(57)【要約】レシピエント細胞の核の近赤外可視化を用いる、核移入によって、ならびに核移入および卵子移入の組み合わせによって、クローン化された非ヒト動物を産生する方法が、本発明書中に記載される。トランスジェニック鳥類、ノックアウト鳥類、およびノックイン鳥類が提供される。外因性タンパク質を含有する卵を産生するための方法が、本発明によって包含される。従って、本発明は、クローン化された鳥類を産生するための効果的な経路に必要なものを満たす。【特許請求の範囲】
【請求項１】
クローン化された非ヒト動物を産生する方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）レシピエント細胞を提供する工程；
（ｉｉ）該レシピエント細胞の核物質を、近赤外領域の光を用いて可視化する工程；
（ｉｉｉ）該レシピエント細胞を脱核する工程；
（ｉｖ）ドナー核を該レシピエント細胞に導入して、再構築された接合子を産生する工程；
（ｖ）該再構築された接合子を活性化する工程；および
（ｖｉ）該再構築された接合子を発生まで発達させる工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記レシピエント細胞の核物質が、二光子レーザー走査顕微鏡を用いて、近赤外線によって可視化される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記可視化および切除が、二光子レーザー走査顕微鏡を用いて実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記動物が鳥類である、方法。
【請求項５】
クローン化された非ヒト動物を産生する方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）レシピエント細胞を提供する工程；
（ｉｉ）該レシピエント細胞の核物質を、近赤外領域の光を用いて可視化する工程；
（ｉｉｉ）該レシピエント細胞を、該近赤外領域の光を用いて脱核する工程；
（ｖｉ）ドナー核を該レシピエント細胞に導入して、再構築された接合子を産生する工程；
（ｖｉｉ）該再構築された接合子を活性化する工程；および
（ｖｉ）該再構築された接合子を発生まで発達させる工程、
を包含する、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、前記レシピエント細胞の核が、二光子レーザー走査顕微鏡を用いて可視化される、方法。
【請求項７】
トランスジェニック鳥類を産生する方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）鳥類レシピエント細胞を提供する工程；
（ｉｉ）該レシピエント細胞の核物質を、近赤外領域の光を用いて可視化する工程；
（ｉｉｉ）該レシピエント細胞を、脱核する工程；
（ｖｉｉｉ）トランスジェニック鳥類のドナー核を該レシピエント細胞に導入して、再構築された鳥類接合子を産生する工程；
（ｉｘ）該再構築された接合子を活性化する工程；および
（ｖｉ）該再構築された接合子を発生まで発達させる工程、
を包含する、方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、導入遺伝子が、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、β−カゼイン、α−１アンチトリプシン、アンチトロンビンＩＩＩ、コラーゲン、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、フィブリノーゲン、ヒアルロン酸、インスリン、ラクトフェリン、プロテインＣ、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、飼料添加酵素、ソマトトロピン、およびキモトリプシンからなる群より選択されるタンパク質をコードする、方法。
【請求項９】
タンパク質を産生する方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）請求項８に記載の方法に従って、トランスジェニック鳥類を産生する工程であって、導入遺伝子は、外因性タンパク質をコードし、該タンパク質は、該鳥類の発生卵の白身に配置される、工程；
（ｉｉ）殻の堅い卵を収集する工程；および
（ｉｉｉ）該卵から該外因性タンパク質を単離する工程
を包含する、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、前記外因性タンパク質が、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、β−カゼイン、α−１アンチトリプシン、アンチトロンビンＩＩＩ、コラーゲン、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、フィブリノーゲン、ヒアルロン酸、インスリン、ラクトフェリン、プロテインＣ、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、飼料添加酵素、ソマトトロピン、およびキモトリプシンからなる群より選択される、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
ａ）発明の分野
本発明は、一般的にクローン化細胞、胚、および動物に関し、そして核移入ならびに核移入および卵子移入の組み合わせを介して、それらを産生する方法に関する。特に、本発明は、鳥類のクローニングに関する。
【０００２】
ｂ）関連分野の説明
生物科学者の主要な目的は、培養によって維持され得る細胞集団から子孫を産生すること、および生殖細胞系列を通じて所望の形質を伝播する、安定な所望の表現型を得ることである。核移入に関して、培養細胞株の有用性は、ドナー核の細胞周期の同調化を促進し、そして、再構築された胚における細胞周期の協調の最適化を可能とする。安定な所望の表現経路を得るために、培養細胞集団からの核移入は、遺伝子改変への有望な代替的経路を提供する。最近までは、家畜動物における遺伝子改変は、必要とされる遺伝子が、接合子の前核に注入される、前核注入に限定されていた。前核注入は、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、およびウシを含む、複数種において適用されたが、この技術には、多数の不都合がある。遺伝子の組み込みが、常に、最初の細胞周期の間に起こるとは限らず、モザイク胚の産生が、生じる。さらには、組み込みは、ゲノム内でランダムに起こり、遺伝子産物の多様な発現が、生じる。従って、生殖細胞系の伝播を可能とする、必要とされる表現型を有する動物の産生は、複数のトランスジェニック株の産生、および創始動物の大量飼育を、要求し得る。対照的に、培養によって維持され得る細胞からの核移入による動物の産生は、前核注入よりも、多くの利点を提供する。核移入において、核ドナー細胞として用いられるべき細胞は、有性で、任意に遺伝子的に改変され、そしてそれらの使用前に培養において選択され得る。得られた動物は、単独の核から産生され、従って、モザイクは、回避され得る。遺伝子改変は、容易に子孫へと伝播される。さらに、全ての動物細胞は、導入遺伝子を含有する傾向にあり、そして発現は、目的の組織において得られ得る。
【０００３】
培養された体細胞から、核移入によって生きた子孫を産生する能力はまた、動物種の正確な遺伝子操作のための経路も、提供する。そのような改変は、遺伝子の付加または「ノック−イン」、ならびに遺伝子もしくはそれらの調節配列の除去もしくは不活性化または「ノック−アウト」を含む（Ｐｏｌｅｊａｅｖａら、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ、５３（１）：１１７−２６（２０００））。遺伝子ターゲッティング技術によってもまた、内因性タンパク質をコードする特定の遺伝子が、外因性のヒトタンパク質をコードするヒト遺伝子によって置換されたトランスジェニック動物の産生が見込まれる。ＹｏｍおよびＢｒｅｍｍｅｌは、１９９３年、牛乳における主要なタンパク質をコードする遺伝子が、ヒトの対応物によって置換され得ることを、示唆した。この様式で改変されたウシは、ヒトの幼児に対してより栄養があり、かつ幼児用調製乳の製造に対してより適切であり得る、ヒト乳汁タンパク質を含む乳汁を産生した（Ｙｏｍ，Ｈ．Ｃ．およびＢｒｅｍｍｅｌ，Ｒ．Ｄ．、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、１９９３、５８（補遺）３０６Ｓ）。ブタ、ヒツジ、ヤギ、およびウシの乳汁における外因性のタンパク質産生のための方法が、報告されている。
