(57)【要約】減少したリポキシゲナーゼ−１酵素活性を有するオオムギ植物、例えば、変異型ＬＯＸ−１蛋白質を発現しているオオムギ植物を提供する。本発明のオオムギ植物は、安定性が増し、Ｔ２Ｎポテンシャルが減少した麦芽および醸造飲料、特にビールなどの植物生産物の生産に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非変異型対照と比べてリポキシゲナーゼ活性が低いかまたは無いことを特徴とする変異型ＬＯＸ−１蛋白質を含むオオムギ植物またはその一部。
【請求項２】
リポキシゲナーゼ活性が、遊離およびエステル化したポリ不飽和脂肪酸およびポリ不飽和オクタデカン脂肪酸が酸化して９−ヒドロペルオキシ脂肪酸誘導体を形成する触媒反応を含む、請求項１記載のオオムギ植物またはその一部。
【請求項３】
ＬＯＸ−１蛋白質が１以上の変異を有する変異型ｌｏｘ−１核酸配列によってコードされる請求項１記載のオオムギ植物またはその一部。
【請求項４】
１以上の変異が化学的突然変異誘発または放射線によって誘導される請求項３記載のオオムギ植物またはその一部。
【請求項５】
１以上の変異が部位特異的突然変異誘発によって誘導される請求項３記載のオオムギ植物またはその一部。
【請求項６】
１以上の変異がｌｏｘ−１核酸配列のプロモーターまたは転写領域内に位置する請求項３記載のオオムギ植物またはその一部。
【請求項７】
変異型ＬＯＸ−１蛋白質が、野生型オオムギＬＯＸ−１の基質キャビティーの内側にある１以上の保存された中性または疎水性アミノ酸残基での酸性、塩基性、または極性アミノ酸置換を含む請求項１記載のオオムギ植物またはその一部。
【請求項８】
変異型ＬＯＸ−１蛋白質が、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、ここに、Ｘａａは酸性、塩基性または極性アミノ酸である請求項７記載のオオムギ植物またはその一部。
【請求項９】
Ｘａａがグルタミン酸またはアスパラギン酸である請求項８記載のオオムギ植物またはその一部。
【請求項１０】
Ｘａａがアスパラギン酸である請求項９記載のオオムギ植物またはその一部。
【請求項１１】
オオムギｌｏｘ−１遺伝子の転写領域の少なくとも一部に対するアンチセンス配列を表示している異種核酸配列を含み、該異種配列が遺伝子プロモーター配列および転写ターミネーター配列に作動可能に連結されているトランスジェニックオオムギ植物またはその一部。
【請求項１２】
遺伝子プロモーターがアンチセンス配列の構造性発現を指示する請求項１１記載のトランスジェニックオオムギ植物またはその一部。
【請求項１３】
遺伝子プロモーターが、植物の組織において作動可能に連結されたアンチセンス配列の組織特異的または一時的に調節された発現を指示する請求項１１記載のトランスジェニックオオムギ植物またはその一部。
【請求項１４】
組織が発育中、発芽中または成熟した胚組織である請求項１１記載のトランスジェニックオオムギ植物またはその一部。
【請求項１５】
遺伝子プロモーター配列がオオムギｌｏｘ−１遺伝子プロモーターまたはその一部である請求項１１記載のトランスジェニックオオムギ植物またはその一部。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項記載のオオムギ植物または植物部分から生産された穀粒または植物子孫。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれか１項記載のオオムギ植物または植物部分あるいは請求項１６記載の穀粒または植物子孫から生産された植物生産物。
【請求項１８】
生産物が麦芽である請求項１７記載の植物生産物。
【請求項１９】
請求項１７〜１８のいずれか１項記載の植物生産物を用いて製造された飲料。
【請求項２０】
請求項１７〜１８のいずれか１項記載の植物生産物を用いて製造されたビール。
【請求項２１】
測定期間にわたり、または高い保存温度にて、非変異型対照の植物生産物から調製された飲料と比べて安定なままの官能性品質を呈示する飲料の調製のための、請求項１７〜１８のいずれか１項記載の植物生産物の使用。
【請求項２２】
飲料の製造のための、請求項１〜１８のいずれか１項記載のオオムギ植物またはその一部、穀粒または植物子孫、または植物生産物の使用。
【請求項２３】
麦芽またはビールの製造のための、請求項１〜１８のいずれか１項記載のオオムギ植物またはその一部、穀粒または植物子孫、または植物生産物の使用。
【請求項２４】
測定期間にわたり、非変異型オオムギ植物またはその一部、穀粒または植物子孫、または植物生産物を用いて生産された対照醸造産物と比べて、醸造産物の官能的特性の安定化のための、請求項１〜１８のいずれか１項記載のオオムギ植物またはその一部、穀粒または植物子孫、または植物生産物の使用。
【請求項２５】
測定期間にわたり、または高温保存条件下にて、非変異型オオムギ植物またはその一部、穀粒または植物子孫、または植物生産物を用いて生産された対照醸造産物と比べて減少したレベルの遊離トランス−２−ノネナールを有する醸造産物の製造のための、請求項１〜１８のいずれか１項記載のオオムギ植物またはその一部、穀粒または植物子孫、または植物生産物の使用。
【請求項２６】
測定期間にわたり、または高温保存条件下にて、非変異型オオムギ植物またはその一部、穀粒または植物子孫、または植物生産物を用いて生産された対照醸造産物と比べて減少したトランス−２−ノネナール含量を有する、請求項１〜１８のいずれか１項記載のオオムギ植物またはその一部、穀粒または植物子孫、または植物生産物から生産された飲料。
【請求項２７】
飲料がビールである請求項２６記載の飲料。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、デンマークの会社のカールスバーグ・リサーチ・ラボラトリーの名前で２００１年１月２２日に全ての国を指定国としてＰＣＴ国際特許出願として提出されている。
【０００２】
発明の分野
本発明は、植物バイオテクノロジーの分野にある。より詳細には、本発明は、非常に減少した９−ヒドロペルオキシ−オクタデカン酸生成活性を有する酵素をコードする変異型オオムギリポキシゲナーゼ１遺伝子（ｌｏｘ−１）に関する。本発明は、また、ビールなどの醸造産物における保存の間の不快臭の生成を減少させるための、醸造工程におけるｌｏｘ−１のオオムギ栽培変種ホモ接合体の使用に関する。
【０００３】
発明の背景
リポキシゲナーゼは、１（Ｚ），４（Ｚ）−ペンタジエン配置を有する遊離およびエステル化されたポリ不飽和脂肪酸の二酸化を触媒する酵素（ＥＣ１．１３．１１．１２）のファミリーである。リポキシゲナーゼ−触媒反応の生産物は、長い間、植物の穀粒／種子および穀粒／種子由来の食品における不快な臭いの出現の主犯として考えられてきた（Robinsonら、1995, Food Chem., 54: 33-43）。リポキシゲナーゼは、望ましくない芳香があり、それにより、食品におけるダイズ蛋白質の使用を制限しているダイズの加工処理の間に発生する揮発性ヘキサナールアルデヒドの生成に関係している。ダイズ種子において発現する３つのリポキシゲナーゼイソ酵素は、脂質酸化およびヘキサナール生成に寄与すると考えられる。これらのイソ酵素のうち１以上を欠くダイズ変異体が、ヘキサナール生成を減少し、それらの風味安定性を改善する目的で生み出された。このアプローチの成功は、Hildebrandら、1990, J. Agric. Food Chem. 38: 1934-1936によって評価されている。ダイズリポキシゲナーゼ３を欠く変異体が、より高レベルのヘキサナールを生産したことにより、該イソ酵素が、脂質酸化によって生産される１３−ヒドロキシペルオキシオクタデカノイドを非揮発性産物の方へ向けることが示唆された。３つの種子リポキシゲナーゼを全て欠くトリプル−ヌルダイズ系統の畑での成果は、これらの酵素が正常な作物および種子特性に必須ではないことを示している（Narvelら、1998, Crop. Sci. 38: 926-928）。
【０００４】
リポキシゲナーゼは、また、穀粒貯蔵の間に起こり得るコメにおける不快臭の発生にも関係している。貯蔵された穀粒において遊離脂肪酸の放出を検出することができ、それは、トリグリセリド貯蔵物代謝の指標である。コメ品種Ｄａｗ Ｄａｍは、より低レベルのペンタナールおよびヘキサナールを蓄積し、貯蔵時のより良好な風味安定性を与えることが見出された（Susukiら、1999, J. Agric. Food Chem., 47: 1119-1124）。この望ましい表現型は、不飽和脂質アシル鎖を酸化して９−ヒドロキシペルオキシオクタデカノン位置異性体を生成するコメリポキシゲナーゼ−３が存在しないことに起因した。
【０００５】
リポキシゲナーゼ経路は多くの分岐を伴って複雑であり、植物生長の非常に多くの態様におけるその役割および生理学は十分に理解されていない。アスペルギルス属によるマイコトキシン汚染に対する感受性を調節するために、種子作物において９−ヒドロ過酸化活性を改変するリポキシゲナーゼ経路の修飾が提案されており（ＷＯ９７２６３６４）、それは、植物病原体耐性における該経路の関与と一致するが、本明細書に記載の本発明の目的とは無関係である。
【０００６】
ビールの風味に寄与する多くの芳香揮発性物質のなかでも、６−１２炭素鎖を有するより高級な不飽和アルデヒドが特に低い官能性風味域値を有する（Meilgaard 1975, MBAA Tech. Quart. 12: 151-168）。該群のメンバーであるトランス−２−ノネナールは、０．１１ｐｐｂという非常に低い風味域値を有し、また、望ましくない麦わらのような「カードボード」臭をビールに付与する。トランス−２−ノネナールによって引き起こされる特徴的な不快臭は、１−３ヶ月以上保存されたビールの共通の特徴であり、これは特に、淡色麦芽を用いて醸造された、繊細な風味を有するラガービールの風味に不利である。
【０００７】
亜硫酸塩は、酸素を結合し、抗酸化剤として作用することによってだけでなく、ビール中に存在するアルデヒドおよびケトンと揮発性重亜硫酸塩付加化合物を形成することによっても、ビールの風味安定性を改善することが長い間知られていた。ビールにおける亜硫酸塩の２つの主要な供給源は、硫黄同化経路を介して発酵の間に酵母によって生産される亜硫酸塩およびパッケージングの前にビールに加えられる亜硫酸塩である。酵母亜硫酸塩生産および分泌を増加させる発酵条件は、麦汁に存在するカルボニル類から亜硫酸塩−カルボニル付加物を生成させ、酵母によるそれらのさらなる代謝を防ぐであろう（Dufour 1991, Proc. Eur. Brew. Conv. Congr., Lisbon, pp. 209-216）。このように、アセトアルデヒドおよびジアセチルのようなカルボニル類がビールに移行し得る。亜硫酸塩のビール老化の間のカルボニル化合物トランス−２−ノネナール出現防止能は、硫黄同化経路を遮断された酵母株を用いてビールを醸造することによって明らかにされた（Johannesenら、1999, Proc. Eur. Brew. Conv. Congr., Nice, pp. 655-662）。瓶詰め後、ビールを３７℃で７日間保存することによる強制老化に付した後、トランス−２−ノネナールレベルが味覚域値よりかなり高いことが認められた。１０ｐｐｍ亜硫酸塩を瓶詰め直前に低亜硫酸塩ビールに加えた場合、強制老化の間のトランス−２−ノネナールの出現は有意に減少された。亜硫酸塩とカルボニル化合物との間の反応は、熱力学的および動力学的調節下で可逆的である。重亜硫酸塩化合物の見かけの平衡定数はカルボニル化合物、例えば、アセトアルデヒド、ヘキサナールおよびデカナールについて１０−６Ｍからジアセチルおよびピルビン酸塩について１０−３の範囲である（Dufour 1991, 上掲）。ビール保存の間に、パッケージングによるガス交換がビール中に酸素を与え、亜硫酸塩が喪失され、その結果、より弱い重亜硫酸塩付加物が解離し、それにより、遊離カルボニルがビール中に出現するのであろう。亜硫酸塩は疑いなく、特に短期間において、ビールの風味安定性を高めるが、パッケージされたビールにおけるその保持は、パッケージングによるガス交換および温度に強く依存する。完成したビールにおいて、発酵の間に生産された亜硫酸塩の天然レベルは変化しやすく、瓶詰め前の亜硫酸塩の添加は一般的に許容される手法ではない。これらの理由のため、亜硫酸塩単独では、世界中で使用される様々なビール保存条件下で、長期間のビールの風味安定性を高める信頼できる方法を提供しない。
【０００８】
一般に、ビール中に見い出されるトランス−２−ノネナールは、１８−炭素鎖脂肪酸、リノール酸（１８：２，ｎ−６ポリ不飽和脂肪酸として分類される（Broun, GettnerおよびSommerville 1999, Annu. Rev. Nutr. 19: 197-216））が最も豊富であるオオムギ穀粒脂質由来のポリ不飽和脂肪酸の酸化に起因することが認められている。しかしながら、トランス−２−ノネナール生成メカニズムに関する文献において意見の一致はわずかしかない。ポリ不飽和脂肪酸からトランス−２−ノネナール生成を導く酵素的経路の存在が提唱されているが、個々の酵素的工程は、オオムギ穀粒において、またはその麦芽製造工程において一度も実験的に証明されていない（Gardner 1988, Adv. Cereal Sci. Technol. 9: 161-215）。オオムギ穀粒におけるリポキシゲナーゼ−１レベルを減少させ、それにより９−ヒドロ過酸化を調節し、最終的なオオムギ穀粒におけるアルデヒドおよびアルコールレベルを減少させるためにアンチセンスまたは相互抑制遺伝子テクノロジーを用いるという考えが不快臭生成を調節するための手段として提唱されたが、かかるアプローチの結果は報告されていない（McElroyおよびJacobsen, 1995, Bio/Technology 13: 245-249）。
