(57)【要約】  【課題】  網膜細胞などの神経細胞の移植を効率よく行うための薬剤を提供する。  【解決手段】  エストロゲンやコンカナバリンAなどのMMP-2活性化剤を神経細胞移植時に添加して移植効率を高める。  【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マトリクスメタロプロテイナーゼ２活性化剤及び／又はマトリクスメタロプロテイナーゼ２タンパク質を有効成分とする神経細胞移植補助剤。
【請求項２】
マトリクスメタロプロテイナーゼ２活性化剤がエストロゲン及びコンカナバリンから選ばれる１種類以上の化合物である、請求項１に記載の神経細胞移植補助剤。
【請求項３】
神経細胞が網膜細胞である、請求項１または２に記載の神経細胞移植補助剤。
【請求項４】
体外において、神経細胞にマトリクスメタロプロテイナーゼ２活性化剤及び／またはマトリクスメタロプロテイナーゼ２タンパク質を添加することを特徴とする移植用神経細胞の製造法。
【請求項５】
マトリクスメタロプロテイナーゼ２活性化剤がエストロゲン及びコンカナバリンから選ばれる１種類以上の化合物である、請求項４に記載の移植用神経細胞の製造法。
【請求項６】
神経細胞が網膜細胞である、請求項４または５に記載の移植用神経細胞の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は神経細胞移植補助剤および移植用神経細胞の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳、網膜、脊髄など中枢神経は再生が難しく、疾患により重篤な機能障害に陥る。現在治療不可能な中枢神経の変性障害に対し、細胞移植が研究され一部で臨床応用されている。その際のひとつの問題点は、移植細胞の生着率、シナプス形成率の低さである。これらの解決には移植細胞の問題もあるが、宿主の環境因子を整える必要があると思われるが、未だその方法については未解明である。特に神経は、他種の細胞に比べデリケートであり、神経回路網に侵入し、シナプスを形成する必要があるということが特殊要因となっている。シナプスを形成しなければ、結局長期には生存できないため、細胞の生着率をあげるためにも神経回路網に侵入し、シナプスを形成することが重要である。
しかしながら、実際に臨床応用されている胎児神経細胞移植は、環境因子の修飾はまったくなされないまま行われており、これが、顕著な効果を生み出せない原因のひとつとなっていると考えられる。動物実験レベルでは、脊髄損傷に対する神経幹細胞移植の際にグリア細胞によるバリア形成を抑制するコンドロイチナーゼとともに細胞を移植する方法（非特許文献１）や炎症性ケモカインを抑制することにより移植神経細胞の生存率を高める方法が報告されているが、細胞の組織への侵入を高める方法の報告はない。
【０００３】
マトリクスメタロプロテイナーゼ（MMP）は細胞マトリクスを分解する亜鉛依存性プロテアーゼであり、１０種類以上のMMPが知られている。これまでにMMPの発現量が癌の浸潤や転移に関係するという報告があるものの（非特許文献２）、MMPの神経細胞における役割はあまり知られていない。
一方、エストロゲンの神経保護効果やシナプス形成促進効果などはin vitroで報告されているが、細胞移植の際の効果については、全身のエストロゲン濃度が移植神経幹細胞のドーパミンニューロンへの分化を促進するという報告（非特許文献３）のみである。他臓器においても組織の保護にエストロゲンが働くことが報告されているが(非特許文献４)、移植効率への影響などについては報告がない。
また、植物由来のレクチンであるコンカナバリンAの神経細胞に対する効果や移植効率に対する効果はこれまでに検討されたことがない。
【非特許文献１】Nature. 2002 Apr 11;416:636-40
【非特許文献２】Curr Opin Genet 2000; 10: 120-127.
