(57)【要約】癌（特に、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに関連の癌）の治療および診断のための組成物および方法が本明細書において開示される。例示的な組成物は、１つ以上のＨｅｒ−２／ｎｅｕポリペプチド、その免疫原性部分、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、このようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞、およびこのようなポリペプチドを発現する細胞に特異的なＴ細胞を含み得る。開示された組成物は、例えば、疾患、特にＨｅｒ−２／ｎｅｕ関連悪性腫瘍の診断、予防および／または処置において有用である。
2004522412.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者において免疫応答を惹起するために有効な単離されたポリヌクレオチドであって、本質的に配列番号３からなるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
免疫応答を惹起するために有効な単離されたポリペプチド組成物であって、本質的に配列番号３からなるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド組成物。
【請求項３】
薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて、請求項１に記載のポリヌクレオチド、または請求項２に記載のポリペプチドを含む薬学的組成物。
【請求項４】
さらに免疫刺激剤を含む、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記免疫刺激剤がアジュバントを含む、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
患者における免疫応答を惹起するための方法であって、請求項１に記載のポリヌクレオチドの有効量を患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項７】
前記患者がＨＬＡ−Ｂ４４陽性である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記患者が乳癌に罹患している、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
患者における免疫応答を惹起するための方法であって、配列番号１のヌクレオチドおよそ２０２６〜３７６５の配列を有するポリヌクレオチドの有効量を患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１０】
前記患者が乳癌に罹患している、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
配列番号１３に示されるＴＣＲα配列を含む、単離されたポリヌクレオチド組成物。
【請求項１２】
配列番号１２に示されるＴＣＲβ配列を含む、単離されたポリヌクレオチド組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、一般的に、癌、特に、乳癌の治療および診断に関する。本発明は、より具体的に、少なくともＨｅｒ−２／Ｎｅｕタンパク質の免疫原性フラグメントを含むポリペプチドに関し、そしてこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。このようなポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、ヒト悪性腫瘍の診断および処置についての薬学的組成物（例えば、ワクチン）および他の組成物において有用である。
【０００２】
（関連分野の説明）
財源および人的資源の莫大な投資にもかかわらず、癌は、主要な死因のうちの１つのままである。例えば、癌は、３５歳〜７４歳の女性において、死の主要な原因である。乳癌は、女性における最も一般的な悪性腫瘍であり、そして乳癌の発生についての発生率が増大している。９人の女性のうち１人が、この疾患を有すると診断される。乳癌を治療するための標準的なアプローチは、手術、放射線療法および化学療法の組み合わせに集中している。これらのアプローチは、特定の悪性腫瘍において、いくつかの劇的な成功をもたらしている。しかし、これらのアプローチは、すべての悪性腫瘍について首尾良くなく、そして乳癌は、特定の病期を超えて処置を試みる場合において、ほとんどの場合、不治である。予防および治療についての別のアプローチが必要である。
【０００３】
悪性腫瘍の一般的な特徴は、制御不可能な細胞増殖である。癌細胞は、正常な表現型から自己増殖可能な悪性表現型への形質転換の工程を受けたようである。体細胞遺伝子の増幅および過剰発現は、一般的な一次事象であると考えられ、これは、悪性細胞への正常細胞の形質転換をもたらす。癌遺伝子によってコードされる悪性表現型の特性は、細胞分裂の間に、形質転換細胞の後代に移る。
【０００４】
癌遺伝子を含む進行中の研究によって、悪性細胞において作動しており、そして形質転換を担うか、または形質転換に関連する少なくとも４０の癌遺伝子を同定した。癌遺伝子は、それらの遺伝子産物（例えば、この癌遺伝子によって発現されるタンパク質）の推定機能または位置に基づいて、異なる群に分類されている。
【０００５】
癌遺伝子は、正常な細胞生理学の特定の局面について必須であると考えられる。これに関して、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ癌遺伝子は、多くのチロシンタンパク質キナーゼファミリーの癌遺伝子であり、そして上皮増殖因子レセプターと高度の相同性を共有する。ＨＥＲ−２／ｎｅｕは、おそらく、細胞増殖および／または分化における役割を果たす。ＨＥＲ−２／ｎｅｕは、量的メカニズムを通じて悪性腫瘍を誘導するようであり、このメカニズムは、本質的に正常な遺伝子産物の発現の増大または統制解除から生じる。
【０００６】
ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（ｐ１８５）は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ癌遺伝子のタンパク質産物である。このＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子が増幅され、そしてＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質が、乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌および血液学的癌を含む種々の癌において過剰発現される。ＨＥＲ−２／ｎｅｕは、悪性形質転換に関連する。これは、５０〜６０％の上皮内腺管癌および２０〜４０％のすべての乳癌、ならびに卵巣、前立腺、結腸および肺において生じる腺癌の実質的画分において見出される。ＨＥＲ−２／ｎｅｕは、悪性表現型だけでなく、悪性腫瘍の攻撃にも密接に関連し、これは、すべての侵襲性乳癌のうちの４分の１に見出される。ＨＥＲ−２／ｎｅｕ過剰発現は、乳癌および卵巣癌の両方における乏しい予後に関連する。ＨＥＲ−２／ｎｅｕは、およそ１２５５アミノ酸（ａａ）長である１８５ｋｄの相対分子質量を有する膜貫通タンパク質である。これは、上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）と４０％の相同性を有するおよそ６４５ａａの細胞外結合ドメイン（ＥＣＤ）、高度に疎水性の膜貫通アンカードメイン（ＴＭＤ）およびＥＧＦＲと８０％の相同性を有するおよそ５８０ａａのカルボキシ末端細胞質ドメイン（ＣＤ）を有する。
【０００７】
ＨＥＲ−２／ｎｅｕ癌遺伝子が関連する癌の治療に対する現在のアプローチの難しさに起因して、当該分野において、化合物および組成物の改善についての必要性が存在する。本発明は、この必要性を果たし、そして他の関連する利点をさらに提供する。
【０００８】
（発明の簡単な要旨）
本発明の１つの局面において、免疫原性である（すなわち、本明細書中においてさらに記載されるように、免疫応答、特に、体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を惹起し得る）Ｈｅｒ−２／ｎｅｕポリペプチドおよびポリヌクレオチド組成物が提供される。１つの好ましい実施形態において、この組成物は、配列番号３において示されるような、ＨＬＡ−Ｂ４４で拘束され、本来プロセスされるＨｅｒ−２／ｎｅｕエピトープを含むポリペプチド配列、またはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド組成物である。
【０００９】
本発明は、開示されるポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド配列のフラグメント、改変体および／または誘導体をさらに提供し、ここで、このフラグメント、改変体および／または誘導体は、好ましくは、本明細書中に示されるポリペプチド配列の免疫原性活性レベルの少なくとも約５０％の免疫原性活性レベル、好ましくは、少なくとも約７０％、そしてより好ましくは、少なくとも約９０％を有する。
【００１０】
本発明は、このようなポリヌクレオチドを含む発現ベクター、およびこのような発現ベクターを用いて形質転換またはトランスフェクトされる宿主細胞をさらに提供する。
【００１１】
他の局面の範囲内において、本発明は、上記のようなポリペプチドまたはポリヌクレオチド、および生理学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。
【００１２】
本発明の関連局面の範囲内において、薬学的組成物（例えば、ワクチン組成物）が、予防適用または治療適用について提供される。このような組成物は、一般的には、本発明の免疫原性ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、および免疫刺激剤（例えば、アジュバント）を含む。
【００１３】
本発明は、以下を含む薬学的組成物をさらに提供する：（ａ）本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント；および（ｂ）生理学的に受容可能なキャリア。
【００１４】
さらなる局面の範囲内において、本発明は、以下を含む薬学的組成物を提供する：（ａ）上記のようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞、および（ｂ）薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤。例示的な抗原提示細胞としては、樹状細胞、マクロファージ、単球、線維芽細胞およびＢ細胞が挙げられる。
【００１５】
関連局面の範囲内において、以下を含む薬学的組成物が提供される：（ａ）上記のようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞、および（ｂ）免疫刺激剤。
【００１６】
本発明は、他の局面において、上記のような少なくとも１つのポリペプチドを含む融合タンパク質、ならびにこのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、代表的には、生理学的に受容可能なキャリアおよび／または免疫刺激剤を含む薬学的組成物（例えば、ワクチン組成物）の形態でさらに提供する。この融合タンパク質は、本明細書中で記載されるような複数の免疫原性ポリペプチドまたはその一部分／改変体を含み得、そしてこのポリペプチドの発現、精製および／または免疫原性の促進のために１つ以上のポリペプチドセグメントをさらに含み得る。
【００１７】
さらなる局面の範囲内において、本発明は、患者における免疫応答、好ましくは、ヒト患者におけるＴ細胞応答の刺激についての方法を提供し、この方法は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕポリヌクレオチド組成物、好ましくは、このＩＣＤ領域のいくつかまたはすべてをコードするＨｅｒ−２／ｎｅｕポリヌクレオチド、およびより好ましくは、配列番号３に示される、少なくともＨＬＡ−Ｂ４４で拘束され、本来プロセスされるＨｅｒ−２／ｎｅｕエピトープをコードするポリヌクレオチドを投与する工程を包含する。患者は、癌に罹患し得、この場合において、この方法は、この疾患についての処置を提供するか、またはこのような疾患のおそれがあると考えられる患者は、予防的に処置され得る。
【００１８】
本発明は、他の局面の範囲内において、生物学的サンプルからの腫瘍細胞の除去についての方法をさらに提供し、この方法は、生物学的サンプルを、本発明のポリペプチドと特異的に反応するＴ細胞と接触させる工程を包含し、ここで、この接触工程は、このサンプルから、タンパク質を発現する細胞の除去を可能にするに十分な条件下で、そしてこれに十分な時間行われる。
【００１９】
関連局面の範囲内において、患者における癌の発達（発生）の阻害についての方法が提供され、この方法は、患者に、上記のように処理される生物学的サンプルを投与する工程を包含する。
【００２０】
本発明のポリペプチドに特異的なＴ細胞の刺激および／または拡張についての方法が、他の局面の範囲内において、さらに提供され、この方法は、Ｔ細胞の刺激および／または拡張を可能にするに十分な条件下で、そしてこれに十分な時間、１つ以上の以下とＴ細胞を接触させる工程を包含する：（ｉ）上記のようなポリペプチド；（ｉｉ）このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および／または（ｉｉｉ）このようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞。上記のように調製されるＴ細胞を含む単離されたＴ細胞集団がまた提供される。
【００２１】
さらなる局面の範囲内において、本発明は、患者における癌の発達（発生）の阻害についての方法を提供し、この方法は、患者に、上記のような有効量のＴ細胞集団を投与する工程を包含する。
【００２２】
本発明は、患者における癌の発達の阻害についての方法をさらに提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）１つ以上の以下：（ｉ）本明細書中に開示されるポリペプチドの少なくとも免疫原性部分を含むポリペプチド；（ｉｉ）このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および（ｉｉｉ）このようなポリペプチドを発現した抗原提示細胞と、患者から単離されるＣＤ４＋  Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋  Ｔ細胞をインキュベートする工程；ならびに（ｂ）患者に、有効量の増殖Ｔ細胞を投与して、それによって、患者における癌の発達を阻害する工程。増殖細胞は、患者への投与の前に、クローニングされ得るが、クローニングされる必要性はない。
【００２３】
さらなる局面の範囲内において、本発明は、癌の存在または非存在、好ましくは、患者における癌の決定についての方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）患者から得られる生物学的サンプルを、上記で列挙されるようなポリペプチドに結合する結合因子と接触させる工程；（ｂ）このサンプルにおいて、この結合因子に結合するポリペプチドの量を検出する工程；および（ｃ）このポリペプチドの量を、所定のカットオフ値と比較して、それから、患者における癌の存在または非存在を決定する工程。好ましい実施形態の範囲内において、この結合因子は、抗体であり、より好ましくは、モノクローナル抗体である。
【００２４】
本発明はまた、他の局面の範囲内において、患者における癌の進行のモニターについての方法を提供する。このような方法は、以下の工程を包含する：（ａ）第一の時点で患者から得られる生物学的サンプルを、上記で列挙されるようなポリペプチドに結合する結合因子と接触させる工程；（ｂ）このサンプルにおいて、この結合因子に結合するポリペプチドの量を検出する工程；（ｃ）引き続く時点で、患者から得られる生物学的サンプルを用いて、工程（ａ）および（ｂ）を繰り返す工程；ならびに（ｄ）工程（ｃ）において検出されるポリペプチドの量を、工程（ｂ）において検出される量と比較して、それから、患者における癌の進行をモニターする工程。
【００２５】
さらなる局面の範囲内において、本発明は、上記のようなポリペプチドに結合する抗体（例えば、モノクローナル抗体）、ならびにこのような抗体を含む診断キットを提供する。上記のような１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを含む診断キットがまた提供される。
【００２６】
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面の参照の下で明らかになる。本明細書中に開示されるすべての参考文献は、各々が、個々に援用されるかのように、本明細書によって、その全体において参考として援用される。
【００２７】
（配列識別名）
配列番号１は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質をコードするＤＮＡ配列を示す。
【００２８】
配列番号２は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質についてのアミノ酸配列を示す。
【００２９】
配列番号３は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質のアミノ酸１０２１〜１０３０に対応する、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの本来プロセスされるＨＬＡ−Ｂ４４拘束エピトープについてのアミノ酸配列を示す。
【００３０】
配列番号４は、クローンＨＩＣＤ  ＣＴ  Ｈｉｓコード領域（ＨＩＣＤ＿ＣＴ＿Ｈｉｓ＿ｃｏｄｉｎｇ＿ｒｅｇｉｏｎ）について決定されるｃＤＮＡである。
【００３１】
配列番号５は、ＨＩＣＤ＿Ｐｌｕｓ＿８＿ＨＩＳ（クローンＨＩＣＤおよび８つのＨＩＳ）について決定されるｃＤＮＡである。
【００３２】
配列番号６は、クローンＨＩＣＤのネイティブコード領域（ＨＩＣＤ＿ｎａｔｉｖｅ＿ｃｏｄｉｎｇ＿ｒｅｇｉｏｎ）について決定されるｃＤＮＡである。
【００３３】
配列番号７は、ｐＰＤＭコード配列におけるクローンＨＩＣＤ（ＨＩＣＤ＿ｉｎ＿ｐＰＤＭ＿ｃｏｄｉｎｇ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅ）について決定されるｃＤＮＡである。
【００３４】
配列番号８は、配列番号４において開示されるｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列である。
【００３５】
配列番号９は、配列番号６において開示されるｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列である。
【００３６】
配列番号１０は、配列番号７において開示されるｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列である。
【００３７】
配列番号１１は、配列番号５において開示されるｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列である。
【００３８】
配列番号１２は、１７Ｄ５  Ｔ細胞クローンのＴＣＲβ鎖である、クローン６８４９９について決定されるｃＤＮＡである。
【００３９】
配列番号１３は、１７Ｄ５  Ｔ細胞クローンのＴＣＲα鎖である、クローン６８４９８について決定されるｃＤＮＡである。
【００４０】
配列番号１４は、配列番号１２において開示されるｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列である。
【００４１】
配列番号１５は、配列番号１３において開示されるｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列である。
【００４２】
配列番号１６は、プライマーＰＤＭ−４４についてのＤＮＡ配列である。
【００４３】
配列番号１７は、プライマーＰＤＭ−４５についてのＤＮＡ配列である。
【００４４】
配列番号１８は、プライマーＰＤＭ−５９１についてのＤＮＡ配列である。
【００４５】
配列番号１９は、プライマーＰＤＭ−５９２についてのＤＮＡ配列である。
【００４６】
配列番号２０は、プライマーＰＤＭ−７２についてのＤＮＡ配列である。
【００４７】
配列番号２１は、プライマーＰＤＭ−６１についてのＤＮＡ配列である。
【００４８】
配列番号２２は、プライマーＴＣＲＶα−１６  ５’についてのＤＮＡ配列である。
【００４９】
配列番号２３は、プライマーＴＣＲα  ３’についてのＤＮＡ配列である。
【００５０】
配列番号２４は、プライマーＴＣＲＶβ−１４  ５’についてのＤＮＡ配列である。
【００５１】
配列番号２５は、プライマーＴＣＲβ  ３’についてのＤＮＡ配列である。
【００５２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、一般的に、癌、特に、乳癌の治療および診断における組成物およびその使用に関する。さらに以下に記載されるように、本発明の例示的な組成物としては、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕポリペプチド、特に、免疫原性ポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、抗体および他の結合因子、抗原提示細胞（ＡＰＣ）ならびに免疫系細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５３】
本発明の実施は、別段の通知がない限り、当該分野の範囲内のウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学および組換えＤＮＡ技術の従来方法を利用し、これらの多くは、例示の目的で以下に記載される。このような技術は、文献において完全に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照のこと。
【００５４】
上記であれ下記であれ、本明細書中で引用されるすべての刊行物、特許および特許出願は、本明細書によって、その全体において参考として援用される。
【００５５】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形の１つの（「ａ」、「ａｎ」）およびこの、その（「ｔｈｅ」）は、内容が、明らかに別段指図しなければ、複数の言及を含む。
【００５６】
（ＨＥＲ−２／ＮＥＵポリペプチド組成物）
本明細書中で使用されるように、用語「ポリペプチド」は、その従来の意味において（すなわち、アミノ酸の配列として）使用される。ポリペプチドは、特定の長さの産物に限定されない；従って、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質が、ポリペプチドの定義の範囲内に含まれ、そしてこのような用語は、別段の通知がない限り、本明細書中で交換可能に使用され得る。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など）、ならびに当該分野で公知の他の修飾（本来生じる修飾および本来生じない修飾の両方）をいわないか、またはこれらの修飾を除外する。ポリペプチドは、タンパク質全体またはそのサブ配列であり得る。本発明の文脈における目的の特定のポリペプチドは、エピトープ（すなわち、ポリペプチドの免疫原性性質を実質的に担い、そして免疫応答を誘発し得る抗原決定基）を含むアミノ酸サブ配列である。
【００５７】
上記のように、本発明は、温血動物における悪性腫瘍について含むＨＥＲ−２／ｎｅｕ癌遺伝子によって発現されるタンパク質産物に対する免疫を惹起または増強するための組成物および方法に関し、ここで、増幅ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子は、悪性腫瘍に関連する。増幅ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子の悪性腫瘍との関連は、この遺伝子のタンパク質発現産物が、腫瘍上に存在することを必要としない。例えば、このタンパク質発現産物の過剰発現が、腫瘍の開始に関与され得るが、このタンパク質発現は、その後失われ得る。本発明の１つの実施形態は、インビボでＨｅｒ−２／ｎｅｕを発現する癌細胞に対する有効な免疫応答の惹起または増強を含む。
【００５８】
より詳細には、１つの局面における本発明の開示は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子のタンパク質発現産物の特定の部分（ＨＥＲ−２／ｎｅｕポリペプチド）に基づくポリペプチドが、胸腺依存性リンパ球（以下、「Ｔ細胞」）によって認識され得、従って、免疫Ｔ細胞応答が、予防的に利用され得るか、あるいはこのようなタンパク質が、過剰発現されるかまたはされている悪性腫瘍を処置するために利用され得ることを提供する。
【００５９】
特定の好ましいポリペプチド組成物は、これに関して、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質のＩＣＤ領域由来であり、好ましくは、配列番号２のおよそアミノ酸６７６〜１２５５由来の領域のいくつかまたはすべてを含み、そしてより好ましくは、配列番号３に示される少なくとも本来プロセスされる、ＨＬＡ−Ｂ４４拘束されるＨｅｒ−２／ｎｅｕエピトープを含む。
【００６０】
一般に、ＣＤ４＋  Ｔ細胞集団は、特定の抗原によって刺激される場合、リンホカインの放出を通じて、ヘルパー／インデューサーとして機能すると考えられる；しかし、ＣＤ４＋  細胞のサブセットは、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）として作用し得る。同様に、ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、抗原性標的を直接溶解することによって機能すると考えられる；しかし、種々の環境下で、これらは、リンホカインを分泌して、ヘルパー機能またはＤＴＨ機能を提供し得る。重複機能の可能性にもかかわらず、表現型のＣＤ４マーカーおよびＣＤ８マーカーが、クラスＩＩ  ＭＨＣ抗原またはクラスＩ  ＭＨＣ抗原に結合したペプチドの認識に関連する。クラスＩＩ  ＭＨＣまたはクラスＩ  ＭＨＣに関連する抗原の認識は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞が、異なる抗原または異なる環境下で提示される同じ抗原に応答することを指令する。クラスＩＩ  ＭＨＣ抗原への免疫原性ペプチドの結合は、通常、抗原提示細胞によって受け入れられる抗原について生じる。従って、ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、一般的に、腫瘍細胞に対して外因的である抗原を認識する。対照的に、正常環境下において、クラスＩ  ＭＨＣへのペプチドの結合は、細胞質ゾルに存在し、そしてその標的自身によって合成されるタンパク質についてのみ生じ、外因性環境におけるタンパク質は除外される。この例外は、明確なクラスＩ結合モチーフとの外因性ペプチドの結合であり、このペプチドは、高濃度で、細胞外部に存在する。従って、ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞は、広範な異なる機能を有し、そして抗原が正常に存在する場合の反射として、異なる抗原を認識する傾向がある。
【００６１】
本発明の範囲内に開示されるように、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ癌遺伝子によって発現されるタンパク質産物のポリペプチド部分は、Ｔ細胞によって認識される。循環ＨＥＲ−２／ｎｅｕポリペプチドは、ペプチドフラグメントに分解される。ポリペプチド由来のペプチドフラグメントは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）抗原に結合する。細胞表面上でのＭＨＣ抗原に結合したペプチドの提示、ならびにペプチドおよび自己ＭＨＣ抗原の組み合わせの宿主Ｔ細胞による認識によって、ＨＥＲ−２／ｎｅｕポリペプチド（悪性細胞上で発現されるペプチドを含む）は、Ｔ細胞に対して免疫原性である。Ｔ細胞レセプターの卓抜した特異性によって、個々のＴ細胞が、１アミノ酸残基だけ異なるペプチド間を識別することが可能になる。
【００６２】
ポリペプチド由来のペプチドフラグメントに対する免疫応答の間、ペプチド−ＭＨＣ複合体の高親和性結合を伴ってＴ細胞レセプターを発現するＴ細胞は、ペプチド−ＭＨＣ複合体に結合し、それによって、活性化され、そして誘導されて、増殖するようになる。ペプチドとの第一の遭遇において、少数の免疫Ｔ細胞は、リンホカインを分泌し、増殖し、そしてエフェクター細胞および記憶Ｔ細胞に分化する。この一次免疫応答は、インビボで生じるが、インビトロでの検出は困難である。記憶Ｔ細胞による同じ抗原との引き続く遭遇は、より速く、そしてより強度の免疫応答を引き起こす。この二次応答は、インビボまたはインビトロのいずれかで生じる。このインビトロ応答は、抗原に再曝露されるＴ細胞集団の増殖の程度、サイトカイン産生の程度または細胞質ゾル活性の作製の測定によって、容易に測定される。特定の抗原に応じたＴ細胞集団の実質的増殖は、抗原への事前の曝露または事前のプライミングを表すと考えられる。
【００６３】
本発明の特定の化合物は、一般的に、ＨＥＲ−２／ｎｅｕポリヌクレオチド分子を含み、この分子は、このようなペプチドの発現を指向し、ここで、ＤＮＡ分子は、ウイルスベクターまたは他の送達ベクターに存在し得る。上記のように、本発明のポリペプチドは、免疫応答を刺激する能力を保持する改変体を含む。このような改変体は、ネイティブポリペプチドの種々の構造形態を含む。イオン化アミノ基およびカルボキシル基の存在に起因して、例えば、ＨＥＲ−２／ｎｅｕポリペプチドは、酸性塩または塩基性塩の形態にあり得るか、あるいは、中性形態にあり得る。個々のアミノ酸残基はまた、酸化または還元によって改変され得る。
【００６４】
本発明はまた、グリコシル化を含むかまたは含まないＨＥＲ−２／ｎｅｕポリペプチドを含む。酵母または哺乳動物の発現系において発現されるポリペプチドは、発現系に依存して、ネイティブ分子と、分子量およびグリコシル化パターンが類似し得るか、またはわずかに異なり得る。例えば、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるポリペプチドをコードするＤＮＡの発現は、代表的には、非グリコシル化分子を提供する。真核生物タンパク質のＮグリコシル化部位は、アミノ酸トリプレットＡｓｎ−Ａ１−Ｚによって特徴付けられ、ここで、Ａ１は、Ｐｒｏ以外の任意のアミノ酸であり、そしてＺは、ＳｅｒまたはＴｈｒである。不活性化Ｎグリコシル化部位を有するＨＥＲ−２／ｎｅｕポリペプチドの改変体は、当業者に公知の技術（例えば、オリゴヌクレオチド合成および連結技術、または部位特異的突然変異誘発技術）によって産生され得、そして本発明の範囲内である。あるいは、Ｎ結合型グリコシル化部位は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕポリペプチドに付加され得る。
【００６５】
ＨＥＲ−２／ｎｅｕポリペプチドは、一般的に、タンパク質をコードするゲノムクローンまたはｃＤＮＡクローンを用いて得られ得る。全長ＨＥＲ−２／ｎｅｕをコードするゲノム配列は、配列番号１に示され、そして推定アミノ酸配列は、配列番号２に示される。このようなクローンは、ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質を発現するクローンについての適切な発現ライブラリのスクリーニングによって単離され得る。このライブラリ調製およびスクリーニングは、一般的に、当業者に公知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９（これは、本明細書中で参考として援用される）に記載される方法）を用いて行われ得る。手短に言えば、バクテリオファージ発現ライブラリがプレーティングされ得、そしてフィルターに転移され得る。次いで、このフィルターは、検出試薬とともにインキュベートされ得る。本発明の文脈において、「検出試薬」は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質に結合し得る任意の化合物であり、次いでこれは、当業者に公知の任意の種々の手段によって検出され得る。代表的な検出試薬は、レポーター基に結合した「結合因子」（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、ＩｇＧまたはレクチン）を含む。好ましいレポーター基としては、酵素、基質、補因子、インヒビター、色素、放射性核種、発光基、蛍光基およびビオチンが挙げられる。より好ましくは、このレポーター基は、西洋ワサビペルオキシダーゼであり、これは、基質（例えば、テトラメチルベンジジンまたは２，２’−アジノ−ジ−３−エチルベンズ−チアゾリンスルホン酸）とのインキュベーションによって検出され得る。ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質を発現するゲノム配列またはｃＤＮＡ配列を含むプラークが、当業者に公知の技術によって単離および精製される。適切な方法が、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９において見出され得る。
【００６６】
別の実施形態において、本発明のポリペプチド組成物はまた、１つ以上のポリペプチドを含み得、このポリペプチドは、本発明のポリペプチド（特に、本明細書中に開示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）に対して作製されるＴ細胞および／または抗体、あるいはその免疫原性フラグメントまたは改変体と免疫学的に反応性である。
【００６７】
本発明の別の実施形態において、ポリペプチドが提供され、このポリペプチドは、本明細書中に記載される１つ以上のポリペプチド、もしくは本明細書中に開示されるポリヌクレオチド配列に含まれる連続した核酸配列によってコードされる１つ以上のポリペプチドと免疫学的に反応性であるＴ細胞および／もしくは抗体、またはその免疫原性フラグメントもしくは改変体を惹起し得る１つ以上のポリペプチドを含むか、あるいは、中程度から高いストリンジェンシー条件下で、１つ以上のこれらの配列とハイブリダイズする１つ以上の核酸配列に対する１つ以上のポリペプチドを含む。
【００６８】
本発明は、別の局面において、本明細書中に示されるポリペプチド組成物（例えば、配列番号２〜３、配列番号８〜１１および配列番号１４〜１５に示されるポリペプチド組成物、または配列番号１、配列番号４〜７および配列番号１２〜１３の配列に示されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド組成物）の少なくともおよそ５、１０、１５、２０、２５、５０または１００以上の連続したアミノ酸（すべての中間の長さを含む）を含むポリペプチドフラグメントを提供する。
【００６９】
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載されるポリペプチド組成物の改変体を提供する。一般的に、本発明によって包含されるポリペプチド改変体は、代表的には、その長さに沿って、本明細書中に示されるポリペプチド配列に対して少なくともおよそ７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上の同一性（以下に記載されるように決定される）を示す。
【００７０】
１つの好ましい実施形態において、本発明により提供されるポリペプチドフラグメントおよび改変体は、本明細書中に詳細に示されるポリペプチドと反応する抗体および／またはＴ細胞と免疫学的に反応性である。
【００７１】
ポリペプチド「改変体」は、本明細書中でこの用語が使用される場合、代表的に、本明細書中で詳細に開示されるポリペプチドと１つ以上の置換、欠失、付加、および／または挿入において異なるポリペプチドである。このような改変体は、天然に存在するか、または例えば、本発明の１つ以上の上記のポリペプチド配列を改変し、そして本明細書中に記載されるようなそれらの免疫学的活性を評価することにより、ならびに／または当該分野で周知の多くの技術のいずれかを用いることにより、合成的に作製され得る。
【００７２】
例えば、本発明のポリペプチドの特定の例示的な改変体として、１つ以上の部分（例えば、Ｎ末端リーダー配列または膜貫通ドメイン）が除去された改変体が挙げられる。他の例示的な改変体としては、小さな部分（例えば、１〜３０アミノ酸、好ましくは５〜１５アミノ酸）が成熟タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端から除去された改変体が挙げられる。
【００７３】
多くの例において、改変体は、保存的置換を含む。「保存的置換」は、アミノ酸が類似の特性を有する別のアミノ酸で置換され、その結果、ペプチド化学の当業者がポリペプチドの二次構造および疎水的性質が実質的に変化していないことを期待するような置換である。上記のように、改変は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造においてなされ得、そしてなお所望の特性（例えば、免疫原性特性）を有する改変体ポリペプチドまたは誘導体ポリペプチドをコードする機能的分子を獲得し得る。本発明のポリペプチドの等価物を（または本発明のポリペプチドの改善された免疫原性の改変体もしくは部分さえも）作製するようポリペプチドのアミノ酸配列が変更されることが所望される場合、当業者は、代表的に、表１に基づくコードＤＮＡ配列の１つ以上のコドンを変更する。
【００７４】