【０００９】
麦汁またはビール中のトランス−２−ノネナール生成を試料を高温低ｐＨ（１００℃、ｐＨ４．０、２時間）に付すことによって誘導する強制試験が、ビールのトランス−２−ノネナールポテンシャルを評価する方法として開発された。麦汁および完成したビール中のトランス−２−ノネナールポテンシャルとキルン乾燥麦芽中のリポキシゲナーゼ活性の全レベルとを相関させようとする試みは、リポキシゲナーゼが老化したビール中でのトランス−２−ノネナールの出現に寄与しうることを示した（Drostら、1990, J. Am. Soc. Brew. Chem. 48: 124-131）。しかしながら、該研究から導くことのできる結論は、オオムギ麦芽中のリポキシゲナーゼ活性が麦芽製造工程の最後にキルン乾燥の間の酵素不活性化の程度によって調節されたという事実によって、激しく制限される。かくして、得られた麦汁および完成したビール中のトランス−２−ノネナールポテンシャルに対する残留麦芽リポキシゲナーゼ活性の影響だけが試験された。該研究は、発育および麦芽製造の間のオオムギ穀粒中のリポキシゲナーゼ酵素経路における第１段階を触媒するリポキシゲナーゼ、およびビール中に見い出されるトランス−２−ノネナールレベルの決定子としてのその役割を評価することができなかった。実際、１以上のリポキシゲナーゼイソ酵素に欠陥のあるオオムギ栽培変種が無いことが、トランス−２−ノネナール生成の調節におけるオオムギ麦芽におけるリポキシゲナーゼ経路の役割について納得する証拠を提供することを不可能にしてきた。自動−酸化／化学的経路と比べて、ビール中のトランス−２−ノネナールの生成に対する酵素の寄与を評価するような実験が必要とされる。醸造工程は、これらの非酵素反応が起こると提唱される麦汁煮沸の高温段階を含む（Noeulら、1999, J. Agric. Food Chem. 47: 4323-4326）。
【００１０】
発明の概要
本発明は、大いに減少したリポキシゲナーゼ−１活性を有するオオムギ栽培変種を提供する。１の具体例において、本発明のオオムギ植物は、大いに減少したレベルのイソ酵素リポキシゲナーゼ−１を発現している変異型ｌｏｘ−１遺伝子を含有する。別の具体例において、該オオムギ植物は、野生型ｌｏｘ−１に対するアンチセンス配列を発現している異種核酸配列を含有し、それにより該酵素活性を減少させている。
【００１１】
本明細書中に示されるように、本発明のリポキシゲナーゼ減少オオムギ、例えば、変異型ｌｏｘ−１遺伝子に関してホモ接合体のオオムギ栽培変種から生産される麦芽および麦汁は、特にトランス−２−ノネナールの出現を促進することが知られている条件下で、有意に強化された風味安定性および減少したＴ２Ｎレベルを有するビールを生産するのに有用である。本発明は、９−ヒドロキシペルオキシ−オクタデカジエン酸（９−ＨＰＯＤ）を生産するためのオオムギ麦芽リポキシゲナーゼ−１の活性とビール中のトランス−２−ノネナールの存在との間の相関関係を明らかにする。本発明は、さらに、醸造工程における変異型ｌｏｘ−１遺伝子に関してホモ接合体のオオムギの使用が、保存の間および高い保存温度に曝露時の両方において、ビールの風味安定性を改善することを明らかにする。これらの特性は、ビールの質を向上し、その貯蔵寿命を延長すること、輸送および保存の間にビールを冷却する必要性を減らすことに有用である。
【００１２】
本発明は、本明細書中に記載のような変異型ＬＯＸ−１蛋白質を発現しているオオムギ植物を包含する、減少したリポキシゲナーゼ−１活性を有するオオムギ植物およびその一部、ならびにかかるオオムギ植物、植物部分、該植物の生産物、および特に、本発明のオオムギ植物から生産された麦芽およびビール生産物の製造法を提供する。
【００１３】
発明の詳細な記載
本発明によると、ビールなどの飲料であって、低含量の不快臭化合物トランス−２−ノネナールを有し、その結果、対照飲料と比べて、保存の間および高温に曝露時の該飲料、例えばビールの風味安定性が改善される飲料を生産するための植物材料、植物生産物および方法が提供される。より詳細には、本発明は、発育中および発芽中の穀粒が大いに減少した活性レベルの酵素リポキシゲナーゼ−１（以下、ＬＯＸ−１と表示する）を生産するオオムギ品種であって、例えば、ビール醸造工程において使用される場合、対照オオムギ品種と比べて減少したトランス−２−ノネナールレベルを有するビールをもたらす品種を提供する。
【００１４】
大いに減少したＬＯＸ−１活性を有するオオムギ品種を作成、特徴付けおよび確認するために使用される方法、および風味安定なビールの生産のためのこの種のオオムギの使用を下記する。
【００１５】
１．定義
本明細書で使用される場合、下記の用語は示される定義を有する。
「植物部分」なる語は、植物または植物の特定部分、例えば、茎、葉、根、花、種子、穀粒、果実または芽を意味する。
「ＬＯＸ−１」なる語は、リポキシゲナーゼ−１蛋白質を意味し；「ｌｏｘ−１」なる語は、ＬＯＸ−１をコードしている遺伝子を意味する。
【００１６】
「変異型オオムギｌｏｘ−１」なる語は、変異型リポキシゲナーゼ１ポリペプチドをコードしている突然変異誘発されたオオムギ遺伝子を意味する。
「非変異型対照」なる語は、野生型遺伝子または蛋白質を含有する植物、核酸、遺伝子、ポリペプチド、植物部分または植物生産物を意味する。
「異種」なる語は、非天然配列、例えば、別の種由来の配列、または天然配列と異なる組換え操作もしくは合成した配列を意味する。
【００１７】
「植物生産物」なる語は、植物または植物部分の加工処理から生じる生産物を意味し、例えば、麦芽および麦汁を包含する。
「酸性アミノ酸」なる語は、アスパラギン酸またはグルタミン酸を意味する。
「塩基性アミノ酸」なる語は、ヒスチジン、リジンまたはアルギニンを意味する。
「極性アミノ酸」なる語は、スレオニン、セリン、チロシン、トリプトファン、アスパラギンまたはグルタミンを意味する。
【００１８】
「官能特性」なる語は、例えば訓練を受けた試飲パネルによって、分析される臭覚および味覚に訴える特性を意味する。
「醸造生産物」なる語は、マッシング（mashing）、煮沸および発酵によって調製される生産物、例えば、ビールを意味する。
「減少したトランス−２−ノネナール」なる語は、野生型（対照）条件と比べて、約５０％未満を意味する。
【００１９】
２．リポキシゲナーゼ活性
リポキシゲナーゼ酵素は、ポリ不飽和脂肪酸の酸化を触媒する。オオムギにおいては、イソ酵素ＬＯＸ−１およびＬＯＸ−２が知られている。ＬＯＸ−１は主にポリ不飽和オクタデカン脂肪酸の９−ヒドロ過酸化を触媒するのに対し、ＬＯＸ−２は主に１３−ヒドロ過酸化を触媒する。下記の実施例に示されたデータは、オオムギＬＯＸ−１の９−ヒドロ過酸化活性とビール中のトランス−２−ノネナールの存在との間の相関関係を明らかにする。したがって、減少したＬＯＸ−１活性を有するオオムギは、対照と比べて減少したトランス−２−ノネナールレベルおよび／またはポテシャルを有するビールを生産するのに有用である。
【００２０】
３．低リポキシゲナーゼオオムギの生産
種々の既知の遺伝的アプローチを本発明の植物の生産に、すなわち、オオムギ植物において発現されるリポキシゲナーゼ１酵素活性のレベルを安定な遺伝可能な方法で減少させるために使用することができる。これらのアプローチは、限定するものではないが、アンチセンス技術および突然変異誘発、例えば、化学的および放射線誘導突然変異誘発、ならびに部位特異的突然変異誘発を包含する。
【００２１】
オオムギ形質転換
オオムギは、ｌｏｘ−１遺伝子発現を操作するように、またはｌｏｘ−１遺伝子の構造を改変するように設計された種々の核酸分子を用いて形質転換できる。オオムギ細胞、例えば、プロトプラスト、カルスまたは胚中に核酸を首尾よく導入するために、種々の方法、例えば、アグロバクテリウム・ツモファシエンス（Agrobacterium tumofaciens）媒介性移入（Tingayら、1997, Plant J., 11: 1369-1376）、粒子爆撃（WanおよびLemaux, 1994, Plant Physiol., 104: 37-48）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介性ＤＮＡ取り込み（FunatsukiおよびKihara, 1995, Theor. Appl. Genet., 91: 707-712）を用いることができる。
【００２２】
種々のプロモーターを用いて目的の遺伝子を発現させることができる。アンチセンス配列を包含するｌｏｘ−１含有ベクターの発現の場合、天然ｌｘｏ−１プロモーター領域を用いることができる。ｌｏｘ−１のプロモーター配列は、ＥＭＢＬ受託番号第Ｕ８３９０４号の５’ＵＴＲを包含するヌクレオチド２６０２−３５１１に含有される。別法では、目的の遺伝子を構成的に発現させるプロモーター、例えば、Ｕｂｉ．１トウモロコシユビキチンプロモーターを用いることができる（WanおよびLemaux, 上掲；Kjaerulffら, P. Mathis編, 1995, Photosynthesis: from Light to Biosphere, Vol.II, 151-154）。発現ベクターはまた、転写終止領域を含有することができ、例えば、ノパリンシンターゼ遺伝子の３’ターミネーター（３’−ｎｏｓ）（Bevanら、1983, Nucl. Acids Res., 11: 369-385）がトランスジェニックオオムギ中に発現される遺伝子に融合された（WanおよびLemaux, 上掲; FunatsukiおよびKihara, 上掲）。
【００２３】
発現ベクターはまた、ベクターが細胞中に首尾よく組み込まれた場合に、形質転換細胞の選択を可能とする遺伝子を含有することができる。これらの遺伝子は、抗生物質または除草剤耐性遺伝子、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔ）またはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ）遺伝子をコードすることができる。発現時に、かかる耐性遺伝子が各々、ネオマイシンまたはビアラホス（bialaphos）含有培地中での形質転換細胞の生育を可能とする（例えば、WanおよびLemaux, 上掲; FunatsukiおよびKihara, 上掲；Kjaerulffら、P. Mathis, 上掲を参照）。
【００２４】
形質転換後、細胞を一定期間、選択培地中で生育させ、次いで、シュート、次いで根系、次いで小植物の形成ができるように培養することができる。成功したオオムギ形質転換手法は、FunatsukiおよびKihara（上掲）によって開発され、ここに、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ含有発現ベクターを用いるＰＥＧによるオオムギプロトプラストの形質転換およびその後のネオマイシン中での選択は、トランスジーンを含有する受精能力のある植物を生産した。トランスジーンは、ゲノム中に組み込まれることが示されており、トランスジェニック植物のほとんどがトランスジーンによってコードされる蛋白質を発現した。また、これらのトランスジェニック植物は、交配後にトランスジーンを伝達および発現することができた。
【００２５】
種々の形質転換法、発現ベクター、プロモーター、選択マーカーなどが知られており、オオムギの形質転換に有用であることが理解される。
【００２６】
オオムギ突然変異誘発
ｌｏｘ−１遺伝子を、キメラＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いる部位特異的突然変異誘発の標的とすることができる。これらのキメラＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、植物細胞（Zhuら、1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 8768-8773; およびBeethamら、1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 8774-8778）および哺乳動物細胞（Yoonら、1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 2071-2076）において所望の位置に突然変異を首尾よく導入することが知られている。キメラＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、オオムギプロトプラストまたは目的の細胞中に種々の方法、例えば、上記のＰＥＧ−媒介性または粒子爆撃媒介性形質転換法を用いて形質転換することができる。次いで、個々のプロトプラストまたは細胞を組織培養によって、受精能力のある全植物体に再生することができ、例えば、下記の実施例において詳述するようなＰＣＲに基づくアプローチを用いて、突然変異事象を確認および追跡することができる。
【００２７】
