(57)【要約】本発明は、製薬学的物質の高い取り込み能力を有する大型のリポソームを作製する方法を提供する。本発明の方法は、一般に、ポリマー水溶液に脂質／アルコール溶液を直接注入することが必要である。得られるリポソームは、製薬学的物質を組み込むことができ、典型的には、約１〜８ミクロンの平均サイズの多層膜小胞からなる。ポリマーに対する脂質の比、ポリマーの平均分子量、ポリマー濃度、イオン強度およびインキュベーション温度は、リポソームサイズ並びに成分および製薬学的物質の組み入れをコントロールするために本明細書に開示する変数である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）水混和性アルコール中またはアルコール／水混合物中に脂質成分を含む第一の溶液を提供するステップと、
（ｂ）水溶性ポリマーを含む第二の溶液を提供するステップと、
（ｃ）該第一の溶液を該第二の溶液に直接注入するステップと、それによってリポソーム懸濁液を生成させるステップと、
（ｄ）該懸濁液から該アルコールとポリマーとを除去するステップと、望ましい大型リポソームを製造するステップと
を含む、大型リポソームを調製する方法。
【請求項２】
前記アルコールとポリマーとが、遠心分離またはダイアフィルトレーションにより前記混合物を洗浄することによって除去される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記脂質成分が、リン脂質と、油と、飽和脂質と不飽和脂質との混合物とからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記脂質成分が、少なくとも一種の脂質と、ステロールとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記脂質／アルコール溶液がエマルジョンである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジステアロイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミンおよびジステアロイルホスファチジルエタノールアミンからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ステロールがコレステロールである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリマーの分子量が約６，０００ダルトン〜約２０，０００ダルトンである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリマーが、ヒドロキシル基、エーテル基およびアミン基からなる群から選択される極性基を有するモノマーから製造される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびデキストランからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記第一の溶液の水分含量が総体積の約０％〜約１０％である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第一の溶液の脂質濃度が、少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリマー濃度が少なくとも約２５％（ｗ／ｗ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記リポソームの平均サイズが、約１ミクロン〜約８ミクロンの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記第一の溶液もしくは前記第二の溶液またはそれらの両方に、少なくとも一種の製薬学的物質を添加するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも一種の製薬学的物質が、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体断片、生物学的製剤、腫瘍抗原およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ペプチドがリポペプチド、糖ペプチドまたは糖リポペプチドである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記生物学的製剤が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、合成有機分子、天然有機分子、ビタミン、ステロイド、免疫調節物質、サイトカイン、リンフォカイン、補助刺激分子、抗生物質、抗腫瘍抗原、抗炎症剤、抗血管形成剤、ケモカイン、アジュバント、中枢神経系に作用する薬剤、感染性病原体の抗原およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記生物学的製剤がインターロイキン−２である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記生物学的製剤が、細菌、ウィルス、寄生虫およびそれらの混合物からなる群から選択される感染性病原体の抗原である