(57)【要約】口蹄疫（ＦＭＤ）に対して感受性である動物の早期保護を、インターフェロンＤＮＡ配列を含むワクチンを該動物に接種することによって、達成することができる。接種の翌日、動物が口蹄疫ビルレントウイルスの攻撃から保護されていることが判明した。口蹄疫ウイルスワクチンとの共同投与は、特異的免疫発生の前に保護をもたらす。これは、ＦＭＤが大発生している中、特に望ましい特徴である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
口蹄疫に対して感受性である動物においてインターフェロンを発現することができるＤＮＡ配列を含む構築物であって、前記動物に投与すると前記インターフェロンが発現される構築物。
【請求項２】
前記インターフェロンが、インターフェロン−αまたはインターフェロン−βである、請求項１に記載の構築物。
【請求項３】
前記の口蹄疫に対して感受性である動物が、豚、蓄牛または羊から成る群より選択される、請求項１に記載の構築物。
【請求項４】
前記構築物が、口蹄疫に対して感受性である動物に投与すると免疫応答を刺激する口蹄疫ウイルスを発現することができるＤＮＡ配列をさらに含む、請求項１に記載の構築物。
【請求項５】
請求項１に記載の構築物を含むベクター。
【請求項６】
該インターフェロンが、インターフェロン−αまたはインターフェロン−βである、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
該ベクターが、ウイルス遺伝子伝達ベクターを含む、請求項５に記載のベクター。
【請求項８】
該ウイルス遺伝子伝達ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、パルボウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ポリオウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターから成る群より選択される、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
該口蹄疫に対して感受性である動物が、豚、蓄牛または羊である、請求項５に記載のベクター。
【請求項１０】
請求項４に記載の構築物を含むベクター。
【請求項１１】
前記インターフェロンが、インターフェロン−αまたはインターフェロン−βである、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
該ベクターが、ウイルス遺伝子伝達ベクターを含む、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１３】
ウイルス遺伝子伝達ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、パルボウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ポリオウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターから成る群より選択される、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
該口蹄疫に対して感受性である動物が、豚、蓄牛または羊である、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１５】
口蹄疫に対して感受性である動物において保護応答をもたらすために有効な量の請求項１に記載の構築物および生理学的に許容されうる担体を含むワクチン。
【請求項１６】
前記インターフェロンが、インターフェロン−αまたはインターフェロン−βである、請求億１５に記載のワクチンベクター。
【請求項１７】
前記の口蹄疫に対して感受性である動物が、豚、蓄牛または羊である、請求項１５に記載のワクチン。
【請求項１８】
口蹄疫に対して感受性である動物において保護応答をもたらすために有効な量の請求項４に記載の構築物および生理学的に許容されうる担体を含むワクチン。
【請求項１９】
前記インターフェロンが、インターフェロン−αまたはインターフェロン−βである、請求億１８に記載のワクチン。
【請求項２０】
前記の口蹄疫に対して感受性である動物が、豚、蓄牛または羊である、請求項１８に記載のワクチン。
【請求項２１】
前記ワクチンが、口蹄疫に対して感受性である動物において保護応答を刺激するために有効な量の有効な口蹄疫ウイルスワクチンをさらに含む組成物である、請求項１５に記載のワクチン。
【請求項２２】
前記の口蹄疫に対して感受性である動物が、豚、蓄牛または羊である、請求項２１に記載のワクチン。
【請求項２３】
有効な用量の請求項１５〜２２のいずれかに記載のワクチンを口蹄疫に対して感受性である動物に接種することを含む、前記動物を口蹄疫から保護するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
口蹄疫（ＦＭＤ）は、経済的な観点からみて世界中の家畜の最も重要な動物病の一つである。該疾病は、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）によって引き起こされるものであり、高感染性であって、接触またはエアロゾルによって急速に広がる。
【０００２】
ＦＭＤの感染力が高い性質の故、該疾病がない国々は、感染諸国からの動物および動物製品に対し厳密な検疫および輸入規制を敷いてその移入を防止し、世界貿易への積極的な参加の継続を可能ならしめている。該疾病は、米国、カナダまたはメキシコでは発生しておらず、北米における該疾病の継続的な不在は、米国畜産業界および米国農務省（ＵＳＤＡ）にとっての優先事項である。
【０００３】
ＦＭＤ制御プログラムには、従来、不活性化全ウイルスワクチンが用いられ、該疾病の制御に大きな成功を治めている。しかし、現行のワクチンに伴う問題には、ワクチン製造に必要なウイルスを生産するために高度封じ込め設備が必要であること、非常に多数のウイルス血清型およびサブタイプを生じるウイルスの抗原性変異の発生、およびワクチンが保護免疫を迅速に誘導することができないことが挙げられる。従って、初期段階のウイルス感染に対してより良好な保護をもたらすさらに有効なワクチンを開発する強い誘因がある。本発明は、既存の市販ワクチンに勝る保護をもたらす、ＦＭＤに対する新規遺伝子設計製作ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００４】
従来の組換え手順に従って生産される遺伝子設計製作ワクチンは、（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．１９９４．Ａｕｓｕｂｅｌら，ｅｄｓ．Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹに記載されているように）当該技術分野においてよく確立されている。加えて、対象となる特定のＤＮＡを含有するベクターは、インビボ発現のための遺伝物質の送達に益々利用されている（Ｒｉｃｉｇｌｉａｎｏら、米国特許第５，７９５，８７２号）。例えば、アデノウイルスは、長さ約３６キロベースの二本鎖線状ＤＮＡウイルスであり、アデノウイルスから構築されたベクターは、遺伝子療法およびワクチン開発に使用するための対象遺伝子の発現に用いられている（Ａｌｋｈａｔｉｂ  ａｎｄ  Ｂｒｉｅｄｉｓ．１９８８．Ｊ．Ｖｉｏｌ．ｖｏｌ．６２，ｐｐ．２７１８−２７２７；Ｃｈａｎｇら  １９９５．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．ｖｏｌ．１，ｐｐ．１７２−１８１；Ｃｈｅｎｇら  １９９２．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．ｖｏｌ．６６，ｐｐ．６７２１−６７２７；Ｃｈｅｎｇａｌｖａｌａら  １９９４．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．ｖｏｌ．７５，ｐｐ．１２５−１３１；Ｅｌｏｉｔ  ａｎｄ  Ａｄａｍ．１９９５．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．ｖｏｌ．７６，ｐｐ．１５８３−１５８９；Ｆｕｅｙｏら  １９９６．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．ｖｏｌ．１２，ｐｐ．１０３−１１０；Ｇａｈｅｒｙ−Ｓｅｇａｒｄら  １９９７．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．ｖｏｌ．２７，ｐｐ．６５３−６５９；Ｇｏｎｉｎら  １９９５．Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ｖｏｌ  ４５，ｐｐ．３９３−４０１；Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｃ．１９９２．Ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ：  Ｎｅｗ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｂｌｅｍ．Ｅｌｌｉｓ，Ｒ．Ｗ．，ｅｄ．，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ｐｐ．３６３−３９０；Ｊａｃｏｂｓら  １９９２．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．ｖｏｌ．６６．ｐｐ．２０８６−２０９５；Ｋａｒｌｓｓｏｎら  １９８５．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．ｖｏｌ．８２，ｐｐ．１５８−１６２；Ｋｏｎｉｓｈｉら  １９９５．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．ｖｏｌ．９６．ｐｐ．１１２５−１１３０；Ｋｏｒｓｔら  １９９５．Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．ｖｏｌ．１５１，ｐｐ．Ｓ７５−Ｓ８７；Ｌｕｂａｃｋら  １９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．ｖｏｌ．８６，ｐｐ．６７６３−６７６７；Ｍａｙｒら  １９９９．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．ｖｏｌ．２６３，ｐｐ．４９６−５０６；Ｍａｙｒら  ２００１．Ｖａｃｃｉｎｅ．ｖｏｌ．１９．ｐｐ．２１５５２−２１６２；Ｍｕｈｌｈａｕｓｅｒら  １９９５．Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．ｖｏｌ．７７，ｐｐ．１０７７−１０８６；Ｐａｐｐら  １９９７．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．ｖｏｌ．７８，ｐｐ．２９３３−２９４３；Ｐｒｅｖｅｃら  １９９０．Ｊ．Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．ｖｏｌ．１６１，ｐｐ．２７−３０；Ｐｒｅｖｅｃら  １９８９．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．ｖｏｌ．７０，ｐｐ．４２９−４３４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら  １９９１．Ｓｃｉｅｎｃｅ．ｖｏｌ．２５２，ｐｐ．４３１−４��４；Ｓｈｅｐｐａｒｄら  １９９８．Ａｒｃｈ．ｖｏｌ．１４３，ｐｐ．９１５−９３０；Ｓｍｉｔｈら  １９９１．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．ｖｏｌ．５，ｐｐ．８６７−８７８；Ｚａｂｎｅｒら  １９９３．Ｃｅｌｌ．ｖｏｌ．７５，ｐｐ．２０７−２１６；Ｈｅら、米国特許第５，９２２，５７６号）。これらの系のほとんどが、一つのアデノウイルス、詳細には、ヒトアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）を活用している。
