(57)【要約】チャネルまたは他の容器から、複数の流体滴を音響排出するための方法を提供する。各々の流体滴は、１つ以上の粒子または他の局在的な体積を含む、この局在的な体積（生存細胞であり得る）は基板表面、容器、またはチャネル上の部位に向かって排出される。キャリア流体からの細胞の選択的排出により、細胞の特性に基づき分類可能な、統合された細胞分類およびアレイ配置システムもまた、提供される。細胞は、調節可能な速度および軌道で排出され得る。排出された細胞は、各々の部位が単一の細胞を含むアレイを形成するよう指向され得る。他の細胞アレイアプローチよりも効果的、迅速、柔軟、そして経済的に単一の生存細胞のアレイを形成する方法が、さらに提供される。この方法は、細胞特性の定量的測定または半定量的測定に基づく細胞の効果的、連続的、かつ同時の分類を可能にし、また非二成分の、いくつかに枝分かれした決定を可能にする。
2004530863.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分離方法であって、以下：
（ａ）表面を有する流体において、排出のために該表面に十分近くに位置する単一の局在的な体積を検出する工程であって、該流体は、該流体と異なる音響インピーダンスを有する複数の局在的な体積を含む、工程；
（ｂ）該単一の局在的な体積が１つ以上の特性を有するか否かを決定する工程；
（ｃ）工程（ｂ）における１つ以上の特性の決定に基づき、該流体からの排出についての該単一の局在的な体積を選択する工程；および
（ｄ）集束されたエネルギーの使用により、該流体から該単一の局在的な体積を排出する工程；
を包含する、方法。
【請求項２】
前記集束されたエネルギーが、集束された音響エネルギーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記集束されたエネルギーが、集束された電磁エネルギーである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記局在的な体積が、固形粒子またはゲル状粒子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記局在的な体積が、細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記局在的な体積が、生存細胞を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記局在的な体積が、前記流体表面に対して実質的に垂直な軌道で排出される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記局在的な体積が、前記流体表面に対して垂直な非ゼロ速度成分および該流体表面に対して平行な非ゼロ速度成分を有して排出されて軌道を生じ、これによって、該局在的な体積が該流体表面に対して平行な方向への正味の移動を生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記軌道が、方向制御可能であり、その結果、前記流体表面に対して平行な正味の移動の方向もまた、方向制御可能である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記流体表面に対して平行な移動の非垂直距離が、前記集束されたエネルギーを変化させることによって制御可能である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記流体表面に対して平行な移動の垂直距離が、前記集束されたエネルギーを変化させることにより制御可能である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記工程（ｂ）における前記１つ以上の特性の決定が、定量的決定または半定量的決定であり、そして工程（ｃ）における選択が、非排出軌道と複数排出軌道との間の選択であり、かつ該定量的決定または半定量的決定に依存する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記流体が、流体チャネルに含まれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記（ａ）の検出および前記（ｂ）の決定からのデータが、プロセッサ入力され、それによって、該プロセッサは、該測定データ、プログラムされた選択基準、およびシステムパラメータを参照して、前記（ｃ）の選択および前記（ｄ）の排出を指示する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記局在的な体積が、生存細胞を含む制限された体積である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
流体表面を有するキャリア流体からの１つ以上の制限された体積の分離システムであって、該キャリア流体は、該キャリア流体と異なる音響インピーダンスを有する複数の制限された体積を含み、該システムは、以下：
流体容器；
局在的な体積を検出し、そして該局在的な体積の特性を決定するための検出器；および
該キャリア流体からの流体滴の音響排出器であって、音響放射を生じるための音響放射生成器、および該流体表面付近の集束点に該音響放射を集束させるための集束手段、を備える、音響排出器、
を備え、ここで、排出のために該流体表面に十分近くで検出される、該キャリア流体に存在する該制限された体積は、該制限された体積が１つ以上の特性を有するか否かに依存して、流体滴中で、該キャリア流体から標的に対して音響排出され得る、システム。
【請求項１７】
前記集束手段が、前記キャリア流体の所望の点における前記集束点に前記音響放射を集束させるのを可能にするような適切な位置に、前記容器と音響連結関係にある前記排出器を位置決めするための手段をさらに備える、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１８】
前記検出器、前記音響排出器、および前記容器に対して該音響排出器を位置決めするための前記手段を統合し、前記検出された特性に基づいて選択された標的に対して前記制限された体積を排出するためのプロセッサをさらに備える、請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
前記流体容器が、表面を有する流体チャネルを備え、該流体チャネルは、前記複数の制限された体積を含む前記キャリア流体が、該チャネルを通って自由に流動することを可能にする寸法を有する、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
前記流体チャネルは、前記複数の制限された体積または該複数の制限された体積のサブセットが、実質的に単一のファイルにおいてのみ、該チャネルを通って自由に流動することを可能にする寸法を有する、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２１】
前記標的が、アレイ部位または標的流体チャネルである、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２２】
前記検出器による前記特性の定量的測定または半定量的測定に基づき、前記制限された体積が、標的チャネルへと排出されないか、該標的チャネルへと排出されるか、またはアレイ部位上に排出されるように選択される、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２３】
前記アレイ部位が、ウェルプレートウェルである、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２４】
前記標的チャネルへと排出される前記制限された体積が、該標的チャネルから引き続く標的チャネルまたは引き続くアレイ部位に排出され得る、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２５】
前記制限された体積が細胞である、請求項１６または２２に記載のシステム。
【請求項２６】
前記細胞が生存細胞である、請求項２５に記載のシステム。
【請求項２７】
表面を有するキャリア流体からの１つ以上の制限された体積の分離システムであって、該キャリア流体は、該キャリア流体と異なる音響インピーダンスを有する複数の制限された体積を含み、該システムは、以下：
容器；
該表面に対して実質的に平行に方向付けられた基板表面を有する基板；
該キャリア流体から、開口部を通って該基板表面上の位置へと、該キャリア流体と異なる音響インピーダンスを有する制限された体積を音響排出するための手段、
を備え、ここで、該開口部の下の流体表面付近で検出される、該キャリア流体に存在する該制限された体積は、該局在的な体積が１つ以上の特性を有するか否かに基づき、流体滴中で、該キャリア流体から基板位置へと音響排出され得る、システム。
【請求項２８】
前記検出器、前記音響排出手段、および前記容器に対して該音響排出器を位置決めするための前記手段を統合し、前記検出された１つ以上の特性に基づいて選択された標的に対して前記制限された体積を排出するためのプロセッサをさらに備える、請求項２７に記載のシステム。
【請求項２９】
前記流体容器が、表面を有する流体チャネルを有し、該流体チャネルは、前記複数の制限された体積を含む前記キャリア流体が、該チャネルを通って自由に流動することを可能にする寸法を有する、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３０】
前記流体チャネルは、前記複数の制限された体積または該複数の制限された体積のサブセットが、実質的に単一のファイルにおいてのみ、該チャネルを通って自由に流動することを可能にする寸法を有する寸法を有する、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３１】
前記標的が、前記基板表面上のアレイ部位または標的流体チャネルである、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３２】
前記検出器による前記特性の定量的測定または半定量的測定に基づき、前記制限された体積が、標的チャネルへと排出されないか、該標的チャネルへと排出されるか、またはアレイ部位上に排出されるように選択される、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３３】
前記アレイ部位が、ウェルプレートウェルである、請求項３２に記載のシステム。
【請求項３４】
前記標的チャネルへと排出される前記制限された体積が、該標的チャネルから引き続く標的チャネルまたは引き続くアレイ部位に排出され得る、請求項３２に記載のシステム。
【請求項３５】
前記制限された体積が細胞である、請求項２７または３２に記載のシステム。
【請求項３６】
前記細胞が生存細胞である、請求項３５に記載のシステム。
【請求項３７】
培地表面上に配置された細胞のコロニーから１つ以上の細胞を、基板表面または容器を含む標的に対して排出するための方法であって
該方法は、コロニーを位置決めする工程および集束されたエネルギーにより該細胞を排出する工程を包含する、方法。
【請求項３８】
前記排出が、集束された音響エネルギーによる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記位置決め工程が、前記培地表面の音響インピーダンスを測定することによりもたらされる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記培地がゲルまたは半固体であり、該方法は、該培地表面に対して平行であり、かつ全体的に前記細胞のコロニーの境界の下にある平面により横断される体積において、該培地を液化する工程をさらに包含する、請求項３７または３９に記載の方法。
【請求項４１】
培地の表面に位置する細胞のコロニーから細胞を排出するためのシステムであって、以下：
音響エネルギー源；
該音響エネルギー源からの音響エネルギーを集束点に集束するための手段；
該培地または該細胞のコロニーにおける任意の点に該集束点を位置決めするための手段、
を備え、ここで、該細胞は、該細胞を排出する一定量の音響エネルギーを送達するのに十分な動力によって、および該送達に十分な時間、該集束点に音響エネルギーを送達することにより排出される、システム。
【請求項４２】
前記音響エネルギー源、音響エネルギーを集束するための前記手段、および前記培地における任意の点に前記集束点を位置決めするための手段を統合し、前記細胞コロニーから選択された標的に該細胞を排出するためのプロセッサをさらに備える、請求項４１に記載のシステム。
【請求項４３】
前記細胞のコロニーが、前記表面を横切る集束点をスキャンし、細胞のコロニーを有さない該表面の領域と異なる音響インピーダンスを有する表面の領域を検出することにより位置決めされる、請求項４１に記載のシステム。
【請求項４４】
前記培地がゲルを含み、音響エネルギーが、該培地表面に対して平行であり、かつ全体的に該細胞のコロニーの境界の下にある平面により横断される体積への該細胞の排出の前に、該培地のバルクにさらに送達される、請求項４１または４２に記載のシステム。
【請求項４５】
前記音響エネルギーが、前記体積の幾何学的中心で該体積に送達され、該幾何学的中心は、前記バルクにおける前記培地の表面の一定距離下に位置する、請求項４４に記載のシステム。
【請求項４６】
前記体積の幾何学的中心は、前記バルクにおける前記培地の表面の約５０〜約１５０μｍ下に位置する、請求項４４に記載のシステム。
【請求項４７】
前記体積中の前記培地が、該体積の幾何学的中心から該培地の表面への排出の前に変化し、それによって、該変化が、前記細胞を排出するための該一定量の音響エネルギーを減少させる、請求項４１に記載のシステム。
【請求項４８】
前記変化が液化であり、該液化は、前記体積の音響インピーダンスまたは音響減衰における変化を測定することにより検出される、請求項４７に記載のシステム。
【請求項４９】
前記標的が、アレイ部位または流体チャネルである、請求項４２に記載のシステム。
【請求項５０】
前記液化が、試薬の堆積、前記コロニーにおける前記細胞の特徴、または前記培地へのエネルギーの送達によって引き起こされる、請求項４８に記載のシステム。
【請求項５１】
前記細胞のコロニーの特性を測定する検出器をさらに備える、請求項４２に記載のシステム。
【請求項５２】
前記検出器による前記特性の定量的測定または半定量的測定に基づき、前記コロニーからの前記細胞が、標的チャネルへと排出されないか、該標的チャネルへと排出されるか、またはアレイ部位上に排出されるように選択される、請求項５１に記載のシステム。
【請求項５３】
前記アレイ部位が、ウェルプレートウェルである、請求項５２に記載のシステム。
【請求項５４】
前記標的容器が流体チャネルである、請求項５２に記載のシステム。
【請求項５５】
前記標的容器へと排出される細胞が、該標的容器から引き続く標的容器または引き続くアレイ部位に排出され得る、請求項５２または５４に記載のシステム。
【請求項５６】
前記細胞が生存細胞である、請求項４１、４２、または５２に記載のシステム。
【請求項５７】
材料の描写された体積における引き続く音響排出を容易にするために該材料を条件付けするための方法であって、該材料の集束点に音響エネルギーを送達する工程を包含する、方法。
【請求項５８】
前記集束点で前記材料が加熱される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記集束点で前記材料が相転移を起こす、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記材料が、ゲル、非晶質固体、または半固体であり、そして前記集束点での前記相転移が液体への相転移である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
前記材料が、表面を有する寒天ゲルであり、前記集束点が前記寒天ゲルの表面下、かつ細胞のコロニー下に位置する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
材料の描写された体積に熱エネルギーを送達する方法であって、該材料における集束点に音響エネルギーを送達する工程を包含する、方法。
【請求項６３】
前記集束点で前記材料が加熱される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記集束点で前記材料が相転移を起こす、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記材料が、ゲル、非晶質固体、または半固体であり、そして前記集束点での前記相転移が液体への相転移である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
前記材料が、表面を有する寒天ゲルであり、前記集束点が前記寒天ゲルの表面下、かつ細胞のコロニー下に位置する、請求項６５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、一般的にキャリア流体中に懸濁された細胞の空間的に指向された排出における収束音響エネルギーの使用に関する。本発明の方法およびデバイスは、細胞の効率的で非破壊的、かつ完全な分類を提供する。
【０００２】
（背景技術）
効率的で、非破壊的で、そして完全な細胞分類法は、基礎生物学的研究および基礎医学的研究における適用を広めた。例えば、細胞分類は、通常、免疫学で使用され、そこでは、特定のマーカーを提示する細胞は、蛍光のような光学的特性を介して、他の細胞から分離される。もう１つの適用は、新形成に対する治療のような、医学的治療においてであり、そこでは、特定の自己細胞型または異種細胞型が、通常、移植に対して望まれる。生体適合性材料および一般的に生体工学の微小製作における進歩は、より効果的な細胞分類方法が、組織工学適用における使用法もまた見出すことを示唆する。
【０００３】
初期の細胞分類デバイスは、物理的パラメータに基いて、細胞を区別した。そのような細胞分類技術は、濾過（これは、細胞の大きさに基づいて選択する）および遠心分離（これは、細胞の密度に基づいて選択する）を含む。これらの方法は、目的の細胞集団が、細胞混合物中のほかの細胞と、大きさまたは密度が有意に異なる場合、効果的である。しかし、個々の細胞集団が、細胞混合物中で、互いに大きさおよび密度が類似する場合、濾過技術も遠心分離技術もどちらもそれらを効果的に分離できない。
【０００４】
これらの欠点を克服するために、表面マーカーまたはエピトープの提示に基づいて細胞集団を区別および分類する技術を開発した。これらの技術は、細胞表面に付着するタグエレメントに基づいて細胞集団を区別し、主要な細胞分類ツールとなる。蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）は、特定の細胞表面マーカーに結合する蛍光抗体標識または蛍光抗体タグを使用する。ほとんどの、そのような分類器は、主として二元的な方法で操作する：選択は、細胞が前もって選ばれた蛍光閾値に基づいて分離をトリガーするのに十分な蛍光ラベルを有するかどうかにのみ基づく。ＦＡＣＳ分類器は、一度に１つの細胞を検査するので、細胞分離の速度は、比較的遅い。一般的に、ＦＡＣＳ分類器は、１０３細胞／秒の速度で、細胞分類を提供し得る。より速い細胞分類速度は可能であるが、いくつかの細胞を損傷し得る。有限数のＦＡＣＳ分類器は、これらが費用がかさみ、熟練された技術によって操作されなければならないので、実験室に存在する。
【０００５】
細胞タグ化を使用するもう１つの分離方法は、高度勾配磁気分離（ＨＧＭＳ）として公知である。磁気ベース分類は、最初に鉱業において使用された。そして、この分類は、この操作に対する、分類された材料の固有の磁気特性における違いによる（Ｆｒａｎｔｚ、米国特許第２，０５６，４２６号を参照のこと）。ＨＧＭＳにおいて、異種細胞集団または細胞混合物は、磁気的にタグ化された細胞部分集団を含み、印加された磁場を通りぬけ、磁気的タグで標識された部分集団の細胞は、磁気供給源に選択的に付着する。磁気的にタグ化された細胞部分集団は、磁気供給源への、または磁気供給源近辺の細胞コレクターへの吸着によって、収集される。ＨＧＭＳの１つの欠点は、ＦＡＣＳより迅速であり得るが、目的の細胞部分集団が、コレクター中で細胞が塊になってしまうことによって、ＨＧＭＳ工程中に損傷し得ることである。分離は単に磁気的タグの存在または非存在に基づくので、ＨＧＭＳは、また主として元来、二元的である。
【０００６】
磁性または蛍光のようなパラメーターに基づく二元的分離技術は、細胞分類における重要な使用法が見出されてきた。しかし、検出された磁性シグナルまたは蛍光シグナルの強度のような、特定のパラメーターの強度に基づいた非二元的方式での細胞の分離に対する必要性が存在する。
【０００７】
