(57)【要約】      （修正有）【課題】癌化学療法の効力改善方法の提供。【解決手段】有効量の化学療法薬及び有効量の下記の一般式で表される化合物を、それを必要とする対象に投与することを含む、癌の治療方法：2007186511.tif 000009式中、Ａｒ１、Ａｒ２は、フェニル、チエニル、フリル、ピロリル、ピリジニル又はピリミジニルであり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４はＨ又はＣ１〜Ｃ６アルキルなどである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を治療するための組成物であって、癌化学療法薬及び下記の一般式で表される化合物を含有する組成物：
【化１】
2007186511.tif 000006
式中、Ａは、Ｈ又は
【化２】
2007186511.tif 000007
であり；
Ａｒ１、Ａｒ２及びＡｒ３は、それぞれ独立に、フェニル、チエニル、フリル、ピロリル、ピリジニル又はピリミジニルであり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、Ｒ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｃ（Ｏ）ＳＲ、Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ’、（ＣＨ２）ｍＯＲ、（ＣＨ２）ｍＳＲ、（ＣＨ２）ｍＮＲＲ’、（ＣＨ２）ｍＣＮ、（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）ＯＲ、（ＣＨ２）ｍＣＨＯ、（ＣＨ２）ｍＣＨ＝ＮＯＲ、（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）Ｎ（ＯＲ）Ｒ’、Ｎ（ＯＲ）Ｒ’であるか、又は、Ｒ１及びＲ２が共に、Ｒ３及びＲ４が共に、若しくはＲ５及びＲ６が共に、Ｏ（ＣＨ２）ｍＯであり、
その中のＲ及びＲ’は、それぞれ独立に、Ｈ又はＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
ｍは、０、１、２、３、４、５又は６であり、
ｎは、０、１、２又は３である。
【請求項２】
Ａは、
【化３】
2007186511.tif 000008
である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ａｒ３は、フェニルである、請求項１〜２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４】
Ａは、Ｈである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
Ａｒ１は、フェニルである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
Ａｒ２は、フリルである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
Ｒ３及びＲ４のいずれか一方は、Ｈであり、他方は、ＣＨ２ＯＨである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５及びＲ６は、それぞれＨである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記化学療法薬は、ＤＮＡ結合化学療法薬である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記化学療法薬は、微小管安定化剤である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本発明は、癌化学療法の効力を改善する方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]主要な致命的疾患である癌は、過剰な細胞分裂に由来する悪性組織の異常な集団を特徴としている。癌細胞は、細胞増殖における正常な抑制を無視して増殖し、他の細胞のために正常に準備されている領域を侵襲し、入植する。癌は、外科的手術、放射線療法、化学療法、ホルモン療法などにより治療することができる。
【０００３】
[0003]化学療法は、癌細胞を阻害又は破壊するために抗癌剤（又は細胞毒）を使用する。これは、細胞増殖周期の特定の部分をターゲットとすることにより、癌細胞の増殖を抑制する。現在、臨床使用が承認されている化学療法薬は５０種を上回り、１００種以上が研究されている。化学療法薬は、様々な機序により、癌細胞のさらなる増殖を止めることができる。大抵の化学療法薬は、癌細胞が細胞増殖及び分裂においてより活動的であるという事実を利用している。したがって、細胞増殖周期又は細胞分裂プロセスを妨害する薬物は、癌細胞の増殖を選択的に阻害するはずである。
【０００４】
[0004]例えば、ドキソルビシン（アドリアマイシン、ルベックス又はドキシル）は、インターカレーション及び酵素阻害を介して癌細胞に作用を及ぼすアンスラサイクリン系抗生物質である。インターカレーターとしては、これはＤＮＡに挿入し、ＤＮＡの複製又は転写を防止する。酵素阻害剤としては、これはＩＩ型トポイソメラーゼを阻害して、ＤＮＡ破断をもたらす。活発に分裂している癌細胞は、ＤＮＡ合成及び複製を有することを必要とするので、ドキソルビシンは、正常細胞に対してよりも、活発に分裂している細胞（即ち癌細胞）に強い影響を及ぼすはずである。ドキソルビシンの作用機序は全般的であるので、この薬物は幅広い癌の治療で使用することができる。
【０００５】
[0005]パクリタキセル（タキソール）又はその類似体（ドセタキセル（タキソテレ））は、チューブリンの重合を促進することで、細胞分裂及び生命維持的中間期プロセスで必要な正常な微小管動力学を中断させることにより細胞死をもたらす。
【０００６】
