(57)【要約】その発現が同時刺激分子をコードする遺伝子由来のプロモーターによって制御される少なくとも１つの免疫化抗原をコードするポリヌクレオチドが、提供される。このポリヌクレオチドはまた、アジュバントをコードし得る。少なくとも１つの免疫化剤および少なくとも１つのサイトカイン（これは、樹状細胞の刺激および／または生存を増強する）を含む組成物もまた、提供される。免疫化剤に対して免疫応答を惹起するための方法もまた、提供される。この方法は、ポリヌクレオチドを投与する工程、および必要に応じて、アジュバントを同時投与する工程を包含する。
2004522403.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
同時刺激分子をコードする遺伝子由来の第一のプロモーターおよび少なくとも１つの抗原をコードする第一の配列を含むポリヌクレオチドであって、ここで、該第一の配列が、該第一のプロモーターに作動可能に連結された、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記プロモーターが、ＣＤ８０（Ｂ７−１）遺伝子由来である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記プロモーターが、ＣＤ８６（Ｂ７−２）遺伝子由来である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドであって、前記第一のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも１つのサイトカインをコードする第二の配列をさらに含む、ポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドであって、少なくとも１つのサイトカインおよび第二のプロモーターをコードする第二の配列をさらに含み、ここで、該第二の配列が、該第二のプロモーターに作動可能に連結された、ポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記第二のプロモーターが、構成的プロモーターである、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、前記サイトカインが、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、腫瘍壊死因子関連活性化誘導サイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）およびＦｌｔ３リガンドからなる群から選択される、ポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドでコーティングされたコアキャリア。
【請求項９】
前記キャリアが金から構成される、請求項８に記載のコアキャリア。
【請求項１０】
粒子送達デバイスにおける使用に適した投薬容器であって、該投薬容器が、請求項８または９に記載のコーティングされたキャリアを含む、投薬容器。
【請求項１１】
請求項８または９に記載のコーティングされたキャリアで充填された粒子送達デバイス。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドおよび薬学的に受容可能な賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項１３】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、薬学的に受容可能な賦形剤およびサイトカインを含む、薬学的組成物。
【請求項１４】
前記サイトカインが、ＣＤ４０Ｌ、腫瘍壊死因子関連活性化誘導サイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）およびＦｌｔ３リガンドからなる群から選択される、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
脊椎動物被験体において免疫応答を惹起するための医薬の製造における、同時刺激分子をコードする遺伝子由来のプロモーターに作動可能に連結された抗原をコードするヌクレオチド配列の使用であって、ここで、該ププロモーターが、該被験体において該抗原の発現を指向し得る、使用。
【請求項１６】
前記同時刺激分子がＣＤ８０またはＣＤ８６である、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記ヌクレオチド配列が、さらに、前記被験体に対する少なくとも１つのサイトカインをコードする、請求項１５または１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記ヌクレオチド配列および少なくとも１つのサイトカインが、前記被験体に同時投与される、請求項１５または１６に記載の使用。
【請求項１９】
前記サイトカインが、ＣＤ４０Ｌ、腫瘍壊死因子関連活性化誘導サイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）およびＦｌｔ３リガンド（ｆｌｔ−３Ｌ）からなる群から選択される、請求項１７または１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記ヌクレオチド配列が、粒子媒介経皮的送達技術を使用する前記被験体への投与に適切なコアキャリア粒子上にコーティングされる、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２１】
前記コアキャリア粒子が、金からなる、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記コーティングされたキャリア粒子の投与が、プライム投与およびブースター投与を提供するために繰り返される、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３】
ワクチン組成物であって、以下：
（ａ）少なくとも１つの抗原をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター；ならびに
（ｂ）ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、腫瘍壊死因子関連活性化誘導サイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）およびＦｌｔ３リガンド（ｆｌｔ−３Ｌ）から選択される少なくとも１つのサイトカイン、
を含む、ワクチン組成物。
【請求項２４】
ワクチン組成物であって、以下：
（ａ）少なくとも１つのペプチド抗原；ならびに
（ｂ）ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、腫瘍壊死因子関連活性化誘導サイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）およびＦｌｔ３リガンド（ｆｌｔ−３Ｌ）から選択される少なくとも１つのサイトカインをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
を含む、ワクチン組成物。
【請求項２５】
ワクチン組成物であって、以下：
（ａ）少なくとも１つのペプチド抗原；ならびに
（ｂ）ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、腫瘍壊死因子関連活性化誘導サイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）およびＦｌｔ３リガンド（ｆｌｔ−３Ｌ）から選択される少なくとも１つのサイトカイン、
を含む、ワクチン組成物。
【請求項２６】
前記発現ベクターおよび／または前記少なくとも１つのサイトカインが、コアキャリア上にコーティングされる、請求項２３に記載のワクチン組成物。
【請求項２７】
前記発現ベクターおよび／または前記少なくとも１つのペプチド抗原が、コアキャリア上にコーティングされる、請求項２４に記載のワクチン組成物。
【請求項２８】
前記少なくとも１つのペプチド抗原および／または前記少なくとも１つのサイトカインが、コアキャリア上にコーティングされる、請求項２５に記載のワクチン組成物。
【請求項２９】
無針シリンジにおける使用に適した投薬容器であって、該投薬容器は、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載のコーティングされたコアキャリアを含む、投薬容器。
【請求項３０】
請求項２６〜２８にいずれか１項に記載のコーティングされたコアキャリアを充填した粒子送達デバイス。
【請求項３１】
脊椎動物被験体において免疫応答を惹起するための医薬の製造における、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載のワクチン組成物の使用。
【請求項３２】
前記ワクチン組成物が、粒子媒介経皮的送達技術を使用する前記被験体への投与に適したコアキャリア粒子上にコーティングされた、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
前記コアキャリア粒子が、金から構成される、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
前記コーティングされた粒子の投与が、プライム投与およびブースター投与を提供するために繰り返される、請求項３２または３３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３５】
脊椎動物被験体において免疫応答を惹起するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）同時刺激分子をコードする遺伝子由来のプロモーターに作動可能に連結された抗原をコードするヌクレオチド配列を提供する工程であって、該プロモーターが、該被験体において該抗原の発現を指向し得る、工程；および
（ｂ）該ヌクレオチド配列を該患者に投与する工程であって、それによって該抗原が、免疫応答を惹起するに十分な量で発現される、工程、
を包含する、方法。
【請求項３６】
脊椎動物被験体において免疫応答を惹起するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）少なくとも１つの抗原をコードするヌクレオチド配列でコーティングされたコアキャリア粒子を提供する工程であって、該ヌクレオチド配列は、同時刺激分子をコードする遺伝子由来のプロモーターに作動可能に連結され、ここで、該プロモーターが、該被験体において抗原コード配列の発現を駆動し得る、工程；および
（ｂ）粒子媒介送達技術を使用して、該被験体に該コーティングされたコアキャリア粒子を投与する工程であって、それによって、該抗原が、免疫応答を惹起するに十分な量で発現される、工程、
を包含する、方法。
【請求項３７】
脊椎動物被験体において免疫応答を惹起するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項２３〜２５のいずれか１項に記載のワクチン組成物を提供する工程；および
（ｂ）免疫応答を惹起するに十分な量で、該組成物を該被験体に投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項３８】
脊椎動物被験体において免疫応答を惹起するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項２６〜２８のいずれか１項に記載のワクチン組成物を提供する工程；および
（ｂ）粒子媒介送達技術を使用して、該患者に工程（ａ）の組成物を投与する工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、ワクチン組成物およびその使用方法に関する。より具体的に、本発明は、その発現が同時刺激分子由来のプロモーターによって制御される少なくとも１つの免疫化抗原をコードするポリヌクレオチドに関する。これらのポリヌクレオチドを使用する免疫方法もまた、提供される。また、少なくとも１つの免疫化薬剤および少なくとも１つのサイトカイン（抗原提示細胞の成熟に関連する）を含む組成物も提供される。これらの組成物を使用して免疫応答を惹起する方法もまた提供される。
【０００２】
（背景）
細胞媒介免疫応答を誘導するワクチンは、寄生生物、自己免疫疾患、アレルギー疾患および癌と戦う際における重要なストラテジーとして現れる。従来のワクチン接種ストラテジーは、一般に、「生きた」または「死んだ」ワクチンのいずれかの投与を含む。Ｅｒｔｌら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：３５７９  −３５８２。いわゆる生きたワクチンは弱毒化した微生物および生きたベクターに基づく組み換え分子を含む。死んだワクチンは、殺された病原体全体に基づくもの、およびサブユニットワクチン（例えば、可溶性病原体サブユニットまたはタンパク質サブユニット）を含む。生きたワクチンは、免疫された被験体における有効な免疫応答を提供することに、一般に成功している；しかし、このようなワクチンは、免疫無防備状態の被験体または妊娠中の被験体において危険であり得るか、病原性生物に戻り得るか、または他の病原体で汚染され得る。Ｈａｓｓｅｔｔら（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８：３０７−３１２。死んだワクチンは、生きたワクチンと関連した安全性の問題を回避する；しかし、このようなワクチンは、しばしば、免疫された被験体の￥における適切および／または有効な免疫応答を提供することを失敗する。
【０００３】
さらに近年、筋肉内注射（Ｗｏｌｆｆら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５：１４６８）または針およびシリンジを用いる皮内注射（Ｒａｚら（１９９４）ＰＮＡＳ  ＵＡＳ  ９１：９５１９−９５２３）による、プラスミドＤＮＡの直接注入が記載されている。衝撃または粒子媒介ＤＮＡ送達と言われる別のアプローチは、ＤＮＡでコーティングされた微視的金ビーズを直接表皮の細胞に投与するために、針粒子送達デバイスを使用する。従って、多くの送達技術が、免疫のための核酸を送達するために使用され得、核酸コーティングミクロ粒子を標的組織に送達する粒子媒介技術を含む（例えば、共同にかかる米国特許第５，８６５，７９６号（１９９９年２月２日公開））。粒子媒介核酸免疫技術は、ナノグラムのＤＮＡの表皮送達に続いて、体液性免疫応答および／または細胞障害性Ｔリンパ球免疫応答の両方を惹起することが示されてる。Ｐｅｒｔｍｅｒら（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ  １３：１４２７−１４３０．このような粒子媒介送達技術は、他の型の核酸接種と比較され、そして顕著に優れていることが見出された。Ｆｙｎａｎら（１９９５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １７：７９−８３、Ｆｙｎａｎら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１４７８−１１４８２、およびＲａｚｓら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９５１９−９５２３。
【０００４】
インタクトな皮膚へおよびこの皮膚を介する制御された用量における固体薬物含有粒子を送達するための無針シリンジの使用を必要とする新規な経皮的な薬物送達系が記載されている。特に、共同にかかる米国特許第５，６３０，７９６号（Ｂｅｌｌｈｏｕｓｅら）は、スーパーソニックガスフロー（ｓｕｐｅｒｓｏｎｉｃ  ｇａｓ  ｆｌｏｗ）と同調して、薬学的粒子を送達する粒子送達デバイス（無針シリンジ）を記載する。この粒子送達デバイスは、粉末の薬物化合物および組成物の経皮的送達のために用いられ、生きた細胞中の遺伝物質の送達（例えば、遺伝子治療）、および皮膚、筋肉、血液、またはリンパへの生物薬剤の送達のために用いられる。このデバイスはまた、薬物および生物薬剤を、組織表面、固形腫瘍および／または外科的な腔（例えば、腫瘍切除後の腫瘍ベッド、または腔）へ送達するために、手術と組み合わせて使用され得る。実質的に固形の粒子形態に適するように調製され得る薬学的な薬剤は、そのようなデバイスを用いて、安全かつ容易に送達され得る。
【０００５】
１つの特定の粒子送達デバイスは、一般的に、最初はノズルを介した通路を塞いでおり、そしてノズルの上流端に実質的に隣接している変化させた破裂し得る膜を有する、細長い管状ノズルを含む。送達される治療剤の粒子は、破裂し得る膜に隣接して配置され、そして膜を破裂させ、そしてそれらの下流端から送達のためのノズルを通してスーパーソニックガスフロー（薬学的粒子を含む）を産生するために充分な膜の上流側へのガス圧を加える加圧手段を用いて送達される。従って、粒子が、破裂し得る膜の破裂を容易に得ることのできるマッハ１〜マッハ８の間の送達速度で無針シリンジから送達され得る。
【０００６】
スーパーソニックガスフロー中に同調する薬学的粒子を有する代わりに、ノズルの下流端が、静止している「裏返し」位置（ここでは、薬学的粒子を含有するために、隔壁が下流面に凹面を有する）と活性な「裏返し」の位置（ここでは、隔壁は、隔壁の上流面に適応された超音波衝撃波の結果として、隔壁の下流面に外向きに凸面を有する）の間を動くことができる双安定の隔壁を提供されることを除いては、別の無針シリンジの構成は一般的に、上記と同様の要素を含む。この様式において、この隔壁の凹面内に含有される薬学的粒子は、それらの経皮的送達のためのデバイスから、目的の皮膚または粘膜表面へ、超音速の初速で発射される。
【０００７】
上記のデバイス装置を用いる経皮的送達は、一般的に、約０．１〜２５０μｍの間の範囲のおよそのサイズを有する粒子を用いて実行される。約２５０μｍより大きな粒子がまた、粒子サイズが皮膚細胞に有害なダメージを引き起こす点である、上限の粒子サイズでデバイスから送達され得る。送達された粒子が貫通する実際の距離は、粒子サイズ（例えば、概算的な球状の粒子幾何学から想定される名目状の粒子の直径）、粒子密度、粒子が皮膚表面に衝突する初速度、そして皮膚の密度および運動粘度に依存している。無針シリンジに一般的に用いるための標的粒子密度は、約０．１と２５ｇ／ｃｍ３との間の範囲であり、そして注入速度は、一般的に約１５０と３，０００ｍ／秒との間の範囲である
（発明の要旨）
本発明は、同時刺激分子をコードする遺伝子由来の第一のプロモーターおよび少なくとも１つの抗原をコードする第一の配列を含むポリヌクレオチドに関し、ここで、第一の配列は、第一のプロモーターに作動可能に連結される。特定の実施形態において、このプロモーターは、ＣＤ８０（Ｂ７−１）遺伝子またはＣＤ８６（Ｂ７−２）遺伝子由来である。
【０００８】
さらなる実施形態において、このポリヌクレオチドは、第一のプロモーター、または第二のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも１つのサイトカインをコードする第二の配列をさらに含む。このプロモーターは、構成的プロモーターであり得る。
【０００９】
他の実施形態において、本発明は、上記のようにポリヌクレオチドでコーティングされたコアキャリア、ならびにこのポリヌクレオチドおよび薬学的に受容可能な賦形剤を含む薬学的組成物に関する。この薬学的組成物は、必要に応じて、サイトカインをさらに含む。
【００１０】
なおさらなる実施形態において、本発明は、（ａ）少なくとも１つの抗原をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター；および（ｂ）ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、腫瘍壊死因子関連活性化誘導サイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）およびＦｌｔ３リガンド（ｆｌｔ−３Ｌ）からなる群から選択されるサイトカインを含むワクチン組成物に関する。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、（ａ）少なくとも１つのペプチド抗原；および（ｂ）ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、腫瘍壊死因子関連活性化誘導サイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）およびＦｌｔ３リガンド（ｆｌｔ−３Ｌ）からなる群から選択されるサイトカインをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含むワクチン組成物に関する。
【００１２】
なお別の実施形態において、本発明は、（ａ）少なくとも１つのペプチド抗原；および（ｂ）ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、腫瘍壊死因子関連活性化誘導サイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）およびＦｌｔ３リガンド（ｆｌｔ−３Ｌ）からなる群から選択されるサイトカインを含むワクチン組成物に関する。
【００１３】
上記ワクチンを投与する工程を包含する脊椎動物被験体において免疫応答を惹起するための方法もまた、提供される。
【００１４】
上記ワクチン組成物の種々の成分がコアキャリア上にコーティングされ得、そして脊椎動物被験体において免疫応答を惹起するための方法において使用され得る。この文脈において、この方法は、粒子媒介送達技術を使用して、被験体に組成物を投与する工程を包含する。
【００１５】
別の実施形態において、本発明は、脊椎動物被験体において免疫応答を惹起するための方法に関する。この方法は、（ａ）同時刺激分子をコードする遺伝子由来のプロモーターに作動可能に連結された抗原をコードするヌクレオチド配列を提供する工程であって、このプロモータが被験体において抗原の発現を指向し得る、工程；および（ｂ）被験体に該コーティングされたコアキャリア粒子を投与する工程であって、それによって、該抗原が、被験体において発現され、そして免疫応答を惹起するに十分な量で、この被験体にこのヌクレオチド配列を投与する工程を包含する。
