(57)【要約】本発明は、タンパク質アレイを構築するための方法を提供する。1つの側面において、本方法は、アレイの構築における帯電したまたは極性のアレイ表面の使用を含む。また、本方法は、アレイの構築においてアレイ表面にポリペプチドを沈着させるための粘性溶液の使用を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、タンパク質アレイを構築するための方法：
（a）正味正のまたは正味負の電荷を有する表面を含むアレイを提供する工程；
（b）アミノ末端またはカルボキシ末端に、正味正（カチオン性）の電荷密度もしくは正味正の電荷極性または正味負（アニオン性）の電荷密度もしくは正味負の電荷極性を有するポリペプチドを含む溶液を提供する工程；および
（c）ポリペプチドの正のまたは負の末端が、アレイ表面の負または正の電荷にそって整列配置することができる条件下で、アレイに溶液を添加する工程。
【請求項２】
アレイ表面が正味負（アニオン性）の電荷密度または正味負の電荷極性を含み、ポリペプチドが正味正（カチオン性）の電荷密度または正味正の電荷極性を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
アレイ表面の水酸基が、正味負（アニオン性）の電荷密度または正味負の電荷極性を提供する、請求項2記載の方法。
【請求項４】
アレイ表面におけるスルフヒドリル基が、正味負（アニオン性）の電荷密度または正味負の電荷極性を提供する、請求項2記載の方法。
【請求項５】
アレイ表面が正味正（カチオン性）の電荷密度または正味正の電荷極性を含み、ポリペプチドが負（アニオン性）の電荷密度または正味負の電荷極性を含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
アレイ表面が、アレイ表面の複数の荷電アミノ基により、正味正（カチオン性）の電荷密度または正味正の電荷極性を含む、請求項5記載の方法。
【請求項７】
以下の工程を含む、タンパク質アレイを構築するための方法：
（a）アレイを提供する工程；
（b）ポリペプチドを含む溶液であって、直径約200nmよりも広いアレイ表面積を超えて広がらないような表面張力を生じる十分な粘性を含む溶液を提供する工程；および
（c）アレイに溶液を添加する工程。
【請求項８】
以下の工程を含む、タンパク質アレイを構築するための方法：
（a）アレイを提供する工程；
（b）ポリペプチドを含む溶液であって、約1mN*s/m2〜約30mN*s/m2の間の粘性を含む溶液を提供する工程；および
（c）アレイに溶液を添加する工程。
【請求項９】
溶液が有機ポリマーを含む、請求項7または請求項8記載の方法。
【請求項１０】
溶液がグリセロールを含む、請求項7または請求項8記載の方法。
【請求項１１】
溶液がポリエチレングリコールを含む、請求項7または請求項8記載の方法。
【請求項１２】
溶液がアジ化ナトリウムまたはヨウ化ナトリウムを含む、請求項7または請求項8記載の方法。
【請求項１３】
アジ化ナトリウム濃度が約0.2%と約0.5%との間である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
以下の工程を含む、ポリペプチドアレイを構築するための方法：
（a）第一の実効電荷を有する表面を有する基質を提供する工程；
（b）アミノ末端またはカルボキシ末端のうちの少なくとも1つについて実効電荷密度または実効電荷極性を有するポリペプチドを含む溶液を提供する工程；および
（c）基質に溶液を接触させる工程。
【請求項１５】
第一の実効電荷が負（アニオン性）の電荷密度または負の電荷極性を含み、ポリペプチドの実効電荷密度が正（カチオン性）の電荷密度を含むか、またはポリペプチドの実効電荷極性が正の電荷極性を含む、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
基質表面における少なくとも1つの水酸基またはスルフヒドリル基が、負（アニオン性）の電荷密度または負の電荷極性を有する第一の実効電荷を提供する、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
第一の実効電荷が正（カチオン性）の電荷密度または正の電荷極性を含み、ポリペプチドの実効電荷密度が負（アニオン性）の電荷密度を含むか、またはポリペプチドの実効電荷極性が正味負の電荷極性を含む、請求項14記載の方法。
【請求項１８】
基質表面におけるアミノ基が、正（カチオン性の）の電荷密度または正の電荷極性を有する第一の実効電荷を提供する、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
以下の工程を含む、タンパク質アレイを構築するための方法：
（a）基質を提供する工程；
（b）ポリペプチドを含む溶液であって、直径約200nmよりも広い表面積を超えて広がらないような表面張力を生じる十分な粘性を含む溶液を提供する工程；および
（c）基質に溶液を添加する工程。
【請求項２０】
溶液が有機ポリマーを含む、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
溶液がグリセロールを含む、請求項19記載の方法。
【請求項２２】
溶液がポリエチレングリコールを含む、請求項19記載の方法。
【請求項２３】
溶液がアジ化ナトリウムまたはヨウ化ナトリウムを含む、請求項19記載の方法。
【請求項２４】
アジ化ナトリウム濃度が約0.2%と約0.5%との間である、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
以下の工程を含む、タンパク質アレイを構築するための方法：
（a）基質を提供する工程；
（b）ペプチドおよび約1mN*s/m2〜約30mN*s/m2の間の粘性を含む溶液を提供する工程；ならびに
（c）基質に溶液を接触させる工程。
【請求項２６】
溶液が有機ポリマーを含む、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
