(57)【要約】      （修正有）【課題】ニワトリをはじめとする鳥類の卵（特に卵黄）内において、目的とするタンパク質を生産するためのベクターを開発し、当該ベクターを用いて目的タンパク質を生産する方法、および当該ベクターを含むキット等を提供する。【解決手段】ベクター（一例）は、プロモーターと、ニワトリ由来ビテロゲニンタンパク質の内、シグナル配列およびＳＥフラグメントを少なくとも含む領域をコードする遺伝子の３’末端側に、カテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子が連結されてなるポリヌクレオチドとを含み、当該ポリヌクレオチドが、プロモーターに制御可能に連結されている。また上記ベクターは、カテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子の３’末端側に、ヒスチジンタグをコードするポリヌクレオチドが連結されている。また上記ベクターは、ポリＡ付加シグナルを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
鳥類の卵黄内で目的タンパク質を生産するためのベクターであって、
プロモーターと、
鳥類由来ビテロゲニンタンパク質の内、シグナル配列およびＳＥフラグメントを少なくとも含む領域をコードする遺伝子の３’末端側に、カテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子が連結されてなるポリヌクレオチドを含み、
当該ポリヌクレオチドが、プロモーターに制御可能に連結されていることを特徴とするベクター。
【請求項２】
上記鳥類由来ビテロゲニンタンパク質が、ニワトリ由来ビテロゲニンタンパク質である、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
鳥類の卵黄内で目的タンパク質を生産するためのベクターであって、
プロモーターと、
配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの内、配列番号１の１位から２４８位のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチドをコードする遺伝子の３’末端側に、カテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子が連結されてなるポリヌクレオチドを含み、
当該ポリヌクレオチドが、プロモーターに制御可能に連結されていることを特徴とするベクター。
【請求項４】
上記カテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子の３’末端側に、精製用タグをコードする遺伝子が連結されていることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項５】
上記精製用タグが、ヒスチジンタグであることを特徴とする請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のベクターにおいて、
目的タンパク質をコードする遺伝子が、カテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子の３’末端側に連結されているベクター。
【請求項７】
鳥類の卵黄内で目的タンパク質を生産する方法であって、
請求項６に記載のベクターを鳥類個体に導入する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
鳥類の卵黄内で目的タンパク質を生産する方法であって、
請求項６に記載のベクターと、リポソームまたはリン酸アルミニウムとを同時に、鳥類個体に導入する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
ベクターが導入された鳥類個体から卵を採取し、当該卵から目的タンパクまたは目的タンパク質を含むタンパク質を分離精製する工程を含む、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
分離精製された上記目的タンパク質を含むタンパク質を、カテプシンＤがプロテアーゼ活性を有する温度で保温する工程を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
上記鳥類個体が、ニワトリである、請求項７ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
鳥類の卵黄内で目的タンパク質を生産するためのキットであって、
請求項１ないし６のいずれか１項に記載のベクターが含まれていることを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はニワトリをはじめとする鳥類の卵黄内において、目的とするタンパク質を生産するためのベクター、当該ベクターを用いて目的タンパク質を生産する方法、および当該ベクターを含むキット等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
これまで、有用タンパク質の生産においては、その生産量が高い、生産コストが安い等の理由から、大腸菌、枯草菌、酵母等の微生物が用いられてきた。しかし目的とするタンパク質によっては、糖鎖の付加、高次構造がその機能に重要な影響を及ぼす場合があり、かかるタンパク質を上記微生物で生産しようとしても、うまく発現しない場合や、発現したとしてもその目的とする機能が得られない場合がある。そこで、近年は、有用タンパク質の生産において、鳥類、哺乳類等の高等生物を用いることが検討され、そのタンパク質の生産系の開発が行なわれている。
【０００３】
例えば、トランスジェニックウシを用いて、その乳中にタンパク質を生産する方法が知られている（例えば、非特許文献７参照）。
【０００４】
また、近年、ヒトに極めて類似した糖鎖構造を有するタンパク質生産し得ることから、ニワトリを始めとする鳥類がタンパク質生産系として特に注目されている。ニワトリを始めとする鳥類は、その卵中にタンパク質、抗体を蓄積することができる。例えば、特許文献１，２、および非特許文献１〜６には、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等のウイルスベクター系を利用しトランスジェニックニワトリを作製し、血中、卵（卵白）中に有用タンパク質、抗体を生産する方法について記載されている。
【特許文献１】特表２０００−５１２１４９号公報（公表日：平成１２（２０００）年９月１９日、国際公開日：平成９年１２月１８日）
【特許文献２】米国特許出願公開２００２／０１０８１３２号明細書
【非特許文献１】Alex J. Harvey, Gordon Speksnijder, Larry R. Baugh, Julie A. Morris, and Robert Ivalie, 2002. nature biotechnology Vol.19, 396-399
【非特許文献２】P. E. Mozdziak, S. Borwornpinyo, D. W. McCoy, and J. N. Petitte, 2003. DEVELOPMENTAL DYNAMICS 226, 439-445
【非特許文献３】Jeffrey C. Rapp, Alex J. Harvey, Gordon L. Speksnijder, Wei Hu & Robert Ivarie, 2003. Transgenic Research 12, 569-575
【非特許文献４】Mo Sun Kwon, Bon Chul Koo, Bok Ruyl Choi, Hoon Taek Lee, Young Hye Kim, Wang-Shik Ryu, Hosup Shim, Jin-Hoi Kim, Nam-Hyung Kim, and Teoan Kim, 2004, Biochemical and Biophysical Research Communications 320, 442-448
【非特許文献５】Micael J. McGrew, Adrian Sherman, Fiona M. Ellard, Simon G. Lillico, Hazel J. Gilhooley, Alan J. Kingsman, Kyriacos A. Mitrophanous, and Helen Sang, EMBO reports VOL 5, NO7, 2004. 728-733
【非特許文献６】Paul E. Mozdziak, Simone Pophal, Suparerk Borwornpinyo and James N. Petitte, 2003, American Society for Nutritional Science. 3076-3079
【非特許文献７】Brophy B, Smolenski G, Wheeler T, Wells D, L'Huillier P, Laible G. Cloned transgenic cattle produce milk with higher levels of beta-casein and kappa-casein.Nat Biotechnol. 2003 Feb;21(2):157-62.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、ウシ等の大型の哺乳動物を用いて有用タンパク質を生産する場合は、成熟するまでに長期間を要すること、広大な面積の飼育設備が必要なこと、飼育コストが高いこと等の問題を有している。
【０００６】
