(57)【要約】本発明は、ＮＯシンターゼの活性化の測定方法、対応するＮＯシンターゼ・モジュレータの識別、特にＨＴＳ（Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）において使用するための方法、および対応する陽イオン交換フィルタプレート膜の使用に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＯシンターゼの活性化の測定方法であって、
（ａ）反応容器中の基質として標識されたアルギニンによるＮＯシンターゼをインキュベーションする方法ステップと、
（ｂ）シトルリンの濃度が上昇する時点で、場合により酵素反応の生成物として発生した標識されたシトルリンから標識されたアルギニンを分離する方法ステップと、
（ｃ）それぞれ分離されたアルギニンの量を測定する方法ステップとを備えた方法において、
分離がフィルタープレート膜を介して行われることを特徴とする方法。
【請求項２】
反応容器の少なくとも１つの中でステップ（ａ）の培養出発物質に物質が添加され、それに基づいて前記物質がＮＯシンターゼのモジュレーター、特にアクチベーターまたはインヒビター、好ましくはインヒビターであるか否かが検査されるべきであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＮＯシンターゼ・モジュレーターの識別方法であって、
（ａ）反応容器中の基質としてＮＯシンターゼおよび標識されたアルギニンによる被験物質のインキュベーションの方法ステップと、
（ｂ）シトルリンの濃度が上昇する時点で、場合により酵素反応の生成物として発生した標識されたシトルリンから標識されたアルギニンを分離する方法ステップと、
（ｃ）それぞれ分離されたアルギニンの量を測定する方法ステップとを備えた方法において、
分離がフィルタープレート膜を介して行われることを特徴とする方法。
【請求項４】
方法がＮＯシンターゼのアクチベーターまたはインヒビター、好ましくはインヒビターの識別に利用されることを特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｂ）（請求項１または３に記載したように）による分離時に反応容器から培養培地が除去されることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
培養培地が広範囲に、特にほぼ完全に、好ましくは完全に除去されることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項７】
標識されたアルギニンが培養培地から分離されることを特徴とする、請求項５または６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｂ）（請求項１または３に記載したように）による分離時に付加的に補因子もしくは補酵素、ＮＯシンターゼ、ＮＯおよび二次生成物および／またはＮＯシンターゼが標識されたアルギニンから分離されることを特徴とする、請求項１ないし７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
フィルタープレート膜が陽イオン交換体であることを特徴とする、請求項１ないし８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
フィルタープレート膜が紙フィルターまたは織物フィルターであり、またはその他の多孔性または打抜き固形状物質、たとえば金属、ガラスまたはセラミックからなり、または前記物質類を含有することを特徴とする、請求項１ないし９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
陽イオン交換のための官能基がフィルタープレート膜に固定されていることを特徴とする、請求項１０または１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
陽イオン交換体の官能基がホスフェート基、カーボネート基、ホスホネート基、サルフェート基および／またはスルホネート基、好ましくはホスフェート基であることを特徴とする、請求項１０ないし１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
フィルタープレート膜が、厚さ１０．００ｍｍ〜０．１０ｍｍ、好ましくは１．００ｍｍ〜０．１５ｍｍ、特に０．５０ｍｍ〜０．２０ｍｍ、好ましくは０．２３ｍｍの紙フィルターであることを特徴とする、請求項１ないし１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
フィルタープレート膜が交換容量≧１．０μＥｑ．／ｃｍ２、特に≧１０．０μＥｑ．／ｃｍ２、好ましくは≧１８．０μＥｑ．／ｃｍ２を有する陽イオン交換体であることを特徴とする、請求項１ないし１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ａ）（請求項１または３に記載したように）が平行に複数の反応容器中でほぼ同時に、好ましくは同時に行われ、および／またはステップ（ｂ）（請求項１または３に記載したように）が平行に複数の反応容器中でほぼ同時に、好ましくは同時に行われることを特徴とする、請求項１ないし１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
反応容器が繋がっており、特にマイクロタイタープレートの「ウェル」（Ｗｅｌｌ）であることを特徴とする、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
マイクロタイタープレートが、＜９６「ウェル」、好ましくは２４または４８「ウェル」、または≧９６「ウェル」、特に９６、３８４、８６４または１５３６「ウェル」を有することを特徴とする、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ａ）および／またはステップ（ｂ）（請求項１または３に記載したように）のための反応容器が、収容容積≦２ｍｌ、特に≦１ｍｌ、好ましくは≦１ｍｌ、≦８００μｌ、≦３５０μｌ、≦３００μｌ、≦２５０μｌ、≦２００μｌ、≦１５０μｌ、≦１００μｌ、≦５０μｌ、≦３０μｌまたは≦５μｌを有することを特徴とする、請求項１ないし１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｂ）（請求項１または３に記載したように）による分離がフィルタープレート膜によるステップ（ａ）からの培養培地の吸引によって行われることを特徴とする、請求項１ないし１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｂ）（請求項１または３に記載したように）による分離後に、標識されたアルギニンから分離された標識されたシトルリンを含有する画分が投棄されることを特徴とする、請求項１ないし１９のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｂ）（請求項１または３に記載したように）による分離後に、分離された標識されたアルギニンがフィルタープレート膜上またはその中に存在することを特徴とする、請求項１ないし２０のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