【０００４】
ＷｉｌｍｕｔおよびＣａｍｐｂｅｌｌ（ＧＢ  ２  ３３１  ７５１  Ｂ）は、適切なレシピエント細胞に、二倍体のドナー細胞の核を移入することによる、再構築された動物胚の産生を報告している。ドナー細胞は、休止していて、（すなわち、活発に増殖していない）、Ｇ０期またはＧ１期にあるとして特徴付けられる。レシピエント細胞としては、好ましくは、脱核された、中期Ｉまたは中期ＩＩにおける卵母細胞、接合子、および２細胞の胚が挙げられる。脱核は、分裂、吸引、または照射によって達成される。核の視覚化に基づいて予想されるこれらの機械的技術においては、ＤＮＡ特異的な蛍光色素の使用が、必要とされる。
【０００５】
核移入（ＮＴ）は、ドナー細胞からの、脱核されたレシピエント細胞（受精された（接合子）または受精されていない（卵母細胞）細胞など）への、完全な二倍体の遺伝物質（核に含有されたそのＤＮＡ）の移入を含む。この技術は、複数の工程を包含する。ドナー細胞は最初、培養により特定の条件下で生育され、数倍のオーダーで細胞数を増加させる。次いでドナー細胞の核は、卵母細胞または接合子に、移入され、再構築された胚が生じる。活性化（発生の開始）は、通常人工的に、もっともしばしば化学的に、ひき起こされる。次いで、この胚は、雌の動物に移植され、そして発生まで発達させる（ｔｏ  ｄｅｖｅｌｏｐ  ｔｏ  ｔｅｒｍ）。いくつかの種（マウス、ウシ、およびヒツジ）において、この再構築された胚は、レシピエントへの移入の前に、培養によって、胚盤胞の段階まで生育され得る。
【０００６】
脱核された卵母細胞または接合子への割球核の移入による、哺乳動物の胚の再構築は、遺伝的に一卵性の個体を産生することが、報告されている（Ｅｙｅｓｔｏｎｅら、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｕｐｐ．、５４：４８９−９７（１９９９））。単一の胚から産生され得る子孫の数は、割球の数（家畜動物種においては、３２細胞〜６４細胞の段階の胚が、もっとも広範に用いられる）および核移入手順の効率の両方によって制限されるが、培養により増殖され、かつ維持され得る細胞からの核移入によって、生きた子孫を産生する能力は、多くの利点を提供する。この利点としては、延長された期間にわたる一卵性の子孫の産生（培養細胞は、冷凍され、無期限に保存され得るので）、ならびに胚の再構築の前に、特定の遺伝子型または表現型の細胞集団を、遺伝的に改変および選択する能力が挙げられる。この目的は、胎児および成体の胚物質から確立された培養細胞由来の核を用いた子ヒツジの産生により達成された。
【０００７】
二つの型のレシピエント細胞が、共通して核移入に用いられる：それは、第二減数分裂の中期（ＭＩＩ）にて停止した卵母細胞および前核接合子である。マウスにおいては、脱核された、二細胞期の割球が、レシピエントとして用いられた。家畜種において、前核接合子が用いられる場合、発生は、前核が接合子間で置換される場合を除くと、常に起こるとは限らず、従って、ＭＩＩ期にて停止した卵母細胞が、しばしばレシピエントの選択肢となった。ＭＩＩ期にて停止した卵母細胞は、核を含有しないが、染色体が、減数分裂時の紡錘体上に配置される、赤道板を含有する。ＭＩＩ期の染色体または赤道板は、哺乳動物の卵母細胞中においては、光学顕微鏡下で容易には見えない。しかし、ＭＩＩ期の染色体または赤道板の可視化は、ＤＡＰＩ（４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール，ヒドロクロリド）染色またはＨｏｅｓｃｈｔ３３３４２（ビス−ベンズイミド）染色を用いて紫外線光により、達成された。脱核およびドナーの遺伝物質の導入の後、再構築された胚は、それが、レシピエント動物に移入され得る段階、一般的には桑実胚期または未分化胚芽細胞の段階まで培養されなくてはならない。このことはインビトロまたはインビボで行われ得る（Ｅｙｅｓｔｏｎｅら、前出）。また二重核移入も、報告されていて、その方法においては、活性化された、既に移入されている核が、宿主の未受精卵から取り出され、そして脱核された受精胚に二度目の移入をされる（Ｐｏｌｅｊａｅｖａら、Ｎａｔｕｒｅ，４０７：５０５−９（２０００））。
【０００８】
核移入と組み合わせた遺伝子ターゲッティング技術は、栄養学的および薬学的応用に関して非常に有望であるが、現在の取り組みは、創始者と産生トランスジェニック群との間の長い世代時間、ならびに多大なる農業的および獣医学的コストを含む、複数の制限を受ける。従って、核移入のための培養体細胞の使用が、より効率的に行われる系を用いることが所望される。大きな潜在性を有する１つの系は、鳥類の再産生系である。
【０００９】
鳥類の再産生系（ニワトリのそれを含む）は、十分に記載されている。卵の産生は、メンドリの卵巣における大きな卵黄の形成から始まる。未受精の卵母細胞または卵子は、卵黄嚢の頂部に位置されている。排卵または卵巣からの卵黄の放出の際、未受精の卵母細胞または卵子は、精子が存在する場合にそこでこれらが受精される卵管漏斗を通過する。次いでこれらは、管状腺細胞が並べられた卵管のマグナム（ｍａｇｎｕｍ）に移動する。これらの細胞は、卵白タンパク質（オボアルブミン、リゾチーム、オボムコイド、コンアルブミン、およびオボムチンを含む）を、マグナムの内腔内に分泌し、その内腔からそれらは、鳥類の胚および卵黄に配置される。
【００１０】
鳥類における核移入に向けての取り組みは、実現が難しいままである。１つの重要な課題は、初期の鳥類の卵の利用しにくさである。鳥類の初期の胚の可視化を必要とするあらゆる形態の遺伝子操作が、標的構造体を適切に可視化し得ないことによって妨げられてきたことは、当該分野において周知である。核移入において、脱核後に、ドナー細胞（核ドナー）からの遺伝物質は、脱核された卵母細胞に導入されなくてはならない。脱核されたレシピエント細胞質体を産生するためには、胚盤内の卵の卵黄膜の約２５μｍ真下に存在する中期ＩＩ赤道板または前核を可視化することが、必要不可欠である。しかし、卵黄の巨大なサイズおよび光学濃度は、鳥類の初期胚およびその構造体の可視化を達成することを困難にしてきた。
【００１１】
メンドリの卵管は、高レベルのタンパク産性、標的タンパク質の適切な折りたたみおよび翻訳前修飾、ならびに生成物回収の容易さに起因して、タンパク質バイオリアクターとして顕著な潜在性を、提供する。結果として、ＤＮＡのマイクロインジェクションを用いて、卵管において外因性タンパク質を発現するトランスジェニックニワトリを作製するための努力が、されてきた（ＰＣＴ公開ＷＯ９７／４７７３９）。Ｂｏｓｓｅｌｍａｎらは、複製欠損レトロウイルスベクターを、インキュベートしていないヒヨコ胚の多能性幹細胞へと導入する方法を記載し、そしてさらに、その細胞が外因性ベクターの核酸配列を発現する、キメラニワトリを記載する。しかし、そのＧ１トランスジェニック子孫（ベクター陽性の雄のＧ０鳥からの子孫）のパーセンテージは、低くそして１％と約８％との間で変化した（米国特許第５，１６２，２１５号）。一般的に、鳥類の卵へのＤＮＡの注入はこれまで、乏しくそして不安定な導入遺伝子の組み込みに至っていた（ＳａｎｇおよびＰｅｒｒｙ、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．、１：９８−１０６（１９８９）；ならびにＮａｉｔｏら、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．、３７：１６７−７１（１９９４））。さらには、ウイルスベクターの使用は、制限される導入遺伝子のサイズおよび子孫の潜在的なウイルス感染を含む、多くの制限を与える。（前出の）ＤＮＡのマイクロインジェクションを用いたトランスジェニックニワトリの産生は、非効率的および時間浪費の両方である。実際に、バイオリアクターとしての任意の動物の使用の主な制限は、その動物ゲノムへの所望の導入遺伝子の導入に必要とされる時間（ニワトリについては約１０ヶ月、有蹄類については２年〜３年）である。
【００１２】