例えば、特定のアミノ酸は、例えば、抗体の抗原結合領域または基質分子上のの結合部位のような構造を有するタンパク質構造中の他のアミノ酸に、感知可能な相互作用的結合能の損失なしで、置換され得る。タンパク質の相互作用的な能力および性質がタンパク質の生物学的機能的活性を規定するので、特定のアミノ酸配列置換は、タンパク質配列、および当然ながら、その根底にあるＤＮＡコード配列においてなされ得、そしてそれにも関わらず、同様の特性を有するタンパク質が入手される。従って、種々の変化が、ペプチドの生物学的有用性または活性の感知可能な損失を伴わずに、開示された組成物のペプチド配列またはそのペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列においてなされ得ることが企図される。
【００７５】
【表１】
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このような変化を作製する際に、アミノ酸の疎水性親水性指標が考慮され得る。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する際の疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、一般的に当該分野において理解されている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２、これは、本明細書中に参考として援用される）。アミノ酸の相対的な疎水性親水性的性質は、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、これが次に、他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）とのそのタンパク質の相互作用を規定することが受け入れられている。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいて疎水性親水性指標を割り当てられている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）。これらの値は以下である：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【００７６】
特定のアミノ酸が類似の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸によって置換され得、そしてなお類似の生物学的活性を有するタンパク質を生じる（すなわち、生物学的に機能的に等価なタンパク質をなお入手する）ことが、当該分野において公知である。このような変化を作製する際に、その疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、その疎水性親水性指標が±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そしてその疎水性親水性指標が±０．５以内であるアミノ酸の置換がなおより特に好ましい。同様なアミノ酸の置換が、親水性に基づいて有効になされ得ることもまた、当該分野で理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号（その全体が本明細書中に参考として詳細に援用される）は、そのタンパク質の最大局所的平均親水性が、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるので、そのタンパク質の生物学的特性と相関することを言及している。
【００７７】
米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されるように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられた：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸は、類似の親水性の値を有する別のアミノ酸に置換され得、そしてなお、生物学的な等価物（特に、免疫学的に等価なタンパク質）を得ることが理解される。このような変化において、その親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、その親水性値が±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そしてその親水性値が±０．５以内であるアミノ酸の置換がなおより特に好ましい。
【００７８】
上記で概説したように、従って、アミノ酸置換は、一般的にアミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性（例えば、その疎水性、親水性、電荷、大きさ、など）に基づく。前述の種々の特徴を考慮する典型的な置換は当業者に周知であり、そして以下を含む：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン。
【００７９】
さらに、任意のポリヌクレオチドが、インビボでの安定性を増加させるためにさらに改変され得る。可能性のある改変として以下が挙げられるがこれらに限定されない：５’末端および／または３’末端での隣接配列の付加；骨格におけるホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートまたは２’Ｏ−メチルの使用；ならびに／あるいは従来とは異なる塩基（例えば、イノシン、キューオシン、およびワイブトシン、ならびにアデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンのアセチル、メチル、チオ、および他の修飾形態）の含有。
【００８０】
アミノ酸置換はさらに、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性特性の類似性に基づいて作製され得る。例えば、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸；正に荷電したアミノ酸としては、リジンおよびアルギニン；そして類似の親水性値を有する非荷電性の極性ヘッド基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシンおよびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；ならびにセリン、トレオニン（スレオニン）、フェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。保存的変化を示し得るアミノ酸の他のグループとしては、（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓが挙げられる。改変体はまた、またはあるいは、非保存的変化を含み得る。好ましい実施形態において、改変体ポリペプチドは、５アミノ酸またはそれより少ないアミノ酸の置換、欠失または付加によって、ネイティブの配列とは異なる。改変体はまた（またはあるいは）、例えば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造および疎水性親水性特性に対する最小の影響を有するアミノ酸の欠失または付加によって、改変され得る。
【００８１】
上記のように、ポリペプチドは、タンパク質のＮ末端にシグナル（または、リーダー）配列を含み得、これは、翻訳と同時に、または翻訳後に、そのタンパク質の転移を指向する。このポリペプチドはまた、このポリペプチドの合成、精製または同定を容易にするために、またはこのポリペプチドの固体支持体への結合を増強するために、リンカー配列または他の配列（例えば、ポリＨｉｓ）に結合体化され得る。例えば、ポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃ領域に結合体化され得る。
【００８２】
ポリペプチド配列が比較される場合、以下に記載されるように最大の一致で整列するときに２つの配列中のアミノ酸の配列が同じである場合、２つの配列は、「同一」であるといわれる。２つの配列間の比較は、代表的には、比較ウインドウによって配列を比較して、配列類似性の局所的領域を同定および比較することによって行われる。本明細書中で使用される「比較ウインドウ」とは、少なくとも約２０、通常は３０〜約７５、４０〜約５０の連続する位置のセグメントをいう。ここで、配列は、２つの配列が最適に整列された後、同じ数の連続する位置の参照配列と比較され得る。
【００８３】
比較のための配列の最適な整列は、生命情報科学ソフトウエアのＬａｓｅｒｇｅｎｅスイート（ｓｕｉｔｅ）におけるＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、デフォルトパラメータを用いて行われ得る。このプログラムは、以下の参考文献に記載のいくつかの整列スキームを統合する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ  第５巻，補遺３，３４５〜３５８頁におけるＤａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．；Ｈｅｉｎ  Ｊ．（１９９０）Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ  ６２６〜６４５頁  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  第１８３巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ  Ｗ．（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．（１９７１）Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ  １１：１０５；Ｓａｉｔｏｕ，Ｎ．Ｎｅｉ，Ｍ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．（１９７３）Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ−ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７２６−７３０。
【００８４】
あるいは、比較のための配列の最適な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ  ２：４８２の部分的同一性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の同一性アライメント（整列）アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化したインプリメンテーション（実装）（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または検査によって行われ得る。
【００８５】
配列同一性および配列類似性の割合を決定するために適切なアルゴリズムの１つの好ましい例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載される。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドについての配列同一性の割合を決定するために、例えば、本明細書中に記載のパラメータを使用して使用され得る。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎを通して公に利用可能である。アミノ酸配列について、スコアリングマトリクスは、累積スコアを算出するために使用され得る。各指示におけるワードヒットの拡大は、以下の場合に停止する：累積アライメントスコアが、その最大到達値から量Ｘだけ低下した場合；累積スコアが、１以上の負のスコアリングの残基整列の累積に起因してゼロ以下になった場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合。このＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。
【００８６】
好ましい１つのアプローチにおいて、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも２０位置の比較ウインドウにわたる２つの最適に整列した配列を比較することによって決定され、ここで比較ウインドウ中のポリペプチド配列の部分は、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、２つの配列の最適な整列について２０パーセント以下、通常は５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。このパーセンテージは、両方の配列で同一のアミノ酸残基が生じる位置の数を決定して一致する位置の数を得、この一致する位置の数を参照配列における位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算し、そしてこの結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。
【００８７】
他の例示的実施形態において、ポリペプチドは、本明細書中に記載の複数のポリペプチドを含むか、または本明細書に記載の少なくとも１つのポリペプチドおよび関連しない配列（例えば、公知の腫瘍タンパク質）を含む融合ポリペプチドであり得る。例えば、融合パートナーは、Ｔヘルパーエピトープ、好ましくはヒトによって認識されるＴヘルパーエピトープを提供する際に補助し得るか（免疫学的融合パートナー）、またはネイティブの組換えタンパク質より高い収量でタンパク質を発現する際に補助し得る（発現エンハンサー）。特定の好ましい融合パートナーは、免疫学的融合パートナーおよび発現増強融合パートナーの両方である。他の融合パートナーは、ポリペプチドの溶解性を増加するように、またはポリペプチドが所望の細胞内コンパートメントに標的化されることを可能にするように選択され得る。なおさらなる融合パートナーとしては、親和性タグ（これは、ポリペプチドの精製を容易にする）が挙げられる。
【００８８】
融合ポリペプチドは、一般に、標準的な技術（化学的結合体化を含む）を使用して調製され得る。好ましくは、融合ポリペプチドは、発現系において、組換えポリペプチドとして発現され、非融合ポリペプチドと比較して、増加したレベルの産生を可能にする。手短に言うと、このポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列を、別々に組立て得、そして適切な発現ベクターに連結し得る。１つのポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の３’末端は、ペプチドリンカーを用いてまたは用いずに、第２のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の５’末端に、これらの配列のリーディングフレームが同位相にあるように連結される。このことが、両方の成分ポリペプチドの生物学的活性を保持する単一の融合ポリペプチドへの翻訳を可能にする。
【００８９】
ペプチドリンカー配列は、各ポリペプチドがその二次構造および三次構造へと折り畳まれるのを保証するために十分な距離で第一および第二のポリペプチド成分を隔てるために用いられ得る。このようなペプチドリンカー配列は、当該分野で周知の標準的な技術を用いて融合ポリペプチド中に組み込まれる。適切なペプチドリンカー配列は、以下の因子に基づいて選択され得る：（１）伸長した可変コンホメーションを取る能力；（２）第一および第二のポリペプチド上の機能的なエピトープと相互作用し得る二次構造を取ることができないこと；ならびに（３）ポリペプチドの機能的なエピトープと反応し得る疎水性または荷電した残基の無いこと。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒ残基を含む。ＴｈｒおよびＡｌａのような中性に近い他のアミノ酸もまた、リンカー配列に用いられ得る。リンカーとして有用に用いられ得るアミノ酸配列としては、Ｍａｒａｔｅａら、Ｇｅｎｅ  ４０：３９−４６、１９８５；Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８２５８−８２６２、１９８６；米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されるアミノ酸配列が挙げられる。リンカー配列は、一般的に１から約５０アミノ酸長であり得る。第一および第二のポリペプチドが、機能的ドメインを分離するため、および立体的な干渉を防ぐために用いられ得る非必須Ｎ末端アミノ酸領域を有する場合、リンカー配列は必要とされない。
【００９０】
連結されたＤＮＡ配列は、適切な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結される。ＤＮＡの発現を担う調節エレメントは、第一のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’側にのみ位置する。同様に、翻訳および転写終結シグナルを終了するために必要とされる終止コドンは、第二のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の３’側にのみ存在する。
【００９１】
融合ポリペプチドは、関連しない免疫原性タンパク質（例えば、リコール（ｒｅｃａｌｌ）応答を惹起し得る免疫原性タンパク質）と共に、本明細書中に記載されるようなポリペプチドを含み得る。このようなタンパク質の例としては、破傷風タンパク質、結核タンパク質および肝炎タンパク質が挙げられる（例えば、Ｓｔｏｕｔｅら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３６：８６−９１（１９９７）を参照のこと）。
【００９２】
１つの好ましい実施形態において、免疫学的融合パートナーは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のＲａ１２フラグメントのようにＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．由来である。Ｒａ１２組成物、ならびに異種ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列の発現および／または免疫原性を増強する際にＲａ１２を使用するための方法は、米国特許出願６０／１５８，５８５（この開示は、本明細書中でその全体が参考として援用される）に記載されている。簡単には、Ｒａ１２は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＭＴＢ３２Ａ核酸のサブ配列であるポリヌクレオチド領域をいう。ＭＴＢ３２Ａは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの毒性菌株および無毒性菌株の遺伝子によってコードされる分子量３２ＫＤのセリンプロテアーゼである。ＭＴＢ３２Ａのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が、記載されている（例えば、米国特許出願６０／１５８，５８５；また、Ｓｋｅｉｋｙら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎ．（１９９９）６７：３９９８〜４００７（これらは、本明細書中で参考として援用される）も参照のこと）。ＭＴＢ３２Ａコード配列のＣ末端フラグメントは高いレベルで発現し、精製プロセス全体にわたって可溶性ポリペプチドとして残存する。さらに、Ｒａ１２は、これが融合される、異種免疫原性ポリペプチドの免疫原性を増強し得る。１つの好ましいＲａ１２融合ポリペプチドは、ＭＴＢ３２Ａのアミノ酸残基１９２〜３２３に対応する１４ＫＤのＣ末端フラグメントを含む。他の好ましいＲａ１２ポリヌクレオチドは、一般的に、Ｒａ１２ポリペプチドの一部をコードする少なくとも約１５個の連続するヌクレオチド、少なくとも約３０個のヌクレオチド、少なくとも６０個のヌクレオチド、少なくとも約１００個のヌクレオチド、少なくとも約２００個のヌクレオチド、または少なくとも約３００個のヌクレオチドを含む。Ｒａ１２ポリヌクレオチドは、ネイティブな配列（すなわち、Ｒａ１２ポリペプチドまたはその一部をコードする内因性配列）を含んでもよいし、このような配列の改変体を含んでもよい。Ｒａ１２ポリヌクレオチド改変体は、１以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含み得、その結果、コードされた融合ポリペプチドの生物学的活性が、ネイティブなＲａ１２ポリペプチドを含む融合ポリペプチドと比較して、実質的に減少していない。好ましくは、改変体は、ネイティブなＲａ１２ポリペプチドまたはその一部をコードするポリヌクレオチド配列に、少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の同一性、そして最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性を示す。
【００９３】
好ましい他の実施形態において、免疫学的融合パートナーは、グラム陰性の細菌Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｂの表面タンパク質である、プロテインＤ（ＷＯ  ９１／１８９２６）に由来する。好ましくは、プロテインＤ誘導体は、このタンパク質のほぼ３分の１（例えば、最初のＮ末端１００〜１１０アミノ酸）を含み、そしてプロテインＤ誘導体は、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）され得る。特定の好ましい実施形態において、リポプロテインＤ融合パートナーの最初の１０９残基は、さらなる外因性Ｔ細胞エピトープを有するポリペプチドを提供するように、そしてＥ．ｃｏｌｉ中の発現レベルを増加するように、Ｎ末端に含まれる（従って、発現エンハンサーとして機能する）。脂質テールは、抗原提示細胞への抗原の最適な提示を保証する。他の融合パートナーは、インフルエンザウイルス由来の非構造的タンパク質、ＮＳ１（血球凝集素）を含む。代表的に、Ｎ末端の８１アミノ酸が用いられるが、Ｔヘルパーエピトープを含む異なるフラグメントが使用され得る。
【００９４】
別の実施形態において、免疫学的融合パートナーは、ＬＹＴＡとして公知のタンパク質、またはその部分（好ましくはＣ末端部分）である。ＬＹＴＡは、アミダーゼＬＹＴＡ（ＬｙｔＡ遺伝子によりコードされる；Ｇｅｎｅ  ４３：２６５〜２９２，１９８６）として公知のＮ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼを合成するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来である。ＬＹＴＡは、ペプチドグリカン骨格中の特定の結合を特異的に分解する自己溶解素である。ＬＹＴＡタンパク質のＣ末端ドメインは、コリンまたはいくつかのコリンアナログ（例えば、ＤＥＡＥ）に対する親和性を担う。この性質は、融合タンパク質の発現のために有用なＥ．ｃｏｌｉ  Ｃ−ＬＹＴＡ発現プラスミドの開発のために利用されてきた。アミノ末端でＣ−ＬＹＴＡフラグメントを含むハイブリッドタンパク質の精製が、記載されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７９５〜７９８，１９９２を参照のこと）。好ましい実施形態において、ＬＹＴＡの反復部分は、融合ポリペプチドに組み込まれ得る。反復部分は、残基１７８で開始するＣ末端領域中に見出される。特に好ましい反復部分は、残基１８８〜３０５を組み込む。
【００９５】
なお別の例示的な実施形態は、融合ポリペプチド、およびそれらをコードするポリヌクレオチドを含み、ここでこの融合パートナーは、米国特許第５，６３３，２３４号に記載のようにポリペプチドをエンドソーム／リソソームコンパートメントへ指向させ得る標的シグナルを含む。本発明の免疫原性ポリペプチドは、この標的シグナルと融合する場合、より効率的にＭＨＣクラスＩＩ分子と結合し、これによってこのポリペプチドに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞のインビボでの増強された刺激が提供される。
【００９６】
本発明のポリペプチドは、周知の種々の合成技術および／または組換え技術のいずれかを使用して調製される。これらの技術の後者を以下でさらに記載する。一般的に約１５０アミノ酸よりも少ないポリペプチド、部分および他の改変体は、当業者に周知の技術を使用して、合成手段により作製され得る。例示的な１つの例において、このようなポリペプチドは、市販の固相技術のいずれか（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成方法）を使用して合成され、ここでアミノ酸は、成長しているアミノ酸鎖に連続的に付加される。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１４６、１９６３を参照のこと。ポリペプチドの自動化された合成のための機器が、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）などの供給業者から市販されており、そして製造者の指示に従って操作され得る。
【００９７】
一般に、本発明のポリペプチド組成物（融合ポリペプチドを含む）が単離される。「単離された」ポリペプチドは、その元来の環境から取り出されたものである。例えば、天然に存在するタンパク質またはポリペプチドは、それが天然の系中で共存する物質のいくつかまたは全てから分離されている場合、単離されている。好ましくは、このようなポリペプチドはまた、精製され、例えば、少なくとも約９０％純粋、より好ましくは少なくとも約９５％純粋、そして最も好ましくは少なくとも約９９％純粋である。
【００９８】
（ポリヌクレオチド組成物）
他の局面において、本発明は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕポリヌクレオチド組成物を提供する。用語「ＤＮＡ」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書中で実質的に交換可能に使用され、特定の種の全ゲノムＤＮＡを含まない単離されたＤＮＡ分子をいう。本明細書中で使用される場合、「単離された」とは、ポリヌクレオチドが、他のコード配列から実質的に分離されており、そしてＤＮＡ分子が、無関係のコードＤＮＡの大部分（例えば、大きな染色体フラグメントまたは他の機能的遺伝子またはポリペプチドコード領域）を含まないことを意味する。当然のことながら、これは、もともと単離されたＤＮＡ分子をいい、後で人工的にセグメントに付加された遺伝子またはコード領域を除外しない。
【００９９】
当業者に理解されるように、本発明のポリヌクレオチド組成物は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドなどを発現するか、または発現し得るように適応されたゲノム配列、ゲノム外配列およびプラスミドにコードされる配列、ならびにより小さな操作された遺伝子セグメントを含み得る。このようなセグメントは、自然に単離され得るか、または人の手によって合成的に改変され得る。
【０１００】
当業者に認識されるように、本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖（コードもしくはアンチセンス）または二本鎖であり得、そしてＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成）またはＲＮＡ分子であり得る。ＲＮＡ分子は、ＨｎＲＮＡ分子（これはイントロンを含み、そしてＤＮＡ分子に１対１の様式で対応する）、およびｍＲＮＡ分子（これは、イントロンを含まない）を含み得る。さらなるコード配列または非コード配列は、本発明のポリヌクレオチド内に存在し得るがその必要はなく、そしてポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持材料に連結され得るがその必要はない。
【０１０１】
ポリヌクレオチドは、ネイティブの配列（すなわち、本発明のポリペプチド／タンパク質、またはその部分をコードする内因性配列）を含み得るか、あるいはこのような配列の改変体または誘導体、そして好ましくは免疫原性改変体または誘導体をコードする配列を含み得る。
【０１０２】
従って、本発明の別の局面に従い、配列番号１、４〜７、および１２〜１３に示されるポリヌクレオチド配列、配列番号１、４〜７、および１２〜１３に示されるポリヌクレオチド配列の相補体、ならびにそれらの縮重改変体のうちいくつかまたは全てを含むポリヌクレオチド組成物が提供される。特定の好ましい実施形態において、本明細書中に示されるＨｅｒ−２／ｎｅｕポリヌクレオチド配列は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質のＩＣＤ領域の免疫原性エピトープ配列、好ましくは配列番号３に示されるエピトープ配列をコードする。
【０１０３】
他の関連する実施形態において、本発明は、例えば、本明細書中で記載の方法（例えば、以下に記載のような標準的なパラメーターを使用するＢＬＡＳＴ分析）を使用して本発明のポリヌクレオチド配列と比較して、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％より高い配列同一性を含む、本明細書中に開示される配列に実質的な同一性を有するポリヌクレオチド改変体を提供する。当業者は、これらの値が、コドンの縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置付けなどを考慮することによって、２つのヌクレオチド配列にコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するように、適切に調整され得ることを理解する。
【０１０４】
代表的には、ポリヌクレオチド改変体は、１つ以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含み、好ましくは、その結果、改変体ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの免疫原性が、本明細書中に具体的に示されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドに対して実質的に減少されない。用語「改変体」はまた、異種起源の相同遺伝子を包含することが理解されるべきである。
【０１０５】
さらなる実施形態において、本発明は、本明細書中に開示される配列の１つ以上に同一であるかまたは相補的な配列の種々の長さの連続したストレッチを含むポリヌクレオチドフラグメントを提供する。例えば、本明細書中に開示される配列の１つ以上の、少なくとも約１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００または１０００以上連続したヌクレオチド、ならびにその間の全ての中間の長さの連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが、本発明によって提供される。この状況において、「中間の長さ」が、示された値の間の任意の長さ（例えば、１６、１７、１８、１９など；２１、２２、２３など；３０、３１、３２など；５０、５１、５２、５３など；１００、１０１、１０２、１０３など；１５０、１５１、１５２、１５３など；２００〜５００；５００〜１，０００などの間の全ての整数を含む）を意味することが容易に理解される。
【０１０６】
本発明の別の実施形態において、本明細書において提供されるポリヌクレオチド配列もしくはそのフラグメントまたはその相補的な配列に対して、中程度〜高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチド組成物が提供される。ハイブリダイゼーション技術は、分子生物学の当該分野において周知である。例示の目的であるが、他のポリヌクレオチドと本発明のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを試験するために適切な中程度にストリンジェントな条件は、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中の事前洗浄；５０℃〜６０℃、５×ＳＳＣでの、一晩のハイブリダイゼーション；続いて、０．１％ＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×ＳＳＣのそれぞれを用いた、６５℃で２０分間の２回の洗浄を含む。当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが、例えば、ハイブリダイゼーション溶液の塩含量および／またはハイブリダイゼーションが実施される温度を変更することによって、容易に操作され得ることを理解する。例えば、別の実施形態において、適切な高いストリンジェントのハイブリダイゼーション条件としては、ハイブリダイゼーションの温度が、例えば、６０〜６５℃または６５〜７０℃に増大される点を除いて、上記の条件が挙げられる。
【０１０７】
特定の好ましい実施形態において、上記のポリヌクレオチド（例えば、ポリヌクレオチド改変体、フラグメント、およびハイブリダイズする配列）は、本明細書中に具体的に示されるＨｅｒ−２／ｎｅｕポリペプチド配列と免疫学的に交差反応するポリペプチドをコードする。他の好ましい実施形態において、このようなポリヌクレオチドは、本明細書中に具体的に示されるポリペプチド配列の免疫原性活性の、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、そしてより好ましくは少なくとも約９０％の免疫原性活性レベルを有するポリペプチドをコードする。
【０１０８】
本発明のポリヌクレオチド、またはそのフラグメントは、そのコード配列自体の長さに関わらず、他のＤＮＡ配列（例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、マルチクローニング部位、他のコードセグメントなど）と組合わされ得、その結果、その全体の長さは、相当変化し得る。従って、ほとんどいずれの長さの核酸フラグメントをも使用し得ることが企図され、その全長は、好ましくは意図した組換えＤＮＡプロトコルにおける調製および使用の容易さによって制限される。例えば、約１０，０００、約５０００、約３０００、約２，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００、約５０塩基対長など（全ての中間の長さを含む）の全長を有する例示的なポリヌクレオチドセグメントが、本発明の多くの実行において有用であることが企図される。
【０１０９】
ポリヌクレオチド配列を比較する場合、２つの配列におけるヌクレオチドの配列が、以下に記載されるように最大一致について整列（アライメント）されるのと同じ場合に、２つの配列が「同一」であるといわれる。２つの配列の間の比較は、代表的には、配列類似性の局部領域を同定および比較するために、比較ウインドウにわたって配列を比較することによって行われる。本明細書中で使用される場合、「比較ウインドウ」は、少なくとも約２０、通常は３０〜約７５、４０〜約５０連続した位置のセグメントをいい、ここで、２つの配列が最適に整列された後に、配列は、連続した位置の同じ数の参照配列と比較され得る。
【０１１０】
比較についての配列の最適な整列は、バイオインフォマティクス（生命情報科学）ソフトウエアのＬａｓｅｒｇｅｎｅ  スイート（ｓｕｉｔｅ）におけるＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、デフォルトパラメーターを用いて行われ得る。このプログラムは、以下の参考文献に記載のいくつかの整列スキームを統合する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ  Ｖｏｌ．５，補遺３，３４５−３５８頁におけるＤａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．；Ｈｅｉｎ  Ｊ．（１９９０）Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ  ６２６−６４５頁  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１８３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ  Ｗ．（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．（１９７１）Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ  １１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．Ｎｅｓ，Ｍ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．（１９７３）Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ−ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７２６−７３０。
【０１１１】
あるいは、比較のための配列の最適なアライメント（整列）は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ  ２：４８２の局部同定アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の同一性整列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化したインプリメンテーション（実装）（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または検査によって行われ得る。
【０１１２】
