(57)【要約】本発明は、個体に治療的効果量のアミノグリコシドを投与する工程を含むことを特徴とする、治療を必要とする個体において、ハーラー症候群およびバットン病のようなリソソーム蓄積症を治療する方法を提供する。本方法は、酵素補充療法で個体を治療する工程をさらに含んでいてよい。さらに、本発明は、個体に薬理学的効果量のアミノグリコシドを投与する工程を含むことを特徴とする、そのようなリソソーム蓄積症の個体において未熟終止突然変異を薬理学的に抑制する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療的効果量のアミノグリコシドを個体に投与する工程を含むことを特徴とする、治療を必要とする個体においてリソソーム蓄積症を治療する方法
【請求項２】
前記リソソーム蓄積症がハーラー症候群であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記アミノグリコシドが、ゲンタマイシン、Ｇ４１８、ハイグロマイシンＢ、パロマイシン、トブラマイシン、リビドマイシンＡ、アミカシン、シソマイシン、およびネオマイシンより成る群から選択されることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
ゲンタマイシンが約１ｍｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇまでの用量で投与されることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記アミノグリコシドが、自然に生じた未熟終止突然変異を抑制することを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項６】
前記自然に生じた未熟終止突然変異が、ＩＤＵＡ−Ｑ７０Ｘ終止突然変異およびＩＤＵＡ−Ｗ４０２Ｘ終止突然変異より成る群から選択されることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
酵素補充療法で前記個体を治療する工程をさらに含むことを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項８】
前記酵素補充療法が、アミノグリコシド治療の前、アミノグリコシド治療と同時、またはアミノグリコシド治療の後の何れかに実施されることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記酵素が、組換えα−Ｌ−イズロニダーゼであることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記酵素が、Aldurazyme（登録商標）であることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ポリ−アニオン性化合物で前記個体を治療する工程をさらに含むことを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリ−アニオン性化合物が、ポリ−Ｌ−アスパラギン酸およびダプトマイシンより成る群から選択されることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ポリ−アニオン性化合物で前記個体を治療する工程をさらに含むことを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリ−アニオン性化合物が、ポリ−Ｌ−アスパラギン酸およびダプトマイシンより成る群から選択されることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
α−Ｌ−イズロニダーゼをコードする遺伝子治療ベクターで前記個体を治療する工程をさらに含むことを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項１６】
ポリ−アニオン性化合物で前記個体を治療する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリ−アニオン性化合物が、ポリ−Ｌ−アスパラギン酸およびダプトマイシンより成る群から選択されることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記リソソーム蓄積症がバッテン病であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１９】
前記アミノグリコシドが、ゲンタマイシン、Ｇ４１８、ハイグロマイシンＢ、パロマイシン、トブラマイシン、リビドマイシンＡ、アミカシン、シソマイシン、およびネオマイシンより成る群から選択されることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ゲンタマイシンが約１ｍｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇまでの用量で投与されることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記アミノグリコシドが、自然に生じた未熟終止突然変異を抑制することを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
酵素補充療法で前記個体を治療する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２３】
前記酵素補充療法が、アミノグリコシド治療の前、アミノグリコシド治療と同時、またはアミノグリコシド治療の後の何れかに実施されることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記酵素が、ヒトＣＬＮ２遺伝子によってコードされる組換えトリペプチジル−ペプチダーゼＩであることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
ポリ−アニオン性化合物で前記個体を治療する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２６】
前記ポリ−アニオン性化合物が、ポリ−Ｌ−アスパラギン酸およびダプトマイシンより成る群から選択されることを特徴とする請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
ヒトＣＬＮ２遺伝子によってコードされるトリペプチジル−ペプチダーゼＩをコードする遺伝子治療ベクターで前記個体を治療する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２８】
ポリ−アニオン性化合物で前記個体を治療する工程をさらに含むことを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記ポリ−アニオン性化合物が、ポリ−Ｌ−アスパラギン酸およびダプトマイシンより成る群から選択されることを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記リソソーム蓄積症がムコ多糖症Ｉ型であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３１】
前記ムコ多糖症Ｉ型がシェイエ症候群であることを特徴とする請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記ムコ多糖症Ｉ型がハーラー／シェイエ症候群であることを特徴とする請求項３１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