標識されたアルギニンが結合していることを特徴とする、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
標識が、放射能、蛍光、発光またはスペクトル変化もしくは色変化を介してアルギニンの測定を可能にすることを特徴とする、請求項１ないし２２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
シンチレーションカウンター内の標識されたアルギニンの測定が、フィルタープレート膜上へのシンチレーション液の添加後に行われることを特徴とする、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）（請求項１または３に記載したように）が同じ反応容器の中で行われないことを特徴とする、請求項１ないし２４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２６】
ステップ（ｂ）による分離後に洗浄ステップが好ましくは≦３回、特に１回、好ましくは水または緩衝液で、特に体積≦１０ｍｌ、特に≦５ｍｌ、好ましくは≦３ｍｌ、特に≦２ｍｌで行われることを特徴とする、請求項１ないし２５のいずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
ＮＯシンターゼとして組換えＮＯシンターゼが使用されることを特徴とする、請求項１ないし２６のいずれか１項記載の方法。
【請求項２８】
ＮＯシンターゼが亜型特異的であり、特にヒト−、ラット−またはマウス特異的なｅＮＯＳ、ｉＮＯＳまたはｎＮＯＳ、特にまたα−もしくはβ−ｎＮＯＳであることを特徴とする、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
使用されたＮＯシンターゼが脊椎動物組織、好ましくは哺乳類動物組織からの粗抽出物の部分であることを特徴とする、請求項１ないし２６のいずれか１項記載の方法。
【請求項３０】
粗抽出物が齧歯類動物から得られ、および／またはＺＮＳから由来し、および／またはホモジネートから得た上澄みであり、特にラット−またはマウス小脳からのホモジネートの上澄みであることを特徴とする、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
ステップ（ａ）（請求項１または３に記載したように）による培養出発物質に使用したタンパク質量がステップｂ）で使用したフィルタープレート膜ｍｍ２あたり最大≦５．０μｇ、特に≦２．５μｇ、好ましくは≦１．０μｇとしてよいことを特徴とする、請求項１ないし３０のいずれか１項記載の方法。
【請求項３２】
請求項１または３のステップａ）による培養出発物質に補因子もしくは補酵素が添加されることを特徴とする、請求項１ないし３１のいずれか１項記載の方法。
【請求項３３】
培養出発物質にＮＡＤＰＨが添加されることを特徴とする、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
培養出発物質にカルモジュリン、Ｃａ２＋、テトラヒドロビオプテリン、ＦＡＤおよび／またはＦＭＮが添加されることを特徴とする、請求項３２または３３記載の方法。
【請求項３５】
培養出発物質にＮＡＤＰＨおよびＣａ２＋が添加されることを特徴とする、請求項２９または３０のいずれか１項記載の方法。
【請求項３６】
ステップ（ａ）（請求項１または３に記載したように）による培養出発物質が緩衝液中に培養培地として混成されることを特徴とする、請求項１ないし３５のいずれか１項記載の方法。
【請求項３７】
インキュベーションがステップ（ａ）（請求項１または３に記載したように）で室温、３７℃、２５℃、１０℃または４℃、好ましくは室温で行われることを特徴とする、請求項１ないし３６のいずれか１項記載の方法。
【請求項３８】
ステップ（ｂ）（請求項１または３に記載したように）による分離がステップ（ａ）によるインキュベーションの開始後１〜６００分、特に３〜１２０分、好ましくは５分〜６０分で行われることを特徴とする、請求項１ないし３７のいずれか１項記載の方法。
【請求項３９】
ＨＴＳ（ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）に好適であることを特徴とする、請求項１ないし３８のいずれか１項記載の方法。
【請求項４０】
方法が、「信号対騒音比」（ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−ｎｏｉｓｅ−ｒａｔｉｏ）≧４、特に≧５、好ましくは≧６または≧１０を有することを特徴とする、請求項１ないし３９のいずれか１項記載の方法。
【請求項４１】
化学反応がＮＯＳの参加下に行われる方法における陽イオン交換フィルタープレート膜の使用。
【請求項４２】
ＮＯシンターゼの活性化の測定および／またはＮＯシンターゼ・モジュレーター、特にアクチベーターまたはインヒビターの識別の方法が利用されることを特徴とする、請求項４１記載の使用。
【請求項４３】
請求項１ないし４０のいずれか１項記載の方法であることを特徴とする、請求項４２記載の使用。
【請求項４４】
方法がＨＴＳ（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ−ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）の枠内の方法であることを特徴とする、請求項４１ないし４３のいずれか１項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＮＯシンターゼの活性化の測定方法、ＮＯシンターゼ・モジュレーターの識別、特にＨＴＳ（ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）に使用するための対応する方法、および対応する陽イオン交換フィルタープレート膜の使用に関する。
【０００２】
１００年以上前からニトログリセリンを冠状動脈心疾患の治療に使用することが公知の医学知識に属している。しかしようやく１５年前に、この効果が酸化窒素（ＮＯ）の形成に還元されることが明らかになった。それ以来この分子の重要性は絶えず増加する出版物の数から読み取ることができる。そのため特に薬理学の観点において、ＮＯの合成方法と、特に調節化合物のＮＯ合成の発見が大きな重要性をもっている。
【０００３】