メンドリはまた、マグナム腺の効率的で直接的な遺伝子導入のための独特の系も提供するが、しかし初期の試みは、乏しい結果を生み出した。導入遺伝子を保有するプラスミドＤＮＡは、エレクトロポレーションによって、成熟したメンドリのマグナムへと直接導入された（Ｏｃｈｉａｉら、Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、７７：２９９−３０２（１９９８））。成熟したメンドリの卵管の大きなサイズ、細胞におけるプラスミドＤＮＡの一過性の持続、および器官エレクトロポレーションの非効率性に起因して、非常に低レベルのタンパク質のみが、屠殺されたメンドリの卵管組織において検出され、そしてその卵において検出されるような発現タンパク質は、報告されなかった。他の試みとしては、鳥類からの細胞の除去の後の、発現カセットを用いたマグナム細胞のトランスフェクションおよび卵管細胞培養の調製が挙げられる（Ｓａｎｄｅｒｓら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１１６：３９８−４０５（１９８５）；Ｓａｎｄｅｒｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７：６５５０−６５５７（１９８８）；Ｓｃｈｗｅｅｒｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６５：７５９０−７５９５（１９９０）；Ｏｔｔｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、２：１４３−１４７（１９８８）；およびＳｃｈｗｅｅｒｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６６：１０４９０−１０４９７（１９９１））。
【００１３】
卵子移入（レシピエントメンドリの卵管へのドナー卵子の移入）は、鳥類における遺伝子操作のための別の手段を提供する。Ｔａｎａｋａらは、卵および殻形成を完全にするために、レシピエントメンドリの卵管に受精卵を戻すことによるインビトロでの受精（ＩＶＦ）によって、ヒヨコを産生した。この実験的手法は、トランスジェニック鳥類の産生についての有用なモデルを示唆する（Ｔａｎａｋａら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ、１００：４４７−４４９（１９９４））。
【００１４】
別の主要な課題は、再構築された卵の培養である。顕微操作の後に、再構築された接合子を孵化させることは、必要不可欠である。ひとつの解決方法は、Ｐｅｒｒｙらによって提唱された（米国特許第５，０１１，７８０号）。Ｐｅｒｒｙらは、エキソオボ（ｅｘ  ｏｖｏ）培養を用いて、ドナーメンドリから胚および卵黄を取出し、そしてその胚および卵黄を、一連の別々の培養系にて孵化までインキュベートする。しかし、この手順は、少数の「試験管ニワトリ」の孵化を扱う、困難かつ非効率なものである。
【００１５】
脱核およびその後の核移入のプロセスを容易にするためにレシピエント細胞における核構造体を可視化するための、改善された方法を提供することが、本発明の目的である。
【００１６】
後の核移入を容易にするためにレシピエント細胞において核を切除するための、改善された方法を提供することもまた、本発明の目的である。
【００１７】
鳥類卵の利用しにくさおよび再構築された接合子の培養の困難さなどの、鳥類のクローニングに関連する技術的な障害を克服する方法を提供することが、本発明の特別の目的である。クローン化された鳥類の産生のための、鳥類における好首尾な核移入のための新規かつ有用な方法は、当該分野における現在の要求を満たす。本様式でクローン化された鳥類は、遺伝子的に改変され得る。商用に適した、卵において生じる外因性タンパク質の発現および配置は、公共に対する直接の利益を提供する。
【００１８】
（発明の要旨）
本発明は、クローン化細胞、細胞株、胚、および動物ならびに、二光子可視化、切除またはその両方を用いた核移入によってそれらを生産する方法を提供する。ひとつの実施形態において、卵子移入と組み合わせた核移入が、用いられる。クローン化された鳥類およびトランスジェニック鳥類（ノックアウトおよびノックインを含む）もまた、提供される。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態において、二光子レーザー走査顕微鏡（ｔｗｏ−ｐｈｏｔｏｎ  ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）（ＴＰＬＳＭ）は、レシピエント細胞中の核構造体を可視化するために用いられる。可視化の後に、その細胞は、二光子レーザー媒介切除を必要に応じて用いて、脱核され、レシピエント細胞質体を提供する。あるいは、そのレシピエント細胞はまた、細胞分裂、核構造体の吸引、照射、または他の脱核手順を介して脱核され得る。好ましくは、そのレシピエント細胞は、動物より取り出され、その核は、二光子レーザー媒介切除を介して可視化および切除される。次いで、ドナー核は、細胞融合、マイクロインジェクション、または他の核再構築手順によって、レシピエント細胞へと挿入される。レシピエント細胞の核とドナー細胞の核との置換は、再構築された接合子を生む。再構築された接合子は、インビボまたはインビトロにおいて、活性化され、そして発生までの発達（ｔｏ  ｄｅｖｅｌｏｐ  ｔｏ  ｔｅｒｍ）を可能とされ得る。本発明の好ましい実施形態においては、動物は、ニワトリ、アヒル、七面鳥、ウズラ、キジ、およびダチョウを含むが、これらに限定されない、鳥類である。
【００２０】
本発明の別の局面は、卵子移入と組み合わせた核移入を含む、クローン化された動物を産生する方法を提供する。ＴＰＬＳＭおよび二光子レーザー媒介切除は、核移入を実施するために用いられ、ここでドナー核は、通常の核型であっても、遺伝子的に改変されたものであってもよい。従って、レシピエント細胞の核とドナー細胞の核との置換は、再構築された接合子を生じる。その卵子は、卵子移入を介して培養され得るか（それによって再構築された接合子は、レシピエント動物へと移入される）、またはインビトロで培養され得、そして発生まで発達（ｔｏ  ｄｅｖｅｌｏｐ  ｔｏ  ｔｅｒｍ）し得る。
【００２１】
本発明の別の局面は、卵子移入と組み合わせた核移入を含む、クローン化された鳥類を産生する方法を提供する。ＴＰＬＳＭおよび二光子レーザー媒介切除は、核移入を実施するために用いられ、ここでドナー核は、通常の核型であっても、または遺伝子的に改変されたものであってもよい。従って、レシピエント細胞の核とドナー細胞の核との置換は、再構築された接合子を生じる。その卵子は、卵子移入を介して培養され得るか（ここで再構築された接合子を含有するこの卵子は、レシピエント鳥類へと移入される）、またはインビトロで培養される。一旦移入されると、その胚は、レシピエントメンドリの体内において発生し、そしてメンドリの卵管を通過し、ここで、その胚は天然の卵白タンパク質および天然の卵殻によって包まれる。外因性の卵黄および再構築された胚を含有する卵が、産まれ、次いでインキュベートされ得、そして通常のヒヨコのように孵化され得る。得られたヒヨコは、遺伝子的に改変され得る。１つの実施形態においては、遺伝子的に改変された、クローン化された鳥類は、そのすべてのまたはほとんどの細胞中に、導入遺伝子を有する。成熟後、そのトランスジェニック鳥類は、１つ以上の外因性タンパク質を含有する卵を産み得る。核移入および卵子移入の組み合わせは、クローン化された鳥類の調製を可能にする。代替的な実施形態において、エキソオボ培養が、卵子移入の代わりに、クローン化された鳥類を産生するために用いられ得る。本発明の好ましい実施形態において、鳥類とは、ニワトリ、アヒル、ウズラ、七面鳥、キジまたはダチョウである。
【００２２】
本発明の別の局面は、（ｉ）二光子可視化および／または切除を介する核移入を用いて、外因性タンパク質をコードする遺伝子を保有する、トランスジェニック鳥類を調製する工程、ならびに（ｉｉ）未成熟のトランスジェニック鳥類を成熟するまで成長させる工程、によってトランスジェニック鳥類を産生する方法を提供し、ここでその外因性タンパク質は、成熟した鳥類の卵管内腔に分泌されそしてその鳥類の産む卵内に配置される。好ましくは、安定な導入遺伝子を含む外因性のＤＮＡ、およびトランスジェニック鳥類は、繁殖され得、そして成長する。新規トランスジェニック鳥類は、１つ以上の所望される外因性タンパク質を含有する卵を産む能力を有する。
【００２３】
