(57)【要約】本発明は、活性化マクロファージが仲介する病態を治療またはモニター／診断する方法に関する。本方法は、マクロファージが仲介する病態にある患者に、以下の一般式のコンジュゲートまたは複合体を含有する組成物の有効量を投与するステップを含む。Ａｂ‐Ｘ（式中、グループＡｂは、活性化マクロファージとの結合能をもつリガンドを含み、グループＸは、該コンジュゲートを該病態の治療に用いる場合、免疫原、細胞毒、もしくはマクロファージ機能を変化させる能力をもつ化合物を含み、また、該コンジュゲートを該病態のモニター／診断に用いる場合は、画像化剤を含む。）この方法は、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症、感染症、骨髄炎、アテローム性動脈硬化症、臓器移植拒絶反応、肺繊維症、サルコイドーシス、および全身性硬化症からなる群から選択される疾患に罹患している患者の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化マクロファージが仲介する病態の治療またはモニター／診断法であって、マクロファージが仲介する病態にある患者に、以下の一般式のコンジュゲートまたは複合体を含有する組成物の有効量を投与するステップを含むことを特徴とする方法。
Ａｂ‐Ｘ
（式中、グループＡｂは、活性化マクロファージとの結合能をもつリガンドを含み、グループＸは、前記コンジュゲートを前記病態の治療に用いる場合は、免疫原、細胞毒、もしくはマクロファージ機能を変化させる能力をもつ化合物を含み、また、前記コンジュゲートを前記病態のモニター／診断に用いる場合は、画像化剤を含む。）
【請求項２】
Ａｂが、葉酸受容体結合リガンドを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ａｂが、抗体または活性化マクロファージ結合抗体断片を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
グループＸが、免疫原を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
グループＸが、免疫原を含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項６】
グループＸが、細胞毒を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
グループＸが、さらにリポソームを含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
グループＸが、細胞毒を含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項９】
グループＸが、さらにリポソームを含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
グループＸが、画像化剤を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
グループＸが、さらにリポソームを含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
グループＸが、画像化剤を含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
グループＸが、さらにリポソームを含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記画像化剤が、金属キレート部分を含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記画像化剤が、さらに金属陽イオンを含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記金属陽イオンが、放射性核種であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記金属陽イオンが、核磁気共鳴画像診断用増強剤であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
グループＸが、活性化マクロファージ機能を変化させる能力をもつサイトカインを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記患者が、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症、皮膚感染症、骨髄炎、アテローム性動脈硬化症、臓器移植拒絶反応、肺繊維症、サルコイドーシス、全身性硬化症、および任意の慢性炎症からなる群から選択される病態にあることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性化マクロファージが仲介する病態の治療法およびモニター法に関する。特に、マクロファージが仲介する疾患を診断および／または治療するため、罹患している宿主に投与することを目的とし、活性化マクロファージと結合するリガンドを、画像化剤、または免疫原、細胞毒、もしくはマクロファージ機能を変化させる作用物質と複合体にする。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物の免疫系は、外来の病原体を認識して除去する手段を与える。免疫系は通常、外来の病原体に対する防衛線を与えるが、その一方で免疫応答そのものが疾患の進行に関与している場合も多い。宿主自身の免役応答により引き起こされたり悪化したりする疾患の代表例としては、多発性硬化症、紅斑性狼瘡、乾癬、肺繊維症、および関節リウマチなどの自己免疫疾患や、アテローム性硬化症、炎症性疾患、骨髄炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、および器官移植拒絶反応の原因となることが多い移植片対宿主病などの、免疫応答が病因に寄与している疾患がある。
【０００３】
マクロファージは、概して、外来の病原体に最初に出会う細胞であり、このため、免疫応答において重要な役割を果たしている。しかし、場合によっては、活性化マクロファージが疾患の病態生理に寄与することがある。活性化マクロファージは、異種病原体を非特異的に飲み込み、加水分解的かつ酸化的攻撃によって自身の内部で殺し、その結果病原体を分解してしまう。分解されたタンパク質のペプチドがマクロファージ細胞表面に提示されると、そこでＴ細胞に認識されることができ、Ｂ細胞表面の抗体と直接相互作用することができる。その結果、Ｔ細胞とＢ細胞が活性化し、さらに免疫応答が刺激される。
関節リウマチ（ＲＳ）は、滑膜の慢性的な炎症を特徴とする全身性疾患であり、通常、末梢関節に生じる。滑膜の炎症が軟骨の変形と骨の腐食を引き起こし、その結果、関節の整合性が壊れる。リウマトイド因子は、ＩｇＧのＦｃ部位に反応する自己抗体であり、ＲＡ患者の３分の２以上に見られる。このことは、ＲＡが自己免疫疾患としての側面をもつことを示すものである。
【０００４】
世界におけるＲＡの罹患率は人口の２％にもおよび、そのうち８０％の患者が３５歳から５０歳の間に発病している。ＲＡの臨床症状は、関節の疼痛、腫脹、および圧痛であり、その結果として動作の制限、脱力感、疲労、および体重の減少が起こる。ＲＡは、全身性疾患であるため、特にリウマトイド因子の力価が高い患者において関節外症状をきたす。関節外症状としては、リウマトイド結節（中心層に壊死性の物質、中間層にマクロファージ、外層に肉芽組織をもつ）、筋肉の萎縮、骨粗鬆症、肺繊維症、およびリウマチ性血管炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）などがあり、リウマチ性血管炎は、皮膚潰瘍、指の壊疽、または神経血管疾患を引き起こすことがある。
【０００５】