ＮＯはＮＯシンターゼ（ＥＣ：１．１４．１３．３９）によって形成される（以下、時々ＮＯＳと略す）。このＮＯシンターゼはＬアルギニンからＬシトルリンへの酸化と、ＮＧヒドロキシアルギニンを介してＮＯを触媒する。ＮＯシンターゼはモノマー形態において１２５および１５５ｋＤａの間の分子量を有するが、ホモ二量体としてのみ活性がある。ＮＯシンターゼの分子構造は強くシトクロムＰ４５０レダクターゼの分子量に類似する。ＮＯシンターゼの様々な種類が公知である：
・サイトカインまたはＬＰＳによって誘導可能のＮＯＳ＝ｉＮＯＳおよび
・Ｃａ２＋によって活性化された構成性ｃＮＯＳ。これはさらに次の下位形態に分けられる：
−内皮性ＮＯＳ＝ｅＮＯＳ
−神経性ＮＯＳ＝ｎＮＯＳ。
【０００４】
文献中に、公知のＮＯＳイソ酵素の活性化をどのように同定できるかについて多数の例がある。
【０００５】
最も良く知られているものは次の方法である。
１．）カラムクロマトグラフィーによる最終生成物シトルリンの分離
【０００６】
【化１】
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酵素出発物質は反応の終了後に別々の陽イオン交換体カラムを介して与えられる。その後、［３Ｈ］Ｌシトルリンの溶離と、βカウンターでの溶離物の同定とを行う。この方法の欠点は、酵素出発物質あたり別々のカラムクロマトグラフィーを実施する必要があることである（たとえば９６穴マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）あたり９６クロマトグラフィーカラムを必要とする）。次による方法：Ｄ．Ｓ．ＢｒｅｄｔおよびＳ．Ｈ．Ｓｎｙｄｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７，６８２（１９９０）
２．）「グリース試薬」によるＮＯ２同定
ＬシトルリンのほかにＮＯＳ反応時（反応１．）参照）にＮＯも最終生成物として発生するが、これは不安定であり、そのため引き続き反応する：
【０００７】
【化２】
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発生したＮＯ３−はＮＯ２−に還元されなければならない。これはカドミウムを用いてまたは酵素的に硝酸レダクターゼの添加によって行ってよい。ＮＯＳ出発物質からの余剰ＮＡＤＰＨはＮＯ２−とのグリース反応を妨害するので、この還元等価物は除去されなければならない。これは酵素的に、乳酸デヒドロゲナーゼ／ピルビン酸塩が付加されることによって行ってよい。グリース試薬（１％スルファニルアミド；０．１％ナフチレンジアミン−ジヒドロクロリド；５％Ｈ３ＰＯ４）の添加後、５４３ｎｍで同定することができる紫色のＡＺＯ色素が生成する。
【０００８】
グリース反応は次のように進行する：
【０００９】
【化３】
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文献：Ｌ．Ｃ．Ｇｒｅｅｎ，Ｄ．Ａ．Ｗａｇｎｅｒ，Ｊ．Ｇｉｏｇｏｗｓｋｉ，Ｐ．Ｌ．Ｓｋｉｐｐｅｒ，Ｊ．Ｓ．Ｗｉｓｃｈｎｏｋ，Ｓ．Ｒ．Ｔａｎｎｅｎｂａｕｍ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２６，１３１（１９８２）
この測定方法の欠点は、ＮＯＳ活性化の同定のために、分離して順次実施する必要がある複数の反応ステップが必要になることである。
３．）化学発光測定：
ＮＯＳ反応時にＬシトルリンのほかに発生したＮＯは、ＮＯ２−およびＮＯ３−に反応する（反応２）参照）。しかし化学発光測定のために、ＮＯ２−およびＮＯ３−はＮＯに還元されなければならない。次いでオゾンとの反応が実施される：
【００１０】
【化４】
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文献：Ｓ．Ａｒｃｈｅｒ，ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ７，３４９（１９９３）
この方法の欠点は、一方でこの場合も複数の反応ステップが有り、他方でオゾンが反応に対し低い半減値のために割高に直接製造する必要があることである。
４．）ＮＯにより刺激可能のグアニル酸環化酵素によるｃＧＭＰの同定
この場合はｃＧＭＰの量からグアニル酸環化酵素の活性化が推論される。グアニル酸環化酵素はＮＯによって活性化されるので、このように生成したＮＯの量、ＮＯＳの活性化を逆推論することができる。
文献：Ｍ．Ｆｅｅｌｉｓｃｈ、Ｅ：ａ：Ｎｏａｃｋ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ。１３９、１９（１９８７）  Ｍａｙｅｒ，Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｈｕｍｂｅｒｔ、Ｂｏｅｈｍｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｓ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎ．１６４，６７８  （１９８９）
この方法の欠点は、これがカップリング酵素反応であることである。カップリング酵素反応が初期速度の測定を多くの場合可能にしないことを除き、反応速度の正確な線形同定のために基質が酵素の飽和領域の濃度で存在しなければならない（〜１００Ｋｍ）。これは多大なコスト要因となりうる。この反応時に、常法によりグアニル酸環化酵素の活性化がまずカップリング反応中に形成されたＮＯによって刺激されるので、前記グアニル酸環化酵素の活性化も一定ではない。
【００１１】
最近の製薬研究において厖大な数の測定を最短時間内で実施する必要性、特に多量の異なる物質類、いわゆるライブラリーを個々の興味のある物質類に及ぼす可能な生理学的作用について調査する必要性に基づき、いわゆるＨＴＳ法（Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ−Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ−Ｖｅｒｆａｈｒｅｎ）が実施される。この場合、自動化可能の、可能な限り簡単かつ迅速な方法ステップであり、そのため特に簡単に自動化可能の最小限の方法ステップと、手動の中間ステップなしに済む試験方法が使用される。ただ１つの諾否回答を提供する必要がある「粗略な方法」で充分である。その限りにおいて測定は必ずしも酵素反応の線形初期速度の領域に維持する必要がない。等分した部分量の抽出のような時間を浪費する操作、カップリング（酵素）反応による別のインキュベーション、自動化できない遠心分離ステップ等々は、ＨＴＳ運転に対し初めから除外される。しかし同時にこの試験は結果において信頼性がなければならない。従ってＨＴＳ経過の実施のためにアッセイの精度が決定的な重要性をもつ。即ち「信号対雑音比」（ｓｉｇｎａｌ  ｔｏ  ｎｏｉｓｅ  ｒａｔｉｏ）は、証明の精度が、さらに高い物質スループットに対立する２倍、３倍またはその上４倍の同定を受け入れる必要をなくすために、可能な限り高くされるべきである。
【００１２】
