(57)【要約】本発明はイソマルツロースを生産することができるトランスジェニック植物、６−０−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−ソルビトールを生産することができるトランスジェニック植物、１−０−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−マンニトールを生産することができるトランスジェニック植物、１，６−ＧＰＳと１，１−ＧＰＭの混合物を生産することができるトランスジェニック植物、これらの植物の増殖体及び収穫物、並びにこれらのトランスジェニック植物の作製方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの細胞が植物で生成されたスクロースからイソマルツロースを生産することができるトランスジェニック植物であって、植物の少なくとも１つの細胞が、スクロースイソメラーゼ活性をコードする安定的に組込まれた発現可能なヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、トランスジェニック植物。
【請求項２】
少なくとも１つの細胞が安定的に組込まれた発現可能なさらなるヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列がソルビトール脱水素酵素の活性をコードし、生成されたイソマルツロースから細胞が６−０−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−ソルビトール（１，６−ＧＰＳ）を生産し得るようにすることを特徴とする、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３】
少なくとも１つの細胞が安定的に組込まれた発現可能なさらなるヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列がマンニトール脱水素酵素の活性をコードし、生成されたイソマルツロースから細胞が１−０−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−マンニトール（１，６−ＧＰＭ）を生産し得るようにすることを特徴とする請求項１又は２に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４】
少なくとも１つの細胞がソルビトール脱水素酵素の活性をコードする安定的に組込まれた発現可能なさらなるヌクレオチド配列及びマンニトール脱水素酵素の活性をコードする安定的に組込まれた発現可能なさらなるヌクレオチド配列を含み、これらのヌクレオチド配列は生成されたイソマルツロースから細胞が１−０−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−マンニトール及び６−０−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−ソルビトールを生産し得るようにすることを特徴とする請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５】
少なくとも１つの細胞がソルビトール脱水素酵素の活性をコードする安定的に組込まれた発現可能なヌクレオチド配列を含むトランスジェニック植物。
【請求項６】
少なくとも１つの細胞がマンニトール脱水素酵素の活性をコードする安定的に組込まれた発現可能なヌクレオチド配列を含むトランスジェニック植物。
【請求項７】
ジャガイモであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。
【請求項８】
テンサイであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。
【請求項９】
ヌクレオチド配列が植物ベクターに含まれていることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。
【請求項１０】
コードヌクレオチド配列がｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ配列である請求項９に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１１】
スクロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列が微生物、特にプロタミノバクター、エルウィニア、セラチア、ロイコノストック、シュードモナス、アグロバクテリウム又はクレブシエラ属の微生物から、ソルビトール脱水素酵素をコードするヌクレオチド配列が微生物、特にグルコノバクター属の微生物から、マンニトール脱水素酵素をコードするヌクレオチド配列が微生物特にシュードモナス属の微生物から得られる請求項１０に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１２】
コードヌクレオチド配列が、植物細胞での転写を確実にする少なくとも１つの調節エレメントにより機能的に制御される請求項１〜１１のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。
【請求項１３】
少なくとも１つの調節エレメントがプロモーター、特に植物特異的プロモーターである請求項１２に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１４】
プロモーターが組織又は器官特異的、とりわけ貯蔵器官特異的プロモーターである請求項１３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１５】
コードヌクレオチド配列が読み枠の中でシグナル配列に融合しており、上記シグナル配列がスクロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質、ソルビトール脱水素酵素活性を有するタンパク質又はマンニトール脱水素酵素活性を有するタンパク質の所定の細胞画分又は所定の細胞小器官への輸送を確実にするシグナルペプチドをコードするか、又はシグナル配列に融合せず、スクロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質、ソルビトール脱水素酵素活性を有するタンパク質又はマンニトール脱水素酵素活性を有するタンパク質が細胞質に局在する請求項１〜１４のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。
【請求項１６】
コードヌクレオチド配列が終結シグナル及び／又はポリアデニル化シグナルと機能的に結合されている請求項１〜１５のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１つに記載の植物の増殖体及び／又は収穫物。
【請求項１８】
ａ）スクロースイソメラーゼの活性をコードするヌクレオチド配列による１以上の植物細胞の形質転換、
ｂ）形質転換した１以上の細胞のゲノムへのヌクレオチド配列の組込み、
ｃ）スクロースからイソマルツロースを生産する植物の再生
を包含する請求項１に記載のトランスジェニック植物の作製方法。
【請求項１９】
ａ）スクロースイソメラーゼ活性をコードするヌクレオチド配列、ソルビトール脱水素酵素活性をコードするヌクレオチド配列及びマンニトール脱水素酵素活性をコードするヌクレオチド配列からなるグループから選ばれた１以上のヌクレオチド配列による１以上の植物細胞の形質転換、
ｂ）形質転換した細胞のゲノムへのヌクレオチド配列の組込み、及び
ｃ）ソルビトール脱水素酵素、マンニトール脱水素酵素及び／又はスクロースイソメラーゼを生産する植物の再生、
を包含する請求項１〜４のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物の作製方法。
【請求項２０】
形質転換がそれぞれ使用されるヌクレオチド配列の共形質転換である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
形質転換される細胞が、スクロースイソメラーゼ活性をコードするヌクレオチド配列、ソルビトール脱水素酵素活性をコードするヌクレオチド配列及びマンニトール脱水素酵素活性をコードするヌクレオチド配列からなるグループから選ばれた少なくとも１つの安定的に組込まれたヌクレオチド配列を含むトランスジェニック細胞である請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
形質転換された１以上のヌクレオチド配列が植物ベクターに含まれていることを特徴とする請求項１８〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２３】