ＲＡの特徴であるリウマチ性滑膜炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ｓｙｎｏｖｉｔｉｓ）は、滑膜表層細胞数の増加、滑膜表層細胞の過形成（hyperplasia）と肥大（hypertrophy）、微細血管の損傷、浮腫のほか、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞等の細胞の浸潤を引き起こす。リウマチの滑膜の特徴は、ＩＬ‐２、ＩＦＮ‐δ、ＩＬ‐６、ＩＬ‐１０、ＧＭ‐ＣＳＦ、およびＴＧＦα、ＴＧＦβなどのＴリンパ球により分泌される因子、ならびにＩＬ‐ｌ、ＩＬ‐６、ＩＬ‐８、ＩＬ‐１０、ＧＭ‐ＣＳＦ、マクロファージＣＳＦ、およびＴＧＦβなどの活性化マクロファージにより分泌される因子のような、免疫細胞の分泌産物の存在である。このようなサイトカインの産生は、滑膜の炎症、滑膜細胞増殖、軟骨と硬骨の退行、およびＲＡの全身性症状等のＲＡの病理の多くの説明となる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＲＡは、理学療法、安静、および副木固定等の様々な治療法を用いて治療することが可能である。ＲＡの治療には、局所的な炎症を抑制するために、アスピリンや非ステロイド系抗炎症剤をはじめとする治療薬もまた用いられる。しかし、このような薬剤は、ＲＡの進行には最低限の効果しかなく、また有害な副作用を伴う。α‐ペニシラミンやスルファサラジンのような疾患修飾性抗リウマチ薬もＲＡの治療に用いられるが、このような薬剤は、効果が発揮されるまでに数週間あるいは数カ月を要し、かつ有害な副作用がある。患者によっては、免疫を抑制する薬や細胞毒性のある薬がＲＡの症状を抑制する場合もあるが、このような薬剤は毒性を伴う。グルココルチコイドを関節内に投与する方法も行われてきたが、一時的に鎮痛させるにすぎなかった。したがって、ＲＡをはじめとする、活性化マクロファージにより引き起こされたり悪化したりする疾患に、有効でかつ毒性の低い新しい治療法を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
葉酸受容体（ＦＲ）は、ビタミンの一種である葉酸に高親和力（＜１ｎＭ）で結合する３８ＫＤａのＧＰＩアンカー型タンパク質である。受容体に結合した後、葉酸は迅速なエンドサイトーシスにより細胞内に輸送され、ｐＨの低いエンドソームの区画で受容体から離れる。重要なことは、小さな分子、タンパク質、およびリポソームですら、葉酸と共有結合することで葉酸の葉酸受容体との結合能を変化することはないため、葉酸塩と薬剤とのコンジュゲートは、受容体が仲介するエンドサイトーシスによって容易に細胞内に進入するということである。
【０００８】
ほとんどの細胞が、必要な葉酸を得るために、関連性のない還元型葉酸塩キャリア（ＲＦＣ）を用いているため、葉酸受容体の発現は、数種類の細胞タイプ（cell-type）に限定される。腎臓と胎盤を除いては、正常組織は、低レベルまたは検出不可能レベルのＦＲしか発現しない。しかし、卵巣癌、乳癌、気管支癌、脳腫瘍を含む多くの悪性組織が、葉酸受容体を有意に高レベルで発現している。実際、全卵巣癌の９５％が葉酸受容体を過剰発現していると推定されている。近年になって報告されたことであるが、葉酸受容体の非上皮性アイソフォームであるＦＲβが、滑膜の活性化（休止期ではなく）マクロファージ上に発現している。そこで、発明者等は、マクロファージが仲介する病態を治療するため、活性化マクロファージの機能を変化させる可能性のある葉酸塩結合化合物を利用することを試みた。例えば、発明者らは、マクロファージを除去して関節の炎症を緩和するために、葉酸塩結合免疫原を用いて、関節炎を罹患する動物における宿主免疫反応を炎症部位の活性化マクロファージに向けさせることが可能であることを明らかにした。
【０００９】
シンチグラフィー用画像化剤は、磁気共鳴画像診断（ＭＲＩ）用造影剤よりもはるかに高感度であり、その選択性は、病変に特異的な細胞マーカーを標的とすることにより、さらに高めることができる。確かに、非特異的ＩｇＧ抗体、抗ＣＤ４抗体、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１４グリコリポペプチドリガンド、およびＥセレクチン結合ペプチドを用いて、放射性同位体９９ｍＴｃを関節炎罹患組織に輸送することが行われてきた。このような放射性画像化剤を用いた前臨床研究では、ｉｎ  ｖｉｖｏで関節炎組織を画像化することにはっきりと力点が置かれてきたが、現在入手できる画像化剤の選択性は未だ最適ではなく、また、現在用いられている化合物のなかに、活性化マクロファージのみを標的とするものはない。葉酸受容体の活性はマクロファージが活性化する間に現れることを考慮し、発明者らは、ｉｎ  ｖｉｖｏで関節炎病変を画像化するために、葉酸を標的とする９９ｍＴｃ画像化剤を用いることが可能かどうかを見極めることを試みた。
【００１０】
炎症部位において、薬剤が活性化マクロファージを選択的に標的とするよう、この高親和性を有するＦＲの発現を利用することが可能かどうかを判断するために、葉酸を９９ｍＴｃキレート剤に結合し、その分布を、アジュバントで関節炎を誘導したラットの正常組織および患部組織において評価した。ＥＣ２０と名付けたこの葉酸結合９９ｍＴｃキレート複合体は、罹患ラットの関節炎を起こしている四肢に集中するのが確かに認められたが、健常ラットの関節には認められなかった。過剰な競合葉酸の存在下では、患部組織のガンマシンチグラフィー画像の強度は、大幅に減少した。また、関節炎罹患動物の肝臓および脾臓も、ＥＣ２０の取り込みの増加を示し、ＦＲのレベルも上がった。このことから、アジュバント誘導関節炎には、全身的なマクロファージの活性化が伴うことが確認された。関節炎罹患動物からマクロファージを除去すると、組織のＦＲ量が減少し、それと付随してＥＣ２０の取り込みがなくなる。また、アジュバント誘導関節炎ラットから単離したクップファー細胞は、葉酸塩コンジュゲートとの結合能が、健常ラットのクップファー細胞より有意に高かった。このようにして、発明者等は、ＥＣ２０が関節リウマチなどの炎症性病変に対する活性化マクロファージの関与をアッセイするのに有用であることを明らかにした。
【００１１】
本発明は、活性化マクロファージが仲介する疾患を治療およびモニターする方法を目的とする。本発明の一つの実施態様によれば、宿主免疫応答を活性化マクロファージに向けさせること、または活性化マクロファージの機能を変化させること、または活性化マクロファージを直接殺すことにより、活性化マクロファージが仲介する病態を治療する。本発明の一つの実施態様では、活性化マクロファージの死を促進することを目的とし、宿主免疫応答を活性化マクロファージに向けさせるため、活性化マクロファージに特異的に結合するリガンドを、免疫原と結合させるか、マクロファージを直接殺すために、リガンドを細胞毒と結合させる。本発明のコンジュゲートに用いられるリガンドは、葉酸受容体のような活性化マクロファージ上に特異的に発現する受容体に結合するリガンドや、活性化マクロファージ上に特異的に発現する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のようなリガンドを含む。本発明のまた別の実施態様では、活性化マクロファージに特異的に結合するリガンドを、画像化剤と結合させる。このコンジュゲートを、活性化マクロファージが仲介する疾患の進行の診断およびモニターのため、患者に投与する。
【００１２】
一つの実施態様では、活性化マクロファージが仲介する疾患の治療またはモニター／診断方法が提供される。この方法は、マクロファージが仲介する病態にある患者に、一般式Ａｂ‐Ｘのコンジュゲートまたは複合体を含有する組成物の有効量を投与するステップを含む。この式中、グループＡｂは、活性化マクロファージへの結合能をもつリガンドを含み、コンジュゲートを病態の治療に用いる場合、グループＸは、免疫原、細胞毒、もしくはマクロファージ機能を変化させる能力をもつ化合物を含み、またコンジュゲートを病態のモニター／診断に用いる場合、Ｘは画像化剤を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明によれば、活性化マクロファージが仲介する病態の治療またはモニター／診断方法が提供される。活性化マクロファージが仲介することが知られている疾患の代表例としては、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、クローン病、乾癬、骨髄炎、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化症、肺繊維症、サルコイドーシス、全身性硬化症、臓器移植拒絶症（ＧＶＨＤ）、および慢性炎症が挙げられる。