(57)【要約】本発明は、ＴＲＥＭ−１の可溶性レセプター改変体に関する。より詳細には、本発明は、ＴＲＥＭ−１の改変体を投与することにより免疫応答を調節する方法に関する。骨髄細胞活性化を減少するおよび／または増加させるために、動物に化合物を投与する工程を包含する、免疫応答を調節する方法である。骨髄細胞活性化は、炎症応答を調節するために減少され、そして骨髄細胞活性化は、腫瘍の免疫化を亢進するために増加される。特定の実施形態において、免疫応答は、炎症応答である。骨髄細胞活性における減少は、ＤＡＰ１２／ＴＲＥＭ−１複合体の活性の減少を含む。特に、化合物は、ＴＲＥＭ−１に対するリガンドの競合的インヒビターである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫応答を調節する方法であって、化合物を動物に投与して骨髄性細胞活性化を減少させる工程を包含し、ここで該減少が、ＤＡＰ１２／ＴＲＥＭ−１複合体の活性を減少させる工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記化合物がＴＲＥＭ−１に対するリガンドの競合的インヒビターである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記競合的インヒビターが、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記インヒビターが、配列番号２のアミノ酸配列の機能的等価物である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記免疫応答が、炎症性応答である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物が、ＴＲＥＭ−１ｓｖのレベルを増加する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
骨髄性細胞活性化を減少させる方法であって、動物に化合物を投与して、ＤＡＰ１２／ＴＲＥＭ−１複合体の活性を減少させる工程を包含する、方法。
【請求項８】
前記化合物が、ＴＲＥＭ−１のリガンドの競合的インヒビターである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記競合的インヒビターが、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記競合的インヒビターが、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドの機能的等価物である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記競合的インヒビターが、薬学的キャリアと混合される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
疾患または状態に罹患した被験体において炎症性応答を調節する方法であって、ここで該疾患または状態が、炎症を引き起こし、該方法は、ＤＡＰ１２／ＴＲＥＭ−１複合体の活性を変更する工程を包含する、方法。
【請求項１３】
前記変更する工程が、ＴＲＥＭ−１に対するリガンドの結合を調節する工程を包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記結合を調節する工程が、ＴＲＥＭ−１のリガンドの競合的インヒビターを投与する工程を包含し、ここで該競合的インヒビターが、配列番号２またはその機能的等価物を含むポリペプチドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記疾患または状態が、臓器移植／臓器拒絶、骨髄移植／骨髄拒絶、対宿主性移植片病、感染症、自己免疫疾患からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記感染症が、敗血症性関節炎または敗血症性ショックである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記結合を調節する工程が、ＴＲＥＭ−１ｓｖのレベルを増加する化合物を投与する工程を包含し、ここでＴＲＥＭ−１ｓｖが、ＴＲＥＭ−１のリガンドに対する競合リガンドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
炎症を処置する方法であって、配列番号２のポリペプチドまたはその機能的等価物と混合された薬学的キャリアを含む化合物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１９】
自己免疫障害を処置する方法であって、炎症応答を調節する工程を包含し、ここで、該調節する工程が、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的等価物を含む化合物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２０】
前記自己免疫障害が、慢性関節リウマチ、狼瘡および強皮症からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリペプチドが、ＤＡＰ１２／ＴＲＥＭ−１複合体の活性を調節する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
組織治癒／組織修復を調節する方法であって、炎症性応答を減少させる工程を包含し、ここで該減少させる工程が、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的等価物を含む化合物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２３】
骨髄性細胞媒介腫瘍の免疫治療を調節する方法であって、動物に化合物を投与して、ＴＲＥＭ−１スプライス改変体のレベルを減少させる工程を包含する、方法。
【請求項２４】
前記化合物が、ＴＲＥＭ−１スプライス改変体に免疫学的に結合する抗体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記化合物が、ＴＲＥＭ−１スプライス改変体のアンチセンス分子である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
被験体において炎症性応答を診断する方法であって、以下の工程：
該被験体から組織サンプルを採取する工程；
該サンプルから単球を単離する工程；および
該単球におけるＴＲＥＭ−１タンパク質のレベルを測定する工程であって、ここで該ＴＲＥＭ−１のレベルの増加が、炎症性応答を示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項２７】
前記組織サンプルからマクロファージを単離する工程、および該マクロファージにおけるＴＲＥＭ−１タンパク質のレベルを測定する工程をさらに包含する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記組織サンプルから好中球を単離する工程、および該好中球におけるＴＲＥＭ−１タンパク質のレベルを測定する工程を包含する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記組織サンプルが、骨髄である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記炎症性応答が、自己免疫疾患の結果である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
被験体における炎症性応答を診断する方法であって、以下の工程：
該被験体から血液サンプルを採取する工程；および
該サンプル中のＴＲＥＭ−１スプライス改変体のレベルを測定する工程であって、ＴＲＥＭ−１スプライス改変体のレベルの減少が、炎症性応答を示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項３２】
被験体における炎症性応答を診断する方法であって、以下の工程：
該被験体から血液サンプルおよび組織サンプルを採取する工程；
該組織サンプルから単球および好中球を単離する工程；
該単球および好中球におけるＴＲＥＭ−１タンパク質のレベルを測定する工程；ならびに
該血液サンプルにおけるＴＲＥＭ−１スプライス改変体のレベルを測定する工程であって、ＴＲＥＭ−１タンパク質のレベルの増加およびＴＲＥＭ−１スプライス改変体のレベルの減少が、炎症性応答を示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項３３】
前記組織サンプルからマクロファージを単離する工程をさらに包含する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記炎症性応答が、自己免疫疾患の結果である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
組織球増殖症に罹患した被験体において細胞活性化および食細胞活性を調節する方法であって、該被験体に化合物を投与して、ＤＡＰ１２／ＴＲＥＭ−１複合体の活性を減少させる工程を包含する、方法。
【請求項３６】
前記化合物が、ＴＲＥＭ−１のリガンドの競合的インヒビターである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記競合的インヒビターが、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記競合的インヒビターが、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドの機能的等価物である、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、２０００年１２月８日に出願された米国仮特許出願第６０／２５４，４０４号に対して優先権を主張している。
【０００２】
本明細書中の研究は、アメリカ合衆国政府からの助成金による援助を受けている。アメリカ合衆国政府は、本発明において一定の権利を有し得る。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、免疫学の分野に関する。より詳細には、本発明は、炎症ならびに骨髄細胞活性化の役割および炎症応答の調節することに関連する。
【０００４】
（関連技術の記述）
炎症は、損傷に対する細胞応答および脈管応答であり、これらの応答としては、炎症メディエーターの放出、血管拡張、血漿の浸出および損傷部位への炎症細胞の移動が挙げられる。細胞応答および脈管応答は、膨張、紅斑、組織温度の上昇、疼痛および組織機能の低下といった古典的な臨床症状を生じる。
【０００５】
炎症応答の重要な細胞成分としては、多形核白血球、肥満細胞、単球／マクロファージおよび血小板が挙げられる。多形核白血球は、損傷の部位に現れる第１の炎症細胞であり、単球そしてＴリンパ球が続く。酵素は、壊死組織の除去を助け得る多形核白血球から放出される。単球／マクロファージは、プロスタグランジン、ロイコトリエンおよび血小板活性因子のような血管作用性メディエーターの直接的な供給源である。また、単球は、損傷した組織の脈管侵襲および修復プロセスを開始する間葉細胞の移動および増殖を刺激するために、インターロイキン−１（ＩＬ−１）および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）のようなサイトカインを放出する。
【０００６】
これらの免疫細胞の活性化は、レセプター特異的である。これらのレセプターは、ｆＭＬＰ、脂質メディエーター、補体因子またはケモカイン、ＦＣおよび補体レセプター、ＣＤ１４およびリポ多糖類（ＬＰＳ）に対するＴｏｌｌ様レセプターおよびインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）およびＴＮＦ−αに対するサイトカインレセプターのいずれかに対して特異的であるＧタンパク質結合７回膜貫通ドメインレセプターを含む細胞表面レセプターである。好中球および単球は、活性ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞レセプターといくらかの相同性を有するさらなる活性レセプターを発現する（Ｌａｎｉｅｒ，１９９８）。これらのレセプター複合体は、１型糖タンパク質ＤＡＰ１２とＩｇスーパーファミリーのレセプター（Ｂｏｕｃｈｏｎら，２０００；Ｄｉｅｔｒｉｃｈら，２０００）もしくはＣ型レクチンスーパーファミリーのレセプター（Ｂａｋｋｅｒら，１９９９；Ｌａｎｉｅｒら，１９９８）との会合によって形成される。非共有結合的会合は、ＤＡＰ１２膜貫通ドメインに位置付けられた負に荷電したアミノ酸残基とこれらのレセプターの膜貫通ドメインに位置付けられた正に荷電したアミノ酸残基との間に形成される。これらの複合体のシグナル伝達サブユニットは、これらのレセプターの細胞内ドメインが、他の分子と相互作用するには短すぎるために、ＤＡＰ１２細胞内ドメインに位置付けられる。レセプターリガンド結合サブユニットの結合の際に、ＤＡＰ１２細胞質免疫レセプターチロシンベース活性モチーフ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｍｏｔｉｆ）（ＩＴＡＭ）は、活性化を導くリン酸化事象のカスケードを開始する（Ｌａｎｉｅｒら，１９９８；ＣａｍｐｂｅｌｌおよびＣｏｌｏｎｎａ，１９９９）。ＤＡＰ１２関連レクチンとして同定される単球レセプターは、単球およびマクロファージにおいて排他的に発現する新規のレセプターである、骨髄（Ｍｙｅｌｏｉｄ）ＤＡＰ１２関連レクチン（ＭＤＬ−１）（Ｂａｋｋｅｒら，１９９９）およびＨＬＡ−Ｅに結合するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞において初めに同定されたレセプターであるＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ（Ｌａｎｉｅｒら，１９９８）である。Ｉｇスーパーファミリーの新しく同定された単球レセプターは、骨髄細胞において発現されるトリガーレセプター（Ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＴＲＥＭ−１）およびシグナル調節タンパク質β１（ＳＩＲＰβ１）（Ｂｏｕｃｈｏｎら，２０００，Ｄｉｅｔｒｉｃｈら，２０００）である。ＴＲＥＭ−１は、血液好中球および単球上に発現されそしてＬＰＳによって上方制御される。ＴＲＥＭ−１のトリガリングは、炎症性サイトカインＩＬ−８の好中球分泌および顆粒成分であるミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の放出を誘導する。単球において、ＴＲＥＭ−１のトリガリングは、ＩＬ−８およびＴＮＦ−αサイトカイン、および単球化学誘引タンパク質（ＭＣＰ−１）ケモカインの分泌を誘導する。好中球および単球において、ＴＲＥＭ−１のトリガリングはまた、血管外遊走に関与するいくつかの接着分子の発現を上方制御する。
【０００７】
炎症は、壊死組織の除去を促進しそして修復を開始することで治癒に寄与し得るが、それは常に有益であるわけではない。例えば、延長された激しい炎症応答は、組織損傷の範囲を増大するか、修復を遅らせるか、または過剰な傷を生じ得、そして首尾よい治癒が炎症を必要とするということは明確ではない。従って、炎症応答の下方制御は、免疫応答が組織損傷を引き起こすか、または不必要な反応を引き起こす複数の医療状況において必要とされることが医療社会において一般的に認識されている。単球−媒介免疫治療を介する癌処置のような、いくつかの特定の医療状況において、免疫応答の強い活性化が所望される。本発明は、ＴＲＥＭ−１レセプターの可溶形態で初めに示される。この可溶性ＴＲＥＭ−１レセプターは、細胞が、細胞外環境から受ける活性化シグナルの量を制限し得る、細胞表面ＴＲＥＭ−１レセプターと競合することによって、下方制御因子として作用し、従って炎症応答を調節し得る。
【０００８】
（発明の要旨）
本発明の特定の実施形態は、骨髄細胞活性化を減少するおよび／または増加させるために、動物に化合物を投与する工程を包含する、免疫応答を調節する方法である。骨髄細胞活性化は、炎症応答を調節するために減少され、そして骨髄細胞活性化は、腫瘍の免疫化を亢進するために増加される。
【０００９】
特定の実施形態において、免疫応答は、炎症応答である。骨髄細胞活性における減少は、ＤＡＰ１２／ＴＲＥＭ−１複合体の活性の減少を含む。特に、化合物は、ＴＲＥＭ−１に対するリガンドの競合的インヒビターである。この競合的インヒビターは、配列番号２のアミノ酸配列を含有するポリペプチドであることが意図される。なおさらに、このインヒビターは、機能的に等価な配列番号２のアミノ酸配列である。
【００１０】
さらなる実施形態において、炎症応答は、インビボでＴＲＥＭ−１ｓｖのレベルを増加させる化合物を動物に投与することによって調節される。
【００１１】
別の特定の実施形態は、ＤＡＰ１２／ＴＲＥＭ−１複合体の活性を減少させる化合物を動物に投与する工程を包含する、骨髄細胞活性を減少させる方法である。より詳細には、この化合物は、ＴＲＥＭ−１に対するリガンドの競合的インヒビターである。特定の実施形態において、この競合的インヒビターは、配列番号２のアミノ酸配列を含有するポリペプチドである。この競合的インヒビターが、機能的に等価なポリペプチド（配列番号２のアミノ酸配列を含有する）であることもまた、意図される。さらなる実施形態において、その競合的インヒビターは、薬学的キャリアと混合される。
【００１２】
本発明のさらなる実施形態は、ＤＡＰ１２／ＴＲＥＭ−１複合体の活性を変化させる工程を包含する炎症を生じる疾患または状態に羅患する被験体における、炎症応答を調節する方法である。
