(57)【要約】本発明はリン酸カルシウムを取得するための新規の室温による方法に関し、より詳細には、治療用の薬剤、タンパク、遺伝子、ＤＮＡをカプセル化するハイドロキシアパタイト、コーティング及びミクロスフィアに関する。コーティング及びミクロスフィアは、遺伝子搬送を介する遺伝子治療等、薬剤搬送に関連した、規定の生物学的機能を実行するよう設計されている。カプセル化と、このような生体機能的コーティング及びミクロスフィアからの治療用の活性物質の実質的な制御放出とのための新規の方法が開示された。このコーティング及びミクロスフィアは、薬剤、タンパク、ＤＮＡ、及び他の治療薬を、副作用が無い、持続的な、標的が定められた、制御放出、搬送するために有用である。
2004530675.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸カルシウム相を作製するための方法であって、
（ａ）第一リン酸カルシウムＣａ（Ｈ２ＰＯ４）２と、水酸カルシウムＣａ（ＯＨ）２前駆体とを、実質的に無水の媒質において、均一に分散することにより前駆体のペースト或いは粘性スラリーを形成する工程と、
（ｂ）前記前駆体スラリーを乾燥させる工程と、
（ｃ）前記スラリーに水ベースのリン酸イオン溶液を混合することにより、混合物を製造する工程と、
（ｄ）生じた混合物を温度が２０〜５０℃の湿潤な環境においてインキュベートすることにより、前駆体を溶解し、リン酸カルシウム相を析出する工程とを備える方法。
【請求項２】
前記リン酸カルシウム相は、ハイドロキシアパタイトである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記前駆物質の混合物のＣａ／Ｐ原子比率は、１．２−１．６７の範囲にあり、及び前記混合物は、３０−７０体積％の固体濃度である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記実質的に無水の媒質は、アルコールである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記アルコールは、エチルアルコール、メチルアルコール、又はプロピルアルコールである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記水ベースのリン酸イオン溶液はリン酸ナトリウムであり、及び湿潤な環境は、相対湿度が５０％〜１００％である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記前駆体スラリーは、規定の形状に乾燥される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記形状は、錠剤、コーティング、ミクロスフィア、又は歯孔、若しくは骨孔の充填剤である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
結晶ハイドロキシアパタイト粉末は、前記前駆体スラリーを添加されることにより、前記インキュベーション期間中に、ハイドロキシアパタイトリン酸カルシウム相の結晶化を促進する請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
治療用活性物質は、前記インキュベーション期間の、前記ハイドロキシアパタイトリン酸カルシウム相の結晶化中に、カプセル化のために、前記前駆物質スラリーに添加される請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記治療用活性物質は、薬剤、プロテイン、遺伝子、又はＤＮＡである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前駆体の前記スラリーは、リン酸カルシウム基質の表面に堆積され、及び乾燥される請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記リン酸カルシウム基質は、ゾル−ゲル処理を使用し金属基質に堆積したハイドロキシアパタイトコーティングの薄膜である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記析出後のリン酸カルシウム相は、Ｃａ２＋及びＰＯ４３−イオンの過飽和溶液に露出されることにより、生体模倣ハイドロキシアパタイト膜のコーティングを、前記析出後のリン酸カルシウム相上に設ける請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記析出後のリン酸カルシウム相は、Ｃａ２＋及びＰＯ４３−イオンの過飽和溶液に露出されることにより、生体模倣ハイドロキシアパタイト膜のコーティングを、前記析出後のリン酸カルシウム相上に設ける請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前駆体の前記スラリーは、細分化され、且つ噴霧乾燥されることにより、前記前駆体のミクロスフィアを取得する請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前駆体の前記スラリーは、細分化され、且つ噴霧乾燥されることにより、前記前駆体のミクロスフィアを取得する請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記前駆体の前記ミクロスフィアは、水ベースのリン酸イオン溶液に露出され、温度が２０−５０℃の湿潤な環境においてインキュベートされることにより、前記前駆体の溶解と、リン酸カルシウム相の析出とを促進する請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記前駆体の前記ミクロスフィアは、水ベースのリン酸イオン溶液に露出され、温度が２０−５０℃の湿潤な環境においてインキュベートされることにより、前記前駆体の溶解と、リン酸カルシウム相の析出とを促進する請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記析出後のリン酸カルシウム相を含む前記ミクロスフィアコーティングは、Ｃａ２＋及びＰＯ４３−イオンの過飽和溶液に露出されることにより、生体模倣ハイドロキシアパタイト膜のコーティングを、前記析出後のリン酸カルシウム相上に設ける請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記析出後のリン酸カルシウム相を含む前記ミクロスフィアコーティングは、Ｃａ２＋及びＰＯ４３−イオンの過飽和溶液に露出されることにより、生体模倣ハイドロキシアパタイト膜のコーティングを、前記析出後のリン酸カルシウム相上に設ける請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記析出後のリン酸カルシウム相は、重合体溶液に露出されることにより、重合体の膜を、前記ミクロスフィア表面上に形成する請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記析出後のリン酸カルシウム相は、重合体溶液に露出されることにより、重合体の膜を、前記ミクロスフィア表面上に形成する請求項１０に記載の方法。
【請求項２４】
前記析出後のリン酸カルシウム相は、重合体溶液に露出されることにより、重合体の膜を、前記ミクロスフィア表面上に形成する請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記析出後のリン酸カルシウム相は、重合体溶液に露出されることにより、重合体の膜を、前記ミクロスフィア表面上に形成する請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記重合体は、生分解性重合体である請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記重合体は、ポリビニルアルコールである請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１の方法に基づき作製したリン酸カルシウム相。
【請求項２９】
請求項１３の方法に基づき作製した層−基質のリン酸カルシウム。
【請求項３０】
