(57)【要約】本発明は、幹細胞分化に関与するポリペプチドをコードするｍＲＮＡを切除するために、抑制性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）を幹細胞に導入することを含む、幹細胞分化を調節する方法、ＲＮＡｉ分子、上記ＲＮＡｉ分子をコードするＤＮＡ分子、および前記方法で得られる細胞に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞の分化状態を調節する方法であって、
（ｉ）幹細胞と、該細胞の分化における少なくとも一つのステップを仲介する遺伝子配列またはその有効な部分を含む、少なくとも一つの抑制性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子とを接触させるステップと、
（ｉｉ）上記（ｉ）で処理された細胞の成長および分化に役立つ条件を提供するステップと、任意選択的に、
（ｉｉｉ）細胞を分化した状態で維持および／または保存するステップと
を含む、幹細胞の分化状態を調節する方法。
【請求項２】
前記条件がｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養条件である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記幹細胞が、奇形癌細胞、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、造血幹細胞、筋幹細胞、神経幹細胞、および皮膚真皮鞘幹細胞から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記幹細胞が胚性幹細胞である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記幹細胞が胚性生殖細胞である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記幹細胞が奇形癌細胞である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記細胞表面受容体が、ヒトＮｏｔｃｈ１（ｈＮｏｔｃｈ１）、ｈＮｏｔｃｈ２、ｈＮｏｔｃｈ３、ｈＮｏｔｃｈ４、ＴＬＥ−１、ＴＬＥ−２、ＴＬＥ−３、ＴＬＥ−４、ＴＣＦ７、ＴＣＦ７Ｌ１、ＴＣＦＦＬ２、ＴＣＦ３、ＴＣＦ１９、ＴＣＦ１、ｍＦｒｉｎｇｅ、ｌＦｒｉｎｇｅ、ｒＦｒｉｎｇｅ、ｓｅｌ  １、Ｎｕｍｂ、Ｎｕｍｂｌｉｋｅ、ＬＮＸ、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、およびＦＲＺＢからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記リガンドが、Ｄ１１−１、Ｄ１１３、Ｄ１１４、Ｄｌｋ−１、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１４、およびＷｎｔ１５からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記遺伝子が、ＳＦＲＰ１、ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ＳＦＲＰ５、ＳＫ、ＤＫＫ３、ＣＥＲ１、ＷＩＦ−１、ＤＶＬ１、ＤＶＬ２、ＤＶＬ３、ＤＶＬ１Ｌ１、ｍＦｒｉｎｇｅ、ｌＦｒｉｎｇｅ、ｒＦｒｉｎｇｅ、ｓｅｌ１ｌ、Ｎｕｍｂ、ＬＮＸＯｃｔ４、ＮｅｕｒｏＤ１、ＮｅｕｒｏＤ２、ＮｅｕｒｏＤ３、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＭＤＦＩ、ＣＢＦ−１、およびＣＩＲからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子が、表４のＤＮＡデータベース寄託番号で特定される遺伝子の少なくとも一つを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記遺伝子が、ＤＬＫ１、Ｏｃｔ４、ｈＮｏｔｃｈ１、ｈＮｏｔｃｈ２、ＲＢＰＪＫ、およびＣＩＲからなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝子がＤＬＫ１である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＲＮＡｉ分子が、図２ａに示す配列を含む核酸配列に由来する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記遺伝子がＯｃｔ４である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＲＮＡｉ分子が、図２ｂに示す配列を含む核酸配列に由来する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記遺伝子がｈＮｏｔｃｈ１である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＲＮＡｉ分子が、図２ｃに示す配列を含む核酸配列に由来する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記遺伝子がｈＮｏｔｃｈ２である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＲＮＡｉ分子が、図２ｄに示す配列を含む核酸配列に由来する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記遺伝子がＲＢＢＪＫである、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＲＮＡｉ分子が、図２ｅに示す配列を含む核酸配列に由来する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記遺伝子がＣＩＲである、請求項１１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＲＮＡｉ分子が、図２ｆに示す配列を含む核酸配列に由来する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
幹細胞分化における少なくとも一つのステップを仲介する少なくとも一つの遺伝子のコード配列を含むことを特徴とする、ＲＮＡｉ分子。
【請求項２５】
前記コード配列がエキソンである、請求項２４に記載のＲＮＡｉ分子。
【請求項２６】
前記ＲＮＡｉ分子が１００ｂｐ〜１０００ｂｐの長さである、請求項２４または２５に記載のＲＮＡｉ分子。
【請求項２７】
前記ＲＮＡｉ分子の長さが１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、または１０００ｂｐからなる群から選択される、請求項２８に記載のＲＮＡｉ分子。
【請求項２８】
前記ＲＮＡｉ分子の長さが少なくとも１０００ｂｐである、請求項２４または２５に記載のＲＮＡｉ分子。
【請求項２９】
前記ＲＮＡｉ分子の長さが１５ｂｐ〜２５ｂｐである、請求項２４または２５に記載のＲＮＡｉ分子。
【請求項３０】
前記ＲＮＡｉ分子の長さが２１ｂｐである、請求項３０に記載のＲＮＡｉ分子。
【請求項３１】
前記ＲＮＡｉ分子が、表４のＤＮＡデータベース寄託番号で特定される配列を含む、請求項２４〜３０のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ分子。
【請求項３２】
前記ＲＮＡｉが、ＤＬＫ１、Ｏｃｔ４、ｈＮｏｔｃｈ１、ｈＮｏｔｃｈ２、ＲＢＰＪＫＭ、およびＣＩＲからなる群から選択される遺伝子に由来する、請求項３１に記載のＲＮＡｉ分子。
【請求項３３】
前記ＲＮＡｉ分子が、２ａ〜２ｆに示す核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項３２に記載のＲＮＡｉ分子。
【請求項３４】
前記分子が修飾されたリボヌクレオチド塩基類を含む、請求項２４〜３３のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ分子。
【請求項３５】
表４で特定されるＤＮＡ寄託番号で示される、幹細胞分化における少なくとも一つのステップを仲介する遺伝子の配列を含む単離されたＤＮＡ分子であって、前記ＤＮＡの転写を促進することができる少なくとも一つのさらなるＤＮＡ分子（「プロモーター」）に前記ＤＮＡが作動可能に連結していることを特徴とする、単離されたＤＮＡ分子。
【請求項３６】
前記遺伝子が、ＤＬＫ１、Ｏｃｔ４、ｈＮｏｔｃｈ１、ｈＮｏｔｃｈ２、ＲＢＰＪｋ、およびＣＩＲからなる群から選択される、請求項３５に記載の単離されたＤＮＡ分子。
【請求項３７】
前記ＤＮＡ分子が図２ａ〜２ｆに示す配列からなる群から選択される配列を含む、請求項３６に記載の単離されたＤＮＡ分子。
【請求項３８】
前記遺伝子が、前記ＤＮＡ分子を含む両方のＤＮＡ鎖がＲＮＡ中に転写されるように配置されていることを特徴とする、少なくとも二つのプロモーターを備えている、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の単離されたＤＮＡ分子。
【請求項３９】
請求項３５〜３８のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子を含むベクター。
【請求項４０】
（ｉ）請求項３５〜３８のいずれか１項に記載の少なくとも一つの単離されたＤＮＡ分子または請求項３９に記載のベクターを提供するステップと、
