(57)【要約】本発明は、ヒトの膜貫通タンパク質（ＴＭＰ）、および、ＴＭＰを同定しコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニストおよびアンタゴニストをも提供する。本発明はまた、ＴＭＰの異常発現に関連する障害を診断、治療、または予防する方法をも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）乃至（ｄ）からなる群から選択した単離されたポリペプチド。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７（配列番号１乃至１７）からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一であるような天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片
【請求項２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択したアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
請求項１のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項２のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を有する、請求項４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３に記載のポリヌクレオチドに対し機能的に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞。
【請求項８】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換体。
【請求項９】
請求項１のポリペプチドを生産する方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、請求項１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を持つ組換えポリヌクレオチドで形質転換される細胞を培養する過程と、
（ｂ）そのように発現した前記ポリペプチドを回収する過程とからなり、前記組換えポリヌクレオチドが、請求項１に記載の前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を有することを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択したアミノ酸配列を持つことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドと特異結合するような単離された抗体。
【請求項１２】
以下の（ａ）乃至（ｅ）からなる群から選択した単離されたポリヌクレオチド。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％が同一であるような天然のポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＲＮＡ等価物
【請求項１３】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続したヌクレオチドを持つ単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１２のポリヌクレオチドの配列を持つ標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドに相補的な配列を持つ少なくとも２０の連続したヌクレオチドを持つプローブを用いて前記サンプルをハイブリダイズする過程と、前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドあるいはその断片との間でハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、プローブが前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズすることを特徴とする過程と、
（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出し、該複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程、とを含む方法。
【請求項１５】
前記プローブが少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１２のポリヌクレオチドの配列を持つ標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、
（ｂ）前記の増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１のポリペプチドと、薬剤として許容できる賦形剤とを有することを特徴とする組成物。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１７の組成物。
【請求項１９】
機能性ＴＭＰの発現低下に関連する疾患又は病状を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して請求項１７に記載の組成物を投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１のポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝すステップと、
（ｂ）前記サンプルにおいてアゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２１】
請求項２０の方法で同定したアゴニスト化合物を有し、薬剤として許容できる賦形剤をも有する組成物。
【請求項２２】
機能性ＴＭＰの発現低下に関連する疾患又は病状を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して請求項２１に記載の組成物を投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項１のポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝すステップと、
（ｂ）前記サンプルにおいてアンタゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２４】
請求項２３の方法で同定したアンタゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを有する組成物。
【請求項２５】
機能的なＴＭＰの過剰な発現に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療を要する患者への請求項２４の組成物の投与を含む治療方法。
【請求項２６】
請求項１のポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを適切な条件下で少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、
（ｂ）請求項１のポリペプチドの試験化合物との結合を検出し、それによって請求項１のポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程を含む方法。
【請求項２７】
請求項１のポリペプチドの活性をモジュレートする化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドの活性が許容される条件下で、請求項１のポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、
（ｂ）請求項１に記載のポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、
（ｃ）試験化合物の存在下での請求項１のポリペプチドの活性を、試験化合物の不存在下での請求項１のポリペプチドの活性と比較する過程を含み、試験化合物の存在下での請求項１のポリペプチドの活性の変化が、請求項１のポリペプチドの活性をモジュレートする化合物を標示するような方法。
【請求項２８】
請求項５の配列を持つ標的ポリヌクレオチドの発現を改変するのに効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチドの発現に好適な条件下で、該標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露する過程と、
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドの発現改変を検出する過程と、
（ｃ）可変量の前記化合物の存在下と前記化合物の不存在下で、前記標的ポリヌクレオチドの発現を比較する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
試験化合物の毒性を算定する方法であって、
（ａ）核酸を含む生物学的サンプルを前記試験化合物で処理する過程と、
（ｂ）処理した前記生物学的サンプルの核酸と、請求項１２のポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続するヌクレオチドを持つプローブをハイブリダイズさせる過程であって、このハイブリダイゼーションゼーションが、前記プローブと前記生物学的サンプル中の標的ポリヌクレオチドとの間で特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で行われ、前記標的ポリヌクレオチドが、請求項１２のポリヌクレオチドまたはその断片のポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドである、前記過程と、
（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の収量を定量する過程と、
（ｄ）前記処理された生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量を、処理されていない生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量と比較する過程とを含み、前記処理された生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量の差が、前記試験化合物の毒性を標示するような方法。
【請求項３０】
生物学的サンプル中のＴＭＰの発現に関連する症状または疾患に対する診断試験法であって、
（ａ）前記生物学的サンプルと請求項１１の抗体との混合を、前記抗体が前記ポリペプチドに結合し、抗体とポリペプチドとの複合体を形成するのに適した条件下で行う過程と、
（ｂ）前記複合体を検出する過程とを含み、前記複合体の存在が、前記生物学的サンプル中の前記ポリペプチドの存在と相関することを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項１１の抗体であって、
（ａ）キメラ抗体
（ｂ）単鎖抗体
（ｃ）Ｆａｂ断片
（ｄ）Ｆ（ａｂ’）２ 断片
（ｅ）ヒト化抗体、のいずれかである抗体。
【請求項３２】
請求項１１の抗体と、許容できる賦形剤とを有する組成物。
【請求項３３】
被検者におけるＴＭＰの発現に関連する症状又は疾患の診断方法であって、請求項３２に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
前記抗体が標識されることを特徴とする、請求項３２の組成物。
【請求項３５】
被検者におけるＴＭＰの発現に関連する症状又は疾患の診断方法であって、請求項３４に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項１１の抗体の特異性を持つポリクローナル抗体を調製する方法であって、
（ａ）抗体反応を誘発する条件下で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したアミノ酸配列またはその免疫原性断片を含むポリペプチドを用いて動物を免疫化する過程と、
（ｂ）前記動物から抗体を単離する過程と、
（ｃ）前記単離された抗体を前記ポリペプチドでスクリーニングし、それによって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドに特異結合するポリクローナル抗体を同定する過程とを含むような方法。
【請求項３７】
請求項３６の方法で産生したポリクローナル抗体。
【請求項３８】
請求項３７のポリクローナル抗体と好適なキャリアとを含む組成物。
【請求項３９】
請求項１１に記載の抗体の特異性を有するモノクローナル抗体を作製する方法であって、
（ａ）抗体反応を誘発する条件下で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したアミノ酸配列またはその免疫原性断片を含むポリペプチドを用いて動物を免疫化する過程と、
（ｂ）前記動物から抗体産出細胞を単離する過程と、
（ｃ）前記抗体産出細胞と不死化した細胞とを融合して、モノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞を形成する過程と、
（ｄ）前記ハイブリドーマ細胞を培養する過程と、
（ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異結合するような前記培養モノクローナル抗体から単離する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法で産出したモノクローナル抗体。
【請求項４１】
請求項４０に記載のモノクローナル抗体と適切なキャリアとを含む組成物。
【請求項４２】
Ｆａｂ発現ライブラリをスクリーニングすることにより産出されることを特徴とする請求項１１に記載の抗体。
【請求項４３】
組換え免疫グロブリンライブラリをスクリーニングすることにより産出されることを特徴とする、請求項１１に記載の抗体。
【請求項４４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドをサンプル中に検出する方法であって、
（ａ）請求項１１に記載の抗体と前記ポリペプチドの特異結合を許容する条件下で、サンプルを用いて前記抗体をインキュベートする過程と、
（ｂ）特異結合を検出する過程とを含み、該特異結合が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドがサンプル中に存在することを標示することを特徴とする方法。
【請求項４５】
或るサンプルからの、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドを精製する方法であって、
（ａ）請求項１１に記載の抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、前記抗体と１サンプルとをインキュベートする過程と、
（ｂ）前記サンプルから前記抗体を分離し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択したアミノ酸配列を有する精製ポリペプチドを得る過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４６】
マイクロアレイの少なくとも１つのエレメントが請求項１３に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項４７】
ポリヌクレオチドを有する或るサンプルの発現プロフィールを作製する方法であって、
（ａ）サンプル中のポリヌクレオチドを標識化する過程と、
（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体が形成されるのに適した条件下で請求項４６のマイクロアレイのエレメントとサンプル中の標識化ポリヌクレオチドとを接触させる過程と、
（ｃ）サンプル中のポリヌクレオチドの発現を定量する過程とを含む方法。
【請求項４８】
固体基板上の固有の物理的位置に付着された種々のヌクレオチド分子を含むアレイであって、少なくとも１つの前記ヌクレオチド分子が、標的ポリヌクレオチドの少なくとも３０の連続したヌクレオチドと特異的にハイブリダイズ可能な最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を有し、前記の標的ポリヌクレオチドが請求項１２に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とするアレイ。
【請求項４９】
請求項４８に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも３０の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５０】
請求項４８に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５１】
請求項４８に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列が前記の標的ポリヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５２】
請求項４８に記載のアレイで、マイクロアレイであることを特徴とするアレイ。
【請求項５３】
請求項４８に記載のアレイで、更に前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列を有するヌクレオチド分子にハイブリダイズした前記の標的ポリヌクレオチドを有することを特徴とするアレイ。
【請求項５４】
請求項４８に記載のアレイで、リンカーが少なくとも１つの前記のヌクレオチド分子と前記の固体基板とを連結していることを特徴とするアレイ。
【請求項５５】
請求項４８に記載のアレイで、基板上の固有の物理的位置の各々が複数のヌクレオチド分子を含み、任意の単一の固有の物理的位置でのその複数のヌクレオチド分子は同一の配列を有し、基板上の固有の物理的位置の各々は、基板上の別の固有の物理的位置でのヌクレオチド分子の配列とは異なる配列を有するヌクレオチド分子を含むことを特徴とするアレイ。
【請求項５６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項６１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項６２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項６３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項６４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項６５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項６６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項６７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項６８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項６９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項７０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項７１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項７２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項７３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、膜貫通タンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列に関する。本発明はまた、これらの配列を利用した、生殖障害、発達障害、心血管障害、神経障害、胃腸障害、脂質代謝、細胞増殖異常、および自己免疫／炎症疾患の、診断・治療・予防に関する。本発明は更に、膜貫通タンパク質の、核酸配列およびアミノ酸配列の発現における外来性化合物の効果についての評価に関する。
【０００２】
（発明の背景）
真核生物が原核生物と異なる点は、細胞内の、膜に囲まれる多くの区画、例えばオルガネラや小胞を持つことである。真核生物の生化学を原核生物の生化学から区別する代謝反応の多くは、これらの区画内で起こる。詳細には、多くの細胞機能は非常にストリンジェントな反応条件を必要とし、オルガネラや小胞が各反応の区画化と隔離とを可能にしなければ、細胞質の各代謝プロセスが混乱し得る。これらのオルガネラの例に、ミトコンドリア、滑面小胞体、粗面小胞体、筋小胞体、およびゴルジ体がある。小胞の例には、食胞、リソソーム、エンドソーム、ペルオキシソーム、および分泌小胞がある。オルガネラと小胞とは、１層または２層の膜で囲まれる。
【０００３】
生体膜が、オルガネラと小胞と、細胞自体とを囲む。生体膜は、脂質２重層シートから成る高度に選択的な透過性障壁であって、シートの構成素材は、ホスホグリセリド、脂肪酸、コレステロール、リン脂質、糖脂質、プロテオグリカン、およびタンパク質である。これらの膜にはイオンポンプや、イオンチャネル、および特異的受容体類があり、受容体は外部刺激を受け、生化学的シグナルを膜の内側に伝達する。これらの膜にはまた、セカンドメッセンジャータンパク質類があって、これらのポンプやチャネルや受容体と相互作用し、これらのシグナルの伝達を増幅し調節する。
【０００４】
形質膜タンパク質
膜貫通タンパク質（ＴＭＰ）類は、細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインによって特徴付けられる。ＴＭＰドメイン群は通常、１５〜２５の疎水性アミノ酸からなり、これらのアミノ酸は、予測では１つのα螺旋コンフォメーションをとる。ＴＭＰを分類すると、バイトピック（ｂｉｔｏｐｉｃ）（タイプＩおよびタイプＩＩ）タンパク質（膜を１回貫通する）と、ポリトピック（ｐｏｌｙｔｏｐｉｃ）（タイプＩＩＩおよびタイプＩＶ）  （Ｓｉｎｇｅｒ， Ｓ．Ｊ． （１９９０） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６：２４７−９６） タンパク質とがあり、後者には、複数の膜貫通セグメントがある。シグナル伝達に関わる細胞表面受容体タンパク質として作用するＴＭＰとしては、成長因子受容体と分化因子受容体、またショウジョウバエのｐｅｃａｎｅｘタンパク質とｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質、ＬＩＶ−１ タンパク質、ＮＦ２ タンパク質、ＧＮＳ１／ＳＵＲ４真核生物の膜内在性タンパク質などの、受容体と相互作用するタンパク質が含まれる。ＴＭＰはまた、イオンまたは代謝産物のトランスポータ（例えばギャップ結合チャネル（コネキシン類）とイオンチャネル類）として作用し、また、細胞接着タンパク質（例えばレクチン類とインテグリン類とフィブロネクチン類）として作用する。ＴＭＰは、小胞とオルガネラとを形成する分子（例えばカベオリン（ｃａｖｅｏｌｉｎ）類）として機能し、また、細胞認識分子（例えば分化クラスター（ＣＤ）抗原、糖タンパク質、およびムチン類）として機能する。
【０００５】
親水性分子を膜内外に輸送する作用は、チャネルタンパク質類の存在によって促進される。これらは水性ポア（ａｑｕｅｏｕｓ ｐｏｒｅｓ）を形成し、ポアは脂質２重層を貫通し得る。多くのチャネルは、複数のサブユニットの集合体によって形成されるタンパク質複合体から構成される。サブユニットの少なくとも１つは膜内在性タンパク質であり、これが寄与してポアを形成する。幾つかの場合、ポアは、ただ１つまたは少数の分子種のみが選択的に通過し得るように構成される。異なるタイプの膜チャネルがいくつかあり、大きな差異は、それらの分布と選択性とである。各タイプは、（１）アクアポリン（ａｑｕａｐｏｒｉｎｓ、水を輸送する）（２）タンパク質伝導チャネル（小胞体膜を通してにタンパク質を輸送する）（３）ギャップ結合（イオンと有機小分子の隣接細胞間での拡散を促進する）、および（４）イオンチャネル（多様な膜を通るイオンフラックスを調節する）である。
【０００６】
ギャップ結合（別名コネクソン）は、原形質膜の特化した領域であり、膜貫通チャネル群からなる。膜貫通チャネルは、多くの組織の隣接細胞間で細胞質を化学的また電気的に連結させて機能する。ギャップ結合は、興奮性の各組織内での活動電位の細胞間伝播のために電気的シナプスとして機能する。非興奮性組織では、ギャップ結合の役割は組織の恒常性にあり、また、調整された生理応答や、代謝協同、成長制御、発生と分化との調節においても働く。
【０００７】
各コネクソンは原形質膜の脂質２重層を貫通しており、また、６つの同一サブユニットであるコネキシン群から構成される。少なくとも１４種の異なるコネキシン・タンパク質があり、それぞれ類似した構造を持つが、異なる組織分布を示す。構造的には、コネキシン類には短い細胞質内Ｎ末端ドメインがあり、４つの膜貫通領域（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、およびＭ４）につながっている。これらの膜貫通領域は、２つの細胞外ループと１つの細胞質内ループを分離するように配置され、その後にＣ末端ドメインがある。Ｃ末端ドメインは細胞質内ドメインであり、多様な長さを持つ（Ｃｘ２６での２０残基から、Ｃｘ５６での２６０残基までがある）。Ｍ２−Ｍ３ループと、Ｎ末端およびＣ末端とは、細胞質内側に向いている。保存された領域は、各膜貫通領域と、２つの細胞外ループとである。両細胞外ループ内に、３つの保存されたシステイン群があり、これらはジスルフィド結合形成に関与する。両ループのシグネチャ・パターンは、次のいずれかであり、Ｃ−［ＤＮ］−Ｔ−ｘ−Ｑ−Ｐ−Ｇ−Ｃ−ｘ−（２）−Ｖ−Ｃ−Ｙ−Ｄ または Ｃ−ｘ（３，４）−Ｐ−Ｃ−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＥＮ］−Ｃ−［ＦＹ］−［ＬＩＶＭ］−［ＳＡ］−［ＫＲ］−Ｐ （ＰＤＯＣ００３４１， Ｐｒｏｆｉｌｅｓｃａｎ 並びに Ｓ． Ｒａｈｍａｎ および Ｗ．Ｈ． Ｅｖａｎｓ， （１９９１） Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． １００：５６７−５７８）である。可変領域は細胞質内ループとＣ末端領域とであり、種々のコネキシン類の調節に関与し得る（Ｈｅｎｎｅｍａｎｎ， Ｈ． 他 （１９９２） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：１７２２５−１７２３３； ＰＲＩＮＴＳ ＰＲ００２０６ ｃｏｎｎｅｘｉｎ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ； Ｙｅａｇｅｒ， Ｍ． 他， （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏ． Ｓｔｒｕｃｔｒ． Ｂｉｏｌ． ８：５１７−５２４を参照）。
【０００８】
ギャップ結合は、心筋収縮と平滑筋収縮との同調を助け、神経伝達を加速し、細胞外シグナルの伝播を助ける。ギャップ結合の開閉は、特定の刺激に応じて可能となる（例えばｐＨ、Ｃａ＋２、および ｃＡＭＰ）。ギャップ結合の効果的なポアのサイズは約１．５ｎｍであり、これは、小分子（例えば１０００ダルトン未満）が自由にポアを通じて拡散できるサイズである。輸送される分子の例に、イオンや低分子代謝産物やセカンドメッセンジャー（例えばＣａ＋２ および ｃＡＭＰ）がある。
【０００９】
コネキシン類は、多くの疾患に関与する。メスのコネキシン３７（Ｃｘ３７）欠損マウスが不妊である原因は、卵母細胞−顆粒膜細胞シグナル伝達経路の欠除である。Ｃｘ４３欠損マウスは生後すぐに死亡し、心臓の欠陥を示すが、この欠陥は、ヒトでのある数種の肺動脈狭窄を連想させる。Ｃｘ３２における突然変異は、Ｘ染色体連鎖型シャルコー−マリー−トゥース病を伴い、この病気は、末梢神経系の運動神経と感覚神経のニューロパシーである。Ｃｘ２６は胎盤において発現し、Ｃｘ２６欠損マウスでは、或るグルコース類似体の、母体循環から胎児循環への経胎盤輸送が低下する。ヒトでは、Ｃｘ２６は非症候群性常染色体感音難聴の最初の感受性遺伝子として同定されている。Ｃｘ３１における突然変異は常染色体優性聴覚障害に連鎖し（第２細胞外ループ内のナンセンス変異またはミスセンス変異）、また、優性遺伝する皮膚障害である変異性紅斑角皮症にも連鎖する（Ｎ末端ドメインまたはＭ２ドメイン内のミスセンス変異）（Ａ． Ｍ． Ｓｉｍｏｎ， （１９９９） Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ９：１６９−１７０を参照）。Ｃｘ４６はレンズ線維細胞内で発現し、Ｃｘ４６欠損マウスは早期発症白内障を起こすが、これはヒト核性白内障に似る（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ， Ｓ．Ｍ． および Ｒ． Ｂｒｕｚｚｏｎｅ （１９９７） Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ７：Ｒ３４０−Ｒ３４４を参照）。
【００１０】
形質膜タンパク質（ＭＰ）は２群に分けられ、その分類基準は膜からのタンパク質の抽出方法である。膜の外にあるタンパク質すなわち膜表在性タンパク質を放出させるには、極端なイオン強度またはｐＨを用いるか、尿素などの、タンパク質相互作用の撹乱物質を用いる。膜の内側にあるタンパク質すなわち膜内在性タンパク質を放出させる唯一の方法は、膜の脂質２重層を界面活性剤で溶解することである。
【００１１】
多くの膜タンパク質（ＭＰ）には、これらのタンパク質を特定の各細胞内部位に局在させるよう働く、アミノ酸配列モチーフ群がある。これらのモチーフの例に、ＰＤＺドメイン群や、ＫＤＥＬ、ＲＧＤ、ＮＧＲ、およびＧＳＬ配列モチーフ群や、フォンウィルブランド因子Ａ（ｖＷＦＡ）ドメイン群や、ＥＧＦ様ドメイン群がある。ＲＧＤ、ＮＧＲ、およびＧＳＬモチーフ含有ペプチド類は、腫瘍血管系の標的癌を治療するための薬物送達剤として用いられている （Ａｒａｐ， Ｗ． 他 （１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７９：３７７−３８０）。膜タンパク質にはまた、細胞外分子や細胞内分子との相互作用で働くアミノ酸配列モチーフ群（例えば糖質認識ドメイン群）がある。
【００１２】
アミノ酸残基側鎖の化学修飾により、ＭＰ類が他の分子（例えば膜リン脂質）と相互作用する方法が変わる。このような化学修飾の例に、グリコサミノグリカン類や、オリゴサッカライド類、リン脂質類、アセチル部分およびパルミトイル部分、ＡＤＰリボース、リン酸、および硫酸基との、共有結合の形成がある。
【００１３】
膜タンパク質をコードするＲＮＡは選択的スプライス部位を持つことがあり、これらの部位により、同一遺伝子がコードするタンパク質群が、異なるメッセンジャーＲＮＡとアミノ酸配列とを持ち得る。スプライス変異膜タンパク質類は、他のリガンドやタンパク質のアイソフォームと相互作用し得る。
【００１４】
原形質膜の膜貫通タンパク質類としてはまた、細胞表面受容体もある。細胞表面受容体が認識する物質の例は、ホルモン、例えばカテコールアミン類（例えばエピネフリン、ノルエピネフリン、およびヒスタミン）や、ペプチドホルモン類（例えばグルカゴン、インシュリン、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、副腎皮質刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、副甲状腺ホルモン、およびバソプレッシン）や、成長因子および分化因子（例えば上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子、インシュリン様成長因子、血小板由来成長因子、神経成長因子、コロニー刺激因子、およびエリスロポエチン）や、サイトカイン類（例えばケモカイン類、インターロイキン類、インターフェロン類、および腫瘍壊死因子）や、小ペプチド因子（例えばボンベシン、オキシトシン、エンドセリン、アンジオテンシンＩＩ、血管作用性小腸ペプチド、およびブラジキニン）や、神経伝達物質（例えば神経ペプチドＹ、ニューロテンシン、ニューロメディンＮ、メラノコルチン類、オピオイド類（例えばエンケファリン類、エンドルフィン類、およびダイノルフィン類）、ガラニン、ソマトスタチン、およびタキキニン類）、並びに、循環系に運ばれるシグナル伝達分子（例えばアンジオテンシン、補体、カルシトニン、エンドセリン類、およびホルミルメチオニルペプチド類）がある。  免疫系細胞上の細胞表面受容体は、抗原、抗体、および主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）結合ペプチドを認識する。他の細胞表面受容体はリガンド類に結合し、リガンドはその細胞によって取り込まれる。この受容体介在性エンドサイトーシスは、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、トランスフェリン、グルコース末端糖タンパク質、マンノース末端糖タンパク質、ガラクトース末端糖タンパク質、免疫グロブリン、ホスホビテロゲニン（ｐｈｏｓｐｈｏｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎ）類、フィブリン、プロテイナーゼ−阻害剤複合体、プラスミノーゲン活性化因子、およびトロンボスポンジンの取り込み時に機能する（Ｌｏｄｉｓｈ， Ｈ． 他 （１９９５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， ７２３ページ； および Ｍｉｋｈａｉｌｅｎｋｏ， Ｉ． 他 （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：６７８４−６７９１を参照）。
【００１５】
多くの細胞表面受容体には７つの膜貫通領域があり、またリガンドに結合する細胞外のＮ末端と、Ｇタンパク質と相互作用する細胞質内のＣ末端がある（Ｓｔｒｏｓｂｅｒｇ， Ａ．Ｄ． （１９９１） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９６：１−１０）。システインリッチドメイン群は、細胞表面受容体の２つのファミリーに見られ、それはＬＤＬ受容体ファミリーと、腫瘍壊死因子受容体／神経成長因子受容体（ＴＮＦＲ／ＮＧＦＲ）ファミリーとである。７つの連続したシステインリッチリピート群（約４０アミノ酸）はＬＤＬ受容体のＮ末端細胞外領域内にＬＤＬとカルシウムとの結合部位を形成し、同様のリピートは脊椎動物の超低密度リポタンパク質受容体に見られ、また、脊椎動物低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）（別名α２ マクログロブリン受容体）や、脊椎動物低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質２ （別名 ｇｐ３３０ またはメガリン） に発見されている （ＥｘＰＡＳｙ ＰＲＯＳＩＴＥ ｄｏｃｕｍｅｎｔ ＰＤＯＣ００９２９； および Ｂａｉｒｏｃｈ， Ａ． 他 （１９９７） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． ２５：２１７−２２１）。システインリッチリピートの構造は、βヘアピンに続いて一連のβターンがあり、６つのジスルフィド結合したシステイン群が各リピート内にある。
【００１６】
ＬＤＬ受容体は膜内在性タンパク質であり、コレステロールを血中から除去することによって脂質の取込を行う。肝臓および腸以外の殆どの細胞は、コレステロールを血中から取り込み、細胞自体では合成しない。細胞表面ＬＤＬ受容体にはＬＤＬ粒子が結合し、粒子はエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれる（Ｍｅｙｅｒｓ， Ｒ．Ａ． （１９９５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ４９４−５０１ページ）。ＬＤＬ受容体の欠除は、家族性高コレステロール血症疾患を生じ、血漿コレステロールレベルを増加させ、最終的にはアテローム性硬化をもたらす（Ｓｔｒｙｅｒ， Ｌ （１９９５） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｗ． Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． ６９１−７０２ページ）。
【００１７】
Ｇタンパク質共役受容体
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）類は膜内在性タンパク質のスーパーファミリーを構成し、細胞外シグナルを伝達する。ＧＰＣＲ類の例には、生体アミン類の受容体や、炎症の脂質媒介物、ペプチドホルモン類、および感覚シグナル媒介物の受容体がある。
【００１８】
構造的には、これらの高度に保存された受容体には、７つの疎水性膜貫通（蛇行）領域群と、第２および第３の細胞外ループ間のシステインジスルフィド架橋群と、細胞外Ｎ末端と、細胞質内Ｃ末端とがある。３つの細胞外ループ群は、３つの細胞内ループ群と交互に現れ、７つの膜貫通領域を連結している。これらのタンパク質の、最も保存された部分は、各膜貫通領域および、第１と第２の細胞質内ループである。システインジスルフィド架橋は、第２と第３の細胞外ループを接続する。１つの保存された、酸性残基−Ａｒｇ残基−芳香族残基のトリプレットが第２細胞質ループ内にあり、Ｇタンパク質と相互作用し得る。ＧＰＣＲコンセンサスパターンは、このスーパーファミリーに属する殆どのタンパク質を特徴付ける （ＥｘＰＡＳｙ ＰＲＯＳＩＴＥ ｄｏｃｕｍｅｎｔ ＰＳ００２３７； および Ｗａｔｓｏｎ， Ｓ． および Ｓ． Ａｒｋｉｎｓｔａｌｌ （１９９４） Ｔｈｅ Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｎｋｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， ２−６ページ）。ＧＰＣＲをコードする遺伝子群の突然変異と転写活性の変化とに伴う神経障害に、統合失調症（精神分裂病）、パーキンソン病、アルツハイマー病、薬物依存、および摂食障害がある。若年発達および繁殖能２（ｊｄｆ−２）遺伝子座、別名ｒｕｎｔｙ−ｊｅｒｋｙ−ｓｔｅｒｉｌｅ （ｒｊｓ） は、ＨＥＲＣ２における欠失と点突然変異とに関連し、ＨＥＲＣ２は、或るグアニンヌクレオチド交換因子タンパク質をコードする遺伝子であって小胞輸送に関わる（Ｗａｌｋｏｗｉｃｚ， Ｍ． 他 （１９９９） Ｍａｍｍ． Ｇｅｎｏｍｅ １０：８７０−８７８）。
【００１９】
或るＧＰＣＲはＦＰとして知られ、プロスタグランジンＦ２α（ＰＧＦ２α） の受容体である。プロスタグランジン類の所属は、生理的応答と炎症性応答での、天然のパラ分泌／自己分泌媒介物の１大ファミリーである。ＰＧＦ２αの果たす役割は幾つかの組織の応答にあり、その組織は例えば生殖器官、肺、骨、および心臓であり、その応答には子宮筋収縮の刺激と、黄体の分解と、気管支収縮とがある。或るＦＰ会合分子（ＦＰＲＰ）はＦＰと同時精製され、発現は、ＰＧＦ２αの生理的役割が説明された各組織でのみ起こる。ＦＰＲＰは、予測では膜貫通タンパク質であり、グリコシル化した細胞外免疫グロブリンループ群と、１つの短い高荷電細胞内ドメインとを持つ。ＦＰＲＰは、ＦＰへのＰＧＦ２αの結合の、負の調節因子のようである。したがってＦＰＲＰはＰＧＦ２α関連疾患に関与する可能性があり、疾患の例には、月経困難症、不妊、喘息、または心筋症があり得る（Ｏｒｌｉｃｋｙ， Ｄ． Ｊ． 他 （１９９６） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． ９７：６５５−６５８）。
【００２０】
スカベンジャー受容体
マクロファージスカベンジャー受容体類は広いリガンド特異性を持っており、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）や外来抗原との結合に関与し得る。スカベンジャー受容体タイプＩおよびＩＩは三量体膜タンパク質であり、各サブユニットは小さいＮ末端細胞内ドメインと、１つの膜貫通ドメインと、１つの大きな細胞外ドメインと、Ｃ末端システインリッチドメインとがある。細胞外ドメインには１つの短いスペーサードメインと、１つのα螺旋コイルドコイルドメインと、１つの３重螺旋コラーゲン性ドメインとがある。これらの受容体は或る範囲のリガンド群と結合することが示され、リガンドの例には、化学修飾されたリポタンパク質およびアルブミンと、ポリリボヌクレオチドと、ポリサッカライドと、リン脂質と、アスベストとがある（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ， Ａ． 他 （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８７：９１３３−９１３７； および Ｅｌｏｍａａ， Ｏ． 他 （１９９５） Ｃｅｌｌ ８０：６０３−６０９）。スカベンジャー受容体が主要な役割を果たすと思われるのはアテローム発生においてであり、これは、動脈壁内の、修飾されたＬＤＬの取り込みを媒介して働き、また宿主防御の中では、細菌性エンドトキシンと、細菌と、原虫とに結合して働く。
【００２１】
テトラスパンファミリータンパク質
膜４回貫通型スーパーファミリー（ＴＭ４ＳＦ）、別名テトラスパンファミリーは多重遺伝子族であり、タイプＩＩＩ膜内在性タンパク質をコードする（Ｗｒｉｇｈｔ， Ｍ．Ｄ． および Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ， Ｍ．Ｇ． （１９９４） Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １５：５８８−５９４）。ＴＭ４ＳＦは、細胞膜を４回貫通する膜タンパク質からなる。ＴＭ４ＳＦのメンバーの例は、血小板および内皮細胞の膜タンパク質と、黒色腫関連抗原、白血球表面糖タンパク質、結腸癌腫抗原、腫瘍関連抗原、および住血吸虫表面タンパク質がある（Ｊａｎｋｏｗｓｋｉ， Ｓ．Ａ． （１９９４） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ９：１２０５−１２１１）。ＴＭ４ＳＦの各メンバーは、約２５〜３０％のアミノ酸配列同一性を互いに共有する。
【００２２】
多数のＴＭ４ＳＦメンバーが関与すると示唆されている作用は、シグナル伝達、細胞接着の制御、細胞の成長と増殖との調節（例えば発生および発癌）、並びに細胞運動性（例えば腫瘍細胞転移）である。ＴＭ４ＳＦタンパク質の発現は多様な腫瘍に関連し、発現のレベルは、細胞が成長する際や活性化する際に変容し得る。
【００２３】
腫瘍抗原
腫瘍抗原は表面分子であり、腫瘍細胞では正常細胞と異なる発現をする。腫瘍抗原は、腫瘍細胞を免疫的に正常細胞と区別し、ヒトの癌に関して診断と治療との標的を提供する（Ｔａｋａｇｉ， Ｓ． 他 （１９９５） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ６１： ７０６−７１５； Ｌｉｕ， Ｅ． 他 （１９９２） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ７： １０２７−１０３２）。
【００２４】
イオンチャネル
イオンチャネルは、事実上、身体のあらゆる細胞の原形質膜内に見られる。例えば、塩素イオンチャネルは多様な細胞機能を媒介し、その機能の例には、膜電位の調節と、上皮膜を通ってのイオンの吸収と分泌とがある。塩素イオンチャネルが、ゴルジ体とエンドサイトーシス小胞の細胞内の膜にある場合、オルガネラのｐＨをも調節する（例えばＧｒｅｇｅｒ， Ｒ． （１９８８） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ５０：１１１−１２２を参照）。塩素イオンチャネル類の電気生理的および薬学的特性、例えばイオンコンダクタンス、電流−膜電位関係、およびモジュレーター類への感受性は、筋肉、神経細胞、線維芽細胞、上皮細胞、および白血球に、別々の塩素イオンチャネルがあることを示唆する。
【００２５】
多くのチャネルは、１個以上のタンパク質キナーゼによるリン酸化部位を有する。これらのタンパク質キナーゼには、タンパク質キナーゼＡ、タンパク質キナーゼＣ、カゼインキナーゼＩＩ、およびチロシンキナーゼがあり、これらはすべて、細胞におけるイオンチャネル活性を調節する。膜タンパク質の不適切なリン酸化は、細胞周期の進行と細胞分化とにおける病理的変化と相関している。細胞周期における変化は、アポトーシスの誘発や癌の誘発に関連することが示されている。細胞分化における変化は、生殖系、免疫系、および骨格筋の、疾患や障害に関連することが示されている。
【００２６】
小脳顆粒神経細胞は非不活化カリウム電流を持ち、これは神経伝達物質からの受容体刺激による発火頻度を調節し、また、静止膜電位を制御する。非不活化電流を示すカリウムチャネル類の例に、ｅｔｈｅｒ ａ ｇｏ−ｇｏ （ＥＡＧ） チャネルがある。ＫＣＲ１と名付けられた膜タンパク質は、ラットＥＡＧと特異的にそのＣ末端領域で結合し、小脳非不活化カリウム電流を調節する。ＫＣＲ１は、１２の膜貫通ドメイン群と、細胞内にアミノ酸末端およびカルボキシル末端を含むと予測される。構造的特徴からは、これらの膜貫通領域はトランスポータスーパーファミリーの領域に類似してみえるが、ＫＣＲ１と既知のトランスポータとの間に相同性は見られないことから、ＫＣＲ１は新規クラスのトランスポータに属すことが示唆される。ＫＣＲ１は、非不活化カリウムチャネルの調節成分のようである （Ｈｏｓｈｉ， Ｎ． 他 （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：２３０８０−２３０８５）。
【００２７】
プロトンポンプ
プロトンＡＴＰアーゼは大きなクラスの膜タンパク質であり、ＡＴＰ加水分解エネルギーを用いて電気化学的プロトン勾配を膜の内外に発生させる。この発生した勾配は、他のイオン（Ｎａ＋、Ｋ＋、または Ｃｌ−）の膜を通しての輸送、または、オルガネラｐＨの維持のために使用し得る。プロトンＡＴＰアーゼ類は更に、ミトコンドリアＦ−ＡＴＰアーゼ、原形質膜ＡＴＰアーゼ、および液胞ＡＴＰアーゼに分類される。液胞ＡＴＰアーゼは、エンドサイトーシスとエキソサイトーシスとの各過程に関与する多様な小胞における、酸性ｐＨを確立し維持する（Ｍｅｌｌｍａｎ， Ｉ． 他 （１９８６） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５５：６６３−７００）。
【００２８】
プロトンと共役する、膜１２回貫通ドメイントランスポータ、例えばＰＥＰＴ １およびＰＥＰＴ ２はペプチド類の、胃腸での吸収と、腎臓での再吸収とに関与し、これには電気化学的プロトン勾配を駆動力として用いる。別のタイプのペプチドトランスポータであるＴＡＰトランスポータは、ＴＡＰ １とＴＡＰ ２から成るヘテロ二量体であり、抗原のプロセシングに関わる。ペプチド抗原はＴＡＰによって小胞体の膜を通して輸送され、その結果、ペプチド抗原は、細胞表面においてＭＨＣ分子と会合して発現し得る。各ＴＡＰタンパク質は複数の疎水性膜貫通セグメントと、１つの高度に保存されたＡＴＰ結合カセットから構成される（Ｂｏｌｌ， Ｍ． 他 （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９３：２８４２８９）。病原微生物、例えば単純ヘルペスウイルスは、ＴＡＰが媒介するペプチド輸送の阻害因子をコードする可能性があり、その目的は、免疫の監視を逃れることである（Ｍａｒｕｓｉｎａ， Ｋ． および Ｍａｎａｃｏ， Ｊ．Ｊ． （１９９６） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｈｅｍａｔｏｌ． ３：１９−２６）。