請求項１６の方法に基づき作製したミクロスフィア。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療用用途のために、カプセル化した薬剤、タンパク質、遺伝子、ＤＮＡを備えるリン酸カルシウム、より詳細にはハイドロキシアパタイト、ミクロスフィア及びコーティングを取得するための新規の室温による方法に関連する。コーティング及びミクロスフィアは、遺伝子送達を介する遺伝子治療等、薬剤送達に関連した規定の生体機能を実行するよう設計される。カプセル化、及びその後のこのような生体機能コーティング及びミクロスフィアからの、治療用活性物質の制御放出のための新規の方法が開示された。このコーティング及びミクロスフィアは、薬剤、タンパク、ＤＮＡ、及び他の治療薬の、副作用が無く、持続的かつ、標的が定められた、制御放出及び搬送に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノム計画の急速な進歩は、従来治療され得なかった病気が、近い将来に治療可能になり得ることを約束する。症状に関心を向け、病気の治療を試行錯誤していた時代が終焉に向かっていることが期待される。そのため、薬剤及び遺伝子の制御放出の問題が重要性を増してきた。現在、多くの種類の新規の薬剤、又は遺伝子は、日ごとの注入、又は一日に数回もの投与が必要とされる。従って、薬剤搬送のための完全に新規の手法は、ゲノム計画の結果による新規の薬剤の利点を完全に利用することが必要である。ゆっくりだが確実な薬剤の放出は、癌及びパーキンソン病から、直接投与したホルモンを短期間だけ体内に持続する肥満のホルモン治療まで、様々な病気の治療として、模索されていた。過去に、重合体物質は、薬剤送達制御のために使用されてきており、特定の薬剤システムに対する十分な臨床的な成功を収めている。薬剤キャリアシステム選択への更なる柔軟性、生体再吸収及び放出の制御、疎水性／親水性の特性の制御、及び少ない副作用を提供する別の無機物の薬剤送達システムに対する需要が、持ち上がって来ている。既に骨の重要な無機要素であり得る、薬剤カプセル化のためのハイドロキシアパタイト（ＨＡ）マトリックスは、薬剤搬送システムのために完全に新しい観点を提供する。
【０００３】
ハイドロキシアパタイトセラミック、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２は、リン酸カルシウム（ＣａＰ）ベースの、薬剤制御放出のための基質を含む、様々な生体医学の用途の生体活性物質の大きな種類に属している［エム．イトカズ（Ｍ．Ｉｔｏｋａｚｕ）等、バイオマテリアル（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）１９，８１７−８１９，１９９８年、エフ．ミングツ（Ｆ．Ｍｉｎｇｕｅｚ）等、ドラックス  エクスペリメンタル  アンド  クリニカル  リサーチ（Ｄｒｕｇｓ  Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ）１６［５］，２３１−２３５，１９９０年、ダブリュ．ポール（Ｗ．Ｐａｕｌ）及びシー．ピー．シャアマ（Ｃ．Ｐ．Ｓｈａｒｍａ）、ジャーナル  オブ  マテリアルズ  サイエンス  マテリアルズ  イン  メディシン（Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｍａｔｅｒ．Ｍｅｄ．）１０，３８３−３８８，１９９９年］。第二リン酸カルシウムＣａＨＰＯ４２ＨＯ２、又は第三リン酸カルシウムＣａ３（ＰＯ４）等、他のＣａＰ族のメンバーも、同様の目的で使用される。ＣａＰ族の物質は人体組織に最適の生体適合性を有すると長く理解されてきている。
【０００４】
リン酸カルシウムセメント（ＣＰＣ）は、リン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ）及び無水第二リン酸カルシウム（ＤＣＰＡ）を含むバイナリシステムとして報告されている［エル．シー．チョウ（Ｌ．Ｃ．Ｃｈｏｗ）等、ジャーナル  オブ  デンタル  リサーチ（Ｊ．Ｄｅｎｔ  Ｒｅｓ）６３，２００，１９８４年］。ＣＰＣの利点の自己凝固、及びＨＡ等の、最終精製物質としてのアパタイト相は、骨の移植及び再生、並びに薬剤送達としての適用を可能にした。［エム．デイア（Ｍ．Ｄａｉｒｒａ）等、バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ），１９  １５２３−１５２７，１９９８年、エム．オオツカ（Ｍ．Ｏｔｓｕｋａ）等、ジャーナル  オブ  コントロールド  リリース（Ｊ．ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ）４３（１９９７年）１１５−１２２、ワイ．タバタ（Ｙ．Ｔａｂａｔａ），ＰＳＴＴ，３巻，３号，８０−８９，２０００年、エム．オオツカ（Ｍ．Ｏｔｓｕｋａ）等、ジャーナル  オブ  ファーマスーティカル  サイエンス（Ｊ．ｏｆ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．）８３巻，５号，１９９４年］。ＣＰＣは典型的に、適切な比率の固体及び液体の成分の混合物として調合され、反応の結果アパタイトを形成する。固体及び液体の成分の混合により生じる物理化学反応は、複雑であるが、溶解及び析出が、最終アパタイトの形態の原因となる重要な機構である［シー．ハマニシ（Ｃ．Ｈａｍａｎｉｓｈ）等、ジャーナル  オブ  バイオメディカル  マテリアルズ  リサーチ（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔ．Ｒｅｓ）３２巻，３８３−３８９，１９９６年、イー．フェランデス（Ｅ．Ｆｅｒａｎｄｅｚ）等、ジャーナル  オブ  マテリアルズ  サイエンス  マテリアルズ  イン  メディシン（Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｍｅｄ）１０，２２３−２３０，１９９９年］。大部分のＣＰＣ機構の反応経路は、化学量論的なＨＡよりも、むしろ骨内に見出されるものと同等のカルシウム欠乏Ｃａ１０−ｘ（ＨＰＯ４）ｘ（ＰＯ４）６−ｘ（ＯＨ）２−ｘ‘を生じる。Ｃａ／Ｐ比率、紛体／液体比率、シードの濃度及び種類、試薬の性質、等、工程のパラメータは、相の容量、間隙率、強度、凝固時間、相変換反応速度、ヒドロキシアパタイトから誘導されたＣＰＣの微小構造（ＣＰＣ−ＨＡ）等の、最終的な属性を制御する。ベルムデス（Ｂｅｒｍｕｄｅｚ）等、［ジャーナル  オブ  マテリアルズ  サイエンス  マテリアルズ  イン  メディシン（Ｊ．Ｍａｔ．Ｓｃｉ．Ｍｅｄ）４，５０３−５０８，１９９３年、同書の５，６７−７１，１９９４年］は、単一リン酸カルシウム一水和物（ＭＣＰＭ）と酸化カルシウムによるシステムにおける、初期Ｃａ／Ｐ比率に対するＣＰＣの圧縮強度に関する。最適なＣａ／Ｐ比率は１．２５〜１．４５の範囲にあることが判明している。ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）等［ジャーナル  オブ  ザ  アメリカン  セラミック  ソサエティ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｅｒｍ．Ｓｏｃ）７４［５］９３４−４０，１９９１年］は、ＤＣＰ／ＴＴＣＰシステムにおける低温のＨＡ形成の反応速度が、初期には反応物質の表面領域より、最終的には分散により、制御されることが判明している。これらの方法の変数は、本プロジェクトにおいて結晶性、従って再吸収及びＨＡミクロスフィアからの放出率を、制御する��めに使用される。
【０００５】
室温によるＨＡ膜の生体模倣による析出（ＢＭ−ＨＡ）は、薬物搬送を含む、様々な生物医学的な適用に使用されてきた［エイチ．ビー．ウェン（Ｈ．Ｂ．Ｗｅｎ）等、ジャーナル  オブ  バイオメディカル  マテリアル  リサーチ（Ｊ．Ｂｉｏ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ），４１，２２７−３６，１９９８年、エス．リン（Ｓ．Ｌｉｎ）及びエイ．エイ．キャンベル（Ａ．Ａ．Ｃａｍｐｂｅｌｌ）、米国特許第５９５８４３０号、１９９９年、ディ．エム．リウ（Ｄ．Ｍ．Ｌｉｕ）等、ジャーナル  オブ  マテリアルズ  サイエンス  イン  メディシン（Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｍａｔｅｒ．Ｍｅｄ）５，１４７−１５３，１９９４年、ケイ．デ．グルート（Ｋ．ｄｅ．Ｇｒｏｏｔ）等、ジャーナル  オブ  バイオメディカル  マテリアル  リサーチ（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ），２１，１３７５−１３８１，１９８７年］。形成機構は、ＨＡが最適な安定相である、適切な水溶液のｐＨの下により、過飽和のＣａ２＋及びＰＯ４３−によって、引き起こされる。アパタイト性結晶は核生成及び成長を通じて形成し、抗生物質、抗癌剤、抗炎症剤等、生物学的活性種を組込み得る。しかしながら析出速度は、一般に０．００５−０．５μｍ／ｈの範囲にあり、ＢＭ−ＨＡに対して小さいため、高濃度の薬剤の調剤は実現が困難である。従って、１μｍを越える膜を目的として形成する場合、単体のＢＭ−ＨＡは適切ではないが、薬剤物質を使用して飽和した親水性のＨＡ構造の上に、追加的にカプセル化するための膜としては適切であり得る。これは特に、骨−ＨＡの接続面において、術後の早期における急性炎症を防ぐために、高濃度の抗生物質が必要とされる整形外科には重要である。更に、ＢＭ−ＨＡ形成のための生理的溶液は、必然的に、疎水性の生体活性剤のＢＭ−ＨＡコーティング内へのカプセル化を不可能にする、水ベースである。