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記腫瘍抗原がペプチドである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記ペプチドがＭＵＣ−１ペプチドまたはその誘導体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＭＵＣ−１ペプチドがグリコシル化されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＭＵＣ−１ペプチドが、配列：ＮＨ2−［ＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰ（Ｋ−パルミトイル）Ｇ］−ＣＯＯＨを有する、ＢＰ１−１４８である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１に記載の方法によって製造されるリポソーム。
【請求項２６】
請求項１に記載の方法によって製造されるリポソームと、腫瘍抗原とを含む、癌ワクチン。
【請求項２７】
少なくとも一種のリン脂質と、コレステロールと、リピドＡ（天然または合成）と、腫瘍抗原とを含む癌ワクチン。
【請求項２８】
請求項１に記載の方法によって製造されるリポソームと、感染性病原体の抗原とを含む感染性病原体ワクチン。
【請求項２９】
前記感染性病原体の抗原が、細菌、ウィルス、寄生虫およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項２８に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、製薬学的物質に対して高い取り込み能力を有する大型リポソームを製造する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
リポソームは、その中に取り込まれている水溶性の内容物を含有する完全に閉じた脂質二重膜である人工小胞である。リポソームはサイズが異なることがある。それらは、単層（二重層の単層膜を有する）または多層（水層によって各膜が隣の膜から分離されている、多層膜層によって特徴付けられるタマネギ様構造）に対応する脂質組成および構造的な構成に関して異なることもある。
【０００３】
リポソームは、薬剤送達の媒体として広範に使用されている。薬剤送達に使用されるリポソームの種類には、小型単層膜小胞（ＳＵＶ）、大型単層膜小胞（ＬＵＶ）および多層膜小胞（ＭＬＶ）が挙げられる。それらの用途を支配する最も重要な特徴の１つは、血液および組織分布からのクリアランス速度に影響を与える小胞サイズである。２５ｎｍ〜１００ミクロンのリポソームは、数多くの薬剤を取り込む技術によって製剤化されている。
【０００４】
大型リポソームと小型リポソームの実験的な比較に基づいて考えると、大型リポソームは、小型リポソームより速く血中から除去される（Ｐｏｓｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４、Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３、Ｈｕｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９）。迅速なクリアランスは、リポソーム取り込まれた薬剤の生物分布を変更する重要な特徴である。大型リポソームが多く蓄積されることを示す比較研究は、肺（Ｈｕｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９、Ａｂｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４、Ｊａｃｋｓｏｎ，１９８０、Ｆｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０）、肝臓（Ｈａｒａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２、Ｊａｃｋｓｏｎ，１９８０、Ａｌｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）および脾臓（Ｍｏｇｈｉｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１、Ｊａｃｋｓｏｎ，１９８０）において観察されている。大型リポソームはクッパー細胞（Kupffer cell）による取り込みを好むことがわかってきているが、小型リポソームは実質細胞に大きな親和性を有する（Ｒａｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２）。小型リポソームはまた、類洞内皮などの障壁を通過することができる（Ｐｏｓｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）。従って、標的部位および取り込まれた薬剤の薬物動態によって、大型リポソームまたは小型リポソームは異なる利点を持つことがある。
【０００５】