【００２９】
ＡＢＣ輸送体
ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体、別名「輸送ＡＴＰアーゼ」は膜タンパク質のスーパーファミリーであり、原核生物と真核生物とにおける輸送機能とチャネル機能とを媒介する（Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｃ．Ｆ． （１９９２） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ８：６７−１１３）。ＡＢＣタンパク質類は、類似した全体構造と、顕著な配列相同性とを共有する。すべてのＡＢＣタンパク質には或る保存されたドメインがあり、このドメインは約２００アミノ酸残基であり、１つ以上のヌクレオチド結合ドメインがある。ＡＢＣ輸送体遺伝子群における突然変異は、高ビリルビン血症ＩＩ／Ｄｕｂｉｎ−Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群、劣性スタルガルト病、Ｘ染色体連鎖副腎白質ジストロフィー、多剤耐性、小児脂肪便症、および嚢胞性線維症など、様々な障害に関与する。
【００３０】
細胞間伝達に関連する膜タンパク質
細胞間伝達は、多細胞生物の発生と生存とに必須である。細胞は、タンパク質シグナル伝達分子の分泌と取り込みとによって互いに通信する。細胞内へのタンパク質の取り込みを達成する手段がエンドサイトーシスであり、ここでは、シグナル伝達分子と原形質膜表面との相互作用が、しばしば特異的受容体への結合を通じて行われる結果、形質膜由来小胞を形成し、これらの小胞が分子を取り囲み、細胞質内に運ぶ。細胞からのタンパク質の分泌を達成する手段がエキソサイトーシスであり、ここでは、細胞内の分子が、トランスゴルジ網に由来する、膜に囲まれた輸送小胞内に詰められる。これらの小胞は原形質膜と融合し、小胞の内容物を周囲の細胞外空間に放出する。エンドサイトーシスとエキソサイトーシスとの結果、原形質膜成分の除去と追加とが起こり、また、これらの成分のリサイクルは、原形質膜と、膜に囲まれた内部区画との双方の、完全性、同一性、および機能性の維持に必須である。
【００３１】
シナプトブレビン（ｓｙｎａｐｔｏｂｒｅｖｉｎ）類はシナプスの小胞会合膜タンパク質（ＶＡＭＰ）であり、初めはラット脳で発見された。これらのタンパク質は、神経細胞に限定され、一細胞の細胞膜からシナプスを通り他の細胞膜への、小胞の移動において機能すると初めは考えられていた。シナプトブレビン類は、今では、構成的な複数の小胞輸送経路に存在および機能し、多くの非神経細胞タイプの、受容体が媒介するエンドサイトーシスおよびエキソサイトーシス経路に関与することがわかった。この調節される小胞輸送経路は、シナプトブレビン分子を切断するクロストリジウム神経毒素の、高度に特異的な作用によってブロックされ得る。
【００３２】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ での研究が、多様な細胞膜に関して行われ （Ｇａｌｌｉ 他 （１９９４） Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １２５：１０１５−２４； Ｌｉｎｋ 他 （１９９３） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：１８４２３−６） 、それらの研究は、ＶＡＭＰＳは広く分布することを示している。これらの重要な膜輸送タンパク質は、発生期の軸索伸展にもエキソサイトーシスを通じて関与し、また、神経伝達物質と調節ペプチドとの放出や、エンドサイトーシスにも関与するようである。エンドサイトーシス性小胞輸送としては、細胞内イベント、例えば核膜、小胞体、ゴルジ体、および多様な封入体（例えばペルオキシソームまたはリソソーム）の、融合および分裂がある。エンドサイトーシスの各プロセスは、真核細胞では、酵母、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、ショウジョウバエ、および哺乳動物に渡り、普遍的なようである。
【００３３】
ＶＡＭＰ−１Ｂは、細胞内ターゲッティングに関与し、また、ＶＡＭＰ−１Ａのアイソフォームである （Ｉｓｅｎｍａｎｎ， Ｓ． 他 （１９９８） Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｃｅｌｌ ９：１６４９−１６６０）。４種の更なるスプライス変異体（ＶＡＭＰ−１ＣからＦまで）が最近、同定された。各変異体には可変配列群があるが、その位置はきわめて末端のＣ末端部のみであることから、Ｃ末端部が、小胞ターゲッティングに重要であると示唆される （Ｂｅｒｇｌｕｎｄ， Ｌ． 他 （１９９９） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２６４：７７７−７８０）。
【００３４】
リソソーム類は、自己貪食時の細胞内物質の分解の部位であり、また、エンドサイトーシス後の細胞外分子の分解の場でもある。リソソーム酵素は、トランスゴルジ網から出芽する小胞内に詰められる。これらの小胞はエンドソームと融合して成熟リソソームを形成し、成熟リソソーム内では、エンドサイトーシスによって取り込まれた物質の加水分解性消化が起こる。リソソームはオートファゴソームと融合し、独特な区画を形成し得る。この区画の中では、オルガネラや他の細胞内成分の分解が起こる。
【００３５】
輸送小胞、例えばエンドソームによるタンパク質選別は、多様な生理的過程にとって重要な結果をもたらす。このような過程の例に、細胞表面成長、異なる細胞内オルガネラ群の生合成、エンドサイトーシス、および、ホルモンと神経伝達物質との制御された分泌がある（Ｒｏｔｈｍａｎ， Ｊ．Ｅ． および Ｗｉｅｌａｎｄ， Ｆ．Ｔ． （１９９６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：２２７−２３４）。特に、神経変性障害その他の神経病理には、エンドソームのタンパク質選別時、または、エンドソーム生合成の際の生化学的欠陥が関連する（Ｍａｙｅｒ Ｒ．Ｊ． 他 （１９９６） Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ３８９：２６１−２６９）。
【００３６】
ペルオキシソーム類は、分泌経路とは独立したオルガネラである。これらは、細胞内の、過酸化物を生成する多くの酸化反応の場である。ペルオキシソームは、真核細胞のオルガネラの内でサイズや数が独特であり、また、酵素内容は、生物と細胞タイプと代謝の需要によって異なる（Ｗａｔｅｒｈａｍ， Ｈ．Ｒ． および Ｃｒｅｇｇ， Ｊ．Ｍ． （１９９７） ＢｉｏＥｓｓａｙｓ １９：５７−６６）。ペルオキシソームタンパク質に遺伝子欠損があるとペルオキシソーム欠損症を生じ、この欠損が関連付けられる多数のヒト病理の例に、ツェルヴェーガー症候群、近位肢型点状軟骨異形成（ｒｈｉｚｏｍｅｌｉｃ ｃｈｏｎｄｒｏｄｙｓｐｌａｓｉａ ｐｕｎｃｔａｔａ）、Ｘ染色体連鎖副腎白質ジストロフィー、アシルＣｏＡオキシダーゼ欠損症、二頭酵素欠損症、古典的Ｒｅｆｓｕｍ病、ＤＨＡＰアルキルトランスフェラーゼ欠損症、および無カタラーゼ血症がある（Ｍｏｓｅｒ， Ｈ．Ｗ． および Ｍｏｓｅｒ， Ａ．Ｂ． （１９９６） Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８０４：４２７− ４４１）。また、Ｇａｒｔｎｅｒ， Ｊ． 他 （１９９１； Ｐｅｄｉａｔｒ． Ｒｅｓ． ２９：１４１−１４６） は、ツェルヴェーガー症候群の患者における低密度ペルオキシソーム様細胞内分画に関連する或る２２ ｋＤａの膜内在性タンパク質を発見した。
【００３７】
正常な胚発生と、生殖細胞成熟の制御とを変調する多数の分泌タンパク質は、それぞれの膜結合受容体と相互作用する。胚発生時の細胞運命は、アクチビン（ａｃｔｉｖｉｎ）／ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー、カドヘリン、ＩＧＦ−２、および他のモルフォゲンによって決定される。また、生殖細胞と生殖組織との増殖、成熟、および再分化は、例えばＩＧＦ−２、インヒビン、アクチビン、およびフォリスタチン（ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎｓ）によって調節される（Ｐｅｔｒａｇｌｉａ， Ｆ． （１９９７） Ｐｌａｃｅｎｔａ １８：３−８； Ｍａｔｈｅｒ， Ｊ．Ｐ． 他 （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｓｏｃ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． ２１５：２０９−２２２）。
【００３８】
小胞体膜タンパク質
正常に機能する真核細胞に必要な条件は、新規に合成された全てのタンパク質が正しく折りたたまれ、修飾され、特定の細胞内部位および細胞外部位に送達されることである。新規合成された膜タンパク質および分泌タンパク質は、細胞の選別・分配網に入る。これは合成時または合成直後に起こり、その後、タンパク質は細胞内外の特定の位置に送られる。この過程の最初の区画である小胞体（ＥＲ）においてタンパク質が受ける修飾の例に、グリコシル化、ジスルフィド結合形成、およびオリゴマー形成がある。修飾されたタンパク質は次に、一連の、膜に囲まれた区画を通って輸送される。この区画の例にゴルジ体の多様な層板があり、この区画では更なる糖質修飾が起こる。区画間の輸送を生じる手段は、小胞の出芽と融合とである。一旦、分泌経路に入るとタンパク質は、細胞表面に達するのに膜を横断する必要は無い。
【００３９】
過半数のタンパク質はＥＲ内でプロセシングされオルガネラから運び出されるが、幾つかは保持される。ＥＲ内に保持されるためのシグナルは、哺乳動物細胞では、テトラペプチド配列であるＫＤＥＬからなり、その位置は、常在ＥＲ膜タンパク質のカルボキシル末端である（Ｍｕｎｒｏ， Ｓ． （１９８６） Ｃｅｌｌ ４６：２９１−３００）。ＫＤＥＬ配列を持つタンパク質はＥＲを出るが、すぐに初期ゴルジ層板から回収され、ＥＲに戻る。一方、このシグナルを欠くタンパク質は、分泌経路を進む。
【００４０】
細胞の分泌経路の妨害は、幾つかのヒト疾患に関与することが示唆されている。家族性高コレステロール血症では低密度リポタンパク質受容体がＥＲ内に残り、細胞表面に移動しない（Ｐａｔｈａｋ， Ｒ．Ｋ． （１９８８） Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １０６：１８３１−１８４１）。βアミロイド前駆体タンパク質（βＡＰＰ）の輸送とプロセシングとの変異は、推定上の小胞輸送タンパク質であるプレセニリン（ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ）と関与しており、また、早期発症アルツハイマー病に関与し得る（Ｌｅｖｙ−Ｌａｈａｄ， Ｅ． 他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：９７３−９７７）。ＥＲに由来するカルシウム恒常性の変化に伴う疾患の例に、心筋症、心臓肥大、筋緊張性ジストロフィー、Ｂｒｏｄｙ病、Ｓｍｉｔｈ−ＭｃＣｏｒｔ異形成、および糖尿病がある。
【００４１】
ミトコンドリア膜タンパク質
ミトコンドリア電子伝達系（すなわち呼吸鎖）は、一連の３種の酵素複合体であってミトコンドリア膜内にあり、ＮＡＤＨから酸素への電子伝達と、この酸化作用をＡＴＰの合成に共役させる過程（酸化的リン酸化）とに関わる。ＡＴＰはその後、主要なエネルギー源を提供することにより、細胞の、エネルギーを必要とする多くの反応を駆動する。
【００４２】
ミトコンドリア呼吸鎖の殆どのタンパク質成分は、核がコードする遺伝子の産物であり、これらはミトコンドリア内に移入されるが、他のタンパク質はミトコンドリア遺伝子の産物である。この呼吸鎖における酵素の欠損や変容した発現に関連して多様な病態がヒトにおいて見られ、その例に、神経変性疾患、ミオパシー（筋疾患）、および癌がある。
【００４３】
リンパ球および白血球膜タンパク質
抗原へのＢ細胞の応答は、正常な免疫系の必須要素である。成熟Ｂ細胞は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）によってが外来抗原を認識し、これらの受容体は膜結合性の特異的抗体であって、外来抗原と結合する。この抗原／受容体複合体は細胞内に取り込まれ、抗原はタンパク質分解処理を受ける。複雑な抗原に対し有効な応答を発生するには、ＢＣＲとＢＣＲに会合するタンパク質とＴ細胞応答との全てが必要である。抗原のタンパク質分解断片は、Ｂ細胞の表面の主要組織適合複合体ＩＩ（ＭＨＣ ＩＩ）分子と複合体を形成する。Ｂ細胞の表面でこの複合体をＴ細胞が認識し得る。一方、マクロファージ他のリンパ様細胞は、ＭＨＣ Ｉ分子に会合する抗原を、Ｔ細胞に提示する。Ｔ細胞はＭＨＣ Ｉ−抗原複合体を認識し、それによって活性化されるが、この作用は、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３複合体との相互作用による。後者の複合体はＴ細胞表面多量体タンパク質で、原形質膜にある。抗原提示によって活性化したＴ細胞は多様なリンホカインを分泌する。リンホカインはＢ細胞の成熟とＴ細胞の増殖とを誘導し、また標的細胞を殺すマクロファージを活性化する。
【００４４】
白血球は炎症応答と免疫応答とにおいて基本的な役割を持ち、白血球の例としては単球／マクロファージ、肥満細胞、多形核白血球、ナチュラルキラー細胞、好中球、好酸球、好塩基球、および骨髄系前駆体がある。白血球膜タンパク質の例に、ＣＤ抗原のメンバー、Ｎ−ＣＡＭ、Ｉ−ＣＡＭ、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩの遺伝子産物、免疫グロブリン、免疫グロブリン受容体、補体、補体受容体、インターフェロン、インターフェロン受容体、インターロイキン受容体、およびケモカイン受容体がある。
【００４５】
異常なリンパ球と白血球との活性に伴う急性障害の例には、ＡＩＤＳ、免疫過敏、白血病、白血球減少症、全身性ループス、肉芽腫症、および好酸球増加症がある。
【００４６】
アポトーシス関連膜タンパク質
多様なリガンド、受容体、酵素、腫瘍抑制因子、ウイルス性遺伝子産物、薬物、および無機イオンは、アポトーシスの細胞破壊の調節と実行において、重要な正または負の役割を持つ。アポトーシス経路の幾つかの特定成分はすでに同定され特徴付けられているが、関与するタンパク質間の多くの相互作用は不明確であり、この経路の主要な諸相は未知のままである。
【００４７】
ＤＮＡ切断と、Ｆａｓが媒介する細胞死とにおけるカルシウムレベルの関与を示す過去の研究は、アポトーシスにおいてカルシウムが必要であることを示唆した（Ｈｅｗｉｓｈ， Ｄ．Ｒ． および Ｌ．Ａ． Ｂｕｒｇｏｙｎｅ （１９７３） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． ５２：５０４−５１０； Ｖｉｇｎａｕｘ， Ｆ． 他 （１９９５） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８１：７８１−７８６； Ｏｓｈｉｍｉ， Ｙ． および Ｓ． Ｍｉｙａｚａｋｉ （１９９５） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５４：５９９−６０９）。別の研究は、細胞内カルシウム濃度の上昇が、胸腺細胞においてＴ細胞受容体架橋または糖質コルチコイドによってアポトーシスが引き起こされた際に見られ、また、この上昇をブロックすることによって細胞死を防げることを示している（ＭｃＣｏｎｋｅｙ， Ｄ．Ｊ． 他 （１９８９） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４３：１８０１−１８０６； ＭｃＣｏｎｋｅｙ， Ｄ．Ｊ． 他 （１９８９） Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ２６９：３６５−３７０）。したがって、膜タンパク質、例えばカルシウムチャネルおよびＦａｓ受容体は、アポトーシス応答にとって重要である。
【００４８】
新規の膜貫通タンパク質、およびそれらをコードするポリヌクレオチド群の発見により、新規の組成物群を提供することで、当分野の要望に応えることができる。これら新規の組成物は、生殖障害、発達障害、心血管障害、神経障害、胃腸障害、脂質代謝障害、細胞増殖異常、および自己免疫／炎症疾患の、診断・治療・予防において有用であり、また、膜貫通タンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列の発現における、外来性化合物群の効果についての算定にも有用である。
【００４９】
（発明の概要）
本発明は、総称して「ＴＭＰ」、個別にはそれぞれ「ＴＭＰ−１」、「ＴＭＰ−２」、「ＴＭＰ−３」、「ＴＭＰ−４」、「ＴＭＰ−５」、「ＴＭＰ−６」、「ＴＭＰ−７」、「ＴＭＰ−８」、「”ＴＭＰ−９」、「ＴＭＰ−１０」、「ＴＭＰ−１１」、「ＴＭＰ−１２」、「ＴＭＰ−１３」、「ＴＭＰ−１４」、「ＴＭＰ−１５」、「ＴＭＰ−１６」、および「ＴＭＰ−１７」と呼ぶ膜貫通タンパク質である精製されたポリペプチドを提供する。  或る実施例において本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を持つ天然アミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した、単離されたポリペプチドを提供する。一実施例で本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７のアミノ酸配列を持つ、単離されたポリペプチドを提供する。
【００５０】
また、本発明は（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を持つ或る天然アミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリヌクレオチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、該ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択した或るポリペプチドをコードする。別の実施態様では、ポリヌクレオチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４からなる群から選択される。
【００５１】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に連結したプロモーター配列を持つ組換えポリヌクレオチドを提供する。一実施態様で本発明は、この組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を提供する。別の実施態様で本発明は、この組換えポリヌクレオチドを持つ遺伝形質転換体を提供する。
【００５２】
更に本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドと、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％以上の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチドと、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片と、（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、とからなる群から選択したポリペプチドを製造する一方法を提供する。製造方法は、（ａ）或る細胞を該ポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、この細胞を組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換する過程と、（ｂ）そのように発現したポリペプチドを回収する過程とからなる。この組換えポリヌクレオチドは、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対し機能的に連結したプロモーター配列を持つ。
【００５３】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドに特異結合する、単離された抗体を提供する。
【００５４】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）に相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）に相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＲＮＡ等価物、からなる群から選択した、単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様で該ポリヌクレオチドは、少なくとも６０の連続したヌクレオチド群からなる。
【００５５】
本発明は更に、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する一方法を提供する。ここで、標的ポリヌクレオチドは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）に相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）に相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＲＮＡ等価物、からなる群から選択した、或るポリヌクレオチドの配列を持つ。検出方法は、（ａ）サンプル中の上記標的ポリヌクレオチドに相補的な或る配列からなる少なくとも２０の連続したヌクレオチド群からなる或るプローブを用いて該サンプルをハイブリダイズする過程と、（ｂ）該ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出し、複合体が存在すればオプションでその量を検出する過程とからなる。該プローブと該標的ポリヌクレオチドあるいはその断片との間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、プローブは、該標的ポリヌクレオチドに対し特異的にハイブリダイズする。一実施態様では、プローブは少なくとも６０の連続したヌクレオチド群からなる。
【００５６】
本発明はまた、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する一方法を提供する。ここで、標的ポリヌクレオチドは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４からなる群から選択したポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＲＮＡ等価物、からなる群から選択した、或るポリヌクレオチドの配列を持つ。検出方法は、（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、（ｂ）増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の有無を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在すればオプションでその量を検出する過程とからなる。
【００５７】
本発明は更に、或る有効量のポリペプチドと薬剤として許容し得る或る賦形剤とからなる、或る組成物を提供する。有効量のポリペプチドは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択した或るアミノ酸配列を含むポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択される。一実施態様では、前記組成物はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択したアミノ酸配列を持つ。更に本発明は、機能性ＴＭＰの発現低下に関連する疾患又は病状を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して前記組成物を投与する過程を有する方法を提供する。
【００５８】
本発明はまた、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために、或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）該ポリペプチドを有するサンプルを或る化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程とからなる。別法では、本発明は、この方法で同定したアゴニスト化合物と許容される医薬用賦形剤とを有する、或る組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、機能的ＴＭＰの発現の低下に関連した疾患やその症状の治療を必要とする患者への、この組成物の投与を含む方法を提供する。
【００５９】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性のために、或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）該ポリペプチドを含むサンプルを或る化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアンタゴニスト活性を検出する過程とからなる。別の一実施態様で本発明は、この方法で同定したアンタゴニスト化合物と薬剤として許容し得る賦形剤とを有する組成物を提供する。更なる別法で本発明は、機能的ＴＭＰの過剰な発現に関連した疾患やその症状の治療を必要とする患者への、この組成物の投与を含む方法を提供する。
【００６０】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドに特異結合する或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）該ポリペプチドを適切な条件下で少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、（ｂ）この試験化合物と該ポリペプチドとの結合を検出し、それにより該ポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程とからなる。
【００６１】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択したアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドの活性をモジュレートする或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）該ポリペプチドの活性にとり許容し得る条件下で、該ポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、（ｂ）該ポリペプチドの活性をこの試験化合物の存在下で算定する過程と、（ｃ）この試験化合物の存在下での該ポリペプチドの活性をこの試験化合物の不存在下での該ポリペプチドの活性と比較する過程とからなり、この試験化合物の存在下での該ポリペプチドの活性の変化は、該ポリペプチドの活性をモジュレートする化合物を標示する。
【００６２】
更に本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つ標的ポリヌクレオチドの発現を改変する効果につき、或る化合物をスクリーニングする一方法を提供する。この方法は、（ａ）この標的ポリヌクレオチドを有するサンプルを化合物に曝露する過程と、（ｂ）この標的ポリヌクレオチドの発現の改変を検出する過程とからなる。
【００６３】
本発明は更に、試験化合物の毒性の算定方法を提供する。この方法には、以下の過程がある。（ａ）核酸群を有する生物学的サンプルを試験化合物で処理する過程。（ｂ）処理済み生物学的サンプルの核酸群をハイブリダイズする過程。この過程には、次のようなプローブを用いる。（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を持つ天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）（ｉ）に相補的な配列を持つポリヌクレオチド、（ｉｖ）（ｉｉ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）のＲＮＡ等価物、からなる群から選択した或るポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続したヌクレオチド群からなるプローブである。ハイブリダイゼーションは、上記プローブと生物学的サンプル中の標的ポリヌクレオチドとの間に特定のハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で生じる。上記標的ポリヌクレオチドは、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｉｖ）（ｉｉ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）のＲＮＡ等価物、からなる群から選択する。あるいは、標的ポリヌクレオチドは、上記（ｉ）〜（ｖ）からなる群から選択したポリヌクレオチド配列の断片を持つ。毒性の算定方法には更に、以下の過程がある。（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の量を定量する過程と、（ｄ）処理した生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量を、非処理の生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量と比較する過程とである。処理した生物学的サンプル内のハイブリダイゼーション複合体の量の差異が、試験化合物の毒性を示す。
【００６４】
（本発明の記載について）
本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列および方法について説明するが、その前に、説明した特定の装置、材料および方法に本発明が限定されるものではなく、修正され得ることを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定の実施態様を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解されたい。
【００６５】
請求の範囲および明細書中で用いている単数形の「或る」および「その（この）」の表記は、文脈から明らかにそうでないとされる場合を除いて複数のものを指す場合もあることに注意されたい。したがって、例えば「或る宿主細胞」と記されている場合にはそのような宿主細胞が複数あることもあり、「或る抗体」と記されている場合には単数または複数の抗体、および、当業者に公知の抗体の等価物などについても言及している。
【００６６】
本明細書中で用いる全ての技術用語および科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説明するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料および方法を用いて本発明の実施または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について説明する。本発明で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本発明に関係があるであろう細胞、プロトコル、試薬およびベクターについて説明および開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００６７】
（定義）
用語「ＴＭＰ」は、天然、合成、半合成或いは組換え体などの、また全ての種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマおよびヒトを含む哺乳動物）から得られる実質的に精製されたＴＭＰのアミノ酸配列を指す。
【００６８】
用語「アゴニスト」は、ＴＭＰの生物学的活性を強化または模倣する分子を指す。アゴニストの例には、ＴＭＰと直接に相互作用し、あるいはＴＭＰが関与する生物学的経路の成分に作用してＴＭＰの活性をモジュレートする、タンパク質、核酸、糖質、小分子、または任意の他の化合物や組成物があり得る。
【００６９】
「対立遺伝子変異体／変異配列」は、ＴＭＰをコードする遺伝子の、別の形態である。対立遺伝子変異配列群は、核酸配列における少なくとも１つの突然変異から生じることがあり、また、変容したｍＲＮＡ群を生じることがあり、または、ポリペプチド群を生じることがあり、それらのポリペプチドの構造または機能は、変容することもしないこともある。或る遺伝子は、その天然型の対立遺伝子変異配列を全く持たない場合もあり、１個以上持つこともある。対立遺伝子変異配列を生じさせる通常の突然変異性変化は一般に、ヌクレオチドの自然な欠失、付加または置換による。これら各種の変化は、単独あるいは他の変化と共に、或る配列内で１回以上、生じ得る。
【００７０】
ＴＭＰをコードする「変容した／改変された」核酸配列に含む配列は、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、或いは置換を生じた配列であって、ＴＭＰと同一のポリペプチドを、或いは、ＴＭＰの機能特性の少なくとも１つを備えるポリペプチドを生じる配列である。この定義には、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチド配列にとって正常な染色体の遺伝子座ではない位置での、対立遺伝子変異配列との不適当あるいは予期しないハイブリダイゼーションを含み、また、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドの或る特定オリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能なあるいは検出困難な多型性を含む。コードされるタンパク質も「変容する／改変される」ことがあり、また、サイレント変化を生じた結果、機能的に等価なＴＭＰとなるような、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を持ち得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にＴＭＰの活性が保持される範囲で、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性についての類似性に基づいて成され得る。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸があり、正に帯電したアミノ酸にはリジンおよびアルギニンがある。親水性値が近似した非荷電極性側鎖を持つアミノ酸には、アスパラギンとグルタミン、セリンとトレオニンがある。親水性値が近似した非荷電側鎖を持つアミノ酸には、ロイシンとイソロイシンとバリン、グリシンとアラニン、フェニルアラニンとチロシンがある。
【００７１】
用語「アミノ酸」および「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質の配列、あるいはそれらの任意の断片を指し、天然分子または合成分子を指す。「アミノ酸配列」が或る天然タンパク質分子の配列を指す場合、「アミノ酸配列」および類似の用語は、記載したそのタンパク質分子に関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定するものではない。
【００７２】
用語「増幅」は、或る核酸配列の付加的複製物を作製する行為に関する。増幅には通常、当業者に公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いる。
【００７３】
用語「アンタゴニスト」は、ＴＭＰの生物学的活性を阻害或いは減弱する分子を指す。アンタゴニストの例には、ＴＭＰと直接相互作用するか、或いはＴＭＰが関与する生物学的経路の成分に作用してＴＭＰの活性を調節する、抗体などタンパク質、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物を含み得る。
【００７４】
用語「抗体」は、エピトープの決定基と結合できる、無傷の免疫グロブリン分子やそれらの断片、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２ およびＦｖ断片を指す。ＴＭＰポリペプチドと結合する抗体は、免疫化抗原として、無傷のポリペプチドを用いて、または、目的の小ペプチドを持つ断片を用いて作製可能である。マウス、ラット、ウサギなどの動物を免疫化するために用いるポリペプチドまたはオリゴペプチドの由来は、ＲＮＡの翻訳の場合や、または化学合成があり得る。また、それらは望むならばキャリアタンパク質に抱合し得る。通常用いられるキャリアであってペプチドと化学結合するキャリアの例は、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン、および、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）などがある。結合したこのペプチドは、前記動物を免疫化するために用いる。
【００７５】
用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する、分子の領域（すなわちエピトープ）を指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫化する場合、タンパク質の多数の領域が、抗原決定基（タンパク質の特定の領域または３次元構造）に特異結合する抗体の産生を誘発し得る。或る抗原決定基は、或る抗体への結合について、無傷抗原（すなわち免疫応答を引き出すために用いられる免疫原）と競合し得る。
【００７６】
用語「アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）」は、核酸またはオリゴヌクレオチド分子であって、特定の分子ターゲットに結合する分子を指す。アプタマーはｉｎ ｖｉｔｒｏでの進化プロセスに由来する（例えば、ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔの略、試験管内選択法）、米国特許第５，２７０，１６３号に記述）。これは、大規模な組み合わせライブラリ群から標的特異的アプタマー配列を選択するプロセスである。アプタマーの構成は二本鎖または一本鎖であり、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体または他のヌクレオチド様分子を含み得る。アプタマーの各ヌクレオチド成分は修飾された糖基を持つことがあり（例えば、リボヌクレオチドの２’−ＯＨ基は２’−Ｆまたは２’−ＮＨ２によって置換され得る）、これは、ヌクレアーゼへの抵抗性または血中でのより長い寿命など、所望の特性を向上し得る。アプタマーを他の分子、例えば高分子量のキャリアと抱合させることにより、循環系からのこのアプタマーのクリアランスを遅らせ得る。アプタマー類は、例えば或る架橋剤の光活性化によって、それらの同種リガンド群と特異的に架橋させ得る（例えば、Ｂｒｏｄｙ， Ｅ．Ｎ．およびＬ． Ｇｏｌｄ（２０００）Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７４：５−１３を参照）。
【００７７】
用語「イントラマー（ｉｎｔｒａｍｅｒ）」は、ｉｎ ｖｉｖｏで発現されるアプタマーを指す。例えば、ワクシニアウイルスに基づく或るＲＮＡ発現系を用いて、白血球の細胞質内で特定のＲＮＡアプタマー類が高レベルに発現されている（Ｂｌｉｎｄ， Ｍ．他（１９９９）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：３６０６−３６１０）。
【００７８】
用語「スピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）」は、アプタマーであって、Ｌ−ＤＮＡ、Ｌ−ＲＮＡその他の左旋性ヌクレオチド誘導体または左旋性ヌクレオチド様分子を含むものを指す。左旋性のヌクレオチド群を持つアプタマー類は、通常は右旋性ヌクレオチド群を持つ基質に作用する、天然酵素類による分解に対して耐性がある。
【００７９】
用語「アンチセンス」は、或る特定の核酸配列のセンス（コーディング）ストランドとの塩基対を形成し得る任意の組成物を指す。アンチセンス組成物の例には、ＤＮＡや、ＲＮＡや、ペプチド核酸（ＰＮＡ）や、修飾されたバックボーン連鎖たとえばホスホロチオ酸、メチルホスホン酸またはベンジルホスホン酸などを有するオリゴヌクレオチドや、修飾された糖基たとえば２’−メトキシエチル糖または２’−メトキシエトキシ糖などを有するオリゴヌクレオチドや、あるいは修飾された塩基たとえば５−メチルシトシン、２−デオキシウラシルまたは７−デアザ−２’−デオキシグアノシンなどを有するオリゴヌクレオチドがあり得る。アンチセンス分子は、化学合成または転写を含む任意の方法で製造することができる。相補的アンチセンス分子は、細胞に導入されると、その細胞が産生した天然核酸配列との塩基対を形成し、転写または翻訳を妨害する二重鎖を形成する。「負」または「マイナス」という表現は、或る参考ＤＮＡ分子のアンチセンス鎖を指すことがあり、「正」または「プラス」という表現は、或る参考ＤＮＡ分子のセンス鎖を意味し得る。
【００８０】
用語「生物学的に活性」は、或る天然分子の、構造的、調節的、あるいは生化学的な機能を有するタンパク質を指す。同様に、用語「免疫学的に活性」または「免疫原性」は、天然或いは組換え体のＴＭＰ、合成ＴＭＰ、またはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞内の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力を指す。
【００８１】
用語「相補的」は、塩基対合によってアニールする２つの一本鎖核酸配列間の関係を指す。例えば、「５’−ＡＧＴ−３’」は、その相補配列「３’−ＴＣＡ−５’」との対を形成する。
【００８２】
「〜のポリヌクレオチド配列を含む（持つ）組成物」または「〜のアミノ酸配列を含む（持つ）組成物」は、広い意味で当該のポリヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列を持つ、任意の組成物を指す。この組成物には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。ＴＭＰ若しくはＴＭＰの断片をコードするポリヌクレオチド配列を持つ組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。これらのプローブは、凍結乾燥状態で保存可能であり、糖質などの安定化剤と結合させることが可能である。ハイブリダイゼーションにおいては、塩（例えばＮａＣｌ）、界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム；ＳＤＳ）およびその他の成分（例えばデンハート液、粉乳、サケの精子のＤＮＡなど）を持つ水溶液中に、プローブを分散させることができる。
【００８３】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を除くためにＤＮＡ配列解析を繰り返し行い、ＸＬ−ＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）を用いて５’および／または３’の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列を指し、または、ＧＥＬＶＩＥＷ 断片構築システム（ＧＣＧ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）またはＰｈｒａｐ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）などの断片構築用コンピュータプログラムを用いて１つ以上の重複するｃＤＮＡやＥＳＴ、またはゲノムＤＮＡ断片から構築された核酸配列を指す。伸長および構築の両方を行ってコンセンサス配列を産生する配列もある。
【００８４】
用語「保存的なアミノ酸置換」は、元のタンパク質の特性を殆ど変えないと予測される置換を指す。すなわち、そのタンパク質の構造、特にその機能が保存され、その置換によって大きくは変わらない。下表は、タンパク質内で元のアミノ酸と置換され得るアミノ酸であり、保存的アミノ酸置換と認められるアミノ酸を示す。
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保存的なアミノ酸置換では通常、（ａ）置換領域におけるポリペプチドのバックボーン構造、例えばβシートやα螺旋構造、（ｂ）置換部位における分子の電荷または疎水性、および／または（ｃ）側鎖の大部分、を保持する。
【００８５】
用語「欠失」は、結果的に１個以上のアミノ酸残基が欠如するアミノ酸配列内の変化、あるいは１個以上のヌクレオチドが欠如するヌクレオチド配列内の変化を指す。
【００８６】
用語「誘導体」は、化学修飾されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による水素の置換は、ポリヌクレオチドの化学修飾に含まれ得る。或るポリヌクレオチド誘導体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持している或るポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、次のようなプロセスによって修飾されたポリペプチドである。すなわち、グリコシル化、ポリエチレングリコール化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、あるいは任意の同様なプロセスであって、誘導元のポリペプチドの少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保持するプロセスによる。
【００８７】
「検出可能な標識」は、測定可能な信号を発生し得る、ポリヌクレオチドやポリペプチドに共有結合あるいは非共有結合するレポーター分子や酵素を指す。
【００８８】
「示差発現」は、少なくとも２つの異なったサンプルを比較して判定する、増加（上方調節）、あるいは減少（下方調節）、または欠損した、遺伝子またはタンパク質の発現を指す。このような比較は例えば、処理済サンプルと不処理サンプル、または病態サンプルと健常サンプルとの間で行われ得る。
【００８９】
「エキソンシャッフリング」は、異なるコード領域（エキソン）群の組換えを意味する。或るエキソンは、コードされるタンパク質の１つの構造的または機能的ドメインを代表し得るため、安定したサブストラクチャー群の新たな組み合わせによって新しいタンパク質群を構築することが可能であり、新しいタンパク質機能の進化を促進できる。
【００９０】
