(57)【要約】本発明は、レバンを産生するLactobacillus sanfranciscensis種の単離して精製した菌株、上記レバンの調製方法、および様々なヒトまたはペットの食料品または化粧品におけるこのレバンおよび/またはこのレバンを産生する菌株の使用に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
レバンを産生するラクトバチルス  サンフランシセンシス(Lactobacillus sanfranciscensis)種の単離して精製した菌株。
【請求項２】
寄託番号CNCM I-2588、CNCM I-2589、またはCNCM I-2613を有する、請求項1に記載の菌株。
【請求項３】
請求項1または2に記載の菌株によって得られる可溶性レバン。
【請求項４】
レバンの産生方法であって、
スクロースを含む培地に請求項1または2に記載の菌株の前培養物を接種し、
これを25-35℃で12-48時間醗酵させた後、
生成する培養物のpHを4.5未満まで低下させた後、冷エタノールを加えて、0-10℃で6-48時間保存する、上記方法。
【請求項５】
培地が少なくとも0.2%のスクロースを含む、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
保存の後、沈降物中のレバンを精製する、請求項4に記載の方法。
【請求項７】
レバンを含む培養物を乾燥して、レバン粉末を生成する、請求項4に記載の方法。
【請求項８】
ヒトまたはペットの食料品または化粧組成物を調製するための、請求項3に記載のレバンおよび/または請求項1または2に記載のラクトバチルス  サンフランシセンシス(Lactobacillus sanfranciscensis)の菌株の使用。
【請求項９】
レバンの量が約0.01-25%である、請求項8に記載の使用。
【請求項１０】
レバンをプレビオティク(prebiotic)フルクタンのイン・シテュー供給源として用いる、請求項8または9に記載の使用。
【請求項１１】
レバンが免疫刺激多糖類である、請求項8または9に記載の使用。
【請求項１２】
ラクトバチルス  サンフランシセンシス(Lactobacillus sanfranciscensis)菌株の量が少なくとも1.105cfu/gである、請求項7に記載の使用。
【請求項１３】
少なくとも請求項3に記載のレバンおよび/または請求項1または2に記載のラクトバチルス  サンフランシセンシス(Lactobacillus sanfranciscensis)菌株を含んでなる、ヒトまたはペットの食料品。
【請求項１４】
レバンの量が約0.01-25%である、請求項13に記載のヒトまたはペットの食料品。
【請求項１５】
ラクトバチルス  サンフランシセンシス(Lactobacillus sanfranciscensis)菌株の量が少なくとも1.105cfu/gである、請求項13に記載のヒトおよびペットの食料品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、主要な多糖類としてレバンを産生するLactobacillusの菌株、および様々なヒトまたはペットの食料品におけるまたはヒトまたはペットの食料品の調製のためのその使用に関する。本発明は、レバンの製造方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
植物、海藻および細菌によって産生される様々な高分子量多糖類(それぞれ、セルロース、ペクチン、および澱粉; アルギン酸塩およびカラゲナン; およびアルギン酸塩、ゲラン、およびキサンタン)は、食物および食物以外の産業において増粘、安定化、乳化、ゲル化、または水結合剤として応用されている。しかしながら、これらの多糖類の総ては添加物であり、従って、食物産業では余り望ましくないと考えられている。
【０００３】
レバン(植物では、フルクタンβ-(2→6)-D-フルクトースまたはβ-(2→6)-D-フルクタンまたはβ-(2→6)-D-フルクトフルクタンまたはβ-(2→6)-D-Frufまたはフレインとしても知られている)は、広汎な分子量(約2kDa - 約60MDa)に亙っている天然のD-フルクトフラノースのホモ多糖類である。低分子量レバンは、植物では炭水化物保存物として生産される(Vandamme, B. J., and Derycke, D. G. (1983) Adv. Appl. Microbiol., 29: 139-176)。分子構造は、この場合にはβ-(2→6)-フルクトースの短い線状鎖である。植物関連細菌から土壌細菌、歯垢細菌、酵母および真菌にまでわたる微生物の幾つかの種類も、レバンを産生する(Han, Y. W., (1990) Adv. Appl. Microbiol., 35,171-194): Acetobacter, Actinomyces, Aerobacter, Aspergillus, Bacillus, Corynebacterium, Erwinia, Leuconostoc, Pseudomonas, Streptococcusなど。微生物では、レバンは分子量が一層高く、一般に植物レバンで見られるβ-(2→6)結合の他にβ-(2→1)結合による広汎な分岐がある。
【０００４】
米国でGRAS(安全であると一般に認知された)ステータスを有し且つ多種多様なエキソ多糖類分子を産生することが知られている食品級微生物である乳酸菌(Cerning, J. (1990) FEMS Microbiol. Rev. 87: 113-130; Dunican, L. K. and Seeley, H. W. (1965) J Gen. Microbiol. 40: 297-308)は、発酵乳の感触に寄与する。これらの細菌由来のエキソ多糖類により、新世代の食品級多糖類を開発することができる。