ＤＡＰ１２／ＴＲＥＭ−１複合体の活性は、ＴＲＥＭ−１に対するリガンドの結合を調節することによって、変更される。具体的な実施形態において、ＴＲＥＭ−１に対するリガンドの結合は、競合的インヒビターをＴＲＥＭ−１のリガンドに投与することによって調節され、ここで、競合的インヒビターは、配列番号２またはこの機能的等価物を含むポリペプチドである。この競合的インヒビターは、非経口の経路を介して投与され得る。なおさらに、ＴＲＥＭ−１に対するリガンドの結合は、ＴＲＥＭ−１ｓｖのレベルを増加する化合物を投与することによって調節され、ここで、ＴＲＥＭ−１ｓｖは、ＴＲＥＭ−１のリガンドに対する競合的インヒビターである。
【００１３】
さらなる実施形態において、疾患または状態は、臓器移植／拒絶、骨髄移植／拒絶、対宿主性移植片病、感染症、自己免疫疾患からなる群から選択される。詳細には、この感染疾患は、敗血症性関節炎または敗血症性ショックである。
【００１４】
本発明の別の実施形態は、配列番号２のポリペプチドまたはこの機能的等価物と混合された薬学的キャリアを含む化合物を投与する工程を包含する、炎症を処置する方法である。この化合物は、非経口の経路、消化経路、局所、吸入または関節内を介して投与され得る。
【００１５】
本発明の具体的な実施形態において、炎症応答を調節する工程を包含する、自己免疫障害を処置する方法が、提供され、ここで、調節する工程は、配列番号２のアミノ酸配列またはこの機能的等価物を有するポリペプチドを含む化合物を投与する工程を包含する。詳細には、この自己免疫障害は、慢性関節リウマチ、狼瘡および強皮症（ｓｃｈｌｅｒｏｄｅｒｍａ）からなる群から選択される。このポリペプチドは、ＤＡＰ１２／ＴＲＥＭ−１複合体の活性を調節する。
【００１６】
本発明の別の実施形態は、炎症応答を減少する工程を包含する、組織治癒／修復を調節する方法であり、ここで、減少する工程は、配列番号２のアミノ酸配列またはこの機能的等価物を有するポリペプチドを含む化合物を投与する工程を包含する。
【００１７】
本発明の別の具体的な実施形態は、ＴＲＥＭ−１スプライス改変体のレベルを減少するために動物に化合物を投与する工程を包含する、骨髄細胞媒介腫瘍免疫治療を調節する方法である。詳細には、この化合物は、ＴＲＥＭ−１スプライス改変体に免疫学的に結合する抗体を含む。別の化合物は、ＴＲＥＭ−１スプライス改変体のアンチセンスＲＮＡ分子を含むが、これらに限定されない。ＴＲＥＭ−１スプライス改変体抗体またはＴＲＥＭ−１スプライス改変体アンタゴニストは、ガン免疫療法におけるアジュバントまたは腫瘍抗原に対する免疫応答を高める試用ワクチンとして用いられ得る。
【００１８】
本発明の別の実施形態は、以下の工程：被験体から組織サンプルを収集する工程；サンプルから単球を単離する工程；および単球中のＴＲＥＭ−１タンパク質のレベルを測定する工程、を包含する、被験体における炎症応答を診断する方法であり、ここで、ＴＲＥＭ−１のレベルにおける増加は、炎症応答を示す。なおさらに、マクロファージおよび／または好中球は、組織サンプルから単離され得、そしてマクロファージおよび／または好中球におけるＴＲＥＭ−１タンパク質のレベルが、測定され得る。この組織サンプルは、骨髄であり得るが、任意の組織サンプルが、マクロファージを測定するために用いられ得る。
【００１９】
さらなる実施形態において、以下の工程：被験体から血液サンプルを収集する工程；およびサンプル中のＴＲＥＭ−１スプライス改変体タンパク質のレベルを測定する工程、を包含する、被験体における炎症応答を診断する方法が、提供され、ここで、ＴＲＥＭ−１スプライス改変体のレベルにおける減少は、炎症応答を示す。
【００２０】
さらなる実施形態において、方法は、以下の工程：被験体から血液サンプルおよび組織サンプルを収集する工程；組織サンプルから単球および好中球を単離する工程；単球および好中球におけるＴＲＥＭ−１タンパク質のレベルを測定する工程；および血液サンプルにおけるＴＲＥＭ−１スプライス改変体のレベルを測定する工程、を包含する、被験体における炎症応答を診断する工程を包含し、ここで、ＴＲＥＭ−１タンパク質のレベルにおける増加およびＴＲＥＭ−１スプライス改変体のレベルにおける減少は、炎症応答を示す。
【００２１】
本発明の別の具体的な実施形態は、強い細胞活性化、ならびに単球／好中球細胞系統の障害（例えば、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、および血球貪食性リンパ組織球増多症（ＨＬＨ））において見られる食細胞の活性を調節する方法である。これら（および他の病理学的存在）の疾患は、組織の組織球および／または単球系統由来細胞の腫瘍性障害ならびに非腫瘍性障害の両方を表し、ここで、これらの細胞は、貪食作用、炎症、ならびに毒性タンパク質の放出を介して、正常な組織および構造を破壊する。これらのプロセスは、発現の上方制御を介するＴＲＥＭ−１活性化を下方制御するか、または前記の任意の方法によるＴＲＥＭ−１スプライス改変体の存在のいずれかによって、下方制御され得る。あるいは、ＴＲＥＭ−１活性化は、ＤＡＰ１２／ＴＲＥＭ−１相互作用の破壊またはＤＡＰ１２シグナル伝達の破壊によって下方制御され得る。
【００２２】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなる。しかし、本発明の精神および範囲内における種々の変更および改変が、この詳細な記載から当業者に明らかとなるので、詳細な説明および具体的な実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、例示の目的のみで示されることが理解されるべきである。
【００２３】
（実施形態の説明）
本発明の範囲および精神から逸脱することなく、種々の実施形態および改変が本願発明に対してなされ得ることは、当業者に容易に明白である。
【００２４】
本明細書中の明細書において用いられる場合、「ａ」または「ａｎ」とは、１つ以上を意味し得る。本明細書中の特許請求の範囲において用いられ、語「〜を含む」と組み合わせて用いられる場合、語「ａ」または「ａｎ」とは、１つかまたは１つより大きいことを意味し得る。本明細書中で用いられる場合、「別の」とは、少なくとも２つ目以降を意味し得る。
【００２５】
本明細書中で用いられる場合、用語「動物」または「被験体」とは、哺乳動物をいう。より具体的には、哺乳動物としては、ラット、マウス、ネコ、イヌ、サルおよびヒトが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
本明細書中で用いられる場合、用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子をいい、この分子は、抗原の特定のエピトープと特異的に結合し得る。本明細書中で用いられる場合、抗原は、任意の免疫学的結合因子（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ）を広くいうことを意図する。抗体は、天然の供給源または組換え供給源に由来する、インタクトな免疫グロブリンであり得、そして、インタクトな免疫グロブリンの免疫活性部分であり得る。抗体は、代表的に、免疫グロブリン分子のテトラマーである。本発明における抗体は、種々の形態で存在し得、これらの形態としては、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２、ならびに一本鎖抗体およびヒト化抗体（Ｈａｒｌｏｗら、１９８８；Ｂｉｒｄら、１９８８）が挙げられる。
【００２７】
本明細書中で用いられる場合、用語「自己免疫疾患」または「自己免疫障害」は、自己抗原に対する免疫応答から生じる障害として定義される。自己免疫は、自己抗原に対する不適当かつ過剰な応答である。例としては、アディソン（Ａｄｄｉｓｉｏｎ）病、グレーヴズ病、多発性硬化症、粘液水腫、悪性貧血、リウマチ熱、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、および潰瘍性大腸炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
本明細書中で用いられる場合、用語「競合的インヒビター」は、ＴＲＥＭ−１のリガンドに結合し得る、ＴＲＥＭ−１細胞表面レセプターの可溶性形態として定義される。従って、この「競合的インヒビター」が、ＴＲＥＭ−１レセプターの改変体（例えば、可溶性レセプターを生じる切断、欠失、または置換）を含むことを、当業者は認識する。なおさらに、この「競合的インヒビター」は、ＴＲＥＭ−１レセプターの任意のスプライス改変体（例えば、ＴＲＥＭ−１ｓｖ）を包含する。
【００２９】
本明細書中で用いられる場合、用語「機能的等価物」は、別個の配列を含むが、同時に、野生型タンパク質または参照タンパク質の目的の生物学的機能を実行する能力を保持するように操作されている、ポリヌクレオチドとして定義される。従って、本明細書中で用いられる場合、機能的等価物という用語は、全長の膜結合型ＴＲＥＭ−１の作用をアンタゴナイズする機能を保持する、ＴＲＥＭ−１あるいはＴＲＥＭ−１スプライス改変体の、切断、欠失、挿入または置換を含む。これはまた、遺伝子コードの縮重（すなわち、同一のアミノ酸をコードする複数のコドンの存在）によって達成され得る。１つの例において、当業者は、制限酵素認識配列をポリヌクレオチドに導入するが、そのポリヌクレオチドがタンパク質をコードする能力を妨害しないことを望み得る。別の例において、ポリヌクレオチドは、より有意な変化を有する機能的等価物であり得る（そして、それをコードし得る）。特定のアミノ酸は、構造（例えば、抗体の抗原結合領域、基質分子の結合部位、レセプターなど）と相互作用的に結合する能力の認識可能な損失を伴わずに、タンパク質構造において他のアミノ酸と置換され得る。いわゆる「保存的」変化は、この構造変化が、その設計された機能を実行するタンパク質の能力を妨害するものではないので、このタンパク質の生物学的活性を崩壊させない。従って、本明細書中で開示される遺伝子配列およびタンパク質配列において種々の変更がなされ得る一方で、それらの変更が本発明の目的をなお果たすことは、本発明者らによって企図される。
【００３０】
本明細書中で用いられる場合、用語「発現」は、そのプロモーターによって駆動される、特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳として定義される。
【００３１】
本明細書中で用いられる場合、用語「発現ベクター」とは、転写され得る遺伝子産物の少なくとも一部をコードするポリヌクレオチド配列を含む、ベクターをいう。いくつかの場合において、次いでＲＮＡ分子が、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳される。他の場合において、例えばアンチセンス分子またはリボザイムの生成において、これらの配列は翻訳されない。発現ベクターは、種々の制御配列を含み得、この制御配列とは、特定の宿主生物における、作動可能に連結されたコード配列の転写およびおそらく翻訳のために必要な、ポリヌクレオチド配列をいう。転写および翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、他の機能を供給し、そして以下に記載される、ポリヌクレオチド配列を含み得る。
【００３２】
本明細書中で用いられる場合、用語「免疫応答」は、宿主によって発生して、宿主自体を病原から防御する応答に関する、一般的な用語である。
【００３３】
本明細書中で用いられる場合、用語「炎症」は、身体的な損傷、感染または局所的な免疫応答によって引き起こされる、流体、血漿タンパク質、および白血球の局所的な蓄積についての一般的な用語である。当業者は、炎症がまた炎症性応答としても公知であることを認識している。
【００３４】
本明細書中で用いられる場合、用語「白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）」は、白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）に対する一般的な用語として定義される。白血球としては、リンパ球、多形核白血球、および単球が挙げられる。
【００３５】
本明細書中で用いられる場合、用語「調節」は、免疫応答を増加させるかまたは減少させるかのいずれかの能力として定義される。この用語はまた、免疫応答を増加または減少させる薬理学的な能力をいうためにも用いられる。
【００３６】
本明細書中で用いられる場合、用語「単球」とは、血流中を循環する白血球をいう。単球は、組織内への移動の際に、マクロファージに分化する。従って、本発明において用いられる場合、用語「単球」とはまた、マクロファージをいう。
【００３７】
用語「マクロファージ」は、本明細書中で使用される場合、生得的な免疫において、抗原提示細胞として宿主防御の初期非順応性期において、そしてエフェクター細胞として体液性免疫および細胞媒介性免疫において重要な大きい単核食細胞をいう。マクロファージは、骨髄前駆細胞に由来する遊走細胞であり、そして体内のほとんどの組織において見出される。マクロファージの活性化は、感染の制御において重要であり、そしてまた隣接組織に対する損傷を引き起こす。
【００３８】
用語「骨髄性細胞」は、本明細書中で使用される場合、単球、好中球およびマクロファージをいう。なおさらに、骨髄性細胞はまた、単球、マクロファージおよび好中球の全ての段階の分化をいう。
【００３９】
用語「好中球」または「好中球性多形核白血球」は、本明細書中で使用される場合、末梢血中の白血球細胞の主要なクラスである。好中球は、細胞外病原体を呑食および殺傷する際に重要な役割を有する。
【００４０】
用語「ナチュラルキラー細胞」または「ＮＫ」は、本明細書中で使用される場合、広く定義され、通常、特定の腫瘍細胞を殺傷する顆粒状非Ｔ細胞、非Ｂ細胞リンパ球である。ＮＫ細胞は、ウイルスまたは他の細胞内病原体に対する生得的免疫において重要である。
【００４１】
用語「薬学的に受容可能なキャリア」としては、本明細書中で使用される場合、当業者に公知の、任意の溶媒および全ての溶媒、分散媒体、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、色素などの材料およびこれらの組み合わせが挙げられる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０、１２８９−１３２９頁（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。任意の従来のキャリアが、活性成分と不適合である範囲を除いて、その治療的組成物および薬学的組成物におけるその使用が企図される。
【００４２】
用語「多形核白血球」は、本明細書中で使用する場合、複数葉の核および細胞質顆粒を有する白血球細胞として定義される。以下の３つの型の多形核白血球が存在する：中性色素で染色される顆粒を有する好中球、エオシンで染色される顆粒を有する好酸球（ｅｓｏｉｎｏｐｈｉｌ）および塩基性色素で染色される顆粒を有する好塩基球。
【００４３】
用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書中で使用される場合、ヌクレオチドの鎖として定義される。さらに、核酸は、ポリヌクレオチドのポリマーである。従って、核酸およびポリヌクレオチドは、本明細書中で使用される場合、交換可能である。当業者は、核酸が、モノマー「ヌクレオチド」に加水分解され得るポリヌクレオチドであるという一般的な知識を有する。モノマーヌクレオチドは、ヌクレオシドに加水分解され得る。本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチドは、当該分野で利用可能な全ての手段（組換え手段（すなわち、通常のクローニング技術またはＰＣＲなどを使用する、組換えライブラリーまたは細胞ゲノムからの核酸配列のクローニングなどが挙げられるが、これらに限定されない）および合成手段によって得られる全ての核酸配列を含むが、これらに限定されない。さらに、当業者は、ポリヌクレオチドが、限定ではなくポリヌクレオチドの変異（当該分野で周知の方法によるヌクレオチドまたはヌクレオシドの変異が挙げられるがこれらに限定されない）を含むことを認識している。
【００４４】
用語「ポリペプチド」は、本明細書中で使用される場合、通常規定された配列を有するアミノ酸残基の鎖として定義される。本明細書中で使用される場合、用語ポリペプチドは、用語「ペプチド」および「タンパク質」を相互に含む。当業者は、ポリペプチドが、限定ではなく、当該分野で周知の方法（すなわち、部位特異的変異誘発または化学的変異誘発）によるポリペプチドの変異を含むことを認識している。
【００４５】
用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、本明細書中で使用される場合、単一の連続領域またはさらなる領域（これは、コード配列および／または非コード配列もまた含み得る）と一緒にポリペプチド（例えば、イントロンが介在する）をコードする不連続領域を含むポリヌクレオチドを包含すると定義される。
【００４６】
用語「プロモーター」は、本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始するために必要な細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識される核酸配列として定義される。
【００４７】
用語「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」は、本明細書中で使用される場合、外因性核酸が宿主細胞中に移入または導入されるプロセスをいう。形質転換された細胞は、初代被験体細胞またはその子孫を含む。
【００４８】
句「転写制御下」または「作動可能に連結された」は、本明細書中で使用される場合、プロモーターが、正しい位置およびＲＮＡポリメラーゼ開始およびポリヌクレオチドの発現を制御するポリヌクレオチドに関する配向にあることを意味する。
【００４９】
