(57)【要約】  【課題】全反射照明範囲を一定に保ちながら、標本における異なる深部でのＬＳＭ画像を高ＮＡで精度よく取得可能なレーザ顕微鏡を提供する。  【解決手段】レーザ走査照明光学系１０と全反射照明光学系２０を有し、２つの照明光学系が対物レンズ１２を共有するレーザ顕微鏡において、対物レンズ１２と標本５０との距離の変化に応じて、全反射照明光束の主光線の対物レンズ１２の瞳面とのなす角度を、標本５０における全反射照明範囲が同じ範囲に保たれる角度に変化させ得る、全反射照明主光線角度調整手段として結像レンズ１３よりも光源側の全反射照明光路上に配置され、傾斜角度が可変に構成された、平行平面板２３を有し、対物レンズ１２と標本５０との距離の変動にかかわらず、標本５０への全反射照明範囲を一定に保ち得るように構成されている。【選択図】  図１
2007072391.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ走査照明光学系と全反射照明光学系を有し、前記２つの照明光学系が対物レンズを共有するレーザ顕微鏡において、
前記対物レンズと標本との距離の変化に応じて、全反射照明光束の主光線の対物レンズの瞳面とのなす角度を、標本における全反射照明範囲が同じ範囲に保たれる角度に変化させ得る、全反射照明主光線角度調整手段を有し、前記対物レンズと標本との距離の変動にかかわらず、標本への全反射照明範囲を一定に保ち得るようにしたことを特徴とするレーザ顕微鏡。
【請求項２】
レーザ走査照明光学系と全反射照明光学系を有し、前記２つの照明光学系が結像レンズと対物レンズを共有するレーザ顕微鏡において、
前記対物レンズと標本との距離の変化に応じて、全反射照明光束の主光線の対物レンズの瞳面とのなす角度を、標本における全反射照明範囲が同じ範囲に保たれる角度に変化させ得る、全反射照明主光線角度調整手段を有し、前記対物レンズと標本との距離の変動にかかわらず、標本への全反射照明範囲を一定に保ち得るようにしたことを特徴とするレーザ顕微鏡。
【請求項３】
前記全反射照明主光線角度調整手段が、
前記結像レンズよりも光源側の全反射照明光路上に配置され、傾斜角度が可変に構成された、平行平面板であることを特徴とする請求項１又は２に記載のレーザ顕微鏡。
【請求項４】
前記全反射照明主光線角度調整手段が、
前記結像レンズよりも光源側の全反射照明光路上に配置され、少なくとも一方が相互の位置関係を垂直又は水平方向に変動可能に構成された、１組の楔型プリズムであることを特徴とする請求項１又は２に記載のレーザ顕微鏡。
【請求項５】
前記全反射照明主光線角度調整手段が、
前記結像レンズよりも光源側の全反射照明光路上に配置され、互いに平行、かつ、光軸に対して傾斜し、少なくとも一方が相互の距離が変化する方向に移動可能に構成された、一対の反射面であることを特徴とする請求項１又は２に記載のレーザ顕微鏡。
【請求項６】
前記全反射照明光学系が、前記結像レンズよりも光源側の全反射照明光路上に、ファイバーを有し、
前記全反射照明主光線角度調整手段が、角度を調整可能に構成された、前記ファイバーの出射端面であることを特徴とする請求項１又は２に記載のレーザ顕微鏡。
【請求項７】
前記全反射照明主光線角度調整手段による前記全反射照明主光線角度の調整を、前記対物レンズと標本との距離の変化に連動させる連動制御手段を有することを特徴とする請求項２、請求項２に従属する請求項３〜６のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。
【請求項８】
前記全反射照明光学系の全反射照明によるエバネッセント蛍光像を撮像する全反射蛍光像撮像素子と、前記エバネッセント蛍光像を前記撮像素子の撮像面に結像する全反射蛍光像撮像光学系を有し、
前記対物レンズと標本との距離の変化に連動して、前記全反射蛍光像撮像素子と前記全反射蛍光像撮像光学系との相対的な距離を、前記エバネッセント蛍光像が前記撮像素子の撮像面にピントが合った状態で結像するように変化させる、第２の連動制御手段を有することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、走査型レーザ照明による共焦点画像（ＬＳＭ画像）と、全反射照明によるエバネッセント蛍光画像（ＴＩＲＦＭ画像）とを取得可能な顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、例えば、生体細胞の機能解析等において、細胞膜の機能を観察するために、走査型レーザ照明による共焦点画像（ＬＳＭ画像）と全反射照明によるエバネッセント蛍光画像（ＴＩＲＦＭ画像）を取得することが必要とされてきている。
このため、従来、例えば、次の特許文献１に記載の顕微鏡のように、走査型レーザ照明による共焦点画像と、全反射照明によるエバネッセント蛍光画像を観察するための顕微鏡が提案されている。
【特許文献１】特開２００３−３０７６８２号公報
【０００３】
特許文献１に記載の顕微鏡では、照明光を対物レンズを介して標本上に集光させるレンズと、照明光を対物レンズの射出瞳上に集光させるレンズとを選択的に光路に挿入させることによって、ＬＳＭ画像とＴＩＲＦＭ画像とを選択的に取得することができるようになっている。
【０００４】
また、例えば、次の特許文献２に記載の顕微鏡のように、標本の上下に対物レンズを配置し、上下からレーザを入射することが可能な顕微鏡が提案されている。
【特許文献２】特開２００２−５５２８２号公報
【０００５】
特許文献２に記載の顕微鏡では、標本の下側の対物レンズから全反射照明を行い、標本の上側の対物レンズからＬＳＭ観察をすることができるようになっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