その病態にある患者に、まず、一般式Ａｂ‐Ｘ（式中、グループＡｂは、活性化マクロファージへの結合能をもつリガンドを含み、グループＸは、画像化剤を含む）のコンジュゲートを含有する組成物の有効量を投与し、次にこの画像化剤を検出することができる画像装置により患者をスキャンすることによって、このような病態をモニターすることができる。本発明によれば、マクロファージが仲介する病態を、上記式の組成物の有効量を投与することによって治療することができる。この場合、グループＡｂは、活性化マクロファージへの結合能をもつリガンドを含み、グループＸは、免疫原、細胞毒、もしくはマクロファージ機能を変化させる能力をもつサイトカインを含む。このようなマクロファージを標的とするコンジュゲートは、活性化マクロファージが仲介する病態にある患者に投与されると、結合している細胞毒、免疫原、またはサイトカインが集中的に活性化マクロファージの集団と結びつくように作用し、活性化マクロファージを殺したり、マクロファージ機能を変化させたりする。活性化マクロファージ集団を除去または不活性化することは、治療中の病態に特徴的な、活性化マクロファージが仲介する疾患の発生を阻止または抑制する効果がある。このコンジュゲートは通常、そのコンジュゲートと薬学的に許容されるその担体とを含む組成物として非経口投与される。コンジュゲートの投与は、通常、当該疾患の症状が緩和または除去されるまで続けられる。
【００１４】
本発明の一つの実施態様では、コンジュゲートＡｂ‐Ｘ（式中、Ａｂは活性化マクロファージへの結合能を有するリガンドを含み、Ｘは画像化剤を含む）を投与し、かつその後画像化剤の局所的集中を検出することができる画像装置を用いて患者をスキャンすることによって、患者の体内で、活性化マクロファージが仲介する病態をモニターまたは診断する。この画像用または診断用コンジュゲートは、上記で説明した治療用コンジュゲートと同様のもので、通常、コンジュゲートと薬学的に許容されるその担体とを含む治療用組成物として投与される。この組成物は、通常、非経口投与用として調剤され、活性化マクロファージ集団が存在する場所を画像化することが可能な有効量を患者に投与される。このコンジュゲートの画像化剤成分の性質は、画像診断法で記述される。したがって、この画像化剤は、例えば、キレート部分と金属陽イオン、例えば、ガドリニウム等の放射性核種または核磁気共鳴画像診断用造影剤、を含みうる。通常、活性化マクロファージを標的とするこの画像化剤を患者に投与し、画像化剤が活性化マクロファージ集団の中に輸送されて集中するよう一定の時間を置いた後、患者を画像診断する。このようにして標的化画像化剤による画像診断が可能となる。
【００１５】
本発明の方法は、ヒト臨床医学と獣医学のいずれにも応用することが可能である。すなわち、活性化マクロファージが仲介する病態にある宿主動物は、ヒトであってもよいし、または獣医学に応用する場合は、実験動物、農業用動物、家畜、野生動物のいずれであってもよい。本発明の方法によって投与されるコンジュゲートは、活性化マクロファージが仲介する病態にある動物またはヒトの患者に対し、例えば、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、または静脈内投与のように、非経口投与されることが好ましい。あるいは、このコンジュゲートは、その他の医学的に有用な方法で動物またはヒトの患者に投与されることができ、標準的投与形態でも、緩徐ポンプ（ｓｌｏｗ  ｐｕｍｐ）のような徐放性投与形態でも、有効量を投与することが可能である。本発明の治療法は、単独で実施してもよいし、またはマクロファージが仲介する病態の治療に認められている他の治療法と組み合わせて実施してもよい。
【００１６】
本発明による一般式Ａｂ‐Ｘのリガンドコンジュゲートにおいて、グループＡｂは、活性化マクロファージへの結合能を有するリガンドである。数多くのマクロファージ結合成分があるが、そのいかなるものでも使用することができる。許容されるリガンドの例としては、特に、葉酸受容体結合リガンドや、活性化マクロファージ内／上にのみ、あるいは他より高いレベルで発現したり提示されたりしている表面成分を認識し、かつこれに特異的に結合する能力を有する抗体および抗体断片が挙げられる。一つの実施態様では、活性化マクロファージ結合リガンドは、葉酸、葉酸類似体、またはその他の葉酸受容体結合分子である。活性化マクロファージは、葉酸および葉酸誘導化合物をナノモルレベル以下（すなわち、＜１ｎＭ）の親和性で結合する３８ＬＤのＧＰＩアンカー型葉酸受容体を発現している。また別の実施態様では、活性化マクロファージ結合リガンドは、特異的なモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、または活性化マクロファージに対する特異的結合能を有する抗体のＦａｂあるいはｓｃＦｖ（すなわち、単鎖可変領域）断片である。
【００１７】
本発明によれば、活性化マクロファージが仲介する病態を診断およびモニターするために用いられる活性化マクロファージ標的コンジュゲートは、患者の活性化マクロファージ集団がある部位を標的とし、ここに画像化剤を集中させるよう調製される。このような一般式Ａｂ‐Ｘのコンジュゲートにおいて、グループＡｂは、活性化マクロファージとの結合能を有するリガンドであり、グループＸは画像化剤を含む。一つの実施態様では、この画像化剤はキレート剤および金属陽イオンを含むが、通常は、ガドリニウム等の、放射性核種または核磁気共鳴画像診断用の増強剤や造影剤のいずれかである。グループＡｂが、葉酸、葉酸類似体、または別の葉酸受容体結合リガンドであるこのようなコンジュゲートは、米国特許第５，６８８，４８８号に詳細に説明されている。この文献の明細書を本出願に援用する。上記のほか、関連する米国特許第５，４１６，０１６号および同５，１０８，９２１号にも、本発明に従い有用なキレートコンジュゲートを調製する方法と実施例が記載されている。これらの文献をそれぞれ本出願に援用する。本発明のマクロファージを標的とする画像化剤は、先に挙げた特許文献の中に記載されている下記の一般的なプロトコールに従って調製し、使用することができる。しかし、葉酸を標的とするコンジュゲートは、結合した画像化成分を活性化マクロファージ集団内にめがけて集中させるために用いることができるという発見に、本発明の診断法は部分的に基づいている。この活性化マクロファージ集団自体が、患部に活性化マクロファージが集中していることを特徴とする病態のモニターおよび診断を可能にするのである。
【００１８】
本発明の一つの実施態様によれば、活性化マクロファージが仲介する病態を、そのような病態にある患者に一般式Ａｂ‐Ｘのコンジュゲートを含有する組成物の有効量を投与することによって治療する方法が提供される。この式中、Ａｂは上記で定義した通りであり、グループＸは細胞毒、免疫原、もしくはマクロファージ機能を変化させる能力を有する化合物を含む。本方法により使用するコンジュゲートを調製するのに有用である細胞毒成分の代表例としては、クロドロネート、炭疽、シュードモナス外毒素（これら３種の細胞毒成分は、正常な細胞と結合しないように改変するのが普通）、およびその他の毒素または細胞障害性薬物が挙げられる。このような毒素または細胞障害性薬物には、当業者に公知の化学療法剤が含まれるが、それは例えば、アドレノコルチコイド、アルキル化剤、抗アンドロゲン、抗エストロゲン、アンドロゲン、エストロゲン、代謝拮抗物質（シトシンアラビノシド、プリン類似体、ピリミジン類似体、およびメトトレキサート等）、ブスルファン、カルボプラチン、クロラムブシル、プラチナ化合物（シスプラチン等）、タモキシフェン、タキソール、シクロフォスファミド、植物アルカロイド、プレドニゾン、ヒドロキシウレア、テニポシド、ブレオマイシン、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、ビンクリスチン、ビンブラスチン、抗炎症剤および炎症誘発剤等である。このような毒素または細胞障害性成分は、例えば、葉酸またはその他の葉酸受容体結合リガンドのような活性化マクロファージ結合成分と直接結合させることもできるし、または、リポソームの中に調剤することもできる。このリポソーム自体が、通常、構成成分のリン脂質にマクロファージ結合成分を共有結合したコンジュゲートとして、標的に向かう。同じように、グループＸがマクロファージ機能を変化させることができる化合物（例えば、ＩＬ‐１０またはＩＬ‐１１のようなサイトカイン）を含む場合、このサイトカインは、標的指向型成分Ａｂ（例えば、葉酸受容体結合リガンド、抗体または抗体断片）と直接共有結合させることができる。あるいは、マクロファージ機能を変化させるサイトカインをリポソーム内に被包することができる。このリポソーム自体が、一つまたは複数のリン脂質リポソーム構成成分に共有結合する懸垂マクロファージ標的化成分Ａｂ  によって、活性化マクロファージを標的にする。