【０００５】
実際に、Lactobacilliなどの乳酸菌によるヘテロ多糖類の合成が現在精力的に検討されている(Cerning, J. (1990) FEMS Microbiol. Rev. 87: 113-130; Grobben, G. J., et al. (1995) J. Appl. Bacteriol. 79: 103107; Stingele, F. et al., (1996), R Bacteriol. 178: 1680-1690、および van den Berg, D. J. C., et al., (1995) Appl. Environ. Microbiol. 61: 2840-2844)。
【０００６】
また、ホモ多糖類(例えば、デキストランおよびレバン)の合成は、主としてLeuconostoc mesenteroides (NO 6055)およびStreptococci (Cerning, J. (1990) FEMS Microbiol. Rev. 87: 113-130)で検討されてきた。Lactobacilliでのホモ多糖類の生合成については、限られた情報しかない(Dunican, L. K. and Seeley, H. W. (1965) J : Gen. Microbiol. 40: 297-308; Pidoux, M. et al., (1990) J. Appl. Bacteriol. 69: 311-320)。
【０００７】
更に最近では、G. van Geel-Schutten et al.が、水溶性エキソ多糖類物質をグルコースおよびフルクトースと共に合成するLactobacillus reuteri LB 121の菌株を同定し、更にこれらのグルカンおよびフルクタンエキソ多糖類を特性決定している(van Geel-Schutten, G. H., et al., (1999), Appl. Environ. Microbiol. 65: 3008-3014)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、Lactobacilliの他の菌株、特にLactobacillus reuteri種以外のものであって、フルクタン、特にレバンを産生することができ、且つ食品産業にとって非常に興味深いものを提供することは、興味深いことである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
従って、第一の態様では、本発明は、単離し、精製したLactobacilli菌株、更に詳細にはラクトバチルス  サンフランシセンシス(Lactobacillus sanfranciscensis)由来であり、主要な多糖類としてレバンを産生する菌株を提供しようとするものである。
【００１０】
意外なことに、本来は伝統的なドウの醗酵に用いられるLactobacillus sanfranciscensisが、レバンと極少量のグルコースポリマーを産生することができることを見出した。
【００１１】
好ましくは、Lactobacillus sanfranciscensis菌株は、寄託番号CNCM I-2588を有するL. sanfranciscensis NCC 2729、または寄託番号CNCM I-2589を有するL. sanfranciscensis NCC 2731、または寄託番号CNCM I-2613を有するL. sanfranciscensis NCC 2733である。
【００１２】
本発明は、Lactobacillus sanfranciscensisからレバンを産生する方法であって、
スクロースを含む培地に上記菌株の前培養物を接種し、
25-35℃で12-48時間醗酵させた後、
生成する培養物のpHを4.5未満まで低下させた後、冷エタノールを加え、0-10℃で6-48時間保存する、上記方法にも関する。
【００１３】
好ましくは、培地は少なくとも0.2%のスクロースを含む。
【００１４】
本発明は、様々なヒトまたはペットの食料品における、または様々なヒトまたはペットの食料品または化粧組成物の調製のための、これらの多糖類および/または上記菌株の使用にも関する。
【００１５】
最も好ましい態様では、Lactobacillus sanfranciscensis由来のレバンをヒトまたはペットの食料品におけるプレビオティク(prebiotic)フルクタンのイン・シテュー供給源として用いることができる。
【００１６】
これは、免疫刺激多糖類の供給源として用いることもできる(P. Z. Allen and W. H. Bowen, (1990) Arch. Oral. Biol., 35, 55-62)。
【００１７】
最後の態様では、本発明は、ヒトまたはペットの食料品または化粧組成物であって、少なくとも上記のような高可溶性レバンおよび/または上記のようなLactobacillus sanfranciscensis菌株を含んでなるものに関する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