最近、細胞に結合した磁気的タグの量に基づいた細胞の分類に対するシステムおよび方法が記載され（Ｚｂｏｒｏｗｓｋｉら、米国特許第６，１２０，７３５号）、それは、タグ化細胞が磁場を通り抜けるチャネルを使用する。この方法は、従来のＦＡＣＳまたはＨＧＭＳに比べて、より高い細胞生存率に匹敵する生存性を維持しつつ、より大きなハイスループットを可能にする。異なる磁気感受性を有する粒子の集団は、流れの中で磁場をかけられ、流れにおける勾配を形成する。チャネル内の分割された流れ区画は、分画された遠心性流れを生成するのに使用される。しかし、これらの分画された細胞の流れ中の粒子は、厳密には分類されず、むしろ特定の画分に濃縮される。従って、細胞の生存性を維持しつつ、よりハイスループットの分画された濃縮方法は、純度の犠牲によって得られる。従って、非二元的分離を実行するための順応性を有し、純度の犠牲を有さない、ハイスループットを可能にする細胞分類の方法に対する必要性が存在する。
【０００８】
細胞分類について、もう１つの最近の記載された方法は、ハイスループットを提供し、単なる濃縮を避けるが、全ての検出された所望されていない細胞をレーザーで破壊することによって細胞を犠牲にする（Ｈｉｒａｋｏら、米国特許第５，１５８，８８９号、１９９２）。
【０００９】
いくつかの細胞分類方法は、Ｆｕｌｗｙｌｅｒら、米国特許第３，７１０，９３３号、ならびにＦｕｌｗｙｌｅｒ、同第３，３８０，５８４号および同第４，１４８，７１８号に記載されるように、チャネル中の流体懸濁細胞の１列の連続的行列を単一の細胞を含む個々の液滴の行列へ分離する能力を含む。個々の液滴の行列は、流れが通過するフローチャンバーまたはオリフィスを、通常４０，０００Ｈｚ程度の頻度で、振動させることによって生成する。これらの液滴は、各々単一の細胞を含み、オリフィスから排出される。この方法において、１列の細胞は、有意な距離、互いから分離され、１列のほとんど近接する細胞の連続的行列を使用する方法における数に比べて、単位時間に検出点または排出点を通過する細胞の数がより少なくなる。従って、分類処理量または分類効率は、比較的低い。なぜなら、選択される細胞は、流体が連続である場合ほどには、迅速に行列から排出され得ないからである。また、多くの細胞を含むチャネルにおいて、個々の細胞の操作に関連して、かなりの非順応性および非効率性がある。例えば、チャネル中の個々の細胞の操作の速度は、本質的に限定される。なぜなら、流れは、チャネルまたは相互に連結したチャネルのシステムにおいて、細胞の衝突の阻害を防止するように遅くされるまたは停止される必要があり得るからである。
【００１０】
そのような流体懸濁細胞分類器の例は、ジェットインエアーソーターであり、これは、通常、市販の哺乳動物細胞分類に対して最適化される。８μｍから１４μｍまでの範囲の直径を有するリンパ球細胞および２００μｍまでの長さの寸法を有する精母細胞は、一般にそのようなデバイスによって分類される。ピエゾベースであるジェットインエアーシステムは、分類される細胞に特定の直径に合わせられ、実質的に異なる平均サイズを有する細胞の部分集団を分類することは困難である。そのようなシステムを異なる細胞サイズまたは流体粘度に適合するために合わせることは、フローチップ直径、シース圧、流速、液滴駆動頻度、駆動振幅、液滴スペーシング、液滴決裂点のようなパラメーターの調節を含む。
【００１１】
ピエゾベースシステムはまた、他の理由について不十分である傾向があり、流れにおける細胞の間隔を空けて、細胞の集中を防止するこれらの必要性を含み、分類操作に対して細胞を迅速に配置する能力を減少する。例えば、細胞の集中を避けるために、１０のうち１つの流体液滴が、１つの細胞を含み得る。従って、１秒当たり３２０００ドロップの流速に対して、１秒当たりほんの３２００細胞がカウントされ、これは、各々の液滴が１つの細胞を含むシステムの使用に比べて、１０倍低い効率である。
【００１２】
従って、フローチップを交換する必要も他の流体パラメーターを調節する必要もない、大きな範囲の粒子サイズを分類できる方法およびシステムに対する必要性が存在する。実際に、目詰まりに対する可能性を排除するための、フローチップを使用しない細胞分類方法および細胞分類システムに対する必要性が存在する。目詰まりを有さずに、細胞の塊と、１つ１つの細胞との間を容易に区別し得、塊が別々に同定され、分類されることを可能にする分類システムおよび分類方法に対する必要性が存在する。エネルギー変換器での周波数および出力設定を単に変えることによって、溶液の変化する粘度に適応して調節され得る分類システムおよび分類方法に対する追加の必要性が存在する。例えば、かなりの平行で多重チャネル分類の使用によって、現在のシステムを越えるスループットレベルおよび効率レベルを経済的に達成し得る細胞分類システムに対する追加の必要性が存在する。分離純度または細胞生存力を犠牲にすることなく、多重パラメーターに従って細胞を区別し、そして単一のパラメーター（非二元的決定をなす）の程度に基づいて細胞を２つ以上の群に分類する改善された方法に対する基本的な必要性がなお存在する。
【００１３】
研究の目的のために、多くの改善が、細胞分類システムに対して望まれる。全体的に見て、例えば、全時間が、細胞混合液（例えば、血液サンプル）を得ることと実験的に分離された細胞を使用することとの間で短くされるように、より効率的にする必要性がある。さらに、実験は、一般的に、少数の特定の細胞型を個々のプレート、皿、ウェル、またはこれらのアレイにプレートすることが必要である。全ての既知の細胞分類方法は、最初、個々に選択される細胞を直接ウェルプレートまたは他の容器に入れて除去することを可能にするよりむしろ、所定の部分集団の全ての細胞を１つの場所に収集するので、より多くの工程が、サンプル収集することと実験に対して準備の整った収集された細胞を有することとの間で必要とされる。かなりの実験室時間および労力が、分離された部分集団全体を単一の容器に入れて収集し、次いで細胞を実験容器中に再分割するよりむしろ、既知の少数の個々に選ばれた細胞を実験での使用のために容器に直接送達することによって節約される。従って、細胞混合物から生存細胞を非二元的に選択的に取り出し、直接実験容器に入れるための手段を使用するための必要性が存在する。この必要性は、音響排出の使用を通して満たされ得る。
【００１４】
個々の生存細胞が流体から排出される、細胞の分類についての現在公知の方法またはシステムは存在しない。従って、流体から生存単一細胞を排出することによって、細胞を分類するための方法および対応するシステムに対する必要性が存在する。この方法および対応するシステムは、好ましくは、非二元的選択を使用し、流体から正確な数の細胞を実験容器に直接送達し得る。分類された細胞を直接実験容器に送達する能力および細胞を単一の本質的な特性またはタグ化された特性に基づいて（ちょうと２ではなく）いくつかの群に分類する能力によって既存の方法と比べた場合、液滴に含まれる個々の選択された細胞の音響排出を使用して細胞を分類するための方法および系は、生存力を減少せずに、増加した順応性および全体的効率を提供する。
【００１５】
（発明の要旨）
従って、先行技術の上記の欠点を克服するシステムおよび方法を提供することが、本発明の目的である。
【００１６】
１つの実施形態において、流体中の局在的な体積を分離する方法を提供し、ここで、各々の局在的な体積は、流体とは異なる音響インピーダンスを有する。検出器は、１つの局在的な体積の位置を同定し、その１つ以上の特性を決定するために使用される。従って、収束エネルギー、好ましくは、収束音響エネルギーは、局在的な体積を流体から液滴として排出するために効果的な方法で、流体に印加される。前述の方法を実行するために好ましいデバイスは、複数の流体液滴の音響排出を可能にするデバイスである。そのようなデバイスは、以下を備える：例えば、その中に懸濁された細胞または他の局在的な体積を運送可能な流体を含むように適合された複数の容器またはレザバ；音響放射を発生する音響排出器および各々のレザバ中の流体表面近くの焦点で収束させるための収束手段；ならびに各々の容器またはレザバと音響連結関係で排出器の位置づけをする手段。好ましくは、各々の容器は、取り外し可能であるか、またはウェルプレート中の個々のウェルからなるか、および／または一列に配列されている。さらに、好ましくは、容器またはレザバは、実質的に互いに音響的に区別できず、含んだ流体の表面近くで、音響エネルギーがエネルギー的に十分収束することを可能にする、適切な音響インピーダンスおよび音響減衰を有する。
【００１７】
前記の方法のバリエーションにおいて、局在的な体積は、基板表面上の流体排出チャネル内での流れに存在するか、または培地（代表的には、寒天または類似する半固体もしくはゲル）上で増殖する細胞コロニー内で生育する細胞である。
【００１８】
他の実施形態において、収束音響排出技術を細胞をまたは他の制限された体積を、流体の表面に平行な面によって実質的に横断されるチャネルまたは他の容器に選択的に分類するために使用するシステムを提供する。この面はまた、液滴が排出される容器を横断する。個々の細胞または他の制限された体積は選択され、次いで、調整可能な速度で、実質的に平面の基板に、この基板上にアレイを形成するように排出され得る。システムのこの操作は、第１のキャリア流体中の細胞または他の制限された体積を含む、第１のレザバと音響的に連結した関係であるように、音響排出器を位置づけすることによって実行される。流体表面の十分近くに、制限された体積が存在することが、音響的に検出された後、排出についての基準として使用される任意の性質は、音響的測定および／または電磁気学的測定によって検出され、この排出器は、キャリア流体内およびその表面近くに焦点を有する音響放射を発生し、指向するように起動される。適用される音響エネルギーは、キャリア流体の液滴の排出を生じる。システムが細胞放出に使用される場合、音響エネルギーは、ただ１つの細胞のみが中に含まれ得るように十分小さい液滴を排出するのに効果的な様式で適用される。好ましくは、液滴は、流体表面の面に平行な成分を有する速度ベクトルで排出される。望まれる場合、この排出器は、第２のレザバと音響的に連結した関係であるように位置づけられ得、このプロセスは、第２の流体の液滴を排出するために上記のように繰り返される。このシステムはまた、複数の流体容器を用いて繰り返し可能なように構成され得る。
【００１９】
さらなる実施形態において、本発明は、他の細胞アレイ形成アプローチより効率的、迅速、順応的かつ経済的に単一の生存細胞のアレイを形成する方法を提供する。本方法は、効果的、連続的かつ同時の選択およびこれらの特性の定量的または半定量的測定に基づいた細胞の分類を可能にする。本方法はまた、多数排出標的、非二元的細胞選択、および複数の分枝決定の使用を可能にする。この配列された細胞は、１つ以上の特定の結合系によって、基板表面に結合され得る。各々の特定の結合系は、リガンドレセプター対のように、同種の部分を特異的に認識する外部マーカー部分を使用する。１つのそのような特異的な結合系は、同種の部分として使用されるビオチンと共に、外部マーカー部分として、形質転換によって産出されるストレプトアビジンを使用する。（細胞の形質転換に対する必要性なしに存在する）内因性外部マーカー部分を使用する結合系の例は、同種の部分として、外部に提示されたＩｇリンパ球クローンおよびエピトープを使用する。
（発明の詳細な説明）
本発明の詳細を記載する前に、本発明は、特定の流体、細胞、生体分子、またはデバイス構造に限定されず、それ自体変化し得ることが理解される。本明細書中で使用される用語は、特定の実施形態のみを記載する目的のためのものであり、限定されることを意図されないこともまた理解される。
【００２０】
本明細書および添付された特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他を規定しない限り、複数の対象を含むことに留意しなければならない。従って、例えば、「容器」または「レザバ」との言及は、単一の容器またはレザバおよび複数の容器またはレザバを含み、「流体」との言及は、単一流体または異なる流体の組合せおよび／もしくは混合物を含み、「生体分子」との言及は、単一分子ならびに生体分子の組合せおよび／または混合物を含む、など。
【００２１】
本発明の記載および請求において、以下の用語は、以下に述べる定義に従って使用される。
【００２２】
用語「局在的な流体の体積」とは、流体の空間的に局在化する体積をいう。代表的には、局在的な流体の体積は、周囲の流体とは異なる物理的特性を有するが、これは、必要とされない。実際には、局在的な流体体積は、この特性が周囲の流体の特性と異なる場合にのみ検出され得る。不飽和（糖によって）水溶液中に懸濁され、そして局部的な流体の糖濃度が大部分の流体の平均糖濃度より高い体積によって取り囲まれる糖の結晶は、詳細に描写するまたは範囲を定める構造を有さない、範囲を定めない局在的な流体の体積の一例である。他の、範囲を定めない局在的な流体の体積は、流体的組成物を含む。そこでは、局在化する脂質領域、もしくは疎水性領域が、親水性（例えば、水性）流体内に含まれるか、または、局在化する親水性（例えば、水性）領域が、脂質性流体、もしくは疎水性流体に含まれる。
【００２３】
「制限された流体体積」は、通常は構造によって、しかしおそらくエネルギー場のポテンシャル井戸によって、線引きまたは制限された、局所的な流体体積である。生物学的細胞が、制限された流体体積の主な例である。なぜなら、これは、細胞膜によって制限されているからである。制限された流体体積の他の例としては、血小板、ミトコンドリア、および核（これらは、細胞小器官または包まれた細胞細区画である）が挙げられる。生きた生物に由来しない制限された体積の例は、流体を含有する微小カプセルであり、そこでは、そのカプセル壁は、そのカプセルの内側と外部流体との間のいくらかの物質交換を可能にしても可能にしなくてもよい。制限された流体体積中の流体は、懸濁された固体粒子およびゲル粒子を含み得る。しかし、制限されることによって、制限された体積全体は、その制限する構造または場が破れない限り、単一の粒子として挙動する。固体粒子またはゲル粒子（例えば、ガラスビーズまたはポリマービーズ）が、企図される意味の制限された体積内に含まれる；そのような粒子は、作製される材料によってキャリア流体から制限されている。他の型の制限された体積は、リポソーム、ミセル、および逆ミセルであり、そこでは、外層が、小胞カプセル化層として作用し、そして小胞の内側は、流体で満たされている。なお他の型の制限された体積は、含まれる流体と非混和性であっても非混和性でなくてもよい、第１流体から構成され、そこでは、非混和性材料の単層が、その流体性の内側とその流体性の外側との間に障壁を提供するように、第１流体を制限する。
【００２４】
他のように示されない限り、用語「細胞」とは、本明細書中で使用される場合、非細胞性の局所的流体体積も指し得る。従って、細胞を含むように述べられた排出された流体液滴は、細胞を含んでも含まなくてもよい局所的な流体体積を含み得る流体液滴として、解釈されるべきである。より大きな体積の流体内に含まれる他の型の局所的流体体積の例は、上記に提供される。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、用語「流体」は、固体でないか、または少なくとも部分的に気体状および／もしくは液体である、物質をいう。流体は、最小限に、部分的に、または完全に、溶媒和、分散もしくは懸濁されている固体を含み得；ゲルまたは不連続流体から構成される粒子もまた、流体中に懸濁され得る。流体の例としては、水性液（水自体および塩類水を含む）ならびに非水性液（例えば、有機溶媒など）が挙げられるが、これらに限定されない。キャリア流体中に懸濁された生細胞は、流体中に懸濁されたゲルまたは不連続流体の例を表す。
【００２６】
用語「近傍（ｎｅａｒ）」は、集束させた音響放射の焦点から、液滴が排出されるべき流体の表面までの距離をいうために、使用される。この距離は、流体に対して集束させた音響放射が、その流体表面からの液滴排出を生じるようになされるべきであり、そして当業者は、簡単かつ慣用的な実験を用いて任意の所定の流体に関して、適切な距離を選択し得る。しかし、一般的に、音響放射の焦点と流体表面との間の適切な距離は、その流体における音速の波長の約１倍〜約１５倍の範囲であり、より代表的には、この波長の約１倍〜約１０倍の範囲であり、好ましくは、この波長の約１倍〜約５倍の範囲である。
【００２７】
用語「レザバ」とは、本明細書中において使用される場合、流体を保持または収容するための、レセプタクルまたはチャンバをいう。従って、レザバ内の流体は、必然的に自由表面（すなわち、液滴がそこから排出されることを可能にする表面）を有する。流体が排出され得る少なくとも１つの自由表面を流体容器が有する限り、この容器は、特定の幾何学的構造にかかわらず、レザバである。従って、「レザバ」としては、例えば、液滴が排出される流れる流体を含む、微小流体チャネルが挙げられる。「細胞容器」または「細胞レザバ」とは、キャリア流体に懸濁された生細胞の排出のために特殊化されたレザバであり、そして例えば、キャリア流体に懸濁された生細胞が流れる、微小流体チャネルまたは他のチャネルが挙げられる。
【００２８】
用語「音響連結」および「音響連結された」とは、本明細書中で使用される場合、対象物が別の対象物と直接的または間接的に接触して配置されて、それらの対象物間で音響エネルギーを実質的には損失することなく音響放射が伝達されることが可能になるようにされている、状態を指す。２つの実体が間接的に音響連結されている場合、「音響連結媒体」が、音響放射が伝達され得る中間体を提供するために必要とされる。従って、排出器は、流体と音響連結され得、これは、例えば、その排出器をその流体中に浸漬することによるか、またはその排出器とその流体との間に音響連結媒体を挿入して、その排出器により生成される音響放射をその音響連結媒体を通してその流体中へと伝達することによる。
【００２９】
用語「結合した（ｂｏｕｎｄ）」（例えば、「結合した」細胞を有する基板表面におけるような「結合した」）は、共有結合、吸着および物理的固定化を包含する。用語「付着した（ａｔｔａｃｈｅｄ）」は、本明細書中で使用される用語「結合した（ｂｏｕｎｄ）」と意味が同一である。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、用語「吸着する」は、基板表面による、分子、分子セグメントまたは細胞の非共有的保持をいう。すなわち、吸着は、基板表面と、吸着される実体上に存在する吸着部分との間の非共有的相互作用の結果として生じる。吸着は、水素結合、ファンデルワールス力、極性引力または静電力を介して（すなわち、イオン結合を介して）生じ得る。時折、この基板は、特定の様式で相互作用するための吸着部分で官能化され得る。
【００３１】
本明細書中で使用される用語「アレイ」は、特徴物または材料（例えば、細胞）の二次元整列をいう。アレイは、一般的に、規則的な（ｒｅｇｕｌａｒ）、順序付けられた（ｏｒｄｅｒｅｄ）特徴物（例えば、直線の格子、平行な片、らせん状の状態にあるような特徴物）から構成されるが、順序付けられていないアレイもまた、同様に有利に使用され得る。
【００３２】
用語「生体分子」および「生物学的分子」とは、全体的または部分的に、天然に存在しようが、組換え生成されようが、または化学合成されようが、すなわち、生きた生物の一部であったのであろうが、または生きた生物の一部であり得ようが、任意の有機分子を指すために本明細書中で互換可能に使用される。これらの用語は、例えば、ヌクレオチド、アミノ酸、および単糖、ならびにオリゴマー種およびポリマー種（例えば、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、ペプチド分子（例えば、オリゴペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質）、糖類（例えば、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、ムコ多糖類、またはペプチドグリカン（ペプチド−ポリ多糖））など）を包含する。この用語はまた、リボソーム、酵素補因子、薬理学的に活性な因子などもまた、包含する。
【００３３】
用語「集束手段」および「音響集束手段」とは、光学レンズと同様に作用する音響エネルギー源とは別個のデバイスによってか、または音響エネルギー源の空間的配置によってかのいずれかによって、焦点において音波を集束させ、強め合う干渉および弱め合う干渉によって、焦点において音響エネルギーの集束をもたらすための手段をいう。集束手段は、湾曲した表面を有する固体部材程度に単純であり得るか、またはフレネルレンズ（これは、音響放射を指向するために、回折を使用する）において見出される構造のような複雑な構造を含み得る。適切な集束手段はまた、当該分野において公知であり、そして例えば、Ｎａｋａｙａｓｕらに対する米国特許第５，７９８，７７９号、およびＡｍｅｍｉｙａら（１９９７）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  １９９７  ＩＳ＆Ｔ  ＮＩＰ  １３  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，６９８−７０２頁に記載されるような、フェーズドアレイ法を包含する。
