(57)【要約】バイオチップカートリッジであって、ａ）ｉ）電極のアレイを含む基板と、各電極は、Ａ）自己集合した単層と、Ｂ）捕獲結合リガンドとを含み、ｉｉ）試薬を導入するための流入口と、を有する反応チャンバと、ｂ）上記電極とプロセッサの電気的接続を可能にする内部結線と、を備えたバイオカートリッジ。
2004530860.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオチップカートリッジであって、
ａ）ｉ）電極のアレイを含む基板と、
各電極は、
Ａ）自己集合した単層と、
Ｂ）捕獲結合リガンドとを含み、
ｉｉ）試薬を導入するための流入口と、を有する反応チャンバと、
ｂ）上記電極とプロセッサの電気的接続を可能にする内部結線と、を備えたことを特徴とするバイオカートリッジ。
【請求項２】
請求項１に記載のバイオチップカートリッジであって、
捕獲結合リガンドは、捕獲プローブであることを特徴とするバイオカートリッジ。
【請求項３】
請求項１に記載のバイオチップカートリッジであって、
流体を上記アレイに接触させた状態で維持するためのガスケットをさらに有することを特徴とするバイオカートリッジ。
【請求項４】
請求項１に記載のバイオチップカートリッジであって、
流入口上にシールをさらに有することを特徴とするバイオカートリッジ。
【請求項５】
請求項１に記載のバイオチップカートリッジであって、
上記反応チャンバは、流出口をさらに有することを特徴とするバイオカートリッジ。
【請求項６】
請求項１に記載のバイオチップカートリッジであって、
反応チャンバは、サンプルを導入する際、気泡の導入または保持を最小限に抑えるように構成されたことを特徴とするバイオカートリッジ。
【請求項７】
請求項１に記載のバイオチップカートリッジであって、
上記アレイは、上記基板の一方の表面上にあることを特徴とするバイオカートリッジ。
【請求項８】
請求項１に記載のバイオチップカートリッジであって、
上記基板の２つの表面のそれぞれに、アレイを有することを特徴とするバイオカートリッジ。
【請求項９】
請求項１に記載のバイオチップカートリッジであって、
アッセイ試薬を含む少なくとも１つのウェルを有するキャップを有することを特徴とするバイオカートリッジ。
【請求項１０】
バイオチップカートリッジを収容するように構成された少なくとも２つのステーションを有する、複数のバイオチップ解析を行うためのデバイス。
【請求項１１】
請求項１０に記載のデバイスであって、
少なくとも１つのステーションが温度コントローラを有することを特徴とするデバイス。
【請求項１２】
請求項１０に記載のデバイスであって、
各ステーションが温度コントローラを有することを特徴とするデバイス。
【請求項１３】
請求項１０に記載のデバイスであって、
少なくとも１つのステーションが発信システムを有することを特徴とするデバイス。
【請求項１４】
請求項１０に記載のデバイスであって、
少なくとも１つのステーションがメモリチップリーダを有することを特徴とするデバイス。
【請求項１５】
請求項１０に記載のデバイスであって、
少なくとも１つのステーションがバーコードリーダを有することを特徴とするデバイス。
【請求項１６】
請求項１０に記載のデバイスであって、
少なくとも１つのステーションがメモリチップライタを有することを特徴とするデバイス。
【請求項１７】
請求項１０に記載のデバイスであって、
少なくとも１つのステーションが暗号化システムを有することを特徴とするデバイス。
【請求項１８】
請求項１０に記載のデバイスであって、
少なくとも２つのバイオチップカートリッジをさらに有することを特徴とするデバイス。
【請求項１９】
請求項１０に記載のデバイスであって、
液体処理システムをさらに有することを特徴とするデバイス。
【請求項２０】
請求項１０に記載のデバイスであって、
無線通信部品をさらに有することを特徴とするデバイス。
【請求項２１】
請求項１０に記載のデバイスであって、
デバイス基板をさらに有することを特徴とするデバイス。
【請求項２２】
請求項１０に記載のデバイスであって、
プロセッサをさらに有することを特徴とするデバイス。
【請求項２３】
請求項１０に記載のデバイスであって、
地球位置システムをさらに有することを特徴とするデバイス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、同時多重バイオチップ分析用デバイスに関する。特に、当該デバイスは、核酸アレイ（ａｒｒａｙ）のようなアレイを含むバイオチップからなる多重カートリッジを保持し、サンプルの高効率分析を可能にするように構成されている。
【０００２】
（発明の背景）
液体または気体中の特異的な物質の存在および／または濃度を検出することについては、多くのアッセイまたはセンサがある。これらの多くは、検出のためのメカニズムとして、特異的なリガンド／抗リガンドの反応に依存している。即ち、対の物質（即ち、結合対やリガンド／抗リガンド）は、互いに結合するが、他の物質とはほとんどまたはまったく結合しないことが知られている。これが、多くの複合体の検出にこれらの結合対を使用する技術の根元である。一般的にこれらの方法は、複合体の１つの成分をなんらかの方法、例えば放射性同位体、蛍光物質および他の光学活性分子、酵素などを用いて標識し、複合体全体を検出可能にして実施される。
【０００３】
他のアッセイは検出に電子的シグナルを用いる。とくに興味深いのはバイオセンサである。少なくとも２種のバイオセンサが知られている。それらは酵素をベースとするかまたは代謝性のバイオセンサ、および結合性またはバイオ親和性センサである。例えば、ＵＳＰ４，７１３，３４７；５，１９２，５０７；４，９２０，０４７；３，８７３，２６７；およびこれら特許に開示の文献参照。これらの既知センサのいくつかは交流電流（ＡＣ）技法を利用しているが、この技法は、一般にバルク（または誘導）インピーダンスの相違を検出することに限定される。
【０００４】
現在、種々の核酸バイオセンサが知られている。これらは、蛍光検出に基づく核酸バイオチップを含むものである。例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ により開発されたもの（ＵＳＰ５，８００，００２；５，４４５，９３４；５，７４４，３０５；および関連特許ならびに文献を含む。）、Ｎａｎｏｇｅｎ により開発されたもの（ＵＳＰ５，５３２，１２９；５，６０５，６６２；５，５６５，３２２；５，６３２，９５７；および関連特許ならびに文献を含む。）、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ により開発されたもの（ＥＰ０３７３０２３Ｂ１）および Ｓｙｎｔｅｎｉ／Ｉｎｃｙｔｅ により開発されたもの（ＷＯ９５／３５５０５および関連特許ならびに文献）がある。
【０００５】
同様に、電極を使用する核酸の電気的検出もまた、知られている。例えば、ＵＳＰ５，５９１，５７８；５，８２４，４７３；５，７０５，３４８；５，７８０，２３４；５，７７０，３６９；ＵＳＳＮ０８／８７３，５９８；０８／９１１，５８９およびＷＯ９８／２０１６２；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１２４３０；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１２０８２；ＰＣＴＵＳ９９／１０１０４；ＰＣＴ／ＵＳ９９／０１７０５；ＰＣＴ／ＵＳ９９／０１７０３；および関連文献参照。
【０００６】
しかしながら、これまで、上記の方法がバイオチップ多重化を可能にする高度の平行系で使用されることはなかった。従って、本発明の目的は、バイオチップ、特に核酸チップの多重的分析のためのデバイスおよび方法を提供することである。
【０００７】
（詳細な説明）
本発明は、複数のバイオチップを受容し、分析するように設計されたデバイスに関するものであり、当該バイオチップはそれぞれ生物学的部分のアレイを持っており、サンプル中の標的被検体の高効率分析と検出を可能にするものである。例えば、多数のサンプル（特に患者からのサンプル）を同時に分析することができ、または、多数のアッセイを単一のサンプルについて実施することができる。当該デバイスは、バイオチップを受容できるように構成されている、多数のカートリッジステーションを有しており、当該カートリッジは異なったタイプの成分を許容する異なったタイプのバイオチップである。当該ステーションは、サーモコントローラ、信号系、漏れ検出センサ、文字数字式デイスプレーおよび検出器を含む、広汎な種類の異なった構成要素を有することが出来る。好ましい態様は、電気化学的検出に依存する電極を含むバイオチップを使用するものであり、従ってデバイスおよび／またはステーションはデバイスボードおよびプロセッサを含むことができる。
【０００８】
バイオチップカートリッジは、バイオ分子のアレイを有する基質を含んでおり、種々の態様に構成することができる。例えば、チップは、試薬を導入し、除去するための入口と出口を備えた反応チャンバを含むことができる。加えて、カートリッジは、ミクロ流体成分を収容するためのキャップまたは蓋を含むことができ、従ってサンプルを導入し、試薬を加え、反応を実施し、次いでサンプルを検出用アレイを含む反応チャンバに添加することができる。
【０００９】
従って、本発明は、サンプル中の標的被検体の存在または不存在を検出する組成物および方法を提供するものである。当業者によって理解されるように、サンプル溶液は、いかなる数の物（ｔｈｉｎｇｓ）を含んでいても良く、当該物としては、限定的にではなく、体液（限定的にではなく、血液、尿、血清、リンパ液、唾液、肛門や膣分泌物、汗や精液などを含み、実質的にいかなる有機体のものでも良いが、哺乳動物のもの、特にヒトからのサンプルが好ましい）、環境サンプル（限定的にではなく、空気、農業的、水および土壌サンプルを含む）、生物学的ウェハー試薬サンプル、研究サンプル（核酸の場合、サンプルは一般的にＰＣＴ／ＵＳ９９／０１７０５に記載されているように、ＰＣＲ増幅反応のような標的およびシグナル増幅を含む増幅反応の生産物であってよい）、精製ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質などの精製サンプル、原サンプル（バクテリア、ウイルス、ゲノムＤＮＡなど）などが含まれ、当業者にとって理解されるように当該サンプルには、実質的にいかなる実験的処理が加えられていてもよい。
【００１０】
本発明方法は、標的被検体の検出に関するものである。「標的被検体」または「被検体」もしくはこれらの文法的均等物によって意味されるものは、検出されるべき分子または化合物であって、後記するように結合種に結合することができるものをいう。適切な被検体は、限定的にではなく、環境または臨床的化学物質、汚染物質またはバイオ分子のような小さな化学的分子を含み、それらには限定的にではなく、農薬、殺昆虫剤、毒素、治療的および濫用医薬、ホルモン、抗生物質、抗体、有機物質などが含まれる。適当なバイオ分子には、限定的にではなく、タンパク質（酵素、イムノグロブリンおよびグリコプロテインを含む）、核酸、脂質、レクチン、炭水化物、ホルモン、全細胞（原核細胞（病原性バクテリアのような）および真核細胞（哺乳動物腫瘍細胞のような）を含む）、ウイルス、胞子などが含まれる。特に好ましい被検体は、酵素を含むタンパク質、医薬、細胞、抗体、抗原、細胞膜抗原および受容体（神経性、ホルモン性、栄養性および細胞表面受容体）またはそれらのリガンドである。
【００１１】
好適な実施態様において、標的被検体はタンパク質である。当業者にとって理解されるように、本発明を使用して検出できる多数の可能なタンパク性標的被検体がある。「タンパク質」またはその文法的均等物とは、タンパク質、オリゴペプチドおよびペプチド、誘導体および類縁体を意味し、非天然アミノ酸やアミノ酸類縁体を含むペプチドならびにペプチド様構造をもつものを含む。その側鎖は（Ｒ）または（Ｓ）いずれの立体配置であってもよい。好適な実施態様において、アミノ酸は（Ｓ）またはＬ−配置である。後記するように、タンパク質が結合リガンドとして使用される場合、タンパク質類縁体を利用して、サンプル汚染物質による分解を遅延させることが望ましい。
【００１２】
適当なタンパク質標的被検体は、限定的にではなく、イムノグロブリン、特にＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭならびに特に治療的または診断的に適切な抗体を含み、限定的にではなく、ヒトアルブミン、アポリポプロテイン（アポリポプロテインＥを含む）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、コルチゾル、α−フェトプロテイン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、アンチトロンビンなどに対する抗体、医薬（抗上皮性（ａｎｔｉｅｐｔｉｌｅｐｔｉｃ）医薬（フェニトイン、プリミドン、カルバリエゼピン、エトスキシミド、バルプロン酸およびフェノバルビタール）、心活性医薬（ジゴキシン、リドカイン、プロカインアミドおよびジソピラミド）、気管支拡張剤（テオフィリン）、抗生物質（クロラムフェニコール、スルホンアミド類）、抗抑鬱剤、免疫抑制剤、濫用医薬（アンフェタミン、メタアンフェタミン、カンナビノイド、コカインおよび阿片薬）などを含む）に対する抗体および後記する多数のウイルスやバクテリアに対する抗体が例示される。
【００１３】
当業者にとって理解されるように、多数の被検体が本発明の方法を使用して検出することができる。基本的に、後記するような結合リガンドが作られ得る標的被検体ならば、いずれも本発明の方法により検出可能である。
【００１４】
好ましい実施態様において、標的被検体は、核酸である。「核酸」または「オリゴヌクレオチド」もしくはそれらの文法的均等物は、共有結合されている少なくとも２個のヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は、一般にホスホジエステル結合を含むが、場合によっては、後記で概説するとおり、交互の主鎖を有し得る核酸類縁体が含まれ、例えばホスホルアミド（Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｏｒｏｎ ４９ （１０） ：１９２５ （１９９３）およびそれに記載された参考文献、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ３５：３８００ （１９７０）； Ｓｐｒｉｎｚｌ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ８１：５７９ （１９７７）； Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：３４８７ （１９８６）； Ｓａｗａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ８０５ （１９８４）； Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１０：４４７０ （１９８８）； Ｐａｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｃｒｉｐｔａ ２６：１４１ ９１９８６））、ホスホロチオエート （Ｍａｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：１４３７（１９９１）、および米国特許第５６４４０４８号）、ホスホロジチオエート（Ｂｒｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１１： ２３２１ （１９８９）、Ｏ−メチルホスホルアミダイト連鎖（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ 参照）およびペプチド核酸主鎖と結合（Ｅｇｈｏｌｍ、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１４：１８９５（１９９２）； Ｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．、３１： １００８ （１９９２）； Ｎｉｅｌｓｅｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６５： ５６６ （１９９３）； Ｃａｒｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３８０： ２０７ （１９９６）参照、これら全てを引用して説明の一部とする）が含まれる。他の類縁体核酸には、鍵付き（ｌｏｃｋｅｄ）核酸を含む二環式構造（Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２０：１３２５２−３ （１９９８））、正の主鎖（Ｄｅｎｐｃｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９２： ６０９７ （１９９５））、非イオン性主鎖（ＵＳＰ５，３８６，０２３；５，６３７，６８４；５，６０２，２４０；５，２１６，１４１；４，４６９，８６３； Ｋｉｅｄｒｏｗｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔｌ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌｉｓｈ， ３０： ４２３ （１９９１）； Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １１０： ４４７０ （１９８８）； Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ， １３： １５９７ （１９９４）；２および３章、ＡＳＣシンポジウムシリーズ５８０、”Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”； Ｙ．Ｓ． ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ． Ｄａｎ Ｃｏｏｋ編、Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．， ４：３９５（１９９４）； Ｊｅｆｆｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ， ３４：１７（１９９４）； Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３７： ７４３ （１９９６））および非リボース主鎖を伴うもの、例えばＵＳＰ５，２３５，０３３；５，０３４，５０６；および６および７章、ＡＳＣシンポジウムシリーズ５８０、”Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”、Ｙ．Ｓ． ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ． Ｄａｎ Ｃｏｏｋ編記載のものがある。また、１個またはそれ以上の炭素環状糖類を含む核酸も核酸の定義内に含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｒｅｖ． （１９９５） ｐｐ １６９−１７６参照）。いくつかの核酸類似体は、Ｒａｗｌｓ、Ｃ ＆ Ｅ Ｎｅｗｓ Ｊｕｎｅ ２， １９９７ ｐａｇｅ ２５ に報告されている。これらの参考文献は全て特に引用して説明の一部とする。リボース−リン酸主鎖にこれらの修飾を加えることにより、ＥＴＭの付加が簡易化され、または生理学的環境における上記分子の安定性および半減期が増加され得る。
【００１５】
当業者によって理解されるように、これらの核酸類縁体は、全て本発明で使用され得る。さらに、天然に存する核酸および類縁体の混合物が製造され得る。例えば、伝達性オリゴマーまたはＥＴＭ結合部位においては、類縁体構造が使用され得る。別法として、異なる核酸類縁体の混合物および天然核酸と類縁体の混合物も製造され得る。
【００１６】
特に好ましいのは、ペプチド核酸類似体を含むペプチド核酸（ＰＮＡ）である。天然に存する核酸の高荷電ホスホジエステル主鎖とは対照的に、これらの主鎖は中性条件下では実質的に非イオン性である。これによって、２つの利点が得られる。まず、ＰＮＡ主鎖は、改善されたハイブリダイゼーション反応速度論を示す。ＰＮＡでは、誤対合対完全適合塩基対において融解温度（Ｔｍ）がより大きく変化する。ＤＮＡおよびＲＮＡは、内部誤対合の場合典型的にはＴｍの２−４℃降下を呈する。非イオン性ＰＮＡ主鎖の場合、降下は７−９℃に近い。これは不一致をよりよく検出することを可能とする。同様に、それらの非イオン的性質故に、これらの主鎖に結合された塩基のハイブリダイゼーションは、塩濃度に対して比較的非感受性である。低減塩ハイブリダイゼーション溶液は生理塩溶液よりも低いファラデー電流を有している（１５０ｍＭの範囲）から、これは本発明の系において、特に有利である。
【００１７】
核酸は、明記されている通り１本または２本鎖であるか、または２本鎖または１本鎖の両配列部分を含み得る。核酸は、ＤＮＡ、ゲノム性およびｃＤＮＡの両方、ＲＮＡまたはハイブリッドであり得、その場合核酸はデオキシリボ−およびリボ−ヌクレオチドの任意の組み合わせ、並びにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンなどを含む塩基の任意の組み合わせを含む。好ましい実施態様は、米国特許第５，６８１，７０２号で総括的に記載されている通り、非特異的ハイブリダイゼーションを低減化するために、標的配列ではなく、他のプローブと相補的になるように設計された核酸においてイソシトシンおよびイソグアニンを用いる。ここで使用されている、「ヌクレオシド」の語は、ヌクレオチド並びにヌクレオシドおよびヌクレオチド類縁体、および修飾ヌクレオシド、例えばアミノ修飾ヌクレオシドを包含する。さらに、「ヌクレオシド」は、非天然的類似構造を包含する。即ち、例えば各々塩基を含む、ペプチド核酸の個々の単位は、ここではヌクレオシドと称される。
【００１８】
好適な実施態様において、標的被検体は、標的配列である。「標的配列」または「標的核酸」もしくは文法的均等物は、１本鎖核酸についての核酸配列を意味する。標的配列は、遺伝子の部分、制御配列、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡやｒＲＮＡを含むＲＮＡなどであってよい。ここで概説するように、標的配列は、サンプルからの標的配列または増幅反応などの生産物のような二次的標的であってもよい。より長い配列はより特異的であるとの理解の下に、標的配列はどのような長さのものであってもよい。当業者によって理解されるように、相補的標的配列は、多くの形を採ることができる。例えば、それは、大きな核酸配列、即ち他の間のなかでも、遺伝子またはｍＲＮＡのすべてまたは一部、プラスミドまたはゲノムＤＮＡの制限断片などの中に含まれていてもよい。後記でより概説されるように、プローブは、標的配列にハイブリダイズさせてサンプル中の標的配列の存在または不存在を決定するために作成される。一般に、この言葉は当業者にとって理解できるものである。標的アレイはまた、異なった標的ドメインを含むものであってもよい。例えば、サンプル標的配列の第１の標的ドメインは、捕捉プローブまたは捕捉伸長プローブの部分にハイブリダイズするものであってよく、第２の標的ドメインは、増幅プローブ、標識プローブまたは異なった捕捉または捕捉伸長プローブなどの部分にハイブリダイズするものであってよい。標的ドメインは、示したように隣接しているか、離れているものであってよい。特記しない限り、「第１」および「第２」の語は、標的配列の５’−３’配向に関連した、配列の配向を示すことを意図するものではない。例えば、相補的標的配列の５’−３’配向を考えた場合、第１標的ドメインは第２標的ドメインに対して５’または３’のいずれに位置していてもよい。
【００１９】
好適な標的被検体には、次のものと関連したバイオ分子が含まれる：（１）ウイルス；限定的にではなく、オルトミキソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、パラミキソウイルス（例えば、呼吸器シンチウムウイルス、マンプスウイルス、はしかウイルス）、アデノウイルス、リノウイルス、コロナウイルス、レオウイルス、トガウイルス（例えば、ルベラウイルス）、パーボウイルス、ポキシウイルス（例えば、バリオラウイルス、ワクシニアウイルス）、エンテロウイルス（例えば、ポリオウイルス、コクサッキウイルス）、肝炎ウイルス（Ａ、ＢおよびＣを含む）、ヘルペスウイルス（例えば、単純疱疹ウイルス、バリセラ−ゾスターウイルス、サイトメガロウイルス、エプシュタイン−バールウイルス）、ロタウイルス、ノルウオークウイルス、ハンタウイルス、アレナウイルス、ラドウイルス（例えば、ラビースウイルス）、レトロウイルス（ＨＩＶ、ＨＴＶＬ−ＩおよびＩＩを含む）、パボバウイルス（例えば、パピローマウイルス）、ポリオーマウイルス、ピコマウイルスなどを含む；および（２）バクテリア；限定的にではなく、広範囲の病原性および非病原性原核生物であって、バチルス、ビブリオ〈例えば、ビブリオ・コレアエ）、エッシエリキア・コリ（例えば、腸管毒性エッシェリキア・コリ）、シゲラ（例えば、シゲラ・デイゼンテリ）、サルモネラ（例えば、サルモネラ・チフィ）、マイコバクテリウム（例えば、マイコバクテリウム・ツベルクロシス、マイコバクテリウム・レプラエ）、クロストリジウム（例えば、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・テタニ、クロストリジウム・ジフィシリ、クロストリジウム・ペルフィンゲンス）、コリネバクテリウム（例えば、コリネバクテリウム・ジフテリエ）、ストレプトコッカス（例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・ニューモニエ）、スタフィロコッカス（例えば、スタフィロコッカス・オウレウス）、ヘモフィルス（例えば、ヘモフィルス・インフルエンザ）、ナイセリア（例えば、ナイセリア・メンギテイデイス、ナイセリア・ゴノロエ）、エルシニア（例えば、ジー・ラムブリア・エルシニア・ペステイス）、シュウドモナス（例えば、シュウドモナス・エルギノーサ、シュウドモナス・プチダ）、クラミジア（例えば、クラミジア・トラコマテイス）、ボルデテラ（例えば、ボルデテラ・ペルタッシス）、トレポネーマ（例えば、トレポネーマ・パラジウム）などを含む。
【００２０】
他の適当な標的被検体としては、限定的にではなく、次のものが含まれる：（１）酵素（および他のタンパク質）；限定的にではなく、心臓病の指示薬または処置に使用される酵素、例えばクレアチンキナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、トロポニンＴ、ミオグロビン、フィブリノーゲン、コレステロール、トリグリセライド、トロンビン、組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔＰＡ）など；膵臓病指示薬、例えばアミラーゼ、リパーゼ、キモトリプシン、トリプシンなど；肝臓機能酵素およびタンパク質、例えばコリンエステラーゼ、ビリルビン、アルカリ性ホスファターゼ；アルドラーゼ、プロスタン酸ホスファターゼ、端末デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼおよびＨＩＶプロテアーゼのような細菌性およびウイルス性酵素など；（２）ホルモンおよびサイトカイン（それらの多くは細胞受容体に対するリガンドとして役立つ）、例えばエリスロポエチン（ＥＰＯ）、スロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ−１ないしＩＬ−１７を含む）、インシュリン、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ−１および２を含む）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、ヒト成長ホルモン、トランスフェリン、表皮成長因子（ＥＧＦ）、低密度リポプロテイン、高密度リポプロテイン、レプチン、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、絨毛向神経性因子、プロラクチン、副腎皮質ホルモン（ＡＣＴＨ）、カルシトニン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、コルチゾル、エストラジオール、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体ホルモン（ＬＨ）、プロゲステロンおよびテストステロンなど：（３）他のタンパク質（α−フェトプロテイン、がん胎児性抗原ＣＥＡ、がんマーカーなど）。
【００２１】
適当な標的被検体としては、炭水化物が含まれ、限定的にではないが、乳がん（ＣＡ１５−３、ＣＡ５４９、ＣＡ２７．２９）、ムチン様がん腫関連抗原（ＭＣＡ）、子宮がん（ＣＡ１２５）、膵臓がん（ＤＥ−ＰＡＮ−２）、前立腺がん（ＰＳＡ）、ＣＥＡ、結腸および膵臓がん（ＣＡ１９、ＣＡ５０、ＣＡ２４２）などに対するマーカーが挙げられる。
【００２２】
他の適当な標的被検体には、金属イオン、特に重金属および／または毒性金属が含まれ、限定的にではないが、アルミニウム、砒素、カドミウム、セレン、コバルト、銅、クロム、鉛、銀およびニッケルが含まれる。
【００２３】
好ましい実施態様において、本発明の方法はバクテリアのような病原体を検出するのに使用される。この実施態様において、好ましい標的配列はｒＲＮＡを含むものであり、一般に米国特許第４，８５１，３３０号；第５，２８８，６１１号；第５，７２３，５９７号；第６，６４１，６３２号；第５，７３８，９８７号；第５，８３０，６５４号；第５，７６３，１６３号；第５，７３８，９８９号；第５，７３８，９８８号；第５，７２３，５９７号；第５，７１４，３２４号；第５，５８２，９７５号；第５，７４７，２５２号；第５，５６７，５８７号；第５，５５８，９９０号；第５，６２２，８２７号；第５，５１４，５５１号；第５，５０１，９５１号；第５，６５６，４２７号；第５，３５２，５７９号；第５，６８３，８７０号；第５，３７４，７１８号；第５，２９２，８７４号；第５，７８０，２１９号；第５，０３０，５５７号および第５，５４１，３０８号に記載されており、これらは参照として本明細書中に取り込まれる。
【００２４】
当業者にとって理解されるように、多数の被検体が本発明の方法を使用して検出することができる。基本的に、後記するような結合リガンドが作られ得る標的被検体ならば、いずれも本発明の方法により検出可能である。後記する技術の多くは標的被検体として核酸を例示するが、当業者にとって他の標的被検体も同じ系を使って検出することができることは容易に認識できるであろう。
【００２５】
必要な場合には、標的被検体は公知の技術を使用して調製される。例えば、サンプルは、公知の分解バッファー、電気穿孔法などを使用して処理することにより細胞を分解し、必要に応じて当業者に理解されるように精製および／または増幅を行ってもよい。標的被検体が核酸である場合、標的配列は必要に応じて増幅されてもよい；適当な増幅技術は、ＰＣＴ／ＵＳ９９／０１７０５に概説されており、参照として本明細書中に取り込まれる。加えて、ハイブリダイゼイションの量や速度を増強するための技術が使用されてもよい。例えば、参照として本明細書中に取り込まれる、ＷＯ９９／６７４２５およびＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／４４０３７１および６０／１７１９８１参照。
【００２６】
標的被検体を含むサンプルは、後記に詳細に概説されるように、バイオチップを含むカートリッジに添加することができる。「カートリッジ」とは、バイオチップに対するケーシングやハウジングを意味する。ここに概説し、当業者によって理解されるように、カートリッジは、多数の構成をとることができ、種々の材料で作成され得る。適当な材料には、限定的にではないが、ファイバーガラス、テフロン、ガラス、シリコン、雲母、プラスチック（アクリル、ポリスチレン、スチレンと他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリカルボネート、ポリウレタン、テフロン（商標）、それらの誘導体を含む）などが含まれる。特に好ましいカートリッジ材料は、プラスチック（ポリカルボネートおよびポリプロピレンを含む）とガラスである。
【００２７】
当業者によって理解されるように、カートリッジは多数の構成分を含むことができ、反応チャンバ、入口および出口、熱電気的構成分を含む加熱要素、ＲＦアンテナ、電磁気的構成分、メモリーチップ、ガスケットのようなシーリング構成分、インターコネクト、マルチプレクサー、プロセッサーを含む電子構成分などが例示される。
【００２８】
好ましい実施態様において、カートリッジは、反応チャンバを含むものである。一般に、反応チャンバは、サンプルをバイオチップアレイに接触させるスペースまたは容積を有する。反応チャンバの容積は、アレイの大きさに依存して変化し、アレイも変化し得る。一般に、反応チャンバは、約１ｎＬ￣１ｍＬの範囲、好ましくは約１〜２５０μｌ、特に好ましくは約１０〜１００μｌの範囲である。いくらかの実施態様においては、反応チャンバ内へ気泡が入る（これは検出を阻害する）のを避けるため、反応チャンバを導入すべきサンプルの容量より小さなものとし、僅かにオーバーフロウさせて、反応チャンバ内に空気が殆どまたは全く存在しないようにする。
【００２９】
カートリッジの反応チャンバは、分析さるべきサンプル導入のための入口を有している。入口は、任意に反応チャンバからサンプルや試薬の蒸発を防止または低下させるためのシールを備えていてもよい。好ましい実施態様において（第１図参照）、シールは、ガスケットを有しており、これを通してピペットやシリンジが押し込まれる。ガスケットは、ゴムまたはシリコーンもしくは他の適当な材質のものであってよい。
【００３０】
反応チャンバは、種々の態様に形成することができる。好ましい実施態様において、反応チャンバは、気泡や他のサンプル不純物の導入や保持を最小限にするように構成される。従って、例えば第１図に示すように、カートリッジが直立した角度に保持すると、入口は流体サンプルが反応チャンバの「底部」に流れ込み、空気や流体が反応チャンバの「頂部」、例えば出口を通って逃げることを可能にする。従って、流体サンプルは、反応チャンバ中へ流れ、アレイに接触する。好ましい実施態様において、反応チャンバは、更に出口を有しており、空気や過剰の試料を反応チャンバから排出することができる。ある実施態様において、出口は、廃出物貯蔵ウエルに放出して、後記するように、チップまたはカートリッジの外表面に放出するか、あるいは、好ましい実施態様において、入り口に返すためのものである。例えば、好ましい実施態様は、出口が入口に向けられており、好ましくは荷重点の上に向けられている系を使用するものである。例えば、ピペットがカートリッジに荷重するために使用される場合、ピペットの端部は、出口の下方に伸長し、出口からの空気が反応チャンバに導入されないように設けられる。加えて、カートリッジハウジングとバイオチップの材料は、気泡の発生を避けるため、嫌気性または好気性の点で類似性であるように選択することができる。
【００３１】
加えて、好ましい実施態様において、反応チャンバ／入口および／または出口は、任意にバルブの使用を含むものである。例えば、半透過性膜またはフィルターを使用し、優先的にガスを逃散させるが、室内に試料流体を保持させてもよい。例えば、ゴアテックス（商標）のような多孔質テフロンは、空気を貫通させるが、流体を貫通させない。
【００３２】
当業者にとって理解されるように、この実施態様で使用され得る種々の反応チャンバの構造がある。一般に、入口と反応チャンバの交線は、カートリッジの「底部」にあり、小さな穴が存在し、広がった反応チャンバを有するのが好ましい。加えて、反応チャンバの「頂部」は、同じ様に狭くてよい。幾らかの実施態様を第２図に示す。反応チャンバの大きさや形状について好ましい実施態様は、反応チャンバの円滑な充填を可能にするものである。好ましい実施態様は、反応チャンバの構造として、気泡形成点となる鋭いコーナーや他の構成分を避けることである。
【００３３】
加えて、若干の実施態様において、反応チャンバは、サンプルの混合を可能にするように構成することができる。例えば、サンプルと試薬が同時にまたは別々に室内に導入される場合、入口と反応チャンバは、堰、チャンネルまたは他の構成分を有することができ、サンプルと試薬の混合を最大にする。更に、後記するように、反応は、混合および／または分離のための磁気ビーズを利用してもよい。
【００３４】
好ましい実施態様において、カートリッジにシーリング機構を設け、サンプルや試薬の基質の他の部分、特に（電子的検出の場合）電子的連結部に対する漏れを防止する。当業者にとって理解されるように、これは種々の異なった形状をとることができる。一つの実施態様において、アレイを有するバイオチップ基質とシート，チューブまたはストリップを有するカートリッジの間には、ガスケットが存在する。これに代えて、ゴムやシリコーンのストリップまたはチューブが使用されてもよい。例えば、ハウジングは、ガスケットが適合する切り込みやチャンネルを有しており、ハウジング、ガスケットおよびチップは一緒に固定されてもよい。更に、接着材を使用して、ガスケットをカートリッジに固着することができ、例えば両面接着材を使用することができる。また、例えば、シリコーン、アクリルおよび組み合わせ接着剤を使用して、ガスケットをバイオチップに固着させ、ついでバイオチップをここに記載したようにカートリッジの中へ固定してもよい。
【００３５】
若干の実施態様において、反応チャンバおよびバイオチップ基質は、分離したシーリング機構が必要でないように構成される。例えば、バイオチップ基質は、内側のアレイと共に、反応チャンバの半分として役立つことができ、反応チャンバハウジングは他の半分として役立つことができる。使用された材料により、両者を接着させる任意の接着剤が使用されてもよい。代わりに、基質の両側にアレイが存在する場合、ハウジングは基質を包含してもよい。
【００３６】
即ち、これらの実施態様において、反応チャンバの容積は、カートリッジにウエルを形成し、バイオチップ基質の付加がアレイの周囲に反応チャンバを形成させるか、または平らなカートリッジを使用し、かつ一定の深さのガスケットを使用するか、または両者を結合させることにより、設けてもよい。
【００３７】
