(57)【要約】【課題】より長いイソプレン側鎖を有するビタミンＫ２を高効率で製造する方法を提供すること。【解決手段】２００５年１２月５日にＤＳＭＺに寄託されたバシラス・サブチリス変異株ＧＮ１３／７２（ＤＳＭ１７７６６）の培養を含む、ビタミンＫ２（ＭＫ−７）の製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）変異株ＧＮ１３／７２（２００５年１２月５日、ＤＳＭＺに寄託；ＤＳＭ１７７６６）を培養する工程を含む、ビタミンＫ２（ＭＫ−７）の製造方法。
【請求項２】
前記培養に使用される炭素源が、デキストリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培養に使用される炭素源が、マルトデキストリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記培養に使用される消泡剤が、大豆油である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記培養により得られるバイオマスが、噴霧乾燥によって乾燥される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記噴霧乾燥によって乾燥された前記バイオマスが、真空下で包装される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
２００５年１２月５日にＤＳＭＺに寄託されたバシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）変異株ＧＮ１３／７２（ＤＳＭ１７７６６）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物を使用するビタミンＫ２（メナキノン（ｍｅｎａｑｕｉｎｏｎｅ）−７：ＭＫ−７）の発酵生産に関する。
【０００２】
本発明は、特定の培養条件下で大量にＭＫ−７を生産することができる、ブダペスト条約の下に寄託された微生物のバシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の突然変異体に関する。
【背景技術】
【０００３】
ビタミンＫは、タンパク質におけるγ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）残基の生成のための必須補助因子である（Ｒ．Ｅ．Ｏｌｓｏｎ（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．４：２８１-３３７、Ｊ．Ｗ．Ｓｕｔｔｉｅ（１９８５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４：４５９-４７７参照）。Ｇｌａ含有タンパク質は、カルシウムイオンに結合し、例えば、血液凝固および組織石灰化に影響を及ぼす（例えば、骨組織に見られるオステオカルシン）（Ｐ．Ｖ．Ｈａｕｓｃｈｋａら（１９７８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：９０６３-９０６８、Ｐ．Ａ．Ｐｒｉｃｅら（１９７６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７３：１４４７-１４５１参照）。ビタミンＫ欠乏症は、新生児の頭蓋内出血（Ｇ．Ｆｅｒｌａｎｄら（１９９３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：１７６１−１７６８、Ｍ．Ｊ．Ｓｈｅａｒｅｒ（１９９５）Ｌａｎｃｅｔ  ３４５：２２９−２３４参照）や骨粗鬆症による骨折（Ｍ．Ｈ．Ｋｎａｐｅｎ（１９８９）Ａｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．１１１：１００１−１００５参照）など、いくつかの臨床的疾患に関与している。
【０００４】
