(57)【要約】【課題】被験者の破骨細胞関連骨疾患を治療し、予防し又は寛解するための活性を目的として化合物を探索する方法を提供する。【解決手段】本発明は、ＣＩＣ−３、ＣＩＣ−６，ＣＩＣ−７及びこれらの機能的な類縁体から成る群から選択される塩素チャンネルの一種又はそれ以上を用いて、破骨細胞関連骨疾患を治療するための活性を目的として化合物を探索する方法に係わる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記する工程を含んで成る、被験者の破骨細胞関連骨疾患を治療し、予防し又は寛解するための活性を目的として化合物を探索する方法：
●  ＣＩＣファミリーの塩素チャンネルの一種又はそれ以上を含んで成る試験細胞を用意すること；
●  該試験細胞を当該化合物の作用に供すること；及び
●  当該化合物が選別塩素チャンネルを遮断・閉塞する性能を測定すること。
【請求項２】
該試験細胞が、ＣＩＣ−３、ＣＩＣ−６，ＣＩＣ−７及びこれらの機能的な類縁体から成る群から選択される塩素チャンネルの一種又はそれ以上を含んで成ることを特徴とする、請求項１において記載された方法。
【請求項３】
該破骨細胞関連疾患が、骨粗しょう症、骨溶解性ガン浸潤、骨化石症又はページェット骨病であることを特徴とする、請求項１又は２のうちの何れか一項において記載された方法。
【請求項４】
請求項１乃至３のうちの何れか一項において記載された方法によって一種の化合物の同定を行うことを含んで成る、医薬開発方法。
【請求項５】
請求項１乃至３のうちの何れか一項において記載された方法によってＣＩＣファミリー塩素チャンネルの遮断剤として同定された化合物又はその薬学的に許容可能な塩若しくはプロドラッグを被験者の破骨細胞関連骨疾患を治療し、予防し又は寛解する医薬を製造するために使用する方法。
【請求項６】
請求項１乃至３のうちの何れか一項において記載された方法によってＣＩＣファミリー塩素チャンネルの遮断剤として同定された化合物又はその薬学的に許容可能な塩若しくはプロドラッグの治療有効量を被験者に投与することを含んで成る、被験者の破骨細胞関連骨疾患を治療し、予防し又は寛解するための方法。
【請求項７】
ＣＩＣファミリー塩素チャンネルの遮断剤又はその薬学的に許容可能な塩若しくはプロドラッグを被験者の破骨細胞関連骨疾患を治療し、予防し又は寛解する医薬を製造するために使用する方法。
【請求項８】
ＣＩＣファミリー塩素チャンネルの遮断剤又はその薬学的に許容可能な塩若しくはプロドラッグの治療有効量を被験者に投与することを含んで成る、被験者の破骨細胞関連骨疾患を治療し、予防し又は寛解するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、破骨細胞関連骨疾患を治療するための活性を目的として化合物を探索するための方法に係わる。
【背景技術】
【０００２】
細胞は、細胞膜によってその外部環境から保護されている。外界との情報伝達を行うために、細胞は、外部分子と結合して細胞内信号伝達機構を活性化し、又は可溶物を細胞内外に輸送する細胞膜貫通（トランスメンブラン）タンパク質を産生している。イオンチャンネルは、細胞膜貫通タンパク質であって、細胞膜を経由した無機イオンの輸送を接触する。
【０００３】
かかるイオンチャンネルは、作動電位の発生とタイミング、シナプス伝達、ホルモン分泌、筋肉収縮、シグナル伝達など、多様なプロセスに関与している。イオンチャンネルは、チャンネルが移送するイオンに従って、即ちＫ+チャンネル、Ｎａ+チャンネル及びＣｌ―チャンネルなどに分類される。Ｃｌ―チャンネルは、恐らくは細菌類から哺乳動物にいたる生物のあらゆる細胞内に認められるであろう。その生理学的機能は、細胞容積調節から膜電位の安定化、経上皮又は細胞間輸送及び細胞内小器官の酸性化に至るまで広範に渉る。このように相異なる機能は、機能的に分化発現し且つ種々の刺激により制御される、多くの明白な塩素イオンの存在を必要とする。
【０００４】
骨粗しょう症とＣｌ−（塩素イオン）チャンネル
健常な骨は、進行する骨形成と骨吸収のプロセスとの均衡から生じる。骨形成は、骨芽細胞の活動度に依存し、一方破骨細胞は、骨吸収に関与する。
【０００５】
骨粗しょう症の病因は、破骨細胞の活動度が優勢となった結果生じる、骨形成と骨吸収との不均衡により生じ得ることが知られている。
【０００６】
破骨細胞は、骨に接触付着し、かくして骨吸収コンパートメントが、破骨細胞と骨との間に生じる空洞部として形成される。このコンパートメントは、密に封止され、細胞周囲コンパートメントからは隔離される。骨接触付着が生起すると直ちに、破骨細胞の原形質膜は、変形膜に変わり、骨吸収コンパートメントの仕切りを無くするに至る。
【０００７】