好ましい実施態様において、カートリッジは、キャップまたは蓋を含むものである。キャップは、後記するように、ミクロ流動性構成分である場合、機能的であってよい。加えて、キャップは、生物学的材料の漏れまたは交叉汚染を防止するため、安全性の目的のためにデザインされてもよい。当業者によって理解されるように、キャップは、広い範囲の構成をとることができる。例えば、ある実施態様において、キャップは単に入口をシールし、検定の間のサンプルの蒸発を防止するものである。好ましい実施態様において、キャップは、サンプル処理および試薬貯蔵に使用するための数多くの付加的要素を有するものであり、種々の異なったサンプル反応を可能にするものであってよい。例えば、種々のミクロ流体構成分は、キャップの中へ収容し、サンプルに対する多数の操作を実施して究極的に標的被検体の検出や定量を可能にする。一般に、参照として本明細書中に取り込まれるＰＣＴ ＵＳ００／１０９０３およびそこに概説された引用文献を参照のこと。これらの操作は、細胞処理（細胞濃度、細胞分解、細胞除去、細胞分離など）、他のサンプル成分からの所望の標的被検体の分離、標的被検体についての化学的または酵素的反応、標的被検体の検出など。本発明のデバイスは、サンプル操作、廃物または試薬のための１つ以上のウエル、これらのウエルに対するおよび間の、電気泳導分離マトリックスを含む、ミクロチャンネル（流路として参照されることもある）、流体の動きを制御するバルブ、電気浸透性、電気流体力学的または界面動電的ポンプのようなオンチップポンプを含む。加えて、ここに概説するように、デバイスの内部表面の部分を、必要に応じて種々の被覆によりコートし、バイオ適合性、流動抵抗性などのために、非特異的結合を低下させたり、結合リガンドの付加を可能にしてもよい。これらのミクロ流動性キャップは、当業者にとって理解されるように、種々方法で形成することができる。例えば、参照として本明細書中に取り込まれる、ＰＣＴ ＵＳ００／１０９０３における概説やそこに記載されている引用文献参照。
【００３８】
カートリッジのキャップをアッセイの部分として使用する場合、本明細書で「モジュール」と呼ぶ、その用途に応じる所望の装置に存在する様々な成分の１つまたはそれ以上を含むように形成し得、必要に応じて微小チャネルで連結されている。これらのモジュールには、サンプル流入口；サンプル導入または収集モジュール；細胞処理モジュール（例えば、細胞溶解、細胞除去、細胞濃縮、細胞分離または捕獲、細胞成育などのためのもの）；例えば、電気泳動、誘電泳動、ゲル濾過、イオン交換／アフィニティー・クロマトグラフィー（捕獲と解放）などのための分離モジュール；標的被検体の増幅（例えば、標的被検体が核酸の場合、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＳＤＡ）、増幅に基づく核酸配列（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＮＡＳＢＡ）およびＷＯ９９／３７８１９およびＰＣＴ ＵＳ００／１９８８９で概説される他の技法を含むがこれらに限定されるものではない、増幅技法は有用である）、物理的、化学的もしくは酵素的な標的被検体の切断、または標的の化学的修飾を含む、サンプルの化学的もしくは生物学的変化のための反応モジュール；流体ポンプ（電気浸透、電気流体力学または動電学的なポンプを含むが、これらに限定されるものではない）；流体バルブ；加熱または冷却用の温度モジュール；アッセイ試薬用の貯蔵モジュール；混合チャンバ；および検出モジュールが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
さらに、本明細書に記載のこれらの微小流体成分はカートリッジのキャップに結合している一方、当業者に理解されるように、これらのモジュールおよびチャネルは（本明細書で概説する他の成分と同様に）カートリッジまたは装置のどこに位置してもよい。さらに、いくつかの成分は装置中にあってもよい；例えば、「オフチップ」ポンプは、装置の１つまたはそれ以上のステーションに位置してもよい。
【００４０】
カートリッジは少なくとも１つのバイオチップを含み、いくつかの実施態様はカートリッジごとに１つまたはそれ以上のバイオチップを利用する。本明細書の「バイオチップ」またはその均等物は、種類が異なる生体分子、特に核酸およびタンパク質のアレイを含む基板を意味する。フォトリソグラフィー技法（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）など）、スポット技法（例えば Ｓｙｎｔｅｎｉ および Ｉｎｃｙｔｅ）、印刷技法（Ａｇｉｌｅｎｔ および Ｒｏｓｅｔｔａ）、三次元「ゲルパッド」アレイを用いて作成されたもの、および電気的成分を含むもの（例えば Ｎａｎｏｇｅｎ）を含む、多様な適する核酸バイオチップがある。好ましい実施態様は下記および米国特許第５，５９１，５７８号；第５，８２４，４７３号；第５，７０５，３４８号；第５，７８０，２３４号および第５，７７０，３６９号；Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／８７３，５９８、０８／９１１，５８９；ＷＯ９８／２０１６２；ＷＯ９８／１２４３０；ＷＯ９８／５７１５８；ＷＯ００／１６０８９；ＷＯ９９／５７３１７；ＷＯ９９／６７４２５；ＷＯ００／２４９４１；ＰＣＴ ＵＳ００／１０９０３；ＷＯ００／３８８３６；ＷＯ９９／３７８１９；ＷＯ９９／５７３１９およびＰＣＴＵＳ００／２０４７６；および関連資料に記載されており、これらの全てを出典明示により全体的に本明細書の一部とする。
【００４１】
本明細書に概説する電気的検出方法の使用の１つのめざましい利点は、反応のリアルタイムでのモニタリングとハイブリダイゼーションが起こり得ることである。つまり、蛍光をベースとするシステムでは、過剰の（例えば結合しなかった）シグナルプローブ（または、例えば増幅反応中に標的配列自体が蛍光標識される場合、標的配列）の除去が必要であるが、本明細書に記載の電気的方法ではその必要がない。つまり、ＥＴＭを含むプローブが表面に結合しない限り、結合しなかったプローブが除去されていなくても、シグナルはほとんど、あるいは全く、見られない。このことは、同一のアッセイでの多重測定と同様に、リアルタイムの反応モニタリングを可能にする。従って、下記の考察は主に電極のアレイを含むバイオチップの使用に向けられているが、他のアレイ技法が本発明に包含される。
【００４２】
好ましい実施態様では、バイオチップは、複数のアレイ位置を有する基板を含む。本明細書中の「基板」もしくは「固体支持体」または文法的均等物は、捕獲リガンドの付着または結合に適する、分離した個々の部位を含むように改変され得るいかなる物質をも意味する。適する基板には、金のような金属表面、下記で定義するような電極、ガラスおよび改変または機能化ガラス、ファイバーグラス、テフロン、セラミック、雲母、プラスチック（アクリル、ポリスチレンおよびスチレンと他の物質とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリウレタン、テフロン（商標）、およびその誘導体など）、ＧＥＴＥＫ（プロピレンオキシドとファイバーグラスの混合物）など、多糖類、ナイロンまたはニトロセルロース、レジン、シリカまたはシリコンまたは改変シリコンを含むシリカベースの物質、炭素、金属、無機ガラスおよび様々な他のポリマーが含まれ、プリント回路基板（ＰＣＢ）物質が特に好ましい。
【００４３】
このシステムはアレイ方式での特定用途が明らかになっている；即ち、アドレス参照可能な検出電極のマトリックスがある場合である（本明細書では「パッド」、「アドレス」または「ミクロ領域」と一般的にいう）。本明細書において、「アレイ」とは複数の捕獲リガンドがアレイ方式にあることを意味する；アレイのサイズはアレイの構成物および最終用途に左右される。約２つの異なる捕獲リガンドから数千ものリガンドまでを含むアレイを作製し得る。一般に、該アレイは電極のサイズ並びにアレイの最終用途によって、２個から１００，０００以上にも及んで構成される。好適な範囲は約２個から約１０，０００個であり、好ましくは約５個から約１０００個であり、特に好ましいのは約１０個ないし約１００個である。一部の実施態様において、本発明の構成物はアレイ方式でない場合もある；即ち、一部の実施態様では単一の捕獲リガンドを含む構成物を同様に作製し得る。さらに、一部のアレイにおいて、異なる構成物または同一の構成物を含む複数の基板を用い得る。このように、例えば、大型のアレイは複数の小型基板から構成されてもよい。
【００４４】
好ましい実施態様では、バイオチップは、アレイを含む、そして好ましい実施態様では電極のアレイを含む、少なくとも１つの表面を有する基板を含む。本明細書での「電極」は、電子装置に接続したとき、電流または電位を感知し、それをシグナルに変換し得る構成物を意味する。あるいは、電極を、電位を電子に適用し得る、および／または、溶液中の種へまたは種から電子を移し得る構成物として定義することができる。このように、電極とは本明細書に記載のＥＴＭである。好適な電極は技法上既知であり、これらに限定されるものではないが、ある種の金属およびその酸化物、例えば、金、白金、パラジウム、シリコン、アルミニウム；金属酸化物電極、例えば、酸化白金、酸化チタン、酸化スズ、酸化スズインジウム、酸化パラジウム、酸化ケイ素、酸化アルミニウム、酸化モリブデン（Ｍｏ２Ｏ６）、酸化タングステン（ＷＯ３）および酸化ルテニウム；および炭素（ガラス状炭素電極、黒鉛およびカーボンペースト）などを包含する。好適な電極は金、ケイ素、炭素および金属酸化物電極などであり、金が特に好ましい。
【００４５】
本明細書に記載の電極は平らな表面として図示しているが、これは電極の可能な一形状であって、図式化を目的とするのみのものである。電極の形状は使用される検出法およびカートリッジの配置により変わる。例えば、平面状の電極は光検出法に好適であり、あるいは、核酸のアレイが作成され、従って合成および検出のためにアドレス可能な位置が必要な場合に好適である。あるいは、単一または低密度の分析のためには、電極をチューブの形状とすることができる。電極コイルまたはメッシュも、いくつかの実施態様では同様に好ましい。これにより、核酸を含む表面領域を、少量のサンプルに最大限露出させられる。
【００４６】
好ましい実施態様では、検出電極を基板上に形成させる。さらに、本明細書における議論は一般に金電極の形成に向けられているが、当業者に理解されるように、他の電極を同様に使用できる。基板は上記概説のように、多様な物質を含み得る。
【００４７】
一般に、好適な物質はプリント回路基板物質である。回路基板物質は伝導層で被覆されている絶縁基板を含む物質であり、リソグラフィー技法、特にフォトリソグラフィー技法により処理加工して、電極と相互接続体の型を形成する（場合により技法上、相互接続またはリード線という）。絶縁基板はすべてというわけではないが、一般にポリマーである。技法上知られているように、１層または複数層を使用し、「二次元」基板（例えば、すべての電極および相互接続体が一平面にある）または「三次元」基板（この場合、電極は１方の表面にあり、相互接続体が基板を貫通して他側へ出ているか、電極が複数の表面にある）を作製する。三次元システムは多くの場合、穿孔またはエッチングを使用し、次いで、銅などの金属で電気メッキし、「貫通基板」相互接続を作製するようにする。回路基板物質はしばしば基板にすでに付着した銅箔などの箔を備えており、必要により（例えば、相互接続のために）、例えば、電気メッキによりさらに銅が加えられる。銅の表面は、次いで、粘着層の付着を可能にするために、例えば、エッチングによりざらつかせる必要がある。
【００４８】
従って、好適な実施態様において、本発明は複数の電極、好ましくは金電極を含む基板を含むバイオチップ（場合により本明細書では「チップ」という）を提供する。電極数はアレイについて概説したとおりである。各電極は、好ましくは、本明細書に概説したように自己集合した単層を含む。好適な実施態様において、単層形成種の１つは本明細書に概説したように捕獲リガンドを含む。さらに、各電極は相互接続をもち、それが一端で電極に付着し、最終的に電極を制御し得る装置に付着している。即ち、各電極は独立してアドレス参照可能である。
【００４９】
回路基板物質（または他の基板）上の検出電極は一般に多様な方法で調製される。一般に、高純度の金を用い、真空蒸着法（スパッタリングおよび蒸発）または溶液析出（電気メッキまたは無電解方法）により被覆してもよい。電気メッキを実施する場合には、基板はまず伝導性物質を含まねばならない；ファイバーグラスの回路基板は多くの場合銅箔を備えている。多くの場合、基板によっては、良好な機械的安定性を保証するために、基板と金の間に粘着層が用いられる。このように、好適な実施態様では、粘着金属、例えば、クロム、チタン、チタン／タングステン、タンタル、ニッケルまたはパラジウムなどの析出層を利用するが、これらの金属は上記金同様に析出させ得る。電気メッキ金属（粘着金属または電極金属）を使用する場合、粒状精製添加物（多くの場合、業界では光沢剤という）を任意に加えて、表面析出性を変化させる。好適な光沢剤は有機物および無機物の混合物であり、コバルトとニッケルが好ましい。
【００５０】
一般に、粘着層は約１００Åから約２５ミクロン（１，０００マイクロインチ）の厚さである。もし粘着金属が電気化学的に活性であるならば、電極金属は「染み出し」を防止する厚さで被覆しなければならない；もし粘着金属が電気化学的に不活性であるならば、電極金属は薄くてもよい。一般に、電極金属（好ましくは金）は約５００Åから約５ミクロン（２００マイクロインチ）の範囲の厚さで、好ましくは約３０マイクロインチないし約５０マイクロインチの厚さで析出させる。一般には、金を析出させて、直径約５ミクロンないし約５ｍｍの範囲、好ましくは約１００ないし２５０ミクロンのサイズの電極とする。このようにして形成される検出電極は、好ましくは、清浄にし、以下に検討するようにＳＡＭを付加する。
【００５１】
このように、本発明は複数の金電極を含む基板の作製法を提供する。この方法はまず基板上に、ニッケルまたはパラジウムなどの粘着金属を（場合により光沢剤と共に）被覆することを含む。電気メッキが好ましい。次いで、電極金属、好ましくは金を粘着金属上に（好ましくは再度電気メッキにより）被覆する。次いで、電極とそれに繋がる相互接続を含む装置の型をリソグラフ技法、特に技法上既知のフォトリソグラフィー技法、および湿式化学エッチングにより作製する。多くの場合、非伝導性化学抵抗性絶縁物質、例えば、蝋マスクまたはプラスチックをフォトリソグラフィー技法により敷き、露光した電極とリード線への接続点のみを残す；リード線はそれ自体一般に被覆されている。
【００５２】
発明の構造のある実施態様では、蝋マスクは水溶性物質よりもむしろ溶媒可溶性物質で作成するのが望ましい。一般に水溶性物質が有する環境上の利点のために、水溶性蝋マスクは産業界では標準的になった。不都合なことに、水性環境に露出される検出チップについては、例えばアセトニトリルのような水溶性物質は、水性溶液に露出された場合に溶解し得る。
【００５３】
本方法では下記のようにＳＡＭの付加が続く。好適な実施態様においては、点滴析出技法を用い、必要な化学物質、即ち、単層形成種であって、その一つは、好ましくは捕獲リガンド構成種、などを付加する。点滴析出技法は「スポット」アレイ作製について周知である。これは各電極に異なる構成物を付加するために実施する。即ち、異なる捕獲リガンドを含む配列を作製する。あるいは、ＳＡＭ種は各電極について同一であってもよく、この場合は点滴析出技法またはその溶液に基板全体もしくは基板表面を浸漬する方法により実施してもよい。
【００５４】
バイオチップが電極を含む場合、下記に概説する化学成分に加えて様々な付加的成分があり、それには、相互接続、マルチプレクサ、継電器、フィルター、ＲＦアンテナ、加熱素子、電磁性成分などが含まれるがこれらに限定されるものではない。
【００５５】
各電極は、アレイの各電極についての入力および電気的反応シグナルを伝達する独立のリード線（相互接続）を含む。各電極への入力シグナルのみを独立に変化させるが電気的反応シグナルは変化させない能力を要する以前のシステムとは対照的に、本発明では入力および電気的反応シグナルの両方を各電極で独立にモニターできることが重要である。
【００５６】
比較的少数の電極パッドには、および／またはアレイの望ましいサイズによっては、平行回路を使用する直接接続を提供することが適切である。
【００５７】
好ましい実施態様では、各電極は対応する相互接続を介して対応するマルチプレクサの入力に個別に接続されている。伝統的なシステムと方法に存在していたある問題点は、特に電極が密集して、または近接して詰まったアレイを形成する場合に、電気的接続（入力および／または出力）を多数の電極に与えることの困難さである。この問題の解決法がいくつか同定され、それには、利用可能な技法の中でも、平行回路と接続の組として同時に、線状サンプルアレイアドレス参照、時間−領域マルチプレックス様式で連続的に、または周波数領域および／または時間−領域ベースの分離技法を用いて平行または連続的に、のいずれかのシグナル加工を可能にする回路構成の使用が含まれる。
【００５８】
例えば、チップ上の第１の多重回路または線をより小さい複数の線にチップから出ているコネクターにおいて接続する好適な方法は、チップまたは基板上の回路を基板外の回路に選択的に連結するための、マルチプレクサ（ＭＵＸ）または継電器のようなスイッチ装置を使用することである。
【００５９】
マルチプレクサの数は、アレイ中の電極の数によって決まる。ある実施態様では、単一のＭＵＸを利用する。好ましい実施態様では、複数のＭＵＸを使用する。当業者に理解されるように、このことは様々な方法で実施可能である；ある実施態様では、電極の「セクター」を、特定のＭＵＸに割り当てる；従って例えば、アレイの行または列が、各々それら自体のＭＵＸを有してもよい。あるいは、サブマルチプレクサを使用する；例えば、列または行をそれぞれのサブマルチプレクサに連結し、サブマルチプレクサの出力が別のサブマルチプレクサに繋がっている。
【００６０】
好ましい実施態様では、マルチプレクサには、コネクターパッドを介する制御シグナルを受け取る２進カウンタが含まれる。制御シグナルは、好ましくは刻時信号のようなパルスシグナルであり、検出器を駆動する連続的なカウントを発生させる。
【００６１】
好ましい実施態様では、基板上の複数の電極を、「オフチップ」に導くより少数のコネクターパッドに連結する別の方法は、個々の電極の選択を可能にする列−行選択シグナルを使用することである。
【００６２】
不都合なことに、異なる電極または電極群に時間的に連続して接近する構造と方法のためには、時間差が結果を変えるのに十分なほど大きい場合に、先に検知され読み出されたデータと後に検知され読み出されたデータとの間の目盛を維持するために、検知した結果をいくらか校正または調整することが必要である。このような調整の必要性はアッセイ、反応速度および時間差に左右され、検知されるか、または読み出される電極の数の関数でもある。例えば、いくつかの実施態様では５ｘ５電極アレイの２５個の電極を数秒間隔（例えば、１０秒間隔）で測定するのが全く合理的である；しかし、他の実施態様では、最初と最後の測定の間が４分離れているのは受け入れ難いか、あるいは補正するのが難しい。
【００６３】
反応が電極表面のような平面的な表面の上または近傍で起こる場合、反応速度論を考慮するのもまた望ましい。反応が溶液中で起こる場合よりも、拡散速度が重要な役割を持ち得る。測定が適切な時間で行われるように、反応がいつ、あるいはどの期間の後に起こるのかを理解することが重要である。このことは中間反応生成物が検知される場合、あるいは例えば反応速度論を行う場合のように、一連の測定が望ましい場合に、特に重要である。
【００６４】
反応速度論はまた、駆動シグナルのためにも重要な考慮事項である。バイオセンサは、化学速度論によって制限を受ける。本発明で関心を持たれる分類の分子（ＤＮＡ、ＤＮＡ断片、タンパク質、抗体など）について、各分子には媒質中での最大スピードまたは速度がある。例えば、分子は１Ｈｚと１０ｋＨｚとの間の周波数で典型的に、５Ｈｚと５ｋＨｚとの間の周波数でより典型的に、溶液中で能動的に駆動されるか、あるいは動かされ得る。高周波数では分子は震えるだけであり、一方低周波数では動きは特に有用ではない。
【００６５】
さらに、各駆動シグナルの周波数に伴う、アッセイで利用可能な量である、アッセイ量がある。周波数が高まるにつれて、アッセイ量は、サイズと体積において縮小する。このことは、電極の分布および駆動シグナルの周波数と密接な関係がある。
【００６６】
反応の検知と測定のためのさらなる考慮事項は、反応媒質（溶液の成分、サンプルの成分、反応の成分など）が電極に与え得る影響である。時間を経て電極が分解、被覆化、またはその他の変化をし、かくして測定の精密度と均一性に影響を与えることがある。そのような条件下では、検知、測定または分析を迅速に行うか、少なくとも集めたデータが正確に解釈されるようにあらかじめ決定したタイミングに従うことが望ましい。
【００６７】
好ましい実施態様では、１またはそれ以上の前置増幅器を使用する。当業者に理解されるように、前置増幅器は例えば「基板上」または「チップ上」のような基板の表面にあってもよいし、あるいはアレイチップ外部の回路構成中に備えてもよい。しかし、外部の回路構成にもたらされるシグナルのノイズ対シグナル比を増加させるために、前置増幅器は基板に含まれるのが好ましい。
【００６８】
好ましい実施態様では、個々の各電極が、付随する前置増幅器を有する。
【００６９】
好ましい実施態様では、アレイを「セクター」に分け、アレイ中の電極のサブセットが、付随するＭＵＸと前置増幅器を有する。同様に、発明の他の成分が、セクターに付随してもよい。
【００７０】
好ましい実施態様では、インピーダンス・マッチングを行う。
【００７１】
好ましい実施態様では、フィルターを使用する。それには時間領域フィルターおよび周波数領域フィルター、ならびに組合せが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７２】
電極成分に加えて、好ましい実施態様の本発明の電極は、自己集合単層（ＳＡＭ）を含む。これらのＳＡＭの組成は使用する検出方法により変化する。一般に、２つの基本的な検出メカニズムがある。好適な実施態様において、ＥＴＭの検出は、２本鎖核酸の積層したπ−軌道を通しての電子伝達に基づく。この基本的メカニズムは米国特許第５，５９１，５７８号、第５，７７０，３６９号、第５，７０５，３４８号およびＰＣＴ ＵＳ９７／２００１４に記載されており、本明細書では「メカニズム−１」と名付ける。簡単に説明すると、これまでの研究では、電子伝達が、２本鎖核酸の積層したπ−軌道を通しては急速に、また、１本鎖核酸では有意によりゆっくりと進行することが示されている。従って、このメカニズムはアッセイの基本となり得る。このように、伝導性オリゴマーを介して検出電極に付着している核酸にＥＴＭを（下記のように、鎖の一方に共有結合により、またはハイブリダイゼーションインジケーターの使用を経てハイブリダイゼーション複合体に非共有結合により）加えることにより、ＥＴＭと電極間の電子伝達が、核酸と伝導性オリゴマーを通して検出し得る。
【００７３】
あるいは、必ずしも核酸を経由する電子伝達を介在せずにＥＴＭを検出することができ、むしろＳＡＭを含む電極上で直接的に検出できる；即ち、ＥＴＭからの電子は積層したπ−軌道を通して移動してシグナルを生成する必要がない。上記のように、この実施態様では、検出電極は、電極をサンプル中のレドックス的に活性な種から隔てるのに役立つ自己集合単層（ＳＡＭ）を含むのが好ましい。この実施態様では、わずかな「欠損」（本明細書中では時に「微小管路」、「ナノ管路」または「電気管路」と表わされる）を含むように形成されたＳＡＭ表面上のＥＴＭの存在は、直接検出できる。この基本概念を本明細書では「メカニズム−２」と称する。本質的に、電気管路は、特定のＥＴＭが表面に近づくのを可能にする。理論によって制限を受けないが、電気管路の配置は、選択されるＥＴＭに部分的に依存することに留意すべきである。例えば、比較的疎水性のＥＴＭでは、親水性または荷電のあるＥＴＭを効果的に排除する疎水性電気管路形成種を使用できる。同様に、より親水性または荷電のある種をＳＡＭ中で使用することは、疎水性ＥＴＭを排除するのに役立ち得る。
【００７４】
これらの欠損は、検出電極とサンプルの構成要素の直接的な接触を可能にする「孔」とは区別されることに留意すべきである。後により詳しく概説するように、電気管路は、いくつかの一般的方法で生成できる。これらの方法には、ＰＣ回路板上に形成される金電極のような粗い電極表面を使用すること、または単層中に少なくとも２種の異なる種を含有し（即ち、「混成単層」の使用）、それらの種の少なくとも１つは電気管路形成種（ＥＦＳ）であることが含まれるが、これらに限定されるものではない。ゆえに、標的非検体を結合する際に、ＥＴＭを含む溶解性の結合リガンドが表面にもたらされ、おそらく電極への「電気管路」を通じて、ＥＴＭの検出が進行できる。本質的には、欠損を含むＳＡＭの役割は、溶液の成分から電極を隔て、電極への非特異的結合の量を減らす利点を提供したまま、ＥＴＭを電極の電気的表面に接触させることである。見方を変えれば、結合リガンドの役割は、ＥＴＭが直接検出される場である表面へＥＴＭを補充するための特異性をもたらすことである。
【００７５】
従って、どちらの実施態様でも、下記により詳しく概説するように、ＥＴＭを含有するアッセイ複合体を形成させ、次いで検出電極を用いてそれを検出する。
【００７６】
ゆえに、好適な実施態様では、電極は電気管路形成種（ＥＦＳ）を含む単層を含む。本明細書に概説するように、被検体が電極から少し離れているとき、標的被検体結合（例えば、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション）の効率は増加し得る。同様に、単層が存在すると、生体分子（標的被検体を含む）の電極への非特定結合は、一般に減少する。このように、単層は被検体を電極表面から離して維持するのを容易にする。さらに、単層は荷電種を電極表面から離しておくのに役立つ。このように、この層は、溶媒内で各電極と各ＥＴＭ間または電極と荷電種間の電気的接触を防止するのに役立つ。かかる接触は、直接の「短絡」またはサンプル内に存在し得る荷電種を介した間接の短絡となり得る。従って、この単層は、好ましくは電極表面上の均一層にきっちりと詰込み、「孔」の存在が最少になるようにする。単層はこのように電極への溶媒接近をブロックする物理的障壁として作用する。
【００７７】
本明細書での「単層」または「自己集合単層」または「ＳＡＭ」とは、表面上に自然に化学吸着した分子の比較的秩序だった集合体を意味し、そこでは分子が互いに略平行に方向づけられており、かつ、表面に対し大まかに垂直に方向づけられている。分子の大部分は表面に接着する官能基を含み、また、一部が単層中の隣接する分子と相互作用し、比較的秩序だったアレイを形成する。「混成」単層は不均質の単層を含む。即ち、そこでは少なくとも２つの異なる分子が単層を作り上げている。
【００７８】
一般に、本発明のＳＡＭは、用いる電極表面とシステムに応じて、多数の方法で生成させることができ、かつ多数の異なる成分を含み得る。「メカニズム−１」の実施態様では、好適な実施態様は２つの単層形成種、即ち１つの単層形成種（絶縁体および伝導性オリゴマーを含む）および捕獲結合リガンドを含む１つの伝導性オリゴマー種、を利用するが、当業者には了知されるように、別の単層形成種をも同時に含ませ得る。「メカニズム−２」システムでは、ＳＡＭの組成は検出電極表面に依存する。一般に、２つの基本的「メカニズム−２」システムを記述する。即ち、金ボール電極のような「滑らかな」表面を含む検出電極、およびＰＣ回路板についての商業的製法を用いて作成される電極のような「粗い」表面を含む電極である。理論によって制限されないが、一般に、不完全な表面（即ち、「粗い」表面）上に作成された単層は、ＥＦＳの非存在下でも、十分な電気管路を有する単層を自然に形成するように思われる。これは、おそらく粗い表面上での均一な単層の形成は困難だという事実に起因する。しかし、均一な表面は、より均一な単層の形成をもたらすので、「より滑らかな」表面は、電気管路を生成するために、十分な数のＥＦＳ含有を要する。再度理論によって制限されないが、単層の均一性を乱す種の含有（例えば硬質な分子をより軟質な分子の背景に含ませることによる）は、電気管路の成因となる。ゆえに、「滑らかな」表面は、３成分を含む単層を含む。即ち、絶縁体種、ＥＦＳ、および捕獲リガンドを含む種、である。ただし、ある環境（例えば捕獲リガンドが高濃度で含まれる場合）では、捕獲リガンドはＥＦＳとして働き得る。この文脈での「滑らかさ」は、物理的には計測されず、むしろＥＦＳが含まれる場合に計測されるシグナルの増加の関数として計測される。つまり、単層形成種に包まれた検出電極からのシグナルが、ＥＦＳを含む単層形成種に包まれた検出電極からのシグナルと比較される。増加は、該表面が相対的に滑らかであることを示す。なぜなら、ＥＦＳの含有はＥＴＭの電極への接近を容易にするのに役立ったからである。ここでの議論は主に金電極およびチオール含有単層形成種に向けられたものであるが、他のタイプの電極および単層形成種を用い得るということにも留意すべきである。
【００７９】
メカニズム−２システムの「電気管路」は、サンプルの成分が電極の表面と直接触れる結果をもたらさないことに留意すべきである。つまり、電気管路は、電極への物理的接近を可能にする大きい穴または孔ではない。むしろ、理論によって制限されないが、電気管路は、あるタイプ群のＥＴＭ、特に疎水性ＥＴＭが、単層中に十分貫通し、検出されるようにすると思われる。しかし、いくつかの親水性の種を含む他のタイプ群のレドックス的に活性な種は、電気管路が存在しても単層を貫通しない。ゆえに、一般に、サンプル中に存在し得るレドックス的に活性な種は、電気管路による実質的なシグナルをもたらさない。的確なシステムはＳＡＭの構成とＥＴＭの選択によって変化するが、一般的に、非特異的結合を減らし、ＥＴＭ検出のための十分な電気管路も有する適切なＳＡＭの試験は、ＳＡＭにフェロセンまたはフェロシアニドを加えることである；前者はシグナルを発すべきであり、後者は発すべきではない。
【００８０】
従って、メカニズム−１のシステムでは、該単層は、下記に詳しく概説するように、捕獲結合リガンドを含む伝導性オリゴマーを含む第１の種、および絶縁体または伝導性オリゴマーのどちらかまたは両方を含む単層形成種を含む第２の種を含有する。
【００８１】
好適な実施態様では、該単層は、電気管路形成種を含む。本明細書中では、「電気管路形成種」または「ＥＦＳ」は、表面でのＥＴＭの検出を可能にする、単層中に十分な電気管路を生成させる能力のある分子、一般的にはアルキル基のような絶縁体の分子、を意味する。一般に、ＥＦＳは以下の特質を１またはそれ以上有する。即ち、例えばアルキル鎖に匹敵するような、比較的硬質な分子である；他の単層形成種と異なる外面形態で電極表面に付着する（例えば、チオール基を有する金表面に付着したアルキル鎖は大体４５°の角度で付着すると考えられ、チオールを介して金に付着したフェニル−アセチレン鎖は９０°の角度で下がると考えられる）；例えばアルキル基のような分岐基の含有、またはポリエチレングリコール単体のような高度に柔軟な種の含有により、きっちりと詰まった単層の形成を立体配置的に妨害するか阻害する構造を有する；または電気管路を形成するように活性化される能力がある（例えば、光活性化によって選択的に表面から除外されて電気管路を残す、光活性化し得る種）。
【００８２】
好適なＥＦＳは下記に定義される伝導性オリゴマー、およびフェニル−アセチレン−ポリエチレングリコール種、並びに１９９９年７月２７日に出願され、出典明示により本明細書の一部とするＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／１４５，９１２の図に記載のような非対称のＳＡＭ形成ジスルフィド種を含む。しかし、いくつかの実施態様では、ＥＦＳは伝導性オリゴマーではない。
【００８３】
好適な態様において、単層は伝導性オリゴマーを含む。本明細書において「伝導性オリゴマー」は実質的に伝導性のオリゴマーを意味し、好ましくは線状であり、そのある実施態様では文献上「分子ワイヤ」という。本明細書において「実質的に伝導性」とは該オリゴマーが１００Ｈｚで電子を移動し得ることを意味する。一般に、伝導性オリゴマーは、伝導性オリゴマーの単量体単位間のように、実質的に重なり合うπ−軌道、即ち、共役π−軌道を有するが、伝導性オリゴマーは１つ以上のシグマ（σ）結合をも含んでいる。さらに、伝導性オリゴマーは会合したＥＴＭへの電子の注入またはＥＴＭからの受け入れ能力によって機能的に定義することもできる。さらに、伝導性オリゴマーは本明細書に定義した絶縁体よりもより伝導性である。さらに、本発明の伝導性オリゴマーは電気活性ポリマーとは区別すべきもので、これはそれ自体で電子を供与または受容できるものである。
【００８４】
好適な実施態様において、伝導性オリゴマーは約１０−６ないし１０４Ω−１ｃｍ−１の伝導性Ｓを有し、好ましくは約１０−５ないし１０３Ω−１ｃｍ−１であって、これらのＳ値は約２０Åないし約２００Åの範囲の分子から計算される。以下に記載するように、絶縁体は約１０−７Ω−１ｃｍ−１以下の伝導性Ｓ、好ましくは１０−８Ω−１ｃｍ−１より低い値を有する。一般的には、Ｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ａ５１ （１９９５） ５７−６６ （参照により本明細書に取込む） を参照されたい。
【００８５】
伝導性オリゴマーの所望の性質は、高い伝導性、本発明の構成物の合成と使用のために有機溶媒および／または水への十分な溶解性、および反応に対する好適な化学的抵抗などであるが、該反応が起こるのは、１）核酸合成の際（本発明の構成物合成に際し、伝導性オリゴマーを含むヌクレオシドを核酸シンセサイザーに加えることができる）、２）伝導性オリゴマーが電極に付着する際、または３）ハイブリダイゼーションアッセイの際、である。さらに、自己集合単層の形成を促進する伝導性オリゴマーが好ましい。
【００８６】
本発明のオリゴマーは、本明細書に記載のように、少なくとも２つの単量体サブユニットを含む。下記に詳しく説明するが、オリゴマーには、ホモおよびヘテロオリゴマーがあり、ポリマーも含む。
【００８７】
好ましい実施態様では、伝導性オリゴマーは、構造１に示した構造を持つ：
構造１
【化１】
2004530860.tif 000003
当業者には理解されるとおり、ここに示した構造は全て、更なる原子または構造を有し得る。即ち、構造１の伝導性オリゴマーは、電極、遷移金属錯体、有機ＥＴＭ、およびメタロセンなどのＥＴＭに、および核酸に、またはこれら数種に結合させることができる。特記しない限り、ここに示した伝導性オリゴマーは、その左側で電極に結合させる。つまり、構造１の場合は、左側の「Ｙ」を本明細書に記載の電極につなげる。伝導性オリゴマーを核酸に結合させるとき、右側の「Ｙ」は、存在するならば、直接的にまたは本発明に記載のリンカーを用いて、核酸に結合させる。
【００８８】
本実施態様では、Ｙは芳香族基であり、ｎは１から５０の整数であり、ｇは１または０のいずれかであり、ｅは０から１０の整数であり、ｍは０または１である。ｇが１のとき、Ｂ−Ｄは隣接した結合と共有し得る結合であり（本明細書中で「共役結合」と呼ぶ）、好ましくはアセチレンから選択され、Ｂ−Ｄは共役結合であり、好ましくはアセチレン、アルケン、置換アルケン、アミド、アゾ、−Ｃ＝Ｎ−（−Ｎ＝Ｃ−、−ＣＲ＝Ｎ−および−Ｎ＝ＣＲ−を含む）、−Ｓｉ＝Ｓｉ−および−Ｓｉ＝Ｃ−（−Ｃ＝Ｓｉ−、−Ｓｉ＝ＣＲ−および−ＣＲ＝Ｓｉ−を含む）から選択される。ｇが０のとき、ｅは好ましくは１であり、Ｄは好ましくはカルボニルまたはヘテロ原子部であり、このヘテロ原子は、酸素、硫黄、窒素、ケイ素またはリンから選択される。そのため、適切なヘテロ原子部には、−ＮＨおよび−ＮＲ、式中、Ｒは本明細書に定義のとおりである；置換硫黄；スルホニル（−ＳＯ２−）スルホキシド（−ＳＯ−）；酸化ホスフィン（−ＰＯ−および−ＲＰＯ−）；およびチオホスフィン（−ＰＳ−および−ＲＰＳ−）があるが、これらに限定されない。しかしながら、下記に概略説明するとおり、伝導性オリゴマーを金電極に結合させるような場合、硫黄誘導体は好ましくない。
【００８９】
「芳香族基」またはその文法的均等物とは、本書では、一般に５から１４の炭素原子を含む芳香族単環式または多環式炭化水素部（より大きい多環式環構造を作ることもできるが）およびそれらの炭素環式ケトンまたはチオケトン誘導体で、その遊離の原子価を持つ炭素原子が芳香族環の一員であるものを意味する。芳香族環には、アリーレン基および２つ以上の原子を除いた芳香族基がある。本願の目的には、芳香族は複素環を含む。「複素環」または「ヘテロアリール」とは、１から５個の指定炭素原子を、窒素、酸素、硫黄、リン、ホウ素およびケイ素から選択されるヘテロ原子で置換した、そしてその遊離の原子価を持つ原子が芳香族環の一員である芳香族基、およびそれらの複素環式ケトンおよびチオケトン誘導体を意味する。従って、複素環には、チエニル、フリル、ピロリル、ピリミジニル、オキサリル、インドリル、プリニル、キノリル、イソキノリル、チアゾリル、イミドジル等がある。
【００９０】
重要なのは、伝導性オリゴマーのＹ芳香族基が異なっていてもよいこと、即ち、伝導性オリゴマーがヘテロオリゴマーであり得ることである。つまり、伝導性オリゴマーは、単一型のＹ基または複数型のＹ基のオリゴマーを含むことができる。
【００９１】
芳香族基は、本書中で一般にＲで表す置換基で置換できる。Ｒ基は、必要に応じて加え、伝導性オリゴマーのパッキングに影響を及ぼすことができる、即ち、Ｒ基を用いて単層におけるオリゴマーの会合を変化させることができる。Ｒ基を加えて、１）オリゴマーまたはオリゴマーを含む組成物の溶解度を変える；２）システムの共役または電子化学電位を変える；および３）単層表面の電荷または特性を変えることもできる。
【００９２】
好ましい実施態様では、伝導性オリゴマーが３つのサブユニットより大きいとき、Ｒ基は、溶液合成を行う場合の溶解度を高めるのに好ましい。しかしながら、Ｒ基およびその位置は、下記のように、表面上、特に単層内での伝導性オリゴマーのパッキングへの影響を最小限にするよう選択される。一般に、単層内では小さいＲ基のみが使用され、大きいＲ基は一般に単層表面上にある。そのため、例えば、単層内の伝導性オリゴマー部分にメチル基を付けて溶解度を高めるのが好ましく、例えば、Ｃ３からＣ１０のより長いアルコキシ基を単層表面上に付けるのが好ましい。一般に、本明細書に記載のシステムでは、このことは、一般に、立体的に重大なＲ基は、単層を形成する分子の平均長さによるが、最初の２つまたは３つのオリゴマーサブユニットのいずれにも結合させないことを意味する。
【００９３】