該部位特異的突然変異誘発法は、ｌｏｘ−１遺伝子中の特定の残基を変異させるために適用することができる。ｌｏｘ−１遺伝子をプロモーター領域中の１以上のヌクレオチド位置で変異させて、ｌｏｘ−１転写をダウンレギュレートまたは廃止することができる。特異的突然変異誘発もまた、例えば、酵素活性を減少させるｌｏｘ−１コーディング領域中における変化を導入するために適用することができる。かかる変異は、限定するものではないが、フレームシフト、ＬＯＸ−１蛋白質の末端切断および／または酵素基質キャビティーの中性および疎水性の改変をもたらす挿入、欠失および置換を包含する。
【００２８】
アンチセンス発現
ｌｏｘ−１発現の減少はまた、オオムギ細胞におけるｌｏｘ−１アンチセンス構築物の発現によって達成することができる。標的蛋白質の発現を減少させるためのオオムギにおけるアンチセンス構築物の発現方法は、例えば、Gilpin, M.J.ら、1998: Photosynthesis: Mechanisms and Effects, G. Garab編, Vol. IV, 2983-2986; Kjaerulffら、1995: Photosynthesis: from Light to Biosphere, P. Mathis編, Vol. II, 151-154において報告されている。
【００２９】
オオムギ細胞は、アンチセンス核酸配列を含有する発現構築物を用いて形質転換することができる。該発現構築物は、相補的塩基対合によって、野生型ｌｏｘ−１遺伝子から生じたｍＲＮＡの少なくとも一部に特異的に結合でき、プレｍＲＮＡのスプライシングまたは該ｍＲＮＡの翻訳を崩壊することのできるアンチセンスＲＮＡ分子を生成する。構成的または組織／一時的特異的プロモーター、例えば、上記のオオムギｌｏｘ−１プロモーターは、アンチセンス核酸配列を発現させることができる。
【００３０】
化学的突然変異誘発
化学的突然変異原アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）がオオムギ突然変異誘発に一般的に用いられており、オオムギゲノムのＤＮＡ（デオキシリボ核酸）配列において安定な変異を誘導することが知られている（Olsenら、1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 8043-8047）。他の化学的突然変異原、例えば、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、アジドグリセロール（ＡＧ、３−アジド−１，２−プロパンジオール）、メチルニトロソ尿素（ＭＮＵ）、およびマレイン酸ヒドラジド（ＭＨ）もまた、ＤＮＡ変異を誘導するために用いることができ（Rank, J.ら、1997, Mutat. Res. 390: 121-7）、同様にＵＶ照射も用いることができる。
【００３１】
下記の実施例に示されるように、オオムギ栽培変種（ｃｖ）ＶｉｎｔａｇｅおよびＣａｒｕｓｏの穀粒をアジ化ナトリウムで処理し、第３世代（Ｍ３）まで自家受粉によって増殖させた。
【００３２】
４．低リポキシゲナーゼオオムギの同定および選択
穀粒において減少したリポキシゲナーゼイソ酵素活性を有するオオムギ植物の同定および選択は、例えば、リポキシゲナーゼ活性の分析によって達成することができる。成熟または発芽中の穀粒のいずれかに存在することが知られている２つの主要なリポキシゲナーゼ、ＬＯＸ−１およびＬＯＸ−２の活性を測定するために、酵素アッセイを用いることができる。かかるアッセイは、ＬＯＸ−１活性とＬＯＸ−２活性を区別するものである。
【００３３】
ＬＯＸ−１およびＬＯＸ−２の１の選択的アッセイは、リポキシゲナーゼによるポリ不飽和脂肪酸の酸化およびかかる酸化のヒドロペルオキシド生産物の分光光度計検出に基づく。ＬＯＸ−１に対する該アッセイの特異性は、ＬＯＸ−２に相対的な、阻害剤、例えば、ＮＤＧＡ（ノルジヒドログアイアレチン酸）に対するＬＯＸ−１の比較感受性を利用する。
【００３４】
選択的アッセイはまた、免疫沈降を用いてＬＯＸ−１またはＬＯＸ−２を該アッセイから選択的に除去することによって達成することもできる。特異的抗−ＬＯＸ−１および抗−ＬＯＸ−２抗体、例えば、モノクローナル抗体を、Holtmanら、1996上掲に記載のように、精製したＬＯＸ−１またはＬＯＸ−２から調製することができる。
【００３５】
これらのアッセイ法は、多くの試料の迅速スクリーニングが可能なミクロタイタープレートアッセイ法または他の既知の反復性ハイスループットアッセイフォーマットに適応させることができる。これらのアッセイは、スクリーンにおいて選択された実生をさらに増殖させることができるように、非破壊的方法で発芽穀粒の葉チップをスクリーニングするのに有効であるとされる。
【００３６】
推定変異体におけるＬＯＸ−１活性の喪失は、酵素活性のアッセイによって確認することができる。例えば、穀粒抽出物をリノール酸と一緒にインキュベートし、リノール酸の酸化生産物を例えば、逆相ＨＰＬＣによって分析することができる。リノール酸から生成された９−ＨＰＯＤおよび１３−ＨＰＯＤの相対量は、その主生産物が９−ＨＰＯＤであるＬＯＸ−１活性の測定を提供する。
【００３７】
下記の実施例において示されるように、突然変異を誘発されたｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅおよびｃｖ ＣａｒｕｓｏのＭ３世代の約２０，０００個の穀粒を、阻害剤の存在下での酸化アッセイによって、また免疫沈降アッセイによって、ＬＯＸ−１およびＬＯＸ−２活性についてスクリーンした。これらのスクリーニング法を用いて、ＬＯＸ−１活性が大きく減少したｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅにおける変異体を見出し、Ｌｉｎｅ Ｇとした。変異体表現型はＭ４およびＭ５世代に遺伝された。
【００３８】
Ｌｉｎｅ Ｇオオムギから生産された種子を２００１年１月４日に英国スコットランドＡＢ２４３ＲＹ、アバーディーン、セント・マーシャル・ドライブ２３番地（23 St. Machar Drive, Aberdeen, AB243RY, Scotland, UK）のナショナル・コレクションズ・オブ・インダストリアル、フード・アンド・マリン・バクテリア（（the National Collections of Industrial, Food and Marine Bacteria）ＮＣＩＭＢ）に、ブダペスト条約の定めの下に受託番号：ＮＣＩＭＢ４１０７８として寄託した。
【００３９】
５．遺伝子配列
本発明のオオムギ植物における低リポキシゲナーゼ表現型の原因である遺伝子型改変の正確な記載は、該遺伝子改変を有する植物の同定および育種計画における他のオオムギ栽培変種中への該遺伝的特徴の交雑に有用である。種々の既知の分子学的および生化学的方法を用いて、低リポキシゲナーゼ表現型の遺伝学的基礎を決定することができる。
【００４０】
一般に、シス作用性およびトランス作用性遺伝子配列はどちらも、ゲノム中の所定の遺伝子の発現および該遺伝子産物の活性を決定することができると認められる。遺伝子発現における制御点は、遺伝子転写のタイミング、組織特異性および速度、転写産物の安定性および転写産物翻訳の速度の調節を包含する。遺伝子発現のレベルならびにコードされる酵素の安定性および比活性のどれもが、組織中で検出される酵素活性レベルを決定するであろう。
【００４１】
植物遺伝子配列における改変は、ゲノムの既知の関連部分のＤＮＡ配列決定によって決定できるが、ノーザン分析は所定の植物組織中の安定な転写産物レベルをモニターするための手段を提供する。植物組織中で発現された酵素は、酵素を組織から抽出し、酵素活性を測定することによって評価できる。
【００４２】
下記の実施例において示されるように、ｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅにおいて誘導されたＬｉｎｅ Ｇ変異体の低リポキシゲナーゼ表現型を決定する遺伝子変化の同定は、下記の方法において決定された。親ｃｖ ＶｉｎｔａｇｅとＬｉｎｅ Ｇの両方においてＬＯＸ−１蛋白質をコードしている構造遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し、該遺伝子の発現を調節する上流プロモーター配列ならびにイントロンおよびエキソン配列を含む全コーディング配列を配列決定した。
【００４３】
Ｌｉｎｅ Ｇおよび野生型ｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅ由来のｌｏｘ−１遺伝子のヌクレオチド配列比較は、２個のエキソン中における２個のヌクレオチド置換を明らかにし、その１つ（＋２３４７位置）は発現蛋白質中に非保存的アミノ酸置換（グリシン３６８→アスパラギン酸塩）を導いた。
【００４４】
図２２は、ダイズ（Ｇｍ：Glycine max L）リポキシゲナーゼＬＯＸ１（受け入れ番号第Ｐ０８１７０号）、ＬＯＸ２（受け入れ番号第Ｐ０８１７０号）、ＬＯＸ３（受け入れ番号第ＡＡＢ４１２７２号）およびオオムギ（ｈｖ：Hordeum vulgare）リポキシゲナーゼＬＯＸ１（受け入れ番号第Ｐ２９１１４号）およびＬＯＸ２（受け入れ番号第ＡＡＢ７０８６５．１号）のアラインメントを示す。保存されたアミノ酸残基および荷電残基の保存的置換を太字で示す。Skrzypezak-Jankunら、1997, Proteins 29: 15-31に記載のように、ダイズGlycine maxのＬＯＸ３に関する第２構造割り当て（ここに、Ｈ＝アルファヘリックスおよびＥ＝ベータストランド）は該アラインメントの上部に示され、酵素機能に関係する残基（星印または黒塗り丸で示される）が示される。
【００４５】
ダイズＬＯＸ３において触媒（＊）を結合するかまたは該触媒に必須の非ヘム鉄に関係するアミノ酸残基は：Ｈ５１８、Ｈ５２３、Ｈ７０９（３Ｎ原子）；Ｎ７１３，Ｉ８５７を包含する。オオムギＬＯＸ１における等価の残基は、Ｈ５１７、Ｈ５２２、Ｈ７０８、Ｎ７１２およびＩ８６２である。触媒（●）において推定の役割を有するダイズＬＯＸ３における残基は：Ｈ２６６、Ｈ５１３、Ｈ７７６、Ｆ２６４、Ｆ２７２、Ｆ７１４、Ｗ５１９、Ｒ５５２、Ｒ７２６、Ｄ７６６、Ｄ７７９、Ｋ２７８である。オオムギＬＯＸ１において等価の残基は：Ｈ２６１、Ｈ５１２、Ｈ７７５、Ｆ２５９、Ｆ２６７、Ｆ７１３、Ｗ５１８、Ｒ５５１、Ｒ７２５、Ｄ７７８およびＫ２７３である。
【００４６】
蛋白質第２構造におけるループおよびヘリックス−キャッピング位置内に配置されるプロリン（Ｐ８６、１０９、１６７、１７１、２２３、２３４、２９１、３１１、３２４、３４３、３４５、３７１、３８１、３８２、４８６、５４１、５４８、６００、６１６、６２７、６８５、７２６、７３４、７８８、８２９、８３３、８３９、８５７）およびグリシン（Ｇ４９、６７、６８、７０、９１、１０７、１３７、１８７、１９２、２１０、２１７、２１８、２６０、３０６、３０７、３３６、３９２、４０９、４５８、４７４、４９０、５６９、６０７、６７４、６７６、７２０、７３６、７８３、８２８、８５０、８５５）残基（＋）は、ペプチド骨格の鋭利なターンおよび折りたたみを容易にしうる。
【００４７】
関連した植物リポキシゲナーゼのアラインメントは、オオムギＬＯＸ−１におけるグリシン−３６８が強く保存されることを示した。さらに、ダイズＬＯＸ−１におけるグリシン−３５３に対応する該残基は、その結晶構造からわかるように、該酵素の基質キャビティーＩＩの内側にある全部で５８個の残基のうち３５個の高く保存された残基のうちの１つである。これらの保存された残基は、図２２に示される植物リポキシゲナーゼ配列のアラインメント中で強調されており（ボックス）（Minorら、1996, Biochemistry 35: 10687-10701）、下記のオオムギＬＯＸ−１残基を包含する：Ｙ２２４、Ｌ２６８、Ｗ３５５、Ｅ３６４、Ｇ３６８、Ｖ３６９、Ｎ３７０、Ｉ３７４、Ｌ４２４、Ｌ４９９、Ｋ５０１、Ａ５０２、Ｖ５０４、Ｄ５０８、Ｓ５０９、Ｈ５１２、Ｑ５１３、Ｌ５１４、Ｈ５１７、Ｗ５１８、Ｈ５２２、Ｉ５５６、Ｌ５５９、Ａ５６０、Ｌ５６４、Ｉ５６５、Ｉ５７０、Ｔ５７４、Ｓ５８５、Ｑ７１５、Ｙ７１８、Ｎ７２４、Ｒ７２５、Ｐ７２６、Ｔ７２７、Ｌ７７２およびＩ８６２。３５個の保存された残基のうち７個を除く全てが中性または疎水性残基である。オオムギにおけるグリシン−３６８位置または基質キャビティーＩＩの内側にある別の保存された中性もしくは疎水性残基での荷電残基の置換は、酵素の構造的および機能的特性を妨げるようである。オオムギＬｉｎｅ Ｇ ＬＯＸ１（◆）におけるＧ→Ｄ３６８変異は、アルファ−ヘリックスＨ６とベータ−ストランドＥ１２との間に位置する。
【００４８】
図２２において示されるように、酵素のリポキシゲナーゼファミリーは高度の配列保存を共有し、それは、ダイズＬＯＸ１およびＬＯＸ３を包含する植物リポキシゲナーゼファミリーのいくつかのメンバーについて決定されたそれらの保存された２次構造に反映されている（Skrzypczak-Jankunら、1997、上掲）。オオムギＬＯＸ１は、オオムギＬＯＸ３と５６．９％の配列同一性および６７．８％の配列類似性を有する。ダイズＬＯＸ３イソ酵素におけるいくつかのアミノ酸残基は、非ヘム鉄に対するリガンドとして同定されたか、またはその活性に必須であることが示唆される（＊●によって示される）。オオムギＬＯＸ１とダイズＬＯＸ３との間の高い配列保存を考慮すると、ＬＯＸ３の機能に重要であると確認された残基と相同性であるオオムギＬＯＸ１配列中の残基もまた酵素活性に必須であると予測することが妥当である。したがって、基質キャビティーの内側および酵素活性に必須の他の位置にあるダイズＬＯＸ３の３５個の高く保存された残基に対応するオオムギＬＯＸ１中の残基の置換を包含するこれらの位置のいずれかでの非保存的アミノ酸置換が、リポキシゲナーゼ活性を減少させるようである。
