(57)【要約】本発明によると、コレステロール基および炭水化物部分を含む陽イオン性脂質として作用し得る化合物が提供される。
2004522722.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コレステロール基および炭水化物部分を含む、陽イオン性脂質として作用し得る化合物。
【請求項２】
式：
Ｃｈｏｌ−Ｌ−Ｃａｒｂ
（式中、Ｃｈｏｌはコレステロール基であり、Ｌは必要に応じたリンカー基であり、Ｃａｒｂは炭水化物部分である。）
で表される請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記コレステロール基がコレステロールである請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
前記コレステロール基が、カルバモイル結合を介して前記必要に応じたリンカー基に接続されている請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
前記リンカー基がポリアミン基である請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
前記ポリアミン基が天然型ポリアミンである請求項４に記載の化合物。
【請求項７】
前記ポリアミン基が、エチレン（−ＣＨ2ＣＨ2−）基によって互いに間隔をおいて配置されている、ポリアミン基における少なくとも２つのアミンを含有する請求項４または５に記載の化合物。
【請求項８】
前記ポリアミンが、スペルミジン、スペルミンまたはカルドペンタミン（caldopentamine）のいずれかである請求項５に記載の化合物。
【請求項９】
前記炭水化物部分が単糖である請求項１〜８のいずれかに記載の化合物。
【請求項１０】
前記炭水化物部分が糖部分である請求項１〜８のいずれかに記載の化合物。
【請求項１１】
炭水化物部分が、マンノース、グルコース（Ｄ−グルコース）、ガラクトース、グルクロン酸、ラクトース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトヘプタオースおよびそれらの混合物から選択される請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１２】
前記炭水化物部分がＤ−グルコースである請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１３】
１〜７の炭水化物部分を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１４】
１つの炭水化物部分を含む請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
式：
Ｃｈｏｌ−Ｌ−Ｃａｒｂ
（式中、Ｃｈｏｌはコレステロールであり、
Ｌはポリアミン基であり、
Ｃａｒｂはグルコースであり、好ましくはＤ−グルコースである）
で表される請求項１に記載の化合物。
【請求項１６】
ヌクレオチド配列と混合または結合されている請求項１〜１５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１７】
コレステロール基およびポリアミンを含む化合物に糖を反応させるステップを含む請求項１〜１５のいずれか１項に記載の化合物を調製する方法。
【請求項１８】
治療に使用するための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の化合物または請求項１７に記載の方法によって調製される化合物。
【請求項１９】
遺伝的な障害または状態または疾患を治療するための医薬の製造における、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の化合物または請求項１７に記載の方法によって調製される化合物の使用。
【請求項２０】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の化合物または請求項１７に記載の方法によって調製される化合物から形成される陽イオン性リポソーム。
【請求項２１】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の化合物または請求項１７に記載の方法によって調製される化合物から陽イオン性リポソームを形成するステップを含む陽イオン性リポソームを調製する方法。
【請求項２２】
治療に使用するための、請求項２０に記載の陽イオン性リポソームまたは請求項２１に記載の方法によって調製される陽イオン性リポソーム。
【請求項２３】
遺伝的な障害または状態または疾患を治療するための医薬の製造における、請求項２０に記載の陽イオン性リポソームまたは請求項２１に記載の方法によって調製される陽イオン性リポソームの使用。
【請求項２４】
ヌクレオチド配列と、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の化合物、請求項１７に記載の方法によって調製される化合物、請求項２０に記載の陽イオン性リポソームまたは請求項２１に記載の方法によって調製される陽イオン性リポソームとの配合物。
【請求項２５】
治療に使用するための、請求項２４に記載の配合物。
【請求項２６】
遺伝的な障害または状態または疾患を治療するための医薬の製造における請求項２４に記載の配合物の使用。
【請求項２７】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の化合物または請求項１７に記載の方法によって調製される化合物であって、薬剤および必要に応じて、製薬学的に許容されうる希釈剤、担体または賦形剤を混合したものを含む医薬組成物。
【請求項２８】
請求項２０に記載の陽イオン性リポソームまたは請求項２１に記載の方法によって調製される陽イオン性リポソームであって、薬剤および必要に応じて、製薬学的に許容されうる希釈剤、担体または賦形剤を混合したものを含む医薬組成物。
【請求項２９】
実質的に、本明細書において、図面のいずれか１つを参照して記載される化合物または陽イオン性リポソーム。
【請求項３０】
実質的に、本明細書において、図面のいずれか１つを参照して記載される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は化合物に関する。また、本発明は、本発明の化合物を製造する方法と、治療、特に遺伝子治療（特に遺伝子導入）におけるその化合物の使用とに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療の一態様は、発現したタンパク質が望ましい治療機能を発揮することができるように、外来核酸（ＤＮＡなど）を細胞に導入することに関する1a。
【０００３】
この種類の治療の例には、癌を治療するＴＫ、ＴＳＧまたはＩＬＧ遺伝子の挿入、嚢胞性繊維症を治療するＣＦＴＲ遺伝子の挿入、神経変性性疾患および循環器疾患を治療するＮＧＦ、ＴＨまたはＬＤＬ遺伝子の挿入、関節リウマチを治療するＩＬ−１アンタゴニスト遺伝子の挿入、ＡＩＤＳおよびＣＭＶ感染症を治療するＨＩＶ抗原およびＴＫ遺伝子の挿入、ワクチンとして作用する抗原およびサイトカインの挿入、並びにタラセミアなどのヘモグロビン異常状態を治療するβ−グロビンの挿入が挙げられる。
【０００４】
多くの最新の遺伝子治療が、Ａｄ３もしくはＡｄ５などのアデノウィルス遺伝子ベクターまたは他の遺伝子を使用している。しかし、それらの使用に関連する重篤な問題が生じている2a。このため、危険がより少ない非ウィルス遺伝子導入方法の開発が刺激された3a。
【０００５】
見込みが大きい非ウィルス導入系は、陽イオン性リポソームの使用に関する4a。これに関しては、通常中性のリン脂質と陽イオン性脂質からなる陽イオン性リポソームが、ＤＮＡ4a、ｍＲＮＡ5a、アンチセンスオリゴヌクレオチド6a、タンパク質7aおよび薬剤8aを細胞に導入するために使用されている。数多くの陽イオン性リポソームが購入でき4a,9a、今日、多数の新しい陽イオン性脂質が合成されている10a。これらのリポソームの有効性はインビトロ4aおよびインビボ11aの両方によって示されている。
【０００６】
陽イオン性リポソームを製造する際に有用な中性のリン脂質は、「ＤＯＴＭＡ」として周知のＮ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウムである。
【０００７】
最も通常に使用される陽イオン性リポソーム系の１つは、中性リン脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（通常「ＤＯＰＥ」として周知である。）と陽イオン性脂質、３β−［（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）カルバモイル］コレステロール（通常「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」として周知である。）の混合物からなる12a。
【０００８】
周知の陽イオン性リポソームの有効性にもかかわらず、ヒト遺伝子治療における陽イオン性リポソームの遺伝子導入効率を最適化する必要性がある10a。ヒトゲノムプロジェクトは完成間近になり、遺伝子治療と表現される、治療目的のための遺伝子の使用は医学に改革をもたらすという期待が高まっている。これに関して、ウィルス技術より効果は少ないが、非ウィルス送達は、ヒトに適用するのに最も安全な選択であるとして、科学団体から認識されることが多くなっている。
【０００９】
異なる既存の技術における多数の要素を含む複雑な高分子構築物が出現し（ウィルスタンパク質またはペプチド、リポソーム、ポリマー、ターゲティング方法およびステルス特定）、この分野はこの１０年でかなり進歩した。
【００１０】
本発明者らの同時係属出願ＰＣＴ／ＧＢ００／０４７６７号には、ウィルスコアペプチドＭｕ、プラスミドＤＮＡおよび陽イオン性リポソームを含む三重構造に基づいた系が記載されている（ＬＭＤ）。このプラットホーム技術により、本発明者らは、インビトロにおける優れた成功とインビボにおける有望な結果を得た。しかし、既存の全ての非ウィルス技術には、インビボにおける治療レベルに達成するために、さらに開発が必要である。
【００１１】
このためには、製剤は体液（血清、肺粘膜）中での粒子の安定性を確保し、効率的なトランスフェクション能力を維持しなければならない。
【００１２】
この要件は、既存の技術全ての大きな障害の１つである。最新の安定な製剤[1,2]はトランスフェクションをほとんど達成しておらず、現在の効率的なトランスフェクション剤のほとんどは、不安定なために適用範囲が大幅に制限されている[3-7]。
【００１３】
（全身適用のために血中に、または肺局所投与のために粘膜に）投与後、荷電複合体は塩および生体高分子に暴露され、強力なコロイド凝集および生物活性な要素（オプソニン）の表面への吸着が生じる[8-11]。遺伝子搬送体は、沈殿、マクロファージによる粒子が離脱を引きこすタンパク質の結合、および崩壊へとつながる表面の不安定化を含み得る大きな変化を受ける。最も広く使用される安定な製剤は、表面グラフト処理済みポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖[12,13]に関する。ＰＥＧは、ほとんどの高分子に対する排除容積が大きい無毒性の中性ポリエーテルである。残念なことに、必要なレベルの安定性を示している製剤は、おそらく、細胞に対する非特異的親和性の低下または必要なエンドソーム破壊特性の損失のために、遺伝子導入能力をなくしている[14,15]。
【００１４】
脂質複合体に対する体液の破壊作用から逃れる別の方法は、自然を模倣し、脂質二重膜の表面を多糖でコーティングすることである[16,17]。
【発明の開示】
【００１５】
本発明は従来技術の問題を軽減する。
【００１６】
本発明の一態様によると、コレステロール基および炭水化物部分を含む、陽イオン性脂質として作用し得る化合物が提供される。
【００１７】