【非特許文献３】J Neurosci Res. 2005 Feb 1;79:279-86
【非特許文献４】Surgery. 2004 Aug;136:336-45
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、新規な神経細胞移植補助剤および移植用神経細胞の製造法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、網膜神経細胞移植の際に、成体ラット海馬由来神経幹細胞は網膜にひろく侵入するのに対し、胎仔網膜由来神経前駆細胞は網膜内への侵入は限られており網膜下にとどまることを発見し、この違いが両細胞におけるマトリクスメタロプロテイナーゼ２（MMP２）の発現量の多少によると考えた。この考えに基づいて検討を行った結果、細胞
移植の際に、MMP２タンパク質、または宿主組織のMMP２を活性化、あるいは産生を増加させる物質を同時に添加することで胎仔網膜由来神経前駆細胞を宿主網膜内に広く侵入させることができることを見出した。さらに、MMP２タンパク質およびMMP２を活性化する物質が移植用神経細胞の製造や神経細胞移植の際の補助剤として使用できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）マトリクスメタロプロテイナーゼ２活性化剤及び／又はマトリクスメタロプロテイナーゼ２タンパク質を有効成分とする神経細胞移植補助剤。
（２）  マトリクスメタロプロテイナーゼ２活性化剤がエストロゲン及びコンカナバリンから選ばれる１種類以上の化合物である、（１）の神経細胞移植補助剤。
（３）  神経細胞が網膜細胞である、（１）または（２）の神経細胞移植補助剤。
（４）  体外において、神経細胞にマトリクスメタロプロテイナーゼ２活性化剤及び／またはマトリクスメタロプロテイナーゼ２タンパク質を添加することを特徴とする移植用神経細胞の製造法。
（５）  マトリクスメタロプロテイナーゼ２活性化剤がエストロゲン及びコンカナバリンから選ばれる１種類以上の化合物である、（４）の移植用神経細胞の製造法。
（６）  神経細胞が網膜細胞である、（４）または（５）の移植用神経細胞の製造法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の神経細胞移植補助剤を神経細胞移植の際に、移植細胞とともに投与することにより、移植効率が向上する。特にエストロゲンはすでに薬剤として存在し、安全性や危険性も把握されている上に神経細胞に対しては保護効果、分化促進、シナプス形成促進、そして組織への侵入促進とすべて移植細胞の生着、機能回復にプラス要因となるため、応用範囲は広いと考えられる。また、体外で神経細胞を本発明の移植補助剤で処理し、処理後に神経細胞を移植することも可能である。
本発明の移植補助剤を網膜神経移植に使用する場合、適用疾患としては、網膜変性や視機能障害を起こした眼科疾患、具体的には、炎症や外傷によるものに加え、緑内障（原発性緑内障、続発性緑内障）、網膜血管閉塞症、糖尿病網膜症、虚血性視神経症、加齢黄斑変性、網膜色素変性、レーベル病、小口病、網膜色素線条、網膜静脈周囲炎、Ｅａｌｅｓ病、虚血性眼症候群、網膜細動脈瘤、又は高血圧、腎疾患もしくは血液疾患による網膜症、網膜ジストロフィー、黄斑ジストロフィー、黄斑浮腫、網膜分離症、錐体ジストロフィー等が挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の神経細胞移植補助剤は、MMP２活性化剤を有効成分として含む。MMP２活性化剤としては、MMP２遺伝子の転写を活性化させる物質や、MMP２を前駆体から活性型に変換する酵素（膜型メタロプロテイナーゼ：MT-MMP）を活性化する物質などが挙げられる。
MMP２遺伝子の転写を活性化させる物質としては、フォルボールエステル（Phorbol ester）, エストロゲン（17β-estradiol (E2)）などの化合物、インターロイキン−１（IL-1）, 腫瘍壊死因子−α（TNF-alpha）, トランスフォーミング増殖因子β−１（TGF β-1）などのタンパク質を含む。
MT-MMPを活性化する物質としては、植物由来のレクチンであるコンカナバリンA（concanavalin A）などが挙げられる。
フォルボールエステル, エストロゲンは市販のものを用いてもよいし、合成して用いてもよい。IL-1, TNF-alpha, TGF beta-1、コンカナバリンAなどのタンパク質は市販のものを用いてもよいし、遺伝子組み換えによって得られたものを用いてもよい。コンカナバリンAの例としては、配列番号3に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。