（ｉｉ）前記ＲＮＡｉ分子を含む各ＲＮＡ鎖の合成を可能にする試薬および条件を提供するステップと、
（ｉｉｉ）各ＲＮＡ鎖が、長さの少なくとも一部、または、少なくとも幹細胞分化を仲介する前記幹細胞をコードする核酸配列に対応する部分に関して結合することができる条件を提供するステップと
を含む、ＲＮＡｉ分子を製造する方法。
【請求項４１】
前記遺伝子が、表４のＤＮＡデータベース寄託番号で特定される遺伝子から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
標的幹細胞の分化を実行するのに十分な、請求項２４〜３４のいずれか１項に記載のＲＮＡｉの有効量を動物に投与することを含む、幹細胞の分化を促進する方法。
【請求項４３】
請求項２４〜３４のいずれか１項に記載の少なくとも一つのＲＮＡｉ分子を含む治療用組成物。
【請求項４４】
細胞／組織が疾病によって破壊される疾病を治療するための分化した細胞／組織を提供するために、幹細胞の分化を促進する際に使用するための医薬を製造するための、請求項２６〜３６のいずれか１項に記載の少なくとも一つのＲＮＡｉ分子の使用。
【請求項４５】
前記疾病が、悪性貧血、脳卒中、パーキンソン病等の神経変性性疾患、アルツハイマー病、冠動脈性心疾患、硬変、糖尿病からなる群から選択される、請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
希釈剤、担体、または賦形剤をさらに含む、請求項４３に記載の治療用組成物、または請求項４４または４５に記載の使用。
【請求項４７】
請求項２４〜３４に記載のＲＮＡｉ分子の導入によって産生される、分化した細胞を含む、治療用細胞組成物。
【請求項４８】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法で得られる細胞。
【請求項４９】
前記細胞が、神経細胞、筋細胞、肝細胞、腎細胞、血球（たとえば、赤血球、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞）、膵臓β細胞、上皮細胞（たとえば、肺、胃、腸）からなる群から選択される、請求項４８に記載の方法で得られる細胞。
【請求項５０】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法で得られる細胞培養体。
【請求項５１】
請求項４８または４９に記載の少なくとも一つの細胞を含む器官。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、幹細胞分化に関与するポリペプチドをコードするｍＲＮＡを切除するために、抑制性ＲＮＡ（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ＲＮＡ：ＲＮＡｉ）を幹細胞に導入することを含む、幹細胞分化を調節する方法に関する。一般に、これらのｍＲＮＡは、除去されることにより、ある特定の細胞型への分化が促進される、分化の負の制御因子をコードする。
【０００２】
近年、遺伝子および／または遺伝子産物を特異的に切除することを目的とする多数の技術が開発された。たとえば、標的ｍＲＮＡ分子を結合し、それによって標的ｍＲＮＡ分子をブロックまたは不活化するためのアンチセンス核酸分子の使用は、遺伝子産物の産生を阻害する有効な方法である。これは、アンチセンス技術が、多数の顕著な表現型の特徴をもたらす植物で非常に有効である。しかし、アンチセンスは変わりやすく、表現型が、アンチセンス導入遺伝子発現に実際に本当に連関していることを確認するために、アンチセンス導入遺伝子の一つ以上のコピーを担持するトランスジェニック生物を多数、時には数百、スクリーニングすることが必要になる。必ずしも安定なトランスフェクタントの産生を含有するとは限らないアンチセンス技術が、培養中の細胞に適用され、多様な結果を生んできた。
【０００３】
加えて、相同組換えによって遺伝子を分裂させることができる能力は、生物学者に、高等生物における発生経路を明確にする上で重要な道具を与えた。マウス遺伝子「ノックアウト」種を使用することにより、欠失したマウス遺伝子のヒト相同体の遺伝子機能および推定される機能を詳細に分析することが可能になった（Ｊｏｒｄａｎ  ａｎｄ  Ｚａｎｔ，１９９８）。
【０００４】
遺伝子機能を特異的に切除するより最近の技術は、抑制性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）とも呼ばれる二本鎖ＲＮＡの細胞への導入によるもので、その結果としてＲＮＡｉ分子に含まれる配列に相補的なｍＲＮＡが破壊される。このＲＮＡｉ分子は、互いにアニーリングされて二本鎖ＲＮＡ分子を形成する２本のＲＮＡ相補鎖（センス鎖およびアンチセンス鎖）を含む。ＲＮＡｉ分子は、一般に、切除すべき遺伝子のエキソン配列またはコード配列に由来する。
【０００５】
最近の研究から、コード配列に由来する１００〜１０００ｂｐの範囲のＲＮＡｉ分子が、遺伝子発現の有効なインヒビターであることが示唆される。意外なことに、遺伝子発現をブロックするために、僅か数分子のＲＮＡｉを必要とするにすぎず、このメカニズムが触媒的であることを意味する。ＲＮＡｉが細胞の細胞質で検出できるとしても僅かなため、この作用部位は核であると考えられ、ＲＮＡｉは、ｍＲＮＡ合成またはプロセッシングの間にその作用を発揮することがわかる。
【０００６】
ＲＮＡｉの正確な作用機序は不詳であるが、この現象を説明する理論がある。たとえば、全ての生物が、外因性遺伝子発現の作用を制限する、進化した保護機構を有する。たとえば、ウイルスは、しばしば、ウイルスが感染した生物に有害な影響を引き起こす。従って、ウイルスの遺伝子発現および／または複製が抑制されることが必要である。加えて、遺伝子の形質転換の急速な進歩およびトランスジェニック植物および動物の提供により、トランスジェーンも外来核酸として認識され、様々に、鎮圧（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）と呼ばれる現象に付されることが認識されるに至った（Ｓｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｓｅｌｋｅｒ，１９９５）、遺伝子サイレンシング（Ｍａｔｚｋｅ  ａｎｄ  Ｍａｔｚｋｅ，１９９８）、および同時抑制（Ｓｔａｍら、２０００）。
【０００７】
ＲＮＡｉを使用した初期の研究では、線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓを使用した。ＲＮＡｉを虫に注入した結果として、ＲＮＡｉ分子を含む遺伝子配列に対応するポリペプチドが消失した（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら、１９９８；Ｆｉｒｅら、１９９８）。近年では、植物、トリパノソーマ（Ｓｈｉら、２０００）Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｓｐｐ．（Ｋｅｎｎｅｒｄｅｌｌ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｈｅｗ、２０００）を含むが、限定するためではなく例として挙げるものである、多数の真核生物でＲＮＡｉ阻害の現象が明らかにされた。最近の実験で、ＲＮＡｉは、高等真核生物でも機能する可能性があることが明らかにされた。たとえば、ＲＮＡｉは、マウス卵母細胞におけるｃ−ｍｏｓおよびマウス着床前胚におけるＥ−カドヘリンを切除できることが証明されている（Ｗｉａｎｎｙ  ａｎｄ  Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ、２０００）。このことから、初期胚細胞の発生の運命に影響を及ぼす可能性があることが示唆される。
【０００８】
哺乳動物発生中に、胚盤胞形成まで胚の一部を形成する細胞は、全能性であると言われる（たとえば各細胞は、完全な胚、および上記胚の成長および発生を支持するために必要な全細胞を形成する、発生的潜在能を有する）。胚盤胞の形成中に、内部細胞塊を含む細胞は、多能性であると言われる（たとえば、各細胞は、様々な組織を形成する発生潜在能を有する）。
【０００９】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞、多能性を有するもの）は、主として二つの胚の源に由来してもよい。内部細胞塊から単離された細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞と呼ばれる。実験用マウスで、交尾後８．５〜１２．５日の胚の腸間膜または生殖隆線から単離される始原生殖細胞の培養から、類似した細胞を誘導することができる。これらは、最後には生殖細胞に分化するであろう、そのため、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）と呼ばれる。これらのタイプの各々の多能性細胞は、代替細胞型への分化に関して類似した発生的潜在能を有するが、考えられる挙動の差（たとえば、刷り込みに関して）によって、これらの細胞が互いに区別されるに至った。
【００１０】
一般に、ＥＳ／ＥＧ細胞培養は、明確に定義された特徴を有する。これらの特徴として、ｉ）線維芽細胞支持細胞層で維持するとき、少なくとも２０継代の培養における維持、ｉｉ）胚様体と呼ばれる培養中の細胞集塊の生成、ｉｉｉ）単層培養で多様な細胞型に分化できる能力、ｉｖ）胚宿主と混合されたとき、胚キメラを形成することができる、ｖ）ＥＳ／ＥＧ細胞特異的マーカーを発現する、が挙げられるがその限りではない。
