(57)【要約】ヒトコネキシン３０遺伝子をコードする組換え核酸（配列番号１）であって、この遺伝子中のミューテーション３１（Ｇ＞Ａ）及び／またはミューテーション２６３（Ｃ＞Ｔ）を有する患者が、クラウストン症候群に罹患していることを特徴とする組換え核酸。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトコネキシン３０遺伝子をコードする組換え核酸（配列番号１）であって、この遺伝子中のミューテーション３１（Ｇ＞Ａ）及び／またはミューテーション２６３（Ｃ＞Ｔ）を有する患者が、クラウストン症候群に罹患していることを特徴とする組換え核酸。
【請求項２】
コネキシン３０のコード配列が、ミューテーションが１１位に位置するアミノ酸、及び／または８８位に位置するアミノ酸の非保存的な置換を導くようにミューテートされていることを特徴とする、請求項１記載の組換え核酸。
【請求項３】
ヒトコネキシン３０遺伝子のコード配列が、真核生物細胞における発現を許容するプロモーターの制御下に配置されていることを特徴とする、請求項１または２記載の核酸。
【請求項４】
ヒトコネキシン３０遺伝子の発現を制御するプロモーターが、適切にミューテートされたヒトＧＪＢ６遺伝子の天然のプロモーターであることを特徴とする、請求項３記載の核酸。
【請求項５】
ヒトコネキシン３０遺伝子のミューテーションが、ＧＪＢ６遺伝子のコード配列に位置することを特徴とする、請求項４記載の核酸。
【請求項６】
ヒトコネキシン３０遺伝子のミューテーションが、ＧＪＢ６遺伝子の発現を調節する配列に位置することを特徴とする、請求項４記載の核酸。
【請求項７】
ミューテーション３１（Ｇ＞Ａ）または２６３（Ｃ＞Ｔ）の一つを含む、請求項１記載の核酸の配列の領域のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項記載の核酸を含む遺伝子輸送ベクター。
【請求項９】
組換えウイルスであることを特徴とする、請求項８記載のベクター。
【請求項１０】
遺伝子輸送のための非ウイルス性ベクターであることを特徴とする、請求項８記載のベクター。
【請求項１１】
クラウストン症候群の治療を企図した組成物の調製のための、請求項８から１０のいずれか一項記載のベクターの使用。
【請求項１２】
遺伝学的感受性を有する脱毛症の治療を企図した組成物の調製のための、請求項８から１０のいずれか一項記載のベクターの使用。
【請求項１３】
毛髪の成長の制限、及び／または毛髪の損失の促進を企図した組成物の調製のための、請求項８から１０のいずれか一項記載のベクターの使用。
【請求項１４】
クラウストン症候群の治療を企図した組成物の調製のための、請求項１，３，４または７のいずれか一項記載の核酸の使用。
【請求項１５】
遺伝学的感受性を有する脱毛症の治療を企図した組成物の調製のための、請求項１，３，４または７のいずれか一項記載の核酸の使用。
【請求項１６】
多毛の減少を企図した組成物の調製のための、請求項２から６のいずれか一項記載の核酸の使用。
【請求項１７】
請求項１から６のいずれか一項記載の組換えＤＮＡ構築物を含む真核生物細胞。
【請求項１８】
ヒトコネキシン３０遺伝子の発現を許容する組換えＤＮＡ構築物が、染色体外形態で存在する、請求項１７記載の細胞。
【請求項１９】
ヒトコネキシン３０遺伝子の発現を許容する組換えＤＮＡ構築物が、前記細胞のゲノム内に挿入されている、請求項１７記載の細胞。
【請求項２０】
ゼノパス卵またはヒーラ細胞であることを特徴とする、請求項１７から１９のいずれか一項記載の細胞。
【請求項２１】
請求項１７から１９のいずれか一項記載の細胞を含むトランスジェニック動物。
【請求項２２】
以下の工程：
−  請求項７から２０のいずれか一項記載の細胞、または請求項２１記載の動物と、候補の分子を接触させる工程；
−  ＧＪＢ６遺伝子の発現のレベル、及び／またはコネキシン３０の活性に対する候補の分子の効果を測定する工程；
を含む、特定のタイプの脱毛症の治療に有効な分子のスクリーニング方法。
【請求項２３】
ＧＪＢ６遺伝子の発現のレベルに対する候補の分子の効果を測定する工程が、ＤＮＡチップを使用して実施される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
ヒトコネキシン３０遺伝子の対立遺伝子を有する細胞がゼノパス卵であり、コネキシン３０の活性に対する候補の分子の効果を測定する工程が、コネクソンの電気生理学的活性を測定することによって実施される、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
３１位で前記ヌクレオチドを含む、ＧＪＢ６遺伝子の断片のミュータジェン増幅のためのプライマーのペアであって、ミューテーション３１（Ｇ＞Ａ）を有するまたは有さないＧＪＢ６対立遺伝子を使用して実施されるミュータジェン増幅の産物が、選択された制限酵素での切断によって識別可能であるプライマーのペア。
【請求項２６】
制限酵素がＢｃｌＩであり、以下の配列：
５’−ＡＴＧＧＡＴＴＧＧＧＧＧＡＣＧＣＴＧＣＡＣ−３’、及び
５’−ＧＣＡＧＣＣＡＣＣＡＣＴＡＧＧＡＴＣＡＴＧＡＣＴＣＧＧＡＡＡ−３’
を有することを特徴とする、請求項２５記載のプライマーのペア。
【請求項２７】