【００４９】
アミノ酸残基プロリンおよびグリシンは、それらが２次構造エレメント間に配置される場合、ペプチド骨格におけるターンを容易にすることが知られており、それが、蛋白質に折りたたまれた３次構造の形態をとらせる。プロリンおよびグリシン残基は、また、ヘリックスキャッピングモチーフにおいて共通である（ParkerおよびHefford, 1997, Protein Eng., 10: 487-496, http://www.cxpasy.ch）。２つの予測される構造エレメント間に配置されるグリシンがアスパラギン酸塩に置換されたＬｉｎｅ Ｇ ＬＯＸ１における単一の非保存的置換は、酵素活性の有意な喪失を導いた。したがって、オオムギＬＯＸ１における１以上のプロリンまたはグリシン残基にて非保存的アミノ酸置換を引き起こす、構造エレメントの外側の領域に配置されるＬＯＸ−１遺伝子における変異は、同様に、天然蛋白質の折りたたみを妨げ、その結果として、コードされる酵素の活性を減少しうる。
【００５０】
かくして、１の具体例において、減少したリポキシゲナーゼ１活性を有する本発明の有用な変異型オオムギ植物は、１以上の酸性、塩基性、または極性アミノ酸の挿入によって酵素の基質キャビティーの中性または疎水性を改変する変異した核酸配列を含有する。例えば、有用な核酸配列（配列番号１１）は、アミノ酸３６８にてグリシンからＸａａ（ここに、Ｘａａは酸性、塩基性、または極性アミノ酸である）への置換を有するオオムギＬＯＸ−１蛋白質（配列番号１２）をコードする。本発明のオオムギ変異型ＬＯＸ−１の１の特定のアミノ酸配列は、Ｘａａがアスパラギン酸であるもの、例えば、Ｌｉｎｅ Ｇである。
【００５１】
下記の実施例において示されるように、Ｌｉｎｅ Ｇにおける遺伝子型変化は、ｌｏｘ−１遺伝子発現に対して検出可能な影響を有さなかったが、Ｌｉｎｅ Ｇの成熟および発芽中の穀粒において検出されたＬＯＸ−１活性は、親系統ｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅの穀粒において検出された活性の約９％であった。Ｌｉｎｅ ＧのＬＯＸ−１におけるアミノ酸変異が低ＬＯＸ−１表現型の原因であったという直接的な証拠を提供するために、Ｌｉｎｅ Ｇ ｌｏｘ−１およびｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅ ｌｏｘ−１のコーディング配列をオオムギ糊粉由来のプロトプラストにおいて一時的に発現させ、変異型ＬＯＸ−１酵素の活性が野生型ＬＯＸ−１酵素と比較して強く減少されることを示した。
【００５２】
６．育種系統間の移行
本発明遺伝子型のオオムギ植物の遺伝学的特徴における改変の検出は、オオムギ系統における特定の遺伝学的特徴の存在を同定するために、および育種計画における育種系統間の該特徴の移行を容易にするために有用である。種々の分子学的手段がゲノム配列における改変の検出に利用可能である。かかる方法は、限定するものではないが、制限酵素フラグメント長多型（restriction fragment lenght polymorphisnms）の検出（GebhardtおよびSalamini 1992, Int. Rev. Cytology., 135: 201-237）および定量的ＰＣＲに基づく検出方法、例えば、蛍光プライマーを用いる増幅、例えば、ＴａｑＭａｎプライマープローブシステム（Ibrahamら、1998, Anal. Chem. 70, 2013-2017）を包含する。検出方法の選択は、特定の遺伝学的特徴に依存するが、好ましくは、迅速であって、明確に解釈可能なデータを提供するものである。
【００５３】
下記の実施例において示されるように、ＰＣＲ−切断増幅多型部位アッセイ（PCR-Cleavage Amplified Polymorphic Site assay）（ＰＣＲ−ＣＡＰＳ）が、Ｌｉｎｅ Ｇの変異型リポキシゲナーゼ−１遺伝子の検出のために提供された。Ｌｉｎｅ Ｇ中のｌｏｘ−１遺伝子における位置＋２３４７でのヌクレオチド置換は、ＰＣＲ−ＣＡＰＳアッセイによって検出可能なＡａｔＩＩ制限エンドヌクレアーゼによる付加的な認識部位を導入した。ｌｏｘ−１に適当な検出方法は、該アッセイに限定されるものではなく、同様に、ＴａｑＭａｎ技術および他の既知の検出方法に基づくことができる。
【００５４】
下記の実施例において示されるように、ＰＣＲ−ＣＡＰＳアッセイを、Ｌｉｎｅ Ｇにおける低リポキシゲナーゼ表現型を計画的にｃｖ Ａｌｅｘｉｓに戻し交配した戻し交配計画由来の育種材料の４世代に適用した。低リポキシゲナーゼ表現型の遺伝は、ｌｏｘ−１遺伝子の遺伝に追随することが示され、該表現型は、劣性形質として同定され、ｌｏｘ−１遺伝子に関してホモ接合体の系統においてのみ見られた。
【００５５】
したがって、本発明の植物子孫は、例えば、戻し交配計画において誘導された、変異型ｌｏｘ−１を含有し、低リポキシゲナーゼ表現型を発現する育種系統を包含する。
【００５６】
７．醸造
植物部分、植物子孫、穀粒、ならびに麦芽および麦汁などの植物生産物を包含する低リポキシゲナーゼ１活性を有する本発明のオオムギ植物は、本明細書において、測定期間にわたり、または高い保存温度条件下にて、野生型対照オオムギ品種から生産された飲料と比べて減少したレベルの遊離トランス−２−ノネナールを有する飲料の製造に有用であることが明らかにされる。これらを比較する目的で、瓶詰め時のより高い亜硫酸塩レベルが遊離トランス−２−ノネナールの出現を一時的に遅らせることが認められるので、ビールの亜硫酸塩含量を５ｐｐｍ以下に調節する。例えば、本明細書に記載される変異型オオムギＬｉｎｅ Ｇ由来の麦芽から醸造されたビールは、測定期間にわたって、対照の非変異型オオムギ由来の麦芽から醸造されたビールと比べて安定した官能特性を有した。
【００５７】
醸造試験および瓶詰めしたビールの評価は、完成したビールの質および安定性に対する種々の原料の影響を評価するための最もよい方法を提供する。種々のオオムギ麦芽の影響を試験するためには、試験的規模および半工業的規模での麦芽製造および醸造試験を行うのに十分なオオムギ穀粒が必要とされる。オオムギ増殖期間の間、該オオムギ系統の畑での成果を評価することができる。オオムギ系統の麦芽製造特性を試験的または工業的規模での麦芽製造の間に評価することができ、好ましくは、国の麦芽製造品質についての推奨、例えば、麦芽製造品質に関するヨーロピアン・ブリューイング・コンベンション（the European Brewing Convention）の推奨（Analytica-EBC/European Brewing Convention, 1998, Publ. Hans Carl Getraenke-Fachverlag, Nuernberg, Germany）内にあるべきである。試験的または半工業的規模での醸造後、ビールを茶色の瓶にパッケージし、最適な保存のために５℃に冷却する。この段階で、不快臭化合物トランス−２−ノネナールを包含する特定のビール風味を検出できる訓練を受けた試飲パネルによって、新鮮なビールを分析することができる。さらに、トランス−２−ノネナールを包含する主要な臭い成分について化学的にビールを分析する。次いで、これらのビール品質分析法を、ビールの長期保存安定性を明らかにすることが知られている種々の保存条件、例えば、強制老化処理後に繰り返す。
【００５８】
下記の実施例において示されるように、Ｌｉｎｅ Ｇオオムギを数シーズンにわたり畑で増殖させて、１０トンの該系を工業的麦芽製造所において麦芽製造に付した。どちらも野生型ＬＯＸ−１表現型を有する対照オオムギ品種ｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅおよびｃｖ Ｎｅｖａｄａを同様の条件下で麦芽製造に付した。Ｌｉｎｅ Ｇおよび対照オオムギ栽培変種由来のキルン乾燥麦芽は、半工業的醸造試験に必要な規格内におかれた。
【００５９】
醸造試験は、３０−ｈｌ規模で行われ、新たに瓶詰めされたビールの評価は、Ｌｉｎｅ Ｇおよび対照栽培変種の両方の麦芽から醸造されたビールが味覚域値を下回るトランス−２−ノネナール含量を有し、試飲パネルによって満足であると考えられたことを示した。２つの強制老化処理、３７℃で７日間保存または３０℃で６ないし１２週間保存のいずれかが、ビールの風味安定性を評価するために用いられた。Ｌｉｎｅ Ｇ麦芽から醸造されたビールの風味安定性は、試飲パネル評価ならびに遊離トランス−２−ノネナールのレベルの両方について対照麦芽のものより優っていることがわかり、その改善は十分に有意であることがわかった。
【実施例】
【００６０】
本発明はさらに下記の実施例において定義付けられる。実施例は、好ましい具体例を示すが、例示するのみであることが理解されるべきである。
【００６１】
実施例１
突然変異誘発されたオオムギ由来のリポキシゲナーゼイソ酵素変異体のスクリーニングおよび選択
１．オオムギ突然変異誘発
オオムギ、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ ｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅおよびｃｖ Ｃａｒｕｓｏの穀粒に、公開された手法（Kleinhoftsら、1978, Mutation Research 51: 29-35）にしたがってアジ化ナトリウムを用いて突然変異誘発した。該突然変異誘発は、例えば、コード化蛋白質においてアミノ酸変化をもたらしうるゲノムＤＮＡにおける点突然変異を導入する。変異型Ｍ１穀粒を２世代まで温室内で増殖させ、３Ｍ穀粒をスクリーニングのために収集した。Kleinhoftsら、1978, 上掲によると、Ｍ２世代における単一遺伝子特性変異体の観察された頻度は、Ｍ２世代由来の１０，０００個の穀粒あたり１．０−２．７変異体である。ほとんどの遺伝子変異は劣性であって、ホモ接合体状態においてのみ検出可能であるので、予測されるホモ接合体変異型穀粒の割合がより高いであろうＭ３世代にて、突然変異誘発した集団をスクリーンした。１０，０００個の穀粒あたり０．９−２．３個の変異頻度が、Ｍ３にて突然変異した材料において予測された。
【００６２】
２．Ｍ３突然変異誘発穀粒におけるリポキシゲナーゼ１（ＬＯＸ−１）およびリポキシゲナーゼ−２（ＬＯＸ−２）活性の非破壊的アッセイ
減少したＬＯＸ−１活性を有する変異体オオムギ穀粒の検出のための迅速スクリーニング法は、下記の基準を用いて開発された。該スクリーニング法は、穀粒／実生の増殖を妨げないものであり；選択された穀粒／実生組織は定量可能なレベルのリポキシゲナーゼ活性を発現するものであり；該アッセイはＬＯＸ−１活性とＬＯＸ−２活性とを区別するものであり；該アッセイ法は複数の試料を含むものである。
【００６３】
発芽穀粒の種々の組織、すなわち、シュート、根、ならびに胚の胚盤組織および内胚乳における全リポキシゲナーゼ活性のレベルを下記のようにアッセイした。オオムギ実生組織の抽出物は、２ｍＭ ＮａＮ３および０．５ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含有する氷冷した２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で組織をホモジナイズし、次いで、１０００ｇにて１０分間の遠心分離によって不溶性材料を除去することによって調製された。１００μｌ抽出物中のリポキシゲナーゼ活性は、２５℃にて、３５μｌリノール酸（遊離酸、Ｌ−１３７６、Sigma, USA）を１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する５ｍｌのＨ２Ｏ中に分散させることによって調製された２０ｍＭリノール酸基質２．９ｍｌを加えることによってアッセイした。反応物を次いで分光光度測定し、ここに、ヒドロペルオキシド産物中の共役型ジエンの生成に起因する２３４ｎｍの吸光度（Ａ２３４ｎｍ）における増加率が酵素活性の存在に比例する。リポキシゲナーゼ活性の１単位を、０．１２マイクロモルのリノール酸の酸化と同等の３−ｍｌ反応中１分あたりのΔＡ２３４＝０．００１として定義付ける。
【００６４】
暗所において４日間発芽させた穀粒の葉組織は、最も高い検出レベルのリポキシゲナーゼ活性を有した（Holtmanら、1996, Plant Physiology 111: 569-576）。したがって、４日目の実生由来の葉チップを非破壊的リポキシゲナーゼスクリーニングアッセイのために選択した。全オオムギリポキシゲナーゼ活性の最適ｐＨは、ｐＨ４．５〜ｐＨ９．０で試験され、ｐＨ６．５であることがわかった。したがって、０．２Ｍホウ酸を含有する２５ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ６．５）をスクリーニングアッセイのために選択した。
【００６５】
