(57)【要約】本発明は、個体の細胞、詳細には免疫反応に関与する細胞のＣＯＸ−２（シクロオキシゲナーゼ２）活性を上昇させ、任意でＩＦＮ−γレベルを上昇させる化合物を投与することによって個体に抗原性物質に対する寛容を誘導する方法、並びに、個体に有害な免疫反応を引き起こさせる、物質又はその抗原性部分に関する。詳細には、本発明は、このような化合物と抗原性物質又はその一部分とを含む、食物組成物又は薬剤組成物に関する。代替実施形態では、本発明は、特定の物質にアレルギー反応を起こす個体の傾向を判定するための、新規なｅｘ  ｖｉｖｏの方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原性物質又はその抗原性部分と、個体の細胞のＣＯＸ−２の活性及び／又はＩＦＮ−γレベルを増大させる少なくとも１つの物質とを個体に投与することによって、抗原性物質に対する寛容を誘導する方法。
【請求項２】
前記抗原が食品材料、自己の物質、又は食物でない非自己の物質である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記食品材料が乳、卵、大豆、木の実、甲殻類、魚、肉、ゴマ、乳清、ベリー、又はリンゴ由来である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記自己の物質が、コラーゲン、インスリン、ミエリン結合タンパク質、ミエリン、アセチルコリン受容体、レチノイド結合タンパク質、又はポリペプチドからなる群から選択される請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記食物でない非自己の物質が、花粉、チリダニ、ヨウ素、ニッケル、銅、毒液、ラテックス、洗剤、化粧品、香水、プラスター、抗生物質又は同種抗原からなる群から選択される請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記個体の細胞中のＣＯＸ−２活性を増大させることができ、任意でＩＦＮ−γレベルを増大させることができる少なくとも１つの物質が、ブチレート、ｎ−６ＰＵＦＡ、セラミド、植物抽出物、又は細菌性物質からなる群から選択される、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項７】
抗原性物質又はその抗原性部分と、個体の細胞中のＣＯＸ−２活性を増大させることができる、少なくとも１つの物質とを含む食物組成物又は薬剤組成物。
【請求項８】
乳、ヨーグルト、凝乳（カード）、チーズ、発酵乳、乳ベースの発酵製品、アイスクリーム、発酵させた穀物ベースの製品、乳ベースの粉末、飲料、水ベースのゼリー、幼児用の粉ミルク、また更にはペット食品からなる群から選択される、請求項７に記載の食物組成物。
【請求項９】
個体の細胞中のＣＯＸ−２レベルを増大させることができ、任意でＩＦＮ−γレベルを増大させることができる少なくとも１つの物質が、ブチレート、ｎ−６ＰＵＦＡ、セラミド、植物抽出物、又は細菌性物質からなる群から選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項１０】
個体が前記組成物に含まれる抗原性物質に対する免疫反応を発生する傾向を防止するための、請求項７から９までに記載の組成物の使用。
【請求項１１】
（ａ）個体から血液試料を採取すること、
（ｂ）リンパ球を含む試料の細胞性物質を任意で回収すること、
（ｃ）試料を前記抗原性物質と接触させること、
（ｄ）ＣＯＸ−２活性を決定し且つ／又はＩＦＮ−γレベルを評価すること、及び
（ｅ）決定したレベルをコントロールと比較すること
を含む、個体が所定の物質に対する有害な免疫反応を発生する傾向を判定する方法であって、ＣＯＸ−２活性の増大及びＩＦＮ−γの増大が前記物質に対する寛容の指標である上記方法。
【請求項１２】
寛容原性の検査対象である前記物質が、食品材料である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記食品材料が、乳、ヨーグルト、凝乳（カード）、チーズ、発酵乳、乳ベースの発酵製品、アイスクリーム、発酵させた穀物ベースの製品、乳ベースの粉末、飲料、水ベースのゼリー、幼児用の粉ミルク、又は更にはペット食品からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、個体の細胞、詳細には免疫反応に関与する細胞のＣＯＸ−２（シクロオキシゲナーゼ２）活性を上昇させ、任意でＩＦＮ−γレベルを上昇させる化合物を投与することによって個体に抗原性物質に対する寛容を誘導する方法、並びに、個体に有害な免疫反応を引き起こさせる、物質又はその抗原性部分に関する。具体的には、本発明は、このような化合物と抗原性物質又はその一部分とを含む、食物組成物又は薬剤組成物に関する。代替実施形態では、本発明は、特定の物質にアレルギー反応を起こす個体の傾向を判定するための、新規なｅｘ  ｖｉｖｏの方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