近年、生体細胞の機能解析等において、細胞膜の機能をより詳しく観察するために、試料の表面を全反射照明して刺激を与えながら走査型レーザ照明による共焦点画像（ＬＳＭ画像）を取得することが必要とされてきている。
しかし、特許文献１に記載の顕微鏡では、試料の表面をＴＩＲＦＭ照明しながらＬＳＭ画像を取得することはできなかった。また、特許文献１に記載の顕微鏡のような、従来のＬＳＭ画像とＴＩＲＦＭ画像とを取得可能にした顕微鏡においては、ＬＳＭ観察において、光軸方向にスキャンするために対物レンズの標本内における焦点位置を変えると、それに伴って全反射照明光が照射する標本表面の照明範囲（ＴＩＲＦＭ照明範囲）が変わってしまい、所望の観察対象領域でのエバネッセント蛍光が得られないという問題があった。
【０００７】
また、特許文献２に記載のような顕微鏡で生細胞を観察するには、上側のＬＳＭ用対物レンズには、水浸対物レンズを用いなければならない。
即ち、正立顕微鏡で生細胞を上側から観察する場合には、通常、ガラスボトムディッシュを用いる。これは、カバーガラスで生細胞を挟んだのでは、生細胞の動きを阻害し、また、生細胞にダメージを与え易いからである。このため、ＬＳＭ用対物レンズを介して生細胞を上側から観察する場合には、ガラスボトムディッシュ上の生細胞とＬＳＭ用対物レンズとの間に液体が介在することになる。ここで、ＬＳＭ用対物レンズに油浸対物レンズを用いると、生細胞に油が接触することになり、生細胞にダメージを与え易い。従って、正立で生細胞を観察する場合には、水浸対物レンズを用いるのが最も効率が良い。
しかし、水浸対物レンズは、油浸対物レンズに比べてＮＡが小さい。
このため、特許文献２に記載のような顕微鏡では、生細胞を観察する場合に、高ＮＡで精度よく観察することができない。
【０００８】
本発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、全反射照明範囲を一定に保ちながら、標本における異なる深部でのＬＳＭ画像を高ＮＡで精度よく取得でき、好ましくはＬＳＭ画像とＴＩＲＦＭ画像とを同時に取得可能なレーザ顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明によるレーザ顕微鏡は、レーザ走査照明光学系と全反射照明光学系を有し、前記２つの照明光学系が対物レンズを共有するレーザ顕微鏡において、前記対物レンズと標本との距離の変化に応じて、全反射照明光束の主光線の対物レンズの瞳面とのなす角度を、標本における全反射照明範囲が同じ範囲に保たれる角度に変化させ得る、全反射照明主光線角度調整手段を有し、前記対物レンズと標本との距離の変動にかかわらず、標本への全反射照明範囲を一定に保ち得るようにしたことを特徴としている。
【００１０】
また、本発明によるレーザ顕微鏡は、レーザ走査照明光学系と全反射照明光学系を有し、前記２つの照明光学系が結像レンズと対物レンズを共有するレーザ顕微鏡において、前記対物レンズと標本との距離の変化に応じて、全反射照明光束の主光線の対物レンズの瞳面とのなす角度を、標本における全反射照明範囲が同じ範囲に保たれる角度に変化させ得る、全反射照明主光線角度調整手段を有し、前記対物レンズと標本との距離の変動にかかわらず、標本への全反射照明範囲を一定に保ち得るようにしたことを特徴としている。
【００１１】
また、本発明のレーザ顕微鏡においては、前記全反射照明主光線角度調整手段が、前記結像レンズよりも光源側の全反射照明光路上に配置され、傾斜角度が可変に構成された、平行平面板であるのが好ましい。
【００１２】
また、本発明のレーザ顕微鏡においては、前記全反射照明主光線角度調整手段が、前記結像レンズよりも光源側の全反射照明光路上に配置され、少なくとも一方が相互の位置関係を垂直又は水平方向に変動可能に構成された、１組の楔型プリズムであるのが好ましい。
【００１３】
また、本発明のレーザ顕微鏡においては、前記全反射照明主光線角度調整手段が、前記結像レンズよりも光源側の全反射照明光路上に配置され、互いに平行、かつ、光軸に対して傾斜し、少なくとも一方が相互の距離が変化する方向に移動可能に構成された、一対の反射面であるのが好ましい。
【００１４】
また、本発明のレーザ顕微鏡においては、前記全反射照明光学系が、前記結像レンズよりも光源側の全反射照明光路上に、ファイバーを有し、前記全反射照明主光線角度調整手段が、角度を調整可能に構成された、前記ファイバーの出射端面であるのが好ましい。
【００１５】
また、本発明のレーザ顕微鏡においては、前記全反射照明主光線角度調整手段による前記全反射照明主光線角度の調整を、前記対物レンズと標本との距離の変化に連動させる連動制御手段を有するのが好ましい。
【００１６】
本発明のレーザ顕微鏡においては、前記全反射照明光学系の全反射照明によるエバネッセント蛍光像を撮像する全反射蛍光像撮像素子と、前記エバネッセント蛍光像を前記撮像素子の撮像面に結像する全反射蛍光像撮像光学系を有し、前記対物レンズと標本との距離の変化に連動して、前記全反射蛍光像撮像素子と前記全反射蛍光像撮像光学系との相対的な距離を、前記エバネッセント蛍光像が前記撮像素子の撮像面にピントが合った状態で結像するように変化させる、第２の連動制御手段を有するのが好ましい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、全反射照明範囲を一定に保ちながら、標本における異なる深部でのＬＳＭ画像を高ＮＡで精度よく取得でき、好ましくはＬＳＭ画像とＴＩＲＦＭ画像とを同時に取得可能なレーザ顕微鏡が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
第一実施形態
図１は本発明の第一実施形態にかかるレーザ顕微鏡の概略構成図、図２は図１のレーザ顕微鏡における要部の作用を示す原理説明図である。
第一実施形態の顕微鏡は、レーザ走査照明光学系１０と、全反射照明光学系２０と、パーソナルコンピュータ３０と、モニタ４０を有している。
