(57)【要約】【課題】IVV法による、一つの遺伝子について幾通りもの部分配列を包含したデータの取得の効率をさらに改善する。【解決手段】(1)核酸ライブラリーから、蛋白質と該蛋白質をコードする核酸とが結合した対応付け分子のライブラリーを製造する工程、(2)前記対応付け分子のライブラリーと標的物質とを混合する工程、(3)標的物質に結合した対応付け分子を選択する工程、(4)(3)で選択された対応付け分子の核酸からRT-PCR又はPCRにより核酸ライブラリーを調製する工程を含むラウンドを繰り返す方法において、前記RT-PCR又はPCRにおいて、増幅産物の増幅量が飽和量以下の一定量に最初に達するサイクル数を求め、そのサイクル数が一定に達した後、さらに１回以上のラウンドを行い、核酸ライブラリーの配列解析を行う。【選択図】  図１０
2007181453.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(1)核酸ライブラリーから、蛋白質と該蛋白質をコードする核酸とが結合した対応付け分子のライブラリーを製造する工程、(2)前記対応付け分子のライブラリーと標的物質とを混合する工程、(3)標的物質に結合した対応付け分子を選択する工程、(4)(3)で選択された対応付け分子の核酸からRT-PCR又はPCRにより核酸ライブラリーを調製する工程を含むラウンドを繰り返すことを含み、
前記RT-PCR又はPCRにおいて、増幅産物の増幅量が飽和量以下の一定量に最初に達するサイクル数を求めること、及び、前記サイクル数が一定に達した後、さらに１回以上のラウンドを経た時に、核酸ライブラリーの配列解析を行うことを特徴とする、配列データの取得方法。
【請求項２】
蛋白質と該蛋白質をコードする核酸とが結合した対応付け分子のライブラリーを用いる配列データの取得方法であって、(a)ベイト蛋白質を設計し、(b)設計されたベイト蛋白質との相互作用に関してライブラリーからのセレクションを行い、(c)セレクションで選択された対応付け分子の配列解析を行い、配列データを取得し、(d)取得された配列データに基づき相互作用部位を決定し、(e)決定された相互作用部位に基づき配列データを抽出することを含み、工程(b)及び(c)が請求項１記載の方法により行われることを特徴とする前記方法。
【請求項３】
配列データに基づき、相互作用部位を抽出し、抽出結果に基づきベイト蛋白質を設計することを含み、請求項１又は２記載の方法により配列データを取得することを特徴とする蛋白質の設計方法。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の方法により配列データを取得し、得られた配列データを用いて、塩基配列の変化によって蛋白質間相互作用が変化する遺伝子を抽出することを特徴とする遺伝子の抽出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、選択的スプライシング、RNAエディティング、一塩基多型(SNP)、配列変異、配列融合などによってDNA配列やmRNA配列が変化し、その結果、蛋白質間相互作用が変化する疾患関連遺伝子等の抽出や、蛋白質相互作用解析におけるベイト蛋白質設計に有用な配列データの取得方法、及び、その配列データを用いて前記抽出及び前記ベイト蛋白質設計を行う方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
創薬ターゲット遺伝子、すなわち、選択的スプライシング、RNAエディティング、SNP、配列変異、配列融合などによってDNA配列やmRNA配列が変化し、その結果、蛋白質間相互作用が変化する疾患関連遺伝子の抽出においては、選択的スプライシング、RNAエディティング、SNPs(single nucleotide polymorphisms)などに由来するDNA配列やmRNA配列の変化を追うのには、蛋白質間相互作用の解析を用いて、多くの配列情報を得ることが重要である。
【０００３】
蛋白質間相互作用の検出方法として、これまで免疫沈降、GST融合蛋白質によるプルダウン・アッセイ、TAP(Tandem Affinity Purification)法、酵母ツーハイブリッド法などが知られている。一方、進化分子工学のツールとして誕生した「遺伝子(遺伝子型)と蛋白質(表現型)の対応付け」を応用して、ポストゲノム機能解析における蛋白質間相互作用を網羅的に解析する方法として、in vitro virus法 (非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、特許文献１、特許文献２)、STABLE法、ファージディスプレイ法、リボソーム・ディスプレイ法、mRNA-ペプチドヒュージョン(mRNAディスプレイ)法などが知られている。
【０００４】
また、従来のツーハイブリッド法やTAP法などの蛋白質間相互作用解析では、ベイト蛋白質設計は蛋白質毎に試行錯誤的に行う必要があった。大規模解析においては、ベイト蛋白質設計が効率よく実現可能で、出来るだけ自動的で連続的に繰り返すことが可能な蛋白質間相互作用解析システムが所望されている。また、蛋白質設計において、三次元構造解析のための結晶化が難しい蛋白質は、アミノ酸の全長の様々な領域を様々な長さでクローニングし、それらの結合能をGST融合蛋白質によるプルダウン・アッセイなどにより、すべて実験的に確認していく必要があった。
【０００５】
in vitro virus法によれば、擬陽性の少ないデータが得られることが知られている（特許文献３）。
【非特許文献１】Miyamoto-Sato E, et al. Viva Origino 25, 35 (1997)
【非特許文献２】Nemoto N, et al. FEBS Lett. 414, 405 (1997)
【非特許文献３】Miyamoto-Sato, E. et al. Nucleic Acids Res. 31, e78 (2003)
【特許文献１】国際公開第ＷＯ９８／１６６３６号パンフレット
【特許文献２】国際公開第ＷＯ０２／４６３９５号パンフレット
【特許文献３】国際公開第WO 2005/050518号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
創薬ターゲット遺伝子の探索において、選択的スプライシング、RNAエディティング、SNPsなどに由来するDNA配列やmRNA配列の詳細な変化を追うためには、どの蛋白質とどの蛋白質が相互作用するかを解析出来るだけでは十分ではない。in vitro virus(IVV)法のように、どのような部位で相互作用しているかを詳細に検出することが重要であり、さらに、バリアントやSNPsなどのデータベースと重ね合わせて新規の機能を見出す場合、一つの遺伝子について幾通りもの部分配列を包含したデータを用いることが重要である。
【０００７】
また、蛋白質間相互作用解析のためのベイト蛋白質設計においては、相互作用の認められる、位置や長さの点で様々な領域の配列データを入手することが重要である。
【０００８】
従来のツーハイブリッド法やTAP法などの蛋白質間相互作用解析法では、上述のような配列データを効率よく得ることが難しい。
【０００９】
IVV法によれば、国際公開第WO 2005/050518号パンフレットに記載されているように、擬陽性の少ないデータが得られ、データの質の点で、上述のような配列データを効率よく得ることができると言えるが、まだ改善が期待される。
【００１０】
本発明は、IVV法による、一つの遺伝子について幾通りもの部分配列を包含したデータの取得の効率をさらに改善することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
IVV法では、プレイライブラリーの作成、ベイトとプレイの複合体の形成、及び、複合体のスクリーニングからなるラウンドを繰り返すことにより、ライブラリーにおける一つの遺伝子についての部分配列の割合が増加する。
【００１２】
一つの遺伝子について多数の部分配列を包含したライブラリーが得られたか否かは、シーケンスをすることにより判定できるが、各ラウンド終了後に、毎回シーケンスしてこれを判定することは効率を向上させる上で問題である。そこで、得られるライブラリーにおける、一つの遺伝子についての部分配列の割合を予め予想して、何処のタイミングで塩基配列解析を行うべきかを知ることのできる方法を検討した。その結果、ラウンド毎のRT-PCRのサイクル数をモニターすると、RT-PCRのサイクル数が一定になったところから所定の濃縮率が得られるまでラウンドを回すことによって、一つの遺伝子について多数の部分配列を包含したライブラリーが得られることを見出した。
【００１３】
これらの知見に基づき、本発明は完成した。本発明は、下記のものを提供する。
［１］  (1)核酸ライブラリーから、蛋白質と該蛋白質をコードする核酸とが結合した対応付け分子のライブラリーを製造する工程、(2)前記対応付け分子のライブラリーと標的物質とを混合する工程、(3)標的物質に結合した対応付け分子を選択する工程、(4)(3)で選択された対応付け分子の核酸からRT-PCR又はPCRにより核酸ライブラリーを調製する工程を含むラウンドを繰り返すことを含み、
前記RT-PCR又はPCRにおいて、増幅産物の増幅量が飽和量以下の一定量に最初に達するサイクル数を求めること、及び、前記サイクル数が一定に達した後、さらに１回以上のラウンドを経た時に、核酸ライブラリーの配列解析を行うことを特徴とする、配列データの取得方法。
［２］  蛋白質と該蛋白質をコードする核酸とが結合した対応付け分子のライブラリーを用いる配列データの取得方法であって、(a)ベイト蛋白質を設計し、(b)設計されたベイト蛋白質との相互作用に関してライブラリーからのセレクションを行い、(c)セレクション
で選択された対応付け分子の配列解析を行い、配列データを取得し、(d)取得された配列データに基づき相互作用部位を決定し、(e)決定された相互作用部位に基づき配列データを抽出することを含み、工程(b)及び(c)が［１］記載の方法により行われることを特徴とする前記方法。
［３］  配列データに基づき、相互作用部位を抽出し、抽出結果に基づきベイト蛋白質を設計することを含み、［１］又は［２］記載の方法により配列データを取得することを特徴とする蛋白質の設計方法。
［４］  ［１］又は［２］に記載の方法により配列データを取得し、得られた配列データを用いて、塩基配列の変化によって蛋白質間相互作用が変化する遺伝子を抽出することを特徴とする遺伝子の抽出方法。
【発明の効果】
【００１４】
一つの遺伝子について幾通りもの部分配列を包含した配列データを効率的に取得できる。この効率向上は、大規模蛋白質間相互作用解析においては特に重要である。また、このような配列データは、創薬ターゲット遺伝子の探索において、相互作用部位の塩基配列が変化することで蛋白質間相互作用が変化する蛋白質の抽出に用いるのに適した配列データである。このことによって、遺伝子の機能解析や疾患メカニズムの解明が加速される。さらに、相互作用部位の塩基配列の変化と疾患との関わりを解析することで、疾患関連遺伝子の抽出が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
