(57)【要約】【課題】分子ディスプレイ法により選択された分子の高感度検出方法を提供する。【解決手段】候補蛋白質をコードするmRNAの配列情報に基づき設計されたプローブを固定したタイリングアレイであって、プローブ間のギャップが平均で25塩基以下、又は、プローブ間のオーバーラップが平均でプローブ長の50%以下となるように設計されているタイリングアレイを準備し、蛋白質と該蛋白質をコードする核酸とが結合した対応付け分子を用いるスクリーニング法で選択されたDNAを、RNA-DNAハイブリダイゼーションを阻害しないリガンド物質で標識されたヌクレオチドの存在下で、RNAポリメラーゼによりRNA増幅に付し、増幅されたRNAをタイリングアレイへハイブリダイズさせ、前記リガンド物質に結合するアダプター物質と蛍光物質又は化学蛍光若しくは化学発光を活性化する物質の結合体を用いて標識し、蛍光又は発光の強度を測定し、その測定結果の解析により相互作用を検出することにより、標的分子と相互作用する蛋白質をコードする核酸を検出する。【選択図】  図２
2007181454.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分子と相互作用する蛋白質又はそれをコードする核酸を検出する方法であって、以下の工程(a)〜(e)を含むことを特徴とする前記方法。
(a)検出候補蛋白質をコードするmRNAの配列情報に基づき設計されたプローブを固定したタイリングアレイであって、プローブ間のギャップが平均で25塩基以下、又は、プローブ間のオーバーラップが平均でプローブ長の50％以下となるように設計されているタイリングアレイを準備する工程。
(b) 蛋白質と該蛋白質をコードする核酸とが結合した対応付け分子を用いるスクリーニング法により標的物質との相互作用に関して選択された対応付け分子からDNAを準備する工程。
(c)(b)で準備されたDNAをテンプレートとして、RNA-DNAハイブリダイゼーションを阻害しないリガンド物質で標識されたヌクレオチドの存在下で、RNAポリメラーゼによりRNA増幅を行う工程。
(d)(c)で増幅されたRNAを(a)で準備されたタイリングアレイへハイブリダイズさせ、前記リガンド物質に結合するアダプター物質と蛍光物質又は化学蛍光若しくは化学発光を活性化する物質の結合体を用いて標識し、蛍光又は発光の強度を測定する工程。
(e)(d)の測定結果の解析により標的分子と相互作用する蛋白質又はそれをコードする核酸を検出する工程。
【請求項２】
RNAポリメラーゼが、工程(b)で準備されたDNAに含まれるプロモーターにより転写を開始するものである請求項１記載の方法。
【請求項３】
プロモーターがSP6プロモーターである請求項２記載の方法。
【請求項４】
リガンド物質がビオチン、アダプター物質がストレプトアビジン又はアビジンである請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程(b)のスクリーニング法が、(b1)核酸ライブラリーから、蛋白質と該蛋白質をコードする核酸とが結合した対応付け分子のライブラリーを製造する工程、(b2)前記対応付け分子のライブラリーと標的物質とを混合する工程、(b3)標的物質に結合した対応付け分子を選択する工程、(b4)(b3)で選択された対応付け分子の核酸に基づいて核酸ライブラリーを調製する工程を含み、上記(b1)〜(b3)の操作を繰り返すことを含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法により、標的分子と相互作用する蛋白質又はそれをコードする核酸を検出することを含む、標的分子と相互作用する蛋白質又はそれをコードする核酸のスクリーニング方法。
【請求項７】
標的分子と相互作用する蛋白質の相互作用部位を検出する方法であって、以下の工程(a)〜(e)を含むことを特徴とする前記方法。
(a) 標的分子と相互作用する蛋白質をコードするmRNAの配列情報に基づき設計されたプローブを固定したタイリングアレイであって、プローブ間のギャップが平均で25塩基以下、又は、プローブ間のオーバーラップが平均でプローブ長の50％以下となるように設計されているタイリングアレイを準備する工程。
(b) 蛋白質と該蛋白質をコードする核酸とが結合した対応付け分子を用いる対応付け分子を用いるスクリーニング法により標的物質との相互作用に関して選択された対応付け分子からDNAを準備する工程。
(c)(b)で準備されたDNAをテンプレートとして、RNA-DNAハイブリダイゼーションを阻害しないリガンド物質で標識されたヌクレオチドの存在下で、RNAポリメラーゼによりRNA増幅を行う工程。
(d)(c)で増幅されたRNAを(a)で準備されたタイリングアレイへハイブリダイズさせ、前記リガンド物質に結合するアダプター物質と蛍光物質又は化学蛍光若しくは化学発光を活性化する物質の結合体を用いて標識し、蛍光又は発光の強度を測定する工程。
(e)(d)の測定結果の解析により相互作用部位を検出する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子ディスプレイ法により選択された分子の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
in vitro virus（IVV）法はピューロマイシンという抗生物質の一種を連結したmRNAを無細胞翻訳系で翻訳することにより、蛋白質とそれをコードするmRNAとが連結した対応付け分子、すなわち試験管内ウイルス（in vitro virus : IVV）を作製する技術である（特許文献１）。これまでに、この技術を用いることで、cDNAやランダム配列のライブラリーから、新規機能性蛋白質や蛋白質間相互作用などを有する蛋白質をスクリーニングする手法が開発され（特許文献２）、一定の成果をあげることに成功している（非特許文献１; 非特許文献２）。
【０００３】
既存のIVV法に基づいた蛋白質相互作用スクリーニングの方法では、特異的に選択された配列を決定するために、複数サイクルのパニング後に、選択されたIVVのmRNA部位をRT-PCRにより増幅、増幅されたDNAを大腸菌にクローニングし、DNAシークエンサーで多数の配列を解析して同定するという戦略をとっている。しかしながら、DNAシークエンサーによる大量の配列解析はコスト的にも、労力的にも困難であるため、1,000クローンを超える配列の解析は現実的ではない。したがって既存の手法では、スクリーニング後に特異的に選択された配列を検出するには、最低でも分子数で全体の0.1％にまで濃縮されなければならないと言える。しかし、このような濃縮が達成される条件では、低発現の遺伝子の配列や、アフィニティーが比較的低い相互作用候補の配列などが検出されないという、「偽陰性」の問題が生じることが懸念される。
【０００４】
多くのスクリーニング技術において問題となる「偽陽性」は、スクリーニング後に検証実験を行なうことである程度排除できるが、偽陰性はその後の実験等では解決できない問題であり、スクリーニング技術としては最も解決すべき問題である。実際に、既存のスクリーニング手法に基づき、マウスの転写因子Junに結合する蛋白質をマウス脳のcDNAライブラリーから選択し、約500個弱のクローンの配列を決定した実験の結果からも、選択されるべき配列が取得されない、偽陰性の例がいくつか示された。
【特許文献１】WO98/016636
【特許文献２】WO03/014734
【非特許文献１】Horisawa et al., (2004) Nucleic Acids Res. 32, e169
【非特許文献２】Miyamoto-Sato et al., (2005) Genome Res. 15, 710-717
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、分子ディスプレイ法により選択された分子の高感度検出方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、特定の態様で、選択されたDNAを蛍光標識することと、マイクロアレイに特定の態様で設計したプローブを固定することとを組み合わせることにより、既存のIVV法に基づくスクリーニング手法におけるクローニング・DNAシークエンシング操作に代えて、オリゴDNAマイクロアレイによる検出を行なうことが可能になること、しかも、既存のクローニング・DNAシークエンシングによる解析と比較すると、高感度で、特異的に選択された配列を検出することができ、既存の方法では偽陰性となってしまう配列を多数検出できることを見出した。
