(57)【要約】本発明は哺乳類における心臓移植拒絶反応を治療するのに有用な薬剤組成物であって、薬理的に受容できる賦形剤、治療的に有効な量の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質、及び腎毒性が生じない量のサイクロスポリンＡ を含む薬剤組成物に向けられている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類における心臓移植拒絶反応を治療するのに有用な薬剤組成物であって、１又は複数の薬理的に受容できる賦形剤、治療的に有効な量の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質、及び腎毒性が生じない量のサイクロスポリンＡ を含む薬剤組成物。
【請求項２】
該非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質が下記の式（Ｉ）：
【化１】
2004530630.tif 000005
〔式中、
Ｒ１ａは、アルキル又はヒドロキシアルキルから成る群から独立に選択される１又は複数の置換基であり；
Ｒ２は、４−位置のフッ素であり；
Ｒ３は、４−位置で塩素によって、２−位置でアミノカルボニル、ウレイド、又はグリシナミドによって置換されたフェニルであり；
Ｒ４は、−Ｏ−であり；
Ｒ５は、メチレンであり；そして
Ｒ６は、−Ｃ（Ｏ）−である〕
から単一立体異性体もしくはそれらの混合物、又は薬理的に受容できるその塩、として選択される化合物であることを特徴とする請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項３】
前記非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質が次の群、すなわち：
（２Ｒ，５Ｓ）−１−（（４−クロロ−２−（アミノカルボニル）フェノキシ）メチル）カルボニル−２，５−ジメチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン；
（ｔｒａｎｓ）−１−（（４−クロロ−２−（グリシナミド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２，５−ジメチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン；
（２Ｒ）−１−（（４−クロロ−２−（ウレイド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２−メチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン；
（ｔｒａｎｓ）−１−（（４−クロロ−２−（ウレイド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２，５−ジメチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン；
（２Ｒ，５Ｓ）−１−（（４−クロロ−２−（ウレイド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２，５−ジメチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン；及び
（２Ｒ，５Ｓ）−１−（（４−クロロ−２−（グリシナミド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２，５−ジメチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン；
から成る群から選択されることを特徴とする請求項２に記載の薬剤組成物。
【請求項４】
前記非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質が（２Ｒ）−１−（（４−クロロ−２−（ウレイド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２−メチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジンであることを特徴とする請求項２に記載の薬剤組成物。
【請求項５】
前記それを必要とする哺乳類がヒトであることを特徴とする請求項２に記載の薬剤組成物。
【請求項６】
哺乳類における心臓移植拒絶反応を治療するのに有用な薬剤組成物をそれを必要とする哺乳類に投与する方法であって、この組成物が１又は複数の薬理的に受容できる賦形剤、治療的に有効な量の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質、及び腎毒性が生じない量のサイクロスポリンＡ を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
前記非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質及びサイクロスポリンＡがそれを必要とする哺乳類に同時に又は順次に投与されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質が下記の式（Ｉ）：
【化２】
2004530630.tif 000006
〔式中、
Ｒ１ａは、アルキル又はヒドロキシアルキルから成る群から独立に選択される１つ以上の置換基であり；
Ｒ２は、４−位置のフッ素であり；
Ｒ３は、４−位置で塩素によって、２−位置でアミノカルボニル、ウレイド、又はグリシナミドによって置換されたフェニルであり；
Ｒ４は、−Ｏ−であり；
Ｒ５は、メチレンであり；そして
Ｒ６は、−Ｃ（Ｏ）−である〕
から単一立体異性体もしくはそれらの混合物、又は薬理的に受容できるその塩、として選択される化合物であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質が次の群、すなわち：
（２Ｒ，５Ｓ）−１−（（４−クロロ−２−（アミノカルボニル）フェノキシ）メチル）カルボニル−２，５−ジメチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン；
（ｔｒａｎｓ）−１−（（４−クロロ−２−（グリシナミド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２，５−ジメチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン；
（２Ｒ）−１−（（４−クロロ−２−（ウレイド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２−メチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン；
（ｔｒａｎｓ）−１−（（４−クロロ−２−（ウレイド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２，５−ジメチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン；