破骨細胞により仲介される骨吸収プロセスは、骨吸収コンパートメントの酸性化に高度に依存している。Ｈ+−ＡＴＰアーゼは、プロトンをこの変形膜を通過して破骨細胞のサイトゾルから骨吸収コンパートメント内に輸送するのである。破骨細胞サイトゾルに由来するＣｌ―イオンは、受動的にかかるプロトンに従ってこの変形膜中のアニオンチャンネルを経由して骨吸収コンパートメントに到る。このようなプロトンとＣｌ―イオン（ＨＣｌを生成する）との協調した輸送が、骨吸収コンパートメントを酸性化させて、その結果ミネラル骨成分が溶解し、その結果タンパク質部分が、破骨細胞プロテアーゼの作用に暴露されるのであるい。
【０００８】
Schlesinger,P.H.ら(J. Biol. Chem. (1997)272, 18636-18643)は、破骨細胞内に発現したアニオンチャンネルの一種が、ウシｐ６４Ｃｌ―チャンネルに関連していることを開示しているが、その変形膜Ｃｌ―チャンネルの分子構造は、知られていない。
【０００９】
ＷＯ００／２４７０７は、塩素チャンネル遮断剤として有用な化合物を開示している。
【特許文献１】
ＷＯ００／２４７０７
【非特許文献１】
J. Biol. Chem. (1997) 272, 18636-18643
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、破骨細胞関連骨疾患、例えば骨粗しょう症などの患者を治療するために、更に有効で且つ選択性の高く而も副作用の少ない化合物が提供されることに対する関心は強い。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明に従えば、ＣＩＣファミリーの塩素チャンネルが、骨吸収に関与していることが発見されたのである。従って、ＣＩＣファミリーの塩素チャンネル、例えばＣＩＣ−３、ＣＩＣ−６及びＣＩＣ−７などは、例えば骨粗しょう症などの破骨細胞関連骨疾患の治療を行うための分子標的を構成するのである。
【００１２】
即ち、本発明はその第一の局面において、被験者の破骨細胞関連骨疾患を治療し、予防し又は寛解するための活性を目的として化合物を探索する方法に係わる。
【００１３】
本発明はその第二の局面において、医薬の開発方法に係わる。
【００１４】
本発明はその第三の局面において、ＣＩＣファミリー塩素チャンネルの遮断剤として前記探索方法により同定された化合物を被験者に被験者の破骨細胞関連骨疾患を治療し、予防し又は寛解するために使用する方法に係わる。
【００１５】
本発明はその第四の局面において、ＣＩＣファミリー塩素チャンネルの遮断剤を被験者の破骨細胞関連骨疾患を治療し、予防し又は寛解するために使用する方法に係わる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のその他の目的は、下記する説明及び実施例に基けば当業者には明らかとなるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明はその第一の局面において、下記する工程を含んで成る、被験者の破骨細胞関連骨疾患を治療し、予防し又は寛解するための活性を目的として化合物を探索する方法を提供するものである：
●  ＣＩＣファミリーの塩素チャンネルの一種又はそれ以上を含んで成る試験細胞を用意すること；
●  該試験細胞を当該化合物の作用に供すること；及び
●  当該化合物が選別塩素チャンネルを遮断・閉塞する性能を測定すること。
【００１８】
本発明はその第二の局面において、上記した方法により化合物の同定を行うことを含んで成る、医薬の開発方法を提供するものである。
【００１９】
本発明はまた別局面において、上記した方法によってＣＩＣファミリー塩素チャンネルの遮断剤として同定された化合物又はその薬学的に許容可能な塩若しくはプロドラッグを被験者の破骨細胞関連骨疾患を治療し、予防し又は寛解する医薬を製造するために使用する方法を提供するのである。
【００２０】
本発明は又更なる別の局面において、上記した方法によってＣＩＣファミリー塩素チャンネルの遮断剤として同定された化合物又はその薬学的に許容可能な塩若しくはプロドラッグの治療有効量を被験者に投与することを含んで成る、被験者の破骨細胞関連骨疾患を治療し、予防し又は寛解する方法を提供するのである。
【００２１】
本発明は又更なる別の局面において、ＣＩＣファミリー塩素チャンネルの遮断剤として同定された化合物又はその薬学的に許容可能な塩若しくはプロドラッグを被験者の破骨細胞関連骨疾患を治療し、予防し又は寛解する医薬を製造するために使用する方法を提供するのである。
【００２２】
本発明は又更なる別の局面において、ＣＩＣファミリー塩素チャンネルの遮断剤として同定された化合物又はその薬学的に許容可能な塩若しくはプロドラッグの治療有効量を被験者に投与することを含んで成る、被験者の破骨細胞関連骨疾患を治療し、予防し又は寛解するための方法を提供するのである。
【００２３】