これに対して、ニワトリを用いて有用タンパク質を生産する場合は、成熟するまでの期間がウシ等の大型哺乳類に比して短期間であること、比較的小さな飼育設備で飼育可能であること、飼育コストが安い等のメリットを有している。またニワトリは、ほぼ毎日産卵し、１年あたり２５０〜３００個の卵を生むため、目的とするタンパク質（以下「目的タンパク質」という）をニワトリの卵中に蓄積させることができれば、目的タンパク質の回収が容易であり、かつ目的タンパク質の高生産が期待できる。
【０００７】
現在、ニワトリの卵中に目的タンパク質を蓄積させることが可能なベクター系としては、上記ウイルスベクター系が知られている（特許文献１、２、および非特許文献１〜６参照）。かかるウイルスベクター系は、高い効率で目的タンパク質をコードする遺伝子（以下「目的遺伝子」という）を導入することが可能なこと、容易にウイルスベクターを調製することができるというメリットはあるが、目的遺伝子が染色体のどこに組み込まれるかについては全くランダムであり、その組み込み位置によっては、目的タンパク質を卵中に蓄積させることができないという問題点を有している。また上記ウイルスベクター系においては、目的遺伝子の組み込み位置によって、目的タンパク質が発現しない場合や、重要な機能を有する遺伝子が破壊されてしまう場合や、細胞に不要な遺伝子が活性化されてしまう場合がある。よって、上記ウイルスベクター系は、目的タンパク質を卵中に蓄積させる系としては満足のいくものとはなっていなかった。
【０００８】
そこで本発明は、ニワトリをはじめとする鳥類の卵（特に卵黄）内において、目的とするタンパク質を生産するためのベクターを開発し、当該ベクターを用いて目的タンパク質を生産する方法、および当該ベクターを含むキット等を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決すべく、分泌シグナル配列（単に「シグナル配列」ともいう）およびＳＥフラグメント（ビテロゲニンレセプターと結合し、ビテロゲニンタンパク質の卵黄内蓄積に関連するフラグメント）を少なくとも有するニワトリ由来ビテロゲニンタンパク質と、目的タンパク質との融合タンパク質であって、両者間にカテプシンＤ認識領域を有する融合タンパク質を発現し得るようにデザインされたベクターを独自に構築し、当該ベクターをニワトリの肝臓、筋肉および静脈へ導入したところ、当該ニワトリの卵黄内に、目的タンパク質である Enhanced Green Fluorecent Protein （以下「ＥＧＦＰ」という）、またはＥＧＦＰとビテロゲニンタンパク質との融合タンパク質が蓄積されているということを初めて見出した。本発明は上記新規知見に基づき完成されたものである。
【００１０】
すなわち本発明にかかるベクターは、上記課題を解決すべく、鳥類の卵黄内で目的タンパク質を生産するためのベクターであって、プロモーターと、鳥類由来ビテロゲニンタンパク質の内、シグナル配列およびＳＥフラグメントを少なくとも含む領域をコードする遺伝子の３’末端側に、カテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子が連結されてなるポリヌクレオチドとを含み、当該ポリヌクレオチドが、プロモーターに制御可能に連結されていることを特徴としている。
【００１１】
また本発明にかかるベクターは、上記課題を解決すべく、上記鳥類由来ビテロゲニンタンパク質が、ニワトリ由来ビテロゲニンタンパク質であってもよい。
【００１２】
また本発明にかかるベクターは、上記課題を解決すべく、鳥類の卵黄内で目的タンパク質を生産するためのベクターであって、プロモーターと、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの内、配列番号１の１位から２４８位のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチドをコードする遺伝子の３’末端側に、カテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子が連結されてなるポリヌクレオチドとを含み、当該ポリヌクレオチドが、プロモーターに制御可能に連結されていることを特徴としている。
【００１３】
また本発明にかかるベクターは、上記課題を解決すべく、上記カテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子の３’末端側に、精製用タグをコードする遺伝子が連結されていてもよい。
【００１４】
また本発明にかかるベクターは、上記課題を解決すべく、上記精製用タグが、ヒスチジンタグであってもよい。
【００１５】
また本発明にかかるベクターは、上記ベクターにおいて、目的タンパク質をコードする遺伝子が、カテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子の３’末端側に連結されているベクターであってもよい。
【００１６】
一方、本発明にかかる方法は、上記課題を解決するために、鳥類の卵黄内で目的タンパク質を生産する方法であって、上記ベクターを鳥類個体に導入する工程を含むことを特徴としている。
【００１７】
また本発明にかかる方法は、鳥類の卵黄内で目的タンパク質を生産する方法であって、上記本発明かかるベクターと、リポソームまたはリン酸アルミニウムとを同時に、鳥類個体に導入する工程を含むことを特徴とする方法であってもよい。
【００１８】
また本発明にかかる方法は、ベクターが導入された鳥類個体から卵を採取し、当該卵から目的タンパク質または目的タンパク質を含むタンパク質を分離精製する工程を含む方法であってもよい。
【００１９】
また本発明にかかる方法は、分離精製された上記目的タンパク質を含むタンパク質を、カテプシンＤがプロテアーゼ活性を有する温度で保温する工程を含む方法であってもよい。
【００２０】
また本発明にかかる方法は、上記鳥類個体が、ニワトリであることが好ましい。
【００２１】
一方、本発明にかかるキットは、上記課題を解決するために、鳥類の卵黄内で目的タンパク質を生産するためのキットであって、上記本発明にかかるベクターが含まれていることを特徴としている。
【発明の効果】
【００２２】
上記本発明によれば、分泌シグナル配列（単に「シグナル配列」ともいう）およびＳＥフラグメント（ビテロゲニンレセプターと結合し、ビテロゲニンタンパク質の卵黄内蓄積に関連するフラグメント）を少なくとも有するビテロゲニンタンパク質と、目的タンパク質との融合タンパク質であって、両者間にカテプシンＤ認識領域を有する融合タンパク質を、ニワトリをはじめとする鳥類で発現させることが可能となる。上記融合タンパク質は、分泌シグナル配列によって血流中へ分泌され、血流に乗って卵母細胞へと移行し、卵母細胞のビテロゲニンレセプターと融合タンパク質のＳＥフラグメントとの相互作用によって卵母細胞内に取り込まれ、卵母細胞内に蓄積する。蓄積した融合タンパク質は、卵母細胞内のカテプシンＤの作用によって、最終的に目的タンパク質およびビテロゲニンタンパク質が切り出され、卵黄内に目的タンパク質を蓄積させることが可能となる。
【００２３】
それゆえ、本発明は、ニワトリを始めとする鳥類の卵黄に目的タンパク質を蓄積させて、卵黄から目的タンパク質を回収するというタンパク質の生産系の実現に寄与することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２５】
（１．本発明にかかるベクター）
本発明にかかるベクターは、鳥類の卵黄内で目的タンパク質を生産するためのベクターであって、プロモーターと、鳥類由来ビテロゲニンタンパク質の内、シグナル配列およびＳＥフラグメントを少なくとも含む領域をコードする遺伝子の３’末端側に、カテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子が連結されてなるポリヌクレオチドとを含み、当該ポリヌクレオチドが、プロモーターに制御可能に連結されていることを特徴としている。
【００２６】
すなわち、本発明にかかるベクターには、シグナル配列およびＳＥフラグメントを少なくとも含むビテロゲニンタンパク質の一部、またはビテロゲニンタンパク質の全部をコードするポリヌクレオチドを含むものである。ここで「ビテロゲニンタンパク質」とは、ニワトリを始めとする鳥類等の卵生動物における卵黄タンパク質の前駆体であり、当該ビテロゲニンタンパク質は肝臓で合成された後、血流中に分泌され卵巣へと輸送された後、卵母細胞内へ取り込まれ、卵母細胞内のリソソームに局在するアスパラギン酸プロテアーゼ（カテプシンＤ）により、卵黄タンパク質であるリポビテリン−１、ホスビチン、リポビテリン−２、β−リベチンに切断される（例えば、非特許文献８「分子細胞生物学辞典、東京化学同人、p651」、および非特許文献９「Deeley RG, Mullinix DP, Wetekam W, Kronenberg HM, Meyers M, Eldridge JD, Goldberger RF. Vitellogenin synthesis in the avian liver. Vitellogenin is the precursor of the egg yolk phosphoproteins. J Biol Chem. 1975 Dec 10;250(23):9060-6.参照」）。つまり上記ビテロゲニンタンパク質には、リポビテリン−１とホスビチンとの間、ホスビチンとリポビテリン−２との間、およびリポビテリン−２とβ−リベチンとの間の合計３箇所に、カテプシンＤによって認識され切断される領域が存在している。
【００２７】
