(57)【要約】Ｃ１炭素基質により増殖することのできる、高増殖メタノトロフィック菌株を単離し特性付けした。この菌株はメタンおよびメタノールの両方を唯一の炭素源として利用することのできるユニークな能力を持ち、機能的エムデン−マイヤーホフ炭素フラックス経路を有することが実証された。この経路を持つことにより、この菌株はエネルギー的に有利となり、Ｃ１炭素源からのバイオマス生産の生産プラットフォームとして特に適したものとなる。
2004530403.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高増殖メタノトロフィック菌株であって、
（ａ）メタンおよびメタノールからなる群から選択される、Ｃ１炭素基質により増殖し、
（ｂ）機能的エムデン‐マイヤーホフ炭素経路を含有し、前記経路はピロリン酸依存性ホスホフルクトキナーゼ酵素をコードする遺伝子を含有し、前記遺伝子は、
（ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子と、
（ｂ）０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、および２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄に０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが続く、ハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離核酸分子と、
（ｃ）配列番号６に記載の配列を持つポリペプチドと比較した時にスミス−ウォーターマン法のアライメントに基づき少なくとも６３％の同一性を有する、少なくとも４３７個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする第一のヌクレオチド配列を含有する単離核酸分子と、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に相補的である単離核酸分子と、
からなる群から選択されることを特徴とする、高増殖メタノトロフィック菌株。
【請求項２】
前記菌株が機能的なエントナー−ドゥドロフ炭素経路を任意に含有する、請求項１に記載の高増殖メタノトロフィック菌株。
【請求項３】
フルクトースビスホスフェートアルドラーゼ酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子を有する、請求項１に記載の菌株。
【請求項４】
少なくとも一つの遺伝子が配列番号１６と配列番号１８とからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するフルクトースビスホスフェートアルドラーゼ酵素をコードする、請求項３に記載の菌株。
【請求項５】
ケト−デオキシホスホグルコネートアルドラーゼをコードする少なくとも一つの遺伝子を有する、請求項２に記載の菌株。
【請求項６】
ケト−デオキシホスホグルコネートアルドラーゼ酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子が、
（ａ）配列番号２０に記載のアミノ酸配列をコードする単離核酸分子と、
（ｂ）０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、および２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄に０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが続く、ハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離核酸分子と、
（ｃ）配列番号２０に記載の配列を持つポリペプチドと比較した時にスミス−ウォーターマン法のアライメントに基づき少なくとも５９％の同一性を有する、少なくとも２１２個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする第一のヌクレオチド配列を含有する単離核酸分子と、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に相補的である単離核酸分子と、
からなる群から選択される、請求項５に記載の菌株。
【請求項７】
炭素フラックスに関与するポリペプチドをコードする遺伝子を有し、前記ポリペプチドは配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０からなる群から選択される、請求項１または２のいずれかに記載の菌株。
【請求項８】
脱窒素酵素経路を任意に含有する、請求項１または２のいずれかに記載の菌株。
【請求項９】
脱窒素経路の酵素が配列番号４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、および６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項８に記載の菌株。
【請求項１０】
細胞外多糖類合成酵素をコードする遺伝子を有し、前記酵素が配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６および３８からなる群から選択される、請求項１または２のいずれかに記載の菌株。
【請求項１１】
イソプレノイド合成酵素をコードする遺伝子を有し、前記酵素が配列番号６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、８６および７８からなる群から選択される、請求項１または２のいずれかに記載の菌株。
【請求項１２】
前記菌株がメチロモナス種（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）である、請求項１に記載の菌株。
【請求項１３】
配列番号８１に記載の１６ｓＲＮＡプロファイルを有する、請求項１２に記載の菌株。
【請求項１４】
前記Ｃ１炭素基質がメタノールであり、前記菌株がバイオマスの乾燥重量の少なくとも約５０％を占めるグリコーゲンを生産する、請求項１に記載の菌株。
【請求項１５】
培地中のメタノール濃度が約２．５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）である、請求項１または請求項１４のいずれかに記載の菌株。
【請求項１６】
消費されたメタン１グラムあたり１．０グラムを超える細胞量の収率を有する、請求項１または請求項２のいずれかに記載の菌株。
【請求項１７】
消費されたメタン１グラムあたり０．５グラムを超える細胞量の収率を有する、請求項１または請求項２のいずれかに記載の菌株。
【請求項１８】
４０ｇ／メタンモル／ｇ／バイオマスモルを超える炭素変換効率を有する、請求項１または請求項２のいずれかに記載の菌株。
【請求項１９】
６５ｇ／メタンモル／ｇ／バイオマスモルを超える炭素変換効率を有する、請求項１または請求項２に記載の菌株。
【請求項２０】
７０ｇ／メタンモル／ｇ／バイオマスモルを超える炭素変換効率を有する、請求項１または請求項２のいずれかに記載の菌株。
【請求項２１】
配列番号８１に記載の１６ｓＲＮＡ配列を含有し、ピロリン酸依存性ホスホフルクトキナーゼ酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子を有する、メタノールおよびメタンからなる群から選択されるＣ１炭素基質により増殖することを特徴とする高増殖メタノトロフィック菌株。
【請求項２２】
ケト−デオキシホスホグルコネートアルドラーゼをコードする少なくとも一つの遺伝子を任意に有する、請求項２０に記載の高増殖メタノトロフィック菌株。
【請求項２３】
ＡＴＣＣ指定ＰＴＡ２４０２を持つことを特徴とする高増殖メタノトロフィック菌株。
【請求項２４】
単細胞タンパク質を生産する方法であって、
ａ）請求項１、２、３、５または１８のいずれかに記載の菌株をメタンおよびメタノールからなる群から選択されるＣ１炭素基質と適した培地中で、単細胞タンパク質の発現と蓄積が行われるに十分な時間接触させる工程と、
ｂ）前記単細胞タンパク質を任意に回収する工程とを有することを特徴とする単細胞タンパク質の生産方法。
【請求項２５】
前記Ｃ１炭素基質を嫌気条件下で前記菌株と接触させる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記Ｃ１炭素基質を好気条件下で前記菌株と接触させる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
請求項８または９のいずれかに記載の菌株をメタンまたはメタノールからなる群から選択されるＣ１炭素基質とを窒素含有化合物の存在下、適した培地中、窒素含有化合物の生体転換が起こるに十分な時間接触させる工程を含有する、アンモニア、硝酸塩、亜硝酸塩および窒素分子からなる群から選択されることを特徴とする窒素含有化合物の生体転換の方法。
【請求項２８】
タンパク質、炭水化物および色素を含有する飼料生成物を生産する方法であって、
ａ）請求項１、２、３、５または１８のいずれかに記載の菌株をＣ１炭素基質と適した培地中、飼料生成物の発現と蓄積が起こるに十分な時間接触させる工程と、
ｂ）前記飼料生成物を任意に回収する工程とを含有することを特徴とする方法。
【請求項２９】
タンパク質、炭水化物および色素の相対組成が配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７および６９からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子のいずれか一つをアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションすることを通じて変更される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１に記載の高増殖メタノトロフィック菌株を同定する方法であって、
（ａ）高増殖メタノトロフィック菌株を含有すると思われるサンプルを適した増殖培地上で唯一の炭素源としてメタンの存在下に増殖させる工程と、
（ｂ）工程（ａ）の条件で増殖するコロニーを同定する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で同定されたコロニーを、そのピロリン酸依存性ホスホフルクトキナーゼ活性の有無について分析する工程とを含有する、方法。
【請求項３１】
工程（ｂ）のコロニーに対し、
（ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子と、
（ｂ）０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、および２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄に０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが続く、ハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離核酸分子と、
（ｃ）配列番号６に記載の配列を持つポリペプチドと比較した時にスミス−ウォーターマン法のアライメントに基づき少なくとも６３％の同一性を有する、少なくとも４３７個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする第一のヌクレオチド配列を含有する単離核酸分子と、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に相補的である単離核酸分子と、
からなる群から選択される遺伝子の有無をさらに分析する請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は２０００年９月１日に提出した米国仮出願第６０／２２９、８５８号の恩恵に浴すことを請求する。
【０００２】
発明の分野
本発明は微生物の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は商業的に有用な製品をより効率的に生産するために中心炭素経路を利用した新規のメタノトロフィック菌株の使用に関する。
【０００３】
発明の背景
メタノトロフィック菌は唯一の炭素およびエネルギー源としてメタンが使用できることにより定義される。メタンの酸化においてメタノールは必ず生じる中間体であるが、その有毒性により、メタノールのみで増殖できる能力に関しては偏性メタノトロフィック菌間で大きく異なる（Ｇｒｅｅｎ、  Ｐｅｔｅｒ．  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉａ．  Ｉｎ：Ｍｅｔｈａｎｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈａｎｏｌ  Ｕｔｉｌｉｚｅｒｓ  （Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋｓ  ５）Ｊ．  Ｃｏｌｉｎ  Ｍｕｒｒｅｌｌ  ａｎｄ  Ｈｏｗａｒｄ  Ｄａｌｔｏｎ  ｅｄｓ．  １９９２  Ｐｌｅａｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  ＮＹ、  ｐｐ．２３−８４）。メタンモノオキシゲナーゼはメタン活性化の最初の工程で必要とされる酵素であり、この反応の生成物がメタノールである（Ｍｕｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、  Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  （２０００）、１７３（５−６）、３２５−３３２）。この反応は周囲温度と圧力で生じるが、メタンをメタノールへと化学的変換させるには数１００度の温度と高い圧力が必要である（Ｇｒｉｇｏｒｙａｎ、  Ｅ．  Ａ．、  Ｋｉｎｅｔ．  Ｃａｔａｌ．  （１９９９）、  ４０（３）、  ３５０−３６３、  ＷＯ  ２０００００７７１８、米国特許第５７５０８２１号）。このメタンを周囲条件の下で変換できるという点、およびメタンが豊富に存在する点により、メタンの生体転換は潜在的にユニークで価値あるプロセスとなっている。
【０００４】
メタンの生体転換は歴史的に見ると大きくわけて３つのカテゴリーで商業的に使用されてきた：すなわち、１）単細胞タンパク質の生産（Ｓｈａｒｐｅ  Ｄ．  Ｈ．  ＢｉｏＰｒｏｔｅｉｎ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ  （１９８９）．  Ｅｌｌｉｓ  Ｈｏｒｗｏｏｄ  ｓｅｒｉｅｓ  ｉｎ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｈａｌｓｔｅａｄ  Ｐｒｅｓｓ）  （Ｖｉｌｌａｄｓｅｎ、  Ｊｏｈｎ、  Ｒｅｃｅｎｔ  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅａｃｔ．  Ｅｎｇ．、  ［Ｐｒｏｃ．  Ｉｎｔ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅａｃｔ．  Ｅｎｇ．  Ｃｏｎｆ．］、  ２ｎｄ  （１９８７）、  Ｖｏｌｕｍｅ  ２、  ３２０−３３．    Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：  Ｋｕｌｋａｒｎｉ、  Ｂ．  Ｄ．、  Ｍａｓｈｅｌｋａｒ、  Ｒ．  Ａ．、  Ｓｈａｒｍａ、  Ｍ．  Ｍ．  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：  Ｗｉｌｅｙ  Ｅａｓｔ．、  Ｎｅｗ  Ｄｅｌｈｉ、  Ｉｎｄｉａ、  Ｎａｇｕｉｂ、  Ｍ．、Ｐｒｏｃ．  ＯＡＰＥＣ  Ｓｙｍｐ．  Ｐｅｔｒｏｐｒｏｔｅｉｎ、  ［Ｐａｐ．］  （１９８０）、  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９７９、  ２５３−７７  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：  Ｏｒｇａｎ．  Ａｒａｂ  Ｐｅｔ．  Ｅｘｐｏｒｔｉｎｇ  Ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ、  Ｋｕｗａｉｔ、  Ｋｕｗａｉｔ）、２）化学製品製造のためのアルケン類のエポキシ化（米国特許第４、３４８、４７６号）、および３）塩素化された汚染物質の生分解（Ｔｓｉｅｎら、  Ｇａｓ、  Ｏｉｌ、  Ｃｏａｌ、  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２、  ［Ｐａｐ．  Ｉｎｔ．  ＩＧＴ  Ｓｙｍｐ．  Ｇａｓ、  Ｏｉｌ、  Ｃｏａｌ、  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．］、  ２ｎｄ  （１９９０）、  ８３−１０４．  Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：  Ａｋｉｎ、  Ｃａｖｉｔ、  Ｓｍｉｔｈ、  Ｊａｒｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：  Ｉｎｓｔ．  Ｇａｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．、  Ｃｈｉｃａｇｏ、  ＩＬ．、ＷＯ  ９、６３３、８２１、  Ｍｅｒｋｌｅｙら、  Ｂｉｏｒｅｍ．  Ｒｅｃａｌｃｉｔｒａｎｔ  Ｏｒｇ．、  ［Ｐａｐ．  Ｉｎｔ．  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｏｎ−Ｓｉｔｅ  Ｂｉｏｒｅｃｌａｍ．  Ｓｙｍｐ．］、  ３ｒｄ  （１９９５）、  １６５−７４．  Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：  Ｈｉｎｃｈｅｅ、  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｅ、  Ａｎｄｅｒｓｏｎ、  Ｄａｎｉｅｌ  Ｂ．、  Ｈｏｅｐｐｅｌ、  Ｒｏｎａｌｄ  Ｅ．  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：  Ｂａｔｔｅｌｌｅ  Ｐｒｅｓｓ、  Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、  ＯＨ．：  Ｍｅｙｅｒら、  Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｒｅｌｅａｓｅｓ  （１９９３）、  ２（１）、  １１−２２）である。生成物の収率の低さ、生成物の有毒性および生成物を製造するのに多量の細胞量が必要である点で、アルケン類のエポキシ化だけが、商業的には殆ど成功していない。
【０００５】
単細胞タンパク質、またはＳＣＰと呼ばれるメタンからのタンパク質の大規模生産は技術的に実行が可能であり大規模に商業化されている（上記のＶｉｌｌａｄｓｅｎ）。しかし、ＳＣＰは農業により得られたタンパク質（例えば大豆タンパク）と比較し、微生物タンパク質を生産するコストが比較的高いために、経済的には決して成功しているわけではない。単細胞タンパク質は比較的低価値の生産物であり、したがってバイオプロセスのコストが高いと経済的な生産は不可能である。このためメタノトロフィック菌株の収率がこのプロセスが総合的に経済的に生き残ることができるかという点で極めて重要となる。メタノトロフィック菌により生産される微生物バイオマスは通常極めてタンパク質含有量が高い（約７０から８０重量パーセント）ため、直接このタンパク質を使用するのはある種の動物の飼料のみに制限される場合もある。
【０００６】
Ｃ１化合物をＣ−Ｃ結合を有する複合分子へと変換することは難しく、従来の化学合成経路によれば資本集約的プロセスとなる。従来、メタンは最初に合成ガス（水素、一酸化炭素および二酸化炭素の混合物）へと変換され、それからその他の出発物質として用いられる低分子量の工業材料を製造するのに使用されてきた。通常これらはアセテート、ホルムアルデヒド、またはメタノールといった「必需品」タイプの化学物質である。基本的な問題はメタン分子の活性化で、これは化学的手段で行うのは熱力学的に極めて困難である。「活性化」とは化学的に非反応的なメタン分子をより反応的にするプロセスを指す。
【０００７】
メタノトロフィック菌株には酵素（メタンモノオキシゲナーゼ）が含まれており、これが周囲温度と圧力でのメタンの活性化を行う能力を持っている。メタン活性化はメタン内に酸素を挿入し、細胞中でさらに複雑な分子へとはるかに容易に代謝される、メタノールを形成することである。メタノトロフィック菌株中には２つの型のメタンモノオキシゲナーゼが発見されている。粒子状のメタンモノオキシゲナーゼ（ｐＭＭＯ）は基質特異性が狭く、より複雑な分子中には酸素を挿入することができない。メタノトロフィック菌のすべてではないが、そのいくつかは、可溶性のメタンモノオキシゲナーゼ（ｓＭＭＯ）を含有する。この酵素は、広範囲の脂肪族および芳香族分子を酸化する能力、すなわちより機能的にする能力を持つため、多くの調査と所有権請求の対象となっている。この特性は、ｓＭＭＯにより変換させるべきより複雑な分子と、メタンとをメタノトロフィック菌株に供給する、共代謝性生産プロセスに利用されてきた。メタンとトルエン、ナフタレン、あるいはデカンなど通常は石油由来の原料の両方が必要である、ｓＭＭＯが作用するプロセスが多数報告されている。しかし、これらの共代謝性変換に対し、これらのメタノトロフィック菌株を用いてメタンから化学物質を純粋に合成するものに関しては何らの技術も報告されていない。純粋な合成のためには、所望の化学物質を生産するように菌株を遺伝子工学的に操作する能力に加えて単に廉価なメタンだけが必要なのである。
【０００８】
メタノトロフィック菌はさらにメタンの酸化生成物（例えばメタノールとホルムアルデヒド）からタンパク質、炭水化物および脂質などのより複雑な分子中を組み立てることができる。例えば、ある条件下で、メタノトロフィック菌株は細胞外多糖類を生産することが知られている（Ｉｖａｎｏｖａら、  Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｙａ  （１９８８）、  ５７（４）、  ６００−５、  Ｋｉｌｂａｎｅ、  Ｊｏｈｎ  Ｊ．、  ＩＩ  Ｇａｓ、  Ｏｉｌ、  Ｃｏａｌ、  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３、  ［Ｐａｐ．  ＩＧＴ’ｓ  Ｉｎｔ．  Ｓｙｍｐ．］、  ３ｒｄ  （１９９１）、  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９０、  ２０７−２６．  Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：  Ａｋｉｎ、  Ｃａｖｉｔ、  Ｓｍｉｔｈ、  Ｊａｒｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：  ＩＧＴ、  Ｃｈｉｃａｇｏ、  ＩＬ）。同様にメタノトロフィック菌株はさまざまな炭素長のイソプレノイド化合物やカロチノイド色素を蓄積することが知られている（Ｕｒａｋａｍｉら、  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  （１９８６）、  ３２（４）、  ３１７−４１）。これらの化合物はメタノトロフィック菌株中で同定されているものの、これらの生物では遺伝子系があまり発達しておらず、化学物質の代謝工学が限られるため、生産のための細菌プラットフォームとしては選択されなかった。