＜１＞本発明配列データ取得方法
本発明配列データ取得方法は、(1)核酸ライブラリーから、蛋白質と該蛋白質をコードする核酸とが結合した対応付け分子のライブラリーを製造する工程、(2)前記対応付け分子のライブラリーと標的物質とを混合する工程、(3)標的物質に結合した対応付け分子を選択する工程、(4)(3)で選択された対応付け分子の核酸からRT-PCR又はPCRにより核酸ライブラリーを調製する工程を含むラウンドを繰り返すことを含み、前記RT-PCR又はPCRにおいて、増幅量が飽和量以下の一定量に最初に達するサイクル数を求めること、及び、前記サイクル数が一定に達した後、さらに１回以上のラウンドを経た時に、核酸ライブラリーの配列解析を行うことを特徴とする。
【００１６】
上記のラウンドは、通常の対応付け分子を用いるスクリーニング方法と同様でよい（特許文献１〜３参照）。蛋白質と該蛋白質をコードする核酸とが結合した対応付け分子を用いるスクリーニング法は、例えば、遺伝子型（核酸）の増幅、表現型（蛋白質）と遺伝子型の連結、及び、アフィニティー選択を含み、これらの工程を必要により繰り返すものである。このような方法の代表的なものは、in vitro virus法に基づくスクリーニング法（例えば、WO 02/48347、特開2002-176987参照）である。
【００１７】
in vitro virus法による対応付け分子（以下、IVVとも呼ぶ）は、蛋白質を含む表現型分子と、該蛋白質をコードする核酸を含む遺伝子型分子とが結合してなる。遺伝子型分子は、蛋白質をコードする領域を、その領域の塩基配列が翻訳され得るような形態で有するコード分子と、スペーサー部とが結合してなる。説明の便宜のため、対応付け分子における、表現型分子に由来する部分、スペーサー分子に由来する部分、および、コード分子に由来する部分をそれぞれ、デコード部、スペーサー部およびコード部と呼ぶ。また、遺伝子型分子における、スペーサー分子に由来する部分、および、コード分子に由来する部分をそれぞれ、スペーサー部およびコード部と呼ぶ。
【００１８】
スペーサー分子は、例えば、核酸の3'末端に結合できるドナー領域と、ドナー領域に結合した、ポリエチレングリコールを主成分としたPEG領域と、PEG領域に結合した、ペプチド転移反応によってペプチドと結合し得る基を含むペプチドアクセプター領域とを含む。
PEG領域はなくてもよい。
【００１９】
核酸の3'末端に結合できるドナー領域は、通常、１以上のヌクレオチドからなる。ヌクレオチドの数は、通常には１〜１５、好ましくは１〜２である。ヌクレオチドはリボヌクレオチドでもデオキシリボヌクレオチドでもよい。
【００２０】
ドナー領域の5'末端の配列は、ライゲーション効率を左右する。コード部とスペーサー部をライゲーションさせるためには、少なくとも1残基以上を含むことが必要であり、ポリA配列をもつアクセプターに対しては、少なくとも１残基のdC(デオキシシチジル酸)または２残基のdCdC(ジデオキシシチジル酸)が好ましい。塩基の種類としては、C>U又はT>G>Aの順で好ましい。
【００２１】
PEG領域はポリエチレングリコールを主成分とするものである。ここで、主成分とするとは、PEG領域に含まれるヌクレオチドの数の合計が20塩基以下、又は、ポリエチレングリコールの平均分子量が400以上であることを意味する。好ましくは、ヌクレオチドの合計の数が10塩基以下、又は、ポリエチレングリコールの平均分子量が2000以上であることを意味する。
【００２２】
PEG領域のポリエチレングリコールの平均分子量は、通常には、400〜30,000、好ましくは1,000〜10,000、より好ましくは2,000〜8,000である。ここで、ポリエチレングリコールの分子量が約400より低いと、このスペーサー分子に由来するスペーサー部を含む遺伝子型分子を対応付け翻訳したときに、対応付け翻訳の後処理が必要となることがあるが（Liu, R., Barrick, E., Szostak, J.W., Roberts, R.W. (2000) Methods in Enzymology,
vol. 318, 268-293）、分子量1000以上、より好ましくは2000以上のPEGを用いると、対応付け翻訳のみで高効率の対応付けができるため、翻訳の後処理が必要なくなる。また、ポリエチレングリコールの分子量が増えると、遺伝子型分子の安定性が増す傾向があり、特に分子量1000以上で良好であり、分子量400以下ではDNAスペーサーと性質がそれほどかわらず不安定となることがある。
【００２３】
ペプチドアクセプター領域は、ペプチドのＣ末端に結合できるものであれば特に限定されないが、例えば、ピューロマイシン、3'-N-アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（3'-N-Aminoacylpuromycin aminonucleoside, PANS-アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのPANS-Gly、バリンのPANS-Val、アラニンのPANS-Ala、その他、全アミノ酸に対応するPANS-全アミノ酸が利用できる。また、化学結合として3'-アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合した結果形成されたアミド結合でつながった3'-N-アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（3'-Aminoacyladenosine aminonucleoside, AANS-アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのAANS-Gly、バリンのAANS-Val、アラニンのAANS-Ala、その他、全アミノ酸に対応するAANS-全アミノ酸が利用できる。また、ヌクレオシドまたはヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども利用できる。その他、ヌクレオシドまたはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質と、アミノ酸またはアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質を化学的に結合可能な結合様式のものなら全て利用することができる。
【００２４】
ペプチドアクセプター領域は、好ましくは、ピューロマイシンもしくはその誘導体、又は、ピューロマイシンもしくはその誘導体と1残基もしくは２残基のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドからなることが好ましい。ここで、誘導体とは蛋白質翻訳系においてペプチドのＣ末端に結合できる誘導体を意味する。ピューロマイシン誘導体は、ピューロマイシン構造を完全に有しているものに限られず、ピューロマイシン構造の一部が欠落しているものも包含する。ピューロマイシン誘導体の具体例としては、PANS-アミノ酸、AANS-アミノ酸などが挙げられる。
【００２５】
ペプチドアクセプター領域は、ピューロマイシンのみの構成でもかまわないが、5'末端側に1残基以上のDNAおよび/またはRNAからなる塩基配列を持つことが好ましい。配列としては、dC-ピューロマイシン, rC-ピューロマイシンなど、より好ましくはdCdC-ピューロマイシン, rCrC-ピューロマイシン, rCdC-ピューロマイシン, dCrC-ピューロマイシンなどの配列で、アミノアシル-tRNAの3'末端を模倣したCCA配列（Philipps, G.R. (1969) Nature 223, 374-377）が適当である。塩基の種類としては、C>U又はT>G>Aの順で好ましい。
【００２６】
スペーサー分子は、ドナー領域とPEG領域との間に、少なくとも１つの機能付与ユニットを含むことが好ましい。機能付与ユニットは、好ましくは、少なくとも1残基のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドの塩基に機能修飾を施したものである。例えば、機能修飾物質として、蛍光物質、ビオチン、またはHis-tagなど各種分離タグなどを導入したものが可能である。
【００２７】
コード分子は、例えば、転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む5'非翻訳領域と、5'非翻訳領域の3'末端側に結合した、蛋白質をコードするORF領域と、ORF領域の3'末端側に結合したポリA配列を持ち、かつポリA配列の5'上流に親和性タグ配列を含む核酸である。
【００２８】
コード分子は、DNAでもRNAでもよく、RNAの場合、5'末端にCap構造があってもなくても良い。また、コード分子は任意のベクターやプラスミドに組み込まれたものとしてもよい。
【００２９】
3'末端領域は、親和性タグ配列とその下流にポリA配列を含んでもよい。スペーサー分子とコード分子とのライゲーション効率に影響を与える要素としては3'末端領域のポリA配列が重要であり、ポリA配列は、少なくとも２残基以上のdAおよび/またはrAの混合または単一のポリA連続鎖であり、好ましくは、3残基以上、より好ましくは６以上、さらに好ましくは８残基以上のポリA連続鎖である。
【００３０】
コード分子の翻訳効率に影響する要素としては、転写プロモーターと翻訳エンハンサーからなる5'UTR、および、ポリA配列を含む3'末端領域の組み合わせがある。3'末端領域のポリA配列の効果は通常には10残基以下で発揮される。5'UTRの転写プロモーターはT7/T3またはSP6などが利用でき、特に制限はない。好ましくはSP6であり、特に、翻訳のエンハンサー配列としてオメガ配列やオメガ配列の一部を含む配列を利用する場合はSP6を用いることが特に好ましい。翻訳エンハンサーは好ましくはオメガ配列の一部であり、オメガ配列の一部としては、TMVのオメガ配列の一部(O29; Gallie D.R., Walbot V. (1992) Nucleic Acids Res., vol. 20, 4631-4638、及び、WO 02/48347の図３参照)やO'（配列番号３７）を含んだものが好ましい。
【００３１】
親和性タグ配列としては、抗原抗体反応など、蛋白質を検出できるいかなる手段を用いるための配列であればよく、制限はない。好ましくは、抗原抗体反応によるアフィニティー分離分析用タグであるFlag-tag配列やHis-tag配列である。
【００３２】
ORF領域については、DNAおよび/またはRNAからなるいかなる配列でもよい。遺伝子配列、エキソン配列、イントロン配列、ランダム配列、または、いかなる自然界の配列、人為的配列が可能であり、配列の制限はない。このような配列からなる核酸ライブラリーが使用できる。また、コード分子の5'UTRをSP6+O29とし、3'末端領域を、たとえば、Flag+XhoI+An(n=8)とすることで、各長さは、5'UTRで約60bp、3'末端領域で約32bpであり、PCRのプライマーにアダプター領域として組み込める長さである。このため、あらゆるベクター
