(57)【要約】本発明は、非メチル化ＣｐＧモチーフであるかもしれない１つ以上のＣｐＧモチーフを最適にコードしている、免疫刺激鎖内ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドオリゴヌクレオチド（ＨＤＲ）に関連した免疫学的組成物および方法を提供する。単独または１つ以上の標的抗原と関連したこれらの化合物の投与は、先天性のおよび抗原特異的な免疫を促進する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ領域およびＤＮＡ領域の両方を含有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む免疫刺激組成物であって、該オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの末端がＲＮＡを含む、上記組成物。
【請求項２】
ＤＮＡ領域が少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
ＤＮＡ領域が少なくとも１つのＣｐＧ配列を含む、請求項２記載の組成物。
【請求項４】
両方の末端が少なくとも１つのＲＮＡヌクレオチドを含む、請求項２記載の組成物。
【請求項５】
少なくとも１つの末端がポリＡ ＲＮＡを含む、請求項３記載の組成物。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドの少なくとも２ヌクレオチドの間の結合がリン酸塩主鎖の修飾を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項７】
修飾がホスホロチオエート修飾である、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
少なくとも第１オリゴヌクレオチドおよび第２オリゴヌクレオチドを含む免疫刺激組成物であって、各オリゴヌクレオチドが少なくとも１つのＲＮＡ領域と少なくとも１つのＤＮＡ領域とを含有し、かつ、それぞれの少なくとも１つの末端がＲＮＡを含む、上記組成物。
【請求項９】
各オリゴヌクレオチドが異なる免疫刺激プロフィールを誘導する、請求項８記載の免疫刺激組成物。
【請求項１０】
ＲＮＡ領域およびＤＮＡ領域の両方を含有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含むアジュバントであって、該オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの末端がＲＮＡを含む、上記アジュバント。
【請求項１１】
ＲＮＡ領域およびＤＮＡ領域の両方を含有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含むワクチンであって、該オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの末端がＲＮＡを含んでおり、かつ該オリゴヌクレオチドが生理学的担体または送達システムを伴っている、上記ワクチン。
【請求項１２】
生理学的担体または送達システムを伴っている少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを投与することを含む先天性免疫を活性化する方法であって、該オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ領域およびＤＮＡ領域の両方を含有し、かつその少なくとも１つの末端がＲＮＡを含む、上記方法。
【請求項１３】
生理学的担体または送達システムを伴っている少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを投与することを含む全免疫を活性化する方法であって、該オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ領域およびＤＮＡ領域の両方を含有し、かつその少なくとも１つの末端がＲＮＡを含む、上記方法。
【請求項１４】
以下の
１）  ＲＮＡ領域およびＤＮＡ領域の両方を含有し、少なくとも１つの末端がＲＮＡを含んでいる、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、および、
２）  少なくとも１つの標的抗原
を含む、ワクチン。
【請求項１５】
以下の
１）  ＲＮＡ領域およびＤＮＡ領域の両方を含有し、少なくとも１つの末端がＲＮＡを含んでいる、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、および、
２）  少なくとも１つの標的抗原
を、投与することを含む、細胞性免疫応答を活性化する方法。
【請求項１６】
以下の
１）  ＲＮＡ領域およびＤＮＡ領域の両方を含有し、少なくとも１つの末端がＲＮＡを含んでいる、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、および、
２）  少なくとも１つの標的抗原
を、投与することを含む、体液性免疫応答を活性化する方法。
【請求項１７】
以下の
１）  ＲＮＡ領域およびＤＮＡ領域の両方を含有し、少なくとも１つの末端がＲＮＡを含んでいる、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、および、
２）  生理学的担体または送達システム
を、組合わせることを含む、ワクチンを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０００年６月７日に出願された米国仮出願第６０／２０９，７９７号に基づき、その優先権は３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づいて主張され、その開示全体は参照により組み入れる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、免疫刺激ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドオリゴヌクレオチド、および免疫応答の増強またはサイトカインの誘導におけるそれらの使用に関する。本発明は更に、ＣｐＧジヌクレオチドを含むＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドオリゴヌクレオチドを含む新規のアジュバントシステムに関する。該ＣｐＧジヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドであってもよく、高分子量多糖類もしくは他の多価担体に結合されていてもよい。
【０００３】
発明の背景
免疫刺激分子としての核酸の使用は最近受け入れられるようになった。核酸の免疫反応性の特性は、それらの塩基組成、修飾およびらせん配向性によって決定される。例えば、細胞ＤＮＡに対する体液性免疫応答は、実験動物において顕著な抗体応答を誘導することができるＺ−ＤＮＡなどの通常の構造とは異なるＤＮＡ構造が関係している。ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＲＮＡ：ＤＮＡ鎖間ハイブリッドを含む二本鎖核酸はすべて、体液性免疫応答を引き起こす可能性を有する（ＥｌｉａｔおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３１：１３７７ （１９９４））。実際に、細胞ＤＮＡに対する抗体は、長らく、自己免疫症状の全身性紅斑性狼瘡に関与しているとみなされてきた。
【０００４】
また、時に「ＣｐＧ ＯＤＮｓ」（ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド）と呼ばれる、いくらかの非メチル化ＣｐＧ配列を含むＤＮＡ配列は、免疫系において高い細胞刺激性を持ち、活発な増殖およびＢ細胞による免疫グロブリン（Ｉｇ）産生を誘導することができる（一般的には、Ｋｌｉｎｍａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ １７：１９ （１９９９）；ならびにＭｃＣｌｕｓｋｉｅおよびＤａｖｉｓ、Ｊ． Ｉｍｍｕｎ． １６１： ４４６３ （１９９８）を参照のこと、これらは各々参照により本明細書に完全に組み入れられる）。興味深いことに、これらの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドは、細菌およびウイルスのゲノムにおいて脊椎動物よりはるかに高頻度に存在し、細菌およびウイルスに対する脊椎動物の先天性免疫応答に寄与し得る（Ｋｌｉｎｍａｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３： ２８７９ （１９９６）；Ｙｉら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎ． １５７：５３９４ （１９９６）；Ｈｕａ Ｌｉａｎｇら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９８：１１１９ （１９９６）；Ｋｒｉｅｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３７４：５４６ （１９９５）、これらは各々参照により本明細書に完全に組み入れられる）。
【０００５】
ＣｐＧ ＤＮＡに対する関心が持たれ始めて以来、考えられ得る作用機構に研究の焦点が当てられた。マウスでは、ＣｐＧ ＤＮＡはほとんどすべての（＞９５％）Ｂ細胞において増殖を誘導する。これらのオリゴヌクレオチドは、イムノグロブリン（Ｉｇ）分泌を促進し、Ｂ細胞からのＩＬ−６の分泌を増加させることによって作用し得る。このＣｐＧ ＤＮＡによるＢ細胞活性化は、Ｔ細胞非依存性かつ抗原非特異的である。Ｂ細胞へのこの直接的な効果に加えて、ＣｐＧ ＤＮＡはまた、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＧＭＣ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＣＳＦおよびインターフェロンを含む様々なサイトカインを分泌する単球、マクロファージおよび樹状細胞をも直接活性化する。これらのサイトカインは、γ−インターフェロン（ＩＦＮ−γ）を分泌するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を活性化し、溶菌活性を増加させる。これらの態様を網羅する出願の例は、国際特許出願第ＷＯ ９５／２６２０４、ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ ９８／１１２１１、ＷＯ ９８／１８８１０、ＷＯ ９８／３７９１９、ＷＯ ９８／４０１００、ＷＯ ９８／５２５８１号およびＰＣＴ／ＵＳ９８／０４７７０３；あるいは米国特許第５，６６３，１５３号に見いだすことができ、これら各々は参照により本明細書に全文を組み入れれる。
【０００６】
上記の所見を考慮して、オリゴヌクレオチド、特に様々な形でＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドは、ワクチンアジュバントまたは広範な免疫応答の活性化剤としてしばしば示唆されている。「細菌のＣｐＧ−ＤＮＡの免疫生物学」（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＣｐＧ−ＤＮＡ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， ２０００， Ｈ． Ｗａｇｎｅｒ編）に概説されている（これは参照により本明細書に全文を組み入れる）。実際、このようなオリゴヌクレオチドは幾分効果的であるが、完全にＤＮＡまたはＤＮＡ類似体から構築されている。例えば上記で引用された「細菌のＣｐＧ−ＤＮＡの免疫生物学」（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＣｐＧ−ＤＮＡ）中のＫｒｅｉｇらを参照。
【０００７】