適切なＲ基には、水素、アルキル、アルコール、芳香族、アミノ、アミド、ニトロ、エーテル、エステル、アルデヒド、スルホニル、ケイ素部、ハロゲン、硫黄含有部、リン含有部、およびエチレングリコールがあるが、これらに限定されない。本明細書に示した構造では、Ｒは、その位置が置換されていない場合は水素である。ある位置では、２つの置換基、ＲおよびＲ’が可能であり、その場合、ＲおよびＲ’基は同一であるかまたは異なっているかのいずれかでよい。
【００９４】
「アルキル基」またはその文法的均等物とは、直鎖状または分枝状アルキル基を意味し、直鎖アルキル基が好ましい。分枝状ならば、１箇所以上の、特記しなければ任意の位置で枝分かれしている。このアルキル基は、約１から約３０の炭素原子（Ｃ１−Ｃ３０）の範囲であり得、好ましい実施態様では、約１から約２０の炭素原子（Ｃ１−Ｃ２０）を利用し、約Ｃ１から約Ｃ１２ないしＣ１５が好ましく、Ｃ１ないしＣ５が特に好ましいが、ある実施態様では、アルキル基は、もっと大きくてもよい。アルキル基の定義の中に含まれるものには、Ｃ５およびＣ６環などのシクロアルキル基や、窒素、酸素、硫黄、またはリンを持つ複素環式環もある。アルキルはまた、好ましくは硫黄、酸素、窒素およびケイ素のヘテロ原子を持つヘテロアルキルも含む。アルキルは、置換アルキル基も含む。「置換アルキル基」とは、更に上記定義の１以上の置換基部「Ｒ」を含むアルキル基を意味する。
【００９５】
「アミノ基」またはその文法的均等物とは、−ＮＨ２、−ＮＨＲおよび−ＮＲ２基を意味し、Ｒは本明細書に定義のとおりである。
【００９６】
「ニトロ基」とは、−ＮＯ２基を意味する。
【００９７】
「硫黄含有部」とは、硫黄原子を含有する化合物を意味し、チア−、チオ−およびスルホ−化合物、チオール（−ＳＨおよび−ＳＲ）、スルフィド（−ＲＳＲ−）、スルホキシド（−Ｒ−ＳＯ−Ｒ−）、スルフォン（−Ｒ−ＳＯ２−Ｒ−）、ジスルフィド（−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ−）およびスルフォニルエステル（−Ｒ−ＳＯ２−Ｏ−Ｒ−）、があるが、これらに限定されない。「リン含有部」は、リンを含有する化合物を意味し、ホスフィンおよびリン酸があるが、これらに限定されない。「シリコン含有部」とは、シリコン含有化合物を意味する。
【００９８】
「エーテル」とは、−Ｏ−Ｒ−基を意味する。好ましいエーテルはアルコキシ基であり、−Ｏ−（ＣＨ２） ２ＣＨ３および−Ｏ−（ＣＨ２）４ＣＨ３が好ましい。
【００９９】
「エステル」とは、−ＣＯＯＲ基を意味する。
【０１００】
「ハロゲン」とは、臭素、ヨウ素、塩素またはフッ素を意味する。好ましい置換アルキルは、部分的にまたは全体的にハロゲン化したアルキル、例えばＣＦ３等である。
【０１０１】
「アルデヒド」とは、−ＲＣＯＨ基を意味する。
【０１０２】
「アルコール」とは、−ＯＨ基およびアルキルアルコール−ＲＯＨを意味する。
【０１０３】
「アミド」とは、−ＲＣＯＮＨ−またはＲＣＯＮＲ−基を意味する。
【０１０４】
「エチレングリコール」または「（ポリ）エチレングリコール」とは、−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−基を意味するが、エチレン基の各炭素原子は、一重にまたは二重に置換されていてもよく、即ち、−（Ｏ−ＣＲ２−ＣＲ２）ｎ−、但しＲは上記定義のとおりである、であってよい。酸素の位置に他のヘテロ原子を持つエチレングリコール誘導体（即ち、−（Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−または−（Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−または置換基を持つ）も好ましい。
【０１０５】
好ましい置換基には、メチル、エチル、プロピル、−Ｏ−（ＣＨ２）２ＣＨ３および−Ｏ−（ＣＨ２）４ＣＨ３などのアルコキシ基およびエチレングリコールおよびそれらの誘導体があるが、これらに限定されない。
【０１０６】
好ましい芳香族基には、フェニル、ナフチル、ナフタレン、アントラセン、フェナントロリン、ピロール、ピリジン、チオフェン、ポルフィリンおよび縮合環誘導体を含むこれらそれぞれの誘導体があるが、これらに限定されない。
【０１０７】
本明細書に示した伝導性オリゴマーでは、ｇが１のとき、Ｂ−Ｄは２つの原子または化学部分をつなげる結合である。好ましい実施態様では、Ｂ−Ｄは、重複または共役π軌道を含有する共役結合である。
【０１０８】
好ましいＢ−Ｄ結合は、アセチレン（−Ｃ≡Ｃ−、アルキンまたはエチンとも呼ばれる）、アルケン（−ＣＨ＝ＣＨ−、エチレンとも呼ばれる）、置換アルケン（−ＣＲ＝ＣＲ−、−ＣＨ＝ＣＲ−および−ＣＲ＝ＣＨ−）、アミド（−ＮＨ−ＣＯ−および−ＮＲ−ＣＯ−または−ＣＯ−ＮＨ−および−ＣＯ−ＮＲ−）、アゾ（−Ｎ＝Ｎ−）、エステルおよびチオエステル（−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−、ＣＳ−Ｏ−および−Ｏ−ＣＳ−）および他の共役結合（−ＣＨ＝Ｎ−、−ＣＲ＝Ｎ−、−Ｎ＝ＣＨ−および−Ｎ＝ＣＲ−）、（−ＳｉＨ＝ＳｉＨ−、−ＳｉＲ＝ＳｉＨ−、−ＳｉＨ＝ＳｉＲ−、およびＳｉＲ＝ＳｉＲ−）、（−ＳｉＨ＝ＣＨ−、−ＳｉＲ＝ＣＨ−、−ＳｉＨ＝ＣＲ−、−ＳｉＲ＝ＣＲ−、−ＣＨ＝ＳｉＨ−、−ＣＲ＝ＳｉＨ−、−ＣＨ＝ＳｉＲ−および−ＣＲ＝ＳｉＲ−）などから選択される。特に好ましいＢ−Ｄ結合は、アセチレン、アルケン、アミドおよびこれら３種の置換誘導体およびアゾである。とりわけ好ましいＢ−Ｄ結合は、アセチレン、アルケンおよびアミドである。二重結合に結合させたオリゴマー成分は、トランスまたはシス配置、または混合型であってよい。そのため、ＢまたはＤのいずれかは、炭素、窒素またはケイ素を含むことができる。置換基は、上記Ｒのところで定義したとおりである。
【０１０９】
構造１の伝導性オリゴマーでｇ＝０のとき、ｅは好ましくは１であり、Ｄ部分は上記定義のカルボニルまたはヘテロ原子部分であり得る。
【０１１０】
上記Ｙ環のように、どの単一伝導性オリゴマー内でも、Ｂ−Ｄ結合（またはｇ＝０のときＤ部分）は、全て同じでもよく、または少なくとも１つが異なっていてもよい。例えば、ｍが０のとき、末端Ｂ−Ｄ結合は、アミド結合であることができ、残りのＢ−Ｄ結合はアセチレン結合であることができる。一般に、アミド結合が存在するとき、アミド結合はできるだけ少ない方が好ましいが、ある実施態様では、全てのＢ−Ｄ結合がアミド結合である。よって、上記Ｙ環のところで概略説明したとおり、単層内ではある一つの型のＢ−Ｄ結合が伝導性オリゴマー中に下記のように存在でき、そして、単層レベル上に別の型のＢ−Ｄ結合、例えば核酸が伝導性オリゴマーを介して結合している場合核酸ハイブリダイゼーションにより大きな柔軟性を与えるために存在できる。
【０１１１】
本明細書に示した構造中、ｎは１から５０の整数であるが、より長いオリゴマーもまた使用できる（例えば、Ｓｃｈｕｍｍ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． １９９４ ３３（１３）： １３６０参照）。理論によって限定されないが、表面上での効率のよい核酸ハイブリダイゼーションのためには、ハイブリダイゼーションが表面から少し離れて起こるべきであり、ハイブリダイゼーション速度は、特に２００から３００塩基対の長いオリゴヌクレオチドの場合、表面からの距離の関数として上昇すると思われる。従って、核酸が伝導性オリゴマーを介して結合しているとき、以下でより詳しく記すように、伝導性オリゴマーの長さは、その核酸の最も近いヌクレオチドが電極表面から約６Åから約１００Å（但し、５００Åまでの距離が使用できる）に位置するような長さであり、約１５Åから約６０Åが好ましく、約２５Åから約６０Åも好ましい。従って、ｎは芳香族基のサイズに応じて変わるが、一般に、約１から約２０であって、約２から約１５が好ましく、約３から約１０が特に好ましい。
【０１１２】
本明細書に示した構造中、ｍは０または１のいずれかである。つまり、ｍが０のとき、伝導性オリゴマーの末端には、Ｂ−Ｄ結合またはＤ部分があり、即ち、Ｄ原子が直接的かまたはリンカーを介するかのいずれかで核酸に結合している。ある実施態様では、例えば、伝導性オリゴマーを核酸のリボース−リン酸主鎖のリン酸に結合させるとき、伝導性オリゴマーと核酸の間に結合させたリンカーなどの別の原子があってもよい。更に、下記に概略説明するとおり、Ｄ原子は、アミノ修飾リボースの窒素原子であり得る。あるいは、ｍが１のとき、伝導性オリゴマーの末端にはＹ、芳香族基があり、即ち、その芳香族基は、核酸またはリンカーに結合している。
【０１１３】
当業者には明らかなように、多数の伝導性オリゴマーが利用できる。これらは、例えば、縮合芳香族環または、−（ＣＦ２）ｎ−、−（ＣＨＦ）ｎ−および−（ＣＦＲ）ｎ−などのテフロン（登録商標）様オリゴマーを含む化合物などの当分野で知られている他の伝導性オリゴマーと同じく、構造１や構造８式の範囲内にある伝導性オリゴマーを含む。例えば、Ｓｃｈｕｍｍ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３３： １３６１ （１９９４）； Ｇｒｏｓｓｈｅｎｎｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｍｅｔａｌｓ Ｒｅｖ． ４０ （１）： ２６−３５ （１９９６）； Ｔｏｕｒ， Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． ９６： ５３７−５５３ （１９９６）； Ｈｓｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ １４： ４８０８−４８１５ （１９９５）；およびここに引用されている文献参照、これらは全て出典明示により本明細書に組込まれている。
【０１１４】
本実施態様の特に好ましい伝導性オリゴマーは、下記である：
構造２
【化２】
2004530860.tif 000004
構造２は、ｇが１のときの構造１である。構造２の好ましい実施態様には、ｅが０であり、Ｙがピロールまたは置換ピロールであるもの；ｅが０であり、Ｙがチオフェンまたは置換チオフェンであるもの；ｅが０であり、Ｙがフランまたは置換フランであるもの；ｅが０であり、Ｙがフェニルまたは置換フェニルであるもの；ｅが０であり、Ｙがピリジンまたは置換ピリジンであるもの；ｅが１であり、Ｂ−Ｄがアセチレンであり、Ｙがフェニルまたは置換フェニルであるもの（例えば、下記構造４参照）がある。構造２の好ましい実施態様はまた、下記構造３に示した、ｅが１である場合のものである：
【０１１５】
構造３
【化３】
2004530860.tif 000005
構造３の好ましい実施態様は、Ｙがフェニルまたは置換フェニルであり、Ｂ−Ｄがアゾであるもの；Ｙがフェニルまたは置換フェニルであり、Ｂ−Ｄがアセチレンであるもの；Ｙがフェニルまたは置換フェニルであり、Ｂ−Ｄがアルケンであるもの；Ｙがピリジンまたは置換ピリジンであり、Ｂ−Ｄがアセチレンであるもの；Ｙがチオフェンまたは置換チオフェンであり、Ｂ−Ｄがアセチレンであるもの；Ｙがフランまたは置換フランであり、Ｂ−Ｄがアセチレンであるもの；Ｙがチオフェンまたはフラン（または置換チオフェンまたはフラン）であり、Ｂ−Ｄがアルケンおよびアセチレン交互の結合であるものである。
【０１１６】
本明細書に示した構造の殆どが構造３の伝導性オリゴマーを利用している。しかしながら、どの構造３オリゴマーも、本明細書中の他の構造、即ち構造１または８オリゴマー、または他の伝導性オリゴマーで置換でき、かかる構造３の使用は、本発明の範囲を限定する意味を持たない。
【０１１７】
構造３の特に好ましい実施態様は、下記の構造４、５、６および７を含む：
構造４
【化４】
2004530860.tif 000006
構造４の特に好ましい実施態様には、ｎが２であり、ｍが１であり、Ｒが水素であるもの；ｎが３であり、ｍが０であり、Ｒが水素であるもの、および溶解度を高めるためのＲ基の使用がある。
【０１１８】
構造５
【化５】
2004530860.tif 000007
構造５のようにＢ−Ｄ結合がアミド結合であるとき、伝導性オリゴマーは、擬似ペプチドオリゴマーである。構造５中のアミド結合は、カルボニルを左側にして、即ち、ＣＯＮＨ−で示すが、逆、即ち−ＮＨＣＯ−も使用できる。構造１７の特に好ましい実施態様には、ｎが２であり、ｍが１であり、Ｒが水素であるもの；ｎが３であり、ｍが０であり、Ｒが水素であるもの（この実施態様では、末端窒素（Ｄ原子）はアミノ修飾リボースの窒素であり得る）、および溶解度を高めるためのＲ基の使用がある。
【０１１９】
構造６
【化６】
2004530860.tif 000008
構造６の好ましい実施態様には、第１のｎが２であり、第２のｎが１であり、ｍが０であり、全てのＲ基が水素であるもの、または溶解度を高めるためのＲ基の使用がある。
【０１２０】
構造７
【化７】
2004530860.tif 000009
構造７の好ましい実施態様には、第１のｎが３であり、第２のｎが１−３であり、ｍが０または１のいずれかであるもの、および溶解度を高めるためのＲ基の使用がある。
【０１２１】
好ましい実施態様では、伝導性オリゴマーは、構造８で示した構造を持つ：
構造８
【化８】
2004530860.tif 000010
この実施態様では、Ｃは炭素原子であり、ｎは１から５０の整数であり、ｍは０または１であり、Ｊは酸素、窒素、ケイ素、リン、硫黄、カルボニルまたはスルホキシドからなる群から選択されるヘテロ原子であり、Ｇはアルカン、アルケンまたはアセチレンから選択される結合であって、２つの炭素原子と一緒になってＣ−Ｇ−Ｃ基がアルケン（−ＣＨ＝ＣＨ−）、置換アルケン（−ＣＲ＝ＣＲ−）またはそれらの混合物（−ＣＨ＝ＣＲまたは−ＣＲ＝ＣＨ−）、アセチレン（−Ｃ≡Ｃ−）またはアルカン（−ＣＲ２−ＣＲ２−、Ｒは水素または本明細書に記載の置換基のいずれかである）であるようにする。各サブユニットのＧ結合は、他のサブユニットのＧ結合と同一かまたは異なっていてもよく、つまり、アルケンとアセチレン結合が交互にあるオリゴマーが使用できる。しかしながら、Ｇがアルカン結合であるとき、オリゴマー中のアルカン結合数は最小に維持すべきであり、伝導性オリゴマー当りシグマ結合約６以下が好ましい。アルケン結合が好ましく、本明細書に総括的に示しているが、アルカンおよびアセチレン結合は、当業者には明らかなように、本明細書に記載したどの構造または実施態様でも置換できる。
【０１２２】
ある実施態様では、例えば、ＥＴＭが存在しないとき、ｍ＝０ならば少なくとも１つのＧ結合はアルカン結合である。
【０１２３】
好ましい実施態様では、構造８のｍは０である。特に好ましい実施態様では、構造９に示したように、ｍは０であり、Ｇはアルケン結合である：
構造９
【化９】
2004530860.tif 000011
構造９のアルケンオリゴマーおよび本明細書に示した別のものは、一般に、好ましいトランス配置で示しているが、シスまたはトランスとシスの混合したオリゴマーも使用できる。上記のように、Ｒ基を加えて、電極上での組成物のパッキング、オリゴマーの親水性または疎水性、およびオリゴマーの柔軟性、即ち、回転、ねじれ、または縦の柔軟性を変えることができる。ｎは上記定義のとおりである。
【０１２４】
好ましい実施態様では、Ｒは水素であるが、Ｒはアルキル基およびポリエチレングリコールまたは誘導体であってもよい。
【０１２５】
別の実施態様では、伝導性オリゴマーは、異なる型のオリゴマー、例えば、構造１や８の混合物であってもよい。
【０１２６】
さらに、いくつかの実施態様では、単層中の少なくともいくつかの伝導性オリゴマーの末端は、電気的に露出している。本明細書で「電気的に露出する」とは、末端の近傍にＥＴＭが置かれ、適切なシグナルを与えた後に、ＥＴＭの存在に依存するシグナルを検出し得ることを意味する。伝導性オリゴマーは末端基を有していても有していなくてもよい。従って、好ましい実施態様では、余分な末端基がなく、伝導性オリゴマーはその末端が、例えばアセチレン結合などのＢ−Ｄ結合のような基の１つで終る構造１から９を示す。あるいは、好ましい実施態様では、本明細書中でしばしば「Ｑ」として示す末端基を加える。末端基はいくつかの理由、例えば、ＥＴＭの検出用の伝導性オリゴマーの電子的利用可能性を改善するために、またはＳＡＭの表面を例えば非特異的結合を防ぐなどの他の事由によって変えるために、使用することができる。例えば、ハイブリダイゼーションを促進するために、末端で陰性に荷電した基として陰性荷電表面を形成させ、核酸がＤＮＡまたはＲＮＡである場合、核酸が表面上に着地するのに反発するか、妨げるようにし得る。好ましい末端基は、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＨ３等のアルキル基、および、（ポリ）エチレングリコールのような（ポリ）アルキルオキサイドを含み、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２Ｈ、−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３Ｈ、および−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）４Ｈが好ましい。
【０１２７】
一実施態様において、異なるタイプの末端基を有する伝導性オリゴマーの混合物を使用することが可能である。従って、例えば、いくつかの末端基は検出を容易にし、いくつかは非特異的結合を防止し得る。
【０１２８】
単層は異なる伝導性オリゴマー種を含み得るが、適度に同一なＳＡＭが形成され得るように、異なる種を選択するのが好ましいことが、理解されるであろう。従って、例えば、核酸を伝導性オリゴマーを用いて電極に共有結合させるとき、核酸を結合させるために使用する１つのタイプの伝導性オリゴマーと、ＥＴＭの検出に機能する別のタイプとを用いることが可能である。同様に、異なる長さの伝導性オリゴマーの混合物を単層中に有して、非特異的シグナルの減少を促進するのが望ましい。従って、例えば、好ましい実施態様は、単層の残部の表面下、つまり使用されているなら、絶縁層の下で、または他の伝導性オリゴマーの特定のフラクション下で終わる伝導性オリゴマーを利用する。同様に、異なる伝導性オリゴマーを使用して、単層の形成を容易にしたり、別の特性を持つ単層をつくることもできる。
【０１２９】
好ましい実施態様では、単層形成種は、伝導性オリゴマーの中にアルキル部分を含有する、「中断された」伝導性オリゴマーである。
【０１３０】
好ましい実施態様では、単層はＥＦＳとして光活性化可能な種を含む。この一般的なスキームを、参照により本明細書の一部とする０９／６２６，０９６の図１１に描出する。光活性化可能な種は当分野で既知であり、３６５ｎｍで２時間光分解され得る４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンジルエステルが含まれる。
【０１３１】
好ましい実施態様において、単層はさらに絶縁部を含み得る。本明細書における「絶縁体」とは、実質的に非伝導性オリゴマーを意味し、好ましくは線状である。本明細書において、「実質的に非伝導性」とは、絶縁体が１００Ｈｚで電子を伝達しないことを意味する。絶縁体を介した電子伝達の比率は、好ましくは本明細書に記載の伝導性オリゴマーを介した比率よりも遅い。
【０１３２】
好ましい実施態様において、絶縁体は、約１０−７Ω−１ｃｍ−１以下の伝導率Ｓを有し、約１０−８Ω−１ｃｍ−１より低いのが好ましい。一般に Ｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（前出）を参照。
【０１３３】
通常、絶縁体はシグマ結合を有する、アルキルまたはヘテロアルキルオリゴマーまたは部分であるが、いずれの具体的な絶縁体分子も芳香族基または１以上の共役結合を含み得る。本明細書において「ヘテロアルキル」とは、少なくとも１つのヘテロ原子、つまり鎖に含まれた窒素、酸素、硫黄、リン、シリコンまたはホウ素を有するアルキル基を意味する。あるいは、絶縁体は、好ましくは電子伝達を実質的に阻害するかまたは遅らせる１以上のヘテロ原子または結合を添加した伝導性オリゴマーと非常に類似であり得る。
【０１３４】
適切な絶縁体は当分野で既知であり、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＲＨ）ｎ−および−（ＣＲ２）ｎ−、エチレングリコールまたは酸素の代わりの他のヘテロ原子、つまり窒素または硫黄（電極が金のとき、硫黄誘導体は好ましくない）を用いる誘導体を含むが、これらに限定しない。
【０１３５】
伝導性オリゴマーについて、絶縁体は本明細書に定義のＲ基で置換され得、電極でのその部分または伝導性オリゴマーのパッキング、絶縁体の親水性または疎水性、および絶縁体の柔軟性、即ち回転の、捩れのまたは縦の柔軟性を変える。例えば、分枝アルキル基を使用し得る。同様に、上記概説のように絶縁体は特に単層の表面に作用する末端基を含み得る。
【０１３６】
好ましい実施態様では、ＳＡＭに含まれる絶縁体種は、非対称のジスルフィドを含む新しい方法と組成物を利用する。本明細書で概説するように、標識プローブから発せられたシグナルは、ＳＡＭの振る舞いと特性によって左右され得る。出典明示により全体を本明細書の一部とするＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／１４５，９１２に概説されているように、「ナノ管路」または「電気管路」を含むＳＡＭは、よいシグナルをもたらす。従って、本発明はジスルフィドをベースとする非対称性絶縁体を提供し、その腕の１本は長いアルキル鎖（または他のＳＡＭ形成種）であり、他方の腕は分岐アルキル基などの大きい基を含み、それはナノ管路を作り出すために極性または非極性であり得る。２つの例示的な種をＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／１４５，９１２の図３１Ａおよび３１Ｂに、データを図３１Ｃに示す。様々な合成スキームを図３２に示す。また、出典明示によりすべて本明細書の一部とする Ｍｕｋａｉｙａｍａ Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． １９６８， ５９０７； Ｂｏｕｓｔａｎｙ Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． １９７０ ３５４７； Ｈａｒｐｐ Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． １９７０ ３５５１； および Ｏａｅ， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ， １９７７， ４０７ も参照されたい。
【０１３７】
単層をつくる種の長さは必要に応じて変化する。上記に概説のように、ハイブリダイゼーションは、表面から離れてより有効であるように見える。核酸が結合する種（下記に概説のように、これらは絶縁体または伝導性オリゴマーのいずれかであり得る）は、基本的に単層を形成する種と同じ長さかそれらより長く、核酸がハイブリダイゼーションのための溶媒により接近可能となる。いくつかの実施態様において、核酸が付着する伝導性オリゴマーは単層より短い。
【０１３８】
当業者には明らかなように、単層を作り上げる異なる種の、実際の組合せと比率は、非常に広範に変化し得、そしてメカニズム−１またはメカニズム−２のいずれが使用されているかに左右される。一般に、メカニズム−２システムでは２または３成分システムが好ましい。３成分システムは、捕獲プローブ含有種を含む第１の種を利用し、それは絶縁体または伝導性オリゴマーのいずれかを介して電極に結合している。第２の種は伝導性オリゴマーであり、第３の種は絶縁体である。この実施態様において、第１の種は約９０％から約１％を含み得、約２０％から約４０％が好ましい。核酸には、約３０％から約４０％が短いオリゴヌクレオチド標的に特に好ましく、約１０％から約２０％が長い標的に好ましい。第２の種は約１％から約９０％を含み得、約２０％から約９０％が好ましく、約４０％から約６０％が特に好ましい。第３の種は約１％から約９０％を含み得、約２０％から約４０％が好ましく、約１５％から約３０％が特に好ましい。これらの近似比率を達成するための、ＳＡＭ構成溶媒中の第１：第２：第３の種の好ましい比率は、短い標的については２：２：１、長い標的については１：３：１であり、全チオール濃度（これらの種との結合に使用する場合、以下で詳記）は、５００μＭから１ｍＭの範囲および８３３μＭが好ましい。
【０１３９】
あるいは、２成分システムを使用することができる。ある実施態様では、メカニズム−１またはメカニズム−２のシステムのいずれかで使用する２成分は、第１および第２の種である。この実施態様において、第１の種は約１％から約９０％を含み得、約１０％から約４０％が好ましく、約１０％から約４０％が特に好ましい。第２の種は約１％から約９０％を含み得、約１０％から約６０％が好ましく、約２０％から約４０％が特に好ましい。あるいは、メカニズム−１またはメカニズム−２のシステムでは、２成分は第１および第３の種である。この実施態様において、第１の種は約１％から約９０％を含み得、約１０％から約４０％が好ましく、約１０％から約４０％が特に好ましい。第２の種は約１％から約９０％を含み得、約１０％から約６０％が好ましく、約２０％から約４０％が特に好ましい。
【０１４０】
好ましい実施態様として、水性溶液中でＳＡＭの析出を行なう。Ｓｔｅｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ７０： ４６７０ （１９９８）， Ｈｅｒｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１９：８９１６ （１９９７）およびＡ． Ｊ． Ｂａｒｄ， Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ａ Ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ Ａｄｖａｎｃｅｓ， Ｖｏｌ． ２０． Ｄｅｋｋｅｒ Ｎ．Ｙ． １９９６−のＦｉｎｋｌｅａ， Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｚｅｄ ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ ｏｆ Ｔｈｉｏｌｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ に概略説明されているように、ＳＡＭ形成種の析出を水性溶液（しばしば塩を含む）から行なうことができる（これらすべては出典明示により本明細書に組込む）。
【０１４１】
伝導性オリゴマーと絶縁体の共有結合は、様々な方法で達成され、使用する電極、および絶縁体と伝導性オリゴマーの組成に依存する。好ましい実施態様として、本明細書に記載のヌクレオシドまたは核酸と共有結合した結合リンカーは、電極に共有結合している。従って、結合リンカーの一方の端または末端がヌクレオシドまたは核酸に結合しており、もう一方が電極に結合している。ある実施態様において、結合リンカーが末端以外の位置で結合するか、またはさらに、分枝結合リンカーが一方の末端で電極に結合し、他の末端で２またはそれ以上のヌクレオシドに結合するのが望ましいことであるが、これは好ましくない。同様に、一般に構造１１−１３に記載されるように、結合リンカーは２つの部位で電極に結合し得る。一般に構造１０で「Ａ」として下記に示すように、あるタイプのリンカーが使用される。構造１０において、「Ｘ」は伝導性オリゴマー、「Ｉ」は絶縁体であり、斜線の表面は電極である：
【０１４２】
【化１０】
2004530860.tif 000012
本実施態様において、Ａはリンカーまたは原子である。「Ａ」の選択は、電極の特徴に一部依存する。従って、例えば、Ａは、金電極を使用する場合、硫黄部である。あるいは、酸化金属電極を使用するとき、Ａはオキサイドの酸素に結合したシリコン（シラン）部である（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｇｍｕｉｒ １０： ３３３２−３３３７ （１９９４）； Ｌｅｎｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ７８： １９５−２０１ （１９７７）参照、両方とも出典明示により本明細書の一部とする）。炭素ベースの電極を使用するとき、Ａはアミノ部である（好ましくは、１級アミン；例えば、Ｄｅｉｎｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｇｍｕｉｒ １０： １３０６−１３１３ （１９９４）参照）。従って、好ましいＡ部は、シラン部、硫黄部（アルキル硫黄部を含む）およびアミノ部を含むが、これらに限定されない。好ましい実施態様において、当分野で既知のようなレドックスポリマーとのエポキシドタイプ結合は使用しない。
【０１４３】
本明細書には一つの部分としてしか記載していないが、絶縁体および伝導性オリゴマーは、１個以上の「Ａ」部で電極と結合し得る；「Ａ」部は同一かまたは異なっていてもよい。従って、例えば、電極が金電極であり、「Ａ」が硫黄原子または部分であるとき、一般に下記構造１１、１２および１３に記載のように、複数の硫黄原子を、電極に伝導性オリゴマーを結合させるのに使用し得る。当業者に認められるように、このような他の構造が製造できる。構造１１、１２および１３において、Ａ部は硫黄原子だけであるが、置換硫黄部も使用し得る。
【０１４４】
【化１１】
2004530860.tif 000013
【０１４５】
【化１２】
2004530860.tif 000014
【０１４６】
【化１３】
2004530860.tif 000015
【０１４７】
構造１３と同様に、３つの硫黄部で電極に結合している一つの炭素原子で終了する伝導性オリゴマーを有することが可能であることも留意すべきである。さらに本明細書に必ずしも記載されていないが、伝導性オリゴマーと絶縁体はまた「Ｑ」末端基を含み得る。
【０１４８】
好ましい実施態様において、電極は金電極であり、結合は当分野で既知のように硫黄結合を介しており、即ち、Ａ部は硫黄原子または部分である。金−硫黄結合の正確な特徴は知られていないが、この結合は本発明の目的で、共有結合と考える。代表的な構造は構造３の伝導性オリゴマーを用いて構造１４に記載するが、本明細書に記載のすべての構造について、いずれの伝導性オリゴマーまたは伝導性オリゴマーの組合せも使用し得る。同様にいずれの伝導性オリゴマーまたは絶縁体も本明細書に記載の末端基を含み得る。構造１４は、「Ａ」リンカーが硫黄原子のみを含むように記載しているが、他の原子も存在し得る（即ち、硫黄から伝導性オリゴマーへのまたは置換基へのリンカー）。さらに、構造１４は、Ｙ芳香族基に結合した硫黄原子を表わしているが、当業者に明らかであろうように、Ｂ−Ｄ基（即ち、アセチレン）と同様に結合したものであってもよい。
【０１４９】
【化１４】
2004530860.tif 000016
【０１５０】
好ましい実施態様において、電極は炭素電極、即ち、ガラス状炭素電極であり、結合はアミン基の窒素原子を介している。代表的な構造を構造１５に示す。また別の原子が存在し得、即ち、Ｚタイプリンカーおよび／または末端基であり得る。
【０１５１】
【化１５】
2004530860.tif 000017
【０１５２】
【化１６】
2004530860.tif 000018
【０１５３】
構造１６において、酸素原子は金属酸化物電極の酸化物からのものである。Ｓｉ原子は他の原子を含んでもよく、即ち、置換基含有のケイ素部分であってもよい。他の電極に対するＳＡＭの他の付着は技術上既知である；例えば、インジウム酸化スズ電極に対する付着については Ｎａｐｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｇｍｕｉｒ， １９９７ 参照、およびインジウム酸化スズ電極に対するリン酸エステルの化学吸着（ＣＨＩ会議（１９９８年５月４〜５日）での Ｈ． Ｈｏｌｄｅｎ Ｔｈｏｒｐｅ の講演）。
【０１５４】
本発明のＳＡＭは種々の方法、例えば、有機溶液からの析出および水性溶液からの析出などにより作製し得る。本明細書にて概説した方法では、例として金電極を使用するが、当業者が認めるように、他の金属および方法も同様に使用し得る。好適な一実施態様においては、インジウム−スズ−酸化物（ＩＴＯ）が電極として用いられる。
【０１５５】
好適な実施態様において、金表面をまず洗浄する。様々な洗浄手法が採用可能であり、例えば、これらに限定されるものではないが、化学的洗浄またはエッチング用試薬（ピランハ（Ｐｉｒａｎｈａ）溶液（過酸化水素／硫酸）または王水（塩酸／硝酸））、電気化学的方法、火炎処理、プラズマ処理またはそれらの併用などである。
【０１５６】
洗浄に続いて、金基板はＳＡＭ種に露呈する。電極がＩＴＯである場合、ＳＡＭ種はリン酸エステル含有種である。この処理も様々な方法で実施し得るものであり、例えば、溶液析出、気相析出、微小接触プリンティング、スプレー析出、ニート成分を用いる析出などであるが、これらに限定されるものではない。好適な実施態様では、溶液中で種々のＳＡＭ種、一般にはチオール含有種の混合物を含む析出溶液を利用する。核酸を含む混合単層は通常２工程手法を用い調製する。チオール化核酸は（一般に少なくとも１種の他の単層形成種の存在下）最初の析出工程に際し析出し、混合単層形成は核酸を含まない第２チオール溶液を加える第２工程の間に完結する。場合により、第２工程は、単層再構成を促進するための緩和な加熱を利用し得る。
【０１５７】
好適な実施態様において、析出溶液は有機析出溶液である。この実施態様において、清浄金表面は清浄バイアル中に入れる。有機溶媒中の結合リガンド析出溶液は、総チオール濃度がマイクロモルと飽和の間にあるように調製する；好適な範囲は約１μＭないし１０ｍＭであり、特に好ましくは約４００μＭないし１．０ｍＭである。好適な実施態様において、析出溶液はチオール修飾ＤＮＡ（即ち、付着リンカーに付着した核酸）およびチオール希釈分子（伝導性オリゴマーまたは絶縁体であるが、後者が好ましい）を含有する。核酸と希釈剤（もしあるとすれば）との比は通常１０００：１と１：１０００との間であり、好ましくは約１０：１ないし約１：１０であり、特に好ましいのは１：１である。好適な溶媒はテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、エタノール、またはその混合物である；一般に、捕獲リガンドを溶解するのに十分な極性の溶媒であれば、その溶媒が表面と反応するような官能基をもたない限り、使用可能である。十分な核酸析出溶液をバイアルに加えて電極の表面を完全に覆うようにする。この金基板は外界温度または外界温度より少し高い温度で、数秒ないし数時間、好ましくは５分ないし３０分間インキュベートする。最初のインキュベーション後、析出溶液を取出し、希釈分子のみの有機溶媒溶液（約１μＭないし１０ｍＭ，好ましくは約１００μＭないし約１．０ｍＭ）を添加する。金基板は室温または室温以上の温度で所定時間（数秒ないし数日、好ましくは約１０分ないし約２４時間）インキュベートする。金サンプルを溶液から取出し、清浄な溶媒中ですすいで使用する。
【０１５８】
好適な実施態様においては、水性析出溶液を用いる。上記のように、清浄金表面を清浄バイアル内に入れる。核酸析出水性溶液は総チオール濃度が約１μＭと１０ｍＭの間、好ましくは約１μＭないし２００μＭであるように調製する。水性溶液は多くの場合、塩を存在させている（飽和まで、好ましくは約１Ｍである）が、精製水を使用し得る。析出溶液はチオール修飾核酸およびしばしばチオール希釈分子を含有する。核酸と希釈剤との比は通常１０００：１と１：１０００との間であり、好ましくは約１０：１ないし約１：１０であり、特に好ましいのは１：１である。核酸析出溶液は電極の表面を完全に覆うような容量でバイアルに加える。この金基板を外界温度または外界温度より少し高い温度で１〜３０分間インキュベートするが、通常５分で十分である。最初のインキュベーション後、析出溶液を取出し、希釈分子のみ（１０μＭないし１．０ｍＭ）の水性溶液または有機溶媒溶液を添加する。金基板は室温または室温以上の温度で、完全な単層が形成されるまで（１０分〜２４時間）インキュベートする。金サンプルを溶液から取出し、清浄な溶媒にすすいで使用する。
【０１５９】
好ましい実施態様では、析出溶液は両性イオン化合物、好ましくはベタインを含む。好ましい実施態様はベタインおよび Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を利用する。
【０１６０】
好適な実施態様においては、本明細書に説明するように、回路基板が金電極用の基板として使用される。金表面上ＳＡＭの形成は、まず基板を、本明細書に記載のように、例えば、１０％硫酸溶液中３０秒間、デタージェント溶液、王水、プラズマなどで清浄にすることにより一般に実施する。硫酸処理に続いて、基板は、例えば、２個のミリ−Ｑ水浴にそれぞれ１分間浸漬することにより洗浄する。この基板を次いで、例えば、窒素気流下で乾燥する。基板上に析出溶液をスポットするには、相当数の既知スポット・システムを用い、一般には基板をＸ−Ｙテーブル上に置き、調湿チャンバ中で実施する。スポット滴のサイズは基板上の電極サイズと溶液送達に使用する器具により変わる；例えば、２５０μＭサイズの電極では、３０ナノリットルの液滴が用いられる。この容量は電極表面を完全に覆うのに十分でなければならない。液滴は室温で所定時間（秒ないし一夜であるが、５分間が好適）インキュベートし、次いでミリ−Ｑ水浴中ですすぐことにより液滴を除去する。基板は次いで、場合により、第２析出溶液、一般に有機溶媒、好ましくはアセトニトリル中に絶縁体を含む溶液により、４５℃の浴に浸漬することによって処理する。３０分後、基板を取出し、アセトニトリル浴に３０秒間浸漬し、次いでミリ−Ｑ水浴中３０秒間浸漬する。基板を窒素気流下で乾燥する。好ましくは、水によるすすぎのみを用いる。
【０１６１】
好適な実施態様においては、ＳＡＭを含む検出電極（または非電極の実施態様では、アレイ上の部位）はさらに捕獲結合リガンド、好ましくは共有結合により付着したリガンドを含む。本明細書において「結合リガンド」または「結合種」とは、標的被検体の存在を探査するために用いる化合物であって、標的被検体に結合する化合物を意味する。一般に、本明細書に記載された実施態様の殆どについて、標的被検体１分子当たり少なくとも２つの結合リガンドが存在する；即ち、本明細書に記載の検出電極に付着する「捕獲」または「アンカー」結合リガンド（本明細書では、特に核酸結合リガンドに関して「捕獲プローブ」という）および可溶性結合リガンド（しばしば本明細書中で「シグナルプローブ」または「標識プローブ」と呼ぶ）であって、標的被検体に独立に結合し、直接または間接に少なくとも１個のＥＴＭを含むリガンドである。しかし、蛍光をベースとする核酸検出システムにおいては、標的配列を一般に増幅し、増幅中に蛍光標識を付加する；従ってこれらのシステムは一般に２つの要素（捕獲プローブと標識された標的）しか含まないことを理解すべきである。再度、下記の考察は電極および電気化学的検出に向けられているが、当業者に理解されるように、蛍光ベースのシステムも同様に使用できる。
