(57)【要約】  【課題】  多価ワクチンにてキャリア蛋白の多糖類に対する割合を減少させつつ、抗体応答の減少を防止するワクチンの提供が望まれている。  【解決手段】  （ａ）キャリア蛋白に接合した、ストレプトコッカス・ニューモニア、またはナイセリア・メニンジチジスＡ、ＢまたはＣから由来の多糖類抗原と、（ｂ）遊離抗原としても存在するキャリア蛋白とを含む複合ワクチンであって、接合体中の多糖類のキャリア蛋白に対する比が１：０.３ないし１：２（ｗ／ｗ）であることを特徴とする複合ワクチンにより、上記した課題が解決される。【選択図】  なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）キャリア蛋白に接合した、ストレプトコッカス・ニューモニア、またはナイセリア・メニンジチジスＡ、ＢまたはＣから由来の多糖類抗原と、
（ｂ）遊離抗原としても存在するキャリア蛋白とを含む複合ワクチンであって、
接合体中の多糖類のキャリア蛋白に対する比が１：０.３ないし１：２（ｗ／ｗ）であることを特徴とする複合ワクチン。
【請求項２】
キャリア蛋白がジフテリアまたは破傷風抗原である、請求項１記載の複合ワクチン。
【請求項３】
ジフテリアまたは破傷風抗原がジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイドである、請求項２記載の複合ワクチン。
【請求項４】
ジフテリアまたは破傷風抗原がジフテリアまたは破傷風から由来の毒素の非毒性誘導体である、請求項２記載の複合ワクチン。
【請求項５】
多糖類：キャリア蛋白の比が１：０.５ないし１：１.５（ｗ／ｗ）である、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の複合ワクチン。
【請求項６】
さらに、ジフテリア、破傷風、および百日咳感染症に対して防御的な抗原を含む、請求項１ないし５のいずれか一項に記載の複合ワクチン。
【請求項７】
さらにＢ型肝炎ウイルスに対する抗原を含む、請求項１ないし６のいずれか一項に記載の複合ワクチン。
【請求項８】
さらにＡ型肝炎ウイルスに対する抗原を含む、請求項１ないし７のいずれか一項に記載の複合ワクチン。
【請求項９】
さらにポリオに対する免疫力を提供する抗原を含む、請求項１ないし８のいずれか一項に記載の複合ワクチン。
【請求項１０】
付加的に適当なアジュバントを含む、請求項１ないし９のいずれか一項に記載の複合ワクチン。
【請求項１１】
医薬において用いるための、請求項１ないし１０のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１２】
感染病に感受的な、または感染病を患っているヒトを治療するための医薬の製造における請求項１ないし１０に記載の有効量の複合ワクチンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キャリア蛋白と結合した接合多糖類抗原を含むワクチンであって、キャリア蛋白がワクチン組成物中フリーな抗原としても存在する複合ワクチンに関する。特に、本発明のワクチン組成物は、多価ワクチン、すなわち１以上の病状の改善または治療用ワクチンに関する。本発明はまた、医薬におけるこのようなワクチンの産生および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