やプラスミドやcDNAライブラリーからPCRによって、5'UTRと3'末端領域をもったコード分子を簡単に作成できる。コード分子において、翻訳はORF領域を超えてされてもよい。すなわち、ORF領域の末端に終止コドンがなくてもよい。
【００３３】
コード分子は、転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む5'非翻訳領域と、5'非翻訳領域の3'末端側に結合した、蛋白質をコードするORF領域と、ORF領域の3'末端側に結合した、ポリA配列を含む3'末端領域を含む核酸であってもよい。
【００３４】
遺伝子型分子は、上記コード分子を、必要により、蛋白質をコードする領域の塩基配列が翻訳され得るような形態に変換した後（例えば転写した後）、コード分子の3'末端と、スペーサー分子のドナー領域を、通常のリガーゼ反応により結合させることにより製造できる。反応条件としては、通常、４〜２５℃で４〜４８時間の条件が挙げられ、PEG領域を含むスペーサー分子のPEG領域内のポリエチレングリコールと同じ分子量のポリエチレングリコールを反応系に添加する場合には、15℃で0.5〜４時間に短縮することも可能である。
【００３５】
スペーサー分子とコード分子の組み合わせはライゲーション効率に重要な効果をもたらす。アクセプターにあたるコード部の3'末端領域において、少なくとも２残基以上、好ましくは３残基以上、さらに好ましくは６〜８残基以上のDNAおよび/またはRNAのポリA配列があること、さらに、5'UTRの翻訳エンハンサーとしては、オメガ配列の部分配列(O29やO' )が好ましく、スペーサー部のドナー領域としては、少なくとも１残基のdC(デオキシシチジル酸)または２残基のdCdC(ジデオキシシチジル酸)が好ましい。このことによって、RNAリガーゼを用いることでDNAリガーゼのもつ問題点を回避し、かつ効率を60〜80%に保つことができる。
【００３６】
(a)転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む5'非翻訳領域と、5'非翻訳領域の3'末端側に結合した、蛋白質をコードするORF領域と、ORF領域の3'末端側に結合した、ポリA配列を含む3'末端領域を含むRNAであるコード分子の3'末端と、(b)上記スペーサー分子のドナー領域であってRNAからなるものとを、スペーサー分子内のPEG領域を構成するポリエチレングリコールと同じ分子量をもつ遊離のポリエチレングリコールの存在下で、RNAリガーゼにより結合させることが好ましい。
【００３７】
ライゲーション反応時に、PEG領域を含むスペーサー部のPEG領域と同じ分子量のポリエチレングリコールを添加することによって、スペーサー部のポリエチレングリコールの分子量によらずライゲーション効率が80〜90%以上に向上し、反応後の分離工程も省略することができる。
この態様の対応付け分子は、上記の遺伝子型分子を無細胞翻訳系で翻訳することにより、ペプチド転移反応で、遺伝子型分子内のORF領域によりコードされた蛋白質である表現型分子と連結することにより得ることができる。無細胞翻訳系は、好ましくは、小麦胚芽又はウサギ網状赤血球のものである。翻訳の条件は通常に採用される条件でよい。例えば、25〜37℃で15〜240分の条件が挙げられる。また、この態様の対応付け分子の核酸部分は、翻訳後に逆転写によりRNAとDNAとのハイブリッドとすることができる。
【００３８】
標的物質はペプチド（化学合成された、又は天然から単離された、又は蛋白質の部分消化物であってもよい）、蛋白質、核酸(DNA、又はRNA)、糖類、種々の低分子化合物、金属、金属化合物など、あらゆる化合物や物質が該当する。
【００３９】
本発明に用いられる標的物質は態様に応じて、樹脂、ビーズ等の固相に結合させるが、結合の時期は、対応付け分子と混合する前でも後でもよく、結合方法に応じて選択される。固相に結合させる方法としては、修飾物質を介して結合させるものと、それ以外の部分
により結合させるものが挙げられる。
【００４０】
修飾物質を介して結合させる場合に用いられる修飾物質は、通常には、特定のポリペプチドに特異的に結合する分子（以下、「リガンド」と称することがある。）であり、固相表面には該リガンドと結合する特定のポリペプチド（以下、「アダプター蛋白質」と称することがある）を結合させる。アダプター蛋白質には、結合蛋白質、受容体を構成する受容体蛋白質、抗体なども含まれる。アダプター蛋白質／リガンドの組み合わせとしては、例えば、アビジンおよびストレプトアビジン等のビオチン結合蛋白質／ビオチン、マルトース結合蛋白質／マルトース、Ｇ蛋白質／グアニンヌクレオチド、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、ＤＮＡ結合蛋白質／ＤＮＡ、抗体／抗原分子（エピトープ）、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合蛋白質／ＡＴＰ、あるいはエストラジオール受容体蛋白質／エストラジオールなどの各種受容体蛋白質／そのリガンドなどが挙げられる。
【００４１】
これらの中で、アダプター蛋白質／リガンドの組み合わせとしては、アビジンおよびストレプトアビジンなどのビオチン結合蛋白質、マルトース結合蛋白質／マルトース、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、などが好ましく、特にストレプトアビジン／ビオチンの組み合わせが最も好ましい。これらの結合蛋白質は、それ自体既知のものであり、該蛋白質をコードするＤＮＡは既にクローニングされている。
【００４２】
アダプター蛋白質の固相表面への結合は、それ自体既知の方法を用いることができるが、具体的には、例えば、タンニン酸、ホルマリン、グルタルアルデヒド、ピルビックアルデヒド、ビス−ジアゾ化ベンジゾン、トルエン-2,4-ジイソシアネート、アミノ基、活性エステルに変換可能なカルボキシル基、又はホスホアミダイドに変換可能な水酸基もしくはアミノ基などを利用する方法を用いることができる。
【００４３】
修飾物質以外の部分により固相に結合させる場合は、通常蛋白質、核酸、糖鎖、低分子化合物を固相に結合させるのに用いられる既知の方法、具体的には例えば、タンニン酸、ホルマリン、グルタルアルデヒド、ピルビックアルデヒド、ビス−ジアゾ化ベンジゾン、トルエン-2,4-ジイソシアネート、アミノ基、活性エステルに変換可能なカルボキシル基、又はホスホアミダイドに変換可能な水酸基もしくはアミノ基などを利用する方法を用いることができる。
【００４４】
固相担体は、好ましくはアガロースビーズ、磁性体が包埋されたアガロースビーズが好ましい。
【００４５】
対応付け分子のライブラリーと標的物質との混合は、対応付け分子の被標的蛋白質が標的物質と相互作用する条件で混合すればよい。この条件は、検出しようとする相互作用および標的物質の種類に応じて適宜選択される。標的物質が蛋白質の場合には、その蛋白質をコードするRNAを準備し、対応付け分子の合成時に一緒に合成してもよい（共翻訳）。このような方法は、WO03/048363に記載されている。
【００４６】
標的物質に結合した対応付け分子を選択する工程は、標的物質に結合した対応付け分子と、標的物質に結合しない対応付け分子を分離する工程であり、通常には、標的物質を固相に固定化しておく又は固定化することによって、対応付け分子と混合後の標的分子を固定化した固相を洗浄することにより分離を行うことができる。洗浄の条件は、検出しようとする相互作用および標的物質の種類に応じて適宜選択される。ここで固相に固定化するとは、対応付け分子と標的物質との結合体が非結合の分子から分離可能になっていること
を意味し、例えば、標的物質が膜蛋白質の場合、細胞の細胞膜等に発現した膜蛋白質や人工膜中に埋め込まれた蛋白質も、固相に固定化された標的物質に包含される。
【００４７】
選択された対応付け分子の核酸に基づいて核酸ライブラリーを調製する工程は、RT-PCR又はPCRによりDNAを調製することを含む。PCRの場合には、逆転写を行い、DNAとしてから行う。RT-PCRの方が、操作の簡便性の点で有利である。調製されたDNAは、配列解析に用いられ、又は、核酸ライブラリーとして、対応付け分子の合成に用いられる。
【００４８】
スクリーニング方法の具体例を、図１５を参照して説明する。このスクリーニング方法は(I)転写、(II)無細胞共翻訳、(III)IVVセレクション及び(IV)RT-PCRからなるラウンドを繰り返すものである。共翻訳では、対応付け分子の製造と、それらとベイトとの混合が同時に行われるため、工程(I)及び(II)が、製造工程(1)及び混合工程(2)に対応している。工程(III)及び(IV)はそれぞれ、選択工程(3)及び調製工程(4)に対応する。
【００４９】
工程(I)では、ベイトDNA及びプレイcDNAライブラリーが転写によりベイト蛋白質mRNA及びプレイIVV mRNA（mRNAの3'側にスペーサーを介してピューロマイシンが結合されたもの）とされる。工程(II)では、ベイト蛋白質mRNA及びプレイIVV mRNAが無細胞翻訳系で翻訳され、IVVとベイトとの複合体が形成される。工程(III)では、二段セレクションが行われる。工程(IV)では、IVVの核酸部分に基づきRT-PCRによりDNAが増幅される。増幅されたDNAは、次のラウンドのライブラリーとして使用されるか、又は、配列解析に付される。
【００５０】
RT-PCR又はPCRにおいては、サイクル数を増やしていくと、反応が飽和状態になる。ライブラリーをテンプレートとして用いた場合には、反応が飽和状態になると、産物量は元のテンプレート量を反映したものにならなくなる。これは、テンプレートの配列や量が異なるため、一部のDNAの増幅が飽和に達しても、その他の増幅は止まらないという現象が生じるためである。このような現象により生じるバイアスは、スクリーニングにおいては好ましくない。
【００５１】
そこで、スクリーニングにおいては、一般に、飽和に達する前の増幅産物を次のラウンドに用いる。通常には、増幅量が飽和量の９０％以下のものを用いる。増幅量の下限は、RT-PCR又はPCRが可能であればよく、一般的には、増幅量が飽和量の４０％以上である。増幅量はリアルタイムPCRによれば、簡便に測定でき、飽和量は、同一条件で、反応が飽和するまで反応させることにより特定することができる。増幅量の指標としては、リアルタイムPCRで測定される蛍光等の強度値をそのまま用いることができる。
【００５２】
本発明においては、このサイクル数を、増幅量が飽和量以下の一定量に最初に達したサイクル数を求める。一定量は、飽和量の、通常には59〜100％の範囲、好ましくは70〜85％の範囲から選ばれる。一定量が小さすぎると、次回のラウンドもしくはクローニングを行うために十分なDNA量を得ることが出来ないことがある。一定量が大きすぎるとセレクションで得られた配列の分布が変化することがある。この特定サイクル数は、後記実施例に示されるように、各ラウンドで得られるライブラリーの質（一つの遺伝子についての部分配列の割合）と関連があることが見出された。
