(57)【要約】本発明は、資料中のＥＳＭ−１タンパク質の検出のための装置又はキットに関し：ａ）ＥＳＭ−１タンパク質のアミノ酸配列の位置２０におけるアミノ酸と位置７８におけるアミノ酸の間に包含される、前記タンパク質のＮ末端領域に特異的に結合する第一抗体；及びｂ）ＥＳＭ−１タンパク質の配列の位置７９におけるアミノ酸と位置１８４におけるアミノ酸の間に包含される、Ｃ末端領域に特異的に結合する第二抗体；を含んでなる。
2004522941.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のタンパク質ＥＳＭ−１の検出用キットであって：
ａ）このタンパク質のアミノ酸配列の位置２０におけるアミノ酸と位置７８におけるアミノ酸の間に含有されるタンパク質ＥＳＭ−１のＮ末端領域に特異的に結合する第一抗体；及び
ｂ）タンパク質ＥＳＭ−１のアミノ酸配列の位置７９におけるアミノ酸と位置１８４におけるアミノ酸の間に含有されるＣ末端領域に特異的に結合する第二抗体
を含んでなるキット。
【請求項２】
請求項１記載の検出用キットであって、タンパク質ＥＳＭ−１のＮ末端領域に特異的に結合する抗体が、真核細胞により産生された組み換えタンパク質ＥＳＭ−１で哺乳類を免疫化することによって得られたことを特徴とするキット。
【請求項３】
請求項１及び２の１項に記載の検出用キットであって、タンパク質ＥＳＭ−１のＮ末端領域に特異的に結合する抗体が、受託番号Ｉ−２５７２のもと２０００年１０月１７日にパスツール研究所のコレクション・デ・カルチャーズ・デ・マイクロオルガニズムズ（ＣＮＣＭ）に寄託されＭＥＣ１５と命名されたハイブリドーマ株によって産生されるモノクローナル抗体であることを特徴とするキット。
【請求項４】
請求項１〜３の１項に記載の検出用キットであって、ＥＳＭ−１のＣ末端に特異的に結合する抗体が、次の３つの抗原決定基：
ａ）ＥＳＭ−１の位置７９におけるプロリン残基から位置９９におけるシステイン残基に及ぶ決定基ＡｇＤ１；
ｂ）タンパク質ＥＳＭ−１の位置１１９におけるセリン残基から位置１３９におけるバリン残基に及ぶ抗原決定基ＡｇＤ２；
ｃ）タンパク質ＥＳＭ−１の位置１５９におけるグリシン残基から位置１８４におけるアルギニン残基に及ぶ抗原決定基 ＡｇＤ３；
の１つを認識することのできる抗体の中から選ばれることを特徴とするキット。
【請求項５】
請求項４記載の検出用キットであって、タンパク質ＥＳＭ−１のＣ末端領域に特異的に結合する抗体が、次の抗体：
ａ）受託番号Ｉ−１９４４のもと１９９７年１１月１９日にＣＮＣＭへ寄託されたハイブリドーマ株によって産生される抗体ＭＥＰ２１；
ｂ）受託番号Ｉ−１９４１のもとＣＮＣＭへ１９９７年１１月１９日に寄託されたハイブリドーマ株によって産生されるモノクローナル抗体ＭＥＰ０８；
ｃ）受託番号Ｉ−１９４２のもとＣＮＣＭへ１９９７年１１月１９日に寄託されたハイブリドーマ株によって産生されるモノクローナル抗体ＭＥＰ１４；
ｄ）受託番号Ｉ−１９４３のもとＣＮＣＭへ１９９７年１１月１９日に寄託されたハイブリドーマ株によって産生されるモノクローナル抗体ＭＥＰ１９；
の中から選ばれることを特徴とするキット。
【請求項６】
請求項１〜５の１項に記載の検出用キットであって、該２つの抗体の少なくとも１つがある分子に共有結合で連結されて、それの直接的又は間接的検出を可能にすることを特徴とするキット。
【請求項７】
請求項１〜６の１項に記載の検出用キットであって、該第一又は該第二抗体が支持体上に不動化されることを特徴とするキット。
【請求項８】
請求項７記載の検出用キットであって、支持体上に不動化される抗体がタンパク質ＥＳＭ−１のＣ末端領域を特異的に認識する抗体であることを特徴とするキット。
【請求項９】
試料中のタンパク質ＥＳＭ−１を検出するための方法であって、次の段階：
ａ）試験される試料を、タンパク質ＥＳＭ−１のＮ末端領域に特異的に結合する第一抗体と、又はタンパク質ＥＳＭ−１のＣ末端領域に結合する第一抗体と接触させ；
ｂ）該試料中に存在するタンパク質ＥＳＭ−１と該第一抗体の間に潜在的に形成される複合体を、Ｎ末端領域又はＣ末端領域から選ばれるタンパク質ＥＳＭ−１の領域であって該第一抗体により認識されない領域に特異的に結合する第二抗体と接触させ；そして
ｃ）タンパク質ＥＳＭ−１と該第二抗体の間に形成される複合体を検出すること
を含んでなることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項９記載の検出方法であって、該第一抗体が支持体上に不動化されることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項９及び１０の１項に記載の検出方法であって、該第一抗体が、タンパク質ＥＳＭ−１のＣ末端領域に特異的に結合する抗体であり、該第二抗体が、タンパク質ＥＳＭ−１のＮ末端領域に特異的に結合する抗体であることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか１項に記載の検出方法であって、タンパク質ＥＳＭ−１のＮ末端領域に特異的に結合する抗体が、受託番号Ｉ−２５７２のもとＣＮＣＭへ２０００年１０月１７日に寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体 ＭＥＣ１５であることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項９〜１２のいずれか１項に記載の検出方法であって、段階ｃ）が、該第二抗体に固定されることのできるビオチン化抗体を使用して行われることを特徴とする方法。
【請求項１４】
該番号Ｉ−１９４２のもと１９９７年１１月１９日にＣＮＣＭへ寄託されたハイブリドーマ株ＭＥＣ１５。
【請求項１５】
受託番号Ｉ−２５７２のもとＣＮＣＭへ２０００年１０月１７日に寄託されたハイブリドーマ株ＭＥＣ１５によって産生されるモノクローナル抗体。
【請求項１６】
ヒトにおける内皮血管壁の劣化を in vitro で検出するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の検出用キットの使用。
【請求項１７】
免疫抑制化合物で処置された患者におけるタンパク質ＥＳＭ−１を in vitroで定量する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の検出用キットの使用。
【請求項１８】
癌を患う患者におけるタンパク質ＥＳＭ−１を in vitro で定量するための請求項１〜８のいずれか１項に記載の検出用キットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のタンパク質ＥＳＭ−１を検出するためのキットに関する。本発明は、このようなキットを使用して試料中のタンパク質ＥＳＭ−１を検出するための方法にも関する。
【０００２】
タンパク質ＥＳＭ−１のための本発明によるキット及び検出方法は、生物学的試料、特に内皮血管壁の劣化が疑われる患者からの生物学的試料中のタンパク質ＥＳＭ−１を定量することについて、特に産業上利用可能性がある。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質ＥＳＭ−１ （内皮細胞特異的分子１ (Endothelial cell-specific Molecule-1)） は、主に内皮細胞によって発現され、そして血管内皮細胞によって優勢に発現されるタンパク質である。タンパク質ＥＳＭ−１は、LASSALLE et al. (1996) によって初めて記載された。ＥＳＭ−１のメッセンジャーＲＮＡは、その配列が LASSALLE et al. (1996) による論文の図１に記載されている１８４アミノ酸のポリペプチドをコードする。
【０００４】
ヒト内皮細胞の細胞溶解産物から単離されたタンパク質ＥＳＭ−１は、２０ｋＤａの見かけ分子量を有する。タンパク質ＥＳＭ−１の分泌形態が５０ｋＤａの見かけ分子量を有するので、このことは、その分泌されたタンパク質ＥＳＭ−１が翻訳後修飾を受けたことを示している。
【０００５】
タンパク質ＥＳＭ−１を検出するためのモノクローナル抗体の使用は、番号第２，７７５，６９１号のもとで公開されたフランス特許出願、及び BECHARD et al. (2000) による論文中に開示されている。これらモノクローナル抗体は、タンパク質ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）と融合されたタンパク質ＥＳＭ−１の位置７９におけるアミノ酸から位置１８４におけるアミノ酸に及ぶ配列から構成される抗原でマウスを免疫化することによって調製された。３ファミリーのモノクローナル抗体が特性決定され、これら抗体ファミリーは、抗原決定基ＡｇＤ１  ７９Ｐ−９９Ｃ（抗体ＭＥＰ０１、ＭＥＰ０６及びＭＥＰ２１）、ＡｇＤ２  １１９Ｓ−１３９Ｖ（抗体ＭＥＰ０８及びＭＥＰ１３）及びＡｇＤ３  １５９Ｇ−１８４Ｒ（抗体ＭＥＰ０４、ＭＥＰ１４及びＭＥＰ１９）にそれぞれ固定された。
