(57)【要約】【課題】血管の損傷部分を、内皮細胞マイトジェンを発現し得る有効量の核酸と接触させる工程を包含する、損傷血管の内層の再内皮形成を誘導するための方法を提供すること。この方法は、例えば、バルーン血管形成および血管内ステントの配備から生じる損傷を含む、血管壁の内皮内層の露出を生じる任意の血管損傷を処置するために使用され得る。【解決手段】内皮細胞マイトジェンをコードする核酸を含有する水溶液、および該核酸を血管の損傷部分に送達するための手段を含む、キット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管の再内層化のための明細書中に記載されるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、内皮細胞（ＥＣ）マイトジェンの使用による血管の再内層化（ｒｅｌｉｎｉｎｇ）を増強するための方法に関する。本発明の方法は、損傷血管の再内皮形成（ｒｅｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）のために特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
動脈硬化症の一般的な形態であるアテローム性動脈硬化症は、内膜損傷の発達およびその後の血管管腔の狭化（ｎａｒｒｏｗｉｎｇ）から生じる。損傷の大きさが増加するにつれて、動脈の直径が減少し、そして血液循環を妨害する。
【０００３】
アテローム性動脈硬化症の処置（外科手術および内科処置を含む）のために、多くの治療的代替物が考察されている。１つの可能性のある治療は、経皮経管動脈形成（バルーン血管形成）である。バルーン血管形成において、膨張可能なバルーンを備えたカテーテルが、血管のアテローム性動脈硬化症の狭化の部位へ、血管内を通される。バルーンの膨張により、血管が拡大して斑が圧縮される。
【０００４】
このような血管形成はより広く受け入れられているが、これは２つの主要な問題（すなわち、剥離閉鎖および再狭窄）を欠点としてもつ。剥離閉鎖は、拡張手順の直後または拡張手順後の最初の数時間内の、血管の急性閉塞をいう。剥離閉鎖は、およそ２０症例中１回生じ、そして、血流が適時に修復されなければ、頻繁に心筋梗塞および死亡をもたらす。
【０００５】
再狭窄は、最初は成功した血管形成の後の、動脈の再狭化をいう。血管の再狭窄は、血管形成の間またはバルーンカテーテルの膨張の間の、血管の内皮細胞に対する損傷に起因すると考えられている。手術後の血管の治癒の間に、平滑筋細胞は内皮細胞より早く増殖し、血管の管腔を狭化し、そして新たにアテローム性動脈硬化症の過程を開始する。近年、平滑筋細胞増殖は、経皮経管冠状動脈形成の長期的効力を制限する主要な臨床的問題として認識されている。
【０００６】
処置された血管の再狭窄を防止する努力において、平滑筋細胞の過剰増殖を減少または防止し得る薬剤の探索が、多くの研究の目的であった。（これらのタイプの外科手術後の平滑筋細胞増殖の発生および影響は、例えば非特許文献１、および非特許文献２に概説されている。）
血管形成に関連する問題を防止するための代替物は、拡張された区域中に血管内ステントを配置して、剥離閉鎖および再狭窄を機械的にブロックする。不運なことに、このようなステントの使用は、直接的合併症（亜急性血栓症）または間接的合併症（出血、末梢血管合併症）のために制限されている。ステント移植の後、ステントの支柱（ｓｔｒｕｔ）が内皮により覆われるまで、患者はステント血栓症に脅かされる。従って、抗凝固剤および／または抗血小板剤を使用する攻撃的治療が、この期間に必要である。これらの治療でステント血栓症の割合が減少し得るが、これらは間接的合併症の主要な原因である。
【０００７】
従って、再狭窄を減少させるための単純かつ有効な手段の必要性が、極めて重要である。
【非特許文献１】Ｉｐら（１９９０年６月）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  １５：１６６７−１６８７
【非特許文献２】Ｆａｘｏｎら（１９８７）、Ａｍ．Ｊ．  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  ６０：５Ｂ−９Ｂ
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
内皮細胞マイトジェンを発現し得る核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が、血管損傷の部位（すなわち、露出した血管壁の内皮内層）に送達されると、損傷血管の再内皮形成を誘導し、そして結果として再狭窄を減少させることが、驚くべくことに今や見出された。
【０００９】
理論に結びつけられることを望まないが、代表的なストラテジー（これは、平滑筋細胞増殖を直接的に阻害することにより、再狭窄を減少するために設計されていた）とは対照的に、本発明者らの方法は、損傷血管の再内皮形成を直接的に促進することにより平滑筋細胞増殖を間接的に阻害すると、本発明者らは考えている。
【００１０】
本発明は、血管の損傷部分を、内皮細胞マイトジェンを発現し得る有効量の核酸と接触させる工程を包含する、損傷血管の内層の再内皮形成を誘導するための方法を提供する。
【００１１】
本発明の方法は、血管壁の内皮内層の露出を生じる任意の血管損傷（例えば、バルーン血管形成および関連のデバイス（例えば、方向性粥腫切除、回転性粥腫切除（ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ  ａｔｈｅｒｅｃｔｏｍｙ）、レーザー血管形成、経管腔摘出（ｔｒａｎｓｌｕｍｉｎａｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）、パルススプレー血栓溶解）ならびに血管内ステントの配備から生じる損傷）を処置するために使用され得る。
【００１２】
血管の損傷部分は、核酸と、任意の投与手段により接触し得る。１つの好ましい投与手段は、当該分野で公知の標準的カテーテル送達システム（例えば、二重バルーンカテーテル、多孔性バルーンカテーテル、またはヒドロゲルポリマーコートバルーンカテーテル）の使用である。
【００１３】
別の実施態様において、血管は核酸と、血管損傷の時に（例えば、バルーン血管形成またはステント配備の時に）接触する。これは、核酸を、バルーンまたはステントの表面上に取り込ませることにより達成され得る。核酸は、バルーン表面上の親水性ポリマーコーティングによりバルーン表面上に取り込まれ得る。
【００１４】
親水性ポリマーは、損傷部位へ送達されそしてその後親水性ポリマーがその部位に接触する際に放出されるべき核酸の取り込みを可能にするように選択される。好ましくは、親水性ポリマーは、ヒドロゲルポリマーである。他の親水性ポリマーは、それらが核酸を保持し得る限り、部位との接触に際して、遺伝子物質の移入が生じるように作用する。
【００１５】
損傷血管はまた、核酸を有する親水性ポリマーでコートされたカテーテルのようなアプリケーターにより、核酸を取り込んでいる親水性ポリマーと接触し得る。好ましくは、アプリケーターは、動脈細胞に対していくらかの圧力を発揮して、核酸を有する親水性ポリマーと動脈細胞との間の接触を改善し得る。従って、バルーンカテーテルの使用が好ましい。好ましくは、親水性ポリマーは、バルーンカテーテルの膨張可能バルーンの少なくとも一部をコートする。
【００１６】
上記のように、核酸は他の手段により投与され得る。例えば、それは、カチオン性リポソームまたは標的特異的ベクターのようなミクロ送達ビヒクルにより運搬され得る。このようなベクターは、当該分野において記載されており、そして標的部分および核酸部分を含むベクターを含む。異なるマイトジェンをコードする核酸は、別々にまたは同時に使用され得る。
【００１７】
本明細書中で用いられる用語「内皮細胞マイトジェン」は、内皮細胞増殖を誘導し得る任意のタンパク質、ポリペプチド、ムテインまたは部分を意味する。このようなタンパク質としては、例えば、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（スキャッター（ｊ  ｃａｔｔｅｒ）因子）、およびコロニー刺激因子（ＣＳＦ）が挙げられる。ＶＥＧＦが好ましい。
【００１８】
用語「有効量」は、損傷の部位の細胞に送達される核酸の、適切なレベル（すなわち、内皮細胞増殖を誘導し得るレベル）の内皮細胞マイトジェンを産生するに十分な量を意味する。このように、重要な局面は、発現されるマイトジェンのレベルである。従って、複数の転写物を使用し得るか、または高レベルの発現を生じるプロモーターの制御下に遺伝子を配置し得る。別の実施態様において、遺伝子は、極めて高レベルの発現を生じる因子（例えば、ｔａｔおよび対応するｔａｒエレメント）の制御下にある。
【００１９】
従って、本願発明は、以下を提供する：
１．内皮細胞マイトジェンをコードする核酸を含有する水溶液、および該核酸を血管の損傷部分に送達するための手段を含む、キット。
２．前記内皮細胞マイトジェンが、血管内皮細胞増殖因子、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、およびコロニー刺激因子からなる群より選択される、項目１に記載のキット。
３．前記マイトジェンが血管内皮細胞増殖因子である、項目１に記載のキット。
４．前記損傷がバルーン血管形成の結果である、項目１に記載のキット。
５．前記損傷が血管内ステントの配備の結果である、項目１に記載のキット。
６．前記核酸を前記血管の損傷部分に送達するための手段がカテーテル送達システムである、項目１に記載のキット。
