(57)【要約】【課題】アレルギー性疾患を治療・予防する新しい組成物を提供すること、及び全身性疾患の治療に適した経粘膜投与用組成物を提供する。【解決手段】有効成分として、インターロイキン２１（IL-21）、IL-21遺伝子及びIL-21レセプターアゴニストからなる群から選択される成分を含有する、アレルギー性疾患の治療・予防用組成物、及び、IL-21及び／又はIL-21レセプターアゴニストを有効成分として含有する、全身性疾患を治療するための、経粘膜投与用組成物。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として、インターロイキン２１（IL-21）、IL-21遺伝子及びIL-21レセプターアゴニストからなる群から選択される成分を含有する、アレルギー性疾患の治療・予防用組成物。
【請求項２】
IL-21及び／又はIL-21レセプターアゴニストを有効成分として含有する、経粘膜投与用の、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記粘膜が、鼻腔、口腔あるいは気道の粘膜である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記粘膜が鼻腔粘膜である、請求項２に記載の組成物
【請求項５】
請求項１ないし４いずれか１項に記載の組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物のアレルギー性疾患の治療・予防方法。
【請求項６】
IL-21及び／又はIL-21レセプターアゴニストを有効成分として含有する、全身性疾患を治療するための、経粘膜投与用組成物。
【請求項７】
鼻腔、口腔あるいは気道投与用である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
鼻腔投与用である、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記全身性疾患がアレルギー性疾患である、請求項６ないし８いずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
全身性疾患を治療するために、経粘膜的にIL-21もしくはIL-21レセプターアゴニストを投与する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン２１（IL-21）、IL-21遺伝子またはIL-21レセプターアゴニストを有効成分として含有するアレルギー性疾患の治療・予防用組成物に関する。また、本発明は、アレルギー性疾患を治療または予防する方法に関する。さらに本発明は、IL-21またはIL-21レセプターアゴニストを有効成分として含有する経粘膜投与用組成物、及び全身性疾患を治療するために、経粘膜的にIL-21もしくはIL-21レセプターアゴニストを投与する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギー性疾患は、とくに先進工業国において、患者数の増加が著しく、重篤な例も多くなっている。従来、アレルギーの治療は、抗ヒスタミン剤などによる化学伝達物質の作用抑制、ステロイド剤等による非特異的な免疫抑制、あるいは抗アレルギー剤等が主流であったが、著効が認められないケースも多く、また副作用とのバランスが難しい。従って、従来とは異なる治療法が今も望まれていた。
【０００３】
このような新しい治療法の一つとして、近年、サイトカインを用いてアレルギー性疾患を治療することが試みられており、様々な研究が発表されている。しかし、in vitroの実験で有効とみなされたサイトカインが、必ずin vivoで有効とは限らず、両者の結果が一致しないことは多々ある。また、アレルギーを誘発するメカニズムの解明が進んでいるが、生体におけるサイトカインの働きは複雑であり、in vivoの実験において、アレルギーを引き起こす一連の反応のある箇所を阻害するとされた物質であっても、実際にはアレルギーの抑制に効果がないことも多い。
【０００４】
従って、数多くのサイトカインの中から、実際にin vivoでアレルギー反応を予防あるいは治療できるサイトカインを見つけ出すことが望まれていた。
【０００５】
また、全身性のアレルギーを治療する場合、一般に内服薬による治療が選択されるが、消化管内での分解や初回通過効果を強く受ける薬物、胃腸障害が強い薬物等には応用が困難であり、また、服薬後吸収され、その効果が現れるまでに時間を要し、速効性は期待できないなどといった問題がある。特に、サイトカインはタンパク質性因子であるため、消化管での分解を受けやすく、経口投与製剤とすることは難しい。
【０００６】
一方、注射薬とすれば、このような問題は解決できるが、その反面、他の適用方法では考えられない種々の危険性が存在するといった問題がある。また、痛みを伴うとともに、自分では投与できず、毎回医療機関に通う必要が生じるため、治療の継続が困難であるといった問題がある。特に、アレルギー性疾患の中でも、入院治療を要しない、花粉症やアトピー性皮膚炎といった疾患では、手軽に投与できる薬剤が望まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記問題を解決するため、in vivoでアレルギー性疾患を治療・予防することができるサイトカインを見出し、該サイトカインを含有するアレルギー性疾患治療・予防用組成物を提供すること、また前記サイトカインを用いてアレルギー性疾患を治療する方法を提供することを課題とする。さらにまた、注射や経口投与によらずに、全身性の効果を発揮できるサイトカインを見出し、局所投与で全身性の疾患を治療する方法を提供すること、及び該サイトカインを含有する、全身性疾患の治療に適した局所投与用製剤を提供することを課題とする。
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために種々の検討を行った。その結果、数あるサイトカインのうち、IL-21を生体内投与することにより、アレルギーを抑制できることを見出した。
【０００９】
また驚くべきことに、本発明者らは、IL-21を局所粘膜から投与したときに、IL-21が、当該局所部位の症状に対してだけでなく、全身的に効果を発揮することを見出し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、本発明は、有効成分として、インターロイキン２１（IL-21）、IL-21遺伝子及びIL-21レセプターアゴニストからなる群から選択される成分を含有する、アレルギー性疾患の治療・予防用組成物である。
【００１１】
前記組成物は、経粘膜投与用であることが好ましい。経粘膜的に投与することにより、注射のような痛みを伴わずにアレルギーを治療することができ、また経口投与に比べて迅速な効果が期待でき、全身投与に比べて副作用が少ない。
【００１２】
さらに前記組成物を鼻腔、口腔あるいは気道投与用とすれば、投与がより簡便である。
【００１３】
また本発明は、疾患の全身治療に有効な量のIL-21及び／又はIL-21レセプターアゴニストを含有して成る、全身性疾患を治療するための、経粘膜投与用組成物である。前記組成物は、鼻腔、口腔あるいは気道投与用であることが好ましい。
【００１４】
本発明に係る経粘膜投与用組成物は、局所投与によって、全身性の効果を得ることが可能である。従って、当該局所部位だけでなく、全身の症状を改善することができる。また、経粘膜的に投与するため、痛みを全く伴わないかあるいは痛みが少なく、簡便、迅速に行なうことが可能である。経粘膜的な投与は、医師や医療従事者が投与しなくても、患者自身、あるいは患者の家族など一般の人で投与可能である。また、反復、あるいは連続して投与することも容易である。またさらに、静脈注射などに比べて、安価である。経粘膜的な投与はまた、全身投与（たとえば静脈注射）に比し副作用も少ないと考えられる。したがって、アレルギー性疾患、及びIL-21の投与が有効と考えられるその他の疾患の治療・予防手段として、極めてメリットが大きい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、さまざまなアレルギー性疾患を効果的に治療することが可能である。また、経粘膜的に投与できるため、患者自身で投与することができ、効果が迅速で副作用も少ない。また、経粘膜的な局所投与により、全身の症状を治療することができるため、IL-21の投与が有効な全身性疾患にとって、極めて有効な治療方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本明細書において、「IL-21」とは、IL-21タンパク質を意味するが、ここでIL-21タンパク質とは、IL-21の全アミノ酸配列を備えている必要はなく、IL-21レセプターに結合してシグナル伝達を惹起できるものであればよい。すなわち、「IL-21」には、IL-21の一部分と共通の配列をふくみ、且つIL-21レセプターに結合してシグナル伝達を惹起できるペプチド、キメラタンパク、融合タンパクが含まれ、また、IL-21の一部分（１０アミノ酸残基以上）と類似（７０％以上のホモロジー）のアミノ酸配列をふくむペプチド、キメラタンパク、融合タンパクも含まれる。
