(57)【要約】【課題】うっ血性心不全の治療法および患者の血中コレステロー値を低くする方法。さらに、３，５−ジヨードチロピオン酸の合成方法の改良。【解決手段】治療に有効な投与量の３，５−ジヨードチロピオン酸を投与する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
うっ血性心不全の患者を治療する方法において、患者に有効治療投与量の３，５−ジヨードチロプロピオン酸を投与することを特徴とする方法。
【請求項２】
３，５−ジヨードチロプロピオン酸を液体製剤、固体製剤、カプセル製剤および移植製剤から成る群の中から選択される配合物として投与する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
配合物が薬学的に許容されるキャリヤをさらに含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
配合物が安定剤、賦形剤、可溶化剤、抗酸化剤、痛み緩和剤および等張剤の少なくとも１種をさらに含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
３，５−ジヨードチロプロピオン酸を注射で非経口投与する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
３，５−ジヨードチロプロピオン酸を静脈注射で非経口投与する請求項１に記載の方法。
【請求項７】
３，５−ジヨードチロプロピオン酸を経口投与する請求項１に記載の方法。
【請求項８】
３，５−ジヨードチロプロピオン酸を患者の肺に直接投与する請求項１に記載の方法。
【請求項９】
３，５−ジヨードチロプロピオン酸を経皮投与する請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
３，５−ジヨードチロプロピオン酸を移植で投与する請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
患者の血中コレステロール値を下げる方法において、有効治療投与量の３，５−ジヨードチロプロピオン酸を投与することを特徴とする方法。
【請求項１２】
３，５−ジヨードチロプロピオン酸を液体製剤、固体製剤、カプセル製剤および移植製剤から成る群の中から選択される配合物として投与する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
配合物が薬学上許容されるキャリヤをさらに含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
配合物が安定剤、賦形剤、可溶化剤、抗酸化剤、痛み緩和剤および等張剤の少なくとも１種をさらに含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
３，５−ジヨードチロプロピオン酸を注射で非経口投与する請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
３，５−ジヨードチロプロピオン酸を静脈注射で非経口投与する請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
３，５−ジヨードチロプロピオン酸を経口投与する請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
３，５−ジヨードチロプロピオン酸を患者の肺に直接投与する請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
３，５−ジヨードチロプロピオン酸を経皮投与する請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
３，５−ジヨードチロプロピオン酸を移植によって投与する請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
下記段階から成る３，５−ジヨードチロプロピオン酸の合成方法：
（1）  エチル−３−（３，５−ジヨード−４−ヒドロキシフェニル）プロピオネートを作り、
（2）  ジアニソールヨードニウムトリフルオロ酢酸を作り、
（3）  上記のエチル−３−（３，５−ジヨード−４−ヒドロキシフェニル）プロピオネートとジアニソールヨードニウムトリフルオロ酢酸とを反応させてエチル−３−（４'−メトキシ−３，５−ジヨードチロ）プロピオネートを作り、
（4）  上記のエチル−３−（４'−メトキシ−３，５−ジヨードチロ）プロピオネートとヨウ化水素および氷酢酸とを反応させて３，５−ジヨードチロプロピオン酸を作る。
【請求項２２】
下記段階をさらに含む請求項２１に記載の方法：
３−(４−ヒドロキシフェニル)−プロピオン酸を作り、
この３−(４−ヒドロキシフェニル)−プロピオン酸をヨウ素と反応させて３−（３，５−ジヨード−３−ヒドロキシフェニル）−プロピオン酸を作り、
この（３，５−ジヨード−３−ヒドロキシフェニル）−プロピオン酸をエタノールと反応させて３−（３，５−ジヨード−３−ヒドロキシフェニル）−プロピオネートを作る。
【請求項２３】
下記段階をさらに含む請求項２２に記載の方法：
発煙硝酸、ヨウ素およびトリフルオロ酢酸を反応させてヨード(III)トリフルオロ酢酸を作り、このヨード(III)トリフルオロ酢酸をアニソールと反応させてジアニソールヨードニウムトリフルオロ酢酸を作る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、うっ血性心不全 (congestive heart failure) の患者および／または血中コレステロール濃度が高い患者に治療に有効な量の３，５−ジヨードチロプロピオン酸 (3,5-dIIodothyropropionic acid) を投与する治療方法に関するものである。