しかし上記の全ての反応１）〜４）は、ここでカップリング酵素反応、等分の部分の抽出、遠心分離ステップ、カラムクロマトグラフィーによる分離切断等がハイスループット・スクリーニングに対立するので、ＨＴＳ両立性が無い。必要な精度を達成するための時間もしくは方法ステップの費用は、ＨＴＳ法にとり多大であり、これらの方法は広範囲に自動化することができない。
【００１３】
従って本発明の課題は、ＮＯシンターゼの活性化を測定するための簡略化した方法、特にＮＯシンターゼ・モジュレーターの識別方法も開発することであった。特にこの方法は、ＨＴＳ、Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ−Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇに使用できるべきである。
【００１４】
この課題は、（ａ）反応容器中の基質として標識されたアルギニンによるＮＯシンターゼをインキュベーションする方法ステップと、
（ｂ）シトルリンの濃度が上昇する時点で、場合により酵素反応の生成物として発生した標識されたシトルリンから標識されたアルギニンを分離する方法ステップと、
（ｃ）それぞれ分離されたアルギニンの量を測定する方法ステップとを備えたＮＯシンターゼの活性化の測定方法において、
分離がフィルタープレート膜を介して行われる前記方法によって解決される。
【００１５】
この場合、本発明の意味において以下のように理解する：
・「インキュベーション」：培地中に場合により、たとえば酵素基質のような別の化合物が添加される、または添加された前記培地中への生物学的オブジェクト（ｏｂｊｅｃｔ）、ここでは酵素、ＮＯＳの取込みおよび放置。この場合一定の効果、ここでは酵素反応、アルギニンからシトルリンおよびＮＯへのＮＯＳにより触媒された変換の進行を達成するために好適な（大抵は生理学的に近い）条件が選ばれる。これらの条件は、たとえば温度、ｐＨ、補酵素もしくは補因子および／または反応時間等のコントロールによって達成される。
・「反応容器」：この用語のもとに容器中で化学反応がコントロール条件下に、しかしまた結合または別の物理力に基づく分離も進行してよい前記容器が理解され、たとえばエッペンドルフカップ、培養シャーレまたは培養ボトル、試薬ガラス、遠心分離管またはマイクロタイタープレートの「ウェル」である。この場合、反応容器は選択的に透過性の膜によって区画に分割してもよく、および／または特に強制的に容器の下側でも液体非透過性に密閉する必要がない。それにより反応容器が一方の側（多くは下側）でも選択的に透過性の膜、たとえばフィルタープレート膜によって密閉した小型カラムまたはマイクロタイタープレートとしてもよい。反応容器中で、インキュベーション（ステップａ））と、好ましくは分離（ステップｂ））も行われる。
・「分離」：この用語によりシトルリンからのアルギニンの局所的分離が意味されており、その結果−両方の物質を均一に一定の比率で含有する培養出発物質と異なり−別々の領域が生じ、一方の領域でアルギニンがほぼ完全に濃縮され、シトルリンが前記濃度に対する比率でほぼ完全に消滅し、他方の領域ではその逆に挙動する。分離は、たとえば物理的に大型−もしくは分子量フィルターを介して、帯電（陽イオン交換体、クロマトグラフィーまたは電圧の印加による）を介して、またはたとえば遠心分離によって行ってよい。本発明の場合において分離は、フィルタープレート膜を介して行われる。
・「標識された」：用語「標識」のもとに、たとえば測定信号を発生する（たとえば蛍光；発光、金属イオン）ことを介助する別の分子への結合による分子の可測性、または前記合成時の放射性原子の使用（放射性標識）による可測性が理解される。
・「シトルリンの濃度が上昇する時点」：この用語により反応がまだ生成物シトルリンの方向へ進行する時点、つまり最終点に達していない時点が意味されている。
・「測定」：用語「測定」のもとに、この意味において好適な装置によって標識された物質の定量が理解されている。
・「フィルタープレート膜」：これは平膜である。つまり液体を濾過する、つまり液体の特定の内容物質を保持することができる一定の透過性の境界面である。
【００１６】
ここで方法としてフィルタープレート膜の使用による基質および最終生成物の間の分離が選択され、簡単な濾過ステップによって個々の溶離画分を捕獲する必要なしに基質および最終生成物の間の定量的分別が行われる。この単純な「濾過ステップ」によって高い精度が得られ、２倍または３倍の同定が余分になる。初めてこのフィルタープレート膜の導入が、たとえばＨＴＳにおける、しかしまた全く一般的にＮＯＳ活性化の簡単な、複雑でない同定のために前記方法の成功裡の使用を可能にする。基質として特に有利であるのは、標識されたＬシトルリンであり、これは特に一生成物としてＬシトルリンの形成をもたらす。
【００１７】
さらに先行技術の評価において第１番のもとに記載した「カラムクロマトグラフィーによる最終生成物シトルリンの分離」、およびこの観点においても本発明による方法がその簡単な構成にもかかわらず精密かつ有効である本発明の方法によって、定性的に驚くべきことにＢｒｅｄｔおよびＳｎｙｄｅｒ（１９９０）による費用のかかる標準方法と充分に競合できるＢｒｅｄｔおよびＳｎｙｄｅｒ（１９９０）による方法による種々の公知のＮＯＳインヒビターのＩＣ５０値同定の比較をもたらした。
【００１８】
反応容器の少なくとも１つの中でステップ（ａ）の培養出発物質に物質が添加され、それに基づいて前記物質がＮＯシンターゼのモジュレーター、特にアクチベーターまたはインヒビターで、好ましくはインヒビターであるか否かが検査されるべきであるように方法が実施される場合、特に有利である。それによりスクリーニング・アッセイにより物質が生理学的効果について調査される前記スクリーニング・アッセイにおける使用が含まれる。この場合、用語「モジュレーター」のもとに、挙動−ここではＮＯＳ−に影響を及ぼす分子が特に増大した活性化（アクチベーター）または低下した活性化（インヒビター）ないし完全に阻害するまでに至ることが理解される。
【００１９】
特にまた本発明の目的は、
（ａ）反応容器中のＮＯシンターゼおよび標識されたアルギニンによる好適な条件下に被験物質をインキュベーションする方法ステップと、
（ｂ）シトルリンの濃度が上昇する時点で、場合により酵素反応の生成物として発生した標識されたシトルリンから標識されたアルギニンを分離する方法ステップと、
（ｃ）それぞれ分離されたアルギニンの量を測定する方法ステップとを備えたＮＯシンターゼ・モジュレーターの識別方法において、
分離がフィルタープレート膜を介して行われる前記方法である。
【００２０】
この場合、用語「被験物質」のもとに、特にＮＯＳ活性化に及ぼす低分子化合物の作用が調査されるべき前記低分子化合物が理解されている。
【００２１】
