(57)【要約】植物及び動物を冒す伝染病、疾病及び寄生虫の増殖を防止する際の殺虫剤及び抗寄生虫組成物。組成物には微生物或いは化学化合物から得た少なくとも１種のキチン分解剤又はキチン分解活性誘導剤及び硫黄又は硫黄誘導剤が含まれ、微生物或いは化学化合物から得た少なくとも１種のキチン分解剤又はキチン分解活性誘導剤及び硫黄又は硫黄誘導剤は上記化合物は個々に適用するより同時に適用したほうが顕著に低い量範囲で効果的増殖防止を達成する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種のキチン分解剤又はキチン分解活性誘導剤と、硫化物又は硫化物産生剤とを含む、農業上及び獣医学上の使用のための組成物。
【請求項２】
前記キチン分解剤が、キチナーゼである、請求項１の組成物。
【請求項３】
前記キチン分解剤が、キチナーゼ産生剤である、請求項１の組成物。
【請求項４】
前記微生物を、組成物グラム当たり１０７〜１０１２コロニー形成単位（ＣＦＵ）含有する、請求項３の組成物。
【請求項５】
前記キチン分解性活性誘導剤が、キチンである、請求項１の組成物。
【請求項６】
前記キチンが、１〜５０％の範囲にある、請求項５の組成物。
【請求項７】
前記硫化物産生剤が、微生物である、請求項１の組成物。
【請求項８】
前記微生物を、組成物グラム当たり１０７〜１０１２コロニー形成単位（ＣＦＵ）含有する、請求項７の組成物。
【請求項９】
前記硫化物産生剤が、化学薬剤である、請求項１の組成物。
【請求項１０】
当該硫化物生産が、組成物グラム当たり０．１ｍｇ／分から１．０ｍｇ／分の範囲である、請求項１の組成物。
【請求項１１】
前記キチン分解剤及び硫化物産生剤が、微生物である、請求項１の組成物。
【請求項１２】
動物寄生線虫の防除用の、請求項１から１１記載の組成物。
【請求項１３】
前記動物寄生線虫が、Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ種、Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ種、及びＤｉｃｔｉｏｃａｌｕｓ種である、請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
植物寄生線虫の防除用である、請求項１から１１記載の組成物。
【請求項１５】
前記植物寄生線虫が、Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ種及びＲａｄｏｐｈｏｌｕｓ  ｓｉｍｉｌｉｓである、請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
植物及び動物の病原性細菌の防除用である、請求項１から１１記載の組成物。
【請求項１７】
前記病原性細菌が、Ｅｒｗｉｎｉａ種及びＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ種である、請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
植物及び動物の病原性真菌類の防除用である、請求項１から１１記載の組成物。
【請求項１９】
前記病原性真菌が、Ｐｅｓｔａｌｏｔｉａ  ｐａｌｍａｒｕｍ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｔａｂａｃｉｎａ及びＳａｒｏｃｌａｄｉｕｍ  ｏｒｉｚａｅである、請求項１８記載の組成物。
【請求項２０】
寄生吸虫の防除用である、請求項１から１１記載の組成物。
【請求項２１】
前記寄生吸虫が、Ｆａｓｃｉｏｌａ  ｈｅｐａｔｉｃａである、請求項２０記載の組成物。
【請求項２２】
肥料、プレパック土壌、種子被覆手段、粉末、顆粒、噴霧液、懸濁液、液体、又はこれらいずれかの、寄生の蠕虫、細菌及び病原性真菌の防除用のカプセル化製剤、といった適当な担体を含む、前記各請求項記載の農業上及び／又は獣医学上の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の組成物は、植物寄生線虫及び動物寄生線虫、真菌性及び細菌性の数種の病気、並びに寄生吸虫類（Ｆａｓｃｉｏｌａ  ｈｅｐａｔｉｃａ）の防除に有用な、数種の相乗作用を有する殺虫用及び駆虫用の組成物である。
【背景技術】
【０００２】
線虫は、世界的規模で、熱帯、亜熱帯及び温帯地域において農業に大きな損害をもたらしている原因である（Ｎｉｃｋｌｅ  Ｗ．Ｒ．（編者）．１９９１．Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｎｅｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．Ｐｕｂ．１０３５ｐｐ）。プランタンのみで、世界総生産の約２０％が線虫関連損失であり、毎年１７８百万ドルの損害がある（Ｓａｓｓｅｒ  Ｊ．Ｎ．ａｎｄ  Ｆｒｅｃｋｍａｎ  Ｄ．Ｗ．１９８７．線虫についての世界的展望（Ａ  ｗｏｒｌｄ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｎ  ｎｅｍａｔｏｌｏｇｙ）：当協会の役割（ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｏｃｉｅｔｙ）．線虫に関する展望（Ｖｉｓｔａｓ  ｏｎ  ｎｅｍａｔｏｌｏｇｙ）：ａ  ｃｏｍｍｅｍｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｗｅｎｔｙ−ｆｉｆｔｈ  ａｎｉｖｅｒｓａｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｍａｔｏｌｏｇｉｓｔｓ／ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｊｏｓｅｐｈ  Ａ．Ｖｅｅｃｈ  ａｎｄ  Ｄｏｎａｌｄ  Ｗ．Ｄｉｃｋｓｏｎ．ｐ７〜１４）。プランタン及びバナナ農園は、顕著にＲａｄｏｐｈｏｌｕｓ  ｓｉｍｉｌｉｓによって影響を受ける。
【０００３】
Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ種は、最も重要な植物寄生線虫で、その活動によって、殆ど全ての熱帯で、収穫の１１％から２５％の損失が発生している（Ｓａｓｓｅｒ  Ｊ．Ｎ．１９７９．Ｒｏｏｔ−ｋｎｏｔ  ｎｅｍａｔｏｄｅｓ．Ｅｄ．Ｆ．Ｌａｍｂｅｒｔｉ  ＆  Ｃ．Ｅ．Ｔａｙｌｏｒ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐ３５９）。このため、これら寄生虫の防除に対して、大きな要求があるものの、過去において、これら寄生虫に対しては、化学的な殺線虫剤を適用してきた経緯がある。当該化合物は非常に効果的であるが、それらの多くは、環境に多大な危険をもたらす。あるケースにおいて、規制当局は、当該化合物の利用に際して、その量若しくは頻度又はそれら両方を制限しているが、それによって、それらの殺線虫効果は、不十分なものとなっている。
【０００４】
線虫防除は、未だ、不十分である。化学的な殺線虫剤の使用は、それらが高い毒性を持ち、しかも広範囲に作用する化合物であることから、日毎に制限されている。その結果、化学的殺虫剤の削減を選択しながらも、線虫による被害を排除する効果的な方法を、見出すための努力がなされてきた。当該取り組みの１つとしては、化学的な殺線虫剤に代え、特異的な作用様式と比較的安全な毒理学的側面を持つ生物的な殺線虫剤の使用がある。当該代替殺線虫剤としては、ＡＢＧ−９００８、Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ  ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ真菌代謝物、及びエバーメクチン（又はミルベシンのような関連化合物）と脂肪酸の組合せ（Ａｂｅｒｃｒｏｍｂｉｅ  Ｋ．Ｄ．１９９４．相乗的殺虫組成物（Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）．米国特許第５３４６６９８号。Ｍｙｃｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｓｅｐｔ．１３）がある。同様に、線虫類、場所、土壌又は種子により植物にもたらされる被害をなくすための同時投与を含む方法であって、ａ）Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ  ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ真菌類代謝物と、ｂ）化学殺虫剤、及びこの場合に有効な相乗的な殺線虫効果を有する組成物の処方を必要とする方法が特許で請求されている（Ｗａｒｒｉｏｒ  Ｐ．Ｈｅｉｍａｎ  Ｄ．Ｆ．ａｎｄ  Ｒｅｈｂｅｒｇｅｒ  Ｌｉｎｄａ  Ａ．１９９６．相乗効果的な殺線虫組成物。Ａｂｂｏｔｔ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．国際特許９６３４５２９、１９９６−１１−０７）。他の取り組みとしては、線虫寄生細菌のＰａｓｔｅｕｒｉａ  ｐｅｎｅｔｒａｎｓの胞子と有機リン化殺線虫剤の組合せがある（Ｎｏｒｄｍｅｙｅｒ  Ｄ．１９８７．Ｐａｓｔｅｕｒｉａ  ｐｅｎｅｔｒａｎｓ胞子及び有機リン殺線虫剤の相乗効果的殺線虫組成物。１９８７．  ＣＩＢＡ−ＧＥＩＧＹ  ＡＧの豪州特許ＡＵ０６０５７３８６Ａ１．０１／２９／１９８７）。