【００１９】
レーザ走査照明光学系１０は、レーザ光源部１１と、対物レンズ１２と、結像レンズ１３と、走査手段１４と、瞳投影レンズ１５と、検出光学系１６を有している。なお、図中、１７は、レーザ光源部１１からのレーザ光を標本５０に向けて透過し、瞳投影レンズ１５を経た標本５０からの光を検出光学系１６に向けて反射する例えばダイクロイックミラーやハーフミラーなどの光分岐部材、１８は、結像レンズ１３を経たレーザ光源部１１からのレーザ光を標本５０に向けて反射し、標本５０からの光を検出光学系１６側の結像レンズ１３に向けて反射する例えばダイクロイックミラーやハーフミラーなどの光分岐部材である。
【００２０】
レーザ光源部１１は、レーザ光源１１ａと、カップリングレンズ１１ｂと、光ファイバ１１ｃと、コリメートレンズ１１ｄを有して構成されており、レーザ光源１１ａから出射されたレーザ光をカップリングレンズ１１ｂを介して光ファイバー１１ｃに導入し、光ファイバー１１ｃから出射されたレーザ光をコリメートレンズ１１ｄを介して平行光に変換するようになっている。
走査手段１４は、ガルバノミラーで構成されており、レーザ光源部１１からのレーザ光を試料５０上で２次元方向に走査することができるようになっている。
瞳投影レンズ１５は、走査手段１４と結像レンズ１３との間に配置されており、走査手段１４で偏向されたレーザ光を、結像レンズ１３を介して対物レンズ１２の瞳面上の所定位置に投影するとともに、結像レンズ１３、対物レンズ２を介して試料５０上に集光させるように構成されている。
検出光学系１６は、ピンホール結像レンズ１６ａと、ピンホール１６ｂと、集光レンズ１６ｃと、フォトマル１６ｄを有して構成されており、試料５０から発し、対物レンズ１２、結像レンズ１３、瞳投影レンズ１４を通り、光分岐部材１７で反射した光を検出するようになっている。
【００２１】
全反射照明光学系２０は、レーザ光源部２１と、レンズ２２と、光分岐部材２４と、対物レンズ１２と、結像レンズ１３と、光分岐部材１８と、検出光学系２５を有して構成されている。
即ち、第一実施形態のレーザ顕微鏡では、対物レンズ１２、光分岐部材１８、結像レンズ１３は、レーザ走査照明光学系１０と全反射照明光学系２０に共通の光学部材として用いられている。
【００２２】
レーザ光源部２１は、レーザ光源２１ａと、カップリングレンズ２１ｂと、光ファイバー２１ｃを有して構成されており、レーザ光源２１ａから出射されたレーザ光をカップリングレンズ２１ｂを介して光ファイバー２１ｃに導入し、光ファイバー２１ｃから出射するようになっている。
レンズ２２は、光ファイバ２１ｃから出射されたレーザ光を、結像レンズ１３を介して対物レンズ１２の瞳面上の所定位置に集光するとともに、結像レンズ１３、対物レンズ１２を介して試料５０上に斜めから投影するように構成されている。
【００２３】
光分岐部材２４は、レーザ光源部２１からのレーザ光を反射し、それ以外の波長（レーザ光源部１１からのレーザ光、試料５０からの光）を透過する特性を備えたダイクロイックミラーで構成されている。なお、光分岐部材２４をミラーを用いて光路内に挿脱可能に構成し、光路内に挿入したときに全反射照明光学系を介してのＴＩＲＦＭ画像が得られ、光路から外したときにレーザ走査照明光学系を介してのＬＳＭ画像が得られるようにしてもよい。
光分岐部材１８は、上述した結像レンズ１３を経たレーザ光源部１１からのレーザ光を標本５０に向けて反射し、標本５０からの光を検出光学系１６側の結像レンズ１３に向けて反射する特性に加えて、結像レンズ１３を経たレーザ光源部２１からのレーザ光を標本５０に向けて反射するとともに、標本５０からのエバネッセント蛍光を検出光学系２５に向けて透過する特性も備えている。
【００２４】
検出光学系２５は、結像レンズ２５ａと、ＣＣＤ２５ｂを有して構成されており、試料５０から発し、対物レンズ１２、光分岐部材１８を通過したエバネッセント蛍光画像を撮像するようになっている。
なお、試料５０と対物レンズ１２との相対的距離は、例えば図示省略したステージを移動することによって調整できるようになっている。
また、パーソナルコンピュータ３０は、レーザ走査照明光学系１０及び全反射照明光学系２０に接続されており、それぞれの検出光学系１６，２５を介して得られた信号情報に所定の変換処理を施して、モニタ４０に表示させたり、レーザ走査照明光学系１０、及び全反射照明光学系２０を構成する光学部材の駆動制御等をすることができる機能を備えている。
【００２５】
ここで、本発明の特徴的な構成として、第一実施形態のレーザ顕微鏡では、全反射照明主光線角度調整手段としての透明平行平板２３を、レンズ２２と光分岐部材２４との間に備えている。
透明平行平板２３は、軸２３ａを中心として回転可能に構成されており、対物レンズ１２と試料５０との距離の変化に応じて、全反射照明光束の主光線の対物レンズ１２の瞳面とのなす角度を試料５０における全反射照明範囲が同じ範囲に保たれる角度に変化させることができる回転量でもって回転するようになっている。
【００２６】
対物レンズ１２と試料５０との距離の変化に伴う平行平板２３の回転と全反射照明範囲との関係を図２を用いて説明する。なお、図２では、説明の便宜上、光分岐部材２４は省略するとともに、図１の構成と光路長は一致させないで示してある。また、ここでは、対物レンズ１２の焦点位置をＰとする。
試料５０の表面５０ａがＡ１の位置（破線で示す位置）に位置するときは、レーザ走査照明光は試料５０の表面５０ａの所定部位に集光する。このときは、透明平行平板２３は破線で示すように、光軸に対して垂直に交差している。透明平行平板２３を透過した全反射照明光Ｍ１は、破線で示す経路を辿り、対物レンズ１２の瞳面上の光軸をずれた所定位置で集光した後、対物レンズ１２に入射し、対物レンズ１２を介して試料５０の表面５０ａにおける、レーザ走査照明光の集光位置Ｐを含む周辺領域５０ｂを斜めから投影する。