用語「断片」は、ＴＭＰまたはＴＭＰをコードするポリヌクレオチドの固有の部分であって、その親配列（ｐａｒｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と配列が同一であるが親配列より長さが短い部分を指す。断片は、定義された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さよりも短い長さを有し得る。例えば或る断片は、５〜１０００の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子として、あるいはその他の目的のために用いられる或る断片は、少なくとも長さ５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２５０若しくは５００の、連続したヌクレオチドあるいはアミノ酸残基であり得る。断片は、或る分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば、或るポリペプチド断片は、或る定義された配列内に見られるようなポリペプチドの最初の２５０または５００アミノ酸（または最初の２５％または５０％）から選択した、或る長さの連続したアミノ酸を持ち得る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施態様では、配列表、表および図面を含む明細書が支持する任意の長さであり得る。
【００９１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４の断片は、例えば、この断片を得たゲノム内の他の配列とは異なる、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４を特異的に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を持つ。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４の或る断片は、例えば、ハイブリダイゼーションや増幅技術、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４を関連ポリヌクレオチド配列から区別する類似の方法に有用である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４の或る断片の正確な長さは、また、その断片に対応するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４の領域は、その断片に意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定し得る。
【００９２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７の或る断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４の或る断片によってコードされる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７の或る断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を特異的に同定する固有のアミノ酸配列の領域を含む。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７の或る断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を特異的に認識する抗体の開発における免疫原性ペプチドとして有用である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７の或る断片の正確な長さは、また、この断片に対応するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７の領域は、その断片の目的に基づいて当業者が慣例的に判定し得る。
【００９３】
「完全長」ポリヌクレオチド配列とは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例えばメチオニン）と、それに続く１オープンリーディングフレームと翻訳終止コドンとを有する配列である。或る「完全長」ポリヌクレオチド配列は、或る「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【００９４】
「相同性」の語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列の、配列類似性、互換性、または配列同一性を意味する。
【００９５】
ポリヌクレオチド配列に適用される「一致率」または「％一致」の語は、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた、２つ以上のポリヌクレオチド配列間で一致する残基の割合を意味する。このようなアルゴリズムは、２配列間のアラインメントを最適化するように、標準化された再現性のある方法で比較対象の配列内にギャップを挿入し得るので、２つの配列をより有意に比較できる。
【００９６】
ポリヌクレオチド配列間の一致率を判定するには、ＭＥＧＡＬＩＧＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１２ｅ配列アラインメントプログラムなどに組込まれているＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアルゴリズムの、デフォルトのパラメータ群を用い得る。このプログラムは、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ ソフトウエアパッケージ（一組の分子生物学的分析プログラム）（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）の一部である。このＣＬＵＳＴＡＬ Ｖは、Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ．およびＰ．Ｍ． Ｓｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３、Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ． 他（１９９２）ＣＡＢＩＯＳ ８：１８９−１９１に記載されている。ポリヌクレオチド配列をペアワイズアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ｋｔｕｐｌｅ＝２、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝５、ｗｉｎｄｏｗ＝４、「ｄｉａｇｏｎａｌｓ ｓａｖｅｄ」＝４と設定される。「ｗｅｉｇｈｔｅｄ」残基重み付け表がデフォルトで選択される。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖによる一致率の報告は、アラインメントされたポリヌクレオチド配列間の「ｐｅｒｃｅｎｔ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ（類似性パーセント）」としてなされる。
【００９７】
あるいは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）が一般的に用いられ、且つ、無料で入手可能な配列比較アルゴリズム一式を提供している（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ． 他（１９９０）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０）。このアルゴリズムは、幾つかの情報源から入手可能であり、メリーランド州ベセスダにあるＮＣＢＩおよびインターネット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）からも入手可能である。このＢＬＡＳＴソフトウェア一式には、既知のポリヌクレオチド配列と様々なデータベースの別のポリヌクレオチド配列とのアラインメントに用いる「ｂｌａｓｔｎ」を含む、様々な配列分析プログラムが含まれる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」と呼ばれるツールも利用可能であり、これは２つのヌクレオチド配列を直接のペアワイズで比較するために用いられる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂｌ２．ｈｔｍｌにアクセスして、対話形式で利用できる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールは、ｂｌａｓｔｎ および ｂｌａｓｔｐ（以下に記載）の両方に用い得る。ＢＬＡＳＴプログラムは、一般的には、ギャップ（ｇａｐ）その他のパラメータをデフォルト設定にセットして用いる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するには、デフォルトパラメータに設定した「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２（２０００年４月２１日）を用いてｂｌａｓｔｎを実行し得る。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【００９８】
Ｍａｔｒｉｘ： ＢＬＯＳＵＭ６２
Ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ｍａｔｃｈ： １
Ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ｍｉｓｍａｔｃｈ： −２
Ｏｐｅｎ Ｇａｐ： ５ 及び Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｇａｐ： ２ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ
Ｇａｐ ｘ ｄｒｏｐ−ｏｆｆ： ５０
Ｅｘｐｅｃｔ： １０
Ｗｏｒｄ Ｓｉｚｅ： １１
Ｆｉｌｔｅｒ： ｏｎ
一致率は、ある定義された配列の全長（例えば特定のＳＥＱ ＩＤナンバーで定義された配列）で測定し得る。あるいは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きな配列から得られた断片（例えば少なくとも２０、３０、４０、５０、７０、１００または２００の連続したヌクレオチドの断片）の長さの一致率も測定し得る。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図および配列リストを含めた本明細書に記載された配列が支持する任意の断片長を用いて、一致率を測定し得る或る長さを説明し得ることを理解されたい。
【００９９】
高度の同一性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝子コードの縮重が原因で、類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸配列内で変化を生じさせ、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコードするような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【０１００】
ポリペプチド配列に用いられる用語「一致率」または「％一致」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラインメントの方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の電荷および疎水性を保存するので、ポリペプチドの構造を（したがって機能も）保存する。
【０１０１】
ポリペプチド配列間の一致率は、ＭＥＧＡＬＩＧＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１２ｅ配列アラインメントプログラムに組込まれているようなＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアルゴリズムの、デフォルトのパラメータを用いて決定できる（参照先と共に上述）。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖを用いて、ポリペプチド配列をペアワイズアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ｋｔｕｐｌｅ＝１、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝３、ｗｉｎｄｏｗ＝５、「ｄｉａｇｏｎａｌｓ ｓａｖｅｄ」＝５と設定される。ＰＡＭ２５０マトリクスが、デフォルトの残基重み付け表として選択される。ポリヌクレオチドアラインメントと同様に、アラインメントされたポリペプチド配列の対の一致率は、「ｐｅｒｃｅｎｔ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ（類似性パーセント）」としてＣＬＵＳＴＡＬ Ｖによって報告される。
【０１０２】
あるいは、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴソフトウェア一式を用い得る。例えば、２つのポリペプチド配列をペアワイズで比較する場合、「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２（２０００年４月２１日）のｂｌａｓｔｐをデフォルトパラメータに設定して用い得る。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【０１０３】
Ｍａｔｒｉｘ： ＢＬＯＳＵＭ６２
Ｏｐｅｎ Ｇａｐ： １１ 及び Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｇａｐ： １ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ
Ｇａｐ ｘ ｄｒｏｐ−ｏｆｆ： ５０
Ｅｘｐｅｃｔ： １０
Ｗｏｒｄ Ｓｉｚｅ： ３
Ｆｉｌｔｅｒ： ｏｎ
一致率は、ある定義されたポリペプチド配列の全長（例えば特定のＳＥＱ ＩＤナンバーで定義された配列）で測定し得る。あるいは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きなポリペプチド配列から得た断片（例えば少なくとも１５、２０、３０、４０、５０、７０、または１５０の連続した残基の断片）の長さの同一性も測定し得る。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図および配列リストを含めた本明細書に記載された配列が支持する任意の断片長を用いて、一致率を測定し得る或る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１０４】
「ヒト人工染色体（ＨＡＣ）」は直鎖状の微小染色体であり、約６ｋｂ 〜１０ＭｂのサイズのＤＮＡ配列を持ち得る。また、染色体の複製、分離および維持に必要な、全てのエレメントを持つ。
【０１０５】
用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつ、よりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列を改変した抗体分子を指す。
【０１０６】
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、或る一本鎖ポリヌクレオチドが或る相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリングのプロセスである。特異的ハイブリダイゼーションは、２つの核酸配列が高い相補性を共有することの指標である。特異的ハイブリダイゼーション複合体は許容されるアニーリング条件下で形成され、１回以上の「洗浄」ステップ後もハイブリダイズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、よりストリンジェントな条件では、非特異結合（すなわち完全には一致しない核酸鎖対間の結合）が減少する。核酸配列のアニーリングに関する許容条件は、当業者が慣例的に決定できる。アニーリング条件はどのハイブリダイゼーション実験でも一定であり得るが、洗浄条件は、所望のストリンジェンシーを、したがってハイブリダイゼーション特異性を得るように、実験ごとに変更し得る。許容されるアニーリング条件は、例えば、温度が６８℃で、約６×ＳＳＣ、約１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、並びに約１００μｇ／ｍｌの、せん断して変性したサケ精子ＤＮＡの存在下である。
【０１０７】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常、所定のイオン強度およびｐＨにおける特定配列の融点（Ｔｍ）より約５〜２０℃低くなるように選択する。このＴｍは、所定のイオン強度およびｐＨの条件下で、完全一致プローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Ｔｍを計算する式および核酸ハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． 他（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， １−３巻， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹに記載されており、特に２巻の９章を参照されたい。
【０１０８】
本発明のポリヌクレオチド間の高ストリンジェンシー条件のハイブリダイゼーションには、約０．２×ＳＳＣおよび約０．１％のＳＤＳの存在下、６８℃で１時間の洗浄条件を含む。別法では、約６５℃、６０℃、５５℃、または４２℃の温度で行い得る。ＳＳＣ濃度は、約０．１％のＳＤＳ存在下で、約０．１〜２×ＳＳＣの範囲で変更し得る。通常は、ブロッキング剤を用いて非特異ハイブリダイゼーションを阻止する。このようなブロッキング剤には、例えば、約１００〜２００μｇ／ｍｌの、せん断した変性サケ精子ＤＮＡがある。特定条件下で、例えばＲＮＡとＤＮＡとのハイブリダイゼーションでは、有機溶剤、例えば約３５〜５０％ｖ／ｖの濃度のホルムアミドを用いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。ハイブリダイゼーションは、特に高ストリンジェント条件下では、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し得る。このような類似性は、ヌクレオチド群、およびヌクレオチドがコードするポリペプチド群について、或る同様の役割を強く標示する。
【０１０９】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合の形成によって形成された、２つの核酸配列間の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶解状態で形成し得る（Ｃ０ｔまたはＲ０ｔ解析など）。あるいは、一方の核酸配列が溶解状態で存在し、もう一方の核酸配列が固体支持体（例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、あるいは他の適切な基板であって細胞若しくはそれらの核酸が固定される基板）に固定されているような２つの核酸配列間に形成され得る。
【０１１０】
用語「挿入」あるいは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基あるいはヌクレオチドがそれぞれ追加される、アミノ酸配列あるいは核酸配列における変化を指す。
【０１１１】
「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患などに関連する症状を指し得る。これらの症状は、細胞および全身の防御系に作用し得る種々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現によって特徴づけ得る。
【０１１２】
用語「免疫原性断片」は、例えば哺乳動物など生物に導入すると免疫応答を引き起こし得る、ＴＭＰのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を指す。用語「免疫原性断片」にはまた、本明細書で開示するまたは当分野で周知のあらゆる抗体生産方法に有用なＴＭＰの任意のポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片をも含む。
【０１１３】
用語「マイクロアレイ」は、或る基板上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物の構成を指す。
【０１１４】
用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有の指定された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物を指す。
【０１１５】
用語「モジュレート」または「活性を調節」は、ＴＭＰの活性の変化を指す。例えば、モジュレートによって、ＴＭＰのタンパク質活性の、或いは結合特性の、またはその他の生物学的特性、機能的特性或いは免疫学的特性の変化が起き得る。
【０１１６】
「核酸」および「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」および「核酸配列」の語はまた、ゲノム起源または合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡであって一本鎖または二本鎖であるかあるいはセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るようなＤＮＡまたはＲＮＡや、ペプチド核酸（ＰＮＡ）や、任意のＤＮＡ様またはＲＮＡ様物質を指すこともある。
【０１１７】
「機能的に連結した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係にある状態を指す。例えば、或るプロモーターが或るコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列と機能的に連結している。機能的に連結したＤＮＡ配列群は非常に近接するか連続的に隣接することがあり、また、２つのタンパク質コード領域を結合するために必要な場合は同一リーディングフレーム内にあり得る。
【０１１８】
「ペプチド核酸（ＰＮＡ）」は、末端がリシンで終わるアミノ酸残基のペプチドのバックボーンに結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを持つ、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。末端のリシンは、この組成物に溶解性を与える。ＰＮＡは、相補的一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡに優先的に結合して転写の伸長を停止させる。ポリエチレングリコール化することにより、細胞内でのＰＮＡの寿命を延長し得る。
【０１１９】
ＴＭＰの「翻訳後修飾」には、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、タンパク質分解性切断およびその他の当分野で既知の修飾を含み得る。これらのプロセスは、合成或いは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、ＴＭＰの酵素環境に依存し、細胞の種類によって異なることとなる。
【０１２０】
「プローブ」とは、同一配列或いは対立遺伝子核酸配列や、関連する核酸配列の検出に用いる、ＴＭＰやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードする核酸配列のことである。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に結合したものである。典型的な標識には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬および酵素がある。「プライマー」とは、相補的な塩基対を形成して標的のポリヌクレオチドにアニーリング可能な、通常はＤＮＡオリゴヌクレオチドである短い核酸である。プライマーは次に、ＤＮＡポリメラーゼ酵素により、標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長され得る。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による、核酸配列の増幅（および同定）に用い得る。
【０１２１】
本発明に用いるプローブおよびプライマーは通常、既知の配列の、少なくとも１５の連続したヌクレオチド群からなる。特異性を高めるため、長めのプローブおよびプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または１５０の連続したヌクレオチドからなるようなプローブおよびプライマーも用い得る。これよりもかなり長いプローブおよびプライマーもある。表、図面および配列リストを含む本明細書が支持する、任意の長さのヌクレオチドを用い得るものと理解されたい。
【０１２２】
プローブおよびプライマーの調製および使用方法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． 他（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， １−３巻， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． 他（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ． Ａｓｓｏｃ． ＆ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ、Ｉｎｎｉｓ， Ｍ． 他（１９９０）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡなどを参照されたい。ＰＣＲプライマー対を既知の配列から得るには、例えば、そのためのコンピュータプログラム、例えばＰｒｉｍｅｒ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ０．５， １９９１， Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）を用い得る。
【０１２３】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のために本技術分野でよく知られているソフトウェアを用いて行う。例えばＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェアは、各１００ヌクレオチドまでのＰＣＲプライマー対の選択に有用であり、また、オリゴヌクレオチドおよび最大５，０００までの大きめのポリヌクレオチドであって３２キロベースまでのインプットポリヌクレオチド配列から得たものを分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のための追加機能が組込まれている。例えば、ＰｒｉｍＯＵプライマー選択プログラム（テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一般向けに入手可能）は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが可能であり、したがってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。Ｐｒｉｍｅｒ３プライマー選択プログラム（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）より入手可能）を用いれば、プライマー結合部位として避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ（ｍｉｓｐｒｉｍｉｎｇ ｌｉｂｒａｒｙ）」を入力できる。Ｐｒｉｍｅｒ３は特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である（後二者のプライマー選択プログラムのソースコードは、それぞれの情報源から得てユーザー固有のニーズを満たすように修正し得る）。ＰｒｉｍｅｒＧｅｎプログラム（英国ケンブリッジ市の英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト−リソースセンターから一般向けに入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計することにより、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域のいずれかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。したがって、このプログラムは、独自のものであれ保存されたものであれ、オリゴヌクレオチド断片およびポリヌクレオチド断片の同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えばＰＣＲまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエレメントとして、あるいは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【０１２４】
「組換え核酸」は、天然の配列ではなく、配列の、２つ以上の離れたセグメントを人工的に組み合わせた配列である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって達成するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えばＳａｍｂｒｏｏｋの文献（前出）に記載されているような遺伝子工学的手法によって達成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部が付加、置換または欠失により改変された核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に連結した核酸配列が含まれる。このような組換え核酸を、例えばある細胞を形質転換するために使用されるベクターの一部と成し得る。
【０１２５】
あるいはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの一部であることができ、例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。そのようなベクターは哺乳動物に接種され、その組換え核酸が発現されて、その哺乳動物内で防御免疫応答を誘導するように使用することができる。
【０１２６】
「調節エレメント」は、遺伝子の非翻訳領域に通常は由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロンおよび５’および３’の非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。調節エレメントは、転写、翻訳またはＲＮＡ安定性を制御する宿主タンパク質またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【０１２７】
「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識に用いる、化学的または生化学的な成分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子およびその他の当分野で既知の成分がある。
【０１２８】
或るＤＮＡ配列に対する「ＲＮＡ等価物」は、基準となるＤＮＡ配列と同じ直鎖のヌクレオチド配列からなるが、生じる全ての窒素性塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる。
【０１２９】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。ＴＭＰ、ＴＭＰをコードする核酸群、またはその断片群を含むと推定される或るサンプルとしては、体液と、細胞や細胞から単離された染色体や細胞内小器官や膜からの抽出物と、細胞と、溶液中に存在するまたは基板に固定されたゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡと、組織と、組織プリントなどがあり得る。
【０１３０】
用語「特異結合」および「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造（例えば抗原決定基すなわちエピトープ）であって結合分子が認識する構造の有無に依存する。例えば、或る抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、結合していない標識した「Ａ」と抗体とを含む或る反応の中に、エピトープＡを含むポリペプチドが、あるいは結合していない無標識の「Ａ」が存在すると、抗体と結合する標識Ａの量が減少する。
【０１３１】
用語「実質的に精製された」は、自然の環境から採取され、単離あるいは分離された核酸配列あるいはアミノ酸配列であって、自然に結合している組成物が少なくとも約６０％除去されたものであり、好ましくは約７５％以上除去、最も好ましくは９０％以上除去されたものを指す。
【０１３２】
「置換」とは、１つ以上のアミノ酸残基またはヌクレオチドを、それぞれ別のアミノ酸残基またはヌクレオチドに置き換えることである。
【０１３３】
用語「基板」は、任意の好適な固体あるいは半固体の支持物を指し、膜およびフィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビーズ、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。基板は、ウェル、溝、ピン、チャネル、孔など、様々な表面形態を有することができ、基板表面にはポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【０１３４】
「転写イメージ」または「発現プロフィール」は、所定条件下での所定時間における、或る特定の細胞タイプまたは組織による、遺伝子発現の集合的パターンを指す。
【０１３５】
「形質転換」とは、外来性ＤＮＡが、或る受容細胞に導入されるプロセスを言う。形質転換は、本技術分野で知られている種々の方法に従って自然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核宿主細胞または真核宿主細胞に挿入する、任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転換する宿主細胞の種類によって選択する。限定するものではないが形質転換方法には、ウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、熱ショック、リポフェクションおよび微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換された細胞」には、導入されたＤＮＡが、自律的に複製するプラスミドとしてあるいは宿主染色体の一部として複製可能である、安定的に形質転換された細胞が含まれる。更に、限られた期間に一過的に導入ＤＮＡ若しくは導入ＲＮＡを発現する細胞も含まれる。
【０１３６】
本明細書で用いる「遺伝形質転換体」とは任意の生物体であり、限定するものではないが動植物を含み、生物体の１個以上の細胞が、ヒトの介入によって、例えば本技術分野で公知の形質転換技術によって導入された異種核酸を有する生物である。細胞への核酸の導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入することによって行う。これは、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によってあるいは組換えウイルスの導入によって行う。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏ受精を指すものではなく、組換えＤＮＡ分子の導入を指す。本発明に基づいて予期される遺伝形質転換体には、バクテリア、シアノバクテリア、真菌および動植物がある。本発明の単離されたＤＮＡは、本技術分野で知られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合によって宿主に導入することができる。本発明のＤＮＡをこのような生物体に移入する技術は公知であり、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ ら （１９８９） 等の参考文献に記載がある。
【０１３７】
或る特定の核酸配列の「変異体／変異配列」とは、核酸配列１本の或る長さ全体について、該特定核酸配列に対し少なくとも４０％の配列同一性を有する核酸配列として決定された配列である。決定には、デフォルトパラメータに設定した「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．９（１９９９年５月７日）を用いてｂｌａｓｔｎを実行する。このような核酸対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。変異配列は、例えば、「対立遺伝子」変異配列（上述）または「スプライス」変異配列、「種」変異配列、「多型」変異配列と記述され得る。スプライス変異配列は参照分子との顕著な同一性を有し得るが、ｍＲＮＡプロセッシング中のエキソン群の選択的スプライシングによって通常、より多数またはより少数のポリヌクレオチドを有することになる。対応するポリペプチドは、追加機能ドメイン群を有するか、あるいは参照分子には存在するドメイン群が欠落していることがある。種変異配列は、種によって異なるポリヌクレオチド配列である。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互に有意のアミノ酸同一性を持つ。多型性変異配列は、或る種の個体間における、或る特定遺伝子のポリヌクレオチド配列内での変異である。多型変異配列にはまた、ポリヌクレオチド配列の１つのヌクレオチド塩基が異なる「１塩基多型性」（ＳＮＰ）も含み得る。ＳＮＰの存在は、例えば特定の個体群、病状または病状性向を示し得る。
【０１３８】
特定のポリペプチド配列の「変異配列」とは、ポリペプチド配列１本の或る長さ全体について、該特定ポリペプチド配列に対し少なくとも４０％の配列同一性を有するポリペプチド配列として決定された配列である。決定には、デフォルトパラメータに設定した「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．９（１９９９年５月７日）を用いてｂｌａｓｔｐを実行する。このようなポリペプチド対は、そのポリペプチドの一方の所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。
【０１３９】
（発明）
本発明は、新規のヒト膜貫通タンパク質（ＴＭＰ）群、およびＴＭＰをコードするポリヌクレオチド群の発見に基づき、また、これらの組成物を使用した、細胞増殖異常、自己免疫／炎症疾患、心血管障害、神経障害、および発達障害の診断、治療、ならびに予防の開発に基づく。
【０１４０】
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の命名の概略である。各ポリヌクレオチドおよびその対応するポリペプチドは、１つのＩｎｃｙｔｅプロジェクト識別番号（ＩｎｃｙｔｅプロジェクトＩＤ）に対応する。各ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列識別番号（ポリペプチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）とＩｎｃｙｔｅポリペプチド配列番号（ＩｎｃｙｔｅポリペプチドＩＤ）によって表示した。各ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）とＩｎｃｙｔｅポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（ＩｎｃｙｔｅポリヌクレオチドＩＤ）によって表示した。
【０１４１】
表２は、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質（ｇｅｎｐｅｐｔ）データベースに対するＢＬＡＳＴ分析で同定した、本発明のポリペプチド群に相同な配列群を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（ポリペプチド ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：）と、それに対応するＩｎｃｙｔｅポリペプチド配列番号（ＩｎｃｙｔｅポリペプチドＩＤ）とを示す。列３は、最も近いＧｅｎＢａｎｋ相同体のＧｅｎＢａｎｋ識別番号（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＯ：）を示す。列４は、各ポリペプチドとその相同体１つ以上との間の一致に関する確率スコアを示す。列５は、該当箇所には適当な引用を示すとともにＧｅｎＢａｎｋ相同体１つ以上の注釈（ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）を示し、これらはすべて本明細書では参考文献に含まれる。
【０１４２】
表３は、本発明のポリペプチドの多様な構造的特徴を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドのポリペプチド配列識別番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）およびそれに対応するＩｎｃｙｔｅポリペプチド配列番号（ＩｎｃｙｔｅポリペプチドＩＤ）を示す。列３は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列４および列５はそれぞれ、ＧＣＧ配列分析ソフトウェアパッケージのＭＯＴＩＦＳプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）によって決定された、リン酸化およびグリコシル化の可能性のある部位を示す。列６は、シグネチャ配列、ドメイン、およびモチーフを含むアミノ酸残基を示す。列７は、タンパク質の構造／機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所には更に、分析方法に利用した検索可能なデータベースを示す。
【０１４３】
表２および表３は共に、本発明の各々のポリペプチドの特性を要約しており、それら特性が、請求の範囲に記載されたポリペプチドが膜貫通タンパク質であることを確立している。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２は、ラットのプロスタグランジンＦ２ａ受容体調節タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１０５４８８４） との８９％の同一性を有することがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって示された（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは０．０であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２はまた、６つの免疫グロブリンドメイン群を有するが、これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された （表３参照）。さらに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ はシグナルペプチドと１つの膜貫通ドメインと、１つのＲＧＤモチーフとを持ち、これはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２がヒト膜貫通タンパク質であることを示す更に実証的な証拠を提供する。
【０１４４】
別の例として、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４は、ヒトのコネキシン３１．１ （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ４３３６９０３）との５６％の同一性を有することがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって示された（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは５．８ｅ−６８であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４はまた、１つのコネキシンドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された （表３参照）。ＢＬＩＭＰＳ、ＭＯＴＩＦＳ、およびＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４ がコネキシンである、更に実証的な証拠を提供する。注意すべきは、６つの同一のコネキシン群が１つのコネクソン（ギャップ結合）を構成し、これは膜貫通チャネルであって原形質膜にあり、化学的また電気的に機能し、多くの組織内の隣接細胞間で細胞質を結合することである。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５は長さが１５５４アミノ酸で、１１５７アミノ酸にわたってヒトＭＥＧＦ７ （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ３４４９３０６） との９９％の同一性を有することがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって示された（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは０．０であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５はまた、低密度リポタンパク質受容体リピート群と、低密度リポタンパク質受容体ドメイン群とを有するが、これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された （表３参照）。ＢＬＩＭＰＳ分析から得たデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５がタンパク質のＬＤＬ受容体ファミリーのメンバーであることを裏づける証拠を更に提供する。
【０１４５】