非仮特許出願である本出願は、２００１年２月２０日に出願され現在は放棄されている米国仮特許出願第６０／２７０，０９２号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、概して、リソソーム蓄積症の分子薬理学および治療に関する。より詳細には、本発明は、アミノグリコシド系抗生物質を用いてムコ多糖症I型（特にハーラー症候群）およびバッテン病を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
リソソームは、細胞において細胞に対する有用性を越えて残存している巨大分子の分解を促進させる細胞コンパートメントである。その分解性役割の重要性のため、そのような過剰な巨大分子の破壊を実施するのに必要とされる多くの加水分解酵素がリソソームに存在する。それら酵素の１つ以上が欠損すると、それら酵素の基質はもはや分解されず蓄積し、しばしばリソソーム蓄積症と称される一連の疾患につながる。
【０００４】
ムコ多糖症の用語は、様々な組織のリソソ−ム内へのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の過剰な蓄積によって特徴付けられるリソソーム蓄積症の１つの分類である。それら蓄積症の中で、ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）は、リソソーム内でグリコサミノグリカンの分解に関与する酵素α−Ｌ−イズロニダーゼの欠損によって生じる、常染色体劣性リソソーム蓄積症である。ムコ多糖症をさらに３つのカテゴリーに細かく分けることができる：ハーラー症候群（ＭＰＳ Ｉ−Ｈ型）、最も重篤な形態；シェイエ症候群（ＭＰＳ Ｉ−Ｓ型）、軽い形態；およびハーラー／シェイエ症候群（ＭＰＳ Ｉ−Ｈ／Ｓ）、中間の形態。ハーラー症候群は、リソソーム内へのデルマタン硫酸およびヘパラン硫酸の両方の蓄積につながるα−Ｌ−イズロニダーゼ活性のほぼ完全な不在によって特徴付けられる（６）。その疾患の身体症状として、関節の硬直、骨格異常、および角膜混濁が挙げられる。ハーラー症候群の進行は、結果として、心臓および肝臓疾患、ならびに痴呆を生じさせ、通常幼児期に死をもたらす（７）。
【０００５】
ハーラー症候群のＭＰＳ Ｉ患者において認められる２つの最も頻出する突然変異であるＱ７０ＸおよびＷ４０２Ｘナンセンス突然変異は、ヨーロッパ出身の患者の〜７０％で存在する（８）。重要なこととして、他の形態のＭＰＳ Ｉは、臨床的により軽い病状を示し、正常なα−Ｌ−イズロニダーゼ活性の１％程度の活性によって病気の表現型の多くが軽減され得ることを示唆する（９−１１）。
【０００６】
抑制療法のためのアミノグリコシドの新規な使用から恩恵を受けることができる別の群のリソソーム蓄積症は、神経性セロイドリポフスチノーシス（ＮＣＬ）であり、総称してバッテン病としても知られている。神経性セロイドリポフスチノーシスは、１００,０００人に１人の発生率を有する最も一般的な小児神経変性疾患である。全ての型の神経性セロイドリポフスチノーシスは、常染色体劣性態様で遺伝する。神経性セロイドリポフスチノーシスの症状は、失明、発作、麻痺、痴呆、および早期の死を含む。神経性セロイドリポフスチノーシスは、発症年齢（幼児、乳児後期、児童、および成人）に基づいて４つの主な型にさらに分類できる。さらには、リソソーム内に蓄積される物質のタイプは、異なる形態の神経性セロイドリポフスチノーシスの間で変化する。詳細には、少なくとも８つの遺伝子が神経性セロイドリポフスチノーシスの根底にあり、そのうちの４つが単離されており、神経性セロイドリポフスチノーシスの原因となる突然変異が特徴付けられている。そのような遺伝子として、ＣＬＮ１、ＣＬＮ２、ＣＬＮ３、およびＣＬＮ５が挙げられる。ＣＬＮ２における突然変異は、乳児後期に発症する形態の神経性セロイドリポフスチノーシスに関連する。ＣＬＮ２は、ＮＣＬ中（特徴付けられた対立遺伝子の２６％）にほとんどのナンセンス突然変異を含むことが分かっている（非特許文献１）。ＣＬＮ２によってコードされるタンパク質は、リソソーム内でタンパク質の分解に機能するトリペプチジル−ペプチダーゼＩ（ＴＴＰ１）である。その酵素が無ければ、選択タンパク質はリソソーム内に蓄積し、蓄積産物の主な成分はミトコンドリアのＡＴＰシンターゼの過度に疎水性のサブユニットである。このタイプの貯蔵産物のリソソーム蓄積は、乳児後期の形態の神経性セロイドリポフスチノーシスの発症の原因となる（非特許文献２および３）。アミノグリコシドは、十分なレベルのＴＴＰ１を回復させるために、ＣＬＮ２遺伝子内での未熟終止突然変異(premature stop mutation)を抑制し、さらに病気の表現型を軽減するのに利用されるであろう。組換えＴＴＰ１および／またはＣＬＮ２遺伝子治療ベクターの投与から成る治療の前またはそれと同時に、そのような試みを用いてもよい（非特許文献４）。
【０００７】
他の研究は、アミノグリコシドが、生理的に適切な量の機能性タンパク質を回復するレベルで、他の非リソソーム病における未熟終止突然変異も抑制できることを示している。この試みの有用性は、常染色体劣性疾患である嚢胞性線維症（ＣＦ）で最初に実証され、アミノグリコシドであるゲンタマイシンおよびＧ４１８が、ＣＦ膜貫通調節タンパク質（ＣＦＴＲ）遺伝子におけるナンセンス突然変異を抑制することが分かった（１、２）。それら化合物は、ヒト気管支上皮細胞株においてゲノムの嚢胞性線維症ナンセンス突然変異を抑制し、頂端側細胞膜に局在化するＣＦＴＲタンパク質およびそのｃＡＭＰ−活性化クロライドチャネル活性の両方を回復することが示された。ΔＦ５０８ＣＦＴＲ対立遺伝子に関してホモ接合性である細胞はアミノグリコシド治療に応答しなかったことから、それら研究においてナンセンス抑制に関するアミノフリコシド作用の特異性が示された。ごく最近、ナンセンス突然変異を担持する嚢胞性線維症患者での予備試験で得られた臨床データは、局所用または静脈投与用のゲンタマイシンが、in vivoで部分的にＣＦＴＲ活性を回復できることを示唆した。別の試験は、ゲンタマイシンが、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの動物モデルであるｍｄｘマウスのジストロフィン（Ｄｍｄ）遺伝子におけるナンセンス突然変異も抑制し得ることを見つけた。ジストロフィン発現の部分的回復が、処置動物における筋肉の劣化を顕著に減らすことによって達成された。しかしながら、アミノグリコシドが終止突然変異を抑制し、さらに任意の他の遺伝病に関連する生化学的欠陥を覆す能力は、非常に予測不可能である。
【０００８】
酵素活性と疾患の重篤性の間の明確な相関性は、ＭＰＳ ＩおよびＮＣＬ疾患を、終止突然変異のアミノグリコシド抑制によって回復されるタンパク質発現のレベルがヒトの遺伝病に関連する生化学的欠陥を覆すことができるか否かを調べるための優れた候補疾患にならしめるであろう。
【非特許文献１】Hum. Mut. 14: 199-215, 1999
【非特許文献２】Biochim. Biophys. Acta 1429: 496-500, 1999
【非特許文献３】J. Neurochem. 72: 2573-2582, 1999
【非特許文献４】J. Neurochem. 73: 700-711, 1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