以下の説明では、下記の略号を用いている: GRAS, 安全であると一般に認知されている; HMBC, 異核多重結合相関(heteronuclear multiple-bond correlation); PEP-HSQC, 異核単一量子干渉性における同等経路の保存(preservation of equivalent pathways in heteronuclear singlequantum coherence); NMR, 核磁気共鳴; NOESY, 核Overhauser効果分光法; RAPD PCR, ランダム増幅多型DNAポリメラーゼ連鎖反応; TOCSY, 総相関分光法(total correlation spectroscopy); TPPI, 時間比例位相増加(time proportional phase increments)。
【００１９】
最後に、「NCC」は、Nestle Culture Collection (Nestle Research Center, Vers-chez-les-Blanc, ローザンヌ, スイス)を示す。
【００２０】
第一の態様によれば、レバンを産生するLactobacillus sanfranciscensis種の単離して精製した菌株が関係している。
【００２１】
実際、意外なことに、本来は伝統的なドウの醗酵に用いられるLactobacillus sanfranciscensisが、高可溶性のフルクトース含有炭水化物、具体的にはレバンと極少量のグルコースポリマーを産生することができることを見出した。
【００２２】
好ましくは、Lactobacillus sanfranciscensis菌株は、例えば、寄託番号CNCM I-2588を有するL. sanfranciscensis NCC 2729、または寄託番号CNCM I-2589を有するL. sanfranciscensis NCC 2731、または寄託番号CNCM I-2613を有するL. sanfranciscensis NCC 2733である。
【００２３】
レバンはイヌリンより可溶性であるが、低温でのそれらの溶解度は変動し、低くなる傾向がある(Han, Y. W., (1990) Adv. Appl. Microbiol., 35,171-194)。対照的に、Lactobacillus sanfranciscensisによって産生されたレバンは、低温でも高可溶性である。
【００２４】
Lactobacillus sanfranciscensis NCC 2729の醗酵によって生成したレバンを、NMRによって分析した。主生成物(＞95%)はレバンであり、第二の生成物(＜5%)はグルカンと思われる。Actinomyces viscosus由来の特異的なレバナーゼを用いて酵素消化を行ったところ、上記菌株によって生成したレバンはβ-(2→6)結合を有することを示していた。A. niger由来のイヌリナーゼを用いる酵素消化により更に分解を行うと、β-(2→1)結合も存在することを示唆している。
【００２５】
最も好ましい態様では、Lactobacillus sanfranciscensis菌株NCC 2729、 NCC 2731およびNCC 2733を、例えば、2000年12月1日にInstitut Pasteur, 28 rue du Docteur Roux, F-75024 Paris cedex 15, フランスにそれぞれCNCM I-2588、CNCM I-2589およびCNCM I-2613の寄託番号で寄託した。
【００２６】
これらの菌株の詳細、特にその形態学、糖の醗酵、および他の様相に関するものを、下記に示す。
【００２７】
規定した培地
Lactobacillus sanfranciscensisのコロニーを増殖させるため、下記の培地を用いた:
2004522431.tif 000003
【００２８】
最後に、3N KOHを添加してpHを5-6、好ましくは5.4の値に補正した。
【００２９】
形態学
Lactobacillus sanfranciscensisは、真直な棹状のグラム陽性菌である。それらは、規定された培地の寒天プレート上に規則的な白色コロニーを形成する。
【００３０】
＞2%のスクロースを添加すると、コロニーは大きさが伸び、粘液性の概観を生じる。
【００３１】
L. sanfranciscensisは、カタラーゼ陰性の通性嫌気性菌である。
【００３２】
糖の醗酵
糖を醗酵するには、L. sanfranciscensisはヘテロ醗酵型である必要がある。それらはマルトースからD/L-乳酸(D/L=40/60)を生成する。L. sanfranciscensisは小麦タンパク質に対してタンパク質分解活性を有し、マルトース、グルコースおよびスクロースなど幾つかの複雑な炭水化物を醗酵することができる。
【００３３】
他の様相
記載されたL. sanfranciscensis菌株は、レバン多糖類を合成する。この菌株は、ターゲット配列について余り知られていない種からゲノムフィンガープリントを作製し、DNA断片(フィンガープリント)の菌株に特異的な配列を任意オリゴヌクレオチドを用いるPCR増幅によって増幅し、偶然マッチしまたはほとんどマッチするゲノム部位からDNA合成を準備する方法であるRAPD PCRによって同定することができる。この方法で増幅したDNAを用いて、特徴的なパターンを調和させることによって種の関連性を決定することができる。
【００３４】
もう一つの態様によれば、本発明は、レバンの産生方法であって、スクロースを含む培地に本発明によるL. sanfranciscensisの菌株の前培養物を接種し、これを25-35℃で12-48時間、好ましくは24時間、スクロースを供給しながら醗酵させることを特徴とする、方法に関する。培地は、好ましくは少なくとも0.2%のスクロースを含む。
【００３５】
