(57)【要約】本発明は、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸（ＰＨＣＡ）を生物学的に生成するための方法をいくつか提供するものである。本発明はまた、ケイ皮酸塩をＰＨＣＡに変換する機能を持つ新規な菌類およびバクテリアの発見に関する。本発明は、野生型ＰＡＬのチロシンをＰＨＣＡに変換する機能に注目して酵母Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓからＥ．ｃｏｌｉに野生型ＰＡＬを取り込むことでグルコースをＰＨＣＡに変換するための新規な生体触媒を開発することに関する。また、本発明は、酵母Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓから得られる野生型ＰＡＬに加えて植物のシトクロムＰ−４５０およびシトクロムＰ−４５０レダクターゼをＥ．ｃｏｌｉに取り込むことでグルコースをＰＨＣＡに変換するための新規な生体触媒を開発することにも関する。さらに他の実施形態では、本発明は、チロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）活性が亢進した野生型酵母のＰＡＬの突然変異誘発によって新規な生体触媒を開発する方法を提供するものである。
2004530402.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）切断を受けた変異型チロシンアンモニアリアーゼのポリペプチドであって、配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有する前記ポリペプチド、をコードする単離された核酸断片と、
ｂ）配列番号３１に記載のヌクレオチド配列を有する単離された核酸断片と、
ｃ）（ａ）または（ｂ）と完全に相補的である単離された核酸断片と、
からなる群から選択されることを特徴とする、単離された核酸断片。
【請求項２】
チロシンアンモニアリアーゼ活性を持つ単離された核酸断片または請求項１によってコードされることを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項３】
ａ）変異型チロシンアンモニアリアーゼのポリペプチドであって、配列番号１０と、配列番号３３と、配列番号３４と、配列番号３５と、配列番号３６と、配列番号３７と、配列番号３８と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する前記ポリペプチドをコードする単離された核酸断片と、
ｂ）（ａ）と完全に相補的である単離された核酸断片と、からなる群から選択されることを特徴とする、単離された核酸断片。
【請求項４】
配列番号１０と、配列番号３３と、配列番号３４と、配列番号３５と、配列番号３６と、配列番号３７と、配列番号３８と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するチロシンアンモニアリアーゼ活性を持つことを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項５】
（ｉ）ケイ皮酸ヒドロキシラーゼ活性を持たず、好適な制御配列に作動的に結合された請求項１または３に記載の単離された核酸断片を含む組換え宿主細胞と、発酵性炭素基質とを接触させ、
（ｉｉ）ｐ−ヒドロキシケイ皮酸を生成するのに十分な時間、前記組換え細胞を成長させ、
（ｉｉｉ）任意に、前記ｐ−ヒドロキシケイ皮酸を回収することを含むことを特徴とする、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸の生成方法。
【請求項６】
前記発酵性炭素基質が、単糖類と、オリゴ糖類と、多糖類と、二酸化炭素と、メタノールと、ホルムアルデヒドと、ギ酸塩と、炭素含有アミンと、からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記発酵性炭素基質がグルコースである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記組換え宿主細胞が、バクテリアと、酵母と、糸状菌類と、藻類と、植物細胞と、からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記組換え宿主細胞が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓと、Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓと、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓと、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓと、Ｐｉｃｈｉａと、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓと、Ｃａｎｄｉｄａと、Ｈａｎｓｅｎｕｌａと、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓと、Ｍｕｃｏｒと、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓと、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒと、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａと、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａと、Ｂａｃｉｌｌｕｓと、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒと、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓと、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒと、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓと、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓと、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓと、からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記組換え宿主細胞が、ダイズと、アブラナと、ヒマワリと、ワタと、トウモロコシと、タバコと、アルファルファと、コムギと、オオムギと、カラスムギと、ソルガムと、コメと、ブロッコリと、カリフラワーと、キャベツと、パースニップと、メロンと、ニンジンと、セロリと、パセリと、トマトと、ジャガイモと、イチゴと、ピーナツと、ブドウと、芝種子と、テンサイと、サトウキビと、マメと、エンドウマメと、ライムギと、アマと、広葉樹と、針葉樹と、牧草と、からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本件特許出願は、１９９９年８月６日に出願された米国仮特許出願第６０／１４７，７１９号による利益を主張して２０００年７月２７日に出願された米国特許出願第０９／６２７，２１６号の一部継続出願である。
【０００２】
技術分野
本発明は、分子生物学および微生物学の分野に関するものである。特に、本発明は、チロシンアンモニアリアーゼ活性が亢進された、遺伝子工学的手法による新規な生体触媒について説明するものである。
【０００３】
発明の背景
植物（Ｋｏｕｋｏｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３６：２６９２〜２６９８（１９６１））、菌類（Ｂａｎｄｏｎｉら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７：２０５〜２０７（１９６８））、酵母（Ｏｇａｔａら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３１：２００〜２０６（１９６７））およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ（Ｅｍｅｓら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４８：６１３〜６２２（１９７０））にはフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）（ＥＣ４．３．１．５）が広く分布しているが、この酵素はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉまたは哺乳類の細胞には見られない（ＨａｎｓｏｎおよびＨａｖｉｒ、Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ、第３版；Ｂｏｙｅｒ，Ｐ．編；Ａｃａｄｅｍｉｃ：ニューヨーク、１９６７；第７５〜１６７頁）。ＰＡＬはフェニルプロパノイドの代謝経路にて最初に作用する酵素であり、Ｌ−フェニルアラニンから（ｐｒｏ−３Ｓ）−水素と−ＮＨ３＋とを除去してｔｒａｎｓ−ケイ皮酸を形成する。植物にはＰ４５０酵素系があるため、ｔｒａｎｓ−ケイ皮酸からリグニンやイソフラボノイドなどのさまざまな二次代謝産物を生成するための共通の中間体として作用するｐ−ヒドロキシケイ皮酸（ＰＨＣＡ）を得ることができる。しかしながら、微生物では二次代謝産物形成の前駆体として作用するのはＰＨＣＡではなくケイ皮酸である。現在までのところ、微生物ソースのケイ皮酸ヒドロキシラーゼ酵素がキャラクタライズされた例はない。植物に含まれるＰＡＬ酵素は、リグニンやイソフラボノイド、その他のフェニルプロパノイドの生合成経路における調節酵素であると考えられている（Ｈａｈｌｂｒｏｃｋら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０：３４７〜３６９（１９８９））。しかしながら、赤色酵母であるＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）では、このリアーゼの持つ異化機能がゆえにフェニルアラニンが分解され、この酵素の作用によって形成されるケイ皮酸塩が安息香酸塩および他の細胞物質に変換される。
【０００４】
Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓをはじめとするさまざまなソースに由来するＰＡＬの遺伝子配列がすでに判定され、発表されている（Ｅｄｗａｒｄｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ  ８２：６７３１〜６７３５（１９８５）；Ｃｒａｍｅｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：３６７〜３８３（１９８９）；Ｌｏｉｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．８：１６４１〜１６４８（１９８９）；Ｍｉｎａｍｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８５：１９〜２５（１９８９）；Ａｎｓｏｎら、Ｇｅｎｅ  ５８：１８９〜１９９（１９８７）；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ＆  Ｏｅｒｕｍ、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、１：２０７〜２１１（１９９１）。酵母、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉおよび昆虫細胞培養では、さまざまなソースに由来するＰＡＬ遺伝子が活性ＰＡＬ酵素として過発現されている（Ｆａｕｌｋｎｅｒら、Ｇｅｎｅ  １４３：１３〜２０（１９９４）；Ｌａｎｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：１０８６７〜１０８７１（１９９７）；ＭｃＫｅｇｎｅｙら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：１２５９〜１２６３（１９９６））。ＰＡＬは、先天性代謝異常症であるフェニルケトン尿症を矯正（Ｂｏｕｒｇｅｔら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１８０：５〜８（１９８５）；米国特許第５，７５３，４８７号）したり腫瘍の代謝を変化させる（Ｆｒｉｔｚら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１：４６４６〜４６５０（１９７６））ほか、血清フェニルアラニンの定量分析時（Ｋｏｙａｍａら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１３６：１３１〜１３６（１９８４））およびケイ皮酸からＬ−フェニルアラニンを合成する経路（Ｙａｍａｄａら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：７７３（１９８１）、Ｈａｍｉｌｔｏｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３：６４〜６８（１９８５）およびＥｖａｎｓら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５：３９９〜４０５（１９８７））としての有用性を秘めていることから注目されるようになった。
【０００５】
植物では、フェニルアラニンがＰＡＬ酵素によってｔｒａｎｓ−ケイ皮酸に変換され、これがさらにパラ位でケイ皮酸−４−ヒドロキシラーゼで水酸化されてＰＨＣＡが生成される（Ｐｉｅｒｒｅｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２２４：８３５（１９９４）；Ｕｒｂａｎら、Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２２２：８４３（１９９４）；Ｃａｂｅｌｌｏ−Ｈｕｒｔａｄｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７３：７２６０（１９９８）；Ｔｅｕｔｓｃｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：４１０２（１９９３））。しかしながら、微生物系では、通常はＰＨＣＡへのパラ水酸化がケイ皮酸の代謝に関与することはないため、微生物におけるこの反応に関する情報は乏しい。
【０００６】
入手可能な情報では、いくつかの植物ならびに微生物に由来するＰＡＬが、フェニルアラニンをケイ皮酸塩に変換できるだけでなく、チロシンを基質として利用できるとされている。このような反応における酵素活性はチロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）と呼ばれる。ＴＡＬによってチロシンを変換するとケイ皮酸塩を生成することなくチロシンからＰＨＣＡが直接形成される。しかしながら、天然のＰＡＬ／ＴＡＬ酵素はいずれもチロシンではなくフェニルアラニンを基質とすることが多い。ＴＡＬ活性の方が常にＰＡＬ活性よりレベルが低いのであるが、この差がどれだけであるかは実にさまざまである。たとえば、パセリ酵素のフェニルアラニンに対するＫＭは１５〜２５μＭ、代謝回転数２２／秒であるが、チロシンに対するＫＭは２．０〜８．０ｍＭ、代謝回転数は０．３／秒である（Ａｐｐｅｒｔら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２２５：４９１（１９９４））。これとは対照的に、トウモロコシ酵素のフェニルアラニンに対するＫＭはチロシンのわずか１５倍にすぎず、代謝回転数は約１０倍である（Ｈａｖｉｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ４８：１３０（１９７１））。この規則が当てはまらないのは、ＰＡＬ触媒活性に対するＴＡＬ触媒活性の比が約０．５８のＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍという酵母である（ＨａｎｓｏｎおよびＨａｖｉｒ、Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ；Ａｃａｄｅｍｉｃ：ニューヨーク、１９８１；第７巻、第５７７〜６２５頁）。
【０００７】
上述した生物系ではＰＨＣＡの生成に役立つ可能性のある多数の酵素が得られるが、このモノマーの効率的な生成には成功していない。したがって、解決すべき課題は、安価な基質または発酵性炭素源を用いて生物ソースからＰＨＣＡを効率よく生成するための方法を設計して実行することである。本願出願人らは、ＰＡＬおよびｐ４５０／ｐ−４５０レダクターゼ系をコードする外来遺伝子の過発現、あるいは、変異型および野生型のＴＡＬ活性をコードする遺伝子の発現のいずれかによって、微生物宿主と植物宿主の両方を遺伝子操作してＰＨＣＡを産生して上述した問題を解決した。
【０００８】
発明の概要
本発明の目的は、液晶ポリマー（ＬＣＰ）を形成するためのモノマーとしての可能性を秘めた化合物であるＰＨＣＡを生物生産することである。グルコースおよび他の発酵性炭素基質からＰＨＣＡを生成できそうな生物経路には次の２つがある。
１）フェニルアラニンをケイ皮酸に変換し、これをさらにＰＨＣＡに変換する。この経路では、酵素であるＰＡＬならびにシトクロムＰ−４５０およびシトクロムＰ−４５０レダクターゼが必要である（スキーム１）
２）ケイ皮酸塩を生成せずに一工程でチロシンをＰＨＣＡに変換する（スキーム１）。この経路は、ＰＡＬと極めて類似していることが多いが、ＰＡＬよりもチロシンに対する基質特異性が高い酵素であるＴＡＬを必要とする。この経路にはシトクロムＰ−４５０やシトクロムＰ−４５０レダクターゼは必要ない。したがって、ＴＡＬ経路を用いるには、ＴＡＬ経路で機能するようにＴＡＬの活性を亢進させた生体触媒を生成しなければならない。
【０００９】
【化１】
2004530402.tif 000003
【００１０】
本発明は、１）ケイ皮酸塩をＰＨＣＡに変換、２）ＰＡＬ経路によってグルコースをフェニルアラニンへ、さらにはＰＨＣＡに変換、および３）チロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）活性が亢進した新たな生体触媒を生成することによって、ＰＨＣＡを生物生産するための方法について説明するものである。ＴＡＬを進化（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）させるには、酵母のＰＡＬ遺伝子を単離し、突然変異を誘発し、ＰＡＬコード配列を進化させ、ＴＡＬ活性が増大した変種を選択する必要がある。本発明はさらに、さまざまな菌類およびバクテリアにおいて上述した経路でグルコースからＰＨＣＡを生物生産することについて示すものである。
【００１１】
したがって、本発明の一目的は、（ｉ）Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系を持たず、好適な制御配列に作動的に結合されたチロシンアンモニアリアーゼ活性をコードする遺伝子を含む組換え宿主細胞と、発酵性炭素基質とを接触させ、（ｉｉ）ＰＨＣＡを生成するのに十分な時間、前記組換え細胞を成長させ、（ｉｉｉ）任意に、前記ＰＨＣＡを回収することを含む、ＰＨＣＡを生成するための方法を提供することである。本発明に関する限り、発酵性炭素基質は、単糖類と、オリゴ糖類と、多糖類と、二酸化炭素と、メタノールと、ホルムアルデヒドと、ギ酸塩と、炭素含有アミンと、からなる群から選択すればよく、宿主細胞は、バクテリアと、酵母と、糸状菌類と、藻類と、植物細胞と、からなる群から選択すればよい。
【００１２】
同様に、シトクロムＰ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系を持たず、好適な制御配列に作動的に結合されたチロシンアンモニアリアーゼ活性をコードする遺伝子を含む組換え宿主細胞も提供する。
【００１３】
また、（ｉ）ａ）植物のＰ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系をコードする遺伝子と、ｂ）好適な制御配列と作動的に結合された酵母のＰＡＬ活性をコードする遺伝子とを含む組換え酵母細胞と、発酵性炭素基質とを接触させ、（ｉｉ）ＰＨＣＡを生成するのに十分な時間、前記組換え細胞を成長させ、（ｉｉｉ）任意に前記ＰＨＣＡを回収することを含む、ＰＨＣＡを生成するための方法も提供する。
【００１４】
本発明の別の目的は、（ｉ）ＰＨＣＡを代謝するのに十分な時間、ＴＡＬ活性をコードする可能性のある外来遺伝子を含む組換え微生物とＰＨＣＡとを接触させ、（ｉｉ）組換え微生物の成長をモニタリングすることを含む（この場合、生物体が成長すればＴＡＬ活性をコードする遺伝子が存在することになる）、ＴＡＬ活性をコードする遺伝子を同定するための方法を提供することにある。
【００１５】
同様に、（ｉ）ＴＡＬ活性をコードする可能性のある遺伝子で、ＰＨＣＡを唯一の炭素源として利用することができる宿主細胞を形質転換して、形質転換体を形成し、（ｉｉ）形質転換体の成長率とＰＨＣＡを唯一の炭素源として利用することができる形質転換されなかった宿主細胞の成長率とを比較することを含む（この場合、形質転換体によって成長率が高まればＴＡＬ活性をコードする遺伝子が存在することになる）、ＴＡＬ活性をコードする遺伝子を同定するための方法を提供する。
【００１６】
さらに、本発明は、ａ）切断を受けた変異型チロシンアンモニアリアーゼのポリペプチドであって、配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有する前記ポリペプチド、をコードする単離された核酸断片と、ｂ）配列番号３１に記載のヌクレオチド配列を有する単離された核酸断片と、ｃ）（ａ）または（ｂ）と完全に相補的である単離された核酸断片と、からなる群から選択される、単離された核酸断片と、これによってコードされるポリペプチドとを提供するものである。
【００１７】
同様に、本発明は、ａ）変異型チロシンアンモニアリアーゼのポリペプチドであって、配列番号１０と、配列番号３３と、配列番号３４と、配列番号３５と、配列番号３６と、配列番号３７と、配列番号３８と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する前記ポリペプチドをコードする単離された核酸断片と、ｂ）いずれかの（ａ）と完全に相補的である単離された核酸断片と、からなる群から選択される、単離された核酸断片と、これによってコードされるポリペプチドとを提供するものである。
【００１８】
配列の説明ならびに生物の寄託
本願出願人らは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の定めにより、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９の米国菌株保存機関（ＡＴＣＣ）に、以下の生物の寄託を行った。
【００１９】
【表１】
2004530402.tif 000004
【００２０】
本件特許出願の一部をなす以下の詳細な説明および添付の配列の説明から、本発明を一層完全に理解することができる。
【００２１】
本願出願人（単数または複数）は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則」）に準拠し、かつ、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＯおよびＰＣＴにおける配列表に関する要件（実施細則の規則５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）ならびにセクション２０８および付録Ｃ）に従って、以下の３０の配列を提示する。
【００２２】
配列番号１〜４は、ベクターの作製に用いられるプライマーである。
配列番号５〜６は、ベクターの作製および変異型ＰＡＬ酵素の局所的かつランダムな突然変異誘発に用いられるプライマーである。
配列番号７は、野生型Ｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓのＰＡＬ酵素をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号８は、野生型Ｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓのＰＡＬ酵素をコードするヌクレオチド配列でコードされる推定アミノ酸配列である。
配列番号９は、ＴＡＬ活性が亢進した変異型Ｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓのＰＡＬ酵素をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１０は、ＴＡＬ活性が亢進した変異型Ｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓのＰＡＬ酵素をコードするヌクレオチド配列でコードされる推定アミノ酸配列である。
配列番号１１は、Ｈ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｓのシトクロムｐ−４５０酵素をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１２は、Ｈ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｓのシトクロムｐ−４５０酵素をコードするヌクレオチド配列でコードされる推定アミノ酸配列である。
配列番号１３は、Ｈ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｓのｐ−４５０レダクターゼ酵素をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１４は、Ｈ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｓのｐ−４５０レダクターゼ酵素をコードするヌクレオチド配列でコードされる推定アミノ酸配列である。
配列番号１５〜２３は、変異型ＰＡＬ酵素のＮ末端の切断に用いられるプライマーである。
配列番号２４〜３０は、変異型ＰＡＬ酵素の局所的かつランダムな突然変異誘発に用いられるプライマーである。
配列番号３１は、切断を受けたＴＡＬ酵素をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号３２は、配列番号３１でコードされる切断を受けたＴＡＬ酵素のアミノ酸配列である。
配列番号３３は、変異型ＴＡＬ酵素のアミノ酸配列である。
配列番号３４は、ＲＭ１２０−１として同定された変異型ＴＡＬ酵素のアミノ酸配列である。
配列番号３５は、ＲＭ１２０−２として同定された変異型ＴＡＬ酵素のアミノ酸配列である。
配列番号３６は、ＲＭ１２０−４として同定された変異型ＴＡＬ酵素のアミノ酸配列である。
配列番号３７は、ＲＭ１２０−７として同定された変異型ＴＡＬ酵素のアミノ酸配列である。
配列番号３８は、ＲＭ４９２−１として同定された変異型ＴＡＬ酵素のアミノ酸配列である。
