(57)【要約】【課題】血小板輸血のための保存時における血小板機能の低下を抑え、輸血後の副作用を抑える事ができる血小板保存剤を提供する。また、その保存方法および保存された血小板を提供する。【解決手段】ポリフェノールを溶解した溶液を、保存血小板液に0.001-0.05重量%（10〜500ppm）の濃度となるように添加する。あるいは、このような濃度のポリフェノール溶液中で血小板を保存する。ポリフェノールとして適しているのは、(−)-エピガロカテキン-3-O-ガレート（EGCg）、(−)-ガロカテキンガレート、及び、(−)-エピカテキンガレートである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板が分散した血漿、または、緩衝塩及び代謝栄養源からなる血漿置換型保存液に、0.001-0.1重量%の濃度となるようにポリフェノールを添加したことを特徴とする血小板保存液。
【請求項２】
ポリフェノールがエピガロカテキンガレート(EGCg)またはガロカテキンガレート(GCg)、またはエピカテキンガレート(ECg)もしくはそれらの混合物である請求項１に記載の血小板保存液。
【請求項３】
緩衝塩として、リン酸水素二ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム及びマグネシウム塩の少なくとも一種を含み、代謝栄養源として、クエン酸 、グルコース、及び膜透過性多価アルコールの少なくとも一種を含むものを、血漿置換型保存液として用いたことを特徴とする請求項１または２に記載の血小板保存液。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかの血小板保存液からなる輸血用血漿製剤。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかの血小板保存液を、１０〜３０℃で、振盪しつつ６〜７日間またはそれ以上保存した後、そのまま、または、洗浄によりポリフェノールを少なくとも部分的に除去してから輸血用血漿製剤として用いることを特徴とする血小板の保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、添加することで血小板の保存期間を延長することができる血小板保存剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
血小板輸血の必要な患者への高単位血小板製剤は、血小板アフェレーシス献血により確保されており日本赤十字社より供給されている。この血小板保存は我が国においては室温で水平振盪機を用いて保存することと規定されており、その保存期間は72時間である。血小板を有効利用する観点からするとさらなる保存期間の延長が望ましいが、保存期間が長くなるにつれて血小板機能の低下、混入した白血球由来のサイトカインによる非溶血性副作用などの問題が起こり、臨床的に望ましくない（非特許文献１）。また、保存時に血小板がアポトーシスを起こし、崩壊していくことも大きな問題である（非特許文献２）。血小板の機能を低下させずに保存期間延長を計る技術の開発が急がれている。
【０００３】
現在、血小板の保存液として研究開発されているものは、ほぼすべてが血漿と置換して使用する保存液である。例えばリン酸水素二ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム 、クエン酸 、グルコース、膜透過性多価アルコール などを混合した保存液（特許文献１）や、重炭酸ナトリウムやマグネシウム塩などを更に加えたもの（特許文献２）である。これら血漿置換保存液の目的は、血小板を保存するために用いられた血漿による発熱・悪寒・ショックなどのアレルギー・免疫反応といった輸血の副作用を抑えることである。しかしこれら置換型保存液ではpHの安定性や血小板の代謝などが血漿に比べ劣ることから保存効果に問題がある。また必要なpH緩衝能を付与するためにイオン濃度を高めることによる腎臓への負担も問題視されている。
【０００４】
ポリフェノールの血小板への作用に関しては凝集能の抑制効果が挙げられる（非特許文献３）。EGCgをはじめとするポリフェノール類が血小板に作用してコラーゲン（collagen）やトロンビン（thrombin）などの凝集惹起剤による凝集を抑えることがわかっている。しかし。この特性を保存効果と結びつけた前例は全くない。
【非特許文献１】藤原満博他  「保存による血液製剤中のサイトカインレベルの変化」Japanese Journal of Transfusion Medicine 47,6,829-836,2002
【非特許文献２】Junzhi Li, et. al. “The mechanism of apoptosis in human platelets during storage” Transfusion 40, 1320-1329, 2000
【非特許文献３】WS.Kang et. Al. “Antithrombotic activities of green tea catechins and (-)-epigallocatechin gallate” Thrombosis Research, 96, 229-237, 1999.