【００１１】
つい最近まで、ヒトＥＳ／ＥＧ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養は不可能であった。培養でヒトＥＳ／ＥＧ細胞の確立を可能にする条件を決定することが可能な第１の指標は、ＷＯ９６／２２３６２に記載されている。その出願には、ある範囲の特徴、または多能性の特徴を有する幹細胞と関連したマーカーを示す霊長類ＥＳ細胞の連続的増殖を可能にする細胞系および成長条件が記載されている。
【００１２】
さらに最近、Ｔｈｏｍｓｏｎら（１９９８）は、培養においてヒトＥＳ細胞を確立できる条件を発表した。霊長類ＥＳ細胞が示す上記特徴は、ヒトＥＳ細胞系も示す。加えて、ヒト細胞系は、未分化の状態で、培養中で絶えず分裂することができる能力を有する細胞に特有の高レベルのテロメラーゼ活性を示す。別のグループ（Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら、２０００）は、ヒトＥＳ細胞がヒト胚盤胞から誘導されることを報告した。第３のグループ（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら、１９９８）は、ＥＧ細胞誘導について記載している。
【００１３】
ＥＳ／ＥＧ細胞の特徴は、線維芽細胞支持細胞層の存在下で、未分化状態で分化できる能力を数世代にわたって保持していることである。支持細胞層が除去されると、細胞が分化する。分化は、しばしば、ニューロンまたは筋細胞への分化であるが、分化が起こる正確なメカニズムおよびその調節については未解決のままである。
【００１４】
ＥＳ／ＥＧ細胞に加えて、多数の成体組織は、幹細胞の特性を備えた細胞を含む。一般に、これらの細胞は、異なる細胞型に分化することができる能力を保持しているが、ＥＳ／ＥＧ細胞の多能特性を持たない。たとえば造血幹細胞は、造血系の全ての細胞（赤血球、マクロファージ、好塩基球、好酸球等）を形成する潜在能力を有する。神経組織、皮膚および筋肉は全て、幹細胞潜在能を備えた細胞のプールを保持する。従って、発生生物学における胚性幹細胞の使用に加えて、細胞分化を制御する因子の決定に関して有用な可能性がある、成体幹細胞もある。さらなる最近の研究から、以前には一つの運命（たとえば、ニューロン）に委ねられていると考えられていた一部の幹細胞は、実際は、ある一定の状況で、かなりの多能性を有する可能性があることが示唆された。最近、神経幹細胞は、マウス胚をキメラ化し、広範囲の非神経組織を形成することが明らかにされた（Ｃｌａｒｋら、２０００）。
【００１５】
発生生物学に関連があるさらなる細胞群は、奇形癌細胞（ＥＣ細胞）である。これらの細胞は、奇形腫と呼ばれる腫瘍を形成し、ＥＳ／ＥＧ細胞と共通の多くの特徴を有する。こうした特徴の中で最も重要なのは、多能性の特性である。
【００１６】
奇形腫は広範囲の分化した組織を含み、何百年もにわたって、ヒトにおいて知られていた。奇形腫は、一般に、性腺腫瘍として、男性および女性の両者で発生する。こうした腫瘍の性腺形は、一般に、生殖細胞に由来すると考えられ、一般に、同一範囲の組織を有する性腺外形は、胚形成中に誤って移動した生殖細胞に起因すると考えられる。従って、奇形腫は一般に、多数の異なる型の癌を含む生殖細胞腫瘍として分類される。これらの中には、精上皮腫、胚性癌腫、卵黄嚢癌および絨毛癌などが含まれる。
【００１７】
細胞の発生の運命を研究し、ＥＣ細胞およびＥＳ／ＥＧ細胞で一般的に発現される細胞マーカーを同定するために、ＥＳ／ＥＧ細胞と類似したＥＣ細胞の生物学的手法が利用されてきた。たとえば、これらに限定する目的ではないが、特異的な細胞表面マーカーＳＳＥＡ−３（＋）、ＳＳＥＡ−４（＋）、ＴＲＡ−１−６０（＋）、ＴＲＡ−１−８１（＋）（Ｓｈｅｖｉｎｓｋｙら、１９８２；Ｋａｎｎａｇｉら、１９８３；Ａｎｄｒｅｗｓら、１９８４ａ；Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９５）、アルカリホスファターゼ（＋）（Ａｎｄｒｅｗｓら、１９９６）、およびＯｃｔ４（Ｓｃｈｏｌｅｒら、１９８９；Ｋｒａｆｔら、１９９６；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら、２０００；Ｙｅｏｍら、１９９６）の発現がある。
【００１８】
我々は、幹細胞、特に胚性幹細胞の発生の運命に関与していると考えられる多数の遺伝子を同定する、発現に関する研究を積み重ねた。我々は、細胞の運命決定において重要であると考えられる二つの情報伝達経路の、ヒト相同体の発現を、ノーザンブロッティングで同定した。ＮｏｔｃｈおよびＷｉｎｇｌｅｓｓ情報伝達カスケードのリガンド、受容体および下流成分の発現が解明されている。モデル系ＮＴＥＲＡ２／Ｄ１胚性癌腫細胞を使用して、我々は、細胞の分化に伴う、これらの成分の一部の発現の変化を記録した。動物界の全体にわたって、これらのカスケードが胚発生で果たす役割を考慮すると、これらの変化から、幹細胞分化における、Ｗｉｎｇｌｅｓｓ情報伝達経路およびＮｏｔｃｈ情報伝達経路の両経路の重要な役割が示唆される。さらに、分化が特定の経路に沿って起こるためには、幾つかの遺伝子、たとえば、筋原性遺伝子ＭｙｏＤ１の活性が必要である。ある特定の経路に沿った細胞分化を阻害する活性を有する遺伝子もある。我々は、以下によって、ある特定の細胞型を得るための幹細胞分化の制御を達成し得ると予想した。それは、（ｉ）特定の経路に沿った分化を通常通り促進する、従って、代替細胞表現型への分化を促進する、ある一定の遺伝子の阻害、（ｉｉ）特定の細胞型への分化を防止する遺伝子活性の阻害、および（ｉｉｉ）上記（ｉ）および（ｉｉ）の組合せである。図１を参照のこと。
【００１９】
胚発生中の幹細胞の分化、成体における組織再生中および創傷修復は、非常に厳しい制御下にある。この制御における逸脱は、発生中に先天性欠損症の形成を引き起こし、成人で癌形成を引き起こすと考えられる。一般に、このような幹細胞は、細胞増殖および細胞分化のプロセス全体にわたって細かく調節することが可能な正の制御下および負の制御下の両方のもとにあると予想される。細胞分化を犠牲にした過剰な増殖は、拡大する組織塊（癌）の形成につながることがあるが、増殖を犠牲にした高速の分化は、幹細胞の損失および長期的には余りにも少ない分化した組織の産生、および特に、再生能力の損失につながることがある。ある腫の遺伝子は、幹細胞の分化の防止において負の役割を有することが既に確認されている。このような遺伝子は、Ｎｏｔｃｈファミリーのものと同様、活性を獲得するように突然変異したとき、分化を阻害することができる。このような突然変異体遺伝子は、癌遺伝子の役割を果たす。反対に、このような遺伝子の、それらの阻害に対する作用がなくなることにより、幹細胞が分化する。我々は、我々のモデル細胞系を有するＥＣ細胞を、ＲＮＡｉの細胞運命に対する作用の追跡に使用することを提案する。
【００２０】
発明の第一の態様に従えば、（ｉ）幹細胞と、該細胞の分化における少なくとも一つのステップを仲介する遺伝子配列またはその有効な部分を含む、少なくとも一つの抑制性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子とを接触させるステップと、（ｉｉ）上記（ｉ）で処理された細胞の成長および分化に役立つ条件を提供するステップと、任意選択的に、（ｉｉｉ）細胞を分化した状態で維持および／または保存するステップとを含む、幹細胞の分化状態を調節する方法が提供される。
【００２１】
上記（ｉ）における幹細胞は、奇形癌細胞であってもよい。
【００２２】
本発明の好ましい方法では、上記条件は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養条件である。
【００２３】
本発明の好ましい方法では、上記幹細胞は、胚性幹細胞または胚性生殖細胞等の多能性幹細胞、および造血幹細胞、筋幹細胞、神経幹細胞、皮膚真皮鞘幹細胞等の系統限定幹細胞（ｌｉｎｅａｇｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）から選択されるが、これらには限定されない。
【００２４】
本発明の方法によれば、中間的な責務の幹細胞を提供できることが明白になるであろう。たとえば、胚性幹細胞を、制限された責務を有する造血幹細胞に分化するようにプログラムすることが可能であろう。あるいは、中間的な責務を有する分化した細胞または幹細胞を、他の分化した細胞系統をそれから誘導することができるよりも多能性の状態に再プログラムすることが可能であろう。
【００２５】
本発明のさらなる好ましい方法では、上記幹細胞は、胚性幹細胞または胚性生殖細胞である。
【００２６】
本発明のまたさらなる好ましい方法では、上記遺伝子は、幹細胞によって発現される細胞表面受容体をコードする。
【００２７】
本発明のさらなる好ましい方法では、上記細胞表面受容体は、ヒトＮｏｔｃｈ１（ｈＮｏｔｃｈ１）、ｈＮｏｔｃｈ２、ｈＮｏｔｃｈ３、ｈＮｏｔｃｈ４、ＴＬＥ−１、ＴＬＥ−２、ＴＬＥ−３、ＴＬＥ−４、ＴＣＦ７、ＴＣＦ７Ｌ１、ＴＣＦＦＬ２、ＴＣＦ３、ＴＣＦ１９、ＴＣＦ１、ｍＦｒｉｎｇｅ、ｌＦｒｉｎｇｅ、ｒＦｒｉｎｇｅ、ｓｅｌ  １、Ｎｕｍｂ、Ｎｕｍｂｌｉｋｅ、ＬＮＸ、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、ＦＲＺＢから選択される。