【０００５】
しかしながら、工業スケールでのＰ．ｐｅｎｅｔｒａｎｓ胞子の調製は、当該生物が絶対寄生細菌であるという問題に直面する。従って、その寄生細菌は、線虫が寄生した根源消化物から単離したもとの線虫中で生育させねばならない。
【０００６】
線虫の生育環境を共用するキチン分解性の真菌及び細菌は、ある種の生物的均衝を保ち、何らかの形で、線虫の増殖を制限することができる。キチン分解性細菌の２菌株（Ｔｏｄａ  Ｔ．ａｎｄ  Ｍａｔｓｕｄａ  Ｈ．１９９３．抗菌性、抗線虫性及び／又は植物細胞活性化組成物及びその物を生産するキチン分解性微生物。Ｔｏｄａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｊａｐａｎ．米国特許第５２０８１５９号、０５／０４／１９９３）が、抗菌性、抗線虫性及び／又は植物細胞活性化組成物として請求されている。
【０００７】
線虫に対するキチン分解性効果の幾つかの例がある。最も顕著なものとしては、真菌及び線虫中でキチンを分解することができる酵素であるキチナーゼをコードするＤＮＡを導入して作られた、新しい細菌株がある（Ｓｕｓｌｏｗ  Ｔ．ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ  Ｄ．Ｇ．１９９４．新規キチナーゼ生産細菌及び植物。ＤＮＡ  Ｐｌａｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，米国特許第０４９４０８４０号、０７／１０／１９９０）。当該菌株は、植物病原体を阻害するキチナーゼの生産に有効である。キチナーゼをコードするＤＮＡを導入した結果、病原体に抵抗性の新規植物も記載されている。
【０００８】
他の微生物の例としては、自然な条件で、植物を攻撃する線虫を減少させる微生物が記載されている。
【０００９】
Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｋａｂａｎａ等（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ−Ｋａｂａｔａ  Ｒ．，Ｊｏｒｄａｎ  Ｊ．Ｗ．，Ｈｏｌｌｉｓ  Ｊ．Ｐ．１９６５．Ｎｅｍａｔｏｄｅｓ：稲田における生物的調節−硫化水素の役割。Ｓｃｉｅｎｃｅ．１４８：５２４〜２６）、並びにＨｏｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ−Ｋａｂａｎａ
2004522727.tif 000002
は、細菌のＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓと、硫化水素の生産と、植物寄生線虫との間で対応関係を観測し、植物寄生線虫の数は、ルイジアナの稲農場では減少していた。硫化物は、ある種の土壌細菌により生産される他の代謝物と同じく好気性生物の電子伝達呼吸経路での阻害剤である
2004522727.tif 000003
【００１０】
ＢＩＯＡＣＴ又はＮｅｍａｃｈｅｋとしても知られているＰＡＥＣＩＬ（登録商標）は、土壌及び種子の処理のために、乾燥して安定化した胞子濃縮物である、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｌａｃｉｎｕｓ由来の特許された菌株を含有する生物的な殺線虫剤である。本真菌種は、一般的に世界中の土壌中に見出される。ＰＡＥＣＩＬ（登録商標）活性成分として用いられる特許された菌種は、特に、植物寄生線虫に対し効き目がある。それは、当初、Ｔｈｅ  Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙで単離され、オーストラリアのＭａｃｑｕａｒｉｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙで発展したものである。更に、ＰＡＥＣＩＬ（登録商標）は、オーストラリア、フィリピン、南アフリカ及び他の国の主たる農作物を冒す様々な線虫の防除について広く試験されてきた。ＰＡＥＣＩＬ（登録商標）製剤は、フィリピンではＢＩＯＡＣＴ（商標）、南アフリカではＰＬ  ＰＬＵＳ、インドネシアではＰＡＥＣＩＬ（登録商標）の名前で登録された殺虫剤として市販されている。最近、オーストラリア国立登録局（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）は、当該製品を殺虫剤として評価している（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｒ．ＰＡＥＣＩＬ（登録商標）．１９９８．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｃｏｒｐ．ｃｏｍ．ａｕ／ａｒｔｉｃｌｅ  １．ｈｔｍ）。上記の例は、全ての寄生蠕虫の問題を解決してはいない。従って、依然として、化学的な殺虫剤や抗寄生虫製品に代わる、寄生虫の防除方法を改良した方法に対する要求がある。
【００１１】
吸虫は、動物生産物やヒトの健康に対し、顕著な経済損失をもたらす。当該種の多様性、比較的穏やかな病原性、及び孤立した地域の風土病であることが、吸虫に関する知識の欠如をもたらす主な原因になっているようである。一般的には、腸に寄生する吸虫は、人畜共通であり、各種において多数の保虫宿主を持っている。
【００１２】
経済的に言うと、最も重要な吸虫の１つは、最初に知られた寄生吸虫であるＦａｓｃｉｏｌａ  ｈｅｐａｔｉｃａであり、それは胆汁導管に住み着いてヒトを冒す。その卵は蠕虫から得られる、卵形で有蓋の最も大きな卵の１つで、胃のジセプシア（ｄｉｓｅｐｓｉａ）における消化器機能不全、結腸運動機能不全、肝臓と胆汁小胞の痛み、熱及び肝仙痛を起こす。他の徴候としては、肺、眼、脳、肝臓血管及び他の組織における嚢胞形成がある（Ｓａｌｅｈａ  Ａ．１９９１．肝臓吸虫病疫学、経済的影響及び公共衛生の重要性（Ｌｉｖｅｒ  ｆｌｕｋｅ  ｄｉｓｅａｓｅ（ｆａｓｉｏｌｏｓｉｓ）ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，ｅｃｏｍｏｎｉｃ  ｉｍｐａｃｔ  ａｎｄ  ｐｕｂｌｉｃ  ｈｅａｌｔｈ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ）．Ｓｏｕｔｈｅａｓｔ  Ａｓｉａｎ  Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  ｈｅａｌｔｈ  ２２  ｓｕｐｐ  １ｄｉｃ．Ｐ３１６〜４）。
【００１３】
人畜共通罹患性蠕虫は、羊及び牛にとって重要な病害虫となっている。抗蠕虫剤抵抗性は広く、特に、小型の反芻動物に寄生する線虫の群で顕著である。
【００１４】
新たな補助的技術が開発されているが、他の技術は研究中である。真菌のＤｕｄｄｉｎｇｔｏｎｉａ  ｆｌａｇｒａｎｓは、ネットを形成し、広範囲に壁やじっとして動かない胞子、即ち、牛、馬、羊及び豚の腸管経路に対しても耐え得る、クラミドスポア（ｃｌａｍｉｄｏｓｐｏｒｅｓ）を作る捕食菌である（Ｌａｒｓｅｎ  Ｍ．１９９９．蠕虫の生物的防除（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｈｅｌｍｉｎｔｈｓ）．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．Ｊａｎ；２９（１）：１３９〜４６、ａｎｄ  Ｌａｒｓｅｎ，Ｍ．２０００．捕食性ミクロ真菌による動物寄生線虫の防除への展望（Ｐｒｏｓｐｅｃｔ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ａｎｉｍａｌ  ｐａｒａｓｉｔｉｃ  ｎｅｍａｔｏｄｅｓ  ｂｙ  ｐｒｅｄａｃｉｏｕｓ  ｍｉｃｒｏ  ｆｕｎｇｉ）．Ｐａｒａｓｉｔｏｇｙ，１２０，Ｓ１２０〜Ｓ１２１）。