７．前記カテーテル送達システムが、二重バルーンカテーテル、多孔性バルーンカテーテル、または親水性ポリマーコートバルーンカテーテルである、項目６に記載のキット。
８．前記親水性ポリマーコートバルーンカテーテルの親水性ポリマーがヒドロゲルポリマーである、項目７に記載のキット。
９．前記核酸がカセット中に挿入され、そこでプロモーターに作動可能に連結される、項目８に記載のキット。
１０．内皮細胞マイトジェンをコードする核酸を含有する水溶液、および該核酸を血管の損傷部分に送達するためのヒドロゲルコートバルーンカテーテルを含む、キット。
１１．内皮細胞マイトジェンを発現し得る核酸を含む血管内ステント。
１２．前記内皮細胞マイトジェンが、血管内皮細胞増殖因子、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子およびコロニー刺激因子からなる群より選択される、項目１１に記載のステント。
１３．前記マイトジェンが血管内皮細胞増殖因子である、項目１２に記載のステント。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、血管の損傷部分と、血管損傷の部位の細胞に送達されるとマイトジェンの発現を生じるようにプロモーター（核酸カセット）に作動可能に連結された内皮細胞マイトジェンをコードする核酸とを接触させる工程を包含する、損傷血管の内層の再内皮形成を誘導するための方法を提供する。生じる、損傷血管の再内皮形成は、平滑筋細胞増殖を阻害し、そして結果として再狭窄を減少させる。本発明の方法は、血管壁の内皮内層の露出を生じる任意の血管損傷（例えば、バルーン血管形成および血管内ステントの配備から生じる損傷を含む）を処置するために使用され得る。
【００２１】
核酸は、マイトジェン（すなわち、内皮細胞増殖を誘導し得るタンパク質、ポリペプチド、ムテインまたは部分）を発現するために使用され得る、内皮細胞マイトジェンをコードする任意の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、およびｍＲＮＡを含む）であり得る。このようなタンパク質としては、例えば、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）（Ｂｊｏｒｎｓｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８８：８６５１−８６５５，  （１９９１））、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（Ｓｃｈｗａｒｚら、Ｊ．  Ｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ．，  ５：２８０−２８８，  （１９８７））、肝細胞増殖因子（スキャッター（ｊ  ｃａｔｔｅｒ）因子）、およびコロニー刺激因子（ＣＳＦ）が挙げられる。ＶＥＧＦが好ましい。
【００２２】
ＶＥＧＦは、内皮細胞特異的マイトジェンであることが示されている（Ｆｅｒｒａｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．，  １６１：８５１−８５５，  （１９８９）、Ｋｅｃｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４６：１３０９−１３１２  （１９８９）、およびＰｌｏｕｅｔら、Ｅｍｂｏ  Ｊ．，  ３８０１−３８０６  （１９８９））。ＶＥＧＦは、Ｍｉｌｅｓアッセイによって、脈管透過性を含む腫瘍分泌性因子として独立して精製され（Ｋｅｃｋら、前出、およびＣｏｎｎｏｌｌｙら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６４：２００１７−２００２４  （１９８９））、従って、別の名称、血管透過因子（ＶＰＦ）を有する。２つの特徴によって、ＶＥＧＦは、他のヘパリン結合、脈管形成性増殖因子から区別される。第１に、ＶＥＧＦのＮＨ２末端には、代表的なシグナル配列が先行する；それゆえ、ｂＦＧＦとは異なり、ＶＥＧＦはインタクトな細胞により分泌され得る。第２に、その高親和性結合部位（チロシンキナーゼレセプターＦｌｔ−１およびＦｌｔ−１／ＫＤＲを含むことが示されている）は、内皮細胞上に存在する。Ｆｅｒｒａｒａら、前出、およびＣｏｎｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８７：１３２３−１３２７  （１９９０）。（ＶＥＧＦの、より低い親和性の結合部位との相互作用により、単核食細胞の走化性が誘導されることが示されている）。Ｓｈｅｎら、Ｂｌｏｏｄ，  ８１：２７６７−２７７３  （１９９３）およびＣｌａｕｓｓら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １７２：１５３５−１５４５  （１９９０）。ＶＥＧＦをコードし得るＤＮＡは、米国特許第５，３３２，６７１号に開示されており、その開示は本明細書に参考として援用される。
【００２３】
多数のペプチドおよびタンパク質（内皮細胞マイトジェンを含む）のヌクレオチド配列は、多数のコンピューターデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、およびＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ）を通して容易に入手可能である。この情報を使用して、所望のものをコードするＤＮＡまたはＲＮＡセグメントは、化学的に合成され得るか、あるいはこのようなＤＮＡまたはＲＮＡはセグメントは、当該分野における慣例的な手順（例えば、ＰＣＲ増幅）を使用して得られ得る。
【００２４】
マイトジェンをコードする核酸の操作および取り扱いを簡便にするために、核酸は好ましくはカセット中に挿入され、そこで核酸はプロモーターに作動可能に連結される。プロモーターは、所望の標的宿主細胞中でマイトジェンの発現を駆動できなければならない。適切なプロモーターの選択は、容易に達成され得る。好ましくは、高発現プロモーターを使用する。適切なプロモーターの例は、７６３塩基対サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）（Ｄａｖｉｓら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ４：１５１  （１９９３））およびＭＭＴプロモーターもまた使用され得る。特定のタンパク質は、その天然のプロモーターを使用して発現され得る。エンハンサーまたは高レベルの発現を生じるシステム（例えば、ｔａｔ遺伝子およびｔａｒエレメント）のような、発現を増強し得るその他の要素もまた含まれ得る。次いで、このカセットは、例えばＥ．  ｃｏｌｉ複製起点を含むベクター（例えば、ｐＵＣ１１８、ｐＢＲ３２２、またはその他の公知のプラスミドベクターのようなプラスミドベクター）中に挿入され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ，  （１９８９）を参照のこと。プラスミドベクターはまた、マーカーポリペプチドが処置される生物の代謝に悪影響を及ぼさないのであれば、アンピシリン耐性のためのβラクタマーゼ遺伝子のような選択マーカーを含み得る。カセットはまた、合成送達システム（例えば、国際公開第ＷＯ  ９５／２２６１８号に開示されるシステム）中の核酸結合部分に結合され得る。
【００２５】
所望であれば、ＤＮＡはまた、カチオン性リポソームおよびアデノウイルスベクターのようなミクロ送達ビヒクルとともに使用され得る。リポソームの調製、標的化、および内容物の送達のための手順の概説については、ＭａｎｎｉｎｏおよびＧｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，  Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ６：６８２  （１９８８）を参照のこと。ＦｅｌｇｎｅｒおよびＨｏｌｍ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓ．  Ｌａｂ．  Ｆｏｃｕｓ，  １１（２）：２１  （１９８９）およびＭａｕｒｅｒ，Ｒ．Ａ．，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓ．  Ｌａｂ．  Ｆｏｃｕｓ，  １１（２）：２５  （１９８９）も参照のこと。
【００２６】
複製欠陥組換えアデノウイルスベクターは、公知の技術に従って産生され得る。Ｑｕａｎｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８９：２５８１−２５８４  （１９９２）；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｄｅｔら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  ９０：６２６−６３０  （１９９２）；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ，  ６８：１４３−１５５  （１９９２）を参照のこと。
【００２７】