別の例において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６ はＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）による同定では、マウス低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質ＬＲＰ１Ｂ／ＬＲＰ−ＤＩＴ （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ８９２６２４３）との３６％の同一性を有する（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは１．５ｅ−４０であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６はまた、低密度リポタンパク質受容体ドメイン群を有することが、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して判定された （表３参照）。ＢＬＩＭＰＳ分析から得たデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６が低密度リポタンパク質受容体関連分子であることを裏づける証拠を更に提供する。更に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４はヒトＴＮＦ誘導性タンパク質ＣＧ１２−１ （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ３９７８２４６）との５９％の同一性を有することがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって示された（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは１．２ｅ−９４であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＨＭＭＥＲ解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４が１つの膜貫通ドメインを持つことを示す、更に実証的な証拠を提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７−１３、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５−１７については、同様の方法で分析し、注釈を付けた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７の解析のためのアルゴリズムおよびパラメータは、表７に記述した。
【０１４６】
表４に示すように、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ配列またはゲノムＤＮＡ由来のコード（エキソン）配列を用いて、あるいはこれら２種類の配列を任意に組み合わせて構築した。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）およびそれに対応するＩｎｃｙｔｅポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（ＩｎｃｙｔｅポリヌクレオチドＩＤ）を示す。列３は、各ポリヌクレオチド配列の長さを塩基対で示す。列４は、ポリヌクレオチド配列の断片の内、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４を同定するため、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４と、関連するポリヌクレオチド配列とを区別するためのハイブリダイゼーションまたは増幅技術に有用な断片を示す。列５は、ｃＤＮＡ配列に対応する識別番号、またはゲノムＤＮＡから予想されたコード配列（エキソン）に、および／または、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを共に有する配列集合に対応する識別番号を示している。これらの配列を用いて、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列を構築した。表４の列６および列７はそれぞれ、それらの完全長配列に関連する列５のｃＤＮＡ配列および／またはゲノム配列の開始ヌクレオチド（５’）位置および終了ヌクレオチド（３’）位置を示す。
【０１４７】
表４の列５の識別番号は、特に例えばＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡとそれに対応するｃＤＮＡライブラリとを指す場合もある。例えば、６７９８８２７Ｊ１はＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列の識別番号であり、ＣＯＬＥＮＯＲ０３は、その配列が由来するｃＤＮＡライブラリの識別番号である。ｃＤＮＡライブラリが示されていないＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ（例えば、７１７６０７５８Ｖ１）は、プールされているｃＤＮＡライブラリに由来する。または、列５の識別番号は、完全長ポリヌクレオチド配列の構築に用いたＧｅｎＢａｎｋのｃＤＮＡまたはＥＳＴの識別番号の場合もある（例えば、ｇ１５０６３５５）。更に、列５の識別番号は、ＥＮＳＥＭＢＬ（Ｔｈｅ Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｒｅ、英国ケンブリッジ）データベースに由来した配列を示す場合もある（すなわち「ＥＮＳＴ」の命名を含む配列）。あるいは、列５の識別番号は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｃｏｒｄｓ データベースに由来する場合もあり（すなわち「ＮＭ」または「ＮＴ」の命名を含む配列）、またＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｃｏｒｄｓに由来する場合もある（すなわち「ＮＰ」の命名を含む配列）。または列５の識別番号は、「エキソンスティッチング（ｅｘｏｎ−ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ）」アルゴリズムにより結び合わせたｃＤＮＡとＧｅｎｓｃａｎ予想エキソンとの両方からなる群を意味する場合がある。例えば、ＦＬ＿ＸＸＸＸＸＸ＿Ｎ１＿Ｎ２＿ＹＹＹＹＹ＿Ｎ３＿Ｎ４ は「スティッチされた」配列であり、その内、ＸＸＸＸＸＸは該アルゴリズムが適用される配列のクラスターの識別番号であり、ＹＹＹＹＹは該アルゴリズムが生成する予測の数であり、Ｎ１，２，３．．．がある場合には、解析中に手動で編集された特定のエキソン群を表す（実施例５参照）。または、列５の識別番号は「エキソンストレッチング（ｅｘｏｎ−ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ）」アルゴリズムにより結び合わせたエキソンの集合を指す場合もある。例えば、ＦＬＸＸＸＸＸＸ＿ｇＡＡＡＡＡ＿ｇＢＢＢＢＢ＿１＿Ｎは「ストレッチ」配列の識別番号である。ここでＸＸＸＸＸＸはＩｎｃｙｔｅプロジェクト識別番号、ｇＡＡＡＡＡは「エキソンストレッチング」アルゴリズムを適用したヒトゲノム配列のＧｅｎＢａｎｋ識別番号、ｇＢＢＢＢＢは一番近いＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体のＧｅｎＢａｎｋ識別番号またはＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ識別番号、Ｎ は特定のエキソンである（実施例５を参照）。或るＲｅｆＳｅｑ配列が「エキソンストレッチング」アルゴリズムのためのタンパク質相同体として使用された場合では、「ＮＭ」、「ＮＰ」、または「ＮＴ」によって表されるＲｅｆＳｅｑ識別子が、ＧｅｎＢａｎｋ識別子（すなわち、ｇＢＢＢＢＢ）の代わりに使用され得る。
【０１４８】
あるいは、接頭コードは、手動で編集された構成配列、ゲノムＤＮＡ配列から予測された構成配列、または組み合わされた配列解析方法に由来する構成配列を同定する。次の表は、構成配列の接頭コードと、接頭コードに対応する配列分析方法の例とを列記する（実施例４と５を参照）。
2004530409.tif 000003
【０１４９】
場合によっては、最終コンセンサスポリヌクレオチド配列を確認するために、列５に示すような配列カバレッジと重複するＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡカバレッジが得られたが、それに関連するＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ識別番号は示さなかった。
【０１５０】
表５は、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列を用いて構築された完全長ポリヌクレオチド配列のための代表的なｃＤＮＡライブラリを示している。代表的なｃＤＮＡライブラリとはＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡライブラリであり、これは、最も頻繁にはＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列群によって代表されるが、これらは、上記のポリヌクレオチド配列を構築および確認するために用いられた。ｃＤＮＡライブラリを作製するために用いた組織およびベクターを表５に示し、表６で説明している。
【０１５１】
本発明はまた、ＴＭＰの変異配列（変異体）をも含む。好適なＴＭＰの変異体は、ＴＭＰアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％、あるいは少なくとも約９０％、さらには少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有し、ＴＭＰの機能的または構造的特徴を少なくとも１つ含む変異体である。
【０１５２】
本発明はまた、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドを提供する。或る特定の実施例において、本発明は、ＴＭＰをコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４からなる一群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列を提供する。配列表に示したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４のポリヌクレオチド配列は、窒素系塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる等価ＲＮＡ配列を含む。
【０１５３】
本発明はまた、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。詳細には、このようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少なくとも約８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも約９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有する。本発明の或る特定の実施態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４からなる群から選択されたアミノ酸配列との少なくとも約７０％、或いは少なくとも約８５％、または少なくとも約９５％もの一致率を有するような、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４からなる群から選択した或る配列を有するポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。上記の任意のポリヌクレオチドの変異体は、ＴＭＰの機能的若しくは構造的特徴を少なくとも１つ有するアミノ酸配列をコードし得る。
【０１５４】
更に別の例では、本発明の或るポリヌクレオチド変異配列は、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチド配列のスプライス変異配列である。或るスプライス変異配列はＴＭＰをコードするポリヌクレオチド配列との顕著な配列同一性を持つ部分複数を有し得るが、ｍＲＮＡプロセッシング中のエキソン群の選択的スプライシングによって生ずる、配列の数ブロックの付加または欠失により、通常、より多数またはより少数のポリヌクレオチドを有することになる。或るスプライス変異配列には、約７０％未満、または約６０％未満、あるいは約５０％未満のポリヌクレオチド配列同一性が、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチド配列との間で全長に渡って見られるが、このスプライス変異配列のいくつかの部分には、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチド配列の各部との、少なくとも約７０％、あるいは少なくとも約８５％、または少なくとも約９５％、なおまたは１００％の、ポリヌクレオチド配列同一性を有することとなる。上記したスプライス変異配列は何れも、ＴＭＰの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有する或るアミノ酸配列をコードし得る。
【０１５５】
遺伝暗号の縮重により、ＴＭＰをコードする種々のポリヌクレオチド配列が産生され、中には、いかなる既知の天然遺伝子のポリヌクレオチド配列にも最小の類似性しか無いものもあることは、当業者には理解されよう。したがって本発明には、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって産出し得るあらゆる可能なポリヌクレオチド配列のバリエーションを網羅し得る。これらの組合せは、天然ＴＭＰのポリヌクレオチド配列に適用される標準トリプレット遺伝暗号を基に成されるものであり、このような変異は全て明確に開示されていると考慮されたい。
【０１５６】
ＴＭＰとその変異配列とをコードするヌクレオチド配列は一般に、好適に選択されたストリンジェンシー条件下で天然ＴＭＰのヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能であるが、非天然コドン群を含めるなどの実質的に異なるコドン使用を有する、ＴＭＰ或いはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは、有益であり得る。宿主が特定のコドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核宿主または原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコドンを選択し得る。コードされるアミノ酸配列を改変せずに、ＴＭＰおよびその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に改変する別の理由には、天然配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるＲＮＡ転写物を作ることもある。
【０１５７】
本発明にはまた、ＴＭＰとＴＭＰ誘導体とをコードする、ＤＮＡ配列またはそれらの断片を、完全に合成化学によって作製する過程をも含む。作製後、当分野で公知の試薬類を用いて、この合成配列を任意の多くの入手可能な発現ベクター及び細胞系中に挿入し得る。更に、合成化学を用いて、ＴＭＰまたはその任意の断片をコードする配列に突然変異を誘発し得る。
【０１５８】
更に本発明には、種々のストリンジェンシー条件下で、請求項に記載されたポリヌクレオチド配列、特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４、およびそれらの断片とのハイブリダイズが可能なポリヌクレオチド配列を含む（例えば、Ｗａｈｌ， Ｇ．Ｍ．およびＳ．Ｌ． Ｂｅｒｇｅｒ （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：３９９−４０７；Ｋｉｍｍｅｌ． Ａ．Ｒ． （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：５０７−５１１を参照）。アニーリングおよび洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載した。
【０１５９】
ＤＮＡシークエンシングの方法は当分野では公知であり、本発明のいずれの実施例も、ＤＮＡシークエンシング方法を用い得る。ＤＮＡシークエンシング方法には酵素を用い得る。例えばＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＯＨ）、Ｔａｑポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、熱安定性Ｔ７ポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）を用い得る。あるいは、例えばＥＬＯＮＧＡＳＥ増幅システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼとを併用し得る。好適には、ＭＩＣＲＯＬＡＢ２２００液体転移システム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ， ＮＶ）、ＰＴＣ２００サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）およびＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などの装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ＡＢＩ ３７３ あるいは ３７７ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）または当分野で公知の他のシステムを用いてシークエンシングを行う。結果として得た配列を、当分野で周知の種々のアルゴリズムを用いて分析する（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． （１９９７） Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ７．７ユニット、Ｍｅｙｅｒｓ， Ｒ．Ａ． （１９９５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ ＶＣＨ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ８５６−８５３ページを参照）。
【０１６０】
当分野で周知の、ＰＣＲ法をベースにした種々の方法と、部分的ヌクレオチド配列とを利用して、ＴＭＰをコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節エレメントなど、上流にある配列を検出し得る。例えば、使用し得る方法の１つである制限部位ＰＣＲ法は、ユニバーサルプライマーおよびネステッドプライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムＤＮＡからの未知の配列を増幅する方法である（例えば、Ｓａｒｋａｒ， Ｇ． （１９９３） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ． ２：３１８−３２２を参照）。別の方法に逆ＰＣＲ法があり、これは多岐の方向に伸長するプライマー群を用いて、環状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、或る既知のゲノム遺伝子座およびその周辺の配列群からなる制限酵素断片群から得る（例えば、Ｔｒｉｇｌｉａ， Ｔ． 他 （１９８８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：８１８６を参照）。第３の方法としてキャプチャＰＣＲ法があり、これにはヒトおよび酵母人工染色体ＤＮＡの既知の配列群に隣接するＤＮＡ断片群をＰＣＲ増幅する方法を含む（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍ， Ｍ．他（１９９１） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ １：１１１−１１９などを参照）。この方法では、ＰＣＲを行う前に、複数の制限酵素の消化およびライゲーション反応を用い、未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入し得る。未知の配列群を検索するために用い得る他の複数の方法も当分野で公知である（Ｐａｒｋｅｒ， Ｊ．Ｄ．他 （１９９１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：３０５５−３０６０などを参照）。更に、ＰＣＲ、ネステッドプライマー類、およびＰＲＯＭＯＴＥＲＦＩＮＤＥＲライブラリ類（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）を用いてゲノムＤＮＡをウォーキングし得る。この手順は、ライブラリ類をスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部の発見に有用である。全てのＰＣＲベースの方法で、市販されているソフトウェア、例えばＯＬＩＧＯ ４．０６プライマー分析ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ ＭＮ）或いは別の好適なプログラムを用いて、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が約５０％以上で、温度約６８℃〜７２℃で鋳型に対してアニーリングするように、プライマー群を設計し得る。
【０１６１】
完全長ｃＤＮＡ群をスクリーニングする際は、より大きなｃＤＮＡ群を含むようにサイズ選択されたライブラリ群を用いるのが好ましい。更に、ランダムプライマーのライブラリ群は、しばしば遺伝子群の５’領域を有する配列を含むライブラリであり、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリが完全長ｃＤＮＡを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラリ群は、５’非転写調節領域への、配列の伸長に有用であろう。
【０１６２】
市販のキャピラリー電気泳動システム群を用いて、シークエンシングまたはＰＣＲ産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認し得る。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離のための流動性ポリマーと、４つの異なるヌクレオチドに特異的であるような、レーザで活性化される蛍光色素と、発光された波長の検出に利用するＣＣＤカメラとを有し得る。出力／光の強度は、適切なソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＧＥＮＯＴＹＰＥＲ、ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＮＡＶＩＧＡＴＯＲなど）を用いて電気信号に変換し得る。サンプルのロードからコンピュータ分析および電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないようなＤＮＡ小断片のシークエンシングに特に適している。
【０１６３】
本発明の別の実施例では、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を組換えＤＮＡ分子にクローニングして、適切な宿主細胞内にＴＭＰ、その断片または機能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の縮重により、実質的に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のＤＮＡ配列を産生し、これらの配列をＴＭＰの発現に利用し得る。
【０１６４】
ＴＭＰをコードする配列を種々の目的で改変するために、当分野で一般的に知られている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。この目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセッシングおよび／または発現の調節が含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドとの、ランダムなフラグメンテーションおよびＰＣＲ再アセンブリによるＤＮＡシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組み換え得る。例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的変異誘導を利用して、新規な制限部位の作製、グリコシル化パターンの改変、コドン優先の変更、スプライス変異配列の生成などを起こす突然変異を導入し得る。
【０１６５】
本発明のヌクレオチドを、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＲＥＥＤＩＮＧ （Ｍａｘｙｇｅｎ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ； 米国特許第５，８３７，４５８号； Ｃｈａｎｇ， Ｃ．−Ｃ． 他 （１９９９） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：７９３−７９７； Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ， Ｆ．Ｃ． 他 （１９９９） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：２５９−２６４； Ｃｒａｍｅｒｉ， Ａ． 他 （１９９６） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４：３１５−３１９）などのＤＮＡシャッフリング技術を用いてシャッフリングし、ＴＭＰの生物学的または酵素的な活性、或いは他の分子や化合物と結合する能力などのＴＭＰの生物学的特性を改変或いは改良することができる。ＤＮＡシャッフリングは、ＰＣＲを介する遺伝子断片組換えを用いて遺伝子変異配列のライブラリを作製するプロセスである。ライブラリはその後、所望の特性を持つ遺伝子変異配列群を同定する、選択またはスクリーニングの手順を経る。続いて、これら好適な変異配列をプールし、更に反復してＤＮＡシャッフリングおよび選択／スクリーニングを行い得る。かくして、「人工的な」育種および急速な分子の進化によって、多様な遺伝子が作られる。例えば、ランダムポイント突然変異を持つ単一の遺伝子の断片を組み換え、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリングし得る。あるいは、或る遺伝子の断片群を同種または異種のいずれかから得た同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子の断片と組み換え、それによって天然に存在する複数の遺伝子の遺伝多様性を、方向付けした制御可能な方法で最大化させることができる。
【０１６６】
別の実施例によれば、ＴＭＰをコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を用いて、全体或いは一部を合成可能である（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ． Ｍ．Ｈ．他 （１９８０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ． ７：２１５２２３； および Ｈｏｒｎ， Ｔ． 他 （１９８０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ． ７：２２５２３２を参照）。別法として、化学的方法を用いてＴＭＰ自体またはその断片を合成することが可能である。例えば、種々の液相または固相技術を用いてペプチド合成を行い得る（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｔ．（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ５５−６０ページ、Ｒｏｂｅｒｇｅ， Ｊ．Ｙ．他（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２−２０４などを参照）。自動合成は、ＡＢＩ ４３１Ａペプチドシンセサイザ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて達成し得る。更にＴＭＰのアミノ酸配列または任意のその一部は、直接的な合成の際の改変、および／または化学的方法を用いた他のタンパク質または任意のその一部からの配列群との組み合わせにより、天然ポリペプチドの配列を有するポリペプチド、または変異体ポリペプチドを作製することが可能である。
【０１６７】
このペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィーを用いて実質的に精製し得る（Ｃｈｉｅｚ， Ｒ．Ｍ．およびＦ．Ｚ． Ｒｅｇｎｉｅｒ （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：３９２−４２１などを参照）。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって確認することができる（前出のＣｒｅｉｇｈｔｏｎ， ２８−５３ページなどを参照）。
【０１６８】
生物学的に活性なＴＭＰを発現させるために、ＴＭＰをコードするヌクレオチド配列またはそれらの誘導体を好適な発現ベクターに挿入することができる。好適な発現ベクターとは、好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写と翻訳との制御に必要なエレメント群を持つベクターである。必要なエレメントの例には、ベクターに、またＴＭＰをコードするポリヌクレオチド配列における調節配列、例えばエンハンサー、構成型および発現誘導型のプロモーター、５’および３’の非翻訳領域などが含まれる。このようなエレメント群は、特長および特異性が様々である。特定の開始シグナル類によって、ＴＭＰをコードする配列の、より効果的な翻訳を達成することも可能である。このようなシグナルの例には、ＡＴＧ開始コドンと、コザック配列など近傍の配列が含まれる。ＴＭＰをコードする配列、およびその開始コドンや、上流の調節配列が、好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写制御シグナルや翻訳制御シグナルは必要ない場合もある。しかしながら、コーディング配列あるいはその断片のみが挿入される場合は、インフレームのＡＴＧ開始コドンなど外来性の翻訳制御シグナルを発現ベクターが提示するようにすべきである。外来性の翻訳エレメント群および開始コドン群は、様々な天然物および合成物を起源とし得る。用いる特定の宿主細胞系に適したエンハンサー類を含めることにより、発現の効率を高めることが可能である（Ｓｃｈａｒｆ， Ｄ． 他（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． ２０：１２５−１６２などを参照）。
【０１６９】
当業者に周知の方法を用いて、ＴＭＰをコードする配列と、好適な転写および翻訳制御エレメントとを持つ発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換え技術がある（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． 他．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ， ４章および８章， および１６−１７章； および Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． 他．（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ９章、１３章および１６章を参照）。
【０１７０】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、ＴＭＰをコードする配列を保持および発現し得る。限定するものではないがこのような発現ベクター／宿主系には、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌など微生物や、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶまたはタバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えばＴｉプラスミドまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換させた植物細胞系、動物細胞系がある（前出のＳａｍｂｒｏｏｋ、前出のＡｕｓｕｂｅｌ、Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ， Ｇ．およびＳ．Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３−５５０９、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ、Ｅ．Ｋ． 他（１９９４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３２２４−３２２７、Ｓａｎｄｉｇ， Ｖ． 他（１９９６）Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１９３７−１９４５、Ｔａｋａｍａｔｓｕ， Ｎ．（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ． ６：３０７−３１１、『マグローヒル科学技術年鑑』（Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（１９９２）ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， １９１−１９６ページ、Ｌｏｇａｎ， Ｊ． および Ｔ． Ｓｈｅｎｋ（１９８４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：３６５５−３６５９、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｊ．Ｊ． 他（１９９７）Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５などを参照）。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団へ輸送することができる（Ｄｉ Ｎｉｃｏｌａ， Ｍ． 他（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎ． Ｔｈｅｒ． ５（６）：３５０−３５６、Ｙｕ， Ｍ． 他（１９９３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０（１３）：６３４０−６３４４、Ｂｕｌｌｅｒ， Ｒ．Ｍ． 他（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１７（６０４０）：８１３−８１５； ＭｃＧｒｅｇｏｒ， Ｄ．Ｐ． 他（１９９４）Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３１（３）：２１９−２２６、Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． および Ｎ． Ｓｏｍｉａ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９−２４２などを参照）。  本発明は、使用する宿主細胞によって限定されるものではない。
【０１７１】
細菌系では、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて多数のクローニングベクターおよび発現ベクターを選択し得る。例えば、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチド配列の慣例的なクローニング、サブクローニング、増殖には、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）またはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。ベクターの多数のクローニング部位にＴＭＰをコードする配列をライゲーションするとｌａｃＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニングされた配列におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖のレスキュー、入れ子状態の欠失の生成にも有用であろう（例えば、Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ， Ｇ．およびＳ．Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３５５０９を参照）。例えば、抗体の産生のためなどに多量のＴＭＰが必要な場合は、ＴＭＰの発現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力な誘導ＳＰ６バクテリオファージプロモーターまたは誘導Ｔ７バクテリオファージプロモーターを含むベクターが使用できる。
【０１７２】
酵母発現系を用いてＴＭＰを産生し得る。α因子、アルコールオキシダーゼ、ＰＧＨプロモーターなど、構成型あるいは誘導型のプロモーターを持つ多数のベクターが、出芽酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）内で使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌か細胞内での保持かのどちらかを指示し、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配列を組み込むことを可能にする（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， １９９５，前出、Ｂｉｔｔｅｒ， Ｇ．Ａ． 他（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４、およびＳｃｏｒｅｒ． Ｃ． Ａ． 他（１９９４）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：１８１−１８４を参照）。
【０１７３】
植物系もＴＭＰの発現に使用可能である。ＴＭＰをコードする配列の転写は、ウイルスプロモーター、例えば単独或いはＴＭＶ（Ｔａｋａｍａｔｓｕ， Ｎ． （１９８７） ＥＭＢＯ Ｊ ６：３０７−３１１）由来のオメガリーダー配列と組み合わせて用いられるような、ＣａＭＶ由来の３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターによって駆動し得る。あるいは、ＲｕＢｉｓＣＯの小サブユニットなどの植物プロモーター、または熱ショックプロモーターを用い得る（例えば、Ｃｏｒｕｚｚｉ， Ｇ． 他．（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ． ３：１６７１−１６８０； Ｂｒｏｇｌｉｅ， Ｒ． 他（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：８３８−８４３； および Ｗｉｎｔｅｒ， Ｊ． 他（１９９１）Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． １７：８５−１０５を参照）。これらの構成物は、直接ＤＮＡ形質転換により、または病原体を媒介とする形質移入により、植物細胞内に導入し得る（『マグローヒル科学技術年鑑』（Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） （１９９２） ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ，１９１−１９６ページなどを参照）。
【０１７４】
哺乳動物細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、後期プロモーターと３連リーダー配列とを持つアデノウイルス転写／翻訳複合体に、ＴＭＰをコードする配列を結合し得る。アデノウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域へ挿入することにより、宿主細胞内でＴＭＰを発現する感染ウイルスを得ることが可能である（例えば、Ｌｏｇａｎ， Ｊ．およびＴ． Ｓｈｅｎｋ（１９８４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：３６５５３６５９を参照）。更に、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させ得る。ＳＶ４０またはＥＢＶをベースにしたベクターを用いてタンパク質を高レベルで発現させることもできる。
【０１７５】
また、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）類を用いて、或るプラスミドに含まれ得るものやプラスミドから発現し得るものより大きな、ＤＮＡの断片を送達し得る。治療のために、約６ｋｂ〜１０ＭｂのＨＡＣｓが作製され、従来の送達方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル）で送達されている（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ． Ｊ．Ｊ． 他（１９９７）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１５：３４５−３５５を参照）。
【０１７６】
哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、細胞株におけるＴＭＰの安定した発現が望ましい。例えば、ＴＭＰをコードする配列を細胞株に形質転換するために、発現ベクター類と、同じ或いは別のベクター上の選択可能マーカー遺伝子とを用い得る。用いる発現ベクターは、複製のウイルス起源、および／または内在性の発現エレメント群を持ち得る。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化培地で約１〜２日間、細胞を増殖させ得る。選択可能マーカーの目的は選択剤への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーの存在により、導入した配列をうまく発現するような細胞の成長および回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖可能である。
【０１７７】
任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。限定するものではないがこのような選択系には、ｔｋ−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子と、ａｐｒ−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子がある（Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ．他 （１９７７） Ｃｅｌｌ １１：２２３−２３２、Ｌｏｗｙ， Ｉ．他（１９８０） Ｃｅｌｌ ２２：８１７−８２３などを参照）。また、選択の基礎として、代謝拮抗物質、抗生物質、あるいは除草剤への耐性を用いることができる。例えばｄｈｆｒはメトトレキセートに対する耐性を与え、ｎｅｏはアミノグリコシドネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を与え、ａｌｓはクロルスルフロンに対する耐性を、ｐａｔはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を各々与える（Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ．他 （１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：３５６７−３５７０、Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ， Ｆ． 他 （１９８１） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１−１４などを参照）。この他の選択可能な遺伝子、例えば、代謝のための、細胞の必要条件を改変するｔｒｐＢおよびｈｉｓＤも、文献に記載されている（Ｈａｒｔｍａｎ， Ｓ．Ｃ．およびＲ．Ｃ． Ｍｕｌｌｉｇａｎ （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：８０４７８０５１を参照）。可視マーカー類、例えばアントシアニンや、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、βグルクロニダーゼおよびその基質であるβグルクロニド、またはルシフェラーゼおよびその基質であるルシフェリンを用い得る。これらのマーカーを用いて、トランスフォーマントを同定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性あるいは安定したタンパク質発現を定量し得る（Ｒｈｏｄｅｓ， Ｃ．Ａ． （１９９５） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５５：１２１１３１などを参照）。
【０１７８】
マーカー遺伝子発現の有無によって目的の遺伝子の存在が示唆されても、その遺伝子の存在および発現の確認が必要な場合もある。例えば、ＴＭＰをコードする配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、ＴＭＰをコードする配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により同定可能である。または、１つのプロモーターの制御下で、或るマーカー遺伝子が、ＴＭＰをコードする配列とタンデムに配置されることも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現をも標示する。
【０１７９】
一般に、ＴＭＰをコードする核酸配列を含み且つＴＭＰを発現する宿主細胞は、当業者によく知られている種々の方法を用いて同定することが可能である。限定するものではないが当業者によく知られている方法には、ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションと、ＰＣＲ増幅とがあり、また、核酸配列或いはタンパク質配列の検出、定量、或いはその両方を行うための、膜系、溶液ベース或いはチップベースの技術を含む、タンパク質の生物学的検定法または免疫学的検定法もある。
【０１８０】
特異的ポリクローナル抗体または特異的モノクローナル抗体を用いてＴＭＰの発現の検出と計測とを行うための免疫学的方法は、当分野で既知である。このような技術の例としては、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などが挙げられる。ＴＭＰ上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体群を用いた、２部位のモノクローナルベースイムノアッセイ（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ， ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ−ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が好ましいが、競合する結合アッセイを用いることもできる。これらのアッセイおよびこれ以外のアッセイは、当分野で公知である（Ｈａｍｐｔｏｎ． Ｒ． 他（１９９０）Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ． Ｓｔ Ｐａｕｌ． ＭＮ， Ｓｅｃｔ． ＩＶ、Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ． Ｅ． 他（１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ、Ｐｏｕｎｄ， Ｊ．Ｄ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ ＮＪなどを参照）。