【０００９】
メタノトロフィック菌の代謝工学に必要な先行条件は最大増殖および／または生成物の収率のための炭素代謝の完全な理解と最適化である。偏性メタノトロフィック菌はケト−デオキシホスホグルコネートアルドラーゼ酵素を用いるエントナー−ドゥドロフ経路によりメタンの炭素から有用な生成物およびエネルギーを導くものと通常考えられている（Ｄｉｊｋｈｕｉｚｅｎ、  Ｌ．、  Ｐ．Ｒ．  Ｌｅｖｅｒｉｎｇ、  Ｇ．Ｅ．  ＤｅＶｒｉｅｓ  １９９２．  Ｉｎ：  Ｍｅｔｈａｎｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈａｎｏｌ  Ｕｔｉｌｉｚｅｒｓ  （Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋｓ  ５）  Ｊ．  Ｃｏｌｉｎ  Ｍｕｒｒｅｌｌ  ａｎｄ  Ｈｏｗａｒｄ  Ｄａｌｔｏｎ  ｅｄｓ．  １９９２  Ｐｌｅａｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  ＮＹ  ｐｐ  １４９−１８１）。この経路はエムデン‐マイヤーホフ経路の場合のようにエネルギーを生じるものではない。したがって、エムデン‐マイヤーホフ経路を利用するとエントナー−ドゥドロフ経路を用いる生物と比較し、細胞生産収率が低下し、二酸化炭素として生産される炭素の比率が高くなる。したがって、よりエネルギー効率のよい炭素処理経路があれば、物質生産のためのメタノトロフィック菌プラットフォームの商業的生き残りがより確実になるであろう。
【００１０】
上に述べたように、メタノトロフィック菌は単細胞タンパク質、細胞外多糖類およびイソプレノイドおよびカロチノイド色素などの長鎖炭素分子といった物質を生産する商業的に有効なプラットフォームとなる可能性を有している。より広範囲な化学物質の生産に対する、メタノトロフィック菌株の有用性は、しかし、メタノトロフィック菌株の増殖速度が比較的遅いこと、メタンの代替基質であるメタノールに対する耐性が限られていること、遺伝子工学の難しさ、メタノトロフィック菌株に存在する複数の炭素同化経路の役割がよく理解できていないこと、およびメタンなど完全飽和物質により要求される酸素の潜在的なコスト高などを始めとするいくつかの制限事項により限られている。したがって解決すべき問題は、増殖が速く、収率のよい、標準的遺伝子操作により外来遺伝子を受け取ることのできる、メタノトロフィック菌株を開発することである。中心的炭素代謝経路の全面的かつ速やかな解明は新製品のための経路工学および炭素フラックスマネージメントを可能にするのに必要不可欠である。
【００１１】
本出願人は前記の問題をメタノールまたはメタンのいずれかを炭素基質として効率良く用いることのできるメタノトロフィック菌株を提供することにより解決した。この菌株はまたホルムアルデヒドからの炭素を３Ｃ単位へと導入するための複数の経路を持つ点で代謝的に多能である。この菌株中でホスホフルクトキナーゼおよびフルクトース１，６ビスホスフェートアルドラーゼが見出されたことから、エントナー−ドゥドロフ経路に加えエネルギー的により有利であるエムデン‐マイヤーホフ経路が利用できることが示唆される。本菌株は単細胞タンパク質に加え、炭水化物、色素、テルペノイド化合物および芳香族化合物を始めとするさまざまな物質の産生に有用であることがわかった。メタンまたはメタノールからの多量の炭水化物の生成をこの菌株により行うことができる。これは驚くべきことであり、この事によりこの菌株はアルコール、酸およびケトン類などの典型的な炭水化物または糖発酵最終生成物の製造に使用できる。本菌株はまた細菌の接合として知られている標準的遺伝子操作によって大腸菌などのドナー種と遺伝子交換が可能であることがわかった。このようにして、この菌株は、天然産出以外の新しいクラスの生産物をメタンから純粋に合成によって製造するように工学することができる。
【００１２】
発明の概要
本発明はＣ１炭素基質により増殖することのできるメタノトロフィック菌株を提供する。この菌株はメタノールまたはメタンのいずれかを唯一の炭素源として、速やかにまた効率良く増殖できる能力によりさらに特徴づけられている。この効率の高さは、機能的エムデン‐マイヤーホフ経路内のピロリン酸結合ホスホフルクトキナーゼ酵素の存在によるものである。これはメタノトロフィック菌株で新しく観察されたことである。機能的には、エントナー−ドゥドロフ経路反応ではなく、エムデン‐マイヤーホフ経路とピロリン酸の利用により、より高い収率、炭素変換効率および増殖速度によって示される、極めて有利な細胞エネルギー特性が得られる。
【００１３】
本発明の菌株はまた硝酸塩あるいは亜硝酸塩を還元し、気体状の窒素酸化物を形成することのできる酵素系を含有する。この能力は酸素要求量を引き下げ、埋め立て、廃水処理システム、あるいはメタン、酸素および硝酸塩の存在する場所であればいずれの場所であってもよいが、メタン含有環境における、硝酸塩および亜硝酸塩の除去に有用である。
【００１４】
デンプン、ポリグルコースおよび／または細胞外多糖類の形で多量の炭水化物を形成する能力はまた炭水化物ベース製品の生産に有用である。さらにメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａはメタンまたはメタノールでのみ増殖が可能であり、人の体内では増殖ができないため完全に無害であり非病原性である。これらの特性によりこの菌株はさまざまな比率で炭水化物／タンパク質を含有する動物の飼料を始めとする広範囲の製品を生産するために理想的な有用性を有する。
【００１５】
本菌株は遺伝子交換を行うことができ、外来遺伝子の発現が可能であることが示されている。さらに本菌株は配列番号８１に示す特徴的な１６ｓＲＮＡ配列により同定することができる。
【００１６】
さらに、本発明は単細胞タンパク質、炭水化物およびカロチノイド色素、またはタンパク質、色素および炭水化物を含有する、より価値の高い混合物を生産する方法を提供する。さらに本菌株はメタンまたはメタノールを炭素源として用いて硝酸塩または亜硝酸塩を一酸化二窒素へと変換するための脱窒素剤として使用することができる。
【００１７】
したがって本発明は高増殖メタノトロフィック菌株を提供するものであり、これは
（ａ）メタンおよびメタノールからなる群から選択される、Ｃ１炭素基質により増殖し、
（ｂ）機能的エムデン‐マイヤーホフ炭素経路を含有し、前記経路はピロリン酸依存性ホスホフルクトキナーゼ酵素をコードする遺伝子を含有し、前記遺伝子は、
（ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列をコードする単離核酸分子と、
（ｂ）０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、および２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄に０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが続く、ハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離核酸分子と、
（ｃ）配列番号６に記載の配列を持つポリペプチドと比較した時にスミス−ウォーターマン法のアライメントに基づき少なくとも６３％の同一性を有する、少なくとも４３７個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする第一のヌクレオチド配列を含有する単離核酸分子と、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に相補的である単離核酸分子と、
からなる群から選択される。
【００１８】
本菌株は機能的エムデン‐マイヤーホフ炭素経路の一部としてフルクトースビスホスフェートアルドラーゼ酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子を任意に含有してもよい。さらに、本発明の菌株は機能的エントナー−ドゥドロフ炭素経路を任意に含有してもよく、ここでエントナー−ドゥドロフ炭素経路はケト−デオキシホスホグルコネートアルドラーゼをコードする少なくとも一つの遺伝子を含有するものである。
【００１９】
一つの実施様態において、本菌株は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０からなる群から選択されるポリペプチドをコードするその他の炭素フラックス遺伝子を含有してもよい。
【００２０】
もう一つの実施様態において、本菌株は脱窒素経路を含有してもよく、ここでこの経路は配列番号４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８および６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含有してもよい。
【００２１】
もう一つの実施様態において、本菌株は１組の細胞外多糖類合成酵素を含有してもよく、ここで前記細胞外多糖類合成酵素は配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６および３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有してもよい。
【００２２】
さらに特定の実施様態において、本菌株はイソプレノイド合成酵素をコードする遺伝子を含有してもよく、前記酵素は配列番号６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、８６および７８からなる群から選択される。
【００２３】
好ましい実施様態において、本発明は
ａ）本高増殖メタノトロフィック菌株をメタンおよびメタノールからなる群から選択されるＣ１炭素基質と、適した培地の中で、単細胞タンパク質の発現と蓄積が行われるのに十分な時間接触させる工程と、
ｂ）前記単細胞タンパク質を任意に回収する工程と、
を有する、単細胞タンパク質の生産方法を提供する。
【００２４】
本発明のさらなる目的は本高増殖メタノトロフィック菌株をメタン、あるいはメタノールからなる群から選択されるＣ１炭素基質と窒素含有化合物の存在下に、適した培地中で、前記窒素含有化合物の生体転換が行われるのに十分な時間接触させることを有する、アンモニア、硝酸塩、亜硝酸塩、および窒素分子からなる群から選択される窒素含有化合物の生体転換の方法を提供することである。
【００２５】
同様に、本発明の目的は、
ａ）高増殖メタノトロフィック菌株を適した培地中で飼料生成物の発現と蓄積が行われるのに十分な時間、Ｃ１炭素基質と接触させる工程と、
ｂ）前記飼料生成物を任意に回収するの工程と、
を有する、タンパク質、炭水化物および色素を含有する飼料生成物を生産する方法を提供することである。
【００２６】
任意に、タンパク質、炭水化物および色素の相対的組成が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７および６９からなる群から選択される、タンパク質をコードする遺伝子のいずれか一つのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを通じて変更される。
【００２７】
好ましい実施様態において、本発明は、
（ａ）高増殖メタノトロフィック菌株を含有すると思われるサンプルを適した増殖培地上で唯一の炭素源としてのメタンの存在下で増殖させる工程と、
（ｂ）工程（ａ）の条件の下で増殖するコロニーを同定する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で同定されたコロニーにピロリン酸依存性ホスホフルクトキナーゼ活性があるかどうかを分析する工程と、
を有する高増殖メタノトロフィック菌株を同定する方法を提供する。
【００２８】
本発明は本出願の一部を形成する下記の詳細な説明と添付の配列の記載からより完全に理解することができる。
【００２９】
下記の配列の記載およびそれに添付の配列表は３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１−１．８２５に記載の特許出願におけるヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列の開示を規定する規則にしたがうものである。この配列の記載にはここに参照として援用するＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３：３０２１−３０３０  （１９８５）およびＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２１９  （Ｎｏ．  ２）：３４５−３７３  （１９８４）に記載のＩＵＰＡＣ−ＩＹＵＢ標準に準じて定義されるヌクレオチド配列キャラクター用の一文字コードとアミノ酸用の三文字コードを含有する。ヌクレオチドならびにアミノ酸のために使用する記号とフォーマットは３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に定義する規則に準じるものである。
【００３０】
【表１】
2004530403.tif 000003
【００３１】
【表２】
2004530403.tif 000004
【００３２】
出願人は特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条件に基づき下記の生物寄託を行った。
【００３３】
【表３】
2004530403.tif 000005
【００３４】
発明の詳細な説明
本発明はタンパク質、炭水化物および色素を含有するバイオマスの生産に有用な高増殖メタノトロフィック菌株の単離と特性決定を記載する。本菌株はＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．としての１６ｓＲＮＡ型であり、ここではＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａと呼ぶ。さらに、本菌株は動物飼料生成を目的とした、タンパク質、炭水化物および色素の混合物の生産に有用である。本菌株はさまざまな物質およびバイオマスの生産プラットフォームとしてこの菌株がエネルギー的に有利となるような、ピロリン酸依存性ホスホフルクトキナーゼ遺伝子を含有する活性なエムデン‐マイヤーホフ炭素フラックス経路の利点を有する。さらに本菌株はこの菌株固有の色素の生成のための活性イソプレノイド経路を天然に有する。本開示においては数多くの用語と省略形が用いられている。下記の定義を提供する。
【００３５】
「エムデン‐マイヤーホフ経路」とはグルコースおよびフルクトースなどのヘキソースをグリセルアルデヒド−３−ホスフェート、ジヒドロキシアセトンホスフェート、ホスホフェノールピルベートおよびピルベートなどの重要な細胞のＣ３中間体へと変換するための一連の生化学的反応を指す。これらの反応が進行すると通常ＡＴＰの形で生化学的に有用なエネルギーが純益として得られる。エムデン‐マイヤーホフ経路独自のキー酵素はホスホフルクトキナーゼとフルクトース−１，６ビスホスフェートアルドラーゼである。
【００３６】
「エントナー−ドゥドロフ経路」とはグルコースあるいはフルクトースなどのヘキソースを生化学的に有用なエネルギーを最終的に生産することなく、ピルベートやグリセルアルデヒド−３−ホスフェートなどの重要な細胞のＣ３中間体へと変換する一連の生化学反応を指す。エントナー−ドゥドロフ経路独自のキー酵素は６ホスホグルコネートデヒドラターゼとケトデオキシホスホグルコネートアルドラーゼである。
【００３７】
経路中の遺伝子の存在に関して使用される「診断的」という用語は、その活性を持つ遺伝子が同定されれば、その経路が存在する証拠となる、ということを意味する。本発明においては、ピロリン酸依存性ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子の存在はエムデン‐マイヤーホフ炭素経路の存在にとって「診断的」であり、ケトデオキシホスホグルコネートアルドラーゼをコードする遺伝子の存在はエントナー−ドゥドロフ炭素経路の存在にとって「診断的」である。
【００３８】
「収率」という用語はここで代謝される炭素基質１グラム当たり生産される細胞の量として定義される。
【００３９】
「炭素変換効率」とはどれくらいの量の炭素が細胞量へ同化されるかの尺度であり、バイオマス組成をＣＨ２Ｏ０．５Ｎ０．２５と仮定して計算される。
【００４０】
「高増殖メタノトロフィック菌株」とはメタンまたはメタノールを唯一の炭素およびエネルギー源として増殖することができる菌株を指し、これは機能的エムデン‐マイヤーホフ炭素フラックス経路を有し、代謝されるＣ１基質１グラム当たり収率で表される細胞量を生じる。ここで記載される特定の「高増殖メタノトロフィック菌株」は「Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａ」または「１６ａ」とよばれ、これらはここで互換性を持つ用語として使用される。
【００４１】
「Ｃ１炭素基質」という用語は炭素−炭素結合を持たない任意の炭素含有分子を指す。例としてはメタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸、メチル化アミンおよびメチル化チオールがあげられる。
【００４２】
「機能的脱窒素酵素経路」とは、硝酸塩または亜硝酸塩を酸化窒素、一酸化窒素または最終的に窒素分子などのより還元された生成物へと順次還元する一連の酵素を指す。このプロセスはエネルギーを生じるものであってもそうでなくてもよい。
【００４３】
「脱窒素」とは硝酸塩または亜硝酸塩を気体の窒素分子またはその他の気体の窒素酸化物へと変換するプロセスを指す。脱窒素を促進するために、本菌株は亜硝酸塩（ＮＯ２）の酸化窒素への還元を触媒する亜硝酸塩レダクターゼをコードするｎｉｒ遺伝子（ｎｉｒＤ、ｎｉｒＦ、ｎｉｒＧ、ｎｉｒＨ、ｎｉｒＪ、ｎｉｒＬおよびｎｉｒＳ）、硝酸塩（ＮＯ３）の亜硝酸塩（ＮＯ２）への還元を触媒する硝酸塩レダクターゼをコードするｎａｓＡ遺伝子、および酸化窒素（ＮＯ）の亜酸化窒素（Ｎ２Ｏ）への還元を触媒する酸化窒素レダクターゼをコードするｎｏｒ遺伝子（ｎｏｒＢ、ｎｏｒＣまたはｎｏｒＺ）を始めとする脱窒素経路中の多数の酵素をコードする遺伝子を含有する。
【００４４】
「イソプレノイド化合物」とはピロリン酸イソペンテニルにより開始する経路を経て派生し、５、１０、１５、２０、３０または４０炭素原子長であってよい、イソプレン単位の頭尾縮合により形成される化合物である。「イソプレノイド色素」とは通常強力な光吸収性を持ち、炭素原子５、１０、１５、２０、２５、３０または４０個のイソプレン鎖の頭尾縮合により生成される１クラスの化合物を指す。これらのイソプレン鎖は最終的にはピロリン酸イソペンテニルから派生する。イソプレノイド生合成経路をコードする本菌株関連の多数の遺伝子および遺伝子生成物としては、１−デオキシキシルロース−５−ホスフェートシンターゼをコードする、ｄｘｓ遺伝子、１−デオキシキシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼをコードするｄｘｒ遺伝子、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシチジルトランスフェラーゼ酵素をコードする「ｉｓｐＤ」遺伝子、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチルエリスリトールキナーゼをコードする「ｉｓｐＥ」遺伝子、２Ｃ−メチル−ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスフェートシンターゼをコードする「ｉｓｐＦ」遺伝子、ＣＴＰシンターゼをコードする「ｐｙｒＧ」遺伝子、ゲラニルトランスフェラーゼまたはファルネセイルジホスフェートシンターゼをコードする「ｉｓｐＡ」遺伝子、ジアポフィトエンデヒドロゲナーゼをコードする「ｃｔｒＮ」および「ｃｔｒＮ１」遺伝子があげられる。
【００４５】
「単細胞タンパク質」は「ＳＣＰ」と略記され、単細胞（ｕｎｉｃｅｌｌｕｌａｒ、またはｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ）状態で存在する生体から派生するタンパク質を指す。これには単細胞バクテリア、酵母、真菌、あるいは藻類などの真核単細胞が含まれる。
【００４６】
「細胞外多糖類（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅまたはｅｘｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）」とは「ＥＳＰ」と略記され、メタノトロフィック菌株により生産され、通常架橋炭水化物ポリマーとして炭水化物「主鎖」を有する多糖類を指す。これらのポリマーは菌体の外に排出され表面への接着において、または環境ストレスに対する応答として機能する。本発明の菌株はＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼをコードする「ｕｇｐ」遺伝子、グリコシルトランスフェラーゼをコードする「ｇｕｍＤ」および［ｗａａＥ］遺伝子、多糖類エクスポートタンパク質をコードする「ｗｚａ」および［ｅｐｓＢ］遺伝子、多糖類生合成関連タンパク質をコードする「ｅｐｓＭ」遺伝子およびシュガートランスフェラーゼをコードする「ｅｐｓＶ」遺伝子を始めとする、細胞外多糖類の合成におけるさまざまな工程をコードする多数の遺伝子を含有する。
【００４７】
「炭水化物」とはグリコーゲンまたはデンプンなどの糖を含有する（とりわけ保存型の）成分および細胞外多糖類を指す。
【００４８】
「醗酵生成物」とはメタンあるいはメタノールからメタノトロフィック菌株により形成される炭水化物の醗酵により派生する生成物を指す。
【００４９】
「粒状メタンモノオキシゲナーゼ」とは「ｐＭＭＯ」と略記され、酸素を酵素基質内に挿入する膜会合メタンモノオキシゲナーゼを指す。
【００５０】
「可溶性メタンモノオキシゲナーゼ」とは「ｓＭＭＯ」と略記され、可溶性の、原形質中に局在する細胞質メタンモノオキシゲナーゼを指す。
【００５１】
ここで用いる「単離核酸断片」とは一本鎖またはニ本鎖の、合成、非天然あるいは変性ヌクレオチド塩基を含有していてもよい、ＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形の単離核酸断片はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの一つ以上のセグメントからなっていてもよい。