血管の損傷部分は、当業者によく知られている任意の手段（例えば、二重バルーンカテーテル、多孔性バルーンカテーテル、および親水性コートバルーンカテーテルを含む）により、内皮細胞マイトジェンをコードするＤＮＡと接触させられる。Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎら、Ｌａｎｃｅｔ  １：１１０６−１１０８，  （１９８９）；Ｗｏｌｉｎｓｋｙら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｏｌｌ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．，  １５：４７５−４８５  （１９９０）；Ｍａｒｃｈら、Ｃａｒｄｉｏ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ，  ２：１１−２６  （１９９２）；国際公開第ＷＯ  ９３／０００５１号および同第９３／０００５２号；米国特許第５，３０４，１２１号を参照のこと。Ｄｉｃｈｅｋ，  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，  第２巻，  ６１：９８９−１００５も参照のこと。
【００２８】
親水性コートバルーンカテーテルは、特定の状況において好ましい。親水性コートバルーンカテーテルは、バルーンの外表面上に親水性ポリマーを有し、これにより、移入されるべき核酸を有する親水性ポリマーと、いくらかの圧力をかけられるべき血管の損傷部分の細胞との間の接触が可能になり、従って核酸の細胞への移入が容易になる。しかし、親水性ポリマーの表面を有するカテーテルまたは固体杆状体（ｒｏｄ）のような、親水性ポリマーのための他の支持体もまた有用である。好ましくは、カテーテルまたは杆状体あるいは可撓性であるその他の基材は、動脈を通って意図される適用の点に達することを容易にする。
【００２９】
好ましくは、親水性ポリマーは、コロイドと水との組み合わせから形成される架橋ポリマー物質であるヒドロゲルポリマーである。架橋によって、可溶性が減少し、そして、膨潤しそして液体（例えば、ＤＮＡを含有する）を吸収する能力により特徴付けられるゼリー様ポリマーを生成する。適切なヒドロゲルポリマーとしては、例えば、ポリカルボン酸、セルロースポリマー、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、無水マレイン酸ポリマー、ポリアミド、ポリビニルアルコール、およびポリエチレンオキシドからなる群より選択されるポリマーが挙げられる。好ましいヒドロゲルは、ＨＹＤＲＯＰＬＵＳ（Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ  Ｂｏｓｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐ．，  Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，  ＭＡ．）として入手可能であり、そして米国特許第５，０９１，２０５号に記載される、ポリアクリル酸ポリマーである。
【００３０】
親水性動脈バルーンが使用される場合、バルーンを膨張前に保護する必要はない。なぜなら、バルーンが膨張され、そして核酸を有する親水性ポリマーが損傷部位に対して押されるまでに、処置部位への移行に際して比較的少しの核酸しか失われないからである。親水性ポリマー表面カテーテルまたは杆状体がビヒクルまたは基材として使用される場合、表面は、例えばシースにより、意図される適用の点に達するまで保護され、次いで、保護は除去されて、核酸を有する親水性ポリマーが損傷部位に接触することが可能になる。
【００３１】
水溶液中の核酸は、親水性ポリマーに取り込まれて、核酸−親水性ポリマー組成物を形成する。核酸は親水性ポリマーとの複合体化も化学反応もなしに取り込まれ、そして、損傷の部位の細胞と接触させられると、好ましくは比較的自由にそこから放出される。得られる構造は、支持体（例えば、バルーンカテーテルのバルーン）を含み、この上にヒドロゲルがのせられ、その中または上に所望のＤＮＡおよびその結合するビヒクル（例えば、ファージまたはプラスミドベクター）が取り込まれる。好ましくは親水性ポリマーは、ＤＮＡの標的細胞への適用後に親水性ポリマーが支持体から除去されるように、支持体に接着される。
【００３２】
好ましくは、核酸−親水性組成物は、カテーテルにより動脈と接触する。カテーテルは、好ましくは、血管中の挿入のために構築されたバルーンカテーテルであり、そしてカテーテルシャフトおよびカテーテルシャフト上にのせられた拡大可能な拡張バルーンを有する。拡大可能な部分の外表面の少なくとも一部が、しっかりと接着された親水性ポリマーのコーティングにより規定される。親水性ポリマー中に取り込まれるのは、血管の損傷部分の細胞に送達されるべきＤＮＡの水溶液である。核酸を送達するための手段（例えば、カテーテル）および水溶液中の核酸は、キット中に一緒に含まれ得る。
【００３３】
一般に、乾燥している場合、親水性ポリマー（好ましくはヒドロゲル）のコーティングは、好ましくは約１〜１０ミクロン厚であり、２〜５ミクロンのコーティングが代表的である。非常に薄いヒドロゲルコーティング（例えば、約０．２〜０．３ミクロン（乾燥）の）およびよりずっと厚いヒドロゲルコーティング（例えば、１０ミクロン（乾燥）より厚い）もまた可能である。代表的には、ヒドロゲルコーティングの厚さは、ヒドロゲルコーティングが水和される場合、約２〜１０またはそれより大きな係数で膨潤し得る。
【００３４】
ヒドロゲルコーティングを有するバルーンの調製および使用のための手順は、米国特許第５，３０４，１２１号に記載されており、その開示は本明細書に参考として援用される。
【００３５】
代表的なカテーテルを図１に記載する。図１を参照すると、１は血管の壁である。図は、閉塞の部位６において膨張されるバルーン３の膨張により適所に保持されるカテーテル本体２を示す。バルーンは、ＤＮＡ５を取り込むヒドロゲルコーティング４を含む。
【００３６】
親水性コートバルーンが本発明の方法を実施するために使用される場合、核酸（例えば、ＤＮＡ）は、エクスビボでバルーンの親水性ポリマーコーティングに施用される。施用を容易にするために、バルーンは膨張され得る。必要であれば、ポリマーは温風で乾燥され得、そしてＤＮＡ施用は反復され得る。動脈表面に施用されるべきＤＮＡの量は、動脈細胞において発現されるべきＤＮＡの能力に依存する。一般に、バルーンカテーテルに施用される裸のＤＮＡの量は、約０．１μｇ／ｍｍ２と１００μｇ／ｍｍ２との間、より好ましくは約０．５μｇ／ｍｍ２と約２０μｇ／ｍｍ２との間、最も好ましくは約１．５μｇ／ｍｍ２と約８μｇ／ｍｍ２との間である。好ましくは、０．５ｍｇと５ｍｇとの間のＤＮＡが、約６３０  ｍｍ２の膨張側面積を有するバルーンカテーテル（例えば、約５ｍｍの膨張直径および約４０  ｍｍの長さを有するバルーンカテーテル）のヒドロゲルコーティングに施用され、バルーンが膨張されそして動脈の内部と接触するときに、約０．８〜約８μｇ／ｍｍ２のＤＮＡを有する表面を提供する。より好ましくは、１ｍｇと３ｍｇとの間のＤＮＡがポリマーに施用され、約１．６〜約４．８μｇ／ｍｍ２のＤＮＡ負荷を提供する。
【００３７】
カテーテルは、標準的な経皮的施用技術を使用して挿入され、そして所望の位置（例えば、閉塞またはステント）に向かう。例えば、アテローム性動脈硬化症の処置において、バルーンは動脈閉塞に向かう。一旦バルーン（例えば、ヒドロゲルコートバルーン）がその所望の位置に達すると、バルーンは膨張され、その結果バルーンのヒドロゲルコーティングは閉塞と接触し、ＤＮＡの動脈組織への直接放出が引き起こされる。斑および周囲の組織へのＤＮＡの導入は、拡張バルーンが閉塞を開くのと同時に起こる。従って、斑の破裂ならびに斑の下の平滑筋細胞および血管壁の健全な組織に沿った平滑筋細胞の刺激が、拡張により引き起こされると、内皮細胞マイトジェンをコードするＤＮＡは、血管の露出した内皮内層に同時に施用され、そこでＤＮＡは発現されて再内皮形成を促進し、従って再狭窄が減少する。バルーン膨張の好ましい期間は、３０秒〜３０分の範囲であり、より好ましくは１分〜５分の範囲である。
【００３８】
一旦移入されると、ＤＮＡは、損傷の部位の細胞により、再内皮形成のために十分な期間発現される。ＤＮＡを含むベクターは通常は細胞のゲノム中に取り込まれないので、目的のタンパク質の発現は、制限された時間にのみ起こる。代表的には、内皮細胞マイトジェンは、治療的レベルで、約２日間〜数週間、好ましくは約１〜２週間発現されるのみである。ＤＮＡの再施用は、治療用ポリペプチドの発現のさらなる期間を提供するために利用され得る。
【００３９】
ビヒクルには、それが動脈バルーン、カテーテル、可撓性杆状体、またはその他の形状のビヒクルであれば、意図される体腔内の正確な配置を補助する手段が提供される。例えば、ビヒクルは、放射性元素が提供されるか、または放射線不透過性にされるか、超音波を使用して容易な位置付けを可能にする手段が提供されるなどし得る。
【００４０】
本発明の方法は、血管壁の内皮内層の露出を生じるその他の血管損傷を処置するために使用され得る。例えば、一次血管形成は、急性心筋梗塞の処置のために広く使用されるようになりつつある。本発明の方法を使用する再内皮形成の加速により、不安定な斑が安定化され得、そして再閉塞が防止され得る。
【００４１】
