(57)【要約】Toll-関連レセプター（TRR）シグナル伝達の調節因子、好ましくは、阻害因子を樹状細胞等の抗原提示細胞、または前駆細胞に供給する工程を含む、抗原提示の増強方法。Toll-関連レセプター（TRR）シグナル伝達の調節因子、好ましくは、増強因子を樹状細胞等の抗原提示細胞、または前駆細胞に供給する工程を含む、抗原提示の阻害方法。TRRシグナル伝達の阻害因子は、MyD88のドミナントネガティブ変異体、例えば、MyD88lprでありうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Toll関連レセプター（TRR）シグナル伝達の調節因子、好ましくは阻害因子を樹状細胞等の抗原提示細胞、または前駆細胞に供給する工程を含む抗原提示の増強方法。
【請求項２】
Toll関連レセプター（TRR）シグナル伝達の調節因子、好ましくは増強因子を樹状細胞等の抗原提示細胞、または前駆細胞に供給する工程を含む抗原提示の阻害方法。
【請求項３】
Toll関連レセプター（TRR）シグナル伝達の調節因子、好ましくは阻害因子を患者または患者の樹状細胞または前駆細胞等の抗原提示細胞に供給する工程を含む抗原提示の増強を必要とする患者の治療方法。
【請求項４】
Toll関連レセプター（TRR）シグナル伝達の調節因子、好ましくは増強因子を患者または患者の樹状細胞または前駆細胞等の抗原提示細胞に供給する工程を含む抗原提示の増強を必要とする患者の治療方法。
【請求項５】
TRRシグナル伝達の調節因子、増強因子または阻害因子がTRRへの細胞外分子の結合を調節する前記請求項のいずれか記載の方法。
【請求項６】
TRRシグナル伝達の調節因子、増強因子または阻害因子がTRRへの細胞内分子の結合を調節する前記請求項のいずれか記載の方法。
【請求項７】
TRRシグナル伝達の調節因子、増強因子または阻害因子がTRRへのMyD88の結合を調節する前記請求項のいずれか記載の方法。
【請求項８】
TRRシグナル伝達の調節因子、増強因子または阻害因子がデスドメイン（DD）を含有するポリペプチドへのMyD88の結合を調節する前記請求項のいずれか記載の方法。
【請求項９】
MyD88に直接関与するシグナル伝達工程の阻害因子を、患者または患者の樹状細胞等の抗原提示細胞、または前駆細胞に供給する工程を含む抗原提示の増強を必要とする患者の治療方法。
【請求項１０】
阻害因子がMyD88のドミナントネガティブ変異体である請求項１〜４、８または９のいずれか記載の方法。
【請求項１１】
MyD88のドミナントネガティブ変異体を、患者または患者の樹状細胞等の抗原提示細胞、または前駆細胞に供給する工程を含む抗原提示の増強を必要とする患者の治療方法。
【請求項１２】
阻害因子またはドミナントネガティブ変異体がMyD88lprである請求項１〜４、８〜１１いずれか記載の方法。
【請求項１３】
MyD88に直接関与するシグナル伝達工程の増強因子を、患者または患者の樹状細胞等の抗原提示細胞、または前駆細胞に供給する工程を含む抗原提示の阻害を必要とする患者の治療方法。
【請求項１４】
増強因子がMyD88である請求項２、４、６、７、８または１３いずれか記載の方法。
【請求項１５】
調節因子、増強因子もしくは阻害因子またはドミナントネガティブ変異体が細胞または患者において発現される前記請求項いずれか記載の方法。
【請求項１６】
患者または細胞が、調節因子、増強因子もしくは阻害因子または細胞または患者におけるドミナントネガティブ変異体を発現しうるポリヌクレオチドを投与される請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ポリヌクレオチドがアデノウイルスベクターに投与される請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
樹状細胞等の抗原提示細胞、またはかかる細胞の前駆体におけるTRRシグナル伝達を調節、好ましくは活性化しうる化合物を同定する工程を含む抗原提示の阻害因子である化合物の同定方法。
【請求項１９】
樹状細胞等の抗原提示細胞、またはかかる細胞の前駆体におけるTRRシグナル伝達を調節、好ましくは阻害しうる化合物を同定する工程を含む抗原提示の増強因子である化合物の同定方法。
【請求項２０】
TRRシグナル伝達の活性化または阻害が相互作用分子とMyD88との相互作用における変化を観察することにより検出される請求項１８または１９記載の方法。
【請求項２１】
抗原提示細胞またはその前駆体において見出されるMyD88もしくはMyD88の結合パートナーに試験化合物を曝露する工程および該化合物がMyD88またはMyD88の結合パートナーに結合しうるかどうかを決定する工程を含む、抗原提示の阻害因子または増強因子である化合物の同定方法。
【請求項２２】
MyD88の結合パートナーがTRRまたはDDを含有するポリペプチドである請求項２２記載の方法。
【請求項２３】
抗原提示の阻害因子または増強因子を同定する方法における、MyD88（または別のアダプター分子、例えば、TIRAPまたはMalまたはTollIP）もしくはMyD88の結合パートナーまたは抗原提示細胞において見出される他のアダプター分子の使用。
【請求項２４】
請求項１８〜２２いずれか記載の本発明のスクリーニング方法により同定されたかまたは同定可能である化合物。
【請求項２５】
医薬における使用のための、請求項１８〜２２いずれか記載の本発明のスクリーニング方法により同定されたかまたは同定可能である化合物。
【請求項２６】
医薬における使用のための、抗原提示細胞において見出されるMyD88の結合パートナーもしくはその変異体、またはそれをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２７】
抗原提示の阻害または増強を必要とする患者の治療のための医薬の製造における請求項１８〜２２いずれか記載のスクリーニング方法により同定されたかまたは同定可能である化合物、または抗原提示細胞において見出されるMyD88の結合パートナーまたはその変異体の使用。
【請求項２８】
医薬における使用のための、Toll関連レセプター（TRR）シグナル伝達の阻害因子またはそれをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２９】
医薬における使用のための、Toll関連レセプター（TRR）シグナル伝達の増強因子またはそれをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３０】
医薬における使用のための、MyD88に直接関与するシグナル伝達工程の増強因子もしくは阻害因子またはドミナントネガティブ変異体またはそれをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３１】
医薬における使用のための、MyD88の定常的に活性な変異体、またはドミナントネガティブ変異体、またはそれをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３２】
（１）請求項１〜１０、１２〜１４のいずれかに規定されるシグナル伝達の阻害因子または増強因子をコードする部分（調節部分）または請求項１１、１２、２６のいずれかに規定されるMyD88またはMyD88ポリペプチドの結合パートナー、または請求項１８〜２２のいずれか記載のスクリーニング方法により同定されたかまたは同定可能である化合物および（２）抗原分子をコードする部分を含有してなる組換えポリヌクレオチド。
【請求項３３】
抗原分子が、トランスフォーム細胞もしくは癌細胞上または病原性生物上、または病原性生物により感染した細胞上に存在するエピトープを含有してなる請求項３２記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項３４】
（１）請求項１〜１０、１２〜１４のいずれかに規定される調節因子、シグナル伝達の阻害因子または増強因子、または請求項１１、１２、２６のいずれかに規定されるMyD88またはMyD88ポリペプチドの結合パートナー、または請求項１８〜２２のいずれか記載のスクリーニング方法により同定されたかまたは同定可能である化合物を含有する調節部分（またはかかる調節部分をコードするポリヌクレオチド）および（２）請求項３２または３３に規定される抗原分子を含有する抗原部分（またはかかる抗原部分をコードするポリヌクレオチド）を含有してなる部分、組成物またはキメラ分子のキット。
【請求項３５】
（１）患者から抗原提示細胞またはその前駆体、好ましくは、樹状細胞またはその前駆体を得ること；（２）該抗原提示細胞と請求項１〜１０、１２〜１４のいずれかに規定される調節因子、シグナル伝達阻害因子または増強因子、または請求項１１、１２、２６のいずれかに規定されるMyD88またはMyD88ポリペプチドの結合パートナー、または請求項１８〜２２のいずれか記載のスクリーニング方法により同定されたかまたは同定可能である化合物（またはそれをコードするポリヌクレオチド）、および任意に免疫応答が必要とされる抗原とを接触させること；または請求項３２〜３４のいずれかに規定されるキメラ分子もしくはポリヌクレオチドとをエキソビボで接触させること；ならびに（３）前記のように処理した抗原提示細胞を患者に再導入することを含む患者における抗原提示を調節する方法。
【請求項３６】
請求項１〜１０、１２〜１４のいずれかに規定されるシグナル伝達の阻害因子、または請求項１１、１２、２６のいずれかに規定されるMyD88またはMyD88ポリペプチドの結合パートナー、または請求項１８〜２２のいずれか記載のスクリーニング方法により同定されたかまたは同定可能である化合物、またはそれをコードするポリヌクレオチドを有効量で含有してなる、癌、または癌もしくは腫瘍細胞に対して、または病原性生物もしくは病原性生物に感染した細胞に対して有効なワクチン。
【請求項３７】
癌もしくは腫瘍細胞、または病原性生物もしくは病原性生物に感染した細胞上に存在するエピトープを有する抗原（または抗原をコードするポリヌクレオチド）をさらに含有してなる請求項３６記載のワクチン。
【請求項３８】
ワクチンが核酸ワクチンである請求項３６または３７記載のワクチン。
【請求項３９】
請求項１〜１０、１２〜１４のいずれかに規定される調節因子、シグナル伝達の阻害因子または増強因子、または請求項１１、１２、２６のいずれかに規定されるMyD88またはMyD88ポリペプチドの結合パートナー、または請求項１８〜２２のいずれかに記載のスクリーニング方法により同定されたか、または同定可能である化合物、またはそれをコードするポリヌクレオチド、または請求項３４記載の組成物もしくはキメラ分子、または請求項３６〜３８のいずれか記載のワクチン、または請求項３２記載のポリヌクレオチド、および薬学的に許容されうるキャリアを含有してなる医薬組成物。
【請求項４０】
（１）患者から樹状細胞等の抗原提示細胞を得ること；（２）該抗原提示細胞と該抗原提示細胞のTRRシグナル伝達の調節因子、好ましくは阻害因子、または抗原提示細胞のTRRシグナル伝達の阻害因子をコードするポリヌクレオチドまたは発現ベクターとをエキソビボで接触させること；（３）任意に、該細胞と該エピトープまたは該エピトープをコードするポリヌクレオチドまたは発現ベクターとを接触させることおよび（４）前記のように処理した抗原提示細胞を患者に再導入することを含む、第１エピトープを異常発現する患者における標的細胞を死滅させる方法。
【請求項４１】
標的細胞が癌細胞である請求項４０記載の患者における標的細胞を死滅させる方法。
【請求項４２】
（１）TRRシグナル伝達の阻害因子または（２）MyD88に直接関与するシグナル伝達工程の阻害因子、または（３）MyD88のドミナントネガティブ変異体を患者または患者の樹状細胞等の抗原提示細胞、または前駆細胞に供給する工程を含む、癌または病原性生物による感染を有するか、またはその危険性がある患者の治療方法。
【請求項４３】
TRRシグナル伝達の調節因子、好ましくはアクチベーター、または（２）MyD88に直接関与するシグナル伝達工程のアクチベーター、または（３）MyD88を、患者または患者の樹状細胞等の抗原提示細胞または前駆細胞に供給する工程を含む、自己免疫疾患または移植片拒絶またはアレルギーを有するか、またはその危険性がある患者の治療方法。
【請求項４４】
抗原提示の増強を必要とするか、および／または癌または病原性生物による感染を有するかまたはその危険性があるか、および／またはアルツハイマー病または海綿状脳障害等の病原性形態のタンパク質の産生に関連する疾患を有する患者を治療するための医薬の製造における（１）TRRシグナル伝達の調節因子、好ましくは阻害因子または（２）MyD88に直接関与するシグナル伝達工程の阻害因子、または（３）MyD88のドミナントネガティブ変異体（またはそれをコードするポリヌクレオチド）の使用。
【請求項４５】
自己免疫疾患または移植片拒絶を有するかまたはその危険性がある患者の治療のための医薬の製造における、（１）TRRシグナル伝達の調節因子、好ましくはアクチベーターまたは（２）MyD88に直接関与するシグナル伝達工程のアクチベーター、または（３）MyD88（またはそれをコードするポリヌクレオチド）の使用。
【請求項４６】
医薬が抗原または抗原をコードするポリヌクレオチドをさらに含有してなる請求項４４または４５記載の使用。
【請求項４７】
医薬における使用のための請求項３９記載の医薬組成物、ポリヌクレオチド、キメラ分子またはワクチン。
【請求項４８】
抗原提示の阻害または増強を必要とする患者の治療のための医薬の製造における請求項３９に規定される医薬組成物、ポリヌクレオチド、キメラ分子またはワクチンの使用。
【請求項４９】
MalまたはTIRAPまたはTollIPを、患者または患者の樹状細胞等の抗原提示細胞または前駆細胞に供給する工程を含む抗原提示の増強を必要とする患者の治療方法。
【請求項５０】
MalもしくはTIRAPもしくはTollIPまたはその断片、融合物もしくはバリアントを患者または患者の抗原提示樹状細胞、もしくは前駆細胞に供給する工程を含む抗原提示の阻害を必要とする患者の治療方法。
【請求項５１】
TRR相互作用分子（アダプター分子）、またはかかるアダプター分子のAPC結合パートナー（すなわち、DC、またはその前駆体等のAPCにおいて見出されるアダプター分子の結合パートナー）に試験化合物を曝露する工程および化合物が、アダプター分子またはアダプター分子のAPC結合パートナーに結合することができるかを決定する工程を含む、例えば、DC等のAPCによる抗原提示の阻害因子または増強因子である化合物の同定方法。
【請求項５２】
アダプター分子がMalまたはTIRAPまたはTollIPである請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
（１）MalもしくはTollIPもしくはTIRAPまたはその断片、誘導体または融合物（または該部分をコードするポリヌクレオチド）および（２）抗原分子を含有するかコードする抗原部分を含有してなる部分または組成物またはキメラ分子のキット。
【請求項５４】
医薬における使用のための請求項５３記載の部分または組成物またはキメラ分子のキット。
【請求項５５】
抗原提示の調節を必要とする患者を治療するための医薬の製造における請求項５３記載の部分または組成物またはキメラ分子のキットの使用。
【請求項５６】
MalもしくはTIRAPもしくはTollIPまたはその断片、バリアントもしくは融合物、またはそれをコードするポリヌクレオチドの有効量を含有してなる、癌、または癌もしくは腫瘍細胞に対して、または病原性生物もしくは病原性生物に感染した細胞に対して有効なワクチン。
【請求項５７】
癌もしくは腫瘍細胞、または病原性生物もしくは病原性生物に感染した細胞上に存在するエピトープを有する抗原（または抗原をコードするポリヌクレオチド）をさらに含有してなる請求項５６記載のワクチン。
【請求項５８】
ワクチンが核酸ワクチンである請求項５６または５７記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、免疫システムの調節、特に樹状細胞による抗原提示の調節に関する。
【０００２】
免疫システムの認識機構で中心となるのは、Toll様レセプター（TLR）として知られている生殖系列にコード化された多数のレセプターである（1）。各TLRは、NF−κB転写因子の活性化によって特定の抗菌遺伝子または抗細菌遺伝子を活性化する（2）。すなわち、TLR4は、細菌のリポ多糖に対する応答性を付与することが明らかになっており（3）、一方、TLR2は、細菌のペプチドグリカンおよびリポテイコ酸、ならびに酵母の糖類に対する応答性を付与する（4）。9種類のTLRが現在知られており（8）、さらに多数存在すると予想されている。
【０００３】
TLRを含むToll関連レセプター（TRR）の細胞外部位は相対的に多様であるが、細胞質部位はより保存されている。これらはtollドメインとして知られている明確な領域を含むが、この部位は、IL−1レセプター、IL−18レセプター、および、他の広くIL−1レセプターファミリーと呼ばれるレセプターからなるタンパク質の細胞質部位にも見られる。さらに、MyD88、TollIP、MalおよびTIRAPのような可溶性細胞質タンパク質がTollドメインをもつことがある。TLRおよびIL−1レセプターは、シグナル伝達のフレームワークと類似したフレームワークを使用している。すなわち、これらは、リガンド結合すると、MyD88がそのC−末端に含むTollドメインとのホモタイプの相互作用により、アダプター分子MyD88を補充する。次に、MyD88は、NF−κBおよびマイトジェン活性化プロテインキナーゼを活性化するためにIRAKおよびTRAF−6を補充する。さらに、TollIPも関係する可能性がある（2、Burnsら、（2000）  Nature  Cell  Biol．  2，  346−351）。
【０００４】
MyD88（ミエロイド分化タンパク質）は、短いリンカーによってC−末側Tollドメインから隔てられているN−末側デスドメイン（DD）からなる分子構成をもつと考えられている（（5）に概説されている）。N−末側DDは、ホモダイマーまたはヘテロダイマーを形成する他のDD配列とのタンパク質−タンパク質相互作用に介在すると考えられている約90アミノ酸のモチーフに関係している（Boldinら（1995）  Ｊ  Biol  Chem  270，  387−391）。
【０００５】
MyD88のTollドメインは約130個のアミノ酸を有する（Mitchamら（1996）Ｊ  Biol  Chem  199，  144−146）。また、Tollドメインは、ホモダイマーまたはヘテロダイマーを形成する他のTollドメインとのタンパク質−タンパク質相互作用に介在すると考えられている（（5）を参照のこと）。
【０００６】
DDおよびToll-Tollの相互作用は、シグナル伝達経路を方向付けることに関与していると考えられている。MyD88は、（リガンドに結合すると）そのTollドメインを介してTLRおよびIL−1レセプターに結合すると考えられている。次に、MyD88は、そのDDを介して他のDD含有タンパク質に結合すると考えられている；特に、IRAKおよびTRAF−6に結合して、NF−κBおよびマイトジェン活性化プロテインキナーゼを活性化すると考えられている（2）。
【０００７】
抗原提示細胞は、当技術分野において周知であり、樹状細胞を含む（Ｊaneway，  CA  ＪrおよびTavers，  P，  免疫生物学（Immunobiology）（第3版）、カレントバイオロジー（Current  Biology）編／チャーチル・リビングストン・アンド・ガーランド・パブリシング（Churchill  Livingstone  and  Garland  Publishing）を参照）。それらは、抗原を処理し、それらのペプチド断片を、リンパ球の活性化に必要とされる分子とともに細胞表面上に提示することができる、高度に特異化された細胞である。最も強力な抗原提示細胞は、樹状細胞、マクロファージ、およびB細胞である。
【０００８】
樹状細胞（DC）は、MHCに拘束されたT細胞による一次免疫の発達に重大な意味をもつ、抗原処理および抗原提示の専門細胞である。それらは、骨髄中のCD34+前駆細胞から発生するが、末梢血中のコロニー形成後単位（post  colony−forming  unit）CD14+中間体からも得ることができる。DCは、皮膚、粘膜、脾臓、および胸腺の末梢部位に移動する。DCは、同種移植片拒絶、アトピー性疾患、自己免疫、および抗腫瘍免疫など、さまざまな臨床上重要なプロセスに関係してきた。
【０００９】
DCは、CD34+幹細胞またはCD14+末梢血単球からサイトカイン、主にGM−CDF、IL−4、およびTNFαを用いて生体外で培養される。これら二つの由来源からのDCはどちらも免疫適格性があり、外因的に提示された抗原を取り込み、それを処理してから、細胞傷害性T細胞に提示する（Grabbeら、（1995）  Immunology  Today  16，  117−121；  GirolomoniとRicciardi−Castagnoli  （1997）  Immunology  Today  18，  102−104）。DCは、インビボで発生した抗原特異的腫瘍免疫を伝達することができ（Kwakら、（1995）  Lancet  345，  1016−1020）、生体外で腫瘍抗原によってパルスされた自己DCは測定可能な抗腫瘍作用を誘導することができる（Hsuら、（1996）  Nature  Medicine  2，  52−58）。DCは、未精製の腫瘍膜ライセート、精製されたペプチドまたはペプチド断片を用いて効果的にパルスすることができる。ペプチド抗原を負荷された患者からの自己樹状細胞を生体外で増殖させて、養子免疫治療として再注入することが、例えば国際公開第00／26249号パンフレットに記載されている。
【００１０】
驚くべきことに、本発明者らは、樹状細胞やマクロファージなどの抗原提示細胞（APC）に特異的で、MyD88を介して作用する阻害シグナルがあることを明らかにする。この阻害シグナルは、一種類以上のTRRを含む可能性がある。
【００１１】
TRRは、TLR、IL−1レセプターおよびIL−18レセプターなど、IL−1レセプターファミリーの構成員、ならびに、MyD88、TollIP、MalおよびTIRAPなどの細胞質タンパク質などの分子を含む。
【００１２】
調節分子、好ましくは、例えば、MyD88の機能喪失（例えばドミナントネガティブな阻害）型のような、樹状細胞などのAPCにおけるTRRシグナル伝達を阻害する分子を、例えばDNAワクチンや癌免疫治療法とともに免疫賦活性剤として使用することができる。例えば、阻害性MyD88をDNAベクターに取り込むと、ベクター単独で使用した場合よりもより効率的にT細胞および抗体の応答を刺激することができる。
【００１３】
本発明の第一の局面では、樹状細胞などの抗原提示細胞（APC）または前駆細胞に、Toll関連レセプター（TRR）のシグナル伝達の調節因子、好ましくは阻害因子を供給する工程を含む抗原提示を増強する方法を提供する。この調節因子は、APC 、例えばDCを活性化する、例えば、例えばAPC 、例えばDCによる抗原提示を増強する。
【００１４】
本発明の第二の局面では、樹状細胞などの抗原提示細胞（APC）または前駆細胞に、Toll関連レセプター（TLR）のシグナル伝達の調節因子、好ましくは増強因子を供給する工程を含む抗原提示を阻害する方法を提供する。
【００１５】