配列同一性および配列類似性の割合を決定するために適切なアルゴリズムの１つの好ましい例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載される。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、本発明のポリヌクレオチドについての配列同一性の割合を決定するために、例えば、本明細書中に記載のパラメータを用いて使用され得る。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎを通して公に利用可能である。１つの例示的な例において、累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメーターＭ（一致する残基の対についての報酬スコア（ｒｅｗａｒｄ  ｓｃｏｒｅｄ）；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を使用して算出され得る。各方向におけるワードヒットの拡大は、以下の場合に停止する：累積アライメントスコアが、その最大到達値から量Ｘだけ低下した場合；累積スコアが、１以上の負のスコアの残基整列の累積に起因してゼロ以下になった場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合。このＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、ワード長さ（Ｗ）１１、および期待値（Ｅ）１０をデフォルトとして、そしてＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照のこと）アラインメントは、（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。
【０１１３】
好ましくは、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも２０の位置の比較ウインドウにわたる２つの最適に整列した配列を比較することによって決定され、ここで比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列の一部は、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、２つの配列の最適な整列について２０パーセント以下、通常は５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。このパーセンテージは、両方の配列で同一の核酸塩基が存在する位置の数を決定して一致する位置の数を得、この一致する位置の数を参照配列中の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算し、そしてこの結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。
【０１１４】
遺伝コードの縮重の結果として、本明細書中に記載されるようなポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することが、当業者に理解される。これらのポリヌクレオチドのうちいくつかは、任意のネイティブな遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。それにもかかわらず、コドン使用頻度における差異に起因して変化するポリヌクレオチドは、本発明によって具体的に企図される。さらに、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内である。対立遺伝子は、１以上の変異（例えば、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換）の結果として変化する内因性遺伝子である。得られたｍＲＮＡおよびタンパク質は、変化した構造または機能を有し得るが、有する必要はない。対立遺伝子は、標準的な技術（例えば、ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較）を用いて、同定され得る。
【０１１５】
従って、本発明の別の実施形態において、変異誘発アプローチ（例えば、部位特異的変異誘発）は、本明細書中に記載のポリペプチドの免疫原性改変体および／または誘導体の調製のために使用される。このアプローチによって、ポリペプチド配列における特定の改変が、これらをコードする、基礎となるポリヌクレオチドの変異誘発を介してなされ得る。これらの技術は、例えば、ポリヌクレオチド中に１つ以上のヌクレオチド配列変化を導入することによって先の考慮の１つ以上を組み込む、配列改変体を調製および試験するための直接的なアプローチを提供する。
【０１１６】
部位特異的変異誘発は、所望の変異のＤＮＡ配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列ならびに十分な数の隣接ヌクレオチドの使用を介して変異体の生成を可能にし、相対する欠失連結部の両側に安定な二重鎖を形成するために、十分なサイズおよび配列複雑性のプライマー配列を提供する。変異は、ポリヌクレオチド自体の特性を改善するか、変更するか、減少させるか、改変するか、さもなくば変化させるため、そして／またはコードされたポリペプチドの特性、活性、組成、安定性または一次配列を変更するために、選択されたポリヌクレオチド配列において使用され得る。
【０１１７】
本発明の特定の実施形態において、本発明者らは、コードされたポリペプチドの１つ以上の特性（例えば、ポリペプチドワクチンの免疫原性）を変更するために、開示されたポリヌクレオチド配列の変異誘発を意図する。部位特異的変異誘発の技術は、当該分野に周知であり、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの両方の改変体を作製するために広範に使用される。例えば、部位特異的変異誘発は、しばしば、ＤＮＡ分子の特定部分を変更するために使用される。このような実施形態において、代表的に約１４ヌクレオチド長〜約２５ヌクレオチド長程度の長さを含むプライマーが使用され、配列の連結部の両側にある、約５残基〜約１０残基が変更される。
【０１１８】
当業者によって理解されるように、部位特異的変異誘発技術は、しばしば、一本鎖形態および二本鎖形態の両方で存在するファージベクターを使用してきた。部位特異的変異誘発において有用である代表的なベクターとしては、Ｍ１３ファージのようなベクターが挙げられる。これらのファージは、容易に商業的に入手可能であり、そしてそれらの使用は、一般的に当業者に周知である。二本鎖プラスミドもまた、目的の遺伝子をプラスミドからファージに転移する工程を除去する部位特異的変異誘発において慣用的に使用される。
【０１１９】
一般的に、本明細書に従う部位特異的変異誘発は、所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列をその配列中に含む一本鎖ベクターを最初に入手する工程、またはこの配列を含む二本鎖ベクターの２本の鎖を融解して分ける工程によって実行される。所望の変異配列を保有するオリゴヌクレオチドプライマーは、一般的に、合成的に調製される。次いで、このプライマーは、一本鎖ベクターとともにアニーリングされ、そして変異を保有する鎖の合成を完了するために、ＤＮＡ重合酵素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩ  Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）に供される。このようにヘテロ二重鎖が形成され、ここで一方の鎖が変異を有さないもともとの配列をコードし、そして２つめの鎖は所望の変異を保有する。次いで、このヘテロ二重鎖ベクターは、適切な細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）を形質転換するために使用され、そして、変異した配列配置を保有する組換えベクターを含むクローンが選択される。
【０１２０】
部位特異的変異誘発を使用する、選択されたペプチドコードＤＮＡセグメントの配列改変体の調製は、潜在的に有用な種を産生する手段を提供し、そしてこれは、限定を意味するものではない。なぜなら、ペプチドの配列改変体およびそれらをコードするＤＮＡ配列を入手し得る他の方法が存在するからである。例えば、所望のペプチド配列をコードする組換えベクターは、変異誘発剤（例えば、ヒドロキシルアミン）で処理されて、配列改変体を入手し得る。これらの方法およびプロトコルに関する具体的な詳細は、Ｍａｌｏｙら、１９９４；Ｓｅｇａｌ、１９７６；ＰｒｏｋｏｐおよびＢａｊｐａｉ、１９９１；Ｋｕｂｙ、１９９４；およびＭａｎｉａｔｉｓら、１９８２（各々がその目的のために本明細書中に参考として援用される）の教示において見出され得る。
【０１２１】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド特異的変異誘発手順」とは、テンプレート（鋳型）依存的プロセスおよびベクター媒介性増殖をいい、これは、その初期の濃度と比較して、特定の核酸分子の濃度の増加を生じるか、または検出可能なシグナルの濃度の増加（例えば、増幅）を生じる。本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド特異的変異誘発手順」は、プライマー分子の鋳型依存的な伸長を含むプロセスをいうことが意図される。用語、鋳型依存的プロセスとは、新規に合成された核酸の鎖の配列が、相補的塩基対形成の周知の規則によって指示されるＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子の核酸合成をいう（例えば、Ｗａｔｓｏｎ、１９８７を参照のこと）。代表的には、ベクター媒介性の方法論は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターへの核酸フラグメントの導入、ベクターのクローン性増幅、および増幅した核酸フラグメントの回収を包含する。このような方法論の例は、その全体が具体的に参考として本明細書中に援用される、米国特許第４，２３７，２２４号によって提供される。
【０１２２】
本発明のポリペプチド改変体の生成のための別のアプローチにおいて、米国特許第５，８３７，４５８号に記載のような、再帰的な配列組換えが使用され得る。このアプローチにおいて、組換えおよびスクリーニングまたは選択の反復性のサイクルが実施されて、例えば、増強された免疫原性活性を有する本発明の個々のポリヌクレオチド改変体を「展開させる（ｅｖｏｌｖｅ）」。
【０１２３】
本発明の他の実施形態において、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列は、核酸ハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして、有利に使用され得る。このように、本明細書中に開示される１５ヌクレオチド長の連続配列と同じ配列か、またはこれに相補的な配列を有する、少なくとも約１５ヌクレオチド長の連続配列の配列領域を含む核酸セグメントが特定の有用性を見出すことが、企図される。例えば、約２０、３０、４０、５０、１００、２００、５００、１０００（全ての中間的な長さのものを含む）およびまさに全長配列までの、より長い連続した同一配列または相補的な配列がまた、特定の実施形態において使用される。
【０１２４】
このような核酸プローブが目的の配列に特異的にハイブリダイズする能力は、所定のサンプル中の相補的配列の存在を検出する際にこれらが使用されることを可能にする。しかし、他の用途（例えば、変異種プライマーまたは他の遺伝的構築物の調製の際の使用のためのプライマーを調製するための配列情報の使用）もまた意図される。
【０１２５】
１０〜１４、１５〜２０、３０、５０、または１００〜２００ヌクレオチド程度（同様に中間的な長さを含む）の連続したヌクレオチドストレッチからなる配列領域を有し、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド配列に同一または相補的なポリヌクレオチド分子は、例えばサザンブロッティングまたはノーザンブロッティングにおける使用のためのハイブリダイゼーションプローブとして特に意図される。これは、遺伝子産物またはそのフラグメントの、多様な細胞型およびまた種々の細菌細胞の両方における分析を可能とする。フラグメントの全サイズ、ならびに相補的ストレッチのサイズは、究極的には、特定の核酸セグメントの意図される用途または適用に依存する。より小さなフラグメントは、一般にハイブリダイゼーション実施形態における用途を見出し、ここで連続した相補領域の長さが変化され得る（例えば、約１５ヌクレオチドと約１００ヌクレオチドとの間）が、検出を望む相補配列の長さに従って、より長い連続した相補ストレッチが使用され得る。
【０１２６】
約１５〜２５ヌクレオチド長のハイブリダイゼーションプローブの使用は、安定かつ選択的な二重鎖分子の形成を可能にする。しかし、１５塩基長より長いストレッチの連続した相補配列を有する分子が、ハイブリッドの安定性および選択性を増加するために一般に好ましく、それによって、得られる特異的ハイブリッド分子の質および程度が改善される。１５〜２５の連続したヌクレオチド、または望まれる場合にはより長い遺伝子相補的ストレッチを有する核酸分子を設計するのが一般には好ましい。
【０１２７】
ハイブリダイゼーションプローブは、本明細書中に開示される配列のいずれかの、任意の部分から選択され得る。必要とされることの全ては、本明細書中に記載の配列、あるいはプローブまたはプライマーとしての利用を望む場合は、約１５〜２５ヌクレオチド長から全長配列まで、および全長配列を含む配列の任意の連続した部分までを再検討することである。プローブおよびプライマー配列の選択は、種々の要因によって支配され得る。例えば、全配列の末端に向かってプライマーを使用することが望まれ得る。
【０１２８】
小さなポリヌクレオチドセグメントまたはフラグメントは、通常は自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して行われるので、例えば化学的手段によってフラグメントを直接合成することによって、容易に調製され得る。また、フラグメントは、核酸複製技術（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号（本明細書中に参考として援用される）のＰＣＲＴＭ技術）の適用によって、組換え産生のために選択配列を組換えベクターに導入することによって、および一般に分子生物学の分野の当業者に公知の他の組換えＤＮＡ技術によって、得られ得る。
【０１２９】
本発明のヌクレオチド配列は、目的の完全遺伝子または遺伝子フラグメントのいずれかの相補的ストレッチと、二重鎖分子を選択的に形成するその能力のために使用され得る。想定される適用に依存して、代表的には、標的配列に対するプローブの選択性の種々の程度を達成するために、ハイブリダイゼーションの種々の条件を使用することが望ましい。高い選択性を必要とする適用について、代表的には、ハイブリッドを形成するための比較的ストリンジェントな条件（例えば、比較的低濃度の塩、および／または高温の条件（例えば、約５０℃〜約７０℃の温度で、約０．０２Ｍ〜約０．１５Ｍの塩の塩濃度によって提供されるような）を使用することが望ましい。このような選択条件は、存在する場合、プローブとテンプレートまたは標的鎖との間のミスマッチにわずかに許容性であり、そして関連する配列の単離のために特に適切である。
【０１３０】
当然のことながら、いくつかの適用（例えば、潜在的なテンプレートにハイブリダイズする変異体プライマー鎖を使用する、変異体の調製が望ましい場合）について、低ストリンジェント（減少したストリンジェンシー）のハイブリダイゼーション条件は、ヘテロ二重鎖を形成するために代表的に必要とされる。これらの状況において、約２０℃〜約５５℃の温度範囲で約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍの塩の条件のような塩条件を使用することが望ましくあり得る。これによって、交差ハイブリダイズ種は、コントロールハイブリダイゼーションに関して、陽性ハイブリダイズシグナルとして容易に同定され得る。任意の場合において、ホルムアミド（これは、増加した温度と同じ様式で、ハイブリッド二重鎖を不安定化するように作用する）の増加した量の添加によって、条件がよりストリンジェントになり得ることが一般に理解される。従って、ハイブリダイゼーション条件は、容易に操作され得、従って、一般に、所望の結果に依存する最適の方法である。
【０１３１】
（ポリヌクレオチドの同定、特徴づけおよび発現）
本発明のポリヌクレオチド組成物は、種々の十分に確立された技術のいずれかを使用して、同定、調製および／または操作され得る（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９、および他の類似の参考文献を参照のこと）。
【０１３２】
多くのテンプレート（鋳型）依存性プロセスが、サンプル中に存在する目的の標的配列を増幅するために利用可能である。最もよく知られた増幅方法の１つは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲＴＭ）であり、これは、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号に詳細に記載され、これらの各々はその全体が本明細書中に参考として援用される。手短に言えば、ＰＣＲＴＭにおいては、標的配列の向かい合った相補鎖上の領域に対して相補的な２つのプライマー配列が調製される。過剰のデオキシヌクレオシド三リン酸を、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）とともに反応混合液に添加する。標的配列がサンプル中に存在する場合、これらのプライマーはその標的に結合し、そしてポリメラーゼは、ヌクレオチドを付加することによって標的配列に沿ってこれらのプライマーを伸長させる。反応混合液の温度を上昇および下降させることによって、伸長したプライマーは、標的から解離して反応生成物を形成し、過剰のプライマーは標的および反応生成物に結合し、そしてこのプロセスが反復される。好ましくは、逆転写およびＰＣＲＴＭ増幅手順が、増幅されたｍＲＮＡの量を定量するために実行され得る。ポリメラーゼ連鎖反応方法論は、当該分野で周知である。
【０１３３】
多くの他のテンプレート依存性プロセスのいずれか（この多くは、ＰＣＲＴＭ増幅技術のバリエーションである）は、当該分野で容易に知られており、利用可能である。例示として、いくつかのこのような方法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲともいわれる）（例えば、欧州特許出願公開番号３２０，３０８号、米国特許第４，８８３，７５０号において記載される）；Ｑβレプリカーゼ（ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０に記載される）；鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）および修復鎖反応（Ｒｅｐａｉｒ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＲＣＲ）が挙げられる。なお他の増幅法は、英国特許出願番号２  ２０２  ３２８号およびＰＣＴ国際特許出願公開番号ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５において記載される。他の核酸増幅手順には、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ）（ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ  ８８／１０３１５）が挙げられ、これには、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）および３ＳＲが含まれる。欧州特許出願公開番号３２９，８２２は、一本鎖ＲＮＡ（「ｓｓＲＮＡ」）、ｓｓＤＮＡ、および二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）をサイクル的に合成する工程を包含する核酸増殖プロセスを記載する。ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ  ８９／０６７００は、プロモーター／プライマー配列の標的一本鎖ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」）へのハイブリダイゼーションに基づく核酸配列増幅スキーム、引き続くこの配列の多くのＲＮＡコピーの転写を記載する。「ＲＡＣＥ」（Ｆｒｏｈｍａｎ、１９９０）および「片側（ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ）ＰＣＲ」（Ｏｈａｒａ、１９８９）のような他の増幅方法がまた、当業者に周知である。
【０１３４】
本発明のポリヌクレオチドの増幅した部分を使用して、適切なライブラリー（例えば、腫瘍ｃＤＮＡライブラリー）から周知の技術を使用して全長遺伝子を単離し得る。このような技術において、増幅に適した１以上のポリヌクレオチドプローブまたはプライマーを使用して、ライブラリー（ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリー）をスクリーニングする。好ましくは、ライブラリーはより大きな分子を含むようにサイズが選択される。ランダムプライムしたライブラリー（ｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅｄ  ｌｉｂｒａｒｙ）もまた、遺伝子の５’領域および上流領域の同定ために好ましくあり得る。ゲノムライブラリーは、イントロンを入手することおよび５’配列を伸長させることについて好ましい。
【０１３５】
ハイブリダイゼーション技術に関して、部分配列は、周知の技術を使用して標識（例えば、ニックトランスレーションまたは３２Ｐでの末端標識）され得る。次いで、細菌ライブラリーまたはバクテリオファージライブラリーは、一般に、標識プローブと、変性した細菌コロニー（またはファージプラークを含む菌叢）を含むフィルターとをハイブリダイズすることによってスクリーニングされる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９を参照のこと）。ハイブリダイズするコロニーまたはプラークを選択し、そして増殖させる。そしてそのＤＮＡをさらなる分析のために単離する。ｃＤＮＡクローンを、付加配列の量を決定するために、例えば、部分配列由来のプライマーおよびそのベクター由来のプライマーを使用するＰＣＲによって分析し得る。制限酵素地図および部分配列を作成して、１以上の重複クローンを同定し得る。次いで、標準的な技術（これは、一連の欠失クローンを作製することを包含し得る）を使用して完全配列を決定し得る。次いで、得られた重複配列を１つの連続配列中に構築し得る。周知の技術を使用して、適切なフラグメントを連結することにより全長ｃＤＮＡ分子を生成し得る。
【０１３６】
あるいは、上記のような増幅技術は、部分的なｃＤＮＡ配列から全長コード配列を得るために有用であり得る。このような増幅技術の１つは、逆（インバース）ＰＣＲである（Ｔｒｉｇｌｉａら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：８１８６，１９８８を参照のこと）。この技術は、制限酵素を使用して、その遺伝子の既知の領域内にフラグメントを生成する。次いで、このフラグメントを分子内連結により環化し、そして既知の領域に由来する多岐したプライマーを用いたＰＣＲのためのテンプレート（鋳型）として使用する。代替のアプローチにおいて、部分配列に隣接した配列を、リンカー配列に対するプライマーおよび既知の領域に特異的なプライマーを使用する増幅により取り出し得る。この増幅した配列を、代表的に、同じリンカープライマーおよび既知の領域に特異的な第２のプライマーを使用する２回目の増幅に供する。既知の配列から反対方向に伸長を開始する２つのプライマーを使用するこの手順についての改変は、ＷＯ  ９６／３８５９１に記載される。そのような別の技術は、「迅速なｃＤＮＡ末端の増幅」またはＲＡＣＥとして公知である。この技術は、公知配列の５’および３’である配列を同定するために、内部プライマーおよび外部プライマー（これらは、ポリＡ領域またはベクター配列にハイブリダイズする）の使用を含む。さらなる技術としては、キャプチャーＰＣＲ（Ｌａｎｇｅｒｓｔｒｏｍら，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．１：１１１−１９，１９９１）およびウォーキングＰＣＲ（Ｐａｒｋｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９：３０５５−６０，１９９１）が挙げられる。増幅を利用する他の方法もまた使用して、全長ｃＤＮＡ配列を入手し得る。
【０１３７】
本発明の他の実施形態において、本発明のポリペプチドまたはその融合タンパク質もしくは機能的等価物をコードするポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントは、適切な宿主細胞におけるポリペプチドの発現を指向するように組換えＤＮＡ分子において使用され得る。遺伝コードの固有の縮重に起因して、実質的に同じか、または機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が産生され得、そしてこれらの配列を使用して所定のポリペプチドをクローン化し、そして発現させ得る。
【０１３８】
当業者によって理解されるように、いくつかの場合において、天然に存在しないコドンを所有するポリペプチドコードヌクレオチド配列を作製することが有利であり得る。例えば、特定の原核生物宿主または真核生物宿主に好まれるコドンは、タンパク質発現の速度を増加させるためか、または所望の特性（例えば、天然に存在する配列から生成される転写物の半減期よりも長い半減期）を有する組換えＲＮＡ転写物を産生するように選択され得る。
【０１３９】
さらに、本発明のポリヌクレオチド配列は、種々の理由（遺伝子産物のクローニング、プロセシング、および／または発現を変更する改変が挙げられるが、それらに限定されない）のためにポリペプチドコード配列を変更するために、当該分野において一般的に公知の方法を使用して操作され得る。例えば、ランダムッフラグメント化（無作為断片化）によるＤＮＡシャッフリングならびに遺伝子フラグメントおよび合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再アセンブリを使用して、ヌクレオチド配列を操作し得る。さらに、部位特異的変異誘発を使用して、新たな制限部位を挿入し得るか、グリコシル化パターンを改変し得るか、コドンの優先度（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を変化させ得るか、スプライス改変体を作製し得るか、または変異の導入などを行い得る。
【０１４０】
本発明の別の実施形態において、天然の核酸配列、改変された核酸配列、または組換え核酸配列は、融合タンパク質をコードする異種配列に連結され得る。例えば、ポリペプチド活性のインヒビターについてペプチドライブラリーをスクリーニングするために、市販の抗体により認識され得るキメラタンパク質をコードすることが有用であり得る。融合タンパク質はまた、ポリペプチドコード配列と異種タンパク質配列との間に位置する切断部位を含むように操作され得、その結果そのポリペプチドは、切断されて、そして異種部分から精製されて取り出され得る。
【０１４１】
所望のポリペプチドをコードする配列が、当該分野において周知の化学的方法を使用して、全体または部分的に合成され得る（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．ら、（１９８０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２１５〜２２３、Ｈｏｒｎ，Ｔ．ら、（１９８０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２２５〜２３２を参照のこと）。あるいは、タンパク質自体は、ポリペプチドのアミノ酸配列またはその一部を合成するための化学的方法を使用して産生され得る。例えば、ペプチド合成は、種々の固相技術を使用して実施され得（Ｒｏｂｅｒｇｅ，Ｊ．Ｙ．ら、（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：２０２〜２０４）、そして自動化合成は、例えば、ＡＢＩ  ４３１Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して達成され得る。
【０１４２】
新たに合成されたペプチドは、分取高速液体クロマトグラフィー（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．（１９８３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）または当該分野において利用可能な他の同等技術により実質的に精製され得る。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析または配列決定（例えば、エドマン分解手順）により確認され得る。さらに、ポリペプチドのアミノ酸配列またはその任意の部分は、直接合成の間改変されて、そして／または化学的方法を使用して、他のタンパク質もしくはその任意の部分に由来する配列と組み合わせられて、改変体ポリペプチドを産生し得る。
【０１４３】
所望のポリペプチドを発現させるために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列または機能的等価物は、適切な発現ベクター（すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳のために必要なエレメントを含むベクター）内に挿入され得る。当業者に周知である方法を使用して、目的のポリペプチドをコードする配列ならびに適切な転写制御エレメントおよび翻訳制御エレメントを含む発現ベクターを構築し得る。これらの方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えが挙げられる。そのような技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．，およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．Ｎ．Ｙ．に記載される。
【０１４４】
種々の発現ベクター／宿主系が、ポリヌクレオチド配列を含み、そして発現させるように利用され得る。これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：微生物（例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌）；酵母発現ベクターで形質転換した酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉもしくはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系；あるいは動物細胞系。
【０１４５】
発現ベクター内に存在する「制御エレメント」または「調節配列」は、転写および翻訳を実行するように宿主細胞タンパク質と相互作用する、それらのベクターの非翻訳領域（エンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域）である。そのようなエレメントは、その長さおよび特異性を変更し得る。利用されるベクター系および宿主に依存して、多数の適切な転写エレメントおよび翻訳エレメント（構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む）が使用され得る。例えば、細菌系においてクローニングする場合、誘導性プロモーター（例えば、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）またはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）などのハイブリッドｌａｃＺプロモーター）が使用され得る。哺乳動物細胞系において、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターが、一般的に好ましい。ポリペプチドをコードする配列の複数のコピーを含む細胞株を生成することが必要とされる場合、ＳＶ４０またはＥＢＶベースのベクターが、適切な選択マーカーと共に有利に使用され得る。
【０１４６】
細菌系において、多数の発現ベクターのいずれかが、発現されるポリペプチドに対して意図される使用に依存して選択され得る。例えば、大量に必要とされる場合（例えば、抗体の誘導のために）、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現を指向するベクターが使用され得る。そのようなベクターとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：多機能性Ｅ．ｃｏｌｉクローニングベクターおよび発現ベクター（例えば、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ここでは目的のポリペプチドをコードする配列が、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔおよびそれに引続く７残基についての配列とインフレームでベクター内に連結され得、その結果、ハイブリッドタンパク質が産生される）；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ，Ｇ．およびＳ．Ｍ．Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５５０３−５５０９）など。ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）もまた、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるために使用され得る。一般的に、そのような融合タンパク質は、可溶性であり、そしてグルタチオン−アガロースビーズに吸着させ、次に遊離のグルタチオンの存在下において溶出させることによって、溶解した細胞から容易に精製され得る。そのような系において作製されたタンパク質は、ヘパリン、トロンビン、または第ＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され得、その結果、クローニングされた目的のポリペプチドが、任意にＧＳＴ部分から放出され得る。
【０１４７】
酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター（例えば、α因子、アルコールオキシダーゼおよびＰＧＨ）を含む多数のベクターが使用され得る。概説については、Ａｕｓｕｂｅｌら、（前出）およびＧｒａｎｔら、（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４を参照のこと。
【０１４８】
植物発現ベクターを使用する場合において、ポリペプチドをコードする配列の発現は、任意の多数のプロモーターにより駆動され得る。例えば、ウイルスプロモーター（例えば、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターおよび１９Ｓプロモーター）は、単独でか、またはＴＭＶに由来するωリーダー配列と組み合わせて使用され得る（Ｔａｋａｍａｔｓｕ，Ｎ．（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３０７−３１１）。あるいは、植物プロモーター（例えば、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットまたは熱ショックプロモーター）を使用し得る（Ｃｏｒｕｚｚｉ，Ｇ．ら、（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１６７１−１６８０；Ｂｒｏｇｌｉｅ，Ｒ．ら、（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：８３８−８４３；およびＷｉｎｔｅｒ，Ｊら、（１９９１）Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．１７：８５−１０５）。これらの構築物は、直接的ＤＮＡ形質転換または病原体媒介性トランスフェクションによって植物細胞内に導入され得る。そのような技術は、多数の一般的に入手可能な概説に記載されている（例えば、Ｈｏｂｂｓ，Ｓ．またはＭｕｒｒｙ，Ｌ．Ｅ．，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ  Ｙｅａｒｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；１９１−１９６頁を参照のこと）。
【０１４９】
昆虫系はまた、目的のポリペプチドを発現させるために使用され得る。例えば、そのような１つの系において、オートグラファカリフォルニア核発汗病ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＡｃＮＰＶ）は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｌａｒｖａｅにおいて外来遺伝子を発現させるベクターとして使用される。このポリペプチドをコードする配列は、ウイルスの非必須領域内（例えば、ポリへドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）遺伝子）にクローニングされ得て、ポリへドリンプロモーターの制御下に置かれ得る。ポリペプチドコード配列の首尾良い挿入は、ポリへドリン遺伝子を不活性化し、そしてコートタンパク質を欠損している組換えウイルスを産生する。次いで、この組換えウイルスを使用して、例えば、目的のポリペプチドが発現され得る、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｌａｒｖａｅに感染させ得る（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，Ｅ．Ｋ．ら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：３２２４−３２２７）。