本発明はさらに、３，５−ジヨードチロプロピオン酸の合成方法に関するものでもある。
【背景技術】
【０００２】
うっ血性心不全は米国で約４６０万人の患者が患っている主要な健康問題であり、罹患率はこれから数十年間増加するであろうと予測されている。従って、心不全の拡大に対して臨床的な問題として新たな治療戦略を開発する必要性がさけばれている。
【０００３】
その一つの方法は甲状腺ホルモンを用いる方法である。甲状腺ホルモンは独特な生理学的、生化学的作用を有するので心不全の治療に有用な新規な薬剤となり得る。甲状腺ホルモンは心筋のカルシウム循環プロテインの含有率に対して転写レベルの所で作用し、筋質細網によるカルシウムの吸収を刺激する。さらに、甲状腺ホルモンは心臓ミオシン重鎖（ＭＨＣ）のアイソフォーム発現において相互シフトを起こさせ、高活性Ｖ1イソフォームの発現を増加させ、低活性Ｖ3イソフォームの発現を減少させる。甲状腺ホルモンによって心室圧の上昇および下降の速度を増加させる能力はこうした生化学的な変化によるものと思われる。
【０００４】
甲状腺ホルモンにはＬ型のチロキシン（３，５，３'，５'−Ｌ−チロニン；以下、チロキシンまたはＴ4という）およびトリヨードチロニン（３'，３，５−Ｌ−トリヨードチロニン；以下、トリヨードチロニンまたはＴ3という）が含まれる。３'，５'，３−Ｌ−トリヨードチロニン（以下、逆Ｔ3またはｒＴ3という）はＴ4の一般的な代謝産物である。Ｔ4は甲状腺で合成され、血漿中に見られる循環型のホルモンである。少量のＴ3は甲状腺で合成されるが、大部分のＴ3は５‘−モノデヨージナーゼ酵素による周辺組織中のチロキシン代謝によって生成される。甲状腺ホルモンの分子レベルの作用原理はＴ3がクロマチン結合核レセプターに結合することによって起こると考えられる。チロイドホルモンレセプターには２つの主要な亜類型すなわちＴＲαとＴＲβがある。これらは２つの異なる遺伝子の産成物である。これらの遺伝子はc-erbAプロトオンコジーンファミリーのメンバーで、多数のステロイドおよびペプチドホルモンレセプター（ステロイド−甲状腺ホルモンスーパーファミリーと総称される）に属する。ＴＲαおよびＴＲβの亜類型は種々の組織で別々に発現する。
【０００５】
現在、臨床的に用いられる主要な甲状腺ホルモンは下記文献に記載の方法で合成したチロキシンである。
【特許文献１】米国特許第２，８０３，６５４号明細書
【０００６】
その理由はその半減期が６〜７日と長いためである。トリヨードチロニンはチロキシンより血漿タンパク質との結合が弱く、作用の開始が急であり、静脈投与に用いることができる。しかし、Ｔ3の半減期は短く、２日以下である。
天然ホルモンの作用を模倣する甲状腺ホルモン類似物を合成するための研究が種々なされている。これらの研究の目的の大部分は心臓に対して副作用を引き起こさないで血漿コレステロールを下げるチロミメティック（thyromimetics）を開発することにある。下記文献には一連の甲状腺類似物とその合成方法が記載されている。
【特許文献２】米国特許第３，１０９，０２３号明細書
【０００７】
下記文献には甲状腺ホルモンレセプターのβ亜類型に特に選択的な甲状腺ホルモン作用薬が記載されている。
【特許文献３】米国特許第５，８８３，２９４号明細書
【０００８】
下記文献にはビフェニル核にあるスルホニル架橋に特徴があるチロミメティックが記載されている。
【特許文献４】米国特許第５，２８４，９７１号明細書
【０００９】
心臓血管コンプロマイズ（compromise）の治療に甲状腺ホルモンを利用する研究が最近開発された。下記文献には急性心臓血管コンプロマイズの患者へ甲状腺ホルモンを投与する治療方法が記載されている
【特許文献４】米国特許第５，１５８，９７８号明細書
【００１０】
この方法では心停止後に静脈、肺循環または心臓へ直接、中心静脈カテーテルを入れ、Ｔ4とＴ3を投与する。
進行したうっ血性心不全患者にＴ3を短期間静脈内投与すると心拍出量が改善され、動脈の血管抵抗が小さくなる。Ｌ−チロキシンを経口投与すると、突発性拡張型心筋症の患者の心臓の働きおよび運動容量が２週間から３ヶ月の間改善される。これらの研究の患者数は少ないが、好ましい結果が得られており、甲状腺ホルモンまたは甲状腺ホルモン類似物の心不全治療での安全性および潜在的価値をさらに研究するための基礎は確立されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
甲状腺ホルモンには副作用、例えば代謝刺激および頻脈があるため、副作用の少ない甲状腺ホルモン類似物が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本出願人は３，５−ジヨードチロプロピオン酸（ＤＩＴＰＡ）はＬ−チロキシンの約半分の変時作用 (chronotropic effect) およびそれより小さな代謝刺激で心臓機能を増加させる甲状腺ホルモン類似物であることを見い出した。このＤＩＴＰＡは甲状腺ホルモンと同様にプロトオンコジーンファミリーc-erbAの核レセプターＴ3に結合する。
【発明の効果】
【００１３】
ＤＩＴＰＡを単独またはアンギオテンシンＩ型変換酵素阻害剤と組み合わせて投与すると、心不全のポスト梗塞形成実験モデルにおける左心室の機能が改善されることが証明された。