ＣｐＧを含むＤＮＡに加えて、多数の他のポリヌクレオチドが生物学的な反応修飾因子とみなされている。おそらく、その最良の例は、マクロファージ活性化因子およびＮＫ活性の誘導因子としてのみならず、インターフェロン（ＩＦＮ）産生の強力な誘導因子となるポリ（Ｉ，Ｃ）である。その強力なｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗腫瘍活性は、（ＲＮＡｓｅによる分解を減少させるために）ポリ−Ｌ−リジンおよびカルボキシメチルセルロースと複合体を形成させたポリ（Ｉ，Ｃ）を用いたいくつかの臨床試験につながった。（Ｔａｌｍａｄｇｅら、Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓ． ４５：１０５８ （１９８５）；Ｗｉｌｔｒｏｕｔら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｓｐ． Ｍｏｄ． ４：５１２ （１９８５） Ｋｒｏｗｎ、Ｓｅｍ． Ｏｎｃｏｌ． １３：２０７ （１９８６）；およびＥｗｅｌら、Ｃａｎｃ． Ｒｅｓ． ５２：３００５ （１９９２））。ＣｐＧ性のオリゴヌクレオチドとは対照的に、デオキシリボース性のポリ（Ｉ， Ｃ）は効果を持たなかったので、ポリ（Ｉ， Ｃ）の免疫刺激効果は、これらの塩基のリボース糖に基づく型に特異的であると思われる。それにも関わらず、有毒な副作用が、今までポリ（Ｉ， Ｃ）が有用な治療薬になることを妨げてきた。対照的に、ＣｐＧに基づく組成物は、有用な抗癌治療法、アジュバントおよびサイトカイン分泌プロフィールの修飾因子を提供しうる。
【０００８】
従って、全体的および特異的な免疫応答の両方を最適に誘導し、かつＴ細胞依存的なまたはＢ細胞依存的な応答および／または特異的にＴｈ１もしくはＴｈ２応答を誘導する能力を支配し得る免疫刺激オリゴヌクレオチドの必要性がある。更に、ワクチンのアジュバントとして、および疾患の治療においてこれらのオリゴヌクレオチドを利用する方法の必要性がある。
【０００９】
発明の概要
本発明者らは、ＲＮＡおよびＤＮＡの鎖内ハイブリッドを有し、場合によっては１つ以上のＣｐＧモチーフをコードするオリゴヌクレオチドが、全体的および抗原特異的な免疫の非常に有効な活性化を提供することから、これらの必要性に答えることを発見した。本発明のこれらおよび他の利点は、更なる発明の特徴と同様に、本明細書で提供される発明の説明から明らかになるであろう。
【００１０】
発明の詳細な説明
上述のように、単にＤＮＡおよびＤＮＡ誘導体のみに基づくオリゴヌクレオチド配列は、免疫刺激活性を示す。対照的に、本発明の免疫原性のあるいは免疫療法の組成物および方法は、新規のハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＨＤＲ）に関する。驚くべきことに、これらのハイブリッドオリゴヌクレオチド配列は、異なる免疫刺激の特徴を示し、一部の態様においては、単にＤＮＡのみに基づくものより、優れた免疫刺激の特徴を示す。これは、特にＲＮＡ性分子の作用しにくさ（ｉｎｏｐｅｒａｂｉｌｉｔｙ）の観点から驚くべきことである。実際、ＲＮＡに基づく成功した免疫修飾因子の報告は１つもない。
【００１１】
本ＨＤＲにおけるリボースおよびデオキシリボースヌクレオチドの混成主鎖は、既知の免疫刺激オリゴヌクレオチド組成物に対して有効な代替物を提供する。更に、一般的なＣｐＧポリヌクレオチド処方と比較して、本発明のＨＤＲは、様々なＴ細胞依存性の応用例において活性の増加を実証し、Ｂ細胞および他の種類の細胞からより明確なサイトカイン産生プロフィールを誘導し、Ｔ細胞非依存性免疫の効果的な活性化因子となる。
【００１２】
本発明のいずれの特定の理論にも制限されることなく、免疫系の細胞によって産生される促進性および抑制性サイトカインの量（ｑｕａｎｔｉｔｙ ａｎｄ ａｍｏｕｎｔ）を変化させることによって、本発明のＨＤＲが直接または間接的に免疫系の細胞に影響すると、現在のところ考えられている。これらのＨＤＲ感受性細胞は、マクロファージ、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ならびに後天性および先天性の免疫の両方に関与している樹状細胞を含む（Ｉｖａｎ Ｒｏｉｔ、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第８版。１９９４）において詳細に論述される。これは、参照により本明細書に完全に組み入れられる）。更に、本発明の目的のために、全体的免疫とは、患者の免疫応答、および不適当に提示された内在性の抗原を含む任意の外来の実体に対する効果的防御を起こすその能力の全体的な感受性を指す。
【００１３】
後天性免疫は、外来性の（例えばアレルゲン、病原体、移植された組織）および自己由来の（例えば腫瘍抗原、自己抗原）両方の抗原による抗原性の惹起に対する宿主の応答から成り、好ましくは記憶応答と関連する。後天性免疫は、細胞性免疫（例えば細胞傷害活性）および体液性免疫（結果として抗体の産生を誘導する）の両方を包含し、一般的にＴ細胞およびＮＫ細胞による調節に依存する。
【００１４】
Ｔ細胞は後天性免疫の多くの態様において中心的役割を果たし、様々な調節および防御機能を行う。あるＴ細胞が感染したまたは癌細胞と遭遇した場合、それらはそれを外来物として認識し、細胞を介した免疫応答の一部として宿主自身の細胞を殺す、キラー細胞として作用することによって応答する。ヘルパーＴ細胞と呼ばれる他のＴ細胞は、Ｂ細胞が抗体を産生するように促進することにより、または、体液性もしくは細胞性免疫応答の特定の態様を抑制することにより、外来の抗原を感知するために反応する。
【００１５】
Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）は、サイトカインの産生を介して免疫応答の多くを統合する。一般的にＣＤ４細胞表面標識を有するものとして定義可能であるが、これらの細胞は、それらが生産するサイトカインのプロフィールおよびそれらが免疫系の他の細胞に与える影響に従って、機能上Ｔｈ１またはＴｈ２の群に分類される。
【００１６】
Ｔｈ１細胞は、Ｔ細胞抗原受容体と呼ばれる認識システムを介して、侵入した病原体または癌化した宿主細胞を検出する。細胞性免疫と呼ばれるＴｈ１が関与する過程は、一般的に非Ｂ細胞の活性化を伴い、しばしばＩＦＮ−γの生産によって特徴づけられる。Ｔｈ１システムは本質的には体液性抗体の生産とは別個であるが、それにも関わらず、Ｔｈ１サイトカインはＩｇＧ２ａアイソタイプへの免疫グロブリンクラススイッチングを促進する。
【００１７】
外来の抗原の検出によって、大部分の成熟したＴｈ１細胞は、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、高レベルのＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳの放出を誘導する。これらのサイトカインは、遅延型過敏症および一般的な細胞性免疫を促進する。例えば、ＩＬ−２は、最初に検出された特定の抗原に対して感受性を持つ更なるＴ細胞のクローンの産生を促進するＴ細胞増殖因子である。感作されたＴ細胞は、抗原を含む細胞または病原体に付着し攻撃する。
【００１８】
対照的に、成熟したＴｈ２細胞は、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳＦおよび低レベルのＴＮＦ−αの分泌を促進する傾向がある。更に、Ｔｈ２応答は、Ｂ細胞の活性化、抗体産生および分泌の刺激、あるいはＩｇＡ、ＩｇＧ１およびＩｇＥアイソタイプへのクラススイッチングの誘導によって、体液性免疫を促進する。
【００１９】
自然状態では、体液性または全身性の免疫応答を引き起こすＢ細胞の活性化は、特異的な抗原を認識するＢ細胞の能力に依存する。Ｂ細胞は、免疫グロブリンまたは抗体と呼ばれるそれらの細胞表面上の特異的な受容体を介して抗原を認識する。ある抗原がＢ細胞の受容体部位に付着した場合、Ｂ細胞は活性化され、娘細胞を形成するために分裂する。例えば細菌の多糖類のようなＴ細胞非依存性抗原の場合、Ｂ細胞活性化は、あるとしてもわずかなクラススイッチングまたは記憶反応によって特徴づけられる低レベルの応答しか生じない。対照的に、Ｔ細胞依存性抗原はＢ細胞とＴｈ２細胞との両方の受容体を刺激し、その結果、活発で複雑な体液性免疫応答を生じる。具体的には、刺激されたＴｈ２細胞によって産生されるＩＬ−６のようなサイトカインは、Ｂ細胞に成熟および抗体産生を引き起こす。成熟は、初期のＩｇＭアイソタイプからのクラススイッチング、記憶細胞の産生、および高い親和性の抗原結合特異性の選択を包含する。
【００２０】
Ｔｈ１およびＴｈ２−型サイトカインはまたＴｈ群自身にも影響を及ぼす。例えば、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γはＴｈ１応答をアップレギュレートするが、Ｔｈ２細胞をダウンレギュレートする。ＩＬ−１２自体はＩＦＮ−γ産生を促進し、Ｔｈ１細胞によるＩＬ−１２産生に対してポジティブフィードバックを提供する。更に、ＮＫ細胞もまた、ＩＦＮ−γを分泌することによってＴｈ１およびＴｈ２免疫を制御する。ＩＦＮ−γを分泌するＮＫ細胞のためのシグナルは、抗原に応答して抗原提示細胞から放出されるサイトカインによって促進されうるが、また本発明のＨＤＲの添加によっても直接または間接的に促進されうる。
【００２１】
その機構に関わらず、本発明のＨＤＲは、Ｔｈ１調節、Ｔｈ２ Ｔ調節、またはこれらの両方の特徴を持つ、すなわち、これらの体液性および細胞性免疫の両方を刺激する効果を示すサイトカインの産生を刺激することができる。
【００２２】
更に、あるタイプの免疫応答のアップレギュレートが他のタイプの免疫応答をダウンレギュレートしうるため、あるタイプの免疫応答の誘導は免疫の制御を可能にするかもしれない。この免疫の制御は、本発明の免疫源組成物を投与した場合の免疫応答のタイプをカスタマイズまたは調整することを可能にするかもしれない。
【００２３】
更に、免疫応答の特定の側面を支持する（または、減少させる）ためのサイトカインの使用に関する当技術分野の豊富な知識を考えると、本発明のＨＤＲは１つ以上のサイトカインとともに投与されうる。従って、１つ以上のサイトカインまたはサイトカインの活性部分は、直接、可溶性因子、コンジュゲートまたは抗原もしくは他のサイトカインとの融合タンパク質として、或いは、間接的に１つ以上のサイトカイン活性をコードしている核酸として、免疫の活性化を必要とする患者に投与されるかもしれない。例えば、ＭｏｎｄおよびＳｎａｐｐｅｒの米国特許第５，８７４，０８５号（参照により本明細書に完全に組み入れられる）で公開された組成物および方法は、Ｔｈ２応答を促進するだけでなく、主にＩｇＡ抗体へのアイソタイプスイッチングを誘導するために、本発明のＨＤＲとともに投与されてもよい。
【００２４】
同様に、ＨＤＲを介した応答のうち体液性の部分は、係属中の米国出願第０８／５６８，３４３号（参照により本明細書に完全に組み入れられる）で教示されるように、ＨＤＲが抗原、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−２とともに投与される場合、主にＩｇＧ１反応を包含するかもしれない。更に、本発明のＨＤＲは、一般的にＩｇＥアイソタイプ以外のアイソタイプへのクラススイッチングを促進する。その結果、アレルゲンを伴うＨＤＲの投与は、アレルギー反応を改善または予防するかもしれない。アレルゲンは、本発明のＨＤＲとともに投与されてもよく、または、ＨＤＲが投与されている生物の環境内に存在してもよい。
【００２５】
後天性免疫を形成および増強させるための上述の方法に加えて、本発明のＨＤＲはまた先天性免疫の効果の増加を促進しうる。本明細書で用いられるように、先天性免疫は、本来、抗原との事前の接触に依存しない免疫系におけるあらゆる効果である。最も広義には、これは、例えば未感作もしくは休止状態のＢ、Ｔ、ＮＫ、または抗原提示細胞の数を増加させることによって、或いは、その後の刺激に対するそれらの感受性を増加させることによって、抗原が存在しない状態での後天性免疫システムを準備することを含む。
【００２６】
先天性免疫は更に、ＴまたはＢリンパ球に直接依存していない免疫系の部分を包含する。マクロファージ、好中球および単球は、先天性免疫にとって重要なエフェクター細胞である。例えば、マクロファージは、活性酸素中間体およびサイトカインＴＮＦの産生を介して、一部では、固形腫瘍の破壊に重要な役割を果たす。外来の抗原を持つ細胞を破壊するマクロファージの能力は、この細胞型を誘引または活性化する他のサイトカインによって増強される。例えば、ＮＫ細胞は、外来の抗原を持つ細胞を破壊するマクロファージを誘引または活性化するサイトカインを提供することによって、後天性と先天性応答との間に重要な連結を提供しうる。ＣｐＧを含むＯＤＮとの類似によって、ＨＤＲはＩＬ−１２に対するＮＫ細胞の感受性を増加させるかもしれず、その結果、ＮＫ細胞群からＩＦＮ−γのようなサイトカインの放出の増加を引き起こすかもしれない。代わりに、または、更に、ＨＤＲは最初にＮＫ細胞に作用するサイトカインを放出する抗原提示細胞（主にマクロファージおよび樹状細胞）に作用するかもしれない。
【００２７】
根本的な機構に関わらず、宿主への本発明のＨＤＲの投与は、病原体の侵入および癌細胞の両方に対する先天性免疫防御を促進することができる。
【００２８】
ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチド
本発明は、少なくとも約９ヌクレオチドの長さの合成ＨＤＲ分子を提供するが、それは約１０から２０、２０〜５０、５０〜１００またはそれ以上の長さのヌクレオチドであるかもしれず、それらの範囲内に包含される任意の値を含む。細胞内への取り込みを容易にするために、４０ヌクレオチド未満が有利であるかもしれない。免疫刺激ポリヌクレオチドの各々はＲＮＡおよびＤＮＡ塩基の両方を含み、それは修飾ポリヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含んでもよい。ＨＤＲは一本鎖であってもよいが、また、二本鎖、部分的二本鎖、および自己相補的ヘアピン構造をも包含する。
【００２９】
ある実施形態では、ＨＤＲは５’ ＤＮＡ部分および３’ ＲＮＡ部分を包含し、別の実施形態では、２つの部分の位置は逆転している。単一のＨＤＲは、複数のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ部分を含んでもよい。ある実施形態では、ＤＮＡ部分はＲＮＡ部分と隣接している。各ＤＮＡ部分は、少なくとも１つのヌクレオチドを含むが、デオキシリボースリン酸塩バックボーンまたはその修飾体を有する約２から５、５から１０、１０から２０、２０から５０またはそれ以上のヌクレオチドであり、列挙された範囲内に包含される任意の値を含みうる。
【００３０】
ＨＤＲの各ＲＮＡ部分は、少なくとも１つのヌクレオチドを含むが、リボースリン酸塩バックボーンまたはその修飾体を有する約２から６、６から１０、１０から２０、２０から５０またはそれ以上のヌクレオチドであり、列挙された範囲内に包含される任意の値を含みうる。ＲＮＡ部分は、例えばプリン塩基の連続のような、（全部または一部にＣｐＧ配列を含む塩基配列を持つ）任意の塩基配列でありうる。塩基は、（これらの塩基がリボース糖に結合された場合）本質的に均一な組成、例えば、ポリアデニン（ｐｏｌｙ Ａ）、ポリウラシル（ｐｏｌｙ Ｕ）、ポリグアニン（ｐｏｌｙ Ｇ）、ポリシトシン（ｐｏｌｙ Ｃ）およびボリイノシンまたはポリチミジンでもよい。
【００３１】
相補的な連続のヌクレオチド、例えばｐｏｌｙ Ａおよびｐｏｌｙ Ｕ、またはｐｏｌｙ Ｇおよびｐｏｌｙ Ｃは、二本鎖ハイブリッドが企図される場合に好まれる。
【００３２】
ＨＤＲの全長に関わらず、ＤＮＡに対するＲＮＡの最適の比率は、経験的に決定されうる。約５、１０、１５、２０、２５、５０、または、７５％以上のＤＮＡであっても許容されうるが、一部の実施形態では、最終的なＲＮＡ部分は本発明の効力に悪影響を及ぼすことなく実質的にＤＮＡ部分より大きくなりうることが、現在信じられている。他の実施形態では、最終的なＲＮＡ部分はＤＮＡ部分より実質的に小さいかもしれない。
【００３３】
ＤＮＡ部分の最適な配列は経験的に決定されうるが、ＨＤＲの少なくとも一部分は、ＣｐＧ配列であるかもしれない少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含み、ＤＮＡから成るかもしれない。「ＣｐＧジヌクレオチド」とは、（５’から３’への方向で）シトシンに続いてグアニンを持ち、リン酸結合によってつながれた核酸配列を指す。ある実施形態では、シトシンのピリミジン環は脱メチル化される。それにも関わらず、メチル化シトシンを持つＣｐＧモチーフは特定の条件下において効果的な免疫刺激剤となることができ（Ｇｏｅｃｋｅｒｉｔｚら、Ｉｎｔｅｒｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１：１６９３（１９９９）（参照により本明細書に完全に組み入れられる））、従って、本明細書において用いられるＣｐＧモチーフは、必ずしも必要ではないが、脱メチル化シトシンを持つかもしれない。更なる実施形態では、本発明のＨＤＲは、ＲＮＡヌクレオチドによって引き離された、または引き離されていない、複数のＣｐＧモチーフを含むかもしれない。
【００３４】
本明細書において用いられる「ＣｐＧ配列」または「ＣｐＧモチーフ」は、この発明の目的のための更なるＤＮＡ配列、または、免疫刺激効果に寄与するＲＮＡ配列と結合されうるＣｐＧジヌクレオチドを指す。ＣｐＧ配列は当技術分野において既知の技術に従って経験的に決定することができ、それぞれ参照により本明細書に全文を組み入れられた米国特許第６，１９４，３８８、６，００８，２００および５，８５６，４６２号に記載されたような様々な標準的公式に従って決定または設計されうる。本発明のある実施形態では、ＣｐＧジヌクレオチドはＤＮＡから成るが、ＣｐＧ配列の一部または残りすべての塩基はＲＮＡである。代替の実施形態では、１つまたは両方のＣｐＧジヌクレオチドはＲＮＡを包含する。別の実施形態では、ＣｐＧ配列はパリンドロームである。更に別の実施形態では、ＣｐＧ配列はＤＮＡから成り、ＨＤＲのＲＮＡ部分のすべてまたは一部とパリンドロームを形成する。ある実施形態では、ＨＤＲはＣｐＧジヌクレオチドを持つコアＤＮＡヘキサマーを含む。このようなヘキサマーの代表例は、ＧＡＣＧＴＴ、ＴＴＣＧＴＡ、ＴＴＣＧＡＧ、ＡＧＣＧＴＴ、ＣＴＣＧＡＧ、ＴＴＣＧＴＴ、ＡＧＣＧＴＴ、ＡＡＣＧＴＴ、ＡＧＣＧＣＴ、およびＧＴＣＧＧＴを含むが、これに限定されない。ある実施形態では、コアＤＮＡヘキサマーはＲＮＡに隣接している。別の実施形態では、コアＤＮＡヘキサマーは、一方または両側に１から５の間のＤＮＡヌクレオチドが隣接している。これらの隣接したＤＮＡ配列は、ＲＮＡと隣接していてもよい。別の実施形態では、コアヘキサマーの両側に隣接しているＤＮＡ配列は、それ自身パリンドロームである。
【００３５】
ある実施形態では、ＲＮＡは、鋳型を用いた、または鋳型を用いない酵素的重合によって、既存のＤＮＡ配列に付加される。付加されたＲＮＡ部分は、任意の長さでありうる。結果として生じるＲＤＲは、不定の長さをとりうる。ある実施形態では、ＲＮＡは鋳型を用いず行われる酵素的合成によって既存のＣｐＧを含むオリゴヌクレオチドに付加される。付加されるＲＮＡは、ポリＡ、ポリＵまたはポリＩのようなホモポリマーであるかもしれない。
【００３６】
ＨＤＲは、好ましくは、標準的ＣｐＧ配列またはモチーフと関連して生じうる１つ以上のＣｐＧジヌクレオチドを含む。本発明のＨＤＲは、当技術分野において既知のＤＮＡに基づくＣｐＧを含むポリヌクレオチド（ＯＤＮ）と同様の塩基配列を含む、または、部分的に重複し得る。従って、本発明のハイブリッド分子は、完全に単糖主鎖（一般的にはデオキシリボース）で構成されるＣｐＧポリヌクレオチドについて提案される適用例と同じ範囲において有用である。これらの提案された用途は、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＣｐＧ−ＤＮＡ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、２０００， Ｈ． Ｗａｇｎｅｒ 編）で概説され、これは参照により本明細書に全文を組み入れられる。当技術分野において既知のＣｐＧモチーフの公式によれば、ＣｐＧモチーフの塩基配列は公式５’ Ｎ１Ｎ２ＭＴ−ＣｐＧ−ＡＫＮ３Ｎ４ ３’によって表される１つ以上のＣｐＧ配列を含むかもしれない。そこでは、Ｍがシトシンである場合Ｋはグアニンであり、Ｍがアデニンである場合Ｋはチミジンであるという条件付きで、Ｍはアデニンまたはシトシン、Ｋはグアニンまたはチミジン、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３およびＮ４は任意のヌクレオチドである。従って、ＨＤＲは公式５’ Ｎ１Ｎ２ＣＴ−ＣｐＧ−ＡＧＮ３Ｎ４ ３’、または、公式５’ Ｎ１Ｎ２ＡＴ−ＣｐＧ−ＡＴＮ３Ｎ４３’によって表される配列を含むかもしれない。
【００３７】
他の実施形態では、ＷＯ ９８／３７９１９（参照により本明細書に完全に組み入れられる）に記載されたように、ＤＮＡ部分は公式５’ Ｎ１Ｘ１ＣＧＸ２Ｎ２ ３’のヌクレオチドの１つ以上の集合から成る、または、部分的に重複している。これらの実施形態では、少なくとも１つのヌクレオチドが連続的ＣｐＧｓを分離し、そこでは、Ｘ１はアデニン、グアニンまたはチミジン、Ｘ２はシトシンまたはチミン、Ｎは欠如しているか、単一のヌクレオチドまたはヌクレオチドの配列であり得るが、但し、Ｎ１＋Ｎ２は０〜２６塩基である。この実施形態では、Ｎ１およびＮ２がＣＣＧＧ四量体、または、１つ以上のＣＧＧ三量体を含まないことが好ましい。ＤＮＡ部分は、８〜３０塩基の間であることが好ましいが、わずか２〜４塩基であってもよく、好ましくはＣｐＧジヌクレオチドを含んでいる。同様に、ＤＮＡ部分は、式５’ Ｎ１Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４Ｎ２ ３’のヌクレオチドの１つ以上の集合から成るか、または、部分的に重複していてもよい。そこでは、Ｘ１Ｘ２はＧｐＴ、ＧｐＧ、ＧｐＡ、ＡｐＴおよびＡｐＡから成る群から選択され、Ｘ３Ｘ４はＴｐＴまたはＣｐＴである。
【００３８】
コアヘキサマー配列ＣＴＣＧＡＧまたはＮＸが１つ以上のＤＮＡヌクレオチドであるＮＸＣＴＣＧＡＧＮＸを含むＤＮＡ部分は、体液性免疫応答を促進する傾向があり、一方、ＣｐＧ配列ＡＴＣＧＡＴまたはＮＸが１つ以上のＤＮＡヌクレオチドであるＮＸＡＴＣＧＡＴＮＸを含むＤＮＡ部分は細胞を介した免疫応答を促進する傾向がある。ＲＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの組み合わせを含むＣＴＣＧＡＧもしくはＡＴＣＧＡＴヘキサマーを持つＨＤＲもまた、それぞれ体液性および細胞を介した免疫応答を促進する傾向があるかもしれない。
ＨＤＲを設計する場合考慮されるべき更なる要素は、ＨＤＲが用いられる種を含む。例えば、Ｖｅｒｔｈｅｌｙｉら、Ｊ． ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６６：２３７２−７７（２００１）（参照により本明細書に完全に組み入れられる）は、Ｍ１およびＭ２はＡまたはＧであり、Ｎ１およびＮ２はＴまたはＣである公式Ｍ１Ｍ２ＣＧＮ１Ｎ２のＣｐＧ配列がマウスにおいては最適であるが、ヒトにおいては不十分にしか機能しないと思われることを教示する。ヒトにおいてよく機能するとＣｐＧ配列は、Ｍ１およびＭ２はＡまたはＧであり、Ｎ１およびＮ２はＴまたはＣである公式Ｍ１Ｎ１ＣＧＭ２Ｎ２のそれらを含む。これらの指針はまた、上記の公式によって設計された、すなわち、同一もしくは実質的に同一の塩基配列から成るまたはそれを含むが、１つ以上のリボースで置換されたデオキシリボース部分を有するＨＤＲにも適用されうる。
【００３９】
免疫刺激特異性を示すＯＤＮ配列を選択することもまた可能である。Ｖｅｒｔｈｅｌｙｉらは当技術分野において標準的な技術を用いて、「Ｄ」および「Ｋ」で表される２つのクラスのＯＤＮを同定した。Ｄ−クラスＯＤＮは優先的にＮＫ細胞を活性化してＩＦＮ−γを分泌させる一方、Ｋ−クラスＯＤＮは優先的に細胞増殖、ＩＬ−６分泌のための単球およびＢ細胞の活性化、およびＢ細胞によるＩｇＭの生産を促進する。同様のアプローチは、特異的な免疫刺激応答を誘導するＨＤＲを同定するために本発明のＨＤＲに適用できる。
【００４０】
ある非限定的な例では、既知のＯＤＮ配列はデオキシリボース主鎖の部分をリボースに置換するように改変される。別の実施形態では、１つ以上のリボヌクレオチドが既知のＯＤＮ配列の３’または５’末端に付加される。もちろん、更なる実施形態はこの明細書の更なる教示から明らかである。
【００４１】
修飾および類似体
本発明のＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチドは、当技術分野において既知の任意の技術によって、ｄｅ ｎｏｖｏ合成することができる。例えば米国特許第５，９３５，５２７号（参照により本明細書に完全に組み入れられる）に記載されている技術、好ましくは、例えばＨＤＲをエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ消化によるｉｎ ｖｉｖｏでの分解に対して抵抗性を付与する任意の適切な修飾を伴う技術が挙げられる。例えば、各々が参照により本明細書に全文を組み入れられる、国際特許出願第ＷＯ ９５／２６２０４号；米国特許第５，００３，０９７号； Ｓｔｅｉｎら、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６（８）：３２０９−２１（１９８８）；Ｓｔｅｉｎら、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １８８：１１（１９９０）；Ｌｙｅｒら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１２：１２５３−５４ （１９９０）；ならびにＭｅｔｅｌｅｖおよびＡｇｒａｗａｌ、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２００：３４２−３４６（１９９２）で述べられるように、リン酸塩主鎖は、非架橋酸素の１つが硫黄に置換されたホスホロチオエート主鎖修飾によって改変され得る。ホスホロチオエート修飾は、好ましくはいずれかまたは両方の末端において、ポリヌクレオチドの任意の場所に存在させることができ、例えば、少なくとも最後の２つもしくは３つの３’および／または５’ヌクレオチドがホスホロチオエート結合によって連結されることができる。ある実施形態では、ＲＮＡ塩基のすべてがホスホロチオエート結合によって連結され、代替として、ＨＤＲのすべてのヌクレオチドがホスホロチオエート結合によって連結されてもよい。ＨＤＲはまた、分解に対して抵抗性を示すように、二次構造（例えばステムループ構造）を含むよう改変されるかもしれない。