さらに、血管内ステントは、バルーン血管形成の補助物として広く使用されるようになりつつある。ステントは、次善の最初の結果をレスキューするためならびに再狭窄を減衰させるために有用である。しかし、今日まで、血管内プロテーゼの欠点は、３．３ｍｍかまたはそれより大きい動脈を有する患者の約３％において血栓性閉塞が生じやすいということである。患者が動脈にこれより小さいステント配備を受ける場合、亜急性血栓症の発生数は、なおより高い。亜急性血栓症は、現在、抗凝固剤の攻撃的な使用によってのみ防止されている。血管への介入と強力な抗凝固剤との組み合わせにより、ステント／血管形成手順の時に末梢血管外傷に関する重大な危険が生じる。ステント配備により損傷された血管の部分の再内皮形成によって、これらの欠点が除かれ得、それによりステント部位のトロンボゲン形成性が弱まり、そしてまた平滑筋細胞増殖（これは、ステント治療を受ける患者の１０〜１５％における狭窄の原因である）が減少する。攻撃的抗凝固剤レジメを除くことで、ステント技術の利用における顕著な改善が構成される。複数のステントによって、亜急性血栓症および再狭窄がより高率になるが、これは本発明の方法の使用により減少され得る。さらに、本発明の方法を利用することにより、ステント配備は今や、直径３．０  ｍｍより小さい動脈を有する患者に適用され得る。
【００４２】
本明細書において言及されるすべての文書は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【００４３】
本発明は、以下の実施例によりさらに例証される。これらの実施例は、本発明の理解の補助のために提供され、そしてその限定としては解釈されない。実施例を通して、以下の略号が使用される：Ａｃｈ、塩化アセチルコリン；ＥＣ、内皮細胞；ＬａｃＺ、核標的化βガラクトシダーゼをコードする遺伝子；ｎＴｆ、非トランスフェクト；ｒＥＴ、再内皮形成；およびＴｆ、トランスフェクト。
【実施例】
【００４４】
（実施例１：バルーン損傷動脈区域の再内皮形成）
動物
雄性ニュージーランドシロウサギ  （３．５〜４．０ｋｇ）（Ｐｉｎｅ  Ａｃｒｅ  Ｒａｂｂｉｔｒｙ，  Ｎｏｒｔｏｎ，  ＭＡ）をＳｔ．Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ’ｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認されるプロトコルに従って、全実験に使用した。３２羽のウサギにおいて、一方の大腿動脈はバルーン損傷とｐｈＶＥＧＦ１６５でのトランスフェクション（ＶＥＧＦ−Ｔｆ）とを同時に受け、一方、対側大腿動脈は同じバルーン損傷を受けたが遺伝子移入は受けなかった（ＶＥＧＦ−ｎＴｆ）  （図２）。別の群の３２羽のウサギは、バルーン損傷と一方の大腿動脈のβ−Ｇａｌでのトランスフェクション（ＬａｃＺ−Ｔｆ）を同時に受け、一方、対側大腿動脈は同じ血管形成バルーン損傷を受けたが、遺伝子移入は受けなかった（ＬａｃＺ−ｎＴｆ）。ＶＥＧＦ対ＬａｃＺ遺伝子移入の血管造影的および組織学的結果を以下の時点でこれら６４羽の動物で系統だてて研究した：３日目（各群ｎ＝４）、５日目（各ｎ＝４）、１週間目（各ｎ＝８）、２週間目（各ｎ＝８）、および４週間目（各ｎ＝８）。さらなる１８羽のウサギをｐｈＶＥＧＦ１６５でトランスフェクトし、そして３羽の正常な非器具処理ウサギと共に用い、ＶＥＧＦ遺伝子発現の経時変化を０日目（血管形成前）、３日目、５日目、１週間目、２週間目、および４週間目の時点で測定した（各時点で３羽の動物）。最後に、４羽のウサギをβ−Ｇａｌでトランスフェクトし、そしてこのモデルにおけるトランスフェクション効率を評価するために５日後に屠殺した。
【００４５】
プラスミドＤＮＡ
これらの実験で用いた哺乳動物発現ベクターは、サイトメガロウィルスプロモーターおよび組換えヒトＶＥＧＦ１６５のｃＤＮＡを含み；後者ははじめにＨＬ６０白血病細胞から調製されたｃＤＮＡライブラリーより単離された（Ｌｅｕｎｇら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４６：１３０６−１３０９  （１９８９））。ウサギ血管平滑筋細胞におけるこのプラスミドの発現は、トランスフェクション後３日目に、ＶＥＧＦタンパク質についての免疫吸着剤アッセイによりインビトロにおいて以前に記載された（Ｉｓｎｅｒら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，  ９１：２６８７−２６９２  （１９９５））。この構造物（ｐｈＶＥＧＦ１６５）でトランスフェクトした細胞から分泌されたＶＥＧＦ１６５の生物学的活性は、インビトロにおいて、トランスフェクトされたヒト２９３細胞により馴化された培地が、毛細血管細胞の増殖を促進したという知見（Ｌｅｕｎｇら、前出）；およびインビボにおいて、ベクターのカテーテル投与後の血管形成の血管造影的および組織化学的証拠により、以前確認された（Ｉｓｎｅｒら、前出）。
【００４６】
シミアンウィルス４０初期プロモーターに結合された核標的化β―ガラクトシダーゼ配列を含むプラスミドｐＧＳＶＬａｃＺ（Ｃｌａｉｒｅ  Ｂｏｎｎｅｒｏｔ博士の好意による）（Ｂｏｎｎｅｒｏｔら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８４：６７９５−６７９９  （１９８７））を、以前に記載のように（Ｔａｋｅｓｈｉｔａら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  ９３：６５２−６６１  （１９９４））、全てのコントロールのトランスフェクションのために使用した。
【００４７】
インビボにおける経皮動脈遺伝子およびバルーン血管形成
各々のウサギを、キシラジン（２ｍｇ／ｋｇ）の前投薬の後、ケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ）およびアセプロマジン（０．２ｍｇ／ｋｇ）を用いて麻酔した。補足的麻酔用量は不要であった。介入の間中、自発的な換気を維持した。右総頸動脈への接近を、首における小さな正中線切開を介して得た。各々のウサギにおいて、直径２．０ｍｍ、長さ２．０ｃｍのヒドロゲルコートバルーンカテーテル（Ｓｌｉｄｅｒ  ｗｉｔｈ  Ｈｙｄｒｏｐｌｕｓ，  Ｂｏｓｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，  ＭＡ）を用いて、バルーン血管形成および動脈遺伝子移入を行った（Ｒｉｅｓｓｅｎら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  ４：７４９−７５８  （１９９３））。血管形成バルーンを、はじめに脱膨張バルーンを５Ｆｒ．のテフロン（登録商標）保護シース（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を通して進行させることによりエクスビボで調製した。このシースは、カテーテルの頸動脈中への導入に際して、血液とバルーンとの間の接触を最小にするように設計された。プラスミド  ＤＮＡを、血管形成バルーンをコートする外部ヒドロゲルポリマーに施用するために、バルーンを３ａｔｍ気圧に膨張させた。次いで、従来のピペットを使用して、４００μｇのｐｈＶＥＧＦ１６５を、膨張したバルーンの外部表面をコートしている２０μｍ厚のヒドロゲルポリマーの層（ｌａｔｅｒ）に施用した。プラスミドＤＮＡを、１０μｇ／μＬの濃度で施用した。一旦乾燥すると、施用したプラスミド溶液はバルーン表面に大いに可視の白色光沢を与える。次いで、バルーンを脱膨張し、保護シースに引き戻し、そしてシース内で３ａｔｍに再膨張させて、バルーン表面を横切る血流を再び最小限にした。次いで、シースおよび血管形成カテーテルを右総頸動脈を介して導入し、そして０．０１４ｉｎ．ガイドワイヤー（Ｈｉ−Ｔｏｒｑｕｅ  Ｆｌｏｐｐｙ（登録商標）  ＩＩ，  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｔｅｍｅｃｕｌａ，  ＣＡ）を透視検査の案内下で使用して、下腹大動脈へ進行させた。次いで、バルーンカテーテルを脱膨張させ、そして一方の大腿動脈に進行させ、そこで血管造影の標識点を用いて配置した。次いで、バルーン膨張を、１分間を３回、各４ａｔｍで実施した。最後の脱膨張後、バルーンおよびシースを引き抜いた。同じプロトコルを用いて、核標的化β―ガラクトシダーゼ配列を含むプラスミドｐＧＳＶＬａｃでコントロール動物の大腿動脈をトランスフェクトした。
【００４８】
各々のウサギについて、一方の大腿動脈のトランスフェクション（ｐｈＶＥＧＦ１６５またはｐＧＳＶＬａｃＺでの）の完了後、対側大腿動脈は、新たな直径２．０ｍｍ、長さ２．０ｃｍのヒドロゲルコート血管形成バルーンを使用して、バルーン損傷を受けた（しかし、トランスフェクションは受けなかった）。バルーン損傷（遺伝子移入をともなうかまたはともなわない）を、処理に盲検である一人の人により実施した。全体の手順の完了後、ニトログリセリン（０．２５ｍｇ，  ＳｏｌｏＰａｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｐａｒｋ，  ＩＬ）およびヘパリンナトリウム（２００ＵＳＰ  ユニット，Ｅｌｋｉｎｓ−ｓｉｎｎ，  Ｃｈｅｒｒｙ  Ｈｉｌｌ，  ＮＪ）を動脈内投与して、バルーン損傷部位の急性閉塞を予防した。
【００４９】
インビボ血管運動反応性
バルーン血管形成および動脈遺伝子移入に供した動脈区域の血管運動反応性を、屠殺の日に評価した。Ａ３Ｆｒ．エンドホール注入カテーテル（Ｔｒａｃｋｅｒ−１８ＴＭ，  Ｔａｒｇｅｔ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ）を左頸動脈に挿入し、そして透視検査の案内下で０．０１８ｉｎ．のガイドワイヤー（Ｈｉ−Ｔｏｒｑｕｅ  Ｆｌｏｐｐｙ（登録商標）  ＩＩ）を用いてトランスフェクトした腸骨の動脈の源まで進行させた。このカテーテルを、大腿動脈の選択的血管造影および血管作用性薬物の注入の両方に用いた。血管造影を、１ｍｌの非イオン性造影剤（Ｉｓｏｖｕｅ−３７０，  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，  ＮＪ）を用いて、薬物投与の直後に行った。連続的血管造影画像を１０５−ｍｍのスポットフィルムに１秒間当たり２フィルムの割合で４秒間記録した。