甲状腺ホルモンは周知の心臓での変時作用および変力作用に加えて、動脈抵抗、静脈抵抗および静脈コンプライアンスを低下させる。これら作用の総合作用として心拍出量が動脈圧より増加し、その結果、動脈の計算血管抵抗値が低下する。心不全の実験モデルにＤＩＴＰＡを用いた場合にはＤＩＴＰＡは甲状腺ホルモンと同様の作用を示し、心臓とその周辺循環器に作用を与える。正の力−頻度関係とよばれる心拍に対する収縮性の正常上昇ロスがヒトの心筋不全患者でも動物の心筋不全モデルでも見られる。ＤＩＴＰＡの投与によってウサギの梗塞心臓が単一心筋細胞の平坦な収縮−頻度関係になるのを阻止できる。
【００１４】
また、ＤＩＴＰＡは心筋細胞の機能を改善し、筋小胞体（ＳＲ）中のカルシウム輸送を促進し、ウサギの梗塞形成後の心不全に伴うＳＲタンパク質の発現低下を阻止する。一般的な霊長類では、ＤＩＴＰＡは甲状腺ホルモンと同じように生体の力−頻度関係および弛緩−頻度関係をインビボで促進させる。ＤＩＴＰＡの投与で心臓をほとんど肥大させず（心室の寸法に悪影響を与えず）に、血流に変化を起こすことができる。ＤＩＴＰＡを投与した梗塞ラットでは梗塞部の周りの境界領域の毛細血管成長が増加するということが細胞測定分析から分かる。
【００１５】
本出願人は、３，５−ジヨードチロプロピオン酸（ＤＩＴＰＡ）はＬ−チロキシンの約半分の変時作用およびそれより小さい代謝刺激で心臓機能を上昇させる甲状腺ホルモン類似物であるということを見出した。ＤＩＴＰＡは甲状腺ホルモンと同様にc-erbAプロトオンコジーンファミリーの核レセプターＴ3に結合する。ＤＩＴＰＡは単独投与またはアンギオテンシンＩ型変換酵素阻害剤と組合せて投与したときに梗塞形成後の心不全実験モデルで左心室（ＬＶ）の機能を改良するということが分かった。
【００１６】
甲状腺ホルモンは、周知の心臓での変時作用および筋収縮作用に加えて、動脈抵抗、静脈抵抗および静脈コンプライアンスを低下させる。これらの作用の総合として心拍出量が動脈圧より増加し、その結果、動脈の計算血管抵抗値が低下する。
心不全の実験モデルにＤＩＴＰＡを用いた場合、ＤＩＴＰＡは甲状腺ホルモンと同様の作用をし、心臓とその周辺の循環器の両方に影響を与える。正の力−頻度関係とよばれる心拍に対する収縮性の正常上昇ロスがヒトの心筋不全患者でも動物の心筋不全モデルでも見られる。ＤＩＴＰＡの投与によってウサギの梗塞心臓が単一心筋細胞の平坦な収縮−頻度関係になるのを阻止できる。また、ＤＩＴＰＡは心筋細胞の機能を改善し、筋小胞体（ＳＲ）中のカルシウム輸送を促進し、ウサギの梗塞形成後の心不全に伴うＳＲタンパク質の発現低下を阻止する。
【００１７】
一般的な霊長類では、ＤＩＴＰＡは甲状腺ホルモンと同じように生体の力−頻度関係および弛緩−頻度関係をインビボで促進させる。ＤＩＴＰＡの投与で心臓をほとんど肥大させず（心室の寸法に悪影響を与えず）に、血流に変化を起こすことができる。ＤＩＴＰＡを投与した梗塞ラットでは梗塞部の周りの境界領域の毛細血管成長が増加するということが細胞測定分析から分かる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
ＤＩＴＰＡの投与量範囲を研究するために、7人の健常なボランティアでテストを実施した。さらに、この化合物が医薬として十分に許容されることが確立された後に、19人の患者に対して二重盲検でＤＩＴＰＡ対偽薬の効果を調べた。
ＤＩＴＰＡは本発明の好ましい製造プロセスを用いて合成した。すなわち、ジアニソールオジウムトリフルオロアセテート（dianisoleiodium trifluoroacetate）をエチル−３−（３、５−ジヨード−４−ヒドロキシフェニル）−プロピオネートとカップリングさせた後、メチルおよびエチル保護基を外す。このカップリング方法ではＴ3またはＴ4が副産物として生成することはない。なぜならば、外側リングとなる化合物にはヨードが含まれず、内側リングの反応物にはアミノ基が無いためである。
この合成方法で得られたＤＩＴＰＡの構造をプロトンＮＭＲで確認し、逆相ＨＰＬＣでその純度を検査した。主要な不純物はＤＩＴＰＡのエチルエステルであることが特定された。研究では最終化合物の純度が９５％以上であるバッチのみを用いた。
【００１９】
本発明のＤＩＴＰＡの合成方法では出発物質として下記の３−(４−ヒドロキシフェニル)−プロピオン酸（化合物Ｉ）を用いる。合成の最初の段階でこの化合物Ｉをヨー化カリウム／ヨードカリウムと反応させ、次にメチルアミンと反応させて、３−（３，５−ジヨード−４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸（化合物II）を作る。
【００２０】
【化１】
2004522747.tif 000002
【００２１】
次に、触媒としてｐ−トルエンスルホン酸を用いて、化合物IIをエタノールと反応させて、エチル−３−（３，５−ジヨード−４−ヒドロキシフェニル）プロピオネート（化合物III）を作る。
【００２２】
【化２】
2004522747.tif 000003
【００２３】
続いて、化合物IIIをカップリング剤のジアニソールヨードニウムトリフルオロ酢酸（dianisoleiodonium trifluoroacetate）と反応させる。
カップリング剤のジアニソールヨードニウムトリフルオロ酢酸の調製では先ず最初にトリフルオロ酢酸（化合物IV）を赤煙硝酸およびヨウ素と反応させてヨウ素（III）トリフルオロ酢酸（化合物V）を作る。
【００２４】
【化３】
2004522747.tif 000004
【００２５】
次の段階で、上記化合物Vをアニソールすなわちメトキシベンゼンと反応させてジアニソールヨードニウムトリフルオロ酢酸(化合物VI)を作る。
【００２６】
【化４】
2004522747.tif 000005
【００２７】
本出願人が化合物VIの対イオンとしてトリフルオロ酢酸を用いた理由は、他の対イオンを用いると吸湿性の化合物になり、保存期間が短くなるためである。