２６３位で前記ヌクレオチドを含む、ＧＪＢ６遺伝子の断片の増幅のためのプライマーのペアであって、ＨａｅＩＩでの増幅断片の切断が、ヌクレオチド２６０と２７０の間のＨａｅＩＩ制限部位の存在または不存在を識別可能であることを特徴とするプライマーのペア。
【請求項２８】
以下の配列：
５’−ＣＴＴＴＧＣＣＣＡＣＴＴＴＴＧＴＣＴＧＴ−３’、及び
５’−ＴＧＡＣＧＣＡＧＣＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＣＴＴ−３’
を有することを特徴とする、請求項２７記載のプライマーのペア。
【請求項２９】
以下の工程：
・請求項２５記載のプライマーのペアで、ＧＪＢ６遺伝子の断片を増幅する工程；
・適切な制限酵素で、増幅産物を切断する工程；
・切断産物を分析する工程；
を含む、クラウストン症候群の診断のための、ミューテーション３１（Ｇ＞Ａ）のサーチ方法。
【請求項３０】
以下の特徴：
・ＧＪＢ６遺伝子の断片の増幅が、請求項６記載のプライマーのペアで実施されること；
・増幅産物が、ＢｃｌＩ酵素で切断されること；
・ミューテートされた対立遺伝子の存在が、３９塩基対の差異を導くこと；
を有する、請求項２９記載のミューテーション３１（Ｇ＞Ａ）のサーチ方法。
【請求項３１】
以下の工程：
・請求項２７または２８記載のプライマーのペアで、ＧＪＢ６遺伝子の断片を増幅する工程；
・ＨａｅＩＩ酵素で、増幅産物を切断する工程；
・ＨａｅＩＩによって切断されないバンドを導くミューテートされた対立遺伝子の存在を、切断産物で分析する工程；
を含む、クラウストン症候群の診断のための、ミューテーション２６３（Ｃ＞Ｔ）のサーチ方法。
【請求項３２】
請求項２５から２８のいずれか一項記載の一つ以上のプライマーのペアを含む、クラウストン症候群の診断のためのキット。
【請求項３３】
さらにＢｃｌＩ及びＨａｅＩＩ制限酵素、及びこれらの酵素の活性に適したバッファーを含む、請求項３２記載の診断キット。
【請求項３４】
請求項１から６のいずれか一項記載の核酸分子によって、または請求項８から１０のいずれか一項記載のベクターによってコードされる組換えタンパク質。
【請求項３５】
請求項３４記載の組換えタンパク質、またはその断片を含む、毛髪システムの疾患の予防及び／または治療のための製薬及び／または化粧品組成物。
【請求項３６】
請求項１から７のいずれか一項記載の核酸分子、及び／または請求項８から１０のいずれか一項記載のベクターを含む、毛髪システムの疾患の予防及び／または治療のための製薬及び／または化粧品組成物。
【請求項３７】
外的及び局所的な適用によって投与できることを特徴とする、請求項３５または３６記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、クラウストン症候群に関与する、ＧＪＢ遺伝子におけるミューテーションの同定から由来する。この症候群の総合的症状は、コネキシン３０（Ｃｘ−３０）をコードするＧＪＢ６が、特に非病理学的タイプである、遺伝学的感受性を有する他のタイプの脱毛症に関与している可能性が高いことを示唆する。それ故本発明は、クラウストン症候群及び／または特定のタイプの脱毛症の治療のため、及び脱毛症の治療における有益な効果を有する傾向のある分子のスクリーニングのために企図される製薬組成物の調製のための、ＧＪＢ６遺伝子を含む構築物の使用に関する。本発明はまた、クラウストン症候群の診断方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
クラウストン症候群、または発汗性外胚葉性形成異常（ＨＥＤ，ＯＭＩＭ１２９５００）は、まれな、単一遺伝子、常染色体優性遺伝子疾患である。この症状に罹患している患者は、主に爪の形成異常と関連する貧毛症及び病理学的脱毛症、並びに手の平と足の裏の角質増殖症を示す。ある場合では、患者は、難聴、精神遅延、皮膚の色素過剰症、及び目と骨格の異常のような他の臨床的兆候を示すであろう。
【０００３】
この病理的状態は、外胚葉起源の層化上皮である表皮に影響する。この上皮は、皮膚−表皮接合部に存在する基底層、顆粒及び棘状層、及び最上部の角質層からなる。二週間でそれ自体再生されるこの組織は、表皮の主たる細胞構成成分であるケラチノサイトにこの特徴を与える。基底層のケラチノサイトは、自己再生能力、分化能力、及び棘状層に到達するために表皮のより上層に移動を始める能力を有し、最後に角質層でその核を損失する。ケラチノサイトの再生のための能力は、自己再生能力に加えて、分裂に対する高い能力を有する娘細胞、及び分化に入る細胞の元となる幹細胞の存在による。３種の集団のケラチノサイトが、表皮の基底で配置されている。さらに、幹細胞もまた、毛髪小胞に配置されていることが示されている（Ｒｏｃｈａｔ， Ｋｏｂａｙａｓｈｉ等， １９９４）。これらの多能性幹細胞は、毛髪小胞の外側鞘の細胞、内側鞘の細胞、または球若しくは脂腺の細胞のような多様化した細胞の元になり、最後に小胞内ケラチノサイトの元になると解される。
【０００４】
１９９６年に同定されたクラウストン症候群に関与するローカスは、第１３染色体の１３ｑ１１に位置する（Ｋｉｂａｒ， Ｄｅｒ Ｋａｌｏｕｓｔｉａｎ等， １９９６）。この症候群に罹患している患者における組換え現象の同定は、動原体ミクロサテライトマーカーＤ１３Ｓ１８３０及びテロメアミクロサテライトマーカーＤ１３Ｓ１３８０で、興味ある染色体領域の範囲を画することを可能にした（Ｋｉｂａｒ， Ｄｕｂｅ等， ２０００；Ｌａｍａｒｔｉｎｅ， Ｌａｏｕｄｊ等， ２０００）。後に、興味ある染色体領域をカバーするＢＡＣのコンティーグマップが得られ、一連の遺伝子とＥＳＴが、このコンティーグマップに配置された（Ｌａｍｅｒｔｉｎｅ， Ｐｉｔａｖａｌ等， ２０００）。