Toll関連レセプター（TRR）のシグナル伝達の阻害因子は、好ましくは、樹状細胞などのAPCまたはその前駆細胞に見られるTRRシグナル伝達経路を阻害する。さらに好ましくは、阻害因子は、その阻害が未成熟の樹状細胞の活性化および／または抗原提示作用の増強を誘導し、また、NF−κBの核移行またはMAPキナーゼの活性化を誘導する可能性のあるTRRシグナル伝達経路を阻害する。したがって、このTRRシグナル伝達経路は、樹状細胞などのAPCで未成熟なものを未成熟型のまま維持し、NF−κBを不活性型のまま維持することに寄与すると考えられる。TRRシグナル伝達経路を活性化させると、樹状細胞などAPCの未成熟型の、例えばGM−CSFおよびIL4のような成熟因子に対する応答を低下させることがある。すなわち、樹状細胞などのAPCの成熟型が形成される数を減少させるか、または、樹状細胞などのAPCの成熟したものを所定数形成するのに必要とされる成熟因子の倍数または用量を増加させることがある。TRRシグナル伝達経路が活性化すると、樹状細胞などのAPCの検査であり、当業者に周知の作用であるMLR（混合リンパ球培養反応）を誘導する、樹状細胞などのAPCの成熟型の能力が低下する可能性がある。樹状細胞などのAPCを同種異系性T細胞とインキュベートして、例えば、6日後にトリチウム標識したチミジンの取り込みを測定して細胞の増殖を測定する。例えば、105個のT細胞を、段階的な用量（例えば、ウェル当たり50から10000個）の樹状細胞とともに96穴の丸底マイクロタイタープレート中で平板培養することができる。
【００１６】
典型的には、APCは、粘膜細胞、マクロファージまたはB細胞などの専門的な抗原提示細胞である。MHCクラスII分子が専門的APC中に見出されている。専門的APCは、Mellmanら、（1998）  Trends  Cell  Biol．  8，  231−237によって定義されているようにCD80およびCD86などの共刺激分子が存在するという特徴を有する。
【００１７】
典型的には、経路を刺激された、単離された前駆細胞または樹状細胞は、刺激されていない細胞に比べて、より大量のHLA−DR、MHCクラスIおよびCD80／86を発現する。
【００１８】
抗原提示作用が増強されると調節を受けるDC表面マーカーのリストが、Banchereauら、（2000）  Ann．  Rev．  Immunol．に示されている。樹状細胞表面マーカーは、高量のCCR1、CCR5、CCR6ケモカインレセプター、低量のCCR7ケモカインレセプター；高量のCD68；低量のMHCクラスI（HLA−A，  B，  C）およびMHCクラスII（HLA−DR、HLA−DQおよびHLA−DP）；低量のCD40、CD54、CD80、CD83およびCD86などの共刺激分子を含み、DC−LAMPを含まない。強い抗原提示を行う活性化DCは、低量のCCR1、CCR5、CCR6；高量のCCR7；低量のCD68；高量の表面MHCクラスIおよびII；高量のCD40、CD54、CD58、CD80、CD83、CD86などの共刺激分子；高量のDC−LAMP；および高量のp55ファシン（fascin）を有する。
【００１９】
「Toll関連レセプター（TRR）シグナル伝達の阻害因子」という用語には、APC（DCなど）TRRシグナル伝達経路における以下のステップのいずれか１つの調節因子を含むことがある。
i）TRRへのアゴニストまたはアンタゴニストの結合、すなわち、細胞外分子へのTRRの結合。
ii）細胞内分子（TRR相互作用分子）、例えばポリペプチド、例えばアダプター分子、例えば、Tollドメインを含む分子、例えばMyD88、Mal（Fitzgeraldら（2001）Nature  415，  78−83）、TIRAP（Horngら（2001）Nature  Immunol  7，  835−841）またはTollIP（Burnsら（2000）Nature  Cell  Biol  2，  346−351）へのTRRの結合。
iii）TRR相互作用分子による、第二の細胞内分子、例えばポリペプチドへの結合。例えば、MyD88は、上記したように、デスドメイン（DD）を含むポリペプチドに結合することができる。DCなどのAPCにおいてMyD88に結合する分子は、IRAKまたはTRAF−6であり、またはTollIPであるかもしれない。IRAKについてはMedzhitovら（1988）Mol．  Cell  2，  253−258に記載されており、IRAK2についてはMuzioら（1997）Science  278，  1612−1615に記載されており、TollIPについてはBurnsら（2000）Nature  Cell  Biol．  2，  346−351に記載されており、また、TRAF6についてはDushayとEldon（1998）Am  Ｊ  Hum．  Genet．  62，  10−14、およびCaoら（1996）Nature  383，  443−446に記載されている。
iv）さらに、未成熟DCの成熟の阻害をもたらすシグナル伝達ステップ（例えば、ポリペプチドに関する：ポリペプチド結合、またはポリペプチドのリン酸化状態の変化、または特定のホスホイノシチド量の変化；可能性は当業者に周知されているはずである）。このさらなるシグナル伝達ステップは、不活性型のNF−κBの持続を増強することができる。さらなるシグナル伝達ステップの一例として、第二の細胞内分子は、第三またはさらなる細胞内分子、例えば、IκBキナーゼまたはMAPキナーゼなどのポリペプチドと相互作用することができる。この相互作用は、ポリペプチドの共有結合修飾における変化、例えば、第二の細胞内分子による第三の細胞内ポリペプチドのリン酸化もしくは脱リン酸化、またはタンパク質分解による切断もしくはユビキチン化を含む。
【００２０】
上記のように、樹状細胞などのAPCは、NF−κBの核移行（活性化）を阻害するTRRシグナル伝達経路をもつと考えられている。したがって、NF−κBの活性化／核移行を増加させる化合物は、DCなどのAPCにおけるTRRシグナル伝達の活性化因子であるとは考えられないということになろう。
【００２１】
同様に、NF−κBの活性化／核移行を阻害する化合物は、DCなどのAPCにおけるTRRシグナル伝達の阻害因子であるとは考えられない。
【００２２】
DCなどのAPCにおけるTRRシグナル伝達の阻害因子または増強因子は、シグナル伝達経路の構成要素に作用しないか、またはAPC阻害性TRRシグナル伝達経路およびNF−κBの活性化をもたらすAPC内のシグナル伝達経路に共通するステップに作用しないことが好ましい。
【００２３】
APCにおけるTRRシグナル伝達の阻害因子または増強因子は、上記ステップ（i）、（ii）または（iii）の１つ、好ましくは、ステップ（ii）または（iii）で作用することが好ましい。このように、APCにおけるTRRシグナル伝達の阻害因子または増強因子は、細胞外分子のTRRへの結合（すなわち、TRRの細胞外部位への結合）を調節するか、または細胞内分子のTRRへの結合（すなわち、TRRの細胞内部位への結合）を調節するか、またはかかる細胞内分子のさらに別の細胞内分子への結合を調節するように作用することが好ましい。TRRシグナル伝達の阻害因子または増強因子は、（機能的な）MyD88のTRRへの結合、または（機能的な）MyD88のさらに別の細胞内分子、例えば、DDを含むポリペプチドへの結合を調節することが特に好ましい。すなわち、DCなどのAPCにおけるTRRシグナル伝達の阻害因子または増強因子は、MyD88に直接関係するシグナル伝達ステップを調節するように作用することが好ましい。
【００２４】
または、DCなどのAPCにおけるTRRシグナル伝達の調節因子、例えば阻害因子または増強因子は、別のTRR相互作用分子またはアダプター、例えばMal（Fitzgeraldら（2001））またはTIRAP（Horngら（2001））またはTollIP（Burnsら（2000））に直接関係するシグナル伝達ステップを調節するよう作用することが好ましい。例えばTIRAPおよびMalは、どちらもTIRドメインを含むが、デスドメイン（DD）は含まない。野生型TIRAPまたは野生型Malは、DCなどのAPCにおいて、機能的DDを欠失したMyD88の変異体に対して類似した効果、例えば、MyD88lprに対するのと同様の効果を示すと考えられる。TollIPはDDを含むことがある。機能的DDを欠失したTollIPの変異体は、DCなどのAPCにおいて、機能的DDを欠失したMyD88の変異体に対して類似した効果、例えば、MyD88lprに対するのと同様の効果を示すと考えられる。
【００２５】
DCなどのAPCにおけるTRRシグナル伝達の調節因子は、TIRAPもしくはMal、またはその断片、融合体、もしくはバリアントである。代替的には、TollIP（Burnsら（2000））、またはその断片、融合体もしくはバリアントでもよい。
【００２６】
また、阻害因子は、TRRをコード化するmRNAを選択的に破壊するリボザイム、またはTRRの転写を妨害するアンチセンス分子でもよい。
【００２７】
本明細書に開示されたウイルスまたはウイルス様粒子のゲノムにコードされている可能性のあるリボザイムが、米国特許第5，180，818号のCechとHerschlagによる「一本鎖DNAの部位特異的切断（Site−specific  cleavage  of  single  stranded  DNA）」、米国特許第5，168，053号のAltmanらによる「RNAse  Pによる標的RNAの切断（Cleavage  of  targeted  RNA  by  RNAse  P）」、米国特許第5，149，796号のCantinらによる「HIV−1  RNAのリボザイム切断（Ribozyme  cleavage  of  HIV−1  RNA）」、米国特許第5，116，742号のCechらによる「RNAリボザイム制限エンドリボヌクレアーゼと方法（RNA  ribozyme  restriction  endoribonucleases  and  methods）」、米国特許第5，093，246号のBeenらによる「RNAリボザイムポリメラーゼ、脱リン酸化酵素、制限酵素、およびその方法（RNA  ribozyme  polymerases，  dephosphorylases，  retriction  endonucleases  and  methods）」、および米国特許第4，987，071号のBeenらによる「RNAリボザイムポリメラーゼ、脱リン酸化酵素、制限酵素、およびその方法；エステル転移反応による、特異的部位における一本鎖RNAを切断する（RNA  ribozyme  polymerases，  dephosphorylases，  retriction  endoribonucleases  and  methods；  cleaves  single−stranded  RNA  at  specific  site  by  transesterification）」に記載されており、これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる。
【００２８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖の核酸であり、相補的な核酸配列に特異的に結合しうる。適切な標的配列に結合することによって、RNA−RNA、DNA−DNA、またはRNA−DNAという二重鎖を形成する。これらの核酸は、遺伝子のセンス鎖またはコード鎖に相補的であるため、しばしば「アンチセンス」と呼ばれる。最近では、オリゴヌクレオチドがDNA二重鎖に結合すると三重らせんの形成が可能であることが証明されている。オリゴヌクレオチドは、DNA二重らせんの主溝中の配列を認識できることが発見された。それによって三重らせんが形成された。このことは、主溝の水素結合部位を認識して二本鎖DNAに特異的に結合する配列特異的な分子の合成が可能であることを示唆するものである。
【００２９】
標的核酸に結合することによって、上記オリゴヌクレオチドは、標的核酸の機能を阻害することができる。これは、例えば、転写の遮断、プロセッシング、ポリ（A）付加反応、複製、翻訳、または、RNAの分解増強など細胞の阻害機作の増強という結果をもたらしうる。
【００３０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは実験室で調製して、次に例えばマイクロインジェクションまたは細胞培養培地から細胞中に取り込ませることによって細胞内に導入する。または、アンチセンス遺伝子をもつプラスミド、レトロウイルスもしくは別のベクターによってトランスフェクションした後、細胞内で発現させる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、まず、ラウス肉腫ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス1型、シミアンウイルス、およびインフルエンザウイルス用の細胞培養物におけるウイルスの複製または発現を阻害することが発見された。それ以後、アンチセンスオリゴヌクレオチドによるmRNAの翻訳の阻害が、ウサギ網状赤血球溶解物およびコムギ胚芽抽出物などの無細胞系で広範に研究されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドによってウイルスの機能が阻害されることが、AIDS  HIVレトロウイルスRNAに相補的なオリゴヌクレオチドを用いてインビトロで実証されている（Goodchild，  Ｊ．  1988  「アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドによるヒト免疫不全症ウイルスの複製阻害（Inhibition  of  Human  Immunodeficiency  Virus  Replication  by  Antisense  Oligodeoxynucleotides）」，  Proc．  Natl．  Acad．  Sci．  （USA）  85（15），  5507−11）。Goodchildによる研究は、最も効果的なオリゴヌクレオチドは、ポリ（A）シグナルに相補的なものであることを明らかにした；また、プライマー結合部位に隣接していて、かつプライマー結合部位であるRNAの5'末端、特に、キャップおよび5'側非翻訳領域を標的とするものも効果的であった。キャップ、5'側非翻訳領域、およびポリ（A）シグナルは、レトロウイルスRNAの末端で反復している配列（R領域）の内側にあり、これらに相補的なオリゴヌクレオチドは、RNAに2回結合することができる。
【００３１】
典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが15から35塩基である。例えば、20塩基長のオリゴヌクレオチドは、上皮成長因子レセプターのmRNAの発現を阻害することが示されており（Wittersら、Breast  Cancer  Res  Treat  53：  41−50  （1999））、また、25塩基長のオリゴヌクレオチドは、副腎皮質刺激ホルモンの発現を90％以上減少させることが示されている（Frankelら、Ｊ  Neurosurg  91：261−7  （1999））。しかしながら、例えば、10、11、12、13もしくは14塩基、または36、37、38、39、または40塩基などという、この範囲に含まれない長さのオリゴヌクレオチドを使用することが望ましいこともあるのは当然である。
【００３２】
アンチセンス核酸は、適切なベクターによってコード化されていよう。
【００３３】
本発明のさらなる局面は、抗原提示の増強を必要とする患者を治療する方法であって、患者に、または患者の樹状細胞などの抗原提示細胞もしくは前駆細胞にToll関連レセプター（TRR）シグナル伝達の調節因子、好ましくは阻害因子を供給するステップを含む方法を提供する。この調節因子は、DCなどのAPCを活性化する。この調節因子は、キナーゼ経路、例えばMAPキナーゼp42またはp44/erkl/erk2、p54/Jnk、p38MAPキナーゼまたはNFκBなどの一定のシグナル伝達経路を活性化することができる。調節因子または阻害因子は、MyD88、Mal、TIRAPもしくはTollIP、またはその断片、融合体もしくはバリアント、好ましくは、機能的なTIRを保持しているが、機能的なDDを持たない（例えば、DDを持たないか、またはDDとして機能しない変異DDをもちうる、例えば、別の（機能的な）DDと相互作用しない）ことがある断片、融合体もしくはバリアントでありうる。
【００３４】
したがって、本発明の更なる局面は、抗原提示の増強を必要とする患者を治療する方法であって、患者に、または患者の樹状細胞などの抗原提示細胞もしくは前駆細胞にMyD88、Mal、TIRAPもしくはTollIPを供給するステップを含む方法を提供する。MyD88、Mal、TIRAPもしくはTollIPには、それらの断片、融合体もしくはバリアント、好ましくは、機能的なTIRを保持しているが、機能的なDDを持たなくてもよい断片、融合体もしくはバリアントが含まれる。
【００３５】
本発明のさらなる局面は、抗原提示の抑制を必要とする患者を治療する方法であって、患者に、または患者の抗原提示樹状細胞もしくは前駆細胞にToll関連レセプター（TRR）シグナル伝達の調節因子、好ましくは増強因子を供給するステップを含む方法を提供する。調節因子または増強因子は、MyD88、MalまたはTIRAPまたはTollIPの断片、融合体もしくはバリアント（または、MyD88、MalまたはTIRAPまたはTollIPでもよい）、好ましくは、MyD88、MalまたはTIRAPまたはTollIPそれぞれの結合特性または触媒特性の全部ではないが、いくつかを保持している断片、融合体もしくはバリアントでありうる。この調節因子または増強因子は、APC、例えばDCを阻害し、例えば、APC 、例えばDCによる抗原提示を阻害する。この調節因子は、キナーゼ経路、例えばMAPキナーゼp42またはp44/erkl/erk2、p54/Jnk、p38MAPキナーゼまたはNFκBなどの一定のシグナル伝達経路を阻害することができる。
【００３６】
本発明の更なる局面は、抗原提示の抑制を必要とする患者を治療する方法であって、患者に、または患者の抗原提示樹状細胞もしくは前駆細胞にMyD88、Mal、TIRAPもしくはTollIPの断片、融合体もしくはバリアントを供給するステップを含む方法を提供する。この断片、融合体またはバリアントは、APC、例えばDCを阻害し、例えば、APC、好ましくはDCによる抗原提示を阻害する。好ましくは、この断片、融合体またはバリアントは、MyD88、Mal、TIRAPまたはTollIPそれぞれの結合特性または触媒特性の全部ではないが、いくつかを保持している。
【００３７】
本発明の更なる局面は、抗原提示の増強を必要とする患者を治療する方法であって、患者に、または患者の樹状細胞などの抗原提示細胞（APC）もしくは樹状前駆細胞に、MyD88に直接関与するシグナル伝達ステップ（DCなどのAPCで生じる）の阻害因子を供給するステップを含む方法を提供する。この阻害因子は、ドミナントネガティブな変異型MyD88でもよい。
【００３８】
本発明の更なる局面は、抗原提示の増強を必要とする患者を治療する方法であって、患者に、または患者の樹状細胞などの抗原提示細胞もしくは前駆細胞に、MyD88のドミナントネガティブな変異体を供給するステップを含む方法を提供する。
【００３９】
ドミナントネガティブな変異体は、デスドメイン（DD）もしくはTollドメイン、またはその一部を含む分子の断片を含んでいるかもしれないMyD88の一部を含む。いくつかの例が参考文献（5）に記載されている。好ましくは、ドミナントネガティブな変異体は、線維芽細胞またはHUVECにおけるIRAKの活性化またはサイトカインの産生などによる、IL-1またはTRRによるシグナル伝達を阻害するものである。
【００４０】
本発明の更なる局面は、抗原提示の抑制を必要とする患者を治療する方法であって、患者に、または患者の樹状細胞などの抗原提示細胞（APC）もしくは前駆細胞に、MyD88に直接関与するシグナル伝達ステップ（DCなどのAPCで生じる）の増強因子を供給するステップを含む方法を提供する。この増強因子は、機能型MyD88、例えば野生型MyD88でもよい。
【００４１】
好ましくは、シグナル伝達の阻害因子または増強因子（例えば、TRRシグナル伝達の阻害因子もしくは増強因子、またはMyD88に直接関与するシグナル伝達ステップの阻害因子もしくは増強因子）は、樹状細胞などのAPC、もしくは前駆細胞を特異的に標的とするが、このことは本質的ではないかもしれない。
【００４２】
シグナル伝達の阻害因子または増強因子は、阻害因子または増強因子を患者または患者の細胞に投与することによって、または患者の細胞の中で発現させることによって患者または患者の細胞に供給することができる。したがって、供給は、シグナル伝達の阻害因子または増強因子をコード化する（また発現することができる）組換えポリヌクレオチドを患者に（または、患者のAPCまたは前駆細胞；例えば、操作のために患者から取り出し、その後患者に戻す細胞などに）投与することによって遂行することができる。
【００４３】
この増強因子は、MyD88シグナル伝達活性を上昇させることができる。例えば、増強因子は、野生型の活性をもつMyD88分子でもよく、または構成的に活性のあるMyD88分子でもよい。例えば、この増強因子は、機能的なTollドメインを持たない（すなわち、Tollドメインに結合することのできるドメインを持たない）MyD88分子でもよい；それは、Tollドメインが欠失および/または非機能的になっているMyD88変異体、例えば（5）に記載されているようなMyD88-DDポリペプチドであってもよい。あるいは、MyD88変異体は、デスドメインが欠失および/または非機能的になっているもの、例えばMyd88lprでもよい。従って、例示したように、野生型MyD88を発現することができる組換えポリヌクレオチドを患者に投与することができる。
【００４４】
野生型活性をもつMyD88分子は野生型MyD88であってもよく、好ましくはマウスヒト野生型MyD88であり、さらに好ましくは、マウスまたはヒトのDCで発現するMyD88であり、または、野生型MyD88の活性を保持している、すなわち、機能的なTollドメインと機能的なデスドメイン（DD；すなわち、デスドメインに結合することができるドメインをもつ）を有する変異MyD88であってもよい。MyD88のTollドメインおよび/またはDDは未変異であること、すなわち、これらのドメイン以外のところに変異があることが好ましい。
【００４５】
MyD88は、Hardimanら（1996）Oncogene 13, 2467-2475; またはBonnertら（1997） FEBS Lett. 402, 81-84; またはHardimanら（1997）Genomics 45, 332-339に記載されている配列を有することが好ましい。それらの配列はすべてヒトのものである。ヒトの配列は、ジェンバンク（GenBank）アクセッション番号NM-002468にも記載されている。
【００４６】
マウスのMyD88配列は、Harrochら（1995）Nucl. Acids Res. 23, 3539-3546、およびHardimanら（1997）Genomics 45, 332-339、およびジェンバンクアクセッション番号NM-010851に記載されている。
【００４７】
ヒトのMyD88は、アミノ酸配列において、マウスMyD88と82％一致する。