【００５３】
本発明においては、特定サイクル数が一定に達した後、さらに１回以上のラウンドを行い、核酸ライブラリーの配列解析を行う。ここで「一定」とは、実験誤差等を考慮して実質的に一定でることを意味し、通常には、上下２回以内、好ましくは上下１回以内の変動が許される。特定サイクル数が一定に達すると、配列データ中の、一つの遺伝子についての部分配列の数が顕著に増加し始める。特定サイクル数が一定に達した後に、実施するラウンドの数の上限は、経済的観点から選択すればよいが、多すぎると、部分配列のバリエーションが低下して、配列データの質が低下する傾向がある。
【００５４】
特定サイクル数が一定に達した後に実施するべきラウンド数は、１０００倍以上の濃縮率が得られるように行うことが好ましい。
【００５５】
ここで濃縮率とは、初期cDNAライブラリーにおける指標遺伝子の存在量と1stラウンド後の指標遺伝子の存在量の比で求まる値である。指標遺伝子とは、FOS/JUNであり、ベイトFosを用いて、相互作用相手のJunが、プレイのcDNAライブラリーで濃縮されるときの比率である。FOS/JUNの相互作用の強さは物理化学的な値であり（Kd=10-7〜10-8）、相互作用の強さは普遍的であるが、濃縮率は、用いるビーズの種類や精製用のタグや精製の段数などの影響を受ける。
【００５６】
後記実施例の条件では、初期cDNAライブラリーにおける指標遺伝子の存在量と1stラウンドの１段目における指標遺伝子の存在量の比は１００であり（濃縮率１００倍）、1stラウンドの２段目における指標遺伝子の存在量の比は１０であり（濃縮率１０倍）、各ラウンドの一段目の濃縮率１００倍、二段目までの濃縮率は１０００倍となる。従って、特定サイクル数が一定に達した後、この一段セレクションを用いるラウンドでは２回、二段セレクションでは１回行えばよい。
【００５７】
濃縮率は、Genome Research vol.15 pp710-717(2005)の方法で評価できる(同文献のFig. 1B参照)。具体的には、100 nM junテンプレートを、後記実施例に記載の条件で、400 nMのfosテンプレート（ベイト）の存在下及び非存在下で翻訳し、翻訳産物の系列希釈物を、電気泳動等で定量することにより求めることができる。
【００５８】
なお、この濃縮率は、初期cDNAライブラリーにおける指標遺伝子の存在量と1stラウンド後の指標遺伝子の存在量の比によって濃縮力の程度を評価したものであり、特定サイクル数が一定に達した後のラウンドにおいて現実にこの濃縮率で濃縮が行われなければならないものではない。
【００５９】
このように、特定サイクル数を指標とし、また、あらかじめ濃縮率の知られたセレクションを用いれば、ラウンド毎に配列解析により、一つの遺伝子について幾通りもの部分配列を包含した配列データが得られたか否かを確認する必要がないので、効率よく目的の配列データを得ることができる。
【００６０】
核酸ライブラリーの配列解析は以下のように行うことができる。
配列決定により得られる塩基配列から、ベクター配列を除去し、cDNA配列を抽出し、必要によりデータベース検索し、蛋白質フレームを確認すると同時に、IVVのフレームを確認する。
【００６１】
IVVセレクションで検出したシーケンス配列とは、市販のシーケンサー(ABI,BECKMANなど)の波形データとその解析に基づく配列データである。
【００６２】
ベクター配列の除去とは、シーケンスのためのクローニングに用いたベクター配列を除去し、余分な配列を除去してcDNAライブラリー配列のみとすることである。
【００６３】
cDNA配列の抽出とは、データベース検索にかけるために、ライブラリーに共通の配列を除去し、ここでは、cDNA配列のみとすることである。
【００６４】
データベース検索とは、核酸データベースとして、ntなどがあり、蛋白質データベースとして、nrなどがあり、その他、refseq, fantom2などのデータベース、ゲノム・データベースなどがある。
【００６５】
蛋白質フレームの確認とは、無細胞翻訳系で翻訳されたフレームがデータベースに登録されている蛋白質のORFとフレームが一致するかどうかを確認することである。フレームが一致していない場合は、フレーム・シフトなのか、3'UTR, 5'UTRの配列なのか、などを明らかにする。
【００６６】
IVVフレームの確認とは、無細胞翻訳系で翻訳されうる配列なのかどうかを確認することである。すなわち、ストップ・コドンが複数出てくるか、場所はＮ末端側か、などによって判断する。
【００６７】
アライメントは、通常の方法によって行うことができる。このようなアライメントを行うためのソフトウェア（例えばClustalX）が入手可能である。
【００６８】
＜２＞本発明配列データ取得方法の応用
本発明配列データ取得方法によれば、一つの遺伝子について多数の部分配列を包含したライブラリーの配列データを効率的に取得できる。このような配列データの性質が重要な用途のために、配列データを取得するために本発明配列データ取得方法を使用できる。以下、例を挙げて説明する。
【００６９】
＜２−１＞ターゲット遺伝子の抽出
選択的スプライシング、RNAエディティング、SNPsなど由来するDNA配列やmRNA配列の変化を追うためには、蛋白質間相互作用解析法において、どの蛋白質とどの蛋白質が相互作用するかを解析出来るだけでは十分ではない。IVV法のように、どのような塩基配列部位で相互作用しているかを詳細に検出することが重要であり、さらに、塩基配列部位が分かるだけではなく、バリアントやSNPsなどのデータベースと重ね合わせて新規の機能を見出す場合、重ね合わせるIVVの配列データ（以下、IVV配列とも呼ぶ）が多い方がよい。一つの遺伝子について多数の部分配列が得られれば、図２のように、バリアント解析の場合、ある遺伝子のどのエクソンが機能に寄与しているかを解析できる。また、融合遺伝子については、図３のように、図２と同様に解析できる。さらに、図４のように、SNPs解析の場合も、ある遺伝子のどのSNPsが機能に寄与しているかを解析できる。また、RNAエディティングや癌由来の変異については、図５のように、SNPsと同様に解析できる。
【００７０】
本発明配列データ取得方法によれば、このような配列データを効率的に得ることができるので、本発明配列データ取得方法により、配列データを取得し、塩基配列の変化によって蛋白質間相互作用が変化する遺伝子を抽出することが有利である。従って、本発明により、本発明配列データ取得方法により配列データを取得し、その配列データを用いて、塩基配列の変化によって蛋白質間相互作用が変化する遺伝子を抽出する遺伝子の抽出方法が提供される。
【００７１】
図１は、本発明配列データ取得方法を利用する、本発明の「塩基配列の変化によって蛋白質間相互作用が変化する遺伝子の抽出」の構成図である。 (1)IVV法の実験、(2)公共データベース、あるいは公共データベースの組み合わせセット、(3)IVVのデータの公共データベースによる解析により、塩基配列の変化によって相互作用が変化する遺伝子の抽出とDB化、(4)さらに、疾患によって塩基配列が変化する遺伝子の抽出とそれらのDB化を行うことにより、疾患に関わる塩基配列の変化によって相互作用が変化する遺伝子を抽出し、蓄積できる。この操作を大規模に進めることにより、新しいDBが構築され、遺伝子機能や疾患メカニズムの解明が加速される。
【００７２】
公共データベース、あるいは公共データベースの組み合わせセットは、バリアントのデータベースとしては、ASD (Alternative Splicing Database)などの公共のデータベース
、自ら実験で得た選択的スプライシングのデータベースなどローカルなデータセットやそれらの組み合わせなどでもかまわない。SNPsのデータベースとしては、dbSNPなどの公共のデータベース、自ら実験得たSNPsのデータベースなどローカルなデータセットやそれらの組み合わせなどでもかまわない。RNAエディティング、変異遺伝子や融合遺伝子なども、公共のデータベース、公共データベースのアノテーションから抽出してきたセット、自ら実験得たSNPsのデータベースなどローカルなデータセットやそれらの組み合わせなどでもかまわない。トランススプライシング、スタートコドンバリエーション、ストップコドンリードスルーなどの情報やデータベースとの組み合わせによる解析も可能である。また、構造解析データベースとの解析では、構造解析による相互作用部位の解析結果とIVV法による結果を照合し、相互作用部位が正確に抽出できていることを確認できる。
【００７３】
疾患によって塩基配列が変化する遺伝子の抽出とそれらのDB化を行うことにより、疾患に関わる塩基配列の変化によって相互作用が変化する遺伝子を抽出し、蓄積できる。この操作を大規模に進めることにより、疾患ターゲット遺伝子の新しいDBが構築され、遺伝子機能や疾患メカニズム解明が加速される。
【００７４】
＜２−２＞蛋白質の設計
一つの遺伝子について多数の部分配列を含む配列データは、高精度な相互作用部位の決定に有用である。相互作用部位の決定を含む、蛋白質間相互作用の効率的な大規模解析のベイト設計やタンパク質の立体構造解析等を行う場合には、このような配列データの取得を効率的に取得することが重要である。
【００７５】
従って、本発明配列データ取得法を利用すれば、作製したベイト蛋白質により蛋白質相互作用解析により得たプレイ蛋白質のデータベース（一次DB）から相互作用部位の正確な決定を行うことにより、ベイト蛋白質設計に必要な領域情報のデータベース(二次DB)を作成し、そのDB情報を利用することにより、ベイト蛋白質設計が速やかに行われ、連続して繰り返し解析可能なシステムを提供できる。また、システムにおける蛋白質設計に必要な領域情報を効率よく取得できる。さらに、三次元構造解析のための結晶化が難しい蛋白質の機能部位とその機能部位の抽出を効率よく行うことができる。
【００７６】
本発明は、蛋白質と該蛋白質をコードする核酸とが結合した対応付け分子のライブラリーを用いる配列データの取得方法であって、(a)ベイト蛋白質を設計し、(b)設計されたベイト蛋白質との相互作用に関してライブラリーからのセレクションを行い、(c)セレクションで選択された対応付け分子の配列解析を行い、配列データを取得し、(d)取得された配列データに基づき相互作用部位を決定し、(e)決定された相互作用部位に基づき配列データを抽出することを含み、工程(b)及び(c)が本発明配列データ取得法により行われることを特徴とする前記方法を提供する。
工程(a)、(d)及び(e)は、通常の方法によって行うことができる。
【００７７】
また、本発明は、配列データに基づき、相互作用部位を抽出し、抽出結果に基づきベイト蛋白質を設計することを含み、本発明配列データ取得方法により配列データを取得することを特徴とする蛋白質の設計方法を提供する。設計される蛋白質は、スクリーニングに使用されるベイト蛋白質、相互作用領域（機能領域）を含む蛋白質の立体構造のX線解析、NMR解析に必要な蛋白質、蛋白質の結晶化技術に必要な蛋白質などである。