産業社会の様々な環境因子によってもたらされる現代病の１つは、アレルギーである。アレルギーとは、外来作用物質に対する過剰免疫応答によって引き起こされる過敏状態であり、無数の生物の生命に影響を与え、しばしば食べてよいもの、触ってよいもの、においを嗅いでよいもの、又は生物が住んでもよい場所さえも決定する。外来作用物質に対する体の反応の程度は、軽微な炎症や不快感から、ひどい場合は死にまで及ぶ。
【０００３】
アレルギー反応の過程で生じる臨床症状は、２つの異なる反応の結果であり、それらはそれぞれ、初期の特異的免疫応答及び後期の炎症反応である。吸入アレルゲン例えば花粉やダニチリは、高親和性免疫グロブリン（ＩｇＥ）受容体、例えば肥満細胞及び好塩基球を刺激し、ヒスタミン及びサイトカインを放出させることによって初期段階を媒介する。この初期段階は約３０分間持続する。初期段階に肥満細胞及び好塩基球から放出されたサイトカインは次いで、鼻道及び上気道に炎症細胞を集めることによって後期段階を媒介する。好酸球、マクロファージ、リンパ球、好中球、血小板の流入が炎症サイクルを開始させる。この後期段階は、一般的に約２日間持続し、最初の免疫応答を増幅させ、更に多くの炎症細胞の放出を引き起こす。
【０００４】
現在のアレルギー治療は、概して２つの一般的な方法に集中している。療法の１つは単にアレルギーの症状のみを治療するもので、抗ヒスタミン剤などの薬剤が利用されている。このような方法の欠点の１つは、この方法は多くの場合、対応する薬剤の反復投与を必要とし、望まない副作用が伴う可能性があることである。更に、この方法は症状を治療するだけで、過敏状態の原因である、根底にある状態は治療されない。アレルギーを治療するための別の方法は、いわゆる脱感作治療であり、これには個体に特定のアレルゲンを注入することが含まれる。それでも、治療を始めることができるようになる前に、まず患者に特異的であるアレルゲンを認識しなければならない。その後、患者に低用量のアレルゲンを繰り返して注入する。この方法は不快感を伴い、５０回もの回数、臨床医師を訪れなければならないことがある。加えて、患者が過敏性であるアレルゲンは必ずしも特定できるわけではなく、脱感作治療は不可能となる。
【０００５】
上記の欠点にくわえて、上の方法のいずれも、過敏状態の除去は保証しない。同様に、いずれも、過敏状態の発生に対する防御を行うことはできない。
【０００６】
環境中で遭遇する作用物質、例えば花粉、繊維などに対してますます多くの人がアレルギーを発症している上に、食物アレルギーに苦しむ消費者が着実に増加している。特に、穀物、木の実、又は乳は、多くの国で主食として消費されており、これらは多数の潜在的なタンパク質性アレルゲンを含むので、これらに対するアレルギー反応に関して深刻な問題が生じている。
【０００７】
食物アレルギーを治療するために、これまで様々な方法がとられてきた。このような方法のうちの１つは、毎日の食事からアレルゲン性食品材料を排除することを狙いとしているが、この方法は厳しい食事改訂を伴い、通常は制限措置を伴い、最終的には生活の質に影響を与え且つ／又は幼い子供又は新生児に期待される成長を阻害する可能性があるので、実践するのは困難である。
【０００８】
別の方法は、アレルゲン性物質の源自体を改変し、その潜在的なアレルギー性を低減させることに関与する。この方法は一般的に、食品材料からアレルゲン性成分を取り去ることによって成されるが、食品材料中の特定の抗原性物質（アレルゲン）が知られていないことが多く、多くの場合、どの成分を選択的に除去するべきかが明確でないので、しばしば問題が引き起こされる。食物のアレルゲン性を改変する別の方法は、前記食品材料を特定の方法、例えば熱によって又はタンパク質分解酵素によって、処理することである。
【０００９】
この点に関していうと、米国特許第４，２９３，５７１号は、低アレルゲン性組成物の調製を開示しており、タンパク質性物質を加水分解処理し、残存の加水分解されなかったタンパク質を熱処理することによって凝固させ、続いて、凝固した物質及びアレルゲンを構成する可能性のあるマクロペプチドを除去するために限外濾過工程に付す。
【００１０】