溶液がグリセロールを含む、請求項25記載の方法。
【請求項２８】
溶液がポリエチレングリコールを含む、請求項25記載の方法。
【請求項２９】
溶液がアジ化ナトリウムまたはヨウ化ナトリウムを含む、請求項25記載の方法。
【請求項３０】
アジ化ナトリウム濃度が約0.2%と約0.5%との間である、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
以下の工程を含む、タンパク質アレイを構築するための方法：
（a）正味正の電荷を有する表面を有する基質を提供する工程；
（b）アミノ末端またはカルボキシ末端のうちの少なくとも1つについて正味負の電荷密度または正味負の電荷極性を有するポリペプチドを含む溶液を提供する工程；および
（c）溶液をアレイに接触させる工程。
【請求項３２】
ポリペプチド含有溶液が、直径約200nmよりも広いアレイ表面積を超えて広がらないような表面張力を生じる十分な粘性を含む、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
溶液が、約1mN*s/m2〜約30mN*s/m2の間の粘性を含む、請求項31記載の方法。
【請求項３４】
基質表面におけるアミノ基が、正味正の電荷密度または正味正の電荷極性によって正味正の電荷を生じる、請求項31記載の方法。
【請求項３５】
以下の工程を含む、タンパク質アレイを構築するための方法：
（a）正味負の電荷を有する表面を有する基質を提供する工程；
（b）アミノ末端またはカルボキシ末端のうちの少なくとも1つについて正味の正（カチオン性）の電荷密度または正味正の電荷極性を有するポリペプチドを含む溶液を提供する工程；および
（c）基質に溶液を接触させる工程。
【請求項３６】
基質表面における少なくとも1つの水酸基またはスルフヒドリル基が、正味負の電荷密度または正味負の電荷極性によって正味負の電荷を生じる、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
溶液が有機ポリマーを含む、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
溶液がグリセロールを含む、請求項36記載の方法。
【請求項３９】
溶液がポリエチレングリコールを含む、請求項36記載の方法。
【請求項４０】
溶液がアジ化ナトリウムまたはヨウ化ナトリウムを含む、請求項36記載の方法。
【請求項４１】
アジ化ナトリウム濃度が約0.2%と約0.5%との間である、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
溶液が約1mN*s/m2〜約30mN*s/m2の間の粘性を含む、請求項35記載の方法。
【請求項４３】
溶液が有機ポリマーを含む、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
溶液がグリセロールを含む、請求項42記載の方法。
【請求項４５】
溶液がポリエチレングリコールを含む、請求項42記載の方法。
【請求項４６】
溶液がアジ化ナトリウムまたはヨウ化ナトリウムを含む、請求項42記載の方法。
【請求項４７】
アジ化ナトリウム濃度が約0.2%と約0.5%との間である、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
基質表面におけるアミノ基が正味正の電荷密度または正味正の電荷極性を提供する、請求項35記載の方法。
【請求項４９】
実効電荷を有する表面を有する基質にポリペプチドアレイを作製する方法であって、表面を、その末端に逆の実効電荷を有するよう選択された、または修飾されたポリペプチドを含む液体と接触させることを含む方法。
【請求項５０】
（a）その末端に実効電荷を有するよう複数のポリペプチドを選択または修飾する工程と；
（b）その表面に逆の実効電荷を有するよう基質を選択または修飾する工程と；
（c）1つまたは複数のポリペプチドを含む水性の液体を、表面の分離した領域に別々に接触させる工程と、
を含む、定方向のポリペプチドアレイを作製する方法。
【請求項５１】
分離した領域に固定された複数の異なったポリペプチドを有する表面を有する基質を含むアレイを作製する方法であって、表面のそれぞれの領域を、それぞれのポリペプチドが表面の実効電荷とは逆の実効電荷を有する末端を有するポリペプチドのうちの1つを含む別々の水性の液体と接触させることを含む方法。
【請求項５２】
（a）正味正の電荷または正味負の電荷を有する表面を有するアレイ基質を提供する工程と；
（b）ポリペプチドを含む溶液であって、ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のうちの少なくとも1つは、i）正味正（カチオン性）の電荷密度、ii）正味正の電荷極性、iii）正味負（アニオン性）の電荷密度、またはiv）正味負の電荷極性、の1つを有する、溶液を提供する工程と；
（c）溶液と基質とを、ポリペプチドの末端を表面の電荷に沿って整列配置することができる条件下で接触させる工程と、
を含むポリペプチドアレイを構築するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2001年5月3日に出願された米国仮出願第60/288,688号の利益を主張するものである。
【０００２】
技術分野
本発明は、一般に細胞生物学、プロテオミクスおよびポリペプチドアレイ、または「バイオチップ」の技術に関する。特に、本発明は、タンパク質アレイを構築するための方法に向けられる。1つの側面において、本方法は、アレイの構築における電荷のある表面または極性の表面の使用を含む。また、本方法は、アレイの構築において、アレイ表面にポリペプチドを沈着するための粘性溶液の使用を含む。
【背景技術】
【０００３】
背景