【００２７】
これに対し、試料５０の表面５０ａがＡ２の位置（実線で示す位置）に位置するときは、レーザ走査照明光は試料５０の内部の所定部位に集光する。
ここで、従来のレーザ顕微鏡では、全反射照明光Ｍ１と同じ経路を辿って対物レンズ１２を介して試料５０を投影することになる。その場合、試料５０の表面５０ａにおける投影領域５０ｂ’は、試料５０の表面５０ａがＡ１の位置に位置したときにおける投影領域５０ｂからずれてしまうことになる。
これに対し、第一実施形態のレーザ顕微鏡では、透明平行平板２３を、実線で示すように、入射光軸に対して所定角度傾斜させることができる。透明平行平板２３に入射した全反射照明光Ｍ２は、透明平行平板２３の入射面及び出射面で屈折して、出射光軸が入射光軸に対して平行にずれて出射し、実線で示すように、全反射照明光Ｍ１と比べて、主光線の対物レンズ１２の瞳面とのなす角度が異なる角度をもつ経路を辿り、対物レンズ１２の瞳面上の所定位置で集光した後、対物レンズ１２に入射し、対物レンズ１２を介して試料５０の表面５０ａにおける、レーザ走査照明光の集光位置Ｐの延長上の周辺領域５０ｂを斜めから投影する。
このように、第一実施形態のレーザ顕微鏡では、全反射照明主光線角度調整手段としての透明平行平板２３を所定量回転させることで、対物レンズ１２と試料５０との距離が変動しても、試料５０における同じ範囲（周辺領域５０ｂ）を全反射照明することができるようになっている。
【００２８】
なお、透明平行平板２３の回転量及び回転駆動は、図１に示したパーソナルコンピュータ３０を介して自動的に制御することができる。その場合、対物レンズ１２と試料５０の表面５０ａとの距離を検出する手段（例えば試料５０を載置するステージの移動量をギアの回転量を検出する手段、ステージと対物レンズ鏡筒との間の距離を検出するセンサ）を設け、パーソナルコンピュータ３０では、距離検出手段で検出された距離に基づいて、回転量を算出し、算出した回転量でもって、透明平行平板２３を回転駆動させるようにすればよい。
【００２９】
このように構成された第一実施形態のレーザ顕微鏡によれば、レーザ走査照明光学系１０のレーザ光源部１１から出射したレーザ光は、光分岐部材１７を透過し、走査手段１４で所定方向に走査され、光分岐部材２４を透過し、瞳投影レンズ１５、結像レンズ１３を経て、光分岐部材１８で反射され、対物レンズ１２を経て、試料５０の所定部位に集光される。試料５０からの光は、対物レンズ１２、光分岐部材１８、結像レンズ１３、光分岐部材２４、瞳投影レンズ２４、走査手段１４というように、逆の経路を辿り、光分岐部材１７に入射する。光分岐部材１７で反射された光が検出光学系１６のフォトマル１６ｄに受光される。フォトマル１６ｄに受光された光は、パーソナルコンピュータ３０で信号変換処理が施されてモニタ４０に表示される。これにより、ＬＳＭ画像が得られることになる。
【００３０】
また、全反射照明光学系２０のレーザ光源部２１から出射したレーザ光は、レンズ２２、透明平行平板２３、光分岐部材２４、結像レンズ１３、光分岐部材１８を経て、対物レンズ１２の瞳面上の所定位置に集光された後、試料５０上に斜めから投影する。これにより、試料５０の表面を全反射照明して刺激を与えることができる。なお、試料５０を全反射照明することにより生じたエバネッセント蛍光は、全反射照明光とともに、対物レンズ１２を経て光分岐部材１８に入射する。光分岐部材１８はエバネッセント蛍光のみを透過しその他の波長を反射する。光分岐部材１８を透過したエバネッセント蛍光は、検出光学系２５のＣＣＤ２５ｂで撮像される。
撮像された画像は、パーソナルコンピュータ３０を介してモニタ４０に表示される。これにより、ＣＣＤ２５ｂにピントが合って撮像された場合には、ＴＩＲＦＭ画像が得られることになる。
【００３１】
ここで、試料５０の異なる深度でのＬＳＭ画像を取得する場合、図示省略したステージを駆動して対物レンズ１２と試料との距離を変動させる。
このとき、第一実施形態のレーザ顕微鏡では、パーソナルコンピュータ３０を介して対物レンズ１２と試料との距離の変動に連動して透明平行平板２３を所定量回転させることによって、試料５０の同じ範囲（周辺領域５０ｂ）を全反射照明することができる。このため、図２を用いて説明したように、試料５０表面の同じ範囲を全反射照明して刺激を与えながら試料５０における異なる深度でのＬＳＭ画像を取得することができる。
【００３２】
また、第一実施形態のレーザ顕微鏡は、レーザ走査照明光学系１０と全反射照明光学系２０を有し、２つの照明光学系が対物レンズ１２を共有するレーザ顕微鏡において、試料５０への全反射照明範囲を一定に保ち得るようにしたので、下側から一つの対物レンズで試料５０の底面を支持するカバーガラス付近を全反射照明しながら、試料５０の深部をＬＳＭ画像を得るように顕微鏡を構成することができる。
このように顕微鏡を構成すれば、観察対象の試料５０がガラスボトムディッシュ内の生細胞であるような場合に、対物レンズ１２とガラスボトムディッシュの底部のカバーガラスとの間に液体を介在させることでＬＳＭ画像を得ることができ、ガラスボトムディッシュ内の試料５０に対しては、その上方から、カバーガラスで押さえたり、液浸対物レンズに用いる液体と接触させたりしないで済む。このため、対物レンズ１２に油浸系の対物レンズを用いてＬＳＭ画像を得ることができる。そして、液浸系の対物レンズは、水浸系の対物レンズに比べて、ＮＡが大きい。
このため、第一実施形態のレーザ顕微鏡によれば、対物レンズ１２に油浸系の対物レンズを用いてＬＳＭ画像を得ることができ、特許文献２に記載のような、標本の下側の対物レンズから全反射照明を行い、標本の上側の対物レンズからＬＳＭ観察をする顕微鏡に比べて、高ＮＡで精度よく試料５０を観察することができる。
【００３３】