【０００６】
高温（３７５−５００Ｃ）におけるＨＡ（ＳＧ−ＨＡ）膜のゾル−ゲル析出は、以前、ディ．リウ（Ｄ．Ｌｉｕ）及び、ティ．トロクジンスキ−（Ｔ．Ｔｒｏｃｚｙｎｓｋｉ）により、２０００年５月２日に出願された米国特許出願第０９／５６３２３１号により、開示された。この内容は参照として本願に併合されている。ＨＡのゾル−ゲル（ＳＧ）処理は、カルシウムとリン前駆体との分子レベルの混合を可能にし、生じたリン酸カルシウムの化学的均一性を改善する。ＳＧ法の転用性は、容易で、穏やかで、比較的低温の方法により、薄膜コーティングを形成する機会を広げる。ディ．リウ（Ｄ．Ｌｉｕ）及び、ティ．トロクジンスキ−（Ｔ．Ｔｒｏｃｚｙｎｓｋｉ）によって新規に発明された方法を使用して取得された、リン酸カルシウム相の結晶性は、処理中の水の取り扱いの適切な使用により強化され得る。ゾル−ゲル前駆体混合物内のＣａ／Ｐ比率の変形は、ハイドロキシアパタイト、第二リン酸カルシウム、第三リン酸カルシウム、又はリン酸四カルシウム等の、リン酸カルシウム相以外のものを取得することを可能にする。薬剤のカプセル化及び放出のための多孔性の厚い（＞１０μｍ）ＣＰＣ−ＨＡの低−結晶性（非結晶質）膜の核生成及び成長のための、ＳＧ−ＨＡの薄く（＜１μｍ）濃い高結晶膜の使用が、本件で開示される。
【０００７】
生体内で（ｉｎ  Ｖｉｖｏ）の薬剤搬送に伴う問題は、自己調整、徐放を生じるよう薬剤搬送を制御する目的と同様に、一般的に、低い薬剤充填能力の、キャリア剤の毒性に関連する。比較的に薬剤の高い充填能力を支援する、コロイドキャリアシステムを除外して、ほとんどのシステムは不十分なレベルの生体活性薬剤を搬送する。遺伝子搬送に関しては、これまで最も効率的だが、安全性が最小限の搬送方法は、ウイルスを仲介した遺伝子導入である。これは非常に非効率な方法であり、及び疎水性且つ不安定なＤＮＡオリゴの性質による薬剤の搬送の問題以上に、さらに大きな問題に直面している。遺伝子又は、アンチセンスオリゴの搬送による問題は、血清核酸分解酵素によるＤＮＡの分解と同様に、肝臓又は腎臓摂取によるプラスミドＤＮＡ又はオリゴの急速な除去のため生じる［タカムラ．ワイ（Ｔａｋａｍｕｒａ．Ｙ）等  ヨーロピアン  ジャーナル  オブ  ファーマスーティカル  サイエンス（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ）１３（２００１年）７１−７６］。これらの効果はその場への（ｉｎ  ｓｉｔｕ）及び静脈搬送のどちらでも観察されてきた。例えば、静脈及びｉｎ  ｓｉｔｕの搬送された裸のＤＮＡの半分以上が、腫瘍内部への注入後の最初の２時間以内に腫瘍部位から除去されると推定される［オウコウチ，ケイ（Ｏｈｋｏｕｃｈｉ，Ｋ）等  キャンサー  リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ）５０，（１９９６年）１６４０−１６４４、及びイモト，エイチ（Ｉｍｏｔｏ，Ｈ）等、キャンサー  リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ）５２，（１９９２年），４３９６−４４０１］。除去後であっても、非常に小さいの比率の残存ＤＮＡ又はオリゴは、標的細胞の細胞質又は核への経路を形成する。裸のＤＮＡ及び特にオリゴの膜の透過率は、それらのポリアニオン的性質により、実質的には無いに等しい。このため、エンドゾーム構造を経由するこれらの摂取は、ｐＨ及び分解により深刻な低下をする。最終的に、搬送された遺伝子の多くは、導入され且つ、安定した発現のためにしばしば、標的細胞のゲノムに組み込まれる。これはｉｎ  Ｖｉｖｏの遺伝子導入を困難にする。更に、効果的な制御放出は、大部分の用途において、依然として問題となり（裸のＤＮＡワクチンは例外）、特定の医学的状況の改良するために、目的の遺伝子が持続的に発現することが望ましい。大部分の適用において、おおよそ数週間から数ヶ月、特定の遺伝子生成物の発現が望まれる。
【０００８】
ＨＡによる薬剤のカプセル化は、過去において、焼結済み、多孔性ＨＡセラミックの単純含侵後によって実現された［ケイ．ヤマムラ（Ｋ．Ｙａｍａｍｕｒａ）等、ジャーナル  オブ  バイオメディカル  マテリアル  リサーチ（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ）２６，１０５３−６４，１９９２年］。この処理により、薬剤分子は容易に多孔性セラミックの表面に吸収される。薬剤放出は脱離、及び浸出によって行われ、生体流に露出した後、周囲の組織へ放出される。あいにく、そのようなシステムからの吸収された薬剤分子の大部分の放出は短時間で行われる。多孔性の焼結済みリン酸カルシウムミクロスフィア内への薬剤物質の含侵は、特許文献により報告されてきた。「徐放」多孔性顆粒は米国特許第５０５５３０７号により請求され［エス．ツル（Ｓ．Ｔｓｕｒｕ）等、１９９１年］、ここで顆粒は２００−１４００Ｃにおいて焼結され、及び薬剤成分は間隙内部に浸透する。「リン酸カルシウムミクロキャリア及びミクロスフィア」は、１９９８年にビ．スタリング（Ｂ．Ｓｔａｒｉｎｇ）等による、国際公開第９８／４３５５８号パンフレットにて特許請求されている。中空のミクロスフィアは、焼結され且つ徐放のための薬剤を含侵される。ディ．リー（Ｄ．Ｌｅｅ）等は、不十分な結晶アパタイト［国際公開第９８／１６２６８号］を特許請求し、ここでは微小形状が硬化し、同時に、徐放のための薬剤物質がカプセル化され得る。感染された骨部位の細菌性の感染を治療するためのアミノ配糖体系抗生物質、ゲンタマイシン（ＧＳ）のためのキャリアとして、多孔性の、合成ＨＡの使用が提案されてきた［ジェイ．エム．ロガーフォイ（Ｊ．Ｍ．Ｒｏｇｅｒｓ−Ｆｏｙ）等、ジャーナル  オブ  イブスティガーティブ  サージャリ−（Ｊ．Ｉｎｖ．Ｓｕｒｇｅｒｙ）１２（１９９７年）２６３−２７５］。ＨＡコーティング内のプロテインの存在はカルシウム又はリン酸の分散特性に影響を与えず、分散特性は単に媒質に依存した［ベンダー  エス．エイ．（Ｂｅｎｄｅｒ  Ｓ．Ａ）等、バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）２１（２０００年）２９９−３０５］。
【０００９】
エム．オオツカ（Ｍ．Ｏｔｓｕｋａ）教授により率いられた神戸大学のグループは、リン酸四カルシウム、及び第二リン酸カルシウムから誘導された自己凝固リン酸カルシウムセメントによる薬剤のカプセル化の一連の発明を行った［ジャーナル  オブ  コントロールド  リリース（Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ）４３  １１５−１２２  １９９７年  同書の５２  ２８１−２８９  １９９８年  ジャーナル  オブ  ファーマスーティカル  サイエンス（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ）８３  ６１１−６１５，２５９−２６３，２５５−２５８，１９９４年］。セメントはｉｎ  ｓｉｔｕで、１５ｍｍの直径のマクロペレット内に、薬剤カプセル化により形成され、モニターされた薬剤（インドメタシン）放出は最大３週間までにわたった。骨組織周辺内でｉｎ  ｓｉｔｕに形成された、セメント−薬剤搬送システムは、高い治療効率で局地骨感染を治療するための最良の方法であり得ると結論付けられている。薬剤搬送のためのＨＡの利点は、ハイドロキシアパタイト物質に対する副作用の不安が存在し得ないことである［ワイ．シント（Ｙ．Ｓｈｉｎｔｏ）等、ジャーナル  オブ  ボーン  アンド  ジョイント  サージェイ（Ｊ．Ｂｏｎｅ．Ｊｔ．Ｓｕｒｇ）７４Ｂ４，６００−４  １９９２年］。リン酸カルシウム−生分解性重合体混合物は、また、薬剤搬送が可能な小胞として調査された［アイ．ソリアーノ（Ｉ．Ｓｏｒｉａｎｏ）及びシー．エボラ（Ｃ．Ｅｖｏｒａ），ジャーナル  オブ  コントロールド  リリース（Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ）６８，１２１−１３４，２０００年］。持続薬剤放出（最大１０週間）は、疎水性ポリマーコーティングでコートした合成物質により得られた。ペンシルベニア大学のグループ［キュー．キュウ（Ｑ．Ｑｉｕ）等、ジャーナル  オブ  バイオメディカル  マテリアルズ  リサーチ（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔ．Ｒｅｓ）５２，６６−７６  ２０００年］は、近年、薬剤搬送のための重合生体活性ガラスセラミックス合成物ミクロスフィアを加工した。多孔性のリン酸カルシウムセメントは骨髄細胞［イー．コン（Ｅ．Ｃｏｎ）等、ジャーナル  オブ  バイオメディカル  マテリアルズ  リサーチ（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔ．Ｒｅｓ）］、及びヒト骨形成プロテイン［アイ．アラン（Ｉ．Ａｌａｍ）等、ジャーナル  オブ  バイオメディカル  リサーチ（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔ．Ｒｅｓ）５２  ２０００年］に含侵される。