また、本明細書において、「IL-21レセプターアゴニスト」とは、IL-21レセプターに直接、または間接に結合してシグナル伝達を惹起するすべての薬剤、抗体、ペプチド、たんぱく、サイトカイン、アプタマー等を含む。「IL-21レセプターアゴニスト」はまた、IL-21あるいはIL-21レセプターに直接、または間接に結合することにより、IL-21とIL-21レセプターの相互作用を惹起あるいは増強するすべての薬剤、抗体、ペプチド、たんぱく、サイトカイン、アプタマー等を含む。「IL-21レセプターアゴニスト」はまた、IL-21あるいは他のリガンドによるIL-21レセプターを介するシグナル伝達を増強するすべての薬剤、抗体、ペプチド、たんぱく、サイトカイン、アプタマー等を含む。
また本明細書において、「IL-21遺伝子」とは、IL-21遺伝子をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。例えば、ゲノムＤＮＡ，ゲノムＤＮＡライブラリー、または、哺乳動物、好ましくはヒトの細胞・組織由来のｃＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリーより公知の方法により単離されたもの、PCR産物、合成ＤＮＡのいずれでもよい。また、アミノ酸配列を変えないように塩基配列を人為的に変更した遺伝子であってもよい。またアミノ酸配列は変わっても、IL-21としての機能を変えないように、塩基配列を人為的に変更した遺伝子であってもよい。またこれら遺伝子はDNAでもよいしRNAでもよい。具体的には、GenBankなどに記載のｃDNAを用いることが出来る。本発明のIL-21遺伝子はすでに公知であり、例えばヒトリンパ球由来ｃDNAライブラリーから得ることができる。これら遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により、例えばプラスミドベクターに挿入し大腸菌にトランスフォームするなどの方法によって調整できる。このようにして調整した遺伝子はまた、例えばイオン交換クロマトグラフィー法等の種々の方法によっても精製可能である。
【００１７】
IL-21タンパク質は活性化Ｔ細胞から分泌されるサイトカインである。Parrish-Novak
J.らによりｃＤＮＡが単離され、２０００年１１月の論文（Nature, 2000, 408(6808): 57-63）、および米国特許第６,３０７,０２４号でその遺伝子配列が発表された。この論文には、ＩＬ−１５との協調作用、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞の増殖・分化促進活性等が報告されている。IL-21は活性化T細胞から分泌される。IL-21レセプター複合体は、commonγ鎖を含み、このcommonγ鎖がシグナル伝達に関与すると考えられている。また、その後の多くの論文で、IL-21がT細胞、NK細胞、B細胞などに対して多彩な作用を示すことが確認されている（非特許文献４など）。
【００１８】
疾患モデル動物に対するIL-21の作用としては、担癌マウスにIL-21遺伝子を投与して治療効果を検討したという報告が、本発明者らによって論文発表されている（岸田ら, 2003、中野ら、2006年）。岸田らの論文では、悪性リンパ腫の肝転移を有するマウスにIL-21遺伝子、またはIL-15遺伝子、またはIL-21とIL-15遺伝子を導入している。その結果、IL-21が腫瘍に対する細胞傷害性T細胞を誘導し、またIL-15によるNK細胞の活性化を増強することを見出している（非特許文献５）。一方中野らの論文では、頭頚部扁平上皮癌の皮下腫瘍を有するマウスを用いて、同様のIL-21遺伝子の活性を認めたのに加えて、IL-21遺伝子の導入によって腫瘍特異的なIgGの産生が誘導されたことを見出した（非特許文献６）。したがって、担癌マウスの系において、IL-21が細胞性免疫、液性免疫、自然免疫をいずれも誘導することが示された。IL-21を含む癌免疫療法に対する製剤は、本発明者らによって特許出願されている（特許文献１）。他にも、IL-21が抗腫瘍効果をもたらすとの論文はある（非特許文献３）。
【００１９】
一方、IL-21と抗体産生の関連については， IL-4によって誘導される免疫グロブリン重鎖C epsilon胚型転写産物の転写亢進を、IL-21がin vitroで著明に抑制するという報告がなされている（非特許文献１）。さらにIL-21レセプターのノックアウトマウスではIgEの産生が著しく亢進し、IgG1産生が減少することが報告された（非特許文献２）。正常マウスにOVAを免疫後、産生されるOVA特異的IgEが、IL-21の投与により抑制されるとも報告されている（非特許文献１）。しかしながら、IL-21がIgEを抑制することは報告されていたが、IL-21がアレルギー性疾患を改善するという報告はなく、むしろ、アレルギー性疾患の治療については、IL-21とIL-21レセプターの相互作用を抑制する分子が有効であると示す文献が存在している（特許文献２）。特許文献２によれば、IL-21の投与は、逆にアレルギーを増悪させると考えられる。
従って、先行技術には、理論とは反する報告が混在しており、アレルギー性疾患に対してIL-21、IL-21遺伝子、あるいはIL-21レセプターアゴニストが有効であるか、無効であるか、あるいは逆に増悪させる可能性があるのかは、全く予測不可能であった。
【００２０】
このような状況において、本発明者らは、アレルギーに対するIL-21の影響を動物モデルで詳細に検討した結果、アレルギーに対してIL-21がin vivoで予防・治療効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２１】
また本発明者らは、アレルギー性鼻炎モデルマウスに経鼻的にIL-21を投与することにより、全身的にIgE産生が抑制されること、鼻炎症状が緩和することを見出した。さらにピーナッツアレルギーモデルマウスにIL-21を経鼻投与することにより、全身的なアナフィラキシーも抑制することも見出した。これらの実験的事実から、局所粘膜的なIL-21の投与が、当該局所部位はもちろん、全身臓器のさまざまなアレルギーを治療・予防することができることが分かった。
これまで、局所粘膜からインターロイキンを投与して、全身性のアレルギー症状を治療できるとの報告はなく、これは驚くべき結果であった。IL-21がアレルギーの抑制に働くメカニズムとしては、B細胞に作用してIgE産生を抑制する可能性が考えられ、実際in vitroではそのような作用がすでに示されている。
しかし、IL-21の局所投与によって全身的にアレルギーが制御できることは、この様なメカニズムだけでは説明はつきにくく、IL-21が粘膜局所の免疫細胞に作用した可能性が考えられるが、その詳細は現在検討中である。
【００２２】
IL-21以外のサイトカインの局所粘膜的あるいは経鼻的または経気道的投与に関しては、従来の技術では、鼻あるいは気道の局所のアレルギーや炎症を抑制できるに留まっており、全身的なアレルギー疾患を抑制したとの報告はない。特許文献３では、IL-12を、経口、経鼻、局所、吸入、経皮、経直腸、非経口のいずれかのルートで投与することにより、炎症性反応に関わる呼吸器疾患、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息、アレルギー性肺気管支アスペルギウス症、過敏性肺炎、好酸急性肺炎、肺気腫、気管支炎、アレルギー性気管支炎気管支拡張症、嚢胞性線維症、過敏性肺臓炎、職業性喘息、サルコイド、反応性気道病症候群、間質性肺病、高好酸球症および寄生虫性肺症などの気道・呼吸器炎症性疾患に対する治療法となるとの方法が開示されている。また、サイトカインの局所投与によって、鼻、気道の局所のアレルギー疾患が抑制できるとの非特許文献は数多く存在する。たとえば、花粉で感作したマウスへのＩＬ−１２の経鼻投与により、肺の炎症と気管の過敏症を抑制したとの報告があるが、この文献では全身性の免疫系への影響は軽微であり、ＩｇＥの産生には影響はなかったと記載されており、また全身的なアレルギーに対する影響は確認されていない（非特許文献７）。
一方で、サイトカインの局所投与がアレルギー性鼻炎や気管支喘息を誘導しあるいは悪化させるとの報告もある（非特許文献８等）。
【００２３】
従って、局所粘膜的あるいは経鼻的な投与によって、全身的な炎症やアレルギーを治療または予防できるサイトカインは従来知られておらず、本発明者らによって見出されたIL-21の当該効果は、極めて予想外のことであった。
【００２４】
【特許文献１】特開２００４−５９５７４号公報
【特許文献２】米国公開公報第20050193434 号
【特許文献３】米国特許第5,674,483号
【非特許文献１】Suto A等著「Interleukin 21 prevents antigen-induced IgE production by inhibitinggerm line C(epsilon) transcription of IL-4-stimulated B cells.」Blood. 2002 Dec15;100(13):4565-73.