【０００６】
BECHARD et al. (2000) は、モノクローナル抗体ＭＥＰ１９及びＭＥＰ２１を使用して試料中のタンパク質ＥＳＭ−１を検出する試験を行う“サンドイッチ”タイプの免疫酵素的試験の開発が記載している。この試験によって、その著者は、敗血症性ショックのために入院している患者の血清中にタンパク質ＥＳＭ−１が強く産生されていることを証明できた。この文献の図４中に掲示された結果は、抗体ＭＥＰ１９及びＭＥＰ２１を使用する検出試験によって、４ｎｇ／ｍＬを上回るタンパク質ＥＳＭ−１の濃度を検出できることを示している。
【０００７】
しかしながら、BECHARD et al. (2000) によって記載されたタンパク質ＥＳＭ−１についての免疫酵素的試験は、試料中の高い濃度のタンパク質ＥＳＭ−１については適するが、少量のこのタンパク質を検出しない。しかしながら、この少量のタンパク質は、本発明によって示されるように、患者における内皮細胞壁の劣化のような生理学的障害においては有意なものである。
【発明の要旨】
【０００８】
本発明者らは、技術の現状において記載された試験よりもずっと感度が良い、試料中のタンパク質ＥＳＭ−１を検出するための免疫学的試験を開発するために努力してきた。
【０００９】
本発明の目的は、試料中のタンパク質ＥＳＭ−１を検出用キットであって：
ａ）タンパク質ＥＳＭ−１のアミノ酸配列の位置１におけるアミノ酸と位置７８におけるアミノ酸の間に含有されるＮ末端領域に特異的に固定される第一抗体；及び
ｂ）タンパク質ＥＳＭ−１のアミノ酸配列の位置７９におけるアミノ酸と位置１８４におけるアミノ酸の間に含有されるＣ末端領域に特異的に固定される第二抗体
を含んでなるキットである。
【００１０】
本発明の更なる目的は、試料中のタンパク質ＥＳＭ−１を検出するための方法であって、次の段階：
ａ）試験される試料を、タンパク質ＥＳＭ−１のアミノ酸配列のＮ末端領域又はＣ末端領域に特異的に固定される第一抗体がその上に不動化されている支持体と接触させ；
ｂ）該不動化抗体とタンパク質ＥＳＭ−１との間に潜在的に形成される複合体を、該第一抗体によって認識されないＮ末端領域又はＣ末端領域に特異的に固定される第二抗体と接触させ；そして
ｃ）タンパク質ＥＳＭ−１と該第二抗体の間に潜在的に形成される複合体を検出すること
を含んでなることを特徴とする方法である。
【００１１】
本発明は、上の方法において使用される一定の抗体にも関する。
本発明の更なる目的は、患者、特に敗血症性ショックもしくは癌を患っている患者又は血管内皮細胞に対して細胞障害性となるおそれのある治療的処置を受ける患者における、内皮血管壁の劣化を検出するための本発明による検出用キットの使用である。
【発明の詳しい説明】
【００１２】
本発明による検出用キット
本発明による検出用キットは、試料中のタンパク質ＥＳＭ−１の存在を高い感度で検出できるようにする。
【００１３】
タンパク質ＥＳＭ−１の存在が探求される試料は、あらゆるタイプのものでありうる。好ましくは、それは、血清、血漿、全血、尿、脳脊髄液、又は、培養上澄み液もしくは細胞溶解産物のような、生物学的流体である。
【００１４】
本発明者らは、真核細胞によって分泌されたタンパク質ＥＳＭ−１が、大腸菌の細胞のような原核細胞によって産生されたタンパク質ＥＳＭ−１においては見出されない格別な特性を有することを示した。
【００１５】
タンパク質ＥＳＭ−１は、真核細胞、特に内皮細胞によって、糖タンパク質の形態で、より正確にはコンドロイチン／デルマタン硫酸タイプの鎖を有するプレテオグリカンの形態で分泌される。更に、本発明者らは、真核細胞によって分泌されたタンパク質ＥＳＭ−１が、このタンパク質のＮ末端領域のシステイン残基間でジスルフィド架橋が形成されることによって引き起こされるコンホメーション修飾を包含する他の翻訳後修飾を受けることを示した。１８４アミノ酸のポリペプチドＥＳＭ−１は、配列番号１として参照される。
【００１６】
タンパク質ＥＳＭ−１についての高感度免疫学的検出試験法を開発するため、本発明者らは、LASSALLE et al. (1996) によって記載された配列番号１の位置２０におけるアミノ酸から位置７８におけるアミノ酸に及ぶＮ末端領域であって、その位置２０におけるアミノ酸が、分泌されたタンパク質ＥＳＭ−１のアミノ末端アミノ酸を構成するＮ末端領域に対して向けられるモノクローナル抗体を調製する戦略をとった。
【００１７】
本発明者らによって調製されるモノクローナル抗体は、好ましくは、真核細胞によって分泌されて上で述べた翻訳後修飾を受けたタンパク質ＥＳＭ−１に対して向けられる。
より具体的には、本発明者らは、ジスルフィド架橋の生成から起きるコンホメーション修飾を受けるタンパク質ＥＳＭ−１の領域に特異的に固定されるモノクローナル抗体、換言すれば、配列番号１のタンパク質ＥＳＭ−１のアミノ酸配列の位置２０におけるアミノ酸から位置７８におけるアミノ酸に及ぶタンパク質ＥＳＭ−１のＮ末端領域に対して向けられた抗体を産生するハイブリドーマの細胞株を生成させた。
【００１８】
試料中のタンパク質ＥＳＭ−１を検出するツールを得るために、本発明者らは，タンパク質ＥＳＭ−１の２つの別異の領域に特異的に結合する２つの抗体、即ち、それぞれＥＳＭ−１の位置２０におけるアミノ酸から位置７８におけるアミノ酸に及ぶＮ末端領域に特異的に結合する抗体と、ＥＳＭ−１の配列の位置７９から位置１８４に及ぶＣ末端領域に特異的に結合する抗体を使用する、“サンドイッチ”タイプの免疫学的試験を開発した。
【００１９】
従って、本発明の第一の目的は、試料中のタンパク質ＥＳＭ−１を検出するためのキットからなり、前記キットは：
ａ）このタンパク質のアミノ酸配列の位置２０におけるアミノ酸と位置７８におけるアミノ酸の間に含有されるタンパク質ＥＳＭ−１のＮ末端領域に特異的に結合する第一抗体；及び
ｂ）タンパク質ＥＳＭ−１のアミノ酸配列の位置７９におけるアミノ酸と位置１８４におけるアミノ酸の間に含有されるＣ末端領域に特異的に結合する第二抗体
を含んでなるキットである。
【００２０】
ＥＳＭ−１のＮ末端領域に特異的に結合する抗体は、好ましくは、真核細胞によって分泌されかつ上で詳述された翻訳後修飾を受けたタンパク質ＥＳＭ−１のＮ末端領域に対して特異的に向けられる。これは、Ｎ末端領域に特異的に結合する抗体が、真核細胞によって産生されるタンパク質ＥＳＭ−１の精製調製物を動物に注射する段階を包含する方法に従って得られたことを意味する。
【００２１】
本発明の文脈における“抗体”によって、タンパク質ＥＳＭ−１のＮ末端領域又はＣ末端領域に特異的に結合することのできる“パラトープ”を含有する分子が意味されると理解されるべきである。本発明による“抗体”によって、タンパク質ＥＳＭ−１のＮ末端領域又はＣ末端領域に特異的に結合することができる同じ“パラトープ”を全てが含有する分子の集団が意味されるとも理解されるべきである。
【００２２】
“パラトープ”によって、イムノグロブリンのＨ鎖又はＬ鎖の可変ドメインＶH及びＶLの超可変ドメイン、若しくは、ＣＤＲドメイン中に局在化した抗体のＦａｂ断片中に含有される抗原結合部位が意味されると理解されるべきである。
【００２３】
本発明による抗体は、KOHLER 及び MIELSTEIN(1975) によって記載された技術によるハイブリドーマからでも、KOZBOR(1983) によって記載されたヒトＢ細胞のハイブリドーマの技術によってでも調製されうる。本発明による抗体は、米国特許第４，９４６，７７８号中に、及び MARTINEAU et al. (1998) によって開示されたもののような単一鎖Ｆｖキメラ抗体（ＳｃＦｖは“単一鎖Ｆｖ”を表す）の断片をも包含する。本発明による抗体は、RIDDER et al. (1995) によって記載されたもののようなファージバンク（“ファージディスプレーライブラリー”）によっても産生されうる。本発明による抗体は、REINMANN et al. (1997) 又は LEGER et al. (1997) よって記載された技術に従って産生されるヒト抗体でもありうる。
【００２４】
タンパク質ＥＳＭ−１についての本発明による検出用キットは、好ましくは、２つの抗体の１つが支持体上に不動化されることを含んでなる。この好ましい態様においては、本検出用キットは、タンパク質ＥＳＭ−１についての“サンドイッチ”タイプの免疫検出試験を行うための“すぐに使える”形態で与えられる。
【００２５】
本発明によって、試料中のタンパク質ＥＳＭ−１の存在を検出するための上で定義されたようなキットの使用は、BECHARD et al. (2000) によって記載されたＥＳＭ−１を検出する試験で観察された検出感度よりも１０倍大きいものをもたらすことが示された。