【００７８】
以下、蛋白質間相互作用の効率的な大規模解析を例にとって説明する。
蛋白質間相互作用の大規模解析システムは、図１１に示すように、ベイト蛋白質を設計し、IVVセレクションを行い、配列解析を行い、ベイトと相互作用するプレイ・蛋白質のデータ・ベース（DB）を一次DBとして得、一次DBに基づいて、結合部位などの相互作用部位の決定を行い、「共通インタラクト領域」、「全長インタラクト領域」などの機能情報
データベースを二次DBとして得るものである。この例では、二次DBを利用して、ベイト蛋白質の設計を行う。
【００７９】
図１１は、「蛋白質間相互作用の大規模解析システム」の構成図とフローである。システムは、(1)（ベイト）蛋白質設計、(2)ベイト作製とセレクション、(3)配列解析、(4)一次DB、(5)相互作用部位の決定、(6)二次DBから構成され、このフローを繰り返すことにより、大規模解析が効率的に行われ、各DBにもデータの蓄積が促進される。
【００８０】
(1)（ベイト）蛋白質設計は、(6)二次DBの情報を利用することで効率化できる構成になっている。具体的な利用の例としては、蛋白質間相互作用解析のためのベイト蛋白質設計、X線やNMRによる蛋白質の立体構造解析のための蛋白質の設計、さらに、創薬（ドラッグデザイン）を目的とした、蛋白質やリガンドなどと相互作用している複合体の立体構造解析のための蛋白質の結晶化技術に必要な蛋白質の設計などへの応用が提供できる。
【００８１】
(2)ベイト作製とセレクションは、図１１のシステムが成立するための重要な構成である。ここでは、完全にin vitroの系でのベイト作製とセレクションが必要である。ベイト作製の具体的方法は、図１４に示した。また、セレクション方法は、in vitro virus法に使用できるものであれば利用可能である。ライブラリーやベイトに使用する生物種については、マウス、ヒト、その他のいずれの生物種でも使用可能である。
【００８２】
(3)配列解析は、配列が解析できる方法であれば利用可能である。具体的には、ジデオキシ法、エピ蛍光イメージング法、光ファイバー法、ナノポア法、リアルタイムDNAシーケンシングによるシーケンス解析、あるいは、マイクロアレイ法やタイリングアレイ法によるシーケンス解析などである。
【００８３】
(4)一次DBは、(3)配列解析で配列が明らかになったデータについて、遺伝子あるいは蛋白質を決定して割り当てた配列情報によって構成されデータベースである。各配列について、遺伝子あるいは蛋白質を決定する方法としては、公共のデータベース（Nt, Locus link, refseqなど）を利用する方法などがある。また、IVV解析システム(IWAS；Genome Research vol.15 pp710-717(2005))を利用する方法もある。
【００８４】
(5)相互作用部位の決定は、図１１のシステムが成立するための重要な手段である。図１２に示したように、(4)一次DBを利用して、各遺伝子（蛋白質）の各配列情報のアミノ酸配列を各遺伝子の「インタラクト領域」として、それらをアライメント（図１２では、ベイトFOSを用いたIVV法により得られたプレイJUNのアライメントを実施）して得た共通アミノ酸領域である「共通インタラクト領域」を高精度な結合部位として得る。同時に、「全長インタラクト領域」などの情報も得ることが出来る。さらに、配列の遺伝子（蛋白質）情報を用いて、公共データベースのPDBにそれら遺伝子（蛋白質）が登録されているかどうかを検索し、されている場合は、第１４図に示したように、PDBデータから算出した相互作用領域と「共通インタラクト領域」の比較による整合性を確認し、高精度な結合部位であることを確認する。
【００８５】
ここで、「IVV共通インタラクト領域」とは、複数のIVV配列をアライメントして共通する核酸（アミノ酸）配列を決定したものである。また、「IVV全長インタラクト領域」とは、複数のIVV配列をアライメントして共通する核酸（アミノ酸）配列を含む５’配列の共通しない配列の先頭から３’配列の共通しない配列の末端までの最も長い領域を決定したものである。
【００８６】
(6)二次DBは、(5)相互作用部位の決定によって作成された「共通インタラクト領域」、「全長インタラクト領域」などによって構成されている。これらの情報を利用することで
、(1)（ベイト）蛋白質設計が実現できる。また、「共通インタラクト領域」、「全長インタラクト領域」などを利用して、三次元構造解析やNMR解析のための蛋白質の設計が可能となる。
【００８７】
次に、プレイの一次DBを用いた相互作用領域等の決定ならびにそれによる二次DBの作成方法およびその利用の例を説明する。
【００８８】
一次DBに基づく結合部位を決定する方法の例としては、プレイとして得られた遺伝子（蛋白質）のIVV配列をアライメントして求める方法がある（図１２：同一遺伝子に複数のIVV配列が得られれば高精度の決定が可能である）。
【００８９】
ベイト蛋白質設計の場合は、IVV配列をアライメントして「IVV共通インタラクト領域」を決定し、それを含む最長のIVV配列を選択してベイト設計に用いることが挙げられる。
【００９０】
また、立体構造のNMR解析やX線解析のための結晶化の蛋白質設計などの場合は、「IVV共通インタラクト領域」を含む「IVV全長インタラクト領域」（IVV配列の全相互作用領域を網羅）までを領域として結晶化のための設計を行うことが挙げられる。
【００９１】
アライメントの手法としては、ClustalWなどのプログラムを用いて、漸進的マルチプルシークエンスアライメントを行うことが挙げられる。このプログラムで同一遺伝子のフラグメントとして検出されたIVV配列をアライメントして共通する核酸（アミノ酸）配列を決定する。
【００９２】
以下、一次DBとしてプレイDBを用いた「IVV共通インタラクト領域」、「IVV全長インタラクト領域」の決定方法、およびこの「IVV共通インタラクト領域」がPDBにより予測される相互作用領域「PDBインタラクト領域」と一致することを確認する方法についての例を示す。
【００９３】
[利用する基礎データの選択]
1. IVV 配列をBLASTでNTにあてて、Ntの中の相同な配列のAccession IDとその配列中の位置情報から、IVV配列が由来する遺伝子を特定し、そのRefseqIDを取得する。
2. 1のRefseqIDからPDB IDを取得する。Ensemblにある情報からPDBとRefseqIDの対応をとる．1つのRefseqIDに複数のPDB IDが存在する場合はすべてのPDB IDを取得する．
3. RefseqIDから全長配列(塩基)を取得し、続いて遺伝子の全長のアミノ酸配列を取得し、読み枠の特定を行う。
【００９４】
[PDB領域の特定]
4. 2のPDB IDからPDBファイルを取得する。
5. 4で得られたPDB IDをPQSで検索し、PQS内に存在するPDB IDには、そのPDB IDにフラグを立てる。
6. 4のPDBファイルから構造決定された領域のPDBアミノ酸配列を抽出する。1つのPDBIDに複数のアミノ酸配列が登録されている場合は、すべてのアミノ酸配列を別々に抽出する。7. 6のPDBアミノ酸配列と3の全長アミノ酸配列をアライメントし、6のPDBアミノ酸配列の領域を特定する。1つのPDB IDに複数のアミノ酸配列が存在する場合は、領域がより長く、かつ相同性がより高いアミノ酸配列をPDBアミノ酸配列として利用する。1つの全長アミノ酸配列に複数のPDB IDが対応する場合は、すべてのPDBアミノ酸配列に対して領域を特定する。
【００９５】
[IVVインタラクト領域の特定]
8. 1のBLAST結果からIVV配列が由来する遺伝子の塩基配列の領域を特定する。
9. 3の全長のアミノ酸配列から、8で特定された領域に対応するアミノ酸配列の領域を特定し「IVVインタラクト領域」とする。複数のIVV配列が存在する場合は、それらを合わせて最上流から最下流までのアミノ酸配列の領域を「全長IVVインタラクト領域」とする。また、複数のIVV配列すべてが共有するアミノ酸配列の領域を「共通IVVインタラクト領域」とする。
10. 7のPDBアミノ酸配列の領域と9の「IVVインタラクト領域」を比較し、二つの領域が重なるPDB IDを特定する。複数のPDB IDが対応する場合は、重なる領域がより長いPDBアミノ酸配列を含むPDB IDを選択する。重なる領域の長さが同じ場合は、より長いPDBアミノ酸配列をもち、かつ5のフラグの付いているPDB IDを選択する。
【００９６】
[PDBインタラクト領域の特定]
11. 10で得られたPDB IDの中で、複数のアミノ酸配列が登録されているPDB IDを選択する。
12. 11で得られたPDB IDに登録されているすべての炭素原子、窒素原子、酸素原子（水素原子は除く）の相互の原子間距離を計算する。
13. それらのうち、異なるアミノ酸配列上に存在し、かつ4オングストローム以下の距離に存在する原子を特定する。
14. 13で特定された原子が存在するアミノ酸を「PDBインタラクト領域」とする。
【００９７】
[インタラクト領域の視覚化]
15. 10で得られたPDB ID のPDB ファイルを、RasMolなどのmolecular graphics
programに読み込ませ三次元構造を可視化する。
その際に、9で得られた「IVVインタラクト領域」「IVV全長インタラクト領域」「IVV共通インタラクト領域」、14で得られた「PDBインタラクト領域」を識別できるように表示する。
【００９８】
また、IVV法によれば、選択されたプレイを効率よくベイトに転用できる。これにより、ベイトとプレイを入れ換えることによる相互作用の態様（直接又は間接など）の検証や、相互作用ネットワークの拡大を効率よく行うことができる。
【００９９】
プレイからのベイトへの転用の手順の例を、図１４を参照して説明する。
IVV法により選択されたプレイの遺伝子を持つプラスミドをテンプレート (Genome Research vol.15 pp710-717(2005)を参照) としてPCR (1st PCR)により、遺伝子の配列に応じて調製したプライマーセット(1st 5'primer及び1st 3'primer)を用いて、それぞれの遺伝子の5'側にenhancer+T7tag、3'側にカルモジュリン結合蛋白質(CBP)を一部付加したDNA断片を作成する。また、そのDNA断片の3'側tagを介してCBP+zz domain (CBPzz断片)を持つDNAをPCR(2nd PCR)により作成する。両断片をオーバーラップPCR (3rd PCR)により結合する。2nd PCR産物の5'末端にSP6 promotorを付加するPCR (4th PCR)を行い、転写のテンプレートDNAを用意する。準備したtemplate DNAを用いて転写反応を行い、mRNAを作成する。
【０１００】