【００３４】
用語「基板」とは、本明細書中において使用される場合、１以上の流体が配置され得る表面を有する、任意の材料をいう。この基板は、例えば、ウェーハ、スライド、ウェルプレート、膜のような、多数の形態のいずれかで構築され得る。さらに、この基板は、特定の流体の配置のために必要とされ得るように、多孔性または非多孔性であり得る。適切な基板材料としては、固相化学合成のために代表的に使用される支持体、例えば、ポリマー材料（例えば、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリビニルピロリドン、ポリアクリロニトリル、ポリアクリルアミド、ポリメチルメタクリレート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニリデンフルオリド、ポリカーボネート、ジビニルベンゼンスチレンベースポリマー）、アガロース（例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標））、デキストラン（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標））、セルロースポリマーおよび他の多糖類、シリカおよびシリカベース材料、ガラス（特に、制御孔隙ガラス、すなわち「ＣＰＧ」）および官能基化ガラス、セラミック、ならびに表面コーティング（例えば、細孔ポリマー（特に、ニトロセルロースのようなセルロースポリマー）、細孔金属化合物（特に、細孔アルミニウム）、抗体結合タンパク質（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬから入手可能）、ビスフェノールＡポリカーボネートなど）で処理されたこのような基板が挙げられるが、これらに限定されない。特に興味深い多孔性基板としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：コーティングされていない多孔性スライドガラス（ＣＰＧスライドを含む）、ポリマーコーティング（例えば、アミノシランコーティングまたはポリ−Ｌ−リジンコーティング）でコーティングされており、従って多孔性ポリマー表面を有する、多孔性スライドガラス；および多孔性コーティングでコーティングされた非多孔性スライドガラス。多孔性コーティングは、多孔性ポリマーコーティング（例えば、セルロースポリマー（例えば、ニトロセルロース）またはポリアクリルアミドからなり得るようなコーティング）、あるいは多孔性金属コーティング（例えば、細孔アルミニウムからなる）であり得る。多孔性表面を有する市販の基板の例としては、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｉｎｃ．（Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）から入手可能な蛍光アレイ表面技術（ＦＡＳＴＴＭ）スライド（これは、１０〜３０μｍの厚みの、多孔性の流体透過性ニトロセルロース層でコーティングされており、この層は、表面の単位面積あたりの利用可能な結合面積を実質的に増加させる）が挙げられる。他の市販の多孔性基板としては、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＡＧ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から現在入手可能な、ＣＲＥＡＴＩＶＥＣＨＩＰ（登録商標）透過性スライド、および整列された高度に多孔性の構造（これは、この構造全体の孔隙およびチャネルを通って試薬が流れ、そして浸透することを可能にする）によって「三次元」幾何学構造を有する基板が挙げられる。このような基板は、Ｇｅｎｅ  Ｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．から、「Ｆｌｏｗ−Ｔｈｒｕ  Ｃｈｉｐ」の商品名で入手可能であり、そしてＳｔｅｅｌら、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｂｉｏｃｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙの第５章（Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ，２０００）によって記載されている。
【００３５】
「多孔性基板」または「多孔性表面を有する基板」におけるような用語「多孔性」とは、約１％〜約９９％、好ましくは約５％〜約９９％、より好ましくは約１５％〜約９５％の範囲の空隙率（空隙の百分率）、および約１００Å〜約１ｍｍ、代表的には約５００Å〜約０．５ｍｍの平均孔隙サイズを有する、基板または表面をそれぞれいう。
【００３６】
用語「不浸透性」とは、水または他の流体が通過することを可能にしないことを意味する、通常の意味で使用される。用語「浸透性」とは、本明細書中において使用される場合、「不浸透性」ではないことを意味する。従って、「浸透性基板」および「浸透性表面を有する基板」とは、水または他の流体が浸透し得る基板または表面をそれぞれいう。
【００３７】
前述の支持体材料は、従来使用される基板の代表的なものであるが、基板は、事実上、任意の生物学的材料、非生物学的材料、有機材料および／または無機材料を含み得、そして種々の物理的形態（例えば、粒子、ひも、沈殿物、ゲル、シート、管、球、容器、毛細管、パッド、スライス、フィルム、プレートなど）のいずれかであり得、そしてさらに、任意の所望の形状（例えば、円盤、正方形、球、円など）を有し得ることが、理解されるべきである。この基板表面は、平坦であっても平坦でなくてもよく、例えば、この表面は、隆起領域または陥凹領域を含み得る。基板はさらに、反応性官能基を含み得るか、または反応性官能基を含むように誘導体化され得る。これらは広く公知であり、そしてこれらとしては例えば、反応性Ｓｉ−ＯＨ基を含む二酸化ケイ素支持体、ポリアクリルアミド支持体、ポリスチレン支持体、ポリエチレングリコール支持体などが挙げられる。
【００３８】
用語「表面修飾」とは、本明細書中において使用される場合、基板表面または基板表面の選択された部位もしくは領域の、１つ以上の化学的特性および／または物理的特性を変化させるための、加法プロセスまたは減法プロセスによる、表面の化学的変更および／または物理的変更をいう。例えば、表面修飾は、以下を包含し得る：（１）表面のぬれ特性を変化させること、（２）表面を官能基化すること（すなわち、表面の官能基を提供するか、修飾するか、または置換すること）、（３）表面を脱官能基化すること（すなわち、表面の官能基を除去すること）、（４）表面の化学的組成を他の様式で（例えば、エッチングによって）変更すること、（５）表面の粗さを増加または減少させること、（６）表面にコーティング（例えば、その表面のぬれ特性とは異なるぬれ特性を示すコーティング）を提供すること、および／あるいは（７）表面に微粒子を配置させること。本明細書中の基板表面のいずれもが、上述の様式のうちの１つ以上で修飾され得、そして用語「表面」は、上に記載されたような修飾された表面を含むことが意図される。
【００３９】
用語「バイナリー」とは、２つの可能性を選択するスキーム（例えば、閾値レベルの蛍光の検出に基づく、排出または非排出）を指す。用語「非バイナリー」とは、２つより多くの可能な選択肢（例えば、高閾値より大きい蛍光発光の検出に基づく第１標的容器への排出、この検出閾値を超えるがこの高蛍光閾値より下で検出される蛍光に基づく第２標的容器への排出、および所定の振動数の蛍光が検出可能でない場合に排出しないこと）を有する選択スキームを指す。
【００４０】
用語「細胞のコロニー」または「細胞コロニー」とは、本明細書中で使用される場合、１つ以上の細胞を指す。複数の細胞がそのコロニーに含まれる場合、それらの細胞は、所定の単一細胞の環境条件または外部条件が近隣の細胞により影響される程度に十分に近い。
【００４１】
例えば語句「アレイの実質的に全ての細胞」におけるような、用語「実質的に」とは、アレイの細胞のうちの少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％、そして最も好ましくは少なくとも９９．９％をいう。用語「実質的に」の他の使用は、類似の定義を包含する。
【００４２】
「任意の」または「必要に応じて」とは、この後に記載される状況が起こっても起こらなくてもよいことを意味し、その結果、この表現は、その状況が起こる例およびその状況が起こらない例を包含する。
【００４３】
次いで、１つの実施形態において、本発明は、流体内の局所的体積を分離するための方法に関し、ここで、各局所的体積は、その流体とは異なる音響インピーダンスを有する。１つの局所的体積の位置を同定し、その１つ以上の特性を決定するために、検出器が使用される。その後、その流体からその局所的体積を液滴として排出するのに有効な様式で、集束されたエネルギー（好ましくは、集束された音響エネルギー）がその流体に適用される。使用されるデバイスは、好ましくは、音響排出デバイスであり、このデバイスは、１つ以上の容器またはレザバ（各々が、生細胞が懸濁されているキャリア流体を含むように適合されている）と；音響放射を生成するための音響放射発生器を備える、排出器；そのレザバの各々におけるその流体表面内またはその流体表面付近の焦点で音響放射を集束させるための、集束手段と；そのレザバの各々に対して音響連結関係にその排出器を位置付けるための、手段；とを備える。
【００４４】
図１および図５は、使用されるデバイスの代替の実施形態を、単純化した断面図で示す。図１は、その容器またはレザバが、放射状に対称的な従来の容器（例えば、従来のペトリ皿）である、細胞排出システムを図示する。図５において、そのレザバは、流体チャネルであり、例えば、このチャネルを通って、生細胞がキャリア流体中を流れる。このデバイス１１は、複数の細胞容器または細胞レザバ（すなわち、少なくとも２つの容器またはレザバ）を備え、第１の容器は、１３で示されており、そして第２の容器は、１５で示されており、これらは、各々、流体を含むよう適合されており、そして各流体は、流体表面を有する；例えば、第１の細胞容器は、流体１４に懸濁された細胞を有し、そして第２の細胞容器は、流体１６に懸濁された細胞を有し、流体表面はそれぞれ、１７および１９で表されている。１４および１６のキャリア流体およびその中に懸濁された任意の細胞は、同じであっても異なってもよい。図示されるように、その容器またはレザバは、実質的に音響的に区別不可能であるように実質的に同一の構成であるが、同一の構成は、必須要件ではない。この容器は、取り外し可能な別個の構成要素として示されるが、所望であれば、プレートまたは他の基板内に固定され得る。例えば、図１における複数の容器は、個々のウェルをウェルプレートに含み得るが、必要に応じて、必ずしもアレイに配置されなくてもよい。同様に、図５における複数の容器は、プレートにおける別個のチャネルまたは個々のチャネルを含み得、例えば、個々の微小流体チャネルのパターンが、フォトリソグラフィーによってなどで、プレートにエッチングされる。細胞容器またはレザバ１３および１５の各々は、好ましくは、左右対称（図５）または軸対称（図１）である。これらの容器の各々は、実質的に垂直な壁２１および２３を有し、これらの壁は、レザバの基部２５および２７から上方に延び、そしてそれぞれ、開口部２９および３１において終結するが、他のレザバ形状（特定の位置における排出のための開口部または開口を有する、流体チャネルを有する形状が挙げられる）が使用され得る。各容器基部またはレザバ基部の材料および厚みは、音響放射がこれらを通ってこのレザバ内に収容される流体内に伝達され得るようなものであるべきである。
【００４５】
図１および図５に示されるデバイスはまた、音響放射を発生させるための音響放射発生器３５と、流体内（ここから液滴が排出される）の焦点（流体表面近傍）にその音響放射を集束させるための集束手段３７とを含む、音響排出器３３を備える。図１および図５に示されるように、この集束手段３７は、音響放射を集束するための凹型表面３９を有する単一の中実部分を含み得るが、この集束手段は、以下に議論されるような他の方法で構成され得る。従って、この音響排出器３３は、それぞれ、レザバ１３および１５に、従って流体１４および１６に音響連結された場合に、流体表面１７および１９の各々から流体の液滴を排出するように、音響放射を生成しそしてその音響放射を集束するように適合される。音響放射発生器３５および集束手段３７は、デバイスの所望の性能に依存して、単一のコントローラにより制御される単一のユニットとして機能し得るか、またはこれらは独立して制御され得る。代表的に、単一排出器設計が、複数排出器設計よりも好ましい。なぜなら、液滴の配置の精度、ならびに液滴のサイズおよび速度の一貫性は、単一の排出器を用いた場合に、より容易に達成されるからである。
【００４６】
当業者に理解されるように、種々の集束手段のいずれかが、本発明と共に用いられ得る。例えば、１つ以上の湾曲表面を使用して、音響放射を流体表面付近の焦点に方向付けし得る。１つのこのような技術は、Ｌｏｖｅｌａｄｙらの米国特許第４，３０８，５４７号に記載される。湾曲表面を有する集束手段は、市販の音響変換器（例えば、Ｐａｎａｍｅｔｒｉｃｓ  Ｉｎｃ．（Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）により製造される音響変換器）に組み込まれている。さらに、対象面から所定の焦点距離に音響エネルギーを方向付けするためのフレネルレンズが、当該分野で公知である。例えば、Ｑｕａｔｅらの米国特許第５，０４１，８４９号を参照のこと。フレネルレンズは、音響エネルギーのかなりの部分を、そのレンズに対して半径方向に変化する回折角度で所定の回折次数に回折させる、半径方向の位相プロフィールを有し得る。この回折角は、所望の対象面上に、その回折次数内の音響エネルギーを集束させるように選択されるべきである。音響エネルギーエミッターのフェーズドアレイもまた、整列された供給源により放射される音波の間の強め合う干渉および弱め合う干渉の結果として、音響エネルギーを指定の点に集束させるために使用されている（Ａｍｅｍｉｙａら（１９９７）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  １９９７  ＩＳ＆Ｔ  ＮＩＰ１３  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ｐｐ．６９８−７０２）。
【００４７】
排出器３３を、個々のレザバの各々、従ってその中の流体に音響連結するための多数の方法もある。１つのこのようなアプローチは、例えば、Ｌｏｖｅｌａｄｙらの米国特許第４，３０８，５４７号に記載されるように、直接接触によるものであり、ここでは、セグメント電極を有する半球型クリスタルから構成された集束手段が、排出される液体中に沈められる。上記の特許は、この集束手段が、その液体の表面にかまたはこの表面の下に配置され得ることをさらに開示する。しかし、排出器が複数の容器またはレザバから異なる流体を排出するために使用される場合、相互汚染を回避するために集束手段の度重なる洗浄が必要であるため、集束手段を流体に音響連結するためのこのアプローチは、望ましくない。必然的に、この洗浄プロセスは、各液滴排出事象の間の移行時間を延長する。さらに、このような方法において、その流体中の細胞は、容器から取り出される場合に、排出器に付着して、稀少であるか代わりのない可能性のある細胞物質が無駄になる。最終的に、レザバが微細製造される場合（例えば、細胞容器が微小流体チャネルまたはマイクロウェルである場合）、流体中に沈めることは、その容器が小さすぎるために、従来の音響エネルギー集束手段を用いては可能ではない。
【００４８】
微細製造の当業者は、微細製造した湾曲部材を含む集束手段を作製し得る。同様に、セグメント電極を有する半球型クリスタルから構築された、微細製造された集束手段（例えば、Ｌｏｖｅｌａｄｙらの米国特許第４，３０８，５４７号に記載されるようなミニチュア集束手段）は、慣用的な微細製造技術によって作製され得る。次いで、流体中に沈めることは、可能であるが、上記と同じ欠点を伴う。微量流体チャネルまたはウェルについて、次いで、集束手段および音響エネルギー源が、微細製造されたアセンブリに組み込まれ得る。
【００４９】
どのレザバ寸法についても実行可能なアプローチは、従来の微細製造されていない排出器またはマクロスケールの排出器を、この排出器のいずれの部分（例えば、集束手段）も、排出される流体と少しも接触させることなく、レザバおよびレザバの流体に音響連結することである。このために、本発明は、排出器を、細胞容器または細胞レザバ中の流体の各々と制御された反復可能な様式で音響連結して位置付けして、その流体の中に排出器を沈めることなくこの流体から液滴を排出するための、排出器位置決め手段を提供する。この方法は、代表的に、排出器と各レザバの外面との間の直接的または間接的な接触を包含する。直接接触が、排出器を各レザバに音響連結するために使用される場合、この直接接触が、効率的な音響エネルギー伝達を保証するために完全に適合していることが好ましい。すなわち、この排出器およびレザバは、嵌合接触に適合した対応する表面を有するべきである。従って、音響連結が、集束手段によって排出器とレザバとの間で達成される場合、このレザバが、集束手段の表面プロフィールに対応する外側表面を有していることが、望ましい。適合した接触がない場合、音響エネルギー伝達の効率および精度が損なわれ得る。さらに、多くの集束手段は湾曲表面を有するので、直接接触アプローチは、特別に形成された逆向き面を有するレザバの使用を必要とし得る。
【００５０】
必要に応じて、音響連結は、図１Ａおよび図５Ａに例示されるように、間接的接触によって、排出器とレザバ各々との間で達成される。これらの図において、音響連結媒体４１が、排出器３３とレザバ１３の基部２５との間に配置され、ここで排出器およびレザバは、互いから所定の距離に位置している。この音響連結媒体は、音響連結流体であり得、好ましくは、音響集束手段３７および各レザバの両方と適合接触した、音響的に均質な材料であり得る。さらに、この流体媒体が、その流体媒体自体とは異なる音響特性を有する材料を実質的に含まないことを保証することが、重要である。示されるように、第１のレザバ１３は、音響集束手段３７に音響連結され、その結果、音波が、音響放射発生器によって生成され、そしてこの集束手段３７によって、音響連結媒体４１に向かって方向付けられ、これにより、次いで音響放射がレザバ１３に伝達される。
【００５１】
作動中、デバイスのレザバ１３および１５の各々は、図１および５に示されるように、それぞれ、第１のキャリア流体および第２のキャリア流体で満たされ、これらのキャリア流体は、それぞれ、その中に懸濁された細胞または細胞混合物１４および１６を有する。音響排出器３３は、音響連結媒体４１を介した排出器とレザバとの間の音響連結を達成するために、レザバ１３の下に示す排出器位置決め手段４３によって配置可能である。基板４５は、第１のレザバ１３の上かつ第１のレザバ１３の近位に配置され、その結果、この基板の一方の表面（図１および５において下側面５１として示される）は、レザバに面し、そしてこのレザバ内の流体１４の表面１７に対して実質的に平行である。一旦、排出器、レザバおよび基板が適切に整列すると、音響放射発生器３５は、音響放射を生成するように作動され、この音響放射は、集束手段３７によって、第１のレザバの流体表面１７付近の焦点４７に方向付けられる。結果として、液滴４９は、この流体表面１７から、基板の下側面５１上の指定した部位に排出される。この排出された液滴は、接触後に基板表面を凝固することによって、この基板表面上で保持され得；このような実施形態において、基板を低温（すなわち、接触後に液滴の凝固が生じる温度）で維持することが必要である。あるいは、またはさらに、液滴に含まれる細胞の表面上に提示される分子部分またはマーカー部分は、接触後に、吸着、機械的固定化または共有結合によって、基板表面に付着する。
【００５２】
次いで、図１Ｂおよび５Ｂに示されるように、基板位置決め手段５０は、基板４５をレザバ１５の上に再配置して、このレザバからの液滴を第２の指定された部位で受け取る。図１Ｂおよび５Ｂはまた、排出器３３が、排出器位置決め手段４３によってレザバ１５の下に、音響連結媒体４１によってこのレザバ１５と音響的に連結した関係で、再配置されていることを示す。一旦、図１Ｂおよび５Ｂに示されるように、適切に整列されると、排出器３３の音響放射発生器３５は、音響放射を生成するように作動され、この音響放射は次いで、集束手段３７によって、流体表面１９付近の流体１６内の焦点に方向付けられ、それにより液滴５３がこの基板に向かって排出される。このような操作は、用いられるデバイスをどのように使用して、流体液滴に含まれる複数の単一の細胞をレザバから排出し、細胞のパターン（例えば、アレイ）を基板表面５１上に形成し得るかの例示であることが明白でなければならない。同様に、このデバイスが、１つ以上のレザバから排出される流体液滴に含まれる複数の個々の細胞を、基板表面の同じ部位に排出するように適合され得ることも明白でなければならない。