【００１６】
さらなる実施形態において、本発明は、脊椎動物被験体において免疫応答を惹起するための方法に関する。この方法は、（ａ）少なくとも１つの抗原をコードするヌクレオチド配列でコーティングされた粒子を提供する工程であって、このヌクレオチド配列は、同時刺激分子をコードする遺伝子由来のプロモーターに作動可能に連結され、ここで、このプロモーターが、この被験体において抗原コード配列の発現を駆動し得る、工程；および（ｂ）粒子媒介送達技術を使用して、この被験体にこの粒子を投与する工程であって、それによって、上記ヌクレオチド配列によってコードされた抗原が、免疫応答を惹起するに十分な量で発現される、工程、を包含する。
【００１７】
上記の方法において、このヌクレオチド配列は、少なくとも１つのサイトカイン（例えば、ＣＤ４０Ｌ、腫瘍壊死因子関連活性化誘導サイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）およびＦｌｔ３リガンド（ｆｌｔ−３Ｌ）からなる群から選択されるサイトカイン）をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
【００１８】
本発明のこれらおよび他の実施形態は、本明細書の開示の観点から、当業者に容易に生じる。
【００１９】
（本発明を実施するための様式）
本発明の詳細な説明の前に、本発明は、特定の抗原または抗原コードヌクレオチド配列に限定されないことが理解されるべきである。開示された方法がの異なる適用が、当該分野における特定の必要性に対して変更されることもまた、理解されるべきである。本明細書中において使用される用語は、ただ本発明の特定の実施態様を記載する目的のためのみで、限定することを意図されないこともまた理解されるべきである。
【００２０】
本明細書中で引用される全ての刊行物、特許および特許出願（前出であろうと後出あろうと）は、その全体は本明細書中で参考として援用される。
【００２１】
本明細書および添付された特許請求の範囲において使用されるような、単数型の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その内容が明らかに別のもの指定しない限り、複数の対象を含むに注意すべきである。従って、例えば、「抗原」に対する参照は、２以上の因子の混合物を含み、「粒子」に対する参照は、２以上の粒子の混合物を含み、「レシピエント細胞」に対する参照は、２以上のこのような細胞を含む、などである。
【００２２】
（定義）
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が関係する当業者によって一般に理解されている意味と同じ意味を有する。以下の用語が、以下に示されるように定義されることが意図される。
【００２３】
用語「ワクチン組成物」は、抗原を含む任意の薬学的組成物（例えば、抗原をコードするポリヌクレオチド）を意図し、その組成物は、被験体における疾患または症状を予防または処置するために使用され得る。従って、この用語は、両方のサブユニットワクチン（すなわち、天然において抗原が結合される生物体全体から分離および分散された抗原を含むワクチン組成物、ならびに殺されるか、弱毒化されるか、または不活性化された細菌、ウイルス、寄生虫あるいは他の微生物全体を含む組成物）を含む。
【００２４】
用語「経皮」送達とは、皮内（例えば、真皮または上皮中へ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）（例えば、「経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）」および経粘膜の投与（すなわち、皮膚または粘膜組織中へのもしくはそれを通る薬剤の通過による送達）を意図する。例えば、以下を参照のこと：Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｉｓｓｕｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅｓ，Ｈａｄｇｒａｆｔ  ａｎｄ  Ｇｕｙ（ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，（１９８９）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｅｅ（ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．，（１９８７）；および  Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆＤｒｕｇｓ，Ｖｏｌｓ．１−３，Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ  ａｎｄ  Ｂｅｒｎｅｒ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８７）。従って、この用語は、米国特許第５，６３０，７９６号に記載されるような無針シリンジ送達、および米国特許第５，８６５，７９６号において記載されるようなコーティングされたコアキャリアの粒子媒介される送達からの送達を包含する。
【００２５】
「コアキャリア」とは、ゲスト核酸（例えば、ＤＮＡ）が規定された粒子サイズを付与し、そして充分に高い密度を提供して細胞膜貫通に必要なモーメントを達成し、その結果、そのゲスト分子が粒子媒介技術（例えば、米国特許第５，１００，７９２号）を用いて送達され得るようにコーティングされるキャリアを意味する。コアキャリアは、代表的には、タングステン、金、白金、フェライト、ポリスチレン、およびラテックスのような材料を含む。例えば、以下を参照のこと：Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ，（１９９４）Ｙａｎｇ，Ｎ．ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １０−１１頁。
【００２６】
「粒子送達デバイス」、または「無針シリンジ」とは、皮膚を窃孔するために従来の針の助けなしに経皮的に粒子組成物を送達する装置を意味する。本発明を用いた使用のための粒子送達デバイスは、本明細書を通して考察される。
【００２７】
「抗原」は、宿主の免疫系を刺激して、細胞性の抗原特異的な免疫応答、または体液性の抗体応答を生じる１以上のエピトープを含む分子を意味する。従って、抗原は、タンパク質、ポリペプチド、抗原性タンパク質フラグメント、オリゴ糖類、多糖類などを含む。さらに、抗原は、任意の公知のウイルス、細菌、寄生虫、植物、原生生物、または真菌由来であり得、そして生物体全体であり得る。この用語はまた、腫瘍抗原を含む。同様に、抗原を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡの免疫適用において）はまた、抗原の定義に含まれる。合成抗原（例えば、ポリエピトープ、隣接エピトープ、および他の組換え体または合成的に由来する抗原）もまた含まれる（Ｂｅｒｇｍａｎｎら  （１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：２７７７−２７８１；Ｂｅｒｇｍａｎｎら  （１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３２４２−３２４９；Ｓｕｈｒｂｉｅｒ，Ａ．（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７５：４０２−４０８；Ｇａｒｄｎｅｒら  （１９９８）１２ｔｈ  Ｗｏｒｌｄ  ＡＩＤＳ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、Ｊｕｎｅ  ２８−Ｊｕｌｙ  ３、１９９８）。
【００２８】
用語「ペプチド」は、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸アナログ、または他のペプチド模倣物をの化合物をいうために、最も広い意味で使用される。これらのサブユニットは、ペプチド結合または他の結合（例えば、エステル、エーテルなど）のよって連結され得る。本明細書中で使用される場合、用語「アミノ酸」は、天然および／または非天然、あるいは合成のアミノ酸のいずれかをいい、グリシンおよびＤまたはＬの光学異性体の両方、ならびにアミノ酸アナログおよびペプチド模倣物を含む。ペプチド鎖が短い場合、３つ以上のアミノ酸のペプチドが、一般にオリゴペプチドといわる。ペプチド差が長い場合、このペプチドは、代表的に、ポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる。
【００２９】
「Ｔ細胞エピトープ」は、「Ｔ細胞エピトープ」とは、概して、Ｔ細胞応答を誘導し得るペプチド構造の特徴をいう。この点に関し、当該分野において、Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣ分子のペプチド結合開裂内の拡張されたコンフォメーションを仮定する線形のペプチド決定因子を含むことが受容され得る（Ｕｎａｎｕｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：５５１−５５７）。本明細書において使用される場合、Ｔ細胞エピトープは、概して、少なくとも約３〜５アミノ酸残基を有するペプチドであり、そして好ましくは、少なくとも５〜１０またはそれを超えるアミノ酸残基を有するペプチドである。
【００３０】
本明細書中で使用されるような「抗原提示細胞」および「ＡＰＣ」は、組織適合性複合体分子またはその部分、あるいは１つ以上のヒ古典的なＭＨＣ分子またはその部分と関連する抗原を、その表面に提示する任意の細胞を意図する。適切なＡＰＣの例が以下に詳細に議論され、そしてランゲルハンス細胞、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、ハイブリッドＡＰＣ、およびフォスター抗原提示細胞のような細胞全体を含むが、これらに限定されない。
【００３１】
樹状細胞（ＤＣ）およびランゲルハンス細胞は、強力な抗原提示細胞である。ＤＣは、種々の免疫器官の主要ではない成分であり、例えば、表皮細胞縣濁物の約１％を構成する（Ｓｃｈｕｌｅｒら（１９８５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６１：５２６；およびＲｏｍａｎｉら（１９８９）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．９３：６００）。それらの相対的な希少性に関わらず、これらの細胞は、Ｔ細胞の活性化および増殖に必要とされるシグナルの全てを提供することが示されている。必要なシグナルは２つの型に分類され得る。第一の型（これは、免疫応答に対する特異性を与える）は、Ｔ細胞レセプター／ＣＤ３（「ＴＲＣ／ＣＤ」）複合体とＡＰＣの表面上の主要組織適合性複合体（「ＭＨＣ」）クラスＩまたはＩＩタンパク質との間の相互作用を介して媒介される。この相互作用は、Ｔ細胞の活性化が起こるために必要であるが、十分ではない。事実、シグナルの第二の型を伴わず、シグナルの第一の型は、Ｔ細胞アレルギーを生じうる（例えば、Ｔ細胞が、さらなるシグナルに非感受性である場合）。第二の型のシグナル（例えば、同時刺激シグナルと呼ばれる）は、抗原特異的またはＭＨＣ制限的のいずれかでもなく、そして第一の型のシグナルの存在化で、Ｔ細胞の完全な増殖応答およびＴ細胞エフェクター機能の誘導を導き得る。従って、上記のように、過去数年間にわたって蓄積された研究は、休止Ｔ細胞が、サイトカイン遺伝子の発現および増殖の誘導のために少なくとも２つのシグナルを必要とすることを、納得のいくように立証した（Ｓｃｈｗａｔｒｚ  Ｒ．Ｈ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：１３４９−１３５６；Ｊｅｎｋｉｎｓ  Ｍ．Ｋ．（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １３：６９−７３）。一方のシグナル（特性を与えるもの）は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体と適切なＭＨＣ／ペプチド複合体との相互作用によって生成され得る。第二のシグナルは、抗原特異性ではなく、そして「同時刺激」シグナルと呼ばれる。
【００３２】
「同時刺激分子」は、抗原提示細胞およびＴ細胞の表面上ｆｒは次げンされるレセプターリガンド対として機能する。この用語は、任意の単一分子または分子の組合せを包含し、この分子は、Ｔ細胞の表面上でＴＣＲによって結合されたペプチド／ＭＨＣ複合体とともに機能する場合、このペプチドに結合するＴ細胞の活性化を達成する同時刺激効果を提供する。
【００３３】
いくつかの分子は、同時刺激活性を増強することが示されてる。これらは、ＣＤ８０（すなわち、Ｂ７−１）、ＣＤ８６（すなわち、Ｂ７−２／Ｂ７０）（Ｓｃｈｗａｔｒｚ  Ｒ．Ｈ．（１９９２）Ｃｅｌｌ  ７１：１０６５−１０６８）、熱安定抗原（ＨＳＡ）（Ｌｉｕ  Ｙ．ら（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：４３７−４４５）、コンドロイチン硫酸改変ＭＨＣインバリアント鎖（Ｎａｕｊｏｋａｓ  Ｍ．Ｆ．，ら（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７４：２５７−２６８）、細胞な接着分子１（ＩＣＡＭ−１）（Ｖａｎ  Ｓｅｖｅｎｔｅｒ，Ｇ．Ａ．（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４４：４５７９−４５８６）である。これらの分子は、各々、Ｔ細胞上のそれらの同族リガンドと相互作用することによって、同時刺激を達成するようである。同時刺激分子は、通常の生理学的条件下でネイティブなＴ細胞の完全な活性化を達成するために必要とされるシグナルを媒介する。１つの例示的なレセプター−リガンド対は、ＡＰＣの表面上のＣＤ８０およびＣＤ８６同時刺激分子ならびにＴ細胞上のそれらの対レセプター、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４である（Ｅｌｌｉｓら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５６：２７００−２７０９；Ｆｒｅｅｍａｎら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：９０９−９１１；Ｎａｂａｖｉら（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３６０：２６６−２６８）。他の重要な同時刺激分子は、ＣＤ４０およびＣＤ５４である。従って、この用語は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、またはＡＰＣのような抗原提示マトリックス上の他の同時刺激分子、ならびにＴ細胞の表面のＴＣＲが、ペプチドに特異的に結合する場合に、同族リガンドに結合し、そしてＴ細胞の活性化を生じる同時刺激分子のフラグメント（これのみ、別の分子との複合体化したもの、または融合タンパク質の一部として）を包含する。同時刺激分子およびそれらのプロモーター領域をコードする遺伝子の配列の多くが、当該分野で公知である。他のプロモーターまたはそのフラグメントはまた、当該分野で公知でそして本明細書中に記載される方法に決定され得る。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、用語「アジュバント」は、薬物、抗原、ポリヌクレオチド、ベクターなどの作用を増強する任意の物質をいう。従って、アジュバントの１つの例は、「サイトカイン」である。本明細書中で使用される場合、用語「サイトカイン」は、細胞に種々の効果を及ぼす多くに因子の任意の１つをいい、例えば、成長、増殖または成熟を含む。特定のサイトカイン（例えば、ＴＲＡＮＣＥ、ｆｌｔ−３およびＣＤ４０Ｌ）は、ＡＰＣの免疫刺激能力を増強する。単独または本発明の実施と組み合せて使用されうるサイトカインの非限定的な例としては、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、Ｇ−ＣＳＦ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）、インテーロイキン−１１（ＩＬ−１１）、ＭＩＰ−１α、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、ｃ−ｋｉｔリガンド、スロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、去腫瘍壊死因子関連活性化誘導サイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）およびｆｌｔ３リガンド（ｆｌｔ−３Ｌ）が挙げられる。サイトカインは、いくつかの供給メーカーから市販され、例えば、Ｇｅｎｚｙｍｅ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、Ａｍｇｅｎ（Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｅｘ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）である。これらの分子の多くの配列はまた、例えば、ＧｅｎＢａｎｋデータベースから利用可能である。通常明白に記載されてはいないが、野生型または精製サイトカインと類似の生物学的活性を有する分子（例えば、組換え的に生成されたものまたはその変異体）およびこれらの分子をコードする核酸が本発明の意図および範囲内で使用されることが意図されることが意図される。
【００３５】
選択された抗原およびアジュバントを含む組成物、またはアジュバントと共に同時投与されるワクチン組成物は、それがアジュバントを含まないで投与される等量の抗原により誘発される免疫応答より大きな免疫応答を誘発する能力を有する場合、「増強された免疫原性」を示す。従って、ワクチン組成物は、「増強された免疫原性」を示し得る。なぜなら、その抗原はより強い免疫原性であるか、あるいはより低用量またはより少用量の抗原が、その抗原が投与される被検体における免疫応答を達成するために必要であるからである。そのような増強された免疫原性は、その動物に対してそのアジュバント組成物および抗原のコントロールを投与して、そしてその２つに対する抗体力価および／または細胞媒介免疫を、標準的なアッセイ（例えば、当該分野で周知の放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＣＴＬアッセイなど）を使用して比較することにより決定され得る。
【００３６】
用語「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」は、互換可能に使用され、そして任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態（デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか）、あるいはそのアナログをいう。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子、遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単利されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマーが挙げられる。
【００３７】
ポリヌクレオチドは、代表的には４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；およびチミン（Ｔ）の特定の配列からなる（ポリヌクレオチドがＲＮＡの場合は、ウラシル（Ｕ）がチミン（Ｔ）に替わる）。従って、用語ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド分子のアルファベットでの表示である。このアルファベットでの表示は、中央演算装置（ＣＰＵ）を有するコンピュータ中のデータベース内にインプットされ、そしてバイオインフォマティクス適用（例えば、機能的ゲノミクスおよびホモロジー検索）のために使用され得る。
【００３８】
本発明の文脈において使用される場合、「遺伝子」は、遺伝子機能が関連する、遺伝子核酸（染色体、プラスミドなど）内のヌクレオチドの配列である。遺伝子は、（例えば、生物の）遺伝性の単位であり、生物のゲノム内で特定の物理的位置（「遺伝子座」（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｌｏｃｕｓまたはｇｅｎｅ  ｌｏｃｕｓ））を占めるポリヌクレオチド配列（例えば、哺乳動物のＤＮＡ配列）を含む。遺伝子は、発現される産物（例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド（例えば、ｔＲＮＡ））をコードし得る。あるいは、遺伝子は、特定の事象／機能（例えば、タンパク質および／または核酸の結合（例えば、ファージの付着部位）であり、この場合遺伝子は、発現される産物をコードしない）についての遺伝子座を規定し得る。代表的には、遺伝子は、コード配列（例えば、ポリペプチドをコードする配列）、および非コード配列（例えば、プロモーター配列、ポリアデニル化配列、転写調節配列（例えば、エンハンサー配列））を含む。多くの真核生物遺伝子は、「イントロン」（非コード配列）によって中断される「エクソン」（コード配列）を有する。特定の場合において、遺伝子は、別の遺伝子と配列を共有し得る（例えば、重複遺伝子）。
【００３９】