これらの知見に基づき、本発明は完成された。本発明は、下記のものを提供する。
【０００７】
［１］  標的分子と相互作用する蛋白質又はそれをコードする核酸を検出する方法であって、以下の工程(a)〜(e)を含むことを特徴とする前記方法。
(a)検出候補蛋白質をコードするmRNAの配列情報に基づき設計されたプローブを固定したタイリングアレイであって、プローブ間のギャップが平均で25塩基以下、又は、プローブ間のオーバーラップが平均でプローブ長の50％以下となるように設計されているタイリングアレイを準備する工程。
(b) 蛋白質と該蛋白質をコードする核酸とが結合した対応付け分子を用いるスクリーニング法により標的物質との相互作用に関して選択された対応付け分子からDNAを準備する工程。
(c)(b)で準備されたDNAをテンプレートとして、RNA-DNAハイブリダイゼーションを阻害しないリガンド物質で標識されたヌクレオチドの存在下で、RNAポリメラーゼによりRNA増幅を行う工程。
(d)(c)で増幅されたRNAを(a)で準備されたタイリングアレイへハイブリダイズさせ、前記リガンド物質に結合するアダプター物質と蛍光物質又は化学蛍光若しくは化学発光を活性化する物質の結合体を用いて標識し、蛍光又は発光の強度を測定する工程。
(e)(d)の測定結果の解析により標的分子と相互作用する蛋白質又はそれをコードする核酸を検出する工程。
［２］  RNAポリメラーゼが、工程(b)で準備されたDNAに含まれるプロモーターにより転写を開始するものである［１］記載の方法。
［３］  プロモーターがSP6プロモーターである［２］記載の方法。
［４］  リガンド物質がビオチン、アダプター物質がストレプトアビジン又はアビジンである［１］〜［３］のいずれか１項に記載の方法。
［５］  工程(b)のスクリーニング法が、(b1)核酸ライブラリーから、蛋白質と該蛋白質をコードする核酸とが結合した対応付け分子のライブラリーを製造する工程、(b2)前記対応付け分子のライブラリーと標的物質とを混合する工程、(b3)標的物質に結合した対応付け分子を選択する工程、(b4)(b3)で選択された対応付け分子の核酸に基づいて核酸ライブラリーを調製する工程を含み、上記(b1)〜(b3)の操作を繰り返すことを含む［１］〜［３］のいずれか１項に記載の方法。
【０００８】
［６］  ［１］〜［５］のいずれか１項に記載の方法により、標的分子と相互作用する蛋白質又はそれをコードする核酸を検出することを含む、標的分子と相互作用する蛋白質又はそれをコードする核酸のスクリーニング方法。
【０００９】
［７］  標的分子と相互作用する蛋白質の相互作用部位を検出する方法であって、以下の工程(a)〜(e)を含むことを特徴とする前記方法。
(a) 標的分子と相互作用する蛋白質をコードするmRNAの配列情報に基づき設計されたプローブを固定したタイリングアレイであって、プローブ間のギャップが平均で25塩基以下、又は、プローブ間のオーバーラップが平均でプローブ長の50％以下となるように設計されているタイリングアレイを準備する工程。
(b) 蛋白質と該蛋白質をコードする核酸とが結合した対応付け分子を用いる対応付け分子を用いるスクリーニング法により標的物質との相互作用に関して選択された対応付け分子からDNAを準備する工程。
(c)(b)で準備されたDNAをテンプレートとして、RNA-DNAハイブリダイゼーションを阻害しないリガンド物質で標識されたヌクレオチドの存在下で、RNAポリメラーゼによりRNA増幅を行う工程。
(d)(c)で増幅されたRNAを(a)で準備されたタイリングアレイへハイブリダイズさせ、前記リガンド物質に結合するアダプター物質と蛍光物質又は化学蛍光若しくは化学発光を活性化する物質の結合体を用いて標識し、蛍光又は発光の強度を測定する工程。
(e)(d)の測定結果の解析により相互作用部位を検出する工程。
【発明の効果】
【００１０】
既存のクローニング・DNAシークエンシングによる解析と比較すると、高感度で、特異的に選択された配列を検出することができ、しかも、既存の方法では偽陰性となってしまう配列を検出できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
＜１＞本発明検出法
本発明の検出法は、上記の偽陰性の問題を解消する手法として、既存の分子ディスプレイ法、特にIVV法に基づくスクリーニング法におけるクローニング・DNAシークエンシング操作に代え、オリゴDNAマイクロアレイによる検出を行なうことを特徴とする（図１）。
本発明の方法は、標的分子と相互作用する蛋白質又はそれをコードする核酸を検出する方法であって、以下の工程(a)〜(e)を含むことを特徴とする。
(a)検出候補蛋白質をコードするmRNAの配列情報に基づき設計されたプローブを固定したタイリングアレイであって、プローブ間のギャップが平均で25塩基以下、又は、プローブ間のオーバーラップが平均でプローブ長の50％以下となるように設計されているタイリングアレイを準備する工程。
(b) 蛋白質と該蛋白質をコードする核酸とが結合した対応付け分子を用いるスクリーニング法により標的物質との相互作用に関して選択された対応付け分子からDNAを準備する工程。
(c)(b)で準備されたDNAをテンプレートとして、RNA-DNAハイブリダイゼーションを阻害しないリガンド物質で標識されたヌクレオチドの存在下で、RNAポリメラーゼによりRNA増幅を行う工程。
(d)(c)で増幅されたRNAを(a)で準備されたタイリングアレイへハイブリダイズさせ、前記リガンド物質に結合するアダプター物質と蛍光物質又は化学蛍光若しくは化学発光を活性化させる物質の結合体を用いて標識し、蛍光又は発光の強度を測定する工程。
(e)(d)の測定結果の解析により標的分子と相互作用する蛋白質又はそれをコードする核酸を検出する工程。
【００１２】
以下、各工程について説明する。
【００１３】
＜１−ａ＞工程(a)
工程(a)は、検出候補蛋白質をコードするmRNAの配列情報に基づき設計されたプローブを固定したタイリングアレイを準備する工程である。
【００１４】
タイリングアレイは、既知の配列情報に基づき、タイル状に（通常には、等間隔に）抽出した塩基配列を有する検出用プローブを基材上に固定したDNAマイクロアレイ（DNAチップ）である。
【００１５】
本発明で用いるタイリングアレイの構成は、検出候補蛋白質をコードするmRNAの配列情報に基づいて、プローブをプローブ間のギャップが平均で25塩基以下、又は、プローブ間のオーバーラップが平均でプローブ長の50％以下となるように設計する他は、通常のものでよい。
【００１６】
検出候補蛋白質は、標的物質との相互作用を検出しようとする蛋白質であり、一つであっても複数であってもよい。標的物質に相互作用することが知られている又は期待される候補蛋白質を選択してもよい。例えば、標的物質がDNAの場合には、転写因子や、種々の推定方法によりその候補となる蛋白質を検出候補蛋白質とすることができる。
【００１７】
プローブの設計においては、検出候補蛋白質をコードするmRNAの全長を対象にしてもよいし、相互作用部位の決定などの検出の目的に応じて、その一部を対象にしてもよい。
【００１８】
プローブの長さは、ハイブリダイズ後のシグナル検出の効率などを考慮して選択すればよく、通常には、平均で25〜100塩基、好ましくは、36〜70塩基、より好ましくは約５０塩基である。
【００１９】
プローブをプローブ間にギャップをおいて設計する場合には、プローブ間のギャップが平均で25塩基以下、好ましくは10塩基以下、さらに好ましくは０塩基である。ギャップが長すぎると、相互作用を検出できず偽陰性が生じ易くなる。一方、プローブがオーバーラップするように設計する場合には、プローブ間のオーバーラップが平均でプローブ長の50％以下、好ましくは25％以下である。例えば、プローブ長が５０塩基の場合は、25塩基以下、好ましくは、12.5塩基以下である。オーバーラップが長いと、スクリーニングの効率の面では不利である。ギャップ又はオーバーラップはなくてもよく、この場合は、ギャップが０塩基、又は、オーバーラップが０％と表わすことができる。
【００２０】
プローブの配列は、センス鎖、アンチセンス鎖、又は、その両方のいずれでもよく、工程(b)で対応付け分子から準備されるDNAに応じて選択すればよい。
【００２１】
＜１−ｂ＞工程(b)
工程(b)は、蛋白質と該蛋白質をコードする核酸とが結合した対応付け分子を用いる対応付け分子を用いるスクリーニング法により標的物質との相互作用に関して選択された対応付け分子からDNAを準備する工程である。