【００１０】
エス．タケノリ（Ｓ．Ｔａｋｅｎｏｒｉ）等、米国特許第５９９３５３５号（及び欧州特許第０８９９２４７号に添付）により、主な成分としてリン酸四カルシウム及びリン酸水素カルシウムを含むリン酸カルシウムセメントが開示された。ハイドロキシアパタイトへの変換のために３７℃で２４時間インキュベートすることが必要とされる。ティ．スミアキ（Ｔ．Ｓｕｍｉａｋｉ）等は、米国特許第５０５５３０７号により、Ｃａ対Ｐの比率が１．３〜１．８、間隙率が０．１〜７０％、０．１〜５０ｍ２／ｇの比表面積、及び１ｎｍ〜１０μｍの孔径を有する多孔性のリン酸カルシウム化合物の顆粒による徐放薬剤搬送顆粒が開示された。２００〜１４００℃の温度で顆粒が焼かれ、薬剤化合物は顆粒の孔内に焼結し、及び同様なものを製造するための方法である。エス．ゴゴレウスキー（Ｓ．Ｇｏｇｏｌｅｗｓｋｉ）は、国際公開第００／２３１２３号パンフレットにより、硬化セメントの分解及び溶解によりヒト又は動物に搬送される、薬剤を含む硬化可能なセラミック水硬化性セメントを開示した。しかし、ＨＡを取得するためのＣＰＣの変換は４０時間必要だった。エル．チョウ（Ｌ．Ｃｈｏｗ）等は、米国特許第５５２５１４８号により、水性溶媒に接触した場合、室温において、実質的にハイドロキシアパタイトに自己硬化するリン酸カルシウムセメントを開示した。より詳細には、セメントは、リン酸四カルシウム以外のリン酸カルシウムと、塩基により約１２．５又はそれ以上のｐＨに保持するために調整され、約０．２ｍｏｌ／Ｌ以上のリン酸濃度の溶液混合物を生成するために、十分に溶解されたリン酸塩を有する水性溶液との組合せを備える。しかし、この方法の主要な欠点は、高いｐＨ（＞１２．５）であり、これはほとんどの薬剤、タンパク、ＤＮＡを変性させ得、そのため、この方法は薬剤カプセル化手段には適さない。シー．レイ（Ｃ．Ｒｅｙ）等は、国際公開第９８１６２０９号パンフレットにより、薬剤搬送、組織の成長及び骨増大等、ｉｎ  Ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏの様々な適用に有用であり、生体活性剤や細胞、好ましくは組織形成又は組織分解細胞、を含有する合成された不十分な結晶リン酸カルシウムアパタイトを開示した。しかし、Ｃａ／Ｐ比率は、１．５未満に限定され、及び発明者はミクロスフィア及びコーティングをどうのように加工するか開示していない。
【００１１】
ヒドロキシアパタイトセラミックの物理的特性、即ち形状は、また、組織の反応にかなりの影響を与える。様々な可能な形状の中には、ハイドロキシアパタイト顆粒は手術のために加工するだけではなく、比較的大きな内部顆粒孔を作製し、宿主組織による進入を可能にすることにより、移植後の組織成長へ利点を提供する。この方法により、薬剤を含むＨＡ顆粒の使用は、実際の医療／生物医学の適用として、治療効果を強化してきた。
【００１２】
上記の研究が、多孔性ＨＡの溶解により、脱離及び溶解を通じて、生物活性成分を活性化する水溶性細胞外液を放出することを記載しているのに対し、本開示はまた、ＨＡマイクロキャリアの吸収を使用する遺伝子、薬剤、又はタンパクの細胞内の搬送を目的とする。主要な観測結果は、ＨＡコートした臀部移植の接触面において、ＨＡ小胞がマクロファージの内部に見出されたことである［バウアー  ティ．ダブリュ．（Ｂａｕｅｒ  Ｔ．Ｗ．）ジャーナル  オブ  ボーン  アンド  ジョイント  サージェリー（Ｊ．Ｂｏｎｅ．Ｊｏｉｎｔ．Ｓｕｒｇ．Ａｍ）７３−Ａ（１９９１年）１４３９−１４５２］。したがって、食細胞はＨＡ粒子を捕まえ且つ可溶化し得る［エバンス  アール．ダブリュ．（Ｅｖａｎｓ．Ｒ．Ｗ）等  カルシファイド  ティシュー  インターナショナル（Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ．Ｉｎｔ）３６（１９８４年）６４５−６５０］。したがって、これは、ウイルスを仲介した遺伝子導入を必要としない、ＨＡコーティング及びミクロスフィアの使用を通じた、遺伝子の細胞内搬送の基本的機構の一つであり得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
出願人は、コーティング又は自己支持的なミクロスフィアによる薬剤搬送のための効率的手段として機能するように、ハイドロキシアパタイトが設計され得る方法を開示する。本方法はリン酸カルシウム（ＣａＰ）に関し、より詳細には、有機性溶液又は水に分散し得る、いかなる種類の薬剤又はタンパクをカプセル化する能力を有するハイドロキシアパタイト（ＨＡ）のミクロスフィア及びコーティングに関する。本方法は、リン酸カルシウムセメント（ＣＰＣ）スラリーから始まり、ミクロスフィア又はコーティングのＨＡ相を析出するためのインキュベーションが続く。薬剤及びタンパクを、ミクロスフィア又はコーティング前駆体のコロイド溶液に（ＣＰＣスラリー）に添加し、直接、ｉｎ  ｓｉｔｕのカプセル化、及びアパタイトミクロスフィアより治療用活性剤の実質的な制御放出が実現される。ミクロスフィアの結晶化の様々な程度により、体液への吸収、したがって薬剤の放出率を制御し且つカスタマイズする。
【００１４】
過去に薬剤搬送のためのＣａＰの定常マクロ−化合物を使用するいくつもの技術が調査されてきたが、ｉｎ  ｓｉｔｕの薬剤のカプセル化を使用して、急速に凝固する機能的な勾配セメントミクロスフィア及びコーティングの処理を可能にできるものはなかった。したがって、出願人は本開示で、新規、安全、安価、及びｉｎ  ｖｉｖｏの、薬剤、タンパク、遺伝子、アンチセンスオリゴの搬送方法を開示する。本方法において、リン酸カルシウムコーティング及びミクロスフィアは、リン酸カルシウムセメント（ＣＰＣ）が凝固するとの同様の溶解−析出機構を通じて、取得される。本方法は、接着性の、（典型的には厚さ１０−１０００μｍ）ＨＡ厚膜の析出と、ＨＡマイクロスフィア（典型的には直径１０−１０００μｍ）の製造のために使用される。
【００１５】
ほとんど他のセメント（ポートランド（Ｐｏｒｔｌａｎｄ）セメント等）と同様に、リン酸カルシウムセメントは、水和及び凝固時に、水和熱を放出する。急速な凝固時（特定の適用において重要な条件）、この熱は十分に早く消散し得ず、セメントされた領域の温度は上昇し、しばしば、セメントにひび等、損傷を与えてしまう水準まで上昇する。より重要なことに、移植の一部として等、セメントを人体に適用した場合、急速な凝固より熱が放熱された際、この温度上昇は、細胞、タンパク及び酵素など周囲の生体構成要素に損害を与え得る。本開示の新規セメントシステムは、凝固中の比較的穏やかな温度上昇、つまり、室温の〜２０℃から、最大で体温に近い３７℃まで、となる。このセメントは又は優れた機械的特性を示した。例えば、圧縮強度は一般的に１０ＭＰａより大きく、特定の化合物では、＞３０ＭＰａである。
【００１６】
このＣＰＣスラリーは、アパタイトシード等、少量の他の無機成分と合せた、第一リン酸カルシウム（ＭＣＰ）の無水物又は、二水和物等の酸性リン酸カルシウムと、塩基性水酸化カルシウムとの混合物である。ボールミル粉砕等により、この混合物は完全に混合される。不活性液体媒質（アルコールなど）又は、不活性媒質及び少量のリン酸塩溶液の混合物に懸濁された混合物は、形成処理が実行される（即ち、セメントによる孔の充填、又は薬剤含侵したミクロスフィアの形成）前に、開始Ｃａ／Ｐ比率が１．２−１．６７の範囲、固体濃度が３０−７０体積％を有する。形成プロトコルは、２−４０分以内に凝固時間を制御するように最適化され得る。
【００１７】
生じたセメントは、処理のパラメータに依存して、針状粒子又は平面状粒子の形態の両方のアパタイト相（ＨＡ）を示している。更にナノ構造化セメントが合成され得、特に、薬剤、抗生物質、タンパク、酵素のカプセル化のために使用される。アパタイト相は、開示されたＣＰＣシステムによる１−６時間のインキュベーションにより生じる。アパタイト相の急速形成は周囲の宿主組織による早期の生体反応に対して有利である。急速な凝固（２−４０分）及び硬化時間（６時間未満）は、セメントの臨床適用に対して非常に利益を与える。最終アパタイト構造が非結晶質（容易に吸収）から硬結晶質（生理学的環境に安定）まで制御可能な結晶は、セメントの適用に基づくカスタマイズが可能である。細かな（ナノからサブミクロン）開始材料は、最終マイクロ構造を十分に制御することを可能にし、高い強度の最終物体を可能にする。新規ＣＰＣのナノ構造は、制御放出と同様に、薬剤のカプセル化のための大きな利点を提供する。アパタイトミクロスフィアは、単純な噴霧乾燥機を使用して、１０−１０００ミクロンの範囲の大きさの、新規のＣＰＣ配合を使用して、容易に加工され得る。セメントミクロスフィアの凝固及び硬化の方法の制御は、注入用充填剤、治療のためのｉｎ  ｓｉｔｕの硬化剤、修復、不全組織の増強等、多様な生物医学又は臨床適用を可能にする。