【００４８】
TIRAPのヒトおよびマウスの配列は、Horngら（2001）Nature Immunol 7, 835-841、ならびにジェンバンクアクセッション番号AF378129およびAF378130にそれぞれ記載されている。
【００４９】
Malのヒトおよびマウスの配列は、Fitzgeraldら（2001）Nature 413, 78-83に記載されている。
【００５０】
TollIPのヒト、マウス、および線虫（C. elegans）の配列は、Burnsら（2000）Nature cell Biol 2, 346-351に記載されている。
【００５１】
当業者には周知されているように、変異は保存的置換が好ましい。「保存的置換」とは、Gly、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；およびPhe、Tyrなどの組み合わせを意味する。変異は、当業者に周知されているタンパク質工学法および部位特異的変異誘発法を用いて作出することができる。
【００５２】
本明細書においては、IUPAC-IUB生化学物質命名委員会（Biochemical Nomenclature Commission）の3文字および1文字のアミノ酸コードを使用する。ポリペプチドの配列は、慣習通りN-末端からC-末端に記載してある。アミノ酸はL-アミノ酸であることが好ましいが、D-アミノ酸残基でもよい。
【００５３】
MyD88シグナル伝達の増強因子は、MyD88またはMyD88の結合パートナーに結合する、例えば、MyD88のシグナル伝達活性を阻害する結合パートナーに結合することによって作用することができる。例えば、MyD88lprは、TRRシグナル伝達の天然阻害因子を変換することによって作用することができる。天然阻害因子は、TNFαシグナル伝達を阻害するSODDポリペプチドに関連しうる。SODDはJiangら（1999）Science 283、1852-1855に記載されている。
【００５４】
阻害因子は、MyD88シグナル伝達活性の阻害因子でもよい。これは、MyD88またはMyD88の結合パートナーに結合して、MyD88が結合パートナーに結合するのを阻害しうる。これはMyD88を経由するシグナル伝達を破壊しうる。例えば、阻害因子は、MyD88がTRRのTollドメインに結合することを阻害でき、および/またはDD、例えばIRAKまたはTRAF-6またはTollIPを含むポリペプチドにMyD88が結合するのを阻害することができる。
【００５５】
阻害因子または増強因子は薬物様化合物でもよい。「薬物様化合物」という用語は当業者に周知であり、医薬において使用するのに適切にしうる特徴、例えば、医薬の有効成分としての特徴をもつ化合物という意味を含みうる。したがって、例えば、薬物様化合物は、有機化学技術によって、あまり好ましくはないが分子生物学技術または生化学技術によって合成しうる分子であってよく、好ましくは、5000ダルトン未満でありうる低分子である。さらに、薬物様化合物は、特定の１つまたは複数のタンパク質と選択的に相互作用する特徴を示し、生物利用可能があり、および/または細胞膜を貫通することができるかもしれないが、これらの特徴は本質的ではないことが認識されるであろう。
【００５６】
阻害因子または増強因子は抗体でもよいが、この用語は、当業者に知られているように、抗体断片または抗体様分子を含む。好ましくは、抗体はMyD88（または、例えば、Mal、TIRAPまたはTollIPなどの他のアダプター分子）、またはMyD88の結合パートナー（または、他のアダプター分子）に結合する。例えば、抗体は、MyD88のDDに（および/またはMyD88の結合パートナーのDDに）結合してもよく、MyD88の結合パートナーのDDへの MyD88の結合を破壊できる。あるいは、抗体はMyD88のTollドメインに（および/またはMyD88の結合パートナーのTollドメインに）結合してもよく、MyD88の結合パートナーのTollドメインへの MyD88の結合を破壊できる。好ましくは、抗体は、野生型マウスMyD88のPhe56に相当する残基を含むMyD88のエピトープに結合することができる。
【００５７】
抗体には、下記で詳しく検討するように、抗体もしくは別の免疫グロブリン、またはその断片もしくは誘導体が含まれる。
【００５８】
抗体の可変重鎖（VH）ドメインおよび可変軽鎖（VL）ドメインは抗原認識に関与するが、これは初期のプロテアーゼ分解実験で初めて認められた事実である。齧歯類の抗体を「ヒト化」することによって、更なる確認が得られた。齧歯類に由来するものの可変ドメインを、得られた抗体が齧歯類を親とする抗体の抗原特異性を保持するように、ヒト由来の定常ドメインに融合させることができる（Morrisonら（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855）。
【００５９】
抗原特異性が可変ドメインにより与えられ、定常ドメインとは無関係であることが、一個以上の可変ドメインをすべてが含む抗体断片の細菌での発現に関する実験から知られている。これらの分子は、Fab様分子(Betterら（1988） Science 240, 1041)；Fv分子（Skerraら（1988）Science 240, 1038）；VHおよびVLパートナードメインが、可動性オリゴペプチドを介して連結している単鎖Fv（ScFv）分子（Birdら（1988） Science 242, 423； Hustonら（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879）、および、単離されたVドメインを含む単一ドメイン抗体（dAbs）（Wardら（1989）Nature 341, 544）を含む。特異的結合部位を保持している抗体断片の合成に関係する技術の総説は、WinterとMilstein（1991）Nature 349, 293-299に見出される。
【００６０】
「ScFv分子」とは、VHおよびVLパートナードメインが可動性オリゴペプチドを介して連結している分子を意味する。
【００６１】
抗体全部ではなく抗体断片を使用することの利点は数倍ある。断片のサイズが小さいほど、優れた薬理学的性質がもたらされるかもしれない。補体結合など、全抗体のエフェクター機能は失われている。Fab、Fv、ScFvおよびdAbという抗体断片はすべて、大腸菌の中で発現させて、大腸菌から分泌させることによって、大量の該断片を容易に生産することが可能になる。断片は、患者の細胞の中で発現させることもできる。
【００６２】
全抗体およびF(ab')2断片は「二価性」である。「二価性」とは、前記抗体およびF(ab')2断片が、2つの抗原結合部位を有することを意味する。これに対して、Fab、Fv、ScFvおよびdAbという断片は一価性で、一つの抗原部位しかない。
【００６３】
好ましくは、抗体は、105.M-1から約1012.M-1、より好ましくは少なくとも108.M-1以上のエピトープに対する親和性を有する。
【００６４】
選択したポリペプチドに対して反応性のある抗体は、当技術分野において周知の方法によって作製することができる。特に、抗体はポリクローナルかモノクローナルでありうる。
【００６５】
選択した抗原に適したモノクローナル抗体は、公知の技術、例えば、H Zola,「モノクローナル抗体：技術マニュアル（Monoclonal Antibodies: A manual of techniques）」（CRCプレス(CRC Press), 1988）、およびJ G R Hurrell、「モノクローナルハイブリドーマ抗体：技術と応用（Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications）」（CRCプレス(CRC Press), 1982）に開示されている技術によって調製することができる。キメラ抗体は、Neubergerら（1988、第8回国際バイオテクノロジーシンポジウム（8th International Biotechnology Symposium）、第2部、792-799頁）によって検討されている。適切に調製された非ヒト抗体は、既知の方法で、例えば、マウス抗体のCDR領域をヒト抗体のフレームワークに挿入することによって、「ヒト化」することができる。
【００６６】
抗体を調製する技術は、例えば、Harlow, EDとLane, D「抗体：実験マニュアル（Antibodies: a laboratory manual）」（1988）ニューヨークにあるコールドスプリングハーバー研究所（New York Cold Spring Harbor Laboratory）に記載されているように、当業者に周知である。適切な抗体、および、適切な抗体を調製する技術は、（5）に記載されているだろう。
【００６７】
抗体（特に抗体断片）は、細胞、例えばDCによる抗体の取り込みを増強させる部分に連結することができる。例えば、抗体は、当業者に知られているように、分子または相互作用するポリペプチドの細胞への取り込みを増強することができる親油性分子またはポリペプチドドメインに連結させることができる。つまり、この部分は、アンテナペディアヘリックス3（Derossiら（1998）Trends Cell Biol 8, 84-87）から、または、細胞への侵入を可能にするHIVの配列、一般的にはtatから得ることができる。代替的には、抗体をコードするポリヌクレオチド、例えばcDNAは、ベクター中に伝達され、上記に示したように細胞中での抗体の発現を可能にする。
【００６８】
阻害因子は、阻害型MyD88分子、好ましくはドミナントな阻害型MyD88分子（すなわち、例えば、野生型と阻害型のMyD88分子が存在する細胞の中で、野生型MyD88分子によってシグナル伝達を阻害することができる）であろう。阻害は、内因性野生型MyD88と内因性MyD88の結合パートナー、例えばTRRとの相互作用を遮断することによって生じる。
【００６９】
阻害型MyD88分子は、DD、例えば、MyD88のDD、またはIRAKもしくはTRAF-6のDDにMyD88よりも結合しにくい、好ましくは、実質的に結合できないMyD88分子であろう。例えば、阻害型MyD88分子は、MyD88と比べてDDを介して二量体化しにくい、好ましくは、実質的に二量体化できない。阻害型MyD88分子は、変異したMyD88分子、例えばDDが、例えば非保存的変異によって変異しているMyD88分子でもよい。例えば、マウスの全長MyD88のPhe56に相当する位置で、例えばAsnに変異させることができる。それは、MyD88のN末側にある53個のアミノ酸も欠失しているMyD88lpr(5)と名付けられた変異MyD88分子であってもよい。野生型MyD88、例えばマウス野生型MyD88と比較すると、MyD88lprには点突然変異がある（F56N；マウスの配列の番号付けによる）。この点突然変異はDDに存在し、DDの二量体化を妨げる（5）。この変異は、Fasの細胞傷害性シグナル伝達を、おそらくDDドメインのコンフォメーションを破壊することによって無効にすることが知られているlprcp変異に対応する（Nagata（1994）Semin Immunol 6, 3-8; Huangら（1996）Nature 384, 638-641）。
【００７０】
野生型MyD88およびドミナントネガティブMyD88（MyD88-lpr）の構成が公表されている（Burns K.ら、J Biol. Chem, 1998）が、MyD88-lprは、そのデスドメインにおける単一アミノ酸変異であり、そこでPhe56がAsnに変異していると、誤って記載されている。この変異は、デスドメインのコンフォメーションを破壊することによって、その下流のシグナル伝達を無効にするFasリガンドのデスドメインに存在するlprcp変異に相当する。実際、点突然変異に加えて、53個のアミノ酸からなるN末側ドメインには欠失がある（ジェンバンク配列の1〜159塩基対が失われている）。この欠失によって、デスドメインの一部が失われる結果となる。
【００７１】
阻害型MyD88は、MyD88の切断型、例えば、デスドメインと呼ばれるドメインの全部または一部が欠失しているMyD88分子であってもよい。阻害型MyD88分子は、デスドメインに結合する能力がないか、または、野生型MyD88分子に比べて弱い。
【００７２】
阻害型MyD88は、機能型Tollドメイン、すなわち、Tollドメインと相互作用可能なTollドメイン、例えば、野生型MyD88、例えば、ヒトまたはマウスの野生型MyD88 のTollドメインまたはTRRを含むことが好ましい。阻害型MyD88は、完全長のTollドメインを含むことが好ましい。完全長のTollドメインは、Toll-Tollドメイン相互作用に必要であろう。理論に束縛されるわけではないが、阻害型MyD88は、次に、Tollレセプター分子のTollドメインに結合して、野生型MyD88がTollレセプターに結合するのを阻害し、このレセプター分子からのシグナル伝達を阻害する。
【００７３】
タンパク質-タンパク質相互作用（およびそれらの増強または破壊）を測定する方法は当業者に周知されている。DDおよびToll-Toll相互作用を測定するのに適した方法は、（5）にも記載されている。適当な方法には、例えば、酵母のツー-ハイブリッド相互作用法、同時精製法、ELISA法、共免疫沈降法、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）技術、および表面プラズモン共鳴法などがある。したがって、ELISA法、共免疫沈降法もしくは表面プラズモン共鳴法によって、または酵母のツー-ハイブリッド相互作用法もしくは同時精製法によって、MyD88ポリペプチドと、DDまたはTollドメインを含むポリペプチドとの間の相互作用が検出できれば、前記MyD88分子はDDまたはTollドメインに結合するか、相互作用することができると考えられるであろう。好ましい方法は表面プラズモン共鳴法である。
【００７４】
阻害因子または増強因子は、ペプチド模倣化合物、例えば、上記したポリペプチド阻害因子または増強因子に相当するペプチド模倣化合物であってもよい。
【００７５】
「ペプチド模倣」という用語は、治療薬としての特定のペプチドのコンフォメーションや望ましい特徴を模倣するが、望ましくないおそれがある特徴は回避する化合物を意味する。例えば、モルヒネは、経口投与することのできる化合物であり、ペプチドであるエンドルフィンのペプチド模倣薬である。
【００７６】
経口による生物利用可能性がなく、蛋白質分解されてしまうため、ペプチドを伴う治療への応用には限度がありうる。典型的には、例えば、ペプチドは、エキソペプチダーゼおよびエンドペプチダーゼによってインビボで速やかに分解され、通常、非常に短い生物学的半減期を生じる。潜在的治療薬としてのペプチドのもう一つの短所は、経口投与によって生物が利用できないことである。胃腸管におけるタンパク質分解酵素によるペプチド分解が重要な原因である可能性が高い。しかし、速やかな代謝物不活性化が行われない低分子の環状ペプチドでも、相変わらず経口による低い生物利用可能性を示すことが認められるため、問題はさらに複雑である。これは、腸膜を通過する輸送量が低いことと、肝臓による抽出およびそれに続く腸への排出によって血液から速やかに除去されることによる可能性が高い。これらの観察結果は、複数のアミド結合が、経口による生物利用可能性を妨げていることを示唆している。ペプチド鎖におけるアミノ酸残基を連結するペプチド結合は、ペプチド薬物が経口投与されると開裂すると考えられる。
【００７７】
ペプチド模倣薬の設計と合成には、いくつか異なった方法がある。ShermanとSpatola, J. Am. Chem. Soc., 112:433 (1990)によって開示されているような方法では、一つ以上のアミド結合が、さまざまな化学官能基によって、本質的にイソテリックに（isoteric manner）置換されている。この段階的な方法は、活性型の類似化合物が得られるという点で、いくらかの成功を収めてきた。いくつかの場合に、これらの類似化合物は、天然のものに較べて長い生物学的半減期をもつことが示されている。それにもかかわらず、この方法には限界がある。一個より多いアミド結合の置換に成功することは稀である。従って、得られる類似化合物は、その分子のどこか別のところで酵素による不活性化に対して感受性のままになっている。ペプチド結合を置換するとき、新しいリンカー部分が、実質的に同一の電荷分布と、ペプチド結合として実質的に同一の平面性をもつことが好ましい。
【００７８】
例えば、Meziereら（1997）J. Immunol. 159 3230−3237に記載の方法など、当技術分野において公知の方法を用いて、ペプチド結合が逆になっているレトロインベルソ（retro−inverso）ペプチド模倣薬を合成することができる。この方法は、側鎖の方向ではなく、基本骨格に関する変化を含む疑似ペプチドを作製することに関する。レトロインバースペプチドは、CO−NHペプチド結合ではなくNH−CO結合を含むが、タンパク質分解にはずっと強い抵抗性がある。
【００７９】
別の方法では、D−アミノ酸およびN−メチルアミノ酸など、さまざまな非コードまたは被修飾アミノ酸が、哺乳動物のペプチドを修飾するために用いられている。または、推定された生物活性型コンフォメーションを、環状化などの共有的修飾によって、またはγ−ラクタム、もしくはそれ以外タイプの架橋を取り込むことによって安定化してきた。例えば、Veberら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 2636 （1978）、およびThursellら、Biochem. Biophys. Res. Comm., 111: 166 (1983)を参照のこと。
【００８０】
合成法の多くに共通するテーマは、ペプチドを基礎とする枠組みの中に何らかの環状部分を導入することであった。環状部分はペプチド構造の立体空間を制約し、その結果、しばしば、特定の生物学的レセプターに対するペプチドの親和性が高まる。この方法の別の利点は、環状部分をペプチドの中に導入することでも、細胞性ペプチダーゼに対する感受性が低下したペプチドを得られる可能性があることである。
【００８１】
安定化環状ペプチド模倣薬の合成法の一つが閉環メタセシス（RCM）法である。この方法は、ペプチド前駆体を合成するステップ、それをRCM触媒に接触させて立体構造的に制約されたペプチドを得るステップを含む。適当なペプチド前駆体は、２個以上の不飽和C−C結合を含みうる。この方法は、固相ペプチド合成技術を用いて実施することができる。この実施態様において、前駆体は、固相支持体に固定されていて、RCM触媒と接触している。次いで、生成物が固相支持体から切断されて、立体構造的に制約されたペプチドが得られる。
【００８２】
本発明の方法を用いて、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシなどの哺乳動物を治療しうる。好ましくは、本方法は、人間の患者を治療するために使用される。
【００８３】
本発明の更なる局面は、抗原提示の阻害因子である化合物を同定する方法であって、樹状細胞またはAPCの前駆細胞などの抗原提示細胞において、TRRシグナル伝達、例えば、MyD88シグナル伝達を調節する、好ましくは活性化することができる化合物を同定するステップを含む方法を提供する。好ましくは、例えばポリペプチドなどの相互作用分子とMyD88との相互作用における変化、例えば、TRRへのMyD88による結合の増加を観察することによって、TRRシグナル伝達の調節、例えば活性化を検出しうる。
【００８４】
本発明の更なる局面は、抗原提示の増強因子である化合物を同定する方法であって、樹状細胞またはAPCの前駆細胞などの抗原提示細胞において、TRRシグナル伝達、例えば、MyD88シグナル伝達を調節する、好ましくは抑制（またはMal、TIRAPもしくはTollIPのシグナル伝達を増強）することができる化合物を同定するステップを含む方法を提供する。阻害されるTRRシグナル伝達は、上記したように、DCの成熟または機能を阻害するシグナル伝達である。好ましくは、例えばポリペプチドなどの相互作用分子とMyD88との相互作用における変化、例えば、TLRへのMyD88による結合の減少を観察することによって、TRRシグナル伝達の抑制を検出することができる。
【００８５】
IRAKまたはMAPキナーゼ活性の変化を観察しうる。IRAK活性はMyD88lprによって上昇されうる。
【００８６】
本発明の更なる局面は、例えば、DCなどのAPCによる抗原提示の阻害因子または増強因子である化合物を同定する方法であって、被験化合物を、MyD88、またはMyD88のAPC結合パートナー（すなわち、DCなどのAPC、またはその前駆細胞に存在するMyD88の結合パートナー）に曝露するステップ、および、その化合物が、MyD88、またはMyD88のAPC結合パートナーに結合できるかを判定するステップを含む方法を提供する。そのように結合できる化合物が選ばれる。好ましくは、本方法は、さらに、その化合物が、MyD88のAPC結合パートナーへのMyD88の結合を阻害するか増強するかを判定するステップ、および、そのような結合を阻害するか増強することができる化合物を選択するステップを含む。化合物は、例えば、DCの成熟または抗原提示に対する効果を観察することによって更に試験されうる。また、本方法は、化合物がMyD88の変異体、例えば、機能的tollドメインを持たないか、機能的DDを持たないMyD88に結合するか否かを判定するステップを含む。
【００８７】
結合パートナーは、上記したように、TRR、または、DDを含むポリペプチドでもよい。DCなどのAPCにおいてMyD88結合パートナーを同定する方法は、当業者に周知であり、共沈殿法、酵母ツーハイブリッド法、および表面プラスモン共鳴法ならびにFRETをなどがある。
【００８８】
本発明の更なる局面は、例えば、DCなどのAPCによる抗原提示の阻害因子または増強因子である化合物を同定する方法であって、被験化合物を、TRR相互作用分子（アダプター分子）、例えば、MalまたはTIRAPまたはTollIP、またはこのようなアダプター分子のAPC結合パートナー（すなわち、DCなどのAPC、またはその前駆細胞に存在するアダプター分子の結合パートナー）に曝露するステップ、および、その化合物が、アダプター分子（例えば、MalまたはTIRAPまたはTollIP）、またはアダプター分子のAPC結合パートナーに結合できるかを判定するステップを含む方法を提供する。そのように結合できる化合物が選ばれる。好ましくは、本方法は、さらに、その化合物が、アダプター分子のAPC結合パートナーへのアダプター分子の結合を阻害するか増強するかを判定するステップ、および、そのような結合を阻害するか増強することができる化合物を選択するステップを含む。化合物は、例えば、DCの成熟または抗原提示に対する効果を観察することによって更に試験されうる。また、本方法は、化合物がアダプター分子の変異体、例えば、TIRAPまたはMalまたはTollIPの変異体であって、機能的tollドメインを持たないか、機能的DDを持たない変異体に結合するか否かを判定するステップを含む。
【００８９】
本発明の更なる局面は、MyD88（または、TIRAPまたはMalまたはTollIPなど、別のアダプター分子）、またはMyD88のAPC結合パートナー、または別のアダプター分子の、例えば、DCなどによる抗原提示の阻害因子または増強因子の同定法における使用を提供する。
【００９０】