【００５３】
別の実施形態では、デバイスがウェルプレート間の流体滴に含まれる細胞の移送を可能にするように構成され、この場合、基板は、基板ウェルプレートを含み、流体懸濁した細胞含有レザバは、レザバのウェルプレートにおける個々のウェルである。図２は、このようなデバイスを示し、レザバウェルプレート１２における４つの個々のウェル１３、１５、７３、および７５は、単一の細胞を含有する小滴の排出のための流体中で懸濁される、複数の特定の型の細胞または異なる細胞型の混合物を含むための流体レザバとして役立ち、そしてこの基板は、５５、５６、５７、および５８で示された４つの個々のウェルのより小さなウェルプレート４５を含む。図２Ａは、細胞容器またはレザバウェルプレートおよび基板ウェルプレートを上面図で示す。示されるように、各ウェルプレートは、ツーバイツーアレイに配置された４つのウェルを含む。図２Ｂは、使用されるデバイスを示し、細胞容器またはレザバウェルプレートおよび基板ウェルプレートがウェル１３、１５および５５、５７それぞれに沿った断面図で示される。図１および５に示されるように、レザバウェル１３および１５のそれぞれは、１７および１９でそれぞれ示されたキャリア流体表面を有するキャリア流体１４および１６中で懸濁された細胞を含む。細胞容器またはレザバウェルプレートのウェルの材料および設計は、図１および５に示された容器のものと同様である。例えば、図２Ｂ（ウェル）および図５Ｂ（チャネル）に示された細胞容器またはレザバは、実質的に音響的に区別不可能であるように実質的に同一の構成である。これらの実施形態において、細胞レザバのベースは、このベースを通って、含まれるキャリア流体に音響放射を効率的に伝達し得るような物質（例えば、適切な音響インピーダンスを有する物質）および厚さである。
【００５４】
図２および５のデバイスはまた、音響発生手段３５および集束手段３７を含む、図１に示された排出器と同様の構成を有する音響排出器３３を含む。図２Ｂは、間接的な接触を介してレザバウェルに音響的に接続された排出器を示し；すなわち、音響連結媒体４１は、排出器３３とレザバウェルプレート１２との間（すなわち、音響集束手段３７の曲がった表面３９と第１の細胞容器またはレザバ（ウェルまたはチャネル）１３のベース２５との間）に配置される。示されたように、第１の細胞容器またはレザバ（ウェルまたはチャネル）１３は、音響集束手段３７に音響的に連結され、その結果、ほぼ上方向に生成された音響放射は、集束手段３７によって音響連結媒体４１に向けられ、次いで、音響放射を細胞容器またはレザバ（ウェルまたはチャネル）１３に伝達する。
【００５５】
動作時では、細胞容器またはレザバ（ウェルまたはチャネル）の各々は、好ましくは、キャリア流体内で懸濁された異なる型の細胞または細胞の混合物を有するキャリア流体で充填される。示されるように、デバイスのレザバウェル１３および１５は、図１のように、第１の細胞混合物１４を有するキャリア流体および第２の細胞混合物１６を有するキャリア流体で各々充填されて、流体表面１７および１９をそれぞれ形成する。図１および５は、排出器３３が、音響連結媒体４１を介してレザバウェルとの音響連結を達成するために、排出器３３が排出器位置決め手段４３によってレザバウェル１３の下に位置決めされることを示す。
【００５６】
細胞容器から個々の細胞をウェルプレートに排出するために、図２Ａは、基板ウェルプレート４５の第１基板ウェル５５を、第１の細胞容器またはレザバ（ウェルまたはチャネル）から排出された液滴を受容するために、第１レザバウェル１３の上に位置決めされることを示す。
【００５７】
一旦、排出器、細胞容器またはレザバ（ウェルまたはチャネル）、ならびに基板が適切に位置調整されると、音響放射発生器は、流体表面１７近くの焦点４７に音波を向けるための集束手段によって集束された音波（エネルギーの量は、流体を排出するには不十分である）を生成させるために起動する。集束された音響エネルギーの第１放出は、音響エネルギーの反射（細胞とキャリア流体との間の音響インピーダンスの違いに起因する反射）による排出のために、表面に十分近い細胞の存在の音響検出を可能にする。音響検出によって細胞の位置を決定するための手段は、超音波顕微鏡および関連分野の当業者によって容易に理解される。細胞を検出および局在的な後、他の特性が、排出するための決定がなされる前に測定され得る。また、どの細胞も排出するために表面の十分近くに存在しない場合、この音響エネルギーは、細胞が局在化され、そして集束された音響エネルギーまたは他の手段によって表面のより近くまで駆動されるまで、この流体表面から次第により離れた距離で集束され得る。例えば、均一な場（ｆｉｅｌｄ）を使用して、この細胞を表面のより近くまで移動させ得る。このような１つの場は、フォトン場であり、この場は、キャリア媒体および細胞の屈折率の違いによって決定される、断面積およびフォトンモーメントの変化に基づく力を及ぼす。細胞を移動させるために使用され得る別のこのような場は、電場であり、これは、正味の表面電荷に基づく力を及ぼす。細胞または密度勾配を含む流体に対して低い密度を有するキャリア流体がまた、排出に関して細胞を配置するために使用され得る。流体表面から細胞の短い平均距離に影響を及ぼす種々の方法が存在することが理解される。チャネル（特に、微小構築されたチャネル）について、機械的な手段または流体手段を使用して、このチャネルを横切るランプ様構造を配置することにより、流体表面から十分に近い距離をもたらし得、ランプを横切るチャネルの深さを、細胞の直径のオーダーの深さまで減少させ、これにより、細胞が表面近くを流れることのみを可能にし；図５Ｄに示されるように、チャネルの深さが最も浅い場所で、流体速度は最も速いので、細胞は、このランプで詰め込まれないようである。図５Ｅは、細胞に作用する力によって、細胞を表面の方に移動させる、微小流体チャネルを示す。
【００５８】
微小流体チャネルは、細胞が配置され得る体積を減少させる小さな寸法で構築され得るので、この微小流体チャネルは、排出に適切な細胞の配置が非常に単純化される場合、音響排出と共に使用するのに特に好ましい。例えば、比較的均一な寸法を有する細胞型または細胞型の混合物（例えば、平均直径１０．０μｍ、ＳＤ．約０．５μｍ）に対して、チャネルが、約１２．０μｍの幅となるように操作され、流体表面（排出体積４／３πｒ３＝０．５２ｐＬ）から約１．０μｍの平均距離で細胞の単一ファイルを作製し得る。このような場合、この流体表面と細胞の位置との間の距離を短くするために、ランプ（図５Ｄ）または任意の他の手段を提供することは、必ずしも必要ではない。チャネルの深さは、そのチャネル中の所望の流体流れについて適切であるような深さであるが、このチャネルは、好ましくは、排出のために表面に十分近い位置に細胞を指向するための手段を備えている（例えば、チャネルの深さは、細胞直径の１０倍以下である）。特定の例では、４０μｍの深さのチャネル様構造（各々が、細胞を表面に指向するランプ（約２５μｍのランプの高さ）を有する）を使用する。細胞が、流体流れ軸に沿って、一定の制限された距離範囲でチャネルから排出され得、スキャンされる流体表面の領域を減少させる。例えば、細胞を排出するための５０μｍの開口が、閉口したキャピラリーに提供され得るか、または開口キャピラリーの流れ軸に沿った制限された距離が、排出のために使用され得、細胞が排出器を通過して移動し、細胞のためにスキャンされる領域を減少させることが有意な利点である。このような方法を、ペトリ皿のような微小スケールの容器内で細胞を浮遊させるために使用する場合でさえ、有意な時間量が、排出するために細胞を配置するための流体表面に対して平行なプレートをスキャンして浪費され得る。微小流体チャネルを使用する利点は、広範な範囲の細胞サイズ（例えば、前述の細胞型（平均直径１０．０μｍ、ＳＤ．約０．５μｍ）と混合された赤血球（ＲＢＣ、平均直径７μｍ、ＳＤ．約０．３μｍ、両凹面ディスク、高さ約０．３μｍ））をわずかに減少させる。ＲＢＣは、流体排出体積に対して表面から有意な深さであり得、これによって、有意なエネルギーがＲＢＣを排出するために必要とされるが、この状態は、細胞を流体表面の方に集束する記載の方法によって克服され得る。ペトリ皿の数ｃｍの幅と対照的に、側方サーチを約１２μｍの幅まで制限する利点は、即座に明確である。
【００５９】
表面に有意に近接する細胞が配置され、そして排出のための任意の他の判断基準に合うように決定されると、この音響放射発生器が起動され、流体表面１７の近くの集束点４７の方に集束手段によって集束される音波を生成し、このエネルギー量は、排出される細胞の体積に実質的に対応する流体の体積を排出するのに十分であるので、その結果、任意の排出された体積は、１個より多くの細胞を含まない。必要とされる体積以下のみを排出するために必要とされる正確な量のエネルギーは、適用されるエネルギーを排出に所望される細胞を排出するには不十分な量から標的される基板の位置に対して所望される距離で細胞に排出するために適用されたまさに十分なエネルギーが存在するまで、次第に増加させることによって最初に較正し得る。この最初の較正後、流体レベルの任意の変化に対して調節したほぼ同じエネルギーが、最初の較正細胞と実質的に同じ体積の細胞を排出するために適用され得る。結果として、液滴４９（単一の生存細胞を含む）は、流体表面１７から、基板ウェルプレート４５の第１の基板ウェル５５に排出される。細胞含有小滴は、表面張力によって基板のウェルプレート上に保持される。
【００６０】
次いで、図２Ｃに示されるように、基板ウェルプレート４５を、基板位置決め手段５０によって、基板ウェル５７が、それから細胞含有液滴を受けるために、細胞容器またはレザバ（ウェルまたはチャネル）１５上に直接位置決めされるように再配置する。図２Ｃはまた、排出器３３が、音響連結媒体４１により排出器および容器を音響的に連結するために、細胞容器ウェル１５の下に排出器位置決め手段により再配置されることを示す。平面上基板上の基板ウェルプレートおよびレザバウェルプレートまたはチャンネルは異なるサイズであるので、排出器位置決め手段の動きと基板ウェルプレートの動きとの間には、同一でない対応のみが存在する。図２Ｃに示されように、一旦適正に整列されると、排出器３３の音響照射発生器３５は作動されて、次いで、集束手段３７により、流体表面１９近傍の焦点に向けられる音波を生成し；この波は、排出されるキャリア流体表面に十分近接している細胞の存在を検出するために用いられる。このような細胞が検出され、そして排出のための規準として用いられる任意の性質が測定された後、排出器３３の音響照射発生器３５は作動され、次いで集束手段３７によって、流体表面１９近傍の焦点に向けられる音波を生成し、そこから、細胞含有液滴５３が基板ウェルプレートの第２のウェル上に排出される。このような操作は、１つのウェルプレートから異なるサイズの別のウェルプレートに、適切なサイズの液滴に含まれる複数の単一細胞を移入するために、採用されたデバイスが、どのように用いられ得るかの例示であることを明確にすべきである。当業者は、この型の移入が、細胞、キャリア流体、および排出器および基板の両方が連続運動するときでさえ実施され得ることを認識する。レザバ、ウェルプレート、および／または基板の種々の組合せが、単一細胞を含む液滴を移入するための採用されたデバイスで用いられ得ることをさらに明確にすべきである。細胞を含有する流体液滴のさらなる移入のため（例えば、細胞アレイ配置のため）にレザバの位置決めの前に、任意のレザバが、流体キャリアで、または懸濁された細胞を含む流体キャリアで、それぞれ、細胞不含流体液滴または細胞含有流体液滴の音響排出により充填され得ることもなおさらに明確にすべきである。
【００６１】
上記のように、個々の（例えば移動可能な）レザバ（ウェルまたはチャンネル）またはプレート（ウェルまたはチャンネル）を用い、排出のためにキャリア流体中に細胞懸濁物を含み得；レザバまたはウェルプレートのウェルは、好ましくは、互いから、音響的には実質的に区別不能である。また、排出器が流体中に隠れることが意図されなければ、レザバまたはウェルプレートは、排出されるべき流体の表面に運搬される排出器からの音響照射を可能にするに十分な音響的伝達性質を有さなければならない。代表的には、これは、キャリア流体に対して適切な音響的インピーダンスを有するレザバまたはウェルベースを提供することを含み、そしてこれらは、作製される材料の音響的インピーダンスに対して十分に薄く、受容されない消散または反射をなくしてそれを通って伝わる音響照射を可能にする。さらに、レザバの構築に用いられる材料は、含まれるキャリア流体と適合しなければならず、そして懸濁された細胞に非毒性でなければならない。
【００６２】
従って、レザバまたはウェルは、水性キャリア中に懸濁される生存細胞を含むことが意図されるので、水中に溶解もしくは膨潤する、または生存細胞に毒性の化合物を水性キャリア中に放出する材料から作製されるレザバは、本発明に使用されるレザバ、基板、またはウェルプレートの形成における使用に不適切である。水ベースの流体には、多くの材料がレザバの構築に適切であり；これらとしては、組織培養もしくは細胞培養のための材料、生体材料、モノ結晶性シリコンもしくはポリ結晶性シリコン、酸化ケイ素および酸化アルミニウムのようなセラミック、ステンレス鋼および白金のような金属、およびポリエステルおよびポリテトラフルオロエチレンのようなポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。これらの材料は、細胞に毒性の物質が細胞に対しキャリア流体毒性を与えるに十分な量でキャリア流体中の漏出しないように調製され得、その結果、これらの表面特性は、意図された使用に適切である。例えば、細胞が排出される容器またはレザバは、容器材料の固い壁または床に対する接着を回避するように、表面が官能化され得る。
【００６３】
採用されるデバイスとの使用に適切な多くのウェルプレートが市販されており、そして、例えば、ウェルプレートあたり９６，３８４または１５３６ウェルを含み得る。採用されたデバイスにおける使用のために適切なウェルプレートの製造は、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）およびＧｒｅｉｎｅｒ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．（Ｌａｋｅ  Ｍａｒｙ，Ｆｌｏｒｉｄａ）を含む。しかし、このような市販のウェルプレートの利用可能性は、少なくとも約１０，０００ウェル、または１００，０００ウェル程度またはそれ以上を含むカスタムメイドのウェルプレートの製造および使用を排除するものではない。アレイを形成する適用には、約１００，０００〜約４，０００，０００のレザバを採用し得ることが予期される。さらに、排出器を各レザバまたはレザバウェルと整列するために必要な動きの量を低減するために、各レザバの中心は、任意の他のレザバ中心から、約１ｃｍより大きくなく、好ましくは約１ｍｍより大きくなく、そして最適には、約０．５ｍｍより大きくなく位置決めされることが好ましい。
【００６４】
一般に、デバイスは、実質的に任意の型および所望される量の流体を排出するように適合され得る。排出された流体は水性および／または非水性であり得るが、水性流体のみが生細胞の移入に適合する。水性流体の例は、水それ自身、水溶媒和イオンおよび非イオン溶液、ゲル、固体の懸濁液またはスラリー、および分離した細胞を含む水液体を含む。本発明の技法を用いて可能である正確さに起因して、デバイスを用いて、約１００ナノリットルより多くない流体、好ましくは約１０ナノリットルより多くない流体を含むように適合されたレザバからの液滴を排出し得る。特定の場合には、排出器は、約１〜約１００ナノリットルの流体を含むように適合されたレザバから液滴を排出するように適合され得る。これは、排出される流体が希少または高価な生体分子または細胞を含むとき特に有用であり、この場合、約１ピコリットルまでの容量を有する液滴を排出することが所望され得る。
【００６５】
上記の記載から、デバイスの種々の部材が、基板上の細胞のアレイを形成するために個々の制御または同調化を必要とし得ることが明らかである。例えば、排出器位置決め手段は、基板表面上に調製されるアレイと関連した予め決定されたシークエンスで、各細胞容器またはレザバから液滴を排出するように適合されている。同様に、排出器に対して基板表面を位置決めする、基板位置決め決め手段は、液滴をその上のパターンまたはアレイ中に受けるために基板表面を配置するように適合され得る。両方または片方の位置決め手段、すなわち、排出器位置決め手段および基板位置決め手段は、例えば、レバー、プーリー、ギア、リニアモーター、それらの組合せ、またはその他の当業者に公知の機械的手段から構築され得る。基板の動きと、排出器の動きと、および適切なパターン形成を確実にする排出器の活性化との間の対応があることを確実にすることが好ましい。
【００６６】
さらに、デバイスは、性能を向上するその他の部材を備え得る。例えば、上記で暗示するように、このデバイスはさらに、サンプルの安定性を確実にするために温度を調節する手段を備え得る。温度調節の１つの例は、例えば、基板表面の温度を低下させて、排出された液滴が基板に接着することおよび細胞の生存性を維持するために急速に冷凍することを、確実にすることである。冷却手段は、基板表面を、細胞含有流体液滴がそれと接触した後、流体が部分的、または好ましくは完全に、すぐに凍結することを可能にする温度に維持するよう適合され得る。細胞を含む水性流体液滴の場合には、この温度調節手段は、基板表面を、細胞の型および実行されるアッセイの目的に依存して、広い範囲内（例えば、−８０℃と８０との間）で維持する能力を有し得る。
【００６７】
さらに、音響エネルギーの流体のレザバへの繰り返し付与は、流体の加熱を生じ得る。加熱は、勿論、生細胞に対し所望されない影響を生じる。従って、デバイスは、細胞容器またはレザバ内の流体を一定の温度に維持するための手段をさらに備え得る。このような温度維持手段の設計および構成は当業者に公知であり、そして、例えば、加熱エレメント、冷却エレメント、熱電対のような温度検出手段、またはそれらの組合せのような部材を備え得る。生体分子および生細胞配置適用には、一般に、生体分子または細胞を含む流体を、約１℃または２℃より大きくない偏差で一定温度に保つことが所望される。さらに、流体は、生細胞には、冷却されなけば生存率が低いことが知られる特別の細胞型を除き、原核生物または真核生物であるか否かにかかわらず、温血生物の場合、細胞が由来する通常温度を約１℃を超えず、そしてその他すべての生物について１６℃と３７℃との間の温度に維持されることが好ましい。生存に冷却を必要とする細胞は、約１℃±約１℃で適切な浸透圧（わずかに高浸透圧）の生理食塩水キャリア流体を必要とすることが、細胞を培養および維持する当業者によって認識される。従って、例えば、生体分子含有流体が水性であるとき、排出の間に流体を約−１℃±約０．５℃に保つことが最適であり得る。
【００６８】
本発明は、音響排出細胞含有液滴を受ける前の、基板表面の修飾を含み得る。表面修飾は、官能化または脱官能化、平滑化または粗面化、コーティング、分解、不動態化、または表面の化学的組成または物理的性質のその他の改変を含み得る。１つの実施形態では、本発明は、外部に表示されるマーカー部分と同族である部分での官能化を必要とするが、記載のその他の表面修飾が、特定の状況における本発明の成功に影響し得る。
【００６９】
１つのこのような表面修飾方法は、表面のぬれ特性を変更することを含む。このような方法は、例えば、指定領域内の表面上に排出された液滴中に含まれる細胞の閉じ込めを容易にするため、または基板もしくは特定の基板位置を官能化（例えば、ビオチン化溶液の音響排出により達成されるパターン化されたビオチン化）するために用いられる分子部分の表面結合を増強するために用いられ得る。基板表面のぬれ特性を変更するための好ましい方法は、流体の音響排出前に基板表面の各指定部位に、適切な表面修飾流体の液滴を堆積して、そこにアレイを形成することを含む。このようにして、音響的に排出された液滴および含まれる細胞の「広がり」は最適化され得、そしてスポットの大きさ（すなわち、直径、高さおよび全体的な形状）における一貫性が確実にされ得る。この方法を実施する１つの方法は、排出器を、表面修飾流体を含むモディファイアレザバに音響的に連結し、次いで上記に詳細に記載されるように、この排出器を作動させて、表面修飾流体の液滴を生成し、そしてこれを、基板表面の指定部位に向かって排出することを含む。この方法は、所望により、表面修飾流体をさらなる指定部位に堆積させるために繰返される。生体分子（特に、形質転換細胞または非形質転換細胞の表面に提示されたマーカー部分に特異的に結合する、同族部分）のアレイを生成する他の方法もまた使用され得る。例えば、単一の同族部分（例えば、ビオチン）は、均一に、またはあるパターン（例えば、非ビオチン化領域によって取り囲まれたビオチン化領域のパターン）で、基板表面に連結され得る。パターン化されるべき細胞を形質転換して、その表面にストレプトアビジンを提示し得る。