鳥類由来ビテロゲニンタンパク質としては、例えば配列番号１に示すアミノ酸配列を有するニワトリ由来ビテロゲニンタンパク質が挙げられる。以下、ニワトリ由来ビテロゲニンタンパク質を一例として本発明を説明するが、本発明におけるビテロゲニンタンパク質は上記ニワトリ由来のものに限定されるものではない。すなわち本発明において利用可能なビテロゲニンタンパク質は、鳥類由来であれば特に限定されるものではなく、ニワトリ由来、ウズラ由来、ガチョウ由来、アヒル由来等のものが全て利用可能である。ただしビテロゲニンタンパク質の由来と、本発明にかかるベクターが導入される鳥類とは同一であることが好ましい。例えば、ニワトリ個体に本発明にかかるベクターを導入する場合は、本発明にかかるベクターにはニワトリ由来ビテロゲニンタンパク質をコードする遺伝子が含まれていることが好ましい。本発明にかかるベクターを用いたタンパク質生産は、鳥類が有する卵黄タンパク質の合成系を利用するため、導入されるビテロゲニンタンパク質をコードする遺伝子の由来が、当該遺伝子が導入される鳥類個体と同一であれば、その鳥類個体が本来有する卵黄タンパク質の合成系に適合し易くなる。それゆえ、目的タンパク質を卵黄に確実に蓄積させることが可能となる。なお、上記ニワトリ由来ビテロゲニンタンパク質の全アミノ酸配列（配列番号１）は、NCBIのホームページ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）において、ACCESSION Number：CAA31942に開示されているアミノ酸配列である（非特許文献１０「van het Schip FD, Samallo J, Broos J, Ophuis J, Mojet M, Gruber M, AB G. Nucleotide sequence of a chicken vitellogenin gene and derived amino acid sequence of the encoded yolk precursor protein.J Mol Biol. 1987 Jul 20;196(2):245-60参照」）。
【００２８】
本発明のベクターには、鳥類由来ビテロゲニンタンパク質の内、シグナル配列およびＳＥフラグメントを少なくとも含む領域をコードする遺伝子の３’末端側に、カテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子が連結されてなるポリヌクレオチドが含まれている。ここで「シグナル配列」とは、ビテロゲニンタンパク質の細胞外分泌に関与するアミノ酸配列のことを意味する。上記シグナル配列は、ビテロゲニンタンパク質のＮ末端のメチオニンを起点とする１５ないし３０アミノ酸からなる領域のことを指す。配列番号１に示すアミノ酸配列を有するニワトリ由来ビテロゲニンタンパク質におけるシグナル配列は、１位のＭ（メチオニン）から１５位のＳ（セリン）までであるといわれている。
【００２９】
また本発明のベクターに含まれている「ＳＥフラグメント」とは、ビテロゲニンタンパク質の一部の領域であって、ビテロゲニンタンパク質の卵母細胞への取り込みに関与している領域である。上記ＳＥフラグメントと卵母細胞上のビテロゲニンレセプターとが相互作用することによって、ビテロゲニンタンパク質が卵母細胞内に取り込まれるということが知られている。魚類（Oreochromis aureus ）由来ビテロゲニンタンパク質のＳＥフラグメントについては、例えば非特許文献１１「Ankang Li, Murali Sadasivam, and Jeak Ling Ding, 2003, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol.278, No.5, pp.2799-2806」に記載されている。上記非特許文献１１には、ＳＥフラグメントとは制限酵素ＳａｃＩとＥｃｏＲＩとに挟まれた塩基配列によりコードされたビテロゲニンタンパク質の領域のことであり、当該ＳＥフラグメントはビテロゲニンレセプターに対してビテロゲニン全領域と同等の結合能を持つという事が記載されている。鳥類由来のビテロゲニンタンパク質のＳＥフラグメントはこれまで知られていなかったが、本発明者らは上記文献に記載されている魚類（Oreochromis aureus ）由来ビテロゲニンタンパク質のＳＥフラグメントのアミノ酸配列情報（非特許文献１１  Ｆｉｇ．９参照）を元に、ニワトリ由来ビテロゲニンタンパク質において上記魚類（Oreochromis aureus ）由来ビテロゲニンタンパク質のＳＥフラグメントのアミノ酸配列と相同性の高い領域を検索し、当該領域をニワトリ由来ビテロゲニンタンパク質のＳＥフラグメントとした。よって、本発明における「ＳＥフラグメント」とは、「ＳＥフラグメント」として同定されているもののみならず、魚類（Oreochromis aureus ）由来ビテロゲニンタンパク質のＳＥフラグメントをはじめとする公知のＳＥフラグメントと相同性の高いペプチド鎖（ＳＥフラグメントであると推定されるペプチド鎖）をも含む意味である。上記ＳＥフラグメントについては、非特許文献１１の出版以降、種々報告されている。例えば、「NAOAKI TSUTSUI, HISAKO SAIDO-SAKANAKA, WEI-JUN YANG, VIDYA JAYASANKAR, SAFIAH JASMANI, ATSURO OKUNO, TSUYOSHI OHIRA, TAKUJI OKUMURA, KATSUMI AIDA, and MARCY N. WILDER. Molecular Characterization of a cDNA Encoding Vitellogenin in the Coonstriped Shrimp, Pandalus hypsinotus and Site of Vitellogenin mRNA Expression. JOURNAL OF EXPERIMENTAL ZOOLOGY 301A:802-814 (2004)」には、エビのビテリンにＳＥフラグメントと相同な領域があることが記載されている。また「N. Ohkubo, T. Andoh, K. Mochida, S. Adachi, A. Hara, and T. Matsubara. Deduced primary structure of two forms of vitellogenin in Japanese common goby (Acanthogobius flavimanus). General and Comparative Endocrinology 137 (2004) 19-28. 」には、ハゼ、ニジマス、マツカワ(カレイ科の魚)のＳＥフラグメントを含むリポビテリン−１領域、またはリポビテリン重鎖領域が相同であり、当該領域がビテロゲニンレセプターと結合することが記載されている。また「Marketa Vlasak, Soile Blomqvist, Tapani Hovi, Elizabeth Hewat, and Dieter Blaas. Sequence and Structure of Human Rhinoviruses Reveal the Basis of Receptor Discrimination. JOURNAL OF VIROLOGY, June 2003, p. 6923-6930.」には、ヒトライノウィルス２由来Ｖ１２３タンパク質とヒトの低比重リポタンパク受容体 (LDLR: low-density lipoprotein receptor) との結合が、ビテロゲニンとビテロゲニンレセプターとの結合に類似していることが記載されている。よって上記文献に記載されたＳＥフラグメントの相��領域、類似する領域を、本発明におけるＳＥフラグメントとして利用することが可能である。なお本明細書において「相同性が高い」とは、相同性が４０％以上、好ましくは６０％以上、最も好ましく８０％以上のことを意味する。また他の鳥類由来ビテロゲニンタンパク質のＳＥフラグメントについても、上記と同様に魚類（Oreochromis aureus ）由来ビテロゲニンタンパク質のＳＥフラグメント等をはじめとする公知のＳＥフラグメントのアミノ酸配列の相同性から特定することが可能である。
【００３０】
図１にOreochromis aureus 由来ビテロゲニンタンパク質の全アミノ酸配列（配列番号２）、およびニワトリ由来ビテロゲニンタンパク質の全アミノ酸配列（配列番号１）を示す。図１中の下段のアミノ酸配列はOreochromis aureus 由来ビテロゲニンタンパク質の全アミノ酸配列であり、上段はニワトリ由来ビテロゲニンタンパク質の全アミノ酸配列を示しており、両者間でアミノ酸が一致した箇所を四角囲みで示している。なお図１中のアミノ酸は１文字表記である。またOreochromis aureus 由来ビテロゲニンタンパク質のアミノ酸配列は、NCBIのホームページ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）から入手した（ACCESSION Number：AA027569）。非特許文献１１によれば、Oreochromis aureus 由来ビテロゲニンタンパク質のＳＥフラグメントは、配列番号２における１６２位から２４８位の領域である（非特許文献１１  Ｆｉｇ．９参照）。この情報を元に、配列番号１に示されるニワトリ由来ビテロゲニンタンパク質の全アミノ酸配列において、上記ＳＥフラグメントのアミノ酸配列と相同性が高い領域を検索したところ、当該領域は配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６２位から２４８位の領域であるということが分かった。この時、両者のアミノ酸配列の相同性は、４１．４％であった。
【００３１】
したがって、本発明における「鳥類由来ビテロゲニンタンパク質の内、シグナル配列およびＳＥフラグメントを少なくとも含む領域」とは、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するニワトリ由来ビテロゲニンタンパク質の場合は、配列番号１の１位から２４８位のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチドであるといえる。なお、上記「鳥類由来ビテロゲニンタンパク質の内、シグナル配列およびＳＥフラグメントを少なくとも含む領域」は、配列番号１の１位から２４８位のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチドであればよく、また配列番号１の２４９位以降に示されるアミノ酸配列をさらに含むものであってもよい。