「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適切な調節配列（または「制御エレメント」）の制御下に配置される場合、インビボにおいて転写され（ＤＮＡの場合）そしてポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）、核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン、および３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列は、ウイルス、原核生物または真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、ウイルスまたは原核生物ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列でさえをも含み得るが、これらに限定されない。転写終結配列は、コード配列の３’に位置され得る。コード配列の転写および翻訳は、代表的には、「制御エレメント」によって調節され、この「制御エレメント」には、転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列（翻訳終止コドンの３’に位置する）、翻訳の開始を最適化する配列（コード配列の５’に位置する）、および翻訳終止配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
「プロモーター」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写を開始するヌクレオチド配列である。プロモーターには、誘導性プロモーター（プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補因子、調節性タンパク質などによって誘導される）、抑制性プロモーター（プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補因子、調節性タンパク質などによって抑制される）、および構成性プロモーターが挙げられ得る。さらに、そのようなプロモーターはまた、組織特異性を有し得る（例えば、ＣＤ８０プロモーターは特定の免疫細胞のみにおいて誘導性であり、ｍｙｏＤプロモーターは、筋肉細胞内においてのみ誘導性である）。用語「プロモーター」または「制御エレメント」とは、全長プロモーター領域およびこれらの領域の機能的（例えば、転写または翻訳を制御する）セグメントを含むことが意図される。プロモーターが、同時刺激分子のプロモーター領域（またはその相補体）の領域として、同一または実質的同一な塩基対配列を有するか、あるいはプロモーターが以下の配列同一性を示す場合、そのプロモーターは、同時刺激分子をコードする遺伝子「由来」である。
【００４１】
「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に移入し得る（例えば、ウイルスベクター、非ウイルス性ベクター、微粒子キャリア、およびリポソーム）。代表的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、および「遺伝子移入ベクター」とは、目的の遺伝子の発現を指向し、遺伝子配列を標的細胞に移入し得る任意の核酸構築物を意味する。従って、この用語は、クローニングビヒクル、発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。
【００４２】
「単離されたポリヌクレオチド」分子は、その分子が天然において見出される生物全体とは別個の分離された核酸分子であるか；天然において通常は会合する配列を全体的にまたは部分的に欠く核酸分子であるか；あるいは天然に存在するが、その分子中に会合した異種配列（以下に定義する）を有する配列である。
【００４３】
「作動可能に連結した」とは、エレメントの配置であって、そのように記載される成分が、その通常の機能を実行するように設計されているものをいう。従って、コード配列（例えば、目的の抗原）と作動可能に連結された所定のプロモーターは、調節タンパク質および適切な酵素が存在する場合、そのコード配列の発現をもたらし得る。ある場合には、特定の制御エレメントは、その制御エレメントがコード配列の発現を指向するように機能する限り、コード配列と連続である必要はない。例えば、介在する、翻訳されないがなお転写される配列が、プロモーター配列とコード配列の間に存在し得、そのプロモーター配列はなお、コード配列と「作動可能に連結されている」と考えられ得る。
【００４４】
本発明において核酸分子を記載するために使用される場合、「組換え」とは、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成、または合成起源のポリヌクレオチドを意味し、その起源および操作のために：（１）天然において会合しているポリヌクレオチドの全部または部分と会合しないか、および／または（２）天然において連結しているポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドと連結する。タンパク質またはポリペプチドに関して使用される場合、用語「組換え」とは、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されるポリペプチドを意味する。
【００４５】
核酸「配列同一性」およびアミノ酸「配列同一性」を決定する技術もまた、当該分野で公知である。代表的には、そのような技術は、遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列の決定、および／またはｍＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列の決定、およびこれらの配列と第２の核酸またはアミノ酸配列との比較を含む。一般に、「同一性」とは、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列それぞれの、正確なヌクレオチド対ヌクレオチド対応、または正確なアミノ酸対アミノ酸対応をいう。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、その「パーセント同一性」を決定することによって、比較され得る。２つの配列のパーセント同一性（核酸配列であっても、アミノ酸配列であっても）は、２つの整列された配列間の正確なマッチを、より短い配列の長さで割って、１００を掛けた数である。核酸配列についてのおおよその整列は、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１））の局所的ホモロジーアルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ（Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編、５補遺  ３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ）によって開発され、そしてＧｒｉｂｓｋｏｖ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６））によって正規化されたスコアリングマトリクスを使用することによって、アミノ酸配列に適用され得る。配列のパーセント同一性を決定するためのこのアルゴリズムの例示的な実行は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティアプリケーションにおいて、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）によって提供されている。この方法のデフォルトパラメーターは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）に記載されている。本発明の文脈において、パーセント同一性を確立するための好ましい方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈによって著作権が保護されたプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージ（Ｊｏｈｎ  Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ  Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、そしてＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ）によって頒布される）を使用することである。この一組のパッケージから、スコアリングテーブルについて、デフォルトパラメーター（例えば、１２のｇａｐ  ｏｐｅｎ  ｐｅｎａｌｔｙ、１のｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ、および６のｇａｐ）を使用する、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用し得る。作成されたデータから、「Ｍａｔｃｈ」値は、「配列同一性」を反映する。配列間のパーセント同一性または類似性を計算するための他の適切なプログラムが、一般に当該��野で公知である（例えば、別のアラインメントプログラムは、デフォルトパラメーターで使用するＢＬＡＳＴである）。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメーターを使用して使用され得る：ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ＝標準；ｆｉｌｔｅｒ＝なし；ｓｔｒａｎｄ＝両方；ｃｕｔｏｆｆ＝６０；ｅｘｐｅｃｔ＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０配列；ｓｏｒｔ  ｂｙ＝ハイスコア；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝重複なし，ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスにおいて見出され得る：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。
【００４６】
あるいは、ホモロジーを、相同性領域間で安定な二重鎖を形成する条件下でポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行ない、その後、１本鎖特異的ヌクレアーゼで消化し、そして消化したフラグメントのサイズを決定することによって、決定し得る。２つのＤＮＡ配列または２つのポリペプチド配列は、上記の方法を使用して決定する場合、配列が少なくとも約８０〜８５％、好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５〜９５％の配列同一性を分子の規定された長さにわたって示す場合、お互いに「実質的に相同」である。本明細書において使用する場合、実質的相同とはまた、特定されたＤＮＡ配列またはポリペプチド配列に対する完全な同一性を示す配列をいう。実質的に相同なＤＮＡ配列を、例えば、特定の系について規定されるように、ストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において同定し得る。例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、５０％のホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含み得、そして洗浄条件は、３７℃での２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、その後、６８℃での１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳを含み得る。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは、当業者の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、上記；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、上記を参照のこと。
【００４７】
本明細書において使用する場合、用語「処置」とは、以下のいずれかを含む：感染または再感染の予防；症状の減少または除去；および病原の減少または完全な除去。処置は、予防的に（感染前）、または治療的に（感染後）になされ得る。「有効量」は、有利な結果または所望の結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、投薬量の１以上の投与、適用において投与され得る。用語「同時投与」（「ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ」または「ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ」）とは、少なくとも２つの物質の投与をいう。同時投与は、同時にまたは異なる時間において、物質を投与することによって達成され得る。さらに、同時投与とは、１つ以上の送達手段を使用する送達を含む。
【００４８】
適切な免疫応答によって、本発明の方法は、免疫した被験体において、ウイルス抗原に特異的なＢリンパ球および／またはＴリンパ球の産生によって特徴付けられる免疫応答を惹起し得、ここで、この免疫応答は、同種のウイルス株または異種ウイルス株でのその後の感染に対して被験体を防御し得るか、ウイルス負荷および／または感染中の脱粒を減少し得るか、非免疫被験体と比較して、より短い時間で感染の回復をもたらし得るか、あるいは疾患症状の臨床的徴候を防ぎ得るか、または減少し得る。
【００４９】
「脊椎動物被験体」によって、ｃｏｒｄａｔａ亜門、特に哺乳動物（ヒトおよび他の霊長類を含むがこれらの限定されない）のいずれかのメンバーを意味する。この用語は、特定の年齢を意味しない。従って、成体の個体および新生の個体の両方を包含することを意図する。
【００５０】
（本発明の一般的概要）
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、特定の処方物にも、特定のプロセスパラメーターにも限定されないことが理解される（これらは、当然変化し得る）。本明細書において使用される技術は、本発明の特定の実施形態を記載する目的のみのためであり、限定することを意図しないことも理解される。
【００５１】
ＤＮＡ−ワクチンは、一般に、標的組織内に存在する細胞によるデノボ合成のための、関連する抗原をコードするプラスミドからなる。ウイルスプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター）は、抗原の発現を駆動するために、ＤＮＡ−ワクチンプラスミド構築物において一般に使用される。「裸の」形態および粒子に付着した形態の両方での、これらのＤＮＡ−ワクチンプラスミドの送達が、体液性免疫応答および細胞媒介性免疫応答の両方を惹起することが示されている（例えば、Ｗａｎｇら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：４１５６−４１６０；Ｔａｎｇら、（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３５６：１５２−１５４；Ｆｙｎａｎ前出を参照のこと）。
【００５２】
特異的ＣＴＬ（細胞障害性Ｔ細胞）応答を引き起こすために、抗原が、Ｔ細胞に対して提示されなければならないことが、公知である。この提示は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（樹状細胞（ＤＣ）、ランゲルハンス細胞、単球、マクロファージ、およびＢ細胞を含む細胞のクラス）を介して達成される。ＤＣは、皮膚の表皮において、ランゲルハンス細胞とは形態学的に異なるとして、最初に記載され（Ｂａｎｃｈｅｒａｅａｕら、（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２４５−２５２によってレビューされるように）、そしてその後、天然のＴ細胞の活性化のために最も効果的なＡＰＣであることが示された。Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  Ａ．（（１９９３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９３７−９４４）およびＢａｎｃｈｅｒａｅａｕら、（１９９８、前出）。注入されたＤＮＡ−ワクチンによってコードされる抗原は、樹状細胞によって、ペプチドにプロセスされ、そしてＴ細胞に対して提示される。表皮内に送達されたＤＮＡ−ワクチンがランゲルハンス細胞を標的化することもまた、示されている。標的とされたランゲルハンス細胞は、ＤＮＡにコードされた抗原を発現し、そして表皮を出て、ランゲルハンス細胞がＤＮＡ−ワクチンによってコードされた抗原をプロセスして、Ｔリンパ球に対して提示する流入領域リンパ節に移動する。従って、ＡＰＣは、ＤＮＡ−ワクチンに対する効果的な免疫応答の誘導において、必須の役割を担う。
【００５３】
抗原に対して曝露されたＡＰＣは、抗原を小さなフラグメント（エピトープとして公知）にプロセスし、次にこのフラグメントは、ＣＤ８＋Ｔリンパ球に対する提示のためにクラスＩの主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）と会合し、そしてＣＤ４＋Ｔリンパ球に対する提示のためにクラスＩＩのＭＨＣと会合する。しかし、特定の同時刺激分子、例えば、ＣＤ８０およびＣＤ８６（それぞれ、Ｂ７−１およびＢ７−２としても公知）もまた、抗原提示のために必要である。従って、Ｔリンパ球の効果的な活性化は、ＡＰＣおよび標的Ｔ細胞の境界面の細胞表面における２つのシグナルを必要とする。第１の活性化シグナルは、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）の抗原ＭＨＣ複合体への結合によって提供され、そして第２の活性化シグナルは、ＡＰＣ上のＣＤ８０／ＣＤ８６同時刺激分子と、Ｔリンパ球上のＣＤ２８レセプターとの結合によって提供されることが公知である。成熟後、ＡＰＣはアポトーシスに対して感受性となり、そのためその天然の刺激能力を限定する。
【００５４】
成功した抗原提示に必要なＣＤ８０／ＣＤ８６同時刺激分子は、ＡＣＰによって構成的に発現されない。むしろ、活性化の際に（例えば、感染病原体に応答して）、ＡＰＣ表面上のＣＤ８０／ＣＤ８６発現は、迅速に上方制御される。ＡＰＣによるＣＤ８０／ＣＤ８６発現を誘導するためのシグナルは、病原体に感染した炎症組織部位内の上皮細胞およびリンパ細胞によって放出されるサイトカインによって提供され得る。さらに、活性化されたＴリンパ球によって分泌される特定のサイトカイン（例えば、ＩＦＮγ）は、ＡＰＣによるＣＤ８０／ＣＤ８６の発現の誘導および維持の両方をなし得る。今日まで、ＴＮＦファミリーの２つのメンバー、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０ＬまたはＣＤ１５４）、およびＴＮＦ関連活性化誘導化サイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）、およびＦｌｔ３リガンドとして公知の因子（Ｆｌｔ３Ｌ）が、ＡＰＣの成熟化と関与している。例えば、Ｇｕｒｕｎａｔｈａｎら、（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：４５６３−４５７１；Ｐｕｌｅｎｄｒａｎら、（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８８：２０７５−２０８２、およびＷｏｎｇら、（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６２：２２５１−２２５８を参照のこと。ＴＲＡＮＣＥはまた、成熟したＤＣの寿命を延ばすことが示されている。（Ｊｏｓｉｅｎら、（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１６２：２５６２−２５６８；Ｗｏｎｇら、（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６：２０７５−２０８０）。ＣＤ４０Ｌおよび腫瘍特異的抗原の同時投与は、Ｔｈ２型免疫応答を反映するＩｇＧ１抗体の産生を生じることが示されている（Ｗｏｎｇら、（１９９９）前出を参照のこと）。
【００５５】
近年、被験体のＴ細胞応答を増強する方法が記載されている。これらの方法は、同一の転写調節エレメントの下に、免疫抗原および全長同時刺激分子をコードするヌクレオチドを投与する工程を必要とする（例えば、米国特許第５，７３８，８５２号、および国際公開公報ＷＯ９７／３２９８７（１９９７年９月１２日公開）を参照のこと）。これらの研究が、構成性プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）の制御下での免疫因子および同時刺激因子の発現を例示し、そして記載することに注意することが有用である。
【００５６】
当該分野において、誘導性のＡＰＣを標的とするＤＮＡ−ワクチン、および標的とされたＡＰＣの成熟および刺激の寿命を効果的に増強する方法（例えば、特異的細胞を標的化することによるか、または特異的細胞中のみで活性であることによる）が依然として必要である。本明細書において記載される発明は、この目的を達成する（例えば、免疫因子をコードするポリヌクレオチドを、同時刺激分子をコードする遺伝子由来のプロモーター配列に作動可能に連結することによるか、および／または免疫因子とＡＰＣの刺激寿命を増強する１つ以上のサイトカインを同時投与することによる）。
【００５７】