【００７０】
図３は、単純化した断面図において、図１に図示したデバイスと類似であるが、異なる型の細胞を含み得るか、または流体表面６１を有する表面修飾流体（流体６０）を含み得る、さらなるレザバ５９を備えるデバイスを用いて、２つの細胞が基板上の異なる部位に堆積される、上記の方法の特定の実施形態を模式的に図示す。図３Ａは、表面修飾流体または細胞を含有するキャリア流体６０の液滴６３（ここでは、表面修飾流体よりむしろ細胞を含むことが示される）の排出を図示する。所望される場合、表面モディファイアは、種々の目的のために用いられ得る；例えば、表面モディファイアは、基板４５（ここに細胞が堆積される）の表面５１上の指定された部位のぬれ特性を変更するように選択され得る。排出器３３は、音響連結媒体４１を介してモディファイアレザバ５９との音響連結を達成するために、排出器位置決め手段４３によってモディファイアレザバ５９の下に配置される。基板４５は、指定部位での表面修飾流体６０の液滴の音響堆積を可能にする位置で、モディファイアレザバ１９の上に配置される。一旦、排出器３３、モディファイアレザバ５９および基板４５が適切に整列されたら、音響放射発生器３５を作動させて、流体表面６１からの表面修飾流体６０の液滴６３の、基板の下側表面５１の指定部位への排出を可能にする様式で集束手段３７によって方向付けされる、音響放射を生じる。一旦、液滴６３が基板表面５１と接触したら、この液滴は、基板表面の領域を修飾して、堆積した流体に関するこの領域の表面エネルギーの増大または減少を生じる。
【００７１】
次に、図３Ｂに示すように、基板４５は、液滴６３によって修飾された基板表面領域が、レザバ１３上に直接的に位置するように、基板位置決め手段５０によって再配置される。図３Ｂはまた、排出器３３が、排出器位置決め手段によってレザバ１３の下に、音響連結媒体４１を介して排出器とレザバとが音響連結するように配置されることを示す。一旦、適切に整列されると、排出器３３は、液滴４９を基板上に排出するように再度作動される。液滴４９は、単一の細胞６５（好ましくは、その細胞外膜上に、この表面に連結した同族部分によって特異的に結合されるマーカー部分を提示して、この表面への特異的結合をもたらす）を含む。マーカー部分は、非形質転換細胞において生じ得るか、または形質転換もしくは遺伝子操作の結果であり得、そして必要に応じて形質転換を示し得、その結果、マーカー以外の遺伝子が発現される（例えば、このマーカーは、別の遺伝子による形質転換のレポーターである）。
【００７２】
図３Ｃに示すように、基板４５は、再度、第一の単一の細胞６５が結合した部位とは異なる部位が、液滴に含まれる細胞を受けるためにレザバ１５上に直接位置するように、基板位置決め手段５０によって再配置される。図３Ｂはまた、排出器３３が、排出器位置決め手段によって、レザバ１５の下に、排出器とレザバとが音響連結媒体４１を通して音響的に連結するように配置されることを示す。一旦、適切に整列されたら、排出器３３は、液滴５３が基板上に排出されるように再度作動される。液滴５３は、第二の単一の細胞を含む。
【００７３】
同族部分は通常、オリゴヌクレオチドおよびペプチドを含む、リガンドである。マーカー部分は、ペプチドまたはペプチドグリカンであるようである。基板に結合したオリゴヌクレオチドを合成する際に用いられる化学は、音響流体液滴排出に適応され得る。これらの方法は、本発明での使用のための基板表面上にオリゴヌクレオチドのアレイを作製するために用いられ得る。このような適応は一般的に、核酸化学の当業者に公知であり、そして／または適切な文献および教科書に記載される、現在の従来技術を含む。例えば、ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ．Ｓｃｈｅｎａ編（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９）を参照のこと。すなわち、個々の連結反応は、オリゴヌクレオチドの合成のために用いられ、そして自動化オリゴヌクレオチド合成機で従来用いられる、標準的な条件下で実施される。このような方法論は、例えば、Ｄ．Ｍ．Ｍａｔｔｅｕｃｉら（１９８０）Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．５２１：７１９、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓらに対する米国特許第４，５００，７０７号、ならびにＳｏｕｔｈｅｒｎらに対する米国特許第５，４３６，３２７号および同第５，７００，６３７号に記載される。集束させた音響エネルギーもまた、インサイチュでの、コンビナトリアルオリゴヌクレオチド合成、オリゴペプチド合成、およびオリゴ糖合成に適応され得る；これらの合成を用いて、本発明で使用するためのコンビナトリアルアレイを生成し得る。
【００７４】
あるいは、オリゴマーは、基板表面への結合の前に合成され得、次いで、本発明の方法論を用いてこの表面の特定の位置に「スポッティング（ｓｐｏｔ）」され得る。さらに、このオリゴマーは、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、オリゴ糖、または任意の他の生体分子（もしくは非生体分子）オリゴマー部分であり得る。
【００７５】
本発明での使用のためのこれらの音響排出方法は、現行のアレイ調製技術（例えば、写真平版プロセス、圧電技術（例えば、インクジェット印刷技術を用いる）およびマイクロスポッティング）を用いて可能であるよりも実質的により高い密度を有する、分子アレイ（特に、生体分子のアレイ）の調製を可能にする。本発明のデバイスおよび方法を用いて達成され得るアレイ密度は、基板表面１平方センチメートルあたり少なくとも約１，０００，０００生体分子であり、好ましくは基板表面１平方センチメートルあたり少なくとも約１，５００，０００である。生体分子部分は、例えば、ペプチド性分子および／またはオリゴヌクレオチドであり得る。このような密度は、一般に、他の細胞からある距離で隔てられている、個々の細胞を含む部位を作製するために必要ではない。しかし、例えば、マーカー部分に特異的に結合する同族部分を用いて、部位表面の別個の部分を官能化するためのこのような方法の適応は、細胞をその部位内に局在させるために、または細胞を互いに極めて近接するように故意に配置するために有用であり得る。例えば、リンパ球アレイ（小さな直径の細胞（８μｍ）、中程度の直径の細胞（１２μｍ）、大きな直径の細胞（１４μｍ）からなる）は、適切な同族部分を用いて、各１００μｍ×１００μｍ部位の中心において直径１０μｍのスポットを官能化して、スポッティングした細胞を特異的に結合させることによって作製され得る。この配置は、例えば、個々の細胞の試験またはスクリーニングを可能にするのに十分な細胞分離を確実にする。この試験は、例えば、隣接部位の細胞を流体に曝露することなく、細胞を曝露または処理するに充分な容量の音響的に堆積された試薬含有流体の液滴により行われ得る。このような方法は、例えば、細胞のコンビナトリアルスクリーニングを可能にする。
【００７６】
次いで、本発明の多くの改変が可能であることが明確であるべきである。例えば、排出された液滴の各々は、単離された「最終的な」特徴として堆積され得る。あるいは、またはさらに、排出された複数の液滴（各々、１つまたは複数の細胞を含む）は、各部位が、確認し得る数の複数の細胞を含む細胞アレイを合成するために、基板表面の同じ位置に堆積され得る。この方法を用いて、細胞を、他の目的のため（例えば、特定の組織学的構造物の複製に基づいて組織を操作するため）にパターン化し得る。細胞アレイおよび基質表面への細胞の結合を含むパターン形成製造技術に関して、洗浄工程は、液滴排出工程の間で用いられ得ると考えられる。このような洗浄工程は、例えば、細胞が堆積された基板表面全体を、洗浄流体中に浸漬することを含み得る。
【００７７】
本発明は、同じレザバから、少なくとも約１，０００，０００滴／分の速度で、および異なるレザバから、少なくとも約１００，０００滴／分の速度で、液滴の排出を可能にする。さらに、現在の位置決め技術は、１つの細胞容器またはレザバから別の容器またはレザバへ、迅速かつ制御された様式で移動させるための排出器位置決め手段を可能にし、それによって、異なる流体の迅速かつ制御された排出を可能にする。つまり、現在市販の技術は、各レザバでの繰り返し可能でかつ制御された音響連結を伴って、高性能位置決め手段について約０．１秒未満、そして通常の位置決め手段について約１秒未満で、１つのレザバから別のレザバへ、排出器を移動させることを可能にする。カスタム設計されたシステムは、繰り返し可能でかつ制御された音響連結を用いて、約０．００１秒未満で、１つのレザバから別のレザバへと排出器を移動させることを可能にする。
【００７８】
カスタム設計されたシステムを提供するために、以下の２種の基本運動が存在することを留意することが重要である：パルス（運動）および連続（運動）。パルス運動は、排出器をある位置に移動させ、音響エネルギーを放出し、そして排出器を次の位置に移動させる、別々の工程を含み；また、このような方法と共に高性能位置決め手段を使用することによって、０．１秒未満での、各レザバにおける繰り返し可能でかつ制御された音響連結を可能にする。これに対して、連続運動設計は、排出器およびレザバを連続的に移動させ（同じ速度ではないが）、そしてこれらの移動が生じている間に排出を提供する。パルス幅は非常に短いので、この型のプロセスは、レザバの移動が、１０Ｈｚよりも高い、そしてさらには１０００Ｈｚよりも高い速度で生じるのを可能にする。
【００７９】
流体排出の正確性を保証するために、排出器に対する、液滴が排出される流体表面の位置および方向を決定することが重要である。さもなければ、排出される液滴は、不適当な大きさにされ得るか、または不適当な軌道で移動し得る。従って、本発明の別の実施形態は、排出事象間のレザバ中の流体表面の高さおよび細胞の近位性を決定するための方法に関する。この方法は、音響放射発生器へ流体含有レザバを音響的に連結する工程、および、次いで、その発生器を起動して、検出音波を生成する工程を包含し、この音波は、流体表面へ移動し、そして反射音波として流体表面から反射される。次いで、反射された音響放射のパラメーターを、音響放射発生器と流体表面との間の空間的関係を評価するために分析する。このような分析は、音響放射発生器と流体表面との間の距離および／または音響放射発生器と関連付けた流体表面の方向の決定を含む。
【００８０】
より詳細には、音響放射発生器は、流体表面から液滴を排出するのに不十分なエネルギーである、低エネルギーの音響放射を発生するように、起動され得る。これは、代表的には、液滴排出に通常必要とされるパルス（マイクロ秒オーダーでの）と比較して、極めて短いパルス（数十ナノ秒のオーダーでの）を使用して行われる。音響放射が流体表面によって反射され、音響放射発生器に戻るのに要する時間を決定し、次いで、その時間を流体中の音の速度と相関させることによって、距離（および従って、流体の高さ）が計算され得る。表面下の細胞の存在および深さは、同じ様式で決定され得る。もちろん、レザバの基部と流体との間の界面によって反射される音響放射が考慮されることを保証するように注意を払わなければならない。当業者は、このような方法が、従来のソナー技術または改良されたソナー技術を使用することを認識する。
【００８１】
一旦、分析が行われると、流体の少なくとも１個の液滴を排出するために、流体表面付近の細胞中心に近い焦点を有する排出音波が生成され、ここで、排出音波の最適な強度および方向が、前述の分析を使用して、必要に応じて、さらなるデータと組み合わせて、決定される。「最適」な強度および方向は、一般に、一貫したサイズおよび速度の液滴を生成するように選択される。例えば、排出音波の所望の強度および方向は、上記で評価した空間的関係のみならず、以下を使用して決定され得る：レザバに関連する幾何学的データ、排出される流体に関連する流体特性データ、細胞の寸法および結果として得られる細胞体積、および／または排出順序に関連する細胞含有液滴排出のヒストリカルデータ。さらに、これらのデータは、所望の場合、排出音波の焦点が流体表面付近にあることを保証するために、流体表面に対して音響放射発生器を再位置決めする必要性を示し得る。例えば、この排出音波が流体表面付近に焦点合わせされ得ないように、音響放射発生器が位置決めされていることを分析が示す場合、音響放射発生器は、垂直方向運動、水平方向運動および／または回転運動を使用して再位置決めされ、排出音波の適切な焦点合わせを可能にする。
【００８２】
本発明の１つの局面は、単一の細胞の排出であるので、本発明の選択的特性は、即座に理解される。単純な排出を使用することによって、最も小さい細胞の排出で開始して、十分に異なるサイズの細胞が分離され得る。従って、デバイスは、アレイを作製するためのその使用に加えて、１つの型のセルソーターとして使用され得る。例えば、単球（直径２０μｍ）は、小さいリンパ球（直径８μｍ）ならびに中程度および大きいリンパ球（直径１２〜１４μｍ）の両方よりもはるかに大きいので（単球の細胞体積は、大きいリンパ球よりも約３倍大きく、小さいリンパ球よりも約１６倍大きいことに対応する）、これらの細胞の混合物は、アレイ化またはソーティングのために選択的に排出され得る。小さいリンパ球を排出するのに十分な最小の音響エネルギーレベルは、大きいリンパ球および単球を排出するのに不十分である。
【００８３】
一旦、全ての小さいリンパ球が排出されると、大きいリンパ球は、より大きくかつ重い単球を排出する危険性をほとんど伴わずに、大きいリンパ球を排出するのに十分な最小の音響エネルギーレベル（中程度のリンパ球を排出するのに十分である）を使用して排出され得る。細胞の外側上で外部に提示されたマーカー部分に対する同族の部分での表面官能基化は、表面上への排出を必要とするが、別のレベルの選択性を提供する。最後に、本発明は、細胞の音響的な位置を提供し、細胞が、排出されるべき表面に十分に近いか否かを決定するので、種々の特性が、排出のさらなる基準として測定および使用され得る。細胞分類の当業者は、さらなる基準を用いるこのような排出が、排出された細胞を別の流体容器へ移すのに適切な軌道での排出によってか、または基板にスポットし、その後、容器内へ所望の細胞を洗い出すことによって、従来の細胞分類適用に適合され得ることを理解する。同様に、キャリア流体とは異なる音響インピーダンスを有する限局体積物（例えば、細胞）を分類するように適合された本発明は、粒子（例えば、ガラスまたはポリマービーズ）の分類に明らかに適合しており、これらの粒子としては、特定の部分を用いてタグ化された粒子、または、さもなければ、いくつかの特性の測定により評価され得る粒子が挙げられる。細胞、および音響インピーダンスの異なる他の限局体積物（例えば、固体またはゲル粒子）を分類する際に有用な特性としては、音響密度および音響サイズ（これらの両方は、公知の音響手段により測定され得る）が挙げられる。密度は、限局体積物とキャリア流体との間の界面により反射された音波を測定することにより得られる音響反射率から計算され得る。サイズおよび形状は、従来のソナー法により測定され得る。
【００８４】
セルソーターとして具現化される本発明は、好ましくは、少なくとも１つのチャネル、好ましくは、１より多いチャネルを用いて構成され、このチャネルから、細胞が排出される。排出チャネルは、好ましくは、分類される細胞が単一のフィールドを通過することを可能にする。細胞は、他の型の容器（流体チャネルを含む）に、または仕切りを有さない基板（例えば、平面アレイ）上に排出され得る。この基板では、細胞が、互いについて十分な距離で付着して、各々の細胞について仮想の別々の容器を形成することにより、局在される；あるいは、この基板は、仮想の容器における細胞間の相互作用を可能にするために十分に接近して整列された、いくつかの細胞を有し得る。従来の容器（例えば、市販のウェルプレート上のウェルのアレイ）は、１つ以上の細胞の仮想の容器のアレイについての物理的容器としての役目を果たし得るか、または個別の細胞もしくは１つ以上の細胞型の複数の細胞についてのレセプタクルとしての役目を果たし得る。細胞の混合物（例えば、単球、Ｂリンパ球、およびＴリンパ球）は、特定の実験について所望され得る。
【００８５】
各排出チャネルについての複数の排出器は、特に、複数のチャネルの場合、スループットを増大させ得、そしてこの構成が好ましい。各排出器は、１つ以上の検出（ｓｅｎｓｉｎｇ）手段または検出（ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ）手段と協調され得る。このような協調は、所定の排出チャネルと関連する１つまたは複数の排出器を個別に解放することによるように、手動で実施され得る。好ましくは、検出および排出の協調は、プロセッサを用いる集積システムにより達成される。このプロセッサは、検出された特性について予め選択されたパラメーターに基づく選択を行う。異なる排出チャネルは、異なるサイズの細胞集団について設計され得る。この細胞集団は、従来の手段（例えば、濃縮技術および限外濾過）を用いて、サイズにより分別され得る。各排出チャネルについての好ましい複数の排出器は、複数の標的（例えば、複数のウェルプレートもしくは同じプレート上の異なるウェル、または異なる容器（流体チャネルを含む））に対して細胞を排出し得る。
【００８６】
選択的に排出された細胞を目的の場所に運ぶための標的チャネルが備えられる。少なくとも１つの領域の頂部で開口する排出チャネルから、同様に頂部で開口する、すぐ近くに位置する輸出管（ｅｆｆｅｒｅｎｔ）または標的チャネル（または他の容器）への細胞の簡便な排出のために、音響排出手段または集束音響エネルギーの供給源は、排出された液滴に対して非垂直方向軌道（すなわち、流体表面に対して並行な速度成分を有する軌道）を与え得るべきである。このような非垂直排出速度は、排出チャネル中の流れに対して並行ではない場合、この排出チャネルから水平方向に間隔をあけられた容器（例えば、標的チャネル）へと、液滴を排出し得ることが容易に理解される。排出チャネルから細胞を受け取るためのこのような標的チャネルは、この排出チャネルと流体連絡していても、していなくてもよく；さらに、音響排出された細胞を受け取るための標的チャネルもまた、別の標的チャネルもしくは容器（細胞が本来排出されたチャネルを含む）に対する細胞の排出のための排出チャネルとしての役目を果たし得る。
【００８７】
最大の分離効率および柔軟性のために、排出速度の水平方向の（または表面に平行な）成分は、（１）流体に対して垂直方向の細胞の排出、（２）この速度の唯一の非水平成分が排出チャネルの流れより与えられるような、この排出チャネルの流れに対して平行な細胞の排出、あるいは（３）このチャネル中の流体の流れの方向に並行ではない、種々の非垂直速度成分による細胞の排出、を可能にするように変更され得る。排出のこのような方向性（音響排出器自体の集束により制御可能である）は、例えば、単一の排出器による、中央の排出チャネルから、この排出チャネルのいずれかの側面に流れる２つの標的チャネルのいずれかへの排出を可能にする。各標的チャネルは、排出チャネルの流れに対して、実質的に並行または逆並行に流れる。最も好ましくは、このような調節可能な音響排出器は、細胞を排出するために、１つのチャネルから別のチャネルへ移動され得る。例えば、細胞が中央のチャネルからいずれか一方の側面のチャネルへ排出される、３つの平行なチャネル配置において、排出器は、好ましくは、いずれかの側方のチャネルに移動されて、細胞を、中央のチャネルに排出して戻し得るか、中央のチャネルから反対側の側方に間隔を空けたチャネルに排出し得るか、または側方のチャネルに十分に近い上記の３つのチャネル以外のチャネルに排出し得る。
【００８８】
さらに、排出の間に、排出容器もしくは排出チャネルまたは標的容器もしくは標的チャネルの中の流体は、他の容器またはチャネル中の流体に対して絶対的または相対的のいずれかの、特定の方向の流れを必要としないか、または全く流れを必要としないことが容易に理解される。流体の流れの場合、標的チャネルは、排出器チャネルに対してループし得るか、排出器チャネルが標的チャネルに対してループし得る；あるいは、慣用的な微小組み立て方法（例えば、Ｃｈｕらに対する米国特許第６，０４４，９８１号（これは、犠牲酸化物を用いて構築されたナノメータースケールの埋め込み型チャネルフィルターおよびシリコン材料の層化を用いる標準的な写真平版技術を教示する）を参照のこと）により簡便に組み立てられ得るように、標的チャネルまたは排出チャネルは互いに交差（ｃｒｏｓｓ  ｏｖｅｒ  ｏｒ  ｕｎｄｅｒ）し得る。