【０１８１】
多岐にわたる標識方法および抱合方法が当業者に知られており、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにこれらの方法を用い得る。ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはＰＣＲプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、エンドラベリング（末端標識化）、または、標識したヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅が含まれる。別法として、ＴＭＰをコードする配列、またはその任意の断片を、ｍＲＮＡプローブを生成するためのベクターにクローニングすることも可能である。このようなベクターは、当分野において知られており、市販もされており、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６などの好適なＲＮＡポリメラーゼおよび標識されたヌクレオチドを加えて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブの合成に用いることができる。このような方法は、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）、およびＵ．Ｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌなどから市販されている種々のキットを用いて実行することができる。検出を容易にするために用い得る好適なレポーター分子あるいは標識には、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤などがある。
【０１８２】
ＴＭＰをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地でのこのタンパク質の発現および回収に好適な条件下で培養される。形質転換細胞から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列、ベクター、あるいはその両者に依存する。ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドを持つ発現ベクターは、原核細胞膜または真核細胞膜を通してのＴＭＰの分泌を誘導するシグナル配列群を持つように設計できることは、当業者には理解されよう。
【０１８３】
更に、宿主細胞株の選択は、挿入した配列の発現をモジュレートする能力、または発現したタンパク質を所望の形に処理する能力に関して行い得る。限定するものではないがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、タンパク質ターゲッティング、折りたたみ、および／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための、特定の細胞装置および特徴的な機序を持つ、種々の宿主細胞（例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＭＥＫ２９３、ＷＩ３８など）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾および処理を確実にするように選択し得る。
【０１８４】
本発明の別の実施例では、ＴＭＰをコードする、自然のあるいは修飾された、または組換えの核酸配列を、或る異種配列に結合させることができ、この結果、上記した任意の宿主系の、或る融合タンパク質の翻訳を生じる。例えば、市販されている抗体を用いて認識可能な異種部分を含むキメラＴＭＰタンパク質は、ＴＭＰ活性阻害剤に対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分および異種ペプチド部分も、市販されている親和性マトリックスを用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、６−Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ、赤血球凝集素（ＨＡ）がある。ＧＳＴは固定化グルタチオン上で、ＭＢＰはマルトース上で、Ｔｒｘはフェニルアルシンオキシド上で、ＣＢＰはカルモジュリン上で、そして６−Ｈｉｓは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃおよび赤血球凝集素（ＨＡ）は、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を用いた、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、ＴＭＰをコードする配列と異種タンパク質配列との間にあるタンパク質分解切断部位を融合タンパク質が含むように遺伝子操作すると、ＴＭＰが、精製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現および精製方法は、前出のＡｕｓｕｂｅｌ（１９９５）１０章に記載されている。市販されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現および精製を促進することもできる。
【０１８５】
本発明の別の実施例では、ＴＮＴウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで、放射能標識したＴＭＰの合成が可能である。これらの系は、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６プロモーターと機能的に連結したタンパク質コード配列の、転写と翻訳とを結合する。翻訳は、例えば３５Ｓメチオニンのような放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。
【０１８６】
本発明のＴＭＰまたはその断片を用いて、ＴＭＰに特異結合する化合物をスクリーニングすることができる。少なくとも１つまたは複数の試験化合物を用いて、ＴＭＰへの特異的な結合をスクリーニングすることが可能である。試験化合物の例には、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば受容体）または小分子が挙げられる。
【０１８７】
一実施例では、このように同定された化合物は、例えばリガンドやその断片などのＴＭＰの天然リガンド、または天然の基質、構造的または機能的な擬態物質、または自然結合パートナーに密接に関連している（Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ．Ｅ． 他 （１９９１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）の５章等を参照）。同様に、この化合物は、ＴＭＰが結合する天然受容体に、或いは例えばリガンド結合部位など少なくともこの受容体の或る断片に、密接に関連し得る。何れの場合も、既知の技術を用いてこの化合物を合理的に設計することができる。一実施例では、このような化合物に対するスクリーニングには、分泌タンパク質或いは細胞膜上のタンパク質の何れか一方としてＴＭＰを発現する好適な細胞の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳動物、酵母、ショウジョウバエ、または大腸菌からの細胞が含まれる。ＴＭＰを発現する細胞またはＴＭＰを含有する細胞膜分画を試験化合物と接触させて、ＴＭＰまたはこの化合物のどちらかの結合、刺激、または活性の阻害を分析する。
【０１８８】
或るアッセイは、単に試験化合物をポリペプチドに実験的に結合させ、蛍光色素、放射性同位体、酵素抱合体またはその他の検出可能な標識により、その結合を検出することができる。例えば、このアッセイは、少なくとも１つの試験化合物を、溶液中の或いは固体支持物に固定されたＴＭＰと混合するステップと、ＴＭＰとこの化合物との結合を検出するステップを含み得る。別法では、標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出および測定を行うことができる。更にこのアッセイは、無細胞再構成標本、化学ライブラリまたは、天然産物の混合物を用いて実施することができ、試験化合物は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定する。
【０１８９】
本発明のＴＭＰまたはその断片を用いて、ＴＭＰの活性をモジュレートする化合物をスクリーニングすることが可能である。このような化合物には、アゴニスト、アンタゴニスト、或るいは部分的または逆アゴニストなどが含まれる。一実施例では、ＴＭＰが少なくとも１つの試験化合物と結合する、ＴＭＰの活性が許容される条件下でアッセイを実施し、試験化合物の存在下でのＴＭＰの活性を、試験化合物不在下でのＴＭＰの活性と比較する。試験化合物の存在下でのＴＭＰの活性の変化は、ＴＭＰの活性をモジュレートする化合物の存在を示唆する。別法では、試験化合物を、ＴＭＰの活性に適した条件下で、ＴＭＰを有するｉｎ ｖｉｔｒｏ系すなわち無細胞系と結合させてアッセイを実施する。これらアッセイの何れにおいても、ＴＭＰの活性をモジュレートする試験化合物は間接的にモジュレートする場合があり、その際は試験化合物と直接接触する必要がない。少なくとも１つ、または複数の試験化合物をスクリーニングできる。
【０１９０】
別の実施例では、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）における相同組換えを用いて動物モデル系内で、ＴＭＰまたはその哺乳動物相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患動物モデルの作製に有用である（米国特許第５，１７５，３８３号および第５，７６７，３３７号などを参照）。例えば１２９／ＳｖＪ細胞株などのマウスＥＳ細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このＥＳ細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ；Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｍ．Ｒ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２）などのマーカー遺伝子で破壊した、目的の遺伝子を持つベクターで形質転換する。このベクターは、相同組換えにより、宿主ゲノムの対応領域に組み込まれる。別法では、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子をノックアウトする（Ｍａｒｔｈ， Ｊ．Ｄ． （１９９６） Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９７：１９９９−２００２； Ｗａｇｎｅｒ， Ｋ．Ｕ． 他 （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：４３２３−４３３０）。形質転換したＥＳ細胞を同定し、例えばＣ５７ＢＬ／６マウス株などから採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。これらの胚盤胞を偽妊娠メスに外科的に導入し、得られるキメラ子孫の遺伝形質を特定し、これらを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物は、潜在的治療薬や毒性薬剤で検査することができる。
【０１９１】
ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドを、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト胚盤胞由来のＥＳ細胞において操作することも可能である。ヒトＥＳ細胞は、内胚葉、中胚葉および外胚葉の細胞タイプを含む、少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統および心筋細胞に分化する（Ｔｈｏｍｓｏｎ， Ｊ．Ａ． 他 （１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５−１１４７）。
【０１９２】
ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組換え動物（マウスまたはラット）を作製することも可能である。ノックイン技術を用いて、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドの或る領域を動物ＥＳ細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組み込ませる。形質転換した細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について試験し、潜在的医薬品を用いて処理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別法では、例えばＴＭＰを乳汁内に分泌するなど、ＴＭＰを過剰に発現する哺乳動物近交系は、便利なタンパク質源となり得る（Ｊａｎｎｅ， Ｊ． 他 （１９９８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． ４：５５−７４）。
【０１９３】
（治療）
ＴＭＰの各領域と膜貫通タンパク質類との間には、例えば配列およびモチーフの文脈における、化学的および構造的類似性が存在する。さらに、ＴＭＰの発現は、脳、前立腺、平滑筋、心血管、下垂体、胃腸、肺、膵臓、および小腸の各組織に密接に関連している。従って、ＴＭＰは、生殖障害、発達障害、心血管障害、神経障害、胃腸障害、脂質代謝障害、細胞増殖異常、および自己免疫／炎症性の疾患においてある役割を果たすと考えられる。ＴＭＰの発現または活性の増大に関連する疾患の治療においては、ＴＭＰの発現または活性を低下させることが望ましい。また、ＴＭＰの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、ＴＭＰの発現または活性を増大させることが望ましい。
【０１９４】
したがって、一実施例において、ＴＭＰの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、患者にＴＭＰまたはその断片や誘導体を投与することが可能である。限定するものではないがこのような疾患の例としては、生殖障害として、プロラクチン産生の障害、不妊（例えば卵管疾患、排卵不良、子宮内膜症、性周期の途絶、月経周期の途絶、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過剰刺激症候群、子宮内膜腫瘍や卵巣腫瘍、子宮筋腫、自己免疫障害、異所性妊娠、奇形発生、乳癌、乳房線維嚢胞病、乳漏症、精子形成の途絶、異常精子生理、精巣癌、前立腺癌、良性前立腺肥大、前立腺炎、ペーロニー病、インポテンス、男性乳癌、女性化乳房、高ゴナドトロピン性腺機能低下症、低ゴナドトロピン性腺機能低下症、仮性半陰陽、無精子症、早発卵巣不全、アクロシン欠損症、晩発思春期、逆行性射精、無射精、血管芽腫、嚢胞・クロム親和細胞腫（ｃｙｓｔｓｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａｓ）、傍神経節腫、精巣上体の嚢胞腺腫、および内リンパ嚢腫瘍）が、発達障害として、尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ／ベッカー筋ジストロフィ、癲癇、性腺発育障害、ＷＡＧＲ症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神遅滞）、スミス・マジェニス症候群、骨髄異形成症候群、遺伝性粘液上皮異形成、遺伝性角皮症、遺伝性ニューロパシー（例えばシャルコー・マリー・トゥース病および神経線維腫症）、甲状腺機能低下症、水頭症、発作障害（例えばシデナム舞踏病と脳性麻痺）二分脊椎、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感音難聴が含まれる他、心血管障害も含まれ、その中には動静脈瘻、アテローム性動脈硬化症、高血圧、脈管炎、レイノー病、動脈瘤、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈炎および静脈血栓、血管系腫瘍、血栓溶解の合併症、バルーン血管形成術、血管置換術、冠動脈バイパス移植、うっ血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性２尖大動脈弁、僧帽弁輪部石灰化、僧帽弁逸脱、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性紅斑性狼瘡の心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、心臓移植の合併症、先天性肺異常、肺拡張不全、肺うっ血および肺水腫、肺動脈塞栓症、肺出血、肺梗塞、肺高血圧症、血管硬化症、閉塞性肺疾患、拘束性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、慢性気管支炎、気管支喘息、気管支拡張症、細菌性肺炎、ウイルス性肺炎およびマイコプラズマ肺炎、肺膿瘍、肺結核、びまん性間質性疾患、塵肺症、サルコイド症、特発性肺線維症、剥離性間質性肺炎、過敏性肺炎、肺好酸球増加、閉塞性細気管支炎―器質化肺炎（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｉｔｉｓ ｏｂｌｉｔｅｒａｎｓ−ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、びまん性肺出血症候群、グッドパスチャー症候群、特発性肺血鉄症、膠原血管病併発性肺疾患、肺胞たんぱく症、肺腫瘍、炎症性および非炎症性胸水、気胸症、胸膜腫瘍、薬物性肺疾患、放射線による肺疾患、および肺移植の合併症などが含まれる。神経障害として、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、脳腫瘍���アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキンソン病その他の錐体外路障害、筋萎縮性側索硬化その他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、網膜色素変性症（色素性網膜炎）、遺伝性運動失調、多発性硬化症その他の脱髄疾患、細菌性およびウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下膿瘍、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎および神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病およびゲルストマン‐シュトロイスラー‐シャインカー症候群を含むプリオン病と、致死性家族性不眠症、神経系の栄養病および代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜性血管腫症（ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｒｅｔｉｎａｌ ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａｔｏｓｉｓ）、脳３叉神経血管症候群、精神遅滞、ダウン症候群を含むその他の中枢神経系発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄病、筋ジストロフィーその他の神経筋疾患、末梢神経疾患、皮膚筋炎および多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性および中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分障害、不安障害および統合失調症（精神分裂病）を含む精神障害と、季節性感情障害（ＳＡＤ）と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、遅発性ジスキネジア、ジストニー、パラノイド精神病、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病、進行性核上麻痺、皮質基底核変性症、家族性前頭側頭痴呆が含まれ、また胃腸障害も含まれ、その中には嚥下障害、消化性食道炎、食道痙攣、食道狭窄、食道癌、消化不良、消化障害、胃炎、胃癌、食欲不振、悪心、嘔吐、胃不全麻痺、洞または幽門の浮腫、腹部アンギナ、胸焼け、胃腸炎、イレウス、腸管感染、消化性潰瘍、胆石症、胆嚢炎、胆汁うっ滞、膵臓炎、膵臓癌、胆道疾患、肝炎、高ビリルビン血症、硬変症、肝臓の受動的うっ血、ヘパトーム、感染性大腸炎、潰瘍性大腸炎、潰瘍性直腸炎、クローン病、ホウィップル病、マロリー‐ワイス症候群、結腸癌、結腸閉塞、過敏性腸症候群、短小腸症候群、下痢、便秘、胃腸出血、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）腸症、黄疸、肝性脳症、肝腎症候群、脂肪肝、血色素症、ウィルソン病、α１アンチトリプシン欠損症、ライ症候群、原発性硬化性胆管炎、肝梗塞、門脈循環閉塞および血栓、小葉中心壊死、肝臓紫斑病、肝静脈血栓、肝静脈閉塞症、子癇前症、子癇、妊娠性急性脂肪肝、妊娠性肝臓内胆汁うっ滞と、結節性過形成および腺腫、癌腫を含む肝癌が含まれ、脂質代謝障害として、脂肪肝、胆汁うっ滞、原発性胆汁性肝硬変、カルニチン欠乏症、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ欠乏症、ミオアデニル酸デアミナーゼ欠損症、高トリグリセリド血症、ファブリー病などの脂質貯蔵病、ゴーシェ病、ニーマン‐ピック病、異染性白質ジストロフィー、副腎白質ジストロフィー、ＧＭ２ガングリオシド蓄積症、セロイドリポフスチン症、無β‐リポ蛋白血症、タンジアー病、高リポ蛋白血症、糖尿病、脂肪異栄養症、脂肪腫症、急性皮下脂肪組織炎、播種性脂肪壊死、有痛脂肪症、リポイド副腎過形成、微小変化型ネフローゼ、脂肪腫、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症を伴った高コレステロール血症、原��性低αリポ蛋白血症、甲状腺機能低下症、腎疾患、肝疾患、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ欠損症、脳腱黄色腫症、シトステロール血症、低コレステロール血症、テイ‐サックス病、サンドホフ病、高脂血症、高脂質血症、脂質筋障害、肥満症が、細胞増殖障害として、光線性角化症、動脈硬化症、アテローム性硬化症、滑液包炎、硬変、肝炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症と、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌を含む癌、具体的には副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌等が含まれ、また自己免疫／炎症疾患も含まれ、その中には後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィー（ＡＰＥＣＥＤ）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球傷害因子性偶発性リンパ球減少症（ｅｐｉｓｏｄｉｃ ｌｙｍｐｈｏｐｅｎｉａ ｗｉｔｈ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｏｔｏｘｉｎｓ）、新生児溶血性疾患（胎児赤芽球症）、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜の炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性紅斑性狼瘡、全身性強皮症（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌の合併症、血液透析、体外循環、ウイルス性感染症、細菌性感染症、真菌性感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症および外傷が含まれる。
【０１９５】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＴＭＰの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、ＴＭＰまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与することも可能である。
【０１９６】
更に別の実施例では、限定するものではないが上記した疾患を含む、ＴＭＰの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製されたＴＭＰを含む組成物を好適な医薬用キャリアと共に患者に投与することも可能である。
【０１９７】
更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＴＭＰの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、ＴＭＰの活性を調節するアゴニストを患者に投与することも可能である。
【０１９８】
更なる実施例では、ＴＭＰの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、患者にＴＭＰのアンタゴニストを投与することが可能である。限定するものではないが、このような疾患の例には、上記した生殖障害、発達障害、心血管障害、神経障害、胃腸障害、脂質代謝障害、細胞増殖異常、および自己免疫／炎症性の疾患が含まれる。一実施態様では、ＴＭＰと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはＴＭＰを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶターゲッティング機構或いは送達機構として間接的に用いられ得る。
【０１９９】
別の実施例では、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含む、ＴＭＰの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防も可能である。
【０２００】
別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補配列、またはベクターを、別の好適な治療薬と組み合わせて投与することもできる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従って選択し得る。治療薬と組み合わせることにより、上記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法により、少量の各薬剤で医薬効果をあげることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減し得る。
【０２０１】
ＴＭＰのアンタゴニストは、本技術分野で一般的に知られている方法を用いて製造し得る。具体的には、精製されたＴＭＰを用いて抗体を作るか、治療薬のライブラリをスクリーニングして、ＴＭＰと特異結合するものを同定することが可能である。ＴＭＰへの抗体も、本技術分野で公知の方法を用いて製造することが可能である。限定するものではないがこのような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、およびＦａｂ発現ライブラリによって作られた断片が含まれ得る。中和抗体（すなわち二量体の形成を阻害する抗体）は通常、治療用に好適である。
【０２０２】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒトその他の種々の宿主が、ＴＭＰまたは任意の断片の注入、または免疫原性の特性を備えるそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）、ジニトロフェノールなどの界面活性剤とがある。ヒトに用いられるアジュバントの中では、ＢＣＧ（カルメット‐ゲラン杆菌）およびコリネバクテリウム‐パルヴム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）が特に好ましい。
【０２０３】
ＴＭＰに対する抗体を誘導するために用いるオリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、少なくとも約５のアミノ酸からなり、一般的には少なくとも約１０のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するものが好ましい。これらのオリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、天然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることが望ましい。ＴＭＰアミノ酸の短いストレッチは、ＫＬＨなどの別のタンパク質の配列と融合し、キメラ分子に対する抗体が産生され得る。
【０２０４】
ＴＭＰに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。限定するものではないがこのような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術がある（Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ． 他．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７、Ｋｏｚｂｏｒ， Ｄ． 他（１９８５）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１：３１−４２、Ｃｏｔｅ， Ｒ．Ｊ． 他（１９８３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：２０２６−２０３０、Ｃｏｌｅ， Ｓ．Ｐ． 他（１９８４）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６２：１０９−１２０などを参照）。
【０２０５】
更に、「キメラ抗体」作製のために発達した、ヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性および生物学的活性を備える分子を得るために用いられる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ．Ｌ．他（１９８４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６８５１６８５５、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｍ．Ｓ．他（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８、Ｔａｋｅｄａ， Ｓ．他（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４などを参照）。別法では、当分野で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、ＴＭＰ特異性一本鎖抗体を生成する。関連した特異性を有するがイディオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリンライブラリからチェーンシャッフリングによって産生することもできる（例えばＢｕｒｔｏｎ Ｄ．Ｒ．（１９９１）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：１０１３４−１０１３７を参照）。
【０２０６】
抗体類の産生は、リンパ球集団におけるｉｎ ｖｉｖｏ産生の誘導によって、あるいは免疫グロブリンライブラリ群のスクリーニングによって、または文献に開示されているような、高度に特異的な結合試薬のパネル群のスクリーニングによっても行い得る（例えばＯｒｌａｎｄｉ， Ｒ． 他（１９８９）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：３８３３−３８３７、Ｗｉｎｔｅｒ， Ｇ． 他（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９を参照）。
【０２０７】
ＴＭＰに対する特異的な結合部位を含む抗体断片も得ることができる。例えば、限定するものではないが、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作製されるＦ（ａｂ’）２ 断片と、Ｆ（ａｂ’）２ 断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製されるＦａｂ断片とがある。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性を持つモノクローナルＦａｂ断片を迅速且つ容易に同定することが可能となる（例えばＨｕｓｅ， Ｗ．Ｄ． 他 （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１を参照）。
【０２０８】
種々の免疫学的検定（イムノアッセイ）を用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体を同定することができる。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる免疫放射線アッセイまたは競合結合アッセイに対する数々のプロトコルは、本技術分野において公知である。このようなイムノアッセイは通常、ＴＭＰとその特異抗体との間の複合体形成の計測を含む。２つの非干渉性ＴＭＰエピトープに対して反応性を持つモノクローナル抗体を用いる、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合的結合アッセイも利用することができる（Ｐｏｕｎｄ、前出）。
【０２０９】
ラジオイムノアッセイ技術と共にＳｃａｔｃｈａｒｄ分析などの様々な方法を用いて、ＴＭＰに対する抗体の親和性を評価し得る。親和性を結合定数Ｋａで表すが、このＫａは、平衡状態下でのＴＭＰ−抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原とのモル濃度で除して得られる値である。ポリクローナル抗体類は多様なＴＭＰエピトープに対する親和性が不均一であり、或るポリクローナル抗体試薬に関して判定したＫａは、ＴＭＰ抗体群の平均親和性または結合活性を表す。或る特定ＴＭＰエピトープに単一特異的なモノクローナル抗体類の、試薬のＫａは、親和性の真の測定値を表す。Ｋａ値が１０９〜１０１２Ｌ／ｍｏｌの高親和性抗体試薬は、ＴＭＰ−抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ｋａ値が１０６〜１０７ｌｉｔｅｒ／ｍｏｌの低親和性抗体試薬は、ＴＭＰが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製（ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）および類似の処理に用いるのが好ましい（Ｃａｔｔｙ， Ｄ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｖｏｌｕｍｅ Ｉ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ； Ｌｉｄｄｅｌｌ， Ｊ． Ｅ． およびＡ． Ｃｒｙｅｒ（１９９１）Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）。
【０２１０】
ポリクローナル抗体試薬の抗体価および結合活性を更に評価して、後に使う或る適用例に対するこのような試薬の品質および適性を決定することができる。例えば、少なくとも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体を含むポリクローナル抗体医薬は一般に、ＴＭＰ−抗体複合体を沈殿させなければならない処理に用いられる。抗体の特異性、抗体価、結合活性、様々な適用例における抗体の品質や使用に対する指針については、一般に入手可能である（前出のＣａｔｔｙの文献、同Ｃｏｌｉｇａｎ 他の文献などを参照）。
【０２１１】
本発明の別の実施例では、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片や相補配列を、治療目的で使用することができる。ある実施態様では、ＴＭＰをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、または修飾したオリゴヌクレオチド）を設計して遺伝子発現を変更することができる。このような技術は当分野では周知であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはより大きな断片を、ＴＭＰをコードする配列の制御領域、またはコード領域に沿った、さまざまな位置から設計可能である（例えばＡｇｒａｗａｌ， Ｓ．， 編集 （１９９６） Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔａｗａ ＮＪを参照）。
【０２１２】
治療に用いる場合、アンチセンス配列を適切な標的細胞に導入するのに好適な、任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を作製する発現プラスミドの形で、細胞内に送達し得る（例えばＳｌａｔｅｒ， Ｊ．Ｅ． 他（１９９８）Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０２（３）：４６９−４７５ および Ｓｃａｎｌｏｎ， Ｋ．Ｊ． 他（１９９５）９（１３）：１２８８−１２９６を参照）。アンチセンス配列はまた、例えばレトロウイルスやアデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクターを用いて細胞内に導入することもできる（例えばＭｉｌｌｅｒ， Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｂｌｏｏｄ ７６：２７１、前出のＡｕｓｕｂｅｌ、Ｕｃｋｅｒｔ， Ｗ．およびＷ． Ｗａｌｔｈｅｒ（１９９４）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ． ６３（３）：３２３−３４７を参照）。その他の遺伝子送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープおよび当分野で公知のその他のシステムが含まれる（Ｒｏｓｓｉ， Ｊ．Ｊ．（１９９５）Ｂｒ． Ｍｅｄ． Ｂｕｌｌ． ５１（１）：２１７−２２５； Ｂｏａｄｏ、Ｒ．Ｊ．他（１９９８）Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ８７（１１）：１３０８−１３１５、Ｍｏｒｒｉｓ， Ｍ．Ｃ． 他（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（１４）：２７３０−２７３６などを参照）。
【０２１３】
本発明の別の実施例では、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドを、体細胞若しくは生殖細胞遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療を行うことにより、（ｉ）遺伝子欠損症（例えばＸ染色体連鎖遺伝（Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ， Ｍ．他 （２０００） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：６６９−６７２）により特徴付けられる重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）−Ｘ１の場合）、先天性アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症に関連する重症複合型免疫不全症候群（Ｂｌａｅｓｅ， Ｒ．Ｍ． 他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５−４８０、Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ， Ｃ．他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７０−４７５）、嚢胞性繊維症（Ｚａｂｎｅｒ， Ｊ．他 （１９９３） Ｃｅｌｌ ７５：２０７−２１６： Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｒ．Ｇ．他 （１９９５） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ ６：６４３−６６６、Ｃｒｙｓｔａｌ， Ｒ．Ｇ．他． （１９９５） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：６６７−７０３）、サラセミア（ｔｈａｌａｓｓａｍｉａ）、家族性高コレステロール血症、第ＶＩＩＩ因子若しくは第ＩＸ因子欠損に起因する血友病（Ｃｒｙｓｔａｌ， Ｒ．Ｇ． （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０、Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． および Ｓｏｍｉａ． Ｎ． （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９−２４２）を治療し、（ｉｉ）条件的致死性遺伝子産物を発現させ（例えば制御不能な細胞増殖に起因する癌の場合）、（ｉｉｉ）細胞内の寄生生物（例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｄ． （１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３５：３９５−３９６、Ｐｏｅｓｃｈｌａ， Ｅ．他 （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９３：１１３９５−１１３９９）などヒトレトロウイルス、Ｂ型若しくはＣ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ、ＨＣＶ）、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓおよびＰａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ等の寄生真菌、並びに熱帯熱マラリア原虫およびクルーズトリパノソーマ等の寄生原虫に対する防御機能を有するタンパク質を発現させることができる。ＴＭＰの発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が疾患を引き起こす場合、導入した細胞の好適な集団からＴＭＰを発現させて、遺伝子欠損によって起こる症状の発現を緩和することが可能である。
【０２１４】
本発明の更なる実施例では、ＴＭＰの欠損による疾患や異常症を、ＴＭＰをコードする哺乳動物発現ベクターを作製して、これらのベクターを機械的手段によってＴＭＰ欠損細胞に導入することによって治療する。ｉｎ ｖｉｖｏあるいはｅｘ ｖｉｔｒｏの細胞に用いる機械的導入技術には、（ｉ）個々の細胞内への直接的なＤＮＡ微量注射法、（ｉｉ）遺伝子銃、（ｉｉｉ）リポソームを介した形質移入、（ｉｖ）受容体を介した遺伝子導入、および（ｖ）ＤＮＡトランスポゾンの使用がある（Ｍｏｒｇａｎ， Ｒ．Ａ． および Ｗ．Ｆ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９３）Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６２：１９１−２１７、Ｉｖｉｃｓ， Ｚ．（１９９７）Ｃｅｌｌ ９１：５０１−５１０； Ｂｏｕｌａｙ， Ｊ−Ｌ． およびＨ． Ｒｅｃｉｐｏｎ（１９９８）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：４４５−４５０）。
【０２１５】
ＴＭＰの発現に影響を及ぼし得る発現ベクターには、限定するものではないが、ＰＣＤＮＡ ３．１、ＥＰＩＴＡＧ、ＰＲＣＣＭＶ２、ＰＲＥＰ、ＰＶＡＸ、ＰＣＲ２−ＴＯＰＯＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）、ＰＣＭＶ−ＳＣＲＩＰＴ、ＰＣＭＶ−ＴＡＧ、ＰＥＧＳＨ／ＰＥＲＶ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）、ＰＴＥＴ−ＯＦＦ、ＰＴＥＴ−ＯＮ、ＰＴＲＥ２、ＰＴＲＥ２−ＬＵＣ、ＰＴＫ−ＨＹＧ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）が含まれる。ＴＭＰを発現させるために、（ｉ）構成的に活性なプロモーター（その由来は例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ＳＶ４０ウイルス、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、若しくはβ−アクチンの遺伝子等）、（ｉｉ）誘導性プロモーター（例えば、市販のＴ−ＲＥＸプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に含まれるテトラサイクリン調節性プロモーター（Ｇｏｓｓｅｎ， Ｍ． および Ｈ． Ｂｕｊａｒｄ （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９：５５４７−５５５１； Ｇｏｓｓｅｎ， Ｍ． 他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１７６６−１７６９； Ｒｏｓｓｉ， Ｆ．Ｍ．Ｖ． および Ｈ．Ｍ． Ｂｌａｕ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：４５１−４５６））、エクジソン誘導性プロモーター（市販のプラスミドＰＶＧＲＸＲおよびＰＩＮＤに含まれる；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＦＫ５０６／ラパマイシン誘導性プロモーター、またはＲＵ４８６／ミフェプリストーン誘導性プロモーター（Ｒｏｓｓｉ， Ｆ．Ｍ．Ｖ． および Ｈ．Ｍ． Ｂｌａｕ， 前出）、または（ｉｉｉ）正常な個体に由来する、ＴＭＰをコードする内在性遺伝子の天然プロモーター、若しくは組織特異的プロモーターを用いることが可能である。
【０２１６】