新生児は自分の不快感を付き添いの者に明白に伝えられず、アレルギー状態は多くの場合、顕著なアレルギー症状、例えばアトピー性皮膚炎、呼吸系及び／又は消化系の障害によってしか発見されないので、食物アレルギーで直面する問題は、新生児でよりいっそう顕著である。
【００１１】
アレルギー性物質の防止には、家庭に対するいろいろな抑制、及びこのような幼児に対する特定の生活ルールが含まれ得る。しかし、その食事療法に関する主要な予防措置は、未変性タンパク質による感作を避けることである。例えば、未変性牛乳タンパク質の摂取を大幅に減少させることによって、牛乳アレルギーの発症を劇的に減らすことができることが示された。
【００１２】
食事療法の選択がどうであれ、原因のタンパク質を用いて免疫系を誘発してみなければ、乳タンパク質に対する免疫寛容の成立を最終的に保証することができない。現在までは、局部（プリックテスト）又は系統的な（ＤＢＰＣＦＣ）誘発後に幼児が特定のアレルギー応答を明示しない場合は、寛容の状態は推定によってしか確認することができなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、本発明の課題は、従来技術の欠点を克服し、アレルギー症状を治療又は予防する新規な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
この課題は、抗原性物質と、個体の細胞、例えばリンパ球など特に免疫反応に関与する細胞中のＣＯＸ−２活性を上昇させ且つ／又はＩＦＮ−γレベルを増大させる物質とを個体に投与することを含む、所定の抗原性物質に対する寛容を個体に誘導する方法を提供することによって解決した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
ＣＯＸ−２は、とりわけアラキドン酸からのプロスタグランジンの合成を触媒する酵素である。他の周知のＣＯＸ−２の基質は、ジホモ−ガンマ−リノレン酸（２０：３ｎ：６）及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ｎ−３）を含み、それぞれＰＧＥ1及びＰＧＥ3を生成する。
【００１６】
ヒトＣＯＸ−２遺伝子がクローニングされ、そのゲノムパターン、及び様々な成分、例えばｃＡＭＰ、ＮＦ−кＢ及びＴＧＦ−β、ＩＬ−１又はＴＮＦ−αに対するその遺伝子発現の応答性が記載されている。
【００１７】
本発明によれば、「ＣＯＸ−２活性を増大させる」という用語は、例えば、補助因子の量を増大させ又は前記補助因子との相互作用を向上させるか、あるいは細胞内のタンパク質の転写及び／又は翻訳を増大させ又は単に基質の量を増大させることによって、酵素活性自体を増大させることと理解するべきである。
【００１８】
同様に、有害な免疫反応という用語は、個体にとって有害なすべての免疫反応、例えばアレルギー反応、自己の免疫反応、臓器拒絶などを含むと理解するものとする。
【００１９】
更に、個体の細胞という用語は、ＣＯＸ−２を発現し、寛容原性活性に関与するすべての細胞を含むものとする。このような細胞には、特に免疫反応に関与する細胞、例えば抗原提示細胞、リンパ球、具体的にはＴリンパ球、好中球、顆粒球、単球などが含まれる。
【００２０】
個体に与える抗原性物質は、一般的な食品材料自体、自己の物質又は食物でない非自己の物質であり得る。このような食品材料の例は、乳、卵、大豆、ピーナッツ、甲殻類、魚、肉、ゴマ、乳清、ベリー、又はリンゴである。
【００２１】
自己の物質としては、個体にとって内在性であるすべての物質、例えばコラーゲン、インスリン、ミエリン結合タンパク質、ミエリン、アセチルコリン受容体、レチノイド結合タンパク質、又は体内で合成されるポリペプチドを挙げることができる。
【００２２】
食物でない非自己の物質は、個体にとって本来外来性であり、有害な免疫反応を誘発する可能性があるどんな物質でもよい。このような物質の例は、アレルゲン性物質、例えば花粉、チリダニ、ヨウ素、ニッケル、銅、毒液又はラテックス、様々な洗剤、化粧品、香水、プラスター、抗生物質など薬剤、移植抗原など同種抗原である。同種抗原については、このような同種抗原、例えば臓器などの移植を受ける患者に、移植を行う前に同種抗原とＣＯＸ−２活性を増大させる物質とを投与し、患者の免疫系による移植の拒絶を減少させ又は実質的に最小限にすることができる。これは、移植片の一部、例えば移植片のそれぞれのＨＬＡ抗原及び対象の物質を含むその細胞性物質を患者に投与し、患者の免疫系に、これから移植する移植片を寛容するように教えることにより達成することができる。
【００２３】