ある一つの実施態様においては、該試験細胞は、ＣＩＣ−３、ＣＩＣ−６，ＣＩＣ−７及びこれらの機能的な類縁体から成る群から選択される塩素チャンネルの一種又はそれ以上を含んで成るのである。また特別の実施態様においては、該試験細胞は、ＣＩＣ−３、ＣＩＣ−６及びＣＩＣ−７から成る群から選択される塩素チャンネルの一種又はそれ以上を含んで成る。
【００２４】
また別の実施態様においては、該破骨細胞関連疾患は、骨粗しょう症、骨溶解性ガン浸潤、骨化石症又はページェット骨病である。
【００２５】
また更に別の実施態様においては、ＣＩＣファミリー塩素チャンネルの遮断剤が、ＣＩＣ−３、ＣＩＣ−６及びＣＩＣ−７から成る群から選択された一種の塩素チャンネルの遮断剤である。
【００２６】
ある特別な実施態様においては、ＣＩＣファミリーの塩素チャンネルの遮断剤は、ＣＩＣ−１，ＣＩＣ−２、ＣＩＣ−４，ＣＩＣ−５，ＣＩＣ−Ｋａ及びＣＩＣ−Ｋｂから成る群から選択された塩素チャンネルの遮断剤ではないのである。
【００２７】
本発明の文脈において、“破骨細胞関連骨疾患”なる用語は、例えば骨粗しょう症、骨溶解性ガン浸潤、骨化石症又はページェット骨疾患など破骨細胞関連疾病又は疾患に関連づけられた骨吸収の偏位の如何なるものをも包含する。
【００２８】
本発明に従って治療される被験者は、かかる治療を必要とする生体、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトである。
【００２９】
本発明の文脈において、ＣＩＣファミリーの塩素チャンネルは、Fahlke,CがKidney Int (2000) 57(3): 780-6において記載しているようにＰ１領域において当該記号を有する塩素チャンネルである。
【００３０】
本発明の文脈において、CIC-3は,Borsani et al [Genomics (1995)27(1)131-141]によって記載され且つGenBank Acc. No. AF29348が付与されているＣＩＣファミリーの塩素チャンネルである。
【００３１】
本発明の文脈においては、本発明の文脈において、ＣＩＣ−６は，Brand,S et al (FEBS lett. (1995)377 15-20)によって記載され且つGenBank Acc. No. AF209724が付与されているＣＩＣファミリーの塩素チャンネルである。
【００３２】
本発明の文脈において、ＣＩＣ−７は，Brand,S et al (FEBS lett. (1995) 377 15-20)によって記載され且つGenBank Acc. No. AF224741が付与されているＣＩＣファミリーの塩素チャンネルである。
【００３３】
塩素チャンネルであるＣＩＣ−３，ＣＩＣ−６及びＣＩＣ−７の機能的類縁体は、これら修飾変成を受けていない塩素チャンネルと比較して実質的に同一活性を有する塩素チャンネルである。かかる類縁体としては、例えば他の種に由来するスプライス(splice)変異体、アイソフォーム、類縁体が挙げられる。
【００３４】
当該試験細胞においては、これらの塩素チャンネルは、例えばＣＩＣ−３とＣＩＣ−６とのヘテロダイマーなどのようにホモダイアマー又はヘテロダイマーの何れかである二量体として存在する可能性がある。
【００３５】
本発明の文脈において、例えばＣＩＣ−３，ＣＩＣ−６及びＣＩＣ−７などのＣＩＣファミリーの塩素チャンネルの遮断剤は、前記塩素チャンネルを閉塞・遮断する化合物である。
【００３６】
ある化合物が、例えばＣＩＣ−３，ＣＩＣ−６及びＣＩＣ−７などの特異的な塩素チャンネルを閉塞・遮断する性能は、実施例4の方法において記載したように測定することが出来る。
【００３７】
ある実施態様においては、ＣＩＣファミリーの塩素チャンネルの遮断剤が、ＣＩＣ−３を閉塞・遮断することが出来る性能は、ＩＣ50値として１００μＭ以下であり、好ましくは１０μＭ以下であり、又より好ましくは１μＭ以下である。
【００３８】
更なる実施態様においては、ＣＩＣファミリーの塩素チャンネルの遮断剤が、ＣＩＣ−６を閉塞・遮断することが出来る性能は、ＩＣ50値として１００μＭ以下であり、好ましくは１０μＭ以下であり、又より好ましくは１μＭ以下である。
【００３９】
更に別の実施態様においては、ＣＩＣファミリーの塩素チャンネルの遮断剤が、ＣＩＣ−７を閉塞・遮断することが出来る性能は、ＩＣ50値として１００μＭ以下であり、好ましくは１０μＭ以下であり、又より好ましくは１μＭ以下である。
【００４０】
更なる別の実施態様においては、ＣＩＣファミリーの塩素チャンネルの遮断剤が、ＣＩＣ−１、ＣＩＣ−２，ＣＩＣ−４，ＣＩＣ−５，ＣＩＣ−Ｋａ及びＣＩＣＩ−Ｋｂを閉塞・遮断することが出来る性能は、ＩＣ50値として１μＭ以上であり、好ましくは１０μＭ以上であり、又より好ましくは１００μＭ以上である。
【００４１】