【００４２】
ＨＤＲのＲＮＡおよびＤＮＡ部分の分解に対する感受性を低くする別の修飾は、アセチル−、チオ−あるいは同様なアデニン、シチジン、グアニン、チミンおよびウリジンの修飾型と同様に、イノシンのような従来とは異なる塩基の包含である。他の修飾ヌクレオチドは、アルキルまたはアリルホスホン酸（すなわち、参照により本明細書に完全に組み入れられた米国特許第４，４６９，８６３号において述べられるように、荷電したホスホン酸の酸素がアルキルまたはアリル基に置換される）、ホスホジエステルおよびアルキルホスホトリエステル（すなわち、各々参照により本明細書に完全に組み入れられている米国特許第５，０２３，２４３号および欧州特許第Ｗ０ ０９２ ５７４号において述べられるように、荷電した酸素原子はアルキル化される）のような非イオン性類似体を含む。他のＤＮＡバックボーン修飾および置換を生じさせる方法は、ＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎ、Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．９０：５４４ （１９９０）；あるいはＧｏｏｄｃｈｉｌｄ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． １：１６５（１９９０）に記載され、その各々は参照により本明細書に完全に組み入れられる。
【００４３】
ＨＤＲは、当技術分野でよく知られている技術、例えば、各々参照により本明細書に全文を組み入れられているＳ． Ｓ． Ｗｏｎｇ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ （１９９１）およびＧｒｅｇ Ｔ． Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９９６）に記載されるそれらを用いて、適切な分子にイオン的にまたは共有電子的に結合されるかもしれない。適切な分子には、多糖類、ポリ−Ｌ−リジン、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコール、ハプテン基、ペプチドおよび抗原などの高分子量の分子が含まれる。いずれかもしくは両方の末端にテトラエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコールのようなジオールを含むＨＤＲは、分解に対してより抵抗性を持つかもしれない。様々なカップリング剤または架橋剤、例えばプロテインＡ、カルボジイミドおよびＮ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）が用いられ得る。
【００４４】
医薬組成物
本発明は更に、１つ以上のＨＤＲ配列のみを含む、または、１つ以上の抗原、部分もしくは担体と混合された免疫刺激組成物を提供する。本発明の免疫刺激組成物は、医薬組成物、または、より具体的には、免疫系における生物学的作用を引き起こす免疫学的組成物と考えられ得る。
【００４５】
少なくとも１つのＨＤＲおよび少なくとも１つの抗原を含む免疫刺激組成物は、免疫原性であると考えられ得る。本明細書で用いられるように、抗原はＨＤＲ以外であり、以下の部分の組み合わせを含む。すなわち、１）少なくとも１つのＴ細胞エピトープ、または、２）少なくとも１つの Ｂ細胞エピトープ、または３）少なくとも１つのＴ細胞エピトープおよび少なくとも１つのＢ細胞エピトープである。好ましくは免疫原性組成物は抗原特異的な細胞性または体液性免疫応答を活性化することができ、好ましくは免疫学的記憶によって特徴づけられる。
【００４６】
ある実施形態では、抗原は１つ以上の抗原性ポリペプチドを機能しうる形でコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む。かかる文脈で用いられる場合、「含む」という語は、例えば米国特許第６，１９４，３８９および６，２１４，８０８号に記載されるように、少なくとも１つの抗原性のポリペプチドが少なくとも１つの抗原性ポリペプチドをコードする外来のポリヌクレオチドに作用する宿主細胞の転写および／または翻訳装置によって提供されることを意味する。
【００４７】
ワクチンは好ましくは製薬上許容されうる担体を伴う、すなわち、これに懸濁された、溶解された、混合された、付着された、または埋め込まれた、本発明の免疫刺激組成物から成る。更に、本明細書で用いる場合、ワクチンとは、抗原エピトープの有無に関わらず、任意の予防、改善、緩和または治療の目的で生体に投与するための、１つ以上のＨＤＲ配列を含む免疫刺激組成物を指す。例として、抗原存在下での１つ以上の本発明のＨＤＲは、特異的な体液性および／または細胞性免疫の活性化のためのワクチンを包含するかもしれない。それにも関わらず、抗原非存在下での１つ以上のＨＤＲは、包括的または先天性免疫の刺激のためのワクチンを包含するかもしれない。
【００４８】
本明細書で用いる場合、医薬組成物またはワクチンは少なくとも１つの免疫学的組成物を含み、それは製薬上許容されうる担体または媒体を、溶解させるか、懸濁させるか、または別の方法で伴うかもしれない。その組成物の投与のために任意の製薬上許容されうる担体が使用され得る。適切な製薬担体はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（Ａ． Ｇｅｎｎａｒｏ、編、１９９０）Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．に記載され、それは参照により本明細書に完全に組み入れられる。担体は、水、ポリエチレングリコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、または、石油、動物油、植物油、落花生油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などを含む油等の殺菌した液体であり得る。担体は、ミスト、スプレー、粉末、ワックス、クリーム、座薬、埋没物、塗剤、軟膏、パッチ、湿布、フィルム、または、化粧品の形であり得る。
【００４９】
医薬組成物またはワクチンの適切な剤形は選択する投与経路に依存する。例えば、ボーラス注入または持続注入による静脈内投与では、組成物は水溶性であることが好ましく、生理食塩水は好ましい担体である。経皮性、鼻腔内、経口、胃、膣内、直腸内、または他の粘膜経由の投与のためには、浸透への障壁に対して適切な浸透剤が処方に含められるかもしれず、当技術分野において知られている。経口投与のために、活性成分は、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などに含有させるのために適切な担体と混合されるかもしれない。時間感応性送達システムもまた、本発明の組成物の投与に適用可能である。代表的なシステムは、ポリ（ラクチド配糖体）、コポリシュウ酸、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸およびポリ無水物などのポリマーに基づくシステムを含む。これらおよび同様のポリマーは、当技術分野において既知の方法に従って、例えば参照により本明細書に完全に組み入れられる米国特許第５，０７５，１０９号で教示されるように、マイクロカプセルに処方されるかもしれない。本発明の開示された免疫刺激混合物の投与のために適切な代替の送達システムは、米国特許第６，１９４，３８９、６，０２４，９８３、５，８１７，６３７、６，２２８，６２１、５，８０４，２１２、５，７０９，８７９、５，７０３，０５５、５，６４３，６０５、５，６４３，５７４、５，５８０，５６３、５，２３９，６６０、５，２０４，２５３、４，７４８，０４３、４，６６７，０１４、４，４５２，７７５、３，８５４，４８０および３，８３２，２５２号（各々は参照により本明細書に完全に組み入れられる）において公開されたそれらを含む。
【００５０】
水溶性デキストロースおよびグリセリン溶液はまた、特に注入可能なまたはエアゾール溶液のための液性担体として使用されることもできる。加圧スプレーまたは噴霧器によるのと同様に、エアゾールによる投与のために、適切な高圧ガスは当業者によって理解されるように添加されうる。免疫学的組成物はまた、可溶化剤；乳化剤；安定剤；分散剤；香料添加剤；アジュバント；担体；ブビバカイン、リドカイン、キシロカインなどのような麻酔薬；抗生物質；および既知のもしくは推測される抗ウイルス性、抗菌性、抗寄生虫性または抗腫瘍性化合物とともに処方されるかもしれない。
【００５１】
治療および投与
本発明は、抗原の存在または非存在下で１つ以上の本発明のＨＤＲ配列を含む組成物を投与することによって、免疫の刺激を必要とする患者を治療する方法を包含する。本明細書で用いられるように、治療は、任意の疾患、状況、異常または症状に関して、矯正、回復、改善および予防の方法を包含する。治療は更に、実験動物またはｅｘ ｖｉｖｏにおける免疫応答の誘導または抑制を包含する。
【００５２】
従って、治療は、一般に経口および鼻腔内の投与法、あるいは、静脈内、筋内および皮下注射を含み、また、腹腔内、子宮内、関節内、脳室内、くも膜下、局所、扁桃、粘膜、経皮的、膣内投与および胃管栄養法を含む、通常の当業者によく知られている任意の方法によって、本発明の任意の免疫刺激組成物の免疫刺激量を投与することを含む。
【００５３】
当業者によって認識されているように、適切な投与方法の選択は治療の効果に寄与し、一部の適用法のためには局所投与が好ましいかもしれない。許容されうる局所投与経路は、皮下、皮内、腹腔内、硝子体内、吸入または洗浄、経口、鼻腔内、および所定の組織、器官、間接、腫瘍または細胞塊への有向注入を含む。例えば、粘膜リンパ節もしくはパイエル板への粘膜塗布または注射は、実質的なＩｇＡクラススイッチングを伴う体液性免疫応答を促進しうる。代替として、損傷、病巣もしくは罹患した身体部位を標的とした注入は、充実性腫瘍、局所感染または免疫刺激を必要とする他の部位の治療に適用できるかもしれない。
【００５４】
代替方法として、免疫系の細胞（例えばＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞または希突起膠細胞）は、宿主から取り出され、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて治療されうる。治療された細胞は更に培養され、または、患者または宿主に免疫の活性化を提供するために患者（もしくは異種宿主）に再導入されるかもしれない。例えば、骨髄細胞を患者から吸引し、全体的または特異的な免疫を活性化するためにＨＤＲを用いて治療し得る。その後、患者に残っている免疫細胞を破壊するために、高線量の放射線照射または相当する治療が用いられるかもしれない。再移植によって、自己ＨＤＲ刺激細胞は患者の正常な免疫機能を回復させるであろう。代替として、癌に罹患している患者から分離されたＮＫおよび／またはＴ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて患者の癌に特異的な抗原の存在下で１つ以上のＨＤＲに曝露されるかもしれない。患者への再移植によって、ＨＤＲ刺激細胞は癌細胞に対して活発な細胞性免疫応答を展開するであろう。
【００５５】
免疫刺激量
免疫刺激（有効）量とは、患者において、病原体の攻撃、アレルギーまたは免疫の異常もしくは状態を、予防、改善または治療するために十分な免疫応答を活性化することができるワクチンの量を指す。対象の抗原と共に投与する場合、免疫刺激量は、抗原がＨＤＲ非存在下で投与される場合に得られる反応と比較して、少なくとも１つの抗原のエピトープに対する体液性または細胞性免疫応答のかなりの増加を提供する量である。従って、例えば、免疫刺激量とは、対象の抗原エピトープに対する抗体の生産を促進することができる、または、病原性もしくはアレルギー性のチャレンジに対して検出可能な防御効果を促進することができるＨＤＲを含む組成物の量を指す。