１以上のコードヌクレオチド配列がｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡである請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
スクロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列が微生物、特にプロタミノバクター、エルウィニア、セラチア、ロイコノストック、シュードモナス、アグロバクテリウム又はクレブシエラ属の微生物から、ソルビトール脱水素酵素をコードするヌクレオチド配列が微生物、特にグルコノバクター属の微生物から、マンニトール脱水素酵素をコードするヌクレオチド配列が微生物特にシュードモナス属の微生物から得られる請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
１以上のコードヌクレオチド配列が植物細胞での転写を確実にする少なくとも１つの調節エレメントによってそれぞれ機能的に制御される請求項１８〜２４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも１つの調節エレメントがプロモーター、特に植物特異的プロモーターである請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
プロモーターが組織又は器官特異的、とりわけ貯蔵器官特異的プロモーターである請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
１以上のヌクレオチド配列が読み枠の中でシグナル配列に融合しており、このシグナル配列がコードされたタンパク質の所定の細胞画分又は所定の細胞小器官への輸送を確実にするシグナルペプチドをコードするか、又はシグナル配列に融合せず、コードされたタンパク質が細胞質に局在する請求項１８〜２７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２９】
１以上のコードヌクレオチド配列が終結及び／又はポリアデニル化シグナルと機能的に結合されている請求項１８〜２８のいずれか１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本発明はイソマルツロースを生産することができるトランスジェニック植物、６−０−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−ソルビトール（以下１，６−ＧＰＳ）を生産することができるトランスジェニック植物、１−０−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−マンニトール（以下１，１−ＧＰＭ）を生産することができるトランスジェニック植物、１，６−ＧＰＳと１，１−ＧＰＭの混合物を生産することができるトランスジェニック植物、これらの植物の増殖体及び収穫物及びこのトランスジェニック植物の作製方法に関する。
【０００２】
スクロースの単糖単位間のグリコシド結合を異性化し、それによってスクロースのイソマルツロース及びトレハルロースへの変換を触媒することができる（例えば微生物、プロタミノバクター・ルブルム及びエルウィニア・ラポンティシの）スクロースイソメラーゼがドイツ国特許第４４１４１８５号明細書で知られている。この刊行物ではスクロースイソメラーゼをコードするＤＮＡ配列及びそれによって形質転換された細胞が説明される。
【０００３】
スクロースからＰａｌａｔｉｎｉｔ（登録商標）（イソマルト又は水素化イソマルツロースともいう）、１，６−ＧＰＳと１，１−ＧＰＭのほぼ等モル混合物並びに個別成分１，１−ＧＰＭ及び１，６−ＧＰＳを作製する方法も周知である。この方法はスクロースをイソマルツロースに酵素的に変換し、得たイソマルツロースを続いて化学的に水素化して２つの立体異性体１，６−ＧＰＳ及び１，１−ＧＰＭを作るものである。Ｓｃｈｉｗｅｃｋ（ａｌｉｍｅｎｔａ１９（１９８０），５−１６）はＰａｌａｔｉｎｉｔ（登録商標）の調製方法を開示する。この方法はスクロースをイソマルツロースに酵素的に変換し、単離されたイソマルツロースを続いてラネーニッケル触媒で水素化する。その場合スクロースのイソマルツロースへの変換は微生物プロタミノバクター・ルブルムによって行われ、こうして得たイソマルツロースをラネーニッケル触媒の存在で水素化して１，６−ＧＰＳ及び１，１−ＧＰＭとし、続いて蒸発及び冷却結晶化法により濃縮する。
【０００４】
まずスクロースを酵素によりイソマルツロース及びトレハルロース含有混合物に変換し、その際得られた生成物を触媒で水素化して１，１−ＧＰＭ、１，６−ＧＰＳ及び１−０−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−ソルビトール（１，１−ＧＰＳ）を含む混合物とする１，１−ＧＰＭ及び１，６−ＧＰＳを含む糖アルコール混合物の調製方法が欧州特許第０６２５５７８号明細書で説明される。
【０００５】
ルテニウム、ニッケル又はその混合物を含む触媒を使用して５０気圧以下の圧力でイソマルツロースを水素化する１，１−ＧＰＭ及び１，６−ＧＰＳの混合物の作製方法がドイツ国特許第１９５２３００８号明細書に開示されている。
【０００６】
担体に結合したニッケル触媒によりイソマルツロースを水素化して１，６−ＧＰＳと１，１−ＧＰＭの混合物を得る方法がドイツ国特許第１９７０１４３９号明細書に開示されている。
【０００７】
ドイツ国特許第１９７０５６６４号明細書は水素化イソマルツロースから１，６−ＧＰＳ又は１，１−ＧＰＭ濃縮混合物を作製する方法を開示する。この刊行物に記載された方法は、水素化イソマルツロース又は水素化イソマルツロースを含む混合物から１，６−ＧＰＳ及び／又は１，１−ＧＰＭ濃縮混合物を作製するものである。この方法を使用して、特定の条件で冷却結晶化により１，６−ＧＰＳ濃縮母液を濃縮することによって、純粋な形の１，６−ＧＰＳを作製することができる。
【０００８】
イソマルツロースを計画的に１，６−ＧＰＳに変換するために使用されるグルコノバクター属の微生物のソルビトール脱水素酵素がドイツ国特許公開第１９９６３１２６．３号に明細書で知られている。
【０００９】
最後に、イソマルツロースを１，１−ＧＰＭに変換することができるマンニトール脱水素酵素がシュードモナス属の微生物から単離された（Ｂｒｕｅｎｋｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔ Ｂｉｏｐｈｉｓｉｃａ Ａｃｔａ，１３５１（１９９７），１５７−１６７）。
【００１０】
先行技術による方法はＰａｌａｔｏｎｉｔ（登録商標）の調製、その個別成分及び前段階に関してとりわけ次の理由から不利であると考えられる。
【００１１】
第１に上記の物質のほとんどすべての製造方法で、まず出発物質としてのスクロースを物理的−化学的方法により例えばテンサイから分離し、後続の工程段階のために精製することが必要である。第２にスクロースから１，６−ＧＰＳ及び／又は１，１−ＧＰＭへのその後の精製は別の複雑な工程を含み、その際種々の反応装置で様々な物理的、化学的及び／又は生物学的方法を使用しなければならない。スクロースから計画的に１，６−ＧＰＳを得るために、例えば少なくとも２つの別個の酵素変換が必要である。その過程で一般に費用のかかる浄化段階を実施しなければならない。同じことが１，１−ＧＰＭ及びイソマルトの製造にもいえる。とりわけスクロースから１，１−ＧＰＭを得るには少なくとも１つの酵素変換、触媒、特殊な水素化反応器及び工業用水素を使用した化学的水素化並びに事前に得た１，１−ＧＰＭ及び１，６−ＧＰＳの混合物から１，１−ＧＰＭを分離するための後続の分離段階を実施しなければならない。
【００１２】
このようにして先行技術で公知の方法の重大は欠点は、多額の技術的経費を費やして複数の工程段階を実施することが必要なことである。またその場合得られる製品は食品工業で使用する予定であるから、例えば触媒から出る有毒物質が最終製品に入り込まないように工程を選定しなければならない。そのために別の精製段階が必要であり、その結果最終製品の収量が十分でないことが多い。
【００１３】
そこで本発明の根底にある技術問題は、イソマルツロース及びその水素化産物特に１，６−ＧＰＳ、１，１−ＧＰＭ又はこれらを含む混合物の簡単で安価な選択的調製を可能にする方法及びその実施のための手段を提供することである。
【００１４】