本化合物は、上記化合物同定法のそれぞれのための、薬物様化合物を開発するための薬物様化合物またはリード化合物であってもよい。当業者に周知されているように、該方法は、薬学的化合物または薬物の開発におけるスクリーニングアッセイ法としても有用でありうることが理解される。
【００９１】
同様に、「リード化合物」という用語は当業者に公知であり、（例えば、目指す標的に対しては弱い効力しかない、その作用が非選択的である、不安定である、合成するのが困難である、または、生物利用可能性が低いなどという理由で）それ自体を薬物として使用するのには適さないが、より所望の特徴をもつ別の化合物を設計するための出発点を提供しうる化合物という意味を含む。
【００９２】
本発明の別の局面は、本発明のスクリーニング法、すなわち、前記３つの本発明の局面によって提供されているスクリーニング法によって同定されるか同定可能な化合物を提供する。本発明のさらに別の局面は、医薬において使用するための本発明のスクリーニング法によって同定されるか同定可能な化合物を提供する。本発明の更なる局面は、医薬において使用するためのMyD88（または、MalまたはTIRAPまたはTollIP）のAPC結合パートナー、またはその変異体を提供する。本発明の更なる局面は、抗原提示の抑制または増強を必要とする患者を治療するため、または、抗原提示の抑制または増強を必要とする患者を治療するための薬剤を製造する際に、本発明のスクリーニング法によって同定されるか同定可能な化合物、または、MyD88（または、MalまたはTIRAPまたはTollIP）のAPC結合パートナー、もしくはその変異体の使用を提供する。
【００９３】
好ましくは、MyD88（または、MalまたはTIRAPまたはTollIP）のAPC結合パートナーはMyD88のDC結合パートナーである。
【００９４】
本発明の更なる局面は、医薬において使用するためのtoll関連レセプター（TRR）によるシグナル伝達の阻害因子を提供する。本発明の更なる局面は、例えば、抗原提示の抑制または増強を必要とする患者を治療するため、医薬において使用するためのtoll関連レセプター（TRR）によるシグナル伝達の増強因子を提供する。
【００９５】
本発明の更なる局面は、例えば、抗原提示の抑制または増強を必要とする患者を治療するために、医薬において使用するための、MyD88に直接関係するシグナル伝達段階（DCなどのAPCにおいて生じる）の増強因子または阻害因子を提供する。
【００９６】
該シグナル伝達の阻害因子および増強因子に対する選択性は上記したとおりである。好ましくは、シグナル伝達の阻害因子は、例えば、MyD88lpr、もしくはデスドメインを持たないMyD88など、MyD88の優性ネガティブ変異体であり、または、上記したように、MyD88に結合できる化合物、好ましくは、低分子または薬物様分子である。また、シグナル伝達の阻害因子または増強因子は、上記したように、TIRAPもしくはMalもしくはTollIP、またはその断片、融合体、もしくはバリアントである。
【００９７】
上記したように、シグナル伝達（例えば、TRRまたはMyD88によるシグナル伝達）の阻害因子または増強因子（または、本発明のスクリーニング法によって同定されるか同定可能な化合物）を、細胞の中でシグナル伝達の阻害因子または増強因子（または化合物）を発現（すなわち合成）させるという方法によって、例えば、細胞内に存在する組換えポリヌクレオチド（すなわち、TRRシグナル伝達の阻害因子または増強因子を発現させることができる組換えポリヌクレオチド）からTRRシグナル伝達の阻害因子または増強因子を発現させるという方法によって細胞に供給されうることが理解される。シグナル伝達の阻害因子または増強因子または化合物を標的細胞で発現させることによるそのような供給は有利であり、例えば、このような供給法は、シグナル伝達の阻害因子または増強因子を所望の細胞に標的化するのを容易にしうることが理解される。また、シグナル伝達の阻害因子または増強因子の存在、またはシグナル伝達の阻害因子または増強因子を細胞に供給する能力を、一時的に拡張するのを増強する。
【００９８】
例えば、上で定義したようなシグナル伝達阻害因子（または、抗原提示の増強因子である、本発明のスクリーニング法によって同定されるか同定可能な化合物）などの調節因子と抗原の両方を所望の細胞に供給するのが望ましいであろうことが理解される。シグナル伝達の阻害因子/化合物または抗原のどちらかを、好ましくは両方を、所望の細胞内で発現させるという方法で所望の細胞に供給するのが好ましい。
【００９９】
同様に、シグナル伝達の増強因子（または、抗原提示の阻害因子である、本発明のスクリーニング法によって同定されるか同定可能な化合物）と抗原の両方を所望の細胞に供給するのが望ましいであろう。シグナル伝達の増強因子/化合物または抗原のどちらかを、好ましくは両方を、所望の細胞内で発現させるという方法で所望の細胞に供給するのが好ましい。
【０１００】
本発明の更なる局面は、医薬において使用するために、シグナル伝達の阻害因子または増強因子（または、MyD88のAPC結合パートナー、もしくは本発明のスクリーニング法によって同定されるか同定可能な化合物）、例えばMyD88ポリペプチド（例えば、定常的に活性のあるMyD88ポリペプチド、または優性ネガティブ変異体MyD88ポリペプチド）、またはMalもしくはTIRAPもしくはTollIPのポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを提供する。シグナル伝達の阻害因子または増強因子は、好ましくは上で定義したような優性ネガティブMyD88ポリペプチドである。好ましくは、組換えポリヌクレオチドは、樹状細胞などのAPC、またはAPC前駆細胞において、シグナル伝達の阻害因子または増強因子を発現することができる。
【０１０１】
組換えポリヌクレオチドは、阻害因子など、シグナル伝達経路の調節因子、および、APCによって提示されているのが望ましい抗原とをコードすることが好ましい。したがって、組換えポリヌクレオチドは、阻害因子など、シグナル伝達の調節因子をコードする部分と、抗原分子をコードする部分を含んでいてもよい。または、抗原分子は、別のポリヌクレオチド分子にコードされていてもよいが、これは余り好ましくない。シグナル伝達分子と抗原は、第二のコード配列についてはリボソーム内部進入部位（IRES）を用いて、単一のプロモーターから転写されうる。または、シグナル伝達分子および抗原は、別のプロモーターから転写されうる。
【０１０２】
抗原分子は、一つ以上のエピトープのコピーを一個よりも多く含みうる。例えば、単一のエピトープを形成する、例えば、長さが約8個から30個のアミノ酸、好ましくは約10個から18個のアミノ酸、さらに好ましくは約15個のアミノ酸配列のコピーを一個含みうる。このようなエピトープを形成する配列のコピーを複数個含んだり、２種類以上の異なったエピトープ形成配列のコピーを一個または複数個含みうる。抗原の配列を連結してドメイン様構造を形成したり、担体ポリペプチドの異なった箇所に配置しうる。ポリヌクレオチドは、一個または数個、または多数の異なった抗原分子をコードすることができ、それぞれが、一個以上の抗原部位またはエピトープを有しうる。
【０１０３】
複数のCD8 CTLエピトープを運搬するために組換えポリエピトープワクチンを使用することが、Thomsonら（1996）J. Immunol. 157, 822−826，およびWO96/03144に記載されていて、これらは両方とも参照として本明細書に組み入れられる。本発明に関しては、一種類のワクチン、一つのペプチド（または、ペプチドをコードする核酸）であって、例えば腫瘍関連抗原に由来する一種類以上のアミノ酸配列（例えば、それぞれの長さが約8個から18個のアミノ酸）をいずれかの順序で含むペプチド、およびCD4 T細胞刺激エピトープ（破傷風類毒素など）を含むことが望ましい。典型的には、このような「数珠玉構造（bead−on−a−string）」のワクチンがDNAワクチンである。
【０１０４】
例えば、抗原分子は、形質転換細胞または癌細胞の上に存在するエピトープ（すなわち、高い割合のヒト黒色腫腫瘍で産生される、例えばMAGE−1抗原などの腫瘍関連抗原またはエピトープ（van der Bruggenら（1991）Science 254, 1643））を含みうる。または、例えばウイルスなどの病原性生物上に、または、例えばウイルス感染細胞など、病原性生物による感染を受けた細胞（好ましくはヒト細胞）上に存在するエピトープを含んでいてもよい。
【０１０５】
このエピトープは、T細胞エピトープ、すなわち、例えばT−ヘルパー細胞応答、好ましくは、CD8+細胞傷害性T細胞応答、または、当業者に周知のCD4+ヘルパーT−細胞応答（TH−2応答）などのT−細胞応答（TH−1応答）を誘導することができるエピトープでもよい。細胞傷害性T細胞応答は、例えば、抗原がマイコバクテリア抗原（例えば、ヒト結核菌（Mycobacterium tuberculosis）またはハンセン菌（M. leprae）抗原）のときなど、一定の場合には望ましくないことがある。
【０１０６】
ここに記載されているシグナル伝達増強因子は、免疫応答のTH1/TH2バランスが変わる、好ましくは、TH1が増え、TH2が減るように、抗原に対する免疫応答を調節しうる。TH2応答はアレルギーに関連している可能性がある。
【０１０７】
癌抗原が、以下のいずれかであるか、または、以下のいずれかに存在する一つ以上のエピトープを有していれば好ましい。
i）腫瘍で異常に大量に発現する正常な細胞タンパク質。例えば、さまざまな腫瘍におけるサイクリンD1；乳癌におけるサイクリンE；さまざまな腫瘍におけるmdm2；EGF−R、erb−B2、erb−B3、FGF−R、インシュリン様成長因子レセプター、Met、myc、p53、およびBCL−2はすべて、さまざまな腫瘍で発現される。
ii）腫瘍の中で変異する正常な細胞タンパク質。例えば、さまざまな腫瘍におけるRasの変異；さまざまな腫瘍におけるp53の変異；CMLおよびALLにおけるBCR/ABL転座；AMLおよびMDSにおけるCSF−1レセプター変異、結腸癌におけるAPCの変異；MEN2A、2B、およびFMTCにおけるRETの変異；神経膠腫におけるEGFRの変異；PMLにおけるPML/RARAの転座；前B白血病および小児急性白血病におけるE2A−PBX1の転座。
iii）ウイルス感染関連腫瘍におけるウイルスにコードされたタンパク質。例えば、子宮頸癌におけるヒトパピローマウイルスタンパク質；B細胞リンパ腫およびホジキンリンパ腫におけるエプスタイン−バーウイルスタンパク質；成人T細胞白血病におけるHTLV−1タンパク質；肝細胞癌腫におけるB型およびC型肝炎ウイルスタンパク質；カボジ肉腫におけるヘルペス様ウイルスタンパク質。
iv）HIV感染患者におけるHIVにコードされたタンパク質。
【０１０８】
このように、上記癌関連抗原は、（ｉ）腫瘍細胞で大量に発現する正常な自己抗原、（ii）腫瘍細胞で発現する変異自己抗原、（iii）ウイルス感染症関連腫瘍において発現するウイルス抗原という３つの主要な分類に分けることができる。分類（ｉ）が好ましい。
【０１０９】
分類（ｉ）には３つの下位分類が含まれる。すなわち、
a）過剰発現される正常な細胞タンパク質
b）正常細胞では組織特異的に発現するが、腫瘍細胞でも発現するタンパク質、および
c）ほとんどの成人組織ではサイレントな胚性抗原であるが、腫瘍では異常に発現するタンパク質。
【０１１０】
b）およびc）の例は、
b）GATA−1、IKAROS、SCLなど、腫瘍反応性CTLに対する標的としての組織特異的分化抗原（造血系および白血病において発現する）、および
免疫グロブリン定常領域（多発性骨髄腫の治療のため）、ならびに
c）白血病およびウィルムス腫瘍を治療するためのウィルムス腫瘍抗原1（WT1）、および肝臓および腸腫瘍に対する癌胎児性抗原（胎児性タンパク質であるCEA）。
【０１１１】
一つの実施態様において、癌関連抗原は、腫瘍サンプルの粗抽出物によって提供されうる。
【０１１２】
ヒト腫瘍における癌遺伝子にコードされたタンパク質の過剰発現、および、ヒト腫瘍で発現される変異した癌遺伝子については、参照として本明細書に組み入れられるStaussとDahl（1995）腫瘍免疫学（Tumour Immunology）、Dalgleish/Browning、第7章に記載されている。
【０１１３】
このように、治療する患者が癌である場合が好ましく、より好ましくは、乳癌、膀胱癌、肺癌、前立腺癌、甲状腺癌、CML、ALL、AML、PMLなどの白血病およびリンパ腫、結腸癌、神経膠腫、精上皮腫、肝臓癌、膵臓癌、膀胱癌、腎臓癌、子宮頸癌、睾丸癌、頭部および頚部の癌、卵巣癌、神経芽細胞腫、および黒色腫のいずれかである。
【０１１４】
CMLは、慢性骨髄性白血病であり、ALLは急性リンパ芽球性白血病、AMLは急性骨髄性白血病、そしてPMLは前骨髄球性白血病である。
【０１１５】
または、患者は、特に、細菌、酵母、ウイルス、トリパノソーマなどの病原体が原因となるいずれかの病気に罹患しているか、その危険性を有しうる。その病気が、病原体による慢性感染症が原因である場合が好ましい。また、この病原体が、宿主の免疫系によって容易に除去できないものである場合が好ましい。
【０１１６】
この病気がウイルス感染症である場合が好ましく、より好ましくは、病気は、HIV、パピローマウイルス、エプスタイン−バーウイルス、HTLV−1、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、または、慢性感染症の原因となる任意のウイルスのいずれか１つが原因となって起こる。ウイルスがＨＩＶである場合が特に好ましい。
【０１１７】
細胞によって産生されるホルモン量の異常な上昇が、ある種のタイプの甲状腺疾患などの病気で生じる。したがって、本発明の方法を用いて、高レベルのホルモンを産生する細胞の除去を増強することができる。この抗原は、ホルモン、ホルモンの合成に関与する生合成酵素であって、細胞が過剰生産しうるものでありうる。
【０１１８】
細菌感染症、特に、慢性感染症の原因となる感染症の患者も有効に治療しうる。細菌感染症は細胞内感染症でもよい。したがって、本方法は結核を治療するのにも有用である。
【０１１９】
また、本方法はマラリアの治療にも利用することができる。
【０１２０】
この他、抗原提示の増強または刺激が有益でありうる患者には、海綿状脳症などのプリオン関連疾患患者などがある。抗原提示を増強または刺激する方法を用いて、例えば、慢性的な炎症に伴う炎症メディエーター（例えばサイトカイン）の量；例えば、フィブロネクチン断片など、細胞または結合組織基質の分解産物；β−アミロイドポリペプチド（アルツハイマー病に関連する）などのポリペプチドのように、体内おける異常型および/または異常に高量の（有害な）分子により特徴づけられる病気または症状を治療すること（予防的に治療することを含む）ができる。このような分子に対する免疫応答を刺激すると、その分子を身体から除去することを助け、症状の解消または予防を助長することができる。
【０１２１】
抗原提示の抑制を必要とする患者とは、自己免疫疾患またはアレルギーをもつ、またはその危険のある患者であり、または、移植組織を受容している、またはその受容を計画している患者、すなわち、移植された組織の拒絶反応を抑制することを必要とする患者であろう。当業者は、適当な抗原を知っている。
【０１２２】
本発明の方法によって治療することが可能な自己免疫疾患には、関節性リウマチ、I型糖尿病、多発性硬化症、クローン病、橋本甲状腺炎、セリアック(coeliac)病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、全身性エリテマトーデス、およびグレーブス病などがある。本明細書に記載された方法によって治療可能なアレルギーには、以下のアレルゲンに対するアレルギーがある。すなわち、Fel d 1（イエネコ、フェリス・ドメスティカス（Felis domesticus）の皮膚および唾液腺アレルゲン―そのアミノ酸配列はWO 91/06571に記載されている）、Der p I、Der p II、Der FI、またはDer fII（ハウスダストであるデルマトファゴイデス属（dermatophagoides）のダニに由来する主要タンパク質アレルゲン―そのアミノ酸配列はWO 94/24281に記載されている）。
【０１２３】
本発明は、以下のいずれかに存在するアレルゲンが原因となるアレルギーなど、実質的にどのようなアレルギーにも利用可能である。すなわち、草木や雑草（ブタクサなど）の花粉；菌類およびコケ類；例えば、魚貝類、カニやロブスター、ピーナッツ、ナッツ類、コムギグルテン、卵および牛乳などの食物；例えば、ミツバチ、ハチ、およびスズメバチなどの刺咬昆虫、ユスリカ（非咬性小昆虫）；クモやハウスダストダニなどのダニ；ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、ラット、モルモット、マウス、およびアレチネズミ（gerbil）などの哺乳動物のふけ、尿、唾液、血液、その他の体液に存在するアレルゲン；一般的に空気中の粒子、ラテックス；およびタンパク質界面活性剤添加剤。
【０１２４】
以下の昆虫に由来するタンパク質に対するアレルギーも治療することができる。すなわちイエバエ、ショウジョウバエ、シープブロウフライ（sheep blow fly）、ラセンウジバエ、コクゾウムシ、カイコ、ミツバチ、非咬性小昆虫の幼虫、ハチミツガの幼虫、ゴミムシダマシの幼虫、ゴキブリ、および甲虫テニブリオ・モリトル（Tenibrio molitor）の幼虫。
【０１２５】
本発明の更なる局面は、部品、組成物、または、例えばキメラポリペプチドなどのキメラ分子であって、上記で規定したように、シグナル伝達の阻害部位または増強部位（抗原分子をコードするポリヌクレオチドでありうる）、および抗原部位（抗原分子をコードするポリヌクレオチドでありうる）を含むキメラ分子からなるキットを含む。どちらかの部位、または両部位とも、さらに、移行部位および/または細胞結合部位を含んでいてもよい。好ましくは、細胞結合部位は樹状細胞、またはその前駆細胞に結合できるものである。移行部位は、分子、または、少なくとも抗原部、および、好ましくはシグナル伝達の阻害部位または増強部位の内部移行に役立つ。それによって、外部から適用されたペプチドをHIVのtatペプチドに連結させうる。これによって、それらのペプチドをMHCクラスI経路に方向付けて、CTLによって提示させうる（例えば、Kimら（1997）J. Immunol. 159, 1666−1668を参照）。本発明に従って適合させうるキメラ分子が、WO 95/31483に記載されている。
【０１２６】
樹状細胞は、CD80、CD86、CD40、CD1a、HLA−DR、および/またはCD83という細胞表面分子が発現しているという特徴をもちうる。未成熟の樹状細胞は、CD34+またはCD14+でありうる。したがって、細胞結合部位は、これらの細胞表面分子の一種類以上に結合することができる（例えば、このような分子に結合できる抗体）。CD1aおよびCD83は、DCの標的化に好ましい。
【０１２７】
ポリペプチドの機能、すなわちインビボでの特異的免疫応答の産生に実質的な変化がない場合には、ポリペプチドを合成する前か後に一個以上のアミノ酸残基を化学的に修飾してあるポリペプチドを抗原として使用しうる。このような修飾には、酸または塩基、特に生理学的に許容しうる有機または無機の酸または塩基による塩の生成、末端のカルボキシル基のエステルまたはアミドの形成、およびN−t−ブトキシカルボニル基などのアミノ酸保護基を付加することなどがある。このような修飾は、インビボ代謝からポリペプチドを保護しうる。
【０１２８】
エピトープ（例えばエピトープ形成アミノ酸配列）は、例えば、一コピーとして、または、例えばタンデム反復など、複数のコピーとして存在することがある。そのようなタンデムまたは複数の反復配列はそれだけで抗原性を持つのに十分であるため、担体を使用しないで済む。N−末端とC−末端が一つに結合したループとなること、または、抗原性を高めたりジスルフィド結合を形成させるために一個以上のCys残基を末端に付加されることは、ポリペプチドにとって有利でありうる。エピトープ、例えばエピトープを形成するアミノ酸配列が、好ましくはポリペプチドである担体に共有結合している場合には、エピトープを形成するアミノ酸配列がループを形成するような構成になっていることが好ましい。
【０１２９】
最新の免疫学説によれば、免疫系を刺激、または刺激を増強するために、免疫原となる製剤は担体機能を持つはずである。前記した発明の局面に関連して上記に規定されているエピトープは、例えば架橋によって、血清アルブミン、ミオグロビン、細菌のトキソイド、およびスカシガイヘモシアニンなどの別の担体と結合することもできる。さらに最近になって開発された担体で、免疫応答においてT細胞の助けを誘導する担体は、B型肝炎コア抗原（ヌクレオキャプシドタンパク質とも呼ばれる）、Thr−Ala−Ser−Gly−Val−Ala−Glu−Thr−Thr−Asn−Cys、β−ガラクトシダーゼ、およびインターロイキン−1の163−171ペプチドなどの推定T細胞エピトープを含む。後者の化合物は、さまざまな面で担体、またはアジュバント、またはその両方と見なされよう。
【０１３０】
または、同一または異なったエピトープのいくつかのコピーを互いに架橋させうるが、この場合、それ自体では単独で担体となるものはないが、架橋することで担体機能が提供される。適当な架橋剤には、シグマ（Sigma）社やピアス（Pierce）社のカタログに記載されているものなどがあり、例えば、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、およびスクシンイミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレートがあり、後者は、（もしあれば）C−末端システイン残基上の−SH基を利用する。O'Sullivanら、Anal. Biochem. (1979) 100, 100−108に一般的に記載されている方法など、ポリペプチドを架橋する従来の方法を用いることができる。例えば、第一の部位をチオール基に富ませ、第二の部位を、それらのチオール基と反応することができる二機能性薬剤、例えば、結合した分子種間のジスルフィド架橋を取り込むヘテロ二機能性架橋剤であるヨード酢酸のN−ヒドロキシスクシンイミドエステル（NHIA）またはN−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオン酸（SPDP）などと反応させることができる。例えばm−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステルによって実現できるアミド結合およびチオエステル結合は、一般的に、ジスルフィド結合よりもインビボで安定性がより高い。
【０１３１】
さらに有用な架橋剤は、穏やかな条件下でスルフィドリル（sulphydryl）基の脱保護を可能にする第一級アミンに対するチオール化試薬であるS−アセチルチオグリコール酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル（SATA）（Julianら（1983）Anal. Biochem. 132, 68）、ジメチルスベリミデート（dimethylsuberimidate）ジヒドロクロライド、およびN,N'−o−フェニレンジマレイミドがある。
【０１３２】