ビタミンＫは、２種の形、すなわち、緑色植物においてＫ１（フィロキノン）、ならびに腸内細菌を含めた動物およびいくつかの細菌においてＫ２（メナキノンＭＫ）として天然に存在する（Ｍ．Ｄ．Ｃｏｌｌｉｎｓら（１９８１）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４５：３１６−３５４、Ｊ．Ｍ．Ｃｏｎｌｙら（１９９２）Ｐｒｏｇ．Ｆｏｏｄ  Ｎｕｔｒ．Ｓｃｉ．１６：３０７−３４３、Ｋ．Ｒａｍｏｔａｒら（１９８４）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５０：２１３−２１８、Ｈ．Ｔａｂｅｒら（１９８０）Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ２  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ．１７７−１８７Ｊ．Ｗ．Ｓｕｔｔｉｅ，Ｅｄ．Ｕｎｉｖ．  Ｐａｒｋ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ、Ｍ．Ｗａｔａｎｕｋｉら（１９７２）Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８：４６９−４７２参照）。ＭＫは、４〜１３個の可変なイソプレン単位の側鎖を有する。これらは、ＭＫ−ηと呼ばれ、η（イータ）は、イソプレノイド残基の数を表す。ＭＫは、細菌の原形質膜の構成要素であり、電子伝達および酸化的リン酸化系における酸化還元剤として機能する（Ｈ．Ｔａｂｅｒ、１９８０年；Ｋ．Ｒａｍｏｔａｒら、１９８４年）。
【０００５】
乳酸菌は、様々な食糧を製造するスターターカルチャーとして使用されており、一般に安全であると見なすことができ（ＧＲＡＳ）、定性的な研究により、いくつかの乳酸菌がＭＫを生産することが示されている。多くの国々で、ビタミンＫの１日の所要量は、体重１ｋｇあたり約１μｇとなっている。
【０００６】
Ｂ．Ｍ．ＲｏｗｌａｎｄおよびＨ．Ｗ．Ｔａｂｅｒ（１９９６年）、Ｂ．Ｒｏｗｌａｎｄら（１９９５年）、Ｈ．Ｗ．Ｔａｂｅｒら（１９８１年）は、バシラス・サブチリスにおけるＭＫ生成のメカニズムを広範囲にわたって研究してきた（Ｂ．Ｍ．ＲｏｗｌａｎｄおよびＨ．Ｗ．Ｔａｂｅｒ（１９９６）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７８：８５４−８６１、Ｂ．Ｒｏｗｌａｎｄら（１９９５）Ｇｅｎｅ  １６７：１０５−１０９、Ｈ．Ｗ．Ｔａｂｅｒら（１９８１）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １４５：３２１−３２７参照）。しかし、バシラス・サブチリスによるＭＫの生産を増加させる研究は、報告されていない。Ｙ．ＴａｎｉおよびＮ．Ｓａｋｕｒａｉ（１９８７年）、Ｙ．ＴａｎｉおよびＨ．Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ（１９８９年）は、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）によるＭＫ−４、ＭＫ−５、およびＭＫ−６の効率的な生産と、生産されたＭＫの最大濃度が１９２ｍｇ／ｌに達したこととを報告した（Ｙ．ＴａｎｉおよびＮ．Ｓａｋｕｒａｉ（１９８７）Ａｇｒｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ５１：２４０９−２４１５、Ｙ．ＴａｎｉおよびＨ．Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ（１９８９）Ｊ  Ｆｅｒｍｅｎｔ  Ｂｉｏｅｎｇ  ６７：１０２−１０６参照）。一方、より長いイソプレン側鎖を有するＭＫの工業的生産は、最近になって初めてＴ．Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら（１９９９年）によって報告された（Ｔ．Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら（１９９９）Ｊ  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ  ８２：１８９７−１９０３参照）。彼らの研究で、２９〜１２３μｇ／ｌのＭＫ−７が、乳酸菌によって生産された。発酵大豆「ナットウ（ｎａｔｔｏ）」は、製造にバシラス・サブチリスが必要であり、日本で有名であり、非常に大量のＭＫ（６００〜９００μｇ／１００ｇ）を含む（Ｔ．Ｓａｋａｎｏら（１９８８）Ｖｉｔａｍｉｎｓ（Ｊａｐａｎ）６２：３９３−３９８参照）。ナットウを製造する上で使用されるバシラス・サブチリスの株は食用なので、それらは食品産業においてＭＫの最も有利な供給源の１つである。