【００１９】
また別の実施態様では、リガンドと免疫原とのコンジュゲートを細胞障害性化合物と組み合わせて投与することができる。上記のパラグラフで列挙した化合物は、この目的のために適切なものの中に含まれている。
【００２０】
本発明のさらにもう一つの治療方法の実施態様では、活性化マクロファージを標的とするコンジュゲートＡｂ‐ＸのグループＸが、免疫原を含む。このリガンド‐免疫原コンジュゲートは、内因性免疫応答または抗体の共投与により、当該疾患を罹患する患者においてその病因となっている活性化マクロファージ集団を特異的に除去することを目的として、そのマクロファージ集団に「標識」を付けるのに効果的である。本発明による治療法においてリガンド−免疫原コンジュゲートを使用することによって、免疫応答を介する活性化マクロファージ集団の除去を促進することができる。これは、内因性免疫応答を介するか、または共投与された抗体による受動的免疫応答を利用することで達成できる。内因性免疫応答は、液性免疫応答、細胞性免疫応答、および宿主動物に内在する他のどのような免疫応答であってもよい。その例としては、補体が仲介する細胞溶解、抗体依存性細胞媒介性障害作用（ＡＤＣＣ）、食作用をもたらす抗体オプソニン作用、アポトーシス、増殖抑制、または分化のシグナル伝達をもたらす抗体結合の際の受容体のクラスター形成、および輸送された抗原／ハプテンを免疫細胞が直接認識すること等がある。また、内因性免疫応答が、免疫細胞の増殖や遊走などのプロセスを調節するサイトカインの分泌を利用しているということも考慮する。内因性免疫応答には、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞や細胞障害性Ｔ細胞のようなＴ細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、好中球、ＬＡＫ細胞等の免疫細胞タイプの関与が含まれてもよい。
【００２１】
また別の実施態様では、免疫細胞によって認識させるために、マクロファージに、リガンド‐免疫原コンジュゲートを取り込ませ、その免疫原を分解させ、分解された免疫原を提示させることにより、分解された免疫源を提示しているマクロファージに対して向けられる免疫応答を引き出すことが可能である。
【００２２】
液性応答は、通常のスケジュールによるワクチン接種や、天然の抗原、人工の抗原、もしくは新たな免疫を誘導する人工の抗原に結合させたフルオレセインイソシアネート（ＦＩＴＣ）等のハプテンによる能動免疫化などのプロセスにより誘導される反応であってよい。能動免疫化には、新たな免疫を誘導するため、通常のワクチン接種計画以外に予定された、人工免疫原やハプテンの複数回の接種が必要である。液性応答はまた、宿主動物が、α‐ガラクトシル基に対する免疫等の、元々天然に存在する免疫を有するような先天性免疫に起因するものであってもよい。あるいは、宿主動物に、血清から収集した天然の抗体またはモノクローナル抗体等の抗体を投与することによって、受動免疫を確立してもよい。そのモノクローナル抗体は、ヒト化抗体をはじめとする遺伝子工学により作製された抗体であるか否かに関わらない。受動免疫を生じさせるため、一定量の抗体試薬を利用すること、および受動的に投与する抗体が当該免疫原に対して働くようなリガンド‐免疫原コンジュゲートを使用することは、他の潜在的免疫原に対する患者の既存の抗体価が治療上有用でない場合に、標準的な１組の試薬を使用できるというメリットをもたらすだろう。受動的に投与する抗体は、リガンド‐免疫原コンジュゲートと「共投与」してもよい。「共投与」とは、抗体を、リガンド‐免疫原コンジュゲートの前、これと同時、またはこの後に投与することであると定義する。既存の抗体、誘導された抗体、または受動的に投与された抗体は、リガンド‐免疫原コンジュゲートの活性化マクロファージ細胞集団との優先的な結合によって、活性化マクロファージを新たに標的とし、このような病原性細胞は、補体が仲介する細胞溶解、ＡＤＣＣ、抗体依存性食作用、または受容体の抗体クラスター形成等によって死ぬと考えられる。細胞障害のプロセスにはまた、上記以外の種類の免疫、例えば細胞性免疫や二次応答等の免疫反応を伴ってもよい。二次応答とは、引き付けられた抗原提示細胞が、活性化マクロファージを貪食し、このような細胞の抗原を免疫系に提示して、このような抗原を提示する他の活性化マクロファージを除去するときに起こる反応である。
【００２３】
本発明の治療法に用いるコンジュゲートを調製するのに許容される免疫原は、宿主動物において抗体産生誘導能を有する免疫原か、宿主動物において以前抗体の産生を誘導したことがあり、その結果既存の免疫をつくる免疫原か、あるいは、先天性免疫系の一部を成す免疫原である。あるいは、その免疫原に対する抗体を、受動免疫を確立するために、宿主動物に投与してもよい。本発明において用いる適切な免疫原としては、ポリオウイルス、破傷風、チフス、風疹、麻疹、流行性耳下腺炎、百日咳、結核、インフルエンザ等の抗原、およびα‐ガラクトシル基等に対し、ワクチン接種を通常のスケジュールにより行ったか、あるいは以前自然に曝露されたために生じた既存の免疫の抗原または抗原ペプチドがある。そのような場合、宿主動物において以前に獲得された液性免疫または細胞性免疫を活性化マクロファージ集団に対して新たに標的とすることによりこのような細胞を除去するために、リガンド‐免疫原コンジュゲートを使用する。そのほかの適切な免疫原には、人工の抗原や例えばフルオレセインイソシアネート（ＦＩＴＣ）やジニトロフェニル等のハプテンに対する免疫化によって宿主動物が新しい免疫を獲得している抗原または抗原ペプチドがある。さらに、スーパー抗原やムラミルジペプチドのような、先天性免疫が存在する場合の抗原もある。また、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドをリガンドに結合したものを用いて、細胞性免疫をマクロファージに対して新たに生じさせ、Ｔ細胞がマクロファージを殺すよう誘導することが可能であるとも考えられる。
【００２４】
本発明に従い使用するためのコンジュゲートを調製する際、マクロファージ結合リガンドと、免疫原、細胞毒性薬剤、サイトカイン、または画像化剤（場合によりこれらのいずれでもよい）とは、当業者に公知の複合体形成法であればいかなるやり方で結合してもよい。その結合には、リガンドと免疫原との共有結合、イオン結合、または水素結合などがあり、直接結合してもよく、二価リンカーのような結合基によって、間接的に結合してもよい。コンジュゲートは、通常、複合体のそれぞれの構成要素上の酸、アルデヒド、ヒドロキシ、アミノ、またはヒドラゾの基の間でアミド結合、エステル結合またはイミノ結合の形成を介してリガンドが標的成分に共有結合することにより形成される。あるいは、先に説明したように、リガンド複合体はリポソームを含むものであってもよい。これは、標的成分（すなわち、画像化剤、または免疫原、細胞毒性物質もしくはマクロファージ機能を変化させる物質）を内包したリポソーム自体を、共有結合により活性化マクロファージ結合リガンドに結合するものである。
【００２５】
本発明の一つの実施態様では、リガンドは葉酸、葉酸類似体、または他の任意の葉酸受容体結合分子であり、この葉酸リガンドは、トリフルオロ酢酸無水物を用い、プテロイル・アジド（ｐｔｅｒｏｙｌ  ａｚｉｄｅ）の中間体を介して葉酸のγ−エステルを調製する方法で標的成分に結合させる。この方法によって、葉酸のグルタミン酸基のγ−カルボキシ基を介してのみ標的成分に結合する葉酸塩リガンドを合成する。あるいは、葉酸類似体を、グルタミン酸基のα‐カルボキシ部分か、もしくはα‐カルボン酸基とγ‐カルボン酸基部分の両方を介して結合してもよい。
【００２６】