【０１５０】
哺乳動物宿主細胞において、多数のウイルスベースの発現系が一般的に利用可能である。例えば、アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合において、目的のポリペプチドをコードする配列は、後期プロモーターおよび３部からなるリーダー配列から構成されるアデノウイルス転写／翻訳複合体内に連結され得る。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域における挿入を使用して、感染した宿主細胞においてポリペプチドを発現し得る、生存可能ウイルスを入手し得る（Ｌｏｇａｎ，Ｊ．およびＳｈｅｎｋ，Ｔ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：３６５５−３６５９）。さらに、転写エンハンサー（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサー）を使用して、哺乳動物宿主細胞における発現を増加させ得る。
【０１５１】
特定の開始シグナルはまた、目的のポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を達成するために使用され得る。そのようなシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。ポリペプチドをコードする配列、その開始コドンおよび上流配列が適切な発現ベクター内に挿入される場合において、さらなる転写制御シグナルまたは翻訳制御シグナルは必要とされなくとも良い。しかし、コード配列のみ、またはその一部のみが挿入される場合、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルが提供されるべきである。さらに、開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために、正確なリーディングフレーム内にあるべきである。外因性翻訳エレメントおよび開始コドンは、種々の起源（天然および合成の両方）に由来し得る。発現の効率は、使用される特定の細胞系に適切なエンハンサー（例えば、文献（Ｓｃｈａｒｆ，Ｄ．ら、（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５−１６２）に記載されるエンハンサー）の封入によって増大され得る。
【０１５２】
さらに、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節するか、または所望の様式において発現されたタンパク質をプロセシングするその能力について選択され得る。ポリペプチドのそのような改変としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、リピデーション（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）およびアシル化が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセシングはまた、正確な挿入、折り畳みおよび／または機能を促進させるために使用され得る。異なる宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３およびＷＩ３８）（これらは、そのような翻訳後活性についての特定の細胞機構（ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）および特徴的機構（ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ）を有する）は、正確な改変および外来タンパク質のプロセシングを確実にするように選択され得る。
【０１５３】
長期間の組換えタンパク質の高収率の産生のために、安定な発現が一般的に好ましい。例えば、目的のポリヌクレオチドを安定に発現する細胞株が、ウイルス複製起点および／または内因性発現エレメントならびに同じかもしくは別個のベクター上の選択マーカー遺伝子を含み得る、発現ベクターを使用して形質転換され得る。そのベクターの導入後、細胞は、それらが選択培地に切換えられる前に、富化（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）培地において１〜２日間の増殖が可能とされ得る。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を与えることであり、そしてその存在は、導入された配列を首尾良く発現する細胞の増殖および回収を可能とする。安定に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適切な組織培養技術を使用して、増殖され得る。
【０１５４】
多数の選択系を使用して、形質転換細胞株を回収し得る。これらの選択系としては、それぞれ、ｔｋ．ｓｕｐ．−細胞またはａｐｒｔ．ｓｕｐ−細胞において使用され得る、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ら、（１９７７）Ｃｅｌｌ  １１：２２３−３２）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ，Ｉ．ら、（１９９０）Ｃｅｌｌ  ２２：８１７−２３）遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。また、代謝拮抗剤耐性、抗生物質耐性または除草剤耐性は、選択のための基礎として使用され得る；例えば、ｄｈｆｒ（これは、メトトレキセートに対する耐性を与える（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ら、（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７：３５６７−７０））；ｎｐｔ（これは、アミノグリコシド、ネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を与える（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，Ｆ．ら、（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１−１４））；ならびにａｌｓまたはｐａｔ（これらは、それぞれ、クロルスルフロンおよびホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を与える（Ｍｕｒｒｙ、前出））。さらなる選択遺伝子が記載されている。例えば、ｔｒｐＢ（これは、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にする）またはｈｉｓＤ（これは、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にする）（Ｈａｒｔｍａｎ，Ｓ．Ｃ．およびＲ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８０４７−５１）。アントシアニン、β−グルクロニダーゼおよびその基質のＧＵＳ、ならびにルシフェラーゼおよびその基質のルシフェリンのようなマーカーを用いる、可視マーカーの使用の人気が高くなっており、形質転換体を同定するためのみならず、特定のベクター系に起因し得る一過性のタンパク質発現または安定なタンパク質発現の量を定量するためにもまた広範に使用されている（Ｒｈｏｄｅｓ，Ｃ．Ａ．ら、（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：１２１−１３１）。
【０１５５】
マーカー遺伝子発現の存在／非存在は、目的の遺伝子もまた存在するということを示唆しているが、その存在および発現は、確認されることを必要とし得る。例えば、ポリペプチドをコードする配列が、マーカー遺伝子配列内に挿入される場合、配列を含む組換え細胞は、マーカー遺伝子機能の非存在により同定され得る。あるいは、マーカー遺伝子は、１つのプロモーターの制御下にポリペプチドコード配列と直列に配置され得る。誘導または選択に応じてのマーカー遺伝子の発現は、通常、その直列遺伝子の発現も同様に示す。
【０１５６】
あるいは、所望のポリヌクレオチド配列を含み、かつ発現する宿主細胞は、当業者に公知の種々の手順によって同定され得る。これらの手順としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：核酸またはタンパク質の検出および／または定量化のための、例えば、膜ベースの技術、溶液ベースの技術、またはチップベースの技術を含む、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション技術もしくはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション技術およびタンパク質バイオアッセイ技術またはイムノアッセイ技術。
【０１５７】
ポリヌクレオチドコード化産物に特異的なポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体のいずれかを使用して、ポリヌクレオチドコード化産物の発現を検出および測定するための種々のプロトコルは、当該分野において公知である。例としては、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる。所定のポリペプチド上の２つの非干渉性エピトープに対して反応性であるモノクローナル抗体を利用する２つの部位の、モノクローナルベースのイムノアッセイが、いくつかの適用のために好まれ得るが、競合的結合アッセイもまた、利用され得る。これらのアッセイおよび他のアッセイは、とりわけＨａｍｐｔｏｎ，Ｒ．ら、（１９９０；Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＡＰＳ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓｔ  Ｐａｕｌ．Ｍｉｎｎ．）およびＭａｄｄｏｘ，Ｄ．Ｅ．ら、（１９８３；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１２１１−１２１６）に記載される。
【０１５８】
広範に種々の標識技術および結合技術は、当業者に公知であり、そして種々の核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにおいて使用され得る。ポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識されたハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを作製するための手段としては、オリゴ標識（ｏｌｉｇｏｌａｂｅｌｉｎｇ）、ニックトランスレーション、末端標識または標識されたヌクレオチドを使用するＰＣＲ増幅が挙げられる。あるいは、ｍＲＮＡプローブの産生のために、配列またはその任意の部分が、ベクター内にクローニングされ得る。そのようなベクターは、当該分野において公知であり、市販されており、そして適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６）および標識されたヌクレオチドを添加することにより、ＲＮＡプローブをインビトロで合成するために使用され得る。これらの手順は、種々の市販キットを使用して実施され得る。使用され得る適切なレポーター分子または標識としては、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光、または色素形成剤ならびに基質、コファクター（補因子）、インヒビター、磁気粒子などが挙げられる。
【０１５９】
目的のポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、タンパク質の発現および細胞培養物からの回収に適した条件下において培養され得る。組換え細胞により産生されたタンパク質は、使用された配列および／またはベクターに依存して、細胞内に分泌され得るかまたは含まれ得る。当業者によって理解されるように、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜または真核細胞膜を介して、コードされたポリペプチドの分泌を指向するシグナル配列を含むように設計され得る。他の組換え構築物を使用して、目的のポリペプチドをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合させ得る。そのような精製促進ドメインとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：固定された金属上での精製を可能にする金属キレート化ペプチド（例えば、ヒスチジン−トリプトファンモジュール）、固定された免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）において利用されるドメイン。精製ドメインとコードされるポリペプチドとの間への、切断可能なリンカー配列（例えば、第ＸＡ因子またはエンテロキナーゼに対して特異的な配列（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．））の封入を使用して、精製を促進させ得る。そのような発現ベクターの１つは、目的のポリペプチドを含む融合タンパク質およびチオレドキシンまたはエンテロキナーゼ切断部位の前に６つのヒスチジン残基をコードする核酸の発現を提供する。ヒスチジン残基は、Ｐｏｒａｔｈ，Ｊ．ら、（１９９２、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．３：２６３−２８１）に記載されるように、ＩＭＩＡＣ（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー）上での精製を促進する一方で、エンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質から所望のポリペプチドを精製するための手段を提供する。融合タンパク質を含むベクターの考察は、Ｋｒｏｌｌ，Ｄ．Ｊ．ら、（１９９３；ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：４４１−４５３）において提供される。
【０１６０】
組換え産生方法に加えて、本発明のポリペプチドおよびそのフラグメントは、固相技術（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  Ｊ．（１９６３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４）を使用する、直接的ペプチド合成によって産生され得る。タンパク質合成は、手動技術を使用してか、または自動化によって実施され得る。自動化合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１Ａペプチド合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、達成され得る。あるいは、種々のフラグメントは、別々に化学的に合成されて、そして全長分子を産生するために化学的方法を使用して組み合わせられ得る。
【０１６１】
（抗体組成物、そのフラグメントおよび他の結合因子）
別の局面によると、本発明はさらに、本明細書中で開示される腫瘍ポリペプチドに対して、またはその一部の改変体もしくは誘導体に対して免疫学的結合を示す結合因子（例えば、抗体およびその抗原結合フラグメント）を提供する。抗体、またはその抗原結合フラグメントとは、本発明のポリペプチドに対して、「特異的に結合する」こと、「免疫学的に結合する」ことを言い、そして／または、それが（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて）検出可能なレベルでそのポリペプチドと反応し、かつ類似の条件下で非関連ポリペプチドと検出可能に反応しない場合、「免疫学的に反応性」であると言う。
【０１６２】
この文脈で使用される場合、免疫学的結合は、一般に、免疫グロブリン分子と、この免疫グロブリンが特異的な抗原との間で起こるタイプの非共有結合的な相互作用をいう。免疫学的結合相互作用のの強度または親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）の観点から表現され得、ここで、より小さいＫｄは、より大きな親和性を示す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当該分野で周知の方法を使用して、定量され得る。１つのこのような方法は、抗原結合部位／抗原複合体形成および解離の速度を測定する工程を必要とし、ここで、これらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および両方の方向における速度に等しく影響を与える幾何学的パラメータに依存する。従って、両方の「会合速度定数（ｏｎ  ｒａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）」（Ｋｏｎ）および「解離速度定数（ｏｆｆ  ｒａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）」（Ｋｏｆｆ）の両方が、濃度ならびに会合および解離の実際の速度を計算することによって決定され得る。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比は、親和性に関係しない全てのパラメータの排除を可能にし、そして従って、解離定数Ｋｄに等しい。一般的には、Ｄａｖｉｅｓら（１９９０）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９−４７３を参照のこと。
【０１６３】
抗体の「抗原結合部位」または「結合部分」は、抗原結合に関係する免疫グロブリン分子の部分をいう。この抗原結合部位は、重鎖（「Ｈ」）および軽鎖（「Ｌ」）のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に分岐したストレッチが、「超可変領域」といわれ、これは、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として公知のより保存された隣接ストレッチの間に挿入される。従って、用語「ＦＲ」は、免疫グロブリンの超可変領域の間で、それに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列をいう。抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域が、３次元空間において互いに相対的に配置されて、抗原結合表面を形成する。この抗原結合表面は、結合した抗原の３次元表面に相補的であり、そして重鎖および軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」またたは「ＣＤＲ」といわれる。
【０１６４】
結合因子は、本明細書中に提供される代表的なアッセイを使用して、癌（例えば、乳癌）を有する患者と有さない患者との間をさらに区別し得る。例えば、腫瘍タンパク質に結合する抗体または他の結合因子は、好ましくは、この疾患を有する患者の少なくとも約２０％、より好ましくは患者の少なくとも約３０％において、癌の存在を示すシグナルを生成する。あるいは、または加えて、この抗体は、癌を有さない個体の少なくとも約９０％において、この疾患の非存在を示す陰性シグナルを生成する。結合因子が、この要求を満たすか否かを決定するために、癌（標準的な臨床試験によって決定されるような）を有する患者および有さない患者からの生物学的サンプル（例えば、血液、血清、痰、尿および／または腫瘍生検）が、この結合因子に結合するポリペプチドの存在について、本明細書に記載されるようにアッセイされ得る。好ましくは、疾患を有するサンプルおよび有さないサンプルの統計的に有意な数が、アッセイされる。各結合因子は、上記の基準を満足すべきである；しかし、当業者は、結合因子が、組合せて使用されて、感度を改善し得ることを認識する。
【０１６５】
上記の要求を満足する任意の薬剤は、結合因子であり得る。例えば、結合因子は、ペプチド成分を含むか含まないリボソーム、ＲＮＡ分子またはポリペプチドであり得る。好ましい実施形態において、結合因子は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。抗体は、当業者に公知の種々の技術のいずれかによって、調製され得る。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。一般に、抗体は、細胞培養技術（本明細書に記載されるようなモノクローナル抗体の生成を含む）によって、または組換え抗体の生成を可能にするために、適切な細菌細胞宿主または哺乳動物細胞宿主への抗体遺伝子のトランスフェクションを介して、生成され得る。１つの技術において、このポリペプチドを含む免疫原が、最初に、広範な種々の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジまたはヤギ）のいずれかに注射される。この工程において、本発明のポリペプチドは、改変を有さない免疫原として機能し得る。あるいは、特に、比較的短いポリペプチドについて、優れた免疫応答が、このポリペプチドがキャリアタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニン）に結合される場合に、惹起され得る。この免疫原は、好ましくは、１回以上のブースター（追加）免疫を組み込む所定のスケジュールに従って、動物宿主に注射され、そしてこれらの動物が、定期的に採血される。このポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体は、次いで、例えば、適切な固体支持体に結合されたポリペプチドを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって、このような抗血清から精製され得る。
【０１６６】
目的の抗原性ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体が、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９，１９７６の技術およびその改善物を使用して、調製され得る。簡潔には、これらの方法は、所望の特異性（すなわち、目的のポリペプチドとの反応性）を有する抗体を生成し得る不死細胞株の調製を含む。このような細胞株は、例えば、上記のように免疫された動物から得られる脾臓細胞から生成され得る。次いで、この脾臓細胞が、例えば、骨髄腫細胞融合パートナー、好ましくは、免疫された動物と同系であるものとの融合によって不死化される。種々の融合技術が使用され得る。例えば、脾臓細胞および骨髄腫細胞は、数分間、非イオン性界面活性剤と組合され、次いで、ハイブリッド細胞の増殖は支持するが、骨髄腫細胞の増殖は支持しない選択培地に低密度でプレートされ得る。好ましい選択技術は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を使用する。十分な時間の後、通常、約１〜２週間の後、ハイブリッドのコロニーが観察される。単一コロニーを選択し、そしてそれらの培養上清を、このポリペプチドに対する結合活性について試験する。高い反応性および特異性を有するハイブリドーマが好ましい。
【０１６７】
モノクローナル抗体は、増殖ハイブリドーマコロニーの上清から単離され得る。さらに、種々の技術が、収量を増加させるために使用され得、この技術は、例えば、適切な脊椎動物宿主（例えば、マウス）の腹腔へのハイブリドーマ細胞株の注入である。次いで、モノクローナル抗体が、腹水または血液から回収され得る。混入物が、従来の技術（例えば、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈澱、および抽出）によって抗体から除去され得る。本発明のポリペプチドは、例えば、アフィニティートクロマトグラフィー工程における精製プロセスにおいて使用され得る。
【０１６８】
抗体分子の免疫学的結合特性を示し得る抗原結合部位を含む多くの治療的に有効な分子が、当該分野で公知である。このタンパク質分解性酵素パパインは、優先的に、ＩｇＧ分子を切断して、いくつかのフラグメントを生じさせ、これら（「Ｆ（ａｂ）フラグメント」）のうちの２つの各々は、インタクトな抗原結合部位を含む共有結合ヘテロダイマーを含む。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、いくつかのフラグメント（両方の抗原結合部位を含む「Ｆ（ａｂ’）２」フラグメントを含む）を提供し得る。「Ｆｖ」フラグメントは、ＩｇＭ、および稀有な場合にはＩｇＧまたはＩｇＡ免疫グロブリン分子の優先的なタンパク質分解的切断によって生成され得る。しかし、Ｆｖフラグメントは、当該分野で公知の組換え技術を使用して、より一般的に誘導される。Ｆｖフラグメントは、非共有結合的なＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーを含み、このへテロダイマーは、ネイティブな抗体分子の抗原認識および結合能力のほとんどを保持する抗原結合部位を含む。Ｉｎｂａｒら（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２６５９−２６６２；Ｈｏｃｈｍａｎら（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １５：２７０６−２７１０；およびＥｈｒｌｉｃｈら（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９：４０９１−４０９６。
【０１６９】
単鎖Ｆｖ（「ｓＦｖ」）ポリペプチドは、共有結合されたＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーであり、このヘテロダイマーは、ペプチドをコードするリンカーによって連結されたＶＨをコードする遺伝子およびＶＬをコードする遺伝子を含む遺伝子融合物から発現される。Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５（１６）：５８７９−５８８３。抗体Ｖ領域からの自然に凝集する（化学的には分離された）ポリペプチド軽鎖および重鎖を、ｓＦｖ分子に転換するための化学構造を識別するための多くの方法が記述され、このｓＦｖは、抗原結合部位の構造に実質的に類似する３次元構造に折り畳まれる。例えば、米国特許第５，０９１，５１３号および同第５，１３２，４０５号（Ｈｕｓｔｏｎら）；ならびに米国特許第４，９４６，７７８号（Ｌａｄｎｅｒら）を参照のこと。
【０１７０】
上記分子の各々は、重鎖および軽鎖ＣＤＲセットを含み、各々は、ＣＤＲＳへの支持を提供し、そして互いに対してＣＤＲの空間的関係を規定する重鎖および軽鎖ＦＲセットの間に挿入される。本明細書中で使用される場合、用語「ＣＤＲセット」は、重鎖または軽鎖Ｖ領域の３つの超可変領域をいう。重鎖または軽鎖のＮ末端から進んで、これらの領域は、各々、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」および「ＣＤＲ３」と表記される。従って、抗原結合部位は、６つのＣＤＲを含み、この６つのＣＤＲは、重鎖および軽鎖Ｖ領域の各々からのＣＤＲセットを含む。単一ＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３）を含むポリペプチドは、本明細書中で「分子認識ユニット」といわれる。多くの抗原−抗体複合体の結晶学的分析により、ＣＤＲのアミノ酸残基は、結合した抗原との広範な接触を形成することが立証され、ここで、最も広範な抗原接触は、重鎖ＣＤＲ３との接触である。従って、分子認識ユニットは、主に、抗原結合部位の特異性の原因である。
【０１７１】
本明細書中で使用される場合、用語「ＦＲセット」は、重鎖または軽鎖のＶ領域のＣＤＲセットのＣＤＲを構成する、４つの隣接アミノ酸配列をいう。いくつかのＦＲ残基は、結合抗原と接触し得る；しかし、ＦＲは、主に、Ｖ領域を抗原結合部位、特にＣＤＲＳに直接隣接するＦＲ残基に折り畳む原因である。ＦＲにおいて、特定のアミノ酸残基および特定の構造特徴が、非常に高度に保存される。この点において、全てのＶ領域配列は、約９０アミノ酸残基の内部ジスルフィドループを含む。Ｖ領域が、結合部位に折り畳まれる場合、このＣＤＲは、抗原結合表面を形成する突出したループモチーフとして表示される。正確なＣＤＲアミノ酸配列に関わらず、特定の「カノニカル（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）」構造に折り畳まれたＣＤＲループの形状に影響するＦＲの保存された構造領域が存在することが一般的に認識される。さらに、特定のＦＲ残基は、抗体重鎖および軽鎖の相互作用を安定化する非共有結合的なドメイン間接触に関係することが知られている。
【０１７２】
非ヒト免疫ブログリン由来の抗原結合部位を含む、多くの「ヒト化」抗体分子が記載され、この抗体分子には、げっ歯類Ｖ領域およびヒト定常領域に融合されたそれらの会合ＣＤＲ（Ｗｉｎｔｅｒら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９；Ｌｏｂｕｇｌｉｏら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：４２２０−４２２４；Ｓｈａｗら（１９８７）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４−４５３８；およびＢｒｏｗｎら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：３５７７−３５８３）、適切なヒト抗体定常ドメインとの融合の前に、ヒト支持ＦＲに融合（グラフト）されたげっ歯類ＣＤＲ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６；およびＪｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５）、ならびに組換えベニアリングされた（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｙ  ｖｅｎｅｅｒｅｄ）げっ歯類ＦＲによって支持されるげっ歯類ＣＤＲ（欧州特許公開番号５１９，５９６（１９９２年１２月２３日公開）を含むキメラ抗体が挙げられる。これらの「ヒト化」分子は、ヒトレシピエントにおけるこれらの部分の治療的適用の持続期間および有効性を制限するげっ歯類抗ヒト抗体分子に対する所望されない免疫学的応答を最小化するように設計される。
【０１７３】
本明細書中で使用される場合、用語「ベニアリングされたＦＲ」および「組換えベニアリングされたＦＲ」は、ネイティブのＦＲポリペプチド折り畳み構造の実質的に全てを保持する抗原結合部位を含む異種分子を提供するために、例えば、げっ歯類の重鎖または軽鎖のＶ領域からのＦＲ残基をヒトＦＲ残基で選択的置換することをいう。ベニアリング技術は、抗原結合部位のリガンド結合特徴が、主に抗原結合表面内の重鎖および軽鎖のＣＤＲセットの構造および相対的な配置によって決定されるという理解に基づく。Ｄａｖｉｅｓら（１９９０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９−４７３。従って、抗原結合特異性は、ＣＤＲ構造、互いとのそれらの相互作用、およびＶ領域ドメインの残りとのそれらの相互作用が注意深く維持されるヒト化抗体のみにおいて保存され得る。ベニアリング技術を使用することによって、外部（例えば、溶媒がアクセス可能な）ＦＲ残基（これは、免疫系に容易に遭遇する）は、ヒト残基と選択的に置換されて、弱い免疫原性ベニアリング表面または実質的に非免疫原性のベニアリング表面のいずれかを含むハイブリッド分子を提供する。
【０１７４】
ベニアリングのプロセスは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第４版（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ，１９８７）において、Ｋａｂａｔらによって編集されたヒト抗体可変ドメインについての利用可能な配列データを使用し、Ｋａｂａｔデータベースに更新され、そして他の米国および海外のアクセス可能なデータベース（核酸およびタンパク質の両方）を使用する。Ｖ領域アミノ酸の溶媒接触可能性は、ヒトおよびマウス抗体フラグメントについての既知の３次元構造から推定され得る。マウス抗原結合部位をベニアリングする際に２つの一般的な工程が存在する。最初に、目的の抗体分子の可変ドメインのＦＲが、上記の供給源から得られたヒト可変ドメインの対応するＦＲ配列と比較される。次いで、最も相同的なヒトＶ領域が、対応するマウスアミノ酸と、残基ごとに比較される。ヒト対応物とは異なるマウスＦＲにおける残基は、当該分野において周知の組換え技術を使用して、ヒト部分に存在する残基によって置換される。残基スイッチングは、少なくとも部分的に露出した（溶媒接触可能である）部分を用いて実施されるのみであり、そしてＶ領域ドメインの三次構造に対する有意な効果を有し得るアミノ酸残基（例えば、プロリン、グリシンおよび荷電したアミノ酸）の置換において、注意がなされる。
【０１７５】
この様式において、得られた「ベニアリングされた」マウス抗原結合部位は、従って、マウスＣＤＲ残基、ＣＤＲに実質的に隣接する残基、埋没したかほとんど埋没した（溶媒のアクセスが不可能）として同定された残基、重鎖ドメインと軽鎖ドメインとの間の非共有結合的な（例えば、静電的および疎水的）接触に関係すると考えられる残基、およびＣＤＲループの「カノニカル」三次構造に影響を与えると考えられるＦＲの保存された構造領域からの残基を保持するように設計される。次いで、これらの設計基準は、ヒト様ＦＲへのマウス抗原結合部位の軽鎖および重鎖の両方のＣＤＲを組合せる組換えヌクレオチド配列を調製するために使用され、このヒト様ＦＲは、マウス抗体分子の抗原特異性を示す組換えヒト抗体の発現のために哺乳動物細胞をトランスフェクトするために使用され得る。
【０１７６】
本発明の別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、１つ以上の治療剤に結合され得る。この点に関して、適切な薬剤としては、放射性核種、分化インデューサー、薬物、毒素、およびそれの誘導体が挙げられる。好ましい放射性核種としては、９０Ｙ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔおよび２１２Ｂｉが挙げられる。好ましい薬物としては、メトトレキサート、ならびにピリミジンおよびプリンアナログが挙げられる。好ましい分化インデューサーとしては、ホルボールエステルおよび酪酸が挙げられる。好ましい毒素としては、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素、Ｓｈｉｇｅｌｌａ毒素、およびアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質が挙げられる。
【０１７７】
治療剤は、適切なモノクローナル抗体に直接的または間接的に（例えば、リンカー基を介して）のいずれかで結合（例えば、共有結合）され得る。薬剤と抗体との間の直接的な反応は、各々が他のものと反応し得る置換基を有する場合に可能である。例えば、一方の上の求核基（例えば、アミノ基またはスルフヒドリル基）は、他方のカルボニル含有基（例えば、酸無水物または酸ハロゲン化物）または良好な脱離基（例えば、ハロゲン化物）を含むアルキル基と反応し得る。
【０１７８】
あるいは、リンカー基を介して治療剤と抗体とを結合させることが所望され得る。リンカー基は、結合の可能性を妨げることを回避するために、抗体を薬剤から隔てるためのスペーサーとして機能し得る。リンカー基はまた、薬剤または抗体上の置換基の化学的反応性を増加させるように働き得、従って結合効率を増大させる。化学的反応性の増大はまた、薬剤または薬剤上の官能基の使用を促進し得る（さもなければ、可能ではない）。
【０１７９】
種々の二官能性または多官能性試薬、ホモ官能性とヘテロ官能性との両方（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬのカタログ中に記載されるもの）が、リンカー基として使用され得ることが当業者には明らかである。結合は、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、または酸化された炭水化物残基を介してもたらされ得る。このような方法論を記載する多数の参考文献（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらに対する米国特許第４，６７１，９５８号）が存在する。
【０１８０】
本発明の免疫結合体の抗体部分がないときに治療剤がより強力である場合、細胞中へのインターナリゼーションの間に、またはその際に切断可能なリンカー基を使用することが望ましくあり得る。多数の異なる切断可能なリンカー基が記載されている。これらのリンカー基からの薬剤の細胞内放出についての機構は、ジスルフィド結合の還元（例えば、Ｓｐｉｔｌｅｒへの米国特許第４，４８９，７１０号）、感光性結合の照射（例えば、Ｓｅｎｔｅｒらへの米国特許第４，６２５，０１４号）、誘導体化されたアミノ酸側鎖の加水分解（例えば、Ｋｏｈｎらへの米国特許第４，６３８，０４５号）、血清補体媒介性加水分解（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらへの米国特許第４，６７１，９５８号）、および酸触媒加水分解（例えば、Ｂｌａｔｔｌｅｒらへの米国特許第４，５６９，７８９号）による切断を含む。
【０１８１】
１つより多い薬剤を抗体に結合させることが望ましくあり得る。１つの実施形態において、薬剤の複数の分子が１つの抗体分子に結合される。別の実施形態において、１つより多い型の薬剤が１つの抗体に結合され得る。特定の実施形態に関わらず、１つより多い薬剤を有する免疫結合体は、種々の方法で調製され得る。例えば、１つより多い薬剤が、抗体分子に直接的に結合され得るか、または付着のための複数の部位を提供するリンカーが使用され得る。あるいは、キャリアが使用され得る。