【非特許文献２】Ozaki K等著「A critical role for IL-21 in regulating immunoglobulin production.」Science. 2002 Nov22;298(5598):1630-4.
【非特許文献３】Wang G等著「In vivo antitumor activity of interleukin 21 mediated by naturalkiller cells.」CancerRes. 2003 Dec 15;63(24):9016-22.
【非特許文献４】Ozaki K等著「Regulation of B cell differentiation and plasma cell generation by IL-21,a novel inducer of Blimp-1 and Bcl-6.」J Immunol. 2004 Nov 1;173(9):5361-71.
【非特許文献５】Kishida, T 等著「Interleukin (IL)-21 and IL-15 Genetic Transfer SynergisticallyAugments Therapeutic Antitumor Immunity and Promotes Regression of MetastaticLymphoma」Mol.Ther. 8 (4): 552-558, 2003 (October).
【非特許文献６】Hiroshi Nakano等著「Interleukin-21 Triggers both Cellular and Humoral Immune ResponsesLeading to Therapeutic Antitumor Effects against Head and Neck Squamous CellCarcinoma」J. GeneMed. (in press).
【非特許文献７】Matsuse H.等著「Intranasal IL-12 produces discreet pulmonary and systemic effects onallergic inflammation and airway reactivity」 Int Immunopharmacol. 2003, 3(4): 457-68.
【非特許文献８】Rajeev Venkayya等著「The Th2 Lymphocyte Products IL-4 and IL-13 Rapidly Induce AirwayHyperresponsiveness Through Direct Effects on Resident Airway Cells」Am. J. Respir. Cell Mol.Biol., Volume 26, Number 2, February 2002 202-208.
【００２５】
本発明のアレルギー性疾患の治療・予防用組成物は、インターロイキン２１（IL-21）、IL-21遺伝子及びIL-21レセプターアゴニストからなる群から選択される成分を有効成分として含有する。前記有効成分は単独で含有されてもよく、混合で含有されてもよい。また、他のサイトカインやケモカインと組合わせて用いることもできる。他のサイトカインは遺伝子でもタンパク質でもよい。他のサイトカインと組合わせて用いる場合、これらを同時に、連続して、または適当な間隔をおいて導入することができる。好ましいサイトカインとしては、ＩＬ−２、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ―２３、およびＩＬ−２７などが挙げられるが、他のサイトカインでもよい。
【００２６】
また、本発明の組成物には、IL-21、 IL-21遺伝子またはIL-21レセプターアゴニスト以外の薬効成分を必要に応じて配合し、あるいは組み合わせて用い、これらを同時に、連続して、または適当な間隔をおいて投与することができる。
【００２７】
本発明の組成物は、ヒト、またはヒト以外の哺乳動物に用いることができる。ヒトに投与する際には、ヒトIL-21、ヒトIL-21遺伝子またはヒトIL-21レセプターアゴニストを用いることが望ましく、ヒト以外の哺乳動物に用いる際には、その哺乳動物種のIL-21、IL-21遺伝子またはIL-21レセプターアゴニストを用いることが望ましいが、異種のIL-21、IL-21遺伝子またはIL-21レセプターアゴニストを用いることも可能である。アレルギーの発症後に治療的に投与することもできるし、発症前に予防的に投与することもできる。
【００２８】
本発明に係るアレルギー性疾患は、狭義のアレルギー疾患だけでなく、自己免疫亢進性疾患を含み、例えばアナフィラキシー、アナフィラキシーショック、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性口唇炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎、アレルギー性紫斑病、好酸球性血管性浮腫、アトピー性皮膚炎、過敏性肺炎、アレルギー性呼吸器疾患、アレルギー性胃腸症、消化管アナフィラキシー、花粉症、食物アレルギー、薬物アレルギー、アレルギー性湿疹、蕁麻疹などを含む。さらに全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、全身性強皮症、皮膚筋炎、多発筋炎、結節性多発動脈炎、混合性結合組織病、ウェゲナー肉芽腫症、シェーグレン症候群、ベーチェット病、種々の自己免疫疾患、化学物質過敏症なども含む。
【００２９】
本発明の組成物を生体に投与する場合は、経鼻的、経口腔粘膜的または経気道的に、あるいは経口的、直腸内、皮下、皮内、髄腔内、筋肉内、静脈内、動脈内、経皮、点眼、舌下等のルートから投与することができる。経鼻的、経口腔粘膜的、あるいは経気道的に投与するのが好ましく、経鼻的に投与するのがより好ましい。経鼻的に投与する際には、スプレー、ネブライザー、プッシュ式容器等を用いて噴霧あるいは滴下あるいは射出し、患者あるいは動物に点鼻あるいは吸入させることができる。また、経口腔粘膜的に投与する場合には、スプレー、ネブライザー、プッシュ式容器等を用いて噴霧し、あるいは軟膏、クリーム、貼付剤等として塗布、投与あるいは貼付することもでき、あるいは口腔洗浄液、うがい液等として添加することもできる。また、経気道的に投与する場合には、ネブライザー、プッシュ式容器等を用いて噴霧あるいは射出し、患者あるいは動物に吸入させることができる。
【００３０】
本発明に係る経粘膜投与用の組成物は、有効成分として、インターロイキン２１（IL-21）、IL-21遺伝子またはIL-21レセプターアゴニストのいずれかを含んでいれば効果が期待できるが、より好ましいのは、IL-21及び／またはIL-21レセプターアゴニストを含有する組成物である。組成物は、前記有効成分を単独で含んでいても、混合物として含んでいてもよい。