【００５６】
抗原の存在下または非存在下で患者に投与される場合、代替として、免疫刺激量は先天性免疫を活性化する量を意味する。上述のように、先天性免疫は一次および二次抗原性攻撃に反応する免疫系の能力であり、非悪性の腫瘍、悪性の細胞および病原性ウイルスまたは微生物による一次攻撃を監視し、戦う能力を含む。従って、先天性免疫の活性化は、体液性または細胞性免疫応答の活性化のいずれをも包含するが、必ずしも抗原の共投与と関連するわけではない。従って、この状況において、免疫刺激量は、腫瘍の拡大、転移、または病原体感染と関連した罹患率もしくは死亡率を予防或いは減少させるために十分な量である。
【００５７】
本発明のＨＤＲを含む組成物の免疫刺激量を用いた治療は、特に、少なくとも１つの免疫系の細胞またはそれに由来する細胞株から成るｅｘ ｖｉｖｏ組織培養宿主を含む宿主の免疫応答において、効果的な任意の直接的、間接的または統計的に観測可能もしくは測定可能な増加、或いははその他の望ましい変化を包含する。宿主細胞は、ヒトまたは動物の末梢血、リンパ節などに由来するかもしれない。好ましい組織培養宿主は、新たに分離されたＴ細胞、Ｂ細胞マクロファージ、希突起膠細胞、ＮＫ細胞および単球を含み、各々は標準的な技術を用いて分離または精製されうる。観測可能または測定可能な反応は、ＢまたはＴ細胞の増殖もしくは活性化；抗体分泌の増加；アイソタイプスイッチング；サイトカイン放出の増加、特に、１つ以上のＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βまたはＲＡＮＴＥＳの放出の増加；特異的な抗原に対する抗体力価または親和力の増加；病原体感染に関連した罹患率または死亡率の減少；ウィルスの潜伏の促進、誘導、維持または強化；悪性および非悪性の腫瘍の成長、転移、影響の抑制または改善；疾患または疾患の影響からの予防的防御の提供を含む。
【００５８】
免疫応答の抑制が要求される場合、例えば自己免疫疾患またはアレルギーの治療において、有効量はまた、治療されるべき状態または病状と関連した応答において、測定可能または観測可能な減少をもたらすために十分な量を包含する。
【００５９】
免疫スケジュール
投与されるべきＨＤＲを含む組成物の量および投与の頻度は、経験的に決定されることができ、治療される患者の年齢および大きさ、あるいは、扱われる状態または疾患を考慮に入れるであろう。適切な投与量は、マウスでは接種原あたり０．０１から１０００μｇ、０．１から１００μｇ、１から５０μｇの範囲内のＨＤＲであり、挙げられた範囲内に包含される任意の値を含む。その量は、ヒト患者および他のより大きい動物において、特に先天性免疫の包括的活性化が要求される場合、相当高いかもしれない。本発明の組成物は、好ましくは標的抗原非存在下において、経皮拡散、点滴、埋込型ポンプまたは当技術分野において既知の他の適切な送達システムによって、連続的に投与されうる。ＨＤＲが標的抗原とともに投与される場合、標的の許容量は接種原あたり０．０１μｇから１００μｇであるが、より高いおよびより低い量もまた示されうる。二次追加免疫は、１週から数ヶ月後にわたる間隔で投与されうる。
【００６０】
ＨＤＲアジュバントおよびワクチン
好ましい実施形態では、本発明のＨＤＲは、本明細書において標的抗原に対する免疫応答を促進または増強する組成物として定義されるアジュバントを包含する。アジュバントは所望する免疫原性はないが、多くのアジュバントは抗体を誘導する。例えば、コレラ毒素は活発な体液性免疫応答を誘導するが、アジュバントとして標的抗原とともに投与された場合、それはまた標的のエピトープに対する抗体反応の増加を促進する。一方、標的抗原は細胞性および／または体液性免疫応答が要求される抗原である。
【００６１】
従って、アジュバントの特質は、アジュバント分子には存在しない少なくとも１つのエピトープに対して体液性または細胞性応答の増加を促進する能力である。ある実施形態では、このエピトープはワクチンとして投与される標的抗原上に現れているかもしれない。別の実施形態では、先天性免疫を増強するためにＨＤＲを含む組成物が投与される場合、標的抗原は患者に意図的に投与されない病原菌または腫瘍細胞のエピトープを含むかもしれない。後者の実施形態では、本明細書において記述される他の実施形態と同様に、標的が特に既知であるまたは同定されていることは必要とされない。
【００６２】
本発明のアジュバントはすべて、少なくとも１つのＨＤＲ配列を包含する。ある実施形態では、アジュバントは少なくとも１つの標的抗原とともに投与されるが、ＨＤＲは包括的に免疫応答を活性化するため、アジュバントは特異的な抗原との接触の４８時間以内、２４時間以内、または１２時間以内に投与されうる。治療の効果を最大にするために、アジュバントは標的抗原の前または同時に投与されるかもしれない。従って、ＨＤＲは抗原とともに投与されるかもしれず、１つ以上抗原物質と直接または間接的に結合、複合または共有結合されるかもしれない。共有結合のための方法は当技術分野において既知であり、Ｓ．Ｓ． Ｗｏｎｇ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）およびＧｒｅｇ Ｔ． Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）に記載される方法を含み、それらは各々参照により本明細書に完全に組み入れられる。
【００６３】
標的抗原のためのアジュバントとしてＨＤＲが用いられる場合、関心の抗原は、一般的に当技術分野で行われているように、（ミョウバン、完全および不完全フロイントアジュバント、ＬＰＳ、コレラ毒素、リポソーム、ＢＣＧ、ＤＥＴＯＸ、Ｔｉｔｅｒｍａｘ Ｇｏｌｄなどのような）従来のアジュバントとともに投与されるかもしれない。
【００６４】
従って、１つ以上のＨＤＲを含むアジュバントは、標的抗原を含む任意の適切なワクチンの効力を向上させるために用いることができる。適切なワクチンの例は、参照により本明細書に完全に組み入れられているＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（２０００）の第５４版に見られ、ライム病、Ａ、ＢおよびＣ型肝炎、ＨＩＶあるいはマラリアに対するワクチンを含む。
【００６５】
更に、適切な標的抗原は以下を含む。すなわち、
１）  アルブミン、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、百日咳トキソイド、（髄膜炎菌の外膜タンパク質を含む）細菌外膜タンパク質、ＲＳＶ−Ｆタンパク質、マラリア由来ペプチド、Ｂ−ラクトグロブリン Ｂ、アプロチニン、オボアルブミン、リゾチーム、および癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ １５−３、ＣＡ １２５、ＣＡ １９−９、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ならびに参照により本明細書に全文を組込まれる米国特許第５，４７８，５５６号のＴＡＡ複合体などの腫瘍関連抗原等の、ウイルス、細菌、寄生虫、動物あるいは菌類のタンパク質を含むタンパク質、リポタンパク質および糖タンパク質；
２）  フィコール、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、アガロース、ポリアクリルアミドおよび他のアクリル樹脂、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリビニルアルコール、部分的に加水分解されたポリ酢酸ビニル、ポリビニルピロリジン、Ｂ群連鎖球菌および肺炎球菌の莢膜多糖類（タイプＩＩＩを含む）、緑膿菌のムコエキソ多糖類および莢膜多糖類（ｆｉｓｈｅｒタイプＩを含む）ならびにインフルエンザ菌の多糖類（ＰＲＰを含む）などの天然に存在する多糖類および他のポリマーならびに合成の多糖類および他のポリマーを含む炭水化物；
３）  ＴＮＰ、糖類、オリゴ糖類、多糖類、ペプチド、毒素、薬物、化学物質およびアレルゲンなどの低分子量の分子を含むハプテンおよび他の成分；ならびに、
４）  ジフテリア、百日咳、破傷風、インフルエンザ菌、肺炎連鎖球菌、大腸菌、クレブシェラ、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、髄膜炎菌、小児麻痺、おたふく風邪、はしか、風疹、呼吸器合胞体ウイルス、狂犬病、エボラ、炭疽菌、リステリア、Ａ、Ｂ、Ｃ型肝炎、ヒト免疫不全ウイルスＩおよびＩＩ、１および２型単純ヘルペス、ＣＭＶ、ＥＢＶ、水疱瘡、マラリア、結核、カンジダ・アルビカンスおよび他のカンジダ、カリニ肺炎菌、マイコプラズマ、インフルエンザウイルスＡおよびＢ、アデノウイルス、Ａ群連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌、緑膿菌、ライノウイルス、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、パラインフルエンザ、１、２および３型、コロナウイルス、サルモネラ、赤痢菌、ロタウイルス、トキソプラズマ、エンテロウイルスあるいはクラミジア・トラコマチスおよびニューモニエを含む、細菌、リケッチア、菌類、ウイルス、寄生虫に由来するハプテンおよび抗原；
である。
【００６６】
更に、本発明のＨＤＲは抗原の投与から独立した免疫応答を非特異的に活性化するため、本発明の組成物は、生物兵器への曝露による症状を治療、予防または改善するために使用され得る。生物兵器は、研究室において特異的に改変されたそれらの天然に存在する生物学的物質を含む。これらの薬剤の改変はそれらを変化させているため、既知の治療法がないことが多い。実施例はエボラ、炭疽菌およびリステリアを含む。
【００６７】
本発明のＨＤＲは、生物兵器または他の病原菌に対する曝露の懸念に対して事前に、免疫系を全体的に活性化するために投与されうる。このような処置は、低投与量の病原菌に関連した罹患率、死亡率または症状を最小にする際に特に有効であり得る。曝露後、症状を改善する間、本ＨＤＲは患者を治癒させないかもしれないが、その後、他の何らかの治療が適用できるように患者の生命を十分に延長することができる。
【００６８】
同様に、旅行する患者へのＨＤＲの投与は、経験のない病原菌との接触の影響を予防または、最小限にするかもしれない。ある実施形態では、ＨＤＲに活性化された先天性免疫は、旅行者を寄生虫感染症から保護する。
【００６９】
上記に示唆されたように、本発明の免疫原性組成物は、フランシセラ属、住血吸虫症、結核、エイズ、マラリア、敗血症およびリーシュマニアを含むがこれに限らず任意の適切な感染症を治療、予防または改善するために用いられることができる。適切な感染性のウイルス、細菌、菌類および他の微生物（例えば原生生物）の実施例は、国際特許出願第ＷＯ ９８／１８８１０号で見ることができ、これは参照により本明細書に完全に組み入れられる。任意選択として、本方法は、任意の適切な抗感染性因子と組み合わせて用いられることができる。適切な抗感染性因子は、他で記述される様々な状態の治療において提供されるそれらの物質を含み、その例はＰｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（２０００）に見られる。
【００７０】
免疫応答を誘導する本発明の方法は、任意のアレルギー反応を治療、予防または改善するために使用され得る。ある実施形態では、アレルギー性抗原とともに１つ以上のＨＤＲを投与することは、非ＩｇＥアイソタイプへのクラススイッチングを促進する。ＨＤＲおよび抗原は、参照により本明細書に完全に組み入れられている米国特許第５，８７４，０８５号で教示されるように、ＣＤ４０リガンド、または、ＴＧＦ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−５のようなサイトカインとともに投与されるかもしれない。任意選択として、本発明の方法はまた、任意の適切な抗アレルギー剤と組み合わせて用いられることができる。適切な抗アレルギー剤は、上記に記述される様々なアレルギー状態の治療において提供されるそれらの物質を含み、その例はＰｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（２０００）で見られる。
【００７１】
本発明の状況において、アレルギーとはある物質（すなわちアレルゲン）に対する後天性過敏症を指す。アレルギーの状態は、湿疹、アレルギー性鼻炎または鼻感冒、花粉症、気管支喘息、蕁麻疹（発疹）、食物アレルギーおよび他のアトピー症状を含む。アレルゲンのリストは広範であり、花粉、昆虫毒、動物の鱗屑、埃、菌類の胞子および薬物（例えばペニシリン）を含む。本発明に適用可能な天然の、動物および植物のアレルゲンの更なる例は、国際特許出願第ＷＯ９８／１８８１０号で見られ、それは参照により本明細書に完全に組み入れられる。ある実施形態では、本発明の方法はアレルギー性喘息の治療のために用いられる。