しかし、大型リポソームを製造する現在の方法には限界があり、それらの製造を複雑にしている。具体的には、脂溶性薬剤に加えて脂質成分の均一な混合を確実にするために通常使用されている有機溶媒（例えば、クロロホルム）は毒性が高い。さらに、製剤からの有機溶媒の除去は困難で、厄介である。大型リポソームの大規模製造には、さらに問題がある。また、エタノール注入などの通常使用される方法は、得られる生成物が主にサブミクロン範囲の粒子からなるので、適当ではない（Ｂａｔｚｒｉ  ａｎｄ  Ｋｏｍ，１９７３）。
【０００６】
上記の障害を克服するためには、大規模製造に対応しやすい方法を使用して、毒性の高い有機溶媒を含有せず、ミクロンの幅で均一にサイズ決定されるリポソームを製造する必要性が存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の１つの目的は、毒性の高い有機溶媒の使用を必要とせず、価格効率的で、大規模製造に十分に適合できる大型リポソーム調製方法を提供することである。本発明の目的はまた、脂溶性薬剤と水溶性薬剤との両者の高い取り込みを示す、ミクロンサイズ範囲の均一な大型リポソームを調製する方法を提供することである。本発明の別の目的は、生物医学的用途に好適なリポソーム形状の癌ワクチンの製造に適用することができる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
これらの目的および他の目的を実施する際に、（１）水混和性アルコールまたはアルコール／水混合物に少なくとも一種の脂質成分を含む第一の溶液を、水溶性ポリマー水溶液に直接注入するステップと、それによってリポソーム懸濁液を形成するステップと、（２）アルコールおよびポリマーを除去するステップと、得られたリポソームを回収するステップとを含む大型リポソームを調製する方法が本発明の一態様により提供されている。
【０００９】
好ましい実施態様において、脂質成分は少なくとも一種のリン脂質とコレステロールなどのステロールとの混合物を含む。
【００１０】
別の態様において、大型リポソームを製造する方法は、少なくとも一種のリン脂質とステロールとの混合物を含む第一の溶液、または水溶性ポリマーを含む水溶液に製薬学的物質を添加するステップをさらに含む。製薬学的物質はタンパク質、ペプチドまたは生物学的製剤を含んでもよい。
【００１１】
好ましい実施態様において、本発明の方法によって調製したリポソームを含む癌ワクチンが提供される。ここで、該リポソームは腫瘍抗原を含む。別の好ましい実施態様において、少なくとも１つのリン脂質、コレステロール、リピドＡおよび腫瘍抗原を含むリポソームが提供される。
【００１２】
さらに別の好ましい実施態様において、本発明の方法によって製造したリポソームを含み、リポソームが感染性病原体の抗原を含む感染性病原体ワクチンが提供される。このような感染性病原体の抗原は、例えば、細菌、ウィルス、寄生虫またはそれらの混合物であってもよい。
【００１３】
上記の一般的な説明および以下の詳細な説明は例示的なものであって、説明のためであり、特許請求されている本発明をさらに説明することを意図するものである。他の目的、利点および新規の特徴は、本発明の以下の詳細な説明から当業者に容易に明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、脂質を含有するアルコール溶液をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）溶液などのポリマー水溶液に直接注入することによって、薬剤を取り込む性能が高い大型リポソームを製造する新規方法に関する。
【００１５】
従来の方法により、小型単層膜小胞（ＳＵＶ）は、２５〜５０％のＰＥＧ、ＭＷ６，０００の存在下で大型多層膜小胞（ＭＬＶ）に融合することが証明された（Ｈｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１、Ｂｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１、Ｂｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１）。得られた大型リポソームは、典型的には、ミクロン範囲で、多層構造であり、親油性薬剤と水溶性薬剤との両方に対し、高い取り込み性能を示した。従来の方法とは異なり、本発明は、脂質／アルコール溶液をポリマー水溶液に直接注入することによって、ＳＵＶを製造するステップを含まない。さらに、ＰＥＧは特に、無毒性の水溶性ポリマーであり、低価格で購入することができ、米国内での消費についてＦＤＡから承認されている（Ｈａｒｒｉｓ，１９９７、Ｗｏｒｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。
【００１６】