適当な宿主の中で適当な塩基配列を発現させてポリペプチドを調製する場合には、担体として働くペプチド配列との融合産物としてポリペプチドを発現させることが有利であろう。カビゲン社の（Kabigen's）「エコセック（Ecosec）」システムは、そのような構成の一例である。
【０１３３】
さまざまな生物源（例えば、さまざまな病原生物）に由来するエピトープを別の抗原に連結させて二重効果をもたらすことができる。
【０１３４】
当業者に周知されているように、エピトープには、ミモトープ（mimotope）が含まれる。
【０１３５】
適当な組換えポリペプチドまたはポリヌクレオチドを調製するのに用いられる適当なベクターまたは構築物は、当業者に知られていよう。
【０１３６】
必要なポリペプチドを発現させることができるポリヌクレオチドは、当業者に周知の方法を用いて調製することができる。
【０１３７】
好ましくは、ポリヌクレオチドは、患者の中でポリペプチドを発現させることができる。例えばTRRシグナル伝達の阻害因子もしくは増強因子、または抗原などのポリペプチドは、必要に応じて、以下に記載するようにして任意のポリヌクレオチド（遺伝子構築物）から発現させて、患者に送達しうる。典型的には、ポリペプチドを発現する遺伝子構築物は、患者の細胞の中で転写されたポリヌクレオチド（例えばmRNA）分子であって、該ポリペプチドを合成するために翻訳されうる分子を発現することができるプロモーターに作動可能に結合している該ポリペプチドコード配列を含む。適当なプロモーターは当業者に知られており、該ポリペプチドを発現させるのが望ましい場所（例えば、樹状細胞またはその前駆細胞の中）に応じて、広範に発現させるための、例えばハウスキーピング遺伝子、または組織選択的遺伝子のためのプロモーターを含みうる。好ましくは、特に、ポリヌクレオチドの送達または取り込みが、例えば樹状細胞または前駆細胞など選択された細胞を標的とする場合には、樹状細胞、または樹状前駆細胞に選択的なプロモーターを用いるが、これは必須ではない。樹状細胞選択的プロモーターには、CD83またはCD36のプロモーターなどがある。
【０１３８】
好ましくは、ポリペプチドを発現できる核酸配列は、該配列の発現に必要な調節因子に作動可能に結合している。
【０１３９】
「作動可能に結合して」とは、構成成分が正常な機能を果たすことができるような近位を意味する。すなわち、調節因子に「作動可能に結合して」いるコード配列は、NF−κＢの阻害因子（または誘導因子で、以下でより詳しく説明するように有用であるもの）をコードする核酸配列が調節配列の制御下で発現されうる配置を意味する。
【０１４０】
「調節配列」とは、特定の宿主生物において、作動可能に結合しているコード配列の発現に必要な核酸配列を意味する。例えば、真核細胞に適した調節配列はプロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーである。
【０１４１】
「ベクター」とは、一本鎖、二本鎖、環状、またはスーパーコイル状のDNA分子を意味する。適当なベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、およびバクテリアプラスミドなどがある。レトロウイルスベクターは、宿主のゲノムの中に自分のゲノムをランダムに組み込むことによって複製するレトロウイルスである。適当なレトロウイルスベクターがWO 92/07573に記載されている。
【０１４２】
アデノウイルスは、直鎖状二本鎖DNAウイルスである。適当なアデノウイルスベクターが、Rosenfeldら、Science, 1991, Vol. 252, page432に記載されている。
【０１４３】
アデノ随伴ウイルス（AAV）は、パルボウイルスファミリーに属し、約4〜6 KBの一本鎖DNAからなる。
【０１４４】
ポックスウイルスベクターは大きなウイルスで、遺伝子を挿入できる部位をいくつかもつ。これらは熱安定的で、室温で保存することができる。安全実験によって、ポックスウイルスベクターは複製欠損であるので、宿主から宿主または環境に伝播されることはありえない。
【０１４５】
例えば抗原提示細胞などの特異的な細胞集団にワクチンを標的することは、例えば、注入部位、標的ベクターと送達系の使用、または、そのような細胞集団を患者から選択的に精製しペプチドまたは核酸を生体外で投与することによって行ないうる（例えば、樹状細胞は、Zhouら（1995）Blood 86, 3295−3301；Rothら（1996）Scand. J. Immunology 43, 646−651の記載に従って保存しうる）。さらに、標的ベクターは、抗原を適当な場所で発現させる組織選択的または腫瘍特異的なプロモーターを含むことができる。
【０１４６】
遺伝子構築物はDNAまたはRNAであるが、DNAの場合が好ましい。
【０１４７】
好ましくは、遺伝子構築物はヒト細胞への送達に適合したものである。
【０１４８】
遺伝子構築物を、動物の身体の中にある、または身体から取り出した細胞の中に導入する手段および方法は当技術分野において知られている。例えば、本発明の構築物は、例えばレトロウイルスを利用した適当な方法によって細胞の中に導入し得、その結果、構築物が（分裂）細胞のゲノムに挿入される。標的となるレトロウイルスは、本発明において使用することができる。例えば、特異的な結合親和性を付与する配列を改造して、予め存在しているウイルスのenv遺伝子に挿入することができる（この、および遺伝子治療のための他の標的ベクターの概説については、MillerとVile（1995）Faseb J. 9, 190−199を参照されたい）。
【０１４９】
好適なレトロウイルスベクターは、VermaとSomia（1997）Nature 389, 239−242に記載されているようなものなどのレンチウイルスベクターである。
【０１５０】
下記に記載されているようなレトロウイルスによる方法は、細胞が分裂細胞である場合にのみ適当であろうことが理解される。例えば、Kuriyamaら（1991）Cell Struc. and Func. 16, 503−510では、精製されたレトロウイルスが投与されている。当技術分野において公知の方法を用いて、所望のポリペプチドをコードするレトロウイルスのDNA構築物を作製することができる。このような構築物から活性型レトロウイルスを作製するには、通常、10％ウシ胎児血清（FCS）を含むダルベッコの修正イーグル培地（DMEM）の中で増殖させたエコトロピックなpsi2パッケージング細胞株を用いる。この細胞株のトランスフェクションは、リン酸カルシウム法によって簡便に行われ、G418を最終濃度1 mg/mlで加えて（レトロウイルス構築物はneoR遺伝子をもつと推定される）、安定した形質転換体を選択する。独立したコロニーを単離・展開し、培養上清を取り出して0.45μm孔径のフィルターで濾過してから−70℃で保存する。レトロウイルスを標的細胞に導入するには、レトロウイルス上清に10μg/mlのポリブレンを加えたものを直接注入するのが便利である。注入は、例えば皮下など、標的細胞が存在する領域の中に行うようにする。
【０１５１】
他の方法には、一定の時間か、またはゲノムの中に組み込まれた後長時間にわたって発現させるために、構築物を細胞中に簡単に送達するものがある。後者の方法の例には、リポソーム（Naessanderら（1992）Cancer Res. 52, 646−653）がある。別の送達法には、抗体−ポリリジン架橋によって外来DNAを運搬するアデノウイルス法（Curiel, Prog. Med. Virol. 40, 1−18参照）、および担体としてトランスフェリン−ポリカチオンコンジュゲート（Wagnerら、（1990）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410−3414）などがある。これらのうち最初の方法では、本発明のDNA構築物または他の遺伝子構築物によってポリカチオン−抗体複合体を形成させる。ただし、この抗体は、野生型アデノウイルスか、その抗体に結合する新しいエピトープが導入されている変異型アデノウイルスのどちらかに特異的である。ポリカチオン部分は、リン酸基本骨格との静電相互作用によってDNAに結合する。アデノウイルスは、未改変の線維タンパク質とペントンタンパク質を有するため、細胞の中に移行し、それとともに本発明のDNA構築物を細胞の中に運搬する。ポリカチオンはポリリジンである場合が好ましい。
【０１５２】
バクテリアによる送達については、Dietrich（2000）Antisense Nucleic Acid Drug Delivery 10, 391−399に記載されている。
【０１５３】
また、DNAは、例えば下記のように、アデノウイルス粒子の中に存在するアデノウイルスによって送達することもできる。
【０１５４】
これらの方法の第二の方法では、レセプターが介在するエンドサイトーシスを用いてDNA高分子を細胞の中に運搬する高効率核酸送達系が用いられている。これは、鉄輸送タンパク質のトランスフェリンを、核酸に結合するポリカチオンと結合させて行われる。ヒトトランスフェリン、もしくはニワトリの相同タンパク質であるコンアルブミン、またはそれらを組み合わせたものを、ジスルフィド結合によって低分子DNA結合タンパク質のプロタミン、またはさまざまな大きさのポリリジンに共有結合させる。これら被修飾トランスフェリン分子は、同族のレセプターに結合して、効率的な鉄輸送を仲介する能力を維持している。トランスフェリン−ポリカチオン分子は、核酸のサイズとは無関係に（短いオリゴヌクレオチドから21キロ塩基対のDNAまで）、本発明のDNA構築物または別の遺伝子構築物と電気泳動的に安定した複合体を形成する。トランスフェリン−ポリカチオンと、本発明のDNA構築物もしくは別の遺伝子構築物との複合体を標的細胞に供給すると、細胞内で構築物から高レベルの発現が起こることが期待できる。
【０１５５】
また、Cottenら（1992）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6094−6098の方法によって作製された欠損アデノウイルス粒子もしくは化学的に不活性化されたアデノウイルス粒子のエンドソーム破壊活性を用いて、本発明のDNA構築物もしくは別の遺伝子構築物をレセプターの仲介によって高効率で送達する方法も用いることができる。この方法は、アデノウイルスが、リソソームを経由せずにエンドソームから自らのDNAを放出できるよう適応させられているという事実に基づくと考えられ、そのため、例えば、本発明のDNA構築物もしくは別の遺伝子構築物に連結したトランスフェリンの存在下で、この構築物は、アデノウイルス粒子として同じ経路で細胞に取り込まれる。
【０１５６】
この方法は、複雑なレトロウイルス構築物を使用する必要がない、レトロウイルス感染で起こるような永久的なゲノム改変が起こらない、また、標的となる発現系が標的となる送達系と共役しているため、他の細胞型に対する毒性が低いという利点がある。
【０１５７】
また、「裸のDNA」、および、カチオン性および中性の脂質と複合体形成したDNAも、本発明のDNAを、治療すべき患者の細胞中に導入する上で有用でありうる。ウイルスを利用しない遺伝子治療法が、Ledley（1995）Human Gene Therapy 6, 1129−1144に記載されている。WO 94/10323に記載されている修飾アデノウイルス系であって、典型的には、アデノウイルスもしくはアデノウイルス様粒に入れてDNAを運搬するという代替的な標的送達系も知られている。Michaelら（1995）Gene Therapy 2, 660−668には、線維タンパク質の中に細胞選択部分を付加するようアデノウイルスを改変することが記載されている。Bischoffら（1996）Science 274, 373−376に記載されているようなp53欠損ヒト腫瘍細胞中で選択的に複製する変異型アデノウイルスも、本発明の遺伝子構築物を細胞に送達するのに有用である。したがって、本発明の更なる局面は、本発明の遺伝子構築物を含むウイルス粒子またはウイルス様粒子を提供することであることが理解される。この他の適当なウイルス粒子またはウイルス様粒子には、HSV、AAV、ワクシニア、レンチウイルス、およびパルボウイルスなどがある。
【０１５８】
免疫リポソーム（抗体指向型リポソーム）は、例えば、CD1、CD14、またはCD83（または、上記したような、この他の樹状細胞もしくは前駆細胞の細胞表面分子）に対する抗体を用いて、樹状細胞または前駆細胞で可能なように、抗体を利用できる細胞表面タンパク質を過剰発現する細胞型を標的とするときに特に有用である。免疫−リポソームを調製するために、MartinとPapahadjopoulos（1982）J. Biol. Chem. 257, 286−288の方法に従ってMPB−PE（N−[4−(p−マレイミドフェニル)ブチリル]−ホスファチジルエタノアミン）を合成する。MPB−PEは、リポソームの二重膜に取り込まれて、抗体またはその断片がリポソーム表面に共有結合することを可能にする。リポソームには、標的細胞への送達のために本発明のDNAもしくは別の遺伝子構築物が簡便に搭載される。例えば、本発明のDNAもしくは別の遺伝子構築物の溶液中で該リポソームを形成させてから、最大0.8 MPaの窒素圧下で孔径0.6μmと0.2μmのポリカーボネート膜フィルターを連続して通過させることによって搭載される。通過させた後、80000×gで45分間超遠心により、トラップされたDNA構築物を遊離したDNA構築物から分離する。脱酸素化した緩衝液内で調製したばかりのMPB−PE−リポソームを、調製したばかりの抗体（またはその断片）と混合し、4℃の窒素の中で一定の回転速度で一晩カップリング反応を行う。80000×gで45分間超遠心して、免疫リポソームを未結合抗体から分離する。免疫リポソームは、例えば腹腔内から、または、例えば皮下から直接、標的細胞が存在する部位に注入しうる。
【０１５９】
好適なベクターは、レンチウイルスベクターおよびアデノウイルスベクターなどであり、例えば、Foxwellら（2000）Ann Rheum Dis 59 Suppl 1, 154−59またはBondesonら（2000）J Rheumatol 27(9), 2078−2089に記載されているベクターと同様のものである。
【０１６０】
細胞内でのポリペプチド（例えば、MyD88lprなど、TRRシグナル伝達の阻害因子）の時間的な発現を調節できることが望ましいことが理解される。したがって、例えば、ペプチドの発現を活性化または抑制したいとき（低分子がプロモーターの活性化をもたらすか、抑制をもたらすかによる）には、患者に投与する低分子の濃度によって調節できるプロモーターの制御下に、ポリペプチドの発現を直接的または間接的に置くことが望ましいであろう。これは、発現構築物が安定しているとき、すなわち、少なくとも１週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、8ヶ月、または１年以上の期間、該細胞の中でポリペプチドを（必要な調節因子の存在下で）発現させることができる場合に特に有益であろうことが理解される。本発明の好適な構築物は、調節可能なプロモーターを含みうる。調節可能なプロモーターの例は、以下の論文に記載されているものなどである。Riveraら（1999）Proc Natl Acad Sci (USA) 96(15), 8657−62（経口で生物的に利用されうるラパマイシンによる調節で、誘導型ヒト成長ホルモン（hGH）標的遺伝子をコードするベクターとラパマイシンによって調節される二分転写因子をコードするベクターという２つの別々のアデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを用いる）；Magariら（1997）J Clin Invest 100(11), 2865−72（ラパマイシンによる調節）；Bueler（1999）Biol Chem 380(6), 613−22（アデノ随伴ウイルスベクターの概説）；Bohlら（1998）Blood 92(5), 1512−7（アデノ随伴ウイルスベクターにおけるドキシサイクリンによる調節）；Abruzzeseら（1996） J Mol Med 74(7), 379−92（例えばホルモン、成長因子、サイトカイン、細胞分裂停止因子、放射線照射、熱ショック、および関連する応答因子などの誘導因子を概説）。テトラサイクリン誘導型ベクターを用いることもできる。これらは、哺乳動物の培養細胞における発現を調節するのに役立つことが示されている比較的無毒性の抗生物質によって活性化される。また、ステロイドレセプター複合体は、そこではDNAベクターが転写前に分離しなければならない核の中に進入するため、ステロイド系誘導因子も特別に有用である。
【０１６１】
このシステムは、例えば、上記されているような、また当業者に知られている組織選択的プロモーター、および、低分子誘導因子のような外来の誘導因子/抑制因子により調節されるプロモーターを使用することによって、２つのレベルで発現を調節することにより、さらに改良しうる。すなわち、調節レベルの一つは、ポリペプチドをコードする適当な遺伝子を誘導型プロモーターに連結することを含み、もう一つの調節レベルでは、必要な誘導型転写因子（誘導型プロモーターから、ポリペプチド（例えばMyD88ポリペプチド）をコードする遺伝子の発現を調節する因子）をコードする遺伝子を作動させるために組織特異的プロモーターを用いる必要がある。遺伝子構築物を細胞型特異的に標的することによって、さらに調節を向上させうる。
【０１６２】
発現されるタンパク質は、最適に機能するため、MyD88またはTRRによるシグナル伝達に関与する別のタンパク質に対して適切なレベルで産生されることが好ましいことが理解される。
【０１６３】
本発明の方法または構築物は、動物の全身で評価する前に、例えば、当業者で知られているように、インビトロで産生された樹状細胞において評価しうる。また、1999年12月24日出願のGB9930616.9記載の方法も、本発明の方法または構築物を評価する際に用いうる。
【０１６４】
本発明の遺伝子構築物は、当技術分野において公知の方法を用いて調製することができる。
【０１６５】
前記治療用分子、例えば、シグナル伝達の阻害因子または増強因子（例えば、MyD88lprのような優性ネガティブMyD88変異型ポリペプチドなどのMyD88ポリペプチド）、もしくは化合物、キメラ分子、もしくは本発明の構築物、またはそれらの製剤は、経口または非経口（例：皮下もしくは筋肉内）注射など常法によって投与することができる。治療法は、一種類の投薬量または複数種の投薬を一定の期間行なうことからなる。治療用分子（例えばポリペプチド、キメラ分子、構築物、または製剤）を注射によって投与すること、好ましくは皮下注射が好ましい。当然ながら、好ましくは、例えば、上記したような低分子誘導因子など、誘導因子は経口投与されよう。
【０１６６】
標的細胞を含む領域を、遺伝子構築物を含む適当な送達用ベクターで一定時間局所的灌流することが望ましい場合がある。例えば、移植するための器官は生体外で灌流することができる。さらに、あるいは、または、送達用ベクターまたは遺伝子構築物は、標的細胞を含む、皮下などの接触可能な領域に直接注射することもできる。例えばアデノウイルスベクター構築物のような遺伝子構築物を患者の細胞に送達する方法は当業者に公知である。
【０１６７】
特に、養子治療プロトコールを用い、または遺伝子銃を用いて、構築物を、例えば皮膚の樹状細胞に送達しうる。
【０１６８】
養子治療プロトコールは、Nestleら（1998）Nature Med. 4, 328−332およびDe Bruijnら（1998）Cancer Res. 58, 724−731に記載されている。
【０１６９】
養子性治療法は、（1）抗原提示細胞またはその前駆細胞、好ましくは樹状細胞またはその前駆細胞、を患者から得るステップ、（2）該抗原提示細胞をシグナル伝達の阻害因子または増強因子（または、本発明のスクリーニング法によって同定されるか同定可能な化合物）、および、選択的に、それに対する免疫応答が要求される抗原、または上記したようなキメラ分子もしくはポリペプチドに生体外でに接触させるステップ、および、（3）このように処理された抗原提示細胞を患者に戻すステップを含む。
【０１７０】
適当なのは、樹状細胞は、例えば、シグナル伝達阻害因子および抗原などのポリペプチドでパルス標識された自己由来の樹状細胞である。腫瘍関連抗原由来のペプチドでパルス標識された自己樹状細胞を用いるT−細胞治療について、Murphyら（1996） The Prostate 29, 371−380およびTjuaら（1997） The Prostate 32, 272−278に記載されている。
【０１７１】
更なる実施態様において、樹状細胞などの抗原提示細胞は、シグナル伝達の阻害因子または増強因子をコードするポリペプチドと接触している。ポリヌクレオチドは適当なポリヌクレオチドであればよく、樹状細胞を形質導入して、抗原提示細胞による抗原提示の活性化または抑制をそれぞれにもたらすことができることが好ましい。
【０１７２】
簡便には、上記したように、ポリヌクレオチドは、ウイルスのポリヌクレオチドまたはウイルスに含まれていてもよい。例えば、アデノウイルスによって形質導入された樹状細胞は、MUC1に対して抗原特異的自己免疫を誘導することが示されている（Gongら（1997）Gene Ther. 4, 1023−1028を参照）。同様に、アデノウイルスを利用した系を用いてもよく（例えば、Wanら（1997）Hum. Gene Ther. 8, 1355−1363）；レトロウイルスの系を利用してもよく（Spechtら（1997）J. Exp. Med. 186, 1213−1221、およびSzabolcsら（1997） Blood 90, 2160−2167）；樹状細胞への粒子移送法（particle−mediated transfer）使用してもよく（Tutingら（1997）Eur. J. Immunol. 27, 2702−2707）；また、RNAを利用してもよい（Ashleyら（1997）J. Exp. Med. 186, 1177−1182）。
【０１７３】
樹状細胞は、患者由来（すなわち自己樹状細胞）、または、健康な個体由来（MHC適合または不適合）であり、上記したようにインビトロで処理した後、養子療法（すなわち、インビボでのそのように操作された樹状細胞の導入）を行い、次いでCTL応答を活性化し得る。ここで「健康な個体」とは、一般的に、個体が健康な状態にあり、好ましくは充分な免疫系を有し、より好ましくは、簡単に検査して検出できる疾患に罹患していないことを意味する。
【０１７４】
このように、本発明の方法は、養子免疫療法を含む。
【０１７５】
約103〜1011個のAPCを患者に投与する場合が好ましく、より好ましくは106〜107個のAPCである。APCはDCであることが好ましい。
【０１７６】
APCは任意の便利な経路で投与することが可能である。APCは静脈内に投与する場合が好ましい。また、APCは、疾患箇所（腫瘍、または局所ウイルス感染または局所細菌感染など）に局所的に投与する場合も好ましい。適宜、APCは、疾患箇所、または疾患が存在する組織に供給を行う動脈に投与する。
【０１７７】
APCを皮下投与してリンパ節に移行させることも可能である。
【０１７８】
好ましくは、APCはDCである。
【０１７９】
細胞（またはワクチン）を、別の方法によって疾患の治療を受けている患者に投与することができる。つまり、この治療法は単独でも利用できるが、アジュバント療法として利用するのが望ましい。
【０１８０】