用語「改変体」は、本明細書中で使用される場合、それぞれ参照ポリヌクレオチドまたは参照ポリペプチドとは異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。この意味での改変体は、以下および本開示の他の場所でより詳細に記載される。例えば、改変体のヌクレオチド配列の変化は、サイレントであり得る（すなわち、これらは、ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸を変更しない可能性がある）。変更がこの型のサイレント変化に限定される場合、改変体は、参照ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。改変体のヌクレオチド配列の変化は、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更し得る。このようなヌクレオチド変化は、以下に議論されるように、参照配列によってコードされるポリペプチド中のアミノ酸の置換、付加、欠失、融合および短縮を生じ得る。一般に、アミノ酸配列の差異は限定され、その結果、参照および改変体の配列は、全体的に密接に類似し、そして多くの領域では同一である。改変体ポリペプチドおよび参照ポリペプチドは、任意の組み合わせで存在し得る１以上の置換、付加、欠失、融合および短縮で、アミノ酸配列が異なり得る。改変体はまた、（例えば、末端欠失または内部欠失によって）参照配列よりも短いことで参照ポリヌクレオチドまたは参照ポリペプチドとは異なる、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのフラグメントでもあり得る。例えば、改変体は、選択的ｍＲＮＡスプライシングの結果であり得る。選択的ｍＲＮＡスプライシングは、別個の機能および調節特性を有する異なるタンパク質産物に翻訳され得るｍＲＮＡの複数の形態を作製することによって、遺伝子発現の組織特異的なパターンを導き得る。これらのスプライス改変体は、イントロンもしくはエキソンにおける変異によって生じ得るか、または転写後に影響され得る。例えば、誘導性一酸化窒素シンターゼの遺伝子は、選択的ｍＲＮＡスプライシングによって４つのｍＲＮＡアイソフォームを生成する能力を有する。これらの選択的にスプライスされたｍＲＮＡ転写物は、組織特異的な様式で調節され、そしてサイトカインによって誘導される（Ｅｉｓｓａら、１９９６）。本発明のポリペプチドの別の改変体はまた、このようなポリペプチド（例えば、プロタンパク質部分の開裂によって活性化されて、活性な成熟ポリペプチドを産生し得るプロタンパク質）と同じ機能または活性を実質的に保持するポリペプチドを含む。改変体はまた、以下であり得る：（ｉ）１以上のアミノ酸残基が、保存的アミノ酸残基もしくは非保存的アミノ酸残基（好ましくは、保存的アミノ酸残基）で置換されたもの（このような置換されたアミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされるものであっても、そうでなくてもよい）、または（ｉｉ）１以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが、別の化合物（例えば、ポリペプチドの半減期を増大させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール））と融合されたもの、または（ｉｖ）さらなるアミノ酸が、成熟ポリペプチドに融合されたもの（例えば、リーダー配列もしくは分泌配列または成熟ポリペプチド配列もしくはプロタンパク質配列の精製のために使用される配列）。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの改変体は、天然に存在する改変体（例えば、天然に存在する対立遺伝子改変体）であってもよく、天然に存在することが知られていない改変体であってもよい。ポリヌクレオチドの天然に存在しないこのような改変体は、変異誘発技術（ポリヌクレオチド、細胞または生物体に適用される技術）によって作製され得るか、または組換え手段によって作製され得る。これに関しては、ポリヌクレオチド改変体の中でもとりわけ、ヌクレオチドの置換、欠失または付加が上記のポリヌクレオチドとは異なる改変体である。置換、欠失または付加は、１以上のヌクレオチドを含み得る。この改変体はまた、コード領域または非コード領域あるいはその両方が変更され得る。コード領域の変更は、保存的または非保存的なアミノ酸の置換、欠失または付加を生じ得る。上で定義されたすべてのこのような改変体は、本明細書中の教示および当該分野から当業者の範囲内であると考えられる。
【００５０】
本発明は、とりわけ、新規ＴＲＥＭ−１スプライス改変体のポリペプチド、ポリヌクレオチド、低分子またはそれらの改変体に関する。用語ＴＲＥＭ−１スプライス改変体およびＴＲＥＭ−１ｓｖは、交換可能である。特定の実施形態において、本発明は、配列番号１および２に示されるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を有するＴＲＥＭ−１スプライス改変体に関する。
【００５１】
（ポリヌクレオチド）
本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態（例えば、ｍＲＮＡ）またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡおよびクローニングによって得られたかまたは化学合成技術もしくはその組み合わせによって生成されたゲノムＤＮＡを含む）であり得る。ＤＮＡは、二本鎖であってもよいし、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡは、コード鎖（センス鎖としても公知）であってもよく、非コード鎖（アンチセンス鎖とも称される）であってもよい。
【００５２】
ＴＲＥＭの配列全体またはその任意のフラグメントもしくは改変体をコードする核酸配列が、上に示されたように本発明の範囲内であることが意図される。以下の核酸配列は、ＴＲＥＭに対応する配列であり、そして以下の対応するＧｅｎＢａｎｋ登録番号で参照される：Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ＴＲＥＭ−２（ＮＭ＿０２１４１０；配列番号３）；Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ＴＲＥＭ３（ＮＭ＿０２１４０７；配列番号４）；Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ＴＲＥＭ１（ＮＭ＿０２１４０６；配列番号５）；ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＴＲＥＭ−２（ＮＭ＿０１８９６５；配列番号６）；ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＴＲＥＭ−１（ＮＭ＿０１８６４３；配列番号７）；ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＴＲＥＭ−１（ＡＦ２８７００８；配列番号８）；ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＴＲＥＭ−１（ＡＦ１９６３２９；配列番号９）；ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ＴＲＥＭ−２（ＡＦ２１３４５８；配列番号１０）；ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＴＲＥＭ−２（ＡＦ２１３４５７；配列番号１１）；Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ＴＲＥＭ−３（ＡＦ２４１２２０；配列番号１２）およびＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ＴＲＥＭ−１（ＡＦ２４１２１９；配列番号１３）。
【００５３】
配列番号２のポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドとして、成熟ポリペプチドのコード配列自体、成熟ポリペプチドのコード配列およびさらなるコード配列（例えば、リーダー配列または分泌配列（例えば、プレタンパク質配列、プロタンパク質配列、またはプレプロタンパク質配列）をコードする配列）；ならびにさらなる非コード配列（イントロンならびに非コード５’および３’配列（例えば、転写およびｍＲＮＡプロセシング（例えば、ｍＲＮＡのリボソーム結合および安定化のためのスプライシングおよびポリアデニル化シグナルを含む）において役割を果たす、転写される非翻訳配列が挙げられるがこれらに限定されない）と共に、前述のさらなるコード配列を含むかまたは含まない成熟ポリペプチドのコード配列が挙げられるがこれらに限定されない。さらなる機能性を提供するコード配列もまた、ポリペプチドに組み込まれ得る。従って、例えば、ポリペプチドは、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列（例えば、ペプチド）に融合され得る。
【００５４】
本発明のさらなる実施形態は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＴＲＥＭ−１スプライス改変体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して、全長にわたって少なくとも９１％同一のポリヌクレオチド、およびこのようなポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドである。これに関して、同一ポリヌクレオチドに対して、全長にわたって少なくとも９５％同一のポリヌクレオチドが特に好ましく、少なくとも９７〜９９％同一のポリヌクレオチドが最も好ましい。
【００５５】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、および本発明のベクターにより遺伝子操作された宿主細胞、ならびに組み換え技術による本発明のポリペプチド産物の生成に関する。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドを組み込み、本発明のポリペプチドを発現するよう遺伝子操作され得る。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング、遺伝子銃導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、感染、または他の方法により達せられ得る。このような方法は、多くの標準的な研究マニュアル（例えば、Ｄａｖｉｓら、１９８６およびＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に記載されている。
【００５６】
組み換えペプチド合成の代替として、他の合成技術を利用することは、本発明の範囲内である。従って、本発明のペプチドはまた、従来技術に従って、溶液中または固体支持体上で合成され得る。種々の自動合成機が市販されており、公知のプロトコルに従って使用され得る。例えば、Ｔａｍら（１９８３）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９８６）；ならびにＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９７９）（各々は本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。本明細書に記載される選択領域に対応する、短いペプチド配列、または重複ペプチド（通常約６から約３５〜５０アミノ酸）のライブラリーは容易に合成され得、次いで、反応性ペプチドを同定するために設計されたスクリーニングアッセイにおいてスクリーニングされ得る。
【００５７】
当業者は、成熟タンパク質が、適切なプロモーターの制御下にて、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で発現され得ることを認識している。これらの技術は、本発明のＤＮＡ構築物から得られたＲＮＡを使用する。原核生物宿主および真核生物宿主と共に使用するための適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９により記載されている。なおさらに、成熟タンパク質は、無細胞環境にて発現され得る。従って、このようなタンパク質を生成するために、無細胞翻訳系または他の生化学的合成プロセスを使用することは、本発明の範囲内である。
【００５８】
本発明の別の実施形態は、翻訳されないＲＮＡ転写物を発現させるためのポリヌクレオチドの使用を包含する。例えば、アンチセンスＲＮＡ。アンチセンス方法は、核酸が相補的配列と対を形成する性質を有するという事実を利用している。相補的により、ポリヌクレオチドが、標準的なワトソン−クリック相補性法則に従い塩基対形成し得ることを意味する。すなわち、より大きなプリンは、より小さいピリミジンと塩基対形成し、グアニンとシトシン（Ｇ：Ｃ）およびアデニンとチミン（Ａ：Ｔ）（ＤＮＡの場合）またはアデニンとウラシル（Ａ：Ｕ）（ＲＮＡの場合）の組み合わせを形成する。ハイブリダイズ配列における、より一般的ではない塩基（例えば、イノシン、５−メチルシトシン、６−メチルアデニン、ヒポキサンチンなど）の含有は、塩基対形成を妨害しない。
【００５９】
ポリヌクレオチドによる二本鎖ＤＮＡの標的化は、三重らせん形成をもたらし；ＲＮＡの標的化は、二重らせん形成をもたらす。標的細胞に導入される場合、アンチセンスポリヌクレオチドは、それらの標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し、転写、ＲＮＡプロセシング、輸送、翻訳、および／または安定化を妨害する。アンチセンスＲＮＡ構築物またはこのようなアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡは、インビトロまたはインビボでのいずれかで、宿主細胞（例えば、ヒト被験体を含む、宿主動物）中での遺伝子の転写または翻訳、あるいはその両方を阻害するために使用され得る。
【００６０】
前述のように、相補的またはアンチセンスは、それらの全長にわたって実質的に相補的であり、ほとんど塩基のミスマッチを有さないポリヌクレオチド配列を意味する。例えば、１５塩基長の配列は、１３または１４個の位置で相補的なヌクレオチドを有する場合、相補的であると呼ばれ得る。当然、完全に相補的な配列は、それらの全体にわたって完全に相補的であり、塩基のミスマッチを有さない配列である。低い程度の相同性を有する他の配列もまた、意図される。例えば、限定された高い相同性の領域を有するが、非相同性領域もまた含むアンチセンス構築物（例えば、リボザイム；以下を参照のこと）が設計され得る。これらの分子は、５０％未満の相同性しか有さないが、適切な条件下で標的配列に結合する。
【００６１】
ＲＮＡ酵素またはリボザイムを生成するためのポリヌクレオチドの使用もまた、本発明の範囲内である。タンパク質は、従来から、核酸の触媒のために使用されているが、この取り組みにおいて有用である別のクラスの高分子が、明らかにされた。リボザイムは、部位特異的な様式で核酸を切断するＲＮＡ−タンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特異的な触媒ドメインを有する（ＫｉｍおよびＣｏｏｋ、１９８７；Ｇｅｒｌａｃｈら、１９８７；ＦｏｒｓｔｅｒおよびＳｙｍｏｎｓ、１９８７）。例えば、多くのリボザイムは、高い程度の特異性で、リン酸エステル転移反応を加速させ、しばしば、オリゴヌクレオチド基質中のいくつかのリン酸エステルのうちのわずか１つのみを切断する（Ｃｏｏｋら、１９８１；ＭｉｃｈｅｌおよびＷｅｓｔｈｏｆ、１９９０；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−ＨｕｒｅｋおよびＳｈｕｂ、１９９２）。この特異性は、基質が、化学反応の前に特異的な塩基対形成相互作用を介してリボザイムの内部ガイド配列（「ＩＧＳ」）に結合する必要性に寄与する。
【００６２】
リボザイム触媒は、主に、核酸を含む、配列特異的な切断／連結反応の一部として観察されている（Ｊｏｙｃｅ  １９８９；Ｃｏｏｋら、１９８１）。例えば、米国特許第５，３５４，８５５号は、特定のリボザイムが、公知のリボヌクレアーゼよりも大きな配列特異性を有し、ＤＮＡ制限酵素の特異性に達しているエンドヌクレアーゼとして作用し得ることを報告している。従って、遺伝子発現の配列特異的なリボザイム媒介阻害は、特に、治療用途に適し得る（Ｓｃａｎｌｏｎら、１９９１；Ｓａｒｖｅｒら、１９９０）。最近、リボザイムの適用されたいくつかの細胞株において、リボザイムは遺伝的変化を誘導され；変更された遺伝子としてオンコジーンＨ−ｒａｓ、ｃ−ｆｏｓ、およびＨＩＶの遺伝子が挙げられることが報告された。この研究の大部分は、特異的なリボザイムにより切断される特異的な変異コドンに基づく標的ｍＲＮＡの修飾に関する。
【００６３】
（ポリペプチド）
本発明の別の実施形態は、ＴＲＥＭ−１の可溶性レセプタースプライス改変体に関する。例えば、可溶性レセプタースプライス改変体は、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドである。
【００６４】
本発明は、ＴＲＥＭ−１の選択的スプライス改変体が、１７．５ｋＤａの分子量を有する１５０アミノ酸のタンパク質をコードすることを実証している（図４）。これらの１５０アミノ酸の最初の１３６アミノ酸は、ＴＲＥＭ−１の最初の１３６アミノ酸と同一であるが、最後の１４アミノ酸は完全に異なる。このタンパク質の最初に位置する疎水性シグナルペプチドおよびＩｇ−スーパーファミリーＶ型フォールドの特徴である鎖間ジスルフィド架橋を潜在的に生成する２つのシステインが保存されている。３つの潜在的なＮ連結グリコシル化部位および膜貫通領域は欠失している。従って、当業者は、膜貫通領域がなくとも、この細胞表面レセプターは可溶性レセプターであることを認識する。