ＬＯＸ−１およびＬＯＸ−２酵素の両方が４日目の実生のシュートにおいて免疫検出されたので（Holtmanら、1996, 上掲）、ＬＯＸ−１およびＬＯＸ−２特異的アッセイを用いた。Eskinら、1977, Crit. Rev. Food, Science and Nutrition 9: 1-40によって同定されたリポキシゲナーゼ阻害剤ノルジヒドログアイアレチン酸（ＮＤＧＡ）は、オオムギリポキシゲナーゼの選択的阻害剤であることが見出された。１ｘ１０−５ＭのＮＤＧＡは精製オオムギＬＯＸ−２を強く阻害したが、ＬＯＸ−１は４７％活性を維持した（図１）。該阻害剤の選択性は、葉チップアッセイにおいて、９−ヒドロペルオキシオクタデカノイド（９−ＨＰＯＤ）の１３−ヒドロペルオキシオクタデカノイド（１３−ＨＰＯＤ）（各々、ＬＯＸ−１およびＬＯＸ−２によるリノール酸酸化に起因する）に対する比率を決定することによって試験された。ｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅ葉チップのリポキシゲナーゼアッセイにおいて、生成された１３−ＨＰＯＤの割合は、１−１０−５Ｍ ＮＤＧＡの添加において２４．５％から９．５％に落ちた。
【００６６】
葉チップ抽出物におけるＬＯＸ−２活性の選択的アッセイは、ＬＯＸ−１特異的モノクローナル抗体（５Ｄ２）（Holtmanら、1996, 上掲）を使用して、抽出物中に存在するＬＯＸ−１を免疫沈降させることを基礎とした。ＬＯＸ−１沈殿後の抽出物中で検出された残留リポキシゲナーゼ活性は、ＬＯＸ−２活性の測定を提供した。該免疫沈降の効率（下記される）は、ＬＯＸ−１（５Ｄ２と示す）およびＬＯＸ−２（５．８と示す）に対する特異的モノクローナル抗体（Holtmanら、1996, 上掲）を用いて、抽出物上清中の残留ＬＯＸ−１およびＬＯＸ−２をＥＬＩＳＡアッセイによって定量することによって評価した。ｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅ葉チップ抽出物由来のＬＯＸ−１免疫沈降は、８５％の（ＬＯＸ−１）蛋白質および１５％のＬＯＸ−２蛋白質を除去した。
【００６７】
免疫沈降は、Ｖ底９６ウェルプレート中、５μｌ ５Ｄ２−被覆ダイナビーズ（Dynabeads (Dynal)）および７５μｌバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１％ｖ／ｖ仔ウシ血清（HyClone））を２０μｌの各葉チップ抽出物に加えることによって行った。プレートをタイタープレート振盪器（ＭＴＳ４，IKA, Labor Technik)上４℃で１時間インキュベートした。免疫沈降物は、Ｓｉｇｍａ３０２−Ｋ遠心機中４℃にて、２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によってペレット化した。各試料由来の上清（７０μｌ）を、平底９６ウェルプレート中、１００μｌアセッイバッファー（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．２Ｍホウ酸、ｐＨ６．５）の添加以外は下記のように、リポキシゲナーゼ活性についてアッセイした。
【００６８】
ＬＯＸ−１およびＬＯＸ−２アッセイは、ハイスループットスクリーニング法に適応させた。８個の４日間発芽させた穀粒由来の葉チップ（１ｃｍ）を個々に、マルチウェルホモジナイザー中、１５０μｌ氷冷バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）中で２ｘ３０秒間ホモジナイズした（Bergら、1992, Electrophoresis 13: 76-81）。３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離後、各抽出物の上清４０μｌを平底９６ウェルプレートに移した。各ウェルに、１７０μｌバッファー（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，０．２Ｍホウ酸ｐＨ６．５、１−１０−５Ｍ ＮＤＧＡ）および１０μｌ基質（２０ｍＭ リノール酸）を加え、次いで、２５℃で２０分間インキュベートした。２０μｌ飽和ヨウ化カリウム溶液（ＫＩ）の添加によって反応を止め、２５℃でさらに８分間インキュベートした。ヒドロペルオキシジエンとＫＩとの間の酸化還元反応がＩ２を生じ、それをミクロプレートリーダー（Multiskan MCC/340）中、３５０ｎｍでのその吸光度最大値によってモニターした。
【００６９】
３．突然変異誘発されたオオムギのＭ３およびＭ４穀粒における可能性のあるリポキシゲナーゼ１変異体の同定
ｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅおよびｃｖ ＣａｒｕｓｏのＭ３世代の穀粒を４５℃で６．５日間保管して休眠状態を破り、９５％発芽頻度を確保した。ｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅ（９３１８）およびｃｖ Ｃａｒｕｓｏ（９６３３）のＭ３穀粒を発芽させ、そのＬＯＸ−１活性が野生型穀粒の１５％未満である系統についてスクリーンした。推定変異型系統（５０個のｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅおよび４２個のｃｖ Ｃａｒｕｓｏ系統）をＭ４世代まで増殖させ、収穫し、発芽させた穀粒を再スクリーンした。各系統由来の５個の葉チップ抽出物におけるリポキシゲナーゼ活性を測定後、変異型ＬＯＸ−１表現型が１つのｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅおよび６個のｃｖ Ｃａｒｕｓｏ系統において確認された。これら７個の推定変異体の発芽している胚におけるＬＯＸ−１およびＬＯＸ−２活性を試験したとき、ｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅ変異体（Ｌｉｎｅ Ｇとする）のみがＬＯＸ−１における大きな減少を示した。成熟休止穀粒において、胚に存在するリポキシゲナーゼ活性は、２つのイソ酵素の差別的な発現パターンのため、ほとんど排他的にＬＯＸ−１活性である（Schmittおよびvan Mechelen, 1997, Plant Sci. 128: 141-150）。Ｌｉｎｅ Ｇ成熟乾燥穀粒（Ｍ５世代）由来の胚抽出物における全リポキシゲナーゼ活性は、実施例１のセクション２において記載された分光光度計リポキシゲナーゼアッセイによって測定した場合、ｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅ胚抽出物における０．７４±０．４４Ｕ／ｍｇ蛋白質に対し、０．０６±０．０４Ｕ／ｍｇ蛋白質であった。Ｍ４およびＭ５世代の両方においてＬｉｎｅ Ｇの成熟胚における残留リポキシゲナーゼ活性は、親系統の約９％であることが見出された。
【００７０】
実施例２
Ｌｉｎｅ Ｇは、低リポキシゲナーゼ表現型を有するｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅ変異体である。
Ｌｉｎｅ Ｇの栽培学的特性および変異表現型をＭ５世代の材料において分析した。最初の分析は、分析されたＭ５材料が変異表現型についてホモ接合体であることを確認するために行われた。Ｍ３世代において検出されたＬｉｎｅ Ｇにおける低ＬＯＸ−１表現型は、優性または劣性変異に起因する可能性があった。もしＭ３世代で選択されたＬｉｎｅ Ｇが優性変異についてヘテロ接合体であったならば、その後の世代は該表現型の分離を示すであろう。Ｍ５世代の休止穀粒由来の２６個の個々のＬｉｎｅ Ｇ胚におけるリポキシゲナーゼ活性を測定し、ｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅ野生型胚と比較した。全てのＬｉｎｅ Ｇ胚におけるリポキシゲナーゼ活性は、野生型ｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅ胚における１ｍｇ蛋白質あたり０．７４±０．４４Ｕリポキシゲナーゼと比べて非常に低く、１ｍｇ蛋白質あたり平均０．０６±０．０４Ｕリポキシゲナーゼであった。これらのデータにより、Ｍ５世代におけるＬｉｎｅ Ｇが低リポキシゲナーゼ性質についてホモ接合体であることを確認した。
【００７１】
１．Ｌｉｎｅ Ｇは野生型植物生長生理機能および穀粒発達を有する。
Ｌｉｎｅ Ｇおよびｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅ穀粒を発芽させ、相対湿度８０％にて１５℃で１６時間明所および１２℃で８時間暗所条件下、気候調節チャンバー中で生育させた。Ｌｉｎｅ Ｇおよびｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅ植物の生長特徴は、植物丈、植物当たりの分げつ枝の数、開花の開始および禾穂あたりの穀粒の数に関して類似した。開花後日数（ＤＡＦ）５日目から完全成熟までの発育の間、約９０ＤＡＦの間に、Ｌｉｎｅ Ｇおよび野生型ｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅの穀粒の生重量（図２）および乾燥重量（図３）は、非常に類似した。
【００７２】
２．Ｌｉｎｅ Ｇ穀粒は、発育中ずっと低リポキシゲナーゼ１表現型を有する。
リポキシゲナーゼ活性は、Ｌｉｎｅ Ｇ（Ｍ５世代）および野生型ｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅの発育中のオオムギ穀粒の抽出物中で測定された。０．１％（ｖ／ｖ）ノニデット（Nonidet）Ｐ−４０（リポキシゲナーゼ抽出を強化する非イオン性界面活性剤）を含有する氷冷した２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーｐＨ７．５中で穀粒をホモジナイズし、１５，０００ｇで２０分間遠心分離して不溶性材料を除去した。抽出物中のリポキシゲナーゼ活性を、酸素消費を測定するためのクラーク型電極を用いて、１．２ｍＭリノール酸を含有する酸素飽和バッファー（０．２Ｍ ホウ酸、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．５）２００μｌ中２５℃で、ポーラログラフィーによって測定した。リポキシゲナーゼ活性は、穀粒発育の最初の２０日間、Ｌｉｎｅ Ｇおよび野生型穀粒の両方で増加したが、Ｌｉｎｅ Ｇにおいてのみ、穀粒成熟化の間に活性レベルが落ちた（図４）。
【００７３】
リノール酸酸化の間に生成された９−ＨＰＯＤおよび１３−ＨＰＯＤの相対量は、穀粒抽出物中のＬＯＸ−１およびＬＯＸ−２活性レベルの測定を提供する。この場合、ヒドロペルオキシド消費酵素の共抽出を避けるために、ノニデットＰ−４０が穀粒抽出バッファーから割愛した。１０ｍｌの２００μＭリノール酸を含有する５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ６．５と混合した抽出物（１００μｌ）を２０分間インキュベートした。ｐＨを３．５に調整することによって反応を止め、内部標準を加えた。該アッセイにおいて生成されたヒドロペルオキシドをオクタデシル固相カラム（Bakerbond, Baker)上に結合させ、メタノールで抽出した。次いで、Aarleら、1999, FEBS Letters 280: 159-162に記載のように、９−ＨＰＯＤおよび１３−ＨＰＯＤをＣ−１８カラム上の逆相ＨＰＬＣにより、無勾配溶出溶媒（濃アンモニアを用いてｐＨ５．５に調整したテトラヒドロフラン：メタノールＨ２Ｏ：酢酸；２５：３０：４４．９：０．１（ｖ／ｖ））を用いて、流速０．５ｍｌ／分にて分離した。ヒドロペルオキシドは２３４ｎｍにて検出され、ＨＰＯＤピークは内部標準、プロスタグランジンＢ２に対して補正された。
【００７４】
図５は、１３−ＨＰＯＤが最初の２０ＤＡＦの間に穀粒に存在するリポキシゲナーゼ活性の主生産物であり、一方、９−ＨＰＯＤは穀粒成熟化の間に活性なリポキシゲナーゼによって生成されたことを示す。Ｌｉｎｅ Ｇおよび野生型穀粒抽出物はどちらも、１３−ＨＰＯＤ合成活性の同様なプロファイルを有したが、Ｌｉｎｅ Ｇは９−ＨＰＯＤ合成活性における野生型増加を示さなかった。これらのデータは、Ｌｉｎｅ Ｇオオムギ穀粒の成熟化におけるＬＯＸ−１活性の喪失と一致する。
【００７５】
３．Ｌｉｎｅ Ｇ穀粒は、発芽において低リポキシゲナーゼ１表現型を有する。
１５℃で発芽させた穀粒の胚の抽出物における全リポキシゲナーゼ活性を実施例１に記載のようにアッセイした。休止野生型穀粒に存在するリポキシゲナーゼ活性は、発芽の最初の４日間に低下し、次いで、増加した（図６）。Ｌｉｎｅ Ｇにおいて、休止穀粒におけるリポキシゲナーゼ活性は非常に低いが、４日後に増加した。
【００７６】
発芽中の胚におけるリポキシゲナーゼ活性によって生成されたＨＰＯＤの分析は、９−ＨＰＯＤが休止野生型穀粒に存在するリポキシゲナーゼの主生産物であったことを示した（図７）。９−ＨＰＯＤ生成レベルは抽出物中のリポキシゲナーゼ活性の低下と共に落ちた。４日後のリポキシゲナーゼ活性の増加は、９−ＨＰＯＤおよび１３−ＨＰＯＤの両方の生成を伴った。Ｌｉｎｅ Ｇ休止穀粒における低リポキシゲナーゼ活性は、ＨＰＯＤ生成の不在と関連したが、４日後の活性の増加は主に１３−ＨＰＯＤを生産した。これらのデータは、９−ＨＰＯＤの生成を導くＬＯＸ−１活性がＬｉｎｅ Ｇの発育、休止および発芽中のオオムギ穀粒のいずれの胚においても大いに減少し、一方、１３−ＨＰＯＤの生成を導くＬＯＸ−２活性はＬｉｎｅ Ｇにおいて変化しないという証拠を提供する。