【００３１】
投与頻度は、月１回投与から連日投与が可能であり、好ましくは１回／２週から５回／週程度もしくは連日投与である。とくに点鼻投与の場合、鼻局所の症状改善を目的とする場合も、全身症状の改善を目的とする場合も、１日１回〜６回程度投与することも可能である。また、アレルギー症状の治療を目的とする場合、アレルギー症状が起こったときに適時投与することもできる。また、アレルギー症状が無いか軽微な時に、前もって予防的に投与することも可能である。とくに抗原に暴露される可能性が予測される場合などに、予防的に投与することが望ましい（たとえば花粉症の患者に、花粉が大量飛散する季節の前に投与するなど）。
【００３２】
投与量は、病態、重症度、投与経路、投与回数、投与期間などにより異なり、また局部の治療を目的とするか、全身の治療を目的とするかによっても異なるが、単回投与、あるいは１日２回以内1週間以内連続投与により症状が軽減する投与量であり、かつ１０倍量投与しても毒性が現れないような投与量が望ましい。経鼻的、経口腔粘膜的、あるいは経気道投与の場合、好ましくは１回あたり０．１μｇ〜２０ｍｇ／体重ｋｇであり、より好ましくは１μｇ〜１０ｍｇ／体重ｋｇであり、特に好ましくは１０μｇ〜７ｍｇ／体重ｋｇであり、さらに好ましくは１００μｇ〜５ｍｇ／体重ｋｇである。全身治療を目的とする場合は、局部治療を目的とする場合の投与量より多く投与することが好ましい。例えば全身治療を目的とする場合、局部治療に用いる投与量の２倍以上の量を用いることもできる。また、静脈あるいは経口投与の場合の投与量は、好ましくは０．１〜１０００μｇ／体重ｋｇ／日であり、より好ましくは０．５〜２０μｇ／体重ｋｇ／日である。
【００３３】
本発明の組成物を経口的、経皮的、あるいは経直腸的等のルートで生体に投与する場合、適当な剤型に製剤化して用いることが可能であり、例えば散剤、顆粒剤、錠剤、細粒剤、カプセル剤、丸剤、シロップ剤、トローチ剤、チュワブル剤、液剤、乳剤、懸濁剤、坐剤、軟膏剤、ローション剤、パップ剤等の製剤として用いることができる。これらの剤型に製剤化するためには適切な担体、添加剤、賦形剤等を用いることが可能である。
散剤、顆粒剤、錠剤、細粒剤、トローチ剤等の固形製剤を調製するには、種々の担体や添加剤を加えることにより常法に従って行なうことができる。この担体には、例えばデンプン、ショ糖、マンニトール、カルボキシメチルセルロース、重炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム等が含まれる。また、添加剤にはグリセリン、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等が含まれる。腸溶性物質の有機溶媒あるいは水中溶液を吹き付けて、腸溶性被膜を施して、腸溶性製剤として製剤化することもできる。この目的で、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、セルロースアセテートフタレート、ポリビニルアルコールフタレート、スチレン−無水マレイン酸共重合体、メタクリル酸−メタクリル酸メチル共重合体等を用いることができる。さらに通常、必要により用いられる補助剤、芳香剤、安定剤あるいは防腐剤の薬学上許容しうる担体を用いることができる。
静脈内投与する際には液剤とすることが好ましい。液剤を調製するためには、例えば生理食塩水、精製水、エタノール・プロピレングリコール・グリセリン・ポリエチレングリコール等のアルコール類、トリアセチン等の溶媒を用いることができる。このような製剤に加えて、さらに防腐剤、分散剤、湿潤剤、安定剤、乳化剤のような補助剤を加えることも可能である。また懸濁剤として静脈投与してもよい。
【００３４】
本発明の組成物を経鼻的に生体に投与する際には、水溶液、懸濁液、軟膏剤等、乳剤、噴霧スプレー等、経鼻投与用の医薬として一般的に使用されているあらゆる製薬形態で用いることができる。特に好ましい剤形は、噴霧スプレーである。また、これら組成物を凍結乾燥等の処理によって粉末剤等としてもよい。粉末剤として提供する場合は、使用に当たって精製水等で溶解して用いることができる。
【００３５】
本発明の点鼻用のアレルギー性疾患の治療・予防用組成物には、IL-21、IL-21遺伝子またはIL-21レセプターアゴニストの他、通常点鼻用組成物に用いられる添加剤、例えば保存剤（パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール等）、緩衝剤・ｐＨ調節剤（クエン酸塩、リン酸塩、ホウ酸等、塩酸、酢酸、水酸化ナトリウム等）、等張化剤（塩化ナトリウム、ソルビトール、グリセリン等）等を添加することもできる。
【００３６】
本発明の点鼻用のアレルギー性疾患の治療・予防用組成物の製剤形態としては、好ましくは一回のプッシュで一定の液が放出するに設定することができるような、プッシュ式容器がよいが、滴剤、噴霧剤（噴霧器を用いて噴霧する液剤、エアゾル剤など）、注入剤、洗浄剤など、通常の点鼻用製剤形態ならば特に制限無く用いることが可能である。
【００３７】
本発明の点鼻用製剤に含まれるIL-21またはIL-21レセプターアゴニストの濃度は、投与経路、アレルギー症状などにより異なるが、好ましくは０．０１重量％以上４．０重量％以下、さらに好ましくは、０．０５重量％以上２．０重量％以下とし、例えば点鼻剤としては、１日１回〜６回程度、１回１〜２度ずつ鼻腔内に噴霧器を用いて噴霧吸入するのが好ましい。
【００３８】
本発明の組成物はまた、吸入によって局所粘膜投与することもできる。吸入製剤としては、例えば、吸入可能に形成した粉剤、液剤、懸濁剤、エアロゾル等がある。
前記粉剤は、IL-21またはIL-21レセプターアゴニスト単独からなってもよく、又は、適切な賦形剤（グルコース、アラビノース、ラクトース、サッカロース、デキストラン等の糖類、ソルビトール、マンニトール等の多価アルコール類、炭酸カルシウム等の塩類）等を含んでもよい。賦形剤の最大平均粒径は２５０μｍ以内が好ましく、より好ましくは１５０μｍ、特に好ましくは１０〜８０μｍである。