【００５２】
「遺伝子」とは、コード配列の前の調節配列（５’非コード配列）と、コード配列の後ろの調節配列（３’非コード配列）を含有する、ある特定のタンパク質を発現する核酸断片を指す。「天然遺伝子」とは天然に、それ自身の調節配列と共に見出される遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、天然遺伝子ではなく、天然には一緒に見い出すことのない調節配列とコード配列を含有する遺伝子を指す。したがって、キメラ遺伝子とは異なる源から得られた調節配列とコード配列とを有するか、あるいは同じ源から得られているが、天然には見られない形で配置されている調節配列とコード配列を有するものであってよい。「内在性遺伝子」とは生体のゲノム中の天然の部位に存在する天然遺伝子を意味する。「異種」遺伝子とは宿主生体中にふつうには見られない遺伝子であり、遺伝子移入によって宿主生体中に導入された遺伝子を指す。異種遺伝子としてはそれがもともと存在するのではない生体中に挿入された天然遺伝子、あるいはキメラ遺伝子を含むことができる。「導入遺伝子」とは形質転換操作によりゲノム中に導入された遺伝子である。
【００５３】
「同一性パーセント」とは当分野ですでに知られているように、二つ以上のポリペプチド配列、または二つ以上のポリヌクレオチド配列を比較することによって求められるそれらの間の関係である。当分野において、「同一性」とはまたポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列の関連している度合いを意味し、場合によってはこのような配列のストリング間のマッチにより決定される。「同一性」と「類似性」は既知の方法により簡単に計算することができ、このような方法としてはこれに限るわけではないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｌｅｓｋ、  Ａ．  Ｍ．、  ｅｄ．）  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、  ＮＹ  （１９８８）、  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ  （Ｓｍｉｔｈ、  Ｄ．  Ｗ．、  ｅｄ．）  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、  ＮＹ  （１９９３）、  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、  Ｐａｒｔ  Ｉ  （Ｇｒｉｆｆｉｎ、  Ａ．  Ｍ．、  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ、  Ｈ．  Ｇ．、  ｅｄｓ．）  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、  ＮＪ  （１９９４）、  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ、  Ｇ．、  ｅｄ．）  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８７）、および  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ  （Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、  Ｍ．  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、  Ｊ．、  ｅｄｓ．）  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、  ＮＹ  （１９９１）に記載されている。同一性を求める好ましい方法は、テストされる配列間にもっともよいマッチを与えるように設計される。同一性および類似性の決定方法は公に入手可能なコンピュータプログラム中に体系化されている。配列決定および同一性パーセントの計算はＬＡＳＥＲＧＥＮＥ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ｓｕｉｔｅ  （ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、  Ｍａｄｉｓｏｎ、  ＷＩ）のＭｅｇａｌｉｇｎ  ｐｒｏｇｒａｍを用いて行ってもよい。複数の配列決定はＣｌｕｓｔａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ  （１９８９）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３）によりデフォルトパラメータ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）で行った。Ｃｌｕｓｔａｌ  ｍｅｔｈｏｄを用いたペア配列のためのデフォルトパラメータはＫＴＵＰＬＥ  １、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５であった。
【００５４】
適した核酸断片（本発明の単離ポリヌクレオチド）はここに報告したアミノ酸配列に少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％同一であるポリペプチドをコードする。好ましい核酸断片はここに報告したアミノ酸配列に少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列をコードする。さらに好ましい核酸配列はここにに報告した核酸配列の少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列をコードする。もっとも好ましいものはここに報告したアミノ酸配列に少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸断片である。適した核酸断片は上記の同一性をもつのみならず、通常少なくとも５０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも２００個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも２５０個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
【００５５】
核酸分子は、一本鎖系の核酸分子を温度、溶液イオン強度が適当である条件の下で他の核酸分子にアニールできる時、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、あるいはＲＮＡなどの他の核酸分子に対し「ハイブリダイゼーション可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件はよく知られておりＳａｍｂｒｏｏｋ、  Ｊ．、  Ｆｒｉｔｓｃｈ、  Ｅ．  Ｆ．  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ、  Ｔ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  （１９８９）、特に１１章と表１１．１に例示されている（その全体をここに参照として援用する）。温度、イオン強度の条件はハイブリダイゼーションの「厳重さ」を決定する。厳重さの条件は遠縁の生物からの相同配列などの中等度に類似した断片のスクリーンから近縁の生物からの機能的酵素を複製する遺伝子などの極めて類似性の高い断片のスクリーンまで調節することが可能である。ハイブリダイゼーション後の洗浄が厳重さ条件を決定する。好ましい条件の１つの組み合わせとしては、６ＸＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを室温で１５分間、それから２ＸＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを４５°Ｃで３０分間、その後０．２ＸＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを５０°Ｃで３０分間２回くりかえすものである。より好ましい厳重条件は、より高温を用いるもので、洗浄は上記と同様で最後の０．２ＸＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの３０分間の２回の洗浄を６０°Ｃで行うようにする点が異なる。もう一つの好ましいかなり厳重な条件は２回の最終洗浄０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを６５°Ｃで行うものである。さらにもうひとつ好ましい厳重条件があるが、これは６５°Ｃの０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを行い、そして２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄し、さらに０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄するものである。
【００５６】
ハイブリダイゼーションには二つの核酸が相補的配列を持つことが必要であるが、ハイブリダイゼーションの厳重さによっては塩基間のミスマッチも起こりうる。核酸のハイブリダイゼーションに対する適切な厳重さは当該分野で公知の変数である、核酸の長さおよび相補性の度合いに依存する。二つのヌクレオチド配列間の類似性または同一性の度合いが大きい程、これらの配列を有する核酸のハイブリッドのＴｍ値が大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（Ｔｍの高さに相当する）は下記の順に減少する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。全長１００個を超すヌクレオチドのハイブリッドの場合、Ｔｍ計算式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、９．５０−９．５１参照）。より短い核酸のハイブリダイゼーションの場合、例えばオリゴヌクレオチドなど、ミスマッチの位置はより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ｓｕｐｒａ、  １１．７−１１．８参照）。一つの実施様態において、ハイブリダイゼーション可能な核酸の長さは少なくともヌクレオチドが約１０個である。好ましくは、ハイブリッド可能な核酸の長さは少なくとも約１５個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも２０個のヌクレオチド、もっとも好ましくは少なくとも３０個のヌクレオチドである。さらに、当業者はプローブの長さなどのファクターにより、必要に応じて温度および洗浄溶液の塩濃度を調節してもよいことに気がつくであろう。
【００５７】
「配列分析ソフトウエア」とはヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析に有用であるコンピュータアルゴリズムまたはソフトウエアプログラムを指す。「配列分析ソフトウエア」は市販されているものであっても独立に開発されたものであってもよい。典型的な配列分析ソフトウエアとしてはこれに限定するわけではないが、ＧＣＧプログラムシリーズ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）、およびＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ、Ｉｎｃ．１２２８  Ｓ．Ｐａｒｋ  Ｓｔ．Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ  ５３７１５  ＵＳＡ）、およびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ含有ＦＡＳＴＡ  ｐｒｏｇｒａｍ  （Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４）、Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２、１１１−２０．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ、Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）があげられる。本出願において、分析に配列分析ソフトウエアを使用する場合、この分析の結果は、特に明記しない限り、当該プログラムの「デフォルト値」を使用したものである。ここで「デフォルト値」とは、最初に初期化した時点でこのソフトウエアにより当初ロードされる１組の値またはパラメータを指す。
【００５８】
ここで使用する標準組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技法は当業界でよく知られておりＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．  Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ  （１９８９）（以後“Ｍａｎｉａｔｉｓ”）、およびＳｉｌｈａｖｙ、Ｔ．Ｊ．、Ｂｅｎｎａｎ、Ｍ．Ｌ．ａｎｄ  Ｅｎｑｕｉｓｔ、Ｌ．Ｗ．、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｌｄ  Ｐｒｅｓｓ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８４）、およびＡｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、  ｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）に記載されている。
【００５９】
本発明はメタンおよびメタノールなどのＣ１炭素源からさまざまな物質を生産するのに有用であるユニークなメタノトロフィック菌株を提供する。この菌株はここでＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａと呼ばれ、急速な倍増時間、高収率、およびエントナー−ドゥドロフ炭素経路ならびにエムデン‐マイヤーホフ経路の両方をコードする遺伝子の存在により、炭素フラックス管理における多様性と炭素導入の高効率化により特徴づけられる。この菌株は単細胞タンパク質、細胞外多糖類およびデンプンなどのさまざまな食料および飼料生成物を製造することが示されている。この菌株は特に食料および飼料材料の生産において貴重である、というのもさまざまなな濃度のタンパク質、炭水化物およびデンプンをすべて同一の生体内で操作可能であるからである。この能力により本菌株を個々の特定の食料ならびに飼料の用途に応じてユニークに仕立てることができるであろう。さらに本菌株は色素およびポリマー材料中でモノマーとして有用である、テルペノイドおよびカロチノイド化合物の生産に用いることができることがわかっている。
【００６０】
Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａの単離
池の堆積物からＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａを含有した原環境試料を得た。池の堆積物を２５％メタン含有空気中で合成ミネラル培地中に直接接種した。メタンを唯一の炭素およびエネルギー源として用いた。６６０ｎｍでの光学濃度が安定になるまで増殖させた後、培養物を希釈率が１：１００倍となるように新しい培地に移した。唯一の炭素およびエネルギー源としてメタンを用いてこの継代を３回行った後、培養物を合成最小寒天培地で２５％メタン含有空気中で平板培養した。このやりかたで多数のメタノトロフィック菌株が単離された。コロニーの増殖が速いこと、コロニーの大きさが大きいこと、最小培地上で増殖できること、さらにカロチノイドの活性生合成経路を示すピンク色の着色という点からＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａが研究すべき生物として選択された。
【００６１】
メタノトロフィック菌株は炭素取り込みモード、形態学、ＧＣ含有量％および特定のキー酵素の存在の有無に基づき、３つの代謝群（「タイプＩ」、「タイプＸ」あるいは「タイプＩＩ」）に分類される。実施例４、表２にメタノトロフィック菌株の３つの主要なグループ分けという点から見たＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａの主な特徴を示す。この菌株は窒素固定の点を除き、すべての特徴に基づいて明らかにタイプＩグループに分類される。これらの微生物が窒素固定を行わないことは一般に認められている。したがってＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａは、窒素代謝の点においてユニークであると思われる。
【００６２】
本菌株から抽出された１６ＳｒＲＮＡを配列決定し、他の微生物から得た既知の複数の１６ＳｒＲＮＡと比較した。このデータはＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＫＳＰＩＩＩおよびＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ  ＬＷ１３からの配列に対し９６％の同一性を示した。このエビデンスならびに表２（実施例４）に記載のその他の生理学的特徴に基づき、本菌株がＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ属に属するものであるとの結論を得た。
【００６３】
Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａの代謝的および生理学的特性決定
炭素代謝：本メタノトロフィック菌株、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａは、炭素利用の第一工程としてメタンモノオキシゲナーゼによりメタンをメタノールに変換する。本菌株中に存在するメタンモノオキシゲナーゼは可溶性のメタンモノオキシゲナーゼとは反対に粒状のものである。粒状のメタンモノオキシゲナーゼ（ｐＭＭＯ）は当分野でよく知られており（Ｍｕｒｒｅｌｌら．、  Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  （２０００）、  １７３（５−６）、  ３２５−３３２）数多くのものが単離され配列決定されている。ｓＭＭＯが選択性をあまり持たないのとは反対にｐＭＭＯはその狭い基質特異性を特徴とする。この理由からｐＭＭＯ酵素は大量生産化学物質の製造に好まれている、というのもｓＭＭＯは特定の生産物を効率よく生産するのに必要な化学中間体のうちの多くのものを修飾しやすいからである。
【００６４】
本菌株から単離されたｐＭＭＯに対応する遺伝子ならびに遺伝子産物は、配列決定を行い公的に入手可能なデータベース中の配列との同一性の比較に基づき機能性が同定された。本配列はＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｂ５７２６６）から単離された配列と高度に相同である。
【００６５】
本菌株は炭素利用経路においていくつかの異常を有する。例えば、ゲノム配列データに基づき、本菌株はヘキソース代謝の二つの経路の遺伝子を含有していることがわかっている。ケト−デオキシホルホグルコネートアルドラーゼ酵素を用いるエントナー−ドゥドロフ経路が本菌株に存在する。これが偏性メタノトロフィック菌において機能的に作用する有効な経路であることは一般によく認められている。しかしフルクトースビスホスフェートアルドラーゼ酵素を利用するエムデン‐マイヤーホフ経路もまた存在している。この経路は偏性メタノトロフィック菌株においては存在しないかあるいは機能的に作用しないことがよく知られている。エネルギー的には、後者の経路が最も有利であり、生物的に有用なエネルギーをより多く生み出すことができ、最終的にＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａ中でより収率の高い細胞量の生産、およびその他の細胞量依存産物をより多量に製造することができる。本１６ａ菌株中のこの経路の活性はＡＴＰの還元を測定する生物化学的エビデンスならびにマイクロアレイデータを通じて確認されている。１６ａ株がエムデン‐マイヤーホフ経路ならびにエントナー−ドゥドロフ経路酵素の両方を有することがわかっているものの、データはエントナー−ドゥドロフ経路酵素よりエムデン‐マイヤーホフ経路酵素がより強く発現していることを示唆している。この結果は驚くべきものであり、メタノトロフィック菌株の解糖代謝に関して現在信じられていることに反するものである。本出願人は、例えばＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｃｌａｒａおよびＭｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｓｐｏｒｉｕｍなどを始めとする、この特性を有するその他のメタノトロフィック菌株を発見した。殆どの微生物システム中の酵素に対する典型的なホスホリルドナーである、ＡＴＰに対して酵素が活性を有していないということにより、この活動がメタノトロフィック菌株中で発見されずに残っていたのかもしれない。
【００６６】
１６ａ菌株中のエムデン‐マイヤーホフ経路の特に新規かつ有用な特徴はキーとなるホスホフルクトキナーゼステップがＡＴＰ依存性ではなくピロリン酸依存性であるということである。この特徴はＡＴＰの代わりにピロリン酸を用いることによって経路のエネルギー収率を増す（実施例６）。エネルギー的な有利性を本菌株に与える上で重要であることから、炭素フラックス経路中の本遺伝子は本菌株にとって診断的であると考えることができる。
【００６７】
ピロリン酸依存性ホスホフルクトキナーゼ遺伝子配列（配列番号５）と推論されるアミノ酸配列（配列番号６）を公的なデータベースと比較すると、最も類似した既知の配列はＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  （Ｗ．  Ｒ．  Ｐｅａｒｓｏｎ、  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、  ［Ｐｒｏｃ．  Ｉｎｔ．  Ｓｙｍｐ．］  （１９９４）、  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２、  １１１−２０．  Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：    Ｓｕｈａｉ、  Ｓａｎｄｏｒ．  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：  Ｐｌｅｎｕｍ、  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、  ＮＹ）を用いると、４３７個のアミノ酸長にわたりここに報告したアミノ酸配列と約６３％同一である。より好ましいアミノ酸断片はここにある配列に少なくとも約８０から９０％同一である。最も好ましいのはここに報告したアミノ酸断片に少なくとも９５％同一な核酸断片である。同様に、本遺伝子に対応する核酸配列をコードする好ましいピロリン酸依存性ホスホフルクトキナーゼは活性タンパク質をコードするものであり、ここに報告する核酸に少なくとも８０％同一である。より好ましいピロリン酸依存性ホスホフルクトキナーゼ核酸断片はここの配列に少なくとも９０％同一である。もっとも好ましいのはここに報告した核酸断片に少なくとも９５％同一であるピロリン酸依存性ホスホフルクトキナーゼ核酸断片である。
