(57)【要約】      （修正有）【課題】食品加工又は環境浄化など工業的に用いられる、好熱性に優れかつ強力な酵素活性を有する酵素剤及び微生物製剤等を提供する。【解決手段】Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ属に近縁で、新規な好熱性細菌、バチルス・エスピーＭＵ３（ＮＩＴＥ  ＡＰ−１５６号）として寄託された、耐熱性プロテアーゼ生産菌。この菌の産生する酵素は、分子量約５７，０００、優れた熱耐性（４５〜８０℃で生育可能）を示し、広いｐＨ範囲（至適ｐＨは６付近）で、高いタンパク質分解能を有する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
耐熱性に優れたプロテアーゼを産生する能力を有し、微生物特許寄託センター第ＮＩＴＥ  ＡＰ−１５６号として寄託された新規バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＭＵ３。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
【背景技術】
【０００２】  産業的に利用される多くの酵素は主としてアミラーゼ、プロテアーゼあるいはリパーゼであり、洗剤用、食品加工用など、その応用範囲は広がっている。最近における酵素利用の特長は，酵素の種類が多岐であり，利用の形態も様々である。しかし、酵素はタンパク質であるために熱変性により失活しやすいという弱点がある。【０００３】  好高熱性細菌はかなり古くから知られており、その存在は広く高温環境に確認できる。たとえば温泉などからも分離することができるとされている。好熱性細菌から得られる酵素は、高温領域に最適温度を持つ耐熱性酵素であることが期待できる。高温領域で効率よく作用する酵素の応用は、例えば、腐敗を起こさない高温度での食品の品質改善（低アレルゲン食品や機能性ペプチドの創出、タンパク質性廃物からのアミノ酸の製造など）を実現できる。また、これまで高温で熱処理後の原料を酵素処理するためには冷却工程が必要であるが、高温で失活しない酵素を用いることで、冷却工程が必要なくなり、コストダウンにも繋がる。さらに、有機性廃棄物をコンポスト化する際、６０〜８０℃の高温となる発熱期での利用、病原菌の増殖を抑制する高温下での廃水処理への利用などがあげられる。また、高温性細菌由来の酵素を検討することで、高温性細菌の生理学的機能及び高い温度への酵素適用機構を解明する上で意義深いものと思われる。好熱菌の生産する熱安定な酵素が、酵素工学の発展にとって重要な意味を持っていることは容易に思い至ることである。【０００４】  しかしながら、これまで開発されてきた常温で働く酵素に比べ、高温領域で作用できる酵素は数や種類に制限があり、多くの分野で新たな熱耐性酵素の開発が望まれている。例えば、熱耐性酵素の利用として最も進んでいる分野にＰＣＲ法での熱耐性ポリメラーゼを活用した技術がある。この分野でも、更に熱安定性に優れ且つ強い活性を有する酵素が望まれている。（非特許文献１、特許文献１参照）【０００５】
【非特許文献１】  Ｙ．Ｉｓｈｉｎｏ，ａｎｄ  Ｓ．Ｉｓｈｉｎｏ（２００１）Ｎｏｖｅｌ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３３４，２４９−２６０．
【０００６】
【特許文献１】  特開平１０−２１０９７９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  本発明の課題は、食品加工又は環境浄化など工業的に用いられる、好熱性に優れかつ強力な酵素活性を有する剤及び微生物製剤等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  そこで、本発明者らは、耐熱性に優れた活性を有する新規なプロテアーゼを産生する微生物を得るべく鋭意検索を行った結果、大分県別府市の温泉地より得られたバチルス・セスピーＭＵ３（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＭＵ３）が工業的に有用な熱耐性プロテアーゼを産生するものであることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明は、かかる知見に基づくものである。