(57)【要約】【課題】【解決手段】Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性エンテロトキシンのＢサブユニット（ＥｔｘＢ）及びＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅトキシンのＢサブユニット（ＣｔｘＢ）から選択されるタンパク質トキシンのＢサブユニットは、細胞表面に発現されるウイルス抗原及び腫瘍抗原に対して治療的効果を有する。特に、前記タンパク質トキシンは、エプスタインバーウイルスに関連した疾病又は症状に罹患した又は新生物に罹患した動物体（人体を含む）を治療するために使用し得る。治療剤は、さらに、細胞表面に発現される抗原、例えば、エプスタインバーウイルス潜伏膜タンパク質を含み得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エプスタインバーウイルス潜伏膜タンパク質ＬＭＰ−２と共に、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性エンテロトキシンのＢサブユニット（ＥｔｘＢ）及びＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅトキシンのＢサブユニット（ＣｔｘＢ）から選択されるタンパク質トキシンのＢサブユニットを含む治療剤。
【請求項２】
前記タンパク質トキシンのＢサブユニットと前記ＬＭＰ−２とが連結されている請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
前記タンパク質トキシンのＢサブユニットと前記ＬＭＰ−２とが抱合されている請求項１に記載の治療剤。
【請求項４】
前記タンパク質トキシンのＢサブユニットとＬＭＰ−２との融合タンパク質を含む請求項１に記載の治療剤。
【請求項５】
前記タンパク質トキシンのＢサブユニットがＥｔｘＢである請求項１〜４の何れか１項に記載の治療剤。
【請求項６】
エプスタインバーウイルスＬＭＰ−２と共に、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性エンテロトキシンのＢサブユニット（ＥｔｘＢ）及びＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅトキシンのＢサブユニット（ＣｔｘＢ）から選択されるタンパク質トキシンのＢサブユニットを含む融合タンパク質。
【請求項７】
前記タンパク質トキシンのＢサブユニットがＥｔｘＢである請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
エプスタインバーウイルスＬＭＰ−２と共に、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性エンテロトキシンのＢサブユニット（ＥｔｘＢ）又はＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅトキシンのＢサブユニット（ＣｔｘＢ）のうちの何れかのＢサブユニットに相同な第一のタンパク質を含む融合タンパク質。
【請求項９】
人体を含む動物体内のエプスタインバーウイルス関連疾患を治療するための医薬の製造における、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性エンテロトキシンのＢサブユニット（ＥｔｘＢ）及びＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅトキシンのＢサブユニット（ＣｔｘＢ）から選択されるタンパク質トキシンのＢサブユニットとエプスタインバーウイルス潜伏膜タンパク質ＬＭＰ−２とを含む組成物の使用。
【請求項１０】
人体を含む動物体内の新生物を治療するための医薬の製造における、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性エンテロトキシンのＢサブユニット（ＥｔｘＢ）及びＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅトキシンのＢサブユニット（ＣｔｘＢ）から選択されるタンパク質トキシンのＢサブユニットとエプスタインバーウイルス潜伏膜タンパク質ＬＭＰ−２とを含む組成物の使用。
【請求項１１】
エプスタインバー関連疾患に罹患している人体を含む動物体を治療する方法であって、有効量の請求項１〜５の何れか１項に記載の治療剤を、人体を含む動物体に投与することを備えた方法。
【請求項１２】
新生物に罹患している人体を含む動物体を治療する方法であって、有効量の請求項１〜６の何れか１項に記載の治療剤を、人体を含む動物体に投与することを備えた方法。
【請求項１３】
ウイルス及び腫瘍抗原の抗原処理及び提示を変化させるための、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性エンテロトキシンのＢサブユニット（ＥｔｘＢ）及びＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅトキシンのＢサブユニット（ＣｔｘＢ）から選択されるタンパク質トキシンのＢサブユニットの使用。
【請求項１４】
エプスタインバーウイルスに感染した人体を含む動物体内のエプスタインバーウイルス関連疾患又は症状を治療するための医薬の製造における、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性エンテロトキシンのＢサブユニット（ＥｔｘＢ）及びＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅトキシンのＢサブユニット（ＣｔｘＢ）から選択されるタンパク質トキシンのＢサブユニットの使用。
【請求項１５】
人体を含む動物体内の新生物を治療するための医薬の製造における、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性エンテロトキシンのＢサブユニット（ＥｔｘＢ）及びＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅトキシンのＢサブユニット（ＣｔｘＢ）から選択されるタンパク質トキシンのＢサブユニットの使用。
【請求項１６】
エプスタインバーウイルス関連疾患に罹患した人体を含む動物体を治療する方法であって、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性エンテロトキシンのＢサブユニット（ＥｔｘＢ）及びＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅトキシンのＢサブユニット（ＣｔｘＢ）から選択される有効量のタンパク質トキシンのＢサブユニットを、人体を含む動物体に投与することを備えた方法。
【請求項１７】