【００２８】
本発明の代替の好ましい方法では、上記遺伝子はリガンドをコードする。
【００２９】
一般に、リガンドは、同種の受容体に結合して、細胞内応答または細胞間応答を誘導または阻害するポリペプチドである。リガンドは可溶性であってもよく、膜結合していてもよい。
【００３０】
本発明のさらなる代替の好ましい方法では、上記リガンドは、Ｄ１１−１、Ｄ１１３、Ｄ１１４、Ｄｌｋ−１、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１４、Ｗｎｔ１５から選択される。
【００３１】
あるいは、上記遺伝子は、ＳＦＲＰ１、ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ＳＦＲＰ５、ＳＫ、ＤＫＫ３、ＣＥＲ１、ＷＩＦ−１、ＤＶＬ１、ＤＶＬ２、ＤＶＬ３、ＤＶＬ１Ｌ１、ｍＦｒｉｎｇｅ、ｌＦｒｉｎｇｅ、ｒＦｒｉｎｇｅ、ｓｅｌ１ｌ、Ｎｕｍｂ、ＬＮＸＯｃｔ４、ＮｅｕｒｏＤ１、ＮｅｕｒｏＤ２、ＮｅｕｒｏＤ３、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＭＤＦＩから選択される。
【００３２】
本発明のさらなる好ましい方法では、上記配列は、表４（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）で特定される配列の少なくとも一つを含む。
【００３３】
本発明による、さらなる好ましい方法では、上記遺伝子は、ＤＬＫ１、Ｏｃｔ４、ｈＮｏｔｃｈ１、ｈＮｏｔｃｈ２、ＲＢＰＪｋ、およびＣＩＲからなる群から選択される。
【００３４】
本発明によるさらなる好ましい方法では、上記遺伝子はＤＬＫ１である。好ましくはＤＬＫ１  ＲＮＡｉ分子は、図２ａに示す配列を含む核酸配列に由来する。
【００３５】
本発明によるさらなる好ましい方法では、上記遺伝子はＯｃｔ４である。好ましくはＯｃｔ４  ＲＮＡｉ分子は、図２ｂに示す配列を含む核酸配列に由来する。
【００３６】
本発明によるさらなる好ましい方法では、上記遺伝子はｈＮｏｔｃｈ１である。好ましくは、上記ｈＮｏｔｃｈ１  ＲＮＡ分子は、図２ｃに示す配列を含む核酸配列に由来する。
【００３７】
本発明によるさらなる好ましい方法では、上記遺伝子はｈＮｏｔｃｈ２である。好ましくは上記ｈＮｏｔｃｈ２  ＲＮＡｉ分子は、図２ｄに示す配列を含む核酸配列に由来する。
【００３８】
本発明によるさらなる好ましい方法では、上記遺伝子はＲＢＰＪｋである。好ましくは上記ＲＢＰＪｋ  ＲＮＡｉ分子は、図２ｅに示す配列を含む核酸配列に由来する。ＲＢＰＪｋは、ＣＢＦ−１とも呼ばれる。
【００３９】
本発明によるさらなる好ましい方法では、上記遺伝子はＣＩＲである。好ましくは上記ＣＩＲ  ＲＮＡｉ分子は、図２ｆに示す配列を含む核酸配列に由来する。
【００４０】
当該技術分野で周知であり、且つＲＮＡｉに適切な適当な細胞に核酸を導入しやすくするために、過去３０年にわたって多くの方法が開発されてきた。
【００４１】
核酸を細胞に導入する方法は、一般に、化学試薬、カチオン性脂質または物理的方法の使用を含む。細胞によるＤＮＡの取り込みを容易にする化学的方法は、ＤＥＡＥ−デキストランの使用を含む（Ｖａｈｅｒｉ  ａｎｄ  Ｐａｇａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １７５：ｐ４３４）。ＤＥＡＥ−デキストランは、会合して、核酸を細胞に導入する負に荷電したカチオンである。リン酸カルシウムもよく使用される化学的試薬であり、この試薬は核酸と共沈させるとき、核酸を細胞に導入する（Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９７３）５２：ｐ４５６）。
【００４２】
カチオン性脂質（たとえば、リポソーム（Ｆｅｌｇｎｅｒ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８４：ｐ７４１３）の使用は、一般的な方法となった。脂質のカチオンヘッドは、導入すべき負に荷電した核酸骨格と会合する。脂質と核酸との複合体は、細胞膜と会合し、細胞と融合して、会合した核酸を細胞内に導入する。リポソームに仲介される核酸移入は、既存の方法に勝る幾つかの利点を有する。たとえば、伝統的な化学的方法で処理しにくい細胞は、リポソームに仲介される移入を使用すれば、より容易にトランスフェクトされる。
【００４３】
さらに最近、核酸を導入するための物理的方法が、細胞を再現的にトランスフェクトする有効な方法となった。直接マイクロインジェクションは、核酸を細胞の核に直接送達することができる方法の一つである（Ｃａｐｅｃｃｈｉ（１９８０）Ｃｅｌｌ，２２：ｐ４７９）。これによって、単細胞トランスフェクション体を分析することが可能である。いわゆる「微粒子銃」方法は、粒子銃を使用して、核酸を細胞および／または細胞器官内に物理的に撃ち込む（Ｎｅｕｍａｎｎ（１９８２）ＥＭＢＯ  Ｊ，１：ｐ８４１）。エレクトロポレーションは、ほぼ間違いなく最も一般的に普及している核酸をトランスフェクトする方法である。この方法は、細胞膜を瞬時に一瞬に透過処理して、細胞膜を、巨大分子複合体が通るようにさせるための、高電圧電荷の使用を含む。
【００４４】
さらに最近、イムノポレーションと呼ばれる方法が核酸を細胞内に導入するための技術として認められるようになった、Ｂｉｌｄｉｒｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ（２０００）４０５，ｐ２９８を参照されたい。この技術は、特異的受容体に対する抗体で被覆されたビーズの使用を含む。トランスフェクション混合物は、核酸、抗体被覆ビーズ、および特異的細胞表面受容体を発現する細胞を含む。この被覆ビーズは、細胞表面受容体を結合し、また剪断力を細胞に加えるとき、このビーズは細胞表面から除去される。ビーズ除去中に、一過性の穴が生じ、それを通って核酸および／または他の生物学的分子が入ることができる。使用する核酸によって、４０〜５０％のトランスフェクション効率が達成される。加えて、特異的な抗体、リガンドまたは受容体へのＲＮＡｉの会合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）または連結（ｌｉｎｋａｇｅ）によって、ＲＮＡｉの細胞送達の特異性を高めることができる。
【００４５】
本発明のさらなる態様によれば、幹細胞分化における少なくとも一つのステップを仲介する少なくとも一つの遺伝子のコード配列を含む点で特徴的な、ＲＮＡｉ分子が提供される。
【００４６】
好ましい実施形態では、上記コード配列はエキソンである。
【００４７】
あるいは、上記ＲＮＡｉ分子は、イントロン配列、または幹細胞分化を仲介する遺伝子のコード配列／エキソン配列に隣接する５’および／または３’非コード配列に、由来する。
【００４８】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、ＲＮＡｉ分子の長さは１００ｂｐ〜１０００ｂｐである。より好ましくは、ＲＮＡｉの長さは、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、または１０００ｂｐから選択される。より好ましくは、上記ＲＮＡｉは、少なくとも１０００ｂｐである。
【００４９】
本発明の別の代替の好ましい実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、１５ｂｐ〜２５ｂｐであり、好ましくは上記分子は２１ｂｐである。
【００５０】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、上記ＲＮＡｉ分子は、表４（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）で識別される配列を含む。
【００５１】
本発明の好ましい実施形態では、上記ＲＮＡｉ分子は、ＤＬＫ１、Ｏｃｔ４、ｈＮｏｔｃｈ１、ｈＮｏｔｃｈ２、ＲＢＰＪｋ、およびＣＩＲからなる群から選択される遺伝子に由来する。好ましくは、上記ＲＮＡｉ分子は、図２ａ〜２ｆに示す核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
【００５２】
本発明のまたさらなる好ましい実施形態では上記ＲＮＡｉ分子は、修飾されたリボヌクレオチド塩基を含む。
【００５３】
当業者には、天然の塩基シトシン、ウラシル、アデノシンおよびグアノシンのみならず修飾された塩基も包含することは、上記修飾された塩基を含有するＲＮＡｉ分子に有利な特性を与える可能性があることが、明白になるであろう。たとえば、修飾された塩基は、ＲＮＡｉ分子の安定性を高め、それによって所望の作用をもたらすために必要な量を減少させることが可能である。
【００５４】
本発明のさらなる態様によれば、表４で特定されるＤＮＡ寄託番号で示される、幹細胞分化における少なくとも一つのステップを仲介する遺伝子の配列を含む単離されたＤＮＡ分子であって、上記ＤＮＡの転写を促進することができる少なくとも一つのさらなるＤＮＡ分子（「プロモーター」）に上記ＤＮＡが作動可能に連結していることを特徴とするＤＮＡ分子が提供される。
【００５５】
本発明の好ましい実施形態では上記遺伝子は、ＤＬＫ１、Ｏｃｔ４、ｈＮｏｔｃｈ１、ｈＮｏｔｃｈ２、ＲＢＰＪｋ、およびＣＩＲからなる群から選択される。好ましくは、上記ＤＮＡは、図２ａ〜２ｆに示す配列からなる群から選択される配列を含む。