先行技術は、ＭＰＳ Ｉ（例えばハーラー症候群）または神経性セロイドリポフスチノーシス（たとえばバッテン病）のための有効な治療計画を欠いている。本発明は、当業界におけるこのような長年の必要性および要求を満たして、そのようなリソソーム蓄積症の治療法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
アミノグリコシド治療の主な副作用はリソソーム機能障害によって顕在化するため、先行技術は、アミノグリコシドの使用が、概してリソソーム蓄積症を治療するのに有用ではないことを示唆している(Antimicrob. Agents Chemother. 43: 1003-1012, 1999)。本発明は、ゲンタマイシンによるナンセンス突然変異の抑制が、ハーラー症候群の生化学的欠陥を覆し得ることを示しており、アミノグリコシド治療（補完的な治療計画と共にまたは無しに）が、ハーラー症候群（ならびに多くの他のリソソーム蓄積症）の多くの患者に効果的な治療法を提供することができる。
【００１１】
ハーラー症候群は、リソソーム内でグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の分解に参加する酵素α−Ｌ−イズロニダーゼの欠損によって生じるリソソーム蓄積症の最も重篤な形態である。ある集団において、未熟終止突然変異が、ハーラー症候群の原因となる突然変異のほぼ２／３に相当する。この研究において、アミノグリコシドであるゲンタマイシンがＩＤＵＡ遺伝子内における終止突然変異を抑制し得るか否かを調べた。ＩＤＵＡ終止突然変異Ｑ７０ＸおよびＷ４０２Ｘに関してヘテロ接合性であるハーラー症候群繊維芽細胞株は、ゲンタマイシンの存在下で培養した場合にα−Ｌ−イズロニダーゼ活性の有意な上昇を示し、結果的に正常α−Ｌ−イズロニダーゼ活性の２.８％の回復をもたらした。免疫定量法によるα−Ｌ−イズロニダーゼタンパク質レベルの特定は、ゲンタマイシン治療がハーラー細胞においてα−Ｌ−イズロニダーゼタンパク質の類似の増加をもたらすことを示唆した。この治療の結果として生じるα−Ｌ−イズロニダーゼ活性およびタンパク質レベルの両方が、軽い症状のハーラー表現型と関連した。ハーラー繊維芽細胞は、正常のものよりもかなり高いレベルのグリコサミノグリカンを含むが、ゲンタマイシン治療は、ハーラー細胞におけるグリコサミノグリカンレベルを正常レベルまで低下させた。さらには、低下したグリコサミノグリカンレベルは、ゲンタマイシン治療が中止された後少なくとも２日間持続された。グリコサミノグリカンレベルの低下は、リソソームの空胞化の著しい減少にも反映された。合わせて、それら結果は、未熟終止突然変異の抑制が、ＩＤＵＡ遺伝子において未熟終止突然変異を有するハーラー症候群の患者に効果的な治療法を提供できることを示唆する。
【００１２】
本発明の１つの実施形態において、治療的効果量のアミノグリコシドを個体に投与する工程を含むことを特徴とする、治療を必要とする個体においてムコ多糖−関連蓄積症を治療する方法を提供する。
【００１３】
本発明の別の実施形態では、個体に薬理学的効果量のアミノグリコシドを投与する工程を含むことを特徴とする、ムコ多糖−関連リソソーム蓄積症（たとえばハーラー症候群）の個体において未熟終止突然変異を薬理学的に抑制する方法を提供する。
【００１４】
本発明のさらに別の実施形態では、個体に治療的効果量のアミノグリコシドを投与する工程を含むことを特徴とする、治療を必要とする個体において未熟終止突然変異によって生じる他のリソソーム蓄積症（たとえばバッテン病）を治療する方法を提供する。
【００１５】
本発明の他のおよび別の態様、特徴、および利点は、以下の発明の好ましい実施形態の記載から明らかになるであろう。それら実施形態は開示の目的で提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
添付図面は、上記の本発明の特徴、利点、および目的が明らかになりかつ詳細に理解できるように本明細書に含まれている。それら図面は本明細書の一部を形成する。しかしながら、添付図面は本発明の好ましい実施形態を例示するものであり、本発明の範囲を限定するものとみなすべきではないことに留意すべきである。
【００１７】
図１は、ＩＤＵＡ−Ｗ４０２Ｘ終止突然変異のゲンタマイシン媒介抑制を示す。ＤＮＡ鋳型は、増量するゲンタマイシンの存在下、ウサギ網状赤血球溶解物結合転写／翻訳システムにおいて発現される。反応終了後直ぐに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって切断および完全長翻訳産物を分離し、ホスフォイメージャー(phosphorImager)分析によって定量化した。図１Ａは、ゲンタマイシンの濃度を上昇させて翻訳を実施した場合の、ヒトＩＤＵＡ−Ｗ４０２Ｘ ｃＤＮＡから産生されるポリペプチドを示す。ＷＴ：完全長α−イズロニダーゼ、Ｗ４０２Ｘ：未熟終止突然変異で切断されたα−Ｌ−イズロニダーゼ。図１Ｂは、ゲンタマイシンの濃度を上昇させて翻訳を実施した場合の、ハーラー症候群Ｑ７０Ｘ終止突然変異およびＩＤＵＡ遺伝子の周辺のコドンを含むＩＤＵＡ−Ｑ７０Ｘ受容体構築物から産生されたタンパク質を示す。Ｑ７０Ｘ突然変異での翻訳終止は２６ｋＤａ産物をもたらし、Ｑ７０Ｘ突然変異の抑制は完全長３７ｋＤａ産物を生じさせる。終止突然変異の抑制のレベル（％完全長タンパク質）は、切断および完全長タンパク質の合計に対する産生された完全長タンパク質の量に相当する。
【００１８】
図２は、ハーラー未熟終止突然変異のゲンタマイシン−媒介抑制は、機能的に有意なレベルのα−Ｌ−イズロニダーゼ活性を産生することを示す。２００μｇ／ｍｌゲンタマイシンの存在下（＋）または不在下（−）において２４時間正常またはハーラー繊維芽細胞株（Ｐ４）を培養した。ハーラー細胞株は、Ｑ７０ＸおよびＷ４０２Ｘ ＩＤＵＡ突然変異に関してヘテロ接合性であった。データを平均±ＳＤで示す。
【００１９】
図３は、ハーラーＱ７０Ｘ／Ｗ４０２Ｘ突然変異のゲンタマイシン媒介抑制が、αイズロニダーゼタンパク質のレベルを上昇させることを示す。ポリクロナール−モノクロナールサンドイッチ免疫測定法を実施して、１０００μｇ／ｍｌゲンタマイシンの存在下または不在下で培養したＱ７０Ｘ／Ｗ４０２Ｘハーラー繊維芽細胞において発現されるα−Ｌ−イズロニダーゼタンパク質の量を特定した。結果を平均±ＳＤで示す
図４は、ゲンタマイシンによって媒介されたハーラー繊維芽細胞におけるα−Ｌ−イズロニダーゼ活性の上昇が、グリコサミノグリカン蓄積を減らすのに十分であることを示す。図４Ａは、正常およびハーラー（Ｑ７０Ｘ／Ｗ４０２Ｘ）繊維芽細胞（Ｐ６）を３５ＳＯ４と共に３日間培養し、その後、１０００μｇ／ｍｌゲンタマイシンの存在下（＋）または不在下（−）で３５ＳＯ４無しに２日間培養した。その後グリコサミノグリカンのレベルを特定した。図４Ｂは、正常およびハーラー繊維芽細胞を３５ＳＯ４と共に３日間培養し（１−３日目）、続いてゲンタマイシンの存在下（＋）または不在下（−）で４８時間非標識（追跡）培養した（４−５日目）。その後、３５ＳＯ４と共に細胞をさらに２日間培養して（６−７日目）、新たに合成されたグリコサミノグリカンを標識した。さらに、グリコサミノグリカンのレベルを特定した。データ−を平均±ＳＤで示す。
【００２０】
図５は、ゲンタマイシン処理後のハーラー線維芽細胞における正常リソソ−ム存在量の回復を示す。１０００μｇ／ｍｌゲンタマイシンの存在下（＋）または不在下（−）、カバースリップ上でハーラー（Ｑ７０Ｘ／Ｗ４０２Ｘ）繊維芽細胞および野生型線維芽細胞を２日間増殖させた。次に、リソソーム特異的蛍光プローブLysoTracker Redと共に３７℃で１時間細胞をインキュベートし、１００倍の倍率で観察した。
