的に含まない場合、もしくはそれがその天然の状態でそれに付随する天然の汚染物質から分離されている場合にもまた「実質的に精製されて」いる。従って、本明細書で使用されるところの、核酸の「実質的に純粋な」調製物は、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から精製されている核酸配列（例えばそれが天然に存在するゲノム中で該フラグメントに通常隣接する配列から取り出されているＤＮＡフラグメント）を指す。
【０１９０】
同様に、本明細書で使用されるところの、タンパク質もしくはポリペプチドの「実質的に純粋な」調製物は、その天然に存在する状態でそれが通常伴う成分から精製されているタンパク質もしくはポリペプチドを指す。
【０１９１】
本明細書で使用されるところの「治療する」ことは、ＨＩＶ−１感染症の症状が患者により経験される頻度を低下させることを意味する。
【０１９２】
該用語が本明細書で使用されるところの「誘導された」により、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖタンパク質は、ｇｐ１２０がＣＸＣＲ４もしくはＣＣＲ５のようなケモカイン受容体タンパク質に結合することができる前にＣＤ４に結合することを必要としないことを意味する。好ましくは、誘導されたＥｎｖは、ＣＤ４への結合の非存在下でケモカイン受容体を結合することができるコンホメーションにあるｇｐ１２０を含んで成る。
【０１９３】
本明細書で使用されるところの「ベクター」という用語により、外因性の核酸をコードするいかなるプラスミドもしくはウイルスも意味する。該用語は、例えばポリリシン化合物などのような、ビリオンもしくは細胞中への核酸の移入を助長する非プラスミドおよび非ウイルス化合物を包含するようにもまた解釈されるべきである。ベクターは、患者へのＨＩＶ−１  Ｅｎｖタンパク質もしくはＨＩＶ−１  ｅｎｖをコードする核酸の送達のための送達ベヒクルとして適するウイルスベクターであることができるか、または、ベクターは、同一の目的上適する非ウイルスベクターであることができる。細胞および組織へのＤＮＡの送達のためのウイルスおよび非ウイルスベクターの例は当該技術分野で公知であり、そして例えばＭａら（１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１２７４４−１２７４６）に記述される。ウイルスベクターの例は、限定されるものでないが組換えワクシニアウイルス、組換えアデノウイルス、組換えレトロウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス、組換えトリポックスウイルスなどを挙げることができる（Ｃｒａｎａｇｅら、１９８６、ＥＭＢＯ  Ｊ．５：３０５７−３０６３；国際特許出願第ＷＯ９４／１７８１０号明細書（１９９４年８月１８日公開）；国際特許出願第ＷＯ９４／２３７４４号明細書（１９９４年１０月２７日公開））。非ウイルスベクターの例は、限定されるものでないがリポソーム、ＤＮＡのポリアミン誘導体などを挙げることができる。
【０１９４】
該用語が本明細書で使用されるところの「ワクチン」という用語により、ヒトもしくは家畜の患者に投与される場合に、ＨＩＶ−１もしくはその成分（１種もしくは複数）に対する体液性および／もしくは細胞性の検出可能な免疫応答を誘導する化合物を意味する。
実施例１：ＨＩＶ−１のＣＤ４非依存性の決定子は、補助受容体特異性に必要とされる外側領域に位置する
本実施例に提示される実験は、以下のとおり要約することができる。
【０１９５】
ＨＩＶによる感染は、典型的にはウイルスエンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）、ＣＤ４およびケモカイン受容体の間の相互作用を必要とするが、ＨＩＶおよびＳＩＶのＣＤ４非依存性の単離物が本明細書で発見された。本発明は、ＣＤ４の非存在下でＣＸＣＲ４を利用する能力を表す、ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘと命名されたＨＩＶ−１／ＩＩＩＢの変異体の派生を開示する。このウイルスでＣＤ４陰性のＴおよびＢ細胞を感染させ、そしてヒトＣＸＣＲ４単独を発現するマウス３Ｔ３細胞と融合した。
【０１９６】
機能的なＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ  ｅｎｖクローンは、５個のグリコシル化部位の目立った喪失を包含するいくつかの突然変異を表した。本明細書に開示されるデータはＣＤ４依存性のｅｎｖをもつキメラの構築を立証する。該データは、ＣＤ４非依存性の決定子が、ケモカイン受容体特異性を決定するＶ１／Ｖ２およびＶ３超可変ループの外側、ならびに少なくとも部分的に、保存されたケモカイン受容体結合部位の形成に関係しているｇｐ１２０コア上の一領域内に位置することを開示する。さらに、本明細書に開示されるデータは、ＣＣＲ５向性のＥｎｖのＶ３ループをＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ  Ｅｎｖ中に置換した場合、生じるキメラはＣＣＲ５を利用したがしかしＣＤ４非依存性のままであったことを立証する。従って、開示されたデータは、ケモカイン受容体特異性のＥｎｖ決定子は、細胞融合へのその受容体の使用を媒介するものと異なることを初めて立証する。これらの知見は、ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ中の突然変異はＣＤ４の非存在下でＣＸＣＲ４もしくはＣＣＲ５のいずれかと相互作用することができる保存されたケモカイン受容体部位を露出させ、そしてワクチン開発のための露出されたケモカイン受容体結合部位をもつＥｎｖの設計に重要な意味を有することができるという証拠を提供する。
【０１９７】
本明細書に提示されるデータは、ＣＤ４の非存在下でＣＸＣＲ４を利用する能力を獲得した、ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘと命名されたＨＩＶ−１／ＩＩＩＢの変異体の派生および分子の特徴づけを開示する。機能的ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ  ｅｎｖクローン（８ｘ）を使用して、緊密に関係するがしかしＣＤ４依存性のｅｎｖを含むキメラを構築し、そしてＣＤ４非依存性の決定子が、部分的に、保存されたケモカイン受容体結合部位、および可変ループの外側に位置することが示された。顕著なことに、８ｘがＣＣＲ５向性のＥｎｖのＶ３ループを含有した場合、それはＣＣＲ５を利用したが、しかしＣＤ４非依存性を維持した。これらの知見は、ＣＤ４結合は、遺伝子的に互いに異なるケモカイン受容体と相互作用することができるｇｐ１２０コア上のドメインを露出させることがありそうであるという証拠を提供する。この研究は、新規生化学的および免疫原性の特性を表すことができる露出されたケモカイン受容体接触部位をもつＨＩＶ−１  Ｅｎｖタンパク質の設計で重要な意味を有することができる。
【０１９８】
本実施例に提示される実験で使用された材料および方法を今や記述する。
【０１９９】
細胞、ウイルスおよび感染力アッセイ。
【０２００】
Ｈｕｔ−７８およびＳｕｐＴ１は不死化されたＣＤ４＋  Ｔ細胞系である。ＢＣ７はＳｕｐＴ１由来のＣＤ４陰性の系統である（Ｅｎｄｒｅｓら、１９９６、Ｃｅｌｌ  ８７：７４５−７５６）。クローン化されないＨＩＶ−１／ＩＩＩＢは、Ｐｏｐｏｖｉｃら（１９８４、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：４９７−５００）に記述されるとおり慢性に感染したＨｕｔ−７８細胞中で得た。この感染したＨｕｔ−７８細胞培養物からの上清のウイルスをＳｕｐＴ１細胞上で連続的に継代し、これからＢＣ７上でのその後の継代によりＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘを単離した。ＩＩＩＢ／Ｓｕｐウイルスは、ＳｕｐＴ１中での早期継代ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢから生じさせた。トランスフェクションされない、およびヒトＣＸＣＲ４で安定にトランスフェクションされたＮＩＨ−３Ｔ３細胞は、（Ｄｅｎｇら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  ３８１：６６１−６６６）に記述された。逆転写酵素（ＲＴ）アッセイは、Ｅｎｄｒｅｓら（１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：１４６２−１４６４）に記述されるとおり培養物上清で実施した。中和アッセイのためには、ＢＣ７細胞を、変動する濃度の抗ＣＸＣＲ４  ＭＡｂもしくは１２Ｇ５（Ｅｎｄｒｅｓら、１９９７、上記）とともに３７℃で３０分間前インキュベートし、細胞にその後ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ（１０  ＴＣＩＤ５０）を接種し、そして細胞をＲＴ活性についてモニターした。
【０２０１】
ＰＣＲ、クローニング、ウイルス産生およびキメラ構築。
【０２０２】
完全長のｅｎｖコーディング領域は、センスプライマー５’−ＣＧＣＡＡＣＣＴＡＴＡＣＣＡＡＴＡＧＴＡＧＣＡＡ−３’［配列番号１］およびアンチセンスプライマー５’−ＣＡＧＴＡＡＧＣＣＡＴＣＣＡＡＴＣＡＣＡＣＴＡＣ−３’［配列番号２］を使用して、バイオサイクラー（ＢｉｏＣｙｃｌｅｒ）（エリコンプ（Ｅｒｉｃｏｍｐ）、カリフォルニア州サンディエゴ）中で、慢性に感染した細胞のゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物をｐＣＤＮＡ３．１（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州サンディエゴ）にＴＡクローン化し、そしてレポーター遺伝子融合アッセイで試験した。自動化シークェンサーを使用して、ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ（８ｘ）およびＩＩＩＢ／Ｓｕｐ（Ｓ１０）の機能的クローンを配列決定した。クローンはまた、Ａｓｐ７１８およびＢａｍＨＩを使用して、ＨＸＢｃ２  ｅｎｖを含有したｐＳＰ７３（プロメガ  コープ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）、ウィスコンシン州マディソン）中にもサブクローニングした（Ｈｏｆｆｍａｎら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：１１３６０−１１３６５）。
【０２０３】
機能的ｅｎｖクローンを、ｅｎｖ中の唯一のＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を使用してｐＮＬ４−３の３’半ゲノム（ＥｃｏＲＩ部位から）にサブクローニングし、これはＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘおよびＩＩＩＢ／Ｓｕｐ中の突然変異を包含する。５’ｐＮＬ４−３  Δｖｐｒ半ゲノム（ＥｃｏＲＩ部位まで）（Ｇｉｂｂｓら、１９９４、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．１０：３４３−３５０）および多様な３’半ゲノム構築物の各２０μｇをＥｃｏＲＩで消化すること、フェノール抽出すること、ならびに電気穿孔法によるＢＣ７およびＳｕｐＴ１へのトランスフェクション前に共沈殿させることにより、ウイルスを生成させた。細胞をシンシチウム形成についてモニターし、そして上清のウイルスを収穫してウイルスストックを生成させた。ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢウイルスストックは、１ｍｌのアリコート中、−７０℃で凍結した。ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘおよび８ｘのウイルスストックは、５％ショ糖中−１４０℃で凍結して感染力を保存した。８ｘとＳ１０もしくはＨＸＢｃ２との間のキメラ（Ｈｏｆｆｍａｎら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：１１３６０−１１３６５）は、ＴＭ（すなわちＥｎｖの膜貫通部分であるＥｎｖのｇｐ４１部分）からＳＵ（すなわちＥｎｖの表面部分であるＥｎｖのｇｐ１２０部分）の変化を単離するためのＢｓａＢＩ部位（ｎｔ７６７３）、ならびにＶ１−Ｖ２、Ｖ３およびＶ４／Ｃ４領域を単離するためのそれぞれＤｒａＩＩＩ（ｎｔ６７１４）、ＳｔｕＩ（ｎｔ６９４８）およびＢｓｕ３６Ｉ（ｎｔ７４３０）を使用して構築した。Ｒ５ウイルスのＶ３ループを含有するクローンは、ＢａＬのＶ３ループをもつＨＸＢのプロウイルスクローン（Ｈｗａｎｇら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：７１−７４）からのＡｓｐ７１８−ＢａｍＨＩフラグメントをｐＳＰ７３−ＨＸＢｃ２（Ｈｏｆｆｍａｎら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：１１３６０−１１３６５）にサブクローニングすることにより構築した。ＢａＬのＶ３ループを含有する８ｘのバージョンは、このプロウイルスのＳｔｕＩ−Ｂｓｕ３６ＩフラグメントをｐＳＰ７３−８ｘ中に挿入することにより類似の様式で作成した。
【０２０４】
細胞−細胞融合アッセイ。
【０２０５】
細胞−細胞融合を媒介するｅｎｖ遺伝子の能力は、ルシフェラーゼに基づく遺伝子レポーターアッセイ（Ｒｕｃｋｅｒら、１９９７、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２８８：１１８−１３３）を使用して評価した。簡潔には、ウズラＱＴ６細胞を、ＣａＰＯ４によりＨＩＶ  ｅｎｖを含有するプラスミドとコトランスフェクションし、そしてＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現するワクシニアウイルス（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９９２、１９９２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２９３４−２９４２）に感染させた。これらの細胞を、ヒトＣＤ４およびＴ７プロモーターの制御下のルシフェラーゼ遺伝子を伴いもしくは伴わずに、ヒトＣＸＣＲ４もしくはＣＣＲ５を一過性に発現するウズラＱＴ６細胞と混合した。細胞を組み合わせた７〜８時間後に細胞を溶解すること、および発光計（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）でルシフェラーゼ発現を測定することにより、融合を定量した。
【０２０６】
逆転写酵素アッセイ。
【０２０７】