【００１５】
フランス、オーストラリア、米国及びメキシコにおけるＤ．ｆｌａｇｒａｎｓについての研究では、この真菌が生物性防除の強い可能性を有することを確認した。
【００１６】
他の多くの重要な羊生産国と同様に、南アフリカも、抗駆虫剤抵抗性に関し、特に羊及びヤギにおける胃腸に寄生する線虫において、重大な問題を抱えている。重要な寄生蠕虫が、この現象に関与している；しかしながら、これは反芻動物の第四胃に寄生する吸血性ファージであるＨａｅｍｏｎｃｈｕｓ  ｃｏｎｔｏｒｔｕｓに関する特殊な問題を起こす。この研究は、南アフリカの最も重要な羊生産地域から得られたこの寄生菌株の９０％以上は、南アフリカ市場で入手できる４駆虫剤群の３群において、様々な薬剤抵抗性を示すことを指摘している。北部地方の如く、通常放牧している地域でさえ、１９９３年に研究された５つの群で検出された（ｖａｎ  Ｗｙｋ  Ｊ．Ａ．，Ｂａｔｈ  Ｇ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｌａｎ  Ｆ．Ｓ．２０００．南アフリカにおける反芻性動物の線虫寄生を防除する代替法に関する必要性。Ｗｏｒｌｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆａｏ．ｏｒｇ／ａｑ／ＡＧＡ／ＡＧＡＰ／ＦＲＧ／ＦＥＥＤｂａｃｋ／Ｗａｒ／ｃｎｔｅｎｔｓ．ｈｔｍ）。
【００１７】
この菌株は、他の地方でも同様に見られたので、耐性株の増大は、深刻な問題になっている。一連の駆虫剤研究が最近ラテンアメリカの４カ国で実施された：アルゼンチン（Ｅｄｄｉ，Ｃ．，Ｃａｒａｃｏｓｔａｎｔｏｇｏｌｏ，Ｊ．，Ｐｅｙａ，Ｍ．，Ｓｃｈａｐｉｒｏ，Ｊ．，Ｍａｒａｎｇｕｎｉｃｈ，Ｌ．，Ｗａｌｌｅｒ，Ｐ．Ｊ．＆Ｈａｎｓｅｎ，Ｊ．Ｗ．１９９６．南ラテンアメリカにおける羊の寄生線虫での駆虫剤抵抗性の流行：アルゼンチン．Ｖｅｔ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，６２：１８９〜１９７）；ブラジル（Ｅｃｈｅｖａｒｒｉａ  Ｆ．，Ｂｏｒｂａ  Ｍ．Ｆ．Ｓ．，Ｐｉｎｈｅｉｒｏ  Ａ．Ｃ．，Ｗａｌｌｅｒ  Ｐ．Ｊ．＆Ｈａｎｓｅｎ  Ｊ．Ｗ．１９９６．南ラテンアメリカにおける羊の寄生線虫での駆虫剤抵抗性の流行：ブラジル．Ｖｅｔ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，６２：１９９〜２０６）；パラグアイ（Ｍａｃｉｅｌ  Ｓ．，Ｇｉｍｉｎｅｚ  Ａ．Ｍ．，Ｇａｏｎａ，Ｃ．，Ｗａｌｌｅｒ  Ｐ．Ｊ．＆  Ｈａｎｓｅｎ  Ｊ．Ｗ．１９９６．南ラテンアメリカにおける羊の寄生線虫における駆虫剤抵抗性の流行：パラグアイ．Ｖｅｔ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，６２：２０７〜２１２）；及びウルグアイ（Ｎａｒｉ  Ａ．，Ｓａｌｌｅｓ  Ｊ．，Ｇｉｌ  Ａ．，Ｗａｌｌｅｒ  Ｐ．Ｊ．＆  Ｈａｎｓｅｎ  Ｊ．Ｗ．１９９６．南ラテンアメリカにおける羊の寄生線虫における駆虫剤抵抗性の流行：ウルグアイ。Ｖｅｔ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，６２：２１３〜２２２）。
【００１８】
牛に重大な損傷をもたらす線虫の１つは、性的に成熟して成虫になると、牛、特に若い牛の肺に住み着く線虫である、Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ  ｖｉｖｉｐａｒｏｕｓである。発生する疾病は、寄生虫性気管支炎又は牛肺吸虫症（Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｏｓｉｓ）として知られており、侵襲は、牧草地に存在するｔｈｅ３を摂取したり、牧草地に存在する幼虫が寄生した後に生じる。治療には駆虫剤を必要とするが（Ｂｏｒｇｓｔｅｅｄｅ  Ｆ．Ｈ．Ｍ．，ｄｅ  Ｌｅｅｕｗ  Ｗ．Ａ．＆  Ｂｕｒｇ  Ｗ．Ｐ．Ｊ．１９８８．仔牛におけるＤｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ  ｖｉｖｉｐａｒｕｓによる感染を防ぐための４種の異なる持続性大丸薬の効き目の比較。Ｔｈｅ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ，Ｖｏｌ  １０，Ｎｏ．３）、それは、薬剤抵抗性の新株を生じるという犠牲を伴い、そのことは、更に寄生された動物の治療をより難しくする。これらの製品の高価格は、多数の畜産物を抱える国にとって制限的な要因であり、しかも有害な生態系への影響は、これらの製剤を使用することで生み出される。
【００１９】
駆虫剤抵抗性に関する国際的な問題は、化学的治療法が寄生虫防除の基礎であり続ける一方で、少なくとも次の１０年間に、新規で化学的に類似しない駆虫剤が出現することを殆ど期待できないという事実によって、いっそう大きくなっている（Ｓｏｌｌ，Ｍ．Ｄ．１９９７．産業展望からの駆虫剤治療の将来。Ｉｎ  Ｊ．Ａ．ｖａｎ  Ｗｙｋ  ＆  Ｐ．Ｃ．ｖａｎ  Ｓｃｈａｌｋｗｙｋ，ｅｄｓ．内部寄生虫における駆虫剤抵抗性の管理。ｐ１〜５．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  １６ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，Ｓｕｎ  Ｃｉｔｙ，Ｓｏｕｔｈ  Ａｆｒｉｃａ，１０〜１５  Ａｕｇｕｓｔ  １９９７）。
【００２０】
細菌及び病原性真菌の場合、生物学的薬剤についての膨大な報告があり、その作用は主に拮抗作用に基づいており、多数の薬剤が市場で入手できる。それら薬剤を挙げると、Ｃｏｎｑｕｅｒ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｏｌａｓｓｉｉに拮抗するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、Ｇａｌｌｔｒｏｌ−Ａ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを防除するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、Ｂｉｏ−Ｆｕｎｇｕｓ（以下の真菌を防除するＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種：Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ，Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ，Ｐｈｙｔｈｉｕｍ種，Ｆｕｓａｒｉｕｍ，Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）、Ａｓｐｉｒｅ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ種．及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ種．を防除するＣａｎｄｉｄａ  ｏｌｅｏｐｈｉｌａ  Ｉ−１８２）などがある。
【００２１】
最も広く活性な生物学的殺真菌剤の１つは、真菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種であり（Ｃｈｅｔ  Ｉ，Ｉｎｂａｒ  Ｊ．１９９４  病原性真菌の生物的防除、Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ；４８（１）：３７〜４３）、その機構について詳しく検討され、宿主真菌の細胞壁を分解するキチナーゼが関与している事が分かった。しかも、真菌病の生物学的制御剤として使用される真菌及び細菌のキチン分解作用に関する実験的証明がなされている（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ  Ａ，Ｃｈｅｔ  Ｉ．１９９９．生物的防除におけるキチナーゼ。ＥＸＳ；８７：１７１〜８４）。しかしながら、これは植物に寄生する真菌に対する細菌作用の唯一の方法ではなく、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＣＨＡ０菌株の特殊な場合においては、根源たる病原性真菌を阻害する青酸のような二次的代謝物の生産に基づく他の防止法もある（Ｂｌｕｍｅｒ  Ｃ．ａｎｄ  Ｈａａｓ  Ｄ．２０００．細菌性シアン化物生合成の機構、制御及び生態的役割。Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍａｒ；１７３（３）：１７０〜７）。