かかる塩素チャンネルは、本探索方法において使用する試験細胞にとって内因性、即ち細胞中に天然に存在する塩素チャンネルであってもよいか又はそうでなくてもよい。
【００４２】
好ましくは、該塩素チャンネルは、対象試験細胞にとって外因性であって、具体的には例えばトランスフェクションや感染などの組換えＤＮＡ技術によって導入することが出来る。かかる細胞としては、例えばヒト胚腎（ＨＥＫ）細胞、具体的にはＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)卵母細胞、又は塩素チャンネルに結合能を有する他の全ての細胞株が挙げられる。
【００４３】
本発明に係わる化合物の薬学的に許容可能な付加塩の例としては、無機酸及び有機酸の付加塩、例えば塩酸塩、臭素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、マンデル酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、桂皮酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、グルタミン酸塩、グリコール酸塩、トルエン−ｐ−スルホン酸塩、ギ酸塩、マロン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、サリチル酸塩及び酢酸塩が挙げられる。かかる塩は、当業界において公知の方法によって形成される。
【００４４】
その他の酸類、例えば蓚酸などは、それ自体薬学的に許容可能ではないものの、本発明の化合物及びその薬学的に許容可能な付加酸塩を得る際の中間体として有用であり得る。
【００４５】
本発明に係わる化合物は、溶媒和しない状態又は例えば水、エタノールなどの薬学的に許容可能な溶媒によって溶媒和された状態で存在することも出来る。一般的に言って、溶媒和された状態のものは、本発明の目的のためには溶媒和されていないものと同等であると考えられる。
＜薬学的に許容可能な塩＞
【００４６】
本発明の化合物は、意図した投与に適合した如何なる形状でも提供することが出来る。かかる形状としては、薬学的に（即ち生理学的に）許容可能な塩、及び本発明の化合物のプリドラッグ又はプロドラッグの形状が挙げられる。
【００４７】
薬学的に許容可能な塩の例としては、以下に限定されないが、非毒性の無機酸及び有機酸の付加塩、例えば塩酸塩、臭素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、アコニット酸塩、アスコルビン酸塩、クエン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、桂皮酸塩、クエン酸塩、エンボン酸塩、エナン酸塩、フマール酸塩、グルタミン酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩、ナフタレン−2−スルホン酸塩、フタール酸塩、サリチル酸塩、ソルビン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、トルエン−ｐ−スルホン酸塩などが挙げられる。かかる塩は、当業界において公知である方法によって形成することが出来る。
【００４８】
本発明の化合物の金属塩としては、例えばカルボキシル基を含む、本発明の化合物のナトリウム塩などアルカリ金属塩が挙げられる。
【００４９】
＜プロドラッグ＞
本発明に従った化合物は、そのまま又はその適当なプロドラッグの形状で投与することが出来る。“プロドラッグ”なる用語は、本医薬の生物可逆性誘導体を意味するが、なお生物可逆性誘導体は、それ自体では治療上実質的に不活性であるが、体内で酵素的又は非酵素的なプロセスによって活性のある物質に転換され得るものである。
【００５０】
本発明に従って使用される物質の適当なプロドラッグの例としては、親物質の一つ又はそれ以上の反応性又は誘導可能な基を適当な生物可逆性誘導体化させて、生物可逆性誘導体を生成させることによって得られる化合物が挙げられる。かかる誘導体化を実施して、当該活性物質の生物学的利用可能性をより高め、それ以外では不安定な活性物質を安定化させ、また投与した物質の親油性を高めるなどとすればよい。
【００５１】
プロドラッグの形状で遊離に投与できる種類の化合物の例としては、カルボン酸、その他の酸性基やアミンであって、適当な生物可逆性誘導体化によって親油性を一層高められるものが挙げられる。適当な基礎の例としては、生物可逆性エステル又は生物可逆性アミドが挙げられる。アミノ酸は、非修飾変成状態では投与時リン酸塩、誘導体は、上記した種類の生物可逆性誘導体の一つ又は双方である。
＜探索方法＞
【００５２】
ある化合物が有する、ＣＩＣファミリーの一つ又はそれ以上の塩素チャンネルを閉塞・遮断することが出来る能力・性能の探索は、当業界においてよく知られている多数の技法によって実施することが出来る。