pHを4.5より低い値まで低下させた後、培養物を回収する。レバンを得るために、氷冷エタノール2容を上清に加えることができ、0-10℃、好ましくは4℃で6-48時間、好ましくは15時間保存した後、沈降物中のレバンを蒸留水に熔解した後、エタノールで沈澱させることによって更に精製することができる。
【００３６】
L. sanfranciscensis細菌を増殖させてレバンを得るために、上記の特別に規定した培地(20g/lスクロース、トリプトン10g/l、酵母エキス7g/l、クエン酸ジアンモニウム5g/l、酢酸ナトリウム(x 3水溶液)5g/l、KH2PO4 x3H2O(x3水溶液)2.5g/l、牛肉エキス(Lab Lemco粉末)2g/l、グルコン酸カリウム2g/l、システイン-HCl 0.5g/l、MgSO4(x7水溶液) 0.2g/l、MnSO4(x4水溶液)0.1g/l、FeSO4(x7水溶液)0.05g/l、Tween 80 1ml、および3N KOHを用いてpHを5.4に補正)で増殖を行うことができる。
【００３７】
レバンを含むLactobacillus sanfranciscensisの培養上清を乾燥して、例えば、レバン粉末を得ることができる。好ましくは、培養物を凍結乾燥、噴霧乾燥、フリーズドライ、流動床乾燥などによって乾燥する。
【００３８】
GRAS Lactobacillus sanfranciscensis菌株による高可溶性レバンの産生により、これを様々な分野で応用することができる。
【００３９】
例えば、もう一つの態様によれば、本発明は、様々なヒトまたはペットの食料品における、または様々なヒトまたはペットの食料品または化粧組成物の調製のためのこれらの多糖類および/または上記Lactobacillus sanfranciscensisの使用に関する。
【００４０】
好ましくは、本発明による多糖類は、例えば、乳児用フォーミュラ、乳を基剤とした製品、穀物を基剤とした製品、サラダドレッシング、ソース、ケチャップ、カラシ、スキンクリームなどの化粧品の調製に用いることができる。
【００４１】
もう一つの態様は、Lactobacillus sanfranciscensis由来のレバンは、ヒトまたはペットの食料品におけるプレビオティクフルクタンの供給源として用いることができる。フルクト-オリゴ-および多-糖類(FOS)の主要な生物学的特性は、ヒト(または哺乳類)の大腸に到達した際にビフィズス菌の増殖を選択的に促進する能力である。今日までは、イヌリンのようなβ-(2→1)-D-フルクトースオリゴ-およびポリマーのみがビフィズス生成性であるとして記載されており、従ってプレビオティク炭水化物として分類されている。このようなフルクタンを醗酵するために、通常の微生物相由来のビフィズス菌は、特異酵素、すなわちフルクトシダーゼを用いなければならない。このような微生物酵素はβ-(2→6)-フルクトースを加水分解し、プレビオティク多糖類としてレバンに栄養上の利点を提供することもできる。最近、ビフィズス菌がβ-(2→6)-フルクトースを加水分解することができることが示された(Marx et al. (2000), FEMS Microbiol. Letters 182,163-169)。
【００４２】
レバンは、免疫刺激多糖類の供給源として用いることもできる (P. Z. Allen and W. H. Bowen, (1990) Arch. Oral. Biol., 35, 55-62)。
【００４３】
従って、本発明によるレバンは、ヒトまたはペットの食料品に約0.01%-約25%、更に好ましくは0.1%-20%の量で含まれていてもよい。化粧品の分野での応用では、本発明によるレバンは、約0.01%-約5%、更に好ましくは0.1%-2%の量で含まれていてもよい。
【００４４】
本発明による菌株は、ヒトまたはペットの食料品並びに化粧品に少なくとも1.105cfu/g、更に好ましくは107cfu/g〜≧108cfu/gの量で用いることができる。
【００４５】
最後に、本発明は、少なくとも上記の多糖類および/または上記の菌株を含んでなるヒトまたはペットの食料品または組成物に関する。
【００４６】
このような食料品または組成物を調製するために、上記の方法で得られたレバンを、乳児用フォーミュラ、穀物粉末、乳粉末、ヨーグルト、ケチャップ、マヨネーズなどの食料または化粧品に、例えばその製造中に配合することができる。
【００４７】
ペットフードは、プレビオティクの供給源としてL. sanfranciscensis由来のレバンおよび/またはL. sanfranciscensis菌株を含んでなることができる。それにより、栄養的に完全なペットフードまたは栄養補助食品またはおやつ(treat)またはビスケットとすることができる。栄養的に完全なペットフードには、レバンおよび/または菌株を含むのが好ましい。
【００４８】
栄養的に完全なペットフードは、任意の適当な形態、例えば、乾燥形態、半湿潤形態、および湿潤形態であることができる。これらのペットフードは、常法によって製造することができる。栄養剤以外には、これらのペットフードは、任意の1種類以上の澱粉源、タンパク質源、および脂質源を含むことができる。適当な澱粉源は、例えば、トウモロコシ、米、小麦、大麦、オート麦、大豆、およびこれらの混合物のような穀類およびマメである。適当なタンパク質源は、任意の適当な動物または植物タンパク質源、例えば、食肉およびミール、鳥肉ミール、魚ミール、大豆タンパク質濃縮物、乳タンパク質、グルテンなどから選択することができる。適当な脂質源としては、食肉、動物性脂肪および植物性脂肪が挙げられる。澱粉、タンパク質、および脂質源の選択は、主として動物の栄養上の要求、嗜好性の考慮、および製造される製品の種類によって決定される。更に、例えば、砂糖、塩、香辛料、シーズニング、ビタミン、ミネラル、香味料、脂肪など様々な他の成分を、所望により乾燥食品に配合することもできる。