【００１８】
開示した方法は、室温において、様々な物理的形態のＨＡセラミックの合成を利用し得る。以下の適用が目的とされるのは、人工骨充填剤／骨再形成のための顆粒状、又はバルク形状、薬剤が組入れられた室温で処理した（Ｔｉ及び他の合金上の）コーティング、生重合体及びセラミック等の他の物質と結合したＨＡ、及び制御した薬剤放出機能や骨成長制御機能を伴うナノ複合材料及び生物複合材料を形成するタンパクを含む有機／無機の複合材料である。
【００１９】
出願人はここで複数層、機能的勾配ＨＡコーティング及びミクロスフィアを実現するための新規の手法を開示する。つまり、複数層のＨＡコーティングは、あらゆる特定の層に採用した様々な機能を伴って、様々な技術を使用して堆積される。より詳細には、出願人は、高温ゾル−ゲル処理と室温の析出処理との組合せにより処理した、機能的勾配ＨＡコーティングによる、ｉｎ  ｓｉｔｕの薬剤のカプセル化を記載する。このプロトコルの結果により、厚さ０．６−０．８μｍの中間のＨＡ膜を通じて金属基質に強固に固定した、厚さ１０−３０μｍ、ナノ−サブマイクロ多孔性ＨＡマトリックスが実現された。ゾル−ゲルＨＡ薄膜（ＳＧ−ＨＡ）は、４００Ｃの処理温度において下部基質との適切な結合を生じ、中間体の核生成／下部基質とＨＡ厚膜マトリックスとの間の結合層として作用する。ＣＰＣ−ＨＡ薄膜マトリックスは、室温でＳＧ−ＨＡ薄膜上に、第一リン酸カルシウム及び水酸化カルシウム前駆体粉末の非水懸濁液による滴下コーティングによって、堆積される。薬剤物質は懸濁液の中に分散され、初期には前駆体の粉末膜の孔内に堆積される。続いて、多孔性の厚膜アパタイトは、溶解−析出処理を通じて、生理学的環境の下で形成される。ＳＧ−ＨＡ薄膜は、核生成及び、厚膜アパタイト結晶の成長を可能にする、シード添加のテンプレートとして作用し、したがって、ＨＡマトリックスに十分な界面強度を与える。ｉｎ  ｓｉｔｕの薬剤のカプセル化に関連する、室温のコーティング処理は、様々な金属又は非金属の器質に適用され得、潜在的に様々な生物医学／生化学適用に利益を提供し得る。
【００２０】
ミクロスフィアは、コーティングと同様の合成経路及び、化学性質を使用した、噴霧乾燥機及びＣＰＣ−ＨＡ前駆体スラリーのインキュベーション処理を通じて製造された、自己支持顆粒である。本発明の更に詳細は以下に提供する。
【００２１】
リン酸カルシウムセメント（ＣＰＣ）の凝固と同様に、溶解−析出機構を通じた、接着性ハイドロキシアパタイト厚膜の、金属基質上への、接着の沈着のための室温処理が開示された。このようなナノ多孔、半非結晶１０−１０００μｍ厚膜は、下部にあるゾル−ゲル処理を通じて堆積したハイドロキシアパタイトの結晶薄膜の上で、急速に成長させられる。直接、ｉｎ  ｓｉｔｕカプセル化、及びアパタイトコーティングからの治療性活性剤の実質的な制御放出が実現された。わずかに変形した同様の方法は直径１０−１０００μｍのＨＡミクロスフィアを媒介した形態を生じる。コーティング及びミクロスフィアの両方とも、薬剤、タンパク、ＤＮＡ等の、副作用が無く、持続的かつ、標的を定めた、制御放出、及び搬送のために設計された。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明はリン酸カルシウム相を作製するための方法に関する。その方法は、（ａ）前駆体のペースト或いは粘性スラリーを形成するために、実質的に無水の溶剤により、第一リン酸カルシウムＣａ（Ｈ２ＰＯ４）２及び水酸カルシウムＣａ（ＯＨ）２前駆体を均一に分散する工程と、（ｂ）前駆体スラリーを乾燥する工程と、（ｃ）混合物を製造するために、水ベースのリン酸イオン溶液をスラリー内に混合する工程と、（ｄ）２０〜５０℃の湿潤な環境において、前駆体を溶解し、且つリン酸カルシウム相を析出するために生じた混合物をインキュベートする工程とを備える。
【００２３】
リン酸カルシウム相はハイドロキシアパタイトで有り得る。前駆体混合物内のＣａ／Ｐ原子比率は１．２−１．６７の範囲にあり、及び混合物は３０−７０体積％の固体濃度を有し得る。実質的に無水の溶質はアルコールであり得る。アルコールは、エチルアルコール、メチルアルコール、プロピルアルコールであり得る。水ベースのリン酸イオン溶液はリン酸ナトリウムで有り得、及び湿潤な環境は相対湿度が５０％〜１００％であり得る。
【００２４】
前駆体スラリーは、規定の形状に乾燥され得る。形状は、ペレット、コーティング、ミクロスフィア、又は、歯孔及び骨孔充填剤であり得る。結晶ハイドロキシアパタイト粉末はインキュベーション中にリン酸カルシウムハイドロキシアパタイト相の結晶化を促進するために、前駆体スラリーに添加され得る。治療用活性物質は、インキュベーション時のリン酸カルシウムハイドロキシアパタイト相の結晶化中にカプセル化のために前駆体スラリーに添加され得る。治療用活性物質は薬剤、タンパク、遺伝子、又はＤＮＡであり得る。
【００２５】
前駆体のスラリーは、リン酸カルシウム基質の表面上に堆積され、且つ乾燥され得る。リン酸カルシウム基質は、ゾル−ゲル処理を使用して、金属基質上に堆積したハイドロキシアパタイトの薄膜であり得る。析出後のリン酸カルシウム相は、析出後のリン酸カルシウム相上に生体模倣ハイドロキシアパタイト膜のコーティングを提供するために、Ｃａ２＋及びＰＯ４３−の過飽和溶液に露出され得る。
【００２６】
前駆体のスラリーは、前駆体のミクロスフィアを取得するために、細分化され得、噴霧乾燥され得る。前駆体のミクロスフィアは、リン酸塩イオンの水ベースの溶液に露出され得、前駆体の溶解及びリン酸カルシウム相の析出を進行するために、２０−５０℃の温度の湿潤な環境でインキュベートされ得る。析出後のリン酸カルシウムのミクロスフィアコーティングは、析出後のリン酸カルシウム相上に生体模倣ハイドロキシアパタイト膜のコーティングを提供するために、Ｃａ２＋及びＰＯ４３−の過飽和溶液に露出され得る。析出後のリン酸カルシウム相は、ミクロスフィアの表面上に重合体膜を形成するため重合体溶液に、露出され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
薬剤カプセル化のためのＨＡ厚膜を製造するために、下部の基質の表面（典型的にはステンレス鋼又はチタン）は、２０００年５月２日に出願された米国特許出願第０９／５６３２３１号に開示されているように、最初に、ゾル−ゲルＨＡの薄い、サブマイクロメータの膜によりコートされる。その内容は参照によって本願に取り込まれている。ゾル−ゲルＨＡ薄膜（ＳＧ−ＨＡ）は、４００℃の処理温度において、下部の基質と適切な結合を生じ、中間体の核生成及び下部基質とＨＡ薄膜マトリックスとの間の結合層として作用する。ＣＰＣ−ＨＡ厚膜マトリックスは、室温でＳＧ−ＨＡ薄膜上に、第一リン酸カルシウム及び水酸化カルシウム前駆体粉末の非水懸濁液によるディップコーティングによって、堆積される。薬剤物質は懸濁液の中に分散され、最初に前駆体の粉末膜の孔内に堆積される。続いて、薬剤物質を含有する、前駆体粉末膜は、リン酸ナトリウムの水ベースの溶液に露出され、３７℃、相対湿度１００％で、２４時間インキュベータに置かれる。この期間に、多孔性のＨＡ厚膜は、前駆体粉末の溶解及び、薬剤物質をカプセル化するアパタイト相の再析出によって、形成される。ＳＧ−ＨＡ薄膜は、核生成及び、厚膜アパタイト結晶の成長を可能にする、シード添加のテンプレートとして作用し、したがって、ＨＡマトリックスに十分な界面強度を与える。このプロトコルの結果、厚さ１０−１０００μｍ、厚さ０．６−０．８μｍの中間のＨＡ膜を通じて金属基質に強固に固定された、薬剤物質をカプセル化したナノ〜サブミクロンの多孔性のＣＰＣ−ＨＡマトリックスが実現された。図１は、（ａ）がＳＧ−ＨＡコーティングを伴わない、（ｂ）が、ＳＧ−ＨＡコーティングを伴う金属基質にコーティングされたＣＰＣ−ＨＡを示している。ＳＧ−ＨＡコーティング中間層が無い場合は、基質からＣＰＣ−ＨＡコーティングの自然分離が生じる。図２は、（ａ）がＣＰＣ−ＨＡ／ＳＧ−ＨＡコーティングシステムの断面図、（ｂ）が商用結晶性ハイドロキシアパタイトと比較した、ＦＴＩＲスペクトルを示している。ＣＰＣ−ＨＡ／ＳＧ−ＨＡコーティングシステムの２つの膜の優れた、密着接触面は、ＣＰＣ−ＨＡのための核生成部位としてＳＧ−ＨＡが作用することを立証する。
【００２８】