本発明の一態様において、脂質成分と、水混和性アルコールまたはアルコール／水混合物とを含む第一の溶液が提供される。脂質／アルコール溶液はエマルジョンであってもよいが、脂質成分は、通常、少なくとも一種のリン脂質とステロールとの混合物を含む。好ましいリン脂質はリポソームを形成することができ、ホスファチジルコリン（ＰＣ、レシチン）などのリン脂質を含む。好適なリン脂質には、ホスファチジン酸、（ＰＡ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）およびホスファチジルセリン（ＰＳ）も挙げられる。他の好適なリン脂質には、さらに、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）、ジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＳＰＳ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）およびジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）が挙げられる。好ましいステロールはコレステロールである。脂質成分のさらに別の好適な成分は油、飽和脂質混合物および不飽和脂質混合物、糖脂質並びにモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）またはリピドＡなどの他の脂質補助物質である。好ましいアルコールには、エタノール、メタノール、プロパノールおよびブタノール（すなわち、ｉｓｏ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノールおよびｔｅｒｔ−ブタノール）などの低級アルコールが挙げられる。
【００１７】
第一の溶液を調製するためには、粉末状の脂質混合物を、水を含んでも含まなくてもよい最小限のアルコール（典型的には、エタノール）に溶解することができる。水分含量は、好ましくは、総体積の約１０％未満である。脂質濃度は、通常、少なくとも約３０ｍｇ／ｍＬであるが、５〜８０ｍｇ／ｍＬであってよい。コレステロールの割合は好ましくは０〜５０Ｍｏｌ％コレステロールであるが、以下の実施例によって実験的に測定するように、最適な取り込み、リポソームサイズの制御および薬剤の作用に適切なように調節することができる。必要に応じて、この時点において、一種以上の製薬学的物質を脂質／アルコール混合物に添加することができる。本発明に使用する好適な製薬学的物質はタンパク質、ペプチドおよび生物学的製剤を含んでもよい。
【００１８】
好ましいタンパク質は抗体または抗体断片を含む。好ましいペプチドはリポペプチド、糖ペプチドおよび糖リポペプチド（glycolipopeptide）を含む。生物学的製剤は、無傷のＤＮＡまたはｍＲＮＡ分子などのＤＮＡ類またはＲＮＡ類、およびヌクレオシド、ヌクレオチド並びにオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドであってもよい。また、生物学的製剤は、合成有機分子類または天然有機分子類、ビタミン類、ステロイド類、免疫調節物質類、抗生物質類、抗腫瘍抗原類、抗炎症剤類、抗血管形成剤類、ケモカイン類、中枢神経系に作用する薬剤類、アジュバント類並びに細菌、ウィルスおよび寄生虫などの感染性病原体の抗原類であってもよい。
【００１９】
脂質の主要な相転移温度（Ｔｍ）より高い温度の短時間の超音波浴を、溶解を促進するために使用することができる。本発明の主要な相転移温度は、典型的な水和脂質が、炭化水素鎖が秩序よく整列しているゲル相から、炭化水素鎖が無秩序な状態の液晶相に転移する温度をいう。得られた透明なアルコール溶液は、例えば、０．２２ミクロンのフィルターでろ過することにより滅菌することができる。
【００２０】
第二に、例えば、絶えず撹拌しながらポリマーに水を混合することによって水溶性ポリマーの別の溶液（separate solution）が提供される。好適な水溶性ポリマーは、例えば、ヒドロキシル、エーテルおよびアミン基のような基から選択される極性基を保有するモノマーから製造される。それらには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびデキストランが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で、典型的には、ＰＥＧ１，０００（Ｍ．Ｗ．  １，０００）、ＰＥＧ６，０００（Ｍ．Ｗ．  ６，０００）またはＰＥＧ２０，０００（Ｍ．Ｗ．  ２０，０００）である。１０％〜約５０％（ｗ／ｗ）の範囲のポリマー濃度が使用される。重合程度の高いＰＥＧ類、例えば、ＰＥＧ６，０００は、毒性がないので使用される。ＰＥＧ溶液の塩分含量は、例えば、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ、好ましくは、５０〜１５４ｍＭのＮａＣｌ）を添加することによって０〜約１０％（ｗ／ｖ）に調節することができる。この範囲は、最適な取り込み、得られるリポソームサイズおよび薬剤の作用に基づく。ポリマー溶液は、例えば、ろ過（０．２２ミクロンフィルター）または高圧蒸気滅菌によって滅菌することができる。必要に応じて、水溶性薬剤をポリマー溶液に添加することができる。
【００２１】
第三に、所定の体積比で（例えば、４：１〜１：４の脂質アルコール：ＰＥＧ（ｖ／ｖ））、滅菌した脂質／薬剤アルコール溶液をポリマー／薬剤水溶液に直接注入するか、またはＰＥＧ溶液に向かい合わせの流れのアルコール溶液（opposing stream of the alcohol solution）を誘導することによって混合する。基本的には、以下の実施例に詳細に示すように、ポリマーに対する脂質の比、ポリマーの平均分子量、ポリマー濃度、塩含量（イオン強度）並びに注入温度およびインキュベーション温度は、リポソームサイズおよび薬剤の取り込みをコントロールする際の変数である。
【００２２】