新生物に罹患した人体を含む動物体を治療する方法であって、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性エンテロトキシンのＢサブユニット（ＥｔｘＢ）及びＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅトキシンのＢサブユニット（ＣｔｘＢ）から選択される有効量のタンパク質トキシンのＢサブユニットを、前記人体を含む前記動物体に投与することを備えた方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、治療剤に関する。より具体的には、本発明は、タンパク質毒素のＢサブユニットを含む治療剤であって、ウイルス感染の治療に有用であり得る治療剤、このようなＢサブユニットを含む融合タンパク質、医薬の製造におけるこのようなＢサブユニットを含む組成物の使用、及び動物体の治療法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
世界の人口の約９０％は、成年前期までに、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）の保有者となり、エプスタイン−バーウイルスは最も一般的なヒトのウイルス感染症の一つとなっている。
【０００３】
ＥＢＶ一次感染の多くは、無症候又は無症状である。僅かな症例では、ＥＢＶ一次感染は、感染性単核球症（腺熱）（全身性の発疹、関節痛、リンパ節腫脹、及び肝脾腫大症を特徴とし、自然治癒する熱性疾患）として臨床症状を呈することもある。
【０００４】
より重要であると思われるのは、ＥＢＶが、上皮及びリンパに由来する多数のヒト腫瘍と関連していることである。これらの腫瘍には、上咽頭癌、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、及び移植後リンパ球増殖症が含まれる。
【０００５】
ＥＢＶは、インビトロでＢ細胞を形質転換して、リンパ芽球細胞株（ＬＣＬ、ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ）を形成する。これらのＬＣＬは、活性化されたＢ細胞と非常に似ているが、加えて、潜伏ＥＢＶ遺伝子の相補物全体を発現し、第ＩＩＩ潜伏パターンを呈する。これらの遺伝子は、核抗原ＥＢＮＡ１、２、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、及びＬＰ、潜伏膜タンパク質ＬＭＰ１及びＬＭＰ２、並びにＥＢＥＲ１及びＥＢＥＲ２として知られる二つの小さなＲＮＡをコードしている。
【０００６】
しかしながら、インビボの感染Ｂ細胞及び多くのＥＢＶ関連腫瘍では、発現されている潜伏遺伝子の範囲が、ＬＭＰ２（第０潜伏）及びＥＢＮＡ（第Ｉ潜伏）に限られる者と、これに加えて、ＬＭＰとＥＢＥＲを発現している者（第ＩＩ潜伏）とが存在する。
【０００７】
一次感染の間に、宿主は、強力な液性及び細胞性反応を生起することができる。しかしながら、第０、第Ｉ、及び第ＩＩ潜伏パターンを呈する感染細胞は、免疫監視機構を逃れることができ、ウイルスの除去は達せられない。これによって、ウイルスは、宿主のＢ細胞プール内に生涯保有されることが可能となる。宿主Ｂ細胞の形質転換及び不死化は、ＥＢＶによる発癌のための重要な段階であると考えられているが、実際の機序は解明されていない。
【０００８】
確立された潜伏感染の制御において、ＥＢＶに対する細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ、ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ−ｃｅｌｌ）反応が殊に重要であることが、ますます明らかになっている（１）。実際、現在の研究は、様々な潜伏遺伝子産物に対するＣＴＬの生成と増殖に焦点を当てており、これによって、ＥＢＶ関連腫瘍に対する免疫療法の基礎が与えられる可能性がある。
【０００９】
ＥＢＶに対するＣＴＬ反応の重要な特徴は、ＥＢＮＡ３Ａ、３Ｂ、及び３Ｃの免疫優性であり、ＬＭＰ２、ＥＢＮＡ２、及びＬＭＰ１（稀）に対する反応はこれより弱い（２）。ＥＢＮＡ１は、内部のグリシン−アラニンリピート（ＧＡｒ）ドメインの存在によって、非免疫原性である（３）。ＥＢＶ関連腫瘍の多くは第Ｉ又は第ＩＩ潜伏パターンを示すので、抗ＬＭＰ１又はＬＭＰ２  ＣＴＬ反応を増強することに力点が置かれている。
【００１０】
Ｅ．ｃｏｌｉの易熱性エンテロトキシンのＢサブユニット（ＥｔｘＢ）、及び近縁の相同体であるＣｔｘＢ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ  ｔｏｘｉｎのＢサブユニット）は、その受容体ＧＭ１（遍在性の細胞表面糖スフィンゴ脂質）を介して、標的細胞の表面上に付着し、これによって、結合したＥｔｘＢ／ＣｔｘＢの急速な凝集又はキャッピングが生じ、次いで毒素の内部移行が起こる。
【００１１】
ＥｔｘＢは、粘膜表面を横切る外来抗原の取り込みと該抗原の免疫原性とを向上させることが示されている。このため、ＥｔｘＢは、粘膜から送達されるワクチンを設計する際のアジュバントとして有用な可能性がある（４）。
【００１２】
ＥＢＶ潜伏膜タンパク質ＬＭＰ１（ｌａｔｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １）及びＬＭＰ２は、ＬＣＬ、並びに上咽頭癌（５）及びホジキン病を含む複数のＥＢＶ関連悪性腫瘍に見出される。ＬＭＰ１は、糖スフィンゴ脂質に富む（ＧＳＬ）ドメイン中の形質膜上に極めて集中していることが示されている（６）。別の発見では、ＬＭＰ２は、蛍光顕微鏡により、ＬＭＰ１と共に存在していることが示された（７）。ＧＭ１は、これらのドメイン内にも豊富に見出される。
【００１３】
理論に拘泥することを意図するものではないが、ＬＭＰ１とＬＭＰ２は、ＥｔｘＢ受容体であるＧＭ１と同一のＧＳＬドメイン中に見出されるので、非毒性の組み換え型ＥｔｘＢをＬＣＬに加えると、ＬＭＰ１とＬＭＰ２がＥｔｘＢと凝集して、ＥｔｘＢと共に内部移行する可能性があると本発明者らは考えている。これらのウイルスタンパク質は、次いで、代替抗原加工経路（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ）に入り、これによって、これらのタンパク質上で保護されていたエピトープは最終的にプロセッシングされ、より効率的に細胞障害性Ｔリンパ球に提示される。この理論は、ＥＢＶ潜伏膜タンパク質のみならず、ＣｔｘＢに、さらには、細胞表面に発現されるウイルス抗原一般にも敷衍されるものと考えられる。
【００１４】
【発明の概要】