【００５０】
内皮依存性血管運動反応性を評価するために、塩化アセチルコリン（Ａｃｈ）およびセロトニンクレアチン硫酸（５−ＨＴ）を、定注入ポンプ（１ｍｌ／分）から３Ｆｒ．のカテーテルを介して、０．１５、１．５、および１５μｇ／ｋｇ／分の用量で、各２分間、送達した。基底血流状態を再確立させるために、各用量間に５分間経過させた。Ａｃｈおよび５−ＨＴそれぞれの投与が完了した後、ニトロプルシドナトリウム（Ｎｐ）（１．５μｇ／ｋｇ／分）の２分間の動脈内注入を投与して、内皮非依存性血管運動反応性を評価した。最後に、同じプロトコルを用いて、対側の損傷はしたがトランスフェクトしていない大腿動脈を評価した。
【００５１】
定量的血管造影
薬物注入前後の大腿動脈の血管造影的管腔直径を、自動エッジ検出システム（ＬｅＦｒｅｅら、Ｐｒｏｃ  ＳＰＩＥ，  ６２６：３３４−３４１  （１９８６）およびＭａｎｃｉｎｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，  ７５：４５２−４６０（１９８７））を用いて測定した。血管形成バルーン損傷のパイロット血管造影に従って、各バルーン損傷部位を規定し、そして境界線を引いた。分析のために選抜した血管造影を、高解像度ビデオカメラでスキャンし；ビデオカメラにより生成されたシグナルをデジタル化し、そしてビデオモニター上に表示した。予め引いた境界線により規定される長さ２０ｍｍの区域について中央線を手動でトレースした。等高線を、デジタル化した明度情報に適用した第一および第二の導関数の加重合計を基礎として自動的に検出した。次いで、平均血管造影管腔直径および最小管腔直径を、各々のトランスフェクトおよび非トランスフェクトバルーン損傷動脈の、規定された長さ２０ｍｍの区域について測定した。
【００５２】
薬物
Ａｃｈ、５−ＨＴ、およびＮｐを、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ．から入手した。各々の新鮮ストック溶液を、各実験直前に調製した。
【００５３】
動物の屠殺
屠殺の３０分前に、全てのウサギに耳静脈を介して送達される０．５％エバンスブルー色素（Ｓｉｇｍａ）（３）６ｍｌの静脈注射を受けさせ、残存非内皮形成領域を同定した。ケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ）およびアセプロマジン（０．２ｍｇ／ｋｇ）の麻酔下で、下腹大動脈にカニューレを挿入し、そしてインサイチュで１０ユニット／ｍｌのヘパリンを含む総量１００ｍｌの０．９％生理食塩水およびそれに続く１００％メタノール１００ｍｌを潅流するために用いた。バルーン損傷前に記録したベースライン血管造影および血管形成バルーンのパイロットＸ線撮影記録を用いて、採取すべき動脈区域を同定した。次いで、はじめに損傷した大腿動脈の長さ２ｃｍの区域を、切除して放し、縦方向に切開した。採取した動脈区域をコルクボードにピンで留め、１００％メタノール中でさらに固定し、そしてｒＥＴ（下記参照）の面積測定分析のための調製において、解剖顕微鏡（ＳＴＥＭＩ  ＳＲ，  Ｚｅｉｓｓ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて写真撮影した。組織を１００％メタノール中に浸してさらに固定し、パラフィン中に縦方向の端で包埋し、そして３−アミノプロピル−トリエトキシ−シランでコートしたスライド上に５−μｍ切片で切断した。
【００５４】
再内皮形成の面積測定分析
面積測定分析を、解剖顕微鏡を通して得た採取動脈区域の写真を用いて行った。エバンスブルー色素の適用後に青色に染色された内膜表面の領域を、内皮欠損のままであった動脈区域の割合を同定すると解釈し；これらの顕微鏡での分析を、内皮細胞特異性マーカー（下記参照）を用いて光学顕微鏡区域の免疫染色により確認した。デジタル化ボード（Ｓｕｍｍａｇｒａｐｈｉｃｓ，  Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，  ＣＴ）とインターフェイスしたコンピューター化スケッチングプログラム（ＭａｃＭｅａｓｕｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．９；  ＮＩＭＨ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ）を、処理プロトコルに盲検の一人の人に使用させ、それぞれエバンスブルー陽性および陰性領域の輪郭付けた。詳細には、内皮形成領域の程度を、長さ２ｃｍの動脈内に含まれる全内膜領域のパーセントとして計算した。
【００５５】
内膜過形成の評価
長さ２０ｍｍの損傷動脈から得、そして弾性組織三色染色で染色した縦方向組織切片を、デジタル化ボードに投影し、そして内膜および中膜のそれぞれの面積を上記のコンピューター化スケッチングプログラムを用いて、処理レジメに盲検の技術者により測定した。
【００５６】
動脈壁の天然中膜の厚さは、個々のウサギ大腿動脈の面積（直径）を部分的に反映して可変的である。従って、中膜の厚さを新生内膜厚化の程度を示すために使用し、従って、それを中膜面積に対する内膜面積の割合（Ｉ／Ｍ）として示す。
【００５７】
損傷動脈における増殖活性の評価
屠殺した時点で採取した、損傷動脈区域中の増殖活性を、以前に記載のように増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）についての免疫染色分析により評価した（Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  ９１：１４６９−１４８０  （１９９３））。内因性過酸化物活性を、ＰＢＳ中の３．０％過酸化水素でブロックした。非特異性タンパク質結合を１０％正常ウマ血清でブロックした。切片を、１％  ＢＳＡ／ＰＢＳ中１：４０希釈のＰＣＮＡに対するマウスのモノクローナル抗体（クローンＰＣ１０、Ｓｉｇｎｅｔ，  Ｄｅｄｈａｍ，  ＭＡ）とともに４℃で一晩インキュベートした。ネガティブコントロールを、精製非特異性マウスモノクローナル抗体であるＭＯＰＣ−２１（Ｓｉｇｍａ）とともにインキュベートした。結合した一次抗体を、アビジン−ビオチン−イムノペルオキシダーゼ法（Ｅｌｉｔｅ  Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，  Ｓｉｇｎｅｔ）を用いて検出した。切片を、５μｇ／ｍｌのＢａｎｄｅｉｒａｅａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ  Ｉ（ＢＳＩ）レクチン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，  ＣＡ）（２５）で軽く対比染色した。レクチン染色のために、０．３％のハイドロジェンペルオキシダーゼで前処理した切片をビオチン化レクチン（Ｖｅｃｔｏｒ）  ５  μｇ／ｍｌとともに４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、スライドガラスをペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（ＢｉｏＧｅｎｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ，  ＣＡ）とともに１時間インキュベートし；次いで、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ，  Ｓｉｇｎｅｔ）を酵素の基質として適用し、その結果、褐色の反応生成物を得た。
【００５８】
各縦方向切片についての増殖活性の程度を、長さ２０  ｍｍの縦方向切片の長さ当たりの内膜中の陽性細胞数、すなわち細胞／ｍｍとして、処理レジメに盲検の一人の人により測定した。ウサギ回腸のＰＣＮＡ染色を、本研究のためのポシティブコントロールとした。
【００５９】
遺伝子発現の分析