【００２２】
蛋白質と該蛋白質をコードする核酸とが結合した対応付け分子を用いるスクリーニング法は、例えば、遺伝子型（核酸）の増幅、表現型（蛋白質）と遺伝子型の連結、及び、アフィニティー選択を含み、これらの工程を必要により繰り返すものである（図１）。このような方法の代表的なものは、in vitro virus法に基づくスクリーニング法（例えば、WO
02/48347、特開2002-176987参照）である。
【００２３】
in vitro virus法による対応付け分子は、蛋白質を含む表現型分子と、該蛋白質をコードする核酸を含む遺伝子型分子とが結合してなる。遺伝子型分子は、蛋白質をコードする領域を、その領域の塩基配列が翻訳され得るような形態で有するコード分子と、スペーサー部とが結合してなる。説明の便宜のため、対応付け分子における、表現型分子に由来する部分、スペーサー分子に由来する部分、および、コード分子に由来する部分をそれぞれ、デコード部、スペーサー部およびコード部と呼ぶ。また、遺伝子型分子における、スペーサー分子に由来する部分、および、コード分子に由来する部分をそれぞれ、スペーサー部およびコード部と呼ぶ。
【００２４】
スペーサー分子は、例えば、核酸の3'末端に結合できるドナー領域と、ドナー領域に結合した、ポリエチレングリコールを主成分としたPEG領域と、PEG領域に結合した、ペプチド転移反応によってペプチドと結合し得る基を含むペプチドアクセプター領域とを含む。PEG領域はなくてもよい。
【００２５】
核酸の3'末端に結合できるドナー領域は、通常、１以上のヌクレオチドからなる。ヌクレオチドの数は、通常には１〜１５、好ましくは１〜２である。ヌクレオチドはリボヌクレオチドでもデオキシリボヌクレオチドでもよい。
【００２６】
ドナー領域の5'末端の配列は、ライゲーション効率を左右する。コード部とスペーサー部をライゲーションさせるためには、少なくとも1残基以上を含むことが必要であり、ポ
リA配列をもつアクセプターに対しては、少なくとも１残基のdC(デオキシシチジル酸)または２残基のdCdC(ジデオキシシチジル酸)が好ましい。塩基の種類としては、C>U又はT>G>Aの順で好ましい。
【００２７】
PEG領域はポリエチレングリコールを主成分とするものである。ここで、主成分とするとは、PEG領域に含まれるヌクレオチドの数の合計が20塩基以下、又は、ポリエチレングリコールの平均分子量が400以上であることを意味する。好ましくは、ヌクレオチドの合計の数が10塩基以下、又は、ポリエチレングリコールの平均分子量が2000以上であることを意味する。
【００２８】
PEG領域のポリエチレングリコールの平均分子量は、通常には、400〜30,000、好ましくは1,000〜10,000、より好ましくは2,000〜8,000である。ここで、ポリエチレングリコールの分子量が約400より低いと、このスペーサー分子に由来するスペーサー部を含む遺伝子型分子を対応付け翻訳したときに、対応付け翻訳の後処理が必要となることがあるが（Liu, R., Barrick, E., Szostak, J.W., Roberts, R.W. (2000) Methods in Enzymology,
vol. 318, 268-293）、分子量1000以上、より好ましくは2000以上のPEGを用いると、対応付け翻訳のみで高効率の対応付けができるため、翻訳の後処理が必要なくなる。また、ポリエチレングリコールの分子量が増えると、遺伝子型分子の安定性が増す傾向があり、特に分子量1000以上で良好であり、分子量400以下ではDNAスペーサーと性質がそれほどかわらず不安定となることがある。
【００２９】
ペプチドアクセプター領域は、ペプチドのＣ末端に結合できるものであれば特に限定されないが、例えば、ピューロマイシン、3'-N-アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（3'-N-Aminoacylpuromycin aminonucleoside, PANS-アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのPANS-Gly、バリンのPANS-Val、アラニンのPANS-Ala、その他、全アミノ酸に対応するPANS-全アミノ酸が利用できる。また、化学結合として3'-アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合した結果形成されたアミド結合でつながった3'-N-アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（3'-Aminoacyladenosine aminonucleoside, AANS-アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのAANS-Gly、バリンのAANS-Val、アラニンのAANS-Ala、その他、全アミノ酸に対応するAANS-全アミノ酸が利用できる。また、ヌクレオシドまたはヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども利用できる。その他、ヌクレオシドまたはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質と、アミノ酸またはアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質を化学的に結合可能な結合様式のものなら全て利用することができる。
【００３０】
ペプチドアクセプター領域は、好ましくは、ピューロマイシンもしくはその誘導体、又は、ピューロマイシンもしくはその誘導体と1残基もしくは２残基のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドからなることが好ましい。ここで、誘導体とは蛋白質翻訳系においてペプチドのＣ末端に結合できる誘導体を意味する。ピューロマイシン誘導体は、ピューロマイシン構造を完全に有しているものに限られず、ピューロマイシン構造の一部が欠落しているものも包含する。ピューロマイシン誘導体の具体例としては、PANS-アミノ酸、AANS-アミノ酸などが挙げられる。
【００３１】
ペプチドアクセプター領域は、ピューロマイシンのみの構成でもかまわないが、5'末端側に1残基以上のDNAおよび/またはRNAからなる塩基配列を持つことが好ましい。配列としては、dC-ピューロマイシン, rC-ピューロマイシンなど、より好ましくはdCdC-ピューロマイシン, rCrC-ピューロマイシン, rCdC-ピューロマイシン, dCrC-ピューロマイシンなどの配列で、アミノアシル-tRNAの3'末端を模倣したCCA配列（Philipps, G.R. (1969) Nature 223, 374-377）が適当である。塩基の種類としては、C>U又はT>G>Aの順で好ましい。
【００３２】
スペーサー分子は、ドナー領域とPEG領域との間に、少なくとも１つの機能付与ユニットを含むことが好ましい。機能付与ユニットは、好ましくは、少なくとも1残基のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドの塩基に機能修飾を施したものである。例えば、機能修飾物質として、蛍光物質、ビオチン、またはHis-tagなど各種分離タグなどを導入したものが可能である。
【００３３】
コード分子は、例えば、転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む5'非翻訳領域と、5'非翻訳領域の3'末端側に結合した、蛋白質をコードするORF領域と、ORF領域の3'末端側に結合したポリA配列を持ち、かつポリA配列の5'上流に親和性タグ配列を含む核酸である。
【００３４】
コード分子は、DNAでもRNAでもよく、RNAの場合、5'末端にCap構造があってもなくても良い。また、コード分子は任意のベクターやプラスミドに組み込まれたものとしてもよい。
【００３５】
3'末端領域は、親和性タグ配列とその下流にポリA配列を含んでもよい。スペーサー分子とコード分子とのライゲーション効率に影響を与える要素としては3'末端領域のポリA配列が重要であり、ポリA配列は、少なくとも２残基以上のdAおよび/またはrAの混合または単一のポリA連続鎖であり、好ましくは、3残基以上、より好ましくは６以上、さらに好ましくは８残基以上のポリA連続鎖である。
【００３６】