【０００５】
ヒトＡｄ５複製能欠失型構築物は、アデノウイルスゲノムのＥ１領域、すなわち、２９３細胞で安定的にトランスフェクトされた細胞においてのみ複製可能なウイルスを生じるＥ１領域に欠失を有する（Ｇｒａｈａｍら  １９７７．ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．ｖｏｌ．３６，ｐｐ．５９−７４）。同様に、これらのベクターの多くが、Ｅ３領域に欠失を有し、その結果、ＭＨＣクラスＩ応答の抑制喪失が生じることとなり、これは、これらのウイスルに感染した動物が、発現外来遺伝子に対して免疫応答を発現する能力を増大させる（Ｃｈｅｎｇａｌｖａｌａら，上記）。Ｅ１領域における約３０００ｂｐのコード配列およびＥ３領域における約２７００ｂｐのコード配列の喪失は、アデノウイスルをパッケージできるゲノムサイズの概算１０５％に加算すると（追加約１８００ｂｐ）、約７５００ｂｐの外来配列を有する能力をベクターに与える。従って、この構築物は、インビボでの遺伝子発現に必要なワクチンの設計に有用なモデルを提供する。
【０００６】
Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮαおよびＩＦＮα／β）は、抗ウイルス活性を有することが知られており、ウイルス感染に対する宿主細胞の第一線の防御のである（Ｖｉｌｃｅｋ  ａｎｄ  Ｓｅｎ．１９９６．Ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｆｉｅｌｄｓら，ｅｄｓ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）。ウイルス感染細胞は、隣接細胞上の特異的受容体に結合しているＩＦＮα／βの発現および分泌を誘導し、その結果、ＩＦＮα／βに刺激された遺伝子（ＩＳＧ）の活性化を導く一連の事象によって、それらをプライミングしてウイルス耐性状態にする。これらの遺伝子の生産物は、ウイルスに対してそれらの複製サイクルの異なる段階で作用し、また、異なるウイルスが、異なるＩＳＧ生産物に対して感受性である。広範に特性付けされているＩＳＧの例には、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）、２’−５’Ａシンセターゼ／ＲＮアーゼＬおよびＭｘが挙げられる。
【０００７】
ＦＭＤＶ複製が、ＩＦＮ−αまたは−βに対して非常に敏感であること、およびブタまたはウシＩＦＮ−αまたは−βを含有する上清液が、ＦＭＤＶ複製を阻害することは、照明されている（Ｃｈｉｎｓａｎｇａｒａｍら  １９９９．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．ｖｏｌ．７３，ｐｐ．９８９１−９８９８）。より直接的にＦＭＤＶ複製に対するＩＦＮ−αまたは−βの効果を研究するために、ブタ腎臓（ＰＫ）およびウシ胎仔腎臓（ＥＢＫ）細胞からのＩＦＮα／β遺伝子が、各種についてのＩＦＮ−αおよび−βに特異的なコンセンサス配列を有するプライマーを用いて、増幅およびクローン化された。各々のＩＦＮのクローンが配列され、大腸菌内で発現された（Ｃｈｉｎｓａｎｇａｒａｍら  ２００１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．ｖｏｌ．７５，ｐｐ．５４９８−５５０３、図１参照）。最大誘導で、ウシＩＦＮ−αおよび−βならびにブタＩＦＮ−αが、類似したレベルで発現された一方で、ブタＩＦＮ−βは、より低いレベルで発現された（Ｃｈｉｎｓａｎｇａｒａｍら，上記，２００１、図１参照）。ｐＨ２．０で処理し、系列希釈し、生物活性について試験した時、ブタおよびウシＩＦＮ−αおよび−βは、豚腎臓細胞系（ＩＢＲＳ２）およびＥＢＫ細胞を含む相同系列からの細胞内でのＦＭＤＶ複製に対して、類似の阻害効果をもたらした（Ｃｈｉｎｓａｎｇａｒａｍら，２００１，上記、表１参照）。予想どおり、対照大腸菌発現ＥＭＤＶ蛋白質３Ｃは、ウイルス複製に対して阻害効果を有さなかった（Ｃｈｉｎｓａｎｇａｒａｍら，２００１，上記）。発現されたブタおよびウシＩＦＮ−αまたは−βは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、脳心筋炎ウイスルおよび古典的な豚コレラウイルスに対して、類似の抗ウイルス活性も有した。加えて、ウシＩＦＮ−βを除き、ブタおよびウシＩＦＮ−αおよびブタＩＦＮ−βは、他の種からの細胞内でのＦＭＤＶ複製も阻害できることが判明した（Ｃｈｉｎｓａｎｇａｒａｍら，２００１，上記、表１参照）。
【０００８】
細胞培養におけるＦＭＤＶ複製は、ＩＦＮ−αおよび−β処理に対して敏感であるので、Ｉ型ＩＦＮは、インビボ抗ＦＭＤＶ剤として有用でありうる。それは、迅速に作用し、また、その投与は、ＦＭＤＶのすべての血清型およびサブタイプ（ＦＭＤＶの抗原の多様性に起因する関係）からの保護をもたらす。しかし、ＩＦＮα／β蛋白質は、急速に消費されるので、臨床使用には、長期間にわたって高用量の多数の注射が必要とされる。Ｉ型ＩＦＮ遺伝子を含む構築物は、ＩＦＮ蛋白質を送達するために別手段を提供するので、動物は、短期間にＩＦＮを内在的に生産することができる。加えて、送達されるＩＦＮの量は、組換えウイルス量によって制御することができる。これらの遺伝子を含む、組換え複製能欠失型ヒトアデノウイルスなどのベクターは、インビボでの送達およびその後の遺伝子発現にも有効である。
【特許文献１】
米国特許第５，７９５，８７２号
【特許文献２】
米国特許第５，９２２，５７６号
【特許文献３】
米国特許第５，８２４，３１６号
【特許文献４】
米国特許第５，６１２，０４０号
【非特許文献１】
Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．１９９４．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ
【非特許文献２】
Ａｌｋｈａｔｉｂ  ａｎｄ  Ｂｒｉｅｄｉｓ．１９８８．Ｊ．Ｖｉｏｌ．ｖｏｌ．６２，ｐｐ．２７１８−２７２７
【非特許文献３】
Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．ｖｏｌ．１，ｐｐ．１７２−１８１
【非特許文献４】
Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９２．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．ｖｏｌ．６６，ｐｐ．６７２１−６７２７
【非特許文献５】
Ｃｈｅｎｇａｌｖａｌａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．ｖｏｌ．７５，ｐｐ．１２５−１３１
【非特許文献６】
Ｅｌｏｉｔ  ａｎｄ  Ａｄａｍ．１９９５．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．ｖｏｌ．７６，ｐｐ．１５８３−１５８９
【非特許文献７】
Ｆｕｅｙｏ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．ｖｏｌ．１２，ｐｐ．１０３−１１０
【非特許文献８】
Ｇａｈｅｒｙ−Ｓｅｇａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．ｖｏｌ．２７，ｐｐ．６５３−６５９
【非特許文献９】
Ｇｏｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５．Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ｖｏｌ  ４５，ｐｐ．３９３−４０１
【非特許文献１０】
Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｃ．１９９２．Ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ：  Ｎｅｗ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｂｌｅｍ．Ｅｌｌｉｓ，Ｒ．Ｗ．，ｅｄ．，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ｐｐ．３６３−３９０
【非特許文献１１】
Ｊａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９９２．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．ｖｏｌ．６６．ｐｐ．２０８６−２０９５
【非特許文献１２】
Ｋａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９８５．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．ｖｏｌ．８２，ｐｐ．１５８−１６２
【非特許文献１３】
Ｋｏｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．ｖｏｌ．９６．ｐｐ．１１２５−１１３０
【非特許文献１４】
Ｋｏｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５．Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．ｖｏｌ．１５１，ｐｐ．Ｓ７５−Ｓ８７