薬剤のカプセル化のためにＨＡミクロスフィアを製造するために、ＣＰＣ前駆体粉末の非水性懸濁液（第一リン酸カルシウム及び水酸カルシウム）は、細かい結晶ＨＡ添加シードと共に、細分化され且つ噴霧乾燥されて（図３ａ、及び図３の概略図の段階１）、約１０−１０００μｍの大きさの球状の粒子を製造する。薬剤物質は、懸濁液に分散され、及び最初に前駆体粉末ミクロスフィアの孔内に堆積される。次に、薬剤物質を含む、前駆体粉末ミクロスフィアは、リン酸ナトリウムの水ベースの溶液に露出され、３７℃、相対湿度１００％、最大２４時間、インキュベータ内に置かれる（段階２）。この期間に、多孔性のＨＡミクロスフィアは、前駆体粉末の溶解、及び薬剤物質をカプセル化したアパタイト相の再析出によって形成される（段階３）。細かい結晶ＨＡ添加粒子は、核生成及びアパタイト結晶の成長を可能にするシードとして作用する。このプロトコルの結果、１０−１０００μｍの大きさのナノ〜サブミクロン多孔性ＣＰＣ−ＨＡミクロスフィアマトリックスにより薬剤をカプセル化することが実現される。最終段階４の処理（図３）において、ＢＭ−ＨＡの薄膜は追加カプセル化のためにミクロスフィアの表面に堆積され得る。図４は、上記の方法に基づいて製造された、（ａ）が〜２０ｕｍ、（ｂ）が〜３００ｕｍの、２つのＣＰＣ−ＨＡのＳＥＭ顕微鏡写真である（ＢＭ−ＨＡはこのミクロスフィアには存在しない）。ミクロスフィア内のＨＡシードの中身を変更することにより、生じるＣＰＣ−ＨＡの結晶（生理学的な環境における吸収率）は様々であり得る。これは、図５で示され、（ａ）がマイクロ結晶、（ｂ）が非結晶の、ＣＰＣ−ＨＡ構造を示している（ＸＲＤ及びＦＴＩＲデータにより確認された）。
【００２９】
コーティング及びミクロスフィアは、開口及び閉鎖多孔性のＨＡ内部に補助的な物質をカプセル化するため等の、処理をされる。補助的な物質は、薬剤、タンパク、遺伝子、ＤＮＡなど、治療使用に対して好適となり得る。出願人は、直接的及びｉｎ−ｓｉｔｕでのカプセル化、及びこのようなアパタイトコーティング及びミクロスフィアからの治療用活性剤の実質的な制御放出が実現し得ることを、明らかにした。コーティング及びミクロスフィアの両方とも、薬剤、タンパク、ＤＮＡ等の、副作用が無く、持続的であり、標的を定めた、放出制御された及び搬送のために設計された。開示した方法は、ＨＡマトリックス内部への含侵よりも、カプセル化（構造内部への取り込み）による薬剤搬送の課題に対するものである。従って、薬剤放出は、マトリックスからの浸出よりも、ＨＡマトリックスの吸収に関するものである。物質プロセス工学は、薬剤カプセル化のためにＨＡの構造を制御することを発達させ、したがって、ＨＡの吸収、及び薬剤と遺伝子の搬送方法の制御を発達させてきた。薬剤カプセル化のための生体内吸収性ＨＡは、開口多孔性のマトリックスからの薬剤の浸出よりも、マトリックスの段階的な吸収の結果による薬剤の放出のために設計され、及び処理される。基質をコートしたＳＧ−ＨＡ上に成長した追加的なＢＭ−ＨＡカプセル膜は、図６のＳＥＭ顕微鏡写真に示される。リン酸カルシウム層（ＣＰＬ）としての生体模倣ハイドロキシアパタイト（ＢＭ−ＨＡ）膜の堆積は、（ａ）が低結晶、（ｂ）が高結晶のＳＧ−ＨＡ基質上への堆積物が示されている。
【００３０】
明細書及び請求項内において、適切な場合、“リン酸カルシウム”（ＣａＰ）の用語は総称として使用され、ハイドロキシアパタイト、第二リン酸カルシウム、第三リン酸カルシウム、及びリン酸四カルシウム等の無機化合物を含むことが理解される。
【００３１】
出願人は、複数層の生体適合性のある／生物活性機能の品質を有するリン酸カルシウムを、（ｉ）典型的にはステンレス鋼又はチタンの、様々な基質上へのコーティング、及び（ｉｉ）自己支持ミクロスフィアという、２つの形態で開示した。２つの種類のコーティングが堆積された。金属表面上に直接設けられた第一コーティングは、約４００Ｃの高温で、ゾル−ゲル技術により製造された、密であり高結晶性のＨＡの薄膜（０．２−０．５μｍ）である。このコーティングは幾つかの目的、（ｉ）周囲の組織から、金属表面を守ること、（ｉｉ）第二ＣＰＣ−ＨＡコーティングのための高接着及び核生成表面を提供することを提供する。第二コーティングは室温で処理されたＨＡの多孔性の厚膜（１０−１０００μｍ）である。目的は、リン酸カルシウムセメント（ＣＰＣ）の凝固と同様に、溶解−析出機構により接着アパタイト層の急速形成を実現することである。様々な濃度の薬剤をＣＰＣコロイド懸濁液に添加することにより、直接的な、ｉｎ−ｓｉｔｕでのカプセル化、及びその後のアパタイトコーティングからの治療用活性剤の実質的な制御放出が実現される。様々な度合いのコーティングの結晶性及び複数工程のコーティング／含侵技術は、ＣＰＣ−ＨＡ吸収過程、したがって、ＣＰＣ−ＨＡマトリックスからの薬剤放出率を制御し、カスタマイズするために使用される。詳細な調査（図２ａ）は、ＣＰＣ−ＨＡコーティングが、下部のＳＧ−ＨＡ薄層に密接に接触することを示している。したがって、本発明の重要な特徴は、プレコートしたＳＧ−ＨＡ薄膜が、ＣＰＣ−ＨＡコーティング内に室温析出したアパタイトの核生成と成長とのためのテンプレートとして作用することである。このような機構は、観察されたように、薄いＳＧ−ＨＡと厚いＣＰＣ−ＨＡの間の著しい密着結合の成長を可能にする。
【００３２】
図２ｂの、生じたＣＰＣ−ＨＡのＦＴＩＲスペクトルは、不十分な対象性のＰＯ４四面体による結晶構造の崩壊を示唆する。効率的に、生じたＣＰＣ−ＨＡは、非結晶であり、又は骨の無機化合物、即ちＣａ９（ＰＯ４）５−ｘ−ｙ（ＣＯ３）ｙ（ＨＰＯ４）ｘ（ＯＨ）１−ｙ／３として見出されるものと同様の、非常に細かく、不十分な結晶性の、非化学量論的な、容易に吸収可能なアパタイトである。ＣＰＣ−ＨＡは、約４５％の多孔性、及び平均約１６ｎｍの孔の大きさを有した。ＣＰＣ−ＨＡ内のナノ孔は、同様の寸法のカプセル化生体高分子を物理的に固定するため、ＣＰＣ−ＨＡマトリックスの溶解は（従来技術として開示されたように、単純な脱離及び浸出以上に）放出反応速度に対する要因となる。これは、ＣＰＣ−ＨＡミクロスフィア又はコーティングの吸収率の調整（結晶化度の調整）による等、薬剤／遺伝子制御放出の更なる様式を提供する。
【００３３】
出願人は、ここで、有機溶剤又は水に分散され得る、いかなる種類の薬剤又は生体高分子をカプセル化する能力を有する、活性ＣａＰミクロスフィアを実現するための新規に発見した手法を開示する。この手法は、リン酸カルシウムセメント（ＣＰＣ）スラリーの球状化と、それに続く析出ＨＡ層のインキュベーションとを組み合わせる（図３，４）。ＣＰＣ−ＨＡミクロスフィアは、自然（骨）のアパタイトと同様に、ＳＧ−ＨＡ基質上に成長した厚いＣＰＣ−ＨＡコーティングのために判定されたものと等しい、不十分な結晶性カルシウム欠乏アパタイトを有する。アパタイト顆粒のマイクロ構造（特定の結晶及びナノ−多孔性）は、焼結済みＨＡサブミクロン粉末のシード添加の濃度を調整することにより、調整され得る。大量のシードは、より細かい、生じたマイクロ構造をマトリックス層に生じる。出願人の研究所において、シード添加及び処理の要因の変更により、製造したＣＰＣ−ＨＡの（ａ）が結晶、（ｂ）が非結晶のマイクロ構造の例が図５に示される。本発明の重要な特徴は、ミクロスフィアが室温で形成され、また室温においてＣＰＣ−ＨＡ核生成及び成長され、薬剤又はタンパクなど、設計した有機物質がカプセル化されることである。
【００３４】
薬剤放出のより良い制御のために、ＢＭ−ＨＡの追加膜は、図３（段階４）、及び図６に示されたように、ミクロスフィアの表面に堆積され得る。出願人は、これまで、優れた品質のＢＭ−ＨＡが、溶液−析出を通じてハイドロキシアパタイト膜上に成長され得ることを示してきた。ＢＭ−ＨＡはＣＰＣ−ＨＡミクロスフィアの表面上に成長し得、最終的には持続的なカプセル化となり得る。
【００３５】
実施例
実施例１：ステレンス鋼上のＣＰＣ−ＨＡ／ＳＧ−ＨＡコーティング
