(57)【要約】【課題】醸造用酵母の正確な判別、分類、同定を迅速且つ容易に行う方法の開発。【解決手段】トランスポゾンのＬＴＲ領域を含むＤＮＡ配列の一部又は全部を増幅させるプライマーを用いて、ＰＣＲ法にて増幅させ、それら増幅させた遺伝子断片を電気泳動又は制限酵素で処理した後、電気泳動し、その電気泳動パターンの違いにより酵母を判別する。その結果、醸造用酵母の正確な分類・判別が迅速且つ容易に可能になる。本法は、再現性が高く、しかも短期間に結果が得られ、清酒酵母と焼酎酵母といった異なった用途の酵母の判別を可能とするだけでなく、協会焼酎酵母ＳＨ４と鹿児島酵母Ｋ２といった同一用途の酵母間の判別も可能とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
醸造用酵母のゲノムＤＮＡをトランスポゾンのＬＴＲ領域を利用しＹｎｒｃ  ｄｅｌｔａ７、Ｙｃｒｗ  ｄｅｌｔａ１３、Ｙｅｒｃ  ｄｅｌｔａ１６、Ｙａｒｗ  ｄｅｌｔａ６、Ｙｉｌｃ  ｄｅｌｔａ３、Ｙｌｒｗ  ｄｅｌｔａ２０、Ｙｌｒｃ  ｄｅｌｔａ２遺伝子の少なくともひとつの遺伝子の一部又は全部を増幅させるプライマーを用いて、ＰＣＲ法にて増幅させ、それらを増幅させた遺伝子断片を直接電気泳動し、その泳動パターンの違いによって酵母を判別すること、を特徴とする醸造用酵母の判別方法。
【請求項２】
醸造用酵母がブドウ酒酵母、焼酎酵母、泡盛酵母、清酒酵母の少なくともひとつの酵母であって、判別が同一用途間及び／又は異なった用途間での判別であること、を特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プライマーが、配列番号１〜２０の少なくともひとつで示される塩基配列からなるＤＮＡ断片であること、を特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
配列番号１〜２０の塩基配列でそれぞれ示される、醸造用酵母判別プライマーのＤＮＡの少なくともひとつ。
【請求項５】
請求項４に記載のプライマーＤＮＡあるいは該プライマーを用いたＰＣＲ産物を含んでなること、を特徴とする醸造用酵母判別キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母の判別に関するものであり、更に詳細には、トランスポゾン、特にそのＬＴＲ（可動遺伝因子ないし転移ＤＮＡ因子）領域を利用して、酵母、特に醸造用酵母を、簡便、正確、かつ迅速に分類、同定する新規システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
醸造用酵母としては、ブドウ酒酵母、焼酎酵母、泡盛酵母、清酒酵母等いくつかの種類の酵母が使用されており、また更にこれらの各酵母のうち、例えばブドウ酒酵母としては、ＣＥＧ、ＥＣ１１１８等が使用され、また清酒酵母も協会７号（Ｋ７）、９号（Ｋ９）、１０号（Ｋ１０）酵母等が使用され、焼酎酵母も協会焼酎酵母ＳＨ４、鹿児島酵母Ｋ２、宮崎酵母ＭＫ０２１等が使用されている。
【０００３】
しかしながら、これらの醸造用酵母はいずれもサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）若しくはサッカロマイセス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）に分類されるものであって、同種に属し醸造に使用されるため、通常の菌学的性質は共通しており、これらの酵母を短時間に且つ正確にそれぞれ区別することはきわめて困難である。したがって、現時点においては、酵母を小仕込試験するなどして、その醸造特性から判別したり、薬剤や培養条件を変えることで酵母を判別したりする方法で酵母の判別を行わざるを得ないのが実情である。しかしながら、これらの判別方法は、酵母を実際に培養したり、仕込みを行ってその醸造特性を確認する必要があるため、判別に相当の時間を要することは不可避であり、当業界においてその改善が求められている。
【０００４】
一方において、実験室用酵母としてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（株）より市販されている酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８Ｃ株は、多くのトランスポゾンを有していることが判明している（非特許文献１参照）。