ｐｈＶＥＧＦ１６５の発現を、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて評価した。全細胞ＲＮＡを、トランスフェクトした動脈区域から、ＴＲＩ  ＲＥＡＧＥＮＴ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，  ＯＨ）を用いて単離した。抽出したＲＮＡを、３７℃で３０分間、ＤＮａｓｅ（０．５μｌ，  １０  Ｕ／μｌ，  ＲＮａｓｅ非含有、Ｍｅｓｓａｇｅ  Ｃｌｅａｎ  ｋｉｔ，  ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ，  Ｂｏｓｔｏｎ，  ＭＡ）で処理して、ＤＮＡ混入を除去した。抽出されたＲＮＡの収量を、２６０  ｎｍにおける紫外線吸収により分光光学的に測定した。ＲＮＡが分解されなかったこと、およびリボゾームバンドがインタクトであったことを決定するために、１ｍｇの各ＲＮＡサンプルを熱変性させ、そして１％非変性ミニアガロースゲルで電気泳動した。本発明者らは、０．５μｇの各ＲＮＡサンプルを用いて、０．５  ｍＭの各デオキシヌクレオチド３リン酸（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，  Ｐｓｉｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）、１０  ｍＭのジチオスレイトール、１０ユニットのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）、５０  ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．３］、７５  ｍＭのＫＣｌ、３  ｍＭのＭｇＣｌ２、１  ｍｇのランダムヘキサヌクレオチドプライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ）、および２００ユニットのＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，  Ｇａｉｔｈｅｒｄｂｕｒｇ，  ＭＤ）を含む２０μｌの反応容量中のｃＤＮＡを作製した。より高い正確性および再現性のために、多数反応のためのマスターミックスを作製し、そしてＲＮＡを含んだチューブに小分けした。反応液を、４２℃で１時間インキュベートし、次いで９５℃で５分間インキュベートして、反応を終結させた。次いで、２０ｍｌのジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）水を添加し、そして５ｍｌの希釈した反応液（１／８）をＰＣＲ分析において用いた。総量２０  μｌでの最適化反応は、０．２  ｍＭの各デオキシヌクレオチド３リン酸、３ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍｌのＰＣＲ  ＩＩ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，  Ｎｏｒｗａｌｋ，  ＣＴ；  最終濃度５０  ｍＭ  ＫＣｌ，  １０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、５  ｎｇ／ｍｌ（１３．７７ｐｍｏｌ）の各プライマー、および０．５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を含んだ。ＰＣＲを、マイクロアンプ０．２  ｍｌ薄壁チューブを用いて９６００  ＰＣＲシステム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）で行った。増幅を、９４℃で２０秒、５５℃で２０秒を、７２℃で２０秒を、３５〜４５サイクル行い、７２℃での５分間で終結させた。偽陽性について試験するために、コントロールには、ＲＮＡもトランスバース転写酵素（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）も含めなかった。ヒトＶＥＧＦのｍＲＮＡから２５８ｂｐの配列を増幅するために、一対のオリゴヌクレオチドプライマー（２２マー）を設計した。特異性を確認するため、および内因性ウサギＶＥＧＦの増幅を回避するために、各プライマーを、異なる種間では保持されていない領域から選択した。使用したプライマーの配列は：５’−ＧＡＧＧＧＣＡＧＡＡＴＣＡＴＣＡＣＧＡＡＧＴ−３’（配列番号１）（センス）；および５’−ＴＣＣＴＡＴＧＴＧＣＴＧＧＣＣＴＴＧＧＴＧＡ−３’  （配列番号２）（アンチセンス）であった。予備実験からは、培養したウサギ平滑筋細胞が、ヒトＶＥＧＦのｃＤＮＡを含むプラスミドでトランスフェクトした場合のみ、このプライマーとハイブリダイズしたことが示された。正常（非トランスフェクト）、またはβガラクトシダーゼトランスフェクトウサギ平滑筋細胞の培養物は、ハイブリダイゼーションを示さなかった。ＲＴ−ＰＣＲ産物を、２％アガロースゲル電気泳動により分析した。エチジウムブロマイドで染色した後、ＵＶ照射下でＤＮＡのバンドを可視化した。
【００６０】
この様式におけるインビボ動脈遺伝子移入の効率を評価するために、ＬａｃＺ−Ｔｆ動脈を５日目に採取し、そしてβガラクトシダーゼ活性を以前に記載（Ｒｉｅｓｓｅｎら、前出）のように５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトシド色素原（Ｘ−Ｇａｌ，  Ｓｉｇｍａ）とともにインキュベートすることにより、測定した。Ｘ−Ｇａｌ溶液での染色後、組織をパラフィン包埋し、切片化し、そしてヌクレアファストレッド（ｕｎｃｌｅａｒ  ｆａｓｔ  ｒｅｄ）で対比染色した。プラスミドｐＧＳＶＬａｃＺの核局在化βガラクトシダーゼ発現は内因性βガラクトシダーゼ活性から生じ得なかった；従って、細胞核内のβガラクトシダーゼの組織学的同定を、遺伝子移入および遺伝子発現の成功の証拠として解釈した。細胞質染色またはその他の染色を、本研究の目的のためには非特異的と考えた。
【００６１】
統計的解析
全ての結果を、平均±標準誤差（ｍ±ＳＥ）として示した。統計的有意性を、２つの平均間の比較については片側スチューデントｔ検定を用い、または頻度の比較については分割表解析を用いて評価した。Ｐ＜０．０５の値を、統計学的に有意であることを示すと解釈した。
【００６２】
結果
再内皮形成
エバンスブルー色素染色を用いて実施した面積測定分析は、ＶＥＧＦトランスフェクト動脈間で、７日目までに、バルーン損傷ウサギ大腿動脈の長さ２０ｍｍ区域のほぼ完全なｒＥＴを示したが、一方ＬａｃＺトランスフェクト動脈中のｒＥＴの程度は、７日目で完全の＜５０％であり、そして４週間目にほぼ２０％不完全なままであった（図４Ａ、４Ｃ）。１０個のＶＥＧＦ−Ｔｆ動脈において、４週間目のｒＥＴは、実際１００％完全であり、これはＬａｃＺ−Ｔｆ動脈では観察されなかった知見である。再内皮形成は、ｐｈＶＥＧＦ１６５でトランスフェクトした動脈（ＶＥＧＦ−Ｔｆ）のみでなく、対側バルーン損傷非トランスフェクト動脈（ＶＥＧＦ−ｎＴｆ）においても促進された（図４Ｂ、４Ｃ）。
【００６３】
血管運動神経の反応性
ｒＥＴの以前の研究により、解剖学的完全性の回復および生理学的機能の回復が同時には進行しないことが実証された（Ｔａｎａｋａら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，  ３３：１７８８−１８０３  （１９９３）  Ｓｈｉｍｏｋａｗａら、  Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．，  ６１：２５６−２７０  （１９８７），およびＷｅｉｄｉｎｇｅｒら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，  ８１：１６６７−１６７９  （１９９０））。従って、本発明者らは定量的血管造影を用いて、内皮依存性アゴニストに対する血管運動応答を測定した。Ｗｅｉｄｉｎｇｅｒら（前出）の以前の経験と一致して、ＬａｃＺでトランスフェクトしたコントロールウサギは、損傷の４週間後に、内皮依存性薬剤に対する血管運動応答における持続性損傷を示した（表１）。対照的に、ｐｈＶＥＧＦ１６５でトランスフェクトした動脈は、１週間以内にほぼ正常な内皮依存性血管反応性の回復を示した（図６および７）。同様の利益が、対側、バルーン損傷、非トランスフェクト肢について観察された（表１）。
表１
ｐｈＶＥＧＦ１６５遺伝子治療後の内皮依存性および非依存性アゴニストに応答しての血管収縮（＋）または血管拡張（−）
【００６４】
【表１】
2007181722.tif 000002
数値は、％管腔狭化の変化を表す：
＊＝ｐ＜０．０１対コントロール、†＝ｐ＜０．０５対コントロール。
【００６５】
新生内膜厚化
新生内膜厚化に対するｒＥＴの促進の効果を、縦方向切断切片中の中膜面積に対する内膜面積の割合（Ｉ／Ｍ比）として、光学顕微鏡検査により評価した（図８）。ＬａｃＺ−Ｔｆ動脈は、４週間を通して進行性の新生内膜厚化を示した（１週間目＝Ｉ／Ｍ＝０．１１±０．０２；  ２週間目＝０．５９±０．０４；  ４週間目＝０．６９±０．１０）。対照的に、ＶＥＧＦ−Ｔｆ動脈は、２週間目と４週間目との間の内膜厚化の退行を含む、有意により少ない内膜厚化を示した（１週間目＝０．０６±０．０２；２週間目＝０．２０±０．０５，  ｐ＜０．１；  ４週間目＝０．１４±０．０２，  ｐ＜０．０１）。
【００６６】
さらに、ＶＥＧＦ遺伝子移入群（ＶＥＧＦ−ｎＴｆ）における対側バルーン損傷動脈のＩ／Ｍ比は、２から４週間目の間に、ＬａｃＺコントロールの対側動脈と比較して、より少ない内膜厚化を発達させ、進行を示さなかった（ＬａｃＺ−ｎＴｆ，１週間目＝０．０５±０．０３；２週間目＝０．５４±０．０６；４週間目＝０．８４±０．０９；ＶＥＧＦ−ｎＴｆ，１週間目＝０．０９±０．０２；２週間目＝０．２９±０．０８，  ｐ＜０．０５；４週間目＝０．３１±０．０９，  ｐ＜０．０１）。
【００６７】
増殖活性
ｐｈＶＥＧＦ１６５促進ｒＥＴについて観察された新生内膜厚化の減少は、中膜および新生内膜の両方における増殖活性の付随する減少と関連した（図１０）。ＬａｃＺ−Ｔｆの中膜における細胞増殖は、損傷後３日目にピークに達し、次いで、残りの４週間に渡って次第に減少した（３日目＝３２．５±４．７  ＰＣＮＡ陽性細胞／ｍｍ；  ５日目＝２７．１±２．９；  １週間目＝１０．５±２．０；  ２週間目＝６．２±２．７；  ４週間目＝０．３±０．２）。ＶＥＧＦ−Ｔｆの中膜における増殖活性もまた、遺伝子移入後３日目にピークに達したが（２４．７±６．８  細胞／ｍｍ）、次いで急速に減少した（５日目＝１２．２±４．２  細胞／ｍｍ；  １週間目＝２．６±１．０；  ２週間目＝１．６±０．５；  ４週間目＝０．１±０．０）。隣接する切片の選択的免疫染色から、増殖細胞はおもに平滑筋細胞であったことが確立された。