次に、エチル−３−（３，５−ジヨード−４−ヒドロキシフェニル）プロピオネート（化合物III）をジアニソールヨードニウムトリフルオロ酢酸（化合物VI）と反応させてエチル−３−(４'−メトキシ−３，５−ジヨードチロ)プロピオネート（化合物VII）を作る。
【００２８】
【化５】
2004522747.tif 000006
【００２９】
本発明の合成方法の最終段階は、エチル−３−（４'−メトキシ−３，５−ジヨードチロ）プロピオネート（化合物VII）をヨウ化水素および氷酢酸と反応させて、エチルエステルおよびメチルエーテルの両方を加水分解してＤＩＴＰＡを生成させる段階である。
【００３０】
【化６】
2004522747.tif 000007
【００３１】
以下、当業者にＤＩＴＰＡの合成方法の実施例を示す。しかし、本発明の範囲が以下の実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲は請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例１】
【００３２】
３−（３，５−ジヨード−４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸の合成
段階１
５０ｇのＫＩを秤量し、栓を閉めた均圧滴下漏斗に入れ、６０ｍｌのＨ2Ｏを加えて塩が溶解するまで撹拌する。５２ｇのＩ2を秤量し、滴下漏斗に加え、完全に溶解するまで撹拌する。９０ｍｌのＨ2Ｏを加え（全部で１５０ｍｌ）、滴下漏斗を密封する。滴下漏斗を安全な場所に置き、段階２へ進む。
【００３３】
段階２
１６．２ｇの３−（４−ヒドロキシフェニル）−プロピオン酸を秤量し、１．０リットルの丸底フラスコに入れる。１００ｍｌの４０％メチルアミン水溶液および１００ｍｌのＨ2Ｏを電磁撹拌棒と一緒に入れる。フラスコに栓をし、フラスコを電磁撹拌装置の上に固定し、全てが溶解するまで制御速度で撹拌する。
段階３
栓を外して滴下漏斗に代える。栓を開けてヨード液が約２０分間で丸底フラスコに入るようにする。添加終了後１０分間、撹拌したまま反応させる。
【００３４】
段階４
反応混合物を濾過し、１リットルビーカーに注ぎ、２Ｎ−ＨＣｌ（約４４０ｍｌ）で酸性にする。得られた沈殿物を濾過し、冷たいＨ2Ｏで洗浄する。生成物を濾紙で覆い、一晩吸引乾燥する。
段階５
エタノールから生成物を再結晶化する。エタノール中にはかなりの量のモノヨウ化化合物が含まれている。生成物の重量をおよび融点を測定する。
【実施例２】
【００３５】
エチル−３−（３，５−ジヨード−４−ヒドロキシフェニル）プロピオネートの合成
段階１
１００ｇの３−（３，５−ジヨード−４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸を秤量し、５００ｍｌの丸底フラスコに移し、電磁撹拌棒を入れる。１５ｍｌの無水エタノールを加える。２．０ｇのｐ−トルエンスルホン酸を加えた後、１５０ｍｌのクロロホルムを加える。丸底フラスコを固定し、油浴に入れるが、加熱はしない。アリーン（Allihn）コンデンサと完全蒸留組立体とを組み立て、コンデンサを再循環氷水で冷却する。
【００３６】
段階２
バケツ一杯分の氷を通る状態で再循環ポンプを稼動させながら、油浴を作動させる（バリアック（Variac）を４０に設定）。Variacの設定を調整して蒸留がゆっくりと進むようにする（このエステル化に必要な全時間は６〜８時間）。１００ｍｌを回収した後(約２時間)、１５ｍｌの無水エタノールと１００ｍｌのクロロホルムをさらに添加する。次の１００ｍｌを回収する時にクロロホルムのみを添加し、引き続きクロロホルムを蒸留する。クロロホルムの残留量が少なくなったときにVariacのスイッチを切り、フラスコを冷却する。
【００３７】
段階３
十分なクロロホルムを加えて全量を１００ｍｌにする。同量の飽和重炭酸ナトリウム溶液を用いて抽出する。重炭酸ナトリウムを用いた抽出を繰返した後に、Ｈ2Ｏを用いて抽出する。塩化カルシウム紛上で乾燥させる。
還流カラムを外して蒸留組立体を組み立てなおし、トラップにドライアイスを添加してから低圧で残留クロロホルムを除去する。
【実施例３】
【００３８】
ヨード(III)トリフルオロ酢酸の合成
段階１
フード内で、１４ｍｌの無水酢酸を２５０ｍｌの丸底フラスコに注ぎ、約−５０℃に冷却した(ドライアイスおよびイソプロピルアルコール浴)。電磁撹拌棒で撹拌しながら、５．４ｍｌの赤煙硝酸（９０％、sp.gr.１．５１）を注意深く加える。丸底フラスコをドライアイス／イソプロパノール浴から取り出す。５．０ｇのヨウ素を２０℃以下の温度で秤量し、このヨウ素と９．４ｍｌのトリフルオロ酢酸を丸底フラスコに加える。ヨウ素が溶解するにつれて亜硝酸が発生し、温度が４０〜４５℃に上昇する。亜硝酸の生成が続いていれば、ヨウ素は反応している。
段階２
必要に応じて、残りの亜硝酸をＮ2ガスで洗い流してから、低圧蒸留用に設定する。容器の温度を４０℃以下にし、溶液をヨード（III）トリフルオロ酢酸の黒い粘性の油にする。
【実施例４】
【００３９】
ジアニソールヨードノイウムトリフルオロ酢酸の合成
段階１
ヨード（III）トリフルオロ酢酸を３０ｍｌの無水酢酸に溶解する。これを−１０℃に冷却し、その温度を維持しながら１７．４ｍｌのアニソール、７０ｍｌの無水酢酸および１０ｍｌのトリフルオロ酢酸を２０分かけて添加する。フラスコに栓をして、冷蔵庫に一晩置き、３時間かけて室温にする。
【００４０】
段階２
実行可能な最低温度で減圧蒸留する。濃い黒い油が残る。反応性無水物が水溶液と急激かつ激しく反応するため、トラップまたは受入フラスコから酸廃物に添加する際には慎重にしなければならない。ジエチルエーテルを油に添加する。ほぼ４００ｍｌ添加すると、沈殿物が生じる。