細胞の生産性感染を、既に記述された（Ｈｏｘｉｅら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１４００−１４０２）ような培養物上清中の逆転写酵素（ＲＴ）活性の検出により報告した。簡潔には、１ｍｌの澄明にされた培養物上清からのウイルスを、１００，０００×ｇで４℃で３０分間ペレットにし、そしてウイルスを１００μｌの可溶化緩衝液（０．１５Ｍトリス  ｐＨ８．０、０．４Ｍ  ＮａＣｌ、０．２５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、１０％グリセロール、０．５ｍＭ  Ｄ．Ｔ．）中で可溶化した。二重の２０μｌのアリコートを８５μｌのＲＴカクテル（０．０５単位のポリｒ（Ａ）および１２．５μＣｉの３Ｈ−ｄＴＴＰを含有する６７．５ｍＭトリス  ｐＨ７．５、１．３ｍＭ  Ｄ．Ｔ．、１ｍＭ  ＡＴＰ、１３．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）と混合し、そして３７℃で１時間インキュベートした。チューブを氷上に置き、２２５μｇのｔＲＮＡを各チューブに添加し、そしてＲＮＡを冷１０％ＴＣＡで沈殿させた。沈殿されたＲＮＡをガラス繊維フィルター上で捕捉し、そしてＲＮＡをＴＣＡおよびＥｔＯＨで洗浄した。フィルターを乾燥し、そして各フィルター上に存在する放射活性（１分あたりのカウント、ｃｐｍで）をシンチレーションカウンター（ＬＫＢ／ワラック（Ｗａｌｌａｃ）、フィンランド・テュルク）中で測定した。
【０２０８】
突然変異誘発。
【０２０９】
製造元の仕様書に従ってクイックチェンジ［Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ］（商標）部位特異的突然変異誘発キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州ラホヤ）を使用して、ｐＳＰ７３中のＥｎｖ構築物中に点突然変異を工作した。以下のプライマー対、すなわちＤ３６８Ｒ−順、５’ＣＣＴＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＡＡＡＴＴＧＴＡＡＣＧＣ−３’（配列番号５）；Ｄ３６８Ｒ−逆、５’ＧＣＧＴＴＡＣＡＡＴＴＴＣＴＧＧＧＴＣＣＣＣＴＣＣＴＧＡＧＧ−３’（配列番号６）が、ＣＤ４結合を除去したＤ３６８Ｒ突然変異を生じた。２組のオリゴヌクレオチド、すなわち８ｘ−Ｇ４３１Ｅ−順  ５’−ＧＧＣＡＧＧＡＡＧＴＡＧＡＡＡＡＡＧＣＡＡＴＧＴＡＴＧＣＣＣＣ−３’（配列番号７）および８Ｘ−Ｇ４３１Ｅ−逆  ５’ＧＧＧＧＣＡＴＡＣＡＴＴＧＣＴＴＴＴＴＣＴＡＣＴＴＣＣＴＧＣＣ−３’（配列番号８）；ならびにＳ１０−Ｅ４３１Ｇ−順  ５’−ＧＧＣＡＧＧＡＡＧＴＡＧＧＡＡＡＡＧＣＡＡＴＧＴＡＴＧＣＣＣＣ−３’（配列番号９）およびＳ１０−Ｅ４３１Ｇ−逆  ５’−ＧＧＧＧＣＡＴＡＣＡＴＴＧＣＴＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＣＣＴＧＣＣ−３’（配列番号１０）を使用して、８ｘおよびＳ１０中の位置４３１の残基の相互交換を達成した。
【０２１０】
ウェスタンブロット。
【０２１１】
感染した細胞培養物の上清から単離されたウイルスを、１００，０００×ｇで４℃で９０分間ペレットにし、そしてウイルスペレットを氷上の溶解緩衝液（２０ｍＭトリス  ｐＨ８．０、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％デオキシコール酸ナトリウム、０．５％  ＮＰ−４０、０．２ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．２ｍＭ  ＮａＦ、１μＭペプスタチン、５μｇ／ｍｌロイペプチン、５μｇ／ｍｌアプロチニン）に再懸濁した。等容積のライセートおよび２×サンプル緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ６．８、２％  ＳＤＳ、３０％グリセロール、１０％  β−メルカプトエタノール、０．２％パイロニンＹ）を７分間沸騰させ、氷上で７分間冷やし、そしてその後サンプルを１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動した。
【０２１２】
マルチフォア（Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ）ＩＩセミドライ電気転写装置（ファルマシア−ＬＫＢ  バイオテクノロジー  インク（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使用して、タンパク質をゲルからニトロセルロース（バイオラッド  ラボラトリーズ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カリフォルニア州リッチモンド）に転写した。Ｅａｒｌら（１９９７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２６７４−２６８４）に記述されるようなＤ１２マウスモノクローナル抗体、次いで、ビオチニル化ヒツジ抗マウスＩＧ（重鎖および軽鎖）（ジャクソン  イムノリサーチ  ラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、フィラデルフィア州ウェストグローヴ）、ワサビペルオキシダーゼに結合されたストレプトアビジン（ストレプトアビジン−ＨＲＰ、アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、イリノイ州アーリントンハイツ）および化学発光基質（ピアース  ケミカル  カンパニー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、イリノイ州ロックフォード）を使用して、ＨＩＶ−１膜貫通タンパク質の存在をブロット上で検出した。
【０２１３】
本実施例に提示される実験の結果を今や記述する。
【０２１４】
ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢのＣＤ４非依存性変異体の派生。
【０２１５】
ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢのＣＤ４非依存性変異体を、ＳｕｐＴ１中のＨＩＶ−１／ＩＩＩＢのクローン化されないストックの連続的継代、およびその後ＢＣ７（ＳｕｐＴ１のＣＤ４陰性系統）（Ｅｎｄｒｅｓら、１９９６、Ｃｅｌｌ  ８７：７４５−７５６）を接種することにより派生させた。１実験においては、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）により、およそ５％のＢＣ７細胞がウイルスのｐ２４ｇａｇについて陽性であった。この培養物からのウイルスを、感染していないＢＣ７細胞上で２回継代し、そして慢性に感染した系統を樹立した。ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘと命名されたこの系統からのウイルスを、ＩＩＩＢ／ＳｕｐＴ１と呼称される、ＳｕｐＴ１細胞中のＨＩＶ−１／ＩＩＩＢのより早期の継代と比較した。図１Ａに示されるとおり、ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘのみがＢＣ７を感染させることができた一方、双方のウイルスがＳｕｐＴ１を感染させることが可能であった。ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘは、Ｒａｊｉ細胞（ＣＤ４陰性のＢリンパ芽球様細胞系）もまた感染させることが可能であった。ＢＣ７の感染は、抗ＣＸＣＲ４  ＭＡｂ、１２Ｇ５により完全に阻害することができ（図１Ｂ）、この感染がＣＸＣＲ４により媒介されることがありそうであったことを示した。さらに、ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘに感染したＢＣ７細胞は、ヒトＣＸＣＲ４を安定に発現したマウス３Ｔ３線維芽細胞と共培養された場合にシンシチウムを誘導した一方、トランスフェクションされない３Ｔ３細胞上では融合が誘導されなかった（図１Ｃ）。加えて、ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢに感染したＨＵＴ−７８細胞をＣＸＣＲ４を発現する３Ｔ３細胞と共培養した場合には、融合が観察されなかった。一緒にすると、これらのデータは、ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ変異体が、ＴおよびＢリンパ球様細胞系ならびにマウス線維芽細胞上で、ＣＤ４の非存在下に主受容体としてＣＸＣＲ４を利用することができることを示す。
【０２１６】
機能的ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ  ｅｎｖのクローニングおよび特徴づけ。
【０２１７】
ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ（８ｘと呼称される）の完全長のｅｎｖクローン（配列番号４）を、感染したＢＣ７細胞からＰＣＲにより増幅し、ｐＳＰ７３にクローン化し、そして細胞融合アッセイで原型のＣＤ４依存性のＩＩＩＢクローン（ＨＸＢｃ２）と比較した。８ｘおよびＨＸＢｃ２の双方が、ＣＤ４およびＣＸＣＲ４の双方を発現するウズラＱＴ６細胞上での融合を媒介することが可能であったが、しかし、８ｘのみが、ＣＸＣＲ４単独を発現した細胞と融合することができた（図２）。注目すべきことに、ＣＤ４およびＣＸＣＲ４が共発現された場合に８ｘの融合が高められ、８ｘ  ＥｎｖはなおＣＤ４と相互作用することが可能であることがありそうであったことを示した。加えて、ｐＮＬ４−３プロウイルスにクローン化された８ｘ  ｅｎｖは、複製能力のあるウイルスを生じさせ、これはＳｕｐＴ１ならびにＢＣ７細胞を感染させ（図３Ａ）、８ｘ  ＥｎｖがＣＤ４の非存在下でＣＸＣＲ４を利用することが可能であった、および、８ｘクローンがクローン化されない親ＩＩＩＢｘウイルスを代表したという、さらなる証拠を提供した。
【０２１８】
８ｘのＣＤ４非依存性を、ｇｐ１２０のアミノ酸位置３６８のＡｓｐからＡｒｇへの置換を導入することにより、さらに評価した。このＡｓｐは全部のＨＩＶ−１単離物のあいだで高度に保存され、そしてＣＤ４のＣＤＲ２ループ中のＡｒｇ−５９と塩橋を形成することによりＣＤ４結合の決定的に重要な決定子である（Ｋｗｏｎｇら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：６４８−６５９）。この位置での突然変異はＣＤ４結合を除去することが示されている（Ｏｌｓｈｅｖｓｋｙら、１９９０、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：５７０１−５７０５）。図２に示されるとおり、Ｄ３６８Ｒ（すなわちアミノ酸３６８でのＡｓｐからＡｒｇ）突然変異は、ＣＤ４およびＣＸＣＲ４を共発現した細胞上のＨＸＢｃ２による融合を排除したとは言え、この突然変異は、ＣＸＣＲ４のみを発現する標的細胞上での８ｘに媒介される融合に影響を及ぼさなかった。８ｘ−Ｄ３６８Ｒの融合は、８ｘクローンと異なり、ＣＤ４がＣＸＣＲ４と共発現された場合に高められず、８ｘ−Ｄ３６８Ｒ  ＥｎｖがＣＤ４と相互作用することが不可能であったことを確認した。従って、８ｘ  Ｅｎｖは、ＣＤ４の非存在下でＣＸＣＲ４を利用することが可能であったのみならず、ｇｐ１２０上のＣＤ４結合部位を破壊した突然変異を耐えることもできた。
【０２１９】
ｅｎｖクローンの配列分析。
【０２２０】
８ｘ（配列番号３）およびＳ１０（配列番号１２）の配列を、ＨＸＢｃ２の発表された配列（配列番号１１）と比較した（図４）。８ｘ中の突然変異の数は多い（ｇｐ１２０中に１６個およびＴＭ中に７個）一方、ｇｐ１２０中の突然変異の６個およびＴＭ中の２個は、ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢ由来の他のｅｎｖクローン中で観察されており、そして従ってＣＤ４非依存性の表現型に関与していることがありそうでない。ｇｐ１２０において、１１個の独特の突然変異のうち８個は、超可変ループ、Ｖ１／Ｖ２（Ｓ１４３Ｇ、Ｉ１６５Ｋ、Ｇ１６７Ｓ、Ｑ１７０ＫおよびＴ１８８Ｐ）、Ｖ３（Ｒ２９８Ｋ、Ｑ３１０ＨおよびＩ３２０Ｖ）ならびにＶ４（Ｎ３８６Ｋ）中であった。３個の突然変異はｇｐ１２０コア中にあった（Ｄ６２Ｅ、Ｎ３３９Ｓ、Ｉ４２３Ｖ）。興味深いことに、ｇｐ１２０中の５個の突然変異は潜在的なＮに結合されるグリコシル化部位の喪失をもたらし、そしてこれらのうち４個（Ｓ１４３Ｇ、Ｔ１８８Ｐ、Ｎ３３９ＳおよびＮ３８６Ｋ）は８ｘに独特であった。ＴＭの外的ドメイン中の４個の８ｘに特異的な突然変異は、コイルドコイルを形成する２領域内に配置された（Ｔ５３６Ａ、Ｌ５４４Ｓ、Ｎ６５１ＩおよびＫ６５５Ｍ）。顕著なことに、８ｘはＴＭの膜にわたるドメイン中に単一のヌクレオチド欠失もまた含有し、これは位置７０６にフレームシフトを導入し、わずか３０アミノ酸の規準から外れた細胞質の尾を生成させた。短縮された細胞質の尾をもつＨＩＶ−１ウイルスは、典型的に減弱されているかもしくは非感染性である（Ｓｈｉｍｉｚｕら、１９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８９：５３４−５４６；Ｄｕｂａｙら、１９９２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：６６１６−６６２５；Ｃｈｅｎら、１９９６、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２６：２６０−２６８）ため、この特徴は驚くべきである。にもかかわらず、上に示されたとおり、８ｘ  Ｅｎｖは、ＳｕｐＴ１ならびにＢＣ７細胞を感染させることができた複製能力のあるウイルスを生成することが可能であった（図３Ａ）。さらに、クローン化されないＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘならびに８ｘ  ｅｎｖを含有するＮＬ４−３からのウイルスライセートのウェスタンブロットは、親ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢの４１ｋＤに比較して、およそ３５ｋＤのＴＭを立証した（図３Ｂ）。
【０２２１】
キメラＥｎｖタンパク質を使用するＣＤ４非依存性のマッピング。
【０２２２】