さらに、本発明の別の局面は、（ｉ）二光子可視化および／または切除を介する核移入に従って、ノックアウトまたはノックイン鳥類を調製する工程、ならびに（ｉｉ）未成熟のノックアウトまたはノックインの産卵する動物を成熟するまで成長させ得る工程、によってノックアウトまたはノックイン鳥類を産生する方法を提供する。このノックアウト鳥類は、通常卵中に存在する内因性タンパク質のすべては含有しない卵を産み得る。これは、卵中に見られる、潜在的に所望でない物質（例えば、アレルゲン）の排除、または特定の栽培学的特性の抑制を可能とする。ノックイン配列は、別の動物の機能的な相同の遺伝子または遺伝子セグメントによって、その動物の内因性遺伝子の全てまたは一部を置換し得る。
【００２４】
必要に応じて遺伝子的に改変された、クローン化された非ヒト細胞、細胞株、胚、および動物は、本発明によって包含される。トランスジェニック動物、ノックアウト動物、およびノックイン動物もまた、提供される。１つの実施形態において、適切なレシピエント細胞への、ドナー細胞の核の移入によって調製された、再構築された鳥類の胚（特にヒヨコの胚）が、提供される。そのドナー細胞は、休止細胞であり得るか、または非休止細胞であり得る。
【００２５】
さらに、自然に発生する鳥類の卵に対して外因性であるタンパク質を含有するインタクトな鳥類の卵が、本発明によって提供される。
【００２６】
（発明の詳細な説明）
ａ）定義および一般的なパラメーター
以下の定義は、本明細書の本発明を記載するために用いられる多様な用語の意味および範囲を、明示しかつ規定するために示される。
【００２７】
用語「ＴＰＬＳＭ」は、二光子レーザー走査顕微鏡を言う。ＴＰＬＳＭは、ニ光子に励起された蛍光の現象（ここで２つの光子は、蛍光分子に同時に衝突する）に基づく。これらの結合されたエネルギーは、蛍光発光を誘導する発蛍光団によって吸収され、この蛍光発光は、光電子増倍機によって検出され、そしてデジタル画像に変換される。ＴＰＬＳＭの主な利点は、生存力に影響を及ぼさずに、生きた画像および必要に応じて延長された期間にわたる光学的に稠密な構造の画像を作製する能力にある。これは、ＴＰＬＳＭが、散乱している検体のより深くまで貫通し得る生物学的に無害なパルス赤外光を用いるので起こる。したがって、本方法は、光学的に稠密な卵母細胞（例えば、鳥類の卵）の、非侵襲性で三次元のリアルタイム画像を生成する能力を提供する。
【００２８】
可視化に加えて、ＴＰＬＳＭはまた、脱核のために用いられ得る。
【００２９】
本明細書において、用語「卵子」および「卵母細胞」は、互換的に用いられる。一度に１つの卵子だけが成熟するが、１体の動物は、限られた数の卵子から産まれる。排卵（卵胞からの卵の離脱）は、脳下垂体が黄体形成ホルモン（ＬＨ）を放出するときに、起こる。成熟した胞は、結合組織および平滑筋の茎（ｓｔａｌｋ）または茎（ｐｅｄｉｃｌｅ）を、形成する。排卵後すぐに、この胞は、薄い壁の嚢（排卵後の胞）となる。成熟した卵子は、その嚢から噴出し、そしてその卵管を通る行程を始める。最終的に、この卵子は、受精の起こる漏斗部分に入る。受精は、この卵子がアルブミンによって覆われてしまう前に、排卵の１５分以内に起きなくてはならない。受精の間、精子（鳥類は、多精子受精を有する）は、胚盤（胚が発生する、卵黄の頂点側にある小さな白色班）を貫通する。この精子が胚盤に刺さりこんだとき、胚は、形成を始める。ここで、これは、「胚盤葉」または「接合子」として公知である。
【００３０】
本明細書において「ドナー細胞」は、レシピエント細胞質体へと移植される核構造体の供給源を記載するために用いられる。胚の細胞、胎児の体細胞、および成体の体細胞を含む、好ましくは休止期にある、通常の核型の全ての細胞は、核ドナーになり得る。核ドナーとしての非休止期の細胞の使用は、Ｃｉｂｅｌｌｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８０：１２５６−８（１９９８）によって、同様に記載された。
【００３１】
本明細書において「レシピエント細胞」は、脱核されたレシピエント細胞、好ましくは脱核された中期Ｉまたは中期ＩＩの卵母細胞、または脱核され事前に活性化された卵母細胞を記載するために用いられる。脱核は、細胞を半分に分裂することか、赤道板、前核を吸引することによって、または照射によってさえ達成され得る。好ましい実施形態においては、脱核は二光子レーザー媒介切除を介して、なされる。あるいは、ＴＰＬＳＭは、機械的脱核を誘導するために用いられ得る。
【００３２】
「核酸配列」または「ポリヌクレオチド」としては、天然のヌクレオチド塩基アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、およびウラシルを含む、真核細胞のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ならびに合成ＤＮＡおよび合成ＲＮＡの配列が挙げられるが、これらの配列に限定されない。この用語はまた、１つ以上の改変されたヌクレオチドを有する配列を包含する。本明細書において用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸配列」は、互換的に用いられ、そしてコーディング配列（適切な調節配列または制御配列の制御下に配置された場合、インビボまたはインビトロで転写されそしてポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチドまたは核酸配列）；制御配列（例えば、翻訳開始コドンおよび翻訳終結コドン、プロモーター配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写因子結合部位、転写終結配列、上流調節ドメインおよび下流調節ドメイン、エンハンサー、サイレンサーなど）；ならびに調節配列（転写因子が結合し、そして遺伝子のプロモーター活性を、正に（誘導）か、または負（抑制）のいずれかに変更する、ＤＮＡ配列）を包含するが、これらに限定されない。長さまたは合成の起源に関する制限は、本明細書中に記載される用語によって示唆されない。
【００３３】
本明細書において用語「内因性核酸配列」および「外因性ＤＮＡ」は、互換的に用いられる。用語「内因性」は、コーディング配列、制御配列、および調節配列のような核酸配列に関連する場合、特定の細胞または組織と通常関連する配列を示す。従って、内因性配列は、天然に見出される。内因性タンパク質は、内因性コーディング配列のような、内因性ＤＮＡの発現産物である。
【００３４】
本明細書において用語「外因性核酸配列」および「外因性ＤＮＡ」は、互換的に用いられる。用語「外因性」は、コーディング配列、制御配列、および調節配列のような核酸配列に関連する場合、特定の細胞または組織にと通常関連し「ない」配列を示す。従って、核酸の「外因性」領域は、天然に他の分子と関連することが見出されない別の核酸分子中にあるか、またはそれに結合された、同定可能な核酸のセグメントである。外因性ＤＮＡは、ドナー細胞のゲノムに組み込まれ得るか、またはドナー細胞のゲノムと独立して存在し得る。例えば、外因性ＤＮＡは、ドナー細胞のゲノムに組み込まれずに、ドナー細胞中に非組換えベクターの一部として存在し得る。
【００３５】
用語「導入遺伝子」は、作動可能な連結で所望のコーディング配列および制御配列を含有し、これらの配列によって形質転換された細胞がコードされた生成物を生成し得るような、外因性のポリヌクレオチド配列を言う。形質転換を果たすために、導入遺伝子は、必要に応じて別のベクターに含まれ得る；しかし、その関連のポリペプチドもまた、宿主染色体に組み込まれたか、または組み込まれ得る組み込みベクターであり得る。「トランスジェニック動物」は、１つ以上の外因性遺伝子を発現する動物である。
【００３６】
用語「ノックアウト動物」は、そのゲノム中に通常存在する特定の遺伝子を完全に欠損する動物を言う。
【００３７】
用語「ノックイン動物」は、既に定義したコーディング領域または非コーディング領域における「ノックイン配列」のような特定の核酸配列を保有する動物を言い、ここでこのノックイン配列が、相同組換えのような、組換えの方法を介して導入される。この組換え事象は、この動物の遺伝子の全てまたは一部を、別の動物の機能的な相同遺伝子または遺伝子セグメントによって置換し、それぞれのノックイン配列がそのゲノム配列に位置されることを含む。
【００３８】
「ベクター」は、一本鎖、二本鎖、環状、超コイルのＤＮＡまたはＲＮＡを含み、好ましくは特定のコーディング配列が適切な調節塩基配列を有するそのベクター中に位置されるように構築されていて、その制御配列に関連するコーディング配列の位置および配向は、そのコーディング配列がその制御配列に関連するコーディング配列の「制御」のもとで転写されるような位置および配置である、ポリヌクレオチドを意味する。