【００６８】
したがって、本発明は、
（ａ）メタンおよびメタノールからなる群から選択されるＣ１炭素基質により増殖し、
（ｂ）機能的エムデン‐マイヤーホフ炭素経路を有し、前記経路はピロリン酸依存性ホスホフルクトキナーゼ酵素をコードする遺伝子を含有し、前記遺伝子は、
（ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、    （ｂ）０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、および２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄に０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが続く、ハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離核酸分子、
（ｃ）配列番号６に記載の配列を持つポリペプチドと比較した時にスミス−ウォーターマン法のアライメントに基づき少なくとも６３％の同一性を有する、少なくとも４３７個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする第一のヌクレオチド配列を含有する単離核酸分子、および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に相補的である単離核酸分子、
からなる群から選択される、高増殖メタノトロフィック菌株を提供する。
【００６９】
メタンおよびメタノールはＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａの増殖を支持する唯一の基質であることが示されている。本菌株は複雑な増殖因子を添加することなく規定培地で増殖する。メタノールの利用には通常「馴化」が必要であると報告されており、０．１％から３％の間のメタノール濃度における増殖もまた「変動的」であると報告されている。Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａの場合は馴化なしで６００ｍＭ（２．４％）に至る濃さのメタノール濃度で収率よく増殖することが示されている（図２）。
【００７０】
メタノトロフィック菌株において、メタンはリブロースモノホスフェート経路すなわち、ＲｕＭＰサイクルとして知られている、循環する一連の反応を経て生体分子に変換される。この経路はそれぞれ一連の酵素ステップである、３つのフェーズからなる。最初のステップは「固定」すなわちＣ１（ホルムアルデヒド）をペントースへ取り込み、ヘキソース、すなわち６炭糖を形成するものである。これは５炭糖（ペントース）とホルムアルデヒド間の縮合反応を通じて起こり、ヘクスロースモノホスフェートシンターゼによって触媒される。第２のフェーズは「切断」と呼ばれ、このヘキソースを２つの３炭素分子へと分裂させる。これらの３炭素分子の一つはＲｕＭＰ経路を通じて再循環し、もう一方の３炭素断片は細胞の増殖に利用される。メタノトロフィック菌株およびメチル資化性菌株において、ＲｕＭＰ経路は３つのバリアントの一つとして生じることができる。しかし、これらのバリアントのうち二つのみが一般に見出されている：ＦＢＰ／ＴＡ（フルクトースビスホスホターゼ／トランスアルドラーゼ）またはＫＤＰＧ／ＴＡ（ケトデオキシホスホグルコネート／トランスアルドラーゼ）経路である（Ｄｉｊｋｈｕｉｚｅｎ  Ｌ．、  Ｇ．Ｅ．  Ｄｅｖｒｉｅｓ．Ｔｈｅ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｇｒａｍ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｇｒａｍ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ．  Ｉｎ：  Ｍｅｔｈａｎｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈａｎｏｌ  Ｕｔｉｌｉｚｅｒｓ  １９９２、  ｅｄ．  Ｃｏｌｉｎ  Ｍｕｒｒｅｌｌ  ａｎｄ  Ｈｏｗａｒｄ  Ｄａｌｔｏｎ．  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、  ＮＹ）。
【００７１】
本菌株は「分割」ステップを取り扱うやり方においてユニークであるが、これはこの変換をキー中間体としてのフルクトースビスホスフェートを経て行う遺伝子が見出されたからである。フルクトースビスホスフェートアルドラーゼおよびトランスアルドラーゼの遺伝子はＤＮＡの一片の上でクラスタを形成していることが見出された。次にケトデオキシホスホグルコネート中間体に関する他のバリアントの遺伝子もまた互いにクラスターを形成していることが見出された。入手可能な文献には、これらの生体（メチル資化性菌株およびメタノトロフィック菌株）はＫＤＰＧ経路にのみ依存し、ＦＢＰ−依存性固定経路は通性メチル資化性菌株により利用されていることが教示されている（Ｄｉｊｋｈｕｉｚｅｎら、同上）。したがって、前者ではなく、後者の観察が期待されていた。偏性メタン利用菌におけるＦＢＰ遺伝子の発見は驚くべきことであり、利用性を示唆するものである。ＦＢＰ経路はＫＤＰＧ経路において利用されるエネルギーよりも少ないエネルギー（ＡＴＰ）が利用されるため、エネルギー的に宿主微生物にとって有利である。したがってＦＢＰ経路を利用する生体は、ＫＤＰＧ経路を利用するものよりエネルギー的に有利であり、増殖の点でも有利である。この利点はまた本菌株におけるエネルギー要求生産経路の点からも有用であろう。この経路を利用することにより、単細胞タンパク質またはその他のＲｕＭＰ経路を通じての炭素の流れから派生する産物の生産プラットフォームとして、メタン利用菌はその他のメタン利用微生物に対し優位になることができる。
【００７２】
したがって本発明は二つの異なる炭素フラックス経路を有し、配列番号１−２０に記載する遺伝子および遺伝子産物を含有し、ピロリン酸依存性ホスホフルクトキナーゼピロホスフェートおよびケト−デオキシホスホグルコネート（ＫＤＰＧ）アルドラーゼの両方をコードする、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓを提供する。ＫＤＰＧアルドラーゼ遺伝子配列（配列番号１９）と推論されるアミノ酸配列（配列番号２０）を公的なデータベースと比較することにより最も類似する既知の配列はここに報告されたアミノ酸配列に２１２個のアミノ酸長さに渡り約５９％同一であることがＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ同上）からわかる。さらに好ましいアミノ酸断片はここの配列に対し少なくとも約８０−９０％同一である。最も好ましいものはここに報告したアミノ酸断片に少なくとも９５％同一である核酸断片である。同様に、本遺伝子に対応する核酸配列をコードする好ましいＫＤＰＧアルドラーゼは活性タンパク質をコードするものであり、ここに報告した核酸配列に少なくとも８０％同一である。より好ましいＫＤＰＧアルドラーゼ核酸断片はここの配列に少なくとも９０％同一である。もっとも好ましいのはここに報告さいた核酸断片に少なくとも９５％同一なＫＤＰＧアルドラーゼ核酸断片である。
【００７３】
したがって本発明の一つの目的は、メタンまたはメタノールのいずれかのみで増殖する能力を有し、機能的エムデン‐マイヤーホフ炭素経路を含有し、前記経路がピロリン酸依存性ホスホフクトキナーゼ酵素をコードする遺伝子を含有し、    （ａ）配列番号２０に記載のアミノ酸配列をコードする単離核酸分子と、
（ｂ）０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、および２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄に０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが続く、ハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離核酸分子と、
（ｃ）配列番号２０に記載の配列を持つポリペプチドと比較した時にスミス−ウォーターマン法のアライメントに基づき少なくとも５９％の同一性を有する、少なくとも２１２個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする第一のヌクレオチド配列を含有する単離核酸分子と、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に相補的である単離核酸分子と、
からなる群から選択される、ケト−デオキシホスホグルコネートアルドラーゼ酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子とを有する、高増殖メタノトロフィック菌株を提供することである。
【００７４】
ピロリン酸依存性ホスホフルクトキナーゼ酵素およびケト−デオキシホスホグルコネートアルドラーゼ酵素に加えて、本菌株はＦＢＰアルドラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ピロリン酸依存性ホスホフルクトキナーゼピロホスフェート、６−ホスホグルコネートデヒドラターゼおよびグルコース−６ホスフェート−１デヒドロゲナーゼを始めとするその他の炭素フラックス遺伝子を含有する。ホスホグルコムターゼはグルコース−６−ホスフェートのグルコース−１−ホスフェートへの相互交換を担当し、これがエントナー−ドゥドロフあるいはエムデン‐マイヤーホフ炭素フラックス経路へと供給される。図３に示すように、フルクトース−６−ホスフェートはグルコースホスフェートイソメラーゼ（エントナー−ドゥドロフ）によりグルコース−６−ホスフェートへと変換されるかあるいはホスホフルクトキナーゼ（エムデン‐マイヤーホフ）によりフルクトース−１，６−ビスホスフェート（ＦＢＰ）に変換されうる。エムデン‐マイヤーホフ経路を辿り、ＦＢＰはついでＦＢＰアルドラーゼにより二つの３炭素部分（ジヒドロキシアセトンおよび３−ホスホグリセルアルデヒド）になる。エントナー−ドゥドロフ系に戻ると、グルコース−６−ホスフェートはグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼにより６−ホスホグルコネートになり、ついで６−ホスホグルコネートデヒドロラターゼにより２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコネート（ＫＤＰＧ）になる。このＫＤＰＧはその後ＫＤＰＧアルドラーゼにより二つの３炭素部分（ピルベートならびに３−ホスホグリセルアルデヒド）へと変換される。したがってエムデン‐マイヤーホフ経路およびエントナー−ドゥドロフ経路は３−ホスホグリセルアルデヒドのレベルで再び一緒になる。
【００７５】
高増殖メタノトロフィック菌株の同定
本１６ａ株は偶然単離されたものであるが、本教示により類似株の一般的同定および単離が可能になることが予期される。例えば、本高増殖株のキー特性はこれが、メタンまたはメタノールのみを唯一の炭素源として使用する偏性メタノトロフィック菌株であり、機能的エムデン‐マイヤーホフ経路を所有し、特にピロリン酸依存性ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子を有するということである。メタノトロフィック菌株の単離方法は一般的なもので当該分野でよく知られている（例えばＴｈｏｍａｓ  Ｄ．  Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ．、またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ、Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６、２２７、（１９９２）を参照）。同様にピロリン酸依存性ホスホフルクトキナーゼは哺乳動物系でよく特性決定がなされており、分析方法も十分に開発されている（例えばＳｃｈｌｉｓｅｌｆｅｌｄ  ら．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９６）、２９（１）、７９−８３、Ｃｌａｒｋ  ら．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．（１９８０）、１２（１０）、１０５３−６４参照）。現代の微生物学者はこれらの技法を本高増殖株を同定するために使用することができるであろう。
【００７６】
本発明の特定の菌株は配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する特定のピロリン酸依存性ホスホフルクトキナーゼを所有している。本菌株はこの酵素をコードする遺伝子の有無に関しメタノトロフィック菌株を分析することによりさらに特性決定することができるであろう。
【００７７】
したがって、本発明の目的は、
（ａ）高増殖メタノトロフィック菌株を含有すると想像されるサンプルを、適した増殖培地上で唯一の炭素源としてのメタンの存在下に増殖させるステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の条件で増殖するコロニーを同定するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で同定されたコロニーのピロリン酸依存性ホスホフルクトキナーゼ活性の有無を分析するステップと、
を有する高増殖メタノトロフィック菌株を同定する方法を提供することである。
【００７８】
増殖特性：上記の炭素フラックス特性の存在はメタノトロフィック菌株において以前は知られておらず、これが本菌株およびその他のこの経路を有する菌株がこの経路を持たない菌株に比べ、高い増殖速度と向上した炭素変換効率を持つことの説明となるであろう。本発明のＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａはわずか２．５時間の倍増時間でメタン上で増殖することが示されている。これは極めて高い増殖速度であり、本菌株の開発において遺伝子操作を行う上で、また商業的利用にとっても明らかに有利である。さらに、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓは酵母エキスなどの有機増殖因子やその他の高価な醗酵添加物を必要としない。本菌株の最適増殖には、ただメタンまたはメタノール、無機ミネラル類、酸素および水が必要であり、このことにより本菌株は低コストでの大規模増殖に有利である。
【００７９】
特に注目すべきことは、本菌株が高収率を有することである。収率とはここで代謝された炭素基質１グラム当たりにつき生産される細胞量と定義する。本菌株は代謝メタン１グラム当たり０．８ｇ、好ましくは１．０ｇを超える細胞量の生産能力を示している。同様に、本菌株は代謝メタノール１グラムあたり、０．３０、好ましくは０．４５、さらに好ましくは０．５を超える細胞量を製造する能力を示している。
【００８０】
炭素変換効率はどれだけの量の炭素が細胞量へ同化されるかを示すもう一つの尺度である。炭素変換効率はメタン１モル当たりのｇ単位（乾燥重量ｇ／メタンｇ）／ｇ／バイオマスモルで表される。炭素変換効率はバイオマス組成がＣＨ２Ｏ０．５Ｎ０．２５と仮定して計算される。本菌株は特別に高い炭素変換効率を持つが、この効率は普通は４０以上であり、好ましくは５０以上、極めて好ましくは６５以上、最も好ましくは７０を超える。
【００８１】
メタノール利用：Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａは６００ｍＭという高いメタノール濃度で増殖することが示されている。通常メタノールはこれらの濃度ではメタノトロフィック菌株によっては有毒となりうる。Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａは約２．４％のメタノールにまで耐性を有するが、これはメタノトロフィック菌株のメタノール耐性の既知の範囲の上限である（Ｇｒｅｅｎ、  Ｐｅｔｅｒ、  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉａ．    Ｉｎ：  Ｍｅｔｈａｎｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈａｎｏｌ  Ｕｔｉｌｉｚｅｒｓ  （Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋｓ  ５）  Ｊ．  Ｃｏｌｉｎ  Ｍｕｒｒｅｌｌ  ａｎｄ  Ｈｏｗａｒｄ  Ｄａｌｔｏｎ  ｅｄｓ．、  １９９２  Ｐｌｅａｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  ＮＹ、  ｐｐ ２３−８４）。この特徴により反応装置の設計における資本コストをさらに引き下げることができる、というのもメタノールに対する耐性が高いと、混合ポートの数を減少させた（したがって製造コストの安い）反応装置を用いることができるからである。この問題（メタノールの有毒性を克服するために混合が必要であるための反応装置のコスト高）はメタノールでメタノトロフィック菌株を増殖させる上での主な欠点であった。
【００８２】
グリコーゲン生産：Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａはメタノール上での活性増殖中自重の５０％を超えてグリコーゲンを生産することが知られており、まためメタンでの活性増殖（ストレスが関与しない）中相当量のグリコーゲンを生産する。この点はその他の偏性メタノトロフィック菌株が唯一の産物としてタンパクのみを生産するのに比べ、本菌株がより幅の拾い一連の動物飼料の栄養的ニーズとして作用するタンパク質と炭水化物の混合物を生産するのに有用である。あるいは、この性質によりＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａはメタンまたはメタノールからグリコーゲンを生産する宿主株として働くことができる。さらに、内部ヘキソース代謝がＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａ中で明らかに生じている。したがってこの生体は炭水化物代謝によりのみ生産されると通常考えられている化学生成物の生産のための宿主として働くことができる。したがって、本発明はメタノールで増殖させた場合、通常は約２０％から約４０％であるが、自重の５０％を超えるグリコーゲンを製造する能力を有するＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａを提供する。
【００８３】
色素およびテルペノイドの生産：本Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ株はさまざまな色素、とりわけイソプレノイド色素を生産するのに有用である。このクラスの色素は強力な光吸収性を持つことが知られており、５、１０、１５、２０、２５、３０または４０個の炭素イソプレン鎖の頭尾縮合から得られる。本菌株中で同定された一つの具体的な色素はＣ３０のカロチノイドである。この色素の細胞中の含有量は極めて高く、イソプレノイド経路によるカーボンフローが本来高いことを示している。この点がイソプレノイド誘導生成物に対し、イソプレノイド経路を「主鎖生成経路」と見る根拠になっている。例えばアスタキサンチン、β−カロチン、カンタキサンチン、およびルテインなどの高価なカロチノイドが本生物により生産可能であると予想される。
【００８４】
さらに、本菌株はさまざまなイソプレノイド化合物を生産する能力を有すると予期される。イソプレノイド類はイソペンテニルニリン酸（ＩＰＰ）として知られる単一の代謝前駆体に基づいた共通の生合成起点を持つ、極めて大きく、多様な一群の天然産物である。イソプレノイドとして知られる天然産物の群にはＣ５化合物イソペンテニルジホスフェートから生合成により誘導されるあらゆる物質が含有される。イソプレノイド化合物はまた「テルペン」または「テルペノイド」と呼ばれているが、これは、このような例のさまざまなクラスを指すのに用いる用語である  （Ｓｐｕｒｇｅｏｎ  ａｎｄ  Ｐｏｒｔｅｒ、  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ、  ｐｐ  ３−４６、  Ａ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  （１９８１））。イソプレノイドはあらゆる生命体中に広く存在する化合物である。イソプレノイドのよく知られた例をあげると、ステロイド（トリテルペン）、カロチノイド（テトラテルペン）およびスクアレンなど枚挙にいとまがない。
【００８５】
このような化合物の生合成には通常イソペンテニルピロリン酸酵素が関与し、長さが炭素５、１０、１５、２０、３０または４０個である、イソプレン単位の頭尾縮合によって形成される。
【００８６】
リモネン、メントールおよびゲラニオールなどのその他の、関連した小さな環状分子は適当な植物誘導テルペンシンターゼの導入により、本株中で生産可能であるかもしれない。したがって、イソプレノイド経路は複雑な環式および不飽和分子をメタンまたはメタノールから生産するためのプラットフォーム経路として見ることができるであろう。この能力は生物学にユニークなもので、純粋に化学的なプロセスではＣ１化合物をいかなるレベルの特異性を持ってしても環式分子に変換することはできない。
【００８７】
イソプレノイド経路においては多数のステップが知られている。例えば、別法の経路の最初のステップはＣ３分子（ピルベートおよびＣ１アルデヒド群、Ｄ−グリセルアルデヒド３−ホスフェート）の縮合によりＣ５化合物（Ｄ−１−デオキシキシルロース−５−ホスフェート）を生じる。ＬｏｉｓらはＤ−１−デオキシキシルロース−５−ホスフェートの大腸菌中での合成を触媒する、  Ｄ−１−デオキシキシルロース−５−ホスフェートシンターゼ（ＤＸＳ）をコードする遺伝子、ｄｘｓを報告している（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：  ２１０５−２１１０  （１９９８））。
【００８８】