【００６５】
本発明のポリペプチドは、組み換えポリペプチド、天然のポリペプチド、または合成ポリペプチドであり得る。本発明の特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２に示されるＴＲＥＭ−１スプライス改変体のアミノ酸配列およびその改変体を含む。
【００６６】
本発明はまた、ＴＲＥＭ−１スプライス改変体の改変体または生物学的機能等価物を含むがこれらに限定されない。保存的アミノ酸置換による配列番号２のＴＲＥＭ−１スプライス改変体ポリペプチドの改変体は、これらの改変体に含まれる。このような置換は、ポリペプチド中の所定のアミノ酸を、類似の特徴を有する別のアミノ酸により置換する置換である。代表的に、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの間の１つのアミノ酸から別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの置換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙｒの間の置換は、保存的置換と考えられる。
【００６７】
さらなる改変体として、いくつか（５〜１０、１〜５、１〜３、２、１または０個）のアミノ酸残基が、任意の組み合わせで置換、欠失、または付加された、配列番号２のＴＲＥＭ−１スプライス改変体ポリペプチドのアミノ酸配列を有するフラグメントが挙げられ得る。当業者は、ＴＲＥＭ−１スプライス改変体のこのようなフラグメントまたは改変体が、生物学的機能等価物（例えば、類似するリガンド結合親和性または改善された結合親和性を保持する機能等価物）であることを認識している。
【００６８】
特定の実施形態において、ポリペプチド、サブユニットタンパク質またはそれらの改変体を精製することが所望され得る。タンパク質精製技術は、当業者に周知の技術である。これらの技術は、あるレベルでポリペプチドおよび非ポリペプチド画分に対する細胞環境の粗画分に関する。他のタンパク質からポリペプチドを分離すると、目的のポリペプチドはさらに、クロマトグラフィーおよび電気泳動技術を用いて精製され得、部分的または完全な精製（あるいは均一な精製）を達成する。純粋なペプチドの分離に特に適した分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー；ポリアクリルアミドゲル電気泳動；等電点電気泳動法である。ペプチドを精製するのに特に有効な方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィーまたは均一なＨＰＬＣである。
【００６９】
上に考察される生物学的機能の等価物に加えて、本発明はまた、構造的に類似する化合物が、本発明のペプチドまたはポリペプチドの重要な部分を模倣するために処方され得ることが意図される。このような化合物（ペプチド模倣物と称され得る）は、本発明のペプチドとして、同様の様式において使用され得る。それゆえ、機能的な等価物でもある。
【００７０】
タンパク質の二次構造および三次構造の要素を模倣する特定の模倣物は、Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９３）に記載されている。ペプチド模倣物の使用は、タンパク質のペプチド骨格が分子相互作用を促進するような方法（例えば、抗体および／または抗原の相互作用）で、アミノ酸側鎖を方向づけるために主に存在するということを、基礎をなす理論的解釈は支持する。従って、ペプチド模倣物は、天然の分子に類似した分子相互作用を可能にするように設計される。
【００７１】
ペプチド模倣物の概念のいくつかの成功した用途は、タンパク質内のβターン（高い抗原性であることが既知である）の模倣物に焦点を合わせている。おそらく、ポリペプチド内のβターン構造は、本明細書中で考察される場合、コンピューターベースのアルゴリズムにより予測され得る。一旦、ターンの成分アミノ酸が決定されると、模倣物は、アミノ酸側鎖の実質的な要素の類似の空間的方向を達成するために構築され得る。
【００７２】
他のアプローチは、大きなタンパク質の結合部位を模倣する生物学的に活性なコンフォメーションを生成するための、誘引的な構造テンプレートとして、小さな複数のジスルフィド含有タンパク質の使用に焦点を合わせている（Ｖｉｔａら、１９９８）。特定の毒素に進化的に保存されているのが明らかである、構造モチーフは、小さく（３０〜４０アミノ酸）、安定で、変異に対する許容性が高い。このモチーフは、３つのジスルフィドにより内部コアにおいて架橋している、βシートおよびαへリックスから構成される。
【００７３】
βＩＩターンは、環式Ｌ−ペンタペプチドおよびＤ−アミノ酸を含む環式Ｌ−ペンタペプチドを用いてうまく模倣された。Ｗｅｉｓｓｈｏｆｆら（１９９９）。また、Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｏｎら（１９９９）は、逆ターンを誘導する特性を有する二環式トリペプチドを報告する。
【００７４】
特定の構造を生成する方法は、当該分野に開示されている。例えば、α−へリックス模倣物は、米国特許第５，４４６，１２８号；同第５，７１０，２４５号；同第５，８４０，８３３号；および５，８５９，１８４号に開示されている。これらの構造物は、ペプチドまたはタンパク質をより熱安定性にし、またタンパク質分解性変性に対する抵抗性を高める。６員環、７員環、１１員環、１２員環、１３員環および１４員環の構造物が開示されている。
【００７５】
コンホメーションの制限されたβターンおよびβバルジを生成する方法が記載されている（例えば、米国特許第５，４４０，０１３号；同第５，６１８，９１４号；および同第５，６７０，１５５号）。β−ターンは、骨格のコンフォメーションに関連する変化を有さず、かつ標準的な合成手順によるペプチド内への組込みに適切な末端を有する側鎖置換基の変化を可能にする。模倣的ターンの他の型としては、逆ターンおよびγターンが挙げられる。逆ターン模倣物は、米国特許第５，４７５，０８５号および同第５，９２９，２３７号に開示されており、そしてγターン模倣物は、米国特許５，６７２，６８１号および同第５，６７４，９７６号に記載されている。
【００７６】
（抗体）
本発明の特定の局面において、１つ以上の抗体は、ＴＲＥＭ−１およびＴＲＥＭ−１スプライス改変体で生成される。これらの抗体は、種々の診断用途または治療用途において使用され得る。種々の抗体ベースの構築物およびフラグメントを調製および使用する技術は、当該分野に周知である。抗体を調製および特徴付けるための手段もまた、当該分野で周知である（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８；これは、本明細書中に参考として援用される）。
【００７７】
（アッセイ）
本発明はまた、細胞または動物において、ＴＲＥＭ−１のスプライス改変体タンパク質、フラグメントまたはその改変体のレベルを検出するための定量的アッセイおよび定性的アッセイのようなアッセイに関する。宿主に由来するサンプルにおけるタンパク質（例えば、本発明のＴＲＥＭ−１スプライス改変体タンパク質）のレベルを決定するのに使用され得るアッセイ技術は、当業者に周知である。このようなアッセイ方法としては、放射免疫アッセイ、競合的結合アッセイ、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。ＥＬＩＳＡアッセイは、ＴＲＥＭ−１スプライス改変体に特異的な抗体（好ましくはモノクローナル抗体）を調製する工程を最初に包含する。さらに、一般的に、モノクローナル抗体に結合するレポーター抗体が調製される。このレポーター抗体は、検出可能な試薬（例えば、放射試薬、蛍光試薬または酵素試薬（本実施例においては、西洋わさびペルオキシダーゼ酵素））が付着される。
【００７８】
従って、本発明の特定の実施形態は、被験体における炎症性応答を診断する方法を含み、この方法は以下：被験体から組織サンプルを収集する工程；サンプルから単球を単離する工程；および単球におけるＴＲＥＭ−１タンパク質のレベルを測定する工程を包含し、ここで、ＴＲＥＭ−１レベルの増大は、炎症性応答を示唆する。なおさらに、マクロファージおよび／または好中球は、組織サンプルから単離され得、そしてマクロファージおよび／または好中球におけるＴＲＥＭ−１タンパク質レベルが測定される。組織サンプルは骨髄であり得るが、いかなる組織サンプルもマクロファージを測定するために使用され得る。なおさらに、サンプルにおけるＴＲＥＭ−１スプライス改変体タンパク質のレベルが測定され得、そしてＴＲＥＭ−１スプライス改変体のレベルの低減は炎症性応答を示唆することが構想される。
【００７９】
ＥＬＩＳＡを実施するために、サンプルは宿主から取り出され、そしてサンプル中のタンパク質を結合する固体支持体（例えば、ポリスチレンディッシュ）でインキュベートされる。次いで、ディッシュ上の、任意の遊離したタンパク質結合部位は、非特異的タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）と共にインキュベートすることにより覆われる。次に、モノクローナル抗体は、このモノクローナル抗体は、このディッシュでインキュベートされ、その間にモノクローナル抗体は、ポリスチレンディッシュに付着された任意のＴＲＥＭ−１スプライス改変体タンパク質に付着する。結合していないモノクローナル抗体は、緩衝液と共に洗い落とされる。西洋わさびペルオキシダーゼに連結したレポーター抗体がディッシュ入れられ、その結果、レポーター抗体は、ＴＲＥＭ−１スプライス改変体に結合した任意のモノクローナル抗体に結合する。次いで、結合していないレポーター抗体は洗い落とされる。ペルオキシダーゼ活性試薬（比色性基質が含まれる）が、次いでディッシュに添加される。１次抗体および２次抗体を介してＴＲＥＭ−１スプライス改変体に連結された固定化ペルオキシダーゼは、発色反応生成物を生成する。所定の時間における発色量は、サンプル中に存在するＴＲＥＭ−１スプライス改変体タンパク質の量を示す。定量的な結果は、代表的に、標準曲線を参照することにより得られる。
【００８０】
競合的アッセイが使用され得る。ここで、ＴＲＥＭ−１スプライス改変体に特異的な抗体は固体支持体に付着され、そして標識されたＴＲＥＭ−１スプライシング抗体および宿主に由来するサンプルは、固体支持体を通り抜ける。検出された、固体支持体に付着した標識の量は、サンプルにおけるＴＲＥＭ−１スプライス改変体の量に相関し得る。
【００８１】
本発明はまた、ＴＲＥＭ−１スプライス改変体に対する結合分子を同定する方法を提供する。ＴＲＥＭ−１スプライス改変体に対する結合分子についてのタンパク質をコードする遺伝子は、当業者に公知の多くの方法（例えば、リガンドパニングおよびＦＡＣＳソーティング）によって同定され得る。このような方法は、多くの実験マニュアル（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（１９９１）およびＲｉｖｅｔｔ，Ａ．（１９９３））に記載されている。
【００８２】
特定の実施形態において、酵母ツーハイブリッド分析が、本発明のポリペプチド（すなわち、ＴＲＥＭ−１スプライス改変体）を用いて、当該分野で標準的な手段により実施される。ツーハイブリッドスクリーニングは、相互作用する他のタンパク質を同定することにより、タンパク質の機能を解明または特徴付けるために使用される。未知の機能のタンパク質（本明細書中で「おとり（ｂａｉｔ）」と参照される）は、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをさらに含むキメラタンパク質として生成される。このキメラタンパク質を発現するヌクレオチド配列を含むプラスミドは、酵母細胞中に形質転換される。これはまた、異なるヌクレオチド配列（異なる潜在的標的タンパク質をコードする）に融合するＧＡＬ４活性化ドメインを含む、ライブラリーに由来する代表的なプラスミドを含む。おとりタンパク質が標的タンパク質と物理的に相互作用する場合、ＧＡＬ４活性化ドメインおよびＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインは繋がれ、それにより、レポーター遺伝子の転写を促進するように、結合的に作用し得る。特定の細胞において、おとりタンパク質と潜在的標的タンパク質との間に相互作用が生じない場合、ＧＡＬ４成分は分離されたままであり、それ自体のレポーター遺伝子転写を促進できない。当業者は、異なるレポーター遺伝子（β−ガラクトシダーゼ、ＨＩＳ３、ＡＤＥ２またはＵＲＡ３が挙げられる）が利用され得ることを理解する。さらに、複数のレポーター配列（各々、異なる誘導可能プロモーターの制御下で）は、ＧＡＬ４成分（ならびにこのような特定のおとりおよび標的タンパク質）の相互作用を示すために、小さな細胞内で利用され得る。当業者は、複数のレポーター配列の使用が、偽陽性候補物を獲得する機会を減少させることを理解する。また、代替的ＤＮＡ−結合ドメイン／活性化ドメインの成分（例えば、ＬｅｘＡ）が使用され得る。任意の活性化ドメインは、これらがレポーター遺伝子の転写活性化を生じる限り、任意のＤＮＡ結合ドメインと対を形成し得ることを、当業者は理解する。さらに、当業者は、他の成分が存在する限り、２つの成分のいずれかは原核生物由来であり得、そしてＬｅｘＡ系のように、レポーター遺伝子の転写活性化を共同で可能にすることを理解する。
【００８３】
ツーハイブリッド実験の試薬および設計は、当業者に周知であり（Ｐ．Ｌ．ＢａｒｔｅｌおよびＳ．Ｆｉｅｌｄｓ（編）のＴｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７）を参照のこと）、これらには、このシステムの最新の改良型（Ｆａｓｈｅｎａら、２０００）を含まれる。当業者は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）製のＭａｔｃｈｍａｋｅｒＴＭ  ＳｙｓｔｅｍｓまたはＨｙｂｒｉＺＡＰ（登録商標）２．１  Ｔｗｏ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）のような市販のベクター、あるいは研究機関から入手可能なベクター（Ｙａｎｇら、１９９５；Ｊａｍｅｓら、１９９６）を認識している。代替的な実施形態において、酵母以外の生物（例えば、哺乳動物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）製のＭａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｗｏ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ）またはＥ．ｃｏｌｉ（Ｈｕら、２０００））が、ツーハイブリッド分析に使用される。
【００８４】
代替的な実施形態において、タンパク質−タンパク質相互作用が、細胞質ベースのアッセイにおいて検出される、ツーハイブリッド系を利用する。この実施形態において、タンパク質は、細胞質で発現され、その細胞質は、翻訳後修飾を生じるのを可能にし、そして転写活性化因子およびインヒビターがそのスクリーニングにおけるベイト（ｂａｉｔ）として使用されるのを可能にする。このような系の例は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）製のＣｙｔｏＴｒａｐ（登録商標）Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍであり、ここでは、標的タンパク質が、酵母細胞膜に係留され、この酵母は、ｈＳｏｓ（グアニルヌクレオチド交換因子）の酵母ホモログである、ｃｄｃ２５遺伝子において、温度感受性変異を含む。標的に対するベイトタンパク質の結合の際に、ｈＳｏｓは、膜に局在化され、その膜が、ＧＤＰ／ＧＴＰ交換を促進することによってＲＡＳの活性化を可能にする。次いで、ＲＡＳは、変異体酵母ｃｄｃ２５Ｈの３７℃での増殖を可能にする、シグナル伝達カスケードを活性化する。ベクター（例えば、ｐＭｙｒおよびｐＳｏｓ）および他の実験詳細は、この系について、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）から当業者に入手可能である（例えば、米国特許第５，７７６，６８９号（本明細書中に参考として援用される）もまた、参照のこと）。
【００８５】
従って、本発明の１つの実施形態に従って、ＴＲＥＭ−１および／またはＴＲＥＭ−１スプライス改変体と相互作用するペプチドについてスクリーニングする方法が存在し、この方法は、試験ペプチドをコードするＤＮＡセグメントを含む第１の核酸、およびＴＲＥＭ−１の少なくとも一部をコードするＤＮＡセグメントを含む第２の核酸を、それぞれ、細胞に導入する工程を包含し、この試験ペプチドは、ＤＮＡ結合ドメインに融合されており、そしてＴＲＥＭ−１のその少なくとも一部は、ＤＮＡ活性化ドメインに融合されている。その後、試験ペプチドとＴＲＥＭ−１スプライス改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントとの間の相互作用についてのアッセイが存在し、これは、そのＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡ活性化ドメインとの間の相互作用をアッセイすることによる。例えば、ＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡ活性化ドメインとの間の相互作用についてのアッセイは、β−ガラクトシダーゼの発現の活性化であり得る。
【００８６】