[0006]ビタミンＡ代謝産物、レチノイン酸（ＲＡ）は、発生、細胞増殖及び分化並びに腫瘍増殖及び侵襲に重要な作用を有することが知られている。細胞増殖及び移動に対するＲＡの幅広い作用は、これらが、多くのタイプの癌のための有用な化学療法薬であることを示唆している。例えば、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）は、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）などの様々な白血病のための「分化療法」として有効に使用されている。ＡＴＲＡは、レチノイド受容体（ＲＡＲ）を活性化させ、前骨髄球を分化（成熟）させて、このような細胞の増殖を防止する。
【０００７】
[0007]長年にわたって、化学療法はその効力において著しく改善され、副作用も低減されているが、癌化学療法における全体治癒率は未だに低く、満足にはほど遠い。したがって、より効果的な化学療法に対する必要性は残っている。
【概要】
【０００８】
[0008]一定の縮合ピラゾリル化合物を化学療法薬と共に使用すると、相乗作用をもたらすことができるという意外な発見に、本発明は基づいている。このような相乗作用は、様々な機序により作動する化学療法薬で観察される。したがって、本発明の縮合ピラゾリル化合物は、パクリタキセル、ドキソルビシン又はレチノイン酸などの他の化学療法薬と共に一般に使用して、化学療法薬の効力を改善し、及び／又はサイズ作用を最小化することができる。
【０００９】
[0009]一態様では、本発明は、癌の治療法に関する。この方法は、その必要のある対象に、有効量の化学療法薬（例えばパクリタキセル、ドキソルビシン又はレチノイン酸）及び有効量の式：
【化１】
2007186511.tif 000002
の化合物を投与することを含む。
【００１０】
[0010]上記の一般式では、Ａは、Ｈ又は
【化２】
2007186511.tif 000003
であり；Ａｒ１、Ａｒ２及びＡｒ３は、それぞれ独立に、フェニル、チエニル、フリル、ピロリル、ピリジニル又はピリミジニルであり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、Ｒ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｃ（Ｏ）ＳＲ、Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ’、（ＣＨ２）ｍＯＲ、（ＣＨ２）ｍＳＲ、（ＣＨ２）ｍＮＲＲ’、（ＣＨ２）ｍＣＮ、（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）ＯＲ、（ＣＨ２）ｍＣＨＯ、（ＣＨ２）ｍＣＨ＝ＮＯＲ、（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）Ｎ（ＯＲ）Ｒ’、Ｎ（ＯＲ）Ｒ’であるか、又は、Ｒ１及びＲ２が共に、Ｒ３及びＲ４が共に、若しくはＲ５及びＲ６が共に、Ｏ（ＣＨ２）ｍＯであり、その中のＲ及びＲ’は、それぞれ独立に、Ｈ又はＣ１〜Ｃ６アルキルであり；ｍは、０、１、２、３、４、５又は６であり、ｎは、０、１、２又は３である。（ＣＨ２）ｍは、分枝鎖又は直鎖であってよい。前記の任意の置換基中に示されている左側の原子が、縮合ピラゾリル環に一番近いことを特記する。さらに、縮合ピラゾリル化合物中に１個又はそれ以上のＲ又は（ＣＨ２）ｍ部分が存在する場合、Ｒ又は（ＣＨ２）ｍ部分は、同じでも異なってもよいことを特記する。
【００１１】
[0011]前記の化合物のうちのいくつかは、Ａｒ１はフェニルであってよく、Ａｒ２はフリル（例えば５’−フリル）であってよく、Ａｒ３はフェニルであってよい。
【００１２】
[0012]前記の化合物のサブセットは、式中のＡが
【化３】
2007186511.tif 000004
であるものである。いくつかの特定の実施形態では、Ａｒ１はフェニル、Ａｒ２は５’−フリルであり、Ａｒ３はフェニルであり、ｎは１である。さらに、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５及びＲ６はそれぞれＨであり、ｎは１であり、Ｒ３及びＲ４のいずれか一方はＨであり、他方はフリルの２位で置換されているＣＨ２ＯＨである。このサブセットの例は、１−ベンジル−３−（５’−ヒドロキシメチル−２’−フリル）インダゾール（化合物１）である。
【００１３】
[0013]前記の化合物の他のサブセットは、式中のＡがＨであるものである。いくつかの特定の実施形態では、Ａｒ１はフェニルであり、Ａｒ２はフリルである。さらに、Ｒ１及びＲ２はそれぞれＨであり、Ｒ３及びＲ４のいずれか一方はＨであり、他方は、フリルの２位で置換されているＣＨ２ＯＨである。
【００１４】
[0014]本願明細書で使用する場合、「Ａｒ」の用語は、アリール及びヘテロアリール基の両方を指している。アリール、例えばフェニルは少なくとも１個の芳香環を有する炭化水素環系である。ヘテロアリールは、Ｏ、Ｎ又はＳなどの少なくとも１個のヘテロ原子を含む少なくとも１個の芳香環を有する炭化水素環系である。ヘテロアリールの例には、これらには限られないが、チエニル、フリル、ピロリル、ピリジニル及びピリミジニルが含まれる。「Ａｒ」は、１個、２個、３個又はそれ以上の置換基をその環上に含んでもよい。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６（前記参照）に該当するものに加えて、置換基はさらに、ニトロ、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクリル又はヘテロシクリルであってもよい。本願明細書で使用する場合、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、シクリル及びヘテロシクリルは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシル、メルカプト、シアノ又はニトロで置換されていてもよい。「アルキル」の用語は、直鎖アルキル及び分枝鎖アルキルの両方を指していることを特記する。
【００１５】