本発明は少なくとも１つの細胞が植物で生成されたスクロースからイソマルツロースを生産することができるトランスジェニック植物、特に形質転換したジャガイモ又は形質転換したテンサイを提供することによってこの技術問題を解決する。特に本発明は生成されたスクロースからイソマルツロースを生産する能力とともに、このイソマルツロースから１，６−ＧＰＳ及び／又は１，１−ＧＰＭを生産する能力を併せ持つ上記の植物に関する。このような植物は意外かつ好都合なことに生成物即ちスクロースの発生の場所で所望の最終産物の直接的生産を可能にするＰａｌａｔｏｎｉｔ（登録商標）、その個別成分及び前駆体イソマルツロースのｉｎ ｖｉｖｏ生産系を提供する。費用のかかる分離、精製及び／又は水素化工程はこの場合回避される。しかも有毒物質はまったく使用されない。
【００１５】
また本発明は上記の植物の作製方法を提供することによって、根底にある技術問題を解決する。
【００１６】
発明の説明
そこで本発明の好ましい実施形態は、少なくとも１つの細胞でスクロースからイソマルツロースを生産することができるトランスジェニック植物、特にトランスジェニック・テンサイ又はジャガイモに関する。このような植物は例えば植物からイソマルツロースを分離した後、化学的水素化によって得られるＰａｌａｔｉｎｉｔ（登録商標）の製造のための貴重な原料を提供する。その場合１，１−ＧＰＭと１，６−ＧＰＳの比が１：１でない１，１−ＧＰＭ、１，６−ＧＰＳ混合物ももちろん作製することができる。このような植物は結局スクロースからＰａｌａｔｉｎｉｔ（登録商標）又はその個別成分への完全な代謝経路を確立するその後の遺伝子工学的操作の出発点とすることができる。
【００１７】
本発明による、植物で生成されたスクロースからイソマルツロースを生産することができるトランスジェニック植物とは、スクロースイソメラーゼの活性をコードする安定的に組込まれた発現可能なヌクレオチド配列を含む植物を意味する。スクロースイソメラーゼはスクロースのイソマルツロースへの異性化を触媒する。その際スクロースのグルコースとフルクトースの間のα→β２グリコシド結合が別のグリコシド結合、特にα１→β６結合に変えられる。スクロースイソメラーゼの活性をコードする本発明による適当なヌクレオチド配列は、とりわけプロタミノバクター（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）又はクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属の微生物のヌクレオチド配列である。ドイツ国特許第４４１４１８５号明細書は微生物プロタミノバクター・ルブルム（ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｒｕｂｒｕｍ）及びエルウィニア・ラポンティシ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｒｈａｐｏｎｔｉｃｉ）のスクロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列の単離とクローニングを開示する。なお上記の文書のＤＮＡ配列の説明と調製については、本学説の開示内容に完全に包含されており、本発明の趣旨に基づきこのＤＮＡ配列に対して保護を請求する。
【００１８】
本発明の特に好ましい実施形態は、少なくとも１つ細胞がスクロースからイソマルツロースを、またこうして生成されたイソマルツロースから１，６−ＧＰＳを生産することができるトランスジェニック植物、特にトランスジェニック・テンサイ又はジャガイモに関する。
【００１９】
本発明に関連して、生成されたイソマルツロースから１，６−ＧＰＳを生産することができるトランスジェニック植物とは、スクロースイソメラーゼの活性をコードする安定的に組込まれた発現可能なヌクレオチド配列を含み、こうしてスクロースからイソマルツロースを生産することができ、さらにソルビトール脱水素酵素の活性をコードする安定的に組込まれた発現可能なヌクレオチド配列を含む植物を意味する。ソルビトール脱水素酵素活性はイソマルツロースを特異的に１，６−ＧＰＳに還元する。ドイツ国特許出願第１９９６３１２６．３号明細書では微生物グルコノバクター・スブオキシダンスの本発明による適当なソルビトール脱水素酵素が開示されている。なお上記の文書のＤＮＡ配列の説明と調製については、該説の開示内容に完全に包含されており、本発明の趣旨に基づきこのＤＮＡ配列に対して保護を請求する。
【００２０】
本発明の別の特に好ましい実施形態は、少なくとも１つの細胞が植物で生成されたスクロースからイソマルツロースを、そして、こうして生成されたイソマルツロースから１，１−ＧＰＭを生産することができるトランスジェニック植物、特にトランスジェニック・テンサイ又はジャガイモに関する。
【００２１】
本発明に関連して、生成されたイソマルツロースから１，１−ＧＰＭを生産することができるトランスジェニック植物とは、スクロースイソメラーゼの活性をコードする安定的に組込まれた発現可能なヌクレオチド配列を含み、こうしてスクロースからイソマルツロースを生成することができ、さらにマンニトール脱水素酵素の活性をコードする安定的に組込まれた発現可能なヌクレオチド配列を含む植物を意味する。マンニトール脱水素酵素活性はイソマルツロースを特異的に１，１−ＧＰＭに還元する。ＢｒｕｅｎｋｅｒらはＢｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｉｓｉｃａ Ａｃｔａ，１３５１（１９９７），１５７−１６７で微生物、蛍光菌（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＤＳＭ５０１０６の本発明に基づく適当なマンニトール脱水素酵素を説明する。なお上記の文書のＤＮＡ配列の記述と調製については、本学説の開示内容に完全に包含されており、本発明の趣旨に基づきこのＤＮＡ配列に対して保護を請求する。
【００２２】
発明の別の特に好ましい実施形態は、少なくとも１つの細胞が植物で生成されたスクロースからイソマルツロースを、こうして生成されたイソマルツロースから１，６−ＧＰＳと１，１−ＧＰＭの混合物、例えば１：１混合物を生産することができるトランスジェニック植物、特にトランスジェニック・テンサイ又はジャガイモに関する。
【００２３】
本発明に関連して、生成されたイソマルツロースから１，６−ＧＰＳ及び１，１−ＧＰＭを生産することができるトランスジェニック植物とは、スクロースイソメラーゼの活性をコードする安定的に組込まれた発現可能なヌクレオチド配列を含み、こうしてスクロースからイソマルツロースを生成することができ、かつソルビトール脱水素酵素の活性をコードする安定的に組込まれた発現可能なヌクレオチド配列及びマンニトール脱水素酵素の活性をコードする安定的に組込まれた発現可能なヌクレオチド配列を含むか、又は非特異的に水素化するポリオール脱水素酵素の活性をコードする安定的に組込まれた発現可能なヌクレオチド配列を含む植物を意味する。
【００２４】
本発明の別の実施形態は少なくとも１つの細胞がソルビトール脱水素酵素の活性をコードする安定的に組込まれた発現可能なヌクレオチド配列を含むトランスジェニック植物、特にテンサイ又はジャガイモに関する。
【００２５】
本発明の別の実施形態は、少なくとも１つの細胞がマンニトール脱水素酵素の活性をコードする安定的に組込まれた発現可能なヌクレオチド配列を含むトランスジェニック植物、特にテンサイを提供する。上記の２つの植物は酵素、ソルビトール脱水素酵素及びマンニトール脱水素酵素の供給を可能にする点で好都合である。しかも上記の植物はスクロースからＰａｌａｔｏｎｉｔ（登録商標）を生産するトランスジェニック植物の作製のための出発材料として利用することができる。その場合スクロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を上記の植物に導入しなければならない。
【００２６】
トランスジェニック植物は多種多様な種、属、科、目及び綱の植物、即ち単子葉及び双子葉植物並びに藻類、蘚類、シダ類又は裸子植物である。トランスジェニック植物はカルス、植物細胞培養及びその一部、器官、組織、収穫物又は増殖体も包含する。
【００２７】
本発明によれば、トランスジェニック植物は特に貯蔵器官でスクロースを生産することができる有用植物、例えばサトウキビ又はテンサイである。また本発明は本発明植物の増殖体及び収穫物、例えば花、果実、貯蔵器官、塊根、茎、種子、塊茎、根、葉、根茎、苗木、挿し木等に関する。
【００２８】
本発明に関連して「その細胞の少なくとも１つで」という表現は、トランスジェニック植物がスクロースイソメラーゼ活性及び／又はソルビトール脱水素酵素活性及び／又はマンニトール脱水素酵素活性をコードする１以上の安定的に組込まれたヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの細胞、但し好ましくは多数の細胞を含むことを意味する。細胞はとりわけスクロースが生成又は貯蔵される細胞である。トランスジェニック・テンサイの場合はテンサイ貯蔵器官の細胞即ち塊根細胞であり、トランスジェニック・ジャガイモの場合は根茎細胞であることが好ましい。