ＣＤ４非依存性の決定子を同定するため、８ｘとＨＸＢｃ２との間で一組の相互キメラを生成させた。ＴＭ中の突然変異からｇｐ１２０中のものを単離しそしてＶ１／Ｖ２、Ｖ３およびＶ４／Ｃ４サブドメイン中の突然変異の効果を定義するため、独特の制限部位を選んだ（図５）。キメラをｐＳＰ７３にクローン化し、そしてＣＸＣＲ４を単独でもしくはＣＤ４とともに発現する標的細胞上で、本明細書に記述されるような融合アッセイで分析した。各キメラの結果は、ＣＸＣＲ４およびＣＤ４双方を発現した標的細胞でのＨＸＢｃ２  Ｅｎｖ融合活性の融合活性のパーセントとして表す。ＣＸＣＲ４およびＣＤ４が標的細胞上で共発現された場合に全部のキメラが機能的であったとは言え、ＨＸＢｃ２のものの約５０％から約５００％までの範囲にわたる融合活性を伴うかなりの量的差異が検出された（図６）。ｇｐ１２０全体およびＴＭを交換した相互キメラはＣＤ４依存性であったが、とは言えＨＸＢｃ２  ＴＭをもつ８ｘ  ｇｐ１２０［８ｘ（ｇｐ１２０）］の評価は、このＥｎｖの乏しい全体的融合活性によりいくぶん限定された。注目すべきことに、８ｘ  ＴＭを含有したキメラは、ＨＸＢｃ２、もしくはＨＸＢｃ２  ＴＭを含有したキメラより融合原性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）であり、８ｘの外部ドメインもしくは未熟に短縮された細胞質の尾中の決定子がこれらのクローンの増大された融合原性に寄与していたことを示唆した。にもかかわらず、これらの知見は、ＣＤ４非依存性の決定子がｇｐ１２０もしくはＴＭに完全に制限されなかったことを示唆した。
【０２２３】
８ｘの背景にＨＸＢｃ２のｇｐ１２０サブドメインを導入したキメラのなかで、個々にもしくは組み合わせでのいずれかでのＶ１／Ｖ２およびＶ３ループの置換は、ＣＤ４非依存性を除外することに失敗した（図６；キメラＨＸ（Ｖ１／Ｖ２）、ＨＸ（Ｖ３）、ＨＸ（Ｖ１−Ｖ３）を参照されたい）。ケモカイン受容体特異性の決定子としてのこれらのループの重要性（Ｃｈｏら、１９９８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２５０９−２５１５；Ｃｈｏｅら、１９９６、Ｃｅｌｌ  ８５：１１３５−１１４８；Ｃｏｃｃｈｉら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．２：１２４４−１２４７；Ｈｏｆｆｍａｎら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１１３６０−１１３６５；ＲｏｓｓとＣｕｌｌｅｎ、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：７６８２−７６８６；Ｓｐｅｃｋら、１９９７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：７１３６−７１３９）を考えるとこの知見は興味深かった。これらのキメラについては、８ｘに関する融合活性はＣＤ陰性および陽性双方の細胞で低下した（８０％）とは言え、ＣＤ４依存性の融合はＨＸＢｃ２でみられるものよりなおより大きかった。対照的に、ＨＸＢｃ２  Ｖ４／Ｃ４を含有したＨＸ（ｖ４／Ｃ４）の融合活性はＣＤ４陰性細胞で低下したが、しかしＣＤ４＋細胞で不変であった。興味深いことに、８ｘのＶ３およびＶ４／Ｃ４双方のドメインをＨＸＢｃ２のもので置き換えた［ＨＸ（Ｖ３−Ｃ４）］場合、ＣＤ４非依存性の融合は完全に排除された一方、ＣＤ４の存在下での融合は影響を及ぼされなかった。
【０２２４】
８ｘのドメインをＨＸＢｃ２の背景上に置いたキメラについて、ｇｐ１２０のどの単一の領域もＨＸＢｃ２にＣＤ４非依存性を賦与することが可能でなく、ｇｐ１２０およびＴＭ双方中の決定子が必要とされるという上で示された証拠と矛盾しなかった（図６）。しかしながら、８ｘからのＶ４／Ｃ４およびＴＭ双方のドメインを含有したＨＸＢｃ２キメラ［８ｘ（Ｖ４−ＴＭ）］は、ＣＤ依存性および非依存性双方の融合に対し高度に能力があった。８ｘおよびＨＸＢｃ２に基づくキメラを用いたこれらの知見は、集合的に、８ｘ  ｇｐ１２０  Ｖ３、およびとりわけＶ４／Ｃ４ドメイン中の決定子が８ｘのＣＤ４非依存性の表現型に寄与するが、しかし８ｘ  ＴＭと会合される場合のみであることを示す。
【０２２５】
ＩＩＩＢｘに感染した細胞からのＣＤ４依存性クローンの評価。
【０２２６】
ＣＤ４依存性のＥｎｖを、ＩＩＩＢｘに感染したＳｕｐＴ１細胞からもまた生じさせた。Ｓ１０と命名されたこのクローンは、ＣＸＣＲ４およびＣＤ４を共発現したＱＴ６細胞上での融合を媒介することが可能であったが、しかしＣＤ４の非存在下で融合することが不可能であった（図７）。配列分析は、Ｓ１０がＨＸＢｃ２に関して８ｘと数個の突然変異を共有したことを立証した（ｇｐ１２０中で８個およびｇｐ４１中で３個）（図４）。加えて、Ｓ１０は数個の独特の突然変異、すなわち、ｇｐ１２０中でＣ４中のＧ４３１ＥおよびＶ５中のＳ４６１Ｎ、ならびにＴＭ中で、位置６１１および６７４の予測されたＮに結合されるグリコシル化部位の喪失を包含する、外部ドメインおよび膜にわたるドメイン中の６個の付加的なアミノ酸変化を含有した（図４）。Ｓ１０は、ＴＭの細胞質の尾中に５５ｎｔの欠失もまた含有し、これは、８ｘに類似に、フレームシフト突然変異および未熟に短縮された細胞質の尾を生じさせる。この欠失はまた、Ｎ末端で核局在化シグナルを除外しかつＲＲＥ結合部位の前でタンパク質を短縮するフレームシフト突然変異を導入することにより、ｒｅｖの読取り枠も混乱させる（ＰｏｌｌａｒｄとＭａｌｉｍ、１９９８、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５２：４９１−５３２）。最後に、Ｓ１０は、８ｘ  ｇｐ１２０（Ｓ１４３Ｇ、Ｇ１６７Ｓ、Ｑ３１０ＨおよびＩ４２３Ｖ）ならびにＴＭ（Ｎ６５１Ｉ）中に存在した数個の変化を欠いていた。Ｓ１０がＣＤ４＋／ＣＸＣＲ４＋標的細胞での融合アッセイで機能的であったとしても、このｅｎｖは、その非機能的Ｒｅｖタンパク質の結果としてありそうであるが、ＮＬ４−３にクローン化された場合に感染性のウイルスを生成させることが不可能であった。
【０２２７】
Ｓ１０  Ｅｎｖは８ｘと数個の突然変異を共有したがしかし完全にＣＤ４依存性であったため、この変化の決定子を同定するために８ｘとＳ１０との間の一組のキメラを作成した。図７に示されるとおり、Ｓ１０の背景上に８ｘ  Ｖ３およびＶ４／Ｃ４［８ｘ（Ｖ３−Ｃ４）］もしくはＶ４／Ｃ４単独［８ｘ（Ｖ４／Ｃ４）］を含有したキメラは若干のＣＤ４非依存性を表した一方、８ｘの背景上の相互キメラ、［Ｓ１０（Ｖ３−Ｃ４）］および［Ｓ１０（Ｖ４／Ｃ４）］は、完全にＣＤ４依存性であった。Ｓ１０  Ｖ４／Ｃ４ドメインは唯一のＧ４３１Ｅ突然変異を含有したため、この変化がＣＤ４非依存性に対する負の影響を有することができた可能性が考えられた。事実、ＧｌｙをＳ１０のこの位置で回復させた場合（Ｓ１０−Ｅ４３１Ｇ）、このクローンはＣＸＣＲ４を発現する標的細胞上で限定された程度のＣＤ４非依存性を表した。さらに、Ｇ４３１Ｅ突然変異を８ｘに導入した場合（８ｘ−Ｇ４３１Ｅ）、このクローンは融合能力のあるままであったが、しかし完全にＣＤ４依存性となった（図７）。従って、Ｃ４ドメイン内での電荷の変化は８ｘのＣＤ４非依存性を排除するのに十分であり、そして、これらのデータは、ＣＤ４非依存性の表現型に決定的に重要であるとしてこの領域を巻き込んだ、上述された８ｘ／ＨＸＢｃ２キメラを使用して得られたマッピングのデータをさらに支持する。
【０２２８】
ＣＣＲ５向性のＶ３ループはケモカイン受容体の特異性を変えるが、しかしＣＤ４非依存性を変えない。
【０２２９】
ケモカイン受容体の特異性の決定におけるＶ３ループの重要性、およびＣＤ４非依存性の決定子がこのドメインの外側に配置されたという証拠を考え、８ｘの向性およびＣＤ４非依存性を分離することができる程度を検査した。マクロファージ／ＣＣＲ５向性の単離物ＨＩＶ−１／ＢａＬからのＶ３ループを含有したＨＸＢ２  ｇｐ１２０（ＨＸＢ２−Ｖ３ＢａＬ）（Ｈｗａｎｇら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：７１−７４）を使用して、８ｘにＢａＬ  Ｖ３ループを導入した。生じるキメラ（８ｘ−Ｖ３ＢａＬ）を、ＣＤ４の存在もしくは非存在下で、ＣＸＣＲ４もしくはＣＣＲ５を発現した標的細胞での融合アッセイにおいて、８ｘ、ＨＸＢｃ２およびＨＸＢ２−Ｖ３ＢａＬと比較した（図８）。本明細書に開示されるデータが立証するとおり、ＨＸＢｃ２およびＨＸＢ２−Ｖ３ＢａＬは、それぞれＣＸＣＲ４もしくはＣＣＲ５を発現する細胞上で融合を表し、そしてそれらの活性は厳格にＣＤ４依存性であった。対照的に、８ｘ−Ｖ３ＢａＬキメラはＣＣＲ５向性およびＣＤ４非依存性の双方であった。従って、８ｘのＣＤ４非依存性の決定子は、ケモカイン受容体の向性を媒介するものと機能的に別個である。
【０２３０】
本明細書に開示されるデータは、ＣＤ４の非存在下でＣＸＣＲ４を利用することができる、ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘと命名されたＨＩＶ−１／ＩＩＩＢのＣＤ４非依存性の変異体の派生および特徴づけを立証する。ＩＩＩＢｘの８ｘ  ｅｎｖクローンは、ＨＩＶ−１プロウイルス中にクローン化される場合に、複製能力のあるＣＤ４非依存性のウイルスを生成させることが可能であり、また、ＣＤ４の非存在下でＣＸＣＲ４を発現するウズラ細胞での融合を媒介することができた。このクローンはまた、ｇｐ１２０の位置３６８（ＤＥ４結合部位の形成に決定的に重要であることが既に示された残基）（Ｋｗｏｎｇら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：６４８−６５９；Ｏｌｓｈｅｖｓｋｙら、１９９０、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：５７０１−５７０５）のＡｓｐの代わりにＡｒｇを用いた場合にも完全に機能的であった。８ｘの配列分析は、他のＨＩＶ−１１／ＩＩＩＢプロウイルスクローンにおいて記述されていない１７個の突然変異、およびｇｐ１２０上の５個のグリコシル化部位の顕著な正味の喪失を示した。８ｘと、関係するＣＤ４依存性クローンＨＸＢｃ２との間の相互キメラは、ＣＤ４非依存性の決定子が超可変Ｖ１／Ｖ２およびＶ３ループの外側に位置したことを示した。８ｘのＶ４／Ｃ４およびＴＭ双方のドメインを含有したＨＸＢｃ２キメラはＣＤ４非依存性であった一方、いずれかのドメイン単独を含有したキメラはＣＤ４依存性であった。加えて、ｇｐ１２０のＣ４ドメイン中に唯一のＧ４３１Ｅ突然変異を含有した、ＩＩＩＢｘ遊走群からのＣＤ４依存性クローンＳ１０は、この突然変異を修正した場合にＣＤ４非依存性となった。８ｘへのＧ４３１Ｅ突然変異の導入はこのＥｎｖを完全にＣＤ４依存性とし、この位置での電荷の変化がＣＸＣＲ４のＣＤ４非依存性（しかしＣＤ４依存性でない）の利用を混乱させるのに十分であったことを示した。これらの知見は、集合的に、ケモカイン受容体結合部位がｇｐ１２０コア上に存在すること、および、この領域中の突然変異は、ＴＭ中の変化と共同してＨＩＶ−１  ＥｎｖをＣＤ４の非存在下で完全に機能的にすることができることを示す。
【０２３１】
ＨＩＶ−１のＶ３ループは、ＣＤ４結合後のＣＣＲ５もしくはＣＸＣＲ４のケモカイン受容体の特異性の主要な決定子であることが示されている（Ｃｈｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２５０９−２５１５；Ｃｈｏｅら、１９９６、Ｃｅｌｌ  ８５：１１３５−１１４８；Ｃｏｃｃｈｉら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．２：１２４４−１２４７；Ｓｐｅｃｋら、１９９７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：７１３６−７１３９；Ｔｒｋｏｌａら、１９９８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１８７６−１８８５；Ｗｕら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  ３８４：１７９−１８３）。より最近、Ｖ１／Ｖ２領域もまた、適切なＶ３の情況において、ＣＣＲ３、ＣＣＲ２ｂ、ＳＴＲＬ３３およびＡＰＪを包含する付加的なケモカイン受容体の使用を媒介することが示され（Ｈｏｆｆｍａｎら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１１３６０−１１３６５；ＲｏｓｓとＣｕｌｌｅｎ、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：７６８２−７６８６）、Ｖ１／Ｖ２とＶ３との間の協同的相互作用がケモカイン受容体の認識に関与していることを示唆する。これらのループは、ＣＤ４結合後にコンホメーション変化を受けることが知られており（Ｊｏｎｅｓら、１９９８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：４０４−４０９；Ｍｏｏｒｅら、１９９４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：４６９−４８４；Ｗｕら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  ３８４：１７９−１８３；Ｗｙａｔｔら、１９９２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：６９９７−７００４）、これは特定のケモカイン受容体との相互作用を助長することができる（Ｊｏｎｅｓら、１９９８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：４０４−４０９；Ｗｕら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  ３８４：１７９−１８３；Ｗｙａｔｔら、１９９２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：６９９７−７００４）。しかしながら、これらの知見は、Ｖ３それ自身がケモカイン受容体結合部位を含有することができることを示唆した一方、ＣＣＲ５もしくはＣＸＣＲ４向性のウイルスの間でのＶ３ループの顕著な遺伝子の多様性は、これらのループが共通の構造要素を含有すること、もしくはＥｎｖ上の他の領域もまたケモカイン受容体の利用に寄与することのいずれかを示す。最近、ＣＣＲ５向性のＨＩＶ−１  ｇｐ１２０の突然変異誘発が、ｇｐ１２０コアの内側および外側のドメインを連結する架橋シートにより形成されるＥｎｖ上のまず確実なＣＣＲ５結合部位を同定した。この領域はＶ１／Ｖ２ループの基部とＶ３ループの基部との間に配置され、そしてＣＤ４結合後に細胞膜に向けられると予測される（Ｒｉｚｚｕｔｏら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１９４９−１９５３）。ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４向性のＥｎｖの間でのこの領域中のアミノ酸の顕著な保存は、この部位が、複数のケモカイン受容体と相互作用することが可能な包括的なケモカイン受容体結合ドメインを表すことができることを示唆した。これらの知見は、特定のケモカイン受容体との最初の相互作用を助長しかつ融合が起こるためにその後必要とされるこの保存された結合部位を露出する、Ｖ１／Ｖ２およびＶ３ループの動きをＣＤ４が誘導するというモデルと矛盾しない（Ｒｉｚｚｕｔｏら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１９４９−１９５３；ＷｙａｔｔとＳｏｄｒｏｓｋｉ、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１８８４−１８８８）。