この目的は、それにより特にスクリーニング法により、たとえばライブラリーからＮＯＳのモジュレーターと共に潜在的に薬理学的に興味のある化合物である物質を識別できる前記スクリーニング法である。この場合、用語「被験物質」のもとに、特にＮＯＳ活性化に及ぼす低分子化合物の作用が調査されるべき前記低分子化合物が理解される。この場合、ＮＯシンターゼのアクチベーターまたはインヒビター、好ましくはインヒビターの識別方法が利用される場合、特に有利である。
【００２２】
さらに本発明による方法の有利な一実施形態において反応容器からステップ（ｂ）による分離時に培養培地が除去される。用語「培養培地」により、培地中でステップ（ａ）によるインキュベーションが実施され、かつ前記培地中で基質（標識されたアルギニン）、ＮＯＳ、発生した生成物（つまり標識されたシトルリンおよびＮＯ）およびその二次生成物ならびに補酵素もしくは補因子が溶解され、かつ前記培地が前記の溶解された物質または場合により懸濁された物質が一緒にステップ（ａ）による培養出発物質を形成する前記培地が意味されている。この場合、培養培地が広範囲に、特にほぼ完全に、好ましくは完全に除去される場合、特に有利である。それにより特にフィルタープレート膜を介した除去も意味されており、用語「広範囲に」とは、まだ培地の少量の滴量のみが残留することを意味し、用語「ほぼ完全に」とは、フィルタープレート膜が少量の培養培地の量を含有することを意味し、用語「完全に」とは培地がフィルタープレート膜からの洗出または乾燥によるかのいずれかで除去されたことを意味する。さらに培養培地の除去時に標識されたアルギニンが培養培地から分離されることが有利である。本発明の意味における用語「二次生成物」のもとに、生成物から由来する別の生成物、たとえば特にＮＯ２−またはＮＯ３−が理解されている。補酵素は低分子の非タンパク質化合物であり、これは一過性および緩く酵素に結合する補基質、たとえばＮＡＤＰＨとして必要とされる。補因子は低分子物質の存在が酵素反応のために必要であり、または必要としてよい前記低分子物質のための集合名称である。たとえば、Ｃａ２＋、カルモジュリンである。
【００２３】
ステップ（ｂ）による分離との関連性で、さらにステップ（ｂ）による分離時に付加的に補因子もしくは補酵素、ＮＯシンターゼ、ＮＯおよび二次生成物および／またはＮＯシンターゼが標識されたアルギニンから分離される場合に有利である。それによりステップ（ａ）による培養出発物質中の培養培地に添加される物質の基質を除く分離が意味されている。前記物質類は多くが水溶性であるので、これは主に培養培地の除去と共に共沈する。
【００２４】
フィルタープレート膜に関して、本方法で使用されたフィルタープレート膜が陽イオン交換体である場合、特に有利である。陽イオン交換体は、液体からの外部陽イオンの交換中の等価量を吸収する物質である。フィルタープレート膜は、さらに有利には紙フィルターまたは織物フィルターとしてよく、またはその他の多孔性または打抜き固形状物質、たとえば金属、ガラスまたはセラミックからなり、または前記物質類を含有してよい。前者の用語のもとに紙または織物を基材とするフィルターが理解されている。後者の用語のもとに、たとえば非被覆のまたは、たとえばゲルまたは樹脂で被覆した金属箔ふるい（−フィルター）または粘土もしくはガラスフィルターが意味されている。さらに、陽イオン交換のために官能基がフィルタープレート膜に固定されている場合も有利である。この場合、官能基は陰性基であり、これは陽イオンのための結合箇所として利用され、担体に、ここではフィルタープレート膜に結合、たとえば共有結合しており、しかし場合により強いイオン結合を介しても結合されている。
【００２５】
本発明による方法で使用した陽イオン交換体フィルタープレート膜の中に使用される有利な官能基は、ホスフェート基、カーボネート基、ホスホネート基、サルフェート基および／またはスルホネート基、好ましくはホスフェート基である。
【００２６】
この場合、フィルタープレート膜が、紙フィルターである場合、特に厚さ１０．００ｍｍ〜０．１０ｍｍ、好ましくは１．００ｍｍ〜０．１５ｍｍ、特に０．５０ｍｍ〜０．２０ｍｍ、好ましくは０．２３ｍｍを有する。さらに、フィルタープレート膜が交換容量≧１．０μＥｑ．／ｃｍ２、特に≧１０．０μＥｑ．／ｃｍ２、好ましくは≧１８．０μＥｑ．／ｃｍ２を有する陽イオン交換体である場合も有利である。この場合、前記フィルタープレートは流量速度＞１００ｍｍ／３０分、好ましくは１２５ｍｍ／３０分を有してよい。
【００２７】
本発明による方法の特に有利な一実施形態において、ステップ（ａ）は平行に複数の反応容器中でほぼ同時に、好ましくは同時に、および／またはステップ（ｂ）は平行に複数の反応容器中でほぼ同時に、好ましくは同時に、特にステップ（ａ）におけるインキュベーション開始および／またはステップ（ｂ）による分離の開始を基準にして行われる。この場合、反応容器が繋がっており、特にマイクロタイタープレートのウェルであることが特に有利である。この場合、用語「ウェル」のもとに、マイクロタイタープレート中の培養出発物質または試料を収容する凹所が理解されている。本発明による方法に使用してよいマイクロタイタープレートとして、特に＜９６「ウェル」、好ましくは２４または４８「ウェル」、または≧９６「ウェル」、特に９６、３８４、８６４または１５３６「ウェル」を有するようなマイクロタイタープレートが好適である。
【００２８】
さらに、本発明による方法に使用されたステップ（ａ）および／またはステップ（ｂ）のための反応容器は、収容容積≦２ｍｌ、特に≦１ｍｌ、好ましくは≦１ｍｌ、≦８００μｌ、≦３５０μｌ、≦３００μｌ、≦２５０μｌ、≦２００μｌ、≦１５０μｌ、≦１００μｌ、≦５０μｌ、≦３０μｌまたは≦５μｌを有する場合に有利である。
【００２９】
本発明による方法の特に有利な一実施形態において、ステップ（ｂ）による分離はフィルタープレート膜によるステップ（ａ）からの培養培地の吸引によって行われる。この場合、負圧がフィルタープレート膜の培養出発物質に離間した側に印加される。用語「培養培地」により、培地中でステップ（ａ）によるインキュベーションが行われ、前記培地中に基質、ＮＯＳ、生成物および二次生成物ならびに補酵素もしくは補因子が溶解された前記培地が意味されている。本発明による方法のもう１つの、特に有利な実施形態において、ステップ（ｂ）による分離後に標識されたアルギニンから分離された標識されたシトルリンを含有する画分が投棄される。この場合、用語「画分」により分離前に存在する培養出発物質の部分量が意味されており、この場合には特定の溶解成分を含む培養培地が意味されている。ここで、これは培地中に培養出発物質の標識されたシトルリンが広範囲に完全に、原初の培養出発物質の標識されたアルギニンが（ほぼ）もはや存在しない前記培地の部分である。まさにこの両方の最後の実施形態が試験の取扱いおよび自動化をさらに著しく軽減し、該試験を特にＨＴＳのために好適にする。
【００３０】
もう１つの有利な本発明による方法において、ステップ（ｂ）による分離後に分離された基質は、フィルタープレート膜上またはその中に存在し、好ましくは結合している。
【００３１】