従って、本発明は、第一の側面において、ウイルス及び腫瘍抗原の抗原処理及び提示を改変するための、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性エンテロトキシン（ＥｔｘＢ）のＢサブユニット及びＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅトキシン（ＣｔｘＢ）のＢサブユニットから選択されるタンパク質トキシンのＢサブユニットの使用を提供する。前記ウイルス抗原は、細胞表面に発現されるウイルス抗原、特にＥＢＶ潜伏膜タンパク質である。このように、第二の側面において、本発明は、エプスタインバーウイルスに感染した人体を含む動物体内のエプスタインパーウイルス関連疾患又は症状を治療するための医薬の製造における、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性エンテロトキシンのＢサブユニット（ＥｔｘＢ）及びＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅトキシンのＢサブユニット（ＣｔｘＢ）から選択されるタンパク質トキシンのＢサブユニットの使用を提供する。第三の側面によれば、本発明は、人体を含む動物体内の新生物を治療するための医薬の製造における、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性エンテロトキシンのＢサブユニット（ＥｔｘＢ）及びＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅトキシンのＢサブユニット（ＣｔｘＢ）から選択されるタンパク質トキシンのＢサブユニットの使用を提供する。
【００１５】
Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性エンテロトキシンのＢサブユニット（ＥｔｘＢ）及びＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅトキシンのＢサブユニット（ＣｔｘＢ）から選択されるタンパク質トキシンのＢサブユニットが、ウイルス細胞又は腫瘍細胞を有する細胞の表面に発現される抗原が発病に関与している人体を含む動物体の疾病又は症状に対して効果を有することは明らかであろう。このため、ＥｔｘＢ又はＣｔｘＢを含む有効量の組成物を投与することによって、エプスタインバーウイルスに感染し、又はエプスタインバーウイルスを保有している人体を含む動物体に治療的処置を施すことができる。さらに、ＥｔｘＢ又はＣｔｘＢを含む有効量の組成物を投与することによって、新生物に罹患している人体を含む動物体に治療的処置を施すことができる。
【００１６】
ＥｔｘＢ又はＣｔｘＢを含む前記組成物は、これに加えて、細胞表面に発現される抗原を含んでもよい。
【００１７】
従って、さらなる側面において、本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性エンテロトキシンのＢサブユニット（ＥｔｘＢ）及びＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅトキシンのＢサブユニット（ＣｔｘＢ）から選択されるタンパク質トキシンのＢサブユニットと細胞表面に発現される抗原とを含む治療剤を提供する。好ましくは、前記細胞表面に発現される抗原は、細胞表面に発現されるウイルス抗原、特に、エプスタインバーウイルスの潜伏膜タンパク質である。エプスタインバーウイルス潜伏膜タンパク質は、ＥＢＶ  ＬＭＰ１又はＥＢＶ  ＬＭＰ２であり得る。
【００１８】
適宜には、前記タンパク質トキシンのＢサブユニットと前記細胞表面に発現されるウイルス抗原は連結（ｌｉｎｋ）されているか、又は抱合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）されている。あるいは、前記タンパク質トキシンのＢサブユニットと前記細胞表面に発現されるウイルス抗原は融合されていてもよい。
【００１９】
本発明は、さらに、前記タンパク質トキシンのＢサブユニット（好ましくはＥｔｘＢ）と細胞表面に発現されるウイルス抗原（好ましくは、ＥＢＶの潜伏膜タンパク質である）とを含む融合タンパク質を提供する。
【００２０】
融合タンパク質を作製する方法は、もちろん、本分野において周知である。このため、本明細書に開示されている融合タンパク質は、公知の技術及び操作に従って作製することができると考えられる。この点に関しては、ＵＳ−Ａ−５５８９３８４、ＥＰ−Ａ−０４１８６２６、及びＷＯ００／１４１１４が参照される。
【００２１】
本発明は、さらに、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性エンテロトキシンのＢサブユニット（ＥｔｘＢ）又はＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅトキシンのＢサブユニット（ＣｔｘＢ）のうち何れかのＢサブユニットに相同な第一のタンパク質と、細胞表面に発現されるウイルス抗原に相同な第二のタンパク質とを含む融合タンパク質であって、前記第一の相同タンパク質がＧＭ１−受容体に結合することが可能であり、前記第二の相同タンパク質が細胞中に内部移行し且つ細胞内の抗原加工経路を改変することが可能である融合タンパク質を提供する。本発明の治療剤は、ウイルス疾患の治療に使用し得る。前記細胞表面に発現されるウイルス抗原がＥＢＶの潜伏膜タンパク質である場合には、前記治療剤は、ＥＢＶ関連疾患を治療するために、又は新生物、例えば白血病の治療に使用することができる。このように、本発明は、さらに、エプスタインバー関連疾患に罹患している人体を含む動物体を治療する方法であって、人体を含む動物体に有効量の前記治療剤を投与することを備えた方法を提供する。本発明は、新生物に罹患した人体を含む動物体を治療する方法であって、人体を含む動物体に有効量の前記治療剤を投与することを備えた方法も提供する。
【００２２】
タンパク質トキシンのＢサブユニットを含む本発明の治療剤、又は細胞表面に発現される抗原をさらに含む本発明の治療剤は、前記治療剤に加えて、薬学的に許容される一以上の担体、希釈剤、又は賦形剤を含む薬学的組成物の形態で、人体を含む動物体に投与し得る。治療剤そのもの、又は薬学的組成物の形態の治療剤は、様々な予防又は治療の目的で投与することができ、投与は経口及び非経口手段を含む薬剤に関して慣用的な任意の手段によって行うことができる。
【００２３】
ここで、添付の図面を参照しながら本発明を説明するが、これらは例示にすぎない。
【００２４】
【実施例】
実験
（Ａ）
細胞培養
本実験では、様々なドナー由来のリンパ芽球細胞株（ＬＣＬ）を用いた。ＥＢ４は、ＥＢＶ陰性のＢ細胞リンパ腫細胞株であり、陰性対照として使用した。５％ＣＯ２の加湿雰囲気下、３７℃で、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ  グルタミン、１００μｇ／ｍＬ  ペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地（完全ＲＰＭＩ培地）中において、これらの細胞を培養した。細胞の生存は、トリパンブルー色素の排除によって決定した。