本発明に従い使用する、式Ａｂ‐Ｘのコンジュゲートは、一つの実施態様として、そのコンジュゲートの有効量と薬学的に許容されるその担体とを含む治療用ならびに診断用組成物を調製するために用いられる。そのような組成物は、通常、非経口投与用に調整される。本発明により使用するためのコンジュゲートの有効量は、治療または診断される疾患の性質、コンジュゲートの分子量、コンジュゲートの投与経路、コンジュゲートの組織分布、および他の治療薬や診断薬と併用する可能性などのさまざまなパラメーターに左右される。患者に投与する有効量は、通常、体表面積、患者の体重、および医師による患者の状態の診断に基づく。有効量の範囲は、約１ｎｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇの間であると考えられるが、より典型的な範囲は約１μｇ／ｋｇから約５００μｇ／ｋｇの間であり、最も典型的な範囲は約１μｇ／ｋｇから約１００μｇ／ｋｇの間である。
【００２７】
画像処理をモニターまたは診断目的で行う場合、通常、活性化マクロファージを標的とする画像化剤の投与後約１時間から６時間の間に行う。
【００２８】
リガンドコンジュゲートを投与するために効果的であれば、どのような投与計画を用いてもよい。例えば、単回投与でもよいし、分割投与にして毎日複数回投与してもよい。また、変則的な投与法として、例えば、毎日投与する代わりに、週１〜３日投与してもよい。本発明の目的にかんがみ、このような間欠的あるいは変則的投与法も毎日投与と同等であり、本発明の範囲内と考えられる。本発明の一つの実施態様では、病原性活性化マクロファージ集団を除去するため、患者にリガンドコンジュゲートを複数回注射する。この場合、標的成分は免疫原または細胞毒性物質である。一つの実施態様において、例えば、患者にリガンドコンジュゲートを複数回投与して治療する場合、例えば１２〜７２時間または４８〜７２時間の間隔をあけて注射する。リガンドコンジュゲートの初回投与後、数日または数カ月の間隔をあけて、追加投与することができる。追加投与により、疾患の再発が防止される。あるいは、活性化マクロファージが仲介する病態を発生しやすいとわかっている患者において疾患の発生防止のため、予防的にリガンドコンジュゲートを投与してもよい。本発明の一つの実施態様では、リガンドコンジュゲートを２種類以上使用してもよい。例えば、フルオレセインイソシアネートおよびジニトロフェニルの両方で予め免疫付与し、次に共投与プロトコールで、同一であるかまたは異なる活性化マクロファージ標的リガンドに結合しているフルオレセインイソシアネートおよびジニトロフェニルで処置してもよい。
【００２９】
本発明に従って投与するリガンドコンジュゲートは、非経口で、最も普通には、腹腔内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、髄腔内注射によって投与される。浸透圧ポンプを用いてリガンドコンジュゲートを患者に輸送することもできる。非経口剤形の例としては、コンジュゲートの水溶液があり、それは例えば等張食塩水溶液、５％グルコースや、アルコール、グリコール、エステル、アミドなどの周知の薬学的に許容される液体キャリアである。本発明に従い使用する非経口組成物は、リガンドコンジュゲートを１種類以上含む再構成可能な凍結乾燥物であってもよい。本発明のまた別の実施態様では、リガンドコンジュゲートを、当業者に知られたいくつかの徐放製剤のうち、任意の形態で調剤することができる。その例としては、米国特許第４，７１３，２４９号、同第５，２６６，３３３号、および同第５，４１７，９８２号に記載の生物分解性炭水化物基質があげられる。これら明細書の開示内容を、本出願に援用する。
【００３０】
［実施例１］
材料
ＥＣ２０（葉酸結合キレート剤９９ｍＴｃ）、ＥＣ２８（葉酸を含まない点を除けばＥＣ２０と同じ９９ｍＴｃキレート複合体）、および葉酸‐フルオレセインイソシアネート（葉酸‐ＦＩＴＣ）は、エンドサイト社（ウエスト・ラファイエット、インディアナ州）より分与された。加熱滅菌したマイコプラズマ・ビュテリカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｕｔｅｒｉｃｕｍ）  は、ＢＤバイオサイエンシーズ社（スパークス、メリーランド州）より購入した。葉酸、軽鉱油、クロドロネート、コラゲナーゼ‐Ａ、およびストレプトアビジン‐Ｒ‐フィコエリトリンはシグマ・ケミカル社（セントルイス、ミズーリ州）より、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）はギブコＢＲＬ社（ゲチスバーグ、メリーランド州）より入手した。３Ｈ−葉酸は、アメリカン・ラジオラベルド・ケミカルズ社（セントルイス、ミズーリ州）より入手した。Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）‐３０メンブレンは、ミリポア社（ベッドフォード、マサチューセッツ州）より購入した。ＲＫ‐４‐ビオチン抗体はベイケム・バイオサイエンシーズ社（フィラデルフィア、ペンシルバニア州）より、ＥＤ２‐Ｒ‐フィコエリトリン抗体はアキュレート・ケミカル・アンド・サイエンティフィック社（ウエストベリー、ニューヨーク州）より購入した。
【００３１】
［実施例２］
関節炎の動物モデル
体重１５０〜２００ｇの雌Ｌｅｗｉｓラット（チャールズ・リバー研究所、ワシントン、マサチューセッツ州）を用い、各投与群４匹で、関節炎を誘導した。簡潔に述べると、鉱油に懸濁した加熱滅菌済みマイコプラズマ・ビュテリカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｕｔｅｒｉｃｕｍ  ）０．５ｍｇ（５ｍｇ／ｍｌ）を、ケタミンおよびキシラジンで麻酔後、当日（０日目）ラットの左後肢に注射した。動物は、疾患を２１日間進行するにまかせたが、その健康状態を確認するため、毎日体重を測定した。注射した足に著明な腫脹がみられ、また注射していない足にも全身にわたる関節炎の進行に起因する進行性腫脹がみられたことと、患部四肢のＸ線解析から、処置した動物はすべて関節炎を発症したことが証明された。ラットはすべて、血清中の葉酸レベルを生理的に適切な濃度に下げるため、３週間葉酸欠乏食（ダイエーツ社、ベツレヘム、ペンシルバニア州）で飼育した後、葉酸塩‐ＦＩＴＣを投与した。対照ラットも葉酸欠乏食で飼育したが、関節炎発症の誘導は行わなかった。
【００３２】
［実施例３］
内因性マクロファージの除去
リポソーム化したクロドロネートで内因性マクロファージを殺すことにより、マクロファージとは無関係の葉酸結合画像化剤の取り込みを評価した。等張クロドロネート液（２５０ｍｇ／ｍｌ）を用いて、卵のリン酸コリン（６０ｍｏｌｅ％）とコレステロール（４０ｍｏｌｅ％）の薄膜を再水和することによってリポソームを形成した。次に、このリポソームを、１０ｍｌのｔｈｅｒｍｏｂａｒｒｅｌ  ｅｘｔｒｕｄｅｒ（リペックス・バイオメンブレンズ社、バンクーバー、カナダ）を用いて、１００ｎｍのポリカーボネート・メンブレンに１０回通過させて押し出すことにより、小さな１枚膜リポソームを作成した。封入されなかったクロドロネートを、分子量３００，０００のカットオフをもつＳｐｅｃｔｒａｐｏｒ酢酸セルロース膜（スペクトラム研究所、ランチョ・ドミンゲス、カリフォルニア州）を用いた透析により除去し、保持されているリポソームのクロドロネート濃度を、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ  誌１９８６年３巻２号、１０９〜１１４頁の記述に従って決定した。関節炎誘導から１７日目にあたる画像化剤投与の３日前に、マクロファージ除去用のラットに、クロドロネート２０ｍｇを含むクロドロネートリポソームを単回注射として腹腔内投与した。
【００３３】
［実施例４］
シンチグラフィーと体内分布解析
画像化剤投与の１２時間前に、動物はすべて、結合しなかった画像化剤が適切に排出されるよう生理食塩水５ｍｌを皮下注射された。関節炎誘導後２１日目に、ラット（各群３匹）はＥＣ２０（葉酸＋キレート剤）、ＥＣ２＋５００倍モル過剰葉酸、またはＥＣ２８（葉酸成分を含まない）のいずれかを腹腔内投与し、投与後４時間経過時点で、核シンチグラフィーによる画像化または体内分布解析のいずれかを行った。
【００３４】