[0015]前記の縮合ピラゾリル化合物には、その化合物自体、さらに適切な場合には、その塩及びそのプロドラッグが含まれる。例えばこのような塩は、縮合ピラゾリル化合物上で負に帯電している置換基（例えばカルボキシレート）とカチオンとの相互作用により形成しうる。適切なカチオンはこれらに限られないが、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン及びテトラメチルアンモニウムイオンなどのアンモニウムカチオンが含まれる。同様に、正に帯電している置換基（例えばアミノ）も、負に帯電している対イオンと塩を形成しうる。適切な対イオンには、これらに限られないが、クロリド、ブロミド、ヨージド、スルフェート、ニトレート、ホスフェート又はアセテートが含まれる。プロドラッグの例には、対象に投与されると、前記の縮合ピラゾリル化合物をもたらしうるエステル及び他の薬学的に許容できる誘導体が含まれる。
【００１６】
[0016]本発明の実施形態に従い縮合ピラゾリル化合物と共に使用するための化学療法薬は、様々な機序により機能しうる。例えばこれは、ＤＮＡインターカレーションにより、微小管動力学を修飾することにより、細胞分化を誘発することにより、アポトーシスを誘発することにより、又は細胞周期を変調する何らかの機序により機能しうる。
【００１７】
[0017]本明細書で使用する場合、「癌」の用語には、細胞腫瘍／癌、リンパ腫及び白血病が含まれる。この用語には、組織病理学的タイプ又は侵襲段階に関わらず、全てのタイプの癌増殖、転移性組織又は悪性に形質転換された細胞、組織又は臓器が含まれることを意味する。癌の例には、これらに限られないが、白血病、肉腫、骨肉腫、リンパ腫、黒色腫、卵巣癌、皮膚癌、睾丸癌、胃癌、膵臓癌、腎臓癌、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、頭頚部癌、脳癌、食道癌、膀胱癌、副腎皮質癌、肺癌、気管支癌、子宮内膜癌、鼻咽頭癌、子宮頚癌、肝臓癌又は未知の原発部位の癌などの癌及び肉腫が含まれる。
【００１８】
[0018]癌を治療するための１種又は複数の前記縮合ピラゾリル化合物及び化学療法薬を含有する組成物並びに癌治療のための医薬品を製造するためのこの組成物の使用も、本発明の範囲内である。
【００１９】
[0019]本発明の他の形態、目的及び利点は、明細書及び請求項から明らかになるであろう。
【詳細な説明】
【００２０】
[0024]本発明は、治療を必要とする対象に、有効量の１種又は複数の縮合ピラゾリル化合物及び有効量の化学療法薬を投与することにより、癌（例えば腎癌、肺癌、腎臓癌又は白血病）を治療する方法に関する。「治療する」の用語は、癌、癌症状又は癌の素因を治療、治癒、緩和、軽減、変化、改善、回復、改善又は作用することを目的として、縮合ピラゾリル化合物（又は縮合ピラゾリル化合物を含む組成物）及び化学療法薬を、癌、癌症状又は癌の素因を有する対象に適用又は投与することを指している。「有効量」とは、治療を必要とする対象に投与した場合に、対象に治療効果をもたらすために必要な活性剤の量を指している。当技術分野の専門家であれば分るように、投与経路、賦形剤の利用及び血管形成関連疾患を治療するための他の薬剤との併用の可能性に応じて、有効用量は変動しうる。
【００２１】
[0025]本発明の方法を実行するために使用される縮合ピラゾリル化合物は、当技術分野の専門家にはよく知られている手順により調製することができる。例えば、本発明の譲受人に付与されていて、そのまま参照により援用される米国特許第５５７４１６８号明細書には、次の合成ステップを含む手順が記載されている：アリールカルボニル塩化物と他のアリール化合物とをカップリングさせることにより、アリールアリールケトンを先ず調製する。どちらかのアリール化合物は、一回又は複数回置換されていてもよい。次いで、前記のケトンを、そのアリール基も一回又は複数回置換されていてもよいアリールアルキルヒドラジンと反応させて、３個のアリール基を含有するヒドラゾンを形成させる。ヒドラゾン基を、アルキレンリンカーを介して縮合ピラゾリル核に変換させ、他のアリール基は、ピラゾリル核の４−Ｃ及び５−Ｃの所で縮合させ、第３のアリール基は、ピラゾリル核の３−Ｃに直接結合させる。任意のアリール基の所で、置換基を修飾することにより、縮合ピラゾリル化合物の誘導体を得ることもできる。
【００２２】
[0026]前記の合成経路で使用される化学物質には、例えば、溶剤、試薬、触媒、保護基及び脱保護基試薬が含まれうる。この合成経路は、さらに付加的に、本願明細書に特に記載されているステップの前後に、縮合ピラゾリル化合物の合成を最終的に可能にするために、適切な保護基を付加又は除去するステップを含んでもよい。加えて、所望の化合物を得るために別の配列又は順番で、様々な合成ステップを行うこともできる。適用可能な縮合ピラゾリル化合物を合成する際に使用することができる合成化学変換及び保護基方法論（保護及び脱保護）は、当技術分野では知られており、例えば、R.Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T.W.Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2d.Ed., John Wiley and Sons(1991); L.Fieser and M.Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994);及びL.Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995)及びその後続の版に記載されているものが含まれる。
【００２３】
[0027]こうして合成された縮合ピラゾリル化合物を、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー又は再結晶化などの方法によりさらに精製することができる。
【００２４】
[0028]本発明の実施形態による縮合ピラゾリル化合物は、全てＴｅｎｇらにより、本発明の譲受人に付与されている米国特許出願公開第２００３／０１８６９９６号明細書、同第２００５／０１０７４０６号明細書及び同第２００５／０２０９２５２号明細書に記載されているように、抗脈管形成作用及び抗癌作用を有することが判明している。これらの出願は、そのまま参照により援用される。
【００２５】