【００７２】
本発明のＨＤＲの投与は、任意の適切な腫瘍、癌または前癌性病変を治療するために用いられることができる。任意選択として、本発明の方法は任意の適切な抗癌剤と組み合わせて使用できる。癌は、癌腫および肉腫と同様に、脳、肺（例えば小細胞および非小細胞）、卵巣、乳房、前立腺および大腸の癌を含む。好ましくは、本発明の方法は充実性腫瘍癌の治療のために用いられる。適切な抗癌剤は、電離放射線、特異的に標的とされる細胞毒性化合物、シスプラチン−トランスフェリン、フルオキセチン、スタウロスポリン、ビンブラスチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシルおよびロイコボリンを含む上述の様々な症状の治療において提供されるそれらの治療あるいは物質を含み、更なる例はＰｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（２０００）で見られる。
【００７３】
本発明のＨＤＲをアレルゲン、ハプテン、低免疫原性ペプチドおよび多糖類のためのアジュバントまたはワクチン成分として使用する場合、それらの免疫原性を増加させるために、標的分子は強力なＴ細胞依存性抗原と結合される、または、別のものと複合体にされることが好ましい。ハプテン部分、および、多糖類のような他の低免疫原性分子は、例えば、参照により本明細書に完全に組み入れられているＣｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ， Ｃｏｎｔｒｉｂ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０：４８−１１４（１９８９）、Ｃｒｕｓｅ ＪＭおよびＬｅｗｉｓ ＲＥ， Ｊｒ．編においてＤｉｃｋおよびＢｕｅｒｅｔによって議論されているように、それらの免疫原性を増加させるために強力なＴ細胞依存性抗原と結合され、または別のものと複合体にされうる。更に最近では、低免疫原性のＴ細胞非依存性抗原（例えば多糖類）へのＴ細胞依存性抗原の結合は、Ｔ細胞依存性およびＴ細胞非依存性成分の両方に対する免疫原性応答を向上させられることが示された。「２成分の結合」組成物において、Ｔ細胞依存性もしくはＴ細胞非依存性の担体またはその両方に更に結合された場合、更に、（非Ｔ細胞依存性ペプチドを含む）低免疫原性分子およびハプテンを含んでいる付加部分に対する抗体応答もまた劇的に向上させることができる。Ｌｅｅｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ １１６０−６６（１９９４）；ＭｏｎｄおよびＬｅｅｓの米国特許第５，５８５，１００および５，９５５，０７９号、これらは各々参照により本明細書に完全に組み入れられる。本発明の実施においてこれらの特性はいずれも絶対に必要とされるわけではないが、付加部分のＢ細胞エピトープが元来多価である、または別に複数のコピーに存在する場合、この増強された応答は特に顕著である。
【００７４】
本明細書において用いられるように、部分とは、それ自身によってまたは一度免疫原性分子と結合されることによって免疫系を活性化できる任意の物質である。従って、部分は、ＨＤＲまたは少なくとも１つのＴもしくはＢ細胞エピトープを包含し、ハプテン、抗原、或いはその組み合わせを含む。ある実施形態では、ＨＤＲはともに投与され、免疫原性の２成分結合組成物の一部分として静電結合または化学結合されているかもしれない。
【００７５】
付加的な免疫調整剤および細胞標的成分
本発明のＨＤＲおよびＨＤＲを含む構築物によって誘導される免疫応答は、免疫調整剤および／または細胞標的部分の投与によって更に増強されるかもしれない。抗原特異的応答が要求される場合、これらの付加的な部分はともに投与され、抗原または免疫原性組成物に化学結合されることが好ましい。許容されうる付加的な部分は、例えば以下のものを含む；すなわち、（１）ＬＰＳおよび解毒されたリポ多糖類またはその誘導体、（２）ムラミルジペプチド（ｍｕｒａｍｙｌ ｄｅｐｕｔｉｅｓ）、（３）免疫関連細胞に構築物をターゲティングするために細胞表面の決定基と相互作用しうる糖質および脂質（陽イオン性および陰イオン性脂質、ステロールなどを含む）、（４）ＣＤ４０リガンドおよびその断片、ならびにＣＲ２受容体に結合するポリペプチドを含む、特異的な免疫刺激活性を持つタンパク質またはポリペプチド（例えば、１９９９年６月１０日、Ｊａｍｅｓ Ｍｏｎｄ および Ａｎｄｒｅｗ Ｌｅｅｓ博士の名前で出願され、参照により本明細書に完全に組み入れられる、Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｂ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｂｙ Ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｓｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ ＥＢＶ Ｇｐ３５０／２２０という名称の係属中の米国出願第０９／３２８，５９９号に記載されたものを含む）、（５）参照により本明細書に全文を組み入れられている米国特許第５，７７６，６７５号に記載されている、制限シグナル、例えばファルネシル化、ゲラニルゲラニル化、ミリストイル化またはパルミトイル化のためのシグナルをコードしているペプチド、（６）普遍的なＴＣＥまたはＰａｎ ＤＲエピトープ（例えば、Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａの米国特許第５，１１４，７１３号；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：７５１−７６１（１９９４）；Ａｈｌｂｏｒｇら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６８：２１０２−９（２０００）；Ｋａｕｍａｙａら、Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ． ６：８１−９４（１９９３）；Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：３９７０−７（１９９２）（各々は参照により本明細書に全文を組み入れられる）に記載されているものなど）、（７）ＣＲ２、ＣＲ２レセプターもしくは抗原受容体複合体の他の成分、ＣＤ４０またはＣＤ４０リガンド、およびＭＨＣ成分に対する抗体を含むがこれに限らず、細胞表面成分と相互作用する抗体、ならびに（８）ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βおよびＧＭ−ＣＳＦ、特にＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−２の組み合わせ、あるいは２０００年５月１０日に出願されたＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ Ｆｏｒ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｔｈｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂｙ Ｂ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓという名称の、ＭｏｎｄおよびＳｎａｐｐｅｒの係属中の米国出願第０８／５６８，３４３号（参照により本明細書に全文を組み入れられる）に記載される他の免疫刺激の組み合わせを含むがこれに限定されない、１つ以上インターロイキンである。
【００７６】
ある実施形態では、タンパク質、ハプテンまたは免疫原性組成物の免疫原性は、１９９９年２月５日および１９９８年３月１６日にそれぞれ出願され、参照により本明細書に完全に組み入れられている係属中の米国出願第０９／０３９，２４７および０９／２４４，７７３号に記載されているように、アジュバントリポタンパク質の共投与によって更に増強されうる。リポタンパク質は、例えば、Ｌｅｅｓの米国特許第５，６９３，３２６号（参照により本明細書に完全に組み入れられる）に記載された方法を用いて、標的タンパク質、ハプテンまたは組成物に共有結合されるかもしれない。
【００７７】
患者
本発明はまた、ＨＤＲの免疫刺激量の投与による宿主の治療に関する。宿主は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏの両方の免疫系細胞を包含し、従って、不死化された、または新鮮に分離された培養細胞から免疫系を有する完全な生体までの全体の範囲を含む。宿主生体は、ここでは、免疫の活性化を必要とする任意のヒトまたはヒト以外の動物、または治療が有益でありうるヒトおよびヒト以外の動物を含む任意の被験体として定義される患者でありうる。治療されるべきこのようなヒト以外の動物は、すべての飼育されたおよび野生の脊椎動物、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、魚類、鳥類、ハムスター、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ウシおよびヒト以外の霊長類を含むが、これらに限定されない。
【００７８】
本発明は以下の実施例により説明されるが、それらは決して限定することを意図しない。
【００７９】
実施例
実施例１
オリゴヌクレオチド設計合成
本発明のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの驚くべき予想外の特性を説明するために、ホスホロチオエート置換されたオリゴヌクレオチドが使用された。以下のＯＤＮおよびＲＤＲあるいはＲＮＡ配列において、ＤＮＡは大文字で、ＲＮＡは小文字で表される。
【００８０】
2004530629.tif 000002
2004530629.tif 000003
対照オリゴヌクレオチドＤＤＤ（配列番号１）は、完全にデオキシリボヌクレオチドで構成される。各々、対照ＯＤＮのそれと同一のコアヘキサマー配列を有する２つの代表的なＨＤＲは、ＤＤＤ（配列番号１）のと直接的な比較に用いられた。すなわち、主にＲＮＡを含むが塩基配列ＡＡＣＧＴＴを有する内部ＤＮＡカセットを含むＲＤＲ（配列番号２）、および、ＲＤＲの逆でリボヌクレオチドの内部ａａｇｇｃｔ配列に隣接したＤＮＡ配列を含むＤＲＤ（配列番号３）である。ＲＲＲ（配列番号４）は、配列番号１と同一の塩基配列を包含するが、完全にＲＮＡから合成されている。上述のように、ＲＮＡから成るＯＤＮ配列は、一般に効力がないと考えられる。
【００８１】
塩基組成とＨＤＲ機能との間の関係を分析するために、７つの更なるＯＤＮ（配列番号５−１１）が生成された。
【００８２】
ＤＤＤ（配列番号１）、ＲＤＲ（配列番号２）およびＤＲＤ（配列番号３）は、市販のＰＥ／ＡＢＩ ３９４ ＲＮＡ／ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで生成された。ＤＮＡ前駆体は、ボトル位置１−４に取り付けられ、２’位の保護のための保護シリル基を有するＲＮＡ前駆体はボトル位置５−８に取り付けられた。米国特許第５，００３，０９７号（参照により本明細書に全文を組み入れられる）に記載されたように、硫化剤としてＢｅａｕｃａｇｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（１ｇ／１００ｍｌアセトニトリル中）を入れたボトルＮｏ．１５以外、残りのボトル位置はβ−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト化学合成のための標準的な化学薬品を収容した。ＲＮＡ前駆体およびＢｅａｕｃａｇｅ Ｒｅａｇｅｎｔは、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ｓｔｅｒｌｉｎｇ ＶＡから購入された。アセトニトリルは、ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃを通じてＢｕｒｄｉｃｋ ＆ Ｊａｃｋｓｏｎから購入された。残りの化学薬品は、ＰＥ／ＡＢＩ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）からであった。
【００８３】