【００２１】
図６は、ゲンタマイシン処理が、強い細胞ストレス反応を誘導しないことを示す。指示された濃度のゲンタマイシンと共に培養した正常繊維芽細胞（Ｐ６）において、誘導形態のＨｓｐ７０の存在量をウェスタンブロットによって測定した。ゲンタマイシン処理によるＨｓｐ７０の倍増(fold increase)として結果を表す。強いストレス反応の間におけるＨｓｐ７０レベルの上昇を特定するため、後述するように繊維芽細胞に熱ショックを与えた。データ−を平均±ＳＤで示す。
【００２２】
図７は、ポリ−Ｌ−アスパラギン酸とゲンタマイシンとの共投与が、未熟終止突然変異の抑制をさらに促進できることを示す。データは、２５０μｇ／ｍｌポリ−Ｌ−アスパラギン酸を添加してまたは添加しないで、様々な濃度のゲンタマイシンの存在下でハーラー繊維芽細胞（Ｐ４）において発現される野生型イズロニダーゼ活性の割合（％）として表す。データ−を平均±ＳＤで示す。
【００２３】
本発明の１つの実施形態において、治療的効果量のアミノグリコシドを個体に投与する工程を含むことを特徴とする、治療を必要とする個体においてハーラー症候群を治療する方法を提供する。治療上有用なアミノグリコシドの例示として、Ｇ４１８、ハイグロマイシンＢ、パロマイシン、トブラマイシン、リビドマイシンＡ、アミカシン、シソマイシン、およびネオマイシンが挙げられる。それらアミノグリコシドの投与は、当業者にとって日常的な作業である。たとえば、約１ｍｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇまでの用量でゲンタマイシンを投与してよい。好ましくは、アミノグリコシドは、自然に生じる未熟終止突然変異を抑制する。たとえば、自然に生じる未熟終止突然変異は、ＩＤＵＡ−Ｑ７０Ｘ終止突然変異およびＩＤＵＡ−Ｗ４０２Ｘ終止突然変異であってよい。さらに、治療を必要とする個体においてハーラー症候群を治療する本方法は、酵素補充療法で前記個体を治療する工程をさらに含んでいてもよい。本発明のさらに別の態様では、本方法は、ポリ−アニオン性化合物で前記個体を治療する工程をさらに含んでいてよい。例示的ポリ−アニオン性化合物として、ポリ−Ｌ−アスパラギン酸およびダプトマイシンが挙げられる。
【００２４】
また、本発明は、薬理学的効果量のアミノグリコシドを個体に投与する工程を含むことを特徴とする、ハーラー症候群の個体において未熟終止突然変異を薬理学的に抑制する方法に関する。治療上有用なアミノグリコシドの例示として、Ｇ４１８、ハイグロマイシンＢ、パロマイシン、トブラマイシン、リビドマイシンＡ、アミカシン、シソマイシン、およびネオマイシンが挙げられる。アミノグリコシドの投与は、当業者にとって日常的な作業である。たとえば、約１ｍｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇまでの用量でゲンタマイシンを投与してよい。好ましくは、アミノグリコシドは、自然に生じる未熟終止突然変異を抑制する。たとえば、自然に生じる未熟終止突然変異は、ＩＤＵＡ−Ｑ７０Ｘ終止突然変異およびＩＤＵＡ−Ｗ４０２Ｘ終止突然変異であってよい。さらに、ハーラー症候群の個体において未熟終止突然変異を薬理学的に抑制する本方法は、酵素補充療法で前記個体を治療する工程をさらに含んでいてもよい。酵素補充療法は、アミノグリコシド治療の前、アミノグリコシド治療と同時、またはアミノグリコシド治療の後の何れに行ってもよい。好ましくは、酵素は、たとえばAldurazyme（登録商標）のような組換えα−Ｌ−イズロニダーゼである。本発明のさらに別の態様では、アミノグリコシドとα−Ｌ−イズロニダーゼをコードする遺伝子治療ベクターとを組み合わせてハーラー症候群の個体を治療してもよい。本方法のさらに別の態様において、本方法は、ポリ−アニオン性化合物で前記個体を治療する工程をさらに含んでいてよい。例示的ポリ−アニオン性化合物として、ポリ−Ｌ−アスパラギン酸およびダプトマイシンが挙げられる。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態において、ゲンタマイシンまたは他のアミノグリコシドでの治療を、酵素補充療法および／または関心治療タンパク質をコードするＤＮＡ分子をそのＤＮＡ分子の発現に適した条件下で用いる遺伝子治療の前または同時に用いることができる。従って、ハーラー症候群［ムコ多糖症Ｉ型、すなわちＭＰＳ−Ｉとしても知られている］の治療に関して、本発明の方法を、現在臨床試験を行っている組換えα−Ｌ−イズロニダーゼ［Aldurazyme, Genzyme Corporation, Combridge, MA and BioMarin Pharmaceuticals, Inc, Nvato, CA; Shull et al, PNAS USA 91: 12937-12941 (1994)を参照］；または組換えα−Ｌ−イズロニダーゼ［国際公開第9310244号パンフレトを参照、参照によって本明細書に組込まれる］での治療の前または同時に用いることができる。
【００２６】
また、本発明は、治療的効果量のアミノグリコシドを個体に投与する工程を含むことを特徴とする、治療を必要とする個体においてリソソーム蓄積症を治療する方法に関する。たとえば、バッテン病（乳児後期神経性セロイドリポフスチノーシス（ＬＩＮＣＬ）としても知られている）の治療に関して、本発明の方法に基づいて、ゲンタマイシンまたは他のアミノグリコシドでの治療を、組換え神経性セロイドリポフスチノース(lipofuscinose)ＣＬＮ２および／またはＣＬＮ２遺伝子をコードする遺伝子治療ベクターでの治療の前または同時に用いることができる。［Sohar et al., J. Neurochemistry, 73: 700-711 (1999）を参照、参照によって本明細書に含まれる］。本方法を用いて、たとえばシェイエ症候群およびハーラー／シェイエ症候群等のムコ多糖症Ｉ型のような、他のリソソーム蓄積症を治療してもよい。
【００２７】
組換え酵素を作成する方法は当業界で周知である。さらに、ウイルスおよび非ウイルスベースのベクターの両方を含む遺伝子治療ベクターも周知である。適切なウイルスベースのベクター系として、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびたとえばヒト免疫不全ウイルス［ＨＩＶ］のようなレンチウイルスを含むレトロウイルスが挙げられる。非ウイルスベクター系として、陽イオン両親媒性化合物および他の高分子化合物；ならびにウイルスまたは非ウイルス化合物を用いないＤＮＡ（裸のＤＮＡとしても知られている）が挙げられる。他の系として、ウイルス成分と非ウイルス成分の両方の組合せが挙げられる。本方法のさらに別の態様において、本方法は、ポリアニオン性化合物で前記個体を治療する工程をさらに含んでいてよい。例示的ポリアニオン性化合物として、ポリ−Ｌ−アスパラギン酸およびダプトマイシンが挙げられる。
【００２８】
本発明の様々な実施形態を説明する目的で以下の実施例を示しており、何れの態様においても本発明を限定することを意図していない。
【実施例１】
【００２９】
In vitro転写／翻訳反応