[0029]例えば、１−ベンジル−３−（５’−ヒドロキシメチル−２’−フリル）インダゾール（後記で詳述される化合物１）は、新規の抗血小板薬であることが判明している。機序研究により、化合物１の抗血小板活性は、可溶性グアニリルシクラーゼ（ｓＧＣ）のＮＯ独立活性に随伴することが判明した。最近では、化合物１は、抗癌活性を有することが判明した；これは、低酸素誘発性ファクター−α（ＨＩＦ−１）活性を抑制し、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害タンパク質ｐ２１ＣＩＰ１／ＷＡＰ１及びｐ２７ＫＩＰ１の発現を増大させることによりヒト肝細胞癌ＨＡ２２Ｔ細胞においてＧ０／Ｇ１期で細胞周期を停止させることを介して、腫瘍血管形成をブロックする。さらに化合物１は、Ｈｅｐ３Ｂ細胞でのエリスロポイエチン及び血管内皮増殖因子の低酸素誘発を阻害する。
【００２６】
[0030]化合物１は、以前から一定の癌に対して抗癌作用を有することが判明していたが、本発明の発明者らは、本発明のピラゾリル化合物が他の化学療法薬と相乗作用をもたらしうることを予期せず発見した。本発明の方法を実施するために使用される化学療法薬は市販されているが、当技術分野でよく知られている手順により合成することもできる。
【００２７】
[0031]本発明の実施形態に従い縮合ピラゾリル化合物と共に使用するための化学療法薬は、様々な機序により作用しうる。例えば、これはＤＮＡインターカレーションにより、微小管動力学を修飾することにより、細胞分化を誘発することにより、アポトーシスを誘発することにより、又は細胞周期を変調する何らかの機序により機能しうる。
【００２８】
[0032]ＤＮＡインターカレーション又はＤＮＡ結合化学療法薬は、それ自体、二本鎖ＤＮＡに結合又は挿入しうる。結果として、ＤＮＡ依存性ＲＮＡ転写が阻害される。加えて、ＤＮＡ複製も妨害される。これらのＤＮＡ結合薬のうちの数種はさらに、ＤＮＡ複製の間に必須であるトポイソメラーゼＩも阻害することができる。したがって、これらのＤＮＡ結合剤は、ＤＮＡ一本又は二本鎖の破壊をもたらしうる。いくつかの一本鎖破断は、細胞が有糸分裂に入る前に、細胞でのＤＮＡ修復系により修復されうる。しかしながら、修復されていない一本鎖破断及びＤＮＡ二本鎖破断の部分は、細胞染色体異常、さらには細胞死をももたらすことがある。ＤＮＡ結合又はインターカレーション化学療法薬の例には、これらに限られないが、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、シクロホスファミド及びマイトマイシン−Ｃが含まれる。
【００２９】
[0033]微小管修飾剤は、微小管細胞骨格の集合及び分解を妨害する。微小管は、チューブリンの重合により形成される。微小管の重合及び解重合は、制御プロセスであるが、それというのも、微小管骨格は、細胞機能の様々な態様において重要な役割を果たすためである。微小管の重合又は解重合を妨害しうる薬剤は、細胞活性を変調するために使用することができる。コルヒチン、コルセミド及びノカダゾールは、チューブリンに結合し、増殖微小管のプラス末端へのその付加を防止することにより、重合を阻害する。ビンブラスチン及びビンクリスチンは、チューブリンを凝集し、微小管解重合を導いて中期で細胞を止めることにより、有糸分裂をブロックする。タキソール（パクリタキセル）又はエポチロンは、微小管に結合することにより微小管を安定化する。
【００３０】
[0034]癌は、混乱した細胞分裂、又は細胞が成熟した細胞種へと分化できないことから生じうる。したがって、分化誘発剤を使用して、癌細胞の分化を誘発することもできる。分化治療剤の例には、レチノイン酸代謝産物及びその誘導体が含まれる。例えば、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）は、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）などの様々な白血病のための「分化療法」として有効に使用されている。ＡＴＲＡは、レチノイド受容体（ＲＡＲ）を活性化させ、前骨髄球を分化（成熟）させて、このような細胞の増殖を防止する。
【００３１】
[0035]他の化学療法薬及びその機序の例には、これらに限られないが、核ＤＮＡに結合することにより、その細胞毒性作用を誘発して、正常な転写及び／又はＤＮＡ複製を妨害するシスプラチン（シス−ジアミンジクロロプラチナム（ＩＩ））；ラジカルの形成によりＤＮＡ分割をもたらすブレオマイシン；トポイソメラーゼＩを阻害するトポテカン、イリノテカン又はカンプトテシン；分裂装置での微小管集合を阻害するポドフィロトキシン；ダクチノマイシンと同様に、ＤＮＡに結合して、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質合成を阻害するプリカマイシン；又はチミジンの正常な産生を阻害することによりＤＮＡ合成を阻害する５−フルオロウラシルが含まれる。
【００３２】
[0036]前記は、一般的に使用される化学療法薬及びその作用機序である。当技術分野の専門家であれば、これらは、例示された例であり、本発明の実施形態はこれらの例に限られないことを認めるであろう。確かに、本発明の実施形態では、縮合ピラゾリル化合物を任意の既知の化学療法薬と共に使用することができる。
【００３３】
[0037]本発明の方法を実施するために、縮合ピラゾリル化合物及び化学療法薬を同時に、又は別々の時間に投与することができる。例えば、癌患者に、縮合ピラゾリル化合物（又は縮合ピラゾリル化合物を含有する組成物）を先ず投与し、次いで、その患者に薬学的に許容できる担体及び化学療法薬及び薬学的に許容できる担体を含有する組成物を投与することができる。
【００３４】
[0038]他の例では、例えば縮合ピラゾリル化合物、化学療法薬及び薬学的に許容できる担体を含有する組成物を使用して、活性剤を同時に投与する。前記の組成物はいずれも、経口、非経口、吸入スプレー又はインプラントされたレザバーを介して投与することができる。本願明細書で使用する場合、「非経口」の用語には、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液包内、胸骨内、くも膜下、病変内及び頭蓋内注射又は注入技術が含まれる。
【００３５】