より具体的には、本発明は、ワクチンとして特に有用な新規のポリヌクレオチドを提供する。代表的には、ポリヌクレオチドは、適切な調節エレメントを含むベクター（例えば、プラスミド）に含まれる。１つの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１つの選択された抗原をコードする配列を含む。抗原の発現は、同時刺激分子（例えば、ＣＤ８０またはＣＤ８６）をコードする遺伝子由来の転写調節エレメント（例えば、プロモーター）によって制御される。特定の理論に拘束されることはないが、同時刺激分子由来のプロモーターエレメントを使用することは、活性化の際、および抗原提示の間に、ＡＰＣによるこれらプロモーターの通常の上方制御を利用するようである。従って、本明細書に記載されるポリヌクレオチドの使用は、例えば、構成性プロモーターによって駆動されるポリヌクレオチドの使用と比較して、抗原の発現、ＡＰＣ内でのプロセシングおよび提示を増強する。
【００５８】
本発明はまた、同時刺激分子プロモーターおよび抗原をコードする配列を含む発現ベクターがさらにアジュバント（例えば、サイトカイン）を含む組成物を含む。好ましくは、サイトカインは、例えば、ＡＰＣの免疫刺激能力を増強することによって、ＡＰＣ表面上において同時刺激リガンドの発現を増加することによって、抗原／ＭＨＣ複合体を安定化することによって、および／またはＡＰＣのアポトーシスを阻害することによって、免疫応答を増強する。同時刺激分子プロモーターに作動可能に連結された抗原を保有するポリヌクレオチドを、アジュバントとともに同時投与する方法もまた、含まれる。選択されたアジュバントは、適切な調節性制御下のポリヌクレオチドの形態において与えられ得るか、ポリペプチド（例えば、組換え産生されたポリペプチド）として与えられ得る。ヌクレオチドとして投与される場合、サイトカインをコードする配列および抗原をコードする配列は、同一のベクター上に保持されても、または異なるベクター上に保持されてもよい。従って、サイトカインをコードする配列は、同時刺激分子由来のプロモーターの制御下であっても、あるいは異なるプロモーター（例えば、構成性プロモーター）の制御下であってもよい。さらに、サイトカインをコードする配列は、抗原をコードする配列の３’または５’のいずれに位置してもよい。
【００５９】
本発明は、樹状細胞の刺激または生存可能性を増強する少なくとも１つのサイトカインと組み合わせた抗原を含むワクチン組成物をさらに含む。上記のように、そのようなサイトカイン（例えば、ＴＲＡＮＣＥ、ｆｌｔ３、ＣＤ４０Ｌ）は、ＡＰＣ表面上の同時刺激分子の発現を増加し得るか、抗原／ＭＨＣ複合体を安定化し得るか、またはそのアポトーシスを防ぎ得、それによって、ＡＰＣの刺激寿命を増加し得る。特に、少なくとも１つの抗原とペプチドサイトカイン（特に、ＴＲＡＮＣＥ、ｆｌｔ−３またはＣＤ４０Ｌのようなサイトカイン）をコードするポリヌクレオチドを含む組成物が記載される。別の組成物としては、少なくとも１つの抗原（例えば、ペプチド）および少なくとも１つのサイトカイン（例えば、ＴＲＡＮＣＥ、ｆｌｔ−３および／またはＣＤ４０Ｌ）を含む組成物が挙げられる。なお別の組成物は、少なくとも１つの抗原（例えば、ペプチド）および少なくとも１つのサイトカイン（例えば、ＴＲＡＮＣＥ、ｆｌｔ−３および／またはＣＤ４０Ｌ）をコードするポリヌクレオチドを含む。１つより多い抗原を、１つ以上のサイトカインと組み合わせて使用し得ることが理解される。
【００６０】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、トランスフェクションによってか、または粒子上にポリヌクレオチドをコートして、コートした粒子を細胞に投与することによって、インビトロまたはインビボにおいて細胞中に導入され得る。あるいは、ポリヌクレオチドおよび／またはペプチドは、微粒子（例えば、粉末）の形態において提供され得、以下および国際公開公報ＷＯ９７／４８４８５およびＷＯ９８／１０７５０の開示（本明細書において参考として援用される）において、十分に考察される。
【００６１】
従って、本発明は、免疫応答（好ましくは、ＣＴＬ応答）を、脊椎動物被験体において、少なくとも１つの選択された抗原をコードするポリヌクレオチドを投与することによって惹起する方法を含み、ここで、この抗原をコードする配列は、同時刺激分子の調節エレメントに作動可能に連結している。選択された抗原を、ＴＲＡＮＣＥ、ｆｌｔ−３ＬまたはＣＤ４０Ｌのようなサイトカインとともに同時投与することによって、脊椎動物被験体中で免疫応答を惹起する方法もまた、提供される。
【００６２】
（抗原）
本明細書中に記載される組成物および方法は、多くの状態（癌、アレルギー、毒性および病原体（例えば、ウイルス、細菌、真菌、および他の病原体生物）による感染が挙げられるが、これらに限定されない）の処置および／または予防のための広範な種々の抗原に対する免疫応答の誘発において有用である。
【００６３】
本組成物および方法における使用のために適切なウイルス抗原としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：肝炎ファミリーのウイルス（Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、デルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）およびＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）を含む）から得られる、または由来の抗原。例えば、国際公開番号ＷＯ８９／０４６６９；ＷＯ９０／１１０８９；およびＷＯ９０／１４４３６を参照のこと。ＨＣＶゲノムは、いくつかのウイルス性タンパク質（Ｅ１およびＥ２を含む）をコードする。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら（１９９１）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １４：３８１−３８８を参照のこと。核酸分子（これらのタンパク質をコードする配列を含む）およびその抗原性フラグメントは、本方法における使用を見出す。同様に、ＨＤＶ由来のδ抗原のコード配列は、公知である（例えば、米国特許第５、３７８、８１４号を参照のこと）。
【００６４】
同様にヘルペスウイルスファミリー由来の広範な種々のタンパク質もまた、本発明において抗原として使用され得、この抗原としては、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型および２型由来のタンパク質（例えば、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の糖タンパク質ｇＢ、ｇＤおよびｇＨ）；水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来の抗原（ＣＭＶ  ｇＢおよびＣＭＶ  ｇＨを含む）；ならびに他のヒトヘルペスウイルス（例えば、ＨＨＶ６およびＨＨＶ７）由来の抗原が挙げられる（例えば、Ｃｈｅｅら（１９９０）Ｃｙｔｏｍｅｇａｒｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｊ．Ｋ．ＭｃＤｏｕｇａｌｌ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１２５〜１６９頁；ＭｃＧｅｏｃｈら（１９８８）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：１５３１〜１５７４；米国特許第５，１７１，５６８号；Ｂａｅｒら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：２０７〜２１１；およびＤａｖｉｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６７：１７５９〜１８１６を参照のこと）。
【００６５】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原（例えば、多数のＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２単離物についてのｇｐ１２０分子）（ＨＩＶの種々の遺伝的サブタイプのメンバーを含む）は、公知であり、そして報告されており（例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ，Ｎｅｗ  Ｍｅｘｉｃｏ（１９９２）；およびＭｏｄｒｏｗら（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：５７０〜５７８）、そして任意のこれらの単離物由来または得られた核酸配列を含む抗原は、本発明の方法における使用を見出す。さらに、任意の種々のＨＩＶ単離物（１つ以上の種々のエンベロープタンパク質（例えば、ｇｐ１６０およびｇｐ４１）、ｇａｇ抗原（例えば、ｐ２４ｇａｇおよびｐ５５ｇａｇ）、ならびにＨＩＶのｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｖｉｆ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびＬＴＲ領域由来のタンパク質を含む）由来の他の免疫原性部分は、本明細書中における使用を見出す。
【００６６】
他のウイルス由来の抗原または他のウイルスから得られる抗原はまた、本明細書中における使用を見出し、以下を含むが、これらに限定されない：ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、ライノウイルスなど）；カリチウイルス科；トガウイルス科（例えば、風疹ウイルス、デング熱ウイルスなど）；フラビウイルス科；コロナウイルス科；レオウイルス科（例えば、ロタウイルスなど）；オルソミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルスＡ型、Ｂ型およびＣ型など）；ビルナウイルス科；ラブドウイルス（Ｒｈａｂｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）科（例えば、狂犬病ウイルスなど）；フィロウイルス科；パラミクソウイルス科（例えば、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルス、パラインフルエンザウイルスなど）；ブンヤウイルス科；アレナウイルス科；レトロウイルス科（例えば、ＨＴＬＶ−１；ＨＴＬＶ−ＩＩ；ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、ＡＲＶ、ｈＴＬＲなどとしても知られる））（これは、単離物ＨＩＶＩＩＩｂ、ＨＩＶＳＦ２、ＨＩＶＬＡＶ、ＨＩＶＬＡ１、ＨＩＶＭＮ；ＨＩＶ−１ＣＭ２３５、ＨＩＶ−１ＵＳ４など由来の抗原を含むが、これらに限定されない）；ＨＩＶ−２；中でもサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）；乳頭腫ウイルス属、ダニ媒介脳炎ウイルスなど。これらおよび他のウイルスの説明については、例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ編，１９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編，１９９１）を参照のこと。
【００６７】
いくつかの状況において、選択された抗原が、代表的に粘膜表面を介して身体へ入るウイルス性病原体から得られるかまたは由来であり、そしてヒト疾患（例えば、ＨＩＶ（ＡＩＤＳ）、インフルエンザウイルス（Ｆｌｕ）、単純疱疹ウイルス（性器感染、単純疱疹、ＳＴＤ）、ロタウイルス（下痢）、パラインフルエンザウイルス（呼吸感染）、ポリオウイルス（ポリオ）、ＲＳウイルス（呼吸感染）、麻疹ウイルスおよび流行性耳下腺炎ウイルス（麻疹、流行性耳下腺炎）、風疹ウイルス（風疹）、およびライノウイルス（一般的風邪）であるが、これらに限定されない）の原因であることが公知である、または関連することが望ましくあり得る。
【００６８】
適切な細菌抗原および寄生生物抗原は、以下のような疾患の原因である公知の原因因子から得られる得かまたは由来され得る：ジフテリア（Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）、百日咳、破傷風、結核、細菌性肺炎または真菌性肺炎、、中耳炎、淋病、コレラ、腸チフス、髄膜炎、単核細胞症ペスト、細菌性赤痢またはサルモネラ症、レジオネラ疾患（Ｌｅｇｉｏｎａｉｒｅ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ）、ライム病、らい病、マラリア、鉤虫、オンコセルカ症、住血吸虫症、トリパノソーマ症、リーシュマニア症（Ｌｅｓｍａｎｉａｓｉｓ）、ジアルジア属、アメーバ症（ａｍｏｅｂｉａｓｉｓ）、フィラリア症、ボレリア属（Ｂｏｒｅｌｉａ）、およびトリパノソーマ症。なおさらなる抗原は、従来にはない病原体（例えば、クールー、クロイツフェルト−ヤーコプ病（ＣＪＤ）、スクラピー、ミンクの伝染性脳症および慢性消耗病の原因因子）、あるいは狂牛病に関連するプリオンのようなタンパク質様感染粒子から得られ得るか、またはそれらに由来し得る。
【００６９】
抗原が由来し得る特定の病原体として、以下が挙げられる：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｖｉｂｒｉｏ  Ｃｈｏｌｅｒａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｆｒａｎｃｉｓｃｅｌｌａ  ｔｕｌｏｒｅｎｓｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｒｉａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｕｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（Ａ型およびＢ型）、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ（ｂ型）、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｃ、Ｃｏｍｐｌｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｏｓｉｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｄｏｎｏｖａｎｏｓｉｓ、およびＡｃｔｉｎｏｍｙｃｏｓｉｓ；真菌病原体として、ＣａｎｄｉｄｉａｓｉｓおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓが挙げられ；寄生生物病原体としてＴａｅｎｉａ、Ｆｌｕｋｅｓ、Ｒｏｕｎｄｗｏｒｍｓ、Ａｍｅｂｉａｓｉｓ、Ｇｉａｒｄｉａｓｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ、ＴｒｉｃｈｏｍｏｎｉａｓｉｓおよびＴｒｉｃｈｉｎｏｓｉｓが挙げられる。従って、本発明はまた、神経獣医学疾患（例えば、足疾患および口疾患、コロナウイルス、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｔｒｏｎｇｙ１ｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ、牛ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓおよびｂｒｏｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）に対する適切な免疫応答を提供するため使用され得る。
【００７０】
代表的に、１つ以上の上に列挙された抗原に対応するヌクレオチド配列は、以下に示すようにポリヌクレオチドの生成において使用される。
【００７１】
（遺伝子およびポリヌクレオチドの構築物の単離）
本発明は、少なくとも１つの抗原（例えば、ウイルス、細菌、真菌、虫、毒素、アレルギーもしくは癌細胞由来および／または発現される抗原）をコードするポリヌクレオチドを提供する。この抗原は、非ウイルス特異的プロモーター、細胞特異的プロモーターまたは組織特異的プロモーター（例えば、同時刺激分子をコードする配列の転写を制御する調節エレメント由来プロモーター）に作動可能に連結される。これらのポリペプチドは、抗原に対する免疫応答（特にＴリンパ球を活性化する際）の誘発において有用である。
【００７２】
本発明において使用されるため選択されたヌクレオチド配列は、公知の供給源由来であり得る（例えば、標準技術を使用して所望の遺伝子またはヌクレオチド配列を含む細胞から同じものを単離することによって）。同様に、ヌクレオチド配列は、当該分野で周知のポリヌクレオチド合成の標準様式を使用して合成的に生成され得る。例えば、Ｅｄｇｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：７５６−７６２；Ｎａｍｂａｉｒら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９−１３０１；Ｊａｙら（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１−６３１７を参照のこと。一般的に、合成オリゴヌクレオチドは、ホスホトリエステル方法（Ｅｄｇｅら、上記、およびＤｕｃｋｗｏｒｔｈら（１９８１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９：１６９１−１７０６に記載される）またはホスホラミダイト方法（Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１）Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｓ．２２：１８５９、およびＭａｔｔｅｕｃｃｉら（１９８１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５に記載される）のいずれかによって調製され得る。合成オリゴヌクレオチドはまた、市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置を使用して調製され得る。従って、ヌクレオチド配列は、特定のアミノ酸配列に対する適切なコドンを用いて設計され得る。一般的に、意図した細胞におけつ発現に対して好ましいコドンを選択する。完全配列は、標準的な方法によって重複オリゴヌクレオチドから組み立てられ、そして完全コード配列に組み立てられる。例えば、Ｅｄｇｅら（上記）；Ｎａｍｂａｉｒら（上記）およびＪａｙら（上記）を参照のこと。
【００７３】
本明細書中で使用するため核酸配列を得る別の方法は、組み換え手段による。従って、所望のヌクレオチド配列は、標準的な制限酵素および手順を使用して同じものを運ぶプラスミドから摘出され得る。部位特異的ＤＮＡ切断は、当該分野で一般的に理解される条件下で適切な制限酵素を使用する処理によって実施され、そして詳細は、制限酵素を市販する製造業者によって明記される。所望の場合、切断されたフラグメントのサイズ分離は、標準的な技術を使用してポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動によって実施され得る。
【００７４】
制限切断フラグメントは、４つのデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下で標準的な技術を使用してＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）のラージフラグメントを用いて処理することで平滑末端化され得る。Ｋｌｅｎｏｗフラグメントは、５’一本鎖オーバーハングで充填されるが、４つのｄＮＴＰが存在している場合でさえ、突き出た３’一本鎖を消化する。所望の場合、選択的修復は、オーバーハングの性質によって指図される制限内で１つだけまたはいくつかの選択されたｄＮＴＰを供給することによって実施され得る。Ｋｌｅｎｏｗ処理後、混合物は、例えばフェノール／クロロホルムを用いて抽出し、そしてエタノール沈降し得た。Ｓ１ヌクレアーゼまたはＢＡＬ−３１を用いた適切な条件下での処理は、任意の一本鎖部分の加水分解を生じる。
【００７５】
特異的な核酸分子を単離するさらに別の適切な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による。Ｍｕｌｌｉｓら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５：３３５−３５０。この技術は、ＤＮＡポリメラーゼ（通常の熱安定なＤＮＡポリメラーゼ）を使用して、所望のＤＮＡの領域を複製する。複製されるべきこのＤＮＡの領域は、複製反応をプライムする所望のＤＮＡの反対の末端および反対の鎖に相補的な特定の配列のオリゴヌクレオチドによって同定される。複製の第一ラウンドの産物は、後の複製のためのそれ自身のテンプレートであり、従って複製の繰り返し連続サイクルは、これらの添加された配列をオリゴヌクレオチドプライマーに組み込むことによってＤＮＡフラグメントの幾何学的増幅を生じる（例えば、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓら（編）Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ  Ｊｏｖａｎｏｖｉｃｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ（１９９４）を参照のこと）。各増幅反応に使用するＰＣＲ条件は、経験的に決定される。多くのパラメーターは、反応の成功に影響を及ぼす。その中には、アニーリング温度および時間、伸長時間、Ｍｇ２＋およびＡＴＰ濃度、ｐＨ、ならびにプライマー、テンプレート、およびデオキシリボヌクレオチドの相対濃度がある。適切なＰＣＲ条件の１つの例は、実施例において以下に見出される。一旦、所望のタンパク質に対するコード配列が、調製されるか、または単離される場合、このような配列は、任意の適切なベクターまたはレプリコンにクローニングされ得る。多数のクローニングベクターは、当業者にとって公知であり、適切なクローニングベクターの選択は、選択の課題である。他の配列に対する連結反応は、当該分野で公知の標準的な手順を使用して実施される。
【００７６】