なお、第一実施形態のレーザ顕微鏡において、検出手段２５におけるＣＣＤ２５ｂの結像位置は、レーザ走査照明光学系１０における対物レンズ１２の焦点位置Ｐと共役となっている。このため、試料５０の表面以外の異なる深度でのＬＳＭ画像を取得するために対物レンズ１２と試料５０との距離を変動させると、エバネッセント蛍光はＣＣＤ２５ｂにピントがぼけた状態で入射するので、良好なＴＩＲＦＭ画像を取得することができない。
そこで、結像レンズ２５ａとＣＣＤ２５ｂの少なくとも一方を、試料５０と対物レンズ１２との相対的距離の変動に連動して、光軸に沿って所定量移動し、エバネッセント蛍光像がＣＣＤ２５ｂの撮像面にピントが合った状態で結像するように結像レンズ２５ａとＣＣＤ２５ｂとの互いの相対的距離を変化させるように、パーソナルコンピュータ３０を介して制御するようにするのが好ましい。このようにすれば、異なる深度でのＬＳＭ画像の取得と同時に、常にピントの合った状態でＴＩＲＦＭ画像を取得できる。
【００３４】
第二実施形態
図３は本発明の第二実施形態にかかるレーザ顕微鏡の概略構成図、図４は図３のレーザ顕微鏡における要部の作用を示す原理説明図である。
第二実施形態のレーザ顕微鏡は、全反射照明主光線角度調整手段として、透明平行平板２３の代わりに、１組の楔型プリズム２３ａ’，２３ｂ’が、レンズ２２と光分岐部材２４との間に設けられている。
１組の楔型プリズム２３ａ’，２３ｂ’は、図４に示すように、点対称かつ平行な間隔をもって配置されている。そして、一方の楔型プリズム２３ｂ’は、他方の楔型プリズム２３ａ’との位置関係が垂直又は水平方向（図４では垂直方向）に変動可能に構成されており、対物レンズ１２と試料５０との距離の変化に応じて、全反射照明光束の主光線の対物レンズ１２の瞳面とのなす角度を試料５０における全反射照明範囲が同じ範囲に保たれる角度に変化させることができる移動量でもって移動できるようになっている。
その他の構成は、第一実施形態のレーザ顕微鏡とほぼ同じである。
【００３５】
対物レンズ１２と試料５０との距離の変化に伴う楔型プリズム２３ｂ’の移動と全反射照明範囲との関係を図４を用いて説明する。なお、図４では、説明の便宜上、光分岐部材２４は省略するとともに、図３の構成と光路長は一致させないで示してある。また、ここでは、対物レンズ１２の焦点位置をＰとする。
試料５０の表面５０ａがＡ１の位置（破線で示す位置）に位置するときは、レーザ走査照明光は試料５０の表面５０ａの所定部位に集光する。このときは、楔型プリズム２３ｂ’は破線で示すように、楔型プリズム２３ａ’との間隔が接近している。楔型プリズム２３ａ’の出射面で屈折した全反射照明光Ｍ１はすぐに楔型プリズム２３ｂ’に入射する。楔型プリズム２３ｂ’の入射面で屈折した全反射照明光Ｍ１は、破線で示す経路を辿り、対物レンズ１２の瞳面上の光軸をずれた所定位置で集光した後、対物レンズ１２に入射し、対物レンズ１２を介して試料５０の表面５０ａにおける、レーザ走査照明光の集光位置Ｐを含む周辺領域５０ｂを斜めから投影する。
【００３６】
これに対し、試料５０の表面５０ａがＡ２の位置（実線で示す位置）に位置するときは、レーザ走査照明光は試料５０の内部の所定部位に集光する。
ここで、従来のレーザ顕微鏡では、全反射照明光Ｍ１と同じ経路を辿って対物レンズ１２を介して試料５０を投影することになる。その場合、試料５０の表面５０ａにおける投影領域５０ｂ’は、試料５０の表面５０ａがＡ１の位置に位置したときにおける投影領域５０ｂからずれてしまうことになる。
これに対し、第二実施形態のレーザ顕微鏡では、楔型プリズム２３ｂ’を、実線で示すように、楔型プリズム２３ａ’に対し、破線の位置に比べて離れた位置に位置させることができる。楔型プリズム２３ａ’の出射面で屈折した全反射照明光Ｍ２は、破線で示した楔型プリズム２３ｂ’の位置よりも長く伸びて楔型プリズム２３ｂ’に入射する。楔型プリズム２３ｂ’の入射面で屈折した全反射照明光Ｍ２は、実線で示すように、全反射照明光Ｍ１と比べて、主光線の対物レンズ１２の瞳面とのなす角度が異なる角度をもつ経路を辿り、対物レンズ１２の瞳面上の光軸をずれた所定位置で集光した後、対物レンズ１２に入射し、対物レンズ１２を介して試料５０の表面５０ａにおける、レーザ走査照明光の集光位置Ｐの延長上の周辺領域５０ｂを斜めから投影する。
このように、第二実施形態のレーザ顕微鏡では、全反射照明主光線角度調整手段としての楔型プリズム２３ｂ’を、相互の楔型プリズム２３ａ’，２３ｂ’の位置関係を垂直又は水平方向に変動するように移動させることで、対物レンズ１２と試料５０との距離が変動しても、試料５０における同じ範囲（周辺領域５０ｂ）を全反射照明することができるようになっている。
【００３７】
なお、楔型プリズム２３ｂ’の移動量及び駆動は、図３に示したパーソナルコンピュータ３０を介して自動的に制御することができる。その場合、対物レンズ１２と試料５０の表面５０ａとの距離を検出する手段（例えば試料５０を載置するステージの移動量をギアの回転量を検出する手段、ステージと対物レンズ鏡筒との間の距離を検出するセンサ）を設け、パーソナルコンピュータ３０では、距離検出手段で検出された距離に基づいて、移動量を算出し、算出した移動量でもって、楔型プリズム２３ｂ’を駆動させるようにすればよい。
【００３８】
このように構成された第二実施形態のレーザ顕微鏡によれば、パーソナルコンピュータ３０を介して対物レンズ１２と試料との距離の変動に連動して、楔型プリズム２３ｂ’を所定量移動させて、楔型プリズム２３ａ’，２３ｂ’の相対的距離を変動させることによって、試料５０の同じ範囲（周辺領域５０ｂ）を全反射照明することができる。このため、図４を用いて説明したように、試料５０表面の同じ範囲を全反射照明して刺激を与えながら試料５０における異なる深度でのＬＳＭ画像を取得することができる。