【０００７】
Ｙｏｓｈｉｎｏｒｉ  Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら（２００１年）は、生産力が乾燥重量で１７１９μｇ／１００ｇであるバシラス・サブチリスのアナログ耐性変異株「ナットウ」を回収した。存在する複数の特許または特許出願によれば、それらのうちのいくつかを以下に列挙するが、Ｋ２（ＭＫ−７）は、乾燥重量で１．０μｇ／ｇまたはそれ以下の量で生産される（特許文献１、２、３、４参照）。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００４／０４３０１５号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／００２５７５９号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００２／０１４６７８６号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００１／００４６６９７号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、大量にＭＫ−７を生産する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明にかかる第一の発明は、バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）変異株ＧＮ１３／７２（２００５年１２月５日、ＤＳＭＺに寄託；ＤＳＭ１７７６６）の培養を含む、ビタミンＫ２（ＭＫ−７）の製造方法である。
【００１０】
本発明にかかる第二の発明は、２００５年１２月５日にＤＳＭＺに寄託されたバシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）変異株ＧＮ１３／７２（ＤＳＭ１７７６６）である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
今回、バシラス・サブチリスの変異株が、１６０〜２００時間、より正確には１７０〜１８５時間の生産サイクル（事前播種から発酵まで）で、乾物で１，０００〜２５，０００ｐｐｍの範囲の生産力を有することが分かり、これは本発明の目的である。バシラス・サチリス変異体ＧＮ１３／７２は、ＮＴＧあるいはＵ．Ｖ．で処理することによって得られ、微粉化大豆ミール固形培地上で回収された。
【００１２】
この株を、２００５年１２月５日に受託番号ＤＳＭ１７７６６としてドイツの特許微生物寄託機関であるＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）にブダペスト条約の条件の下に寄託した。
【００１３】
ＭＫ−７の高含有量バイオマスを、炭素源（グルコース、ショ糖、グリセロール、デンプン加水分解物など）、窒素源（酵母エキス、自己分解物質、様々な起源のペプトン、大豆ミールなど）、様々な塩（リン酸カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛など）を含む培地を用いて既知の発酵技術に従って調製する。
【００１４】
ｐＨは、６．０〜８．５、より正確には６．５〜７．８の範囲であり、気流は、０．１〜２．０ｖｖｍ、より正確には０．２５〜１．０ｖｖｍの範囲であり、発酵槽での撹拌速度は、１００〜２５０ｒｐｍであり、圧力は、０．０１〜０．１２ＭＰａ（０．１〜１．２ｂａｒ）、より正確には０．０２５〜０．１０ＭＰａ（０．２５〜１．０ｂａｒ）の範囲である。発酵は、回分（ｂａｔｃｈ）または流加（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）モードで行われ、従来のＳＴＲ（＝撹拌タンク型反応器）またはＣＳＴＲ（＝連続撹拌タンク型反応器）発酵槽を使用する。
【００１５】
このバイオマスは、遠心分離または精密ろ過によって集められ、精製水で２回洗浄され、精製水中で再懸濁される。得られたクリーム状物を、真空凍結乾燥または噴霧乾燥によって乾燥し、次いで真空下で包装する。
【００１６】
本発明を、以下の実施例によって詳細に説明する。
【実施例】
【００１７】
（実施例１）