【００３２】
また、本発明における「鳥類由来ビテロゲニンタンパク質の内、シグナル配列およびＳＥフラグメントを少なくとも含む領域をコードする遺伝子」は、鳥類由来ビテロゲニンタンパク質の内、シグナル配列およびＳＥフラグメントを少なくとも含む領域をコードする遺伝子（ポリヌクレオチド）であれば、その塩基配列は特に限定されるものではない。例えば、ニワトリ由来ビテロゲニンタンパク質をコードする遺伝子（以下「ニワトリ由来ビテロゲニン遺伝子」という）の全塩基配列としては、例えば配列番号３に示すものが挙げられる。上記ニワトリ由来ビテロゲニン遺伝子の全塩基配列（配列番号３）は、NCBIのホームページ  ACCESSION Number：X13607に開示されている（非特許文献１０参照）。なお、ニワトリ由来ビテロゲニン遺伝子の塩基配列は、配列番号３に示されるものに限定されない。ここで配列番号３に示される塩基配列を有するニワトリ由来ビテロゲニン遺伝子において、配列番号１の１位から２４８位のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、配列番号３の１４位から２９１５位に示されている。したがって本発明における「鳥類由来ビテロゲニンタンパク質の内、シグナル配列およびＳＥフラグメントを少なくとも含む領域をコードする遺伝子」とは、例えば配列番号３に示される塩基配列を有するニワトリ由来ビテロゲニン遺伝子の少なくとも１４位から２９１５位に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドのこと意味する。なお「鳥類由来ビテロゲニンタンパク質の内、シグナル配列およびＳＥフラグメントを少なくとも含む領域をコードする遺伝子」には、配列番号３における１４位から２９１５位に示される塩基配列以外の塩基配列（１４位以前、２９１５位以降の塩基配列）が含まれていてもよい。なお、本発明の説明において「遺伝子」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡをも包含する意味である。
【００３３】
本発明にかかるベクターには、上記「鳥類由来ビテロゲニンタンパク質の内、シグナル配列およびＳＥフラグメントを少なくとも含む領域をコードする遺伝子」の３’末端側に、カテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子が連結されている。ここで「カテプシンＤ認識領域」とは、カテプシンＤがポリペプチドを切断する際に認識する一定のアミノ酸配列のことを意味する。かかるカテプシンＤ認識領域のアミノ酸配列としては、例えば「Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ」（配列番号４）、「Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ」（配列番号５）、「Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ」（配列番号６）、「Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ」（配列番号７）、「Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ」（配列番号８）、「Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ」（配列番号９）、「Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ」（配列番号１０）、「Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ」（配列番号１１）、「Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ」（配列番号１２）、「Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ」（配列番号１３）、「Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ」（配列番号１４）、「Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ」（配列番号１５）が挙げられる。
【００３４】
上記カテプシンＤ認識領域のうち、「Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ」（配列番号４）、「Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ」（配列番号５）、および「Ｔｒｐ−ＡＳｎ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ」（配列番号６）は、ニワトリ由来カテプシンＤ認識領域のアミノ酸配列である。また上記カテプシンＤ認識領域はニワトリ由来ビテロゲニンタンパク質に含まれるものである。配列番号１に示すアミノ酸配列を有するニワトリ由来ビテロゲニンタンパク質においては、当該タンパク質のＮ末端側から、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するカテプシンＤ認識領域、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するカテプシンＤ認識領域、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するカテプシンＤ認識領域の順序で、各カテプシンＤ認識領域が存在している。
【００３５】
また、「Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ」（配列番号７）は、ウズラおよびウシ由来カテプシンＤ認識領域のアミノ酸配列である（非特許文献１２「Gerhartz B, Auerswald EA, Mentele R, Fritz H, Machleidt W, Kolb HJ, Wittmann J. Proteolytic enzymes in yolk-sac membrane of quail egg. Purification and enzymatic characterisation. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 1997 Sep;118(1):159-66.」参照）。また「Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ」（配列番号８）、および「Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ」（配列番号９）は、ウシ由来カテプシンＤ認識領域のアミノ酸配列である（非特許文献１３「Pohl J, Baudys M, Kostka V. Chromophoric peptide substrates for activity determination of animal aspartic proteinases in the presence of their zymogens: a novel assay. Anal Biochem. 1983 Aug;133(1):104-9.」参照）。また、「Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ」（配列番号１０）はウシ由来のカテプシンＤ認識領域のアミノ酸配列であり、「Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ」（配列番号１１）はブタ由来のカテプシンＤ認識領域のアミノ酸配列であり、「Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ」（配列番号１２）はウシ由来のカテプシンＤ認識領域のアミノ酸配列であり、「Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ」（配列番号１３）はウシおよびヒト由来のカテプシンＤ認識領域のアミノ酸配列であり、「Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ」（配列番号１４）および「Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ」（配列番号１５）は、ヒト由来のカテプシンＤ認識領域のアミノ酸配列である（非特許文献１４「蛋白質分解酵素Ｉ、鶴 大典、船津 勝編、学会出版センター、ｐ77-87」参照）。
【００３６】