多糖類を利用するワクチンは当業界で公知である。例えば、ヘモフィルス・インフルエンゼｂ（Ｈｉｂ）感染症の予防用ワクチンは、キャリア蛋白と接合した莢膜多糖類（ＰＲＰ）に基づく。典型的には、キャリア蛋白はジフテリアまたは破傷風トキソイドである。このような破傷風トキソイドまたはジフテリアトキソイドのようなキャリア蛋白と接合した莢膜多糖類に基づいたストレプトコッカス・ニューモニアの予防用ワクチンを産生することも提案されてきた。このような接合ワクチン抗原の例は、ＵＳ４３６５１７０、ＵＳ４６７３５７４、ＥＰ２０８３７５、ＥＰ４７７５０８およびＥＰ１６１１８８に開示されている。
【０００３】
このような接合ワクチンを他の抗原またはワクチンと同時に投与することが望ましく、これは複数注射を含むことができる。複数注射に伴う問題は、より複雑な投与手順および合計注射体積が大きいことを包含する。ワクチンが乳児用である場合に特に深刻な問題である。
【０００４】
したがって、複合ワクチンを産生することが提案されてきた。よく知られた複合ワクチンの一例は、ジフテリア、破傷風および百日咳菌感染症に対する防御を提供する。このワクチンは、百日咳成分（死菌全細胞百日咳菌または典型的には最高３個の抗原−ＰＴ、ＦＨＡおよび６９ｋＤａからなる無細胞百日咳）を含む。このようなワクチンは、ＤＴＰｗ（全細胞）またはＤＴＰａ（無細胞）と称することが多い。
【０００５】
多糖類接合ワクチンをこのような組み合わせに添加することが望ましい。しかし、本発明者らは、成分の単純な混合の結果、多糖類成分に対する抗体価が減少し、このような抗体価の防御レベルの維持が低下することを見いだした。このように、破傷風トキソイド（ＴＴ）を無毒化する接合ＰＲＰ Ｈｉｂ多糖類の免疫原性はＤＰＴａと組み合わせたＴＴ−ＰＲＰ接合物によって免疫化した乳児において、ＴＴ−ＰＲＰ接合物とＤＴＰａで同時にではあるが、別の部位で免疫化した乳児に比べて減少することが観察された。
【０００６】
一価の状況において、すなわち、ワクチンがキャリア蛋白と接合した１つの多糖類（ＰＳ）のみを含む場合、接合物の蛋白質含量が高いほど、多糖類に対する抗体応答は高い。これは、Ｔ細胞依存性多糖類特異性抗体応答の誘発は、キャリア蛋白の多糖類との共有結合を必要とするためと考えられる。蛋白キャリアは、キャリアに対して良好なＴＨ細胞応答が誘発され、このＴＨ応答が共有結合キャリア蛋白由来のペプチドを発現するＰＳ特異性Ｂ細胞クローンを認識できるような濃度（すなわち、蛋白質に対するＰＳの比）で存在しなければならない。
【０００７】
典型的には、従来の単価ワクチンの多糖類：蛋白質キャリアの比は１：３（重量比）である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
驚くべきことに、そして単価ワクチンと正反対に、本発明者らは、多糖類接合成分がフリーな形態のキャリア蛋白を含む多価ワクチンの一部である場合、多糖類成分の免疫原性は、接合抗原の蛋白質含量の減少により向上されることを見いだした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、本発明は、キャリア蛋白と接合した多糖類抗原を含有する複合ワクチンであって、キャリア蛋白が、多糖類のキャリア蛋白に対する比が約１：０.３ないし１：２であることを特徴とするフリーな抗原としても存在するワクチンを提供する。好ましい比は、１：０.５ないし１：１.５、典型的には１：１のオーダーである。
【００１０】