[0039]経口投与のための組成物は、これらに限られないが、錠剤、カプセル、エマルジョン及び水性懸濁液、分散液及び溶液を含む任意の経口で許容できる剤形であってよい。錠剤のために一般に使用される担体には、ラクトース及びコーンスターチが含まれる。ステアリン酸マグネシウムなどの滑剤も、通常は錠剤に加えられる。カプセル形態での経口投与では、有用な希釈剤には、ラクトース及び乾燥コーンスターチが含まれる。水性懸濁液又はエマルジョンを経口投与する場合には、乳化剤又は懸濁剤と組み合わされている油相に、活性成分を懸濁又は溶解させることもできる。望ましい場合には、一定の甘味剤、香料又は着色剤を加えることもできる。
【００３６】
[0040]適切な分散剤又は湿潤剤（例えばツイーン８０など）及び懸濁剤を使用して、当技術分野で知られている技術に従い、無菌の注射可能な組成物（例えば水性又は油性懸濁液）を処方することもできる。無菌の注射可能な製剤は、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液などの、非毒性の非経口許容できる希釈剤又は溶剤中の無菌の注射可能な溶液又は懸濁液であってもよい。使用することができ許容できるビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）及び溶剤は、特に、マンニトール、水、リンガー液及び等張性塩化ナトリウム溶液である。加えて、無菌の不揮発性油が慣用的に、溶剤又は懸濁媒体として使用されている（例えば合成モノ−又はジグリセリド）。オレイン酸及びそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は、注射可能な製剤で有用であり、特にはそのポリオキシエチレン化されたバージョンのオリーブ油又はヒマシ油などの天然の薬学的に許容できるオイルも有用である。これらのオイル溶液又は懸濁液は、長鎖アルコール希釈剤又は分散剤又はカルボキシメチルセルロース又は同様の分散剤を含有してもよい。
【００３７】
[0041]薬物処方の分野で良く知られている技術に従い、吸入組成物を調製することができ、ベンジルアルコール又は他の適切な防腐剤、生物学的利用率を高めるための吸収促進剤、フルオロカーボン及び／又は当技術分野で知られている他の可溶化剤又は分散剤を使用して、生理食塩水中の溶液として調製することができる。
【００３８】
[0042]医薬組成物中の担体は、処方物の活性成分と相容性であり（及び、好ましくはそれを安定化しうる）、治療される対象に対して有害でないという意味において「許容できる」ものでなければならない。例えば、シクロデキストリンなどの可溶化剤（縮合ピラゾリル化合物と共により可溶性で特殊な複合体を形成する）を、縮合ピラゾリル化合物を輸送するための薬学的賦形剤として利用することができる。他の担体の例には、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム及びＤ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ♯１０が含まれる。
【００３９】
[0043]前記の方法はさらに、放射線治療を含んでもよい。患者に望ましい用量の縮合ピラゾリル化合物及び化学療法薬を投与する前、その間又はその後に、放射線を患者における癌部位に当てることができる。放射線は、イオン化放射線及び非イオン化放射線であってよい。イオン化放射線は、原子と相互作用して、その軌道から電子を外して、原子を帯電又は「イオン化」させるために十分なエネルギーを有する。これには、ガンマ線、Ｘ線、中性子、電子、アルファ粒子及びベータ粒子を伴う放射線が含まれる。非イオン化放射線は、その軌道から電子を外すために十分なエネルギーを有さない電磁放射線である。これには、紫外線、可視光、赤外光、マイクロ波及び電波を伴う放射線が含まれる。放射線量及び時間は、治療される患者に治療作用をもたらすのに十分であるべきである。当技術分野の専門家であれば分るように、これは、放射線のタイプ及び強度、治療される癌のタイプ及び位置並びに患者の身体的状態に応じて変動しうる。
【００４０】
[0044]適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、一定の癌細胞系の増殖を阻害する際の、１種又は複数の前記の化合物及び化学療法薬の組み合わせの効力を予備的に評価することができる。この組み合わせをさらに、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにより、癌を治療する際のその効力に関して試験することができる。例えば、この組み合わせを、癌を有する動物（例えばマウスモデル）に投与して、次いでその治療作用を評価することができる。その結果をもとに、適切な用量範囲及び投与経路を決定することもできる。
【００４１】
[0045]さらに詳述しなくても、前記の記載により適切に、本発明が可能になると考えられる。したがって、次の具体的な実施形態は、単なる例示と解釈されるべきであり、本開示の他の部分を何ら制限するものではない。本願明細書に挙げられている特許を含む刊行物は全て、そのまま参照により本願明細書に援用される。
【００４２】
１−ベンジル−３−（５’−ヒドロキシメチル−２’−フリル）インダゾール（化合物１）の合成
[0046]無水塩化カルシウム（８８．８ｍｇ、０．８ミリモル）をホウ水素化ナトリウム（６０ｍｇ、１．６ミリモル）と共に無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）中で４時間攪拌することにより、ホウ水素化カルシウムを先ず調製した。次いで、１−ベンジル−３−（５’−メトキシカルボニル−２’−フリル）インダゾール８８．０ｍｇ（０．２７ミリモル）を含有するＴＨＦ溶液３０ｍｌをホウ水素化カルシウム溶液に３０±２℃で滴加した。混合物を環流まで６時間加熱し、冷却し、粉砕氷中でクエンチし、減圧下に置いて、ＴＨＦを除去し、濾過して、固体生成物を得た。この固体をジクロロメタンで抽出した。抽出物を濃縮して５０ｍＬにし、石油エーテルを加えると固体が沈殿した。沈殿物を集め、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル−ベンゼン）により精製すると、１−ベンジル−３−（５’−ヒドロキシメチル−２’−フリル）インダゾール７０．０ｍｇが８７％の収率で得られた。
融点：１０８〜１０９℃
MS(%),m/z:304(M+).