前記エアロゾルは、噴霧剤を含有し、噴霧ガスに溶解又は分散した形態で、IL-21またはIL-21レセプターアゴニストを含み得る。噴霧ガスとしては、ハイドロカーボン類（例えばｎ−プロパン、ｎ−ブタン又はイソブタン等）、またはハロハイドロカーボン類（メタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパンあるいはシクロブタンの塩素化・フッ素化誘導体等）等があり、これらは単独であるいは混合して用いることができる。好ましくは、ハロゲン化アルカン誘導体（例えばＴＧ１１、ＴＧ１２、1,1,1,2-テトラフルオロエタン、1,1,1,2,3,3,3-ヘプタフルオロプロパン）であり、単独であるいは混合して用いることができる。エアロゾルは、溶解補助剤、安定剤、乳化剤、保存剤または緩衝剤のような他成分を含んでいてもよい。本発明のエアロゾルは、例えば0.002〜5質量％、0.01〜4質量％、0.05〜3質量％、0.1〜2質量％、0.5〜2質量％又は0.5〜1質量％のIL-21またはIL-21レセプターアゴニストを含むことができる。IL-21またはIL-21レセプターアゴニストが分散形態で存在する場合、その平均粒径は１０μｍ以内であることが好ましい。より好ましくは０．１〜５μｍであり、特に好ましくは１〜５μｍである。
前記液剤又は懸濁剤の溶媒としては、水性あるいはアルコール性溶媒（エタノール溶液等）を用いることができる。また、溶解補助剤、安定剤（有効成分の化学的分解を抑制する：例えば、抗酸化剤）、保存剤（微生物の汚染を阻止する：例えば、セチルピリジニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、ベンゾエート類）等を含んでいてもよい。
【００３９】
本発明の組成物を、気道から投与する際にも、上記点鼻用製剤と同様の製剤形態はもちろん、一般的に吸入剤として使用されているあらゆる製剤形態で用いることもできる。また口腔粘膜から投与する際には、口腔用の軟膏、クリーム、貼付剤、口腔洗浄液、うがい液用の医薬として一般的に使用されているあらゆる製薬形態で用いることができる。
【００４０】
また、IL-21、IL-21遺伝子あるいはIL-21レセプターアゴニストは、ナノ粒子に封入し、あるいはナノ粒子に結合させて溶液に溶解、または懸濁させて用いてもよい。ナノ粒子を用いれば、その小さな粒径により、また電荷や官能基の付加により、組織への浸透性を高めることが可能である。これらの製剤は、上記のような種々の溶媒、担体、補助剤、または添加剤等と組み合わせた形態とすることもできる。
【００４１】
本明細書において、「ナノ粒子」とは長径あるいは短径のいずれかが１nm以上1000nm以下のすべての物質を指す。
【００４２】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４３】
アレルギー性鼻炎モデルマウスに対するIL-21遺伝子導入の効果
6週齢メスのＢＡＬＢ/cマウスを4群に分けた。第I群（9匹）は、第28日目に、４０mg/mlの卵白アルブミン（OVA）を含む生理的食塩水０．０２ｍｌを鼻腔内投与した（正常群）。第II群（8匹）は、第０、７、１４日に、０．５mg/mlのOVAと２０mg/mlのAl(OH)3を含む生理的食塩水０．２ｍｌを腹腔内投与し、さらに第２１日から28日に連日、４０mg/mlのOVAを含む生理的食塩水０．０２ｍｌを鼻腔内投与した（アレルギー性鼻炎誘導群）。第III群（5匹）は、第II群と同様の操作に加えて、第27日目にマウスIL-21cDNAの発現プラスミドである、ｐGEG.IL-21を２５マイクログラム含む生理食塩水１．６ｍｌを、5秒以内に尾静脈から急速静注した（単回投与群）。第IV群（8匹）は、第II群と同様の操作に加えて、第１、６、１３、２０、27日目に、ｐGEG.IL-21を２５マイクログラムを含む生理食塩水１．６ｍｌを、5秒以内に尾静脈から急速静注した（反復投与群）。これらの実験の概略を図１に示す。ｐGEG.IL-21の詳細、および遺伝子導入の方法は、岸田らの論文で公開されている（Kishida et al., Mol. Ther. 8 (4): 552-558, 2003）。
【実施例２】
【００４４】
実施例１のマウスについて、第28日目のOVA溶液投与後、10分間のくしゃみの回数を測定した。その結果を図2に示す。正常群に比して、アレルギー性鼻炎誘導群では著明にくしゃみの回数が増加していたが、反復投与群ではこのくしゃみの回数の増加が正常群と同レベルにまで顕著に減少していた。単回投与群ではアレルギー性鼻炎誘導群よりもくしゃみの回数は少ない傾向があったが、両群間で有意差は認められなかった。
【００４５】
このことから、IL-21遺伝子導入がアレルギー性鼻炎の症状を抑制したことが分かった。＊ｐ＜０．０５
【実施例３】
【００４６】
アレルギー性鼻炎モデルマウスに対するIL-21点鼻投与の効果
6週齢メスのＢＡＬＢ/cマウスを4群に分けた。第I群（７匹）は、第28日目に、４０mg/mlの卵白アルブミン（OVA）を含む生理的食塩水を０．０２ｍｌ鼻腔内投与した（正常群）。第II群（8匹）は、第0、７、１４日に、０．５mg/mlのOVAと２０  mg/mlのAl(OH)3を含む生理的食塩水を０．２ｍｌ腹腔内投与し、さらに第２１から28日に連日、４０  mg/mlのOVAを含む生理的食塩水を０．０２ｍｌ鼻腔内投与した（アレルギー性鼻炎誘導群）。第III群（８匹）は、第II群と同様の操作に加えて、第−１、６、１３日目に、５ngのリコンビナントマウスIL-21を含む生理食塩水溶液０．０１ｍｌを鼻腔内に投与した（予防群）。第IV群（8匹）は、第II群と同様の操作に加えて、第２１日から27日目に連日、５ngのリコンビナントマウスIL-21を含む生理食塩水溶液０．０１ｍｌ鼻腔内に投与した（治療群）。これらの実験の概略を図３に示す。リコンビナントマウスIL-21はＲ＆Ｄ社より購入した。
【実施例４】
【００４７】
実施例３のマウスについて、第28日目のOVA溶液投与直後から10分間のくしゃみの回数を測定した。その結果を図４に示す。正常群に比して、アレルギー性鼻炎誘導群では著明にくしゃみの回数が増加していたが、予防群、および治療群ではこのくしゃみの回数の増加が顕著に減少していた。予防群と治療群の間では有意差は認められなかった。
【００４８】
このことから、IL-21の経鼻的投与を予防的または治療的に行なうことにより、アレルギー性鼻炎の症状を抑制できたことが分かった。＊ｐ＜０．０５
【実施例５】
【００４９】
実施例３のマウスを、第28日目のOVA溶液投与の2時間後に安楽死させ、血清を回収した。血清中の総IgE濃度を、ELISA法にて測定した。その結果を図５に示す。正常群に比して、アレルギー性鼻炎誘導群では著明に血清総IgEが増加していた。予防群、および治療群において、アレルギー性鼻炎誘導群よりも血清総IgE濃度が有意差に減少していた。＊ｐ＜０．０５
【実施例６】
【００５０】
実施例５のマウスの血清中の、OVA特異的IgE濃度を、ELISA法にて測定した。その結果を図６に示す。正常群に比して、アレルギー性鼻炎誘導群では著明に血清中のOVA特異的IgEが増加していた。治療群はアレルギー性鼻炎誘導群よりも低いOVA特異的IgE濃度を示し、両群間で有意差が認められた。予防群ではアレルギー性鼻炎誘導群との間で、OVA特異的IgE濃度に有意差は認められなかった。＊ｐ＜０．０５