【０２３２】
８ｘクローンのＣＤ４非依存性の決定子はケモカイン受容体の特異性に必要とされる外側領域に位置したため、異なるＶ３が、そのＣＤ４非依存性に影響を及ぼすことなく８ｘのケモカイン受容体の向性を変えることができるという可能性を検討した。顕著なことに、本明細書に開示されるデータは、ＣＣＲ５向性のＥｎｖ（ＨＩＶ−１ＢａＬ）からのＶ３ループを８ｘ中に挿入した場合に、生じるキメラがＣＣＲ５を発現する細胞上でのＣＤ４非依存性の融合を媒介することが可能であったことを立証する。ＣＤ４を伴うもしくは伴わない、ＣＸＣＲ４を発現する細胞上での融合は、このキメラで観察されなかった。対照的に、ＨＸＢｃ２の背景上でＨＩＶ−１／ＢａＬ  Ｖ３ループを含有するキメラはＣＣＲ５を利用したが、しかし完全にＣＤ４依存性であった。これらのデータは、ケモカイン受容体の特異性、および融合のためのその受容体の利用が、ｇｐ１２０の別個の領域により媒介されることを明瞭に示す。さらに、本明細書に開示されるデータは、Ｖ３上の特異性決定子がなお必要とされるとは言え、ＣＤ４非依存性のウイルス上で機能的にされるｇｐ１２０コア上の一領域が、遺伝子的に互いに異なるケモカイン受容体を使用する融合を媒介することが可能であるという直接の証拠もまた提供する。
【０２３３】
上に示されたｇｐ１２０上の架橋シートは、主としてＣ４ドメインおよびＶ１／Ｖ２の幹（ｓｔｅｍ）からのアミノ酸から構成される（Ｒｉｚｚｕｔｏら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１９４９−１９５３）。この領域はまた、ＣＤ４結合により誘導されるｇｐ１２０のエピトープの形成に寄与することも示されている（Ｋｗｏｎｇら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：６４８−６５９；Ｔｈａｌｉら、１９９３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３９７８−３９８８）。興味深いことに、８ｘ  Ｖ４／Ｃ４ドメイン中の２個の突然変異（Ｎ３８６ＫおよびＩ４２３Ｖ）ならびにＶ３ループの基部近くの第三の突然変異（Ｒ２９８Ｋ）は、この領域にすぐに隣接する位置に位置する（図９Ａ）。本明細書に開示されるデータが立証するとおり、ＨＸＢｃ２からの対応するＶ３およびＶ４／Ｃ４ドメインを包含しかつこれらの突然変異を欠いた８ｘキメラは、融合に対し高度に能力があったが、しかし完全にＣＤ４依存性であった（図６）。理論により拘束されることを願わないが、推定のケモカイン受容体結合ドメインへのＲ２９８Ｋ、Ｎ３８６ＫおよびＩ４２３Ｖの顕著な近接は、これらの突然変異がこの部位を露出させ、そして／もしくはそれをウイルス結合の間にケモカイン受容体に提示するのを助けることを強く示唆する。さらに、本明細書の別の場所に開示されるデータ（実施例２、下）は、組換え８ｘ  ｇｐ１２０がＣＸＣＲ４を発現する細胞にＣＤ４に独立に結合することが可能であること、および、ｇｐ１２０のケモカイン受容体ドメイン内に部分的に含有されるＣＤ４に誘導されるエピトープが、ＣＤ４結合の非存在下で安定に露出されることを立証する。加えて、Ｓ１０および８ｘ上のＣＤ４非依存性を排除するのに十分であった、Ｃ４中のＧ４３１Ｅ突然変異は、ｇｐ１２０コアの結晶構造により、ケモカイン受容体結合部位に寄与するＶ１／Ｖ２の幹の基部の残基に並置されることが示されている（図９Ｂ）。理論により拘束されることを願わないが、この残基での負の電荷の獲得は、Ｖ１／Ｖ２ループの向きを変えかつ／もしくはｇｐ１２０上のケモカイン受容体結合部位のコンホメーションに影響を及ぼすことができる。機構に関係なく、このケモカイン受容体結合部位中もしくはその周囲の突然変異は、ＣＤ４なしで機能する８ｘ  Ｅｎｖの能力に対し正もしくは負に影響する可能性があり、そしてＣＤ４結合がケモカイン受容体の利用の全体的な効率および／もしくは親和力を向上させるという見方と矛盾しないことが明らかである。
【０２３４】
Ｖ４／Ｃ４ドメインはＩＩＢｘのＣＤ４非依存性に明瞭に関連する一方、Ｅｎｖの他の領域もまたこの表現型に寄与することが明らかである。ＨＸＢｃ２の背景上に８ｘ  Ｖ４／Ｃ４含有したキメラは、それが８ｘ  ＴＭもまた含有した場合にのみＣＤ４非依存性であった。ＣＤ４非依存性のＨＩＶ−２／ＲＯＤ−ＢのＲｅｅｖｅｓらによる以前の研究（１９９６、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１４５３−１４６５）は、ｇｐ１２０およびＴＭの双方における突然変異がこの表現型に対する最小の要件であった（すなわち、ＨＩＶ−１の類似のＶ４ループにすぐ近接するＬｅｕからＰｈｅへの突然変異、およびＴＭの外部ドメインの最初の７個の基の反復中の２個の突然変異）ことを立証した。この効果の根底にある機構は不明であるが、ＨＩＶ−１  ＴＭの領域が、ＣＤ４および／もしくはケモカイン受容体へのその結合に影響を及ぼすことができるｇｐ１２０との多数の協同的相互作用に関係している（Ｃａｏら、１９９３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：２７４７−２７５５；Ｃｈａｎら、１９９７、Ｃｅｌｌ  ８９：２６３−２７３；Ｍａｔｔｈｅｗｓら、１９９４、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１４０：９３−１０４）。注目すべきことに、上述されたｇｐ１２０のケモカイン受容体結合部位は、ＴＭとの相互作用が生じることがありそうである、集成されたＥｎｖオリゴマーの予測される三量体の軸近くに配置される（Ｈａｉｇｗｏｏｄら、１９９２、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｐｒｉｍａｔｏｌ．２１：８２−９０）。最近の実験で得られたデータは、ならびに８ｘ  Ｖ４／Ｃ４およびＴＭ中の８ｘのフレームシフトのみを含有するＨＸＢｃ２キメラが、８ｘのもののおよそ１０％のレベルまでＣＤ４非依存性の融合を媒介することが可能であったことを立証する。この小さなしかし再現可能な効果がトランスフェクションされた細胞上のＥｎｖの表面発現の増大によるのかどうか（ＬａＢｒａｎｃｈｅら、１９９５、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：５２１７−５２２７；Ｍｕｌｌｉｇａｎら、１９９２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：３９７１−３９７５）、またはこの効果がＴＭの外部ドメイン（Ｒｉｔｔｅｒら、１９９３、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９７：２５５−２６４；Ｓｐｉｅｓら、１９９４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：５８５−５９１）および／またはｇｐ１２０（Ｃａｏら、１９９３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：２７４７−２７５５；Ｃｈａｎら、１９９７、Ｃｅｌｌ  ８９：２６３−２７３；Ｍａｔｔｈｅｗｓら、１９９４、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１４０：９３−１０４）中の構造の変化によるのかどうかは、決定されるべきままである。
【０２３５】
さらに、８ｘは、本明細書の別の場所で既に示されたようなＮ３８６Ｋを包含するｇｐ１２０中の５個のグリコシル化部位を除外すると予測される突然変異を含有し、この突然変異は推定のケモカイン受容体結合部位に隣接して存する。最近、炭水化物が、ＳＩＶ  ｇｐ１２０の免疫原性の改変および中和エピトープの遮蔽に関係している（Ｒｅｉｔｔｅｒら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．４：６７９−６８４）。理論により束縛されることを願わないが、１個もしくはそれ以上のグリコシル化部位の喪失はケモカイン受容体結合部位の露出にもまた関与することができることが可能である。
【０２３６】
本明細書に開示されるデータは、ＣＤ４非依存性の決定子としてのＩＩＩＢｘ  Ｖ４／Ｃ４およびＴＭ中の突然変異を巻き込んだとは言え、ｇｐ１２０の多様な領域中の突然変異が他のＨＩＶ−１単離物のＣＤ４非依存性と関連していることが注目されるべきである。Ｃ２、Ｃ３およびＶ３ドメイン中の突然変異の組み合わせによって、ＣＸＣＲ４を使用してＨｅＬａ細胞を感染させることができたＨＩＶ−１／ＮＤＫのＣＤ４非依存性の変異体が記述されている（Ｄｕｍｏｎｃｅａｕｘら、１９９８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５１２−５１９）。Ｓｏｄｒｏｓｋｉらによる最近の知見は、ＨＩＶ−１／ＡＤＡのＣＤ４非依存性のＣＣＲ５向性の変異体の決定子が、Ｖ１／Ｖ２の幹の遠位領域中の点突然変異に位置したことを立証した。これらの遺伝子の差異にもかかわらず、ＣＤ４非依存性のウイルスは、この表現型の類似の構造的基礎を有することができた。この点に関して、ＣＤ４非依存性のＨＩＶ−１／ＮＤＫおよびＨＩＶ−１／ＡＤＡ中の変化の少なくともいくつかはＩＩＩＢｘに類似であり、それらがケモカイン受容体へのこの領域の提示に影響を及ぼすことができるｇｐ１２０の架橋シート近くに配置されている。
【０２３７】
ＨＩＶは、活発な宿主免疫応答にもかかわらずウイルス複製を継続することを可能にする戦略を進化させている（Ｗｅｉら、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ  ３７３：１１７−１２２；Ｐｅｒｅｌｓｏｎら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７１：１５８２−１５８６）。抗体の中和は、典型的には、あったとしても感染の経過の後期に生じ、そして頻繁にｇｐ１２０上の群特異的（ｇｒｏｕｐ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）決定子よりはむしろ型特異的（ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）決定子に向けられる（ＷｙａｔｔとＳｏｄｒｏｓｋｉ、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１８８４−１８８８；ＭｏｏｒｅとＨｏ、１９９５、ＡＩＤＳ  ９：Ｓ１１７−Ｓ１３６）。ｇｐ１２０コアの推定される結晶構造は、ＣＤ４結合ドメインおよびケモカイン受容体結合部位が乏しく接近可能であり、そして／もしくはＥｎｖオリゴマー内に隠されることを示唆した（ＷｙａｔｔとＳｏｄｒｏｓｋｉ、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１８８４−１８８８；Ｒｉｚｚｕｔｏら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１９４９−１９５３）。対照的に、ｇｐ１２０の露出された表面は、体液性免疫応答のための免疫学的おとりとして作用することができる超可変ドメインおよび炭水化物を含有する（ＳｔａｍａｔａｔｏｓとＣｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ、１９９８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：７８４０−７８４５；Ｒｅｉｔｔｅｒら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．４：６７９−６８４；Ｃａｏら、１９９７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：９８０８−９８１２）。これらの保存されかつ機能的に決定的に重要なドメインを露出させるためのアプローチは、質的に異なりかつおそらくより有効な免疫応答が生成されることを可能にすることができる。ＬａＣａｓｓｅらによる最近の研究（１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：３５７−３６２）は、ｇｐ１２０およびｇｐ４１上の保存された中和エピトープが明らかに安定化された、融合で活性化された形態のＥｎｖが、マウスにおいて強力かつ広範に交差中和する抗体応答を生じさせることが可能であったことを立証した。この点に関して、派生されるもしくは設計されるＣＤ４非依存性のＥｎｖは、生物学的に関係した情況でこれらのドメインを提示するための手段を提供することができる。本明細書の別の場所で開示されるデータは、８ｘ  ｇｐ１２０が、ＣＤ４に誘導されるエピトープの増大された露出（実施例２を参照されたい）およびＣＤ４の非存在下でＣＸＣＲ４に結合する能力を包含する、多数の新規の免疫学的および生化学的特性を表すことを立証する。ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘおよび付加的なＣＤ４非依存性の単離物の今後の研究は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質の構造および機能に探りを入れ（ｐｒｏｂｅ）かつ治療の様式としての変えられた免疫原性の特徴をもつｇｐ１２０分子の理にかなった設計につながる効果的なツールを提供するはずである。
実施例２：ＣＤ４非依存性のＨＩＶ−１エンベロープタンパク質中の補助受容体結合部位の安定な露出
本実施例に提示される実験は、以下のとおり要約することができる。
【０２３８】
実施例１に既に提示されたデータは、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４と直接相互作用してＣＤ４の非存在下で細胞を感染させる、ＣＤ４非依存性のＨＩＶ−１ウイルス、ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘを開示する。本明細書に提示されるデータは、実施例１で既に開示された、８ｘと命名された、ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ遊走群からの新規のクローン化されたＥｎｖを使用することにより、ＣＤ４非依存性の根底にある機構を開示する。８ｘ  Ｅｎｖクローンを使用して可溶性ｇｐ１２０を生じさせた。本明細書に開示されるデータは、８ｘ  ｇｐ１２０がＣＸＣＲ４のみを発現する細胞に直接結合した一方、ＩＩＩＢ  ｇｐ１２０の結合は可溶性ＣＤ４もまた必要としたことを立証する。さらに、光学的バイオセンサーを使用して、本明細書に開示されるデータは、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）１７ｂおよび４８ｄにより認識される、ＣＤ４に誘導される（ＣＤ４ｉ）エピトープが、ＩＩＩＢ  ｇｐ１２０上でよりも８ｘ上でより露出されたことを立証する。ＣＤ４の非存在下での、ＣＸＣＲ４に直接結合しかつＭＡｂ  １７ｂおよび４８ｄと反応する８ｘ  ｇｐ１２０の能力は、１７ｂエピトープと重なり合うｇｐ１２０中の保存された補助受容体結合部位が露出される、部分的に誘導されたしかし安定な状態で８ｘ  ｇｐ１２０が存在することを示す。