【００４９】
乾燥ペットフードには、適当な方法は押出加熱であるが、ベーキングおよび他の適当な方法を用いることができる。押出加熱を行うときには、乾燥ペットフードは通常は粗挽きの形態で提供される。プレビオティク(prebiotic)を用いるときには、このプレビオティクを乾燥ペットフードの他成分と混合した後に加工することができる。
【００５０】
適当な方法は、欧州特許出願第0850569号明細書に記載されている。この菌株を用いるときには、この生物を乾燥ペットフードにコーティングしまたはこの中に充填するのが最も好ましい。適当な方法は、欧州特許出願第0862863号明細書に記載されている。
【００５１】
湿潤食物については、米国特許第4,781,939号および第5,132,137号明細書に記載の方法を用いて、疑似食肉生成物を製造することができる。厚切りタイプの生成物を製造するための他の手続き、例えば、スチームオーブンでの加熱を用いることもできる。あるいは、適当な肉材料を乳化して肉エマルションを生成させ、適当なゲル化剤を加え、肉エマルションを加熱した後、缶または他の容器に充填することによってローフタイプの生成物を製造することができる。
【００５２】
ペットフードでのプレビオティクとしてのレバンの最大濃度は、好ましくは約20重量%であり、特に約10重量%である。例えば、プレビオティクは、ペットフードの約0.1-約20重量%となることがある。
【００５３】
下記の例は、単なる例示のために提示されるものであり、本願の主題を制限するものと解釈すべきではない。総ての百分率は、特に断らない限り、重量によって示される。これらの例の前に、図面の簡単な説明が置かれる。
【実施例】
【００５４】
例1  レバンを産生するLactobacillus sanfranciscensisの菌株についての試験
上記の規定された培地である寒天プレート(20g/lスクロース、トリプトン10g/l、酵母エキス7g/l、クエン酸ジアンモニウム5g/l、酢酸ナトリウム(x3水溶液)5g/l、KH2PO4x3H2O(x3水溶液)2.5g/l、牛肉エキス(Lab Lemco粉末)2g/l、グルコン酸カリウム2g/l、システイン-HCl 0.5g/l、MgSO4(x7水溶液)0.2g/l、MnSO4(x4水溶液)0.1g/l、FeSO4(x7水溶液)0.05g/l、Tween 80 1ml、および3N KOHを用いてpHを5.4に補正)上で菌株を増殖した。
【００５５】
粘液性の外観に達した菌株を、次に液体特殊培地で増殖させた後、25-35℃で12-48時間、好ましくは24時間醗酵させた。pHを4.5より小さな値まで低下させた後、培養物を回収する。レバンを得るために、氷冷エタノール2容を上清に加え、0-10℃、好ましくは4℃で6-48時間、好ましくは15時間保管した後、沈降物を蒸留水に熔解し、エタノールでレバンを沈澱させることによって沈降物中のレバンを更に精製した。
【００５６】
Lactobacillus sanfranciscensisは真直な桿状であり、規定された培地である寒天プレート上に規則的な白色コロニーを形成する。
【００５７】
＞2%スクロースを加えたところ、コロニーは大きさが広がり、粘液性の外観を生じ、肉眼により同定できる。
【００５８】
糖の醗酵のためには、L. sanfranciscensisはヘテロ醗酵型である必要がある。それらはマルトースからD/L-乳酸(D/L=40/60)を生成する。L. sanfranciscensisは小麦タンパク質に対してタンパク質分解活性を有し、マルトース、グルコースおよびスクロースなど幾つかの複雑な炭水化物を醗酵することができる。
【００５９】
上記のL. sanfranciscensis菌株CNCM I-2588およびCNCM I-2589は、レバン多糖類を合成する。これらの菌株は、ターゲット配列について余り知られていない種からゲノムフィンガープリントを作製し、DNA断片(フィンガープリント)の菌株に特異的な配列を任意オリゴヌクレオチドを用いるPCR増幅によって増幅し、偶然マッチしまたはほとんどマッチするゲノム部位からDNA合成を準備する方法であるRAPD PCRによって同定することができる。この方法で増幅したDNAを用いて、特徴的なパターンを調和させることによって種の関連性を決定することができる。
【００６０】
例2  Lactobacillus sanfransciscensis CNCM I-2588によって生成した多糖類の構造分析
特性決定は、単糖類分析、核磁気共鳴分光法(NMR)および酵素消化によって行った。
【００６１】
単糖類分析
L. sanfranciscensis CNCM I-2588によって生成した多糖類の定量的単糖類分析は、ソフト酸加水分解(2Nトリフルオロ酢酸, 60℃, 試料は30分および1時間後に採取)の後にパルス化電流滴定検出(PAD)を備えた高性能アニオン交換(HPAE)クロマトグラフィーによって行った。フルクトース単糖類単位の(マンノースおよびグルコースへの)分解を避けるため、低温加水分解条件が必要であった。
【００６２】
この分析は、＞95%のフルクトースと痕跡量のグルコースが含まれていることを示した。
【００６３】
NMR分光法