【特許文献１】特開平０９−０８７１８３
【特許文献２】特開平０８−１６５２４５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の解決しようとする課題は、血小板の機能の低下を防ぎ保存期間の延長を計ることである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の血小板保存剤は、ポリフェノール成分からなり、これを保存血小板の分散液中に溶解させることで、血小板の凝集能を維持し、アポトーシスを防ぐことにより保存期間を延長させることを特徴とする。本保存剤は、従来の血漿置換型血小板保存液に添加して使用することも可能である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明では、ポリフェノールの血小板凝集阻害効果を血小板の保護に用い、保存効果を高めることができる。つまり、保存時に凝集能を阻害することで、血漿中の他の成分による保存中の自然凝集を防ぐことができる。また、ポリフェノールの血小板凝集阻害効果は洗浄により回復することが可能な可逆的作用であることから、保存期間終了と共に洗浄もしくは輸血による希釈により凝集能が速やかに回復する。本発明では、無添加保存に比べて血小板の保護効果により、凝集能を高く維持することが可能である。
【０００８】
また、本発明では、血小板保護効果によりアポトーシスを抑制することで血小板の機能と生存率を保ち、保存期間を延長することができる。また、ポリフェノールの免疫反応抑制作用により、非溶血性副作用の予防も期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明におけるポリフェノールについては、限定されない。カテキン類、タンニン類、プロアントシアニジン又はリスベラトロールが使用され得る。特に好ましいのは、(−)-エピガロカテキン-3-O-ガレート（EGCg）、(−)-ガロカテキンガレート（GCg）、(−)-エピカテキンガレート（ECg）である。エピガロカテキンガレート（EGCg）、ガロカテキンガレート、エピカテキンガレートの純度は９０重量％以上が望ましく、９８重量％以上がより望ましい。
【００１０】
またポリフェノールは、例えば、茶、ワイン、チョコレート、サボテン、海藻、野菜（たまねぎ（最外部の黄褐色の皮）、アロエ抽出物パセリの葉、白色野菜など）、柑橘類（温州みかん、だいたい、ポンカンの皮、夏みかんの皮、グレープフルーツ、レモンなど）、リンゴなどの果実類、穀物（こうりゃん、大豆、そば、小麦など）、ダリアの花などの種々の食品・植物に多く含まれているので、茶抽出物、海草抽出物、果実抽出物、サボテン抽出物又はワイン抽出物などの抽出物でも良い。
【００１１】
例えば茶抽出物は、水、エタノール、酢酸エチルなどの溶剤を用いて茶の葉より抽出することで得られ、エピガロカテキンガレートを最も多く含むカテキン類を主成分とする。また、得られた茶抽出物あるいは市販の茶抽出物から、クロロフィルの除去、さらにカラムクロマトグラフ法による精製をすることによって、高純度のエピガロカテキンガレート（EGCg）を得ることが可能である。
【００１２】
本発明において、ポリフェノールの濃度は、0.001-0.1重量%（10〜1000ppm）が好ましい。より好ましい濃度は0.005〜0.1重量％（50〜1000ppm）である。さらに好ましくは0.005〜0.03重量％（50〜300ppm）である。
【００１３】
本発明においてポリフェノールを安定化させるため、L-アスコルビン酸および二亜硫酸カリウムが添加されていても良い。L-アスコルビン酸の濃度は0.0001〜0.3重量%（1〜300ppm）である。二亜硫酸カリウムの濃度は0.0001〜0.3重量%（1〜300ppm）である。
【００１４】
本発明の血小板保存剤には、用途に応じて抗酸化剤、安定化剤等の薬剤が適宜添加されても良い。そのような成分として、以下が挙げられる：リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；抗酸化剤（例えば、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ビタミンＥまたはグルタチオン）；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；単糖類、二糖類、及び多糖類の化合物（グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、ポリオキシエチレン・ソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ(商標)）、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンブロック共重合体（プルロニック(pluronic、商標)）またはポリエチレングリコール）；血栓溶解剤；血管拡張剤；組織賦活化剤；カテコラミン；ＰＤＥＩＩ阻害剤；カルシウム拮抗剤；βブロッカー；ステロイド剤；脂肪酸エステル；抗炎症剤；抗アレルギー剤；抗ヒスタミン剤等。