なお、第二実施形態のレーザ顕微鏡においても、結像レンズ２５ａとＣＣＤ２５ｂの少なくとも一方を、試料５０と対物レンズ１２との相対的距離の変動に連動して、光軸に沿って所定量移動し、エバネッセント蛍光像がＣＣＤ２５ｂの撮像面にピントが合った状態で結像するように結像レンズ２５ａとＣＣＤ２５ｂとの互いの相対的距離を変化させるように、パーソナルコンピュータ３０を介して制御するようにするのが好ましい。このようにすれば、異なる深度でのＬＳＭ画像の取得と同時に、常にピントの合った状態でＴＩＲＦＭ画像を取得できる。
その他の作用効果は、第一実施形態のレーザ顕微鏡とほぼ同じである。
【００３９】
第三実施形態
図５は本発明の第三実施形態にかかるレーザ顕微鏡の概略構成図、図６は図５のレーザ顕微鏡における要部の作用を示す原理説明図である。
第三実施形態のレーザ顕微鏡は、全反射照明主光線角度調整手段として、透明平行平板２３の代わりに、一対のミラー２３ａ”，２３ｂ”が、レンズ２２と光分岐部材２４との間に設けられている。
一対のミラー２３ａ”，２３ｂ”は、互いに平行であり、かつ、光軸に対して傾斜して配置されている。そして、一方のミラー２３ｂ”は、一対のミラー２３ａ”，２３ｂ”相互の反射面の距離が変化する方向に移動可能に構成されており、対物レンズ１２と試料５０との距離の変化に応じて、全反射照明光束の主光線の対物レンズ１２の瞳面とのなす角度を試料５０における全反射照明範囲が同じ範囲に保たれる角度に変化させることができる移動量でもって移動できるようになっている。
その他の構成は、第一実施形態のレーザ顕微鏡とほぼ同じである。
【００４０】
対物レンズ１２と試料５０との距離の変化に伴うミラー２３ｂ”の移動と全反射照明範囲との関係を図６を用いて説明する。なお、図６では、説明の便宜上、光分岐部材２４は省略するとともに、図５の構成と光路長は一致させないで示してある。また、ここでは、対物レンズ１２の焦点位置をＰとする。
試料５０の表面５０ａがＡ１の位置（破線で示す位置）に位置するときは、レーザ走査照明光は試料５０の表面５０ａの所定部位に集光する。このときは、ミラー２３ｂ”は破線で示すように、ミラー２３ａ”との反射面の間隔が接近している。ミラー２３ａ”の反射面で反射した全反射照明光Ｍ１はすぐにミラー２３ｂ”に入射する。ミラー２３ｂ”の反射面で反射した全反射照明光Ｍ１は、破線で示す経路を辿り、対物レンズ１２の瞳面上の光軸をずれた所定位置で集光した後、対物レンズ１２に入射し、対物レンズ１２を介して試料５０の表面５０ａにおける、レーザ走査照明光の集光位置Ｐを含む周辺領域５０ｂを斜めから投影する。
【００４１】
これに対し、試料５０の表面５０ａがＡ２の位置（実線で示す位置）に位置するときは、レーザ走査照明光は試料５０の内部の所定部位に集光する。
ここで、従来のレーザ顕微鏡では、全反射照明光Ｍ１と同じ経路を辿って対物レンズ１２を介して試料５０を投影することになる。その場合、試料５０の表面５０ａにおける投影領域５０ｂ’は、試料５０の表面５０ａがＡ１の位置に位置したときにおける投影領域５０ｂからずれてしまうことになる。
これに対し、第三実施形態のレーザ顕微鏡では、ミラー２３ｂ”を、実線で示すように、ミラー２３ａ”に対し、破線の位置に比べて離れた位置に位置させることができる。ミラー２３ａ”の反射面で反射した全反射照明光Ｍ２は、破線で示したミラー２３ｂ”の位置よりも長く伸びてミラー２３ｂ”に入射する。ミラー２３ｂ”の反射面で反射した全反射照明光Ｍ２は、実線で示すように、全反射照明光Ｍ１と比べて、主光線の対物レンズ１２の瞳面とのなす角度が異なる角度をもつ経路を辿り、対物レンズ１２の瞳面上の光軸をずれた所定位置で集光した後、対物レンズ１２に入射し、対物レンズ１２を介して試料５０の表面５０ａにおける、レーザ走査照明光の集光位置Ｐの延長上の周辺領域５０ｂを斜めから投影する。
このように、第三実施形態のレーザ顕微鏡では、全反射照明主光線角度調整手段としてのミラー２３ｂ”を、相互のミラー２３ａ”，２３ｂ”の反射面の距離が変動するように移動させることで、対物レンズ１２と試料５０との距離が変動しても、試料５０における同じ範囲（周辺領域５０ｂ）を全反射照明することができるようになっている。
【００４２】
なお、ミラー２３ｂ”の移動量及び駆動は、図５に示したパーソナルコンピュータ３０を介して自動的に制御することができる。その場合、対物レンズ１２と試料５０の表面５０ａとの距離を検出する手段（例えば試料５０を載置するステージの移動量をギアの回転量を検出する手段、ステージと対物レンズ鏡筒との間の距離を検出するセンサ）を設け、パーソナルコンピュータ３０では、距離検出手段で検出された距離に基づいて、移動量を算出し、算出した移動量でもって、ミラー２３ｂ”を駆動させるようにすればよい。
【００４３】
このように構成された第三実施形態のレーザ顕微鏡によれば、パーソナルコンピュータ３０を介して対物レンズ１２と試料との距離の変動に連動して、ミラー２３ｂ”を所定量移動させて、ミラー２３ａ”，２３ｂ”の反射面の相対的距離を変動させることによって、試料５０の同じ範囲（周辺領域５０ｂ）を全反射照明することができる。このため、図６を用いて説明したように、試料５０表面の同じ範囲を全反射照明して刺激を与えながら試料５０における異なる深度でのＬＳＭ画像を取得することができる。
なお、第三実施形態のレーザ顕微鏡においても、結像レンズ２５ａとＣＣＤ２５ｂの少なくとも一方を、試料５０と対物レンズ１２との相対的距離の変動に連動して、光軸に沿って所定量移動し、エバネッセント蛍光像がＣＣＤ２５ｂの撮像面にピントが合った状態で結像するように結像レンズ２５ａとＣＣＤ２５ｂとの互いの相対的距離を変化させるように、パーソナルコンピュータ３０を介して制御するようにするのが好ましい。このようにすれば、異なる深度でのＬＳＭ画像の取得と同時に、常にピントの合った状態でＴＩＲＦＭ画像を取得できる。
その他の作用効果は、第一実施形態のレーザ顕微鏡とほぼ同じである。
【００４４】
第四実施形態