【００２９】
ヌクレオチド配列は細胞核、また色素体ゲノム又はミトコンドリアゲノムに、とりわけ次世代に安定的に遺伝されるように組み込むことが好ましい。
【００３０】
そこで本発明はまた上記のヌクレオチド配列を含むトランスジェニック細胞及びこのような細胞に由来する植物に関する。
【００３１】
このような細胞は、天然にはこれらの細胞に現われない１以上の上記のコードヌクレオチド配列を含むか、又は上記のコードヌクレオチド配列が天然に現われないゲノム座位に組み込まれているか、又は上記のコードヌクレオチド配列が天然のコピー数と異なるコピー数で存在することが、天然に現われる細胞と相違する。さらに上記の植物は本発明に基づき生じさせた代謝活性及び上記の酵素の発現が相違する。本発明は成長力、表現型及び／又は栽培条件が野生型植物とまったく同じである上記植物を提供する利点がある。
【００３２】
本発明に関連して「安定的に組み込まれた発現可能なヌクレオチド配列」という表現は、ヌクレオチド配列がこのヌクレオチド配列の植物ゲノムへの安定的な組込みを行わせる核酸エレメントと結合され、組込まれたヌクレオチド配列が植物細胞の天然に存在するゲノムの構成要素によって複製されること、及びヌクレオチド配列がヌクレオチド配列の転写及びヌクレオチド配列によりコードされた産物のその後の発現を確実にする調節ＤＮＡエレメントと結合されていることを意味する。
【００３３】
好ましい実施形態では上記のヌクレオチド配列を植物細胞で特にセンス配向で発現するために、好ましい実施形態ではこのヌクレオチド配列のコード領域が調節エレメントと結合される。特に植物細胞での転写を確実にするプロモーターがこれに含まれる。上記のヌクレオチド配列の発現のために、原則として相同プロモーターも異種プロモーターも考えられる。その場合構成的発現を生じさせるプロモーター又は植物の発育の特定の時期に特定の組織でだけ又は外的影響を受ける特定の時にだけ作用するプロモーターを取り上げることができる。また好ましい実施形態では上記のヌクレオチド配列が終止配列と結合され、それによって正しい転写終了と転写物へのポリ（Ａ）テールの付加が生じる。このようなエレメントは文献に記載されている（Ｇｉｅｌｅｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．， ８ （１９８９），２３−２９）。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態ではヌクレオチド配列が組織又は器官特異的、特に貯蔵器官特異的プロモーターの制御のもとで少なくとも１つの植物細胞に発現されることによって、酵素活性をコードするヌクレオチド配列の発現が得られる。
【００３５】
酵素活性をコードするヌクレオチド配列を種子組織で発現するための組織特異的プロモーターは、例えばエンドウのビシリン（Ｖｉｃｉｌｉｎ）プロモーターである（Ｎｅｗｂｉｇｉｎら、Ｐｌａｎｔａ， １８０（１９９０），４６１−４７０）。本発明の別の好ましい実施形態はいわゆるシンク器官の表皮及び柔組織で上記のヌクレオチド配列を発現するために、シロイヌナズナ・プロモーターＡｔＡＡＰ１（早期の胚発育で内乳での発現）又はＡｔＡＡＰ２（珠柄の師部での発現）（Ｈｉｒｎｅｒら、ＰｌａｎｔｂＪ．， １４ （１９９８），５３５−５４４）を使用する。
【００３６】
特に好ましい実施形態では酵素活性をコードするヌクレオチド配列が、大量のスクロースを蓄積する植物器官で発現される。例えばテンサイの塊根、サトウキビの幹又はジャガイモのＡＧＰａｓｗアンチセンスライン９３、いわゆる「スクロースバレイショ」の塊茎がこれに属する（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｒｏｅｂｅｒら、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， ２２４（１９９０）， １３６−１４６）。酵素活性をコードするヌクレオチド配列のこのような器官での発現は、例えばジャガイモのＢ３３遺伝子のＢ３３プロモーターを使用することによって実現される（Ｒｏｃｈ−Ｓｏｓａら、ＥＭＢＯ Ｊ．， ８（１９８８），２３−２９）。
【００３７】
発明の別の実施形態では構成的発現プロモーター例えばＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、アグロバクテリウムの伴細胞特異的ｒｏｌＣプロモーター又は増強ＰＭＡ４プロモーター（Ｍｏｒｉａｎら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．， １９ （１９９９）， ３１−４１）を使用することができる。
【００３８】
発明の別の実施形態は、酵素活性をコードするヌクレオチド配列が読み枠の中でシグナル配列に融合されたトランスジェニック植物に関する。このシグナル配列は酵素活性を有する遺伝子産物を真核細胞の小胞体に取り込むためにシグナルペプチドをコードする。このようにして本発明は細胞の特定の画分への遺伝子産物の局在化を可能にするシグナル配列をヌクレオチド配列に設けることができる。特に小胞体へのタンパク質の取り込みをもたらすシグナルペプチドをコードするシグナル配列が考えられる。このシグナルペプチドは、前駆体タンパク質で検出されるが、プロセシングされた成熟タンパク質では検出されないことによって検証される。周知のようにシグナルペプチドは小胞体に取り込まれるときにタンパク質分解によって取り除かれるからである。発明の一実施形態ではシグナルペプチド、例えばジャガイモのプロテアーゼインヒビターの短縮されたＮ末端配列（Ｋｅｉｌら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １４ （１９８６）， ５６４１−５６５０； Ｓｃｈａｅｗｅｎら、ＥＭＢＯ Ｊ． ９ （１９９０），３０３３−３０４４）を使用することができ、それによって小胞体への遺伝子産物の取り込みとその後のアポプラスト領域への分泌が得られる。もちろん本発明に基づきその他のシグナル配列も使用することができる。
【００３９】
本発明の別の実施形態は、酵素活性をコードするヌクレオチド配列を、真核細胞特に植物細胞の小胞体への取り込み及び液胞への輸送のためにシグナルペプチドをコードするシグナル配列に融合させる。遺伝子産物の液胞への局在化が特に好都合である。本発明に基づき例えばオオムギのレクチンの液胞局在化のためのシグナルペプチド（Ｒａｉｋｈｅｌ及びＬｅｒｎｅｒ， Ｄｅｖ． ＧＥｎｅｔ．， １２ （１９９１）， ２５５−２６０）、マメの成熟フィトヘマグルチニンのアミノ末端領域の４３アミノ酸をコードするシグナル配列（Ｔａｇｕｅら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，２（１９９０），５３３−５４６）及びジャガイモのパタチン（Ｐａｔａｔｉｎ）遺伝子のシグナル配列を使用することができる。
【００４０】
本発明によれば遺伝子産物の液胞への局在化のためにパタチン−Ｂ３３遺伝子のシグナル配列、特にプロペプチドのアミノ末端の２３アミノ酸をコードするシグナル配列（Ｒｏｓａｈｌら、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， ２０３（１９８６），２１４−２２０）、即ち７３６〜８０４のヌクレオチドを使用することが特に好ましい。この配列はジャガイモのゲノムＤＮＡ及びＢ３３遺伝子のｃＤＮＡの断片として得られる。拡張されたＢ３３シグナル配列とコードヌクレオチド配列の融合は液胞への遺伝子産物の取り込みをもたらす。
【００４１】
別の特に好ましい実施形態では酵素活性をコードするヌクレオチド配列がシグナル配列と融合せず、発現された遺伝子産物が細胞質に残る。
【００４２】
また本発明はスクロースイソメラーゼの活性をコードするヌクレオチド配列、ソルビトール脱水素酵素の活性をコードするヌクレオチド配列及びマンニトール脱水素酵素の活性をコードするヌクレオチド配列からなるグループから選ばれた１以上のヌクレオチド配列を含むベクター特にプラスミドによる１以上の植物細胞の形質転換と、このベクター又はプラスミドに含まれるコードヌクレオチド配列（場合によってはそのシグナル配列及び／又は調節エレメントを含む）の形質転換細胞のゲノムへの組込みと、ソルビトール脱水素酵素、マンニトール脱水素酵素及び／又はスクロースイソメラーゼを生産する無傷の結実可能な形質転換植物への植物細胞の再生とからなる上記のトランスジェニック植物の作製方法に関する。
【００４３】