タンパク質マイクロアレイの1つの分類では、固定された「捕獲抗体」を使用する。ポリペプチドは、アミノシランなどで処理された表面を有するガラスなどの固体基質に結合される。ポリペプチドは、一般にビオチン−ストレプトアビジンの結合を介して基質に結合される。これは、困難で、非特異的で、高価であろうプロセスである基質の修飾を必要とする。次いで、捕獲抗体に結合すると考えられる抗原を含む溶液とアレイを、時間、緩衝液成分、および認識特異性に依存する方法でインキュベートする。次いで、抗原を、これらが予め標識されている場合は、直接視覚化してもよく、または二次的に標識された試薬（もう1つの抗体であることが多い）に結合させてもよい。捕獲抗体に結合した抗原の量を視覚化する手段は、利用した標識方法に依存するが、標識の放射を励起して検出するのに適したフィルターセットを使用して、CCDイメージング装置またはレーザスキャナによることが多い。イメージング装置では、検出光子の量を電子信号（8ビットまたは16ビットスケールであることが多い）に転換し、次いでソフトウェアパッケージを使用して解析することができる。
【０００４】
タンパク質アレイを製造する上で達成すべき主要な点は、アレイ表面にポリペプチド（例えば、抗体または抗原）を、生物学的活性を保持させたまま、結合させることである。
【発明の開示】
【０００５】
概要
本発明は、以下の工程を含む、タンパク質アレイを構築するための方法を提供する：（a）正味正（net positive）のまたは正味負（net negative）の電荷を有する表面を含むアレイを提供する工程；（b）アミノ末端またはカルボキシ末端に、正味正（カチオン性）の電荷密度もしくは正味の正の電荷極性または正味の負（アニオン性）の電荷密度もしくは正味負の電荷極性を有するポリペプチドを含む溶液を提供する工程；および（c）ポリペプチドの正のまたは負の末端が、アレイ表面の負のまたは正の電荷にそって整列配置することができる条件下で溶液を添加する工程。
【０００６】
本方法の1つの側面において、アレイ表面は、正味負（アニオン性）の電荷密度または正味負の電荷極性を含み、およびポリペプチドは、正味正（カチオン性）の電荷密度または正味正の電荷極性を含む。1つの側面において、アレイ表面における水酸基は、正味負（アニオン性）の電荷密度または正味負の電荷極性を提供する。1つの側面において、アレイ表面のスルフヒドリル基は、正味負（アニオン性）の電荷密度または正味負の電荷極性を提供する。
【０００７】
本方法の1つの側面において、アレイ表面は、正味正（カチオン性の）電荷密度または正味正の電荷極性を含み、およびポリペプチドは、負（アニオン性）の電荷密度または正味負の電荷極性を含む。1つの側面において、アレイ表面は、アレイ表面における複数の電荷をもつアミノ基により、正味正（カチオン性）の電荷密度または正味正の電荷極性を具備する。
【０００８】
本発明は、以下の工程を含む、タンパク質アレイを構築するための方法を提供する：
（a）アレイを提供する工程；
（b）ポリペプチドを含む溶液であって、溶液は、ポリペプチド含有溶液が直径約200nmよりも広いアレイ表面積を超えて広がらないような表面張力を産生するのに十分な粘性を含む溶液を提供する工程；および
（c）アレイに溶液を添加する工程。
【０００９】
本発明は、以下の工程を含む、タンパク質アレイを構築するための方法を提供する：
（a）アレイを提供する工程；
（b）ポリペプチドを含む溶液であって、溶液は、約1mN*s/m2〜約30mN*s/m2の間の粘性を具備する溶液を提供する工程；および
（c）アレイに溶液を添加する工程。
【００１０】
1つの側面において、溶液は、水溶性のポリマー（本発明の溶液に使用することができるポリマーの完全な考察については下記の考察を参照されたい）などの有機ポリマーを含む。別の側面において、溶液は、グリセロールまたはポリエチレングリコールを含む。別の側面において、溶液は、アジ化ナトリウムまたはヨウ化ナトリウムを含む。アジ化ナトリウム濃度は、約0.2%と約0.5%との間でありうる。
【００１１】
本発明の1つまたは複数の態様の詳細は、添付の図面および下記の説明に記載する。本発明のその他の特徴、目的、および効果は、記載および図面から、および請求の範囲から明らかであろう。
【００１２】
本明細書において引用した全ての刊行物、特許、特許出願、GenBank、およびATCC寄託物は、全ての目的のために参照により明白に組み入れられる。
【００１３】
種々の図面における同様の参照シンボルは、同様のエレメントを示す。
【００１４】
詳細な説明
本発明は、ポリペプチドアレイを製造するための新規方法を提供する。
【００１５】
本発明の1つの側面において、荷電されたアレイ表面または静電気的に極性のアレイ表面が使用され、その結果、ポリペプチドがアレイに結合する際に整列配置されるように、表面を電荷のあるポリペプチドまたは極性のポリペプチドをアレイに対して定方向にすることができる。これは、結合速度をも改善する。したがって、本発明の方法の本発明の1つの側面において、ポリペプチドアレイは、基質と静電気的に相互作用する表面を使用して製造される（例えば、同時係属中のPCT/US00/23438および米国特許出願第09/636,268号を参照されたい；静電気的に「調整できる」表面を記載する）。1つの側面において、基質表面は、正または負の電荷によって修飾されていてもよい。例えば、基質自体またはアレイ表面に固定されたポリペプチドもしくはその他の分子は、例えば選択されたアミノ酸部位にヒドロキシ部分を含むことにより、正味負の電荷を含むことができる。アレイ基質の修飾は、基質がポリペプチドに結合して特定の向き（すなわち、カルボキシ末端対アミノ末端）でアレイに固定されるように、選択的に選択される。逆に、アレイに固定されるポリペプチドは、アレイ基質表面の電荷および表面上の所望の向きのポリペプチドに依存して、正または負の電荷を有するようにデザインされる。
【００１６】
本発明の1つの側面において、ポリペプチドは、プリントまたは相補性を妨げない「水和緩衝液」中でアレイに添加される。これにより、保管の間に基質を水和状態のままにすることができるので、これはタンパク質マイクロアレイの開発において有意な改良である。1つの側面において、「水和緩衝液」は、ポリペプチドが直径約200nmよりも広い面積を超えて広がらないような表面張力を生じるのに十分な粘性の溶液を提供するポリマーを含む。本発明のもう1つの側面において、「水和緩衝液」は、約1〜30mN*s/m2の間の粘性の溶液を与えるポリマーを含む。