標識が、放射能、蛍光、発光またはスペクトル変化もしくは色変化を介して基質の測定を可能にする場合、特に有利である。特に有利な実施形態において、シンチレーションカウンターでの基質の測定はフィルタープレート膜上へのシンチレーション液の添加後に行われる。これにより特に、ステップ（ｂ）による分離後の特に有利な方法ステップにおいて標識されたアルギニンが存在するフィルタープレート膜が個別的または全体のいずれかとして複数のフィルタープレート膜を包含するマイクロタイタープレートが、たとえば乾燥箱中で乾燥されることが意味されている。マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）は、それに続き裏面が封印され、それに対し個々のフィルター膜がシンチレーション容器の中へ移行される。次にフィルター膜がシンチレーション液を注入されて、密閉（ＭＴＰ前面が封印）され、カウンター、シンチレーションカウンターによって計数される。
【００３２】
方法のもう１つの変形体において、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）は同じ反応容器の中で行われない。またこの変形体は特に良好にＨＴＳに好適である。これにより特に、ステップ（ａ）による培養出発物質が、たとえばフィルタープレート膜を含有し、ステップ（ｂ）で行われる別の容器中へ移されることが意味されている。たとえば平行に培養出発物質がマイクロタイタープレートから別のマイクロタイタープレートの中へ移され、前記マイクロタイタープレートのウェルがフィルタープレート膜の底部で、たとえば陽イオン交換体の形態で有し、これが液体透過性ふるいによって固定される。ここで次に、たとえば分離はフィルタープレート膜の下側の負圧の印加を介して行ってよく、培養培地がたとえば標識されたシトルリンと一緒に吸引され、標識されたアルギニンがフィルタープレート膜上またはその中でウェルの底部に残留する。
【００３３】
本発明による方法のもう１つの特に興味のある変形体は、ステップ（ｂ）による分離後に洗浄ステップが好ましくは≦３回、特に１回、好ましくは水または緩衝液で、特に体積≦１０ｍｌ、特に≦５ｍｌ、好ましくは≦３ｍｌ、特に≦２ｍｌで行われることを考慮する。洗浄液の体積は（ステップａ）により分離された（ステップｂ）あたり、つまり好ましくは反応容器あたり培養出発物質の量に関係する。またこれはＨＴＳでの使用を改善し、特に試験のより大きな精度を許容することができる。この場合、洗浄容積は、洗浄液の添加と平行に前記洗浄液が再び、たとえば吸引によって除去される場合、反応容器の容積より明らかに高くしてよい。これがその場合でないときは、洗浄画分の容積は、好ましくは反応容器中でステップ（ｂ）が実施される前記反応容器の最大の容積に相当する。
【００３４】
本方法の有利な一実施形態は、ＮＯシンターゼとして組換えＮＯシンターゼが使用されることを考慮しており、このＮＯシンターゼは特に亜型特異的であり、好ましくは、ヒト−、ラット−またはマウス特異的なｅＮＯＳ、ｉＮＯＳまたはｎＮＯＳ、特にまたα−もしくはβ−ｎＮＯＳである。この場合、用語「組換えＮＯＳ」のもとに、遺伝子技術的操作の使用下に製造されたＮＯＳが理解されている。たとえばクローンＮＯＳ遺伝子の配列から出発して組換えＤＮＡ構造物、たとえばクローニング−または改変された発現ベクターが構成される。それにより次に細胞が形質転換（ｔｒａｎｓｆｉｚｉｅｒｔ）され、それに続きこの細胞が特別の培養条件下に遺伝子を発現し、タンパク質、組換えＮＯＳが形成される。
−（組換え）ＤＮＡ構造物：これはＤＮＡ分子のインビトロ結合によって生成されたＤＮＡ分子の各種類の一般的名称を表す。
−クローニングベクター：これはクローニングにおいて外部遺伝子または前記遺伝子の部分の担体として利用される核酸分子の一般的名称を表す。
−発現ベクター：好適な宿主細胞への取込み後にベクター中にクローニングされた外部遺伝子の転写および翻訳を可能にする特異的に構成されたクローニングベクターの名称を表す。
【００３５】
しかし本発明による方法で使用したＮＯシンターゼは、脊椎動物組織、好ましくは哺乳類動物組織からの粗抽出物の部分（以下、時々「ＮＯＳ粗抽出物」と呼ぶ）である場合、特に有利である。この場合、粗抽出物は齧歯類動物から、および／またはＺＮＳから得てよく、および／または前記粗抽出物はホモジネートから得た上澄みとしてよく、特にラット−またはマウス小脳からのホモジネートの上澄みとしてよい。この場合、齧歯類動物の、好ましくはラットまたはマウスのＺＮＳ（中枢神経系）から組織、好ましくは小脳が摘出され、前記小脳がホモジェナイズされ、遠心分離され、上澄みが神経性ＮＯＳ粗抽出物として使用される。対応する製造方法の一例は、以下の例の中に見い出される。
【００３６】
さらに、ステップ（ａ）による方法において培養出発物質に使用したタンパク質量はステップ（ｂ）で使用したフィルタープレート膜ｍｍ２あたり最大≦５．０μｇ、特に≦２．５μｇ、好ましくは≦１．０μｇとしてよいことが有利である。前記タンパク質量は経験値であり、その値の上方ではフィルタープレート膜が分離時に、特に吸引時に目詰まりしうる。
【００３７】
洗浄されたＮＯＳ（たとえば組換え酵素も含む）は、基質および補酵素ＮＡＤＰＨのほかに、さらにテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）、ＦＡＤ、ＦＭＮ、カルモジュリン（ＣａＭ）およびＣａ＋＋のようなその他の補酵素／補因子を必要とする（Ａ．Ｊ．Ｈｏｂｂｓ，Ａ．Ｈｉｇｇｓ，Ｓ．Ｍｏｎｃａｄａ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３９，１９１，１９９９）。従って第一に、本発明による方法においてステップａ）による培養出発物質に補因子もしくは補酵素および／またはＮＡＤＰＨが付加される場合に有利である。特に培養出発物質にカルモジュリン、Ｃａ２＋、テトラヒドロビオプテリン、ＦＡＤおよび／またはＦＭＮを付加してよい。
【００３８】
ＨＴＳ運転開始時の費用を可能な限り少なく維持するために、別法として上述のＮＯＳ粗抽出物を用いて処理してもよく、上記補酵素の大部分の添加を省いてよい。即ち、上記神経性ＮＯＳ粗抽出物の使用時にＢＨ４、ＣａＭ、ＦＡＤおよびＦＭＮの使用を省いてもよい。従って上記ＮＯＳ粗抽出物の使用時に培養出発物質にＮＡＤＰＨおよびＣａ２＋を、特に唯一の補因子もしくは補酵素として付加される場合、特に有利である。まさにこの変形体は特に費用的に有利である。
【００３９】
さらに本発明による方法において、培養出発物質が緩衝液中に培養培地として混成され、同様に、インキュベーションがステップ（ａ）で室温、３７℃、２５℃、１０℃または４℃、好ましくは室温で行われることが有利である。
【００４０】
さらに、ステップ（ｂ）による分離がステップ（ａ）によるインキュベーションの開始後１〜６００分、特に３〜１２０分、好ましくは５分〜６０分で行われる場合、特に有利である。前記時間は特に使用したＮＯＳの活性化に依存する。
【００４１】