L. sanfranciscensis CNCM I-2588によって生成した多糖類5mgを99.96原子%の2H2O (Euriso-Top)に溶解した。総ての実験は、能動遮断したパルス化磁場z-グラディエント逆三重共鳴プローブを備えた三チャンネルBruker DRX 600 MHzスペクトル分析計で記録した。化学シフトは、外部[13C-1]-グルコースのα-アノマーシグマに対してppmで示す(H-1についてはδH-1 5.15、およびC-1についてはδC-1 92.90)。
【００６４】
位相感知二次元実験は、TPPI(Marion, D. et al., (1983) Biochem. Biophys. Res. Commun. 113, 967-974): 混合時間が15ms-90msのTOCSY(Braunschweiler, L. et al., (1983) J. Magn. Reson. 53,521-528)、混合時間が50ms-200msのNOESY (Jeener, J. et al., (1979) J Chem. Phys. 11, 45464553; Anil Kumar, Ernst, R. R. et al. (1980) Biochem. Biophys. Res. Commun. 95,16)、およびグラディエント感度増進1H-13C異核単一量子干渉性(PEP-HSQC)(Kay, L. E., et al. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114,10663-10665)を用いて記録した。グリコシド結合の決定には、マグニチュード方式グラディエント濾過50ms1H-13C HMBC (Bax, A. et al. (1986) J. Am. Chem. Soc. 108,2093-2094)を記録した。
【００６５】
下記の数の複合点を得た(F1, F2): 256 x 1024 (TOCSYおよびNOESY)、512 x 1024 (HSQC)および256 x 4096 (HMBC)、16回の掃引(TOCSY, HSQC)または64回の掃引(NOESY, HMBC)について平均。1800Hzx 1800Hz(TOCSYおよびNOESY)または3020Hzx 1800Hz(HSQCおよびHMBC)のスペクトル幅(ω1, ω2)を用いた。A 90°シフトした平方サイン-ベルを総ての場合に用い、ゼロ-フィリングを一回行った。総てのデーターは、Bruker XWINNMR 2.6ソフトウェアを用いて処理した。
【００６６】
L. sanfranciscensis CNCM I-2588によって生成した多糖類の1D 1H NMRスペクトル(図2)は、Aと標識したプロトン共鳴の主要な組を示した。5ppm附近の振幅が遙かに小さな追加の組の共鳴(積分値、Aと比較して＜5%)は、グルカンのアノマー共鳴によるものとし、それ以上帰属を決定しなかった。
【００６７】
二次元スペクトルの分析の後、1Hおよび13C NMRの帰属を決定し、表Iにまとめる。
【００６８】
表I  2H2O中67℃で測定したL. sanfranciscensis CNCM I-2588によって生成した多糖類の1Hおよび13C NMR化学シフト。値は、外部[13C-1]グルコース(δH-1(α)5.15およびδC-1(α)92.90)に対するppmで示す。
【表１】
2004522431.tif 000004
【００６９】
L. sahfraraciscensis CNCM I-2588によって生成した多糖類の1Hの帰属を、記録されているTOCSYおよびNOESYスペクトルの総ての痕跡量を追跡することによって決定した。13C共鳴は、C-2共鳴を除きPEP-HSQCスペクトルから得、C-2は第四級炭素であり、H-1およびH-3とのロングレンジスカラーカップリングによりHMBCスペクトルから得られたPEP-HSQCでシグナルを生じることは期待されなかった。
【００７０】
最も多量にある残基Aの帰属は、β-D-Fruf単糖類単位の化学シフトに相当する(van Geel-Schutten, G. H. et al., (1999), Appl. Environ. Microbiol. 65: 3008-3014)。小さめの強度のNMRピークに相当する余り多量に存在しない残基BおよびCも、置換が異なっているβ-D-Fruf単糖類単位(表1, J. W. Timmermans et al., (1993), Carbohydr. Res. 243: 379-384)に相当する。PEP-HSQCピークの積分値は、異なる種の比の極めて精確な方法を提供する。(C-6, H-6)メチレン交差ピークから、A+B:Cは5.5:2であり、また(C-1, H-1)メチレン交差ピークからは、A+B+C=6.7となる。一方、i=3,4,5である(C-i, H-i)交差ピークは、A+B+C=4.1であることを示唆している。これらの値から、反復単位は２つの非分岐Fruf、一つの分岐点Frufおよび一つの末端Frufを有すると結論することができる。構造は、図1に示す。
【００７１】
それにも拘わらず、プロトンおよび炭素化学シフトはいずれも1または2位のグリコシド置換の後で実質的に変化しないので、置換パターンは確定が困難である(J. W. Timmermans et al., (1993), Carbohydr. Res. 243: 379-384)。6位の置換の場合には、炭素化学シフトは64ppmより大きく、未置換C-6については、それらは63ppm附近にある。NOESYおよびHMBCデーターは、内部残基転移が可能な残基間転移と重複するので、ホモ多糖類の場合と同様に、ほとんど助けにならない。メチル化分析データーがない場合には、置換は1、2，および6位にあると推測することができる。
【００７２】
酵素消化