図７は本発明の第四実施形態にかかるレーザ顕微鏡の概略構成図、図８は図７のレーザ顕微鏡における要部の作用を示す原理説明図である。
第四実施形態のレーザ顕微鏡は、全反射照明主光線角度調整手段として、透明平行平板２３等の光学部材を設ける代わりに、対物レンズ１２と試料５０との距離の変化に応じて、全反射照明光束の主光線の対物レンズ１２の瞳面とのなす角度を試料５０における全反射照明範囲が同じ範囲に保たれる角度に変化させることができる角度でもって、光ファイバー２１ｃの出射端面の角度を調整可能に構成されている。
その他の構成は、第一実施形態のレーザ顕微鏡とほぼ同じである。
【００４５】
対物レンズ１２と試料５０との距離の変化に伴う光ファイバー２１ｃの出射端面の向きと全反射照明範囲との関係を図８を用いて説明する。なお、図８では、説明の便宜上、光分岐部材２４は省略するとともに、図７の構成と光路長は一致させないで示してある。また、ここでは、対物レンズ１２の焦点位置をＰとする。
試料５０の表面５０ａがＡ１の位置（破線で示す位置）に位置するときは、レーザ走査照明光は試料５０の表面５０ａの所定部位に集光する。このときは、光ファイバー２１ｃの出射端面は、破線で示すように、レンズ２２の中心を通る軸に対して垂直になっている。光ファイバー２１ｃの出射端面で出射しレンズ２２に入射した全反射照明光Ｍ１は、破線で示す経路を辿り、対物レンズ１２の瞳面上の光軸をずれた所定位置で集光した後、対物レンズ１２に入射し、対物レンズ１２を介して試料５０の表面５０ａにおける、レーザ走査照明光の集光位置Ｐを含む周辺領域５０ｂを斜めから投影する。
【００４６】
これに対し、試料５０の表面５０ａがＡ２の位置（実線で示す位置）に位置するときは、レーザ走査照明光は試料５０の内部の所定部位に集光する。
ここで、従来のレーザ顕微鏡では、全反射照明光Ｍ１と同じ経路を辿って対物レンズ１２を介して試料５０を投影することになる。その場合、試料５０の表面５０ａにおける投影領域５０ｂ’は、試料５０の表面５０ａがＡ１の位置に位置したときにおける投影領域５０ｂからずれてしまうことになる。
これに対し、第四実施形態のレーザ顕微鏡では、光ファイバー２１ｃの出射端面を、実線で示すように、レンズ２２の中心を通る軸に対して傾かせることができる。光ファイバー２１ｃの出射端面で出射しレンズ２２に入射した全反射照明光Ｍ２は、実線で示すように、全反射照明光Ｍ１とは主光線の対物レンズ１２の瞳面とのなす角度が異なる角度をもつ経路を辿り、対物レンズ１２の瞳面上の光軸をずれた所定位置で集光した後、対物レンズ１２に入射し、対物レンズ１２を介して試料５０の表面５０ａにおける、レーザ走査照明光の集光位置Ｐの延長上の周辺領域５０ｂを斜めから投影する。
このように、第四実施形態のレーザ顕微鏡では、全反射照明主光線角度調整手段として光ファイバー２１ｃの出射端面の角度を調整可能にすることで、対物レンズ１２と試料５０との距離が変動しても、試料５０における同じ範囲（周辺領域５０ｂ）を全反射照明することができるようになっている。
【００４７】
なお、光ファイバー２１ｃの出射端面の向き及び所定の向きへの駆動は、図７に示したパーソナルコンピュータ３０を介して自動的に制御することができる。その場合、対物レンズ１２と試料５０の表面５０ａとの距離を検出する手段（例えば試料５０を載置するステージの移動量をギアの回転量を検出する手段、ステージと対物レンズ鏡筒との間の距離を検出するセンサ）を設け、パーソナルコンピュータ３０では、距離検出手段で検出された距離に基づいて、向き及び駆動量を算出し、算出した向き及び駆動量でもって、光ファイバー２１ｃの出射端面の向きを所定の向きに駆動させるようにすればよい。
【００４８】
このように構成された第四実施形態のレーザ顕微鏡によれば、パーソナルコンピュータ３０を介して対物レンズ１２と試料との距離の変動に連動して、光ファイバー２１ｃの出射端面の向きを調整することによって、試料５０の同じ範囲（周辺領域５０ｂ）を全反射照明することができる。このため、図８を用いて説明したように、試料５０表面の同じ範囲を全反射照明して刺激を与えながら試料５０における異なる深度でのＬＳＭ画像を取得することができる。
なお、第四実施形態のレーザ顕微鏡においても、結像レンズ２５ａとＣＣＤ２５ｂの少なくとも一方を、試料５０と対物レンズ１２との相対的距離の変動に連動して、光軸に沿って所定量移動し、エバネッセント蛍光像がＣＣＤ２５ｂの撮像面にピントが合った状態で結像するように結像レンズ２５ａとＣＣＤ２５ｂとの互いの相対的距離を変化させるように、パーソナルコンピュータ３０を介して制御するようにするのが好ましい。このようにすれば、異なる深度でのＬＳＭ画像の取得と同時に、常にピントの合った状態でＴＩＲＦＭ画像を取得できる。
その他の作用効果は、第一実施形態のレーザ顕微鏡とほぼ同じである。
【００４９】
第五実施形態
図９は本発明の第五実施形態にかかるレーザ顕微鏡の概略構成図である。
第五実施形態のレーザ顕微鏡は、第一実施形態〜第四実施形態のレーザ顕微鏡におけるレーザ光源部２１〜光分岐部材２４を備える代わりに、光分岐部材２６ａ、レンズ２６ｂ、ミラー２６ｃ，２６ｄ、レンズ２６ｅ、光分岐部材２６ｆを設けて、レーザ走査照明光学系１０における瞳投影レンズ１５からのレーザ光の一部を全反射照明光として用いるように構成されている。
そして、全反射照明主光線角度調整手段としての透明平行平板２３を、レンズ２６ｅと光分岐部材２６ｆとの間に備えている。
【００５０】
光分岐部材２６ａ，２６ｆは、瞳投影レンズ１５を経た、レーザ光源部１１からのレーザ光のうち、全反射照明用の波長のみを反射し、それ以外の波長を透過する特性を備えた第クロイックミラーで構成されている。なお、光分岐部材２６ａ，２６ｆをミラーを用いて光路内に挿脱可能に構成し、光路内に挿入したときに全反射照明光学系を介してのＴＩＲＦＭ画像が得られ、光路から外したときにレーザ走査照明光学系を介してのＬＳＭ画像が得られるようにしてもよい。また、その場合は、光分岐部材２６ａから光分岐部材２６ｆまでの光学部材を一つのユニットとして、レーザ走査照明光学系の光路に挿脱可能に構成してもよい。