本発明による方法の特に有利な形態は、ＨＴＳ（Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ−Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）に好適であり、即ち特に簡単、再現可能および良好に自動化も可能である。
【００４２】
試験方法（アッセイ）の品質、特にＨＴＳのための重要な基準は、「信号対騒音比」（ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−ｎｏｉｓｅ−ｒａｔｉｏ）、低い測定信号と平均背景騒音（信号なし）との間の比である。そこで特に大きい比が目指されるべきである。これは本発明による方法に該当する。これは、特に有利な実施形態において、「信号対騒音比」が≧４、特に≧５、好ましくは≧６または≧１０を示す。
【００４３】
本発明のもう１つの目的は、化学反応がＮＯＳの参加下に行われる方法における陽イオン交換フィルタープレート膜の使用である。それによって特に、たとえばアルギニンの酵素変換が意味されており、しかしまたＮＯＳが酵素として参加してよいその他の反応も意味している。
【００４４】
この場合、ＮＯシンターゼの活性化の測定および／またはＮＯシンターゼ・モジュレーターの識別の方法、特にアクチベーターまたはインヒビターが利用される場合、特に本発明による方法である場合、全く特に方法がＨＴＳ（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ−ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）の枠内の方法である場合、特に有利である。
【００４５】
以下の例および図によって本発明を説明するが、本発明はこれによって限定されない。
【００４６】
（図および例）
図
図１は、例４によるスクリーニング・アッセイのグラフに作成した結果であり、表３に相当する。この場合、ｘ軸およびｙ軸は９６穴マイクロタイタープレートの文字数字の区分に相当し、ｚ軸は測定した「毎分補正計数（ｃｃｐｍ）」（ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｕｎｔｓ  ｐｅｒ  ｍｉｎｕｔｅ）、零値および急冷係数分（Ｑｕｅｎｃｈｆａｋｔｏｒ）だけ補正して計数器で計数した毎分放射性崩壊に相当する。尚、図中の「Ｒｅｉｈｅ」は“系列”を意味する。
【００４７】
例１：
ＨＴＳ−ＮＯＳアッセイの一般処理法
ＨＴＳ−ＮＯＳアッセイにおいて放射性アルギニンが基質として利用される。アッセイ容積は、それぞれのマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）に応じて２５μｌおよび２５０μｌの間の範囲で選択してよい。使用した酵素源との依存性で、補因子および補酵素が添加される。ステップ（ａ）による前記マイクロタイタープレート（アッセイＭＴＰ）中の出発物質のインキュベーションは室温で行われ、それぞれ使用した酵素活性（ユニット）に応じて５分および６０分の間にある。インキュベーション（ステップ（ａ））の終了時に、プレートが、陽イオン交換体膜をフィルター底部として有するＭＴＰを装着した細胞採取器の中に配置される（フィルターＭＴＰ）。アッセイＭＴＰの全ての出発物質がこのフィルターＭＴＰの中に移され、陽イオン交換体フィルタープレート、ホスフェート基を負荷した紙フィルターを介して吸引される。フィルターＭＴＰはそれに続き緩衝液または水で洗浄される。この方式によって残留する基質アルギニンが陽イオン交換体上で結合し、他方酵素的に結合した放射性シトルリンが定量的に洗出される。フィルターＭＴＰの乾燥およびシンチレーション液の添加後、結合したアルギニンをシンチレーション計数器で計数することができる。阻害されないＮＯＳ反応が低い放射能に反映される。阻害された酵素反応は、放射性アルギニンが変換されていないことを意味する。即ちフィルター上に高い放射能がある。
【００４８】
アッセイは非常に低い基質濃度で行ってよい（たとえば５０ｎＭ）。またこの条件下に「信号対騒音比」はまだ６以上である。より高い基質濃度の使用時に、１０以上の比率を達成することができる。この極端に簡単な方法（アッセイＭＴＰの内容物は陽イオン交換体を含有するフィルタープレートを介してのみ吸引され（フィルターＭＴＰ中）、次いでその放射能が測定される）に制約されて、それぞれ既存のＨＴＳ装置に応じてライブラリーの数十万の化合物を僅か数日以内にスクリーニングすることができる。
【００４９】
例２：
使用した材料の例
−アルギニン、Ｌ−［２，３，４−３Ｈ］−モノヒドロクロリド；注文番号ＮＥＴ−１１２３、ＮＥＮ社
−Ｃａｃｌ２無水；注文番号２３８８、１０００；Ｍｅｒｃｋ社
−１，４−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、注文番号７０８９８４；ＲＯＣＨＥ社
−Ｎａ２ＥＤＴＡ−ジヒドラート；注文番号０３６８０；ＦＬＵＫＡ社
−ＨＥＰＥＳ、注文番号Ｈ−３３７５；ＳＩＧＭＡ社
−ＮＡＤＰＨ、テトラソジウム塩；注文番号１５８５３６３；ＲＯＣＨＥ社
−ＴＲＩＳ；注文番号９３３４９；ＦＬＵＫＡ社
酵素調製緩衝液：１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むトリスＨＣｌ  ５０ｍＭ：緩衝液のｐＨは４℃で７．４に調節される。
インキュベーション緩衝液（培地）；ＥＤＴＡ  １ｍＭを含むＨＥＰＥＳ  ５０ｍＭ：ＣａＣｌ２１．２５ｍＭおよびジチオスレイトール１ｍＭ。
緩衝液のｐＨは２５℃で７．４に調節される。
洗浄培地：Ｈ２Ｏ
例３：
酵素調製
出発組織としてラット小脳を使用する。ラット小脳あたり酵素調製緩衝液１ｍｌ（４℃）を付加する。この動物を麻酔させ、死亡させ、小脳組織、小脳を摘出し、ポリトロン・ホモジェナイザーで１分間６０００ｒｐｍで分解する。
↓
４℃で１５分間２００００ｇで遠心分離
↓
上澄みを傾潟し、−８０℃で部ごとに凍結する（沈殿物を投棄する）。
【００５０】
Ｎｎｏｓ含有の組織上澄みは、この保管条件下で長く安定性があるが、一度だけ解凍し、再び凍結してはならない。
【００５１】
例４：
例１ないし３によるＨＴＳ−ＮＯＳアッセイの例
ａ）培養出発物質（ステップ（ａ））
「ウェル」容量≦２５０μｌを有する９６穴ＭＴＰを使用する。
ピペット採取順序、表１参照：
表１：
【００５２】
【表１】
2004522417.tif 000007
＊Ｏ．Ｈ．Ｌｏｗｒｙら；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３，２６５（１９５１）によるタンパク質同定
Ｉ．Ａ．＝出発物質中
ピペット採取過程の終了後、覆いを前記ＭＴＰ（アッセイＭＴＰ）に載せる。５〜６０分間、それぞれ使用した酵素の量と活性に応じて室温（ＲＴ）に相当する２５℃でインキュベーション。
ｂ）吸引ステップ（ステップ（ｂ））