【０１８２】
キャリアは、種々の方法（直接的にかまたはリンカー基を介するかのいずれかの共有結合を含む）で薬剤を保有し得る。適切なキャリアとしては、アルブミンのようなタンパク質（例えば、Ｋａｔｏらへの米国特許第４，５０７，２３４号）、ペプチド、およびアミノデキストランのような多糖類（例えば、Ｓｈｉｈらへの米国特許第４，６９９，７８４号）が挙げられる。キャリアはまた、例えばリポソーム小胞内に、非共有結合によってかまたはカプセル化によって、薬剤を保有し得る（例えば、米国特許第４，４２９，００８号および同第４，８７３、０８８号）。放射性核種薬剤に特異的なキャリアは、放射性ハロゲン化低分子およびキレート化合物を含む。例えば、米国特許第４，７３５，７９２号は、代表的な放射性ハロゲン化低分子およびそれらの合成を開示する。放射性核種キレートは、金属、または金属酸化物、放射性核種を結合するためのドナー原子として窒素原子および硫黄原子を含むものを含む、キレート化合物から形成され得る。例えば、Ｄａｖｉｓｏｎらへの米国特許第４，６７３，５６２号は、代表的なキレート化合物およびそれらの合成を開示する。
【０１８３】
（Ｔ細胞組成物）
別の局面において、本発明は、本明細書中に開示されるＨｅｒ−２／ｎｅｕポリペプチドに特異的なＴ細胞、または本明細書中に開示されるＨｅｒ−２／ｎｅｕポリペプチドの改変体もしくは誘導体に特異的なＴ細胞を提供する。１つの好ましい実施形態において、Ｔ細胞は、配列番号３に示されるＨｅｒ−２／ｎｅｕペプチドに特異的である。このような細胞は、一般的に標準的手順を使用して、インビトロまたはエキソビボで調製され得る。例えば、Ｔ細胞は、市販の細胞分離システム（例えば、ＩｓｏｌｅｘＴＭシステム（Ｎｅｘｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ；米国特許第５，２４０，８５６号；米国特許第５，２１５，９２６号；ＷＯ８９／０６２８０；ＷＯ９１／１６１１６およびＷＯ９２／０７２４３もまた参照のこと）から入手可能）を使用して、患者の骨髄、末梢血あるいは骨髄または末梢血の画分中から単離され得る。あるいは、Ｔ細胞は、関連または無関連のヒト、非ヒト動物、細胞株または培養物から誘導され得る。
【０１８４】
Ｔ細胞は、ポリペプチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／またはそのようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いて刺激され得る。このような刺激は、目的のポリペプチドに特異的であるＴ細胞の生成を可能にする条件下および十分な時間、行われる。好ましくは、本発明の腫瘍ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、送達ビヒクル（例えば、ミクロスフェア）中に存在して、特定のＴ細胞の生成を容易にする。
【０１８５】
Ｔ細胞は、このＴ細胞が、特異的に増殖するか、サイトカインを分泌するか、または本発明のポリペプチドで被覆されるか、もしくはこのポリペプチドをコードする遺伝子を発現する標的細胞を殺傷する場合に、本発明のポリペプチドに特異的であるとみなされる。Ｔ細胞特異性は、種々の標準的技術のいずれかを使用して評価され得る。例えば、クロム放出アッセイまたは増殖アッセイにおいて、ネガティブコントロールと比較して、溶解および／または増殖における２倍を超える増加の刺激指標は、Ｔ細胞特異性を示す。このようなアッセイは、例えば、Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：１０６５−１０７０，１９９４に記載されるように、実行され得る。あるいは、Ｔ細胞の増殖の検出は、種々の公知の技術によって達成され得る。例えば、Ｔ細胞増殖は、ＤＮＡ合成の速度の増加を測定することによって検出され得る（例えば、トリチウム化チミジンでＴ細胞の培養物をパルス標識し、そしてＤＮＡに取り込まれたトリチウム化チミジンの量を測定することによって）。３〜７日間の腫瘍ポリペプチド（１００ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは、２００ｎｇ／ｍｌ〜２５μｇ／ｍｌ）との接触は、代表的に、Ｔ細胞の増殖において少なくとも２倍の増加を生じる。２〜３時間の上記のような接触は、標準的なサイトカインアッセイを使用して測定されるように（ここで、サイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＦＮ−γ）放出のレベルの２倍の増加が、Ｔ細胞の活性化を示す）、Ｔ細胞の活性化を生じるはずである（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（Ｇｒｅｅｎｅ  １９９８）を参照のこと）。腫瘍ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド発現ＡＰＣに応答して活性化されたＴ細胞は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋であり得る。腫瘍ポリペプチド特異的Ｔ細胞は、標準的な技術を使用して拡大され得る。好ましい実施形態において、Ｔ細胞は、患者、関連するドナーまたは無関連のドナーに由来し、そして刺激および拡大後にその患者に投与される。
【０１８６】
治療目的で、腫瘍ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはＡＰＣに応答して増殖するＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞は、インビトロまたはインビボのいずれかで大量に拡大され得る。このようなＴ細胞のインビトロでの増殖は、種々の方法で達成され得る。例えば、Ｔ細胞は、Ｔ細胞増殖因子（例えば、インターロイキン−２）の添加を伴うか、または伴わずに、腫瘍ポリペプチド、またはこのようなポリペプチドの免疫原性部分に対応する短いペプチドに対して再曝露され得、そして／または腫瘍ポリペプチドを合成する刺激細胞に対して再曝露され得る。あるいは、腫瘍ポリペプチドの存在下で増殖する１つ以上のＴ細胞は、クローニングによって数の上で拡大され得る。細胞をクローニングするための方法は、当該分野で周知であり、そしてこれらとしては、限界希釈が挙げられる。
【０１８７】
（Ｔ細胞レセプター組成物）
Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）は、ジスルフィド結合によって連結されている、２つの異なる、非常に可変性のポリペプチド鎖（Ｔ細胞レセプターのα鎖およびβ鎖と呼ばれる）からなる（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｔｒａｖｅｒｓ、Ｗａｌｐｏｒｔ．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．第４版、１４８〜１５９．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ／Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ．１９９９）。このα／βヘテロダイマー（異種二量体）は、細胞膜で不変のＣＤ３鎖と複合体化する。この複合体は、ＭＨＣ分子に結合した特定の抗原性ペプチドを認識する。ＴＣＲ特異性の膨大な多様性は、体細胞遺伝子再配列により、まるで免疫グロブリンの多様性のように生成される。このβ鎖遺伝子は、５０を超える可変性領域（Ｖ）、２つの多様性領域（Ｄ）、１０を超える連結セグメント（Ｊ）、および２つの定常領域セグメント（Ｃ）を含む。α鎖遺伝子は、７０を超えるＶセグメント、および６０を超えるＪセグメントを含むが、Ｄセグメントを含まず、そして１つのＣセグメントを含む。胸腺におけるＴ細胞発達の間、β鎖のＤ〜Ｊ遺伝子再配列が生じ、続いて、Ｖ遺伝子セグメントのＤＪへの再配列が生じる。この機能的ＶＤＪβエキソンは、転写され、そしてスプライシングされてＣβに連結される。α鎖に関しては、Ｖα遺伝子セグメントは、Ｊα遺伝子セグメントに再配列して、機能的エキソンを形成し、これが次に転写され、Ｃαにスプライシングされてる。多様性は、さらにβ鎖のＶセグメントと、Ｄセグメントと、Ｊセグメントとの間、そしてα鎖のＶセグメントと、Ｊセグメントとの間のＰおよびＮ−ヌクレオチドの無作為な付加によって、組み換えプロセスの間にさらに増大する（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｗａｌｐｏｒｔ．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．第４版、９８および１５０．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ／Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ．１９９９）。
【０１８８】
本発明は、別の局面において、本明細書に開示のＨｅｒ−２／Ｎｅｕポリペプチド、またはその改変体もしくは誘導体に特異的なＴＣＲを提供する。特に、本発明は、所定のＴＣＲの特異性を決定するＶＪ接合配列またはＶＤＪ接合配列についての核酸配列およびアミノ酸配列を提供する。例えば、Ｈｅｒ−２／Ｎｅｕペプチドに特異的なＴＣＲをコードするｃＤＮＡは、標準的な分子生物学技術および組み換えＤＮＡ技術を用いて、Ｈｅｒ−２／Ｎｅｕポリペプチドに特異的なＴ細胞から単離され得る。
【０１８９】
本発明はさらに、適切な哺乳動物宿主細胞であって、本明細書に記載のＨｅｒ−２／Ｎｅｕポリペプチドに特異的なＴＣＲをコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトされている（これによって、この宿主細胞はこのＨｅｒ−２／Ｎｅｕポリペプチドに特異的にされる）適切な哺乳動物宿主細胞、例えば、非特異的Ｔ細胞を提供する。ＴＣＲのα鎖およびβ鎖は、別々の発現ベクターに含まれ得るか、または単一の発現ベクター（これはまた、リボソーム内侵入部位（ＩＲＥＳ）の下流の遺伝子のｃａｐ依存性翻訳のためのＩＲＥＳを含む）に含まれ得る。このＨｅｒ−２／Ｎｅｕポリペプチドに特異的なＴＣＲを発現するこの宿主細胞は、例えば、以下にさらに考察されるようなＨｅｒ−２／Ｎｅｕ関連悪性腫瘍の養子免疫療法のために、用いられ得る。
【０１９０】
本発明のさらなる局面において、本明細書に挙げたＨｅｒ−２／Ｎｅｕポリペプチドに特異的なクローニングされたＴＣＲは、Ｈｅｒ−２／Ｎｅｕ関連癌の診断のためのキットに用いられ得る。例えば、Ｈｅｒ−２／Ｎｅｕ関連腫瘍特異的ＴＣＲの核酸配列またはその一部は、生物学的サンプル中で、特定のＴＣＲをコードする再配列された遺伝子の発現を検出するためのプローブまたはプライマーとして用いられ得る。従って、本発明はさらに、Ｈｅｒ−２／Ｎｅｕポリペプチドに特異的なＴＣＲをコードするメッセンジャーＲＮＡまたはＤＮＡを検出するためのアッセイを提供する。
【０１９１】
（薬学的組成物）
さらなる実施形態において、本発明は、細胞または動物への投与のための、単独でかまたは治療の１つ以上の他の様相と組合わせてかのいずれかでの、薬学的に受容可能な溶液中の本明細書中に開示される１つ以上のポリヌクレオチド、ポリペプチド、Ｔ細胞および／または抗体組成物の処方物に関する。
【０１９２】
所望される場合、本明細書中に開示される組成物が、他の薬剤（例えば、他のタンパク質もしくはポリペプチドまたは種々の薬学的に活性な薬剤など）と組合わせても同様に投与され得ることが、理解される。事実、さらなる薬剤が標的細胞または宿主細胞と接触した際に有意な有害な影響をもたらさないとすれば、さらに含まれ得る他の成分に実質的に制限はない。従って、この組成物は、特定の例において必要とされる種々の他の薬剤と共に送達され得る。このような組成物は、宿主細胞または他の生物学的供給源から精製され得るか、あるいは、本明細書中に記載されるように化学的合成され得る。同様に、このような組成物はさらに、置換または誘導体化されたＲＮＡ組成物またはＤＮＡ組成物を含み得る。
【０１９３】
従って、本発明の別の局面において、生理学的に受容可能なキャリアと組合わせた、本明細書中に記載される１つ以上のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、および／またはＴ細胞組成物を含む薬学的組成物が、提供される。特定の好ましい実施形態において、本発明の薬学的組成物は、予防ワクチン適用および治療ワクチン適用における使用のための、本発明の免疫原性ポリヌクレオチド組成物および／または免疫原性ポリペプチド組成物を含む。ワクチン調製物は、一般的に、例えば、Ｍ．Ｆ．ＰｏｗｅｌｌおよびＭ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ編、「Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ（ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ）」、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（ＮＹ，１９９５）に記載される。一般的にこのような組成物は、１つ以上の免疫刺激剤と組合わせた、本発明のポリヌクレオチド組成物および／またはポリペプチド組成物の１つ以上を含む。
【０１９４】
本明細書中に記載される任意の薬学的組成物が、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの薬学的に受容可能な塩を含み得ることは、明らかである。このような塩は、例えば、薬学的に受容可能な非毒性の塩基（有機塩基（例えば、一級アミン、二級アミンおよび三級アミンならびに塩基性アミノ酸の塩）および無機塩基（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩）を含む）から調製され得る。
【０１９５】
別の実施形態において、本発明の例示的な免疫原性組成物（例えば、ワクチン組成物）は、上記のようなポリペプチドの１つ以上をコードするＤＮＡを含み、その結果このポリペプチドは、インサイチュで生成される。上記のように、ポリヌクレオチドは、当業者に公知の種々の送達系の内のいずれかで投与され得る。実際、多数の遺伝子送達技術（例えば、Ｒｏｌｌａｎｄ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １５：１４３−１９８，１９９８およびこの中に引用される参考文献に記載される遺伝子送達技術）が、当該分野で周知である。当然、適切なポリヌクレオチド発現系は、患者における発現のための必要な調節性のＤＮＡ調節配列（例えば、適切なプロモーターおよび終結シグナル）を含む。あるいは、細菌送達系は、その細胞表面上にポリペプチドの免疫原性部分を発現するか、またはエピトープなどを分泌する細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｒｉｎ）の投与を含み得る。
【０１９６】
従って、特定の実施形態において、本明細書中に記載される免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、多数の公知のウイルスに基づく系のうちのいずれかを用いて、発現のための適切な哺乳動物宿主細胞に導入される。１つの例示的な実施形態において、レトロウイルスが、遺伝子送達系のための簡便かつ有効な基盤を提供する。本発明のポリペプチドをコードする選択されたヌクレオチド配列は、当該分野で公知の技術を用いて、ベクターに挿入され得、そしてレトロウイルス粒子にパッケージングされ得る。次いで、組換えウイルスが、単離され、そして被験体に送達され得る。多数の例示的なレトロウイルス系が、記載されている（例えば、米国特許第５，２１９，７４０号；ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ（１９８９）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７：９８０−９９０；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５−１４；Ｓｃａｒｐａら（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８０：８４９−８５２；Ｂｕｒｎｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：８０３３−８０３７；ならびにＢｏｒｉｓ−ＬａｗｒｉｅおよびＴｅｍｉｎ（１９９３）Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：１０２−１０９）。
【０１９７】
さらに、多数の例示的なアデノウイルスに基づく系もまた、記載されている。宿主ゲノムに組込むレトロウイルスとは異なり、アデノウイルスは、染色体外に残り、このようにして、挿入変異誘発に関連する危険性を最小化する（Ｈａｊ−ＡｈｍａｄおよびＧｒａｈａｍ（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７−２７４；Ｂｅｔｔら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５９１１−５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７１７−７２９；Ｓｅｔｈら（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：９３３−９４０；Ｂａｒｒら（１９９４）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５１−５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６−６２９；ならびにＲｉｃｈら（１９９３）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：４６１−４７６）。
【０１９８】
種々のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系もまた、ポリヌクレオチド送達に関して開発されている。ＡＡＶベクターは、当該分野で周知の技術を用いて容易に構築され得る。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および同第５，１３９，９４１号；国際公開番号ＷＯ  ９２／０１０７０およびＷＯ  ９３／０３７６９；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔら（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９０（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：５３３−５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ（１９９４）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１６５−１６９；ならびにＺｈｏｕら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１８６７−１８７５を参照のこと。
【０１９９】
遺伝子移入による、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を送達するのに有用なさらなるウイルスベクターとしては、ポックスウイルスのファミリー（例えば、ワクシニアウイルスおよび鳥類ポックスウイルス）から誘導されるものが挙げられる。例として、新規分子を発現するワクシニアウイルスの組換え体は、以下のように構築され得る。ポリペプチドをコードするＤＮＡを最初に、ワクシニアプロモーターおよび隣接ワクシニアＤＮＡ配列（例えば、チミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする配列）に隣接するように、適切なベクターに挿入する。次いで、このベクターを使用して、ワクシニアで同時に感染させる細胞にトランスフェクトする。相同組換えによって、ワクシニアプロモーターおよび目的のポリペプチドをコードする遺伝子を、ウイルスゲノムに挿入する。生じるＴＫ．ｓｕｐ．（−）組換え体を、５−ブロモデオキシウリジンの存在下でこの細胞を培養し、そして５−ブロモデオキシウリジンに耐性のウイルスプラークをピックアップすることによって、選択し得る。
【０２００】
ワクシニアに基づく感染／トランスフェクション系は、生物の宿主細胞における、本明細書中に記載される１つ以上のポリペプチドの誘導可能な一過性発現または同時発現を提供するために、好都合に使用され得る。この特定の系において、細胞を最初に、インビトロで、バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードするワクシニアウイルスの組換え体で感染させる。このポリメラーゼは、それがＴ７プロモーターを保有する鋳型のみを転写する点で、鋭敏な特異性を示す。感染後、細胞を、Ｔ７プロモーターによって駆動される目的のポリヌクレオチドでトランスフェクトさせる。ワクシニアウイルスの組換え体から細胞質中で発現されるポリメラーゼは、トランスフェクトされたＤＮＡをＲＮＡに転写し、このＲＮＡは次いで、宿主翻訳機構によってポリペプチドに翻訳される。この方法は、大量のＲＮＡおよびその翻訳産物の、高レベルで一過性の細胞質産生を提供する。例えば、Ｅｌｒｏｙ−ＳｔｅｉｎおよびＭｏｓｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７：６７４３−６７４７；Ｆｕｅｒｓｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：８１２２−８１２６を参照のこと。
【０２０１】
あるいは、アビポックスウイルス（ａｖｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）（例えば、鶏痘ウイルスおよびカナリア痘ウイルス）もまた使用されて、目的のコード配列を送達し得る。哺乳動物病原体由来の免疫原を発現する組換えアビポックスウイルスは、非鳥類種に投与された場合に、防御免疫を与えることが公知である。アビポックスベクターの使用は、ヒトおよび他の哺乳動物種において特に望ましい。なぜなら、アビポックス属のメンバーは、感受性の鳥類種においてのみ生産的に複製し得、故に、哺乳動物細胞において感染性ではないからである。組換えアビポックスウイルスを産生するための方法は、当該分野で公知であり、そしてワクシニアウイルスの産生に関して上記に記載されるように、遺伝子組換えを使用する。例えば、ＷＯ  ９１／１２８８２；ＷＯ  ８９／０３４２９；およびＷＯ  ９２／０３５４５を参照のこと。
【０２０２】
多数のアルファウイルスベクターのいずれかもまた、本発明のポリヌクレオチド組成物の送達のために使用され得、これらとしては、米国特許第５，８４３，７２３号；同第６，０１５，６８６号；同第６，００８，０３５号および同第６，０１５，６９４号に記載されるベクターが挙げられる。ベネズエラウマ脳脊髄炎（ＶＥＥ）に基づく特定のベクターもまた、使用され得、この例示的な例は、米国特許第５，５０５，９４７号および同第５，６４３，５７６号に見出され得る。
【０２０３】
さらに、分子結合体化ベクター（例えば、Ｍｉｃｈａｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６８：６８６６〜６８６９およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：６０９９〜６１０３に記載のアデノウイルスキメラベクター）がまた、本発明における遺伝子送達に用いられ得る。
【０２０４】
これらおよび他の公知のウイルスベースの送達系に対するさらなる例示的情報は、例えば、以下に見出され得る：Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：３１７〜３２１、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５６９：８６〜１０３、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ８：１７〜２１、１９９０；米国特許第４，６０３，１１２号、同第４，７６９，３３０号および同第５，０１７，４８７号；ＷＯ８９／０１９７３；米国特許第４，７７７，１２７号；ＧＢ  ２，２００，６５１：ＥＰ  ０，３４５，２４２号；ＷＯ  ９１／０２８０５；Ｂｅｒｋｎｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６〜６２７、１９８８；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１〜４３４、１９９１；Ｋｏｌｌｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：２１５〜２１９、１９９４；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１４９８〜１１５０２、１９９３；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８８：２８３８〜２８４８、１９９３；ならびにＧｕｚｍａｎら、Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３：１２０２〜１２０７、１９９３。
【０２０５】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドを標的細胞のゲノムに組み込み得る。この組み込みは、相同組み換え（遺伝子置換）を介して特定の位置および方向であり得るか、または無作為な非特異的位置に組み込まれ得る（遺伝子増大）。なおさらなる実施形態において、ポリヌクレオチドはＤＮＡの別のエピソームセグメントとして細胞において安定に維持され得る。このようなポリヌクレオチドセグメントすなわち「エピソーム」は、宿主細胞の周期に独立してまたは同調して維持および複製を可能にするのに十分な配列をコードする。発現構築物が細胞に送達され、そしてこの細胞中にこのポリヌクレオチドが残る様式は、使用される発現構築物のタイプに依存する。
【０２０６】
本発明の別の実施形態において、例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５〜１７４９、１９９３に記載され、そしてＣｏｈｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１６９１〜１６９２、１９９３によって概説されるように、ポリヌクレオチドは、「裸の」ＤＮＡとして投与／送達される。裸のＤＮＡの取り込みは、生分解性ビーズ（これは、細胞に効率的に輸送される）上にそのＤＮＡをコーティングすることによって増加され得る。
【０２０７】
なお別の実施形態において、本発明の組成物は、微粒子銃アプローチ（その多くが記載されている）を介して送達され得る。１つの代表的な例において、ガス駆動粒子加速（ｇａｓ−ｄｒｉｖｅｎ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ）は、Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ＰＬＣ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）およびＰｏｗｄｅｒｊｅｃｔ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって製造されたデバイスのようなデバイスで達成され得る。そのいくつかの例は、米国特許第５，８４６，７９６号；同第６，０１０，４７８号；同第５，８６５，７９６号；同第５，５８４，８０７号；および欧州特許番号第０５００７９９号に記載されている。このアプローチは、注射針のない（無注射針）（ニードルフリー）送達アプローチを提供する。ここでは、微視的な粒子（例えば、ポリヌクレオチド粒子、またはポリペプチド粒子）の乾燥粉末処方物を、手持ちデバイスによって生成されたヘリウムガスジェット内で高速に加速し、目的の標的組織内へ粒子を噴射する。
【０２０８】
関連の実施形態において、本発明の組成物のガス駆動注射針なし注入に有用であり得る他のデバイスおよび方法は、Ｂｉｏｊｅｃｔ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）によって提供されるものが挙げられ、そのいくつかの例は、米国特許第４，７９０，８２４号；同第５，０６４，４１３号；同第５，３１２，３３５号；同第５，３８３，８５１号；同第５，３９９，１６３号；同第５，５２０，６３９号；および同第５，９９３，４１２号に記載されている。
【０２０９】
別の実施形態に従って、本明細書に記載される薬学的組成物は、本発明の免疫原性ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、Ｔ細胞および／またはＡＰＣ組成物に加えて、１つ以上の免疫賦活剤（免疫刺激因子）を含む。免疫賦活剤とは、本質的に、外因性抗原に対する免疫応答（抗原および／または細胞媒介）を増大または増強する任意の物質をいう。免疫賦活剤の１つの好ましい型は、アジュバントを含む。多くのアジュバントは、迅速な異化作用から抗原を保護するように設計された物質（例えば、水酸化アルミニウムまたは鉱油）および免疫応答の刺激物質（例えば、脂質Ａ、Ｂｏｒｔａｄｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ誘導化タンパク質）を含む。特定のアジュバント、例えば、フロイント不完全アジュバントおよびフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）；Ｍｅｒｃｋ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ６５（Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ）；ＡＳ−２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）；アルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウム）；カルシウム，鉄または亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アセチル化糖；カチオンの誘導化多糖またはアニオンの誘導化多糖；ポリフォスファーゼン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ）；生分解性ミクロスフェア：モノホスホリル脂質Ａおよびモノホスホリルクイル（ｑｕｉｌ）Ａとして、市販されている。サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン−２、インターロイキン−７、インターロイキン−１２および成長因子のような他のもの）はまた、アジュバントとして使用され得る。
【０２１０】
本発明の特定の実施形態において、アジュバント組成物は、Ｔｈ１型の免疫応答を優勢に誘導するものが好ましい。高レベルのＴｈ１型サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）は、投与される抗原に対する細胞媒介性応答の誘導を支持する傾向がある。対照的に、高レベルのＴｈ２型サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）は、体液性免疫応答の誘導を支持する傾向がある。本明細書中に提供されるようなワクチンの適用の後、患者は、Ｔｈ１型応答およびＴｈ２型応答を含む免疫応答を支持する。応答が優勢にＴｈ１型である好ましい実施形態において、Ｔｈ１型サイトカインのレベルは、Ｔｈ２型サイトカインのレベルより高い程度まで増加する。これらのサイトカインのレベルは、標準的アッセイを使用して容易に評価され得る。サイトカインのファミリーの概説については、ＭｏｓｍａｎｎおよびＣｏｆｆｍａｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１４５〜１７３、１９８９を参照のこと。
【０２１１】
Ｔｈ１型優勢の応答を誘発するための特定の好ましいアジュバントは、例えば、モノホスホリルリピドＡ、好ましくは３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡとアルミニウム塩との組み合わせを含む。ＭＰＬ（登録商標）アジュバントは、Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ；例えば、米国特許第４，４３６，７２７号；同第４，８７７，６１１号；同第４，８６６，０３４号および同第４，９１２，０９４号を参照のこと）から入手可能である。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ここで、ＣｐＧジヌクレオチドはメチル化されていない）はまた、Ｔｈ１優勢の応答を誘導する。このようなオリゴヌクレオチドは周知であり、そして例えばＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９９／３３４８８ならびに米国特許第６，００８，２００号および同第５，８５６，４６２号に記載される。免疫賦活剤ＤＮＡ配列がまた、例えば、Ｓａｔｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：３５２，１９９６によって記載される。別の好ましいアジュバントは、サポニン（例えば、Ｑｕｉｌ  Ａ）、またはその誘導体（ＱＳ２１およびＱＳ７（Ａｑｕｉｌａ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）を含む）；Ｅｓｃｉｎ；Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ（ジキトニン）；またはＧｙｐｓｏｐｈｉｌａもしくはＣｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ｑｕｉｎｏａサポニンを含む。他の好ましい処方物としては、本発明のアジュバントの組み合わせ、例えば、ＱＳ２１、ＱＳ７、Ｑｕｉｌ  Ａ、β−エスシン、またはジギトニンを含む以下の群のうち少なくとも２つの組み合わせ、において１つより多いサポニンを含む。
【０２１２】
あるいは、このサポニン処方物は、キトサン、または他のポリカチオン性ポリマーからなるワクチンビヒクル、ポリラクチドおよびポリラクチド−ｃｏ−グリコリド粒子、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンベースのポリマーマトリックス、ポリサッカライドまたは化学修飾されたポリサッカライドからなる粒子、リポソームおよび脂質ベースの粒子、グリセロールモノエステルからなる粒子、などと組み合わせられ得る。サポニンはまた、コレステロールの存在下で処方されて、リポソームまたはＩＳＣＯＭのような粒子構造を形成し得る。さらに、サポニンは、非粒子的溶液もしくは懸濁液で、または小数層リポソームもしくはＩＳＣＯＭのような粒子状構造で、ポリオキシエチレンエーテルまたはエステルと一緒に処方され得る。サポニンはまた、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）のような賦形剤と一緒に処方されて、粘度を増大され得るか、またはラクトースのような粉末賦形剤とともに乾燥粉末形態に処方され得る。
【０２１３】
１つの好ましい実施形態において、アジュバント系は、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体との組み合わせ（例えば、ＷＯ９４／００１５３に記載されるような、ＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬ（登録商標）アジュバントとの組み合わせ、またはＷＯ９６／３３７３９に記載されるような、ＱＳ２１がコレステロールでクエンチ（ｑｕｅｎｃｈ）される、あまり反応発生的（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）でない組成物）を含む。他の好ましい処方物は、水中油型エマルジョンおよびトコフェロールを含む。水中油型エマルジョン中のＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬ（登録商標）アジュバントおよびトコフェロールを使用する、別の特に好ましいアジュバント処方物は、ＷＯ９５／１７２１０に記載されている。
【０２１４】
別の強化されたアジュバント系は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドとサポニン誘導体の組み合わせを含み、特にＣｐＧとＱＳ２１の組み合わせがＷＯ００／０９１５９に開示されている。好ましくは、この処方物は、さらに、水中油型エマルジョンおよびトコフェノールを含む。
【０２１５】
本発明の薬学的組成物における使用のためのさらなる代表的アジュバントとしては、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＳＡＦ（Ｃｈｉｒｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）、ＩＳＣＯＭＳ（ＣＳＬ）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ）、アジュバントのＳＢＡＳシリーズ（例えば、ＳＢＡＳ−２またはＳＢＡＳ−４（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ、Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから入手可能）、Ｄｅｔｏｘ（Ｅｎｈａｎｚｙｎ（登録商標））（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）、ＲＣ−５２９（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）および他のアミノアルキルグルコサミニド４−ホスフェート（ＡＧＰ）（例えば、係属中の米国出願登録番号０８／８５３，８２６および０９／０７４，７２０（これらの開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されるアジュバント）、ならびにＷＯ  ９９／５２５４９Ａ１に記載のポリオキシエチレンエーテルアジュバントのようなアジュバントが挙げられる。