以上のように、本発明によれば、ベイト蛋白質からプレイ蛋白質の一方向のみの解析ではなく、得られたプレイからベイトを作製できるため、蛋白質間相互作用の効率的な大規模解析とそれによるDBへのデータの蓄積、およびデータの信頼性の向上を提供できる。また、大規模解析システムは、DBへのデータの蓄積が効率的に出来ることから、ベイト蛋白質設計に必要な領域情報の大規模DBとその作成方法を提供することが出来る。大規模DBの利用方法としては、蛋白質間相互作用解析のベイト蛋白質設計のみならず、相互作用領域（機能領域）を含む蛋白質の立体構造のX線解析、NMR解析に必要な蛋白質の設計、さらに、創薬（ドラッグデザイン）のための立体構造解析では、蛋白質やリガンドなどと相互作用している複合体の立体構造解析が重要になり、そのための蛋白質の結晶化技術に必要な
蛋白質の設計などへの応用が提供できる。すなわち、アミノ酸の全長が長い、または全長では構造が不安定で、結晶化が困難である蛋白質は、機能領域だけをクローニングし部分的に翻訳させて結晶化させることが多い。これまでの手法では、アミノ酸の全長の様々な領域を様々な長さでクローニングし、それらの結合能をすべて実験的に確認していく必要があった。また、ダイマーを形成する蛋白質は、ペアとなる蛋白質と相互作用することで安定化し、結晶化に成功するケースもあるため、場合によってはペアとなる蛋白質の同定も必要であった。IVV法で得られた配列は、蛋白質の相互作用機能部位を示しており、IVV配列が複数存在すれば、その相互作用機能部位の予測がより正確となる。さらにその部位に相互作用するペアの蛋白質は既にベイトとして特定されており、そのまま結晶化に利用できる。IVV配列を用いて特定された蛋白質コード領域を結晶化に使う領域として利用し、これによって効率の良い三次元構造解析が可能となる。
【実施例１】
【０１０１】
以下、具体的に本発明の実施例を記述するが、下記の実施例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものでない。
【０１０２】
＜参考例１＞
一つの遺伝子について幾通りもの部分配列を包含したライブラリーを用いて選択的エクソンについて検討した例を示す。
【０１０３】
ライブラリーにおける一つの遺伝子についての部分配列の割合の指標として、ライブラリー中の部分配列についてシーケンサーで配列解析を行い、Entrez gene DBに登録されているマウスの遺伝子に対し、以下のように算出されたシングルジーン率を用いた。
シングルジーン率：単一遺伝子にヒットした配列の総数/遺伝子にヒットした配列の総数
【０１０４】
マウスFosをベイト蛋白質とし、ライブラリーはマウス組織から抽出したmRNAを用いて、IVVセレクションを行い、シーケンサーにより塩基配列解析した。具体的には、下記の実施例１に記載されたように行った。
【０１０５】
続いてIVV解析システム(In Vitro Virus Analysis System: IWAS)で遺伝子解析を行った(Genome Research vol.15 pp710-717 (2005))。
【０１０６】
セレクション条件として、実験条件(1)４サイクル、１段セレクション、実験条件(2)４サイクル、２段セレクションの実験条件で行い、各条件で配列解析を行い、IVVの配列データにおいて、シングルジーン率を求めた。結果は、図６に示す。実験条件(1)では、241配列解析し、シングルジーン率は42％であった。条件(2)では、131配列解析し、シングルジーン率は24％であった。
【０１０７】
得られたIVVの配列データについて、公共のデータベースを利用して、選択的スプライシングのバリアント解析を以下のように行った。
【０１０８】
(a) ASD (Alternative Splicing Database) の中から、選択的に変化するエクソンの領域のみを抽出しFASTA 形式のファイルとして保存した。
【０１０９】
(b) IVV 配列を (a) の 選択的エクソンに対してBLASTで相同性検索を行った。
その際の閾値は、期待値が0.001以下、相同性が90%以上、領域の長さが 60bp以上、とした。その結果、IVV 配列と選択的エクソンの対応が得られた。
【０１１０】
(c) CDS 領域内に存在するもので重複するものを統合し、その中にIVV 配列と、それに
対応する選択的エクソンが存在する遺伝子を抽出した。
【０１１１】
Eefldに関する結果を、図７に示す。実験条件(1)では、Eef1dの配列は、１本であり、正確に相互作用部位を決定できないが、実験条件(2)では、Eef1dは複数本得られているので、大変正確に相互作用部位が決定でき、それにより、選択的エクソンを特定することが出来る。
【０１１２】
＜参考例２＞
一つの遺伝子について幾通りもの部分配列を包含したライブラリーを用いてSNPについて検討した例を示す。
【０１１３】
ベイトとしてマウスFosの代わりにヒトFosを、ライブラリーとしてマウス脳組織から抽出したmRNAの代わりにヒト脳組織から抽出したmRNAを用いて、参考例１と同様に、シングルジーン率を指標にして条件を検討した。但し、シングルジーン率は、Entrez gene DBに登録されているヒトの遺伝子に対して算出した。
【０１１４】
セレクション条件として、実験条件(3)２サイクル、１段セレクション、実験条件(4)４サイクル、１段セレクション、実験条件(5)５サイクル、２段セレクションの実験条件で行い、各条件で配列解析を行い、IVVの配列データにおいて、シングルジーン率を求めた。結果は、図８に示す。実験条件(3)では、72配列解析し、シングルジーン率は７９％であった。実験条件条件(4)では、74配列解析し、シングルジーン率は44％であった。実験条件条件(5)では、57配列解析し、シングルジーン率は33％であった。
【０１１５】
得られたIVVの配列データについて、公共のデータベースを利用して、SNPs解析を以下のように行った。
【０１１６】
(a) IVV 配列をRefSeq 配列に対してBLASTで相同性検索を行った。その際の閾値は、期待値が10以下、相同性が90%以上とした。ここからIVV 配列と RefSeq ID との対応表を作成した。
【０１１７】
(b) dbSNPのSNP 配列は対応する RefSeq の ID が割り振られているため、そのデータを抽出してSNP と RefSeq ID との対応表を作成した。
【０１１８】
(c) 双方の対応表に一致する RefSeq ID を抽出し、複数の IVV 配列や、複数の SNP が、ひとつの RefSeq ID に対応している場合があったため、それらを統合した。
【０１１９】
(d) 次に dbSNP から対応する SNP の周辺配列(FASTA形式)を抽出した。IVV 配列と SNP
周辺配列をSIM4によってアライメントし、実際の位置関係を確認した。
その結果、IVV 配列上に SNP が位置していることが確認できた。
【０１２０】
(e) それらの中から、コード領域に存在するもの（cSNP）を選別し、さらにアミノ酸に変化を与えるもの（Non-synonymous cSNP）を選別した。
【０１２１】
JUNに関する結果を図８に示す。実験条件(3)では、JUNの配列は、１本も検出されなかった。実験条件(4)では、１本検出できたので、相互作用解析は出来るが、正確な相互作用部位は抽出できず、SNPsも絞り込めない。実験条件(5)では、複数本検出できたので、JUN のFOSとの相互作用部位に対応する1つの Non-synonymous cSNP が存在することを確認できた（図９）。
【０１２２】
以上から、一つの遺伝子について幾通りもの部分配列を包含したライブラリーを効率よ
く得ることが、選択的スプライシングによってDNA配列やmRNA配列の変化、SNPsなどに由来するDNA配列やmRNA配列の変化等を追うために重要であることがわかる。
【０１２３】
＜実施例１＞
マウスc-Fosをベイト蛋白質とし、ライブラリーはマウス脳組織から抽出したmRNAを用いて、IVVセレクションを行った(Genome Research vol.15 pp710-717 (2005))。具体的には、以下の通りであった。
【０１２４】
<1-1>cDNAライブラリーの調製
Chechik et al. 1996 BioTechniques 21: 526-534の方法に従って、マウス脳由来のpoly(A)+ mRNAライブラリー(Clontech)又はヒト脳由来poly(A)+ mRNAライブラリー(Cosmo Bio)から、プライマー(TCATCGTCCTTGTAGTCAAGCTTNNNNNNNNN(配列番号１))を用いるランダムプライミングによる逆転写(RT)及び増幅を行い、cDNAライブラリーを調製した。5'リン酸化dsDNAは、SuperScriptII Double Strand cDNA Synthesis Kit (Invitrogen)を用いて得た。5'リン酸化dsDNAにおいては、合成二本鎖アダプター(GGAATTCG及びGAACAACAACAACAACAAACAACAACAAAATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGCGAATTCC(配列番号２))がセンスcDNA鎖の5'端に結合することを利用して、アダプター結合cDNAライブラリーを、プライマー5'IVVlib (GGAAGATCTATTTAGGTGACACTATAGAACAACAACAACAACAAACAACAACAAAATG(配列番号３))及び3'IVVlib (ttttttttcttgtcgtcatcgtccttgtagTCAAGC(配列番号４))を用いてPCRにより増幅した。
【０１２５】
ついで、cDNAライブラリーの転写、及び、PEG Puroスペーサーとの連結を行った(Miyamoto-Sato et al. 2003 Nucleic Acids Res. 31: e78)。
【０１２６】
<1-2>ベイトRNAテンプレートの調製
ベイトのFos（アミノ酸118-211の部分）のDNAテンプレートは、pCMV-FosCBPzz (Miyamoto-Sato et al. 2003 Nucleic Acids Res. 31: e78)から、delta-TMV配列(Sleat et al. 1988 Nucleic Acids Res. 16: 3127-3140)を含むプライマー5'FosCBPzz(gaatttaggtgacactatagaaACAATTACTATTTACAATTACAatggctagcatgactggtggacag(配列番号５))及びプライマー3'FosCBPzz (GGATCTCCATTCGCCATTCA(配列番号６))を用いて、95℃, 1 minの後、 (98℃, 20 sec; 55℃, 1 min; 72℃, 4 min) 15サイクルの条件でPCRにより調製した。このテンプレートは、Fosの一部、ならびに、TAP法のための、カルモジュリン結合蛋白質(CBP)及びプロテインA (zドメイン)を含む。
【０１２７】
ベイトのMdm2（アミノ酸1-188の部分）のDNAテンプレートはヒト脳poly(A)+ mRNAライブラリー(Cosmo Bio)からクローニングにより調製した。すなわち、逆転写後、PCR (94℃