段階３
沈殿物を濾過し、氷で冷した乾燥ジエチルエーテルで洗浄して粗ジアニソールヨードニウムトリフルオロ酢酸を得る。トルエンから再結晶化すると白く羽毛のような針状構造が得られる（ｍｐ１３４〜１３６℃）。生成物を秤量する。必要に応じてＮＭＲまたは融点測定用に生成物を少し取っておく。
【実施例５】
【００４１】
エチル−３−（４'−メトキシ−３、５−ジヨードチロ）プロピオネートの合成
段階１
０．１モルのエチル−３−（３、５−ジヨード−４−ヒドロキシフェノール）プロピオネート、５０ｍｌのメタノール、１．５ｍｌのトリエチルアミンおよび０．１ｇの変色していない金属の銅粉末を秤量し、２５０ｍｌの丸底フラスコ内で混合する。５．９ｇのジアニソールヨードニウムトリフルオロ酢酸を７０ｍｌのメタノールに添加し、この混合物を丸底フラスコに加える。撹拌棒を入れて、フラスコに栓をし、室温で２４時間撹拌する。
【００４２】
段階２
濾過によって未反応の銅を除去する。減圧下でメタノールを除去してシロップにし、これをトルエンに溶解する。１N−HClを加え、５分間振る。大量のトリエチルアミンが沈殿するので、それを濾過で除去する。分液漏斗内の有機相を１０％のＮａＯＨとＨ2Ｏで洗浄する。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥する。減圧下でトルエンを除去して生成物を残す。
段階３
生成物を秤量し、ＮＭＲおよび／またはＨＰＬＣ分析用のサンプルを作る。
【実施例６】
【００４３】
ＤＩＴＰＡの合成
段階１
５０ｇのカップリング生成物を秤量し、これを丸底フラスコへ移す。１００ｍｌのＨＩおよび１００ｍｌの氷酢酸を加える。非常に遅いＣＯ2流で覆う。５〜６時間還流し、１００ｍｌのＨＩを添加してから、一晩還流する。
段階２
減圧蒸留によって酸の大部分を除去する。２００ｍｌのＨ2Ｏを加え、１N−NaOHを用いてｐＨを５に調整する。沈殿物を濾過回収し、濾過物を氷で冷したＨ2Ｏで洗浄し、ＣＯ2流で覆って乾燥させる。
【００４４】
段階３
生成物をエタノールから再結晶化する。ＮＭＲ分析および融点測定用のサンプルを作る。
段階４
最終生成物を鍵をかけ利用が制限された冷蔵庫中で０℃以下の乾燥機内に保管する。
ヒトの患者または動物に投与する前に、得られたＤＩＴＰＡに安定剤、賦形剤、可溶化剤、抗酸化剤、痛み緩和剤、等張剤およびこれらの混合物から成る群の中から選択される１種または複数の成分を配合することもできる。
【００４５】
ＤＩＴＰＡは液体製剤、固体製剤、カプセル製剤、移植製剤等の種々の形態の配合物にすることができる。ＤＩＴＰＡは従来のキャリヤを用いて注射による非経口投与用配合物にすることもできる。また、従来のキャリヤを用いて経口投与用配合物にすることもできる。注射による非経口投与用配合物は当業者に公知の従来法、例えば下記方法で配合できる：ＤＩＴＰＡを滅菌水、緩衝液、生理食塩液等の適切な溶剤に溶解し、濾過殺菌し、溶液を滅菌壜に充填する。
【００４６】
非経口配合物中のＤＩＴＰＡの量は約０．０００２〜０．２（Ｗ／Ｖ％）、好ましくは約０．００１〜０．１（Ｗ／Ｖ％）である。配合物は従来の配合方法で調製できる。
ＤＩＴＰＡを吸入、吸引投与することもできる。吸入投与ではＤＩＴＰＡ溶液を加圧容器またはネブライザーから二酸化炭素またはその他の適切な気体推進剤を用いてエアゾールスプレーの形で噴霧する。さらに、ＤＩＴＰＡを当業者に公知の薬物送達システムを用いて投与することもできる。薬物送達システム用の配合物の例としてはミクロスフィア（ナノ粒子、ミクロ粒子、マイクロカプセル、ビーズ、リポゾーム、多重エマルジョン等）等がある。
【００４７】
配合物に安定剤を添加してもよい。安定剤には例えばアルブミン、グロブリン、ゼラチン、マンニトール、グルコース、デキストラン、エチレングリコール等がある。本発明配合物には賦形剤、可溶化剤、抗酸化剤、痛み緩和剤、等張剤等の必要な添加剤が含まれる。液体配合物は凍結状態または凍結乾燥等の方法で水分を除去した後に保存する。凍結乾燥した配合物は使用前に純水に溶解して注射する等の方法で用いる。
【００４８】
ＤＩＴＰＡの有効投与量および投与スケジュールは実験によって決定し、その決定方法は当業者に周知の範囲である。配合物の投与経路は配合物の形態によって異なる。例えば非経口配合物は静脈注射、動脈注射、皮下注射または筋肉内注射で投与できる。
さらに、経皮投与または移植投与用にＤＩＴＰＡを配合することもできる。長期間作用する移植投与には皮下移植または筋肉内移植がある。そのために、ＤＩＴＰＡは適当な高分子物質または疎水性物質（例えば油中エマルジョン）またはイオン交換樹脂と一緒に配合するか、わずかに可溶な誘導体、例えばわずかに可溶な塩の形に配合することができる。
【００４９】
本発明のＤＩＴＰＡの経皮送達系にはキャリヤ、例えば液体、ゲル、固体基質または感圧接着剤等が含まれる。本発明の一実施例では経皮送達系は基材 (backing material) を含まない。本発明の別の実施例では本発明方法にキャリヤと一緒に基材が用いられる。この実施例では皮膚または粘膜と物理的に接触しないキャリヤの部分が基材で覆われる。基材は、すべきＤＩＴＰＡを含むキャリヤ中に含まれる成分とキャリヤを外界から保護する。本発明方法で用いるのに適した基材には金属箔、メッキプラスチックフィルムおよび単層および重層のポリマーフィルム等がある。
【００５０】
本発明方法の一実施例では、溶剤系に溶解したＤＩＴＰＡを経皮投与する。溶剤系は水を含み、場合によって１種または複数のアルコール、例えばエタノールイソプロピルアルコール、プロピルアルコール等を含む。このアルコールの炭素含有量は２〜約６であるのが好ましい。