個体の細胞中のＣＯＸ−２活性を増大させる物質、特にリンパ球など免疫反応に関与する細胞は、このような効果を発揮することができるどのような物質であってもよい。このような物質は、例えばＴリンパ球のアラキドン酸からのＰＧＥ2（プロスタグランジンＥ2）の合成に対する効果によって容易に確認することができ、これは、通常の酵素免疫アッセイによって検定することができる。
【００２４】
好ましい実施形態によれば、個体の細胞のＣＯＸ−２活性の増大、及び任意でＩＦＮ−γのレベルの増大にも影響を及ぼすことができるこのような物質は、ブチレート、ｎ−６多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）、例えばアラキドン酸又はセラミドからなる群から選択することができる。
【００２５】
目的物質は、別々に又は単一の製品中で一緒に、個体に与えることができる。
【００２６】
このために、目的物質及び抗原性物質を、対応する投与経路に必要であり所望される担体及び賦形剤を含む、錠剤、サシェ（ｓａｃｈｅｔ）、溶液、カプセルなど周知のどのような薬剤組成物にも含めることができる。このような投与経路には、局在投与、経鼻投与、経口投与、静脈投与、又は腹腔内投与が含まれる。
【００２７】
抗原性物質は、必要に応じて前処理することができる。例えば、有害な免疫反応に影響を与える物質全体を薬剤組成物に含める代わりに、それぞれの物質に含まれる抗原性化合物又はその一部分、例えば特定のアレルゲン性ペプチドを単離し、これらの化合物を薬剤組成物に含めることもできる。
【００２８】
目的物質を食品材料に含めることもできる。この場合、３つの代替案が考えられうる。
【００２９】
第１に、抗原性であり食物でない自己の物質又は非自己の物質を、目的物質と一緒に通常の食品材料に含める。したがって、この実施形態は、目的化合物を補充して、食品材料中に、上述のように周知の抗原を添加することを企図している。このような食品材料として、すべての液体、例えば水又は更には乳、ゼリー、菓子などが提案される。
【００３０】
第２の代替案として、食品材料それ自体が抗原性物質を表す、すなわち食品材料が本質的に、潜在的なアレルゲン性物質を含むことができる。この場合、本発明に従った組成物に到達するために、食品材料に目的物質を単に添加することができる。このような食品材料として、個体がアレルギー反応を生じる可能性があるすべての食物が包含され、すべての種類のベリー、リンゴ、モモが含まれる。具体的には、穀物又は牛乳由来の食物製品は、アレルゲン性の高い化合物を含むことで知られているので、これらの食物製品は好ましい食物種を代表する。このような食物製品の例は、ヨーグルト、凝乳（カード）、チーズ、発酵乳、乳ベースの発酵製品、アイスクリーム、穀物製品例えば発酵させた穀物ベースの製品、乳ベースの粉末、飲料、水ベースのゼリー、幼児用の粉ミルク、又は更にはペット食品である。
【００３１】
したがって、本発明は、個体の細胞、特に、例えばリンパ球、好ましくはＴ細胞など特に免疫反応に関与する細胞中のＣＯＸ−２活性を増大させることができ、任意でＩＦＮ−γレベルを増大させることができる物質を単に食品材料に含めることによって、個体に所定の抗原、好ましくは潜在的なアレルゲン性食品材料に対する経口寛容を誘導する、新規で興味深い概念を提供する。
【００３２】
したがって、本発明は、食品材料に対する個体の経口寛容を誘導する方法を教示する。このコンセプトは、食品材料に対して寛容又はアレルギーを発症しかけている新生児に特に適している。本発明の教示を適用する中で、新生児がアレルギー反応を発生しない幼児用ミルクを提供することができる。その上、新生児の免疫系はむしろ、前記牛乳タンパク質を寛容するように教えられ、その結果新生児に対応する食品材料を与える際に問題が生じなくなる。
【００３３】
あるいは、抗原性構成成分を、所望する他のあらゆる食品材料に添加してもよい。例えば、ピーナッツ又はその関連するアレルゲン性構成成分を発酵乳製品、例えばヨーグルトに添加することでピーナッツ味のヨーグルトを提供し、目的物質を含めることで、所望する療法を提供することもできる。この方法は同様に、ベリー、リンゴなどの断片をこのような発酵乳製品に添加することにも適用される。
【００３４】
本発明の組成物は、個体でアレルギーが発症し得る前にそれを撃退するのに、見事に適していることが理解されよう。特定の理論に縛られるわけではないが、免疫系を抗原に暴露させることと同時に、前記物質に対する限度を超えた免疫反応の抑制に関与する生物学的ステップを導入することとが相まって、一般的に、免疫系に、提示された特定の抗原に有害な反応を生じないように教えるものと考えられる。したがって、本発明の根底にあるコンセプトは基本的に、経口寛容の誘導に関係する個体の細胞、好ましくは免疫反応に関与する細胞の生化学／代謝を変調させることである。このコンセプトは更に、自己免疫疾患（自己の物質又は自己の抗原）及び特定の食物でない非自己の抗原に対する寛容の発生に適用することができる。