【００８９】
臨床細胞分類適用のために、速度および高スループットが医学的な理由のために所望され得る場合、制限された分類が、頻繁に起こり得る。例えば、特定の特殊な細胞（例えば、未成熟な幹細胞）のみが、異質の同種異系移植片（または、恐らく異種移植片）の場合に、注入のために分離される必要がある。自己再注入のために、病的な細胞のみが取り出される必要がある。このような場合、複数の音響細胞排出手段「プレチャネル」を用いて、１チャネルあたりの細胞スループットを増加させる単一または複数の検出手段と協調するように、望ましくない細胞を所定のチャネルから連続して（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｒ  ｉｎ  ｓｅｒｉｅｓ）排出し得る。この増加した１チャネルあたりのスループットは、さらに、同時排出のための複数のチャネルの組み合わせを用いることにより達成される。
【００９０】
図７は、周辺チャネルの側方に、高速で、細胞を供給する中央流体チャネルを有するデバイスを示す。周辺チャネルから、好ましくは、複数の排出器の使用により、細胞が基板上に排出される。図７Ａは、より大きな容器内の、細胞を含有する垂直チャネルの側面図を示す。垂直チャネルからの流体は、この垂直チャネルから側方に突き出た斜めのリップの下を通過することにより、より大きな容器の周辺部にのみ接近可能である。このリップとより大きな容器の底との間の距離は、放射状に外に向きに減少し、その結果、細胞は、中央チャネルから周辺部へと放射状に外に向きに通過し得る。周辺部で、垂直チャネル中での細胞の間隔に対して、細胞がさらに離れて間隔をあけ、そして細胞が水平面に移動する場所にチャネルが形成される。図７Ａおよび図７Ｂは、容器の壁９２のすぐ内側に位置する周辺チャネル８９に達している、細胞を排出するための回転流体チャンバの外周に位置する、２つの排出器部位９３および９４の２つの集束音響要素を示す。収集デバイスまたは基板は示さない。複数の集束音響要素は、好ましくは、この外周に位置づけらる。この要素の各々は、好ましくは、少なくとも１つの細胞特性検出器（ここではＤ１およびＤ２）の前に置かれる。液体はまた、上記の斜めのリップ９１から引き集められて、音響要素のフォーカルスポットの排出ゾーンへの粒子の流れをさらに誘導し、そして細胞が存在し得る水平方向の領域を減少させる。この構成は、大きな容量の流体を排出ゾーンへの掃引の利点、ならびに細胞分類のスループットおよび全体の効率の両方を増加する利点を有する。流体の全体の容量、および含まれる全ての細胞は、共通の中央チャネル９０を通過した後、周辺チャネル８９の途中の斜めのリップ９１舌を通過する。周辺チャネル８９に進入した過剰な流体は、音響排出（示さず）によってか、または分別される細胞に対して小さすぎて細胞が通過できない寸法を有する従来のミクロ流体チャネルによって取り除かれ得る；このようなチャネルは、慣用的な微小組み立て技術により容易に作製されることが理解される。
【００９１】
１つのこのような分別ユニットにおける多重化検出器および多重化排出器に加えて、複数のこのようなユニットが、並行して同時に用いられて、スループットおよび効率を大幅に増大し得る。さらに、二者択一ではない排出判定器（ｎｏｎ−ｂｉｎａｒｙ  ｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｄｅｃｉｓｉｏｎ）が、このユニットの各排出器に作製され得、そしてさらなる柔軟性が、複雑な分離について連続でユニットを用いることにより得られ得る。連続で用いられるユニットは、複雑な分類手順に関する、逐次的に異なる平均細胞サイズまたは他の細胞パラメーターについて最適化され得る。
【００９２】
好ましい方向付け可能な音響排出手段は、チャネルにおける流体の流れに全く同じ水平方向速度および反対の方向で液滴を排出することにより、流体運動にもかかわらず、液滴を垂直に排出するように調整され得る。この排出手段は、チャネルの流体の流れに並行な静止した基準系に対する任意の水平方向の速度があろうとなかろうと、このチャネル中の流体の流れに対して垂直の方向に、正味の水平方向の速度を有する液滴を排出するように容易に調整され得る。従って、例えば、細胞を含む液滴は、１つの方向付け可能な排出器から、排出チャネルの近くの２つのチャネルのうちの１つに排出され得るか、または排出器チャネル上に配置された基板表面上に排出され得る。この排出器は、二者択一ではない。なぜならば、４つの選択が存在するからである：排出しない、２つの可能なチャネルの各々に排出する、および基板表面に排出する。同様に、排出のための可能な標的としての固体基板がないとしても、排出しない、または２つの標的ｖチャネルの各々に排出するという選択は、単一の排出器での二者択一の選択スキームよりむしろ三者択一（ｔｅｒｎａｒｙ）選択スキームを提供する。
【００９３】
種々の検出手段が、しばしば、いくつかの性質（例えば、強磁性または蛍光など）を付与される特異的抗体（Ａｂ）のようなタグを使用して、慣用的に使用される。このようなタグ化された性質および内在性の性質（例えば、内在性の蛍光性質）は、細胞の特性（例えば、直径、細胞質の体積に対する核の体積の割合、そしていくつかの場合において、細胞質内および核内の状態）を決定するために使用され得る。例えば、アミノ酸トリプトファン（Ｔｒｐ）の内在性蛍光の測定は、特定のタンパク質からの、または、異なる条件下での同じタンパク質の、正味のスペクトルへの寄与を検出することによって、細胞の正体についての有用な情報を生じ得る。各トリプトファン分子は、分子の局所環境によって影響または移行される吸収スペクトルおよび発光スペクトルを有する。従って、あるプロテアーゼは、別のプロテアーゼと異なるスペクトルを有し、同一のプロテアーゼは、そのプロテアーゼ周辺の流体のｐＨが変化される場合、そのスペクトルにおける移行を受ける。従って、顆粒球の中でも、例えば、好中球または多形核細胞（ＰＭＮ）（過剰の好中性の膜に囲まれた顆粒を伴う）は、それらの特性的に異なる顆粒を有する好酸球および好塩基球とは異なる正味の内在性Ｔｒｐ蛍光を提示する。同様に、クロマチンに高レベルの密度でパックされたヒストンを有する核は、内在性Ｔｒｐ蛍光によって細胞質とは識別可能である。細胞の外表面の蛍光タグ化は、細胞が検出器を通過するときの、その細胞の蛍光発光を測定することによって細胞のサイジングが可能であり、ここで、検出ウインドウを通る発光スペクトルの任意の成分の発光の持続時間は、流れに対して平行な断面の面積に比例する。このシグナルは、可能な限り最も長い持続時間のシグナルを得る場合（例えば、細胞中心を横断してかまたは最も長い横断距離に沿って得られる）、このシグナルは、細胞直径に比例する。この検出はまた、流れの方向と、検出器から細胞中心への軸の両方に対して直交する横断面における全ての位置からの発光の検出である場合、時間にわたって積算した蛍光の強度は、その提示された断面積に比例するシグナルを生じる。時間に対する時間の関数として測定される強度の微分（一定の速度の流れに対する距離に対応する）は、立方体の細胞よりも鋭くないシグナルを示すことが予測される球状細胞を用いて、いくつかの形状についての情報をもたらす。細胞成分の内在性の蛍光が測定される場合、発光持続時間は細胞直径に対して比例し、一方、時間にわたって積算した発光強度は、検出ウインドウを通過した全体積に対して比例し、時間に対して微分した強度は、形状についての情報をもたらす。
【００９４】
多くの異なる性質またはパラメーターのうちの任意の１つが検出され得ることが容易に理解される。一般的に、検出される性質は、プロービングシグナルまたは励起シグナルを必要とする。例えば、最も分光的な方法（蛍光を含む）は、電磁波による励起から生じる、電磁的な発光または吸収の測定を使用する。音響または超音波型の検出は、界面（例えば、細胞表面とキャリア流体との間の界面、または核と細胞質との間の界面）での音響インピーダンスにおける差異の結果としてもたらされる、集束音響エネルギーのプロービングシグナルを必要とする。例えば、高密度でパックされ、そしてしっかりと保持される核の物質と、緩く、低い密度の細胞質との間の音響インピーダンスにおける差異は、核の音響検出ならびに核および細胞質の体積の決定を可能にすることが理解される。表面を蛍光でタグ化した細胞をサイジングする、現在の慣用的な方法の良い例は、Ｈａｒｒｉｓらに対する米国特許第４，７６５，７３７号に記載され、これは、細胞の混合物において最も大きな細胞よりも大きな直径を有するレーザービームを使用し、光散乱および蛍光の両方が測定される。等価な情報が音響検出方法または超音波方法から誘導され得ることが容易に理解される。しかしながら、核および細胞質の体積を測定するための内在性の蛍光検出の適応性は、音響的な寸法測定から計算された値よりも、より信頼性の高い全細胞体積、細胞質体積および核体積の推定をもたらすことが理解される。さらに、先に考察したように、内在性蛍光は、例えば、形態学的に類似する顆粒球間を識別可能である。
【００９５】
物理学的特性において検出される差異は、視覚的特性における差異として明示され得る。これらの視覚的特性は、肉眼、顕微鏡検査または適切にプログラムされた画像処理装置を備えるビデオカメラによって検出可能であり得る。光学的特性における差異（例えば、伝達性、反射性、色、極性など）は、測定され得る。
【００９６】
検出される差異は、他の物理学的特性の差異（例えば、導電率、静電容量、インダクタンス、マイクロ波の透過性または磁気特性）であり得る。これらの差異は、細胞生存度に実質的に影響を与えない検出方法である限り、超音波または他の音響エネルギーの使用によって、あるいは分光的技術によって検出され得る。
【００９７】
一旦、特定の性質によって分けられると、これらの細胞は、さらに分けられる。例えば、広範なサイズの分布を有する細胞の混合物は、３つのサイズのビンに分けられ得る：大、中および小。これらのサイズを揃えた集団（例えば、中程度のサイズに揃えた集団）は、さらに、３つのビンにサイズによって再び分けられ得る。一般的に、同一の性質における小さな差異の連続的な検出は、検出条件を変化させることによってもたらされ得る。例えば、迅速に移動する流体中で、超音波または音響画像を用いて、サイズにおける大きい差異により分けられた細胞の亜集団は、よりゆっくりと移動する流体において、さらにサイズによって分けられ得る。血球は、このように分類され得る細胞の１つの例示である。単球（直径約１１〜２０μｍの球）、リンパ球（直径約８μｍ（小）、１２μｍ（中）または１４μｍ（大）の球）および赤血球（直径約７μｍ、高さ約３μｍのドーナツ状円盤）の混合物は、約２２μｍ幅の排出チャネルの使用を通して細胞型によって分類され得る。このチャネルは、全ての細胞を確実に浮遊させるための手段（例えば、細胞生存度に影響しない、適切な密度のキャリア流体、または排出部位からすぐ上流の排出チャネルにおける物理的なランプ様構造）を使用する。リンパ球および単球は、約１５μｍの幅を有するリンパ球用の標的チャネルおよび約２２μｍの幅を有する単球用の標的チャネルを用いて、適切なサイズのチャネルに排出される。いくつかの赤血球は、排出チャネルにおける排出の間に排出される細胞と並んで配置されるそれらの能力に起因して、リンパ球と共に排出され得、単球と共に排出される可能性は少ない。一旦、１５μｍ幅に流されたリンパ球は、全体にわたって高スループットを維持するために適度に迅速であるよりゆっくりとした流速を用いて、再び音響的にサイジングされ得る。なぜなら、このリンパ球の亜集団は、単に細胞総数の一割に過ぎないからである。
【００９８】
あるいは、混合物における異なる細胞は、所定の波長での励起を用いて、内在性の蛍光によって分けられ得、そして測定された体積あたりの発光が測定され得；最初に分けられたグループは、細胞の異なる性質をプローブし得る、異なる波長での発光を測定することによってさらに分けられる。
【００９９】
前述は、連続的な多重化の型であり、ここでは、異なる性質が、最初に分けられた亜集団の全てかまたはいくつかについて測定され、この亜集団をさらに分ける。この方法はまた、選択が連続的に変化する性質（例えば、サイズ）の値に基づいてなされ得るので、アナログ分離に類似する。この方法は、任意の形態の連続的処理のような方法は、処理能力を増加するために平行して実行され得る。
【０１００】
細胞の複雑な混合物のために、連続的多重化および平行多重化の両方は、好ましくは、複数の検出器と異なる型の検出器とを組み合わされる。例えば、複数の検出部位での内在性蛍光と組み合わせた音響検出が使用され得る。多くのパラメーターが、経時的に、音響反射と蛍光の両方を測定することから決定され得る。例えば、細胞および核の直径は、核の存在および核／細胞質／全細胞の体積は、音響および内在性蛍光データを統合することによって決定され得る（本明細書中に記載される目的のために、細胞質体積は、オルガネラ（例えば、マクロファージ内のミトコンドリアおよび顆粒球の顆粒）を含む体積を含むものとして解釈されるが、これらの体積は、厳密には細胞質ではなく、そしてより正確な用語は、核外体積（すなわち、全細胞体積−核体積）である）。種々の周波数で内在性蛍光を測定すること（例えば、血液の細胞型にわたる平均に対するＴｒｐ発光周波数強度最大値；有核血液細胞の核の同様の平均に対するＴｒｐ発光周波数強度最大値；ＰＭＮの発光周波数強度最大値に対応する周波数偏移）は、細胞質体積に対する核体積の比率のような幾何学的パラメーターによって識別することはできない顆粒球のような細胞の選択を可能にする。導入されたタグを無効にすることが通常所望され得るが、意図的に標識された細胞に関する選択方法もまた、本発明と共に使用され得る。
【０１０１】
図６は、中央チャネル、排出チャネル、細胞が流れる２つの検出デバイスＤ１およびＤ２、および大きな楕円形によって示される２つの排出部位の上面図（各々は、細胞の描写を含む）である。この放出部位から、細胞は、基板表面に対して垂直に排出され得るか（示さず）、または隣接する標的チャネル中に排出され得る。細胞の流れは、排出部位に到達する前に検出器を通過する。細胞は、流体表面に実質的に平行な平面（ここでは、水平面（その面に対する直角方向が垂直方向である））に対して垂直である速度成分のみを伴って、排出部位から排出され得る。垂直な排出の速度成分が、０ではない速度の成分である場合、排出軌道が流体表面に対して垂直であり（ここで、垂直）、先の図面で示したように、アレイ形成のために基板表面（ここでは、示さず）上の排出を可能にする。細胞を含有する液滴はまた、非垂直な速度成分で排出され得、点線によって示される軌道のような軌道を可能にする。
【０１０２】
中央または排出チャネル付近に示されるチャネルは、排出された細胞を受け取るための標的チャネルである。排出チャネルにおける排出部位の各側部で、共通の流体チャネルは、排出チャネルに到達するすぐ前に２つのチャネルに分けられ、そして、２つのチャネルに向って輪になり、これらは、短距離にわたり、排出チャネルにおける流体の流れに対して平行および逆平行に流れる。標的チャネルは、中央のチャネルに十分近く、細胞が、排出チャネルから任意に選択された標的チャネル（排出部位近くで排出チャネルに隣接する）へ排出されることを可能にする。この描写において構成されるように、排出部位の１つで、細胞は、排出されないことが選択され得るか、基板表面（基板表面上のアレイ部位のような）に垂直に排出されることが選択され得るか、または４つの排出部位のいずれかに選択的に排出され得る。それゆえ、各部位からの６つの可能な排出先（排出しないことを含む）が存在し、１１個（９つのチャネルおよび２つの基板表面）までの異なる細胞亜集団を分類することが可能である。あるいは、このチャネルは、細胞または細胞亜集団の９つの異なる型に分類するために使用され得、そして基板表面上のアレイ部位（ウェルプレートのウェルのような）での、これらの細胞の垂直な排出は、分類される細胞の特徴付けのために同時に実行され得る。
【０１０３】
細胞選択の１つの共通な仕事は、コロニー採集に関する。ここで、アガー表面は、細菌細胞または他の微生物由来の細胞で「穿刺」される。代表的に、コロニー採集デバイスは、接種ループまたは接種針を含むロボットアームを駆使する光学システムを備える。光学システムは、目的のコロニーを配置させ、針をアガーに刺し、そしてさらに増殖させるための容器にコロニーを移動させる。これらのシステムは、時々、目的のコロニーを見つける能力があてにならない。
【０１０４】
これらのデバイスの針は、接種の間にリンスされ、滅菌されなければならない。リンスおよび滅菌の処理は、炭素堆積物および化学的残渣の堆積を導き、これらは、目的の生物のさらなる増殖を妨げ得る。機械的ロボットアームはまた、失敗する傾向があり、そして密接な間隔のコロニーを採集するために、または高密度アレイ中に細胞を送達するために、比較的不正確に配置しかねない。
【０１０５】
コロニーからの直接的な細胞の音響排出は、アガーまたは他の半固体、ゲルなどの上で増殖する任意の数の細菌コロニーからの、特定数の細胞を排出する優れた方法を提供する。高密度にパックしたコロニーは、音響エネルギーを正確および厳密に集束することが可能なので、近くのコロニーからの細胞による採集されたコロニーの汚染を伴わずに別個に採集され得る。
【０１０６】
コロニーの存在は、音響顕微鏡手段によって、例えば、コロニーを有する領域とコロニーを有さない領域との比較において、アガー表面で異なる音響インピーダンスを検出することにより検出され得る。無数の他の検出手段（標準的な光学顕微鏡法および内在性トリプトファンの蛍光の検出を含む）と交換可能であるか、または付加する能力は、すぐに明らかである。
【０１０７】
細胞は、ウェルプレートのウェル中または他の物理学的容器に排出され得る。あるいは、平面の基板（基板に細胞を接着させるための特徴的な手段を有するか、または有さない）が、使用され得る。容器またはウェルは、そこへ細胞を排出する前に、栄養培地（例えば、栄養アガー）を含み得るか、または栄養物が排出後に添加され得る。単位時間当たりに送達される音響エネルギーの出力を調節すること（排出が起こる表面に十分近い焦点に対して、そしてこの距離を一定に保持すること）およびその結果としての液滴の体積は、再生可能な様式において、所望される細胞数（標的の容器またはレセプタクルあたりの）の堆積が可能である。複数の別個のコロニーが、１つ以上の培養容器で検出可能な場合、細胞サンプルは、ウェルプレートまたは他の基板表面上にコロニーによって整列され得る。
【０１０８】
コロニーの生物および形態に依存して、この細胞は、排出を容易にする特定の条件を生成する（例えば、コロニー中の流体の粘度、またはその基質もしくは培地を形成する下に存在するゲルもしくは半固体の粘度を減少させる）必要なく、寒天または他の栄養性表面から排出され得る。いくつかの状況は、排出を可能にする特定の条件を促進するための手段を必要とする。排出許容条件を生成するための種々の手段としては、細胞内接着および／または細胞体流体もしくは下に存在する寒天（もしくは他の寒天様培地）の粘度に影響を与える、コロニー部位における化学的または生化学的試薬の堆積が挙げられる。例えば、アガロースを含有する流体（または別の寒天分解酵素）は、コロニーの下にある寒天を液化してか、または液体培地の粘度を減少させて、コロニーからの細胞の排出を容易にするために、堆積され得る。例えば、細胞が増殖される培地のタイプに依存して、他の酵素が用いられ得る。
【０１０９】
真核生物細胞は、代表的に、ゲル様培地上では増殖させないが、これらは、しばしば、細胞内接着を減少するためにある処理を必要とし、この処理はまた、いくつかの原核生物細胞にも必要であり得る。真核生物が、ゲルまたは別の半固体培地上で増殖される場合、音響エネルギーまたは他のエネルギーの送達によって、細胞の下にある基質における相または粘度の変化に影響を与えることは、細胞間の接着を減少させるために必要な任意の処理と共に使用され得る。
【０１１０】
好ましくは、コロニーの下に存在する領域は、その上に存在するコロニー中の細胞の生存度に影響を与えることなく、寒天（または他のゲルもしくは半固体培地）を融解する温度（Ｔｍ）まで加熱される。このために、低Ｔｍ寒天またはゲル様培地が使用され得る。また、相変化は、細胞が排出されるコロニーの下にある領域に局在するべきであり、その結果、隣接するコロニーは破壊されない。多数のコロニーを含有する寒天プレート中の培地の大規模な融解は所望されない。なぜなら、全ての別個のコロニーは、いくつかの細胞が各コロニーから排出され得る前に、合体するからである。細胞が、各コロニーから絶え間なく排出され得るために、細胞が連続的に排出されるコロニーの下に存在する培地の局所的な相変化または融解が、迅速に達成されなければならない。局所的に迅速に加熱するための種々の手段が用いられ得る。例えば、薄い部材またはピンを備える電気加熱要素が、コロニーの下に挿入され得、そしてその下に存在する培地は、電気パルスにより融解され得る。
【０１１１】