【非特許文献１５】
Ｌｕｂａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．  １９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．ｖｏｌ．８６，ｐｐ．６７６３−６７６７
【非特許文献１６】
Ｍａｙｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．ｖｏｌ．２６３，ｐｐ．４９６−５０６
【非特許文献１７】
Ｍａｙｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１．Ｖａｃｃｉｎｅ．ｖｏｌ．１９．ｐｐ．２１５５２−２１６２
【非特許文献１８】
Ｍｕｈｌｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５．Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．ｖｏｌ．７７，ｐｐ．１０７７−１０８６
【非特許文献１９】
Ｐａｐｐ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．ｖｏｌ．７８，ｐｐ．２９３３−２９４３
【非特許文献２０】
Ｐｒｅｖｅｃ  ｅｔ  ａｌ．  １９９０．Ｊ．Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．ｖｏｌ．１６１，ｐｐ．２７−３０
【非特許文献２１】
Ｐｒｅｖｅｃ  ｅｔ  ａｌ．  １９８９．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．ｖｏｌ．７０，ｐｐ．４２９−４３４
【非特許文献２３】
Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．  １９９１．Ｓｃｉｅｎｃｅ．ｖｏｌ．２５２，ｐｐ．４３１−４３４
【非特許文献２４】
Ｓｈｅｐｐａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８．Ａｒｃｈ．ｖｏｌ．１４３，ｐｐ．９１５−９３０
【非特許文献２５】
Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  １９９１．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．ｖｏｌ．５，ｐｐ．８６７−８７８
【非特許文献２６】
Ｚａｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９９３．Ｃｅｌｌ．ｖｏｌ．７５，ｐｐ．２０７−２１６
【非特許文献２７】
Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．  １９７７．ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．ｖｏｌ．３６，ｐｐ．５９−７４
【非特許文献２８】
Ｖｉｌｃｅｋ  ａｎｄ  Ｓｅｎ．１９９６．Ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｆｉｅｌｄｓら，ｅｄｓ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ
【非特許文献２９】
Ｃｈｉｎｓａｎｇａｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．ｖｏｌ．７３，ｐｐ．９８９１−９８９８
【非特許文献３０】
Ｃｈｉｎｓａｎｇａｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．ｖｏｌ．７５，ｐｐ．５４９８−５５０３
【非特許文献３１】
Ｍｏｒａｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．ｖｏｌ．３１，ｐｐ．１０５０−１０５６
【非特許文献３２】
Ｍａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．ｖｏｌ．２２６３，ｐｐ．４９６−５０６
【非特許文献３３】
Ｍａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１．Ｖａｃｃｉｎｅ．ｖｏｌ．１９，ｐｐ．２１５２−２１６２
【非特許文献３４】
Ｍｏｒａｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２．Ｖａｃｃｉｎｅ．ｖｏｌ．２０，ｐｐ．１６３１−１６３９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、感受性の動物に早期保護をもたらすために特に有用である、インターフェロン遺伝子を含有する組換え複製能欠失型ベクターを構築した。本ベクターを接種した翌日、動物は、口蹄疫ビルレントウイルス（ＦＭＤＶ）の攻撃から保護されていることがわかった。ワクチンにＩＦＮを含めることによって、特定の免疫の発生前に早期保護が発現する。これは、ＦＭＤが大発生している中、特に望ましい特徴である。
【００１０】
従って、本発明の目的は、ＦＭＤＶ対して感受性である動物をＩＦＮ−αまたは−βの発現によりＦＭＤＶから早期保護するために有効なワクチンとして有用な新規構築物を提供することである。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、ＦＭＤＶ対して感受性である動物をＩＦＮ−αまたは−βの発現によりＦＭＤＶから早期保護するために有効なワクチンとして有用なインビボでＩＦＮ−αまたはＩＮＮ−βを発現するための新規構築物を含むベクターを提供することである。
【００１２】
本発明のもう一つの目的は、生理学的に許容されうる担体中のＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βをコードしている遺伝子を含有する新規構築物およびＦＭＤＶに有効な一定のワクチンを含む、ＦＭＤＶに有効なワクチンを提供することである。
【００１３】
新規構築物および生理学的に許容されうる担体を含む有効な用量の組成物を投与することによる、感受性動物の免疫法を提供することも、本発明の目的である。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、新規構築物を含有する有効な用量のベクターと生理学的に許容されうる担体とＦＭＤＶに有効なワクチンとを含む組成物を投与することによる、ＦＭＤに対して感受性である動物の免疫法を提供することである。
【００１５】
本発明の他の目的および利点は、以下の説明から容易に明らかになるだろう。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本明細書中では、ワクチンは、そのワクチンが送達された動物において、細胞性免疫応答と体液性免疫応答の両方を含む（しかし、これらに限定されない）あらゆる保護応答を包含する保護応答を刺激することができる生物学的製剤と定義する。この応用で、ＩＦＮによりもたらされる保護応答は、通常のＦＭＤワクチンが暴露された動物においてその後の保護応答を充分刺激しうる疾病の発症またはその疾病の重症度のいずれかを遅らせる場合、有効とみなされる。
【００１７】
組換えワクチンは、ワクチン接種プロトコルにおいてワクチンとして有効な構築物を含み、且つ、プロモータ（例えば、ＣＭＶプロモータ）、そのＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、保護応答を刺激する物質をコードする非相同ＤＮＡ配列に機能するように連結された終止配列などの少なくとも一つの調節要素を含む。該構築物は、当該技術分野においてよく知られている組換え法に従って調製され、保護応答を惹起するために充分な量の免疫物質を発現することができる。
【００１８】
該構築物を、免疫化プロトコルまたはワクチン接種プロトコルに有用なベクターに挿入してもよい。必要な配列をベクターに個々に挿入してもよいし、またはカセットとして挿入するために合わせてライゲーションしてもよい。
【００１９】
本発明のワクチンは、該構築物または該構築物を含むベクター、およびリン酸緩衝生理食塩水、生理食塩水または培養液などの生理学的に許容される担体を含む組成物である。該構築物は、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、またはそれらの組合せをコードする配列を含むことができる。適切なＦＭＤＶ抗原をコードする配列は、ＩＦＮ抗原とＦＭＤＶ抗原の両方を便利に共同投与のために該構築物に含まれていてもよいし、または個別の構築物として含まれていてもよい。こうした抗原は、一般に、当業者に知られている。有効な組換えワクチンの例は、Ｇｒｕｂｍａｎらの米国特許第５，８２４，３１６号に記載されているようなリーダー−プロテイナーゼ削除口蹄疫ウイルス、およびＭａｓｏｎらの米国特許第５，６１２，０４０号に記載されているとおり調製される非感染性ＦＭＤＶである。この非感染性ウイルスは、ＶＰ１のＧ−Ｈループからアミノ酸配列ＧＶＲＧＤＦが削除され、アミノ酸配列ＮＰで置換されている突然変異ウイルスである。あるいは、本ワクチンは、適便な投与のために、ＩＦＮ含有ベクターと一定の有効なＦＭＤワクチンまたは別の構築物の混合物を含有することができる。
【００２０】
本ワクチンは、抗ウイルス活性を生じるとともに、ＦＭＤＶのビルレント菌株による攻撃から動物を保護するために充分な量のＩＦＮの発現に有効である量で、筋肉内、皮内、皮下または経鼻接種または注射により投与することができる。この量は、接種を受ける動物のサイズおよび体重ならびにＩＦＮのタイプを考慮して、接種を受ける動物によって変わりうる。例えば、豚のワクチン接種に有効な量は、約１０８〜約１０１０ｐｆｕ、好ましくは約１０８〜約１０９ｐｆｕ  Ａｄ５−ＩＮＦの範囲である。蓄牛についての有効量は、約１０９〜約１０１０ｐｆｕ  Ａｄ５−ＩＮＦの範囲である。有効量は、具体例１〜１４によって提供されるガイダンスに従って、当業者が必要に応じて経験的に決定するできる。
【００２１】
ＩＦＮを含有する組換えワクチンは、ＩＮＦ−αまたは−βｃＤＮＡ構築物を有効なベクターに挿入することによって調製される。ＦＭＤＶ抗原をコードしている配列をこの挿入構築物に含めることもできる。遺伝物質をインビボで組織に送達するために有効なシステムは、当業者によく知られており、ウイスルならびに非ウイルス伝達法（例えば、Ｒｉｃｉｇｌｉａｎｏ，上記）が挙げられる。ウイルス遺伝子伝達ベクターの使用は、当該技術分野において広く開示されており、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイル、ポリオウイルスおよび多数のレトロウイルスの使用が挙げられる。本明細書中に記載されているアデノウイルスベクター（Ａｄ５）は、実験のために使用され、従って、例として呈示されているが、いずれの既知ベクターも、ＩＦＮの送達に首尾よく使用することができる。