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明はＰＨＣＡを生成するための生物学的な方法について説明するものである。一実施形態では、ｔｒａｎｓ−ケイ皮酸塩をＰＨＣＡに変換する機能を持つさまざまなバクテリアおよび菌類を発見した。別の実施形態では、酵母のＰＡＬを宿主のＥ．ｃｏｌｉに形質転換し、グルコースのＰＨＣＡへの変換について示した。別の実施形態では、酵母のＰＡＬ遺伝子と、キクイモ植物のシトクロムＰ−４５０およびシトクロムＰ−４５０レダクターゼ遺伝子とを、酵母宿主株に導入したところ、組換え酵母にはグルコースをＰＨＣＡに変換する機能が備わっていた。これらの別の実施形態では、チロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）活性が亢進した新規なバイオ触媒を開発し、この活性をコードする遺伝子を用いてＰＨＣＡ生成用の組換え宿主を形質転換した。ＴＡＬを進化させるには、機能的ＰＡＬ遺伝子を単離し、弱い発現ベクターを作製し、突然変異を誘発し、ＰＡＬコード配列を進化させ、ＴＡＬ活性が増大した変種を選択する必要があった。ＴＡＬ活性が増大した変異体を局所的に突然変異誘発すると、変異体をさらに強め（ｅｎｈａｎｃｅ）、ＴＡＬ活性に影響する酵素の重要な領域について理解することができる。進化したＴＡＬ酵素は、微生物にチロシンから一工程でＰＨＣＡを産生させることができる。
【００２４】
本件明細書および特許請求の範囲を解釈するにあたり、以下の略号および定義を使用する。
【００２５】
「フェニルアンモニアリアーゼ」をＰＡＬと略記する。
「チロシンアンモニアリアーゼ」をＴＡＬと略記する。
「ｐ−ヒドロキシケイ皮酸」をＰＨＣＡと略記する。
「ケイ皮酸４−ヒドロキシラーゼ」をＣ４Ｈと略記する。
【００２６】
本願明細書では「ケイ皮酸」および「ケイ皮酸塩」という用語を同義のものとして使用する。
【００２７】
「ＴＡＬ活性」という用語は、タンパク質がチロシンのＰＨＣＡへの直接的な変換を触媒する機能を示す。
【００２８】
「ＰＡＬ活性」という用語は、タンパク質がフェニルアラニンのケイ皮酸への変換を触媒する機能を示す。
【００２９】
「Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系」という用語は、ケイ皮酸のＰＨＣＡへの触媒変換を担うタンパク質系を示す。Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系は、ケイ皮酸４−ヒドロキシラーゼの機能を果たす従来技術において周知のいくつかの酵素または酵素系のうちのひとつである。本願明細書において使用する「ケイ皮酸４−ヒドロキシラーゼ」という用語は、ケイ皮酸のＰＨＣＡへの変換を引き起こす一般的な酵素活性を示し、一方、「Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系」という用語は、ケイ皮酸４−ヒドロキシラーゼ活性を持つ特定の二成分タンパク質系を示す。
【００３０】
「ＰＡＬ／ＴＡＬ活性」または「ＰＡＬ／ＴＡＬ酵素」という用語は、ＰＡＬ活性とＴＡＬ活性の両方を含むタンパク質を示す。このようなタンパク質は、酵素基質としてのチロシンとフェニルアラニンの両方に対して少なくともいくらかの特異性を持つ。
【００３１】
「変異型ＰＡＬ／ＴＡＬ」という用語は、ＰＡＬ活性よりもＴＡＬ活性の方が大きい野生型ＰＡＬ酵素に由来するタンパク質を示す。変異型ＰＡＬ／ＴＡＬタンパク質は、もともとフェニルアラニンよりもチロシンに対して高い基質特異性を持つものである。
【００３２】
「触媒効率」という用語は、酵素のｋｃａｔ／ＫＭであると定義される。「触媒効率」は、基質に対する酵素の特異性を表す目的で用いられる。
【００３３】
「ｋｃａｔ」という表記は「代謝回転数」に用いられることが多い。「ｋｃａｔ」という表記は、単位時間に生成物に変換された基質分子の活性部位あたりの最大数または単位時間に酵素が代謝回転した回数として定義される。ｋｃａｔ＝Ｖｍａｘ／［Ｅ］であり、式中、［Ｅ］は酵素濃度（Ｆｅｒｓｔ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ、第２版；Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ：ニューヨーク、１９８５；第９８〜１２０頁）。
【００３４】
「芳香族アミノ酸の生合成」という表現は、生物学的なプロセスおよび芳香族アミノ酸の生成に必要な細胞内部の酵素的な経路を示す。
【００３５】
「発酵性炭素基質」という用語は、本発明の宿主生物体によって代謝される炭素源、特に、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、一炭素基質またはこれらの混合物からなる群から選択される炭素源を示す。
【００３６】
「相補的である」という表現については、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係について説明するのに使用する。たとえば、ＤＮＡに関していえば、アデノシンはチミンに対して相補的であり、シトシンはグアニンに対して相補的である。したがって、本発明は、添付の配列表に列挙したような完全配列に対して相補的である単離された核酸断片ならびに実質的に類似の核酸配列も含む。
【００３７】
「遺伝子」とは、コード配列に先行（５’非コード配列）および後続（３’非コード配列）する制御配列をはじめとする特定のタンパク質を発現する核酸断片を示す。「未変性遺伝子」または「野生型遺伝子」とは、自然界に見られるような制御配列を持つ遺伝子を示す。「キメラ遺伝子」とは、未変性遺伝子ではなく、自然界では一緒に見られることのない制御配列とコード配列とを含む遺伝子を示す。したがって、キメラ遺伝子は、異なるソースに由来する制御配列およびコード配列を含むものであってもよいし、あるいは、同一ソース由来であるが自然界で見られる形とは違った形に配列された制御配列およびコード配列を含むものであってもよい。「内在性遺伝子」とは、生物体のゲノムにおいて正常な位置にある未変性遺伝子を示す。「外来」遺伝子とは、宿主の生物体には通常は見られないが、遺伝子移行によって宿主の生物体に導入された遺伝子を示す。外来遺伝子は、変性生物体に挿入された未変性遺伝子、あるいはキメラ遺伝子を含むことができる。
【００３８】
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を示す。
【００３９】
「好適な制御配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列内またはコード配列の下流（３’非コード配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、あるいは関連のコード配列の翻訳に影響するヌクレオチド配列を示す。制御配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロンおよびポリアデニル化認識配列を含むものであってもよい。
【００４０】
「プロモーター」とは、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を示す。通常、コード配列はプロモーター配列の３’に位置する。プロモーターは、全体が未変性遺伝子由来のものであってもよいし、自然界で見られる異なるプロモーター由来の異なる要素からなるものであってもよく、合成ＤＮＡセグメントを含むものであってもよい。プロモーターごとに異なる組織または細胞型または異なる発達段階で、あるいは異なる環境条件に応答して遺伝子の発現を指示する場合があることは当業者であれば理解できよう。ほとんどの細胞型でほぼ常に遺伝子を発現させるプロモーターは一般に「構成的プロモーター」と呼ばれている。さらに、多くの場合は制御配列の正確な境界を完全に定義することができないため、長さの異なるＤＮＡ断片が同じプロモーター活性を持つこともあると言われている。
【００４１】
「作動的に結合された」という表現は、一方の機能が他方に影響するような形で１つの核酸断片上にて核酸配列が会合した状態を示す。たとえば、プロモーターは、コード配列の発現に影響を及ぼすことができるときに、そのコード配列と作動的に結合される（すなわち、そのコード配列がプロモーターの転写制御下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンスの向きで調節配列への作動的な結合が可能である。
【００４２】
本願明細書で使用する「発現」という用語は、本発明の核酸断片由来のセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を示す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も示すことがある。「アンチセンス阻害」とは、標的タンパク質の発現を抑制することのできるアンチセンスＲＮＡ転写物が生成されることを示す。「過発現」とは、健常な生物体または非形質転換生物体において生成されるレベルを超えて遺伝子産物がトランスジェニック生物体で生成されることを示す。「コサプレッション」とは、同一または実質的に類似の外来遺伝子または内在性遺伝子の発現を抑制することのできるセンスＲＮＡ転写物が生成されることを示す（米国特許第５，２３１，０２０号）。
【００４３】
「ＲＮＡ転写物」とは、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒転写によって生じる産物を示す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全に相補的なコピーである場合、これを一次転写物と呼び、一次転写物の転写後プロセシングで得られるＲＮＡ配列であれば成熟ＲＮＡと呼ぶ。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは、イントロンを持たず、細胞によってタンパク質への翻訳が可能なＲＮＡを示す。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡと相補的でｍＲＮＡ由来の二本鎖ＤＮＡを示す。「センス」ＲＮＡとは、ｍＲＮＡを含むため細胞によってタンパク質への翻訳が可能なＲＮＡ転写物を示す。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的の一次転写物またはｍＲＮＡの全体または一部に対して相補的であり、標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を示す（米国特許第５，１０７，０６５号）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、５’非コード配列、３’非コード配列、イントロンまたはコード配列など特定の遺伝子転写物のどの部分に対するものであってもよい。「機能的ＲＮＡ」とは、翻訳はされないが細胞プロセスに対する影響力のあるアンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡまたは他のＲＮＡを示す。
【００４４】
「形質転換」とは、核酸断片が宿主生物体のゲノムに移行し、遺伝的に安定した遺伝継承がなされることを示す。形質転換された核酸断片を含む宿主生物体を「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物体と呼ぶ。
【００４５】
「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」の各用語は、細胞の中心的代謝の一部ではなく、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形である遺伝子を持っていることが多い特別な染色体因子を示す。このような因子としては、あらゆるソースに由来する自己複製配列、ゲノム組込配列、ファージまたはヌクレオチド配列、線状または環状の一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡが可能であり、この場合、複数のヌクレオチド配列が連結または組換えられて、選択された遺伝子産物に対するプロモーター断片およびＤＮＡ配列を適切な３’未翻訳配列と共に細胞に導入できる独特の構成となっている。「形質転換カセット」とは、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を容易にする因子を有する特定のベクターを示す。「発現カセット」とは、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて外来宿主でその遺伝子の発現を増すことのできる因子を有する特定のベクターを示す。
【００４６】
「ラインウィーバー・バーク式という用語は、動態パラメータであるＫＭおよびＶｍａｘを評価する目的で酵素動態に関するデータをプロットしたものを示す。
【００４７】
「タンパク質またはペプチドまたはポリペプチド」という表現は同義に用いられ、定義された機能を持つ連続したアミノ酸からなる配列を示す。「野生型タンパク質」とは、変更されない形で自然界から単離されたタンパク質を示す。「変異型タンパク質」とは、アミノ酸配列が変更された野生型タンパク質を示す。
【００４８】
「アミノ酸」という用語は、タンパク質またはポリペプチドの基本的な化学構造単位を示す。本願明細書では特定のアミノ酸に対して以下の略号を使用する。
【００４９】
【表２】
2004530402.tif 000005
【００５０】
「化学的に等価なアミノ酸」という表現は、特定のタンパク質の化学的または機能的な性質を変えることなく、そのタンパク質において別のアミノ酸で置換されている場合があるアミノ酸を示す。たとえば、特定の部位で化学的に等価なアミノ酸が得られるが、コードされるタンパク質の機能的な特性には影響しない遺伝子における変化が従来技術において周知である。本発明の目的において、置換とは、以下の５つの群のうちひとつの範囲内での交換であると定義される。
１．非極性または若干極性の小さな脂肪族残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）；
２．極性でマイナスに荷電した残基およびそのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
３．極性でプラスに荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；
４．非極性の大きな脂肪族残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ（Ｃｙｓ）；
５．大きな芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ。
【００５１】
したがって、疎水性アミノ酸であるアラニンを、これより疎水性が低い他の残基（グリシンなど）またはこれよりも疎水性が高い他の残基（バリン、ロイシンまたはイソロイシン）で置換することができる。同様に、マイナスに荷電した残基が１つ他の残基に（グルタミン酸がアスパラギン酸に）置換される、あるいは、プラスに荷電した残基が１つ他の残基に（アルギニンがリシンに）なる変更でも機能的に等価な産物が得られるものと思われる。さらに、多くの場合、タンパク質分子のＮ末端部分およびＣ末端部分が変わってもタンパク質の活性に変化はないと思われる。
【００５２】
本願明細書にて使用する標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング手法は従来技術において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．によるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：ニューヨーク州コールドスプリング、１９８９（以下「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）、Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．、Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．およびＥｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．によるＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：ニューヨーク州コールドスプリング、１９８４およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．らによるＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ出版、１９８７に記載されている。
【００５３】
本発明は、ＰＨＣＡを生成するための生物学的な方法について説明するものである。この方法では、ケイ皮酸４−ヒドロキシラーゼ活性（Ｃ４Ｈ）、フェニルアラニンアンモニウムリアーゼ（ＰＡＬ）活性またはチロシンアンモニウムリアーゼ（ＴＡＬ）活性を持つタンパク質をコードする遺伝子を利用する。ケイ皮酸ヒドロキシラーゼ活性によってケイ皮酸塩がＰＨＣＡに変換される。本発明に関する限り、Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系がＣ４Ｈの機能を果たす。Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系が存在すれば、ＰＡＬ活性によってフェニルアラニンがＰＨＣＡに変換される。これらの活性は以下のスキームに示すようにして関連している。
［ＰＡＬ］  ［Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ］
フェニルアラニン  →  ケイ皮酸      →        ＰＨＣＡ
【００５４】
ＴＡＬ活性は、以下のスキームによって中間工程を通すことなくチロシンを直接ＰＨＣＡに変換する。
［ＴＡＬ］
チロシン        →          ＰＨＣＡ
【００５５】
一実施形態において、本方法では同じタンパク質でＰＡＬとＴＡＬの機能の両方を含む活性を発現している組換え微生物宿主細胞を利用する。この実施形態では、宿主細胞にはＰ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系がなく、ＴＡＬ経路でＰＨＣＡが生成される。
【００５６】
別の実施形態では、本方法ではＰ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系をコードする遺伝子の存在下でＰＡＬ活性をコードする遺伝子を含む組換え宿主を利用する。
【００５７】
別の実施形態において、本発明は、Ｃ４Ｈ活性について選択した生物体によってケイ皮酸塩からＰＨＣＡを生成するための方法について説明するものである。
【００５８】
本発明は、液晶ポリマー（ＬＣＰ）製造時のモノマーとして用いることができるＰＨＣＡを生物学的に生成する上で有用である。ＬＣＰは、電子コネクタや電気通信、航空宇宙での用途に利用できる。ＬＣＰは滅菌用の放射線に対する耐性があるため、この材料を医療装置や化学、食品包装の用途に用いることもできる。
遺伝子：
本発明において用いる鍵になる酵素活性は、従来技術において周知の多数の遺伝子によってコードされる。主な酵素として、ケイ皮酸−４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）活性（Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ）、フェニルアラニンアンモニウムリアーゼ（ＰＡＬ）およびチロシンアンモニウムリアーゼ（ＴＡＬ）があげられる。
【００５９】
フェニルアラニンアンモニウムリアーゼ（ＰＡＬ）、チロシンアンモニウムリアーゼ（ＴＡＬ）活性およびＰ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系：
ＰＡＬをコードする遺伝子は従来技術において周知であり、このうちいくつかは植物と微生物の両方のソースですでに配列が決定されている（たとえば、ＥＰ３２１４８８［Ｒ．ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ］；ＷＯ９８１１２０５［Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓおよびＰｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａ］；ＷＯ９７３２０２３［Ｐｅｔｕｎｉａ］；ＪＰ０５１５３９７８［Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ］；ＷＯ９３０７２７９［ジャガイモ、コメ］を参照のこと）。ＰＡＬ遺伝子の配列は入手可能である（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＪ０１０１４３およびＸ７５９６７を参照のこと）。組換え宿主で野生型ＰＡＬ遺伝子を発現させると望ましい場合、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｓｐ．、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．およびＳｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．などの酵母；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓなどの細菌生物；エンドウマメ、ジャガイモ、コメ、ユーカリ、マツ、トウモロコシ、ペチュニア、シロイヌナズナ、タバコ、パセリなどの植物を含むがこれに限定されるものではない、どのようなソースから野生型遺伝子を得るようにしてもよい。
【００６０】
ＴＡＬ活性のみを持つ、すなわち、ＰＨＣＡを生成するための基質としてチロシンのみを利用する酵素をコードする遺伝子は知られていない。上述したＰＡＬ酵素の中にはチロシンに対する若干の基質親和性を持つものがある。したがって、ＴＡＬ活性をコードする遺伝子を、上述したＰＡＬ遺伝子と同時に同定および単離できる可能性がある。たとえば、パセリから単離したＰＡＬ酵素（Ａｐｐｅｒｔら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２５：４９１（１９９４））およびトウモロコシから単離したＰＡＬ酵素（（Ｈａｖｉｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４８：１３０（１９７１））にはどちらも基質としてチロシンを利用する機能があることが分かっている。同様に、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍから単離したＰＡＬ酵素（Ｈｏｄｇｉｎｓ  ＤＳ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４６：２９７７（１９７１））も基質としてチロシンを利用できる。このような酵素を本願明細書ではＰＡＬ／ＴＡＬ酵素または活性と呼ぶ。ＰＡＬ／ＴＡＬ活性をコードする野生型遺伝子を発現している組換え生物体を作出するのが望ましい場合、ＨａｎｓｏｎおよびＨａｖｉｒ、Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ；Ａｃａｄｅｍｉｃ：ニューヨーク、１９８１；第７巻、第５７７〜６２５頁に記載されているように、トウモロコシ、コムギ、パセリ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｐａｒａｒｏｓｅｕｓおよびＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍから単離した遺伝子を用いることができるが、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍから単離した遺伝子が好ましい。
【００６１】
本発明は、ケイ皮酸塩をＰＨＣＡに変換する上で有用なＣ４Ｈ活性を持つＰ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系を提供するものである。この系は、従来技術において周知であり、さまざまな植物組織から単離されている。たとえば、キクイモ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｓ）、［ＥＭＢＬ  ｌｏｃｕｓ名ＨＴＵ２ＮＦＲ、アクセッション番号Ｚ２６２５０．１］；パセリ、（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）［Ｋｏｏｐｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４（２６）、１４９５４〜１４９５９（１９９７）、［ｌｏｃｕｓ名ＡＦ０２４６３４、アクセッション番号ＡＦ０２４６３４．１］；カリフォルニアポピー（Ｅｓｃｈｓｃｈｏｌｚｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、Ｒｏｓｃｏら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３４８（２）、３６９〜３７７（１９９７）、［ｌｏｃｕｓ名ＥＣＵ６７１８６、アクセッション番号Ｕ６７１８６．１］；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、［ＰＩＲ：ｌｏｃｕｓ名Ｓ２１５３１］；ソラマメ（Ｖｉｃｉａ  ｓａｔｉｖａ）、［ＰＩＲ：ｌｏｃｕｓ名Ｓ３７１５９］；リョクトウ、（Ｖｉｇｎａ  ｒａｄｉａｔａ）、Ｓｈｅｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０（７）、２８９０〜２８９４（１９９３）、［ＰＩＲ：ｌｏｃｕｓ名Ａ４７２９８］；およびケシ（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）、［ｌｏｃｕｓ名ＰＳＵ６７１８５、アクセッション番号Ｕ６７１８５．１］からレダクターゼが単離されている。
【００６２】
シトクロムについては、キクイモ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｓ），［ＥＭＢＬ  ｌｏｃｕｓ名ＨＴＴＣ４ＭＭＲ、アクセッション番号Ｚ１７３６９．１］；Ｚｉｎｎｉａ  ｅｌｅｇａｎｓ、［ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ：ｌｏｃｕｓ名ＴＣＭＯ＿ＺＩＮＥＬ、アクセッション番号Ｑ４３２４０］Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ［ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ：ｌｏｃｕｓ名ＴＣＭＯ＿ＣＡＴＲＯ、アクセッション番号Ｐ４８５２２］；Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ［ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ：ｌｏｃｕｓ名ＴＣＭＯ＿ＰＯＰＴＭ、アクセッション番号Ｏ２４３１２］；Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｋｉｔａｋａｍｉｅｎｓｉｓ［ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ：ｌｏｃｕｓ名ＴＣＭＯ＿ＰＯＰＫＩ、アクセッション番号Ｑ４３０５４］；Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ  ｅｃｈｉｎａｔａ［ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ：ｌｏｃｕｓ名ＴＣＭＯ＿ＧＬＹＥＣ、アクセッション番号Ｑ９６４２３］；Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ［ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ：ｌｏｃｕｓ名ＴＣＭＯ＿ＳＯＹＢＮ、アクセッション番号Ｑ４２７９７］ならびに他のソースから単離されている。