Ｗ４０２Ｘ（ＴＧＧからＴＡＧ）またはＱ７０Ｘ（ＣＡＧからＴＡＧ）突然変異の何れかを含むヒトＬ−イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）ｃＤＮＡを、ウサギ網状赤血球溶解物結合転写／翻訳システム(Promega)においてＳＰ６プロモーターによって発現させた。終止突然変異の抑制に用いるのに最適なゲンタマイシン濃度は、Manovakova et al.(12)に記載されている濃度に類似していた。翻訳反応への３５Ｓ−標識メチオニンの添加は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる翻訳産物の分析およびホスフォメージャー分析による定量化を可能にした。終止突然変異の抑制レベルは、切断タンパク質と完全長タンパク質との総量に対する産生された完全長タンパク質の量として表した。必要な場合は、切断および完全長の翻訳種に存在するメチオニン残基の数の差に関して修正を行った。
【００３０】
ＩＤＵＡＱ７０Ｘ突然変異の抑制を評価するのに用いられる読み過ごしレポーラープラスミドｐＤＢ６５０は、プラスミドｐＤＢ６０３から派生したものである（１２）。そのプラスミドを作成するため、ポリリンカーを越えたＨｉｎｄIII部位をまずＮｓｉI部位（ＡＴＧＣＡＴ）（配列番号１）に変えた。QuikChange突然変異誘発キット(Stratagene)、ならびにプライマーＤＢ８４３（５'−ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＣＣＣ  ＡＴＧ  ＣＡＴ  ＧＧＣ  ＧＴＡ  ＡＴＣ  ＡＴＧ  ＧＴＣ−３'）（配列番号２）、およびその相補体ＤＢ８４４（５'−ＧＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＴ  ＴＡＣ  ＧＣＣ  ＡＴＧ  ＣＡＴ  ＧＧＧ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＧＴＣ  ＧＡＣ−３'）（配列番号３）を用いて実施した。Ｑ７０Ｘ ＴＡＧ終止突然変異、ならびに隣接する上流および下流のＩＤＵＡの配列の６つのコドンを含む合成制限断片（配列番号４）を、読み過ごしカセット中に位置する独特なＢａｍＨＩ部位とＨｉｎｄIII部位との間に導入した。ＤＮＡオリゴヌクレオチドＤＢ８６３（５'−ＧＡＴ  ＣＣＴ  ＡＣＧ  ＴＣＣ  ＴＣＡ  ＧＣＴ  ＧＧＧ  ＡＣＴ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＴＣＡ  ＡＣＣ  ＴＣＧ  ＣＣＴ  ＡＴＧ  ＣＡ−３'）（配列番号７）とＤＢ８６４（５'−ＡＧＣ  ＴＴＧ  ＣＡＴ  ＡＧＧ  ＣＧＡ  ＧＧＴ  ＴＧＡ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＡＧＴ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＴＧＡ  ＧＧＡ  ＣＧＴ  ＡＧ−３'）（配列番号８）とをアニーリングさせて合成ＤＮＡ断片を作成した。
【実施例２】
【００３１】
細胞培養
ＩＤＵＡ遺伝子座（Ｑ７０Ｘ／Ｗ４０２Ｘ）でヘテロ接合性の初代ヒト皮膚繊維芽細胞株、および同じ継代数（Ｐ４−Ｐ６）培養した正常繊維芽細胞対照をこの実験で用いた。１０％ウシ胎児血清を補足したダルベッコ変法イーグル培地を用いて、５％ＣＯ２の下、３７℃で細胞を培養した。５０−７０％コンフルエントの繊維芽細胞を用いて全ての実験を実施した。この実験で用いるゲンタマイシンの濃度は、２００から１０００μｇ／ｍｌまでの範囲で変化し、高い継代数の細胞でより高濃度のゲンタマイシンを用いた。
【実施例３】
【００３２】
Ｌ−イズロニダーゼ活性および免疫定量測定法
ゲンタマイシン（Gibco BRL)の存在下、ハーラー繊維芽細胞（Ｐ４−Ｐ６）を２４時間増殖させた。M-PerMammalian Protein Extraction Reagent(Pierce)を用いて細胞を溶解させ、ＢＣＡ法(Pierce)を用いて各細胞抽出物の全タンパク質濃度を測定した。α−Ｌ−イズロニダーゼ活性を測定する方法は、Hopwoodらの方法（３７）を改良した。５０μｌの反応混合物に８０ｎｍｏｌの４−メチル−ウンベリフェロンイズロニド（ＦＭＵ）(Calbiochem)基質を添加した後、ハーラー細胞からの〜２０μｇのタンパク質および正常繊維芽細胞抽出物からの〜２.５μｇのタンパク質を含む細胞抽出物における酵素活性を測定した。反応液を３７℃で１時間インキュベートし、その後、１ｍｌのグリシン−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ１０.８）の添加によって反応を停止させた。Shimadzu蛍光光度計を用いて３６５ｎｍの励起波長と４５０ｎｍの発光波長で切断された遊離ＦＭＵ分子の蛍光を直ぐに測定し、活性イズロニダーゼの量をｎｍｏｌ 切断ＦＭＵ／時間／ｍｇタンパク質で表した。ブランク対照は、タンパク質抽出試薬の添加で蛍光に全く変化が生じないことを示した。免疫定量測定法は、Ashton et al（１０）によって以前記載されたように実施した。正常ヒト繊維芽細胞から調製された細胞溶解物（〜３０ｎｇのα−Ｌ−イズロニダーゼタンパク質が１ｍｇの全細胞タンパク質あたり存在する）から作成された標準曲線を用いる内挿によって、ハーラー細胞中に存在するα−Ｌ−イズロニダーゼタンパク質の量を特定した。
【実施例４】
【００３３】
細胞ＧＡＧレベルの測定
グリコサミノグリカン標識測定法は、Thompsonらの方法を適用した（１６）。正常およびハーラー（ｐ６）細胞を培養し、４μＣｉ／ｍｌの３５ＳＯ４を培養液に添加することによって標識した。放射能標識抽出物を調製し、連続の熱エタノール抽出を行って、高分子（主にタンパク質およびグリコサミノグリカン）に取り込まれた全カウントを特定した。並行して処理した非標識対照試料を用いて、沈降法から回収された全タンパク質を特定した。
【実施例５】
【００３４】
無傷細胞中のリソソーム存在量の可視化
１０００μｇ／ｍｌゲンタマイシンの存在下または不在下、ポリスチレン培養皿においてガラスのカバースリップ上で正常およびハーラー繊維芽細胞（Ｐ６）を４８時間増殖させた。４０ｍＭ ＨＥＰＥＳをバッファーに添加した後、５０ｍＭ LysoTracker Red(Molecular Probes)培地を３７℃で１時間添加した。固定しないでカバースリップをOlympus倒立蛍光顕微鏡に取り付けて、１００倍の倍率で観察した。
【実施例６】
【００３５】
Ｈｓｐ７０ウェスタンブロット
ゲンタマイシンの存在下または不在下で、正常繊維芽細胞を２４時間増殖させた。その後、ＳＤＳサンプルバッファーの存在下で溶解させて細胞抽出物を調製した。小型微量遠心機(microfuge)で短時間回転させて不溶性の残骸を除去した後、２５μｇの全タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに装填した。タンパク質をゲルからImmobilonペーパー(Millipore)に転写させ、ウサギ抗ヒトＨｓｐ７０抗体(StressGen)と共にインキュベートし、続いて１２５Ｉ−プロテインＡ(Amersham)と共にインキュベートした。各試料中に存在するＨｓｐ７０の量をホスフォイメージャー分析によって定量化した。４５℃で２時間熱ショックを細胞に与え、続いて細胞回収前に３７℃でさらに２時間インキュベートすることによって、最大ストレス反応に関する陽性対照を調製した。
【実施例７】
【００３６】
ハーラーＱ７０ＸおよびＷ４０２Ｘ未熟終止突然変異はゲンタマイシン媒介抑制を受けやすい