【００２２】
本ワクチンが、生理学的に許容されうる担体中の、ＩＦＮおよび所望される場合にはＦＭＤＶ抗原をコードしている配列を含有する構築物を含むことができることも考察している。あるいは、本ワクチンは、ＩＦＮをコードしている配列を含む構築物と既知の有効なＦＭＤＶワクチンとの混合物であることができる。
【００２３】
ＩＦＮ含有ワクチンは、既知組換え法に従って調製される。先ず、適切なＩＦＮ遺伝子をクローン化し、次に、選択されたベクターに挿入する。当業者にガイダンスを提供するために、具体例を本明細書に提供する。適切なＩＦＮ遺伝子は、ＦＭＤに対して感受性であるいずれかの動物から得られたＩ型ＩＦＮα／βであり、前記動物には、豚、蓄牛および羊などのあらゆる分趾蹄動物が挙げられる。本ワクチンは、ＦＭＤおよび他のウイルス薬に対して迅速な短期保護をもたらす。ＩＦＮ含有ワクチンと既知の通常のＦＭＤワクチンと共同投与することにより、長期、短期、両方の保護がもたらされる。
【００２４】
ブタＩＦＮ−αまたは−βｃＤＮＡは、直接ライゲーションにより、複製能欠失型ヒトアデノウイルス５型（Ａｄ５）ゲノムのＥ１領域に挿入し、そのキメラＤＮＡを用いて、Ｅ１機能を発現するように２９３細胞をトランスフェクトして、組換えアデノウイルス（実施例１〜５に記載されているような、Ａｄ５−ｐＩＦＮαまたはＡｄ５−ｐＩＦＮβ）を生じた。
【００２５】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）およびクマシーブルー染色法によって検出されるような、両ＩＦＮ分子は、複製能欠失型アデノウイルスの保護複製をサポートしないＡｄ５−ｐＩＦＮαまたはＡｄ５−ｐＩＦＮβ感染豚腎臓細胞系（ＩＢＲＳ２）において、高レベルまで発現された。放射性免疫沈降アッセイにおいて、ウサギ抗ブタＩＦＮ−αまたは−β抗体を用いて、特異性を確認した。Ａｄ５−ｐＩＦＮα感染ＩＢＲＳ２細胞からの上清は、ＦＭＤＶプラーク減少アッセイによって判定すると、相同細胞に対して１０５単位より大きな抗ウイルス活性を生じる。１０８または１０Ｒ９ｐｆｕのＡｄ５−ＩＮＦαでの豚の筋肉内接種は、試験した最も早い時点、すなわち、接種後１６時間での血漿サンプルにおいて、約４００単位より大きい抗ウイルス活性を生じた。
【００２６】
実験結果は、豚が、Ａｄ５−ｐＩＦＮ−αの接種によりＦＭＤから迅速に保護されることを示している（実施例８参照）。さらに、高用量のＡｄ５−ｐＩＦＮ−αの接種後、少なくとも５日間、抗ウイルス活性を示すデータは、動物を少なくともこの期間の間は保護できることを示唆している。
【００２７】
以下の実施例は、本発明をさらに説明するためのものでしかなく、特許請求の範囲によって定義されているような本発明の範囲を制限するためのものではない。
【００２８】
本明細書中に引用されているすべての参照は、それら全文、本明細書に参照として組み入れられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
実施例
【実施例１】
【００３０】
菌株および哺乳動物細胞系
アデノウイルスプラスミドおよびｐＡｄ−Ｂｌｕｅ（Ｍｏｒａｅｓら  ２００１．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．ｖｏｌ．３１，ｐｐ．１０５０−１０５６）を、エレクトロコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐ（商標）Ｃｅｌｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）内で増殖させた。他のベクターは、ケミカルコンピテントＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０，上記）内で増殖させた。ｐＡｄ５−Ｂｌｕｅベクターの設計に先立ち、コンピーテントＢＪ５１８３細胞において、その製造業者（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）のプロトコルに従って相同組換を行うことにより、外来遺伝子を含有する前駆体ベクターを構築した。
【００３１】
ｐＡｄ５−Ｂｌｕｅベクターから誘導された組換えアデノウイルスを２９３細胞内で増殖させ、そこから精製した（Ｇｒａｈａｍら，上記）。ＶＳＶ−ＮＪグリコプロテイン（Ｇ）遺伝子を含有するプラスミド（ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ−ＶＳＶ  Ｇ）は、Ｄｒ．Ｌｕｉｓ  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚに提供していただいた。
【実施例２】
【００３２】
Ｉ型インターフェロン遺伝子のクローン化
豚およびウシＩＦＮ−αおよび−β遺伝子を、利用可能なゲンバンク配列に基づくプライマーを用いて、それぞれ、ブタ腎臓（ＰＫ）細胞およびウシ胎仔腎臓（ＥＢＫ）細胞から得られたＤＮＡ（ＩＦＮ遺伝子はイントロンを含有しないので）またはｃＤＮＡから増幅した。５’プライマーは、ＩＦＮ分泌シグナル配列を含有し、３’プライマーは、停止コドンに続くＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含有した。前記遺伝子を、Ｐｆｕポリメラーゼおよびその適切なプライマーとのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用して、２５周期増幅した（表１）。ＰＣＲ産物（平滑末端のもの）を線形化ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯにライゲーションし、形質転換してＴＯＰ１０細胞にした。制限エンドヌクレアーゼ消化によってクローンを試験し、適切なサイズの挿入物を含有するクローンを配列した（図１〜４）。試験したすべての動物の種は、大きなＩＦＮ−αサブファミリーを有し、豚および雌牛は、少なくとも５つの相関ＩＦＮ−β遺伝子を有する（Ｖｉｌｃｅｋ  ａｎｄ  Ｓｅｎ，上記）ので、一つ以上のＩＦＮ−αおよび−ベータ遺伝子についてのクローンが得られた。図１〜４におけるＩＦＮ配列は、組換えアデノウイルスを生じるために用いた遺伝子を表す（実施例４参照）。組換えアデノウイルスＡｄ５−ｐＩＦＮα７．６．３は、図１ａ（配列番号１）の配列から誘導し、Ａｄ５−ｐＩＦＮα９．９．６は、図１ｂ（配列番号２）の配列から誘導し、Ａｄ５−ｐＩＦＮβ１．４．６は、図２の配列（配列番号３）から誘導し、Ａｄ５−ｂＩＦＮα９．２．２は、図３の配列（配列番号４）から誘導し、およびＡｄ５−ｂＩＦＮβ５．３．１は、図４の配列（配列番号５）から誘導した。
【実施例３】
【００３３】
ＩＦＮ含有プラスミドの発現
ブタＩＦＮ−αクローン７および９を含有するプラスミド（図１）ならびにＩＦＮ−βクローン１（図２）を異なる制限エンドヌクレアーゼで消化して、同様に消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋（ｐＫＳＩＩ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）にライゲーションした。適正な配向状態のクローンを、インビトロ転写／翻訳システム（ＴＮＴ  ｋｉｔ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）での放射性標識によって、発現について試験した。インビトロで発現されたＩＦＮを、ポリクローナル血清を用いて免疫沈降させ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）により分析した。一つのバンドがＩＦＮ−αとＩＦＮ−βの両方について観察された（データは示していない）。大腸菌系内での発現により、ブタおよびウシＩＦＮに対するウサギポリクローナル抗血清を事前に生成しておいた（Ｃｈｉｎｓａｎｇａｒａｍら，２００１，上記）。
【００３４】
【表１】
2004530677.tif 000002
【００３５】
ウシＩＦＮ−αクローン８および９（図３）ならびにウシＩＦＮ−βクローン５（図４）および１０を含有するプラスミドを、ＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで消化し、同様に消化したｐＫＳＩＩにライゲーションした。クローンを、ブタＩＦＮ遺伝子について記載したようにインビトロＴＮＴ系における発現について試験した。試験したすべてのクローンが、適切なサイズの一つのバンドを発現した（データは示していない）。
【実施例４】
【００３６】
Ａｄ５−ＩＦＮベクターの構築
複製能欠失型ヒトアデノウイルス５ベクター、ｐＡｄ５−Ｂｌｕｅ（Ｍｏｒａｅｓ，上記）を用いて哺乳類発現系を発現させた。このウイルスは、β−ガラクトシダーゼのαフラグメントを含有する。このｐＡｄ５−Ｂｌｕｅベクター系によって、適切な外来遺伝子挿入達成の３週間以内に組換えアデノウイルスを発生させることができる。
【００３７】
ブタＩＦＮ−αクローン７および９（図１参照）、ブタＩＦＮ−βクローン１（図２）、ウシＩＦＮ−αクローン９（図３）およびウシＩＦＮ−β（図４）クローン５からのＩＦＮ遺伝子をＣｌａＩ／ＸｂａＩで消化し、ＣｌａＩ／ＸｂａＩで消化してアルカリ性ホスファータゼで処理したｐＡｄ５−Ｂｌｕｅにライゲーションした。このライゲーション反応物をエレクトロポレーションしてＴＯＰ１０細胞にし、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（ＸｇａＩ）の存在下に、適切な抗体を収容する寒天プレートを用いて白色コロニーを選択した。ＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲル電気泳動法によって分析して、組換え構築物内のＩＦＮ遺伝子の存在を証明した。ＨｉｎｄＩＩＩ消化後に適正な遺伝子フラグメントを有するｐＡｄ５−ＩＦＮベクター各々につき１〜２コロニーの大量調製物を増殖させ、プラスミドＤＮＡをＣｓＣｌ遠心法によって精製した。
【００３８】
精製したＤＮＡを、ＰａｃＩで線形化し、ＣａＰＯ４沈降法（Ｍｏｒａｅｓ，上記）によって２９３細胞にトランスフェクトした。細胞を毎日検査し、プラークをピックして、１５０ｍｍフラスコの２９３細胞の感染によって増幅させた。感染２〜３日後、細胞変性効果（ＣＰＥ）が発現したら、Ｍｏｒａｅｓが記載しているように（上記）ウイルスを分離した。ウイルスＤＮＡを抽出し、ＨｉｎｄＩＩＩ消化によって試験して、適切な遺伝子フラグメントの存在を確認した。これらのウイルス調製物（Ａｄ５−ｐＩＦＮ−α、Ａｄ５−ｐＩＦＮ−β、Ａｄ５−ｂＩＦＮ−αおよびＡｄ５−ｂＩＦＮ−β）は、高力価の粗菌株の代表であり、これらを用いて大量のウイルスを調製し、これを不連続塩化セシウム勾配遠心法、続いて連続塩化セシウム勾配遠心法によって精製した。ウイルス力価は、２９３細胞における組織培養感染量アッセイ（ＴＣＩＤ５０）によって判定し、約１０１０ｐｆｕ／ｍＬ（ｐｆｕ力価に換算後）であった。