ただし、MT-MMPを活性化するものである限り、この配列のものに限定されず、その他の
公知のコンカナバリンAやそれらのホモログであってもよい。コンカナバリンAのホモログとしては例えば配列番号３のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を有し、神経細胞の移植効率を向上させるタンパク質が挙げられる。
なお、エストロゲンおよびコンカナバリンAのMMP2に対する効果は、それぞれ、Am J Physiol Renal Physiol  2002; 282: F164-169.、Proc Natl Acad Sci U S A 2001; 98: 13693-13698.に記載されている。
【０００９】
本発明の神経細胞移植補助剤は、MMP2タンパク質を含むものであってもよい。MMP2タンパク質としては、ヒトMMP2タンパク質が好ましい。ヒトMMP2タンパク質の例としては、配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。配列番号２のアミノ酸配列においては１−１０９位の配列が切断されて活性型MMP2となるため、１１０−６６０位の活性型MMP2を用いることがより好ましい。なお、MMP2タンパク質は神経細胞の移植効率を向上させるものである限り、ヒト以外の生物由来のタンパク質やそれらのホモログであってもよい。MMP2タンパク質のホモログとしては例えば配列番号２の１１０−６６０位のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を有し、神経細胞の移植効率を向上させるタンパク質が挙げられる。MMP2タンパク質は市販のものを用いてもよいし、遺伝子組み換えによって得られるものを用いてもよい。遺伝子組換えによりMMP2タンパク質を得るためには、例えば、配列番号１（ヒトMMP2遺伝子）の塩基配列を有するDNAを大腸菌や動物細胞等に導入して組換えタンパク質を発現させ、該タンパク質を精製することによって得ることができる。上記ＤＮＡを大腸菌に導入するためのベクターとしてはpETベクター（Novagen社）やpGEXベクター（Amersham Pharmacia社）などが挙げられ、動物細胞に導入するためのベクターとしては、pcDNAベクター（Invitrogen社）などが挙げられる。
なお、本発明の神経細胞移植補助剤は、上記MMP2活性化剤とMMP2タンパク質の両方を含むものであってもよい。
エストロゲンおよびコンカナバリンAなどのMMP2活性化剤及びMMP2タンパク質は、溶解剤、希釈剤、界面活性剤などの薬学的に許容される担体と組み合わせて移植補助剤として使用してもよい。
【００１０】
移植細胞（ドナー細胞）としては、ヒト神経由来の細胞が好ましく、ヒト神経由来の初代培養細胞や株化細胞などが挙げられる。また、神経への分化能を有する前駆細胞であってもよい。神経細胞の種類は特に限定されないが、網膜細胞が特に好ましい。ヒト由来の網膜細胞としては、例えば、アイバンクより得られる網膜細胞などを用いることができる。
また、神経細胞はMMP2をコードする遺伝子（例えば、配列番号１のDNA）が外来的に導入された細胞であってもよい。MMP２遺伝子の導入はプラスミドやウイルスベクターなどを使用する公知の方法に従って行うことができる。
【００１１】
神経疾患部位や神経障害部位に神経細胞を移植する際に、本発明の移植補助剤を添加する。なお、移植補助剤は神経細胞と同時に加えてもよいし、後から加えてもよい。加える濃度は神経障害の程度などによっても異なるが、例えば、エストロゲンの場合、１０-15〜１０-5Ｍが好ましく、コンカナバリンAの場合、５〜５０μｇ／ｍｌが好ましい。
【００１２】
なお、体外で神経細胞に本発明の移植補助剤を添加して移植用細胞の調製を行ったのちに、得られた細胞を移植してもよい。この場合、MMP2を活性化させるために十分な量の移植補助剤を添加し、好ましくは１〜１２時間保持してMMP2を活性化した後に、神経の障害部位に移植する。なお、網膜細胞を移植する場合は、網膜下腔に移植することが特に好ましい。
【実施例】
【００１３】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００１４】
＜試薬と方法＞
１．試薬