本発明の別の態様によると、コレステロール基およびポリアミンを含む化合物に糖を反応させるステップを含む、本発明にかかる化合物を製造する方法が提供される。
【００１８】
本発明の別の態様によると、治療に使用するための、本発明にかかる化合物または本発明の方法によって調製される化合物が提供される。
【００１９】
本発明の別の態様によると、遺伝的な障害または状態または疾患を治療するための医薬の製造における、本発明にかかる化合物または本発明の方法によって製造される化合物の使用が提供される。
【００２０】
本発明の別の態様によると、本発明にかかる化合物または本発明の方法によって調製される化合物から形成される陽イオン性リポソームが提供される。
【００２１】
本発明の別の態様によると、本発明にかかる化合物または本発明の方法によって調製される化合物から陽イオン性リポソームを形成するステップを含む陽イオン性リポソームを調製する方法が提供される。
【００２２】
本発明の別の態様によると、治療に使用するための、本発明にかかる陽イオン性リポソームまたは本発明の方法によって調製される陽イオン性リポソームが提供される。
【００２３】
本発明の別の態様によると、遺伝的な障害または状態または疾患を治療するための医薬の製造における、本発明にかかる陽イオン性リポソームまたは本発明の方法によって調製される陽イオン性リポソームの使用が提供される。
【００２４】
本発明の別の態様によると、ヌクレオチド配列と、本発明にかかる化合物、本発明の方法によって調製される化合物、本発明にかかるリポソームまたは本発明の方法によって調製されるリポソームのいずれか１つ以上との配合物（combination）が提供される。
【００２５】
本発明の別の態様によると、治療に使用するための、本発明による配合物が提供される。
【００２６】
本発明の別の態様によると、遺伝的な障害または状態または疾患を治療するための医薬の製造における本発明による配合物の使用が提供される。
【００２７】
本発明の別の態様によると、本発明にかかる化合物または本発明の方法によって調製される化合物であって、薬剤および必要に応じて、製薬学的に許容されうる希釈剤、担体または賦形剤を混合したものを含む医薬組成物が提供される。
【００２８】
本発明の別の態様によると、本発明にかかる陽イオン性リポソームまたは本発明の方法によって調製される陽イオン性リポソームであって、薬剤および必要に応じて、製薬学的に許容されうる希釈剤、担体または賦形剤を混合したものを含む医薬組成物が提供される。
【００２９】
本発明のいくつかのさらに別の態様は添付の特許請求の範囲に規定されている。
【００３０】
本発明の化合物の主要な利点は、遺伝子治療、特に治療上の有益性を導くために細胞への（インビトロ、インビボおよび半ビボにおける）核酸（遺伝子およびアンチセンスＤＮＡ／ＲＮＡを含む）の導入に有用な陽イオン性リポソームを調製する際に、陽イオン性脂質（両親媒性）として本発明の化合物を使用することができることであると考えられている。
【００３１】
炭水化物は数多くの生物学的機能を有する。本発明者らは、標的能力と安定化特性をあわせ持つものを開発した[18-20]。本発明者らは、二重膜内に適切に挿入するために、以前に開発されたコレステロール系陽イオン性脂質に基づいた糖脂質ファミリーを設計した。本発明者らの系を安定化するのに必要な炭水化物モチーフの最小サイズを評価するために、化学的選択方法[21-23]を選択し、グリコシド単位の数を容易に調整することができた[24-26]。主要な段階では、単純な炭水化物などのアルデヒド含有化合物に脂質を結合するためのオキシム結合の形成を使用した。糖脂質の合成に適用される他の方法と大きく異なり、本発明の手法は、糖単位の環状性質を効率よく保存することができ、従来の方法より簡単で、アルデヒド型が存在する限り、結合される新たな糖の各々について保護基を広範に導入する操作を必要としない（変旋光平衡）。
【００３２】
従って、本発明の別の態様によると、コレステロール基およびポリアミン基を含む化合物に保護されていない糖を反応させるステップを含む、本発明による化合物を製造する方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
（好ましい態様）
好ましい態様において、本発明の化合物は、式：Ｃｈｏｌ−Ｌ−Ｃａｒｂ（式中、Ｃｈｏｌはコレステロールであり、Ｌは必要に応じたポリアミン基であり、Ｃａｒｂはグルコースである）で表されるものである。
【００３４】
好ましい態様において、コレステロール基はコレステロールである。
【００３５】
好ましい態様において、コレステロール基は、カルバモイル結合を介して必要に応じたリンカー基に接続されている。
【００３６】
さらに好ましい態様において、本発明の化合物は、式：Ｃｈｏｌ−Ｌ−Ｃａｒｂ（式中、Ｃｈｏｌはコレステロールであり、Ｌはポリアミン基であり、Ｃａｒｂはグルコースであり、好ましくはＤ−グルコースである）で表されるものである。
【００３７】
（リンカー）
好ましい態様において、リンカー基はポリアミン基である。ポリアミン基は、得られるリポソームのＤＮＡ結合能力および遺伝子導入効率を増加するので有利であると考えられている。
【００３８】
一実施態様において、好ましくは、ポリアミン基は天然型ポリアミンである。アミノ官能基が増加すると、リポソームの全体的な正電荷が増加されるので、ポリアミンヘッド基は有利であると考えられている。また、ポリアミンはＤＮＡに強力に結合して、安定化することが知られている14a。また、ポリアミンは細胞中に天然に存在するので、毒性に関する問題が非常に小さいと考えられている15a。
【００３９】
別の実施態様において、好ましくは、本発明のポリアミン基の２つ以上のアミン基は、天然には見られず、天然型ポリアミン化合物のアミン基を分離する１つ以上の基によって分離されている（すなわち、好ましくは、本発明のポリアミン基は非天然型スペーサー基を有する）。
【００４０】
好ましくは、ポリアミン基は、エチレン（−ＣＨ2ＣＨ2−）基によって互いに分離されている（互いに間隔をおいて配置されている）、ポリアミン基における少なくとも２つのアミンを含有する。
【００４１】
好ましくは、ポリアミン基のアミンは各々エチレン（−ＣＨ2ＣＨ2−）基によって分離されている（互いに間隔をおいて配置されている）。
【００４２】
好適なポリアミンの典型的な例には、スペルミジン、スペルミン、カルドペンタミン（caldopentamine）、ノルスペルミジンおよびノルスペルミンが挙げられる。スペルミジンおよびスペルミンは、１本鎖または２本鎖ＤＮＡと相互作用することが知られているので、好ましくは、ポリアミンはスペルミジンまたはスペルミンである。別の好ましいポリアミンはカルドペンタミンである。
【００４３】
好ましい態様において、リンカー基はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基である。ＰＥＧ基は、好ましくは、サイズが４〜１６オキシエチレン単位、例えば、４、６、８、１０、１２、１４または１６オキシエチレン単位を含有する。
【００４４】
好ましい態様において、リンカー基は（ＰＥＧ）基およびポリアミン基を含有する。好ましい態様において、リンカー基は、オキシエチレン基とアミン基の接合物である。これらの態様のどれにおいても、上記に等しく開示されているＰＥＧ基およびポリアミン基の好ましい特徴が適用される。
【００４５】
（炭水化物）
好ましい態様において、炭水化物部分は単糖である。
【００４６】
好ましい態様において、炭水化物部分は糖部分である。
【００４７】
好ましくは、炭水化物部分は、マンノース、グルコース（Ｄ−グルコース）、ガラクトース、グルクロン酸、ラクトース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトヘプタオースおよびそれらの混合物から選択される。さらに好ましくは、炭水化物部分はＤ−グルコースである。
【００４８】
一態様において、本発明の化合物は１〜７の炭水化物部分を含む。好ましくは、本発明の化合物は１つの炭水化物部分を含む。
【００４９】
（コレステロール）
コレステロール基はコレステロールまたはその誘導体であってもよい。コレステロール誘導体の例には、環状ＣＨ2またはＣＨ基の１つ以上および／または直鎖状ＣＨ2またはＣＨ基の１つ以上が適当に置換されている置換誘導体が挙げられる。代わりにまたは加えて、環状基の１つ以上および／または直鎖状基の1つ以上は置換されていてもよい。
【００５０】
好ましい実施態様において、コレステロール基はコレステロールである。コレステロールは得られるリポソーム二重膜を安定化するので、有利であると考えられている。
【００５１】
好ましくは、コレステロール基は、カルバモイル結合を介して必要に応じたリンカー基に結合される。得られるリポソームは細胞毒性が低いかごくわずかなので、この接続は有利であると考えられている。
【００５２】
（さらに別の態様）
好ましくは、化合物は、ヌクレオチド配列と混合または結合される。
【００５３】
ヌクレオチド配列は、遺伝子治療などの治療に有用になりうる発現系の一部または全てであってもよい。
【００５４】
好ましい態様において、本発明の化合物は、非ウィルス核酸送達ベクターを提供するために、凝縮されたポリペプチド／核酸複合体（condensed polypeptide/nucleic acid complex）と混合される。凝縮されたポリペプチド／核酸複合体は、好ましくは、本発明者らの同時係属出願番号ＰＣＴ／ＧＢ００／０４７６７号に開示されているものを含む。好ましくは、ポリペプチドまたはそれらの誘導体は、核酸複合体に結合することができる。好ましくは、ポリペプチドまたはそれらの誘導体は核酸複合体を凝縮することができる。好ましくは、核酸複合体は、ポリペプチドまたはそれらの誘導体に対して異種である。
【００５５】
好ましくは、本発明の方法はモレキュラーシーブの使用を含む。
【００５６】
好ましくは、陽イオン性リポソームは、本発明の化合物およびＤＯＴＭＡまたはＤＯＰＥなどの中性リン脂質から形成される。好ましくは、中性リン脂質はＤＯＰＥである。
【００５７】
一態様において、糖は、ポリアミンの末端アミンを介してポリアミン基に結合される。言い換えると、ポリアミンの一級アミンは置換されている。
【００５８】
要約すると、本発明は、コレステロール基および炭水化物部分を含む、陽イオン性脂質として作用し得る化合物を提供する。
【００５９】
本発明の好ましい実施態様は、陽イオン性脂質として作用することができ、ポリアミン基を介して糖に接続されているコレステロール基を含む化合物である。
【００６０】
本発明のさらに好ましい実施態様は、陽イオン性脂質として作用することができ、ポリアミン基を介してグルコースが接続されているコレステロール基を含む化合物である。
【００６１】
本発明のさらに好ましい実施態様は、陽イオン性脂質として作用することができ、ポリアミン基を介してグルコース（好ましくは、Ｄ−グルコース）が接続されているコレステロールを含む化合物である。
【００６２】
本発明の一態様において、本発明の糖はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）によって完全に、または部分的に置換されていてもよい。従って、さらに別の態様において、本発明によると、
・陽イオン性脂質として作用することができ、コレステロール基およびポリエチレングリコール部分を含む化合物。
・陽イオン性脂質として作用することができ、ポリエチレングリコールにポリアミン基を介して接続されているコレステロール基を含む化合物。
・陽イオン性脂質として作用することができ、ポリアミン基を介してポリエチレングリコールが接続されているコレステロール基を含む化合物。
・陽イオン性脂質として作用することができ、ポリアミン基を介してポリエチレングリコールが接続されているコレステロールを含む化合物。
が提供される。
【００６３】