第四に、均一な懸濁液を得るのに十分な時間にわたって得られた混合物をインキュベーションする。典型的なインキュベーション時間は、断続的に混合しながら、約４℃〜約５５℃の温度範囲において少なくとも１５分〜約２４時間実施する。成分を、確実に十分に混合するために、混合温度およびインキュベーション温度は、好ましくは、液体混合物のＴｍより高い温度である。取り込んだ薬剤の安定性を確保するために、高温への長時間の暴露は避けるべきである。
【００２３】
第五に、ポリマーおよびアルコールは、典型的には、リポソームを洗浄することによって除去される。一つの洗浄方法は、滅菌水を添加して混合物を遠心分離し、次に滅菌水または通常の生理食塩液（０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）のような生理学的に許容されうる溶液でリポソームペレットを懸濁させることによる。ポリマーおよびアルコールが十分に除去されるまで、遠心分離および懸濁化を繰り返し実施する。最終的なペレットを生理学的に許容されうる溶液に懸濁させ、望ましい最終的な脂質濃度を達成する。この濃度は製剤に依存するが、好ましくは約１５〜５０ｍｇ／ｍＬのバルク脂質（ｗ／ｖ）である。洗浄は、無菌条件下において標準的なダイアフィルトレーション方法によっても実施することができる。最終的なリポソームは、薬剤が組み込まれている多層膜小胞（ＭＬＶ）である。ＭＬＶｓの典型的な平均サイズは、使用するパラメーターに応じて、１〜８ミクロンの範囲である。
【００２４】
大型多層膜リポソームを製造する本発明は、エタノール（Ｂａｔｚｒｉ  ａｎｄ  Ｋｏｒｎ，１９７３、Ｋｒｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７）または水不混和性溶媒（Ｃｏｅ  ｅｔａｌ．，１９９６）に溶解した脂質を水または緩衝水溶液に注入することに基づく従来技術よりも、簡単かつ安全で、かかる従来技術とは異なる。後者の手法は、主に、平均径が約２５ｎｍ〜２００ｎｍの小型単層膜小胞（ＳＵＶ）を産生する。また、本発明によって製造される多層膜小胞（ＭＬＶ）は、典型的には、１〜８ミクロンの範囲の平均径を有し、Ｃｏｅら（１９９６）またはＬｅｉｇｈ（１９９１）によって得られるものより大きい。
【００２５】
特定の理論に結びつける意図はないが、ポリマーが存在することにより脂質分子は合体して大型の多層膜小胞を形成すると考えられる。ポリマー溶液中のアルコールを過剰のバルク水および結合水と交換すると、脂質分子は速やかに水和されて、自然に大型の二重膜構造を形成する。ＭＬＶ内の小体積の「自由（free）」水が、薬剤を二重膜疎水性中心または膜層間の水性空間に大量に取り込む。得られたＭＬＶのサイズおよび薬剤の大量取り込みにより、それらは治療薬送達のための優れた候補になる。
【００２６】
上記発明により製造されたリポソームは、組み込んだ抗原に対する強力なインビボ免疫を誘導することを含むさまざまな用途に使用することができる。リポソームは、現在数多くの免疫化手法に使用されている。本発明のリポソームはそのような手法にとって代わることができる。具体的には、本発明の方法はワクチンの製造にも適用されている。
【００２７】
ほぼあらゆる種類の抗原を、例えば、腫瘍抗原を含むワクチンを製造するための本発明のリポソームに組み入れることができる。抗原をコードするＤＮＡおよびＲＮＡも使用することができる。腫瘍抗原は、肺癌、結腸癌、黒色腫、神経芽細胞腫、乳癌、卵巣癌等から誘導することができる。好ましい腫瘍抗原はＭＵＣ−１並びに関連する抗原ペプチドおよびそれらの誘導体である。ＭＵＣ−１ムチンは、２０個のアミノ酸配列のタンデム反復と高度に分岐した炭水化物側鎖からなるタンパク質コアを有する高分子量の糖タンパク質である。グリコシル化程度の低いＭＵＣ−１タンパク質は、乳癌、結腸癌、肺癌、卵巣癌および膵臓癌などの多数のヒト腺癌において分泌され、多量に過剰発現される。高いレベルのＭＵＣ−１発現は高い転移の可能性および予後不良に関連する。従って、ＭＵＣ−１はこれらの癌の臨床的に重要なマーカーである。特に有用な抗原性ＭＵＣ−１ペプチド誘導体は、標準的な方法により脂質で修飾および／または炭水化物で修飾されていてもよい２０個のアミノ酸の反復配列に基づいている。
【００２８】
好ましいＭＵＣ−１ペプチドは、以下の配列によって与えられる、２５量体の抗原性ＭＵＣ−１由来リポペプチドであるＢＰ１−１４８である。
ＮＨ2−［ＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰ（Ｋ−パルミトイル）Ｇ］−ＣＯＯＨ。
２つの非ＭＵＣ−１アミノ酸を、合計２７のアミノ酸を作製するための、脂質末端に付着させるための足場として添加する。ＢＰ１−１４８は、Ｃ末端リジンのεアミノ基にパルミトイル基を有する。このリポペプチドは、いくつかの異なる種類の癌についての臨床試験で現在使用されているリポソームワクチン（ＢＬＰ−２５）の免疫原である。脂質末端を有する形態および脂質末端のない形態のＢＰ１−１４８は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする１９９８年５月８日出願のＡｇｒａｗａｌ，Ｂらの米国特許出願番号第０９／０７４，４１０号および１９９９年１月１５日出願のＢｏｎｉら、米国特許出願番号第０９／２３１，６４１号にそれぞれ記載されている。