本発明にかかるベクターに含まれているカテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子としては、当該ベクターが導入される宿主である鳥類のカテプシンＤによって認識されるカテプシンＤ認識領域であれば、上記例示したカテプシンＤ認識領域またはその他のカテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子が利用可能である。したがって、本発明にかかるベクターをニワトリへ導入する場合には、配列番号４、５、および６に示されるアミノ酸配列を有するカテプシンＤ認識配列が特に好ましいといえる。また、本発明にかかるベクターに含まれるカテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子の具体的な塩基配列は、カテプシンＤ認識領域のアミノ酸領域に対応する塩基配列であれば特に限定されるものではなく、適宜遺伝暗号表（コドン表）を元に塩基配列を決定すればよい。なお、配列番号３に示される塩基配列を有するニワトリ由来ビテロゲニン遺伝子において、配列番号４に示されるカテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子（ポリヌクレオチド）は配列番号３に示される塩基配列の１１１１５位から１１１３５位の塩基配列（aacactgtgctagcagagttt；配列番号１６）であり、配列番号５に示されるカテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子（ポリヌクレオチド）は配列番号３に示される塩基配列の１２２２７位から１２２５０位の塩基配列（catgagatttatcagtatcgcttt；配列番号１７）であり、配列番号６に示されるカテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子（ポリヌクレオチド）は配列番号３に示される塩基配列の１４６５５位から１４６７５位の塩基配列（tggaacgtctttgctgaagcc；配列番号１８）である。本発明にかかるベクターに含まれるカテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子は、例えば公知のＤＮＡ合成機を用いて取得することが可能である。
【００３７】
本発明にかかるベクターにおいては、上記「鳥類由来ビテロゲニンタンパク質の内、シグナル配列およびＳＥフラグメントを少なくとも含む領域をコードする遺伝子」の３’末端側に、上記「カテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子」が連結されている。上記２つの遺伝子の連結は、通常の遺伝子工学的手法を用いて行なうことができる。この時、上記２つの遺伝子の間に、任意の塩基配列が挿入されていてもよい。ただし、上記挿入を行なう場合には、フレームシフトが起こらないように留意する必要がある。なお、「鳥類由来ビテロゲニンタンパク質の内、シグナル配列およびＳＥフラグメントを少なくとも含む領域をコードする遺伝子」に連結する「カテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子」は一つに限定されるものではなく、２つ以上連結されていてもよい。本発明にかかるベクターが２つ以上の「カテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子」を有することによって、複数の目的遺伝子を、それぞれの「カテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子」の３’末端側に連結することができ、目的タンパク質を鳥類の卵中において高濃度に蓄積させたり、複数種類の目的タンパク質を同時に卵中に蓄積させたりすることが可能となる。
【００３８】
また本発明でいう「鳥類由来ビテロゲニンタンパク質の内、シグナル配列およびＳＥフラグメントを少なくとも含む領域をコードする遺伝子の３’末端側に、カテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子が連結されてなるポリヌクレオチド」は、シグナル配列、ＳＥフラグメントおよびカテプシンＤ認識領域を含む、天然型のビテロゲニンタンパク質の一部または全部をコードする遺伝子であってもよい。例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１位から１１１４位までのアミノ酸配列を有するニワトリ由来ビテロゲニンタンパク質をコードするビテロゲニン遺伝子（配列番号３の１４位から１１１３５位）が本発明にかかるベクターに含まれていれば、シグナル配列、ＳＥフラグメント、および１つのカテプシンＤ認識領域を含むタンパク質を発現させることができる。
【００３９】
本発明にかかるベクターに含まれるプロモーターは、当該ベクターが導入される鳥類細胞内において機能するものであれば特に限定されるものではなく、誘導型プロモ−ターであっても、非誘導型プロモーターであってもよい。上記プロモーターとしては、従来公知のプロモーターを適宜用いることができ、例えば誘導型のプロモーターとしては、テトラサイクリンによる誘導を行なうTet System（クロンテック社製）、ＩＰＴＧによる誘導を行なうLacプロモーター等、また非誘導型プロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＣＡＧプロモーター、Ｃｘプロモーター、ユビキチンプロモーター等が利用可能である。
【００４０】
また本発明にかかるベクターは、上記のカテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子の３’末端側に、ヒスチジンタグ等の精製用タグをコードする遺伝子（ポリヌクレオチド）が連結されていてもよい。カテプシンＤによって切り出された目的タンパク質を、当該精製用タグによって容易に回収および精製を行なうことができる。例えば上記ヒスチジンタグは、ニッケルカラムを用いて容易に目的の外来タンパク質を回収および精製することができる。また精製用タグは、従来公知のものを適宜選択の上、用いればよく、上記ヒスチジンタグのほか、ＧＳＴ(glutathion S transferase)タグ、ＦＬＡＧタグ、Ｖ５タグ、ｍｙｃタグ、チオレドキシンタグ、AviｔagTM等が利用可能である（例えば、非特許文献１５「先端バイオ用語集、羊土社ｐ15-20」参照）。上記精製用タグをコードする遺伝子を本発明のベクターへ連結する方法については、特に限定されるものではなく、通常の遺伝子工学的手法を用いて行なうことができる。
【００４１】
本発明にかかるベクターを用いてタンパク質の生産を行なう場合は、目的遺伝子を当該ベクター内のカテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子の３’末端側に連結して使用する。目的遺伝子の挿入位置は、カテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子の３’末端側であれば特に限定されるものではなく、例えば、本発明にかかるベクターが精製用タグをコードする遺伝子を含む場合において、目的遺伝子は当該精製用タグをコードする遺伝子の３’末端側に連結しても、５’末端側に連結してもよい。
【００４２】
また本発明にかかるベクターが、既述のように２つ以上の「カテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子」を有する場合、「カテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子」と「カテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子」との間に精製用タグをコードする遺伝子が連結されていることが好ましい。かかる構成のベクターを用いて目的タンパク質の生産を行なう場合は、目的遺伝子を「カテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子」と「カテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子」との間に挿入して行なえばよい。この時、精製用タグをコードする遺伝子と目的遺伝子との位置関係は、目的遺伝子が当該精製用タグをコードする遺伝子の３’末端側または、５’末端側のいずれに挿入されていてもよい。本発明にかかるベクターが上記構成を備えることによって、複数の目的遺伝子を、それぞれの「カテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子」の３’末端側に連結することができ、目的タンパク質を鳥類の卵中において高濃度に蓄積させたり、複数種類の目的タンパク質を同時に卵中に蓄積させたりすることが可能となる。
【００４３】
ここで上記「目的遺伝子」とは、目的遺伝子が導入される鳥類個体が元来有していないタンパク質をコードする遺伝子のみならず、元来有しているタンパク質をコードする遺伝子をも含む意味である。なお本発明にかかるベクターに目的遺伝子を連結する方法については、特に限定されるものではなく、通常の遺伝子工学的手法を用いればよい。
【００４４】
なお、本発明にかかるベクターには、当該ベクターを大腸菌等の微生物へ導入し、当該微生物内で大量調製ができるように、ＤＮＡ複製開始点ori配列、形質転換体の選抜のための薬剤耐性遺伝子等の選択マーカー遺伝子等が含まれていてもよい。また目的遺伝子を本発明にかかるベクターに導入するためのマルチクローニングサイトが含まれていてもよい。上記のごとくマルチクローニングサイトが本発明にかかるベクターに含まれることによって、目的遺伝子を該ベクターへ容易に導入することができる。
【００４５】
また本発明にかかるベクターは、従来公知のベクターを適宜選抜の上、それを基本骨格として構築してもよい。よって本発明にかかるベクターには、従来公知のベクター由来のＤＮＡセグメント（ポリＡ付加シグナル、ヒスチジンタグ等の精製用タグ、薬剤耐性マーカー、myc epitope等の検出用タグ）が含まれていてもよい。また本発明にかかるベクターは、サーキュラー状であっても、リニア状であってもよい。
【００４６】
（２．本発明にかかるタンパク質の生産方法）