【００３９】
「プラスミド」は、細菌または酵母の宿主細胞の中で独立して複製できる、小さい環状のＤＮＡベクターである。
【００４０】
用語「形質転換」、「形質導入」、および「トランスフェクション」はすべて、胚細胞または体細胞などの、細胞へのポリヌクレオチドの導入を示す。
【００４１】
用語「外因性タンパク質」は、特定の組織もしくは細胞において通常存在しないタンパク質もしくはポリペプチド、外因性遺伝子、外因性発現構築物もしくは導入遺伝子の発現産物であるタンパク質、または特定の組織もしくは細胞において所定の量で通常存在しないタンパク質、を意味する。
【００４２】
用語「鳥類」は、任意の公知の種または型のトリを意味する。この用語は、多様な公知のＧａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ系統、または、ニワトリ（例えば、Ｗｈｉｔｅ  Ｌｅｇｈｏｒｎ、Ｂｒｏｗｎ  Ｌｅｇｈｏｒｎ、Ｂａｒｒｅｄ−Ｒｏｃｋ、Ｓｕｓｓｅｘ、Ｎｅｗ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ、Ｒｈｏｄｅ  Ｉｓｌａｎｄ、Ａｕｓｓｔｒａｌｏｒｐ、Ｍｉｎｏｒｃａ、Ａｍｒｏｘ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｇｒａｙ、Ｉｔａｌｉａｎ  Ｐａｒｔｉｄｇｅ−ｃｏｌｏｒｅｄ）、および七面鳥、キジ、ウズラ、アヒル、ダチョウ、および商業用の量にて一般的に飼育される他の飼鳥を包含する。
【００４３】
ｂ）核移入およびＴＰＬＳＭ
本発明は、核移入によって、ならびに核移入および胚移入の組み合わせによって、クローン化された動物を産生する方法を、提供する。核移入は、動物種のクローニングを可能にし、ここで個々の工程は、胚細胞クローニング手順、胎児の細胞クローニング手順、および成体の細胞クローニング手順に共通する。これらの工程は、細胞質体とよばれる、染色体を有さないレシピエント細胞の調製（この工程は、しばしば脱核と言われる染色体の除去を含む）；ドナー細胞の核（核ドナー）の単離および再構築された胚を産生するための細胞質体への移入；必要に応じた再構築された胚の培養；および同調された宿主動物への胚移入を包含するが、これらに限定されない。
【００４４】
二光子可視化を用いる、動物における核移入に対する新規な手法が、本発明において記載される。好ましい実施形態においては、受精卵または未受精卵が、動物から取り除かれ、そしてインビトロで操作され、ここでこの卵の核物質が、可視化され、そして取り除かれ、そしてこの切除された核が、ドナー核と置換される。必要に応じて、このドナー核は遺伝子的に改変され得る。二光子レーザー走査顕微鏡（ＴＰＬＳＭ）は、核構造体を可視化するために用いられる。可視化の後に、受精卵または未受精卵などの、レシピエント細胞中の核は、必要に応じてＴＰＬＳＭを用いて、取り除かれるか、または切除される。ＴＰＬＳＭは、２つの光子が同時に蛍光分子と衝突する、二光子励起蛍光に基づく。これらの結合されたエネルギーは、発蛍光団によって吸収され、蛍光発光を誘導し、この蛍光発光は、光電子増倍管によって検出され、そしてデジタル画像へと変換される。Ｓｑｕｉｒｒｅｌｌら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７：７６３−７（１９９９）；およびＰｉｓｔｏｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、９：６６−９（１９９９）を参照のこと。ＴＰＬＳＭは、生存力に影響を及ぼさずに、生体、必要に応じて、延長された期間にわたって稠密な構造の画像を作製し得る。これは、ＴＰＬＳＭが、生物学的に無害な（通常約７００ｎｍ〜約１０００ｎｍの波長で）パルス近赤外線（これは、このパルス近赤外線を散乱させている検体のより深くまで貫通し得る）を用いるので、可能となる。ＴＰＬＳＭは、波長が固定されている、モード固定レーザー、または用いられる色素の発光の範囲に依存して、約７００ｎｍと約１０００ｎｍとの間で整調され得る製調可能レーザーなどの、異なるレーザーを用い得る。ＤＡＰＩおよびＨｏｅｓｃｈｔ３３３４２色素に対しては、７２０〜７７０ｎｍが好ましい。新しい発蛍光団は、異なる発光範囲で生成され得、そして本発明は、現在入手可能な色素およびそれぞれの発光範囲に限定されない。
【００４５】
さらに、ＴＰＬＳＭにおいて用いられるレーザーは、フェムト秒レーザーおよびピコ秒レーザーに分類され得る。これらのレーザーは、パルスの持続時間によって区分され得る。本発明においては好ましくは、フェムト秒レーザーが、用いられる。なぜなら、このレーザーは、検体を損傷することなく可視化するために特に適切であるからである。
【００４６】
好ましい実施形態においては、ＴＰＬＳＭは、光学的に稠密な鳥類の卵の、非侵襲の、三次元の、リアルタイムの画像の作製方法を実現する。核移入の間に、鳥類の卵における赤道板または前核を可視化する能力はこれまで、これらの核構造体の可視化を不可能にする、卵黄の存在によって、妨げられてきた。しかし、卵黄の望ましくない光学的な特性にもかかわらず、近赤外線にて作動するフェムト秒レーザーを用いる二光子イメージングは、細胞構成物を損傷することなく、核構造体を可視化し得る。可視化より前に、検体は、ＤＡＰＩ（４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドールハイドロクライド）またはＨｏｅｓｃｈｔ３３３４２（ビス−ベンズイミド）などのＤＮＡ特異的な色素と共にインキュベートされ得るか、これらの色素を注入され得る。インキュベーションより前に、卵白嚢は、取り除かれ、そして卵子は、頂部に面している胚盤と共に、ディッシュに位置される。卵白嚢の任意のレムナントは、胚盤の頂部から取り除かれる。水溶液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ））が、卵子の乾燥を回避するために添加される。クローニングシリンダーが、胚盤周辺に置かれ、ＰＢＳ中のＤＡＰＩは、このシリンダーに添加される。あるいは、ＤＡＰＩ−ＰＢＳ溶液は、ガラスピペットを用いることによって胚盤へと注入され得、その後この色素は、核構造体へと移動する。色素を注入する場合、卵白嚢の除去は、必ずしも必要ではない。しかし、この盤への核の注入は、この卵白嚢が無い場合に、容易となる。ＤＮＡ特異的な色素のインキュベーションまたは注入の後で、鳥類の初期の胚の内部の画像は、ＴＰＬＳＭの使用を介して作製され得る。可視化は、インキュベーションの約１０〜１５分後または注入の約１０分後に実施され得る。可視化の間、この胚盤は、顕微鏡の対物レンズの下に位置され、そして前核構造体は、この盤の中心領域の中にて、約３〜６ｍＷの比較的低いレーザーの出力を用いて捜される。一旦その構造体が見つかれば、それらは、ＴＰＬＳＭによって支援され、より高いレーザーの出力を用いることによって切除され得るか、または、機械的に取り除かれ得る。
【００４７】
核移入はまた、核ドナーが卵母細胞に導入され得る前に、前核が破壊されるか、または脱核されることを要求する。細胞質体ドナーを産生するための卵母細胞の脱核のために、胚盤内における卵子の卵黄膜の約２５μｍ下に位置する前核を可視化することは、必要不可欠である。顕微手術はこれまで、前核の除去または脱核を達成するための好ましい方法であった。しかし、核構造体の二光子レーザー媒介切除は、顕微手術に対する代替物を提供する。イメージングのために用いられるレーザーの出力より高いレーザーの出力が、細胞に対する最小限の付帯的な損傷を伴って、脱核のために用いられる。一般的に、可視化の間、切除のためのその波長は、約７００ｎｍ〜１０００ｎｍ（通常約７５０ｎｍ）で変化する。ＴＰＬＳＭおよび二光子レーザー媒介切除が、操作者の依存がより少なく、そしてより侵襲性が低く、レシピエント細胞のより高い生存力を生むことに起因して、この方法は、代替的な方法よりも効率的である。可視化の後に、前核構造体は、約３０〜約７０ｍＷのより高いレーザー出力を用いて、切除され得る。
【００４８】