代替的な方法は、組換えＴＲＥＭ−１スプライス改変体を含む、λｇｔ１１、λＬＺＡＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）または等価的なｃＤＮＡ発現ライブラリーのスクリーニングである。組換えＴＲＥＭ−１スプライス改変体タンパク質またはそのフラグメントは、小さいペプチドタグ（例えば、ＦＬＡＧ、ＨＳＶまたはＧＳＴ）に融合される。これらのペプチドタグは、キナーゼ（例えば、心筋クレアチンキナーゼ）に対する簡便なリン酸化部位を有し得るか、またはそれらは、ビオチン化され得る。組換えＴＲＥＭ−１スプライス改変体は、３２［Ｐ］でリン酸化され得るか、あるいは未標識で使用され、そしてそのタグに対するストレプトアビジンまたは抗体を用いて検出され得る。λｇｔ１１ｃＤＮＡ発現ライブラリーは、目的の細胞から作製され、そして組換えＴＲＥＭ−１スプライス改変体と共にインキュベートされ、洗浄され、そしてＴＲＥＭ−１スプライス改変体と相互作用するｃＤＮＡクローンが、単離される。このような方法は、当業者に慣用的に使用される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前出）を参照のこと。
【００８７】
別の方法は、哺乳動物発現ライブラリーのスクリーニングであり、ここで、ｃＤＮＡは、哺乳動物プロモーターとポリアデニル化部位との間で、ベクターにクローニングされ、そして細胞に一過的にトランスフェクトされる。４８時間後、結合タンパク質は、標識されたＴＲＥＭ−１スプライス改変体との、固定および洗浄された細胞のインキュベーションによって、検出される。この様式で、目的の結合タンパク質をコードするｃＤＮＡを含むｃＤＮＡのプールが、選択され、そして目的のｃＤＮＡが、各プールのさらなる細分、それに続く、一過的トランスフェクション、結合およびオートラジオグラフィーのサイクルによって、単離され得る。あるいは、目的のｃＤＮＡは、哺乳動物細胞にｃＤＮＡライブラリー全体をトランスフェクトし、そしてプレートに結合させたＴＲＥＭ−１スプライス改変体を含むディッシュ上で細胞をパニングすることによって、単離され得る。洗浄後に接着している細胞を溶解し、そしてプラスミドＤＮＡを、単離して、細菌中で増幅して、そしてトランスフェクションおよびパニングのサイクルを、単一のｃＤＮＡクローンが得られるまで、繰り返す。Ｓｅｅｄら、１９８７およびＡｒｕｆｆｏら、１９８７（これらは、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。結合タンパク質が分泌される場合、一旦、結合アッセイまたは中和アッセイが、一過的にトランスフェクトした細胞由来の上清をアッセイするために確立されると、そのｃＤＮＡが、類似のプールストラテジーによって得られ得る。上清をスクリーニングするための一般的方法は、Ｗｏｎｇら（１９８５）に開示される。
【００８８】
別の代替的な方法は、ＴＲＥＭ−１スプライス改変体と相互作用するタンパク質を、細胞から直接単離することである。ＧＳＴまたは小さいペプチドタグを有するＴＲＥＭ−１スプライス改変体の融合タンパク質を、作製し、そしてビーズ上に固定化する。目的の細胞由来の生合成的に標識したかまたは未標識のタンパク質抽出物を、調製し、ビーズとインキュベートし、そして緩衝液で洗浄する。ＴＲＥＭ−１スプライス改変体と相互作用するタンパク質は、ビーズから特異的に溶出され、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析される。結合パートナーの一次アミノ酸配列を、微量配列決定によって得る。必要に応じて、細胞を、細胞タンパク質のチロシンリン酸化のような機能的応答を誘導する薬剤で処理し得る。このような薬剤の例は、増殖因子またはサイトカイン（例えば、インターロイキン−２）である。
【００８９】
別の代替的方法は、免疫アフィニティー精製である。組換えＴＲＥＭ−１スプライス改変体を、標識したかまたは未標識の細胞抽出物と共にインキュベートし、そして抗ＴＲＥＭ−１スプライス改変体抗体で免疫沈降させる。この免疫沈降物を、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて回収し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。未標識タンパク質を、ビオチン化によって標識し、そしてＳＤＳゲル上でストレプトアビジンを用いて検出する。結合パートナーのタンパク質を、微量配列決定によって分析する。さらに、当業者に公知の標準的な生化学的精製工程が、微量配列決定の前に使用され得る。
【００９０】
なお別の代替的方法は、結合パートナーについてのペプチドライブラリーのスクリーニングである。組換えタグ化または標識化ＴＲＥＭ−１スプライス改変体を使用して、ＴＲＥＭスプライス改変体と相互作用するペプチドライブラリーまたはホスホペプチドライブラリー由来のペプチドを選択する。これらのペプチドの配列決定は、相互作用タンパク質に見出され得るコンセンサスペプチド配列の同定を導く。
【００９１】
（処置）
本発明は、免疫応答（例えば、炎症応答が挙げられるが、これに限定されない）を調節する方法を提供し、この方法は、動物に化合物を投与して、骨髄性細胞の活性化を減少させる工程を包含する。この動物または被験体は、好ましくは、哺乳動物であり、そしてより好ましくは、ヒトである。
【００９２】
骨髄性細胞活性化が、ＤＡＰ１２／ＴＲＥＭ−１複合体の活性化を減少することによって減少され得ることが想定され、これは、ＴＲＥＭ−１に対するリガンドの競合的インヒビターである化合物を提供することによる。この競合的インヒビターは、配列番号２のアミノ酸配列または配列番号２のアミノ酸の機能的等価物を含むポリペプチドであり得る。この化合物は、免疫応答の調節を生じるのに有効な量で動物に投与される。
【００９３】
本発明において、骨髄性細胞活性化は、単球、マクロファージおよび／または好中球の活性化を含む。この活性化は、単球／マクロファージに特異的であり得るか、または好中球に対して特異的であり得る。なおさらに、骨髄性細胞活性化は、活性化された単球、マクロファージおよび好中球の組み合わせを含み得る。従って、本発明は、単球、マクロファージおよび／または好中球の活性化ならびにこれらの細胞の分化の任意の段階を調節することが、想定される。
【００９４】
ＴＲＥＭ−１レセプターは、シグナル伝達メディエータに対する結合（ｄｏｃｋｉｎｇ）モチーフを欠く、短い細胞内ドメインを有する。従って、ＴＲＥＭ−１について、活性化シグナルを媒介するために、ＴＲＥＭ−１は、アダプター分子と会合しなければならない。アダプター分子（例えば、ＤＡＰ１２）は、活性化シグナルを媒介するための別個のシグナル伝達サブユニットである。ＴＲＥＭ−１は、その膜貫通ドメイン中に正に荷電したアミノ酸を含み、この膜貫通ドメインは、アダプター分子の負に荷電した膜貫通ドメインと対形成し得る。このアダプター分子は、細胞質免疫レセプターチロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含み、リン酸化の際に、このアダプター分子は、タンパク質チロシンキナーゼを動員し、このキナーゼが、細胞の活性化を導く。
【００９５】
本発明は、可溶性の循環ＴＲＥＭ−１スプライス改変体の存在を同定し、これを使用して、細胞がＤＡＰ１２／ＴＲＥＭ−１経路および／またはＤＡＰ１２／ＴＲＥＭ−１複合体の活性化をダウンレギュレートするのを、補助し得る。当業者は、膜貫通ドメインを欠くレセプターの分泌が、ＤＡＰ１２に対してシグナルを伝達し得ず、そしてダウンレギュレーターとして作用することを理解する。ＴＲＥＭ−１スプライス改変体は、ＴＲＥＭ−１に結合するリガンドに対して、全長ＴＲＥＭ−１レセプターと競合することによって、免疫応答をダウンレギュレートすることが、想定される。この競合的阻害は、細胞に、完全に機能的なレセプター複合体に利用可能な活性化シグナルの量を制限させる。従って、ＴＲＥＭ−１スプライス改変体および類似の分子（例えば、機能的等価物）は、生じるリン酸化カスケードの量を調節し、そしてその速度論を潜在的に調節することが、予測され得る。
【００９６】
細胞表面レセプターの可溶性形態が、リガンドに結合し、従って、そのリガンドを細胞表面レセプターに対して利用可能でないものにすることによって、細胞のリガンド媒介活性化をダウンレギュレートまたは低下させ得ることが、当該分野で公知である。ＴＲＥＭ−１スプライス改変体に類似する例は、ｓＣＤ１４である。これは、ＣＤ１４細胞表面レセプターの可溶性形態である（ＴａｐｐｉｎｇおよびＴｏｂｉａｓ、２０００）。この可溶性ＣＤ１４は、単離されたヒト単核細胞の酸化的バースト応答を阻害し、ＬＰＳ誘導性ＴＮＦ放出を阻害し、そしてＬＰＳ誘導性の致死性からマウスを防御することが、示されている。従って、当業者は、可溶性ＴＲＥＭ−１スプライス改変体レセプターまたはその機能的等価物の増加が、細胞表面膜ＴＲＥＭ−１レセプターに対するリガンドと競合的に競合し得、そしてＤＡＰ１２／ＴＲＥＭ−１複合体の活性をダウンレギュレートすることによって骨髄細胞活性化を減少し得ることを認識する。
【００９７】
さらなる実施形態において、ＴＲＥＭ−１ｓｖのレベルを増加させる化合物が、免疫応答を調節するために動物に投与され得ることが、想定される。この化合物は、ＴＲＥＭ−１ｓｖのレベルを増加させる。スプライス改変体は、当該分野で周知でありそして理解されている。従って、当業者は、そのスプライス改変体のレベルを増加させるために使用され得る種々の改変に気付く。例えば、投与される化合物は、インビボにおいてそのＴＲＥＭ−１ｓｖタンパク質の増加をもたらすように、翻訳前または翻訳後のいずれかで作用し得る。この化合物は、核酸、タンパク質、または低分子である。
【００９８】
本発明の別の実施形態は、骨髄性細胞活性化を減少させる方法であり、この方法は、動物に、ＤＡＰ１２／ＴＲＥＭ−１複合体の活性を減少させる化合物を投与する工程を包含する。この化合物または競合的インヒビターは、薬学的キャリアと混合される。この化合物は、ＴＲＥＭ−１に対するリガンドの競合的インヒビターである。この競合的インヒビターは、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドであるか、または配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドの機能的等価物である。
【００９９】
本発明はまた、炎症を生じる疾患または状態に罹患している被験体における炎症応答を調節する方法を提供し、この方法は、ＴＲＥＭ−１へのリガンドの結合を調節することによって、このＤＡＰ１２／ＴＲＥＭ−１複合体の活性を変化させる工程を包含する。ＴＲＥＭ−１のリガンドに対する競合的インヒビターが、この結合を調節するために非経口経路を介して投与される。この競合的インヒビターは、配列番号２を含むポリペプチドまたはその機能的等価物である。なおさらに、この競合的インヒビターは、可溶性形態の細胞表面ＴＲＥＭ−１レセプターである。このインヒビターが、ＴＲＥＭ−１のスプライス改変体であり得ることを、当業者は認識している。このようなスプライス改変体は、このＴＲＥＭ−１レセプターに対する種々の改変によって生成され得る。天然のスプライス改変体が、本発明によって単離された。また、本発明には、合成改変体、またはこの天然のスプライス改変体の合成機能的等価物が、含まれる。ＴＲＥＭ−１のリガンドに結合しそして細胞応答を媒介するために必要である、特定の領域を確認するために、欠失突然変異が実施され得る。さらに、可溶性形態を達成するようにＴＲＥＭ−１の膜貫通ドメインを変化させるために、アミノ酸置換が利用され得る。アミノ酸置換はまた、ＴＲＥＭ−１スプライス改変体へのこのリガンドの結合親和性を増加させるために使用され得る。
【０１００】
なおさらに、本発明はまた、炎症応答を調節する方法を提供し、この方法は、ＴＲＥＭ−１へのリガンドの結合を調節することによって、このＤＡＰ１２／ＴＲＥＭ−１複合体の活性を変化させる工程を包含する。ＴＲＥＭ−１ｓｖのレベルを増加させるために、化合物が、この動物に投与される。ＴＲＥＭ−１ｓｖは、ＴＲＥＭ−１のリガンドの競合的インヒビターである。
【０１０１】
この疾患または状態は、臓器移植／臓器拒絶、骨髄移植／骨髄拒絶、対宿主性移植片疾患、感染性疾患、自己免疫疾患からなる群より選択される。この感染性疾患は、敗血症性関節炎または敗血症性ショックである。
【０１０２】
本発明の別の実施形態は、炎症を処置する方法であり、この方法は、配列番号２のポリペプチドまたはその機能的等価物と混合された薬学的キャリアを含む、化合物を投与する工程を包含する。投与する工程は、非経口経路、食事経路、局所投与、吸入、または関節内投与を介する。炎症を処置することが、免疫応答を調節することを包含するがこれに限定されないことを、当業者は認識する。この免疫応答は、骨髄性細胞活性化の減少によって調節され得る。例えば、可溶性形態の細胞表面レセプターが、動物に投与され得る。この可溶性形態のレセプターが、そのリガンドに結合し、それによりそのリガンドが、細胞表面レセプターにとって利用不可能にすることによって、そのリガンドが媒介する細胞活性化を低下させることを、当業者は理解する。
【０１０３】
特定の実施形態は、自己免疫障害を処置する方法であり、この方法は、その炎症応答を調節する工程を包含し、調節する工程は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的等価物を含む、化合物を投与する工程を包含する。この自己免疫障害は、慢性関節リウマチ、狼瘡、および強皮症からなる群より選択される。このポリペプチドは、ＤＡＰ１２／ＴＲＥＭ−１複合体の活性を調節する。
【０１０４】
別の実施形態は、組織治癒／組織修復を調節する方法であり、この方法は、炎症性応答を減少させる工程を包含し、減少させる工程は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的等価物を含む、化合物を投与する工程を包含する。ＴＲＥＭ−１スプライス改変体、その可溶性レセプターが、虚血損傷、熱損傷、または挫傷損傷後の組織治癒／組織損傷を調節するために使用され得ること、それは、組織マクロファージ、好中球または他の白血球により放出されるサイトカインが、これらの生物学的プロセスの最終的な損傷（ｓｃａｒｉｎｇ）、機能不全、および損傷（ｄｉｓｆｉｇｕｒｅｍｅｎｔ）を増加させるように作用するからであることを、当業者は理解する。従って、このサイトカインの放出が調節され得る場合、損傷、機能不全、および損傷が軽減され得る。なおさらに、減少させる工程は、インビボでＴＲＥＭ−１ｓｖのレベルを増加させる化合物を投与する工程を包含する。
【０１０５】
本発明の別の特定の実施形態は、骨髄性細胞媒介腫瘍免疫治療を調節する方法であり、この方法は、動物に化合物を投与して、ＴＲＥＭ−１スプライス改変体のレベルを減少させる工程を包含する。例えば、この化合物は、ＴＲＥＭ−１スプライス改変体に免疫学的に結合する抗体を含むが、これに限定されない。この抗体は、ＴＲＥＭ−１スプライス改変体の一部に結合するがＴＲＥＭ−１には結合しない、抗体であることが、企図される。従って、ＴＲＥＭ−１スプライス改変体のみの減少は、この免疫応答を増強または増加させ得る。ＴＲＥＭ−１スプライス改変体抗体またはＴＲＥＭ−１アンタゴニストが、腫瘍抗原に対する免疫応答をブーストするために、癌免疫治療またはワクチンの過程（ｔｒａｉｌ）においてアジュバントとして使用され得ることが、企図される。ＴＲＥＭ−１スプライス改変体の減少が、先天性免疫欠損状態および後天性免疫欠損状態の両方に対して有益であり得ることもまた、本発明の範囲内にある。なおさらに、ＴＲＥＭ−１スプライス改変体の減少は、ＴＲＥＭ−１の過剰発現または過剰なＴＲＥＭ−１と等価であり、炎症の増加およびこの免疫治療の効率の増加を生じることが、企図される。
【０１０６】
ＴＲＥＭ−１スプライス改変体を減少させる他の手段は、本出願の範囲内にあることを、当業者は認識している。例えば、他の化合物（例えば、ＴＲＥＭ−１スプライス改変体のアンチセンスＲＮＡ、リボザイム、または他のアンタゴニスト）が使用され得る。アンチセンスＲＮＡとリボザイム活性を有するＲＮＡとの両方が、ポリヌクレオチドの発現を減少または除去するために役立つことを、当業者は理解する。アンチセンスＲＮＡおよびリボザイムを調製するための手段は、当該分野で周知であり、そして、本発明において以前に議論されている。アンチセンスＲＮＡは、そのｍＲＮＡからのポリペプチド生成物の生成を減少させる。なおさらに、エンドリボヌクレアーゼとして作用し、そして選択された配列を有するＲＮＡ分子の切断を触媒して、そのポリペプチド生成物の減少を生じる、リボザイムが、生成され得る。従って、当業者は、ＴＲＥＭ−１スプライス改変体の発現を阻害または減少させてこの免疫応答を増加させるために、種々の化合物を使用し得る。
【０１０７】
（化合物の投与）
本発明のポリペプチドおよび他の化合物（例えば、低分子）は、単独でかまたは他の化合物（例えば、治療化合物）と組み合わせて、使用され得る。
【０１０８】
注射可能な使用に適する薬剤形態としては、滅菌した水性溶液および／または水性分散剤；ゴマ油、落花生油および／または水性プロピレングリコールを含む処方物；ならびに／あるいは滅菌した注射可能な溶液および／または分散剤の即時調製のための滅菌した粉末が、挙げられる。すべての場合において、その形態は、滅菌していなければならず、そして／または注入性の容易さが存在する程度に流体でなければならない。その形態はまた、製造条件下および／または保存条件下で安定でなければならず、そして／あるいは微生物（例えば、細菌および／または真菌）の混入作用に対して保護されなければならない。
【０１０９】
遊離塩基および／または薬学的に受容可能な塩としてのその活性化合物の溶液が、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と適切に混合された水中で調製され得る。分散剤もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、および／またはその混合物中、ならびに／あるいは油中で、調製され得る。通常の保存条件および／または使用条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を妨げるために、保存剤を含む。