コード分子の翻訳効率に影響する要素としては、転写プロモーターと翻訳エンハンサーからなる5'UTR、および、ポリA配列を含む3'末端領域の組み合わせがある。3'末端領域のポリA配列の効果は通常には10残基以下で発揮される。5'UTRの転写プロモーターはT7/T3またはSP6などが利用でき、特に制限はない。好ましくはSP6であり、特に、翻訳のエンハンサー配列としてオメガ配列やオメガ配列の一部を含む配列を利用する場合はSP6を用いることが特に好ましい。翻訳エンハンサーは好ましくはオメガ配列の一部であり、オメガ配列の一部としては、TMVのオメガ配列の一部(O29; Gallie D.R., Walbot V. (1992) Nucleic Acids Res., vol. 20, 4631-4638、及び、WO 02/48347の図３参照)やO'(配列番号１０)を含んだものが好ましい。
【００３７】
親和性タグ配列としては、抗原抗体反応など、蛋白質を検出できるいかなる手段を用いるための配列であればよく、制限はない。好ましくは、抗原抗体反応によるアフィニティー分離分析用タグであるFlag-tag配列やHis-tag配列である。
【００３８】
ORF領域については、DNAおよび/またはRNAからなるいかなる配列でもよい。遺伝子配列、エキソン配列、イントロン配列、ランダム配列、または、いかなる自然界の配列、人為的配列が可能であり、配列の制限はない。このような配列からなる核酸ライブラリーが使用できる。また、コード分子の5'UTRをSP6+O29とし、3'末端領域を、たとえば、Flag+XhoI+An(n=8)とすることで、各長さは、5'UTRで約60bp、3'末端領域で約32bpであり、PCRのプライマーにアダプター領域として組み込める長さである。このため、あらゆるベクターやプラスミドやcDNAライブラリーからPCRによって、5'UTRと3'末端領域をもったコード分子を簡単に作成できる。コード分子において、翻訳はORF領域を超えてされてもよい。すなわち、ORF領域の末端に終止コドンがなくてもよい。
【００３９】
コード分子は、転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む5'非翻訳領域と、5'非翻訳領域の3'末端側に結合した、蛋白質をコードするORF領域と、ORF領域の3'末端側に結合した、ポリA配列を含む3'末端領域を含む核酸であってもよい。
【００４０】
遺伝子型分子は、上記コード分子を、必要により、蛋白質をコードする領域の塩基配列が翻訳され得るような形態に変換した後（例えば転写した後）、コード分子の3'末端と、スペーサー分子のドナー領域を、通常のリガーゼ反応により結合させることにより製造できる。反応条件としては、通常、４〜２５℃で４〜４８時間の条件が挙げられ、PEG領域を含むスペーサー分子のPEG領域内のポリエチレングリコールと同じ分子量のポリエチレングリコールを反応系に添加する場合には、15℃で0.5〜４時間に短縮することも可能である。
【００４１】
スペーサー分子とコード分子の組み合わせはライゲーション効率に重要な効果をもたらす。アクセプターにあたるコード部の3'末端領域において、少なくとも２残基以上、好ましくは３残基以上、さらに好ましくは６〜８残基以上のDNAおよび/またはRNAのポリA配列があること、さらに、5'UTRの翻訳エンハンサーとしては、オメガ配列の部分配列(O29やO' )が好ましく、スペーサー部のドナー領域としては、少なくとも１残基のdC(デオキシシチジル酸)または２残基のdCdC(ジデオキシシチジル酸)が好ましい。このことによって、RNAリガーゼを用いることでDNAリガーゼのもつ問題点を回避し、かつ効率を60〜80%に保つことができる。
【００４２】
(a)転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む5'非翻訳領域と、5'非翻訳領域の3'末端側に結合した、蛋白質をコードするORF領域と、ORF領域の3'末端側に結合した、ポリA配列を含む3'末端領域を含むRNAであるコード分子の3'末端と、(b)上記スペーサー分子のドナー領域であってRNAからなるものとを、スペーサー分子内のPEG領域を構成するポリエチレングリコールと同じ分子量をもつ遊離のポリエチレングリコールの存在下で、RNAリガーゼにより結合させることが好ましい。
【００４３】
ライゲーション反応時に、PEG領域を含むスペーサー部のPEG領域と同じ分子量のポリエチレングリコールを添加することによって、スペーサー部のポリエチレングリコールの分子量によらずライゲーション効率が80〜90%以上に向上し、反応後の分離工程も省略することができる。
【００４４】
この態様の対応付け分子は、上記の遺伝子型分子を無細胞翻訳系で翻訳することにより、ペプチド転移反応で、遺伝子型分子内のORF領域によりコードされた蛋白質である表現型分子と連結することにより得ることができる(図４のＡ)。無細胞翻訳系は、好ましくは、小麦胚芽又はウサギ網状赤血球のものである。翻訳の条件は通常に採用される条件でよい。例えば、25〜37℃で15〜240分の条件が挙げられる。また、この態様の対応付け分子の核酸部分は、翻訳後に逆転写によりRNAとDNAとのハイブリッドとすることができる。
【００４５】
in vitro virus法に基づくスクリーニング方法は、通常には、(b1)核酸ライブラリーから、蛋白質と該蛋白質をコードする核酸とが結合した対応付け分子のライブラリーを製造する工程、(b2)前記対応付け分子のライブラリーと標的物質とを混合する工程、(b3)標的物質に結合した対応付け分子を選択する工程を含む。また、(b4)(b3)で選択された対応付け分子の核酸に基づいて核酸ライブラリーを調製する工程をさらに含み、(b4)で調製された核酸ライブラリーを(b1)の核酸ライブラリーとして用いて、上記(b1)〜(b3)の操作を繰り返すことを含んでもよい。
【００４６】
標的物質はペプチド（化学合成された、又は天然から単離された、又は蛋白質の部分消化物であってもよい）、蛋白質、核酸(DNA、又はRNA)、糖類、種々の低分子化合物、金属、金属化合物など、あらゆる化合物や物質が該当する。
【００４７】
本発明に用いられる標的物質は態様に応じて、樹脂、ビーズ等の固相に結合させるが、結合の時期は、対応付け分子と混合する前でも後でもよく、結合方法に応じて選択される
。固相に結合させる方法としては、修飾物質を介して結合させるものと、それ以外の部分により結合させるものが挙げられる。
【００４８】
修飾物質を介して結合させる場合に用いられる修飾物質は、通常には、特定のポリペプチドに特異的に結合する分子（以下、「リガンド」と称することがある。）であり、固相表面には該リガンドと結合する特定のポリペプチド（以下、「アダプター蛋白質」と称することがある）を結合させる。アダプター蛋白質には、結合蛋白質、受容体を構成する受容体蛋白質、抗体なども含まれる。アダプター蛋白質／リガンドの組み合わせとしては、例えば、アビジンおよびストレプトアビジン等のビオチン結合蛋白質／ビオチン、マルトース結合蛋白質／マルトース、Ｇ蛋白質／グアニンヌクレオチド、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、ＤＮＡ結合蛋白質／ＤＮＡ、抗体／抗原分子（エピトープ）、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合蛋白質／ＡＴＰ、あるいはエストラジオール受容体蛋白質／エストラジオールなどの各種受容体蛋白質／そのリガンドなどが挙げられる。
【００４９】
これらの中で、アダプター蛋白質／リガンドの組み合わせとしては、アビジンおよびストレプトアビジンなどのビオチン結合蛋白質、マルトース結合蛋白質／マルトース、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、などが好ましく、特にストレプトアビジン／ビオチンの組み合わせが最も好ましい。これらの結合蛋白質は、それ自体既知のものであり、該蛋白質をコードするＤＮＡは既にクローニングされている。
【００５０】
アダプター蛋白質の固相表面への結合は、それ自体既知の方法を用いることができるが、具体的には、例えば、タンニン酸、ホルマリン、グルタルアルデヒド、ピルビックアルデヒド、ビス−ジアゾ化ベンジゾン、トルエン-2,4-ジイソシアネート、アミノ基、活性エステルに変換可能なカルボキシル基、又はホスホアミダイドに変換可能な水酸基もしくはアミノ基などを利用する方法を用いることができる。
【００５１】