【００７７】
実施例３
Ｌｉｎｅ Ｇは、低リポキシゲナーゼ表現型を引き起こす変異型リポキシゲナーゼ１遺伝子（ｌｏｘ−１）を有する。
変異体の完全な記載を提供するために、Ｌｉｎｅ Ｇの低ＬＯＸ−１表現型の分子学的基礎が研究された。該表現型の完全な特徴付けを提供するために、下記の分析が行われた。
【００７８】
１．リポキシゲナーゼ−１は、Ｌｉｎｅ Ｇの発育中および発芽中の穀粒において合成される。
発育中および発芽中のオオムギ穀粒由来の胚抽出物のウェスタンブロット分析を、実施例２に記載のように、リポキシゲナーゼ活性の測定と同時に行った。粗抽出物は、Laemmli, 1970, Nature 227: 680-685にしたがって、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離した。分離された蛋白質を、Towbinら、(1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354にしたがって、セミドライ・ブロッティングによってニトロセルロースに移した。ブロットを、Holtmanら、1996, Plant Physiology 111: 569-576に記載のように、５００ｘ希釈のＬＯＸ−１特異的モノクローナル抗体５Ｄ２でプローブし、次いで、アルカリホスファターゼに結合したヤギ抗−マウス抗体と一緒にインキュベートし、Holtmanら、1996, Plant Physiology 111: 569-576に記載のように、アルカリホスファターゼ基質ニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェートを用いて検出した。ウェスタンブロット分析は、ＬＯＸ−１蛋白質がｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅ胚において１０ＤＡＦ由来の発育中の穀粒において検出され、そのレベルは穀粒成熟化の間に増加したことを示した（図８）。該蛋白質はまた、ｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅ休止穀粒の胚にも存在したが、発芽中にゆっくりと減少した（図９）。ＬＯＸ−１はＬｉｎｅ Ｇ胚抽出物中に認められ、ｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅ ＬＯＸ−１と同様の大きさの蛋白質としてＳＤＳ−ＰＡＧＥ中を移動するが、Ｌｉｎｅ Ｇ中の該蛋白質の免疫検出可能なレベルは、ｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅ中よりもわずかに低かった。
【００７９】
２．ｌｏｘ−１遺伝子はＬｉｎｅ Ｇの発育中および発芽中の穀粒において発現される。
実施例２に記載のリポキシゲナーゼ活性の測定と同時に、Hensgensおよびvan Os-Ruygrok, 1989, Rice Genet. Newslett. 6: 163-168の手法にしたがって、発育中および発芽中のオオムギ穀粒の胚から全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡ試料（７．５μｇ）を変性アガロースゲル上で分離し、Sambrookら、1989, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NYに記載のようにノーザンブロットした。該ブロットを、アマシャム・ランダム・プライム・キット（Amersham Random Prime Kit）を用いて、Holtmanら、1996 Plant Physiol. 111: 569-576に記載のように、ｌｏｘ１ｃＤＮＡ（ＥＭＢＬ受託番号Ｌ３５９３１）のオオムギ３’非翻訳領域、ヌクレオチド２６５９−２８０１（配列番号１）から作成した３２Ｐ−標識化プローブとハイブリダイズさせた。
【００８０】
ＬＯＸ−１をコードしているｌｏｘ−１転写産物は、３０ＤＡＦ由来の発育中および成熟したｃｖ ＶｉｎｔａｇｅおよびＬｉｎｅ Ｇ穀粒の胚において検出された（図１０）。ｌｏｘ−１転写産物のレベルは、ｃｖ ＶｉｎｔａｇｅおよびＬｉｎｅ Ｇ胚の両方において発芽中に増加し、ｌｏｘ−１遺伝子の新たな発現を示した（図１１）。ｌｏｘ−１転写産物の検出可能なレベルは、Ｌｉｎｅ Ｇおよびｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅ胚において類似していたので、減少したｌｏｘ−１転写も転写産物安定性も、Ｌｉｎｅ Ｇの低リポキシゲナーゼ表現型を説明することはできない。
【００８１】
３．Ｌｉｎｅ Ｇのｌｏｘ−１遺伝子はリポキシゲナーゼ−１の変異形態をコードする。
穀粒中の発現されたリポキシゲナーゼ酵素の減少した蓄積および活性を除いて、ｌｏｘ−１遺伝子の正常な転写によって特徴付けられるＬｉｎｅ Ｇの低ＬＯＸ−１表現型に関する分子学的基礎を決定するために、Ｌｉｎｅ Ｇおよびｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅのｌｏｘ−１遺伝子のヌクレオチド配列を分析し、比較した。
【００８２】
Ｌｉｎｅ Ｇおよび野生型ｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅ由来のゲノムＤＮＡを、PichおよびSchubert 1993, Nucleic Acids Res. 21: 3328に記載の方法にしたがって、実生葉組織から単離した。ゲノムＤＮＡ調製物中のｌｏｘ−１遺伝子を、オオムギｌｏｘ−１遺伝子の配列（van Mechelenら、1995, BBA 1254: 221-225; Rousterら、1997, Plant J. 11: 513-523）に基づくプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。図１２に示されるｌｏｘ−１プロモーターおよびコーディング領域を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマーの位置および配列は下記のとおりであった。
【００８３】
順方向プライマー５’−ＧＡＡ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＧＡ ＧＧＴ ＡＧＡ ＣＧＣ ＴＧＣ−３’（配列番号２）および逆方向プライマー５’−ＴＡＴ ＡＧＧ ＡＴＣ ＣＴＴ ＧＴＴ ＣＴＴ ＧＧＣ ＣＴＣ ＣＴＣ ＴＣＣ ＴＣＧ−３’（配列番号３）を用いて、Ｌｉｎｅ Ｇおよびｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅ ｌｏｘ−１のｌｏｘ−１プロモータードメイン（−３６１〜＋６８）をＰＣＲ増幅した。
【００８４】
順方向プライマー５’−ＡＧＴ ＧＡＡ ＡＡＡ ＣＡＧ ＴＧＴ ＧＣＴ ＧＧＴ Ｇ−３’（配列番号４）および逆方向プライマー５’−ＧＧＣ ＴＴＡ ＡＡＧ ＡＧＣ ＡＡＣ ＴＧＣ ＴＧＡ−３’（配列番号５）を用いて、Ｌｉｎｅ Ｇ ｌｏｘ−１コーディング領域をＰＣＲ増幅した。
【００８５】
順方向プライマー５’−ＣＡＡ ＧＡＴ ＧＣＡ ＴＡＴ ＧＣＴ ＧＣＴ ＧＧＧ ＡＧ−３’（配列番号６）および逆方向プライマー５’−ＣＧＡ ＴＧＧ ＴＴＴ ＡＡＡ ＴＴＡ ＧＡＴ ＧＧＡ ＧＡＴ ＧＣＴ ＧＴ−３’（配列番号７）は、ｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅ ｌｏｘ−１コーディング領域をＰＣＲ増幅した。
【００８６】
ＰＣＲ反応は、酵素供給元の指示に従って、５０ｐｍｏｌプライマーおよび２Ｕ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Promega）を含有する５０μｌ容量における２５０ｎｇのゲノムＤＮＡより構成された。ＰＣＲ増幅は、ストラタジーン・ロボサイクラー（Stratagene Robocycler）：９４℃１分を１サイクル；９４℃１分、６２℃２分および７２℃５分を３０サイクル；７２℃１０分を１サイクルにおいて行った。ＰＣＲ産物は、１．２％アガロースゲル上で分離した。増幅領域に対応する長さのＤＮＡフラグメントを、Ｑｉａｘ ＩＩゲル抽出キット（Qiagen）を用いて精製し、プラスミドｐｃＤＮＡ２．１（Invitrogen）中にクローン化した。特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いるジデオキシヌクレオチド鎖ターミネーション反応を用いて、クローン化したｌｏｘ−１プロモーターおよびコーディング領域の両ストランドのヌクレオチド配列を決定し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＲ（登録商標）３１０遺伝子分析器（PE Biosystems）上で分析した。ＤＮＡ ＳＴＡＲ配列分析ソフトウェアパッケージ（DNA STAR Inc., USA）を用いて、配列比較を行った。
【００８７】
オオムギｌｏｘ−１コーディング領域のプロモーター領域およびイントロン−エキソン構造を図１３に示すが、これは、野生型ｌｏｘ−１ゲノムおよびｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列（図１２）の比較から推定された。−３６３〜＋６８（決定された転写開始部位に相対的に番号が付けられた；van Mechelenら、1995, BBA 1254: 221-225）のｌｏｘ−１プロモーター領域の配列決定領域は、天然遺伝子の胚特異的で時間的に調節される遺伝子発現特徴を指示するのに十分である（Rousterら、1998, Plant J 15: 345-440）。野生型ｌｏｘ−１遺伝子のプロモーターおよび転写領域（配列番号８）は４６６３ｎｔ長であり、各ｃＤＮＡ（配列番号１０）から欠けていて、それ故、ＲＮＡ転写スプライシングの間に除去されるに違いない８２ｎｔ〜６３４ｎｔ長の６個のイントロンを含有する。
【００８８】
Ｌｉｎｅ Ｇと野生型とのｌｏｘ−１のヌクレオチド配列の比較（図１２）は、Ｌｉｎｅ Ｇ ｌｏｘ−１対立遺伝子が２つの点突然変異を有することを示した。１つは、エキソン１中の位置２２１でのサイレントＣ→Ｔ置換であり、２つ目は、エキソン３中の位置２３４７でのＧ→Ａ置換である（図１３）。野生型オオムギｌｏｘ−１遺伝子は、８６２個のアミノ酸残基の蛋白質をコードし（配列番号９）、一方、Ｌｉｎｅ Ｇ ｌｏｘ−１対立遺伝子における位置２３４７での突然変異は、コード化蛋白質中の残基３６８にてグリシンからアスパラギン酸へのアミノ酸置換を引き起こす。
【００８９】
関連する植物リポキシゲナーゼのアラインメントは、オオムギＬＯＸ−１中のグリシン−３６８が強く保存されることを示した。さらに、ダイズＬＯＸ−１中のグリシン−３５３に対応する該残基は、その結晶構造からわかるように、該酵素の基質キャビティーの内側にある５１個の中性または疎水性残基のうちの１つであり（Minorら、1996, Biochemistry 35: 10687-10701）、図２２に示される。かくして、該位置での荷電アミノ酸残基の挿入が、該酵素の構造的および機能的特性を妨害するようである。
【００９０】
４．Ｌｉｎｅ Ｇ ｌｏｘ−１対立遺伝子によってコードされる変異型ＬＯＸ−１蛋白質は、低酵素活性を有し、Ｌｉｎｅ Ｇの低リポキシゲナーゼ表現型の原因である。
Ｌｉｎｅ Ｇにおいて変異型ｌｏｘ−１対立遺伝子を誘導したｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅ穀粒のアジ化ナトリウム突然変異誘発は、Ｌｉｎｅ Ｇゲノムにおいて付加的な変異を誘導したかもしれない。ゲノム中の他の変異ではなく、Ｌｉｎｅ Ｇにおける変異型ｌｏｘ−１対立遺伝子がその低リポキシゲナーゼ表現型の原因であることを明らかにするために、２つの実験的アプローチが行われた。変異型酵素におけるグリシン→アスパラギン酸置換が減少した安定性および活性を引き起こすことを証明するために、変異型および野生型ｌｏｘ−１対立遺伝子によってコードされるＬＯＸ−１の酵素活性が測定された。浸漬させた成熟穀粒から単離した糊粉プロトプラストにおける内在性リポキシゲナーゼ発現レベルは検出限界よりも低いと予測されたので、これらの細胞において２つのｌｏｘ−１遺伝子を一時的に発現させた。発芽オオムギにおいて発現される同定されたオオムギリポキシゲナーゼ遺伝子のうち、糊粉組織において検出されるものは無い（van Mechelenら、1999, 上掲）。糊粉プロトプラストにおけるｌｏｘ−１遺伝子の一時的発現を指示するために、それらのコーディング領域をこれらのプロトプラストにおいて活性であることが知られている構造プロモーターに翻訳的に融合させた。
【００９１】