脱核は、核再構築に先立ち、ここで培養された体細胞の核（核ドナー）は、脱核されたレシピエント細胞質体へと注入される。核再構築は、微量注入器およびマイクロマニピュレーターを含む顕微操作ユニットの上の顕微鏡のもとで実施され得る。切除の後で、核ドナーが、エピスコープの照明（すなわち、対物レンズを通してサンプルに来る光）を用いる支援された注入を介して胚盤へと導入される。次いで、この再構築された接合子は、殻の堅い卵を産生するように、レシピエントメンドリの卵管に、外科的に移入され得る。あるいは、この再構築された胚は、外科的移入の前に、２４時間培養され得、そして発生についてスクリーニングされ得る。さらにこの卵は、必要に応じて遺伝子的に改変された、クローン化されたヒヨコを産生するためにインキュベートされ得る。このクローン化されたヒヨコは、その全ての細胞中またはほとんどの細胞中に導入遺伝子を有し得る。成熟の後、このトランスジェニック鳥類は、１つ以上の所望の、外因性タンパク質を含有する卵を産み得る。あるいは、この得られたヒヨコは、卵中に通常存在する内因性のタンパク質の全ては含有しない卵を産み得るノックアウト動物であり得る。このクローン化されたヒヨコはまた、代替的な表現型を発現するか、または内部に外因性タンパク質を有する卵を産み得る、ノックインヒヨコであり得る。この再構築された卵はまた、Ｐｅｒｒｙら（前出）によって記載されたエキソオボの方法を用いて、発生まで培養され（ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｔｏ  ｔｅｒｍ）得る。本発明の好ましい実施形態において、その動物は、ニワトリ、アヒル、七面鳥、ウズラ、キジおよびダチョウを含むが、これらに限定されない、鳥類である。
【００４９】
このレシピエント細胞の核とドナー細胞の核との置換は、再構築された接合子を産む。１つの好ましい実施形態において、核ドナーとして用いられる細胞の細胞質膜は、その核をレシピエント細胞質体の卵質に曝すために、破壊される。この核ドナーは、胚盤中へと注入され得、そこで再プログラミングをうけ、そして再構築された１細胞の胚の核になる。あるいは、ドナー細胞は、当該分野にて周知の方法（例えば、ポリエチレングリコールなどの、融合促進化学薬品、センダイウイルスなどの、不活性化されたウイルス、または電気的刺激を用いて）を用いて、レシピエント細胞に融合され得る。
【００５０】
本明細書において記載されたＴＰＬＳＭおよび二光子レーザー媒介切除の方法論はまた、哺乳動物種および他の脊椎動物種における核移入を含む、生殖細胞および／または体細胞内における選択的な特定の構造体の可視化および破壊のためにも、用いられ得る。当業者は、哺乳動物、魚類、爬虫類、両生類、昆虫を含むが、これらに限定されない、他の型の動物に対して、本明細書に記載された、鳥類のために確立された方法を、直ちに適用し得る。
【００５１】
ｃ）卵子移入
本発明の別の局面は、卵子移入を組み合わせた核移入を含む、クローン化された動物を産生する方法を提供する。二光子可視化および切除は、上記の、核移入を実施するために用いられ得る。従って、レシピエント細胞の核とドナー細胞の核との置換は、再構築された接合子を生む。好ましい実施形態において、前核期の卵は、受精によって既に活性化されたレシピエント細胞質体として用いられる。あるいは、活性化されていない中期ＩＩの卵は、レシピエント細胞質体として、作用し得、そして活性化は、核再構築の後に誘導される。この卵子は、卵子移入を介して培養され得、ここで再構築された接合子を含有するこの卵子が、レシピエントメンドリに移入される。この卵子が、産卵直後のレシピエントメンドリの卵管へと外科的に移入される。これは、通常の農学的手順（産卵、インキュベーション、および孵化；Ｔａｎａｋａら、上記を参照のこと）に従って達成される。
【００５２】
代替的な実施形態において、この卵子はレシピエントメンドリへと移入する前に、第Ｘ期（ｓｔａｇｅ  Ｘ）まで培養され得る。より詳細には、再構築された第Ｉ期（ｓｔａｇｅ  Ｉ）の胚は第Ｘ期まで２４〜４８時間培養される。これは、外科的移入の前の、再構築された胚の発生スクリーニングを可能にする。第Ｉ期の胚は厚い卵白嚢内に覆われる。この新規な手順において、この卵白嚢は、取り除かれ、その後、核ドナーは、この胚盤へと注入される。その後、この嚢および胚盤は、卵黄の頂部上の胚盤と接してこの厚い嚢を配置することによって再結合される。胚はそれらのインタクトの嚢を伴って培養された場合と同様の速度で、第Ｘ期まで発生する。第Ｘ期にて、この胚は、レシピエントメンドリの卵管に移入される。
【００５３】
一旦移入されると、その胚は、レシピエントメンドリの体内において発生し、そして、メンドリの卵管（この場所でその胚は、天然の卵白タンパク質および天然の卵の殻に包まれる）を通り、移動する。内因性の卵黄および別のメンドリからの胚を含有するこの卵は、産まれ、次いでインキュベートされ得、そして通常のヒヨコのように孵化し得る。この得られたヒヨコは、そのすべての細胞中またはほとんどの細胞中に導入遺伝子を保有し得る。成熟の後に、このクローン化された鳥類は、所望の表現型を発現し得るかまたは、１つ以上の所望の、外因性タンパク質を含有する卵を産むことが可能であり得る。
【００５４】
核移入および卵子移入の組み合わせは、必要に応じて遺伝子的に改変された、完全な生物体である、クローン化された動物の調製を可能にする。本発明に包含される、遺伝子的に改変された動物は、トランスジェニック動物、ならびにノックイン動物およびノックアウト動物である。
【００５５】
ひとつの代替的な実施形態において、エキソオボ培養は、クローン化された動物を産生するための卵子移入の代わりに、用いられ得る（Ｐｅｒｒｙら、上記を参照のこと）。本発明の１つの好ましい実施形態において、この動物は、ニワトリ、アヒル、ウズラ、七面鳥、キジ、およびダチョウを含むが、これらに限定されない、鳥類である。別の実施形態において、この動物は、哺乳動物、魚類、爬虫類、両生類、または、昆虫である。
【００５６】
ｄ）クローン化された動物、トランスジェニック動物、ノックアウト動物、およびノックイン動物、ならびにそれらの卵
本発明は、本明細書中に、核移入によってならびに核移入および卵子移入の組み合わせによって産生される、クローン化した産卵する動物を提供する。二光子可視化および切除を用いる、核移入の新規な手法は、クローン化された動物の産生に用いられる。さらに、本発明は、トランスジェニック動物、ノックアウト動物、およびノックイン動物を含むが、これらに限定されない、遺伝子的に改変された、クローン化された動物を包含する。本発明は、卵中の外因性タンパク質の発現および沈着への迅速な経路に対する必要性を満たす。ある卵に対して外因性であるタンパク質を含有する卵もまた、本発明によって、提供される。
【００５７】
さらに、本発明は、二光子可視化および切除を介する核移入、および卵子移入を介して、クローン化された、トランスジェニック動物を産生する新規な方法を提供する。トランスジェニック動物は、それらの生殖細胞への組換えＤＮＡの導入によって恒久的に改変された遺伝的特性を有し得る。本明細書に開示されるように、卵子移入に先立つ接合子の再構築の組み合わせは、動物のクローニングおよびトランスジェニックの産生を達成するための、より効率的かつフレキシブルな経路を約束する。この技術の１つの適切な使用は、作物学的な特性を改善するための家禽および家畜のゲノムの改変である。その導入または欠失が作物学的な特性を増強する、候補遺伝子が、本発明の使用を通して標的とされ得る。最も重要なのは、鳥類種のクローニングの可能性は、市場に対して巨大な利益を約束することである。本明細書において開示される新しい技術は、ニワトリおよびそれらの卵における増強された特性を導く、選択的な家禽飼育において使用され得る。さらに、本明細書において開発された核移入技術（例えば、卵母細胞の核構造体の、選択的レーザー媒介切除）はまた、哺乳動物のトランスジェネシス（ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ）、遺伝学、細胞の治療、および移植などの分野において広範な適用を有する。
【００５８】
本発明の１つの局面は、（ｉ）二光子可視化および必要に応じて、レーザー媒介切除を介する核移入、ならびにその細胞中に外因性ＤＮＡを含有する卵子の移入に従って、トランスジェニック動物を調製する工程、ならびに（ｉｉ）未成熟なトランスジェニック動物を成熟するまで成長させ得る工程を包含する、トランスジェニック動物を産生する方法を提供する。鳥類の場合においては、外因性タンパク質が、成熟した動物の卵管内腔へと分泌され、そして、その動物が産む卵中に沈着される。本発明の１つの好ましい実施形態においては、その外因性ＤＮＡは、導入遺伝子を含有し、そしてその生じるトランスジェニック動物は飼育され、そして繁殖され得る。本発明によって産生されるトランスジェニック鳥類はまた、１つ以上の所望の外因性タンパク質を含有する卵を産む能力を有する。