【００６３】
本発明において好ましいのは、配列番号１１および配列番号１３に示すような、キクイモ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｓ）から単離したＰ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系をコードする遺伝子である。当業者であれば、植物から単離したシトクロムＰ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系がいずれも本発明の目的において適したものとなるであろうことを理解できよう。シトクロム遺伝子の配列（配列番号１１）は、これらの系における周知のＰ−４５０シトクロムに対して同一性約９２％（Ｚｉｎｎｉａ  ｅｌｅｇａｎｓ、Ｑ４３２４０）から同一性約６３％（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、ＥＭＢＬ  ｌｏｃｕｓ名ＰＶ０９４４９、アクセッション番号Ｙ０９４４９．１）の範囲にわたり、配列番号１１に対する同一性が少なくとも６３％の植物から単離したＰ−４５０シトクロムであればいずれも本発明に適するものであろうと思われる。同様に、この系のｐ−４５０レダクターゼ（配列番号１３）の同一性は周知のレダクターゼＰ−４５０に対して同一性約７９％（パセリ、ＡＦ０２４６３４．１］から同一性約６８％（ケシ、Ｕ６７１８５．１）にわたるため、配列番号１３に対する同一性が少なくとも６８％の植物から単離したＰ−４５０レダクターゼであればいずれも本発明に適するものであろうと思われる。
【００６４】
配列依存のプロトコールを用いて上記の野生型遺伝子または野生型の相同遺伝子群を得る方法は従来技術において周知である。配列依存のプロトコールの一例として、核酸増幅技術のさまざまな用途（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ））に見られるような核酸ハイブリダイゼーションの方法ならびにＤＮＡおよびＲＮＡ増幅の方法があげられるが、これに限定されるものではない。
【００６５】
たとえば、既知の配列の全部または一部をＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして用いて、当業者間で周知の方法で、相同体または上述した活性（ａｃｔｉｖｉｔｅｓ）（ＰＡＬ、ＴＡＬまたはＰ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系）のうちいずれかをコードする遺伝子を直接単離し、所望の植物、菌類、酵母またはバクテリアからライブラリをスクリーニングすることが可能であった。従来技術において周知の方法（上掲のＭａｎｉａｔｉｓ）で、文献に記載のある核酸配列に基づく特定のオリゴヌクレオチドプローブを設計および合成することが可能である。さらに、ランダムプライマーＤＮＡ標識、ニックトランスレーションまたは末端標識法などの当業者間で周知の方法で、配列全体を用いて直接ＤＮＡプローブを合成することが可能であり、また、入手可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系を用いてＲＮＡプローブを合成することが可能である。また、特定のプライマーを設計および使用して、本配列の一部または全長を増幅することができる。このようにして得られる増幅産物については、増幅反応時に直接標識してもよいし、増幅反応の後で標識してもよく、適切なストリンジェンシーの条件下で全長ｃＤＮＡ断片またはゲノム断片を単離するためのプローブとして用いることができる。
【００６６】
また、文献に記載のある配列の２つの短いセグメントをポリメラーゼ連鎖反応のプロトコールで用いて、ＤＮＡまたはＲＮＡから相同的な遺伝子をコードするさらに長い核酸断片を増幅してもよい。また、クローニングした核酸断片のライブラリでポリメラーゼ連鎖反応を実施してもよい。この場合、一方のプライマーの配列を文献に記載のある配列に由来するものとし、他方のプライマーの配列にバクテリア遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆体の３’末端に対するポリアデニル酸トラクトの存在をうまく利用するようにする。あるいは、第２のプライマー配列を、クローニングベクター由来の配列に基づくものとしてもよい。たとえば、当業者であれば、ＲＡＣＥプロトコール（Ｆｒｏｈｍａｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：８９９８（１９８８））に従ってＰＣＲでｃＤＮＡを生成し、転写物における１ヶ所と３’末端または５’末端との間の領域のコピーを増幅することができる。文献に記載のある配列から３’方向および５’方向のプライマーを設計することが可能である。市販の３’ＲＡＣＥ系または５’ＲＡＣＥ系（ＢＲＬ）を使用して、特定の３’ｃＤＮＡ断片または５’ｃＤＮＡ断片を単離することが可能である（Ｏｈａｒａら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８６：５６７３（１９８９）；Ｌｏｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：２１７（１９８９））。
【００６７】
変異型ＰＡＬ／ＴＡＬ活性：
本発明の一目的は、フェニルアラニンに対する基質特異性よりもチロシンに対する基質特異性の高い変異型ＰＡＬ／ＴＡＬ活性を提供することにある。一般に、この方法ではフェニルアラニンに対する基質特異性よりもチロシンに対する基質特異性の高いＰＡＬ／ＴＡＬ活性を持つ生物体を選択することになる。通常、基質特異性はｋｃａｔ／ＫＭ（触媒効率）で表されるが、これは酵素において同定された活性部位の数を基準にして算出されるものである。
【００６８】
フェニルアラニンアンモニアリアーゼは分子量が約３３０，０００であり、約８０ＫＤの同一のサブユニット４つで構成されている（Ｈａｖｉｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １４：１６２０〜１６２６（１９７５））。また、ＰＡＬには触媒的に重要なデヒドロアラニン残基が含まれるのではないかという意見がある（Ｈａｎｓｏｎら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１４１：１〜１７（１９７０））。パセリのＰＡＬのＳｅｒ−２０２はデヒドロアラニンの前駆体であることが明らかになっている（Ｌａｎｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３６：１０８６７〜１０８７１（１９９７））。相同的な酵素であるヒスチジンアンモニアリアーゼ（ＨＡＬ）の結晶構造に関する最近の研究から得られる情報を用いてＰＡＬのｋｃａｔを算出した。これらの研究では、酵素の活性部位における求電子的な反応性残基が４−メチリデン−イミダゾール−５−オンであり、これがＡｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ配列を含む残基１４２〜１４４の環化および脱水によって自己触媒的に形成されるものであることが明らかになった（Ｓｃｈｗｅｄｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８：５３５５〜５３６１（１９９９））。現在までに研究がなされている四量体のＰＡＬ酵素はいずれも活性部位それぞれにＡｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ配列を含むため、ＰＡＬの各活性部位にこの配列から形成される４−メチリデン−イミダゾール−５−オンも含まれている可能性が高い。
【００６９】
本発明に関してみれば、突然変異誘発の目的で選択する好適な野生型酵素の触媒効率はチロシンの場合で約４．１４×１０３から１×１０９Ｍ−１ｓｅｃ−１であり、この触媒効率が約１×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１から約５×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１の範囲にあると好ましい。
【００７０】
好適なＰＡＬ／ＴＡＬ酵素を選択するプロセスでは、弱い発現ベクターを作製し、突然変異を誘発し、ＰＡＬコード配列を発展させ、最後にＴＡＬ活性が亢進した変種を選択する必要がある。
【００７１】
ＰＡＬの突然変異誘発：
ＰＡＬ／ＴＡＬ酵素の突然変異誘発にはさまざまな手法を用いることができる。本願明細書で使用する好適な手法として、ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ（Ｌｅｕｎｇら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１：１１〜１５（１９８９）およびＺｈｏｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：６０５２〜６０５２（１９９１）およびＳｐｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：７７７〜７７８（１９９３））とｉｎ  ｖｉｖｏ突然変異誘発の２つがあげられる。
【００７２】
ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲの主な利点として、この方法で導入する突然変異はすべてＰＡＬ遺伝子内にあり、ＰＣＲ条件を変えるだけでどのような変化でも容易に制御できるという点がある。あるいは、ストラタジーン（カリフォルニア州ラホーヤのストラタジーン社、ＧｒｅｅｎｅｒおよびＣａｌｌａｈａｎ、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ７：３２〜３４（１９９４））から入手可能なＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｒｅｄ株およびＥｐｉｃｕｒｉａｎ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｒｅｄ変異誘発遺伝子株などの市販の材料を用いるｉｎ  ｖｉｖｏ突然変異誘発を利用してもよい。この系統では主要なＤＮＡ修復経路のうち３つ（ｍｕｔＳ、ｍｕｔＤおよびｍｕｔＴ）が不足しているため、野生型の場合と比して変異率が５０００倍になる。Ｉｎ  ｖｉｖｏ突然変異誘発はライゲーション効率に左右されない（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲの場合同様）が、ベクターのどの領域でも変異が起こる可能性があり、一般に変異率はかなり低い。
【００７３】
あるいは、「遺伝子シャッフリング」の方法（米国特許第５，６０５，７９３号、米国特許第５，８１１，２３８号、米国特許第５，８３０，７２１号、米国特許第５，８３７，４５８号）を用いて、ＴＡＬ活性が亢進した変異型ＰＡＬ／ＴＡＬ酵素を構成できるとも考えられる。この遺伝子シャッフリングの方法は、実現するのが容易で突然変異誘発率が高いため、特に魅力的である。遺伝子シャッフリングのプロセスでは、該当する遺伝子と類似したＤＮＡ領域または異なったＤＮＡ領域の別の個体群の存在下で、該当する遺伝子を特定サイズの断片に制限する必要がある。このような断片のプールを変性させ、再アニーリングして変異した遺伝子を得る。その後、変異した遺伝子の活性がどのように変わったかについてスクリーニングする。
【００７４】
この方法で野生型ＰＡＬ／ＴＡＬ配列を変異させ、ＴＡＬ活性がどのように変化または亢進したかをスクリーニングするようにしてもよい。この場合の配列は二本鎖でなければならず、５０ｂｐから１０ｋｂにわたるさまざまな長さが可能である。これらの配列は、従来技術において周知の制限エンドヌクレアーゼでランダムに消化されて約１０ｂｐから１０００ｂｐの範囲の断片になるものであってもよい（上掲のＭａｎｉａｔｉｓ）。全長配列だけでなく、これらの配列すべてまたはその一部とハイブリダイズ可能な断片からなる個体群を加えてもよい。同様に、野生型配列とハイブリダイズ可能ではない断片からなる個体群を加えてもよい。一般に、このような追加断片の個体群は、核酸全体に比して重量で約１０から２０倍過剰な量で加えられる。通常、このプロセスで混合物に含まれる約１００から１０００の異なる特定の核酸断片を生成することができる。ランダムな核酸断片の混合個体群を変性させ、一本鎖核酸断片を形成し、次いでこれを再アニーリングする。他の一本鎖核酸断片と相同な領域を持つ一本鎖核酸断片だけが再アニーリングされる。ランダムな核酸断片を加熱によって変性させてもよい。当業者であれば、二本鎖核酸を完全に変性させるのに必要な条件を判断することができるであろう。この場合、温度を８０℃から１００℃にすると好ましい。また、これらの核酸断片を冷却することで再アニーリングを行うようにしてもよい。好ましくは、この温度を２０℃から７５℃とする。ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）または塩を添加することで再生を加速することが可能である。塩の濃度は０ｍＭから２００ｍＭであると好ましい。次に、アニーリング後の核酸断片を、核酸ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）の存在下にてインキュベートする。核酸ポリメラーゼには、従来技術において周知のクレノー断片、Ｔａｑポリメラーゼまたは他のＤＮＡポリメラーゼなどを用いることができる。このポリメラーゼについては、アニーリング前にランダムな核酸断片に加えてもよいし、アニーリングと同時にあるいはアニーリング後に加えてもよい。ポリメラーゼの存在下における変性、再生およびインキュベーションのサイクルを所望の回数繰り返す。好ましくは、このサイクルを２から５０回繰り返し、一層好ましくは１０から４０回配列を繰り返す。このようにして得られる核酸は、約５０ｂｐから約１００ｋｂと大きくなった二本鎖ポリヌクレオチドであり、標準的なクローニングプロトコールおよび発現プロトコール（上掲のＭａｎｉａｔｉｓ）で発現およびＴＡＬ活性の変化についてスクリーニングすることが可能なものである。
【００７５】
突然変異誘発方法の如何を問わず、触媒効率が約４．１４×１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１から約１×１０９Ｍ−１ｓｅｃ−１になるように遺伝子を進化させることを企図しており、一般的な触媒効率は約１２．６×１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１である。
【００７６】
ＴＡＬ活性が亢進した変種の選択：
ＰＨＣＡ反応に対するチロシンの可逆性による選択
ＴＡＬ活性が亢進したタンパク質をコードする遺伝子を持つ変異体を選択するために、ＰＨＣＡ反応に対するチロシンの可逆性を利用した選択系を開発した。チロシンのＰＨＣＡへの変換を担うＴＡＬ活性が逆の反応で平衡状態になることは明らかであろう。チロシンがないと成長できないＥ．ｃｏｌｉチロシン栄養要求株に変異体遺伝子を標準的な方法でクローニングした。形質転換体を適切な濃度のＰＨＣＡの存在下でチロシンマイナス培地に移した。このような条件下で成長したコロニーを採取し、変異体遺伝子の有無を分析した。このようにして、触媒効率が約１２．６×１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１であり、野生型では０．５のＰＡＬ触媒活性に対するＴＡＬ触媒活性の比が１．７である遺伝子を単離した。
【００７７】
当業者であれば、亢進したＴＡＬ活性をコードする遺伝子を選択する別のスクリーンを想定することができよう。たとえば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ  ＤＳＭ  ５８６（ＡＴＣＣ  ３３３０４）はｐ−クマル酸（ＰＨＣＡ）を効率的に分解でき、これを単一の炭素源として利用することが周知である（Ｄｅｌｎｅｒｉら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２４４：３６３〜３６７（１９９５））。この分解について示されている経路を経路Ｉとして以下にあげておく。
経路Ｉ
ｐ−ヒドロキシケイ皮酸→ｐ−ヒドロキシ安息香酸→プロトカテク酸
ここに示された経路に関与する酵素はいずれも、細胞培養にＰＨＣＡを加えることで誘発されるものである。ＴＡＬ遺伝子をＡ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ  ３３０４）またはＰＨＣＡを単一の炭素源として利用できる他の微生物に形質転換すれば、経路ＩＩに示すとおりチロシンがＰＨＣＡの基質になるように上記の経路が修飾される。
経路ＩＩ
Ｌ−チロシン→ｐ−ヒドロキシケイ皮酸→ｐ−ヒドロキシ安息香酸→プロトカテク酸
経路ＩＩの因子を持つ細胞は、ＰＨＣＡで成長させると経路Ｉしか持たない細胞よりも活発に成長することは理解できよう。したがって、この系をＴＡＬ活性を持つ遺伝子を同定するスクリーンとして用いることができる。さらに、この選択系には、ＰＨＣＡの阻害レベルによる影響を排除できるという利点もある。これは炭素が中心的代謝に加わるまでこの化合物をさらに分解する経路が細胞に含まれるためである。
【００７８】
ＴＡＬ／ＰＡＬ比を比較することによる選択
ＰＡＬまたはＴＡＬ活性が変化した遺伝子を同定するための高スループットのアッセイを開発することで微生物の形質転換体のスクリーニングが大幅にやりやすくなることは当業者であれば理解できよう。細胞全体のＴＡＬ活性とＰＡＬ活性とを別々に測定する簡単な方法のひとつを開示する。この方法では、ＰＡＬ活性に対するＴＡＬの比を算出し、すみやかに野生型での活性と比較してバイオ触媒の活性の変化をモニタリングすることができる。
【００７９】
ＰＡＬのタンパク質工学
現在、三次元構造および従来からあるタンパク質化学についての情報と遺伝子工学および分子グラフィックス、すなわちタンパク質工学の方法とを組み合わせることで、タンパク質が持つ多くの特性の改変を試みることが可能である。このような活性の変化した酵素を得ようというやり方では、まず第一にモデル分子を生成するか、あるいは未知の構造と配列が類似した既知の構造を用いる必要がある。本発明では、ヒスチジンアンモニアリアーゼ（ＨＡＬ）の結晶構造に基づいてＰＡＬ酵素に対する相同性モデルを構築して利用した（Ｓｃｈｗｅｄｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８：５３５５〜５３６１（１９９９））。ＨＡＬはＰＡＬ酵素に対する相同性が４０％であるが、発展時に構造が一次タンパク質配列よりも多く保持されるため、この相同性はモデリングが正しいことを証明するには十分な程度である。ＰＡＬの３次元モデルを用いることで、構造中のどの修飾がタンパク質の特性に所望の変化を引き起こしたのかを推定することができた。特に興味の対象となったのが、チロシンまたはフェニルアラニン基質の結合に関与している酵素の活性部位周囲のアミノ酸残基である。本願出願人らは、これらの特定のアミノ酸またはアミノ酸の領域の局所的な部位特異的突然変異を標的し、これを変化させることで酵素の触媒機能に影響が及んでＰＡＬ／ＴＡＬ活性が変化するか否かを判定した。
【００８０】
必須のアミノ酸をＴＡＬ活性で同定
本願出願人らは、野生型遺伝子と比してＴＡＬ活性が亢進したさまざまな変異型ＰＡＬ酵素を開示している。これらの変異体については、上述した突然変異誘発およびスクリーニングの方法を用いて同定した。変異体、変化したアミノ酸残基およびＴＡＬ／ＰＡＬ活性を以下にまとめておく。
【００８１】
【表３】
2004530402.tif 000006
【００８２】
上述した特定の突然変異だけでなく、化学的に等価な（ｅｑｕａｖａｌｙ）アミノ酸による置換が可能な突然変異も本発明に包含されることは理解できよう。したがって、あるアミノ酸を非極性の脂肪族アミノ酸であるアラニンで置換する場合、これと化学的に等価なアミノ酸であるセリンで同じ部位を置換できると考えられる。このように、本発明は、野生型ＴＡＬアミノ酸配列（配列番号８）に以下のアミノ酸置換を含む変異型ＴＡＬタンパク質を提供するものである。
【００８３】
【表４】
2004530402.tif 000007
【００８４】
さらに、本願出願人らは、変異型ＰＡＬ酵素においてＴＡＬ活性を得る上で重要である、Ｎ末端、Ｃ末端、さまざまな特定領域の重要性についても開示すしている。たとえば、最大で３０のアミノ酸のＮ末端領域を切断してもＴＡＬ酵素の活性が大幅に変化することはないと判断した。
【００８５】
生成生物：
微生物宿主
本発明の生成生物には、ＰＨＣＡの生成に必要な遺伝子を発現できる一切の生物体を含む。一般に、生成生物は微生物と植物とに限定される。
【００８６】
本発明においてＰＨＣＡを生成するのに有用な微生物としては、腸内細菌（ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａなど）ならびにＢａｃｉｌｌｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ、ＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａなどのバクテリア；ＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒおよびＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓなどのＣｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、Ｍｕｃｏｒ、ＰｉｃｈｉａおよびＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓなどの酵母；ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓおよびＡｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓなどの糸状菌類ならびに藻類があげられるが、これに限定されるものではない。本発明のＰＡＬ遺伝子、ＰＡＬ／ＴＡＬ遺伝子、Ｐ−４５０遺伝子およびＰ−４５０レダクターゼ遺伝子を上記微生物の宿主ならびに他の微生物の宿主において得て、商業的に有用な大量のＰＨＣＡを生成することができる。
【００８７】
外来タンパク質の高濃度での発現を指示する制御配列を含む微生物の発現系および発現ベクターが当業者間で周知である。ＰＨＣＡ生成用のキメラ遺伝子を構築するにあたり、このような発現系および発現ベクターのいずれを用いてもよい。その後、キメラ遺伝子を形質転換によって適当な微生物に導入し、高濃度で酵素を発現させることができる。
【００８８】
好適な微生物宿主細胞を形質転換するのに役立つベクターまたはカセットは従来技術において周知である。一般に、このベクターまたはカセットは、関連のある遺伝子の転写および翻訳を指示する配列、選択可能なマーカー、自己複製または染色体組み込みを可能にする配列を含む。好適なベクターは、転写開始制御を含む遺伝子の５’の領域と転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’の領域とを含む。これは両方の制御領域が形質転換した宿主細胞と相同的な遺伝子に由来する場合に最も好ましいが、このような制御領域が生成宿主として選択した特定の種に固有の遺伝子に由来するものでなくてもよいことは理解できよう。
【００８９】
所望の宿主細胞において関連の遺伝子の発現をドライブするのに役立つ開始制御領域またはプロモーターには多数あり、当業者には馴染みのあるものである。これらの遺伝子をドライブすることができるほとんどすべてのプロモーターが本発明に適しており、一例として、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓでの発現に有用）；ＡＯＸ１（Ｐｉｃｈｉａでの発現に有用）；ｌａｃ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃおよびｔｒｃ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉでの発現に有用）があげられるが、これに限定されるものではない。
【００９０】
終結制御領域も好ましい宿主に固有のさまざまな遺伝子から誘導することができる。任意に、終結部位が必要ないこともあるが、終結部位を含む形が最も好ましい。
【００９１】
ＰＨＣＡを商業的に生成したい場合、さまざまな発酵法を適用することができる。たとえば、バッチ発酵または連続発酵のいずれにおいても大規模な生成を行うことができる。
【００９２】
従来からのバッチ発酵は、培地の組成物を発酵開始時に仕込み、発酵の途中で人工的に変化させることのない閉じた系のひとつである。このため、発酵開始時に所望の微生物または複数の微生物を培地に播種し、系に何も加えずに発酵を引き起こさせる。しかしながら、一般に「バッチ」発酵での炭素源の濃度には限度があるため、ｐＨおよび酸素濃度などの要因の制御が試みられることが多い。バッチ系では、発酵が停止するまで系の代謝物とバイオマス組成が絶えず変化する。バッチ培養では、細胞は動きのない誘導期から大きく成長する対数期へと移り、最後に静止期において成長率が低下または停止する。未処理の状態では、静止期の細胞は最終的には死んでしまう。最終生成物または中間体の大半が対数期の細胞によって作られるのが普通である。
【００９３】
標準的なバッチ系のバリエーションのひとつにＦｅｄ−バッチ系がある。Ｆｅｄ−バッチ発酵プロセスも本発明において好適であり、発酵が進むにつれて基質を増やしながら加えること以外は一般的なバッチ系を含む。Ｆｅｄ−バッチ系は、カタボライト抑制によって細胞の代謝が阻害されやすい場合や、培地に含まれる基質の量を制限するのが望ましい場合に有用なものである。Ｆｅｄ−バッチ系で実際の基質濃度を測定するのは困難であるため、ｐＨ、溶存酸素、ＣＯ２などの廃ガスの分圧といった測定可能な要因の変化に基づいて濃度を推測する。バッチ発酵およびＦｅｄ−バッチ発酵は、一般的かつ従来技術において周知であり、その一例が、本願明細書に援用するＢｒｏｃｋ，Ｔ．Ｄ．；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版；Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：マサチューセッツ州サンダーランド、１９８９；またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍ．Ｖ．、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６：２２７（１９９２）に記載されている。
【００９４】
連続発酵を用いてＰＨＣＡを商業的に生産することもできる。連続発酵は、処理時に一定の発酵培地を連続してバイオリアクターに加えると同時に、これと同じ量の条件培地を除去する開いた系のひとつである。連続発酵では細胞が主に成長の対数期にある培養液を一定の高い密度に維持するのが普通である。