【００５３】
現在利用可能な探索方法の例として、例えばパッチ-クランプ法などの従来公知の電気生理学的方法、又は例えばＦＬＩＰＲアッセイ(Fluorescence Image Plate Reader, Molecular Devices社から入手可能)又はVIPR (Voltage Ion Probe Reader、 Aurora社から入手可能）などの従来公知の顕微鏡法がある。
【００５４】
これらの方法は、通常は塩素チャンネルを含有する細胞の膜電位をモニターし、かくして本発明の化合物の作用によって惹起される膜電位の変化を同定することから成る。
【００５５】
他の探索法としては、リガンド結合アッセイ、Ｃｌ-フラックスを用いたアッセイや適当な不均質システム中でＣＩＣ  ｃＤＮＡを発現させた後の卵母細胞ボルテージクランプ法が挙げられる。
＜医薬組成物＞
【００５６】
治療に使用出来る本発明の化合物は、原料化合物の形状で投与してもよいが、選択的には生理学的に活性な塩の形状である有効成分を一つ又はそれ以上の補助薬、賦形剤、担体、緩衝剤、希釈剤及び/又は通常の医薬副資材と共に医薬組成物にすることが好ましい。
【００５７】
ある好ましい実施態様においては、本発明は、本発明の化合物、又はその薬学的に許容可能な塩若しくは誘導体及び一種又はそれ以上の薬学的に許容可能な担体と選択的には当業界において公知であり且つ使用されているその他の治療成分及び/又は予防成分とを含んで成る医薬組成物を提供するのである。該担体は、本製剤処方の他の成分と混和可能でありまたこれの服用者にとって有害ではないと言う意味で“許容可能”であればよい。
【００５８】
本発明の医薬組成物は、所望とする治療に適合する好便な経路であれば如何なる経路によっても投与することが出来る。好ましい投与経路は、具体的に言えば錠剤、カプセル、糖衣錠、粉剤又は液状での経口投与、及び具体的には経皮、皮下、筋肉内又は静脈内注射による非経口投与がある。本医薬組成物は、所望とする製剤処方に適した標準的な、従来公知の方法を用いて当業者によって製造することが出来る。所望ならば、有効成分の除放性を賦与するよう適合せしめられた組成物を用いてもよい。
【００５９】
製剤処方及び投与の方法に関する更なる詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, PA)の最新版において見られるであろう。
【００６０】
現実の用量・用法は、治療処置する疾病の本質と重篤度に依存して異なり、医師の裁量の範囲にあるが、具体的な状況に用量・用法を合わせることによって変えて所望とする治療効果を発揮させればよい。しかしながら、各用量当り有効成分をほぼ０．０１乃至ほぼ５００ｍｇ、好ましくはほぼ０．１乃至ほぼ１００ｍｇ、より好ましくはほぼ１乃至ほぼ１０ｍｇ含有する医薬組成物が、治療的処置に適していることが意図される。
【００６１】
本有効成分は、一日当り一回又は数回の用量として投与すればよい。満足するべき結果は、場合によっては、０．１μｇ／ｋｇｉ．ｖ．（静脈内投与）及び１μｇ／ｋｇｐ．ｏ．（経口投与）なる低い用量で得られる。用量範囲の上限は、目下のところほぼ１０ｍｇ／ｋｇｉ．ｖ．（静脈内投与）及び１００ｍｇ／ｋｇｐ．ｏ．（経口投与）であると考えられる。好ましい範囲は、ほぼ０．１μｇ／ｋｇからほぼ１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙｉ．ｖ．（静脈内投与）まで及びほぼ１μｇ／ｋｇからほぼ１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙｐ．ｏ．（経口投与）までである。
【００６２】
下記する実施例によって、本発明を更に詳細に説明するが、かかる実施例は、制限的であると解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００６３】
破骨細胞のＣＩＣチャンネルの同定
ＣＩＣ−３(GenBank Acc.No.AF029348)、  ＣＩＣ−６(GenBank Acc.No.AF209724)及びＣＩＣ−７(GenBank Acc.No.AF224741)のチャンネルを下記するＲＴ−ＰＣＲを用いたストラテジーを使用することによってヒト破骨細胞（マクロファージから発生させたもの、OsteoPro）中において同定した。
方法
【００６４】
破骨細胞からの全ＲＮＡの精製(RNeasy kit, Qiagenを用いる;又は例えばAusubel, FM, Brent, R, Kingston, RE, Moore、DD, Seidman, JG, Smith、JA and Stuhl, K eds.(2000) Current Protocols in Molecular Biology Vol.1, Wileys & Sonsなどにおいて記載されている標準的方法を使用する）。