一態様において、本発明の陽イオン性脂質には、糖部分またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分が修飾されている。さらに別の態様において、本発明の複合体は、陽イオン性脂質として作用することができ、アミン基を介して、糖部分またはポリエチレングリコール部分に接続されているコレステロール基を含む化合物をさらに含む。実施例において証明するように、本発明者らは、このような糖／ＰＥＧ修飾した陽イオン性脂質は特に有利であることを見出した。従って、さらに別の態様において、本発明は、陽イオン性脂質として作用することができ、アミン基を介して、糖部分またはポリエチレングリコール部分に接続されているコレステロール基を含む化合物を提供する。好ましくは、化合物は、１〜７の糖部分またはポリエチレングリコール部分を含む。化合物は、糖部分とポリエチレングリコール部分の混合物を含んでもよい。好ましくは、糖部分は、グルコースまたはＤ−グルコースであるか、またはグルコースまたはＤ−グルコース由来である。
【００６４】
本発明は、ここで、添付の図面を参照して、単に例としてさらに詳細に記載される。
【００６５】
本発明は、ここで、以下の実施例においてさらに詳細に記載される。
【実施例】
【００６６】
［実験の部］
〔ネオ糖脂質の合成〕
一般：1Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、周囲温度において、Brucker DRX400、DRX300またはJeol GX-270Q分光計で、内部基準として同位体で標識していない残存溶媒（例えば、ＣＨＣｌ3、δH＝７．２６）を用いて記録した。13Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、内部基準として同位体で標識していない残存溶媒（例えば、ＣＨＣｌ3、δH＝７７．２）を用いて、それぞれ、１００、７５および６８．５ＭＨｚの同じ範囲の分光計で記録した。赤外スペクトルは、ＮａＣｌプレートを使用して、JascoFT/IR620で記録し、質量スペクトル（正イオンエレクトロスプレイ）は、VG-7070BまたはJEOL SX-102装置を使用して記録した。クロマトグラフィーはフラッシュクロマトグラフィーをいい、都合のよい溶媒を用いてMerck-Kieselgel60（２３０〜４００メッシュ）で最初から最後まで実施した。薄層クロマトグラフィー（Ｔｌｃ）は、アルミニウムの板上にMerck-Kieselgel60F254を事前コーティングしたもので実施し、紫外線、ヨウ素、酸性モリブデン酸アンモニウム（IV）、酸性バニリンエタノール液または他の試薬で適宜可視化した。ネオ糖脂質の純度は、Purospher（登録商標）RP-18エンドキャップ処理済みカラム（５μｍ）を使用したHitachiシステムで分析用高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して評価した。溶出は、ＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ（６０：４０）を用いて１ｍＬ／分のイソクラティック流速で実施し、分画を２０５ｎｍの波長で検出してから、回収し、質量分析を実施した。乾燥ＣＨ2Ｃｌ2は、使用前に五酸化リン（phosphorous pentoxide）と共に蒸留した。他の乾燥溶媒および化学物質は全てシグマ−アルドリッチカンパニーＬＴＤ（Sigma-Aldrich Company LTD）（Poole,Dorset,UK）から購入した。
【００６７】
略語：Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、ｂｒ：広域（broad）、Ｃｈｏｌ：コレステリル、ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド、ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸、ＴＨＦ：テトラヒドロフラン。
【００６８】
２−（コレステリルオキシカルボニル）アミノエタノール（２）：コレステリルクロロホルメート（９９．８９ｇ，０．２１８ｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2（６００ｍＬ）溶液を、撹拌中の２−アミノエタノール（２９．５ｍＬ，０．４８９ｍｏｌ，２．２当量）のＣＨ2Ｃｌ2（４５０ｍＬ）溶液に０℃において２時間で添加した。反応液を室温にし、撹拌をさらに１４時間継続した。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ3（２＊２００ｍＬ）、水（２＊２００ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ4）、減圧下溶媒を除去した。得られた固体を再結晶して（ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ）、２を白色の固体として得た。収率：９９．６７ｇ（９７％）、ｍ．ｐ．：１８０℃、Ｒｆ＝０．２６（アセトン／エーテル１：９）、ＩＲ（ＣＨ2Ｃｌ2）：νmax＝３３５３，２９４２，２８７０，１６９３，１６７４，１５６２，１４６７，１３８２，１２６４ｃｍ-1、1Ｈ  ＮＭＲ（２７０  ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ＝５．３５（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，  Ｈ，Ｈ６'），５．２５−５．２９（ｍ，１Ｈ，ＮＨ），４．４２−４．５７（１Ｈ，ｍ，Ｈ３'），３．７０−３．６２（ｍ，２Ｈ，Ｈ１），３．２５−３．３５（ｍ，２Ｈ，Ｈ２），３．１２（ｓ，１Ｈ，ＯＨ），２．２８−２．３８（ｍ，２Ｈ，Ｈ４'），１．７７−２．０３（ｍ，５Ｈ，Ｈ２'，Ｈ７'，Ｈ８'），１．５９−０．９６（ｍ，２１Ｈ，Ｈ１'，Ｈ９'，Ｈ１１'，Ｈ１２'，Ｈ１４'−Ｈ１７'，Ｈ２２'−Ｈ２５'），１（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１９'），０．９（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ，Ｈ２１'），．８７（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ，Ｈ２６'＆Ｈ２７'）および．６７（ｓ，３Ｈ，Ｈ１８'）、ＭＳ（ＦＡＢ+）：ｍ／ｚ＝４９６［Ｍ＋Ｎａ］+，４７４［Ｍ＋Ｈ］+，３６９［Ｃｈｏｌ］+，２５５，１７５，１４５，１０５，９５，８１，４３。
【００６９】
２−［（コレステリルオキシカルボニル）アミノ］エチルメタンスルホネート（３）：２（２５ｇ，５２．３ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２２ｍＬ，０．１６ｍｏｌ，３当量）のＣＨ2Ｃｌ2（５００ｍＬ）溶液に、０℃において、塩化メタンスルホニル（１０．５ｍＬ，０．１３ｍｏｌ，２．５当量）溶液を滴加した。反応混合物を室温に加温し、１時間３０分撹拌した。反応が終了したことをＴｌｃ分析が示したら、氷を添加して反応を停止した。反応混合物を飽和ＮＨ4Ｃｌ水溶液（６００ｍＬ）に添加し、エーテル（３＊３００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせて水（２＊３００ｍＬ）、食塩水（２５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥した（ＭｇＳＯ4）。減圧下溶媒を除去して、白色の固体を得、クロマトグラフィー（エーテル）で精製して３を得た。収率：２８．３ｇ（９８％）、ＩＲ（ＣＨ2Ｃｌ2）：νmax＝３４５３，３３４２，１７１６，１５３１，１３７７，１１３７＆７９８ｃｍ-1、1Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ＝５．３４（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ６'），５−５．１（ｍ，１Ｈ，ＮＨ），４．４１−４．５３（１Ｈ，ｍ，Ｈ３'），４．２９−４．２５（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ１），３．４７−３．５２（ｍ，２Ｈ，Ｈ２），３．０１（ｓ，３Ｈ，Ｈ３），２．２４−２．３６（ｍ，２Ｈ，Ｈ４'），１．７４−２（ｍ，５Ｈ，Ｈ２'，Ｈ７，Ｈ８'），０．９−１．６（ｍ，２１Ｈ，Ｈ１'，Ｈ９'，Ｈ１１'，Ｈ１２'，Ｈ１４'−Ｈ１７'，Ｈ２２'−Ｈ２５'），０．９８（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１９'），０．８４（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ，Ｈ２１'），．８３（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ，Ｈ２６'＆Ｈ２７'）および．６５（ｓ，３Ｈ，Ｈ１８'）、ＭＳ（ＦＡＢ+）：ｍ／ｚ＝１１０４［２Ｍ＋Ｈ］+，５７４［Ｍ＋Ｎａ］+，５５２［Ｍ＋Ｈ］+，３６９［Ｃｈｏｌ］+，２５５，１７５，１４５，９５，８１。
【００７０】
４−アザＮ6（コレステリルオキシカルボニルアミノ）ヘキサノール）（４）：最小量のＴＨＦに溶解した３（２８，３ｇ，５１ｍｍｏｌ）の撹拌中の溶液に、アミノ−プロパノール（１６０ｍＬ、２ｍｏｌ、３９当量）を添加した。Ｔｌｃが反応の終了を示したら（１２時間）、ＣＨＣｌ3（３５０ｍＬ）およびＫ2ＣＯ3（２０ｇ）を添加し、溶液を３０分間激しく撹拌した。次いで、懸濁液をCelite（登録商標）の短いパッドでろ過し、ＣＨＣｌ3で十分に洗浄した。これを飽和炭酸水素ナトリウム（Sodium Hydrogenocarbonate）で洗浄し、乾燥した（Ｎａ2ＣＯ3）。溶媒を除去して、４を白色固体として得た。収率２６．１ｇ（９６％）、ＩＲ（ＣＨ2Ｃｌ2）：νmax＝３３５０−３２１０，２９３７，２８５０，１５３１，１４６０，１３８０，１２２０，１１２０，１０４０ｃｍ-1，1Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ＝５．３３−５．３５（ｍ，１Ｈ，Ｈ６'），４．９２−４．９６（ｍ，１Ｈ，ＮＨ），４．４２−４．５１（１Ｈ，ｍ，Ｈ３'），３．７−３．８３．（ｍ，２Ｈ，Ｈ５）３．２３−３．２９（ｍ，２Ｈ，Ｈ１），２．７３−２．５７（ｍ，６Ｈ，Ｈ２，Ｈ３，Ｈ４），２．２−２．３６（ｍ，２Ｈ，Ｈ４'），１．７−２（ｍ，５Ｈ，Ｈ２'，Ｈ７'，Ｈ８'），０．８５−１．５８（ｍ，２１Ｈ，Ｈ１'，Ｈ９'，Ｈ１１'，Ｈ１２'，Ｈ１４'−Ｈ１７'，Ｈ２２'−Ｈ２５'），０．９８（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１９'），０．８４（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ，Ｈ２１'），８（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ，Ｈ２６'＆Ｈ２７'）および０．６１（ｓ，３Ｈ，Ｈ１８'）、ＭＳ（ＦＡＢ+）：ｍ／ｚ＝５４３［Ｍ＋Ｎａ］+，５３０［Ｍ＋Ｈ］+，４８５［Ｍ−ＣＯ2］+，３６９［Ｃｈｏｌ］+，１４４［Ｍ−Ｏｃｈｏｌ］+，６９，５５。
【００７１】