【００２６】
本発明による免疫検出試験法の高い感度は、生物学的試料、例えば、ヒト血清中の、非常に低い濃度のタンパク質ＥＳＭ−１を検出することを可能にし、従って、患者における内皮血管壁の劣化を早期に検出できるようにした。
【００２７】
特に、本発明による免疫検出用キットの使用は、敗血症を患う“アトピー”個体における１〜３ｎｇ／ｍＬのＥＳＭ−１の血清濃度を検出できるようにした。
実施例に示されるように、本発明による免疫検出用キットの使用は、１００〜２００ｐｇ／ｍＬのオーダーのＥＳＭ−１の濃度を検出するために使用されうる一方で、BECHARD et al. (2000) によって記載された試験は、１ｎｇ／ｍＬ未満のＥＳＭ−１の濃度を検出しないものである。
【００２８】
ＥＳＭ−１のＮ末端領域に対して向けられる抗体は、有利には、真核細胞、例えば、LASSALLE et al.によって記載されたタンパク質ＥＳＭ−１をコードするＤＮＡ挿入物を含有する発現ベクター、例えば、ベクターｐｃＤＮＡ３によって形質転換されたＣＨＯ株の細胞によって合成された組み換えタンパク質ＥＳＭ−１で、哺乳類、好ましくはマウスを免疫化した後に得られるハイブリドーマ株によって産生されるモノクローナル抗体である。
【００２９】
好ましくは、受託番号Ｉ−２５７２のもと２０００年１０月１７日にパスツール (Pasteur) 研究所のコレクション・デ・カルチャーズ・デ・マイクロオルガニズムズ (Collection de Cultures de Micro-organismes)（ＣＮＣＭ）に寄託されＭＥＣ１５と命名されたハイブリドーマ株によって産生されるモノクローナル抗体である。
【００３０】
このＭＥＣ１５抗体は、本発明の目的を構成する。
タンパク質ＥＳＭ−１のＣ末端部分に特異的に結合する抗体は、大腸菌のような原核細胞によって産生されタンパク質ＥＳＭ−１に対して向けられる抗体でも、ＣＨＯ株の細胞のような真核細胞によるもののいずれでもよい。
【００３１】
タンパク質ＥＳＭ−１のＣ末端部分に特異的に結合する抗体は、好ましくは、タンパク質ＥＳＭ−１の次の３つの抗原決定基：
・BECHARD et al. (2000) によって記載されたハイブリドーマ株ＭＥＰ０１、ＭＥＰ０６及びＭＥＰ２１によって産生される抗体のような、ＥＳＭ−１の位置７９におけるプロリン残基から位置９９におけるシステイン残基に及ぶ決定基ＡｇＤ１；
・BECHARD et al. (2000) によって記載されたハイブリドーマＭＥＰ０８及びＭＥＰ１３によって産生される抗体によって認識される、ＥＳＭ−１の位置１１９におけるセリン残基から位置１３９におけるバリン残基に及ぶ抗原決定基ＡｇＤ２；
・BECHARD et al. (2000) によって記載されたハイブリドーマ株ＭＥＰ０４、ＭＥＰ１４及びＭＥＰ１９によって産生される抗体によって認識される、ＥＳＭ−１の位置１５９におけるグリシン残基から位置１８４におけるアルギニン残基に及ぶ抗原決定基ＡｇＤ３のうちの１つを認識することのできる抗体の中から選ばれる。
【００３２】
好ましい態様においては、当業者は、タンパク質ＥＳＭ−１のＣ末端領域に特異的に結合する抗体の使用について、次の抗体：
・受託番号Ｉ−１９４４のもと１９９７年１１月１９日にＣＮＣＭへ寄託されたハイブリドーマ株によって産生される、抗原決定基Ｄ１の特異的モノクローナル抗体 （抗体ＭＥＰ２１）；
・受託番号Ｉ−１９４１のもと１９９７年１１月１９日にＣＮＣＭへ寄託されたハイブリドーマ株によって産生される、抗原決定基Ｄ２の特異的モノクローナル抗体（抗体ＭＥＰ０８）；
・受託番号Ｉ−１９４２及びＩ−１９４３のもと１９９７年１１月１９日にＣＮＣＭへ寄託されたハイブリドーマ株によって産生される、抗原決定基Ｄ３の特異的モノクローナル抗体（Ｉ−１９４２：抗体ＭＥＰ１４、Ｉ−１９４３：抗体ＭＥＰ１９）；
を有利なものとして挙げることができる。
【００３３】
本発明による免疫検出用キットの好ましい態様においては、第一及び第二抗体は、２つの抗体のそれぞれの認識部位があまりに近い場合における立体障害現象によって引き起こされうる一方の抗体の他方に関する競合的固定がタンパク質上でいかようにも起こらないように、タンパク質ＥＳＭ−１上のそれらのそれぞれの認識部位が互いから非常に離れるように選ばれる。
【００３４】
従って、本発明による検出用キットの好ましい態様においては、タンパク質ＥＳＭ−１のＮ末端領域に特異的に結合する第一抗体は、ハイブリドーマ株ＭＥＣ１５によって産生される抗体である。この好ましい態様によれば、タンパク質ＥＳＭ−１のＣ末端領域に特異的に結合する抗体は、ハイブリドーマ株ＭＥＰ１４によって産生されるモノクローナル抗体である。
【００３５】
一般に、タンパク質ＥＳＭ−１のＣ末端領域に対して向けられる抗体は、タンパク質ＧＳＴと融合したタンパク質ＥＳＭ−１のＣ末端領域をコードするＤＮＡ挿入物を含有する発現ベクターを調製し、次いで、前記発現ベクターで形質転換された大腸菌細胞の細胞溶解産物から得られた精製タンパク質ＥＳＭ−１でマウスを免疫化することからなる、BECHARD et al. (2000) によって記載された技術に従って選択されうる。このように免疫化されたマウス脾臓細胞を、モノクローナル抗体を産生する一連のハイブリドーマを得るために骨髄腫細胞と融合した後、タンパク質ＥＳＭ−１のＣ末端領域に特異的に結合する興味の対象となる抗体が、ＥＳＭ−１に由来するペプチドであって、このタンパク質のＣ末端領域のＮ終末の進行性欠失を含有するペプチドを使用して、エピトープをマッピングすることによって選択されうる。
【００３６】
同様に、当業者は、全タンパク質ＥＳＭ−１、好ましくは真核宿主細胞によって産生される全タンパク質ＥＳＭ−１でマウスを免疫化し、次いで、その免疫化マウスの脾臓細胞から一連のハイブリドーマ株を産生させ、次いで、Ｎ末端領域に特異的に結合する興味の対象である抗体を、例えば、ＥＳＭ−１のＣ末端領域に特異的に固定される抗体での競合的免疫検出試験法により選択することによって、タンパク質ＥＳＭ−１のＮ末端領域に特異的に結合する抗体を選択することができる。興味の対象である抗体は、ＥＳＭ−１のＣ末端領域の特異的抗体と競合しないもの、換言すれば、タンパク質ＥＳＭ−１の抗原決定基Ｄ１、Ｄ２及びＤ３の特異的抗体と競合しない抗体である。
【００３７】
本発明による検出用キットを構成する２つの抗体のうちの１つは、好ましくは、支持体上に不動化される。抗体がその上に不動化される支持体は、免疫検出試験、特に“サンドイッチ”タイプの免疫検出試験の当業者にとって公知のあらゆるタイプのものでありうる。
【００３８】
例としては、抗体がその上に不動化される支持体は、水に不溶性の有孔性又は非有孔性材料でありうる。その支持体は、親水性であり、そして、シリカ、硫酸マグネシウム及び硫酸アルミニウムのような無機粉末；天然ポリマー、特に、セルロース材料及びそれらの誘導体；ニトロセルロース、セルロースアセテート、ポリ（塩化ビニル）、ポリアクリルアミド、架橋デキスロラン、アガロース、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、ナイロン、ポリ（ビニルブチレート）のような天然又は合成ポリマー類；生体ガラス又はセラミックスのような一定のタイプのガラスを含有することができる。
【００３９】
本発明による抗体の支持体上への固定は、当業者にとって周知の技術によって行われうる。その支持体は、小片、又は特にビーズを包含する種々の異なる形態であってもよい。支持体の表面は、特異的であっても非特異的であってもよい共有結合性又は非共有結合性相互作用を介して抗体を固定するために、多官能基性であっても多官能基化されることができるものであってもよい。
【００４０】
例としては、抗体を支持体上に不動化させるために、当業者は、米国特許第４，１６８，１４６号又は米国特許第４，３４７，３１１号を有利に参照することができる。
検出用キットを構成する抗体の１つは、有利には、それの直接的又は間接的検出を可能とする分子に共有結合で結合する。
【００４１】
抗体が支持体上に不動化される態様においては、他方の抗体は、それの直接的又は間接的検出を可能とする分子に好ましくは共有結合で結合する。
検出を可能にする分子は、同位体であっても非同位体であってもよい。
【００４２】
例示的であるが非限定的な例として、検出を可能にする分子は、酵素、酵素断片、酵素基質、酵素阻害剤、補酵素又は触媒のように、触媒反応に関与しうる。検出を可能にする分子は、蛍光体、着色剤、又は化学発光分子のような色原体でもありうる。
【００４３】