【００１７】
当業者は、約1〜30mN*s/m2の間の粘性の溶液またはポリペプチドが直径約200nmよりも広い面積を超えて広がらないような表面張力を生じるのに十分な粘性の溶液を調製するために、ルーチンのスクリーニングを使用して他の試薬およびポリマーを選択することができる。例えば、Nishida (2000) Eur. J. Pharm. Biopharm. 50: 397-402; Sato (2000) Protein Sci. 9: 1601-1603; Freerksen (1990) Anal. Biochem. 189: 163-168; Danish (1983) J. Lab. Clin. Med. 101: 515-526; Kawahara (1966) J. Biol. Chem. 241: 3228-3232；および米国特許第6,215,033号；第6,214,956号；第6,196,058号；第6,023,961.5,644,395号；第5,203,203号；第4,862,735号；第4,852,388号；第4,704,898号；第4,667,519号；第4,499,753号；第4,388,823号を参照されたい。
【００１８】
これらの緩衝液は、どのような有機ポリマーも含むことができ、例えばグリコーゲンまたはポリエチレングリコールを含みうる。種々のMWを有するポリエチレングリコール（PEG）、例えばPEG400、PEG800、PEG1000、PEG1,500、PEG2,000、PEG4,000、PEG8,000、およびPEG20,000など、並びにこれらの混合液を使用することもできる。ポリビニルピロリドン（例えばBASFからのPVP K30、K90）、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリエチレンオキシドポリマー（例えば（PolyoxWSR-303（商標））、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシビニルポリマー（Carbopol940（商標））など；D-ソルビトール、マンニトール、およびその他同種のものなどの糖アルコール；例えばスクロース、グルコース、D-フルクトース、およびその他同種のものなどの糖；ポリエチレン-ポリオキシプロピレングリコール、ポリエチレン-ソルビタン脂肪酸エステル、塩、およびその他同種のものなどの、どのような水溶性のポリマーを使用することもできる。
【００１９】
また、その他の組成物、例えばヨウ化ナトリウム、アジ化ナトリウムをこれらの緩衝液に含めることもできる。
【００２０】
さらなる改良としては、基質を表面に結合させるために、ビオチン-ストレプトアビジン結合よりむしろ天然の基質を利用する表面化学の開発である。
【００２１】
どのようなタイプのアレイ表面も、本発明に使用することができ、例えば、本方法は、シラン処理された表面を利用することもできる。アレイ基質表面は、どのようなポリペプチドまたはペプチドも、例えば「捕獲抗体」、抗原、抗体に結合する抗原などを含むこともできる。これらのポリペプチドは、アレイ基質表面（例えば、シラン処理された表面）に共有結合または非共有結合で結合することもできる。
【００２２】
定義
他に定義しない限り、本明細書において使用される全ての技術的および科学的な用語は、本発明が属する分野における当業者によって通常理解される意味を有する。本明細書において使用するものとして、以下の学術用語は、他に特定しない限りこれらに基づく意味を有する。
【００２３】
本明細書において使用されるものとして、「アレイ」または「マイクロアレイ」または「タンパク質アレイ」または「プロテオームアレイ」または「バイオチップ」の用語は、交換可能に使用され、以下に詳細を議論されるように、これらの装置の全ての既知のバリエーションを含む。
【００２４】
「バイオサイト（biosite）」は、アレイの反応基質または基材の表面に沈着された生体分子または捕獲プローブ（例えば、ポリペプチド）を意味する。適切な条件下で、会合、例えば特異的な結合またはハイブリダイゼーションが、プローブと標的分子の間で生じうる。生体分子の成分鎖と標的分子の間では、相互作用または反応が生じる可能性があるので、生体分子の成分鎖は、バイオサイトを形成する。アレイあたりのバイオサイトの最大数は、アレイ、またはアレイ内の反応容器の大きさに依存し、プローブ沈着技術（例えばプリンティング）、プローブの性質、結合を評価するためにおよび／または体積を決定するために使用される手段、またはバイオサイトの形（質の制御のため）に依存して変更してもよい。例えば、アレイにおけるバイオサイトの大きさは、付随する検出器／イメージング装置の実用的な光学分割に依存するであろう。例えば、16（4×4アレイ）バイオサイトのアレイは、ハイブリダイゼーション基質または基材に沈着させて、最終的に反応容器全体の底を形成してもよい。この例では、それぞれのバイオサイトは、直径約25〜200ミクロン（μm）の円を含んでいてもよい。したがって、16バイオサイトアレイについては、16×200μm直径領域のそれぞれが、プローブの大きさおよびウェルの大きさに非常に依存した濃度で、ハイブリダイゼーション基質（基材）に付着されたプローブの均一な場を含む。それぞれの25〜200μm直径領域は、何百万ものプローブ分子を含むことができる。また、16の種々のバイオサイト（プローブ部位）のそれぞれは、1つのタイプのプローブを含むことができる。したがって、反応チャンバーにつき16バイオサイト（4×4アレイ）を含むアレイにおいては、16の種々のプローブタイプをアッセイすることができる。もう1つの例として、4つの別々の10×10アレイ（400バイオサイト）を、400バイオサイトのそれぞれの間に十分な間隔を有して、96ウェルのマイクロタイタープレートの1つのウェルに適合するように作製することができる。この10×10形式については、単一の反応チャンバー内において400のハイブリダイゼーション実験が可能であり、38,400（96×400）のアッセイ／ハイブリダイゼーションをほぼ同時に行うことができる。