【００９５】
連続発酵では、細胞の成長または最終生成物の濃度に影響する要因をいくつでも調整することができる。たとえば、ひとつの方法では、炭素源などの限られた栄養素または窒素濃度を一定率に維持し、他のすべてのパラメータを加減できるようにする。他の系では、培地の混濁度で測定される細胞濃度を一定に保ちながら、成長に影響する多数の要因を連続して変化させることができる。連続系は、定常状態の成長条件を維持することを目指すものであるため、発酵時における細胞の成長率と培地除去による細胞喪失とのバランスを保つようにしなければならない。連続発酵プロセスで栄養素と成長因子とを調節する方法ならびに、生成物の形成速度を最大限にするための手法は工業用微生物学の従来技術において周知であり、上掲のＢｒｏｃｋの著書においてさまざまな方法が詳細に説明されている。
【００９６】
Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系の存在下におけるＰＡＬ経路によるＰＨＣＡの生成では、細胞の成長を支持する培地であればどのような培地でも適している。しかしながら、微生物における自然な炭素の流れの一部としてＰＨＣＡを生成すると望ましい場合、発酵培地に好適な炭素基質を含有させる必要がある。好適な基質としては、グルコース、ラフィノースおよびフルクトースなどの単糖類、ラクトースまたはスクロースなどのオリゴ糖類、スターチまたはセルロースなどの多糖類、あるいはこれらの混合物ならびに、乳清浸透液（ｃｈｅｅｓｅ  ｗｈｅｙ  ｐｅｒｍｅａｔｅ）、コーンスティープリカー、甜菜糖蜜および大麦麦芽などの再生可能な原料から得られる未精製混合物があげられるが、これに限定されるものではない。さらに、この炭素基質は重要な生化学的中間体への代謝変換が認められる一炭素基質（二酸化炭素、ホルムアルデヒド、ギ酸塩またはメタノールなど）であってもよい。
【００９７】
植物宿主
あるいは、本発明は、関連のＰＡＬ遺伝子、ＰＡＬ／ＴＡＬ遺伝子、Ｐ−４５０遺伝子およびＰ−４５０レダクターゼ遺伝子を持つ植物細胞においてＰＨＣＡを生成するものである。好ましい植物宿主にはＰＨＣＡまたはＰＨＣＡ−グルコシドコンジュゲートを高濃度で生成できる多種多様なものがある。好適な緑色植物としては、ダイズ、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｓ）、キクイモ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｔｕｂｅｒｏｓｉｓ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、トウモロコシ、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｓｐ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、カラスムギ（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ，Ｌ）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、コメ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、十字花科の野菜類（ブロッコリ、カリフラワー、キャベツ、パースニップなど）、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、ピーナツ、ブドウ、芝種子、テンサイ、サトウキビ、マメ、エンドウマメ、ライムギ、アマ、広葉樹、針葉樹および牧草があげられるが、これに限定されるものではない。所望の組織において所望の発育段階で遺伝子の発現を指示できるプロモーターにコード領域が作動的に結合されたキメラ遺伝子をまず作製することで、本発明による必要な遺伝子を過発現させることができる。便宜上の理由で、キメラ遺伝子が同一の遺伝子に由来するプロモーター配列および翻訳リーダー配列を含むものであってもよい。転写終結シグナルをコードする３’非コード配列もなければならない。さらに、本キメラ遺伝子は、遺伝子発現を容易にすべく１つまたはそれ以上のイントロンを含むものであってもよい。
【００９８】
このキメラ遺伝子配列では、コード領域の発現を誘導できるどのようなプロモーターとターミネーターとをどのように組み合わせて用いてもよい。プロモーターおよびターミネーターのいくつかの好適な例として、ノパリン合成酵素（ｎｏｓ）遺伝子、オクトピン合成酵素（ｏｃｓ）遺伝子およびカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）遺伝子から得られるものがあげられる。使用できる効率的な植物プロモーターのタイプのひとつに、高等植物のプロモーターがある。このようなプロモーターは、本発明の遺伝配列と作動的に結合された際に、本遺伝子産物の発現を促進できるものでなければならない。本発明において使用できる高等植物のプロモーターとしては、たとえばダイズから得られるリブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓ）のプロモーター（Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ａｐｐ．Ｇｅｎ．１：４８３〜４９８（１９８２））ならびにクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモーターがあげられる。これらの２種類のプロモーターは植物細胞において光誘導されることが知られている（たとえば、Ｃａｓｈｍｏｒｅ，Ａ．、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ、ａｎ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ；Ｐｌｅｎｕｍ：ニューヨーク、１９８３；第２９〜３８頁；Ｃｏｒｕｚｚｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１３９９（１９８３）およびＤｕｎｓｍｕｉｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２：２８５（１９８３）を参照のこと）。
【００９９】
このようにして、本キメラ遺伝子を含むプラスミドベクターを作製することが可能である。どのプラスミドベクターを選択するかは、宿主植物の形質転換に使用する方法によって決まる。当業者であれば、キメラ遺伝子を含む宿主細胞を形質転換し、選択し、増殖させる過程を成功させるにはプラスミドベクターにどのような遺伝因子を存在させておく必要があるか分かるであろう。また、当業者であれば、互いに独立した異なる形質転換イベントでは得られる発現のレベルやパターンが異なる（Ｊｏｎｅｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２４１１〜２４１８（１９８５）；Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１８：７８〜８６（１９８９））ため、所望の発現レベルとパターンとを呈する系統を得るには複数のイベントをスクリーニングしなければならないことも理解できよう。このようなスクリーニングについては、ＤＮＡブロットのサザン分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３（１９７５））、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析（Ｋｒｏｃｚｅｋ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．、６１８：１３３〜１４５（１９９３）、タンパク質発現のウェスタン分析、発現された遺伝子産物の酵素的な活性分析または表現型の分析によって行うことができる。
【０１００】
用途によっては、ＰＨＣＡ生成遺伝子の遺伝子産物に異なる細胞区画を向ける（ｄｉｒｅｃｔ）とよい。したがって、コード配列を変更し、転移配列（Ｋｅｅｇｓｔｒａ，Ｋ．、Ｃｅｌｌ  ５６：２４７〜２５３（１９８９））、シグナル配列、あるいは、小胞体局在化シグナル（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ，Ｊ．Ｊ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２：２１〜５３（１９９１））または核局在化シグナル（Ｒａｉｋｈｅｌ，Ｎ．、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．１００：１６２７〜１６３２（１９９２））をコードする配列などの適当な細胞内標的配列を追加および／またはすでに存在する標的配列を除去した状態で酵素をコードすることで、上述したキメラ遺伝子をさらに補うことができると思われる。上記にて引用した参考文献にはそれぞれの例があげられているが、この一覧は網羅的なものではなく、本発明において利用できる有用な他の標的シグナルが将来的に発見される可能性もある。
【０１０１】
任意に、ＰＨＣＡの下流にある酵素をコードする遺伝子のコサプレッションまたはアンチセンス阻害によって、植物におけるＰＨＣＡの生成量を増大させることも企図される。これらの酵素はＰＨＣＡを有用性の低い産物に形質転換し、ＰＨＣＡの蓄積を防ぐ機能を果たすものである。このような下流の遺伝子をアンチセンスコンホメーションでコードする遺伝子を持つコンストラクトを含むトランスジェニック植物が、ＰＨＣＡの蓄積を増大させる上で有用な場合がある。同様に、過発現された同じ遺伝子が、遺伝子のコサプレッションによってＰＨＣＡの蓄積を増大させる機能を果たすこともある。したがって、遺伝子または遺伝子断片を逆向きに植物プロモーター配列に結合させることで、この下流の遺伝子の一部または全部についてアンチセンスＲＮＡを発現するように設計したキメラ遺伝子（米国特許第５，１０７，０６５号）を作製可能であることは当業者であれば明らかであろう。コサプレッションキメラ遺伝子またはアンチセンスキメラ遺伝子のいずれかを形質転換によって植物に導入し、対応する内在性遺伝子の発現を減少させるか、あるいはこれをなくすことが可能であろう。
【０１０２】
生成方法：
本発明は、ＰＨＣＡを生物生成するための方法をいくつか提供するものである。一実施形態では、必要なＣ４Ｈ活性を持つ生物体とケイ皮酸塩とを接触させることができる。これらの生物体は野生型生物体であっても組換え生物体であってもよい。本発明によって、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ（ＡＴＣＣ  １３２７３、ＡＴＣＣ  １３９６８、ＴＵ６）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ（ＡＴＣＣ  ４２７７）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐｅｔｒａｋｉｉ（ＡＴＣＣ  １２３３７）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ（ＡＴＣＣ  １０５４９）およびＡｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ  ｒｏｂｕｓｔａ（ＡＴＣＣ  １１８５６）をはじめとするいくつかの生物体がケイ皮酸塩をＰＣＨＡに変換する機能を持つことが明らかになった。
【０１０３】
別の実施形態では、酵母のＰＡＬ遺伝子ならびに植物のシトクロムＰ−４５０およびシトクロムＰ−４５０レダクターゼ遺伝子を酵母宿主株に取り込んだところ、組換え酵母においてグルコースをＰＨＣＡに変換する機能が認められた。この生成手段ではＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを選択したが、上述した微生物の生成生物を含むがこれに限定されるものではない、さまざまな酵母が好適であることは当業者であれば理解できよう。同様に、炭素基質にはグルコースを用いたが、他のさまざまな発酵性炭素基質を利用してもよい。
【０１０４】
好ましい実施形態では、Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系がなく、ＰＡＬ／ＴＡＬ酵素を持ち、この酵素のＴＡＬ活性が最低レベルであり、炭素の流れが発酵性炭素源からチロシンを介してＰＨＣＡに至る組換え微生物または植物の細胞からＰＨＣＡを生成することができる。
【０１０５】
以下、実施例において本発明をさらに明確にする。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものではあるが、単に一例にすぎないことを理解されたい。当業者であれば、上記の説明および以下の実施例から本発明の本質的な特徴を確認することができ、その趣旨および範囲を逸脱することなく、本発明にさまざまな変更および修正を加えてさまざまな用途および条件に適合させることができよう。
【０１０６】
実施例
基本方法：
ＰＣＲ増幅、ＤＮＡをクローニングするのに望ましい末端を生成するためのエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによるＤＮＡの修飾、ライゲーションおよびバクテリア形質転換に必要な手順が従来技術において周知である。本願明細書で使用する標準的な分子クローニング手法は従来技術において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．によるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：ニューヨーク州コールドスプリング、１９８９（以下「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）ならびにＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．、Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．およびＥｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．によるＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：ニューヨーク州コールドスプリング、１９８４、さらにはＡｕｓｕｂｅｌらによるＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；１９８７に記載されている。
【０１０７】
細菌培養の管理と増殖に適した材料および方法が従来技術において周知である。以下の実施例で使用するのに適した手法が、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ；Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ、Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ、Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ、Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ、Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ、Ｎｏｅｌ  Ｒ．ＫｒｉｅｇおよびＧ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ編、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ、１９９４またはＢｒｏｃｋ，Ｔ．Ｄ．によるＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版；Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：マサチューセッツ州サンダーランド、１９８９に列挙されている。特に明記しない限り、細菌細胞の増殖および管理に用いる試薬、制限酵素および材料はいずれも、アルドリッチケミカルズ（ウィスコンシン州ミルウォーキー）、ＤＩＦＣＯラボラトリーズ（ミシガン州デトロイト）、ギブコ／ＢＲＬ（メリーランド州ゲーサーズバーグ）またはシグマケミカル社（ミズーリ州セントルイス）から入手した。
【０１０８】
ＰＣＲ反応については、特に明記しない限りＧｅｎｅＡＭＰ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００においてＡｍｐｌｉｔａｑまたはＡｍｐｌｉｔａｑ  Ｇｏｌｄ酵素（カリフォルニア州フォスターシティのＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施した。サイクリング条件および反応を製造業者の指示に従って標準化した。
【０１０９】
略号の意味は以下のとおりである。「ｓｅｃ」は秒（単数または複数）を意味し、「ｍｉｎ」は分（単数または複数）を意味し、「ｈ」は時間（単数または複数）を意味し、「ｄ」は日数（単数または複数）を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモル（単数または複数）を意味し、「μモル」はマイクロモルを意味し」、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｍＵ」はミリ単位を意味する。
【０１１０】
系統、ベクターおよび培養条件：
まず最初に、チロシン栄養要求性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株ＡＴ２４７１および野生型Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０を、コネチカット州ニューヘブンにあるエール大学のＣｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＳＣ番号４５１０））から入手した。ストラタジーンからＥｐｉｃｕｒｉａｎ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｒｅｄ株を購入した。酵素の過発現にはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を用いた（Ｓｈｕｓｔｅｒ，Ｂ．およびＲｅｔｅｙ、Ｊ．、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３４９：２５２〜２５４（１９９４））。ニューイングランドバイオラボ（マサチューセッツ州ビバリー）からベクターｐＢＲ３２２を購入した。ノバジェン（ウィスコンシン州マディソン）からｐＥＴ  ２４ｄおよびｐＥＴ  １７ｂを購入し、アマシャムファルマシアからｐＫＫ２２３−３を購入した。
【０１１１】
Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ用の成長培地：
複合培地：麦芽エキス（１．０％）、酵母エキス（０．１０％）、Ｌ−フェニルアラニン（０．１０％）を脱イオン水中に含有する培地にて、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ（ＡＴＣＣ番号１０７８８）を培養した。Ｄｉｆｃｏが認可したＢａｃｔｏ−麦芽エキスとＢａｃｔｏ−酵母エキスとを用いた。麦芽エキスと酵母エキスの溶液をフェニルアラニンのない状態でオートクレーブ処理した。フェニルアラニンのフィルタ滅菌済２％溶液のアリコート（５０ｍＬ）をオートクレーブ処理した麦芽エキスおよび酵母エキス溶液１．０Ｌに加えた（Ａｂｅｌｌら、「Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  Ａｍｍｏｎｉａ−ｌｙａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４２：２４２〜２４８（１９８７））。
【０１１２】
最小培地：この培地は、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．２）と、ＭｇＳＯ４（１００ｍｇ／ｌ）と、ビオチン（１０ｍｇ／ｌ）と、Ｌ−フェニルアラニン（２．５ｇ／Ｌ）とを脱イオン水中に含有していた。リン酸緩衝液の溶液を他の成分のない状態でオートクレーブ処理した。Ｌ−フェニルアラニン（２５ｇ／Ｌ）と、ＭｇＳＯ４（１．０ｇ／Ｌ）と、ビオチン（０．１ｇ／Ｌ）とを５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．２）１．０ｌに入れた溶液をフィルタ滅菌し、オートクレーブ処理したリン酸緩衝液９００ｍＬに１００ｍＬを加えた。成分の最終濃度を以下のとおりとした。ＫＨ２ＰＯ４（５．５５ｇ／Ｌ）；Ｋ２ＨＰＯ４（１．６１ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４（１００ｍｇ／ｌ）、ビオチン（１０ｍｇ／ｌ）、Ｌ−フェニルアラニン（２．５ｇ／Ｌ）（Ｍａｒｕｓｉｃｈ，Ｗ．Ｃ．、Ｊｅｎｓｅｎ，Ｒ．Ａ．およびＺａｍｉｒ，Ｌ．Ｏ．「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌ−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  Ａｍｍｏｎｉａ−Ｌｙａｓｅ  Ｄｕｒｉｎｇ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ａｓ  ａ  Ｃａｒｂｏｎ  ｏｒ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓｏｕｒｃｅ  ｉｎ  Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ」、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４６：１０１３〜１０１９（１９８１））。
【０１１３】
酵素活性アッセイ：
Ａｂｅｌｌら、「Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  Ａｍｍｏｎｉａ−ｌｙａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４２：２４２〜２４８（１９８７）に従って、精製した酵素のＰＡＬ活性またはＴＡＬ活性を分光光度計で測定した。ＰＡＬを判定するための上記のような分光光度的なアッセイを、１．０ｍＭのＬ−フェニルアラニンと５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌとを含有する溶液（ｐＨ８．５）に酵素を加えることから開始した。この反応に続いて、モル吸光係数を９０００ｃｍ−１として生成物であるケイ皮酸の２９０ｎｍにおける吸光度をモニタリングした。さらに、０．００７５から０．０１８／分の範囲で吸光度が変化する量の酵素を用いて５分間にわたってアッセイを実施した。フェニルアラニン１．０μｍｏｌが脱アミノ化してケイ皮酸になる１分あたりの量を活性１単位とした。また、反応溶液中のチロシンを用いてＴＡＬ活性も同様に測定した。生成されたｐ−ヒドロキシケイ皮酸の吸光度を３１５ｎｍに合わせ、ＰＨＣＡに対する吸光係数を１０，０００ｃｍ−１として活性を求めた。チロシン１μｍｏｌが脱アミノ化してｐ−ヒドロキシケイ皮酸になる１分あたりの量を活性１単位とした。
【０１１４】
ＳＤＳゲル電気泳動：
１レーンあたり４．０μｇのタンパク質を用いて、８〜２５％のネイティブＰｈａｓｔＧｅｌを泳動させ、クマシーブルーで染色した。ファルマシアの高分子量（ＨＭＷ）マーカーおよびシグマから入手したグレードＩのＰＡＬをスタンダードとして用いた。
【０１１５】
ＨＰＬＣ分析用の試料の調製：
細胞全体によって形成されたケイ皮酸およびＰＨＣＡの濃度を測定するためのＨＰＬＣアッセイを開発した。一般的なアッセイでは、選択した培地で成長した培養を遠心分離した後、上清２０〜１０００μＬをリン酸で酸性化し、０．２または０．４５ミクロンのフィルタを通して濾過し、ＨＰＬＣで分析して成長培地中のＰＨＣＡおよびケイ皮酸の濃度を求めた。あるいは、遠心分離の後、１．０ｍＭのチロシンまたは１．０ｍＭのフェニルアラニンを含有する１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）に細胞を再懸濁させ、室温にて１．０〜１６時間インキュベートした。次に、この懸濁液を濾過した後のアリコート（２０〜１０００μＬ）を分析した。
【０１１６】
ＨＰＬＣ法：
オートサンプラーとダイオードアレイＵＶ／Ｖｉｓ検出器とを備えたヒューレットパッカード製の１０９０Ｍ  ＨＰＬＣ系を、ＭＡＣ−ＭＯＤ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｃ．から提供された逆相Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ８カラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）で用いた。カラム温度４０℃で１分あたりの流量を１．０ｍＬとした。２５０、２３０、２７０、２９０および３１０ｎｍの波長で溶出液をモニタリングできるようにＵＶ検出器を設定した。
【０１１７】
溶媒／グラジエント：
【表５】
2004530402.tif 000008
【０１１８】
上述したＨＰＬＣ系を用いる場合の関連の代謝物の保持時間（ＲＴ）を以下にまとめておく。
【０１１９】
【表６】
2004530402.tif 000009
【０１２０】
ＭＯＮＯ  Ｑ緩衝液：
これらの分析に使用した緩衝液は、開始緩衝液としての５０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、これに続いてＭｏｎｏ−Ｑカラムの溶離液としての４００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）であった。
【０１２１】
ＥＢ緩衝液：
遺伝子クローニングに使用した緩衝液は、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）緩衝液であった。
【０１２２】
実施例１
ケイ皮酸をＰＨＣＡに変換するための微生物
実施例１では、さまざまな微生物におけるケイ皮酸ヒドロキシラーゼの有無についてのスクリーニングと、これらの微生物がケイ皮酸をＰＨＣＡに変換する機能に関する研究調査について説明する。
【０１２３】
ケイ皮酸ヒドロキシラーゼ活性を持つ微生物を発見するために、バクテリアと菌類の１５０種を超える系統でケイ皮酸をＰＨＣＡに変換する機能をスクリーニングした。ここでは二段階の発酵プロトコールを利用した。まず、培地にて３日間かけて微生物を成長させた後、２０％の種菌を用いて第二段階の培養を開始した。第二段階において２４ｈ成長させた後、ケイ皮酸を加え、試料を一定間隔で採取し、ＰＨＣＡの有無をＨＰＬＣで分析した。
【０１２４】
成長培地：
ＡＴＣＣ培地番号１９６−酵母／麦芽培地
この培地には、（１リットルあたりのグラム数で）麦芽エキス６．０と、マルトース１．８と、デキストロース６．０と、酵母エキス１．２とを含有していた。ｐＨを７．０に調整した。
【０１２５】
ＡＴＣＣ培地番号５−芽胞形成用ブロス
この培地には、（１リットルあたりのグラム数で）酵母エキス１．０と、牛肉エキス１．０と、トリプトン２．０と、グルコース１０．０とを含有していた。
【０１２６】
きなこ／グリセロール培地（ＳＢＧ）：