【０００５】
ＨＥＤ領域に存在することが知られている遺伝子の中には、ＧＪＢ２及びＧＪＢ６遺伝子があり、それらは二つのタンパク質をコードしている（それぞれコネキシン２６とコネキシン３０）。コネキシンファミリーは、約１５のメンバーを含む。これらのタンパク質は、コネクソンと称されるホモマーまたはヘテロマーのヘキサマーを形成するために、細胞膜で互いに会合している。二つのコネクソンが、ギャップ接合部と称される二つの細胞を連結するチャンネルを形成している。いくつかのギャップ接合部は接合プラークを形成し、ＩＰ３、糖、アミノ酸、またはカルシウムのようなイオンといった小分子の輸送に関与している。発達中のまたは環境の変化に対する一連の細胞の適応的で協調的な応答がかくして確保される。
【０００６】
コネキシン遺伝子中のミューテーションは、皮膚科学的病理的状態及び難聴の病理学的状態、シャルコー‐マリー‐ツース神経障害、及び白内障といった、各種の遺伝性病理学的状態に関与する。いくつかの例は、特に難聴の遺伝性病理学的状態及び皮膚科学的病理学的状態におけるコネキシンの関与を説明している。
【０００７】
例えば、コネキシンＣｘ−２６をコードするＧＪＢ２遺伝子中のミューテーションは、ＤＮＦＢ１難聴のような遺伝学的形態の難聴に関与し、その難聴の伝播の常染色体劣性方法は、現在の知見に基づいて、皮膚科学的な臨床上の兆候とは関連しないことが示されている。さらに、Ｃｘ−２６をコードする遺伝子中の他のミューテーションは、難聴と関連する掌蹠角皮症の形成に関与する。
【０００８】
コネキシンＣｘ−３１をコードするＧＪＢ３遺伝子中のミューテーションもまた、遺伝学的形態の難聴に関与している。これは、非症候群性感覚神経性常染色体劣性難聴である。
【０００９】
さらにこの遺伝子のミューテーションは、変異性紅斑角皮症という遺伝性の形態の皮膚病に関与している。
【００１０】
最後に、コネキシンＣｘ−３０をコードするＧＪＢ６遺伝子のミューテーションは、遺伝学的起源の形態の難聴に関与していることが知られている。これは、常染色体優性非症候群性感覚神経性難聴（ＮＳＲＤ３）である。５位でのトレオニンのメチオニンへのミューテーションは、この病理学的状態に関与する。同じ遺伝子のミューテーションはさらに、発汗性外胚葉性形成異常またはクラウストン症候群に関与する。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の発明者は、クラウストン症候群を引き起こす遺伝子及びミューテーションを同定した。
【００１２】
最初に、ＧＪＢ２遺伝子中のミューテーションが、遺伝学的起源の非症候群性難聴に関与し、難聴がクラウストン症候群と関連した症状であり得ることが示されていたため、ＧＪＢ２は最も適切な候補であった。しかしながらこの遺伝子中のミューテーションは、ＨＥＤファミリーの罹患患者において見出されていなかった。
【００１３】
より最近、ＧＪＢ６遺伝子によってコードされた別のコネキシン（コネキシン３０）が、ＧＪＢ２に近い１３ｑ１１領域に配置された（Ｋｅｌｌｅｙ， Ａｂｅ等， １９９９）。ＧＪＢ６はイントロンを含まない７８６塩基対の遺伝子であり、特にネズミの表皮で発現される（Ｄａｈｌ， Ｍａｎｔｈｅｙ等， １９９６）。ヒトコネキシン３０中のミューテーションは、常染色体優性難聴の形態に関与している（Ｇｒｉｆａ， Ｗａｇｎｅｒ等， １９９９）。従って、ＧＪＢ６もまた、クラウストン症候群の非常に適切な候補である。
【００１４】
一つのみのエキソンを有するこの遺伝子の配列決定は、クラウストン症候群と関連するＧＪＢ６遺伝子のコード領域中のミューテーションを同定することを可能にする。二つのタイプのミューテーションが、多様な家系的起源を有する患者で同定された。ミューテーション３１（Ｇ＞Ａ）は、１１位でグリシンからアニリンへの変化を導く。別のミューテーション２６３（Ｃ＞Ｔ）は、８８位でアラニンからバリンへの置換を引き起こす。これらのミューテーションは、研究されたファミリーの正常な患者では見出されず、且つ一般的な集団でも見出されない（１１８の患者が研究された）。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
それ故本発明の第一の特徴点は、ヒトＧＪＢ６遺伝子の配列、及びクラウストン症候群に関与するこの配列のミューテートされた形態である。本発明は特に、ミューテートされたまたはミューテートされていないヒトＧＪＢ６遺伝子の配列を有するＤＮＡ構築物、これらの構築物を有するベクター、これらのベクターでトランスフォームされた細胞、並びに野生型またはミューテートされたヒトコネキシン３０を発現するトランスジェニック動物に関する。
【００１６】
本発明はまた、ミューテートされた対立遺伝子３１（Ｇ＞Ａ）及び２６３（Ｃ＞Ｔ）に対して向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びクラウストン症候群の遺伝子治療による治療のために企図された遺伝子輸送ベクター、並びにこの症候群の診断方法、ミューテーション３１（Ｇ＞Ａ）及び２６３（Ｃ＞Ｔ）を検出するためのＰＣＲプライマー、及びクラウストン症候群を診断するためのキットに関する。