【０１６２】
一般に、捕獲結合リガンドは検出を目的として、検出電極に標的被検体が付着するのを可能にする。以下により詳細に説明するように、標的被検体が捕獲結合リガンドに付着するのは直接的（即ち、標的被検体が捕獲結合リガンドに付着する）または間接的（１種以上の捕獲伸長リガンドを使用し得る）であってもよい。
【０１６３】
好適な実施態様において、結合は特異的であり、結合リガンドは結合対の部分である。本明細書において「特異的に結合する」とは、該リガンドが、試験サンプルの被検体と他の成分または混入物とを識別するのに十分な特異性をもって被検体に結合することを意味する。しかし、当業者には明らかなように、それ程特異的ではない結合を用いても被検体を検出することが可能である；例えば、このシステムには異なる結合リガンド、例えば、異なるリガンドのアレイを使用でき、特定のどの被検体の検出も、結合リガンドのパネルへの結合の「サイン」を介するが、これは「電子の鼻」が作用する様式に類似している。この結合は、被検体が非特異結合を除去するための洗浄工程を含むアッセイの条件下でも結合したままであるために十分なものでなければならない。ある実施態様においては、例えば、ある生体分子の検出では、結合リガンドに対する被検体の結合定数は少なくとも約１０４〜１０６Ｍ−１であり、好ましくは約１０５ないし１０９Ｍ−１であり、そして特に好ましいのは約１０７〜１０９Ｍ−１である。
【０１６４】
当業者には明らかなように、結合リガンドの組成は標的被検体の組成に依存する。広範な被検体に対する結合リガンドが既知であるか、または既知技法を用いて容易に見出すことができる。例えば、被検体が１本鎖核酸である場合、結合リガンドは、一般に、実質的に相補的な核酸であろう。あるいは、米国特許第５，２７０，１６３号、第５，４７５，０９６号、第５，５６７，５８８号、第５，５９５，８７７号、第５，６３７，４５９号、第５，６８３，８６７号、第５，７０５，３３７号、および出典明示により明細書に組込まれている関連特許に概略説明されている通り、核酸「アプトマー（ａｐｔｏｍｅｒ）」を、任意の標的被検体と実質的に結合させるために発生させることができる。同様に、被検体は核酸結合タンパク質であってもよく、捕獲結合リガンドは１本鎖または２本鎖核酸である；あるいは、結合リガンドは、被検体が１本鎖または２本鎖核酸である場合、核酸結合タンパク質であろう。被検体がタンパク質である場合、結合リガンドは、タンパク質（とりわけ、それらの抗体またはフラグメント（ＦＡｂｓなど）を含む）、小分子、または上記したアプトマーを含む。好適な結合リガンドタンパク質はペプチドを包含する。例えば、被検体が酵素である場合、適切な結合リガンドは基質、阻害剤、および酵素と結合する他のタンパク質（即ち、多酵素（またはタンパク質）複合体の成分）を包含する。当業者には明らかなように、会合する任意の２つの分子を、被検体または結合リガンドとして、好ましくは特異的に、使用し得る。適切な被検体／結合リガンド対は、抗体／抗原、受容体／リガンド、タンパク質／核酸；核酸／核酸、酵素／基質および／または阻害剤、炭水化物（糖タンパク質および糖脂質を含む）／レクチン、炭水化物および他の結合パートナー、タンパク質／タンパク質；およびタンパク質／小分子などを含むが、これらに限定されるものではない。これらは野生型または誘導配列であってもよい。好適な実施態様において、結合リガンドは多量化することの知られる細胞表面受容体、例えば、成長ホルモン受容体、グルコース輸送体（特にＧＬＵＴ４受容体）、トランスフェリン受容体、表皮成長因子受容体、低密度リポタンパク質受容体、高密度リポタンパク質受容体、レプチン受容体、インターロイキン受容体（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、およびＩＬ−１７受容体を含む）、ＶＥＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＥＰＯ受容体、ＴＰＯ受容体、毛様神経栄養因子受容体、プロラクチン受容体、およびＴ細胞受容体などの部分である。同様に、結合化学方法に基づく、結合パートナーの発展に関係する多くの文献がある。
【０１６５】
本実施態様において、結合リガンドが核酸である場合、好ましい組成物と技法は米国特許第５，５９１，５７８号；第５，８２４，４７３号；第５，７０５，３４８号；第５，７８０，２３４号および第５，７７０，３６９号、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／８７３，５９８ ０８／９１１，５８９；ＷＯ ９８／２０１６２； ＷＯ９８／１２４３０；ＷＯ９８／５７１５８；ＷＯ００／１６０８９；ＷＯ９９／５７３１７；ＷＯ９９／６７４２５；ＷＯ００／２４９４１；ＰＣＴ ＵＳ００／１０９０３；ＷＯ００／３８８３６；ＷＯ９９／３７８１９；ＷＯ９９／５７３１９ および ＰＣＴ ＵＳ００／２０４７６および関連資料に概説されており、これらすべては出典明示により全体的に本明細書の一部とする。
【０１６６】
捕獲結合リガンドを付着リンカー（絶縁体または伝導性オリゴマーのいずれか）に付着させる方法は、一般に当該技術分野で知られているように実施されるが、付着リンカーの組成と捕獲結合リガンドの両方に左右される。一般に、捕獲結合リガンドは官能基の使用を介して付着リンカーに付着させるが、各官能基は次いで付着に用い得るものである。付着に好適な官能基は、アミノ基、カルボキシ基、オキソ基およびチオール基である。これらの官能基は次いで直接または間接的に本明細書では「Ｚ」で表すリンカーの使用を介して付着させ得る。リンカーは当技術分野でよく知られている；例えば、ホモ−またはヘテロ−二官能性リンカーがよく知られたものである（参照：１９９４ Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ ｃａｔａｌｏｇ， ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｓｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒｓ， ｐａｇｅｓ １５５−２００；出典明示により本明細書の一部とする）。好適なＺリンカーは、アルキル基（置換アルキル基およびヘテロ原子部分を含むアルキル基）、短鎖アルキル基を有するエステル、アミド、アミン、エポキシ基およびエチレングリコール、および好ましい誘導体などであり、プロピル、アセチレン、およびＣ２アルケンがとりわけ好ましいが、これらに限定されるものではない。Ｚはスルホンアミドを形成するスルホン基であってもよい。
【０１６７】
この様式で、タンパク質、レクチン、核酸、小型有機分子、炭水化物などを含む捕獲結合リガンドを付加し得る。
【０１６８】
好適な実施態様ではタンパク質性の捕獲結合リガンドを利用する。当技術分野で知られているように、相当数の技法がタンパク質性の捕獲結合リガンドを付着リンカーに付着させるのに使用し得る。ある部分をタンパク質に付加させるための広範な技術が知られている。
【０１６９】
好適な実施態様では核酸を捕獲結合リガンドとして利用する。当業者には明らかなように、下記概説のいくつかの方法を、同様の方法で非核酸システムおよび金属電極以外の表面への付着に依存する他のシステムに同じように適用することができる。
【０１７０】
核酸捕獲結合リガンドは、伝導性オリゴマー（メカニズム−１システム）であるか、または絶縁体であり得る「付着リンカー」を介して電極に共有結合により付着している。本明細書において「共有結合により付着した」とは、２つの部分が少なくとも１つの結合により付着していることを意味し、該結合はシグマ結合、パイ結合および配位結合を包含する。
【０１７１】
このようにして、付着リンカーの一端を核酸（あるいは他の結合リガンド）に付着させ、他端（当業者が認めるところであるが、いずれの場合にも正確な末端である必要はない）を電極に付着させる。このように、本明細書中に描出した構造のいずれもさらに末端基として有効な核酸を含み得る。このように、本発明は、下記構造１７に一般的に描出したように、電極に共有結合により付着した核酸を含む組成物を提供する。
【０１７２】
【化１７】
2004530860.tif 000019
構造１７において、左側の斜線記号は、電極を表す。本明細書に定義するように、Ｘは伝導性オリゴマーであり、Ｉは絶縁体である。Ｆ１は、電極および伝導性オリゴマーまたは絶縁体の共有結合をもたらす結合であり、本明細書に記載され、例えば下記に「Ａ」と定義されるように、結合、原子またはリンカーを含む。Ｆ２は、核酸に伝導性オリゴマーまたは絶縁体を共有結合させる結合であり、本明細書に記載のように結合、原子または結合であり得る。Ｆ２は伝導性オリゴマーの一部、絶縁体の一部、核酸の一部であり得、または例えば本明細書で「Ｚ」について定義するように両方に外在性であり得る。
【０１７３】
好適な実施態様において、捕獲プローブ核酸は付着リンカーを介して電極に共有結合により付着している。核酸と付着リンカーの共有結合付着は、いくつかの方法で達成することができる。好適な実施態様において、その付着は下記説明のように、ヌクレオシド塩基への付着によるか、核酸の主鎖（リボース、リン酸エステル、または核酸類似体主鎖の類似基）への付着によるか、または遷移金属配位子への付着による。下に概説する技法は一般に天然に存在する核酸について説明しているが、当業者も認めるように、同様の技法は核酸類似体にも使用し得、そしていくつかの場合では他の結合リガンドを使用することができる。同様に、本明細書では殆どの構造は付着リンカーとして伝導性オリゴマーを描出しているが、アルキル鎖などの絶縁体が多くの実施態様で好ましい。
【０１７４】
好適な実施態様において、付着リンカーは核酸のヌクレオシド塩基に付着させる。これは下記説明のように、リンカーの種類に応じていくつかの方法で実施し得る。一実施態様において、リンカーは末端のヌクレオシド、即ち、核酸の３’または５’ヌクレオシドに付着させる。あるいは、リンカーを内部ヌクレオシドに付着させる。
【０１７５】
塩基への付着点は塩基により異なる。一般に、いずれの位置での付着も可能である。一部の実施態様では、例えば、ＥＴＭを含むプローブがハイブリダイゼーション（即ち、メカニズム−１システム）に使用される場合、相補的な塩基の水素結合に関与しない位置に付着させるのが好ましい。このように、例えば、一般に付着はウリジン、シトシンおよびチミンなどのピリミジン類の５または６位置に対するものである。アデニンおよびグアニンなどのプリン類については、結合は、好ましくは８位置を介する。非標準の塩基に対する付着は、相当する位置で好適になされる。
【０１７６】
一実施態様において、付着は直接的である；即ち、付着リンカーと塩基の間に介在する原子はない。この実施態様において、例えば、末端アセチレン結合を有する伝導性オリゴマーを含む付着リンカーを、塩基に直接付着させる。構造１８はこの結合の一例であり、ここでは構造３の伝導性オリゴマーと塩基としてウリジンを使用しているが、当業者も認めるように、他の塩基と付着リンカーを使用することもできる。
【０１７７】
【化１８】
2004530860.tif 000020
【０１７８】
本明細書に示したペントース構造には、水素、ヒドロキシ、リン酸またはアミノ基などの他の基が結合していることに留意すべきである。更に、本明細書に示したこのペントースおよびヌクレオシド構造は、通常表現の鏡像として非慣用的に示す。更に、ペントースおよびヌクレオシド構造はまた、任意の位置に、例えば、合成中に必要に応じて、保護基などの新たな基を含有できる。
【０１７９】
加えて、塩基は、必要に応じて更なる修飾を含むこともあり、即ち、カルボニルまたはアミン基を変更したり、保護することもできる。
【０１８０】
別の実施態様では、結合は、一般に、塩基としてウリジン、および付着リンカーとして構造３のオリゴマーを用いる構造１９に示したように、アミドおよびアミン結合を含む、多くの異なるＺ−リンカーを介する：
【０１８１】
【化１９】
2004530860.tif 000021
この実施態様では、Ｚはリンカーである。好ましくは、Ｚは約１から約１０原子の短いリンカーであり、１から５原子が好ましく、アルケン、アルキニル、アミン、アミド、アゾ、イミンなどの結合を含有してもよく、含有しなくてもよい。リンカーは当分野では知られており、例えば、よく知られているとおり、ホモまたはヘテロ二官能性リンカーである（１９９４ Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ ｃａｔａｌｏｇ， ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｓｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒ， ｐａｇｅｓ １５５−２００ 参照、出典明示により本明細書の一部とする）。好ましいＺリンカーには、アルキル基（置換アルキル基およびヘテロ原子部分を含有するアルキル基を含む）があるが、これらに限定されず、好ましいのは、短いアルキル基、エステル、アミド、アミン、エポキシ基およびエチレングリコールおよび誘導体であり、特に好ましいのは、プロピル、アセチレンおよびＣ２アルケンである。Ｚはまた、スルホン基であってもよく、下記のようにスルホンアミド結合を形成する。
【０１８２】
好ましい実施態様では、核酸と付着リンカーの結合は、核酸主鎖への結合を介して行う。これは、リボース−リン酸主鎖のリボースへの結合または主鎖のリン酸への結合、または類似主鎖の他の基への結合を含む多くの方法で実施できる。
【０１８３】
予備事項として、下記に十分説明するように、本実施態様における結合部位は、３’または５’末端ヌクレオチド、または内部ヌクレオチドであると理解されるべきである。
【０１８４】
好ましい実施態様では、付着リンカーをリボース−リン酸主鎖のリボースへ結合させる。これは、いくつかの方法で実施できる。当分野では知られているように、リボースの２’または３’位のいずれかにアミノ基、硫黄基、ケイ素基、リン基またはオキソ基で修飾したヌクレオシドを作成できる（Ｉｍａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， ４４： ２０３９ （１９７９）； Ｈｏｂｂｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ４２ （４）： ７１４ （１９７７）； Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ３６ （２）： ２５０ （１９７１）； ＭｃＧｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ６１： ７８１−７８５ （１９９）； Ｍｉｋｈａｉｌｏｐｕｌｏ ｅｔ ａｌ．， Ｌｉｅｂｉｇｓ． Ａｎｎ． Ｃｈｅｍ． ５１３−５１９ （１９９３）； ＭｃＧｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １４ （６）： １３２９ （１９９５）、全て出典明示により本明細書の一部とする）。次いで、付着リンカーを加えるためにこれらの修飾ヌクレオシドを用いる。
【０１８５】
好ましい実施態様は、アミノ修飾ヌクレオシドを利用する。このとき、これらのアミノ修飾リボースを用いて、伝導性オリゴマーに対してアミドまたはアミン結合を形成できる。好ましい実施態様では、アミノ基を直接リボースに結合させるが、当業者には明らかであるように、「Ｚ」について記載したような短いリンカーをアミノ基とリボースとの間に与えることができる。
【０１８６】
好ましい実施態様では、リボースに結合させるためにアミド結合を使用する。好ましくは、構造１〜３の伝導性オリゴマーを用いるならば、ｍは０であり、従って伝導性オリゴマーの末端はアミド結合である。この実施態様では、アミノ修飾リボースのアミノ基の窒素は、伝導性オリゴマーの「Ｄ」原子である。よって、本実施態様の好ましい結合を、構造２０に示す（付着リンカーとして構造３の伝導性オリゴマーを用いる）。
【０１８７】
【化２０】
2004530860.tif 000022
当業者には明らかなように、構造２０は、アミド結合として固定された末端結合を有する。
【０１８８】
好ましい実施態様では、ヘテロ原子結合、即ち、オキソ、アミン、硫黄等を用いる。好ましい実施態様はアミン結合を利用する。また、アミド結合について上記で概説したとおり、アミン結合の場合も構造３の伝導性オリゴマーを用いると、アミノ修飾リボースの窒素が伝導性オリゴマーの「Ｄ」原子であり得る。よって、例えば、構造２１および２２は、それぞれ付着リンカーとして構造３および９の伝導性オリゴマーを持つヌクレオシドを示し、ヘテロ原子として窒素を用いているが、他のヘテロ原子を使用することもできる：
【０１８９】
【化２１】
2004530860.tif 000023
構造２１では、好ましくは、ｍもｔも０ではない。ここで好ましいＺはメチレン基またはその他の脂肪族アルキルリンカーである。この位置にある１、２または３つの炭素は特に合成の際に有用である。
【０１９０】
【化２２】
2004530860.tif 000024
構造２２では、Ｚは上記定義のとおりである。適切なリンカーには、メチレンおよびエチレンがある。
【０１９１】
別の実施態様では、付着リンカーを、核酸のリボース−リン酸主鎖（または類似体）のリン酸を介して核酸に共有結合させる。この実施態様では、結合は直接的か、またはリンカーまたはアミド結合を利用する。構造２３は、直接結合を示しており、構造２４は、アミド結合を介した結合を示している（両方とも、構造３の伝導性オリゴマーを利用しているが、いかなる数の他の付着リンカーも、構造８の伝導性オリゴマーも可能である）。構造２３および２４は、３’位の伝導性オリゴマーを示しているが、５’位も可能である。更に、構造２３および２４とも、天然のホスホジエステル結合を示しているが、当業者には明らかなように、ホスホジエステル結合の非標準類似体も使用できる。
【０１９２】
【化２３】
2004530860.tif 000025
構造２３中、末端にＹが存在する（即ちｍ＝１）場合、Ｚは存在しない（即ち、ｔ＝０）のが好ましい。末端にＹが存在しない場合、Ｚは存在するのが好ましい。
【０１９３】
構造２４は、末端Ｂ−Ｄ結合がアミド結合であり、末端にＹが存在せず、Ｚが上記定義のリンカーである好ましい実施態様を示す。
【化２４】
2004530860.tif 000026
【０１９４】
好ましい実施態様では、付着リンカーは、遷移金属の配位子を介して核酸に共有結合する。本実施態様では、付着リンカーを遷移金属に１以上の配位原子を提供する配位子に共有結合させる。一実施態様では、下記構造２５に総括的に示したように、付着リンカーが結合する配位子には、核酸も結合している。あるいは、下記構造２６に総括的に示したように、付着リンカーは１つの配位子に結合しており、核酸は別の配位子に結合している。よって、遷移金属の存在下で付着リンカーは核酸に共有結合する。これらの構造はいずれも構造３の伝導性オリゴマーを示しているが、その他の付着リンカーを利用することもできる。構造２５および２６は、核酸用の２つの代表的な構造を示す：
【０１９５】
【化２５】
2004530860.tif 000027
【０１９６】
【化２６】
2004530860.tif 000028
【０１９７】
本明細書記載の構造中、Ｍは金属原子であり、遷移金属が好ましい。本発明に使用するのに適した遷移金属はカドミウム（Ｃｄ）、銅（Ｃｕ）、コバルト（Ｃｏ）、パラジウム（Ｐｄ）、亜鉛（Ｚｎ）、鉄（Ｆｅ）、ルテニウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｈ）、オスミウム（Ｏｓ）、レニウム（Ｒｅ）、白金（Ｐｔ）、スカンジウム（Ｓｃ）、チタニウム（Ｔｉ）、バナジウム（Ｖ）、クロム（Ｃｒ）、マンガン（Ｍｎ）、ニッケル（Ｎｉ）、モリブデン（Ｍｏ）、テクネチウム（Ｔｃ）、タングステン（Ｗ）、およびイリジウム（Ｉｒ）などであるが、これらに限定されるものではない。即ち、遷移金属の第１系列、白金族（Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、ＩｒおよびＰｔ）並びにＦｅ、Ｒｅ、Ｗ、ＭｏおよびＴｃが好ましい。特に好ましいのはルテニウム、レニウム、オスミウム、白金、コバルトおよび鉄である。
【０１９８】
Ｌは補助配位子であり、金属イオン結合のための配位原子を提供する。当業者が理解するように、補助配位子の数と性質は金属イオンの配位数に依存する。単座、二座または多座補助配位子はどの位置で使用してもよい。従って、例えば、金属が６の配位数を有する場合、伝導性オリゴマーの末端からのＬ、核酸から与えられるＬ、およびｒを６まで加える。従って、金属が六配位数の場合、ｒは０（全配位原子が他の２つの配位子によって与えられる場合）から４（全ての補助配位子が一座配位の場合）の範囲であろう。従って、一般に、金属イオンの配位数および他の配位子の選択に依存してｒは０ないし８であるであろう。
【０１９９】
ある実施態様において、金属イオンは６の配位数を有し、そして伝導性オリゴマーに付着した配位子および核酸に付着した配位子は、両方共、少なくとも２量体である；即ち、ｒは、好ましくは、０、１（即ち残った補助配位子は２量体である）または２（２つの一座配位補助配位子が使用される）である。
【０２００】
技術的に認識されるように、補助配位子は同一であっても異なってもよい。適切な配位子は２つの範疇に入る：配位原子（一般的には文献上、シグマ（σ）供与体という）として（金属イオンに依存して）、窒素、酸素、硫黄、炭素またはリン原子を用いる配位子、およびメタロセン配位子などの有機金属配位子（一般的には文献上、パイ（π）供与体といい、本明細書ではＬｍで図示する）である。適切な窒素供与配位子は技術上周知であり、以下のものを包含するがこれらに限定されるものではない：ＮＨ２；ＮＨＲ；ＮＲＲ’；ピリジン；ピラジン；イソニコチンアミド；イミダゾール；ビピリジンおよびビピリジンの置換誘導体；テルピリジンおよび置換誘導体；フェナントロリン、特に１，１０−フェナントロリン（ｐｈｅｎと略記）およびフェナントロリンの置換誘導体、例えば、４，７−ジメチルフェナントロリンおよびジピリド［３，２−ａ：２’，３’−ｃ］フェナジン（ｄｐｐｚと略記）；ジピリドフェナジン；１，４，５，８，９，１２−ヘキサアザトリフェニレン（ｈａｔと略記）；９，１０−フェナントレンキノン・ジイミン（ｐｈｉと略記）；１，４，５，８−テトラアザフェナントレン（ｔａｐと略記）；１，４，８，１１−テトラ−アザシクロテトラデカン（ｃｙｃｌａｍと略記）、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよびイソシアニド。融合した誘導体を包含する置換誘導体も使用することができる。ある実施態様においては、ポルフィリンおよびポルフィリンファミリーの置換誘導体を使用してもよい。例えば、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｅｄ． Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｅｒｇａｍｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， １９８７， Ｃｈａｐｔｅｒｓ １３．２ （ｐｐ ７３−９８）， ２１．１ （ｐｐ ８１３−８９８） ａｎｄ ２１．３ （ｐｐ ９１５−９５７）参照。この文献の全部を特に参照により本明細書に取込む。
【０２０１】
炭素、酸素、硫黄およびリンを用いる適切なシグマ供与配位子は技術上既知である。例えば、適切なシグマ炭素供与体は Ｃｏｔｔｏｎ ａｎｄ Ｗｉｌｋｅｎｓｏｎ， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９８８ に見出されるが、この文献を参照により本明細書に取込む；例えば、３８ページ参照。同様に、適切な酸素配位子は、クラウンエーテル、水、および技術上既知の他のものを包含する。ホスフィンおよび置換ホスフィンも適切である；Ｃｏｔｔｏｎ ａｎｄ Ｗｉｌｋｅｎｓｏｎ の３８ページ参照。
【０２０２】
酸素、硫黄、リンおよび窒素−供与配位子は、ヘテロ原子が配位原子として作動するような様式で付着する。
【０２０３】
好適な実施態様においては、有機金属配位子を用いる。レドックス部分として使用する純有機化合物、およびヘテロ環状またはエキソ環状置換基として供与原子をもつδ−結合有機配位子との種々の遷移金属配位複合体に加えて、π−結合有機配位子をもつ多様な遷移金属有機金属化合物が入手可能である（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ５ｔｈ Ｅｄ．， Ｃｏｔｔｏｎ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９８８， Ｃｈａｐｔｅｒ ２６； Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ， Ａ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， Ｅｌｓｃｈｅｎｂｒｏｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２ｎｄ Ｅｄ．， １９９２， ＶＣＨ； およびＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＩＩ， Ａ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ １９８２−１９９４， Ａｂｅｌ ｅｔ ａｌ． Ｅｄ．， Ｖｏｌ． ７， Ｃｈａｐｔｅｒｓ ７， ８， １０ ＆ １１， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， 特に参照により本明細書に取込む）。かかる有機金属配位子は、シクロペンタジエニド・イオン［Ｃ５Ｈ５（−１）］などの環状芳香族化合物および種々の環置換および環融合誘導体、例えば、インデニリド（−１）イオンなどであって、一群のビス（シクロペンタジエニル）金属化合物（即ち、メタロセン）を産生する；例えば、Ｒｏｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １０４： １８８２−１８９３ （１９８２）； および Ｇａｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １０８： ４２２８−４２２９ （１９８６）参照；これらを出典明示により本明細書の一部とする。これらの内、フェロセン［（Ｃ５Ｈ５）２Ｆｅ］およびその誘導体が多様な化学的（Ｃｏｎｎｅｌｌｙ ｅ ａｌ．， Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． ９６： ８７７−９１０ （１９９６）、出典明示により本明細書に組込まれている）および電子化学的（Ｇｅｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３： １−９３； および Ｇｅｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４： ８７、出典明示により本明細書に組込まれている）電子伝達または「レドックス」反応に使用されている原型的な例である。様々な第１、第２および第３列遷移金属のメタロセン誘導体は、核酸のリボース環またはヌクレオシド塩基のいずれかに共有結合により付着しているレドックス部分としての有力な候補である。他の潜在的に適切な有機金属配位子は、ベンゼンなどの環状アレンなどを包含し、ビス（アレン）金属化合物とその環置換および環融合誘導体を産生するが、そのビス（ベンゼン）クロミウムは原型的な例である。アリル（−１）イオンなどの他の非環状π−結合配位子またはブタジエンは潜在的に適切な有機金属化合物を産生し、かかる配位子はすべて他のπ−結合およびδ−結合配位子と連携して、金属−炭素結合をもつ一般クラスの有機金属化合物を構成する。架橋有機配位子およびさらなる非架橋配位子を有し、同様に金属−金属結合を有し、また有さない、かかる化合物の種々のダイマーおよびオリゴマーの電気化学的研究は、核酸分析における有力な候補レドックス部分である。
【０２０４】
１種以上の補助配位子が有機金属配位子である場合、該配位子は一般に有機金属配位子の炭素原子の一つを介して付着するが、ただし付着は複素環式の配位子に対し他の原子を介してであってもよい。好適な有機金属配位子は、置換誘導体およびメタロセンオファンを含むメタロセン配位子を包含する（上記 Ｃｏｔｔｏｎ ａｎｄ Ｗｉｌｋｅｎｓｏｎ の１１７４ページ参照）。例えば、メチルシクロペンタジエニルなどのメタロセン配位子の誘導体、好ましくは複数のメチル基を有する例えば、ペンタメチルシクロペンタジエニルなどを用い、メタロセンの安定性を増大させることができる。好適な実施態様において、メタロセンの２つのメタロセン配位子の１つのみが誘導化される。
【０２０５】
本明細書に記載のように、配位子の任意の組み合わせを使用し得る。好ましい組み合わせは：ａ）全配位子が窒素供与配位子である；ｂ）全配位子が有機金属配位子である；そしてｃ）付着リンカーの末端の配位子がメタロセン配位子であり、核酸により提供される配位子は窒素投与配位子であることを含み、必要により、他の配位子と一緒であり、それは窒素供与配位子またはメタロセン配位子またはその混合物である。これらの組み合わせは、構造３の伝導性オリゴマーを使用した代表例に記載され、構造２７（フェナンスロリンおよびアミノを代表的配位子として使用して）、２８（フェロセンを金属−配位子組合わせとして使用して）および２９（シクロペンタジエニルおよびアミノを代表的配位子として使用して）に記載する。
【０２０６】
構造２７
【化２７】
2004530860.tif 000029
【０２０７】
構造２８
【化２８】
2004530860.tif 000030
【０２０８】
構造２９
【化２９】
2004530860.tif 000031
【０２０９】
再度、アルキル基などの他の付着リンカーも利用し得る。
【０２１０】
好ましい実施態様において、本発明で使用する配位子は、キレート化金属イオンのレドックス状態に依存して、別の蛍光特性を示す。下記のように、これは、従って、ＥＴＭと電極間の電子伝達の検出の別のモードとして作用する。
【０２１１】
さらに、同様の方法を使用して、タンパク質を検出電極に付着させることができる；例えば米国特許第５，６２０，８５０号参照、出典明示により本明細書に組込まれている。
【０２１２】
下記により詳細に示すような、好ましい実施態様において、核酸に結合した配位子は、リボース−リン酸主鎖のリボースの２’または３’位置に結合したアミノ基である。本配位子は、金属イオンに結合する多座配位子を形成するように、多くのアミノ基を含み得る。他の好ましい配位子は、シクロペンタジエンおよびフェナンスロリンを含む。
【０２１３】
好適な実施態様において、捕獲プローブ核酸（または他の結合リガンド）を、絶縁体を介して電極に共有結合により付着させる（例えば、付着リンカーは絶縁体である）。核酸（および他の結合リガンド）がアルキル基などの絶縁体に付着することは周知であり、それらの付着は、塩基、またはリボースまたはリン酸エステル部分を含む主鎖に対して、または核酸類似体の代替主鎖に対して実施し得る。
【０２１４】
好適な実施態様においては、表面上に１種またはそれ以上の異なる捕獲プローブ種があってもよい。一部の実施態様においては、以下により詳細に説明するように、そこには捕獲プローブの１タイプまたは捕獲伸長プローブの１タイプがあってもよい。あるいは、異なる捕獲プローブ、または多様な異なる捕獲伸長プローブをもつ１種の捕獲プローブを用いることもできる。同様に、（特にメカニズム−２システムでの核酸被検体および結合リガンドの場合）比較的短いプローブ配列を含む補助捕獲プローブを使用することが望ましく、これはシステムの成分、例えば、リクルートリンカーを「取押さえる」のに使用し、表面でのＥＴＭ濃度を上げることができる。
【０２１５】
好ましい実施態様では、いくつかのプローブを設計し、各標的配列に使用する。つまり、アレイの単一の電極パッドは標的被検体に対して１個のプローブを有するか、または同一の標的配列に対して複数のプローブ（好ましくは重複しないが、このことは必要ではない）を有してもよい。
【０２１６】
このように、本発明は標的被検体検出システムに有用な、単層と捕獲結合リガンドを含む、少なくとも１つの検出電極を含む基質を提供する。
【０２１７】
好適な実施態様においては、該組成物はさらに溶液あるいは溶解性結合リガンドを含むが、メカニズム−１システムについて下に詳記したように、ＥＴＭを、非共有的に付着したハイブリダイゼーション指示体の形態で添加してもよい。溶液結合リガンドは、好ましくは特異的に、標的被検体に結合する点で捕獲結合リガンドに似ている。溶液結合リガンド（標的非検体が核酸である場合、本明細書ではしばしば標識プローブと呼ぶ）は捕獲結合リガンドと同一でもまたは異なっていてもよい。一般に、溶液結合リガンドは、直接表面に結合するものではない。溶液結合リガンドは少なくとも１つのＥＴＭ（６０／１９０，２５９の図４Ａ）を含むリクルートリンカーを直接含むか、またはリクルートリンカーが溶液結合リガンドと直接的（図４Ａ）にまたは間接的（図４Ｅ）に結合する。
【０２１８】
このように、共有結合的に付着したＥＴＭを含むリクルートリンカーを有する、「溶液結合リガンド」または「溶解性結合リガンド」または「シグナル担体」または「標識プローブ」または「標識結合リガンド」が提供される。即ち、標識プローブまたは溶液結合リガンドのある部分が、直接的または間接的に、標的被検体と結合しており、そしてある部分が共有結合的に付着したＥＴＭを含むリクルートリンカーを含む。いくつかのシステム、例えばメカニズム−１核酸システム中では、これらは同一であってもよい。同様に、メカニズム−１において、リクルートリンカーは、検出プローブとハイブリダイズし得る核酸を含む。「電子供与体部分」、「電子受容体部分」、および「ＥＴＭ」（ＥＴＭ）という用語または文法的均等物は、一定の条件下で電子伝達し得る分子をいう。電子供与体および電子受容体の許容力は相対的であるということは理解されるべきである；即ち、一定の実験条件下で電子を失う分子が、異なる実験条件下で電子を受容し得る。可能な電子供与体部分と電子受容体部分の数は非常に多く、また、電子転移化合物の当業者であれば本発明において多くの化合物を利用し得るであろう、ということも理解されるべきてある。好適なＥＴＭとは、遷移金属錯体、有機ＥＴＭ、および電極であるが、これらに限定されるものではない。
【０２１９】
好適な実施態様において、ＥＴＭは遷移金属錯体である。遷移金属とはその原子が部分的または完全な電子のｄ殻を有するものである。本発明に使用する適切な遷移金属は上に列記してある。
【０２２０】
遷移金属は上記定義の様々な配位子Ｌと錯体を形成し、当該技術上周知のように、適切な遷移金属錯体となる。
【０２２１】
好ましいＥＴＭは、メタセロン、特にフェロセンを含む。
【０２２２】
遷移金属錯体に加えて、他の有機電子供与体および受容体は、本発明に使用する核酸に共有結合により付着していてもよい。これらの有機分子は、リボフラビン、キサンテン色素、アジン色素、アクリジンオレンジ、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−２，７−ジアザピレニウム・ジクロリド（ＤＡＰ２＋）、メチルビオロジェン、臭化エチジウム、キノン類、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアントラ（２，１，９−ｄｅｆ．６，５，１０−ｄ’ｅ’ｆ’）ジイソキノリン・ジクロリド（ＡＤＩＱ２＋）；ポルフィリン（［メソ−テトラキス（Ｎ−メチル−ｘ−ピリジニウム）ポルフィリン・テトラクロリド］）、ベルラミン・ブルーＢ塩酸塩、ビンドシェドラー（Ｂｉｎｄｓｃｈｅｄｌｅｒ）グリーン；２，６−ジクロロインドフェノール、２，６−ジブロモフェノールインドフェノール；ブリリアント・クレストブルー（塩化３−アミノ−９−ジメチルアミノ−１０−メチルフェノキシアジン）、メチレンブルー； ナイルブルーＡ（アミノアフトジエチルアミノフェノキサジン硫酸塩）、インジゴ−５，５’，７，７’−テトラスルホン酸、インジゴ−５，５’，７−トリスルホン酸；フェノサフラニン、インジゴ−５−モノスルホン酸；サフラニンＴ；塩化ビス（ジメチルグリオキシマト）鉄（ＩＩ）；インデュリンスカーレット、ニュートラルレッド、アントラセン、コロネン、ピレン、９−フェニルアントラセン、ルブレン、ビナフチル、ＤＰＡ、フェノチアジン、フルオランテン、フェナントレン、クリセン、１，８−ジフェニル−１，３，５，７−オクタテトラセン、ナフタレン、アセナフタレン、ペリレン、ＴＭＰＤおよびこれら化合物の類似体と置換誘導体であるが、これらに限定されるものではない。
【０２２３】
一実施態様において、電子供与体および受容体は技術上既知のレドックスタンパク質である。しかし、多くの実施態様においてレドックスタンパク質は好ましくない。
【０２２４】
特異ＥＴＭの選択は、以下に一般的に概説するように、使用する電子伝達検出のタイプにより影響を受ける。好適なＥＴＭはメタロセンであり、特に好ましいのはフェロセンである。
【０２２５】
従って、本発明は核酸および他の標的被検体の検出に有用な方法と構成物を提供する。当業者には理解されるように、本発明の構成物は多様な配置を取り得る。下記により詳しく概説するように、本発明の好ましいシステムは以下のように作用する。一般に伝導性オリゴマーを含む単層を含む電極に標的核酸配列が（ハイブリダイゼーションを介して）付着する。この付着は表面上の捕獲プローブに直接的にか、捕獲伸長プローブを使用して間接的にかのどちらかであり得る。いくつかの実施態様では、標的配列自体がＥＴＭを含む。あるいは、標識プローブを次いで加え、アッセイ複合体を形成する。標識プローブの付着は直接（即ち標的配列の一部分にハイブリダイズする）または間接（即ち、標的配列にハイブリダイズする増幅プローブにハイブリダイズする）であってよく、必要とされる全核酸はアッセイ複合体を形成する。標識プローブの第１部分のハイブリダイゼーションの結果として、ＥＴＭを含有する標識プローブの第２部分、即ち「リクルートリンカー」が、電極上のＳＡＭ表面の空間的近傍にもたらされ、その後ＥＴＭの存在が電気的に検出され得る。
【０２２６】