この培地は、（１リットルあたりのグラム数で）グリセロール２０と、酵母エキス５．０と、きなこ５．０と、塩化ナトリウム５．０と、二塩基性リン酸カリウム５．０とを含有していた。ｐＨを７．０に調整した。
【０１２７】
ジャガイモ−デキストロース／酵母培地（ＰＤＹ）：
（１リットルあたりのグラム数で）ジャガイモデキストロースブロス２４．０と酵母エキス５．０とを含有していた培地を真菌株の増殖に利用した。
【０１２８】
試験した１００〜１５０の微生物のうち、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓの３種類の異なる株（ＡＴＣＣ  １３２７３、ＡＴＣＣ  １３９６８、ＴＵ６）、バクテリアであるＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ（ＡＴＣＣ  ４２７７）、真菌株であるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐｅｔｒａｋｉｉ（ＡＴＣＣ  １２３３７）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ（ＡＴＣＣ  １０５４９）およびＡｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ  ｒｏｂｕｓｔａ（ＡＴＣＣ  １１８５６）でケイ皮酸をＰＨＣＡに変換する機能が認められた。これらの結果から、通常はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ、特にＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓがこの水酸化において最も活性であるように思われた。したがって、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓの以下の株を用いてさらに研究を行った（ＡＴＣＣ  １３２７３、ＡＴＣＣ  １３９６８、ＴＵ６）。
【０１２９】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ株が３種類の複合培地（ＳＢＧ、芽胞形成用ブロスおよび酵母／麦芽培地）において成長しながらケイ皮酸をｐ−水酸化してＰＨＣＡに変換する機能について検討した。ＳＢＧ、芽胞形成用ブロスおよび麦芽／酵母培地で二段階の発酵プロトコールを利用した。試料をさまざまな間隔で採取し、ＰＨＣＡの有無をＨＰＬＣで分析した。データを以下の表１に示す。
【０１３０】
【表７】
2004530402.tif 000010
【０１３１】
上記のデータから明らかなように、ＳＢＧ培地で成長させた場合、試験したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ株のうちＡＴＣＣ  １３２７３に続いてＡＴＣＣ  １３９６８およびＴＵ６の順でＰＨＣＡを生成する際の活性が最も高かった。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓのＡＴＣＣ  １３９６８株を用いると、ＳＢＧと芽胞形成用ブロスのどちらで成長させてもケイ皮酸をＰＨＣＡに変換する機能が得られた。２４時間成長させた後のＰＨＣＡ生成機能は芽胞形成用培地で成長させた細胞（ＡＴＣＣ  １３９６８）が最大であり、一方、ＳＧＢ培地で成長させた細胞のＰＨＣＡ生成活性が最大になったのは６０時間後であった。
【０１３２】
実施例２
最適なＴＡＬ／ＰＡＬ活性比を持つ微生物のスクリーニング
実施例２では、さまざまな微生物のＰＡＬおよびＴＡＬ活性をスクリーニングことについて説明する。この情報は、以後のＰＡＬおよびＰＡＬ／ＴＡＬ酵素のクローニング、発現、精製および動態分析に最も適した微生物を選択できるようにする上で必要であった。
【０１３３】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓでの成長用の培地とＰＡＬの誘導：
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓには二段階の発酵プロトコールを用いた。ステージＩの培地は、グルコース（２％）と、きなこ（１％）と、酵母エキス（０．５％）と、肉エキス（０．３％）と、炭酸カルシウム（０．３％）とを含有し、ステージＩＩに合わせて４％の種菌を使用した。ステージＩＩの培地は、グルコース（２％）と、酵母エキス（２％）と、塩化ナトリウム（０．５％）と、炭酸カルシウム（０．３％）とを含有していた。この培地を５００ｍＬ容のフラスコに１００ｍＬずつ配分した。この培地に移した細胞を振盪機にて２５℃で２４ｈインキュベートした。
【０１３４】
複合培地での成長後におけるＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ細胞の調製：
成長細胞収量およびＰＡＬ／ＴＡＬ特異的活性を求めるために、（２５０ｍＬ容のＤｅＬｏｎｇフラスコにて）複合培地５０ｍＬでＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓの細胞を成長させた。細胞収量（細胞の湿重量）は８．１１グラムであった。最初の収穫から０．８ｇ（湿重量）を用いて（１０×１リットルのＤｅＬｏｎｇフラスコにて）２００ｍＬに２回目の移行を行った。１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．１）で３回洗浄した後の細胞収量は１６．０グラムであった。
【０１３５】
細胞抽出液の調製
細胞０．５ｍＬ／ｇと５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）とを用いて細胞ペレットを再懸濁させ、２０，０００ｐｓｉでＦｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｃｅｌｌを１回通して破壊した。次に、破壊された細胞を１４，２００×ｇで３０分間遠心分離し、壊れなかった細胞塊を除去した。抽出液の試料を用いてタンパク質濃度アッセイとＰＡＬ／ＴＡＬ活性の判定とを行った。また、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．から入手したＢＣＡ（ビシンコニン酸）での方法を用いてタンパク質を判定した。
【０１３６】
ゲル：
ＢｉｏＲａｄ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）から入手した７．５％のプレキャストアクリルアミドゲルを利用した。分子量に合わせて細胞抽出液または酵素溶液の試料をゲルに仕込み、標準についてはファルマシア（スウェーデンのウプサラ）から入手した。高分子量（ＨＭＷ）の凍結乾燥タンパク質を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）１００μＬに可溶化し、ブロモフェノールブルーを添加した。ＢｉｏＲａｄから入手した泳動用緩衝液を１０×溶液から調製し、１５０ボルトでゲルを泳動させた。泳動用染料をゲルから電気泳動させ、ゲルをさらに１時間泳動させた。ゲルの分子量マーカーと試料レーンとを含む側の端を切断し、約４５分間かけてクマシーブルーで染色した。２つのゲル切片を切り取り、ゲル材料を細かく切断して４℃にて５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）１．０〜２．０ｍＬに入れた。続いて２通りの時間間隔でＰＡＬ活性を測定した。ゲルスライスのＰＡＬ活性を上述したように判定したところ、最大で１７３ｍＵであった。
【０１３７】
ＰＡＬ／ＴＡＬ活性：
上述したようにしてＰＡＬ／ＴＡＬ活性を求めた。この手順を用いて、ＰＡＬおよびＴＡＬでそれぞれ０．０２４１±０．０００５Ｕ／ｍｇおよび０．０１４３±０．０００５Ｕ／ｍｇの特異的活性が観察された（表２）。これらの結果に基づいて、ＰＡＬ／ＴＡＬの比を算出したところ、１．６８±０．０７であった。精製酵素ではＰＡＬ／ＴＡＬ比２．１２が観察された。これらの酵素では文献値で１．７が報告されている（ＨａｎｓｏｎおよびＨａｖｉｒ、Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ；Ａｃａｄｅｍｉｃ：ニューヨーク、１９８１；第７巻、第５７７〜６２５頁）。完全なデータを表２に示す。
【０１３８】
【表８】
2004530402.tif 000011
【０１３９】
表２において概要を説明したように、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓｓとしても知られるＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ（ＡＴＣＣ  １０７８８）が最もＴＡＬ活性が高く、よって以後の研究用にこれを選択した。
【０１４０】
実施例３
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓのＰＡＬのクローニングおよび発現
実施例３は、精製に十分な量のＰＡＬを生成するためのクローニングとＥ．ｃｏｌｉにおけるＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓのフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）の発現とについて説明するものである。
【０１４１】
ＲＮＡ精製：
フェニルアラニンを含有する複合培地において成長させた対数期の細胞からＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓのＲＮＡを精製した。トータルＲＮＡを単離し、キアゲン製のトータルＲＮＡ単離キットおよびｍＲＮＡ単離キットをそれぞれ製造業者の指示に従って用いてｍＲＮＡを精製した。
【０１４２】
逆転写：
ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理水を使用せずに、パーキンエルマー（コネチカット州ノーウィッチ）ＧｅｎｅＡｍｐキットの指示に従ってＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓのｍＲＮＡ（３μＬ、７５ｎｇ）を逆転写した。使用したＰＣＲプライマー（０．７５μＭ）は、キットに添付されていたランダム六量体すなわち、ＥｃｏＲＩ制限部位を含有する上流プライマー（配列番号１）５’−ＡＴＡＧＴＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＧＣＴＣＧＡＣＴＣＧＡ−３’とＰｓｔＩ制限部位を含有する下流ＰＣＲプライマー（配列番号２）５’−ＧＡＧＡＧＡＣＴＧＣＡＧＡＧＡＧＧＣＡＧＣＣＡＡＧＡＡＣＧ−３’であった。これらのプライマーをＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓのＰＡＬ遺伝子から合成した。キットｐＡＷ１０９  ＲＮＡとＤＭ１５１プライマーおよびＤＭ１５２プライマーとを用いるプラスの対照も実施した。融点９５℃にて１．０分間、アニーリング温度５５℃にて１．０分間、伸長温度７２℃にて２．０分間を３０サイクルでＰＣＲを実施した。各サイクルごとに伸長工程に５秒を加え、最終伸長工程を１０分間とした。ＰＣＲ反応ミックスからアリコート（５．０μＬ）を得て、これを１％アガロースゲルに仕込んでＰＣＲ反応生成物を確認した。
【０１４３】
１０×マルチバッファ（２．０μＬ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、１０ｍｇ／ｍｌ、１．０μＬ）、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ（各０．５μＬ）、ＰＣＲ産物（４．０μＬ）および蒸留した脱イオン水（１２．５μＬ）を用いて、ＰＣＲ断片を消化した。反応物全体を１％アガロースゲルに仕込み、所望のサイズのＤＮＡ断片を精製した。
【０１４４】
ライゲーション：
コンストラクト用のライゲーション混合物（総量５０μＬ）には、ライゲーション緩衝液（１０×、５．０μＬ）、３．０Ｕ／μＬ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（１．０μＬ）、ＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ、２．５μＬ）、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ制限部位のプライマー（２５μＬ）を用いるＰＣＲ産物１９ｎｇ／μＬ、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ（２．０μＬ）で事前に切断したｐＫＫ２２３−３を３３ｎｇ／μＬ、蒸留脱イオン水（１４．５μＬ）を含有させた。対照ベクター用のライゲーション混合物（総量５０μＬ）には、ライゲーション緩衝液（１０×、５．０μＬ）、３．０Ｕ／μＬ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（１．０μＬ）、ＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ、２．５μＬ）、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ（２．０μＬ）で事前に切断したｐＫＫ２２３−３を３３ｎｇ／μＬ、蒸留脱イオン水（３９．５μＬ）が含まれていた。反応混合物を一晩１６℃にてインキュベートした。
【０１４５】
形質転換：
コンピテントＤＨ１０ｂ  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（ギブコ）を氷上にて約２０分間かけて融解した。次に、ライゲーションミックス２．０μＬを細胞５０μＬに加え、氷上にて３０分間インキュベートした。これらの細胞を３７℃で２０秒間熱ショック処理した後、氷上にて再度冷却した。続いてＬＢブロス０．９５ｍＬを細胞に加え、振盪機にて３７℃で１．０時間インキュベートした。さらに、細胞を遠心分離し、ＬＢブロス約５０μＬに再懸濁させ、アンピシリン１００ｍｇ／ｌを含有するＬＢプレートに画線し、３７℃で一晩インキュベートした。
【０１４６】
クローン：
Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓのＰＡＬ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで過発現させた。この実施例で調製したＰＣＲ産物を、まず標準的なクローニングベクターにクローニングした後、ｔａｃプロモーターの下でＤＨ１０ｂ  Ｅ．ｃｏｌｉにおいてｐＫＫ２２３−３過発現ベクターにクローニングした。全部で６のクローンを細胞全体のＰＡＬ活性と無細胞でのＰＡＬ活性の両方について試験した。
【０１４７】
細胞の成長：
まず、２５０ｍＬ容のバッフルフラスコ中、アンピシリン１００ｍｇ／ｌを含むＬＢ培地５０ｍＬにて３７℃で一晩細胞を成長させた。誘導されない細胞を収穫する前に、アリコート５．０ｍＬを新鮮な培地に移し、約０．９（ＯＤ６００）まで成長させた。次に最終濃度が０．２ｍｇ／ｍｌになるようにＩＰＴＧを加えて酵素を誘導し、細胞をさらに３．０時間成長させた。ＯＤ６００の測定値を表３に示す。
【０１４８】
【表９】
2004530402.tif 000012
【０１４９】
細胞全体のＰＡＬ活性：
誘導されなかった細胞（１．０ｍＬ）と誘導された（０．２ｍＬ）細胞のアリコートを収穫前に採取した。細胞をペレット化し、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．５）に１．０ｍＬに再懸濁させた。次に、フェニルアラニンを加え（１．０ｍＭ、最終濃度）、混合物を振盪機にて３７℃で１．０時間インキュベートした。次に、この混合物をリン酸５０μＬで酸性化し、細胞をペレット化した。次に溶質を濾過し、上述したようにＨＰＬＣで分析した。誘導された細胞から得た培養液を同様に処理し、ＨＰＬＣで分析した。ケイ皮酸標準およびＰＨＣＡ標準（１．０ｍＭ）についても分析し、試料中における化合物の濃度の算出に用いた（たとえば、（試料１７７．６６ｍＡＵ）／（標準１２７３４．１３ｍＡＵ／ｍＭ）×（１０００μＭ／ｍＭ）＝ケイ皮酸１３．９５μＭ）。結果を表３にあげておく。
【０１５０】
無細胞でのＰＡＬ活性：
細胞を遠心分離によって収穫した。収穫した細胞ペレットに、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．５）１．０ｍＬを加え、Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｃｅｌｌに約１８，０００ｐｓｉで１回通して細胞を破壊した。抽出物をエッペンドルフマイクロチューブにて４℃で１０〜１５分間遠心分離した。上清（１．０ｍＬ）を除去し、ＰＡＬ活性およびブラッドフォードタンパク質のアッセイに利用した（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７２、２４８、１９７６）。観察された中で最も高い特異的活性は、タンパク質０．２４４（ＰＡＬ）および０．０６５０（ＴＡＬ）Ｕ／ｍｇであった。
【０１５１】
ＳＤＳゲル電気泳動：
精製したＰＡＬタンパク質を基本方法で説明したようにして８〜２５％のネイティブＰｈａｓｔＧｅｌで泳動した。これらの分析結果に基づいて、精製したＰＡＬの分子量は２８７ｋＤであると推定された。
【０１５２】
上記の実験の際、ＰＨＣＡおよびケイ皮酸の両方ともＬＢ培地での細胞の成長時に現れ、細胞全体のアッセイの間にも現れることが明らかになった。Ｅ．ｃｏｌｉにはケイ皮酸をＰＨＣＡに変換するための酵素的な仕組みが含まれないため、形質転換したＥ．ｃｏｌｉ培養でＰＨＣＡが検出されるというのは予想外の発見であった。したがって、これらの培養にＰＨＣＡが存在することから、Ｅ．ｃｏｌｉで発現された野生型酵母のＰＡＬ酵素が、ＰＡＬ活性だけでなくＴＡＬ活性も持っており、チロシンを直接ＰＨＣＡに変換することが明らかになった。
【０１５３】
実施例４
Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓの野生型ＰＡＬを過発現している組換えＥ．ｃｏｌｉグルコースからのＰＨＣＡの生成
この実施例では、グルコースまたはＬＢ培地のいずれかでの成長時に野生型ＰＡＬを過発現しているＥ．ｃｏｌｉ株の持つＰＨＣＡ生成機能を分析することについて説明する。
【０１５４】
上述したように、ＰＨＣＡを合成するには２つの経路がある。一方の経路では、ＰＡＬによってフェニルアラニンをｔｒａｎｓ−ケイ皮酸に変換し、これをシトクロムＰ−４５０酵素系によってパラ位で水酸化してＰＨＣＡを合成することが可能である。他方の経路では、ＴＡＬによって一工程の反応でチロシンをＰＨＣＡに変換するため、シトクロムＰ−４５０は必要ない。Ｅ．ｃｏｌｉにはシトクロムＰ−４５０酵素が存在しないため、これらの細胞で形成されるＰＨＣＡはいずれもＴＡＬ経路によるもののはずである。この仮説を裏付けるために、以下のような実験を実施した。ＰＣＡ１２Ｋｍ（実施例８で説明）を含有するＥ．ｃｏｌｉ細胞を１．０ｍＭのケイ皮酸と一緒に一晩インキュベートし、ＨＰＬＣによってＰＨＣＡの生成をモニタリングした。
【０１５５】
細胞の成長：
ＬＢブロス、ＬＢ＋０．２％グルコースにアンピシリン１００ｍｇ／ｌを加えた中で３０℃にて、あるいはＭ９培地（下記参照）＋０．２％グルコースまたはＭ９培地＋２％グルコースにアンピシリン１００ｍｇ／ｌを加えた中で３０℃にて２４時間、細胞を成長させた。Ｍ９培地＋グルコースで成長させた細胞の方が、ＬＢ培地で成長させた細胞よりもかなりゆっくりと成長した。
【０１５６】
ＰＨＣＡのアッセイ：
一般的な手順で説明したようにして各細胞培養のアリコート（１．０ｍＬ）をリン酸５０μＬで酸性化してペレット化し、上清を濾過し、ＨＰＬＣによって分析した。２４時間後または７２時間後に試料を採取した。ＰＨＣＡ標準（１．０ｍＭ）についても分析し、試料中における化合物濃度の判定に用いた。成長とＰＨＣＡの生成とを関連づけるために（表３、実施例２参照）、試料を採取して６００ｎｍで細胞密度を測定した。
【０１５７】
表３のデータから明らかなように、野生型ＰＡＬを含有しているＥ．ｃｏｌｉ細胞は、ＬＢ（グルコース含有およびグルコース含有せず）またはグルコース加Ｍ９（下記参照）培地のどちらで成長させてもＰＨＣＡを生成した。ＬＢ培地にグルコースを加えることで、形成されるＰＨＣＡの総量と培養の細胞密度は増加したが、細胞密度あたりのＰＨＣＡの生成量は低下した。
【０１５８】
Ｍ９培地：
バクテリアを培養するためのＭ９最小培地には、（１リットルあたりのグラム数で）Ｎａ２ＨＰＯ４６．０と、ＫＨ２ＰＯ４３．０と、ＮＨ４Ｃｌ１．０と、ＮａＣｌ０．５と、グルコース４とを含有している（Ｍａｎｉａｔｉｓ、付録Ａ．３）。
【０１５９】
実施例５
Ｅ．ｃｏｌｉからの組換え野生型Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓのＰＡＬの精製
形質転換したＥ．ｃｏｌｉから得られた野生型組換えＲ．ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓのＰＡＬを、熱処理、硫酸アンモニウム沈殿、陰イオン交換カラム、疎水性相互作用クロマトグラフィ、ゲル濾過を用いて精製した。
【０１６０】
細胞の成長：
１０Ｌ容の発酵槽にて２８℃で、アンピシリン１００ｍｇ／ｌを加えた２×ＹＴ培地において細胞を成長させた。
【０１６１】
無細胞抽出物の調製：
細胞を収穫し、使用する必要がでるまで冷凍ペレットで保持した。このペレット（湿重量７６ｇ）を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で洗浄し、同じ緩衝液を用いて、緩衝液１．０ｍＬあたりの細胞の湿重量密度が２．０ｇになるまで再懸濁させた。少量のＤＮａｓｅを加え、Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｃｅｌｌに約１８，０００ｐｓｉで細胞を２回通した。次に、プロテアーゼ阻害剤であるＰＭＳＦを最終濃度が０．５ｍＭになるまで抽出物に加えた。１３，０００×ｇにて３０分間の遠心分離した後、１０５，０００×ｇで１．０時間さらに遠心分離して細胞片を除去した。
【０１６２】
抽出物の熱処理：
抽出物を６０℃の温度まで１０分間加熱した後、氷上にのせた。変性したタンパク質を２５，０００×ｇで３０分間の遠心分離によってペレット化した。
【０１６３】
硫酸アンモニウム沈殿：
４℃にて硫酸アンモニウムの飽和溶液を加えて硫酸アンモニウム沈殿を行った。この溶液を氷上にて１５〜３０分間攪拌した。沈殿したタンパク質を２５，０００×ｇで１５分間の遠心分離によってペレット化し、ペレットを最低量のＴｒｉｓ緩衝液に溶解させた。３５％の硫酸アンモニウムカット時、溶液のｐＨを測定し、８．５に調節しなおした。沈殿するごとに抽出物の容量を測定した。抽出物を別々に硫酸アンモニウム沈殿処理したが、どちらの実験でも５０％の硫酸アンモニウムカットをプールし、濃縮し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−５０限外濾過チューブ（マサチューセッツ州ベッドフォードのミリポア社）で脱塩した。
【０１６４】
陰イオン交換クロマトグラフィ：
２０ｍｍ×１６５ｍｍ、５０μｍのＨＱカラム（マサチューセッツ州ファーミンガムのＰｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて、流量３０ｍＬ／分で陰イオン交換クロマトグラフィを実施した。開始緩衝液（緩衝液Ａ）は５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）であり、溶出用緩衝液（緩衝液Ｂ）は５．０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）に０．５ＭのＮａＣｌを加えたものとした。２カラム容量（ＣＶ）についてカラムを平衡化し、試料注入後に２ＣＶにわたって緩衝液Ａで洗浄した。緩衝液Ａ１００％から緩衝液Ａ５０％までと緩衝液Ｂのグラジエントを１０ＣＶについて作製した。緩衝液Ａ５０％および緩衝液Ｂから緩衝液Ｂ１００％まで２ＣＶについて第２のグラジエントを作製した。カラムを２ＣＶの緩衝液Ｂで洗浄した後、２ＣＶにわたって緩衝液Ａで再平衡化した。２８０ｎｍにてタンパク質をモニタリングし、第１のグラジエントの間に１０ｍｌの画分を氷上にて回収した。試料のサイズは最大５．０ｍｌであり、タンパク質最大３４０ｍｇすなわち２８５０ｍｇのカラム容量の約１２％を含有していた。別の実験で得られた画分をプールし、上述したようにして濃縮した。
【０１６５】
疎水性相互作用クロマトグラフィ：
２０ｍｍ×１６７ｍｍ、５０μｍのＰＥカラム（マサチューセッツ州ファーミンガムのＰｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて、流量３０ｍＬ／分で疎水性相互作用クロマトグラフィを実施した。開始緩衝液（緩衝液Ａ）は５．０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）に１．０Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４を加えたもの、溶出用緩衝液（緩衝液Ｂ）は５．０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）であった。２ＣＶにわたってカラムを平衡化し、試料注入後に２ＣＶにわたって緩衝液Ａで洗浄した。次に、緩衝液Ａ１００％から緩衝液Ｂ１００％までのグラジエントを１０ＣＶにわたって作製した。２ＣＶの緩衝液Ｂでカラムを洗い流した後、２ＣＶの緩衝液Ａで再平衡化した。２８０ｎｍにてタンパク質をモニタリングし、１０ｍＬの画分を回収し、グラジエント作製時には氷上にて保持した。タンパク質を最大５０ｍｇすなわち４２０ｍｇのカラム容量の１２％含有している最大５．０ｍＬの試料を、飽和硫酸アンモニウム溶液を加えることで１．０Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４に調節した。異なる実験で得られた画分を上述したようにプールし、脱塩し、濃縮した。
【０１６６】
ゲル濾過クロマトグラフィ（ＧＦ）：
１０ｍｍ×３０５ｍｍのＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨＲカラムにて、流量０．５ｍＬ／分でゲル濾過を行った。０．２ＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）を使用して、カラムを１ＣＶ通し、タンパク質の溶出を２８０ｎｍでモニタリングした。画分（０．５ｍＬ）を回収し、氷上にて保持した。カラムに加えた試料の容量は１００μＬであり、これに最大で１０ｍｇのタンパク質が含まれていた。ピークの中心から得られた画分をプールし、上述したように濃縮した。
【０１６７】
精製と特異的活性の増大について示しているデータを表４にあげておく。
【０１６８】
【表１０】
2004530402.tif 000013
【０１６９】
実施例６
炭素源の選択
この実施例は、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓのＰＡＬ遺伝子（配列番号７）に加えて植物のＰ−４５０およびＰ−４５０レダクターゼ（それぞれ配列番号１１および配列番号１３）を含有する組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（ＰＴＡ  ４０８）がフェニルアラニンをＰＨＣＡに変換する機能にさまざまな炭素源がどのように影響するかについて説明するためのものである。
【０１７０】