従って、検出を可能にする分子は、ICHINOSE et al. (1991) によって記載された分子若しくは蛍光性イソチオシアネート誘導体、フィコエリトリン、ローダミンイソチオシアネート、ダンシルクロリド又は化合物ＸＲＩＴＣ、魚類 Aequorea Victoria のタンパク質ＧＦＰ（“緑色蛍光タンパク質”）及びその多くの誘導体、又はタンパク質ＹＦＰ（“黄色蛍光タンパク質”）並びにタンパク質ルシフェラーゼのような、蛍光分子でありうる。
【００４４】
触媒活性を有する検出を可能にする分子のうち、好ましい分子は、国際分類 I.U.B. に従う次の酵素：（ｉ）クラス１の酸化還元酵素、及び（ｉｉ）クラス３の加水分解酵素である。好ましい酸化還元酵素は、（ｉ）クラス１．１、最も特定的には、１．１．１、１．１．３及び１．１．９９の脱水素酵素、及び（ｉｉ）クラス１．１１のペルオキシダーゼ、及び（ｉｉｉ）クラス３．１、最も特定的にはクラス３．１．３、及びクラス３．２、最も特定的にはクラス３．２．１の加水分解酵素である。好ましい脱水素酵素は、リンゴ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素及び乳酸脱水素酵素である。好ましい酸化酵素は、グルコース酸化酵素である。好ましいペルオキシダーゼは、ホースラディッシュペルオキシダーゼである。好ましい加水分解酵素は、アルカリ性ホスファターゼ、β−グルコシダーゼ及びリゾチーム (lyzozyme) である。
【００４５】
検出を可能にする分子は、例えば、［3Ｈ］、［32Ｐ］及び［125Ｉ］の中から選ばれる同位体によって放射標識された分子でもありうる。
検出を可能にする分子が間接的マーカーを含んでなる態様においては、本発明による検出用キットを構成する抗体の１つは、ビオチン又はストレプトアビジンのようなリガンドに共有結合しうる。
【００４６】
この特定的な態様においては、検出を可能にする分子は、抗体に共有結合しているリガンド上に固定されるように選ばれる。検出を可能にする分子は、例えば、それ自体がビオチン又はストレプトアビジンそれぞれに結合しうる。
【００４７】
本発明による検出用キットの別の態様によれば、試験される試料中に存在するタンパク質ＥＳＭ−１とタンパク質ＥＳＭ−１の特異的抗体の１つの間に複合体が形成されたことを明らかにする手段は、抗体、例えば、抗ＥＳＭ−１抗体のＦｃ部分に特異的に結合できる抗体又はその抗ＥＳＭ−１抗体が属するイソタイプに特異的に結合することができる抗体、例えば、イソタイプＩｇＧ１のマウス抗体を特異的に認識する抗体でありうる。
【００４８】
本発明による検出用キットの好ましい態様においては、支持体上に不動化されるのは、タンパク質ＥＳＭ−１のＣ末端領域を特異的に認識する抗体である。
そのような検出用キットは、有利には、ハイブリドーマＭＥＰ１４（ＣＮＣＭ番号Ｉ−１９４２）によって産生される抗体が支持体上に不動化されており、そしてハイブリドーマＭＥＣ１５（ＣＮＣＭ番号 Ｉ−２５７２）によって産生される抗体がタンパク質ＥＳＭ−１のＮ末端領域に特異的に結合する抗体であるところのキットである。
【００４９】
従って、本検出ツールは、例えばラットからの、イソタイプＩｇＧ１のマウス抗体を特異的に認識するビオチン化モノクローナル抗体であることができ、その検出系はストレプトアビジン−ペルオキシダ−ゼ接合体によって供給される。
本発明による免疫検出法
本発明の更なる目的は、試料中のタンパク質ＥＳＭ−１を検出するための方法であって、次の段階：
ａ）試験される試料を、タンパク質ＥＳＭ−１のＮ末端領域に特異的に結合する第一抗体又はタンパク質ＥＳＭ−１のＣ末端領域に結合する第一抗体と接触させ；
ｂ）該試料中に存在するタンパク質ＥＳＭ−１と該第一抗体の間に潜在的に形成される複合体を、該Ｎ末端領域及び該Ｃ末端領域の中から選ばれ該第一抗体により認識されないタンパク質ＥＳＭ−１の領域に特異的に結合する第二抗体と接触させ；そして
ｃ）タンパク質ＥＳＭ−１と該第二抗体の間に形成される複合体を検出する
段階を含んでなることを特徴とする方法である。
【００５０】
“タンパク質ＥＳＭ−１と該第二抗体の間に形成される複合体”によって：
・タンパク質ＥＳＭ−１と該第一抗体の間に形成される複合体、及び
・該第二抗体
の間に形成される複合体が把握されるべきである。
【００５１】
上の免疫検出法の第一の態様によれば、第一又は第二抗体が、支持体の表面上に不動化されうる。
上の免疫検出法の第二の態様によれば、支持体上に不動化される抗体が、タンパク質ＥＳＭ−１のＣ末端領域に特異的に結合する抗体であり、そして、第二抗体が、このタンパク質のＮ末端領域に特異的に結合する抗体である。
【００５２】
上の免疫検出法の第三の態様によれば、支持体上に不動化される抗体は、タンパク質ＥＳＭ−１のＮ末端領域に特異的に結合する抗体であり、そして、第二抗体は、このタンパク質のＣ末端領域に特異的に結合する抗体である。
【００５３】
ＥＳＭ−１のＮ末端又はＣ末端領域上に特異的に結合する抗体は、上に定義された通りである。
本発明による検出方法の好ましい態様においては、タンパク質ＥＳＭ−１のＮ末端領域に特異的に結合する抗体は、受託番号Ｉ−２５７２のもとＣＮＣＭへ２０００年１０月１７日に寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体ＭＥＣ１５である。
【００５４】
第二抗体は、受託番号Ｉ−１９４２のもと１９９７年１１月１９日にＣＮＣＭへ寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体ＭＥＰ１４でありうる。
上に記載された方法の段階ｃ）は、第二抗体に固定されることができるビオチン化抗体を用いて行われることができ、その検出を可能にする分子は、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼタイプの複合体からなる。
本発明による検出方法の用途
本発明者らは、タンパク質ＥＳＭ−１の本発明による免疫検出の方法が、ヒト、特に敗血症を患っている患者におけるタンパク質ＥＳＭ−１の血清濃度を高い感度で定量でき、かつそれら患者にいて循環しているタンパク質ＥＳＭ−１の量とその敗血症の重症度の間の相関関係を樹立できることを示した。
【００５５】
Ammerican College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medcine Consensus Conference (１９９２年の、敗血症及び多発性臓器不全についての定義及び敗血症における革新的治療法の使用についてのガイドライン；Crit Care Med., vol. 20: 864-874) によって定義された基準によれば、敗血症は、増大する重症度の３つのカテゴリー、即ち、：敗血症、重症敗血症及び敗血症ショックに分けられることができる。
【００５６】
本発明による免疫検出法の恩恵で、敗血症の重症度とその患者において循環しているタンパク質ＥＳＭ−１の濃度の間の相関関係が樹立された。
更に、本発明による免疫検出試験法の高い感度によって、単純敗血症を患う患者は、低濃度とはいえ有意に検出可能でありかつ健康なボランティアの血清中に見出されるタンパク質ＥＳＭ−１の濃度よりも有意に高い（ｐ＜０．００１）循環性タンパク質ＥＳＭ−１の濃度を有することが示された。
【００５７】
これまで、患者における敗血症の進展は、３つのマーカー、即ち、それぞれＣ反応性タンパク質、可溶性ＩＣＡＭ−１タンパク質及びプロカルシトニンを定量することによって追跡されていた。
【００５８】
本発明によって、Ｃ反応性タンパク質及び可溶性ＩＣＡＭ−１タンパク質のレベルの進展はＥＳＭ−１の濃度の進展と相関しないことが示された。
対照的に、プロカルシトニンのレベルの進展とタンパク質ＥＳＭ−１のものとの間には良好な相関関係がある。しかしながら、敗血症の場合におけるプロカルシトニンの生物学的意義は分かっておらず、従って、このタンパク質は敗血症の進展についての良好な生物学的マーカーに該当しない。
【００５９】
他方、タンパク質ＥＳＭ−１は、炎症反応の調節におけるそれの役割のために、敗血症の進展の新たなマーカーを構成する。その生物学的意義は、炎症反応、特に、白血球の新たな補充であって、原因となる異なる組織、特に肺組織におけるこれら細胞の血管外遊出又は大量浸潤の現象中の、又は、内皮血管壁の劣化と少なくとも同時発生的な現象の時点での白血球の新たな補充の制御されない進展と直接関連付けられることである。
【００６０】
かくして、本発明者らは、本発明の免疫検出試験法が１〜３ｎｇ／ｍＬのオーダーの低濃度の循環性タンパク質ＥＳＭ−１を検出できるようにし、アトピー患者において見出されるこれら低濃度を、健康なボランティアにおいて測定されるｎｇ／ｍＬのオーダー又は一層低い基礎濃度から明らかに識別できることを示した。
【００６１】