従って、好ましい実施態様では、本発明は、核酸（または他の標的被検体）検出システムで有用な、ＳＡＭ形成種と捕獲プローブを含む単層を含む電極を提供する。好ましい実施態様では、構成物はさらに標識プローブを含む。標識プローブは核酸であり、一般的に１本鎖であるが、下記により詳しく概説するように、２本鎖部分を含有してもよい。以下に定義するように、メカニズム−２システムでは、標識プローブは、アッセイ複合体の成分にハイブリダイズできる第１部分、およびアッセイ複合体の成分にハイブリダイズしない第２部分を含み、そして少なくとも１個の共有結合により付着したＥＴＭを含む。
【０２２７】
理論によって限定されないが、「メカニズム−２」システムにおいて、電子伝達は、ＥＴＭが単層にある程度入り込む（「擦り寄る」）ことができる場合に助長されるように思われる。つまり、一般に、疎水性ＳＡＭと共に疎水性のＥＴＭを用いると、電荷があるかまたはより親水性のＥＴＭを用いるよりも、よい（大きい）シグナルが生じる。従って、例えば、溶液中のフェロセンは、実施例の単層に入り込むことができ、電気伝導体が存在するとシグナルをもたらし、一方溶液中のフェロシアニドは、ほとんどまたは全くシグナルを生じさせない。従って、一般に、疎水性のＥＴＭはメカニズム−２システムで好ましい；しかし、極性はあるが、１個またはそれ以上の疎水性配位子を有する遷移金属錯体（ＲｕおよびＯｓ錯体など）は、よいシグナルをもたらす。同様に、ＥＴＭと電極との間の電子伝達は、単層に入り込む柔軟性をＥＴＭにもたらすリンカーまたはスペーサーの使用により助長される；従って本発明のＮ６構成物は、ＥＴＭを核酸に付着させる４個の炭素リンカーを有する。
【０２２８】
好適な実施態様においては、複数のＥＴＭが使用される。多様なＥＴＭの使用はシグナルの増幅につながり、より感度の高い検出限界を可能とする。以下に検討するように、相補鎖にハイブリダイズする核酸上で複数のＥＴＭを使用すると、その数、付着の部位および複数ＥＴＭ間の空間関係に依存してハイブリダイゼーション複合体のＴｍの減少を引起す。一方、それはＥＴＭがリクルートリンカー上にある場合、要因ではなくなる。なぜなら、それが相補配列にハイブリダイズしないからである。従って、複数のＥＴＭが好ましく、リクルートリンカー当たり少なくとも約２個のＥＴＭが好ましく、また少なくとも１０個が特に好ましく、また少なくとも約２０〜５０個がとりわけ好ましい。ある事例では、非常に多くのＥＴＭ（１００ないし１０００個）が使用可能である。
【０２２９】
当業者に理解されるように、ＥＴＭを含む標識プローブ（またはいくつかの実施態様では標的）（本明細書では「リクルートリンカー」または「シグナル担体」と称する）の部分は、核酸であり得、または標識プローブの第１ハイブリダイズ部分をＥＴＭに連結する非核酸リンカーで有り得る。つまり、標識プローブのこの部分はハイブリダイゼーションに必要とされないため、核酸である必要はないが、合成が簡単なので核酸で作られ得る。いくつかの実施態様では、以下により詳しく概説するように、リクルートリンカーは２本鎖部分を含んでもよい。従って、当業者が認めるように、使用し得る多様な構成が存在し得る。好適な実施態様において、リクルートリンカーは核酸（類似体も含む）であり、ＥＴＭの付着は、下記に示すように、（１）塩基；（２）主鎖、例えば、リボース、リン酸エステル、または核酸類似体の相当する構造；（３）下記のヌクレオシド置換；または（４）下記のごときメタロセンポリマー；を介する。好適な実施態様において、リクルートリンカーは非核酸であり、メタロセンポリマーまたはＥＴＭ置換基を含むアルキル型ポリマー（以下により詳細に説明するように、ヘテロアルキルを含む）であってもよい。これらの選択肢は図に一般的に描出する。
【０２３０】
好適な実施態様において、リクルートリンカーは核酸であり、共有結合により付着したＥＴＭを含んでいる。ＥＴＭは様々な位置で核酸内のヌクレオシドに付着していてもよい。好適な実施態様は、（１）ヌクレオシド塩基への付着、（２）塩基置換体としてのＥＴＭの付着、（３）リボース−リン酸主鎖のリボースまたはリン酸部分への、または核酸類似体の類似構造へなどの核酸主鎖への付着、および（４）メタロセンポリマーを介しての付着、などであるが、これらに限定されるものではないが、後者がより好ましい。
【０２３１】
さらに、下記のように、リクルートリンカーが核酸である場合、第２の標識プローブを用いることが望ましく、該プローブは本明細書に定義のように第１標識プローブの一部にハイブリダイズする第１部分とリクルートリンカーを含む第２部分を有する。これは一般的にＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／１９０，２５９の図１６に図示される；これは増幅プローブの使用に似ているが、第１および第２標識プローブ両者がＥＴＭを含む場合は例外である。
【０２３２】
好適な実施態様において、付着リンカーの付着のために、既に一般的に概説されているようにヌクレオシドの塩基に付着する。付着は内部ヌクレオシドまたは末端ヌクレオシドに対してなされる。
【０２３３】
共有結合による塩基への付着は選定されたＥＴＭ上の部分に依存するが、一般には上記されているように、伝導性オリゴマーが塩基に付着するのに似ている。付着は、一般には、塩基のどの部位になされてもよい。好適な実施態様において、ＥＴＭは遷移金属錯体であり、かくして、適切な金属配位子の塩基への付着がＥＴＭの共有結合による付着に導く。あるいは、当業者が理解するように、同様のタイプの結合を有機ＥＴＭの付着に使用してもよい。
【０２３４】
一実施態様において、シトシンのＣ４付着アミノ基、アデニンのＣ６付着アミノ基、またはグアニンのＣ２付着アミノ基が遷移金属配位子として使用し得る。
【０２３５】
芳香族基を含む配位子は技術上既知のようにアセチレン結合を介して付着することができる（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｔｒｏｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ｅｄ．， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｈａｐｔｅｒ ２．４； Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ Ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｐ２ ａｎｄ ｓｐ Ｃａｒｂｏｎ Ｃｅｎｔｅｒｓ， Ｓｏｎｏｇａｓｈｉｒａ， ｐｐ ５２１−５４９， および ｐｐ ９５０−９５３ 参照； 出典明示により本明細書に組込まれている）。構造３０は金属イオンと他の必要な配位子存在下での代表的な構造を図示する；構造３０ではウリジンを図示しているが、本明細書全体について、他の塩基を使用することも可能である。
【０２３６】
【化３０】
2004530860.tif 000032
Ｌａは配位子であり、窒素、酸素、硫黄またはリン供与配位子またはメタロセンリガンドなどの有機金属配位子を包含する。適切な配位子Ｌａはフェナントロリン、イミダゾール、ｂｐｙおよびｔｅｒｐｙなどであるが、これらに限定されるものではない。ＬｒおよびＭは上記定義のとおりである。再度、当業者が理解するように、リンカー（「Ｚ」）はヌクレオシドとＥＴＭの間に含まれる。
【０２３７】
同様に、付着リンカーに関しては、その結合がリンカーを用いてなされるが、リンカーはアミド結合を利用することができる（一般的に、Ｔｅｌｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１１： ７２２１−７２２６ （１９８９）； Ｔｅｌｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１１： ７２２６−７２３２ （１９８９）参照；両文献を特に出典明示により本明細書に組込まれている）。これらの構造は下記構造３１に一般的に図示する。再度ここではウリジンを塩基として使用しているが、上記同様、他の塩基も使用し得る。
【０２３８】
【化３１】
2004530860.tif 000033
この実施態様において、Ｌは上記定義の配位子であり、ＬｒおよびＭも上記定義のとおりである。好ましくは、Ｌはアミノ、ｐｈｅｎ、ｂｙｐおよびｔｅｒｐｙである。
【０２３９】
好適な実施態様において、ヌクレオシドに付着したＥＴＭはメタロセンである；即ち、構造３１のＬおよびＬｒは両者ともメタロセン配位子であり、上記のＬｍ’である。構造３２は好適な実施態様を図示するものであり、この場合メタロセンはフェロセン、塩基はウリジンであるが、他の塩基も使用可能である。
【０２４０】
【化３２】
2004530860.tif 000034
予備データが示唆するところでは、構造３２は環化可能であって、第２アセチレン炭素原子がカルボニル酸素を攻撃し、フラン様構造を形成する。好適なメタロセンはフェロセン、コバルトセンおよびオスミウムオセンなどである。
【０２４１】
好適な実施態様において、ＥＴＭは核酸のリボース−リン酸主鎖のいずれかの位置、即ち、５’または３’末端またはいずれかの内部ヌクレオシドでリボースに付着している。この場合のリボースはリボース類似体を包含する。技術的に知られているように、リボースの２’または３’位置のいずれかで修飾されているヌクレオシドは、窒素、酸素、硫黄およびリン−含有修飾により可能となり得る。アミノ−修飾および酸素−修飾リボースが好ましい。一般的には、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／１５９７１（出典明示により本明細書に組込まれている）を参照されたい。これらの修飾基は遷移金属配位子として、または他の遷移金属配位子および有機金属配位子付着のための化学的に官能性の部分、または当業者認知の有機電子供与体部分として使用することができる。この実施態様において、本明細書において「Ｚ」として図示したようなリンカーも同様に、あるいはリボースとＥＴＭ間の伝導性オリゴマーも使用可能である。好適な実施態様では、リボースの２’または３’位での付着を利用するが、２’位置が好ましい。このように例えば、構造１３、１４および１５に図示された伝導性オリゴマーはＥＴＭに置換えることができる；あるいは、ＥＴＭは伝導性オリゴマーの遊離末端に加えてもよい。
【０２４２】
好適な実施態様において、メタロセンはＥＴＭとして作動し、下記構造３３に図示するようにアミド結合を介して付着する。例示ではメタロセンがフェロセンである場合の好適な化合物につきその合成を概説する。
【化３３】
2004530860.tif 000035
【０２４３】
好適な実施態様においては、アミンの結合が構造３４に一般的に図示するように使用される。
【化３４】
2004530860.tif 000036
Ｚは本明細書に定義のごときリンカーであり、１〜１６原子のものが好ましく、２〜４原子がとりわけ好ましい。ｔは１または０である。
【０２４４】
好適な実施態様においては、オキソ結合が構造３５に一般的に図示するように使用される。
【化３５】
2004530860.tif 000037
構造３５において、Ｚは本明細書に定義のとおりのリンカーであり、ｔは１または０である。好適なＺリンカーは、（ＣＨ２）ｎおよび（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎなどのヘテロアルキル基を含むアルキル基を包含し、ｎは１ないし１０が好ましく、ｎ＝１ないし４がとりわけ好ましく、ｎ＝４が特に好ましい。
【０２４５】
他のヘテロ原子を利用する結合も可能である。
【０２４６】
好適な実施態様において、ＥＴＭは核酸のリボース−リン酸主鎖のいずれかの位置でリン酸エステルに付着する。これは様々な様式でなされる。一実施態様において、ホスホジエステル結合類似体、例えば、ホスホラミドまたはホスホラミダイト結合は核酸中に取込まれていてもよく、その場合、ヘテロ原子（即ち、窒素）が遷移金属配位子として作動する（ＰＣＴ公開ＷＯ９５／１５９７１参照；出典明示により本明細書に組込まれている）。あるいは、構造２３および２４に図示されている伝導性オリゴマーをＥＴＭに置換えてもよい。好適な実施態様において、組成物は構造３６に示した構造を有する。
【化３６】
2004530860.tif 000038
【０２４７】
構造３６において、ＥＴＭはリン酸エステル結合を介して、一般にはリンカーＺを使用することにより付着する。好適なＺリンカーは、（ＣＨ２）ｎ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎなどのヘテロアルキル基を含むアルキル基を包含し、ｎは１ないし１０が好ましく、ｎ＝１ないし４がとりわけ好ましく、ｎ＝４が特に好ましい。
【０２４８】
ＥＴＭがヌクレオシドの塩基または主鎖に付着している場合、より詳しく下に概説するように、「樹枝状」構造を介してＥＴＭを付着させることが可能である。図に一般的に示すように、アルキルベースのリンカーを用い、各枝の末端に１個以上のＥＴＭを含む多数の分枝構造を創り出すことができる（内部のＥＴＭも同様に使用できるが）。一般に、これは多数のヒドロキシ基を含む分枝点を創り出すことにより実施されるが、このヒドロキシ基を用いてさらなる分枝点を加えることができる。一般的にはヌクレオシド置換およびメタロセンポリマー反応のために以下に実施するように、末端のヒドロキシ基を次いでホスホラミダイト反応に用い、ＥＴＭに加えることができる。分枝点は内部のものまたは末端のものであり得、そして化学分枝点またはヌクレオシド分枝点であり得る。
【０２４９】
好適な実施態様において、メタロセンなどのＥＴＭは、ＥＴＭとして作動するように「ヌクレオシド置換体」として使用する。例えば、フェロセンの２つのシクロペンタジエン環の間の距離は、２本鎖核酸中の２つの塩基間の直交距離に類似している。フェロセンに加え、他のメタロセン、例えば、コバルトまたはルテニウムなどを含むメタロセンなどの空気安定性メタロセンを使用することができる。このように、メタロセン部分は、構造３７（リボース−リン酸主鎖を有する核酸）および構造３８（ペプチド核酸主鎖）に一般的に図示するように、核酸の主鎖に取込んでもよい。構造３７および３８ではフェロセンを図示しているが、当業者が理解するように、他のメタロセンも同様に使用し得る。一般に、空気に安定なメタロセンが好ましく、金属としてルテニウムおよびコバルトを利用するメタロセンが包含される。
【０２５０】
【化３７】
2004530860.tif 000039
構造３７において、Ｚは上記定義のリンカーであり、一般的には短いアルキル基をもち、酸素などのヘテロ原子を含むものが好ましい。一般に、重要なことはリンカーの長さであり、より詳しく以下に説明するように、２本鎖核酸の混乱が最小になるようにする。このように、メチレン、エチレン、エチレングリコール、プロピレンおよびブチレンがすべて好適であり、エチレンおよびエチレングリコールが特に好ましい。さらに、各Ｚリンカーは同一であっても、異なってもよい。構造３７はリボース−リン酸主鎖を表示しているが、当業者が理解するように、リボース類似体およびリン酸エステル結合類似体などの核酸類似体を使用してもよい。
【０２５１】
【化３８】
2004530860.tif 000040
構造３８において、好適なＺ基は上記掲載のとおりであるが、再度、各Ｚリンカーは同一または異なってもよい。上述のように、他の核酸類似体も同様に使用し得る。
【０２５２】
さらに、上記の構造と検討ではメタロセン、特にフェロセンを描出しているが、同じ一般的な着想を用い、下記のように、ヌクレオシドの置換体として、またはポリマーの実施態様において、メタロセンに加えてＥＴＭを付加することができる。このように、例えば、１、２または３個（またはそれ以上）の配位子を含む、メタロセン以外の遷移金属錯体である場合、該配位子をフェロセンについて表現したように機能化し、ホスホラミダイト基の付加を可能とすることができる。特に、この実施態様において好ましいのは、少なくとも２つの環（例えば、アリールおよび置換アリール）配位子を含む複合体であり、その場合、各配位子はホスホラミダイト化学による付着のための官能基を含む。当業者が理解するように、このタイプの反応は、核酸主鎖の一部としてまたは核酸の「側鎖基」としてＥＴＭのポリマーを創出し、ここで生じるシグナルの増幅を可能とするが、このタイプの反応を、正しい化学基を含むように官能化し得る実質的にいずれのＥＴＭによっても実施することができる。
【０２５３】
このように、フェロセンなどのメタロセン（または他のＥＴＭ）を核酸の主鎖に挿入することにより、核酸類似体が調製される；即ち、本発明は少なくとも１個のメタロセンを含む主鎖をもつ核酸を提供する。これは、主鎖に付着した、即ち、リボース、リン酸エステルなどを介して、メタロセンを有する核酸から識別される。即ち、伝統的な核酸または類似体から造られた２つの核酸（この場合の核酸は単一のヌクレオシドを包含する）それぞれは、メタロセンを介して互いに共有結合により付着することができる。異なる観点で、メタロセン誘導体または置換メタロセンが提供されるが、その場合は、メタロセンの２つの芳香環それぞれが核酸置換基を有する。
【０２５４】
さらに、より詳しく以下に説明するように、間にヌクレオチドをもつか、および／または隣接するメタロセンをもつ１個より多いメタロセンを主鎖に取込ませることが可能である。隣接するメタロセンを主鎖に付加する場合、これは「メタロセンポリマー」としての下記の工程と同じである；即ち、主鎖内にメタロセンポリマーの領域が存在する。
【０２５５】
核酸置換基に加え、ある場合には、メタロセン（またはＥＴＭ）の芳香環の一方または双方にさらなる置換基を付加することが望ましい。例えば、これらのヌクレオシド置換体は一般に実質的に相補的な核酸、例えば、標的配列またはもう一つのプローブ配列とハイブリダイズすべきプローブ配列の部分なので、置換基をメタロセン環に付加して、反対鎖上の１個または複数個の塩基に水素結合形成するのを容易にすることが可能である。これらはメタロセン環上のどの位置に付加してもよい。適切な置換基は、アミド基、アミン基、カルボン酸、および置換アルコールを含むアルコール類であるが、これらに限定されるものではない。さらに、これらの置換基は同様にリンカーを介して付着させることができるが、一般的には好ましくない。
【０２５６】
さらに、ＥＴＭ、特にフェロセンなどのメタロセン上に置換基を付加してＥＴＭのレドックス性を変化させてもよい。このように、例えばある実施態様では、より詳しく以下に記載するように、異なる様式で（即ち、塩基またはリボース付着）、異なるプローブ上、または異なる目的で（例えば、目盛または内部基準として）付着した異なるＥＴＭを有することが望ましい。このように、メタロセン上に置換基を付加することは、２つの異なるＥＴＭの識別を可能とする。
【０２５７】
これらのメタロセン主鎖核酸類似体を生成させるために、中間成分も提供される。このように、好適な実施態様において、本発明は構造３９に一般的に表示するように、ホスホラミダイト・メタロセンを提供する。
【化３９】
2004530860.tif 000041
【０２５８】
構造３９において、ＰＧは保護基であり、一般に核酸の合成に適した基であって、ＤＭＴ、ＭＭＴおよびＴＭＴなどがすべて好適である。芳香環はメタロセンの環であるか、または遷移金属錯体もしくは他の有機ＥＴＭ用配位子の芳香環であることができる。芳香環は同一または異なってもよく、また、本明細書に検討するように置換されていてもよい。
【０２５９】
構造４０はフェロセン誘導体を図示する：
【化４０】
2004530860.tif 000042
【０２６０】
これらのホスホラミダイト類似体は技術上既知の標準的オリゴヌクレオチド合成に追加することができる。
【０２６１】
構造４１はフェロセンペプチド核酸（ＰＮＡ）モノマーを図示し、技術上既知のＰＮＡの合成に追加することができる。
【化４１】
2004530860.tif 000043
構造４１において、ＰＧ保護基はペプチド核酸合成に使用するのに適しており、ＭＭＴ、ｂｏｃ、およびＦｍｏｃなどが好ましい。
【０２６２】
これら同一の中間化合物を用いてＥＴＭまたはメタロセンポリマーを形成することが可能であり、これらは、より詳しく以下に説明するように、主鎖置換体としてよりもむしろ核酸に付加される。
【０２６３】
好適な実施態様において、ＥＴＭはポリマーとして、例えば、メタロセンポリマーとして、本明細書および米国特許番号第５，１２４，２４６号に概説されているように、「分枝したＤＮＡ」実施態様と同様の「分枝した」構成で、修飾した機能化ヌクレオチドを用い付着させる。一般的な着想は以下のとおりである。修飾されたホスホラミダイトヌクレオチドが生成されるが、それはメタロセンなどのホスホラミダイトＥＴＭの付着に使用し得る遊離のヒドロキシ基を最終的に含むことができる。この遊離のヒドロキシ基は塩基またはリボースもしくはリン酸エステルなどの主鎖上に存在し得る（当業者も認識するであろうが、他の構造を含む核酸類似体も使用し得る）。修飾されたヌクレオチドを核酸に取込み、ヒドロキシ保護基を除去し、遊離のヒドロキシを生じる。構造３９および４０において上述したように、メタロセンなどのホスホラミダイトＥＴＭの付加に基づき、メタロセンＥＴＭなどのＥＴＭを付加する。メタロセンなどのさらなるホスホラミダイトＥＴＭを付加し、本明細書で特にフェロセンについて描写したように「メタロセンポリマー」を含む「ＥＴＭポリマー」を形成することができる。さらに、ある実施態様においては、図１２に一般的に描出したように、「キャッピング」基をポリマー中の末端ＥＴＭに、例えば、最終リン酸エステル基をメタロセンに付加することによりポリマーの溶解性を上昇させることが望ましい。他の適切な溶解度上昇性「キャッピング」基は当業者が理解するであろう。留意すべきことは、これらの溶解度上昇性基は、配位子の環（例えば、本明細書で検討したメタロセン）を含む他の位置でポリマーに付加させることができることである。
【０２６４】
好ましい実施態様において（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／６２６，０９６の図に描写されているように）、ホスホラミダイトヌクレオチドのリボースの２’位置を、この場合はオキソ結合を介して保護されたヒドロキシ基を含むようにまず官能化するが、リンカーの数については、Ｚリンカーについて本明細書で一般的に記載するようにいずれの数も使用し得る。保護修飾されたヌクレオチドは、次いで標準的なホスホラミダイトの化学によって、伸長している核酸中に取込む。保護基を除去し、遊離のヒドロキシ基を用い、再び標準的なホスホラミダイトの化学を用い、フェロセンなどのホスホラミダイトメタロセンを付加させる。同様の反応は核酸の類似体についても可能である。例えば、構造４１に示したペプチド核酸とメタロセンモノマーを用い、メタロセンポリマーを含むペプチド核酸構造を生成させることができる。
【０２６５】
このように、本発明は図１２および１３に一般的に図示したように、メタロセンポリマーの「分枝」を含む核酸のリクルートリンカーを提供する。好適な実施態様ではメタロセンの長さが１ないし約５０個、好ましくは約５ないし約２０個、とりわけ好ましくは約５ないし約１０個のメタロセンポリマーを利用する。
【０２６６】
さらに、リクルートリンカーが核酸である場合、任意の組合わせでＥＴＭの付着がなされる。
【０２６７】
好適な実施態様において、リクルートリンカーは核酸ではなく、代りにいかなる種類のリンカーまたはポリマーであってもよい。当業者が理解するように、ＥＴＭを含むように修飾し得る一般的なリンカーまたはポリマーを用いることができる。一般に、ポリマーまたはリンカーは適度に溶解すべきであり、ＥＴＭ付加のための適切な官能基を含むべきである。
【０２６８】
本明細書にて用いる場合、「リクルートポリマー」とは共有結合により付着している少なくとも２または３個のサブユニットを含む。モノマーサブユニットの少なくともある部分はＥＴＭの共有結合による付着のための官能基を含む。ある実施態様において、カップリング部分を、サブユニットとＥＴＭとを共有結合させるために用いる。付着のための好適な官能基は、アミノ基、カルボキシ基、オキソ基およびチオール基などであって、アミノ基が特に好ましい。当業者が理解するように、多様なリクルートポリマーが可能である。
【０２６９】
適切なリンカーとしては、アルキルリンカー（ヘテロアルキル（（ポリ）エチレングリコール型構造を含む）、置換アルキル、アリールアルキルリンカーを含む）を包含するが、これらに限定されるものではない。ポリマーについては上記のごとく、リンカーはＥＴＭ付着のための１個以上の官能基を含み、付着は当業者認識のとおりに、例えば、周知のホモ−またはヘテロ−二官能性リンカーを使用することによって実施される（１９９４ Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ ｃａｔａｌｏｇ， ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｓｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒｓ， ｐａｇｅｓ １５５−２００ 参照。出典明示により本明細書の一部とする）。
【０２７０】
適切なリクルートポリマーは、機能化したスチレン、例えば、アミノスチレン、機能化したデキストラン、およびポリアミノ酸などを包含するが、これらに限定されるものではない。好適なポリマーは、ポリリジンなどのポリアミノ酸（ポリ−Ｄ−アミノ酸およびポリ−Ｌ−アミノ酸両方）、およびリジンと特に好適な他のアミノ酸を含むポリマーなどである。他の適切なポリアミノ酸は、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、リジンとグルタミン酸またはアスパラギン酸との共重合体、リジンとアラニン、チロシン、フェニルアラニン、セリン、トリプトファン、および／またはプロリンとの共重合体などである。
【０２７１】
好適な実施態様において、リクルートリンカーには上記のようにメタロセンポリマーが含まれる。
【０２７２】
標識プローブ第１部分へのリクルートリンカーの付着は、当業者が理解するように、リクルートリンカーの組成に依存する。リクルートリンカーが核酸である場合、付着は、一般に、要求されるＥＴＭ含有ヌクレオシドの取込みとともに、標識プローブの第１部分の合成の際に形成される。あるいは、標識プローブの第１部分とリクルートリンカーが別個に造られ、次いで付着してもよい。例えば、相補性の重なり合う区分があって、例えば、技術的に既知のソラレンを使用することにより、化学的に架橋し得る２本鎖核酸の区分を形成させてもよい。
【０２７３】
非核酸リクルートリンカーを使用する場合、リクルートリンカーのリンカー／ポリマー付着は一般に、当業者が理解するような標準的化学技法を用いて実施される。例えば、アルキル−ベースのリンカーを使用する場合、付着は核酸への絶縁体付着と同様である。
【０２７４】
さらに、核酸と非核酸の混合物であるリクルートリンカーを、線状形態（即ち、核酸セグメントがアルキルリンカーとともに結合している）または分枝形態（ＥＴＭを含み、かつ、さらに分枝していてもよいアルキル「分枝」をもつ核酸）で入手することが可能である。
【０２７５】
好適な実施態様において、ＥＴＭを担持するのは、標識プローブのリクルートリンカーよりもむしろ標的配列それ自体である。例えば、以下により詳しく説明するように、本発明の各ＥＴＭを含むヌクレオチド三リン酸を、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に際し、増殖する核酸に酵素的に加えることが可能である。当業者が認めるであろうように、いくつかの酵素は修飾したヌクレオチドに対し一般に寛容 （ｔｏｌｅｒａｔｅ） であることが示されているが、本発明の修飾ヌクレオチドの一部、例えば、「ヌクレオシド置換」の実施態様および恐らく一部リン酸エステルの付着は、増殖する核酸への取込みを可能とする酵素により認識されることもあり、されないこともある。従って、この実施態様での好適な付着はヌクレオチドの塩基またはリボースに対するものである。
【０２７６】
このように、例えば、当業者周知のように、標的配列のＰＣＲ増幅は、その配列に一般にランダムに取込まれたＥＴＭを含む標的配列を与えることとなる。本発明のシステムは、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／１９０，２５９の図１６Ａ、１６Ｂおよび１６Ｄに一般的に描出したように、これらのＥＴＭを用いて検出可能となるように構成することができる。
【０２７７】
別法として、より詳細に以下に説明するように、ＥＴＭを含むヌクレオチドを核酸の末端、例えば、標的核酸に酵素的に付加することが可能である。この実施態様においては、有効な「リクルートリンカー」を標的配列の末端に付加させ、それを検出に使用することができる。このように、本発明は、伝導性オリゴマーの単層と捕獲プローブを含む電極を利用する構成物、並びにアッセイ複合体の成分にハイブリダイズすることの可能な第１部分、およびアッセイ複合体の成分にハイブリダイズせず、少なくとも１つの共有結合により付着した電子伝達部分を含む第２部分とを含む標的配列を提供する。同様に、これらの組成物を利用する方法も提供する。
【０２７８】
プローブ配列、即ち、相補性配列にハイブリダイズするように設計された配列にＥＴＭを連接させることも可能である。このように、ＥＴＭは非リクルートリンカーにも同様に付加させることができる。例えば、アッセイ複合体の成分にハイブリダイズする標識プローブ断片、例えば、第１部分に、または上記および標的配列に付加したＥＴＭが存在してもよい。これらのＥＴＭは一部の実施態様において電子伝達検出に使用してもよく、あるいはその位置とシステムによっては使用することができない。例えば、ある実施態様において、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／１９０，２５９の図１６Ａに図示したように、無作為に取込ませたＥＴＭを含有する標的配列が捕獲プローブに直接ハイブリダイズする場合には、捕獲プローブにハイブリダイズする部分にＥＴＭが存在する。もし捕獲プローブが伝導性オリゴマーを用いる電極に付着するならば、これらのＥＴＭはすでに説明したように電子伝達を検出するのに使用することができる。あるいは、これらのＥＴＭは特異的に検出し得ない可能性もある。
【０２７９】
同様に、ある実施態様においては、リクルートリンカーが核酸である場合、リクルートリンカーの一部またはすべてが２本鎖であることが、ある例では望ましい。一実施態様においては、第２リクルートリンカーが存在し、それが実質的に第１リクルートリンカーに相補的であり、第１リクルートリンカーにハイブリダイズし得ることがある。好適な実施態様において、第１リクルートリンカーは共有結合により付着したＥＴＭを含む。別の実施態様において、第２リクルートリンカーはＥＴＭを含み、第１リクルートリンカーは含まず、ＥＴＭは第２リクルートリンカーが第１に対してハイブリダイズすることにより表面に集められる。さらにもう一つの実施態様においては、第１および第２リクルートリンカー双方がＥＴＭを含む。留意すべきことは、上記のように、大量数のＥＴＭを含む核酸は、同様にはハイブリダイズしない、即ち、ＥＴＭの付着部位と特性に依存してＴｍが低下することがある。かくして、一般に、多数のＥＴＭが鎖のハイブリダイズに用いられるとき、一般には約５より小さく、好ましくは約３より小さくする。あるいはＥＴＭは、介在するヌクレオチドが充分にハイブリダイズして良好な反応速度が可能となるように十分な空間距離をとるべきである。
【０２８０】
同様に、本発明のシステムは、Ｎａｐｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊ． Ｃｈｅｍ． ８：９０６ （１９９７）（引用して明示的に本明細書の一部とする）で概略説明されているように、共有結合によらずに付着したＥＴＭを用いることができる。本実施形態においては、ＤＮＡが存在する結果（すなわち、ルテニウム錯体によるグアニン酸化）として、特定の分子に関する酸化還元状態の変化を、同様に導電性オリゴマーを含むＳＡＭを用いて、検出することができる。
【０２８１】
したがって本発明は、導電性オリゴマーと、一般に、捕獲プローブとを有し、さらにＥＴＭを含むリクルートリンカーを有する標的配列または標識プローブを有する単層を備えた電極を提供する。本発明のプローブは、標的配列のハイブリダイゼーションおよび本発明のプローブが生じるように、（以下詳述するように、サンプルの標的配列、または他のプローブ配列に対する）標的配列に対して相補的となるように設計されている。以下概説するように、この相補性は完全である必要はない。標的配列と本発明の１本鎖核酸間のハイブリダイゼーションを阻害するような、相当数の塩基対ミスマッチがあってもよい。しかし、もし突然変異の数が多すぎて、ストリンジェンシーが最少のハイブリダイゼーション条件下でもハイブリダイゼーションが起こらないならば、その配列は相補的標的配列ではない。このように、本明細書において「実質的に相補的」とは、プローブが通常の応答条件下でハイブリダイズするために標的配列に十分に相補的であることを意味する。
【０２８２】
一般に、本発明の核酸組成物はオリゴヌクレオチドプローブとして有用である。当業者には明らかなように、プローブの長さは、標的配列の長さおよびハイブリダイゼーションと洗浄条件により変わる。一般に、オリゴヌクレオチドプローブは約８ないし約５０ヌクレオチドの範囲であり、好ましくは約１０ないし約３０であり、特に好ましいのは約１２ないし約２５である。ある場合には、非常に長いプローブ、例えば、５０ないし２００〜３００ヌクレオチドの長さのものを用いてもよい。このように、本明細書に描出した構造において、ヌクレオチドは核酸と置換え得る。
【０２８３】
多様なハイブリダイゼーション条件が本発明において使用し得るが、高度、中程度および低度のストリンジェンシー条件などである；例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９８９， ａｎｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｅｄ． Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ．（出典明示により本明細書の一部とする）参照。ハイブリダイゼーション条件は、当業者には広く知られたように、非イオン性主鎖、すなわちＰＮＡを用いても変わり得る。さらに、標的結合の後にのハイブリダイゼーション複合体の２本鎖を架橋する、すなわち、共有結合により付着させるために、架橋剤を加えてもよい。
【０２８４】
当業者には明らかなように、本発明のシステムは、米国特許出願第０９／６２６，０９６号の図面（次のパラグラフは米国特許出願第０９／６２６，０９６号の図面を参照する。）に一般的に描出したように、多数の異なる配置を取り得る。一般に、使用し得るシステムには３つのタイプがある：（１）標的配列それ自体がＥＴＭで標識されるシステム（図１６Ａ、１６Ｂ、および１６Ｄ参照）；（２）標識プローブが直接に標的配列にハイブリダイズするシステム（図１６Ｃおよび図１６Ｈ参照）；および（３）標識プローブが間接的に標的配列に、例えば、増幅プローブの使用を介してハイブリダイズするシステム（図１６Ｅ、１６Ｆ、および１６Ｇ参照）。
【０２８５】
一般に、ここで概説するすべてのシステムにおいて、核酸および他の標的被検体の両方に関して、本発明は、標的被検体と捕獲結合リガンドを微量含むアッセイ複合体を提供する。核酸標的配列に関し、「アッセイ複合体」とは、核酸を含むハイブリダイゼーション複合体の集合体であって、少なくとも１つの標識（好適には、本発明の電子的な方法におけるＥＴＭ）を含み、検出を可能とするプローブと標的を有する。アッセイ複合体の組成は、ここで概説する異なるプローブの組成の使用に依存する。アッセイ複合体は、ここで開示され、米国特許出願第０９／６２６，０９６号に開示されたように、用いられる構成に依存して、標識プローブ、捕獲伸長プローブ、標識伸長プローブ、および増幅プローブを有していてもよい。
【０２８６】
このアッセイは、標的の存在下にのみ標識プローブハイブリダイゼーション複合体の形成を可能とするストリンジェンシー条件下に一般に実施する。ストリンジェンシーは熱力学的変数である工程パラメータを変えることにより制御し得る。パラメータは温度、ホルムアミド濃度、塩濃度、カオトロピック塩濃度ｐＨ、有機溶媒濃度などであるが、これらに限定されるものではない。
【０２８７】
これらのパラメータは、米国特許第５，６８１，６９７号に一般的に概説されているように、核酸における非特異結合を制御するためにも使用することができる。このように、一定の工程はストリンジェンシーが高い条件で実施するのが望ましい；例えば、最初のハイブリダイゼーション工程が標的配列と標識伸長と捕獲伸長プローブの間で実施される場合である。特定の結合を優先させる条件でこの工程を実施すると、非特異結合を減少させることができる。
【０２８８】
当業者には理解されるように、ここで概説される反応をさまざまな方法で実施することができる。以下の好適な実施形態において、反応組成物を同時に、あるいは任意の順序で加えることができる。さらに、反応は、アッセイに含み得るさまざまな試薬を含んでいてもよい。こうした試薬は、最適化されたハイブリダイゼーションおよび検出を助長し、そして／または非特異反応または背景反応を低減するために用いられ得る塩、緩衝剤、アルブミン等の中性蛋白質、洗剤等を含む。サンプル準備方法および標的純度に依存して、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌性試薬等のアッセイの有効性を改善する試薬を用いることができる。
【０２８９】
したがって本発明は、共有結合により付着した結合リガンド（例えば、捕獲プローブ）を有するバイオチップを提供する。バイオチップは、本発明のカートリッジに組み込まれ、本発明の多重化デバイスのステーション内に取り付けられる。
【０２９０】
好適な実施形態において、バイオチップは、さまざまな手法でカートリッジの残りの部分に取り付けられる。１つの実施形態において、バイオチップは、カートリッジの一部の上に直接取り付けられた後、システム内に組み込まれる。択一的には、ここで概説するように、バイオチップは、カートリッジの残りの部分以外の異なる基板上に形成される場合、２つの基板の組成および形態に依存して用いられるさまざまな固定メカニズムがある。例えば、バイオチップがプリント回路基板材料上に構成される場合、ホールに挿入される「ピン」または「ロッド」を設けて、（例えば、溶剤または熱を用いて）続けて溶融する。同様に、表面−表面間の熱、または溶融溶媒を用いることができる。択一的には、接着剤を用いて、２つを一体に接着させることができる。同様に、ガスケットなどの追加的なシール部材を用いて、これらの技術を利用することができる。択一的には、モールド成型されたスナップデバイスなどのような部品を用いて、バイオチップをカートリッジ内にスナップ嵌合（ｓｎａｐ）させることができる。
【０２９１】