酵母のＰＡＬと植物のシトクロムＰ−４５０およびシトクロムＰ−４５０レダクターゼとを含有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから得られた２つのコロニー（Ｎｏ．１およびＮｏ．２）を選択し、ラフィノース、ガラクトースまたはグルコースのいずれかを含有する３種類の異なる培地で成長させた。これらの培地を、Ｒａｆ／ＳＣＭまたはＧａｌ／ＳＣＭまたはＧｌｕ／ＳＣＭとした。これらの実験で用いたさまざまな培地の組成を以下にあげておく。
【０１７１】
Ｇｌｕ／ＳＣＭ（Ａｄｅ／Ｈｉｓ／Ｕｒａ）：Ｂａｃｔｏ−酵母窒素ベース（６．７ｇ／Ｌ）、グルコース（２０．０ｇ／Ｌ）、ＳＣＭ（２．０ｇ／Ｌ）含有。
Ｒａｆ／ＳＣＭ（Ａｄｅ／Ｈｉｓ／Ｕｒａ）：Ｂａｃｔｏ−酵母窒素ベース（６．７ｇ／Ｌ）、ラフィノース（２０．０ｇ／Ｌ）、ＳＣＭ（２．０ｇ／Ｌ）含有。
Ｒａｆ／Ｇａｌ  ＳＣＭ（Ａｄｅ／Ｈｉｓ／Ｕｒａ）／Ｔｙｒ／Ｐｈｅ：Ｂａｃｔｏ−酵母窒素ベース（６．７ｇ／Ｌ）、ラフィノース（１０．０ｇ／Ｌ）、ガラクトース（１０．０ｇ／Ｌ）、ＳＣＭ（２．０ｇ／Ｌ）、チロシン（０．５ｇ／Ｌ）、フェニルアラニン（１０．０ｇ／Ｌ）含有。
酵母用ＳＣＭ（Ａｄｅ／Ｈｉｓ／Ｕｒａ）寒天板：Ｂａｃｔｏ−酵母窒素ベース（３．３５ｇ／Ｌ）、デキストロース（１０．０ｇ／Ｌ）、寒天（１０．０ｇ／Ｌ）、ＳＣＭ（１．０ｇ／Ｌ）、ｄｄＨ２Ｏ（５００ｍＬ）含有。
【０１７２】
各コロニーのグリセロールストック（３００μＬ）を用いて、Ｇｌｕ／ＳＣＭ、Ｇａｌ／ＳＣＭおよびＲａｆ／ＳＣＭ培地に播種した。各株で同じ培養を２つずつ調製し、各培地および培養を２４時間および４８時間増殖した。
【０１７３】
上述したようにして細胞密度を測定した後、細胞を遠心分離し、０．８５％の生理食塩リン酸緩衝液で１回洗浄し、ＳＣＭ培地（５．０ｍＬ）に再懸濁させ、ＯＤ６００を再度測定した。次に、２５．０ｍＬのＲａｆ／ＳＣＭまたはＧａｌ／ＳＣＭ培地の入った対応するフラスコに細胞を加えて最終ＯＤ６００を０．５とした。それぞれのフラスコにガラクトース（最終濃度５％）を加え、振盪機にて約１６時間放置して誘導が起こるようにした。誘導後、各フラスコにフェニルアラニン（最終濃度１．０ｍＭ）を加え、２時間、４時間、６時間、２４時間および４８時間の時点で各フラスコから試料（１．０ｍＬ）を採取し、ＰＨＣＡの有無をＨＰＬＣで分析した（表５参照）。
【０１７４】
【表１１】
2004530402.tif 000014
【０１７５】
表５のデータから明らかなように、試験した株はどちらも異なる培地で成長させた際に同様の挙動を呈するように見えた。６〜２４ｈの間にＰＨＣＡ生成濃度の観察値が最高に達し、３０％前後のフェニルアラニンがＰＨＣＡに変換された。最初に発生して蓄積した後、ＰＨＣＡ濃度の低下が観察された（４８ｈ）。
【０１７６】
実施例７
Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓのＰＡＬ、植物のシトクロムＰ−４５０およびシトクロムＰ−４５０レダクターゼを含有する組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株によるＰＨＣＡの生成
この実施例は、野生型ＰＡＬに加えて植物のシトクロムＰ−４５０およびシトクロムＰ−４５０レダクターゼ遺伝子を含有する組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株によるＰＨＣＡの生成をガラクトースで誘導することについて説明するためのものである。
【０１７７】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株に取り込まれたＰＡＬ、シトクロムＰ−４５０およびシトクロムＰ−４５０レダクターゼは、ガラクトースプロモーターの制御下にあるため、ガラクトースによる誘導時間が形成されるＰＨＣＡの濃度にどのような影響をおよぼすかについて検討すべく実験を行った。ＰＨＣＡの濃度が最高になったＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株Ｎｏ．２を選択し、ガラクトースによって誘導した。組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅがグルコースを直接ＰＨＣＡに変換できるか否かを検討するために、ガラクトースを用いて１時間の誘導後、一組の細胞にグルコースを与えたが、フェニルアラニンの添加は行わなかった。もう一組の細胞をラフィノースで成長させた。すべてのフラスコから一定間隔で試料を採取し、上述したようにＨＰＬＣ分析用に調製した。
【０１７８】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのグリセロール懸濁液の試料をＳＣＭ−グルコース板に画線し、３０℃でインキュベートした。４つのコロニーをプレートから採取し、Ｇｌｕ／ＳＣＭ培地４．０ｍＬに播種し、振盪機（３０℃、２５０ｒｐｍ）にて一晩放置した。細胞懸濁液１ｍＬを採取し、ＯＤ６００を測定した。２４ｈ成長させた後、ＯＤ６００が１．４から１．６前後になった時点で、細胞（１．０ｍＬ）をＧｌｕ／ＳＣＭ培地２５ｍＬまたはＲａｆ／ＳＣＭ培地５０ｍＬに移した。一晩成長（３０℃、２５０ｒｐｍ）させた後、各フラスコから試料（１．０ｍＬ）を採取し、ＯＤ６００を測定した。
ＯＤ６００ 
１．Ｎｏ．１、Ｒａｆ／ＳＣＭ培地                          ０．３７７５
２．Ｎｏ．１、Ｇｌｕ／ＳＣＭ培地                          １．５１１９
３．Ｎｏ．２、Ｒａｆ／ＳＣＭ培地                          ０．４７３０
４．Ｎｏ．２、Ｇｌｕ／ＳＣＭ培地                          １．４９２３
【０１７９】
ＯＤデータから明らかなように、ラフィノースよりもグルコースで成長させた後の方が大きな細胞塊が得られた。組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅがフェニルアラニンを追加しなくてもグルコースを直接ＰＨＣＡに変換できるか否かを検討するために、グルコースまたはラフィノースでの成長後、グルコースを添加する前に細胞をガラクトースで誘導する実験を行った。試料を一定間隔で採取し、上述したようにＨＰＬＣ分析用に調製した。データを表６にあげておく。
【０１８０】
【表１２】
2004530402.tif 000015
【０１８１】
表６のデータから明らかなように、グルコースを含有する培地で成長させる方が多くの細胞塊が生成されるが、形成されるＰＨＣＡの量はラフィノースの存在下で成長させた後の方がかなり多かった（ラフィノースでの成長では２４ｈ以内にＰＨＣＡが約２００μＭであったのに対し、グルコースでの成長後は約１４．５μＭ）。ここでは、ガラクトースで誘導可能なプロモーターに対してグルコースがおよぼす阻害作用に注目している
【０１８２】
別の実験では、グルコースまたはラフィノースのいずれかを含有する成長培地にフェニルアラニンを加えることによる影響を調べた。各フラスコから得た試料（１０ｍＬ）を、培地２５ｍＬの入った１２５ｍＬ容のフラスコに移し、ガラクトース（最終濃度２％）で細胞を誘導した。この誘導については、１．０時間、３．０時間、６．０時間および一晩行った。指定の誘導時間経過後、各フラスコにフェニルアラニン（１．０ｍＭ）を加え、ＰＨＣＡの形成を測定した。結果を以下の表７にまとめておく。
【０１８３】
【表１３】
2004530402.tif 000016
【０１８４】
表７に示され、かつ予想通り、どちらの培養にもフェニルアラニンを加えるとフェニルアラニンを追加しない場合の生成量に比べてＰＨＣＡの濃度が高くなった。おおむね、ラフィノースで成長させた細胞の方がグルコースで成長させた細胞よりも多くのＰＨＣＡをフェニルアラニンから生成した。ラフィノースで成長している細胞によってフェニルアラニンから生成されたＰＨＣＡの平均濃度は５００μＭであり、２４時間前後で最高濃度のＰＨＣＡが形成された。ほとんどの場合、ＰＨＣＡの濃度は２４時間の時点または２４時間前後で最高値に達し、実験終了時まで（約５４時間）大きな変化もなく維持された。誘導時間（すなわち、１．０時間、３．０時間、６．０時間および一晩）の違いが生成されるＰＨＣＡの濃度に大きな違いを生んだようには見えなかった。グルコースで成長している培養で形成されるＰＨＣＡの濃度は３００μＭであった。グルコースで成長させた細胞によって形成されたＰＨＣＡの総量はラフィノースで成長させた細胞によって生成された総量よりも少なかったが、ＰＨＣＡの生成パターンは類似していた。
【０１８５】
要するに、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓの野生型ＰＡＬに加えて植物のシトクロムＰ−４５０およびシトクロムＰ−４５０レダクターゼを含有する組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞には、フェニルアラニンを添加しない状態でもグルコースを直接ＰＨＣＡに変換する機能があった（約２５％変換）。フェニルアラニンを加えると、約５０％がＰＨＣＡに変換された。
【０１８６】
実施例８
変異型ＰＡＬ（ＰＡＬ／ＴＡＬ）酵素を同定するための選択系の開発
この実施例は、ＴＡＬ活性が亢進した変異型ＰＡＬ酵素を選択する方法について説明するためのものである。現在、中間工程を介さずにチロシンのＰＨＣＡへの直接変換を効率的に触媒できる改変酵素はない。この反応では酵素がチロシンをＰＨＣＡとアンモニアに変換するが、逆の反応では同じ酵素がＰＨＣＡおよびアンモニアをチロシンに変換する。チロシンをＰＨＣＡに変換できる変異型ＰＡＬ酵素を検出するために、以下のスクリーニングを開発した。
【０１８７】
発現ベクター（ＰＣＡ１２Ｋｍ）の作製：
市販のｐＢＲ３２２ベクターを修飾し、弱い発現ベクターを作製した。簡単に説明すると、ｐＢＲ３２２をＰｓｔ  Ｉで消化し、ｐＢＲ１（配列番号３）５’−ＧＡＧＡＧＡＣＴＣＧＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＴＣＡＧＡＣＣＡＡＧＴＴＴＡＣＴＣＡＴＡＴＡ−３’とｐＢＲ２（配列番号４）５’−ＧＡＧＡＧＡＣＴＣＧＡＧＣＴＧＣＡＧＴＣＴＡＧＡＡＣＴＣＴＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴＡＴＴＧ−３’の２つのプライマーを用いてＰＣＲを２０サイクル実施した。ＰＣＲ反応産物をフェノールクロロホルムで抽出し、ＥｔＯＨ沈殿させ、Ｘｈｏ  Ｉで消化した。次に、Ｘｈｏ  Ｉで消化した産物をゲル単離し、ライゲーションし、テトラサイクリン耐性を選択しながらＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。したがって、このベクターはアンピシリン耐性遺伝子を持たないがβ−ラクタマーゼプロモーターと制限部位Ｘｂａ  Ｉ、Ｐｓｔ  Ｉ、Ｘｈｏ  Ｉ、Ｓｍａ  Ｉ、Ｂｇｌ  ＩＩとを含有するｐＢＲ３２２である。ｐＢＲ３２２のテトラサイクリン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子と入れ替えた。テトラサイクリン耐性遺伝子をＥｃｏＲ  Ｖ（１８５）部位およびＮｒｕ  １（９７２）部位でｐＣＡ１２（図１）から切り離し、ｐｆｕポリメラーゼを用いて末端をポリッシュし（ストラタジーン製ＰＣＲポリッシングキット）、平滑末端化した９ｋｂのカナマイシン耐性遺伝子断片でライゲーションした（ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ、Ｇｅｎｅ  １９：２５９〜２６８（１９８２））。ライゲーションのＸＬ１−Ｂｌｕｅベクターへの形質転換後にＬＢ／ｋｍプレートで最終コンストラクトを選択した（図１）。
【０１８８】
Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓのＰＡＬ遺伝子をＰＣＡ１２Ｋｍにサブクローニング：
酵母（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）のＰＡＬの遺伝子配列は、すでに決定および公表されている（Ａｎｓｏｎら、Ｇｅｎｅ  ５８：１８９〜１９９（１９８７））。公表されている配列に基づいて、ｐＢＲ３２２ベースのベクターに遺伝子をサブクローニングした。次に、ＰＡＬ遺伝子全体をＸｂａＩ−ＰｓｔＩでの消化によってプラスミドから除去し、ＸｂａＩ−ＰｓｔＩで消化したＰＣＡ１２Ｋｍに上記の遺伝子をライゲーションした。このＰＡＬ遺伝子を含有する新規なコンストラクトをＰＣＡ１８Ｋｍとした。
【０１８９】
チロシン栄養要求性Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰＡＬ酵素の発現：
ＰＣＡ１２ＫｍおよびＰＣＡ１８Ｋｍをチロシン栄養要求性Ｅ．ｃｏｌｉ株ＡＴ２４７１に形質転換し、細胞全体のアッセイを用いてＴＡＬ活性およびＰＡＬ活性を測定した。これらの細胞をチロシンまたはフェニルアラニンと共にインキュベーションした後に少量のＰＨＣＡまたはケイ皮酸の形成を検出した（表８）。
【０１９０】
【表１４】
2004530402.tif 000017
【０１９１】
表８から明らかなように、ＰＣＡ１８Ｋｍベクターを含有するチロシン栄養要求性Ｅ．ｃｏｌｉ株ＡＴ２４７１で酵母のＰＡＬ酵素が弱く発現された。
【０１９２】
選択条件の決定（選択系の開発）：
ｐＣＡ１８Ｋｍを含有するチロシン栄養要求性Ｅ．ｃｏｌｉ株ＡＴ２４７１においても元の株と同じチロシン栄養要求特性が認められた。細胞は最小プレートでは成長しなかったが、０．００４ｍＭのチロシンをプレートに添加すると十分に成長した。選択に適した条件を見つけるために、さまざまな濃度のチロシンまたはＰＨＣＡを含有する最小プレートにて細胞の成長を試験した（表９参照）。
【０１９３】
【表１５】
2004530402.tif 000018
【０１９４】
表９に示す結果から、高濃度のＰＨＣＡは細胞にとって有毒であることが分かる。選択実験ではＰＨＣＡ濃度２．０ｍＭを選択した。異なるチロシン濃度での細胞の成長に関する情報が選択には重要である。たとえば、細胞によってＰＨＣＡから得られるチロシンは細胞の成長を支持するには不十分であるため、少量のチロシン（０．０００１〜０．０００２ｍＭ）をプレートに添加することが可能である。これによって、ＴＡＬ活性が若干亢進した酵素を発現している株を同定することができるようになる。換言すれば、選択プレートにおけるＰＨＣＡおよびチロシンの濃度を変えることで、選択のストリンジェンシーを調節することが可能なのである。
【０１９５】
実施例９
ＴＡＬ活性が亢進した変異型ＰＡＬ酵素の操作
Ｅｒｒｏｒ−Ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ：
以下のプライマーを用いてＰＣＡ１８ＫｍコンストラクトからＰＡＬ遺伝子全体を増幅した。
【０１９６】
プライマーＡ（配列番号５）：
５’−ＴＡＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＧ−３’
プライマーＢ（配列番号６）：
５’−ＡＡＣＴＧＣＡＧＣＴＡＡＧＣＧＡＧＣＡＴＣ−３’
【０１９７】
プライマーＡ（フォワードプライマー）はＸｂａ  Ｉ制限酵素部位をＡＴＧコドンの直前に含有し、プライマーＢ（リバースプライマー）はＰｓｔ  Ｉ部位を停止コドンの直後に有していた。ＰＣＲのエラー率を高めるために、プレーンなＴａｑポリメラーゼとさらに多くの反応サイクル（３５サイクル）を用いた。さらに、ＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰの比を変更した。４通りの異なる反応を実施した。それぞれの反応で、ｄＮＴＰのうち１つの濃度を０．１ｍＭとし、他の３つのｄＮＴＰを０．４ｍＭに調節した。反応終了後、４通りの反応で得られるＰＣＲ産物を混合した。ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ産物をＸｂａ  ＩおよびＰｓｔ  Ｉで消化した後、ＸｂａＩ−ＰｓｔＩで消化したＰＣＡ１２Ｋｍに上記の断片をライゲーションした。
【０１９８】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｒｅｄ株を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ突然変異誘発：
ＰＣＡ１８ＫｍをＸＬ１−Ｒｅｄ株に形質転換し、細胞をカナマイシン加ＬＢ培地にて一晩成長させた。変異率を高めるために、新鮮な成長培地を用いて細胞を希釈し、さらに成長させた。２〜４回の細胞成長サイクル後、プラスミドを精製し、選択に使用した。
【０１９９】
選択：
突然変異誘発後、ランダムに変異したＰＡＬ遺伝子を含有する変異型ＰＣＡ１８Ｋｍのプールを電気穿孔法によってチロシン栄養要求性Ｅ．ｃｏｌｉ株に形質転換した。形質転換効率は１．５×１０８ｃｆｕ／μｇ  ＤＮＡであった。次に、５．０時間を上回る時間、細胞を抗生物質と共にＬＢ培地にインキュベートした。最小培地での洗浄後、０．０００２ｍＭのチロシンおよび２．０ｍＭのＰＨＣＡを加えた最小培地を含有するプレートに細胞を画線した。３０℃でのインキュベーションの３．０〜５．０日後、各プレートに１．０〜１０のコロニーが現れた。
【０２００】
選択プレートに現れたコロニーのＰＡＬ／ＴＡＬ活性を、基本方法で説明した細胞全体のアッセイを用いて分析した。変異体のうちＥＰ１８Ｋｍ−６と呼ぶものにおいて野生型細胞よりＴＡＬ活性比が大きくなった。ＥＰ１８Ｋｍ−６変異体の遺伝的分析を実施した。この変異型細胞からプラスミドＤＮＡを精製した後、Ｅ．ｃｏｌｉに再形質転換した。新規な形質転換体においても同じように元の変異体よりもＴＡＬ比の増大が認められたことから、ＴＡＬ活性の亢進に関与する突然変異がすべてこのプラスミドにあったことが分かる。これらの変異体をさらにキャラクタライズするために、以下のような分析を実施した。
【０２０１】
実施例１０
変異型ＰＡＬ酵素のキャラクタリゼーション
変異型遺伝子の配列の分析：
ＥＰ１８Ｋｍ−６の遺伝子全体をＡＢＩ  ３７７自動シーケンサー（カリフォルニア州フォスターシティのアプライドバイオシステムズ）にて配列決定し、ＤＮＡｓｔａｒプログラム（ウィスコンシン州マディソンのＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）を用いてデータを管理した。得られたＰＡＬ変異体を分析した後、野生型遺伝子（配列番号７）と比較したところ、ＣＴＧ（Ｌｅｕ２１５）からＣＴＣ、ＧＡＡ（Ｇｌｕ２６４）からＧＡＧ、ＧＣＴ（Ａｌａ２８６）からＧＣＡ、ＡＴＣ（Ｉｌｅ５４０）からＡＣＣという４つの単塩基置換突然変異（点突然変異）が変異型遺伝子（配列番号９）に含まれていることが分かった。最初の３つの突然変異は第３塩基において起こり、アミノ酸を変化させることのないサイレント突然変異を作り出していた。４番目の変異は第２塩基の変化（ＡＴＣからＡＣＣ）であった。この変異が原因で、酵素の保存領域内におけるイソロイシン−５４０がトレオニンに変化した。異なるソースから得られるさまざまなＰＡＬ酵素において、この重要な位置にイソロイシンまたはロイシンのいずれかが含まれている。
【０２０２】
ＥＰ１８Ｋｍ−６変異型酵素の過発現と精製：
酵素的な動態分析を行うにあたって十分な量の純粋な酵素を得るために、過発現ベクターであるｐＥＴ−２４−ｄで酵素を発現させた。ｐＥＴ−２４−ｄベクターをＥｃｏＲＩで消化し、クレノー酵素（ウィスコンシン州マディソンのプロメガ社）を用いて製造業者の指示に従って消化産物をフィルインした。線状化ベクターをＮｈｅＩで消化し、ＸｂａＩおよびＳｍａＩを用いてＥＰ１８Ｋｍ−６を切断することで変異型ＰＡＬ遺伝子を得た。ＮｈｅＩおよびＸｂａＩは両立可能な部位であるため、ｐＥＴＡＬコンストラクト（図２）を作製すべくライゲーションによって変異型遺伝子をｐＥＴ２４−ｄベクターにサブクローニングした。ｐＥＴ−２４−ｄベクターにはＮ末端Ｔ７  Ｔａｇ配列に加えて任意にＣ末端ＨｉｓＴａｇ配列があるため、Ｎ末端とＣ末端の両方において自然な配列で酵素を発現できるように、これらのＴａｇを使用しなかった。変異型遺伝子をｐＥＴ−２４−ｄベクターにクローニングした後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）にコンストラクトを形質転換した。過発現については、カナマイシンを含有するＬＢ培地でＯＤ６００が１．０になるまで細胞を成長させた後、１．０ｍＭのＩＰＴＧを添加した。４．０時間の誘導後、遠心分離によって細胞を収穫し、基本方法のセクションで説明したようにして粗抽出物を調製した。この粗抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析したところ、発現された酵素が特徴的なタンパク質バンドであることが分かり、発現レベルはタンパク質全体の１０〜１５％であると推定された（図３）。精製した変異型ＰＡＬ酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（レーンＡ）と精製の開始材料として使用した細胞の粗抽出物（レーンＢ）を図３に示す。レーンＣは分子量（上から下に９４、６７、４３、３０、２０および１４ｋＤ）の標準的なマーカーである。ＰＡＬを精製するために、プロテアーゼ阻害剤、ＰＭＳＦ、アミノカプロン酸およびベンズアミジン（各１．０ｍＭ）を含有する１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．６）に細胞ペレットを懸濁させた。音波処理（Ｂｒａｎｓｏｎモデル１８５、７０％粉末設定、氷浴中にて４分間）に続いて遠心分離（３０，０００×ｇ、３０分間）を行って細胞を破壊した。透明な上清をＭｏｎｏ−Ｑ  ＨＰＬＣカラムに通した（流量１．０ｍＬ／分）。このカラムでは、まず最初に５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を使用し、続いて４００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を溶出用緩衝液として用いた。リン酸カリウム約９０ｍＭの濃度で酵素を溶出させた。活性画分をプールし、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ１００（マサチューセッツ州ベッドフォードのミリポア社）を用いて濃縮した。酵素の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で判定したところ、＞９８％であった（図３）。
【０２０３】
変異型ＰＡＬ酵素の生化学的キャラクタリゼーション：
酵母の野生型ＰＡＬ酵素および精製変異型ＰＡＬ酵素ならびにチロシンまたはフェニルアラニンを基質として用いての詳細な酵素動態分析を実施した。ＰＡＬ活性およびＴＡＬ活性を基本方法で説明したようにして分光光度的に測定し、そのラインウィーバー・バークプロットからＫＭおよびＶｍａｘを求めた。ｋｃａｔについては、活性四量体に４つの活性部位があると想定してＶｍａｘから算出した。このようにして求めた酵素のＫＭおよびｋｃａｔを表１０にあげておく。
【０２０４】
【表１６】
2004530402.tif 000019
【０２０５】
野生型酵素と変異型酵素の両方についてｋｃａｔ／ＫＭで定義される触媒効率を求めた。野生型酵素におけるＴＡＬ触媒効率ｖｓ．ＰＡＬの比は０．５であったのに対し、変異型酵素の場合はこの比が１．７まで増加した（表１１参照）。これらの結果から、フェニルアラニンを使いたがる野生型ＰＡＬ酵素とは異なり、変異型酵素はチロシンを基質として使いたがるため、酵母のＰＡＬ酵素の基質特異性が突然変異誘発および選択の後に変化したのは明らかであった。
【０２０６】
【表１７】
2004530402.tif 000020
【０２０７】
実施例１１
ＴＡＬ経路によるＥ．ｃｏｌｉにおけるグルコースからのＰＨＣＡの生物生産
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて変異型ＰＡＬを用いてグルコースからＰＨＣＡを生成：
変異型ＰＡＬ遺伝子を持ち、ＴＡＬ活性が亢進したプラスミド（ＥＰ１８Ｋｍ−６）を野生型Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０に形質転換した。次に、グルコースを唯一の炭素源として用いて細胞を最小培地で成長させた。一晩成長させた後、成長培地２０μＬを濾過し、ＰＨＣＡが検出されるか否かをＨＰＬＣで分析した。野生型（対照）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞ではＰＨＣＡの蓄積は認められなかった。しかしながら、変異型ＰＡＬ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで発現させると、グルコースを唯一の炭素源として含有する最小培地で細胞を一晩成長させる間に０．１３８ｍＭのＰＨＣＡが検出された（表１２参照）。
【０２０８】
【表１８】
2004530402.tif 000021
【０２０９】
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞にはケイ皮酸ヒドロキシラーゼ活性が欠如：
ＰＣＡ１２Ｋｍベクターを含有するＥ．ｃｏｌｉ細胞を、１．０ｍＭのケイ皮酸と共に一晩インキュベーションしたところ、ＰＨＣＡは生成されなかったことから、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞にはケイ皮酸をＰＨＣＡに変換する機能がないことが裏付けられた。
【０２１０】
実施例１２
修飾ＰＡＬの酵母発現ベクターへの取り込み
以下の酵母株およびｐＧＰＤ３１６発現ベクターを利用した。ＺＸＹ３４−１Ａ株は、Ｍａｔａ、ａｄｅ２−１、ｃａｎ１−１００、ｈｉｓ３−１１、−１５、ｌｅｕ２−３、−１１２、ｔｒｕｐ１−１、ｕｒａ３−１、ａｒｏ  ３：：ΔＵＲＡ３、ａｒｏ４：：ΔＨＩＳ３を遺伝子型として含有しており、これをａｒｏ３、ａｒｏ４ダブルノックアウトとした。ＺＸＹ０３０４Ａ株は、Ｍａｔａ、ａｄｅ２−１、ｃａｎ１−１００、ｈｉｓ３−１１、−１５、ｌｅｕ２−３、−１１２、ｔｒｕｐ１−１、ｕｒａ３−１、ａｒｏ  ３：：Δｕｒａ３、ａｒｏ４：：ΔＨＩＳ３を遺伝子型として含有しており、ａｒｏ３、ａｒｏ４ダブルノックアウトであった。
【０２１１】
従来技術において周知の標準的なサブクローニング法を使用して、修飾ＰＡＬを上記のベクターに取り込んだ。ＸｂａＩおよびＳｍａＩ制限酵素で修飾ＰＡＬ  ｃＤＮＡ（２．０ｋｂ）を切断し、得られた切断片を、ＳｐｅＩおよびＳｍａＩ  制限酵素で切断した発現ベクターｐＧＰＤ３１６にライゲーションした。ｐＧＰＤ３１６にｐＥｐ１８からのインサートを加えた新規なコンストラクトをｐＧＳＷ１８とした（図４）。制限酵素による消化に続いてアガロースゲル電気泳動を行い、この新規なコンストラクトを確認した。
【０２１２】
実施例１３
芳香族アミノ酸の非存在下においてグルコースをＰＨＣＡに変換するＡＲＯ４ＧＳＷの機能
Ｍａｔａ、ａｄｅ２−１、ｃａｎ１−１００、ｈｉｓ３−１１、−１５、ｌｅｕ２−３、−１１２、ｔｒｕｐ１−１、ｕｒａ３−１、ａｒｏ  ３：：Δｕｒａ３、ａｒｏ４：：ΔＨＩＳ３が遺伝子型として含まれ、ａｒｏ３、ａｒｏ４ダブルノックアウトと呼ばれるＺＸＹ０３０４Ａ株を用いた。標準的な酢酸リチウム法を用いて、修飾ＰＡＬを含有するｐＧＳＷ１８でＺＸＹ０３０４Ａ株を形質転換した。ＳＣＭ培地（ロイシンおよびウラシルなし）を用いて、形質転換体であるＡＲＯ４ＧＳＷを選択した。ＡＲＯ４ＧＳＷ（グリセロールストック１００μＬ）を用いて２％グルコースを含有する通常のＳＣＭ培地に播種した。３０℃にて５．０時間生物体を成長させ、細胞を遠心分離し、２％グルコースを含有するが芳香族アミノ酸を含まないＳＣＭ培地に再懸濁させ、一晩成長させた。次に、細胞を遠心分離し、最終細胞密度が１．０（ＯＤ６００ｎｍ）になるように、ａ）フェニルアラニンおよびチロシン約４００μｍを含有する通常のＳＣＭ培地、ｂ）芳香族アミノ酸を含まないＳＣＭ培地に再懸濁させた。細胞を振盪機（２５０ｒｐｍ、０℃）に放置し、２．０時間、４．０時間、６．０時間および１６時間の時点でＨＰＬＣ分析用の試料（１．０ｍＬ）を採取した。結果を表１３に示す。