更に、敗血症を患っている患者において見出される血清ＥＳＭ−１の量が、これら患者についての致死の信頼性ある診断法に相当することが示された。かくして、試験された６８患者について、その入院後１０日後に死亡した患者は、生存した患者の血清中に見出されたＥＳＭ−１の濃度より有意に高い循環性ＥＳＭ−１の濃度（生存した患者における４．０±０．６ｎｇ／ｍＬに対し、死亡した患者においては１０．６±０．８ｎｇ／ｍＬ［ｐ＞０．０１］）を、第０日及び第１日に示した。
【００６２】
循環性タンパク質ＥＳＭ−１のレベルと患者の致死の予測との間におけるこの密接な相関関係は、敗血症の慣用的マーカー、換言すれば、Ｃ反応性タンパク質、プロカルシトニン及び可溶性ＩＣＡＭ−１タンパク質については見出されなかった。
【００６３】
しかしながら、患者における循環性ＥＳＭ−１の濃度を測定するだけでは、医師が患者の状態全体に適する治療的手段をとれるようにする医学的診断を行うには十分でない。
本発明の更なる目的は、ヒト、特に患者における内皮血管壁の劣化を in vitro で検出するための、タンパク質ＥＳＭ−１についての本発明による検出用キットの使用からなる。
【００６４】
本発明は、患者における敗血症の重症度のマーカーを in vitro で追跡するための上で定義されたタンパク質ＥＳＭ−１についての検出用キットの使用にも関する。
本発明によって、正常よりも高い循環性タンパク質ＥＳＭ−１の濃度が、臓器移植を受けて免疫抑制化合物で処置された患者において見出されることも示された。循環性タンパク質ＥＳＭ−１の濃度の増大は、内皮細胞、特に血管壁の内皮細胞に対する免疫抑制化合物の細胞障害活性の指標である。
【００６５】
従って、タンパク質ＥＳＭ−１についての本発明による検出用キットの使用によって、免疫抑制化合物で治療された患者を追跡してこれら免疫抑制化合物が細胞障害性となる時を特定することが可能となる。
【００６６】
これら患者において正常より高い循環性ＥＳＭ−１のレベルを検出することは、この測定が患者における他の生理学的パラメーターを伴なう時には、投与される免疫抑制化合物の量を適度にするための医師にとっての指標に相当しうる。
【００６７】
更なる側面によると、本発明は、免疫抑制化合物で処置された患者、特に臓器移植を受けた患者において in vitro でタンパク質ＥＳＭ−１を定量するための本発明による免疫検出用キットの使用に関する。
【００６８】
本発明者らは、癌、特に気管支−肺癌を患っている患者における循環性タンパク質ＥＳＭ−１のレベルが有意に増大することも示した。
更に別の側面によると、本発明は、癌を患っている患者においてタンパク質ＥＳＭ−１を in vitro で定量するための上で定義されたような免疫検出用キットの使用にも関する。
【００６９】
一般に、１ｎｇ／ｍＬより高い循環性タンパク質ＥＳＭ−１のレベルは、血管壁の内皮細胞の劣化を意味し、従って、患者の臨床的診断が確立される間に医師によって考慮に入れられるべきパラメーターに相当するが、このパラメーター単独では、即ち、独立して解釈しても、患者についての治療的又は臨床的診断方法をそれ自体確立し得ないことが理解される。
【００７０】
本発明は、次の図及び実施例によって更に例示されるが、いかなるやり方によっても限定されるものではない。
【実施例】
【００７１】
実施例１：真核細胞によって産生されるタンパク質ＥＳＭ−１のＮ末端領域に特異的に結合するモノクローナル抗体の調製
システイン残基に富むタンパク質ＥＳＭ−１のＮ末端領域に対して向けられる抗ＥＳＭ−１モノクローナル抗体を得るために、タンパク質ＥＳＭ−１をコードするＤＮＡ挿入物を含有する発現ベクターによって形質移入されたＣＨＯ細胞株によって産生された天然形態のタンパク質ＥＳＭ−１が、精製された。
【００７２】
タンパク質ＥＳＭ−１をコードするｃＤＮＡ配列は、配列表における配列番号２として参照される。
ＥＳＭ−１のｃＤＮＡは、真核性発現ベクターｐｃＤＮＡ３（ｉｎ  ｖｉｔｏｒｇｅｎ）に挿入され、次いで、製造業者の推奨によるリポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ）でＣＨＯ細胞中に形質移入された。形質移入の４８時間後、その細胞は、１０００μｇ／ｍＬの量の選択剤（Ｇ４１８，Ｇｉｂｃｏ）の存在下で継代培養された。２週間の選択の後、Ｇ４１８に耐性のあるＣＨＯ細胞は、限界希釈によってクローン化された。次いで、ＥＳＭ−１を発現しているクローンが選択され、ＣＨＯ-ＥＳＭ（ＣＮＣＭへ寄託された）と命名された。
【００７３】
産生のため、ＣＨＯ-ＥＳＭ 細胞は、子ウシ胎児血清を有さない培地（培地ＣＨＯＳＦＭＩＩ，Ｇｉｂｃｏ）中で懸濁状態で培養された。その上澄み液はｐＨ８に調整され、そしてＤＥＡＥ−セファロースのカラム（ファルマシア）に通された。そのカラムは、５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８、０．２ＭＮａＣｌ緩衝液で洗浄された。タンパク質ＥＳＭ−１は、５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８、１ＭＮａＣｌ緩衝液中で溶出された。次いで、その溶出液は、５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８緩衝液中で１：４に希釈され、そしてアガロース（Ｂｉｏｒｄ）上に不動化された抗ＥＳＭ−１モノクローナル抗体（ＭＥＣ４）の存在下でインキュベートされた。攪拌しながら４℃で一晩インキュベートした後、そのアガロースビーズが、５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８、０．２ＭＮａＣｌ緩衝液で洗浄された。ＥＳＭ−１は、３ＭＭｇＣｌ2で溶出された。その溶出液は、濃縮され、５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８、０．５ＭＮａＣｌ緩衝液中で透析され、そして−７０℃で保存された。
【００７４】
Ｂａｌｂ／ｃマウスは、Freund のアジュバントの存在下、標準的免疫化プロトコールに従って、マウス当たり１０μｇの精製組み換えタンパク質ＥＳＭ−１の注射によって免疫化された。
【００７５】
抗ＥＳＭ−１モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞は、BECHARD et al. (2000) によって記載された技術に従って、融合し、スクリーニングし、そしてサブクローニングすることによって得られた。
【００７６】
５つのハイブリドーマ細胞クローンが得られ、総称的にＭＥＣ（ＣＨＯ細胞によって産生されたＥＳＭ−１へのマウスモノクローナル抗体 (Mouse Monoclonal Antibody to ESM-1 produced by CHO Cells)）と命名された。
【００７７】
選択された４つハイブリドーマのは、イソタイプＩｇＧ１，ｋのもので、それぞれＭＥＣ４、ＭＥＣ５、ＭＥＣ１５及びＭＥＣ３６と命名された。
それらハイブリドーマの１つは、イソタイプＩｇＭ，ｋのもので、ハイブリドーマＭＥＣ１１であった。
【００７８】
これらハイブリドーマ細胞クローンは、血清の不存在下で培地中で培養され、それら抗ＥＳＭ−１抗体は、ファルマシア（ＵＰＰＳＡＬＡ、スウェーデン）によって販売されているタンパク質Ｇ−セファロースのカラム上でクロマトグラフィーによって精製された。
【００７９】
実施例２：ＣＨＯ株の細胞によって産生されたタンパク質ＥＳＭ−１のＮ末端部分に対して特異的に向けられるモノクローナル抗体の選択
クラス ＩｇＧ１，ＫのＭＥＣ抗体は、異なるイソタイプのＭＥＰ抗体の存在下１μｇ／ｍＬの最終濃度においてＭＥＣシリーズの抗体とＥＳＭ／Ｆｃとの間に強い結合が持続することによって選択された。それら試験は、ＭＥＰ及びＭＥＣ抗体の選択についての上の例に従って（特に、LASSALLE et al. (1996) によって記載された競合実験による免疫検出法によって）、ＥＬＩＳＡによって行われた。
【００８０】
実施例３：タンパク質ＥＳＭ−１についての本発明による免疫検出試験
本免疫検出試験は、その全体に渡った特性が BECHARD et al. (2000) によって記載されたものと同一である“サンドイッチ”タイプの免疫酵素的試験からなった。
【００８１】
ハイブリドーマ株ＭＥＰ１４（ＣＮＣＭ 番号 Ｉ−１９４２）によって産生された抗ＥＳＭ−１モノクローナル抗体は、０．１Ｍ、ｐＨ９．５の炭酸緩衝液中で５μｇ／ｍＬの濃度に希釈され、そして９６穴プレート(プレートE.I.A./R.I.A., Costar, Cambridge, MA, 米国)上に＋４℃で一晩吸着された。
【００８２】
そのプレートは、０．１％のウシ血清アルブミン及び５ｍＭのＥＤＴＡを含有する２００μＬ／穴の容量のＰＢＳ緩衝液と共に実験室温度で１時間飽和され、次いで、ＥＬＩＳＡ緩衝液（０．１％のＴｗｅｅｎ２０を追加された上のＰＢＳ緩衝液）で２回洗浄された。