【００２５】
「基質」は、プローブが沈着された、例えばバイオサイトの形態の基質を意味する。「基質」は、限定されるものではないが、様々な物質、例えばポリビニル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ビニル、その他のプラスチック、ガラス、SiO2、その他のシラン、ナイロン膜、金、またはプラチナから選択され、以下に記載されたさらなる例を参照されたい。固体表面は、誘導体化することができ、例えばチオール誘導体化されたバイオポリマーおよび有機チオールを金属固体基質に結合することができ；例えば米国特許第5,942,397号を参照されたい（より多くの例については下記を参照されたい）。例えば、本発明の方法に使用することができる、静電気的に「調整できる」表面を記載するPCT/US00/23438および米国特許出願第09/636,268号を参照されたい。
【００２６】
「固定された」の用語は、プローブが、いずれかの手段またはいずれかの方法；例えば、可逆的または不可逆的結合、共有結合性または非共有結合性の付着などで表面（例えば基質）に付着されうることを意味する。
【００２７】
「溶液」の用語は、様々な緩衝液および／または試料から構成され、タンパク質アレイに適用される液体または半流動体を意味する。
【００２８】
「抗体」の用語は、エピトープに特異的に結合することができる、免疫グロブリン遺伝子もしくは免疫グロブリン遺伝子群、またはその断片もしくは同等物によって実質的にコードされたペプチドまたはポリペプチドを指し、例えばFundamental Immunology, Third Edition, W. E. Paul, ed., Raven Press, N. Y. (1993); Wilson (1994) J. Immunol. Methods 175: 267-73; Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys. Methods 25: 85-97を参照されたい。当業者であれば、抗体断片は、化学的にまたは組換えDNA法を利用することのいずれかにより、単離するか、または新規に合成してもよいことを認識するであろう。また、抗体の用語は、抗体全体の修飾によって産生されたか、または組換えDNA法を使用して新規に合成された、いずれかの「キメラ」抗体も含む。典型的には、このようなキメラ抗体は、「ヒト化抗体」、すなわちエピトープ結合部位は免疫哺乳動物（マウスなど）から作製され、構造上のフレームワークはヒトから作製したものである。また、免疫グロブリンは、ファージディスプレイライブラリーおよびそのバリエーションを使用して作製することができる。翻訳後修飾されたポリペプチドに結合する抗体またはその他の分子は、当業者に周知であり、例えば米国特許第6,008,024号；第5,763,198号；第5,599,681号；第5,580,742号を参照されたい。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生する方法は、当業者に既知であり、科学文献および特許文献に記載されており、例えばColigan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY (1991); Stites (eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (7th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA; Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (2d ed.) Academic Press, New York, NY (1986); Harlow (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, New Yorkを参照されたい。
【００２９】
核酸およびポリペプチドプローブ
本発明は、固定されたポリペプチドを含むアレイを提供する（核酸またはオリゴヌクレオチド、および多糖、脂質または小分子などのその他の分子を固定することもできる）。例えば、ポリペプチドは、オリゴヌクレオチドに結合させ、アレイ表面に固定された核酸に特異的にハイブリダイズすることによって、アレイ基質表面に固定することができる（例えば米国特許第6,083,763号を参照されたい）。これらのプローブは、インビトロまたはインビボで作製および発現させることができ、本発明の装置または実施に使用されるポリペプチドを作製および発現するいずれの手段を使用することもできる。本発明は、科学文献および特許文献に詳しく記載されている当業者に既知のいずれの方法またはプロトコールと合わせて実施することもできる。
【００３０】
例えば配列の変異の作製、サブクローニング、標識プローブ、シーケンシング、ハイブリダイゼーション、およびその他同種のものなどの、核酸操作および組み換えポリペプチドの作製のための技術は、科学文献および特許文献に詳しく記載されており、例えばSambrook, ed., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ND ED.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N. Y. (1993)を参照されたい。
【００３１】