多糖類接合体は、いずれかの公知のカップリング技術により調製できる。例えば、多糖類はチオエーテル結合によりカップリングできる。この接合法は、多糖類を１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）により活性化してシアン酸エステルを形成することによる。活性化多糖類はこのように直接またはスペーサー基を介してキャリア蛋白上のアミノ基とカップリングする。好ましくは、シアン酸エステルをヘキサンジアミンと結合させ、アミノ−誘導多糖類をチオエーテル結合の形成を含むヘテロ結合化学反応を用いてキャリア蛋白と結合させる。このような接合体は、ＰＣＴ公開出願ＷＯ９３／１５７６０（Ｕniformed Ｓervice Ｕniversity）に記載されている。
【００１１】
接合体はまた、ＵＳ４３６５１７０［ジェニングス（Ｊennings）］およびＵＳ４６７３５７４［アンダーソン（Ａnderson）］に記載されているような直接還元的アミノ化法により調製できる。他の方法は、ＥＰ−０−１６１−１８８、ＥＰ−２０８３７５およびＥＰ−０−４７７５０８に記載されている。
【００１２】
さらに別の方法は、アジピン酸ヒドラジド（ＡＤＨ）で誘導化したシアノゲンブロミド活性化多糖類のカルボジイミド縮合による蛋白キャリアとのカップリングを含む［チュー・シー（Ｃhu Ｃ.）ら、インフェクション・アンド・イミュニティー（Ｉnfect.Ｉmmunity）、１９８３ ２４５ ２５６］。
【００１３】
好ましくは、キャリア蛋白は破傷風、またはジフテリア、好ましくは破傷風トキソイドまたはジフテリアトキソイド由来の抗原である。キャリアはまたボルデテラ由来である。典型的には、抗原は破傷風またはジフテリア由来のトキソイドの無毒誘導体である。
【００１４】
好ましくは、本発明の組成物は適当なアジュバントを含む。
【００１５】
好ましいアジュバントは、ＭＰＬ（３−脱アシル化モノホスホリルリピッドＡ、３Ｄ−ＭＰＬとも称する）である。３Ｄ−ＭＰＬは３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピッドＡと４、５または６アシル化鎖との混合物としてＧＢ２２２０２１１［リビ（Ｒｉｂｉ）］から公知であり、リビ・イムノケム社により製造されている。ＭＰＬの好ましい形態は、国際特許出願番号９２／１１６５５６に開示されている。
【００１６】
本発明において用いうる他のアジュバントは、ＱＳ２１として知られている。
ＱＳ２１は南米の木キラヤサポナリアモリナの樹皮由来のサポニンのＨｐ１ｃ精製非毒性フラクションであり、その製造法はＵＳ特許番号５０５７５４０に開示されている（ＱＡ２１として）。
【００１７】
ＱＳ２１および３Ｄ−ＭＰＬの組み合わせは、相乗的に有効なワクチン製剤を産生することが知られており、国際特許出願番号ＷＯ９４／００１５３に開示されている。
【００１８】
本発明のＨｉｂ成分ワクチンは特定のキャリアを必要としない場合が多く、水性または他の医薬上許容される緩衝液中に調製される。場合によっては、本発明の全ワクチンを水中油乳濁液中、または他の適当なビヒクル、例えばリポソーム、中心体または莢膜抗原粒子中に提供する。
【００１９】
ワクチン製剤はさらに別の抗原を含有してもよい。ＨＩＶ−１（例えばｇｐ１２０またはｇｐ１６０）、ヒトまたは動物ヘルペスウイルス、例えばｇＤまたはその誘導体またはイミディエイトアーリープロテイン、例えばＨＳＶ１またはＨＳＶ２由来のＩＣＰ２７、サイトメガロウイルス（特にヒト）（例えばｇＢまたはその誘導体）、水痘様帯状庖疹ウイルス（例えば、ｇｐＩ、ＩＩ、またはＩＩＩ）、またはＢ型肝炎ウイルスなどの肝炎ウイルス由来のもの、例えば、Ｂ型肝炎表面抗原またはその誘導体、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスおよびＥ型肝炎ウイルス、または他のウイルス性病原体由来の物、例えば呼吸器合胞体ウイルス、ヒト乳頭腫ウイルスまたはインフルエンザウイルス、またはポリオウイルス由来のもの、例えば不活化ポリオウイルス（ＩＰＶ）またはジフテリア（Ｄ）、破傷風（Ｔ）、サルモネラ、ナイセリア、特にナイセリア・メニンジチジスＡ、Ｂ、またはＣ由来の物、ボレリア（例えば、ＯｓｐＡまたはＯｓｐＢまたはその誘導体）、またはクラミジア、またはボルデテラ例えば百日咳菌（Ｐ）由来のＰ.