それに続きアッセイＭＴＰの内容物を、たとえば９６穴細胞採取器を用いて９６穴陽イオン交換体ＭＴＰ（フィルターＭＴＰ）に移し、吸引する。それに続きＨ２Ｏ２００ｍｌ（槽から）で１回だけ洗浄する。
ｃ）測定ステップ（ステップ（ｃ））
次にプレートを１時間６０℃で乾燥箱内で乾燥する。ここでフィルターＭＴＰの底側を下方から正確に「バック・シール」（ｂａｃｋ  ｓｅａｌ）を貼り付ける。その後、ウェルあたり３５μｌシンチレータをピペットで付加する。さらに、ここでプレート上側に「トップ・シール」（ｔｏｐ  ｓｅａｌ）を貼り付ける。待ち時間１ｈ後にプレートをβ−カウンタで測出してよい（測定は、測定シグナルが安定した状態にとどまるので、非常に後から行ってもよい）。
【００５３】
ＨＴＳ運転中に、時間費用がかかる３つの別々のピペット採取を行う必要がないため、培養培地、ＮＡＤＰＨ−および酵素溶液をピペット採取ステップの開始前にまとめておくことが望ましい。アッセイ容積は同じ濃度の場合に縮小してもよい。
【００５４】
例５：
スクリーニング中の例２〜４による方法の使用：
以下を使用した：
表２：
【００５５】
【表２】
2004522417.tif 000008
被験物質：出発物質１×１０−５Ｍ
内部標準：７−ニトロインダゾール、出発物質１×１０−５Ｍ
ＮＡＤＰＨ：出発物質中０．５ｍＭ
［３Ｈ］基質：出発物質中５０ｎＭ
インキュベーション時間：室温で３０分
その他の全ての助変数および方法ステップは上記と同様（例４参照）。
【００５６】
表３は８０物質を試験した実験系列である（位置Ａ２−Ａ１１；Ｂ２−Ｂ１１；Ｃ２−Ｃ１１；Ｄ２−Ｄ１１；Ｅ２−Ｅ１１；Ｆ２−Ｆ１１；Ｇ２−Ｇ１１およびＨ２−Ｈ１１）。この場合、文字数字の区分は９６穴マイクロタイタープレートの区分に対応し、零値および急冷係数分だけ補正して計数器で計数した毎分放射性崩壊を表す「毎分補正計数」ｃｃｐｍが測定される。
【００５７】
完全な出発物質（しかし酵素を含有しない）が１００％［３Ｈ］アルギニン出発含量を表す（「Ｍａｘ」＝位置Ａ１；Ｂ１；Ｃ１；Ａ１２；Ｂ１２；Ｃ１２）。
【００５８】
完全な出発物質（酵素を含む）は、［３Ｈ］アルギニンの含量が分離されたことによって、［３Ｈ］シトルリンおよびＮＯへの収量を表す（「Ｍｉｎ」＝最小［３Ｈ］アルギニン含量＝非阻害酵素反応；位置Ｄ１、Ｅ１；Ｆ１；Ｄ１２；Ｅ１２およびＦ１２）。しかしこれは、その箇所でまだ非調節酵素の場合よりも多いアルギニンが変換され、その結果さらに少ない放射能がフィルター上に残留するので、ＮＯＳアクチベーターの場合に優れているとしてよい。
【００５９】
内部標準（基準）として、ＮＯＳインヒビター７−ニトロインダゾールを濃度１×１０−５Ｍで使用した（「Ｒｅｆ」＝Ｇ１；Ｈ１；Ｇ１２およびＨ１２）。
【００６０】
表３：９６穴マイクロタイタープレート・フォーマットでＮＯＳアッセイ中の８６物質の試験。
【００６１】
【表３】
2004522417.tif 000009
試験した８０化合物のうち３ＮＯＳインヒビターを示す（位置Ａ２；Ｃ２およびＢ７；Ｎ＝１）
基準物質７−ニトロインダゾールの平均値（＝内部標準、出発物質中１×１０−５）は次のとおりである：
＝１２６９７１０５０ｃｃｐｍ（ＳＤ；Ｎ＝４）
この７−ニトロインダゾール濃度は意図的に、前記濃度が約５０％阻害の範囲内にあるように選択した。
【００６２】
「Ｍａｘ」データの平均値（酵素なし、１００％［３Ｈ］アルギニンの基準値）は以下のようになる：
＝１９７４６６０７ｃｃｐｍ（ＳＤ；Ｎ＝６）
「Ｍｉｎ」データの平均値（非阻害酵素反応）は以下の放射能を得る：
＝３１５８３３４ｃｃｐｍ（ＳＤ；Ｎ＝６）
従って全測定区間として本例において１６５８８ｃｃｐｍ（１９７４６〜３１５８ｃｃｐｍ）が提供される。
【００６３】
例６：
本発明による方法による種々の基準物質のＩＣ５０値の測定と、比較におけるＤ．Ｓ．ＢｒｅｄｔおよびＳ．Ｈ．Ｓｎｙｄｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７，６８２（１９９０）によるカラムクロマトグラフィーを利用したシトルリンの常法の測定。
【００６４】
カラムクロマトグラフィーを利用したシトルリンの測定は、Ｄ．Ｓ．ＢｒｅｄｔおよびＳ．Ｈ．Ｓｎｙｄｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７，６８２−６８５（１９９０）の記載に従って実施し、基質［３Ｈ］アルギニンは出発物質中に濃度５０ｎＭで存在し、酵素は、例３に記載したように、ラット小脳から単離したｎＮＯＳであった。精製はカラムクロマトグラフィーを介して行った。
【００６５】
本発明による方式は、例４による方式に相当し、ここでも［３Ｈ］基質、［３Ｈ］アルギニンは出発物質中に濃度５０ｎＭで存在し、酵素は、例３に記載したように、ラット小脳から単離したｎＮＯＳであった。精製は本発明により９６穴陽イオン交換体マイクロタイタープレートを介して行った（ＭＴＰ／フィルターＭＴＰ）。
【００６６】
被験物質として、以下の公知のＮＯＳインヒビターを種々の濃度でＩＣ５０値の同定のために両方の比較試験に使用した：
・７−ニトロインダゾール
・１−（２−トリフルオロメチルフェニル）イミダゾール（＝ＴＲＩＭ）
・ＮＧ−モノメチル−Ｌアルギニン（＝Ｌ−ＮＭＭＡ）
・Ｎ５−（１−イミノ−３−ブテニル）−Ｌ−オルニチン（＝ビニル−Ｌ−ＮＩＯ）
・Ｎ−［３−（アミノメチル）ベンジル］アセトアミジン（＝１４００Ｗ）
・Ｎ５−［イミノ（プロピルアミノ）メチル］−Ｌ−オルニチン（＝Ｎ−Ｐｒ−Ｌ−Ａｒｇ）
この結果は下表４から読み取ることができる。
【００６７】
表４：
【００６８】
【表４】
2004522417.tif 000010
表４から明らかなように、両方の異なる方法で測定したＩＣ５０値は互いに非常に近接し、６個の物質自体で最悪の場合でも単に係数２．４だけ異なるにすぎない。これは、両方の方法がＩＣ５０の同定について完全に等価であり、それによって本発明による方法が、カラムクロマトグラフィーのために非常に多くの費用がかかる公知の標準方法、ＢｒｅｄｔおよびＳｎｙｄｅｒ（１９９０）によるシトルリン方法と定量的に充分匹敵しうるＮＯＳインヒビターの同定のための非常に有効な方法であることの明確な証明である。本発明による方法が非常に簡単であり、有利であり、その上ＨＴＳ能力があるという事実に鑑みて、ここに本発明による方式の大きな長所がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、例４によるスクリーニング・アッセイのグラフに作成した結果を示す。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004522417.tif 000048
【国際調査報告】
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2004522417.tif 000050
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