【００３９】
同じプロトコルに従って、ヒツジＡｄ５−ＩＦＮベクター（Ａｄ５−ｏＩＦＮαおよびＡｄ５−ｏＩＦＮβ）を調製する。
【実施例５】
【００４０】
哺乳動物細胞におけるＩＦＮの発現
増殖型複製ではなく複製能欠失型Ａｄ５での感染に対して感受性である細胞系、ＩＢＲＳ２細胞におけるＩＦＮ発現について、Ａｄ５−ｐＩＦＮを試験した。ＩＢＲＳ２細胞は、ウイルス感染後、Ｉ型ＩＦＮ  ｍＲＮＡを生産せず（Ｃｈｉｎｓａｎｇａｒａｍら，２００１，上記）、従って、検出されるＩＦＮは、Ａｄ５感染の結果であろう。感染後の様々な時点で、１時間、［３５Ｓ］メチオニンで細胞を放射標識し、適切なポリクローナルウサギ抗体を用いて上清（ｓ）および細胞溶解産物（ｐ）を免疫沈降（ＲＩＰ）させて、ＰＡＧＥにより試験した。Ａｄ５−ｐＩＦＮα９．９．６感染細胞について見られたように、ｐＩＦＮ−αは、試験した最も早い時点、感染後の時間（ｈｐｉ）４．５、ならびに６、２５および３０ｈｐｉに上清（ｓ）において観察される。発現されたＩＦＮ−αは、インビトロ翻訳ＩＦＮ（レーンｃ１およびｃ２）より大きい。多分、糖鎖形成されるからである。発現されたＩＦＮは、シグナル配列を含有し、それらが分泌されることとなるので、ＩＦＮは、細胞上清において検出されることが予想された。同様の結果が、Ａｄ５−ｐＩＦＮα７．６．３およびＡｄ５−ｐＩＦＮβ１．４．６感染ＩＢＲＳ２細胞で得られた（データは示していない）。これらの結果は、ＩＦＮ発現が、４．５ｈｐｉまたはそれより早く開始し、少なくも３０ｈｐｉまで継続することを示している。
【００４１】
感染した非標識ＩＢＲＳ２細胞も、ＰＡＧＥ分析およびクマシーブルー染色法により、上清液におけるＩＦＮ発現についてモニターした。ｍｏｃｋ感染細胞および他のＡｄベクターに感染した細胞（Ａｄ５−ＦＭＤＶＡ２４）を含む適切な対照を発現分析の間に含めた。大腸菌発現ｐＩＦＮ−αより有意に遅いバンド遊走は、Ａｄ５−ｐＩＦＮα７．６．３感染細胞では、４ｈｐｉまでにほとんど検出することができず、６ｈｐｉにレベル増加が存在した（図６）。ｍｏｃｋ感染細胞およびＡｄ５−ＦＭＤＶＡ２４感染細胞では、匹敵するバンドは観察されなかった（レーン１および２）。ｐＩＦＮ−αの分子量に対応する二つのバンドが、２５および３０ｈｐｉに観察された。おそらくこれは、異なるレベルのグリコシル化を示している（ＩＦＮ−αクローン７．６．３は、一つの潜在的グリコシル化部位を有する）。Ａｄ５−ｐＩＦＮα９．９．６に感染したＩＢＲＳ２細胞は、類似のＩＦＮ−α発現動態を生じたが、ＩＦＮは、２ｈｐｉで最初に観察された（データは示していない）。Ａｄ５−ｐＩＦＮα１．４．６感染細胞では、広いバンドが、４．５ｈｐｉで最初に観察された。おそらくこれは、異なるレベルのグリコシル化を反映している（ｐＩＦＮ−βクローン１．４．６は、２つの潜在的グリコシル化部位を有する）。予備分析は、上清液１ｍＬにつき約２５μｇのｐＩＦＮ−αが生産されることを示している。より少ない量のｐＩＦＮ−βが生産された（データは示していない）。
【００４２】
ウシＩＦＮ−αおよび−β遺伝子の発現のために、ＩＢＲＳ２細胞をＡｄ５−ｂＩＦＮα９．２．２およびＡｄ５−ｂＩＦＮβ５．３．１に感染させ、感染後様々な時点で、１時間、［３５Ｓ］メチオニンで細胞を放射標識した。上清液および細胞溶解産物を、ＰＡＧＥによって直接試験するか、またはウシＩＦＮ−αもしくはウシＩＦＮ−βに対するウサギポリクローナル抗血清を用いて免疫沈降させた。発現は、２３ｈｐｉまでに（５ｈｐｉで、非常に低レベルの発現）観察され、少なくとも４８時間継続した（図７）。ウシＩＦＮ−αの免疫沈降は、単一のバンドを示し、その一方で、ウシＩＦＮ−βの多数のバンドが、免疫沈降された。多分、これは、様々なレベルのグリコシル化を示している（データは示していない）。感染ＩＢＲＳ２上清液における発現も、ＰＡＧＥ分析およびクマシーブルー染色法によってモニターした。ｂＩＦＮ−αに対応するバンドは、５ｈｐｉまでに最初に見られ、有意なレベルが２３ｈｐｉまでに検出された。予備分析は、約１２〜２５μｇのｂＩＦＮ−αおよび約５μｇのｂＩＦＮ−ベータが、上清液１ｍＬあたりに生産されたことを示している。
【実施例６】
【００４３】
感染細胞におけるＩＦＮ−α遺伝子およびＩＦＮ−β遺伝子により誘導された抗ウイルス活性
ｐＩＦＮ−α遺伝子およびｐＩＦＮ−β遺伝子による抗ウイルス活性を証明するために、Ａｄ５−ＩＦＮα７．６．３、Ａｄ５−ｐＩＦＮα９．９．６およびＡｄ５−ｐＩＦＮβ１．４．６感染ＩＢＲＳ２細胞からの上清液をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  １００フィルタに通して濾過して、残存するＡｄ５接種材料の大部分を除去（この手順によって、１０４〜１０５ｐｆｕのウイルスが除去される）し、一晩、ｐＨ２で処理（この手順によって、１０２〜１０３ｐｆｕのウイルスが不活性化される）し、中和して、さらにＡｄ５接種材料を除去した。上清を、ＦＭＤＶ  Ａ１２型を有するＩＢＲＳ２細胞を用いるプラーク減少アッセイにより、抗ウイルス生物活性について検定した（Ｃｈｉｎｓａｎｇａｒａｍら，１９９９，上記）。Ａｄ５−ＩＦＮα７．６．３、Ａｄ５−ｐＩＦＮα９．９．６およびＡｄ５−ｐＩＦＮβ１．４．６感染細胞の上清における抗ウイルス活性は、１〜４ｈｐｉの間で最初に検出され、２５ｈｐｉまでは、６４〜２５６，０００単位の間の活性であった（表２）。Ａｄ５−ＦＭＤＶＡ２４感染ＩＢＲＳ２細胞（２４ｈｐｉ）およびｍｏｃｋ感染細胞からの上清液を対照として含め、これは、検出可能な抗ウイルス活性を有さなかった（データは示していない）。
【００４４】
Ａｄ５−ｐＩＦＮ−αおよびＡｄ５−ｐＩＦＮ−β感染ＩＢＲＳ２細胞において生じた上清液を、ＩＢＲＳ２およびＭＤＢＫ細胞（ウシ細胞系）の両方において検定した。表３に示すように、ｐＩＦＮ−αまたはｐＩＦＮ−βのいずれかを含有する上清液は、豚およびウシ細胞系において同等の活性を有した。ｐＩＦＮ−αと比較して、ｐＩＦＮ−βにより誘導された抗ウイルス活性が低いのは、より低いその発現レベルに関連しうる。
【００４５】
【表２】
2004530677.tif 000003
【００４６】
【表３】
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【００４７】
ｂＩＦＮ−α遺伝子およびｂＩＦＮ−β遺伝子による抗ウイルス活性を判定するために、Ａｄ５−ｂＩＦＮα９．２．２およびＡｄ５−ｂＩＦＮ５．３．１感染ＩＢＲＳ２細胞からの上清液を記載したように処理して、一切の残留Ａｄ５を除去した。処理した上清をＭＤＢＫ細胞とＩＢＲＳ２細胞の両方に対する抗ウイルス活性について検定した。抗ウイルス活性は、５ｈｐｉまでに検出でき、２８〜４８ｈｐｉには約２０４，０００単位／ｍＬのレベルに達した（表４）。照明されているとおり、ｂＩＦＮ−αは、ウシ細胞と豚細胞の両方において同等の生物活性を有するが、ｂＩＦＮ−βは、ウシ細胞においてのみ活性であった（Ｃｈｉｎｓａｎｇａｒａｍ，１９９１，上記）。
【００４８】
【表４】
2004530677.tif 000005
【実施例７】
【００４９】
豚におけるＩＦＮの発現：安全性および効力についての試験
Ａｄ５−ｐＩＦＮα７．６．３を接種した豚において用量−応答実験を行って、生物活性ＩＦＮが接種動物において検出できるかどうか判定した。豚（各用量について１匹）に１０７、１０８または１０９ｆｐｕのＡｄ５−ｐＩＦＮ−α７．６．３を筋肉内（ＩＭ）接種し、さらなる動物に１０８ｆｐｕのＡｄ５−ＶＳＶＧ（水疱性口内炎ウイルスのグリコプロテイン遺伝子を含有するアデノウイルス、Ｍｏｒａｅｓ，上記）をＩＭ接種した。動物をＩＦＮ投与による有害反応について試験し、体温を毎日測定した。１６、１８，２０および２２ｈｐｉに、およびその後、６日間、１日１回、血漿サンプルを採取した。それらのサンプルをプラーク減少アッセイ（Ｃｈｉｎｓａｎｇａｒａｍら，１９９９，上記）により抗ウイルス活性について試験した。
【００５０】
どの接種動物も、接種後に有害な臨床徴候または体温の上昇を発現しなかった。Ａｄ５−ＶＳＶＧを接種した動物および１０７ｆｐｕのＡｄ５−ｐＩＦＮを接種した動物は、両方とも、抗ウイルス活性を発現しなかった。１０８または１０９ｐｆｕのＡｄ５−ｐＩＦＮを接種した動物は、検定した最も早い時点、例えば、１６ｈｐｉに抗ウイルス活性を発現した。１０９ｐｆｕのＡｄ５−ｐＩＦＮを接種した動物は、１６ｈｐｉに血漿において４００単位／ｍＬの抗ウイルス活性を有し、この活性は、このレベルで２日間継続した。抗ウイルス活性は、時間が経つにつれて低下したが、４ｄｐｉに、まだ検出できた。
【実施例８】
【００５１】
Ａｄ５−ｐＩＦＮ−αを接種した豚のＦＭＤＶでの感染からの保護
別の部屋に入れた豚のグループ（１グループ３匹）に、１０８または１０９ｐｆｕのＡｄ５−ｐＩＦＮ−α７．６．３をＩＭ接種し（グループ２および３）、対照グループには、１０９ｐｆｕのＡｄ５−ＢｌｕｅをＩＭ接種した（グループ１）（表５）。１日後、左前足の踵球状部（ｈｅｅｌ  ｂｕｌｂ）に３×１０５の５０％ウシ感染量（ＢＩＤ５０）のＦＭＤＶ  Ａ２４を直接接種することにより動物を攻撃した。攻撃後１４日（ｄｐｃ）まで、熱、ウイルス血症およびＦＭＤＶ特異的抗体の導入を含むＦＭＤの臨床徴候について、ならびに接種後（ｄｐｉ）７日間、抗ウイルス活性について動物をモニターした。動物の三つの同じグループには、上記のとおり接種したが、ＦＭＤＶでの攻撃は行わなかった（グループ４〜６）。これらの動物を熱および検定される抗ウイルス活性についてモニターした。結果を図８〜１３に示す。
【００５２】
【表５】
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【００５３】
攻撃後の臨床応答：対照グループの動物の３匹中２匹は、２ｄｐｃまでに水疱性病変を発症し（すなわち、＃３０２−３および３０５−３）、３ｄｐｃまでに動物３匹すべてが病変を有した（図８）。３匹の動物すべてが、３ｐｃまでに重度の疾病にかかった。豚＃３０５−２は、３日続けて発熱（１０４°Ｆを超える体温）したが、このグループの他の２匹の動物は、１または２日間しか発熱しなかった（データは示していない）。１０８ｐｆｕのＡｄ５−ｐＩＦＮ−αを接種したグループ２において、＃５０１−３は、４ｄｐｃまでに重度のＦＭＤを発現し、＃１９９−２は、５ｄｐｃまでに病変有して、７ｄｐｃまでに重度のＦＭＤにかかり、および＃１８６−１は、８ｄｐｃに左後足に一つの病変を発現しただけだった（図８）。１０９ｐｆｕのＡｄ５−ｐＩＦＮ−αを接種したグループ３では、どの動物も、実験過程を通して、すなわち、攻撃後１４日間、いかなるＦＭＤの徴候も示さなかった（図８）。グループ３の豚＃７−７は、（攻撃後）１２日目に死亡した。剖検では、ＦＭＤ感染の徴候は示されず、且つ、咽頭扁桃、心臓、肺、左皮膜前リンパ節（ｌｅｆｔ  ｐｒｅｃａｂｓｕｌａｒ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ）、または血液において、ＢＨＫ細胞に対する力価測定により検出されたＦＭＤＶはなかった。回腸穿孔から、この動物は、おそらく充実性腹膜炎であることが明らかになった。