各々、プラスミドｐｃＤＮＡ２．１（セクション３参照）においてクローン化された変異型（配列位置＋１〜＋４３５０）および野生型ｌｏｘ−１遺伝子（配列位置＋６９〜＋４２３０）のコーディング領域ならびに野生型ｌｏｘ−１ｃＤＮＡ（配列位置＋６９〜＋２６５４）を、ベクターポリリンカー中のＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＶ部位消化によって切断した。該コーディング領域を、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードするｂａｒ遺伝子の代わりに、ｐＵＢＡＲＮプラスミド（Jensenら、1998, Hereditas 129: 215-225）中において、構成的に活性なトウモロコシユビキチンＵｂｉプロモーター（米国特許第０５５１０４７４Ａ号において記載される）とＮｏｓターミネーターとの間にクローン化した（図１４）。
【００９２】
浸漬させたＨｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ ｃｖ Ｈｉｍａｌａｙａの糊粉組織から、Skriverら、1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266-7270のプロトコールにしたがって、プロトプラストを単離した。２−１０５個のプロトプラストのアリコートを０℃にて、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介性ＤＮＡ取り込み（Leeら、1997, Plant Mol. Biol. 13: 21-29）によって〜１００μｇプラスミドＤＮＡ（等モル量の各プラスミド）でトランスフェクトし、次いで、以前（Skriverら、1991, 上掲）に記載されたように、糊粉プロトプラスト培養培地中２５℃にてインキュベートした。４８時間インキュベーション後、培養培地を注意深く取り除き、プロトプラストを再懸濁し、３００μｌリポキシゲナーゼアッセイバッファー（０．２ｍＭホウ酸、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．５）中でホモジナイズした。ホモジネートを１５，０００ｇで５分間遠心分離して不溶性材料をペレット化し、次いで、ＮＤＧＡ阻害剤を割愛する以外は実施例１のセクション１に記載の迅速スクリーニングアッセイを用いて、上清（１０μｌ）を全リポキシゲナーゼ活性についてアッセイした。プロトプラスト抽出物の蛋白質含量をBio-Rad Laboratories, Hercules, California, USAによって供給されるブラッドフォード染色結合アッセイ（Bradford 1976, Anal. Biochem., 72: 248）によって測定し、リポキシゲナーゼ活性を抽出物中の１ｍｇ蛋白質当たりで表した。
【００９３】
トウモロコシユビキチン−１プロモーターがβ−グルクロニダーゼレポーター遺伝子の発現を指示する対照プラスミドｐＵＢＩ−ＧＵＳでトランスフェクトされたプロトプラストは、検出可能なリポキシゲナーゼ活性を提供しなかった。プロトプラストにおける野生型ｌｏｘ−１遺伝子およびｃＤＮＡの一時発現はどちらも、プロトプラスト抽出物中における高レベルのリポキシゲナーゼ活性を提供した（図１５）。ゲノム配列と比べて野生型ｌｏｘ−１ｃＤＮＡのより高い発現は、より小さいｌｏｘ−１ｃＤＮＡ発現プラスミド（４９２９ｂｐ対６５０５ｂｐ ｌｏｘ−１遺伝子構築物）に関するより高いトランスフェクション頻度に起因しうる。変異型ｌｏｘ−１遺伝子の一時発現は、低レベルのリポキシゲナーゼ活性、野生型リポキシゲナーゼ活性の〜１０％を与えた。これらのデータは、明らかに、Ｌｉｎｅ Ｇにおける変異型ｌｏｘ−１遺伝子が非常に減少した活性を有するリポキシゲナーゼをコードし、それが低リポキシゲナーゼ表現型の原因であることを示す。
【００９４】
実施例４
ＰＣＲ−切断増幅多型部位（PCR-Cleavage Amplified Polymorphic Site（ＰＣＲ−ＣＡＰＳ））アッセイ：変異型ｌｏｘ−１遺伝子の同定に用いられる方法
いずれの遺伝的背景においてもＬｉｎｅ Ｇ変異型ｌｏｘ−１遺伝子の同定を可能にする分析方法がＰＣＲ−ＣＡＰＳアッセイに基づいて開発された。該アッセイは、ゲノムＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅、次いで、制限酵素フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）を展示するための特定の制限エンドヌクレアーゼを用いる増幅配列の消化を含む。
【００９５】
変異型ｌｏｘ−１遺伝子のコーディング配列は２つの点突然変異を有し（実施例３参照）、ここに、位置２３４７の変異（図１２）は、野生型ｌｏｘ−１遺伝子において見い出されない付加的なＡａｔＩＩ制限エンドヌクレアーゼ切断部位を導入する（図１６）。下記のＰＣＲ−ＣＡＰＳアッセイは、ｌｏｘ−１遺伝子における該制限部位の存在によって作成される多型に基づいて、野生型ｌｏｘ−１遺伝子と変異型ｌｏｘ−１遺伝子とを区別することが示される。
【００９６】
ゲノムＤＮＡをＨｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ、Ｌ．ｃｖ ＶｉｎｔａｇｅおよびＬｉｎｅ ＧのＭ６実生の若葉から、PichおよびSchubert（1993、上掲の手法にしたがって単離した。ｌｏｘ−１遺伝子（配列番号８）に特異的なプライマーを用いて位置２３４７（Ｌｉｎｅ Ｇ ｌｏｘ−１遺伝子変異部位）を含むＤＮＡ配列をＰＣＲによって増幅した。選択された順方向プライマー５’−ＣＧＣＴＡＣＧＡＣＧＴＣＴＡＣＡＡＣＧＡ−３’（配列番号１３）および逆方向プライマー５’−ＣＡＧＡＣＴＡＣＴＴＴＴＴＧＧＣＧＧＧＡ−３’（配列番号１４）によって増幅されたＤＮＡフラグメントを図１７に示す。ＰＣＲ反応は、各プライマー５０ｐｍｏｌおよびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Promega）１単位を含有する５０−μｌ容量における２５０ｎｇゲノムＤＮＡを用いて、提供元の指示に従って行った。ＰＣＲ増幅は、ストラタジーン・ロボサイクラーにおいて下記のように行った：９４℃１分を１サイクル；９４℃１分、６０℃１．５分および７２℃２分を３０サイクル；７２℃１０分を１サイクル。変異型および野生型ｌｏｘ−１遺伝子の増幅フラグメントは、予測された大きさ（図１７）に相当する〜６５０ｂｐであった（図１８）。スピンカラム（Qiagen）において精製されたＰＣＲ産物を２５単位のＡａｔＩＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて３７℃で２４時間消化し、１．２％アガロースゲル上で分析した。
【００９７】
野生型ｌｏｘ−１ ＰＣＲ産物の消化は、１０、１７９および４６２ｂｐのＤＮＡフラグメントを生じ、変異型ｌｏｘ−１ ＰＣＲ産物由来のフラグメントは１０、１４９、１７９および３１３ｂｐであり、ここに付加的なＤＮＡフラグメントはｌｏｘ−１ ＰＣＲ生産物の部分消化に起因した（図１９）。フラグメントパターンは、該変異に起因する予測ＲＦＬＰに対応し、ここに、３１３ｂｐフラグメントは変異型ｌｏｘ−１に独特である。該ＰＣＲ−ＣＡＰＳアッセイは、オオムギにおけるｌｏｘ−１対立遺伝子の同定のための再現可能で特異的な手段を提供するので、新規なオオムギ品種において該遺伝子を導入することを目指したオオムギ育種計画において活用することができる。
【００９８】
実施例５
Ｌｉｎｅ Ｇの低リポキシゲナーゼ表現型のｃｖ Ａｌｅｘｉｓへの戻し交配は、変異型ｌｏｘ−１遺伝子に対する遺伝的連鎖を明らかにする。
反復性戻し交配を用いて、低リポキシゲナーゼ表現型をＬｉｎｅ Ｇから反復親（この場合、ｃｖ Ａｌｅｘｉｓ）に移行させた。低リポキシゲナーゼ表現型の選択と組み合わせた図２０に示される戻し交配計画は、Ｌｉｎｅ Ｇゲノムを段々に反復親ゲノムで置換する。さらに、アジ化ナトリウム突然変異誘発処理の間にＬｉｎｅ Ｇゲノム中に導入された他の変異が排除されるであろう。ホモ接合体低リポキシゲナーゼＬｉｎｅ Ｇ（遺伝子型ｌｌと示される）のｃｖ Ａｌｅｘｉｓ（遺伝子型ＬＬと示される）に対する第１戻し交配において、子孫系統はヘテロ接合体（遺伝子型Ｌｌと示される）であろう。劣性変異による低リポキシゲナーゼ表現型は、該変異についてヘテロ接合体の系統において検出不可能であろう。該子孫を自家受粉させ、正常なメンデルの分離集団、すなわち、１ＬＬ：２Ｌｌ：１ｌｌを与える。第１戻し交配に起因する低ｌｏｘホモ接合体ｌｌ遺伝子型は、５０％ｃｖ Ａｌｅｘｉｓ遺伝的背景を有するであろう。１０回の戻し交配後、反復親背景は約９９．９％であろう。
【００９９】
Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ，Ｌ．ｃｖ ＡｌｅｘｉｓおよびＬｉｎｅ Ｇを戻し交配計画の間、温室内で増殖させた。戻し交配した子孫穀粒をペトリ皿において、４ｍｌのＨ２Ｏに浸したろ紙上で暗所中２２℃で３日間、発芽させた。実施例１に記載のように、発芽している実生由来の子葉鞘（先端７ｍｍ）抽出物における全リポキシゲナーゼ活性を測定することによって、低リポキシゲナーゼ系統をスクリーンした。第３および第４の戻し交配の子孫もまた、実施例４に記載のＰＣＲ−ＣＡＰＳアッセイを用いて、変異型ｌｏｘ−１遺伝子の遺伝について分析した。
【０１００】
４回の戻し交配世代の分離子孫における低リポキシゲナーゼ表現型の予測頻度は、劣性変異について２５％であった。４回の戻し交配世代の子孫（２４粒）における低リポキシゲナーゼ活性の観察された頻度は、予測頻度と一致する（図２０）。低ｌｏｘホモ接合体ｌｌ遺伝子型を有する第３および第４の戻し交配子孫をＰＣＲ−ＣＡＰＳアッセイによって分析した時、それらは全て、診断的３１３ｂｐフラグメントを有するが、野生型リポキシゲナーゼ活性を有する子孫は該フラグメントを欠失していたことが見出された（図２１）。
【０１０１】
戻し交配計画は、変異型ｌｏｘ−１対立遺伝子が新規な遺伝的背景に移行することができ、メンデルの分離にしたがって劣性単因子によって遺伝されることを明らかにする。反復親背景は、第４戻し交配子孫において９３．８％であるので、変異型ｌｏｘ−１遺伝子と低リポキシゲナーゼ表現型の共同遺伝は、それらの遺伝的連鎖を立証する。
【０１０２】
実施例６
Ｌｉｎｅ Ｇオオムギ麦芽から醸造されたビールは、保存の間にトランス−２−ノネナールをあまり蓄積せず、改善された風味安定性を与える。
工業的に麦芽製造するのに十分な穀粒を提供するために、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ Ｌ ｃｖ ＶｉｎｔａｇｅおよびＬｉｎｅ Ｇを数シーズンにわたり畑で増殖させた。改善された風味安定性についてＬｉｎｅ Ｇ低リポキシゲナーゼオオムギの価値を明らかにするために、下記の工業的規模の麦芽製造および醸造試験ならびに完成したビールの分析を行った。
【０１０３】
１．Ｌｉｎｅ Ｇおよびｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅの工業的麦芽製造およびキルン乾燥
下記のような２つの試験において、工業的麦芽製造所において１０トンの規模で麦芽製造を行った。
【０１０４】
試験１：Ｌｉｎｅ Ｇオオムギ穀粒（１９９６年収穫）
浸麦条件：１６℃の浸麦水中、８時間湿潤；１４時間乾燥；８時間湿潤；１０時間乾燥；４時間湿潤。麦芽製造条件：１８℃１２時間；１６℃２４時間；１４℃２４時間；１２℃６０時間。キルン乾燥条件：６０℃１２時間；６８℃３時間；７４℃４時間；８０℃３時間。
【０１０５】
試験２：ｃｖ ＶｉｎｔａｇｅおよびＬｉｎｅ Ｇ（１９９６／１９９７年収穫）
浸麦条件：１５℃の浸麦水中、８時間湿潤；１０時間乾燥；６時間湿潤；１５時間乾燥；４時間湿潤。麦芽製造条件：１５℃で空気を挿入して、湿度レベルを維持するようにスプレーしながら５日間。キルン乾燥条件：５０℃１０時間；６０℃２時間；８０℃２．５時間。
【０１０６】
対照麦芽ｃｖ Ｎｅｖａｄａと比較した試験１由来（表１）およびｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅと比較した試験２由来（表２）のＬｉｎｅＧ麦芽の２つの試料の麦芽製造分析により、Ｌｉｎｅ Ｇ麦芽が醸造試験に適当であったことを確認した。
【０１０７】
【表１】
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【０１０８】
【表２】
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【０１０９】
２．Ｌｉｎｅ Ｇ、ｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅ麦芽、および対照麦芽ｃｖ Ｎｅｖａｄａを用いる工業的醸造
試験１においてＬｉｎｅ Ｇおよび対照麦芽ｃｖ Ｎｅｖａｄａ麦芽から、および試験２においてＬｉｎｅＧおよび対照麦芽ｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅから調製された麦汁を用いて２つの醸造試験を行った。
【０１１０】
４７５ｋｇ麦芽を用いる３０−ｈｌの工業的規模において、下記のスキームにしたがってビールを醸造した：５０℃でのマッシング；５０℃で３０分；５０℃から７０℃に加熱しながら３０分；７０℃で１５分。麦汁の一部を７０℃から１００℃に２０分間、１００℃で５分間加熱し、一方、主要部をなすマッシュを７０℃でさらに２５分間維持し、次いで、２つのマッシュを合わせ、７６℃で１０分間維持した。麦汁の醸造工程、煮沸、ビール糟（spent grain）のワールプール分離、冷却、発酵、貯蔵（lagering）および茶色ガラス瓶へのパッケージングは、標準的な手法にしたがった。