【０２３９】
ＣＣＲ５向性のＨＩＶ−１／ＢａＬ株からのＶ３ループでの、８ｘのＣＸＣＲ４特異的Ｖ３ループの置換は、ＣＤ４非依存性のＣＣＲ５依存性のウイルス感染を媒介したＥｎｖクローンをもたらした。従って、Ｖ３ループの置換はＣＤ４の非存在下でＣＣＲ５に結合したｇｐ１２０キメラ（８ｘ−ＢａＬ）を生じさせた。かように、本明細書に開示されるデータは、部分的に誘導されたＥｎｖタンパク質において、Ｖ３ループが補助受容体の使用の特異性を変えることができるが、しかしＣＤ４非依存性を変えないことを立証する。さらに、本明細書に開示されるデータは、ＣＤ４非依存性およびケモカイン補助受容体結合が分離可能であることを示す。さらに、ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘは、ＣＤ４依存性のＩＩＩＢ株がそうであったよりも、ＨＩＶ陽性のヒト血清、多様な抗ＩＩＩＢ  ｇｐ１２０ウサギ抗血清、およびＣＤ４ｉ  ＭＡｂによる中和に対し、はるかにより感受性であった。抗体により中和に対する、ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘウイルスの増大された感受性、およびｇｐ１２０の高度に保存された領域の安定な露出は、この機能上重要なドメインに対する抗体および小分子阻害剤の開発のための新規戦略を示唆する。
【０２４０】
本実施例に提示される実験で使用された材料および方法を今や記述する。
【０２４１】
プラスミド
ヒトＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４およびＣＤ４はｐＣＤＮＡ３ベクター（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して発現した。ルシフェラーゼ遺伝子は、ｐＧＥＭ２ベクター（プロメガ  コープ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）、ウィスコンシン州マディソン）中で、Ｔ７プロモーターの制御下に発現した。ＩＩＩＢのＨＸＢｃ２クローンからのＥｎｖおよび８ｘは、双方ともｐＳＰ７３ベクター（プロメガ  コープ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）、ウィスコンシン州マディソン）中で発現した。Ｒ５  ＨＩＶ−１株ＢａＬのＶ３ループを含有するＥｎｖ構築物を生成させるために、完全長のプロウイルスクローンｐＩＩＩＢ−Ｖ３ＢａＬからのｅｎｖ中のＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをｐＳＰ７３−ＩＩＩＢにクローン化した。ＢａＬのＶ３ループを含有する８ｘの１バージョンを生じさせるため、ｐＩＩＩＢ−Ｖ３ＢａＬのＳｔｕＩ−Ｂｓｕ３６１  ｅｎｖフラグメントをｐＳＰ７３−８ｘにクローン化した。クイックチェンジ［Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ］（商標）部位特異的突然変異誘発キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州ラホヤ）を使用して、ｇｐ１２０／ｇｐ４１接合部で各ｅｎｖプラスミドに終止コドンを挿入して、ｇｐ１２０産生のための構築物を作成した。全部の突然変異体およびクローンの正体をＤＮＡ配列決定により確認した。
【０２４２】
細胞−細胞融合アッセイ
このアッセイは別の場所でより詳細に記述されている。簡潔には、Ｔ２５フラスコ中のエフェクターＱＴ６細胞を、Ｔ７ポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウイルス（ｖＴＦ１．１）に感染させ、そして３０μｇのｅｎｖ構築物でトランスフェクションし、ここで発現はＴ７プロモーターにより駆動された。標的ＱＴ６細胞を２４穴プレート中でプレート培養し、そして、細胞の各ウェルを、ＣＭＶプロモーターの制御下の０．５μｇのＣＤ４プラスミドおよび１．０μｇの補助受容体プラスミド、ならびにＴ７プロモーターの制御下の１．５μｇのルシフェラーゼレポータープラスミドでトランスフェクションした。一夜発現の後、エフェクター細胞を標的細胞に添加し、そして、混合後７．５時間の細胞ライセート中でルシフェラーゼ活性を定量した。
【０２４３】
タンパク質の産生および精製
２９３Ｔ細胞を、Ｔ２２５フラスコ中でｖＴＦ１．１に感染させ、そして、細胞をその後、２００μｇのｇｐ１２０プラスミドでトランスフェクションした。トランスフェクション後４時間に、細胞をリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、そして血清を含まない培地中に２４時間置いた。培地を収集し、０．１％  ＴＸ−１００の添加に先立ち遠心分離および０．２μｍ濾過により澄明にした。上清中のタンパク質を、ガランティス  ナヴァリス（Ｇａｌａｎｔｈｉｓ  Ｎａｖａｌｉｓ）カラム（ベクター  ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カリフォルニア州バーリンゲーム）に結合させ、メチル−α−Ｄ−マンノピラノシド（ＭＥＳ）緩衝液（２０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ７．０、０．１３Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２）で洗浄し、そして０．５Ｍα−メチルマンノシドを含有するＭＥＳ緩衝液中に溶出した。溶出物を、付加的精製、洗浄、および５０ｋＤのタンパク質分子量カットオフを用いるアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）限外濾過系を使用する濃縮にかけた。ＨＰＬＣ分析は、この様式で調製されたＥｎｖが高度に純粋であったことを決定し、そして正確なタンパク質濃度をアミノ酸分析およびＢＣＡアッセイにより測定した。
【０２４４】
細胞表面結合アッセイ
補助受容体へのｇｐ１２０の結合は、Ｄｏｒａｎｚら（１９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７３：２７５２−２７６１）により記述されたとおり測定した。簡潔には、およそ５μｇの各ｇｐ１２０を、ＩＩＩＢ、８ｘ、ＩＩＩＢ−Ｖ３ＢａＬおよび８ｘ−Ｖ３ＢａＬについてそれぞれ１２．３μＣｉ／μｇ、７．１５μＣｉ／μｇ、４７．３μＣｉ／μｇおよび２２．０μＣｉ／μｇの比活性までヨードゲン（Ｉｏｄｏｇｅｎ）（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ））を使用してヨウ素化した。１分あたり１００，０００カウント（ＣＰＭ）を、総量で１００μｌの結合緩衝液（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、５％  ＢＳＡ）中の１４μｇのＤＮＡで前日にトランスフェクションされていた約０．５ないし約１．０×１０６個の２９３Ｔ細胞に添加した。示された場合に可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）を１００ｎＭで添加した。細胞を２５℃で１時間インキュベートした。
【０２４５】
０．３％ポリエチレンイミン中に前浸積されたワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）ＧＦ／Ｃフィルターを通して細胞を濾過すること、および４ｍｌの洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、５００ｍＭ  ＮａＣｌ）で２回洗浄することにより、結合されない放射活性を除去した。細胞の非存在下でフィルターに非特異的に結合した放射活性の量を、全部のデータ点から差し引いた。
【０２４６】
バイオセンサー実験
全部の実験は、２５℃でバイアコア（ＢＩＡＣＯＲＥ）２０００（スウェーデン・ウプサラ）光学的バイオセンサーを使用して実施した。およそ２００ＲＵのｓＣＤ４、ならびに完全長のヒトＭＡｂ  １７ｂおよび４８ｄを、アミンカップリングにより研究等級のＣＭ５チップに結合した。抗体もしくはｓＣＤ４を伴わない裸の（ｎａｋｅｄ）センサー表面が、各結合相互作用の陰性対照として作用した。連続的に希釈していたＥｎｖを、ＰＢＳ＋０．００５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０の運転緩衝液（ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）中の６種の異なる濃度（ｇｐ１２０について１１ｎＭないし５８５ｎＭ、ｇｐ１２０＋ｓＣＤ４について５ｎＭないし９１ｎＭ）で各センサー表面を横切って運転した（ｒｕｎ）。可溶性ＣＤ４は、結合を測定する少なくとも３０分前に８倍モル過剰でＥｎｖに添加し、そしてセンサー表面に結合されたＣＤ４へのＥｎｖの結合を完全に除外した。結合および解離を、流れに依存しない結合のオン速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）を与えた３０μｌ／分の流速で、それぞれ３００秒間測定した。センサー表面は、１００μｌ／分で１５秒間の１０ｍＭ  ＨＣｌの２回の洗浄を使用することにより各結合反応の間に再生し、これは固定された表面の結合能力を低下させることなくシグナルを完全に基礎まで戻すことが見出された。陰性対照フローセルから得られたシグナルの減法により、各結合曲線を非特異的結合について補正した。会合および解離の動力学的定数を、最低５濃度の被検体の輸出された結合データの線形変換から生じさせた。得られた動力学的パラメータは、ＢＩＡ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．１ソフトウェアを使用してデータを単純１：１ラングミュアー相互作用モデルに適合させることにより推定されたものと比較した。
【０２４７】
中和アッセイ
抗血清もしくはＭＡｂによるウイルスの中和は、既に記述されたＭＡＧＩアッセイ（Ｃｈａｋｅｒｉａｎら、１９９７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３９３２−３９３９）の改変物、もしくはＣｏｎｎｏｒら（１９９５、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０６：９３５−９４４）により記述されたルシフェラーゼレポーターウイルス系を使用して実施した。簡潔には、１．２５×１０５個のＭＡＧＩ細胞を４８穴プレート中でプレート培養し、そして細胞を接着させた。抗体の連続的希釈物と３７℃で１時間前インキュベートしていたウイルスで細胞を感染させた。使用されたウイルスの量は、４００〜８００感染単位を含有するようにＭＡＧＩアッセイで既に決定された量であった。感染の２４時間後にＤＰ１７８阻害ペプチドを５μｇ／ｍｌの最終濃度で添加してシンシチウムの形成を予防した。細胞培養物を別の４８時間インキュベートし、固定しそして細胞をＸ−ｇａｌで染色した。アルファイメージャー（ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ）２０００（アルファイノテック  コーポレーション（ＡｌｐｈａＩｎｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、カリフォルニア州サンリアンドロ）を使用して、青色の核を定量した。ルシフェラーゼレポーターウイルスの感染のためには、相対的光単位（ＲＬＵ）により判断されるような等量のウイルスもまた、抗体の連続的希釈物とともに３７℃で１時間インキュベートした。ウイルスを、９６穴プレート中でＧＨＯＳＴ−ＣＣＲ５細胞に添加し、そして感染２日後に、細胞ライセートをルシフェラーゼ活性について測定した。
【０２４８】
本実施例に提示される実験の結果を今や記述する。
【０２４９】
ＣＸＣＲ４への８ｘ  ｇｐ１２０の直接結合
ＨＩＶ−１  ＥｎｖへのＣＤ４の結合は、その後のＥｎｖと補助受容体の相互作用に必要とされるコンホメーション変化を誘導する。これらの変化は、補助受容体結合に関係しているｇｐ１２０中の例外的に良好に保存されたドメインの増大された露出を包含することがありそうである（図１２）。多くのＳＩＶおよびＨＩＶ−２株は、ＣＤ４非依存性の様式でウイルス進入に補助受容体を利用することにより、この正常な進入過程を省くことができるが、とは言えそれらの効率はＣＤ４が存在する場合に典型的に高められる。実施例１に既に提示されたデータは、ＣＤ４陰性、ＣＸＣＲ４陽性の細胞上でのＨＩＶ−１  ＩＩＩＢの反復された継代によるＣＤ４非依存性のＨＩＶ−１株の産生を開示する（実施例１、上記）。生じるウイルス株（ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ）は、広範な細胞型を感染させるのに、ＣＤ４の非存在下でＣＸＣＲ４を利用することができる（実施例１、上記）。８ｘと命名された、ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘに慢性に感染した細胞由来のＥｎｖクローンはこの表現型を維持する。従って、８ｘ  Ｅｎｖを発現する細胞は、ＣＤ４陰性、ＣＸＣＲ４陽性の細胞との融合を媒介した。ＣＤ４の存在下で、融合の効率はおよそ３倍高められた（図１０Ａおよび１０Ｂ）。８ｘにより媒介される融合はＣＸＣＲ４に厳格に依存し、そして他の補助受容体が発現される場合に観察されない（図１０Ａおよび１０Ｂ）。ＣＤ４は、それが補助受容体と相互作用することを可能にするＥｎｖのコンホメーション変化を誘導することが既知であるため、また、８ｘ  ＥｎｖはＣＤ４の非存在下でＣＸＣＲ４依存性の融合を媒介することができるため、８ｘ  Ｅｎｖタンパク質が部分的に誘導された状態で存在してそれによりそれがＣＤ４非依存性の様式でＣＸＣＲ４を結合することを可能にするかどうかを決定するための実験を実施した。
【０２５０】
８ｘ  ｇｐ１２０のコンホメーションの差異を評価するために、ＣＸＣＲ４に直接に結合する精製された８ｘ  ｇｐ１２０の能力を検査した。この点に関して、Ｄｏｒａｎｚら（１９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：２７５２−２７６１）により記述されかつ本明細書に示されるような細胞表面結合アッセイを使用し、ここで、可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）との前インキュベーションを伴うもしくは伴わない、放射ヨウ素化されたｇｐ１２０を、所望の補助受容体を発現する細胞に添加した。細胞を洗浄し、そして結合された放射標識されたｇｐ１２０の量を測定した。本明細書に開示されるデータは、ｓＣＤ４と複合体形成されたＩＩＩＢ  ｇｐ１２０がＣＸＣＲ４を発現する細胞に結合したが、しかし他の補助受容体を発現する細胞に結合しなかったことを立証する（図１１）。対照的に、８ｘ  ｇｐ１２０は、ｓＣＤ４の存在もしくは非存在下で同等に良好に、ＣＸＣＲ４を発現する細胞に結合した（図１１）。ベクター単独もしくはＣＣＲ５を発現する細胞への結合は観察されなかった。これらの結果は、親ＩＩＩＢ  Ｅｎｖと異なり、８ｘ  ｇｐ１２０は、それがＣＤ４の非存在下でＣＸＣＲ４と直接相互作用することを可能にする安定なコンホメーションで存在することを立証する。