【００２５】
メトリザミド処理
幾つかの実験では、ＬＣＬを含有する２ｍｌの完全ＲＰＭＩ培地の下に１ｍｌのメトリザミド（ＰＢＳ中の１８％  ｗ／ｖ  メトリザミド及び２％ＦＣＳ）溶液を置くことによって、健康な細胞から破砕物を分離し、５００ｇで１５分間回転させた。次いで、生きた細胞を界面から注意深く採集し、洗浄した。
【００２６】
ＥｔｘＢ及び抗体
非毒性の組み換えＥｔｘＢ、１１８．８モノクローナルマウス抗ＥｔｘＢ抗体、及びウサギ抗ＥｔｘＢ血清は、ブリストル大学のＴ．Ｒ．Ｈｉｒｓｔ教授から頂いた。ＣＳ１−４マウス抗ＬＭＰ−１抗体（Ｄａｋｏ）、ＦＩＴＣ抱合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）、テキサスレッド抱合ロバ抗ウサギＩｇＧ抗体、及びＦＩＴＣ抱合ロバ抗マウスＩｇＧ抗体（何れもＪａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手）。
ＥｔｘＢによる細胞の処理
１０μｇ／ｍＬのＥｔｘＢと共に１×１０６細胞／ｍＬを含有するＬＣＬ培養物をインキュベートし、各実験に明記した時間、３７℃、５％ＣＯ２加湿雰囲気下、２ｍｌのウェル中に置いた。これらの条件は、キャッピングと内部移行を誘導し得る条件である。０．１％のアジ化物を含有する氷冷したＰＢＳ中で洗浄することによって、この工程を停止させた。陰性対照細胞は、上記の条件からＥｔｘＢを除去してインキュベートした。これとは別の陰性対照群は、ＥｔｘＢで処理した細胞からなるが、４℃でインキュベートした（これによって、表面への結合は可能であるが、キャッピングと内部移行は阻害される）。
【００２７】
フローサイトメトリー
ＬＭＰ１とＬＣＬを検出するために、リン酸リジン緩衝液中の１％パラホルムアルデヒドを用いて、４℃で１時間、細胞を固定した。続いて、ＣＳ１−４（１：１００）、次にＦＩＴＣ抱合抗マウスＩｇＧ（１：１００）を用いて、細胞にＬＭＰ１を間接的に標識した。ＬＣＬへのＥｔｘＢの結合親和性を測定する場合には、様々な濃度のＥｔｘＢで細胞を１時間４℃で処理し、洗浄した後、１１８．８（１：２０）を一次抗体として、ＦＩＴＣ抱合抗マウスＩｇＧ抗体（１：１００）を二次抗体として用いて、ＥｔｘＢを標識した。何れの実験でも、適切に染色した後、細胞を一度洗浄し、Ｂｅｃｔｏｎ ＤｉｃｋｉｎｓｏｎのＦＡＣＳｃａｎシステムを用いて分析した。
【００２８】
共焦点顕微鏡
リン酸リジン緩衝液中の１％パラホルムアルデヒドを用いた固定を行う前に、上述のように、ＥｔｘＢを用いて、４℃又は３７℃で４時間、細胞を処理した。これらは、まず、ＣＳ１−４（１：５０）とウサギ抗ＥｔｘＢ血清（１：５００）で処理した後、二次抗体としてＦＩＴＣ抱合ロバ抗マウスＩｇＧ抗体（１：１００）及びテキサスレッド抱合抗ウサギＩｇＧ抗体（１：５００）で処理した。次いで、１０−２０μＬのＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ（Ｖｅｃｔｏｒ）中に、細胞ペレットを再懸濁し、スライド上に載置した。Ｚｅｉｓｓの直立走査共焦点顕微鏡を用い、４０倍及び６０倍の倍率で、ＬＭＰ１とＥｔｘＢを同時に可視化した。
【００２９】
ゲル電気泳動とウェスタンブロッティング
ゲル電気泳動とウェスタンブロッティングには、Ｐｒｅ−ｃａｓｔ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓミニゲルセット（Ｎｏｖｅｘ）及び標準的なＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて、最大１０時間にわたって、ＥｔｘＢと共に又はＥｔｘＢを除いてインキュベートしたＬＣＬ中のＬＭＰ１を検出した。次いで、異なる時点で、等しい数の細胞を採取した。
【００３０】
非特異的なタンパク質の分解を抑えるためにプロテアーゼ阻害剤（１：７最終容量）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を加えた、予め混合したサンプル緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）中に、細胞ペレット全体を可溶化することによって、ミニゲルで使用するための細胞可溶化液を調製した。この後に、５分間煮沸し、３０秒間音波処理を行った。４−１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓグラジエントゲル中での電気泳動によって、等しい細胞数（１．３×１０５細胞／レーン）を含有する可溶化液を分離した。次いで、ニトロセルロース膜上への転写を行った。非特異的部位のブロッキングは、０．０５％Ｔｗｅｅｎを含有するＴＢＳ中の５％無脂肪乳を用いて行った。ブロットは、まずＣＳ１−４（１：５０）と共にインキュベートし、続いて、ＨＲＰ抱合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と共にインキュベートした。最後に、ＨＲＰ基質混合液（Ｐｉｅｒｃｅ）中にブロットを置き、Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ）に曝露させた。
【００３１】
標準的なＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの場合、サンプル緩衝液（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８、２％ ２−ＭＥ、１０％グリセロール、０．０１％  ブロモフェノールブルー）を変えたことを除いて、同じようにサンプルを調製した。同じく、等しい細胞数（１×１０６細胞／レーン）を各レーンにロードし、１２−２０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドグラジエントゲルを用いて分離した。ニトロセルロース膜上への転写、非特異的部位のブロッキング、及びＣＳ１−４のＬＭＰ１の結合は、ミニゲルシステムの場合と同様に行った。アルカリホスファターゼ抱合二次抗体（Ｓｉｇｍａ）を使用し、ＡＬＰ基質（Ｖｅｃｏｒ）を用いた処理によって、ＬＭＰ１特異的なバンドの検出を行った。
【００３２】
ＣＤ８＋株と標的細胞
ＷＴポリＴは、ＬＭＰ２に特異的なポリクローナルＣＴＬ株である。ＤＡ  ｃ６４は、標的ＨＬＡ−Ａ２．０１拘束性エピトープＣＬＧ（ＬＭＰ２上の４２６−４３４位に位置する配列ＣＬＧＧＬＬＴＭＶを有する９マーのペプチド）に対するＬＭＰ２特異的なＴ細胞クローンである。細胞障害アッセイに際しては、自家のＬＣＬを標的細胞を用いた。これらのものは、バーミンガム大学、ＣＲＣ癌研究所（ＣＲＣ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）のＡ．Ｂ．Ｒｉｃｋｉｎｓｏｎ教授から頂いた。