DCなどのAPC、またはワクチンは、別の療法の前、最中または後に投与することができる。
【０１８１】
治療すべき疾患が癌であるときには、癌が従来の治療法または外科手術および本発明の方法によって治療されていたか、治療中であるか、治療予定である場合が好ましい。癌は、療法に応じて、適宜、放射線療法または化学療法によって治療する。
【０１８２】
免疫応答が必要となる癌抗原については、上記詳細に開示されている。
【０１８３】
治療すべき疾患が病原体による感染症であるときには、その感染症が、従来の治療法または外科手術によって治療されていたか、治療中であるか、治療予定である場合が好ましい。
【０１８４】
治療すべき患者がHIVに感染しているときには、本発明の方法は、他の治療法、例えば、AZTまたは3TCなどの逆転写酵素インヒビターによる治療、あるいは、併用療法、例えばHART（高活性レトロウイルス療法）の補助的手段として利用する場合が好ましい。
【０１８５】
本発明の方法を用いて固形癌を治療するときには、DCまたはワクチンを手術後最初の治療法として投与する場合が好ましい。
【０１８６】
本発明の方法を用いて白血病を治療する場合、放射線療法または化学療法の後、DCまたはワクチンを投与する場合が好ましい。また、白血病患者には、骨髄移植と併用して、DCによる治療を行う場合が好ましい。
【０１８７】
例えば養子免疫療法などの癌治療は、バルク疾患を軽減するよりも、微小残存病変を制御または除去する上でもっとも効果的であろう。免疫療法は、細胞傷害性Tリンパ球の流入と、組織排出の結果によって、バルク疾患の寸法を一時的に増加させると考えられる。治療後、疾患の程度と大きさを監視することができるが、正式な終点として使用することができない。患者には長期間にわたって通常の追跡調査を行い、有害な作用が長期間現れないことを確認する。
【０１８８】
更なる送達法または標的法には以下のものがある。培養細胞またはインビボ細胞の衝撃圧縮空気駆動DNA/タンパク質被覆ナノ粒子貫通法（例えば、BioRadデバイスを用いる）を用いることができる。送達のための構築物は、好ましくは細胞型選択的プロモーターを有してもよい。
【０１８９】
本明細書に記載された治療用分子、例えば、シグナル伝達のエンハンサーまたはインヒビターまたは構築物または分子が、単独で投与されることは可能であるが、一種類以上の許容できる担体と一緒に、薬学的製剤として提供することが好ましい。担体は、治療用分子（核酸またはポリペプチドであろう）と適合性があり、また、そのレシピエントに対して有害でないという意味で「許容できる」ものでなければならない。典型的には、担体は、滅菌され、かつ発熱物質を含まない水または食塩水である。
【０１９０】
鼻腔用スプレーは有用な製剤であろう。
【０１９１】
製剤は、適宜、単位投薬形態で提供することもできれば、薬学分野において周知のいずれの方法によっても調製することができる。このような方法は、活性成分（例えば、シグナル伝達のエンハンサーもしくはインヒビター、または本発明の構築物もしくは分子）を、一種類以上の補助成分を構成する担体と会合させるステップを含む。通常、活性成分を、液状担体または細かく分割された固形担体、またはその両者と均一かつ密接に会合させることによって製剤を調製してから、必要に応じて製品を成形する。
【０１９２】
経口投与に適する、本発明の製剤は、それぞれ所定量の活性成分を含むカプセル剤、カシェ剤、または錠剤など、別個の単位として；散剤または顆粒剤として；水性液体または非水性液体中の溶液または懸濁剤として；あるいは、水中油型液状乳化剤または油中水型液状乳化剤として提供することができる。また、活性成分はボーラス、舐剤、またはペースト剤として提供することもできる。
【０１９３】
錠剤は、任意に、一種類以上の補助成分と共に圧縮または成形によって製造される。圧縮型錠剤は、粉末または顆粒など自由に流動する形状の活性成分を、任意に結合剤（例えば、ポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、グリコール酸デンプンナトリウム（sodium starch glycolate）、架橋ポビドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、表面活性剤、または分散剤と混合して、適切な機械の中で圧縮して調製することができる。成形型錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末状化合物の混合物を、適切な機械の中で成形することによって作製することができる。錠剤は、任意に、コートしたり割線を付けたりでき、また、例えば、所望の放出プロフィールを提供するような種々の割合のヒドロキシプロピルメチルセルロースを用いて、そこに含まれている活性成分の徐放を提供するよう荷製剤化できる。
【０１９４】
口腔への局所投与に適した製剤には、風味成分、通常、ショ糖およびアカシアまたはトラガカントの中に活性成分を含むロゼンジ；ゼラチンおよびグリセリンなどの不活性成分、またはショ糖およびアカシアの中に活性成分を含む香剤；ならびに、適切な液状担体中に活性成分を含むうがい薬がある。
【０１９５】
非経口投与に適した製剤には、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および、製剤を意図されたレシピエントの血液と等張になるようにする溶質を含むことができる水性および非水性の滅菌注射液；および懸濁剤と濃化剤を含むことができる水性および非水性の滅菌懸濁液がある。製剤は、単位用量容器または複数用量容器、例えば、密封したアンプルおよびバイアルに入れて提供することができ、また、使用直前に注入用水などの滅菌液状担体を加えるだけのフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することができる。即時注射液および懸濁液は、前記した種類の滅菌散剤、顆粒剤および錠剤から調製することができる。
【０１９６】
好適な単位投薬製剤は、活性成分の一日分の用量または単位、一日分の部分用量またはそれらの適切な画分を含むものである。
【０１９７】
特に上記した成分に加えて、本発明の製剤は、当該製剤の種類を考慮して、当技術分野において従来からある他の薬剤を含むことができ、例えば、経口投与に適した製剤は香料を含むことができる。
【０１９８】
治療用分子、例えば、本発明のインヒビターまたはエンハンサーまたは分子または構築物は、薬物の局所投与に適した手段によってその位置に送達することができることは明らかである。例えば、該構築物の溶液をその部位に直接注射するか、輸液ポンプを用いて輸液によって送達することができる。また、構築物は、例えば、移植可能な装置の中に取り込まれ、所望の部位に置かれると、構築物が周囲の位置に放出されるようにする。
【０１９９】
構築物は、例えば、ヒドロゲル材料によって投与することができる。ヒドロゲルは非炎症性で生物分解性である。今では、このような材料の多くが知られており、天然および合成のポリマーから作られるものなどがある。好ましい態様において、本方法は、体温よりも低いと液体であるが、体温または体温に近い温度では、形状維持したままの半固体ヒドロゲルを形成するようなゲルであるヒドロゲルを利用する。好ましいヒドロゲルは、エチレンオキシド−プロピレンオキシド反復単位のポリマーである。ポリマーの性質は、ポリマーの分子量、および、ポリマー中のポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドの相対的割合に依存する。好適なヒドロゲルは、約10重量％から約80重量％のエチレンオキシドと、約20重量％から約90重量％のプロピレンオキシドを含む。特に好適なヒドロゲルは約70％のポリエチレンオキシドと約30％のポリプロピレンオキシドを含む。使用できるヒドロゲルは、例えば、BASF Corp., Parsippany, NJから商標名Pluronic（登録商標）として入手することが可能である。
【０２００】
本態様において、ヒドロゲルを液状に冷却し、例えば、構築物を、ヒドロゲル1グラム当たり約1mgの核酸濃度まで該液体に混合する。そして、得られた混合液を、例えば、外科手術中のスプレーまたは塗布、あるいはカテーテルまたは内視鏡手順を用いて、治療しようとする表面上に適用する。ポリマーは暖まるにつれて固化してゲルを形成し、構築物は、ゲルの正確な組成によって規定される期間にわたりゲルから周囲の細胞内に拡散する。
【０２０１】
構築物は、例えば、市販されているか、または科学論文に記載されている他の移植片（リポソーム、マイクロカプセル、および移植可能デバイスが挙げられる）により投与され得る。例えば、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、およびポリグリコール酸、ならびにこれらのコポリマー、コラーゲン、ならびにタンパク質ポリマーなどの生分解性物質、または、エチレンビニルアセテート（EVAc）、ポリビニルアセテート、エチレンビニルアルコール、およびこれらの誘導体などの非生分解性物質からなる移植片を用いて、構築物を局所的に送達することができる。構築物は、融解または溶媒による蒸発技術を用いて、または、材料と機械的に混合することにより重合または固化されている材料の中に取り込むことができる。一つの態様では、構築物（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる）を、デキストランコートしたシリカビーズ、ステント、またはカテーテルなど移植可能なデバイスの被覆剤の中に混ぜ込むか、またはその上に適用する。
【０２０２】
構築物の用量は、例えば、構築物の大きさおよび投与目的に依存する。一般的には、その範囲は、治療すべき組織の表面積に基づいて計算される。構築物の有効用量は、構築物の大きさ、および用いられる送達ビヒクル/標的方法、およびオリゴヌクレオチドの化学的組成に依存し得るが、適切な用量は、例えば、上記した動物およびインビトロ試験系から得られたデータを利用して当業者が決定することができよう。
【０２０３】
構築物は、例えば、治療目的および予防目的の両方のために、患者に対して全身に投与することができる。構築物は、例えば、上記したように、効果的な方法、例えば非経口的（例えば、静脈内、皮下、筋肉内）または経口、経鼻、もしくは、例えば、構築物が患者の血流に入って循環できるようにする他の手段によって投与することができる。好ましくは、全身に投与された構築物は、局所的に投与された構築物に追加して投与されるが、局所的投与がなくても有用である。
【０２０４】
樹状細胞による核酸の取り込みおよびそれにコードされたポリペプチドの発現が、免疫応答の開始機構であろうと考えられている。ただし、樹状細胞はトランスフェクトされないが、組織中のトランスフェクトされた細胞から発現されたペプチドを選び出すことができるので、依然重要である。
【０２０５】
DNAワクチンなどのワクチンは、筋肉内に投与される場合が好ましい。また、ワクチンは、皮膚の上または中に投与される場合も好ましい。
【０２０６】
本発明のさらなる局面は、癌、または癌細胞もしくは腫瘍細胞、または病原生物もしくは病原生物に感染した細胞に対して有効なワクチンであって、上記したような抗原提示のシグナル伝達エンハンサーまたは活性化因子、あるいはそのような抗原提示のシグナル伝達エンハンサーまたは活性化因子をコードする核酸を有効量含むワクチンを提供する。好ましくは、ワクチンは、さらに、癌細胞もしくは腫瘍細胞上、または病原生物もしくは病原生物に感染した細胞の上に存在するエピトープをもつ抗原（または抗原をコードするポリヌクレオチド）を含む。
【０２０７】
例えば、本発明は、癌、または癌細胞もしくは腫瘍細胞、または病原生物もしくは病原生物に感染した細胞に対して有効なワクチンであって、MalまたはTIRAPまたはTollIPまたはそれらの断片、変異体もしくはその融合体、またはそれをコードするポリヌクレオチドを有効量含むワクチンを提供する。好ましくは、ワクチンは、さらに、癌細胞もしくは腫瘍細胞上、または病原生物もしくは病原生物に感染した細胞の上に存在するエピトープをもつ抗原（または抗原をコードするポリヌクレオチド）を含む。
【０２０８】
ワクチンが核酸ワクチンである場合が特に好ましい、癌のポリヌクレオチド媒介免疫化療法は、Conryら（1996）Semiars in Oncology 23, 135〜147；Condonら（1996）Nature Medicine 2, 1122〜1127；Gongら（1997）Nature Medicine 3, 558〜561；Zhaiら（1996）J. Immunol. 156, 700〜710；Grahamら（1996）Int. J. Cancer 65, 664〜670；およびBurchellら（1996）、Calvoら（編）「Breast Cancer, Advance in biology and therapeutics」、309〜313頁、John Libbey Eurotextに記載されている。そして、これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる。
【０２０９】
核酸ワクチンは、上記したように、適宜、任意の適切な核酸送達手段を含むことができる。核酸、好ましくは、DNAは裸（すなわち、実質的に、投与すべき別の成分なしで）でもよく、または、リポソームに入れたり、ウイルスベクター送達系の一部として送達することができる。
【０２１０】
核酸ワクチンは、アジュバントなしで投与することができる。また、核酸ワクチンは、BCGまたはミョウバンなどのアジュバントとともに投与することができる。他に適切なアジュバントには、サポニン、マイコバクテリア抽出物および合成細菌細胞壁模倣薬由来のAquilaのQS21 stimulon (Aquila Biotech, Worcester, MA, USA)、およびRibiのDetoxなどの独占アジュバントが挙げられる。別のサポニン由来アジュバントであるQuil Aも使用することができる（Superfos, Denmark）。これ以外にFreundなどのアジュバントも有用である。核酸ワクチンはアジュバントなしで投与する場合が好ましい。
【０２１１】
本発明のさらなる局面は、シグナル伝達のインヒビターまたはエンハンサー、あるいはMyD88またはMyD88ポリペプチドまたはMal、TIRAPもしくはTollIPの結合パートナー、あるいは本発明のスクリーニング法によって同定されるか同定可能な化合物、あるいはそれをコードするポリヌクレオチド、あるいは本発明の組成物もしくはキメラ分子、ワクチンまたはポリヌクレオチド、および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。
【０２１２】
本発明のさらなる局面は、患者の体内で、第一のエピトープを異常に発現する標的細胞を死滅させる方法であって、（1）該患者から抗原提示細胞（APC）を得るステップ、（2）該APCを、調節因子、好ましくは、樹状細胞においてシグナル伝達するTRRのインヒビター、またはAPCにおいてシグナル伝達するTRRのインヒビターをコードするポリヌクレオチドもしくは発現ベクターとエキソビボで接触させるステップ、（3）任意に、該細胞を、該エピトープ、または該エピトープをコードするポリヌクレオチドもしくは発現ベクターと接触させるステップ、および、（4）このように処理されたAPCを患者に再導入するステップを含む方法を提供する。
【０２１３】
患者に再導入すると、APCは、標的細胞に対する細胞傷害性T細胞の応答を刺激する。
【０２１４】
典型的には、APCは樹状細胞である。
【０２１５】
標的細胞は癌細胞であろう。
【０２１６】
本発明のさらなる局面は、癌、または病原生物による感染症に罹患しているか、その危険のある患者を治療する方法であって、（1）調節因子、好ましくはTRRシグナル伝達のインヒビター（上記したように、MalまたはTIRAPまたはTollIP（またはその断片、変異体もしくは融合体）であり得、APC（例えばDC）を活性化、例えば、APC（例えば、DC）による抗原提示を増強し得る）、または、（2）MyD88に直接関係するシグナル伝達ステップのインヒビター、または、（3）MyD88のドミナントネガティブ変異体を、患者、または患者の抗原提示細胞もしくは前駆細胞に供給するステップを含む方法を提供する。
【０２１７】
本発明のさらなる局面は、自己免疫疾患または移植片拒絶に罹患しているか、その危険のある患者を治療する方法であって、（1）調節因子、好ましくはTRRシグナル伝達の活性化因子（上記したように、MalまたはTIRAPまたはTollIPまたはその断片、融合体もしくは変異体であり得、APC（例えばDC）を活性化、例えば、APC（例えば、DC）による抗原提示を増強し得る）、または、（2）MyD88に直接関係するシグナル伝達ステップの活性化因子、または、（3）MyD88を、患者、または患者の抗原提示細胞もしくは前駆細胞に供給するステップを含む方法を提供する。
【０２１８】
本発明のさらなる局面は、（1）調節因子、好ましくはTRRシグナル伝達のインヒビター（上記したように、MalまたはTIRAPまたはTollIPまたはその断片、変異体もしくは融合対であり得る）または（2）MyD88に直接関係するシグナル伝達ステップのインヒビター、または（3）MyD88のドミナントネガティブ変異体（またはそれをコードするポリヌクレオチド）の、抗原提示の増強を必要とする患者、および/または、癌、または病原生物による感染症に罹患しているか、もしくはその危険にある患者を治療するための医薬の製造における使用を提供する。
【０２１９】
好ましくは、本医薬は、さらに、抗原または抗原をコードするポリヌクレオチドを含む。さらにより好ましくは、本医薬は、抗原をコードするポリヌクレオチドおよびインヒビター分子、または本発明のキメラ分子を含む。
【０２２０】
あるいは、本医薬は、本発明のスクリーニング法によって同定可能な、または同定される適切な化合物を含む。
【０２２１】
本発明のさらなる局面は、（1）調節因子、好ましくはTRRシグナル伝達の活性化因子（上記したように、MalもしくはTIRAPもしくはTollIP、またはその断片、融合体もしくは変異体であり得る）、または、（2）MyD88に直接関係するシグナル伝達ステップの活性化因子、または、（3）MyD88（またはそれをコードするポリヌクレオチド）の、自己免疫疾患または移植片拒絶に罹患しているか、あるいはその危険のある患者を治療するための医薬製造における使用を提供する。
【０２２２】
好ましくは、本医薬は、さらに、抗原または抗原をコードするポリヌクレオチドを含む。さらにより好ましくは、本医薬は、抗原をコードするポリヌクレオチドおよびインヒビター分子、または本発明のキメラ分子を含む。
【０２２３】
あるいは、本医薬は、本発明のスクリーニング法によって同定可能な、または同定される適切な化合物を含む。
【０２２４】
本発明のさらなる局面は、パーツまたは組成物またはキメラ分子のキットであって、（1）MalもしくはTollIPもしくはTIRAPまたはその断片、誘導体もしくは融合体（これらの選択性については上記のとおりである）（または、そのような部位をコードするポリヌクレオチド）、および（2）抗原分子含むか、またはコードする抗原部位を含むキットを提供する。本発明のさらなる局面は、医薬において使用するために、パーツまたは組成物またはキメラ分子の該キットを提供する。本発明の一層さらなる局面は、抗原提示の調節を必要とする患者を治療するための医薬の製造における、パーツまたは組成物またはキメラ分子の該キットの使用を提供する。
【０２２５】
本発明のこれらの局面におけるいずれかまたは両方の部位は、上記したように、さらに、転座部位および/または細胞結合部位を含み得る。
【０２２６】
ここで、本発明は、以下の非限定的な図面と実施例を参照して記載される。
【実施例】
【０２２７】
実施例１：ヒト細胞におけるトール様レセプターのシグナル伝達
材料および方法
１．試薬
ヒト組換えGM-CSFおよびTNFαは、それぞれ、Dr Glenn Larsen （GI）およびDr D Tracey (BASF)から無償でいただいた。ヒト組換えIL-4を、R&D Systems（Minneapolis, USA）から購入し、IL-1はHoffman La Rocheから無償でいただいた。LPSをSigma Chemical Co.（St Louis, USA）から得た。
【０２２８】
２．末梢血単核細胞の調製
末梢血単核細胞（PBMC）を、健康なボランティア由来の白血球搬出残渣（North London Blood Transfusion Service, Colindale, UK）の密度遠心により得た。ヘパリン処理した残渣をHBSSで２倍希釈し、25mlを、50mlの滅菌チューブ内の等量のFicoll-Hypaque lymphoprep (Nycomed, Oslo, Norway)の上に慎重に積層し、その後、室温下2000rpmで30分間遠心分離した。遠心分離後、界面層を回収して、HBSSで２回洗浄した（2000rpmで10分間遠心分離した）。そして、PBMCを回収して、5％FCSを含む30mlのRPMIに再懸濁した。
【０２２９】
３．末梢血T細胞および単球の単離
Beckman JE6エルトリエーターで細胞と細胞を分離した後、末梢血T細胞および単球をPBMCから得た。1％FCSを含むRPMI（溶離培地）の中で溶離を行った。リンパ球および単球純度を、CD45、CD3、CD14、およびCD19に対する蛍光色素結合抗ヒトモノクローナル抗体（Becton Dickinson, Oxford, UK）を用いたフローサイトメトリーによって評価した。Tリンパ球画分は、典型的には、約80％のCD3発現細胞、約6％のCD19発現細胞、および1％未満のCD14発現細胞を含んでいた。単球画分は、通常、85％を超えるCD14発現細胞、0.5％未満のCD19発現細胞、および3％未満のCD3発現細胞からなっていた。
【０２３０】
４．アデノウイルス感染のためのM-CSFによる単球分化
アデノウイルス感染を最適なものにするため、新たに溶離された単球を、10cmペトリ皿（Falcon, UK）中で1×106細胞/mlで、100ng/mlのM-CSF（Genetics Institute, Boston USA）とともに培養した。2〜3日後、これらをPBSで洗浄して未接着の細胞を取り除き、残った接着単球を10mlの細胞分離溶液（Sigma, UK）とともに37℃で1時間インキュベートした。細胞懸濁液を、5％FCSを含むRPMIで2回洗浄してから、細胞生存率（90％）をトリパンブルー排除法によって評価した。この段階の細胞は、FACS染色によると99％がCD14陽性であり、さらなる実験を行うため、24穴または48穴の平底組織培養皿（Falcon, UK）に入れて、1×106細胞/mlで培養した。
【０２３１】
５．単球の樹状細胞への分化
新たに溶離された単球を、1×106細胞/mlで10cmペトリ皿（Falcon, UK）中、50ng/mlのGM-CSFおよび10ng/mlのIL-4を添加した5％FCS RPMIの中で5〜6日間培養した。3日目に、サイトカインを補充した。この方法は、血液または骨髄前駆体から直接樹状細胞を分化させるのと比べていくつかの利点がある。簡単で多数の細胞を得られるという以外に、安定した「未成熟DC」表現型をもつ均一な細胞集団ができる。この表現型を、TNFα（10ng/ml）、LPS（100ng/ml）または単球釧化培地（50%v/v）をさらに2〜3日間DCに添加することにより成熟化に進めることができる。
【０２３２】
６．57Aかつ未形質転換のHELA、HUVECおよびHSF