【００１７】
【発明の実施の形態】
それ故本発明者は、クラウストン症候群におけるコネキシン３０の直接的関与を示した。クラウストン症候群またはＨＥＤの主要な臨床上の兆候の一つは貧毛症である。この貧毛症は特に頭皮に影響し、毛髪がまばらとなり非常に細くなり、あるいは存在しなくなりさえする。ＯＭＩＭ（Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ）データベースを調べてみた場合、用語、脱毛症はＨＥＤを含む１１７タイトルに接近することができ、ＨＥＤは疾患の臨床上の兆候の一つによって、脱毛症のタイプの一部を形成することに注意すべきである。
【００１８】
コネキシン３０は、患者が脱毛症に罹患する皮膚科学的病理学的状態に関与しているとして、今日までに同定された唯一のコネキシンであることは注目に値する。それ故コネキシン３０は、遺伝学的感受性を有する少なくともいくつかの他の形態の脱毛症に関与する因子の一つである可能性がある。
【００１９】
クラウストン症候群とは無関係の脱毛症のタイプに少なくとも部分的に関与する、ＧＪＢ６遺伝子のミューテーションの二つのタイプを想像することが可能である。
【００２０】
第一のタイプのミューテーションは、ＧＪＢ６遺伝子の発現を調節する配列に影響し、特に男性患者における脱毛症の原因であろう。ＧＪＢ６遺伝子の調節領域における、アンドロゲンに応答する因子を結合するヌクレオチド配列の存在は、アンドロゲン性脱毛症に関与するであろう。しかしながら、この遺伝子の発現に関与するであろう、調節領域中の他のタイプの配列は排除されるべきではない。
【００２１】
ＧＪＢ６の発現の調節に関与するタンパク質因子または分子は、毛髪の成長における効果を有する製薬学的薬剤として、または医薬製品または化粧品製品としてさえ機能するであろう。そのようなタンパク質因子または分子は、以下のものを含む群に含まれる：
・ＧＪＢ６遺伝子の転写を阻害する転写因子を阻害または中和する分子；
・ＧＪＢ６遺伝子の発現を活性化する転写因子を活性化する分子；
・ＧＪＢ６遺伝子の発現の抑制または活性化に関与する転写因子。
【００２２】
ＧＪＢ６遺伝子に対する作用は、直接的であっても良く、即ち転写因子またはそれらを阻害する因子に対するものでも良く、間接的であっても良い、即ちこれらの因子と相互作用することが可能な物質または代謝産物の合成に対するものでも良い。
【００２３】
遺伝学的感受性を有するタイプの脱毛症を促進する傾向を有する、ＧＪＢ６遺伝子の第二のタイプのミューテーションは、この遺伝子のコード領域中のミューテーションに関するものであり、それはＣｘ−３０における機能的欠失を導くであろう。特に、クラウストン症候群の優性性質を説明する仮説の一つは、ミューテーション３１（Ｇ＞Ａ）及び２６３（Ｃ＞Ｔ）が、例えば細胞膜に対する輸送を妨げることによって（コネキシン３２のミュータントについて記載されているように（ＶａｎＳｌｙｋｅ， Ｄｅｓｃｈｅｎｅｓ等， ２０００））、またはコネキシンを形成する能力を妨げることによって、ＧＪＢ６遺伝子の産物を不活性化することである。この場合、この疾患は、一倍体不十分性の現象によるであろう。これらのミュータントがドミナントネガティブミュータントであり、コネキシンにおける一つ以上の非機能的サブユニットの存在が、その機能を破壊または妨害するのに十分であることは、この仮説を前進させることができる。それ故、ＧＪＢ６遺伝子中の他のミューテーションが、クラウストン症候群に関与するミューテーションよりも劇的にではなく、コネキシンの機能性を部分的に破壊し、この部分的な破壊は、毛髪の成長を阻害し、及び／または毛髪の損失を促進する唯一の因子であることが想像できる。
【００２４】
クラウストン症候群以外の遺伝学的感受性を有する脱毛症のタイプは、おそらく複数の因子の起源、特に多遺伝子起源を有することに注意すべきである。しかしながら、コード配列またはＧＪＢ６遺伝子の発現を調節する配列中に位置するＧＪＢ６遺伝子の特定のミューテーションは、遺伝学的感受性を有する脱毛症のタイプと関連するであろう。それ故、脱毛症のタイプにおけるＧＪＢ６遺伝子の関与に関する前述の考慮は、一般的に、本発明者が、この遺伝子と関連するいくつかの応用を測定することを可能にする。
【００２５】
本発明は特に、ＧＪＢ６遺伝子を含む核酸構築物に関し、それは先天的な脱毛症または遺伝学的因子と明らかに関与している脱毛症を有する患者で観察される一つ以上のミューテーションを有するのが適切である。これらの構築物の一つを有するトランスフォーム化細胞及びトランスジェニック動物もまた、本発明の一部である。そのような細胞またはトランスジェニック動物は、脱毛症に対して有益な効果を有する傾向にある分子をスクリーニングするために使用できる。特に、前述のような構築物を有する細胞と分子を接触させることによって分子をスクリーニングし、次いでコネキシン３０の発現及び／またはその機能性に対する前記分子の効果を分析することが可能である。コネキシン３０の発現は、例えばＤＮＡチップを使用して測定でき、その機能性は、例えばゼノパス卵のようなシステムにおいて、コネクソンの電気生理学的活性を測定することによって試験できる。そのようなスクリーニング方法もまた本発明の一部である。