【００６５】
ＣＩＣ、ＣＩＣＡ及びＣＬＩＣファミリーに属する種々のサブタイプのＣｌ-チャンネルに対して特異的なＰＣＲプライマーを用いた配列特異的ＲＴ−ＰＣＲ。
ＲＴ  ｍｉｘ
３μｇの全ＲＮＡ又は３０−１５０ｎｇのｍＲＮＡ
２．５μＭなるオリゴｄＴの最終濃度
７０℃にて１０分間変性し、次いで氷に浸漬。
下記を添加する：
１ｍＭ            ｄＮＴＰ最終濃度（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
５ｍＭ            ＭｇＣｌ2最終濃度（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）
１Ｘ              ＭｇＣｌ2を含まないＰＣＲ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）
２０  ｕｎｉｔｓ  Ｒｎａｓｅ阻害剤（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）
Ｈ2Ｏ            最終容積２０μｌとする
室温で１０分間アニールする
５０  ｕｎｉｔｓのＲＴ  Ｍｕｌｖ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）
４２℃において１時間次いで７０℃にて１５分間インキュベートする。
ＲＴ−ＰＲＣ
上記ＲＴ  ｍｉｘの１／１０をＲＴ―ＰＣＲに使用する。
２μｌ        ＲＴ  ｍｉｘ
２５０μＭ    ｄＮＴＰ最終濃度
０．５μＭ    センス及びアンチセンスプライマーの最終濃度
１．５  Ｍ    ＭｇＣｌ2最終濃度
１Ｘ          ＭｇＣｌ2を含まないＰＣＲ緩衝液
２．５Ｕ      Ｔａｑポリメラーゼ
Ｈ2Ｏ          最終容積２０μｌとする
下記する配列特異的プライマーを用いる：
【００６６】
【表１】
2004522441.tif 000002
ＰＣＲプロファイル
９４℃２分、９４℃１分、６０／６６℃１分、７２℃１分を２９回反復繰り返し、７２℃５分、４℃永久。
標準方法を使用したノーザンブロット
【００６７】
ＲＴ-ＰＣＲで得られた結果は、ノーザンブロットによってバリデーションすることが出来る。即ち、１０μｇのヒト破骨細胞全ＲＮＡをhybond membrane (Amersham Pharmacia Biotech)でブロットし、ExpressHyb (Clontech)内で６５℃にて３０分間プリハイブリダイズさせる。ＣＩＣ−３、ＣＩＣ−６及びＣＩＣ−７に特異的なＰ32標識化ＤＮＡプローブをランダムプライミング(Amersham Pharmacia Biotech)を使用して作成・生成し、ExpressHyb内で６５℃において１６時間ブロットした膜にハイブリダイズさせる。このハイブリダイズさせた膜を洗浄し、次いでオートラジオグラフィーで解析する。
【実施例２】
【００６８】
ＨＥＫ２９３細胞内でのＣＩＣ−３、ＣＩＣ−６及びＣＩＣ−７の発現
リポフェクタミントランスフェクション（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いた標準方法を使用して、ＣＩＣ−３、ＣＩＣ−６及びＣＩＣ−７をＨＥＫ２９３細胞内に組換え発現させる。
簡潔に言えば、ＣＩＣ−３，ＣＩＣ−６及びＣＩＣ−７をｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）から切除し、ｐＺＯＯＭ＿ＣＩＣ３，ｐＺＯＯＭ＿ＣＩＣ６及びｐＺＯＯＭ＿ＣＩＣ７と命名された複数の発現ベクターを産生する哺乳動物／卵母細胞発現ベクター内にサブクローンする。
【００６９】
ＨＥＫ２９３組織培養細胞を１０％ＦＣＳ（Ｆｏｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）を添加したＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）内で５％ＣＯ2中３７℃において増殖させた。翌日、細胞をリポフェクタミン（２０μｌリポフェクタミンTM、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，なおそれぞれ２．５μｇのｐＺＯＯＭ＿ＣｌＣ３，ｐＺＯＯＭ＿ＣｌＣ６及びｐＺＯＯＭ＿ＣｌＣ７を全容量５４０μＬとして同時に使用）を用いてトランスフェクトさせた。
【００７０】
このリポフェクション混合物を細胞の上に重ねてのせ、３７℃において５時間培養した。細胞を次いで通常の培地で漱ぎ、１０％ＦＣＳのＤＥＭＥ内において５％ＣＯ２中３７℃において７２時間増殖させた。
【００７１】