シンチグラフィーを行うため、ラットをケタミンとキラシンで麻酔し、画像取り込み面に腹臥位で保定した。画像取得は、Ｔｅｃｈｎｉｃａｒｅ  Ｏｍｅｇａ  ５００  Ｓｉｇｍａ  ４１０  Ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅ  Ｇａｍｍａ  Ｃａｍｅｒａを用いて、毎分５０〜７５，０００カウントのカウント速度で行った。全身像を取得した後、上部胴体（後膝関節から上部）の放射線を１／８インチの鉛板でブロックし、後肢の画像を取得した。データはすべて、Ｍｅｄａｓｙｓ（商標）Ｐｉｎｎａｃｌｅソフトウェア搭載のＭｅｄａｓｙｓ（商標）ＭＳ−ＤＯＳベースのコンピューターにより解析した。
【００３５】
体内分布解析を行うため、ラットを、ネンブタール、すなわちペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射により麻酔した。次に、肝臓、脾臓、心臓、肺、腸、および腎臓を採取し、各組織の放射線を、ガンマカウンター（パッカード・バイオサイエンス社、メリディアン、コネチカット州）で計測して求めた。
【００３６】
［実施例５］
組織の葉酸受容体レベルのアッセイ
各組織の葉酸受容体レベルを次のようにして測定した。簡潔に述べると、組織をホモゲナイズし、細胞膜を遠心分離により単離した。膜タンパク質を一晩かけて可溶化し、濾過装置Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）−３０に移し、さらに５０ｎＭの３Ｈ−葉酸とともにインキュベートした。非特異的結合を測定するのに用いた各試料の複製（duplicate）も３Ｈ−葉酸５０ｎＭに曝露させたが、ただし１０００倍過剰の非標識葉酸の存在下で行った。結合しなかった３Ｈ−葉酸を細胞膜全体から洗い落とし、結合した３Ｈ−葉酸を含む膜タンパク質を回収しシンチレーションカウンタ（パッカード・バイオサイエンス社）で計測して、組織１グラムあたりの活性葉酸受容体数を求めた。
【００３７】
［実施例６］
肝臓における葉酸受容体を発現している細胞タイプの同定
関節炎ラットおよび健常ラットをまずケタミンとキラシンで麻酔し、次に正中線に沿って下腹部から胸腔へ切開した。２４Ｇカテーテルを肝静脈に、また２４Ｇ針を心臓の左心室にそれぞれ挿入し、灌流の流出口とした。次にラットに生理食塩水を注入して灌流した後、さらにカテーテルを通して０．０５％コラゲナーゼＡ含有ゲイ平衡塩類溶液で灌流した。各溶液は、２０ｍｌ／分で２分間灌流させた。灌流後直ちに、肝臓を摘出してその膜状外部組織を切断した。残りのゲル状組織は、０．０２５％コラゲナーゼＡ含有ＤＭＥＭで懸濁し、１μＭの葉酸−ＦＩＴＣ、または１μＭの葉酸−ＦＩＴＣ＋１ｍＭの葉酸の存在下で、３７℃で２時間インキュベートした。それから、結合しなかった葉酸−ＦＩＴＣを除去するため細胞を３回洗浄し、直ちにフローサイトメトリーのため調製した。
【００３８】
［実施例７］
フローサイトメトリー試料の調製と解析
葉酸−ＦＩＴＣに曝露した肝細胞試料を、塩化アンモニウム溶解緩衝液（１５０ｍＭ  ＮＨ４Ｃ１、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ３、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）で、１０分間４℃で処理し、赤血球を溶解させた。リン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄した後、残りの細胞をＥＤ２  Ｒ−フィコエリトリン標識マウス抗ラットマクロファージ抗体またはＲＫ-４ビオチン標識マウス抗ラット顆粒細胞抗体のいずれかとともにインキュベートした。細胞を再び２回洗浄した後、ビオチン化一次抗体が結合した細胞のみを、ストレプトアビジンＲ−フィコエリトリンとともにさらに３０分間インキュベートした。細胞を最後に２回洗浄した後、ＦＡＣＳｃａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＸＬ  フローサイトメーターで、ＦＩＴＣとフィコエリトリンとの二重染色について調べた。
【００３９】
［実施例８］
免疫療法を介するアジュバント関節炎に対する防御
実施例２に記述した関節炎誘発に関するプロトコールが用いられた。ラットのアジュバント誘導関節炎に対する葉酸‐ＦＩＴＣコンジュゲート（葉酸‐フルオレセインイソシアネートコンジュゲート）の効果を調べた。実験に用いた各ラットを、尾根部で、ＦＩＴＣ−ＫＬＨ（１５０μｇ）を用いて免疫し、マイコプラズマ・ビュテリカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｕｔｅｒｉｃｕｍ）（アジュバント）の投与により関節炎を誘発する３８日前および１０日前に、ＦＩＴＣに対する抗体を誘導した。ＦＩＴＣ−ＫＬＨの免疫は、アジュバント（すなわち、ＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄ  （１５０μｇ）、Ａｌｕｍ（１５０μｇ）、または  ＧＰＩ‐１００（１５０μｇ）など。これらはいずれも、関節炎誘発用アジュバントとは異なり、ＦＩＴＣに対する抗体を誘導するアジュバントである。）と一緒に行った。次に、第０日目に、免疫した動物の左足の肉球（footpad）に加熱殺菌したマイコプラズマ・ビュティリカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）（アジュバント）０．５ｍｇを注射して関節炎を発症させた。さらに、後アジュバント（マイコプラズマ・ビュティリカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ））注射後第１、２、３、９、１１、１４日目に、ラットに生理食塩水（対照ラット）または葉酸‐ＦＩＴＣ（ＦＦ）２０００ｎｍｏｌｅｓ／ｋｇを腹腔内に注入した。毎日、カリパスを用いて左右の足の寸法を測定した。図９は、アジュバントを注射した足（上２本の折れ線）と処置しなかった足（下２本の折れ線）の両方の測定値をグラフにしたものである。アジュバントを投与した足の腫脹が突然増大しているのは、葉酸受容体をもたない好中球の流入によるものである。したがって、この段階では、免疫療法は足の腫脹に効果がないということになる。ところが、１０日目あたりから、注射した足にもしない足にも活性化マクロファージが浸潤し、骨の分解とさらなる炎症が引き起こされている。この活性化マクロファージは機能的葉酸受容体をもち、葉酸‐ＦＩＴＣのような葉酸‐ハプテンコンジュゲートを結合することにより、除去されたかもしくは数が減少したことが明らかである。
【００４０】
［実施例９］
関節炎ラットの葉酸を標的とする画像化
実施例２および４に記述したプロトコールが用いられた。先に述べた通り、休止期ではなく活性化しているマクロファージは、ビタミンの一種である葉酸に対する受容体を発現している。関節炎の炎症部位が９９ｍＴｃの標的となるように、葉酸を利用することが可能であるかどうか判断するために、９９ｍＴｃの葉酸結合キレート剤（図８参照）であるＥＣ２０をラット（各群５匹）に腹腔内投与し、ガンマカメラでシンチグラフィー画像を取得した。ＥＣ２０はクリアランスが速いため、投与後少なくとも４時間で良好なコントラストが得られた（図１）。重要なことに、関節炎ラットのほうが、健常ラットよりも全身への取り込みが有意に増加し、この取り込みは飽和量の遊離葉酸とともにＥＣ２０を投与すると大幅に減少した。このことから、あらゆる組織による取り込みが、主に葉酸特異的受容体によって決定されることが示唆される。
【００４１】
ＥＣ２０の器官への激しい取り込みのため、関節炎ラットの全身像における肢の画像化ができなかった。しかし、体の中央部および上部の放射線をブロックすると、後肢の画像は容易に取得することが可能であった。このような遮蔽を行うと、関節炎に罹患した肢のほうが健常な肢よりＥＣ２０を多く取り込むのが認められ、この取り込みは、過剰な葉酸の存在下で完全に除去された（図１）。さらに、関節炎に罹患した動物の左後肢（ここの炎症が最も重篤）で、炎症がそれより軽度の右後肢より多くの取り込みが認められた（図１）。
全身像より、関節炎に罹患している動物において、ＥＣ２０取り込みのほとんどを担うのは腹部臓器であると結論することができた。この評価を確認するため、肝臓、脾臓、腎臓を摘出し個別に画像化した（図２）。ＥＣ２０の取り込みは、関節炎ラットの肝臓が最も高く、健常ラットの肝臓が最も低かった。脾臓に関しては、関節炎ラットのみ画像化できた。肝臓と脾臓では、遊離葉酸によりＥＣ２０取り込みが完全に阻害されたが、腎臓による取り込みは、遊離ビタミンにより部分的に減少したにすぎなかった。