修飾物質以外の部分により固相に結合させる場合は、通常蛋白質、核酸、糖鎖、低分子化合物を固相に結合させるのに用いられる既知の方法、具体的には例えば、タンニン酸、ホルマリン、グルタルアルデヒド、ピルビックアルデヒド、ビス−ジアゾ化ベンジゾン、トルエン-2,4-ジイソシアネート、アミノ基、活性エステルに変換可能なカルボキシル基、又はホスホアミダイドに変換可能な水酸基もしくはアミノ基などを利用する方法を用いることができる。
【００５２】
固相担体は、好ましくはアガロースビーズ、磁性体が包埋されたアガロースビーズが好ましい。
【００５３】
対応付け分子のライブラリーと標的物質との混合は、対応付け分子の被標的蛋白質が標的物質と相互作用する条件で混合すればよい。この条件は、検出しようとする相互作用および標的物質の種類に応じて適宜選択される。標的物質が蛋白質の場合には、その蛋白質をコードするRNAを準備し、対応付け分子の合成時に一緒に合成してもよい（共翻訳）。このような方法は、WO03/048363に記載されている。
【００５４】
標的物質に結合した対応付け分子を選択する工程は、標的物質に結合した対応付け分子と、標的物質に結合しない対応付け分子を分離する工程であり、通常には、標的物質を固相に固定化しておく又は固定化することによって、対応付け分子と混合後の標的分子を固定化した固相を洗浄することにより分離を行うことができる。洗浄の条件は、検出しようとする相互作用および標的物質の種類に応じて適宜選択される。ここで固相に固定化する
とは、対応付け分子と標的物質との結合体が非結合の分子から分離可能になっていることを意味し、例えば、標的物質が膜蛋白質の場合、細胞の細胞膜等に発現した膜蛋白質や人工膜中に埋め込まれた蛋白質も、固相に固定化された標的物質に包含される。
【００５５】
選択された対応付け分子の核酸に基づいて核酸ライブラリーを調製する工程は、通常には、逆転写によりDNAを調製することを含む。調製されたDNAは、配列解析に用いる、又は、核酸ライブラリーとして、対応付け分子の合成に用いられる。
【００５６】
スクリーニング方法の具体例を図４のＢを参照して説明する。[1]では、種々の蛋白質をコードするcDNAライブラリーがPCRで増幅され、逆転写され、ピューロマイシンを含むＰＥＧスペーサーに連結され、IVVテンプレートRNAライブラリーが調製される。[2]では、ベイト蛋白質をコードするベイトテンプレートRNAと共にIVVテンプレートRNAライブラリーが共翻訳され、IVVライブラリーとベイト蛋白質の複合体が得られる。[3]では、IVVライブラリーとベイト蛋白質の複合体がアフィニティースクリーニングに付される。[4]では、選択されたIVVのRNA部分が逆転写され、PCRで増幅され、RT-PCR産物が得られる。RT-PCR産物は、[5]で、転写されて、次の選択ラウンドに付されるか、又は、[6]で、アレイ解析に付される。
【００５７】
＜１−ｃ＞工程(c)
工程(c)は、工程(b)で準備されたライブラリーのDNAをテンプレートとして、RNA-DNAハイブリダイゼーションを阻害しないリガンド物質で標識されたヌクレオチドの存在下で、RNAポリメラーゼによりRNA増幅を行う工程である。
【００５８】
この工程は、DNAをテンプレートとして用いるRNAポリメラーゼによるRNA増幅方法に従って行うことができる（例えば、Everwine法(Proc Natl Acad Sci USA 87, 1663-1667)）。また、市販のRNA増幅キット（例えば、Ambion社のMEGAscript(登録商標) kit）を用いて行うことができる。
【００５９】
RNAポリメラーゼは、工程(b)で準備されたDNAに含まれるプロモーターにより転写を開始するものであることが好ましい。これにより、DNAに、RNAポリメラーゼに対応したプロモーターを導入する必要がなくなる。
【００６０】
プロモーターは、例えば、SP6プロモーターである。
【００６１】
RNA-DNAハイブリダイゼーションを阻害しないとは、RNA増幅の際のヌクレオチドの取り込み効率に影響を与えたり、工程(d)の際のハイブリダイゼーション効率に影響を与えたりすることにより、工程(d)で測定される蛍光や発光の強度においてばらつきや低下を実質的に生じさせないことを意味する。上記リガンド物質の例としては、ビオチン、ジゴキシゲニンなどが挙げられる。
【００６２】
上記リガンド物質で標識されるヌクレオチドは、ATP、GTP、CTP及びUTPの１種以上であればよく、例えば、CTP及びUTPの２種類を用いてもよい。上記リガンド物質で修飾されたヌクレオチドは市販品として入手可能である。上記リガンド物質で標識されたヌクレオチドの存在量は、好ましくは、標識されていないヌクレオチド全体の10〜15モル％である。
【００６３】
＜１−ｄ＞工程(d)
工程(d)は、工程(c)で増幅されたRNAを工程(a)で準備されたタイリングアレイへハイブリダイズさせ、上記リガンド物質に結合するアダプター物質と蛍光物質又は化学蛍光若しくは化学発光を活性化する物質の結合体を用いて標識し、蛍光又は発光の強度を測定する工程である。
【００６４】
アダプター物質の例としては、ビオチンに対するストレプトアビジン又はアビジン、ジゴキシゲニンに対する抗ジゴキシゲニン抗体などが挙げられる。化学蛍光又は化学発光を活性化する物質の例としては、化学蛍光基質若しくは化学発光基質を分解して蛍光や発光を生じさせる酵素等が挙げられる。
【００６５】
ハイブリダイゼーション、標識、及び、蛍光又は発光の強度の測定は、タイリングアレイに通常に適用される方法によって行うことができる（例えば、Stolc V, Samanta MP, Tongprasit W, Marshall WF. Genome-wide transcriptional analysis of flagellar regeneration in Chlamydomonas reinhardtii identifies orthologs of ciliary disease genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Mar 8;102(10):3703-7. Epub 2005 Feb 28.参照）。
【００６６】
＜１−ｅ＞工程(e)
工程(e)は、工程(d)の測定結果の解析により標的分子と相互作用する蛋白質又はそれをコードする核酸を検出する工程である。
【００６７】
測定結果の解析は、通常の方法に従って行うことができる（例えば、Kim TH, Barrera LO, Zheng M, Qu C, Singer MA, Richmond TA, Wu Y, Green RD, Ren B. A high-resolution map of active promoters in the human genome. Nature. 2005 Aug 11;436(7052):876-80. Epub 2005 Jun 29.参照）。
【００６８】
例えば、SignalMapソフトウェア(NimbleGen)に実装されたFind Peaksプログラムを用い、適宜、検出ウインドウ幅やシグナルの閾値などのパラメータを最適化することにより行うことができる。最適化の方法としては、相互作用が既知の蛋白質を検出候補蛋白質として用いてパラメータを最適化する方法が挙げられる。
【００６９】
測定結果の解析により検出されたプローブに基づき、mRNAが特定され、それにより、蛋白質及びそれをコードする核酸が検出されることになる。
【００７０】
＜２＞本発明検出法の応用
本発明の検出方法により、標的分子と相互作用する蛋白質又はそれをコードする核酸を検出することによって、標的分子と相互作用する蛋白質又はそれをコードする核酸を高感度でスクリーニングすることが可能になる。従って、本発明検出法により、標的分子と相互作用する蛋白質又はそれをコードする核酸を検出することを含む、標的分子と相互作用する蛋白質又はそれをコードする核酸のスクリーニング方法が提供される。
【００７１】
この応用では、標的分子はスクリーニングの目的に応じて選択される。例えば、転写因子スクリーニングの場合には、DNAを用いることができる。また、創薬の目的のスクリーニングでは、薬剤候補低分子を用いることができる。
【００７２】
本発明の検出方法において、検出候補蛋白質をコードするmRNAの配列情報の代わりに、標的物質と相互作用する蛋白質をコードするmRNAの配列情報を用いれば、検出結果と検出されたプローブのmRNA内の位置情報とに基づき相互作用部位を検出することができる。従って、本発明検出法の主要部を利用した、標的分子と相互作用する蛋白質の相互作用部位を検出する方法が提供される。