７２時間のポストトランスフェクションを行い、ｐＺＯＯＭでトランスフェクトさせた細胞を０．５μｇ／ｍｌのＧ４１８を添加した培地で選別した。単一クローンを取り出し、次いで凍結処理用の細胞が充分煮鳴るまで選別培地内で増殖させた。その後、細胞を選別剤を用いることなく通常の培地で培養した。
【００７２】
機能的なＣＩＣ−３、ＣＩＣ６及びＣＩＣ−７チャンネルの発現が、パッチ-クランプ測定値により証明された。
【実施例３】
【００７３】
化合物に対するパッチクランプ探索
下記する方法を用いて、各種化合物の塩素チャンネル遮断活性を探索することが出来る。
【００７４】
実験は、幾つかのパッチクランプ装置の一つを使用して実施する。細胞をスライド上に載せて覆い、Ｎｏｒｍａｓｋｉ又はＨｏｆｆｍａｎｎ  ｏｐｔｉｃｓを備えたＩＭＴ−２顕微鏡に取り付けた１５μｌ潅流チャンバー（流速-1ｍｌ／ｍｉｎ）内に置く。これらの顕微鏡を設置したファラデーケージ内の無振動のテーブルに載置する。全ての実験は室温（２０−２２℃）で実施する。ＥＰＣ−９パッチクランプ増幅装置(HEKA-Electronics, Lambrect, Germany)をＩＴＣ１６-インターフェースを介してマッキントッシュコンピュータに接続する。データは、直接ハードディスクに記憶させ、ＩＧＯＲソフトウエア(WaveMetrics, Lake Oswega, USA)で解析する。
【００７５】
パッチクランプ法の全細胞構成機器を適用する。ほう珪酸ピペット（抵抗２乃至４ＭΩ）の先端をゆっくりと（遠隔操作システム）細胞膜上に置く。軽度の吸引を行うと、ギガシールが得られ（ピペット抵抗は、１ＧΩ以上に達する）、この細胞膜を更に吸引を強くして破砕する。細胞の容量は電子的に補償され、ピペットと細胞内部との抵抗（直列抵抗、Ｒｓ）を測定し、補償する。通常は、細胞容量は、５から２０ｐＦまでであり（細胞のサイズに依存して異なる）、直列抵抗は、３乃至６ＭΩまでの範囲にある。Ｒｓ及び容量補償は、実験の間更新される（各刺激を与える前に）。
【００７６】
Ｒｓ値が変動する実験は全て排除・取り消すものとする。洩れ減法は行わない。
細胞外（浴）溶液は下記を含有する：１４４ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．４）。試験化合物は、ストック溶液からのＤＭＳＯ中に溶解し、次いで希釈して、細胞外溶液中での最終濃度がほぼ１０μＭとする。ＣａＣｌ2の濃度は、７．６ｍＭであり、またＭｇＣｌ2の濃度は、１．２ｍＭであり、その結果算定遊離濃度はそれぞれ３００ｎＭ及び１ｍＭとなる。
定量化
【００７７】
全細胞構成機器を確立した後、電圧勾配（通常は、−１００乃至＋１００ｍＶ）を５秒ごとに細胞に印加する。安定したベースライン電流が１００−３００秒のうちに得られるので、次いで試験化合物を含む細胞外液に変えることによって化合物を次々に添加する。ネイティブのＨＥＫＬ２９３細胞においてはかかる状況下では内因性電流は殆ど活性化されない。
【実施例４】
【００７８】
ＣＩＣ型チャンネルのためのノーザンブロット
ヒト胎児脳(Strategene)から得られた５μｇの全ＲＮＡ、ＲＡＮＫＬの存在下１週間分化させたヒト破骨細胞から得られた１０μｇの全ＲＮＡ及びＲＡＮＫＬの存在下２週間分化させたヒト破骨細胞から得られた１０μｇの全ＲＮＡの三つの試料を変性ホルムアルデヒドゲルで分離し、写真撮影し次いでキャピラリブロッティングを用いてＨｙｂｏｎｄ  Ｎ膜(Amersham)にトランスファーした。
【００７９】
同一量のＲＮＡを含む三種の膜を作成し、ヒトＣＩＣ−７（塩基１５２４−２０２６）、ヒトＣＩＣ−６（塩基１１７１−１６２４）又はヒトＣＩＣ−３（塩基２４２−６５１）のそれぞれに対する32Ｐで標識化したＰＣＲ断片(Rediprime II random labelling kit, Amersham)でプローブした。プリハイブリダイ-ション及びハイブリダイゼーションをAmbion‘s Ultrahyb hybridization bufferを用いてそれぞれ４２℃で３０分間及び一晩実施し、次いで２ｘＳＣ／０．１％ＳＤＳで二回ざっと洗浄しまた０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（２０ｘＳＳＣ：３ＭＮａＣｌ，０．３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７）で１５分間二回洗浄した。
これらの膜は、プラスチック製のフォイルに包み、三週間までKodaky Biomax  ＭＬフィルムに露光した。
【００８０】
ヒトＣＩＣ−７のほぼ４ｋｂの転写産物が、脳及び二種のヒト破骨細胞調製物において検出することが出来た。最も強力なシグナルは、最も高く分化させた破骨細胞（ＲＡＮＫＬの存在下二週間の分化処理）において認められた。ヒトＣＩＣ−６の弱い６．２ｋｂのメッセージが、ヒト胎児脳において認められたが、ヒト破骨細胞においては長期間露光しても認められなかった。ヒトＣＩＣ−３は、何れの試料においても検出可能ではなかった。