本明細書において使用されるものとして、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、例えば、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、その他の短いポリマー、または有機分子を含むことができる。アミノ酸が使用される場合は、市販されており、形成反応（支持体表面に対する関連表面の結合）によって変化しないという事実により、別の態様では、メチルエステルを使用することができる。「ペプチド模倣体」は、対応する組成物、例えば本発明の結合表面に使用されるペプチド、オリゴペプチド（例えばオリゴヒスチジン、オリゴアスパラギン酸、オリゴグルタミン酸、ポリ-(his)2(gly)1、およびポリ-(his)2(asp)1）、ポリペプチド、イミダゾール誘導体、または同等物の、実質的に同じ構造的および／または機能的な特徴を有する合成化学化合物を含む。模倣体は、完全に合成の非天然のアミノ酸の類似体から構成されるものか、または部分的に天然のペプチドアミノ酸で部分的に非天然のアミノ酸の類似体であるキメラ分子であるもののいずれでもありうる。また、模倣体は、任意の量の天然のアミノ酸の保存的置換を、このような置換が実質的に模倣体の構造および／または活性を変えない限り、取り入れることができる。個々のペプチド模倣体残基は、ペプチド結合によって、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能性マレイミド、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、もしくはN,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）などのその他の化学結合または結合手段によって結合することができる。従来のアミド結合（「ペプチド結合」）結合基に代わりうる結合基は、例えばケトメチレン（例えば、-C(=O)-CH2-または-C(=O)-NH-）、アミノメチレン（CH2NH）、エチレン、オレフィン（CH=CH）、エーテル（CH2-O）、チオエーテル（CH2-S）、テトラゾール（CN4-）、チアゾール、レトロアミド（retroamide）、チオアミド、またはエステルを含む（例えばSpatola (1983) in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, p 267-357, Marcell Dekker, NYを参照されたい）。
【００３２】
アレイまたは「バイオチップ」
本発明は、タンパク質アレイを構築するための方法を提供する。タンパク質は、結合のための固体表面上に、直接または間接的に固定することができる。バイオサイトは、固体表面において種々の大きさおよび種々の密度で配置されてもよい。本発明の方法は、全体的にあるいは部分的に、以下に記載されたようなアレイ、結合成分、および方法のデザインを取り入れることができる。例えば、米国特許第6,197,503号；第6,174,684号；第6,156,501号；第6,093,370号；第6,087,112号；第6,087,103号；第6,087,102号；第6,083,697号；第6,080,585号；第6,054,270号；第6,048,695号；第6,045,996号；第6,022,963号；第6,013,440号；第5,959,098号；第5,856,174号；第5,843,655号；第5,837,832号；第5,770,456号；第5,723,320号；第5,700,637号；第5,695,940号；第5,556,752号；第5,143,854号；また、例えば、国際公開公報第99/51773号；国際公開公報第99/09217号；国際公開公報第97/46313号；国際公開公報第96/17958号；国際公開公報第89/10977号を参照されたい；また、例えばJohnston (1998) Curr. Biol. 8 : R171-R174; Schummer (1997) Biotechniques 23: 1087-1092; Kern (1997) Biotechniques 23: 120-124; Solinas-Toldo (1997) Genes, Chromosomes & Cancer 20: 399-407; Bowtell (1999) Nature Genetics Supp. 21: 25-32; Epstein (2000) Current Opinion in Biotech. 11: 36-41; Mendoza (1999) "High-throughput microarray-based enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), "Biotechniques 27: 778-788; Lueking (1999) Protein microarrays for gene expression and antibody screening," Anal. Biochem. 270: 103-111; Davies (1999) "Profiling of amyloid beta peptide variants using SELDI protein chip arrays," Biotechniques 27: 1258-1261を参照されたい。
【００３３】
基質に対するプローブの沈着
本発明は、ポリペプチドを含む複数のバイオサイトを基質上に固定することによるアレイを提供する。ポリペプチドは、当該技術分野において既知のいずれの方法または方法の組合せ、例えばインクジェット式などのpizo-電気的なプロセスおよび系、ロボット沈着、フォトリソグラフィーによるインサイチュー合成、マイクロシリンジの使用、または連続フロー・バンドル・マイクロキャピラリープロセス（例えば、米国特許第6,083,763号を参照されたい）を使用して、基質に「沈着」または「固定」することができる。本発明の作製または使用に、全体的にもしくは部分的に組み入れることができるアレイ製作方法は、例えば米国特許第6,197,503号；第6,177,238号；第6,164,850号；第6,150,147号；第6,083,763号；第6,048,695号；第6,010,616号；第5,599,695号；第5,919,523号；第5,861,242号；第5,770,722号；第5,750,669号；第5,143,854号に記載されたものを含む。