【００３５】
したがって、本発明によると、個体の細胞、好ましくは免疫反応に関与する細胞のＣＯＸ−２活性、及び任意でＩＦＮ−γレベルを増大させることができる物質と一緒に同時に提示される物質に、反応しないように免疫系に「教える」ことによって、アレルギーの発症を防止するだけでなく、既に存在するアレルギー状態を治療することも可能である。
【００３６】
薬剤組成物又は食物組成物中の目的物質の量が、所望する効果をもたらすのに、すなわち、個体中の対応する細胞、好ましくはリンパ球、より好ましくはＴリンパ球のＣＯＸ−２活性の増大に、及び任意で末梢組織のＩＦＮ−γレベルの増大に影響を与え、並外れた免疫応答の誘発の対象となる外来抗原であると一度認識された抗原性物質を寛容するように、個体の免疫系に効果的に教えるのに、十分であることが理解されよう。
【００３７】
別の実施形態によれば、本発明は、個体がある抗原性物質に対するアレルギー反応を発生する素質を判定する方法であって、個体から血液試料を採ることを含み、任意でそれを処理してリンパ球を含む試料の細胞性物質を回収することも可能である上記方法を、提供する。この方法は、例えばカラムで細胞を回収し、又は血液試料を培養基に移動することによって初代培養を調製し、血液中に存在する細胞を培養することによって、容易に達成できる。続くステップで、試料又は血液細胞、特にリンパ球、より具体的にはＴリンパ球を抗原性物質と接触させ、次いで、試料又は細胞中のそれぞれのＣＯＸ−２活性、任意で試料中のＩＦＮ−γ活性を定量し、前記レベルを、一般的な検量線又は好ましくは抗原性物質に暴露させていない同一試料であるコントロールと比較する。
【００３８】
コントロールに比べて増大したＣＯＸ−２活性、及びＩＦＮ−γレベルの増大から、試料を採取した個体は、前記抗原性物質に対する相当な、すなわち限度を超えた又は有害な免疫反応を引き起こすことはなく、むしろ寛容することが示唆される。逆に、本質的に低減したＣＯＸ−２活性のレベル及び本質的に低減したＩＦＮ−γレベルからは、この個体はこの物質に対して有害な反応を生じることが示唆される。
【００３９】
上記の方法は、抗原性物質を用いて個体を直接誘発させることが回避されるので、従来技術に勝る根本的な利点を有している。したがって、検査対象の患者又は個体は、その対応する傾向を評価するためにはアレルギー性症状を発症する必要がなく、そのため、前記の試験タイプに関連する危険性が低下する。更に、本発明の方法は細胞レベル又は分子レベルの測定に依存するので、この検定は、個体がアレルギー性症状を発生するかどうかを評価するのに比べて、はるかに感度が高い。別の利点は、本発明の方法は、既に若年となっている子供及び新生児でさえも、危険にさらすことなく検査することを可能にする。
【００４０】
以下の実施例は、本発明をより詳細に例示するが、それに限定することはない。
【００４１】
以下の物質を使用し、以下の方法を適用した。
動物
ＩＦＦＡ−Ｃｒｅｄｏ（Ｌ’Ａｂｒｅｓｌｅ、フランス）から入手したＢａｌｂ／ｃマウスの雌をすべての実験に使用し、実験は３週齢のマウスで実施した。すべてのマウスを、牛乳を含まない食餌で繁殖させ飼育した。すべての実験で、マウスの体重に応じた強制飼養（ｇａｖａｇｅ）の量を決定するために、飼料を与える日に体重を測定した。
【００４２】
抗原
ＢＬＧ（ウシラクトグロブリン、３×結晶化）及びＯＶＡ（卵白アルブミン、Ｖ級）をシグマ薬品（株）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈａｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）から入手した。乳清タンパク質濃縮物（Ｌａｃｐｒｏｄａｎ８０）をＤａｎｍａｒｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓ（ＭＤフーズ（ＭＤ−Ｆｏｏｄｓ））から入手した。これは、酸性乳清（ａｃｉｄ  ｗｈｅｙ）の限外濾過によって生成され、タンパク質含量は８０％であった。
【００４３】
統計
ＡＮＯＶＡ単一因子試験を使用して血清（ｓｅｒｉｃ）ＩｇＥ応答を比較した。ｐ＜０．０５で、有意であるとした。
【実施例】
【００４４】
例１
マウスの処置