【０００５】
また、プライマーとしては、ＥＩ−２プライマーが既知となっているが、これを利用した酵母の判定は行われておらず（例えば、非特許文献２参照）、結局現時点においては、遺伝子に着目した酵母の判定法として成功した例は、本発明者や当研究所の下飯らが開発するのにはじめて成功した数例しか報告されていない（特許文献１、２、３参照）。
【非特許文献１】Ｌｙｅ  Ｇ.，  Ｂｏｗａｎ，  Ｓ.，  Ｃｈｕｒｃｈｅｒ，  Ｃ.，  インターネット＜ＵＲＬ:  ｈｔｔｐ:／／ｗｗｗ.ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ.ｏｒｇ／＞
【非特許文献２】Ｍｉｇｕｅｌ  Ｂ．Ｌ．Ａｌｉｓｏｎ，  Ｓ．Ｐａｕｌ，  Ａ．Ｈ.  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒ  Ｌ．，  「Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」  １９９６，  ｐ４５１４〜４５２０
【特許文献１】特開２００３−２４５０７７号公報
【特許文献２】特開２００４−３２９０８６号公報
【特許文献３】特開２００５−２７５２７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このように、実際の酒類製造の現場において、そしてまた試験研究機関において、短期間で正確且つ簡易な酵母の判別システムの確立は従来より重要な課題である。本発明は、このような技術の現状に鑑み、例えばブドウ酒酵母と焼酎酵母、焼酎酵母と清酒酵母といった異なった用途の酵母間だけでなく、その判別が非常にデリケートで難しい、例えば協会焼酎酵母ＳＨ４と鹿児島酵母Ｋ２といった同一用途の酵母間においても、それを短期間で正確且つ簡易に判別できるシステムの開発という困難な技術的課題をあえて設定した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、本技術分野におい従来注目されることのなかったトランスポゾン、しかもそのＬＴＲ領域に着目し、ＬＴＲ領域に由来するＤＮＡ断片をプライマーとして用い、醸造用酵母ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行って、増幅された遺伝子断片の長さ、数の違い等により、その醸造用酵母の判別を行う点を基本的技術思想とするものである。
【０００８】
以下、本発明について詳しく述べる。
【０００９】
本発明者らは、既に報告されている非特許文献２（Ｍｉｇｕｅｌ  Ｂ．Ｌ．Ａｌｉｓｏｎ，  Ｓ．Ｐａｕｌ，Ａ．Ｈ．  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒ，  Ｌ．，「Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」  １９９６，  ｐ４５１４〜４５２０）にかかるＥＩ−２  ｐｒｉｍｅｒ「（ＣＴＧ  ＧＣＴ  ＴＧＣ  ＴＡＣ  ＡＴＡ  Ｃ）を用いて焼酎酵母のゲノムＤＮＡに対してＰＣＲ法により増幅したところ、株によって３種類もしくは４種類の増幅されたＤＮＡのバンドを認めた。更にこのＤＮＡ断片をクローニングし、塩基配列情報を決定したところ、Ｙｉｌｃ  ｄｅｌｔａ３遺伝子を見出し、４種類の増幅されたＤＮＡのハンドを認めた株には当該遺伝子が２つ存在することが判明した。すなわち長さの異なるＹｉｌｃ  ｄｅｌｔａ３遺伝子を酵母が有するか否かによって、ＥＩ−２による増幅ＤＮＡ断片の数が異なることを見出した。
【００１０】
更に、Ｙｉｌｃ  ｄｅｌｔａ３遺伝子は、酵母のトランスポゾンＴｙ−１遺伝子のＬＴＲ領域であったことから、酵母遺伝子内に散在するＬＴＲ領域を含む遺伝子を酵母判別に利用する着想を得た。そこで本発明者らは、トランスポゾンのＬＴＲ領域を含む数種類の遺伝子を増幅させるプライマーを用いて、ＰＣＲ法にて増幅させ、それら増幅ＤＮＡ断片を電気泳動したところ、酵母によって異なる長さのＤＮＡ断片が増幅し、トランスポゾンのＬＴＲ領域の利用による酵母の判別が可能であることをはじめて確認した。
【００１１】