【００２２】
細菌−細菌相互作用の分析により、抗生作用、基質競合及び寄生という、３つの主なタイプがあることが示された。抗生作用の場合、幾つかの細菌株において、周囲に存在する細菌の活性を抑制するために抗生物質を放出することが知られており、それを病原性種の生物学的防除に利用することができる。同じように、適切な生物制御をする微生物は、鉄伝達微量元素消去剤を合成することができ、それが培地中の微量元素欠乏、特に鉄欠乏を起こして各病原体の発育を阻害するので、基質競合は適切な生物学的な制御を達成するためにより一層使用することができる機構である。（Ｏｎｇｅｎａ  Ｍ．１９９８．Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ．Ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｒｅａ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｔｏ  ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｂｉｏｉｎｄｕｓｔｒｙ．Ｇｅｍｂｌｏｕｘ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）。
【００２３】
（発明の開示）
本発明は、少なくとも１種のキチン分解剤又はキチン分解活性誘導と、硫化物又は微生物由来の若しくは化学的な合成物からなる硫化物産生剤とを含有する組成物であって、当該キチン分解剤又はキチン分解活性誘導剤と、当該硫化物又は微生物由来若しくは化学的な合成物からなる硫化物産生剤とを、同時に、各成分を個々に使用する際より実質的に少量で適用して、蠕虫、及び細菌や真菌による疾病の原因成分の効果的な防除を達成する組成物に関する。
【００２４】
本発明はまた、植物寄生線虫（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  種，Ａｎｇｉｎａ  種、Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ  種、Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ  種、Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  種、Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ  種、Ｐａｄｏｐｈｏｌｕｓ  種、Ｘｉｐｈｉｎｅｍａ  種、Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ  種）、動物寄生線虫及び動物寄生吸虫（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ  種，Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ  種，Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ  種．ｙ  Ｆａｓｃｉｏｌａ  ｈｅｐａｔｉｃａ）、病原性の細菌性薬剤（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ，Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌｕｍａｅ）、並びに病原性の真菌性薬剤（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉａ  ｐａｌｍａｒｕｍ，Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｔａｂａｃｉｎａ，Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ  ｏｒｉｚａｅ）などの広範囲に亘り効果的に防除する生物学的薬剤及び化学的薬剤のような異なる根源の前記合成物の同時投与、又はこれらを含む組成物の使用に関する。
【００２５】
キチン分解剤又はキチン分解活性誘導剤、並びに硫化物又は硫化物産生剤の、蠕虫、細菌及び真菌に対する効能は、既に実証され、報告されている。しかしながら、両成分を同時に適用したときの相乗効果は、本研究において、初めて実証されたものである。
【００２６】
キチン分解剤又はキチン分解活性誘導剤、及び硫化物又は硫化物産生剤を別々に適用すると、その効能は、常に２種の薬剤を同時に適用するときより小さい。
【００２７】
本発明の組成物として適用する場合、当該キチン分解剤又は当該キチン活性誘導剤、並びに硫化物又は硫化物産生剤は、寄生蠕虫、並びに細菌性及び真菌性の疾病を防除する溶液、懸濁液、乳化液、粉末又は顆粒混合物の形で適当に混合され、肥料、プレパック土壌、種子被覆手段、粉末、顆粒、噴霧液、懸濁液、液体又はこれらをカプセル化したものとして、植物又は土壌に適用される。
【００２８】
線虫、吸虫、細菌又は真菌の特定の場合、並びに特異な条件の場合、キチン分解剤又はキチン分解活性誘導剤、並びに硫化物又は硫化物産生剤の最適な適用範囲は、生体外である温室又は野外の条件下などで実験に基づく調査により決定される。
【００２９】
本発明において説明された結果によれば、蠕虫、細菌及び真菌に対する顕著な防除は、１）組成物グラム当たり、１０７〜１０１２コロニー形成単位（ＣＦＵ）のキチナーゼ産生微生物、又は当該組成物の１％〜５０％のキチンと、２）組成物グラム当たり、１０７ＣＦＵ〜１０１２ＣＦＵの硫化物生産微生物、又は硫化物が組成物グラム当たり１．０ｍｇ／分で変化するような硫化物産生化学薬剤、の混合物で達成される。
【００３０】
組成物グラム当たり１０７ＣＦＵ〜１０１２ＣＦＵの、キチン分解剤及び硫化物を同時に生産する微生物を有する組成物は、蠕虫、細菌及び真菌に対する防除に好適である。上記組成物は、上記比率による以下の薬剤の組合せを含んでいる：
１．キチナーゼ及びＮａ２Ｓ、
２．キチナーゼ及びＦｅＳ、
３．キチナーゼ及び微生物Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ、
４．キチナーゼ及びＮａ２Ｓ、
５．キチナーゼ及びＦｅＳ、
６．キチン及び微生物Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｖａｎｓ、
７．キチン分解活性とＨ２Ｓを同時に生産する微生物。
前記組成物は、これに限らないが、Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａのようなＭｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ種、Ａ．ｔｒｉｔｉｃｉのようなＡｎｇｉｎａｓ種、Ｄ．ｄｉｐｓａｃｉのようなＤｉｔｙｌｅｎｃｕｓ種、Ｐ．ｃｏｆｆｅｅのようなＰｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ種、Ｈ．ｇｌｙｃｉｎｅｓのようなＨｅｔｅｒｏｄｅｒａ種、Ａ．ａｖｅｎａｅのようなＡｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ種、Ｒ．ｓｉｍｉｌｉｓのようなＲａｄｏｐｈｏｌｕｓ種、Ｘ．ｉｎｄｅｘのようなＸｉｐｈｉｎｅｍａ種、Ｒ．ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓのようなＲｏｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ種などを含む植物寄生線虫；Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ種、Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ種、Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ種、Ｎｅｍａｔｏｄｉｒｕｓ種、Ｃｏｏｐｅｒｉａ種、Ａｓｃａｒｉｓ種、Ｂｕｎｏｓｔｏｍｕｍ種、Ｏｅｓｏｐｈａｇｏｓｔｏｍｕｍ種、Ｃｈａｂｅｒｔｉａ種、Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ種、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ種、Ｔｒｉｃｈｏｎｅｍａ種、Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ種、Ｃａｐｉｌｌａｒｉａ種、Ｈｅｔｅｒａｋｉｓ種、Ｔｏｘｏｃａｒａ種、Ａｓｃａｒｉｄｉａ種、Ｏｘｙｕｒｉｓ種、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ種、Ｕｎｃｉｎａｒｉａ種、Ｔｏｘａｓｃａｒｉｓ種、及びＰａｒａｓｃａｒｉｓ種のような動物寄生線虫；Ｆａｓｃｉｏｌａ  ｈｅｐａｔｉｃａのような吸虫；Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌｕｍａｅのような植物病原性細菌、並びにＰｅｓｔａｌｏｔｉａ  ｐａｌｍａｒｕｍ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｔａｂａｃｉｎａ及びＳａｒｏｃｌａｄｉｕｍ  ｏｒｉｚａｅのような植物病原性真菌など、広い範囲で効き目がある。
【実施例】
【００３１】
（実施例１）化学的原料から得た硫化水素とキチン分解酵素による殺線虫効果の生体外での評価。
動物線虫である、Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ種とＴｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｕｓ  ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓとＤｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ  ｖｉｖｐａｒｕｓから得た卵とともにＭｅｌｏｄｏｉｇｙｎｅ  ｉｎｃｏｇｎｉｔａから得た寄生性植物線虫の幼虫（幼虫２）を用いた。
【００３２】
Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ種及びＴｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ  ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓ線虫類の採集をヒツジ（羊）及びウシ（牛）の第四胃からそれぞれ行った。成虫メス線虫を生理食塩水で洗浄し、０．５％“ヒビテン”（酢酸クロルヘキシジン）で、１分間、３７℃の工程で処理した。予め殺菌した個体約１００個を５０ｍｌのＬＢ培地溶液を入れたエーレンマイヤーフラスコに導入して、滅菌蒸留水で１０倍に希釈し、次いでそれらの卵を一夜放置した（８〜１０時間）。
【００３３】
Ｄ．ｖｉｖｉｐａｒｏｕｓ線虫の採集を、予め屠殺したウシ（牛）の寄生肺から行った。同じ手順をＨａｅｍｏｃｈｕｓ種及びＴ．ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓにつき用いた。但し、そのメスについては、その卵を２〜３時間放置した。
【００３４】
このときから、操作は、２４穴組織培養プレートを用いて、垂直方向の層流中における無菌条件下で行なった。当該メス及び卵を含有する培地の全容を６０μｍのｓｈｉｆｔ  ｎｅｔでろ過した。当該線虫卵は、第２ｓｈｉｆｔの３０μｍのｎｅｔ上に捕集した。それを０．５％のヒビテン溶液中に３分間導入し、次いで滅菌蒸留水で１０倍に希釈したＬＢ培地で３回洗浄した。
【００３５】
消毒後直ちに、卵をｓｈｉｆｔ  ｎｅｔから取出し、滅菌蒸留水で１０倍希釈したＬＢ培地で注意深く再懸濁した。分配の最終的な状態をオリンパス倒立顕微鏡にて各穴における当該卵を計数及び記録して検査し、この時期で、発生状態が均一であることも観測した。
【００３６】
Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ種及びＴ．ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓの卵は、２８℃の培養では、２４から４８時間で孵化するが、Ｄ．ｖｉｖｐａｒｕｓの卵は、２４時間前に孵化する。全ての未処理の対照中、孵化の６０％より多くが、各種につき事前に予測した時間で起こるとき、良好な試料調製が達成される。
【００３７】
Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｉｎｃｏｇｎｉｔａの卵塊の採集は、予め寄生させ温室で栽培したカボチャ属の根（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｐｅｐｏ）から行った。この操作には実体顕微鏡及び適切に改良したチップを付けた針を用いた。卵塊を２８℃でペトリ皿中の滅菌蒸留水に入れ、１皿に５０塊数とした。毎日卵の孵化を観察した。約７２時間で収集及び殺菌を開始するのに充分な幼虫となった。
【００３８】
卵塊及び幼虫を含有する全容を、６０μｍのｓｈｉｆｔ  ｎｅｔを通してろ過した。その時から引き続き、全ての操作は、２４穴組織培養プレートを用いて、垂直方向の層流中における無菌状態で行なった。卵塊から分離した卵は孵化できず、３０μｍのｓｈｉｆｔ  ｎｅｔの上に残った。更に５μｍのｎｅｔを用いて幼虫を採集した。それを０．５％のヒビテン溶液に３分間導入し、次いで滅菌蒸留水で１０倍に希釈したＬＢ培地で洗浄した。一回消毒して、当該Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｉｎｃｏｇｎｉｔａ幼虫をｓｈｉｆｔ  ｎｅｔから取除き、注意深く滅菌蒸留水で１０倍に希釈したＬＢ培地溶液に再懸濁した。最終的な採集及び消毒の状態は、オリンパス倒立顕微鏡により生きている幼虫を計数し記録して検査した。
【００３９】
当該線虫の卵及び幼虫を、１０倍に希釈したＬＢ培地の約２ｍｌ中に１００個体数入れた。この内容物を、空気をその液体に通させる安全バルブに導入し、当該空気が卵や幼虫に接触できるようにした。各処理に関して全てのバルブは、同じレプリカである。
【００４０】
硫化水素は、２種の硫化物（Ｎａ２Ｓ及びＦｅＳ）を塩酸と反応させるか、細菌Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ  ｓｕｂｓ．ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ  ＡＴＣＣ  ２７７７４（羊類の第一胃から単離）の嫌気性発酵で得た。使用したキチン分解酵素は、細菌Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓから得たキチナーゼＳＩＧＭＡ  Ｃ  １６５０である。
【００４１】
実験された線虫の卵及び幼虫は、２４時間、以下の処理に供された：
１．対照処理：キナーゼは適用せず、バルブを通して空気を循環した；
２．キチナーゼ処理：複製物当たり０．２単位の比率；
３．硫化物処理：Ｎａ２Ｓからの硫化水素を０．３ｍｇ／分において０．２の流束；
４．硫化物処理：ＦｅＳからの硫化水素を０．３ｍｇ／分において０．２の流束；
５．硫化物処理：Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓからの硫化水素を０．３ｍｇ／分において０．２の流束；
６．組合せ処理：処理２及び処理３の同時適用；
７．組合せ処理：処理２及び処理４の同時適用；
８．組合せ処理：処理２及び処理５の同時適用。
上記処理の全ては、４つの複製物に供された。
【００４２】
実験を開始してから２４時間後、全ての処理において、新生の幼虫（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ種，Ｔ．ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓ及びＤ．ｖｉｖｉｐａｒｏｕｓ）及び生存幼虫の数（Ｍｅｌｏｄｏｇｙｎｅ  ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）を計数した。効能結果（Ｅ）を表１に示した。この値は全ての処理において４つの複製物の平均である。分散分析（ＡＮＯＶＡ）を本研究における各線虫種で得た結果に別々に適用した；ダンカン（Ｄｕｎｃａｎ）検定