活性型MMP-2はChemicon社から購入した。コンカナバリンA（ConA）はWako社から購入した。MMP-2阻害剤(Cis-9-Octadecenoyl-N-hydroxylamide)はCalbiochem社から購入した。エストロゲン（E2）はSigma社から購入した。
【００１５】
２．網膜移植片培養系（体外器官培養）を用いた体外移植
網膜移植片培養はMethods 2002; 28: 387-395.、Brain Res 2002;954:286-293.に記載の方法に従って行った。成体のフィッシャーラット(Shimizu Laboratory Supplies, 京都)から目を摘出した。残った組織から網膜神経を取り出し、Millicell-CM チャンバーフィルター(Millipore社； 直径30mm)上に、神経細胞層を上にして置いた。Millicell-CM チャンバーフィルターを、1ウェルあたり1 ml の培養液 [50% minimum essential medium with Hepes (Invitrogen), 25% Hanks' solution (Invitrogen), 25% 熱不活化ウマ血清, 200 μM L-グルタミン及び5.75 mg/ml グルコース]を含む６ウェル培養プレート (Millipore)に入れた。
各ウェルには、それぞれ、0.1μg/ml活性化型MMP-2, 20μg/ml Con A, 20μg/ml Con A
＋20μg/ml MMP-2阻害剤, 10-10M E2, 10-10M E2 ＋20μg/ml MMP-2阻害剤, 20μg/ml Con A ＋ 10-10M E2, 20μg/ml Con A＋10-10M E2 ＋ 20μg/ml MMP-2 阻害剤, 20μg/ml MMP-2 阻害剤を添加した。培養液に何も添加しないウェルをコントロールとした。
体外移植は次のようにして行った。生後０〜２日のgreen fluorescent protein (GFP) トランスジェニックマウス(大阪大学岡部氏より入手) から単離した網膜由来神経前駆細胞をPapain Dissociation System (Worthington Biochemical)を用いてばらばらにし、この細胞懸濁液 (1.0×105 cells/μl) を2 μｌずつ、上記で用意したプレートの、宿主網膜（フィッシャーラット由来）とチャンバーフィルターの間（網膜下腔）に添加し、 34°C、 5% CO2の条件で培養した。培地は一日おきに交換し、約1週間後に組織学的解析のために凍結切片を作製した。
【００１６】
３．In vivo 移植
In vivo 移植は Mol Cell Neurosci 2001;18:473-484.に記載の方法に従って行った。生体 C57BL/6 マウスに、60 mg/kg の MNU (N-Methyl-N-nitrosourea；Sigma)を腹腔内投与することにより網膜の変性を誘導した。網膜変性処理の７日後に、20 μg/ml Con A及び 10-10M E2を含む１μｌの細胞懸濁液(1.0×105 cells/μl) をガラスピペットを用い、強膜を介して網膜変性モデルマウスの網膜下腔に注入した。Con A及び E2を含まない細胞懸濁液を注入し、これをコントロールとした。
【００１７】
４．組織切片の調製
移植後4週のマウスに過剰のpentobarbitalナトリウムを注射して処理し、PBS、ついで４％パラホルムアルデヒド（メルク社）／0.1Mリン酸バッファーで還流した。眼球を摘出し、これを新たな4% PFAに4℃で16時間浸漬し、次いで25% sucrose／PBSに浸漬した。optimal cutting temperature compound (Miles社)に包埋した後， 12−16μm の連続した凍結切片をクライオスタット上で調製した。
【００１８】
５．組織解析
移植細胞を含む切片を共焦点レーザー顕微鏡 (Leica Microsystems社)を用いてGFPの蛍光を観察した。１０切片ごとの平均細胞数を数え、宿主網膜全体にわたってサンプリングした。各セクションにおける全GFP陽性細胞に対する宿主網膜に侵入したGFP陽性細胞の数
を数え、宿主網膜に侵入した細胞のパーセンテージを算出した。細胞数は平均値±SDで表した。全てのデータはStudent's t-testによって評価した。
【００１９】
＜結果＞
体外器官培養系での網膜由来神経前駆細胞移植におけるMMP-2の効果