４−アザ−［Ｂｏｃ］−Ｎ6（コレステリルオキシカルボニルアミノ）ヘキサノール（５）：４（２６．１ｇ，４９ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｅｔ3Ｎ（８．３ｍＬ，１．１当量）およびＢｏｃ2Ｏ（１０．７ｇ，１当量）のＣＨ2Ｃｌ2（２００ｍＬ）溶液を添加し、得られた溶液をｔｌｃで追跡した。反応が終了したら、反応混合物をＮＨ4Ｃｌ（１００ｍＬ）に注ぎ、水で洗浄して、乾燥した（Ｎａ2ＳＯ4）。真空下溶媒を除去して、白色の固体５を得た。溶媒を減圧下除去して、白色の固体を得、クロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ／ＮＨ3  ９２：７：１）で精製して、３を得た。収率（２７．９ｇ，９０％）、ＩＲ（ＣＨ2Ｃｌ2）：νmax＝３３５２，３０５４，２９３７，１６７５，１５３０，１４５５，１３８０，１２２０，１１２０、1Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ＝５．３３−５．３５（ｍ，１Ｈ，Ｈ６'），４．８６（ｍ，１Ｈ，ＮＨ），４．４２−４．５（１Ｈ，ｍ，Ｈ３'），３．６２−３．７（ｍ，２Ｈ，Ｈ５），３．２７−３．３８（ｍ，６Ｈ，Ｈ１，Ｈ２，Ｈ３），２．１８−２．３３（ｍ，２Ｈ，Ｈ４'），１．７３−２（ｍ，５Ｈ，Ｈ２'，Ｈ７'，Ｈ８'），１．４５（ｓ，９Ｈ，Ｂｏｃ），１−１．６５（ｍ，２３Ｈ，Ｈ４，Ｈ１'，Ｈ９'，Ｈ１１'，Ｈ１２'，Ｈ１４'−Ｈ１７'，Ｈ２２'−Ｈ２５），０．９７（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１９'），０．９３（ｄ，  Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ，Ｈ２１'），０．８（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ，Ｈ２６'＆Ｈ２７'）および０．６５（ｓ，３Ｈ，Ｈ１８'）、ＭＳ（ＦＡＢ+）：ｍ／ｚ＝  ６５４［Ｍ＋Ｎａ］+，５４３［Ｍ−Ｂｏｃ］+，３６９［Ｃｈｏｌ］+，１４５，１２１，９５，６９，５７。
【００７２】
４−アザ−（Ｂｏｃ）−Ｎ6−（コレステリルオキシカルボニルアミノ）ヘキシルメタン−スルホネート（６）：この実験では、２−［（コレステリルオキシカルボニル）アミノ］エチルメタンスルホネート３の製造と同様の方法を４４ｍｍｏｌスケールで実施し、６を得た。収率（２８ｇ，９０％）、ＩＲ（ＣＨ2Ｃｌ2）：νmax＝３３０５，２９８０，２９００，２８６５，１６７５，１５３０，１４５５，１３５０，１１５０、1Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ＝５．３３−５．３５（ｍ，１Ｈ，Ｈ６'），４．８６（ｍ，１Ｈ，ＮＨ），４．３５−４．５５（ｍ，１Ｈ，Ｈ３'），４．２２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，Ｈ５），３．２−３．４（ｍ，６Ｈ，Ｈ１，Ｈ２，Ｈ３），３．０１（ｓ，３Ｈ，Ｈ６），２．１５−２．３３（ｍ，２Ｈ，Ｈ４'），１．７３−２（ｍ，５Ｈ，Ｈ２'，Ｈ７'，Ｈ８），１．４４（ｓ，９Ｈ，Ｂｏｃ），１−１．６７（ｍ，２３Ｈ，Ｈ４，Ｈ１'，  Ｈ９'，Ｈ１１'，Ｈ１２'，Ｈ１４'−Ｈ１７，Ｈ２２'−Ｈ２５'），０．９７（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１９'），０．９４（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ，Ｈ２１'），０．８（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ，Ｈ２６'＆Ｈ２７'）および０．６５（ｓ，３Ｈ，Ｈ１８'）、ＭＳ（ＦＡＢ+）：ｍ／ｚ＝７２２［Ｍ＋Ｎａ］+，６０９［Ｍ−Ｂｏｃ］+，３６９［Ｃｈｏｌ］+，１４５，１２１，９５，６９，５５。
【００７３】
４−アザ−（Ｂｏｃ）−Ｎ6−（コレステリルオキシカルボニルアミノ）ヘキサンアミン（７）：６（２５ｇ，３５ｍｍｏｌ）、アジ化ナトリウム（１１．４９，１７５．７ｍｍｏｌ，５当量）およびヨウ化ナトリウム（５ｇ，３５ｍｍｏｌ，１当量）に、窒素雰囲気下において無水ＤＭＦ（２００ｍＬ）を撹拌しながら添加した。還流冷却器に入れ、８０℃において２時間加熱して反応を終了させた。反応混合物を室温に冷却し、減圧下ＤＭＦを除去し、残渣をＥｔＯＡｃに溶解した。これを水（２＊１００ｍＬ）、食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、クロマトグラフィー（ヘキサン／エーテル  １：１）で精製後、７を白色固体として得た。収率（２２ｇ，９５％）、1Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣl３）：δ＝５．３４−５．３６（ｍ，１Ｈ，Ｈ６'），４．３５−４．５５  （ｍ，１Ｈ，Ｈ３'），４．２５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，Ｈ５），３．２−３．５（ｍ，６Ｈ，Ｈ１，Ｈ２，Ｈ３），２．２５−２．３３（ｍ，２Ｈ，Ｈ４'），１．７−２．０５（ｍ，５Ｈ，Ｈ２'，Ｈ７'，Ｈ８'），１．４５（ｓ，９Ｈ，Ｂｏｃ），  １−１．７２（ｍ，２３Ｈ，Ｈ４，Ｈ１'，Ｈ９'，Ｈ１１'，Ｈ１２'，Ｈ１４'−Ｈ１７'，Ｈ２２'−Ｈ２５'），０．９８（３Ｈ，ｓ，Ｈ１９'），０．９４（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ，Ｈ２１'），０．８３（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ，Ｈ２６'＆Ｈ２７'）および０．６４（ｓ，３Ｈ，Ｈ１８'）、ＭＳ（ＦＡＢ+）：ｍ／ｚ＝５６８［Ｍ＋Ｎａ−Ｂｏｃ］+，５５６［Ｍ−Ｂｏｃ］+，３６９［Ｃｈｏｌ］  +，１４５，１２１，９５，６９，５７。
【００７４】
４−アザ−（Ｂｏｃ）−Ｎ6−（コレステリルオキシカルボニルアミノ）ヘキシルアミン（８）：７（２２．７５ｇ，３４，６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２３０ｍＬ）を入れた丸底フラスコに、トリメチルホスフィンのＴＨＦ溶液（１Ｍ，４０ｍＬ，  １．１５当量）を添加し、反応をｔｌｃでモニターした。反応が終了したら、反応液を水（３ｍＬ）およびアンモニア水（３ｍＬ）と共に１時間撹拌し、溶媒を減圧下除去した。クロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ／ＮＨ3  ９２：７：１〜７５：２２：３）後、８を白色の結晶として得た。収率（１９．１ｇ，８８％）、ＩＲ（ＣＨ2Ｃｌ2）：νmax＝３６８９，３４５６，３１５５，２９４８，２９０７，２８６９，２２５３，１７９３，１７０９，１５１２，１４６８，  １３８１，１１６８、1Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ＝５．３２−５．３５（ｍ，１Ｈ，Ｈ６'），４．３５−４．５１（ｍ，１Ｈ，Ｈ３'），３．４５−３．０５（ｍ，８Ｈ，Ｈ１，Ｈ２，Ｈ３，Ｈ５），２．１８−２．４（ｍ，  ２Ｈ，Ｈ４'），１．８−２．１（ｍ，５Ｈ，Ｈ２'，Ｈ７'，Ｈ８'），１．４６（ｓ，  ９Ｈ，Ｂｏｃ），１．０１−１．７２（ｍ，２３Ｈ，Ｈ４，Ｈ１'，Ｈ９'，Ｈ１１'，  Ｈ１２'，Ｈ１４'−Ｈ１７'，Ｈ２２'−Ｈ２５'），０．９７（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１９'），０．８５（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ，Ｈ２１'），０．８２（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ，Ｈ２６'＆Ｈ２７'）および０．６４（ｓ，３Ｈ，Ｈ１８'）、ＭＳ（ＦＡＢ+）：ｍ／ｚ＝６３０［Ｍ＋Ｈ］+，５３０［Ｍ−Ｂｏｃ］+，３６９  ［Ｃｈｏｌ］+，１４５，１２１，９５，６９，５７。
【００７５】
（Ｂｏｃ）アミノオキシ酢酸（９）：Ｏ−（カルボキシメチル）ヒドロキシルアミンヘミ塩酸塩（１．１６ｇ，５．３ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（４０ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（３ｍＬ）を添加してｐＨを９に調整した。次いで、ジ−ｔｅｒｔ−ジカルボネート（２．３６ｇ，１０．６ｍｍｏｌ，２．０当量）を添加し、ｔｌｃが反応の終了を示すまで、混合物を室温において撹拌した。希ＨＣｌを添加してｐＨを３に低下した。反応混合物を、飽和ＮＨ4Ｃｌ水溶液（２０ｍＬ）とＣＨ2Ｃｌ2（３０ｍＬ）に分配した。水層をＣＨ2Ｃｌ2（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機抽出層を合わせてＨ2Ｏ（２×１００ｍＬ）で洗浄して、乾燥した（Ｎａ2ＳＯ4）。真空下溶媒を除去して、９を白色の固体として得た。収率（１．８６ｇ，９７％）、ＩＲ（ＣＨ2Ｃｌ2）νmax＝３３７３，２９８３，２５７４，２４６１，１７２４，１４１３，１３６９，１２３５、1Ｈ  ＮＭＲ  （２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ＝４．４８（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2），１．４８（ｓ，９Ｈ，Ｂｏｃ）、ＭＳ（ＦＡＢ+）：ｍ／ｚ＝２１４［Ｍ＋Ｎａ］+，１９２［Ｍ＋Ｈ］+，１３５，１２３，１０９，６９。
【００７６】
（Ｂｏｃ）アミノオキシ化合物（１０）：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．３６ｇ，３．１３ｍｍｏｌ，１当量）、９（０．６ｇ，３．１３ｍｍｏｌ，１当量）およびＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．６８ｇ，３．１３ｍｍｏｌ，１当量）をＥｔＯＡｃ（９０ｍＬ）に溶解し、不均質な混合物を室温において終夜撹拌した。次いで、混合物をCelite（登録商標）パッドでろ過して、白色の沈殿物として形成されたジシクロヘキシルウレアを除去し（６０ｍＬのＥｔＯＡｃですすいだ）、８（１．９７ｇ，３．１３ｍｍｏｌ，１当量）のＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液に添加した。トリエチルアミン（６ｍＬ）を添加して、この不均質な反応ではｐＨ８を維持した。得られた混合物を室温において終夜撹拌した。反応が終了したら、混合物をろ過し、減圧下溶媒を除去して、フラッシュ−クロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ／ＮＨ3  ９２：７：１）による精製後、１０を白色の固体として得た。収率（２．３ｇ，９０％）、1Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ＝５．３３−５．３５（ｍ，１Ｈ，Ｈ６'），４．４−４．５２（ｍ，１Ｈ，Ｈ３'），４．３（ｓ，２Ｈ，Ｈ９０，３．２−３．４２（ｍ，８Ｈ，Ｈ１，Ｈ２，Ｈ４，Ｈ６），２．２３−２．３５（ｍ，２Ｈ，Ｈ４'），１．７−２．１（ｍ，７Ｈ，Ｈ２'，Ｈ７'，Ｈ８'，Ｈ５），１．４４−１．４６（ｍ，１８Ｈ，２Ｂｏｃ），１−１．７３（ｍ，２１Ｈ，Ｈ１'，Ｈ９'，Ｈ１１'，Ｈ１２'，Ｈ１４'−Ｈ１７，Ｈ２２'−Ｈ２５'），０．９８（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１９'），０．８５（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ，Ｈ２１'），０．８３（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ，Ｈ２６'＆Ｈ２７'）および０．６５（ｓ，３Ｈ，Ｈ１８'）、ＭＳ（ＦＡＢ+）：ｍ／ｚ＝８０３［Ｍ＋Ｈ］+，７０３［Ｍ−Ｂｏｃ］+，６４７，６０３  ［Ｍ−２Ｂｏｃ］+，３６９，２７９，２５５，２３５，２０４，１４５，９５，６９。
【００７７】