本発明は、装置のステーション内にカートリッジを装填する前に、サンプルを装填するカートリッジのためのホルダを提供する。一般に、当業者には理解されるように、ホルダは、カートリッジおよびキャップ（もしあれば）の構成に依存して、さまざまな手法で構成することができる。標準的な試薬取扱いツールが使用できるように、カートリッジを位置合わせするホルダであることが好ましい。図面を参照すると、９６ウェル形式の複数チャンネルのピペットまたはロボットシステムを使用可能にするホルダであることが好ましい。このホルダは、使用しやすい位置に配置されたキャップ、試薬、および／または緩衝成分を有していてもよい。一般に、ホルダは、アッセイで用いられる化学物質および試薬に対して耐性を有する材料で構成されることが好ましい。
【０２９２】
本発明のカートリッジは、多重化デバイスのステーション内に挿入されるように設計されている。当業者には理解されるように、また以下に説明するように、本発明のデバイスは、所望する構成成分、エンドユース、および装置の所望する最終的な寸法に依存して、さまざまな形態を取り得る。
【０２９３】
各多重化デバイスは、カートリッジが挿入される数多くの異なるステーションを有する。カートリッジ／ステーションの対は、「スナップ式（ｓｎａｐ−ｉｎ）」固定手法を用い、さらにカートリッジだけが、異なる寸法のカートリッジに対する異なる寸法のステーションを特定の方向において装置内に嵌合して、非対称となるように広範な手法で構成することができる。この実施形態は、カートリッジの存在の有無を検出し、カートリッジが正しく配置されているかどうかを検出する電気的なセンサを有する。
【０２９４】
一般に、装置当たりのステーションの数は、所望の用途により変化する。好適な実施形態においては、少なくとも２つまたは３つのステーションを有し、好適には少なくとも５ないし１００個、より好適には２５ないし５０個、とりわけ好適には４８個のステーションを有する。一般に、この装置は、行と列を含むマトリクス状にレイアウトされている。
【０２９５】
ここで概説するように、各ステーションは、これに限定するわけではないが、電気部品間の電気配線、温度コントローラ、発信システム、リーク検出センサ、英数字表示ディスプレイ、および検出器を含む異なる機能部品を有することができる。
【０２９６】
好適な実施形態において、カートリッジが検出のための電極に基づくバイオチップを有する場合、バイオチップと装置の間の電気的通信を可能にするバイオチップのための接続配線を有する。
【０２９７】
好適な実施形態において、各ステーションは個別の温度コントローラを有する。この文脈における「熱コントローラ」または「温度コントローラ」は、カートリッジおよびその内部のサンプルを加熱し、冷却できる構成部品を有する。一般に、装置の寸法および機能に対して、小型で速い温度コントローラを用いることが好ましい。ペルティエ装置を含む、広く知られた適当な温度コントローラが数多くある。
【０２９８】
一般に、温度コントローラは、０．０１℃／秒ないし１０℃／秒の範囲の速さで、０℃から約１００℃まで加熱／または冷却する能力を有する必要がある。
【０２９９】
アッセイ後、温度コントローラを用いて、カートリッジ内の生物学的物質を破壊できることに留意する必要がある。すなわち、ヘルスケアの作業者および研究所の従業員が潜在的に危険なサンプルに曝されることを極力避け、これらの物質を処分しやすくすることがしばしば好ましい。サンプルを死滅または破壊するために、温度コントローラを用いて、所定時間、使用済みのサンプルを極めて高い温度に加熱することができる。さらに、他の一般的な苛酷な試薬（強酸、強塩基等）を加えて加熱することも可能である。さらなる実施形態において、流体を除去した後、すべての生物学的物質を死滅させるために、ＲＦアンテナを用いて、プラズマを形成し、これをチャンバ内に注入することができる。
【０３００】
１つの実施形態においては、各ステーションが個別の温度コントローラを有するのではなく、（例えば、列または行などの）一連の組が温度コントローラを共有する。択一的な実施形態においては、この多重化デバイスが単一の温度コントローラを有する。
【０３０１】
好適な実施形態において、本発明の装置は「スタットスロット（Ｓｔａｔ Ｓｌｏｔ）」を有し、連続的に実施するのではなくて、カートリッジを１つのステーション内に挿入し、すぐさま読み取ることができる。一般に、このステーションにおける温度は事前設定することができる。
【０３０２】
好適な実施形態において、この装置のステーションは、発信システムを有する。例えば、光、とりわけ有色光システムを各ステーションにて用い、カートリッジまたはアッセイの状態、カートリッジの有無、アッセイの進捗状況、エラー、アッセイの完了などを示唆することができる。さらに、色による構造は、（特に色盲の人にとって）コードともなり得、２色の光によりカートリッジが入っていることを示し、点滅する光によりアッセイが完了したことを示す。同様に、このような発信システムは、各ステーションにあってもよいし、ステーションの組に配置されてもよい。
【０３０３】
好適な実施形態において、本発明の装置は、データまたは他の情報を表示できるような英数表示ディスプレイを有する。例えば、このディスプレイを、以下説明するバーコードリーダとともに用いて、カートリッジが挿入されたこと（ＨＩＶパネル、ＨＣＶパネル、感染病パネル、胸部癌ＳＮＰパネルなど）、またはカートリッジに関する他のデータ（ロット数またはバッチ数など）をオペレータに表示することができる。加えて、ディスプレイを用いて、テスト結果などをオペレータに表示することができる。この信号システムに関して、ディスプレイは、各ステーションにあってもよいし、ステーションの一連の組、あるいは装置全体にディスプレイを設けてもよい。
【０３０４】
好適な実施形態において、バイオチップ上で電気泳動または誘電泳動を可能にするように、装置の各ステーションを構成することができる。すなわち、ここに一体のものとして統合される国際特許公報ＷＯ９９／６７４２５号および米国特許出願第０９／１７１，９８１号に開示されているように、被検体をアレイの表面に凝集させ、そして／または移動させることを可能にする追加的な電極または電気的な構成部品を設けることができる。
【０３０５】
同様に、国際特許公報ＷＯ９９／６７４２５号および米国特許出願第０９／１７１，９８１号に開示されるように、電気泳動電極または誘電泳動電極をバイオチップ上に設けることができる。
【０３０６】
好適な実施形態においては、この装置（あるいは各ステーション）は、カートリッジ上に対応するバーコードを読み取るためのバーコードリーダを有する。これらのバーコードは、これらに限定するわけではないが、サンプル（例えば、患者番号または患者コード）、実施されるテスト、チップのバッチ番号、較正情報、周期時間を含むアッセイプロトコル、信号処理条件などを特定するさまざまな目的に利用することができる。
【０３０７】
加えて、このバーコードを用いて、装置を制御することができる。例えば、キーボード、マウス、またはバーコードリーダを用いて、装置を制御できる。したがって、例えば、カートリッジ上にバーコードを設けてチップを特定するだけでなく、カード上にバーコードを設けてアッセイを開始し、アッセイを停止し、データをダウンロードすることができる。好適な実施形態において、バーコード指令のカードは、ここで概説するように、装置の引き出しの中にある。
【０３０８】
好適な実施形態において、各ステーションはメモリチップリーダを有する。この実施形態においても同様に、各カートリッジは、サンプル情報（例えば、患者番号または患者コード、実施されるテスト、チップのバッチ番号、較正情報、アッセイプロトコル等）、またはユーザインターフェイスによる表示内容（例えば、番号ではなく「ＨＩＶ陽性」として）を有するメモリチップを有する。
【０３０９】
好適な実施形態において、各ステーションは、どのようなテストが実施されたか、日付、その結果などをカートリッジへ情報を書き込むためのメモリチップライタを有する。
【０３１０】
好適な実施形態において、各ステーションは、患者情報を暗号化するために、カートリッジに関連して暗号化部品を有する。すなわち、とりわけ雇用および保険の問題に関して、患者情報の秘密保持に関する関心が高まっている。こうして例えば、いくつかの実施形態において、本発明の装置によれば、テスト結果がオペレータにより知られないようにしている。テストが適正に実施され、現実的な反応があったことの確認が出力され、行われた実際のテスト内容およびその結果については何ら出力されない。患者情報に加えて、テスト結果自体は、暗号化されて、以下説明するように処理、複合化、または記録されるために遠く離れた場所に送信される。
【０３１１】
好適な実施形態において、この装置は、試薬、カートリッジ、キャップ、ホルダ、ピペットなどを保管できるような引き出しまたは貯蔵コンパートメントを有していてもよい。
【０３１２】
好適な実施形態において、例えば、アッセイで蛍光染料を用いた場合、蛍光リーダが用いられる。１つの実施形態において、この装置は、各ステーションにおいてリーダを有する。択一的には、好適な実施形態においては、この装置は、リーダを移動させるか、装置内においてステーションを単一のリーダまで移動させることにより、移動させる単一のリーダを有する。こうして、いくつかの実施形態において、ステーション、カートリッジ、またはリーダを移動できるように、モータ、プーリ、コードなどが設けてある。
【０３１３】
好適な実施形態において、本発明の装置は、各ステーションまたはステーションの組において流体を供給、排出するするための構成部品を含む液体処理部品を有する。液体処理システムは、任意の数の構成部品からなるロボットシステムを有していてもよい。さらに、概説される任意の工程、またはすべての工程は、自動化されていてもよく、例えば、このシステムは完全に、または部分的に自動化されている。
【０３１４】
当業者ならば理解されるように、さまざまな構成部品が利用され、これらに限定するわけではないが、１つまたはそれ以上のロボットアーム、マイクロプレートを配置するためのプレートハンドラ、カートリッジおよびまたはキャップを有するホルダ、非交差汚染プレート上のウェルに対する蓋を移動させ、置換するための自動化された蓋またはキャップハンドラ、処分可能な先端部を有し、サンプルを分配するための先端アセンブリ、サンプルを分配するための洗浄可能な先端アセンブリ、９６ウェル供給ブロック、冷却された試薬ラック、マイクロリッタ・プレート・ピペット位置（随時冷却される）、プレートおよび先端部のためのスタックタワー、およびコンピュータシステムを有する。
【０３１５】
完全にロボット化された、あるいは微小流体システムは、液体、粒子、細胞を自動的に処理するステップを有し、スクリーニングへの用途に関するすべてのステップを実行するために、処理量の高いピペット処理を含む。これは、液体、粒子、細胞、および組織に対して、吸引、調剤、混合、希釈、洗浄、正確な用量の移送、回収、ピペット先端部の処分、１回の吸引から同一用量を多数回供給する反復的なピペット処理等の操作を含む。これらの操作は、交差した汚染されない液体、粒子、細胞、および組織の移送である。この装置は、マイクロプレートのサンプルをフィルタ、メンブレン、および／または娘プレートへの自動的な複製、高密度移送、プレート全体の連続的希釈、および大容量動作を行う。
【０３１６】
好適な実施形態において、化学的に派生させた粒子、プレート、カートリッジ、試験管、磁性粒子、または他のアッセイ成分に特化させた固相基質が用いられる。マイクロプレート、試験管、または任意の固相基質の結合表面は、極性を持たない表面、高い極性を有する表面、共有結合を助長するための変性デキストラン被膜、抗体被膜、溶融蛋白質またはペプチドを結合するための親和媒体、組換え型の蛋白質ＡまたはＧ等の表面固定蛋白質、ヌクレオチド樹脂または被膜、および他の親和基質が有用である。
【０３１７】
好適な実施形態において、マルチウェルプレート、マルチ試験管、ホルダ、カートリッジ、小型試験管、ウェルの深いプレート、マイクロヒュージ、クリオビアル（ｃｒｙｏｖｉａｌ）、正方形ウェルプレート、フィルタ、チップ、光ファイバ、ビーズ、およびさまざまな用量を有する他の固相基質またはプラットフォームが、機能を追加するために、アップグレード可能なモジュラプラットフォームに搭載されている。このモジュラプラットフォームは、速度可変の軌道攪拌器、ソースサンプルのための複数位置の作業デッキ、サンプルおよび試薬の希釈アッセイプレート、サンプルおよび試薬の貯蔵器、ピペット先端部、および能動的洗浄ステーションを有する。
【０３１８】
好適な実施形態において、温度サイクル装置および温度制御システムを用いて、制御されたブロックまたはプラットフォームなどの熱交換器の温度を安定させて、サンプルを４℃から１００℃までの間で正確に保温する温度制御器を設ける。すなわち、これが温度コントローラステーションに追加されるか、あるいはこれに代用される。
【０３１９】
好適な実施形態において、単一または複数の磁石プローブを有する交換可能なピペットヘッド（単一または複数チャンネル）、親和プローブ、またはピペットが、液体、粒子、細胞、および組織をロボット操作する。複数ウェルまたは複数チューブの磁石セパレータのまたはプラットフォームが、液体、粒子、細胞、および組織を、単一または複数のサンプル形態で操作する。
【０３２０】
いくつかの実施形態において、例えば、電気的な検出が実施されない場合、この装置は、標識およびアッセイに依存して、大きく異なり得る検出器を有する。好適な実施形態において、有用な検出器は、蛍光発光する複数チャンネルを有する顕微鏡、蛍光を発するプレートリーダ、単一および二重の波長終点および運動性能、蛍光共鳴エネルギ転移（ＦＲＥＴ）、発光、消光、２光子励起、および強度再分布を用いた紫外線および可視光の分光光度検出器、定量化可能なフォーマットにデータを取り込み、転送するＣＣＤカメラ、およびコンピュータワークステーションを備える。
【０３２１】
これらの装置は、マルチウェルプレートまたはチューブ内における細胞培養成長および変換のために、そして危険な処理を行うために、滅菌した層流または喚起フード内に取り付けられ、あるいは包囲された組込み式のシステムである。生細胞のアッセイの時系列において、温度、湿度、およびガスを制御した状態で制御された成長条件下で生細胞を成長させる。細胞の自動化された形質変換および自動化されたコロニ選別器を用いると、所望する細胞のスクリーニングが助長される。
【０３２２】
フロー血球計算またはキャピラリ電気泳動フォーマットを用いて、磁性体および他のビーズ、粒子、細胞、および組織を個別に捕獲することができる。
【０３２３】
柔軟なハードウェアおよびソフトウェアによれば、複数の用途に対する装置の汎用性を可能にする。ソフトウェアプログラムモジュールによれば、方法の形成、修正、および実行を可能にする。このシステム診断モジュールは、装置の位置合わせ、正確な接続、およびモータ動作を可能にする。カスタマイズされたツール、実験器具、および液体、粒子、細胞、および組織の移送パターンにより、異なる用途を可能にする。データベースにより、方法およびパラメータを記憶できる。ロボットを用いた、そしてコンピュータインターフェイスにより、装置間の通信を可能にする。
【０３２４】
好適な実施形態において、ロボットを用いた装置は、メモリおよび一連の入力／出力デバイス（例えば、キーボード、マウス、モニタ、プリンタなど）と通信可能な中央演算ユニットを有する。同様に、概略したように、これは、本発明の多重化デバイスのためのＣＰＵに加え、あるいはそのＣＰＵに代えることができる。中央演算ユニット、メモリ、入力／出力デバイス、およびバスの間の一般的な相互通信は、同業界に知られたものである。こうして、実行すべき実験に応じた数多くの異なる処理をＣＰＵメモリ内に記録することができる。
【０３２５】
これらのロボットを用いた流体処理システムは、緩衝剤、試薬、サンプル、洗液、標識プローブなどのアッセイ成分を含む数多くの異なる試薬を利用することができる。
【０３２６】
好適な実施形態において、本発明のデバイスは、漏れ検出センサを有する。これらには一般に２つの種類がある。すなわち、電気抵抗を測定するか、光学的または検出可能なタグのスパイクを測定するかどちらかである。このことは、危険物質または腐食性化学物質を検査する場合など、いくつかの実施形態において、極めて重要なことである。
【０３２７】
好適な実施形態において、本発明のデバイスは、上述したように、信号処理、デジタル的な適合、論理回路の構成などのさまざまな分析を実行するために用いることができるデバイス基板を有する。
【０３２８】
好適な実施形態において、本発明のシステムはプロセッサ（ＣＰＵ）を有する。これは、装置自体の内部に物理的に収容されるか、ケーブルを介して接続できるか、あるいは無線技術を用いて接続することができる。デバイスあたりに１つまたはそれ以上ある。
【０３２９】
好適な実施形態において、本発明のデバイスは、当業者に広く知られた地球位置システム（グローバル・ポジショニング・システム：ＧＰＳ）等の位置特定デバイスを有する。これにより、農業、生物戦争、問題症状の遠隔診断における特定の用途において用いることができる。
【０３３０】
好適な実施形態において、本発明のデバイスは、データ、アッセイ結果、患者情報などをデバイスから遠く離れた現場に通信するための構成部品を有する。つまり、例えば、１つまたはそれ以上のモデム（電話モデムまたはケーブルモデムを含む）、インターネットカード等がデバイス内に収納され、これにより、データおよび他の関連情報（バーコード情報、アッセイの条件およびプロトコル、オペレータの同定、タイムスタンプ）が、一般的な情報格納場所、病院、開業医の事務所、疫学センタ、薬局、政府センタ、保険プロバイダ等の遠く離れた現場と通信可能になる。
【０３３１】
好適な実施形態において、本発明のデバイスは、物理的または電気的な通信接続が存在しなくとも、このデータ通信を可能にする無線通信用の構成部品を有する。さらに、無線受信器を収容していてもよい。
【０３３２】
したがって、本発明は、サンプルおよび標的被検体の多重分析を行うための方法と構成を提供する。（未処理サンプルまたは（例えば、増幅または純化された）処理済みサンプルのいずれかの）サンプルが、本発明のカートリッジ内に格納され、任意のキャップを装着し、カートリッジがデバイスのステーション内に装填される。追加的な試薬が必要に応じて加えられ、アッセイ複合体が形成される。
【０３３３】
標的配列および標識プローブを最低限有する本発明のアッセイ複合体が形成されると、電気的起動を伴って検出が処理される。メカニズムまたは理論により制限されることなく、電子がＥＴＭから電極へ移動することに起因して、検出が行われる。
【０３３４】
電子の移動の検出、すなわちＥＴＭの存在は、一般に、好適な電圧を用いて起動される。電位がアッセイ複合体に印加される。印加される電圧の正確な制御および変更は、電位安定装置を介した、３電極システム（１つの電極が基準電極で、１つの電極がサンプル（または動作）電極で、１つの電極がカウンタ電極である）、または２電極システム（１つの電極がサンプル（または動作）電極で、１つの電極がカウンタ電極である）である。これにより、印加される電位を、ＥＴＭの選択に部分的に依存し、他のシステム構成部品、単層の組成および純度、および用いられる基準電極の種類に部分的に依存するシステムのピーク電位に、合致させることができる。ここで概説するように、フェロセンが好適なＥＴＭである。いくつかの実施形態においては、参考として明確に取り込まれる国際特許公報ＷＯ／１６０８９号に開示されているように、共同還元剤または共同酸化剤が用いられる。
【０３３５】
単層の表面におけるＥＴＭの存在は、数多くの方法で検出することができる。さまざまな検出方法を用いることができるが、これに限定されるわけではないが、蛍光、燐光、ルミネセンス、化学ルミネセンス、電気化学ルミネセンス、および屈折率を含む（酸化還元状態におけるスペクトル変化の結果としての）光学的検出方法、およびこれに限定されるわけではないが、電流測定法、電圧測定法、静電容量、およびインピーダンスを含む電気的検出方法がある。これらの方法は、ＡＣまたはＤＣ電流に基づく時間または周波数に依存する方法、パルス方法、適合技術、フィルタ処理技術（ハイパス、ローパス、バンドパス）、および時分割蛍光を含む時分割技術を含む。
【０３３６】
１つの実施形態において、電子がＥＴＭから電極へ効率よく移動することにより、ＥＴＭの酸化還元状態における典型的な変化が生じる。ＥＴＭがピリジンおよびイミダゾールリングを含むルテニウム複合体を有するとき、酸化還元状態におけるこれらの変化は、スペクトル特性における変化と関連している。これらの分子の還元状態および酸化状態で、吸光度における重大な差異が観測される。例えば、ＦａｂｂｒｉｚｚｉらのＣｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｒｅｖ． １９９５ ｐｐ １９７−２０２を参照されたい。これらの差異は、分光光度計または単純な光電子増倍管デバイスを用いて、モニタすることができる。
【０３３７】
この実施形態において、可能性のある電子のドナーおよびアクセプタは、光活性または起動に関して上記にリストされたすべての誘導体を含む。好適な電子ドナーおよびアクセプタは、酸化還元に基づいて特性上の大きなスペクトル変化を有するため、電子の移動を極めて感度よくモニタできる。こうした具体例は、好適な具体例としてＲｕ（ＮＨ３）４ｐｙおよびＲｕ（ｂｐｙ）２ｉｍを含む。吸光によりモニタされるドナーおよびアクセプタだけが、理想的なスペクトル特性を有する必要があることを理解すべきである。
【０３３８】
好適な実施形態において、電子の移動は蛍光測定法により検出される。ルテニウム複合体を含む数多くの遷移金属複合体が、際立った蛍光特性を有する。したがって、核酸に付着する電子ドナーおよび電子アクセプタの酸化還元状態における変化は、例えば、Ｒｕ（４，７−２ビフェニル−フェナントロリン）３２＋を用いて、蛍光により極めて感度よくモニタすることができる。この化合物の生成は、標準的な蛍光アッセイ技術を用いて、容易に測定することができる。レーザで励起された蛍光は、例えば、標準的な単細胞蛍光計、（クロマトグラフィシステムに取り付けられた蛍光計のような）フロースルー式「オンライン」蛍光計、または９６ウェル免疫アッセイ用に市販されるものと同様の多重サンプル「プレート・リーダ」に記録される。
【０３３９】
択一的には、溶液内の核酸プローブを含む光ファイバセンサ、または光ファイバに固定された光ファイバセンサを用いて、蛍光を測定することができる。このシステムの利点は、極めて少量のサンプルをアッセイすることができる点にある。
【０３４０】
加えて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓから市販されているＦｌｕｏｌｍａｇｅｒ等の走査蛍光検出体が、固体表面に配列した変性核酸分子の蛍光をモニタする上で理想的に適している。このシステムの利点は、数千もの異なる核酸プローブでカバーされたチップを用いて、数多くの電子移動プローブを１度に走査できる点にある。
【０３４１】
数多くの遷移金属複合体が、ストークスのシフト移動を含む蛍光を示す。適当な具体例は、ルテニウムなどの遷移金属の２または３−フェナントロリン複合体、２または３−ピリジル複合体を含む。（Ｊｕｒｉｓ， Ａ．， Ｂａｌｚａｎｉ， Ｖ．， らのＣｏｏｒｄ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．， Ｖ． ８４， ｐ．８５−２７７， １９８８を参照されたい。）好適な具体例は、低い再編成エネルギと同様、（相当に高い量子が生成され）有効な蛍光を示す。これらは、Ｒｕ（４，７−２ビフェニル−フェナントロリン）３２＋、Ｒｕ（４，４’ジフェニル−２，２’バイピリジン）３２＋、およびプラチナ複合体を含む。（ＣｕｍｍｉｎｇｓらのＪ． Ａｍ Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１８： １９４９−１９６０（１９９６）を参照されたい。）択一的には、これらのシステムを用いて、ハイブリダイゼーションに関連する蛍光の減少を測定することができる。
【０３４２】
さらなる実施形態において、電気化学的ルミネッセンスを電子移動の検出の根拠として用いることができる。Ｒｕ２＋（ｂｐｙ）３等のいくつかのＥＴＭにおいて、励起状態からの減衰を伴って、直接的なルミネッセンスが生じる。この特性上の変化は、核酸ハイブリダイゼーションに関連し、単純な光電子増倍管装置を用いてモニタすることができる。（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ， Ｇ． Ｆ． Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ３７： １５３４−１５３９ （１９９１）、および前掲のＪｕｒｉｓらを参照されたい。）
【０３４３】
好適な実施形態において、電流測定法、電圧測定法、静電容量、およびインピーダンスを含む電気的検出法が用いられる。適当な技術は、これに限定されるわけではないが、電気重量測定法、（制御電位電量分析法および定電流電量分析法を含む）電量分析法、（周期電圧測定法、および（通常パルス電圧測定法、矩形波電圧測定法、微分パルス電圧測定法、Ｏｓｔｅｒｙｏｕｎｇ矩形波電圧測定法、静電気バルス技術の）パルス電圧測定法を含む）電圧測定法、ストリッピング分析（アノード・ストリッピング分析、カソード・ストリッピング分析、および矩形波ストリッピング分析電圧測定法）、静電容量測定法、電動度測定（電解質電導度、直接的分析）、時間依存性の電気化学的分析法（クロノ電流測定法、クロノ電圧測定法、周期性クロノ電圧および電流測定法、ＡＣポログラフィ（ｐｏｌｏｇｒａｐｈｙ）、クロノ検流法、およびクロノ電量分析法）、ＡＣインピーダンス測定法、静電容量測定法、ＡＣ電圧測定法、および光電気化学法がある。
【０３４４】
好適な実施形態においては、電流検出を介して、電子の移動をモニタする。この検出方法は、問題とする標的遺伝子を含むサンプル内にある、核酸と結合した電極と基準（カウンタ）電極の間に、（個別の基準電極と比較した）電位を印加するステップを有する。効果が異なる電子移動は、標的核酸がサンプル内にあるかどうかにより誘発される。すなわち、標的核酸および標識プローブの有無により、電流値が変化する。
【０３４５】
電流測定法により電子移動を測定するデバイスは、高感度の電流測定検出し、通常、電位安定装置である電圧電位を制御する手段を有する。この電圧は、標識プローブの電子優勢複合体の電位を基準として最適化される。可能性のある電子優勢複合体は、好ましくは、上述した、鉄、オスミウム、プラチナ、コバルト、レニウムの複合体で、最も好適には、鉄の複合体である。
【０３４６】
好適な実施形態において、択一的な電子検出モードが利用される。例えば、電位測定法（電圧測定法）による測定は、非誘導電流（正味の電流が全く流れない）プロセスを含み、ｐＨまたは他の検出器において伝統的に用いられていた。同様のセンサを用いて、ＥＴＭおよび電極の間の電子移動がモニタされる。加えて、他の（抵抗などの）絶縁特性、および（導電性、インピーダンス、および静電容量）の導電特性を用いて、ＥＴＭおよび電極の間の電子移動をモニタすることができる。最後に、（電子移動等の）電流を生成する任意のシステムは、微小磁場を形成し、いくつかの実施形態においては、これをモニタすることができる。
【０３４７】
本発明の構成において確認される高速の電子移動に関する１つの利点は、光吸収、蛍光、および電流に基づいてモニタした信号／ノイズ比を大幅に改善することができる点にある。本発明の電子移動の高速性により、高い信号、および電子移動の開始から完了までの典型的な遅延が生じる。電子移動をパルス的な起動、検出のための「適合」増幅器、およびフーリエ変換を用いるなどして、特定の遅延を増幅する。
【０３４８】
好適な実施形態において、電子移動は交流（ＡＣ）法を用いて起動される。理論に拘束されることなく、電極に固定したＥＴＭは、一般に、抵抗およびコンデンサを含む回路に印加されるＡＣ電圧に同様に応答する。
【０３４９】
信号を増長し、ノイズを低減し、あるいは信号をより明瞭に、またはノイズのバックグラウンドにおいて信号を検出可能にするために用いられるさまざまな技術がある。すなわち、バックグラウンドノイズにおいて信号をより良好に特定するように機能する任意の技術を、本発明において用いることが可能である。これらの技術は、一般に３つの方法に分類することができる。すなわち（１）起動信号を印加する種別または方法における変形（すなわち、同じ信号を最大化または特定するための「入力」を変形させること）、（２）データ処理、すなわち、同じ信号を最大化または特定するために「出力」信号に対して用いられる技術、（３）アッセイ自体の変形、すなわち電極表面、またはサンプル信号をより良好に特定可能にするためのシステムの構成部品に対する変形である。すなわち、例えば、適当な「入力」ＡＣ法は、これに限定するわけではないが、複数の周波数を用いること、ＡＣ振幅を増大させること、矩形波ＡＣＶの利用、特定の複雑な波形の利用等を含む。同様に、適当な「ＡＣ」技術は、これに限定するわけではないが、より高次の倍音周波数のモニタ技術、位相分析または位相フィルタ技術、バックグラウンド減算技術（これに限定するわけではないが、インピーダンス解析、信号認識技術またはピーク認識技術の利用）、デジタルフィルタ技術、バンド幅狭小化技術（はめ込み検出スキーム、特にデジタル式はめ込み技術）、高速フーリエ変換（ＦＥＴ）法、補正技術および／またはたたみ込み技術、信号平均化技術、スペクトル分析技術などを含む。追加的にアッセイの組成を変化させることにより、サンプル信号とノイズ信号を非平行関係で変化させることができる。すなわち、２つの信号が互いに対して非線形に応答する。これらの技術は、国際特許公報ＷＯ００／１６０８９号、およびＯ’ＣｏｎｎｏｒらのＪ． Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ４６２ （２）： １９７−２０２ （１９９９）に開示されており、これらは参考として明白に統合される。
【０３５０】
一般に、不特定に固定された標識プローブ／ＥＴＭは、ＥＴＭを含む標識プローブが正確な方向に特定して固定された場合と比べて、異なるインピーダンス（つまり高いインピーダンス）を示す。ＡＣ検出法によれば、一般に上述したように、感度が向上すること、バックグラウンドノイズを「フィルタ除去」できることを含め、いくつかの利点がある。とりわけ、ＥＴＭを含むプローブの不特定の固定と、標的に特定したアッセイ複合体の形成の間でのインピーダンス（例えば、バルクインピーダンス）における変化をモニタすることができる。
【０３５１】
したがって、ＡＣ起動および検出方法を用いる場合、システムの周波数の応答性は、ＥＴＭの存在により変化する。ここで「周波数の応答性」とは、電極とＥＴＭの間で電子が移動した結果生じる信号変形を意味する。この変形は、信号周波数に依存して異なる。周波数の応答性は、１つまたはそれ以上の周波数におけるＡＣ電流、位相シフト、ＤＣオフセット電圧、誘導電流インピーダンスなどを含む。
【０３５２】
標的配列および標識プローブを含むアッセイ複合体が形成されると、電極とＥＴＭの間の電子移動を起動するために、少なくともサンプル電極（本発明の複合体を含む）およびカウンタ電極を介して、第１の入力電気信号がシステムに供給される。同様に、基準電極および動作電極に電圧を印加して、３電極システムを用いることができる。第１の入力信号は、少なくともＡＣ成分を有する。このＡＣ成分は、変動可能な振幅と周波数を有することができる。一般に、本発明の方法を用いるとき、ＡＣ振幅の範囲は約１ｍＶないし約１．１Ｖで、好適には、約１０ｍＶないし約８００ｍＶで、とりわけ好適には、１０ｍＶないし約５００ｍＶである。ＡＣ周波数の範囲は、約０．０１Ｈｚないし約１００ＭＨｚで、好適には、約１０Ｈｚないし約１０ＭＨｚで、とりわけ好適には、約１００Ｈｚないし約２０ＭＨｚである。
【０３５３】
ＡＣ信号およびＤＣ信号を組み合わせて用いると、驚くべき感度および信号の最大化を含む、さまざまな利点が得られる。
【０３５４】
好適な実施形態において、第１の入力信号は、ＤＣ成分およびＡＣ成分である。すなわち、動作電極とカウンタ電極との間のＤＣオフセット電圧は、ＥＴＭの電気化学的電位により掃引される。（例えば、フェロセンが用いられた場合、掃引は、一般に、０から５００ｍＶである）（択一的には、動作電極は接地され、カウンタ電極は０ないし５００ｍＶに掃引される。）。掃引を用いて、システムの最大応答が確認されるＤＣ電圧を特定することができる。これは、一般に、あるいはおよそＥＴＭの電気化学的電位である。この電圧が決まると、掃引または均一なＤＣオフセット電圧のいずれかを用いることができる。ＤＣオフセット電圧は、好適には、約−１．１Ｖないし約１．１Ｖで、より好適には、約−５００ｍＶないし約＋８００ｍＶで、さらにより好適には約−３００ｍＶないし約＋５００ｍＶである。好適な実施形態において、ＤＣオフセット電圧はゼロではない。最大のＤＣオフセット電圧において、変動可能な振幅および周波数のＡＣ信号成分が適用される。ＥＴＭが存在して、ＡＣの動揺に呼応し得るならば、ＡＣ電流は、電極とＥＴＭの間の電子移動により形成される。
【０３５５】
したがって本発明のデバイスは、好適には、ＡＣおよびＤＣ電流の両方を供給できる電源を提供する。
【０３５６】
定義されたシステムにおいて、ＥＴＭ（標的配列の存在）の有無を区別するための入力信号を印加することが十分である。択一的には、複数の入力信号が印加される。ここで開示されるように、複数の周波数、複数のＤＣオフセット電圧、または複数のＡＣ振幅、またはこれらの任意のすべての組み合わせを用いることを含み、さまざまな形態を取ることができる。
【０３５７】
こうして、好適な実施形態において、複数のＤＣオフセット電圧が用いられた場合、概説したけれども、ＤＣ電圧の掃引が好ましい。これは、単一の周波数、２つまたはそれ以上の周波数で実施することができる。
【０３５８】
好適な実施形態においては、ＡＣ周波数が変化する。異なる周波数において、異なる分子が異なる方法で応答する。当業者には理解されるように、周波数を増大させることは、一般に、出力電流を増大させることである。しかし周波数は、電子が電極とＥＴＭの間を移動できる速度より大きいとき、より高い周波数は、出力信号の損失または減少を招く。いつかのポイントにおいて、周波数は、ＥＴＭと電極の間の電子移動の速度より大きくなり、出力信号は減少する。
【０３５９】
好適な実施形態において、微小なＡＣ電圧を含む複数の周波数が印加され、それぞれの基本振動数が評価される。択一的に、好適な実施形態では、大きいＡＣＶを有するいくつかの周波数が用いられる。同様に、好適な実施形態では、大きいＡＣＶを有するいくつかの周波数が用いられ、このときシステムに対する異なる周波数の効果は、個々の周波数における出力の合計とは異なる合計となり得る。
【０３６０】
１つの実施形態において、検出に際して、単一の周波数における出力信号の測定が用いられる。すなわち、標的配列が存在せず、ＥＴＭを含む標識プローブが存在しないときのシステムの周波数応答が、特定の高い周波数において、極めて小さくなるように事前に設定できる。この情報を用いると、特定の周波数における任意の応答が、アッセイ複合体の存在を示すことになる。すなわち、特定の周波数における任意の応答が、アッセイ複合体の特徴を示すものとなる。したがって、単一の入力周波数だけが必要となる。周波数応答における任意の変化は、ＥＴＭが存在し、ひいては標的配列が存在することを示唆する。
【０３６１】
好適な実施形態において、入力信号およびデータの処理ステップを行い、システムの非線形性を増大させる。すなわち、例えば、フェロセンは、非線形に応答し、バックグラウンド内の信号の上方にある倍音応答を形成する。ＡＣ電圧測定法からのこの倍音信号により、電気化学的セルの非線形応答による倍音歪みの形成を多分に招く傾向がある。（参考として統合されるＹａｐ， Ｊの Ｅｌｅｃｔｒｏｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍ． ４５４：３３ （１９８８）を参照されたい。）したがって、この非線形性を増大させる任意の技術が好ましい。好適な実施形態において、この技術は、より高次の倍音信号を増大させるために用いられ、したがって、印加された波形の基本周波数と同様に複数の基本周波数（より高次の倍音）の両方において、周波数および位相依存の適合検出が行われる。バックグラウンド静電容量は、ＡＣ信号に対して比較的に線形に応答する（正弦波の入力ＡＣ電圧により、比較的に歪んでいない正弦波の出力が形成される。）。極めて小さいより高次の倍音電流は、バックグラウンド中に形成される。これにより、信号ノイズ比が劇的に増大する。とりわけ（２次ないし１０次以上の倍音を利用することができるが）、３次、４次、および５次の高次の倍音の周波数の検出は、（二層電荷のように）非誘導電流プロセスに関連し、標的分子からの信号を埋没させ得るバックグラウンド電流を劇的に減少させることが確認されている。このように、より高次の倍音周波数および位相においてシステムを評価することにより、検出の限界および信号の明確性において相当に改善することができる。しかし、いくつかの実施形態においては、より高次の倍音による解析は望ましくない。したがって、好適な実施形態において、非線形な倍音の応答性を増大させる方法は、ＡＣ動揺の振幅を増大または変化させることである。ただしこれは、基本周波数をモニタする上でも使用することができる。理論的に拘束されることなく、振幅を増大させることは、駆動力を非線形に増大させるように見える。こうして、一般に、この同じシステムにより、より高い過電圧を用いることにより、任意の単一の信号周波数において改善された応答（すなわち、より高次の出力信号）を得ることができる。したがって、高い周波数で振幅を増大させることができ、システム内の電子移動の速度を増大させ、より大きい感度を与える。さらに、これを用いて、例えば、最適な空間構成を有さないようなシステムなど、より遅いシステムにおける応答を誘導することができる。
【０３６２】
好適な実施形態において、システムの測定は、少なくとも２つの個別の振幅または過電圧において行われ、複数の振幅における測定が好ましい。上述のように、振幅が変化する結果としての応答の変化は、システムの同定、較正、および定量化の基礎を形成することができる。さらに、１つまたはそれ以上のＡＣ周波数を同様に用いることができる。
【０３６３】