【０２５１】
補助受容体結合部位の露出
理論により拘束されることを願わないが、ＣＸＣＲ４に結合する８ｘ  ｇｐ１２０の能力は、ＣＸＣＲ４と相互作用するｇｐ１２０上の部位の増大された露出の結果であることができる。これらの部位の増大された露出が存在したかどうかを決定するために、ＣＤ４ｉ  ＭＡｂ  １７ｂおよび４８ｄと相互作用するＩＩＩＢおよび８ｘ  ｇｐ１２０の能力を検査した。１７ｂのＦａｂフラグメントをｇｐ１２０およびｓＣＤ４と共結晶化し（Ｋｗｏｎｇら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：６４８−６５９）、そして開示されるデータは、１７ｂとｇｐ１２０の相互作用に関与する接触残基の多くが補助受容体結合にもまた重要であることを立証する（図１２）。従って、１７ｂを、Ｒｉｚｚｕｔｏら（１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１９４９−１９５３）により定義される保存された補助受容体結合部位の露出を測定するための免疫学的代理物として使用することができる。
【０２５２】
ｓＣＤ４との前インキュベートを伴うもしくは伴わない、ＩＩＩＢおよび８ｘ  ｇｐ１２０のＣＤ４ｉ  ＭＡｂ  １７ｂおよび４８ｄへの結合を、本明細書の別の場所に記述されるような光学的バイオセンサーアッセイ法を使用して測定した（実施例２の材料および方法を参照されたい）。このアプローチは、タンパク質−タンパク質相互作用を実時間で測定することを可能にし、そしてオン速度およびオフ速度、ならびに親和性定数を生じさせるのに使用することができる。所望のＭＡｂをセンサー表面に共有結合し、その後ｇｐ１２０もしくはｇｐ１２０−ｓＣＤ４複合体を適用した。典型的なセンサー図（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）を図１３に示す。期待されたとおり、ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢ  ｇｐ１２０がＭＡｂ  １７ｂに結合した速度は、ｓＣＤ４とＥｎｖの前インキュベーションにより顕著に増大した。１７ｂに結合されれば、ＩＩＩＢ  ｇｐ１２０およびｇｐ１２０−ｓＣＤ４複合体の双方が、無視できるオフ速度を表した。ＩＩＩＢ  ｇｐ１２０に対照的に、８ｘ  ｇｐ１２０はｓＣＤ４なしで１７ｂに効率的に結合し、ＩＩＩＢ  ｇｐ１２０のものより大きな桁であったオン速度を表した。ｓＣＤ４の添加はこのオン速度を２倍高めた。ｓＣＤ４と複合体形成された場合に、８ｘおよびＩＩＩＢ双方のｇｐ１２０は同一のオン速度を表した（表１）。興味深いことに、１７ｂに結合されれば、８ｘ  ｇｐ１２０はＩＩＩＢ  ｇｐ１２０が表したより大きなオフ速度を表した。この効果は、アミノ酸位置４２３（１７ｂの接触部位であることが既に示されている残基（Ｋｗｏｎｇら、上記））での８ｘ  ｇｐ１２０中のＩｌｅからＶａｌへの突然変異によることができる（図１２）。
【０２５３】
【表１】
2004522401.tif 000002
【０２５４】
表１に開示されるデータは、本明細書の別の場所に既に記述されたとおり実施されたバイオセンサー実験で、ＣＤ４ｉ抗体へのｇｐ１２０の結合から生じられる見かけの動力学的定数および平衡定数を立証する。簡潔には、ＣＤ４ｉ抗体１７ｂおよび４８ｄをバイオセンサー表面に結合し、そして８ｘおよびＨＸＢ  ｇｐ１２０の連続的希釈物の結合および解離の双方を測定した。飽和量のｓＣＤ４と前混合していた双方のＥｎｖの連続的希釈物の結合もまた測定した。全部の結合は２５℃で実施し、そしてサンプルのセンサー図を図１３に示す。データの直線化されたプロットの傾きの最も適合された値（ｒ２≧０．９８）を報告する。単純１：１ラングミュアー相互作用モデルを適合させることにより推定されたパラメータは、包括的に、報告された値の１５％内であった。斜体の値は、それらがバイオセンサーの検出限界にあったくらい遅かった解離速度を表し、これらの値から生じられる親和性定数をより少なく正確にする。
【０２５５】
異なるＣＤ４ｉ  ＭＡｂ、４８ｄの分析は、１７ｂに類似であった結果を生じた（表１）。最後に、ＩＩＩＢおよび８ｘ  ｇｐ１２０分子は、同一の様式で、センサー表面に結合されたＣＤ４と相互作用した。従って、それをＣＤ４非依存性にする８ｘ中の突然変異はＣＤ４結合にはっきりと感知できる程度まで影響を及ぼさなかったが、しかし１７ｂエピトープのより大きな露出（保存された補助受容体結合部位と重なり合う）をもたらした。
【０２５６】
補助受容体の選択およびＣＤ４非依存性の分離
ｇｐ１２０の保存された補助受容体結合部位ならびにＶ１／Ｖ２およびＶ３ループの双方が、Ｅｎｖと補助受容体の相互作用で重要な役割を担っている。入手可能な証拠は、Ｖ３ループ、およびより少ない程度までＶ１／Ｖ２領域が、与えられたＥｎｖにより使用される補助受容体の数および型を支配することを示す（Ｈｏｆｆｍａｎら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：１１３６０−１１３６５；ＲｏｓｓとＣｕｌｌｅｎ、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：７６８２−７６８６；Ｓｐｅｃｋら、１９９７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：７１３６−７１３９；Ｃｏｃｃｈｉら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．２：１２４４−１２４７；Ｃｈｏら、１９９８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２５０９−２５１５；Ｃｈｏｅら、１９９６、Ｃｅｌｌ  ８５：１１３５−１１４８）。対照的に、保存された補助受容体結合部位中の突然変異はＥｎｖと補助受容体の結合に影響を及ぼすことができる（Ｒｉｚｚｕｔｏら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１９４９−１９５３）が、しかし、この領域が補助受容体の特異性においてもまたある役割を担っているかどうかは明らかでない。ＣＸＣＲ４と直接相互作用する８ｘ  ｇｐ１２０の能力は、補助受容体の選択、および補助受容体結合部位を露出させるＥｎｖ中の変化が分離可能であるかどうかを決定する機会を提供した。以前の研究は、ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢ背景へのＲ５  Ｖ３ループ（ＨＩＶ−１  ＢａＬから）の導入が、ウイルス感染にＣＣＲ５を使用した（しかしＣＸＣＲ４でない）Ｅｎｖタンパク質（ＩＩＩＢ−ＢａＬ）をもたらしたことを立証した（ＲｏｓｓとＣｕｌｌｅｎ、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：７６８２−７６８６；Ｒｏｓｓら、１９９７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１９１８−１９２４）。実施例１で本明細書に既に開示されたデータは、細胞−細胞融合アッセイを使用して、Ｒ５  Ｅｎｖ（ＢａＬ）からのＶ３ループでの８ｘ  Ｅｎｖのものの置換は、ＣＣＲ５陽性、ＣＤ４陰性の細胞との融合を媒介することが可能であったタンパク質（８ｘ−ＢａＬ）を生じさせたことを立証する。８ｘ−ＢａＬがＣＤ４非依存性のウイルス感染もまた媒介することができたかどうかを決定するため、ＩＩＩＢ−Ｖ３ＢａＬもしくは８ｘ−Ｖ３ＢａＬいずれかのＥｎｖタンパク質を担持するＣｏｎｎｏｒら（１９９５、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０６：９３５−９４４）に記述されたようなルシフェラーゼレポーターウイルスを生じさせた。８ｘ−Ｖ３ＢａＬ  Ｅｎｖを担持するビリオンは、ＣＤ４非依存性、ＣＣＲ５依存性のウイルス感染を媒介した（図１０Ｂ）。融合アッセイにおいて８ｘ  Ｅｎｖで観察されたとおり、ＣＤ４の存在はウイルス進入の効率を増大させた。ＣＤ４の存在もしくは非存在下で、ＩＩＩＢ−ＢａＬもしくは８ｘ−ＢａＬのいずれもＣＸＣＲ４を使用しなかった。また、ＩＩＩＢ−ＢａＬおよび８ｘ−ＢａＬ  ｇｐ１２０分子が産生され、そして、本明細書で開示されるデータは、ＩＩＩＢ−ＢａＬ  ｇｐ１２０がＣＤ４依存性の様式でＣＣＲ５に結合した一方、８ｘ−ＢａＬはＣＤ４に依存せずにＣＣＲ５に結合したことを立証する。��ずれのタンパク質も、検査されたいかなる条件下でもＣＸＣＲ４に結合しなかった。従って、Ｖ３ループ中の変化はどの補助受容体が使用されたかに影響を及ぼしたが、しかしＣＤ４非依存性に影響しなかった。
【０２５７】
ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘの中和
Ｅｎｖと補助受容体の相互作用を封鎖する抗体はＨＩＶ−１を中和することができる（Ｗｕら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  ３８４：１７９−１８３；Ｔｒｋｏｌａら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  ３８４：１８４−１８７）。ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ  ｇｐ１２０中の補助受容体結合部位の露出された性質は、従って、このウイルスを抗体に媒介される中和に対しより感受性にすると期待することができる。Ｖ１／Ｖ２領域中の改変を伴う数種のＳＩＶおよびＨＩＶ−１株が、おそらく保存された決定子の増大された露出により、中和感受性であることが示されている（ＳｔａｍａｔａｔｏｓとＣｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ、１９９８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：７８４０−７８４５；Ｒｅｉｔｔｅｒら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．４：６７９−６８４）。従って、ＨＩＶ陽性のヒト血清による中和、およびＩＩＩＢもしくは８ｘいずれかのｇｐ１２０で免疫化されたウサギからの血清に対するＨＩＶ−１／ＩＩＩＢおよびＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘの相対的感受性を比較し、そして結果を表２に示す。
【０２５８】
【表２】
2004522401.tif 000003
【０２５９】
表２に開示されるデータは、ｓＭＡＧＩ細胞を同等量のＨＩＶ−１／ＩＩＩＢおよびＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘに感染させることにより得た。感染は、Ｃｈａｃｋｅｒｉａｎら（１９９７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３９３２−３９３９）により既に記述されたとおり感染後７２時間に決定した。ＭＡｂ  １７ｂおよび４８ｄについて、ＩＩＩＢ−ＢａＬもしくは８ｘ−ＢａＬ  Ｅｎｖを担持する同等量のルシフェラーゼレポーターウイルスを使用してＧＨＯＳＴ−ＣＣＲ５細胞を感染させ、これを感染４８時間後に溶解した。全部の感染について、ウイルス、ならびにＭＡｂ、ヒト血清およびウサギ血清の連続的希釈物を、標的細胞への添加前に１時間混合した。入力ウイルス（ｉｎｐｕｔ  ｖｉｒｕｓ）の５０％および９０％を中和するのに必要とされる血清もしくは抗体の濃度を示す。ＭＡｂ  ４８ｄは試験されたいかなる条件下でもＩＩＩＢ−ＢａＬを中和せず、そして８ｘ−ＢａＬの８８％の中和のみが２００ｎｇ／ｍｌ（＊により示されるような）の濃度でこのＭＡｂにより達成された。ＭＡｂ  ５０．１はＷｈｉｔｅ−Ｓｃｈａｒｆら（１９９３、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９２：１９７−２０６）により記述されるようなＢａＬ  Ｖ３ループに対し向けられる。
【０２６０】
本明細書に開示されるデータは、ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘが、多くの場合で１対数もしくはそれ以上、親ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢよりも中和に対し均一により感受性であったことを立証する（表２）。ＨＩＶ−１陽性のヒト血清、ＩＩＩＢ  ｇｐ１２０に対し生じられたウサギ血清、および８ｘ  ｇｐ１２０に対し生じられたウサギ血清は、全部、ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢよりはるかにより効率的にＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘを中和した。加えて、本明細書に開示されるデータは、８ｘ−ＢａＬ  Ｅｎｖを含有するビリオンが、ＩＩＩＢ−ＢａＬ  Ｅｎｖを含有するものよりも、ＣＤ４ｉ  ＭＡｂ  １７ｂおよび４８ｄによる中和に対しずっとより感受性であったが、しかし８ｘ−ＢａＬ  ＥｎｖビリオンはこれらのウイルスのＶ３ループを認識する抗体による中和に対し増大された感受性を立証しなかったことを立証する（表２）。従って、理論により拘束されることを願わないが、本明細書に開示されるデータは、補助受容体結合部位の増大された露出、ならびにＣＤ４ｉエピトープの増大された露出が、抗体に誘導される中和に対するＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘの増大された感受性の原因であることがありそうであることを立証する。
【０２６１】
従来技術は、受容体結合が、その膜融合の潜在能力を活性化するＥｎｖのコンホメーション変化を誘導することを教示する。ＣＤ４への結合は、Ｅｎｖが適切な補助受容体（通常はＣＣＲ５もしくはＣＸＣＲ４）と相互作用することを可能にし（Ｗｕら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  ３８４：１７９−１８３；Ｔｒｋｏｌａら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  ３８４：１８４−１８７；Ｌａｐｈａｍら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：６０２−６０５；Ｈｉｌｌら、１９９７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：６２９６−６３０４）、これは最終的に膜融合およびウイルス進入につながるＥｎｖの付加的なコンホメーション変化をもたらすと考えられる。融合はウイルス感染で決定的に重要な一段階であり、そしてこの過程につながるＥｎｖの構造の中間体を理解することは、新規の抗ウイルス戦略の開発を示唆することができる。事実、膜融合反応のペプチド阻害剤での早期の臨床試験は、ウイルス負荷のかなりの低下を示している（Ｋｉｌｂｙら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．４：１３０２−１３０７）。