次に、Ｄ−１−デオキシキシルロース−５−ホスフェートの分子内転移が２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−４−ホスフェートを形成する、詳細不明の還元プロセスによって生じる。この還元プロセスに関与する酵素の一つはＤ−１−デオキシキシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ（ＤＸＲ）である。タカハシらは、大腸菌中での別の経路で、ｄｘｒ遺伝子産物が２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−４−ホスフェートの形成を触媒することを報告している  （Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：  ９８７９−９８８４  （１９９８））。
【００８９】
２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−４−ホスフェートをイソペンテニルモノホスフェートへと転換するステップはあまりよく特性決定がなされていないが、いくつかのステップについてはわかっている。２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−４−ホスフェートは４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールにシトシントリホスフェート（ＣＴＰ）依存性反応中、２Ｃ−メチル−ｄ−エリスリトールシチジリルトランスフェラーゼをコードするアノーテーションなされていない遺伝子ｙｇｂＰによりコードされる酵素により４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールに変換される。Ｒｏｎｄｉｃｈらは上記の反応を触媒する大腸菌中のＹｇｂＰタンパク質を報告している（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９６：１１７５８−１１７６３  （１９９９））。最近ｙｇｂＰ遺伝子がｉｓｐ遺伝子クラスターの一部としてｉｓｐＤと新たに命名された。この４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールの２位のヒドロキシ基はｙｃｈＢ遺伝子によりコードされる４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチルエリスリトールキナゼによりＡＴＰ依存性反応においてホスホリル化することができる。Ｌｕｔｔｇｅｎらは４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールをホスホリル化し、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２−ホスフェートを生じる大腸菌中のＹｃｈＢタンパク質を報告している（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７：１０６２−１０６７  （２０００））。最近このｙｃｈＢ遺伝子はｉｓｐ遺伝子クラスターの一部としてｉｓｐＥと新たに命名された。
【００９０】
Ｈｅｒｚらは大腸菌中のｙｇｂＢ遺伝子産物（２Ｃ−メチル−ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスフェートシンターゼ）がＣＴＰ依存性反応中４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２−ホスフェートを２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスフェートへと変換することを報告した。２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスフェートはさらにカロチノイド生合成経路（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７：２４８６−２４９０（２０００）によりカロチノイドへと変換することができる。近年ｙｇｂＢ遺伝子はｉｓｐ遺伝子クラスターの一部としてｉｓｐＦと新たに命名された。
【００９１】
ＹｇｂＢ酵素とＹｇｂＰ酵素により触媒される両反応ともＣＴＰ依存的に実施される。したがってＣＴＰシンターゼはイソプレノイド経路において重要な役割を演じている。大腸菌中のｐｙｒＧ遺伝子によってコードされるＰｙｒＧはＣＴＰシンターゼをコードするということが調べられた（Ｗｅｎｇら、  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、  ２６１：５５６８−５５７４  （１９８６））。
【００９２】
いくつかのまだ特性決定のなされていない反応を経て、イソペンテニル一リン酸が形成される。イソペンテニル一リン酸はｉｐｋ遺伝子によりコードされるイソペンテニルモノホスフェートキナーゼ酵素によりイソペンテニルニリン酸（ＩＰＰ）に変換される（Ｌａｎｇｅ  ａｎｄ  Ｃｒｏｔｅａｕ、  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９６：１３７１４−１３７１９  （１９９９））。
【００９３】
プレニルトランスフェラーゼはイソペンテニルニリン酸（ＩＰＰ）の連続縮合を触媒し、さまざまな鎖長のプレニルニリン酸を生じる、幅広い一群の酵素を構成している。プレニルトランスフェラーゼの相同遺伝子はそのアミノ酸配列に高度に保存された領域を持つ。ＯｈｔｏらはシアノバクテリウムＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ中にある３つのプレニルトランスフェラーゼ遺伝子を報告した（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４０：３０７−３２１  （１９９９））。これらはゲラニルゲラニル（Ｃ２０）ジホスフェートシンターゼ、ファルネシル（Ｃ１５）ジホスフェートシンターゼ（ｉｓｐＡ）および長さの異なる５個のプレニルジホスフェートの合成を触媒することのできるもう一つのプレニルトランスフェラーゼである。
【００９４】
さらにイソプレノイド生合成経路中を下るとさらに多くの遺伝子が、特定のイソプレノイドの合成に関与している。例をあげると、Ｈｅｌｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ中に見出されたｃｒｔＮ遺伝子（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：１４８５１−１４８５６  （１９９８））はカロチノイド生合成経路の一部であるジアポフィトエンデヒドロゲナーゼをコードする。
【００９５】
イソプレノイド経路に関与する遺伝子のいくつかはよく知られているが、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．のイソプレノイド経路に関与する遺伝子が存在することは稀である。したがって、上記の遺伝子のすべてを本菌株（配列番号６１から配列番号７８）中に見い出すことは驚くべきことである。このことから本菌株がさまざまなテルペノイドの製造に有用であることが示唆される。従って、本発明はＤ−１−デオキシキシルロース−５−ホスフェートシンターゼ、１−デオキシキシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ、２Ｃ−メチル−ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスフェートシンターゼ、２Ｃ−メチル−ｄ−エリスリトールシチジルトランスフェラーゼ、ＣＴＰシンターゼ、ゲラニルトランスフェラーゼ（ファルネシル−ジホスフェートシンターゼ）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチルエリスリトールキナーゼ、およびジアポフィトエンデヒドロゲナーゼをコードする配列番号６１から配列番号７８に記載の遺伝子および遺伝子産物を有するＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ株を提供する。
【００９６】
単細胞タンパク質の生産：本菌株は食品および飼料産業において価値ある、単細胞タンパク質（ＳＣＰ）の生産に有用である。メタノトロフィック菌株をＳＣＰの生産のための生産プラットフォームとして用いる方法は当分野においてよく知られている（例えば米国特許第４、７９５、７０８号、Ｓｈｏｊａｏｓａｄａｔｉら、  Ａｍｉｒｋａｂｉｒ  （１９９６）、  ８（３０）、  ３３−４１参照）。本菌株は炭素フラックスの点とさらに、窒素源の存在下で酸素消費が減少する点で有利なため、この用途に大変適している。本菌株は好気性と嫌気性条件のいずれにおいても単細胞タンパク質を生産するのによく適している。
【００９７】
約１．３ｇタンパク質／乾燥重量／ｇメタンに至る、および約０．４５ｇタンパク質／乾燥重量／ｇメタノールに至る生産を行う本菌株は他の株と比較してもひけをとらない。
【００９８】
細胞外多糖類の製造：多糖類は食品および非食品産業において増粘剤として幅広く用いられている糖ポリマーである（Ｓａｎｆｏｒｄら、  Ｐｕｒｅ  ＆  Ａｐｐｌ．  Ｃｈｅｍ．  ５６：  ８７９−８９２  （１９８４）、  Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ、  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、  １６（１）：  ４１−６  （１９９８））。これらはサラダドレッシング、ジャム、冷凍食品、ベーカリー製品、缶詰めおよび乾燥食品などの食料製品中に見出される。その他の用途も多く、殺虫剤、塗料およびその他の塗布剤の懸濁剤などがある。これらは凝集剤、バインダー、フィルム形成剤、潤滑剤、および減摩剤として作用することもできる。さらに細胞外多糖類は油田での油の回収にも一般的に用いられている。
【００９９】
伝統的に、工業的に有用な多糖類は藻類および植物源から誘導されてきた。過去１０年の間に微生物由来の多糖類がますます利用されるようになった（Ｓａｎｆｏｒｄ  ら、  Ｐｕｒｅ  ＆  Ａｐｐｌ．  Ｃｈｅｍ．  ５６：  ８７９−８９２  （１９８４）、  Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ、  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、  １６（１）：  ４１−６  （１９９８））。
【０１００】
その他細胞外多糖類生合成に関与する多くの遺伝子が他の有機体から得られ特性決定あるいは配列決定がなされている。ｅｐｓＢ遺伝子は、おそらくＥＰＳの重合および／またはイクスポートに関与するＥｐｓＢタンパク質をコードするものでＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａ内で配列決定されている（Ｈｕａｎｇら、  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １６：  ９７７−９８９  （１９９５））。
ＥｓｐＭタンパク質をコードするｅｓｐＭ遺伝子はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのｅｓｐ遺伝子クラスター中で見つかっている（Ｓｔｉｎｇｅｌｅら、  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｉｏｌ．  １７８：  １６８０−１６９０  （１９９６））。もう一つの多糖類イクスポートタンパク質と予想されるＷＺＡは大腸菌中で同定されている（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：  １４５３−１４７４  （１９９７））。最後にｅｐｓＶ遺伝子は、糖を多糖類中間体へと転移するトランスフェラーゼである、ＥｐｓＶタンパク質をコードするが、これもまたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中で配列決定されている（Ｂｏｕｒｇｏｉｎら．、  Ｐｌａｓｍｉｄ  ４０：  ４４−４９  （１９９８）、  Ｂｏｕｒｇｏｉｎ、Ｆ．ら、  Ｇｅｎｅ  ２３３：１５１−１６１  （１９９９））。
【０１０１】
微生物細胞外多糖類をコードする遺伝子に関しては豊富な情報があるにも関わらず、この経路に関与する遺伝子はＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓなどのＣ１利用有機体からは一つも単離あるいは特性決定がなされていない。上に記載したように、微生物細胞外多糖類はさまざまな用途を持つので、この物質をメタンなどの豊富に存在する廉価な炭素源から合成することは有利となるであろう。
【０１０２】
驚くべきことに、本Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａが高レベルで細胞外多糖類を生産することがわかった。関連多糖類合成経路をコードする遺伝子が単離され特性決定され、配列番号２１から配列番号３８にその遺伝子生成物とならんで記載されている。
【０１０３】
したがって、本発明は細胞外多糖類を合成する能力を有し、微生物多糖類生合成に関連するｕｇｐ、  ｇｕｍＤ、  ｗｚａ、  ｅｐｓＢ、  ｅｐｓＭ、  ｗａａＥ、  ｅｐｓＶ、  ｇｕｍＨ  およびグリコシルトランスフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子を有するＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ株を提供する。
【０１０４】
脱窒素：偏性メタノトロフィック菌中の脱窒素酵素の存在は知られていない。本菌株は配列番号３９から配列番号６０に記載の遺伝子および遺伝子産物からなる経路を含有する。本Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａの新規の特徴はメタンあるいはメタノールから得られる等価物を減少させるために低酸素濃度において窒素源を追加の「エレクトロンシンク」として利用する能力である。窒素源にはこれに限るわけではないが、亜硝酸塩、硝酸塩、アンモニウムおよび窒素分子があげられる。本菌株は硝酸塩または亜硝酸塩をガス状の最終生成物である亜酸化窒素に還元することが示されている。このプロセスの有用性は硝酸塩が極めて溶解性に富み低コストであること、さらに硝酸塩の利用がプロセス中に溶解酸素を維持するのに必要な高エネルギーを緩和できるという点である。実際硝酸塩はいくつかの廃水処理システム中で副酸化剤として利用されている（Ｋｏｃｈ、Ｇｅｒｈａｒｄ、Ｓｉｅｇｒｉｓｔ、Ｈａｎｓｒｕｅｄｉ  Ｖｅｒｂａｎｄｓｂｅｒ．−Ｖｅｒｂ．Ｓｃｈｗｅｉｚ．Ａｂｗａｓｓｅｒ−Ｇｅｗａｅｓｓｅｒｓｃｈｕｔｚｆａｃｈｌｅｕｔｅ（１９９８）、５２２（Ｏｐｔｉｍｉｅｒｕｎｇｓｍａｓｓｎａｈｍｅｎ  ｂｅｉ  Ｓｔａｒｋ  Ｂｅｌａｓｔｅｔｅｎ  Ｂｅｌｅｂｕｎｇｓａｎｌａｇｅｎ）、３３−４８）。
【０１０５】
非メタノトロフィック脱窒素菌において、脱窒素として知られている微生物プロセスは、一連の酵素によって触媒されるが、これらは一緒になって硝酸塩を気体状の窒素分子へと還元的に変換する。下記に酵素名および遺伝子呼称と共に示す、このプロセスのステップおよび中間体は現在考えているプロセスの範囲を規定する。
【０１０６】
１．  ＮＯ３→ＮＯ２  呼吸的硝酸塩レダクターゼ（Ｎａｒ遺伝子）
２．  ＮＯ２→ＮＯ  呼吸的亜硝酸塩レダクターゼ（Ｎｉｒ遺伝子）
３．  ＮＯ→Ｎ２Ｏ  酸化窒素レダクターゼ（Ｎｏｒ遺伝子）
４．  Ｎ２Ｏ→Ｎ２  亜酸化窒素レダクターゼ（Ｎｏｓ遺伝子）
【０１０７】
エコロジー的に見れば、これらのプロセスの結果、窒素は土壌から除去される（脱窒素）。しかし、硝酸塩は酸素に対して補助的または別の酸化剤であると見ることもできる。これは脱窒素プロセスの極めてプラスなレドックス電位による。
【０１０８】
第二の主要な微生物的プロセスは硝化と呼ばれるものでこれは下記の反応、酵素および遺伝子からなる。
【０１０９】
１．  ＮＨ４→ＮＨ２ＯＨ  アンモニアモノオキシゲナーゼ（ａｍｏ遺伝子）
２．  ＮＨ２ＯＨ→ＮＯ２（ヒドロキシルアミンオキシドレダクターゼ）
３．  ＮＯ２→ＮＯ３（亜硝酸塩オキシダーゼ）
【０１１０】
脱窒素が土壌中の硝酸塩を枯渇させる還元的プロセスであるのに対し、硝化は土壌中に硝酸塩を作り出す酸化的プロセスである。
【０１１１】
偏性メタノトロフィック菌が硝化細菌群に属することは良く知られている。これはアンモニアモノオキシゲナーゼの作用と同一の反応、そしてメタノールを形成するメタンの酸素化と類似の反応によりヒドロキシルアミンを形成するためにアンモニアを酸素化するすべての偏性メタノトロフィック菌中に見出されるメタンモノオキシゲナーゼの能力によるものである。ヒドロキシルアミンはその後さらに酵素により代謝されて亜硝酸塩となる。硝酸塩への亜硝酸塩の酸化は酵素的にあるいは空気中で化学的酸化により自発的に起こることができる。しかし、メタノトロフィック菌株はＨｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓなどの脱窒素細菌を伴うため、脱窒素と間接的に関連している（Ａｍａｒａｌ、  Ｊ．Ａ．  Ａｒｃｈａｍｂａｕｌｔ、  Ｃ．  Ｓ．Ｒ．  Ｒｉｃｈａｒｄｓ、  Ｒ．  Ｋｎｏｗｌｅｓ  １９９５．  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｅｃｏｌｏｇｙ  １８  ２８９−２９８）。上記の呼吸プロセスは細胞同化作用のための硝酸塩または亜硝酸塩の還元とは区別される。前者の呼吸プロセスはエネルギーを生産するのに対し、後者の同化作用は細胞塊に取り込むための窒素を提供するのである。この同化プロセスはピリジンヌクレオチド結合硝酸塩あるいは亜硝酸塩レダクターゼに基づいて行われる。これらの酵素はメタノトロフィック菌株を始めとし、広く天然に見出されている。メタノトロフィック菌株が生合成の唯一の窒素源としての硝酸塩により増殖することについては既存の文献でよく知られている（Ｈａｎｓｏｎ  Ｒ．Ｓ．Ａ．Ｉ．Ｎｅｔｒｕｓｏｖ、Ｋ．Ｔｓｕｊｉ．１９９２．Ｔｈｅ  ｏｂｌｉｇａｔｅ  ｍｅｔｈａｎｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ、  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ．  Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ  ２ｎｄ  ｅｄ．Ｃｈ  １８．Ｐｐ２３５０−２３６３、Ａ．Ｂａｌｏｗｓ、Ｈ．Ｇ．Ｔｒｕｐｅｒ、Ｍ．Ｄｗｏｒｋｉｎ、Ｗ．Ｈａｒｄｅｒ、Ｋ−Ｈ  Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ  ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ）。
【０１１２】
ここに記載の遺伝子（配列番号３９から配列番号６０）の機能性は硝酸塩または亜硝酸塩をガス状のＮ２Ｏにすると呼吸的還元にある。この機能を行うのに必要なすべての遺伝子がＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａに存在することが、配列分析および窒素含有化合物の生理学的還元の両方から示されている。さらにアンモニアの生体転換（硝化）に必要な酵素をコードする遺伝子もまた存在する。
【０１１３】
偏性メタノトロフィック菌株にこの脱窒素能力が存在することの利点は、少なくとも２つある。
１．硝酸塩は増殖に必要なエレクトロンアクセプタとしての酸素を置換あるいは補充することができる。これは過剰な酸素要求量を必要とし、その結果気体状の酸素を溶液へと物質移動するのに過剰のコストが必要となる、高度に還元された飼料により低コストで大規模培養をするのには有利となろう。
２．硝酸塩またはその他の酸化窒素誘導体が問題となるような水系あるいはプロセスから可溶性の硝酸塩を除去するのにメタノトロフィック菌の脱窒素を用いることができるであろう。
【０１１４】
Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａのアンモニアを亜硝酸塩へと変換する能力と本発明で示された亜硝酸塩を亜酸化窒素へと変換する能力とを組み合わせたことにより、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａおよびその他の効率良く亜硝酸塩を還元するメタノトロフィック菌株はプロセス水、廃水、または天然水、あるいは農業廃水から清澄化と解毒のためにアンモニアを除去するものとして使用することができる。
【０１１５】
Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａへの遺伝子移入：Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａは大腸菌および酵母を含む他の生体からの遺伝子を受け入れ発現することが示されている。供与体生物からの遺伝子移入とＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａ中の遺伝子発現の両方を促進するいくつかのプラスミドベクターが同定されている。したがってこの菌株は遺伝子組み替えを行うことができる。
【０１１６】
食品および飼料基材の製造
本Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａがタンパク質、多糖類、および色素を個々に生産するのみならずこれらの材料を特定の量含有する所望の混合物からなるユニークに特注した食品または飼料生成物を生産する能力があることが理解されるであろう。本菌株のこの特性は極めて重要な商業的価値を持つ。
【０１１７】
例えば、家畜の種類が異なると、タンパク質の炭水化物に対する相対比という点で異なる栄養必要量を持つかもしれない。例えば多くの種類の肉食性熱帯魚は、極めて高いタンパク要求量を持つ。一方反芻動物の家畜は、繊維／炭水化物を多く含む食餌を食べて育つ。Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａはつねに細胞タンパクを製造することに加えて、ある種の条件の下では多量の炭水化物を生成する能力を有する。グルコネオゲネシス（グリコーゲン形成）あるいはグリコーゲン分解に関与する遺伝子はグリコーゲン含量が減少あるいは増加するように変化あるいは調整することができるであろう。したがって、粗細胞塊の組成は高タンパク質飼料市場（低炭水化物）をターゲットとするべく調整するか、または高い炭水化物比でタンパク質比の低い飼料マーケットをターゲットとするべく調整することができる。この微生物の組成を工学する能力により、外部から添加することにより人工的にタンパク質／炭水化物比をフォーミュレートする必要がなくなる。
【０１１８】