植物宿主細胞へのＤＮＡの導入のために、多数の方法がある。多くの方法では導入されるヌクレオチド配列がクローニング及び／又は発現ベクターに存在することが必要である。ベクターは原則としてプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、シャトルベクター及び遺伝子技術で慣用のその他のベクターである。ベクターはさらに宿主生物でベクターを安定化し及び／又はその複製を可能にするその他の機能単位を持つことができる。またベクターは、含まれたヌクレオチド配列を機能的に結合し、宿主生物でヌクレオチド配列を発現させる調節エレメントを含むことができる。このような調節エレメントはプロモーター、エンハンサー、オペレーター及び／又は転写終止シグナルである。さらにベクターはそれを含む宿主生物の選択を可能にする標識遺伝子、例えば抗生物質耐性遺伝子を含むことが多い。
【００４４】
植物細胞へのＤＮＡの導入のための方法は、形質転換手段としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス又はアグロバクテリウム・リゾゲネスを使用するＴ−ＤＮＡを有する植物細胞の形質転換、原形質体融合、微量注入、ＤＮＡのエレクトロポレーション、バイオリスティック法によるＤＮＡの挿入及びその他の方法を包含する。植物細胞への微量注入及びＤＮＡのエレクトロポレーションの場合は、使用されるプラスミドに対して元来特別な要求はない。単純なプラスミド、例えばｐＵＣ誘導体を使用することができる。ところがこのような形質転換細胞から全植物を再生しようとするときは、選択可能な遺伝標識が存在しなければならない。
【００４５】
コードヌクレオチド配列の植物細胞への導入のために使用する方法によっては、ベクターは別のＤＮＡ配列を含むことが必要である。例えば植物細胞の形質転換のためにＴｉ−又はＲｉ−プラスミドを使用する場合は、フランキング領域として少なくとも右の境界配列、多くの場合は左右の境界配列を、導入される遺伝子と結合することが必要である。形質転換のためにアグロバクテリウムを使用するときは、導入されるＤＮＡを特別のプラスミド、すなわち中間ベクター又はバイナリーベクターにクローニングしなければならない。Ｔ−ＤＮＡの配列と相同の配列に基づき、中間ベクターを相同的組換えによりアグロバクテリウムのＴｉ−又はＲｉ−プラスミドに組込むことができる。またこの中間ベクターはＴ−ＤＮＡの転移のために必要なＶｉｒ領域を含む。中間ベクターをアグロバクテリウムで複製することはできない。ヘルパープラスミドによって中間ベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンスに転移することができる。これと対照的にバイナリーベクターは大腸菌でもアグロバクテリウムでも複製することができる。バイナリーベクターは選択マーカーの遺伝子及び左右のＴ−ＤＮＡ境界領域に囲まれるリンカー又はポリリンカーを含む。バイナリーベクターはアグロバクテリウムで直接的に形質転換される（Ｈｏｌｓｔｅｒら、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， １６３（１９７８），１８１−１８７）。宿主細胞として利用されるアグロバクテリウムは、ｖｉｒ領域を持つプラスミドを含むという。このｖｉｒ領域はＴ−ＤＮＡを植物細胞に転移するために必要である。こうして形質転換されたアグロバクテリウムは植物細胞の形質転換のために使用される。植物細胞の形質転換のためのＴ−ＤＮＡの使用はとりわけ欧州特許第１２０５１６号明細書；Ｈｏｅｋｅｍａ： Ｔｈｅ Ｂｉｎａｒｙ Ｐｌａｎｔ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｏｆｆｓｅｔｄｒｕｋｋｅｒｅｊ Ｋａｎｔｅｒｓ． Ｂ． Ｖ， Ａｌ−ｂｌａｓｓｅｒｄａｍ （１９８５）， Ｋａｐｉｔｅｌ Ｖ； Ｆｒａｌｅｊら、Ｃ−ｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．， ４， １−４６及びＡｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．， ４（１９８５），２７７−２８７に記載されている。ＤＮＡを植物細胞に転移するために、植物外植片をアグロバクテリウム・ツメファシエンス又はアグロバクテリウム・リゾゲネスと共存培養することができる。感染した植物材料、例えば葉片、茎断片、根、さらには原形質体又は懸濁培養した植物細胞から次に形質転換細胞の選択のために抗生物質又は生物致死剤を含む適当な培地で再び全植物を再生することができる。アグロバクテリウム・ツメファシエンスによる塊根細胞の好ましい形質転換方法が欧州特許第０５１７８３３号明細書に開示されている。
【００４６】
バイオリスティック法を使用した、又は原形質体形質転換による外部ＤＮＡの別の導入法がとりわけＬ． Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ （Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ａ Ｍｕｌｔｉ−Ｖｏｌｕｍｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｒｅａｔｉｓｅ （Ｈ． Ｊ． Ｒｅｈｍ， Ｇ． Ｒ−ｅｅｄ， Ａ． Ｐｕｅｈｌｅｒ， Ｐ． Ｓｔａｄｌｅｒ監修）２巻（１９９３）、６２７−６５９，ＶＣＨ Ｗｅｉｎｈｅｉｍ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂａｓｅｌ Ｃ−ａｍｂｒｉｄｇｅ所載）に開示されている。単子葉植物の形質転換のための代替となる系は電気的又は化学的に誘導される原形質体へのＤＮＡの取り込み、半透過性細胞のエレクトロポレーション、花序へのＤＮＡのマクロインジェクション、小胞子及び原芽体へのＤＮＡのマイクロインジェクション、発芽する花粉によるＤＮＡの取り込み、膨潤による胚へのＤＮＡの取り込みである（Ｐｏｔｒｙｋｏｓ， Ｐｈｉｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ （１９９０），２６９−２７３）。最近の研究は単子葉植物もアグロバクテリウムをベースとするベクターによって形質転換できることを指摘する（Ｃｈａｎら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２ （１９９３），４９１−５０６；Ｈｉｅｉら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．， ６（１９９４），２７１−２８２；Ｂｙｔｅｂｉｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８４（１９８７），５３４５−５３４９；Ｒａｉｎｅｒｉら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８ （１９９０），３３−３８；Ｇｏｕｌｄら、Ｐｌａｎｔ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９５（１９９１），４２６−４３４；Ｍｏｏｎｅｙら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉ−ｓｓ．＆ Ｏｒｇ． Ｃｕｌｔ． ２５（１９９１），２０９−２１８；Ｌｉら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２０（１９９２），１０３７−１０４８）。各種の穀物について上記の形質転換系の幾つかが確立されている。例えば組織のエレクトロポレーション、原形質体の形質転換及び再生可能な組織及び細胞へのパーティクルガンによるＤＮＡ導入等である（Ｊａｅｈｎｅら，Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ， ８５（１９９５），３５−４４）。コムギの形質転換がＭａｈｅｓｈｗａｒｉら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｉｎ Ｐｌａｎｔ，１４（２）（１９９５），１４９−１７８により、トウモロコシの形質転換がＢｒｅｔｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．， ９４（１９９７），７３７−７４８及びＩｓｈｉｄａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４（１９９６），７４５−７５０により説明された。
【００４７】
下記の図と実施例に基づき発明を説明する。
【００４８】
実施例１：スクロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含むベクターの作製