2004522727.tif 000004
を適用し、表１に同様に示す。同じアルファベットは当該処理の間に有意差（ｐ＜０．０５）がないことを示している。
【００４３】
【表１】
2004522727.tif 000005
＊有効性（Ｅ）は、実施例に関して、孵化又は生存幼虫についての活性頻度（Ｆｒ）の値を１から差引いた結果である。Ｆｒは各処理（Ｎｔｔｏ）における新生又は生存幼虫の数と処理１（Ｎｃ）における新生又は生存幼虫数の間の比率である。
【００４４】
Ｅ＝１−Ｆｒであり、その式中のＦｒは、Ｆｒ＝Ｎｔｔｏ−Ｎｃである。それ故、Ｅ＝１−Ｎｔｔｏ／Ｎｃである。
【００４５】
処理６，７及び８における相乗効果を測定するために、それらにおいて生じる事象が排除されないと仮定した。
【００４６】
この種の分析で、予期される有効性（ＥＥ）は、個々の効果の合計と等しくなければならず、キチナーゼ作用（Ｅｑ）に反映する有効性と硫化水素（Ｅｓｎ、Ｅｓｆ及びＥｓｄ）に反映する有効性との総和から交差効果（ｅｉ）
2004522727.tif 000006
を差引いて得られる。
【００４７】
ＥＥ＝Ｅｑ＋Ｅｓ−ｅｉであり、その式中ｅｉは、ｅｉ＝Ｅｑ×Ｅｓである。
【００４８】
２種類の殺真菌薬剤の組合せた（処理６，７，８）処理における実験での有効性（Ｅ）がこれらの処理につき予期した有効性（ＥＥ）より大きな場合、キチン分解剤（キチナーゼ）及び硫化水素を同時に同じ処理に適用するときに殺真菌活性において相乗効果があることを確証することができる。得られた値は表２にまとめた。
【００４９】
【表２】
2004522727.tif 000007
【００５０】
キチナーゼ及び硫化水素を同時に組合せた３種類の処理では、実験を行った４種の線虫についての当該実験での有効性（Ｅ）は予期した有効性（ＥＥ）を超えており、それらの殺線虫活性に関して両合成物（同時に作用するとき）の間に相乗作用の存在を統計的に示している。硫化物源及びそれらの殺線虫効果については有意差は認められなかった（表１）。
【００５１】
（実施例２）キチン分解活性誘導剤（キチン）及び硫化水素産生剤（土壌から単離したＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ  ｓｕｂｐｓ．ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ  ＡＴＣＣ２９５７７）による殺線虫効果の温室における評価
【００５２】
中性ｐＨの褐色土壌を選択し、それを乾燥し、０．５ｃｍの網で篩をかけて望ましくない粒子を除去した。この土壌を縦型オートクレーブ中で、１２０℃及び１気圧にて１時間で滅菌した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ．Ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ）。これを室温で３〜４日間乾燥し、その後、川砂、土壌生物腐葉土及びキチン（ＩＣＮ  カタログ番号１０１３３４）で処理して予定の混合物を作成した。
【００５３】
２０個のポット（直径１５ｃｍ×深さ１３ｃｍ及び容量１リットル）に以下の処理物を所定比率で満たした：
１．対照処理：土壌７０％、川砂２５％及び腐葉土５％；
２．キチン処理：土壌７０％、川砂２５％、腐葉土４％及びキチン１％；
３．微生物処理：土壌７０％、川砂２５％、腐葉土５％、及びポット当たり１０１０ＣＦＵの濃度で適用されたＤ．ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ；
４．混合処理：土壌７０％、川砂２５％、腐植土４％、キチン１％、及びポット当たり１０１０ＣＦＵの濃度で適用されたＤ．ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ。
各処理は５つのレプリカ（ポット）で実施した。
【００５４】
２及び４の処理では、腐葉土とキチンの予備混合物を４：１の比率で作成し、次いで土壌及び砂を混ぜ、最終混合物を作成した。３及び４の処理では、Ｄ．ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓを、ポット当たり１００ｍｌの脱イオン水を用いて利用した。これらの量を最初の注水の間、均一に適用した。
【００５５】
全ての処理で、天然の寄生バナナの根から予め採集したＲａｄｏｐｈｏｌｕｓ  ｓｉｍｉｌｉｓの線虫試料５００個をポットに接種した。採集には、遠心分離−浮遊方法（Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｗ．Ｒ．１９６４．土壌から線虫分離する際の迅速遠心−浮遊方法。Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ，４８：６９２）を用いた。試料は、５ｍｌの蒸留水で希釈し、土壌表面下５ｃｍの深さで均等にアプライした。ポットを温室に置き、処理後３日間静置し、線虫を接種した。注水は、良好な湿度条件を保持するために、この段階の間、毎日実施した。処理の第四日目前に、生体外組織培養で得られたバナナ変種Ｃａｖｅｎｄｉｓｈをポットに移植した。この時から厳格な注水管理をとって、その圃場容水量に関し不変の土壌水分を保った。
【００５６】
最終評価は実験を開始してから３ヶ月後、植物の根を注意深く土壌から取出した。その後、植物から採集した試料（幼虫及び成虫）及び生きている線虫の数を、遠心分離−浮遊手法（Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｗ．Ｒ．１９６４．土壌から線虫分離する際の迅速遠心−浮遊手法。Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ，４８：６９２）、計数用に倒立顕微鏡を用いて記録した。異なる処理についての有効性の結果を表３に示す。これは各処理での５複製物の平均値である。得られた結果に変動分析を適用し（ＡＮＯＶＡ），次いでダンカンの検定
2004522727.tif 000008
を適用した。それぞれ、表３に示す。同じアルファベットは当該処理の中で有意差（ｐ＜０．０５）がないことを示す。
【００５７】
【表３】
2004522727.tif 000009
＊有効性（Ｅ）は、１から生存試料相対頻度（Ｆｒ）値を差引いた結果である。Ｆｒは、各処理（Ｎｔｔｏ）における生存試料の数と処理１（Ｎｃ）における生存試料の数との比率である。
【００５８】
Ｅ＝１−Ｆｒであり、その式中Ｆｒは、Ｆｒ＝Ｎｔｔｏ／Ｎｃである。それ故Ｅ＝１−Ｎｔｔｏ／Ｎｃである。
【００５９】
処理４において、可能性ある相乗効果を測定するために、発生する事象（殺線虫効果）は排除されないと仮定した。
【００６０】
実施例１と同様に、予測される有効性（ＥＥ）は各効果（ＥＩ）の合計に等しいはずであり、土壌及び腐葉土の混合物中に存在する微生物のキチン分解活性の誘導物質としてキチン作用に反映された有効性（Ｅｑ）と、細菌Ｄ．ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓから得られる硫化水素の作用に反映される有効性（Ｅｓｄ）との総和から、２つの処理間の交差効果（ｅｉ）を差引いたものである
2004522727.tif 000010
【００６１】
ＥＥ＝Ｅｑ＋Ｅｓ−ｅｉ，その式中ｅｉは、ｅｉ＝Ｅｑ×Ｅｓである。
【００６２】
２種の殺線虫剤を組合せた処理４において、実験での有効性（Ｅ）が予期した有効性（ＥＥ）より大きい場合には、キチン分解活性誘導剤（キチン）及び硫化水素（Ｄ．ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓより）が同時に同じ処理に適用されたとき、それらによる相乗効果の存在を確証することができる。得られた値は表４に示す。
【００６３】
【表４】
2004522727.tif 000011
【００６４】
処理４は、キチン分解活性誘導物質（キチン）と硫化水素の生物学的根源（Ｄ．ｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ）を組合せたものである。この処理において、実験での効果（Ｅ）は予期した有効性（ＥＥ）より大きく、それ故土壌に同時に適用した場合２種の合成物には相乗効果（その殺線虫活性に関して）が存在することを示した。
【００６５】