ヒドロキシルアミン（１１）：１０（１．１ｇ，１．３６ｍｍｏｌ，１当量）のＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍＬ）溶液に、ＴＦＡ（２ｍＬ，２０．４ｍｍｏｌ，１５当量）を０℃において添加した。溶液を室温において５時間撹拌した。反応が終了したら、反応混合物からのＴＦＡ共沸混合物にトルエンを添加した。真空下溶媒を除去し、クロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ／ＮＨ3  ９２：７：１〜７５：２２：３）で精製して、１１を白色の固体として得た（７０９ｍｇ，収率８６％）、ＩＲ（ＣＨＣｌ3）：νmax＝３３０６，２９４８，２８５０，２２４６，１６９８，１６４７，１５４１，１４６７，１２５３，１１３３、1Ｈ  ＮＭＲ  （２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ＝５．２６−５．４（ｍ，１Ｈ，Ｈ６'），４．４−４．５２（ｍ，１Ｈ，Ｈ３'），４．１２（ｓ，２Ｈ，Ｈ９），３．３４−３．４１（ｍ，２Ｈ，Ｈ２），３．１５−３．３（ｍ，２Ｈ，Ｈ４），２．６−２．７４（ｍ，４Ｈ，Ｈ１＆Ｈ６），２．１４−２．３９（ｍ，２Ｈ，Ｈ４'），１．６２−２．１（ｍ，７Ｈ，Ｈ２'，Ｈ７'，Ｈ８'，Ｈ５），１．０２−１．６（ｍ，２１Ｈ，Ｈ１'，Ｈ９'，Ｈ１１'，Ｈ１２'，Ｈ１４'−Ｈ１７'，Ｈ２２'−Ｈ２５'），  ０．９６（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１９'），０．８６（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ，Ｈ２１'），０．８３（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ，Ｈ２６'＆Ｈ２７'）および０．６６（ｓ，３Ｈ，Ｈ１８'）、ＭＳ（ＦＡＢ+）：ｍ／ｚ＝６０３［Ｍ＋Ｈ］+，３６９［Ｃｈｏｌ］+，１６０，１３７，１０９，９５，８１，６９，５５。
【００７８】
マンノシル化合物（１２ａ）：Ｄ−マンノース（２６６ｍｇ，４．８ｍｍｏｌ）の酢酸緩衝水溶液（酢酸ナトリウム／酢酸０．１Ｍ、ｐＨ４、７ｍＬ）および１１（２９０ｍｇ，０．４８ｍｍｏｌ，１０当量）のＤＭＦ（７ｍＬ）溶液を混合し、室温において３日間撹拌した。凍結乾燥によって溶媒を真空下除去し、クロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ／ＮＨ3  ７５：２２：３）により生成物２１を白色の固体（２３３ｍｇ，収率：６５％）として得た。ＨＰＬＣによってさらに純度を確認した。最終生成物は、分離しなかったが、混合物で特徴づけた、β−ピラノース（８２％）型およびα−ピラノース（１８％）型を含有した。ＭＳ（ＦＡＢ+）：ｍ／ｚ＝７６５［Ｍ＋Ｈ］+，７８７［Ｍ＋Ｎａ］+，３９７，３６９［Ｃｈｏｌ］+，３２２，２４０，１２１，１０９，９５，８１，６９，５７。β−ピラノース型。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ／ＣＤＣｌ3［７５／２５］）：δ＝７．６４−７．６２（ｄ，3Ｊ1a-2a＝７Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１ａ），５．３５−５．３６（ｍ，１Ｈ，Ｈ６'），４．４５−４．５（ｓ，２Ｈ，Ｈ９），４．３５−４．５（ｍ，１Ｈ，Ｈ３'），４．１９−４．２４（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ２ａ，3Ｊ1a-2a＝７．４Ｈｚ，3Ｊ2a-3a＝７．７Ｈｚ），３．８１−３．９（ｍ，  １Ｈ，Ｈ３ａ），３．７３−３．８（ｍ，２Ｈ，Ｈ４ａ，Ｈ６axａ），３．６３−３．７１（ｍ，２Ｈ，Ｈ５ａ，Ｈeq６ａ），３．３４−３．４２（ｍ，２Ｈ，Ｈ２），３．２７−３．３０（ｍ，２Ｈ，Ｈ４），３−３．０８（ｍ，２Ｈ，Ｈ１），２．９−２．９８（ｍ，２Ｈ，Ｈ６），２．２５−２．３５（ｍ，２Ｈ，Ｈ４'），１．７８−２．０７（ｍ，７Ｈ，Ｈ２'，Ｈ７'，Ｈ８'，Ｈ５），１．０３−１．６５（ｍ，２１Ｈ，Ｈ１'，Ｈ９'，Ｈ１１'，Ｈ１２'，Ｈ１４'−Ｈ１７'，Ｈ２２'−Ｈ２５'），１．０１（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１９'），０．９１（ｄ，Ｊ＝６．５  Ｈｚ，３Ｈ，Ｈ２１'），０．８５（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ，Ｈ２６'＆Ｈ２７'）および０．６９（ｓ，３Ｈ，Ｈ１８'）、13Ｃ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3／ＣＤ3ＯＤ［２５／７５］）：１２．３３（Ｃ１８'），１９．２０（Ｃ２１'），１９．７４（Ｃ１９'），２１．９１（Ｃ１１'），２２．９１（Ｃ２７'），２３．１７（Ｃ２６'），２４．６７（Ｃ２３'），２５．０７（Ｃ１５'），２７．３７（Ｃ５），２８．８５（Ｃ２５'），２８．９６（Ｃ２'），２９．０７（Ｃ１２'），  ３２．７６（Ｃ７'），３２．８７（Ｃ８'），３６，３８（Ｃ２），３６．７８（Ｃ２０'），３７．０９（Ｃ１）３７．７６（Ｃ２２'），３７．９５（Ｃ１'），３８．４（Ｃ４），３９．３６（Ｃ４'），４０．４１（Ｃ２４'），４０．７６（Ｃ１６'），４６．１６（Ｃ６），５１．１９（Ｃ９'），５７．１９（Ｃ１７'），５７．７５（Ｃ１４'），６４．６２（Ｃ６ａ），７０．１９（Ｃ２ａ），７０．５８（Ｃ４ａ），７２．１２（Ｃ３ａ），７２．３７（Ｃ５ａ），７３．１１（Ｃ９），７５．９１（Ｃ３'），１２３．３９（Ｃ６'），１４０．７２（Ｃ５'），１５５．０２（Ｃ１ａ），１５８．６９（ＮＨＣＯＯＣｈｏｌ），１７３．１（Ｃ８）、α−ピラノース型：以下を除いて同じデータ、1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ／ＣＤＣｌ3  ［７５／２５］��：δ＝６．９０−６．８８（ｄ，3Ｊ1a-2a＝７Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１ａ），５−５．０５（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ２ａ，3Ｊ1a-2a＝７．３Ｈｚ，3Ｊ2a-3a  ＝７．６Ｈｚ）、13Ｃ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3／ＣＤ3ＯＤ［２５／７５］）：６５．３３（Ｃ２ａ），１５５．７９（Ｃ１ａ）。1Ｈ  ＮＭＲ（４００，  ＣＤ3ＯＤ／ＣＤＣｌ3［７５／２５］）：（ｍ，１Ｈ，Ｈ３'）溶媒ピークに隠れている；1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ＝４．６７−４．８２（ｍ，１Ｈ，Ｈ３'）。13Ｃ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3／ＣＤ3ＯＤ［２５／７５］）：Ｃ１はＭｅＯＨピークに隠れている。４９付近を４００ＭＨｚにおいて1Ｈ／13Ｃ相関で確認。1Ｈグラジエント型ＤＱＦ−ＣＯＳＹおよびＴＯＣＳＹを使用してプロトン共鳴帰属を確認した。1Ｈ／13Ｃ相関およびＤＥＰＴ１３５を使用して、炭素共鳴を明白に帰属した。αピラノース型は1Ｊ13Ｃ１ａ−Ｈ１ａ＝１７７Ｈｚであり、βピラノース型は1Ｊ13Ｃ１ａ−Ｈ１ａ＝１６７Ｈｚであった。1Ｈフェーズセンシティブ（phase-sensitive）ＮＯＥＳＹは立体配座を確認した。
【００７９】
グリコシル化合物（１２ｂ）：これは、１２ａの製造と同様の方法で、Ｄ−グルコース（１５０ｍｇ，０．８２ｍｍｏｌ）および１１（１００ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ）の溶液を用いて製造し、１日撹拌し、クロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ／ＮＨ3  ７５：２２：３）で精製し、生成物１２ｂを白色の固体として得た（１０３ｍｇ，収率：８２％）。ＨＰＬＣでさらに純度を確認した。最終生成物は、分離しなかったが、混合物で特徴づけた、α−ピラノース（１１％）アノマーおよびβ−ピラノース（８９％）アノマーを含有した。（ＦＡＢ+）：ｍ／ｚ＝７６５［Ｍ＋Ｈ］+，７８７［Ｍ＋Ｎａ］+，３９１，３６９［Ｃｈｏｌ］+，３０９，２９０，１７１，１５２，１３５，１２３，１０９，９５，８１，６９；β−ピラノース型。（３００ＭＨｚ，ＣＤＣ１3／ＣＤ3ＯＤ［９０／１０］）：δ＝７．５３−７．５６（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１ａ），５．２６−５．３６（ｍ，１Ｈ，Ｈ６'），４．２−４．４５（ｍ，３Ｈ，Ｈ９，Ｈ３'），４．０５−４．１５（ｍ，１Ｈ，Ｈ２ａ），３．４５−３．８５（ｍ，５Ｈ，Ｈ６ａ，Ｈ３ａ，Ｈ５ａ，Ｈ４ａ），２．９−３．４（ｍ，Ｈ２，Ｈ４，ＭｅＯＨ），２．９−３．１５（ｍ，４Ｈ，Ｈ１，Ｈ６），２．１５−２．３（ｍ，２Ｈ，Ｈ４'），１．６５−２（ｍ，５Ｈ，Ｈ２'，Ｈ７'，Ｈ８'），０．９５−１．５５（ｍ，２３Ｈ，  Ｈ５，Ｈ１'，Ｈ９'，Ｈ１１'，Ｈ１２'，Ｈ１４'−Ｈ１７'，Ｈ２２'−Ｈ２５'），  ０．９３（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１９'），０．８４（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ，Ｈ２１'），０．７８（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ，Ｈ２６'＆Ｈ２７'）および０．６２（ｓ，３Ｈ，Ｈ１８'）；α−ピラノース型：以下を除いて同じデータ。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣ１3／ＣＤ3ＯＤ［９０／１０］）：δ＝７．２２−７．２４（ｄ，Ｊ＝６，６１Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１ａ），４．９５−５．０７（ｍ，１Ｈ，  Ｈ２ａ）；1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）：（ｍ，１Ｈ，Ｈ３'）溶媒ピークに隠れていると思われる；1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ＝４．７−４．８６（ｍ，１Ｈ，Ｈ３'）で確認した。
【００８０】
ガラクトシル化合物（１２ｃ）：これは、１２ａの製造と同様の方法でＤ−ガラクトース（５０ｍｇ，０．２７ｍｍｏｌ）および１１（４０ｍｇ，０．０６６ｍｍｏｌ）の溶液を用いて製造し、１日撹拌し、クロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ／ＮＨ3  ７５：２２：３）により精製して、生成物１２ｃを白色の固体として得た（３５ｍｇ，収率：７０％）。ＨＰＬＣでさらに純度を確認した。最終生成物は、分離しなかったが、混合物で特徴づけた、α−ピラノース（１５％）型およびβ−ピラノース（８５％）型を含有した。ＭＳ（ＦＡＢ）+）：ｍ／ｚ＝７６５［Ｍ＋Ｈ］+，５８８，３９１，３６９［Ｃｈｏｌ］+，３２２，２９０，１６５，１５２，１３５，１２１，１０９，９５，８１，６９；β−ピラノース型。1Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ＝７．７８−７．８２（ｍ，１Ｈ，Ｃ８のＮＨＣＯ），７．５５−７．５８（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１ａ），６．９５−７．１（ｍ，１Ｈ，ＮＨＣＯＯＣｈｏｌ），５．２５−５．３７（ｍ，  １Ｈ，Ｈ６'），４．２−４．４３（ｍ，３Ｈ，Ｈ９，Ｈ３'），３．２−３．９（ｍ，Ｈ２ａ，Ｈ６ａ，Ｈ３ａ，Ｈ５ａ，Ｈ４ａ，ＯＨ），２．９−３．１８（ｍ，４Ｈ，  Ｈ２，Ｈ４），２．４−２．６５（ｍ，４Ｈ，Ｈ１，Ｈ６），２．１５−２．３（ｍ，  ２Ｈ，Ｈ４'），１．６７−２（ｍ，５Ｈ，Ｈ２'，Ｈ７'，Ｈ８'），０．９２−１．６（ｍ，２３Ｈ，Ｈ５，Ｈ１'，Ｈ９'，Ｈ１１'，Ｈ１２'，Ｈ１４'−Ｈ１７'，  Ｈ２２'−Ｈ２５'），０．９６（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１９'），０．８９（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ，Ｈ２１'），０．８４（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ，Ｈ２６'＆Ｈ２７'）および０．６５（ｓ，３Ｈ，Ｈ１８'）。α−ピラノース型：以下を除いて同じデータ、1Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：６．８６−６．８８（ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１ａ）。