以下に詳細に記載されるように、選択されたヌクレオチド配列は、調節配列（例えば、プロモーター）の制御下におかれ得、その結果、所望のタンパク質をコードする配列が、この発現構築物を含むベクターによって形質転換された宿主組織内のＲＮＡへ転写される。
【００７７】
（プロモーター）
プロモーターの選択は、本明細書中に記載される特定のポリヌクレオチドの構築に対して中枢である。従って、本発明は、非ウイルス性、好ましくは哺乳動物細胞（または組織）特異的プロモーターによって駆動される選択された抗原の発現を提供する。好ましい実施形態において、プロモーターは、同時刺激分子の転写を制御する調節配列由来である（例えば、ＣＤ８０（Ｂ７−１としてまた公知）、ＣＤ８６（Ｂ７−２そしてまた公知）、ＣＤ４０またはＣＤ５４遺伝子由来のプロモーター）。他の適切なプロモーターは、本明細書中の教示を使用してすぐに決定され得る。
【００７８】
適切な同時刺激因子（例えば、ＣＤ８０およびＣＤ８６）のゲノム構築物（プロモーターマッピングを含む）は、例えばＺｈａｎｇら（１９９６）Ｇｅｎｅ  １８３：１−６；Ｓｅｌｖａｋｕｍａｒら（１９９３）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３８：２９２−２９５およびＦｏｎｇら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４４４２−４４５０に記載される。これらの研究は、ＣＤ８０（Ｂ７−１）遺伝子プロモーターが３つの正の調節領域：推定転写因子結合部位を含む−２５９７〜−１５５５の遠位領域；縦列反復配列を含む−１３０〜−１１０の近位領域および＋２６９〜＋２５のダウンストリーム領域からなることを示す（Ｚｈａｎｇら、上記）。ヌクレオチド位置−９０６〜−８４切断は、ＣＤ８０発現Ｒａｊｉ細胞において増加した転写活性を生じることが示され、そして−４１周辺の調節エレメントが同定される（Ｆｏｎｇら、上記）。さらに、ＣＤ８０プロモーターまたは他の同時刺激分子プロモーターのマッピングは、これらの文献および本明細書の教示を考慮して当該分野で公知の方法を使用して行われ得る。
【００７９】
本発明はまた、ＡＰＣ（例えば、樹状細胞）の刺激性寿命を高める少なくとも１つのサイトカインと組み合わせる免疫化薬剤を使用して免疫応答を誘発する方法を提供する。これらの実施形態において、免疫化薬剤またはサイトカインのいずれかは、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとして非験体へ送達され得る。これらのポリヌクレオチドは、広範な種々のプロモーター（例えば、構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶ、ＳＶ−４０、ハウスキーピング遺伝子プロモーターなど）、誘導プロモーター（例えば、メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）、熱ショック、シトクロム、タンパク質チロシンキナーゼ、一酸化炭素合成プロモーターなど）、および組織または細胞特異的プロモーター（例えば、ＣＤ８０／８６、筋クレアチンキナーゼなど）を含む）を含み得る。
【００８０】
プロモーターに加え、送達されたヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質配列の発現の調節をし得る他の調節配列を加えることが望ましくあり得る。適切な付加調節配列は、当業者に対して公知であり、そして例として、化学的もしくは物理的刺激（調節化合物の存在を含む）に応答して表されるまたは表されないコード配列の発現を引き起こす配列が挙げられる。調節エレメントの他の型もまた、ベクター、例えばエンハンサー配列中に存在し得る。
【００８１】
発現ベクターは、構築され、それにより特定のコード配列が、適切な調節配列を有するベクター中に局在化され、その結果コントロール配列に関するコード配列の位置決めおよび方向付けが、コード配列のコントロール配列の「制御」下で転写を可能にする（すなわち、コントロール配列でＤＮＡ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼがコード配列を転写する）。目的の特定のタンパク質をコードする配列の改変は、この終止を達成するために望まれ得る。例えば、いくつかの場合において、配列を改変することが必要であり得、その結果、適切な方向付けでコントロール配列に結合される（すなわち、リーディングフレームを維持するため）。コントロール配列および他の調節配列は、ベクターへの挿入の前にコード配列に結合され得る。あるいは、コード配列は、すでにコントロール配列および適切な制限部位を含む発現ベクターへ直接クローニングされ得る。
【００８２】
一般的に、対象方法において使用される核酸分子は、適切なコントロール配列および必要に応じてサイトカインまたは他の免疫増強ポリペプチドをコードする補助的なヌクレオチド配列を有するコード領域を含む。核酸分子は、一般的に必要なエレメントを含み、レシピエント細胞において転写および翻訳を指向するベクターの形式で調製される。
【００８３】
（アジュバント）
被験体において免疫応答を増強するため、本明細書中に記載の組成物および方法は、さらに補助的物質（例えば、アジュバント）（例えば、薬理学的薬剤、サイトカインなど）を含み得る。適切なアジュバントは、本発明のポリヌクレオチドに対する被験体の免疫応答を増強する任意の物質を含む。非限定的な例として、サイトカイン（例えば、Ｆｌｔ３リガンド、ＣＤ４０ＬおよびＴＲＡＮＣＥ）が挙げられる。上記のように、これらのサイトカインは、任意の数の経路に影響を及ぼすことによって（例えば、抗原／ＭＨＣ複合体を安定化することによって、抗原／ＭＨＣ複合体がより細胞表面上に存在することを引き起こすことによって、ＡＰＣの成熟化を増強することによって、またはＡＰＣの生存を長くすることによって（例えば、アポトーシスを阻害する））免疫応答を増強し得る。例えば、最近の研究は、ＣＤ４０ＬおよびＦｌｔ３リガンドが、マウスモデルにおいてアジュバントして供給され得ることを示唆する（Ｇｕｒｕｎａｔｈａｎら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１．４５６３およびＰｕｌｅｎｄｒａｎら（１９９８），Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８８：２０７５）。Ｗｏｎｇら（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：２０７５は、ＴＲＡＮＣＥが成熟樹状細胞の寿命を促進し得ることを報告する。上記のように、これらのサイトカイン（ペプチドまたは機能的タンパク質をコードするポリヌクレオチドとしてのいずれかで送達される）はまた、免疫応答の誘発において有用である。
【００８４】
補助的物質は、例えばタンパク質もしくは他の高分子として同時刺激分子プロモーター駆動ポリヌクレオチド、ペプチド抗原もしくは目的の抗原をコードするポリヌクレオチドの投与と同時に、前に、または引き続いて投与され得る。サイトカインは、種々の供給源（例えば、Ｉｍｍｕｎｅｘ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）およびＡｍｇｅｎ（Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ））から得られ得る。あるいは、サイトカインは、本明細書の教示を考慮して当業者に公知の種々の方法を使用して生成され得る。特に、サイトカインは、標準的な精製技術を使用して直接自然の供給源から単離され得る。あるいは、サイトカインは、上記の発現系を使用して組み換え的に生成され、そして公知の技術を使用して精製され得る。このサイトカインはまた、公知のアミノ酸配列または目的の分子のＤＮＡ配列由来のアミノ酸配列に基づいて、化学的ポリマー合成（例えば、固相ペプチド合成）を介して合成され得る。このような方法は、固相ペプチド合成技術について例えばＪ．Ｍ．ＳｔｅｗａｒｔおよびＪ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬ（１９８４）およびＧ．ＢａｒａｎｙおよびＲ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，著者Ｅ．ＧｒｏｓｓおよびＪ．Ｍｅｉｎｅｎｈｏｆｅｒ，ｖｏｌ．２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８０），ｐｐ２５４に記載される。
【００８５】
あるいは、宿主の免疫応答を刺激、改変、調節することが公知のペプチド（例えば、サイトカイン）をコードする補助的核酸配列は、上記の抗原をコードするポリヌクレオチドまたはペプチド抗原と共にポリヌクレオチドとして同時投与され得る。多くのこれらのサイトカインに対する遺伝子配列は、公知である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋおよび他の公に利用可能なデータベース；Ｗｏｎｇら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２（４０）：２５１９０−４（ＴＲＡＮＣＥ）；Ｌｙｍａｎｅｔら（１９９５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １１（６）：１１６５−７２（ｆｌｔ３）；Ｓｐｒｉｇｇｓら（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６．１５４３−１５５０およびＡｒｍｉｔａｇｅら（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：８０−８２（ＣＤ４０Ｌ）；Ｓｐｒｉｇｇｓ（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｓｅｒ．５６：３−３４（ＴＮＦ−α）；Ｍｏｒｇａｎら（１９７６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９３：１００７−１００８（ＩＬ−２）；米国特許第５，１８７，０７７号（ＬＩＦ）；Ｂｒａｎｋｅｎｈｏｆｆら（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：４１１６−４１２１（ＩＬ−６）；などを参照のこと）。
【００８６】
従って、適切なサイトカインは、サイトカインをコードする（またはその活性フラグメントをコードする）ポリヌクレオチドの投与によって供給され得る。これらのサイトカインコードヌクレオチドは、抗原コード配列を運ぶ同じベクター上で、あるいは異なるベクター上でのいずれかで投与され得る。いくつかの場合において、抗原コード配列およびサイトカインコード配列の両者が、同じプロモーター（例えば、同時刺激分子由来のもの）の制御下でポリヌクレオチドを設計することが望まれ得る。他の場合、異なるプロモーター（例えば、構造性プロモーター）の制御下でサイトカインコード配列を使用することが望まれ得る。
【００８７】
（ポリヌクレオチドおよびアジュバントの投与）
本明細書中に記載されるポリヌクレオチドおよび補助物質は、任意の適切な方法によって投与され得る。好ましい実施形態において、以下に記載されるように、このポリヌクレオチドは、粒子上にそれらをコーティングし、次いで、粒子を被験体または細胞に投与することによって投与される。しかし、このポリヌクレオチドはまた、当該分野で公知のウイルスベクターを使用してか、または、例えば、米国特許第５，５８９，４６６号に記載されるように、非ウイルスベクター系を使用して送達され得る。
【００８８】
（ウイルスベクター）
多数のウイルスベースの系が、遺伝子送達のために使用されてきた。例えば、レトロウイルス系が公知であり、そして、ウイルスの全ての遺伝子を発現する組み込まれた欠損プロウイルス（「ヘルパー」）を有するパッケージング系を一般的に使用するが、ｐｓｉ配列として公知のパッケージングシグナルの欠失に起因してそれ自身のゲノムをパッケージングし得ない。従って、この細胞株は、空のウイルス外皮を産生する。産生株は、ヘルパーに加えて、長い末端反復（ＬＴＲ）として公知のウイルスの複製およびパッケージングのためのｃｉｓにおいて必要な配列を含むウイルスベクターを含むパッケージング株に由来し得る。目的の遺伝子は、ベクターに挿入され得、そして、レトロウイルスヘルパーによって合成されるウイルス外皮中にパッケージングされ得る。次いで、組換えウイルスは単離され、被験体に送達され得る（例えば、米国特許第５，２１９，７４０号を参照のこと）。代表的なレトロウイルスベクターとしては、例えば、米国特許第５，２１９，７４０号（これは、本明細書中にその全体が参考文献として援用される）に記載される、ＬＨＬ、Ｎ２、ＬＮＳＡＬ、ＬＳＨＬおよびＬＨＬ２ベクターなどのベクター、ならびにこれらのベクターの誘導体（例えば、本明細書中に記載される、改変されたＮ２ベクター）が挙げられるが、これらに限定されない。レトロウイルスベクターは、当該分野で周知の技術を使用して構築され得る。例えば、米国特許第５，２１９，７４０号；Ｍａｎｎら（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：１５３−１５９を参照のこと。
【００８９】
アデノウイルスベースの系が、遺伝子送達のために開発され、そして、本明細書中に記載されているポリヌクレオチドを送達するために適している。ヒトアデノウイルスは、レセプター媒介エンドサイトーシスによって細胞に侵入する二重鎖ＤＮＡウイルスである。これらのウイルスは、遺伝子移入に特に適している。なぜなら、これらは増殖および操作が簡単であり、そして、これらは、インビボおよびインビトロで広範な宿主範囲を示すためである。例えば、アデノウイルスは、造血起源、リンパ系起源および骨髄起源のヒト細胞に感染し得る。さらに、アデノウイルスは、休止細胞および複製標的細胞に感染する。宿主ゲノム中に組み込まれるレトロウイルスとは異なり、アデノウイルスは、染色体外に存続し、従って、挿入性変異誘発に関連した危険を最小化する。このウイルスは、高い力価で容易に産生され、そして、それが精製および貯蔵されるように安定している。複製コンピテントな形態においてさえ、アデノウイルスは、低いレベルの罹患率のみを引き起こし、そして、ヒト悪性腫瘍に関連していない。従って、これらの利点を利用するアデノウイルスベクターが開発されてきた。アデノウイルスベクターおよびそれらの使用の記載については、例えば、Ｈａｊ−ＡｈｍａｄおよびＧｒａｈａｍ（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７−２７４；Ｂｅｔｔら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５９１１−５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７１７−７２９；Ｓｅｔｈら（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：９３３−９４０；Ｂａｒｒら（１９９４）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５１−５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６−６２９；Ｒｉｃｈら（１９９３）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：４６１−４７６を参照のこと。
【００９０】
アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）もまた本明細書中に記載されているポリヌクレオチドを投与するために使用され得る。ＡＡＶベクターは、制限なく、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶＸ７などを含む、いずれかのＡＡＶ血清型に由来し得る。ＡＡＶベクターは、全体または一部欠失した１つ以上のＡＡＶ野生型遺伝子、好ましくはｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子を有し得るが、１つ以上の機能的な隣接する逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を保持する。機能的なＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製およびパッケージングに必要である。従って、ＡＡＶベクターは、ウイルスの複製およびパッケージング（例えば、機能的なＩＴＲ）のためのｃｉｓにおいて必要とされるこれらの配列を少なくとも含む。ＩＴＲ配列は野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、そして、この配列が機能的なレスキュー、複製およびパッケージングを提供する限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって変更され得る。
【００９１】
ＡＡＶ発現ベクターは、公知の技術を使用して構築され、転写方向で作動可能に連結された成分として、転写開始領域、目的のＤＮＡおよび転写末端領域を含む制御エレメントを少なくとも提供する。哺乳動物細胞において機能的である制御エレメントが選択される。作動可能に連結された成分を含む得られた構築物は、機能的なＡＡＶ  ＩＴＲ配列と結合される（５’および３’）。適切なＡＡＶ構築物は、当該分野で周知の技術を使用して設計され得る。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および同５，１３９，９４１号；国際公開番号ＷＯ９２／０１０７０（１９９２年１月２３日公開）およびＷＯ９３／０３７６９（１９９３年３月４日公開）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔら（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９０（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：５３３−５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ（１９９４）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１６５−１６９；ならびにＺｈｏｕら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１８６７−１８７５を参照のこと。
【００９２】
（従来の薬学的調製物）
アジュバント組成物を添加するかまたはせずに、本発明のポリヌクレオチドを含む調製物の処方は、標準的な薬学的処方物化学および方法論を使用して行なわれ得る。これらの全ては当業者に容易に利用可能である。例えば、１つ以上の核酸分子を含む組成物（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター中に存在する）は、１つ以上の薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒクルと組み合わせて、液体調製物を提供し得る。
【００９３】
補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ干渉物質など）が、賦形剤またはビヒクル中に存在し得る。これらの賦形剤、ビヒクルおよび補助物質は、一般的に、この組成物を受容する個体の免疫応答を誘導せず、そして過度な毒性なく投与され得る薬学的因子である。薬学的に受容可能な賦形剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：例えば、水、生理的食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセロールおよびエタノールなどの液体。薬学的に受容可能な塩がまた、そこに含まれ得る：鉱酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素塩、リン酸塩、硫酸塩など）；および有機酸の塩（例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸の塩、安息香酸塩など）。必要とされないが、ペプチド、タンパク質または他の分子がワクチン組成物に含まれるべき場合、調製物は、特にそれらに対する安定剤として働く薬学的に受容可能な賦形剤を含むこともまた好まれる。ペプチドに対する安定剤としてもまた作用する適切なキャリアの例としては、これらに限定されないが、以下の薬学的グレードが挙げられる：ブドウ糖、ショ糖、乳糖、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストランなど。他の適切なキャリアとしては、以下が挙げられるが、再度これらには限定されない：デンプン、セルロース、リン酸ナトリウムまたはリン酸カルシウム、クエン酸、酒石酸、グリシン、高分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびその組み合わせ。薬学的に受容可能な賦形剤、ビヒクルおよび補助物質が、本明細書中で参考として援用される、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）において利用可能である。
【００９４】