57A HELA細胞は、アール・ヘイ（R. Hay）（英国、セントアンドリュース大学（University of St Andrews）から無償でいただき、5% FCS, 1%ペニシリン/ストレプトマイシンDMEMの中で維持した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）は、既述されている（Jaffe EAら（1973）J Clin Invest 52: 2745〜8）ようにして単離し、10％FCS、10％NCS、１％ペニシリン/ストレプトマイシン、15μg/ml内皮細胞増殖補助剤（シグマ社、英国、プール（Poole））、および50 IU/mlヘパリン存在下RPMI中で維持した。初代ヒト皮膚線維芽細胞（HSF）は、T−75組織培養用フラスコ中、5% FCS, 1%ペニシリン/ストレプトマイシン入りDMEMで培養した割礼標本（circumcision speciments）から得られた。
【０２３３】
８．アデノウイルスベクターとそれらの増殖
大腸菌のβ−ガラクトシダーゼをコードする複製欠損組換えアデノウイルスベクター（Adβ−gal）、または挿入配列をもたないもの（Ad0）は、エイ・バーンズ（A. Byrnes）博士とエム・ウッド（M. Wood）博士（英国、オックスフォード大学（Oxford University））から提供された。GFP発現アデノウイルス（AdGFP）は、AdTrackを、ビー・ボーゲルシュタイン（B. Vogelstein）教授（ハワード・ヒューズ医学研究所（The Howard Hughes Medical Institute）、米国、ボルチモア（Baltimore））から提供されたAdEasy−1アデノウイルスプラスミドと二重組換えを行うことによって作製した。AdMyD88wtおよびAdMyD88lprは、クー（Xu）博士（テキサス大学（University of Texas）、サウスウエスタン（Southwestern）とケイ・バーンズ（K. Burns）博士（スイス、ローザンヌ（Lausanne, Switzerland））から提供されたプラスミドから作製した。特に、pAdTrackCMVをAdMEKK−1wtに用い、一方、AdMyD88wtおよびAdMyD88lprには、AdTrack.CMVKS17という名前のpAdTrack.CMVベクターの派生ベクターを用いた。pAdTrack.CMVKS17は、AdTrack.CMVのEcoRI部位とマルチクローニング部位（MCS）を除去し、pBCSK(+) ベクター（ストラタジーン社（Stratagene））のより長いマルチクロニーング部位を挿入して構築した。1μgの直鎖化したpAdTrack.CMV−MEKK1wt、AdTrack.CMVKS17−MyD88wt、またはAdTrack.CMVKS17−My88lprの構築物、および100 ngの複製欠損アデノウイルスベクターpAdEasy−1を用い、ヒートショック法によって形質転換されたBJ5183バクテリア細胞の中で組換えウイルスを作製した。カナマイシンに対する抵抗性によって組換え陽性クローンを選抜した。選抜後、抽出されたDNAを293ヒト胚性腎細胞におけるウイルス増殖に使用した。Heらに記載のとおり（He T.C.ら（1998）、Science 281: 1509〜12）、２種類の塩化セシウム勾配による超遠心によってウイルスを精製した。無血清DMEM培地（ギブコBRL社（Gibco BRL））の中で1時間曝露したのち、(1.5％)アガロース/（4％のFCS入り2×DMEM）混合液（v/v、1：１）で覆い、10〜14日間インキュベートした後、HEK293細胞において、プラークアッセイ法によってウイルスストックの力価を測定した（He T.C.ら（1998）、Science 281: 1509〜12）。
【０２３４】
９．細胞のアデノウイルス感染
M−CSF分化されたマクロファージ、および未成熟または成熟した樹状細胞を回収し、カウントして再培養した。次いで、それらを、無血清RPMIの中で、所定の遺伝子を発現する複製欠損アデノウイルスに感染させた。マクロファージと未成熟DCについては50〜100の感染多重度を、成熟CDについては、150〜300を用いた。2時間後、ウイルスを取り除き、完全培地中で細胞をさらに1〜2日培養して目的のタンパク質を発現させた。次いで、それらを更なる実験に使用した。
【０２３５】
同様に、57A HELA、HUVEC、およびHSFを無血清培地で2時間感染させた。感染多重度40〜100を用いた。次いで、ウイルスを除去し、再び完全培地を加え、さらに、1〜2日培養した。
【０２３６】
１０．抗原特異的T細胞系の樹立
緑色蛍光タンパク質をクローンテック社（Clonetech）から購入した。抗原特異的ポリクローナルT細胞系を樹立するために、1×106PBMC/mlを、1μg/mlの緑色蛍光タンパク質（抗原）とともに7日間培養し、次に、20 ng/mlのIL−2とともにさらに10〜14日間培養した。４日毎にIL−2を補充した。この結果、抗原特異的T細胞が増大し、PBMCに存在する他の細胞集団の殆どが細胞死した。培養17〜21日後に、放射線照射した自己PBMCと1:1の割合で、また新鮮な抗原とともにIL−2不在下でT細胞を培養することによって、再刺激ステップを含ませた。4日後にIL−2を加え、さらに10〜14日おいた。この再刺激サイクルを少なくとも4回繰り返した後、抗原特異的T細胞を更なる実験に用いた。
【０２３７】
１１．抗原特異的T細胞の増殖アッセイ法
抗原特異的T細胞系の特異性を測定するため、1×105個の抗原特異的T細胞を、1×105個の放射線照射した自己PBMC、および、さまざまな濃度の抗原とともに、96穴平底マイクロタイタープレートの中で培養した。3日後、細胞を[3H]チミジンで一晩パルス標識し、翌日回収した。
【０２３８】
樹状細胞に誘導された抗原特異的T細胞増殖を測定するために、1×105個の抗原特異的T細胞を、段階的な用量の放射線照射されたか、マイトマイシン処理された樹状細胞であって、未標識、抗原標識された、未感染、またはアデノウイルス感染した樹状細胞とともに培養した。2日後に、[3H]チミジンの取り込みを測定した。抗原特異的増殖アッセイはすべて、3回反復して行った。
【０２３９】
１２．混合リンパ球反応（MLR）
非照射または照射済み（137Cs源から3000ラド）DCの免疫刺激能力を測定するために、未感染DCおよびアデノウイルス感染したDCを段階的な用量にして、96穴平底マイクロタイタープレート（ファルコン社）の中で、1×105個の同種異系の溶出されたＴ細胞とともに4回反復して培養した。5日目に、[3H]チミジン（0.5μCi/ウエル；アマーシャムライフサイエンス社（Amersham Life Science、英国））で16時間パルスした後、チミジン取り込みによって増殖を測定した。
【０２４０】
１３．サイトカイン解析
細胞に、アデノウイルスベクターを2時間感染させてから、さらに2日間培養して、関連タンパク質の過剰発現が起こるようにした。細胞を刺激してから24時間後に培養上清を回収して凍結しておいた。標準的な２層または３層サンドイッチ式ELISA技術によって、TNFα、IL−4、IL−6、IL−8、IL−12、およびIFNγに特異的なモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を用いて、細胞培養上清中のサイトカイン量を測定した。抗体ペアとこれらのアッセイに対する標準は、遺伝学研究所（Genetics Institute）（米国、ボストン（Boston））から無償譲渡されたIL−12の試薬以外、ファーミンゲン社（Pharmingen）から購入した。
【０２４１】
１４．免疫経口染色およびフローサイトメトリー
FACS染色するために、まず細胞を回収した。表面レセプターが完全なままであることが必要な接着細胞については、PBS中2％EDTAの温かい溶液を37℃で20分間用いた。細胞を溶液に入れた後、それらを一回洗浄してから、氷冷したFACS洗浄緩衝液に再懸濁した。その後のインキュベーションはすべて、4℃で行なった。各解析ごとに、5×105個の細胞を、関連する抗原特異的抗体またはアイソタイプ対照とともに30分間インキュベートしてから、FACS洗浄緩衝液で2回洗浄した。次いで、フローサイトメトリーで細胞を調べた。細胞は、CellQuest（ベクトン・ディキンソン社）を用いることによって、FACScanフローサイトメーター（ベクトン・アンド・ディキンソン社）上で解析する準備ができた。HLA−DR、HLA−A、B、C、CD80、CD86、CD3、CD14およびCD25に直接結合したモノクローナル抗体をファーミンゲン社（米国、サンディエゴ）から購入した。
【０２４２】
１５．サイトゾルタンパク質抽出物の調製
シグナル伝達に関係する生化学的現象をウエスタンブロッティングによって調べるためにサイトゾル抽出物を調製した。接着細胞を組織培養皿/フラスコから掻き取って新鮮なPBSに入れ、遠心分離（4℃、13000 gで10秒）によって回収した。非接着細胞も、同様に遠心分離によって沈殿させ、新鮮なPBSで一回洗浄した。上清を捨てた後、溶解すべき細胞の数に応じて（1×106個の細胞当たり50〜100μl）適当な量の氷冷した低張の溶解緩衝液（Whiteside S.T.ら（1992）Nucelic Acids Res 20: 1531〜8）を加えた。氷上で10分間インキュベートした後、核と細胞残渣を取り除くため、溶解物を遠心分離（4℃、13000 gで5分間）した。次いで、清澄になった溶解物を新しいチューブに移し入れて、引き続き、タンパク質濃度を測定し、ウエスタンブロッティングに使用するため、凍結して−20℃で保存した。
【０２４３】
１６．核タンパク質抽出物の調製
NF−κBの活性化およびサイトゾルから核への移行、ならびにそのDNA結合能力を調べるために核タンパク質抽出物を調製した。低張溶解緩衝液（第  節参照）で細胞を溶解した後、遠心分離（4℃、13000 gで5分間）によって核を沈殿させ、低張溶解緩衝液で一回洗浄して、混入しているサイトゾルタンパク質を取り除いてから、高張抽出緩衝液に再懸濁して、振とうしながら4℃で1〜2時間おいた。低張溶解緩衝液は、溶解の最中にタンパク質が核から浸出するのを防ぐが、高張な抽出緩衝液は、核膜を穴だらけにして、核タンパク質が溶液の中に入り込むのを可能にする。遠心分離（4℃、13000 gで10分間）後、核タンパク質を含む上清を新しいチューブに取り出して、−70℃で保存した。この核抽出物調製法は、Whiteside S.T.ら（1992）Nucelic Acids Res 20: 1531〜8の方法に基づいている。
【０２４４】
１７．免疫沈殿
IRAKを免疫沈殿させるために、サイトゾル抽出物を3μgの抗IRAK抗体と振とうしながら4℃で1時間インキュベートした。次いで、50μlの50％スラリー状プロテインGセファロース（アマーシャム社）を加えて、さらに2時間振とうした。その後、プロテインGセファロースに結合したIRAKを回収して、4回洗浄し、ウエスタンブロッティングローディング緩衝液に再懸濁し、5分間沸騰させてから、直ちにウエスタンブロッティングに使用した。
【０２４５】
１８．タンパク質濃度アッセイ法
さらなる実験手順（例、ウエスタンブロッティング、電気泳動による移動度シフトアッセイ）において、サイトゾルまたは核の抽出物を使用する前に、各試料中に等量のタンパク質が存在することを保証するために、それらのタンパク質濃度を決定する必要があった。タンパク質の濃度は、ブラッドフォード測定法で測定した。簡単に説明すると、適当に希釈した抽出物20μlを、3つ組で、標準として使用される、10〜1000μg/mlの範囲での、一連のBSA濃度（シグマ社、英国）20μlとともに96穴組織培養皿に加えた。次いで、200μlのブラッドフォード試薬を各ウエルに加えて、分光光度計（マルチスキャン・バイクロマティック（Multiscan Biochromatic）、ラボシステム社（Labsystems））において595 nmでの吸光度を測定した。その範囲のBSA濃度によって形成される直線的標準曲線から、サイトゾルおよび核の抽出物におけるタンパク質の量を決定した。
【０２４６】
１９．ウエスタンブロッティングおよび電気泳動移動度シフトアッセイ法
サイトゾルタンパク質を、10％（w/v）ポリアクリルアミドゲル上でSDS−PAGEによって分離し、ニトロセルロース膜に電気的に転移させた。それぞれサンタクルツ・バイオテクノロジー社（Santa CruzBiotechnology）（米国、サンタクルツ（Santa Cruz, USA）およびアップステート・バイオテクノロジー社（Upstate Biotechnology）（米国）から購入した抗体を用いることによって、IκBαおよびIRAKを検出した。一方、IκBα、p38、およびp42/44 MAPKのリン酸化型は、ニューイングランドバイオラボ（New England Biolabs）から入手した抗体によって検出した。
【０２４７】
２０．ルシフェラーゼアッセイ法
LPS刺激の後、細胞をPBSで一回洗浄してから、100μlのCAT溶解緩衝液（0.65％（v/v）NP40、10 mM Tris−HCl, pH 8, 0.1 mM EDTA, pH 8, 150 mM NaCl）で溶解した。細胞溶解物（50μl）を、ルミノメーターのキュベットストリップのウエルの中に移し入れて、ルシフェラーゼ測定緩衝液（220μl）を加えた。30μlのルシフェリン（1.5 mM、シグマ社、英国、プール）を分注し、ラボシステム社のルミノメーターによってルシフェラーゼ活性を、アッセイポイント毎に測定した。ブラッドフォード測定法によって、タンパク質濃度について細胞の溶解物を測定し、測定したルシフェラーゼ活性を適宜調整した。
【０２４８】
結果
Myd88は、tollドメインおよびデスドメインを含むサイトゾルタンパク質で、TRRのメンバーであるTLR（図2）およびIL−1レセプターのシグナル伝達機構に関係づけられていた（図1）。N−末側に53アミノ酸の欠失とPhe56Asn変異を含む、Myd88のムテインであるMyd88lpr（図1）は、IL−1の阻害因子として作用しうるが、HeLa細胞（図3）およびヒト皮膚線維芽細胞（図4）におけるNF−κBのTNF活性化（図3および4）およびMAPK活性化（図4）には作用し得ない。この結果と一致して、ヒト皮膚線維芽細胞におけるIL−1誘導によるIL−6産生も、これらの細胞においてMyd88lprが発現されると阻害された（図5）。これに対し、Myd88単独では、IL−1活性化を要求することなくIL−6産生を誘導した（図5および6）。これに対し、Myd88lprは、HSFにおけるTNF誘導によるIL−6産生には何ら効果を与えなかった（図6）。これにより、Myd88がTNFシグナル伝達に関係しないことが予想される。また、ヒト皮膚線維芽細胞で発現されたとき、Myd88lprもIL−1を阻害することができた（図7）が、TNF誘導によるIL−8産生は阻害できなかった（図8）。AdMyd88lprによって形質転換されたHUVECにおける研究が、IL−1およびLPSによって誘導されるNF−κB活性化、およびp42/44 MAPK活性化（図9）、ならびにIL−6およびIL−8の産生（図10および11）も阻害されることを示したため、Myd88lprの阻害効果はヒト皮膚線維芽細胞に限定されなかった。これらの結果とは対照的に、未成熟DCで発現されると、Myd88lprは、さらなる刺激を要することなくNF−κBを活性化した（図12）。さらに、Myd88lprの発現によって、未成熟DCによるTNF産生を誘導することが可能であった（図13）。ところが、HSFとは異なり、Myd88は効果がなかった（図13）。Myd88lprのDCにおける活性化効果Myd88によってアンタゴナイズされ、同一のシグナル伝達経路に関する２つの分子種による競合があることを示唆した（図14）。GFP抗原特異的T細胞（図15）を用いた研究、または同種異系MLRにおいて示されているように、Myd88lprの活性化効果は、DCの抗原提示機能を増強すると解された（図16）。DCの抗原提示機能は、CD80およびCD86など、DCの表面上にある共刺激分子の発現を上方制御することと関連している。Myd88lprの刺激作用と一致して、Myd88lprは、未成熟なDCで発現されたとき、CD80およびCD86の発現を増強することが分かった（図17）。別の潜在的APCである、MCSF−ヒトマクロファージにおいてMyd88lprの発現がp38 MAPK（図18）およびIRAK（図19）の活性化をもたらしたので、Myd88lprの活性化効果はNF−κBに限定されなかった。これに対して、ただし、図3に示されているHela細胞における以前の研究とは一致して、Myd88lprがIL−1誘導によるIRAKのリン酸化を阻害した（図19）。DCと同様、Myd88lprもヒトMCSFマクロファージにおけるIκBαのリン酸化を誘導し（図20）、また、ヒトマクロファージによるTNF、IL−6およびIL−8の産生を誘導または増強する（図21）。
【０２４９】
考察
toll関連レセプターは、LPS−LBP−CD14複合体を認識できるロイシンリピートを含む細胞外タンパク質と、IL−1Rとそれに関連した分子（Gay NJおよびKeth FH、Rock Fら1997）の細胞内部位にも見られる細胞質ドメイン（tollドメイン）をもつ膜貫通レセプタータンパク質であるtoll様レセプター（TLR）を含む。TRRは、一般的に、Myd88、IRAKおよびTRAF6などのシグナル伝達構成因子を利用する。特に、TRR同様Myd88は、tollドメインを含み、同型の相互作用を介して、レセプターのtollドメインと結合する。また、Myd88は、それによってIRAKと結合して、TRRを細胞内シグナル伝達経路に連結させるデスドメインを有する。優性ネガティブMyd88の発現が、293細胞におけるIL−1とLPSのシグナル伝達（Mujioら1998）を阻害し、サイトカイン放出ならびにMAPK/NF−κB活性化の両方も阻害されることは以前明らかになっていた。同様の結果がヒト真皮微小血管内皮細胞、および前単球細胞系であるTHP−1（Zhang FXら1999）で観察され、そこでは、優性ネガティブMyd88の一過的な過剰発現によってIL−1およびLPSの誘導によるNF−κB活性化が阻害された。
【０２５０】
Myd88ノックアウトマウスは、LPS依存的TNFα産生を誘導することができない（Kawaiら1999）。しかし、IL−1およびIL−18の誘導によるMAPKおよびNF−κBの活性化がノックアウトされても、マウスMyd88-/-マクロファージにおけるこれらの経路のLPS誘導による活性化は、少し遅れることを除けば、正常と考えられる。
【０２５１】
我々は、野生型（Myd88wt）またはMyd88ムテインであるMyd88lpr（図1）を過剰発現させる効果的なアデノウイルス遺伝子移入技術を用いることにより、ヒト初代細胞におけるTRRの役割を調べた。Burnsら（1998）による以前の研究から予想されたように、Myd88lprは、HSF、HUVEC、およびHela細胞におけるIL−1のシグナル伝達を阻止できた。さらに、Myd88lprは、HUVECにおけるLPSのシグナル伝達を阻止した。Myd88lprの阻害作用は、NF−κBおよびMAPKなどのシグナル伝達分子の活性化、および、サイトカイン産生の両方を含んでいた。予想されたように、TNFシグナル伝達経路は影響を受けなかった。さらに、HSFにおいては、Myd88wtは、さらなる刺激なしにサイトカイン産生を誘発することができた。しかし、意外にも、我々は、Myd88lprを未成熟DCおよびMCSFマクロファージに導入すると、NF−κB、MAPK、およびサイトカイン産生を活性化がもたらされることを発見した。さらに、DCにおいては、これらのAPCの抗原提示機能に主にかかわる共刺激分子CD80およびCD86の発現が、Myd88lprによって上方制御された。これらの作用の結果、Myd88lprの発現によってDCの抗原提示機能は大きく増強された。
【０２５２】
これらのデータは、TRRシグナル伝達の阻害は、DCおよびマクロファージにおいて細胞の活性化をもたらすことができることを意味している。このことは、APC、特にDCの機能を阻害することを役割とするTRRが存在することを示唆している。この示唆は、一部は、Myd88lprの刺激効果が、Myd88wtを同時発現させると阻害されるという観察によって支持される。さらに、Myd88lprがIRAK活性化を阻害するHela細胞とは異なり、マクロファージでは、Myd88lprがこのキナーゼの活性化を誘導する。
【０２５３】
TRRシグナル伝達、および、これらのレセプターが細胞機能の制御で果たす役割についての我々の理解に一層の複雑さを加えたこと以外に、これらのデータは、抗原提示活性の調節に関する新しい経路を明らかにした。この経路は、自己免疫疾患やアレルギーの予防および治療のために、免疫系を治療によって調節するために役立てることもできるし、また、ワクチン接種など、免疫系を刺激することが望ましい場面でも役立てることができる。これらの経路の発見は、ワクチン設計や、免疫調節法一般にも深い影響を与えるかもしれない。
【０２５４】
参考文献
1. Rockら、（1998） PNAS 95, 588〜593
2. O'Neill＆Dinarello（2000） Immunol Today 21, 206〜209
3. Poltorakら、（1998） Science 282, 2085〜2088
4. Underhillら、（1999） Nature 401, 811〜815
5. Burnsら（1998） J Biol Chem 273, 12203〜12209
6. Kawaiら（1999） Immunity 11, 115〜122
7. Takeuchiら（2000） Int Immunol 163, 978〜984
8. Duら（2000） Eur Cytokine Netw 11, 362〜371
【０２５５】
実施例２：樹状細胞培養
正常な有志被験者からの例示的樹状細胞培養
CD14+末梢血単球は、組織培養フラスコに付着するので、1％AB血清、GM−CSF（400 ng/ml）、およびIL−4（400 IU/ml）存在下で7日間培養する。これによって、DCの形態を持った細胞を得られ、平均して49％が、抗原を取り込んで提示することができる未成熟型DCであることを示すCD1a+マーカーを持っている。次いで、DCが細胞傷害性T−細胞に対して抗原提示できるようにするTNFα（15 ng/ml）を加えることにより、これらの細胞は成熟してCD83+細胞となる。7％の細胞は、１日以内にCD83+になるが、最大の効果を得るには少なくとも3日が必要である。単球条件培地で1％AB血清に代えることは可能であるが、おそらくこれは望ましくないだろう。
【０２５６】
癌患者からの例示的樹状細胞培養
救助化学療法の前後に、再発した転移性疾患の患者6人からDCを作製する（全部で末梢血12サンプル、各50 ml）。
【０２５７】
臨床実験