好適な実施形態では、倍音矩形波ＡＣＶが用いられる。参考として統合されるＢａｒａｎｓｋｉらのＪ． Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ３７３：１５７ （１９９４）を参照されたい。ただし、いくつかの実施形態においては、これはあまり好適ではない。これはいくつかの潜在的な利点を与える。例えば、矩形波は、デジタル式に形成する上でより容易であり、矩形波のパルス形状は、電荷静電容量に対してより良好な弁別を可能にする。正弦波の倍音ＡＣ電圧測定法において、倍音信号は、誘電電流の応答が電荷静電容量よりも非線形であり得るので、バックグラウンドに対するより良好な信号を提供する。同様の考え方をＳＷ倍音ＡＣＶに適用することができる。２つの技術の鍵となる差異は、ＡＣ波形の周波数スペクトルである。すべての奇数倍の倍音と同様、特異な矩形波が基本周波数を含む場合、特異な周波数の正弦波形は基本周波数を含む。静電電流に対する誘電電流の比が改善された場合、この技術は、偶数倍の倍音を見出す。奇数倍の倍音すべてが単一のＡＣＶピークを有する一方、すべての偶数倍の倍音が２重のＡＣＶピークを有する。これは、不可逆的な酸化還元対を有するシステムの正弦波状倍音ＡＣＶの場合と逆である。
【０３６４】
好適な実施形態においては、多重周波数ＡＣＶが利用される。その考え方として、ＡＣＶと同様、電気化学的セルを励起するために、同一の、または異なる振幅を有する複数の周波数からなる波形を形成することである。この方法は、細胞応答を分析する上で、高速フーリエ変換または接合時間周波数変換（ｊｏｉｎｔ ｔｉｍｅ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）による利点が得られる。多重周波数ＡＣＶのＪＴＦＴスペクトルは、倍音成分と同様に、駆動された（基本の）周波数上に情報を提供する。いくつかの可能性のあるデータ分析は、１）基本周波数の応答性に関する比較、２）すべての倍音周波数の比較、３）すべての励起された周波数に関する特定の倍音周波数の応答性の比較、および４）標準的な単一の周波数ＡＣＶによる可能性のあるすべての分析である。
【０３６５】
したがって、好適な実施形態において、一般に具体例で概説したように、高速フーリエ変換が行われる。フーリエ変換解析は、正弦波状の電気化学法が行われる場合、ノイズに対する信号を改善する方法、および所望する信号を分離する方法である。一般的なＡＣ技術は、１次の周波数の測定だけに依拠する。正弦波状の電圧測定法（および他の入力）を用いて、より高次の倍音を観測することにより、主に動力学に基づいた信号の弁別を可能にする。例えば、（ＡＣ周波数があまりにも高くなければ、）１次の周波数において、速いそして遅い酸化還元事象により、同様のピークが得られる。しかしながら、より高次の倍音において、いくつかの酸化還元分子は信号を形成し、他のものは信号を形成しない。ＦＥＴを用いて、正弦波状の入力に対する応答のさまざまなすべての周波数成分を直ぐに観測することができる。
【０３６６】
同様に、好適な実施形態において、接合時間周波数変換（ＪＴＦＴ）が行われる。
【０３６７】
好適な実施形態において、デジタル式のはめ込み技術が用いられる。過去において、電気化学的セルからのデジタル化された未処理データは、高速フーリエ変換または接合時間周波数変換解析の複雑な形態を用いて解析することができる。これらの方法の重大な問題点は、周波数変形技術に関連する莫大な計算時間にある。原則的に、デジタル式はめ込み技術はアナログ式はめ込み技術と同一のものである。先の事例において、バンド幅を狭小化するステップは、入力電圧と同じ周波数を有するが９０°の位相のずれを有する正弦波を用いて、セルの応答を多重化することにより数学的に行うことができる。この技術は、１度にただ１つの周波数しか分析できないので、アナログの対応するものと同じ限界を有する。しかし、未処理データを保管することができるので、アナログ式のはめ込み技術とは異なり、他の周波数も（より能力の高いプロセッサを用いて平行して）連続的に分析することができる。次の入力電圧に対して、
【数１】
2004530860.tif 000044
セルの応答は、本質的に次のとおりになる。
【数２】
2004530860.tif 000045
【０３６８】
周波数（ｎ０ｗ）に関する電圧依存係数Ｉｎを見出すためには、我々は、この応答に、２ｓｉｎ（ｗｎ０ｔ）および−２ｃｏｓ（ｗｎ０ｔ）を乗算し、ローパスフィルタをかけて、実成分と虚成分を得る。この具体例で用いられるローパスフィルタは、単純な移動平均である。数学的に、このプロセスは次のように表現される。
【数３】
2004530860.tif 000046
【０３６９】
好適な実施形態においては、電流ベクトルのバックグラウンド減算および位相最適化が行われる。
【０３７０】
好適な実施形態において、補正および／またはたたみ込み技術が用いられる。この実施形態において、同じ電極が数多く走査される。単一の走査におけるピークを探す代わりに、数多くの走査を測定して、走査間における一般的な補正を確認する。例えば、ノイズ内のバンプは、フェロセンが存在しない場合であっても、およそマイナス１８０ｍＶ付近に現われる。しかし、周波数が走査された場合、同じバンプが同じ場所に現われるというわけではない。こうして、好適な実施形態は、数多くの周波数で走査を行い、それらのすべてにおいて、ピークが生じる場合にのみ、肯定的に考慮する。これは、非常に簡単な補正で、より複雑な補正も同様に行うことができる。
【０３７１】
好適な実施形態において、信号認識およびバックグラウンド減算を用いて、信号再生を行う。この実施形態において、その考え方は、セルの応答性を２つの合算された関数に適合させることであって、一方は信号を記述し、他方はバックグラウンドの容量性電流をモデル化するものである。一旦、関数が構成されると、適合されたバックグラウンドの容量性電流を減算することにより、信号を応答から容易に再生させる。この信号認識スキームは、任意のシステムに適用可能であり、信号の挙動および形状は、比較的によく知られたものである。次の具体例は、本発明のシステムに対し、どのようにスキームが適用されるかを示す。
【０３７２】
電気化学的セルからの応答を、はめ込み増幅技術または同様のバンド幅狭小化技術を用いて処理することができる。これは、バンド幅狭小化技術のいくつかの形態を用いて、バックグラウンドに対して信号を増大させる数多くの方法の内の１つである。
【０３７３】
好適な実施形態において、信号のスペクトル分析が行われる。この実施形態において、周波数領域におけるフィルタ処理技術は、信号の平均値、分散、密度、自己相関、関数、およびパワースペクトル密度を用い、これをこのシステムに適用して、信号ノイズ比を改善する。（参考として統合されるＳｃｈｗａｒｚらのＳｉｇｎａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ： Ｄｉｃｒｅｔｅ Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｅｓｔｉｍａｔｉｏ， Ｎ． Ｙ． ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ， １９７５， を参照されたい。）
【０３７４】
好適な実施形態において、デジタル式フィルタ処理技術が用いられる。これらは、限定するわけではないが、ウィーナフィルタ処理、カルマンフィルタ処理、有限インパルス共鳴、狭小バンドフィルタ処理を含む。
【０３７５】
好適な実施形態においては、照合フィルタが用いられる。（Ｚｉｅｍｅｒらの”Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｎｏｉｓｅ”， ４ｔｈ Ｅｄ． Ｊｏｈｎ Ｗｅｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ４６５−４７１， １９８８、およびＨｅｌｓｔｒｏｍ， Ｃ． Ｗ．， ”Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｓｉｇｎａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ”， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， １１２−１１５， １９６８を参照されたい。これらはともに参考として統合される。）最も簡単な形態において、照合フィルタは、ノイズに対する信号を改善するために、測定された応答をいくつかの対応する既知の信号振幅により「重み付け」し、２つの信号をたたみ込むための信号処理技術である。
【０３７６】
好適な実施形態においては、ウィーナフィルタ処理が用いられる。（前掲のＰｒｅｓｓと、ＥｌｌｉｏｔらのＦａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｓ： Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ， Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９８２）を参照されたい。これらはともに参考として統合される。）ウィーナフィルタ処理は、「汚染された」信号からノイズまたはバックグラウンドを除去する最適フィルタを見出すことを含む。この信号処理方法は、フーリエ変換技術を用いて機能する。その考え方は、次のとおりである。信号ノイズ比が良好でないため、あるいはバックグラウンドが大きい場合、装置からの出力信号は「汚染された」信号である。すなわち、
【数４】
2004530860.tif 000047
であり、ここでｓ（ｔ）は信号で、ｎ（ｔ）はノイズである。ｓ（ｔ）は、我々が求めている信号ではないことに留意されたい。真の汚染されていない信号ｕ（ｔ）は、いくつかの既知の応答関数ｒ（ｔ）でたたみ込まれた真の「汚染されていない」信号から構成される。酸化還元対を有するＣＭＳシステムの場合において、ｕ（ｔ）は、Ｎｅｒｎｓｔｉａｎである。換言すると、
【数５】
2004530860.tif 000048
となる。
【０３７７】
周波数空間において、この関係は、
【数６】
2004530860.tif 000049
となり、Ｓ、Ｒ、およびＵは、それぞれｓ、ｒ、およびｕのフーリエ変換である。最適フィルタφ（ｔ）または対応フーリエ変換φ（ω）を見出すことにより、汚染されていない信号を再生することができる。これにより、測定された信号ｃ（ｔ）またはＣ（ω）に適用したとき、ｒ（ｔ）またはＲ（ω）により逆たたみ込みされ、汚染されていない信号ｕ（ｔ）またはＵ（ω）を近似する信号を次式により形成する。
【数７】
2004530860.tif 000050
【０３７８】
一般に、最適フィルタは、次のように定義される。
【数８】
2004530860.tif 000051
【０３７９】
好適な実施形態においては、ノイズが存在するとき、変化する信号の電流値を追跡する帰納的推定フィルタ処理技術であるカルマンフィルタが用いられる。ＫａｌｍａｎらのＡ Ｎｅｗ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｌｉｎｅａｒ Ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｌｅｍｓ， Ｔｒａｎｓ． ＡＳＭＥ Ｊ． Ｂａｓｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｅｒｉｅｓ Ｄ， ８２， Ｍａｒｃｈ ３５， １９６０、Ｅｌｌｉｏｔ Ｅｄ． Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｄｉｆｉｔａｌ Ｓｉｇｎａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ： Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ” Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ｐ９０８， １９８７、およびＣｈｕｉらのＫａｌｍａｎ Ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ： ｗｉｔｈ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ” Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７を参照されたい。これらはすべて、参考として、明確に統合される。
【０３８０】
好適な実施形態においては、非線形倍音応答は、非対称の応答を誘導することにより増大する。好適な実施形態において、これは、不可逆的な酸化還元対を有する系を用いることにより行われる。例えば、フェロセンは極めて可逆性のある酸化還元対である。すなわち、所与のポイントにおいてＡＣ電圧により範囲が定められたフェロセンは、ＡＣ電圧の上昇時において酸化し、下降時において還元する。しかし、半可逆的または不可逆的な酸化還元対が用いられた場合、例えば、分子は上昇時に酸化し、下降時に（部分的に）還元しない。逆も同様である。これにより、所定の周波数における非線形性がより大きくなる。
【０３８１】
これを実行するための３つの具体的な方法は、一般に、国際公開公報ＷＯ００／１６０８９に開示されているように、ルミノールのように酸化された形態で解体されるＥＴＭ分子を利用すること、共同還元または酸化還元仲介物を使用すること、および酵素結合仲介物を使用することである。
【０３８２】
好適な実施形態においては、交流電流（ＡＣ）法を用いて、電子移動は起動する。加えて、ＡＣ技術を利用すると、ＥＴＭ以外の物質に起因する、任意の信号周波数におけるバックグラウンド信号を著しく低減することができ、こうして、不要な信号を締め出す、またはフィルタ処理できる。すなわち、溶液内の電荷キャリアまたは酸化還元性の活性分子に関する周波数応答性は、その拡散係数および電荷移動係数により限定される。したがって、高い周波数においては、電荷キャリアは電荷を電極へ移動させる上で十分速く拡散できず、そして／または電荷移動の運動力学は十分に速くない。このことは、良好な単層をもたない、つまり部分的または不完全な単層を有し、溶媒が電極に達し得るような実施形態においては極めて重要なことである。上記に概説したように、ＤＣ技術においては、電極が溶媒にアクセス可能であるときに「ホール」が存在すると、溶媒電荷キャリアによりシステムが「短絡」し、すなわち電極に到達し、バックグラウンド信号を形成する。しかし、本発明のＡＣ技術を用いると、単層が存在するかどうかに依存して、溶液中の１つまたはそれ以上の電荷キャリアの周波数応答を阻止するように、１つまたはそれ以上の周波数を選択することができる。このことは、血液などの数多くの生物学的流体が、電流測定検出法と干渉し得る酸化還元性の活性分子を相当量有するので、極めて重要である。
【０３８３】
好適な実施形態において、このシステムの測定は、少なくとも２つの異なる周波数で実施されるが、複数の周波数で測定されることが好ましい。複数の周波数は、１つの走査を含む。例えば、１ないし２０Ｈｚの低い入力周波数において、例えば、ＡＣ電流である出力信号を測定し、その応答と、１０ないし１００ｋＨｚ等の高周波で出力信号を比較することにより、ＥＴＭが存在するときと、不存在しないときの周波数応答の差異を示すことができる。好適な実施形態において、周波数応答は、少なくとも２つの周波数で、好適には少なくとも約５つの周波数で、より好適には少なくとも約１０の周波数で決定される。
【０３８４】
電子移動を起動するために入力信号を加えた後、出力信号が受信または検出される。出力信号の存在および大きさは、入力信号の過電圧／電流、入力ＡＣ信号の周波数、仲介媒体の組成、ＤＣオフセット値、システムの環境、ＥＴＭの特性、溶剤、および塩の種類および濃度を含む数多くのファクタに依存する。所与の入力信号において、出力信号の存在および大きさは、一般に、ＥＴＭが存在するかどうか、単層の表面からのＥＴＭの位置および距離、および入力信号の特性に依存する。いくつかの実施形態において、標識プローブの不特定結合と、標識プローブを含む標的特定アッセイ複合体の形成とを、インピーダンスを元に区別することができる。
【０３８５】
好適な実施形態において、出力信号はＡＣ電流を有する。上記に概説したように、出力電流の大きさは、数多くのパラメータに依存している。これらのパラメータを変化させることにより、このシステムを数多くの手法で最適化することができる。
【０３８６】
一般に、本発明において形成されるＡＣ電流は、約１フェムトアンペアから約１ミリアンペアの範囲にあり、好適には約５０フェムトアンペアから約１００マイクロアンペアの範囲にあり、とりわけ好適には約１ピコアンペアから約１マイクロアンペアの範囲にある。
【０３８７】
好適な実施形態においては、出力信号が入力信号に対して位相シフトされる。理論的に制約されることなく、本発明のシステムは、十分に均一で、検出に基づく位相シフトを可能にする。すなわち、電子が移動したことによる本発明の複雑な生体分子は、標準的な電気的成分と同様に、ＡＣ入力に対して均一に応答するので、位相シフトを決定することができる。これは、ＥＴＭの存在と不存在の間の検出、および／または標識プローブを含む標的特定アッセイ複合体の存在と、システム構成部品に対する標識プローブの不特定結合との差異の根拠として機能することができる。
【０３８８】
出力信号は、ＥＴＭの存在に関して特徴的である。すなわち、出力信号は、標識プローブおよびＥＴＭを含む標的特定アッセイ複合体の存在に関して特徴的である。好適な実施形態において、検出の根拠は、アッセイ複合体が形成された結果として、システムの誘導電流のインピーダンスにおける差異である。誘導電流のインピーダンスは、電極とＥＴＭの間のシステムインピーダンスである。誘導電流のインピーダンスは、バルクまたは誘電性のインピーダンスとは全く異なる。数多くのファクタは、誘導電流インピーダンスを変化させ、誘電性インピーダンスには影響を与えない。逆も同様である。こうして、システムにおいて拡散を含むアッセイ複合体は、中でも、ＥＴＭと電極の間の距離、電気的特性、および仲介媒体の組成に依存する所定の誘導電流インピーダンスを有する。本発明の方法の重要な点は、ＥＴＭと電極の間の誘導電流インピーダンスは、ＥＴＭを含む標識プローブが、特定的に、あるいは不特定に電極と固定されているかどうかに依存する。
【０３８９】
したがって本発明は、さらに、本発明の構成を用いた被検体検出のための電子デバイスまたは電子装置をさらに提供する。この装置は、サンプル溶液を受容するためのテストチャンバを有し、このテストチャンバは、少なくとも第１の測定電極またはサンプル電極と、第２の測定電極またはカウンタ電極とを有する。同様に、３電極システムが有用である。第１および第２の測定電極は、テストサンプル受容領域と接触しているので、液体テストサンプルが存在するとき、２つの電気泳動電極が電気的に接触している。
【０３９０】
好適な実施形態において、この装置は、同様に、ここで説明したように、付属リンカーを介して共有結合により付着した単一の標準的な核酸捕獲プローブを含む検出電極と、導電性オリゴマーを含む単層と、を備える。
【０３９１】
この装置は、テストチャンバ、すなわち測定電極と電気的に接続されたＡＣ電源をさらに有する。好適には、ＡＣ電源は、同様に、ＤＣオフセット電圧を供給することができる。
【０３９２】
好適な実施形態において、この装置は、入力信号と出力信号を比較できるプロセッサを有する。このプロセッサは、電極と接続され、出力信号を受信し、標的核酸の存在を検出するように構成されている。
【０３９３】
一旦行われると、本発明の多重化デバイスおよびカートリッジが数多くの用途において利用される。とりわけ、本発明の構成部品がハイブリダイゼーションアッセイにおいて利用される。当業者には理解されるように、単一種の核酸、すなわち、単一の核酸配列または複数の核酸種を有する電極を形成することができる。
【０３９４】
最近では、多様な性質をもつＤＮＡマーカを利用することにより、遺伝学的変異および表現型の間の関係を分析することに焦点が当てられている。過去の研究では、多様な性質をもつ位置マーカとして、ＳＴＲ（短列反復：ｓｈｏｒｔ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ）を用いたが、現在、人ゲノムＤＮＡにおいて、１キロベース以上の平均頻度で生じるＳＮＰ（単一核酸多形性：ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）の利用に焦点が当てられている。とりわけ暗号配列の中およびその付近にあるいくつかのＳＮＰは、治療に関連する表現型の変形および／または疾病素質の直接的な原因となる傾向がある。臨床的に重要な表現型を引き起こす、数多くの広く知られた多形性がある。例えば、ａｐｏＥ２／３／４変形は、アルツハイマ病および他の疾病の異なる相対的リスクに関連する（ＣｏｒｄｏｒらのＳｃｉｅｎｃｅ ２６１ （１９９３）を参照されたい。）。一連のオリゴヌクレオチドに対する連続的なハイブリダイゼーションを用いたＳＮＰ座の多重ＰＣＲ増幅法は、少なくとも数百ものＳＮＰを同時に分類するための正確で信頼性の高い方法であることが確認された。
【０３９５】
本発明の方法は、電極上での電気泳動検出を用いて、特定の位置にある標的核酸の配列を決定する方法に関する。本発明は、好適には、変形を検出するための電極アレイを用いて、配列（すなわちＳＮＰ）の差異または変形の検出（および任意であるが、定量化）を有する。
【０３９６】
当業者には広く知られているように、標的核酸内の特定位置にある塩基を特定または検出するために用いられる技術が数多くある。これに限定するわけではないが、温度、標的配列に対する完全または不完全プローブの拮抗的ハイブリダイゼーションの利用、例えば、単一塩基拡張技術（ときどき「小規模配列（ｍｉｎｉｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」と呼ばれる。）を用いた人工的配列、オリゴヌクレオチド・リガーゼ増幅（ＯＬＡ）反応、回転円増幅（ＲＣＡ）、対立性ＰＣＲ、拮抗的ハイブリダイゼーション・インベーダＴＭ技術である。加えて、本発明は、表面結合アレイの新規な特性を利用する新規な発明に関し、「コンペチマー（ｃｏｍｐｅｔｉｍｅｒ）」を用いて、不特定結合を低減する。
【０３９７】
したがって、本発明の構成部品は、数多くの研究用、臨床用、品質管理用、またはフィールド検査設定において利用することができる。
【０３９８】
好適な実施形態において、プローブは、遺伝学的診断において利用されている。例えば、非ポリポシス性結腸癌遺伝子、ＢＲＣＡ１胸部癌遺伝子、さまざまな癌に関連するＰ５３、患者に対して容易に徴候的スクリーニングが実施できるように、アルツハイマ病のより高いリスクを示すＡｐｏＥ４遺伝子、嚢胞性繊維症遺伝子における突然変異、または他の当業者によく知られた任意の遺伝子などの遺伝子である標的配列を検出するために、ここで開示された技術を用いて、プローブを形成することができる。
【０３９９】
追加的な実施形態において、ウイルスおよびバクテリアの検出は、本発明の複合体を用いて行われる。この実施形態において、プローブは、ウイルスおよびバクテリアの変形からの標的配列を検出するように設計されている。例えば、現在の血液スクリーニング技術は、ＨＩＶ抗体の検出に基づいている。ここで開示される方法により、ＨＩＶ核酸配列、とりわけ一定保存されたＨＩＶ配列を検出するために、臨床的サンプルを直接的にスクリーニングすることができる。加えて、これにより、抗ウィルス治療の効力を評価する改善された方法として、患者内に循環するウィルスを直接的にモニタすることができる。こうして、白血病、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩに関連するウィルスを検出することができる。例えば、標的配列としてリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を用いて、結核、クラミジア、または他の性感染症を検出することができる。
【０４００】
好適な実施形態において、本発明の核酸は、水および食物サンプルのスクリーニングにおける毒性バクテリアに関するプローブとして利用される。例えば、サンプルを処理して、その核酸（特に、ｒＲＮＡ）を放出させるようにバクテリアを分離することができ、そしてプローブは、これに限定するわけではないが、例えば、サルモネラ、カンピロバクタ、ビブリオコレラ、リーシュマニア、Ｅ． ＣｏｌｉおよびＬｅｇｉｏｎａｉｒｅの疾病バクテリアなどの病原性菌種を含むバクテリア菌種を特定するように設計することができる。同様に、本発明の構成部品を用いて、生物学的治療法を評価することができる。
【０４０１】
さらなる実施形態において、プローブは法医学的「ＤＮＡ指紋」として用いられ、犯罪現場のＤＮＡが、被害者および被疑者から採取されたサンプルと照合される。
【０４０２】
追加的な実施形態において、ハイブリダイゼーションにより配列するために、アレイ内のプローブが用いられる。
【０４０３】
すなわち本発明は、いくつかの実施形態において、ハイブリダイズされないプローブを取り除くことなく、標的配列を検出可能なとりわけ明確で感度の良いプローブを提供する。これは、自動化された遺伝子プローブアッセイを形成する上で有用である。
【０４０４】
択一的には、本発明の構成部品は、ＰＣＲで成功裡に増幅された遺伝子を検出する上で有用であり、ＰＣＲ反応が成功したことで、標的配列の存在または不存在を示唆することができる。ＰＣＲは、このようにいくつかの方法で利用することができる。たとえば、１つの実施形態において、ＰＣＲ反応は、当業者に広く知られた方法で行われ、標的配列の連続的検出により導電性オリゴマを介して共有結合して電極に付着したＥＴＭを含む標的核酸を有する本発明の構成部品に加えることができる。択一的には、導電性オリゴマと標的核酸を含む電極の存在下で、あるいはこれに連続的に追加して、ＰＣＲは、ＥＴＭにより識別された核酸を用いて行われる。ＥＴＭを含むＰＣＲ生成物と電極の結合は、電子移動を介して検出される。最後に、導電性ポリマを介して電極に付着した核酸は、ＥＴＭで識別された第２のプライマを追加した１つのＰＣＲプライマであってもよい。延長することにより、ＥＴＭおよび共有結合により付着した電極を含む二重螺旋核酸が形成される。このように、標的配列をＰＣＲ検出するために、本発明が用いられる。
【０４０５】
好適な実施形態において、ｍＲＮＡの検出にはアレイが用いられる。好適な実施形態は、ｍＲＮＡの３’ポリアデニレーションのテールに隣接してハイブリダイズする捕獲プローブまたは捕獲伸長プローブのいずれか一方を用いる。これにより、検出のための標的結合プローブの１種を用いることができる。すなわち、このプローブは、ｍＲＮＡ標的のポリ−Ａのテールと結合するポリ−Ｔ部分を含む。一般に、このプローブは、好適には、検出プローブ（他のプローブ）と結合する非ポリ−Ｔである第２の部分を含む。これにより、１つの標的結合プローブを形成することができる。行うべき異なるプローブ合成の数量が低減される。
【０４０６】
好適な実施形態において、制限酵素の利用および結紮法により、「汎用」アレイを形成することができる。この実施形態において、単層は、一般に、ＰＣＴ  ＵＳ９７／２００１４の図７に示すように、制限エンドヌクレアーゼ端部を有する。核酸の補完部分を利用し、「粘っこい端部」を放置することにより、任意の数の制限エンドヌクレアーゼ部位が形成される。これらの１つまたはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いて、標的サンプルを処理することにより、標的をアレイに結合させることができる。これは、標的配列を知ることなく、行うことができる。標的配列は、必要ならば、リガーゼなどの標準的手法を用いて結紮することができ、標的配列は、標準的な標識または本発明の手法を用いて検出することができる。
【０４０７】
本発明は、核酸を感度よく検出できる方法を提供する。好適な実施形態において、約１０×１０６個未満、好適には約１０×１０５個未満、さらに好適には約１０×１０４個未満の分子が検出され、とりわけ好適には約１０×１０３個未満、最も好適には約１０×１０２個未満の分子が検出される。当業者には理解されるように、これは、標的配列と報告分子の間に１：１の相関関係を仮定しており、各標的配列に対して１つ以上の報告分子（すなわち電子移動の一部分）が用いられる場合、感度は向上する
【０４０８】
ここに引用されたすべての文献は、参考として全体が統合される。
【０４０９】
実施例１
（信号解析）
本発明は、生物学的および化学的標的を検出するために、電気泳動技術を用いる。一般に、これらの技術により、有益な、または特徴的形状、寸法、および配置位置に関する信号が形成される。信号の独特の特徴を認識するコンピュータプログラムを作成することにより、我々は、バックグラウンド現象から信号を区別し、正確に検出するために必要なすべての関連情報を抽出することができる。
【０４１０】
（モデルへの適合）
所与の測定技術から得られる信号を記述する方程式の群（ｆａｍｉｌｙ）および境界条件の組（ｓｅｔ）を設定することは可能である。この数学的記述は「モデル」と呼ばれている。このモデルは、基礎的な科学的理論に基づく場合がときどきあるが、多くの場合、このモデルは、観測された信号の挙動に合致する近似であってもよい。ほとんどの場合、このモデルは、「非線形」であり、基本的な多項式よりも複雑な方程式から構成されている。
【０４１１】
データを非線形モデルへ適合するためのいくつかの手法があるが、これらの手法は、以下のステップを有する。すなわち、１）モデルにより記述されないすべての一般的な挙動に関する迅速な検出、２）初期的な推定、３）必要に応じて繰り返される反復的な改良および評価、４）一般的な誤差を含む適合の検出および補正、そして５）この適合の品質を判断するための最終的評価。一旦、適合が選択されると、重要なパラメータの値は、さらなるデータ解析で利用するために抽出される。
【０４１２】
（ＡＣ信号を記述するためのベクトル表記）
この報告で記述される信号認識方法を説明するための具体例として、私は、現在最も一般的な電気化学的技術、すなわち第４倍音でモニタされる交流（ＡＣ）ボルタンメトリ法を用いた。この技術によれば、入力ＤＣ電圧の関数として、振幅（高さ、Ｒ）および位相（位置、ｑ）が変化するＡＣ信号（正弦波）が形成される。我々が既知の周波数でモニタする限り、こうした波を定義するために２つの値だけが必要となる。図１６は、正弦波および対応するベクトル表示を示す。
【０４１３】
その２つの値とはＲとθであるが、上述のように、１振動の４分の１、つまり９０°で分離される（Ｘ，Ｙ）の対であってもよい。こうした系の表象化を単純にするための１つの方法は、いわゆるベクトル表示を用いることであり、図１７の４つの構成において図示されている。
【０４１４】
値（Ｒ，θ）と（Ｘ，Ｙ）は、異なるが、同じベクトルを記述する上で置換可能な値である。ベクトル自体は、正弦波ひいてはデータを表示するものである。さらに、（図の左側にある値に対して右側にある値の）プライムを付した値と付していない値との差異は、（図示されたように、例えば、極座標の図において破線で示した相対位置だけ）基準フレームが回転させたことだけである。このように回転させることによりデータは変化しないが、以下の節で説明するように有用となり得る。
【０４１５】
ベクトル表示の重要な属性は、ベクトルが対応する波と全く同様に加算されるという点にある。例えば、ほぼ反対方向にある２つのベクトル点があって、これらは、加算されると、互いに相殺し合って、わずかな残余ベクトルだけが残る。こうして如何にして、２つの波を一体に加算して「破壊的干渉」が得られることが可能であるかを正確にモデル化し、結果として得られる振幅は、各入力信号の振幅より小さくなる。すべての波が同一の周波数を有する限り、ベクトルは、互いに対する干渉をモデル化する。
【０４１６】
ＡＣボルタンメトリ法において、我々は、所与の周波数において、入力電圧の関数として振動をモニタする。ベクトル表示により、適合に関する我々の記述における任意の信号、既知の周波数を有する正弦波の挙動が正確にモデル化されるので、私はベクトルとしてのデータだけを記述する。
【０４１７】
（ＸおよびＹの適合に対する選択）
ベクトルデータを収集する任意の実験において、（Ｒとθが記録される場合であっても）Ｒの値だけを能動的にモニタすることは科学者にとって一般的なことである。なぜなら、システムおよび実験的設定に依存して、基準フレームが装置により、あるいは実験日により変化し得るためである。しかし、Ｒは基準フレームとともに変化することはない。（なお、極座標においては、基準フレームの回転はθだけを変化させることに留意されたい。）
【０４１８】
しかし、信号認識が機能するためには、我々は、観測すると予想される形状を数学的に記述するモデルを必要とする。形状がより簡単で変化が少なければ、より簡単に記述でき、認識される。図１８および図１９は、第４倍音のＡＣボルタンメトリ法（ＡＣＶ−４）に対するＲとθの軌跡の一例を示す。
【０４１９】
Ｒ空間における４つの突出部を描く形状は、中程度ないし大きい信号の特徴を示すが、信号がバックグラウンドの大きさに対して小さくなるとき、Ｒ空間信号は歪んでしまう。さらに、より大きい信号を有する走査のｑ軌跡は、より小さい信号を有するものとは全く異なる。図２０および図２１は、より小さい信号の具体例を示す。
【０４２０】
この複合値（Ｒ，θ）の挙動は、信号およびバックグラウンドの両方を含むベクトル軌跡の特性を示す。（ＲＢとθＢで記述される）バックグラウンド−Ｂベクトルを含む（ＲＳとθＳで記述される）信号−Ｓベクトルを有する場合、データ−Ｄベクトルは、Ｄベクトル＝Ｓベクトル＋Ｂベクトルとなる。Ｄベクトルは、ＲＤとθＤで記述され、信号値とバックグラウンド値に依存する。
【数９】
2004530860.tif 000052
【数１０】
2004530860.tif 000053
【０４２１】
Ｒ軌跡およびｑ軌跡が複雑なのは、ＲＤおよびθＤが４つすべてのパラメータ（ＲＳ，θＳ，ＲＢ，θＢ）に依存するという事実に起因する。しかし、極座標の代わりにデカルト座標を用いた場合、Ｄベクトルは、ＸＤおよびＹＤを用いて次のように記述される。
【数１１】
2004530860.tif 000054
【０４２２】
デカルト座標を用いることにより、Ｄ’ベクトルパラメータのＳベクトルおよびＢベクトルに対する依存性を簡素化することができる。先に示した同じ具体例を（Ｘ，Ｙ）でグラフ化して、図２２および図２３で中程度の信号、図２４および図２５でより小さい信号を図示すると、このような簡素化が顕著となる。
【０４２３】
このとき、より小さい信号は、中程度の信号と定性的に同様であるので、同じ数学的モデルを用いて、より記述しやすくなる。このため我々は、モデルを想定し、適合のための計算を行う際、ＸおよびＹへの適合を選択し、また両方の次元において同時に適合させるのではなく、個別にＸおよびＹへ適合させることを選択した。
【０４２４】
（ＡＣＶ−４の仮定モデル）
我々は、ＡＣＶ−４信号により表された独特の形状をいくつかの異なる数式と比較した。４つの突出部を有するプロファイルは、我々がピーク形状に関する３次導関数に関する方程式を利用することを、すぐさま示唆し、数多くの比較を行った後、ガウス関数の３次導関数（Ｇ’’’）がＡＣＶ−４信号に対する極めて良好な近似を示すことを、我々は結論付けた。多項式の次数（ひいては形状を記述するために必要なパラメータの数）は、走査する長さに依存する。より長い走査は、同じ走査の特徴を説明するために、より高次の多項式を必要とする。バックグラウンドに関して、多項式（Ｐ）は、我々が観測する異なる形状の大部分に関して説明するのに十分なものでなければならない。こうして、次の方程式を得、ここでベクトルＩ（Ｖ）はデータ、ベクトルＩＳ（Ｖ）は信号、ベクトルＩＢ（Ｖ）はバックグラウンドである。
【数１２】
2004530860.tif 000055
【０４２５】
これにより、我々がＡＣＶ−４モデルのために用いる最終的な方程式を導く。
【数１３】
2004530860.tif 000056
【０４２６】
我々は、同様に、（電圧空間における位置により区別される）１つ以上の標識を有するシステムのための適合手順を創造した。これらは、上述したものと類似したモデルを用いるが、１つ以上の信号に関する基礎的仮定を用いる。
【数１４】
2004530860.tif 000057
【０４２７】
境界条件に関して、ガウス導関数ＧＸおよびＧＹのそれぞれは、３つのパラメータを有し、すなわち１つは高さで、１つは幅で、そして１つは（電圧における）位置である。高さには制限がなく、信号を出力する電気化学的標識の数だけに対応する。しかし、真の電気化学的信号を表すためには、適合の幅は、合理的な範囲に収まる必要がある。さらに、独立したＸおよびＹの適合における信号は、確実に、ともに同じ電気化学的標識に対応させるために、（電圧空間において）互いに近接していなければならない。意義のある適合を保証するために、如何にこれらの境界条件が「制約」されなければならないか、私は後に説明する。
【０４２８】
（最適位相）
上述のように、基準フレームの選択は任意である。データに関する限り、１つの対（Ｘ，Ｙ）は別の回転した対（Ｘ’，Ｙ’）と同様に良好である。しかし、このモデルは、正確な理論的な記述というより、現実に対する近似であることがしばしばあり、モデルは好適な基準フレームを強要する場合がある。このことは、上述のＡＣＶ−４システムの場合も当てはまる。
【０４２９】
具体例として、バックグラウンドに対して大きい信号を有する１つのＡＣＶ−４の軌跡を考えてみる。２次元グラフにおいて、データベクトルの先端部を電圧の関数としてプロットした場合、図２６に示す結果を得る。これらは、ただ１つの電気化学的標識を含むシステムに対応していることに留意されたい。
【０４３０】
Ｘ軸およびＹ軸が信号に跨るように、我々が基準フレームを選択した場合、上述のように、そして図２７および図２８に示すように、信号はＸおよびＹの両方に強く影響を与える。
【０４３１】
しかし、我々が（この頁の上段にあるグラフで図示された軸に対して、４５°回転させた）信号に対してほぼ平行な軸と垂直な軸の対を選択した場合、図２９および図３０に図示したように、信号は垂直なベクトルにほとんど影響を与えない。
【０４３２】
さらに、ＡＣＶ−４モデルのために我々が選択した４つの突出部を有する形状が、垂直な軌跡の６つの突出部について記述していないことを確認できる。平行および垂直な対（Ｘ，Ｙ）を用いてデータを適合するモデルを、我々が利用しようとしなかった場合、我々は、平行成分のみから信号を抽出できたに過ぎず、データの一方の次元を失うことになる。
【０４３３】
装置は、一般に、ＡＣ入力駆動力の位相に基づいてＸ軸およびＹ軸を付与する。この選択は電気化学的システムを考慮しないため、上述のような垂直／水平問題を引き起こし得る。したがって、上述のモデルに基づいて信号認識するためには、任意の既存の電気化学的信号に確実に跨るような新しい軸の対を選択することが最良となる。
【０４３４】