【０１１０】
本発明のＴＲＥＭ−１スプライス改変体タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、低分子、アゴニスト、および／またはアンタゴニストが、中性形態および／または塩形態の組成物へと処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、（そのタンパク質の遊離アミノ基を用いて形成され）酸付加塩が挙げられ、そして／またはこの酸付加塩は、無機酸（例えば、塩酸および／またはリン酸）ならびに／あるいは有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）を用いて形成される。遊離カルボキシル基を用いて形成された塩はまた、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、および／または水酸化鉄（ＩＩＩ））、および／またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような、有機塩基から誘導され得る。活性成分としてペプチド治療剤を使用することに関して、米国特許第４，６０８，２５１号；同第４，６０１，９０３号；同第４，５９９，２３１号；同第４，５９９，２３０号；同第４，５９６，７９２号；および／または同第４，５７８，７７０号（各々が、参考として本明細書中にて援用される）の技術が、使用され得る。
【０１１１】
そのキャリアはまた、溶媒および／または分散媒質（例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および／または液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、ならびに／あるいは植物油を含む）であり得る。その適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散剤の場合は必要な粒子サイズの維持によって、そして／または界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および／または抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によってもたらされ得る。多くの場合において、等張剤（例えば、糖および／または塩化ナトリウム）を含めることが、好ましい。その注射可能な組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよび／またはゼラチン）をその組成物において使用することによって、もたらされ得る。
【０１１２】
滅菌注射用溶液を、上記に列挙した種々の他の成分と共に、適切な溶媒中に必要量の活性化合物を取り込むことにより調製する（必要に応じて、その後、濾過滅菌した）。一般的に、分散物は、種々の滅菌した活性成分を滅菌ビヒクルに取り込むことにより調製する。このビヒクルは、ベースの分散媒体および／または上記に列挙したものからの、必要とされる他の成分を含む。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥技術および／または凍結乾燥技術であり、これらの技術により、活性成分と既に滅菌濾過されたその溶液からの任意のさらなる所望の成分との粉末を得る。直接注射のために、より濃縮されたおよび／または高度に濃縮された溶液の調製もまた企図される。この場合、溶媒としてのＤＭＳＯの使用は、非常に急速な浸透を生じて、高濃度の活性成分を小さな領域に送達することが考えられる。
【０１１３】
処方の際、溶液は、投薬の処方と適合可能な様式でおよび／または治療的に有効な量で投与される。処方物は、上記の注射用溶液の型のような、種々の投薬形態で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなどもまた用いられ得る。
【０１１４】
水溶液での非経口投与のために、例えば、この溶液は、必要な場合、適切に緩衝化され、そして／または、液体希釈剤は、初めに、十分な生理食塩水および／またはグルコースを用いて等張にされるべきである。これらの特定の水溶液は、特に、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与および／または腹腔内投与に適切である。この点について、用いられ得る滅菌水性媒体は、本開示に鑑みれば、当業者に分かる。例えば、ある投薬は、１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解され得、そして／または、１０００ｍｌの皮下注入液に加えられ得、そして／または、提唱される注入の部位に注射され得る（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１５版、１０３５〜１０３８頁および／または１５７０〜１５８０頁を参照のこと）。投薬におけるいくつかの変更は、処置される被験体の状態に依存して必ず生じる。投与を担う人物は、いずれにしても、個々の被験体について、適切な用量を決定する。
【０１１５】
活性なＴＲＥＭ−１スプライス改変体タンパク質に由来するペプチドおよび／または薬剤は、治療用混合物中に、１用量あたり、約０．０００１ｍｇ〜１．０ｍｇ、および／または約０．００１ｍｇ〜０．１ｍｇ、および／または約０．１ｍｇ〜１．０ｍｇ、および／または、さらに、約１０ｍｇなどを含むように、処方され得る。多用量もまた投与され得る。
【０１１６】
非経口投与（例えば、静脈内注射、関節内注射および／または筋肉内注射）のために処方された化合物に加えて、他の薬学的に受容可能な形態としては、例えば、経口投与のための錠剤および／または他の固体；リポソーム処方物；徐放性カプセル；および／またはクリームを含む現在用いられている任意の他の形態が挙げられる。
【０１１７】
本発明において、鼻内溶液および／または鼻内スプレー、エアロゾルおよび／または吸入もまた使用し得る。鼻内溶液は、通常、滴（ｄｒｏｐ）および／またはスプレーで鼻道に投与されるように設計された水溶液である。鼻内溶液は、鼻分泌物に対して、多くの点で類似するように調製され、その結果、通常の線毛作用が維持される。従って、水性鼻内溶液は、通常、等張であり、かつ／または５．５〜６．５のｐＨを維持するようにわずかに緩衝化される。さらに、必要に応じて、抗微生物保存料（眼内調製物に類似する）および／または適切な薬物安定剤が、処方に含まれ得る。種々の市販の鼻内調製物が公知であり、そして／または、例えば、抗菌剤および／または抗ヒスタミン剤を含み、そして／または、喘息予防に用いられる。
【０１１８】
投与の他の様式に適切であるさらなる処方物としては、膣坐剤および／または膣ペッサリーが挙げられる。直腸ペッサリーおよび／または直腸坐剤もまた、用いられ得る。坐剤は、直腸、膣および／または尿道への挿入のための、通常薬の入った、種々の重量および／または形状の固体投薬形態である。挿入の後、坐剤は、腔の液体で、軟化、融解および／または溶解する。一般に、坐剤について、伝統的な結合剤および／またはキャリアは、例えば、ポリアルキレングリコールおよび／またはトリグリセリドを含み得；このような坐剤は、０．５％〜１０％、好ましくは、１％〜２％の範囲の活性成分を含む混合物から形成され得る。
【０１１９】
経口処方物としては、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような通常用いられる賦形剤が挙げられる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放性処方物および／または粉末の形態をとる。特定の規定された実施形態では、経口の薬学的組成物は、不活性希釈剤および／または同化可能な食用キャリアを含み、そして／または、これらは、硬質殻ゼラチンカプセルおよび／または軟質殻ゼラチンカプセルにカプセル化され得、そして／または、これらは、錠剤へと圧縮され得、そして／または、治療食の食品に直接取り込まれ得る。経口の治療的投与について、活性化合物は、賦形剤と共に取り込まれ得、そして／または、経口摂取可能な錠剤、バッカル錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、カシェ剤などの形態で用いられ得る。このような組成物および／または調製物は、少なくとも０．１％の活性化合物を含むべきである。組成物および／または調製物の割合は、もちろん、変化し得、そして／または、都合よく、単位重量の約２〜約７５％の間、および／または好ましくは２５〜６０％の間であり得る。このような治療的に有用な組成物における活性化合物の量は、適切な投薬が得られるような量である。
【０１２０】
錠剤、トローチ、丸剤、カプセルなどはまた、以下を含み得る：結合剤として、カラヤゴム、アカシア、トウモロコシ澱粉、および／またはゼラチン；リン酸二カルシウムのような賦形剤；トウモロコシ澱粉、ジャガイモ澱粉、アルギン酸などのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのような潤沢剤；および／またはスクロース、ラクトースおよび／またはサッカリンのような甘味料（が添加され得）、ならびに／あるいはペパーミント、冬緑油、および／またはチェリー香味料のような香味料。投薬単位形態がカプセルである場合、上記の型の材料に加えて、液体キャリアを含む得る。種々の他の材料が、コーティングとして存在し得、そして／または、さもなければ、投薬単位の物理的形態を変更し得る。例えば、錠剤、丸剤、および／またはカプセルは、シェラック、砂糖および／またはその両方でコーティングされ得る。エリキシル剤のシロップは、以下の活性化合物を含み得る：甘味料としてショ糖、および／または保存料としてメチルパラベンおよび／またはプロピルパラベン、色素および／またはチェリーフレーバーおよび／またはオレンジフレーバーのような香味料。
【０１２１】
特定の実施形態では、脂質処方物および／またはナノカプセルの使用が、ＴＲＥＭ−１スプライス改変体タンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび／または薬剤、および／または遺伝子治療ベクター（野生型ベクターおよび／またはアンチセンスベクターの両方を含む）の宿主細胞への導入のために企図される。
【０１２２】
ナノカプセルは、一般的に、安定な方法および／または再現性のある方法で、化合物をエントラップし得る。細胞内ポリマーオーバーローディング（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｏｖｅｒｌｏａｄｉｎｇ）に起因する副作用を避けるため、このような超微細粒子（約０．１μｍのサイズ）が、インビボで分解し得るポリマーを使用して設計されるべきである。これらの要求に見合う生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノカプセルは、本発明における使用を企図され、そして／または、このような粒子は、容易に作製され得る。
【０１２３】
本発明のある実施形態では、ＴＲＥＭ−１またはＴＲＥＭ−１スプライス改変体のポリペプチドまたはフラグメントは、脂質と会合され得る。脂質と会合したポリペプチドは、リポソームの水性の内部にカプセル化され得るか、リポソームの脂質二重層内に内部散在し得るか、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方と会合される連結分子を介してリポソームに付着され得るか、リポソーム内にエントラップされ得るか、リポソームと複合体化され得るか、脂質を含む溶液に分散され得るか、脂質と混合され得るか、脂質と合され得るか、脂質中に懸濁液として含まれ得るか、ミセルに含まれるかまたはミセルと複合体化され得るか、あるいは、さもなければ、脂質と会合され得る。本発明の脂質または脂質／ポリペプチド会合組成物は、溶液中の任意の特定の構造に限定されない。例えば、これらは、二重層構造、ミセルとして、または折畳み構造で存在し得る。これらはまた、単に、溶液中に内部散在し得、これは、恐らく、サイズまたは形状のいずれかにおいて均一ではない凝集体を形成する。
【０１２４】
脂質は、天然に存在する脂質または合成脂質であり得る脂肪物質である。例えば、脂質としては、細胞質中に天然に存在する脂質液滴、および長鎖脂肪族炭化水素およびその誘導体（例えば、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、およびアルデヒド）を含む当業者に周知である化合物のクラスが挙げられる
リン脂質は、本発明に従うリポソームを調製するために用いられ得、そして有効正電荷、有効負電荷、または有効中性電荷を保有し得る。ジアセチルホスフェートは、リポソーム上に負電荷を与えるために用いられ得、そしてステアリルアミンは、リポソーム上に正電荷を与えるために用いられ得る。リポソームは、１つ以上のリン脂質から構成され得る。
【０１２５】
中性に荷電した脂質は、電荷を有さない脂質、実質的に荷電していない脂質、または等しい数の正電荷と負電荷とを有する脂質混合物を含み得る。適切なリン脂質は、ホスファチジルコリン、および当業者に周知の他のものを含む。
【０１２６】
本発明に従う使用に適切な脂質は、商業的供給元から入手し得る。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から入手し得、ジセチルホスフェート（「ＤＣＰ」）は、Ｋ  ＆  Ｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）から入手し得；コレステロール（「Ｃｈｏｌ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇから入手し得；ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）および他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ）から入手し得る。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質のストック溶液は、約−２０℃で保存され得る。好ましくは、クロロホルムは、唯一の溶媒として用いられる。なぜならば、クロロホルムは、メタノールよりもより容易にエバポレートされるからである。
【０１２７】
天然の供給源由来のリン脂質（例えば、卵またはダイズのホスファチジルコリン、脳ホスファチジン酸、脳または植物のホスファチジルイノシトール、心臓カルジオリピン、および植物または細菌のホスファチジルエタノールアミン）は、得られるリポソームの不安定性および漏れが原因で、好ましくは、主要ホスファチド（すなわち、総ホスファチド組成の５０％以上を構成すること）として使用されない。
【０１２８】
リン脂質は、水中に分散される場合、脂質  対  水のモル比に依存して、リポソーム以外の種々の構造を形成し得る。低い比においては、リポソームは、好ましい構造である。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度、および／または二価カチオンの存在に依存する。リポソームは、イオン性物質および／または極性物質に対する低い透過性を示し得るが、高い温度では、明らかにこれらの透過性を変化させる相転移を受ける。この相転移は、密に充填された、秩序立てった構造（ゲル状態として公知）から、ゆるく充填された、あまり秩序立っていない構造（流体状態として公知）への変化を含む。これは、特徴的な相転移温度で生じ、そして／あるいはイオン、糖および／または薬物に対する透過性の増大を生じる。
【０１２９】
リポソームは、以下の４つの異なる機構を通じて、細胞と相互作用する：マクロファージおよび／または好中球のような細網内皮系の貪食細胞によるエンドサイトーシス；非特異的な弱い疎水性力および／もしくは静電力か、ならびに／または細胞表面成分の特異的相互作用かのいずれかによる、細胞表面への吸着；リポソームの脂質二重層を細胞質膜へ挿入することによる、細胞質と膜との融合（細胞質へリポソーム内容物を同時放出する）；ならびに／あるいはリポソーム内容物が会合せずに、リポソーム脂質が細胞膜および／もしくは亜細胞膜へ移動すること、および／またはその逆。リポソーム処方物を変化させることは、どの機構が作動するかを変化させ得るが、１を超える機構が同時に作動し得る。
【０１３０】
インビトロでの外来ＤＮＡのリポソーム媒介性オリゴヌクレオチド送達および発現は、非常に成功した。Ｗｏｎｇら（１９８０）は、培養したニワトリ胚細胞、ＨｅＬａ細胞および肝癌細胞における外来ＤＮＡのリポソーム媒介性送達および発現の実現可能性を実証した。Ｎｉｃｏｌａｕら（１９８７）は、静脈注射後のラットにおける首尾よいリポソーム媒介性遺伝子移入を達成した。
【０１３１】
本発明の特定の実施形態において、脂質は、血球凝集性ウイルス（ＨＶＪ）と会合し得る。これは、細胞膜との融合を容易にし、リポソームカプセル化ＤＮＡの細胞進入を促進することが示された（Ｋａｎｅｄａら、１９８９）。他の実施形態において、脂質は、核非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と複合体化得るかまたはこれとともに使用され得る（Ｋａｔｏら、１９９１）。なおさらなる実施形態において、脂質は、ＨＶＪおよびＨＭＧ−１の両方と複合体化され得るか、またはこれらとともに使用され得る。このような発現ベクターが、インビボまたはインビトロでのオリゴヌクレオチドの移入および発現において首尾よく使用されるという点で、これらは、本発明に適用可能である。細菌プロモーターが、ＤＮＡ構築物において使用される場合、適切な細菌ポリメラーゼをリポソーム内に含めることもまた、望ましい。
【０１３２】