【００６８】
ＬａｃＺ対ＶＥＧＦトランスフェクト動物の新生内膜について、増殖活性の時間的差も観察した。ＬａｃＺ−Ｔｆ動脈における新生内膜増殖は、トランスフェクション後２週間まで上昇し続けた（３日目＝０．２±０．１  細胞／ｍｍ；  ５日目＝４．１±１．９；  １週間目＝８．６±２．０；  ２週間目＝１０．７±２．０；  ４週間目＝２．３）。ＶＥＧＦ−Ｔｆについては、新生内膜増殖活性は５日目にピークに達し、次いで急速に下降した（３日目＝２．４±０．６  細胞／ｍｍ；  ５日目＝７．０±３．４；  １週間目＝０．８±０．３；  ２週間目＝２．０±０．７；  ４週間目＝０．１±０．１）。
【００６９】
ＰＣＮＡ陽性細胞を、隣接する（連続的に切断された）組織学的切片の管腔境界にそって位置する見かけ上同じ細胞の陽性ＢＳＩレクチン染色によるＥＣととして同定した。ＥＣの増殖活性は、ＬａｃＡ−Ｔｆにおいて、バルーン損傷後４週間を通して、一定であった。対照的に、ＶＥＧＦ−Ｔｆ動脈におけるＥＣ増殖は、３日目に顕著なピークを示し、次いで、トランスフェクションの１週間後まで減少した（図１１）。
【００７０】
血栓抵抗性（ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）
血栓抵抗性は、血管形成直後の状況において、重要な問題を構成する。このことは、急性心筋梗塞のために血管形成を実施する場合（この場合、亜急性再閉塞の危険性が増加する）特に真である。最近の研究において、ｐｈＶＥＧＦ１６５促進ｒＥＴが、血栓抵抗性の増大を導いた。詳細には、血栓性閉塞は、ＬａｃＺでトランスフェクトした動物（１４／６４）よりｐｈＶＥＧＦ１６５でトランスフェクトした動物（２／６４）において低頻度で発達した（ｐ＜０．００１）。
【００７１】
遺伝子発現
ＶＥＧＦ遺伝子発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより、３羽の正常な非器具処理ウサギ、および０日目（血管形成前）、３日目、５日目、１週間目、２週間目、および４週間目のｐｈＶＥＧＦ１６５でトランスフェクトしたウサギ（各ｎ＝３）について評価した。遺伝子発現は、早くも３日目に観察され、２週間に渡り持続し、そして３週間目までに減少した（図１２）。
【００７２】
ＲＴ−ＰＣＲをまた、他の器官由来の切片に対して実施し、それによりＶＥＧＦトランスフェクト動脈区域から離れたいかなる部位においてもＶＥＧＦのｍＲＮＡ発現は示されなかった（図１２）。
【００７３】
４羽のウサギをＬａｃＺでトランスフェクトし、そして５日後に屠殺した；選抜した光学顕微鏡視野中の全ての細胞を含む定量検査により、トランスフェクション効率は＜０．１％であったことが示され、これは以前の報告と一致した（Ｉｓｎｅｒら、前出、およびＭａｎｃｉｎｉら、前出）。
【００７４】
種々の動物モデルにおけるｒＥＴの以前の研究により、解剖学的完全性の回復および生理学的機能の回復は同時には進行しないことが実証されている（Ｔａｎａｋａら、前出、  Ｓｈｉｍｏｋａｗａら、前出、およびＷｅｉｄｉｎｇｅｒら、前出）。従って、本発明者らは３つの方法でＶＥＧＦ誘導性再内皮形成の機能的挙動を特徴付けることを試みた。第一に、本発明者らは内皮依存性アゴニストに対する血管運動応答を測定した。Ｗｅｉｄｉｎｇｅｒら（前出）の以前の経験と一致して、ＬａｃＺでトランスフェクトしたコントロールウサギは、損傷後４週間目にＡｃｈおよび５−ＨＴに応答して持続的悪化を示した。対照的に、ｐｈＶＥＧＦ１６５でトランスフェクトした動脈は、１週間以内にほぼ正常な内皮依存性応答の回復を示した。ちなみに、４週間目におけるＶＥＧＦ−Ｔｆウサギ間の生理学的応答は、進行中のＶＥＧＦ１６５分泌の非存在下における回復された内皮の応答を表すと推定され得る。なぜなら、ＲＴ−ＰＣＲを用いた本研究および以前の研究（Ｉｓｎｅｒら、前出）における分析により、３週間目を越えるトランスジーンの発現の証拠がないことを一致して示したからである。
【００７５】
平滑筋細胞間の減少した増殖活性およびそれに関連するＶＥＧＦ遺伝子移入の部位に隣接する動脈区域において観察された内膜厚化の減少は、迅速に回復したＥＣ機能の第二指標を構成する。それによって新生内皮が内膜過形成を調整する正確なメカニズムは今後明らかにされるべき課題であるが（下記参照）、おそらく、健常ＥＣに特徴的な抗増殖的性質の迅速な回復を反映している。
【００７６】
ＶＥＧＦ誘導性ｒＥＴは、血栓抵抗性の改善を生じた。これは、血管形成後の状況において特に重要な機能である。実際、急性心筋梗塞の処置において血管形成の適用の増加が好まれているという最近の傾向の中で、急性破裂斑を安定化する目的のためのＶＥＧＦ遺伝子移入は、付加的な利点を有し得る。
【００７７】
（実施例２：バルーン脱内皮形成およびステント移植後の動脈区域の再内皮形成）
プラスミド
ｐＧＳＶＬａｃＺベクターは、上記した。
【００７８】
’  本実施例で使用するｃＤＮＡは、ＶＥＧＦの１６５アミノ酸イソ型をコードし、そして以前に記載されている。ＶＥＧＦｃＤＮＡを挿入したプラスミド  ｐｈＶＥＧＦ１６５  ＳＲは、ＶＥＧＦを発現させるためにサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター／エンハンサーを利用する、単純な真核生物発現プラスミドである。このプラスミドは、ｐＣＧ（Ｔａｎａｋａら、Ｃｅｌｌ，  ６０：３７５−３８６  （１９９０））の誘導体である。骨格プラスミドベクターは、ｐＢＳＭ１３＋に由来する。カナマイシン耐性遺伝子をコードするカセットを挿入し、そして元のベクター（ｐｈＶＥＧＦ１６５）内に存在するＳＶ４０の複製起点を大部分除去した。ＣＭＶプロモーターはＣＭＰｃａｐ部位に関して−５２２〜＋７２の位置にある。ｐｈＶＥＧＦ１６５  ＳＲコード配列の上流には、ＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子５’リーダーが、チミジンキナーゼｃａｐ部位に関して＋５１〜＋１１４の位置に存在する。ＶＥＧＦコード配列の下流には、ウサギｂ−グロビン遺伝子配列が、ｂ−グロビンｃａｐ部位に関して＋９０５〜＋２０８０の位置に存在する。
【００７９】
プラスミドの同一性を確認するために、全体のｐｈＶＥＧＦ１６５ＳＲ配列（６６０９ｂｐ）を、３０の配列プライマーを用いて決定した。二本鎖ＤＮＡの構造を、蛍光ジデオキシターミネーターヌクレオチドを用い、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  ３７３Ａ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いるサイクル配列決定法により決定した。配列を、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ  Ｑｕａｄｒａコンピューターで、ＭａｃＶｅｃｔｏｒおよびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ｎａｖｉｇａｔｏｒ  ソフトウェアを用いて解析した。この配列決定解析の品質管理は、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔおよびＭ１３のコントロールの平行配列解析からなる。この解析により、本発明者らの決定した配列と６６０９ｂｐプラスミドの推定配列との間の９９．１％の配列相同性が明らかになった。
【００８０】
ＶＥＧＦコード領域の配列を、両方の鎖について決定し、そしてそれは推定配列と１００％一致した。
【００８１】
方法
手順を、ニュージーランドウサギ（３．５〜４．０ｋｇ）を使用して実施した。全ての動物は、手順前に１週間アスピリン（１００  ｍｇ／日）を受け、処理を屠殺まで続けた。全て、手順の時点に、ヘパリン（１０００ユニット）および抗生物質（２．５ｍｇ／ｋｇ）を受けた。治療の局所的および全身的効果の両方を区別するように、プロトコルを設計した。
【００８２】
【表Ａ】
2007181722.tif 000003
全ての動物をステント移植の７日後に屠殺した。ステント表面の内皮被覆の割合を、光学顕微鏡および走査電子顕微鏡により評価した。
結果
群Ａ＝６羽のウサギ
群Ｂ＝４羽のウサギ
―％再内皮形成：
群Ａ（ＶＥＧＦ）          処置側＝８７．０＋／−５．０
コントロール側＝４２．２＋／−１１．３
群Ｂ（βガラクトシダーゼ）処置側＝２．１＋／−１．１
コントロール側＝２１．６＋／−１４．８
ＶＥＧＦ群の処置側は、他の全ての側より７日目において顕著に良好な内皮被覆を有した（ｐ＜０．０５）。
【００８３】
本発明は、その好ましい実施態様を含めて詳細に記載された。しかし、当業者が本開示を考慮して、請求の範囲に記載される本発明の精神および範囲から逸脱ることなく、それに対して修飾および改良を加え得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】図１は、内皮細胞マイトジェンをコードする核酸を、バルーン血管形成の間に閉塞部に送達する、バルーンカテーテルの概略断面図を示す。