哺乳類細胞における終止突然変異の抑制は、終止コドンの周りの配列に依存する（１２、１３）。アミノグリコシドが、ハーラー症候群を生じさせる自然に生じた未熟終止突然変異を抑制できるか否かを特定するため、Ｑ７０ＸまたはＷ４０２Ｘ突然変異を含むＩＤＵＡ ｃＤＮＡ鋳型を、ゲンタマイシンの濃度を増加させて、ウサギ網状赤血球溶解物結合転写／翻訳システムにおいて発現させた。ヒトＩＤＵＡ ｃＤＮＡ構築物から発現される哺乳類翻訳系において、ＩＤＵＡ Ｗ４０２Ｘ切断ペプチドをうまく可視化させることができる。ＩＤＵＡ Ｗ４０２Ｘ ｃＤＮＡから産生される完全長α−Ｌ−イズロニダーゼタンパク質の量の用量依存的増加が、翻訳混合物へのゲンタマイシンの添加に基づいて観察され、１０μｇ／ｍｌゲンタマイシンの存在下では４.６％の頻度で未熟終止コドンが発生した（図１Ａ）。しかしながら、切断Ｑ７０Ｘ産物はサイズが小さくかつメチオニンコドンを欠くため、可視化できなかった。
【００３７】
ゲンタマイシンがＱ７０Ｘ突然変異を抑制できるか否かを特定するため、終止突然変異のアミノグリコシド媒介抑制を定量化するために以前開発された構築物にＱ７０Ｘ突然変異ならびにその上流および下流の６つのコドンを導入した（図１Ｂ）（１２）。このレポーター系において、Ｑ７０Ｘ終止コドンでの効率的な翻訳停止は２７ｋＤａポリペプチドの産生をもたらし、Ｑ７０突然変異の抑制は３７ｋＤａタンパク質の合成を可能にした。ゲンタマイシンは、１０.９％程度のレベルまでＱ７０Ｘ突然変異を抑制した。それら結果は、ＩＤＵＡ Ｑ７０ＸおよびＷ４０２Ｘ未熟終止突然変異の両方がゲンタマイシンによる抑制を受けやすいことを実証する。
【実施例８】
【００３８】
ゲンタマイシン処理の後、ハーラー繊維芽細胞においてα−Ｌ−イズロニダーゼ活性およびタンパク質は部分的に回復する
ＩＤＵＡ遺伝子におけるＱ７０Ｘ／Ｗ４０２Ｘ未熟終止突然変異が無傷細胞において抑制されうるか否かを特定するため、ハーラー繊維芽細胞（Ｐ４）をゲンタマイシンの存在下で２４時間培養した。その後、細胞抽出物を調製し、α−Ｌ−イズロニダーゼ活性測定を実施した。ゲンタマイシン処理はα−Ｌ−イズロニダーゼ特異的活性を０.８９ｎｍｏｌ／時間／ｍｇまで高めた（図２Ａ）。この結果は、正常繊維芽細胞で測定したα−Ｌ−イズロニダーゼ特異的活性の〜２.８％に相当し、ハーラー表現型を軽減または防止するのに十分であることが以前報告されているレベルである（１０、１１）。
【００３９】
ゲンタマイシン処理の後に観察されるα−Ｌ−イズロニダーゼ活性の上昇がα−Ｌ−イズロニダーゼタンパク質の量の増加と相関するか否かを調べた。ゲンタマイシンの存在下または不在下においてハーラー繊維芽細胞（Ｐ６）を培養し、ポリクロナール−モノクロナールサンドイッチ免疫測定法を用いて、細胞抽出物中に存在するα−Ｌ−イズロニダーゼタンパク質の量を定量化した（１０、１５）。α−Ｌ−イズロニダーゼタンパク質の量もゲンタマイシン処理ハーラー繊維芽細胞において有意に増加した（図３）。ゲンタマイシンの不在下で培養した細胞において観察されるα−Ｌ−イズロニダーゼタンパク質のレベルは（０.０３９ｎｇ／ｍｇ全タンパク質）、通常重篤なハーラー表現型に関連する。一方、ゲンタマイシン処理ハーラー細胞中のα−Ｌ−イズロニダーゼの量は、０.４１ｎｇ／ｍｇ全タンパク質であり、軽度のハーラー表現型に関連することが以前報告されたレベルである（１０、１５）。総合すれば、酵素測定法およびタンパク質定量測定法の両方の結果は、ゲンタマイシンが、ＩＤＵＡ遺伝子における未熟終止突然変異を抑制し、かつ培養ハーラー繊維芽細胞において機能的に有意なレベルのα−Ｌ−イズロニダーゼ活性およびタンパク質を回復できることを示唆する。
【実施例９】
【００４０】
ゲンタマイシン−処理ハーラー繊維芽細胞はＧＡＧ滞留を減らした
以前の研究は、ハーラー繊維芽細胞が正常繊維芽細胞よりもはるかに高いレベルのＧＡＧを蓄積することを示した。このことは、α−Ｌ−イズロニダーゼ活性がリソソームグリコサミノグリカン分解に必須であるために生じる（６、１６）。終止突然変異のアミノグリコシド媒介抑制が、グリコサミノグリカン蓄積を減らすのに十分なレベルのα−Ｌ−イズロニダーゼ活性を回復できるか否かを特定するため、正常およびハーラーＱ７０Ｘ／Ｗ４０２Ｘ繊維芽細胞（Ｐ６）を３５ＳＯ４と共に３日間培養してその期間に合成された硫酸化グリコサミノグリカンを標識した。その後、３５ＳＯ４を含まない培地中において、ゲンタマイシンの存在下または不在下で２日間細胞を培養した。この追跡期間の後、グリコサミノグリカンを沈殿させ、沈殿性カウントに取り込まれた全３５Ｓを定量した。その後、この値を、沈殿物中に回収された全タンパク質に対して表した。それら条件の下、未処理ハーラー繊維芽細胞は、正常繊維芽細胞よりもほぼ４倍多い３５Ｓ−標識グリコサミノグリカンを蓄積した。しかしながら、ゲンタマイシン処理ハーラー繊維芽細胞中の３５Ｓ−沈殿性カウントの量は、正常繊維芽細胞で観察されるレベルに近いレベルまで減少した。それら結果は、ゲンタマイシン処理によって回復された低レベルのα−Ｌ−イズロニダーゼ活性が、ハーラー繊維芽細胞において、定常状態のグリコサミノグリカンレベルを劇的に減らすことができることを示唆する。
【００４１】
ゲンタマイシンは、小サブユニットｒＲＮＡの解読部位に結合することによって終止突然変異の抑制を媒介する（１７）。この作用機序によると、完全長α−Ｌ−イズロニダーゼの合成は、ゲンタマイシンがＩＤＵＡ遺伝子における終止突然変異の抑制を促進させるのに利用可能である間のみ、ハーラー繊維芽細胞において維持されなければならない。しかしながら、α−Ｌ−イズロニダーゼ活性は、ゲンタマイシン処理の間に合成されたタンパク質が分解されるまで存続する。
【００４２】
低下したグリコサミノグリカンレベルがゲンタマイシン処理の中止の後維持され得るか否かを特定するため、正常およびハーラー繊維芽細胞を３５ＳＯ４で７２時間（１−３日目）標識し、続いてゲンタマイシンの存在下または不在下において４８時間の非標識（追跡）（４−５日目）を行った。その後、さらに４８時間（６−７日目）３５ＳＯ４と共にインキュベートして、新たに合成されたグリコサミノグリカンを標識した（図４Ｂ）。この手順の後、グリコサミノグリカンのレベルを特定した。
【００４３】
このプロトコルを用いると、ゲンタマイシンの不在下で細胞を培養した場合、ハーラー繊維芽細胞中のグリコサミノグリカンのレベルは正常細胞よりも１.６倍高かった。ゲンタマイシン処理を４−７日目の間連続して行った場合、ハーラー繊維芽細胞中のグリコサミノグリカンレベルは正常レベルに維持された。最後に、ゲンタマイシンが４−５日目の間は存在するが６−７日目の間は除去された場合、ハーラー繊維芽細胞において中間レベルのグリコサミノグリカン蓄積（正常よりも１.３倍多い）が観察された。このレベルはゲンタマイシンの不在下で培養した同じ細胞で観察される値よりも有意に低いため、ゲンタマイシン処理の中止の後少なくとも２日間、グリコサミノグリカンレベルを部分的に低下させるのに十分なα−Ｌ−イズロニダーゼ活性をゲンタマイシン処理細胞が維持できると結論付けることができる。
【実施例１０】
【００４４】
ゲンタマイシン処理はハーラー繊維芽細胞において正常なリソソーム分布および形態を回復できる
ハーラー細胞は、光学および電子顕微鏡で観察して、リソソームの存在量の増加（空胞化と称される）および異常なリソソーム形態を示す（１８）。このような形態学的変化がリソソーム内へのグリコサミノグリカンの蓄積の直接的結果として生じると考えられたため、ゲンタマイシン処理がこの異常なリポソームの形態を覆すことができるか否かを次に調べた。
【００４５】