【００８１】
グルクロン酸化合物（１２ｄ）：これは、１２ａの製造と同様の方法でＤ−グルクロン酸ナトリウム塩一水和物（３０ｍｇ，０．１２８ｍｍｏｌ，１．５当量）および１１（５０ｍｇ，０．０８ｍｍｏｌ）の溶液を用いて製造し、１日撹拌し、クロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ／ＮＨ3  ７５：２２：３）により精製して、生成物１２ｄを白色の固体として得た（４１ｍｇ，収率：６０％）。ＨＰＬＣでさらに純度を確認した。最終生成物は、分離しなかったが、混合物で特徴づけた、α−ピラノース（８５％）型およびβ−ピラノース（１５％）型を含有した。ＭＳ（ＦＡＢ+）：ｍ／ｚ＝７７９［Ｍ＋Ｈ］+，７３３，５８８，４１１，３６９［Ｃｈｏｌ］+，３３６，２９０，２４０，２１４，１５９，１４５，１３５，１２１，１０９，９５，８１，６９，５５。β−ピラノース型。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3／ＣＤ3ＯＤ［７５／２５］）：δ＝７．５１−７．５３（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１ａ），５．２５−５．３３（ｍ，１Ｈ，Ｈ６'），４．２−４．４５（ｍ，３Ｈ，Ｈ９，Ｈ３'），３．８−４．１（ｍ，３Ｈ，Ｈ２ａ，Ｈ３ａ，Ｈ４ａ），３．６−３．７５（ｍ，１Ｈ，Ｈ５ａ），３．２−３．５５（ｍ，Ｈ２，Ｈ４，ＭｅＯＨ），２．７−３．１５（ｍ，４Ｈ，Ｈ１，Ｈ６），２．１８−２．３２（ｍ，２Ｈ，Ｈ４'），１．６２−２（ｍ，５Ｈ，Ｈ２'，Ｈ７'，  Ｈ８'），０．９−１．６（ｍ，２３Ｈ，Ｈ５，Ｈ１'，Ｈ９'，Ｈ１１'，Ｈ１２'，Ｈ１４'−Ｈ１７，Ｈ２２'Ｈ２５'），０．９３（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１９'），０．８３（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ，Ｈ２１'），０．７７（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ，Ｈ２６'＆Ｈ２７）および０．６（ｓ，３Ｈ，Ｈ１８））；α−ピラノース型：以下を除いて同じデータ、1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）：＆７．  ２２−７．２４（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１ａ），５−５．１（ｍ，１Ｈ，Ｈ２ａ）。
【００８２】
β−Ｄ−ラクトシル化合物（１２ｅ）：α（１．１３ｇ，３．３ｍｍｏｌ）および１１（２００ｍｇ，０．３３ｍｍｏｌ）を含有するβ−Ｄ−ラクトースの１４ｍＬのＤＭＦ／酢酸緩衝水溶液の溶液を室温において４日間撹拌した。凍結乾燥によって真空下溶媒を除去し、クロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ／ＮＨ3  ７５：２２：３）により生成物１２ｅを白色の固体として得た（１４５ｍｇ，収率：４７％）。ＨＰＬＣでさらに純度を確認した。最終生成物は、分離しなかったが、混合物で特徴づけた、α−ピラノース（１５％）型およびβ−ピラノース（８５％）型（約２５％のαラクトースを含有する）を含有した。ＭＳ（ＦＡＢ+）：ｍ／ｚ＝９２７［Ｍ＋Ｈ］+，５８８，４８２，３６９［Ｃｈｏｌ］+，２９０，２４３，２１６，１７８，１５２，１３５，１２１，１０９，９５，８１，６９，５５；β−ピラノース型。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3／ＣＤ3ＯＤ［２０／８０］）：δH＝７．６９−７．７１（ｄ，3Ｊ1a-2a＝５．８Ｈｚ，１Ｈ，βラクトースのＨ１ａ），７．６６−７．６８（ｄ，3Ｊ1a-2a＝  ６．２Ｈｚ，１Ｈ，αラクトースのＨ１ａ），５．３５−５．３７（ｍ，１Ｈ，Ｈ６'），  ４．３７−４．６（ｍ，４Ｈ，Ｈ９，Ｈ３'，Ｈ２ａ），４．２４．３７（ｍ，１Ｈ，Ｈ１ｂ），３．６５−４．０５（ｍ，７Ｈ，Ｈ３ａ，Ｈ４ａ，Ｈ５ａ，Ｈ４ｂ，  Ｈ５ｂ，Ｈ６ｂ），３．２５−３．６（ｍ，８Ｈ，Ｈ２，Ｈ４，Ｈ６ａ，Ｈ２ｂ，  Ｈ３ｂ，ＭｅＯＨ），３−３．２（ｍ，４Ｈ，Ｈ１，Ｈ６），２．２５−２．４２  （ｍ，２Ｈ，Ｈ４'），１．８−２．１５（ｍ，５Ｈ，Ｈ２'，Ｈ７'，Ｈ８'），１−１．６５（ｍ，２３Ｈ，Ｈ５，Ｈ１'，Ｈ９'，Ｈ１１'，Ｈ１２'，Ｈ１４'−Ｈ１７'，Ｈ２２'−Ｈ２５'），１．０１（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１９'），０．９１（ｄ，  Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ，Ｈ２１'），０．８５（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ，Ｈ２６'＆Ｈ２７'）および０．６９（ｓ，３Ｈ，Ｈ１８'）、13Ｃ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3／ＣＤ3ＯＤ［２０／８０］）：13Ｃ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ3／ＣＤ3ＯＤ［２０／８０］）：１２．３２（Ｃ１８'），１９．２（Ｃ２１'），１９．７６（Ｃ１９'），２１．９４（Ｃ１１'），２２．９１（Ｃ２７'），２３．１７（Ｃ２６'），２４．７（Ｃ２３'），２５．１（Ｃ１５'），２７．２２  （Ｃ５），２８．８９（Ｃ２５'），２９（Ｃ２'），２９．１（Ｃ１２'），３２．８  （Ｃ７'），３２．９２（Ｃ８'），３６．２９（Ｃ２２'），３６．８１（Ｃ１０'），  ３７．１２（Ｃ１'），３７．９９（Ｃ６），３８．１１（Ｃ１），３９．４８（Ｃ２），４０．４５（Ｃ２４'），４０．８０（Ｃ１６'），４６．１３（Ｃ４'），５１．２３（Ｃ９'），５７．２２（Ｃ１７'），５７．８０（Ｃ１４'），６２．４１（Ｃ６ａ），６３．４（Ｃ６ａ），７０．０２（Ｃ５ｂ），７０．６３（Ｃ２ａ），７２．８（Ｃ３ａ），７３（Ｃ３'），７３．１８（Ｃ９），７４，７５（Ｃ２ｂ），７６．  ８（Ｃ３ａ），８１（Ｃ４ｂ），９２．３９（Ｃ１ｂ），１０５．２（Ｃ３'），１２３．４２（Ｃ６'），１４０．７２（Ｃ５'），１５４．８（Ｃ１ａ），１５６．２（ＮＨＣＯＯＣｈｏｌ），１７３．１７（Ｃ８）。α−ピラノース型：以下を除いて同���データ。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ／ＣＤＣｌ3［８０／２０］）：  ８Ｈ＝７．０４−７．０５（ｄ，3Ｊ1a-2a＝５．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１ａ），５．０５−５．０７（ｍ，１Ｈ，Ｈ２ａ），４．０９−４．１１（ｍ，１Ｈ，Ｈ３ａ）；1Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）：（ｍ，１Ｈ，Ｈ３'）おそらく溶媒ピークに隠れている。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）で確認した。1Ｈグラジエント型ＤＱＦ−ＣＯＳＹおよびＴＯＣＳＹを使用してプロトン共鳴帰属を確認した。1Ｈ／13Ｃ相関およびＤＥＰＴ１３５を使用して、炭素共鳴を明白に帰属した。1Ｈフェーズセンシティブ（phase-sensitive）NOESYは立体配座を確認した。
【００８３】
マルトシル化合物（１２ｆ）：これは、１２ｅの製造と同様の方法でＤマルトース（３０ｍｇ，１．８ｍｍｏｌ，５当量）および１１（１００ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌの溶液を用いて製造し、１日撹拌し、クロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ／ＮＨ3  ７５：２２：３）により精製して、１２ｆを白色の固体として得た（１００ｍｇ，収率：６５％）。ＨＰＬＣでさらに純度を確認した。最終生成物は、分離しなかったが、混合物で特徴づけた、α−ピラノース（８７％）型およびβ−ピラノース（１３％）型を含有した。ＭＳ（ＦＡＢ+）：ｍ／ｚ＝９２７  ［Ｍ＋Ｈ］+，７６５，５８８，５５９，４８４，３６９［Ｃｈｏｌ］+，３２２，２９０，２１３，１６７，１６１，１４３，１３５，１２１，１０９，９５，８１，６９，５５。β−ピラノース型。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3／ＣＤ3ＯＤ［８０／２０］）：δ＝７．５５−７．５７（ｄ，3Ｊ1a-2a＝５．  ３  Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１ａ），５．３（ｓ，１Ｈ，Ｈ６'），４．８５−５．０２（ｍ，１Ｈ，Ｈ３'），４．０９−４．２２（ｍ，１Ｈ，Ｈ１ｂ），３．５７−４（ｍ，７Ｈ，  Ｈ３ａ，Ｈ４ａ，Ｈ５ａ，Ｈ４ｂ，Ｈ５ｂ，Ｈ６ｂ），３．２−３．６（ｍ，８Ｈ，  Ｈ２，Ｈ４，Ｈ６ａ，Ｈ２ｂ，Ｈ３ｂ，ＭｅＯＨ），２．８−３．１（ｍ，４Ｈ，  Ｈ１，Ｈ６），２．１−２．３６（ｍ，２Ｈ，Ｈ４'），１．６−２．０５（ｍ，５Ｈ，Ｈ２'，Ｈ７'，Ｈ８'），１−１．６（ｍ，２３Ｈ，Ｈ５，Ｈ１'，Ｈ９'，Ｈ１１'，Ｈ１２'，Ｈ１４'−Ｈ１７'，Ｈ２２'Ｈ２５'），０．９３（３Ｈ，ｓ，  Ｈ−１９'），０．８３（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ，Ｈ２１'），０．７８（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ，Ｈ２６'＆Ｈ２７'）および０．６（ｓ，３Ｈ，Ｈ１８'）、α−ピラノース型：以下を除いて同じデータ1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ／ＣＤＣｌ3［８０／２０］）：δ＝６．９２−６．９４（ｄ，Ｊ＝４．６２  Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１ａ），５．０２−５．１５（ｍ，１Ｈ，Ｈ２ａ），４．０４−４．０８（ｍ，１Ｈ，Ｈ３ａ）。
【００８４】