【００４２】
［実施例１０］
マクロファージ除去の効果
実施例２、３、および４に記述したプロトコールを用いた。ただし、ＥＣ２０の投与量は０．２５ｍＣｉとした。マクロファージがＥＣ２０の取り込みを担っているかどうかを判断するため、クロドロネートのリポソーム製剤を用いて、常在型マクロファージを関節炎ラットの全身から除去した（各群３匹）。足の大きさを評価したところ、クロドロネート投与後４日目までには、クロドロネートを投与したラットが、投与しないラットと比べて炎症が有意に軽いことが明らかになった（データは示さず）。次に、マクロファージの除去が、葉酸結合画像化剤の取り込みに影響を与えるかどうかを判断するため、クロドロネート処置ラットのＥＣ２０体内分布解析を行い、クロドロネート処置をしていない健常ラットならびに関節炎ラットのＥＣ２０体内分布解析と比較した。図３（黒の棒は関節炎ラット、明るい灰色は健常ラット、暗い灰色は、クロドロネート処置によりマクロファージを除去された関節炎ラットをそれぞれ示す。）に示すように、関節炎ラットでは、マクロファージを除去されたことで、ＥＣ２０の肝臓への取り込みがほぼ２０分の１に減少した。一方、脾臓と腸における貯留は３分の１に減少した。ほとんどの組織において、クロドロネート処置により、ＥＣ２０の取り込みが健常ラットの取り込みレベルよりも低くなった。このことによって、活性化マクロファージが、正常組織におけるＥＣ２０貯留の大部分の原因となっているという仮説が確認された。これに対し、腎臓へのＥＣ２０取り込みは、マクロファージを除去されたラットにおいて増加した。これは、活性化マクロファージによってＥＣ２０のインターナリゼーションが減退し、腎臓の葉酸受容体と結合するためにより多くのＥＣ２０が利用可能になったためである可能性が高い。
【００４３】
［実施例１１］
関節炎組織における、葉酸受容体を介するＥＣ２０の取り込み
実施例２および４に記述したプロトコールを用いた。関節炎ラットの組織によるＥＣ２０取り込みは葉酸受容体が仲介することを確認するため、生体分布の研究をさらに２回行った（各群３匹）。まず、５００倍過剰の遊離葉酸の存在下（明るい灰色の棒）および非存在下（黒の棒）でＥＣ２０の生体分布を調べた。図４に示す通り、腎臓を除くすべての組織でＥＣ２０取り込みのほぼ完全な除去が認められた。これは、結合が確かに葉酸受容体により仲介されていることを示すものである。事実、過剰葉酸が、肝臓、脾臓、心臓、肺、腸、および血液におけるＥＣ２０貯留をほぼバックグラウンドレベルにまで競合的に減少させた（図４）。次に、ＥＣ２０が仲介する、キレート化９９ｍＴｃの標的化における葉酸の役割を確認するため、葉酸成分を欠く同様の複合体（ＥＣ２８）についても生体分布を調べた（暗い灰色の棒）。ＥＣ２０とともに図４に示した通り、腎臓を除いていずれの組織においてもＥＣ２８の取り込みはごくわずかであった。腎臓では、競合的な葉酸の存在で、非標的複合体の貯留がＥＣ２０と同様であった。
【００４４】
［実施例１２］
関節炎ラットの様々な組織における葉酸受容体の発現
実施例２、４、および５に記載したプロトコールを用いた。上記の結果により、葉酸受容体が組織へのＥＣ２０取り込みを担っていることが示唆されるので、このことを確認するため、発明者はラットの様々な組織における葉酸結合タンパク質を直接定量化することを試みた。調べた主要な器官のそれぞれにおいて、活性葉酸受容体が検出され、関節炎ラットにおいてＦＲレベルが有意に増加していた（図５。黒の棒は関節炎ラット、明るい灰色の棒は健常ラットを示す）。また、ＦＲ量は、生体分布研究においてみられたＥＣ２０取り込みと良好な相関を示した。実際、ＦＲアッセイにより、関節炎に罹患した肝臓ならびに脾臓で受容体のレベルがほぼ同じであり、それは同じ器官による同様のＥＣ２０取り込みに一致することが示された（図４）。いずれの関節炎罹患組織においても、クロドロネート処置（暗い灰色の棒）によりマクロファージを体全体から除去したことで、葉酸受容体レベルが有意に低下し（図５）、しかもＥＣ２０の生体内分布解析と良く一致した。最後に、腎臓と心臓においては、関節炎の誘発もクロドロネート処置もＦＲレベルを変化させないことがＦＲアッセイにより確認された。これらの組織では、ＦＲが活性化マクロファージに関係しているとは考えられない。
【００４５】
［実施例１３］
関節炎ラットの肝臓マクロファージ上の機能的葉酸受容体の発現
実施例２、４、６および７に記載したプロトコールを用いた。関節炎ラットの肝臓におけるＥＣ２０取り込み増大が、マクロファージ集団に起因するものであることをさらに確認するため、コラゲナーゼで灌流したラットから肝臓を摘出し、葉酸‐ＦＩＴＣをＦＲ発現の蛍光マーカーとして用いて、脱凝集化した細胞の葉酸受容体取り込みを調べた。また、同じ肝細胞懸濁液をラットの肝マクロファージに特異的な抗体で標識することにより、関節炎ラットにおいてマクロファージが確かに高レベルの葉酸受容体を発現する細胞タイプであることを証明することができた（図６）。すなわち、フローサイトメトリー分析により、関節炎ラットの肝細胞マクロファージの７０％が葉酸塩‐ＦＩＴＣを結合したことが明らかにされ、３０％しか結合しなかった健常ラットの肝細胞マクロファージとは対照的であった（図６）。さらに、関節炎ラットのマクロファージのＦＩＴＣ強度は、健常ラットの肝臓マクロファージより高かった。葉酸−ＦＩＴＣの結合が、過剰な遊離葉酸（１ｍＭ）の存在下で抑制されたことから、われわれは、肝細胞マクロファージによる葉酸コンジュゲートの取り込みが、葉酸受容体により仲介されると結論した。
【００４６】
われわれはまた、顆粒細胞に特異的な抗体を用いて、組織に浸潤している好中球が葉酸コンジュゲートを取り込む可能性があるかどうかを調べた。肝臓にはほとんど好中球が存在せず、検出された好中球も葉酸‐ＦＩＴＣとの結合能を示さなかった（データは示さず）。また、Ｍａｃ‐１＋末梢血細胞を調べたところ、好中球と同じく、葉酸コンジュゲートとの結合能を示さなかった（データは示さず）。事実、肝臓においてはＦＩＴＣ蛍光陽性に分類された末梢血細胞はなく、このことは、常在型の組織マクロファージ（しかも、明らかにそのうちの一部の集団）のみがＦＲを発現していることを示唆する。
【００４７】
最後に、ヒトの患者において、葉酸結合薬剤によって活性化マクロファージを標的とすることが可能であるかどうかの検討を始めるため、われわれは、最近終了したガンマ画像化剤１１１Ｉｎ‐ＤＴＰＡ‐葉酸の臨床試験に登録していた卵巣癌の疑いのある患者２８例の全身像を検討する許可を得た。図７に示す通り、１人の患者が右膝に有意な画像化剤取り込みを示したが、左膝では示さなかった。重要なことは、他のいずれの患者も測定可能な関節への取り込みを示さなかったということである。担当医師に依頼し、その匿名患者に連絡を取って、以前何らかの慢性的な不快感が関節になかったかを尋ねてもらった。その医師は、患者が右膝に関節炎を患っていたと報告した、と回答した。
【００４８】
考察
活性化マクロファージは、関節リウマチの病因に密接に関与していると考えられる。活性化マクロファージは、メタロプロテナーゼを分泌し、かつサイトカインの放出により他の免疫細胞を誘引／活性化することによって、関節組織を直接破壊する。ヒトにおいて、活性化マクロファージ量は関節の破壊および悪い疾患予後と良い相関を示すため、関節組織内の活性化マクロファージを定量化することは、診断としての価値があるのではないかと考えられる。
【００４９】
ＥＣ２０を投与したラットのガンマカメラによるシンチグラフィーにより、関節炎を起こしている外肢が、葉酸標的９９ｍＴｃにより確かに写し出されるのが証明された。これに対し、健常ラットの脚と足は画像化することができず、これは関節炎に応用する場合に画像化剤が有する選択性を証明する。内臓の強度もまた、アジュバント誘導関節炎では増大したが、内臓からのガンマ線照射は、容易く遮ることができるため、このような組織からの干渉は、この方法を損なうものではなかったと思われる。さらに、ＥＣ２０の注入から１、２時間内に良好なコントラストが得られることから明らかなように、画像化剤投与、ガンマカメラによるシンチグラフィー、および画像解析を同じ検査の中で行うことが可能である。
【００５０】