本発明にかかるタンパク質の生産方法は、鳥類の卵黄内で目的タンパク質を生産する方法であって、上記本発明にかかるベクターを鳥類個体に導入する工程（以下「導入工程」という）を含むことを特徴としている。上記説示したとおり、本発明にかかるべクターは、シグナル配列およびＳＥフラグメントを少なくとも有するビテロゲニンタンパク質と、目的タンパク質との融合タンパク質であって、両者間にカテプシンＤ認識領域を有する融合タンパク質を、ニワトリをはじめとする鳥類細胞内で発現させることが可能となる。上記融合タンパク質は、分泌シグナル配列によって血流中へ分泌され、血流に乗って卵母細胞へと移行し、卵母細胞のビテロゲニンレセプターと融合タンパク質のＳＥフラグメントとの相互作用によって卵母細胞内に取り込まれ、卵母細胞内に蓄積する。蓄積した融合タンパク質は、卵母細胞内のカテプシンＤの作用によって、最終的に目的タンパク質およびビテロゲニンタンパク質が切り出され、卵黄内に目的タンパク質を蓄積させることが可能となる。すなわち本発明にかかるタンパク質の生産方法は鳥類が有する卵黄タンパク質の合成系を利用して、目的タンパク質を卵黄内に蓄積させるというものである。
【００４７】
本発明者らは、本発明にかかるベクターを独自に構築し、当該ベクターをニワトリ個体に導入したところ、ビテロゲニンタンパク質が合成される肝臓や、ビトロゲニンタンパク質の卵母細胞への移行に関与する静脈のみならず、筋肉へ導入した場合であっても、目的タンパク質が卵黄内に蓄積するということを初めて見出した。よって、本発明にかかるベクターによれば、ベクターが導入される場所（器官）によらず、目的タンパク質を卵黄内に蓄積することができるという効果を得ることができる。なお、上記効果は当業者が予想しうる程度のものではない。
【００４８】
以下、本発明にかかるタンパク質の生産方法の「導入工程」を説明する。なお本発明はこれに限定されるものではない。
【００４９】
＜導入工程＞
本発明における「導入工程」は、本発明にかかるベクターであって目的遺伝子を含むベクター（便宜上「ベクター」という）を鳥類個体に導入する工程である。上記の通り、本発明にかかるベクターは、それが導入される場所（器官）によらず、目的タンパク質を卵黄内に蓄積させることができる。したがって、上記ベクターが鳥類個体内に導入される方法であれば、本「導入工程」の具体的な実施方法は特に限定されるものではない。
【００５０】
例えば、上記ベクターを鳥類（静脈、筋肉等）へ注射により導入すればよい。鳥類個体へ導入するベクター量の好ましい範囲は、ベクターを導入する鳥類の種類や体重、導入されるベクターのサイズ等によって異なるために限定されるものではなく、好ましい条件を適宜検討の上、採用すればよい。本発明者らの検討によれば、約８２００ｂｐのベクターをニワトリ成体へ導入する場合は、１μｇ以上５００００μｇ未満が好ましく、５０μｇ以上１００００μｇ未満がさらに好ましく、１００μｇ以上１０００μｇ未満が最も好ましい。上記好ましい範囲を超えるとニワトリ個体の生命へ悪影響をおよぼす場合があり、目的タンパク質を卵黄内に蓄積させることができなくなる。一方、上記好ましい範囲以下であると、ニワトリ個体内で目的タンパク質およびビテロゲニンタンパク質（一部または全部）を含む融合タンパク質が発現しなくなる、または発現量が少なくなる。その結果、目的タンパク質が卵黄内に蓄積させることができなくなる。
【００５１】
また上記のごとく、ベクターを注射により鳥類個体に導入する場合、ベクターを水、生理食塩水、または緩衝液に溶解して導入することが好ましい。上記緩衝液としては、リン酸緩衝液（ｐＨ７〜８）等が利用可能である。またベクターを注射により鳥類個体に導入する際に、ベクターと、リポソームまたはリン酸アルミニウムとを混合して、両者を同時に導入することが好ましい。上記のようにすることで、鳥類細胞へのベクターの導入効率が向上するからである。なおリン酸アルミニウムとベクターとを混合して宿主細胞へ導入した場合の効果については非特許文献１６「Miguel Rosado-Vallado, Mirza Mut-Martin, Maria del Rosario Garcia-Miss and Eric Dumonteil, “Aluminium phosphate potentiates the efficacy of DNA vaccines against Leishmania mexicana”Vaccine, Volume 23, Issues 46-47, 2005, Pages 5372-5379 」に記載されている。また市販のリポフェクション用リージェントとベクターとを混合して鳥類個体に導入してもよい。上記市販のリポフェクション用のリージェントとしては、例えばPolyFect Transfection Reagent （商品名、Qiagen社製）、Lipofectamine （商品名、Invitrogen社製）、Lipofectin （商品名、Invitrogen社製）等が好適に利用可能である。
【００５２】
本発明における「導入工程」は、上記方法に限られず、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法等の公知の方法を適宜選択の上、利用して実施してもよい。
【００５３】
また上記ベクターが導入される鳥類個体は、特に限定されるものではないが、ニワトリ個体が好ましい。ニワトリは、ほぼ毎日卵を産むという性質を有していること、これまでにニワトリの大量飼育技術および大量飼育設備等が既に完成していること等の理由により、目的タンパク質の大量生産に好適だからである。
【００５４】
上記導入工程後は、ベクターが導入された鳥類（例えばニワトリ）の卵を採取すれば、当該卵の卵黄中に目的タンパク質が蓄積しているため、当該卵黄から適宜目的タンパク質を分離および精製すれば、目的タンパク質を取得することができる。よって、本発明にかかるタンパク質の生産方法には、鳥類個体から卵を採取する工程（採取工程）や、卵から目的タンパク質、または目的タンパク質を含むタンパク質（すなわち、目的タンパク質およびビテロゲニンタンパク質（一部または全部）を含む融合タンパク質）を分離および精製する工程（分離精製工程）が含まれていてもよい。また分離精製工程によって取得した目的タンパク質または目的タンパク質を含むタンパク質を、カテプシンＤがプロテアーゼ活性を有する温度で保温する工程（保温工程）が含まれていてもよい。以下に「採取工程」、「分離精製工程」、および「保温工程」を説示する。
【００５５】
＜採取工程＞
「採取工程」は、導入工程の翌日以降に、導入工程を経た鳥類個体（例えばニワトリ）から卵を採取する工程である。卵の採取方法は特に限定されるものではなく、鳥類個体が産卵した卵を採取してもよいし、切開手術により体内から卵（卵黄）を採取してもよい。ただし、切開手術を行なう方法は所望のタイミングで目的タンパク質を回収することができるというメリットを有しているが、切開手術の操作が煩雑であること、および鳥類個体を傷つける場合があり永続して目的タンパク質の生産を行なうことが困難な場合があること等の理由により、上記「採取工程」は、鳥類個体が自然に産卵した卵を回収する方法にて実施することが好ましい。
【００５６】
なお「導入工程」後の翌日以降であれば、目的タンパク質が既に卵黄内に蓄積しているため、採取工程は「導入工程」後の翌日以降に行なえばよい。ただし、ニワトリの卵黄は排卵約２４時間後に産卵される為、目的タンパク質の生産量が安定するのは導入工程の翌々日以後であり、導入工程の翌々日以後に採取工程を行なうことがさらに好ましい。
【００５７】
＜分離精製工程＞
「分離精製工程」は採取工程によって採取した卵（卵黄）から、目的タンパク質を分離精製する工程である。上記「分離精製工程」は、目的タンパク質を卵（卵黄）から分離精製することができる方法であれば特に限定されるものではなく、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、等のタンパク精製法として従来公知の方法を適宜選択の上、実施すればよい。また目的タンパク質を回収する際に、卵白と卵黄を分離する必要は特にないが、夾雑タンパク質が少なくなり生成効率が高くなるために、卵から卵黄を回収して、分離精製工程を行なうことが好ましい。卵黄を回収は公知の方法にて適宜実施すればよい。また本発明者らの検討によって、目的タンパク質は卵黄の脂質画分に存在することが分かっている（後述する実施例参照）。よって卵（または卵黄）から脂質画分を回収して、分離精製工程を行なうことが、精製効率の向上の観点から好ましい。脂質画分の回収方法は、水溶性画分と脂質画分の分離方法として従来公知の方法を適宜採用すればよい。また、脂質画分の回収は市販されているキットを利用して行なうことも可能である。上記キットとしては、例えばEggcelent Chicken IgY Purification Kit(PIERE社製)が挙げられる。
【００５８】
またカテプシンＤ認識領域をコードする遺伝子の３’末端側に、ヒスチジンタグ等の精製用タグをコードするポリヌクレオチドが連結されたベクターが鳥類（例えばニワトリ）に連結されている場合には、目的タンパク質を当該精製用タグによって容易に分離および精製を行なうことができる。精製の方法はその精製用タグに応じた最適な方法を採用すればよい。例えば上記ヒスチジンタグは、ニッケルカラムを用いて容易に目的タンパク質を分離および精製することができる。より具体的には、卵（卵黄）溶液をリン酸水素ナトリウム溶液(50 mM NaH2PO4, 500 mM NaCl, pH8.0)等の適当な緩衝液で希釈し、当該卵（卵黄）溶液をニッケルカラムに通し、レジンに吸着した目的タンパク質を溶出すればよい。
【００５９】
＜保温工程＞
「保温工程」は分離精製工程によって取得した目的タンパク質を含むタンパク質を、カテプシンＤがプロテアーゼ活性を有する温度で保温する工程である。「保温工程」によれば、卵黄中においてビテロゲニンタンパク質と目的タンパク質との融合タンパク質として残存するタンパク質から、目的タンパク質を切り出すことができ、目的タンパク質の回収量を向上させることができる。