バシラス・サブチリスＧＮ１３／２７（ＤＳＭ１７７６６）を、以下の組成を有する発酵培地「Ｆ１０」が、幾何学的スケール上、２０ｌ入った３０ｌ容の発酵槽において好気的に増殖させる。
・微粉化大豆ミール  １５．００ｇ／ｌ
・酵母エキス  １．００ｇ／ｌ
・グリセロール  １０．００ｇ／ｌ
・Ｋ2ＨＰＯ4  ０．０５ｇ／ｌ
・ＮａＣｌ  ５．００ｇ／ｌ
・ｐＨ７．３（±０．１）
・殺菌  １２１℃、３０分
発酵槽に、培地「Ｓ３」が以下の組成を有する８％（１６００ｍｌ）の１６時間（±２時間）シードを接種する。
・大豆ペプトン  １０．００ｇ／ｌ
・グリセロール  ５．００ｇ／ｌ
・ｐＨ７．２（±０．１）
次に、シードに、精製水１０ｍｌで洗浄したスラント（斜面培養株）からのバシラス・サブチリス懸濁液５ｍｌを接種した。
増殖条件：
・シード：
培地８００ｍｌが入った３ｌ容の撹拌フラスコ
インキュベーション温度  ３７℃
撹拌  ９０ｒｐｍ
時間  １７時間（±２時間）
・発酵槽：
撹拌  １２０ｒｐｍ
気流  ０．６ｖｖｍ
圧力  ０．０２５ＭＰａ（０．２５ｂａｒ）
温度  ３７℃
シリコン消泡剤
時間  １４４時間（±４時間）
前記条件下で得られたバイオマスは、乾燥重量で８（±１）ｇ／ｌであり、ＭＫ−７含有量が１１００（±１００）ｐｐｍであった。
（実施例２）
バシラス・サブチリスＧＮ１３／７２（ＤＳＭ１７７６６）を実施例１と同様に培養するが、発酵培地「Ｆ１２」は以下の組成を有する。
・大豆ペプトン  １０．００ｇ／ｌ
・グリセロール  １０．００ｇ／ｌ
・酵母エキス  １．００ｇ／ｌ
・Ｋ2ＨＰＯ4  ０．０５ｇ／ｌ
・ＮａＣｌ  ５．００ｇ／ｌ
発酵期間は、１４０時間（±２時間）である。
【００１８】
乾燥重量で１０（±１）ｇ／ｌが得られ、ＭＫ−７含有量は３０００（±１００）ｐｐｍである。
（実施例３）
バシラス・サブチリスＧＮ１３／７２（ＤＳＭ１７７６６）を実施例１と同様に培養するが、発酵培地「Ｆ１３」は以下の組成を有する。
・大豆ペプトン  １２．００ｇ／ｌ
・酵母エキス  ０．５０ｇ／ｌ
・デキストリン  ６０．００ｇ／ｌ
・Ｋ2ＨＰＯ4  ０．０５ｇ／ｌ
・ＮａＣｌ  ５．００ｇ／ｌ
発酵期間は、１４０時間（±１時間）である。
【００１９】
乾燥重量で９．０（±１．０）ｇ／ｌが得られ、ＭＫ−７含有量は７８００（±２００）ｐｐｍである。
（実施例４）
バシラス・サブチリスＧＮ１３／７２（ＤＳＭ１７７６６）を実施例３と同様に培養するが、炭素源は、デキストリンの代りにマルトデキストリンからなる。
【００２０】
発酵期間は、１４０時間（±３時間）である。
【００２１】
乾燥重量で８．０（±１．０）ｇ／ｌが得られ、ＭＫ−７含有量は８５００（±１５０）ｐｐｍである。
（実施例５）
バシラス・サブチリスＧＮ１３／７２（ＤＳＭ１７７６６）を実施例４と同様に培養するが、消泡剤は大豆油とする。
【００２２】
発酵期間は、１４４時間（±４時間）である。
【００２３】
乾燥重量で１１（±１）ｇ／ｌが得られ、ＭＫ−７含有量は１１７００（±３００）ｐｐｍである。
（実施例６）
バシラス・サブチリスＧＮ１３／７２（ＤＳＭ１７７６６）を、培地「Ｆ１３」が２２５ｌの実用的な量であり、ｐＨがＮａＯＨで自動的に７．２に維持され、撹拌が１００ｒｐｍであり、気流が０．５ｖｖｍであり、圧力が０．０３ＭＰａ（０．３ｂａｒ）であり、消泡剤の大豆油が自動制御される３００ｌ容の発酵槽において培養する。
【００２４】
接種物が、合計３０ｌ容に２０ｌの実用的な量の「Ｓ３」培地を含むシードにおいて４％得られた（実施例１参照）。
【００２５】
発酵期間は、１４２時間（±４時間）である。得られたバイオマスは、乾燥重量で１１（±１．０）ｇ／ｌであり、得られたＭＫ−７は、１５１５０（±２００）ｐｐｍである。
（実施例７）
バシラス・サブチリスＧＮ１３／７２（ＤＳＭ１７７６６）を、実施例６と同様に培養する。定常期に達する前に発酵を止めた。乾燥重量で７．０（±１．５）ｇ／ｌが得られ、ＭＫ−７の生産力は２１０００ｐｐｍである。バイオマスを二部に分割し、一部を凍結乾燥して１７０００（±３５０）ｐｐｍの粉末を得、もう一部を噴霧乾燥して２００００（±５００）ｐｐｍを得た。
噴霧乾燥機の動作条件：
・吸気温度  ２００℃
・排気温度  ８０℃
（実施例８）
実施例７の手順に従うと、発酵の有効量は２ｍ3であった。噴霧乾燥した最終製品を、真空下で２５０ｇの小袋（ｓａｃｈｅｔ）として包装した。