【００３３】
細胞障害アッセイ
本実験は、バーミンガム大学のＣＲＣ癌研究所と共同で行った。標準的な５時間のクロム放出アッセイにおけるエフェクターとして、ＷＴポリＴ及びＤＡ  ｃ６４を使用した。以下の処理：（１）ＥｔｘＢのみに２時間曝露、（２）ＣＬＧ（０．１μｇ／ｍＬ）に２時間曝露、洗浄、ＥｔｘＢと共に２時間インキュベーション、又は（３）ＬＭＰ２をコードする組み換えワクシニアウイルスに一晩感染、洗浄、次いでＥｔｘＢに２時間曝露のうちの一つを行った後、徹底的に洗浄してから、異なる標的細胞群を使用した。対照標的は、ＥｔｘＢを加えずに調製した。既述のように調製した後、３７℃で１時間、５１Ｃｒで標的細胞を標識し、３回洗浄し、９６Ｕ底ウェルプレートの二つ組ウェルの中に、既知のエフェクター（ｅｆｆｏｒｔ）：標的比率で、標的細胞をエフェクターと共に入れた。エフェクター細胞の代わりに、１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ溶液中で標的細胞をインキュベートすることによって最大の放出が得られたのに対し、ＲＰＭＩ培地のみの中で標的細胞を処理すると自発的放出が得られた。５時間のインキュベーション後に、ガンマカウンターを用いて、上清中の放射能の定量を行った。
【００３４】
フローサイトメトリーによるＬＣＬ上に存在するＬＭＰ１の相対量の測定
使用した様々なリンパ芽球細胞上に存在するＬＭＰ１の量の変動を測定するために、フローサイトメトリーを使用した。これは、その後の実験で使用すべきＬＣＬの選択に影響を与え得る。
【００３５】
この実験では、６つのＬＣＬ、すなわち、ＢＥＲ、ＨＯＭＩＩ、１１０Ｗ１０、ＩＲ、ＪＧ、及びＷＴ１８を使用し、ＥＢ４を陰性対照とした。抗体結合部位がタンパク質の細胞質Ｃ末端上に位置するので、ＣＳ１−４をＬＭＰ１に結合させる前に、細胞の固定と透過処理を必要とした。
【００３６】
図１は、６つのＬＣＬの間には、ＬＭＰ１の相対量に有意な差が見られないことを示している。このことは、（１）ＥＢＶを安定的に形質転換したＢ細胞集団によって必要とされるＬＭＰ１の量は宿主細胞に依存しないこと、及び（２）使用したＬＣＬの選択は、ＬＭＰ１又はＬＭＰ２の抗原加工経路に対するＥｔｘＢの影響を調べるその後の実験の結果に対して最小限の影響しか与えないことを示していた。
【００３７】
フローサイトメトリーによるＥｔｘＢの滴定
最大７２時間までは、ＥｔｘＢとのインキュベーションによって、ＬＣＬの生存性が影響を受けないことが、本発明者らの研究室によって以前に示されているが（データは図示せず）、本発明者らは、細胞表面上のＧＭ１への結合を最大化するために、使用すべきＥｔｘＢの至適濃度を決定する必要があった。
【００３８】
異なる濃度で、１×１０６細胞／ｍＬのＬＣＬをＥｔｘＢと共にインキュベートした後、ＬＣＬ中に見出されるＥｔｘＢの量を測定するために、フローサイトメトリーを用いた分析を実施した（図２）。
【００３９】
この結果から、ＬＣＬへのＥｔｘＢの結合は、１．０〜２０．０μｇ／ｍＬの濃度の間で最大となるようであるが（表１）、これらの群間での差は小さかった。これらの結果に基づいて、続く実験では、１０μｇ／ｍＬの濃度のＥｔｘＢを使用した。
【００４０】
【表１】
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表１−表記のごとく、様々な濃度のＥｔｘＢでＬＣＬを処理した。次いで、これらのＬＣＬのＥｔｘＢを標識し、ＦＡＣＳを用いて分析した。１．０−２０．０μｇ／ｍＬのＥｔｘＢで細胞を処理すると、最強のシグナルが得られ、これらの濃度でＥｔｘＢの結合親和性がより高いことを示している。
【００４１】
免疫蛍光共焦点顕微鏡によって明らかとなったＥｔｘＢとＬＭＰ１の同時キャッピング
前述のように、ＧＭ１とＬＭＰ１は共に、細胞表面上の糖スフィンゴ脂質に富む（ＧＳＬ）ドメイン上に見出される。ＧＭ１への結合後のＥｔｘＢのキャッピングと内部移行によって、ＬＳＬ中のＬＭＰ１の分布が変化する可能性があるかもしれないと考えた。
【００４２】
蛍光色素抱合抗体でＥｔｘＢを標識することによって、その後にキャッピングと内部移行を伴うＧＭ１へのＥｔｘＢの結合を、免疫蛍光顕微鏡を用いて実証することができた。第二に、ＥｔｘＢとＬＭＰ１との共存及びキャッピング後のＬＭＰ１の再分布は、異なる蛍光色素でＬＭＰ１を標識することによっても示すことができた。細胞表面上の標識タンパク質の分布と細胞内の標識タンパク質の分布をともに可視化するために必要な感度を与えるので、共焦点顕微鏡を用いた。
【００４３】
４℃で処理した細胞を可視化すると、テキサスレッドで標識したＥｔｘＢが、細胞表面全体にわたって点状に分布していることが明らかとなり（図３）、ＧＭ１への結合は起こったが、キャッピングは見られなかったことを示している。ＦＩＴＣ標識されたＬＭＰ１も、予測どおり、細胞表面全体にわたって広く斑に分布していた。より重要なことには、ＥｔｘＢとＬＭＰ１の同時検出を実施すると、細胞表面上には、ＥｔｘＢとＬＭＰ１の共存が見られた。
【００４４】
３７℃では、細胞の一極方向へのＥｔｘＢのキャッピングが顕著であり、これによって、ＬＭＰ１も同様のキャッピングを行うように誘導された（すなわち、同時キャッピングが起こった）（図４）。しかしながら、細胞内にＥｔｘＢとＬＭＰ１が分布していることを示すことは不可能であった。これは、（１）僅かな量のＥｔｘＢ及びＬＭＰ１しか内部移行しなかった、（２）内部移行後に、ＥｔｘＢとＬＭＰ１が細胞内で急速に分解された、（３）相対的に小さなＬＣＬ（平均サイズ１０−２０μ）中では、十分に薄い「光学的切片」（最小１μｍ）を得ることが困難、（４）細胞内の細胞質区画と核区画との境界をより明確にするカウンター染色が存在しないことに起因する可能性がある。（１）の推定が正しいものと思われる。
【００４５】
ＥｔｘＢ処理後のウェスタンブロットでは、ＬＭＰ１の分解は全く見られない
ＬＭＰ１はＥｔｘＢと共存しており、同時キャッピングが起こるという共焦点顕微鏡から得られた証拠に基づいて、ＬＭＰ１がＥｔｘＢと共に実際に内部移行するかどうかを示すために、さらなる調査が必要となった。内部移行後に、ＬＭＰ１は、新規な分解経路に入り、このため、新しい分解産物を産生すると考えられた。ＬＭＰ１又は他の膜貫通タンパク質全般を取り除くには、膜貫通ドメインを分かつ細胞質のリバースループ中に切れ目を作出する特異的なタンパク質分解酵素が必要であると考えられる。これが起これば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動中で全細胞可溶化液を分離すると、完全長のＬＭＰ１の減少が検出されるであろう。実際に、この過程で産生される初期の断片は、ＣＳ１−４抗ＬＭＰ１抗体によって認識される完全な状態のカルボキシル末端をなお含有しているであろう。これを調べるために、グラジエントゲルを用いて、分解後のバンド、とりわけＬＭＰ１の小さな断片の分離度を向上させた。細胞可溶化液の調製中には、サンプルを氷上に保ち、可溶化液にプロテアーゼ阻害剤を添加することによって、溶解中に放出される内在性プロテアーゼの効果を最小化するための注意を払った。転写後に、イムノブロットのポンソーＳ染色を使用して、可溶化液が等しくロードされていることをチェックした。幾つかの実験では、無関係なＥＢＶタンパク質であるＥＢＮＡをウェスタンブロット中に検出することによって、内部標準を与えた。