カロチノイド色素は数多くの魚や水生甲殻類の着色や抗酸化性をもたらすという役割を果たしている（Ｎｅｌｉｓ  Ｈ．Ｊ．、  Ｄｅ  Ｌｅｅｎｈｅｅｒ  １９９１．  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  ７０：１８１−１９１）。Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  １６ａは多くの商業的に利用されているメタノトロフィック菌株（すなわちＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）とは異なり、アスタキサンチンなどの高価値のカロチノイドと類似した、しかし構造的には同一ではない、ピンクの色素を高レベルで生産する天然のカロチノイド色素生産経路を有する。この経路をアスタキサンチンまたはその他の高価値カロチノイドの合成の最終ステップに関与する遺伝子を加えて修正することにより本菌株はこれらのカロチノイドを生産する能力を得ることになる。このようにしてＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａはタンパク質／炭水化物／色素の比率を個々の栄養要求に合わせて調節することのできる動物飼料製造株としてユニークに有用となる。このようにして、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓは他の植物タンパク質または炭水化物源へより高価値の成分を供給する手段として利用することができ、これらの植物により価値の高い特徴をもたせるために遺伝子組み替えするという問題を回避することができる。
【０１１９】
遺伝子経路を操作する方法は一般的なものであり当該分野でよく知られている。特定の経路中で選択された遺伝子をさまざまな方法によってアップレグレーションまたはダウンレギュレションすることができる。さらに、生体中での競合経路を遺伝子破壊または類似の技法により除去あるいは昇華させることもできる。
【０１２０】
ひとたびキー遺伝子経路が同定されると配列決定された特定遺伝子はアップレギュレーションにより経路の出力を増加することができる。例えばｐＢＲ３２２などの多コピー型プラスミド上で宿主細胞へとターゲットされた遺伝子の追加コピーを導入することができる。別法としてターゲット遺伝子は非天然プロモータの調整下になるよう修飾することができる。経路が細胞周期あるいは醗酵中のある特定の時点で作用することが求められる時は、調整したあるいは誘導可能なプロモータをターゲット遺伝子の天然プロモータと交換して用いてもよい。同様に、場合によっては天然すなわち内在性プロモータを修飾して遺伝子発現を増加してもよい。例えば内在性プロモータを生体内で突然変異、欠失および／または置換により変化させることも可能である（Ｋｍｉｅｃ、米国特許第５，５６５，３５０号、  Ｚａｒｌｉｎｇら、  ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３８６８参照）。
【０１２１】
別法として、ターゲット経路中あるいはエネルギーまたは炭素の競合シンクとして作用するかもしれない競合経路中のある遺伝子の発現を減少あるいは除去することが必要であるかもしれない。この目的のために遺伝子のダウンレギュレーションを行う方法は調査されている。破壊すべき遺伝子の配列が既知である時は最も有効な遺伝子ダウンレギュレーション法は、転写を中断するために構成的遺伝子中に外来ＤＮＡを挿入することによる、ターゲット遺伝子の破壊である。これは挿入ＤＮＡ（しばしば遺伝マーカ）に破壊すべき遺伝子部分と同一性の高い配列を隣接させた遺伝子カセットを作ることによって行うことができる。このカセットを宿主細胞に導入するとその細胞の生来のＤＮＡ複製機構を通じて外来ＤＮＡが構成的遺伝子ヘ挿入される（例えば  Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：４６１７−４６２２、Ｂａｌｂａｓ  ら．（１９９３）Ｇｅｎｅ  １３６：２１１−２１３、Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：２５１９−２５２４、ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  ら．（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５：２７０−２７７．参照）。
【０１２２】
ターゲット遺伝子の配列がわかっているときのもう一つの遺伝子ダウンレギュレーション法はアンチセンス技術である。これを実行するには、所望の遺伝子からの核酸セグメントをクローン化し、ＲＮＡのアンチセンス鎖が転写されるようにプロモータへと作用可能に結合する。この構造体をついで宿主細胞中に導入し、ＲＮＡのアンチセンス鎖を形成する。アンチセンスＲＮＡは問題のタンパク質をコードするｍＲＮＡの蓄積をさまたげることにより遺伝子の発現を抑制する。当業者は特定の遺伝子の発現を低下するためにアンチセンス技術の使用に伴う特定の配慮についてはおわかりであろう。例えば、アンチセンス遺伝子の適切なレベルの発現には当業者には公知である異なる調整要素を用いた異なるキメラ遺伝子の使用が必要となるかもしれない。
【０１２３】
配列が既知である時には、ターゲット遺伝子の破壊およびアンチセンス技術により遺伝子の効果的なダウンレギュレーション手段が提供されるが、特異性にはやや劣るものの配列に基づくことのないその他の方法論が開発されている。例えば細胞をＵＶ照射にさらし、ついで所望の表現型をスクリーニングする。化学物質による突然変異誘発もまた突然変異体を生成するための有効な方法であり、一般に使用されている物質にはＨＮＯ２およびＮＨ２ＯＨなどの非複製ＤＮＡに影響を与える化学薬品ならびにフレームシフト突然変異を起こすことで知られているアクリジン染料などの複製ＤＮＡに影響を与える化学薬品がある。放射線または化学薬品を用いた突然変異作成のための特定の方法に関しては多くの記録がある。例えばＴｈｏｍａｓ  Ｄ．  Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ．、  ｏｒ  Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ、Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６、２２７、（１９９２）を参照。
【０１２４】
もう一つの非特異性遺伝子破壊方法は転位因子、すなわちトランスポゾンの使用である。トランスポゾンは、ＤＮＡにランダムに挿入するがその後どこに挿入が生じたかを決定するために配列に基づき検索できる遺伝要素である。生体内転位方法および生体外転位方法の両方が知られている。これらの方法では転位因子を転位可能な酵素と共に使用する。転位因子またはトランスポゾンがトランスポゼースの存在下で核酸断片と接触すると、転位因子はランダムにこの核酸断片中に挿入する。この技法は破壊された遺伝子が転位因子の配列に基づき同定できるかもしれないため、ランダムな突然変異誘発と遺伝子単離にとって有用である。生体内転位のためのキットが市販されている（例えばＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、ＮＪ、、から得られるｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  Ｔｙ１  ｅｌｅｍｅｎｔに基づくＴｈｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｉｓｌａｎｄ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、  Ｂｅｖｅｒｌｙ、  ＭＡから得られるｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  Ｔｎ７に基づくＴｈｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｉｍｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ、さらにＥｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、から得られるｔｈｅ  Ｔｎ５  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ  ｅｌｅｍｅｎｔに基づくｔｈｅ  ＥＺ：ＴＮ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓを参照）。
【０１２５】
本発明では、同定された生合成経路の発現を変化させることが有用であろう。例えば本Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａがエントナー−ドゥドロフ経路およびエムデン‐マイヤーホフ炭素フラックス経路の両方をコードする遺伝子を含有することが分かっている。エムデン‐マイヤーホフ経路がよりエネルギー効率が良いので、この経路の遺伝子を過剰発現することが望ましいであろう。さらにエントナー−ドゥドロフ経路が競合的経路であり、この経路の阻害がエムデン‐マイヤーホフ系における練るギー効率の増加をもたらすかもしれない。これはケト−デオキシホスホグルコネートアルドラーゼをコードする配列（配列番号９）、またはエントナー−ドゥドロフ系のその他のメンバーのいずれかに対する先に説明した遺伝子ダウンレギュレーション、およびエムデン‐マイヤーホフ系のフルクトースビスホスファターゼアルドラーゼをコードする遺伝子（配列番号５番または７番）のアップレギュレーションを選択的に用いることにより行うことができるであろう。このようにして本Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａ中の炭素フラックスは最適化することができる。さらに、モノマー生産のための芳香族などの特定の有機物質を生産するため本菌株を工学する場合、炭素フラックス経路の最適化はこれらの材料の収率を向上するであろう。
【０１２６】
同様のやりかたで、イソプレノイドまたは色素の合成に関与するキー酵素をコードする遺伝子を調整することができるであろう。例えば、本菌株はテルペノイド経路中のキー酵素をコードし、色素の生産と小さなイソプレノイド化合物を提供する多数の遺伝子を提供する。単離した遺伝子としてはｄｘｓおよびｄｓｒ遺伝子、ｉｓｐＡ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子およびｃｒｔＮ遺伝子がある。とりわけＣ３分子（ピルビン酸およびＣ１アルデヒド群、Ｄ−グリセルアルデヒド３−ホスフェート）の初期の縮合のアップレギュレーションをすることは、ｄｘｓ遺伝子により媒介される、Ｃ５化合物（Ｄ−１−デオキシキシルロース−５−ホスフェート）を生じるのに有用であるかもしれない。別法として、もし特定の非色素イソプレノイドを生産したい場合、この経路の下流端でさまざまな遺伝子を破壊することが望ましいであろう。例えば、この経路で所望する生産物がより小さな上流テルペノイドである場合、ｃｒｔＮ遺伝子（ジアポフィトエンデヒドロゲナーゼをコードすることがわかっている）の遺伝子破壊またはアンチセンス阻害を用いることが望ましいであろう。
【０１２７】
すでに記載したように、本菌株は大量に多糖類を生産する能力を有する。このプロセスはｕｇｐ遺伝子、ｇｕｍＤおよびＨ遺伝子、ｅｐｓＢ、Ｍ、およびＶ遺伝子さらにｗａａＤ遺伝子を含む一連の遺伝子により支配されている。この経路において、多糖類の重合および／またはイクスポートに関与するｅｓｐＢ遺伝子、または砂糖の多糖類中間体への移送を制御するｅｓｐＶ遺伝子のアップレギュレーションを行うことがとりわけ重要となるであろう。
【０１２８】
このようにして本菌株、または類似の菌株は食品および飼料生成物として使用するための物質の特定の組成物、またはタンパク質、多糖類および色素の特定の組み合わせを生産するように工学することができる。
【０１２９】
実施例
本発明を下記の実施例においてさらに明らかにする。これらの実施例は本発明の好ましい実施様態を示しているものの、単に説明のために示すものである。上記の説明とこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的な特徴を確認することができ、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、本発明をさまざまな用途および条件に適合するために、これにさまざまな変更や修正を加えることが可能である。
【０１３０】
一般的方法
本実施例で使用する標準的組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当分野でよく知られておりＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．  Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、（１９８９）  （Ｍａｎｉａｔｉｓ）およびＴ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ、Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ、ａｎｄ  Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８４）およびＡｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｐｕｂ．ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  （１９８７）に記載されている。
【０１３１】
微生物培養物の維持および増殖に適した材料と方法は当分野で知られている。下記の実施例で使用するのに適した技術はＭａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ、Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ、Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ、Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ、Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ、Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ  ａｎｄ  Ｇ．  Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ、ｅｄｓ）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ．（１９９４））またはＴｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ（１９８９）に記載されているようなものである。微生物菌体の増殖と維持に用いた試薬、制限酵素および材料は、特に明記しないかぎりすべてＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、  ＷＩ）、ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、  ＭＩ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、または  Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、  ＭＯ）から得たものである。
【０１３２】
略号の意味は下記の通り：「ｈ」は時間、「ｍｉｎ」は分、「ｓｅｃ」は秒、「ｄ」は日、「ｍＬ」はミリリットル、「Ｌ」はリットルを示す。
【０１３３】
微生物の培養および細胞懸濁液の調製、関連した分析
Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａは通常気／液比を少なくとも８：１（すなわち硝酸塩液体培地２０ｍＬ）として培地を用い、セラム栓付きの全容積が１６０ｍＬウイートン瓶（Ｗｈｅａｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｈｅａｔｏｎ  ＩＬ）中で増殖させた。培養用の標準気相は空気中に２５％のメタンを含有する空気を用いた。これらの条件が増殖条件であり、細胞を増殖細胞と呼ぶ。特に明記しない限り、すべての場合において培養物はＬａｂ−Ｌｉｎｅロータリーシェーカーで一定の振盪を与えつつ３０℃で増殖させた。
【０１３４】
実験目的のために得た細胞を最大光学濃度（Ｏ．Ｄ．６６０  約１．０）へと増殖させた。ＳＳ−３４ローターを用いたＳｏｒｖａｌ  ＲＣ−５Ｂ遠心分離器により６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することにより細胞を収穫した。これらの細胞ペレットを５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファーｐＨ７に再度懸濁した。これらの懸濁細胞は洗浄休止細胞と呼ぶ。
【０１３５】
すべての実験において微生物の増殖はＵｌｔｒｏｓｐｅｃ２０００紫外／可視分光光度計（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｅｎｇｌａｎｄ）により光路長１ｃｍのキュベットを用いて６６０ｎｍで培養物の光学濃度を測定することによって評価した。別法として微生物の増殖を上記のように遠心分離をおこなって培養物から細胞を収穫し、この細胞を蒸留水に再度懸濁し培地の塩を除去するために２度目の遠心分離を行うことによって評価した。乾燥重量を求めるにあたっては、洗浄した細胞を１０５℃で一晩乾燥オーブンで乾燥した。
【０１３６】
メタン濃度はここに参照として援用するＥｍｐｔａｇｅらの記載（１９９７  Ｅｎｖ．  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ３１：７３２−７３４）のようにして求めた。
【０１３７】
Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａ用の硝酸塩培地
硝酸塩液体培地、ここでは「規定培地」とも呼ぶ、は下記に示す、溶液１とさまざまな塩とを混合したものから構成される。また特に明記してあるところでは、硝酸塩の代わりに１５ｍＭの塩化アンモニウムを用いた。
【０１３８】
【表４】
2004530403.tif 000006
【０１３９】
【表５】
2004530403.tif 000007
【０１４０】
硝酸塩および亜硝酸塩アッセイ
１ｍＬの細胞培養物サンプルを取り０．２ミクロンのアクロディスクフィルターで濾過して細胞を除去した。このステップで得られるろ液が分析すべき亜硝酸塩または硝酸塩を含有している。分析はＤｉｏｎｅｘイオンクロマトグラフ５００システム（Ｄｉｏｎｅｘ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  ＣＡ）でＡＳ３５００オートサンプラーを用いて行った。カラムにはＡＧ−ＡＣガードカラムとＡＴＣトラップカラム付きの４ｍｍのＩｏｎ−Ｐａｃ  ＡＳ１１−ＨＣ分離カラムを用いた。カラムはすべてＤｉｏｎｅｘ製である。
【０１４１】
移動相は１２分間の時間間隔にわたり０から５０ｍＭまでの水酸化カリウムによる水酸化カリウム勾配を用いた。細胞温度は３５℃で、流速は１ｍＬ／ｍｉｎであった。
【０１４２】
遺伝子単離および特性決定
Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａから特定識別酵素をコードする多数の遺伝子を単離し、配列決定した。これらにはエントナー−ドゥドロフ炭素フラックス経路、エムデン‐マイヤーホフ炭素フラックス経路に見出される特徴的な遺伝子、脱窒素経路をコードする遺伝子、イソプレノイド合成経路をコードする遺伝子および細胞外多糖類の合成のための経路をコードする遺伝子が含まれる。これらの遺伝子は下記の方法にしたがって、配列決定し、それぞれの配列を公の核酸およびタンパク質データベースの情報と比較することによって機能性の特性決定を行った。
【０１４３】
標準的プロトコルにより、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａからゲノムＤＮＡを単離した。公表されているプロトコル（Ｆｒａｓｅｒら、Ｔｈｅ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０、  １９９５）にしたがって、ゲノムＤＮＡとライブラリ構成体を調製した。細胞ペレットを１００ｍＭのｐＨ８．０Ｎａ−ＥＤＴＡ、１０ｍＭのｐＨ８．０ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４００ｍＭＮａＣｌおよび５０ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する溶液に再懸濁した。
【０１４４】
ゲノムＤＮＡの調製  再懸濁の後、細胞を１０％ＳＤＳ中で徐々に溶解し、５５℃で３０分間インキュベートした。室温でのインキュベーションの後、プロテイナーゼＫを加え１００μｇ／ｍＬとし、３７℃で懸濁液が透明になるまでインキュベートした。ＤＮＡをｔｒｉｓ平衡化フェノールで２回、クロロホルムで２回抽出した。ＤＮＡを７０％エタノール中で沈澱させ、１０ｍＭのｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび１ｍＭのＮａ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）ｐＨ７．５を含有する溶液中に再懸濁した。ＤＮＡ溶液をＲＮＡアーゼ混合物で処理し、ついでｔｒｉｓ平衡化フェノールで２回、クロロホルムで２回抽出した。続いてエタノール中で沈澱させ、ＴＥに再懸濁した。
【０１４５】
ライブラリの構築  ２００から５００μｇの染色体ＤＮＡを３００ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＮａ−ＥＤＴＡおよび３０％グリセロールを含有する溶液に再懸濁させ、Ａｅｒｏｍｉｓｔ  Ｄｏｗｎｄｒａｆｔ  Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒ（ＩＢＩ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）中１２ｐｓｉで６０秒間せん断した。沈澱、再懸濁したＤＮＡをＢａｌ３１ヌクレアーゼで処理した。サイズ分別後、画分（２．０ｋｂまたは５．０ｋｂ）を切除し、清浄にして２段の連結操作を行い９９％を超える単一挿入を有する力価の高いライブラリを生産した。
【０１４６】
配列決定  微生物の全ゲノムの配列決定にはショットガン配列決定戦略アプローチを採用した（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ、  Ｒｏｂｅｒｔ  ら、Ｗｈｏｌｅ−Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒａｎｄｏｍ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｒｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  、  ２６９：  １９９５）。