【０１１１】
３．Ｌｉｎｅ Ｇ、ｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅ麦芽および対照麦芽ｃｖ Ｎｅｖａｄａから醸造されたビールの風味安定性およびＴ２Ｎ含量
新鮮な瓶詰ビールを５℃で保存し、製造後２ヶ月以内に分析した。新鮮および保存されたビールの風味安定性を、２つの異なるビール保存条件に従う２つの独立した研究室において評価した。研究室Ａにおいて、ビールは強制老化工程に付され、ここに、ビールは３７℃で７日間保存され、一方、研究室Ｂにおいて、ビールは３０℃で６および１２週間保存された。ビール中のトランス−２−ノネナールレベルは、基本的にGroenqvistら、1993, Proceedings of the 24th EBC Congress, Oslo, 421-428によって記載されたように、Ｏ−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンジル）−ヒドロキシルアミンを用いるカルボニル類の誘導体化にしたがってガスクロマトグラフィーおよび質量分析検出によって測定した。訓練されたビール試飲パネルが、ビール中の遊離トランス−２−ノネナールを示すカードボード臭の検出を包含するビールの全風味スコアを評価した。
【０１１２】
研究室Ａ：強制老化耐性
第１醸造試験（表３）におけるＬｉｎｅ Ｇおよび対照麦芽ｃｖ Ｎｅｖａｄａから醸造されたビールの比較は、Ｌｉｎｅ Ｇ由来のビールが、対照と比べて、強制老化後により大きな風味安定性およびより低いトランス−２−ノネナール含量を有したことを明らかにした。Ｌｉｎｅ Ｇ麦芽から醸造されたビールとｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅ麦芽（親栽培変種）から醸造されたビールとを比較する第２試験により、最初のデータが確認された（表４）。
【０１１３】
【表３】
2004522434.tif 000004
＊風味評価スケール：質が上がるにつれて１−１０
＊＊トランス−２−ノネナール
【０１１４】
【表４】
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＊風味評価スケール：質が上がるにつれて１−１０
＊＊トランス−２−ノネナール
【０１１５】
研究室Ｂ：３０℃保存耐性
Ｌｉｎｅ Ｇ麦芽から醸造されたビールは、対照麦芽のいずれかから醸造されたビールと比べて、３０℃の高い保存温度にて６および１２週間後、より低いトランス−２−ノネナールレベルを有し（表５および６）、試飲パネルによって判断された場合、より良好な風味安定性を有した。これらの分析されたビールにおいてトランス−２−ノネナールに関する味覚域値は、０．０８ｐｐｂ近くにある。
【０１１６】
【表５】
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＊１−１０のスケールにおけるトランス−２−ノネナール風味検出スコア
【０１１７】
【表６】
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＊１−１０のスケールにおけるトランス−２−ノネナール風味検出スコア
【０１１８】
合わせた醸造試験データから、３０℃保存後のビールにおいて検出されるトランス−２−ノネナールのレベルによって測定された場合、Ｌｉｎｅ Ｇ麦芽から醸造されたビールの改善された風味安定性は、統計学的に有意であることが示される（表７）。
【０１１９】
【表７】
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【０１２０】
天然亜硫酸塩レベルは両方の醸造試験において低かったので、老化したビール中の遊離トランス−２−ノネナールレベルは、異なるビールのトランス−２−ノネナールポテンシャル、すなわち、新鮮なビール中に存在するトランス−２−ノネナール付加物のレベルを厳密に反映したであろう。亜硫酸塩の添加は、遊離トランス−２−ノネナールを複合体化することによって、亜硫酸塩レベルがパッケージング中の気体交換による酸化によって減少されるまで、古くなる工程を一時的に遅らせることができる。
【０１２１】
低ＬＯＸ−１オオムギ麦芽を用いる記載の醸造試験は、麦芽製造および醸造工程の間のオオムギにおけるＬＯＸ−１活性が、老化したビールにおける不快臭化合物トランス−２−ノネナールの出現の重要な決定子であるという最初の明白な証拠を提供する。
【０１２２】
上記の詳述は、多数の出版物の引用を包含する。これにより、各出版物は、まるで完全に示されているように、全ての意味で出典明示により本明細書の一部とされる。
【０１２３】
【表８】
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【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】図１は、発芽３日目のオオムギ穀粒の胚から免疫アフィニティー精製したリポキシゲナーゼ１および２活性に対する阻害剤ノルジヒドログアイアレチン酸（ＮＤＧＡ）の影響を示すグラフである。
【図２】図２は、開花後５日目から完全成熟（ＦＭ）までのＬｉｎｅ Ｇおよびｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅの発育中の穀粒の生重量を示すグラフである。各測定は、６個の禾穂由来の平均単一穀粒重量である。
【図３】図３は、開花後５日目から完全成熟（ＦＭ）までのＬｉｎｅ Ｇおよびｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅの発育中の穀粒の乾燥重量を示すグラフである。各測定は、５つの穀粒のうち３個の試料由来の平均単一穀粒重量である。
【図４】図４は、開花後５日目から完全成熟（ＦＭ）までのＬｉｎｅ Ｇおよびｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅの発育中の穀粒における全リポキシゲナーゼ活性を示すグラフである。
【図５】図５は、Ｌｉｎｅ Ｇの発育中の穀粒におけるリポキシゲナーゼ活性によるリノール酸酸化の９−および１３−ＨＰＯＤ生産物を示すグラフである。
【図６】図６は、マイクロモル／分／胚１０個（Ｕ／胚１０個）として表されたＬｉｎｅ Ｇおよびｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅの発芽穀粒の胚における全リポキシゲナーゼ活性を示すグラフである。
【図７】図７は、Ｌｉｎｅ Ｇおよびｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅの発芽穀粒の胚におけるリポキシゲナーゼ活性によるリノール酸酸化の９−ＨＰＯＤおよび１３−ＨＰＯＤ生産物を示し、９−ＨＰＯＤおよび１３−ＨＰＯＤのレベルを示すグラフである。
【図８】図８は、開花後５日目から完全成熟（ＦＭ）までのＬｉｎｅ Ｇおよびｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅ（ｗｔ）の発育中の穀粒の胚におけるリポキシゲナーゼ１の免疫検出を示すウェスタンブロットである。
【図９】図９は、０−６日間発芽したＬｉｎｅ Ｇおよびｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅ（野生型）の穀粒の胚におけるリポキシゲナーゼ１の免疫検出を示すウェスタンブロットである。
【図１０】図１０は、ｌｏｘ−１ ｃＤＮＡの３’非転写領域でプローブした、開花後５日目から完全成熟（ＦＭ）までのＬｉｎｅ Ｇおよびｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅ（野生型）の発育中の穀粒の胚において検出されたリポキシゲナーゼ１転写産物を示すノーザンブロットである。
【図１１】図１１は、ｌｏｘ−１ ｃＤＮＡの３’非転写領域でプローブした、０−６日間発芽させたＬｉｎｅ Ｇおよびｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅ（野生型）の胚において検出されたリポキシゲナーゼ１転写産物を示すノーザンブロットである。
【図１２】図１２Ａ−１２Ｇは、プロモーターおよびｌｏｘ−１野生型ｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅ対立遺伝子（ＷＴ）およびＬｉｎｅ Ｇ対立遺伝子（ＬＧ）の転写領域のヌクレオチド配列アラインメントである。遺伝子配列中において転写開始部位（＋１）、ＡＴＧ開始コドン（＋６９）および翻訳終止コドン（＋４２３１）に下線を付す。Ｌｉｎｅ Ｇ対立遺伝子において同定されるヌクレオチド変異を太字イタリックで示し、星印をつける。
【図１３】図１３は、ｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅ（野生型）のｌｏｘ−１遺伝子およびＬｉｎｅ Ｇの変異型ｌｏｘ−１遺伝子の概略図である。＋１から＋４３７５までの転写産物は７個のエキソン（斑点ボックス）および６個のイントロン（白抜きボックス）よりなる。ｌｏｘ−１遺伝子における２つの変異が示される。
【図１４】図１４は、野生型ｌｏｘ−１ｃＤＮＡおよびｌｏｘ−１遺伝子ならびにＬｉｎｅ Ｇの変異型ｌｏｘ−１遺伝子のの一時的発現のための遺伝子カセットの概略図である。リポキシゲナーゼコーディング配列は、イントロン１を有する保存的トウモロコシユビキチンプロモーター（Ｕｂｉ−１）とｎｏｓターミネーターとの間でクローン化された。
【図１５】図１５は、野生型ｌｏｘ−１ｃＤＮＡ；Ｌｉｎｅ Ｇ由来の変異型ｌｏｘ−１遺伝子；ＷＴｌｏｘ−１遺伝子；および対照ＧＵＳレポーター遺伝子を含有する遺伝子カセットでトランスフェクトされたオオムギ糊粉プロトプラストにおけるリポキシゲナーゼ１活性を示す棒グラフである。トランスフェクトされたプロトプラストの抽出物中のリポキシゲナーゼ活性は、ＫＩの酸化によってミクロタイタープレート中でアッセイされ、分光光度計で定量された。リポキシゲナーゼ１活性は、抽出物中μｇ蛋白質あたりの単位として表され、２回の反復アッセイ由来の３つの測定値の平均として示す。
【図１６】図１６は、野生型および変異型ｌｏｘ−１遺伝子間のＲＦＬＰがヌクレオチド２３４７での点突然変異により、付加的なＡａｔＩＩ制限部位を生じることを明らかにする配列アラインメントである。
【図１７】図１７は、ポリメラーゼ連鎖反応−切断増幅多形部位（ＰＣＲ−ＣＡＰＳ）アッセイにおいて増幅および切断されたｌｏｘ−１ＰＣＲフラグメントの概略図である。ＰＣＲプライマーの位置を矢印で示し、ＡａｔＩＩ部位を遺伝子上部に示す（配列位置）。ＰＣＲ産物内のエキソンおよびイントロン領域は、各々、斑点および白抜きボックスによって区別され、ＡａｔＩＩ消化フラグメントの大きさが与えられる。
【図１８】図１８は、Ｌｉｎｅ Ｇおよびｃｖ ＶｉｎｔａｇｅゲノムＤＮＡ由来のＰＣＲ−ＣＡＰＳアッセイの第１段階において増幅されたｌｏｘ−１ＰＣＲフラグメント（６５２ｂｐ）を示す電気泳動アガロースゲルである。
【図１９】図１９は、野生型および変異型ｌｏｘ−１遺伝子においてＰＣＲ−ＣＡＰＳによって検出されたＲＦＬＰを示す電気泳動アガロースゲルである。変異型遺伝子のＡａｔＩＩ消化フラグメントは、独特の３１３ｂｐ制限フラグメントを包含し、星印で示される。
【図２０】図２０は、Ｌｉｎｅ Ｇ単一劣性遺伝子対ｌｌ（低リポキシゲナーゼ特性）のｃｖ Ａｌｅｘｉｓへの戻し交配計画を示す表である。ＬＬ遺伝子型は、野生型リポキシゲナーゼ活性（優性対立遺伝子）を発現する植物であり、ｌｌ遺伝子型は、低リポキシゲナーゼ（劣性対立遺伝子）を発現する植物である。Ｌｌは、野生型および低リポキシゲナーゼ対立遺伝子の両方を含有するヘテロ接合体植物である。低リポキシゲナーゼ性質は劣性形質なので、Ｌｌ植物は野生型リポキシゲナーゼ活性を示す。戻し交配（自家受粉を包含する）の各ラウンド後、ｌｌ子孫は子孫の２５％を示すと予想される。低リポキシゲナーゼ活性の観察された頻度を示す。ホモ接合体低リポキシゲナーゼ対立遺伝子を有するｃｖ Ａｌｅｘｉｓ遺伝的背景の計算されたパーセンテージは、％Ａｌｅｘｉｓで示す。
【図２１】図２１は、Ｌｉｎｅ Ｇ−Ａｌｅｘｉｓ戻し交配計画のｌｌ子孫における変異型ｌｏｘ−１遺伝子のＰＣＲ−ＣＡＰＳ検出を示す電気泳動アガロースゲルである。Ｌｉｎｅ Ｇ（レーン２）、ｃｖ Ｖｉｎｔａｇｅ（レーン３）、第３（レーン４）および第４の戻し交配（レーン５−９）のｌｌ子孫、ＤＮＡラダー（レーン１）、対照の戻し交配した高ｌｏｘ系統（レーン１０）のゲノムＤＮＡにおけるＰＣＲ−ＣＡＰＳアッセイ。
【図２２】図２２Ａ−２２Ｂは、ダイズリポキシゲナーゼＬＯＸ−１（Ｇｍ１）、ＬＯＸ−２（Ｇｍ２）、ＬＯＸ−３（Ｇｍ３）およびオオムギリポキシゲナーゼＬＯＸ−１（Ｈｖ１）およびＬＯＸ−２（Ｈｖ２）のアミノ酸配列の比較アラインメントである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｇ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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