本発明は、これらの有用新知見に基づいてなされたものであって、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）若しくはサッカロマイセス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｅｃｓ  ｂａｙａｎｕｓ）に属する醸造用酵母のゲノムＤＮＡを用いて、ＰＣＲ法によりトランスポゾンのＬＴＲ領域を含む遺伝子の一部又は全部を増幅させ、その増幅されるＤＮＡ断片の長さ、数の違いにより、その醸造用酵母の判別を行う点を基本的技術思想とするものである。なお、本発明において、トランスポゾンのＬＴＲ領域を含む遺伝子には、ＬＴＲ領域のみからなる遺伝子も包含される。
【００１２】
すなわち、本発明は、トランスポゾンのＬＴＲ領域を含むＤＮＡ配列が醸造用酵母で異なることを発見し、これら有用な新知見に基づき、更に検討した結果完成されたものであって、トランスポゾンのＬＴＲ領域を含むＤＮＡ配列に基づいた醸造用酵母の判別、確認、検出システムにも関するものである。
【００１３】
本発明においては、トランスポゾンのＬＴＲ領域を含む遺伝子がすべて対象とされるが、例えばＹｎｒｃ  ｄｅｌｔａ７、Ｙｃｒｗ  ｄｅｌｔａ１３、Ｙｅｒｃ  ｄｅｌｔａ１６、Ｙａｒｗ  ｄｅｌｔａ６、Ｙｉｌｃ  ｄｅｌｔａ３、Ｙｌｒｗ  ｄｅｌｔａ２０、Ｙｌｒｃ  ｄｅｌｔａ２等が例示される。これらは、非特許文献１により既知であって、市販されているＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８Ｃ株にも含有されている。
【００１４】
本発明の実施にあたり、プライマーとして、今回本発明者らがはじめて開発に成功したプライマー１〜２０（それらの塩基配列を、配列表の配列番号１〜２０：表１に示す。）を選択、使用し、酵母のゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行うのであるが、プライマーとしては、ＬＴＲ領域を含む遺伝子から切り出してもよいし、また、上記したプライマーを合成して用いても良い。プライマーとしては、判別しようとする酵母に応じたものを適宜選択して使用すればよく、酵母によっては１〜２０以外のプライマーを設計し、合成すればよく、その結果、目的とする遺伝子断片を得ることができる。
なお、本発明において、プライマーは、配列番号１〜２０の少なくともひとつで示される塩基配列からなるＤＮＡ断片のほか、該塩基配列を含むＤＮＡ断片も包含するものである。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
このようにして増幅して得た遺伝子断片は、電気泳動し、その泳動パターンを観察することにより、酵母の判別をすることができる。プライマーの種類、組み合わせを選択することにより、酵母に特有な明確な泳動パターンが得られる。また、所望するのであれば、ＰＣＲにて増幅された遺伝子断片を制限酵素で切断し、これを電気泳動してその泳動パターンを観察することによっても、酵母の判別を簡易且つ明確に行うことができる。
【００１７】
したがって、本発明によれば、プライマー、鋳型に用いるゲノムＤＮＡ、増幅されたＤＮＡ断片、その制限酵素消化物の少なくともひとつを用いて、その種類を変えることによって、各種の醸造用酵母を判別・同定が可能となり、あるいは逆に特定の醸造用酵母の判別・同定するためには、プライマー等を選別すればよく、酵母のバリエーションが出るようにあるいはそれに対応するようにプライマー等についてもバリエーション設計をすればよい。
【００１８】
このようにして本発明によれば、醸造用酵母の判別、同定、分類の少なくともひとつが可能となるので、上記したプライマー等の少なくともひとつを用いて、そして更に、マーカー等の電気泳動に必要な試薬類を適宜セットして、酵母の判別、同定、分類用キットを組むことができる。
【００１９】