【００２６】
さらに、クラウストン症候群の優性性質は、毛髪小胞の細胞で発現される、ミューテーション３１（Ｇ＞Ａ）またはミューテーション２６３（Ｃ＞Ｔ）を有するＧＪＢ６遺伝子の一つの対立遺伝子の存在が、毛髪小胞の成長期、退行期、または休止期のサイクルを破壊するのに十分であることを示唆する。この観察は、過剰毛髪（多毛症）と関連する特定の異常を矯正すること、または多毛を減少することが所望される領域の表皮細胞に、ＧＪＢ６遺伝子のミューテートされた対立遺伝子を局所的に輸送することによる、身体の特定の領域の多毛を制限することを企図した新たなストラテジーを想像することを可能にする。特に、残基１１及び／または残基８８で非保存的なミューテーションを有するコネキシン３０の形態をコードする核酸分子の輸送は、処理された領域において脱毛症を導くであろう。コネキシン３０の他のミューテーションは同じ結果を引き起こすであろう。それ故本発明は、処理された領域の多毛を減少することを企図した製薬及び／または化粧品組成物の調製のための、コネキシン３０のミューテートされた非機能的な形態の発現を可能にする核酸の使用に関する。
【００２７】
それ故本発明の著者は、コネキシン３０をコードする、ＧＪＢ６遺伝子であるクラウストン症候群に関与する遺伝子を同定し、配列決定した。彼らは、この遺伝子におけるミューテーション３１（Ｇ＞Ａ）または２６３（Ｃ＞Ｔ）の一つを有する患者が、クラウストン症候群に罹患していることを示した。それ故本発明はまず第一に、ヒトコネキシン３０遺伝子のコード配列（配列番号１）に関し、さらに１１位に位置するアミノ酸、及び／または８８位に位置するアミノ酸の非保存的な置換をミューテーションが導くように適切にミューテートされたものである、この配列を有する組換え核酸分子に関する。本明細書を通じて、用語、「配列」は、第一にヌクレオチドの連続に関する情報を表し、第二にこの情報のキャリアー、即ち前記ヌクレオチドの連続を有する核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を表す。
【００２８】
本発明の核酸分子の好ましい実施態様では、ヒトコネキシン３０遺伝子のコード配列は、特に表皮の細胞である真核生物細胞において発現を許容するプロモーターの支配下に配置される；好ましくはこのプロモーターは、適切にミューテートされたヒトＧＪＢ６遺伝子の天然のプロモーターである。
【００２９】
遺伝学的感受性を有する脱毛症を有する患者で一般的に観察される少なくとも一つのミューテーションを有するヒトコネキシン３０のバージョンを含む核酸分子はまた、本発明の一部であり、問題となるミューテーション（類）は、ＧＪＢ６遺伝子のコード配列に位置しても、この遺伝子の発現を調節する配列に位置しても良い。
【００３０】
クラウストン症候群を引き起こすミューテーションの同定は、この病理学的状態に対する治療を構想することを可能にする。それ故本発明の特定の実施態様は、ミューテーション３１（Ｇ＞Ａ）または２６３（Ｃ＞Ｔ）の一つを含むコネキシン３０のコード配列の領域のアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
【００３１】
もちろん本発明はまた、前述のもののような核酸を含む遺伝子輸送ベクターに関する。前記ベクターはウイルスベクターでも良く、例えばアデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス関連ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ワクシニアウイルス、アルファウイルス、バキュロウイルス、ＳＶ４０ウイルス、及びエプスタインバールウイルスからなる群から選択されるウイルスから由来しても良い。それらはまた、いくつかのウイルスのエレメントを含むキメラ、または非ウイルス性の、任意に合成のベクターであっても良い。
【００３２】
本発明の特徴点の一つは、クラウストン症候群の治療のため、または遺伝学的感受性を有する脱毛症の治療のために企図された組成物を調製するための、前述のような核酸またはベクターの使用である。
【００３３】
本発明の別の特徴点は、ミューテーション３１（Ｇ＞Ａ）または２６３（Ｃ＞Ｔ）の検出のためのプライマーのペア、及びこれらのミューテーションの検出方法に関する。
【００３４】
以下の実施例２に記載されるように、ミューテーション３１（Ｇ＞Ａ）は制限部位に作用しない。他方で、ヌクレオチド３１に近接する塩基を改変すれば、制限部位を作製することが可能である。このため、例えばＰＣＲの間でヌクレオチド３１に近接するヌクレオチドを改変するであろうオリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲによって、ミュータジェン増幅（ｍｕｔａｇｅｎｉｃ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を実施できる。この方法は、前記ヌクレオチド３１を含む制限部位を作製することを可能にする。実施例２は、ミューテーション３１（Ｇ＞Ａ）を有する対立遺伝子を使用するＢｃｌＩ制限部位の作製を可能にするミュータジェンＰＣＲを記載するが、それは３１位でミューテートされていない対立遺伝子を使用する制限部位では作製しない。次いで二つの対立遺伝子は、ＢｃｌＩでの切断の後、アガロースゲルでの移動によって同定できる。それ故本発明は、ミューテーション３１（Ｇ＞Ａ）を有するまたは有さないＧＪＢ６対立遺伝子を使用して実施されるミュータジェン増幅の産物が、選択された制限酵素での切断によって識別されるような、３１位で前記ヌクレオチドを含むＧＪＢ６遺伝子の断片のミュータジェン増幅のためのプライマーのペアに関する。本発明のこの特徴点の特定の実施態様では、制限酵素はＢｃｌＩであり、プライマーペアは以下の配列を含む：