【００６０】
上記「カテプシンＤがプロテアーゼ活性を有する温度」としては、カテプシンＤがプロテアーゼとして機能する温度であれば特に限定されるものでない。よって上記温度としては２０℃から４０℃であればよい。また室温であってもよい。ただし、目的タンパク質を効率良く融合タンパク質から切り出すためには、上記温度はカテプシンＤの反応至適温度（３７℃）であることがより好ましい。
【００６１】
また保温工程における目的タンパク質を含むタンパク質の保温時間の好ましい条件については、保温温度に因るため特に限定されるものではない。例えば上記カテプシンＤの反応至適温度で保温する場合には、３０分から１６時間保温を行なえば十分である。必要以上に保温すると、目的タンパク質が夾雑するエンドペプチダーゼ等によって切断されてしまう可能性がある。なお「保温工程」は、温度調節が可能なインキュベーターを用いて行なってもよいし、室温で静置することにより行なってもよい。
【００６２】
（３．本発明にかかるキット）
本発明にかかるキットは、上記課題を解決するために、鳥類の卵黄内で目的タンパク質を生産するためのキットであって、上記本発明にかかるベクターが含まれていることを特徴としている。上記キットを用いることによって、簡便に、ニワトリをはじめとする鳥類の卵黄内に目的タンパク質を蓄積させることが可能となる。
【００６３】
上記本発明にかかるキットは、本発明にかかるベクターを含むものであるため、本発明にかかるタンパク質の生産方法を実施するために利用することが可能である。よって本発明にかかるキットには、上記本発明にかかるベクター以外に、本発明にかかるタンパク質の生産方法を実施するために必要な試薬および器具等が含まれていてもよい。より具体的には、本発明にかかるキットには、上記のほか、ベクターに目的遺伝子を導入するために必要な器具および試薬類、ベクターを鳥類個体へ導入するために必要な器具および試薬類、目的タンパク質を分離精製するために必要な器具および試薬類、等が含まれていてもよい。上記目的遺伝子をベクターへ導入するために必要な器具および試薬類としては、例えば、サーマルサイクラー、チューブ、制限酵素、緩衝液等が挙げられる。また、ベクターを鳥類個体へ導入するために必要な器具および試薬類としては、生理食塩水、緩衝液、リポソーム、リポフェクション用リージェント、リン酸アルミニウム、エレクトロポレーター等が挙げられる。またタンパク質を分離精製するために必要な器具・試薬類としては、イオン交換樹脂を含むイオン交換カラム等の各種カラム類、電気泳動装置、アガロースゲル、ニッケルカラム等の精製用カラム、緩衝液等が挙げられる。
【００６４】
なお本発明にかかるキットに含まれるベクターは、目的遺伝子が既に挿入されているものであっても、挿入されていないものであってもよい。目的遺伝子が挿入されていないベクターが本発明にかかるタンパク質生産キットに含まれている場合には、本発明のキットを使用する者が、目的遺伝子を挿入して使用すればよい。また目的遺伝子が既に本発明にかかるベクターに挿入されている場合は、本発明にかかるキットを使用する者が必要に応じて、既に挿入されている目的遺伝子と、所望の目的遺伝子とを置換して使用すればよい。
【００６５】
なお、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様および以下の実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、当業者は、本発明の精神および添付の特許請求の範囲内で変更して実施することができる。
【００６６】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００６７】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００６８】
〔実施例１〕
（方法）
＜ベクターの構築＞
図２に本実施例にかかるベクターpEF-VTG-catD-GFP-polyAの構築方法、および当該ベクターの構造を示した。pEF/Bsd（invitrogen社製）をベースとして用い、当該pEF/BsdをＫｐｎＩおよびＳｐｈＩで消化し、以下に示す融合タンパク質をコードする遺伝子を挿入してpEF-VTG-catD-GFPを構築した。pEF-VTG-catD-GFPは、Human EF-1α promoter、ｐUC ori、およびAmpicillin耐性遺伝子を含み、融合タンパク質をコードする遺伝子がHuman EF-1α promoter に制御可能に連結されている。
【００６９】
融合タンパク質をコードする遺伝子は、５’末端側から(1)シグナル配列およびＳＥフラグメントを含むビテロゲニンタンパク質の一部をコードする遺伝子、(2)カテプシンＤ認識領域（Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ：配列番号４）をコードする遺伝子、(3)６×Ｈｉｓをコードする遺伝子、(4)ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）遺伝子、および(5)β-globin polyA signal配列（図２中「polyA signal」で示す）の順で連結されてなるものである。
【００７０】
上記(1)シグナル配列およびＳＥフラグメントを含むビテロゲニンタンパク質の一部をコードする遺伝子は、ニワトリ由来ビテロゲニン遺伝子のExon 1のスタートコドンからExon 6までのゲノム塩基配列（すなわち配列番号３に示す塩基配列を有するニワトリ由来ビテロゲニン遺伝子の１４位から２９１５位の塩基配列）であり、ニワトリの赤血球から抽出したゲノムを鋳型として、ＰＣＲ法により目的の遺伝子領域の塩基配列を増幅することによって取得された。
【００７１】
また上記(2)カテプシンＤ認識領域（Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ：配列番号４）をコードする遺伝子は、「aacactgtgctagcagagttt：配列番号１６」の塩基配列を有する遺伝子である。当該遺伝子は、ニワトリの赤血球から抽出したゲノムを鋳型として、ＰＣＲ法により目的の遺伝子領域の塩基配列を増幅することによって取得された。
【００７２】
また上記(3)６×Ｈｉｓをコードする遺伝子は、「遺伝暗号(コドン)表」に記載された塩基配列を有する遺伝子であり、ＧＦＰ遺伝子を増幅する際のプライマーに付加することによって取得された。
【００７３】
また上記(4)ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）遺伝子は、「Digest 1 of pIRES2-EGFP: 5308 bases (circular)」（クロンテック社のホームページよりダウンロードしたファイル）に記載された塩基配列を有する遺伝子であり、pIRES2-EGFPベクター(クロンテック社)を鋳型にＰＣＲ法により目的の遺伝子領域の塩基配列を増幅することによって取得した。本ベクターに組み込まれたＧＦＰのアミノ酸配列は元のＥＧＦＰと比べて１アミノ酸変異している（Ｄ→Ｇ）がＧＦＰの発光反応および抗ＧＦＰ抗体に影響を与えるものではないことを発明者らは確認している。
【００７４】
また上記(5)β-globin polyA signal配列は、「Digest 1 of pTRE2-Hyg.txt: 5325 bases (circular)」(クロンテック社のホームページよりダウンロードしたファイル)に記載された塩基配列を有する遺伝子であり、pTRE2hygベクター(クロンテック社)を鋳型にＰＣＲ法により目的の遺伝子領域の塩基配列を増幅することによって取得された。
【００７５】
なお、上記融合タンパク質をコードする遺伝子は、ニワトリ由来ビテロゲニン遺伝子のExon 1のスタートコドンからExon 6までのゲノム塩基配列の５’末端に制限酵素ＫｐｎＩサイトを、３’末端に制限酵素ＳａｌＩサイトを付加した遺伝子断片を、制限酵素ＫｐｎＩとＳａｌＩで切断したpEF/Bsdベクターへクローニングし、pEF/Bsd-VTGベクターを作製した。続いて、５’末端に制限酵素ＳａｌＩサイトを、３’末端に制限酵素ＳｐｈＩサイトを付加したカテプシンＤ認識領域、ヒスチジンタグ、ＧＦＰ遺伝子からなるＤＮＡ断片を、制限酵素ＳａｌＩとＳｐｈＩとで切断したpEF/Bsd-VTGベクターへ、クローニングすることで、pEF-VTG-catD-GFPベクターを作製した。続いて、５’末端と３’末端に制限酵素ＳｐｈＩサイトを付加したベータグロビン遺伝子のポリＡ付加シグナル（β-globin polyA signal配列）からなるＤＮＡ断片を、制限酵素ＳｐｈＩで切断したpEF/Bsd-VTG-catD-GFPベクターへクローニングすることで、pEF-VTG-catD-GFP-polyAベクターを作製した。pEF/Bsd（invitrogen社製）ＫｐｎＩ−ＳｐｈＩサイトに挿入された遺伝子断片の塩基配列を配列番号２０に示した。配列番号２０に示す遺伝子断片は、５’末端側から制限酵素 ＫｐｎＩサイト、Kozak配列、開始コドン（ATG）、ビテロゲニン遺伝子（Exon１、Intron、Exon 2、Intron、Exon 3、Intron、Exon 4、Intron、Exon 5、Intron、Exon 6）、制限酵素 ＳａｌＩサイト、カテプシンＤ認識配列(配列番号４)、６×Ｈｉｓをコードする遺伝子、ＧＦＰ遺伝子、ストップコドン（TAA）、制限酵素 ＳｐｈＩサイト、ベータグロビンポリＡ付加シグナル配列領域、制限酵素 ＳｐｈＩサイトの順で連結されてなるものである。
【００７６】