【０２１３】
【表１９】
2004530402.tif 000022
【０２１４】
表１３から明らかなように、組換え酵母株ＡＲＯ４ＧＳＷは、成長培地に芳香族アミノ酸を加えなくてもグルコースからＰＨＣＡを生成した。また、このデータから、芳香族アミノ酸を成長培地に加えると、芳香族アミノ酸のない状態での成長時に比して生成されるＰＨＣＡの濃度がほぼ２．５倍になることが分かる。これらの結果から、変異型ＰＡＬを含有する組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが、シトクロムＰ−４５０およびシトクロムＰ−４５０レダクターゼのない状態でグルコースをＰＨＣＡに変換できることが裏付けられた。
【０２１５】
実施例１４
芳香族アミノ酸飢餓時に修飾ＰＡＬを含有するＡＲＯ４ＧＳＷによるＰＨＣＡの生成に対してフェニルアラニンおよびチロシンがおよぼす影響
この実施例では、芳香族アミノ酸飢餓時に修飾ＰＡＬを含有する組換え酵母株ＡＲＯ４ＧＳＷによるＰＨＣＡの生成に対してフェニルアラニンおよびチロシンがおよぼす影響について研究調査する。
【０２１６】
ＡＲＯ４ＧＳＷのグリセロールストックの試料（１００μＬ）を、２％グルコースを含有する通常のＳＣＭ培地に播種した。細胞を３０℃で５．０時間振盪機に放置した後、収穫した。２％グルコースを含有するが芳香族アミノ酸は含まないＳＣＭ培地にペレットを再懸濁させ、３０℃にて振盪機で一晩成長させた。次に、培養を遠心分離し、最終細胞密度が１．０ＯＤ６００ｎｍになるようにして、ａ）通常のＳＣＭ培地、ｂ）芳香族アミノ酸を含有せず、２％グルコースおよび１．０ｍＭのフェニルアラニンを含有するＳＣＭ培地、ｃ）芳香族アミノ酸を含有せず、２％グルコースおよび１．０ｍＭのチロシンを含有するＳＣＭ培地に再懸濁させた。これらの培養を振盪機（２５０ｒｐｍ、３０℃）に戻し、２．０時間、４．０時間、６．０時間および１６時間の時点でＨＰＬＣ分析用に試料（１．０ｍＬ）を採取した。結果を表１４に示す。
【０２１７】
【表２０】
2004530402.tif 000023
【０２１８】
表１４のデータから明らかなように、細胞で芳香族アミノ酸を欠乏させると、有意なＰＨＣＡは生成されなかった。フェニルアラニンを添加しても生成されるＰＨＣＡの濃度に対する有意な影響はなかった。しかしながら、チロシンを添加すると、ＰＨＣＡ濃度が有意に増大した。したがって、これらの結果から、本発明において開発された修飾ＰＡＬ遺伝子を含有する新規な組換え株がＰＨＣＡ生成用の基質としてチロシンを好むことが確認できる。
【０２１９】
実施例１５
トウモロコシにおける変異型ＰＡＬ／ＴＡＬの形質転換および発現とＰＨＣＡの生成
適当なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことで、変異型ＰＡＬ／ＴＡＬ遺伝子（配列番号８）をセンス方向に含むキメラ遺伝子を作製することができる。後述するように、消化したベクターｐＭＬ１０３に挿入する際には、クローニング部位（ＮｃｏＩまたはＳｍａＩ）をオリゴヌクレオチドに取り込むことでＤＮＡ断片を適切な方向にすることができる。続いて、各オリゴヌクレオチド０．４ｍＭと標的ＤＮＡ０．３ｐＭとを、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのｄＧＴＰ、２００ｍＭのｄＡＴＰ、２００ｍＭのｄＴＴＰ、２００ｍＭのｄＣＴＰおよび０．０２５単位のＤＮＡポリメラーゼに入れたものからなる標準的なＰＣＲミックスを１００μＬ容量で増幅する。パーキンエルマー製Ｃｅｔｕｓ  ＴｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒＴＭにて、９５℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間のサイクルで反応を３０回実施し、最後のサイクルの後に７２℃で７分間伸長させる。続いて、増幅後のＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩおよびＳｍａＩで消化し、４０ｍＭのＴｒｉｓ−アセテート（ｐＨ８．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ中にて、０．７％低融点アガロースゲルで分画する適切なバンドをゲルから切り出し、６８℃で溶融し、プラスミドｐＭＬ１０３の４．９ｋｂのＮｃｏＩ−ＳｍａＩ断片と組み合わせることができる。プラスミドｐＭＬ１０３については、ブタペスト条約の定めに従ってＡＴＣＣに寄託済みであり、アクセッション番号はＡＴＣＣ  ９７３６６である。ｐＭＬ０３から得られるＤＮＡセグメントは、トウモロコシの２７ｋＤのゼイン遺伝子の１．０５ｋｂのＳａｌＩ−ＮｃｏＩプロモーター断片と、トウモロコシの１０ｋＤのゼイン遺伝子の３’末端から得られる０．９６ｋｂのＳｍａＩ−Ｓａｌ断片とを、ベクターｐＧｅｍ９Ｚｆ（＋）（７１１３  Ｂｅｎｈａｒｔ  Ｄｒ．，Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣのプロメガ社）に含む。ベクターおよび挿入ＤＮＡを、基本的に文献に記載されている（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ようにして１５℃で一晩ライゲーションすることが可能である。ライゲーションしたＤＮＡを用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ  Ｃｏｌｉ  ＸＬ−１；ストラタジーン）を形質転換してもよい。プラスミドＤＮＡの制限酵素での消化ならびにジデオキシ鎖終結法（ＤＮＡシークエンシングキット、Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いる制約付きの（ｌｉｍｉｔｅｄ）ヌクレオチド配列分析によって、バクテリアの形質転換体をスクリーニングすることも可能である。このようにして得られるプラスミドコンストラクトには、トウモロコシの２７ｋＤのゼインプロモーターを５’から３’の方向にコードするキメラ遺伝子、変異型ＰＡＬ／ＴＡＬ酵素をコードするＤＮＡ断片、１０ｋＤのゼイン３’領域が含まれる。
【０２２０】
このようにして作製したキメラ遺伝子を、以下の手順でトウモロコシ細胞に導入することが可能である。近交系のトウモロコシ系統Ｈ９９とＬＨ１３２との交雑種（Ｉｎｄｉａｎａ  Ａｇｒｉｃ．  Ｅｘｐ．  Ｓｔａｔｉｏｎ、ＩＮ、ＵＳＡ）由来の発達中の穎花から未成熟のトウモロコシ胚を得ることができる。この胚を、受粉の１０から１１日後に長さ１．０から１．５ｍｍになったところで単離する。さらに、軸側を下に向けてアガロースを添加したＮ６培地（Ｃｈｕら、Ｓｃｉ．Ｓｉｎ．Ｐｅｋｉｎｇ  １８：６５９〜６６８（１９７５））に接触した状態で胚をのせる。この胚を２７℃で暗所に保持する。体細胞性の前胚および胚様体が懸垂構造の未分化の細胞の塊からなる脆弱な胚形成カルスが未成熟胚の胚盤から増殖する。一次外植体（ｐｒｉｍａｒｙ  ｅｘｐｌａｎｔ）から単離した胚形成カルスをＮ６培地で培養し、この培地で２から３週間ごとに継代培養してもよい。プラスミドｐ３５Ｓ／Ａｃ（ドイツのフランクフルト市にあるＤｒ．  Ｐｅｔｅｒ  Ｅｃｋｅｓ、Ｈｏｅｃｈｓｔ  Ａｇから入手）を形質転換実験に使用し、選択可能なマーカーを得るようにすることもできる。このプラスミドは、フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）をコードするＰａｔ遺伝子（欧州特許出願公開第０  ２４２  ２３６号参照）を含有している。酵素ＰＡＴは、フォスフィノスリシンなどの除草剤のグルタミン合成酵素阻害因子に耐性を与えるものである。ｐ３５Ｓ／Ａｃにおけるｐａｔ遺伝子は、カリフラワーモザイクウイルス由来の３５Ｓ  プロモーター（Ｏｄｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０〜８１２（１９８５））およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡから得られるノパリン合成酵素遺伝子の３Ｍ領域の制御下にある。微粒子銃法（Ｋｌｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０〜７３（１９８７））を用いて遺伝子をカルス培養細胞に移行するようにしてもよい。この方法によれば、以下の手法で金粒子（直径１μｍ）にＤＮＡをコーティングする。金粒子の懸濁液５０μＬにプラスミドＤＮＡを１０μｇ加える（６０ｍｇ／ｍＬ）。塩化カルシウム（２．５Ｍの溶液で５０μＬ）ならびに無スペルミジンベース（１．０Ｍの溶液で２０μＬ）を粒子に加える。これらの溶液を添加している間は懸濁液を強く攪拌する。１０分後、チューブを軽く遠心（１５，０００ｒｐｍで５秒）し、上清を除去する。絶対エタノール２００μＬに粒子を再懸濁させ、再度遠心分離し、上清を除去する。再びエタノール洗浄を行い、エタノールの最終容量３０μＬで粒子を再懸濁させる。このＤＮＡコート金粒子のアリコート（５μＬ）はフライングディスク（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｓ、８６１  Ｒｉｄｇｅｖｉｅｗ  Ｄｒ，Ｍｅｄｉｎａ，ＯＨ）の中央に配置することが可能なものである。次に、ヘリウム圧１０００ｐｓｉ、ギャップ距離０．５ｃｍ、飛行距離１．０ｃｍとして、ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｓ、８６１  Ｒｉｄｇｅｖｉｅｗ  Ｄｒ．，Ｍｅｄｉｎａ，ＯＨ）でトウモロコシ組織中で粒子を加速する。
【０２２１】
ボンバードメントの目的で、アガロース添加Ｎ６培地においた濾紙に胚形成組織をのせる。組織を薄い芝のように配置し、直径約５ｃｍの円形の部分をカバーする。組織の入ったペトリ皿を、ストッピングスクリーンからの距離を約８ｃｍとしてＰＤＳ−１０００／Ｈｅのチャンバに入れることができる。さらに、２８インチＨｇの真空になるまでチャンバ内を脱気する。ショックチューブ内のＨｅ圧が１０００ｐｓｉに達した時点で破裂する破裂膜（ｒｕｐｔｕｒｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）を用いてマクロキャリアをヘリウムショックウェーブで加速する。
【０２２２】
ボンバードメントから７日経過すれば、グルホシネート（２ｍｇ／リットル）を含有するがカゼインまたはプロリンは含まないＮ６培地に組織を移すことができる。この培地でも組織はゆっくりと成長を続ける。さらに２週間経過すると、グルホシネートを含有する新鮮なＮ６培地に組織を移すことができる。６週間後、グルホシネート加培地を含むいくつかのプレートで活発に成長しているカルスの直径約１ｃｍの領域を同定することが可能である。これらのカルスは、選択培地で継代培養してもさらに成長を続けることがある。トランスジェニックカルスから植物を再生させるには、まず２，４−Ｄを０．２ｍｇ／リットル加えたＮ６培地に組織のクラスターを移すようにする。２週間後、この組織を再生培地に移すことができる（Ｆｒｏｍｍら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：８３３〜８３９（１９９０））。
【０２２３】
ＰＨＣＡの生成レベルは植物組織の乾燥重量で約０．１％から約１０％の範囲にあると思われる。
【０２２４】
実施例１６
Ｌ−チロシンを単一の炭素源として用いて改良されたＴＡＬ酵素を選択
突然変異誘発したＴＡＬ遺伝子（配列番号８）を、基本的に本願明細書に援用するＫｏｋら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：１６７５〜１６８０（１９９９））に記載されているようにして、自然な形質転換によってＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒの染色体に導入する。構成的プロモーターの制御下かつ抗生物質耐性マーカー遺伝子の存在下にて、ＴＡＬ遺伝子をベクターの宿主に挿入する。寒天を１５ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４を６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を３ｇ、ＮａＣｌを０．５ｇ、ＮＨ４Ｃｌを１ｇ、Ｌ−チロシンを０．５ｇ、１ＭのＭｇＳＯ４を２ｍｌ、１ＭのＣａＣｌ２を０．１ｍｌを１Ｌの蒸留水（ｐＨ７．４）に入れて含有するＭ９塩培地（実施例４）で形質転換体を培養する。形質転換体を抗生物質耐性に基づいて単離する。Ｌ−チロシンのＰＨＣＡへの変換を改善する進化したＴＡＬ遺伝子を含む形質転換体では、Ｌ−チロシンを含む最小培地での成長率が高まり、一層大きなコロニーが形成される。このような大きなコロニーを回収し、所望のレベルでのＴＡＬ活性が達成されるまでさらに発達させる。
【０２２５】
実施例１７
変異型ＰＡＬ（ＥＰ１８Ｋｍ−６）遺伝子のｐＥＴ１７ｂベクターへのクローニング
Ｎ末端およびＣ末端切断変異体をいずれもベクターｐＥＴ１７ｂで作製した。正の対照として、変異型ＰＡＬ（ＥＰ１８Ｋｍ−６）遺伝子をまずベクターｐＥＴ１７ｂにクローニングした。このコンストラクトをｐＥＴ１７ｂ−Ｋｍ６と命名した。このコンストラクトについては、局所的な突然変異誘発実験（実施例２１および２２参照）における正の対照としても使用する。
【０２２６】
ＮｈｅＩ／フィルインｐＥＴ１７ｂベクターおよびＸｂａＩ／ＳｍａＩで消化した変異型ＰＡＬ遺伝子の調製：
４μＬの１０×プロメガ制限酵素反応緩衝液Ｅ（ウィスコンシン州マディソンのプロメガ社）、２μＬのＢａｍＨＩ、３４μＬの蒸留脱イオン水中にて、ｐＥＴ１７ｂプラスミドＤＮＡ（５００ｎｇ／μＬ）１０μＬを３７℃で１時間消化した。消化後、試料を１％アガロースゲルに仕込み、線状化ベクターをキアゲン社のゲル抽出キット（カリフォルニア州バレンシアのキアゲン社）を用いて製造業者の指示に従ってゲル精製した。ＥＢ緩衝液５０μＬにＤＮＡを溶出した。プロメガ社のクレノー酵素１μＬ、２ｍＭのｄＮＴＰを１μＬ、５×クレノー緩衝液１２μＬを用いて線状化ベクターをフィルインした。３７℃で２０分間のインキュベーション後、エタノールでＤＮＡを沈殿させた後、ＥＢ緩衝液２０μＬに懸濁させた。１０×プロメガ制限酵素反応緩衝液Ｂを３μＬ、ＮｈｅＩを１μＬ、蒸留脱イオン水を６μＬ用いて、フィルインベクターを消化した。３７℃で３０分間のインキュベーション後、６５℃で２０分間反応混合物を加熱し、酵素を失活させた。エタノールで再度ＤＮＡを沈殿させ、ＥＢ緩衝液５０μＬに再懸濁させた。
【０２２７】
ＸｂａＩ／ＳｍａＩで消化した変異型ＰＡＬ遺伝子を得るために、５μＬの１０×マルチバッファ、２μＬのＸｂａＩ、２μＬのＳｍａＩ、２１μＬの蒸留脱イオン水中にて、ＥＰ１８Ｋｍ−６プラスミドＤＮＡ（２００ｎｇ／μＬ）２０μＬを消化した。消化混合物を２５℃で１時間インキュベートし、続いて３７℃でさらに１時間インキュベートした。消化後、反応混合物を１％アガロースゲルに仕込み、プロメガ社のＰＣＲクリンナップキットを用いて変異型ＰＡＬ遺伝子（２．１５ｋｂ）を精製し、ＥＢ緩衝液７０μＬにＤＮＡ試料を再懸濁させた。
【０２２８】
変異型ＰＡＬ遺伝子のｐＥＴ１７ｂへのクローニング：
ＮｈｅＩおよびＸｂａＩは両立可能な部位であるため、ＸｂａＩ／ＳｍａＩで消化した変異型ＰＡＬ遺伝子を６μＬ、ＮｈｅＩ／フィルインｐＥＴ１７ｂを２μＬ、１０×ライゲーション緩衝液を１μＬ、Ｔ４リガーゼ（３Ｕ／μＬ）を１μＬ含有するライゲーション混合物にて、変異型ＰＡＬ遺伝子をｐＥＴ１７ｂベクターにライゲーションした。ライゲーション混合物を１５℃で３時間インキュベートした後、コンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（ウィスコンシン州マディソンのノバジェン社）に形質転換した。簡単に説明すると、コンピテント細胞を氷上にて約２０分で融解した。続いて、細胞２０μＬにライゲーション混合物３．３μＬを加え、氷上にて２０分間放置した。細胞に４５秒間４２℃で熱ショック処理を施し、氷上に戻した。ＳＯＣ培地０．５ｍＬを加えた後、細胞を振盪機にて３７℃で１時間インキュベートした。これらの細胞をアンピシリンの存在下にてＬＢプレートに蒔き、３７℃で一晩インキュベートした。プラスミド調製用にいくつかのコロニーを採取した。ＡＢＩ３７７自動シーケンサー（カリフォルニア州フォスターシティのアプライドバイオシステムズ）にてインサート全体の配列を決定し、ＤＮＡｓｔａｒプログラム（ウィスコンシン州マディソンのＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）を用いてデータを管理した。配列決定の結果から、サブクローニング時に突然変異は導入されていないことが分かった。
【０２２９】
細胞全体でのＴＡＬ／ＰＡＬ活性アッセイ：
以下のアッセイを実施し、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞において完全に活性の変異型ＰＡＬ酵素が生成されることを確認した。ＬＢ培地でＥ．ｃｏｌｉ細胞を一晩成長させた。細胞培養１ｍＬをペレット化し、０．５ｍＭのチロシン（ＴＡＬ活性測定用）またはフェニルアラニン（ＰＡＬ活性測定用）を含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍＬに再懸濁させた。反応混合物を振盪機にて３７℃で１時間インキュベートした。孔の大きさが０．２μｍのフィルタ（マサチューセッツ州ベッドフォードのミリポア社）を用いて反応混合物を濾過し、ＨＰＬＣ（カリフォルニア州パロアルトのヒューレットパッカード社）に注入した。得られたＰＨＣＡまたはケイ皮酸塩の濃度を測定することで、ＴＡＬ活性またはＰＡＬ活性を求めた。以上の結果から、変異型ＰＡＬ遺伝子がＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞において完全に活性であることが分かった。
【０２３０】
実施例１８
切断変異体を作製し、変異型ＰＡＬ（ＥＰ１８Ｋｍ−６）遺伝子におけるＴＡＬ活性に対するＮ末端の役割を調査
この実施例は、ＴＡＬ活性に対するＮ末端の役割を研究調査するために一連のＮ末端切断変異型ＰＡＬ酵素を生成する目的で使用する方法について説明するためのものである。
【０２３１】
ＰＣＲによる切断変異型ＰＡＬ遺伝子断片の作製：
以下のフォワードプライマーを用いてＰＣＲによって切断変異型ＰＡＬ遺伝子断片を作製した。
１８ＮＴ−１５（配列番号１５）：５’−ＧＧＣＡＣＴＧＣＴＡＧＣＧＡＣＴＣＧＡＴＣＴＣＧＣＡＣ−３’
１８ＮＴ−３０（配列番号１６）：５’−ＧＧＣＡＣＴＧＣＴＡＧＣＴＣＧＴＴＣＧＣＡＡＡＣＧＧＣ−３’
１８ＮＴ−４５（配列番号１７）：５’−ＧＧＣＡＣＴＧＣＴＡＧＣＧＴＣＧＣＡＴＣＣＧＣＡＡＡＧ−３’
１８ＮＴ−６０（配列番号１８）：５’−ＧＧＣＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＡＧＧＣＴＧＴＣＡＡＴＧＧＣ−３’
１８ＮＴ−９０（配列番号１９）：５’−ＧＧＣＡＣＴＧＣＴＡＧＣＧＣＡＧＴＣＧＣＡＧＧＣＴＣＧ−３’
１８ＮＴ−１２０（配列番号２０）：５’−ＧＧＣＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＡＧＧＴＣＡＣＧＣＡＧＧＴＣ−３’
１８ＮＴ−１５０（配列番号２１）：５’−ＧＧＣＡＣＴＧＣＴＡＧＣＡＴＧＣＴＣＧＣＣＧＣＧＣＣＧＡＣＣ−３’
１８ＮＴ−３９０（配列番号２２）：５’−ＧＧＣＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＡＧＡＡＧＧＣＴＣＴＣＣＴＣＧＡＧ−３’
１８ＮＴの後ろにある数字は、プライマーによって切断された塩基対の数を示す。たとえば、１８ＮＴ−１５は、最初の１５塩基対（最初の５アミノ酸）をＮ末端で切断するのに使用し、１８ＮＴ−３０は最初の３０塩基対（最初の１０アミノ酸）を切断するのに使用したといった具合である。これらのプライマーはいずれもクローニング用のＮｈｅＩ（ＧＣＴＡＧＣ）制限酵素部位を含有する。
【０２３２】
すべてのＮ末端切断実験において、終結コドンの直後にＥｃｏＲＩ制限酵素部位を含有する以下のリバースプライマーをＰＣＲに使用した。
ＥＰ９（配列番号２３）：５’−ＧＣＡＧＡＡＴＴＣＧＧＴＡＣＣＣＴＡＡＧＣＧＡＧＣＡＴＣＴＴＧＡＧ−３’
【０２３３】
２ｍＭのｄＮＴＰを５μＬと、１ｐｍｏｌ／μＬのフォワードプライマー３μＬと、１ｐｍｏｌ／μＬのリバースプライマー３μＬと、テンプレートとしての３０ｎｇ／μＬのＥＰ１８Ｋｍ−６プラスミドＤＮＡを１μＬと、ＨｏｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑポリメラーゼ（プロメガ）０．５μＬと、蒸留脱イオン水３３μＬとを含有するＰＣＲ反応物５０μＬを、それぞれの切断実験で用意した。９５℃のホットスタートで１０分、９４℃の融点で３０秒、５５℃のアニーリング温度で３０秒、７２℃の伸長温度で２分のサイクルを２５回行うＰＣＲを実施した。
【０２３４】
ｐＥＴ１７ｂベクターへのＰＣＲ断片のクローニング：
ＰＣＲ後、反応混合物を１％アガロースゲルに仕込み、キアゲン社のゲル抽出キットを用いて製造業者の指示に従ってＰＣＲ断片をゲル精製した。１０×マルチバッファ（６μＬ）、ＮｈｅＩ（２μＬ）、ＥｃｏＲＩ（２μＬ）およびＰＣＲ産物（５０μＬ）中にてＰＣＲ断片を消化した。３７℃で４時間のインキュベーション後、反応混合物を６５℃で２０分間加熱し、酵素を失活させた。プロメガ社のＰＣＲクリンナップキットを用いて製造業者の指示に従って上記のＤＮＡ断片をさらに精製した。線状化ベクターを作製するために、１０μＬの１０×マルチバッファ、３μＬのＮｈｅＩ、３μＬのＥｃｏＲＩおよび２４μＬの蒸留脱イオン水中にて、ｐＥＴ１７ｂプラスミドＤＮＡ６０μＬを３７℃で一晩消化した。熱による不活化後、試料を１％アガロースゲルに仕込み、プロメガ社のＤＮＡクリンナップキットを用いて線状化ベクターをゲル精製した。
【０２３５】
次に、ＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩで消化したＰＣＲ断片（２０ｎｇ／μＬ）６μＬ、線状化ｐＥＴ１７ｂ（２０ｎｇ／μＬ）２μＬ、１０×ライゲーション緩衝液１μＬおよびＴ４リガーゼ（３Ｕ／μＬ）１μＬを含有するライゲーション反応物中にて、切断変異型ＰＡＬ遺伝子断片を線状化ｐＥＴ１７ｂベクターにライゲーションした。ライゲーション混合物を１５℃で一晩インキュベートした後、実施例１７で説明したようにしてＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換した。それぞれの実験のためにいくつかのコロニーを採取し、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列分析によって切断コンストラクトを確認した。
【０２３６】
切断変異体のキャラクタリゼーション：
実施例１７で説明した細胞全体のアッセイを用いてＴＡＬ活性を測定することで、切断変異体を分析した。表１５に結果をまとめておく。
【０２３７】
【表２１】
2004530402.tif 000024
【０２３８】
これらの結果から、３０〜３５を超えるアミノ酸が切断されると酵素活性が低下しはじめると思われた。したがって、変異型ＰＡＬ酵素におけるＴＡＬ活性にはアミノ酸番号３０から開始するＮ末端が重要だということになる。
【０２３９】
実施例１９
切断変異体を作製し、変異型ＰＡＬ（ＥＰ１８Ｋｍ−６）遺伝子におけるＴＡＬ活性に対するＣ末端の役割を調査
この実施例は、ＴＡＬ活性に対するＣ末端の役割を研究調査するためにＣ末端切断変異型ＰＡＬ酵素を生成する目的で使用する方法について説明するためのものである。変異型タンパク質から１８のアミノ酸を除去した。
【０２４０】
Ｃ末端切断変異型ＰＡＬ遺伝子断片の作製：
Ｂｇｌ  ＩＩ制限酵素部位は変異型ＰＡＬの独特な切断部位である。この部位は塩基対番号２０９０で切断され、最後の１８のＣ末端アミノ酸が切断される。この部位を使って切断遺伝子断片を作製するために、４μＬの１０×マルチバッファ、１μＬのＸｂａＩ、１μＬのＥｃｏＲＩおよび１４μＬの蒸留脱イオン水中にて、ＥＰ１８Ｋｍ−６プラスミドＤＮＡ（２００ｎｇ／μＬ）２０μＬを３７℃で１時間消化した。消化後、反応混合物を１％アガロースゲルに仕込み、プロメガ社のＰＣＲクリンナップキットを用いて切断遺伝子断片（２．１ｋｂ）を精製した。ＥＢ緩衝液７０μＬにＤＮＡ試料を再懸濁させた。
【０２４１】
切断変異型ＰＡＬのｐＥＴ１７ｂへのクローニング：
まず、線状化ｐＥＴ１７ｂベクターを作製した。４μＬの１０×マルチバッファ、１μＬのＮｈｅＩ、１μＬのＢａｍＨＩおよび１０μＬのプラスミドＤＮＡ（６００ｎｇ／μＬ）を用いてベクターを消化した。３７℃で１時間のインキュベーション後、試料を１％アガロースゲルに仕込み、プロメガ社のＤＮＡクリンナップキットを用いて線状化ベクターをゲル精製した。最後に、線状化ｐＥＴ１７ｂベクターをＥＢ緩衝液７０μＬに懸濁させた。
【０２４２】
ＸｂａＩ／ＢｇｌＩＩで消化した切断遺伝子断片を８μＬ、線状化ｐＥＴ１７ｂを０．５μＬ、１０×ライゲーション緩衝液を１μＬ、Ｔ４リガーゼ（３Ｕ／μＬ）を１μＬ含有するライゲーション混合物中にて、切断変異型ＰＡＬ遺伝子断片を線状化ｐＥＴ１７ｂベクターにライゲーションした。ライゲーション混合物を１５℃で一晩インキュベートした後、実施例１７で説明したようにしてＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換した。それぞれの実験のためにいくつかのコロニーを採取し、ＡＢＩ３７７自動シーケンサーを用いるＤＮＡ配列分析によって切断コンストラクトを確認した。
【０２４３】
Ｃ末端切断変異体のＴＡＬ活性を測定：
実施例１７で説明した細胞全体のアッセイを用いてＴＡＬ活性およびＰＡＬ活性を測定することで、Ｃ末端切断変異体を分析し、ｐＥＴ１７ｂ−Ｋｍ−６を正の対照として用いた。結果を表１６にまとめておく。
【０２４４】
【表２２】
2004530402.tif 000025
【０２４５】
これらの結果から、Ｃ末端の最後の１８のアミノ酸が切断されることで、変異型ＰＡＬ酵素のＴＡＬ活性が完全に失活していることが明らかになったことから、この領域が変異型ＰＡＬにおける酵素活性にとって重要なものであることが分かる。
【０２４６】
実施例２０
ＴＡＬ／ＰＡＬ比の異なる変異型ＰＡＬ酵素を同定するための高スループットのスクリーニングアッセイの開発
この実施例は、ＴＡＬ／ＰＡＬ活性の異なる変異型ＰＡＬ酵素をスクリーニングするための新規な方法について説明するためのものである。この方法では、細胞全体を用いて高スループットでＴＡＬ／ＰＡＬ比を直接に測定することができる。この方法をＴＡＬまたはＰＡＬ活性が亢進した変異体のスクリーニングに用いることが可能である。
【０２４７】