市販のリポソーム形質転換キット（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＰｅｒＦｅｃｔ Ｌｉｐｉｄ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いれば、当業者は実験の各パラメータを最適化する努力をさほど要さず、ポリヌクレオチド群を、培養中の標的細胞群に送達し得る。別法では、リン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍ． Ｆ．Ｌ． および Ａ．Ｊ． Ｅｂ（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６−４６７）若しくは電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ， Ｂ． 他（１９８２）ＥＭＢＯ Ｊ． １：８４１−８４５）を用いて形質転換を行う。初代培養細胞にＤＮＡを導入するためには、標準化された哺乳動物の形質移入プロトコルの修正が必要である。
【０２１７】
本発明の別の実施例では、ＴＭＰの発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や障害を、（ｉ）レトロウイルス長末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター若しくは或る独立プロモーターのコントロール下でＴＭＰをコードするポリヌクレオチドと、（ｉｉ）好適なＲＮＡパッケージングシグナル群と、（ｉｉｉ）追加のレトロウイルス・シス作用性ＲＮＡ配列と、効率的なベクター増殖に必要なコーディング配列とを伴うＲｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）と、からなるレトロウイルスベクターを作製して治療することができる。レトロウイルスベクター（例えばＰＦＢおよびＰＦＢＮＥＯ）はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社から市販されており、刊行データ（Ｒｉｖｉｅｒｅ， Ｉ． 他（１９９５）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：６７３３−６７３７）に基づく。上記データを引用することを以て本明細書の一部とする。このベクターは、好適なベクター産生細胞株（ＶＰＣＬ）において増殖される。ＶＰＣＬは、各標的細胞上の受容体への親和性を持つエンベロープ遺伝子を、またはＶＳＶｇなど汎親和性エンベロープタンパク質を発現する（Ａｒｍｅｎｔａｎｏ， Ｄ． 他 （１９８７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１：１６４７−１６５０、Ｂｅｎｄｅｒ， Ｍ．Ａ． 他 （１９８７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１：１６３９−１６４６、Ａｄａｍ， Ｍ．Ａ． および Ａ．Ｄ． Ｍｉｌｌｅｒ （１９８８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２：３８０２−３８０６、Ｄｕｌｌ， Ｔ． 他 （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：８４６３−８４７１、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ， Ｒ． 他 （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：９８７３−９８８０）。Ｒｉｇｇに付与された米国特許第５，９１０，４３４号（「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｈｉｇｈ ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ」）において、レトロウイルスパッケージング細胞株群を得る方法が開示されており、引用を以て本明細書の一部とする。レトロウイルスベクター類の増殖や、細胞集団（例えばＣＤ４＋Ｔ細胞群）の形質導入、および形質導入した細胞群の患者への戻しは、遺伝子治療の分野では当業者に周知の手法であり、多数の文献に記載されている（Ｒａｎｇａ， Ｕ． 他（１９９７）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：７０２０−７０２９、Ｂａｕｅｒ， Ｇ． 他（１９９７）Ｂｌｏｏｄ ８９：２２５９−２２６７、Ｂｏｎｙｈａｄｉ， Ｍ．Ｌ．（１９９７）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：４７０７−４７１６、Ｒａｎｇａ， Ｕ． 他（１９９８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５：１２０１−１２０６、Ｓｕ， Ｌ．（１９９７）Ｂｌｏｏｄ ８９：２２８３−２２９０）。
【０２１８】
別法では、アデノウイルス系遺伝子治療の或る送達系を用いて、ＴＭＰの発現に関連する１つ以上の遺伝子異常を有する細胞群に、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチド群を送達する。アデノウイルス系ベクター類の作製およびパッケージングについては、当業者に周知である。複製不全型アデノウイルスベクター類は、種々の免疫調節タンパク質をコードする遺伝子群を、無損傷の膵島内にインポートする目的で多様に利用し得ることが証明された（Ｃｓｅｔｅ， Ｍ．Ｅ． 他 （１９９５） Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２７：２６３−２６８）。潜在的に有用なアデノウイルスベクター類はＡｒｍｅｎｔａｎｏに付与された米国特許第５，７０７，６１８号（「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ」）に記載されており、引用することを以て本明細書の一部とする。アデノウイルスベクター類については、Ａｎｔｉｎｏｚｚｉ， Ｐ．Ａ． 他 （１９９９） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｎｕｔｒ． １９：５１１−５４４ 並びに、Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． および Ｎ． Ｓｏｍｉａ （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ １８：３８９：２３９−２４２も参照されたい。両文献は、引用を以て本明細書の一部とする。
【０２１９】
別法では、ヘルペス系遺伝子治療の送達系を用いて、ＴＭＰの発現に関連する１つ或いは複数の遺伝子異常を有する標的細胞に、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドを送達する。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）系のベクターは、ＨＳＶ親和性の中枢神経細胞にＴＭＰを導入する際に特に有用である。ヘルペス系ベクター類の作製およびパッケージングは、当業者に公知である。或る複製適格性単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）Ｉ型系のベクターが、或るレポーター遺伝子の、霊長類の眼への送達に用いられている（Ｌｉｕ， Ｘ． 他 （１９９９） Ｅｘｐ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ．１６９：３８５−３９５）。ＨＳＶ−１ウイルスベクターの作製についても、ＤｅＬｕｃａに付与された米国特許第５，８０４，４１３号（「Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ」）に詳細に開示されており、該特許の引用を以て本明細書の一部とする。米国特許第５，８０４，４１３号は、ヒト遺伝子治療などの目的で、好適なプロモーターの制御下において細胞に導入される少なくとも１つの外来遺伝子を有するゲノムを持つ、組換えＨＳＶ ｄ９２の利用について記載する。上記特許はまた、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、およびＩＣＰ２２を欠失した組換えＨＳＶ系統の、作製および使用について開示している。ＨＳＶベクター類については、Ｇｏｉｎｓ， Ｗ．Ｆ． 他 （１９９９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３：５１９−５３２ および Ｘｕ， Ｈ． 他 （１９９４） Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １６３：１５２−１６１も参照されたい。両文献は、引用を以て本明細書の一部とする。クローン化したヘルペスウイルス配列群の操作、大ヘルペスウイルスゲノム（ｌａｒｇｅ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅｓ）の様々なセグメントを持つ複数のプラスミドを形質移入した後の組換えウイルスの産生、ヘルペスウイルスの成長および増殖、並びに細胞群へのヘルペスウイルスの感染は、当業者に公知の技術である。
【０２２０】
別法では、或るαウイルス（正の一本鎖ＲＮＡウイルス）ベクターを用いて、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチド群を標的細胞群に送達する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）の生物学的研究が広範に行われており、遺伝子導入ベクター類は、ＳＦＶゲノムに基づく（Ｇａｒｏｆｆ， Ｈ． および Ｋ．−Ｊ． Ｌｉ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：４６４−４６９）。αウイルスＲＮＡの複製中に、ウイルスのキャプシッドタンパク質群を通常はコードする、サブゲノムＲＮＡが産生される。このサブゲノムＲＮＡは、完全長ゲノムＲＮＡよりも高レベルに複製するので、酵素活性（例えばプロテアーゼおよびポリメラーゼ）を持つウイルスタンパク質に比べてキャプシッドタンパク質群が過剰産生される。同様に、ＴＭＰをコードする配列をαウイルスゲノムのキャプシッドをコードする領域に導入することによって、ベクター導入細胞において多数のＴＭＰをコードするＲＮＡが産生され、高いレベルでＴＭＰが合成される。通常、αウイルスの感染は、数日以内の細胞溶解を伴う。一方、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）の或る変異体を有するハムスター正常腎臓細胞（ＢＨＫ−２１）群が持続的な感染を確立する能力は、αウイルス類の溶解複製を、遺伝子治療に応用し得るように好適に改変可能であることを示唆する（Ｄｒｙｇａ， Ｓ．Ａ． 他 （１９９７） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２８：７４−８３）。様々な宿主にαウイルスを導入できることから、様々なタイプの細胞にＴＭＰを導入することできる。或る集団における或るサブセットの細胞群の特異的形質導入は、形質導入前に細胞の選別を必要とし得る。αウイルスの感染性ｃＤＮＡクローンの処置方法、αウイルスのｃＤＮＡおよびＲＮＡの形質移入方法およびαウイルスの感染方法は、当業者に公知である。
【０２２１】
転写開始部位由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも可能である。転写開始部位とは、例えば開始部位から数えて約−１０と約＋１０との間である。同様に、三重螺旋塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三重螺旋塩基対形成は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために十分に開く、二重螺旋の能力を阻害するので有用である。三重螺旋ＤＮＡを用いる最近の治療の進歩については文献に記載がある（Ｇｅｅ， Ｊ．Ｅ． 他（１９９４）ｉｎ Ｈｕｂｅｒ， Ｂ．Ｅ．およびＢ．Ｉ． Ｃａｒｒ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ， Ｆｕｔｕｒａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｍｔ． Ｋｉｓｃｏ， ＮＹ， １６３−１７７ページなどを参照）。相補配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってｍＲＮＡの翻訳をブロックすべく設計し得る。
【０２２２】
リボザイム類は、酵素性ＲＮＡ分子である。ＲＮＡの特異的切断を触媒するためにリボザイムを用い得る。リボザイム作用のメカニズムは、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションと、その後に起こる内ヌクレオチド鎖切断に関与している。例えば、人工的に作製されたハンマーヘッド型リボザイム分子が、ＴＭＰをコードする配列の、内ヌクレオチド鎖分解性の切断を特異的且つ効果的に触媒できる可能性がある。
【０２２３】
任意の潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、ＧＵＡ、ＧＵＵ、ＧＵＣ配列などリボザイム切断部位に対して標的分子をスキャンすることによって先ず同定される。一度同定されると、切断部位を持つ標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列が、そのオリゴヌクレオチドを機能不全にするような２次構造の特徴をもっていないかを評価することが可能になる。候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのアクセス可能性をテストすることによって行うことができる。
【０２２４】
本発明の相補リボ核酸分子およびリボザイムは、核酸分子合成のために当分野でよく知られている任意の方法を用いて作製し得る。作製方法には、固相ホスホラミダイト化学合成など、オリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。或いは、ＴＭＰをコードするＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ転写によってＲＮＡ分子を産出し得る。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７やＳＰ６などの好適なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを用いて多様なベクター内に組み込むことが可能である。あるいは、相補的ＲＮＡを構成的あるいは誘導的に合成するこれらのｃＤＮＡ構成物を、細胞株、細胞または組織内に導入することができる。
【０２２５】
細胞内の安定性を高め、半減期を長くするためにＲＮＡ分子を修飾し得る。限定するものではないが可能な修飾には、分子の５’末端、３’末端、あるいはその両方において隣接配列群を追加したり、分子の主鎖内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネートまたは２’ Ｏ−メチルを使用したりすることが含まれる。この概念は、本来はＰＮＡ群の産出におけるものであるが、これら全ての分子に拡大することができる。そのためには、内在性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されない、アデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンにアセチル−、メチル−、チオ−および同様の修飾をしたものや、非従来型塩基、例えばイノシン、クエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、ワイブトシン（ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ）を加える。
【０２２６】
本発明の更なる実施例には、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドの発現の改変に有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。限定するものではないが、特異ポリヌクレオチドの発現改変を起こすのに有効であり得る化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重螺旋形成オリゴヌクレオチド、転写因子その他のポリペプチド転写制御因子、および、特定ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る非高分子化学的実体がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビターまたはエンハンサーのいずれかとして作用することにより、ポリヌクレオチド発現を改変し得る。従って、ＴＭＰの発現または活性の増加に関連する疾患の治療においては、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、ＴＭＰの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
【０２２７】
或る特定ポリヌクレオチドの発現を改変する際の有効性に対して、少なくとも１個または複数個の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物は、当分野で広く知られている任意の方法により得られる。このような方法には、ポリヌクレオチドの発現を改変する場合と、既存の、商用または専用の、天然または非天然の化合物のライブラリから選択する場合と、標的ポリヌクレオチドの化学的および／または構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインする場合と、組合せ的にまたは無作為に生成した化合物のライブラリから選択する場合と、に有効であることが知られる化合物の化学修飾がある。ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドを有するサンプルを、このようにして得た試験化合物の少なくとも１つに曝露する。サンプルは例えば、無傷細胞、透過化処理した細胞、ｉｎ ｖｉｔｒｏ無細胞系すなわち再構成生化学系があり得る。ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドの発現における改変は、当分野で周知の任意の方法でアッセイする。通常は、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、特定のヌクレオチドの発現を検出する。ハイブリダイゼーション量を定量することも可能であり、それにより、１つ若しくは複数の試験化合物に曝露される、または曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較のための基礎を形成し得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化の検出は、ポリヌクレオチドの発現を改変する際に試験化合物が有効であることを示す。或る特定ポリヌクレオチドの改変発現に有効な化合物に対して、例えば分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）遺伝子発現系（Ａｔｋｉｎｓ， Ｄ． 他 （１９９９） 米国特許第５，９３２，４３５号、Ａｒｎｄｔ， Ｇ．Ｍ． 他 （２０００） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８：Ｅ１５）、またはＨｅＬａ細胞等のヒト細胞株（Ｃｌａｒｋｅ， Ｍ．Ｌ． 他 （２０００） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２６８：８−１３）を用いてスクリーニングを実行できる。本発明の或る特定の実施例は、或る特定ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性について、オリゴヌクレオチド類（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾したオリゴヌクレオチド）の組み合わせライブラリをスクリーニングする過程に関する（Ｂｒｕｉｃｅ， Ｔ．Ｗ． 他 （１９９７） 米国特許第５，６８６，２４２号、Ｂｒｕｉｃｅ， Ｔ．Ｗ． 他 （２０００） 米国特許第６，０２２，６９１号）。
【０２２８】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｅｘ ｖｉｖｏの使用に対して同程度に適している。ｅｘ ｖｉｖｏ治療の場合、ベクターを、患者から採取した幹細胞内に導入し、クローニング増殖して同患者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクションによる、またはリボソーム注入やポリカチオンアミノポリマーによる送達は、当分野でよく知られている方法を用いて実行することができる（Ｇｏｌｄｍａｎ， Ｃ．Ｋ． 他（１９９７）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５：４６２−４６６などを参照）。
【０２２９】
上記の治療方法はいずれも、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サルなどの哺乳動物を含めて治療が必要な全ての対象に適用できる。
【０２３０】
本発明の或る更なる実施例は、薬剤として許容できる賦形剤と共に処方される活性成分を一般に持つ、或る組成物の投与に関する。賦形剤には例えば、糖、でんぷん、セルロース、ゴムおよびタンパク質がある。様々な処方が広く知られており、詳細はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）の最新版に記載されている。このような組成物は、ＴＭＰ、ＴＭＰの抗体、擬態物質、アゴニスト、アンタゴニスト、またはＴＭＰのインヒビターなどからなる。
【０２３１】
本発明に用いる組成物は、任意の数の経路によって投与することができ、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸がある。
【０２３２】
肺から投与する組成物は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このような組成物は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば伝統的な低分子量有機薬）の場合には、速効製剤のエアロゾル送達は当分野で公知である。高分子（例えばより大きなペプチドおよびタンパク質）の場合には、当該分野において肺胞領域を介しての肺送達が最近向上したことにより、インスリンなどの薬剤を実質的に血液循環へ輸送することを可能にした（Ｐａｔｔｏｎ， Ｊ．Ｓ． 他， 米国特許第５，９９７，８４８号などを参照）。肺送達は、針注射なしに投与する点で優れており、有毒な可能性のある浸透エンハンサーの必要性をなくす。
【０２３３】
本発明での使用に適した組成物には、所定の目的を達成するために必要なだけの量の活性成分を含有する組成物が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行う。
【０２３４】
ＴＭＰまたはその断片を含む高分子を直接細胞内に輸送するべく、特殊な形態に組成物が調製されるのが好ましい。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソーム製剤は、その高分子の細胞融合と細胞内送達とを促進し得る。別法では、ＴＭＰまたはその断片を、ＨＩＶ Ｔａｔ−１タンパク質の陽イオンＮ末端部に結合することもできる。このようにして生成された融合タンパク質類は、或るマウスモデル系の、脳を含む全ての組織の細胞群に形質導入することがわかっている（Ｓｃｈｗａｒｚｅ， Ｓ．Ｒ． 他 （１９９９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１５６９−１５７２）。
【０２３５】
任意の化合物に対して、先ず細胞培養アッセイ、例えば新生物性細胞の細胞培養アッセイにおいて、あるいは、動物モデル、例えばマウス、ウサギ、イヌまたはブタなどにおいて、治療の有効投与量を推定することができる。動物モデルはまた、好適な濃度範囲および投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を用いて、次にヒトに対する有益な投与量および投与経路を決定することができる。
【０２３６】
医学的に効果的な薬用量とは、症状や容態を回復させる、たとえばＴＭＰまたはその断片、ＴＭＰの抗体、ＴＭＰのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなど活性処方成分の量を指す。薬用有効度および毒性は、細胞培養または動物実験における標準的な薬学手法によって、例えばＥＤ５０（集団の５０％の医薬的有効量）またはＬＤ５０（集団の５０％の致死量）を測定するなどして決定することができる。毒性効果の、治療効果に対する投与量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療指数を示すような組成物が望ましい。細胞培養アッセイと動物実験とから得られたデータは、ヒトに用いる投与量の範囲での調剤に用いられる。このような組成物に含まれる投与量は、毒性を殆どあるいは全く含まず、ＥＤ５０を含むような血中濃度の範囲にあることが好ましい。用いられる投与形態、患者の感受性および投与の経路によって、投与量はこの範囲内で様々に変わる。
【０２３７】
正確な投与量は、治療が必要な被験者に関する要素を考慮して、現場の医者が決定することになる。充分なレベルの活性成分を与え、あるいは所望の効果を維持すべく、用法および用量を調整する。被験者に関する要素としては、疾患の重症度、患者の一般的な健康状態、患者の年齢、体重および性別、投与の時間および頻度、薬剤の配合、反応感受性および治療に対する応答などを考慮し得る。作用期間が長い組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス率によって３〜４日毎に１度、１週間に１度、あるいは２週間に１度の間隔で投与し得る。
【０２３８】
通常の投与量は、投与の経路にもよるが約０．１〜１００，０００μｇであり、合計で約１ｇまでとする。特定の投与量および送達方法に関するガイダンスは文献に記載されており、現場の医者は通常それを利用することができる。当業者は、タンパク質またはそれらのインヒビター類についての処方とは異なる、ヌクレオチドについての処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、症状、部位などに特異的なものとなる。
【０２３９】
（診断）
別の実施例では、ＴＭＰに特異的に結合する抗体を、ＴＭＰの発現によって特徴付けられる障害の診断に、または、ＴＭＰやＴＭＰのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用い得る。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方法と同じ方法で調製される。ＴＭＰの診断アッセイには、ヒトの体液から、あるいは細胞や組織の抽出物から、抗体および標識を用いてＴＭＰを検出する方法が含まれる。この抗体は修飾されたものもされていないものも可能であり、レポーター分子との共有結合または非共有結合で標識化できる。レポーター分子としては広くさまざまな種類が本分野で知られており、また使用可能で、そのうちのいくつかは上記で説明されている。
【０２４０】
ＴＭＰを測定するためのＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ，およびＦＡＣＳなど、種々のプロトコルは、当分野では周知であり、変容した或いは異常なレベルのＴＭＰの発現を診断するための基礎を提供する。正常あるいは標準的なＴＭＰの発現の値は、複合体の形成に適した条件下で、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験者から採取した体液または細胞抽出物と、ＴＭＰに対する抗体とを混合することによって確定する。標準複合体形成量は、種々の方法、例えば測光法で定量できる。被験者、対照、および、生検組織からの疾患サンプルでの、ＴＭＰの発現の量を標準値と比較する。標準値と被験者の値との偏差が、疾患を診断するパラメータを確定する。
【０２４１】
本発明の別の実施態様によれば、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドを診断のために用いることもできる。用い得るポリヌクレオチドの例には、オリゴヌクレオチド配列、相補的ＲＮＡおよびＤＮＡ分子、そしてＰＮＡが含まれる。これらのポリヌクレオチドを用いて、ＴＭＰの発現が疾患と相関し得る生検組織における遺伝子発現を検出し定量し得る。この診断アッセイを用いて、ＴＭＰの存在の有無、更には過剰な発現を判定し、治療時のＴＭＰレベルの調節を監視する。
【０２４２】
或る実施形態では、ＴＭＰまたは近縁の分子をコードする、ゲノム配列などポリヌクレオチド配列を検出可能なＰＣＲプローブ類とのハイブリダイゼーションを、ＴＭＰをコードする核酸配列を同定するために用いることができる。例えば５’調節領域など高度に特異的な領域か、それとも例えば保存されたモチーフなどやや特異性の低い領域から作られているかという、プローブの特異性と、ハイブリダイゼーション或いは増幅のストリンジェンシーとにより、プローブが、ＴＭＰをコードする天然配列のみを同定するのか、或いは対立遺伝子変異体や関連配列を同定するかが決まる。
【０２４３】
プローブはまた、関連する配列の検出に利用でき、また、ＴＭＰをコードする任意の配列との少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。目的の本発明のハイブリダイゼーションプローブにはＤＮＡあるいはＲＮＡが可能であり、プローブはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４の配列、或いはＴＭＰ遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【０２４４】
ＴＭＰをコードするＤＮＡに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの作製方法には、ＴＭＰをコードまたはＴＭＰ誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をｍＲＮＡプローブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある。ｍＲＮＡプローブ作製用ベクター類は、当業者に知られており、市販されており、好適なＲＮＡポリメラーゼと好適な標識されたヌクレオチドとを加えることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するために用い得る。ハイブリダイゼーションプローブ類は、種々のレポーターの集団によって標識され得る。レポーター集団の例としては、３２Ｐまたは３５Ｓなどの放射性核種が、あるいはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼなど酵素標識が挙げられる。
【０２４５】
ＴＭＰをコードするポリヌクレオチド配列は、ＴＭＰの発現に関係する疾患の診断の為に用い得る。限定するものではないがこのような疾患の例としては、生殖障害として、プロラクチン産生の障害、不妊（例えば卵管疾患、排卵不良、子宮内膜症、性周期の途絶、月経周期の途絶、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過剰刺激症候群、子宮内膜腫瘍や卵巣腫瘍、子宮筋腫、自己免疫障害、異所性妊娠、奇形発生、乳癌、乳房線維嚢胞病、乳漏症、精子形成の途絶、異常精子生理、精巣癌、前立腺癌、良性前立腺肥大、前立腺炎、ペーロニー病、インポテンス、男性乳癌、女性化乳房、高ゴナドトロピン性腺機能低下症、低ゴナドトロピン性腺機能低下症、仮性半陰陽、無精子症、早発卵巣不全、アクロシン欠損症、晩発思春期、逆行性射精、無射精、血管芽腫、嚢胞・クロム親和細胞腫（ｃｙｓｔｓｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａｓ）、傍神経節腫、精巣上体の嚢胞腺腫、および内リンパ嚢腫瘍）が、発達障害として、尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ／ベッカー筋ジストロフィー、癲癇、性腺発育障害、ＷＡＧＲ症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神遅滞）、スミス・マジェニス症候群、骨髄異形成症候群、遺伝性粘液上皮異形成、遺伝性角皮症、遺伝性ニューロパシー（例えばシャルコー・マリー・トゥース病および神経線維腫症）、甲状腺機能低下症、水頭症、発作障害（例えばシデナム舞踏病と脳性麻痺）二分脊椎、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感音難聴が含まれ、また心血管障害も含まれ、その中には動静脈瘻、アテローム性動脈硬化症、高血圧、脈管炎、レイノー病、動脈瘤、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈炎および静脈血栓、血管系腫瘍、血栓溶解の合併症、バルーン血管形成術、血管置換術、冠動脈バイパス移植、うっ血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性２尖大動脈弁、僧帽弁輪部石灰化、僧帽弁逸脱、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性紅斑性狼瘡の心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、心臓移植の合併症、先天性肺異常、肺拡張不全、肺うっ血および肺水腫、肺動脈塞栓症、肺出血、肺梗塞、肺高血圧症、血管硬化症、閉塞性肺疾患、拘束性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、慢性気管支炎、気管支喘息、気管支拡張症、細菌性肺炎、ウイルス性肺炎およびマイコプラズマ肺炎、肺膿瘍、肺結核、びまん性間質性疾患、塵肺症、サルコイド症、特発性肺線維症、剥離性間質性肺炎、過敏性肺炎、肺好酸球増加、閉塞性細気管支炎―器質化肺炎（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｉｔｉｓ ｏｂｌｉｔｅｒａｎｓ−ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、びまん性肺出血症候群、グッドパスチャー症候群、特発性肺血鉄症、膠原血管病併発性肺疾患、肺胞タンパク症、肺腫瘍、炎症性および非炎症性胸水、気胸症、胸膜腫瘍、薬物性肺疾患、放射線による肺疾患、および肺移植の合併症などが含まれる。神経障害として、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、脳腫瘍、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキンソン病そ���他の錐体外路障害、筋萎縮性側索硬化その他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、網膜色素変性症（色素性網膜炎）、遺伝性運動失調、多発性硬化症その他の脱髄疾患、細菌性およびウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下膿瘍、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎および神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病およびゲルストマン‐シュトロイスラー‐シャインカー症候群を含むプリオン病と、致死性家族性不眠症、神経系の栄養病および代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜性血管腫症（ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｒｅｔｉｎａｌ ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａｔｏｓｉｓ）、脳３叉神経血管症候群、精神遅滞、ダウン症候群を含むその他の中枢神経系発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄病、筋ジストロフィーその他の神経筋疾患、末梢神経疾患、皮膚筋炎および多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性および中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分障害、不安障害および統合失調症（精神分裂病）を含む精神障害と、季節性感情障害（ＳＡＤ）と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、遅発性ジスキネジア、ジストニー、パラノイド精神病、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病、進行性核上麻痺、皮質基底核変性症、家族性前頭側頭痴呆が含まれ、また胃腸障害も含まれ、その中には嚥下障害、消化性食道炎、食道痙攣、食道狭窄、食道癌、消化不良、消化障害、胃炎、胃癌、食欲不振、悪心、嘔吐、胃不全麻痺、洞または幽門の浮腫、腹部アンギナ、胸焼け、胃腸炎、イレウス、腸管感染、消化性潰瘍、胆石症、胆嚢炎、胆汁うっ滞、膵臓炎、膵臓癌、胆道疾患、肝炎、高ビリルビン血症、硬変症、肝臓の受動的うっ血、ヘパトーム、感染性大腸炎、潰瘍性大腸炎、潰瘍性直腸炎、クローン病、ホウィップル病、マロリー‐ワイス症候群、結腸癌、結腸閉塞、過敏性腸症候群、短小腸症候群、下痢、便秘、胃腸出血、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）腸症、黄疸、肝性脳症、肝腎症候群、脂肪肝、血色素症、ウィルソン病、α１アンチトリプシン欠損症、ライ症候群、原発性硬化性胆管炎、肝梗塞、門脈循環閉塞および血栓、小葉中心壊死、肝臓紫斑病、肝静脈血栓、肝静脈閉塞症、子癇前症、子癇、妊娠性急性脂肪肝、妊娠性肝臓内胆汁うっ滞と、結節性過形成および腺腫、癌腫を含む肝癌が含まれ、脂質代謝障害として、脂肪肝、胆汁うっ滞、原発性胆汁性肝硬変、カルニチン欠乏症、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ欠乏症、ミオアデニル酸デアミナーゼ欠損症、高トリグリセリド血症と、ファブリー病などの脂質貯蔵病、ゴーシェ病、ニーマン‐ピック病、異染性白質ジストロフィー、副腎白質ジストロフィー、ＧＭ２ガングリオシド蓄積症、セロイドリポフスチン症、無β‐リポ蛋白血症、タンジアー病、高リポ蛋白血症、糖尿病、脂肪異栄養症、脂肪腫症、急性皮下脂肪組織炎、播種性脂肪壊死、有痛脂肪症、リポイド副腎過形成、微小変化型ネフローゼ、脂肪腫、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症を伴った高コレステロール血症、原発性低αリポ蛋白血症、甲状腺機能低下症、腎疾患、肝疾患、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ欠損症、脳腱黄色腫症、シトステロール血症、低コレステロール血症、テイ‐サックス病、サンドホフ病、高脂血症、高脂質血症、脂質筋障害、肥満症が、細胞増殖障害として、光線性角化症、動脈硬化症、アテローム性硬化症、滑液包炎、硬変、肝炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症と、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌を含む癌、具体的には副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌等が含まれ、また自己免疫／炎症疾患も含まれ、その中には後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィー（ＡＰＥＣＥＤ）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球傷害因子性偶発性リンパ球減少症（ｅｐｉｓｏｄｉｃ ｌｙｍｐｈｏｐｅｎｉａ ｗｉｔｈ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｏｔｏｘｉｎｓ）、新生児溶血性疾患（胎児赤芽球症）、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜の炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性紅斑性狼瘡、全身性強皮症（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌の合併症、血液透析、体外循環、ウイルス性感染症、細菌性感染症、真菌性感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症および外傷が含まれる。ＴＭＰをコードするポリヌクレオチド配列は、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術、ＰＣＲ法、ディップスティック（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）、ピン（ｐｉｎ）、およびマルチフォーマットのＥＬＩＳＡ式アッセイ、および、変容したＴＭＰ発現を検出するために患者から採取した体液或いは組織を利用するマイクロアレイに使用可能である。このような定性方法または定量方法は、当分野で公知である。
【０２４６】
或る特定の形態では、関連する疾患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて、ＴＭＰをコードするヌクレオチド配列が有用であり得る。ＴＭＰをコードするヌクレオチド配列を、標準的な方法で標識化し、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件の下、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加えることができる。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が、対照サンプルと較べて著しく変化した場合は、サンプル内のＴＭＰをコードするヌクレオチド配列の変異レベルにより、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を推定するため、あるいは個々の患者の治療をモニターするために用いることもできる。
【０２４７】
ＴＭＰの発現に関連する疾患の診断の基準を提供するために、発現の正常すなわち標準的なプロフィールが確立される。これは、ハイブリダイゼーションあるいは増幅に好適な条件の下、動物あるいはヒトのいずれかの正常な被験者から抽出された体液あるいは細胞と、ＴＭＰをコードする配列あるいはその断片とを混合することにより達成され得る。実質的に精製されたポリヌクレオチドを既知量で用いて行った実験から得た値を正常な対象から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量することができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサンプルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０２４８】
疾患の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返し得る。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。
【０２４９】
癌に関しては、個体からの生体組織における異常な量の転写物（過少発現または過剰発現）の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床的症状が現れる前に疾患を検出する方法を提供し得る。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法または積極的な治療法を早くから利用し、それによって癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。
【０２５０】
ＴＭＰをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への利用には、ＰＣＲの利用が含まれ得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素により生産するか、あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏで産出し得る。オリゴマーは、好ましくはＴＭＰをコードするポリヌクレオチドの断片を、或いはＴＭＰをコードするポリヌクレオチドに対し相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件下で、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェンシー条件下で、近縁のＤＮＡあるいはＲＮＡ配列の検出、定量、あるいはその両方のため用いることが可能である。
【０２５１】
或る特定の態様においては、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて一塩基多型（ＳＮＰ）を検出し得る。ＳＮＰは、多くの場合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿入および欠失である。限定するものではないがＳＮＰの検出方法には、ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）および蛍光ＳＳＣＰ（ｆＳＳＣＰ）がある。ＳＳＣＰでは、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーと、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）とを用いたＤＮＡの増幅を行う。ＤＮＡは例えば、病変組織または正常組織、生検サンプル、体液その他に由来し得る。ＤＮＡ内のＳＮＰは、一本鎖形のＰＣＲ産物の２次および３次構造に差異を生じさせる。差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。ｆＳＣＣＰでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光性に標識する。それによってＤＮＡシークエンシング機などの高処理機器でアンプリマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）の検出が可能になる。更に、インシリコＳＮＰ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ＳＮＰ， ｉｓＳＮＰ）と呼ばれる配列データベース分析法は、一般的なコンセンサス配列に配列されるような個々の重畳するＤＮＡ断片の配列を比較することにより、多型性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、ＤＮＡの実験室での調製に、または統計モデルとＤＮＡ配列クロマトグラムの自動分析とを用いたシークエンシングのエラーに起因する配列変異を、フィルタリングして除去する。別の態様では、例えば高処理ＭＡＳＳＡＲＲＡＹシステム（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を用いた質量分析によりＳＮＰを検出し、特徴付ける。
【０２５２】