ステレンス鋼金属基質（３１６Ｌ）は、近年発達したゾル−ゲル技術を使用することにより、０．６−０．８μｍのアパタイトの薄膜（ＳＧ−ＨＡ）を使用して、コートされた。特に、結晶化ハイドロキシアパタイトを作製するためのゾル−ゲル方法は、（ａ）リン前駆体（リン酸塩）を水ベースの媒質に加水分解する工程と、（ｂ）リン酸塩が、ハイドロキシアパタイト等、リン酸カルシウムゲルを取得するために加水分解された後に、カルシウム塩前駆体を媒質に添加する工程と、（ｃ）ディップコーティングを通じて基質上にゲルを堆積する工程と、及び（ｃ）結晶化ハイドロキシアパタイトを取得するために４００℃で２０分間、膜を焼成する工程を備える。リン酸カルシウム前駆体Ｃａ（ＯＨ）２とリン酸塩の第一リン酸カルシウム無水物とを含む無機コロイドスラリーが、エタノール内でボールミル粉砕される。二つの出発成分は、それぞれ、粒径０．３−２μｍと０．５−４μｍを有する。スラリーの開始Ｃａ／Ｐ比率は、１．５に保持される。溶解及び析出がこのシステムでアパタイトの成長のための主要な機構であるため、５重量％のサブミクロン、結晶ハイドロキシアパタイト粉末が、ＣＰＣ−ＨＡの不均一系核生成のためのシードとして使用される。薄膜ＳＧ−ＨＡ表面を修飾した試料は前駆体のエタノール懸濁液によりディップコートされた。単一ディップコーティング後に、約３０μｍ厚層の多孔性の前駆体粉末混合物が、エタノールの急速蒸発により基質上に成長した。前駆体スラリーのコロイドの性質によって、厚膜は、次の処理段階を受け入れるための十分に構造的完全性（強度及び硬度）に成長する。この段階により、膜は、膜の開口孔内に浸透が可能した、リン酸ナトリウムの水ベースの溶液（０．２５Ｍ）に露出され、次に３７℃、相対湿度１００％、２４時間インキュベータに置かれる。インキュベーション中、コロイド前駆体は、リン酸塩水溶液及び析出ＨＡと反応する。生じたＣＰＣ−ＨＡ厚膜のマイクロ構造は、図５ａに示される。ＡＳＴＭ  Ｃ−６３３標準に基づいて、コーティングに行われた付着強度試験は、ＳＧ−ＨＡ薄膜に対するＣＰＣ−ＨＡ厚膜の付着強度が６．１±１．２ＭＰａであることを示した（〜２０μｍ厚コーティングの６つの試料でテスト）。結合強度は，一般的に＜２ＭＰａの，文献に報告されたバルクＣＰＣ−ＨＡの引張り強さ以上である。破壊モードは、大部分のＳＧ−ＨＡ／ＣＰＣ−ＨＡ接触面において存在し、接触面が最も弱い接続領域であると示される。ＣＰＣ−ＨＡは、多孔性が約４５％、孔径が約１６ｎｍである。コートした試料の顕微鏡写真が図１ｂに示される。コーティングの接触面の顕微鏡写真が図２ａに、ＦＴＩＲスペクトルが図２ｂに示される。
実施例２：ステンレス鋼上のＣＰＣ−ＨＡコーティング
実施例１に記載したように、中間ＳＧ−ＨＡ膜の無いステンレス鋼金属基質（３１６Ｌ）がＣＰＣ−ＨＡによりコートされた。図１ａに示すように、ＨＡインキュベーション期間中、コーティングは自発的に基質から分離した。明らかに、ＣＰＣ−ＨＡコーティングは、金属基質に結合せず、即ち、付着強度は０ＭＰａであった。他のコーティングの属性、つまり相の容量と多孔性は、実施例１において取得されたものと同様である。
実施例３：ステレンス鋼上のＢＭ−ＨＡ／ＳＧ−ＨＡコーティング
実施例１に記載したように、ステンレス鋼金属基質（３１６Ｌ）が０．６−０．８μｍのアパタイトの薄層（ＳＧ−ＨＡ）でコートされた。試料の一つのグループは、結晶ＳＧ−ＨＡ（Ｃ）膜を実現するために、２０分間４００℃でアニ−ルされ、及び別のグループは、非結晶ＳＧ−ＨＡ（Ａ）膜を実現するために、６０分間３７５℃でアニ−ルされた。これらの膜はＢＭ−ＨＡ膜の析出のための核生成領域として使用された。ＳＧ−ＨＡコートした試料は、イオン組成（単位はｍｍｏｌ／ｌ）１４２Ｎａ＋，５．０Ｋ＋，２．５Ｃａ２＋，１．５Ｍｇ２＋，１０３Ｃｌ−，２５ＨＣＯ３−，１．４ＨＰＯ４２−，０．５ＳＯ４２−の“擬似体液”（ＳＢＦ）に浸透される。ＳＢＦは、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン及びＨＣｌを使用してｐＨ７．４に緩衝される。このｉｎ−ｖｉｔｒｏの定常的な堆積（堆積中にＳＢＦが交換されない）は、〜２４度において、図６で示したように、平面のＳＧ−ＨＡ基質上に適切な品質で、密度の高い３−５μｍのＢＭ−ＨＡ薄膜を製造した。図６ｂの、結晶ＳＧ−ＨＡ（Ｃ）膜は、密度の高いＢＭ−ＨＡを使用してコートされるが、図６ａの、非結晶ＳＧ−ＨＡ（Ａ）膜は、多孔性のＢＭ−ＨＡを使用してコートされる。下部のＳＧ−ＨＡ表面修飾膜の属性は、核生成し及び堆積した上部のＢＭ−ＨＡ膜の多孔性等、様々な属性が使用され得る。
実施例４：薬剤カプセル化を伴うＣＰＣ−ＨＡ／ＳＧ−ＨＡコーティング
ステンレス鋼金属基質（３１６Ｌ）は、実施例１に記載したように、ＣＰＣ−ＨＡ／ＳＧ−ＨＡコーティングによりコートされた。制御した薬剤放出のためにＣＰＣ−ＨＡの使用の可能性の実現のために、ＣＰＣ−ＨＡ前駆体の固定相の容量の５％の量により、アメトプテリン（シグマ  ケミカルズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）米国）が採用された。ディップコーティングが実行される前に、薬剤は前駆体のコロイド懸濁液を使用して混合された。インキュベーションなど、他の全ての処理は、実施例１と同様に実行された。インキュベーション期間中に、２０μｍ厚さＣＰＣ−ＨＡコーティングは、カプセル化した薬剤分子を、結晶化ＨＡのナノ孔内に析出した。カプセル化後に、（ＣＰＣコーティング重量）／（ＰＢＳの容量）が一定比率の１ｍｇ／ｍｌによる２０ｍｌのリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）内へ基質を浸透することにより、薬剤放出の研究は実施された。ハイドロゲル膜にコートされた標準試料は、更に薬剤放出反応速度のための試験をされた。ハイドロゲル膜は、３％ポリビニルアルコールを含む重合溶液内に、薬剤を含むＣＰＣ−ＨＡ層の滴下により作製される。乾燥後、追加ハイドロゲルコーティングによるＣＰＣ−ＨＡ層の〜２０ｍｇの重量増加は、対応する約２．５％のＣＰＣ−ＨＡマトリックス内の重合体膜の容量、〜０．５ｍｇであった。放出した薬剤を伴うＰＢＳ溶液の試料は、定期的に除去され（即ち完全に液体が空にされた）、同量の２０ｍｌのＰＢＳにより補充された。上清内の薬剤濃度は、ＵＶ−可視分光法経由で判定された。図７は、両方種類のＣＰＣ−ＨＡの薬剤充填に対する、３日間の間の薬剤放出反応速度を示している。バースト効果が、約８時間の初期期間を通じて両方のコーティングに検出され、徐放は、ハイドロゲルを使用したコート後の試料において明白である。線形関係が、放出薬剤量及び８時間以上の放出時間に対する平方根との間で取得される。８〜６０時間の持続的放出期間が拡散のフィックの法則により上手く記載される。放出反応速度は、コート後のヒドロゲル薄膜の存在により、修正され、薬剤分子の拡散率の減少を示唆する。急性又は重度の炎症反応を防ぐために、抗炎症剤が移植装置に組入れられ場合、バースト効果は整形外科／歯科手術後の早期に時期に利点を提供し得る。
【００３６】
実施例５：ＣＰＣ−ＨＡミクロスフィア
Ｃａ（ＯＨ）２及び第一リン酸カルシウム無水物を含む無機コロイドスラリーは、Ｃａ／Ｐ率＝１．５で、エタノールによるボールミル粉砕される（方法のこの段階は実施例１で記載した、ＣＰＣ−ＨＡコーティング処理と同様）。溶解及び析出がこのシステムのアパタイトの成長のために重要な機構のため、少量（２重量％）の結晶ＨＡ粉末がＨＡの不均一核生成のためのシードとして添加される。アパタイト顆粒のマイクロ構造、より詳細にはナノ−多孔性は、１−１０重量％の範囲のシード添加ＨＡの焼結済みサブミクロン粉末の濃度を調整することにより調整される。大量のシードにより、より細かいＣＰＣ−ＨＡマトリックス相の生じたマイクロ構造となる。スラリーは図３ａに示すようにエタノールの急速乾燥によって、球体を製造するために、細分化され、噴霧乾燥される。ミクロスフィアの大きさの狭い分布は、平均粒径の大きさを直径１０−１０００μｍの範囲に実現可能であり、噴霧要因（噴霧圧、スラリーの粘性及び濃度）の変化により実現され得る。薬剤など、あらゆる補助的な添加物は、実施例４と同様に、更に図３ｂに概略が示される、この処理の段階において、球体の孔に取り込まれる。前駆体のゾルの性質は、比較的強固な結合が気流乾燥した前駆体ミクロスフィア内に成長することを可能にする（段階１，図３ｂ）。続いて、ミクロスフィアは、リン酸ナトリウム水ベースの溶液（０．２５Ｍ）に露出され、３７℃、相対湿度１００％のインキュベータに２４時間置かれる（段階２）。不十分な結晶、カルシウム欠乏アパタイト構造は、コーティングに対して上記したように、自然に発生したアパタイトと同様に、この処理により、ミクロスフィア内に成長する（段階３）。不十分な結晶、カルシウム欠乏アパタイト構造は、自然に発生したアパタイト（即ち、骨）と同様に、この処理により、ミクロスフィア内に成長する。段階３の石化処理は、リン酸ナトリウム溶液に露出した膜によるＣａ（ＯＨ）２及びＣａ（ＨＰＯ４）２間の相互作用の結果として表現され得る。
【００３７】
３Ｃａ（ＨＰＯ４）２＋６Ｃａ（ＯＨ）２→Ｃａ９（ＰＯ４）５（ＨＰＯ４）（ＯＨ）生じた小さい（〜２０μｍ）及び大きな（〜３００μｍ）ミクロスフィアのマイクロ構造は図５に示された。図３ｂに示された処理の最終第４段階により、ＢＭ−ＨＡの密度の高い、薄膜が、持続カプセル化機能のための多孔性のＨＡマクロフィアの表面に堆積され得る。これを実現するために、ナノ孔内にカプセル化した薬剤を伴うＨＡ−ＣＰＣ球体は、例３の記載と同様に、擬似体液内に浸透された。
【００３８】
当業者が、開示した権利により、本発明の精神と範囲から離れることなく本発明の実施に際して、多くの変形及び改変が可能であることが推定されるため、したがって本発明の範囲は、添付した請求項による本質的な定義に基づき解釈され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１ａ】ＳＧ−ＨＡコーティング中間層を備えないときの金属基質上のＣＰＣ−ＨＡコーティングを示す顕微鏡写真。