【実施例】
【００１５】
＜実施例１＞
健常成人男性ボランティア12名より1/6ACD-A下において採血を行い、1000rpmで10分の遠心分離により多血小板血漿(PRP)を採取した。採血血小板に、すなわち、得られた多血小板血漿(PRP)に、EGCgを添加し最終濃度（EGCgの重量÷添加後のPRPの全重量）が0ppm（比較例1）及び50ppm（実施例１）となるようにした。そして、血小板用保存バッグ（川澄化学  血液分離バッグ）中にて、水平振盪機を用いて23℃、60ストローク/分の条件で保存した。
【００１６】
保存前及び保存三日後と六日後における血小板の凝集能と、ATP（アデノシン三リン酸）放出量、血漿中のRANTES（ケモカインβファミリーに属するサイトカインの一種）濃度、及び、血漿中のLDH(Lactate Dehydrogenase)量を調べた。
【００１７】
血小板凝集能の測定は、常法に従ってlumi-aggregometer（Chronolog社）を用い、ＰＲＰの光の透過度の変化を計測することにより行なった。この際、血小板凝集惹起剤としては、５μｇ／ml collagen および0.1U/ml トロンビンを用いた。すなわち、上記の多血小板血漿(PRP)に、コラーゲンを５μｇ／mlの濃度となるように添加するか、または、トロンビンを0.1U/mlの濃度となるように添加した場合の血小板凝集能を測定した。また、同時に、凝集時に放出されるATPの濃度も測定した。RANTES濃度およびLDH活性は市販のキット（Biosource社の「ヒト RANTES ELISA」、及び、タカラバイオ（株）のMK401）を用いて測定した。なお、予め、保存前の新鮮な血小板分散液（PRP）について、同様に血小板凝集能及びＡＴＰ放出濃度を測定しておいた。そして、保存前の凝集能（凝集率）を100%としたときの、保存三日後と六日後における凝集能維持率、及び、保存前のＡＴＰ放出濃度（放出能）を100%としたときの、保存三日後と六日後におけるＡＴＰ放出能維持率を求めた。
【００１８】
図１は、コラーゲン刺激による場合の凝集能維持率を、比較例の結果とともに示す。コラーゲンによる凝集では、比較例1（EGCg無添加）では三日保存後に70%、六日保存後に60%にまで凝集能が低下していたのに対し、実施例1（EGCg50ppm添加系）では三日保存後で80%、六日保存後で70%の凝集能を維持していた。一方、トロンビンによる凝集においては、図2に示す様に比較例1では三日保存で90%、六日保存では70%程度の維持率であったが、実施例1では三日保存でほぼ100%、六日保存でも90%の維持率を示した。この差は統計的に有意（p<0.05）であった。どちらの凝集惹起剤を用いても比較例に比べ、EGCgを添加することで三日の保存期間延長効果が見られた。すなわち、EGCgの添加により、六日保存後にも、EGCg無添加系での三日保存（前述の現行規定による保存期間72時間）後と同様の凝集能を保持していた。
【００１９】
血小板は凝集する際にATPを放出する。そこで、トロンビン凝集の際のATPの放出能を測定し、保存前を100%としたＡＴＰ放出能維持率を、図3に示した。比較例1（EGCg無添加）に比べ実施例1では明らかに、より高いATP放出能を維持していた。
【００２０】
RANTES（Regulated upon Activation Normal Tcell Expressed and Secreted） は好酸球や好塩基球に対し強力な走化作用を示すと共に好塩基球の脱顆粒を起こしヒスタミンの遊離を惹起する事が知られているケモカインであり、保存中の血小板の活性化と共に徐々に血漿中に放出される。そこで、EGCgを添加した系で保存中のRANTES濃度を調べ、図4に示した。この結果も同じくEGCg添加系で有意にRANTES放出が抑制された。これらの事から、EGCgにより血小板の活性化が抑えられ、保存効果が向上しているということが言える。
【００２１】