【００５６】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、上記遺伝子は、上記ＤＮＡ分子を含む両方のＤＮＡ鎖がＲＮＡに転写されるように配置されていることを特徴とする、少なくとも二つのプロモーターを備えている。
【００５７】
当業者には、ＲＮＡｉを形成するＲＮＡ分子の合成は、プロモーター配列に作動可能に連結された標的遺伝子、または標的遺伝子のフラグメントを含むベクターを提供することによって達成できることが明白になるであろう。一般に、プロモーター配列はファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター（たとえば、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６）である。有利なことに、ベクターは、遺伝子または遺伝子フラグメントをサブクローニングすることができる多数のクローニング部位を備えている。一般に、ベクターは、ファージプロモーターが、関心のある遺伝子を含有する多数のクローニング部位に隣接するように設計される。ファージプロモーターは、一つのプロモーターが、センスＲＮＡおよび別のファージプロモーター、アンチセンスＲＮＡを合成するように配置されている。従って、ＲＮＡｉの合成が促進される。
【００５８】
あるいは、オリゴ合成技術によりキメラプロモーター／遺伝子融合体を作成することによって、標的遺伝子または標的遺伝子のフラグメントをファージプロモーターに直接融合させてもよい。このように作成された構築物は、ポリメラーゼ連鎖反応で容易に増幅され、ＲＮＡｉを含むＲＮＡ分子を製造するための鋳型を提供することができる。
【００５９】
本発明のさらなる態様によれば、本発明によるＤＮＡ分子を含むベクターが提供される。
【００６０】
本発明のさらなる態様によれば、（ｉ）本発明によるＤＮＡ分子またはベクターを提供するステップと、（ｉｉ）上記ＲＮＡｉ分子を含む各ＲＮＡ鎖の合成を可能にする試薬および条件を提供するステップと、（ｉｉｉ）それらの長さの少なくとも一部、または少なくとも、幹細胞分化を仲介する上記幹細胞遺伝子をコードする核酸配列に対応する部分について、各ＲＮＡ鎖を会合させることができる条件を提供するステップとを含む、ＲＮＡｉ分子を製造する方法が提供される。
【００６１】
好ましくは、上記遺伝子または遺伝子フラグメントは、表４に示す遺伝子から選択される。
【００６２】
ＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写は確立された方法論である。ベクター、リボヌクレオチド三リン酸、緩衝液、リボヌクレアーゼインヒビター、ＲＮＡの産生を促進するＲＮＡポリメラーゼ（たとえば、ファージＴ７、Ｔ３、ＳＰ６）を提供するキットが市販されている。
【００６３】
本発明のさらなる態様によれば、標的幹細胞の分化を達成するのに十分な、本発明によるＲＮＡｉの有効量を動物に投与することを含む、幹細胞の分化を促進するｉｎ  ｖｉｖｏ方法が提供される。好ましくは、上記方法は、組織損傷をｉｎ  ｓｉｔｕで修復するために、内因性幹細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ分化を促進する。
【００６４】
当業者には、ＲＮＡｉは、標的遺伝子ＲＮＡとＲＮＡｉ分子との間の相同性に頼ることが明白になるであろう。このことは、幹細胞を標的とする際に、かなりの程度の特異性をＲＮＡｉ分子に与える。たとえば、造血幹細胞は、骨髄に存在し、ＲＮＡｉ分子を骨髄組織内に直接注入することによって、動物に投与することができる。
【００６５】
ＲＮＡｉ分子をリポソーム内に封入して、動物免疫系および／または動物血清中に存在するヌクレアーゼから保護することが可能である。
【００６６】
リポソームは、選択された治療薬を封入し、次いで患者に導入される、脂質を主成分とする小胞である。一般に、リポソームは、純粋なリン脂質かまたはリン脂質とホスホグリセリドとの混合物のいずれかから製造される。一般に、２００ｎｍ未満の直径を有するリポソームを製造することができ、これよって静脈内に注射することが可能になり、また、肺毛細血管床を通過することができる。さらに、リポソームは、その生化学的性質により、血管膜を横切って透過し、選択された組織に接近する。リポソームは比較的短い半減期を有する。ポリエチレングルコール（ＰＥＧ）で被覆されたリポソームを含む、いわゆるＳＴＥＡＬＴＨ（登録商標）リポソームが開発された。このＰＥＧ処理リポソームは、患者に静脈内投与されたとき、有意に増加した半減期を有する。加えて、ＳＴＥＡＬＴＨ（登録商標）リポソームは、細網内皮系における取り込み減少および選択された組織における蓄積増加を示す。加えて、選択された細胞／組織へのＲＮＡｉ分子の送達の特異性を高めるために、脂質を主成分とする小胞と抗体とを組み合わせた、いわゆるイムノリポソームが開発されている。
【００６７】
送達手段としてのリポソーム類の使用は、ＵＳ５５８０５７５号およびＵＳ５５４２９３５号に記載されている。
【００６８】
当業者には、ＲＮＡｉ分子は、経口用、または鼻内噴霧、エアゾール、懸濁液製剤、乳剤、および／または点眼液の形で提供できることが明白になるであろう。あるいは、ＲＮＡｉ分子は、錠剤の形で提供することもできる。代替の送達手段としては、吸入器またはネブライザーなどがある。
【００６９】
本発明のまたさらなる態様によれば、本発明による少なくとも一つのＲＮＡｉ分子を含む治療用組成物が提供される。
【００７０】
好ましくは、上記ＲＮＡｉ分子は、疾患によって細胞／組織が破壊される疾患を治療するための、分化した細胞／組織を提供するために、幹細胞の分化を促進するのに使用するための、医薬の製造のためである。一般に、この疾患としては、悪性貧血、脳卒中、パーキンソン病等の神経変性性疾患、アルツハイマー病、冠動脈性心疾患、硬変、糖尿病等がある。（たとえば、脊髄組織の補充）の結果として、損傷した神経を補充するために、分化した幹細胞を使用できることも明白になるであろう。
【００７１】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、上記治療用組成物は、希釈剤、担体または賦形剤をさらに含む。
【００７２】
本発明のさらなる態様によれば、ＲＮＡｉ分子または本発明による組成物の導入によってもたらされる分化した細胞を含む治療用の細胞組成物が提供される。
【００７３】
本発明のさらなる態様によれば、本発明による方法で得られる細胞が提供される。
【００７４】
本発明の好ましい実施形態では、上記細胞は、下記からなる群から選択される。神経細胞、間葉細胞、筋細胞（心筋細胞）、肝細胞、腎細胞、血球（たとえば、赤血球、ＣＤ４＋リンパ球、ＣＤ８＋リンパ球、膵臓のβ細胞、上皮細胞（たとえば、肺、胃）、および内皮細胞。
【００７５】
本発明のさらなる態様によれば、本発明による方法で得られる細胞培養が提供される。
【００７６】
本発明のまたさらなる態様によれば、本発明による少なくとも一つの細胞を含む少なくとも一つの器官が提供される。
【００７７】
次に、本発明の実施形態を単なる例によって、また下図および表を参照しながら説明する。ここで、表１は、幹細胞分化のモニタリングに使用される抗体の選択を示す。表２は、幹細胞分化のｍＲＮＡマーカーを評価するために使用される核酸プローブを示す。表３は、幹細胞分化のタンパク質マーカーを示す。表４は、遺伝子特異的阻害用のＲＮＡｉを作成するために使用される特異的プライマーおよびＤＮＡデータベース寄託番号を有する遺伝子配列を示す。表５は、図３に示すＦＡＣＳデータのまとめを示す。
【００７８】
図１は、幹細胞の分化が、正および負の制御因子（Ａ）によって調節されることを示す図である。誘導される特異的細胞表現型は、特定の分化事象を活性化または抑制する正および負の制御因子の直接的結果である。特定の細胞運命を通常は促進するであろう正のアクティベーターを抑制することによって、幹細胞の初期分化（Ａ）と分化した細胞Ｄ１およびＤ２の最終的な運命との両方を調節するために、ＲＮＡｉを使用することができる。
【００７９】
図２ａは、デルタ様１（ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ−１：ＤＬＫ１）を増幅するために使用されたフォワードプライマーおよびリバースプライマー、および増幅された配列を示す図である。図２ｂは、Ｏｃｔ４を増幅するために使用されたフォワードプライマーおよびリバースプライマー、および増幅された配列を示す図である。図２ｃは、Ｎｏｔｃｈ１を増幅するために使用されたフォワードプライマーおよびリバースプライマー、および増幅された配列を示す図である。図２ｄは、Ｎｏｔｃｈ２を増幅するために使用されたフォワードプライマーおよびリバースプライマー、および増幅された配列を示す図である。図２ｅは、ＲＢＰＪＫを増幅するために使用されたフォワードプライマーおよびリバースプライマー、および増幅された配列を示す図である。図２ｆは、ＣＩＲを増幅するために使用されたフォワードプライマーおよびリバースプライマー、および増幅された配列を示す図である。
【００８０】