核酸の取り込みおよび／または発現の特定の促進剤（ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）（「トランスフェクション促進化因子」）もまた、組成物中に含まれ得る（例えば、非ウイルスベクター組成物（例えば、ブピバカイン、心臓毒素（ｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｎ）およびスクロースなどの促進剤）ならびにトランスフェクション促進化ビヒクル（例えば、核酸分子を送達するのに慣例的に使用されるリポソーム調製物））。アニオン性および中性リポソームは広範に利用可能であり、そして、核酸分子を送達することが周知である（例えば、Ｌｏｐｏｓｏｍｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９０）ＲＰＣ  Ｎｅｗ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）。カチオン性脂質脂質調製物はまた、核酸分子の送達における使用のための周知のビヒクルである。適切な調製物としては、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド）、（商品名リポフェクチンＴＭで入手可能）およびＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレイルオキシ）−３−（トリメチルアミノ）プロパン）が挙げられる（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１６；Ｍａｌｏｎｅら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６０７７−６０８１；米国特許第５，２８３，１８５号および同５，５２７，９２８号、および国際公開番号ＷＯ９０／１１０９２、ＷＯ９１／１５５０１およびＷＯ９５／２６３５６を参照のこと）。これらのカチオン性脂質は、好ましくは、中性脂質（例えば、ＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン））と会合して使用され得る。上記脂質またはリポソーム調製物に添加され得る、なおさらなるトランスフェクション促進化組成物としては、スペルミン誘導体（例えば、国際公開番号ＷＯ９３／１８７５９）およびＧＡＬＡ、グラミシジンＳおよびカチオン性胆汁酸塩のような膜浸透性化合物が挙げられる（例えば、国際公開番号ＷＯ９３／１９７６８）。
【００９５】
あるいは、本発明の核酸分子は、カプセル化され得るか、粒子状キャリアに吸着され得るか、または結合され得る。適切な粒子状キャリアは、ポリメチルメタクリレートポリマーならびにポリ（ラクチド）、およびポリ（ラクチド−コ−グリコリド）に由来するＰＬＧ微粒子に由来する粒子状キャリアを含む。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら（１９９３）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１０：３６２−３６８を参照のこと。他の粒子系およびポリマーもまた使用され得る（例えば、ポリマー：例えば、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、スペルミン、スペルミジン、ならびにこれらの分子の結合体）。
【００９６】
従って、処方されたワクチン組成物は、代表的に、免疫学的応答をマウントするのに十分な量で、目的の抗原をコードする配列を含むポリヌクレオチド（例えば、プラスミド）を含む。適切な有効量は、当業者によって容易に決定され得る。このような量は、慣例的な試験を介して決定され得る比較的広範な範囲に分類される。例えば、免疫応答は、１μｇほど少量のＤＮＡを使用して獲得され得るが、他方、他の投与において、２ｍｇまでのＤＮＡが使用される。ゲノムフラグメントを含むポリヌクレオチドの効果的な用量は、約１０μｇ〜１０００μｇの範囲に入ることが一般的に予想されているが、この範囲を超えるかまたはこの範囲未満の用量もまた、効果的であると見出されている。従って、この組成物は、ポリヌクレオチド分子の約０．１％〜約９９．９％を含み得る。
【００９７】
（従来の薬学的調製物の投与）
上記の薬学的調製物の投与は、処置の経過中、連続的または断続的に、単回用量で行なわれ得る。送達は、液体組成物について、および粒子性組成物を含む液体懸濁液についての従来の針およびシリンジを介して、最も代表的に行われる。さらに、種々の液体インクインジェクターが、当該分野で公知であり、そして、本発明の組成物を投与するために使用され得る。最も効果的な手段および投与の用量を決定する方法は当業者に周知であり、そして、送達ビヒクル、治療組成物、標的細胞、および処置される被験体と共に変化する。単回および複数投与は、内科医によって選択される投薬レベルおよびパターンを使用して実行され得る。１つ以上の抗原配列が、ポリヌクレオチド構築物によって実行され得ることが理解されるべきである。あるいは、別々のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター）（それぞれが、１つ以上の抗原を発現する配列を含む）がまた、本明細書中に記載されるように被験体に送達され得る。
【００９８】
さらに、本発明の方法によって送達され得るポリヌクレオチドは、他の適切な組成物および治療法と組み合わせられ得ることがまた意図される。例えば、被験体における免疫応答を増大させるために、本明細書中で記載された組成物および方法が、薬理学的因子、サイトカインなどの補助物質（例えば、アジュバント）をさらに含み得る。補助物質は、例えば、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドの投与と同時、投与の前、または投与に引き続いて、タンパク質または他のマクロ分子として、投与され得る。この核酸分子組成物は、被験体に直接投与され得るか、あるいは、当業者に公知の方法を使用して、被験体に由来する細胞にエキソビボで投与され得る。
【００９９】
（コーティングされた粒子）
１つの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡワクチン）および／またはアジュバントは、キャリア粒子（例えば、コアキャリア）を使用して送達される。このような核酸調製物を送達するための粒子媒介方法は、当該分野で公知である。従って、一旦調製および適切に精製され、上記の核酸分子および／またはアジュバントは、当該分野で公知の種々の技術を使用して、キャリア粒子（例えば、コアキャリア）上にコーティングされ得る。キャリア粒子は、適切な粒子媒介送達デバイスから細胞内送達のために代表的に使用される粒子サイズの範囲で、適切な密度を有する材料から選択される。最適なキャリア粒子サイズは、もちろん、標的細胞の直径に依存する。あるいは、コロイド性金粒子が使用され得、ここで、コーティングされたコロイド性金が、組織（例えば、皮膚または筋肉）に投与され（例えば、注射され）、引き続いて、免疫コンピテントな細胞に取り込まれる。
【０１００】
本発明の目的で、タングステン、金、白金およびイリジウムのキャリア粒子が、使用され得る。タングステンおよび金の粒子が好ましい。タングステン粒子は、０．５〜２．０μｍの直径の平均サイズで、容易に入手可能である。このような粒子は、粒子加速送達方法における使用のための最適な密度を有し、そしてＤＮＡを使用する高度に効率的なコーティングを可能とするが、タングステンは、潜在的に特定の細胞タイプにとって毒性であり得る。金粒子または微晶質金（例えば、金粉末Ａ１５７０（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ  Ｃｏｒｐ．、Ｅａｓｔ  Ｎｅｗａｒｋ、ＮＪから入手可能））もまた、本発明に用途を見出す。金粒子は、均一な大きさ（Ａｌｐｈａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから１〜３μｍの粒子サイズで入手可能、またはＤｅｇｕｓｓａ、Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪから０．９５μｍを含む粒子サイズの範囲で入手可能）および毒性の減少を提供する。
【０１０１】
ＤＮＡまたはＲＮＡを金またはタングステンの粒子上にコーティングまたは沈殿させるための、多数の方法が公知であり、そして記載されてきた。このような方法の大部分は、一般に、所定の量の金またはタングステンを、プラスミドＤＮＡ、ＣａＣｌ２およびスペルミジンと組み合わせる。得られる溶液を、コーティング手順の間連続的にボルテックスして、反応混合物の均一性を確実にする。核酸の沈殿後、コーティングされた粒子は適切な膜に移されて使用前に乾燥され得るか、サンプルモジュールまたはカセットの表面にコーティングされ得るか、あるいは適切な粒子送達器具において使用するための送達カセットに装填され得る。
【０１０２】
ペプチドアジュバント（例えば、サイトカイン）は、適切なキャリア粒子（例えば、金またはタングステン）上にコーティングされ得る。例えば、経験的に決定される比率で２つの成分を単純に混合することによって、硫酸アンモニウム沈殿または当業者に知られた他の溶媒沈殿方法によって、または、ペプチドのキャリア粒子への化学的なカップリングによって、ペプチドは、キャリア粒子へ付着され得る。Ｌ−システイン残基の金へのカップリングは、以前に記載されている（Ｂｒｏｗｎら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ：２７１−３１１（１９８０））。他の方法としては、例えば、無水エタノール、水、またはアルコール／水混合物中でペプチド抗原を溶解する工程、この溶液を定量のキャリア粒子に添加する工程、次いで、ボルテックスする間、空気または窒素の気流下で混合物を乾燥する工程を包含する。あるいは、このペプチド抗原は、減圧下での遠心分離によってキャリア粒子上で乾燥させられ得る。一旦乾燥すると、コーティングされた粒子は、適切な溶媒（例えば、酢酸エチルまたはアセトン）中で懸濁され得、そして、粉砕され得（例えば、超音波処理によって）、実質的に均一な懸濁液を提供する。
【０１０３】
（コーティングされた粒子の投与）
これらの形成に従って、核酸調製物またはペプチドもしくはタンパク質アジュバント調製物のいずれかでコーティングされたキャリア粒子は、例えば、粒子媒介送達技術を使用して、被験体に経皮的に送達される。
【０１０４】
粒子媒介送達技術に適切な種々の粒子送達デバイスは、当該分野で公知であり、そして本発明の実施において用いるために全ての適切である。現在のデバイスの設計は、爆発的な、電気的または気体的発射を用いて、コーティングされたキャリア粒子を標的細胞に向けて推進する。コーティングされたキャリア粒子それ自体を、移動可能なキャリアシートに放出可能に付着させ得るか、または気流が通過する表面に取り外し可能に付着させ得、粒子をこの表面から持ち上げ、そしてこれらを標的に向けて加速する。気体発射デバイスの例は、米国特許第５，２０４，２５３号に記載される。爆発型デバイスは、米国特許第４，９４９，０５０号に記載される。電気的発射型粒子加速装置の一例は、米国特許第５，１２０，６５７号に記載される。本明細書中での使用に適切な別の電気的発射装置は、米国特許第５，１４９，６５５号に記載される。これらの特許の全ての開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０１０５】
コーティングされた粒子は、投薬処方物に適合性の様式で、そして、所望の免疫応答をもたらすのに効果的な量で処置される被験体に投与される。一般的に、核酸分子が、単回用量当り核酸分子０．００１〜１００．１μｇ、より代表的には、０．０１〜１０．０μｇの範囲にある場合、そして、ペプチドまたはタンパク質分子が、ペプチドの１μｇ〜５ｍｇ、より代表的には、１〜５０μｇにある場合、送達される組成物の量は、処置される被験体に依存する。必要な正確な量は、免疫される個体の年齢および通常の状態、および特定のヌクレオチド配列または選択されるペプチド、ならびに他の因子に依存して変化する。適切な有効量は、瞬時に詳細を読み取る際に、当業者によって容易に決定され得る。
【０１０６】
従って、本明細書中に記載される抗原の有効量、またはそのための核酸コードは、免疫された被験体において適切な免疫応答をもたらすのに十分であり、そして、慣例的な試験を介して決定され得る比較的広範な範囲に分類される。好ましくは、コーティングされた粒子は、処置された被験体において、免疫応答（例えば、Ｔ細胞活性化）をもたらすために、適切な受容体細胞に送達される。
【０１０７】
（粒子性組成物）
あるいは、目的の抗原（ならびに１つ以上の選択されたアジュバント）は、粒子性組成物として、処方され得る。より詳細には、目的の抗原および／またはアジュバントを含む粒子の処方物は、標準的な薬学的処方物化学を使用して行われ得、そして、それらの全ての方法論は、当業者に容易に利用可能である。例えば、１つ以上の抗原および／またはアジュバントは、１つ以上の薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒクルと組み合わされ得、抗原、アジュバント、またはワクチン組成物を提供し得る。補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ干渉物質など）が、賦形剤またはビヒクル中に存在し得る。これらの賦形剤、ビヒクルおよび補助物質は、一般的に、この組成物を受容する個体の免疫応答を誘導せず、そして過度な毒性なく投与され得る薬学的因子である。薬学的に受容可能な賦形剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：例えば、水、生理的食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセロールおよびエタノールなどの液体。薬学的に受容可能な塩がまた、そこに含まれ得る：鉱酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素塩、リン酸塩、硫酸塩など）；および有機酸の塩（例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸の塩、安息香酸塩など）。必要とされないが、特に、ペプチド、タンパク質または他の抗原に対して安定剤として働く薬学的に受容可能な抗原組成物を含むこともまた好まれる。ペプチドに対する安定剤としてもまた作用する適切なキャリアの例としては、これらに限定されないが、以下の薬学的グレードが挙げられる：ブドウ糖、ショ糖、乳糖、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストランなど。他の適切なキャリアとしては、以下が挙げられるが、再度これらには限定されない：デンプン、セルロース、リン酸ナトリウムまたはリン酸カルシウム、クエン酸、酒石酸、グリシン、高分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびその組み合わせ。薬学的に受容可能な賦形剤、キャリア、安定剤および補助物質の徹底した議論が、本明細書中で参考として援用される、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）において入手可能である。
【０１０８】
処方された組成物は、上記に規定のような、免疫学的応答を開始させるに十分な量の目的の抗原を含む。適切な有効量は、当業者によって容易に決定され得る。このような量は、比較的広範の範囲、一般に、目的の抗原の０．１μｇ〜２５ｍｇ以上の範囲内に入り、そして特定の適切な量は、慣用試験によって決定され得る。組成物は、約０．１％〜約９９．９％の抗原を含む。アジュバンドがこの組成物中に含まれる場合、またはこの方法が粒子性アジュバンド組成物を提供するために試用される場合、このアジュバンドは、上記のように適切な量で存在する。次いで、この組成物が標準的な技術を使用して（例えば、単純なエバポレーション（空気乾燥）、減圧乾燥、スプレー乾燥または凍結乾燥（ｌｙｐｏｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）、スプレー−凍結乾燥、スプレー冷却、沈殿、懸濁液粒子形成などによって）粒子として調製される。所望の場合、残留粒子は、国際出願ＷＯ９７／４８４８５（本明細書中で参考として援用される）に記載される技術を使用して緻密にされ得る。
【０１０９】
これらの方法を使用して、約０．１〜約２５０μｍ、好ましくは、約１０〜約１５０μｍ、および最も好ましくは、約２０〜約６０μｍの範囲のサイズ；ならびに約０．１〜約２５ｇ／ｃｍ３の範囲の粒子密度、約０．５〜約３．０ｇ／ｃｍ３以上のかさ密度を有する核酸粒子を得うる。
【０１１０】
同様に、約０．１〜約２５０μｍ、好ましくは、約０．１〜約１５０μｍ、および最も好ましくは、約２０〜約６０μｍの範囲のサイズ；約０．１〜約２５ｇ／ｃｍ３の範囲の粒子密度、約０．５〜約３．０ｇ／ｃｍ３、および最も好ましくは約０．８〜約１．５ｇ／ｃｍ３のかさ密度を有する選択されたアジュバンドの粒子が得られ得る。
【０１１１】
単回用量または複数回用量の容器（この粒子は、使用の前にパッケージングされ得る）は、目的の抗原および／または選択したアジュバンド（例えば、ワクチン組成物）を含む適切な量の粒子を包理する密封容器を含み得る。この粒子組成物は、滅菌処方物としてパッケージングされ得、そしてこの密封容器は、本発明の方法で使用するまでこの処方物の無菌を維持するように設計され得る。所望の場合、この容器は、無針シリンジシステムでの直接的な使用に適合され得、そしてカプセル形態、ホイルポーチ形態、におい袋形態、カセット形態などをとり得る。
【０１１２】
この粒子がパッケージングされる容器は、さらに、この組成物を特定するためにラベルが貼られ、そして明らかな用量情報を提供する。さらに、この容器は、政府機関（例えば、Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって定められた形態の注意書きが貼りつけられ得、この注意書きは、ヒトへ投与するために含まれる抗原、アジュバンド（またはワクチン組成物）の製造、使用または販売に関する、連邦法による承認を示す。
【０１１３】
（粒子性組成物の投与）
これらの形成の後、この粒子性組成物（例えば、粉末）を、適切な経皮送達技術を使用して、脊椎動物に経皮的に送達し得る。目的の物質を投与するために適切な種々の粒子送達技術は、当該分野で公知であり、そして本発明の実施においての使用が見出される。特に好ましい経皮的粒子送達系は、無針シリンジを使用して、制御された用量の固体粒子を、無傷の皮膚および組織の中に、かつ無傷の皮膚および組織を通して発射する。例えば、Ｂｅｌｌｈｏｕｓｅらの米国特許第５，６３０，７９６号（無針シリンジ（「ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ（登録商標）粒子送達デバイス」としても知られる）を記載している）を参照のこと。他の無針シリンジの構成は、当該分野で公知であり、そして本明細書中に記載される。
【０１１４】
次いで、粒子性組成物（目的の抗体および必要に応じてアジュバンドを含む）を、経皮送達技術を介して送達する。好ましくは、粒子性組成物は、粉末注射方法を介して送達される（例えば、無針シリンジ（共願の国際公開第ＷＯ９４／２４２６３、ＷＯ９６／０４９４７、ＷＯ９６／１２５１３およびＷＯ９６／２００２２（これらの全ては、本明細書中で参考として援用される）に記載されるような無針シリンジ）から送達される）。このような粒子性送達デバイスからの粒子の送達は、一般に０．１〜２５０μｍの範囲、好ましくは、約１０〜７０μｍの範囲のサイズを有する粒子で実施される。約２５０μｍより大きな粒子はまた、デバイスから送達され得、上限は、粒子のサイズが皮膚細胞に対して都合の悪い損傷を引き起こす点である。送達された粒子が標的表面を貫通する実際の距離は、粒子サイズ（例えば、ほぼ球形の粒子外形とみなした名目粒子直径）、粒子密度、粒子が表面に衝突する初速度、ならびに標的とされた皮膚組織の密度および動粘性率に依存する。このことに関して、無針の注射に使用するための最適粒子密度は一般に、約０．１ｇ／ｃｍ３と２５ｇ／ｃｍ３との間、好ましくは約０．９ｇ／ｃｍ３と１．５ｇ／ｃｍ３との間の範囲であり、そして注射速度は一般に約１００ｍ／秒と３，０００ｍ／秒との間の範囲である。適切な気体圧力を用いて、１０μｍ〜７０μｍの平均直径を有する粒子は、駆動気体流の超音波速度に近づく速度でノズルを通して加速され得る。
【０１１５】
所望の場合、これらの粒子送達デバイス（例えば、無針シリンジ）は、目的の抗原および／または選択されたアジュバンドを含有する粒子の適切な用量を含んだ、予め充填された状態で提供され得る。この充填されたシリンジは、密封シールした容器の中にパッケージングされ得、これにさらに上記のようにラベルが貼られ得る。
【０１１６】
本明細書中に記載されるような、治療学的に有効量の粉末粒子を含む組成物は、上記の粒子送達デバイスを介して任意の適切な標的組織に送達され得る。例えば、この組成物は、筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、腸、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織に送達され得る。核酸分子に関して、好ましくは、一定期間、分化した細胞に送達され、そしてこの分子は、そこで発現され；しかし、この分子は、分化していないか、または部分的に分化した細胞（例えば、血液の幹細胞および皮膚の線維芽細胞）にも送達され得る。
【０１１７】
この粉末化組成物は、用量処方物に適合性の様式および、予防的および／または治療学的効果がある量で処置されるように、被験体に投与される。送達されるべき組成物の量（一般に、一回の用量当たり０．５μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇの核酸分子）は、処置されるべき被験体に依存する。用量は、５０ｋｇの被験体に対して０．５μｇ（すなわち、約０．０１μｇ／ｋｇ）程度の低さであり得る。他の薬物（例えば、生理学的に活性なペプチドおよびタンパク質）の投与は、一般に、約０．１μｇ〜約２０ｍｇ、好ましくは、１０μｇ〜約３ｍｇの範囲である。必要な正確な量は、処置されるべき個体の年齢および一般的な状態、処置される状態の重篤度、送達される特定の調製物、投与の部位、および他の因子に依存して変化する。適切な有効量は、当業者によって容易に決定され得る。
【０１１８】
従って、本発明の粒子性組成物の「治療有効量」は、疾患または状態の治療または予防を達成するのに十分であり、そして試験を介して決定され得る比較的広範の範囲である。
【０１１９】
（ワクチン接種法）