ＰＥ／ＡＢＩによって提供される１μＭ Ｓｕｌｆｕｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｐｒｏｇｒａｍは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ’ Ｕｓｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５３およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．６：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、１９９４年３月（参照により本明細書に完全に組み入れられる）でＥＸＰＥＤＩＴＥ（登録商標）、ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ（登録商標）およびＢＥＣＫＭＡＮ（登録商標） ｓｙｓｔｈｅｓｉｚｅｒのために提供される一般的な方法と同様、任意のＨＤＲの調製に適切である。とは言え、収量を増加させるために以下の多数の修正が採用された。すなわち、
１）アセトニトリルを用いてカラムマトリックスを洗い流す洗浄段階を約３０％まで増加させた：
２）キャッピング時間を５秒から１０秒へと倍にした：
３）ＤＮＡのために２５秒およびＲＮＡのために６００秒の推薦される結合時間を、すべての付加について７２５秒まで増加させた：
４）硫化剤としてＢｅａｕｃａｇｅ ＲｅａｇｅｎｔをＴＥＴＤと取り替えた：
通常の硫化時間はＴＥＴＤのために６００秒、または、Ｂｅａｕｃａｇｅ Ｒｅａｇｅｎｔのために２０−３０秒であるが、硫化をＢｅａｕｃａｇｅで６０秒までに延長した：
５）３：１の比率の３０％ＮＨ４ＯＨ：エタノールを用いて、オリゴヌクレオチドを合成カラムマトリックスから開裂させた。環外アミン保護基は、開裂溶液中で１８時間５５℃の熱を通して除去された。室温に冷えた後、オリゴヌクレオチドはｓｐｅｅｄ−ｖａｃエバポレーターで完全に乾燥された：
６）２’シリル保護基は、３００μｌのフッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）とともに室温で２２時間、試験管ローテーターを用いて溶液を穏やかに振とうして除去された：
７）サンプルをＰＤ１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／Ａｍｅｒｓｈａｍ）にアプライし、ＴＢＡＦおよび合成またはアンモノリシスから生じる他の夾雑物を除去した。溶出のために用いられた水は、２つの「重ねられた」滅菌Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ ．２２μｍフィルターで濾過された：
８）オリゴヌクレオチドは２０％ポリアクリルアミド／８Ｍ尿素ゲルでのポリアクリルアミドゲル電気泳動を用い、１％メチレンブルーで染色、水中で脱色されて、視覚化された。
【００８４】
オリゴヌクレオチドＲＲＲ（配列番号４）は、同様の方法を用いて合成された。
【００８５】
本発明のＨＤＲの相対的な効力は、以下の実施例で使用される標準的な方法を用いて検定されうる。特に、１つ以上のＨＤＲによる様々なＴ細胞群の治療は、Ｔｈ１および／またはＴｈ２型のサイトカイン、例えば、それぞれＩＦＮ−γおよびＩＬ−６の産生を誘導する。
【００８６】
もちろん、当業者は、多数の更なるｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイはまた、適切な投与計画および最適の応答を引き起こすために十分な量と同様に、本発明の範囲内の組成物の効力を評価するためにも用いられうることを理解する。例えば、Ｂ細胞活性化は、当技術分野において既知の方法（例えば、Ｌｉａｎｇら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９８：１１１９−２９（１９９６）（参照により本明細書に全文を組み入れられる））を用いて評価されうる。ＮＫ活性は、ＷＯ ９８／１８８１０（参照により本明細書に全文を組み入れられる）に記載されるように決定されうる。樹状細胞、マクロファージおよび単球におけるＨＤＲの影響は、Ｓｔａｃｅｙら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５７：２１１６（１９９６）；Ｃｈａｃｅら、Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ． ８４：１８５（１９９７）；Ｈａｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ． １７：６２３０（１９９８）；およびＢｅｈｂｏｕｄｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９９：３６１−６６（２０００）（各々参照により本明細書に全文を組み入れられる）に記載されたように決定されうる。サイトカインの種類、量および比率、あるいは産生される細胞表面分子を比較することによって、本発明のＨＤＲが、先天性および後天性、体液性および細胞性免疫の活性化において有用であることは明白であろう。更に、当業者は、それによって、要求される免疫の活性化の種類に適合する最も有効なＨＤＲ配列を選択しうる（Ｖｅｒｔｈｌｙｉら、Ｊ． ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６６：２３７２−７７（２００１））。各ＨＤＲは特有な方法（例えば、１つ以上のＴ、Ｂ、ＮＫ、または、単球群からのサイトカイン分泌および／または抑制のプロフィールを生じること）で免疫系を活性化するので、特定の種類の免疫刺激のために最も適切なＨＤＲを選択することが可能なだけではなく、要求される免疫刺激のパターンを誘導するために複数のＨＤＲが併用されうる。
【００８７】
ｉｎ ｖｉｔｒｏのアッセイは、当技術分野における標準的な方法に従って分離されたヒトまたは動物の細胞（例えばＢ、Ｔ、ＮＫ、希突起膠細胞もしくは単球）を用いて行われうる。テスター細胞は、新鮮に分離されたヒト末梢リンパ球またはマウス脾臓細胞であるかもしれない。任意の特定のアッセイまたは応用法の必要条件に従って、細胞は混合群であるかもしれず、または、Ｓｎａｐｐｅｒら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１５８： ２７３１−３５ （１９９７）（参照により本明細書に完全に組み入れられる）に記載されるように９９％もしくはより高い純度に精製されるかもしれない。ＮＫ細胞はＳｎａｐｐｅｒら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５１： ５２１２−６０ （１９９３）（参照により本明細書に完全に組み入れられる）に従って調製されうる。
【００８８】
代替として、既に特徴づけられた或いは確立された免疫細胞株、例えばＢ細胞株またはＴｈ１細胞クローンもしくはＴｈ２細胞クローン（例えばＡＦ７細胞）を含むＴ細胞株が使用されるかもしれない。
【００８９】
実施例２
ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、Ｔｈ１およびＴｈ２−型サイトカイン産生を促進する
Ｓ１からＳ４で示された４人の健康なボランティア被験者から培養されたヒト末梢リンパ球におけるサイトカインＩＬ−６およびＩＦＮ−γの活性化は、標準的な方法を用いて分析された。簡潔に述べると、実施例１のオリゴヌクレオチドＤＤＤおよびＲＤＲは、０．３、３または３０μｇ／ｍｌの最終濃度で、培養細胞の培地に添加された。オリゴヌクレオチド添加の２４時間後、培地中のＴｈ１およびＴｈ２−型サイトカインのレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。結果は、以下の表１および２に任意のＥＬＩＳＡ ＵＮＩＴＳ（ＥＵ）で示される。
【００９０】
【表１】
2004530629.tif 000004
【表２】
2004530629.tif 000005
【００９１】
表１および表２の結果から明らかなように、本発明のハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ヒト末梢リンパ球においてＴｈ１（ＩＦＮ−γ）とＴｈ２（ＩＬ−６）型との両方の応答の誘導に関与するサイトカインの産生を促進する。
【００９２】
更に、ハイブリッドＲＤＲ分子およびＤＮＡ対照配列ＤＤＤを用いて得られた結果の比較は、ＯＤＮに対する本発明のＨＤＲの驚くべき予想外の優位性を示す。例えば、検定された最高濃度では、ハイブリッドＲＤＲ分子は、ＩＦＮ−γの誘導において３倍以上効果的であり、ＩＬ−６放出の刺激については６倍以上効果的であった。従って、相補的な活性化パターンを誘導するＨＤＲの混合物を含む本発明のＨＤＲは、ＤＮＡに基づくオリゴヌクレオチドと比較して、患者のＴｈ１およびＴｈ２応答に対して相当の優れた改善を提供するであろうと期待される。
【００９３】
実施例３
ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、Ｂ細胞増殖を活性化する
実施例２のヒト末梢Ｂ細胞群は、Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４０：３３６４−７２ （１９８８）；およびＳｎａｐｐｅｒら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５５：５５８２−８９ （１９９５）（各々参照により本明細書に全文を組み入れられる）の記載に従い、増殖についてチミジン取り込みアッセイで分析した。表３のデータから明らかなように、本発明のＨＤＲは、トリチウム化チミジンの取り込みによって測定したところによると、Ｂ細胞の複製においてほぼ１０倍活性化し得る。表４に示されるように、比較可能な結果がマウスＢ細胞を用いて得られた。表４のデータはまた、この特定のアッセイにおいてオリゴヌクレオチドＲＤＲのＤＲＤに対する優位性を実証していることも注目に値する。
【００９４】
従って、アジュバントまたはワクチンの成分としてのＨＤＲの投与は、抗原特異的なＢ細胞のクローン性増殖を刺激し、それにより抗体の生産を促進し、効果的に標的抗原の免疫原性を増加させ得る。更に、ＨＤＲは全体的にＢ細胞の分裂を刺激し、それによって先天性体液性免疫を増加させるであろう。
【００９５】
【表３】
2004530629.tif 000006
【表４】
2004530629.tif 000007
【００９６】
実施例４
ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドは抗体分泌を刺激する
Ｂ細胞を活性化して抗体を生産させるＨＤＲの能力は、本質にはＰｅｃａｎｈａら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４６：８８３−８９ （１９９１）；およびＳｎａｐｐｅｒら、Ｊ． Ｉｍｍｕｂｏｌ． １５４：５８４２−５０ （１９９５）（各々参照により本明細書に完全に組み入れられる）に記載される通り、ポリクローナル活性化およびＥＬＩＳＡアッセイを用いて示された。Ｆｉｎｋｅｌｍａｎら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３８：２８２６−３０（１９８７）（参照により本明細書に完全に組み入れられる）に記載された技術もまた適切である。更に、抗体産生およびクラススイッチング、特にＩｇＡクラススイッチングの刺激についてのアッセイ方法は、参照により本明細書に完全に組み入れられているＭｏｎｄおよびＳｎａｐｐｅｒの米国特許第５，８７４，０８５号から明らかである。
【００９７】
【表５】
2004530629.tif 000008
【００９８】
表５に示されるように、ＲＤＲオリゴヌクレオチドは、この特定の実験では、抗体分泌を実質的にバックグラウンド以上には誘導しなかった（値はＥＬＩＳＡにおける任意の単位）。この作用の欠如は、実験誤差またはアッセイの感受性の欠如に起因するかもしれない。それにも関わらず、表６に示すその後の実験において、精製されたヒト末梢Ｂ細胞は、ＲＤＲオリゴヌクレオチドに対する曝露の後、２２倍以上まで抗体を分泌した。
【００９９】
【表６】
2004530629.tif 000009
【０１００】
実施例５
ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、Ｔｈ１−型およびＴｈ２−型サイトカインを分泌するＴ細胞を個別に活性化する