Actinomyces viscosus由来の特異的レバナーゼによる酵素消化では、上記菌株によって生成したレバンがβ-(2→6)結合を有することが示された。Aspergillus niger由来のイヌリナーゼによる酵素消化によって更に分解を行ったところ、β-(2→1)結合が存在し得ることも示唆される。
【００７３】
化学的単糖類分析およびNMR分光法に基づく結論では、L. sanfranciscensis CNCM 1-2588によって分泌された多糖類の反復単位の構造は、→6)-β-D-Fruf-(2→6)-[β-D- Fruf (2→1)-]-β-D-Fruf-(2→6)-β-D-Fruf-(2→として示すことができ、図1に表されている。
【００７４】
例3  本発明によるレバンの調製
規定した培地(20g/lスクロース、トリプトン10g/l、酵母エキス7g/l、クエン酸ジアンモニウム5g/l、酢酸ナトリウム(x 3水溶液)5g/l、KH2PO4 x3 H2O (x3水溶液)2.5g/l、牛肉エキス(Lab Lemco粉末)2g/l、グルコン酸カリウム2g/l、システイン-HCl 0.5g/l、MgSO4 (x7水溶液) 0.2g/l、MnSO4 (x4水溶液)0.1g/l、FeSO4(x7水溶液)0.05g/l、Tween 80 1ml、および3N KOHを用いてpHを5.4に補正)で25-35℃で24時間増殖を行った後、培養上清を(スクロースが消費された後に)回収し、遠心分離(10分間、1000g、4℃)して、菌体を除去した。
【００７５】
次に、氷冷エタノール1容を加えた。4℃で15時間攪拌し、冷却した後、沈澱した細胞外多糖類を遠心分離(30分間、15000g, 4℃)によって回収した。
【００７６】
沈澱を蒸留水に溶解し、再度回収し、上清にエタノール1容を加えた(4℃で15時間保管)。遠心分離(27000 x g、25分間)の後、沈澱を蒸留水に溶解し、脱イオン水に対して2日間透析し(分子量カットオフ12000-14000Da)、凍結乾燥した。
【００７７】
例4  本発明によるレバンの調製
本発明によるレバンのもう一つの調製方法は、下記の通りである。
レバンを、酵素レバン-スクラーゼによって合成する。酵素は細胞表面タンパク質であることが分かった。レバン-スクラーゼ活性は、細胞表面と会合していることが分かった。1%グルコースおよび1%スクロースを含む培地で増殖した後、菌体を遠心分離によって回収し、食塩溶液で洗浄し、50mM酢酸Na、200mMスクロースおよび50mg/l CaCl2、2H2O、アジド0.1%、pH5.2中で25℃-37℃の温度でインキュベーションした。24時間後、菌体を遠心分離によって分離した。上清を上記の氷冷エタノールで沈澱させ、不溶性ペレットを蒸留水に溶解した。水に対して透析を徹底的に行った後、多糖類を含む溶液を0.5N TFAで50℃にて30分間加水分解した。フルクトースのみが、単糖類として見出された。この実験は、レバンを、菌体ペレットを用いてスクロースのみを含む緩衝液中で合成することができることを示している。
【００７８】
菌体の増殖に対する温度、および酢酸緩衝液中での多糖類の合成に対する温度の影響を検討した。表は、25℃で増殖した菌体について最良のレバン生成が得られたことを示している。
【００７９】
表:  菌体の増殖に対する温度、および酢酸緩衝液中での多糖類の合成に対する温度の影響(試料を10倍に希釈した後、フェノール/硫酸分析法による485nmでの吸光度)
【表２】
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【００８０】
例5  乳製品におけるL. sanfranciscensis菌株の使用
本発明による菌株 L. sanfranciscensis CNCM I-2588、CNCM I-2589またはCNCM I-2613を用いて、醗酵ヨーグルト様乳製品を製造する。
【００８１】
これを行うため、脂肪2.8%を含み脱脂粉乳2%およびスクロース6%を補足した乳製品1lを調製し、これを96℃で30分間殺菌した後、温度を42℃まで下げる。Streptococcus thermophilusの非濃厚化(non-thickening)菌株および非粘着性(non-viscous)菌株Lactobacillus bulgaricusの前培養物を、再構成粉乳10%および市販酵母エキス0.1%を含む滅菌したMSK培地で再活性化する。
【００８２】
L. sanfranciscensisの菌株の前培養物も、上記で定義した規定培地で、次いで再構成粉乳10%、および1%スクロースを含む市販酵母エキス0.1%を含む滅菌したMSK培地で再活性化する。次に、滅菌乳製品にこれらの再活性化前培養物のそれぞれ1%を接種した後、この乳製品を、pHが4.5の値に到達するまで32℃で醗酵させる。
【００８３】
醗酵乳のヨーグルト様生成物をこのやり方で生成し、4℃で保管する。 L. sanfranciscensisの菌株を用いて調製したこれらの発酵乳のヨーグルト様生成物は、特に4℃で10日間保管した後には、滑らかな舌触りで快い風味がある。更に、このレバンは、プレビオティクの可能性を有する。
【００８４】
例6  乳児用フォーミュラにおけるプレビオティクとしてのL. sanfranciscensis菌株由来のレバンの使用
フォーミュラ100gに対して、ペプチド5-20%、好ましくは10%、脂肪2-40%、好ましくは20%、非レバン炭水化物(ラクトース65%、マルトデキストリン20%、澱粉15%を含む)10-60%、好ましくは40%、および(例3に準じて調製した)レバン1-10%、好ましくは3%、一日必要量に見合う微量のビタミンおよびオリゴ成分(oligoelements)、およびミネラル0.1-5%、好ましくは1.5%の乾燥乳児用フォーミュラで用いられる乾燥混合物を調製した。