IR(KBr)νmax:3350 cm-1(-OH).
1H-NMR(DMSO-d6,200MHz)δ:4.51(2H,d,J=5.5Hz,-CH2O-),5.31(1H,t,J=5.5Hz,-OH),5.70(2H,s,=NCH2-),6.48(1H,d,J=3.4Hz,H-4’),6.97(1H,d,J=3.4Hz,H-3’),7.21-7.31(6H,m,H-5,フェニル),7.45(1H,t,J=8.2Hz,H-6),7.75(1H,dd,J=8.2,1.8Hz,H-7),8.12(1H.dd,J=8.2.1.0Hz.C4-H).
【００４３】
癌細胞の増殖に対する阻害作用：
[0047]無胸腺マウス（ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ雌、６〜８週齢）を２２℃、１２時間の明／暗周期で飼った。マウスに、Ａ４９８腎臓癌細胞（１０７細胞／マウス）を皮下注射した。接種後１５日間で、腫瘍は１００から１５０ｍｍ３のサイズまで増殖した。次いで、マウスを６グラウンドにランダムに分けた（各群５匹）。群１（対照群）及び２のマウスを０．５％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）及び０．５％ＣＭＣ中の化合物１（１０ｍｇ／ｋｇ／日）でそれぞれ経口治療した。群３及び４のマウスには、パクリタキセル及びドキソルビシン（２０ｍｇ／ｋｇ／週）をそれぞれ腹腔内注射した（パクリタキセル及びドキソルビシンは市販品である）。群５のマウスを先ず０．５％ＣＭＣ中の化合物１（１０ｍｇ／ｋｇ／日）で経口治療し、次いですぐにパクリタキセル（２０ｍｇ／ｋｇ／週）を腹腔内注射した。群６のマウスを先ず０．５％ＣＭＣ中の化合物１（１０ｍｇ／ｋｇ／週）で経口治療し、次いですぐにドキソルビシン（２０ｍｇ／ｋｇ／週）を腹腔内注射した。各マウスでの腫瘍サイズを３から４日毎に測定した。対照群の腫瘍サイズが１０００〜１５００ｍｍ３に達したら、ペントバルビタールを腹腔内投与することで、マウスを安楽死させた。腫瘍を慎重に切除し、秤量した。
【００４４】
[0048]結果は、化合物１、パクリタキセル又はドキソルビシンのみで治療されたマウスは、対照群での腫瘍よりも小さい腫瘍を有したことを示している。さらに結果は、化合物１及びパクリタキセルの組み合わせ又は化合物１及びドキソルビシンの組み合わせで治療されたマウスは、化合物１、パクリタキセル又はドキソルビシンのみで治療された腫瘍よりも予測できなかったほど小さい腫瘍を有したことを示している。
【００４５】
白血病の治療における化合物１及びオールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）の相乗作用
[0049]体重２２〜２８ｇ、８週齢のオスのＢＡＬＢ／ｃマウスを、国立台湾医科大学実験動物センター（Laboratory Animal Center, National Taiwan University College of Medicine）(Taipei, Taiwan)から得た。マウス骨髄性単球性白血病細胞系ＷＥＨＩ−３を食品産業研究開発研究所（Food Industry Research and Development Institute）(Hsinchu, Taiwan)から得た。マウスＷＥＨＩ−３白血病細胞系は、１９６９年に初めて確立され、骨髄性単球性白血病の特性を示した。この細胞系は薬物の抗白血病作用を評価するために、同系ＢＡＬＢ／ｃマウスで白血病を誘発しうる(He Q, Na X, "The effects and mechanisms of a novel 2-aminosteroido on murine WEHI-3B leukemia cells in vitro and in vivo", Leuk. Res. 25(6):455-61, (2001)参照)。この細胞を７５ｃｍ２組織培養フレークに入れ、加湿５％ＣＯ２雰囲気下、１０％ウシ血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ペニシリン１００００Ｕ／ｍｌ及びストレプトマイシン１０ｍｇ／ｍｌ）及び１％グルタミンを補足されているＲＰＭＩ１６４０培地中で、３７℃で増殖させた。
【００４６】