【実施例７】
【００５１】
実施例５のマウスの血清中の、総IgG2a濃度を、ELISA法にて測定した。その結果を図７に示す。正常群、アレルギー性鼻炎誘導群、予防群、治療群の間で、いずれも有意差は認められなかった。
【実施例８】
【００５２】
実施例５のアレルギー性鼻炎誘導群と治療群のマウスの鼻を10％ホルマリン固定し、ギ酸ホルマリン液で脱灰処理した後、パラフィン包埋した。同様の実験を2回行ない、実験A、実験Bとした。各群３例（実験A）または各群２例（実験B）のマウス鼻腔をレベルII及びIIIから切り出した各2標本ずつについて切片を作成後、鏡検観察した（レベルII：切歯乳頭部を通る横断面で薄切、レベルIII：鼻咽頭管の開口部を通る横断面で薄切）。その結果の代表的な例を図８に示す。上パネルは弱拡大、下パネルは強拡大である。
【００５３】
アレルギー性鼻炎誘導群では鼻腔にアレルギー疾患を示す組織変化が生じており、治療群ではその軽減化を示す各種の変化が全例に観察された。
すなわち、多少の個体差はあるが、形態変化としては炎症性細胞浸潤とNALT （nasal
lymphoid tissue）における反応性変化を焦点として観察し、炎症に伴う血管病変（充血／出血）や鼻腔粘膜上皮、上皮下結合織の各種障害性、反応性変化の有無が注目された。
炎症性細胞の反応的出現ではリンパ球を主体に、好酸球（Luna染色で確認）、好中球などの顆粒球やリンパ系の形質細胞が関与した。特にレベルIIIでは、鼻腔中隔部粘膜の炎症性腫脹に伴う炎症細胞浸潤と粘膜上皮変性（特に呼吸上皮）などが目立った。NALTのリンパ装置では小型のリンパ球の増生が観察されたが、二次濾胞中心の形成は認められなかった。粘膜上皮の粘液産生杯細胞（PAS染色で確認）の出現、呼吸上皮や一部嗅上皮のエオジン好性変化も目立ったが、上皮の過形成や粘液性物質の管腔内貯留は特に認められなかった。  その他、鼻腺、嗅腺、上顎洞などにも炎症性病変は波及しており、各治療群ではこれら全般の所見について影響が及んだと考えられる。
【００５４】
実験Aでは、各3例ずつ群間の鼻腔所見を比較すると、完全な修復は得られなかったが、炎症細胞浸潤などを中心に反応全般に軽減化は認められた。すなわち、炎症細胞では顆粒球をはじめ細胞の出現の程度が１ランクずつ下がり、NALTでも反応が軽減し、鼻腺、嗅腺、上顎洞などに及んだ炎症性病変も多少軽減化した。また、上皮の変性性病変や、化生などの炎症に付随した二次的変化の軽減も観察された。
実験Bでは、各2例ずつ群間の鼻腔所見を比較すると、完全な修復は得られなかったが、炎症細胞浸潤などを中心に反応全般に軽減化は認められた。ただ、炎症細胞では顆粒球をはじめ細胞の出現の程度や、NALTの反応の軽減、鼻腺、嗅腺、上顎洞などに及んだ炎症性病変の軽減化などについては、実験Aの治療群に比べた場合、その陽性対照群の病変に比較し効果の少ない所見であった。
【００５５】
これらのことから、IL-21の経鼻的投与がアレルギー性鼻炎を抑制することが、病理組織学的にも示された。
【実施例９】
【００５６】
ピーナッツアレルギーモデルマウスに対するIL-21遺伝子導入の効果
生ピーナッツを細かく砕き，ヘキサンを用いて脱脂後、１７０℃で１０分間ローストした．ローストしたピーナッツに抽出バッファー（１Ｍ NaCl, 20mM Sodium Phosphate，8M Urea  pH7.0)を加え、４℃で８時間、成分抽出を行った。遠心後の上清をクルード・ピーナッツ・エクストラクト（ＣＰＥ）として回収した．
４週齢メスのAKR/J マウス を4群に分けた。第I群（７匹）は、第２８日目に、１００mg/mlのＣＰＥを含む生理的食塩水１００μlを、30分間隔で2回、胃ゾンデにて胃内投与した（正常群）。第II群（７匹）は、第０、７、１４、２１日に、10ｍg/mlのＣＰＥと100μｇ/mlのコレラ毒素（CT）を含む生理食塩水を100μl胃ゾンデにて胃内投与し，第１，８，１５，２２日に5μｇ／ｍｌのＣＰＥと200 μg／ｍｌのAl(OH)3を含む生理的食塩水を０．１ｍｌ腹腔内投与し、さらに２８日目に１００mg/mlのＣＰＥを含む生理的食塩水100μlを、30分間隔で2回、胃ゾンデにて胃内投与した（ピーナッツアレルギー誘導群）。第III群（７匹）は、第II群と同様の操作に加えて、第２１日目に、25μgのｐGEG.IL-21を生理食塩水１．６mlに溶解した溶液を、5秒以内に尾静脈内急速注入した（単回遺伝子導入群）。第IV群（７匹）は、第II群と同様の操作に加えて、第０，７，１４、２１日目に25μgのｐGEG.IL-21を生理食塩水1.6mlに溶解した溶液を、5秒以内に尾静脈内急速注入した（反復遺伝子導入群）。この実験の概略を、図９に示す。
【実施例１０】
【００５７】
実施例９のマウスの直腸温を、第２８日目の以下の時間に測定した。（１）１回目のCPE胃内投与の前、（２）１回目のCPE胃内投与の３０分後（2回目のCPE胃内投与の前であるが、図と以下の説明ではCPE投与30分後と記載する）、（３）１回目のCPE胃内投与の60分後（2回目のCPE胃内投与の３０分後であるが、図と以下の説明ではCPE投与６０分後と記載する）。その結果を図１０に示す。ピーナッツアレルギー誘導群では，３０分後に直腸温が低下し，６０分後にはさらに顕著に下降した．この体温低下はIL-21遺伝子の反復導入群では認められず、反復導入マウスの体温は正常群のそれと差はなかった．また，単回遺伝子導入群においても，ピーナッツアレルギー誘導群と比較すると60分後の体温低下は有意に抑制されており、単回遺伝子導入マウスの体温は正常群のそれと有意差はなかった。
【００５８】
直腸温はアナフィラキシーショックの指標と考えられるので、この結果はIL-21遺伝子の導入がアナフィラキシーを抑制したこと、その効果が投与回数に依存することを示している。
【実施例１１】
【００５９】
実施例９のマウスのアレルギー症状を、第２８日目の以下の時間に観察し，アナフィラキシー臨床症状スコアリング（下記）で評価した．(1)１回目のCPE胃内投与の３０分後（2回目のCPE胃内投与の前であるが、図と以下の説明ではCPE投与30分後と記載する）、(2)１回目のCPE胃内投与の60分後（2回目のCPE胃内投与の３０分後であるが、図と以下の説明ではCPE投与６０分後と記載する）。その結果を図１１に示す。ピーナッツアレルギー誘導群では，ＣＰＥ経口投与の３０分後，および６０分後にアレルギー症状のスコアが高値を示した．それに対してIL-21遺伝子の単回導入群と反復導入群はいずれも、ピーナッツアレルギー誘導群に比し、スコアは有意に低値であった。また、IL-21遺伝子の単回導入群と反復導入群はいずれも、正常群とスコアに有意差は無かった。
アナフィラキシー臨床スコア
0：無兆候。
1：鼻と頭部周辺の引っ掻きおよび擦過。
2：動作の低下，深い呼吸、体毛起立，および/または眼周囲の膨潤。