６９、ＰＴおよびＦＨＡ、または寄生虫由来の物、例えばプラスモジウムまたはトキソプラズマを包含する当業界で公知の抗原または抗原性組成物を本発明の組成物において用いることができる。
【００２０】
特に好ましい本発明のワクチンは、ＤＴＰａ、Ｈｉｂ；およびＤＴＰａ Ｈｉｂ Ｈｅｐ Ｂ；およびＤＴＰａ Ｈｉｂ Ｈｅｐ Ｂ ＩＰＶを包含する。本発明の複合ワクチンにおいて、Ｈｉｂ成分は投与直前に他の抗原と配合されると考えられる。したがって、凍結乾燥Ｈｉｂ成分を使用前に、他の抗原の水性製剤と混合することにより復元する。
【００２１】
前記組み合わせは、所望により、Ａ型肝炎に対して防御的な成分を含んでもよい。
【００２２】
このようなワクチンにおいて用いるのに適した成分は、すでに市販されており、詳説は世界保健機関より得られる。例えば、ＩＰＶ成分はＳａｌｋ不活化ポリオワクチンである。ジフテリア、破傷風および百日咳ワクチンは、Ｉnfanrix ＤＴＰａ（スミス・クライン・ビーチャム・バイオロジカルズ製品）などの無細胞製品を含んでもよい。Ａ型肝炎に対する防御をもたらす成分は、好ましくは、ＨＡＶのＨＭ−１７５株由来の死菌弱毒化ワクチンである「Ｈavrix」（スミス・クライン・ビーチャム・バイオロジカルズ製品）として知られる製品である［「Ａ型肝炎についての不活化ワクチン」エフ・イー・アンドレ（Ｆ.Ａ.Ａndre）、エイ・ヘプバーン（Ａ.Ｈepburn）およびイー・ドント（Ｅ.Ｄ'Ｈondt）、プログレス・イン・メジシナル・バイロロジー（Ｐrog.Ｍed.Ｖirol.）、第３７巻、７２−９５ページ（１９９０）およびスミス・クライン・ビーチャム・バイオロジカルズ出版製品モノグラフ「Ｈavrix」参照］。Ｂ型肝炎成分は、「Ｅngerix−Ｂ」におけるものなど「Ｓ」抗原を含んでもよい。
【００２３】
有利には、ヘモフィルス・インフルエンゼＢワクチンまたは本発明の複合ワクチンは小児用ワクチンである。
【００２４】
ワクチン製剤は、一般にワクチンデザイン−ザ・サブユニット・アンド・アジュバント・アプローチ(Ｖaccine Ｄesign-the subunit and Ａdjuvant approach)、マイケル・エフ・ポウェル（Ｍichael Ｆ Ｐowell）およびマーク・ニューマン（Ｍark Ｎewman）編（Ｐlenum Ｐress）に記載されている。リポソーム中の封入は、例えば、ファラートン（Ｆullerton）、ＵＳ特許第４２３５８７７号により記載されている。蛋白質の巨大分子との複合は、例えば、リックハイト（Ｌikhite）、ＵＳ特許第４３７２９４５号およびアーモー（Ａrmor）ら、ＵＳ特許第４４７４７５７号に記載されている。
【００２５】
各ワクチン用量中の抗原の量は、典型的な被接種者において著しい副作用を起こすことなく免疫防御応答を誘発する量として選択される。このような量は、どの免疫原を用いるかによって変わる。一般に、用量は、各々、１ないし１０００ｕｇ、好ましくは、２ないし１００ｕｇ、最も好ましくは４ないし４０ｕｇの全免疫原を含有すると考えられる。特定のワクチンに対する最適量は、被験者における抗体価および他の応答の観察を含む標準的研究により確認できる。初回接種の後、被験者は、１回または約４週間の間隔をあけて２回の追加抗原剌激注射を受ける。