【００８３】
BECHARD et al. (2000) によって記載された技術に従って、精製タンパク質ＥＳＭ−１で較正が行われた。
血液試料は、ＥＬＩＳＡ緩衝液中で逐次的に希釈され（１：２〜１：１２８）、そして実験室温度で１時間ＥＬＩＳＡプレート上でインキュベートされた。
【００８４】
それら穴は、ＥＬＩＳＡ緩衝液で３回洗浄され、次いで、ＥＳＭ−１に対して向けられた、穴あたり１００μＬの緩衝液中の０．１μｇ／ｍＬの濃度の第二モノクローナル抗体、即ち、抗体ＭＥＣ１５（ＣＮＣＭ番号Ｉ−２５７２）と共に、実験室内温度で１時間インキュベートされた。
【００８５】
３回洗浄した後、ＥＬＩＳＡ 緩衝液中で希釈された、マウスＩｇＧ１に対して向けられるビオチン化ラットモノクローナル抗体（ＰＨＡＲＭＩＮＧＥＮによって販売されているもの）が加えられ、１時間放置してインキュベートされた。
【００８６】
ＥＬＩＳＡ緩衝液中で３回洗浄した後、その穴は、１：１０，０００ｖ／ｖの希釈率でストレプトアビジン−ペルオキシダ−ゼ接合体（ＺＹＭＥＤによって販売されているもの）と共にインキュベートされた。
【００８７】
ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ接合体との３０分のインキュベーションの後、各々の穴の３回洗浄がＥＬＩＳＡ緩衝液中で、次いで、２回洗浄がＰＢＳ緩衝液中で行われた。
【００８８】
ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ接合体は、５μＬのＨ2Ｏ2の存在下、ＳＩＧＭＡ（Ｓａｉｎｔ−Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）によって販売されている基質ＴＭＢに３０分間曝露された。
【００８９】
この曝露反応は、１００μＬの容量の２ＮのＨ2ＳＯ4の添加によって停止された。
そのプレートは、分光光度計（ａｎｔｈｏｓ  ｌａｂｔｅｃｈ  ＬＰ４０．フランス）を用いて、４０５ｎｍの波長で読まれた。
【００９０】
タンパク質ＥＳＭ−１の血漿又は血清濃度は、光学密度測定値から計算され、ｎｇ／ｍＬで表現された。
【００９１】
実施例４：
本発明による免疫検出試験及び従来技術の免疫検出試験でのＥＳＭ−１の測定の比較結果
形質移入されたＣＨＯ細胞株によって産生され、次いで、実施例１において記載された通りに精製された既知の濃度の組み換えタンパク質ＥＳＭ−１の比較測定が行われた。
【００９２】
第一の測定は、実施例３の教示に従って行われた。簡単に説明すると、抗体ＭＥＰ１４がＥＬＩＳＡタイプの９６穴プレート上に不動化され、次いで、既知の濃度のタンパク質ＥＳＭ−１を含有する一連のＰＢＳ緩衝液と接触状態に置かれた。洗浄の後、不動化抗体ＭＥＰ１４とタンパク質ＥＳＭ−１の間に形成された複合体が、本発明の抗体ＭＥＰ１５を含有する緩衝溶液と共にインキュベートされた。
【００９３】
更に数組の洗浄の後、その形成された抗原／抗体複合体は、ビオチン化ラット抗体抗マウスＩｇＧ１、次いでストレプトアビジン−ペルオキシダ−ゼ接合体と逐次的にインキュベートされてから、過酸化水素に曝露された。
【００９４】
第二の試験は、ＥＬＩＳＡタイプの９６穴プレート上に不動化された抗体ＭＥＰ１９を使用しかつ抗体ＭＥＰ２１を“サンドイッチ”タイプのこの免疫酵素的技術における第二抗体として使用することを除いて同じ条件下で行われた。
【００９５】
その結果を、図１中に示す。
本発明による抗体の組み合わせで、０．１５〜０．２ｎｇ／ｍＬのオーダーのタンパク質ＥＳＭ−１の濃度で光学密度値の有意な差が得られた。
【００９６】
対照的に、抗体ＭＥＰ１９とＭＥＰ２１の組み合わせでは、１又は２ｎｇ／ｍＬに等しいＥＳＭ−１の濃度について光学密度値における有意な増大が得られるに過ぎなかった。
これら２試験の間では本発明の免疫検出試験の方が５〜１０倍高い感度差で観察されうるので、図１において得られた結果は、タンパク質ＥＳＭ−１についての本発明による免疫検出試験が、従来技術の免疫検出試験と比較して高い感度を有することを明確に示している。
【００９７】
実施例５：
株ＨＥＫ２９３の形質移入細胞によって産生されたタンパク質ＥＳＭ−１のＮ末端領域に対して向けられた本発明の異なる複数の抗体を用いる免疫検出試験の比較結果
“サンドイッチ”タイプの免疫検出試験は、実施例３において記載されたプロトコールに従って行われた。
【００９８】
全ての場合において、抗体ＭＥＰ１４が、ＥＬＩＳＡタイプの９６穴プレートの穴中に不動化された。このように調製されたプレートを株ＨＥＫ２９３の形質転移細胞によって産生された組み換えＥＳＭ−１の既知濃度の溶液と共にインキュベートして洗浄した後、形成された抗原／抗体複合体が、第二抗体、即ち、それぞれ抗体ＭＥＣ２、抗体ＭＥＣ１５及び抗体ＭＥＣ３６の存在下でインキュベートされた。
【００９９】
その結果を図２中に示す。
真核細胞によって産生された組み換えタンパク質ＥＳＭ−１のＮ末端領域に対して向けられるモノクローナル抗体を“サンドイッチ”タイプの免疫酵素的試験において使用することは、高い感度のタンパク質ＥＳＭ−１の測定をもたらし、かくして、その感度がある抗体から別の抗体まで再現されることが、この結果によって示される。
【０１００】
０．１５〜０．２ｎｇ／ｍＬのオーダーのＥＳＭ−１の濃度を、試験された抗体ＭＥＣ１５、ＭＥＣ２及びＭＥＣ３６のグループについて検出することができた。
【０１０１】
実施例６：異なる重症度の敗血症を患っている患者における循環性タンパク質ＥＳＭ−１を定量するための本発明による免疫検出試験の応用
Ａ．材料及び方法
Ａ．１  免疫検出試験
本免疫検出試験は、上の実施例３に記載されたプロトコールに従って行われた。
Ａ．２  他の血液マーカーの試験
血清可溶性ＩＣＡＭ−１タンパク質の定量試験が、市販のＥＬＩＳＡ試験 (Diaclone-Research, Besancon, フランス) で行われた。そのプレートは、分光光度計 (Anthos labtech LP 40, フランス) を用いて４５０ｎｍの波長で読まれた。血清可溶性ＩＣＡＭ−１の濃度は、光学密度の測定値から計算され、ｎｇ／ｍＬで表現された。可溶性ＩＣＡＭ−１タンパク質の濃度の正常値は、５７１±１６８ｎｇ／ｍＬ（２１９〜１０４２；ｎ＝７７）であった。
【０１０２】
タンパク質プロカルシトニンを定量する試験は、ＩＬＭＡタイプの免疫学的試験（Lumitest, B. R. A. M. S.-Diagnosica GmbH, ドイツ）で行われた。
プロカルシトニンの正常値は、０．５ｎｇ／ｍＬ未満である。全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を患っている患者について測定された値は、一般に０．５〜２ｎｇ／ｍＬであった。
【０１０３】
Ｃ反応性タンパク質の量は、免疫ネフェロメトリーによって測定された。その正常値は１０ｍｇ／Ｌ未満 （Morley et al., 1982, Ann. Acad. N. Y. Sci., vol. 389:406-418） であった。
Ａ．３  対象
本検討は、４グループの対象、即ち、１グループの非アトピー健康対象（性比１）及び３グループの全身性及び／又は肺敗血症炎症性問題を患っている患者（性比１．６、年齢：５６±２才）について行われた。
【０１０４】
全ての非アトピー健康対象は即時型過敏症皮膚反射試験（乱刺法）に陰性反応を示し、そしてアレルギーの臨床的履歴を示さなかった。
血液試料が採取された時には、６８患者のうち、コルチコステロイドで処置された者も、血液透析を受けた者もいなかった。
【０１０５】
本実験プロトコールは、スイス大学病院の地方倫理委員会によって承認された。
Ａ．４  定義
次の用語が、本検討において用いられた。
【０１０６】
感染症は、微生物の存在下での炎症反応、又はこれら微生物によって宿主の本来無菌の組織が侵襲されることによる炎症反応によって特徴付けられる細菌現象である。
感染症の兆候を伴なわない全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）は、４つの次の臨床的基準：
ａ）発熱又は低体温（１００．４°Ｆより上［＜３８℃］、又は＞９６．８°Ｆ［＞３６℃］の体温）；
ｂ）頻脈（＞９０拍動／分）；
ｃ）頻呼吸（＞２０呼吸／分、又はＰａＣＯ2＜４．３ｋＰａ［３２ｍｍＨｇ］）；及び
ｄ）異常白血球数＞１２，０００細胞／ｍｍ3；＜４０００細胞／ｍｍ3、又は１０％を超える未成熟形態の存在それぞれ；
の少なくとも２つの存在によって特徴づけられる。
【０１０７】
敗血症は、感染症を伴なうＳＩＲＳと定義される。