【００５９】
導入遺伝子は二光子可視化および切除を介する核移入を通じて動物の卵子へと導入され、ここでこの核ドナーは、そのゲノム中に、所望の外因性ＤＮＡ配列を含有する。当業者は、レシピエント細胞質体への核ドナーの注入の前にか、または核ドナーの細胞とレシピエント細胞の融合の前に、核ドナーのゲノムに所望の導入遺伝子を挿入するための従来の方法を、容易に適用し得る。例えば、１つ以上の導入遺伝子を含有するベクターは、送達ビヒクルの使用を通じて、核ドナーの細胞へ送達され得る。次いで、この導入遺伝子が、核ドナーを伴ってレシピエント卵子へと移入される。接合子の再構築の後で、この卵子が、レシピエントメンドリの生殖管へと移入される。好ましい実施形態において、この卵子が、レシピエントメンドリの漏斗へと移入される。再構築の後で、導入遺伝子を含有する胚は、レシピエントメンドリの体内において発生し、そして、メンドリの卵管（この場所で、この胚は、天然の卵白タンパク質および天然の卵の殻に包まれる）を通り、移動する。その卵は、産まれ、そしてインキュベートされ得、そして孵化され得、トランスジェニックヒヨコを産生する。生じるトランスジェニックヒヨコは、その生殖細胞系列中に、１つ以上の所望の導入遺伝子を有する。成熟の後に、トランスジェニック鳥類は、容易に収集され得る１つ以上の所望の外因性タンパク質を含有する卵を産み得る。
【００６０】
本発明の１つの実施形態において核ドナーの細胞が、導入遺伝子を含有するベクター構築物によってトランスフェクトされる。体細胞の核のトランスフェクションの方法は、当該分野において周知であり、そして、例としては、レトロウイルスベクター、レトロトランスポゾン、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、裸のＤＮＡ、脂質を介するトランスフェクション、エレクトロポレーションおよび核への直接の注入の使用が挙げられる。このような技術は、特に鳥類に適用された場合、Ｂｏｓｓｅｌｍａｎ（米国特許第５，１６２，２１５号）、Ｅｔｃｈｅｓ（ＰＣＴ公開ＷＯ９９／１０５０５）、Ｈｏｄｇｓｏｎ（米国特許第６，０２７，７２２号）、Ｈｕｇｈｅｓ（米国特許第４，９９７，７６３号）、Ｉｖａｒｉｅ（ＰＣＴ公開ＷＯ９９／１９４７２）、ＭａｃＡｒｔｈｕｒ（ＰＣＴ公開ＷＯ９７／４７７３９）、Ｐｅｒｒｙ（米国特許第５，０１１，７８０号）、Ｐｅｔｉｔｔｅ（米国特許第５，３４０，７４０号および第５，６５６，４７９号）、およびＳｉｍｋｉｓｓ（ＰＣＴ公開ＷＯ９０／１１３５５）に開示され、これらの開示は、参考として本明細書中に援用される。
【００６１】
本発明の別の局面は、（ｉ）二光子可視化および／または切除を介する核移入に従って、ノックアウト動物またはノックイン動物を調製する工程、ならびに（ｉｉ）未成熟のノックアウト動物またはノックイン動物を成熟するまで成長させ得る工程を包含する、ノックアウト動物またはノックイン動物を産生する方法を提供する。
【００６２】
本発明の１つの実施形態において、このノックアウト動物は、内因性の遺伝子が、そのドナー核のゲノムから除かれるように操作されている。これは、いわゆる「ｈｉｔ  ａｎｄ  ｒｕｎ」（Ｈａｓｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３５０：２４３−６（１９９１）；ならびにＶａｌａｎｃｉｕｓおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１１：１４０２−８（１９９１））、タグおよび交換（Ａｓｋｅｗら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１３：４１１５−２４（１９９３））ならびに二重の置換（Ｓｔａｃｅｙら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１４：１００９−１６（１９９４））などの、多くの記載された戦略を用いて、正の遺伝子（例えばネオマイシン耐性遺伝子）および／もしくは負の遺伝子（単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ）または他の適用可能な選択マーカー遺伝子が隣接した、所望の改変を含有するゲノムＤＮＡを含むターゲッティングベクターを用いた、核ドナーの形質転換を含む、ノックアウトマウス産生について記載されたプロトコールを用いて達成され得る。
【００６３】
生じるノックアウト動物は、飼育され得、そして繁殖され得る。この様式において産生された動物は、家禽の飼育および特定の作物学的特性に対する特定の薬物の効果を主に研究するための調査目的に適している。これらのノックアウト動物はまた、卵中に通常存在する内因性のタンパク質の全ては含有しない卵を産む能力を有し、このことは、卵中に見られる、潜在的な所望でない物質（例えば、アレルゲン）の除去を可能にする。
【００６４】
本発明の別の実施形態において、ノックイン動物は、そのゲノムの既に定義されたコーディング領域または非コーディング領域に「ノックイン配列」などの特定の核酸配列を保有するように、操作されている。このノックイン配列は、別の動物の機能的な、相同遺伝子または相同の遺伝子セグメントによって、その動物の内因性遺伝子の全てまたは一部が置換され得る。ノックイン動物は、導入された遺伝子が、内因性遺伝子の発現を通常制御する、調節エレメントの制御下であるような様式（Ｌｅ  Ｍｏｕｅｌｌｉｃら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：４７１２−６（１９９０）；およびＭｃＣｒｅａｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ，４０５：１０６６−１０６９（２０００））で、多様な標準的ノックアウトのバリエーション（ターゲッティングベクターへの外来遺伝子の導入を含む）に従って、調製され得る。
【００６５】
本発明の別の実施形態は、卵子移入後の胚の再構築によって得られた、クローン化された、遺伝子的に改変された卵を産む動物由来のタンパク質を産生する方法を提供する。この方法は、外因性タンパク質を含有する殻の堅い卵を産生する工程およびその後にその卵から外因性タンパク質を単離する工程を包含する。鳥類の卵に対して外因性であるタンパク質を含有するインタクトの鳥類の卵が、本発明によって、意図される。本発明のトランスジェニック動物は、それらの卵管中に外因性タンパク質をコードする導入遺伝子を有する鳥類を含み、ここでその鳥類は、それらの卵の中に、その導入遺伝子によって発現されたタンパク質を分泌する。ヒトタンパク質（例えば、ヒトインターフェロン）を作製するトランスジェニック鳥類は、この物質を自分自身のものとして認識し得、従ってそれに対する免疫反応を生成しない。このことにより、この卵を産むトランスジェニックは、大量のヒトタンパク質の産生に、申し分なく適するようになる。この局面において、その内部が無菌でありかつ抗菌化合物を含有し、そしてそれが容易に接触可能であることに起因して、この鳥類の卵は、組換えタンパク質産生のための理想的な含有物を提供する。その結果、このタンパク質産物の純度は、向上され得、そしてこの効力は、より効率的に試験される。この様式において産生され得る複数のタンパク質が、本発明によって意図される。これらのタンパク質としては、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、β−カゼイン、α−１アンチトリプシン、アンチトロンビンＩＩＩ、コラーゲン、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、フィブリノーゲン、ヒアルロン酸、インスリン、ラクトフェリン、プロテインＣ、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、飼料添加酵素、ソマトトロピン、およびキモトリプシンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
ｅ）実施例
以下の特定の実施例は、本発明を説明することを意図し、そして特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきものではない：