新生仔GFPマウスから調製した網膜由来神経前駆細胞を用い、この細胞の、器官培養された宿主網膜への侵入を外から加えたMMP-2が促進するかについて調べた結果、移植の際にMMP-2を加えた群では全GFP陽性細胞のうちの18.43 ( 1.60% が宿主網膜に侵入した（図１）。一方、MMP-2を加えない対照群では2.46 ( 0.54%であり、MMP-2添加の効果は有意であった（p < 0.01）。
また、Con A, E2をそれぞれ単独または組合わせて添加し、移植細胞の侵入の程度を調べた結果、Con A投与群, E2投与群, Con A＋E2投与群では、それぞれ15.68 ( 2.86%, 12.88 ( 2.29%, および17.72 ( 2.43%が宿主網膜に侵入した（図２、３）。統計的な有意差はCon A投与群がコントロール群に対してp < 0.05, E2投与群がコントロール群に対してp
< 0.01であった。両者を同時に加えた場合に相加的効果は見られなかったものの、網膜内層（inner retina）に侵入する細胞の数が増加した。
さらに、上記のConAおよびE2の効果がMMP-2を介するものであるかについて検討するため、MMP-2 阻害剤を同時に加えて評価した。その結果、MMP-2阻害剤はConAおよびE2、Con
A＋E2の効果を低下させた(侵入率はそれぞれ7.54 ( 0.55%, 5.82 ( 1.06%, 11.71 (1.66%であった)（図４、５）。
【００２０】
網膜障害モデルマウスへの網膜由来神経前駆細胞の移植効率に対するConA とE2 の効果
次に、MNU(N‐methyl‐N‐nitrosourea)誘発網膜変性症モデルマウスを用いて網膜由来神経前駆細胞のインビボでの移植効率に対するConA とE2 の影響を調べた。移植4週後、動物を処理し、凍結切片を作製して解析した結果、ConA＋E2 処理群（図６Ｂ）では宿主網膜の内顆粒層（INL）および内網状層（IPL）に移植細胞が侵入したが、非処理群（図６Ａ）では大部分の細胞が網膜下腔にとどまっていることがわかった。
【００２１】
＜参考例＞
生体ラット海馬由来神経幹細胞（adult rat hippocampus-derived neural stem cells ：AHSC）の移植効率に対するMMP-2 の効果
AHSCは胎仔網膜細胞と比べて移植効率がよい。そこで、両細胞における各MMPの発現量をRT-PCRで調べた。その結果、MMP2のみが胎仔（胎生19日）網膜細胞に比べてAHSCで多く発現していることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】MMP-2非添加時（コントロール）または添加時（MMP-2）の、器官培養された宿主網膜への網膜由来神経前駆細胞の侵入を示す図（写真）。略語は以下のとおりである。GCL；神経細胞層（ganglion cell layer）, INL; 内顆粒層（inner nuclear layer）, ONL; 外核層（outer nuclear layer）, SUB; 網膜下領域（subretina）
【図２】エストロゲン添加時（E2）、コンカナバリンA添加時（ConA）、エストロゲンとコンカナバリンAの同時添加時（E2＋ConA）または非添加時（コントロール）の、器官培養された宿主網膜への網膜由来神経前駆細胞の侵入を示す図（写真）。
【図３】MMP-2非添加時、MMP-2添加時、エストロゲン添加時（E2）、コンカナバリンA添加時（ConA）、エストロゲンとコンカナバリンAの同時添加添加時（E2/ConA）の、網膜由来神経前駆細胞の侵入効率を定量的に示すグラフ図。
【図４】エストロゲンとコンカナバリンAの同時添加添加時およびMMP-2阻害剤をさらに添加したときの、器官培養された宿主網膜への網膜由来神経前駆細胞の侵入を示す図（写真）。
【図５】MMP-2非添加時、MMP-2添加時、エストロゲン添加時（E2）、コンカナバリンA添加時（ConA）、エストロゲンとコンカナバリンAの同時添加添加時（E2/ConA）、およびこれらにさらにMMP-2阻害剤を添加したときの、網膜細胞の侵入効率を定量的に示すグラフ図。
【図６】エストロゲンとコンカナバリンAの同時添加添加時（Ｂ）または非添加時（Ａ）の、MNU誘発網膜変性症モデルマウスの網膜への、網膜由来神経前駆細胞の侵入を示す図（写真）。縮尺は２０ｍｍを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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