本発明に従って使用される脂質は、異なる方法により作製され得る。リポソームのサイズは、合成方法に依存して変化する。水溶液中に懸濁されるリポソームは、概して、脂質二重層分子の１以上の同心層を有する球状小胞の形状にある。各層は、式ＸＹにより示される分子の平行な配置からなり、ここでＸは、親水性部分であり、Ｙは、疎水性部分である。水性懸濁液において、同心層は、親水性部分が水相と接触した状態であり続ける傾向があり、かつ疎水領域は、自己会合する傾向があるように、配置される。例えば、水相がリポソーム内またはリポソームなしの両方に存在する場合、脂質分子は、配置ＸＹ−ＹＸの二重層（ラメラとして公知）を形成し得る。脂質の凝集物は、１を超える脂質分子の親水性部分および疎水性部分が互いに会合する場合に形成し得る。これらの凝集物のサイズおよび形状は、多くの異なる変数（例えば、溶媒の性質および溶液中の他の化合物の存在）に依存する。
【０１３３】
本発明の範囲内のリポソームは、公知の実験技術に従って調製され得る。１つの好ましい実施形態において、リポソームは、リポソーム脂質を容器（例えば、ガラス製の洋ナシ型フラスコ）中の溶媒中で混合させることにより調製される。この容器は、予測されるリポソーム懸濁液の容積より１０倍大きな容積を有するべきである。ロータリーエバポレーターを使用して、この溶媒を、約４０℃で陰圧下で除去する。この溶媒は、通常は、リポソームの所望の容積に依存して、約５分〜２時間内に除去される。この組成物は、真空下でデシケーター中でさらに乾燥され得る。乾燥した脂質は、一般に、時間を経るにつれて劣化する傾向があるので、約１週間後に廃棄される。
【０１３４】
乾燥した脂質は、発熱物質を含まない滅菌水中で、脂質の膜の全てが再懸濁されるまで振盪することにより、約２５〜５０ｍＭのリン脂質にて水和され得る。次いで、水性リポソームは、アリコートに分けられて、各々がバイアルに入れられ、真空下で、凍結乾燥および密封され得る。
【０１３５】
代替方法において、リポソームは、他の公知の実験手順に従って調製され得る：Ｂａｎｇｈａｍら（１９６５）の方法（その内容は、本明細書中に参考として援用される）；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓの方法（ＤＲＵＧ  ＣＡＲＲＩＥＲＳ  ＩＮ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ，Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ編（１９７９）２８７−３４１頁に記載（その内容は、本明細書中に参考として援用される））；逆相エバポレーション法（ＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ（１９７８）により記載される）。上述の方法は、水性物質を捕捉するそれらそれぞれの能力およびそれらそれぞれの水性空間  対  脂質の比が異なる。
【０１３６】
上記のように調製される乾燥脂質または凍結乾燥リポソームは、阻害性ペプチドの溶液中にて水和および再構成され、適切な溶媒（例えば、ＤＰＢＳ）により適切な濃度に希釈され得る。次いで、この混合物は、ボルテックスミキサー中で激しく攪拌される。カプセル化されていない核酸は、２９，０００×ｇでの遠心分離により除去され、リポソームペレットが洗浄される。洗浄されたリポソームは、適切な総リン脂質濃度（例えば、約５０〜２００ｍＭ）で再懸濁される。カプセル化された核酸の量は、標準的な方法に従って決定され得る。リポソーム調製物中にカプセル化された核酸の量を決定した後に、このリポソームを、適切な濃度に希釈し、使用するまで４℃で保存し得る。
【０１３７】
リポソームを含む薬学的組成物は、通常、滅菌された薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤（例えば、水または生理食塩水溶液）を含む。
【０１３８】
（実施例）
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含められる。以下の実施例に開示される技術は、本発明者らにより発見された技術を、本発明の実施において十分に機能するように示しており、従って、本発明の実施のための好ましい態様を構成するとみなされ得ることが当業者に認識されるはずである。しかし、本開示を参照して、開示される特定の実施形態において、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、多くの変更が行われ得、同様な結果または類似の結果をなお得ることを、当業者は理解するはずである。
【０１３９】
（実施例１：Ｕ９３７細胞分化）
Ｕ９３７細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（Ｄ３）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて分化させ、組換えヒトＴＧＦ−β１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を毎日２５０ｎｇ／ｍｌ（６０ｎＭ）および１ｎｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ４日間添加した（ＧｉｎｇｒａｓおよびＭａｒｇｏｌｉｎ，２０００）。
【０１４０】
（実施例２：細胞単離）
ヒト骨髄ＣＤ３４＋幹細胞および末梢血由来ＣＤ１４＋成熟単球を、ＧｉｎｇｒａｓおよびＭａｒｇｏｌｉｎ（２０００）に記載されるように単離する。ＣＤ３４＋細胞調製物およびＣＤ１４＋細胞調製物の純度が、それぞれ９０％および９８％より高いことを、ＦＡＣＳ分析により確認した。ｐｒｅ−Ｂ急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）（ＦＡＢ１およびＦＡＢ５）と診断された患者の白血球搬出サンプルを、ポリスクロース勾配（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ，Ｓｉｇｍａ）上で分画し、細胞を界面に集めた。
【０１４１】
（実施例３：差し引きライブラリーの構築およびスクリーニング）
差し引きライブラリーを、ＧｉｎｇｒａｓおよびＭａｒｇｏｌｉｎ（２０００）により記載されるように構築し、スクリーニングした。簡潔には、総細胞ＲＮＡおよびｍＲＮＡを、それぞれ、Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ  ＩＩ（Ｂｉｏｔｅｃｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）およびＯｌｉｇｏｔｅｘ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ，ＣＡ）を用いて抽出した。ＰＣＲベースのｃＤＮＡ差し引き法を、未分化Ｕ９３７細胞  対  分化Ｕ９３７細胞に対して行った（Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏら、１９９６およびＧｕｒｓｋａｙａら、１９９６）。増幅した、差し引き処理した細胞ｃＤＮＡをｐＴ７Ｂｌｕｅベクターに連結し、ＮｏｖａＢｌｕｅコンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に形質転換した。差示的に発現した遺伝子のスクリーニングを、ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ差示的スクリーニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて行った。ＴＲＥＭ−１およびＭＤＬ−１を、それぞれ、７１３塩基および４９８塩基のＲｓａＩフラグメントとして得た。
【０１４２】
（実施例４）
（ドットブロット分析）
Ｃｌｏｎｔｅｃｈの多重組織発現アレイ（ＭＴＥ）を、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ハイブリダイゼーション溶液を使用して、６５℃で一晩、Ｓｔｒｉｐ−ＥＺ３２Ｐ標識プローブ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）にハイブリダイズした。このアレイを、推奨されるようにして洗浄し（６５℃、２×ＳＳＣ／１％ＳＤＳ中で５×２０分、および５５℃、０．１×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳ中で２×２０分）、そしてＫｏｄａｋ  Ｘ−ＯＭＡＴ  ＡＲフィルムに暴露した。
【０１４３】
ＴＲＥＭ−１およびＭＤＬ−１の発現分布を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈの多重組織発現アレイを使用して分析した。ＴＲＥＭ−１の発現は、骨髄におけるより末梢血白血球においてより上昇したが、ＭＤＬ−１の発現は、末梢血白血球におけるより骨髄においてわずかに多かった。ＴＲＥＭ−１およびＭＤＬ−１の発現をまた、リンパ節において検出した。ＴＲＥＭ−１は、成人の肝臓、肺および脾臓において、対応する胎児組織におけるよりもより多く発現し、ＭＤＬ−１は、胎児肝臓組織および肺組織より成人においてより多く発現した。ＴＲＥＭ−１はまた、胎盤、脊髄および心臓組織において発現した。
【０１４４】
（実施例５）
（ＣＤ３４＋細胞およびＣＤ１４＋細胞、Ｕ９３７細胞、ＡＭＬ患者およびＡＬＬ患者におけるＴＲＥＭ−１、ＭＤＬ−１およびＤＡＰ１２遺伝子発現）
ＴＲＥＭ−１、ＭＤＬ−１およびＤＡＰ１２遺伝子発現を、いくつかの細胞型において分析した。１μｇのＣＤ３４＋およびＣＤ１４＋の総ＲＮＡ、ならびに１００ｎｇのＵ９３７、ＡＭＬおよびＡＬＬのｍＲＮＡを、２０μｌの容量のオリゴｄＴの存在下で逆転写した。１μｌのｃＤＮＡを、２５μｌの容量で、ＧＡＰＤＨプライマーセットを用いて２０サイクル、ＴＲＥＭ−１プライマーセットを用いて２５サイクル（ＣＤ３４＋細胞およびＣＤ１４＋細胞）または３２サイクル（Ｕ９３７細胞、ＡＭＬ細胞およびＡＬＬ細胞）、ＭＤＬ−１プライマーセットを用いて３０サイクル、およびＤＡＰ１２プライマーセットを用いて２６サイクル増幅した。以下のプライマーセットを使用した。
【０１４５】
ＴＲＥＭ−１プライマーセット：正常な改変体およびスプライス改変体の発現を検出するために設計される；その位置は、図４に示されるＴＲＥＭ−１配列に関する。（配列番号１４；センスプライマー）５’ＧＧＡＣＧＧＡＧＡＧＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡＣＣ３’（塩基２４１〜２６２）および（配列番号１５；アンチセンスプライマー）５’ＡＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＡＴＧＡＣＡＡＴＧ３’（塩基６７９〜７００）（ＣＤ３４＋細胞およびＣＤ１４＋細胞）。（配列番号１６；センスプライマー）５’ＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＴＴＣＡＡＡＧＡＡＴ３’（塩基２７３〜２９２）および（配列番号１７；アンチセンスプライマー）５’ＣＣＴＣＣＣＴＴＧＧＣＡＣＡＡＣＴ３’（塩基８２１〜８３７）（Ｕ９３７細胞、ＡＭＬ細胞およびＡＬＬ細胞）。ＭＤＬ−１プライマーセット：（配列番号１８；センスプライマー）５’ＴＴＧＴＧＧＡＧＧＡＴＴＴＧＡＡＧＴＴＧＡＧ３’および（配列番号１９；アンチセンスプライマー）５’ＣＧＴＧＡＧＴＣＴＡＡＧＧＧＴＴＧＧＡＴＧＧ３’。ＤＡＰ１２プライマーセット：（配列番号２０；センスプライマー）５’ＡＴＣＣＣＡＣＣＧＧＣＣＣＴＴＡＣＡＣＴ３’および（配列番号２１；アンチセンスプライマー）５’ＧＧＧＧＡＧＣＧＧＴＣＴＧＧＴＣＴＣＴ３’。ＧＡＰＤＨプライマーセット：Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入。
【０１４６】
ＲＴ−ＰＣＲを、前駆ＣＤ３４＋幹細胞および成熟ＣＤ１４＋単球について、並行して実施し、そして成熟単球におけるＴＲＥＭ−１、ＭＤＬ−１およびＤＡＰ１２の発現の著しい増加が示された（図２Ａ）。各遺伝子について、前駆細胞における任意の発現を検出するために必要なＰＣＲサイクルの数は、成熟ＣＤ１４＋単球においてＰＣＲプラトーに達するために必要なサイクルの数よりも多かった。未分化のＵ９３７細胞において、ＴＲＥＭ−１、ＭＤＬ−１およびＤＡＰ１２の発現は、ノーザンによって全くかまたはほとんど検出されず、ＲＴ−ＰＣＲによって明らかになった（図２Ｂおよび図３）。対照的に、ノーザンブロットにおいて得られたシグナルに基づいて、ＴＲＥＭ−１、ＭＤＬ−１およびＤＡＰ１２を、分化したＵ９３７細胞において高度に発現させた（図３）。
【０１４７】
ＡＭＬ  ＦＡＢ１細胞およびＡＭＬ  ＦＡＢ５細胞におけるＴＲＥＭ−１およびＤＡＰ１２の発現は、ノーザンにより検出可能であり、そしてＦＡＢ１細胞におけるよりも分化したＦＡＢ５細胞において強かった（図３）。ＡＭＬ細胞におけるＭＤＬ−１の発現は、ノーザンによりほとんど検出不可能であったが、ＲＴ−ＰＣＲにより検出された（図２Ｂおよび図３）。しかし、ＭＤＬ−１およびＤＡＰ１２の発現は、ＦＡＢ５細胞においてほんのわずかだけ多かった。ＴＲＥＭ−１、ＭＤＬ−１およびＤＡＰ１２の発現をまた、ＲＴ−ＰＣＲによって、ＡＬＬにおいて検出した（図２Ｂ）。
【０１４８】
（実施例６）
（ｃＤＮＡ全長検出）
ＴＲＥＭ−１でクローン化したフラグメントを、５’末端をビオチン化したネスト化プライマー１およびネスト化プライマー２Ｒを使用して、ＰＣＲによって増幅した。これらのプライマーを、抑制減法ハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）（ＧｉｎｇｒａｓおよびＭａｒｇｏｌｉｎ、２０００）のために使用されるｃＤＮＡの全てに連結したアダプター中に位置した。得られたビオチン化プローブを、２％アガロースゲルで電気泳動し、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ遠心フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｔ，ＭＡ）を使用して精製した。１００ｎｇのビオチン化プローブおよび１μｇの増幅した分化Ｕ９３７  ｃＤＮＡ（ＳＭＡＲＴ  ｃＤＮＡ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を一緒に変性し、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ｋｉｌｏｂａｓｅＢＩＮＤＥＲ結合溶液（Ｄｙｎａｌ，Ｌａｋｅ  Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）と混合し、そして６５℃で一晩ハイブリダイズした。次いで、ビオチン化ハイブリッドを、５０μｇのＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ２８０ストレプトアビジンと共に３時間インキュベートした。０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳを用いて室温で１５分の洗浄を２回行い、そして１５分の洗浄を６５℃で３回行った。全長ｃＤＮＡを、水中９５℃で、５分間溶離し、そしてＳＭＡＲＴ  ＰＣＲ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からのＰＣＲプライマーを用いて増幅した。ハイブリダイゼーションを、１００ｎｇのビオチン化プローブおよび１００ｎｇの増幅して選択したｃＤＮＡを用いて、２回以上繰り返した。この全長ｃＤＮＡを、ｐＣＲ２．１ベクター（ＴＡクローニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にクローニングし、ＰＣＲによって同定し、そして配列決定した。
【０１４９】
Ｕ９３７細胞から得られた配列がいずれの変異も含まないことを確認するために、１μｇのＣＤ１４＋総ＲＮＡを、オリゴｄＴおよび以下のプライマーセットで増幅したｃＤＮＡを用いて逆転写した。プライマーの位置は、図４に関する。−５’末端セット：（配列番号２２；センスプライマー）５’ＧＧＡＧＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＴＴＧ３’（塩基２６〜４５）および（配列番号２３；アンチセンスプライマー）５’ＴＴＧＧＧＴＧＧＡＧＣＴＴＧＧＧＴＣＡＣ３’（塩基５７８〜５９７）−３’末端セット：（配列番号１６；センスプライマー）５’ＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＴＴＣＡＡＡＧＡＡＴ３’（塩基２７３〜２９２）および（配列番号２４；アンチセンスプライマー）５’ＴＴＴＡＡＧＧＴＧＡＧＡＣＧＣＴＧＡＣＴ３’（塩基９０４〜９２３）。
【０１５０】
ＴＲＥＭ−１およびＴＲＥＭ−１スプライス改変体を、ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１ベクター（ＴＡクローニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）においてクローニングすることによって、配列決定するために単離した。
【０１５１】
（実施例７）
（イントロン分析：ＴＲＥＭ−１スプライス改変体における選択的スプライシングの確認）
正常な個体由来の血液を、ポリスクロース勾配（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ，Ｓｉｇｍａ）で分画し、単核細胞（ＰＢＭＣ）を界面で回収した。ＰＢＭＣゲノムＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）で抽出した。分化したＵ９３７細胞のｍＲＮＡについてのＲＴ−ＰＣＲ、および正常なＰＢＭＣゲノムＤＮＡについてのＰＣＲを、推定５’および３’連結部位に隣接するように設計された以下のプライマーセットを用いて、並行して行った：−５’連結セット：（配列番号２５；センスプライマー）５’ＣＧＡＡＴＧＧＴＣＡＡＣＣＴＴＣＡＡＧ３’（塩基３５９〜３７７）および（配列番号２６；アンチセンスプライマー）５’ＣＴＧＧＴＡＴＡＧＡＧＴＧＧＧＣＡＣＡＡ３’（塩基５４８〜５６７）−３’連結セット：（配列番号２７；センスプライマー）５’ＡＡＧＣＴＣＣＡＣＣＣＡＡＧＴＣＡＡＣＴＧＣ３’（塩基５８５〜６０６）および（配列番号１５；アンチセンスプライマー）５’ＡＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＡＴＧＡＣＡＡＴＧ３’（塩基６７９〜７００）。