図３は、Ｎｏｔｃｈ（Ａ）、ＲＢＰＪｋ（Ｂ）、Ｏｃｔ４（Ｃ）および対照ＲＮＡｉ（Ｄ）に対するＲＮＡｉで処理した後の、ＮＴＥＲＡ２ｃｌ  Ｄ１ヒトＥＣ細胞によるＳＳＥＡ３の発現をモニタリングするＦＡＣＳスキャンを示す図である。ａ）Ｎｏｔｃｈ１およびＮｏｔｃｈ２に向けられたＲＮＡｉ。ｂ）ＲＢＰＪｋに向けられたＲＮＡｉ。ｃ）Ｏｃｔ４に向けられたＲＮＡｉ。ｄ）対照ＲＮＡｉを形質移入した４日後の、ＮＴＥＲＡ２ｃｌ．Ｄ１ヒトＥＣ細胞によるＳＳＥＡ３発現のフローサイトメトリー分析。各パネルは、細胞をモノクローナル抗体ＭＣ６３１（抗ＳＳＥＡ３）で、続いてＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＭで、染色した後の、対数蛍光強度（任意の単位）に対する細胞数の、二つのヒストグラムを示す図である。各パネルにおいて、一つのヒストグラムは、ＲＮＡｉを除く全ての関連試薬で処理しておいた「ｍｏｃｋ」トランスフェクトされた細胞から導出し、各パネルの第２のヒストグラムは、上述の遺伝子セットに向けられたＲＮＡｉで処理した細胞から導出した。この細胞は、ＳＳＥＡ３＋およびＳＳＥＡ３−群（それぞれ、Ｍ１およびＭ２で印をつけた領域）を示す全ての場合に、双峰ヒストグラムを示すことに注目されたい。Ｎｏｔｃｈ１およびＮｏｔｃｈ２（パネルＡ）およびＯｃｔ４（パネルｃ）に対するＲＮＡｉで処理した後、幹細胞分化の証拠を示す、ＳＳＥＡ３＋集団の蛍光強度が下向きにシフトしたことに注目されたい。ＲＢＰＪｋで処理した細胞（パネルＢ）で、やはり下向きの、小さいシフトが明白であった。このような結果から、未分化のＥＣ細胞表現型を維持する上でこうした遺伝子産物がある役割を果たすかどうか、また、対応するｍＲＮＡに向けられたＲＮＡｉによる処理が、こうした重要な制御タンパク質のダウンレギュレーションを招くかどうかが予測される。対照的に、対照ＲＮＡｉ（パネルＤ）で処理することによって、ＳＳＥＡ３のダウンレギュレーションは起こらなかった。ＳＳＥＡ３の発現は、未分化ＥＣ幹細胞表現型の非常に鋭敏なマーカーのようであり、また、分化したときに最も速やかに消失するマーカーの一つである（Ｆｅｎｄｅｒｓｏｎら、１９８７；Ａｎｄｒｅｗｓら、１９９６）。同様に、ＳＳＥＡ３は、ヒトＥＳ細胞によって発現され（Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９８）、やはり、それらが分化するとすぐに消失する（Ｐ  Ｗ  Ａｎｄｒｅｗｓ  ａｎｄ  Ｊ  Ｓ  Ｄｒａｐｅｒ、未発表の結果）。
【００８１】
図４は、（Ａ）ＮｏｔｃｈおよびＷｎｔ情報伝達経路を説明する略線図である。Ｎｏｔｃｈ情報伝達経路およびＷｎｔ情報伝達経路を示す。Ｄｅｌｔａ／Ｓｅｒｒａｔｅ／Ｌａｇ（ＤＳＬ）ファミリーのリガンドはＮｏｔｃｈ受容体を結合し、Ｈａｉｒｌｅｓｓ（Ｓｕ−Ｈ）／ＣＢＦ１／ＲＢＰＪｋのサプレッサーの活性化および標的遺伝子の転写増強を招く。（Ｂ）ＮＴＥＲＡ２ＥＣ細胞におけるＤＬＳリガンドＤｌｋおよびＮｏｔｃｈ標的遺伝子ＴＬＥ１の発現のノーザンブロット分析。ＴＬＥ１は、ＮＴＥＲＡ２ＥＣ細胞におけるＮｏｔｃｈ経路の標的遺伝子として同定される。ＴＬＥ１は、レチノイン酸誘導性分化中に、ＤＳＬリガンドであるＤｌｋ１と極めて類似した発現パターンを示す。ＲＡ処理の３日後（ＲＡ３）、両遺伝子はかなりダウンレギュレートされる。次の時点で、ＲＡ処理の２１日後（ＲＡ２１）まで、発現の漸進的回復が見られる。ＴＬＥ１のダウンレギュレーションは、細胞が分化経路に入ったことを示す。（Ｃ）ＲＮＡｉ処理したＥＳ細胞におけるＴＬＥ１およびＨＡＳＨ１のＲＴ  ＰＣＲ分析。ｄｓＲＮＡ処理の３日後、ＴＬＥ１およびＨＡＳＨ１についてＲＴ−ＰＣＲを実施した。レーン１は水である。レーン２は未処理ＥＳ細胞である。レーン３はｍｏｃｋトランスフェクションである。レーン４はＮｏｔｃｈ１及びＮｏｔｃｈ２ｄｓＲＮＡである。レーン５はＤｌｋ１ｄｓＲＮＡである。レーン６はＲＢＰＪｋｄｓＲＮＡである。レーン７はＣＩＲｄｓＲＮＡである。レーン８はＯｃｔ４ｄｓＲＮＡである。レーン９は対照ｄｓＲＮＡである。ｄｓＲＮＡがＮｏｔｃｈ情報伝達経路の成分を標的とするサンプルに対応する、レーン５および６におけるＴＬＥ１発現の特異的減少に注目されたい。レーン５におけるＨＡＳＨ１の出現にも注目されたい。これらのデータから、この細胞が神経分化プログラムを開始していることがわかる（ｄｅ  ｌａ  Ｐｏｍｐａら、哺乳動物神経発生におけるＮｏｔｃｈ情報伝達経路の保存。Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４，１１３９−１１４８（１９９７）。Ｎｏｔｃｈ１及びＮｏｔｃｈ２ｄｓＲＮＡが類似した結果をもたらせないことは、受容体系の機能的重複性、または他の経路成分に比して受容体が非常に多いことに起因する。
【００８２】
図５は、ｍＲＮＡの定常状態レベルをモニタリングするためにＲＴ  ＰＣＲを使用した、幹細胞分化に関与する異なる遺伝子に由来するＲＮＡｉ分子を使用した、ヒトＥＳ細胞のＲＮＡｉを示す。ｄｓＲＮＡ処理の３日後のヒト胚性幹細胞における標的転写物の存在割合のＲＴ−ＰＣＲ分析。レーン１は水である。レーン２は未処理ＥＳ細胞である。レーン３はｍｏｃｋトランスフェクションである。レーン４はＮｏｔｃｈ１及びＮｏｔｃｈ２ｄｓＲＮＡである。レーン５はＤｌｋ１ｄｓＲＮＡである。レーン６はＲＢＰＪｋ（ＣＢＦ１）ｄｓＲＮＡである。レーン７はＣＩＲｄｓＲＮＡである。レーン８はＯｃｔ４ｄｓＲＮＡである。レーン９は対照ｄｓＲＮＡである。標的転写物の存在割合の特異的減少は、ｄｓＲＮＡ処理後少なくとも３日間持続することに注目されたい。この作用は、Ｎｏｔｃｈ１とＮｏｔｃｈ２、ＲＢＰＪｋ（ＣＢＦ１）およびＯｃｔ４ｄｓＲＮＡで処理した細胞で特に顕著である。βアクチンＰＣＲをＰＣＲ用の鋳型ローディング対照として使用した。
【００８３】
図６は、ｍＲＮＡの定常状態レベルをモニタリングするためにＲＴ  ＰＣＲを使用した、幹細胞分化に関与する異なる遺伝子に由来するＲＮＡｉ分子を使用した、ＮＴＥＲＡ２／Ｄ１のＲＮＡｉを示す。ｄｓＲＮＡ処理の１７時間後の、ヒト胚性癌腫細胞系、ＮＴＥＲＡ２に豊富な標的転写物のＲＴ−ＰＣＲ分析。レーン１は水である。レーン２は未処理ＥＣ細胞である。レーン３はＯｃｔ４ｄｓＲＮＡである。レーン４は対照ｄｓＲＮＡである。レーン５はＲＢＰＪｋｄｓＲＮＡである。レーン６はＮｏｔｃｈ１及びＮｏｔｃｈ２ｄｓＲＮＡである。レーン７はｍｏｃｋトランスフェクションである。標的転写物の存在割合の特異的且つかなりの減少に注目されたい。βアクチンＰＣＲを鋳型ローディング対照として使用した。
【００８４】
［材料および方法］
［細胞培養］
既述の通り、ＮＴＥＲＡ２および２１０２ＥｐヒトＥＣ細胞系を、空気中に１０％のＣＯ２を含む加湿大気下、１０％ｖ／ｖのウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を加えたＤＭＥＭ（高グルコース配合物）（ＤＭＥＭ）（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）中で、高細胞密度にて維持した（Ａｎｄｒｅｗｓら、１９８２、１９８４ｂ）。
【００８５】
［二本鎖ＲＮＡ合成］
およそ５００ｂｐの生成物サイズを与えるように、関心のあるｍＲＮＡ配列に対するＰＣＲプライマーをデザインした。各プライマーの５’末端にて、以下の配列：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧまたは、配列：ＡＡＴＴＡＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡのどちらかを含むＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを加えた。これらのプライマーを使用して、適切なｃＤＮＡソース（たとえば、標的とする細胞型に由来する）にＰＣＲを実施し、生成物をクローニングし、配列決定して、その同一性を確認した。ＲＮＡ合成用鋳型ＤＮＡを作成するために、必要に応じて、配列決定されたクローンを鋳型として使用して、さらなるＰＣＲを実施した。いずれの場合にも、生成物サイズおよび存在割合を確認するために、アガロースで、ある一定量のＰＣＲを電気泳動させ、その間に残りをアルカリフェノール／クロロホルム抽出で精製した。製造会社のプロトコールに従ってＭｅｇａｓｃｒｉｐｔキット（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．製）を使用してＲＮＡを合成し、酸性フェノール／クロロホルム抽出した。ＲＮＡの相補鎖を一反応で同時合成することにより、アニーリングステップの必要性がなくなる。しかし、合成されたＲＮＡの質および二本鎖化をアガロースゲル電気泳動で確認したところ、同じ長さの二本鎖ＤＮＡで予測される通りに、所望の生成物が移動していた。
【００８６】
［ＲＮＡｉを作成するための、ヒト細胞のｄｓＲＮＡ処理］
以下の方法は、６ウェルプレートにおける細胞培養のＲＮＡｉについて説明するものである。より大きいまたは小さい培養容器の場合には、体積および細胞数は適切にスケールアップまたはスケールダウンすべきである。
【００８７】
処理前日に、ウェル当たり５００，０００の細胞を播種し、それらの通常の培地で成長させた。処理すべき各ウェルについて、関心のある二本鎖ＲＮＡの９．５μｇを１５０ｍＭの３００μｌのＮａＣｌで希釈した。希釈したＲＮＡ溶液にＥｘＧｅｎ５００（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ製）２１μｌを加え、渦巻攪拌により混合した。ｄｓＲＮＡとＥｘＧｅｎ５００の混合物を室温で１０分間インキュベートした。次いで、新鮮な細胞増殖培地３ｍｌを加え、ＲＮＡｉ処理培地を作成した。培養容器から増殖培地を吸引し、ウェル当たり３ｍｌのＲＮＡｉ処理培地を補充した。次いで、培養容器を２８０ｇで５分間遠心分離し、インキュベーターに戻した。１２〜１８時間後、ＲＮＡｉ処理培地を通常の増殖培地と取り替え、必要に応じて細胞を維持した。