[0050]ＷＥＨＩ−３白血病細胞を有するＢＡＬＢ／ｃマウス（ＷＥＨＩ−３／ＢＡＬＢ／ｃマウス）の生存に対する化合物１、ＡＴＲＡ及び化合物とＡＴＲＡとの組み合わせの作用を試験するために、化合物１、ＡＴＲＡ及び化合物１とＡＴＲＡとの組み合わせを、３０ｍｇ／ｋｇ／２日で、１４日間、１×１０５ＷＥＨＩ−３細胞を接種されたＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内投与した。特に、ＢＬＡＢ／ｃマウスを４つの群に分けた。群Ｉには、ＷＥＨＩ−３のみを腹腔内注射した。群ＩＩでは、ＷＥＨＩ−３細胞注射の１４日後に化合物１治療（３０ｍｇ／ｋｇ／２日を１４日間、腹腔内で）を開始した。群ＩＩＩでは、ＷＥＨＩ−３細胞注射の１４日後にＡＴＲＡ治療（３０ｍｇ／ｋｇ／２日を１４日間、腹腔内で）を開始した。群ＩＶでは、ＷＥＨＩ−３細胞注射の１４日後に化合物１及びＡＴＲＡ治療（３０ｍｇ／ｋｇ／２日を１４日間、腹腔内で）を開始した。対照マウス及び全ての群のマウスを２週間治療し、その後、動物を秤量し、血液を抜き、さらなる実験のために屠殺した。
【００４７】
[0051]これらの研究からの結果は、化合物１、ＡＴＲＡ及び化合物１とＡＴＲＡとの組み合わせは、ＷＥＨＩ−３／ＢＡＬＢ／ｃマウスの平均生存時間を著しく延ばしたことを示している（表１）。ＷＥＨＩ−３／ＢＡＬＢ／ｃマウスの平均生存時間は、３０日であったが、ＷＥＨＩ−３／ＢＡＬＢ／ｃマウスを化合物１、ＡＴＲＡ及び化合物１とＡＴＲＡとの組み合わせ３０ｍｇ／ｋｇ／マウスで治療すると、それぞれ４０、４２及び４４日まで延びた（ｐ＜０．０５、ｌｏｇ−順位検定及び一般化ウィルコクソン検定）。
【００４８】
【表１】
2007186511.tif 000005
【００４９】
[0052]脾臓及び肝臓組織を個々の動物から単離し、撮影し、秤量し、組織病理学的に試験した。代表的な結果を図１及び２に示す。これらのデータは、化合物１、ＡＴＲＡ及び化合物１とＡＴＲＡとの組み合わせは、実験の１カ月以内に、白血病マウスでの体重損失を改善したことを示していた（データは示さない）。脾臓、リンパ節、肝臓転移の腫脹は、未治療の白血病マウスにおいてと比べると、全ての治療群で著しく低減した（図１）。加えて、脾臓切片のＨ−Ｅ染色により、未熟な骨髄芽球細胞の脾赤髄への浸潤が化合物１、ＡＴＲＡ及び化合物１とＡＴＲＡとの組み合わせ治療群では減少したことが明らかになった（図２）。
【００５０】
[0053]ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＷＥＨＩ−３細胞での化合物１、ＡＴＲＡ及び化合物１とＡＴＲＡとの組み合わせの増殖阻害作用、細胞周期を研究するために、ＴＵＮＥＬ染色と共にＮＢＴ還元を使用して、分化及びアポトーシスを決定した。化合物１（５μＭ）、ＡＴＲＡ（１μＭ）及び化合物１とＡＴＲＡとの組み合わせで細胞を２４時間治療した後に、ＡＴＲＡ及び化合物１とＡＴＲＡとの組み合わせで治療されたＷＥＨＩ−３細胞で、明白なＧ０／Ｇ１停止が観察された。この現象は、ＡＴＲＡ治療されたＷＥＨＩ−３細胞では生じなかったが、化合物１及び化合物１とＡＴＲＡとの組み合わせで治療されたＷＥＨＩ−３細胞の両方は、サブ−Ｇ１集団を増大させた（データは示さない）。
【００５１】
[0054]アポトーシスを誘発する化合物１の能力及びＷＥＨＩ−３細胞の分化を誘発するＡＴＲＡの能力を研究するために、ＮＢＴ還元活性及びＴＵＮＥＬ／ＤＡＰＩ染色を、化合物１、ＡＴＲＡ及び化合物１とＡＴＲＡとの組み合わせで治療されたＷＥＨＩ−３細胞で評価した。化合物１及び化合物１とＡＴＲＡとの組み合わせと共に２４時間培養した後に、細胞は、核収縮、染色質縮合及びＤＮＡ断片化を示した。この現象は、ＡＴＲＡ治療されたＷＥＨＩ−３細胞では観察されなかった（図３Ａ）。対照細胞とは逆に、ＡＴＲＡ及び化合物１とＡＴＲＡとの組み合わせを伴う細胞では、ＮＢＴ還元の著しい増大が観察された。化合物１、ＡＴＲＡ及び化合物１とＡＴＲＡとの組み合わせで治療した後、ＮＢＴ陽性細胞のパーセンテージは、それぞれ３．５６、３３．４２及び４５．２２％であり、ＴＮＵＥＬ陽性細胞は、それぞれ４０．３３、５．４５及び４５．２２％であった（図３Ｂ）。これらの結果は、ＷＥＨＩ−３細胞では、ＡＴＲＡが分化を誘発し、化合物１がアポトーシスを誘発したことを示している。
【００５２】