実験を開始するために、ブチレート（ＣＯＸ−２活性を促進する）、イブプロフェン（ＣＯＸ活性を阻害する）、又は生理食塩水（コントロール）を、−３日目から４日目まで毎日、マウスに強制的に給餌及び／又は腹腔内注入した。０日目に、強制飼養によってマウスに乳清タンパク質（体重１ｇあたり３ｍｇ）又は同体積の生理食塩水を給餌した。強制飼養製品は０．３ｍｌの生理食塩水に溶解した。各実験の４日目に、０．１６ｍｌの２％Ａｌ（ＯＨ）3（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ  Ｂｉｏｓｅｃｏｔｒ  Ａ／Ｓ、デンマーク）と混合した０．０４ｍｌの滅菌生理食塩水中の、０．０８ｍｇのＢＬＧ及び０．０８ｍｇのＯＶＡを腹腔内に注入することによって、すべてのマウスを免疫化した。
【００４５】
４日目又は２６日目に、３％イソフルラン麻酔（アボットＳＡ（Ａｂｂｏｔ  ＳＡ））下で心臓大動脈穿刺により血液試料を得た。頚椎脱臼による死の直後に、脾臓を取り出し、５％のＦＣＳを補充した２０ｍｌの冷ＲＰＭＩに、投与群ごとにプールした。脾臓細胞溶液をセルラーシーブ（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｅｖｅ）（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ））でホモジナイズし、赤血球から、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ比重遠心（シグマ）を使用して、３９０×ｇ、２０分間で精製した。９６ウェルの平底マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ）中で、４８時間、５×１０6個／ｍｌの細胞密度で、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｓｅｒｏｍｅｄ）、１００Ｕペニシリン／１００ｍｇストレプトマイシン（Ｓｅｒｏｍｅｄ）、１０％のＦＣＳ（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ）中で、５％のＣＯ2、３７℃で、５、２．５、０．５、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＬＧ（シグマ）又は２５０、５０、１０、２μｇ／ｍＬのフィトヘマグルチニンＡ（Ｓｅｒｏｍｅｄ）の存在下で、細胞を共培養した。培養の最後の６時間で（3Ｈ）Ｔｄｒ（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、チューリッヒ）を加え、プレートを収集し、シンチレーション計測（トップカウント（ＴｏｐＣｏｕｎｔ）、キャンベラ・パッカード（Ｃａｎｂｅｒｒａ  Ｐａｃｋａｒｄ）、チューリッヒ）によって分析した。（3Ｈ）Ｔｄｒの取り込みは、それぞれ３つの培養物の平均値としてｃｐｍで表し、次いでブランクを減算した平均値をＢＬＧ濃度に対してプロットした。１ｍＬあたり２．５ｍｇのＢＬＧ及び１ｍＬあたり５０μｇのＰＨＡで、ブランクを減算した試験と対象の値との比として刺激指数を計算した。
【００４６】
各群について特異的な増殖検定を実施した。単離した血清を−２０℃で急速に凍結し、ＢＬＧに特異的なＩｇＥを検定するまで凍結しておいた。
【００４７】
例２
ＥＬＩＳＡによる特異的ＩｇＥ抗体の測定
血清試料を、２組ずつＥＬＩＳＡによって抗ＢＬＧ  ＩｇＥを検定した。手短に述べると、マイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ  Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  Ｆ９６、デンマーク）を、各ウェル１００μｌの、炭酸塩−炭酸水素塩緩衝液、ｐＨ９．６に溶解した０．５ｍｇ／ｍＬのＢＬＧを用いて、終夜４℃でコーティングした。次の試薬を加える前に毎回、ＰＢＳ−Ｔｗ（リン酸緩衝生理食塩水−ツイーン（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ−Ｔｗｅｅｎ）０．０５％）を用いて４回の洗浄ステップを実施した。プレート上の占有されていない部分を、各ウェル２００μＬの、ＰＢＳ−Ｔｗ中の０．５％フィッシュゼラチン（シグマ）を用いて、１時間ＲＴでブロックした。各マウスの試料の一連の希釈液（血清の３倍）を、２組ずつ検定した。血清は、検定の前にまずＰＢＳ−Ｔｗで１／２０に希釈した。希釈した試料を加え、室温で１時間インキュベートした後、ペルオキシダーゼ標識ラット抗マウスＩｇＥ抗体（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｅｒａ−Ｌａｂ、米国）を２時間添加し、次いでＯＰＤ基質（シグマ）を加えた。１５分室温でインキュベートした後、Ｄｙｎａｔｅｃｈ  ＭＲ５００  ＥＬＩＳＡリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ、Ｅｍｂｒａｃｈ−Ｅｍｂｒａｐｏｒｔ、スイスを使用して４９２ｎｍで吸光度を測定した。２０匹の免疫化していない雌マウスからのプールした試料を、各プレートのネガティブコントロールとして使用した。ネガティブコントロールの２倍の吸光度を示した試料の希釈率を計算することによって、希釈率のカットオフ値を決定した。力価は、希釈率のカットオフ値の逆数のｌｏｇ10として表した。