【００３４】
基質表面
本発明に使用されるアレイは、硬質、半硬質、または軟質の材料の基質表面を含むことができる。基質表面は、平らまたは平面状で、ウェル、盛り上がった領域、削られた溝、細孔、ビーズ、フィラメント等として形成することもできる。基質は、「捕獲プローブ」を直接的または間接的に結合することができるどのような物質であることもできる。例えば、適切な材料は、紙、ガラス（例えば、米国特許第5,843,767号を参照されたい）、セラミック、石英もしくはその他の結晶性基質（例えばヒ化ガリウム）、金属、メタロイド、ポリアクリロイルモルホライド、種々のプラスチックおよびプラスチックコポリマー、ナイロン（商標）、テフロン（商標）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（4-メチルブテン）、ポリスチレン、ポリスチレン／ラテックス、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、レーヨン、ナイロン、ポリ（ビニル酪酸塩）、ポリビニリデンジフルオライド（PVDF）（例えば、米国特許第6,024,872号を参照されたい）、シリコーン（例えば、米国特許第6,096,817号を参照されたい）、ポリホルムアルデヒド（例えば、米国特許第4,355,153号；第4,652,613号を参照されたい）、セルロース（例えば、米国特許第5,068,269号を参照されたい）、酢酸セルロース（例えば、米国特許第6,048,457号を参照されたい）、ニトロセルロース、種々の膜およびゲル（例えば、シリカエアロゲル、例えば米国特許第5,795,557号を参照されたい）、常磁性もしくは超常磁性の微小粒子（例えば、米国特許第5,939,261号を参照されたい）などを含むことができる。プローブが固定されるその他の化合物に適用するために、基質を誘導体化することもできる。反応性の官能基は、例えば、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基等であることができる。シラン（例えば、モノおよびジヒドロキシアルキルシラン、アミノアルキルトリアルコキシシラン、3-アミノプロピル-トリエトキシシラン、3-アミノプロピルトリメトキシシラン）は、アミン官能基と反応するためのヒドロキシル官能基を提供することができる。
【００３５】
検出プローブおよび装置
アレイ上のポリペプチド、または完成したアレイの性能は、、例えば放射性の、比色性の、生物発光性の、蛍光性の、もしくは化学発光性のどのような検出可能部分も、または別の光子検出可能部分も含む種々の方法および装置を使用して検出することもできる。蛍光、生体発光もしくは化学発光、または放射線などの「検出可能部分」は、例えば、当該技術分野において周知の、例えば米国特許第6,225,670号；第6,211,524号；第6,198,835号；第6,197,928号；第6,197,499号；第6,194,731号；第6,194,223号；第6,191,852号；第6,191,425号；第6,132,983号；第6,087,476号；第6,060,261号；第5,866,348号；第5,094,939号；第5,744,320号；第5,631,734号；第5,192,980号；第5,091,652号に記載されたようなアッセイ法および装置を使用して、検出並びに定量することができる。
【００３６】
例えば、1つのイメージングシステムは、近位電荷結合素子（CCD）検出/イメージングであることができ；また、これは、その固有の多用性により、化学発光、蛍光、および放射性同位体による標的分子検出、高処理量、および高感度にも適応させることができる。この検出/イメージング装置は、CCDのアレイ、MOSアレイの光伝導体、CMOSアレイの光伝導体、電荷インジェクション装置（CID）、薄膜トランジスタアレイの光伝導体、アモルファスシリコンセンサー、フォトダイオードアレイ、およびその他同種のもの等の複数の固体イメージング装置を含むレンズのないイメージングアレイを含むことができる。本発明の装置および方法は、例えば、米国特許第6,197,503号；第6,197,498号；第6,150,147号；第6,083,763号；第6,066,448号；第6,045,996号；第6,025,601号；第5,599,695号；第5,981,956号；第5,698,089号；第5,578,832号；第5,632,957号に記載されたような検出装置のデザインを、全体的にもしくは部分的に組み入れる。
【００３７】
実施例
以下の実施例は、実例を示すために提供されるが、請求の範囲の発明を限定しない。
【００３８】
実施例1：ポリペプチドアレイを構築するための方法
アレイを構築するための例示的な方法を提供する。これらの実験に使用したアレイは、プリントされた抗体の8×8アレイとして、標準的な8×12のマイクロタイター形式のウェルあたり1アレイで構成され；特定のアレイデザインを図1に例示する。64エレメントのアレイには、PSAの両形態について5エレメントの段階希釈2組およびIL-6について4エレメントの段階希釈を2組プリントしたものを含んだ。ウサギIgGマーカーは、位置A1〜A8にプリントし、H-7および8は、アレイ内のプローブの向きおよび同定のために有用である。
【００３９】