【００７３】
この場合には、スクリーニングの場合に比べて、プローブ間のギャップを小さく、又は、オーバーラップを大きくとることが好ましい。
【００７４】
以下、具体的に本発明の実施例を記述するが、下記の実施例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものでない。
【実施例１】
【００７５】
（１）In vitro virus（IVV）鋳型RNAライブラリーの作製
まず、マウス脳由来のpoly(A)+ RNA（BD Biosciences）を用いてcDNAライブラリーを作製した。cDNAライブラリーの作製は9塩基のランダム配列をもつオリゴヌクレオチド（3'random+adp）(配列番号１)を用いて、ランダムプライミング法により作製した（以下断りが無い限りオリゴDNAは全てダテコンセプトによる合成）。cDNAライブラリーの作製にはSuperScript double strand cDNA synthesis kit（Invitrogen）を使用し、操作はキットのプロトコールに従った。具体的に説明すると、まずSuperScript double strand cDNA synthesis kitおよび3'random+adpを用いて一本鎖cDNAを作製した。その後PCRに必要な共通配列を付加するため、相補的な２種類のオリゴヌクレオチド（5'adp_FW(配列番号２)および5'adp_RV(5'-GGAATTCG-3')）を予めアニールさせたアダプターをLigation high kit（Toyobo）で連結した。エタノール沈殿後、アダプターを付加した一本鎖cDNAライブラリーを5'F3(配列番号３)および3'lib_PCR(配列番号４)プライマーを用いてPCR増幅した。PCR産物はQIAquick PCR purification kit（QIAGEN）で精製後、mRNA由来配列をほとんど含まない200bp以下の短い分子をCHROMA SPIN-1000ゲルろ過カラム（BD Biosciences）で排除した。その後cDNAライブラリーは、RiboMax large RNA production system-SP6（Promega）を用いたin vitro転写、T4 RNA ligase（Takara）を用いたPEG Puroスペーサー（Nemoto et al., (1997) FEBS Lett. 414, 405-408）の付加、RNeasy mini kit（QIAGEN）による精製を経てIVVの鋳型RNAライブラリーとした。
【００７６】
（２）ベイトタンパク質の鋳型RNAの作製
マウスJunタンパク質の167から319番目のアミノ酸配列(配列番号５)を含むように、BamHI、XhoIサイトを付加したプライマー（5'Jun-BamHI(配列番号６); 3'Jun-XhoI(配列番号７)）を用いてcDNAよりPCR増幅した。PCR産物はQIAquick PCR purification kitで精製しBamHI、XhoI酵素（Toyobo）で処理することで、pCMV-CBPzzベクター(Horisawa et al., (2004) Nucleic Acids Res. 32, e169)のBamHI/XhoIサイト内に挿入した。その後、サブクローニングしたプラスミドから5'SP6(O')T7(配列番号８)および3'FosCBPzz(配列番号９)プライマーを用い、ExTaq DNAポリメラーゼ（Takara）を使用したPCRにより増幅すると同時に、in vitro転写に必要なSP6プロモーター、効率的な無細胞翻訳に必要なO'配列(配列番号１０)を付加した。PCR産物はQIAquick PCR purification kitによって精製した。精製したPCR産物はRiboMax large-scale RNA production system-SP6によりin vitro転写し、RNeasy mini kitにより精製した。
【００７７】
（３）アフィニティー選択と選択後のin vitro virus（IVV）分子の増幅
まず、鋳型RNAライブラリー 10 pmolを50μlの小麦胚芽由来の無細胞翻訳系(Promega)に投入しIVVを形成させた。その際、ベイトとなるJunの鋳型RNA(配列番号１１) 10 pmolも同時に投入し発現させた［bait(+)］。また対照としてベイトの鋳型RNAを投入しない実験［bait(-)］も行なった。翻訳は26℃で1時間行なった。翻訳後、全量に50μlのIPP150 buffer（10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% NP-40）を加え、予めIPP150 buffer 500μlで２回予備洗浄したrabbit IgG agarose beads（Sigma）と、4℃で、2時間転倒混和した。その後上清を捨て、800μlのIPP150 bufferで２回、800μlのTEV cleavage buffer（10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% NP-40, 0.5 mM EDTA, 1 mM DTT）で１回洗浄した。rabbit IgG agarose beadsに100 UのTEV protease（Invitrogen）を含む100μlのTEV cleavage bufferを加え、16℃で2時間処理することでベイトとそれに結合するIVV分子を上清に遊離し、回収した。
【００７８】
回収した上清のうち5μlを50μlのRT-PCRの反応系に鋳型として投入した。RT-PCR反応はOneStep RT-PCR kit（QIAGEN）により5'F3(配列番号３)および3'Flag-1AL(配列番号１２)プライマーを使用して行なった。RT-PCRのプログラムは、24〜32 PCRサイクルの間で条件検討を行ない、プラトーに達しない条件をラウンド毎に決定した。PCR産物は上記の方法で再びIVVライブラリーテンプレートRNAとし、繰返しスクリーニングを行なった。スクリーニングはbait(+)、bait(-)ともに５ラウンド行なった。
【００７９】
（４）オリゴDNAマイクロアレイの設計
使用したオリゴDNAマイクロアレイは、GeneFrontier社の「なんでもアレイ」サービスを通し、NimbleGen社のデジタルミラーを用いた光リソグラフィー技術（Nuwaysir et al., (2002) Genome Res. 12, 1749-1755）により作製された。本実施例において解析対象とした塩基配列は、マウスの転写因子および一次配列構造的に転写因子の候補であると考えられる遺伝子のmRNA配列群である。これはGunjiら（Gunji W., (2004) Biochem Biophys Res Commun. 325, 265-275）が作製したリストを中心とした、1,602個のmRNA配列である。プローブ長は、過去の結果（Nuwaysir et al., (2002) Genome Res. 12, 1749-1755）から高感度が得られると期待される50merとし、mRNA配列群上にギャップが無いように設計した。その結果、センス、アンチセンスの両鎖に設計された総プローブ数は167,186個となった。また、再現性確認のために、同じアレイ上に二組の同様のプローブセットを構築した。
【００８０】
（５）アフィニティー選択後のDNAライブラリーの標識物質の導入
（３）の工程で得られた、５ラウンドのアフィニティー選択後にRT-PCRにより増幅された、bait(+)およびbait(-)のDNAサンプルを蛍光標識するのに適した方法を検証した。標識の方法としては、ChIP on chip法などのDNAサンプルの標識に通常用いられるランダムプライム法、および発現解析などでmRNAサンプルの増幅・標識に用いられるEberwine法（Van Gelder R.N., (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87, 1663-1667）の変法を用い、両者の結果を比較した。
【００８１】
ランダムプライム法では、まずCy5またはCy3で標識した9merのランダムオリゴDNA（Trilink Biotechnologies）が2 O.D.となるように希釈したRandom 9mer Buffer（125mM Tris-HCl, 12.5mM MgCl2, 0.00175% β-メルカプトエタノール）を作製した。この溶液を1μg