2 min; (94℃ 30 sec, 62℃ 30 sec, 73℃ 2 min) 15サイクル; 73℃ 15 min)を、プライマーhuman_5'T7+mdm2 (atggctagcatgactggtggacagcaaatgggtcgcggatccATgTgCAATACCAACATgTCTgTAC(配列番号７))及びhuman_3'mdm2-564 (actatcagatttgtggcgttttctttgtcgttcacc(配列番号８))により行った。また、pCMVFosCBPzzから、PCR(上記PCRと同条件)を、プライマーhuman_5'mdm2+CBP (ggtgaacgacaaagaaaacgccacaaatctgatagtctcgagctcaagagaagatggaaaaagaatttcatag(配列番号９))及び3'FosCBPzzにより行った。両方の増幅断片を用いて、プライマーhuman_5'T7+mdm2及び3'FosCBPzzを用いてオーバーラップPCR(上記PCRと同条件)を行い、その増幅産物から、プライマー5'SP6(O')T7 (GAATTTAGGTGACACTATAGAAacaattactatttacaattacaATGGCTAGCATGACTGGTGGACag(配列番号１０))及び3'FosCBPzzを用いてさらにPCR(上記PCRと同条件)を行った。
【０１２８】
これらのDNAテンプレートから、Miyamoto-Sato et al. 2003 Nucleic Acids Res. 31: e78に記載の方法で、mRNAテンプレートを調製した。
【０１２９】
<1-3>無細胞共翻訳及びIVVセレクション
無細胞共翻訳を、200 nMの上記で調製したマウス又はヒト脳IVV mRNAライブラリー（プレイ）、400 nM fos又はmdm2 mRNA（ベイト）を用いて、400 nM DNA (Jun/FosのAP1複合体に結合する５リピートTGACTCA配列(Chinenov and Kerppola 2001))の存在下又は非存在下で、Wheat Germ Extract (Promega)により、26℃で1 h行った。二段又は一段の精製（セレクション）は、TAP法(Rigaut et al. 1999 Nat. Biotechnol. 17: 1030-1032)に従って行った。
【０１３０】
セレクションにより得られたIVVライブラリーに対し、one-step RT-PCR kit (QIAGEN)を用いて、プライマー5'IVVlib及び3'IVVlibによりRT-PCRを行い、ライブラリーを増幅した。RT-PCR産物をCHROMA SPIN-1000 Columns (Clontech)で精製し、PCR Cloning Kit (QIAGEN)を用いてクローニングした。
【０１３１】
配列決定には、Qpix (GENETIX)及びGenePCR System 2700 (Applied Biosystems)を用いて、ベクター特異的プライマー(M13R: gAAACAgCTATgACCATgATTACg(配列番号１１)及びM13F: gTTTTCCCAgTCACgACgTTg(配列番号１２))によりコロニーPCRを行った。コロニーPCR産物の精製は、BioRobot 8000 (QIAGEN)を用いて行い、産物の配列は、ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)を用いて決定した。
【０１３２】
ラウンド毎に、ライブラリーのテンプレートを増幅するRT-PCRの条件（サイクル数）を検討した。RT-PCRにより増幅したDNAテンプレート量が、飽和量１００％とした場合５９％以上となる最初のサイクル数を採用すると（表１）、図１０に示すように、一段セレクション（プロテインＡのみ）では、第３ラウンド（図１０の星印）でサイクル数は一定になった。サイクル数が一定になった後のセレクションで、シングルジーン率が顕著に低下し始め、特に二回セレクションを行うと、相互作用部位を正確に抽出するために適した、一つの遺伝子について十分な部分配列を包含したライブラリーが得られることが判明した。また、二段セレクション（プロテインＡ及びカルモジュリン）では、サイクル数が一定になった第３ラウンド（図１０の星印）からもう一回、二段セレクションを行うと、相互作用部位を正確に抽出するために適した、一つの遺伝子について十分な部分配列を包含したライブラリーが得られることが判明した。
【０１３３】
【表１】
2007181453.tif 000003
【０１３４】
ヒトMDM2を用いた場合の結果を表２に示す。ヒトMDM2をベイト蛋白質とし、ライブラリーはヒト脳組織から抽出したmRNAを用いて、IVVの一段セレクションを行い、図１０と同様に、サイクル数が一定になった後、二回のセレクションを行うと、一つの遺伝子について十分な部分配列を包含したライブラリーが得られることが判明した。
【０１３５】
【表２】
2007181453.tif 000004
【０１３６】
＜参考例３＞
FOS/JUNを例として、「IVV共通インタラクト領域」、「IVV全長インタラクト領域」を決定した。
【０１３７】
FOSをベイトとして、ライブラリーはヒト脳組織から抽出したmRNAを用いて、IVVセレクションを行った(Genome Research vol.15 pp710-717(2005))。その結果得られたプレイ遺伝子のJUN(Refseq ID: NM_002228.2)について、IVV配列として、下記のIVV(1)〜IVV(9)を
得た（図１２）。IVV(1)〜IVV(9)をアライメントすることで、「IVV共通インタラクト領域」、「IVV全長インタラクト領域」を得た。この「IVV共通インタラクト領域」は、PDBにより予測される相互作用領域（アミノ酸番号286〜318（286, 287, 290, 291, 293, 294, 297, 298, 300, 301, 304, 305, 307, 308, 311, 312, 314, 315, 318））と良く一致していた。
【０１３８】
プレイJUN(Refseq ID: NM_002228.2)の「IVVインタラクト領域」：
IVV(1): 050517_5_D1_C05_5_D1C5_034.seq; 284-327 
IVV(2): 050517_5_D1_H05_5_D1H5_044.seq; 257-326 
IVV(3): 050519_m5_2_G09_m5_2_G9_068.seq; 282-326
IVV(4): D1_A12.seq; 257-326 
IVV(5): D1_D12.seq; 284-327 
IVV(6): D1_E02.seq; 277-331 
IVV(7): H1_M17.seq; 284-327
IVV(8): d1_5th_c04.seq; 277-331
IVV(9): d1_5th_f12.seq; 257-326
【０１３９】
プレイJUNの「IVV共通インタラクト領域」：282-326
プレイJUNの「IVV全長インタラクト領域」：257-331
【０１４０】
＜参考例４＞
c-Fosをベイト蛋白質とし、ライブラリーとしてはマウス脳組織から抽出したmRNAを用いて、IVVセレクションを行い、シーケンサーにより配列解析した。続いてIVV解析システム(IWAS)で遺伝子解析を行い、プレイの一次DBを得た(Genome Research vol.15 pp710-717(2005))。
【０１４１】
ベイトc-Fosとの相互作用を確認したプレイ(Jun/ Tro1/ Tro2/ Eef1d/ Ship1/ Opt/ JunD/ C130020M04Rik/ Psmc5/ FLJ32000/ Snapc5/Rit2)について（図１３Ａ：プルダウンによるプレイとベイトc-Fosとの相互作用確認）、一次ＤＢに基づき、「IVV共通インタラクト領域」を決定し、それを含む最長のIVV配列を選択した。
選択された配列を以下に示す。
【０１４２】
1. Jun
DNA配列(配列番号１３)
GCGGATCAAGGCAGAGAGGAAGCGCATGAGGAACCGCATTGCCGCCTCCAAGTGCCGGAAAAGGAAGCTGGAGCGGATCGCTCGGCTAGAGGAAAAAGTGAAAACCTTGAAAGCGCAAAACTCCGAGCTGGCATCCACGGCCAACATGCTCAGGGAACAGGTGGCACAGCTTAAGCAGAAAGTCATGAACCACGTTAACAGTGGGTGCCAACTCATGCTAACACAGCAG
アミノ酸配列(配列番号１４)
RIKAERKRMRNRIAASKCRKRKLERIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNHVNSGCQLMLTQQ
【０１４３】
2. Tro1
DNA配列(配列番号１５)
GATTGAGGCATCTAACAGACAGATTGGGGCATCTAACAGACAAACTGAGGCATCTAACAGACAGATTGGGCATCTAACAGACAGACTGAGGCATCTAACAGACAGATTGGGGCATcTAACAGACAGACTGATGCATCTAACAGACAGACTGATGCATCTAACAGACAGACTGAGGCATCTAGCAGACAGACAGAGGCATCTAGCAGACAGACTG
アミノ酸配列(配列番号１６)
IEASNRQIGASNRQTEASNRQIGHLTDRLRHLTDRLGHLTDRLMHLTDRLMHLTDRLRHLADRQRHLADRL
【０１４４】
3. Tro2
DNA配列(配列番号１７)
GAGGCATCTAACAGACAGATTGGGGCATCTAACAGACAGACTGAGGCATCTAACAGACAGATTGGGGCATCTAACAGACAGACTGATGCATCTAACAGACAGACTGAGGCATCTAGCAGACAGACAGAGGCATCTAGCAGACAGGCAGAGGCAC
アミノ酸配列(配列番号１８)
RHLTDRLGHLTDRLRHLTDRLGHLTDRLMHLTDRLRHLADRQRHLADRQRH
【０１４５】
4. Eef1d
DNA配列(配列番号１９)
CCACAGTGAGCTCATTGTGAGGATTACCAGTCTGGAAGTGGAGAATCAGAACCTTCGAGGCGTGGTGCAAGATTTGCAGCAGGCCATTTCCAAGTTGGAGGCCCGGCTGAGCTCTCTAGAGAAGAGTTCACCTACTCCCCGAGCCACGGCCCCACAGACCCG
アミノ酸配列(配列番号２０)
HSELIVRITSLEVENQNLRGVVQDLQQAISKLEARLSSLEKSSPTPRATAPQTR
【０１４６】
5. Schip1
DNA配列(配列番号２１)
CCCACACATGCCTCACATAAGCGAATGTTTGATGAAAAGAAGCTTAAAGCCCACCGACCTGAGAGACATGACTATCGGGCAGCTACAAGTGATCGTCAATGACCTCCACTCCCAGATTGAGCGTTTGAATGAAGAGTTGGTCCAGCTGCTCCTTATTCGAGATGAGCTGCACACAGAACAAGATGCCATGCTGGTGGACATTGAAGACTTGACTAGACACGCTGAGAAGGAGCAG