【００４６】
図５は、４−１２％のミニゲルを用いて得られた典型的な結果を示している。ＬＣＬに由来する可溶化液を含有するレーンにのみ完全長のＬＭＰ１が明確に検出されたのに対して、ＥＢＶ陰性の対照細胞株ＥＢ４中には完全長のＬＭＰ１は存在しなかった。しかしながら、ＥｔｘＢによる処理時間を増加させても、完全長ＬＭＰ１バンドは目に見えて減少しなかった。また、ＬＭＰ１断片も検出されなかった。
【００４７】
ミニゲルは良好な品質のブロットを与えたが、各レーンにロードすることができるタンパク質の量に制限があった。このため、主として、レーン当りに添加される可溶化液の量を増加させることによって感度を向上させるために、標準ゲルに切り替えた。同様に、バンドの分離度を改善するために、グラジエントゲル（１２−２０％）を用いた。
【００４８】
同じく、完全長のＬＭＰ１が容易に検出された（図６）が、ＥｔｘＢとのインキュベーションを延長しても、完全な状態のＬＭＰ１の有意な減少は存在せず、又は何らの分解バンドも見られなかった。この免疫ブロット群には、バックグラウンドの増加という更なる問題が存在したので、産生されたかもしれない小断片を認識することが困難であった。
【００４９】
これまでのところ、ＥｔｘＢ後のＬＭＰ１の内部移行及び分解の過程を、共焦点顕微鏡及びウェスタンブロッティングを用いて実証することには成功していない。これは、以下の理由、（１）仮定が誤っており、内部移行及び分解という過程は起こっていない、（２）これまでに使用した方法は、内部移行し分解された極く微量のＬＭＰ１を検出するには感度が十分でない、（３）ＥｔｘＢ処理直後に、Ｃ末端のタンパク質分解が生じ、用いた抗ＬＭＰ１抗体（ＣＳ１−４）に対する抗体結合部位が失われる、又は（４）ＬＭＰ１の回転が迅速であるために、現在のプロトコールを用いると、検出すべき細胞内での総ＬＭＰ１の小さな変化を妨げることによるものかもしれない。
【００５０】
５１Ｃｒ放出アッセイによって検出されたＣＴＬ ＥｔｘＢ被処理ＬＭＰ２特異的標的細胞による死滅の増大
細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、ＨＬＡクラスＩ分子ともに細胞表面上に提示された抗原を、たとえこれらの抗原の量が微量であっても認識することができる。ＥｔｘＢの添加がＬＭＰ１及びＬＭＰ２を誘導して、代替抗原加工経路を引き起こし、保護を受けた状態のエピトープがより効率的に提示されるようになることが正しければ、ＥｔｘＢ処理された標的細胞に作用するＬＭＰ１又はＬＭＰ２に対するＣＴＬ株を用いた細胞障害アッセイによって、これらの潜伏膜タンパク質の加工及び提示に対するＥｔｘＢの効果が極めて感度よく且つ特異的に測定されるであろう。
【００５１】
幾つかのＨＬＡクラスＩ拘束性ＬＭＰ２エピトープが同定されており、ＬＭＰ２に対するＣＤ８＋株及びそのエピトープが作製されている（Ｒｉｃｋｉｎｓｏｎ）。逆に、ＬＭＰ１エピトープは、現在のところ、一つしか報告されていない（Ｋｈａｎｎａ）。このため、ＥｔｘＢ処理された自家標的細胞に対して、ＬＭＰ２特異的なＴ細胞株を用いたクロム放出アッセイを使用した。
【００５２】
これらの実験では、２つのＣＴＬ株、ＷＴポリＴとＤＡ  ｃ６４を用いた。標的細胞として使用した自家ＬＣＬは、以下の３つのグループに分けられた。（１）ＥｔｘＢのみで処理、（２）ＥｔｘＢと共にインキュベートする前にＣＬＧペプチドを短時間を与える、（３）ＥｔｘＢを添加する前に、ＬＭＰ２Ａ遺伝子を有するワクシニアウイルスをトランスフェクト。
【００５３】
表２から、ＬＣＬにＥｔｘＢのみを添加すると、ＤＡ  ｃ６４クローンのＣＴＬ応答が４倍増加し、これより小さいがポリクローナル株ＷＴ  ポリＴもなお有意に二倍増加することが明らかである。ｖａｃＬＭＰ２のみで処理した標的と比べて、ＬＭＰ２を有するワクシニアウイルス（ｖａｃＬＭＰ２）を予めトランスフェクトしたＥｔｘＢ処理標的に対する活性が向上したことも、この知見と合致した。ＥｔｘＢによるＬＭＰ２特異的なＣＴＬ応答の増強は、図７及び８により明確に記されている。
【００５４】
しかしながら、ペプチドを短時間与えた標的細胞をＥｔｘＢで処理しても、細胞障害活性は増大しなかった。標的細胞を短時間処理するために用いたペプチドの量が、細胞表面上に存在する利用可能な結合部位を飽和させたので、至適な認識をもたらし、このため最大のＣＴＬ応答をもたらしたということが、一つの説明として考えられるであろう。
【００５５】
この一群の結果は、ＥＢＶ感染した細胞をＥｔｘＢで処理することが、ＬＭＰ２の加工と提示の増強を引き起こすことができ、該タンパク質に対するＣＴＬ反応の顕著な増加をもたらすことの最初の証拠である。
【００５６】
【表２】
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表２−ＷＴポリＴ及びＤＡ  ｃ６４を用いた場合の異なる標的細胞の特異的溶解の％。ＥｔｘＢで処理したＤＡ ｃ６４のＬＣＬに対する及びｖａｃＬＭＰ２トランスフェクトＬＣＬに対する活性が増加していた。程度は低いが、これらの結果はＷＴポリＴにも同じように見られた。前もってＣＬＧペプチドを短期間与えたＬＣＬは、ＥｔｘＢ処理にもかかわらず、ＣＴＬによる死滅に対してさらに影響を受けやすくなるということはなかった。
【００５７】
ワクチンの開発におけるアジュバントとして、又は近年には融合タンパク質として、外来抗原の細胞内への送達を増大させるために、ＥｔｘＢは広く使用されてきたが、これら一連の実験は、細胞膜上に存在する内在性タンパク質に対して同様の効果を有していることを初めて示した。
【００５８】
この仮説の要を成すのは、ＥｔｘＢは、その受容体であるＧＭ１と同一のドメイン内に見出される膜タンパク質に対してのみ作用すると思われるということである。ＥＢＶで形質転換されたリンパ芽球細胞株上に見出されるＥＢＶの潜伏膜タンパク質は、この厳格な基準を充足している。
【００５９】
ＥｔｘＢは、細胞表面上のＬＭＰ１の分布の変化を引き起こすことが示されている。より重要なことは、ＬＭＰ２のケースで示されたように、ＥｔｘＢが抗原加工経路を変化させて、ＣＴＬ反応の劇的な増大をもたらすらしいということである。
【００６０】
これらの結果は初期段階のものにすぎないが、ＣＴＬ認識を増強するのに、及びＬＭＰ２を発現している標的（おそらくは、ＬＭＰ１を発現している標的も）を死滅させるのにＥｔｘＢを使用することができることを示している。このため、第ＩＩ潜伏パターンを示しているＥＢＶ関連腫瘍（特に上咽頭癌及びホジキン病）の免疫療法において、このことは重要な役割を果たすことができる。