【００５４】
血清分析：対照グループ、グループ１のすべての動物は、１ｄｐｃまでにウイルス血症を発現し、これは、３ｄｐｃまで検出でき、１０４〜１０５ｐｆｕ／ｍＬの力価に達した（図９）。これらの動物は、４ｄｐｃまでにＦＭＤＶ特異的中和抗体応答を発現した。グループ２の豚＃５０１−３は、わずか１ｄｐｉ（−１ｄｐｃ）で１００単位の検出可能な抗ウイルス活性を有し、２ｄｐｃにウイルス血症を発症し、および４ｄｐｃまでに病変を発現した（図１０Ａおよび１１）。豚＃１９９−２は、１ｄｐｉ（−１ｄｐｃ）に検出可能な抗ウイルス活性を有し、これは、さらに一日持続した。この動物は、５ｄｐｃにウイルス血症にかかり、これがさらに二日間持続し、また、５ｄｐｃに一つの病変を発症し、７ｄｐｃには疾病がさらに拡大していた。豚＃１８２−２は、１ｄｐｉ（−ｄｐｃ）までに検出可能な抗ウイルス活性を有し、これがさらに一日持続した。この動物は、ウイルス血症を発現しなかったが、８ｄｐｃに一つの病変を有し、７ｄｐｃまでにＦＭＤＶ特異的中和抗体応答を有した。
【００５５】
グループ３の動物は、１ｄｐｉ（−ｄｐｃ）に高レベルの抗ウイルス活性（４００単位）を有し、これが、さらに２〜３日間検出可能であった（図１０Ｃおよび１２）。このグループのすべての動物は、ウイルスの攻撃から完全に保護された。このグループのどの動物も、ウイルス性血症にかからなかった。
【００５６】
ＦＭＤＶでの攻撃を受けなかったグループ５および６の動物は、同等のＦＭＣＶの攻撃を受けたグループに比べ、高いレベルの抗ウイルス活性を一般に生じ、これが１〜２日長く持続した（図１０Ｂおよび１０Ｄ）。Ａｄ５−Ｂｌｕｅ接種動物（対照グループ４）は、検出可能な抗ウイルス活性を発現しなかった（データは示していない）。両グループの動物は、２〜３日間発熱したが、体温は、正常に戻り、他の有害な臨床徴候は示さなかった（データは示していない）。
【００５７】
ＩＦＮ処理が、攻撃ウイルス複製を阻止するかどうかを判定するために、グループ１〜３からの１４ｄｐｃの血清を、ＲＩＰにより、ウイルス構造蛋白質およびウイルス非構造（ＮＳ）蛋白質に対する抗体の存在について試験した。攻撃を受けた動物からの血清がウイルスＮＳ蛋白質を免疫沈降させる能力は、これらの動物におけるウイルス複製を示す。予想どおり、グループ１の動物３匹すべてからの血清が、ウイルス構造蛋白質およびウイルスＮＳ蛋白質に対する抗体を含有していた（図１３、レーン９〜１１）。同様に、グループ２のすべての動物が、ウイルス構造蛋白質およびウイスルＮＳ蛋白質に対する抗体を発現した（レーン６〜８）。対照的に、臨床的疾患およびウイルス血症から完全に保護されたグループ３のすべての動物は、ウイルスＮＳ蛋白質に対する抗体を発現しなかった。これは、このアッセイにより、これらの動物が攻撃ウイルス複製から完全に保護されたことを示している（レーン３〜５）。上記血清に対する３回のＡＢＣ  ＥＬＩＳＡアッセイによって、グループの動物にウイルス複製が存在しなかったことが確認された。
【実施例９】
【００５８】
Ａｄ５−ｐＩＦＮ−αを接種した豚のＦＭＤＶでの感染からの保護の持続期間
実施例１８に記載されている実験は、１０９ｐｆｕのＡｄ５−ｐＩＦＮ−αの投与から１日後、豚がビルレントＦＭＤＶ  Ａ２４の攻撃から完全に保護されたことを示した。Ａｄ５−ｐＩＦＮα接種動物を臨床的疾患からどのくらい長く保護することができるか、および感染前の動物を、一日後にＡｄ５−ｐＩＦＮ−αを投与することにより、ウイルス血症および疾病の臨床的徴候から保護することができるかを判定するために、複数のグループの複数の動物（動物３匹／グループ）に１０９ｐｆｕのＡｄ５−ｐＩＦＮα７．６．３を接種し、１、３、５および７ｄｐｉに、およびＡｄ５−ｐＩＦＮ−α投与の１日前に、左後足を３．５×１０５のＢＩＤ５０  ＦＭＤＶ  Ａ２４で攻撃した（５０μＬ／足指）（表５）。結果を図１４〜２０に示す。
【００５９】
前の実験におけるがごとく、個々のブループを別々の部屋に入れ、熱および嗜眠などのＩＦＮ投与の副作用の徴候および血漿における抗ウイルス活性について臨床的にモニターした。ＦＭＤＶ攻撃後、１４日間、動物を、体温および病変を含む疾病の徴候についてモニターし、ならびにウイルス血症、ＦＭＤＶ特異的抗体の誘導、および抗ウイルス活性について臨床的にモニターした。
【００６０】
【表６】
2004530677.tif 000007
【００６１】
攻撃前の抗ウイルス応答の判定において、Ａｄ５−ｐＩＦＮαを接種したすべての動物は、１日後、高レベルの抗ウイルス活性、すなわち、２００〜８００単位／ｍＬのウイルス活性を有することが判明した（図１４〜１９、パネルＡ）。その活性は、二日目までに低下したが、さらに二日間、１００単位／ｍＬより高い活性が一般に維持された。抗ウイルス活性は、接種後３〜５日間、検出できた。一般に、Ａｄ５−ｐＩＦＮ−α接種動物は、接種後５〜６日間発熱したグループ２を除き、高熱を発しなかった（データは示していない）。ビルレントＦＭＤＶの直接接種から１日後にＡｄ５−ｐＩＦＮ−αを投与したグループ（グループ＃６）において、＃８１−６および３０８−９は、検出可能レベルの抗ウイルス活性を有したが、＃８１−１０は、有さなかった（図１９、パネルＡ）。一部の動物（グループ２の＃７０−４および７０−５、グループ３の＃７１−４）は、Ａｄ５−ｐＩＦＮ−α接種後に発熱し、多少、嗜眠を見せたが、これらの兆候は、１〜２日間しか持続しなかなかった。
【００６２】
攻撃後のウイルス血症および臨床応答については、対照グループの動物３匹すべてが、１ｄｐｃにウイルス血症を、２日目に病変を発現した（図１４．パネルＢおよびＣ）。ウイルス血症は、４日間検出可能であり、９×１０５〜３．１×１０７ｐｆｕ／ｍＬの力価に達した。対照グループの動物３匹すべてが、３日目までに重度の臨床的疾患にかかった。動物＃６９−８は、３日続けて発熱したが、このグループの他の動物２匹は、１日しか発熱しなかった。対照動物＃６１１−６は、５ｄｐｃに死亡し、一方、＃６９−８は、８ｄｐｃに死亡した。剖検に基づく組織病理学的所見は、＃６１−６と＃６９−８の両方が、ＦＭＤに典型的な心臓障害を有すること、および両動物の死因が、心筋壊死による可能性が最も高いことを示していた。
【００６３】
攻撃７日前にＡｄ５−ｐＩＦＮ−αを投与したグループは、攻撃当日に検出可能な循環抗ウイルス活性を有さなかった（図１４、パネルＡ）。このグループは、対照グループより１日遅い２ｄｐｃにウイルス血症にかかった（図１５、パネルＢ）。ウイルス力価は、１．９×１０４〜９．１×１０４ｐｆｕ／ｍＬの範囲であり、対照グループより１〜３ログ低かった。このグループの動物３匹中２匹は、４ｄｐｃに病変を発現し、一方、三番目の動物は、５日目に病変を発現した（図１５、パネルＣ）。このグループのすべての動物が、１〜２日間、発熱した。動物＃７０−５は、１２ｄｐｃに死亡した。この組織病理学的報告では、脳幹、甲状腺および肺の膿瘍が見出され、最も可能性が高い死因は、ＦＭＤとは関係ない脳膿瘍および脳腫脹であった。
【００６４】
攻撃５日前にＡｄ５−ｐＩＦＮ−αを投与したグループ＃３のすべての動物は、低レベルではあるが、検出可能なレベルの抗ウイルス活性、２５−５０単位／ｍＬを攻撃当日に有した（図１６、パネルＡ）。動物＃７０−７は、７ｄｐｃにウイルス血症を、８ｄｐｃに病変を発現した（図１６、パネルＢおよびＣ）。動物＃７１−４は、７ｄｐｃにウイルス血症を、８ｄｐｃに病変を発現した。動物＃７１−４および＃７０−７は、それぞれ８ｄｐｃおよｂ９ｄｐｃに病変を発現した後、別々の部屋に移動した。動物＃７０−８は、臨床的に病気の動物と少なくとも２日間接触させることによる暴露を受けたにもかかわらず、ウイルス血症も病変も発現しなかった。
【００６５】
攻撃の３日前および１日前にそれぞれＡｄ５−ｐＩＦＮ−αを投与したグループ＃４および＃５のすべての動物が、攻撃当日、抗ウイルス活性を有した（図１７および１８、パネルＡ）。活性は、グループ４の動物では、攻撃１日後にまだ検出可能であり、一方、グループ＃５は、攻撃後２日間、検出可能な活性を有した。これらいずれのグループのいずれの動物も、ＢＨＫ細胞における血液の３回の盲目継代の後でさえ、検出可能なウイルス血症を有さず、且つ、疾病のいかなる臨床徴候も発現しなかった（図１６および１８、パネルＢおよびＣ）。
【００６６】
１ｄｐｃにＡｄ５−ｐＩＦＮ−αを投与したグループ＃６のすべての動物が、１日後にウイルス血症を発現した（図１９、パネルＢ）。しかし、＃８１−６の最大ウイルス力価は、わずか７×１０１ｐｆｕ／ｍＬであった。この動物は、２匹の積極的に感染させた動物に少なくとも７日間接触させることによる暴露を受けたにもかかわらず、疾病の臨床徴候を決して発現しなかった。しかし、＃８１−６は、攻撃後９日目に死亡した。この組織病理学的報告は、重度の細菌性髄膜炎を示しており、死亡は、ＦＭＤとは関係ない皮膚膿瘍からの血液による細菌性髄膜炎の内転移に起因する可能性が最も高かった。
【００６７】
血清応答については、すべての動物からの血清を、ＦＭＤＶ特異的中和抗体応答について検定し、１４ｄｐｃの血清を、ウイルスＮＳ蛋白質に対する抗体の導入について検定した。グループ１および２の中の生存動物すべてが、有意なＦＭＤＶ特異的中和抗体応答を有し（図１４および１５）、ウイルスＮＳ蛋白質に対する抗体を発現した（図２０、レーン３〜５）。グループ３の中の２匹の臨床的に病気の動物が、ウイルスＮＳ蛋白質に対する抗体を発現した（図２０、レーン６および８）が、臨床的疾患またはウイルス血症を発現しなかったそのグループ内の動物、＃７０−８は、ウイルス構造蛋白質に対する抗体のみを有し、ウイルスＮＳ蛋白質に対する抗体は有さなかった（図２０、レーン７）。すべてが臨床的疾患から保護され、ウイルス血症にかからなかったグループ４および５の動物は、ウイルス構造蛋白質に対する低レベルの抗体を有し、ウイルスＮＳ蛋白質に対する検出可能な抗体は有さなかった（図２０、レーン１１〜１６）。これらの結果のサポートとして、グループ４および５の動物からの血清は、３回のＡＢＣ  ＥＬＩＳＡにおいて陰性であった。これらの結果は、３匹の動物が、ウイルス複製から保護されたことを示している。グループ６の中の生存動物は、有意なＦＭＤＶ特異的中和抗体応答を発現し（図１９）、且つ、ウイルスＮＳ蛋白質に対する抗体を発現した（図２０、レーン９および１０）。
【実施例１０】
【００６８】
Ａｄ５−ｐＩＦＮ−αとＡｄ５−Ａ２４を共同投与した豚のＦＭＤＶでの感染から保護