【０１５２】
自動化配列決定反応を行った。
【０１５３】
（実施例８）
（３サイズのＴＲＥＭ−１  ｍＲＮＡ）
ノーザンブロットを、１％ホルムアルデヒドゲルで電気泳動した１．６５μｇのｍＲＮＡを用いて調製し、ナイロン膜（ＢｒｉｇｈｔＳｔａｒ−Ｐｌｕｓ，Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）（ＧｉｎｇｒａｓおよびＭａｒｇｏｌｉｎ，２０００）上で下に移動させ、そしてＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ハイブリダイゼーション溶液を使用して、Ｓｔｒｉｐ−ＥＺ  ３２Ｐ標識プローブ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）に６５℃で一晩ハイブリダイズした。この膜を、推奨されるようにして洗浄し（６５℃、２×ＳＳＣ／１％  ＳＤＳ中で５×２０分、および５５℃、０．１×ＳＳＣ／０．５％  ＳＤＳ中で２×２０分）、そしてフィルムに暴露した。
【０１５４】
ＴＲＥＭ−１、ＤＡＰ１２およびＭＤＬ−１  Ｒｓａ  Ｉフラグメントにハイブリダイズしたノーザンブロットにより、３つの異なるサイズのＴＲＥＭ−１  ｍＲＮＡ（約９５０塩基、約１，７００塩基および約３，５００塩基）、ならびに分化したＵ９３７細胞における約３，５００塩基のＭＤＬ−１  ｍＲＮＡおよび約７５０塩基のＤＡＰ１２  ｍＲＮＡが検出された（図３）。
【０１５５】
（実施例９）
（ＴＲＥＭ−１およびＴＲＥＭ−１スプライス改変体）
ＴＲＥＭ−１クローン化配列を、７１３塩基のＲｓａ  ＩフラグメントとしてＳＳＨライブラリーから単離した。９４８塩基のＴＲＥＭ−１（配列番号８）全長配列を、分化したＵ９３７細胞における間接的なハイブリッド捕獲によって得、そして正常なＣＤ１４＋細胞において確認した（図４）。９４８塩基配列は、Ｂｏｕｃｈｏｎ、ＤｉｅｔｒｉｃｈおよびＣｏｌｏｎｎａ（配列番号９）により最近公開された８８４塩基のうち８５４塩基と同一であった。これは、５’非コード領域の長さ（６４塩基をＯＲＦの前の４７塩基と比較）、およびポリアデニル化部位に達した３’非コード領域の長さにおいて異なる。２つの配列間の３０塩基の不一致は、５’非コード領域に存在した：Ｂｏｕｃｈｏｎらにより公開された初めの３０塩基配列は、Ｕ９３７およびＣＤ１４＋細胞において得られた初めの４７塩基配列と相同性を共有しなかった。ＣＤ１４＋細胞において、５’末端プライマーセットを用いる増幅により、Ｕ９３７細胞において得られるＴＲＥＭ−１配列と完全に一致する産物を得た。このプライマーセットは、この配列の内側の５７８塩基に位置するアンチセンスプライマーと対形成した５’非コード領域（塩基２６〜４５）に位置するセンスプライマーから構成される（図４）。このセンスプライマーは、ＢｏｕｃｈｏｎらのＴＲＥＭ−１の初めの３０塩基配列と相同性を有さなかった。この結果は、図４に記載される５’非コード領域配列を証明する。さらに、配列番号８；ＴＲＥＭ−１配列（５’非コード領域を含む）は、ＧｅｎＢａｎｋ（寄託番号ＡＣ０２３３２０）の未完成のヒトゲノム配列（ｈｔｇ）において利用可能な情報と相関した。
【０１５６】
プライマーセットは、ＴＲＥＭ−１配列の予測された大きさのみならず、予測されなかったより短い産物の増幅された６７９塩基においてまたはその後に配置されるアンチセンスプライマーと対になった、最初の第１の３００塩基内に配置されるセンスプライマーからなる（図２）。その改変体を、前駆体ＣＤ３４＋細胞（高められたＰＣＲサイクル）、成熟ＣＤ１４＋単球、分化Ｕ９３７細胞、およびＡＭＬ細胞におけるＲＴ−ＰＣＲによって検出した。その改変体は、使用した実験条件下では、未分化Ｕ９３７またはＡＬＬ細胞において、ＲＴ−ＰＣＲによって検出されなかった。その改変体は、２００塩基より小さく分離されたｍＲＮＡ間の近似した移動、および９５０塩基バンドの強度のために、Ｎｏｒｔｈｅｒｎにおける個々のバンドとして検出されなかった。
【０１５７】
配列決定後、この産物を、塩基４７１〜６６３の１９３塩基欠失を含むＴＲＥＭ−１スプライス改変体（配列番号１）として同定した（図４）。この欠失した配列（ＣＡＡＧＧおよびＣＡＧＧ）の両方の境界における塩基は、ｃＤＮＡスプライス接合のコンセンサス配列（Ｍｏｕｎｔ、１９８２）と一致する。このＣＡＡＧ配列およびＣＡＧ配列は、５’末端隣接エキソンの最初のＧに連結するエキソンスプライシング接合の３’末端に由来する。これは、この改変体がエキソンの代替的なスプライシングによって得られたことを示す。次に、プライマーセットを、各スプライシング境界をカバーするように設計した。正常ゲノムＤＮＡのＰＣＲは、約１，４００および４，８００塩基対産物の増幅を生じた。これは、ＧｅｎＢａｎｋの未完成ヒトゲノム配列（ｈｔｇｓ）（Ａｌｔｓｈｕｌら、１９９７）に対して、ＴＲＥＭ−１  ｃＤＮＡを使用するＢＬＡＳＴ分析から得られた結果と対応する。この検索は、ＴＲＥＭ−１ゲノム（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＣ０２３３２０）における４つのエキソンおよび３つのイントロンの位置を同定し、そして改変体において欠失した配列が、実際に第３のＴＲＥＭ−１エキソンであるエキソンであったことをもう一度確認した（図５）。
【０１５８】
（実施例１０）
（ＴＲＥＭ−１スプライス改変体の診断的使用）
ＴＲＥＭ−１スプライス改変体のレベルを、正常な個体および自動免疫疾患に罹患する個体から採集したサンプル中で測定する。採集されるサンプルは、全血および骨髄のサンプルである。単球および好中球を、当該分野で周知の標準的手順を使用して単離し、そしてＴＲＥＭ−１タンパク質のレベルを、単球および好中球中で測定する。ＴＲＥＭ−１スプライス改変体のレベル（これは、ＴＲＥＭ−１の循環性であってかつ可溶な形態である）を、血液サンプル中で測定する。
【０１５９】
単球および好中球に関する異常量のＴＲＥＭ−１、および血液中に排泄された異常量のＴＲＥＭ−１ｓｖについて、サンプルを分析する。
【０１６０】
なお、さらに、当業者は、マクロファージが組織サンプルから単離され得、そしてＴＲＥＭ−１および／またはＴＲＥＭ−１スプライス改変体が単離されたマクロファージ中で測定されることを実現する。使用され得る組織サンプルは、全ての組織を含む。
【０１６１】
（実施例１１）
（インビトロ機能的アッセイ）
免疫応答のインビトロ活性化を、この系にＴＲＥＭ−１スプライス改変体タンパク質を流入ことによってブロックする。
【０１６２】
免疫学的細胞株を、インビトロ研究のために使用する。この細胞をプレートに入れ、集密下で増殖させる。一旦、細胞が集密になったら、次いで、サイトカイン産生のような免疫応答を誘発するために刺激剤または誘発性が加えられる。ＬＰＳのような刺激物質が、当該分野において、周知慣用である。ＬＰＳは、周密細胞に加えられる。刺激に際し、サイトカイン産生を測定する。次に、ＴＲＥＭ−１スプライス改変体を細胞に加える。一定時間のインキュベーション後、サイトカイン産生を測定する。サイトカイン産生の減少は、ＴＲＥＭ−１スプライス改変体が免疫応答を下方制御したことを示す。
【０１６３】
このインビトロ方法に対する改変は、本発明の範囲内にある。例えば、ＬＰＳとＴＲＥＭ−１スプライス改変体とを、同時に集密細胞に加える。インキュベーション期間後、サイトカインレベルを測定する。刺激されていない未処理の細胞と同様のサイトカインレベルは、ＴＲＥＭ−１スプライス改変体の同時添加が免疫応答の開始を阻害したことを示す。
【０１６４】
（実施例１２）
（炎症応答のインビボ遮断）
この炎症応答は、この系にＴＲＥＭ−１スプライス改変体タンパク質を流入することによってインビボで遮断する。
【０１６５】
ＴＲＥＭ−１スプライス改変体ポリペプチドを、炎症性応答に罹患している動物に対して静脈内に投与する。このポリペプチドを、ペプチド製剤としてか、または薬学的キャリアと組み合わせて、投与する。
【０１６６】
ＴＲＥＭ−１スプライス改変体ポリペプチドを、炎症の部位に直接投与する。
【０１６７】
過剰ＴＲＥＭ−１スプライス改変体の投与が炎症性応答の下方制御を生じ得ることが想定される。
【０１６８】
（実施例１３）
（敗血症性ショックにおける炎症の調節）
ＴＲＥＭ−１スプライス改変体または改変体が敗血症性ショックのための潜在的治療であることが想定される。
【０１６９】
マウスを、異なる濃度のＬＰＳで腹腔内注射する。ＴＲＥＭ−１スプライス改変体ポリペプチドまたはＴＲＥＭ−１に対するリガンドの他の競合的インヒビターを、ＬＰＳ投与の１時間後、２時間後、４時間後および６時間後に動物に投与する。
【０１７０】
別の代替は、ＬＰＳ投与の１時間前に、動物にＴＲＥＭ−１スプライス改変体ポリペプチドまたはＴＲＥＭ−１に対するリガンドの他の競合的インヒビターを投与することである。
【０１７１】
両方の実施例において、ＴＲＥＭ−１スプライス改変体の投与がショックおよび死を防止する炎症性応答の下方制御を生じることが想定される。従って、可溶性ＴＲＥＭ−１の投与は、敗血症性ショックおよび炎症性疾患の処置のための適切な治療である。
【０１７２】
（実施例１４）
（構造的機能研究）
構造的機能研究を、当該分野で周知慣用である標準的な一過性トランスフェクション技術を使用して、ＴＲＥＭ−１スプライス改変体の変異体を発現することによって行う。ＴＲＥＭ−１スプライス改変体の領域を欠失し、そして刺激物質の存在下の細胞の活性化を阻害する変異体の能力を測定する。具体的な測定として、炎症誘発性のケモカインおよびサイトカイン、カルシウム固定化およびチロシンリン酸化が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７３】
ＴＲＥＭ−１スプライス改変体の変異体を使用して構造的研究を行うことに加えて、同様の構造的研究を、ＴＲＥＭ−１の変異体を発現することによって行う。
【０１７４】
（実施例１５）
（ＴＲＥＭ−１スプライス改変体による腫瘍細胞の単球媒介殺傷の調節）
Ｋ５６２、Ｕ９３７、およびＫＧ−１のような白血病細胞（標的細胞）を、１２：１のエフェクター標的比率で、１０５細胞／ｍｌにおいて、単球（エフェクター細胞）とともにプールする。このプレートを２００×ｇで遠心分離して細胞接合を促進し、そして以下の群の試薬のうちの１つと３７℃で２４時間インキュベートする：コントロール；ＴＲＥＭ−１スプライス改変体；抗ＴＲＥＭ−１抗体（またはＴＲＥＭ−１リガンド）；抗ＴＲＥＭ−１抗体およびＴＲＥＭ−１スプライス改変体；ＧＭ−ＣＳＦ；ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＲＥＭ−１スプライス改変体；ＬＰＳ；ＬＰＳおよびＴＲＥＭ−１スプライス改変体；ＧＭ−ＣＳＦおよびＬＰＳ；ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＰＳ、およびＴＲＥＭ−１スプライス改変体。
【０１７５】
単球媒介殺傷を、ＭＴＴ細胞傷害アッセイによって測定する。
【０１７６】
ＴＲＥＭ−１スプライス改変体は、異なる経路（すなわち、ＤＡＰ１２／ＴＲＥＭ−１またはＴＮＦ）を通して活性化される単球によって白血病細胞殺傷を阻害し得ることが企図される。
【０１７７】
（実施例１６）
（単球媒介腫瘍免疫治療の調節）
単球媒介腫瘍免疫治療の課程の間のＴＲＥＭ−１スプライス改変体の下方制御が処置の効率を増加し得ることが想定される。
【０１７８】
抗体は、ＴＲＥＭ−１スプライス改変体のテイル部分に対して惹起される。これらの抗体は、ＴＲＥＭ−１スプライス改変体と結合するが、ＴＲＥＭ−１とは結合しない。この抗体を、単球／マクロファージ治療を使用して、適合した免疫治療を受けた腫瘍を有する動物に投与する。単球媒介免疫治療は、当該分野において周知慣用である技術を使用して行われる（Ａｎｄｒｅｅｓｅｎら、１９９８；Ｌｅｓｉｍｐｌｅら、１９９８；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、１９９９ａ、Ｗｉｌｌｉａｍｓら、１９９９ｂおよびＷｉｌｌｉａｍｓら、１９９９ｃ）。
【０１７９】
抗体が、ＴＲＥＭ−スプライス改変体の減少、ならびに炎症の増加および免疫応答の増強を生じるＴＲＥＭ−１レベルの増加を生じる、ＴＲＥＭ−１スプライス改変体に結合することが企図される。炎症におけるこの増加は、免疫治療の効率をを増加することが想定される。
【０１８０】
ＴＲＥＭ−１スプライス改変体に加えて、抗体またはアンタゴニストが、例えば、ＴＲＥＭ−１スプライス改変体アンチセンスＲＮＡに投与され得るが、これに限定されない。
【０１８１】
（実施例１７）
（免疫媒介移植片拒絶の調節）
ＴＲＥＭ−１ｓｖ産生の上方制御、またはＴＲＥＭ１−ｓｖタンパク質もしくは誘導体の投与が、移植片拒絶に関する急性免疫反応および慢性免疫反応を減少し得ることが企図される。これは、固体器官移植および骨髄移植の両方を含む。
【０１８２】
（実施例１８）
（悪性および非悪性の組織球障害における免疫反応の調節）
ＴＲＥＭ−１ｓｖの上方制御、またはＴＲＥＭ−１もしくはＴＲＥＭ１−ｓｖタンパク質もしくは誘導体の投与が、炎症性媒介物質の放出を減少し得、そして以下のような悪性および非悪性の組織球疾患の両方に見られる心臓血管効果および組織破壊を軽減し得ることが企図される：ランゲルハンス細胞組織球増殖症、別名ＬＣＨ、血球貪食性リンパ組織球増多症、別名ＨＬＨ、およびウイルス関連血球貪食性症候群、別名ＶＡＨＳ。
【０１８３】
本明細書中で言及される全ての特許および刊行物は、本発明の属する当業者のレベルの指標である。全ての特許および刊行物は、各個々の刊行物が特異的にかつ個々に参考として援用されることが指示されているかのように、本明細書中において、同程度に参考として援用される。
【０１８４】
【表１】
2004522742.tif 000002
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本発明が、目的を実行し、そして本明細書に記述され、かつ固有の結果および利点を得るために十分適合されることを、当業者は容易に理解する。本明細書に記載されるタンパク質、ペプチドフラグメント、スプライス改変体、ベクター、方法、手順および技術は、好ましい実施形態を現在代表するものであり、そして例証を意図しており、範囲を限定することを意図しない。本発明における変形およびその他の用途は、本発明の精神に含まれるかまたは係属中の特許請求の範囲により規定されるということを当業者は想到する。
【図面の簡単な説明】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、そして本発明の特定の局面をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書中で提示される具体的な実施形態の詳細な説明と一緒に１つ以上のこれらの図面を参照することによって、より良好に理解され得る。
【図１】
図１は、ＤＡＰ１２およびＴＲＥＭ−１の図式モデルである。ジスルフィド結合したＤＡＰ１２ホモダイマーは、ＴＲＥＭ−１の膜貫通架橋ドメイン内の２つのリジン残基（Ｋ＋）と相互作用する潜在能力を有する、原形質膜内の２つのグルタミン酸残基（Ｄ−）を示す。ＴＲＥＭ−１は、１つの細胞外免疫グロブリン様ドメインを含む。ジスルフィド結合は、（ＳＳ）で示される。ＳｙｋキナーゼおよびＺＡＰ７０キナーゼは、チロシンリン酸化ＩＴＡＭ（ｐＹｘｘＬ）と関連してこれらの二重のＳＨ２ドメインで示される。
【図２】
図２Ａおよび図２Ｂは、ＴＲＥＭ−１発現、ＴＲＥＭ−１スプライス改変体発現、ＭＤＬ−１発現、およびＤＡＰ１２発現のＲＴ−ＰＣＲ産物を例示する。図２Ａは、ＣＤ３４＋前駆体細胞および成熟ＣＤ１４＋単球由来のＲＴ−ＰＣＲ産物を示す。図２Ｂは、Ｕ９３７細胞（非分化（Ｕ）および分化（Ｄ））、ＡＭＬ（ＦＡＢ１およびＦＡＢ５）ならびにＡＬＬ由来のＲＴ−ＰＣＲ産物を示す。
【図３】
図３は、Ｕ９３７細胞（非分化（Ｕ）および分化（Ｄ））、ＡＭＬ（ＦＡＢ１およびＦＡＢ５）、ならびにＡＬＬにおけるＴＲＥＭ−１発現、ＭＤＬ−１発現およびＤＡＰ１２発現のノーザン分析を例示する。
【図４】
図４は、ＴＲＥＭ−１およびＴＲＥＭ−１スプライス改変体：ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を図示する。ｃＤＮＡ：この改変体にスプライシングされる１９３塩基の領域を、太字および下線で示す。タンパク質：疎水性シグナルペプチドは小文字であり、そしてＮ＋は、潜在的なＮ−グリコシル化部位を示す。小さなボックスは、ジスルフィド架橋の発生に潜在的に関与するコンセンサス配列を含む。膜貫通ドメインを、より長いボックスで囲む。
【図５】
図５は、ＴＲＥＭ−１ゲノム構造およびｍＲＮＡプロセシングの図式的表示を図示する。ボックスは、ＧｅｎＢａｎｋゲノム配列登録番号ＡＣ０２３３２０と相関するＴＲＥＭ−１  ｃＤＮＡ配列によって決定されるような、４つのエキソンの位置を表す。灰色の領域および斜線の領域は、それぞれ、非翻訳領域および膜貫通ドメインを表す。改変体でスプライシングされたエキソンは、黒で塗りつぶされている。水平方向の数字は、エキソンおよびイントロンのサイズを表す。垂直方向の数字は、ゲノム配列（ＡＣ０２３３２０）におけるエキソンおよびイントロンの位置に対応する。
【図１】
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【図２】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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