また上記pEF-VTG-catD-GFP-polyAベクターから発現する融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１９）を図３に示し、その模式図を図４に示した。図３に示すアミノ酸配列において、シグナル配列、ＳＥフラグメント、カテプシンＤ認識領域、６×Ｈｉｓ、およびＧＦＰの位置に下線を引き、それぞれを「signal sequence」、「SE-fragment」、「catD sequence」、「6×His」、および「GFP」で示した。図４においては、ビテロゲニンタンパク質の一部、シグナル配列、ＳＥフラグメント、カテプシンＤ認識領域、６×Ｈｉｓ、およびＧＦＰのそれぞれを「Partial vitellogenin」、「signal sequence」、「SE-fragment」、「catD sequence」、「6×His」、および「GFP」で示した。
【００７７】
＜ニワトリへの遺伝子導入＞
構築したpEF-VTG-catD-GFP polyA  １００μｇとPolyFect Transfection Reagent （Qiagen社製）１００μｌとを混合し、ニワトリ（雌）の翼下静脈へ注射した（注射量５０ｍｌ）。
【００７８】
ベクター投与後１５日後に上記ニワトリを切開し、体内より卵黄を摘出した。
【００７９】
＜ＧＦＰの精製＞
摘出した卵黄をEggcelent Chicken IgY Purification Kit(PIERE社製)のマニュアルに準じて脂質画分を抽出した。具体的には４℃に冷やした卵黄重量１に対し、４℃に冷やしたDelipidation Bufferを５倍量の加え、攪拌し４℃に静置した。その後、遠心分離により水溶性画分と脂質画分とに分画し、脂質画分を回収した。
【００８０】
次に上記脂質画分より、ProBond Nickel-Chelating Resin (Invitrogen社製)を用いてＧＦＰの精製を行なった。精製方法は付属のマニュアルに準じて行なった。
【００８１】
＜ＧＦＰの検出＞
上記において精製した画分をウェスタンブロットに供した。より具体的には、精製した画分を12.5％アクリルアミドゲル電気泳動に供した後、ポリビニル膜へ転写し、抗ＧＦＰ抗体（クロンテック社製）で検出を行なった。
【００８２】
（結果）
精製した画分について、ウェスタンブロット法によりＧＦＰの検出を行なった結果を図５に示す。図５における各レーンは図に示すとおりである。ここで「Elution fraction 1」、「Elution fraction 2」、および「Elution fraction 3」は、それぞれニッケルカラムについて溶出を１回行なった際に回収された溶出画分、同ニッケルカラムについてもう一度溶出を行なった際に回収された溶出画分、同ニッケルカラムについてさらにもう一度溶出を行なった際に回収された溶出画分のことを意味する。上記の各画分について、３倍希釈したサンプルおよび９倍希釈したサンプルについても、同時にＧＦＰの検出を行なった。また同図中の矢印Ａは陽性対照として用いたPosiTope control Protein (25ng、53kD)の位置を示し、矢印Ｂは融合タンパク質（fusion protein of partial VTG and GFP、55kD）の位置を示し、矢印ＣおよびＤはＧＦＰ（27kD）の位置を示している。
【００８３】
図５の結果によれば、構築したベクターpEF-VTG-catD-GFP polyAをニワトリの静脈へ注射した場合に、目的タンパク質であるＧＦＰがビテロゲニンタンパク質から切断された状態で卵黄内に蓄積しているということが分かった。
【００８４】
なおビテロゲニンタンパク質から切断されたＧＦＰが異なる２つの分子量で検出された（図５矢印Ｃ、Ｄ参照）。この原因は明らかではないが、糖鎖付加などの翻訳後修飾の影響の可能性が考えられた。
【００８５】
〔実施例２〕
（方法）
＜ベクター＞
実施例１と同様のものを用いた。
【００８６】
＜ニワトリへの遺伝子導入＞
構築したpEF-VTG-catD-GFP polyA  ５００μｇとPolyFect Transfection Reagent （Qiagen社製）２５０ｍｌとを混合し、ニワトリ（雌）の肝臓へ注射した（結果において「ニワトリＡ」と表記する）。
【００８７】
構築したpEF-VTG-catD-GFP polyA  １０００μｇとPolyFect Transfection Reagent （Qiagen社製）５００ｍｌとを混合し、ニワトリ（雌）の肝臓へ注射した（結果において「ニワトリＢ」と表記する）。
【００８８】
構築したpEF-VTG-catD-GFP polyA  １０００μｇと４．５％（ｗ／ｖ）リン酸アルミニウム水溶液１０μｌとを混合し、ニワトリ（雌）の胸筋へ注射した（結果において「ニワトリＣ」と表記する）。
【００８９】
構築したpEF-VTG-catD-GFP polyA  １００μｇと４．５％（ｗ／ｖ）リン酸アルミニウム水溶液１μｌとを混合し、ニワトリ（雌）の胸筋へ注射した（結果において「ニワトリＤ」と表記する）。
【００９０】
べクター投与後６日後に上記ニワトリを切開し、体内より卵黄を摘出した。ニワトリＢについては、ベクター投与後２日後および５日後に各ニワトリが生んだ卵を回収した。またベクター投与前のニワトリが産んだ卵を回収し、陰性対照として用いた。
【００９１】
＜ＧＦＰの精製＞
回収した各卵から卵黄を分離した。
【００９２】
実施例１に記載の方法と同様にして、上記各卵黄を水溶性画分と脂質画分とに分画した。
【００９３】
次に上記水溶性画分および脂質画分をProBond Nickel-Chelating Resin (Invitrogen社製)に供し、吸着タンパク質を回収した。精製方法は付属のマニュアルに準じて行なった。
【００９４】
＜ＧＦＰの検出＞
上記において精製したタンパク質をウェスタンブロットに供した。より具体的には、精製した画分を12.5％アクリルアミドゲル電気泳動に供した後、ポリビニル膜へ転写し、抗ＧＦＰ抗体（クロンテック社製）で検出を行なった。
【００９５】
なお精製したタンパク質を室温で２時間静置したものも上記と同様にして、ＧＦＰの検出を行なった。
【００９６】
（結果）
精製タンパク質について、ウェスタンブロット法によりＧＦＰの検出を行なった結果を図６に示す。また精製タンパク質を２時間静置したサンプルについての結果を図７に示す。また同図中の矢印Ａは陽性対照として用いたPosiTope control Protein (25ng、53kD)の位置を示し、矢印Ｂは融合タンパク質（fusion protein of partial VTG and GFP、55kD）の位置を示し、矢印ＣおよびＤはＧＦＰ（27kD）の位置を示している。
【００９７】
図６において、ニワトリＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄの卵および摘出卵黄の脂質画分について、融合タンパク質のシグナルが確認された。一方、水溶性画分および陰性対照では上記シグナルが確認されなかった。よって構築したベクターpEF-VTG-catD-GFPをニワトリの肝臓および筋肉へ注射することによって、目的タンパク質であるＧＦＰがビテロゲニンタンパク質の融合タンパク質の状態で卵黄内に蓄積させることができるということが分かった。
【００９８】
また、図７において、ニワトリＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄの卵および摘出卵黄の脂質画分について、ＧＦＰのシグナルが確認された。よって、精製タンパク質を室温で２時間静置することによって、融合タンパク質から目的タンパク質であるＧＦＰとビテロゲニンタンパク質とが切断されるということが分かった。上記の切断は内在するプロテアーゼの影響によるものと考えられる。
【００９９】
なお実施例１の結果と同様、ＧＦＰが異なる２つの分子量で検出された（図７矢印Ｃ、Ｄ参照）。この原因は明らかではないが、糖鎖付加などの翻訳後修飾の影響の可能性が考えられた。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
以上説示したように、本発明によれば、卵黄内に目的タンパク質を蓄積させることができ、ニワトリをはじめとする鳥類を用いて有用タンパク質を大量に生産することが可能となる。よって、本発明は、医薬品産業、酵素産業等タンパク質の生産に関与する産業に広く用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】Oreochromis aureus 由来ビテロゲニンタンパク質の全アミノ酸配列（配列番号２）、およびニワトリ由来ビテロゲニンタンパク質の全アミノ酸配列（配列番号１）を比較した結果を示す図である。
【図２】実施例において使用するpEF-VTG-catD-GFP-polyAの構築方法、および当該ベクターの構造を示す図である。
【図３】実施例において、pEF-VTG-catD-GFPが導入されたニワトリ内で発現する融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図４】実施例において、pEF-VTG-catD-GFPが導入されたニワトリ内で発現する融合タンパク質の構造を示す模式図である。
【図５】実施例１において、精製した画分について、ウェスタンブロット法によりＧＦＰの検出を行なった結果を示す図である。
【図６】実施例２において、精製タンパク質（室温での静置無し）について、ウェスタンブロット法によりＧＦＰの検出を行なった結果を示す図である。
【図７】実施例２において、精製タンパク質（室温での静置有り）について、ウェスタンブロット法によりＧＦＰの検出を行なった結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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