3：努力性呼吸および口と尾周辺のチアノーゼ。
4：突付いても全く、あるいはほとんど反応しない、および振戦または痙攣。
5：死亡。
【００６０】
この結果から、IL-21遺伝子の導入がアナフィラキシーを抑制したこと、単回導入でも十分に効果があることが分かった。
【実施例１２】
【００６１】
ピーナッツアレルギーモデルに対するIL-21遺伝子導入実験を、実施例９と同様のプロトコールで、別のマウスを用いて再度おこなった。ただし、今回の実験ではマウスの個体数は第I群７、第II群８、第III群７、第IV群９であった。第２８日目の1回目のCPE胃内投与の2時間後に安楽死させ、血清を回収した。血清中の総IgE濃度を、ELISA法にて測定した。その結果を図１２に示す。正常群に比して、ピーナッツアレルギー誘導群では著明に血清総IgEが増加していた。それに対してIL-21遺伝子の反復導入群では血清総IgE濃度が著名に減少し、正常マウスとほぼ同じレベルであった。単回遺伝子導入群においても、ピーナッツアレルギー誘導群よりも血清総IgE濃度が有意差に減少していた。＊ｐ＜０．０５
【実施例１３】
【００６２】
ピーナッツアレルギーモデルに対するＩＬ−２１の経鼻的投与の効果
実施例９と同様の方法でＣＰＥを作成した．４週齢メスのAKR/J マウスを4群に分けた。第I群（6匹）は、第２３日目に、１００mg/mlのＣＰＥを含む生理的食塩水200μlを、30分間隔で2回に分けて、胃ゾンデにて胃内投与した（正常群）。第II群（５匹）は、第１、８、１５日に、10ｍg/mlのＣＰＥと１０0μｇ/mlのコレラ毒素（CT）を含む生理食塩水100μlを胃ゾンデで胃内投与し，第２，９，１６日に0.5ｍｇのＣＰＥと２００μg／ｍｌのAl(OH)3を含む生理的食塩水100μlを腹腔内投与し、さらに２３日目に１０mgのＣＰＥを含む生理的食塩水100μlを、30分間隔で2回、胃ゾンデにて胃内投与した（ピーナッツアレルギー誘導群）。第III群（５匹）は、第II群と同様の操作に加えて、第２，９，１６日目に、１０ｎgのリコンビナントマウスIL-21を生理食塩水に溶解した溶液２０μlを、鼻腔内投与した（IL-21投与群）。この実験の概略を図１３に示す。
【実施例１４】
【００６３】
実施例１３のマウスの直腸温を、第２３日目の以下の時間に測定した．(1)１回目のCPE胃内投与の前、(2)１回目のCPE胃内投与の１０分後（2回目のCPE胃内投与の前であるが、図と以下の説明ではCPE投与１０分後と記載する）、(3)１回目のCPE胃内投与の４０分後（2回目のCPE胃内投与の１０分後であるが、図と以下の説明ではCPE投与４０分後と記載する）。その結果を図１４に示す。１０分後の直腸温は、各群間で有意差は認められなかったが、４０分後には、正常群に比し、ピーナッツアレルギー誘導群において，直腸温が顕著に下降していた．この体温低下は、ＩＬ−２１点鼻投与によって有意に抑制されていた。IL-21投与群の体温は正常群のそれと差はなかった．
【００６４】
この結果はIL-21の経鼻的投与がアナフィラキシーを抑制したことを示している。＊ｐ＜０．０５  N.S. 有意差なし。この結果から、IL-21の経鼻的投与が、鼻局部の症状だけでなく、全身性の症状を改善できることが分かった。
【実施例１５】
【００６５】
ピーナッツアレルギーモデルに対するIL-21経鼻投与実験を、実施例１３と同様のプロトコールで、別のマウスを用いて再度おこなった。ただしこの実験では、マウスの個体数は第I群６、第II群６、第III群６、第IV群７であった。第２３日目のマウスの直腸温を、以下の時間に測定した．(1)１回目のCPE胃内投与の３０分後（2回目のCPE胃内投与の前であるが、図と以下の説明ではCPE投与30分後と記載する）、(2)１回目のCPE胃内投与の60分後（2回目のCPE胃内投与の３０分後であるが、図と以下の説明ではCPE投与６０分後と記載する）。その結果を図１５に示す。正常群に比し、ピーナッツアレルギー誘導群では，３０分後に直腸温が低下し、６０分後にはさらに顕著に低下した．それに対して、IL-21投与群の直腸温は、ＣＰＥ胃内投与の30分後および60分後において、正常群の直腸温との間に有意差がなかった。
【００６６】
この結果から、IL-21の経鼻的投与がアナフィラキシーを抑制することが再度確認された。＊ｐ＜０．０５  N.S. 有意差なし。
【実施例１６】
【００６７】
実施例１５のマウスの血圧を、第２３日目の1回目のCPE胃内投与の60分後に測定した。その結果を図１６に示す。正常群に比し、ピーナッツアレルギー誘導群では，血圧が有意に低下した．それに対してIL-21投与群の血圧は、正常群の血圧との間に有意差はなかった。
【００６８】
この結果からもまた、IL-21の経鼻的投与がアナフィラキシーを抑制したことが確認できた。＊ｐ＜０．０５  N.S. 有意差なし。
【実施例１７】
【００６９】
実施例１５のマウスのアレルギー症状を、第２３日目の1回目のＣＰＥ経口投与の３０，６０分後に観察し，実施例１１に記載のアナフィラキシー臨床症状スコアリングで評価した。その結果を図１７に示す。ピーナッツアレルギー誘導群では，アレルギー症状のスコアが高値を示した。それに対してIL-21投与群では、ピーナッツアレルギー誘導群よりも有意に低いスコアであった。
【００７０】
この結果からもまた、IL-21の経鼻的投与がアナフィラキシーの症状を抑制したことが確認できた。＊ｐ＜０．０５
【実施例１８】
【００７１】
ピーナッツアレルギーモデルに対するIL-21腹腔内投与の効果
実施例９と同様の方法でＣＰＥを作成した．４週齢メスのAKR/J マウス を4群に分けた。第I群（７匹）は、第28日目に、１００mg/mlのＣＰＥを含む生理的食塩水100μlを、30分間隔で2回に分けて、胃ゾンデにて胃内投与した（正常群）。第II群（７匹）は、第０、７、１４、２１日に、10mg/mlのＣＰＥと１００μｇ/mlのコレラ毒素を含む生理食塩水を100μl胃ゾンデを用いて胃内投与し，さらに第１，８，１５，２２日に5μｇ/mlのＣＰＥと200 μg／ｍｌのAl(OH)3を含む生理的食塩水を100μl腹腔内投与し、さらに28日目に１００mg/mlのＣＰＥを含む生理的食塩水200 μlを、30分間隔で2回に分けて、胃ゾンデにて胃内投与した（ピーナッツアレルギー誘導群）。第III群（７匹）は、第II群と同様の操作に加えて、第21，24日目に０．５μgのリコンビナントマウスIL-21を生理食塩水200μlに溶解した溶液を腹腔内投与した（単クール投与群）。第IV群（７匹）は、第II群と同様の操作に加えて、第０，３，７，１０，１４，１７，２１，２４日目に、０．５μgのリコンビナントマウスIL-21を生理食塩水200μlに溶解した溶液を、腹腔内投与した（反復投与群）。リコンビナントマウスIL-21はＲ＆Ｄ社より購入した。この実験の概略を図１８に示す。