従って、本発明は、高温領域で活性を発現するプロテアーゼ、前記プロテアーゼを生産する新種バチルス属細菌に関するものである。【０００９】  すなわち、本発明は、バチルス属に属し、バチルス・エスピーＭＵ３（ＮＩＴ  ＡＰ−１５６号）として寄託された耐熱性プロテアーゼ生産菌を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】本発明は、広範囲な温度領域で作用する耐熱性プロテアーゼを産生する新規微生物に関し、更に詳細には、高温に処理される食品加工時における酵素処理や工場排水中に含まれる有機物、生ゴミなどをコンポスト処理するのに適し、有機物消化酵素として広く用いることのできる耐熱性プロテアーゼを産生し、バチルス属に属する新規耐熱性プロテアーゼ生産菌及びそのプロテアーゼに関する。【００１１】  本発明の新種バチルス・セスピーＭＵ３は、以下に示すような菌学的性質を示す。
【図１】
【００１２】（Ａ）形態的性質
（１）細胞の形及び大きさ桿菌：０．８〜０．９×２．０〜３．０μｍ。
（２）運動性：鞭毛を有し運動性あり。
（３）胞子：０．４〜０．８×０．５〜１．０μｍ卵円形
【００１３】（Ｂ）培地での生育状態
（１）ＩＳＰ２寒天平板での発育状態：不透明な低凸状。
（２）コロニーの色：乳白色
（３）光沢：あり
（４）生育ｐＨ範囲：ｐＨ６〜１０で生育良好（ｐＨ９付近が最適）
（５）生育温度範囲：４５〜８０℃で生育良好、但し４０〜９０℃で生育可能
（７０℃付近が最適）
（６）酸素要求性：好気性。
【００１４】（Ｃ）生理学的性状
（１）グラム染色：陽性
（２）硝酸塩の還元：−
（３）インドールの生成：−
（４）硫化水素の生成：−
（５）クエン酸の利用：−
（６）ウレアーゼ：−
（７）オキシダーゼ：＋
（８）カタラーゼ：＋
（９）酸素に対する態度：通性嫌気性
（１０）Ｏ−Ｆテスト（グルコース）：−／−
（１１）糖類からの酸及びガスの生成：Ｄ−グルコース：酸（−）／ガス（−）
【００１５】（Ｄ）糖の資化性
【００１６】
【表１】
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【００１７】  以上の試験は、ＡＰＩ５０ＣＨＢを用い、測定方法（５０４３０）に従った。
【００１８】（Ｅ）遺伝学的性質
細菌基準株データベースに対する相同性検索の結果、本菌株の１６ｓ  ＤＮＡ塩基配列は、相同率９６．５％でＡｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ  ＬＭＧ２１８８１株に対し最も高い相同性を示した。分子系統解析の結果、本菌株はＡｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ属が形成するクラスターに含まれ、Ａ．  ｖｏｉｎｏｖｓｋｉｅｎｓｉｓ  ＴＨ１３株及びＡ．ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ  ＬＭＧ２１８８１株が形成するクラスターの外側に単独で系統枝を形成した。従って、本菌株はＡｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ属に近縁な新規な好熱細菌であることがわかった。
【００１９】  また、本菌株はグルコースの資化性、硝酸の還元などの性質上の点でアノキシバチルス属と異なっており、さらに、アノキシバチルス属は通性嫌気性または嫌気性であるのに対し、本菌株は嫌気条件下では生育できない。［００１９］以上のことから、本発明のＭＵ３株は、新たな熱耐性を有するプロテアーゼ生産菌であることは明白であり、また他のバチルス属細菌の中にも本発明のＭＵ３株は存在しないことから、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センターに寄託したバチルス・セスピーＭＵ３株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−１５６号）は、新規なクラスターを形成する新種バチルスであることが明らかとなった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】  本発明の熱耐性プロテアーゼ生産菌は、適当な液体培地を用いて好気的に培養することにより菌体外に熱耐性プロテアーゼを生産させることができる。