ゲンタマイシンの存在下または不在下においてガラスのカバーストリップ上で正常およびハーラー繊維芽細胞を２日間培養した。その後、リソソーム中にエンドサイトーシスによって取り込まれる蛍光色素であるLysoTracker Redと共に３７℃で１時間細胞をインキュベートした。未処理ハーラー繊維芽細胞は、正常細胞よりも多くのリソソームを含み、それらコンパートメントは正常細胞で観察されるリソソームよりもサイズが小さく見えた（図５）。一方、ゲンタマイシン処理ハーラー繊維芽細胞の大部分は、外観上正常であるより少ないリソソームを含んでいた。ゲンタマイシン処理ハーラー繊維芽細胞で観察される染色パターンは、調べた細胞の７０％以上において、野生型細胞で観察されるパターンに類似しており、ゲンタマイシン処理が、ハーラー繊維芽細胞においてリソソーム分布および形態の正常パターンを大部分回復したことを示唆する。
【実施例１１】
【００４６】
未熟終止突然変異を抑制するゲンタマイシン濃度は強いストレス反応を誘導しない
未熟終止突然変異の薬理学的抑制に関連する主な関心は、正常細胞のｍＲＮＡの末端に存在する天然の終止コドンも抑制され得る可能性である。遺伝子の末端にある終止コドンの全域的抑制は、タンパク質のミスフォールディングにつながるＣ−末端伸長を有する多くのタンパク質を産生することが予測される。そのような広範囲におよぶタンパク質のミスフォールディングは、分子シャペロンＨｓｐ７０の定常状態レベルの上昇につながるストレス反応を誘導するであろう。Ｈｓｐ７０は、多くの様々な状態で誘導され、細胞ストレスの結果として蓄積するであろうミスフォールディングタンパク質の凝集を防止する働きをする（１９）。
【００４７】
この実験で用いられるゲンタマイシン濃度がストレス反応を誘導し得るか否かを特定するため、ゲンタマイシンレベルを上昇させて正常ヒト繊維芽細胞（Ｐ６）を培養し、ウェスタンブロット分析によってＨｓｐ７０の誘導をモニターした。並列したフラスコ中の細胞に熱ショックを与えて、全面的なストレス反応の間に得られた最大Ｈｓｐ７０レベルを特定した（図６）。
【００４８】
ゲンタマイシン濃度の上昇に伴いＨｓｐ７０レベルの僅かな累進的増加が観察された。２００μｇ／ｍｌゲンタマイシンの存在下で培養した細胞においてＨｓｐ７０レベルが１.２倍に増加し、６００μｇ／ｍｌゲンタマイシンの存在下で培養した細胞では１.３倍に増加し、さらに１０００μｇ／ｍｌゲンタマイシンと共に培養した細胞では２.７倍に増加した。しかしながら、この最大レベルのＨｓｐ７０は、熱ショックに曝された細胞で観察されるＨｓｐ７０レベルよりも１０倍低いレベルに留まった。それら結果と一致して、この範囲のアミノグリコシドレベルは、細胞生存性または全細胞タンパク質合成速度に有意な効果を持たないことが分かった（データは示していない）。それら結果は、この実験で用いられる条件下でのゲンタマイシン処理が、非常に緩やかなストレス反応のみを誘導することを示唆する。
【実施例１２】
【００４９】
ポリ−Ｌ−アスパラギン酸は、アミノグリコシドの毒性副作用を軽減しながら、ゲンタマイシンが未熟終止突然変異を抑制する能力を高めることができる
以前の研究は、ポリアニオン性化合物の共投与が、in vitroおよびin vivoでアミノグリコシドの腎毒性および難聴毒性を顕著に軽減できることを示している。それら化合物は、アミノグリコシドとリソソーム膜における酸性リン脂質ヘッドグループ部位との間の静電的相互作用を減らすことによってこのような防御を媒介できると考えられている。たとえば、ポリ−Ｌ−アスパラギン酸（J. Pharm. Exp. Ther. 262: 424-432, 1992; Life Sci. 56: 1877-1887, 1995)、またはダプトマイシン（Antimicrob. Agents Chemother. 38: 1027-1035, 1994)の共投与は、動物モデルにおいてアミノグリコシド−誘導腎毒性を軽減することが分かっている。それら結果は、治療効果を維持しながら、最近示唆されているように（Antimicrob. Agents Chemother. 43: 1003-1012, 1999)、アミノグリコシドの毒性副作用を回避できることを示唆する。
【００５０】
終止コドンのアミノグリコシド媒介抑制に対するポリ−Ｌ−アスパラギン酸の効果を特定するため、次に、ポリ−Ｌ−アスパラギン酸と共に投与した場合にゲンタマイシンが読み過ごしを促進させる能力について調べた。ポリ−Ｌ−アスパラギン酸の共投与は、低いゲンタマイシン濃度では読み過ごしのレベルに影響を及ぼさなかったが、高いゲンタマイシン濃度では、ポリ−Ｌ−アスパラギン酸はハーラー繊維芽細胞において６０−７０％α−Ｌ−イズロニダーゼ活性を上昇させた（図７）。このゲンタマイシン濃度において、ポリ−Ｌ−アスパラギン酸：ゲンタマイシンのモル比１：１００を用いた（質量比１：５に相当する）。
【００５１】
ポリ−Ｌ−アスパラギン酸は、２つの機序の内の一方によってこの効果を媒介する。ポリ−Ｌ−アスパラギン酸は、静電的相互作用を介してゲンタマイシンと直接相互作用し、ゲンタマイシンの細胞への取込みを促進させることができる。あるいは、ポリ−Ｌ−アスパラギン酸は、より多くのゲンタマイシンが翻訳機構と相互作用できるように、ゲンタマイシンとたとえば脂質ヘッドグループ部位（細胞表面または細胞内部の何れかにある）のような非生産的結合部位との結合を妨げることができる。
【００５２】
考察
３つの試みは、ハーラー症候群の患者の治療の有望な手段と考えられている：骨髄移植；酵素補充療法；および遺伝子治療。異質遺伝子型の骨髄移植を受けたハーラー症候群の患者は、血清α−Ｌ−イズロニダーゼ活性の顕著な上昇、尿グリコサミノグリカンレベルの顕著な低下、および生存率の顕著な改善を示した。肝臓および心臓疾患のような身体疾患、聴覚障害、ならびに身体形態異常の様々な症状も治療患者においてかなり軽減される。骨格異常は存続するが、ある患者では神経症状の改善が生じる（２０−２３）。それら結果はかなり有望であるが、拒絶反応を防止するために免疫抑制剤の使用を伴う潜在的な問題が、この試みを理想的なものではなくしている。
【００５３】
ハーラー症候群の患者の別の有望な治療法は、酵素補充療法、すなわち精製α−イズロニダーゼの定期的な静脈投与である。最近、組換えα−Ｌ−イズロニダーゼを毎週投与されたハーラー症候群の患者が、グリコサミノグリカン排泄および肝疾患の顕著な軽減、ならびに関節の可動性および心機能の改善を示すことが分かった（２４）。この試みの潜在的な欠点として、用いられる組換えタンパク質の正常な翻訳後修飾の欠如が挙げられ、このことは細胞取込みを減らし、かつ免疫応答の機会を増やすであろう。ある治療患者において限定された免疫応答が生じても、それら応答は治療の中止を余儀なくさせる程は重篤なものではなく、この試みは有望であり続けている。
【００５４】
最後に、遺伝子治療もハーラー症候群の患者の治療法として用いられている。ヒトＩＤＵＡ ｃＤＮＡを含む組換えアデノ随伴ウイルスまたはレトロウイルス構築物で形質導入したハーラー繊維芽細胞およびＣＤ３４＋骨髄細胞は、in vitroで高い長期のα−Ｌ−イズロニダーゼ発現およびグリコサミノグリカンのクリアランスを示した（２５−２７）。しかしながら、ハーラー症候群の患者の標準的治療法として遺伝子治療を用いることはまだ何年かかかるであろう。
【００５５】