図5は血漿中LDH活性を示したものである。LDH(Lactate Dehydrogenase)は、血小板中にある酵素で、血小板が崩壊した際に血漿中に放出されるものであるので、血小板の生存率の指標として用いた。この結果より、EGCg添加系で有意に保存中の血漿LDH活性が抑制されていることから、EGCgにより血小板の崩壊が抑制されていることがわかる。
【００２２】
＜実施例2＞
健常成人男性ボランティア9名より1/6ACD-A下において採血を行い、1000rpmで10分の遠心分離により多血小板血漿(PRP)を採取した。採血血小板にEGCg、GCg、ECgをそれぞれ最終濃度100ppmとなるように添加したもの（実施例2；全ポリフェノール濃度300ppm）と、代わりに実施例２の全ポリフェノールと同重量の生理食塩水を添加したもの（比較例2）を、血小板用保存バッグ（川澄化学  血液分離バッグ）中にて、水平振盪機を用いて23℃、60ストローク/分の条件で保存した。
【００２３】
保存前及び保存七日後の血小板の凝集能と血漿中LDH量を、実施例１の場合と同様の方法により調べた。
【００２４】
血小板凝集能の測定は、常法に従い lumi-aggregometerを用い、ＰＲＰの光の透過度の変化から行なった。血小板凝集惹起剤としては、５μｇ／ml collagen および0.1U/ml トロンビンを用いた。LDH活性は市販のはキットを用いて測定した。図６Ａ及び６Ｂに保存前を100%としたときの七日保存後の凝集能の維持率を示す。コラーゲン、トロンビンどちらで刺激したときも実施例2の方が高い維持率を示した。また、図７に上清中のLDH活性を示す。この場合も実施例2のポリフェノール添加群で有意にLDH活性が抑制されている。これらの結果から、ポリフェノール添加群で血小板の機能と生存率を保つことにより保存期間の延長が可能であることがわかった。
【００２５】
＜実施例3＞
健常成人男性ボランティア12名より1/6ACD-A下において採血を行い、1000rpmで10分の遠心分離により多血小板血漿(PRP)を採取した。採血血小板にEGCgを最終濃度0ppm（比較例3）及び50ppm（実施例3）となるように添加し、血小板用保存バッグ（川澄化学  血液分離バッグ）中にて、水平振盪機を用いて23℃、60ストローク/分の条件で保存した。
【００２６】
保存十日後の血小板を2000rpmで15分遠心し、血漿成分を取り除き、血小板溶解液で溶解した。氷上で10分放置した後、13000rpmで15分遠心し、上清を回収した。得られた上清中のタンパクの状態をSDS-PAGE・ウェスタンブロットにて評価した。調べたタンパク質はカスパーゼ3、及びゲルゾリンである。血小板がアポトーシスを起こし崩壊する際にカスパーゼ3が活性化され、分子量が35kDaから21kDaに低下する。その活性化されたカスパーゼ3はゲルゾリンを開裂させ分子量を86kDaから47kDaに低下させる。図８は、ウェスタンブロットの結果である。比較例3ではカスパーゼ3もゲルゾリンも分子量の低下が見られるが、実施例3では明らかに分子量低下が抑制されている。この結果から、血小板保存時の生存率の維持はアポトーシス抑制によるものであることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】保存血小板の凝集機能維持率に対するEGCgの影響を示すグラフ（１）である。コラーゲン５μｇ／ｍｌにより刺激した場合を示す。
【図２】保存血小板の凝集機能維持率に対するEGCgの影響を示すグラフ（２）である。トロンビン０．１Ｕ／ｍｌにより刺激した場合を示す。
【図３】ATP放出能維持率に対するEGCgの影響を示すグラフである。
【図４】保存中の血漿中のRANTESに対するEGCgの影響を示すグラフである。
【図５】保存中の血漿中のLDH活性に対するEGCgの影響を示すグラフである。
【図６Ａ】７日保存後にコラーゲン５μｇ／ｍｌを添加した場合の、凝集機能維持率に対するポリフェノールの影響を示すグラフである。
【図６Ｂ】７日保存後にトロンビン０．１Ｕ／ｍｌを添加した場合の、凝集機能維持率に対するポリフェノールの影響を示すグラフである。
【図７】保存中の上清LDH量に対するポリフェノールの影響を示すグラフである。
【図８Ａ】ウェスタンブロットにより、カスパーゼ３の保存による変化と、EGCgの影響を測定した結果を示す図（写真と注記との組み合わせ）である。
【図８Ｂ】ウェスタンブロットにより、ゲルゾリンの保存による変化と、EGCgの影響を測定した結果を示す図（写真と注記との組み合わせ）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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