【０１４７】
配列は染料ターミネーター技術（米国特許第５３６６８６０号、ＥＰ  ２７２００７）により、ベクターと挿入−特定プライマーを使用しＡＢＩ自動シーケンサーによって生成した。配列の編集はＤＮＡＳｔａｒ（ＤＮＡ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．、）またはＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＧＣＧ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０、  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  （ＧＣＧ）、  Ｍａｄｉｓｏｎ、  ＷＩ）とＣＯＮＳＥＤ  ｐａｃｋａｇｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ７．０）を用いて行った。配列はすべて両方向に少なくとも２回のカバレージを意味している。
【０１４８】
遺伝子発現のマイクロアレイ
ＤＮＡマイクロアレイの構築のためのＤＮＡ領域の増幅：Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ１６ａの各タンパク質特定ＯＲＦを増幅するために特定のプライマーペアを用いた。ゲノムＤＮＡ（１０から３０ｎｇ）をテンプレートとして用いた。ＰＣＲ反応をＨｏｔＳｔａｒｔ  ＴａｑＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ、  Ｖａｌｅｎｃｉａ、  ＣＡ）とｄＮＴＰｓ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ、ＭＤ）の存在下で行った。９５℃で３５回の変性サイクルを３０秒間、５５℃でのアニーリングを３０秒間そして７２℃での重合を２分間行った。ＰＣＲ反応の質を１％アガロースゲル中での電気泳動によりチェックした。ＤＮＡサンプルをＱｉａｇｅｎ製高生産性ＰＣＲ精製キットで精製した。
【０１４９】
増幅したＯＲＦの整列  整列に先立ち、同量のＤＭＳＯ（１０μＬ）およびＤＮＡ（１０μＬ）サンプルを３８４穴マイクロタイタープレート中で混合した。ジェネレーションＩＩＤＮＡスポッター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ、  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、  ＣＡ）を用いてサンプルをコートしたガラススライド（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ、  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、  ＣＡ）上に整列させた。各ＰＣＲ産物を各スライド上で二列に整列させた。紫外光で架橋させた後、このスライドを室温でデシケータ中真空状態で保存した。
【０１５０】
ＲＮＡ単離：Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａを規定培地中で２５％メタン含有空気中窒素源としてアンモニウムまたは硝酸塩（１０ｍＭ）を用いて培養した。最小培地培養物のサンプルをＯ．Ｄ．がＡ６００で０．３に達した時（対数期）に収穫した。細胞培養物はすばやく収穫し、ＲＬＴバッファー［Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、  Ｖａｌｅｎｃｉａ、  ＣＡ］中ビーズビーター（Ｂｉｏ１０１、Ｖｉｓｔａ、ＣＡ）を用いて破壊した。破片は４℃で３分間遠心分離を１４０００ｘｇで行いペレットとした。ＲＮＡ単離はこのキットと一緒に供給されたプロトコルを用いて完了した。カラム上でＤＮＡアーゼ処理を行った後、ＲＮＡ産物を５０から１００μＬの無ＲＮＡアーゼで溶離した。ＲＮＡ調製物を−２０℃または−８０℃のいずれかで冷凍保存した。
【０１５１】
全ＲＮＡからの蛍光ｃＤＮＡの合成：ＲＮＡサンプル（７から１５μｇ）とランダムヘキサマープライマー（６μｇ：Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を無ＲＮＡアーゼ水で希釈し、体積を２５μＬとした。サンプルを７０℃で１０分間変性し、氷上で３０秒間氷冷した。１４μＬの標識混合物を加えた後、室温で１０分間インキュベーションを行いアニーリングした。標識混合物には８μＬの５ｘ酵素バッファー、４μＬのＤＴＴ（０．１Ｍ）および２μＬの２０ｘ染料混合物が含まれていた。この染料混合物はｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ各２ｍＭ、１  ｍＭのｄＣＴＰ、および１  ｍＭのＣｙ３−ｄＣＴＰまたはＣｙ５−ｄＣＴＰからなるものであった。１から１．５μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩリバーストランスクリプターゼ（２００  単位／ｍＬ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を加えた後、ｃＤＮＡ合成を４２℃で２時間進行させた。２μＬのＮａＯＨ（２．５Ｎ）を反応物に加えてＲＮＡを除去した。３７℃で１０分間インキュベーションを行った後、１０μＬのＨＥＰＥＳ（２Ｍ）でｐＨを調製した。標識されたｃＤＮＡをついでＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）で精製した。標識効率をＣｙ３の取り込みに対してはＡ５５０で、Ｃｙ５に対してはＡ６５０を用いてモニターした。
【０１５２】
ゲノムＤＮＡの蛍光標識：ゲノムＤＮＡを噴霧化し約２ｋｂペア断片を得た。ゲノムＤＮＡ（０．５から１μｇ）を１５μＬの水中に入れた６μｇのランダムヘキサマープライマー  （Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と混合した。混合物を沸騰水に５分間おいて変性した。その後氷上で３０秒間アニールを行い、室温に戻した。２μＬの５ｘバッファー２（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）と２ｕｌの染料混合物を加えた。染料混合物の成分と標識手順とは、酵素としてＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片（５  μｇ／μＬ、  Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたことを除き、ＲＮＡ標識のところで先に述べたのと同じである。３７℃で２時間インキュベーションを行った後、標識したＤＮＡプローブをＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて精製した。
【０１５３】
ハイブリダイゼーションと洗浄：スライドを最初に３．５ｘＳＳＣ（ＢＲＬ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、０．１％のＳＤＳ（ＢＲＬ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ、  ｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含むプレハイブリダイゼーション溶液でインキュベートした。プレハイブリダイゼーションの後、標識プローブ含有ハイブリダイゼーション溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）をスライドに加えカバースリップを載せた。スライドを４２℃のインキュベータに入れ、加湿室に入れた。一晩ハイブリダイゼーションを行った後、スライドをまず室温で５分間１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳおよび０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む洗浄溶液で洗浄した。ついでスライドを６５℃で同じ溶液を用いて１０分間３回洗浄した。洗浄後、スライドを窒素流で乾燥させた。
【０１５４】
データ収集と分析：各スライドから生成された信号をレーザースキャナー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ、  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、  ＣＡ）で定量した。画像を（Ａｒｒａｙ  Ｖｉｓｉｏｎ  ４．０  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ．、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）で解析した。各スポットの生の蛍光強度はバックグラウンドを引いて調整した。これらの読みと理知をスプレッドシートへ書き出しさらに解析を行った。
【０１５５】
表１にＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａの発見され注記をつけた遺伝子を記載する。この表には配列の類似性％、同一性％、および中心炭素代謝、脱窒素、細胞外多糖類合成、およびイソプレノイド生合成のキー遺伝子に対する予想値を示す。
【０１５６】
表１はこれらの配列と当該分野で既知の配列との関係を示す。すべての配列はＢＬＡＳＴ“ｎｒ”データベース（あらゆる非重複ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳ならびに３次元構造Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列データベース、ＥＭＢＬ、およびＤＤＢＪデータベース由来の配列を含有する）に含まれる配列への類似性を調べるＢＬＡＳＴサーチ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ、  Ａｌｔｓｃｈｕｌ、  Ｓ．  Ｆ．ら、（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／も参照のこと）を行って同定した。これら配列に対しては、ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォーメーション（ＮＣＢＩ）により提供されるＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを用いて、“ｎｒ”データベースに含まれるあらゆる公に入手可能なＤＮＡ配列との類似性を分析した。ＤＮＡ配列はすべての読み取り枠中で翻訳され、ＮＣＢＩにより提供されるＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（Ｇｉｓｈ、Ｗ．  ａｎｄ  Ｓｔａｔｅｓ、Ｄ．Ｊ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６−２７２）を用いて、“ｎｒ”データベースに含まれるあらゆる公に入手可能なタンパク質配列との類似性を分析した。すべての比較はＢＬＡＳＴＮｎｒまたはＢＬＡＳＴＸｎｒアルゴリズムのいずれかを用いて行った。ＢＬＡＳＴ比較の結果を下記の表１に示すが、表１にはもっとも類似性の高い配列がまとめられている。表１にはＢＬＡＳＴＸｎｒアルゴリズムに基づくデータを、期待値で表す値と共に示す。期待値はこの規模のデータベースの検索では全く偶然としか期待できないマッチの数を特定して、与えられたスコアで示し、このマッチの統計的有意性を評価する
【０１５７】
【表６】
2004530403.tif 000008
【０１５８】
【表７】
2004530403.tif 000009
【０１５９】
【表８】
2004530403.tif 000010
【０１６０】
【表９】
2004530403.tif 000011
【０１６１】
【表１０】
2004530403.tif 000012
【０１６２】
【表１１】
2004530403.tif 000013
【０１６３】
【表１２】
2004530403.tif 000014
【０１６４】
実施例１
Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａの単離
池の堆積物から単離株を含有した原環境試料を得た。この池の堆積物を２５％メタン含有空気下で窒素源としてアンモニウムを含む規定培地中に直接接種した。メタンを唯一の炭素およびエネルギー源とした。６６０ｎｍでの光学濃度が安定になるまで増殖させた後、培養物を希釈率が１：１００倍となるように新しい培地に移した。メタンを唯一の炭素およびエネルギー源として用いてこの継代を３回つづけて行った後、培養物をアンモニウムを窒素源とする増殖寒天培地により２５％メタン含有空気下で平板培養した。このやりかたで多数のメタノトロフィック菌株を単離した。しかしコロニーの増殖が速いこと、コロニーの大きさが大きいこと、最小培地上で増殖できること、さらにカロチノイドの活性生合成経路を示すピンクの着色という点からＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａを研究対象生物として選択した。
【０１６５】
実施例２
最小培地中でのメタンによる急速な増殖
Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａはメタン含有空気の培養ヘッドスペースと無機塩のみからなる規定培地上で増殖する。通常の増殖用メタン濃度は培養ヘッドスペースの体積の５から５０％である。イースト抽出物などの有機添加物やビタミン類は図１に示す増殖を行うのに必要ではない。図１は１６ａの増殖を全く同一の増殖条件、すなわち２５％メタン含有空気を基質とした最小培地、のもとでのＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓの増殖と比較して示す。このデータはメタンを基質とした時Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａは２から２．５時間毎に倍加するが、一方Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓの倍加は３．５時間毎であることを示している。メタノールを基質とすると、倍加時間はＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａでは２．５から３時間、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓでは４．５から５時間である。細胞密度もまたメタンで増殖するＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａの方が有意に高い。Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓは実験および商業目的で広く用いられているメタノトロフィック菌である。
【０１６６】
実施例３
メタノール耐性
Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａを硝酸塩を唯一の窒素源とし、メタノールを唯一の炭素源として規定培地上で増殖させた。増殖を培養物の最大光学密度、または濁度を得るのに通常十分な期間である、３６時間に渡りモニターした。図２はメタノール濃度が６００ｍＭ以下の時、３６時間以内に最大増殖または濁度が達成されていることをはっきりと示している。しかし８００ｍＭでは増殖は見られなかった。したがってこの菌株は２．４％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のメタノールで増殖することがわかる。
【０１６７】
実施例４
Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａの性質と分類
表２にＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａの諸性質を示す。表２に掲載した判定基準は物理的ならびに酵素的性質に基づき、菌株を任意にＩ型、ＩＩ型、またはＸ型であると考えることができるかどうか判断する時に通常用いられるものである。この表は酵素の直接酵素アッセイと遺伝子ならびに遺伝子経路の存在を示すゲノムデータの両方から作成されたものである。このカテゴリー化は、機能ベースのもので、この菌株が炭素を取り込むのにエネルギー的にもっとも有効な経路、リブロースモノホスフェートすなわち「ＲｕＭＰ」経路、を利用しているということを示している。ゲノムデータはＲｕＭＰ経路中のキー酵素の存在を明らかに示している。内部膜構造もまたＩ型の生理機能を示している。本菌株にユニークな点はＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａ中に窒素固定化遺伝子が見つかったことである。この菌株はイースト抽出物やビタミンが存在しなくても増殖することが示されている。硝酸塩、アンモニウムイオンまたは窒素分子は生合成の窒素要求を満足させることができる。この機能的データは他のＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ株と比較すると、１６ｓｒＲＮＡ同族体と完全に一致する。１６ｓＲＮＡの比較、すなわち１６ａ株（配列番号８１）と他のＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．と比較するとＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａがＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．（ｓｔｒａｉｎ：ＫＳＰＩＩＩ）に９６％の同一性を持つことが分かる［Ｈａｎａｄａ、Ｓら、Ｊ．  Ｆｅｒｍｅｎｔ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ８６、  ５３９−５４４  （１９９８）］  ａｎｄ  ｗｉｔｈ  Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  （ｓｔｒａｉｎ  ＬＷ１３）、  ［Ｃｏｓｔｅｌｌｏ、  Ａ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｌｉｄｓｔｒｏｍ、  Ｍ．Ｅ．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６５  （１１）、  ５０６６−５０７４  （１９９９）］］。したがってＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａは正しくＩ型のＲｕＭＰ利用、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ種と分類できる。
【０１６８】
【表１３】
2004530403.tif 000015
【０１６９】
酵素アッセイの方法
ニトロゲナーゼは分析しなかったが、ゲノム配列分析に基づき、もし遺伝子が存在するのであればプラスであると考えられる。
【０１７０】
グルコース６ホスフェートデヒドロゲナーゼ：１ｍＬの反応混合物は１００μＬの１０ｍＭＮＡＤＰ、１００μＬの１０ｍＭグルコース、７００μＬの１００ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７バッファーおよび１００μＬ以下の酵素抽出物を含有する。この酵素活性をＮＡＤＰがＮＡＤＰＨに還元されるのを３４０ｎｍで分光光度計を用いてモニターすることによって測定した。
【０１７１】
イソクエン酸デヒドロゲナーゼ：１ｍＬの反応混合物は１００μＬの１０ｍＭイソクエン酸ナトリウム、１００μＬの１０ｍＭＮＡＤＰ、、７００μＬの１００ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７バッファーおよび１００μＬ以下の酵素抽出物を含有する。この酵素活性を３４０ｎｍでＮＡＤＰＨ形成をモニターすることによって測定した。
【０１７２】
硝酸塩の資化は硝酸塩を唯一の窒素源としてこの菌が増殖する能力に基づく。
【０１７３】
酵素アッセイの結果を表２にまとめる。
【０１７４】
実施例５
エントナー−ドゥドロフ経路中の遺伝子発現レベルのエムデン‐マイヤーホフ経路との比較
実施例５は１６ａ株中のエムデン‐マイヤーホフ経路の使用に対するマイクロアレイによるエビデンスを示す。
【０１７５】
図３にエントナー−ドゥドロフ経路とエムデン‐マイヤーホフ経路の相対的遺伝子発現レベルを示す。各遺伝子の相対的転写活性を先に記載されている（Ｗｅｉら、  ２００１．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．  １８３：５４５−５５６）ように、ＤＮＡマイクロアレイを用いて評価した。
【０１７６】
特に、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ１６ａの４０００ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）を含有する一つのＤＮＡマイクロアレイをゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡから作成したプローブとハイブリダイゼーションした。１６ａのゲノムＤＮＡはＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片と蛍光染料Ｃｙ−５により標識し、一方全ＲＮＡは逆転写酵素とＣｙ−３で標識した。ハイブリダイゼーション後、Ｃｙ−３およびＣｙ−５の信号強度をアレイの各スポット毎に定量した。Ｃｙ−３とＣｙ−５の強度の比と下記の式
（遺伝子比／全比率の合計）ｘ１００
を用いて各転写率（パーセント）を計算した。得られた値は各遺伝子のｍＲＮＡの相対的な存在度を反映している。したがって、アレイにより表されるあらゆる遺伝子の転写活性がこのｍＲＮＡ相対的存在度に基づき降順に位置付けすることができる。例えばメタンモノオキシゲナーゼのｍＲＮＡ存在度は＃１にランクされるが、これはメタンを炭素源としてこの生体を増殖させた時に、遺伝子が最も高い転写活性を持っていたためである（図３）。
【０１７７】