ＤＢＡ／２マウス脾臓細胞は、培地、または３．０μｇ／ｍｌのＲＤＲもしくは対照オリゴヌクレオチドを含む培地で処理した。細胞を、その後、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γを発現している細胞を確認するために酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイに供した。表７には細胞１００，０００個あたりの陽性細胞の数を示す。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは当技術分野においてよく知られている。代表的な方法は、各々参照により本明細書に全文を組み入れるＣｚｅｒｋｉｎｓｋｙら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ６５：１０９−１２１ （１９８３）；ＳｅｄｇｗｉｃｈおよびＨｏｌｔ、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ５７：３０１−３０９ （１９８３）；Ａｍａｎｏら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． １４４：１２７−１４０；Ｓｐａｒｈｏｌｔら、Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ａｌｌｅｒｇｙ． ２１：８５−９０ （１９９１）；ならびにＪｏｎｅｓら、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ． ３１：１１７−１２４ （１９９９）に記載されている。当業者に公知であるとおり、ＥＬＩＳＰＯＴ法は、任意のＴ細胞の型、サブタイプ、または、樹立Ｔ細胞テスター株を用いるために修正されうる。更に、分析される特定のＨＤＲの効力を検定するために、任意の関連するサイトカインに対する抗体を用いてもよい。
【０１０１】
【表７】
2004530629.tif 000010
【０１０２】
対照ＯＤＮ、ＤＤＤ（配列番号１）は、ＩＬ−６（Ｔｈ１−型サイトカイン）およびＩＬ−１２（Ｔｈ２−型サイトカイン）を発現するＴ細胞数の約２／３増大させる。ＤＤＤはまた、ＩＦＮ−γを発現する細胞数を半分に減少させ、大幅にＩＬ−１０産生を減少させた。予想通り、ＲＮＡに基づくオリゴヌクレオチドはＩＬ−６産生を促進しなかった。興味深いことに、それは一部の細胞でＩＬ−１２の分泌を誘導し、実質的にＩＬ−１０およびＩＦＮ−γ発現を除去した。これらの結果は、ＲＮＡに基づくアジュバントが臨床的に不適切であるという見解と基本的に一致している。
【０１０３】
単一糖構築物の効果と驚くべき対照をなして、本発明のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、ＲＤＲ（配列番号２）は、ＩＦＮ−γを発現する細胞の数を減少させず（実際、増加させ）、ＩＬ−６およびＩＬ−１２の両方を分泌する細胞の割合を劇的に増加させた。実際、同一の塩基配列のＤＤＤ対照と比較して、ＨＤＲ構築物による処理は、ＩＬ−１２を分泌する細胞を１０倍以上に、ＩＬ−６を発現する細胞を完全に３５倍以上に誘導した。応答性Ｔ細胞数のこの劇的かつ予想外の増加は、体液性および細胞性免疫応答の刺激において、本発明の組成物によって享受される臨床的な利点を示す。
【０１０４】
実施例６
ＤＤＤおよびＤＲＤオリゴヌクレオチドアジュバントの用量応答試験
表８は、実質的に実施例５について記述されたように行われた用量応答実験の結果を示す。簡潔に述べると、これらの結果は、ＩＬ−６およびＩＬ−１２を分泌する免疫系細胞の刺激において、本発明のＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの優位性を確認する。（データは、１００，０００あたり陽性細胞数である。）この効果は、より高いヌクレオチド濃度で最も顕著であり、３μｇ／ｍｌを上回る局所濃度が最も有効であり得ることを示唆する。奇妙なことに、ＲＤＲ（配列番号２）およびＤＤＤ（配列番号１）対照は、より高い検査濃度ではおよそ等しいＩＦＮ−γ産生の刺激性があった。
【０１０５】
【表８】
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【０１０６】
実施例７
ＨＤＲ機能は構造と関連がある
ＯＤＮの活性は配列によって変化することが知られている。ＨＤＲ活性もまた配列に基づいて変化するどうかを調べるために、異なる多数のＨＤＲを設計し、個別のＴ細胞を活性化してＴｈ１型およびＴｈ２型サイトカインを分泌するそれらの能力が検定された。この実験は、ヒトＰＢＬを用いた点を除いて、実施例５で記述されたものと同様にして行われた。表９に示されるように、Ｔｈ１−型およびＴｈ２−型サイトカイン産生を活性化するＨＤＲの能力は、ＨＤＲ配列に高度に依存している。（データは１００，０００個あたりの陽性細胞数である。）従って、ＨＤＲはＴｈ−１型応答とＴｈ−２型応答のどちらかを優先的に活性化するように設計することができる。更に、異なるが相補的であるサイトカイン刺激のパターンを誘導するＨＤＲは、所望の免疫応答を刺激するために併用して使用することができる。
【０１０７】
【表９】
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【０１０８】
実施例８
ＨＤＲはｉｎ ｖｉｖｏにおいて先天性免疫を活性化する
ＨＤＲは、リン酸緩衝生理食塩水に懸濁され、２−５００μｇ／動物の投与量でＤＢＡ／２マウスの腹膜内に注射される。２４時間後、一部の注射されたマウスおよびＰＢＳを擬注射された対照マウスからの脾臓細胞を、３色フローサイトメトリーを用いてＢ細胞表面活性化マーカーであるＬｙ−６Ａ／Ｅ、Ｂｌａ−１およびクラスＩＩＭＨＣの発現について分析し、標準的なトリチウム化チミジンアッセイを用いて自発的な増殖活性について分析した。活性化マーカーの発現は、対照に対してＨＤＲを注射されたマウスにおいて有意に増加するであろう。同様に、ＨＤＲを注射された動物からの細胞は、有意により多く標識チミジンを取り込むであろう。注射されたマウスからの脾臓細胞のサンプルを、例えば、Ｂａｌｌａｓら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０：１７（１９９３）（参照により本明細書に全文を組み入れる）に記載されている短期クロム放出アッセイを用いて、ＮＫ活性について分析する。ＨＤＲを注射された動物からの細胞は、対照と比較してＮＫ細胞活性化レベルの増加を示すであろう。
【０１０９】
注射の４日後、残りのマウスからの血清を集め、ＥＬＩＳＡまたはオクテロニーアッセイによって全ＩｇＭについて分析された。ＨＤＲを注射されたマウスは、ＰＢＳを注射された対照に対して全ＩｇＭレベルの増加を示すであろう。
【０１１０】
実施例９
ＨＤＲはｉｎ ｖｉｖｏにおいて先天性免疫を活性化する
ＣｐＧ ＯＤＮの単回投与は、マウスに最長２週間まで持続するＬ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ感染からの免疫防御を与えることができる（Ｋｒｉｅｇら、Ｊ． ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１６１：２４２８−２４３４ （１９９８））（参照により本明細書に完全に組み入れられる）。ＯＤＮが反復投与である場合、この抵抗性は無期限に維持されることができる（Ｋｌｉｎｍａｎら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ６７：５６５８−６３（１９９９））（参照により本明細書に完全に組み入れられる）。
【０１１１】
本発明のＨＤＲが同様に先天性免疫を活性化できることを実証するために、我々はバクテリアの攻撃に対する抵抗性を分析するＫｌｉｎｍａｎら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ６７：５６５８−６３ （１９９９）に記載された技術を採用した。簡潔に述べると、ＢＡＬＢ／ｃマウスに（表１０に記述されたような）様々な作用物質を注射し、５日後に、１，０００ ＬＤ ５０のＬ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓでチャレンジした。表１０で見られるように、ＤＤＤ（配列番号１）またはＲＤＲ（配列番号２）（ＨＤＲの代表的な例）いずれかの単回投与は、ほとんどもしくはすべての検査されたマウスに、最短で投与後５日間、抵抗性を与えることが可能である。予想されたように、オリゴヌクレオチドの効果は投与後４週間まででは実証されることができなかった。表１０で実証されるように、活性化物質が放出される期間を有意に延長するリポソームとともにＯＤＮを投与することは、少なくとも４週までは検出可能な先天性免疫の増加期間を延長する。リポソーム、ミョウバン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ化）などの大型のポリマーへの共キレート結合、共役、結合のような時効性アジュバント、時間依存性送達処方、または、ＨＤＲの放出または分解を遅らせる他の方法と関連した本発明のＨＤＲの投与もまた、活性化ＨＤＲの反復投与と同様に免疫刺激の期間を延長するであろう。
【０１１２】
【表１０】
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【０１１３】
実施例１０
ＨＤＲは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて抗体産生およびクラススイッチングを促進する
ＨＤＲをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とともにリン酸緩衝生理食塩水に懸濁する。約２〜５００μｇのオリゴヌクレオチドおよび１〜２５μｇのタンパク質を含む１回容量をＢａｌｂ／ｃマウスの皮下に注射する。対照マウスには、ヌクレオチドを含まない対応する投与量のタンパク質を注射する。タンパク質またはＨＤＲを加えたタンパク質を一緒に注射したさらなる群のマウスには、ＧＭ−ＣＳＦ、あるいはＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−２、または、他のサイトカインおよびサイトカインの組み合わせを一緒に注射する。注射を１４日後に繰り返す。
【０１１４】
２週後に採取した血清を、ＥＬＩＳＡによって標的抗原に対する反応性抗体について検査する。ＥＬＩＳＡアッセイはまた、各アイソタイプの抗ＢＳＡ抗体の相対的な、または好ましくは絶対的なレベルを決定するためにも用いられる。ＨＤＲを注射された動物は、抗ＢＳＡ抗体のレベルの向上、特にＩｇＡおよび／またはＩｇＧ抗体のレベルの増加を示し、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２および／またはＩｇＧ２ａアイソタイプのレベルの増加を示しうる。
【０１１５】
実施例１１
本発明の代表的なＨＤＲ
以下のＨＤＲは本発明の代表例であり、決してこれらに限定していない。これらの実例となる配列は、（先天性、全体的、細胞性および／または体液性の）免疫刺激活性を有する当技術分野において既知のＯＤＮ配列を踏まえ、且つ、本明細書で報告した、ハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡ ＯＮＤ（ＨＤＲ）がｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で強い免疫刺激活性を有するという驚くべき観察を踏まえて選択された。実施例１−１０、または、当技術分野において一般に用いられる他のアッセイの教示によって、当業者はこのようなＨＤＲおよび本発明の範囲内の他のすべてのＨＤＲ配列がｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて免疫刺激活性について分析できることを理解するであろう。
【０１１６】
以下の配列において、「ｔ」はリボース糖を介して少なくとも１つの他の塩基に結合されたチミジンを指す。そこで本発明は更に、以下の例示的な配列において、任意の「ｕ」（ウラシル）が「ｔ」と置換し、更に、「ｉ」（リボース糖を介して少なくとも１つの他の塩基に結合されたイノシン）が任意のリボースに結合された塩基と置換したＨＤＲをも考慮する。
【０１１７】
【配列表】
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【０１１８】
本明細書は、明細書内で引用され、すべて参照により本明細書に完全に組み入れられている参照の教示を踏まえて、ほぼ完全に理解される。本明細書内の実施形態は本発明の実施形態の実例を提供し、本発明の範囲を制限するために解釈されるべきではない。当業者は、請求項に示される本発明の真の範囲および精神とともに、他の多くの実施形態が請求項の発明に含まれること、あるいは、本明細書および実施例が単に例示的にのみ考慮されることを意図されていることを理解できる。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004530629.tif 000098