【００２９】
本発明によるリポソームワクチン製剤は、一種以上の免疫調節物質を含んでもよい。免疫調節物質は、免疫応答を変更し、好ましくは抗原に対する応答を刺激する任意の物質である。典型的な免疫調節物質には、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）、リピドＡ、合成リピドＡおよびその変種、ムラニルジペプチド、ＣｐＧオリゴ並びにリポテイコ酸などのアジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。ＭＰＬＡは、特定のＴリンパ球に対する抗原提示細胞によるリポソーム抗原の発現を増加させる効果的なアジュバントとして働くことが示されている（Ａｌｖｉｎｉｎｇ，Ｃ．Ｒ．１９９３）。他の免疫調節物質には、サイトカインおよびリンフォカイン、特にインターロイキン−２（ＩＬ−２）、ケモカインおよび補助刺激分子、特にＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ８０およびＣＤ８６が挙げられる。
【００３０】
以下は、ＰＥＧへの注入を使用する本発明の方法の実施例である。それらは、最適なリポソーム薬剤を製造するのに役立てるために異なってもよい多数のパラメーターを示すために提供されている。これらの実施例は本発明を例示するために提供されており、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００３１】
［リポソームサイズに対する水およびＰＥＧ注入方法の影響］
この実施例は、ＰＥＧ水溶液に脂質混合物を直接注入することによって平均リポソームサイズが大きいリポソームを得ることができることを証明している。注入媒体として水を用いると、より小型サイズのリポソームが得られた。
【００３２】
脂質製剤（１７．４４ｍｇのＤＰＰＣ、２．１８ｍｇのＤＭＰＧおよび１０．４ｍｇのコレステロール（５０Ｍｏｌ％））を０．７８ｍＬのエタノールおよび０．０４ｍＬの脱イオン水に溶解した。超音波処理浴中で５５℃において短時間の超音波処理を実施した。次いで、３．１８ｍＬの脱イオン水、または３．１８ｍＬの５０％（ｗ／ｗ）の「ＰＥＧ６，０００を含む脱イオン水に、透明な溶液を注入した。混合物を２５℃において１時間放置し、次いで通常の生理食塩液（０．９％のＮａＣｌ（ｗ／ｖ））で５０ｍＬに希釈し、その後１８，０００ｒｐｍおよび４℃において３０分間遠心分離することによりペレット化した（ＳｏｒｖａｌｌＳＳ−３４ローター）。ペレットを５０ｍＬの通常の生理食塩液に懸濁させることによって３回洗浄し、上記のように遠心分離した。最終的なペレットを１．５ｍＬの通常の生理食塩液に懸濁させた。
【００３３】
平均リポソームサイズは、水に注入した試料では０．４μｍであったが、５０％のＰＥＧ水溶液に注入した同じ脂質混合物は、平均リポソームサイズが２．１２μｍであった（表１）。これは、脂質の組成、水和溶媒および注入体積などの他のパラメーターを一定にしたとき、ＰＥＧ溶液への注入の結果として形成されるリポソームの平均径は水に注入したものより顕著に増加していることを示している。
【００３４】
【表１】
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【実施例２】
【００３５】
［リポソームサイズに対する脂質組成の影響］
この実施例は、脂質の組成が平均リポソームサイズに影響を与えることを示す。実施例１の脂質製剤を１９．７４ｍｇのＤＰＰＣおよび１０．４ｍｇのコレステロールに変更した（すなわち、ＤＭＰＧを除いた）。リポソームは、５０％のＰＥＧ６，０００を水に注入することによって、実施例１と同じ方法で製造した。得られた平均リポソームサイズは、実施例１で製剤化したＰＥＧ注入において２．１２μｍであったのと比較して、１．４０μｍであった（表１）。これは、リポソームサイズが脂質の組成に大きく依存していることを証明している。
【００３６】
コレステロールは、立体配座的に柔軟でなく、水に不溶性の平面的なステロイド環を有する。従って、コレステロールを添加すると、脂質の炭化水素鎖の立体配座的な柔軟性が制限されることによって脂質二重膜が配列され、より平面的な（湾曲の少ない）二重膜が得られる。結果として、二重膜の充填欠損が減って受動的透過性が低下している（すなわち、溶質の漏れを少なくする）、より大型のリポソーム（平面的）が形成される。
【実施例３】
【００３７】
［大型リポソームを製造する際の要件］
この実施例は、大型リポソームの製造は添加する異なる脂質混合物に依存するだけでなく、使用する種々のＰＥＧ濃度にも依存することを証明している。
【００３８】
図１は、実施例１および実施例２の製剤を２５℃において０．１０％、２５％および５０％（ｗ／ｗ）のＰＥＧ溶液に注入したときに得られる平均リポソームサイズを比較している。図からわかるように、脂質混合物が異なると、大型リポソームを製造するためのＰＥＧ濃度の要件が異なる。
【実施例４】
【００３９】
［５０％のＰＥＧ６，０００を使用したときの、平均リポソームサイズに対する注入温度の影響］
５０％のＰＥＧ６，０００を用いると、より高温において、より大型のリポソームを得ることができることをこの実施例は示している。
【００４０】