植物で発現可能なプロモーター、スクロースイソメラーゼをコードするプロタミノバクター・ルブルムのヌクレオチド配列及びＴ−ＤＮＡオクトピンシンターゼのポリアデニル化シグナル（Ｇｉｅｌｅｎら、１９８４）をそれぞれバイナリーベクターに含む一連の構築物を作製した。コードヌクレオチド配列は、遺伝子産物の液胞局在化を生じさせるジャガイモのパタチン遺伝子のシグナル配列（Ｒｏｓａｈｌら、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， ２０３（１９８６），２１４−２２０）と融合するか、又は液胞標的配列なしで各植物細胞の細胞質で発現させるために使用した。プロモーターとしてＣａＭＶ３５Ｓプロモーターもジャガイモのパタチン遺伝子Ｂ３３のプロモーター（Ｒｏｃｈａ−Ｓｏｓａら、ＥＭＢＯ Ｊ．， ８ （１９８９），２３−２９）も使用した。このプロモーターによってジャガイモの塊茎及びテンサイの貯蔵塊根で器官特異的発現が得られる。ジャガイモの場合はすでにＢ３３プロモーター及びポリアデニル化シグナルを含み、さらにマーカーとしてＨｙｇ耐性遺伝子を含むバイナリーベクターｐＢＩＮＢ３３−Ｈｙｇ（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １８ （１９９０），２０３）を使用した。テンサイの場合はカナマイシン耐性遺伝子を有するバイナリーベクターｐＧＡ４９２（Ａｎ， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ８１（１９８６），８６−９１）を使用した。得たプラスミドでアグロバクテリウムを形質転換した。形質転換したアグロバクテリウムをジャガイモ又はテンサイの形質転換のために使用した。スクロースイソメラーゼをコードする配列の５’末端が“インフレーム”でパタチン遺伝子のシグナルペプチドと、３’末端がＴ−ＤＮＡのオクトピンシンターゼのポリアデニル化シグナルと融合し、Ｂ３３プロモーターにより制御されるプラスミドＵＬ８−１９の構造を次に説明する。
【００４９】
プロタミノバクター・ルブルムのスクロースイソメラーゼの未変性遺伝子をベクターｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ， ２ （２） （１９７７）， ９５−１１３；Ｐｅｄｅｎ，ＧＥｎｅ，２２（２−３）（１９８３），２７７−２８０）に含む、図１に示すプラスミドｐＨＷＧ２７９，１（シュツットガルト大学マッテス教授のご好意により提供していただいた）の約１．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片（スクロースイソメラーゼコード配列を含む）をベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ハイデルベルク）にクローニングして、ｐＳＫ２７９，１と呼ばれるプラスミドを得た。パタチン遺伝子の液胞シグナルペプチド（２９７ｂｐ，Ｒｏｓａｈｌら、１９８６）の“インフレーム”でクローニングするためにパタチン遺伝子のシグナル配列をＰＣＲ法で増幅し、末端を制限酵素ＡｐａＩ及びＳａｌＩで切断した後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫにクローニングして、プラスミドｐＳＫ２７９を得た。プラスミドｐＳＫ２９７を制限酵素ＳａｌＩで切断し、突き出た末端を平らな末端に変え、続いてプラスミドｐＳＫ２７９，１の１．７ｋｂの断片と結合した。プラスミドｐＳＫ２７９，１の末端は予め同じく平らな末端に変えておいた。得たプラスミドをＵＬ５−１９と名づけた。試験のためにシグナル配列とスクロースイソメラーゼコード配列の間の架橋領域で、架橋が適正であることを証明するために配列決定した。そして、架橋は適正であるが、プラスミドｐＨＷＧ２７９，１のスクロースイソメラーゼコード配列は幾つかの配列の欠陥、とりわけ停止コドンが含まれていることが判明した。そこでＨｉｎｄＩＩＩ断片を無欠陥のスクロースイソメラーゼコードＨｉｎｄＩＩＩ断片と取り替えた。得たプラスミドｐＨＷＧ４３２，３を大腸菌ＤＨ５αで形質転換した後、酵素活性を検査した。プラスミドｐＨＷＧ４３２，３をＸｂａＩで切断し、突出末端を平らにし、その上でＡｓｐ７１８で切断することにより、シグナル配列と融合したｃＤＮＡを単離した。その際得られた２．０ｋｂの断片をバイナリーベクターｐＢｉｎＢ３３−Ｈｙｇにクローニングし、方向づけられたクローニングが可能なように、これをＳａｌＩで（その場合は突き出た末端を続いて平らにした）及びＡｓｐ７１８で切断した。こうして得たＵＬ８−１９と呼ばれるベクターでアグロバクテリウム・ツメファシエンス株ｐＧＶ２２６０（Ｄｅｂｌａｅｒｅら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ．，１３（１９８５），４７７７−４７８８）をエレクトロポレーションにより形質転換した。形質転換したアグロバクテリウムをジャガイモのＡＧＰａｓｅ−アンチセンスライン９３（いわゆる「シュガーポテト」；Ｍｕｌｌｅｒ−Ｒｏｅｂｅｒら、１９９０）及びジャガイモ野生型変種Ｄｅｓｉｒｅｅの形質転換のために使用した。その際トランスジェニック植物０８６ＢＫ又は０９６ＢＫを得た。
【００５０】
実施例２：ソルビトール脱水素酵素をコードするヌクレオチド配列を含むベクターの作製
植物で発現可能なプロモーター、ソルビトール脱水素酵素をコードするグルコノバクター・スブオキシダンスのヌクレオチド配列及びＴ−ＤＮＡ−オクトピンシンターゼのポリアデニル化シグナルをそれぞれバイナリーベクターに含む一連の構築物を作製した。本例でもコードヌクレオチド配列は、遺伝子産物を液胞に局在させるためにパタチン遺伝子のシグナル配列と融合するか、又は液胞標的配列なしで細胞の細胞質に遺伝子産物を発現するために使用した。プロモーターとしてＣａＭＶ３５Ｓプロモーター又はジャガイモのＢ３３遺伝子のＢ３３プロモーターを使用した。ジャガイモの場合はすでにＢ３３プロモーター及びポリアデニル化シグナルを含むバイナリーベクターｐＢｉｎＢ３３−Ｈｙｇ、テンサイの場合はバイナリーベクターｐＧＡ４９２を使用した。得たプラスミドでアグロバクテリウムを形質転換した。形質転換したアグロバクテリウムをジャガイモ又はテンサイの形質転換のために使用した。ソルビトール脱水素酵素コード配列の５’末端が“インフレーム”でパタチン遺伝子のシグナルペプチドと、３’末端がＴ−ＤＮＡのオクトピンシンターゼのポリアデニル化シグナルと融合し、Ｂ３３プロモーターにより制御されるプラスミドＵｌ２０／１９の構造を次に説明する。
【００５１】
ベクターｐＳＫ２９７（パタチン遺伝子の２９７ｂｐの液胞標的配列を有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）を制限酵素ＥｃｏＲＶで切断した。グルコノバクター・スブオキシダンスのソルビトール脱水素酵素の未変性遺伝子をベクターｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ， ２ （２） （１９７７）， ９５−１１３；Ｐｅｄｅｎ， Ｇｅｎｅ，２２（２−３）（１９８３），２７７−２８０）に含むプラスミドｐＨＷＧ４６９（図２を参照）（シュツットガルト大学マッテス教授のご好意により提供していただいた）から、制限酵素ＥｃｏＲＶ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断することによって、グルコノバクター・スブオキシダンスのソルビトール脱水素酵素をコードする断片を切取り、張り出す末端を後ろ向きの平らな末端に変えた後、液胞標的配列にクローニングし、連続する読み枠が生じるようにした。配列決定により読み枠の融合部位を検査した。こうして得たプラスミドＵＬ１９／１９から制限酵素Ａｓｐ７１８及びＢａｍＨＩで切断することによって、融合したタンパク質をコードする１１４５ｂｐ断片を切り取った。この断片をバイナリーベクターｐＢｉｎＢ３３（Ｂｅｃｋｅｒ，ＮＡＲ，１８（１９９０），２０３）にクローニングした。生じたプラスミドＵＬ２０／１９でアグロバクテリウム・ツメファシエンス株ｐＧＶ２２６０を形質転換した。形質転換したアグロバクテリウムをジャガイモライン０９６ＢＫのライン２１及び３３の形質転換のために使用した。その際トランスジェニック植物１５８ＢＫ又は１５９ＢＫが得られた。
【００５２】
実施例３：マンニトール脱水素酵素をコードするヌクレオチド配列を含むバイナリーベクターの作製