培地中には資化しうる炭素源、窒素源、更にビタミン類、金属塩類等の微量栄養源を適当に組合せ、培地のｐＨは５〜１０の間、好ましくは６〜８に調整し、培養温度は４０〜１００℃、好ましくは６０〜８０℃、２〜７日間、好ましくは３日間振盪培養を行えば良い。使用する炭素源、窒素源は特に限定されないが、炭素源としてはマルトース、フラクトース、シュークロース、可溶性澱粉等、窒素源としては魚肉エキス、各種アミノ酸、酵母エキス、肉エキス、ポリペプトン、コーンスティープリカー、ソイビーンミール、アジプロン、無機窒素化合物等が挙げられる。また、その他のリン酸、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｎａ＋、Ｋ＋等の無機塩、ビオチン、パントテン酸、ピリドキサール、チアミン等のビタミン類を添加することもできる。【００２１】  かくして得られた培養液から熱耐性プロテアーゼを得るには目的に応じて精製、結晶化、あるいは造粒化すればよい。また、熱耐性プロテアーゼの生産量を高めるために本発明菌株を変異育種することで得られる高生産変異株も使用することができる。【００２２】  さらに、本発明菌株の遺伝子から目的とする熱耐性プロテアーゼ遺伝子をクローン化することもできる。得られた遺伝子を用いた熱耐性プロテアーゼの生産方法は、例えば当該遺伝子を安定に増幅できるプラスミドベクターに連結させる、あるいは当該変異遺伝子を安定に維持できる染色体ＤＮＡ上に導入させる等の方法で熱耐性プロテアーゼをコードする遺伝子を安定に増幅し、さらに当該遺伝子を安定にかつ効率よく発現させることが可能である宿主に導入し、熱耐性プロテアーゼを生産させる方法が採用できる。この条件を満たす宿主菌としては例えば本発明のバチルス・セスピーＭＵ３株をはじめとする熱耐性バチルス属細菌、カビ、酵母、放線菌等が挙げられる。【００２３】  斯くして得られた培養物中からの目的物質であるプロテアーゼの採取及び精製は、一般の酵素の採取及び精製の手段に準じて行うことが出来る。【００２４】  すなわち、培養物を遠心分離、又は濾過等によって菌体を分離し、その菌体及び培養濾液から通常の分離手段、例えば、塩析法、等電点沈殿法、また、限外濾過により濃縮させてプロテアーゼを得る。塩析法では例えば、硫安（３０〜９０％飽和画分）で沈殿させた後、濾過或いは遠心分離、脱塩することによってこれを凍結乾燥粉末とすることも可能である。脱塩の方法としては透析又はセファデックスＧ−２５等を用いるゲル濾過法等の一般的方法が用いられる。【００２５】  このようにして得られるプロテアーゼ液は、そのまま使用することもできるが、更に公知の方法によりプロテアーゼを精製結晶化して用いることもできる。プロテアーゼを精製するには、例えば各種のイオン交換クロマトグラフィーやセファデックス、バイオゲルのような分子篩ゲルクロマトグラフィーを適宜組み合わせて分別精製すれば良い。この様にして得られたプロテアーゼは以下に示すような理化学的性質を有する。バチルス・セスピーＭＵ３株が産生する熱耐性プロテアーゼ（Ｍｕ−３）の性質を示す。【００２６】  （１）分子量
セファデックスＧ−２００で得られた酵素の分子量は、約５７，０００である。【００２７】  （２）最適反応ｐＨ
カゼインを基質として各ｐＨの緩衝液中で酵素反応を行った場合、ｐＨ５−１０の間で作用し、最適反応ｐＨは６付近である。
【図３】
【００２８】
【００２９】  （３）ｐＨ安定性
カゼインを基質として各ｐＨの緩衝液中で酵素反応を行った場合、ｐＨ５以下からｐＨ１０の間で作用し、ｐＨ６付近で最も安定である。
【図４】
【００３０】
【００３１】  （３）最適反応温度
カゼインを基質として１００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ９）中、各温度で酵素反応を行った場合、分解活性は６０〜７０℃付近で最も高く、それ以上の温度でもカゼイン分解活性は保持する。