【００８８】
［Ｏｃｔ４ＲＮＡｉ産生］
およそ５００ｂｐの生成物サイズを与えるように、関心のあるＯｃｔ４  ｍＲＮＡ配列に対するＰＣＲプライマーをデザインした。各プライマーの５’末端にて、以下の配列：ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇを含むＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを加えた。これらのプライマーを使用して、適切なｃＤＮＡソース（たとえば、標的とする細胞型に由来する）にＰＣＲを実施し、生成物をクローニングし、配列決定して、その同一性を確認した。ＲＮＡ合成用の鋳型であるＯｃｔ４ＤＮＡを作成するために、必要に応じて、配列決定されたクローンを鋳型として使用して、さらなるＰＣＲを実施した。いずれの場合にも、生成物のサイズおよび存在割合を確認するために、アガロースで、ある一定量のＰＣＲを電気泳動させ、その間に残りをアルカリフェノール／クロロホルム抽出で精製した。製造会社のプロトコールに従ってＭｅｇａｓｃｒｉｐｔキット（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．製）を使用してＲＮＡを合成し、酸性フェノール／クロロホルム抽出した。ＲＮＡの相補鎖を一反応で同時合成することにより、アニーリングステップの必要性がなくなる。しかし、合成されたＲＮＡの質および二本鎖化をアガロースゲル電気泳動で確認したところ、同じ長さの二本鎖ＤＮＡで予測される通りに、所望の生成物が移動していた。
【００８９】
［ＲＮＡｉを作成するための、ヒト細胞のＯｃｔ４ｄｓＲＮＡ処理］
以下の方法は、６ウェルプレートにおける細胞培養のＯｃｔ４  ＲＮＡｉについて説明するものである。より大きいまたは小さい培養容器の場合には、体積および細胞数は適切にスケールアップまたはスケールダウンすべきである。
【００９０】
処理前日に、ウェル当たり５００，０００の細胞を播種し、それらの通常の培地で成長させた。処理当日、処理すべき各ウェルについて、Ｏｐｔｉｍｅｍ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ製）１００μｌに、リポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ製）のアリコート１５μｌを加えた。同時に、処理すべき各ウェルについて、Ｏｐｔｉｍｅｍ３００μｌにＯｃｔ４ｄｓＲＮＡ６μｇを加えた。リポフェクチン−ＯｐｔｉｍｅｍおよびｄｓＲＮＡ−Ｏｐｔｉｍｅｍ溶液を室温で４０分間インキュベートし、次いで混合し、各ウェルについて総量およそ４１５μｌのＲＮＡｉ処理培地を作った。使用前に、この処理培地を室温で１０分間インキュベートした。この期間中に、細胞から増殖培地を吸引し、各ウェルを３ｍｌのＰＢＳで洗浄した。次いでＰＢＳ洗浄液を、さらにウェル当たり０．５ｍｌのＯｐｔｉｍｅｍを加えたＲＮＡｉ処理培地と取り替えた。培養容器をインキュベーターに６．５時間戻し、その後、処理培地を吸引し、通常の増殖培地を補充した。ＰＣＲ処理の３日後、標的ｍＲＮＡ阻害を評価した。
【００９１】
［細胞系へのＲＮＡｉ導入］
ヒトＥＣ幹細胞を、６ウェルプレートのウェル当たり２×１０５細胞で、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改良型Ｅａｇｌｅｓ培地３ｃｍ３に播種し、３時間落着かせた。ＲＮＡｉ  ６μｇを培地に加え、細胞を室温で３０分間かき混ぜた。
【００９２】
ウシ胎仔血清（ＧＩＢＯ  ＢＲＬ製）を、濃度１０％まで培地に加え、細胞を増殖させた。
【００９３】
［総ＲＮＡ産生］
増殖中の細胞培養を吸引して、ＤＭＥおよびウシ胎仔血清を除去した。リン酸緩衝食塩水で洗浄することにより、微量のウシ胎仔血清が除去された。新鮮なＰＢＳを細胞に加え、酸洗浄ガラスビーズを使用して、細胞を培養容器から除去した。このようにして得られた細胞懸濁液を、３００×ｇで遠心分離した。ペレットからＰＢＳを吸引した。Ｔｒｉ試薬（Ｓｉｇｍａ社製，ＵＳＡ）を、１０７細胞当たり１ｍｌで加え、室温で１０分間放置した。この反応からの溶解物を、４℃にて、１２０００×ｇで１５分間遠心分離した。結果として得られた水性相を新しい容器に移し、イソプロパノール０．５ｍｌ／トリゾールｍｌを加えて、ＲＮＡを沈澱させた。４℃にて、１２０００×ｇで１０分間遠心分離することにより、ＲＮＡをペレット化させた。上澄を除去し、ペレットを７０％のエタノールで洗浄した。洗浄したＲＮＡを、ＤＥＰＣ処理２回蒸留水に溶解した。
【００９４】
［ＲＮＡｉ暴露により誘導されるＥＣ幹細胞分化の分析］
重要な特異的制御遺伝子に対応するＲＮＡｉに暴露させた後、その後のＥＣ細胞の分化を様々な方法でモニタリングした。一つのアプローチは、幹細胞表現型の代表的なマーカーの消失をモニタリングすることである。もう一つのアプローチは、誘導された特定の系統に関するマーカーの出現をモニタリングすることである。関連マーカーは、表面抗原、ｍＲＮＡ種および特異的タンパク質を含んでいた。
【００９５】
［抗体染色およびＦＡＣＳによる形質移入体の分析］
細胞をトリプシン（０．２５％ｖ／ｖ）で５分間処理して、細胞を分解し、洗浄し、２×１０５細胞／ｍｌに再懸濁した。回転式シェーカー上の９６ウェルプレートで、この細胞懸濁液を一次抗体５０μｌと共に、４℃にて１時間インキュベートした。骨髄腫細胞系Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８からの上澄を陰性対照として使用した。９６ウェルプレートを、１００ｒｐｍで３分間、遠心分離した。このプレートを、５％のウシ胎仔血清を含有するＰＢＳで３回洗浄し、結合していない抗体を除去した。次いで、この細胞を、適切なＦＩＴＣ複合二次抗体５０μｌと共に、４℃にて１時間インキュベートした。細胞を、ＰＢＳ＋５％のウシ胎仔血清で３回洗浄し、ＥＰＩＣＳエリートＥＳＰフローサイトメーター（Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｅｌｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｕ．Ｋ）を使用して分析した（Ａｎｄｒｅｗｓら、１９８２）。
【００９６】
［ＲＮＡのノーザンブロット分析］
ＲＮＡの分離は、一般に、標準ＤＮＡと同じ原理によるが、ＲＮＡは、それ自体または他のＲＮＡ分子とハイブリダイズする傾向がある。ホルムアルデヒドをゲルマトリックスに使用して、ＲＮＡのアミン基と反応させ、シッフ塩基を形成する。標準アガロースゲル電気泳動法を使用して、精製したＲＮＡを泳動させる。大抵のＲＮＡの場合、１％のアガロースゲルで十分である。アガロースは、１×ＭＯＰＳ緩衝溶液で作製し、０．６６Ｍのホルムアルデヒドを加える。乾燥させたＲＮＡサンプルを再構成し、ＲＮＡローディング緩衝溶液で変性させ、ゲルにローディングする。ゲルを約３時間（染色の先端が、ゲルの下方の３／４になるまで）泳動させる。
【００９７】
ＲＮＡを使用してきれいなブロッティングを得ることに関する主な問題は、ホルムアルデヒドの存在である。ホルムアルデヒドをマトリックスから除去するために、蒸留水を４回交換しながら、泳動ゲルを蒸留水に２０分間浸漬した。ＤＮＡ（サザン）ブロッティングの場合とまったく同じ様式で、トランスファーアセンブリを組立てた。しかし、使用したトランスファー緩衝溶液は、１０ＸＳＳＰＥであった。ゲルを一晩トランスファーさせた。膜を２ＸＳＳＰＥに浸漬してアガロースをトランスファーアセンブリから除去し、ＲＮＡを膜に固定した。固定は、短波長（２５４ｎＭ）ＵＶ光線を使用して実行した。固定した膜を１〜２時間ベークし、残留ホルムアルデヒドを除去した。
【００９８】
所与のプローブに合わせてハイブリダイゼーション温度を下げるために、ホルムアミドを含む水性相でハイブリダイゼーションを実行した。ＲＮＡブロットを、ノーザンプレハイブリダイゼーション溶液中で２〜４時間プレハイブリダイズした。標識したＤＮＡプローブを、９５℃で５分間変性させ、ブロットに加えた。全てのハイブリダイゼーションステップを、インキュベーションオーブン内のローリングボトルで実行した。プローブを、プレハイブリダイゼーション溶液中で一晩、少なくとも１６時間、ハイブリダイズさせた。標準セットの洗浄液を使用した。洗浄のストリンジェンシーは、低塩含有洗浄用緩衝液を使用することによって達成した。後続の洗浄手順は下記の通りである。
【００９９】
【表１】
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【０１００】
［放射標識ＤＮＡプローブの作製］
Ｆｅｉｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎの方法（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，１９８３）を使用してＤＮＡを放射性標識した。簡単に記載すると、このプロトコールは、Ｋｌｅｎｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼＩフラグメントを使用した、変性したＤＮＡ鋳型上の多数の部位におけるＤＮＡ合成を誘導するために、ランダム配列ヘキサヌクレオチドを使用した。一貫性の助けとなるように、予備形成したキットを使用した。ＤＮＡフラグメント（ＰＣＲのゲル精製または制限消化物から得られる）５〜１００ｎｇを水で作製し、ランダムヘキサマーと共に９５℃で５分間変性させた。この混合物を氷で急冷し、５μｌの［（−３２Ｐ］ｄＡＴＰ  ３０００Ｃｉ／ミリモル、１μｌのＫｌｅｎｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼ（４Ｕ）を加えた。次いで、反応を３７℃で１時間インキュベートした。取り込まれなかったヌクレオチドをスピンカラム（Ｎｕｃｌｅｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で除去した。