５’−ＡＴＧＧＡＴＴＧＧＧＧＧＡＣＧＣＴＧＣＡＣ−３’、及び
５’−ＧＣＡＧＣＣＡＣＣＡＣＴＡＧＧＡＴＣＡＴＧＡＣＴＣＧＧＡＡＡ−３’。
【００３５】
本発明はまた、以下の工程を含む、クラウストン症候群の診断のための、ミューテーション３１（Ｇ＞Ａ）の診断のための、サーチ方法に関する：
・前述のもののようなプライマーのペアでＧＪＢ６遺伝子の断片を増幅する工程；
・増幅が、ミューテーション３１（Ｇ＞Ａ）を有する対立遺伝子を使用するＢｃｌＩ制限部位の作製を導く特定の場合ではＢｃｌＩである、適切な制限酵素で増幅産物を切断する工程；
・切断産物を分析する工程。
【００３６】
ミューテーション２６３（Ｃ＞Ｔ）は、野生型対立遺伝子に存在するＨａｅＩＩ制限部位を消失する。それ故このミューテーションは、このミューテーションを含む領域の増幅と、それに引き続くＨａｅＩＩ制限酵素での増幅産物の切断によって明らかにできる。次いで二つの対立遺伝子が、アガロースゲルでの移動によって分離できる。それ故本発明は、ＨａｅＩＩでの増幅産物の切断が、ヌクレオチド２６０と２７０の間でのＨａｅＩＩ制限部位の存在または不存在を識別可能とするように選択された、２６３位で前記ヌクレオチドを含むＧＪＢ６遺伝子の断片を増幅するためのプライマーのペアに関する。特に本発明は、以下の配列を含む２０から５０ヌクレオチドのプライマーのペアに関する：
５’−ＣＴＴＴＧＣＣＣＡＣＴＴＴＴＧＴＣＴＧＴ−３’、及び
５’−ＴＧＡＣＧＣＡＧＣＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＣＴＴ−３’。
【００３７】
これらのプライマーのペアは、以下の工程を含む、クラウストン症候群の診断のための、ミューテーション２６３（Ｃ＞Ｔ）のサーチ方法で使用できる：
・前述のもののようなプライマーのペアでＧＪＢ６遺伝子の断片を増幅する工程；
・ＨａｅＩＩ酵素で増幅産物を切断する工程；
・ＨａｅＩＩによって切断されないバンドを導くミューテートされた対立遺伝子の存在を、切断産物で分析する工程。
【００３８】
前述のプライマーのペアは、クラウストン症候群の診断のためのキットに含まれることができ、それも本発明の一部である。そのようなキットは、一つ以上のプライマーのペアを含んでも良い。それはまた、ＢｃｌＩ及びＨａｅＩＩ制限酵素、及びこれらの酵素の活性に適したバッファーを含んでも良い。
【００３９】
脱毛症の症状の一つである、ドミナントな単一遺伝子の病理学的状態に関与するミューテーションの知見は、他の応用を有しても良い。かくして、前述のもののような、例えば残基１１または残基８８の非保存的なミューテーションを導くＧＪＢ６遺伝子のミューテートされたバージョンを有する核酸またはベクターは、本発明によれば、毛髪の成長を制限する、及び／または毛髪の損失を促進することを企図した組成物の調製のために使用できる。コネキシン３０の機能性の損失を導く他のミューテーションも、本発明のこの特徴点で考慮できる。
【００４０】
それ故本発明は、前述のもののような核酸分子及び／またはベクターを含む、いずれの製薬及び／または化粧品組成物をも含む。各ケースに依存して、この組成物は、クラウストン症候群の治療のため、遺伝学的感受性を有する他のタイプの脱毛症の治療のため、または身体の特定の領域の多毛の減少のために企図される。
【００４１】
本発明はまた、前述の核酸及びベクターによってコードされる組換えタンパク質、並びにこれらの組換えタンパク質の一つ以上を含むいずれの製薬及び／または化粧品組成物にも関する。適切な場合、これらのタンパク質は切り詰められていても良い。本発明の組成物はまた、前述のような組換えタンパク質の断片のみを含んでも良い。
【００４２】
好ましくは本発明の組成物は、外的なまたは局所的な適用によって投与できる。それらは例えば、クリーム、ゲル、またはスプレーであっても良い。
【００４３】
本発明の別の特徴点は、前述のもののような組換えＤＮＡ構築物を含む真核生物細胞に関する。これらの細胞では、ヒトコネキシン３０遺伝子の発現を許容する組換えＤＮＡ構築物が、染色体外形態で存在しても良く、または前記細胞のゲノム内に挿入されても良い。本発明のこの特徴点の特定の実施態様では、ヒトコネキシン３０遺伝子の発現を許容する組換えＤＮＡ構築物を含む細胞は、ゼノパス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵またはヒーラ（ＨｅＬａ）細胞である。本発明の細胞では、ヒトコネキシン３０の発現は、安定的または一過的でも良く、構成的または誘導可能であっても良い。
【００４４】
本発明はまた、前述の細胞のような、野生型形態またはミューテートされた形態で、ヒトコネキシン３０遺伝子を発現する細胞を含むトランスジェニック動物に関する。本発明の動物におけるヒトコネキシン３０遺伝子の発現は、組織特異的であってもなくとも良く、構成的、誘導可能、または抑制的であっても良い。