こうした軸を選択するために、我々は信号の方向を測定する手法を必要とする。極座標上の信号に直線を適合することは可能であるが、Ｘ信号およびＹ信号は互いに独立しているので、基本的な線形適合法を用いることができない。１［Ｙ軸に沿って配列された信号を想定されたい。我々が直線的な最小自乗法（最も一般的な適合法である）を適用しようとした場合、結果として得られる直線は、適合直線の上方および下方に同数のポイントを有し、信号に沿わず、むしろＸ軸に沿う。なぜなら、データをＹ方向における値としてのみ考慮するとき、データにはＸ依存性がないためである。］非線形適合法ならば機能するだろうが、２［Ｊａｖｉｅｒ Ｇｉｎｚａｌｅｚは以下のように説明した：Ａｍｏｒ／ｃ／ｍｙ ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｌａｂｖｉｅｗ ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｐｈａｓｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅ／ｌｉｎｅａｒｆｉｔ． ｖｉ．］それは反復的な処理となり、我々が要した時間よりも多くの処理時間を必要とする。こうした手法は、ベクトルの合計値を用いることである。図３１に示す３つのポイントからなるグループ分けについて検討されたい。
【０４３５】
これらのポイントをベクトルと考えた場合、これらの座標を合算することにより、これらのベクトルを追加することができる。このベクトルの合計は、次の座標を有する。
【数１５】
2004530860.tif 000058
【０４３６】
ベクトルを合計することにより、（０，０）を通り、データを貫く最良直線に対する合理的な角度が得られる。
【数１６】
2004530860.tif 000059
【０４３７】
我々はこの角度のことを「最適位相」と呼ぶ。例えば、合計することが図３２に図示されている。図３３は、３つのサンプルデータのポイントが如何に直線周りに収束するかを示す図である。これらより、最適位相は６４°である。
【０４３８】
この手法の利点は、元のデータポイントのベクトルの長さに応じて結果を重み付けすることができる点にある。すなわち、データポイントの振幅が小さいとき（信号が存在せずに、データポイントが走査部分を表さない場合に、そうであるように）、最適位相の値に対する影響がより小さい。例えば、我々が小さいデータポイントをサンプル集団に加えた場合の結果が図３４および図３５に示されている。
【０４３９】
新しいポイントは、最適位相を３度以下の角度だけ変化させる。必要ならば、小さい値により小さい重み付けを与えることも可能である。最適位相に関するより一般的な数式は、個々のデータポイントのベクトル長（ｒｉ）により重み付けられた合計を含む。ｎの値を増やすことにより、小さいデータの重み付けは、よりいっそう小さくなる。しかし、現在あるすべての適合プログラムにおいて、我々は、ｎがゼロであるときも満足する上記のような方程式を用いる。
【数１７】
2004530860.tif 000060
【０４４０】
我々は、信号を適合する上で最適位相を計算するためのこの方法を用いることができるが、検討を要する複雑さが存在する。数多くの技術（ＡＣＶ−４）において、電気化学信号は、上述の計算を実行する際に、互いに相殺できるような形状を有する。これを回避するために、我々は、まずデータの半分を１８０°回転させる。図２６に示すデータを用いる場合、我々は、図３６に示すデータを用いて最適位相を計算する。その結果得られた直線は、図３７に示す元のデータ上に重なる。
【０４４１】
こうして描かれた直線の角度（１０１°）は、このファイルにおいてＸ軸およびＹ軸を（±４５°で）選択するために用いられたものである。しかし残念ながら、さらなる複雑さが存在し得る。回転された部分と回転されなかった部分を分割する直線に対して、信号が異なる方向に向いている場合、上記の操作により、適正な角度を形成し得ない。例えば、私が上記信号を用い、１０１°時計方向に回転させたとすると、最適位相は０°となる。しかし計算した値は、実際には、図３８に示すように、−４８°となる。
【０４４２】
これを防ぐため、信号に対して平行な回転境界ではなく、より垂直な回転境界を選択する必要がある。まず信号がほとんど０°またはほとんど９０°に沿っているかどうかを判断することにより、我々はこれを実施することができる。我々は、９０に近い信号の絶対座標値のベクトル合計値を取ると、その結果の角度は次のようになり、４５°以上となる。
【数１８】
2004530860.tif 000061
一方、上述の場合に対して、我々は、４５°以下の１０°の角度（図３９参照）を求め、この信号は０°により沿ったものであると結論付ける。したがって、我々は、信号の半分を９０°軸の遠い方の側から信号の半分を回転させる。
【０４４３】
ベクトルの合計を計算すると、最適位相に関して、期待された値０°に近似する合理的な値１°が得られる。
【０４４４】
我々は走査全体に対する最適位相を望んでいるのではなく、走査された任意の電気化学信号に対する最適位相を求めようとしているという事実に、最後の複雑さがある。我々は、任意のバックグラウンドを無視したい。残念ながら、信号が小さい場合、これまで概説した最適位相の計算は、バックグラウンドの位相に左右される。これを回避するため、ベクトルの合計を計算する前に、近似的なバックグラウンドを引き算する。
【０４４５】
例えば、我々が６頁にある「より小さい信号」と呼ばれる走査を実行した場合、バックグラウンドによる大きな寄与を確認する。我々が２次元において走査を実行した場合、全体の走査の位相がほとんど１２０°に沿うことを確認できる（図４１）。
【０４４６】
しかし、多項式を全体の走査に適合させるために必要な迅速な計算を、我々が行う場合、我々は、図４２および図４３に示すようにバックグラウンドを近似することができる。この場合、我々は、利点を得るためにＡＣＶ−４の対称性を用いる。（任意の倍音ＡＣＶに関して、そうであるように、）信号がバックグラウンドの上方および下方において等しい寄与を有するならば、多項式適合は、信号の中央線に追随する傾向がある。こうして、走査に対する多項式適合において、バックグラウンドを精度よく推定することができる。多項式を計算するために、我々は現在、「一般的な多項式による特異値分解適合法」を用いている。
【０４４７】
バックグラウンドに対するこの近似を差し引くことができ、図４４および図４５に示すように、走査を遥かにより純粋な信号らしきものに変換する。図４６は、２次元プロットとして図示する。
【０４４８】
上述したことから分かるように、この節で概説された技術を用いて、我々は、約７０°の最適位相を計算することができた。
【０４４９】
要約すると、Ｘ軸およびＹ軸を選択するための基本的手法は、以下のとおりである。
１．０°および９０°の各方向に沿った近似するバックグラウンドを適合する。
これらを走査から差し引き、信号に左右される残余軌跡を残す。
２．すべての座標軸（０°および９０°に沿って）の絶対値を取る。ベクトルの合計を計算する。角度（θａｂｓ）が０°または９０°に近いかどうか判断する。
３．角度（θａｂｓ）が０°に近ければ、９０°軸の左方にあるすべてのデータポイントを選択する。角度（θａｂｓ）が９０°に近ければ、０°軸の下方にあるすべてのデータポイントを選択する。これらを１８０°回転させる。
４．ベクトルの合計を計算する。その角度が「最適位相（θｏｐｔ）」となる。
５．θｏｐｔから±４５°にあるＸ軸およびＹ軸を選択する。
【０４５０】
（モデル化されない挙動の確認）
処理時間を短縮するために、走査を適合することを意味のないものにしてしまうモデルからの著しい逸脱が走査に含まれるかどうか、早期に気付くことが最善である。ＡＣボルタンメトリ法（第４倍音）において我々が直面したこうした特徴の１つは、金属汚染物質を除去することにより生じる鋭いピークであった。図４７は、Ｒ空間内で表示される具体例を示す。
【０４５１】
（最適位相から±４５°にある）Ｘ軸およびＹ軸において、鋭いスパイクの特徴は、図４８および図４９に示すように、明確に残っている。
【０４５２】
この特徴の対称性により、この特徴と通常の信号を区別する。ＡＣＶ−４信号がバックグラウンドの上方および下方に等しい部分を有するのに対して、このスパイクはそうではない。
【０４５３】
この対称性をモニタする１つの迅速ではあるが大雑把な方法は、（最適位相を決めるために行ったように）近似するバックグラウンドを分離した後、基線の上方にあるポイントの分布と、下方にある分布と比較することである。例えば、我々は、Ｙ軌跡から多項式を差し引いた場合、図５０および図５１に示す結果を得る。
【０４５４】
我々が近似されたバックグラウンドの上方および下方にあるデータ分布を調べると、我々は、図５２に示すように、スパイクが存在することにより、基線の下方に存在する値が、上方に存在する値よりも大きい範囲を有することを確認する。
【０４５５】
この具体例では、基線より下方にあるデータの標準偏差は、基線より上方にあるデータの標準偏差に比して２．５倍より大きい。ＡＣＶ−４信号は、仮定されたバックグラウンドの周りに均一に分配され、したがって１に近い比を有するので、我々は、ＡＣＶ−４信号の期待される対称性とは異なる対称性の示唆として、これを捉える。この大雑把な方法によれば、許容可能な値の範囲を設定することにより、３［我々は、この比が２．２５未満で１／２．２５より大きければ、さらなる適合に際して許容可能であると考える。しかし、この値は、走査の長さなどの通常でないパラメータに依存することに留意することは重要である。］、迅速な検出および大きなスパイクを有する走査の拒絶を可能にする。
【０４５６】
（初期推定）
反復的な適合処理を行う際、常に、起動ポイント、すなわちデータに合致するモデル方程式の値に関する初期推定が必要となる。（次の節で説明するように、）反復処理は、こうした推定を段階的に改善する。単純なシステムを用いたシステムにおいては、単一の所定の初期推定だけを必要とする場合もある。この場合、この推定は、すべての可能性あるデータに対する十分な起動ポイントである。しかし、（ＡＣＶ−４に対して我々が用いたモデルなどのように）複雑な形状を含むモデルにおいては、それぞれ個別の走査に基づいて正確に初期推定することにより、より迅速に適合でき、誤差を含む適合を低減または排除することができる。
【０４５７】
同様に、我々は利点を得るために対称性を利用することができる。まず、信号が基線の上方または下方に等しく分布するような対称性を有する信号に関して、我々は、高速多項式適合法、４［上述の「一般的な多項式による特異値分解適合法」である。］を用いて、バックグラウンドに対する初期推定を計算する。先の節で概説した最適位相においてそうであったように、この多項式は、任意の信号の中央線に適合する傾向があるので、良好なバックグラウンドの推定を行うことができる。
【０４５８】
我々がバックグラウンドの推定を差し引くと、残ったもの（「残余」）は、（もしあれば）ほとんど信号である。この信号を推定するために、我々は、所与の測定技術および化学的系によれば、一般に特徴的挙動を含む信号が形成されるという事実から出発することができる。ＡＣＶ−４を用いて実験したＣＭＳセンサにおいて、すべての信号は同様の幅を有する。したがって、最も一般的な幅に依存する初期推定が適正なものとなる。
【０４５９】
信号の位置および信号の高さに関する残りのパラメータを推定するために、我々は、同様に、特徴的な幅に関する知見を組み合わせて既知のＡＣＶ−４の対称性を利用する。我々は、２つのより大きい中央突出部の間の平均的な間隔を知っているので、我々は信号の複製を作り、その間隔の半分だけ対向する方向に２つのコピーをシフト移動させる。我々が一方から他方を差し引いた場合、中央の突出部は、建設的に干渉する。結果として得られた波の絶対値は、信号の高さおよび位置に関する良好な推定を提供する。このプロセスは、突出部の間隔が０．０７２で、０．２０の位置において高さが１１．９の信号に関して、図５３、図５４、および図５５に図示されている。
【０４６０】
この具体例の最終的なグラフにおける軌跡は、０．２０の位置において２３．２５の最大値を有する。この位置は、実際のデータ値にうまく合致する。（両方とも０．２０である。）建設的な干渉高さは、中心からピークまでの信号の高さの約２倍とする必要があり、これは、干渉プロットによれば１／２×２３．２５＝１１．６の初期推定が与えられることを意味する。これは、入力値から３％しか異ならない。（この差異は、上述のプロセスで用いられたシフト移動が０．０６２で、サンプル信号の実際の間隔０．０７２とは異なるためである。）
【０４６１】
上記方法の１つの重要な利点は、（生データから最大値と最小値を単にサーチするのではなく、）信号の期待される幅および対称性に関する特徴だけを増幅できる点にある。上述と同じ信号であって、一方側に信号自体より若干高い通常でないピークを有するような信号を考えてみる（以下参照）。最大値／最小値の単なるサーチにおいて、これは初期推定を干渉する傾向がある。しかし、上記に概説した手順を用いて、図５６および図５７に示すように、位置０．２０において初期推定の高さを１１．６に維持する。
【０４６２】
したがって我々は、すべてのパラメータ（信号の高さ、位置、および幅、ならびにバックグラウンド）に関する初期推定を計算する方法を得、この方法は、１）高速（線形）適合法を用いて多項式を計算するステップ、２）組の中の最大数をサーチするステップ、および３）単純な算数のステップだけを有する。この技術の効力の具体例として、図５８は、実際のデータ軌跡と対応する初期推定の重ね合わせ図である。
【０４６３】
（最適化およびダイナミックレンジ）
一旦、初期推定が完了すると、我々は、数多くあるうちの任意の適合を最適化するための標準的な非線形回帰アルゴリズムを用いることができる。（我々は、現在、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ法に基づいたバージョンを用いる。５［これは、Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｒｅｃｉｐｅｓ ｉｎ Ｃ： Ｔｈｅ Ａｒｔ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ， Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， ｂｙ Ｗ． Ｈ． Ｐｒｅｓｓ Ｓ． Ａ． Ｔｅｕｋｏｉｓｋｙ， Ｗ． Ｔ． Ｖｅｔｔｅｒｌｉｎｇ， ａｎｄ Ｂ． Ｐ． Ｆｌａｎｎｅｒｙ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９２）の１５章で議論されている。これは、本来、Ｄ． Ｗ． Ｍａｒｑｕａｒｄｔ著、”ｍａｘｉｍｕｍ ｎｅｉｇｈｖｏｕｈｏｏｄ” ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ， １１ （１９６３） ４３１−４４１に説明されている。］）これらは詳細には異なっているが、基本的な処理手順は同じである。初期推定を実際のデータと比較して、この比較に基づき「誤差」を最小化するように適合を変更する。我々は、誤差が「精度」（事前設定された所定値）より小さくなるまで、反復する（このプロセスを連続的に繰り返えす）。この場合、適合が「収束」したという。しかし、データがモデルにより記述される全体形状と合致しない場合、適合に対する修正により誤差が小さくならないことがあり得る。（これは、走査が信号および信号に類似した雑音の両方を含まない場合に生じる。）「最大反復回数」（同様に、事前設定された所定値）以内で、誤差が精度よりも小さくならない場合、この適合は「発散」したという。
【０４６４】
誤差および精度は、しばしば単位を有するように定義される。例えば、データがピコアンペアで測定された電流である場合、誤差および精度は、ピコアンペアの二乗である。すべての期待される信号が同様の大きさであるとき、これは非常に有効である。なぜなら、絶対項にあるすべてを検討し、微小な特徴に対する適合を最適化しようとしないためである。しかし、定量的解析技術は、一般に、広範なダイナミックレンジを要請する。例えば、２０億ピコアンペアの信号高さを測定するのと同じ容易さで、２ピコアンペアの信号高さを測定する必要があるかもしれない。このようなダイナミックレンジを実現するために、我々は、信号高さに関して、データを初期推定に規格化する。これにより、大きい信号と同様に微小信号を適合することができ、このとき形状およびバックグラウンドノイズだけが適合に影響を与える。
【０４６５】
（境界条件および重み付け）
境界条件に関する問題は、モデルの選択を議論したとき、より初期の段階から生じていた。いくつかのシステムにおいて、あるパラメータは、所定の範囲においてのみ合理的である場合がある。例えば、ＡＣＶ−４に関して、１つのＣＭＳセンサ信号の２つの中央突出部の幅は、常に、１１０ないし２６５ｍＶの間にあり、最も一般的には１５０ないし２００ｍＶの間にある。これらの境界を制約するいくつかの手法があり、そのうちの２つについて以下説明する。
【０４６６】
走査に対する初期推定がかなり正確で、走査の信号がバックグラウンドに対して相当に大きい場合、適合処理は、信号を適正にはめ込む。境界条件を制約する必要性はない。しかし、信号がない場合、または信号が不明瞭である場合、パラメータが許容可能な範囲の外側へずれてしまうことがあり得る。そこで、良好に挙動するシステムにおいて、このずれを示す適合のみ、真の信号が含まれない。したがって我々は、許容できない値を有する適合を放棄して、対応する走査がバックグラウンドのみから構成されるものと理解する。（以下の「負の定量化」を参照されたい。）これは、現在あるソフトウェアで最も広く用いられた処理手順である。
【０４６７】
しかし、あまりうまく挙動しないシステムにおいて、適合の後ではなく、適合自体の最中において、境界条件を制約することが好ましい。我々はこれを以下のようにして実行できる。すなわち、制約された各パラメータに関する誤差を記述する方程式に追加的な項を追加し、パラメータが所望の範囲から逸脱したとき罰則を与える。６［Ｊａｖｉｅｒ Ｇｏｎｚａｌｅｚが最初にこのアイデアを思いついたとき、彼は他で記述される同様の方法を見出した。例えば、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｂｉｓｈｏｐは、「正規化項（ｒｅｇｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｒｍ）」ｉｎ Ｎｅｕｔｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｆｏｒ Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ， Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ （１９９５） １４−１５）で説明している。］例えば、非線形回帰技術により定義される誤差をＥとし、パラメータ（ａ）が、いくつかの期待される値（ａバー）に接近するように制約される必要がある場合、我々は、次式によりＥをＥ’で置き換えることができ、このときｋはある定数で、ｎは整数である。
【数１９】
2004530860.tif 000062
【０４６８】
反復して最適化するとき、目標は誤差を最小化することにあることを留意されたい。我々が上記方程式を用いる場合、ａがａバーとはかけ離れているほど、誤差は大きくなり、したがって適合はあまり好適ではない。我々は、標準的な誤差Ｅに対して（同様に他のパラメータの制約に対して）、パラメータを制約することが如何に重要であるかを判断するために、ｋの値を利用することができる。ｎの値は、所定の範囲の値が如何に好ましくないか、影響を与える。例えば、図５９に示すグラフにおいて、我々は、追加された項が２ｎ＝１６を有するときの形状と、２ｎ＝２を有するときの形状とを比較する。
【０４６９】
２ｎ＝１６の場合において、期待されたものの±７以内の値は、すべて等しく許容可能で、ほとんど罰則が与えられない。しかし、２ｎ＝２の場合において、期待される値から遠ざかるにつれて、苛酷な罰則が増加する。
【０４７０】
追加項が常に正である限り、その形式はあまり重要でないことを留意することは重要である。例えば、我々が真の値の近傍において鋭い制約を所望し、離れたところで大きな依存性を望まない場合、我々は次式を用いることができる。
【数２０】
2004530860.tif 000063
この方程式は、図６０に示すような形状を与える。
【０４７１】
さらにより複雑なグラフ形状を用いることもできる。例えば、（先に説明した）ＡＣＶ−４の中央突起の対において、我々は、図６１に示す形状を利用したいと考える。この形状は次式で定義することができる。
【数２１】
2004530860.tif 000064
このとき、上へｎステップ、下へｍステップあり、ｓはステップの位置で、ｂはその高さで、ｃは勾配を制御する。
【０４７２】
適合のさまざまな部分を走査にはめ込む場合に、制御すべき誤差を利用する別の方法がある。誤差Ｅ（しばしば、平均二乗誤差またはＭＳＥと呼ばれる。）に関する数学的定義は以下のとおりである。
【数２２】
2004530860.tif 000065
【０４７３】
この方程式において、Ｎはデータポイント数で、Ｆｉはデータポイント番号ｉに対する適合値で、Ｄｉは対応するデータ値で、そしてｓｉはこのデータ値における標準偏差である。この標準偏差は、Ｄｉにおける不確定性の尺度であって、Ｄｉを形成するためにいくつかの異なる測定値が平均された場合にのみ、この標準偏差は、一般に既知となる。（平均されなかったデータに関して、平均情報が失われた場合、値ｓｉ＝１と仮定して、すなわちすべての値は等しい確度で知られていると仮定する。）所与のポイントに対して、当初、そのデータ値が未確定である場合、ｓｉ２で割り算することにより、より大きい適合誤差が許容可能となると我々は指摘する。
【０４７４】
データ値におけるすべての不確定性に関係なく、我々は同じ種類の処理を行って、各ポイントに対して重み付けｗｉを導入することにより、強制的に、適合を所定のデータ範囲において他よりも近接するようにデータと合致させることができる。より大きい重み付けｗｉを有するデータポイントは、より小さい重み付けｗｉを有するデータポイントに比べて、より近接するように適合する。
【数２３】
2004530860.tif 000066
（これは、σｉ／ｗｉと等しい択一的な標準偏差を導入することと全く同じことであることに留意されたい。）
【０４７５】
ここで、これは、大きい重み付けを有する領域に存在するように、適合の信号部分を直接的に強制するものではない。これは、走査の他の部分に対し、この領域において、適合全体を強制的により緊密にするものである。しかし、信号を記述するこの方程式は、バックグラウンドを記述する方程式より局在化し、一般に、遥かにより曲線的である。このため、期待された信号位置の近くでより大きい重み付けｗｉを行うと、その値の近くに信号をはめ込めてしまう傾向がある。
【０４７６】
良好な適合を計算する際、初期推定が非常に重要なファクタであるので、我々は、そのステップにおいても同様に、重み付けを利用する必要がある。これを実現するために、我々は、「初期推定」の節で説明した（シフト移動および減算）の値に、重み付けｗｉ、または方法に依存してＥ’を形成するための追加項に基づく何らかのファクタを掛け合わせることができる。
【０４７７】
（瑕疵ある適合の検出および修正）
最適化を完了し、適合へ収束させた後、適合が依然として不適切にはめ込まれることがあり得る。例えば、端部効果があり得る。すなわち、コンピュータが走査範囲の外側にデータを有しない場合、その範囲の外側にあるデータに対して任意の形状を仮定することは完全に自由である。このため、この適合処理は、走査端部における通常でないバックグラウンド振動が実際に信号であることを結論付けることができる。この種の適合は、放棄するか、おそらく上述の重み付けを用いることにより、避ける必要がある。
【０４７８】
他の可能性のある誤差を修正することができる。例えば、ＡＣＶ−４において、我々はＸおよびＹに個別に適合させた。そのため、小さい信号または不安定なバックグラウンドを有する走査に対して、プログラムが、ＸまたはＹのいずれかにおける信号の不適切な突出部にはめ込むことがあり得る。すなわち、この適合は、２つの中央ピークとして、サテライトと中央ピークと名付けることができる。これは、ＸおよびＹにおいて実質的に異なる信号位置に対する適合であることを証明することになる。これらの場合、我々は、期待された位置からあまりにもとかけ離れてはめ込まれた走査（ＸまたはＹ）を取り出し、再適合することができる。我々は（バックグラウンドと信号幅を維持する一方、信号位置を補正して）不適切な適合に関し新しい初期推定を基礎とし、反復的な最適化を再開することができる。これで問題が解決されなければ（あるいは位置における元の差異が極めて大きければ）、我々は信号ではなくてノイズをはめ込んだことを意味し、我々はこの適合を放棄する。
【０４７９】
（適合適性の評価）
適合が収束し、一般的な瑕疵を含む適合が放棄され、補正されると、適合があまりにも多くの誤差を含んでいるかどうか判断する必要がある。すなわち、我々は、真の信号をはめ込んだことを確認する必要がある。例えば、図６２に示すグラフを確認されたい。
【０４８０】
適合がデータの平均経路に密接して追随するが、上述の場合、適合とデータの間の差異があまりにも大きいので、この適合は信頼性がない。走査内あまりにも多くのノイズが含まれている。我々は、許容可能な誤差Ｅに関する閾値、７［同様に、これは重み付けられた平均二乗誤差、ｗＭＳＥである。］を設定することにより、これを定量的に判断することができる。ＡＣＶ−４の場合、我々は、ＸおよびＹを個別に適合したので、Ｒ空間における許容可能な最大ノイズに対する閾値を設定した。
【数２４】
2004530860.tif 000067
ＥＲは、適合が真の信号をはめ込んだと考えられるように、経験的に判断される値より小さくなければならない。
【０４８１】
（負の定量化）
上述のすべての処理が完了した後、数多くの走査は、適合収束するか、放棄される。これらは、観測可能な信号が存在しないものとして分類され、同様に、バックグラウンドだけを用いてモデルとして再適合される。例えば、図６３はＲ合成数、つまり（Ｘ２＋Ｙ２）１／２である。図６４において、Ｒ合成数がバックグラウンド多項式で引き算されている。
【数２５】
2004530860.tif 000068
バックグラウンドが適合された後、残されたノイズの中に隠されている可能性のある最大信号の大きさに関する定量的推定を抽出することが好ましい場合がしばしばある。ソフトウェアが形状を認識するので、我々が検討しなければならないことは、モデル化された信号の形状と類似するノイズ内の振動である。（ＡＣＶ−４において、信号は電圧空間において特徴的な周期を有する。つまり、中央の突出部は、一般に、約０．１６ボルトの完全な１周期を有する。）バックグラウンド適合を差し引いて、残ったものだけを調べることにより、我々は、低周波のバックグラウンドを取り除く。高周波ノイズを取り除くために、（すなわち、信号のような振動だけを考慮して、）我々は残りのものをローパスフィルタにかける。８［ＡＣＶ−４に関する適当なフィルタパラメータを特定するために、我々は、信号を含む数千ものＸ軌跡およびＹ軌跡のパワー周波数域を平均した。これにより、すべての信号を通過させる適当なパラメータを選択するために我々が用いた平均周波数（Ｖ−１）を得た。我々は、一般に、ＩＦＩＲローパスフィルタを用いる。（保管されたＦＩＲフィルタに関し、Ｙ． Ｎ． Ｎｅｕｖｏらにより、ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓ． Ａｃｏｕｓｔ．， Ｓｐｅｅｃｈ， Ｓｉｇｎａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ， ｖｏｌ． ＡＳＳＰ−３２， ｐｐ． ５６３−５７０において記述されている。）］このフィルタを通過する任意の走査は、不明確な信号を意味する可能性のある信号だけを有する。図６５は、フィルタ処理された、信号のようなノイズが先の具体例から残余（未処理）のトップ上で差し引かれることを図示する。
【０４８２】
ＡＣＶ−４において、ベクトル信号は、ＸおよびＹにおいて個別に適合されるので、フィルタ処理された残余は、以下のように定量化される。
【数２６】
2004530860.tif 000069
ＲＭＳ測定は、中心−ピークの測定に変換するために、√２で乗算された。我々は、この残余電流値ｉｒと名付けた。
【０４８３】
ｉｒは、どれほど多くの信号のようなノイズが走査全体に存在するか、その推定値を与えるが、１）フィルタによる減衰、２）我々の信号が走査の信号領域の長さ全体に亙って分散するのではなく、局在化しているという事実、または３）ノイズから信号を抽出するとき、非線形の最適化に関する可能性のある限定を考慮しているわけではない。このため、ｉｒだけでは、可能性のある隠された信号を実際より小さく推定することになる。したがって我々は、Ｃ×ｉｒが観測され得る最大のピーク高さ（ｉｐ）と等しくなるような乗数因子Ｃを導入する。上記具体例において、最大の可能性のある見落された信号は、Ｃ×ｉｒ＝７．５７×１０−１２である。
【０４８４】
（バックグラウンドの減算および情報の抽出）
信号を含む走査において、我々は、適合を得ると、データ解析するために必要な情報をすべて準備したことになる。このモデルをガイドとして、我々は、適合パラメータを用いて、バックグラウンドだけに関する方程式を計算し、データからこれを差し引くことができる。例えば、ＡＣＶ−４において、ＸおよびＹの多項式を差し引くことができる。図６６は元のデータ、図６７はバックグラウンドを差し引いたデータである。
【０４８５】
我々は、関心のある値を計算することができる。例えば、ＡＣＶ−４において、我々は、ＸおよびＹで適合した値に基づいて、ピーク高さｉｐとピーク位置Ｅ０を計算することができる。
【数２７】
2004530860.tif 000070
【数２８】
2004530860.tif 000071
このようにして、我々は、全体の走査を実験的に意味のある数の簡単な部分集合に減らすことができる。
【０４８６】
（結論）
我々は、データ走査を実験的に意味のあるすべての情報が抽出されるものから少数のパラメータに減らす自動化された適合方法を考案した。我々は、２次元のベクトルデータに集中したが、上述の方法の簡略化されたバージョンが１−Ｄ走査を適用する。概略された処理における重要なステップは、１）モデルを仮定するステップ、２）最適位相を計算するために、ベクトル合計を計算するステップ、３）モデルに追随しない挙動を確認するステップ、４）初期推定を形成し、信号の本質的特性を用いて、常軌を逸したノイズの効果を最小限に抑えるステップ、５）多分に重み付けスキームを実行しながら、反復的に適合を最適化するステップ、６）境界条件を強制するステップ、７）瑕疵ある適合を検出し、修正するステップ、８）適合適性を判断するステップ、および９）意味のある定量的情報を抽出するステップを有する。このプロセスを実行するようにコンピュータをプログラムすることにより、我々は、１つの走査から意味のあるデータを、次の走査を測定するために装置が必要とする時間よりも短い時間で、抽出する自動化された適合方法を考案した。
【０４８７】
（実施例２）
（既知の周波数を有し、ノイズを含むデジタル化された正弦波からの位相および振幅の高速抽出）
純粋な正弦波を形成するための極めてクリーンなシステムにおいて、ゼロ交点を見出すことにより波の位相を決定し、局在的な最大値および最小値を見出すことにより振幅を測定することができる。これらの極値を見出すことが難しい場合、代わりに、波のＲＭＳを計算することができ、この場合振幅は、抽出されたＲＭＳ値の（２の平方根）倍となる。しかし、上述したシステムのような純粋な正弦波は、実際の世界のシステムでは稀である。信号に含まれるノイズにより、サンプルが生物学的物質を含む場合は特に、最小値、最大値、ゼロ交点を見出すことは、値を抽出するための方法として、より困難なものとなる。さらに、ＲＭＳ法は、周波数に関係なく、パワーを測定するので、標的信号が振幅において減少するとき、高周波ノイズが支配的となり始め、真の信号を埋没させる。
【０４８８】
非線形回帰技術によれば、ノイズを含むデータから値を信頼性よく抽出することができるが、これらの技術は反復的なプロセスであり、相当な計算時間を必要とする。本実施例は、合計（および差）、再標準化、および基本的座標変換だけを用いたシステムの使用に関する。したがって極めて高速である。同様に
（１周期当たりの相当数のポイントから１周期当たりたった２つのポイントまでの）データの削減に関するすべてを有する合計は、埋め込まれたデバイス内に容易にプログラムすることができ、したがって、収集デバイス（つまり本発明の装置）から、データ操作および記憶デバイス（つまりコンピュータ）へ、より高速にデータ送信できる。
【０４８９】
以下の方程式を用いて、１周期当たり４ｎポイントを有するようにデジタル化された、既知の周波数を有する正弦波から位相および振幅を抽出することができる。ＸおよびＹを形成するために合算することは、任意のノイズを平均化する手段であり、ファームウェア内にプログラムする上で十分に簡単なものである。
【０４９０】
（デカルト座標において、）我々が次式をプロットした場合、
【数２９】
2004530860.tif 000072
原点を中心とする円を形成する。我々が円の４分の１だけをプロットした場合、１つの円の半分からの値を用いたことになる（第１の４分の１をｙのために、第２の４分の１をｘのために）。この部分集合において、我々は、ｙとｘの平均値、すなわちｙ１／２ｃｙｃｌｅバーとｘ１／２ｃｙｃｌｅバーを計算することができる。
【数３０】
2004530860.tif 000073
【数３１】
2004530860.tif 000074
【０４９１】
これらの値は、４分の１円の弧の若干内側にあるポイントを記述し、その角度は、弧の範囲を２分する。これらより、我々は、元の位相および振幅を再生することができる。
【数３２】
2004530860.tif 000075
【０４９２】
これらの平均値を計算するとき、全円からの情報を含むようにするため、我々は、同じ結果を得るために、単にｓｉｎ（ｘ）＝−ｓｉｎ（ｘ＋π／２）という事実を用いることができる。
【数３３】
2004530860.tif 000076
【数３４】
2004530860.tif 000077
【０４９３】
我々は、この挙動を次のように活用することができる。第１に、ＡＣ信号を加え、所望する周波数成分にはめ込む。１周期当たりのポイント数が４で均等に分割できるように、収集速度を選択する。つまり、ｎを整数として４ｎで表せるように選択する。第１のｎポイントは第１の４分の１円に対応し、第２のｎポイントは第２の４分の１円に対応する。以下同様。
【０４９４】
第１の４分の１円におけるｎ個のデータポイントすべてを加え、第３の４分の１円におけるｎ個のデータポイントすべてを差し引くと、規格化されない値を得、これを上述と類似するものと呼ぶ。同様に、第２の４分の１円におけるポイントを加え、第４の４分の１円におけるポイントを差し引くことにより、形成する。データから位相および振幅を抽出するために、我々は、上記ｊおよびＲにつき、方程式において置換するが、デジタル化の際、いくつかの変更を要する。
【数３５】
2004530860.tif 000078
【数３６】
2004530860.tif 000079
【０４９５】
Ｒに関する上記方程式において、Ｃｎは以下のような値を有する。
【表１】
2004530860.tif 000080
（ｎが非常に大きくなると、これらの方程式は、連続する場合の上述の方程式に近似される。１／ｎがゼロに近づくと、Ｃｉｎｆに対してリストされた０．９００３１６の値は、正確に２√２／πである。）
【０４９６】
前頁のボックス内の方程式は、正弦波から位相および振幅を我々が抽出できる処理を記述するもので、この正弦波は、既知の周波数を有し、１周期当たり４ｎポイント有するようにデジタル化される。ｘおよびｙを形成する合計計算は、任意のノイズを平均化する手段であり、ファームウェア内にプログラム可能な程度に十分簡単である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、流入口にゴムガスケットを有するカートリッジを示す。
【図２】図２は、多数の異なった反応チャンバを示す。
【図３】図３は、本発明の好適な実施形態を示す。
【図４】図４は、本発明の好適な実施形態を示す。
【図５】図５は、本発明の好適な実施形態を示す。
【図６】図６は、本発明の好適な実施形態を示す。
【図７】図７は、本発明の好適な実施形態を示す。
【図８】図８は、本発明の好適な実施形態を示す。
【図９】図９は、本発明の好適な実施形態を示す。
【図１０】図１０は、本発明の好適な実施形態を示す。
【図１１】図１１は、本発明の好適な実施形態を示す。
【図１２】図１２は、本発明の好適な実施形態を示す。
【図１３】図１３は、本発明の好適な実施形態を示す。
【図１４】図１４は、本発明の好適な実施形態を示す。
【図１５】図１５は、本発明の好適な実施形態を示す。
【図１】
2004530860.tif 000081
【図２】
2004530860.tif 000082
【図５】
2004530860.tif 000083
【図６】
2004530860.tif 000084
【図８】
2004530860.tif 000085
【図１１】
2004530860.tif 000086
【図１２】
2004530860.tif 000087
【図１３】
2004530860.tif 000088
【図１６】
2004530860.tif 000089
【図１７】
2004530860.tif 000090
【図１８】
2004530860.tif 000091
【図１９】
2004530860.tif 000092
【図２０】
2004530860.tif 000093
【図２１】
2004530860.tif 000094
【図２２】
2004530860.tif 000095
【図２３】
2004530860.tif 000096
【図２４】
2004530860.tif 000097
【図２５】
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【図２６】
2004530860.tif 000099
【図２９】
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【図３０】
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【図３２】
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【図３４】
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【図３５】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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