加熱デバイスと培地との間の物理的接触を必要としない加熱手段が、好ましい。例えば、適切な断面および周波数を有する方向付けされた電磁エネルギー（例えば、方向付けされたマイクロ波もしくは赤外線、またはレーザービーム）が、用いられ得る。好ましくは、電磁放射線源は、電磁波が、細胞が排出されるコロニーの下に存在する培地を通過するように位置し（例えば、この供給源は、培地の下に位置する）、その結果、この下に存在する培地は、上に存在するコロニー中の細胞よりも早くかつより大きな程度まで加熱されて、この細胞を所望しない加熱からシールドする。
【０１１２】
集中した音響エネルギーによるコロニーの下の培地の液化は、局所的な融解を実施する最も好ましい手段である。なぜなら、熱エネルギーが伝達される深さおよび容量の大きさが、制御され得るからである。集中した音響エネルギーは、中程度の熱伝導率を有する物質の円柱形領域の外側を有意に加熱することなく、約２０μｍ程度の小さな直径および約２００μｍ程度の低い高さを有する円柱形領域を加熱するために、使用され得る。従って、一旦、例えば、音響的手段によってコロニーが位置決めされると、音響エネルギーの焦点は、その動力が表面から液滴を排出する閾エネルギーを送達するには不十分であるように調節され得る。加熱の領域は、目的のコロニーの境界の下に全体的に存在するように培地表面（範囲）に対して平行な面において、空間的に制御される。音響焦点の深さおよび加熱の深さは、培地とその上に存在するコロニーとの間の表面または界面より下にあるように調節され、このことにより排出がさらに防止される。排出することなく、所望の焦点においてより均一な加熱を達成するために、音波の周波数は、排出のために使用される周波数に対して減少され得る。音波の振幅は、加熱速度を調節するように、調節され得る。
【０１１３】
いくつかの場合において、コロニーを形成する、排出される細胞は、下に存在する培地を液化するように形質転換され得る。例えば、寒天ベースのゲル培地が使用される場合、細胞は、アガラーゼ（下に存在する寒天を加水分解的に液化する酵素）を放出するように、形質転換され得る。類似の酵素が、異なる培地について使用され得、例えば、セルラーゼは、種々のポリサッカリド部分を加水分解するために使用され得る。アガラーゼを放出するための形質転換は、アガロースゲル材料からの排出を促進するためのみに行われ得るか、またはこの形質転換は、形質転換されたコロニーからのみの排出を選択的に促進する別の形質転換と共に行われ得る。例えば、細菌は、細胞質におけるパンサイトケラチン（ｐａｎｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ）（哺乳動物タンパク質）の発現のため、および周辺細胞へのアガラーゼの放出のための構築物で形質転換され得、その結果、排出性は、形質転換された細胞のマーカーとなる。
【０１１４】
本発明の細胞を分類または整列するための方法およびシステムに必要ではないが、検出および排出の好ましい連続的な並行多重化は、プロセッサに適し、そして好ましくは、このプロセッサと一体化される。このプロセッサは、種々の検出データをまとめて、検出および測定された細胞が排出部位に到達する時間を計算し、そして適切な排出を実施するように機能し、標的容器、チャネルまたはアレイ部位を正確に標的化するのに適切な速度ベクトルおよび軌道を有する、細胞を含む排出液滴を与える。従って、最大の効率およびスループットは、各部位に多数の選択可能な排出標的を有する検出部位および排出部位の連続的かつ並行な高レベルの多重化を伴って、達成される。
【０１１５】
本発明が細胞分類に使用され得ることに加えて、排出基準としての性質を測定する能力は、キャリア流体とは異なる非生存固体、ゲルおよび流体領域の分類を可能にする。例えば、固相コンビナトリアル合成に使用され、このコンビナトリアル配列を同定するあるマーカーまたは特性を有するビーズの排出は、本発明の方法によって分離され得ることが、容易に理解される。
【０１１６】
（実施例１）
（赤血球細胞、顆粒球およびリンパ球のチャネルへの同時分離を伴う、末梢血由来の細胞の混合物からのアレイとしての基板への単球の音響排出）
ヒトＭＨＣ（全ての細胞上に提示される）に対するウサギポリクローナルＡｂを作製し、個体に対して特異的なエピトープではなく、全てのヒトに共通のＭＨＣエピトープに結合する、単一のクローンを選択する。基板を、慣用的方法によってモノクローナル抗体（ｍＡｂ）で官能基化する。単結晶Ｓｉを官能基化するための公知の方法の多さに起因して、単結晶Ｓｉを、基板として選択する。
【０１１７】
図６に例示されるように、２５μｍの幅を有するチャネルを使用して、細胞を探して排出するのにかかる時間を減少する。分類装置のこの中心排出チャネル要素は、約６ｃｍ長であり、約２．７５ｃｍと３．２５ｃｍとの間で上側が開いており、一端の約０．５ｃｍが開いている。血液細胞は、流体連絡されたチャネル（示されず）から供給される。２つのディテクターＤ１およびＤ２は、この示されるチャネルの最初の約０．５ｃｍに配置される。集中音響エネルギー変換器は、上部で開いた排出チャネルの領域中の排出部位の下に直接位置する。各排出部位の各側面に向かって、共通流体チャネルは２つのチャネルに分岐し、この２つのチャネルは、排出チャネルに向かって輪になり、その結果、短距離の間、排出チャネル内の流体の流れに対して、一方のチャネル中の流体は平行に流れ、そして他方のチャネル中の流体は、逆平行に流れる；これらの２つのチャネルは、排出チャネルに十分に接近しており、これにより、細胞は、排出チャネルから選択された標的チャネルに排出され得る。排出部位１つあたり、４個のチャネルがあり、合計で８個のチャネルがある。音響排出は、ゼロの大きさの速度成分、または流体表面に対して平行な（例えば、任意の水平方向）ゼロではない方向速度成分を与え得る。これにより、細胞含有液滴は、検出される特性に基づいて、４つの標的チャネルのいずれかにか、または排出部位の上の流体表面に対して実質的に平行に方向付けられた基板表面上に、音響的に排出されるか、あるいは全て排出されないのを可能にする。これらのチャネルは、慣用的な微小製造技術によりカバーガラスプレートに熱融着された（上部の開口部以外）ＨＦエッチングガラスプレートから製造される。
【０１１８】
用いられるディテクターは、レーザー／固有蛍光ディテクター（Ｄ１）および音響画像化ディテクタ（Ｄ２）である。音響排出変換器はまた、排出部位においていくつかの検出機能を実行して、最低限、細胞が排出のための流体表面に十分に接近しているか否かを検出する。細胞は、図５Ｄに示されるように、ランプ様構造により表面に押しつけられる。加えられるストリンジェンシーは、排出される細胞の容量に基づいて送達される音響エネルギーを調節することにより、達成され、従って、細胞サイズを実質的に過小評価するサイズ決めにおける誤りが存在する場合、実質的により大きな細胞の排出を防止する。
【０１１９】
蛍光データ、光散乱データおよび音響データを、このプロセスを制御するプロセッサに入力する。サイズ化データ（寸法を含む）、細胞および検出された核の体積、および適切な細胞質／総／核のサイズ比または体積比を、組み込んだ音響データ、蛍光データおよび／または散乱データから得る。固有のＴｒｐ蛍光放出スペクトルもまた、各細胞について測定する。細胞の大半は、形態学的特徴によって区別可能であるので、決定樹は、第１に、サイズ比および体積比、ならびに第２に、固有の蛍光データに基づく。赤血球（ＲＢＣ）は、それらの大きい寸法において、小さいリンパ球と幾分重複を有するが、半径が同一である場合でさえ、はるかに小さい総体積を有する。なぜなら、リンパ球は、球形であるが、ＲＢＣは、ドーナツ状であるからである。ＲＢＣはまた、核を持たない。小さいリンパ球は、中程度のリンパ球および大きいリンパ球と同様に、大きい核対細胞質（および核対全細胞）体積比を有する。中程度のリンパ球および大きいリンパ球は、顆粒球および小さい単球とサイズが重複するが、いずれよりも、実質的に大きい核対細胞質体積比を有し、ほとんどの場合、厳密性を加える場合を除いて、蛍光スペクトルデータの使用を必要としない。顆粒球とサイズが重複する単球は、ほぼ球形の２つの葉型の核を有して、より大きい核対細胞質体積比および連続的な核シグナルを含む、異なる形態学的特徴を有する傾向があり；顆粒球は、非連続的な核シグナルを有し、そして従って、それらの多葉型核形態に起因して、多核性であるようである。蛍光スペクトルは、それらが顆粒球または大きいリンパ球ではないことを確認するために、いくつかの小さい単球について、結論的なデータを提供する。顆粒球（ＰＭＮ、好酸球および好塩基球を含む）は、形態学的に類似し、従って、それらの固有のＴｒｐ蛍光放出スペクトルの差異に基づいて区別され、これらのスペクトルは、それらの異なる特徴的な顆粒の結果として、特徴的にシフトされる。血小板もまた、末梢血中に存在し、そして、技術上、細部のフラグメントであり、核を持たず、そしてＲＢＣより小さい。これらは、外科的手順において使用されるので、これらは、中心チャネルからも排出チャネルからも排出されず、さらなる精製のために血漿と共に収集される。
【０１２０】
分離される末梢血は、１個体由来であっても、多数の個体由来であってもよいが、容易に理解されるように、Ｉｇは、異なる抗原性の血液型と混合する前に、血液から除去されなければならない。２つの排出部位で８つの標的チャネルを、排出される異なる細胞（小さいリンパ球、中程度のリンパ球および大きいリンパ球を含む）に対して使用し、そして過剰の単球は、最も遠位側の排出部位から排出され、別々の排出チャネルに排出される。Ｄ１およびＤ２に近位の排出部位で、ＰＭＮ、好酸球、好塩基球、およびＲＢＣが、別々の標的チャネルに排出される。近位部位はまた、提供される基板を使用して、実験用の単球のアレイを作製するために使用される。１以上の細胞型のさらなるアレイが、遠位側の排出部位に同時に作製され得ることが、容易に理解され；例えば、アレイは、全ての有核細胞型（最も近く隣接する種は、同じ細胞型でない）から作製され得るか、またはアレイは、大きいリンパ球（ほぼおそらく、記憶リンパ球である）から作製され得る。排出チャネルは、慣用的な方法によって流体カラムに流体連結され、この流体カラムに細胞懸濁液が添加される。カラムの大きさは、５ｍＬの流体キャリアおよび細胞が添加されるのを可能にし、その結果、十分なカラム圧が存在し、チャネルを通る流体の流れを開始して、流体が、十分に短時間で開口した上部領域に到達するのを可能にする。次いで、カラムの上部を圧力調節器に連結し、この調節器は、カラム中のキャリア流体の上にある気体の圧力を調節し、チャネルを通るキャリア流体の流れの精密な調整、終結および再開を可能にする。
【０１２１】
キャリア流体は、生理学的食塩水、または血液の血清の浸透圧重量モル濃度とほぼ等しい浸透圧重量モル濃度を有する他の電解質溶液であり得る。単球を、約３８℃で維持された基板上にスポットする。使用される基板は、平面であり、そして１０，０００部位／ｃｍ２の密度が選択され、各部位は単一の細胞によって占有される。１０人の異なる個体由来の循環単球を、慣用的な方法によって獲得および精製する。
【０１２２】
各個体の単球は、約４．２ｐＬの容量を有する液滴の音響排出によって、アレイに付着される。詳細には、各列の１０番目の部位ごとに、１人の個体由来の単球をアレイにスポットし、そして個体の細胞の分配を、その次の列へとずらし、個体由来の細胞間で分離を増加する。個体の細胞の分離は、それが、異なる基板領域間の条件における変動に対して内部コントロールを提供するので、好ましい。残りの個体由来の単球を、音響排出された液滴で、アレイ部位上に同様にスポットする。１０個の２連のアレイが作製される。
【０１２３】
単球は、走化性により炎症した組織へと誘引されるので（単球が、免疫メディエイターの影響下でマクロファージへとトランスフォーメーションされる場合）、アレイを、ヒスタミン、インターロイキン（ＩＬ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ロイコトリエン、および当該分野で公知の他の炎症性メディエイターのような、１つ以上の炎症メディエイターを含む、種々の生理学的溶液中に浸漬することにより研究する。これらの細胞はまた、熱および公知の抗炎症剤（ステロイドを含む）、非ステロイド抗炎症薬物、ならびにマクロファージの活性に影響すると思われる物質のような、炎症に影響し得る他の条件に曝され得る。特定のメディエイターおよびこれらの組み合わせが、炎症誘発効果または抗炎症効果を有すること、ならびに個体の間で、および、より少ない程度で、個々の細胞の間で、差異が存在することが、容易に理解される。単球はｍＡｂ／ＭＨＣ特異的結合により結合されるので、このアレイは、浸漬により破壊されない。
【０１２４】
単球のマクロファージへのトランスフォーメーション、および単球へのマクロファージの逆のトランスフォーメーションは、細胞の生存能力に影響することなく光学顕微鏡により観察され得る。個々の細胞を測定する他の公知の方法としては、個々の細胞のＸＰＳ（Ｘ線光電子分光法）が挙げられる。免疫細胞（特に、活性化されたマクロファージ）は、免疫メディエイターおよび走化性因子の放出により他の免疫細胞を活性化し得るので、ある個体の単球が、免疫メディエイターまたは免疫状態に対して非応答性であり得るが、この実験条件に対して応答性であった別の個体のマクロファージにより放出される免疫メディエイターに対して応答性であるという、可能性が存在する。上記のコントロールとして、標準のウェルプレートを、同一の方法を使用するコントロールとして用いる。このウェルプレートは、各ウェルに同じ個体由来の複数の単球を有する（９６ウェルプレートについて、９ウェル／個体、各１１０個の細胞）。ｍＡｂ／ＭＨＣ結合系を含まないウェルプレートを用いる最終コントロールをまた、記載した方法により作製する。このウェルプレートは、排出された細胞含有液滴を定所に保持するのに十分な表面張力を有する。各ウェルプレートに配置される１１０個の液滴は、好ましくは、複数の配置によって、形成される液滴が大きくなり過ぎて、表面張力により定所に液滴を保持されなくなるのを防止するために、ウェル内の異なる場所に配置されることが容易に理解される。
【０１２５】
図７Ａおよび７Ｂに示され、そして先に記載された、高スループット設計もまた、図６に示される構成と共に、本実施例において使用されるのと実質的に同じ様式で使用され得る。この設計の１つの利点は、細胞が、固有に再循環されるということである。いくつかの例において、排出部位は、操作されるべき細胞の数によって過負荷になり得る。血液の場合、この状況は、特に、ＲＢＣ（これは、最も多い細胞である）に当てはまる。ＲＢＣの排出のために１より多い排出器を使用することによってか、またはＲＢＣ専用の第３の排出器をこのシステムに加えることによって（図６および７に例示されるシステムにおいて具体化されるような）、この問題を克服する能力が、容易に理解される。最初の通過中に排出されない再循環しているＲＢＣ（流れの破壊を伴わずに、細胞の整然とした処理を可能にするために）は、全てのより少ない数の多くの細胞型を分類した後に、キャリア流体を再循環することによって後に排出され得る。
【０１２６】
（実施例２）
（刺激細胞計数を用いて炎症応答を研究するための気管支肺胞洗浄液ヒト気道上皮（ＨＡＥ）細胞アレイ）
前述の実施例の方法を、同時分類および差示的細胞計数を用いて気管支肺胞洗浄液から得たＨＡＥ細胞をアレイ化するように適合させる。上皮細胞に加えて、気管支肺胞洗浄液は、慣用的には、他の細胞を含む。洗浄液中に見出される細胞としては、無顆粒白血球、リンパ球、および単球（これは、代表的に、マクロファージとして活性化される）、および顆粒球白血球、好中球（ＰＭＮ）、好酸球および好塩基球が挙げられる。しばしば、以下のような病原体が存在する：ウイルス（インフルエンザウイルスおよびＤＮＡウイルス（ヘルペスウイルスファミリーメンバー、最も顕著には、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）ＫＳＶ（カポージ肉腫関連ヘルペスウイルスを含む）を含む）；真菌種（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｉｄｕｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓを含む）；真核生物日和見病原体（例えば、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ（これは、健常な患者に見出され、そして重篤な免疫無防備状態で肺炎を引き起こす）；グラム陽性細菌群およびグラム陰性細菌群のメンバー；ミコバクテリア種；および偏性細胞内原核生物（例えば、ｃｈｌａｍｙｄｉａ、ｍｙｃｏｐｌａｓｍａおよびｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）。偏性細胞内原核生物の可能性のある例外を除き、全ての病原体は、全ての哺乳動物細胞を排出した後に残存する流体から、慣用的な微生物学的方法およびウイルス学的方法によって培養され得る。Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ嚢胞（直径５〜７μｍ）、栄養型、およびスポロゾイトは、細胞外細菌（代表的には、直径１μｍ）が排出され得るように、染色のために排出され得る。染色および試験は、培養の代わりに、または培養に加えて、同定に必要とされる場合に行われ得る。例えば、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ嚢胞は、染色された標本の顕微鏡試験によって、培養を行うことなく同定され得る。
【０１２７】
分類、計数、およびアレイ化は、実質的に実施例１に記載されるように進行し、計数目的のために、排出された各細胞の正体をさらに記録する。通常、差示的計数は、単独で有用な診断的および病態生理学的情報を提供する。例えば、好酸球およびリンパ球の上昇は、ぜん息または関連する好酸球性肺炎症プロセスを示す。分離されたリンパ球は、細胞表面活性化マーカーＨＬＡ−ＤＲ、ＩＬ−２Ｒ（インターロイキン２レセプター）およびＶＬＡ−１を発現する活性化されたＴリンパ球が上昇されたことをさらに確認され得る。あるいは、これらのリンパ球を、その上記マーカーを認識する抗体で異なる部位において官能基化した基板上にアレイ化する。下気道の線維症炎症疾患（一般に、間質性肺疾患と呼ばれる）は、優勢なＰＭＮおよび肺胞マクロファージを産生する。マクロファージ、ならびにより少ない程度のＰＭＮおよび気道上皮細胞の免疫細胞化学は、これらの細胞が、早期の慢性肺疾患において特徴的なサイトカイン（例えば、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、およびＩＬ−８）を含むことを示す（Ｋｏｔｅｃｈａら（１９９６）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｒｅｓ．４０：２５０−５６）。細菌性肺炎は、それらが、類似の差示的な細胞数を生じるので区別可能であるが、洗浄液中および時にはマクロファージ内に、より多くの免疫細胞および細菌粒子が存在する。
【０１２８】
差示的な細胞計数および微生物学的／ウイルス学的病原体培養物および同定方法を使用して、好酸球性および好中球性の初期炎症プロセスは、互いに区別され、そして肺洗浄液サンプルを採取した患者における、感染プロセスに対して二次的な炎症と区別される。患者由来のＨＡＥ細胞もまた、このアレイにおいて研究される。
【０１２９】
容易に理解されるように、適切な大きさを有するチャネルが、提供されなければならない（ＨＡＥ細胞よりも、そしておそらく、大きい単球よりも、わずかに大きく、従って、約２５〜３０μｍ）。あるいは、このチャネルの幅は、細胞よりもわずかにより広く；より速い充填のために、深さは、細胞の直径の約３倍であり、そしてランプ（ｒａｍｐ）（図５Ｄに示されるような）を、開口するチャネル領域の直前のチャネル流路において使用する。さらなる選択肢として、光子場（光ピンセットにおいて通常使用されるように、レーザーによって提供され得る）を、細胞を表面に近づけるために用い得る。アレイ化されるＨＡＥ細胞を、気管支肺胞洗浄液によって得、そして本明細書中および前述の実施例において記載されるように、分類および計数の間に基板表面上に排出する。排出のためにロードされる前に、この洗浄液を、従来の組織培養方法を使用して脱凝集することによって、接着している細胞を個々の細胞として懸濁するように処理される。
【０１３０】
ＨＡＥ細胞に対する実験は、細胞分裂を可能にする条件下で行われ得る。前述のための要件およびこれに必要とされる条件は、当業者によって理解される。ウェルプレートを用いるコントロールは、有用であるが、単球を有するプレートほど重要ではない。
【０１３１】
（実施例３）
（発癌の代わりとして変異誘発に対する個体の感受性を研究するためのＨＡＥ細胞アレイ）