溶剤系はさらにグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール等を含むことができる。溶剤系はさらに、１種または複数のジアルキルホキシドおよび／またはジアルキルスルホンを含むことができる。溶剤系はさらに一種または複数のケトン、エーテルおよびエステルを含むことができる。例としてはアセトン、メチルエチルケトン、ジメチルエーテル、ジエチルエーテル、ジブチルエーテル、アルキルアセテート、アルキルプロピオネート、アルキルブチレート等が挙げられる。
【００５１】
ＤＩＴＰＡの溶液が好ましいが、エマルジョンも有効である。エマルジョンは水性相が大部分を占め、連続相になっているものか、不水溶性系が連続層となる非水性のものにすることができる。
本発明のＤＩＴＰＡの経皮投与を用いてうっ血性心不全および／または低ＬＤＬ−コレステロール値を治療する方法は、アデノシン３',５'−環状モノホスフェートをインビボ刺激する物質が含まなくても有効であり、さらにはグアノシン３',５'−環状ノホスフェートをインビボ刺激する物質が含まなくても有効である。本発明の各実施例では、本発明のＤＩＴＰＡ経皮投与配合物にColeus Forskholiの抽出物のような物質を任意成分として約０．０００１重量％〜約１．０重量％含むことができる。
【００５２】
本発明の経皮配合物はヒトを含む動物の皮膚または粘膜中で医薬の送達を促進することが知られている医薬を含むこともできる。これらの医薬は浸透促進剤、促進剤、アジュバントおよび吸着促進剤として知られているが、本明細書では「エンハンサー」とよぶことにする。エンハンサーの例としてはジプロピレングリコール等の多価アルコール；オリーブオイル、スクアレンおよびラノリン等の油脂；セチルエーテルおよびオレイルエーテル等のポリエチレングリコールエーテルおよび脂肪族エーテル；イソプロピルミリスチン酸等の脂肪酸エステル；オレイルアルコール等の脂肪酸アルコール；アラントイン等の尿素および尿素誘導体；ジメチルデシルホスホキシド、メチルオクチルスルホキシド、ジメチルアセトニド、ジメチルラウリルアミド、ドデシルピロリドン、イソソルビトール、デシルメチルスルホキシド、オヨビジメチルホルムアミド等の極性溶剤；サリチル酸；ベンジルニコチネート；胆汁酸塩；ラウリルスルホン酸塩等の高分子脂肪族界面活性剤等が挙げられる。その他の医薬としてはオレイン酸およびリノール酸、アスコルビン酸、パンテノール、ブチル化ヒドロキシトルエン、トコフェロール、トコフェリル酢酸塩、トコフェリルリノレン酸塩、イソプロピルパルミテート、オレアミド、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびポリオキシエチレンオレイルエーテル等が挙げられる。本実施例では皮膚透過エンハンサーを約０．０１重量％〜約５重量％用いる。
【００５３】
本実施例における本発明の経皮送達系は適切な基材に適切なキャリヤを塗布する従来方法を用いて調製できる。例えば、下記方法で粘着性ＤＩＴＰＡデバイスを製造できる。すなわち、ＤＩＴＰＡおよびその他の必要な任意成分を含む溶剤系に接着剤の溶液を混合して均質な溶液または懸濁液の配合物とし、得られた配合物を基材または裏地等の下地上にナイフまたは棒を用いて塗布するか、押出しコーティングし、被覆された基材を乾燥して溶剤を除去し、露出表面を裏地または基材に張り合わせる。
当業者は以下の臨床研究によって本発明方法とその使用法、好ましい実施例をより良く理解できよう。しかし、本発明が以下の臨床実験に限定されるものではない。
【００５４】
臨床研究
以下の臨床研究ではＤＩＴＰＡをボランティアおよび患者に経口投与した。ＤＩＴＰＡは正規の薬剤師の監視下で乳糖と混合され、５０ｍｇの活性成分を含むゼラチンカプセルに包装した。また、同一のカプセルに乳糖を包装して偽薬として用いた。
７人の健常なボランティアに対して投与量の研究を実施した。研究参加者は１８〜６５歳の年齢の男性で、研究に参加する前に完全な健康診断、心電図および心エコー図の検査を実施した。全血球算定（ＣＢＣ）、血液化学検査(肝酵素および脂質のプロフィール)および甲状腺機能検査(全Ｔ3、全Ｔ4、フリーＴ4、ｒＴ3、および甲状腺刺激ホルモン)を測定した。
【００５５】
第１日目に健常ボランティアに対して１．８７５ｍｇ／ｋｇを１日に２回に分けて投与した。この投薬計画を２週間続けた。２週間終了時に最初の実験室研究を繰返した。次に、投与量を２倍の３．７５ｍｇ／ｋｇにしてボランティアに対する投薬をさらに２週間続けた。この２週間の終了時にも健康診断および全ての実験変数を再度測定した。
【００５６】
ボランティアのデータをスチューデントＴテスト(Student's paired t-test)を用いて分析した。ＤＩＴＰＡおよび偽薬グループのベース値（基準値）のデータはアンペアースチューデントＴテストで比較した。偽薬グループおよび薬物処置グループの比較は反復測定ＡＮＯＶＡ（SPSS Version 9.5, SPSS Chicago,11）によって実施した。薬物−時間の相互作用に対するＰ値が有意な場合には２週間の薬物−時間相互作用とベース値とのアプリオリ対照を実施した。ベース値と４週間のデータしか得られない場合には差スコアで比較した。各参加者のベース値を４週間の投薬後の値から引き、ＤＩＴＰＡと偽薬による処置の違いを比較した。テストでＰ値が０．０５以下の場合有意とみなされる。
下記の［表１］は健常なボランティアにＤＩＴＰＡを投与した後の臨床変数をまとめたものである。上記の通り、７人の健常ボランティアに２つの投与量で２週間および４週間の間ＤＩＴＰＡを投与した。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