【０２６２】
ウイルス補助受容体の発見、およびｇｐ１２０コアフラグメントの最近解明された結晶構造は、ウイルス進入過程のより大きな理解を提供し、また、薬理学的もしくは免疫学的介入のための新たな潜在的標的を同定した（Ｋｗｏｎｇら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：６４８−６５９；Ｒｉｚｚｕｔｏら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１９４９−１９５３；Ｗｙａｔｔら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：７０５−７１０）。Ｅｎｖの場合には、ｇｐ１２０中の例外的に良好に保存された領域がＣＣＲ５結合に関係している（Ｒｉｚｚｕｔｏら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１９４９−１９５３）。ｇｐ１２０の内側ドメインと外側ドメインとの間の架橋シート中に配置されるこの領域は、Ｖ３ループの基部とＶ１／Ｖ２領域との間に存する（図１２）。これらの可変領域の位置を変えることが知られている（Ｗｙａｔｔら、１９９５、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：５７２３−５７３３）ＣＤ４への結合は、この高度に保存された部位の露出および／もしくは形成につながることができる。１７ｂのような中和抗体は、この領域と重なり合うエピトープに結合し（Ｒｉｚｚｕｔｏら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１９４９−１９５３；Ｗｙａｔｔら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：７０５−７１０）、こうしてこのドメインの露出のための免疫学的代理物として作用し、かつ、適正に提示される場合はこの領域が広範に交差反応性の中和抗体を導き出すことができることを示唆する。しかしながら、本発明の前には、ｇｐ１２０の補助受容体結合領域に対する免疫応答を生じさせるような方法で、この領域を免疫系に提示する方法が存在しなかった。
【０２６３】
ＣＣＲ５もしくはＣＸＣＲ４と直接相互作用して細胞を感染させることにより正常なウイルス進入過程を迂回する、多数のＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶウイルス株が記述されている（実施例１；Ｅｄｉｎｇｅｒら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１４７４２−１４７４７；Ｅｎｄｒｅｓら、１９９６、Ｃｅｌｌ  ８７：７４５−７５６）。ＣＤ４非依存性のウイルスはウイルスの向性および病因に影響することができる一方、それらはまたウイルス進入経路を詳細に分析するための有用なツールとしても作用する。本明細書に開示されるデータは、本明細書で開示されるＣＤ４非依存性のＨＩＶ−１  Ｅｎｖは安定な部分的に誘導された状態で存在し、ここでは保存された補助受容体結合部位が十分に露出されていることを示す、２方向の証拠を立証する。第一に、８ｘ  ｇｐ１２０はＣＸＣＲ４に直接結合した一方、親ＩＩＩＢ  ｇｐ１２０はＣＤ４依存性の様式でＣＸＣＲ４を結合した。第二に、８ｘ  ｇｐ１２０は、親のＣＤ４依存性のタンパク質が結合したよりもずっとより迅速に２種のＣＤ４ｉ  ＭＡｂに結合した。しかしながら、より迅速なオフ速度の結果として、ＣＤ４ｉ  ＭＡｂに対する８ｘ  ｇｐ１２０の全体的な親和性はＨＩＶ−１  ＩＩＩＢ  ｇｐ１２０のものに類似であり、タンパク質−タンパク質相互作用における重要な差異が、光学的バイオセンサーの使用により提供される実時間分析によりどのように示されることができるかの目立つ例を提供した。ＩＩＩＢに関して８ｘにより表されるより迅速なオフ速度は、Ｉ４２３Ｖ（１７ｂの接触部位として作用する残基）を包含する補助受容体結合部位の近傍の８ｘタンパク質中の多数のアミノ酸変化によることができる（Ｋｗｏｎｇら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：６４８−６５９）。
【０２６４】
ＨＩＶ−１の向性は、大部分で、補助受容体の選択により支配される。ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４もしくは双方を利用するウイルスの能力は、それが進入することができるＣＤ４陽性の細胞の型を主に命令する。ｇｐ１２０中のＶ３ループは補助受容体の選択で決定的に重要な役割を担っており、Ｖ１／Ｖ２領域はより従属的な役割を演じている（Ｈｏｆｆｍａｎら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：１１３６０−１１３６５；ＲｏｓｓとＣｕｌｌｅｎ、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：７６８２−７６８６；Ｓｐｅｃｋら、１９９７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：７１３６−７１３９；Ｃｏｃｃｈｉら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．２：１２４４−１２４７；Ｃｈｏら、１９９８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２５０９−２５１５；Ｃｈｏｅら、１９９６、Ｃｅｌｌ  ８５：１１３５−１１４８）。本明細書に開示されるデータは、８ｘ  Ｅｎｖの補助受容体の選択およびＣＤ４非依存性の根底にある決定子が分離可能であることを立証する。従って、Ｒ５  ＥｎｖからのＶ３ループを含有する８ｘ  ＥｎｖはそのＣＤ４非依存性の表現型を維持するが、しかし、今や、細胞−細胞融合およびウイルス感染にＣＸＣＲ４よりはむしろＣＣＲ５を使用する。さらに、本明細書に開示されるデータは、８ｘ−ＢａＬ  ｇｐ１２０がＣＤ４の非存在下でＣＣＲ５を発現する細胞に結合することが可能であることを立証する。これらのデータは、補助受容体の選択およびケモカイン受容体のＣＤ４非依存性の使用が分離可能であることを初めて明瞭に立証する。これらのデータは、理論により拘束されることを願わず、補助受容体結合領域が、会合されたＶ３ループの性質に依存して、ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ５の双方と相互作用することができることを示唆する（Ｒｉｚｚｕｔｏら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１９４９−１０５３）。従って、本明細書に開示されるＨＩＶ−１変異体の情況において、Ｖ３ループは部分的に誘導されたＥｎｖでの補助受容体の選択に同様に影響を及ぼすことができる。本発明の開示は、補助受容体の相互作用において可変領域および保存された結合部位が担うそれぞれの役割の解明、ならびにそれぞれが相互作用するＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４中のドメインの同定を助長することができる。
【０２６５】
ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ遊走群および８ｘ分子クローンのとりわけ目立つ特徴は、抗体による中和に対するそれらの感受性であった。ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘは、ＨＩＶ陽性のヒト血清による中和、ならびにＩＩＩＢ  ｇｐ１２０もしくは８ｘ  ｇｐ１２０のいずれかに対して生じられたウサギ血清に対しおよそ１０倍より感受性であった。理論により拘束されることを願わないが、抗体に媒介される中和に対するＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘの増大された感受性は、この部分的に誘導されたＥｎｖ中の１種もしくはそれ以上の中和決定子が、親のＣＤ４依存性のＥｎｖにおけるよりも抗体により一般的に接近可能であることを示唆する。保存された補助受容体結合部位は、８ｘ  Ｅｎｖに直接結合しかつ８ｘ−ＢａＬ  Ｅｎｖに偽型分類される（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）ビリオンを効率的に中和するＣＤ４ｉ  ＭＡｂの能力により示されるとおり、この表現型の原因であることができる標的でありそうである。加えて、本明細書の実施例１で開示されたデータにより立証されるとおり、８ｘ  Ｅｎｖは親ＩＩＩＢに関して５個のグリコシル化部位の顕著な喪失もまた表し、炭水化物の喪失がこの領域の露出である役割を担うことができるという可能性を生じる。ＣＤ４ｉ  ＭＡｂによる８ｘ−ＢａＬの増大された中和にもかかわらず、補助受容体結合部位の増大された露出は、Ｖ３ループに対し向けられたＭＡｂに対する８ｘ−ＢａＬの増大された感受性につながらなかった（表２）。Ｖ１／Ｖ２領域中のグリコシル化部位を欠くＳＩＶｍａｃ２３９、ならびにＶ１中に１個の欠失を含有するＨＩＶ−１  ＳＦ１６２株を包含する、数種の他の中和感受性のウイルスが最近、記述されている（ＳｔａｍａｔａｔｏｓとＣｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒ、１９９８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：７８４０−７８４５）。本発明は、Ｖ１／Ｖ２の幹に隣接する補助受容体結合部位がこれらのウイルスで同様に露出されるかどうかを決定するための研究を助長することができる。
【０２６６】
組換えｇｐ１２０での免疫感作は広範に交差反応性の中和抗体を生じさせることに典型的に失敗することを、多数の研究が示しているが、それでもなお、こうした抗体がウイルス感染の結果として若干の個体で生じられることが明らかである（ＢｕｒｔｏｎとＭｏｔｅｆｉｏｒｉ、１９９７、ＡＩＤＳ  １１（Ｓｕｐｐ．Ａ）：Ｓ８７−Ｓ９８）。理論により拘束されることを願わないが、株特異的中和のみがｇｐ１２０による免疫感作後に観察されたかもしれない。なぜなら、Ｅｎｖの保存された領域は、ＣＤ４結合の前にＣＤ４依存性のｇｐ１２０中に隠されているからである。本明細書に開示されるデータは、ｇｐ１２０がケモカイン受容体タンパク質に結合することができる前にＣＤ４への最初の結合をもはや必要としない、部分的に誘導された形態のｇｐ１２０からＣＤ４非依存性が生じる場合には、高度に保存されたケモカイン受容体結合部位の露出がウイルスを中和に対しより感受性にすることを示唆する。より重要なことに、本明細書に開示されるデータは、部分的に誘導され従ってそれ以外は隠されたケモカイン受容体結合部位を安定に露出させるＥｎｖでの免疫感作は、この領域に対し向けられる広範に交差反応性の中和抗体のより効率的な生成をもたらすことができることを示唆する示す。これが起こるためには、おそらく、この領域への接近が高められる誘導されたコンホメーションをＣＤ４結合が誘導した後に、本来のＣＤ４依存性のＥｎｖタンパク質中の補助受容体結合部位に接近することができる抗体が生じられなければならない。ＥｎｖをＣＤ４非依存性にしかつこの領域の露出に影響する決定子の同定は、中和抗体を導き出すこの部位の潜在能力を系統的に取り扱うことを可能にすることができる。補助受容体結合部位の露出はＣＤ４非依存性のＥｎｖの重要な一成分であることができる一方、Ｅｎｖ中の他の変化もまたＣＤ４非依存性の様式で細胞を感染させる能力に影響することがありそうであることに注目することが重要である（実施例１）。
【０２６７】
加えて、分子レベルでケモカイン受容体結合部位の決定子（１個もしくは複数）を検査しかつ位置づける能力は、ｇｐ１２０／ケモカイン受容体結合の小分子阻害剤の開発を助長することができる。
【０２６８】
該用語が本明細書で使用されるところの「小分子」は、ケモカイン受容体タンパク質へのｇｐ１２０の結合を阻害することが可能でありかつ大きさが約１ｋＤａ未満である、限定されるものでないがペプチド模倣物およびＡＬＸ４０−４Ｃ（Ｄｏｒａｎｚら、１９９７、Ｊ．Ｅｘｐ．ｍｅｄ．１８６：１３９５−１４００）のような核酸およびポリペプチドを包含する化合物（合成であろうと天然に存在しようと）を意味する。
【０２６９】
従って、本明細書に開示されるデータは、限定されるものでないが抗体に基づく様式を挙げることができる有効な抗ウイルス治療薬の開発において重要な意味を有する。従って、本発明は、ｇｐ１２０とケモカイン受容体タンパク質の相互作用の阻害剤のような化合物の広範な一分類の開発を包含すると解釈されるべきである。
【０２７０】
さらに、補助受容体結合部位を安定に露出させることができることは、ウイルスの進入に対する意味を有することができる。理論により拘束されることを願わないが、ＣＤ４結合後の補助受容体結合部位の露出および／もしくは形成は、比較的不安定であるＥｎｖのコンホメーションをもたらす可能性があり、短い時間の期間内に補助受容体との相互作用を必要とすることが想像できる。例えば、酸性のｐＨによるセムリキ森林ウイルスのスパイクの糖タンパク質のコンホメーション変化の誘導は、それが数分以内にその脂質補助受容体と相互作用することができない限り、該タンパク質の膜融合の潜在能力の迅速な不活性化につながる（Ｋｉｅｌｉａｎ、１９９５、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．４５：１１３−１５１）。しかしながら、部分的に誘導されたしかし安定な状態で存在する８ｘ  Ｅｎｖタンパク質は、補助受容体結合部位の露出が寿命の長い誘導されたＥｎｖのコンホメーションと適合性であることを示唆する。従って、補助受容体結合は、この事象を可能にするＣＤ４により誘導されるコンホメーション変化のずっと後に発生する可能性があり、おそらく十分なレベルのＣＤ４が存在する場合に非常に低レベルの補助受容体を発現する細胞を感染させるＨＩＶ−１の能力の原因である（Ｐｌａｔｔら、１９９８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２８５５−２８６４；Ｋｏｚａｋら、１９９７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：８７３−８８２）。この発見は、ＨＩＶ−１とケモカイン受容体の相互作用の阻害に基づく抗ウイルス治療薬の開発における本発明の潜在能力をさらに強調する。なぜなら、誘導されたコンホメーションは、潜在的に、必要な決定子を封鎖する化合物が宿主細胞の受容体へのウイルス結合の阻害を達成するのに十分長く存在することができるからである。