【実施例１９】
【００７２】
実施例１８のマウスの直腸温を、第２８日目の以下の時間に測定した。(1)１回目のCPE胃内投与の前、(2)１回目のCPE胃内投与の３０分後（2回目のCPE胃内投与の前であるが、図と以下の説明ではCPE投与30分後と記載する）、(3)１回目のCPE胃内投与の60分後（2回目のCPE胃内投与の３０分後であるが、図と以下の説明ではCPE投与６０分後と記載する）。その結果を図２０に示す。ピーナッツアレルギー誘導群では，３０分後，６０分後ともに体温が有意に下降した．それに対してIL-21の反復投与群の体温は正常群のそれと差はなかった．また，単クール投与群においても，ピーナッツアレルギー誘導群と比較すると体温低下は抑制されていた（図１９）。
【００７３】
直腸温はアナフィラキシーショックの指標と考えられるので、この結果から、IL-21の腹腔内投与がアナフィラキシーを抑制したこと、その効果が投与回数に依存することが分かった。
【実施例２０】
【００７４】
実施例１８のマウスの症状を、第２８日目の以下の時間に観察し、実施例１１に記載のアナフィラキシー臨床症状スコアリングで評価した．(1)１回目のCPE胃内投与の３０分後（2回目のCPE胃内投与の前であるが、図と以下の説明ではCPE投与30分後と記載する）、(2)１回目のCPE胃内投与の60分後（2回目のCPE胃内投与の３０分後であるが、図と以下の説明ではCPE投与６０分後と記載する）。その結果を図２０に示す。ピーナッツアレルギー誘導群では，ＣＰＥ経口投与の３０分後，および６０分後にアレルギー症状のスコアが高値を示した．それに対してIL-21の単クール投与群と反復投与群はいずれも、ピーナッツアレルギー誘導群に比し、スコアは有意に低値であった。また、IL-21反復投与群はいずれも、正常群とスコアに有意差は無かった。
【００７５】
これらの結果からもまた、IL-21の腹腔内投与がアナフィラキシーを抑制したこと、その効果は投与回数に依存することが確認できた。
【実施例２１】
【００７６】
実施例１８の、ピーナッツアレルギー誘導群と反復治療群のマウスを、２８日目の1回目のＣＰＥ胃内投与の60分後に安楽死させ、脾臓を摘出した。脾臓よりリンパ球を回収後，マウスＢ細胞磁気分離キット（Militeny Biotec, Sunnyval社製)を用いてＢ細胞を分離し，RNA抽出キット（Qiagen社製）で総RNAを回収した．回収した総RNAを逆転写反応キット（Qiagen社製）を用いてcDNAを合成した．それらのcDNAを鋳型にして，胚型C epsilon転写産物に特異的なプライマーペア（5’-gcacagggggcagaagat-3’ および5’-cgttgaatgatggaggat-3’）、あるいはグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）特異的なプライマーペア（5’-aggcagaagctccaagatga-3’ および5’-ggcgatagtcgttagcttcg-3’）とPCRキット（Qiagen社製）用いてPCRを行った．１％アガロースゲル電気泳動を行ったのち，エチジウムブロマイドで染色し，紫外光を照射して撮像した．その結果を図２１に示す（各レーンは1匹のマウスのB細胞由来のPCR産物に相当する。また、図中右に示した数字はDNAのサイズを塩基対で表したものである）。
【００７７】
反復治療群では，ピーナッツアレルギー誘導群と比較して胚型C epsilon転写産物が有意に抑制されているのが示された。
【００７８】
結論
以上の実施例から、アレルギー性鼻炎モデルマウスに経鼻的にIL-21を投与することにより、全身的にIgE産生が抑制されること、鼻炎症状が緩和することが示された。さらにピーナッツアレルギーモデルマウスにIL-21を経鼻投与することにより、全身的なアナフィラキシーも抑制することも示された。これらの実験的事実から、局所粘膜的なIL-21の投与が、当該局所部位はもちろん、全身臓器のさまざまなアレルギーを治療・予防することができることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】IL-21遺伝子導入のアレルギー性鼻炎に対する影響を調べた実験の概略である（実施例１）。
【図２】実施例１の実験の、マウスのくしゃみの回数を表したグラフである（実施例２）。
【図３】IL-21の経鼻的投与のアレルギー性鼻炎に対する影響を調べた実験の概略である（実施例３）。
【図４】実施例３のマウスの、マウスのくしゃみの回数を表したグラフである（実施例４）。
【図５】実施例３のマウスの、血清中総IgE濃度を示すグラフである（実施例５）。
【図６】実施例３のマウスの、血清中のOVA特異的IgE濃度を示すグラフである（実施例６）。
【図７】実施例３のマウスの、血清中総IgG2a濃度を示すグラフである（実施例７）。
【図８】実施例３のマウスの、鼻組織切片HE染色像である（実施例８）。
【図９】IL-21遺伝子導入のピーナッツアレルギーに対する影響を調べた実験の概要である（実施例９）。
【図１０】実施例９のマウスの、直腸温を表したグラフとその統計解析の結果である（実施例１０）。
【図１１】実施例９のマウスの、アナフィラキシースコアを表したグラフとその統計解析の結果である（実施例１１）。
【図１２】実施例９と同様の実験を行なったマウスの、血清中総IgE濃度を表したグラフである（実施例１２）。
【図１３】IL-21経鼻投与のピーナッツアレルギーに対する影響を調べた実験の概要である（実施例１３）。
【図１４】実施例１３のマウスの、直腸温を表したグラフである（実施例１４）。
【図１５】実施例１３と同様の実験を行なったマウスの、直腸温を表したグラフである（実施例１５）。
【図１６】実施例１５のマウスの、血圧を表したグラフである（実施例１６）。
【図１７】実施例１５のマウスの、アナフィラキシースコアを表したグラフである（実施例１７）。
【図１８】ピーナッツアレルギーに対するIL-21腹腔内投与の影響を調べた実験の概要である（実施例１８）。
【図１９】実施例１８のマウスの、直腸温を表したグラフとその統計解析の結果である（実施例１９）。
【図２０】実施例１８のマウスの、アナフィラキシースコアを表したグラフとその統計解析の結果である（実施例２０）。
【図２１】実施例１８のマウスより得た、脾臓B細胞RNAを用いたRT−PCR産物を、電気泳動した結果である（実施例２１）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図８】
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【図２１】
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