下記の［表２］は健常ボランティアに２週間および４週間、ＤＩＴＰＡ処置をした後の甲状腺ホルモンの測定値をまとめたものである。
【００５９】
【表２】
2004522747.tif 000009
【００６０】
甲状腺刺激ホルモン、フリーＴ4およびｒＴ3の血漿濃度は基準値では正常であった。医薬を少ない投与量（１．８７５ｍｇ／ｋｇ）で２週間投与した後は甲状腺刺激ホルモン（Ｐ＝０．０４）および全Ｔ4（Ｐ＝０．０２）は有意に減少したが、フリーＴ4は変化しなかった。逆Ｔ3は有意に増加した（Ｐ＝０．０２）。投薬開始後、ＤＩＴＰＡは免疫学的検定法で交差反応をしたため、全Ｔ3は測定しなかった。
多い投与量（３．７５ｍｇ／ｋｇ）で投与した追加の２週間後には甲状腺刺激ホルモンの平均値はさらに下がって０．４４±０．２９μＵ／ｍｌ（Ｐ＝０．０３）となった。この値は実験値の正常範囲（０．４８〜４．０μＵ／ｍｌ）の下限であった。投薬中、全被験者はそれぞれ日常生活を続けており、副作用は全く見られなかった。
【００６１】
この本発明の予備研究の第１段階は、健常なボランティアへのＤＩＴＰＡ投与が十分に許容されるもので、いずれの投与量でも血圧および心拍数に有意な変化をもたらさないことを示している。被験者には心エコー検査のパラメータにも有意な変化は見られなかった。甲状腺刺激ホルモンのレベルは両方のＤＩＴＰＡ投与量で減少したが血漿Ｔ4は正常範囲内のままであった。ＤＩＴＰＡが抗Ｔ3抗体と交差反応したため全Ｔ3は投薬中に測定できなかった。しかし,逆Ｔ3は実質的に上昇した。ｒＴ3が上昇するメカニズムは不明であるがＤＩＴＰＡによる酵素５'−脱モノヨードの競合阻害によってＴ4からＴ3への変換とｒＴ3の破壊を触媒するのを示していると思われる。健常なボランティアに副作用が全く見られなかったため、本出願人は中程度の心不全の患者群にＤＩＴＰＡの投与を実施した。
【００６２】
ＤＩＴＰＡの安全性が確立された後、臨床研究を行ってうっ血性心不全の治療にＤＩＴＰＡが有効なことを確認した。この臨床研究には心不全の症状があって駈出分画が３５％以下の患者が適している。患者は洞律動状態である必要がある。ジギタリス、アンギオテンシン変換酵素阻害剤および利尿剤による治療は許されるが、抗アドレナリン作用薬は許めらない。
偽薬群の３人の患者とＤＩＴＰＡを投薬した一人の患者がＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を服用していた。アミオダロンを服用していたり、不安定狭心症、６ヶ月以内の心筋梗塞、重篤な大動脈弁狭窄症、肝不全または腎不全、貧血（赤血球容積率＜３０％）、先在性甲状腺疾患、ヨウ素過敏、活性癌、その他の生死にかかわる疾病を罹っている患者は除いた。
【００６３】
治療開始前に全ての患者を入院させ、右心カテーテル検査、放射線核種駈出分画および心エコー図を実施した。血清サンプルを採取して甲状腺刺激ホルモン、全Ｔ4、フリーＴ4および逆Ｔ3を測定した。
ＤＩＴＰＡがＴ３の検出抗体と交差反応したため、Ｔ３は測定しなかった。腎・肺機能テストも実施した。患者を２重盲検でランダムに分け、毎日１．８７５ｍｇ／ｋｇのＤＩＴＰＡまたは偽薬を２回または３回に分けて投与した。最初の４日間の投薬時に患者をテレメータ装置で観察した。その後、心電図を毎週撮り、患者の甲状腺または心臓の状態の変化或いは薬物毒性の徴候等を検査した。
【００６４】
２週間の最後にも心エコー図を撮った。心不全の進行または不整脈が発症する臨床的徴候がなければＤＩＴＰＡの投与量を一日３．７５ｍｇ／ｋｇに増加した。増えた投与量でさらに２週間治療した後、患者を再び病院に呼び、最初の測定で実施したテストを繰り返した。
２．５ｍＨｚの変換器（GE VingMed, Milwaukee, WI）を備えた超音波診断装置を用いてアメリカ心エコー図学会の推奨に従ってＭ−モード、２次元およびドップラー心エコー図を撮った。ゲート付き放射性核種心筋イメージングによって駈出分画（ejection fraction）を測定した。
【００６５】
患者を一晩絶食させた後に右心カテーテル法を実施した。前投薬はなかった。右大腿静脈に導入した7Fr Swan-Ganzカテーテルを用いて肺動脈、肺毛細血管策楔入圧および右心圧を測定した。自動血圧計バンド（arm cuff system）を用いて血圧を記録した。初期安定時間の２０〜３０分後、安静時血行動態の測定値を得た。熱希釈心拍出量の測定値は最大値と最小値を除いて５つの記録を平均して得た。全ての血液検査は南アリゾナ退役軍人局健康医療システムの臨床病理学研究所で実施した。
【００６６】
２２人の患者に初期右心カテーテル法を行い、ランダムに分け、目的の医薬または偽薬を与えた。１９人の患者が研究を完了した（平均年齢６１．６歳、範囲４７〜７６歳）。ＮＹＨＡ心機能分類による患者の機能クラスはII（ｎ=１２）とIII（ｎ=７）であった。患者の一人は拡張型心筋症であった。残りの患者は冠状動脈疾病であり、この疾病はうっ血性心不全の病因である可能性が高いと考えられる。偽薬を与えた患者の一人が亡くなった。ＤＩＴＰＡ群の患者の一人は腹痛のため研究から抜けた。後で胆石症であることが分かった。
【００６７】
残りの患者は自発的に研究から抜けたか、服薬不履行であった。２つのグループのベースラインの変数は駈出分画（ＤＩＴＰＡ群が低い）を除いてほぼ同じであった。治療の臨床効果を下記の［表３］に示す。
【００６８】
【表３】
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【００６９】
ＤＩＴＰＡのグループでは２週間の治療後に体重変化は全くなかった。４週間後には４ｋｇの減少が見られた。一方、偽薬のグループでは体重増加が見られ、境界域で統計的に有意な差があった（Ｐ＝０．０５９）。ＮＹＨＡ心機能分類または放射性核種駈出分画の変化は見られなかった。平均の収縮期圧および拡張期圧は減少したが、統計的に有意ではなかった。