【００８５】
例7  L. sanfranciscensis由来のレバンを含む乳児用フォーミュラ
乳児用フォーミュラを得るため、フォーミュラ100mlに対して、ペプチド0.5-5%、好ましくは2%、脂肪0.2-10%、好ましくは4%、非レバン炭水化物(ラクトース65%、マルトデキストリン20%、澱粉15%を含む)1-25%、好ましくは8%、および(例3に準じて調製した)レバン0.5-20%、好ましくは5%、一日必要量に見合う微量のビタミンおよびオリゴ成分(oligoelements)、およびミネラル0.01-2%、好ましくは0.3%、および水50-90%、好ましくは75%を含む混合物を調製した。
【００８６】
例8  醗酵穀物を基剤とする飲料
下記の成分を熱処理に適する容器で混合した(部はキログラムで表した): 19.8米粉末、15.0小麦粉、13.9オート麦フレーク、24.3スクロース、1.5酵母エキス、および850水。
【００８７】
次に、上記混合物に水蒸気を吹き込んで温度を130℃とし、更にこの温度で1分間保持し、最後に約32℃で冷却した。次に、生成するスラリーを醗酵槽に移した後、L. sanfranciscensis菌株CNCM I-2588, CNCM I-2589またはCNCM I-2613の1菌株を接種し、スラリー中の菌体濃度約1-5x106cfu/mlを得た。
【００８８】
醗酵が32℃で8時間起こり、酸性化した醗酵穀物ベースを生じた。醗酵穀物ベースは、4℃で1週間まで保管した後使用することができ、または長期保存のために低温殺菌/滅菌することができる。
【００８９】
例9  L. sanfranciscensis菌株を含むペットフード
飼料混合物を、トウモロコシ、トウモロコシグルテン、鶏肉および魚肉、塩、ビタミン、およびミネラルから作製した。予備調整装置から出る加湿飼料を、次に押出機-加熱調理器に入れ、ゼラチン化する。押出機から出てくるゼラチン化マトリックスをダイに押し込み、押し出した。ダイヘッドから出てくる押出物を犬に与えるのに適当な小片に切断し、約110℃で約20分間乾燥し、冷却してペレットを形成した。このペレットの生成水活性は、約0.6である。
【００９０】
ペレットに、獣脂を含んでなるコーティング基剤を噴霧する。標準的コーティングに加えて、L. sanfranciscensis菌株 CNCM I-2588、CNCM I-2613またはCNCM I-2589によって生成したレバン(例3に準じて調製)を含む乾燥して濃縮した粉末をペレットに0.1-20%、好ましくは0.5-5%の割合でコーティングする。
【００９１】
従って、これによって得た乾燥ドッグフードは、特にペットにレバンのプレビオティク供給源を提供し、例えば、消化管の微生物叢の組成または皮膚およびコーティング条件などを改良しようとするものである。
【００９２】
例10  L. sanfranciscensis由来のレバンを含む湿潤ペットフード
鶏肉断片、ブタ肺および牛肉肝臓(挽肉)73%、小麦粉16%、水7%、色素、香味料、ビタミン、および無機塩2%から、混合物を調製する。この混合物を12℃で乳化し、プリンの形態で押し出し、次にこれを90℃の温度で加熱する。これを30℃まで冷却し、厚く切断する。厚切り物45%を、水98%、色素1%、およびL. sanfranciscensis CNCM I-2588、CNCM I-2589またはCNCM I-2613によって生成した多糖類レバン1%から調製し且つ例3に準じてプレビオティク特性を有する増粘剤として調製したソース55%と混合する。ブリキ缶に入れ、125℃で40分間滅菌する。
【００９３】
例11  醗酵穀物ベースの乳児用フォーミュラ
小麦、米またはトウモロコシの花、またはそれらと水の混合物（乾燥分含量が20-60%、好ましくは30-50%、更に一層好ましくは35-45%）に、L. sanfranciscenss菌株 CNCM I-2588、CNCM I-2589またはCNCM I-2613の菌株を接種して、約1-5 x 10E+06 cfu/mlのスラリー中の菌体濃度を得る。醗酵を、32℃で10時間行う。(複数の)菌株の増殖中に、レバンがイン・シテューで生成する。醗酵して酸性化した花を、次に水蒸気吹き込み(120-140℃)によって滅菌し、ローラー乾燥(120-140℃)または押出加熱(140-180℃)によって乾燥し、プレビオティクエキソ多糖類レバンを強化した乳児用フォーミュラを生成した。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】残基文字コード(A-C)によって同定された単糖類単位を有するL. sanfansciscensis CNCM 1-2588によって産生したレバンの構造。
【図２】（上）600MHzおよび67℃で2H2O中で記録したL. sanfransciscensis CNCM I-2588によって産生したレバンの1D 1H NMRスペクトル。総てのβ-D-Fruf共鳴は、相当する残基文字コードおよび数によって同定される。（下）L. sanfransciscensis CNCM I-2588によって産生したレバンのPEP-HSQCスペクトル。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004522431.tif 000035
【国際調査報告】
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