実施例２と同じ製剤を作製した。ＰＥＧ注入およびインキュベーション温度は、２５℃ではなく５５℃とした。得られた平均リポソームサイズは、２５℃においては１．５２μｍであったのと比較して、５５℃では１．９４μｍであった（図２）。従って、大型リポソームを得るために温度を上昇させることができる。また、より小型サイズのリポソームを得るためには温度を低下させることができる。
【実施例５】
【００４１】
［２５℃および５５℃における平均リポソームサイズに対するＰＥＧ重合の影響］
リポソームサイズはＰＥＧの分子量に直接依存することをこの実施例は証明している。
【００４２】
ＰＥＧ６，０００の代わりに５０％のＰＥＧ２０，０００を用いて、実施例２と同じ製剤を作製した。平均リポソームサイズは２５℃において３．００μｍであり、５５℃において３．９７μｍである。これらの結果をＰＥＧ６，０００を用いて得られるリポソームサイズと比較すると（図３）、より大きいＭＷのＰＥＧへの注入により大型のリポソームが作製されると思われる。
【実施例６】
【００４３】
［最終的なリポソームサイズに対する塩濃度の影響］
この実施例は、ＰＥＧ溶液のイオン強度が最終的なリポソームサイズに与える影響および脂質組成に対するその依存性を示す。
【００４４】
実施例１および実施例２と同じ製剤を作製したが、５０％のＰＥＧ６，０００を１０％のＮａＣｌに注入した。図４に示すように、ＰＥＧ６，０００の高イオン強度媒体溶液への２５℃における注入により、平均リポソームサイズは２．４８μｍ（ｗ／ＤＭＰＧ）および１．６８μｍ（ｗ／ｏＤＭＰＧ）であった。一方、ＰＥＧ６，０００の低イオン強度溶媒溶液に注入した同様の製剤は、それぞれ、２．１２μｍおよび１．４μｍであり、より小型のリポソームサイズを生じた（表１）。実施例４に記載した温度の影響と矛盾することなく、５５℃では、ＰＥＧ６，０００の高イオン強度媒体溶液への注入は、平均リポソームサイズを３．６９μｍ（ｗ／ＤＭＰＧ）および４．１２μｍ（ｗ／ｏＤＭＰＧ）に増加した。従って、ＰＥＧ溶液のイオン強度は最終的なリポソームサイズに影響を与えることができる。
【実施例７】
【００４５】
［体積のより増加したＰＥＧ６，０００の１０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ溶液がリポソームサイズに与える影響］
この実施例は、体積のより増加したＰＥＧ６，０００の１０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ溶液に注入すると、平均リポソームサイズが低下することを示す。
【００４６】
実施例１および実施例２の方法において、ＤＭＰＧの０．７８ｍＬのエタノールおよび０．０４ｍＬの脱イオン水溶液を用いる場合、および用いない場合に製剤を作製した。これらの製剤を、２５℃または５０℃において、１０％のＮａＣｌを含有する５０％の３．２ｍＬ、１．６ｍＬ、０．８ｍＬおよび０．４ｍＬのＰＥＧ６，０００溶液に注入した。図５は、ＰＥＧ溶液：注入媒体の比（ｖ／ｖ）が増加すると、平均リポソームサイズが低下することを示す。この影響は、２５℃および５０℃において観察され、ＤＭＰＧ添加とは関係ないと思われる。
【実施例８】
【００４７】
［ＰＥＧおよび生理食塩液の注入がリポソームサイズに与える影響に対する種々のコレステロール含量の影響］
０ｍｇ〜１０．４ｍｇ（０〜５０Ｍｏｌ％）の範囲のコレステロールを含有する１９．７５ｍｇのＤＰＰＣの脂質製剤を０．７８ｍＬのエタノールおよび０．０４ｍＬの水に溶解した。ＰＥＧ（１０％ＮａＣｌ溶液）および生理食塩液（ｗ／ｏＰＥＧ）注入により大型リポソームが形成された。図６は、コレステロール含量が高い場合には、生理食塩液注入は、小胞サイズが低下したことを示している。一方、コレステロール含量が増加している場合には、ＰＥＧ注入は小胞サイズの増加を証明している。これは、コレステロール含量が高いとき、ＰＥＧ注入はより大型の小胞を製造するためにより適当であることを示している。
【実施例９】
【００４８】
［直接ＰＥＧ注入により製造したリポソームワクチンによるペプチド特異的細胞応答の誘導］
この実施例の目的は、ＰＥＧの直接注入により製造されるリポソームワクチンは抗原性応答を刺激することができることを例示することである。
【００４９】
試料ＦＷ９１６９９−１は、ＤＰＰＣ、コレステロール、リピドＡおよびＢＰ１−１４８を含有するエタノール溶液を５０％（ｗ／ｗ）ＰＥＧ６，０００の１０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌに注入することによって製造した。試料ＦＷ９１６９９−２は、同様の方法であるが、ＰＥＧ２０，０００の水溶液に注入して製造した。通常の生理食塩液で洗浄し、次に遠心分離してＰＥＧを除去し、ペレット化したＭＬＶを得た。これらを、現在臨床試験で使用されている対照のＢＬＰ２５ワクチン製剤、ＢＵＳＡ２７と比較した。ＢＵＳＡ２７は、最初にエタノール注入によりＬＵＶを製造し、次に凍結乾燥し、滅菌した通常の生理食塩液で再構成してＭＬＶを製造することによって調製した。ＢＵＳＡ２７もＤＰＰＣ、コレステロール、リピドＡおよびＢＰ１−１４８を含有するが、さらに５．９Ｍｏｌ％のＤＭＰＧを含有する。
【００５０】