アッセイを実施するにあたり、アガロースプレートからＥ．ｃｏｌｉコロニーを採取し、９６深穴のプレート（カリフォルニア州ＦｕｌｌｅｒｔｏｎのＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）で成長させた。深穴プレートの各ウェルは最大で培養２ｍＬを保持することができるが、成長培養０．３ｍＬのみを用いて振盪機での良好な混合状態が得られるようにした。各プレートを滅菌アルミニウム箔で覆い、３００ＲＰＭの振盪機で３６℃にて５〜１６時間成長させた。成長後、細胞培養２５μＬをミリポア社のＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ９６穴プレート（マサチューセッツ州ベッドフォードのミリポア社）に移した。ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎプレートの底には孔のサイズが０．２２μｍのＤｕｒａｐｏｒｅ膜が設けられている。これによって、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞が膜を通過できないようにすると同時に、成長培地を真空除去することが可能なようになっている。続いてＢｉｏｍｅｋ２０００  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（カリフォルニア州ＦｕｌｌｅｒｔｏｎのＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を用いて５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で細胞を洗浄した。ＴＡＬ活性を測定するために、洗浄緩衝液中０．５ｍＭのチロシン１００μＬを各ウェルに加えた。振盪機にて室温で５〜１２時間にわたるプレートのインキュベーション後、反応溶液を細胞から分離し、Ｂｉｏｍｅｋ２０００を用いて真空を形成してＣｏｓｔｅｒ９６穴ＵＶプレート（ニューヨーク州コーニングのコーニング社）に移した。これでプレートはいつでも検出が可能な状態にある。
【０２４８】
０．５ｍＭのフェニルアラニンを反応に用いたこと以外は同じ手順を用いてＰＡＬ活性を測定した。細胞培養からプレートを２つずつ作ってＴＡＬ活性とＰＡＬ活性とを同時に測定してもよいし、あるいは、ＴＡＬ活性を先に測定してもよい。反応溶液を濾過してＵＶプレートに移した後、まだＥ．ｃｏｌｉ細胞が残っているＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎプレートを洗浄し、ＰＡＬ活性を測定できるようにするために各ウェルにフェニルアラニン溶液を加えた。どちらのやり方もうまく機能した。
【０２４９】
検出については、２９０ｎｍまたは２７０ｎｍでの吸収を測定すれば、それぞれＰＨＣＡまたはケイ皮酸塩の形成を容易に検出することが可能である。チロシンおよびフェニルアラニンはこれらの波長で強い吸収を示さない。測定はＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ１９０の９６穴プレートリーダー（カリフォルニア州サニーベールのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．）で行った。各プレートに負の対照（発現ベクターのみを含むＥ．ｃｏｌｉ細胞）と正の対照（変異型ＰＡＬ遺伝子が発現されたＥ．ｃｏｌｉ細胞）とを持たせた。負の対照と正の対照との吸収は一般に一桁違う。このようなシグナル対雑音レベルで信頼性の高い結果が得られる。
【０２５０】
各ウェルの細胞成長率と酵素発現レベルは常に同じわけではない。このため、アッセイの結果にムラができる。このようなムラをなくすために、ＴＡＬおよびＰＡＬデータをマイクロソフトエクセルにエクスポートした後でＴＡＬ／ＰＡＬ比を求めた。本願発明者らは、正の対照のＴＡＬ／ＰＡＬ比が極めて一貫性のあるものだということを見出した（ムラは常に２０％未満であった）。本願明細書にて説明する方法は極めて単純であり、この方法によってコロニーを手作業で採取して毎日何千ものクローンをスクリーニングすることができる。ロボットのコロニー採取機を使用すれば、スループットを容易に５から１０倍に高めることができる。また、この方法はＥ．ｃｏｌｉだけでなく他のタイプの細胞（酵母細胞など）にも用いることができるものである。
【０２５１】
実施例２１
変異型ＰＡＬ酵素の相同性モデリング
現時点ではＰＡＬ／ＴＡＬ酵素の結晶構造は確認できていないが、ＰＡＬ／ＴＡＬに対して４０％までの相同性を示すヒスチジンアンモニアリアーゼ（ＨＡＬ）の結晶構造であれば、Ｓｃｈｗｅｄｅら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８：５３５５〜５３６１（１９９９））によって解決されている。ＨＡＬの結晶構造に基づいて、ＳＷＩＳＳモデルサーバー（Ｐｅｉｔｓｃｈ，Ｍ．Ｃ．  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：６５８〜６６０（１９９５）；Ｐｅｉｔｓｃｈ，Ｍ．Ｃ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２４：２７４〜２７９（１９９６）；Ｇｕｅｘら  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １８：２７１４〜２７２３（１９９７））を用いてＰＡＬ／ＴＡＬ酵素の相同性モデルを構築した。ＨＡＬとＰＡＬ／ＴＡＬの相同性モデルとのオーバーラップを図５に示す。ヒスチジンアンモニアリアーゼを赤で示し、ＰＡＬ／ＴＡＬ酵素を白で示してある。スペースを埋めているモデルは活性部位の補欠分子属の４−メチリデン−イミダゾール−５−オンである。ＨＡＬおよびＰＡＬ／ＴＡＬはいずれも、四量体として機能するように見える。ＨＡＬの結晶構造から明らかなように、活性部位は３つのサブユニットから得られる残基からなる（Ｓｃｈｗｅｄｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８：５３５５〜５３６１（１９９９））。
【０２５２】
本願発明者らの相同性モデリングでは、ＰＡＬ／ＴＡＬ配列はＨＡＬ配列よりも２０８アミノ酸多く、かなり長い。ＰＡＬ／ＴＡＬとＨＡＬとではどちらかというと相同部分に限りがあるため、ＰＡＬ／ＴＡＬの相同性モデルには最初の１５０のアミノ酸が含まれない。しかしながら、ＨＡＬのＮ末端は基質結合ポケットの形成に関与しているため、ＰＡＬ／ＴＡＬのＮ末端の最初の１５０のアミノ酸のうちいくつかも結合ポケットの形成に寄与している可能性が極めて高い。特に、本願発明者らが行ったＮ末端切断実験（実施例１８）および局所的突然変異誘発（実施例２２）において得られた結果は、この考えを裏付けているように思われる。
【０２５３】
この相同性モデルは、観察された突然変異を合理化し、さらに重要なことに以後の突然変異誘発実験を行うための潜在的な領域を選択するための価値のある構造フレームであることが明らかになっている。第２のサブユニットのアミノ酸番号５５６近辺の領域が活性部位の形成に寄与している。ＥＰ１８Ｋｍ６に見られるＩｌｅ５４０Ｔｈｒ変異はこの領域からさほど離れていない。
【０２５４】
実施例２２
アミノ酸番号１２０〜２８０を標的している局所的かつランダムな突然変異誘発  変異型ＰＡＬ遺伝子（ＥＰ１８Ｋｍ−６）をさらに改善し、変異型ＰＡＬにおけるＴＡＬ活性に重要な他の領域を研究調査するために、本願発明者らは遺伝子で局所的な突然変異誘発を実施した。部位特異的突然変異誘発による触媒作用および他の機能にＳｅｒ２１２が関与していることが明らかになった（Ｈａｎｓｏｎら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１４１：１〜１７（１９７０）；Ｌａｎｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３６：１０８６７〜１０８７１（１９９７））。これに基づいて、突然変異誘発で標的する最初の領域をアミノ酸番号１２０から２８０とした。
【０２５５】
ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ：
ｐＥＴ１７ｂ−Ｋｍ６コンストラクトにはＢａｍＨＩとＣｌａＩの２つの独特な制限酵素部位がある。ＢａｍＨＩは変異型ＰＡＬ遺伝子を塩基対番号３５２で切断し、ＣｌａＩは塩基対番号８２９でこれを切断する。これはアミノ酸番号１２０から２８０をカバーしている。以下のプライマーを用いて、ｐＥＴ１７ｂ−Ｋｍ６から変異型ＰＡＬ遺伝子の一部（５’末端から塩基対番号９６０）を増幅した。
プライマーＡ（配列番号５）：５’−ＴＡＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＧ−３’
１８ＥＰ−３  プライマー（配列番号２４）：５’−ＣＧＣＧＴＧＡＣＧＴＣＧＴＧＡＡＧＧＡＡ−３’
ｐＥＴ１７ｂ−Ｋｍ６プラスミドＤＮＡをテンプレートとして用いて、実施例９で説明したようにしてｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲを実施した。ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ産物は、変異型ＰＡＬ遺伝子の５’末端から塩基対番号９６０までの９６０塩基対のＤＮＡ断片であった。このＰＣＲ産物を制限酵素で消化すればＢａｍＨＩ−ＣｌａＩ断片を得ることができる。
【０２５６】
局所的な変異体ライブラリの作製：
ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルに仕込み、９６０塩基対のＤＮＡ断片を（製造業者の指示に従ってキアゲン社のＰＣＲクリンナップキットで）ゲル精製し、ＥＢ緩衝液５０μＬで溶出した。１０×マルチバッファ（６μＬ）、ＮｈｅＩ（２μＬ）、ＥｃｏＲＩ（２μＬ）および蒸留脱イオン水（２０μＬ）中でｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ断片３０μＬを消化した。３７℃で２時間のインキュベーション後、反応混合物を１％アガロースゲルに仕込んだ。プロメガ社のＰＣＲクリンナップキットを用いて、ＢａｍＨＩ／ＣｌａＩで消化したＤＮＡ断片を精製した。
【０２５７】
１０μＬの１０×マルチバッファ、３μＬのＢａｍＩ、３μＬのＣｌａＩおよび３４μＬの蒸留脱イオン水中にて、ｐＥＴ１７ｂ−Ｋｍ６プラスミドＤＮＡ５０μＬを３７℃で２時間消化した。消化混合物を１％アガロースゲルに仕込み、プロメガ社のＤＮＡクリンナップキットを用いて４．９ｋｂのＤＮＡ断片をゲル精製した。この消化によってコンストラクトが線状化され、変異型ＰＡＬ遺伝子から４７７の塩基対（塩基対番号３５２から８２９）が除去された。
【０２５８】
３５μＬのＰＣＲ断片、５μＬの線状化ｐＥＴ１７ｂ−Ｋｍ６、５μＬの１０×ライゲーション緩衝液、３μＬのＴ４リガーゼ（３Ｕ／μＬ）および２μＬの蒸留脱イオン水を含有するライゲーション混合物中にて、ＢａｍＨＩ／ＣｌａＩで消化したｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ断片を、ＢａｍＨＩ／ＣｌａＩで消化したｐＥＴ１７ｂ−Ｋｍ６にライゲーションした。ライゲーション混合物を１５℃で２時間インキュベートした。実施例１７で説明したようにしてライゲーション混合物をＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換し、局所的な変異体のライブラリを得た。
【０２５９】
変異体ライブラリのスクリーニングと変異体のキャラクタリゼーション：
アガロースプレートから５，０００の変異体コロニーを採取し、高スループットのアッセイ（実施例２０）でスクリーニングした。最初にヒットしてきたものをフォローアップアッセイでさらに研究調査し、スクリーニング結果を確認した。実施例１７で説明した細胞全体のアッセイを用いてＴＡＬ活性およびＰＡＬ活性を測定した後、ＴＡＬ／ＰＡＬ活性の比を求めた。ＴＡＬ／ＰＡＬ比の異なる４種類の変異体についてフォローアップアッセイの結果を以下の表にまとめておく。
【０２６０】
【表２３】
2004530402.tif 000026
【０２６１】
本願発明者らの目標は開始遺伝子よりもＴＡＬ／ＰＡＬ比の高い変異体を見つけることであったが、ＴＡＬ／ＰＡＬ比の低い変異体にも興味はある。どちらのタイプの変異も、酵素がチロシンおよびフェニルアラニンとどのような違いで結合するかに関する重要な情報であることが分かっている。表から明らかなように、ＲＭ１２０−７では、ＴＡＬ／ＰＡＬ比が大幅に小さくなっている。これとは対照的に、ＲＭ１２０−１のＴＡＬ／ＰＡＬ比はＫｍ−６の場合よりも４倍以上改善されている。変異型ＰＡＬでは野生型酵母のＰＡＬ酵素（ＴＡＬ／ＰＡＬ比０．５）に比してＴＡＬ／ＰＡＬ比がすでに改善されているため、変異体ＲＭ１２０−１では野生型ＰＡＬと比べてＴＡＬ／ＰＡＬ活性が１４倍以上改善されていた。
【０２６２】
変異体の配列分析：
キアゲン社のプラスミドＭｉｎｉＰｒｅｐキットを用いて、これらの変異体からプラスミドＤＮＡを精製した。ＡＢＩ３７７自動シーケンサー（カリフォルニア州フォスターシティのアプライドバイオシステムズ）で変異体遺伝子を配列決定し、ＤＮＡｓｔａｒプログラム（ウィスコンシン州マディソンのＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）を用いてデータを管理した。変異体を分析し、続いて野生型酵母のＰＡＬ遺伝子と比較したところ、変異体遺伝子が以下の一塩基置換突然変異（点突然変異）を含んでいることが明らかになった。
【０２６３】
【表２４】
2004530402.tif 000027
【０２６４】
変異型ＰＡＬ遺伝子（ＥＰ１８Ｋｍ−６）を開始遺伝子として使用したため、変異型ＰＡＬにおける４つの点突然変異が局所的な変異体にも存在していた（表１８において太字で示してある）。４つの突然変異のうち３つは、アミノ酸を変化させることのないサイレント突然変異であった。ＡＴＣからＡＣＣの変異ではイソロイシン−５４０がトレオニンに変化した。これらの突然変異に加えて、ＲＭ１２０−２には別のアミノ酸置換と１つのサイレント変異が含まれており、一方、ＲＭ１２０−１、ＲＭ１２０−４およびＲＭ１２０−７はいずれもさらに２つのアミノ酸置換を含んでいた。このようなアミノ酸置換による影響については、各変異体のＴＡＬ／ＰＡＬ比の変化において上述したとおりである。
【０２６５】
ヒスチジンアンモニアリアーゼ（ＨＡＬ）のＮ末端が基質結合ポケットを形成する機能を持つのではないかという意見がある（Ｓｃｈｗｅｄｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８：  ５３５５〜５３６１（１９９９））。ＨＡＬに対するＰＡＬの相同性に基づいて考えると、ＰＡＬのＮ末端が同じような役割を果たす可能性は高い。本願発明者らは、実施例１８において、変異型ＰＡＬのＮ末端がＴＡＬ活性にとって重要であることを示した。ＲＭ１２０−１に見られる２つの突然変異（Ａｓｐ１２６ＧｌｙおよびＧｌｎ１３８Ｌｅｕ）が上記の仮説をさらに裏付けている。変異部位のうち少なくとも一方は基質結合ポケットと極めて近い可能性がある。
【０２６６】
本願発明者らが得た結果から、アミノ酸領域１２０から２８０が酵素基質特異性にとって極めて重要であることが分かる。ＰＡＬ酵素のＴＡＬ活性を改善する上で、これはタンパク質工学の理想的な領域のひとつである。
【０２６７】
実施例２３
アミノ酸番号３５０〜３６１、４９２〜５０３および５５６〜５６４を標的している局所的かつランダムな突然変異誘発
変異型ＰＡＬの相同性モデルをＨＡＬの結晶構造（Ｓｃｈｗｅｄｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８：  ５３５５〜５３６１（１９９９））と比較することで、本願発明者らは、局所的かつランダムな突然変異誘発に以下の領域を選択した。１）アミノ酸番号３５０〜３６１；２）アミノ酸番号４９２〜５０３および３）アミノ酸番号５５６〜５６４。これらの領域はいずれも極めて短いため、オリゴ特異的突然変異誘発法を用いて変異体のライブラリを作製した。
【０２６８】
変性オリゴヌクレオチドの設計および合成：
オリゴ特異的突然変異誘発のために以下の変性オリゴヌクレオチドプライマーを設計および合成した。
ＲＭ３５０−Ｆ２（配列番号２５）：
５’−ＧＡＧＧＡＧＧＴＣＡＡＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＧＧＧＣＡＴＴＣＴＣＣＧＣＣＡＧＧＡＣＣＧＣＴＡＣＣＣＣ−３’
ＲＭ３５０−Ｒ１（配列番号２６）：
５’−ＧＧＧＧＡＴＧＣＧＧＴＣＣＴＧＧＣＧＧＡＧＡＡＴＧＣＣＣＴＣＧＴＣＧＴＣＣＴＴＧＡＣＣＴＴＧＡＣＣＴＣＣＴＣ−３’
ＲＭ４９２−Ｆ２（配列番号２７）：
５’−ＡＣＧＡＣＧＣＡＴＧＴＣＣＡＧＣＣＧＧＣＴＧＡＧＡＴＧＧＣＧＡＡＣＣＡＧＧＣＧＧＴＣＡＡＣＴＣＧＣＴＴＧＣＧ−３’
ＲＭ４９２−Ｒ１（配列番号２８）：
５’−ＣＧＣＡＡＧＣＧＡＧＴＴＧＡＣＣＧＣＣＴＧＧＴＴＣＧＣＣＡＴＣＴＣＡＧＣＣＧＧＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＧＴＣＧＴ−３’
ＲＭ５５６−Ｆ２（配列番号２９）：
５’−ＧＴＣＴＣＧＣＴＣＡＴＣＧＡＣＣＡＧＣＡＣＴＴＴＧＧＣＴＣＣＧＣＣＡＴＧＡＣＣＧＧＣＴＣＧ−３’
ＲＭ５５６−Ｒ１（配列番号３０）：
５’−ＣＧＡＧＣＣＧＧＴＣＡＴＧＧＣＧＧＡＧＣＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＴＣＧＡＴＧＡＧＣＧＡＧＡＣ−３’
プライマーＲＭ３５０−Ｆ２およびＲＭ３５０−Ｒ１はアミノ酸番号３５０〜３６１間、ＲＭ４９２−Ｆ２およびＲＭ４９２−Ｒ１は領域４９２〜５０３間、ＲＭ５５６−Ｆ２およびＲＭ５５６−Ｒ１は領域５５６〜５６４間の局所的な突然変異誘発用である。Ｆ２を付したプライマーはフォワードプライマーであり、Ｒ１を付したプライマーはリバースプライマーである。各組のプライマーは互いに相補的である。太字の塩基は突然変異誘発の領域をコードする。突然変異誘発の標的領域付近で５’末端および３’末端の両方に９つの特別なヌクレオチドが含まれていたため、これらの塩基には通常のオリゴ合成条件を用いた。
【０２６９】
太字の塩基には非野生型（ＷＴ）ヌクレオチドでのドーピングが必要である。ＲＭ３５０−Ｆ２、ＲＭ３５０−Ｒ１、ＲＭ４９２−Ｆ２およびＲＭ４９２−Ｒ１の合成には以下の特別な塩基を使用した。
Ａ（５０ｍＭ）を、０．７３ｍＭのＧ、０．７３ｍＭのＣおよび０．７３ｍＭのＴと混合
Ｇ（５０ｍＭ）を、０．７３ｍＭのＡ、０．７３ｍＭのＣおよび０．７３ｍＭのＴと混合
Ｃ（５０ｍＭ）を、０．７３ｍＭのＡ、０．７３ｍＭのＧおよび０．７３ｍＭのＴと混合
Ｔ（５０ｍＭ）を、０．７３ｍＭのＡ、０．７３ｍＭのＧおよび０．７３ｍＭのＣと混合
したがって、このようにして合成チャンバで得られるヌクレオチド混合物は、３つの非ＷＴヌクレオチドを各々１．４％ずつとＷＴを９５．８％含み、誤った取り込みの率は０．０４２／ヌクレオチドであった。この誤った取り込みで標的した領域は３６塩基であるため、オリゴマー１つあたり平均１．５の誤った取り込み（非ＷＴヌクレオチド）ということになるが、これは得られる変性オリゴマーのプールで一塩基置換および二塩基置換の割合を最大限にするレベルである。
【０２７０】
ＲＭ５５６−Ｆ２およびＲＭ５５６−Ｒ１については、誤った取り込みで標的した領域は２７塩基であった。太字で示した塩基を合成する際には以下の特別な塩基を使用した。
Ａ（５０ｍＭ）を、０．９８ｍＭのＧ、０．９８ｍＭのＣおよび０．９８ｍＭのＴと混合
Ｇ（５０ｍＭ）を、０．９８ｍＭのＡ、０．９８ｍＭのＣおよび０．９８ｍＭのＴと混合
Ｃ（５０ｍＭ）を、０．９８ｍＭのＡ、０．９８ｍＭのＧおよび０．９８ｍＭのＴと混合
Ｔ（５０ｍＭ）を、０．９８ｍＭのＡ、０．９８ｍＭのＧおよび０．９８ｍＭのＣと混合
繰り返すが、これによってオリゴマー１つあたり平均１．５の誤った取り込みとなった。
【０２７１】
ＰＣＲによる変異体ＤＮＡ断片の作製：
変異体ＤＮＡ断片の作成時には以下のような通常のオリゴプライマーも使用した。
プライマーＡ（配列番号５）：５’−ＴＡＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＧ−３’
プライマーＢ（配列番号６）：５’−ＡＡＣＴＧＣＡＧＣＴＡＡＧＣＧＡＧＣＡＴＣ−３’
【０２７２】
アミノ酸番号３５０〜３６１の局所的な突然変異誘発のために２種類のＰＣＲ反応物を調製した。プライマーセットとして、プライマーＡ（フォワードプライマー）／ＲＭ３５０−Ｒ１（リバースプライマー）およびＲＭ３５０−Ｆ２（フォワードプライマー）／プライマーＢ（リバースプライマー）を使用した。テンプレートのＤＮＡはＥＰ１８Ｋｍ−６プラスミドとし、ＨｏｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ（ウィスコンシン州マディソンのプロメガ社）をポリメラーゼとして利用した。９５℃のホットスタートで１０分、９４℃の融点で３０秒、４５℃のアニーリング温度で１分、７２℃の伸長温度で２分のサイクルを２５回行うＰＣＲを実施した。次に、ＰＣＲ産物を精製（キアゲン社のＰＣＲ  Ｑｕｉｃｋｅｎ  Ｓｐｉｎキット、製造業者の指示に従う）した。ＰＣＲ産物を５０μＬ、２ｍＭのｄＮＴＰを２μＬ、Ｐｆｕ酵素（５Ｕ／μＬ）（カリフォルニア州ラホーヤのストラタジーン社）を２μＬ、１０×Ｐｆｕ緩衝液を６μＬ含有するポリッシング反応混合物中にてＰＣＲ断片の末端をポリッシュした。ポリッシング反応混合物を２℃で３０分間インキュベートした。どちらのＰＣＲ産物も互いにオーバーラップしていたため、２つの断片を組み合わせ、外側のプライマーの組での３’伸長および増幅によって全長遺伝子（２．１５ｋｂ）を得た。２種類のポリッシュしたＰＣＲ断片（各１０μＬ）、エキスパンドしたＴａｑポリメラーゼ（インディアナ州インディアナポリスのＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ）１μＬ、１０×緩衝液７μＬ、プライマーＡ３μＬ、プライマーＢ３μＬ、蒸留脱イオン水６０μＬを含有している反応混合物でタッチダウンＰＣＲ反応を実施した。以下のタッチダウンＰＣＲ条件を使用した。
９４℃で１分間、６０℃で１分間、６８℃で４分間を３サイクル、
９４℃で１分間、５８℃で１分間、６８℃で４分間を３サイクル、
９４℃で１分間、５６℃で１分間、６８℃で４分間を３サイクル、
９４℃で１分間、５４℃で１分間、６８℃で４分間を３サイクル、
９４℃で１分間、５２℃で１分間、６８℃で４分１５秒を３サイクル、
９４℃で１分間、５０℃で１分間、６８℃で４分３０秒を３サイクル。
【０２７３】
このタッチダウンＰＣＲ産物を１％アガロースゲルに仕込み、キアゲン社のＱｕｉｃｋｅｎ  Ｓｐｉｎキットを用いてゲルから２．１５ｋｂのＤＮＡバンドを精製した。この２．１５ｋｂの断片は、５’末端から３’末端への全長ＰＡＬ遺伝子を含んでいる。アミノ酸番号３５０〜３６１に対応する領域はランダムに突然変異誘発された。
【０２７４】
プライマーＡ／ＲＭ４９２−Ｒ１およびＲＭ４９２−Ｆ２／プライマーＢを使用して、アミノ酸番号４９２〜５０３の局所的な突然変異誘発で同じ実験を実施し、プライマーＡ／ＲＭ５５６−Ｒ１およびＲＭ５５６−Ｆ２／プライマーＢを使用して、アミノ酸番号５５６〜５６４の局所的な突然変異誘発で同じ実験を実施した。それぞれの場合において、所望の領域がランダムに突然変異誘発した全長遺伝子が得られた。
【０２７５】
局所的な変異体ライブラリの作製：
独特な制限酵素であるＣｌａＩ（変異型ＰＡＬ遺伝子を塩基対番号８２９で切断；実施例２１参照）に加えて、２つの他の独特な部位すなわち、ＮｃｏＩおよびＳａｃＩがそれぞれ塩基対番号１２６２および１７１８でｐＥＴ１７ｂ−Ｋｍ６を切断する。これらの３つの部位を用いてライブラリを作製した。
【０２７６】
アミノ酸番号３５０〜３６１について局所的な突然変異誘発ライブラリを作製するために、上述した２．１５ｋｂの断片をＣｌａＩおよびＮｃｏＩで消化し、４３４ｂｐのＤＮＡ断片を生成した。次に、この断片をＣｌａＩ／ＮｃｏＩで消化したｐＥＴ１７ｂ−Ｋｍ６ベクターにライゲーションした。ライゲーション混合物をＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換することで、変異体ライブラリを得た。他の２つのライブラリについても、ＣｌａＩ−ＮｃｏＩの代わりにＮｃｏＩ−ＳａｃＩを用いたこと以外は同様にして作製した。
【０２７７】
変異体ライブラリのスクリーニングと変異体のキャラクタリゼーション：
上記の３つのライブラリから得た合計５，０００の変異体コロニーを、高スループットのアッセイ（実施例２０）でスクリーニングした。最初にヒットしてきたものをフォローアップＨＰＬＣアッセイでさらに研究調査し、実施例２１に述べたようなスクリーニング結果を確認した。ＴＡＬ／ＰＡＬ比が改善された変異体がひとつ見出された（表１９）。
【０２７８】
【表２５】
2004530402.tif 000028
【０２７９】
この結果から、ＴＡＬ活性にはアミノ酸領域４９２〜５０３が重要なのではないかと思われる。スクリーニングした５，０００のクローンの中には、アミノ酸番号３５０〜３６１および５５６〜５６４の局所的な変異体ライブラリでＴＡＬ活性が亢進した変異体はなかったが、この２つのライブラリにおける多くの変異体でＴＡＬ活性の低下が認められたことから、これらの２つの領域がＴＡＬ活性にとって何らかの役割を果たしていることが分かる。
【０２８０】
ＲＭ４９２−４変異体の配列分析：
キアゲン社のプラスミドＭｉｎｉＰｒｅｐキットを用いてプラスミドＤＮＡを精製し、ＡＢＩ３７７自動シーケンサーで変異体遺伝子を配列決定した。変異体を分析した後、野生型酵母のＰＡＬ遺伝子と比較したところ、変異体ＲＭ４９２−４に、ＧＴＣ（Ｖａｌ５０２）からＧＧＣ（Ｇｌｙ）、ＣＴＧ（Ｌｅｕ２１５）からＣＴＣ（Ｌｅｕ）、ＧＡＡ（Ｇｌｕ２６４）からＧＡＧ（Ｇｌｕ）、ＧＣＴ（Ａｌａ２８６）からＧＣＡ（Ａｌａ）、ＡＴＣ（Ｉｌｅ５４０）からＡＣＣ（Ｔｈｒ）という５つの塩基置換突然変異（点突然変異）が認められた。最初の変異であるＧＴＣ（Ｖａｌ５０２）からＧＧＣ（Ｇｌｙ）を除き、残りの変異はいずれも開始変異型ＰＡＬ遺伝子（ＥＰ１８Ｋｍ−６）から生じたものであった。この最初の変異はＴＡＬ／ＰＡＬ比が変化することの一因を担っている。相同性モデルではＶａｌ５０２が基質結合ポケットに存在するのではないかと考えられる。この部位でバリンをグリシンに変えると基質結合ポケットが大きくなるため、チロシンの方が結合しやすくなる。これは、元の基質であるフェニルアラニンよりもチロシンの方が大きいためである。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＢＲ３２２由来であり、ＰＡＬ発現ベクターＰＣＡ１８Ｋｍの作製に利用されるベクターＰＣＡ１２Ｋｍのプラスミドマップである。
【図２】変異型（ｍｕｔａｌ）ＰＡＬ／ＴＡＬ酵素を含有するベクターｐＥＴＡＬのプラスミドマップである。
【図３】精製した変異型ＰＡＬ酵素ならびに変異型ＰＡＬ酵素精製の開始材料として用いられる細胞粗抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図４】変異型ＰＡＬ／ＴＡＬ酵素を酵母で発現させるのに利用される発現ベクターｐＧＳＷ１８のプラスミドマップである。
【図５】ヒスチジンアンモニウム−リアーゼ酵素とＰＡＬ／ＴＡＬ酵素の相同性モデルである。
【表２６】2004530402.tif 000029
【表２７】2004530402.tif 000030
【表２８】2004530402.tif 000031
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
2004530402.tif 000171
2004530402.tif 000172
2004530402.tif 000173