（実施例３）細菌Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｕｒｏｍｅｔａｂｏｌｕｍ  Ｃ−９２４とＴｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ  ｐａｕｒｏｍｅｔａｂｏｌａ  ＤＳＭ２０１６２によるキチン分解活性及び硫化水素産生の実証
【００６６】
硫化物産生の測定：
気体採取用の１００ｍｌの管中に、５ｌの生物反応器に入れた菌株Ｃ−９２４及びＤＳＭ２０１６２の発酵で生じた気体から得た試料を取り込んだ。全培養時間は２４時間であった。硫化水素の生成は最初に１６時間目に検出された。
【００６７】
試料を、Ｈ２Ｓパターン生成に類似の方法で処理した。
分析は、Ｖａｒｉａｎガスクロマトグラフにて以下の条件で実施した：
・硫黄を含有する化合物に高感度のフィルターを有する炎光光度計検出器；
・硫化水素パターン：４３．２ｎｇ／ｍｌ、２回；
・試料：試料採取を行なう毎に２度；
・注入：１ｍｌ又は１μｌのヘッドスペース；
・カラム：ＤＢ−５（１５ｍ×０．５３ｍｍ）；
・温度：３５℃；
・キャリヤーガス：窒素１．５ｍｌ／分；
・検出器：ＦＰＤ−Ｓ；
・パージガス：窒素３０ｍｌ／分。
【００６８】
表５は異なる時間にて２種の菌株により生成した硫化物ガス分析のまとめを示す。
【表５】
2004522727.tif 000012
両菌株とも硫化物を生産するが、Ｃ−９２４は菌株ＤＳＭ２０１６２より高い流量を産生する。
【００６９】
キチン分解性活性測定：
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｕｒｏｍｅｔａｂｏｌｕｍ  Ｃ−９２４，Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ  ｐａｕｒｏｍｅｔａｂｏｌａ  ＤＳＭ２０１６２，Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎ  ＡＴＣＣ  １３８８０及びＥ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ２５９２２菌株を使用した。
【００７０】
検討した菌株の細菌培養はＬＢ培地にて２８℃で１００ｒｐｍにて２４時間行い、次いで３５００ｒｐｍの遠心分離を行なった。その上澄み液を２種の０．２μｍの網でろ過した。ろ過した生成物を、キチンコロイド状懸濁液（０．５％）を用いて調製され、培地をゲル化させ、蛋白質拡散を促進する気孔率を確保するためにアガロースを０．８％に至るまで加えたプレートで検定した。ゲル化後、５ｍｍ直径の穴を開き、そこに各細菌菌株から得たろ過上澄み液１００μｌを加えた。３つの複製物が、全てのプレートで使用され、暗所で２８℃にて培養した。
【００７１】
４８時間目から光輪（ｈａｌｏ）状の濁りの減少が培地で観測され、キチンが加水分解されていることが示された。以下の表（表６）では、検討中の異なる菌株の培養から得た上澄み液について異なる培養時間における加水分解による光輪（ｈａｌｏ）現象の発生から得た定性的結果を示す。
【００７２】
【表６】
2004522727.tif 000013
＋＋＋は最大の加水分解による光輪（ｈａｌｏ）が観察されたことを表す。
＋＋  は中程度の加水分解による光輪（ｈａｌｏ）を表す。
＋    は最小の加水分解による光輪（ｈａｌｏ）が観察されたことを表す。
【００７３】
両菌株（Ｃ．ｐａｕｒｏｍｅｔａｂｏｌｕｍ及びＴ．ｐａｕｒｏｍｅｔａｂｏｌａ）は、用いた陽性対照（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎ）と同じようにキチン加水分解による光輪（ｈａｌｏ）現象を示し、Ｅ．ｃｏｌｉ（陰性対照）は加水分解による光輪（ｈａｌｏ）現象を生じなかった。
【００７４】
（実施例４）細菌Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｕｒｏｍｅｔａｂｏｌｕｍ  Ｃ−９２４及びＴｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ  ｐａｕｒｏｍｅｔａｂｏｌａ  ＤＳＭ２０１６２が産生した硫化物及びキチナーゼの寄生虫Ｆａｓｃｉｏｌａ  ｈｅｐａｔｉｃａ（吸虫）に対する効果の生体外評価
【００７５】
寄生虫Ｆａｓｃｉｏｌａ  ｈｅｐａｔｉｃａから得た卵を使用した。卵採集は、予め屠殺したウシ（牛）の寄生肝臓胆汁から直接行なった。胆汁の内容物を３倍の蒸留水に再懸濁し、２８℃で２〜３時間静置して卵を沈殿させた。次いで上澄み液を最大限除去した。得られた沈殿物を７１μｍのｓｈｉｆｔ  ｎｅｔにてろ過して、卵を捕集した。
【００７６】
このときから、全ての操作は、２４穴組織培養プレートを用いて、垂直層流における無菌条件で行った。Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａの卵を有するｓｈｉｆｔ  ｎｅｔを０．５％ヒビテン溶液中に３分間導入し、次いで滅菌蒸留水で１０倍希釈したＬＢ培地で３回洗浄した。消毒後直ちに、卵をｓｈｉｆｔ  ｎｅｔから取出し、注意深く滅菌蒸留水で１０倍に希釈したＬＢ培地で再懸濁した。採集及び消毒による最終的な状態は、オリンパス倒立顕微鏡にて生存幼虫を計数及び記録して検査した。この時期で、発生状態が均一であることも観測した。
【００７７】
この寄生吸虫の卵は、予め生体外で設定された条件下で、２８℃で約１５日培養して孵化させた。当該試料の良好な調製は、６０％より多い卵が培養期間終了時に孵化する場合とみなした。
【００７８】
実験を進行させ、消毒した卵の数約１００個体を１０倍に希釈したＬＢ培地１ｍｌに入れた。この内容物を、空気をその液体に通すことができる２０個の安全バルブに導入し、当該空気が卵や幼虫に接触できるようにした。全ての５処理に関して、各バルブは、同じレプリカ（処理当たり４）である。
【００７９】
Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａの卵は、培養の最後の４日間に以下の処理に曝した：
１．対照処理：１０倍希釈したＬＢ培地の１ｍｌをキチナーゼなしで全てのバルブに添加し、空気をその中で循環させる；
２．各バルブに、１０１０コロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍｌ）のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｕｒｏｍｅｔａｂｏｌｕｍ  Ｃ−９２４の培養物から細菌細胞なしで得たキチン分解活性を有する上澄み液１ｍｌの添加；
３．各バルブに、１０１０ＣＦＵ／ｍｌのＴｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ  ｐａｕｒｏｍｅｔａｂｏｌａ  ＤＳＭ２０１６２から、細菌細胞なしで得たキチン分解活性を有する上澄み液１ｍｌの添加；
４．１０１０ＣＦＵ／ｍｌのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｕｒｏｍｅｔａｂｏｌｕｍ  Ｃ−９２４の連続培養から得たガス流を、バルブを通過させる；
５．１０１０ＣＦＵ／ｍｌのＴｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ  ｐａｕｒｏｍｅｔａｂｏｌａ  ＤＳＭ２０１６２の連続培養で得たガス流を、バルブを通過させる。
６．組合せ処理：処理２及び４の同時適用；
７．同時処理：処理３及び５の同時適用。
【００８０】
実験を開始して第４日目に、孵化した卵を計数した。Ｆ．ｈｅｐａｔｉｃａの場合、幼虫（ミラシド）は、その激しい自己運動性のため計数ができないので、顕微鏡での観察は卵について行なった。異なる処理による有効性の結果は表７に示した。この結果は各処理において４つの複製物についての平均値である。同一のアルファベットは当該処理間に有意差（ｐ＜０．０５）がないことを示す。
【００８１】
【表７】
2004522727.tif 000014
有効性＊は１から孵化値の相対頻度（Ｆｒ）を差引いた結果である。Ｆｒは処理毎の孵化卵の数（Ｎｔｔｏ）と処理１で孵化した卵の数（Ｎｃ）との比率である。
【００８２】
Ｅ＝１−Ｆｒであり、その式中Ｆｒは、Ｆｒ＝Ｎｔｔｏ／Ｎｃである。それ故、Ｅ＝１−Ｎｔｔｏ／Ｎｃである。
【００８３】
処理６及び７において、可能性ある相乗効果を測定するために、それらで起こる事象（抗寄生効果）は排除されないと仮定した。