【００６１】
（Ｂ）
ＥｔｘＢとその変異体
非毒性の組み換えＥｔｘＢについては先述した。これらの実験では、ＥｔｘＢの二つの変異体型、すなわちＧ３３ＤとＨ５７Ａも使用した。Ｇ３３Ｄは、Ｇｌｙ−３３からＡｓｐへの置換を含有しており、この置換はＧ３３ＤのＧＭ１への結合を阻害するのに対して、Ｈ５７ＡはＧＭ１に結合するが、５７位のＨｉｓがＡｌａに置換されているために、免疫調節活性を欠如している。ＥｔｘＢと上記の変異体は、ブリストル大学のＴ．Ｒ．Ｈｉｒｓｔ教授から頂いた。
【００６２】
Ｗ６／３２及びＤＡ６．２３１上清
Ｗ６．３２培養上清を集め、汎ＨＬＡクラスＩブロッキング抗体源として使用したのに対して、ＤＡ６．２３１から得た上清は、同様に、抗ＨＬＡクラスＩＩブロッキング抗体源として使用した。
【００６３】
ペプチド
ＥＢＶの潜伏抗原中に存在する公知のエピトープに対応するペプチドは、標準的な９−フルオレニルメチオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）化学反応（ブリストル大学）によって作製し、既知の濃度でＤＭＳＯ中に溶かした。
【００６４】
ポリクローナル細胞障害性ＣＤ８＋Ｔ細胞株
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、健康な血清陽性ドナーから得た。磁気細胞分別（ＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、ＣＤ８＋細胞を陽性的に選択し、別に取り分けた。次いで、残りのＰＢＭＣを５０μＭの公知のペプチドにより１時間３７℃で処理した。次いで、これらを三回洗浄し、ＣＤ８＋細胞と共にプールした。次いで、２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７を補充した完全ＲＰＭＩ培地中に、１×１０８細胞／ｍＬになるように、プールした前記細胞を播種した。第３日目に、１０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を加えた。その後、２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７と１０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含有する増殖培地を、週に二回、培養物に与えた。第１２日目に、ＣＤ８＋細胞を再び磁気で選択し、計数した。次いで、培養物中に存在する残りの細胞を、５０−１００μＭのペプチドで１時間処理した後、３７℃でさらに１時間、５０μｇ／ｍＬのマイトマイシン−Ｃで処理した。次いで、これらを三回洗浄し、応答物：刺激物の比率が２：１になるように、ＣＤ８＋細胞に加えた。続いて、これらの培養物を細胞障害アッセイ中で試験し、マイトマイシンＣ処理したＬＣＬで毎週再刺激した。
【００６５】
細胞障害アッセイ
上記ＰＢＭＣと同一のドナーから得た自家ＬＣＬを標的細胞として使用した。これらは、（１）単独で使用するか、又は（２）１０μｇ／ｍＬのＥｔｘＢ又はその変異体の一つで４時間又は一晩処理した。続いて、７０−１００μＣｉの放射性クロムで９０分間、標的を標識した。幾つかの標的には、最後の６０分間、５μＭの最終濃度になるように特定のペプチドを加えるか、又はＤＭＳＯ溶媒を加えた。続いて、これらを洗浄し、標準的なクロム放出アッセイで、４時間の間、エフェクターと共にインキュベートした。ＨＬＡクラスＩ抗原提示の阻害を伴う実験の場合、エフェクター細胞を添加する前に、１：１０のＷ６／３２又はＤＡ６．２３１上清と共に、標識した前記標的を室温で１時間インキュベートした。
【００６６】
実験Ｂ１
ＬＣＬのＥｘｔＢ処理は、ＬＭＰ１及びＬＭＰ２特異的ＣＴＬによる認識と死滅を増大させたが、ＥＢＮＡ３Ａ特異的ＣＴＬによる認識と死滅は増大させなかった
ドナーＤＷ（ＨＬＡ−Ａ０２０１、Ａ２３、Ｂ７、Ｂ４９、Ｃ７）から、二つのペプチド特異的ポリクローナルＣＴＬ株を作製した。一方は、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＬＭＰ１エピトープＹＬＬＥＭＬＷＲＬ（ＹＬＬ）に対して生じたものであるのに対して、他方は、ＨＬＡ−Ａ２．０１拘束性であるＬＭＰ２エピトープＣＬＧＧＬＬＴＭＶ（ＣＬＧ）に対して特異的であった。これらの株を幅広いペプチドに対して試験し、これらの株を生じせしめたペプチドに対して特異的であることを明らかにした（図９及び１０）。
【００６７】
図９及び１０。単独で使用する自家ＬＣＬ標的又は様々な公知のクラスＩペプチドで短時間処理した自家ＬＣＬ標的又は等量のＤＭＳＯ溶媒に対して、それぞれ、図９及び１０に示されているＣＬＧ特異的及びＹＬＬ特異的ＤＷ  ＣＴＬ株を使用した。ＬＬＤは、ＥＢＮＡ３ＣエピトープであるＬＬＤＦＶＲＦＭＧＶを表し（ＨＬＡ−Ａ０２０１を介して拘束される）、ＰＹＬは、ＨＬＡ−Ａ２３０１拘束性ＬＭＰ２エピトープであるＰＹＬＦＷＬＡＡＩに対応する。ここで調べた両ＣＴＬ株は、それらを生じせしめたペプチド、すなわちＹＬＬ（公知のＨＬＡ−Ａ２  ＬＭＰ１拘束性ペプチドＹＬＬＥＭＬＷＲＬに対応する）及びＣＬＧ（アミノ酸配列ＣＬＧＧＬＬＴＭＶを有し、公知のＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性ＬＭＰ２エピトープである）に対して特異的であることを明らかに実証している。
【００６８】
これらの株は何れも、ＥｔｘＢで処理された自家ＬＣＬ標的を認識し、溶解することができ（図１１及び１２）、未処置ＬＣＬのバックグラウンドの死滅に比べて、両株における死滅のレベルは有意に高かった。ＥｔｘＢの効果は立ち上がりが早く、持続的であり、標的細胞のＣＴＬによる認識と死滅の増強は、４時間後でも明確で、一晩インキュベーションを行った後でさえ、同様のレベルで維持されていた。
【００６９】
ＥＢＮＡ３Ａは、核内にのみ発現され、細胞膜上には発現されていない別のＥＢＶ潜伏抗原である。ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＥＢＮＡ３ＡエピトープであるＲＹＳＩＦＦＤＹ（ＲＹＳ）に対して特異的であった別のドナーＯＫＷ（ＨＬＡ−Ａ１１、Ａ２４、Ｂ４０、Ｃ４、Ｃ７）からＣＴＬ株を得た。ＬＭＰ１及びＬＭＰ２に対して特異的なＣＴＬ株とは異なり、ＥＢＮＡ３Ａ特異的なＣＴＬ株によっては、ＥｔｘＢで処理した標的ＬＣＬの死滅は増加しない（図１３）。このことは、脂質内に浮かんだ膜結合タンパク質の抗原加工経路及び提示経路を、ＥｔｘＢは調節することができるにすぎないという仮説を支持する。
【００７０】