アジュバント誘導関節炎ラットの体全体にわたるマクロファージの活性化が記録された。つまり、これまで、関節炎を発症させた動物で葉酸標的画像化剤の検討が行われたことがなかったので、ＥＣ２０の取り込み増大にマクロファージが特異的に関与していることを立証することが重要であったのだ。この目的のために、３つの実験を行った。まず、クロドロネートを封入したリポソームを用いて、処置したラットの体全体からマクロファージを除去した。その結果、組織のＦＲレベルが大幅に減少したのみならず、マクロファージに富む器官におけるＥＣ２０の取り込みもほとんど除去された。これは、常在型マクロファージが、細網内皮系（ＲＥＳ）器官におけるＦＲの発現とＥＣ２０の貯留の両方の原因となり得ることを示唆するものである。次に、コラゲナーゼ処置によって肝細胞を分離し、個々の細胞への葉酸受容体取り込みを評価した。図６に認められるように、葉酸コンジュゲート取り込みが陽性と判定された細胞のほとんどが、マクロファージ・マーカー、ＥＤ２でも陽性に分類された。このことにより、ＦＲが確かにマクロファージ上に存在していることが確認された。最後に、アジュバント関節炎に罹患しているラットの組織では、他の免疫細胞および骨髄球性細胞が増加していることが知られていることから、また別の血管外遊出を起こしている血球細胞タイプが、ＥＣ２０の取り込みに関与しているとも考えられる。しかし、肝臓に浸潤している顆粒細胞も、循環しているどの血球も、葉酸‐ＦＩＴＣとの結合能を全く示さない。したがって、活性化マクロファージが、関節炎ラットの器官において主に葉酸コンジュゲートを内在化している細胞タイプではないかと思われるのである。
【００５１】
驚くべきことに、健常ラットにおいても肝マクロファージの３０％までが葉酸受容体を発現している（図６）。機能的葉酸受容体は休止期の滑膜マクロファージ上にはみつからないことから、健常ラットにおいては、葉酸‐ＦＩＴＣ結合画分も活性化集団を構成しているのではないかと想像したくなる。二つの観察が、この想像を支持するかもしれない。まず、活性化マクロファージは、外来の抗原のような免疫刺激物質に曝露された後に、健常組織にもみられるということである。体内から異物を取り除くという肝臓の役割を考えると、低レベルの定常在型マクロファージ活性化が起こっていると考えるのも理不尽ではないようだ。もうひとつは、肝細胞の葉酸‐ＦＩＴＣ（およびＥＣ２０）結合集団は、局所の炎症の誘発および全身性のマクロファージ活性化が起こると有意に増加するということである。
【００５２】
葉酸を利用して、活性化マクロファージに付着分子を輸送する能力を今や確立したので、葉酸結合画像化剤を用い、関節リウマチの早期の発症や引き続く進行を診断することができるだろう。移植片対宿主病、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、疥癬、骨髄炎、およびアテローム性硬化症でさえも、活性化マクロファージにより引き起こされる／悪化するので、これらの疾患を診断／評価するのに葉酸塩結合画像化／造影剤が役立つ可能性がある。炎症を起こしている関節や肝臓の活性化マクロファージが、コンジュゲートを貪欲に取り込むことから、マクロファージは、解剖学的にはどこに存在しているかには関係なく、効果的な標的となることができることが明らかである。
【００５３】
［実施例１４］
免疫療法を介するアジュバント誘導関節炎の防止
図１０に示すアッセイを行うため、実施例３に記載したプロトコールを用いた。ただし、葉酸‐ＦＩＴＣを、１日あたり３０００ｎｍｏｌｅｓ／ｋｇ（第１、２、３日目と３回投与）投与し、輸送はラットの腹腔内に埋め込んだ浸透圧ポンプを用いて行った。アジュバント投与後、１、８、１５日目に、メトトレキセート（ＭＴＸ）０．１５ｍｇを１日１回腹腔内投与した。ＭＴＸで処置した動物については、葉酸−ＦＩＴＣの代用としてＭＴＸを用いた。左足（注射部位）と右足（注射しなかった部位）の両足の結果を示す。その結果、ＭＴＸも葉酸‐ＦＩＴＣもアジュバント誘導関節炎を抑制することが示された。
【００５４】
［実施例１５］
免疫療法を介するアジュバント誘導関節炎の防止
実施例１４に記載したプロトコールを用いた。ただし、右足の容積のみ測定し、葉酸‐ＦＩＴＣの投与量を３０００、６００、および１２０ｎｍｏｌｅｓ／ｋｇとした（図１１）。また、ＦＦを１回３０００ｎｍｏｌｅｓ／ｋｇで、実施例１４のように（図１１では「３回」と示されている）３回投与か、または実施例８に記載したように第１、２、３、９、１１、１４日目に投与するか（図１１では“ＦＦ３０００”と示されている）のいずれかの方法で投与した。その結果、ＦＦは関節炎ラットの右足におけるアジュバント誘導関節炎を抑制することが示された（注射をしていない右足にも、関節炎が全身に進行しているため、恐らく炎症は生じる）。また、アジュバント誘導関節炎を治療するためには、３回の初期投与より、ＦＦによる持続的治療のほうが効果が高いことも示された。
【００５５】
［実施例１６］
免疫療法を介するアジュバント誘導関節炎の防止
実施例８に記載したプロトコールを用いた。ただし、ＦＦの代わりにＭＴＸを１回０．１５ｍｇ（ＦＦ＋ｌｏｗ、ｅａｒｌｙＭＴＸ、ｌａｔｅＭＴＸ、およびｌａｔｅＦＦＭＴＸ）で投与した動物と（図１２参照）、０．７５ｍｇのＭＸＴ（ＦＦ＋ｍｉｄ）または１．５ｍｇのＭＸＴ（ＦＦ＋ｈｉｇｈ）を投与した動物があった。“ｅａｒｌｙＭＴＸ”の処置とは、関節炎誘発後１、８、１５日目にラットにＭＴＸを注射したもので、“ｌａｔｅＭＴＸ”の処置とは、アジュバント投与後８、１５日目にラットにＭＴＸを注射したものである。測定値はいずれも、注射していない右足のものである。その結果、葉酸‐ＦＩＴＣ（ＦＦ）とＭＴＸ（ｅａｒｌｙまたはｌａｔｅ処置および低用量、中用量、高用量ＭＸＴ）との併用投与が、ＦＦ単独投与より良好にアジュバント誘導関節炎を抑制することが示された。
【００５６】
［実施例１７］
免疫療法を介するアジュバント関節炎の防止
図１３に示す結果については、実施例８に記載したプロトコールに従った。ただし、動物によっては、関節炎誘発後第１、８、１５日目にＭＴＸのみで処置（０．１５ｍｇ）したか、または実施例１４に記述したように、ＦＦとの併用投与でＭＴＸ処置（０．１５ｍｇ；  第１、８、１５日目）したものがあった。その結果、ＦＦとＭＴＸとの併用投与が、ＭＩＸもしくはＦＦ単独投与よりはるかに良好にアジュバント関節炎を抑制することが示された。
【００５７】
［実施例１８］
免疫療法を介するアジュバント関節炎の防止
実施例８に記載したプロトコールを用いた。ただし、ＩＬ−１０（１０，０００  Ｕ；ＦＦ１０）またはＩＬ−２（３μｇ，／ｋｇ；ＦＦ２）を、ＦＦと併用投与した。（すなわち、アジュバント投与後１、２、３、９、１１、１４日目に、サイトカインを腹腔内注射により投与した。図１４参照。）測定値は、注射をしていない右足のものである。その結果、ＩＬ‐１０またはＩＬ‐２のいずれかが、ＦＦの治療によるアジュバント誘導関節炎の抑制を阻止することが示された。以上の免疫療法の結果をまとめると、マクロファージにとって細胞毒性のある葉酸結合薬剤は、マクロファージが仲介する病態を治療するために用いることができることが示される。
【００５８】
［実施例１９］
関節炎ラットの葉酸を標的とする画像化
図１５に示すアッセイのため、実施例２および８に記載したプロトコールを用いた。ただし、実施例８に記載の通りＦＦで処置（２０００ｎｍｏｌｅｓ／ｋｇ；第１、２、３、９、１１、１４日目）したものと、実施例１４に記載の通りＭＴＸで処置（０．１５ｍｇ；第１、８、１５日目）したものがあった。その結果、腎臓を除いて、調べた器官のいずれにおいても、ＦＦあるいはＭＴＸがＥＣ２０の取り込みを阻害していることが示された。ＥＣ２０の取り込みは、ほとんどの器官で減少したが、その結果、腎臓を通して排出するＥＣ２０がより多くなったようだ。これは、腎臓組織において検出されたＥＣ２０の増加の説明となる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】本文参照。
【図２】本文参照。
【図３】本文参照。
【図４】本文参照。
【図５】本文参照。
【図６】本文参照。
【図７】本文参照。
【図８】本文参照。
【図９】本文参照。
【図１０】本文参照。
【図１１】本文参照。
【図１２】本文参照。
【図１３】本文参照。
【図１４】本文参照。
【図１５】本文参照。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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