【００４８】
例３
サイトカインＥＬＩＳＡ
５×１０5個の脾臓細胞を各ウェル２．５ｍｇ／ｍＬのＢＬＧで刺激し、９６ウェルのマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ）中でサイトカイン分泌を誘導させた。４８時間の刺激の後、細胞培養物の上清を回収した。サイトカインに特有のＥＬＩＳＡキットＥｎｄｏｇｅｎを使用してＩＦＮ−γレベルを測定し、これは製造者の指示に従って実施した。すべてのサイトカイン試料は、２組ずつ検定した。
【００４９】
例４
プロスタグランジンＥ2及びインターフェロン−ガンマの測定
培養基中の、６時間又は１２時間培養したリンパ球のＰＧＥ2レベルを、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）キット（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、）を使用して決定した。３組の試料をそれぞれ２つの希釈率で検定した。
【００５０】
マウスに乳清タンパク質を給餌することによる寛容の誘導の結果、寛容化の５日後、培養物中のＢＬＧで刺激したリンパ球によるＰＧＥ2及びＩＮＦ−γの生成が、寛容化していないコントロールされたマウスに比べて、増大した。
【００５１】
このＰＧＥ2及びＩＮＦ−γの生成は、ＣＯＸの阻害剤であるイブプロフェンを用いてマウスを処置した場合には観察されない。一方、ブチレートで処置したマウスは、ポジティブコントロールである乳清を給餌したマウスに比べて、ＰＧＥ2及びＩＮＦ−γの両方の生成量が更に増大する。
【００５２】
例５
増殖
マウスに乳清タンパク質を給餌することによる寛容の誘導の結果、寛容化の４日後、増殖応答指数が減少する（図３）。０．５未満の刺激指数は、マウスが寛容化されたことを示す。マウスを、ＣＯＸの阻害剤であるイブプロフェンで処置した場合、この増殖応答指数の減少は観察されない。一方、ブチレートで処置したマウスは、ポジティブコントロールである乳清を給餌したマウスに比べて、増殖応答指数が更に減少していたことを示した。
【００５３】
寛容原を給餌してから４日後にＢＬＧで誘発したマウスでは、寛容化後２６日で、同様でよりはっきりした結果が観察された。
【００５４】
例６
ＩｇＥ
マウスに乳清タンパク質を給餌することによる寛容の誘導の結果、寛容化の２６日後、液性抗ＢＬＧ  ＩｇＥ力価が減少した。この減少は、寛容化していないマウスに比べて統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。マウスを、ＣＯＸの阻害剤であるイブプロフェンで処置した場合、この液性抗ＢＬＧ  ＩｇＥ力価の減少は観察されなかった（図２参照）。
【００５５】
一方、ブチレートで処置したマウスは、ポジティブコントロールである乳清を給餌したマウスに比べて、液性抗ＢＬＧ  ＩｇＥ力価が更に減少していたことを示す。この液性抗ＢＬＧ  ＩｇＥ力価のさらなる減少は、寛容化したマウス（ポジティブコントロール）に比べて統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】薬剤及び栄養治療による細胞性免疫応答の、寛容化中の変調を示す図である。
【図２】薬剤及び栄養治療によるＢＬＧへの液性免疫応答の、寛容化中の変調を示す図である。
【図３】経口寛容を評価するための、ＰＧＥ2及びＩＦＮ−γの測定値を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年8月20日(2003.8.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原性物質又はその抗原性部分と、個体の細胞のＣＯＸ−２（シクロオキシゲナーゼ２）の活性及び／又はＩＦＮ−γ（インターフェロンγ）レベルを増大させる少なくとも１つの物質とを個体に投与することによって、抗原性物質に対する寛容を誘導する方法。
【請求項２】