【図１ｂ】ＳＧ−ＨＡコーティング中間層を備える金属基質上のＣＰＣ−ＨＡコーティングを示す顕微鏡写真。
【図２ａ】ＣＰＣ−ＨＡ／ＳＧ−ＨＡコーティングシステムの断面図。
【図２ｂ】ＣＰＣ−ＨＡ／ＳＧ−ＨＡコーティングシステムのＦＴＩＲスペクトル。
【図３ａ】薬剤カプセル化のためのＣＰＣミクロスフィアのための噴霧乾燥システムの概略図。
【図３ｂ】ＣＰＣ−ＨＡミクロスフィア処理の４つの工程を示す概念図。
【図４ａ】〜２０μｍの大きさのＣＰＣ−ＨＡミクロスフィアを示すＳＥＭ顕微鏡写真。
【図４ｂ】〜３００μｍの大きさのＣＰＣ−ＨＡミクロスフィアを示すＳＥＭ顕微鏡写真。
【図５ａ】結晶ＣＰＣ−ＨＡマイクロ構造。
【図５ｂ】非結晶ＣＰＣ−ＨＡマイクロ構造。
【図６ａ】低結晶性のＳＧ−ＨＡ基質上への、リン酸カルシウム相（ＣＰＬ）としての、生体模倣ハイドロキシアパタイト（ＢＭ−ＨＡ）膜の堆積を示すＳＥＭ顕微鏡写真。
【図６ｂ】高結晶性のＳＧ−ＨＡ基質上への、リン酸カルシウム相（ＣＰＬ）としての、生体模倣ハイドロキシアパタイト（ＢＭ−ＨＡ）膜の堆積を示すＳＥＭ顕微鏡写真。
【図７】カプセル化した薬剤の５％アメトプテリンのＨＡ−ＣＰＣコーティングに対する放出％と放出時間（時間）のプロットを示すグラフ。
【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年2月5日(2003.2.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸カルシウム相を作製するための方法であって、
（ａ）第一リン酸カルシウムＣａ（Ｈ２ＰＯ４）２と、水酸カルシウムＣａ（ＯＨ）２前駆体とを、実質的に無水の媒質において、均一に分散することにより前駆体のペースト或いは粘性スラリーを形成する工程と、
（ｂ）前記前駆体スラリーを乾燥させる工程と、
（ｃ）前記スラリーに水ベースのリン酸イオン溶液を混合することにより、混合物を製造する工程と、
（ｄ）生じた混合物を温度が２０〜５０℃の湿潤な環境においてインキュベートすることにより、前駆体を溶解し、リン酸カルシウム相を析出する工程とを備える方法。
【請求項２】
前記リン酸カルシウム相は、ハイドロキシアパタイトである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記前駆物質の混合物のＣａ／Ｐ原子比率は、１．２−１．６７の範囲にあり、及び前記混合物は、３０−７０体積％の固体濃度である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記実質的に無水の媒質は、アルコールである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記アルコールは、エチルアルコール、メチルアルコール、又はプロピルアルコールである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記水ベースのリン酸イオン溶液はリン酸ナトリウムであり、及び湿潤な環境は、相対湿度が５０％〜１００％である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記前駆体スラリーは、規定の形状に乾燥される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記形状は、錠剤、コーティング、ミクロスフィア、又は歯孔、若しくは骨孔の充填剤である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
結晶ハイドロキシアパタイト粉末は、前記前駆体スラリーを添加されることにより、前記インキュベーション期間中に、ハイドロキシアパタイトリン酸カルシウム相の結晶化を促進する請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
治療用活性物質は、前記インキュベーション期間の、前記ハイドロキシアパタイトリン酸カルシウム相の結晶化中に、カプセル化のために、前記前駆物質スラリーに添加される請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記治療用活性物質は、薬剤、プロテイン、遺伝子、又はＤＮＡである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前駆体の前記スラリーは、リン酸カルシウム基質の表面に堆積され、及び乾燥される請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記リン酸カルシウム基質は、ゾル−ゲル処理を使用し金属基質に堆積したハイドロキシアパタイトコーティングの薄膜である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記析出後のリン酸カルシウム相は、Ｃａ２＋及びＰＯ４３−イオンの過飽和溶液に露出されることにより、生体模倣ハイドロキシアパタイト膜のコーティングを、前記析出後のリン酸カルシウム相上に設ける請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記析出後のリン酸カルシウム相は、Ｃａ２＋及びＰＯ４３−イオンの過飽和溶液に露出されることにより、生体模倣ハイドロキシアパタイト膜のコーティングを、前記析出後のリン酸カルシウム相上に設ける請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前駆体の前記スラリーは、細分化され、且つ噴霧乾燥されることにより、前記前駆体のミクロスフィアを取得する請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前駆体の前記スラリーは、細分化され、且つ噴霧乾燥されることにより、前記前駆体のミクロスフィアを取得する請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記前駆体の前記ミクロスフィアは、水ベースのリン酸イオン溶液に露出され、温度が２０−５０℃の湿潤な環境においてインキュベートされることにより、前記前駆体の溶解と、リン酸カルシウム相の析出とを促進する請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記前駆体の前記ミクロスフィアは、水ベースのリン酸イオン溶液に露出され、温度が２０−５０℃の湿潤な環境においてインキュベートされることにより、前記前駆体の溶解と、リン酸カルシウム相の析出とを促進する請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記析出後のリン酸カルシウム相を含む前記ミクロスフィアコーティングは、Ｃａ２＋及びＰＯ４３−イオンの過飽和溶液に露出されることにより、生体模倣ハイドロキシアパタイト膜のコーティングを、前記析出後のリン酸カルシウム相上に設ける請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記析出後のリン酸カルシウム相を含む前記ミクロスフィアコーティングは、Ｃａ２＋及びＰＯ４３−イオンの過飽和溶液に露出されることにより、生体模倣ハイドロキシアパタイト膜のコーティングを、前記析出後のリン酸カルシウム相上に設ける請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記析出後のリン酸カルシウム相は、重合体溶液に露出されることにより、重合体の膜を、前記ミクロスフィア表面上に形成する請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記析出後のリン酸カルシウム相は、重合体溶液に露出されることにより、重合体の膜を、前記ミクロスフィア表面上に形成する請求項１０に記載の方法。
【請求項２４】
前記析出後のリン酸カルシウム相は、重合体溶液に露出されることにより、重合体の膜を、前記ミクロスフィア表面上に形成する請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記析出後のリン酸カルシウム相は、重合体溶液に露出されることにより、重合体の膜を、前記ミクロスフィア表面上に形成する請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記重合体は、生分解性重合体である請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記重合体は、ポリビニルアルコールである請求項２２に記載の方法。
【国際調査報告】
2004530675.tif 000040
2004530675.tif 000041
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