標準的なプロトコールに従って、患者が自己血液を一単位献血する。献血の前に、患者は、輸血サービスの医師による診断を受ける。同種献血と同じようにして、通常のウイルスマーカー（HIV、HBV、HCV、および梅毒）について自己献血をスクリーニングし、患者は、参加を希望する場合には、適切なカウセリングを受けた後同意書を提出する。このような注意を払うことによって、医療スタッフや研究スタッフが感染する可能性を防止し、また、通常の血液供給が交差汚染する可能性を防止する。血液は、通常の角形パックの中に入れられる。これによって、赤血球、バフィーコート、および血漿に自動的に分離できる。バフィーコートからは、約670×106個の単核白血球が得られ、これから、現在の技術を用いて約47×106個のDCが得られる。患者当たり8〜128×106個のDCという投薬量範囲を用いる。末梢血単球を２つの等量液に分割し、TRRシグナル伝達阻害因子（例えば、MyD88lpr、選択的には、細胞への取り込みのプロモーター）および抗原によってパルス標識するか、または、1日から10日目の腫瘍細胞抽出物でパルス標識する。または、例えば、TRRシグナル伝達阻害因子（例えばMyD88lpr）をコードし、また、抗原ペプチドをコードするアデノウイルス構築物などのDNAワクチン構築物に末梢血単球を曝露して、10日間、できれば、何回もワクチンに曝露して培養する。無血清培養条件または自己血漿は、同種のAB血清よりも優先して用いられる。培養したDCをプールして、洗浄し、注射する1時間以上前に100mlの食塩水に再懸濁する。自己赤血球細胞の濃縮物は、標準的な臨床上の適合性がない限り、患者に戻されることはない。エキソビボでのDC培養法は、以下の優れた製造規範に従って行われる。
【０２５８】
この時までに最初の血液サンプルを献血した患者は、救済化学療法を受けていて、臨床上寛解しているかもしれないし、していなかもしれない。さらに、再発した転移性疾患患者は、化学療法を受ける前に治療を受ける。治療法は２種類ある。すなわち、
（1）転移再発、標準的な療法の後で養子免疫療法
（2）転移再発、養子免疫療法の後で標準的な療法。
【０２５９】
製品の注入は、経験を積んだ医師の直接監督の下で、必要があれば救急蘇生処置および対症療法のための施設が利用可能な病室の寝台兼用長椅子ユニットの上で実施する。
【図面の簡単な説明】
【０２６０】
【図１】図１は、トールドメインおよびデスドメインを含むMyD88の構造を示す。MyD88は、C-末側トールドメインから短いリンカーにより隔てられたN−末側デスドメイン（DD）を含むモジュール構成を有する。N-末側DDは、FAS/APO1/CD95の細胞質末端（tail）とTNFレセプターとの間に共通し、かつホモダイマーまたはヘテロダイマーのいずれかを形成する他のDD配列とのタンパク質相互作用を媒介することが公知の約90アミノ酸のモチーフに関連する（Boldin M.P.ら、J Biol Chem 1995）。これらの相互作用は、MAPキナーゼおよび転写因子NF−κBを活性化することができるシグナル伝達複合体を築くための基礎を形成する（Nagata S. Cell 1997）。MyD88のC-末側トールドメインは、トール様、IL-1レセプターおよびIL-18レセプターを含むToll関連レセプターの拡張ファミリーに見られる約130アミノ酸を含む。また、トールドメインは、タンパク質−タンパク質相互作用にも関与する。MyD88は酵母において自己会合する。全長のMyD88およびMyD88変異体の概略図を示す。黒と灰色の四角形は、それぞれデスドメインとTollドメインを表す。デスドメインに点変異F56N（白丸で示す）を含むMyD88は、MyD88-lpr.とも呼ばれる（Burnsら、1998、JBC 273 12203から改変）。
【図２】図２は、免疫系の細胞におけるトール様レセプター1〜5の発現パターンを示す。最近になって、Muzioら（J Immunol 2000）は、TLR1〜5の発現パターンを調べて、TLR1は免疫系の細胞においていたるところで発現されるが、TLR2、4および5は、多形核細胞、単球、および樹状細胞に限定されていることを発見した。TLR3は、樹状細胞に限定されると考えられている。
【図３】図３は、ドミナントネガティブ（阻害性）MyD88が、57A HELA細胞において、IL-1に応答したNF-κBレセプターの活性化を阻害することを示す図である。NF-κBレセプター遺伝子で安定的にトランスフェクトされた57A HELA細胞は、未感染のままにしておくか、またはGFP、無関係なタンパク質（AdGFP）、IκBα（Ad IκBα）、野生型MyD88、MyD88-lprとして公知のMyD88変異体またはMyD88-トール変異体のみをコードする対照アデノウイルスで感染させた。一日後、細胞を、20ng/mlのTNFまたはIL-1で刺激して、NF−κBレポーター遺伝子に由来するルシフェラーゼ活性を測定した。ドミナントネガティブ（阻害性）MyD88-lprタンパク質の発現は、IL-1誘導NF−κB活性化を特異的に阻害し得るが、TNF誘導NF−κB活性化を阻害できなかった。一方、野生型MyD88は、予想したような効果を有さなかった。
【図４】図４は、野生型でないドミナントネガティブ（阻害性）型MyD88の発現が、IL-1に応答して、ヒト皮膚線維芽細胞（HSF）においてp38MAPK、p42/44 MAPKおよびNF−κBの活性化ならびにIκBαの分解をブロックすることを示す図である。初代ヒト皮膚線維芽細胞（HSF）を、無血清RPMIにおいて、対照タンパク質β-gal、野生型MyD88またはドミナントネガティブMyD88-lprをコードするアデノウイルスで感染させた。2時間後、ウイルスを除去し、細胞を5％FCS RPMIの中で一日培養して発現を生じさせた。そして、20ng/mlのIL-1またはTNFαで30分間刺激してから、細胞をサイトゾルおよび核の抽出のために溶解した。ウエスタンブロッティングを用いて、MyD88、リン酸化p38およびp42/44 MAPK、ならびにIκBαについてサイトゾル抽出物を解析した。電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）を用いて、核NF−κB−DNA結合活性を解析した。
【図５】図５は、野生型でないドミナントネガティブ（阻害性）型MyD88の発現が、HSFにおいてIL-1誘導IL-6産生をブロックすることを示す図である。初代ヒト皮膚線維芽細胞（HSF）を、無血清RPMIにおいて、対照タンパク質β-gal、野生型MyD88またはドミナントネガティブMyD88-lprをコードするアデノウイルスで感染させた。2時間後、ウイルスを除去し、細胞を5％FCS RPMIの中で一日培養して発現を生じさせた。そして、20ng/mlのIL-1で24時間刺激し、上清を回収して、ELISAによりIL-6産生について解析した。ドミナントネガティブMyD88-lprの発現は、ヒト皮膚線維芽細胞において、IL-1誘導IL-6産生を阻害することができた。
【図６】図６は、ドミナントネガティブ（阻害性）型MyD88または野生型MyD88の発現が、HSFにおいてTNFα誘導IL-6産生をブロックしないことを示す図である。初代ヒト皮膚線維芽細胞（HSF）を、無血清RPMIにおいて、対照タンパク質β-gal、野生型MyD88またはドミナントネガティブMyD88-lprをコードするアデノウイルスで感染させた。2時間後、ウイルスを除去し、細胞を5％FCS RPMIの中で一日培養して発現を生じさせた。そして、20ng/mlのIL-1で24時間刺激し、上清を回収して、ELISAによりIL-8産生について解析した。ドミナントネガティブMyD88-lprの発現は、ヒト皮膚線維芽細胞において、IL-1誘導IL-8産生を阻害することができた。
【図７】図７は、野生型でないドミナントネガティブ（阻害性）型MyD88の発現が、HSFにおいてIL-1誘導IL-8産生をブロックすることを示す図である。初代ヒト皮膚線維芽細胞（HSF）を、無血清RPMIにおいて、対照タンパク質β-gal、野生型MyD88またはドミナントネガティブMyD88-lprをコードするアデノウイルスで感染させた。2時間後、ウイルスを除去し、細胞を5％FCS RPMIの中で一日培養して発現を生じさせた。そして、20ng/mlのTNFαで24時間刺激し、上清を回収して、ELISAによりIL-6産生について解析した。ドミナントネガティブMyD88-lprの発現は、ヒト皮膚線維芽細胞において、TNFα誘導IL-6産生を阻害することができなかった。このことは、MyD88は、IL-1シグナル伝達経路には特異的に必要であるが、TNFシグナル伝達経路には必要でないことを示している。
【図８】図８は、ドミナントネガティブ（阻害性）型または野生型MyD88の発現が、HSFにおいてTNFα誘導IL-8産生をブロックしないことを示す図である。初代ヒト皮膚線維芽細胞（HSF）を、無血清RPMIにおいて、対照タンパク質β-gal、野生型MyD88またはドミナントネガティブMyD88-lprをコードするアデノウイルスで感染させた。2時間後、ウイルスを除去し、細胞を5％FCS RPMIの中で一日培養して発現を生じさせた。そして、20ng/mlのTNFαで24時間刺激し、上清を回収して、ELISAによりIL-8産生について解析した。ドミナントネガティブMyD88-lprの発現は、ヒト皮膚線維芽細胞において、TNFα誘導IL-8産生を阻害しなかった。このことは、MyD88は、IL-1シグナル伝達経路には特異的に必要であるが、TNFシグナル伝達経路には必要でないことを示している。
【図９】図９は、野生型でないドミナントネガティブ（阻害性）型MyD88の発現が、IL-1およびLPSに応答して、ヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）においてp42/44 MAPKおよびNF-κB活性化ならびにIκBα分解をブロックすることを示す図である。初代臍静脈内皮細胞（HUVEC）を、無血清RPMIにおいて、対照タンパク質β-galまたはドミナントネガティブMyD88-lprをコードするアデノウイルスで感染させた。2時間後、ウイルスを除去し、細胞を5％ FCS RPMIの中で一日培養して発現を生じさせた。そして、20ng/mlのIL-1または1μg/mlのLPSで30分間刺激し、細胞をサイトゾルおよび核の抽出のために溶解した。ウエスタンブロッティングを用いて、MyD88発現、p42/44 MAPKのリン酸化、およびIκBαの発現についてサイトゾル抽出物を解析した。電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）を用いて、核NF-κB-DNA結合活性を解析した。
【図１０】図１０は、野生型でないドミナントネガティブ（阻害性）型MyD88の発現が、IL-1およびLPS誘導IL-6産生をブロックするがTNF誘導IL-6産生をブロックしないことを示す図である。初代HUVECを、無血清RPMIにおいて、対照タンパク質β-gal、野生型MyD88、ドミナントネガティブMyD88-lpr、IκBαまたはドミナントネガティブのIKK-2をコードするアデノウイルスで感染させた。2時間後、ウイルスを除去し、細胞を5％ FCS RPMIの中で一日培養して発現を生じさせた。そして、20ng/mlのIL-1、20ng/mlのTNFαまたは1μg/mlのLPSで24時間刺激し、上清を回収して、ELISAによりIL-6産生について解析した。ドミナントネガティブなMyD88-lprの発現は、IL-1およびLPS誘導IL-6産生を阻害することができ、これは、トール関連レセプターの特異的インヒビターであることを示唆している。また、IκBαおよびドミナントネガティブIKK-2も、トール関連レセプターのシグナル伝達経路において、MyD88の下流で作用するので、IL-6産生をブロックした。TNF誘導IL-6産生は、MyD88が関与しないのでブロックされなかった。しかし、IKK-2およびIκBαも、TNF-Rシグナル伝達経路によって利用されている。
【図１１】図１１は、野生型でないドミナントネガティブ（阻害性）型MyD88の発現が、IL-1およびLPS誘導IL-8産生をブロックするがTNF誘導IL-8産生をブロックしないことを示す図である。初代HUVECを、無血清RPMIにおいて、対照タンパク質β-gal、野生型MyD88、ドミナントネガティブMyD88-lpr、IκBαまたはドミナントネガティブのIKK−2をコードするアデノウイルスで感染させた。2時間後、ウイルスを除去し、細胞を5％ FCS RPMIの中で一日培養して発現を生じさせた。そして、20ng/mlのIL-1、20ng/mlのTNFαまたは1μg/mlのLPSで24時間刺激し、上清を回収して、ELISAによりIL-8産生について解析した。ドミナントネガティブなMyD88-lprの発現は、IL-1およびLPS誘導IL-8産生を阻害することができ、これは、トール関連レセプターの特異的インヒビターであることを示唆している。また、IκBαおよびドミナントネガティブIKK−2も、トール関連レセプターのシグナル伝達経路において、MyD88の下流で作用するので、IL-8産生をブロックした。TNF誘導IL-8産生は、MyD88が関与しないのでブロックされなかった。しかし、IKK-2およびIκBαも、TNF-Rシグナル伝達経路によって利用されている。
【図１２】図１２は、樹状細胞におけるドミナントネガティブ（阻害性）型MyD88の発現が逆の影響を有する：NF−κB活性化を誘導することを示す図である。未成熟DCを、50ng/mlのGM-CSFおよび10ng/mlのIL-4による培養5日後に末梢血単球から末梢血単球から生成した。そして、それらを未感染のままにしておくか、または無血清培地において、インサートをもたない対照アデノウイルス（Ad0）およびドミナントネガティブMyD88をコードするアデノウイルス（AdMyD88-lpr）で感染させた。感染多重度100を用いた。発現６時間後と24時間後に細胞を溶解し、NF−κBのDNA結合活性について、EMSAによりその核抽出物を調べた。驚いたことに、ドミナントネガティブMyD88の発現は、そのままでNF−κB活性化を誘導したが、これは、これまで発見されたこととは全く対照的である。
【図１３】図１３は、野生型でないドミナントネガティブ（阻害性）型MyD88の発現が、樹状細胞においてそのままでTNFα産生を誘導し、LPS誘導TNFα産生を阻害しないことを示す図である。未成熟DCを、50ng/mlのGM-CSFおよび10ng/mlのIL-4による培養５日後に末梢血単球から生成した。そして、それらを未感染のままにしておくか、または無血清培地において、β-galをコードする対照アデノウイルス（Adβ-gal）、ドミナントネガティブMyD88をコードするアデノウイルス（Adlpr）および野生型MyD88をコードするアデノウイルス（AdMyD88wt）で感染させた。Adtollは、非機能性であることが示されているので無視した。感染多重度100を用いた。24時間後に、100ng/mlのLPSで細胞を刺激した。驚いたことに、ドミナントネガティブMyD88の発現は、それ以外のさらなる刺激なしに、そのままで樹状細胞TNFα産生を誘導することができた。さらに、LPS誘導TNFα産生を阻害することはできず、この発見は、これまで発見されたいずれのこととも対照的である。
【図１４】図１４は、野生型MyD88の発現が、樹状細胞においてMyD88-lpr（ドミナントネガティブ）誘導TNFα産生を排除することを示す図である。未成熟DCを、50ng/mlのGM-CSFおよび10ng/mlのIL-4による培養５日後に末梢血単球から生成した。次いで、それらを未感染のままにしておくか、または無血清培地において、β-galをコードする対照アデノウイルス（Adβ-gal）、野生型MyD88をコードするアデノウイルス（AdMyD88wt）およびドミナントネガティブMyD88をコードするアデノウイルス（Adlpr）で感染させた。場合によってはAd-lprおよびAdβ-gal またはAdMyD88wtによる1:1および1:5の比での二重感染を用いた。単一の感染について感染多重度100を用いた。24時間後に、100 ng/mlのLPSで細胞を刺激した。驚いたことに、ドミナントネガティブMyD88の発現は、さらなる刺激なしに、そのままで樹状細胞のTNFα産生を誘導することができた。さらに、LPS誘導TNFα産生を阻害することはできず、この発見は、これまで発見されたいずれのこととも対照的である。
【図１５】図１５は、樹状細胞におけるドミナントネガティブMyD88の発現は、抗原特異的なT細胞増殖を増強することを示す図である。未成熟DCを、50ng/mlのGM-CSFおよび10ng/mlのIL-4による培養５日後に末梢血単球から生成した。次いで、それらを未感染のままにしておくか、または無血清培地において、インサートをもたない対照アデノウイルス（Ad0）、プロトタイプ抗原として緑色蛍光タンパク質をコードするアデノウイルス（AdGFP）、およびドミナントネガティブMyD88に連結しているGFPをコードするアデノウイルス（AdGFP-lpr）で感染させた。48時間後に、段階的な量の樹状細胞を2×104個の抗原特異的T細胞とともに培養し、3日後に増殖を測定した。抗原GFPの樹状細胞への送達は、ドミナントネガティブMyD88の発現によって増強される抗原特異的T細胞増殖を誘導した。このことは、ヒト皮膚線維芽細胞またはHUVECではなく樹状細胞におけるMyD88活性の阻害が、樹状細胞活性化をもたらすという本発明者らの予期せぬ結果と合致する。
【図１６】図１６は、樹状細胞におけるドミナントネガティブMyD88の発現が、同種混合リンパ球反応（MLR）を増強することを示す図である。未成熟DCを、50ng/mlのGM-CSFおよび10ng/mlのIL-4による培養５日後に末梢血単球から生成した。次いで、それらを未感染のままにしておくか、または無血清培地において、インサートをもたない対照アデノウイルス（Ad0）、およびドミナントネガティブMyD88をコードするアデノウイルス（Ad-lpr）で感染させた。48時間後に、段階的な量の樹状細胞を1×105個の同種T細胞とともに培養し、6日後に増殖を測定した。ドミナントネガティブMyD88の発現は、同種T細胞の増殖を増強するが、これは、DCの抗原提示が上昇したことを示す発見である。
【図１７】図１７は、樹状細胞におけるドミナントネガティブMyD88の発現が、同時刺激分子（CD80、CD86）の発現を増強することを示す図である。未成熟DCを、50ng/mlのGM-CSFおよび10ng/mlのIL-4による培養５日後に末梢血単球から生成した。次いで、それらを未感染のままにしておくか、または無血清培地において、GFPをコードする対照アデノウイルス、およびドミナントネガティブMyD88をコードするアデノウイルス（Adlpr）で感染させた。48時間後に、樹状細胞を回収して、CD80およびCD86（有効な抗原提示機能に必要とされる非常に重要な２つの同時刺激分子）に対する染色を行った。ドミナントネガティブMyD88の発現は、CD80およびCD86の細胞表面発現を増強したが、このことは、樹状細胞の抗原提示機能が増強したことを示している。
【図１８】図１８は、マクロファージにおけるドミナントネガティブMyD88の発現が、p38MAPKのリン酸化を誘導することを示す図である。ヒトマクロファージを、5％FCS RPMIに2〜3日間100ng/mlのM-CSFを添加することによって末梢血単球から分化させた。次いで、それらを未感染のままにしておくか、無血清培地において、β-galをコードする対照アデノウイルスで感染させるか、またはドミナントネガティブMyD88をコードするアデノウイルス（Adlpr）で感染させた。示すように、moi 100（一例においてはmoi 50）を用いた。6時間、24時間、および48時間後に、細胞を溶解し、抽出物をウエスタンブロッティングおよびホスホ-p38 MAPK-特異的抗体を用いてp38 MAPK活性についてアッセイした。意外にも、ドミナントネガティブMyD88の発現は、ヒトマクロファージにおけるp38 MAPK活性を誘導する。
【図１９】図１９は、マクロファージにおけるドミナントネガティブMyD88の発現が、IRAKのリン酸化を誘導することを示す図である。ヒトマクロファージを、5％FCS RPMIに2〜3日間100ng/mlのM-CSFを添加することによって末梢血単球から分化させた。5％FCS DMEM中で培養したHELA細胞も使用した。両細胞型は、未感染のままにしておくか、無血清培地において、β-galをコードする対照アデノウイルス、野生型MyD88をコードするアデノウイルスまたはドミナントネガティブMyD88をコードするアデノウイルス（Adlpr）で感染させた。moi 100を用いた。5分後または12時間後に、細胞を溶解し、抽出物を、ウエスタンブロッティングを用いてIRAKおよびホスホ-IRAKについてアッセイした。HELA細胞においては、ドミナントネガティブMyD88（MyD88-lpr）の発現は、IL-1誘導性のIRAKの活性化を阻害することがわかった。しかし、意外にも、ドミナントネガティブMyD88の発現は、LPSの添加により増加しないヒトマクロファージにおけるIRAK活性を誘導する。この発見は、MyD88活性もまたマクロファージにおける（HELA細胞ではなく）IRAKリン酸化を阻害する阻害性シグナルに必要であり、そのブロックによってIRAKの活性化がもたらされることを示唆している。
【図２０】図２０は、マクロファージにおけるドミナントネガティブMyD88の発現が、IκBαリン酸化を誘導することを示す図である。ヒトマクロファージを、5％FCS RPMIに2〜3日間100ng/mlのM-CSFを添加することによって末梢血単球から分化させた。細胞を、無血清培地において、β-galをコードする対照アデノウイルスまたはドミナントネガティブMyD88をコードするアデノウイルス（Adlpr）で感染させた。moi 100を用いた。24時間後に、細胞を溶解し、抽出物をウエスタンブロッティングを用いてホスホ-IκBαについてアッセイした。意外にも、ドミナントネガティブMyD88の発現は、ヒトマクロファージにおいてIκBαリン酸化を誘導する。
【図２１】図２１は、マクロファージにおける野生型でないドミナントネガティブMyD88の発現が、他の刺激なしにTNFα、IL-6およびIL-8の産生を誘導することを示す図である。ヒトマクロファージを、5％FCS RPMIに2〜3日間100ng/mlのM-CSFを添加することによって末梢血単球から分化させた。次いで、それらを未感染のままにしておくか、無血清培地において、β-galをコードする対照アデノウイルスで感染させるか、野生型MyD88をコードするアデノウイルスで感染させるか、またはドミナントネガティブMyD88をコードするアデノウイルス（Adlpr）で感染させた。moi 100を用いた。（a）48時間後に、上清を回収して、さらなる刺激なしのTNFα、IL-6およびIL-8サイトカインの産生についてアッセイした。サイトカイン産生は、ドミナントネガティブMyD88を発現する細胞では検出されたが、野生型MyD88を発現する細胞または対照細胞では検出できなかった。このことは、HSFまたはHUVECではなく樹状細胞と同様にマクロファージにおけるMyD88活性のブロックは、細胞の活性化および炎症性サイトカインの放出をもたらすことを示唆した。（b）発現して0時間、4時間、24時間、および48時間目に上清を回収して、ELISAによってTNF、IL-6およびIL-8についてアッセイした。対照細胞または野生型MyD88を発現する細胞は、サイトカイン産生のバックグランドレベルを有しているので、ドミナントネガティブMyD88（MyD88-lpr）を過剰発現する細胞から得られた結果のみを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004522432.tif 000146
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