【０２１６】
他の好ましいアジュバントは、一般式（Ｉ）：ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ−Ｒのアジュバント分子を含み、
ここで、ｎは、１〜５０であり、Ａは、結合または−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｒは、Ｃ１〜５０アルキルまたはフェニルＣ１〜５０アルキルである。
【０２１７】
本発明の１つの実施形態は、一般式（Ｉ）のポリオキシエチレンエーテルを含むワクチン処方物からなり、ここで、ｎは、１と５０との間、好ましくは４〜２４、最も好もしくは９であり、このＲ成分は、Ｃ１〜５０、好ましくはＣ４〜Ｃ２０アルキル、そして最も好ましくはＣ１２アルキルであり、そしてＡは、結合である。ポリオキシエチレンエーテルの濃度は、０．１〜２０％の範囲、好ましくは０．１〜１０％、そして最も好ましくは０．１〜１％の範囲にあるべきである。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウロイルエーテル、ポリオキシエチレン−９−ステアリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン−８−ステアリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。ポリオキシエチレンラウリルエーテルのようなポリオキシエチレンエーテルは、Ｍｅｒｃｋインデックス（第１２版、７７１７項目）に記載される。これらのアジュバント分子は、ＷＯ９９／５２５４９に記載される。
【０２１８】
上記の一般式（Ｉ）に従うポリオキシエチレンエーテルは、所望の場合、別のアジュバントと組み合わせられ得る。例えば、好ましいアジュバントの組み合わせは、好ましくは、係属中の英国特許出願第ＧＢ９８２０９５６．２号に記載されるようなＣｐＧとの組み合わせである。
【０２１９】
本発明の別の実施形態に従って、本明細書に記載される免疫原性組成物は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、単球、および有効なＡＰＣであるように操作され得る他の細胞）を介して宿主に送達される。このような細胞は、抗原を提示する能力を増大するように、Ｔ細胞応答の活性化および／または維持を改良するように、それ自体で抗腫瘍効果を有するように、そして／あるいは受け手と免疫学的に適合性（すなわち、一致するＨＬＡハプロタイプ）であるように遺伝学的に改変されてもよいが、改変される必要はない。ＡＰＣは、一般に、種々の生物学的な流体および器官（腫瘍および腫瘍周辺組織を含む）のいずれかから単離されてもよいし、そして自己細胞、同種異系細胞、同系細胞、または異種細胞であってもよい。
【０２２０】
本発明の特定の好ましい実施形態は、抗原提示細胞として、樹状細胞またはその前駆細胞を使用する。樹状細胞は、高度に強力なＡＰＣであり（ＢａｎｃｈｅｒｅａｕおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２４５−２５１、１９９８）、そして予防的または治療的な抗腫瘍免疫性を誘発するための生理学的アジュバントとして有効であることが示されてきた（ＴｉｍｍｅｒｍａｎおよびＬｅｖｙ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５０：５０７−５２９、１９９９を参照のこと）。一般に、樹状細胞は、それらの代表的な形状（インサイチュでは星状、インビトロでは目に見える顕著な細胞質プロセス（樹状突起）を有する）、高い効率で抗原を取り込み、プロセシングし、そして提示するそれらの能力、および未処理の（ナイーブな）Ｔ細胞応答を活性化するそれらの能力に基づいて同定され得る。もちろん樹状細胞は、インビボまたはエキソビボで樹状細胞上に通常見出されない特定の細胞表面レセプターまたはリガンドを発現するように操作され得、このような改変樹状細胞は本発明によって意図される。樹状細胞の代替として、分泌小胞抗原装荷樹状細胞（ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｌｏａｄｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）（エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）と呼ばれる）がワクチン内で使用され得る（Ｚｉｔｖｏｇｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．４：５９４−６００，１９９８を参照のこと）。
【０２２１】
樹状細胞および前駆細胞は、末梢血、骨髄、腫瘍浸潤細胞、腫瘍周辺組織浸潤細胞、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血、または任意の他の適切な組織もしくは流体から得られ得る。例えば、樹状細胞は、末梢血から収集された単球の培養物に、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３および／またはＴＮＦαのようなサイトカインの組み合わせを添加することによってエキソビボで分化され得る。あるいは、末梢血、臍帯血または骨髄から収集されたＣＤ３４陽性細胞は、培養培地にＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＴＮＦα、ＣＤ４０リガンド、ＬＰＳ、ｆｌｔ３リガンドおよび／または樹状細胞の分化、成熟、および増殖を誘導する他の化合物の組み合わせを添加することによって、樹状細胞に分化され得る。
【０２２２】
樹状細胞は、「未熟」細胞および「成熟」細胞として都合良く分類され、このことは、２つの充分に特徴付けられた表現型の間を区別する単純な方法を可能にする。しかしこの命名は、あらゆる可能な分化の中間段階を排除すると解釈されるべきではない。未熟な樹状細胞は、抗原の取り込みおよびプロセシングの高い能力を有するＡＰＣとして特徴付けられ、この能力は、Ｆｃγレセプターおよびマンノースレセプターの高度な発現と相関する。成熟表現型は、代表的に、クラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ、接着分子（例えば、ＣＤ５４およびＣＤ１１）ならびに同時刺激性分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６および４−１ＢＢ）のようなＴ細胞活性化を担う細胞表面分子の高度な発現ではなく、これらのマーカーのより低い発現によって特徴付けられる。
【０２２３】
ＡＰＣは、一般に、本発明のポリヌクレオチド（またはその部分もしくは他の改変体）を用いてトランスフェクトされ得、その結果、このコードされたポリペプチドまたはその免疫原性部分が細胞表面上に発現される。このようなトランスフェクションはエキソビボで生じ得、次いでこのようなトランスフェクトされた細胞を含む薬学的組成物は、本明細書中に記載されるように、治療目的のために使用され得る。あるいは、樹状細胞または他の抗原提示細胞を標的とする遺伝子送達ビヒクルが、患者に投与され得、インビボで起こるトランスフェクションを生じる。樹状細胞のインビボおよびエキソビボでのトランスフェクションは、例えば、ＷＯ９７／２４４４７に記載される方法、またはＭａｈｖｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７５：４５６−４６０、１９９７によって記載される遺伝子銃アプローチのような当該分野で公知の任意の方法を使用して一般に実施され得る。樹状細胞の抗原ローディングは、樹状細胞または前駆細胞を、腫瘍ポリペプチド、ＤＮＡ（裸のもしくはプラスミドベクター中の）またはＲＮＡ；あるいは抗原発現性組換え細菌またはウイルス（例えば、牛痘、鶏痘、アデノウイルスまたはレンチウイルスのベクター）とインキュベートすることによって達成され得る。ローディングの前に、このポリペプチドは、Ｔ細胞補助を提供する免疫学的パートナー（例えば、キャリア分子）に共有結合され得る。あるいは、樹状細胞は、別々にまたはポリペプチドの存在下で、結合していない免疫学的パートナーでパルスされ得る。
【０２２４】
当業者に公知の任意の適切なキャリアが、本発明の薬学的組成物において使用され得るが、このタイプのキャリアは、代表的に投与の様式に依存して変化する。本発明の組成物は、投与の任意の適切な様式、例えば、局所投与、経口投与、経鼻投与、粘膜投与、静脈投与、頭蓋内投与、腹腔内投与、皮下投与、および筋肉内投与を含む様式のために処方され得る。
【０２２５】
このような薬学的組成物内での使用のためのキャリアは、生体適合性であり、そしてまた生分解性であり得る。特定の実施形態において、好ましくは、この処方物は比較的一定レベルの活性成分の放出を提供する。しかし、他の実施形態において、投与直後のより迅速な放出速度が所望され得る。このような組成物の処方は十分に、公知の技術を使用する当業者のレベル内である。この点に関して有用な例示的なキャリアとしては、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリアクリレート、ラテックス、デンプン、セルロース、デキストランなどの微粒子が挙げられる。他の例示的な徐放性キャリアとしては、非液性（ｎｏｎ−ｌｉｑｕｉｄ）親水性コア（例えば、架橋ポリサッカリドまたはオリゴサッカリド）を含む超分子バイオベクター、ならびに必要に応じて、両親媒性化合物を含む外部層（例えば、リン脂質）（例えば、米国特許第５，１５１，２５４号およびＰＣＴ出願ＷＯ９４／２００７８、ＷＯ／９４／２３７０１およびＷＯ９６／０６６３８を参照のこと）を含む超分子バイオベクターが挙げられる。徐放性処方物内に含まれる活性な化合物の量は、移植の部位、放出の速度および予期される持続期間、ならびに処置または予防されるべき状態の性質に依存する。
【０２２６】
別の例示的な実施形態において、生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリ乳酸ポリグリコレート）は、本発明の組成物のためのキャリアとして使用される。適切な生分解性ミクロスフェアは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号；同第５，０７５，１０９号；同第５，９２８，６４７号；同第５，８１１，１２８号；同第５，８２０，８８３号；同第５，８５３，７６３号；同第５，８１４，３４４号；同第５，４０７，６０９号および同第５，９４２，２５２号に開示される。改変Ｂ型肝炎コアタンパク質キャリア系（例えば、ＷＯ／９９  ４０９３４およびそこで引用される参考文献に記載されるような系）もまた、多くの用途に有用である。別の例示的なキャリア送達系（システム）は、キャリア含有粒子−タンパク質複合体（例えば、米国特許第５，９２８，６４７号に記載される複合体）を使用し、これは、宿主においてクラスＩ拘束細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導し得る。
【０２２７】
本発明の薬学的組成物はしばしば、１つ以上の、緩衝剤（例えば、中性の緩衝化生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水）；糖質（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）；マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸（例えば、グリシン）；抗酸化剤；静菌剤；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；処方物をレシピエントの血液に対して等張性、低張性または弱く高張性にする溶質；懸濁剤；濃化剤および／または保存剤をさらに含む。あるいは、本発明の組成物は、凍結乾燥物として処方され得る。
【０２２８】
本明細書中に記載される薬学的組成物は、単回用量容器または多用量容器（例えば、密閉アンプルまたはバイアル）中に存在し得る。このような容器は、代表的に、使用まで処方物の無菌性および安定性を維持するような様式で、密封される。一般に、処方物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクル中の、懸濁液、溶液またはエマルジョンとして保存され得る。あるいは、薬学的組成物は、使用の直前に無菌水性キャリアの添加のみを必要とする、凍結乾燥状態で保存され得る。
【０２２９】
様々な処置レジメンにおいて本明細書中で記載される特定の組成物を使用するための適切な投薬レジメンおよび処置レジメン（例えば、経口、非経口、静脈内、鼻腔内、および筋肉内の投与および処方を含む）の開発は、当該分野で周知であり、これらのいくつかは、一般的な例示目的のために以下で簡単に考察される。
【０２３０】
特定の用途において、本明細書中で開示される薬学的組成物は、経口投与によって動物に送達され得る。このように、これらの組成物は、不活性希釈剤と共にかまたは同化可能食用キャリアと共に処方され得るか、あるいはこれらの組成物は、硬質または軟質殻ゼラチンカプセルに入れられ得るか、あるいはこれらの組成物は錠剤に圧縮され得るか、あるいはこれらの組成物は食餌の食品に直接組み込まれ得る。
【０２３１】
活性化合物は、さらに賦形剤と共に組み込まれ得、そして経口摂取錠剤、経頬粘膜錠剤、トローチ、カプセル剤、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェハ剤などの形態で使用される（例えば、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９７  Ｍａｒ  ２７；３８６（６６２３）：４１０−４；Ｈｗａｎｇら、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ  １９９８；１５（３）：２４３−８４；米国特許第５，６４１，５１５号；米国特許第５，５８０，５７９号および米国特許第５，７９２，４５１号を参照のこと）。錠剤、トローチ、丸剤、カプセル剤などはまた、任意の種々のさらなる成分を含み得、例えば、結合因子（例えば、トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、リン酸二カルシウム）；崩壊剤（例えば、コーンスターチ、ポテトデンプン、アルギン酸など）；潤沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）；および甘味料（例えば、スクロース、ラクトースまたはサッカリン）または香料（例えば、ペパーミント、ウインターグリーン油、またはチェリー香料）が添加され得る。投薬量単位形態がカプセル剤である場合、これは上記のタイプの材料に加えて液体キャリアを含み得る。様々な他の材料が、コーティングとして存在し得るか、またはそうでなければ投薬単位の物理的形態を改変し得る。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤は、セラック、糖またはその両方でコーティングされ得る。もちろん、任意の投薬単位形態を調製する際に使用される任意の材料は、薬学的に純粋でありかつ用いられる量で実質的に非毒性でなければならない。さらに、活性化合物が、持続性放出調製物および処方物に組み込まれ得る。
【０２３２】
代表的に、これらの処方物は、少なくとも約０．１％またはそれよりも多い活性化合物を含み得るが、活性成分の割合は、もちろん、変化し得、そして好都合には、全処方物の重量または体積の約１または２％と、約６０％または７０％以上のとの間であり得る。当然、治療的に有用な組成物の各々の中の活性化合物の量は、適切な投薬量が、化合物の任意の所定の単位用量において得られるような様式で、調製され得る。溶解度、バイオアベイラビリティー、生物学的半減期、投与の経路、製品の貯蔵寿命のような因子、および他の薬理学的考慮が、このような薬学的処方物を調製する分野の当業者によって意図され、そしてそのようなものとして、種々の投薬量および処置レジメンが、所望され得る。
【０２３３】
経口投与について、本発明の組成物は、うがい薬、歯みがき剤、バッカル錠、経口スプレー、または舌下経口投与処方物の形態で、１つ以上の賦形剤と混合され得る。あるいは、活性成分は、経口溶液（例えば、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび炭酸水素カリウムを含む溶液）に組み込まれ得るか、または歯みがき剤に分散され得るか、または治療的有効量で、水、結合因子、研磨剤、香料、発泡剤、および湿潤剤を含み得る組成物に添加され得る。あるいは、これらの組成物は、舌下に置かれ得るか、そうでなければ口の中で溶解され得る錠剤形態または溶液形態に成形され得る。
【０２３４】
特定の状況において、本明細書中で開示される薬学的組成物を、非経口送達、静脈内送達、筋肉内送達またはさらに腹腔内送達することが所望される。このようなアプローチは、当業者に周知であり、これらのいくつかは例えば、例えば、米国特許第５，５４３，１５８号；米国特許第５，６４１，５１５号および米国特許第５，３９９，３６３号にさらに記載される。特定の実施形態において、遊離塩基または薬学的に受容可能な塩としての活性化合物の溶液は、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と適切に混合された水中で調製され得る。分散物もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、ならびにオイル中で調製され得る。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は一般に、微生物の増殖を防止するために、防腐剤を含む。
【０２３５】
注入用途のために適切な例示的な薬学的形態として、滅菌水性液剤または分散物および滅菌注射用液剤または分散物の即時調製のための滅菌散剤が挙げられる（例えば、米国特許第５，４６６，４６８号を参照のこと）。全ての場合において、その形態は、滅菌でなけらばならず、そして容易に注射することができる程度に、流動性でなければならない。それは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用に対して保存されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および／もしくは植物油を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散物の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、そして／または界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン（ｐａｒａｂｅｎ）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によって促進され得る。多くの場合において、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含めることが、望ましい。注射可能な組成物の長期にわたる吸収は、組成物中での吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の使用によって、もたらされ得る。
【０２３６】
一実施形態において、水溶液の非経口投与のために、必要ならばその溶液は、適切に緩衝化されるべきであり、そして液体希釈剤が、最初に、十分な生理食塩水またはグルコースで等張にされる。これらの特定の水溶液は、特に、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、および腹腔内投与に適切である。これに関連して、使用され得る滅菌水性媒体は、本開示の観点から当業者に公知である。例えば、一投与量は、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解され得、そして１０００ｍｌの皮下注入流体に添加され得るか、または注入予定部位で注入され得るかのいずれかである（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照のこと）。投薬量におけるいくらかの変化が、処置される被験体の状態に依存して必然的に生じる。さらに、ヒト投与について、調製物は、もちろん、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ｓｔａｎｄａｒｄｓによって要求されるような、無菌性、発熱性、ならびに一般的な安全性標準および純度標準を好ましく満たす。
【０２３７】
本発明の別の実施形態において、本明細書中で開示される組成物は、中性形態または塩形態で処方され得る。例示的な薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成される）が挙げられ、そしてこれらの塩は、無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸とともに形成される。遊離カルボキシル基とともに形成される塩もまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄）、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導され得る。処方の際に、溶液は、投薬処方物と適合する様式でかつ治療的に有効な量で投与される。
【０２３８】
キャリアは、任意および全ての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収を遅延させる薬剤、緩衝液、キャリア溶液、懸濁液、コロイドなどをさらに含み得る。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が、活性成分と不適合である場合を除いては、治療組成物におけるその使用が、企図される。補助的活性成分もまた、これらの組成物に組み込まれ得る。句「薬学的に受容可能な」とは、ヒトに投与される場合に、アレルギー反応または類似の厄介な反応を生じない分子実体および組成物をいう。
【０２３９】
特定の実施形態において、薬学的組成物は、鼻腔内スプレー、吸入、および／または他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達され得る。遺伝子、核酸およびペプチド組成物を、経鼻エアロゾルスプレーを介して肺に直接送達するための方法は、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号および米国特許第５，８０４，２１２号に記載されている。同様に、鼻腔内微粒子樹脂（Ｔａｋｅｎａｇａら、Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １９９８  Ｍａｒ  ２；５２（１−２）：８１−７）およびリゾホスファチジル−グリセロール化合物（米国特許第５，７２５，８７１号）を使用する薬物の送達はまた、薬学分野で周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックスの形態での例示的な経粘膜薬物送達は、米国特許第５，７８０，０４５号に記載される。
【０２４０】
特定の実施形態において、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、脂質粒子、小胞などを、適切な宿主細胞／生物への本発明の組成物の導入のために使用する。特に、本発明の組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフィア、またはナノ粒子などのいずれかにカプセル化して送達するために処方され得る。あるいは、本発明の組成物は、このようなキャリアビヒクルの表面に、共有結合的または非共有結合的のいずれかで結合され得る。
【０２４１】
潜在的な薬物キャリアとしてのリポソームおよびリポソーム様調製物の形成および使用は一般に、当業者に公知である（例えば、Ｌａｓｉｃ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９８  Ｊｕｌ；１６（７）：３０７−２１；Ｔａｋａｋｕｒａ，Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ  １９９８  Ｍａｒ；５６（３）：６９１−５；Ｃｈａｎｄｒａｎら、Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ．１９９７  Ａｕｇ；３５（８）：８０１−９；Ｍａｒｇａｌｉｔ，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．１９９５；１２（２−３）：２３３−６１；米国特許第５，５６７，４３４号；米国特許第５，５５２，１５７号；米国特許第５，５６５，２１３号；米国特許第５，７３８，８６８号および米国特許第５，７９５，５８７号（これらの各々は、その全体が本明細書中で参考として詳細に援用される）を参照のこと）。
【０２４２】
リポソームは、Ｔ細胞懸濁液、初代肝細胞培養物およびＰＣ１２細胞を含む他の手順によるトランスフェクションが通常困難である多くの細胞型とともに、首尾よく使用されている（Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９０  Ｓｅｐ  ２５；２６５（２７）：１６３３７−４２；Ｍｕｌｌｅｒら、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９０  Ａｐｒ；９（３）：２２１−９）。さらに、リポソームは、ウイルスベースの送達系に典型的なＤＮＡ長の制限がない。リポソームは、遺伝子、種々の薬物、放射線治療剤、酵素、ウイルス、転写因子およびアロステリックエフェクターなどを、種々の培養細胞株および動物に導入するために効果的に使用されている。さらに、リポソームの使用は、全身送達後の、自己免疫応答にも受容不可能な毒性にも関連しないようである。
【０２４３】
特定の実施形態において、リポソームは、水性媒体中に分散したリン脂質から形成され、そして多層同心性二重層小胞（多層小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を自発的に形成する。
【０２４４】
あるいは、他の実施形態において、本発明は、本発明の組成物の薬学的に受容可能なナノカプセル処方物を提供する。ナノカプセルは一般に、安定かつ再現可能な様式で化合物を捕獲し得る（例えば、Ｑｕｉｎｔａｎａｒ−Ｇｕｅｒｒｅｒｏら、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  Ｉｎｄ  Ｐｈａｒｍ．１９９８  Ｄｅｃ；２４（１２）：１１１３−２８を参照のこと）。細胞内ポリマーのオーバーローディングに起因する副作用を回避するために、このような超微粒子（約０．１μｍのサイズ）は、インビボで分解され得るポリマーを使用して設計され得る。このような粒子は、例えば、Ｃｏｕｖｒｅｕｒら、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．１９８８；５（１）：１−２０；ｚｕｒ  Ｍｕｈｌｅｎら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ．１９９８  Ｍａｒ；４５（２）：１４９−５５；Ｚａｍｂａｕｘら、Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ．１９９８  Ｊａｎ  ２；５０（１−３）：３１−４０；および米国特許第５，１４５，６８４号に記載されるようにして作製され得る。
【０２４５】
（癌治療法）
本発明のさらなる局面において、本明細書に記載される薬学的組成物は、癌の処置のため、特に、乳癌および他のＨｅｒ−２／ｎｅｕ関連悪性腫瘍の免疫治療のために使用され得る。このような方法において、本明細書中に記載される薬学的組成物は、患者、代表的には、温血動物、好ましくはヒトに投与される。患者は、癌に罹患していてもしていなくてもよい。従って、上記薬学的組成物は、癌の発症を予防するため、または癌に罹患した患者を処置するために使用され得る。薬学的組成物およびワクチンは、原発性腫瘍の外科的除去および／または放射線治療剤もしくは従来の化学療法剤の投与のような処置の前、あるいはその後のいずれかに投与され得る。上記のように、薬学的組成物の投与は、任意の適切な方法（静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮内、肛門、膣、局所的および経口経路による投与を含む）によってであり得る。
【０２４６】
特定の実施形態において、免疫療法は、能動的免疫療法であり得、この療法にける処置は、免疫応答改変剤（例えば、本明細書中で提供されるポリペプチドおよびポリヌクレオチド）の投与を用いる、腫瘍に対して反応する内因性宿主免疫系のインビボ刺激に依存する。
【０２４７】
他の実施形態において、免疫療法は、受動的免疫療法であり得、この療法における処置は、確立された腫瘍免疫反応性を有する因子（例えば、エフェクター細胞または抗体）（これらは、抗腫瘍効果を直接的または間接的に媒介し得、そして必ずしもインタクトな宿主免疫系に依存しない）の送達を含む。エフェクター細胞の例としては、上記のようなＴ細胞、本明細書中に提供されるポリペプチドを発現するＴリンパ球（例えば、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球およびＣＤ４＋Ｔヘルパー腫瘍浸潤性リンパ球）、キラー細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞およびリンホカイン活性化キラー細胞）、Ｂ細胞および抗原提示細胞（例えば、樹状細胞およびマクロファージ）が挙げられる。本明細書中に列挙されるポリペプチドに特異的なＴ細胞レセプターおよび抗体レセプターは、養子免疫療法のために他のベクターまたはエフェクター細胞中にクローニングされ、発現され、そして移入され得る。本明細書に提供されるポリペプチドはまた、受動免疫療法のための抗体または抗イディオタイプ抗体（上記および米国特許第４，９１８，１６４号に記載される）を生成するために用いられ得る。
【０２４８】
エフェクター細胞は、一般に、本明細書中に記載されるように、インビトロでの増殖により養子免疫治療のために十分な量で得られ得る。単一の抗原特異的エフェクター細胞を、インビボでの抗原認識を保持しながら数十億まで増殖させるための培養条件は当該分野で周知である。このようなインビトロの培養条件は代表的に、しばしばサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）および分裂しない支持細胞の存在下で、抗原での間欠刺激を用いる。上で述べたように、本明細書中で提供される免疫反応性ポリペプチドは、抗原特異的Ｔ細胞培養物を急速に増殖するために用いられ、免疫治療に十分な数の細胞を生成し得る。詳細には、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、単球、繊維芽細胞、および／またはＢ細胞）は、当該分野で周知の標準的技術を用いて、免疫反応性ポリペプチドでパルスされ得るか、または１つ以上のポリヌクレオチドでトランスフェクトされ得る。例えば、抗原提示細胞は、組換えウイルスまたは他の発現系における発現を増大するのに適切なプロモーターを有するポリヌクレオチドでトランスフェクトされ得る。治療において使用するための培養されたエフェクター細胞は、インビボで増殖されかつ広範に分散され得、そして長期間生存し得なければならない。培養されたエフェクター細胞が、インビボで増殖し、そしてＩＬ−２を補充された抗原での反復刺激によって、長期間、多数生存するように誘導され得ることが、研究によって示されている（例えば、Ｃｈｅｅｖｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １５７：１７７、１９９７を参照のこと）。
【０２４９】
あるいは、本明細書において列挙されるポリペプチドを発現するベクターは、患者から得られた抗原提示細胞に導入され得、そして同じ患者に戻す移植のためにエキソビボでクローン的に増殖され得る。トランスフェクトされた細胞は、当該分野で公知の任意の手段（好ましくは、静脈投与、腔内投与、腹腔内投与、または腫瘍内投与による滅菌形態）を用いて患者に再導入され得る。
【０２５０】
本明細書中に記載される治療的組成物の投与の経路および頻度、ならびに投薬量は、個々人で異なり、そして標準的技術を用いて容易に確立され得る。概して、薬学的組成物およびワクチンは、注射（例えば、皮内、筋肉内、静脈内、または皮下）により、経鼻的に（例えば、吸引により）または経口的に、投与され得る。好ましくは、５２週間にわたって１〜１０用量の間が投与され得る。好ましくは、１ヶ月の間隔で６用量が投与され、そしてブースター（追加）ワクチン接種がその後定期的に与えられ得る。交互のプロトコルが個々の患者に適切であり得る。適切な用量は、上記のように投与された場合、抗腫瘍免疫応答を促進し得、そして基底（すなわち、未処置）レベルより少なくとも１０〜５０％上である、化合物の量である。このような応答は、患者内の抗腫瘍抗体を測定することによってか、または患者の腫瘍細胞をインビトロで殺傷し得る細胞溶解性エフェクター細胞のワクチン依存性の生成によってモニターされ得る。このようなワクチンはまた、ワクチン接種されていない患者と比較すると、ワクチン接種された患者において、改善された臨床的結果（例えば、より頻繁な寛解、完全もしくは部分的に疾患を有さないか、またはより長く疾患を有さない生存）を導く免疫応答を生じ得るはずである。一般に、１つ以上のポリペプチドを含む薬学的組成物およびワクチンについて、用量中に存在する各ポリペプチドの量は、宿主の体重（ｋｇ）あたり、約２５μｇ〜５ｍｇの範囲である。適切な用量サイズは、患者の大きさで変化するが、代表的には約０．１ｍＬ〜約５ｍＬの範囲である。
【０２５１】
一般に、適切な投薬量および処置レジメンは、治療的および／または予防的利点を提供するのに十分な量の活性化合物を提供する。このような応答は、処置されていない患者と比較して、処置された患者において、改善された臨床的結果（例えば、より頻繁な寛解、完全なまたは部分的な、あるいはより長い疾患なしでの生存）を確立することによってモニターされ得る。腫瘍タンパク質に対する既存の免疫応答における増加は、一般的に、改善された臨床的結果と関連する。このような免疫応答は、一般的に、標準的な増殖アッセイ、細胞障害性アッセイまたはサイトカインアッセイを使用して評価され得、これは、処置の前または後に患者から得られるサンプルを使用して行われ得る。
【０２５２】
（癌の検出および診断組成物、方法およびキット）
別の実施形態において、癌は、患者から得られた生物学的サンプル（例えば、血液、血清、痰、尿、および／または腫瘍生検）における１つ以上のＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質および／またはこのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在に基づいて患者において検出され得る。言い換えると、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、癌の存在または非存在を示すためのマーカーとして使用され得る。本明細書中で提供される結合因子は、一般に、生物学的サンプル中で、この薬剤に結合する抗原のレベルの検出を可能にする。ポリヌクレオチドプライマーおよびプローブは、癌の存在または非存在をも示す、腫瘍タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを検出するために使用され得る。サンプル中のポリペプチドマーカーを検出するために結合因子を使用するための、当業者に公知の種々のアッセイ型式が存在する。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。一般的に、患者における癌の存在または非存在は、（ａ）患者から得られた生物学的サンプルを結合因子と接触させる工程；（ｂ）結合因子に結合するポリペプチドのレベルをサンプルにおいて検出する工程；および（ｃ）ポリペプチドのレベルと所定のカットオフ値とを比較する工程によって決定され得る。
【０２５３】
好ましい実施形態において、このアッセイは、ポリペプチドに結合するためおよびサンプルの残りからポリペプチドを除くために固体支持体上に固定された結合因子の使用を含む。次いで、結合されたポリペプチドは、レポーター基を含み、結合因子／ポリペプチド複合体に特異的に結合する検出試薬を使用して検出され得る。このような検出試薬は、例えば、ポリペプチドまたは抗体に特異的に結合する結合因子あるいは結合因子に特異的に結合する他の薬剤（例えば、抗免疫グロブリン、プロテインＧ、プロテインＡまたはレクチン）を含み得る。あるいは、競合アッセイが、使用され得、ここで、ポリペプチドは、レポーター基で標識され、そしてサンプルと結合因子のインキュベーション後にその固定された結合因子に結合される。サンプルの成分が、標識ポリペプチドの結合因子への結合を阻害する程度は、サンプルの固定された結合因子との反応性を示す。固体支持体は、腫瘍タンパク質が付着され得る当業者に公知の任意の材料であり得る。例えば、固体支持体は、マイクロタイタープレートにおける試験ウェルあるいはニトロセルロースまたは他の適切な膜であり得る。あるいは、その支持体は、ビーズまたはディスク（例えば、ガラス）、ファイバーグラス、ラテックス、またはプラスチック物質（例えば、ポリスチレン、またはポリ塩化ビニル）であり得る。その支持体はまた、磁気粒子または光ファイバーセンサー（例えば、米国特許第５，３５９，６８１号に記載のような）であり得る。この結合因子は、当業者に公知の種々の技術を使用して固体支持体上に固定され得、これらは特許および科学文献に十分に記載されている。本発明の状況において、用語「固定化」とは、非共有結合的な会合（例えば、吸着）および共有結合的な付着（これは、薬剤と支持体上の官能基との間で直接結合され得るかまたは架橋剤を用いる結合であり得る）の両方をいう。マイクロタイタープレートのウェル、または膜への吸着による固定化は好ましい。このような場合、吸着は、適切な緩衝液中で固体支持体を用いて適切な時間量で結合因子に接触させることによって達成され得る。接触時間は、温度によって変化するが、代表的には、約１時間から約１日の間である。一般的には、約１０ｎｇ〜約１０μｇ、そして好ましくは約１００ｎｇ〜約１μｇの範囲の量の結合因子とプラスチックマイクロタイタープレート（例えば、ポリスチレンまたはポリ塩化ビニル）のウェルを接触させることは、適切な量の結合因子を固定化するのに十分である。