【００２６】
以下の実施例で本発明を説明する。
【００２７】
実施例
【００２８】
実施例１ａ）ＤＴＰａ−Ｈｉｂ ＰＲＰ−ＴＴおよびＨＢＳＡｇを含むワクチン
【００２９】
Ｈｉｂ ＴＴ複合体の産生材料と方法材料Ｈｉｂ ＰＲＰを不活性化細胞培養物から抽出し、精製する。精製した物質はＷＨＯおよびＵＳ明細書と残存する蛋白質、核酸、内毒素、構造糖および分子寸法分布において一致する。
【００３０】
ベーリングベルケ（Ｂehringwerke）により調製された破傷風トキソイドもＷＨＯ明細書と合致する。物質をさらに酸性ｐＨ沈降およびゲル濾過クロマトグラフィーにより精製して、ＴＴのモノマー形態（１５０ｋＤａ）を単離する。
【００３１】
活性化およびカップリングの化学反応
【００３２】
２０ｍｇのＨｉｂ ＰＲＰを４ｍｌの２Ｍ ＮａＣｌ中に溶解させた。１４０ｍｃｌのＣＤＡＰ（１−シアノ−４−ジメチルアミノ−ピリジニウムテトラフルオロボレート）を多糖類溶液（アセトニトリル中１００ｍｇ／ｍｌのストック溶液から）に添加した。１分後、３００ｍｃｌのトリエチルアミン０.２Ｍを添加した。２分間０℃でｐＨ９.５−１０で多糖類の活性化を行った。
【００３３】
濃度１５ｍｇ／ｍｌの２０ｍｇまたは４０ｍｇの破傷風トキソイド（初期ＰＲＰ／蛋白質比１／１または１／２）を添加し、カップリング反応を２５℃で１時間行った。次に、３ｍｌの１Ｍグリシン溶液ｐＨ５.０を用いて反応を１時間２５℃、一夜４℃で停止させた。
【００３４】
複合体を０.２Ｍ ＮａＣｌで平衡化したセファクリルＨＲ５００ゲル濾過カラムを用いてゲル濾過クロマトグラフィーにより精製する。溶出されたフラクションの炭水化物および蛋白質含量を測定した。複合体をプールし、滅菌濾過した。
【００３５】
複合調製物中のＰＲＰ／蛋白質比およびフリーなＰＳ含量を測定した。
【００３６】
実施例１ｂ）
【００３７】
ＤＴＰ Ｈｉｂ ＰＲＰ ＴＴ ＨＢｓＡｇ複合ワクチン製剤
【００３８】
Ｂ型肝炎ワクチンを含むかまたは含まないＤＴＰａ製剤（ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、ペルタクチンおよびＦＨＡを含む）は当業界で公知である。例えば、このようなワクチンは国際特許出願番号ＷＯ９３／２４１４８に開示されている。実施例１に記載されているような複合体を免疫原性研究のための注射の前にワクチンに添加し、混合した。
【００３９】
本研究において、以下の工程を行った：
・フェノキシ−エタノール（静菌剤）含量を５ｍｇ／ｍｌに調整する
・ｐＨを６.１±０.１に調整する
・ＰＲＰ濃度を最高１００ｍｃｇ／ｍｌに調整する
・ＤＴＰａＨＢＶ（０.５ｍｌ）を０.１ｍｌのＰＲＰ−ＣＤＡＰ−ＴＴ溶液に添加する。
【００４０】
ワクチンの最終組成物は１服用量について以下の通りである：
・ＰＲＰ'Ｐ              １０ｍｃｇ
・Ｄ                      ２５Ｌｆ
・Ｔ                      １０Ｌｆ
・ＰＴ                    ２５ｍｃｇ
・ＦＨＡ                  ２５ｍｃｇ
・６９Ｋ                  ８ｍｃｇ
・Ｈｅｐ Ｂ              １０ｍｃｇ
・Ａｌ(ＯＨ)3Ｂehring                        ０.３５ｍｇ