[0055]アポトーシスをさらに評価するために、化合物Ｉ治療されたＷＥＨＩ−３細胞でＤＮＡ断片化及びカスパーゼ−３活性アッセイを試験した。アガロースゲル電気泳動は、１２及び２４時間、５μＭの化合物１で治療されたＷＥＨＩ−３細胞から抽出されたＤＮＡが１８０〜２００塩基対のラダーに断片化されたことを示した（図４Ａ）。カスパーゼ−３の活性が化合物１によるアポトーシスの誘発に必要であるかどうかを決定するために、５０μＭの化合物１に暴露する前に１時間、ＷＥＨＩ−３細胞をカスパーゼ−３阻害剤（Ｚ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ）を用いて、又は用いないで、予備処理した。図４Ｂに示されているように、ＹＣ−１の１２、１８及び２４時間治療は、カスパーゼ−３活性の迅速な誘発をもたらした。誘発されたカスパーゼ−３活性は、Ｚ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ予備処理によりブロックされた。これらの結果は、化合物１によるアポトーシスの誘発が、カスパーゼ−３活性によりもたらされる特異的な生化学的事象であることを示唆している。
【００５３】
他の実施形態
[0056]本出願に開示されている形態は全て、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本出願に開示されている各形態は、同じ、同等又は類似の目的に役立つ別の形態に代えることもできる。したがって、他に特に記載されていない限り、開示されている各形態は、同等又は類似の形態の一般的なシリーズの単なる一例である。
【００５４】
[0057]前記の説明から、当技術分野の専門家であれば、本発明の必須の特性を容易に確認することができ、本発明の意図及び範囲から逸脱することなく、様々な利用及び条件に合うように本発明を様々に変化及び変更することができる。例えば、縮合ピラゾリル化合物と構造的に類似の化合物を、本発明を実施するために使用することもできる。したがって、他の実施形態も、本請求項の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】化合物１（ＹＣ−１）、ＡＴＲＡ、化合物１とＡＴＲＡとの組み合わせで治療された又は治療されなかったＢＡＬＢ／ｃマウス及びＷＥＨＩ−３／ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓（Ａ）及び肝臓（Ｂ）の重量の変化を示すグラフである（ｎ＝８）。この結果は、平均±Ｓ．Ｄ．として表されており、群の間の差異は、一元ＡＮＯＶＡにより試験した。ＷＥＨＩ−３Ｂ／ＢＡＬＢ／ｃマウス及び様々な治療における値の著しい差異は、＊Ｐ＜０．０５で示されている。
【図２】図２は、対照マウス（Ａ）、ＷＥＨＩ−３／ＢＡＬＢ／ｃ白血病マウス（Ｂ）、化合物１治療された白血病マウス（Ｃ）、ＡＴＲＡ治療された白血病マウス（Ｄ）及び化合物１とＡＴＲＡとの組み合わせで治療された白血病マウス（Ｅ）の脾臓のパラフィン切片のヘマトキシリン及びエオシン染色を示している。治療の１４日後に、マウスを屠殺した。脾臓を４％ホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋した。脾臓切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色した（Ｒ：赤色パルプ；Ｗ：白色パルプ；：浸潤未熟骨髄芽球細胞）。
【図３（Ａ）】ＷＥＨＩ−３細胞の分化及びアポトーシスに対する、化合物１、ＡＴＲＡ及び化合物１とＡＴＲＡとの組み合わせの作用を示す図である。（Ａ）ＴＵＮＥＬ／ＤＡＰＩ染色により誘発された核形態変化。
【図３（Ｂ）】ＷＥＨＩ−３細胞の分化及びアポトーシスに対する、化合物１、ＡＴＲＡ及び化合物１とＡＴＲＡとの組み合わせの作用を示す図である。（Ｂ）ＮＢＴ低下及びＴＵＮＥＬ染色。化合物１、ＡＴＲＡ、化合物１とＡＴＲＡとの組み合わせで治療されたＷＥＨＩ−３細胞を２４時間培養し、その後、全ての治療を、ＴＵＮＥＬ／ＤＡＰＩで染色し（×４００）、続いて顕微鏡分析した。結果を平均±Ｓ．Ｄ．として表した。
【図４】ＷＥＨＩ−３細胞での化合物１誘発アポトーシスの作用を、（Ａ）ＤＮＡ断片化及び（Ｂ）カスパーゼ−３活性によって示す図である。ＤＮＡ断片化では、ＤＮＡ抽出物を１．５％アガロースゲル中に電気泳動させた。ＹＣ−誘発カスパーゼ−３活性に対するカスパーゼ−３阻害剤の作用。細胞をカスパーゼ−３阻害剤、Ｚ−ＤＥＶＥ−ＦＭＫで１時間予備処理し、次いで、５μＭの化合物１で刺激した。結果を平均±Ｓ．Ｄ．として表し、群の間の差異は、一元ＡＮＯＶＡにより試験した。０時間治療及び様々な時間治療での値の著しい差異は、＊Ｐ＜０．００１で示されている。
【図１】
2007186511.tif 000010
【図２】
2007186511.tif 000011
【図３（Ａ）】
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【図３（Ｂ）】
2007186511.tif 000013
【図４】
2007186511.tif 000014
【外国語明細書】
2007186511000001.pdf