【０１０１】
［ｃＤＮＡの作製］
オリゴ（ｄＴ）および（ｄＮ）プライマーで誘導した組換えモロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）ネズミ白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写酵素の３’〜５’ポリメラーゼ活性を使用して、ＲＮＡの、１本鎖ｃＤＮＡへの酵素的転換を実行した。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応に、１本鎖ｃＤＮＡを使用した。ｃＤＮＡを、１μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡから合成するか、または全ＲＮＡを以下のものと一緒にインキュベートした。
【０１０２】
【表２】
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反応を、４２℃で２〜３時間インキュベートした。
【０１０３】
［蛍光自動化配列決定］
ＲＮＡｉ製造に使用する鋳型の作成に使用するＰＣＲプライマーの特性を確認するために、プリズム蛍光標識連鎖ターミネーター配列決定キット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）（Ｐｒｏｂｅｒら、１９８７）を使用して、自動配列決定を行った。適量の鋳型（２００ｎｇのプラスミド、１００ｎｇのＰＣＲ産物）、１０μＭの配列決定用プライマー（一般に、５０％のＧ−Ｃ含量を有する２０量体）を、８μｌのプリズムプレミックス（ｐｒｉｓｍ ｐｒｅ−ｍｉｘ）に加え、総反応体積を２０μｌに調整した。２４サイクルのＰＣＲ（１０秒間９４℃、１０秒間５０℃、４分間６０℃）。熱サイクルの後、３Ｍの酢酸ナトリウム２μｌおよび１００％のエタノール５０μｌを加えることにより生成物を沈澱させた。ＤＮＡを、エッペンドルフ微量遠心分離機で、１３０００ｒｐｍにてペレット化し、７０％のエタノールで１回洗浄し、および真空乾燥させた。サンプルを、Ｉｎ−ｈｏｕｓｅ配列決定サービス（Ｋｒｅｂｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）で分析した。乾燥サンプルをホルムアミドローディング緩衝溶液４μｌ中に再懸濁し、変性させ、ＡＢＩ３７３自動シーケンサーにローディングした。生の配列を収集し、ＡＢＩプリズムソフトウェアを使用して分析し、分析したヒストグラム追跡の形で結果を与えた。
【０１０４】
［ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングによる特異的タンパク質標的の検出］
細胞溶解物を得るために、細胞の単分子層を、２ｍＭのＣａＣｌ２を加えた氷冷ＰＢＳで３回すすいだ。細胞を、１ｍｌ／７５ｃｍ２フラスコ溶解用緩衝溶液（ＰＢＳ中、１％ｖ／ｖのＮＰ４０、１％ｖ／ｖのＤＯＣ、０．１ｍＭのＰＭＳＦ）と共に、４℃にて１５分間インキュベートした。細胞溶解物をエッペンドルフ管にトランスファーし、２１ゲージの針を通過させて、ＤＮＡを除去した。続いて凍結解凍し、次に遠心分離（３０分、４℃，１５０００ｇ）して、不溶性物質を除去した。市販のタンパク質アッセイ（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して上澄のタンパク質濃度を決定し、１．３ｍｇ／ｍｌに調整した。４倍のＬａｅｍｍｌｉ電気泳動サンプル緩衝溶液を加え、５分間煮沸することによって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルを調製した。タンパク質１６μｇを、１０％のポリアクリルアミドゲル（Ｌａｅｍｍｌｉ製，１９７０）を電気泳動させた後、このタンパク質を０．４５μｍのポアサイズを有するニトロセルロース膜にトランスファーした。ブロットを、ＰＢＳおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄した。ＰＢＳ−Ｔ中５％の粉乳（室温にて６０分）で、ブロットのブロッキンングが起こった。ブロットを、適切な一次抗体と共にインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体を使用して、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｕｃｋｓ．，ＵＫ）により抗体結合を可視化した。特に記載がなければ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングに使用した材料は、Ｂｉｏｒａｄ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）から入手した。
【０１０５】
【表３】
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【０１０６】
【表４】
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【０１０７】
【表５】
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【０１０８】
【表６−１】
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【０１０９】
【表６−２】
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【０１１０】
【表６−３】
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【０１１１】
【表７】
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【０１１２】
［引用文献］
【表８−１】
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【０１１３】
【表８−２】
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【０１１４】
【表８−３】
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【０１１５】
【表８−４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
幹細胞分化が、正および負の制御因子（Ａ）によって調節されることを示す図である。
【図２ａ】
デルタ様１（ＤＬＫ１）を増幅するために使用されたフォワードプライマーおよびリバースプライマー、および増幅された配列を示す図である。
【図２ｂ】
Ｏｃｔ４を増幅するために使用されたフォワードプライマーおよびリバースプライマー、および増幅された配列を示す図である。
【図２ｃ】
Ｎｏｔｃｈ１を増幅するために使用されたフォワードプライマーおよびリバースプライマー、および増幅された配列を示す図である。
【図２ｄ】
Ｎｏｔｃｈ２を増幅するために使用されたフォワードプライマーおよびリバースプライマー、および増幅された配列を示す図である。
【図２ｅ】
ＲＢＰＪＫを増幅するために使用されたフォワードプライマーおよびリバースプライマー、および増幅された配列を示す図である。
【図２ｆ】
ＣＩＲを増幅するために使用されたフォワードプライマーおよびリバースプライマー、および増幅された配列を示す図である。
【図３】
Ｎｏｔｃｈ（Ａ）、ＲＢＰＪｋ（Ｂ）、Ｏｃｔ４（Ｃ）および対照ＲＮＡｉ（Ｄ）に対するＲＮＡｉで処理した後の、ＮＴＥＲＡ２ｃｌ  Ｄ１ヒトＥＣ細胞によるＳＳＥＡ３の発現をモニタリングするＦＡＣＳスキャンを示す図である。
【図４Ａ】
ＮｏｔｃｈおよびＷｎｔ情報伝達経路を説明する略線図である。
【図４Ｂ】
ＮＴＥＲＡ２ＥＣ細胞におけるＤＬＳリガンドＤｌｋおよびＮｏｔｃｈ標的遺伝子ＴＬＥ１の発現のノーザンブロット分析を示す図である。
【図４Ｃ】
ＲＮＡｉ処理したＥＳ細胞におけるＴＬＥ１およびＨＡＳＨ１のＲＴ  ＰＣＲ分析を示す図である。
【図５】
ｍＲＮＡの定常状態レベルをモニタリングするためにＲＴ  ＰＣＲを使用した、幹細胞分化に関与する異なる遺伝子に由来するＲＮＡｉ分子を使用した、ヒトＥＳ細胞のＲＮＡｉを示す。
【図６】
ｍＲＮＡの定常状態レベルをモニタリングするためにＲＴ  ＰＣＲを使用した、幹細胞分化に関与する異なる遺伝子に由来するＲＮＡｉ分子を使用した、ＮＴＥＲＡ２／Ｄ１のＲＮＡｉを示す。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図２ｆ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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