ＴＭＰの発現を定量するために用い得る方法には、ヌクレオチドの放射標識またはビオチン標識、対照核酸の共増幅（ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、および標準曲線から得た結果の補間もある（例えば、Ｍｅｌｂｙ， Ｐ．Ｃ．他（１９９３）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １５９：２３５−２４４； Ｄｕｐｌａａ， Ｃ．他（１９９３）Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１２：２２９−２３６を参照）。複数サンプルの定量速度を加速するには、目的のオリゴマーまたはポリヌクレオチドを種々の希釈液中に置き、分光光度法または比色反応によって定量が迅速になるような高処理フォーマットでのアッセイを行い得る。
【０２５３】
更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列に由来するオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、マイクロアレイにおけるエレメントとして用いることができる。多数の遺伝子の相対発現レベルを同時にモニターする転写イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。これについては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異および多型性の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行／後退をモニターし、疾病治療における薬剤の活性を開発およびモニターすることができる。特に、患者にとって最適且つ有効な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロフィールを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロフィールに基づき、患者に対して高度に効果的で副作用を殆ど示さない治療薬を選択することができる。
【０２５４】
別の実施例では、ＴＭＰ、ＴＭＰの断片、ＴＭＰに特異的な抗体を、マイクロアレイ上のエレメントとして用いることができる。マイクロアレイを用いて、上記のようなタンパク質−タンパク質相互作用、薬剤−標的相互作用および遺伝子発現プロフィールをモニターまたは測定することが可能である。
【０２５５】
或る実施態様は、或る組織または細胞タイプの転写イメージを生成する、本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞タイプによる、遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所与の条件下で所与の時間に発現した遺伝子の数および相対存在量を定量することにより分析し得る（Ｓｅｉｌｈａｍｅｒ 他の米国特許第５，８４０，４８４号「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ」を参照。該特許は特に引用することを以って本明細書の一部となす）。したがって、特定の組織または細胞タイプの転写物または逆転写物全体に、本発明のポリヌクレオチドまたはそれらの相補体をハイブリダイズすることにより、転写イメージを生成し得る。  或る実施例では、本発明のポリヌクレオチドまたはそれらの相補体が１マイクロアレイ上に複数エレメントの１サブセットを含むような高処理フォーマットでハイブリダイゼーションを発生させる。結果として得られる転写イメージは、遺伝子活性のプロフィールを提供し得る。
【０２５６】
転写イメージは、組織、細胞株、生検またはその生物学的サンプルから単離した転写物を用いて生成し得る。転写イメージはしたがって、組織または生検サンプルの場合にはｉｎ ｖｉｖｏ、細胞株の場合にはｉｎ ｖｉｔｒｏでの遺伝子発現を反映する。
【０２５７】
本発明のポリヌクレオチドの発現プロフィールを作製する転写イメージはまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデル系および薬剤の前臨床評価に、あるいは工業的または天然の環境化合物の毒性試験に関連して使用し得る。全ての化合物は、作用および毒性のメカニズムを標示する、しばしば分子フィンガープリントまたは毒性シグネチャと称される、特徴的な遺伝子発現パターンを惹起する（Ｎｕｗａｙｓｉｒ， Ｅ．Ｆ． 他（１９９９）Ｍｏｌ． Ｃａｒｃｉｎｏｇ． ２４：１５３−１５９、Ｓｔｅｉｎｅｒ， Ｓ． および Ｎ．Ｌ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ（２０００）Ｔｏｘｉｃｏｌ． Ｌｅｔｔ． １１２−１１３：４６７−４７１、該文献は特に引用を以って本明細書の一部となす）。試験化合物が、既知毒性を有する化合物のシグネチャと同一のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性がある。フィンガープリントまたはシグネチャは、多数の遺伝子および遺伝子ファミリーからの発現情報を含んでいる場合には、最も有用且つ正確である。理想的には、発現の、ゲノム全域にわたる測定が、最高品質のシグネチャを提供する。たとえ、発現が任意の試験された化合物によって変容しない遺伝子があったとしても、それらの発現レベルを残りの発現データを標準化するために使用できるため、それらの遺伝子は重要である。標準化手順は、種々の化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。或る毒性シグネチャのエレメント群に遺伝子機能を割り当てることは毒性機序の解釈に役立つが、毒性の予測につながる、シグネチャ群の統計的マッチングには、遺伝子機能の知識は必要でない（例えば２０００年２月２９日に米国国立環境健康科学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）より発行されたＰｒｅｓｓ Ｒｅｌｅａｓｅ ００−０２を参照されたい。これについてはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｅｈｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｃ／ｎｅｗｓ／ｔｏｘｃｈｉｐ．ｈｔｍで入手可能である）。したがって、毒性シグネチャを用いる中毒学的スクリーニングの際に、全ての発現した遺伝子配列を含めることは、重要且つ望ましい。
【０２５８】
或る実施態様では、核酸を有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより、この試験化合物の毒性を算定する。処理した生物学的サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な１つ以上のプローブでハイブリダイズし、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写レベルを定量し得る。処理した生物学的サンプル中の転写レベルを、未処理生物学的サンプル中のレベルと比較する。両サンプルの転写レベルの差は、処理済サンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を標示する。
【０２５９】
別の実施態様は、本発明のポリペプチド配列を用いて組織または細胞タイプのプロテオームを分析することに関連する。プロテオームの語は、特定の組織または細胞タイプでのタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームの各タンパク質成分は、個々に更なる分析の対象とすることができる。プロテオーム発現パターンすなわちプロフィールは、所与の条件下で所与の時間に発現したタンパク質の数および相対存在量を定量することにより分析し得る。したがって、或る細胞のプロテオームのプロフィールは、特定の組織または細胞タイプのポリペプチドを分離および分析することにより作成し得る。或る実施態様では、１次元等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、２次元ドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に応じて分離するような２次元ゲル電気泳動により、分離が達成される（前出のＳｔｅｉｎｅｒ および Ａｎｄｅｒｓｏｎ）。タンパク質は、通常はクーマシーブルー、あるいは銀染色液または蛍光染色液などの物質を用いてゲルを染色することにより、分散した、独自の位置にある点としてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常、サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処理または未処理のいずれかの生物学的サンプルからの、同等に位置したタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連するタンパク質スポット密度の変化を同定する。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的切断とそれに続く質量分析を用いる標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。或るスポット内のタンパク質の同一性は、その部分配列を、好適には少なくとも５個の連続するアミノ酸残基を、本発明のポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列データが得られる。
【０２６０】
プロテオームのプロフィールは、ＴＭＰに特異的な抗体を用いてＴＭＰ発現レベルを定量することによっても作成可能である。或る実施態様では、マイクロアレイ上のエレメントとしてこれら抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝して各アレイエレメントへのタンパク質結合レベルを検出することにより、タンパク質発現レベルを定量する（Ｌｕｅｋｉｎｇ， Ａ． 他 （１９９９） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２７０：１０３−１１１、Ｍｅｎｄｏｚｅ， Ｌ．Ｇ． 他 （１９９９） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２７：７７８−７８８）。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオールまたはアミノ反応性蛍光化合物を用いてサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイのエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【０２６１】
プロテオームレベルでの毒性シグネチャも中毒学的スクリーニングに有用であり、転写レベルでの毒性シグネチャと並行に分析するべきである。いくつかの組織のいくつかのタンパク質については、転写物の存在量とタンパク質の存在量との相関が乏しいので（Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｎ．Ｌ． および Ｊ． Ｓｅｉｌｈａｍｅｒ（１９９７）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １８：５３３−５３７）、転写イメージにはそれ程影響しないがプロテオームのプロフィールを改変するような化合物の分析において、プロテオーム毒性シグネチャは有用たり得る。更に、体液中の転写物の分析はｍＲＮＡの急速な分解のために困難なので、プロテオームのプロフィール作成はこのような場合により信頼し得、情報価値があり得る。
【０２６２】
別の実施態様では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより、試験化合物の毒性を算定する。処理された生物学的サンプル中で発現したタンパク質を、各タンパク質の量を定量し得るように分離する。各タンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質の量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を標示する。個々のタンパク質を同定するため、個々のタンパク質のアミノ酸残基をシークエンシングし、これら部分配列を本発明のポリペプチドと比較する。
【０２６３】
別の実施態様では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより、試験化合物の毒性を算定する。生物学的サンプルから得たタンパク質は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いてインキュベートする。抗体が認識したタンパク質の量を定量する。処理された生物学的サンプル中のタンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質の量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を標示する。
【０２６４】
マイクロアレイは、本技術分野で既知の方法で調製し、使用し、分析する（Ｂｒｅｎｎａｎ， Ｔ．Ｍ． 他（１９９５）米国特許第５，４７４，７９６号、Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ． 他（１９９６）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１０６１４−１０６１９、Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ 他（１９９５）ＰＣＴ出願第ＷＯ９５／２５１１１６号、Ｓｈａｌｏｎ， Ｄ．他（１９９５）ＰＣＴ出願第ＷＯ９５／３５５０５号、Ｈｅｌｌｅｒ， Ｒ．Ａ． 他（１９９７）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：２１５０−２１５５、Ｈｅｌｌｅｒ， Ｍ．Ｊ． 他（１９９７）米国特許第５，６０５，６６２号などを参照）。様々なタイプのマイクロアレイが公知であり、詳細については、ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｍ． Ｓｃｈｅｎａ， 編集 （１９９９） Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎに記載されている。該文献は、特に引用を以って本明細書の一部となす。
【０２６５】
本発明の別の実施態様ではまた、ＴＭＰをコードする核酸配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製することが可能である。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることができ、いくつかの例では、コード配列より非コード配列が好ましい。例えば、多重遺伝子族のメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。配列は、或る特定の染色体に、または或る染色体の或る特定領域に、または人為形成の染色体、例えば、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、細菌Ｐ１構成物、あるいは単一染色体ｃＤＮＡライブラリ群に対してマッピングされる（例えばＨａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｊ．Ｊ． 他（１９９７）Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５； Ｐｒｉｃｅ， Ｃ．Ｍ．（１９９３）Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ． ７：１２７−１３４； Ｔｒａｓｋ， Ｂ．Ｊ．（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． ７：１４９−１５４を参照）。一度マッピングすると、本発明の核酸配列を用いて例えば病状の遺伝を特定の染色体領域の遺伝または制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）と相関させるような遺伝子連鎖地図を開発し得る（例えば、Ｌａｎｄｅｒ， Ｅ．Ｓ．およびＤ． Ｂｏｔｓｔｅｉｎ（１９８６）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：７３５３−７３５７を参照）。
【０２６６】
蛍光原位置ハイブリッド形成法（ＦＩＳＨ）は、他の物理的および遺伝地図データと相関し得る（前出のＨｅｉｎｚ−Ｕｌｒｉｃｈ， 他（１９９５）ｉｎ Ｍｅｙｅｒｓ， ９６５−９６８ページなどを参照）。遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはＯｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）のウェブサイトに見ることができる。物理的染色体地図上の、ＴＭＰをコードする遺伝子の位置と、特定の疾患との相関性、あるいは特定の疾患に対する素因との相関性は、この疾患と関連するＤＮＡの領域の決定に役立ち得るため、位置を決定するクローニングの作業を促進し得る。
【０２６７】
確定した染色体マーカー類を用いた連鎖分析などの物理的マッピング技術、および染色体標本の原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。例えばマウスなど別の哺乳動物の染色体上に遺伝子を配置することにより、正確な染色体上の遺伝子座が未知でも、関連するマーカー類をしばしば明らかにし得る。この情報は、位置クローニングその他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を探る研究者にとって価値がある。疾患または症候群に関与する遺伝子（群）が、血管拡張性失調症の１１ｑ２２−２３領域など、特定のゲノム領域への遺伝的連鎖によって、大まかに位置決めがなされると、該領域に対するいかなる配列マッピングも、更なる調査のための関連遺伝子あるいは調節遺伝子を表し得る（Ｇａｔｔｉ， Ｒ．Ａ．他（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３６：５７７−５８０などを参照）。転座、反転などに起因する、健常者、保有者、罹病者の三者間における染色体位置の相違を発見するために、本発明のヌクレオチド配列を用いてもよい。
【０２６８】
本発明の別の実施例では、ＴＭＰ、その触媒作用断片あるいは免疫原性断片またはそのオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における、化合物のライブラリのスクリーニングに用いることができる。薬剤スクリーニングに用いる断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持物に固定されるか、細胞表面上に保持されるか、細胞内に位置することができる。ＴＭＰと検査する薬剤との結合による複合体の形成を測定してもよい。
【０２６９】
別の薬剤スクリーニング方法は、目的のタンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる（Ｇｅｙｓｅｎ他（１９８４）ＰＣＴ出願番号 ＷＯ８４／０３５６４などを参照）。この方法においては、多数の様々な小さな試験用化合物を固体基板上で合成する。試験用化合物は、ＴＭＰ、或いはその断片と反応してから洗浄される。精製したＴＭＰはまた、上記した薬剤のスクリーニング技術において用いるプレート上で直接コーティングすることもできる。別法では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物に固定することもできる。
【０２７０】
別の実施例では、ＴＭＰと特異結合可能な中和抗体がＴＭＰとの結合について試験化合物と競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法では、抗体を用いて、１つ以上の抗原決定基をＴＭＰと共有するどのペプチドの存在をも検出できる。
【０２７１】
別の実施例では、ＴＭＰをコードするヌクレオチド配列を、将来に開発される分子生物学技術であり、現在知られているヌクレオチド配列の特性（限定はされないが、トリプレット遺伝コード、特異的な塩基対相互作用等を含む）に依存する新技術に用い得る。
【０２７２】
更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限に利用できるであろう。したがって、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。
【０２７３】
前述した、および以下に記載する全ての特許出願、特許、刊行物、米国特許出願第６０／２４４，０１７号、同第６０／２５２，８５５号、同第６０／２５１，８２５号、および同第６０／２５５，０８５号も含めて、言及することをもって本明細書の一部とする。
【０２７４】
（実施例）
１  ｃＤＮＡライブラリの作製
Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ群の由来は、ＬＩＦＥＳＥＱ ＧＯＬＤデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）に記載されたｃＤＮＡライブラリ群であり、表４の列５に列記した。幾つかの組織はホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解し、また、ホモジナイズしてフェノールまたは変性剤類の好適な混合液に溶解した組織もある。変性剤の混合液は、例えばフェノールとグアニジンイソチオシアネートとの単相溶液であるＴＲＩＺＯＬ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。結果として得られた溶解物は、塩化セシウムのクッション液の上に重層して遠心分離するか、クロロホルムで抽出した。イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、あるいは別の慣例的方法を用いて、溶解物からＲＮＡを沈殿させた。
【０２７５】
ＲＮＡの純度を高めるため、フェノールによるＲＮＡの抽出および沈殿を、必要な回数繰り返した。場合によっては、ＤＮアーゼでＲＮＡを処理した。殆どのライブラリでは、オリゴｄ（Ｔ）連結常磁性粒子（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＯＬＩＧＯＴＥＸラテックス粒子（ＱＩＡＧＥＮ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ ＣＡ）またはＯＬＩＧＯＴＥＸ ｍＲＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを単離した。別法では、別のＲＮＡ単離キット、例えばＰＯＬＹ（Ａ）ＰＵＲＥ ｍＲＮＡ精製キット（Ａｍｂｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ）を用いて、組織溶解物からＲＮＡを直接単離した。
【０２７６】
場合によってはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社へのＲＮＡ提供を行い、対応するｃＤＮＡライブラリをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社が作製した。そうでない場合は、ＵＮＩＺＡＰベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）またはＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴプラスミドシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて本技術分野で既知の推奨方法または類似の方法でｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡライブラリを作製した（前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９７， ５．１−６．６ユニットなどを参照）。逆転写は、オリゴｄ（Ｔ）またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖ｃＤＮＡに連結反応させ、好適な制限酵素または酵素群でｃＤＮＡを消化した。殆どのライブラリに対して、ｃＤＮＡのサイズ選択（３００〜１０００ｂｐ）は、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ Ｓ１０００、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ２ＢまたはＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ４Ｂカラムクロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、あるいは調製用アガロースゲル電気泳動法を用いて行った。ｃＤＮＡは好適なプラスミドのポリリンカーの適合する制限酵素部位でライゲーションされた。好適なプラスミドは、例えばＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＰＣＤＮＡ２．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）、ＰＢＫ−ＣＭＶプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＰＣＲ２−ＴＯＰＯＴＡプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰＣＭＶ−ＩＣＩＳプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＩＧＥＮ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）またはｐｌＮＣＹ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、またはこれらの誘導体である。組換えプラスミドは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＸＬ１−ＢＩｕｅＭＲＦまたはＳＯＬＲ、あるいはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＤＨ５α、ＤＨ１０ＢまたはＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ ＤＨ１０Ｂなど適格な大腸菌細胞に形質転換した。
【０２７７】
２  ｃＤＮＡクローンの単離
実施例１のようにして得たプラスミドの、宿主細胞からの回収は、ＵＮＩＺＡＰベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いたｉｎ ｖｉｖｏ切除によって、あるいは細胞溶解によって行った。プラスミドを精製する方法は、ＭａｇｉｃまたはＷＩＺＡＲＤ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＡＧＴＣ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ精製キット（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）、ＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌａｓｍｉｄ、ＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌｕｓ ＰｌａｓｍｉｄおよびＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｕｌｔｒａ Ｐｌａｓｍｉｄ 精製システム、Ｒ．Ｅ．Ａ．Ｌ． Ｐｒｅｐ ９６プラスミド精製キットの中から少なくとも１つを用いた。プラスミドは、沈殿させた後、０．１ｍｌの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。
【０２７８】
別法では、高処理フォーマットで直接結合ＰＣＲ法を用い、宿主細胞溶解物からプラスミドＤＮＡを増幅した（Ｒａｏ， Ｖ．Ｂ．（１９９４）Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１６：１−１４）。宿主細胞の溶解および熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行った。サンプルを加工し、それを３８４穴プレート内で保管し、増幅したプラスミドＤＮＡの濃度をＰＩＣＯＧＲＥＥＮ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）およびＦＬＵＯＲＯＳＫＡＮＩＩ蛍光スキャナ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて蛍光分析的に定量した。
【０２７９】
３  シークエンシングおよび分析
実施例２に記載したようにプラスミドから回収したＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡを、以下に示すようにシークエンシングした。ｃＤＮＡのシークエンス反応は、標準的方法あるいは高処理装置、例えばＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００ サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはＰＴＣ−２００ サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を、ＨＹＤＲＡマイクロディスペンサー（Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＭＩＣＲＯＬＡＢ ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）液体転移システムと併用して処理した。ｃＤＮＡのシークエンス反応は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社が提供する試薬、またはＡＢＩシークエンシングキット、例えばＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の試薬を用いて準備した。ｃＤＮＡのシークエンス反応の電気泳動的分離には、また、標識したポリヌクレオチドの検出には、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）か、標準ＡＢＩプロトコルと塩基対呼び出しソフトウェアとを用いるＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７３または３７７シークエンシングシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）か、あるいはその他の本技術分野で既知の配列解析システムを用いた。ｃＤＮＡ配列内のリーディングフレームは、標準的方法（前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９７， ７．７ユニットに概説）を用いて同定した。いくつかのｃＤＮＡ配列を選択し、実施例８に開示した技術で配列を伸長させた。
【０２８０】
Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡに由来するポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカーおよびポリ（Ａ）配列を除去し、あいまいな塩基対をマスクすることによって有効性を確認した。その際、ＢＬＡＳＴと、動的プログラミングと、隣接ジヌクレオチド頻度分析とに基づく、アルゴリズムとプログラムとを用いた。次に、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列またはそれらの翻訳の問い合わせを、以下のデータベース群より選択した１つに対して行った。すなわち、公共のデータベース群、例えばＧｅｎＢａｎｋの霊長類およびげっ歯類、哺乳動物、脊椎動物、真核生物のデータベースと、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＤＯＭＯ、ＰＲＯＤＯＭ、ＰＲＯＴＥＯＭＥの、ヒト、ラット、マウス、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）およびＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）からの配列群を持つデータベース群、および、ＰＦＡＭ等の、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）ベースのタンパク質ファミリーデータベース群である（ＨＭＭは、遺伝子ファミリーのコンセンサス１次構造を分析する確率的アプローチである。例えば、Ｅｄｄｙ， Ｓ．Ｒ． （１９９６） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ６：３６１−３６５を参照）。問合せは、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＩＭＰＳ、およびＨＭＭＥＲに基づくプログラムを用いて行った。Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列を構築し、完全長のポリヌクレオチド配列を産出した。あるいは、ＧｅｎＢａｎｋ ｃＤＮＡ群、ＧｅｎＢａｎｋ ＥＳＴ群、スティッチされた配列群、ストレッチされた配列群、またはＧｅｎｓｃａｎ予測コード配列群（実施例４および５を参照）を用い、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡの集団を完全長まで伸長させた。構築にはＰｈｒｅｄとＰｈｒａｐとＣｏｎｓｅｄとに基づくプログラムを用い、ＧｅｎＭａｒｋとＢＬＡＳＴとＦＡＳＴＡとに基づくプログラムを用いて、ｃＤＮＡの集団を、オープンリーディングフレームについてスクリーニングした。完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳し、対応する完全長ポリペプチド配列を誘導した。あるいは、本発明のポリペプチドは、完全長翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基で開始し得る。完全長ポリペプチド配列群の続いての分析としての問い合わせを、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質データベース群（ｇｅｎｐｅｐｔ）、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＲＯＴＥＯＭＥデータベース群、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＤＯＭＯ、ＰＲＯＤＯＭおよびＰｒｏｓｉｔｅ等のデータベースや、ＰＦＡＭなど隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）ベースのタンパク質ファミリーデータベース群に対し行った。完全長ポリヌクレオチド配列はまた、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニアリング， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）およびＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて分析した。ポリヌクレオチドとポリペプチドとの配列アラインメントは、ＭＥＧＡＬＩＧＮマルチシークエンスアラインメントプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）に組み込まれたＣＬＵＳＴＡＬ���ルゴリズムが指定する、デフォルトパラメータを用いて生成する。これは、アラインメントした配列間の一致率も計算する。
【０２８１】
Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡと完全長配列との分析と構築とに利用したツールとプログラムとアルゴリズムとの概略と、適用可能な説明、引用文献、閾値パラメータを表７に示す。用いたツール、プログラムおよびアルゴリズムを表７の列１に、それらの簡単な説明を列２に示す。列３は好適な参照文献であり、全ての文献は引用を以って全文を本明細書の一部となす。適用可能な場合には、列４は、２つの配列が一致する強さを評価するために用いた、スコア、確率値その他のパラメータを示す（スコアが高いほど、または確率値が低いほど、２配列間の同一性が高い）。
【０２８２】
完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の構築および分析に用いる上記のプログラムは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４のポリヌクレオチド配列断片の同定にも利用できる。ハイブリダイゼーションおよび増幅技術に有用な約２０〜約４０００ヌクレオチドの断片を、表４の列４に示した。
【０２８３】
４  ゲノムＤＮＡからのコード配列の同定および編集
推定上の膜貫通タンパク質類の同定には、先ずＧｅｎｓｃａｎ遺伝子同定プログラムを、公共のゲノム配列データベース（例えば、ｇｂｐｒｉやｇｂｈｔｇ）に対して実行した。Ｇｅｎｓｃａｎは、様々な生物からのゲノムＤＮＡ配列を分析する汎用遺伝子同定プログラムである（Ｂｕｒｇｅ， Ｃ． および Ｓ． Ｋａｒｌｉｎ（１９９７）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６８：７８−９４、Ｂｕｒｇｅ， Ｃ． および Ｓ． Ｋａｒｌｉｎ（１９９８）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ８：３４６−３５４参照）。このプログラムは予測されたエキソン群を連結し、メチオニンから終止コドンに及ぶ、構築されたｃＤＮＡ配列を形成する。Ｇｅｎｓｃａｎの出力は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のＦＡＳＴＡデータベースである。Ｇｅｎｓｃａｎが一度に分析する配列の最大範囲は、３０ｋｂに設定した。これらのＧｅｎｓｃａｎ予測ｃＤＮＡ配列の内、どの配列が膜貫通タンパク質をコードするかを決定するために、コードされたポリペプチドを、ＰＦＡＭモデルにおいて膜貫通タンパク質について問合せて分析した。潜在的な膜貫通タンパク質はまた、既に膜貫通タンパク質として注釈が付けられたＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列群に対する相同性により、同定した。これら選択されたＧｅｎｓｃａｎ予測配列を、次にＢＬＡＳＴ分析により、公共データベースｇｅｎｐｅｐｔおよびｇｂｐｒｉと比較した。必要であれば、ｇｅｎｐｅｐｔからのトップＢＬＡＳＴヒットと比較することによりＧｅｎｓｃａｎ予測配列を編集し、余分なまたは取り除かれたエキソンなど、Ｇｅｎｓｃａｎが予測した配列におけるエラーを補正した。ＢＬＡＳＴ分析はまた、Ｇｅｎｓｃａｎ予測配列の、いかなるＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡまたは公共ｃＤＮＡカバレッジ（ｃｏｖｅｒａｇｅ）の発見にも用いられ、したがって転写の証拠を提供する。Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡカバレッジが利用できる場合には、この情報を用いてＧｅｎｓｃａｎ予測配列を補正または確認した。完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例３に記載した構築プロセスを用いて、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列および／または公共ｃＤＮＡ配列でＧｅｎｓｃａｎ予測コード配列を構築して得た。あるいは、完全長ポリヌクレオチド配列は、編集後または非編集のＧｅｎｓｃａｎ予測コード配列に、完全に由来する。
【０２８４】
５  ｃＤＮＡ配列データを使ったゲノム配列データの構築
スティッチ配列（Ｓｔｉｃｈｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
部分ｃＤＮＡ配列群は、実施例４に記載のＧｅｎｓｃａｎ遺伝子同定プログラムが予測したエキソン群を用いて伸長させた。実施例３に記載したように構築した部分ｃＤＮＡ群を、ゲノムＤＮＡにマッピングした。また、関連するｃＤＮＡ群と、１つ以上のゲノム配列からＧｅｎｓｃａｎ予測されたエキソン群とを含むクラスター群に分解した。ｃＤＮＡとゲノムとの情報を統合すべく、グラフ理論および動的プログラミングに基づく或るアルゴリズムを用いて各クラスターを分析し、潜在的スプライシング変異配列群を生成した。配列群を続いて確認、編集または伸長し、完全長配列を創出した。区間の全長が、２つ以上の配列に在るような配列区間群をクラスター内で同定し、そのように同定された区間群は、推移性により、等しいと考えた。例えば、或る区間が、１つのｃＤＮＡと２つのゲノム配列とに在る場合、３つの区間は全て等しいと考えた。このプロセスにより、無関係だが連続したゲノム配列群を、ｃＤＮＡ配列で結び合わせて架橋し得る。このようにして同定した区間を、それらの親配列（ｐａｒｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）に沿って現われるようにスティッチアルゴリズムで「縫い合わせ」、可能な限り最長の配列と変異配列群とを生成する。１種類の親配列に沿って続く区間間の連鎖（ｃＤＮＡ−ｃＤＮＡまたはゲノム配列−ゲノム配列）は、親の種類を変える連鎖（ｃＤＮＡ−ゲノム配列）より優先した。結果として得たスティッチ配列群を、ＢＬＡＳＴ分析で翻訳し、公共データベースｇｅｎｐｅｐｔおよびｇｂｐｒｉと比較した。Ｇｅｎｓｃａｎが予測した不正確なエキソン群は、ｇｅｎｐｅｐｔからのトップＢＬＡＳＴヒットとの比較により補正した。必要な場合、追加ｃＤＮＡ配列群を用いるかゲノムＤＮＡの検査により、配列群を更に伸長させた。
【０２８５】
ストレッチ配列（Ｓｔｒｅｔｃｈｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
部分ＤＮＡ配列を、ＢＬＡＳＴ分析に基づくアルゴリズムにより完全長まで伸長した。先ず、ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、ＧｅｎＢａｎｋの霊長類、げっ歯類、哺乳動物、脊椎動物および真核生物のデータベースなどの公共データベースに対し、実施例３に記載されたように構築された部分ｃＤＮＡを問い合わせた。次に、最も近いＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体を、ＢＬＡＳＴ分析により、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列または実施例４に記載のＧｅｎＳｃａｎエキソン予測配列のいずれかと比較した。結果として得られる高スコアリングセグメント対（ＨＳＰ）を用いてキメラタンパク質を産出し、翻訳した配列をＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体上にマッピングした。元のＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体に対し、キメラタンパク質内では挿入または欠失が起こり得る。ＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体、キメラタンパク質またはその両方をプローブとして用い、公共のヒトゲノムデータベースから相同ゲノム配列を検索した。このようにして、部分的なＤＮＡ配列を、相同ゲノム配列の付加により「ストレッチ」すなわち伸長した。結果として得られるストレッチ配列を検査し、完全遺伝子を含んでいるか否かを決定した。
【０２８６】
６  ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４を構築するために用いた配列を、ＢＬＡＳＴ他のＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムの実装を用いて、Ｉｎｃｙｔｅ ＬＩＦＥＳＥＱデータベースおよび公共のドメインデータベース群の配列と比較した。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４と一致するこれらのデータベースの配列を、Ｐｈｒａｐなどの構築アルゴリズム（表７）を使用して、連続および重複した配列のクラスター群に組み入れた。スタンフォード・ヒトゲノムセンター（ＳＨＧＣ）、ホワイトヘッド・ゲノム研究所（ＷＩＧＲ）、Ｇｅｎｅｔｈｏｎなどの公的な情報源から入手可能な放射線ハイブリッドおよび遺伝地図データを用いて、いずれかのクラスター化された配列が既にマッピングされているかを判定した。マッピングされた配列が或るクラスターに含まれている場合、そのクラスターの全配列が、個々の配列番号と共に、地図上の位置に割り当てられた。
【０２８７】
地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または間隔として表される。センチモルガン間隔の地図上の位置は、染色体のｐアームの末端に対して測定する（センチモルガン（ｃＭ）は、染色体マーカー間の組換え頻度に基づく計測単位である。平均して、１ｃＭは、ヒトＤＮＡの１メガベース（Ｍｂ）にほぼ等しい。尤も、この値は、組換えのホットスポットおよびコールドスポットに起因して広範囲に変化する）。ｃＭ距離は、各クラスター内に配列が含まれる放射線ハイブリッドマーカー類に対して境界を提供するＧｅｎｅｔｈｏｎによってマッピングされた遺伝マーカー群に基づく。ＮＣＢＩ「ＧｅｎｅＭａｐ’９９」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅｍａｐ／）など一般個人が入手可能なヒトゲノム地図その他の資源を用いて、既に同定されている疾患遺伝子類が、上記の区間内若しくは近傍にマップされているかを判定できる。
【０２８８】
このようにして、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２は、１１番染色体の５９．５０から６２．５０センチモルガンの区間内にマップされ、またＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６は、１番染色体の１７９．２から１８６．４センチモルガンの区間内にマップされた。
【０２８９】
７  ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験技術であり、特定の細胞種または組織からのＲＮＡが結合している膜への、標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに関与している（前出のＳａｍｂｒｏｏｋ， ７章、同Ａｕｓｕｂｅｌ （１９９５） ４章および１６章などを参照）。
【０２９０】
ＢＬＡＳＴを応用した類似のコンピュータ技術を用いて、ＧｅｎＢａｎｋやＬＩＦＥＳＥＱ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）などのｃＤＮＡデータベースにおいて、同一または関連分子を検索した。ノーザン分析は、いくつかの膜系ハイブリダイゼーションよりも非常に速い。更に、特定の一致を厳密なあるいは相同的なものとして分類するか否かを決定するため、コンピュータ検索の感度を修正することができる。検索の基準は積スコアであり、次式で定義される。