重症敗血症は、臓器の機能不全、低灌流又は低血圧が付随した敗血症と定義される。低灌流及び灌流における異常には、尿量過少（分泌容量＜３０ｍｌ／ｈ）、乳酸アシドーシス（２ｍｍｏｌ／Ｌより大きい血清乳酸のレベル）、又は鎮静を伴なわない精神状態の急性劣化（Ｇｌａｓｇｏｗタイプの昏睡スコアに従う基礎値に関して少なくとも３点減少するもの）が含まれるが、それらに限られない。
【０１０８】
敗血症ショックは、適切な蘇生法及び妥当な血圧を維持するための血管活性アミンが必要であるにも関わらず、灌流異常病態（上を参照のこと）の存在が付随した、収縮期血圧における持続性減少（＜９０ｍｍＨｇ、又は収縮期血圧の基礎値と比較して４０ｍｍＨｇの減少）を伴なう、敗血症の存在と定義づけられる (Crit. Care Med. 19992, vol. 20:864-874)。
Ａ．５  検討の説明
各々の患者について、次の生物学的及び臨床的パラメータが得られた：年齢、性別、Crit. Care ed., 1992, vol. 20: 864-874 において定義された第一及び第二の診断、先例、治療、血液採取１０日前の生命状態、タンパク質ＥＳＭ−１の血清及び血漿濃度。
【０１０９】
殆どの患者について、循環性可溶性 ＩＣＡＭ−１（ｓＩＣＡＭ−１）、プロカルシトニン （ｐｒｏＣＴ） 及びＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）のような他の血液生物学的パラメータも測定された。
【０１１０】
血液試料は、患者（又は健康なボランティア）の各々から乾燥チューブ中及びＥＤＴＡで処理されたチューブ中に取り込まれ、ＪｏｕａｎＣ３１タイプ（フランス）の遠心機中で、３５００r.p.m. の速度で３０分遠心分離された。
【０１１１】
その血清及び血漿試料は、試験が行われる前に−２０℃で短時間保存された。
入院１０日間の生存期間は「これら患者において感染症が死に直接寄与した」又は「他の死因と比較して初期炎症性問題の寄与が除外されえない」と仮定することによって選ばれた。
Ａ．７  統計的分析
データは、平均±標準偏差として表現される。
【０１１２】
異なるグループの間のＥＳＭ−１、ｓＩＣＡＭ−１、プロカルシトニン及びＣＲＰの平均レベルの比較が、“一元分析”試験Ａｎｏｖａ (Bonferroni-Dunn)、Kruskal-Wallis 試験及び Mann-Whitney 試験を使用して行われた。
【０１１３】
マーカーの値間の相互関連付けが、Spearman 等級付け試験を使用して行われた。
循環性マーカーのレベルと患者状態の重症度の間の相互関連付けが、“一元分析”試験Ａｎｏｖａ (Bonferroni-Dunn)、Mann-Whitney 試験及び Wilcoxon 試験を使用して行われた。
【０１１４】
一般に、ｐ＜０．０５の値は、統計的に有意であるとみなされた。
グラフは、それらの中央値及び第一及び第三４分位値により表される縦棒のグラフの形態で作製された。
Ｂ．結果
Ｂ．１  ＥＳＭ−１の血漿レベルと血清レベルの間の相関関係
第一の試験では、血液試料を採取する条件がＥＳＭ−１レベルの値に影響しうるかどうかを確認した。４１の健康な対象におけるＥＳＭ−１の血漿レベルと血清レベルの値の比較により、強い相関関係（ｒ＝０．８５；ｐ＜０．０００１）が示されていた。図３では、コントロールグループに関する限り、この検討の最初の３６患者については、所与の患者についてＥＳＭ−１の血漿レベルと血清レベルの間に有意な差は検出されえないことが観察できる。
【０１１５】
これら結果は、まず、血液の凝固はＥＳＭ−１レベルを変えないことを示唆する。これら結果は、タンパク質ＥＳＭ−１が、血液試料と血漿試料のいずれからでも定量されうることも示唆する。
【０１１６】
従って、ＥＳＭ−１の血清レベルだけが、残りの検討について用いられた。
Ｂ．２  コントロールグループ
ＥＳＭ−１の血清レベルの平均値は、表１に示されているように、健康な対象においては０．７±０．４ｎｇ／ｍＬである一方で、アトピー対象のグループにおいてはＥＳＭ−１の血清レベルは１．０±０．１ｎｇ／ｍＬであった。
【０１１７】
差は小さいものの、統計的に有意（ｐ＜０．０５）であった。
結論として、本検討において言及されたコントロールグループは、一般集団の代表である健康な非アトピー対象のグループであるので、この健康な非アトピー対象のグループにおけるＥＳＭ−１レベルの平均値が基準正常値と決定された。
Ｂ．３  患者のグループ
患者の複数のグループにおける循環性マーカーの結果が、表１に纏められ、図４及び５中に示されている。
【０１１８】
重症敗血症と認定された患者の血清において、ｓＥＳＭ−１、ｓＩＣＡＭ−１、ＣＲＰ及び ｐｒｏＣＴ レベルが、各々の患者グループについて、コントロールグループと比較して強く増大した（表１）。
【０１１９】
これら増大したレベルは、敗血症を患っている患者のグループにおけるプロカルシトニン（表１、図４及び５）を除いて、全てのマーカー及び全ての患者のグループについて統計的に有意なもの（ｐ＜０．０１又はそれを下回る）であった。
【０１２０】
障害の重症度は、敗血症、重症敗血症及び敗血症ショックとそれぞれ命名された３つのレベルに従って定義された。これらグループの各々において、ＥＳＭ−１レベルは、障害の重症度に統計的に相関するやり方（ｐ＜０．０１，ｎ＝６１）で増大した（表２を参照のこと）。
【０１２１】
類似の増大が、血清プロカルシトニン及びＣＲＰレベル（それぞれｐ＝０．０００１，ｎ＝３４と、ｐ＜０．０１，ｎ＝４３）について見出された。
しかしながら、ｓＩＣＡＭ−１のレベルは正常値の約５倍まで増加したが、各々の患者のグループ内においては、類似のレベルを示したにすぎなかった。
【０１２２】
ＣＲＰ(Ａｎｏｖａ及び Mann-Whitney) 及びＰｒｏＣＴレベル (Mann-Whitney) は、敗血症を患っている患者のグループを、重症敗血症を患っている患者から識別できるようにしたが、それは、ＥＳＭ−１レベルについてはそうではなかった。
【０１２３】
ＥＳＭ−１ (Ａｎｏｖａ及び Mann-Whitney) 及びＰｒｏＣＴレベル (Mann-Whitney) は、重症敗血症を患っている患者のグループを、敗血症ショックを患っている患者から識別できるようにしたが、ＣＲＰレベルについてはそうではなかった（表２参照のこと）。
【０１２４】
これら結果からみて、ＣＲＰは、最も重症度の低い障害についての最も感度の良好なマーカーと考えられ、そして、ＥＳＭ−１レベルは、より重症な敗血症についてＰｒｏＣＴマーカーよりも良好なマーカーと考えられる。
【０１２５】
ＥＳＭ−１、ｓＩＣＡＭ−１、ＣＲＰ又はＰｒｏＣＴの血清レベルの間の相関関係を調査することによって、ＣＲＰレベルとプロカルシトニンレベルの間の有意な相関関係（ｐ＜０．０１、表３）が樹立された。
【０１２６】
しかしながら、他のマーカー間には有意な相関関係が見出されなかった（表３参照のこと）。
更に、敗血症ショックを患っている患者のグループにおいては、ＥＳＭ−１のレベルと血漿クレアチニンのレベルの間に相関関係が観察されなかった（結果は示されていない）。
【０１２７】
ＥＳＭ−１の血清レベルが死亡兆候を予測できるかどうかを確認するために、第一のアプローチは、死亡した患者と生存している患者の間で血清ＥＳＭ−１の平均レベルを比較することであった。
【０１２８】
蘇生した患者及び致命的結末を迎えた患者の全ての患者を考慮に入れると、その結果は、入院の日（第０日）における血清ＥＳＭ−１のレベルが、第１０日に死亡した患者のグループにおいて有意により高かったことを示した（第１０日；ｐ＜０．０１；図６Ａ及び図７）。このような差は、他のマーカーであるｓＩＣＡＭ−１、ＣＲＰ又はＰｒｏＣＴについては示されなかったことが強調されうる（図６Ｂ〜９）。
【０１２９】
第二のアプローチにおいては、ｓＥＳＭ−１及びｓＩＣＡＭ−１のレベルが、入院の日（第０日）と２４時間後（第１日）の両方で測定された。第０日でのＥＳＭ−１のレベルは、生存した患者よりも死亡した患者において有意に高かった（図７Ａ）。この差は、第１日でも持続した（ｎ＝２０，ｐ＜０．０５）（図７Ａ）。
【０１３０】
このような差は、他のマーカーであるｓＩＣＡＭ−１（図７Ｂ）、ＣＲＰ、プロカルシトニン又はｓＩＣＡＭ−１のもいずれにも観察されなかった。
敗血症ショックを患っている患者のグループ内だけででも、第０日及び第１日（ｎ＝１１）におけるＥＳＭ−１の血清レベルは、生存した患者よりも死亡した患者において有意に高かった（図８Ａ〜Ｂ）。
【０１３１】
各々のグループにおいて、各々の患者の第０日におけるｓＩＣＡＭ−１、第１日におけるｓＩＣＡＭ−１（図８Ｂ）、第０日におけるＣＲＰ又は第０日におけるＰｒｏＣＴのレベルと、第１０日の生存の間に統計的に有意な相関関係が見出されなかった。
【０１３２】
この実施例におけるこれら結果は、循環性タンパク質ＥＳＭ−１の濃度の平均値が、健康な対象と比較して大きく高いことを示している。この循環性ＥＳＭ−１の平均濃度の増大は、その障害の臨床的重症度のレベルと相関している。障害の初期の段階における循環性ＥＳＭ−１の最も高いレベルは、１０日後の患者の生存の見込みがより低いことと関連した。