実施例１４に記載されている実験では、攻撃１日前または３日前にＡｄ５−ｐＩＦＮ−αを投与した時、豚をＦＭＤから保護することができた。攻撃５日前にＡｄ５−ｐＩＦＮαを接種した豚は、完全に保護された（＃７０−８）か、または対照グループより６〜７日遅くウイルス血症および臨床的疾患を発現したので、ワクチンに用いられる特異的ＦＭＤＶ血清型に対して適応する免疫応答を発現する前に非特異的抗ウイルス保護作用を非常に迅速に誘導する方法として、Ａｄ５−ｐＩＦＮαおよびＡｄ５−ＦＭＤＶでの豚の二重接種の可能性を調査した。
【００６９】
ＦＭＤＶのカプシド（Ｐ１）および３Ｃプロテイナーゼコード領域を含有するＡｄ５−ＲＭＤＶベクターは、ビルレントＦＭＤＶでの攻撃を受けた豚を保護することができることは、照明されている（Ｍａｙｅｒら  １９９９．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．ｖｏｌ．２２６３，ｐｐ．４９６−５０６；Ｍａｙｅｒら  ２００１．Ｖａｃｃｉｎｅ．ｖｏｌ．１９，ｐｐ．２１５２−２１６２；Ｍｏｒａｅｓら  ２００２．Ｖａｃｃｉｎｅ．ｖｏｌ．２０，ｐｐ．１６３１−１６３９）。従って、２４Ａ  Ｃｒｕｚｉｅｒｏ、ブラジル産菌種（ｆｉｅｌｄ  ｓｔｒａｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｂｒａｚｉｌ）（Ａｄ５−Ａ２４）のＰ１コード領域を含有するＡｄ５−ＦＭＤＶベクターを用いた。このベクターを１回接種した豚は、相同ウイルスでの直接接種攻撃から、７日後のように早くに保護される（Ｍｏｒａｅｓら，２００２，上記）。
この実験では、複数のグループに、Ａｄ５−ＶＳＶＧ（グループ１）、Ａｄ５−Ａ２４（グループ２）、Ａｄ５−ｐＩＦＮ−α（グループ３）およびＡｄ５−Ａ２４とＡｄ５−ｐＩＦＮ−α（グループ４）を接種した（表７）。５日後、動物を、３．５×１０５のＢＩＣ５０  ＦＭＤＶ  Ａ２４での足蹠接種により攻撃した。血漿、血清および全血のサンプルを採取し、実施例９におけるがごとく検定した。加えて、鼻腔スワブを検定して、ウイルス放出をモニターした。動物は、実験過程を通して臨床的にもモニターした。結果を図２１〜２５に示す。
【００７０】
【表７】
2004530677.tif 000008
【００７１】
攻撃前の抗ウイルス応答を判定するために、接種後様々な時点で血漿を得た。Ａｄ５−ｐＩＦＮ−αを接種したグループ（グループ３および４）のすべての動物が、４ｈｐｉ（−４．８）のように早くに抗ウイルス応答を発現し、これは、約４〜５日間持続した（図２３および２４）。最大活性は、４００〜８００単位／ｍＬであった。ＩＦＮ−α遺伝子を含まないＡｄ５ベクターを投与したグループ１および２も、４ｈｐｉ（−４．８）までに抗ウイルス応答を発現したが、これは、約１日間しか持続しなかった（図２１および２２）。これらの後者２グループは、グループ３より５倍多いウイルスを受けた（表７）。
【００７２】
攻撃後のウイルス血症およびその臨床応答もモニターした。グループ１（対照）の動物３匹すべてが、１ｄｐｃに高レベルのウイルス血症を発現し、１ｄｐｃに鼻腔スワブにおいて低ウイルス力価（１０１〜１０２ｐｆｕ／ｍＬ）を発現し、これがさらに２〜３日持続し、および２ｄｐｃに病変を発現した（図２１）。すべての動物が、重度の疾病徴候を発現した。動物は、４ｄｐｃまでに血清交換した。
【００７３】
Ａｄ５−Ａ２４を投与したグループ（グループ２）では、動物＃９９８３のみが、１日間、低レベルのウイルス血症（１０２ｐｆｕ／ｍＬ）を発現した（図２２）。しかし、このグループの動物３匹すべてが、１〜２日間、鼻腔スワブ中に低レベルのウイルス（１０１〜１０２ｐｆｕ／ｍＬ）を有した。病変は、対照グループより１〜２日遅い３〜４ｄｐｃに検出することができ、有意に重症度が低かった。これらの動物は、攻撃当日に、低いが検出可能なＦＭＤＶ特異的中和抗体応答を有した。力価は、４ｄｐｃまでに有意に上昇した。
【００７４】
Ａｄ４−ｐＩＦＮ−αを単独で投与したグループ（グループ３）またはＡｄ５−Ａ２４と併せて投与したグループ（グループ４）は、完全に保護された（図２３および２４）。これらのグループの動物６匹のうち５匹が、攻撃当日に抗ウイルス活性を有した。これらの動物は、ウイルス血症を発現せず、鼻腔スワブ中に検出可能なウイルスを有さず、また、疾病の臨床徴候を有さなかった。グループ４の動物は、４ｄｐｉに、低いが検出可能なＦＭＤＶ特異的中和抗体応答を有し、それが４ｄｐｃまでに有意に高まり、２１ｄｐｃに高レベルのままだった（図２４）。
【００７５】
血清学的応答も判定した。１４ｄｐｃの血清を、ウイルス構造蛋白質およびウイスルＮＳ蛋白質に対する抗体について試験した。すべてが臨床的疾患を発現を発現したグループ１および２の動物は、すべて、ウイルス構造蛋白質とウイスルＮＳ蛋白質の両方に対する抗体を有した（図２５、レーン９〜１４）。対照的に、臨床的疾患もウイルス血症も発症しなかったグループ３および４の動物は、ウイルス構造蛋白質に対する抗体のみを有した（レーン３〜８）。興味深いことに、Ａｄ５−ｐＩＦＮ−αとＡｄ５−Ａ２４の両方を投与した、且つ、Ａｄ５−ｐＩＦＮ−αのみを接種したグループ３の動物に比べて高いレベルのＦＭＤＶ特異的中和抗体を有した（図２３および２４）グループ４の動物は、ウイルス構造蛋白質蛋白質に対する抗体も、より高いレベルで有した（図２５、レーン３〜５［両方のベクターを接種したもの］、レーン６〜８［Ａｄ５−ｐＩＦＮ−αのみを接種したもの］）。これらの結果のサポートとして、グループ３および４の動物からの血清は、すべて、３回のＡＢＣ  ＥＬＩＳＡで陰性であった。
【実施例１１】
【００７６】
蓄牛におけるＡｄ５−ｂＩＦＮ−αおよびＡｄ５−ｂＩＦＮ−βの発現
Ａｄ５−ｂＩＦＮ−αおよびＡｄ５−ｂＩＦＮ−βを接種した蓄牛において用量−応答実験を行った。蓄牛（各用量について１匹）に１、２．５または５×１０９ｐｆｕの各ウイルスをＩＭ接種した。対照として、さらなる動物に５×１０９ｐｆｕのＡｄ５−ＶＳＶＧを投与した。ＩＦＮ投与の有害臨床作用について動物をモニターし、毎日体温を計った。血漿サンプルを７日間、毎日採取し、抗ウイルス活性について検定して、Ａｄ５特異的中和抗体の分析のために血清サンプルを０および１３ｄｐｉに採取した。
【００７７】
異常な挙動を示したり、高熱を出したりした動物は、いなかった。ウイルスを接種したいずれの動物においても、抗ウイルス応答は検出できなかった。すべての動物が、１３ｄｐｉに有意なＡｄ５特異的中和抗体応答を発現した。これは、これらの動物が、組換えウイルスに暴露したことを示している。
【００７８】
蓄牛における検出可能な抗ウイルス活性の欠如の説明には、実験に用いられた豚と蓄牛のサイズの違い（３５〜４０ポンド対４００〜４５０ポンド）、豚におけるｐＩＦＮの発現レベルと比較して低い蓄牛におけるｂＩＦＮの発現レベル、およびヒトＡｄ５ウイルスでの豚の有効な感染と比較して低い蓄牛の有効な感染を含む多数の可能性がある。
【実施例１２】
【００７９】
蓄牛および豚におけるＡｄ５−ｐＩＦＮ−αおよびＡｄ５−ｐＩＦＮ−βの発現
ｐＩＦＮ−αおよびｐＩＦＮ−βが、ウシ細胞培養において生物活性であることは、明らかにされている（Ｃｈｉｎｓａｎｇａｒａｍら，２００１，上記、表３）。従って、ブタおよび蓄牛に異なる用量のこれらのウイスルを接種し、ｄｐｉ７日間、毎日、それらの動物をモニターして、血漿サンプルを採取した（表８）。
【００８０】
いずれかの用量のＡｄ５−ｐＩＦＮ−αを接種した豚は、１〜２日間、発熱した。高い用量を接種した動物は、嗜眠性でもあり、あまり食べなかった。接種した他の豚または蓄牛のすべてが、正常に挙動し、発熱しなかった。
【００８１】
低用量のＡｄ５−ｐＩＦＮ−αを投与した豚は、１ｄｐｉまでに抗ウイルス応答を発現し、これは、さらに３日間持続した（表８）。高用量のＡｄ５−ｐＩＦＮ−αを接種した豚は、１ｄｐｉまでに、より高い抗ウイルス応答を発現し、これは、さらに４日間持続した。高用量のＡｄ５−ｐＩＦＮ−βを投与した豚のみが、抗ウイルス応答を発現した。この動物における誘導抗ウイルス活性は、高用量のＡｄ５−ｐＩＦＮ−αを接種した動物におけるものより有意に低く、且つ、２日間しか持続しなかった。Ａｄ５−ｐＩＦＮ−α感染豚において誘導された抗ウイルス活性レベルと比較して低い、Ａｄ５−ｐＩＦＮ−β感染ブタにおいて誘導された抗ウイルス活性レベルは、感染ＩＢＲＳ２細胞におけるｐＩＦＮ−αの発現レベルに対して低いｐＩＦＮ−βの発現レベルに関係しうる（実施例５参照）。
【００８２】
【表８】
2004530677.tif 000009
【００８３】
高用量のＡｄ５−ｐＩＦＮ−αを接種したウシのみが抗ウイルス応答を発現した。この応答は、全く同様に接種した豚において見出されたものより有意に低く、且つ、１日間しか持続しなかった。これらの結果は、ＩＦＮ処理の有効性が、接種の用量および接種を受ける動物のサイズに関係することを示唆している。ヒトＡｄ５ウイルスの結合が、蓄牛においてより豚においてのほうが有効であるという可能性もある。
【実施例１３】
【００８４】
Ａｄ５−ｂＩＦＮ−αおよびＡｄ５−ｂＩＦＮ−βの発現
ｂＩＦＮ−αが、ウシ細胞および豚細胞の両方において生物活性である一方で、ｂＩＦＮ−βが、ウシ細胞系においてしか生物活性を有さないことは、以前に明らかにされている（Ｃｈｉｎｓａｎｇａｒａｍら，２００１，上記、表４）。Ａｄ５−ｂＩＦＮが、抗ウイルス応答を豚に誘導することができるかどうかを判定するために、豚に異なる用量のこれらのウイルスを接種した（表９）。動物をモニターし、血漿サンプルを適切な細胞系における抗ウイルス応答について検定した。
【００８５】
１または５×１０９ｐｆｕのＡｄ５−ｂＩＦＮ−αを接種した豚は、両方とも、１ｄｐｉまでに抗ウイルス応答を発現した。より高い用量を接種した動物は、より高い活性を有したが、各ケースにおいて抗ウイルス活性は、１日間しか検出できなかった。１または５×１０９ｐｆｕのＡｄ５−ｂＩＦＮ−βを接種した豚は、両方とも、１ｄｐｉまでに抗ウイルス活性を発現した。低用量を接種した動物は、さらに３日間検出可能な活性を有し、一方、高用量を接種した動物は、さらに４日間活性を有した。
【００８６】
【表９】
2004530677.tif 000010
【実施例１４】
【００８７】
Ａｄ５−ｐＩＦＮ−αを接種したウシのＦＭＤＶでの感染からの保護
ｐＩＦＮ−αは、ウシ細胞において生物活性であり（表３）、Ａｄ５−ｐＩＦＮ−αの投与は、ウシに低レベルの抗ウイルス活性を誘導する（表８）。Ａｄ５−ｐＩＦＮ−αが、蓄牛を蓄牛継代ＦＭＤＶの攻撃から保護することができるかどうかを判定するために、体重約２００ポンドの蓄牛に、非常に高い用量のＡｄ５−ｐＩＦＮ−α、すなわち、動物１匹あたり１×１０１０ｐｆｕのＡｄ５−ｐＩＦＮ−αを接種した。グループ１では、蓄牛に、対照ウイルス、Ａｄ５−ＢｌｕｅをＩＭ接種し、グループ２および３では、Ａｄ５−ｐＩＦＮ−αをＩＭ接種した。すべての動物は、２×１０４のＢＩＤ５０の蓄牛継代Ａ２４で、舌に皮内攻撃した。グループ１および２の動物は、１ｄｐｉに攻撃し、その一方で、グループ３の動物は、２ｄｐｉに攻撃した。動物を、１日おきに疾病の臨床徴候についてモニターした。体温を毎日計り、血液サンプルおよび鼻腔スワブを８ｄｐｃまで毎日採取し、血清サンプルを１、４、７および１４ｄｐｃに採取した。