・Ａｌ(ＯＨ)3Ｓuperpos                      ０.１５ｍｇ
・ＡｌＰＯ4Ｓuperpos                         ０.２０ｍｇ
・ＮａＣｌ               １５０ｍＭ
・２ΨＥｔＯＨ           ３ｍｇ（５ｍｇ／ｍｌ）
・ｐＨ                   ６.１±０.１
・体積                   ０.６ｍｌ
【００４１】
実施例２
【００４２】
免疫原性
【００４３】
ヘモフィルス・インフルエンゼＢ型由来の多糖類：蛋白質（重量：重量）比（１：３、１：２および１：１）の免疫原性を、２つの異なるカップリング化学反応を用いて、若年ＯＦＡラットにおいて初回および二回接種後を比較する。
【００４４】
初回接種後２８日に得られたデータは明確に、複合体を単独で注射した場合ではなく、複合抗原をＤＴＰａＢ型肝炎と組み合わせた場合、複合ワクチン中の蛋白含量の減少と関連して抗ＰＳ抗体価が上昇することを示す。これはより低いＰＳ−ＴＴ比（すなわちより多くのキャリア蛋白）のために多糖類に対してより良い抗体応答が得られる複合ワクチンを単独で投与した場合に見られる状況と明らかに異なる（第４２日１ないし３群の抗ＰＳ価はＴＴ量の減少にともない２５から１８ないし５μｇ／ｍｌになるが、ＤＴＰａ Ｈｅ Ｂワクチンと組み合わせて投与した場合には同じＴＴ含量について３.４から８ないし１９μｇ／ｍｌになる）。
【００４５】
実施例３
【００４６】
ＴＴ／ＰＳ比のＨｉｂのＤＴＰａｔとの適合性に対する効果
【００４７】
１０匹のラットの群（ＯＦＡ、５週齢、雌）を皮下経路により、２通りの投与量：０.５γＰＳ／ラット（表２）または０.０５γＰＳ／ラット（表３）で投与した異なるＴＴ−ＰＲＰワクチンで２４日間隔で２回免疫化した。Ｈｉｂ００１ワクチンを食塩水または１服用量のＤＴＰａ（ロット１１９）で１０γＰＳ／ｍｌの濃度になるように復元した。液体ワクチンを食塩水で希釈するかまたは１人服用量のＤＴＰａは１０γＰＳ／ｍｌの濃度を有する。ワクチンをさらに食塩水で、２.５γＰＳ／ｍｌまたは０.２５γＰＳ／ｍｌの濃度になるように希釈した。ラットに２００μｌの各ワクチンを希釈後１時間以内に注射した。
【００４８】
動物を２４日および３８日に採血し、抗ＰＲＰ Ｉｇ ＧＡｂｓを個々の血清中ＥＬＩＳＡにより測定し、γ／ｍｌで表した。ＧＭＴを各群について計算した。
【００４９】
実施例４
【００５０】
ＤＴＰａ、および低比の「正常」ＰＴＰ：ＴＴと混合したＤＴＰａＢ型肝炎ワクチンの免疫原性の比較
【００５１】
１０匹のラットの群（ＯＦＡ、１週齢）を、注射の１時間前に１／２０の人投与量のＤＴＰａまたはＤＴＰａ ＨｅｐＢと合わせた０.５μｇのＰＳで２週間隔で３回免疫化（ＳＣ）した。動物を３回目の投薬後２週間に採血し、百日咳トキソイド（ＰＴ）、ＦＨＡ、ペルタクチン（６９ｋ）、ジフテリアトキソイド（Ｄ）、破傷風トキソイド（Ｔ）およびＢ型肝炎表面抗原（ＨＢＳ）に対する抗体をＥＬＩＳＡにより測定した。参考値を用いて希釈度の中点として表した力価を表４に示す。
【００５２】
この実験の結果は、実施例３からの結果と合わせて、複合体中の蛋白量が減少した場合、Ｈｉｂ応答が複合ワクチン中で向上することを示す。さらに、ワクチンの他のいずれの成分の免疫応答に対しても著しい妨害はない。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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