【０２７１】
結論として、本明細書に開示されるデータは、８ｘ  Ｅｎｖタンパク質のＣＤ４非依存性の表現型が補助受容体結合部位の安定な露出と関連していることを立証する。従って、このタンパク質は、通常の融合過程の構造の中間体を表すことがありそうであり、そして、膜融合につながるコンホメーション変化に影響する構造パラメータを検討するのに使用することができる。重要なことに、この安定に露出されたドメインの高度に保存された性質、および中和抗体をそれに対して向けることができるという事実は、適正に提示される場合にＨＩＶ−１に対する広範に交差反応性の中和抗体を導き出すのにこのドメインを使用することができるという可能性を生じる。
【０２７２】
本明細書で引用されるそれぞれのおよびすべての特許、特許出願ならびに刊行物の開示は、これによりそっくりそのまま引用により本明細書に組み込まれる。
【０２７３】
本発明は特定の態様に関して開示された一方、本発明の他の態様および変形物を、本発明の真の技術思想および範囲から離れることなく当業者により工夫することができることが明らかである。付属として付けられる請求の範囲は、全部のこうした態様および同等の変形物を包含するよう解釈されるよう意図している。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
発明にかかる、ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢもしくはＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘによるＣＤ４陽性およびＣＤ４陰性のＴ細胞におけるウイルス複製を描く、２図を含んで成るグラフである。ＣＤ４陰性のＢＣ７細胞（上図）およびＳｕｐＴ１  ＣＤ４陽性細胞（下図）に、等量のＨＩＶ−１／ＩＩＩＢ（白菱形）もしくはＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ（黒丸）を接種し、そしてウイルス複製を培養物上清中の逆転写酵素（ＲＴ）活性により測定した。
【図１Ｂ】
発明にかかる、抗ＣＸＣＲ４抗体（１２Ｇ５）によるＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ複製の阻害を描くグラフである。ＣＤ４陰性のＢＣ７細胞に、抗ＣＸＣＲ４抗体１２Ｇ５の非存在（白棒）または存在（５μｇ／ｍｌ（斜線をつけられた棒）もしくは２０μｇ／ｍｌ（黒棒））下にＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘを接種し、そして逆転写酵素（ＲＴ）活性を示された時点で測定した。
【図１Ｃ】
発明にかかる、ＣＸＣＲ４を発現するマウス細胞でＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘにより誘導される細胞融合を描く、２図を含んで成る像である。ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘに感染したＢＣ７細胞を、ＣＸＣＲ４を発現しないマウス３Ｔ３細胞（３Ｔ３、左図）もしくはヒトＣＸＣＲ４を発現する３Ｔ３細胞（３Ｔ３／ＣＸＣＲ４、右図）と２４時間共培養し、そしてその後、Ｅｎｄｒｅｓら（１９９６、Ｃｅｌｌ  ８７：７４５−７５６）に記述されるとおりシンシチウム形成について細胞を染色した。
【図２】
発明にかかる、ＩＩＩＢｘ  ｅｎｖ遺伝子の相対的光単位（ＲＬＵ）で表される融合活性を描くグラフである。示されたｅｎｖ遺伝子をｐＳＰ７３にクローン化し、ＱＴ６細胞にトランスフェクションし、そして、Ｒｕｃｋｅｒら（１９９７、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２８８：１１８−１３３）に記述されるとおりかつ本明細書の別の場所に記述されるとおり、ＣＤ４およびＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ４単独、もしくはＣＤ４単独を発現するＱＴ６細胞上での融合アッセイで遺伝子を評価した。結果は、ＣＸＣＲ４＋／ＣＤ４＋細胞上での８ｘの活性に対して正規化されたＲＬＵの平均＋ＳＥＭとして表す。Ｏｌｓｈｅｖｓｋｙら（１９９０、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：５７０１−５７０５）に記述されるような、ＣＤ４結合部位を除去するＤ３６８Ｒ突然変異を含有する８ｘおよびＨＸＢｃ２  Ｅｎｖの融合活性もまた示す。
【図３Ａ】
発明にかかる、ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ  ｅｎｖ遺伝子の融合活性を立証するグラフである。８ｘ  ｅｎｖをｐＮＬ４−３に挿入し、そしてＢＣ７細胞のトランスフェクション後にウイルスストックを生成させた。等量の生じるウイルス（ＮＬ４３／８ｘと呼称される）およびＨＩＶ−１／ＩＩＩＢをＳｕｐＴ１およびＢＣ７細胞に接種し、そして時間にわたってＲＴレベルをモニターした。
【図３Ｂ】
発明にかかる、多様なウイルスのＴＭポリペプチドの大きさの評価を描くウェスタンブロットの像である。ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢに感染したＳｕｐＴ１細胞（レーン１）、ＩＩＩＢｘに感染したＢＣ７細胞（レーン２）およびＮＬ４３／８ｘに感染したＢＣ７細胞からのウイルスライセートを、抗ＴＭマウスモノクローナル抗体Ｄ１２を使用するウェスタンブロットにより評価した。配列分析（図４）と矛盾せず、ＩＩＩＢｘおよびＮＬ４３／８ｘ双方が短縮されたＴＭタンパク質を表した。
【図４】
発明にかかる、ＩＩＩＢｘ  ｅｎｖクローンのアミノ酸配列分析を描く図である。ＩＩＩＢｘ  ｅｎｖクローン８ｘ（配列番号３）およびＳ１０（配列番号１２）の配列分析を、ＨＸＢｃ２（配列番号１１）のものと比較する。影を付けられた領域は、ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢからの他のクローン中でもまた見出される突然変異を示す。予測されるＮに結合されるグリコシル化部位は、アミノ酸位置（アミノ酸は一文字記号を使用して呼称する）の直接上に、影を付けられた灰色の丸の記号により示す。可変ループ、ｇｐ１２０／ｇｐ４１切断部位およびＴＭの膜にわたるドメイン（ｍｓｄ）の位置もまたＨＸＢｃ２のアミノ酸配列の上に示す。８ｘの配列はアミノ酸位置７０６にフレームシフト突然変異を含有し、これはＨＸＢｃ２に比較して未熟に短縮された細胞質の尾をもたらす。Ｓ１０は５０ヌクレオチドの欠失を含有し、これもまたフレームシフトおよび未熟に短縮された細胞質の尾につながる。図４において、破線はＨＸＢｃ２の対応するアミノ酸残基に同一であるアミノ酸残基を示す。
【図５】
発明にかかる、融合アッセイにおけるキメラＥｎｖタンパク質の評価を描く図である。図は、８ｘ、Ｓ１０、ＨＸＢｃ２、および図の上に示される示された制限部位を使用して構築されたキメラからのｅｎｖ遺伝子を描く。８ｘ中に存在する突然変異は上図の上に示す。キメラをｐＳＰ７３にクローン化し、そして下の図６に記述されるような細胞融合アッセイで評価した。
【図６】
発明にかかる、融合アッセイにおけるキメラＥｎｖタンパク質の評価を描くグラフである。上の図５に示される、ＨＸＢｃ２と８ｘとの間で構築されたキメラＥｎｖタンパク質を、ＣＸＣＲ４単独、ＣＸＣＲ４およびＣＤ４、もしくはＣＤ４単独を発現するＱＴ６標的細胞での融合アッセイで評価した。結果は、ＣＸＣＲ４＋／ＣＤ４＋細胞上でのＨＸＢｃ２のものに関するルシフェラーゼ活性（すなわち相対的ルシフェラーゼ単位、ＲＬＵ）として表す。棒は３回の実験の平均のＲＬＵ＋ＳＥＭを示す。
【図７】
発明にかかる、ＩＩＩＢｘのＣＤ４依存性クローンの決定子のマッピングを描くグラフである。ＩＩＩＢｘのＣＤ４依存性Ｓ１０クローン、および上の図５で示されるようなＳ１０／８ｘキメラの融合活性を示す。加えて、Ｃ４ドメイン中のＧ４３１Ｅ突然変異を修正した（Ｓ１０−Ｅ４３１Ｇ）Ｓ１０  Ｅｎｖ、およびこの突然変異を含有した８ｘ  Ｅｎｖ（８ｘ−Ｇ４３１Ｅ）の活性を示す。結果は、ＣＸＣＲ４およびＣＤ４を共発現した標的細胞上での８ｘルシフェラーゼ活性のパーセントとして表す。
【図８】
発明にかかる、ＣＣＲ５向性のＥｎｖ、ＨＩＶ−１／ＢａＬからのＶ３ループを含有するＥｎｖタンパク質のＣＣＲ５向性を描くグラフである。ＣＤ４依存性であるＨＸＢ２（ＩＩＩＢ遊走群由来の分子クローン）のＥｎｖ、およびＨＩＶ−１／ＢａＬからのＶ３ループを含有する８ｘ  Ｅｎｖタンパク質を構築し、そしてそれらの融合活性を、ＣＣＲ５もしくはＣＸＣＲ４±ＣＤ４を発現した標的細胞上で親ＨＢＸｃ２  Ｅｎｖもしくは８ｘ  Ｅｎｖと比較した。融合活性は、ＣＸＣＲ４およびＣＤ４双方を発現した標的細胞上でのＨＸＢｃ２のルシフェラーゼ活性のパーセントとして表す。棒は平均＋ＳＥＭを示す。
【図９Ａ】
発明にかかる、ＨＩＶ−１／ＨＸＢ２のｇｐ１２０コア結晶構造を描きかつｇｐ１２０結晶構造上でのＨＩＶ−１／ＩＩＩＢｘ突然変異の位置を立証する空間実体模型の像である。コア結晶構造は、ＣＤ４のリボン図（Ｋｗｏｎｇら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：６４８−６５９）（像の下右四分円中に示される）とともに白色で描く。突然変異がＣＣＲ５へのｇｐ１２０の結合の５０％の減少もしくは増大を生じさせたアミノ酸部位（Ｒｉｚｚｕｔｏら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１９４９−１９５３）を赤色で示す。理論により拘束されることを願わないが、ｇｐ１２０のコア上にマッピングすることができた８ｘ中の６個の突然変異のうち、３個（淡青色で示される）がこの推定のケモカイン受容体結合部位にすぐ隣接して配置されている。
【図９Ｂ】
発明にかかる、Ｇ４３１Ｅ突然変異の位置を示すために上の図９Ａに示されたものとわずかに異なる向きで描かれた、ｇｐ１２０／ＣＤ４複合体のリボン図の像である。これは、８ｘクローンのＣＤ４非依存性の融合を排除するのに十分であったが、しかしＣＤ４依存性の融合はそうでなかった。
【図１０Ａ】
発明にかかる、ＨＸＢもしくは８ｘのＥｎｖクローンによるＣＤ４非依存性の細胞−細胞融合を描くグラフである。示されるとおりＨＸＢ  Ｅｎｖもしくは８ｘ  Ｅｎｖ、ならびにＴ７ポリメラーゼを発現するＱＴ６エフェクター細胞を、Ｔ７プロモーターの制御下にケモカイン受容体ＣＸＣＲ４（斜交平行線の陰影をつけられた棒）、ＣＤ４（白棒）もしくはＣＸＣＲ４／ＣＤ４（黒棒）およびルシフェラーゼ遺伝子を発現するＱＴ６標的細胞と混合した。ＨＩＶ−１／ＩＩＩＢはクローン化されていないウイルスであり、これからＨＸＢｃ２（「ＨＸＢ」）およびＩＩＩＢｘ（「８ｘ」）のような数種の分子クローンが生じている。本明細書に開示されるデータはこれら２種のＥｎｖ分子クローンを比較する。ルシフェラーゼは、本アッセイにおいて、Ｅｎｖがエフェクター細胞と標的細胞との間の融合を媒介する場合にのみ産生される。各Ｅｎｖについての結果はＲＬＵで表し、そしてＩＩＩＢ  ＥｎｖエフェクターおよびＣＸＣＲ４／ＣＤ４標的細胞で得られた融合の量に対し正規化する。典型的な一実験の結果を示す。
【図１０Ｂ】
発明にかかる、ＨＸＢ−Ｖ３ＢａＬもしくは８ｘ−Ｖ３ＢａＬのＥｎｖクローンによるＣＤ４非依存性の細胞−細胞融合を描くグラフである。示されるような、ＨＸＢ−Ｖ３ＢａＬもしくは８ｘ−Ｖ３ＢａＬのＥｎｖタンパク質を担持するルシフェラーゼレポーターウイルスを使用して、Ｔ７プロモーターの制御下にＣＣＲ５（斜交平行線の陰影を付けられた棒）、ＣＤ４（白棒）もしくはＣＣＲ５／ＣＤ４（灰色棒）およびルシフェラーゼ遺伝子を発現する２９３Ｔ細胞を感染させた。感染３日後にルシフェラーゼ活性の量を測定した。各Ｅｎｖについての結果はＲＬＵで表し、そしてＩＩＩＢ−ＢａＬ  Ｅｎｖを担持するビリオンおよびＣＣＲ５／ＣＤ４標的細胞を用いて得られた結果に対し正規化する。典型的な一実験の結果を示す。
【図１１】
発明にかかる、ＣＤ４、ＣＸＣＲ４もしくはＣＣＲ５を発現する細胞における多様なｇｐ１２０の細胞表面結合を描くグラフである。放射ヨウ素化されたｇｐ１２０を、補助受容体もしくはＣＤ４のプラスミドで一過性にトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞とともにインキュベートした。可溶性のＣＤ４（ｓＣＤ４）を、示されたとおり結合反応に添加した。細胞に結合される比放射活性の量を提示し、そしてＣＤ４への結合が１００％になるように、示される各ｇｐ１２０について正規化する。各値は３回以上の独立の実験の平均を表し、そして誤差の棒（ｅｒｒｏｒ  ｂａｒ）はＳＥＭを表す。以下の組み合わせを示す。すなわち、空ベクターｐＣＤＮＡ３を発現する細胞（白棒）、ＣＤ４を発現する細胞（黒棒）、ＣＸＣＲ４を発現する細胞（濃灰色棒）、ｓＣＤ４が添加された、ＣＸＣＲ４を発現する細胞（濃い斜交平行線の棒）、ＣＣＲ５を発現する細胞（淡灰色棒）、ｓＣＤ４が添加された、ＣＣＲ５を発現する細胞（薄い斜交平行線の棒）。
【図１２】
発明にかかる、ＣＣＲ５補助受容体結合部位とＭＡｂ  １７ｂエピトープとの間の重なり合いを描く、ＣＤ４に結合されたｇｐ１２０の空間実体模型の像である。突然変異される場合にＣＣＲ５結合を５０％以上減少させる一方ＣＤ４結合を５０％未満減少させる、Ｒｉｚｚｕｔｏら（１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１９４９−１９５３）により示されるアミノ酸残基を赤色で示す。ＭＡｂ  １７ｂの接触残基を淡青色で示し、また、ＣＣＲ５および１７ｂ双方の結合に関与する残基を薄紫色で示す。実施例１に既に開示されたような補助受容体結合部位の近傍で８ｘとＩＩＩＢとの間で異なりかつＣＤ４非依存性に影響することができる３個の残基を緑色で示す。これらの残基の１個（４２３）はＭＡｂ  １７ｂの接触部位でもまたある。超可変Ｖ１／Ｖ２およびＶ３ループの幹を橙色で示す。
【図１３】
発明にかかる、ＣＤ４ｉ  ＭＡｂ  １７ｂへのｇｐ１２０の結合のセンサー図を描くグラフである。ＭＡｂ  １７ｂをセンサー表面に結合し、その後、示されるような飽和するレベルのｓＣＤ４との前インキュベーションを伴うもしくは伴わない、示された（等濃度の）ｇｐ１２０分子を、フローセルに適用した。３００秒会合させ、次いで、追加の３００秒間、運転緩衝液で洗浄し、その間に解離を測定した。データの線形変換から得られた動力学的定数を、本明細書の別の場所の表１に提示する。
【図１４（図１４Ａおよび１４Ｂを含んで成る）】
発明にかかる、クローン８ｘから得られるｅｎｖのヌクレオチド配列を列挙する。
【図１Ａ−１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ−３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ−９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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