図2は、16ウェルのイメージであり、適切な抗原（A1〜B3）に対する抗体の選択性を示し、関心対象の3つのタンパク質（C1〜D3）について直列にアッセイした7点の標準曲線を含む。ウェルB4およびD4は、両方ともネガティブ対照（組換えタンパク質を添加しない）である。予想されたとおり、ウェルA1（PSAのみ）では、総PSA捕獲プローブのみでシグナルが検出でき、A2（PSA-ACT）では、総PSAおよび特異的ACT結合PSA捕獲プローブの両者においてシグナルが検出でき、およびA3（IL-6）では、検出可能なシグナルは、唯一IL-6プローブのみから発出される。その上、これらの基質の組合せのそれぞれについては、添加した抗原に特異的なプローブのみが、検出可能なシグナル（A4〜B3）を生じる。標準曲線ウェル（C1〜D3）から得られた濃度測定値は、それぞれの抗原濃度についてそれぞれのウェルで3抗原のそれぞれについての捕獲（プリントされた）抗体濃度、対、濃度測定値のグラフを構築するために使用し、これらのグラフのうちの1つの例を図3Bに示した。次いで、これらのグラフに由来する線形回帰式を使用して、図3Aに示した抗原濃度グラフ（標準曲線）、対、線形回帰値に対する点を得た。総PSA曲線については、上限が両方のPSA形態にマッチするように最も高い濃度を省略する（検出可能な抗原についての滴定曲線が、総PSA抗体に対して40ng/ml〜0.625ng/mlの範囲を実際にカバーするように、PSA総濃度は、PSAとPSA-ACTの合計である）。回帰線に由来する相関係数は、上位でないならば、標準的なELISAを利用して達成されたものに匹敵する。
【００４０】
標準曲線が単一または複製ウェルの代わりに、同時に（単一のウェルに全ての分析物を）それぞれの濃度のそれぞれの抗原または試料について実施できるという事実のために、この多重マイクロELISA系は、従来のELISAと比較して標準曲線の構築および試料の解析の材料並びに時間を倹約することができる。さらに、時間および試料を節約するために（25μlの試料のみが必要である）、捕獲抗体の利用能も、同様にこの系では減少される。例としては、製造業者の推奨された希釈に従った標準的なELISAのために1つの96ウェルマイクロタイタープレートを調製するためには、40μlのIL-6捕獲抗体が必要であろう。キャピラリープリンター6によるアレイ構築を利用して、このマイクロELISA系によるタンパク質の定量を行えば、この同じ40μlの捕獲抗体で100よりも多い96ウェルアレイをプリントすることができる。
【００４１】
同様に、このマイクロアレイ配置では、それぞれのウェルから入手可能な情報は、標準的なELISAと比べても有意に大きい。標準的なELISAにおいて、分析物濃度を決定するために使用される値は、3試料吸光度値（試験が三つ組で行われる場合）であり、ここで、これらの濃度を決定するために使用されるデータポイントの数はしばしばその数の二倍であり、より低い分析物濃度ではそれより少ないことはなく、単一のウェルおよび2つ組でプリントされた複数の抗体希釈を利用する。捕獲抗体希釈系列の使用により、我々のELISA形式の作用範囲を広くすることもできる。抗原濃度を増大すると、より低い捕獲抗体濃度のプローブが検出可能であり、より高い検出プローブ濃度では飽和するので、より低いプローブ濃度を定量のために使用することができる。この因子は、試料を希釈し、かつアッセイを繰り返さなければならないという必要性を実質的に除去し；これは、限られた試料量で研究するときに特に価値がある。この例として、PSA（総）アレイは、100ng/mlまでの濃度でPSAを検出することができる（データ示さず）。その上、このアレイのデザインでは、試料内にほぼ等濃度で存在するタンパク質を分析する必要性によって制約されない。本明細書において報告した実験において、最高タンパク質濃度（PSA、20ng/ml）から最低タンパク質濃度（IL-6、0.0046875ng/ml）までの差は約500倍であり、我々が完了した他の研究では、約400,000倍の範囲を示した（2mg/ml〜4pg/ml）。
【００４２】
このマイクロアレイELISAの系は、アレイを産生するために通常使用される標準的な大きさ（16×16エレメント）（例えば、Genometrix Genomics, The Woodlands, TX）に拡張可能であり、これにより、単一のアレイ内で20〜30の個々のタンパク質の測定が可能になると考えられる。このアレイでは、検出抗体としてポリクローナル抗体を使用して交叉反応性は検出されなかったので、完全にモノクローナル抗体で作製した大規模なアレイでも、交差反応性は同様に問題ないはずである（もっぱらモノクローナル捕獲抗体が利用される限り、ポリクローナル検出抗体は、より高密度でも、おそらく問題に遭遇しないと考えられる）。
【００４３】
このELISA系のもう1つの利点は、単一のデータポイント（プローブ値）の欠損では、試験ウェルの値が否定されないという事実である。これは、重複性（2つ組でプリントされた捕獲抗体）およびいくつかの捕獲抗体濃度を使用することによるものである。捕獲抗体の滴定により形成される回帰式の使用により、時折生じる域外のデータポイントに対して、全セットに対するこれらの影響を強調したりまたは弱めたりせずに、つりあい効果（balancing effect）も有する。
【００４４】
このアッセイの形式は、全てのアレイについて利用される標準的な96ウェルガラススライドアレイである。この形式は、遺伝子型解析および遺伝子発現のためなどの自動操作に容易に取り入れられる。
【００４５】
本発明のいくつかの態様を記載した。しかし、本発明の精神と範囲から逸脱することなく種々の修飾がなされてもよいことは理解されるだろう。したがって、その他の態様も、請求の範囲に含まれるものである。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】実施例1に記載した例示的な方法に使用されるアレイの地図を図式的に記載する。
【図２】実施例1に記載したように、特異性および標準曲線を示すアレイイメージを表す図解である。
【図３Ａ−Ｂ】図３Ａは、実施例1に記載したものに由来する直線回帰グラフおよび方程式である。図３Ｂは、実施例1において詳細に記載したように、アレイに試料を適用したものに由来するデータからの抗原濃度グラフおよび標準曲線である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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