アミノ酸配列(配列番号２２)
PHMPHISECLMKRSLKPTDLRDMTIGQLQVIVNDLHSQIERLNEELVQLLLIRDELHTEQDAMLVDIEDLTRHAEKEQ
【０１４７】
6. Optinurin
DNA配列(配列番号２３)
GCTGAAGACCCAGGTGGAGCAGGAAGTGGAGCATCTGAAGATCCAGGTGATGCGCCTTCGGGCTGAAAAGGCAGACCTGCTGGGCATCGTCTCAGAACTGCAGCTCAAACTCAACTCCGGCGGCTCCTcGGAAGACTCCTTcGTTGAGATCAGGATGACCGAAGGAGAGACTGAAGGGGCAATGAAGGAGATGAAGAGCTGCCCTACACCCaCAAGAACAGACCCCATCAGCTTGAGCAACTGTACAGAGGATGCCAGGAGTTGTGCGGAGTTTGAAGAACTGACTGTGAGCCAGCTTcTGCTTTGCCTAAGGGAAGGAAACCAA
アミノ酸配列(配列番号２４)
LKTQVEQEVEHLKIQVMRLRAEKADLLGIVSELQLKLNSGGSSEDSFVEIRMTEGETEGAMKEMKSCPTPTRTDPISLSNCTEDARSCAEFEELTVSQLLLCLREGNQ
【０１４８】
7. JunD
DNA配列(配列番号２５)
CAAGAGGCTGCGCAACCGCATCGCCGCCTCCAAATGCCGCAAGCGCAAGCTGGAGCGTATCTCGCGCCTGAAGGAGAAAGTCAAGACCCTCAAAAGCCAGAACACCGAGCTGGCGTCCACCGCCAGCCTGCTGCGCGAGCAGGTGGCGCAGCTCAAACAGAAAGTCCTCAGCCACGTCAACAGCGGCTGCCAGCTGCTGCCCCAGCACCAGGCC
アミノ酸配列(配列番号２６)
KRLRNRIAASKCRKRKLERISRLKEKVKTLKSQNTELASTASLLREQVAQLKQKVLSHVNSGCQLLPQHQA
【０１４９】
8. C130020M04Rik
DNA配列(配列番号２７)
CGATGCCGGCAAAAGCGGAAACTGTGGGTGTCCTCCCTGGAAAAGAAGGCAGAAGAACTTACTTCTCAGAACATTCAGCTGAGTAATGAAGTCACATTACTACGCAATGAGGTGGCTCAGCTGAAGCAGCTACTGTTAGCTCATAAAGATTGTCCAGTCACCGCACAA
アミノ酸配列(配列番号２８)
RCRQKRKLWVSSLEKKAEELTSQNIQLSNEVTLLRNEVAQLKQLLLAHKDCPVTAQ
【０１５０】
9. Psmc5
DNA配列(配列番号２９)
GCCAGAATCTCCGTAGACTGCAGGCACAGAGGAATGAGCTGAATGCAAAAGTTCGCCTGTTGCGGGAGGAGCTGCAGCTGTTGCAGGAACAGGGCTCCTACGTTGGAGAAGTCGTGAGGGCAGA
アミノ酸配列(配列番号３０)
RQNLRRLQAQRNELNAKVRLLREELQLLQEQGSYVGEVVRAE
【０１５１】
10. FLJ32000
DNA配列(配列番号３１)
GGAAGAAGTTCAGCAGCCTGCAGAAGGAGATCGAAGAGCGCACCAACGACATCGAGCTCCTCAAGTCGGAGCGGATGAAGCTGCAGGGCATCATCAGATCCCTGGAGAAAGACATCCAAGGGCTCAAGAGAGAGATCCAGGAGAGGGACGAGACCATTCAAGACATGGAGAAGCTTGACTACAAGGACGATTATAATTCAAACCTAGAGATC
アミノ酸配列(配列番号３２)
RKKFSSLQKEIEERTNDIELLKSERMKLQGIIRSLEKDIQGLKREIQERDETIQDMEKLDYKDDYNSNLEIKL
【０１５２】
11. Snapc5
DNA配列(配列番号３３)
CGCCCTAAGGAAGTGGAAGGGGACGTTGAGTCGACTGCAGGAGCTCCGCAAGGAGGTGGAAACCCCGCTGCGTcTAAAGGCGGCTCTACACGACCAACTGAACCGCCTCAAGGTTGAAGAATTAGCCCTTCAATCCATGATAAATTCTCGAGGAAGGACCGAGACACTGTCTTCTCAGCCTGCaCCTGAACAGTTATGTGATATGTCCCTACATGTAGACAACGAAGTGACAATAAATCAGACTAGGCTG
アミノ酸配列(配列番号３４)
ALRKWKGTLSRLQELRKEVETPLRLKAALHDQLNRLKVEELALQSMINSRGRTETLSSQPAPEQLCDMSLHVDNEVTINQTRL
【０１５３】
12. Rit2
DNA配列(配列番号３５)
TGCAGCCCTGCGATTCGGTATCGATGATGCTCTTCAAGGCTTAGTGAGAGAAATTCGCAGGAAGGAATCCATGCTGCCCTTGGTGGAAAGGAAATTGAAGAGGAAGGACAGCCTGTGGAAGAAGATAAAAGCCTCCCTGAAGAAGAAGAGG
アミノ酸配列(配列番号３６)
AALRFGIDDALQGLVREIRRKESMLPLVERKLKRKDSLWKKIKASLKKKR
【０１５４】
このように選択されたIVV配列を有するプレイの遺伝子からベイト用テンプレートを作成し（図１４）、プルダウンにより、ベイトとしての機能について検証した。その結果、発現しなかった一つのクローン（C130020M04Rik）を除いて、１２個中１１個がベイトとして機能可能なことが確認できた（図１３Ｂ：プルダウンによる各ベイトとプレイc-Fosとの相互作用確認）。このことは、この方法によるベイト設計が非常に効率的であることを示している。
【０１５５】
各手順の詳細は以下の通りであった。
１．ベイト蛋白質mRNAの準備
選択されたクローンを持つプラスミドをテンプレート (Genome Research vol.15 pp710-717を参照) としてExTaq (Takara)を用いたPCR (1st PCR)により、それぞれの遺伝子の5'側にenhancer+T7tag、3'側にカルモジュリン結合蛋白質 (CBP)を一部付加したDNA断片を作成し、QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN)で精製した。そのDNA断片の3'側タグを介してCBP+zz domain (CBPzz断片)を持つDNAをオーバーラップPCR (2nd PCR)により結合、1st PCRと同様に処理した。2nd PCR産物の5'末端にSP6 promotorを付加するPCR (3rd
PCR)を行い、1st PCRと同様に処理することで転写のテンプレートDNAを用意した。
【０１５６】
準備したテンプレートDNAとCap analoge (Invitrogen)を用いてRiboMAX Large Scale RNA Production System-SP (Promega)により転写反応を行い、mRNAを作成した。mRNAはRNeasy Mini Kit (QIAGEN)で精製した。
【０１５７】
２．プレイc-FOS mRNAの準備
ベイトc-FOSをコードするプラスミドをテンプレートとしてExTaq (Takara)を用いたPCR
(4th PCR、プライマーセット：Table4)によりc-FOSをコードするDNA断片を増幅、QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN)で精製した。4th PCRの産物をテンプレートとしてPCR
(5th PCR)を行い、QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN)で精製した。この5th PCR産物、RiboMAX Large Scale RNA Production System-SP (Promega)とCap analoge (Invitrogen)を用いて転写を行い、mRNAを作成した。mRNAはRNeasy Mini Kit (QIAGEN)で精製した。
【０１５８】
３．プルダウン実験
作成したmRNAからベイト蛋白質とプレイ蛋白質を小麦胚芽抽出液 (Promega)を用いたin
vitro翻訳により作成した。この際にプレイ蛋白質はC末端を蛍光標識しておいた。ベイト蛋白質とプレイ蛋白質を混合し、ベイト蛋白質をIgG ビーズ (SIGMA)に固定した。固定したビーズを洗浄後、ビーズとベイト蛋白質-プレイ蛋白質複合体の結合を切断し、電気泳動によりベイト蛋白質と結合しているプレイ蛋白質を検出した。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】塩基配列の変化によって蛋白質間相互作用が変化する遺伝子の抽出の構成図である。
【図２】バリアント解析の説明図である。
【図３】融合遺伝子解析の説明図である。
【図４】SNPs解析の説明図である。
【図５】変異遺伝子、RNAエディティング解析の説明図である。
【図６】参考例１の条件検討結果を示す。
【図７】Eef1dの相互作用部位における選択的エクソンの解析結果を示す。
【図８】参考例２の条件検討結果を示す。
【図９】JUNとFOSとの相互作用部位におけるSNPの解析結果を示す。
【図１０】シングルジーン率の変化とRT-PCRのラウンド数の関係を示す。
【図１１】蛋白質相互作用大規模解析システムの説明図である。
【図１２】一次ＤＢを利用した結合領域の一例である。
【図１３】プルダウン実験の結果を示す。
【図１４】プレイの遺伝子からのベイト用テンプレート作製の手順の説明図である。
【図１５】スクリーニング方法の一例の説明図である。
【図１】
2007181453.tif 000005
【図２】
2007181453.tif 000006
【図３】
2007181453.tif 000007
【図４】
2007181453.tif 000008
【図５】
2007181453.tif 000009
【図６】
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【図７】
2007181453.tif 000011
【図８】
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【図９】
2007181453.tif 000013
【図１０】
2007181453.tif 000014
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2007181453.tif 000017
【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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