図１１、１２、及び１３。  図１１では、ＣＬＧ特異的ＤＷ  ＣＴＬによる、ＥｔｘＢ処理したＬＣＬ標的の死滅レベルが、未処理ＬＣＬに対して見られたレベルより劇的に高かった。自然発生的なカウントと最大カウント間の絶対数と比率が、全ての標的群で概ね同等であったので（データは図示せず）、これは、ＥｔｘＢ処理の結果、細胞の透過性が増大したことによるものではなかった。同様に、ＹＬＬ特異的ＤＷ  ＣＴＬ株を使用したときにも、この効果は見られた（図１２）。何れのケースでも、かかる細胞障害性死滅の増加は、ＥｔｘＢで標的細胞を４時間処理するか、一晩インキュベートした後であるかにかかわらず同様であった。このことは、ＬＭＰ１及びＬＭＰ２に対するＥｔｘＢの効果が迅速且つ持続的であることを示唆している。ＨＬＡ−２４拘束性ＥＢＮＡ３ＡエピトープであるＲＹＳＩＦＦＤＹ（ＲＹＳ）に対して特異的な対照ＣＴＬ株も類似の実験に使用した。しかしながら、ＥｔｘＢで標的ＬＣＬを処理したにもかかわらず、細胞障害性の死滅は増加しなかった（図１３）。このことは、ＥｔｘＢが、存在する膜結合抗原の抗原加工経路及び提示経路に影響を与え得るにすぎないことを示唆している。
【００７１】
実験Ｂ２
ＥｔｘＢ処理したＬＣＬのＣＴＬによる死滅の増加は、ＨＬＡクラスＩによって媒介される
ＥｔｘＢ処理後のＣＴＬによる死滅の増加がＨＬＡクラスＩによって媒介されているかどうかを決定するために、汎ＨＬＡクラスＩ抗体（ｐａｎ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）を含有するＷ６／３２上清と共に、ＥｔｘＢ処理したＬＣＬをインキュベートした。これによって、ＣＤ８＋ＣＴＬ上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）とＬＣＬ標的上のＨＬＡクラスＩ分子間の相互作用が阻害される。
【００７２】
図１４及び１５。標的ＬＣＬのＥｔｘＢ処理又はペプチドによる短期間の処理を行った後、汎ＨＬＡクラスＩブロッキング抗体Ｗ６／３２を使用した。ペプチド処理した標的の関連ＣＴＬ株による溶解は効率的にブロックされたのに対して、抗ＨＬＡクラスＩＩ抗体ＤＡ６．２３１で処理した標的は影響を受けないままであった。この効果は、同様に、ＥｔｘＢ処理した標的群にも見られ、ＬＭＰ１及びＬＭＰ２に対するＥｔｘＢの効果が、ＨＬＡクラスＩ抗原提示経路によって媒介されるものであることを示唆している。
【００７３】
図１４及び１５に示されているように、Ｗ６／３２抗体と共にインキュベートすると、ＥｔｘＢ処理した標的に対するＹＬＬ特異的ＤＷ  ＣＴＬ及びＣＬＧ特異的ＤＷ  ＣＴＬの両者による死滅のレベルが著しく減少した。関連ペプチドで短期間処理した標的にも、同様の予想された減少が見られた。ＤＡ６．２３１抗クラスＩＩ抗体を使用したときには、ＥｔｘＢの効果に目に見えるほどの変化は存在しなかった。
【００７４】
このように、ＥｔｘＢ処理後のＣＴＬによる死滅の増加は、ＬＭＰ１及びＬＭＰ２の両者の中に存在する既知のクラスＩエピトープの産生が増加し、続いて、このエピトープがＨＬＡクラスＩ分子と複合体を形成し、ＬＣＬ標的の表面上に提示されることによるものであると思われる。
【００７５】
実験Ｂ３
ＬＭＰ１及びＬＭＰ２に対するＥｔｘＢの影響にはＧＭ１の結合が必要であるが、ＧＭ１の免疫調節活性には依存しない
ＥｔｘＢは、Ｂ細胞中のＭＨＣクラスＩＩ及びＣＤ２５のアップレギュレーションやＮＦκＢ依存性及びカスパーゼ−３依存性の経路を介したマウスＣＤ８＋Ｔ細胞中でのアポトーシスの誘導など幾つかの免疫調節効果を有していることが知られている。
【００７６】
図１６及び１７。ＥｔｘＢの非結合変異体であるＧ３３Ｄで処理した標的細胞は、ＣＴＬ株によって認識されず、死滅しなかった。このことは、ＥｔｘＢがそのガングリオシド受容体ＧＭ１に結合するには、ＬＭＰ１及びＬＭＰ２に対するその効果が必要であることを示している。ＧＭ１に結合するが、ＮＦκＢ及びカスパーゼ依存性であるマウスＣＤ８＋Ｔ細胞中でのアポトーシスの誘導などの既知の免疫調節効果を有していない別の変異体であるＨ５７Ａも用いた。この場合、ＬＭＰ１及びＬＭＰ２に対するＣＴＬによる死滅の増加は阻害されず、ＥｔｘＢを介したシグナル伝達が、ここでは役割を果たしていないことを示唆している。
【００７７】
図１６及び１７から、非結合変異体Ｇ３３Ｄによる処理後には、ＣＴＬによる死滅が増大していないので、ＥｔｘＢのＬＭＰ１及びＬＭＰ２に対する効果には、ＧＭ１へのＥｔｘＢの結合が必要不可欠であることが明らかである。しかしながら、ＧＭ１に結合するが免疫調節活性を欠いている変異体Ｈ５７Ａは、ＥｔｘＢを用いたときに見られたように、ＣＴＬの増大をもたらす。このため、ＬＭＰ１及びＬＭＰ２の加工に対するＥｔｘＢの効果、及びこれに引き続く免疫原性ペプチドの産生は、その免疫調節活性に依存しないようである。
【００７８】
【参考文献】
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2004530639.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１】
同一の条件を用いた、６つの異なるＬＣＬ株のＬＭＰ１による標識を示す一連のグラフ。
【図２】
様々な濃度のＥｔｘＢのＬＣＬへの結合を示すグラフ。
【図３】
形質膜上へのＥｔｘＢの結合を示す免疫蛍光顕微鏡写真。
【図４】
細胞の一極へのＥｔｘＢのキャッピングを示す免疫蛍光顕微鏡写真。
【図５】
ＥｔｘＢ処理後における、ＬＣＬ中のＬＭＰ１の検出を示すウェスタンブロット。
【図６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のウェスタンブロットによるＬＭＰ１の検出を示す図。
【図７】
様々な標的細胞に対するＷＴポリＴの細胞障害活性を比較した棒グラフ。
【図８】
様々な標的に対するＤＡ  ｃ６４のＣＴＬ活性をグラフで表した図。
【図９】
様々なペプチドで短時間処理したＬＣＬに対するＣＬＧ特異的なＤＷ  ＣＴＬを示す棒グラフ。
【図１０】
様々なペプチドで短時間処理したＬＣＬに対するＹＬＬ特異的なＤＷ  ＣＴＬを示す棒グラフ。
【図１１】
ＥｔｘＢ処理したＬＣＬに対するＣＬＧ特異的なＤＷ  ＣＴＬを示すグラフ。
【図１２】
ＥｔｘＢ処理したＬＣＬに対するＹＬＬ特異的なＤＷ  ＣＴＬを示すグラフ。
【図１３】
ＥｔｘＢ処理したＬＣＬに対するＲＹＳ特異的なＯＫＷ  ＣＴＬを示すグラフ。
【図１４】
抗クラスＩＡｂで処理したＬＣＬに対するＣＬＧ特異的なＤＷ  ＣＴＬを示す棒グラフ。
【図１５】
抗クラスＩＡｂで処理したＬＣＬに対するＹＬＬ特異的なＤＷ  ＣＴＬを示す棒グラフ。
【図１６】
様々なＥｔｘＢ変異体で処理したＬＣＬに対するＣＬＧ特異的なＤＷ  ＣＴＬを示す棒グラフ。
【図１７】
様々なＥｔｘＢ変異体で処理したＬＣＬに対するＹＬＬ特異的なＤＷ  ＣＴＬを示す棒グラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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