本発明において、酵母としてはサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）若しくはサッカロマイセス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）に属する酵母であればすべての酵母が使用可能であり、例えば、ブドウ酒酵母（ＣＥＧ、ＥＣ１１１８）、また清酒酵母（協会７号（Ｋ７）、９号（Ｋ９）、１０号酵母（Ｋ１０））、焼酎酵母（協会焼酎酵母ＳＨ４、鹿児島酵母Ｋ２、宮崎酵母ＭＫ０２１）等の実用酵母に使用できる。例えばブドウ酒酵母と焼酎酵母、焼酎酵母と清酒酵母といった異なった用途の酵母間だけでなく、協会焼酎酵母ＳＨ４と鹿児島酵母Ｋ２といった同一用途の酵母間の判別も可能であるいう著効も奏するものである。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、小仕込試験、薬剤や培養条件を変えて判別する等従来の方法に比して、短時間に判別できるという著効が奏され、しかも明確に判別することができ、安定的な結果が得られ、再現性を有するものであり、操作も簡単という著効が奏される。
【００２１】
更に本発明によれば、異なった醸造用酵母間の判別はもとより、非常に困難でデリケートな同一の醸造用酵母間の判別、例えばブドウ酒酵母間の判別も可能であって、本発明は、酒類製造業、試験研究機関等において、短期間に簡易にして正確な酵母の分類・同定・判別を可能とするものであり、野生酵母ともろみ中の酵母の明確な判別も可能である。また、本発明によれば、侵入してきた野生酵母（例えば、サッカロマイセス・バヤヌス）の正確な検出も可能となる。
【００２２】
以下、本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００２３】
（実施例１：醸造用酵母の判別法）
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）若しくはサッカロマイセス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）に属するブドウ酒酵母（２３２３、ＢＭ４５、７１Ｂ、Ｋ１Ｖ１１１８、ＣＳ２、ＣＥＧ、ＥＣ１１１８、Ｔ７３、４３、ＢＣ）、また清酒酵母（Ｋ６号、Ｋ７号、Ｋ９号、Ｋ１０号、Ｋ１１号、Ｋ１３号、Ｋ１４号、Ｋ１５０１号、Ｋ１６０１号、Ｋ１７０１号酵母）、焼酎酵母（ＫＦ１、ＫＦ３、ＣＡＮ１、ＭＫ０２１、Ｉ３３、Ｃ１４、Ｃ４、Ｈ５、Ｋ２、ＡＷ１０１、ＳＨ４、ＳＨ３）よりタカラバイオの「じぇんとる君」を用いて精製したゲノムＤＮＡをプライマー１〜２０（配列番号１〜２０：表１）の各々の組み合わせでＰＣＲ法により増幅したのち、電気泳動を行った。
【００２４】
ブドウ酒酵母は、すべてＬａｌｌｅｍａｎｄ社より購入し、清酒酵母は、すべて財団法人  日本醸造協会より購入した。
【００２５】
焼酎酵母は、それぞれ、次の機関より購入した。
ＫＦ１、ＫＦ３、ＣＡＮ１：  球磨焼酎酒造組合
ＭＫ０２１、１３３、Ｃ１４：  宮崎県食品開発センター
Ｃ４、Ｈ５、Ｋ２：  鹿児島県工業技術センター
Ａｗ１０１：  沖縄国税事務所
ＳＨ３、ＳＨ４：  財団法人  日本醸造協会
【００２６】
ＰＣＲは、上記プライマーを用いて上記ゲノムＤＮＡに対して行った。反応条件は次のとおりである。
（ＰＣＲ条件）
以下１サイクル
９５℃  ３分
以下２５サイクル
９５℃  １分
６０℃  １分
７２℃  ４分
以下１サイクル
７２℃  ３分
【００２７】
電気泳動の結果を、表２（電気泳動の結果、検出された増幅ＤＮＡ断片の長さ（ｂｐ）に示す。なお、表中、ＮＤは増幅されるＤＮＡ断片が検出されないことを示し、清酒酵母Ｋ１５０１号、Ｋ１６０１号、Ｋ１７０１号は、それぞれ、Ｋ１５、Ｋ１６、Ｋ１７と表示した。
【００２８】
【表２】
2007181438.tif 000003
【００２９】
上記から明らかなように、プライマーの組み合わせを各種選択し、増幅されるＤＮＡ断片の有無、及び／又は増幅されるＤＮＡの長さを各種検討することによって、各酵母を判別することができる。
【００３０】
本発明によれば、小仕込試験、薬剤や培養条件を変えて判別する従来の方法に比して、短時間に判別できるという著効が奏され、しかも明確に判別することができ、安定的な結果が得られ、再現性を有するものであり、操作も簡単という著効が奏される。
【００３１】
更に本発明によれば、異なった醸造用酵母間の判別はもとより、非常に困難でデリケートな同一の醸造用酵母間の判別も可能であって、本発明は、酒類製造業、試験研究機関等において、短期間に簡易にして正確な酵母の分類、同定、判別を可能とするものであり、野生酵母ともろみ中の酵母の明確な判別も可能である。
【配列表】
2007181438000001.app