【０２９１】
【数１】
2004530409.tif 000004
積スコアは、２つの配列間の類似度と、配列が一致する長さとの両方を考慮している。積スコアは、０〜１００の、正規化された値であり、次のようにして求める。ＢＬＡＳＴスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を２つの配列の短い方の長さの５倍で除する。或る高スコアリングセグメント対（ＨＳＰ）内の一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不一致塩基に−４を割り当てることにより、ＢＬＡＳＴスコアを計算する。２つの配列は、２以上のＨＳＰを共有し得る（ギャップにより隔離される）。２以上のＨＳＰがある場合には、最高ＢＬＡＳＴスコアのセグメント対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、断片的重畳とＢＬＡＳＴアラインメントの質とのバランスを表す。例えば積スコア１００は、比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致する場合のみ得られる。積スコア７０は、一端が１００％一致し、７０％重畳しているか、他端が８８％一致し、１００％重畳しているかのいずれかの場合に得られる。積スコア５０は、一端が１００％一致し、５０％重畳しているか、７９％一致し、１００％重畳しているかのいずれかの場合に得られる。
【０２９２】
或いは、ＴＭＰをコードするポリヌクレオチド配列を、由来する組織に対して分析する。例えば或る完全長配列は、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列（実施例３を参照）と少なくとも一部は重畳するように構築される。各ｃＤＮＡ配列は、ヒト組織から作製されたｃＤＮＡライブラリに由来する。各ヒト組織は、以下の臓器／組織カテゴリーの１つに分類される。すなわち心血管系、結合組織、消化器系、胎芽構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液および免疫系、肝、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器、皮膚、顎口腔系、非分類性／混合性または尿路である。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。同様に、各ヒト組織は、以下の疾患／病状カテゴリーすなわち癌、細胞株、発達、炎症、神経性、外傷、心血管、プール、その他の１つに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。得られるパーセンテージは、ＴＭＰをコードするｃＤＮＡの、組織特異的発現および疾患特異的発現を反映する。ｃＤＮＡ配列およびｃＤＮＡライブラリ／組織の情報は、ＬＩＦＥＳＥＱ ＧＯＬＤ データベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）から得ることができる。
【０２９３】
８  ＴＭＰをコードするポリヌクレオチドの伸長
完全長のポリヌクレオチド配列もまた、完全長分子の適切な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマー群を用いて該断片を伸長させて産生した。或るプライマーは既知の断片の５’伸長を開始するべく合成し、別のプライマーは既知の断片の３’伸長を開始するべく合成した。開始プライマー群の設計には、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が約５０％以上となり、約６８〜約７２℃の温度で標的配列にアニーリングするように、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）或いは別の適切なプログラムを用いて行った。ヘアピン構造およびプライマー−プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチド群の伸長は全て回避した。
【０２９４】
選択したヒトｃＤＮＡライブラリ群を用い、配列を伸長した。２段階以上の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマーあるいはプライマーのネステッドセットを設計した。
【０２９５】
高忠実度の増幅が、当業者によく知られている方法を利用したＰＣＲ法によって得られた。ＰＣＲは、ＰＴＣ−２００ サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて９６穴プレート内で行った。反応混合液は、鋳型ＤＮＡを有し、また、２００ ｎｍｏｌの各プライマーを有する。また、Ｍｇ２＋と（ＮＨ４）２ＳＯ４と２−メルカプトエタノールとを含有する反応バッファーと、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と、ＥＬＯＮＧＡＳＥ酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）とを含有する。プライマー対であるＰＣＩ ＡとＰＣＩ Ｂとに対し、以下のパラメータで増幅を行った。
ステップ１    ９４℃で３分間
ステップ２    ９４℃で１５秒間
ステップ３    ６０℃で１分間
ステップ４    ６８℃で２分間
ステップ５    ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す
ステップ６    ６８℃で５分間
ステップ７    ４℃で保存
別法では、プライマー対であるＴ７とＳＫ＋に対して以下のパラメータで増幅を行った。
ステップ１    ９４℃で３分間
ステップ２    ９４℃で１５秒間
ステップ３    ５７℃で１分間
ステップ４    ６８℃で２分間
ステップ５    ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す
ステップ６    ６８℃で５分間
ステップ７    ４℃で保存
各ウェルのＤＮＡ濃度は、１× ＴＥおよび０．５μｌの希釈していないＰＣＲ産物に溶解した１００μｌのＰＩＣＯＧＲＥＥＮ定量試薬（０．２５（ｖ／ｖ）ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）を不透明な蛍光光度計プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ， Ａｃｔｏｎ ＭＡ）の各ウェルに分配してＤＮＡが試薬と結合できるようにして測定する。サンプルの蛍光を計測してＤＮＡの濃度を定量すべく、プレートをＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ ＩＩ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）でスキャンした。反応混合物のアリコット５〜１０μｌを１％アガロースゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを判定した。
【０２９６】
伸長したヌクレオチドは、脱塩および濃縮して３８４穴プレートに移し、ＣｖｉＪＩコレラウイルスエンドヌクレアーゼ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて消化し、音波処理またはせん断し、ｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）への再連結を行った。ショットガン・シークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度（０．６〜０．８％）のアガロースゲル上で分離し、断片を切除し、寒天をＡｇａｒ ＡＣＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化した。伸長させたクローンをＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を用いてｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再連結し、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で処理して制限部位のオーバーハングを満たし、適格な大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞群の選択を抗生物質を含む培地で行い、それぞれのコロニーを採取し、ＬＢ／２Ｘカルベニシリン培養液内の３８４ウェルプレート群に３７℃で一晩培養した。
【０２９７】
細胞を溶解し、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて以下の手順でＤＮＡをＰＣＲ増幅した。
ステップ１    ９４℃で３分間
ステップ２    ９４℃で１５秒間
ステップ３    ６０℃で１分間
ステップ４    ７２℃で２分間
ステップ５    ステップ２、３、及び４を２９回繰り返す
ステップ６    ７２℃で５分間
ステップ７    ４℃で保存
ＤＮＡの定量化には、上記したようにＰＩＣＯＧＲＥＥＮ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いた。ＤＮＡの回収率が低いサンプルは、上記と同一の条件を用いて再増幅した。サンプルは２０％ジメチルスルホキシド（１：２， ｖ／ｖ）で希釈し、ＤＹＥＮＡＭＩＣ エネルギートランスファー シークエンシングプライマー、およびＤＹＥＮＡＭＩＣ ＤＩＲＥＣＴ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）またはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ ターミネーターサイクル シークエンシングレディ反応キット（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてシークエンシングした。
【０２９８】
同様に、上記手順を用いて完全長ポリヌクレオチド配列を検証した。あるいは、完全長ポリヌクレオチドを用い、上記手順で、そのような伸長のために設計したオリゴヌクレオチド類と、或る適切なゲノムライブラリとを用いて５’調節配列を得た。
【０２９９】
９  個々のハイブリダイゼーションプローブの標識および使用
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４由来のハイブリダイゼーションプローブを用いて、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡをスクリーニングする。約２０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対しても本質的に同一の手順を用いる。オリゴヌクレオチドは、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）等の最新ソフトウェアを用いて設計し、各オリゴマー５０ｐｍｏｌと、［γ−３２Ｐ］アデノシン３リン酸 （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）２５０μＣｉと、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ， Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ）を混合することにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、ＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ−２５超細繊分子サイズ排除デキストラン ビーズカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて実質的に精製する。Ａｓｅ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｐｓｔ Ｉ、ＸｂａＩまたはＰｖｕ ＩＩ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ）のいずれか１つのエンドヌクレアーゼで消化されたヒトゲノムＤＮＡの、典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において、毎分１０７カウントの標識されたプローブを含むアリコットを用いる。
【０３００】
各消化物から得たＤＮＡは、０．７％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（Ｎｙｔｒａｎ Ｐｌｕｓ， Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｄｕｒｈａｍ ＮＨ）に移す。ハイブリダイゼーションは、４０℃で１６時間行う。非特異的シグナル群を除去するため、最大で例えば０．１×クエン酸ナトリウム食塩水および０．５％ドデシル硫酸ナトリウムの条件下で、ブロット群を室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比較する。
【０３０１】
１０  マイクロアレイ
或るマイクロアレイ上でのアレイエレメント群の結合または合成は、フォトリソグラフィ、圧電印刷（インクジェット印刷、前出のＢａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒなどを参照）、機械的マイクロスポッティング技術およびこれらから派生した手段を用いて達成し得る。上記各技術において基板は、均一な、非多孔性の表面を持つ固体とすべきである（Ｓｃｈｅｎａ（１９９９）前出）。推奨する基板には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップおよびシリコンウエハがある。あるいは、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似した手順を利用し、熱的、紫外線的、化学的または機械的結合手順を用いて基板の表面にエレメントを配置および結合させてもよい。通常のアレイは、利用可能な、当業者に公知の方法と機械とを用いて作製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る（例えばＳｃｈｅｎａ， Ｍ． 他（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４６７−４７０、Ｓｈａｌｏｎ． Ｄ． 他（１９９６）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ６：６３９−６４５、Ｍａｒｓｈａｌｌ， Ａ． および Ｊ． Ｈｏｄｇｓｏｎ（１９９８）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６：２７−３１を参照）。
【０３０２】
完全長ｃＤＮＡ、発現配列タグ（ＥＳＴ）、またはそれらの断片またはオリゴマーが、マイクロアレイのエレメントと成り得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片またはオリゴマーを、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）など本技術分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメントは、生物学的サンプル中でポリヌクレオチドを用いてハイブリダイズする。生物学的サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識その他の分子タグに抱合させる。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズされていないヌクレオチドを生物学的サンプルから除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントでのハイブリダイゼーションを検出する。あるいは、レーザ脱離および質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上の或るエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの、相補性の度合と相対存在度とを算定し得る。 一実施態様におけるマイクロアレイの調整および使用について、以下に詳述する。
【０３０３】
組織または細胞サンプルの調製
全ＲＮＡを組織サンプル群から単離するためグアニジニウム チオシアネート法を用い、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを精製するためオリゴ（ｄＴ）セルロース法を用いる。各ポリ（Ａ）＋ＲＮＡサンプルを、ＭＭＬＶ逆転写酵素、０．０５ｐｇ／μｌのオリゴ（ｄＴ）プライマー（２１ｍｅｒ）、１×第一鎖バッファー、０．０３ｕｎｉｔ／μｌのＲＮアーゼ阻害因子、５００μＭのｄＡＴＰ、５００μＭのｄＧＴＰ、５００μＭのｄＴＴＰ、４０μＭのｄＣＴＰ、４０μＭのｄＣＴＰ−Ｃｙ３（ＢＤＳ）またはｄＣＴＰ−Ｃｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて逆転写する。逆転写反応は、ＧＥＭＢＲＩＧＨＴキット（Ｉｎｃｙｔｅ）を用い、２００ｎｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを含有する体積２５ｍｌで行う。特異的対照ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ群は、非コード酵母ゲノムＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により合成する。３７℃で２時間インキュベートした後、各反応サンプル（１つはＣｙ３、もう１つはＣｙ５標識）は、２．５ｍｌの０．５Ｍ水酸化ナトリウムで処理し、８５℃で２０分間インキュベートし、反応を停止させてＲＮＡを分解させる。サンプルを精製するため、２つの連続するＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ ３０ゲル濾過スピンカラム（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （ＣＬＯＮＴＥＣＨ）， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）を用いる。混合後、２つの反応サンプルをエタノール沈殿させるため、１ｍｌのグリコーゲン（１ｍｇ／ｍｌ）、６０ｍｌの酢酸ナトリウム、および３００ｍｌの１００％エタノールを用いる。サンプルを次にＳｐｅｅｄＶＡＣ（Ｓａｖａｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｈｏｌｂｒｏｏｋ ＮＹ）を用いて完全に乾燥させ、１４μｌの５×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中で再懸濁する。
【０３０４】
マイクロアレイの調製
本発明の配列を用いて、アレイエレメント群を作製する。各アレイエレメントは、クローン化したｃＤＮＡインサート群により、ベクター含有細菌細胞群から増幅する。ＰＣＲ増幅は、ｃＤＮＡインサートの側面に位置するベクター配列群に相補的なプライマー類を用いる。３０サイクルのＰＣＲによって、１〜２ｎｇの初期量から５μｇを超える最終量まで、アレイエレメントを増幅する。増幅したアレイエレメントは、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ−４００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて精製する。
【０３０５】
精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドグラス上に固定する。顕微鏡スライドグラス（Ｃｏｒｎｉｎｇ）は、０．１％のＳＤＳおよびアセトン中で超音波洗浄し、処理中および処理後に多量の蒸留水で洗浄する。スライドグラスは、４％フッ化水素酸（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＶＷＲ）， Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ ＰＡ）中でエッチングし、多量の蒸留水中で洗浄し、９５％エタノール中で０．０５％アミノプロピルシラン（Ｓｉｇｍａ）を用いてコーティングする。コーティングしたスライドガラスは、１１０℃のオーブンで硬化させる。
【０３０６】
米国特許第５，８０７，５２２号に記載されている方法を用いて、コーティングしたガラス基板にアレイエレメントを付加する。この特許は引用することを以って本明細書の一部とする。平均濃度１００ｎｇ／μｌのアレイエレメントＤＮＡ１μｌを、高速ロボット装置（ｒｏｂｏｔｉｃ ａｐｐａｒａｔｕｓ）により、開放型キャピラリープリンティングエレメント（ｏｐｅｎ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｐｒｉｎｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）に充填する。装置はここで、スライド毎に約５ｎｌのアレイエレメントサンプルを置く。
【０３０７】
マイクロアレイをＵＶ架橋するため、ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ ＵＶ架橋剤（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いる。マイクロアレイの洗浄を、室温において、０．２％ＳＤＳで１回、蒸留水で３回行う。各非特異結合部位をブロックするため、マイクロアレイのインキュベートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｔｒｏｐｉｘ， Ｂｅｄｆｏｒｄ ＭＡ）中の０．２％カゼイン中において６０℃で３０分間行った後、前に行ったように０．２％ＳＤＳおよび蒸留水で洗浄する。
【０３０８】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応に用いる９μｌのサンプル混合体には、Ｃｙ３またはＣｙ５で標識したｃＤＮＡ合成産物群の各０．２μｇを、５×ＳＳＣ，０．２％ＳＤＳハイブリダイゼーション緩衝液中に含む。サンプル混合体は、６５℃まで５分間加熱し、マイクロアレイ表面上で等分して１．８ｃｍ２のカバーガラスで覆う。アレイを、顕微鏡用スライドよりわずかに大きい空洞を有する防水チェンバーに移す。チェンバー内を湿度１００に保つため、１４０μｌの５×ＳＳＣをチェンバーの１コーナーに加える。アレイを含むチェンバーは、６０℃で約６．５時間インキュベートする。アレイは、第１洗浄緩衝液中（１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）において４５℃で１０分間洗浄し、第２洗浄緩衝液中（０．１×ＳＳＣ）において４５℃で１０分間ずつ３回洗浄して乾燥させる。
【０３０９】
検出
レポーター標識したハイブリダイゼーション複合体を検出するには、Ｃｙ３の励起のために４８８ｎｍ、Ｃｙ５の励起のために６３２ｎｍでスペクトル線を発生し得るＩｎｎｏｖａ７０混合ガス１０Ｗレーザ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ）を備えた顕微鏡を用いる。励起レーザ光の焦点をアレイ上に置くため、２０×顕微鏡対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ， Ｍｅｌｖｉｌｌｅ ＮＹ）を用いる。アレイを含むスライドを、顕微鏡の、コンピュータ制御のＸ−Ｙステージに置き、対物レンズを通してラスタースキャンする。本実施例で用いる１．８ｃｍ×１．８ｃｍのアレイは、解像度２０μｍでスキャンする。
【０３１０】
異なる２回のスキャンで、混合ガスマルチラインレーザは２つの蛍光色素を連続的に励起する。発光された光は、波長に基づき分離され、２つの蛍光色素に対応する２つの光電子増倍管検出器（ＰＭＴ Ｒ１４７７， Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ ＮＪ）に送られる。好適なフィルター群をアレイと光電子増倍管との間に設置して、シグナルをフィルターする。用いる蛍光色素の最大発光の波長は、Ｃｙ３では５６５ｎｍ、Ｃｙ５では６５０ｎｍである。装置は両方の蛍光色素からのスペクトルを同時に記録し得るが、レーザ源において好適なフィルターを用いて、蛍光色素１つにつき１度スキャンし、各アレイを通常２度スキャンする。
【０３１１】
通常、各スキャンの感度を較正するため、ｃＤＮＡ対照種を或る既知濃度でサンプル混合体に添加し、対照種が発生するシグナル強度を用いる。アレイ上の或る特定の位置には或る相補的ＤＮＡ配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度をハイブリダイゼーション種の重量比１：１００，０００で相関させる。異なる源泉（例えば代表的な試験細胞および対照細胞など）からの２つのサンプルを、各々異なる蛍光色素で標識し、異なる発現をする遺伝子群を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には、較正するｃＤＮＡのサンプルを２種の蛍光色素で標識し、ハイブリダイゼーション混合液に各々等量を加えることによって較正を行う。
【０３１２】
光電子増倍管の出力は、ＩＢＭコンパチブルＰＣコンピュータにインストールした１２ビットＲＴＩ−８３５Ｈアナログ−ディジタル（Ａ／Ｄ）変換ボード（Ａｎａｌｏｇ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｏｒｗｏｏｄ ＭＡ）を用いてディジタル化される。ディジタル化したデータは、青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラースケールへのリニア２０色変換を用いて、シグナル強度がマッピングされたイメージとして表示される。データは、定量的にも分析される。２つの異なる蛍光色素を同時に励起および測定する場合には、各蛍光体の発光スペクトルを用いて、データは先ず蛍光色素間の光学的クロストーク（発光スペクトルの重なりに起因する）を補正される。
【０３１３】
グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからのシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナルは統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用いるソフトウェアは、ＧＥＭＴＯＯＬＳ遺伝子発現分析プログラム（Ｉｎｃｙｔｅ）である。
【０３１４】
１１  相補的ポリヌクレオチド
ＴＭＰをコードする配列群或いはその任意の部分に対する相補配列群を用いることにより、天然ＴＭＰの発現が検出、低減、または阻害される。約１５〜３０塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さなあるいは大きな配列の断片の場合でも、本質的に同じ手順を用いる。適切なオリゴヌクレオチド群を設計するため、Ｏｌｉｇｏ ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および、ＴＭＰのコーディング配列を用いる。転写を阻害するためには、最も独特な５’配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計して用いることにより、プロモーターがコーディング配列に結合するのを防止する。翻訳を阻害するには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計することにより、リボソームが、ＴＭＰをコードする転写物に結合するのを防ぐ。
【０３１５】
１２  ＴＭＰの発現
ＴＭＰの発現および精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて行うことができる。細菌内でＴＭＰが発現するよう、ｃＤＮＡを好適なベクターにサブクローニングする。ベクターは、抗生物質耐性遺伝子と、ｃＤＮＡ転写レベルを高める誘導性のプロモーターとを持つものを用いる。このようなプロモーターの例には、限定するものではないが、ｌａｃオペレーター調節エレメントに関連するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーターおよびｔｒｐ−ｌａｃ（ｔａｃ）ハイブリッドプロモーターが含まれる。組換えベクターを、ＢＬ２１（ＤＥ３）などの好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性細菌にＴＭＰを発現させるには、イソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘発する。真核細胞でのＴＭＰの発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に、一般にバキュロウイルスとして知られるＡｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の組換え型を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須ポリヘドリン遺伝子をＴＭＰをコードするｃＤＮＡと置換するには、相同組換えを行うか、或いは、転移プラスミドの媒介を伴う、細菌の媒介による遺伝子転移を行う。ウイルスの感染力は維持され、強力な多角体プロモーターによって高レベルのｃＤＮＡ転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合は夜蛾の１種Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）昆虫細胞への感染に用いるが、ヒト肝細胞への感染に用いることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスへの更なる遺伝的修飾が必要になる（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ． Ｅ． Ｋ．他（１９９４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３２２４−３２２７、Ｓａｎｄｉｇ， Ｖ． 他（１９９６）Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１９３７−１９４５を参照）。
【０３１６】
殆どの発現系では、ＴＭＰが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはＦＬＡＧや６−Ｈｉｓなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製を、迅速に１回で行うことができる。ＧＳＴは日本住血吸虫からの２６ｋＤａの酵素であり、タンパク質の活性および抗原性を維持した状態で、固定化したグルタチオン上での融合タンパク質の精製を可能とする（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。精製後、ＧＳＴ要素を、操作した特定の部位においてＴＭＰからタンパク分解的に切断することが可能である。ＦＬＡＧは８アミノ酸のペプチドであり、市販されているモノクローナルおよびポリクローナル抗ＦＬＡＧ抗体（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）を用いた免疫親和性精製を可能にする。６ヒスチジン残基が連続して伸長した６−Ｈｉｓは、金属キレート樹脂（ＱＩＡＧＥＮ）上での精製を可能にする。タンパク質の発現および精製の方法は、前出のＡｕｓｕｂｅｌ（１９９５）１０章、１６章に記載されている。これらの方法で精製したＴＭＰを直接用いて、適用可能な場合は以下の実施例１６、および１７のアッセイを行うことができる。
【０３１７】
１３  機能的アッセイ
ＴＭＰの機能は、哺乳動物細胞培養系において生理的に高められたレベルでの、ＴＭＰをコードする配列の発現によって算定する。ｃＤＮＡを高いレベルで発現する強いプロモーターを持つ哺乳動物発現ベクターにｃＤＮＡをサブクローニングする。選択されるベクターの例には、ｐＣＭＶ ＳＰＯＲＴ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびｐＣＲ ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）があり、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを持つ。リポソーム製剤あるいは電気穿孔法を用いて、５〜１０μｇの組換えベクターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に、一過的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μｇのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形質移入細胞とを区別する手段が与えられる。また、標識タンパク質の発現によって、組換えベクターからのｃＤＮＡ発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰ融合タンパク質から選択できる。自動化された、レーザー光学に基づく技術であるフローサイトメトリー（ＦＣＭ）を用いて、ＧＦＰまたはＣＤ６４−ＧＦＰを発現する形質移入された細胞を同定し、それらの細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。ＦＣＭは、細胞死に先行するかあるいは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出して計量する。このような現象として挙げられるのは、プロピジウムヨウ化物によるＤＮＡ染色によって計測される核ＤＮＡ内容物の変化、前方散乱光と９０°側方散乱光によって計測される細胞サイズと顆粒性の変化、ブロモデオキシウリジンの取込量の低下によって計測されるＤＮＡ合成の下方調節、特異抗体との反応性によって計測される細胞表面および細胞内におけるタンパク質の発現の変容、および蛍光複合アネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変容とがある。フローサイトメトリー法については、Ｏｒｍｅｒｏｄ， Ｍ． Ｇ．（１９９４）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹに記述がある。
【０３１８】
遺伝子発現におけるＴＭＰの影響は、ＴＭＰをコードする配列と、ＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰのどちらかとが形質移入された、高度に精製された細胞集団を用いて評価することができる。ＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰは、形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の、保存された領域と結合する。形質転換された細胞と形質転換されない細胞とは、ヒトＩｇＧかＣＤ６４に対する抗体かのどちらかで被覆された磁気ビーズを用いて効率的に分離することができる（ＤＹＮＡＬ， Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ ＮＹ）。ｍＲＮＡは、当業者に周知の方法で細胞から精製することができる。ＴＭＰと、目的とする他の遺伝子とをコードするｍＲＮＡの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析することができる。
【０３１９】
１４  ＴＭＰに特異的な抗体の作製
実質的に精製されたＴＭＰを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ；例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｍ．Ｇ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：４８８−４９５を参照）または他の精製技術で作製し、これを用いて標準的なプロトコルでウサギを免疫化して抗体を作り出す。
【０３２０】
別法では、ＴＭＰアミノ酸配列をＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて解析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを合成してこれを用いて当業者に周知の方法で抗体を生産する。Ｃ末端付近の、或いは隣接する親水性領域内のエピトープなどの適切なエピトープの選択については、当分野で周知である（例えば、前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９５，１１章を参照）。
【０３２１】
通常は、長さ約１５残基のオリゴペプチドを、ＦＭＯＣケミストリを用いるＡＢＩ ４３１Ａ ペプチドシンセサイザ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて合成し、Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を用いた反応によってＫＬＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）に結合させて、免疫原性を高める（例えば前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９５を参照）。完全フロイントアジュバントにおいて、オリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性および抗ＴＭＰ活性を検査するには例えば、ペプチドまたはＴＭＰを基板に結合し、１％ＢＳＡを用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに、放射性ヨウ素標識したヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させる。
【０３２２】
１５  特異的抗体を用いる天然ＴＭＰの精製
天然ＴＭＰあるいは組換えＴＭＰを実質的に精製するため、ＴＭＰに特異的な抗体類を用いるイムノアフィニティー（免疫親和性）クロマトグラフィを行う。イムノアフィニティーカラムは、ＣＮＢｒ−活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のような活性化クロマトグラフィー用レジンと抗ＴＭＰ抗体とを共有結合させることにより形成する。結合後に、製造者の使用説明書に従ってこのレジンをブロックし、洗浄する。
【０３２３】
ＴＭＰを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、ＴＭＰを優先的に吸着できる条件で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファーで）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とＴＭＰとの結合を切るような条件で（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸イオンのようなカオトロープで）溶出させ、ＴＭＰを回収する。
【０３２４】
１６  ＴＭＰと相互作用する分子の同定
ＴＭＰまたは生物学的に活性なＴＭＰ断片を、１２５Ｉボルトンハンター試薬で標識する。（例えば Ｂｏｌｔｏｎ， Ａ．Ｅ．およびＷ．Ｍ． Ｈｕｎｔｅｒ（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １３３：５２９−５３９を参照）。マルチウェルプレートの各ウェルに予め配列しておいた候補の分子群を、標識したＴＭＰと共にインキュベートし、洗浄して、標識したＴＭＰ複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々なＴＭＰ濃度で得られたデータを用いて、候補分子と結合したＴＭＰの数量、親和性、および会合についての値を計算する。
【０３２５】
別法では、ＴＭＰと相互作用する分子を、Ｆｉｅｌｄｓ， Ｓ．および Ｏ． Ｓｏｎｇ（１９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６）に記載の酵母２−ハイブリッドシステム（ｙｅａｓｔ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）や、ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などの、２−ハイブリッドシステムに基づく市販のキットを用いて分析する。
【０３２６】
ＴＭＰはまた、ハイスループット型の酵母２ハイブリッドシステムを使用するＰＡＴＨＣＡＬＬＩＮＧプロセス（ＣｕｒａＧｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ ＣＴ）に用いて、遺伝子の２つの大きなライブラリによってコードされるタンパク質間の全ての相互作用を決定することができる（Ｎａｎｄａｂａｌａｎ， Ｋ． 他 （２０００） 米国特許第６，０５７，１０１号）。
【０３２７】
１７  ＴＭＰ活性の実証
ＴＭＰのギャップ結合活性
ＴＭＰのギャップ結合活性を実証するには、細胞間チャネルの形成を誘発する能力を、１対のアフリカツメガエル卵母細胞にＴＭＰのｃＲＮＡを注入して調べる（Ｈｅｎｎｅｍａｎｎ、前出）。ＴＭＰｃＲＮＡを実験注入する１週間前に、卵母細胞に、ＴＭＰに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを注入してバックグラウンドを低減する。ＴＭＰｃＲＮＡ注入卵母細胞のインキュベートを１晩行い、卵黄膜を剥ぎ、対にして、接合部電流の記録を、２細胞電圧固定で行う。測定したコンダクタンスは、ＴＭＰのギャップ結合活性に比例する。
【０３２８】
別法では、ＴＭＰ活性のアッセイのための、ＴＭＰのイオンチャネル活性の測定に、イオンコンダクタンスについての電気生理学的アッセイを用いる。哺乳動物細胞株、（例えばＣＯＳ７、ＨｅＬａ、若しくはＣＨＯなど）を、ＴＭＰをコードする真核細胞発現ベクターで形質転換させて、ＴＭＰを発現し得る。真核細胞発現ベクターは市販されており、それらを細胞内に導入する技術は当業者には周知である。β−ガラクトシダーゼなど多数のマーカー遺伝子のいずれか１つを発現させる第二のプラスミドをこれら細胞へと同時形質転換することにより、外来ＤＮＡを取り込んで発現させた細胞群の迅速な同定が可能となる。形質転換の後、この細胞株がＴＭＰおよびβ−ガラクトシダーゼを発現し蓄積するのに適した条件下でこれらの細胞を４８〜７２時間、インキュベーションする。
【０３２９】
β−ガラクトシダーゼを発現する形質転換細胞は、好適な比色用基質が本技術分野で公知の条件下で培地へ添加されると、青く染色される。染色した細胞は、本技術分野で公知の電気生理技術を用いて膜コンダクタンスの違いを試験する。形質転換していない細胞、および／または、形質転換に、ベクター配列群のみ、またはβ−ガラクトシダーゼ配列群のみを用いた細胞を対照として用い、平行して試験する。ＴＭＰを発現する細胞は、対照細胞に比べてより高いアニオンコンダクタンスまたはカチオンコンダクタンスを持つこととなる。コンダクタンスに対するＴＭＰの寄与は、ＴＭＰに特異的な抗体類を用いて細胞をインキュベートすることで確認し得る。抗体は、ＴＭＰの細胞外側に結合することにより、イオンチャネル内のポアと、それに伴うコンダクタンスとをブロックする。
【０３３０】
ＴＭＰの膜貫通タンパク質活性
ＴＭＰ活性に対する或るアッセイは、細胞表面におけるＴＭＰの発現を測定する。ＴＭＰをコードするｃＤＮＡを、好適な哺乳動物細胞株に形質移入する。細胞表面タンパク質を、記載されているようにビオチンで標識する（ｄｅ ｌａ Ｆｕｅｎｔｅ， Ｍ． Ａ． 他 （１９９７） Ｂｌｏｏｄ ９０：２３９８−２４０５）。ＴＭＰ特異抗体を用いて免疫沈降を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット技術を用いて免疫沈降サンプルを分析する。標識された免疫沈降素と非標識免疫沈降素との比は、細胞表面に発現したＴＭＰの量に比例する。
【０３３１】
ＴＭＰ活性の或る別のアッセイは、リガンド／受容体が媒介する、細胞増殖の変調についての原型のアッセイに基づいている。このアッセイは、ＴＭＰを発現するスイスマウス３Ｔ３細胞において新規に合成されたＤＮＡの量を測定する。ＴＭＰをコードするｃＤＮＡを持つ好適な哺乳動物発現ベクターを、当分野で周知のトランスフェクション法を用いて静止状態の３Ｔ３培養細胞に加える。形質転換細胞を、［３Ｈ］チミジンと可変量のＴＭＰリガンドとの存在下でインキュベートする。酸沈殿性ＤＮＡ内へ取り込まれた［３Ｈ］チミジンを、トリチウムラジオアイソトープカウンターを用いて適当な時間間隔で測定する。取り込まれた量は、新規に合成されたＤＮＡの量に正比例する。少なくとも１００倍のＴＭＰリガンド濃度範囲に対する用量反応曲線がリニアであることは、受容体活性を示唆するものである。ミリリットル当りの１単位の活性の定義は、５０％の反応レベルを産出するＴＭＰの濃度であり、１００％であれば、［３Ｈ］チミジンを酸沈殿性ＤＮＡに最大限、取り込むことを表す（ＭｃＫａｙ， Ｉ．およびＬｅｉｇｈ， Ｉ．， ｅｄｓ． （１９９３） Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ７３ページ）。
【０３３２】
当業者は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本発明の記載した方法およびシステムの種々の修正を行い得る。本発明について説明するにあたり幾つかの実施態様に関連して説明を行ったが、本発明の請求の範囲が、そのような特定の実施態様に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載する本発明の実施方法の様々な修正は、明確に特許請求の範囲内にあるものとする。
【０３３３】
（表の簡単な説明）
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の命名法の概略を示す。
【０３３４】
表２は、ＧｅｎＢａｎｋ識別番号と、本発明のポリペプチドに最も近いＧｅｎＢａｎｋ相同体の注釈とを示す。また、各ポリペプチドとその相同体（１つ以上）が一致する確率スコアも併せて示す。
【０３３５】
表３は、予測されたモチーフおよびドメインを持つ本発明のポリヌクレオチド配列の構造的特徴を、ポリペプチドの分析に用いる方法、アルゴリズムおよび検索可能なデータベースと共に示す。
【０３３６】
表４は、本発明のポリヌクレオチド配列を構築するために用いたｃＤＮＡ断片やゲノムＤＮＡ断片を、ポリヌクレオチド配列の選択した断片と共に示す。
【０３３７】
表５は、本発明のポリヌクレオチドの代表的なｃＤＮＡライブラリを示す。
【０３３８】
表６は、表５に示したｃＤＮＡライブラリの作製に用いた組織およびベクターを説明する付表である。
【０３３９】
表７は、本発明のポリヌクレオチドとポリペプチドの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可能な説明、引用文献および閾値パラメータと共に示す。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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