【図２】図２は、実施例１の実験プロトコルを示す図解である。ＬａｃＺまたはｐｈＶＥＧＦ１６５プラスミドＤＮＡ（１０μｇ／μＬ、総量＝４００μｇ）を、直径２．０ｍｍ、長さ２．０ｃｍのヒドロゲルコートバルーンカテーテル（Ｓｌｉｄｅｒ  ｗｉｔｈ  Ｈｙｄｒｏｐｌｕｓ，  Ｂｏｓｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，  ＭＡ）をコートする外部ヒドロゲルポリマーに施用した。カテーテルを、血液とバルーンとの間の接触を最小化するように設計された、５Ｆｒ．テフロン（登録商標）保護シース（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を介して一方の大腿動脈中に進行させた。次いで、バルーン膨張を、１分間各々４気圧で３回実施した。各々のウサギについて、一方の大腿動脈のトランスフェクション（ｐｈＶＥＧＦ１６５またはｐＧＳＶＬａｃＺでの）の完了後、対側の大腿動脈は、新たなカテーテルを使用してバルーン損傷（トランスフェクションしない）を受けた。
【図３】図３は、バルーン損傷および／またはトランスフェクション後４週間目（ｗｋｓ）の、代表的な血管造影図を示す。
【図４Ａ】図４Ａおよび４Ｂは、トランスフェクション後３日目、５日目、１週間目、および２週間目における、（４Ａ）バルーン損傷した、トランスフェクトした動脈（ＬａｃＺ−ＴｆおよびＶＥＧＦ−Ｔｆ）、ならびに（４Ｂ）対側のバルーン損傷した、トランスフェクトしていない動脈（ＬａｃＺ−ｎＴｆおよびＶＥＧＦ−ｎＴｆ）の代表的な顕微鏡的外観を示す。エバンスブルー色素により染色されない再内皮形成領域は、白く見える。
【図４Ｂ】図４Ａおよび４Ｂは、トランスフェクション後３日目、５日目、１週間目、および２週間目における、（４Ａ）バルーン損傷した、トランスフェクトした動脈（ＬａｃＺ−ＴｆおよびＶＥＧＦ−Ｔｆ）、ならびに（４Ｂ）対側のバルーン損傷した、トランスフェクトしていない動脈（ＬａｃＺ−ｎＴｆおよびＶＥＧＦ−ｎＴｆ）の代表的な顕微鏡的外観を示す。エバンスブルー色素により染色されない再内皮形成領域は、白く見える。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、損傷したトランスフェクトした動脈（５Ａ）、および損傷したトランスフェクトしていない動脈（５Ｂ）の再内皮形成を示すグラフである。（＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＝ｐ＜０．０５対ＬａｃＺ−Ｔｆまたは−ｎＴＦ。）
【図６Ａ】図６Ａおよび６Ｂは、薬物前（ベースライン）、ならびに、ＬａｃＺ−ＴｆおよびＶＥＧＦ−Ｔｆ動脈についてのトランスフェクション後２週間目における、セロトニンクレアチン硫酸（５−ＨＴ）、塩化アセチルコリン（Ａｃｈ）およびニトロプルッシドナトリウム（ＮＰ）の直後に記録した、代表的な血管造影図である（６Ａ）。各々の血管造影図中の２つの矢印の間の動脈の区域は、バルーン損傷の部位を示す。図６Ｂは、トランスフェクション後４週間目における知見を示す。
【図６Ｂ】図６Ａおよび６Ｂは、薬物前（ベースライン）、ならびに、ＬａｃＺ−ＴｆおよびＶＥＧＦ−Ｔｆ動脈についてのトランスフェクション後２週間目における、セロトニンクレアチン硫酸（５−ＨＴ）、塩化アセチルコリン（Ａｃｈ）およびニトロプルッシドナトリウム（ＮＰ）の直後に記録した、代表的な血管造影図である（６Ａ）。各々の血管造影図中の２つの矢印の間の動脈の区域は、バルーン損傷の部位を示す。図６Ｂは、トランスフェクション後４週間目における知見を示す。
【図７】図７は、トランスフェクション後１週間目、２週間目、および４週間目での、血管運動応答の、定量的血管造影分析である。５−ＨＴにより、正常（非バルーン損傷）ウサギ大腿動脈における軽い血管収縮が生じ、そして特に損傷後１週間目および２週間で、ＬａｃＺ−ｔｆにおいて激しい収縮が生じた。極めて少ない血管収縮がＶＥＧＦ−Ｔｆにおいて見られ、そしてこれは実際、正常（すなわち、非損傷、非トランスフェクト）動脈において観察された血管収縮と同様またはそれより少なかった。Ａｃｈ注入により、非バルーン損傷動脈において、わずかな拡張が引き起こされた。バルーン損傷後、１週間目および２週間目でＡｃｈによってはＬａｃＺ−Ｔｆは拡張しなかったが、Ａｃｈは、ＶＥＧＦ−Ｔｆにおいて拡張を誘導した。再度、ＶＥＧＦ−Ｔｆにおける血管運動応答は、正常な損傷していない動脈において観察された応答と同様であった。Ｎｐにより損傷前に軽い拡張を生じさせ、そしてＬａｃＺ−ＴｆおよびＶＥＧＦ−Ｔｆの両方において等価な拡張が生じた（＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＝ｐ＜０．０５対ＬａｃＺ−Ｔｆ）。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、ＬａｃＺ−Ｔｆ動脈が４週間を通じて進行性新内膜厚化（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌ  ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ）を示したことを示すグラフである。極めて少ない内膜厚化（２週間目と４週間目との間の内膜厚化の後退を含む）がＶＥＧＦ−Ｔｆ動脈の間に観察された（＊＝ｐ＜０．０１対ＬａｃＺ−Ｔｆ）。（８Ａ）ＬａｃＺ−ｎＴｆと比較して、ＶＥＧＦ群中の対側のバルーン損傷した、トランスフェクトしていない動脈（ＶＥＧＦ−ｎＴｆ）は、２〜４週間目の間に、内膜厚化の発達はより少なく、そして進行を示さなかった（＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＝ｐ＜０．０５対ＬａｃＺ−ｎＴｆ）（図８Ｂ）。
【図９】図９は、ＬａｃＺ−ＴｆおよびＶＥＧＦ−Ｔｆについての、トランスフェクション後２週間目および４週間目での、ＬａｃＺ−ＴｆおよびＶＥＧＦ−Ｔｆについての、内膜厚化に対するトランスフェクションの代表的な効果を示す。
【図１０】図１０は、ＬａｃＺ−Ｔｆ（白丸）およびＶＥＧＦ−Ｔｆ（黒丸）の両方の中膜中の増殖活性が、損傷後３日目（３ｄ）でピークになり；残りの４週間にわたって、増殖活性が、ＬａｃＺ−ＴｆにおいてよりもＶＥＧＦ−Ｔｆにおいて迅速に減少したことを示すグラフである。内膜において、増殖の経時変化は、ＶＥＧＦ−Ｔｆ（黒三角）よりもＬａｃＺ−Ｔｆ（白三角）において延長された。
【図１１】図１１は、３日目および５日目で、ＶＥＧＦ−ＴｆにおけるＥＣ増殖が、ＬａｃＺ−ＴｆのＥＣ増殖を超えたことを示す。上部の顕微鏡写真は、遺伝子移入後３日目の、内部弾性膜の管腔側のＰＣＮＡ陽性細胞を示し；下部の顕微鏡写真におけるＢＳＩ−レクチンは、これらをＥＣとして同定する（＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＝ｐ＜０．０５）。
【図１２】図１２Ａおよび図１２Ｂは、ＶＥＧＦ遺伝子発現を示す。図１２Ａは、３日目ほど早期にＲＴ−ＰＣＲにより観察され、２週間にわたって持続して発現し、そして３週間目までに発現が減少した、ＶＥＧＦ遺伝子発現の経時変化を示す。矢印は、２５８ｂｐにおけるＶＥＧＦバンドの位置を示す。ＶＥＧＦでトランスフェクトした動脈を、ＲＴ−ＰＣＲにより、３日目（レーン６）、１週間目（レーン７）、２週間目（レーン８）、３週間目（レーン９）、４週間目（レーン１０）、および６週間目（レーン１１）でのＶＥＧＦ遺伝子発現の存在について検討した。
【００８５】
レーン１＝ポジティブコントロール（ＶＥＧＦでトランスフェクトしたＳＭＣ）；レーン２＝ネガティブコントロール（ＲＮＡなし）；レーン３＝ネガティブコントロール（組織なし）；レーン４＝ネガティブコントロール（ＬａｃＺ−Ｔｆ動脈のＰＣＲ）；レーン５＝ネガティブコントロール（逆転写酵素反応を除外した、ＶＥＧＦ−Ｔｆ動脈のＰＣＲ）；レーン１２＝分子量マーカー、ＨａｅＩＩＩで消化したｐＧＥＭ３ｚｆ（−）。
【００８６】
図１２Ｂは、ＶＥＧＦトランスフェクトウサギから回収された器官における遺伝子発現を示す。ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡは、トランスフェクト動脈区域（レーン７）以外のいかなる器官（レーン８〜１５＝心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、精巣、脳、大腿内側由来の骨格筋）においても観察されなかった。レーン１＝分子量マーカー；レーン２＝ポジティブコントロール（ＶＥＧＦでトランスフェクトされた平滑筋細胞）；レーン３＝ネガティブコントロール（ＲＮＡなし）；レーン４＝ネガティブコントロール（組織なし）；レーン５＝ネガティブコントロール（ＬａｃＺ−Ｔｆ動脈のＰＣＲ）；レーン６＝ネガティブコントロール（逆転写酵素反応を除外したＶＥＧＦ−Ｔｆ動脈のＰＣＲ）。
［配列表］
【表２】
2007181722.tif 000004
【表３】
2007181722.tif 000005
【図１】
2007181722.tif 000006
【図２】
2007181722.tif 000007
【図３】
2007181722.tif 000008
【図４Ａ】
2007181722.tif 000009
【図４Ｂ】
2007181722.tif 000010
【図５】
2007181722.tif 000011
【図６Ａ】
2007181722.tif 000012
【図６Ｂ】
2007181722.tif 000013
【図７】
2007181722.tif 000014
【図８】
2007181722.tif 000015
【図９】
2007181722.tif 000016
【図１０】
2007181722.tif 000017
【図１１】
2007181722.tif 000018
【図１２】
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