【００４５】
本発明の細胞及びトランスジェニック動物は、特に特定のタイプの脱毛症の治療において有効である分子のスクリーニングのために使用されて良い。それ故、以下の工程を含む、特定のタイプの脱毛症の治療において有効である分子のスクリーニング方法も、本発明の一部である：
−  本発明に係る細胞または動物と、候補の分子を接触させる工程；
−  ＧＪＢ６遺伝子の発現のレベル、及び／またはコネキシン３０の活性に対する候補の分子の効果を測定する工程。
【００４６】
この方法では、ＧＪＢ６遺伝子の発現のレベルに対する候補の分子の効果を測定する工程は、ＤＮＡチップを使用して実施されて良い。
【００４７】
本発明の方法の特定の実施態様では、ヒトコネキシン３０遺伝子の対立遺伝子を有する細胞はゼノパス卵であり、コネキシン３０の活性に対する候補の分子の効果を測定する工程は、コネクソンの電気生理学的活性を測定することによって実施される。
【００４８】
以下に挙げられる実施例及び図面は、非制限的な性質で、本発明の特定の態様を説明し特定する。
【００４９】
【実施例】
実施例１：ＧＪＢ６中のミューテーションのサーチ
使用される遺伝学的材料：
多様な家系的起源を有する健常人及び罹患患者のＤＮＡサンプルを使用した（表１参照）。この集積は、疾患を有する二つの関連しないフランス人ファミリー（ＨＥＤ１及びＨＥＤ２）から得られたサンプルを特に含む。ネガティブコントロールとして使用された関連しない患者は、ＣＥＰＨ（Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）のいくつかの独立のファミリーから由来する。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
ＧＪＢ６遺伝子の配列決定：
ＧＪＢ６遺伝子におけるミューテーションの初期の研究は、イントロンを含まない完全な遺伝子をカバーする三つのＰＣＲ断片（ペアＦ１／ＯＲＬ２、Ｓ２／Ｓ６、及びＳ３／Ｒ１、図２及び表２参照）を配列決定することによって実施された。研究された二つのファミリーのそれぞれから得られる健常人及び疾患患者のＤＮＡ、並びに患者Ｒｏｕ１２８６６及びＲｏｕｌ１２８６２のＤＮＡを配列決定した。この研究は、Ｇｅｎｅｔｈｏｎの配列決定部門との共同研究で実施された。
【００５２】
【表２】
2004522419.tif 000003
【００５３】
結果：
ＨＥＤ１ファミリーの患者Ｃ．１（罹患）及びＩＩＩ．１５（健常）から得たＤＮＡの配列の分析は、前者が配列のコドン１１の第一の塩基に影響し、グリシン残基のアルギニン残基での置換を導くポイントミューテーション３１（Ｇ＞Ａ）に対してヘテロ接合体であることを示すことを可能にした。
【００５４】
さらに、ミューテーション３１（Ｇ＞Ａ）を示さないファミリーの罹患患者（Ｒｏｕ１２８６２）及び健常人（Ｒｏｕ１２８６６）から得たＧＪＢ６遺伝子の完全なコード配列の配列決定は、このファミリーでは、この同じ遺伝子中の新規なミューテーション２６３（Ｃ＞Ｔ）を同定することを可能にした。このミューテーションは、この配列のコドン８９の第二の塩基に影響し、アラニン残基のバリン残基での置換を導く。
【００５５】
実施例２：ＧＪＢ６におけるミューテーションの確認
ミューテーションについての数多くの患者の遺伝子タイピングの原理
数多くの患者の遺伝子タイピングは、既に既知のミューテーションを検出するための単純な方法を使用して実施されるべきである。ここで使用される方法は、ミューテートされた配列中の制限部位の作製または消失を表すことを含む。二つの方法が使用された：
・ミューテーション２６３（Ｔ＞Ｃ）：このミューテーションは、野生型対立遺伝子で存在するＨａｅＩＩ制限部位を消失する。ミューテーションを表すことは、ミューテーションを含む領域のＰＣＲ増幅と、適切な制限酵素での増幅産物の切断によって実施される。次いで二つの対立遺伝子が、アガロースゲルでの移動によって分離できる。
・ミューテーション３１（Ｇ＞Ａ）：このミューテーションは制限部位に影響しない。他方で、ミューテートされた部位に近接する塩基も改変したならば、制限部位を作製することが可能である。ＰＣＲの間で、ＢｃｌＩ制限部位を作製するように、ミューテーションに近接するヌクレオチドを改変するために、ミュータジェンオリゴヌクレオチドがここで使用された。次いで二つの対立遺伝子が、適切な酵素での切断の後、アガロースゲルでの移動によって同定できる。
【００５６】
ミューテーション３１（Ｇ＞Ａ）：
一度ミューテーション３１（Ｇ＞Ａ）が同定されると、他の患者におけるこのミューテーションが、ミューテートされた対立遺伝子でＢｃｌＩ制限部位を作製するミュータジェンＰＣＲ（Ｃｘ３０−ＢｃｌＩ／Ｃｘ３０−３０ｍｅｒ−Ｒ；表３参照）を使用して求められた。次いでＰＣＲ産物をＢｃｌＩ酵素で切断する。ゲル（２％アガロース＋２％Ｎｕｓｉｅｖｅ（登録商標））での移動により、３９塩基対のサイズの差異によって、ミューテートされた対立遺伝子と野生型対立遺伝子の間を識別可能である。
【００５７】
【表３】
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【００５８】