本明細書を考慮すると当業者に明らかであるように、上記のポリヌクレオチドを含むワクチン（ＤＮＡワクチン）は、この処置過程全体にわたって継続的または断続的に１回用量で効果があり得る。最も効果的な手段および投与の用量を決定する方法は、当業者に周知であり、そして送達ベクター、組成物の性質、探し出された特定の治療、標的細胞、および処置される被験体で変化する。単一および複数の投与が、適切な医者によって選択された用量レベルおよびパターンを用いて実施され得る。１以上の抗原が送達されたポリヌクレオチドによって発現され得ることを理解すべきである。あるいは、個々のベクター（同時刺激分子プロモーターの制御下で、１以上の異なる抗原をそれぞれ発現する）は、本明細書中に記載されるように被験体に送達され得る。
【０１２０】
さらに、本発明の方法によって送達された免疫抗原（例えば、ポリヌクレオチドまたはペプチド）が他の適切な組成物および治療と組み合わせられることも意図される。例えば、Ｔ細胞応答は、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドまたはペプチドを１以上のさらなる薬剤（例えば、サイトカイン）と共に送達することによって増強され得、その前、または後、または同時に、（１）抗原発現を駆動する同時刺激分子プロモーターを有するポリヌクレオチド；（２）少なくとも１個の抗原をコードするポリヌクレオチドまたは（３）ペプチド抗原が投与され得る。これらのさらなる薬剤は、種々の形態（例えば、精製された分子）で、またはポリペプチドの全長フラグメントもしくは画分フラグメントをコードするベクターによって提供され得る。このベクターは、この抗原をコードする配列を運搬するベクターとは異なり得るか、または同一のベクター上で運搬され得る。サイトカインコード配列が同一のベクターまたは異なるベクターであろうと、この発現は、抗原発現を駆動する同一のプロモーターまたは異なるプロモーターによって駆動され得る。この方法において、ＡＰＣ成熟サイトカイン（例えば、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０ＬもしくはＣＤ１５４）、腫瘍壊死因子関連活性誘導サイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）、およびＦｌｔ３リガンド（ｆｌｔ−３Ｌ））は、ＡＰＣ上での同時刺激性リガンドの発現を増加させるか、抗原／ＭＨＣ複合体を刺激するか、またはＡＰＣのアポトーシスを阻害することによって、明白に、免疫応答を増強させるように提供され得る。
【０１２１】
以下は、本発明を実行するための特定の実施態様の例である。これらの実施例は、例証の目的だけのために提供され、かついかなるようにも本発明の範囲を制限することを意図されない。
【０１２２】
（実施例）
使用されるメンバーに関する精度（例えば、量、温度など）を確実にするための努力がなされてきたが、もちろん、いくらかの実験誤差および逸脱は、考慮されるべきである。
【０１２３】
（実施例１：ＣＤ８０プロモーター駆動プラスミドを使用する核酸免疫）
ＣＤ８０またはＣＤ８６プロモーターを含むＤＮＡワクチンプラスミドを使用して、核酸免疫の特定をおよび効果を評価するために、以下の研究を実施した。
【０１２４】
（Ａ．プラスミドの調製）
マウスおよびヒトＣＤ８０遺伝子プロモーターのＤＮＡ配列を、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄａｔａｂａｓｅから入手した。このマウスＣＤ８０プロモーターをＰＣＲによって合成するためのＤＮＡプライマーを、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬから入手し、そして以下の配列を有した：
（１）５’−ＡＣＧ  ＣＧＴ  ＣＧＡ  ＣＴＣ  ＴＡＧ  ＡＡＧ  ＧＡＧ  ＡＣＡ  ＴＴＣ  ＡＧＣ  ＴＧ−３’（配列番号１）
（２）５’−ＡＣＧ  ＣＧＴ  ＣＧＡ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＣＣＴ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＴＡ−３’（配列番号２）
（３）５’−ＡＴＴ  ＣＧＧ  ＣＣＧ  ＣＧＧ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＧＣＣ  ＡＡＴ  ＧＧＡ  ＧＣＴ  ＴＡＧ  Ｇ−３’（配列番号３）
（４）５’−ＡＴＴ  ＣＧＧ  ＣＣＧ  ＣＧＧ  ＡＧＡ  ＧＴＴ  ＣＴＧ  ＡＡＴ  ＣＡＧ  ＧＧＴ  ＧＴ−３’（配列番号４）。
【０１２５】
同様に、ヒトＣＤ８０プロモーターをＰＣＲによって合成するためのＤＮＡプライマーをＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬから入手し、そして以下の配列を有した：
（５）５’−ＡＣＧ  ＣＧＴ  ＣＧＡ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＴＣＣ  ＴＣＡ  ＴＣＣ  ＣＡＣ  ＣＡ−３’（配列番号５）
（６）５’−ＡＣＧ  ＣＧＴ  ＣＧＡ  ＣＣＡ  ＴＣＡ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＡＡＧ  ＧＣＴ  ＡＧ−３’（配列番号６）
（７）５’−ＡＣＧ  ＣＧＴ  ＣＧＡ  ＣＧＴ  ＴＴＧ  ＴＴＡ  ＧＴＣ  ＣＡＴ  ＧＣＡ  ＣＧ−３’（配列番号７）
（８）５’−ＴＣＣ  ＣＣＧ  ＣＧＧ  ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＧＣＧ  ＡＣＡ  ＴＴＴ  Ｃ−３’（配列番号８）。
【０１２６】
ＣＤ８０プロモーター（ヒトおよびマウス）のフラグメントを、２００μｇのヒトまたはマウス遺伝子ＤＮＡ、１×ＴｒｂｏＴＭ  Ｐｆｕ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ  ８．８、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ、０．１ｍｇ／ｍｌ  ヌクレアーゼ−フリーＢＳＡ）、２０ｐｍ  ５’プライマー、２０ｐｍ  ３’プライマー、２００μｍ  ｄＮＴＰ、ｌＵ  Ｐｅｒｆｅｃｔ  ＭａｔｃｈＴｍ  ＰＣＲエンハンサー（ＳｔｒａｔａＧｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）および２．５Ｕ  Ｐｆｕ  ＴｕｒｂｏＴＭ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を９６℃（４５秒）；５５℃（４５秒）および７２℃（４５秒）を３５サイクル反応させることによるＰＣＲによって増幅した。３５サイクルの完了後に、このＰＣＲ産物を４℃に保持した。このＰＣＲ産物を、ＱＬＡｑｕｉｃｋＴｍ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により製造業者の指導書に従って精製した。
【０１２７】
精製したＰＣＲ産物を、緩衝液＃３（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ  ７．９）中でＳａｌ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）およびＳａｃ  ＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて、３７℃で一晩かけて二重で消化した。この消化したＰＣＲ産物を、１％のアガロースゲルにかけて、そして正確なバンドを、このゲルから切除した。このゲルスライス中のＤＮＡを、ＧｅｎＥｌＵｔｅＴｍエチジウムブロミドスピンカラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ）を使用して精製した。
【０１２８】
プラスミドを、プラスミドｐＷＲＧ７１２８（Ｔａｃｋｅｔら（１９９９）Ｖａｃｃｉｎｅ  １７：２８２６）由来のＣＭＶプロモーターを取り除くことによって構築し、そしてこの増幅したＣＤ８０プロモーターセグメントで置換した。このプラスミドｐＷＲＧ７１２８は、適切なコントロールエレメントに加えて、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの転写コントロール下に存在するＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）をコードする配列を含み、そしてほとんどの細胞型へのトランスフェクトする際にＨｂｓＡｇ粒子を産生することが示された。このｐＷＲＧ７１２８プラスミドは、以下のようにして構築された。ＢａｍＨ１を用いて完了するためにベクターを消化し、続いて、Ｈｉｎｄ３を用いて部分的に消化することによって、クローニングベクターｐＷＲＧ７０７７（Ｓｃｈｍａｌｊｏｈｎら（１９９７）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７１：９５６３−９５６９）を、ＨＢｓＡｇコード配列を受容するように調製した。Ｋｌｅｎｏｗフラグメントおよびデオキシリボヌクレオチドを用いて処理することによって５’突出を平滑化した後に、この４．３ｋＢベクターフラグメントを単離した。この１．３５ｋＢ  ＨｂｓＡｇインサートフラグメント（翻訳されていないプレ−Ｓ２配列，ａｄｗ株の２２６アミノ酸ＨｂｓＡｇコード配列、およびＨＢＶエンハンサーエレメントを含む）を、ＢａｍＨ１を用いて消化することによってプラスミドｐＡＭ６（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＭＤ）から切除した。Ｋｌｅｎｏｗフラグメントおよびデオキシリボヌクレオチドを用いて処理することで末端を平滑した後に、このフラグメントを単離し、そして上記のように４．３ｋＢベクターフラグメントにライゲーションした。得られた組換え体を、インサートの適切な起点に関してスクリーニングし、そして正確な単離物を同定し、そして中間プラスミド（ｐＷＲＧ７０７４）と命名した。Ｘタンパク質（ｐＡＭ６  １．３５ｋＢインサートの３’末端に存在する）のコドンの開始部分を取り除くために、４．８６ｋＢのベクターフラグメントを、Ｂｇｌ２で消化し、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントおよびデオキシリボヌクレオチドを用いて末端を平滑化し、次いで、ＢｓｔＸ１を用いて消化することによりｐＷＲＧ７０７４プラスミドから単離し、７５４ｂｐインサートフラグメントを、Ｎｃｏ１を用いて消化し、リョクトウヌクレアーゼを用いて処理し、ＢｓｔＸ１を用いて消化することによってｐＷＲＧ７０７４構築物から単離した。次いで、得られたベクターおよびインサートフラグメントを、共にライゲーションすることによって、分析的プラスミドｐＷＲＧ７１２８を形成する。このプラスミド構築物は、表１および図１〜７に示される。
【０１２９】
（表１：代表的なプラスミド）
【０１３０】
【表１】
2004522403.tif 000003
ｐＷＧＲ７１２８を、緩衝液＃３中でＳａｌ  ＩおよびＳａｃ  ＩＩを用いて消化した。この消化したベクターを１％のアガロースゲルにかけて、正確なベクターバンドをゲルから切除し、ＧｅｎＥｌｕｔｅＴｍエチジウムブロミドスピンカラムを使用して精製した。
【０１３１】
調製したベクター中にプロモーターをライゲーションし、２０ｎｇのベクターおよび１００ｎｇのインサートプロモーターを、６ワイスユニットＴ４  ＤＮＡリガンド（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）によって、１×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰ、２５μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、ｐＨ  ７．８）中で１５℃で一晩かけてライゲーションさせた。
【０１３２】
適切にライゲーションさせた構築物の断片に関して、このライゲーション混合物を、生理食塩水中で１：３に希釈した。５μｌの希釈混合物を、５０μｌのＭＡＸ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ＤＨ５α  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ＣｅｌｌｓＴＭ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）に添加し、そして氷上で３０分間インキュベートした。形質転換した混合物を４２℃で４５分間かけて熱ショックをかけて、そして２分間のインキュベーションに迅速に戻した。１ｍｌのＳＯＣ培地をこの形質転換した細胞に添加し、そして３７℃で１時間振盪した。インキュベーション後に、この細胞を、手短に遠心分離し、そしてカナマイシン−ＬＢプレート上にプレート化した。このプレートを、３７℃で一晩かけてインキュベートした。
【０１３３】
首尾良くライゲーションを確認するために、単一のクローンを取り出し、そして３．０ｍｌのＬＢ／Ｋａｎ培地中にインキュベートし、そして３７℃で一晩攪拌しながら培養した。プラスミドを培地から単離し、Ｓａｌ  ＩおよびＳａｃ  ＩＩを用いて消化し、エチジウムブロミドで染色した１％アガロースゲル上で視覚化させた。
【０１３４】
（Ｂ．抗原の発現）
２ｍｌのＢ１６細胞を、２×１０５細胞／ｍｌの６ウェルプレートに播種した。この細胞を、５％のＣＯ２を用いて３７℃インキュベーションで一晩かけて培養し、６０〜８０％のコンフルエンシーに達した。２μｇの血清培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を減らしたエンドトキシンフリープラスミドＤＮＡ（１００μｌ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）１中）および１０μｌの血清培地を減らしたリポフェクチン（９０μｌ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）１中）を、室温で４５分間別々にインキュベートした。次いで、２つの溶液を混合し、そして１５分間室温でインキュベートした。このインキュベートの間に、Ｂ１６細胞を、血清フリー培地中で３回洗浄した。各トランスフェクションに関して、０．８ｍｌの血清培地を減らしたＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）１を、混合溶液に添加し、そしてこの複合体をＢ１６細胞上に被せた。次いで、この細胞を３７℃で５時間インキュベートした。続いて、１．０ｍｌの２０％  ＦＢＳ培地を添加した。この培地を、抗原発現分析のために４８時間後に収集した。
【０１３５】
トランスフェクトしたＢ１６細胞中のＨＢｓＡｇの発現を、表２に示した。この細胞を、以下の３つの手段の一つで処理した：（１）Ｂ１６細胞中で抗原（すなわち、ＨＢｓＡｇ）を発現させたポジティブコントロール（すなわち、ｐＷＲＧ７１２８）を用いたトランスフェクション；（２）上記のようなプラスミドｐ５０２０およびｐ５０２１を用いたトランスフェクションおよび（３）トランスフェクトしない（ネガティブコントロール）。
【０１３６】
（表２．ウイルスを用いて細胞をトランスフェクトすることによるＨＢｓＡｇのインビトロ発現）
（プラスミド）
【０１３７】
【表２】
2004522403.tif 000004
＊データは、２つの別個の培地から得られる上清に関して平均ＯＤ値（４９２．６波長）として示され、ＨＢＶ表面抗原キット（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  （Ａｕｓｚｙｍｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ，  Ｌｉｓｔ  Ｎｏ．１９８０−２４）を使用して分析した。
【０１３８】
表２に示されるように、陽性コントロールプラスミドｐＷＲＧ７１２８と異なり、ＨＢＶ表面抗原の発現は、プラスミドｐ５０２０およびｐ５０２１でトランスフェクトされた培養Ｂ１６細胞中で検出されなかった。従って、ＣＤ８０プロモーターは、非抗原提示細胞中で抗原の発現を駆動しない。
【０１３９】
（Ｃ．コートされた微小粒子の調製）
プラスミドＤＮＡを、１〜３μｍ金粒子（Ｄｅｇｕｓｓａ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）上に、Ｅｉｓｅｎｂｒａｕｎら（１９９３）ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：７９１−７９７によって記載される技術を用いてコートした。簡単に言うと、金粒子を、５０ｍＭ  スペルミジン中に懸濁し、そして水中の等量のプラスミドと混合する。この溶液を、ボルテックス上で混合し、そしてこの金／ＤＮＡ混合物の半分の量の１Ｍ  ＣａＣｌ２を滴下した。この混合物を、室温で１０分間インキュベートし、そして遠心分離してこの粒子をペレットにした。この粒子を、１００％エタノールで３回洗浄し、そして０．０５〜０．５％のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含むエタノール中に再懸濁した。次いで、ＤＮＡコートされた金粒子を、ＭｃＣａｂｅに対する米国特許第５，５８４，８０７に記載されるようにＴｅｆｚｅｌ（登録商標）チューブにロードし、このチューブを１．２７ｃｍ長に切断してＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ（登録商標）ＸＲ−１粒子送達装置（ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）中のカートリッジとして提供する。ヘリウムパルスＸＲ−１粒子送達装置は、以前に記載されている（例えば、米国特許第５，５８４，８０７および５，８６５，７９６を参照のこと）。ワクチン接種において、各１．２７ｃｍのカートリッジは、２μｇのプラスミドＤＮＡでコートされた０．５ｍｇの金粒子を含んだ。
【０１４０】
（Ｄ．抗体応答）
上記のインビトロトランスフェクト研究で見出された陽性の結果に基づいて、ワクチン接種試験を、インビボ粒子媒介送達方法を用いて開始した。本研究において核酸免疫を受ける動物被験体は：（１）ｐＷＧＲ７１２８ポジティブコントロールを用いた表皮への粒子媒介送達によってワクチン接種された４匹のマウスの、第１の実験群；および（２）ＣＤ８０プロモーター駆動ＨＢｓＡｇプラスミドｐ５０２０およびｐ５０２１を用いた表皮への粒子媒介送達によってワクチン接種された６匹のマウスの、第２の実験群を含んだ。血液サンプルを、免疫の前に各動物から採取した（ナイーブマウス）。
【０１４１】
マウスを、プラスミドｐ５０２０およびｐ５０２１またはコントロールｐＷＧＲ７１２８で、金粒子上にプラスミドコートされた粒子媒介送達（２μｇＤＮＡ／ｍｇ金でコートされた０．５ｍｇの金／ショット）によって免疫（プライム）した。免疫に関して、マウスを剃り、この粒子を５００ｐｓｉのヘリウムで操作された研究バレルでＸＲ−１装置を用いて腹部の皮膚に送達した。２ショットを、１免疫につき各マウスに与えた。４週間後、プライム免疫に使用した同じ免疫プロトコールに従って、このマウスをブーストした。
【０１４２】
血清を、免疫前、プライム後２週間目および４週間目、ならびにブースト後２週間目にこの動物から収集した。血清抗体レベルを、ＡＵＳＡＢ  ＥＩＡキット（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）を用いて、製造者によって供給された指示書に従って分析した。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）表面抗原に対する抗体反応性は、プラスミドｐ５０２０およびｐ５０２１で免疫した動物から採取された血清サンプル中で検出されなかったが；ブースト後２週間目に、血清抗体力価は、ｐＷＧＲ７１２８で免疫したマウスにおいて＞３０００ｍｌＵ／ｍｌであった（表３）。
【０１４３】
（表３．ＣＤ８０プラスミドで免疫したマウス中のＨＢｓＡｇ特異的血清抗体力価）
【０１４４】
【表３】
2004522403.tif 000005
＊データを、示されたマウス群に対する平均ＨＢＶ表面抗原抗体力価（ｍｌＵ／ｍｌ）として示す。血清抗体力価を、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（ＡＵＳＡＢ  ＥＩＡ、リスト９００６−２４）からのアッセイキットを用いて決定した。
【０１４５】
従って、ＣＤ８０プロモーター駆動プラスミドは、血清中の平均抗体力価に上昇を引起さない。
【０１４６】
（Ｅ．細胞媒介免疫応答）
上記の血清抗体力価の分析に見出された陽性の結果に基づいて、免疫マウス中の細胞障害性Ｔ細胞活性の研究を実施した。細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）活性を、ブースト後２週間目に屠殺した免疫マウスから得た脾細胞を用いて分析した。図８に示されるように、プラスミドｐ５０２０およびｐ５０２１での免疫によって誘発されたＣＴＬ応答は、プラスミドｐＷＧＲ７１２８によって誘発された応答よ類似していた。これらの応答は、ナイーブマウスから収集された脾細胞に見出されたものよりもはるかに大きかった。
【０１４７】
上記研究の結果として、抗原発現が同時刺激分子から誘導されたプロモーターによって駆動される場合に、核酸免疫はＴ細胞特異的免疫応答を提供することが、見出され得る。さらに、Ｔ細胞応答は、ポジティブコントロールを用いて見出されたものに匹敵する。
【０１４８】
（実施例２：ＳＩＶ免疫応答）
ヒトＣＤ８０プロモーター駆動ＨＢｓＡｇ（ｈＣＤ８０−ＨＢｓＡｇ）をコードする発現ベクターがサル樹状細胞中で発現されるか否かを決定するために、以下の研究を実施する。サル樹状細胞（ＤＣ）を、本質的に、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｉｄｅら（１９９５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｐｒｉｍａｔｏｌ．２４：２７１−２８１に記載されるように、ＰＢＭＣから単離する。次いで、単離したＤＣを、本質的にＢ１６細胞に関して実施例１に記載されるように、ヒトＣＤ８０プロモーター駆動ＨＢｓＡｇをコードするプラスミドでトランスフェクトする。非ＡＰＣ株（例えば、サルＣＯＳ細胞）を、同様にトランスフェクトする。上清および／または細胞中のＨＢｓＡｇの発現を、免疫組織化学染色によって実施する。