マンニトール脱水素酵素をコードする蛍光菌ＤＳＭ５０１０６（Ｂｒｕｅｎｅｎｋｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｉｓｉｃａ Ａｃｔａ， １３５１（１９９７），１５７−１６７）のヌクレオチド配列と植物特異的プロモーター及びＴ−ＤＮＡ−オクトピンシンターゼのポリアデニル化シグナルをそれぞれバイナリーベクターに含む一連の構築物を作製した。本例でもコードヌクレオチド配列は、遺伝子産物を液胞に局在させるためにパタチン遺伝子のシグナル配列と融合するか、又は遺伝子産物を細胞の細胞質に発現するために液胞標的配列なしで使用した。プロモーターとしてＣａＭＶ３５Ｓプロモーター又はジャガイモのＢ３３遺伝子のＢ３３プロモーターを使用した。ジャガイモの場合はすでにＢ３３プロモーター及びポリアデニル化シグナルを含むバイナリーベクターｐＢｉｎＢ３３−Ｈｙｇ、テンサイの場合はバイナリーベクターｐＧＡ４９２を使用した。得たプラスミドでアグロバクテリウムを形質転換した。形質転換したアグロバクテリウムをジャガイモ又はテンサイの形質転換のために使用した。
【００５３】
実施例４：アグロバクテリウム・ツメファシエンスの形質転換
Ｈｏｅｆｇｅｎ及びＷｉｌｌｍｉｔｚｅｒの方法（Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １６（１９８８），９８７７）で直接的形質転換によりアグロバクテリウムへのＤＮＡ導入を行った。形質転換したアグロバクテリウムのプラスミドＤＮＡをＢｉｒｎｂｏｉｍ及びＤｏｌｙの方法（Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ７（１９７９），１５１３−１５２３）で単離し、適当な制限切断の後にゲル電気泳動により分析した。
【００５４】
実施例５：ジャガイモの形質転換
Ｄｉｅｔｚｅら、Ｇｅｎｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ Ｐｌａｎｔｓ，（１９９５），２４−２９に記載された方法でアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ｃ５８Ｃ１のｐＧＶ２２６０株；Ｄｅｂｌａｅｒｅら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ．， １３（１９８５），４７７７−４７８８）が仲介する遺伝子転移により植物の形質転換を行った。カナマイシン又はハイグロマイシンを含む培地でトランスジェニック植物を選択した。
【００５５】
実施例６：テンサイの葉の再生可能なカルスの誘導
温室でテンサイの種子の発芽の約１ヶ月後に、Ｓａｕｎｄｅｒｓら（Ｊ． Ｗ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ及びＷ． Ｐ． Ｄｏｌｙ， Ｊ． Ｐｌａｎｔ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １２４（１９８６），４７３−４７９）が記述した方法によりカルスの誘導実験を行った。その場合各植物から長さ３〜５センチメートルの若い葉を取って消毒し、無菌の水で３回洗浄し、無菌の濾紙上で乾燥した。次に各葉を約０．２５ｃｍ２の個片に切断し、こうして得た外植片をペトリ皿のＭＳＢ１培地で培養した。皿をプラスチックフィルムで気密に覆った後、暗所で３０℃で３０日保温し、続いて栽培室へ移した。栽培開始の４〜１０週後に葉の外植片の上又は下に白色のもろいカルスが現われた。
【００５６】
実施例７：誘導されたテンサイのカルスの細胞懸濁液の調製
カルスの発生の４〜６週後にカルスを採取して、フィルムで閉じた２５０ｍｌ三角フラスコで１００ｍｌの液体ＭＳＢ１培地で培養した。三角フラスコを回転振とう装置で約２００ｒｐｍ／分で振とうした。約２〜３週後に細胞懸濁液を得た。
【００５７】
実施例８：テンサイの細胞懸濁液及び若いカルスの形質転換
約３週間の培養後の細胞懸濁液で形質転換を行った。１０ｍｌの懸濁培地に１０ｍｌの新しいＭＳＢ１培地を加えた。こうして希釈した懸濁液を４つのペトリ皿に分けた。
【００５８】
用意したバイナリーベクターで形質転換したアグロバクテリウム・ツメファシエンス株の原培養から５０μｌを取り出し、リファンピシン及びテトラサイクリンを含む２ｍｌのＬＢ培地で培養した。培養を３０℃で２日間２００ｒｅｖ／ｍｉｎで攪拌し、前述の条件で一晩中培養した。
【００５９】
当該のテンサイ細胞を収容するペトリ皿の１つに５０μｌの各アグロバクテリウム・ツメファシエンス株を加えることによって、植物細胞に感染させた。テンサイ細胞と細菌を培養室で暗所で３日間培養した。続いてまずＭＳＢ１と６００ｍｇ／ｌのセホタキシムで、次にＭＳＢ１＋セホタキシム３００ｍｇ／ｌで洗浄することによって、植物細胞から細菌を取り除いた。こうして洗浄したテンサイ細胞をペトリ皿のカナマイシン含有ＭＳＢ１培地＋セホタキシム３００ｍｇ／ｌの上に乗せた１枚の無菌のワットマンペーパー上で培養した。皿をプラスチックフィルムで気密に閉じ、培養室で１５日間保温した。それから３〜８週間後に死細胞の層の上に白色のカルスが現われた。
【００６０】
新たに誘導されたカルスの分散
葉の外植片から新たに誘導された若いカルスを形質転換した。その場合２〜６週後に葉にちょうどその時現われたカルスを使用した。このカルスを無菌のプラスチック細管で液体ＭＳＢ１培地に分散させ、細胞懸濁液と同様な形質転換法を行った。
【００６１】
実施例９：形質転換したカルスからのテンサイ植物の再生
形質転換したカルスをまずＭＳＢ１とセホタキシム又はＭＳＢ１とセホタキシムとカナマイシンで１ヶ月培養した後、形質転換したカルスをＭＳＢ１培地でさらに培養した。
【００６２】
しばらくして特定のカルスから芽及び／又は胚が発生した。葉の発生とともに出芽が始まると、直ちにこれを１ｍｇ／ｌのナフチル酢酸を含むＭＳ培地に定着させた。２〜６週後に根が現われた。根の発生の後に植物を温室内で腐植土に定植した。さらに３ヶ月後に完全な植物が発生した。
【００６３】
実施例１０：形質転換した組織に生成されたマンニトール脱水素酵素、ソルビトール脱水素酵素及びスクロースイソメラーゼ遺伝子の検出
カナマイシン又はハイグロマイシンを含む培地で形質転換植物の予選択を行った。導入遺伝子の検出のためにます当該の組織（ジャガイモの塊茎又はテンサイの貯蔵根）のゲノムＤＮＡを単離した。それぞれ３０ｎｇのゲノムＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；Ｓａｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９（１９８８），４８７−４９１）のための鋳型として使用した。プライマーとしてプロタミノバクター・ルブルムのスクロースイソメラーゼ、グルコノバクター・スブオキシダンスのソルビトール脱水素酵素及び蛍光菌のマンニトール脱水素酵素の５’及び３’領域からなる遺伝子特異的プローブを使用した。３’−及び５’−プライマー  １μＭ、ｄＮＴＰｓ  ０．２ｍＭ、ＭｇＣｌ２ １．５ｍＭ、ＫＣｌ ５０ｍＭ及びトリスＨＣｌ ２０ｍＭを含み全容積５０μｌ、ｐＨ値８．４でＴａｇポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）１単位を含む溶液で反応を行った。ＰＣＲ調合物にそれぞれ９５℃で１分間の変性、６５℃で１分間のプライマー付加、７２℃で２．５分間の合成を含む４０サイクルを行い、鎖を完成するための１０分間の最終合成で全反応を終了した。ゲル電気泳動で反応生成物の分析を行い、その際断片の大きさでそれぞれの導入遺伝子に相当するＰＣＲ産物を決定した。ＰＣＲ産物のサブクローニングと部分的配列決定の後、形質転換を明確に同定することができた。
【００６４】
実施例１１：形質転換した組織のスクロースイソメラーゼ活性の検出
形質転換したジャガイモ塊茎のスクロースイソメラーゼ活性の検出を次のように行った。トランスジェニック・ジャガイモ植物及び対照として使用した野生型変種Ｄｉｓｉｒｅｅのジャガイモ塊茎を粉砕し、５０ｍｌの沸騰水を加えた後、それぞれ２〜５ｇの粉砕した材料をＯｍｎｉミキサーで２分間均質化し、続いて９５℃の水浴で１５分間熱した。遠心分離し、上澄みを希釈した後、ＨＰＡＥＣ法でイソマルツロースの検出を行った。その際得られた結果を表１に示す。
【００６５】
【表１】
表１：トランスジェニック・ジャガイモ植物のイソマルツロースの検出
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、スクロースイソメラーゼをコードする配列（ＳｍｕＡ＊）を有する１．７ｋｂの大きさのＨｉｎｄＩＩＩ断片をベクターｐＢＲ３２２に含むプラスミドｐＨＷＧ２７９．１の制限地図を示す。
【図２】