（実施例１．レシピエント細胞質体の調製）
（インキュベーション）
卵子は、先の卵の産卵後の２〜４時間の間に安楽死させたメンドリから単離した。あるいは、卵は、その卵管が瘻孔形成された（ｆｉｓｔｕｌａｔｅｄ）メンドリから単離した（ＧｉｌｂｅｒｔおよびＷｏｏｄｇｕｓｈ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ、５：４５１−４５３（１９６３）；ならびにＰａｎｃｅｒら、Ｂｒ  Ｐｏｕｌｔ  Ｓｃｉ．、３０：９５３−７（１９８９））。
【００６７】
鳥類の初期の胚の画像作製の前に、以下のプロトコールに従って、ＤＮＡ特異的な色素のインキュベーションを、実施した：卵白嚢を取り除き、そして頂部に面する胚盤と共に卵子をディッシュに配置した。卵白嚢のレムナントを、胚盤の頂部から取り除いた。この卵子の乾燥をふせぐために、リン酸緩衝化生理食塩水を、このディッシュに添加した。胚盤周辺にクローニングシリンダーを配置し、そして、このシリンダーに１．０μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ含有ＰＢＳを添加した。このインキュベーションの約１５分後に、可視化を実施した。
【００６８】
（注入）
インキュベーションについて記載したように、この卵の調製を行った。嚢の除去の後に、ガラスピペットを用いて、胚盤中に、０．１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩのＰＢＳ溶液を１０〜５０ｎｌ注入した。注入の約１５分後に、可視化を実施した。
【００６９】
（可視化）
インキュベーションの後に、ＴＰＬＳＭの使用を通じて、鳥類の初期の胚の内部の画像を作製した。この胚盤を、この顕微鏡の対物レンズの下に配置し、そして３〜６ｍＷの低いレーザー出力（７５０ｎｍの波長）を用いてこの盤の中心領域内、６０μｍの深さまで、この前核構造体を探索した。一旦、その構造体を見つけた後、それらを切除した。
【００７０】
（核切除および脱核）
前核構造体を、レーザー媒介切除に供した。これらの実験において、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ２０ｘ／０．５ＮＡ（開口数）水浸レンズを用いた。除去されるべきｘ平面およびｙ平面は、二光子ソフトウェアを用いて規定し、一方、そのｚ平面（深さ）は、この型の対物レンズのちょうど１０μｍ下であった。前核構造体が、直径約２０μｍであったので、この切除は、２回の工程（１０μｍを２回）を含んだ。残っている前核を可視化するために、焦点を下げ、その後、その前核を切除した。この前核を切除するために用いられたレーザー出力は、７５０ｎｍの波長において、３０ｍＷ〜７０ｍＷの間であった。上記の切除実験のために、この画像を、４〜５倍にズームし、面積を１／１６〜１／２５倍に圧縮した。次いで、可視化の３〜６ｍＷの強度と比較して総強度を１６０〜３００倍増加するために、出力を１０〜１２倍増加した。切除強度（出力密度）は、関数パラメーターであり、すなわち、１０〜１２倍の出力の増加は、３０〜７０ｍＷの切除出力を生じるが、この出力を１／１６〜１／２５倍小さな面積に圧縮するズーム率は、出力密度の１６０〜３００倍の増加を生じる。
【００７１】
（実施例２．核ドナーの細胞の調製）
（ドナー核の単離）
培養線維芽細胞を、トリプシンで処理し（０．２５％トリプシンおよび１μＭ  ＥＤＴＡ、Ｇｉｂｃｏ  カタログ番号２５２００−０５６）、５％の胎仔ウシ血清を含有するＰＢＳ中にて２回遠心分離処理をし、そして６０ｍｍのプラスチックディッシュ中、５％の胎仔ウシ血清を含有するＰＢＳ中に配置させた。次いで、下記の顕微鏡／マイクロマニピュレーターユニットを用い、透過光の下で、細胞を繰り返しピペッティングすること（これは、細胞質膜を破壊しかつ細胞内部から核を放出させる）よって、核ドナーを単離した。
【００７２】
（実施例３．再構築された接合子の調製）
（注入）
ＩＭ−１６微量注入器およびＭＭ−１８８ＮＥマイクロマニピュレーター（共にＮｉｋｏｎ／Ｍａｒｉｓｈｉｇｅ製）を含む微量操作ユニットを、直立型Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ８００に適合させた。透過光と反射光の両方の条件下で操作するように、この顕微鏡を、適合させた。この特有の配置により、本発明発明者らは、懸濁液中の体細胞を形態学的に試験および調製（上記のような、核の単離）し得、そしてダイアスコープの照明または透過光の下で、乾燥レンズまたは水浸レンズを用いて、注入ピペットを充填し得る。この直後に、顕微鏡の下で、胚盤の局在化および位置決めをし、次いで、光ファイバー照明およびエピスコープ照明（それぞれ側面からおよび対物レンズを通してサンプルに来る光）の下で、乾燥の長距離レンズを用いて、体細胞の誘導された注入を導いた。
【００７３】
（実施例４．卵子移入）
産卵のときに、翼の静脈へのペントバルビタール（０．７ｍｌの６８ｍｇ／ｍｌ溶液）の注入によって、レシピエントメンドリを麻酔する。このとき、漏斗は、ドナー卵子を受容し得るが、まだ排卵はしていない。本発明者らはまた、ペントバルビタールが麻酔薬の選択肢であることをも、確立した。腹部領域から羽根を取り除き、ベタジンを用いて、この領域を洗浄し、７０％エタノールを用いてすすいだ。この鳥を、仰臥姿勢に配置し、そしてこの鳥の曝された手術部分に手術用無菌布を乗せる。胸骨への肋骨の接合部を起点に、胸骨に平行に切開を行う。切開の長さは、約２インチである。平滑筋層および腹膜に沿って切断した後、漏斗部が配置される。手袋をした手で、この漏斗部を外面化し、そして開き、そしてドナー卵子を、開いた漏斗部に、静かに適用する。この卵子は、重力送りによって、この漏斗部内および前方のマグナム内に移動し得る。この内在化された卵子を、体腔内に配置し、そして切開を、平滑筋層および皮膚の両方の連結縫合によって閉じる。このレシピエントメンドリは、その籠に戻され、そして、飼料と水の両方を自由に利用することで、回復し得る。この鳥が、覚醒し、活動し、飼料を摂取する回復時間は、通常この操作終了の４５分以内である。このレシピエントメンドリが産んだ卵を、翌日収集し、Ｊａｍｅｓｗａｙインキュベーター中に設置し、その中でインキュベートする。それらをその後２１日間で孵化する。
【００７４】
あるいは、卵管が瘻孔形成されたメンドリは、上述のように、脱核のため（ＧｉｌｂｅｒｔおよびＷｏｏｄｇｕｓｈ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ、５：４５１−４５３（１９６３）；ならびにＰａｎｃｅｒら、Ｂｒ  Ｐｏｕｌｔ  Ｓｃｉ．、３０：９５３−７（１９８９））だけでなく、殻の堅い卵を産生するためにレシピエントメンドリに再構築された胚を移入するため（Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ、Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、３９：７８２−７８４（１９６０））にもまた、卵の収集を可能にする。最初の技術は、レシピエント細胞質体のための卵子を得るために用い得、そして後者は、再構築された胚の移入のために繰り返し用いられ得るレシピエントメンドリを産生するために用いられ得る。それらが機能し得る場合、両方、そして特に後者の技術は、収集および手術にかかる時間を削減することによって、産生物を増加す。
【００７５】
上記の明細書において引用された全ての文書は、参考として本明細書中に援用される。本発明の多様な改変およびバリエーションは、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者に明らかとなり得る。本発明は、特定の好ましい実施形態と関連して記載されたが、請求されたような本発明が、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきでないことは、理解されるべきである。実際に、当業者にとって明らかな本発明を達成するための記載された様式の多様な改変は、上記の特許請求の範囲内であることが意図される。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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