【００５１】
レンズ２６ｂ，２６ｅは、瞳投影レンズ１５を経たレーザ光を、結像レンズ１３を介して対物レンズ１２の瞳面上の所定位置に集光するとともに、結像レンズ１３、対物レンズ１２を介して試料５０上に斜めから投影するように構成されている。
全反射照明主光線角度調整手段としての透明平行平板２３は、第一実施形態のレーザ顕微鏡における透明平行平板２３と同様に回転可能に構成されている。なお、全反射照明主光線角度調整手段を、透明平行平板２３の代わりに、第二実施形態のレーザ顕微鏡における１組の楔型プリズムで構成してもよい。あるいは、第三実施形態のレーザ顕微鏡における一対のミラーで構成してもよい。
その他の構成及び作用効果は、第一実施形態のレーザ顕微鏡とほぼ同じである。
【００５２】
第六実施形態
図１０は本発明の第六実施形態にかかるレーザ顕微鏡の概略構成図である。
第六実施形態のレーザ顕微鏡では、レーザ走査照明光学系１０と、全反射照明光学系２０が、それぞれ別個に結像レンズ１３，２７を有するとともに、共通の光路上に光分岐部材２８を設けて、対物レンズ１２を共有するように構成されている。光分岐部材１８は、ダイクロイックミラーやハーフミラーなどで構成されており、結像レンズ１３を経たレーザ光源部１１からのレーザ光を標本５０に向けて反射し、標本５０からの光を結像レンズ１３に向けて反射する特性に加えて、レーザ光源部２１からの光を照射されることによって生じた標本５０からのエバネッセント蛍光を検出光学系２５に向けて透過する特性を備えている。光分岐部材２８は、ダイクロイックミラーやハーフミラーなどで構成されており、結像レンズ１３、光分岐部材１８を経たレーザ光源部１１からのレーザ光を標本５０に向けて透過し、標本５０からの光を光分岐部材１８に向けて透過する特性に加えて、結像レンズ２７を経たレーザ光源部２１からのレーザ光を標本５０に向けて反射し、標本５０からのエバネッセント蛍光を検出光学系２５に向けて透過する特性を備えている。
そして、第一実施形態のレーザ顕微鏡と同様に、全反射照明主光線角度調整手段としての透明平行平板２３を、レンズ２２と結像レンズ２７との間に備えている。
なお、全反射照明主光線角度調整手段を、透明平行平板２３の代わりに、第二実施形態のレーザ顕微鏡における１組の楔型プリズムで構成してもよい。あるいは、第三実施形態のレーザ顕微鏡における一対のミラーで構成してもよい。
その他の構成及び作用効果は、第一実施形態のレーザ顕微鏡とほぼ同じである。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明のレーザ顕微鏡は、医学、生物学、薬学、農学等において、ＴＩＲＦＭ照明で試料表面に刺激を与えながらＬＳＭ画像を顕微鏡で観察することが必要とされる分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明の第一実施形態にかかるレーザ顕微鏡の概略構成図である。
【図２】図１のレーザ顕微鏡における要部の作用を示す原理説明図である。
【図３】本発明の第二実施形態にかかるレーザ顕微鏡の概略構成図である。
【図４】図３のレーザ顕微鏡における要部の作用を示す原理説明図である。
【図５】本発明の第三実施形態にかかるレーザ顕微鏡の概略構成図である。
【図６】図５のレーザ顕微鏡における要部の作用を示す原理説明図である。
【図７】本発明の第四実施形態にかかるレーザ顕微鏡の概略構成図である。
【図８】図７のレーザ顕微鏡における要部の作用を示す原理説明図である。
【図９】本発明の第五実施形態にかかるレーザ顕微鏡の概略構成図である。
【図１０】本発明の第六実施形態にかかるレーザ顕微鏡の概略構成図である。
【符号の説明】
【００５５】
１０          レーザ走査照明光学系
１１          レーザ光源部
１１ａ        レーザ光源
１１ｂ        カップリングレンズ
１１ｃ        光ファイバー
１１ｄ        コリメートレンズ
１２          対物レンズ
１３，２５，２７          結像レンズ
１４          走査手段
１５          瞳投影レンズ
１６，２５    検出光学系
１６ａ        ピンホール結像レンズ
１６ｂ        ピンホール
１６ｃ        集光レンズ
１６ｄ        フォトマル
１７，１８，２４，２６ａ，２６ｆ，２８          光分岐部材
２０          全反射照明光学系
２１          レーザ光源部
２１ａ        レーザ光源
２１ｂ        カップリングレンズ
２１ｃ        光ファイバー
２２，２６ｂ，２６ｅ          レンズ
２３          透明平行平板
２３’        １組の楔型プリズム
２３ａ’，２３ｂ’            楔型プリズム
２３”        一対のミラー
２３ａ”，２３ｂ”，２６ｃ，２６ｄ          ミラー
２５ｂ        ＣＣＤ
３０          パーソナルコンピュータ
４０          モニタ
５０          試料
５０ａ        試料５０の表面
５０ｂ        試料５０におけるレーザ走査照明光の集光位置Ｐを含む周辺領域
【図１】
2007072391.tif 000003
【図２】
2007072391.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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