上記実施例の方法を、化学突然変異誘発原および他の突然変異誘発原（例えば、熱および放射線）に、アレイ化したＨＡＥ細胞を曝露するように適合する。遺伝子の損傷は、慣用的な方法（例えば、破壊された架橋およびＤＮＡに対する他の損傷の生化学的アッセイ）によって、曝露が停止された後の種々の時点で測定される。ＤＮＡ修復酵素の遺伝学における差異は、曝露後の種々の時点での回復（損傷の減少の程度）を比較することによって研究され得る。ウェルプレートアレイは、コントロールとして依然有用であり、そして細胞をこのウェルプレート中で培養し得るか、またはアレイ細胞を取り出しそして培養して、曝露後のその後の細胞世代における形成異常細胞または新生物細胞の実際の出現、および検出された任意の形成異常細胞または新生物細胞における任意の脱分化の程度を決定し得る。
【０１３２】
（実施例４）
（細胞パターン化（ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ））
実施例１および２の方法を、基底扁平上皮細胞をパターン化するように適合する。基底扁平角質化上皮細胞および扁平非角質化上皮細胞を、実施例１のように、官能化したニトロセルロース基板上にパターン化する。生成したパターンは、唇の朱色輪郭を模倣する。次いで、基板上のパターン化した細胞を、適切な培養培地中に浸漬し、そして研究を、皮膚／非角質化接合部の形成に関して行う。
【０１３３】
（実施例５）
（血液からのリンパ球のエピトープアレイ上への音響排出）
小さいリンパ球、中程度のリンパ球、および大きなリンパ球を、クローンエピトープアレイを形成するために、上記実施例の方法により排出する。２つの平行に隣接するチャネルを異なる幅で構築し、そして細胞を表面に近づけるように適切に設計する。より幅広いチャネルは、培地および大きなリンパ球を収容するために約１５μｍの幅であり；より狭いチャネルは、小さなリンパ球を収容するために１０μｍの幅である。小さなリンパ球を、慣用的な方法または音響排出により、大きなリンパ球および中程度のリンパ球から分離し得る。小さなリンパ球を排出するのにかろうじて十分なエネルギーの量を、混合物中の全てのリンパ球が１つの共通チャネル（１５μｍの幅）を通過するように加える。このエネルギーを、各リンパ球に加えて、各リンパ球を、排出領域を形成するチャネル開口部またはアパーチャで検出する。排出されたリンパ球を、基板上に排出し、そしてペトリ皿または他の容器中に洗い流し得る。あるいは、音響エネルギーを、非垂直軌道で液滴を排出するように送達し得、その結果、この液滴は、容器（例えば、上部が開口しており、そして排出チャネルに十分に近いチャネル）のすぐ近くに着地する。
【０１３４】
エピトープアレイは、天然に存在するアミノ酸から形成したコンビナトリアルテトラペプチドアレイである。他のエピトープは、タンパク質において（非一次構造の結果として）、ハプテンを有するペプチド分子において、ならびにペプチドグリカンおよび多糖類のような他の生体分子の両方において存在することが容易に理解される。約１０１２個のエピトープの小さな画分のみをアレイ化する。Ｔ細胞およびＢ細胞の両方は、容易に理解されるように、わずかに異なる機構によって、これらのエピトープに結合する。テトラペプチドアレイは、種々の方法によって（例えば、上記のコンビナトリアル化学についての同時係属出願に記載されるような、試薬の集束させた音響排出を用いるデバイスに対して、固相ペプチド合成技術を適用することよって）作製され得る。１．６×１０４個の異なる天然のテトラペプチドが存在する場合、１６個のアレイ合成領域（各々、１ｃｍ２であり、そして各々、１０００個のアレイ部位を含む）が、全てのテトラペプチドの合成に、そして個々の細胞の分離を可能にするのに適切な密度を維持するために、利用可能であるはずである。
【０１３５】
細胞を、可能な限り迅速にアレイ部位上にスポットする（従って、異なるサイズであるにも拘わらず、２つのチャネルは、それらのチャネル中で細胞の一列の線を維持する必要がある）。これらの１６，０００個のアレイ部位の各々が、これらの部位上に排出された液滴を有するときに、このアレイを洗浄して、配置部位でエピトープに結合しない細胞を取り除く。これらのアレイを画像化して、どの部位が細胞を結合しているのかを決定し、そして細胞を結合していない部位に対して、このサイクルを繰り返し、これらの部位が、再スポットされる。このプロセスは、洗浄後のアレイの画像化を必要とし、そして自動化されなければならないことが直ぐに理解される。このようなシステムの自動化は、容易に達成でき、そしてクローン分離に対する価値ある情報が、この計画の完了の前に導き出される。異なる型のエピトープの使用はさらに、分類分けされる。
【０１３６】
（実施例６）
（形質転換された細菌を選択するための細菌の排出）
Ｅ．ｃｏｌｉを、細胞表面上のストレプトアビジンの発現および提示もまた引き起こす構築物によって、パンサイトケラチン（ｐａｎｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ）（真核生物タンパク質）を発現するように、慣用的な方法により形質転換する。この細胞を、上記実施例１〜５に記載されるように、慣用的な方法によりビオチン化された基板上に音響排出する。この排出チャネルサイズは、細菌の寸法（１μｍ）に適合され得るが、これは、公知の微小製造方法により達成され得る。形質転換された細胞を、マーカー部分（ストレプトアビジン）によってビオチン同族部分に特異的に結合させる。基板を洗浄して、形質転換していない細胞を取り除き、基板に付着した形質転換された細胞のみを残す。
【０１３７】
形質転換された細胞を形質転換されていない細胞から分離する能力を、末梢血から全血液細胞を取り出す能力（実施例１）と組み合わせて、形質転換されたＥ．ｃｏｌｉおよび形質転換されていないＥ．ｃｏｌｉがマウスにおいて菌血症を引き起こす能力を評価し、そしてそれらの形質転換された細菌および形質転換されていない細菌に対してマウントされた免疫応答を比較する。接種されたマウスの血液を採取し、実施例１のように分類する。ただし、全ての異なる血液細胞を分類することに加えて、各型の細胞の数を計数して、免疫応答に関する情報を提供する。ベースライン計数を、接種前に慣用的な方法によって行う。実施例１に従う血液細胞の分類および計数後、細菌、血小板および血漿のみが、中央の排出チャネルに残る。血小板とほぼ同じサイズおよび形状であるが、細菌は、核封入体（ここに、細菌の染色体が局在している（これは、光散乱または他の手順によって検出され得る）の存在によって血小板と区別され得るか、または固有のＴｒｐ蛍光（これは、血小板と細菌との間で異なる）によって区別され得る。全ての細菌を計数および排出し、そして形質転換されている排出された細菌の数および割合を、洗浄後にビオチン化基板表面に付着されたままの細菌を計数することによって決定する。
【０１３８】
４つのマウスのグループを評価する。第１のグループには、適切なキャリア（例えば、緩衝化生理食塩水）のプラシーボを静脈内接種し、このプラシーボは、細菌を有さず、そして他のグループについての接種量と等量である。第２のグループには、既知の数の、形質転換された、生きたＥ．ｃｏｌｉを含むキャリアを接種する。第３のグループには、既知の数の、形質転換されていない、生きたＥ．ｃｏｌｉ（上記の形質転換された細菌と同じ株）を含むキャリアを接種する。第４のグループには、既知の数の生きたＥ．ｃｏｌｉの同じ株を含むキャリアを接種し、その集団は、形質転換された細菌と形質転換されていない細菌との等量混合物である。血液を、接種後１週間の間、または菌血症でマウスが死亡するまで、規則的な間隔でマウスから採取する。全てのグループからの細胞型および差示的計数についての統計的データは、グループ内の免疫応答の個々の変動についてのデータを提供する。
【０１３９】
第１のグループからのデータは、主に、非接種マウスの血液への細菌（ストレプトアビジンを提示するか否かにかかわらず）の自然発生的進入を決定するためのコントロールとして使用し；このグループ由来のマウスの血液中に検出された全ての細菌を、コントロールの目的で、培養しそして特徴付ける。第２のグループからのデータは、第４のグループについてのコントロールであることに加え、第３のグループからのデータと比較して、形質転換されていない細菌からの競合を伴わない相対的な病原性を研究し得る。さらに、第２のグループからのデータを使用して、この構築物の全てまたは一部の損失を研究し得る。例えば、ストレプトアビジンを提示せず、そしてビオチン化表面を結合しない、接種後の第２グループのマウスから得た細菌を培養し、そして免疫染色し、これらが、パンサイトケラチンを発現するか否かを決定し、コントロールの目的で復帰変異を定量する。第３のグループからのデータもまた、自然発生的な形質転換が生じたか否かを決定するため、およびストレプトアビジン／パンサイトケラチン構築物がその集団に（幾分）侵入するという遠い可能性を調査するために、得られ得る。第４のグループは、形質転換された株および形質転換されていない株が、競合条件下で菌血症を引き起こす能力についてのデータを提供する。１容量あたりの総細菌についての第４のグループからのデータを、他のグループと比較する。また、形質転換された細菌および形質転換されていない細菌の相対的割合が、自然感染の適切な考慮後に、形質転換の損失または獲得について分析され得る。これらの目的のために、接合体による形質転換構築物の移入は、自然発生的とはみなさない。異なる接種比率の形質転換された細菌と形質転換されていない細菌とを用いる他のグループの追加もまた、望ましくあり得る。
【０１４０】
（実施例７）
（寒天培地上で増殖したコロニーからの直接的な細胞の排出）
寒天上で増殖したコロニーからの、正確で非接触的な細胞選択の１つの様式は、液滴の排出をもたらす集束された音響エネルギーにより提供される。排出された液滴は、１つ以上の細胞を含み得、そして排出毎により多くの細胞またはより少ない細胞を堆積させるよう、体積が調節され得る。細胞のコロニーは、隣接するコロニーからの生物によるサンプルの汚染を回避するために、培地または基板の表面に対して平行な平面において、中心からサンプリングされる。個々のコロニーからの別個のサンプルの数（従って、堆積され得るサンプルの数）は、コロニーの大きさおよびサンプルの大きさに依存し；最小で、最も小さいコロニーのいくつかのサンプルが排出され得る。
【０１４１】
慣用的なスロートスメア（ｔｈｒｏａｔ  ｓｍｅａｒ）は、従来のプラスチックペトリ皿中の標準的な血液寒天培地上で培養され、そして培養物は、約３８℃で７２時間インキュベートされる。インキュベーション後、音響変換器は、寒天および細菌コロニーを含むプラスチックペトリ皿の下に配置され、そしてコロニーの存在または非存在が、音響顕微鏡を通じて検出される。
【０１４２】
細胞の位置決めをするのに使用される同一の音響変換器は、寒天の表面から細胞を進めるのに使用される（ただし、表面は、適当な粘度を有する）。集束された音響エネルギーは、寒天培地の表面の約７５μｍ下の集束点におけるコロニー中心の直下に送達される（「熱送達音響パルス」）。この音響エネルギーのパルスは、培地表面に対して平行な平面において寸法を有する寒天の円柱を液化するのに十分な動力および十分な持続時間を有し、この円柱は、このプレートにおけるコロニーの寸法内であり、表面に対して垂直な基板表面方向に延び、４５℃付近の温度で液化する（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｃ．（現在は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｍｄ．、ａ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。種々の直径の円柱状体積を溶解するために、特定の寒天の組成および深度ならびにペトリ皿に対して熱送達音響パルスを較正する必要性は、直ちに理解される。あるいは、スキャンレーザーは、低融点寒天を加熱するために使用され得る。低融寒天を用いることで、寒天表面上の選択された微生物の生存率を有意に減少させることなく、表面の液化が可能となる。レーザーが用いられる場合、レーザーの配置は、音響顕微鏡により決定されるコロニー位置に結び付けられ得る。排出のための音響エネルギーの焦点は、培地の表面である。局所的に寒天を加熱することによって、培地の表面の粘度は減少し、ウェルプレートまたは他の容器への目的の細胞の直接的な排出を可能にする。
【０１４３】
熱エネルギーの音響送達は、音響排出前にコロニー下での局所的な溶解をもたらすために使用される。この様式において、各々のコロニーは、４回サンプリングされる。細菌コロニーから排出される細胞の２つの二連アレイは、栄養寒天培地を含む標準的なウェルプレートを用いて作製され、各々の液滴は、約０．１〜１．０ｐＬの量を有する。異なるウェルが異なる培地および栄養素を含み得ることは、すぐに理解される。各々のコロニーからの２つのさらなるサンプル（各々、約１．０〜１００ｐＬの量を有する（必要とされる場合、複数の滴中に））は、清潔な表面上に堆積され、そして生理食塩水を用いて栄養流体を含むフラスコ中へと（あるいは、栄養流体の容器へと注がれる流れる流体を含むチャネルへと）洗い流される。
【０１４４】
サンプリングされた細胞は、細胞培養の従来法により、フラスコからペトリ皿上で直ちに培養される。アレイプレートおよびフラスコは、細菌の繁殖を遅らせるために冷凍保存され、さらなる培養および試験を可能にする。元々の培養ペトリ皿もまた、培養結果を未決定のまま維持するよう冷凍保存される。スロート培養物からの培養結果は、従来の顕微鏡および他の手段により試験される。多数のグラム陰性細菌種およびグラム陽性細菌種は、いくつかの酵母種と共に、免疫適格性成人に対して全て非病原性であることが最初に同定されている。抗生物質耐性を決定するための慣用的な方法を用いる、抗生物質を含む栄養寒天培地を用いたフラスコからのさらなる培養は、同一種の細菌の異なるコロニーが、異なるレベルの抗生物質耐性を有することを明らかにし、これによって、異なるコロニーが異なる株および亜株であることが実証される。
【０１４５】
寒天培地上で増殖したコロニーからの細胞の排出方法は、形質転換された細胞を選択的に排出するために使用され得る。指標は、所望の遺伝的形質転換（本明細書中では、パンサイトケラチンの発現）と共に形質転換構築物において使用される。例えば、この構築物は、アガラーゼを分泌するよう細胞をさらに形質転換し得、そして形質転換コロニーは、変化した音響インピーダンスを検出することにより選択され得る。あるいは、形質転換コロニーは、構築物が、形質転換細胞がマーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質）を同時発現するよう設計される場合、最適に選択され得る。最適に検出された緑色蛍光コロニーのみが排出される。
【０１４６】
本発明は、本発明の好ましい実施形態と共に記載されているが、前述の記載は、説明であって、本発明の範囲を限定することを意図しないことが理解される。他の局面、利点、および修飾は、本発明の属する分野の当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明に関連する有用なデバイス（第１および第２のセル容器またはレザバ、音響排出器、および排出器位置決め手段を備える）の実施形態を、簡易化された断面図で図解により示す。類似する部分は、類似する数字によって参照されている、本明細書中に参照される全ての図と同様、図１は釣り合いがとれていないので、特定の寸法が、表示の明瞭性のため誇張され得る。図１Ａは、第１のセル容器またはレザバに音響的に連結され、第１のセル容器およびレザバ内から基板表面の示される部位へ向けて、単一の細胞を含む流体の液滴を排出するために活性化される音響排出器を示す。図１Ｂは、第２のセル容器またはレザバに音響的に連結される音響排出器を示す。
【図２】
図２は、図１の発明の実施形態のバリエーションの概略図で図示する。ここで、セル容器またはレザバが、レザバウェルプレートに個々のウェルを含み、基板表面は、対応するウェルの番号を有するより小さなウェルプレートを含む。図２Ａは、２つのウェルプレートの略図的な上面図であり、すなわち、セル容器またはレザバウェルプレートおよび流体液滴に含まれる、整列された細胞を有する基板表面である。図２Ｂは、音響排出器と音響的に連結する、図２Ａのセル容器またはレザバウェルプレートを含むデバイスの断面図を示す。ここで、液滴に含まれる細胞は、セル容器またはレザバの第１のウェルから、基板ウェルプレートの第１のウェルに排出される。図２Ｃは、図２Ｂで図示されるデバイスの断面図を示す。ここで、音響排出器は、セル容器またはレザバウェルプレートの第２のウェルと音響的に連結され、さらにここで、デバイスは整列され、音響排出器が、セル容器またはレザバウェルプレートの第２のウェルから、基板ウェルプレートの第２のウェルに液滴を排出する。
【図３】
図３Ａは、発明の方法の実施形態の簡易化された断面図で概観的に示す。ここで、外部に提示されるマーカー部分を有する細胞は、図１のデバイスを使用して基板上に排出される。図３Ａは、基板表面の指示される部位での、細胞を含む流体液滴の排出を図示する。図３Ｂは、第１の同族部分が付着された、改変された基板表面への付着に対して適合された第１のマーカー部分を提示する、第１の細胞を含む液滴の排出を図示する。図３Ｃは、この表面上の異なる部位への付着に対して適合された第２の分子部分を提示する第２の細胞を含む、第２の液滴の排出を図示する。図３Ｄは、基板ならびに図３Ａ、図３Ｂ、および図３Ｃで図示される工程によって、この基板の上に整列された第１および第２の細胞を図示する。
【図４】
図４は、図１のデバイスを使用して音響排出によって置かれた液滴中に含まれる、整列された細胞を示す。図４Ａは、表面張力によって、基板表面の示される部位に付着する流体液滴に含まれる、近接する整列部位に存在する２つの異なる細胞を図示する。各々の細胞は、ストレプトアビジン（ＳＡ）のビオチン化された（ビオチン（Ｂ）結合）表面への結合によって、この部位にさらに付着される。ストレプトアビジンは、外部提示標的化ストレプトアビジンに対する遺伝的コード配列による形質転換の結果として細胞外部に提示される。図４Ｂは、表面張力によって基板表面の示される部位に付着する流体液滴に含まれる、近接する整列部位に存在する２つの異なる細胞を図示する。各々の細胞は、この細胞に特徴的な２つの外部に提示された抗原性エピトープ（ここでは、Ｅ１およびＥ２）の、それぞれ異なるエピトープに対して特異的な、２つの異なるモノクローナル抗体（ｍＡｂ−Ｅ１、ｍＡｂ−Ｅ２）への結合によって、この部位にさらに付着される。各々のｍＡｂは、近接する整列部位のただ１箇所で表面に連結する。
【図５】
図５は、容器として流体のチャネルを有するデバイスを示す。細胞は、その容器から基板に排出される。図５Ａおよび図５Ｂは、このデバイスを概略的に図示する。図５Ｃは、生存細胞を含むチャネルの上方面視を図示する。基板表面は、流体液滴に含まれる整列された細胞を有する。図５Ｄは、細胞を排出のために十分に流体表面に近づけるための、チャネル床の上向きの突出物を示すチャネルの断面を図示する。図５Ｅは、細胞を、排出のために十分に流体表面に近づけるための、音響エネルギーのような、集束エネルギーの使用を示すチャネルの断面を図示する。
【図６】
図６は、中心のチャネル、排出チャネル、ならびに細胞が流れて通過する２つの検出デバイスＤ１およびＤ２の上面図を示す。２つの大きな楕円によって表される２つの排出部位もまた示され、各々は、細胞の描画を含み、そこから、細胞は、基板（示さず）上にまたは近接した標的化チャネルに、表面に対して垂直に排出され得る。
【図７】
図７は、中心流体チャネルを有するデバイスを図示する。このチャネルは、好ましくは複数の排出器の使用によって、細胞を、細胞が基板に放出される周辺のチャネルへ、側方に高速で送り込む。図７Ａは、より大きな容器内の、細胞を含む垂直のチャネルの側面図を図示する。垂直のチャネルからの流体は、垂直のチャネルから側方に突出している、ある角度に折り曲げられたリップの下を通り抜けることによって、より大きな容器の周辺へのみ接近できる。細胞が、中心チャネルから周辺チャネルへ、放射状に外側へ移動し得るように、リップとより大きな容器の床との距離は、放射状に外側へ向かって減少する。周辺では、チャネルが形成され、そこでは細胞は、垂直のチャネルでの間隔に比べてより広い間隔をおかれている。図７Ｂは、より大きな容器の側壁に沿った細胞を示す上面図である。この配置によって、多数の細胞の同時排出が、複数の排出器の使用によって可能となり、ハイスループットおよび有効性をもたらす。
【図５】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004530863.tif 000092
2004530863.tif 000093
【国際調査報告】
2004530863.tif 000094
2004530863.tif 000095
2004530863.tif 000096
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