のDNAサンプルに対し40μl加え、さらに蒸留水で68μlとした。それを98℃で5分間加熱し、氷上で急冷した。急冷後、10μlの30× dNTP mix（1× TE, 6mM dATP, 6mM dGTP, 6mM dTTP, 6mM dCTP）、40UのKlenow酵素（NEB）を加え100μlとし、37℃、２時間インキュベートした。反応後、0.5M EDTAを10μl加えて反応を停止させ、イソプロパノール沈殿による精製を行なった後、生成したDNAを10μlの蒸留水に懸濁し、ハイブリダイゼーションに用いた。
【００８２】
Eberwine変法は、通常のEberwine法がmRNAの逆転写時に付加したT7プロモーターを用いてビオチン標識したCTPおよびUTPを取り込ませたcRNAを合成する方法であるのに対し、IVV鋳型分子に必ず付属しているSP6プロモーターを用いて、ビオチン標識したsRNAを生成する、新たに考案した方法である（DNA-RNAハイブリダイゼーションの場合、RNAに直接蛍光を標識すると効率が低下するため、ビオチンを介して間接的に蛍光標識する方法をとる）。具体的には、サンプルDNA 1μgに対し、MEGAscript kit（Ambion）、Bio-11 CTPおよびBio-16 UTP（ともにEnzo）を用いて37℃で5時間in vitro 転写反応を行なうことで、ビオチン標識されたsRNAプローブを生成した。詳細な手順はキットの使用法に準じた。反応後、RNeasy mini kit（QIAGEN）を用いてsRNAを精製し、蒸留水で濃度を1.0μg/μlに希釈してハイブリダイゼーションに用いた。
【００８３】
（６）ハイブリダイゼーション、シグナルの検出およびデータ処理
ランダムプライム法により直接蛍光標識したサンプルは、Kimらの実験条件（Kim T.H. (2005) Nature 436, 876-880）に準じてマイクロアレイへのハイブリダイゼーションを行った。Cy3標識したbait(+)のサンプルとCy5標識した対照のbait(-)サンプルを同量混在させ、競合的にハイブリダイゼーションした。一方、Eberwine変法によりビオチンを標識したサンプルは、Nuwaysirらの方法（Nuwaysir E.F. (2002) Genome Res. 12, 1749-1755）に基づき、ハイブリダイゼーションを行った後に、Streptoavidin-Cy3（Amersham）を結合させ蛍光標識した。こちらは、対照のサンプルは別のアレイにハイブリダイゼーションした。蛍光標識後いずれのアレイも、Kirmizisらの方法（Kirmizis A. (2004) Genes Dev. 18, 1592-1605）に準じて、Axon 4000B蛍光スキャナー（Axon Instruments）を用いて各スポットの蛍光強度を測定した。測定後、Kimらの方法（Kim T.H. (2005) Nature 436,
876-880）に準じてデータの処理を行った。具体的には、bait(+)とbait(-)のデータに関してそれぞれ２を底とした対数をとり、その比を算出した（log2[bait(+)]/log2[bait(-)]）。このデータを"ratio"としてその後の解析を行った。
【００８４】
（７）検出結果の解析と評価
実験により得られたratioデータに対し、SignalMapソフトウェア（NimbleGen）に実装されたFind Peaksプログラムを用いて、有意なシグナルの検出を行った。Find Peaksのシグナル検出のアルゴリズムは、任意のウインドウ幅（塩基数で表わす）で、限定された領域の核酸配列をサーベイし、その限定された領域内に設置されたプローブのうち、閾値以上の値をもつものが４個以上存在する領域を、ピークとして検出するものである。本実施例では、具体的な検出アルゴリズムのパラメータ条件として、任意のmRNA配列上の連続したプローブに対し、300塩基（50塩基のプローブ６個分）のウインドウの範囲内で、そのmRNA配列上最大のシグナルを示すプローブの数値の20%以上の値をもつものが４個以上存在する領域を、ピークとして検出するものとした。ピーク検出アルゴリズムにおいては、ピークを検出するために必要な最低プローブ数は、ノイズの増大を防ぐために４個以下に変更することは現実的に不可能であり、またプローブ鎖長に関しても、効率の良いシグナルを得るために50塩基程度に固定する必要がある。したがって、パラメータとして変更することが可能なのは、検出ウインドウ幅とシグナルの閾値であるが、転写因子JunのbZIPドメインをベイトとして通常のIVV法によるスクリーニングを行った結果から得られた20個の相互作用タンパク質候補群（Horisawa et al., (2005) J Biochem. 137, 121-124）を指標に検討したところ、偽陰性・偽陽性ともに最も少なくなる条件は上記の値であった。
【００８５】
この結果、Eberwine変法による標識、ハイブリダイゼーション、検出を行った系では、前出の既存の手法により検出された20個の相互作用タンパク質候補群が全て特異的にシグナルとして検出されたのに対し、ランダムプライム法による標識を行い、２色の蛍光標識サンプルによる競合ハイブリダイゼーションで検出を行った系では、検出されない配列が存在した。一例（遺伝子名：9130229H14Rik）を図２に示す。このような結果の相違が生じた理由としては、（１）ランダムプライム法では、ランダムプライマーの末端に蛍光分子を１分子標識する方法をとるため、１断片に多数の蛍光分子が標識されるEberwine変法よりも感度が低くなった、（２）Eberwine変法では、効率的なRNA-DNAハイブリダイゼーションを阻害する蛍光分子による直接標識を行わず、ビオチン-ストレプトアビジンによる間接的な標識を行うため、シグナルが増感され感度が向上した、（３）ランダムプライム法では、ランダムプライマーの配列の偏りが増幅する配列の存在比にバイアスを与えている可能性があるのに対し、Eberwine変法では、転写によるRNAの増幅は比較的リニアであり量的バイアスが生じにくいことから、正確に選択された配列を検出することができた、などの可能性が考えられる。したがってIVV法により特異的な選択をうけたDNA断片の濃縮をタイリングアレイで検出するためには、Eberwine変法を用いるのが有効であると考察される。したがって以下の解析はEberwine変法によるデータを用いた。なお、本実施例では、Eberwine変法のプロトコールとして、Ambion社のMEGAscript kitを用いてビオチンを結合したUTPおよびCTPをRNAに取り込ませ、間接的に蛍光標識する方法を採ったが、IVV法
によって得られるDNA断片は概して鎖長が短いものが多く、標識の効率が無細胞転写のためのキット固有の性能に大きく左右されるとは考えにくいため、RNAポリメラーゼを利用した他の無細胞転写キットを用いても、ほぼ同様の結果が得られると期待される。同様に、RNAに取り込ませるビオチン結合NTPに関しても、今回採用したUTP、CTP以外のもの（ATP、GTP）を用いた場合にも同様の結果が得られると考察される。蛍光標識サンプルとしてRNAを用いる以外にも、DNAを複製する際に蛍光標識したdNTPやビオチン標識したdNTPを取り込ませ、シグナル感度をあげることで、Eberwine変法と同等の結果が得られる可能性もあるが、PCRなどのDNA増幅は、転写によるRNA増幅に比べてリニアリティが低いために、配列の存在比にバイアスが生じる可能性は否定できない。また、Eberwine変法はIVV法により濃縮されたcDNAライブラリーからワンステップで標識が可能であるため、バイアスが入り込む余地が少なく、操作の簡便性においても優位であると考察される。
【００８６】