前記抗原が食品材料、自己の物質、又は食物でない非自己の物質である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記食品材料が乳、卵、大豆、木の実、甲殻類、魚、肉、ゴマ、乳清、ベリー、又はリンゴ由来である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記自己の物質が、コラーゲン、インスリン、ミエリン結合タンパク質、ミエリン、アセチルコリン受容体、レチノイド結合タンパク質、又はポリペプチドからなる群から選択される請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記食物でない非自己の物質が、花粉、チリダニ、ヨウ素、ニッケル、銅、毒液、ラテックス、洗剤、化粧品、香水、プラスター、抗生物質又は同種抗原からなる群から選択される請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記個体の細胞中のＣＯＸ−２活性を増大させることができ、任意でＩＦＮ−γレベルを増大させることができる少なくとも１つの物質が、ブチレート、ｎ−６ＰＵＦＡ（ｎ−６多価不飽和脂肪酸）、セラミド、植物抽出物、又は細菌性物質からなる群から選択される、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項７】
前記いずれかの請求項に記載の、寛容を誘導するための方法で使用する食物組成物又は薬剤組成物であって、その組成物が抗原性物質又はその抗原性部分と、個体の細胞中のＣＯＸ−２活性を増大させることができる、少なくとも１つの物質とを含む上記食物組成物又は薬剤組成物。
【請求項８】
乳、ヨーグルト、凝乳（カード）、チーズ、発酵乳、乳ベースの発酵製品、アイスクリーム、発酵させた穀物ベースの製品、乳ベースの粉末、飲料、水ベースのゼリー、幼児用の粉ミルク、又はペット食品からなる群から選択される、請求項７に記載の食物組成物。
【請求項９】
個体の細胞中のＣＯＸ−２レベルを増大させることができ、任意でＩＦＮ−γレベルを増大させることができる少なくとも１つの物質が、ブチレート、ｎ−６ＰＵＦＡ、セラミド、植物抽出物、又は細菌性物質からなる群から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
抗原性物質又はその抗原性部分と、個体の細胞中のＣＯＸ−２活性を増大させることができる、少なくとも１つの物質とを含む薬剤組成物。
【請求項１１】
乳、ヨーグルト、凝乳（カード）、チーズ、発酵乳、乳ベースの発酵製品、アイスクリーム、発酵させた穀物ベースの製品、乳ベースの粉末、飲料、水ベースのゼリー、幼児用の粉ミルク、ペット食品からなる群から選択される、請求項１０に記載の薬剤組成物。
【請求項１２】
個体の細胞中のＣＯＸ−２レベルを増大させることができ、任意でＩＦＮ−γレベルを増大させることができる少なくとも１つの物質が、ブチレート、ｎ−６ＰＵＦＡ、セラミド、植物抽出物、又は細菌性物質からなる群から選択される、請求項１０に記載の薬剤組成物。
【請求項１３】
個体が前記組成物に含まれる抗原性物質に対する免疫反応を発生する傾向を防止するための、請求項７から１２までに記載の組成物の使用。
【請求項１４】
（ａ）個体から血液試料を採取すること、
（ｂ）リンパ球を含む試料の細胞性物質を任意で回収すること、
（ｃ）試料を前記抗原性物質と接触させること、
（ｄ）ＣＯＸ−２活性を決定し且つ／又はＩＦＮ−γレベルを評価すること、及び
（ｅ）決定したレベルをコントロールと比較すること
を含む、個体が所定の物質に対する有害な免疫反応を発生する傾向を判定する方法であって、ＣＯＸ−２活性の増大及び／又はＩＦＮ−γの増大が前記物質に対する寛容の指標である上記方法。
【請求項１５】
寛容原性の検査対象である前記物質が、食品材料である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記食品材料が、乳、ヨーグルト、凝乳（カード）、チーズ、発酵乳、乳ベースの発酵製品、アイスクリーム、発酵させた穀物ベースの製品、乳ベースの粉末、飲料、水ベースのゼリー、幼児用の粉ミルク、又はペット食品からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【国際調査報告】
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2004522725.tif 000024
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