【００８４】
この種の分析で、予期される有効性（ＥＥ）は、キチナーゼ作用（Ｅｑ）に反映される有効性と、硫化水素に反映される有効性（Ｅｓｎ、Ｅｓｆ及びＥｓｄ）との合計から、これらの交差効果（ｅｉ）を差引いて得られる
2004522727.tif 000015
【００８５】
ＥＥ＝Ｅｑ＋Ｅｓ−ｅｉ、その式中ｅｉ＝Ｅｑ×Ｅｓ
【００８６】
２種の抗寄生薬剤を組合せた（処理６及び７）処理における実験の有効性（Ｅ）が、これらの処理についての予期される有効性より大きい場合には、キチン分解性薬剤（キチナーゼ）及び硫化水素の両方を同時に同一処理に適用するとき、抗寄生活性の点で相乗効果があることを確証することができる。得られた値を表８にまとめて示す。
【００８７】
【表８】
2004522727.tif 000016
【００８８】
キチナーゼ及び硫化水素を組合せた処理において、実験での有効性（Ｅ）は、予期した有効性（ＥＥ）より大きかった、このことは、殺線虫活性の点で同時に作用する２つの化合物の相乗作用を実証する。
【００８９】
（実施例５）硫化水素を生産し、且つ数種の細菌及び真菌に対しキチン分解活性を有する細菌菌株（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｕｒｏｍｅｔａｂｏｌｕｍ  Ｃ−９２４）の生体外での効果評価
【００９０】
以下の真菌種を使用した：
Ｐｅｓｔａｌｏｔｉａ  ｐａｌｍａｒｕｍ、Ａｌｔｅｎａｒｉａ  ｔａｂａｃｉｎａ、Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ  ｏｒｉｚａｅ、Ｐｉｔｉｕｍ  ｄｅｂａｒｙａｎｕｍ。
また以下の細菌種を使用した：
Ｅｒｗｉｎｉａ  Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌｕｍａｅ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎ  ＡＴＣＣ１３８８０、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｆ１６９５及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ２５９２２。
【００９１】
Ａ）真菌アッセイ
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｕｒｏｍｅｔａｂｏｌｕｍ  Ｃ−９２４の真菌に対する相互作用を、以下のこれら真菌につき分析した：
Ｐｅｓｔａｌｏｔｉａ  ｐａｌｍａｒｕｍ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  Ｔａｂａｃｉｎａ、Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ  ｏｒｉｚａｅ及びＰｙｔｉｕｍ  ｄｅｂａｙｉａｎｕｍ。
Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎ  ＡＴＣＣ１３８８０の菌株は、抗真菌活性につき陽性対照として、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＡＴＣＣ２５９２２は、抗真菌活性につき陰性対照として使用した。当該細菌培養は全ての種につき通常の振とう及び温度条件で２４時間生育させた。細胞濃度１０９ｃｆｕ／ｍｌを保証するために５３０ｎｍの吸光度で必要な希釈を行なった。これらはＰＤＡ培地（寒天−ジャガイモ−デキストローズ）を含むペトリ皿に入れ、接種は中心線に微生物用輪匙を用いて行った。接種したペトリ皿を、２８℃で４８時間培養し、次いで、予め生育させておいた（ＰＤＡ培地を含むプレート）異なる真菌菌株から得た直径８ｍｍの円盤状コロニー（disc）を接種し、接種細菌の中心線のどちらか一端でプレート表面に塗抹した。３個の複製物を各真菌に用いて検討し、２８℃で１０日間培養した。結果は、実験の開始から５日目で判読した。
【００９２】
ｂ）細菌アッセイ
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｕｒｏｍｅｔａｂｏｌｕｍ  Ｃ−９２４、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ２５９２２及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｆ１６９５の相互作用の発生を、以下の細菌について検討した：
Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈａｎｅｍ及びＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌｕｍａｅ。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ菌株Ｆ１６９５を、他の細菌との拮抗に関する陽性対照として用い、陰性対照として、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＡＴＣＣ２５９２２を用いた。細菌株はＬＢ培地にて普通の振とう及び温度条件で２４時間成育させた。これら培養物に対し、細胞濃度１０９ｃｆｕ／ｍｌを保証するために、５３０ｎｍの予備的吸光度で必要な希釈を行った。Ｃ−９２４の場合、５μｌの液滴をＬＢ培地のプレートの異なる３ヶ所に塗抹したが、陽性対照においては異なる２ヶ所、陰性対照用は他の異なる２ヶ所に、それぞれ塗抹した。塗抹したプレートは、２８℃で４８時間培養した。その後、それらを３分間クロロホルム蒸気で処理し（不活性化し、更なる工程で分散をさけるため）、プレートは、半分蓋を開けてガス過剰を排除して層流中に設置された。試験菌株であるＥｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ及びＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌｕｍａｅの接種を実施した。接種は、半固体のＬＢ培地（０．１％工業用寒天Ｎｏ．３）で３ミリリットルとした後、細胞濃度１０９ｃｆｕ／ｍｌなるような量を採取した微生物毎の純粋培養で始めた。試験菌株を含むプレートの上に、混合物を分散させ、その後それらを２８℃で４８時間培養して結果を評価した。
表９は上記相互作用分析において得られた結果を示す。
【００９３】
【表９】
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＋＋＋：強い拮抗作用が見られ、生育が停止し、Ｃ−９２４の効果により光輪（ｈａｌｏ）の形成を生じる。真菌の場合典型的な放射状の成長が阻止される。
＋＋：微生物に対するＣ−９２４の中程度の拮抗効果。
＋：微生物に対しＣ−９２４の僅かな拮抗効果。
−：微生物に対しＣ−９２４の拮抗効果が見られなかった。
【００９４】
表９に示したように、菌株Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｕｒｏｍｅｔａｂｏｌｕｍ  Ｃ−９２４は、その構造中、高いキチン含有量を有する特徴がある真菌Ｐｅｓｔｌｏｔｉｏａ  ｐａｌｍａｒｕｍ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｔａｂａｃｉｎａ及びＳａｒｏｃｌａｄｉｕｍ  ｏｒｉｚａｅに対し、顕著な拮抗作用がある。硫化水素作用による拮抗作用は、ごく僅かであることが観測された。検討した細菌との相互作用の場合、拮抗作用は２種の病原性菌株（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ及びＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌｕｍａｅ）で観測され、その一方で、他の微生物を有する拮抗土壌から単離されたように、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓの場合は拮抗作用が観察されなかった。従って、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓは、不利な環境因子にもより抵抗性がある。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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