【０１４９】
細胞特異的発現を考慮して、ＡＰＣ中でのＨＢｓＡｇ発現の程度を決定するための研究を実施する。プラスミドｈＣＤ８０−ＨＢｓＡｇを、ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ（登録商標）ＸＲ粒子送達装置を用いてサルの皮膚の表皮に送達する。種々のさらなる表皮部位をまた、研究する。金をネガティブコントロールとして使用し、一方、ＣＭＶ−ＨＢｓＡｇをポジティブコントロールとして使用する。ＧＭ−ＣＳＦを、樹状細胞リクルートメントを試験するために投与する。生検を、２４または４８時間後に、投与部位において実施する。組織を断片化し、そしてＨＢｓＡｇの特異的抗体および樹状細胞表面マーカーを用いた免疫組織化学染色によって、樹状細胞中のＨＢｓＡｇ発現を評価する。樹状細胞およびランゲルハンス細胞におけるＨＢｓＡｇ発現を評価する。
【０１５０】
ｈＣＤ８０−ＳＩＶ発現ベクターを、例えば、ＨＢｓＡｇをコードする配列を適切なＳＩＶコード配列で置換することによって構築する。サルを、ｈＣＤ８０−ＳＩＶ構築物で免疫し、そしてＣＭＶ−ＳＩＶプラスミド（ポジティブコントロール）で免疫したサルと比較する。プラスミドの送達を、粒子送達装置を用いて実施する。抗原発現、抗体応答、およびＣＴＬ活性化を、本質的に上記の実施例１に記載のように評価する。次いで、このサルを、病原性ＳＩＶでチャレンジし、ＳＩＶの臨床的な発現に関してモニターする。
【０１５１】
（実施例３：サイトカインアジュバントの使用）
ＴＮＦ関連活性化誘導キナーゼ（ＴＲＡＮＣＥ）をコードする核酸が同時投与された抗原配列に対する免疫応答を増強する能力を評価するために、以下の研究を実行した。
【０１５２】
（Ａ．プラスミド調製物）
マウスＴＲＡＮＣＥのｃＤＮＡコード配列を、ｍＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦ０１３１７０）から誘導し、そしてｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ２発現ベクター（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｅ４０２６）の挿入部位にクローン化し、ＣＭＶ２プロモーターの転写制御下でＴＲＡＮＣＥコード配列を含む発現構築物を得た。このプラスミド構築物を、ｐＴＲＡＮＣＥと命名した。
【０１５３】
Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）およびＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）をコードする配列を含むプラスミドを、以下のように構築した。ＨＢｃＡｇおよびＢＨＢｓＡｇをコードする配列の両方を、ＨＢＶクローンｐＡＭ６（ＡＴＣＣ登録番号４５０２０）から得た。ＨＢｓＡｇコード領域を作製するために、ｐＡＭ６構築物をＮｃｏＩで切断し、そして緑豆ヌクレアーゼを用いて処理し、Ｘ抗原の開始コドンを取り除いた。次いで、生じるＤＮＡを、ＢａｍＨＩで切断し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理してこのＤＮＡを平滑末端にし、ＨＢｓＡｇ発現カセットを作製する。ＨＢｓＡｇ発現カセットは、１．２ｋＢフラグメントで存在する。全長ヒトＣＭＶ（Ｔｏｗｎｅ種）最初期プロモーター（エンハンサーと共に）を含むプラスミド構築物ｐＰＪＶ７０７７（Ｓｃｈｍａｌｊｏｈｎら（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：９５６３−９５６９）を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｇｌＩＩで切断し、次いで、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼおよびウシアルカリホスファターゼで処理して平滑末端ＤＮＡを作製し、そしてＨＢｓＡｇ発現カセットを、プラスミドに連結してｐＷＲＧ７１２８構築物を得た。
【０１５４】
ＨＢｃＡｇコード領域を作製するために、ｐＡＭ６構築物を切断してＨＢｃＡｇ発現カセットを作製し、この後、ＨＢｃＡｇ配列を部位指向型変異誘発によって短縮化し、Ｃ末端アルギニンリッチ領域をコア抗原粒子から取り除いた（この欠失は、粒子形成を妨害しない）。次いで、この短縮ＨＢｃＡｇ配列を、ヒト伸長因子プロモーター（「ｈＥＬＦ」、Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：５３２２）を含むプラスミド構築物にクローン化してＨＢｃＡｇベクター構築物を得た。
【０１５５】
（ａ）ＣＭＶプロモーター／エンハンサー、イントロンＡ−５’非翻訳領域、およびヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｈＴＰＡ）シグナルペプチド（「ＣＭＶ−ＩＡ−ＴＰＡ」）；または（ｂ）ウシ成長ホルモンポリＡ配列（ｂＧＨｐＡ）を含む発現カセットを、各々、ＪＷ４３０３ベクター構築物（マサチューセッツ大学のＨａｒｒｉｅｔ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ博士の供与）から得て、プラスミド骨格に挿入した。生じる構築物を、ＮｈｅＩで切断し、ポリメラーゼで充填し、次いで、ＢａｍＨＩで切断して、ｐＵＣ１９複製起点、アンピシリン耐性遺伝子およびｂＧＨｐＡ配列を含むベクターフラグメントを作製した。このプラスミド骨格を、２度目はＳａｌＩで切断し、ポリメラーゼで充填し、ＢａｍＨＩで切断して、ＣＭＶ−ＩＡ−ＴＰＡベクターフラグメントを含むベクターフラグメントを遊離させた。この２つのベクターフラグメントを一緒に連結して、ｐＷＲＧ７０５４と命名する構築物を得た。
【０１５６】
ｐＷＲＧ７０５４構築物を、ＮｈｅＩで切断し、ポリメラーゼで充填し、ＢａｍＨＩで切断して、ベクターフラグメントを作製した。ＨＢｃＡｇベクター構築物を、ＮｃｏＩで切断し、ポリメラーゼで充填し、ＢａｍＨＩで切断して、挿入フラグメントを作製した。次いで、この２つのフラグメントを一緒に連結して、ｐＷＲＧ７０６３と命名する構築物を得た。
【０１５７】
ＰＥＬ−ＢｏｓをＥｃｏＲＩで切断し、ウシ腸ホスファターゼで脱リン酸化して、ベクターフラグメントを作製した。ｐＷＲＧ７０６３プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ポリメラーゼで充填し、ＥｃｏＲＩで切断して、ｈＴＰＡシグナルペプチド、ＨＢｃＡｇ抗原配列およびｂＧＨｐＡ領域を含む挿入フラグメントを作製した。これらの２つのフラグメントを一緒に連結して、ｐＷＲＧ７１４５と命名する構築物を得た。
【０１５８】
ｐＷＲＧ７１２８構築物を、ＥｃｏＲＩで切断し、ウシ腸ホスファターゼで脱リン酸化して、ｈＣＭＶプロモーターの転写制御下でＨＢｓＡｇコード領域を含むベクターフラグメントを作製した。このｐＷＲＧ７１４５構築物を、ＭｆｅＩおよびＥｃｏＲＩで切断して、ｈＥＬＦプロモーター／イントロン、ｈＴＰＡシグナルペプチド配列、ＨＢｃＡ抗原配列およびｂＧＨｐＡ領域を含む挿入フラグメントを作製した。次いで、これらの２つのフラグメントを一緒に連結して、ＨＢｃＡｇおよびＨＢｓＡｇコード配列を含むｐＰＪＶ７１９３プラスミド構築物を得た。
【０１５９】
（Ｂ．ワクチン調製および免疫）
ＤＮＡワクチン組成物のパネルを、以下のＤＮＡプラスミドの種々の組合せを用いて整理した：ｐＰＪＶ７１９３構築物（Ｂ型肝炎表面抗原およびＢ型肝炎コア抗原をコードする）；ｐＰＪＶ７０４６構築物（空のＤＮＡプラスミド）；およびｐＴＲＡＮＣＥ構築物（ＴＲＡＮＣＥサイトカインをコードする）。各ワクチン組成物中のＤＮＡの終濃度は、２．０μｇ／ｍｇ金であり、そして、抗原構築物（ｐＰＪＶ７１９３）の濃度を、全組成物中で一定に保ち、一方で、ＴＲＡＮＣＥ構築物の濃度を変化させた。ＤＮＡワクチン組成物のパネル中に存在する各構築物の実際の濃度を、以下の表４に報告する。
【０１６０】
（表４．ＴＲＡＮＣＥ  ＤＮＡワクチン組成物）
【０１６１】
【表４】
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プラスミドＤＮＡ（ｐＰＪＶ７１９３、ｐＰＪＶ７０４６およびｐＴＲＡＮＣＥ）を、上記表４に報告される比率であわせ、次いで、このプラスミド混合物を、上記実施例１に記載される技術を用いて１〜３μｍ金粒子上にコートして、２μｇ  ＤＮＡ／ｍｇ金の終濃度を得た。ＤＮＡコートされた金粒子を、次いで、上記実施例１のようにＴｅｆｚｅｌ（登録商標）チューブにロードし、ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ（登録商標）ＸＲ粒子送達装置のカートリッジとして提供するされる長さに切断する。各カートリッジは、０．５ｍｇの金粒子を含んだ。
【０１６２】
４匹のＢａｌｂ／ｃマウスの６実験群を各々集合させ、そして上記表４に列挙されるＤＮＡワクチン組成物を用いて、金粒子上にコートされたプラスミドＤＮＡの粒子媒介送達によって免疫（プライム）した。免疫のために、マウスを剃り、この粒子を５００ｐｓｉのヘリウムで操作された粒子送達装置を用いて単一ショットで腹部の皮膚に送達した。これらのマウスを、免疫２週間後に屠殺し、そして脾臓をＥＬＩＳＰＯＴ分析のために取り除いた。
【０１６３】
（Ｃ．ＥＬＩＳＰＯＴ分析）
ＥＬＩＳＰＯＴフィルタープレートを、ラット抗マウスＩＬ−４抗体を用いて０．１Ｍ  カーボネート緩衝液中０．７５μｇ／ウェルの濃度でコートした。このプレートを一晩４℃でインキュベートした。リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を用いた２回の洗浄後、このプレートを、１０％  胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を補充した１００μｌのＲＰＭＩ培地を用いて１時間３７℃でブロックした。この培地をブロッキング後に捨てた。溶解されそしてＲＰＭＩ（１０％  ＦＢＳ、ピルビン酸ナトリウム、および非必須アミノ酸で補充されている）に１×１０７細胞／ｍｌで再懸濁された赤血球を有する脾細胞を、１ウェルにつき１×１０６細胞または１ウェルにつき０．５×１０６細胞の濃度で添加した。１０％ＦＢＳで補充されたＲＰＭＩ中に２０μｇ／ｍｌに希釈された、１００μｌの全Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ）を、ウェルに添加し、そしてプレートを、３７℃で４８時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞および培地を捨て、プレートを２回ＰＢＳで洗浄し、続いて、任意の残存する細胞を溶解するために脱イオン水で洗浄し、次いで、ＰＢＳを用いてさらに２回洗浄した。検出抗体（ビオチン化されたラット抗マウスＩＬ−４）を、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌに希釈し、そして５０μｌを、各ウェルに添加し、そして室温で１時間インキュベートした。次いで、このプレートを、５回ＰＢＳで洗浄し、そして５０μｌのストレプトアビジンアルカリホルファターゼ結合体（ＰＢＳ中１：１０００希釈）を、各ウェルに添加した。室温で１時間のインキュベーション後、このプレートをＰＢＳで５回洗浄し、そして５０μｌのクロマゲン（ｃｈｒｏｍａｇｅｎｉｃ）アルカリホスファターゼ基質を、各ウェルに添加した。スポットが現れると直ぐに、この反応を、タップ水を用いてプレートをリンスすることによって停止した。スポットを、計数し、この結果を、図９に、１００万個の脾細胞当たりの特定のスポットとしてグラフにした。図９に示されるデータを再検討することによって見出されるように、ＨＢｃＡｇに特異的なＩＬ−４産生は、コントロール（非ｐＴＲＡＮＣＥ含有組成物）に比較して増加し、そして特定のスポットに用量関連の減少が示された。
【０１６４】
（Ｄ．抗体分析（ＥＬＩＳＡ））
上記研究を、前出のように調製されたコートＤＮＡ粒子カートリッジを用いて反復したが、以下の改変を用いた：ｐＰＪＶ７１９３構築物（Ｂ型肝炎表面抗原およびＢ型肝炎コア抗原をコードする）およびｐＴＲＡＮＣＥ構築物（ＴＲＡＮＣＥサイトカインをコードする）を、別のバッチの金粒子上にコートした（ｐＴＲＡＮＣＥおよびｐＰＪＶ７０４６プラスミドは、上記のようにあわせ、この組合せを金粒子上にコートしたが、ｐＴＲＡＮＣＥプラスミドは、別のバッチの金粒子上にコートした）。次いで、２つのバッチのコートされた金粒子を、Ｔｅｆｚｅｌ（登録商標）チューブをコードする前に一緒に混合した。上記表４に報告されるような同じ濃度のＤＮＡを、６２５：１の比率をこの第２の研究に含めなかったことを１つの例外として、使用した。４匹のＢａｌｂ／ｃマウスの各々の実験群を、前出のように免疫し、そしてマウスを、免疫の２週間後に屠殺し、そして血清を、ＥＬＩＳＡによる抗体分析のために収集した。
【０１６５】
抗体分析のために、ＥＬＩＳＡプレートを１００μｌの全Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ）でコートし、ＰＢＳ中０．１μｇ／ｍｌに希釈し、そして４℃で一晩インキュベートした。このプレートを、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）を用いて１回洗浄し、次いで、３００μｌのブロッキング溶液（ＰＢＳおよび５％乾燥ミルク）を用いて室温で１時間ブロックした。このブロッキング溶液を捨て、そして１００μｌの連続希釈血清を添加した。このプレートを室温で１時間インキュベートし、続いて、ＰＢＳ−Ｔを用いて３回洗浄した。結合体化抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼ）を、ＰＢＳおよび２％乾燥ミルク中で１：５０００希釈した。１００μｌの結合体化抗体を各ウェルに添加し、プレートを１時間室温でインキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、そして１００μｌのＴＭＢ基質を各ウェルに添加した。１５分後、この反応を、１００μｌの１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止した。吸光度を、４５０ｎｍで読み取った。各実験群の相乗平均を、次いで算出し、そして図１０に、希釈に対してグラフ化した。図１０に示されるデータを再検討することによって見出されるように、２５：１の比率を含む組成物に関して以外、ｐＴＲＡＮＣＥアジュバント組成物を受けた全ての群において、抗ＨＢｃＡｇ抗体応答が増加した。
【０１６６】
従って、肝炎ＤＮＡワクチン組成物中のプラスミド構築物をコードするｐＴＲＡＮＣＥサイトカインの添加は、目的の抗原に対する細胞性免疫応答および体液性免疫応答の両方を増強した。
【０１６７】
従って、免疫を誘発する新規組成物が、記載される。これらの組成物を用いる方法がまた記載される。本発明の好ましい実施形態はいくらか詳細に記載されるが、明らかな改変は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく添付の特許請求の範囲によって規定されるようになされえることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＣＤ８０プロモーター駆動発現ベクターｐ５０２０の概略図である。このプラスミドベクターは、ｐＵＣ１９骨格に基づくｐＷＲＧ７１２８（哺乳動物発現ベクター）から構築された。ＣＭＶプロモーターが除去され、そしてマウスＣＤ８０プロモーター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｇｉｅｓ，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬから得られた）の増幅によって得られた２５４塩基対ＰＣＲフラグメントで置換した。このプラスミドはまた、調節エレメント、およびウシ成長ホルモンのポリＡシグナルを含み、Ｂ型肝炎表面抗原をコードする全長ｃＤＮＡに作動可能に連結される。
【図２】
図２は、ＣＤ８０プロモーター駆動発現ベクターｐ５０２１の概略図である。このプラスミドベクターは、ｐＵＣ１９骨格に基づくｐＷＲＧ７１２８（哺乳動物発現ベクター）から構築された。ＣＭＶプロモーターが除去され、そしてマウスＣＤ８０プロモーター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｇｉｅｓ，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬから得られた）の増幅によって得られた４８９塩基対ＰＣＲフラグメントで置換した。このプラスミドはまた、調節エレメント、およびウシ成長ホルモンのポリＡシグナルを含み、Ｂ型肝炎表面抗原をコードする全長ｃＤＮＡに作動可能に連結される。
【図３】
図３は、ＣＤ８０プロモーター駆動発現ベクターｐ５０２２の概略図である。このプラスミドベクターは、ｐＵＣ１９骨格に基づくｐＷＲＧ７１２８（哺乳動物発現ベクター）から構築された。ＣＭＶプロモーターが除去され、そしてマウスＣＤ８０プロモーター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｇｉｅｓ，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬから得られた）の増幅によって得られた３１２３塩基対ＰＣＲフラグメントで置換した。このプラスミドはまた、調節エレメント、およびウシ成長ホルモンのポリＡシグナルを含み、Ｂ型肝炎表面抗原をコードする全長ｃＤＮＡに作動可能に連結される。
【図４】
図４は、ＣＤ８０プロモーター駆動発現ベクターｐ５０２３の概略図である。このプラスミドベクターは、ｐＵＣ１９骨格に基づくｐＷＲＧ７１２８（哺乳動物発現ベクター）から構築された。ＣＭＶプロモーターが除去され、そしてマウスＣＤ８０プロモーター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｇｉｅｓ，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬから得られた）の増幅によって得られた３３５７塩基対ＰＣＲフラグメントで置換した。このプラスミドはまた、調節エレメント、およびウシ成長ホルモンのポリＡシグナルを含み、Ｂ型肝炎表面抗原をコードする全長ｃＤＮＡに作動可能に連結される。
【図５】
図５は、ＣＤ８０プロモーター駆動発現ベクターｐ５０２４の概略図である。このプラスミドベクターは、ｐＵＣ１９骨格に基づくｐＷＲＧ７１２８（哺乳動物発現ベクター）から構築された。ＣＭＶプロモーターが除去され、そしてマウスＣＤ８０プロモーター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｇｉｅｓ，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬから得られた）の増幅によって得られた５７８塩基対ＰＣＲフラグメントで置換した。このプラスミドはまた、調節エレメント、およびウシ成長ホルモンのポリＡシグナルを含み、Ｂ型肝炎表面抗原をコードする全長ｃＤＮＡに作動可能に連結される。
【図６】
図６は、ＣＤ８０プロモーター駆動発現ベクターｐ５０２５の概略図である。このプラスミドベクターは、ｐＵＣ１９骨格に基づくｐＷＲＧ７１２８（哺乳動物発現ベクター）から構築された。ＣＭＶプロモーターが除去され、そしてマウスＣＤ８０プロモーター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｇｉｅｓ，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬから得られた）の増幅によって得られた２０２塩基対ＰＣＲフラグメントで置換した。このプラスミドはまた、調節エレメント、およびウシ成長ホルモンのポリＡシグナルを含み、Ｂ型肝炎表面抗原をコードする全長ｃＤＮＡに作動可能に連結される。
【図７】
図７は、ＣＤ８０プロモーター駆動発現ベクターｐ５０２６の概略図である。このプラスミドベクターは、ｐＵＣ１９骨格に基づくｐＷＲＧ７１２８（哺乳動物発現ベクター）から構築された。ＣＭＶプロモーターが除去され、そしてマウスＣＤ８０プロモーター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｇｉｅｓ，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬから得られた）の増幅によって得られた２９４塩基対ＰＣＲフラグメントで置換した。このプラスミドはまた、調節エレメント、およびウシ成長ホルモンのポリＡシグナルを含み、Ｂ型肝炎表面抗原をコードする全長ｃＤＮＡに作動可能に連結される。
【図８】
図８は、ＣＭＶプロモーターまたはＣＤ８０プロモターの制御下で、Ｂ型肝炎抗原（ＨＢｓＡｇ）をコードするプラスミドで免疫されたマウスにおいて惹起された細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を示すグラフである。
【図９】
図９は、Ｂ型肝炎コア／表面抗原をコードするプラスミドおよびＴＲＡＮＣＥサイトカインアジュバントで免疫されたマウスからの脾細胞における抗Ｂ型肝炎コア抗原特異的ＩＬ−４産生を示すヒストグラムである。
【図１０】
図１０は、Ｂ型肝炎コア／表面抗原をコードするプラスミドおよびＴＲＡＮＣＥサイトカインアジュバントで免疫されたマウスにおける抗Ｂ型肝炎コア抗原特異的抗体産生を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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