【０１３３】
先の検討と矛盾することなく、Ｃ反応性タンパク質若しくはＣＲＰ(Morley et al.)、プロカルシトニン若しくはＰｒｏＣＴ (ASSICOT M et al.; MULLER B et al.; WANNER GA et al.) 及び可溶性ＩＣＡＭ−１若しくはｓＩＣＡＭ−１ (KAYAL S et al.; SESSLER C N et al. (1995); SESSLER C N et al. (1993)) のような循環性マーカーも、本検討の患者において有意に増大した。ＣＲＰ及びＰｒｏＣＴマーカーは、患者の臨床的重症度に相関した。
【０１３４】
しかしながら、３つのマーカー、即ち、ＣＲＰ、ＰｒｏＣＴ、ｓＩＣＡＭ−１のレベルを測定しても、循環性タンパク質ＥＳＭ−１のレベルの測定とは対照的に、死亡前兆を予測できなかった。更に、ＥＳＭ−１の血清レベルの予言的な値は、入院の第０日における血清ＥＳＭ−１の初期値に優勢にリンクしていた。
【０１３５】
本検討においては、血清ＥＳＭ−１のレベルの増大は、血漿クレアチニンレベルの増大によって測定されたとき、腎機能不全とは相関しなかった。この結果は、敗血症ショックを患っている患者における血清中のタンパク質ＥＳＭ−１の増大したレベルが、劣化した肺組織又はストレス状態にある血管壁の細胞から起きることを示唆する。
【０１３６】
結論として、この実施例に提示された検討の結果は、ＥＳＭ−１が、敗血症を患っている患者における内皮細胞の機能不全の新たなマーカーに相当することを示している。
可溶性接着分子、サイトカイン類、プロカルシトニン、又は一定の細胞の特殊な機能不全の他のマーカーのような循環性マーカーを他のパラメーターの値と組み合わせれば、タンパク質ＥＳＭ−１のレベルは、敗血症を患っている患者についての臨床的重症度と結末に関する有用な情報を供給する。
【０１３７】
【表１】
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【０１３８】
【表２】
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【０１３９】
【表３】
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【０１４０】
文献
・AMERICAN COLLEGE OFCHEST PHYSICIANS/SOCIETY OFCRITICAL CARE MEDICINE CONSENSUS CONFERENCE (1992).
・ASSICOT M et al., 1993, Lancet, vol.341: 515-518
・BECHARD et al. (2000) J. Vasc, Res., vol.37 (5): 417-425.
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・KAYAL S et al., 1998, Am. J. Respir. Crit Care Med, vol.157:774-776;
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・ASSALLE P et al. (1996) The Journal of Biological Chemistry,vol.271(34): 20.458-20.464).
・LEGER et al., (1997, Hum. Antibodies,. Vol.8 (1):3-16).
・MARTINEAU et al. (1998, J. Mol. Biol., vol.280 (1): 117-127).
・MORLEY et al., Ann. N.Y. Acad. Sci, 1982, vol. 389:406-418),
・MULLER B et al (2000), Ceit. Care Med., vol.28:977-983;
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・SESSLER C.N. et al., Am. J. Respir. Crit Care Med., 1995,vol. 151:1420-1427;
・SESSLER C.N., 1993, Chest, vol.104(2): 11S)
・WANNER et al., 2000. Crit. Care Mod., vol 28 (4): 950-957
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】図１は、タンパク質ＥＳＭ−１についての本発明による免疫検出試験（白抜きの丸）と、黒塗りの丸で表される BECHARD et al. (2000) により記載された検出試験の検出の感度の比較を示す。縦座標は、試験された試料中のタンパク質ＥＳＭ−１のｎｇ／ｍＬで表現された濃度を表す。光学密度が横座標上に表されている。
【図２】図２は、“サンドイッチ”タイプの免疫酵素的技術に従って行われた免疫検出プロファイルを示す。全ての場合において、ハイブリドーマＭＥＰ１４によって産生されたモノクローナル抗体が、マイクロ滴定プレート上に吸着された。光学密度が横座標上に表されている。縦座標は、ＨＥＫ２９３株の細胞によって産生されたタンパク質ＥＳＭ−１におけるｎｇ／ｍＬで表現された濃度を表す。この免疫検出試験において用いられた第二抗体は、タンパク質ＥＳＭ−１のＮ末端領域に対して特異的に向けられた抗体であった。それは、抗体ＭＥＣ２（図２Ａ）、ＭＥＣ１５（図２Ｂ）及び ＭＥＣ３６（図２Ｃ）であった。
【図３】図３は、健康なボランティア若しくは患者の血漿又は血清中に見出されたタンパク質ＥＳＭ−１の濃度の比較を示す。縦座標は、タンパク質ＥＳＭ−１のｎｇ／ｍＬで表現された血清濃度を表す。横座標は、タンパク質ＥＳＭ−１のｎｇ／ｍＬで表現された血漿濃度を表す。
【図４】図４は、健康なボランティア又は増大する臨床的重症度の敗血症を患っている患者の血清中に見出された循環性タンパク質ＥＳＭ−１の量を示す。ｎｇ／ｍＬで表現された血清タンパク質ＥＳＭ−１の濃度が、縦座標上に示されている。横座標は、試験された個体の異なる集団、即ち、それぞれ健康な対象（ＣＴＲＬ）、Crit. Care Med., 1992, vol. 20: 864-874 に公開されている臨床的定義に従う敗血症、重症敗血症又は敗血症ショックを患っている患者を示す。
【図５】図５は、健康者の集団、又は、敗血症、重症敗血症もしくは敗血症ショックを患っている患者の集団における３つの敗血症マーカーの定量を示す。  図５Ａは、血清中の可溶性ＩＣＡＭ−１タンパク質のｎｇ／ｍＬで表現された定量を示す。  図５Ｂは、Ｃ反応性タンパク質のｍｇ／ｍＬで表現された定量を示す。  図５Ｃは、血清プロカルシトニンのｎｇ／ｍＬで表現された定量を示す。
【図６】図６は、それぞれ生存した患者及び死亡した患者の入院第０日における、循環性タンパク質ＥＳＭ−１のレベルと、３つの慣用的敗血症マーカー、即ち、それぞれ可溶性ＩＣＡＭ−１タンパク質、Ｃ反応性タンパク質及びプロカルシトニンの各々のレベルとの間の比較を示す。  図６Ａは、タンパク質ＥＳＭ−１のｎｇ／ｍＬで表現された血清レベルを示す。  図６Ｂは、可溶性ＩＣＡＭ−１タンパク質のｎｇ／ｍＬで表現された血清レベルを示す。  図６Ｃは、Ｃ反応性タンパク質のｎｇ／ｍＬで表現された血清レベルを示す。  図６Ｄは、プロカルシトニンのｎｇ／ｍＬで表現されたレベルを示す。
【図７】図７は、タンパク質ＥＳＭ−１又は可溶性ＩＣＡＭ−１タンパク質の量の入院後第０日及び第１日の患者における前兆値を死亡した患者のものと比較して示す。  図７Ａは、生存した患者（黒塗りの丸）及び死亡した患者（白抜きの丸）において入院後第０日及び第１日にそれぞれ見出されたタンパク質ＥＳＭ−１のｎｇ／ｍＬで表現されたレベルを示す。  図７Ｂは、その同じ患者における血清可溶性ＩＣＡＭ−１タンパク質のレベルを示す。
【図８】図８は、ＥＳＭ−１及び可溶性ＩＣＡＭ−１タンパク質のレベルの入院後第０日及び第１日に測定された死亡前兆値を示す。  図８Ａは、生存した患者（黒塗りの円）及び死亡した患者（白抜きの円）における血清タンパク質のｎｇ／ｍＬで表現されたレベルを示す。  図８Ｂは、生存した患者（黒塗りの円）及び死亡した患者（白抜きの円）における血清可溶性ＩＣＡＭ−１タンパク質のｎｇ／ｍＬで表現されたレベルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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