【００８８】
【表１０】
2004530677.tif 000011
【００８９】
グループ２および３の動物は、５０〜２００単位／ｍＬの間の抗ウイルス応答を発現し、これは、１ｄｐｉに始って、さらに１〜２日間持続した。予想どおり、Ａｄ５−Ｂｌｕｅ接種動物は、検出可能な抗ウイルス活性を有さなかった。グループ２および３の動物のみが、１〜２日間発熱し、その後、正常に戻り、でなければ、これらの動物は、健康に見えた。
【００９０】
Ａｄ５−Ｂｌｕｅ接種動物すべてが、１ｄｐｃに低レベルのウイルス血症を発現し、これが上昇して、さらに１〜３日間継続した。すべての動物において、ウイルスが、２〜３ｄｐｃに鼻腔スワブ中で検出された。攻撃後２日目、動物は、攻撃部位とは異なる部位の舌に、および足に小水疱を有した。その後、一部の動物が、歯肉および鼻の小水疱ならびに４本の足すべてに小水疱を有した（図２６）。
【００９１】
ウイルス血症は、グループ２および３の動物では、２ｄｐｃまで遅延し、さらに２日間継続した。ウイルスは、２〜３ｄｐｃにはすべての動物の鼻腔スワブ中で検出できた。グループ２における小水疱の出現は、４ｄｐｃまで遅延し、疾病は、対照グループにおけるほど重症ではなかった（図２６）。グループ３において、動物＃１６は、小水疱を決して発現しなかった一方で、このグループにおける他の２匹の動物の小水疱の出現は遅延し、疾病は、対照グループにおけるほど重症ではなかった（図２６）。
【００９２】
ビルレントＦＭＤＶでの攻撃１日前（グループ１）または２日前（グループ２）にＡｄ５−ｐＩＦＮ−αを接種した蓄牛は、臨床的疾患から一部保護された。１匹のＡｄ５−ｐＩＦＮ−α接種動物は、臨床的疾患を決して発現しなかった一方で、残りの動物では、小水疱の出現が遅延し、疾病は、対照Ａｄ５−Ｂｌｕｅ接種動物のものより重症ではなかった。同様に、Ａｄ５−ｐＩＦＮ−α接種動物すべてが、ウイルス血症を発現したが、それは、対照グループと比較して１日遅延した。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】ブタインターフェロン−α（ｐＩＦＮ−α）についてのＤＮＡ配列を示す図である。パネルＡは、シグナル配列を含有するｐＩＦＮ−αクローン７の配列（配列番号１）を示す。このクローンをｐＴＯＰＯ中で配列し、ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで消化して、同様に消化したＫＳＩＩにライゲーションした。その後、そのプラスミドをＣｌａＩおよびＸｂａＩで消化して、ＣｌａＩ／ＸｂａＩで消化したｐＡｄ５−Ｂｌｕｅにライゲーションした。このプラスミドから誘導されたウイルスをＡｄ５−ｐＩＦＮα７．６．３と呼ぶ。パネルＢは、シグナル配列を含有するｐＩＦＮ−αクローン９の配列（配列番号２）を示す。このクローンをｐＴＯＰＯ中で配列し、ＰｓｔＩおよびＳｐｅＩで消化して、同様に消化したＫＳＩＩにライゲーションした。その後、そのプラスミドをＣｌａＩおよびＸｂａＩで消化して、ＣｌａＩ／ＸｂａＩで消化したｐＡｄ５−Ｂｌｕｅにライゲーションした。このプラスミドから誘導されたウイルスをＡｄ５−ｐＩＦＮα９．９．６と呼ぶ。
【００９４】
【図２】シグナル配列を含有するブタインターフェロン−β（ｐＩＦＮ−β）クローン１についてのＤＮＡ配列（配列番号３）を示す図である。このクローンをｐＴＯＰＯ中で配列し、ＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで消化して、同様に消化したＫＳＩＩにライゲーションした。その後、そのプラスミドをＣｌａＩおよびＸｂａＩで消化して、ＣｌａＩ／ＸｂａＩで消化したｐＡｄ５−Ｂｌｕｅにライゲーションした。このプラスミドから誘導されたウイルスをＡｄ５−ｐＩＦＮβ１．４．６と呼ぶ。
【００９５】
【図３】シグナル配列を含有するウシインターフェロン−α（ｂＩＦＮ−α）クローン９についてのＤＮＡ配列（配列番号４）を示す図である。このクローンをｐＴＯＰＯ中で配列し、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＶで消化して、同様に消化したＫＳＩＩにライゲーションした。その後、そのプラスミドをＣｌａＩおよびＸｂａＩで消化して、ＣｌａＩ／ＸｂａＩで消化したｂＡｄ５−Ｂｌｕｅにライゲーションした。このプラスミドから誘導されたウイルスをＡｄ５−ｂＩＦＮα９．２．２と呼ぶ。
【００９６】
【図４】シグナル配列を含有するウシインターフェロン−β（ｂＩＦＮ−β）クローン５についてのＤＮＡ配列（配列番号５）を示す図である。このクローンをｐＴＯＰＯ中で配列し、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＶで消化して、同様に消化したＫＳＩＩにライゲーションした。その後、そのプラスミドをＣｌａＩおよびＸｂａＩで消化して、ＣｌａＩ／ＸｂａＩで消化したｐＡｄ５−Ｂｌｕｅにライゲーションした。このプラスミドから誘導されたウイルスをＡｄ５−ｂＩＦＮβ５．３．１と呼ぶ。
【００９７】
【図５】放射性免疫沈降法（ＲＩＰ）によるＡｄ５ｐＩＦＮ−α感染ＩＢＲＳ細胞におけるｐＩＦＮ−αの発現の動態を示す図である。サンプルは、攻撃後の時間（ｈｐｉ）４．５、６、２５よび３０に採取した。
【００９８】
【図６】Ａｄ５−ｐＩＦＮ−α感染ＩＢＲＳ２細胞におけるｐＩＦＮ−αの発現の動態を示す図である。サンプルは、０、２、４、６、２５および３０ｈｐｉに採取した。
【００９９】
【図７】Ａｄ５−ｂＩＦＮ−αまたはＡｄ５−ｂＩＦＮ−β感染ＩＢＲＳ２細胞におけるＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−ベータの発現の動態を示す図である。サンプルは、５、２３、２８および４８ｈｐｉに採取した。
【０１００】
【図８】ＦＭＤＶでの攻撃からの豚の保護に対するＡｄ５−ｐＩＦＮ−α投与の効果を示す図である。攻撃後１４日まで、病変を評点付けした。グループＩは、Ａｄ５−ｂｌｕｅを受け（対照）、グループ２は、低用量のＡｄ５−ｐＩＦＮ−αを受けた。
【０１０１】
【図９】Ａｄ５−Ｂｌｕｅ接種動物における攻撃後の血清応答および臨床応答を示す図である。応答は、抗ウイルス活性、ウイルス血症、評点付けした病変、および生産されたＦＭＤＶ中和抗体によって示す。
【０１０２】
【図１０】低または高用量のＡｄ５−ｐＩＦＮ−αを接種した豚における抗ウイルス活性を示す図である。
【０１０３】
【図１１】低用量のＡｄ５−ｐＩＦＮ−αを接種した動物における攻撃後の血清応答および臨床応答を示す図である。応答は、抗ウイルス活性、ウイルス血症、評点付けした病変、および生産されたＦＭＤＶ中和抗体によって示す。
【０１０４】
【図１２】高用量のＡｄ５−ｐＩＦＮ−αを接種した動物における攻撃後の血清応答および臨床応答を示す図である。応答は、抗ウイルス活性、ウイルス血症、評点付けした病変、および生産されたＦＭＤＶ中和抗体によって示す。
【０１０５】
【図１３】Ａｄ５−ｐＩＦＮ−αを接種し、１日後に攻撃した豚からの１４ｄｐｃ血清のＲＩＰを示す図である。
【０１０６】
【図１４】対照グループにおけるＦＭＤＶ攻撃からの豚の保護に対するＡｄ５−ＩＦＮ−α接種の効果を示す図である。効果は、抗ウイルス活性、ウイルス血症、評点付けした病変、および生産されたＦＭＤＶ中和抗体によって判定する。
【０１０７】
【図１５】グループ２におけるＦＭＤＶ攻撃からの豚の保護に対するＡｄ５−ｐＩＦＮ−α接種（攻撃７日前投与）の効果を示す図である。効果は、抗ウイルス活性、ウイルス血症、評点付けした病変、および生産されたＦＭＤＶ中和抗体によって判定する。
【０１０８】
【図１６】グループ２におけるＦＭＤＶ攻撃からの豚の保護に対するＡｄ５−ｐＩＦＮ−α接種（攻撃５日前投与）の効果を示す図である。効果は、抗ウイルス活性、ウイルス血症、評点付けした病変、および生産されたＦＭＤＶ中和抗体によって判定する。
【０１０９】
【図１７】グループ２におけるＦＭＤＶ攻撃からの豚の保護に対するＡｄ５−ｐＩＦＮ−α接種（攻撃３日前投与）の効果を示す図である。効果は、抗ウイルス活性、ウイルス血症、評点付けした病変、および生産されたＦＭＤＶ中和抗体によって判定する。
【０１１０】
【図１８】グループ２におけるＦＭＤＶ攻撃からの豚の保護に対するＡｄ５−ｐＩＦＮ−α接種（攻撃１日前投与）の効果を示す図である。効果は、抗ウイルス活性、ウイルス血症、評点付けした病変、および生産されたＦＭＤＶ中和抗体によって判定する。
【０１１１】
【図１９】グループ２におけるＦＭＤＶ攻撃からの豚の保護に対するＡｄ５−ｐＩＦＮ−α接種（攻撃１日前投与）の効果を示す図である。効果は、抗ウイルス活性、ウイルス血症、評点付けした病変、および生産されたＦＭＤＶ中和抗体によって判定する。
【０１１２】
【図２０】Ａｄ５−ｐＩＦＮ−αを接種し、様々な日数の後、攻撃した豚からの１４ｄｐｃ血清のＲＩＰを示す図である。
【０１１３】
【図２１】Ａｄ５−ＶＳＶＧを投与した対照グループにおけるＦＭＤＶでの直接接種攻撃からの豚の保護を示す図である。保護効果は、抗ウイルス活性、ウイルス血症、評点付けした病変、および生産されたＦＭＤＶ中和抗体によって判定する。
【０１１４】
【図２２】ＦＭＤＶでの直接接種攻撃からの豚の保護（Ａｄ５−Ａ２４の効果）を示す図である。保護効果は、抗ウイルス活性、ウイルス血症、評点付けした病変、および生産されたＦＭＤＶ中和抗体によって判定する。
【０１１５】
【図２３】ＦＭＤＶでの直接接種攻撃からの豚の保護（Ａｄ５−ｐＩＦＮ−αの効果）を示す図である。保護効果は、抗ウイルス活性、ウイルス血症、評点付けした病変、および生産されたＦＭＤＶ中和抗体によって判定する。
【０１１６】
【図２４】ＦＭＤＶでの直接接種攻撃からの豚の保護（Ａｄ５−ｐＩＦＮ−αおよびＡｄ５−Ａ２４の効果）を示す図である。保護効果は、抗ウイルス活性、ウイルス血症、評点付けした病変、および生産されたＦＭＤＶ中和抗体によって判定する。
【０１１７】
【図２５】Ａｄ５−ｐＩＦＮ−α、Ａｄ５−Ａ２４、またはＡｄ５−ｐＩＦＮ−αとＡｄ５−Ａ２４を接種し、５日後に攻撃した豚からの１４ｄｐｃ血清のＲＩＰを示す図である。
【０１１８】
【図２６】ＦＭＤＶでの攻撃からの蓄牛の保護に対するＡｄ５−ｐＩＦＮ−α投与の効果を示す図である。
【図１．ａ】
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【図１．ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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