マルトトリオシル化合物（１２ｇ）：これは、１２ｅの製造と同様の方法でマルトトリオース（２４６．４ｍｇ，０．４６ｍｍｏｌ，７当量）および１１（４０ｍｇ，０．０６６ｍｍｏｌの溶液を用いて製造し、５日撹拌し、クロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ／ＮＨ3  ７５：２２：３）により精製して、１２ｆを白色の固体として得た（６１ｍｇ，収率：８５％）。ＨＰＬＣでさらに純度を確認した。最終生成物は、分離しなかったが、混合物で特徴づけた、α−ピラノース（１５％）型およびβ−ピラノース（８５％）型を含有した。ＭＳ（ＦＡＢ+）：ｍ／ｚ＝１１１１［Ｍ＋Ｎａ］+，１０８９［Ｍ＋Ｈ］+，５８８，４２３，３９１，３６９［Ｃｈｏｌ］+，２４０，１７１，１５９，１４５，１２１，１０５，９５，８１，６９；β−ピラノース型：1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3／ＭｅＯＨ［２０／８０］）：δ＝７．５６−７．５８（ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ，１Ｈ，  Ｈ１ａ），５．２−５．２７（ｍ，１Ｈ，Ｈ６'），４．９−４．９５（ｍ，１Ｈ，  Ｈ３'），４．２−４．４５（ｍ，４Ｈ，Ｈ９  Ｈ３'，Ｈ２ａ），４．０５−４．２（ｍ，２Ｈ，Ｈ１ｂ，Ｈ１ｃ），２．９５−４（ｍ，２１Ｈ，Ｈ２，Ｈ４，Ｈ６ａ，Ｈ３ａ，Ｈ５ａ，Ｈ４ａ，Ｈ２ｂ−６ｂ，Ｈ２ｃ−６ｃ，ＭｅＯＨ），２．８５−２．９５（ｍ，４Ｈ，Ｈ１，Ｈ６），２．２−２．３（ｍ，２Ｈ，Ｈ４'），１．８−２．１（ｍ，５Ｈ，Ｈ２'，Ｈ７'，Ｈ８'），０．９８−１．６（ｍ，２３Ｈ，  Ｈ５，Ｈ１'，Ｈ９'，Ｈ１１'，Ｈ１２'，Ｈ１４'−Ｈ１７'，Ｈ２２'−Ｈ２５'），  ０．９４（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１９'），０．８４（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ，Ｈ２１'），０．７８（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ，Ｈ２６'＆Ｈ２７'）および０．６１（ｓ，３Ｈ，Ｈ１８'）；α−ピラノース型：以下を除いて同じデータ。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3／ＭｅＯＨ［２０／８０］）：δ＝６．８５（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１ａ）。
【００８５】
マルトテトラオシル化合物（１２ｈ）：これは、Ｄマルトテトラオース（２００ｍｇ，０．３０３０ｍｍｏｌ）および１１（８０ｍｇ，０．１３３ｍｍｏｌ）の溶液を用いて製造し、５日撹拌し、クロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ／ＮＨ3  ７５：２２：３）により精製して、１２ｈを白色の固体として得た（６７．５ｍｇ，収率：４１％）。ＨＰＬＣでさらに純度を確認した。最終生成物は、分離しなかったが、混合物で特徴づけた、α−ピラノース（１５％）型およびβ−ピラノース（８５％）型を含有した。ＭＳ（ＦＡＢ+）：ｍ／ｚ＝１２７３［Ｍ＋Ｎａ］+，１２５１［Ｍ＋Ｈ］+，５８８，３６９［Ｃｈｏｌ］+，１５９，１４５，１２１，１０９，９５，８１，６９；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ+）Ｃ59Ｈ102Ｎ4Ｏ24Ｎａ：［Ｍ＋Ｎａ］+  算出値１２７３．６７８２，実験値１２７３．６８２１。β−ピラノース型：1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3／ＭｅＯＨ［２０／８０］）：δ＝７．５６−７．５８（ｄ，１Ｈ，Ｈ１ａ），５．１５−５．２５（ｍ，  １Ｈ，Ｈ６'），４．９５−５．１（ｍ，１Ｈ，Ｈ３'），４．３８−４．５（ｍ，  ４Ｈ，Ｈ９，Ｈ３'，Ｈ２ａ），４．０４−４．２２（ｍ，３Ｈ，Ｈ１ｂ，Ｈ１ｃ，  Ｈ１ｄ），３．１−３．９５（ｍ，２７Ｈ，Ｈ２，Ｈ４，Ｈ６ａ，Ｈ３ａ，Ｈ５ａ，  Ｈ４ａ，Ｈ２ｂ−６ｂ，Ｈ２ｃ−６ｃ，Ｈ２ｄ−６ｄ，ＭｅＯＨ），２．８５−３．１（ｍ，４Ｈ，Ｈ１，Ｈ６），２．２−２．３３（ｍ，２Ｈ，Ｈ４'），１．７５−２．１（ｍ，５Ｈ，Ｈ２'，Ｈ７'，Ｈ８'），１−１．６（ｍ，２３Ｈ，Ｈ５，Ｈ１'，Ｈ９'，Ｈ１１'，Ｈ１２'，Ｈ１４'−Ｈ１７'，Ｈ２２'−Ｈ２５'），０．９２（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１９'），０．８２（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ，Ｈ２１'），  ０．７８（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ，Ｈ２６'＆Ｈ２７'）および０．６８（ｓ，３Ｈ，Ｈ１８'）；α−ピラノース型：以下を除いて同じデータ1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3／ＭｅＯＨ［２０／８０］）：δ＝７（ｄ，１Ｈ，Ｈ１ａ）。
【００８６】
マルトヘプタオシル化合物（１２ｉ）：これは、Ｄマルトヘプタオース（１００ｍｇ，０．０８６７３ｍｍｏｌ）および１１（３０ｍｇ，０．０４９７ｍｍｏｌ）の溶液を用いて製造し、７日撹拌し、クロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ／ＮＨ3  ７５：２２：３）により精製して、１２ｉを白色の固体として得た（４６ｍｇ，収率：５３％）。ＨＰＬＣでさらに純度を確認した。最終生成物は、分離しなかったが、混合物で特徴づけた、α−ピラノース（１５％）型およびβ−ピラノース（８５％）型を含有した。ＭＳ（ＦＡＢ+）：ｍ／ｚ＝１７５９［Ｍ＋Ｎａ］+，１７３７［Ｍ＋Ｈ］+，３６９［Ｃｈｏｌ］+，１４５，１２１，１０９，９５，８１。β−ピラノース型：1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3／ＭｅＯＨ［２０／８０］）：δ＝７．５３−７．５８（ｄ，１Ｈ，Ｈ１ａ），５．３５−５．３７（ｍ，１Ｈ，Ｈ６'），４．９７−５．１２（ｍ，１Ｈ，Ｈ３'），４．４５−４．６（ｍ，４Ｈ，Ｈ９，Ｈ３'，Ｈ２ａ），４−４．５（ｍ，６Ｈ，Ｈ１ｂ，  Ｈ１ｃ−ｇ），３．１−３．９（ｍ，４５Ｈ，Ｈ２，Ｈ４，Ｈ６ａ，Ｈ３ａ，Ｈ５ａ，Ｈ４ａ，Ｈ２ｂ−６ｂ，Ｈ２ｃ−６ｃ，Ｈ２ｄ−６ｄ，Ｈ２ｅ−６ｅ，Ｈ２ｆ−６ｆ，Ｈ２ｇ−６ｇ，ＭｅＯＨ），２．７−３（ｍ，４Ｈ，Ｈ１，Ｈ６），２．１５２．３５（ｍ，２Ｈ，Ｈ４'），１．７−２．１（ｍ，５Ｈ，Ｈ２'，Ｈ７'，Ｈ８'），１−１．６（ｍ，２３Ｈ，Ｈ５，Ｈ１'，Ｈ９'，Ｈ１１'，Ｈ１２'，Ｈ１４'−Ｈ１７'，Ｈ２２'−Ｈ２５'），０．９４（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１９'）０．８４（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ，Ｈ２１'），０．７７（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ，Ｈ２６'＆Ｈ２７'）および０．６３（ｓ，３Ｈ，Ｈ１８'）；α−ピラノース型：以下を除いて同じデータ、1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3／ＭｅＯＨ［２０／８０］）：δ＝６．９（ｄ，１Ｈ，Ｈ１ａ）。
【００８７】
〔生物学的および生物物理学的評価〕
一般：ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）はAvanti Lipid(Alabaster, Al,USA)から購入した。プラスミドｐＣＭＶβはBayou Biolabs(Harahan,LA,USA)が製造した。ＤＣ−Ｃｈｏｌは本発明者らの実験室で合成した[27]。Ｍｕ−ペプチドは、Wang樹脂上での標準的なＦｍｏｃ系Merrifield固相ペプチド化学によってM.Kellerが合成した。
【００８８】
リポソームの製造：ＤＣ−Ｃｈｏｌ（７．５ｍｇ，１５μｍｏｌ）およびＤＯＰＥ（７．５ｍｇ，１０μｍｏｌ）をジクロロメタン中で合わせた。溶液を丸底フラスコ（典型的には、５０ｍｌ）に移し、減圧下有機溶媒を除去して（回転式エバポレーター）、薄い脂質膜を得、真空下２〜３時間乾燥した。この後、薄い脂質膜を水和するように、４ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．２（３ｍｌ）を丸底フラスコに添加した。アルゴン雰囲気下において短時間（２〜３分間）超音波処理し、得られたリポソーム懸濁液（脂質濃度５ｍｇ／ｍｌ）を押出装置によって押出した（Northern脂質）。最初に、２枚重ねのポリカーボネートフィルター（０．２μｍ）を３回、次いで、２枚重ねのポリカーボネートフィルター（０．１μｍ）を１０回押出して、小型の単層膜陽イオン性リポソーム（ＰＣＳ分析により平均径１０５ｎｍ）を製造した。脂質濃度（約４〜４．８ｍｇ／ｍｌ）はStewartアッセイによって測定した[44]。
【００８９】
リポソーム：Ｍｕ：ＤＮＡ（ＬＭＤ）およびリポソーム：ＤＮＡ（ＬＤ）複合体の製造：最初に、以下のように混合することによって、ｍｕ：ＤＮＡ（ＭＤ）粒子を製造した。ｍｕペプチド（１ｍｇ／ｍｌ）の４ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．２の希釈溶液をボルテックスミキサーで混合したものに、プラスミドＤＮＡストック溶液（典型的には、１．２ｍｇ／ｍｌ）を添加した。特に明記しない限り、最終的なｍｕ：ＤＮＡ比は０．６１：１ｗ／ｗであり、最終的なプラスミドＤＮＡ濃度は０．２７ｍｇ／ｍｌであった。次いで、上記したように製造した押出し後の陽イオン性リポソーム（典型的には、約４．５ｍｇ／ｍｌ）の懸濁液に撹拌しながら、ＭＤを含有する溶液を徐々に添加し、ＰＣＳで測定したとき、サイズ分布が狭い（１２０±３０ｎｍ）の小型ＬＭＤ粒子を製造した。最終的な脂質：ｍｕ：ＤＮＡ比  １２：０．６：１  ｗ／ｗ／ｗ。次いで、スクロース（１００％、ｗ／ｖ）の４ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ  ７．２の溶液を添加し、望ましいＤＮＡ濃度（最終的なＤＮＡ濃度は典型的には、０．１４ｍｇ／ｍｌである）において１０％ｗ／ｖスクロースを含有するＬＭＤ粒子の４ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ  ７．２の懸濁液を得、全体を−８０℃で保存した。Ｍｕペプチドを添加しない同じプロトコールにより、脂質：ＤＮＡ比１２：１（ｗ／ｗ）を用いた実験のために、リポソーム：ＤＮＡ（ＬＤ）複合体（脂質複合体）を製造した。
【００９０】
粒子サイズ測定：脂質複合体は、３７℃において生物媒体に３０分暴露してから、光子相関スペクトロスコピー（N4 plus,Coulter）によって評価した。選択したＤＮＡ粒子（particular）濃度はインビトロ条件に適合する。使用したパラメーターは２０℃、０．０８９ｃＰ、リフレキシブインデックス（reflexive index）１．３３、角度９０℃、６３２．８ｎｍ。単様式の（unimodal）分析を使用して、Optimem中の平均粒子サイズを評価した。CONYINアルゴリズムを使用したサイズ分布プログラムを使用して、５０ｎｍより小さい小型の血清粒子の亜集団を分離し、算出したサイズの脂質複合体をOptimem+10%FCS中に抽出した。
【００９１】
ＨｅＬａ細胞のトランスフェクション：２４−ウェル培養プレートの１０％ＦＣＳを補給したＤＭＥＭに細胞を播種し、５％ＣＯ2の存在下において、３７℃において集密度約７０％まで２４時間増殖させた。細胞をＰＢＳ中で洗浄してから、トランスフェクション培地を各ウェルに加えた（０、５０または１００％ウシ胎仔血清のDubelco OptiMem溶液０．５ｍｌ）。１００μｇ／ｍｌ  ＤＮＡ（ｎｌｓ  βｇａｌ）濃度のＬＭＤ５μｌをＨｅＬａ細胞に３０分トランスフェクトした。次いで、細胞をＰＢＳで３回すすいで、１０％ＦＣＳを補給したＤＭＥＭ中でさらに４８時間インキュベーションしてから、標準的な化学発光リポーター遺伝子アッセイキット（Roche Diagnostics,GmbH Cat No.1758241）を使用することによってβ−Ｇａｌ発現について処理した。
【００９２】
〔結果と考察〕
ネオ糖脂質の合成：標的のネオ糖脂質ファミリーの各メンバーは、リンカーによって接続された脂質およびオリゴ糖分子を保有するコレステロールからなった。全体の合成方法は２つの部分に分けられる。１つめは、リンカーを有する脂質の合成で、２つめは、選択した糖部分によるこの脂質の化学的選択的カップリングである。この方法の主要点はヒドロキシルアミンの製造である（図１）。
【００９３】