各製剤をＣ５７ＢＬ／６マウスの鼠径部に皮下注射した。注射から９日後に、脾臓およびリンパ節を取り出し、細胞に解離した。細胞を、ＢＰ１−１４８の非パルミチン酸化型であるペプチドＢＰ１−１５１、陰性対照ペプチドＢＰ−０７２または培地と共に７２時間培養した。リンパ節細胞の増殖はＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅアッセイによって測定し、ＩＦＮ−γの放出は取り込みＡｂアッセイで測定した。
【００５１】
表２は、脂質製剤、ＦＷ９１６９９−１およびＦＷ９１６９９−２は、マウスにおいてペプチド特異的（ＢＰ１−１５１）な免疫応答を誘導することを示す。
【００５２】
【表２Ａ】
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【００５３】
【表２Ｂ】
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【００５４】
【表２Ｃ】
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【実施例１０】
【００５５】
［異なるＢＬＰ−２５様リポソームワクチン製剤によるＴ細胞の増殖およびγ−インターフェロン産生］
直接ＰＥＧ注入により製剤化したＢＬＰ−２５様リポソームワクチンは、Ｔ細胞増殖およびＩＦＮ−γ産生を誘導することにより細胞性免疫応答を刺激することができることをこの実施例は提供する。
【００５６】
温度、注入速度および混合速度をコントロールすることによって、ＰＥＧ注入方法により製造したＢＬＰ−２５ワクチンの４つの液体製剤を作製した。ＢＵＳＡ２７のように製造した２つの別のロットである、ＢＵＳＡ０１４およびＢＵＳＡ２６と命名される標準的な製剤とこれらを比較した。両方の標準品は、ＢＵＳＡ２７の手法により作製し、ＤＰＰＣ、コレステロール、リピドＡ、ＢＬＰ−１４８および５．９Ｍｏｌ％のＤＭＰＧを含有する。注入は生理食塩液単独または５０％のＰＥＧ６，０００の１０％ＮａＣｌ溶液に行った。製剤の成分は、表３に示すように、ＤＭＰＧを含有するおよび含有しない、ＤＰＰＣ（１１．６ｍｇ／ｍＬ）、コレステロール（６．９ｍｇ／ｍＬ）、ＢＰ−１４８（４００μｇ／ｍＬ）およびリピドＡ（２００μｇ／ｍＬ）である。これらの製剤は、ろ過滅菌したリン酸緩衝生理食塩液（１０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、ｐＨ６．６）に対して、１５〜２０ｐｓｉの一定の吸入圧においてダイアフィルトレーションすることにより洗浄した。ＰＥＧへの注入およびＤＭＰＧの添加は共にＢＰ１−１４８ペプチドの高い回収に寄与した（表３）。
【００５７】
【表３】
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【００５８】
ペプチド特異的な免疫応答（Ｔ細胞の増殖およびＩＦＮ−γ産生）を誘導する効力を求めるために、これらの製剤をＣ５７ＭＬ／６マウスに注射した（皮下、鼠径部）。図７Ａは、４つの製剤は全て、流入領域リンパ節のＴ細胞のＢＰ１−１４８特異的増殖応答を誘導しており、これは標準的な製剤ＢＵＳＡ２６およびＢＵＳＡ０１４により誘導されるものに匹敵することを証明している。図７Ｂは、４つの液体製剤全ておよび標準的な製剤、ＢＵＳＡ２６およびＢＵＳＡ０１４はＴ細胞も刺激して、インビトロにおけるＢＰ１−１４８による再刺激に応答して、大量のＩＦＮ−γを産生させることを示している。細胞によって放出されるＩＦＮ−γの量は、大まかには、個々の製剤におけるＢＰ１−１４８ペプチドの回収量に関連していた（表３）。
【００５９】
［参照文献］
【表４Ａ】
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【００６０】
【表４Ｂ】
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【００６１】
【表４Ｃ】
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【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】大型リポソームを製造するための異なる脂質混合物による種々のＰＥＧ６，０００濃度の必要量を示す。
【図２】５０％のＰＥＧ６，０００を使用したとき、注入温度が平均リポソームサイズに与える影響を示す。
【図３】５０％のＰＥＧ２０，０００を使用したとき、注入温度が平均リポソームサイズに与える影響を示す。
【図４】ＰＥＧ溶液のイオン強度が最終的なリポソームサイズに与える影響およびＰＥＧ溶液のイオン強度の脂質組成への依存を示す。
【図５】ＰＥＧ溶液の体積およびイオン強度の、リポソームサイズへの依存を示す。
【図６】種々のコレステロール含量は、ＰＥＧおよび生理食塩液注入がリポソームサイズに対して与える影響にさまざまに影響することがあることを示す。
【図７Ａ】ＢＬＰ−２５製剤によるワクチン化後のリンパ節Ｔ細胞の増殖を示す。
【図７Ｂ】ＢＬＰ−２５製剤を注射したマウスのＴ細胞によるインターフェロン−γ産生を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004522717.tif 000054
【国際調査報告】
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