【００８１】
ＣＩＣ−７及びＣＩＣ−６の転写産物のサイズは、Brandt and Jentsch(1995) FEBS Letters 377, 15-20（それぞれ４．２ｋｂ及び６ｋｂ）において記載されたものと極めてよく合致するものである。
【００８２】
即ち、ＣＩＣ−７は、試験した三種のうちでヒト破骨細胞において唯一検出可能なＣＩＣチャンネルである。更には、このｍＲＮＡは、破骨細胞分化の過程では上流制御され、このチャンネルが破骨細胞生理学において該当することを示すように思われる。しかしながら、ＣＩＣ−６及びＣＩＣ−３は、破骨細胞中には有意には発現されるようには見えないが、さらに感度の高いＲＴ−ＰＣＲ法によれば検出することが出来る。
【国際公開パンフレット】
2004522441.tif 000003
2004522441.tif 000004
2004522441.tif 000005
2004522441.tif 000006
2004522441.tif 000007
2004522441.tif 000008
2004522441.tif 000009
2004522441.tif 000010
2004522441.tif 000011
2004522441.tif 000012
2004522441.tif 000013
2004522441.tif 000014
2004522441.tif 000015
2004522441.tif 000016
2004522441.tif 000017
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004522441.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】平成15年7月18日(2003.7.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記する工程を含んで成る、被験者の破骨細胞関連骨疾患を治療し、予防し又は寛解するための活性を目的として化合物を探索する方法：
●  ＣＩＣファミリーの塩素チャンネルの一種又はそれ以上を含んで成る試験細胞を  用意すること；
●  該試験細胞を当該化合物の作用に供すること；及び
●  当該化合物が選別塩素チャンネルを遮断・閉塞する性能を測定すること。
【請求項２】
該試験細胞が、ＣＩＣ−３、ＣＩＣ−６，ＣＩＣ−７及び該天然型と実質的に同等の活性を有する、これらの機能的な類縁体から成る群から選択される塩素チャンネルの一種又はそれ以上を含んで成ることを特徴とする、請求項１において記載された方法。
【請求項３】
該破骨細胞関連疾患が、骨粗しょう症、骨溶解性ガン浸潤、骨化石症又はページェット骨病であることを特徴とする、請求項１又は２のうちの何れか一項において記載された方法。
【請求項４】
請求項１乃至３のうちの何れか一項において記載された方法によって一種の化合物の同定を行うことを含んで成る、医薬開発方法。
【請求項５】
請求項１乃至３のうちの何れか一項において記載された方法によってＣＩＣファミリー塩素チャンネルの遮断剤として同定された化合物又はその薬学的に許容可能な塩若しくはプロドラッグを被験者の破骨細胞関連骨疾患を治療し、予防し又は寛解する医薬を製造するために使用する方法。
【請求項６】
請求項１乃至３のうちの何れか一項において記載された方法によってＣＩＣファミリー塩素チャンネルの遮断剤として同定された化合物又はその薬学的に許容可能な塩若しくはプロドラッグの治療有効量を被験者に投与することを含んで成る、被験者の破骨細胞関連骨疾患を治療し、予防し又は寛解するための方法。
【請求項７】
ＣＩＣファミリー塩素チャンネルの遮断剤又はその薬学的に許容可能な塩若しくはプロドラッグを被験者の破骨細胞関連骨疾患を治療し、予防し又は寛解する医薬を製造するために使用する方法。
【請求項８】
前記遮断剤が、ＣＩＣ−３、ＣＩＣ−６及びＣＩＣ−７チャンネルの一種又はそれ以上の遮断剤であって、ＣＩＣ−１，ＣＩＣ−２，ＣＩＣ−４，ＣＩＣ−５、ＣＩＣ−Ｋａ及びＣＩＣ−Ｋｂのうちの少なくとも一種を遮断・閉塞しないものである、請求項７において記載された使用方法。
【請求項９】
ＣＩＣファミリー塩素チャンネルの遮断剤又はその薬学的に許容可能な塩若しくはプロドラッグの治療有効量を被験者に投与することを含んで成る、被験者の破骨細胞関連骨疾患を治療し、予防し又は寛解するための方法。
【国際調査報告】
2004522441.tif 000019
2004522441.tif 000020
2004522441.tif 000021
2004522441.tif 000022
2004522441.tif 000023