二つのフランス人ＨＥＤ１ファミリーの全ての入手可能なサンプルを、このミュータジェンＰＣＲを使用して試験した。全ての罹患患者はヘテロ接合体であることが分かった一方で、健常人はホモ接合体である（図３参照）。
【００５９】
この同じ方法は、多様化した他の罹患患者での、ミューテーション３１（Ｇ＞Ａ）の検出が可能であった（表４参照）。
【００６０】
ミューテーション２６３（Ｃ＞Ｔ）
患者Ｒｏｕ１２８６２における発見の後、ミューテーション２６３（Ｃ＞Ｔ）が、前述の方法によって他の患者で求められた。このミューテーションは、野生型対立遺伝子に存在するＨａｅＩＩ制限部位を消失する。二つの対立遺伝子の識別は、ＰＣＲ（Ｃｘ３０−Ｆ１／Ｃｘ３０−Ｒ１；表３参照）とＨａｅＩＩでの酵素切断の後に実施される。ヘテロ接合体患者は、野生型対立遺伝子に対応するより小さなバンドに加えて、非切断のＰＣＲ産物に対応するバンドを示す。
【００６１】
それ故、ＨａｅＩＩ酵素でのＰＣＲＣｘ３０−Ｆ１／Ｃｘ３０−Ｒ１の産物の単純な切断（表４参照）は、ミューテーション３１（Ｇ＞Ａ）を有さない罹患患者の全てがミューテーション２６３（Ｃ＞Ｔ）を示し、後者は健常人では存在しないことが確認できた。
【００６２】
コントロールの遺伝子タイピング
これらの二つのミューテーションは多型に相当しないことを確認するために、数多くの独立な健常人のＤＮＡを、前述の二つのストラテジーを使用して研究した。試験された９３の患者は、ＣＥＰＨの２４ファミリーの祖父母である。試験された患者は、二つのミューテーションのどちらも示さない。ミューテーション２６３（Ｃ＞Ｔ）はインド人起源のファミリーで同定されたため、２１の独立の健常なインド人が試験された。これらの患者は、二つのミューテーションの両方を示さない。
【００６３】
【表４】
2004522419.tif 000005
【００６４】
実施例３：コネキシン３０の野生型及びミュータント対立遺伝子のクローニング
各種の真核生物細胞系での野生型及びミューテートされたコネキシン３０での機能的な研究を実施するために、ＢｇｌＩＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に隣接したＧＪＢ６遺伝子の各種の対立遺伝子を、ベクターｐＵＣ１９内にクローン化した。
【００６５】
第一の工程では、５’末端に近接したＢｇｌＩＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含むプライマーを使用するＰＣＲによって、遺伝子を増幅した（Ｃｘ３０−Ｆ１ ＢｇｌＩＩ／Ｃｘ３０−Ｒ１ ＢｇｌＩＩまたはＣｘ３０−Ｆ１ ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｃｘ３０−Ｒ１ ＨｉｎｄＩＩＩ、表３参照）。一度遺伝子が増幅されると（二つのミューテーションのそれぞれを有する疾患のヘテロ接合体患者から由来するゲノムＤＮＡから）、増幅産物の末端は、ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー断片の作用によって平滑化された。ＰＣＲ産物をベクターｐＵＣ１９内にクローン化した（平滑末端を生ずる酵素で直線化して）。ライゲーションと大腸菌株ＪＭ１０９へのトランスフォーメーションの後、組換え体を、ベクターのプライマーＭ１３−２１及びＭ１３−４０を使用するＰＣＲによって同定した。挿入物の性質（ミューテートされたものか野生型か）を、実施例２に記載された方法を使用して測定した。
【００６６】
野生型形態、及びＢｇｌＩＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ部位によって境界付けられたミューテートされた形態３１（Ｇ＞Ａ）及び２６３（Ｃ＞Ｔ）に対応する、６の異なるクローンを得た。
【００６７】
【参考文献】
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2004522419.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、この研究で分析されたフランスファミリー（ＨＥＤ１及びＨＥＤ２）及びウェールズファミリーの家系図である。グレーの数字は、分析されたＤＮＡを有する患者を表す。
【図２】図２は、使用された各種のプライマーの位置を有するＧＪＢ６遺伝子の配列を表す図である。コード領域が大文字で表されている。
【図３】図３は、ミューテーション３１（Ｇ＞Ａ）を有する二つのファミリー由来の疾患患者と健常人の遺伝子型を表す図である。ミュータント対立遺伝子のミュータジェンＰＣＲによる増幅の産物がＢｃｌＩで切断され、二つの断片が得られる（８０ｂｐ及び３９ｂｐ、それらは写真では見えない）。野生型対立遺伝子のミュータジェンＰＣＲによる増幅の産物は切断されない（１１９ｂｐ）。
【図４】図４は、ミューテーション２６３（Ｃ＞Ｔ）を有するファミリー由来の患者の遺伝子型を表す図である。ミュータント対立遺伝子のＰＣＲ増幅の産物（切断されない）は、８５４ｂｐの長さである。野生型対立遺伝子のＰＣＲ増幅の産物はＨａｅＩＩで切断され、二つの断片が得られる（３０４ｂｐと５５０ｂｐ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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