【００７０】
【表４】
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【００７１】
心エコーのデータを［表４］に示す。２週間または４週間の治療後にＤＩＴＰＡは心室の質量または寸法に有意な変化をもたらさなかった。心臓収縮の徴候、例えば心収縮力（fractional shortening）および基礎層板繊維の縮力（circumferential fiber shortening）の速度は変化しなかった。しかし、等容性弛緩時間すなわち活性心臓拡張の測定値は２週間（Ｐ＝０．０５）および４週間（Ｐ＝０．０４５）の治療後に有意に減少した。初期および後期の心臓拡張性の心室充満率は変化しなかった。
【００７２】
【表５】
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【００７３】
ＤＩＴＰＡを用いた治療の血流動態変数に対する効果を［表５］に示す。ＤＩＴＰＡを用いた４週間の治療後に心拍数、肺動脈圧または右動脈圧には全く影響が見られなかった。しかし、ＤＩＴＰＡを投与した患者の安静時の心拍出量および心臓指数の群平均値は偽薬治療群と比べて有意に増加した（それぞれＰ＝０．０７およびＰ＝０．０２）。これにはＤＩＴＰＡ群の体血管抵抗指数の減少（Ｐ＝０．０２）を伴っている。それに対して心拍出量、心臓指数および末梢抵抗は４週間の偽薬投薬後も変化しなかった。
【００７４】
【表６】
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【００７５】
［表ＶＩ］に示すように、甲状腺刺激ホルモン、フリーＴ4およびｒＴ3の血清濃度は基準値において治療群と参照群との間に有意な差は見られなかった。甲状腺刺激ホルモンおよびフリーＴ4の値は正常範囲であったが、ｒＴ3の値は両群において高かった。２週間後、ＤＩＴＰＡを投与した患者の甲状腺刺激ホルモン量は大きく減少し、４週間の治療後にはこれがより明確になった。偽薬群では甲状腺刺激ホルモンはどちらの場合も変化が無かった。ＤＩＴＰＡを用いた治療ではフリーＴ4に有意な変化をもたらさなかった。しかし、ｒＴ3は２週間および４週間の治療後に漸進的に増加した。
【００７６】
血清脂質量に対するＤＩＴＰＡおよび偽薬の効果を［表６］に示す。ＤＩＴＰＡで２週間治療した後、基準値での１８５．８±４６．９ｍｇ／ｄＬから１６０．６±１４．３ｍｇ／ｄＬ（Ｐ＜０．０５）へとコレステロール値に有意な減少が見られた。ＤＩＴＰＡで４週間治療した後はさらに減少し、１４０．７±１６．２ｍｇ／ｄＬ（Ｐ＝０．０１３）となった。ＬＤＬ−コレステロール値は１０７．３±４２．８ｍｇ／ｄＬ（基準値）から８９．４±１２．７ｍｇ／ｄＬ（２週間）、さらに８０．５±１３．７ｍｇ／ｄＬ（４週間）となった。４週間治療した９人中８人の患者においてＬＤＬコレステロールは減少したが、反応の程度は変動性であり、ＡＮＯＶＡ値は統計的に有意ではなかった（Ｐ＝０．２３５）。ＨＤＬコレステロールはＤＩＴＰＡによる治療と共に下降したが、統計的有意性は得られなかった。血清の中性脂肪は基準値ではＤＩＴＰＡ治療群で高かったが、２週間の治療後には１１％（Ｐ＜０．０５）、４週間後には３５％（Ｐ＝０．００５）減少した。こうした血清脂質の変化は偽薬群の患者には全く見られなかった。
【００７７】
甲状腺機能低下症での甲状腺ホルモン補充はＬＤＬコレステロール受容体およびリオタンパク質リパーゼの活性を大きくし、コレステロール値を下げると考えられる。しかし、ＤＩＴＰＡがコレステロール値を下げる作用を有することに関する臨床試験は実施されたことはなかった。ＤＩＴＰＡを投与したグループでの２週間後のコレステロールおよびＬＤＬコレステロールの平均減少率はそれぞれ１４％および１７％であった。４週間の治療後にはコレステロールおよびＬＤＬコレステロールはそれぞれ２４％および２５％減少した。
【００７８】
基準値における血清脂質は両方のグループで高く、ＤＩＴＰＡで２週間および４週間治療すると減少した。２次的疾患として冠状動脈疾患を罹患している多くの心不全患者に投与した場合のＤＩＴＰＡの脂質低減効果がこの医薬の有用性である。
【００７９】
心不全患者におけるＤＩＴＰＡの主たる血流力学的効果には心臓指数の増加と体血管抵抗の低下が挙げられる。これらの変化は安静時の心拍数を増加せずに起こる。基準値でのゲート付き放射性核種の駈出分画はＤＩＴＰＡの治療群の方が偽薬群より小さく、研究中に有意な変化は見られなかった。未変化の駈出分画および収縮機能の心エコーパラメータから判断すると、ＬＶ収縮機能はＤＩＴＰＡ治療で影響を受けないと考えられる。しかし、等容性弛緩時間の短縮で確認されたように心臓拡張機能はほぼ一様に改善が見られた。健常ボランティアに心エコーの変化が見られなかったことから、ＤＩＴＰＡ治療は心機能の低下を改善するが、正常な心臓の心機能には刺激を与えないということが分かる。
【００８０】
実験からＤＩＴＰＡは甲状腺ホルモンより代謝反応が小さく、正常な被験者に寛容であることが示されるので本発明は虚血性心疾患の患者に向いている。本発明医薬はこの患者群にも十分に寛容であり、不整脈は全く起こらなかった。狭心症の発作の頻度または重症度は全く変わらず、甲状腺機能亢進症の臨床的徴候も見られなかった。
以上、本発明の好ましい実施例を詳細に説明したが、当業者は多くの改良および変更を加えることができる。従って、請求の範囲の全ての改良および変更は本発明の範囲内である。
【国際公開パンフレット】
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