Find Peaksプログラムによりratioのデータから得られた個別のピークに着目すると、ベイトタンパク質との結合部位が既知のタンパク質に関して、ベイトタンパク質との結合に必要最低限に近い範囲が、シグナルとして得られていることが判明した。一例（遺伝子名：Maf）を図３に示す。IVV法により検出されるタンパク質の相互作用に必要最低限の領域は、モチーフレベルの短い領域である場合が多く、実際、過去の研究の結果得られている配列の多くも200〜350bp程度のモチーフ配列に限定された断片が殆どであった。このことから考察すると、今回特異的に濃縮された配列のシグナルを効率よく得られたのは、タイリングアレイを設計するうえで、プローブ間にギャップを設けない、密なプローブ配置のアレイをカスタムに設計したことが成功の要因であると考えられる。なぜなら、通常、ChIP on chip法などで一般的に用いられる市販のタイリングアレイのプローブ設計では、プローブ間に平均50〜300bp程度のギャップを設けることが多いために、解像度が低く短い領域のDNA断片を検出することが難しいと考えられるからである。したがって、IVV法の性質により、特異的に選択されたDNA断片は比較的短い、限定された領域のものとなる点、先に示した理由からピーク検出のためのアルゴリズムの条件がある程度固定される点、また効率的なシグナル検出のためには50塩基程度以上のプローブ鎖長が必要である点などを考慮すると、DNAマイクロアレイを用いてIVV法により選択されたDNA断片を効果的に検出するためには、50塩基程度の鎖長のオリゴDNAプローブを、プローブ間のギャップが少ない状態で設計することが必須であること分かった。本実施例ではプローブ間の間隔をO塩基に設定したが、上述の条件から考察すると、プローブの鎖長を大きく超えることの無いようなプローブ間のギャップやオーバーラップは、設計上許容され得ると考えられる。
【００８７】
全ての配列のratioのデータのうち、再現性良くピークのシグナル強度の最大値が3.0以上となったものを選択したところ、過去の報告（Horisawa et al., (2004) Nucleic Acids Res. 32, e169）で検出されている20個の配列に加え、23個の配列をシグナルとして検出することができた（表１）。これら23個の配列のスクリーニング前後のライブラリー中の存在量をLightCycler（Roche）、SYBR Premix PCR kit（Takara）、および配列特異的プライマーセットを用い、キットのプロトコールに基づき定量したところ、16個が特異的に濃縮されていることが分かった（表１）。配列特異的プライマーの配列は、対象遺伝子名に「_F」(フォワードプライマー)及び「_R」(リバースプライマー)を付した名称で配列表に示す（配列番号１３〜５８）。16個の配列のうち5個はJunの相互作用因子として既知の遺伝子であり、残りは新規の相互作用候補であった。既存のIVVスクリーニングにおける配列の検出法であるクローニングによる手法（WO 03/014734）では、1,000クローンを超える解析は現実的に困難であり、その際の検出限界は理論上分子数で0.1%である。実際の結果（Horisawa et al., (2004) Nucleic Acids Res. 32, e169）でもおよそこれに符合する結果となっていた。本実施例により検出された候補群では、スクリーニング後の濃度が最も低い候補で0.0001%である。このことから、既存のIVVスクリーニングよりも、およそ100〜1,000倍の高感度となることが示された。
【００８８】
【表１】
2007181454.tif 000003
【００８９】
表１における参照文献は以下の通りである。
Horisawa et al.（2004）： Nucleic Acids Res. 32, e169
Kataoka et al.（1994）： Mol. Cell Biol. 14, 700-712
Chatton et al.（1994）： Oncogene 9, 375-385
Hai and Curran（1991）： Proc Natl Acad Sci USA. 88, 3720-3724
Kerppola and Curran（1993）： Mol. Cell Biol. 13, 5479-5489
Kouzarides and Ziff（1989）： Nature 340, 568-571
【実施例２】
【００９０】
様々なプローブ間隔におけるタイリングアレイ解析を行った。より詳しくは、実施例１
におけるオリゴDNAマクロアレイの設計において、プローブ間隔を変更する他は、実施例１と同じ操作を行い、プローブ間隔の影響を検討した。具体的には以下の通りであった。
【００９１】
DNAマイクロアレイにより解析するcDNAライブラリーサンプルは、実施例１の（１）〜（３）において作製したものを使用した。実施例１においてシグナル強度が高かった遺伝子など、表２に示す遺伝子を選択し、実施例１の（４）の手法により、プローブのオーバーラップがそれぞれ、25、22、20、17、15、12、10、7、5、0、-20 base(マイナスはプローブ間の間隔を示す)となるようなオリゴDNAマイクロアレイを設計した。実施例１の（５）において、サンプルへの標識物質の導入法として、Eberwin変法を用いた。ハイブリダイゼーション、シグナルの検出、データ処理、解析は、実施例１の（６）〜（７）と同様の方法で行った。
結果を表２に示す。
【００９２】
【表２】
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【００９３】
プローブがオーバーラップする領域を増加させた場合（プローブ鎖長の0〜50％）には
、オーバーラップ無しの場合と比較して、多少の変動はあるものの、検出される遺伝子の数が大幅に変動するようなことはないが、一方、プローブの間隔を空けた設計では、検出される遺伝子数が著しく減少することが判った。これは、IVV法により選択されるDNA断片の鎖長と、ある領域に連続してシグナルが得られることを要求するタイリングアレイ技術の特性に起因すると考えられ、本発明におけるプローブ設計におけるプローブ間隔は、IVV法におけるタイリングアレイの活用に有効かつ必須の条件であることが判る。
【実施例３】
【００９４】
従来のIVV法、及び、本発明の方法による検出感度を比較検討するために、検出された候補蛋白質をコードするDNAが、cDNAライブラリー中にどの程度濃縮されているか、リアルタイムPCRを用いて測定した。具体的には以下の通りであった。
【００９５】
cDNAライブラリーとしては、実施例１の（３）において作製した、５ラウンドのスクリーニング後のDNAサンプルを用いた。リアルタイムPCRは、プライマーとして、実施例１で使用したもの（配列番号１２〜５８）を用いる他は、非特許文献１に示した方法により行った。
【００９６】
結果を図５に示す。図５の左側のカラム（A）が、従来のIVV法による検出が報告され、かつ、本発明の方法（実施例１）においても検出された候補、右側のカラム（B）が、本発明の方法（実施例１）でのみ検出された候補である。それぞれの数値はスクリーニング後のcDNAライブラリー（1.0E+10分子）中の各候補の分子数を示している。従来のIVV法ではクローニングを経てそれぞれの配列を解析するために、最終的にライブラリー中に0.001%以上に濃縮されなければ、現実的に検出は難しい（1,000クローン程度の配列解析）。対して本発明の方法は0.000001%（1,000,000クローン程度の配列解析）程度の存在量の候補も検出することができている。これは従来の手法よりも約100〜1,000倍感度が向上したと言える。
【００９７】
この感度の向上は、発現量の少ない蛋白質や、ベイトとのアフィニティーが比較的弱い蛋白質など、最終的にライブラリー中の濃縮度をあまり上げることができない候補に対して非常に有効であると考えられる。実際に、本実施例により検出された既知のJunの相互作用蛋白質であるAtf3について、スクリーニング前の存在量をリアルタイムPCRで確認したところ、初期の存在量は、cDNAライブラリーの抽出源としたマウス脳組織の1,000個の細胞中1細胞に数コピーだけ発現しているという、極微量であることが判った。このことから、本発明の方法は、体性幹細胞など、サンプル入手の量的制限が相互作用解析を困難にしている例に対して非常に有効であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】従来のスクリーニング戦略と本発明によるスクリーニング戦略の模式図。
【図２】ランダムプライム法及びEberwine変法による蛍光標識の結果を同じ遺伝子について比較した例。
【図３】既知の結合に必要な部位が選択的に検出されている遺伝子の例。
【図４】IVVスクリーニング法の一例の説明図。Ａは、無細胞翻訳系におけるリボゾーム上でのIVV形成の原理の説明図。Ｂは、IVVを用いる蛋白質相互作用の、繰返し選択の説明図。
【図５】従来法及び本願発明の方法により検出された候補タンパク質と最終的なcDNAライブラリー中の濃度を比較した例。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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