このＢｏｃ−保護された脂質（８）の合成は、元は、出発物質として容易に入手可能なアミノアルコールおよびアミノ基の相補的なブロッキ基方法を使用した収束的な方法に基づいて設計された。この以前に報告された方法は、ほとんど改良しないで、遺伝子導入用のこのポリアミド系脂質を製造することができた[27]。
【００９４】
記載するように、ヒドロキシルアミノ誘導体のグリコシル化は、本発明者らの合成要件に好適な解決法を提供している。市販のＯ−（カルボキシメチル）ヒドロキシルアミン塩酸塩を先ずＢｏｃ保護し、次いでＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよびＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）と反応させて、対応する活性化されたエステルを製造した。この化合物をｐＨ８のＴＨＦ中で速やかにインサイチューにおいて脂質（８）で処理して、保護されたヒドロキシルアミンを製造した。トリフルオロ酢酸水溶液で非常に直接的に脱保護すると、ヒドロキシルアミノ脂質（１１）の合成が終了した。
【００９５】
この段階において、本発明者らは、脂質（１１）に数多くの市販の保護されていないオリゴ糖を反応させることで、本発明者らの化学的選択的カップリングの可能性を検討した。この反応は、糖および脂質の溶解を促進するＤＭＦおよび酢酸緩衝ｐＨ４水溶液の溶媒系（１：１）を使用して軽度な条件下で実施した。図２に示すように、反応物は、開いたイス型（open chair）の保護された中間体と動的平衡状態であった。平衡を生成物が製造される方向に向けるために、過剰の糖を添加した。ネオ糖脂質生成物の両親媒性のために、作業中の単離はミセルおよびフォーム形成の結果として困難であることがわかった。溶解度の問題も、単離、精製および分析方法を妨害した。反応時間および収率は、使用する炭水化物により変化した（表１）。
【００９６】
【表１】
2004522722.tif 000003
【００９７】
ネオ糖脂質の立体配座：炭水化物の立体配座は、溶液のＮＭＲによって確認することができる[28〜33]。アノマー中心（Ｃ１ａ）の立体配座の最も有用なデータは、おそらく、1Ｊ13Ｃ１ａ−Ｈ１ａである[34,35]。このカップリング定数の絶対値は、環酸素の孤立電子対に対する炭素−酸素結合の配向、Ｃ１の置換基の電気的陰性および分子の残りの部分に結合している電気的陰性置換基の性質に依存する。ピラノースのαおよびβアノマー間の1Ｊ13Ｃ１−Ｈ１の差を使用してアノマーの立体配置を判定することができる。1Ｊ（Ｃ１−Ｈ１ｅｑ）＞1Ｊ（Ｃ１−Ｈ１ａｘ）であり、差はおよそ１０Ｈｚであることがしっかりと確立されている。1Ｊ（Ｃ１−Ｈ１ｅｑ）は通常約１７０Ｈｚであり、1Ｊ（Ｃ１−Ｈ１ａｘ）は約１６０Ｈｚである。Ｏ−１が塩素またはフッ素などのさらに電気的陰性な元素で置換されるとさらに大きい値が観察されるが、１０Ｈｚの差は通常観察される[36]。フラノシドの炭素−水素カップリング定数を調査したところ、1Ｊ（Ｃ１−Ｈ１ｅｑ）＞1Ｊ（Ｃ１−Ｈ１ａｘ）であるが、差はもっと小さい（１〜３Ｈｚ）。
【００９８】
特徴はマンノースの例に基づいて考察しているが、ＮＭＲ分析条件が好ましい場合には、同じ分析手法を他の糖に使用した。４つの別個の環構造を描くことができる（図３）。ピラノース型は、立体的な理由により、フラノース環より好ましいことを理にかなって予想することができる。従って、ＮＭＲに観察される２つの化合物のうち、主なものはおそらくピラノースであるだろう。フェーズセンシティブ（phase-sensitive）ＮＯＥＳＹは、２つのＣ１ａシグナル間にクロスピークを示さなかったので、二番目に観察される化合物は変旋光平衡に寄与しないと思われる（ただし、それは別個の分子である）。従って、関連する置換されたフラノース等価物について証明されているように[33]、13Ｃ５ａのシフトは観察されず、13Ｃ１ａはデシールドされて（deshielded）いなかったので、この化合物はフラノース型に帰属されなかった。
【００９９】
本発明者らは、主化合物は1Ｊ13Ｃ１ａ−Ｈ１ａ＝１６７Ｈｚであり、第２の化合物は1Ｊ13Ｃ１ａ−Ｈ１ａ＝１７７Ｈｚであると測定した。それらの1Ｊ13Ｃ１−Ｈ１の絶対値は、典型的な4Ｃ1立体配座に予測されるより１０Ｈｚ高いが、これは、イス型構造をわずかに変形すると思われるＯ−置換ヒドロキシルアミン基の顕著な電気的陰性によって説明される。ピラノース環では、［1Ｊ（Ｃ１−Ｈ１ｅｑ）−1Ｊ（Ｃ１−Ｈ１ａｘ）］≒１０Ｈｚであると確立されているので、主化合物はβアノマー（Ｈ１ａｘ）であり、第２の化合物はαアノマー（Ｈ１ｅｑ）であることが容易に結論づけることができる。
【０１００】
1ＨフェーズセンシティブＮＯＥＳＹはこの結論を確認した。核オーバーハウザー効果は、主化合物のＨ１ａとＨ２ａ＆Ｈ３ａ間で観察された。上記の詳細な構造を考慮すると、エカトリアルＨ１はＨ３と空間で相互作用することができないが、βアノマーはこのような相互作用を完璧に生ずることができるので、この化合物はαピラノシルアノマーではないと思われる。核オーバーハウザー効果は第２の化合物のＨ１ａでは観察されなかったが、これは感受性が欠損しているからであると思われる。このように、1Ｊ13Ｃ１−Ｈ１およびＮＯＥＳＹ分析のデータにより、本発明者らは、２つのマンノースピラノースαβ型（２０／８０）が製造されたと結論づけた。
【０１０１】
ネオ糖脂質について得られる非常に類似したアノマー（β／α）異性体比は驚くことはなく（表１）、全ての糖は、マンノースを除いてＣ２にエカトリアルヒドロキシルを有する。この最後の化合物について得られる比は、βアノマーは通常αアノマーほど立体的に好ましくないと報告されているので、驚きである。考えられる説明は、この反応は、糖とヒドロキシルアミンリンカーとの間のなんらかの二次的な相互作用（水素結合）によって駆動され、βアノマーを安定化すると思われるということである（これは、βアノマーのＮＭＲシグナルは、常に、αアノマーよりはるかにデシールドされているという観察に一致する）。合成した糖脂質のこのアノマー混合物は、リポソーム構築物の調査した生物学的特性を大きく変更すると予測されないので、本発明者らは、分取用高速液体クロマトグラフィーによるそのようなジアステレオマーのめんどうな分離を試みなかった。
【０１０２】
生物適用：ＬＭＤの糖修飾は、ミセル懸濁液が脂質膜に組み込む自然の能力に基づいた[37,38]。先ず、標準的なプロトコールによりＬＭＤを製剤化し、第２に、合成したネオ糖脂質ミセルのＨｅｐｅｓ緩衝液４ｍＭ  ｐＨ７の懸濁液をＬＭＤに添加して、室温において３０分間インキュベーションしてから、通常は−８０℃で保存した。製造した異なる割合の全てのネオ糖脂質を安定化効果について試験したが、長い鎖のものだけ（マルトテトラオース１２ｈおよびマルトヘプタオース１２ｉ）は１０％未満で重要な特性を示した（データは示していない）。
【０１０３】
ネオ糖脂質修飾ＬＭＤの安定化効果は、７．５モル％の化合物１２ｈまたは１２ｉの導入によって証明された。脂質層状のリポソームに基づいた製剤は、塩または血清に暴露されると凝集することが知られている[11,39,40]。この現象は、一定時間後の平均粒子サイズ増加を測定することによって追跡することができ、ＬＭＤ粒子の任意の安定性はこのパラメーターの低下に反映されるはずである。標準的なインビトロ状態を模倣するために、３７℃においてOptiMemまたはOptiMem＋１０％ＦＣＳに３０分間暴露後、光子相関スペクトロスコピー（ＰＣＳ）によって脂質複合体のサイズを測定することを選択した。高い割合の血清では、極端すぎて、意味のある測定値を取ることができなかったので、ＰＣＳを用いてその効果を分析することができなかった。図４は、そのような脂質複合体のサイズ増加の割合を記載している。
【０１０４】
結果は、ＬＭＤと標準的なリポソーム製剤との間の粒子の明らかな安定化を示している。７．５％のネオ糖脂質の導入は、OptiMemおよび１０％血清においてかなり有用であることを証明した。１２ｉの導入は最も効率的であることを証明した。この結果は、そのような陽イオン性リポソーム層の上部に効率的な分子ブラシを形成するためには、長い炭水化物鎖が必要であることを示している[41,Sheiko,2001#119]。
【０１０５】
ある程度の安定化が証明されても、通常、負に荷電した細胞膜に対する正に荷電したＬＭＤの親和性が低下し、構築物のトランスフェクション能力の低下を誘発する。しかし、この場合には、インビトロにおけるトランスフェクション結果は、０％および５０％血清条件においてネオ糖脂質修飾によるトランスフェクション効率の増加を示した（図５）。この結果は、これらのネオ糖脂質が、同様の特性の脂質二重膜間の狭い範囲のファンデルワールス力に基づいた相互作用を妨害するが、反対に荷電した膜間の広い範囲の電荷相互作用には影響しないことによる、狭い範囲の保護作用に寄与した。血清によって誘発される凝集は、ＬＭＤと負に荷電したタンパク質との相互作用に主に基づいているので[42]、本発明者らのネオ糖脂質の有用な影響も、血清の割合が増加すると低下した（１００％血清では重要な利益はない）。
【０１０６】
上記の明細書に記載の全ての報告は参照として本明細書に組み入れられている。本発明の記載されている方法およびシステムの種々の改良および変更は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者に明らかである。本発明は特定の好ましい実施態様に関連して記載されたが、主張されている本発明はこのような特定の実施態様に不当に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際、化学または関連する技術分野の当業者に明らかである、本発明を実施するために記載されている様式の種々の改良は特許請求の範囲内であることが意図されている。
【０１０７】
［引用文献］
【表２Ａ】
2004522722.tif 000004
【表２Ｂ】
2004522722.tif 000005
【表２Ｃ】
2004522722.tif 000006
【表２Ｄ】
2004522722.tif 000007
【表２Ｅ】
2004522722.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】ヒドロキシルアミン脂質１１の合成スキーム１である。試薬：（ａ）ＣＨ2Ｃｌ2、Ｅｔ3Ｎ、Ｂｏｃ2Ｏ、室温、５時間、９８％、（ｂ）ＥｔＯＡｃ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１当量）、ＤＣＣ（１当量）、１０時間、室温、（ｃ）（８）ＥｔＯＡｃ／ＴＨＦ［９５／５］、Ｅｔ3Ｎ（ｐＨ＝８）、２時間、室温、９０％、（ｄ）ＣＨ2Ｃｌ2、ＴＦＡ（１５当量）、０℃、Ｎ2、５時間、８６％。
【図２】Ｄ−グルコースによるＯ−置換ヒドロキシルアミンの化学選択的グリコシル化の原理である（β−アノマーが示されているが、変旋光が生じ、α−アノマーも同様に製造される）。
【図３】マンノースから得られるネオ糖脂質の可能性がある構造。
【図４】光子相関スペクトロスコピー（ＰＣＳ）による異なる脂質複合体の分析結果である。サイズは、脂質複合体では３０分後に、Ｏｐｔｉｍｅｍ＋／−１０％ＦＣＳ中、３７℃、［ＤＮＡ］＝１μｇ／ｍｌにおいて測定した。標準的なＬＭＤ製剤（ＬＭＤ）と、７．５モル％の生成物１２ｈおよび１２ｉを付加することによって修飾したＬＭＤとを、Ｏｐｔｉｍｅｍ（白）および１０％血清（黒）中で比較し、元の測定サイズ１８０ｎｍに対するサイズの増加のパーセント単位で表した。
【図５】基本的なＬＭＤと７．５モル％の生成物１２ｈおよび１２ｉで糖修飾したＬＭＤとの、０％（白）、５０％（白黒）および１００％血清（黒）条件におけるＨｅｌａ細胞に対するトランスフェクション効率の比較である。結果は、タンパク質１ミリグラムあたりの相対的光線単位（relative light units）として表してある（ｎ＝４）。
【図１】
2004522722.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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