本発明は、ナンセンス−抑制治療が、ＩＤＵＡ遺伝子における未熟終止突然変異を担持するハーラー症候群の患者の治療に、新規な非侵襲的選択肢を提供することができることを示唆する。以前の研究は、低レベルのα−Ｌ−イズロニダーゼ活性およびタンパク質が、より軽度のＭＰＳ Ｉ表現型に関連することを示した（１０、１１、１５）。現在の研究では、ゲンタマイシン処理が、培養ハーラー繊維芽細胞において正常α−Ｌ−イズロニダーゼ活性の２.５−３％を回復できた。また、ゲンタマイシン処理ハーラー細胞におけるα−Ｌ−イズロニダーゼタンパク質のレベルは０.４１ｎｇ／ｍｇ全タンパク質であり、軽度のハーラー表現型に関連する酵素のレベルであった（１０、１５）。従って、酵素的基準および免疫学的基準の両方が、ゲンタマイシン処理が、ＩＤＵＡ遺伝子において未熟終止突然変異を有するハーラー症候群の患者由来の培養細胞においてＭＰＳ Ｉ表現型の重篤性を軽減するのに十分なレベルのα−Ｌ−イズロニダーゼを回復できることを示唆する。
【００５６】
アミノグリコシド治療の別の利点は、この試みによって産生されるタンパク質が分泌経路を正常に通過し、結果としてＥＲおよびゴルジ装置内でタンパク質の正常なグリコシル化をもたらすことである。未熟終止突然変異の抑制によって産生された全体で低レベルのα−Ｌ−イズロニダーゼと相まって、回復されたα−イズロニダーゼの発現によって誘導される免疫応答の可能性は、ＭＰＳ Ｉ患者において低くなければならない。そのタンパク質は、終止突然変異が生じた位置でおそらく正常なアミノ酸を有しないため、そのタンパク質の半減期が変化することもありうる。しかしながら、ゲンタマイシンを除去した後２日間標識した細胞は、低減したグリコサミノグリカンレベルを維持することができた。このことは、読み過ごしによって産生されたα−Ｌ−イズロニダーゼがこの期間の間比較的安定であることを示唆する。ハーラー症候群の治療としてのこの試みの１つの潜在的な制限は、血液−脳関門を越えるゲンタマイシンの透過性が低いことであり、そのことは疾患の神経徴候の是正を妨げるであろう（２８）。脳におけるグリコサミノグリカンレベルを低下させる、ＩＤＵＡ遺伝子における終止突然変異のゲンタマイシン媒介抑制について動物モデルで調べることができる。
【００５７】
過去数年間に亘る研究において、アミノグリコシド透過性が、様々な細胞型の間で顕著に変化することが分かった。このことは、用いるアミノグリコシド濃度の範囲を１０から１０００μｇ／ｍｌまでの範囲で変化させたＣＦおよび筋ジストロフィーモデルを用いた以前のin vitro研究から明らかである（１、２、５）。この研究において、初代繊維芽細胞におけるゲンタマイシンの透過性または流出が継代回数が増えるに従って変化し得ることを示唆する証拠が得られた。膜透過性の変化が培養初代繊維芽細胞の連続継代に伴い生じることが報告された（１４）。それら問題を回避する試みにおいて、一般に用いられる透過促進剤(permeabilizing agent)がハーラー繊維芽細胞へのゲンタマイシンの侵入を増加させることができるか否かを調べた。残念ながら、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびマンニトールのいずれも、ゲンタマイシン処理によって産生されたα−Ｌ−イズロニダーゼ活性のレベルを上昇させないことが分かった（データは示していない）。しかしながら、増殖培地へのポリ−Ｌ−アスパラギン酸の添加は、高いゲンタマイシン濃度でゲンタマイシンがハーラー繊維芽細胞においてα−Ｌ−イズロニダーゼ活性を刺激する能力を高めることが分かった。このことは、ポリ−Ｌ−アスパラギン酸が、おそらく液相エンドサイトーシスを含む機序を介して、細胞へのアミノグリコシドの取込みを促進させることができることを示唆する。培養初代細胞に関連するそれら透過性の問題のせいで、in vitro実験で日常的に用いられるアミノグリコシド濃度は、通常、臨床設定で有用と思われる濃度より高い濃度である。しかしながら、予備試験は、アミノグリコシドが、臨床に適した用量で投与された場合に、終止突然変異の抑制を介してＣＦＴＲ発現を部分的に回復できることを示した（３、４）。ハーラー症候群に関連すると思われる是正のための低い閾値と相まって、それら所見は、この試みがハーラー症候群のＭＰＳ I患者の実行可能な治療法を提供できることを示唆する。
【００５８】
長期間のゲンタマイシン治療に対する障害は、ある患者におけるアミノグリコシド治療に関連すると思われる神経毒性および腎毒性である。しかしながら、いくつかの研究は、アミノグリコシド−誘導毒性の原因が、翻訳終結を抑制する能力に関連しないと思われることを示しており、さらにゲンタマイシン治療がストレス反応を誘導しないという我々の発見はそれら結果を支持する（２９、３０）。ポリアニオン性化合物の共投与がラットにおいてアミノグリコシド−誘導神経毒性を軽減すると考えられる多くの研究が報告されており（３１、３２）、さらに抗酸化化合物がモルモットにおいて腎毒性を軽減することが分かった（３３、３４）。さらには、アミノグリコシド（ゲンタマイシンを含む）内での構造変化が、ラットモデルにおいてその神経毒性作用を軽減することが示された（３５、３６）。このことは、アミノグリコシドに関連する毒性副作用を誘導することなく未熟終止突然変異を抑制できる新規な化合物を設計することが可能であることを示唆する。未熟終止突然変異のアミノグリコシド抑制がハーラー症候群の患者の長期間の治療にうまく使えるように開発できるか否かを特定するためにはさらなる研究が必要である。
【００５９】
以下の参考文献を本明細書において挙げた：
【参考文献】
【００６０】
2004522763.tif 000002
2004522763.tif 000003
2004522763.tif 000004
2004522763.tif 000005
2004522763.tif 000006
本明細書において挙げられている任意の特許または刊行物は、本発明が属する分野の当業者レベルを指示する。さらに、それら特許および刊行物は、各刊行物が特別かつ個別に参照によって組込まれることが示唆されているのと同様に、参照によって本明細書にその全てが含まれる。
【００６１】
当業者は、本発明をうまく適用して、目的を達成しかつ述べられている目標および利点、ならびに本発明に固有の目的、目標、および利点を得ることができる。本明細書に記載されている方法、手段、処理、分子、および特定化合物と共に、本実施例は例示であり、本発明の範囲を限定することを意図していない。実施例への変化および他の使用は、当業者に容易に思いつき、特許請求の範囲によって特定される本発明の精神にそれらも含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、ＩＤＵＡ−Ｗ４０２Ｘ終止突然変異のゲンタマイシン媒介抑制を示す。
【図２】図２は、ハーラー早期突然変異のゲンタマイシン−媒介抑制が、機能的に有意なレベルのα−Ｌ−イズロニダーゼ活性を産生することを示す。
【図３】図３は、ハーラーＱ７０Ｘ／Ｗ４０２Ｘ突然変異のゲンタマイシン−媒介抑制が、αイズロニダーゼタンパク質のレベルを上昇させることを示す。
【図４】図４は、ゲンタマイシンによって媒介されたハーラー繊維芽細胞におけるα−Ｌ−イズロニダーゼ活性の上昇が、グリコサミノグリカン蓄積を減らすのに十分であることを示す。
【図５】図５は、ゲンタマイシン処理後のハーラー線維芽細胞における正常リソソ−ム存在量の回復を示す。
【図６】図６は、ゲンタマイシン処理が、強い細胞ストレス反応を誘導しないことを示す。
【図７】図７は、ポリ−Ｌ−アスパラギン酸とゲンタマイシンとの共投与が、未熟終止突然変異の抑制をさらに促進できることを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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