エントナー−ドゥドロフ経路にとって「診断的」とみなされる遺伝子は６ホスホグルコネートデヒドラターゼと２ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコネートアルドラーゼである。ホスホフルクトキナーゼおよびフルクトースビスホスフェートアルドラーゼはエムデン‐マイヤーホフ配列に対し「診断的」である。図３で各ステップの横に示される数は、その酵素の相対的発現レベルを示す。例えば細胞中で最も高度に発現した酵素はメタンモノオキシゲナーゼ（ランク＃１）である。次に高度に発現したのがメタノールデヒドロゲナーゼ（ランク＃２）である。ホスホフルクトキナーゼ（ランク＃２３２）とフルクトースビスホスフェートアルドラーゼ（ランク＃６５）のメッセンジャーＲＮＡ転写物はグルコース６ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ランク＃７１７）、６ホスホグルコネートデヒドラターゼ（ランク＃７６３）あるいは２−ケト−３−デオキシ−６−グルコネートアルドラーゼのものよりも高い存在度であった。このデータはエムデン‐マイヤーホフ経路酵素がエントナー−ドゥドロフ経路酵素よりも、より強く発現していることを示唆している。この結果は驚くべきものであり、メタノトロフィック菌株の中心的代謝に対して信じられていたこと（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｂｏｏｋ  ｐａｇｅｓ  ｉｎ．  Ｔｈｅ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｇｒａｍ−  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｉｎ：  Ｍｅｔｈａｎｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈａｎｏｌ  Ｕｔｉｌｉｚｅｒｓ、  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋｓ  ５．  １９９２．    Ｅｄｓ：  Ｃｏｌｉｎ  Ｍｕｒｒｅｌｌ、  Ｈｏｗａｒｄ  Ｄａｌｔｏｎ．  Ｐｐ  １４９−１５７）に反する。
【０１７８】
実施例６
ピロリン酸結合ホスホフルクトキナーゼを示す直接的酵素エビデンス
実施例６は本菌株中のエムデン‐マイヤーホフ経路の機能性を確認することになる、ピロリン酸結合ホスホフルクトキナーゼ酵素が本菌株中に存在するエビデンスを示す。
【０１７９】
下に記載する組合酵素アッセイを用いて、ホスホフルクトキナーゼ活性がＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａ中に存在することを示した。アッセイの条件を下記の表３に示す。このアッセイはさらに下記の表４に示すように他の多数のメタノトロフィック菌株中で活性を分析するのにもまた使用された。表４のデータはホスホリルドナーとしてＡＴＰまたはピロリン酸を用いてホスホフルクトキナーゼ活性を試験した既知のＡＴＣＣ株を示す。これらの生体はＩ型またはＸ型リブロースモノホスフェート利用株、またはＩＩ型セリン利用株のいずれかに分類された。
【０１８０】
結合アッセイ反応
ホスホフルクトキナーゼ反応を結合酵素アッセイにより測定した。ホスホフルクトキナーゼ反応はフルクトース１，６−ビスホスフェートアルドラーゼと結合し、その後トリオースホスフェートイソメラーゼと結合させた。酵素活性をＮＡＤＨの消失によって測定した。
【０１８１】
特に、酵素ホスホフルクトキナーゼはフルクトース６ホスフェートとピロリン酸をフルクトース１，６ビスホスフェートおよびオルトホスフェートに変換するキー反応を触媒する。
【０１８２】
フルクトース−１，６−ビスホスフェートはフルクトース１，６−ビスホスフェートアルドラーゼにより３−ホスホグリセルアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンホスフェートに分割される。
【０１８３】
ジヒドロキシアセトンホスフェートはトリオースホスフェートイソメラーゼによる異性化により３−ホスホグリセルアルデヒドとなる。
【０１８４】
グリセロールホスフェートデヒドロゲナーゼとＮＡＤＨおよび３−ホスホグリセルアルデヒドはアルコールグリセロール−３−ホスフェートとＮＡＤを生じる。ＮＡＤＨの消失を分光光度計（ＵｌｔｒａＳｐｅｃ  ４０００、  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて３４０ｎｍでモニターした。
【０１８５】
【表１４】
2004530403.tif 000016
【０１８６】
【表１５】
2004530403.tif 000017
【０１８７】
上記に示したデータからいくつかの結論を引き出すことができる。第一にＡＴＰ（これはホスホフルクトキナーゼにとって典型的なホスホリルドナーである）がメタノトロフィック菌株中のホスホフルクトキナーゼ反応において本質的に無効であることは明らかである。無機のピロリン酸のみが試験したすべてのメタノトロフィック菌株中でこの反応を支持することが見出された。第ニに、メタノトロフィック菌株がすべてこの活性を有するわけではない。この活性はＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｗｈｉｔｅｔｔｅｎｂｕｒｙおよびＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓでは本質的に存在していなかった。中間レベルの活性がＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｃｌａｒａおよびＭｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｓｐｏｒｉｕｍで見られた。これらのデータは多くのメタノトロフィック菌株がいままで報告されて無いホスホフルクトキナーゼ活性を有しているのかもしれないことを示している。このことからこの活性を有するメタノトロフィック菌株は活性なエムデン‐マイヤーホフ経路を持つと推論してもよいであろう。
【０１８８】
実施例７
Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａによる増殖収率と炭素変換
増殖収率と炭素変換効率をＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａとＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓで比較した。これらの菌株を選択したのは１６ａが高レベルのホスホフルクトキナーゼを有するのに対し、Ｍ．Ｃａｐｓｕｌａｔｕｓが本質的にこの酵素活性に欠けているからである。もしＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａがよりエネルギー的に有利なエムデン‐マイヤーホフ経路を利用でき、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓがエントナー−ドゥドロフ経路を使用することしかできなかったのであれば、本Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａ株のエネルギー的優位性は細胞収率および炭素変換効率に反映されるであろうと考えたのである。エネルギー効率におけるこの差はエネルギーが制限されている状況でのみ明らかになるであろう。これらの条件は本実験においては各培養物中の酸素量を２０％（図１および表９で用いられた増殖条件）でなく１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）に制限することにより実現された。この酸素制限条件下では有気呼吸でメタンからもっとも多くのエネルギーを生産する菌株がより多くの細胞量を生じるであろう。
【０１８９】
細胞はセラム栓付きの５００ｍＬウイートン瓶で２００ｍＬの培養物として増殖させた。瓶のヘッドスペースはメタン２５％、酸素１０％に調節した。規定培地フォーミュレーションは両者とも同じものである。
【０１９０】
【表１６】
2004530403.tif 000018
【０１９１】
収率定量：収率は酸素制限のもとでアンモニウムを窒素源として用い、三重の培養物を５００ｍＬ瓶中で増殖させて測定した。これは３００ｍＬの培養物を３００ｍＬの２５％メタン、１０％酸素、残り窒素のヘッドスペースと共に用いて行った。増殖の終わりに（すなわち静止期）ヘッドスペース中に残留するメタンをガスクロマトグラフィーにより定量した。細胞を遠心分離で集め、蒸留水で洗浄し、一晩乾燥オーブン中で乾燥させて秤量した。
【０１９２】
炭素変換効率はどれだけの炭素が細胞量に同化されたかを示す尺度である。これはバイオマス組成がＣＨ２Ｏ０．５Ｎ０．２５であると仮定して計算される。
【０１９３】
Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａ：１６ｇ／メタン・モルＸ（乾燥重量１ｇ／メタンｇ）／２５ｇ／バイオマス・モル
Ｍ．  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  １６ｇ／メタン・モルＸ（乾燥重量０．６４ｇ／メタンｇ）／２５ｇ／バイオマス・モル
【０１９４】
これらのデータ（表５）からＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａは温度以外は全く同一の増殖条件のもとで、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ株よりはるかに多い細胞量を生産したことがわかる。Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓが増殖する最適温度は４５℃であるが、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓは３３℃で増殖する。データから、よりエネルギーを生じるエムデン‐マイヤーホフ経路によりＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａは増殖の点で有利になるとの推論が導けるであろう。
【０１９５】
表６にすべての場合においてピルベートに規準化した炭素生産量と共にＡＴＰ収量を炭素同化経路の関数として示す理論的計算値を示す（Ｔｈｅ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｇｒａｍ−  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｉｎ：Ｍｅｔｈａｎｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈａｎｏｌ  Ｕｔｉｌｉｚｅｒｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋｓ  ５．１９９２．Ｅｄｓ：Ｃｏｌｉｎ  Ｍｕｒｒｅｌｌ、Ｈｏｗａｒｄ  Ｄａｌｔｏｎ．Ｐｐ．１４９−１５７）。表６にセリンサイクル、キシルロースホノホスフェートサイクル、およびリブロースモノホスフェートサイクル経路の炭素３分子（ホルムアルデヒドあるいは二酸化炭素としての）ごとに生産または消費されるＡＴＰの量を示す。後者の経路は先に述べたように通常２−ケト−３デオキシ−６−ホスホグルコネート／トランスアルドラーゼ（ＫＤＰＧＡ／ＴＡ）変異株として存在すると考えられている。これらのデータは実際フルクトースビスホスフェートアルドラーゼ／トランスアルドラーゼ（ＦＢＰＡ／ＴＡ）変異株がメタノトロフィック菌株中に存在しているらしいことを示している。もしメタノトロフィック菌株がＡＴＰ結合ホスホフルクトキナーゼを持つのであれば、このエネルギーの影響はメタノトロフィック菌株にとってさらに余分な１個のＡＴＰの純生産であり、ピロリン酸結合酵素にとってはさらに２個のＡＴＰの生産となる。したがってＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａが派生し、さらに２個のＡＴＰが３個の炭素毎に同化されることが予想され、このことにより本菌株がＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓに対しより多くの収率と炭素効率を有することが説明されるであろう。
【０１９６】
【表１７】
2004530403.tif 000019
【０１９７】
実施例８
硝酸塩／亜硝酸塩は酸素を節約する
図４に酸素消費を検出するためにオリオン酸素プローブ（Ｏｒｉｏｎ、ＵＫ）を用いた、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａの細胞懸濁液による酸素消費を相対検知単位で示す。硝酸塩の存在下、または不在下で、かつエレクトロンドナーであり炭素源としてのメタノールの存在下で酸素を時間の関数として測定した。この培養物はｐＨ７のＨＥＰＥＳバッファー中に懸濁したＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａからなっていた。最終濃度が約１００ｍＭとなるようにメタノールを両培養物中に３分後に注入した。メタノールの注入の後、硝酸塩を含まない培養物中では酸素の消費が予想通り加速されたのを見ることができた（図４）。硝酸塩の存在下での酸素消費速度は、しかし硝酸塩を含まない細胞のものには決して追い付くことはなかった。このデータはしたがって硝酸塩はメタノールを炭素源とした時に酸素消費を節約できるという知見を支持する。
【０１９８】
Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａ細胞を再度ｐＨ７のＨＥＰＥＳバッファーに懸濁させ、Ｏｒｉｏｎ酸素プローブを備えたウォータージャケット付チャンバー中で培養した。培養は３０℃で行った。メタノールをこの培養物に１分後に注入した。一つの培養物には亜硝酸ナトリウム（２５ｍＭ）を２３分後に注入した。結果を図５に示す。図５からわかるように、亜硝酸塩の添加の後酸素消費速度に減少がみられる。このデータはさらに、亜硝酸塩および間接的に硝酸塩がもう一つのエレクトロンシンクとして用いられ、その結果培養物による酸素消費が減少するという主張を再びはっきりと支持するものである。
【０１９９】
Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａを２５％メタン含有空気下、規定培地中に懸濁したものにつきデッドスペース中の酸素およびＮ２Ｏの同時モニターを行った。添加された窒素源は１００ｍＭの亜硝酸塩のみであった。結果を図６に示す。図６はデッドスペースにＮ２Ｏがあらわれるのは酸素の枯渇と同時期であることを示している。プロットした数はそれぞれＮ２Ｏおよび酸素の出現速度および消失速度である。酸素の消失速度が低値へと減少するにつれ（ヘッドスペースのＯ２濃度が低下するため）、Ｎ２Ｏの生産が増加し、生体中の全電子フローの大きな部分を形成する（酸素制限下でのみ）。
【０２００】
実施例９
他のメタノトロフィック菌株およびＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａによる硝酸塩または亜硝酸塩の還元
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅコレクションから得られるすべてのメタノトロフィック菌株を亜硝酸塩または硝酸塩からのＮ２Ｏ産生能力に関し、テストした。全菌株は規定培地上で増殖させ、６６０ｎｍでの光学濃度が１．０に達した後収穫した。この細胞懸濁液を遠心分離で集め、硝酸塩または亜硝酸塩を唯一の窒素源として、５ｍＬの規定培地に再懸濁した。下記の表７に示すデータは３０℃で培養した１０ｍＬアッセイバイアルのヘッドスペース中のＮ２Ｏの蓄積（濃度ｕＭ）を示す。得られた結果はテストした菌株中でＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａが硝酸塩をＮ２Ｏへ変換するユニークな能力を持っていたことを示している。さらにこのデータはその他の二つのＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ株が亜硝酸塩をＮ２Ｏへと変換する同様の能力を持っていることを示している。
【０２０１】
【表１８】
2004530403.tif 000020
【０２０２】
実施例１０
グリコーゲンの生産
Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａはメタンまたはメタノール上で増殖させると多量のグリコーゲンを蓄積することが示されている。Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ細胞に対しデンプンアッセイキット（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）を用いてグリコーゲンの分析をした。このアッセイはデンプンあるいはグリコーゲン特異的であり、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａ中のグリコーゲンの存在を結論づけるものである。細胞は一般方法で概略をのべた条件に従って増殖させ、１００ｍＭメタノールまたは２５％ヘッドスペースメタンにより３０℃で規定培地を用いて増殖させて収穫した。培養物サンプルを増殖カーブの２つの時点で採取した：対数増殖期中間（Ｏ．Ｄ．６６０  ０．３）
および静止期（Ｏ．Ｄ．６６０  １．０）。これらのサンプルは製造者の指示書に従いデンプンアッセイキットを用いて速やかに分析した。下記の表８に示す結果が示すのは、メタノールでの増殖中の驚くべき量の蓄積ポリマーと、メタンでの増殖中のこれよりは少ないが、しかしかなりの量のグリコーゲンを示している。
【０２０３】
【表１９】
2004530403.tif 000021
【０２０４】
さらに、メタノールで増殖させた細胞中に顆粒が存在することが走査電子顕微鏡により観察され、多糖類に特異的な着色によりこれがデンプンを含有することがわかった。
【０２０５】
実施例１１
細胞集団からのタンパク質の製造
Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａおよびＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（タンパク生産のための参照株）をＯＤ６６０に増加が見られなくなるまで規定培地で増殖させた。メタンまたはメタノールの全消費量を計算できるように、メタンまたはメタノール消費をガスクロマトグラフィー（ＨＰ−Ｐｌｏｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｉｅｖｅ  ｃｏｌｕｍｎ、  Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ５８９０  ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩ  ｇａｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ）で増殖曲線の終わりまでモニターした。ＧＣの運転条件は、オーブン温度：４０℃、初期温度：４０℃、初期時間：３分間、速度：０度／分、最終温度４０℃、最終時間０、注入Ａ温度：１００℃、検出Ａ温度：１２５℃、および平衡時間：０であった。
【０２０６】
細胞を遠心分離で集め、一晩１０５℃の乾燥オーブンで乾燥した。表９に示すデータは消費されたメタンまたはメタノール１グラムあたり、生産された細胞の乾燥重量（グラム）である。
【０２０７】
【表２０】
2004530403.tif 000022
【０２０８】
表９のデータからわかるように、本菌株はメタンまたはメタノール上で増殖させると、この目的のために選ばれた商業的なメタノトロフィック菌株よりも高率でタンパク質の生産を行う。
【０２０９】
実施例１２
細胞外多糖類の生産
Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａを規定培地上３０℃、２００ｍＬのバッチカルチャー中で２５％のメタンにより増殖させた。窒素でフラッシュした瓶の中に純粋な酸素を注入することにより初期酸素濃度を変化させた。細胞を静止期まで、あるいは光学濃度が約１．０になるまで増殖させた。その時点で培養物を６０００ｘｇで３０分間遠心分離し、細胞と細胞外多糖類の両方を沈降させた。これらの遠心分離からの沈渣は２層からなっていた。底に細胞があり、その上を透明粘稠な物質がおおっており、これが細胞外多糖類（ＥＰＳ）であった。このＥＰＳ層は、さらに細胞から分離するために洗い流し、遠心分離した。細胞ペレットもまた乾燥させ、秤量した。ＥＰＳを５０％エタノール中に再懸濁させ、遠心分離でペレット化した。最後にこの物質を乾燥、秤量した。ＥＰＳは周囲大気に近い酸素濃度では培養物の全乾燥重量の５０％に登ることがわかった。これは培養物を１０、０００ｘｇで３０分間遠心分離して求めた。得られたペレットは下部の赤い層（パック細胞）と細胞外多糖類である上部の透明層とからなっていた。ＥＰＳを選択的にスパチュラで除去し、１０５℃で一晩乾燥させた。細胞ペレットを除去し、１０５℃で乾燥させた。遠心分離から得た上澄みと冷イソプロパノールを混合（体積比１：１）した。このステップで沈澱したＥＰＳを遠心分離（１０、０００ｘｇで３０分間）により集め、ペレットを１０５℃で一晩乾燥させ、秤量した。ＥＰＳを化学分析したところ、これが主としてポリグルコース（約７０％）であることがわかった。ＥＰＳサンプルをＣｉｕｃａｎｕ、Ｉ．、Ｆ．Ｋｅｒｅｋ．１９８４．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３１：２０９−２１７の方法でメチル化した。メチル化したサンプルを２ＭのＴＦＡで１２１℃で２時間加水分解し、加水分解した炭水化物を重水素化硼素ナトリウムにより室温で還元した。生成物をＳｐ２３３０Ｓｕｐｅｌｃｏカラムを用いたＧＣ−ＭＳによりアセチル化した。この還元ステップに先立ち、内部標準ミオイノシトールを各サンプルに添加した。
【図面の簡単な説明】
配列の説明および寄託生物
【図１】同一の増殖条件の下で、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓの増殖と比較した、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａの増殖を示す。
【図２】Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａをメタノールのみで増殖させた時の光学的濃度対メタノール濃度をプロットしたものである。
【図３】Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａ中のエントナー−ドゥドロフ経路およびエムデン‐マイヤーホフ経路の図であり発現レベルの減少順に数字でランキングしたマイクロアレイ発現結果を示す。
【図４】酸素消費を検出するために、任意のユニット中でのＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａの細胞懸濁液による酸素消費を任意の単位で示す。
【図５】硝酸ナトリウムを培養物に加える前後の酸素消費を検出するために、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａの細胞培養液による酸素消費を任意単位で示す。
【図６】毎時発生するＯ２およびＮ２Ｏの濃度を好気条件の下でのＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ１６ａ細胞懸濁液媒体中のＯ２濃度に対してプロットしたものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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