【０２５４】
固体支持体への結合因子の共有結合的付着は、一般に、支持体および結合因子上の官能基（例えば、水酸基またはアミノ基）の両方と反応する二官能性試薬と支持体を最初に反応させることによって達成され得る。例えば、この結合因子は、ベンゾキノンを用いるかまたは結合パートナー上のアミンおよび活性水素と支持体上のアルデヒド基との縮合によって、適切なポリマーコーティングを有する支持体に、共有結合的に付着され得る（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９１、Ａ１２−Ａ１３を参照のこと）。
【０２５５】
特定の実施形態において、このアッセイは、２抗体サンドイッチアッセイである。本アッセイは、最初に、固体支持体（一般に、マイクロタイタープレートのウェル）上で固定されている抗体をサンプルに接触させて、その結果、サンプル内のポリペプチドを固定された抗体に結合させることによって実施され得る。次いで、非結合サンプルは固定されたポリペプチド−抗体複合体から除去され、そして検出試薬（好ましくは、そのポリペプチド上の異なる部位に結合し得る第２の抗体（レポーター基を含む））が添加される。次いで、固体支持体に結合したままである検出試薬の量が、特定のレポーター基に関して適切な方法を用いて決定される。
【０２５６】
より詳細には、一旦抗体が上記のように支持体上に固定化されると、支持体上の残りのタンパク質結合部位は、典型的にはブロックされる。任意の適切なブロック剤（例えば、ウシ血清アルブミンまたはＴｗｅｅｎ２０ＴＭ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））は、当業者に公知である。固定された抗体は次いで、サンプルとインキュベートされ、そしてポリペプチドをこの抗体に結合させる。インキュベーションの前に、このサンプルは適切な希釈液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ））で希釈され得る。概して、適切な接触時間（すなわち、インキュベーション時間）は、癌を有する個体から得られたサンプル内のポリペプチドの存在を検出するのに十分な時間である。好ましくは、この接触時間は、結合ポリペプチドと非結合ポリペプチドとの間の平衡で達成される結合レベルの少なくとも約９５％である結合レベルを達成するのに十分な時間である。当業者は、ある時間にわたって起こる結合レベルをアッセイすることによって、平衡に達するまでに必要な時間が容易に決定され得ることを認識する。室温では、一般に、約３０分間のインキュベーション時間で十分である。
【０２５７】
次いで、非結合サンプルが、適切な緩衝液（例えば、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭを含むＰＢＳ）を用いて固体支持体を洗浄することによって除去される。次いで、レポーター基を含む第２の抗体が、固体支持体に添加され得る。好ましいレポーター基は、上記の基を含む。
【０２５８】
次いで、検出試薬が、結合されたポリペプチドを検出するのに十分な量の時間、固定された抗体−ポリペプチド複合体とインキュベートされる。適切な量の時間は、一般に、ある時間にわたって起こる結合のレベルをアッセイすることによって決定され得る。次いで、非結合の検出試薬は除去され、そして結合した検出試薬は、レポーター基を用いて検出される。レポーター基を検出するために使用される方法は、レポーター基の性質に依存する。放射性基について、一般的には、シンチレーション計数法またはオートラジオグラフィー法が適切である。分光法は、色素、発光基および蛍光基を検出するために使用され得る。ビチオンは、異なるレポーター基（一般に、放射性もしくは蛍光基または酵素）に結合されたアビジンを使用して検出され得る。酵素レポーター基は、一般に、基質の添加（一般には、特定の時間の間）、続いて反応産物の分光分析または他の分析により検出され得る。
【０２５９】
癌（例えば、乳癌）の存在または非存在を決定するために、固体支持体に結合したままのレポーター基から検出されるシグナルが、一般に、所定のカットオフ値と対応するシグナルと比較される。１つの好ましい実施形態において、癌の検出のためのカットオフ値は、固定された抗体を、癌を有さない患者由来のサンプルとインキュベートした際に得られる平均シグナル値である。概して、所定のカットオフ値を３標準偏差上回るシグナルを生じるサンプルが、癌に対して陽性とみなされる。代替の好ましい実施形態において、このカットオフ値は、Ｓａｃｋｅｔｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，１９８５，１０６〜７頁の方法に従って、レシーバーオペレーターカーブ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｏｒ  Ｃａｒｖｅ）を使用して決定される。簡単に言うと、本実施形態において、このカットオフ値は、診断試験結果についての各可能なカットオフ値に対応する真の陽性割合（すなわち、感度）および偽陽性割合（１００％−特異性）の対のプロットから決定され得る。プロット上の上方左手角に最も近いカットオフ値（すなわち、最大領域を囲む値）が、最も正確なカットオフ値であり、そして本方法によって決定されたカットオフ値より高いシグナルを生ずるサンプルが陽性と見なされ得る。あるいは、カットオフ値は、偽陽性割合を最小にするためにプロットに沿って左へシフトされ得るか、または偽陰性割合を最小にするために右へシフトされ得る。概して、本方法によって決定されたカットオフ値より高いシグナルを生ずるサンプルが、癌に対して陽性と見なされる。
【０２６０】
関連の実施形態において、このアッセイは、フロースルー試験形式またはストリップ試験形式で実行される（ここで、結合因子は、ニトロセルロースのような膜上で固定化される）。フロースルー試験では、サンプル内のポリペプチドは、サンプルが膜を通過するにつれて固定された結合因子に結合する。次いで、第２の標識化された結合因子が、この第２の結合因子を含む溶液がその膜を介して流れるにつれて、結合因子−ポリペプチド複合体と結合する。次いで、結合した第２の結合因子の検出は、上記のように実行され得る。ストリップ試験形式では、結合因子が結合される膜の一端を、サンプルを含む溶液中に浸す。このサンプルは、膜に沿って、第２の結合因子を含む領域を通って、そして固定された結合因子の領域まで移動する。固定された抗体の領域での第２の結合因子の濃度が、癌の存在を示す。代表的には、その部位での第２の結合因子の濃度は、視覚的に読みとられ得るパターン（例えば、線）を生成する。このようなパターンを示さないことは陰性の結果を示す。概して、この膜上に固定化される結合因子の量は、生物学的サンプルが、上記の形式において、２抗体サンドイッチアッセイにおいて陽性シグナルを生じるのに十分であるレベルのポリペプチドを含む場合、視覚的に識別可能なパターンを生じるように選択される。このようなアッセイにおける使用に好ましい結合因子は、抗体およびその抗原結合フラグメントである。好ましくは、膜上に固定化される抗体の量は、約２５ｎｇ〜約１μｇの範囲であり、そしてより好ましくは、約５０ｎｇ〜約５００ｎｇの範囲である。このような試験は、代表的には、非常に少ない量の生物学的サンプルを用いて実行され得る。
【０２６１】
もちろん、本発明の腫瘍タンパク質または結合因子との使用に適する多数の他のアッセイプロトコールが存在する。上記の記載は、例示であることを意図するにすぎない。例えば、上記プロトコールが、腫瘍ポリペプチドを使用するために容易に改変され得て、生物学的サンプル内でこのようなポリペプチドに結合する抗体を検出し得ることが当業者に明かである。このような腫瘍タンパク質特異的抗体の検出は、癌の存在と相関し得る。
【０２６２】
癌もまた、あるいは癌は、生物学的サンプル中の腫瘍タンパク質と特異的に反応するＴ細胞の存在に基づいて検出され得る。特定の方法では、患者から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む生物学的サンプルは、腫瘍ポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／またはこのようなポリペプチドの少なくとも免疫原性部分を発現するＡＰＣとともにインキュベートされ、そしてＴ細胞の特異的活性化の存在または非存在が検出される。適切な生物学的サンプルとしては、単離されたＴ細胞が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｔ細胞は、慣用技術によって（例えば、末梢血リンパ球のＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離法によって）患者から単離され得る。Ｔ細胞は、２〜９日間（代表的に４日間）、３７℃にてポリペプチド（例えば、５〜２５μｇ／ｍｌ）とともにインビトロでインキュベートされ得る。Ｔ細胞サンプルの別のアリコートを、コントロールとして役立てるために、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕポリペプチドの非存在下でインキュベートすることが所望され得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞に関して、活性化は好ましくは、Ｔ細胞の増殖を評価することによって検出される。ＣＤ８＋Ｔ細胞に関しては、活性化は好ましくは、細胞溶解活性を評価することによって検出される。疾患のない患者におけるよりも少なくとも２倍高い増殖レベルおよび／または少なくとも２０％高い細胞溶解活性レベルは、患者における癌の存在を示す。
【０２６３】
上記のように、癌もまた、あるいは癌は、生物学的サンプル中のＨｅｒ−２／ｎｅｕポリペプチドをコードするｍＲＮＡレベルに基づいて検出され得る。例えば、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくアッセイにおいて用いて、生物学的サンプルに由来する腫瘍ｃＤＮＡの一部を増幅し得、ここで、オリゴヌクレオチドプライマーのうちの少なくとも１つは、腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的である（すなわち、ハイブリダイズする）。次いで、増幅されたｃＤＮＡが、当該分野で周知の技術（例えば、ゲル電気泳動）を用いて分離され、そして検出される。同様に、腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いて、生物学的サンプル中でこの腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在を検出し得る。
【０２６４】
アッセイ条件下でのハイブリダイゼーションを可能にするために、オリゴヌクレオチドのプライマーおよびプローブは、少なくとも１０ヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドの長さの、本発明の腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部に対して少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７５％、そしてより好ましくは少なくとも約９０％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列を含むべきである。好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブは、上記に規定されるような、中程度にストリンジェントな条件下で、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする。本明細書中に記載される診断方法において有用に用いられ得るオリゴヌクレオチドのプライマーおよび／またはプローブは、好ましくは、少なくとも１０〜４０ヌクレオチドの長さである。好ましい実施形態において、これらのオリゴヌクレオチドプライマーは、本明細書中に開示される配列を有するＤＮＡ分子の少なくとも１０の連続するヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む。ＰＣＲに基づくアッセイおよびハイブリダイゼーションアッセイの両方についての技術は、当該分野で周知である（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５１：２６３，１９８７；Ｅｒｌｉｃｈ編，ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９を参照のこと）。
【０２６５】
１つの好ましいアッセイは、ＲＴ−ＰＣＲを用い、ＲＴ−ＰＣＲでは、ＰＣＲは、逆転写と組み合わせて適用される。代表的に、ＲＮＡは生物学的サンプル（例えば、生検組織）から抽出され、そして逆転写されてｃＤＮＡ分子を生成する。少なくとも１つの特異的プライマーを用いるＰＣＲ増幅は、ｃＤＮＡ分子を生成し、このｃＤＮＡ分子は、例えば、ゲル電気泳動を用いて分離および可視化され得る。増幅は、試験患者および癌に罹患していない個体から採取された生物学的サンプルについて行われ得る。増幅反応は、２桁の大きさに及ぶいくつかのｃＤＮＡ希釈物について行われ得る。試験患者サンプルのいくつかの希釈物における発現の増加が、癌のないサンプルの同一希釈の物と比較して２倍以上である場合、これは、代表的に、陽性とみなされる。
【０２６６】
別の実施形態において、本明細書中に記載された組成物は、癌の進行についてのマーカーとして使用され得る。この実施形態において、癌の診断について上記に記載されるようなアッセイは、経時的に実行され得、そして反応性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルの変化を評価し得る。例えば、このアッセイは、６ケ月〜１年の期間、２４〜７２時間毎に実行され得、そしてその後、必要に応じて実行され得る。一般に、癌は、検出されるこのポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルが経時的に増大する患者において進行している。対照的に、癌は、反応性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルが一定のままであるか、または時間とともに減少するかのいずれかである場合、進行していない。
【０２６７】
特定のインビボ診断アッセイは、腫瘍上で直接実施され得る。１つのこのようなアッセイは、腫瘍細胞を結合因子と接触させる工程を包含する。次いで、結合された結合因子は、レポーター基によって直接的または間接的に検出され得る。このような結合因子はまた、組織学的な用途において使用され得る。あるいは、ポリヌクレオチドプローブは、このような用途において使用され得る。
【０２６８】
上記のように、感度を改善するために、複数の腫瘍タンパク質マーカーは、所定のサンプル内でアッセイされ得る。本明細書中に提供される異なるタンパク質に特異的な結合因子が単一のアッセイにおいて組み合わせられ得ることは明かである。さらに、複数のプライマーまたはプローブが同時に用いられ得る。腫瘍タンパク質マーカーの選択は、最適な感度をもたらす組み合わせを決定する慣用実験に基づき得る。さらに、または代替として、本明細書中に提供される腫瘍タンパク質のアッセイは、他の公知の腫瘍抗原に対するアッセイと組み合わせられ得る。
【０２６９】
本発明はさらに、上記の診断方法のうちのいずれかにおいて使用するためのキットを提供する。このようなキットは代表的に、診断アッセイを行うのに必要な２以上の構成要素を備える。構成要素は、化合物、試薬、容器および／または器具であり得る。例えば、キット内の１つの容器は、腫瘍タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含み得る。このような抗体またはフラグメントは、上記のように支持体材料に付着されて提供され得る。１以上のさらなる容器は、アッセイにおいて使用される要素（例えば、試薬または緩衝液）を封入し得る。このようなキットもまた、あるいはこのようなキットは、抗体結合の直接的または間接的な検出に適切なレポーター基を含む上記のような検出試薬を備え得る。
【０２７０】
あるいは、キットは、生物学的サンプル中の腫瘍タンパク質をコードするｍＲＮＡレベルを検出するように設計され得る。このようなキットは一般に、腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする、上記のような、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドのプローブまたはプライマーを備える。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いられ得る。このようなキット内に存在し得るさらなる構成要素としては、腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドの検出を容易にする、第２のオリゴヌクレオチドおよび／または診断試薬もしくは容器が挙げられる。
【０２７１】
以下の実施例は、例示のために提供され、そして限定のためではない。
【０２７２】
（実施例）
（実施例１）
（組換えアデノウイルスを用いて感染される樹状細胞を用いたＨｅｒ−２／ｎｅｕ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞のプライミング）
ＥＩＡ、およびＨｅｒ−２／ｎｅｕの細胞内ドメイン（ＩＣＤ；配列番号１のおよそヌクレオチド２０２６〜３７６５由来）についての組換え体について欠失されるアデノウイルス（ＡｄＶ）ベクターを構築し、そして使用して、健康なドナーから得られる樹状細胞（ＤＣ）を感染した。刺激物質としてＡｄＶ−ＩＣＤ感染したＤＣ、および応答物質として自己ＰＢＭＣを含んだプライミング培養を開始した。第一の再刺激の前に、培養物を、ＣＤ８＋細胞について濃縮し、そしてＣＤ８＋濃縮集団を、ＡｄＶ−ＩＣＤ感染したＤＣを用いて再刺激した。引き続く再刺激は、ＩＣＤについてのレトロウイルス組換え体を用いて形質導入される自己線維芽細胞に対してであった。第四のインビトロ刺激後、得られるＴ細胞株を、標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイによって、ＩＣＤ特異的ＣＴＬ活性について試験した。図１に示されるように、バルク（ｂｕｌｋ）Ｔ細胞株は、ＩＣＤに特異的な活性を含んだ。なぜなら、この株は、ワクシニアＩＣＤを用いて感染される自己Ｂ−ＬＣＬを溶解したが、ワクシニアＥＧＦＰを用いて感染されるＣ−ＬＣＬまたは非感染のＢ−ＬＣＬ標的を溶解しなかったからである。図１における各々のデータポイントは、３つの測定値の平均であった。
【０２７３】
２回以上の刺激後、このＴ細胞株を、ＩＣＤを発現する自己線維芽細胞に応答して、γ−ＩＦＮを分泌する能力について試験した。γ−ＩＦＮ  ＥＬＩＳＰＯＴ分析を、ＩＣＤまたはＥＧＦＰのいずれかを用いて形質導入される自己線維芽細胞に対する応答物質として、ＩＣＤでプライムされるＣＤ８＋  Ｔ細胞株を用いて行った。この分析において、２×１０３の線維芽細胞刺激物質を、三連で、１ウェル当たり２×１０４の応答Ｔ細胞でプレーティングした。この三連のウェルについての平均Ｅｌｉｓｐｏｔ数は、ＩＣＤ線維芽細胞に対して３４４、そしてＥＧＦＰ線維芽細胞に対して２２であった。従って、このＴ細胞株は、ＩＣＤ特異的γ−ＩＦＮ分泌を実証した。
【０２７４】
ＣＤ８＋  ＩＣＤ特異的Ｔ細胞株のクラスＩ拘束を研究するために、抗体ブロッキング実験を、カリエスクラスＩ分子に特異的な抗体を用いて行った。刺激物質を、モノクローナル抗体Ｗ６／３２（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃ反応性）、モノクローナル抗体ＢＢ１２３．２（ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃ反応性）またはモノクローナル抗体ＢＢ７．２（ＨＬＡ−Ａ２特異的）のいずれかとともにあらかじめインキュベートした。Ｔ細胞応答を、標準的な一晩のγ−ＩＦＮ  Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを用いて測定した。応答細胞は、７回の刺激サイクルについて、インビトロで培養されるＩＣＤ特異的ＣＴＬ系統であり、そして１ウェル当たり１５，０００細胞で用いた。刺激物質は、ＩＣＤまたはＥＧＦＰのいずれかを用いてレトロウイルスによって形質導入される自己線維芽細胞であり、そして１ウェル当たり２，０００細胞で用いた。刺激物質を、アッセイに添加する前に、２０分間指示ｍＡｂ（５０μｇ／ｍＬ）とともにインキュベートした。このアッセイを、三連で行った。
【０２７５】
表２に示されるように、Ｗ６／３２抗体またはＢＢ１２３．２抗体のいずれかとの刺激細胞のインキュベーションは、ＩＣＤを形質導入される線維芽細胞の認識を完全にブロックしたが、一方、ＢＢ７．２とのインキュベーションは、γ−ＩＦＮ分泌に影響を与えなかった。これらの結果は、ＩＣＤ特異的活性が、ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子またはＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子によって拘束されたことを示す。
【０２７６】
（表２）
（ＩＣＤ特異的γ−ＩＦＮ分泌のＨＬＡクラスＩ抗体のブロッキング）
【０２７７】
【表２】
2004522412.tif 000004
バルク株から単離されるＩＣＤ特異的クローンを拡張し、そしてさらに、全長Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを認識する能力について特徴付けた。さらに、ＨＬＡクラスＩに特異的なモノクローナル抗体を用いて、クローンのＨＬＡ拘束を試験した。実験は、標準的な一晩のγ−ＩＦＮ  Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイであった。応答細胞は、ＩＣＤ特異的Ｔ細胞クローン、１７Ｄ５であった。刺激物質は、形質導入されないか、あるいはＥＧＦＰ、ＩＣＤまたは全長Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（Ｈ２Ｎ）のいずれかを用いて、レトロウイルスによって形質導入されるかのいずれかの自己線維芽細胞であった。１０，０００の１７Ｄ５細胞および１０，０００の刺激物質を、１ウェル当たり使用した。抗体を、アッセイにおいて、２５μｇ／ｍＬで使用した。このアッセイを三連で行い、そして標準偏差は、三連について、０と＋／−１８との間であった。
【０２７８】
表３に示されるように、このクローンは、ＩＣＤまたは全長Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを用いて形質導入される自己線維芽細胞を特異的に認識したが、形質導入されない線維芽細胞、または無関係の抗原、ＥＧＦＰを用いて形質導入される線維芽細胞は認識しなかった。さらに、この反応性は、ｐａｎ−ＨＬＡクラスＩモノクローナル抗体、ｗ６／３２の添加、ならびにＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子およびＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子に特異的なモノクローナル抗体（ＢＢ１２３．２）によって完全にブロックされたが、ＨＬＡ−Ａ２に特異的な抗体（ＢＢ７．２）によってはブロックされなかった。これらの結果によって、このＨｅｒ２／ｎｅｕ特異的クローンが、ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子またはＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子によって拘束され、そしてＨＬＡ拘束の同じパターンが、クローンが由来するバルク細胞株について観察されたことが示される。
【０２７９】
さらなる分析は、この応答が、ＨＬＡ−Ｂ４４０２によって拘束されたことを示した。これらの分析を、クローン１７Ｄ５が、異なるＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子およびＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子で調和され、そしてＡｄＶ−ＩＣＤまたはＡｄＶ−ＥＧＦＰを用いて感染される同種線維芽細胞のパネルを認識する能力を試験することによって行った。組換えレトロウイルスを用いた形質導入、または組換えＡｄＶを用いた感染のいずれかを受ける自己線維芽細胞を、コントロールとして用いた。
【０２８０】
（表３）
（ＩＣＤ特異的クローン、１７ＤＳのＨｅｒ−２／ｎｅｕ反応性のＨＬＡ拘束を試験するγ−ＩＦＮ  Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ）
【０２８１】
【表３】
2004522412.tif 000005
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ特異的クローンを、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを発現するヒト腫瘍細胞を認識する能力について試験した。乳房癌腫細胞株ＭＣＦ−７は、本来、低いレベルのＨｅｒ−２／ｎｅｕを細胞表面で発現し、そしてまた、ＨＬＡ−ｂ４４０２である。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕについてのレトロウイルス組換え体を用いたＭＣＦ−７の形質導入の際に、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの表面レベルは、フローサイトメトリー分析、その後のＨｅｒ−２／ｎｅｕ特異的モノクローナル抗体を用いた染色によって測定されるように、約５倍増大した。ＡｄＶ−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを用いたＭＣＦ−７細胞の感染は、腫瘍細胞に対して、表面Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの約２０倍の増大をもたらした。これらの結果を、図２に示す。
【０２８２】
このＴ細胞クローンは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕをコードするアデノウイルスを用いて感染されるＭＣＦ−７細胞に応答して、γ−ＩＦＮを分泌した。しかし、このクローンは、ＭＣＦ−７細胞、またはＨｅｒ−２／ｎｅｕを発現するレトロウイルスを用いて形質導入されるＭＣＦ−７細胞を認識しないようであった。このクローンが、ＩＣＤまたはＨｅｒ−２／ｎｅｕのいずれかを用いて形質導入されるヒト線維芽細胞を認識し、そしてこの形質導入される線維芽細胞が、形質導入されるＭＣＦ−７細胞と類似のレベルのタンパク質を発現するので、この結果が、単に抗原の発現レベルに起因するということはありそうもない。
【０２８３】
（実施例２）
（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕのＨＬＡ−Ｂ４４拘束され、本来プロセスされるエピトープの同定）
本実施例は、上記のＴ細胞クローンのうちの１つ、１７Ｄ５によって認識されるエピトープの特徴付けを記載する。このクローンは、ＩＣＤまたは全長Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質を発現するＡＰＣを認識した。このクローンについてのＨＬＡ拘束エレメントを、γインターフェロンＥｌｉｓｐｏｔアッセイにおけるＡＰＣとして、種々のＨＬＡ対立遺伝子で、Ｔ細胞クローンと調和する同種細胞株のパネルを用いることによって、ＨＬＡ−Ｂ４４０２であると決定した。これを、Ｂ４４０２組換えレトロウイルスを用いたＨＬＡ−Ｂ４４ネガティブの、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕポジティブのＡＰＣの形質導入によって確認して、認識を確認した。このクローンによって認識されるＩＣＤの領域を、ＩＣＤの一連の５つのフラグメントを発現する組換えレトロウイルスの使用によって限定して、Ｂ４４＋  ＡＰＣを形質導入した。これらのフラグメントのうちの２つのクローンによる認識（γインターフェロン放出によって実証されるような）は、エピトープが、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ配列の９７５位で開始する２３５アミノ酸フラグメントの内部に含まれることを示した。このフラグメント内部由来の推定のＢ４４を結合する９マーおよび１０マーのペプチドを選択および合成した。合成される１３のペプチドのうちの１つが、このクローンによって認識され、そしてエピトープであると決定した。これは、γインターフェロン放出アッセイおよびＴＮＦ−α放出アッセイによって実証されている。この本来プロセスされるＨｅｒ−２／ｎｅｕエピトープの配列は、以下である：ＥＥＹＬＶＰＱＱＧＦ（配列番号３）、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質配列における１０２１位〜１０３０位。
【０２８４】
（実施例３）
（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ  ＤＮＡおよびポリペプチドのワクチン接種は、Ｈｅｒ−２／Ｎｅｕを発現する腫瘍の成長を阻害する）
（材料および方法）
（動物）８〜１２週齢の雌性Ｃ５７Ｂ１／６マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から得、そしてＣｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎでの本発明者らの動物施設において維持した。
【０２８５】
抗体および試薬：ラット抗マウスＣＤ４（ＧＫ１．５）ハイブリドーマ細胞株およびラット抗マウスＣＤ８（２．４３）ハイブリドーマ細胞株を、ＡＴＣＣから得た。抗体を、腹水流体から精製した。Ａｂ−５（抗ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕ  ＥＣＤ特異的抗体）を、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から購入した。Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ７２０を、Ｓｅｐｐｉｃ  Ｉｎｃ．（Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ、ＮＪ）から購入した。
【０２８６】
腫瘍細胞株：ＥＬ４（Ｃ５７ＢＬマウスに本来由来するマウス胸腺腫）を、ＡＴＣＣから得た。ＥＬ４細胞を、標準的なエレクトロポレーションプロトコルを用いて、全長ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕを用いてトランスフェクトした。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを安定に発現するＥＬ４細胞を、ネオマイシンを用いたインビトロ薬物選択後に得た。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ発現を、フローサイトメトリー分析によって確認した。
【０２８７】
Ｈｅｒ−２ｎｅｕワクチン：Ｈｅｒ−２／ｎｅｕプラスミドＤＮＡワクチン（ｐＶＲ１０１２−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ）は、ＶＲ１０１２（Ｖｉｃａｌ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に挿入される全長ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕ  ｃＤＮＡからなった。ＥＣＤプラスミドＤＮＡワクチン（ｐＶＲ１０１２−ＩＣＤ）は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕのアミノ酸１〜６９５をコードするＤＮＡからなり、そしてＩＣＤプラスミドＤＮＡワクチン（ｐＶＲ１０１２−ＥＣＤ）は、ＶＲ１０１２において、アミノ酸６９２〜１２５６をコードするＤＮＡからなった。エンドトキシンを含まない大量のプラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）キット試薬および標準的な技術を用いて調製した。プラスミドＤＮＡワクチンを、０日目および２１日目に筋肉内送達した（１００μｇ）。ＩＣＤ（アミノ酸６７６〜１２５６）およびＥＣＤ（アミノ酸２２〜６５３）組換えサブユニットタンパク質を、Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにて産生した。手短に言えば、ＥＣＤタンパク質を、Ｌ細胞の安定なトランスフェクションによって産生し、そしてＤＥＡＥ、逆相ＨＰＬＣおよびＭｏｎｏ  Ｓカラムクロマトグラフィーの組み合わせを用いて精製した。ＩＣＤタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて産生し、そしてＨｉｇｈ  Ｑ陰イオン交換を介して、可溶化される封入体から精製し、その後、ニッケル樹脂アフィニティークロマトグラフィーに供した。組換えタンパク質ワクチンを、７：２（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ７２０：タンパク質）の比で、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ７２０と混合し、そして皮下送達した。
【０２８８】
（インビボ腫瘍モデル）腫瘍保護実験について、ＥＬ４−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ細胞の一定の供給源を確保するために、細胞を、インビボ継代（ｉ．ｐ．）によって拡張し、そして個々の実験における使用について、アリコートにおいて凍結した。腫瘍を、側腹に対して皮下注入される２００，０００のＥＬ４−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ細胞を用いて確立した。触診可能な腫瘍は、代表的には、注入の８〜１０日以内に発達した。腫瘍サイズを、マイクロカリパスデバイスを用いた腫瘍の領域（長さ×幅）の測定によって決定されるように、ｍｍ２で表す。
【０２８９】
（エフェクターＴ細胞のインビボ枯渇）マウスを、０日目および２１日目に、プラスミドＤＮＡまたはタンパク質を用いて免疫して、エフェクターＴ細胞を作製した。ＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞を、実験の開始後３５日目、３８日目および４２日目に、１日当たり１００μｇの精製抗ＣＤ４抗体または抗ＣＤ８抗体のｉ．ｐ．投与によって枯渇した。枯渇される脾臓細胞のフローサイトメトリー分析は、標的集団の９８％を超える枯渇を示した。
【０２９０】
免疫血清の養子移入：免疫血清を、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕプラスミドＤＮＡまたはＩＣＤタンパク質で免疫されるマウスの血液採取を通じて得た。各々の群からの１２の個々のマウス由来の血清を、６匹のナイーブなレシピエントマウスへの（ｉ．ｖ．）移入のためにプールした。免疫血清の抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体力価を、血清移入の前に、ＥＬＩＳＡによって評価した。
【０２９１】
（インビトロサイトカイン分析）マウス（１群当たり４匹）を、０日目および２１日目に、１００μｇのｐＶＲ１０１２またはｐＶＲ１０１２−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（ｉ．ｍ．）、あるいはＭｏｎｔａｎｉｄｅ中の５０μｇのＩＣＤタンパク質（ｓ．ｑ．）またはＭｏｎｔａｎｉｄｅ単独を用いて免疫した。第二の免疫化の２週間後、２．５×１０５の脾臓細胞を収集し、そしてインビトロで、媒体単独、ＩＣＤタンパク質またはＥＣＤタンパク質（１０μｇ／ｍｌ）を用いて刺激した。ＩＦＮγ分泌を、ＥＬＩＳＡによって、上清からインビトロ刺激の４８時間後にアッセイした。値は、４匹の個々のマウスについて、三連のウェルの平均を示す。
【０２９２】
（結果）
（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質サブユニットおよびプラスミドＤＮＡワクチンは、腫瘍保護を媒介する）