図２はグルコノバクター・スブオキシダンスのソルビトール脱水素酵素（ｓｄｈ）の未変性遺伝子をベクターｐＢＲ３２２に含むプラスミドｐＨＷＧ４６９の制限地図を示す。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年10月22日(2002.10.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの細胞が植物で生成されたスクロースからイソマルツロースを、また生成されたイソマルツロースから６−０−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−ソルビトール（１，６−ＧＰＳ）及び／又は０−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−マンニトール（１，１−ＧＰＭ）を生産することができるトランスジェニック植物であって、植物の少なくとも１つの細胞が、スクロースをイソマルツロースに異性化するためのスクロースイソメラーゼの活性をコードする安定的に組込まれた発現可能なヌクレオチド配列と、イソマルツロースを１，６−ＧＰＧに還元するためのソルビトール脱水素酵素の活性をコードするヌクレオチド配列及びイソマルツロースを１，１−ＧＰＭに還元するためのマンニトール脱水素酵素の活性をコードするヌクレオチド配列からなる群から選ばれた少なくとも１つの安定的に組込まれた発現可能なヌクレオチド配列とを含むことを特徴とするトランスジェニック植物。
【請求項２】
少なくとも１つの細胞がイソマルツロースを１，６−ＧＰＳに還元するためのソルビトール脱水素酵素の活性をコードする安定的に組込まれた発現可能なヌクレオチド配列を含む、トランスジェニック植物。
【請求項３】
少なくとも１つの細胞がイソマルツロースを１，１−ＧＰＭに還元するためのマンニトール脱水素酵素の活性をコードする安定的に組込まれた発現可能なヌクレオチド配列を含む、トランスジェニック植物。
【請求項４】
ジャガイモであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。
【請求項５】
テンサイであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。
【請求項６】
ヌクレオチド配列が植物ベクターに含まれていることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。
【請求項７】
コードヌクレオチド配列がｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ配列である請求項６に記載のトランスジェニック植物。
【請求項８】
スクロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列が微生物、特にプロタミノバクター、エルウィニア、セラチア、ロイコノストック、シュードモナス、アグロバクテリウム又はクレブシエラ属の微生物から、ソルビトール脱水素酵素をコードするヌクレオチド配列が微生物、特にグルコノバクター属の微生物から、マンニトール脱水素酵素をコードするヌクレオチド配列が微生物特にシュードモナス属の微生物から得られる請求項７に記載のトランスジェニック植物。
【請求項９】
コードヌクレオチド配列が、植物細胞での転写を確実にする少なくとも１つの調節エレメントにより機能的に制御される、請求項１〜８のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。
【請求項１０】
少なくとも１つの調節エレメントがプロモーター、特に植物特異的プロモーターである請求項９に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１１】
プロモーターが組織又は器官特異的、とりわけ貯蔵器官特異的プロモーターである請求項１０に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物であって、コードヌクレオチド配列が、読み枠の中で、スクロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質、ソルビトール脱水素酵素活性を有するタンパク質又はマンニトール脱水素酵素活性を有するタンパク質の所定の細胞画分又は所定の細胞小器官への輸送を確実にするシグナルペプチドをコードするシグナル配列に融合しているか、又は該コードヌクレオチド配列がシグナル配列に融合していないためにスクロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質、ソルビトール脱水素酵素活性を有するタンパク質又はマンニトール脱水素酵素活性を有するタンパク質が細胞質に局在することを特徴とする、上記トランスジェニック植物。
【請求項１３】
コードヌクレオチド配列が終結シグナル及び／又はポリアデニル化シグナルと機能的に結合されている、請求項１〜１２のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１つに記載の植物の増殖体及び／又は収穫物。
【請求項１５】
ａ）スクロースイソメラーゼの活性をコードするヌクレオチド配列、ソルビトール脱水素酵素の活性をコードするヌクレオチド配列及びマンニトール脱水素酵素の活性をコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される１以上のヌクレオチド配列による１以上の植物細胞の形質転換、
ｂ）形質転換した細胞のゲノムへのヌクレオチド配列の組込み、
ｃ）ソルビトール脱水素酵素、マンニトール脱水素酵素及び／又はスクロースイソメラーゼを生産する植物の再生、
を包含する、請求項１〜３のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物の作製方法。
【請求項１６】
形質転換が使用されるそれぞれのヌクレオチド配列の共形質転換である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
形質転換される細胞が、スクロースイソメラーゼ活性をコードするヌクレオチド配列、ソルビトール脱水素酵素活性をコードするヌクレオチド配列及びマンニトール脱水素酵素活性をコードするヌクレオチド配列からなる群より選択される少なくとも１つの安定的に組込まれたヌクレオチド配列を含むトランスジェニック細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
形質転換された１以上のヌクレオチド配列が植物ベクターに含まれていることを特徴とする、請求項１５〜１７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１９】
１以上のコードヌクレオチド配列がｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
スクロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列が微生物、特にプロタミノバクター、エルウィニア、セラチア、ロイコノストック、シュードモナス、アグロバクテリウム又はクレブシエラ属の微生物から、ソルビトール脱水素酵素をコードするヌクレオチド配列が微生物、特にグルコノバクター属の微生物から、マンニトール脱水素酵素をコードするヌクレオチド配列が微生物特にシュードモナス属の微生物から得られる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
１以上のコードヌクレオチド配列が植物細胞での転写を確実にする少なくとも１つの調節エレメントによってそれぞれ機能的に制御される、請求項１５〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも１つの調節エレメントがプロモーター、特に植物特異的プロモーターである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
プロモーターが組織又は器官特異的、とりわけ貯蔵器官特異的プロモーターである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
１以上のヌクレオチド配列が、読み枠の中で、コードされるタンパク質の所定の細胞画分又は所定の細胞小器官への輸送を確実にするシグナルペプチドをコードするシグナル配列に融合しているか、又はシグナル配列に融合していないためにコードされたタンパク質が細胞質に局在することを特徴とする、請求項１５〜２３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２５】
１以上のコードヌクレオチド配列が終結及び／又はポリアデニル化シグナルと機能的に結合されている請求項１５〜２４のいずれか１つに記載の方法。
【国際調査報告】
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