【図４】
【００３２】
【００３３】  （４）熱安定性
カゼインを基質として１００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ９）中、７０℃及び９０℃で経時的に酵素反応を行った場合、粗酵素液の分解活性は７０℃及び９０℃で一次的に低下するものの２時間をすぎる頃から酵素活性の低下は見られず、８時間以上安定である。
【図５】
【００３４】
【００３５】  以上のとおり、本発明のＭＵ３株が産生するプロテアーゼＭｕ−３は、優れた熱耐性を有し且つ酸性からアルカリ側の広い範囲で高いタンパク質分解能を有する。
【実施例】
【００３６】  以下に、実施例を挙げて、本発明について更に詳細に説明するが、本発明がかかる実施例にのみ限定されないことは言うまでもない。
実施例１
以下に、耐熱性プロテアーゼ生産菌の分離方法を説明する。温泉土壌サンプル（０．５ｇ）を沸騰浴中に保持した５ｍＬの生理食塩水に懸濁し、希釈系列を作製した。予め作製しておいた３％スキンミルク含有ＩＳＰ−２培地に塗沫し、６０℃で２日間培養した。スキンミルクを溶解し、ハローを形成したコロニーを釣菌し、同培地に植え継ぎ、単離した。得られた菌株はＩＳＰ−１の液体培地へ接種し、６０℃で振盪培養を行い、経時的にカゼインに対するプロテアーゼ活性を測定した。中でもカゼインの高分解活性を示したＭＵ３株を熱耐性プロテアーゼ生産菌として選抜した。尚、活性測定法は以下に述べる２通りの方法を用いた。【００３７】  プロテアーゼ活性測定は、カゼイン１％（和光純薬）を含む１００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ９）２．０ｍＬを６０℃で５分間保温した後、０．２ｍＬの酵素溶液を加え、２０分間の条件で反応を行った。反応停止液（５％トリクロロ酢酸）３．０ｍＬ加え、室温で１０分間放置したのち、フィルター濾過を行い、濾液中のタンパク質分解産物を波長２８０ｎｍの吸光度で測定した。【００３８】実施例２
熱耐性プロテアーゼ（Ｍｕ−３）の実施例１で得られたＭＵ３株を酵母エキス、ペプトン及びグルコースを主成分とする液体培地に接種し、５５℃で３日間撹拌培養した。遠心分離により得られた培養上清液（１Ｌ）に９０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、タンパク質を塩析した。遠心分離により得られた沈殿物を適当な緩衝液に溶解した後、同緩衝液にて透析を行なった。透析内液をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、活性画分を回収した。次にこの活性画分を限外濾過により濃縮した後、ゲル濾過を行い精製した。タンパク質濃度の測定は牛血清アルブミンを標準タンパク質として用いてミクロビューレット法でおこなった。
【産業上の利用可能性】
【００３９】本発明のプロテアーゼ生産菌が分泌する酵素によれば、熱耐性に優れ且つ酸性側からアルカリ側の広い範囲で高いタンパク質分解能を有するので、食品加工用及びコンポスト用をはじめ、洗剤用、写真工業などで使用可能な耐熱性プロテアーゼが工業的に生産できる。さらに、ＭＵ３株は多くの炭素源を資化できるので微生物製剤として加工することで、循環水を用いた温泉等の水処理製剤として用いることも期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】バチルス・セスピーＭＵ３株の電子顕微鏡写真
【図２】バチルス・セスピーＭＵ３株と近縁種の系統樹を示す図
【図３】耐熱性プロテアーゼ（Ｍｕ−３）の至適ｐＨを示す図
【図４】耐熱性プロテアーゼ（Ｍｕ−３）のｐＨ安定性を示す図
【図５】耐熱性プロテアーゼ（Ｍｕ−３）の至適温度を示す図
【図６】耐熱性プロテアーゼ（Ｍｕ−３）の耐熱性を示す図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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