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの全長または短縮型形態のいずれかからなるＨｅｒ−２／ｎｅｕワクチンを、同系のＨｅｒ−２／ｎｅｕを発現する腫瘍細胞株を用いたチャレンジに対する防御免疫応答を惹起する能力について評価した。Ｃ５７Ｂ１／６マウスを、全長ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕ、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕのＩＣＤ部分またはＥＣＤ部分をコードするプラスミドＤＮＡを用いて免疫した。２つのＤＮＡ免疫化後、マウスを、全長ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕを用いてトランスフェクトされるＥＬ４細胞（ＥＬ４−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ）を用いて皮下チャレンジし、そして腫瘍成長をモニターした。ナイーブなマウスにおいて、ＥＬ４−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ細胞は、皮下投与の１４〜２０日以内に、大きな固形腫瘍を形成した。全長、ＩＣＤサブユニットまたはＥＣＤサブユニットのいずれかのＨｅｒ−２／ｎｅｕプラスミドＤＮＡを用いたワクチン接種は、腫瘍細胞の増殖を実質的に阻害した（図３）。大半のマウスは、腫瘍の発達から完全に保護されるが、一方、一部の動物は、腫瘍チャレンジ後３週間まで、腫瘍発達における遅延を実証する。類似のレベルの腫瘍保護が、短縮型Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ構築物および全長Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ構築物の両方を用いて達成されることに注意することが興味深い。
【０２９３】
タンパク質サブユニットワクチンがまた、腫瘍保護の惹起に有効であるか否かを決定するために、マウスを、ＩＣＤタンパク質またはＥＣＤタンパク質およびアジュバントを用いて免疫し、ＥＬ４−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを用いてチャレンジし、そして腫瘍成長についてモニターした。図４に示される結果は、ＩＣＤタンパク質を用いたワクチン接種が、部分的に防御免疫応答を惹起し、これにおいて、腫瘍を発達するマウスの頻度および腫瘍を保有するマウスの平均腫瘍サイズの両方が減少することを実証する。この代表的な実験において、ＩＣＤワクチン接種は、一動物の完全な保護、および腫瘍を発達するマウスの平均腫瘍サイズの減少（２３日目に１６２ｍｍ２）をもたらした。これを、ナイーブな群における４／４マウスの腫瘍成長（平均腫瘍サイズは、５２７ｍｍ２）、およびＥＣＤワクチン接種群における４／４マウスの腫瘍成長（平均腫瘍サイズは、４６２ｍｍ２）と比較する。
【０２９４】
予想外に、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ  ＤＮＡワクチン接種と比較して、タンパク質を用いたワクチン接種は、ＤＮＡワクチン接種ほど有効ではなかったことが明らかである。
【０２９５】
このモデルにおいて観察される保護が、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ特異的であるか否かを決定するために、マウスを、全長Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、またはベクター制御プラスミドＤＮＡを用いてワクチン接種し、そして引き続いて、親ＥＬ４細胞またはＥＬ４−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ細胞のいずれかを用いてチャレンジした。腫瘍の成長を、翌１０〜２５日にわたってモニターした。これらの結果は、腫瘍成長の阻害が、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕプラスミドＤＮＡを用いて免疫されるマウスにおいてのみ生じることを実証し、このことは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに対する免疫が惹起され、そして保護について必要とされることを示唆する。腫瘍保護が、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ特異的であるというさらなる証拠は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕプラスミドＤＮＡを用いたワクチン接種が、親ＥＬ４細胞の増殖を阻害しないという観察によって提供される。類似の結果は、ＩＣＤタンパク質が、ワクチンとして使用される場合に観察された（データは示さず）。合わせて、これらの結果は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕワクチンによって媒介される腫瘍保護が、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ特異的であることを示す。
【０２９６】
（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質サブユニットまたはプラスミドＤＮＡワクチンによって媒介される腫瘍保護の機構）
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕプラスミドＤＮＡまたはタンパク質のワクチン接種を用いた腫瘍保護の媒介を担う免疫応答の性質を決定するために、本発明者らは、次に、一連のインビボ枯渇実験および養子移入実験を行った。第一の実験を、ＣＤ４エフェクターＴ細胞およびＣＤ８エフェクターＴ細胞のそれぞれの役割を評価するように設計した。マウスを、全長Ｈｅｒ−２／ｎｅｕまたはコントロールのプラスミドＤＮＡを用いて２回免疫した。第二の免疫化の２週間後、マウスを、抗ＣＤ４抗体または抗ＣＤ８抗体を用いてインビボで処置して、エフェクターＴ細胞を枯渇した。９８％を超えるＣＤ４脾臓Ｔ細胞枯渇またはＣＤ８脾臓Ｔ細胞枯渇を、７日のクールにわたる抗体の３回の投与によって達成した。３日後、マウスを、ＥＬ４−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを用いてチャレンジし、そして腫瘍成長についてモニターした。図１に示される以前の実験と一致して、完全な腫瘍保護が、マウスにおいて観察され、このマウスは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕプラスミドＤＮＡを用いてワクチン接種された（未処理群）。対照的に、ＣＤ４エフェクターＴ細胞のインビボ枯渇は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ  ＤＮＡワクチン接種によって媒介される腫瘍保護を完全に阻害するが、ＣＤ８エフェクターＴ細胞は、これを阻害しない。類似の結果を、養子移入実験において獲得し、ここで、ＣＤ８枯渇エフェクターＴ細胞の養子移入が、腫瘍チャレンジに対する保護を与えたが、ＣＤ４枯渇エフェクターＴ細胞の養子移入は、これを与えなかったことが観察された（データは示さず）。集合的に、これらの結果は、この系におけるプラスミドＤＮＡワクチン接種によって媒介される保護が、ＣＤ４エフェクターＴ細胞の存在に依存するが、ＣＤ８エフェクターＴ細胞の存在には依存しないことを示唆する。
【０２９７】
類似の実験を、ＩＣＤタンパク質を用いたワクチン接種後に行って、このワクチンによって惹起される免疫応答におけるＣＤ４  Ｔ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞の役割を決定した。再び、マウスを、アジュバントにおけるＩＣＤタンパク質を用いて免疫およびブーストし、インビボ抗体処理によって、ＣＤ４エフェクターＴ細胞およびＣＤ８エフェクターＴ細胞を枯渇し、そして引き続いて、ＥＬ４−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを用いてチャレンジした。この結果は、ＣＤ４  Ｔ細胞またはＣＤ８  Ｔ細胞のいずれかの枯渇が、ＩＣＤワクチン接種を用いて得られる親保護を阻害することを示し、これは、ＣＤ４エフェクターＴ細胞およびＣＤ８エフェクターＴ細胞の両方が、ＩＣＤタンパク質媒介性の腫瘍保護における役割を果たすことを示唆する。養子移入実験の結果はまた、ＣＤ４エフェクター細胞およびＣＤ８エフェクター細胞の両方が、ＩＣＤタンパク質ワクチン接種によって惹起される免疫応答に重要であることを示した（データは示さず）。
【０２９８】
抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体が、腫瘍細胞に対する抗増殖効果を示し得ることが知られるので、本発明者らは、プラスミドＤＮＡまたはタンパク質のいずれかのワクチン接種によって惹起される抗体が、観察される保護に寄与するか否かを調査した。この問題に取り組むために、マウスを、全長Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ  ＤＮＡまたはＩＣＤタンパク質を用いて免疫およびブーストした。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ免疫マウス由来の血清または非免疫マウス由来のコントロール血清を収集し、次いで、ナイーブなマウスに移入し、次いでこのマウスを、ＥＬ４−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを用いてチャレンジした。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ  ＤＮＡ免疫血清由来の結果は、抗体の移入が、保護を与えなかったことを示した。これらの結果は、プラスミドＤＮＡワクチン接種を用いて得られる抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体のレベルがかなり低いと仮定すると、いくぶん予測可能である（データは示さず）。同様に、抗ＩＣＤ含有血清の移入は、この血清に存在する抗ＩＣＤ抗体の実質的力価（１０，０００〜１００，０００）の存在にもかかわらず、保護しなかった。合わせて、これらの結果は、抗体が、ＥＬ４−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ腫瘍細胞を用いて、このモデルにおいて観察される保護を媒介しないことを示唆する。
【０２９９】
これらのインビボ枯渇実験および養子移入実験の結果は、ＣＤ４＋Ｔ細胞が、このモデルにおいて、防御的な抗腫瘍免疫応答の惹起において、主要な役割を果たすことを示す。ＣＤ４＋  Ｔ細胞が保護を媒介する機構をより完全に解明するために、本発明者らは、Ｔ細胞のサイトカイン分泌プロフィール、その後のＨｅｒ−２／ｎｅｕ  ＤＮＡまたはＩＣＤタンパク質のいずれかを用いたワクチン接種を試験した。以下の表に要約される結果は、組換えＩＣＤタンパク質またはＥＣＤタンパク質を用いたインビトロ再刺激の際に、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕプラスミドＤＮＡをワクチン接種されるマウス由来の脾臓細胞が、刺激を受けない細胞と比較して、かなりのレベルのＩＦＮγを分泌することを実証する。ＩＣＤタンパク質をワクチン接種されるマウス由来の脾臓細胞はまた、ＩＣＤタンパク質を用いたインビトロ刺激に応答して、ＩＦＮγを産生したが、ＥＣＤタンパク質を用いたこの刺激に応答して、ＩＦＮγを産生しなかった。これらの同じ培養物におけるＩＬ４およびＩＬ５のレベルは、Ｔｈ１型免疫応答に一致して、検出未満であった。合わせて、これらの結果は、ＩＦＮγが、このモデルにおいて、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕワクチンによって媒介される保護において役割を果たし得ることを示唆する。
【０３００】
（表４）
（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ  ＤＮＡまたはタンパク質のワクチン接種後のＩＦＮγ産生）
【０３０１】
【表４】
2004522412.tif 000006
ａマウス（１群当たり４匹）を、０日目および２１日目に、１００μｇのｐＶＲ１０１２またはＶＲ１０１２−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（ｉ．ｍ．）、あるいはＭｏｎｔａｎｉｄｅ中の５０μｇのＩＣＤタンパク質（ｓ．ｑ．）またはＭｏｎｔａｎｉｄｅ単独を用いて免疫した。
ｂ第二の免疫化の２週間後、脾臓細胞を収集し、そしてインビトロで、媒体単独、ＩＣＤタンパク質またはＥＣＤタンパク質（１０μｇ／ｍｌ）を用いて刺激した。
ｃＩＦＮγ分泌を、ＥＬＩＳＡによって、インビトロ刺激の４８時間後にアッセイした。値は、４匹の個々のマウスについて、三連のウェルの平均を示す。
【０３０２】
（実施例４）
（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに特異的なＴ細胞クローンは、ヒト腫瘍細胞を認識する）
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに特異的なＴ細胞クローンを、実施例１に記載されるように、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕのＩＣＤについてのアデノウイルス組換え体を用いて感染される自己樹状細胞を用いたインビトロのプライミングによって誘導した。このＴ細胞クローンが、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを内因性に発現するヒト腫瘍を認識する能力を決定するために、以下の実験を行った。
【０３０３】
ヒト腫瘍細胞株、ＳＫＢＲ３（乳房癌腫）およびＳＫＯＶ３（卵巣癌腫）の両方は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを過剰発現する。ヒト腫瘍細胞株、ＨＣＴ−１１６（結腸癌腫）およびＭＣＦ−７（乳房癌腫）は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質をほとんど発現しないか、またはこのタンパク質を発現しない。これらの腫瘍のうち、ＭＣＦ−７のみが、ＨＬＡタイピングによって示されるようなＨＬＡ−Ｂ４４０２（このクローンについての制限対立遺伝子）を本来発現する。ＨＬＡ−Ｂ４４０２についてのレトロウイルス組換え体を用いて、ＳＫＯＶ３腫瘍細胞株、ＳＫＢＲ３腫瘍細胞株およびＨＣＴ−１１６腫瘍細胞株を形質導入した。フローサイトメトリー分析を行って、親および形質導入される腫瘍細胞株および線維芽細胞株のコントロールに対するＨＬＡクラスＩ発現、ＨＬＡ−Ｂ４４発現およびＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現を試験した。腫瘍細胞株または線維芽細胞株を、以下のＦＩＴＣ標識されるモノクローナル抗体を用いて染色した：ＩｇＧ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ネガティブコントロール）；抗ＨＬＡクラスＩ抗体（Ｓｉｇｍａ）；抗Ｂｗ４抗体（これは、ＨＬＡ−Ｂ４４（１λ）を含むＨＬＡ−Ｂ分子のサブグループを結合する）；抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体、ＣＮ２（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ由来のＡｂ２）。サンプルを固定し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。
【０３０４】
結果は、試験されるすべての細胞株が、期待どおり、細胞表面上で、ＨＬＡクラスＩを発現したことを実証した。自己線維芽細胞およびＭＣＦ−７腫瘍細胞が、ＨＬＡ−Ｂ４４を発現したが、親腫瘍細胞株、ＳＫＢＲ３、ＳＫＯＶ３またはＨＣＴ−１１６は、ＨＬＡ−Ｂ４４を発現しなかった。ＨＬＡ−Ｂ４４レトロウイルスを用いた以下の形質導入後、各々の腫瘍細胞株は、ＨＬＡ−Ｂ４４の発現を獲得した。期待どおり、ＳＫＢＲ３腫瘍細胞株およびＳＫＯＶ３腫瘍細胞株の両方は、細胞表面でＨｅｒ−２／ｎｅｕを発現し、そしてレベルは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを用いてレトロウイルスによって形質導入される自己線維芽細胞によって発現されるＨｅｒ−２／ｎｅｕの量に匹敵した。対照的に、ＭＣＦ−７、ＨＣＴ−１１６および形質導入されない線維芽細胞は、細胞表面でＨｅｒ−２／ｎｅｕをほとんど発現しないか、または発現しなかった。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕについてのレトロウイルス組換え体を用いて形質導入されるＭＣＦ−７細胞は、ＳＫＢＲ３およびＳＫＯＶ３によって発現されるレベルに匹敵したＨｅｒ−２／ｎｅｕのレベルを発現した。
【０３０５】
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ特異的ＣＴＬクローン（クローン１７Ｄ５）が上記の細胞株を認識する能力を、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＡおよびＴＮＦαバイオアッセイにおいて試験した。表５は、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＡの結果を示す。クローン１７Ｄ５は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを発現するように形質導入される自己ＨＬＡ−Ｂ４４０２ポジティブ線維芽細胞に応答して、ＩＦＮγを特異的に分泌した。重要なことに、クローン１７Ｄ５は、ＨＬＡ−Ｂ４４０２を用いて形質導入されるＳＫＢＲ３腫瘍細胞およびＳＫＯＶ３腫瘍細胞に応答して、ＩＦＮγを特異的に分泌したが、ＨＬＡ−Ｂ４４０２ネガティブの親を形質導入される腫瘍細胞株またはコントロールを形質導入される腫瘍細胞株に応答して、ＩＦＮγを分泌しなかった。クローン１７Ｄ５は、ＨＬＡ−Ｂ４４０２を用いて形質導入されるＨＣＴ−１１６腫瘍細胞株を認識しなかった。この結果は、ＨＣＴ−１１６細胞が、極めて低いレベルのＨｅｒ−２／ｎｅｕのみを発現するので予想された。１７Ｄ５はまた、乳房腫瘍細胞株ＭＣＦ−７またはＨｅｒ−２／ｎｅｕを用いて形質導入されるＭＣＦ−７を認識しなかった。これらの結果は、ＭＣＦ−７によって発現されるＨＬＡ−Ｂ４４０２の不十分なレベルによって最も説明されるようである。なぜなら、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕレトロウイルスを用いて形質導入されるＭＣＦ−７細胞に対するＨｅｒ−２／ｎｅｕのレベルが、対応する形質導入される線維芽細胞に対するＨｅｒ−２／ｎｅｕのレベルに類似するからである。（これは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ組換えアデノウイルスを用いた感染を介して、ＭＣＦ−７細胞における極めて高レベルのＨｅｒ−２／ｎｅｕを発現することによって克服され得る。）
（表５）
（ＩＣＤ特異的Ｔ細胞クローン１７Ｄ５１による腫瘍認識を実証するＩＦＮγ  ＥＬＩＳＡ）
【０３０６】
【表５】
2004522412.tif 000007
１標準的なＩＦＮγ  ＥＬＩＳＡを、指示刺激物質または媒体単独とのクローン１７Ｄ５  Ｔ細胞のインキュベートから得られる２４時間の上清を用いて行った。１７Ｄ５  Ｔ細胞および刺激物質を、このアッセイにおいて、各々１ウェル当たり１０，０００の細胞で用いた。アッセイを、９６ウェルプレートにおいて、三連で行った。Ｔ細胞を伴わずにインキュベートされる刺激物質からの上清を、コントロールとして含んだ、どの値も、バックグラウンドを超えなかった（データは示さず）。ＥＬＩＳＡの現像後、Ｏ．Ｄ．を、参照として５７０ｎｍを用いて、４５０ｎｍで読みとった。
２示されるデータは、三連のウェルについてのＯ．Ｄ．示度の平均である。
【０３０７】
ＴＮＦαバイオアッセイの結果は、ＩＦＮγの結果と一致した。
【０３０８】
ＥＬＩＳＡ：クローン１７Ｄ５は、ＳＫＢＲ３細胞株およびＳＫＯＶ３細胞株が、ＨＬＡ−Ｂ４４０２を発現するレトロウイルス構築物を用いて形質導入された場合、ＳＫＢＲ３およびＳＫＯＶ３の両方に応答して、ＴＮＦαを特異的に分泌した（表６）。
【０３０９】
（表６）
（Ｔ細胞クローン１７Ｄ５１による腫瘍認識を実証するＴＮＦαバイオアッセイ）
【０３１０】
【表６】
2004522412.tif 000008
１クローン１７Ｄ５  Ｔ細胞（１ウェル当たり１０，０００細胞）を、９６ウェルプレートにおいて三連で、指示ＡＰＣ（１ウェル当たり１０，０００細胞）とともにインキュベートするか、または媒体単独においてインキュベートした。４時間の上清を収集し、そしてＴＮＦα感受性細胞株ＷＥＨＩに添加し、９６ウェルプレートにおいて、１ウェル当たり３０，０００細胞でプレーティングした。ＷＥＨＩ細胞を、上清とともに一晩インキュベートし、そしてアロマー（ａｌｏｍａｒ）ブルーを、１ウェル当たり１０分の１の最終容量で添加した。Ｏ．Ｄ．５７０ｎｍ〜６３０ｎｍを、Ａｌｏｍａｒブルーの添加後７時間および２４時間で読みとった。示される結果は、２４時間の時点由来である。
２Ｏ．Ｄ．値は、三連のウェルの平均であり、そしてＴＮＦα感受性ＷＥＨＩ細胞の相対的生存能を示し、より低い値は、細胞死の増大、従って、ＴＮＦα分泌の増大を示す。
【０３１１】
上記の結果は、ＩＣＤ組換えアデノウイルスを用いてインビトロでプライムされるＣＤ８＋  Ｔ細胞が、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを過剰発現するヒト腫瘍細胞を認識し得ることを実証するので重要である。２０〜４０％のヒト乳房癌腫、ならびに卵巣、肺および結腸の癌腫の一部が、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを過剰発現する。これらのデータは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕポジティブ腫瘍についてのワクチンとしてのＩＣＤの使用を支持する。
【０３１２】
（実施例５）
（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕ  ＨＩＣＤの発現）
本実施例は、組換えヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕ  ＩＣＤ（ＨＩＣＤ）タンパク質の発現について作製された構築物を記載する。
【０３１３】
ヒトＩＣＤについてのオープンリーディングフレームを、Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質の発現について、ＰＣＲ増幅し、そして改変ｐＥＴ２８ベクターにサブクローニングした。２つの構築物を、一方はプロテアーゼ開裂部位を有し、他方はこの部位を有さないＮ末端ヒスチジンタグとともに作製した。１つの構築物を、Ｃ末端ヒスチジンタグを用いて作製し、そして１つの構築物を、ヒスチジンタグを用いずに作製した。
【０３１４】
ＨＩＣＤおよび８ＨＩＳ（ＨＩＣＤ＿ｐｌｕｓ＿８＿ＨＩＳ）の構造（配列番号５および配列番号１１）：
ＩＣＤコード領域を、以下のプライマーを用いて、ｐＧＳ１０  ＡＴＧプラスミドから本来ＰＣＲ増幅した：
ＰＤＭ−４４（配列番号１６）：
５’ａｔｃｔｃｔｇｇｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａｃｇａｔｇａｃａａｇａａａｃｇａｃｇｇｃａｇｃａｇａａｇ
ＰＤＭ−４５（配列番号１７）：
５’ｃａｇｇｇｃｇｃｇｃｃａｃｔｃｇａｇｔｃａｔｔａｃａｃｔｇｇｃａｃｇｔｃｃａｇａｃｃｃａｇ
このＰＣＲ条件は、以下の通りであった：１０μｌ  １０×Ｐｆｕ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、１．２５μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、３μｌ  １０μＭ  ＰＤＭ−４４オリゴ、３μｌ  １０μＭ  ＰＤＭ−４５オリゴ、８０μｌ滅菌水、２μｌ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、５ｎｇ  ｐＧＳ１０ΔＡＴＧ  ＤＮＡ。サーモサイクリング条件は、以下の通りであった：９６℃で２分間の単一変性工程、その後の９６℃で３０秒間、６８℃で１５秒間および７２℃で６分４５秒間の４０サイクル、ならびに７２℃で１０分間の最終伸長。サンプルを、さらなる分析まで４℃で保存した。このＰＣＲ産物を、改変ｐＴ７ブループラスミドにクローニングし、このプラスミドは、８つのＨｉｓタグコード領域を、ＢｓｓＨＩＩ部位とインフレームで含み、このＢｓｓＨＩＩ部位は、ＰＤＭ−４４プライマーに含まれる。このベクターおよびＰＣＲ産物を、ＢｓｓＨＩＩおよびＡｓｃＩを用いて消化した。正確な構築物を、配向についてスクリーニングし、次いで配列決定した。次いで、この構築物を、ＮｃｏＩ部位およびＡｓｃＩ部位で、ｐＥＴ１４ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）にクローニングした。次いで、この構築物を、ＮｃｏＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位で、ｐＥＴ２８ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）ベクターにクローニングした。最終構築物は、８つのヒスチジンタグ、ならびにエンテロキナーゼ開裂部位を含む。
【０３１５】
ｐＰＤＭコード配列におけるＨＩＣＤ（ＨＩＣＤ＿ｉｎ＿ｐＰＤＭ＿ｃｏｄｉｎｇ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（配列番号７および配列番号１０）の構築：
ＩＣＤコード領域をまた、以下のプライマーを用いて、ｃＤＮＡ鋳型からＰＣＲ増幅した：
ＰＤＭ−５９１（配列番号１８）５’ｃａｃａａａｃｇａｃｇｇｃａｇｃａｇａａｇａｔｃｃｇｇａａｇ３’
ＰＤＭ−５９２（配列番号１９）５’ｇｃｇｃｃａｃｔｃｇａｇｔｃａｔｔａｃａｃｔｇｇｃａｃｇｔｃ３’
このＰＣＲ条件は、以下の通りであった：１０μｌ  １０×Ｐｆｕ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、１μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、２μｌ  各１０μＭ  ＰＤＭ−５９１オリゴおよびＰＤＭ−５９２オリゴ、８３μｌ滅菌水、１．５μｌ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、１μｌ  ｃＤＮＡ。サーモサイクリング条件は、以下の通りであった：９６℃で２分間の最初の変性、その後の９６℃で３０秒間、６６℃で１５秒間および７２℃で５分間の４０サイクル。この後、７２℃で６分間の最終伸長が続く。このＰＣＲ産物を、ＸｈｏＩを用いて消化し、そしてｐＰＤＭ  Ｈｉｓ−（改変ｐＥＴ２８構築物）にクローニングし、これは、Ｈｉｓタグをインフレームで含み、これは、Ｅｃｏ  ７２ＩおよびＸｈｏＩを用いて消化されていた。正確な構築物を、配列分析を通じて確認し、次いで発現について、ＢＬＲ  ｐＬｙｓ  Ｓ細胞に形質転換した。
【０３１６】
ＨＩＣＤ  ＣＴ  Ｈｉｓコード領域（ＨＩＣＤ＿ＣＴ＿Ｈｉｓ＿ｃｏｄｉｎｇ＿ｒｅｇｉｏｎ）（配列番号４および配列番号８）の構築：
ＩＣＤコード領域を、以下のプライマーを用いて、ｃＤＮＡ鋳型からＰＣＲ増幅した：
ＰＤＭ−７２（配列番号２０）５’ｃｇａｃｔｔｃａｔａｔｇａａａｃｇａｃｇｇｃａｇｃａｇａａｇａｔｃ３’
ＰＤＭ−６１（配列番号２１）５’ｃｃａｃｇｔｃｔａｇａｇａａｇｇｃｇｃｇｃｃａｔｃｔｇｇａｔｃａｔｔａａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇｃａｃｔｇｇｃａｃｇｔｃｃａｇａｃｃｃａｇｇｔａ３’
このＰＣＲ条件は、以下の通りであった：１０μｌ  １０×Ｐｆｕ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、１μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、２μｌ  １０μＭ  ＰＤＭ−７２オリゴ、２μｌ  １０μＭ  ＰＤＭ−６１オリゴ、８３μｌ滅菌水、１．５μｌ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、１μｌ  ｃＤＮＡ。サーモサイクリング条件は、以下の通りであった：９６℃で２分間の最初の変性、その後の９６℃で３０秒間、６６℃で１５秒間および７２℃で５分間の４０サイクル。この後、７２℃で６分間の最終伸長が続く。このＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩを用いて消化し、そしてｐＰＤＭ  Ｈｉｓ−（改変ｐＥＴ２８構築物）にクローニングし、これは、Ｈｉｓタグをインフレームで含み、これは、ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩを用いて消化されていた。正確な構築物を、配列分析を通じて確認し、次いで発現について、ＢＬＲ  ｐＬｙｓ  Ｓ細胞に形質転換した。
【０３１７】
ＨＩＣＤネイティブコード領域（ＨＩＣＤ＿ｎａｔｉｖｅ＿ｃｏｄｉｎｇ＿ｒｅｇｉｏｎ）（配列番号６および配列番号９）の構築：
ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕのＩＣＤ領域のＣ末端部分を、ＫｐｎＩおよびＡｓｃＩを用いた消化によって、ＶＲ１０２ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕから単離した。この７０４ｂｐの挿入物を、Ｃ末端Ｈｉｓタグを有するｐＥＴ２８ＨＩＣＤにサブクローニングし、これはまた、ＫｐｎＩおよびＡｓｃＩを用いて消化された（この消化は、構築物からＣ末端Ｈｉｓタグを除去し、これは次いで、７０４ｂｐの挿入物を用いて置換される）。正確な構築物を、配列分析を通じて確認した。
【０３１８】
（実施例６）
（ｈｅｒ−２／ｎｅｕに特異的なＣＤ８  Ｔ細胞に由来するＴＣＲα鎖およびβ鎖のクローニングおよび配列決定）
本実施例は、実施例４に記載されるＨｅｒ−２／ｎｅｕに特異的なＣＤ８  Ｔ細胞クローンからのＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）α鎖およびβ鎖のクローニングおよび配列決定を記載する。配列分析は、ＴＣＲのα鎖が、Ｖα１６ファミリーに属し、そしてβ鎖が、Ｖβ１４ファミリーに属することを実証した。さらに、独特の多様性および結合セグメント（応答の特異性に寄与する）を同定した。
【０３１９】
ＣＴＬクローン１７Ｄ５由来の２×１０６細胞からの総ｍＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を用いて単離し、そしてｃＤＮＡを、Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｇｏキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて合成した。このクローンにおけるＶα配列およびＶβ配列を決定するために、ＶαサブタイプおよびＶβサブタイプに特異的なプライマーのパネルを合成し（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡによって作製されるプライマー配列に基づく）、そしてＲＴ−ＰＣＲ反応において、各々のクローンから作製されるｃＤＮＡとともに用いた。このＲＴ−ＰＣＲ反応は、各々のクローンが、Ｖβ１４サブファミリーに対応する共通のＶβ配列を発現することを実証した。さらに、このクローンから作製されるｃＤＮＡを用いて、発現されるＶα配列を、Ｖα１６であると決定した。クローン１７Ｄ５から、完全なＴＣＲα鎖およびβ鎖をクローニングするために、イニシエーターおよびターミネーターをコードするＴＣＲヌクレオチドに及ぶプライマーを設計した。このプライマーは、以下の通りであった：
ＴＣＲ  Ｖα−１６  ５’（センス）（ＢａｍＨＩ部位−−−Ｋｏｚａｋ−−ＴＣＲα配列）（配列番号２２）：ＧＧＡＴＣＣ−−−ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ−−ＡＴＧＧＣＣＴＣＴＧＣＡＣＣＣＡＴＣＴＣＧＡ
ＴＣＲα  ３’（アンチセンス）（ＳａｌＩ部位−−−ＴＣＲα定常配列）（配列番号２３）：ＧＴＣＧＡＣ−−−ＴＣＡＧＣＴＧＧＡＣＣＡＣＡＧＣＣＧＣＡＧ
ＴＣＲ  Ｖβ−１４  ５’（センス）（ＢａｍＨＩ部位−−−Ｋｏｚａｋ−−ＴＣＲα配列）（配列番号２４）：ＧＧＡＴＣＣ−−−ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ−−ＡＴＧＧＧＣＣＣＣＣＡＧＣＴＣＣＴＴＧＧＣＴＡ
ＴＣＲβ  ３’（アンチセンス）（ＳａｌＩ部位−−−ＴＣＲβ定常配列）（配列番号２５）：ＧＴＣＧＡＣ−−−ＴＣＡＧＡＡＡＴＣＣＴＴＴＣＴＣＴＴＧＡＣ。
【０３２０】
標準的な３５サイクルのＲＴ−ＰＣＲ反応を、プルーフリーディング熱安定ポリメラーゼＰＷＯ（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、ＣＴＬクローンおよび上記のプライマーから合成されるｃＤＮＡを用いて確立した。得られた特定のバンド（αについては約８５０ｂｐ、およびβについては約９５０ｂｐ）を、ＰＣＲ平滑ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に連結し、そしてＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。全長α鎖およびβ鎖を含むプラスミドを用いて形質転換されるＥ．ｃｏｌｉを同定し、そして対応するプラスミドの大規模調製物を作製した。全長ＴＣＲα鎖およびβ鎖を含むプラスミドを、配列決定した。この配列決定反応は、全長ＴＣＲα鎖およびβ鎖のクローニングを実証した。このα鎖およびβ鎖についてのｃＤＮＡ配列を、それぞれ配列番号１３および配列番号１２に開示し、そしてこのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１５および配列番号１４に開示する。ＢＬＡＳＴ検索は、Ｖαが、Ｖα１６ファミリーに属し、そしてＶβが、Ｖβ１４ファミリーに属することを確認した。ＴＣＲの特異性に寄与するこの多様性結合（ＤＪ）領域は、独特であった。
【０３２１】
上述から、本発明の特定の実施形態が、本明細書中において、例示の目的で記載されているが、種々の改変が、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなくなされ得ることが明らかである。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲による限定を除いて限定されない。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＡｄＶを用いてプライムされるＣＤ８＋  Ｔ細胞株におけるＩＣＤ反応性を実証する５１Ｃｒ放出アッセイの結果を示すグラフである。正常なドナーＰＢＭＣを、ＩＣＤを発現する組換えＡｄＶで感染されるＤＣを用いてプライムした。このアッセイは、標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイであった；示されるように、標的は、自己Ｂ−ＬＣＬであり、ＩＣＤまたはＥＧＦＰを発現する組換えワクシニアウイルスを用いて非感染または感染のいずれかを受けた。各々のデータポイントは、３つの測定値の平均であった。
【図２】
図２は、ＭＣＦ−７腫瘍細胞上の表面Ｈｅｒ−２／ｎｅｕのフローサイトメトリー分析の結果を示すグラフである。細胞を、表面Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに対するｍＡｂで染色し、その後、ＰＥに結合体化した二次ウサギ抗マウスＩｇ抗体で染色した。標識される細胞を、フローサイトメトリーによって分析した。平均蛍光強度についての値は、以下の通りであった：ＭＣＦ−７＝３２；ＭＣＦ−７＋ＲＴＶ−Ｈ２Ｎ＝１６５；ＭＣＦ−７＋Ａｄ−Ｈ２Ｎ＝６８３；ＭＣＦ−７＋ＲＴＶ−Ｈ２Ｎ＋Ａｄ−Ｈ２Ｎ＝６５１。
【図３】
図３は、ＥＬ４−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの増殖が、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕをコードするプラスミドＤＮＡを用いたワクチン接種によって阻害されることを例示する。マウス（１群あたり５匹）を、０日目および２１日目に、ｐＶＲ１０１  Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ｐＶＲ１０１２−ＥＣＤまたはｐＶＲ１０１２−ＩＣＤ（１００μｇ）を用いて（ｉ．ｍ．）免疫した。マウスを、３５日目に、２００，０００のＥＬ４−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ細胞を用いて皮下チャレンジした。腫瘍サイズを、腫瘍チャレンジ後２５日間モニターした。
【図４】
図４は、ＥＬ４−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの増殖が、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ  ＩＣＤを用いたワクチン接種によって部分的に阻害されるが、ＥＣＤタンパク質サブユニットを用いては阻害されないことを例示する。マウス（１群あたり４匹）を、０日目および２１日目に、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ７２０において、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ  ＩＣＤまたはＨｅｒ−２／ｎｅｕ  ＥＣＤタンパク質（５０μｇ）を用いて（ｓ．ｑ．）免疫した。マウスを、３５日目に、２００，０００のＥＬ４−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ細胞を用いて皮下チャレンジした。腫瘍サイズを、腫瘍チャレンジ後２５日間モニターした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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