（２Ｒ，５Ｓ）−１−（（４−クロロ−２−（ウレイド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２，５−ジメチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン；及び
（２Ｒ，５Ｓ）−１−（（４−クロロ−２−（グリシナミド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２，５−ジメチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン；
から成る群から選択されることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質が（２Ｒ）−１−（（４−クロロ−２−（ウレイド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２−メチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジンであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記それを必要とする哺乳類がヒトであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
哺乳類における心臓移植拒絶反応を治療する方法であって、前記方法が１又は複数の薬理的に受容できる賦形剤、治療的に有効な量の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質、及び腎毒性が生じない量のサイクロスポリンＡ を含む薬剤組成物をそれを必要とする哺乳類に投与するステップを含む方法。
【請求項１３】
前記非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質が下記式（Ｉ）：
【化３】
2004530630.tif 000007
〔式中、
Ｒ１ａは、アルキル又はヒドロキシアルキルから成る群から独立に選択される１つ以上の置換基であり；
Ｒ２は、４−位置のフッ素であり；
Ｒ３は、４−位置で塩素によって、２−位置でアミノカルボニル、ウレイド、又はグリシナミドによって置換されたフェニルであり；
Ｒ４は、−Ｏ−であり；
Ｒ５は、メチレンであり；そして
Ｒ６は、−Ｃ（Ｏ）−である〕
から単一立体異性体もしくはそれらの混合物、又は薬理的に受容できるその塩、として選択される化合物であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質が次の群、すなわち：
（２Ｒ，５Ｓ）−１−（（４−クロロ−２−（アミノカルボニル）フェノキシ）メチル）カルボニル−２，５−ジメチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン；
（ｔｒａｎｓ）−１−（（４−クロロ−２−（グリシナミド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２，５−ジメチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン；
（２Ｒ）−１−（（４−クロロ−２−（ウレイド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２−メチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン；
（ｔｒａｎｓ）−１−（（４−クロロ−２−（ウレイド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２，５−ジメチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン；
（２Ｒ，５Ｓ）−１−（（４−クロロ−２−（ウレイド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２，５−ジメチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン；及び
（２Ｒ，５Ｓ）−１−（（４−クロロ−２−（グリシナミド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２，５−ジメチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン
から成る群から選択されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質が（２Ｒ）−１−（（４−クロロ−２−（ウレイド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２−メチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジンであることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記それを必要とする哺乳類がヒトであることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質及びサイクロスポリンＡがそれを必要とする哺乳類に同時に又は順次に投与されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、哺乳類における心臓移植拒絶反応の治療に有効な薬剤組成物であって、製薬的に受容される賦形剤、治療的に有効な量の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質、及び腎毒性が生じない量の（ｓｕｂ ｎｅｐｈｒｏｔｏｘｉｃ）サイクロスポリンＡを含む薬剤組成物に関する。本発明はまた、そのような薬剤組成物を哺乳類における心臓移植拒絶反応の治療に使用する方法に関する。
【０００２】
発明の背景
炎症過程の重要な成分は、循環系からの白血球の選択的集団の移動と活性化、及び当該組織へのそれらの蓄積に関わる。白血球の走行性という考えは新しいものではないが、最近、セレクチン及びインテグリンという付着分子のファミリー、及びケモカインと呼ばれる選択的走化性サイトカインの大きなファミリーの発見と研究によってそれが復活してきた。ケモカイン・レセプターは白血球で発現され、ケモカインが結合した後の信号を処理し、それによって場合によってはケモカインの源の方向への白血球の移動と活性化にこの信号が変換される。したがって、末梢血液から器官における血管外部位、皮膚、関節、結合組織、への白血球の移動と活性化を調節することによって、ケモカインは宿主防御の維持、ならびに免疫応答の発現に決定的な役割を演ずる。
【０００３】
元来、ケモカイン・ファミリーの分子は２つのグループ：「Ｃ−Ｘ−Ｃ」サブファミリーと「Ｃ−Ｃ」サブファミリーに区分されていた。これらの２つのサブファミリーの特徴は分子の非常に保存的な位置における４つのシステイン残基の存在である。「Ｃ−Ｃ」サブファミリーでは、最初の２つの残基が互いに隣接し、「Ｃ−Ｘ−Ｃ」サブファミリーでは１つのアミノ酸残基がシステイン残基を隔離している。最近の「−Ｃ−」ケモカインの記述は、「−Ｃ」ケモカインが「Ｃ−Ｃ」サブファミリー又は「Ｃ−Ｘ−Ｃ」サブファミリーに存在する４つのシステイン残基のうちの２つを欠いているという点でケモカインの新しいファミリーを表しているように思われる。
【０００４】
ケモカインの「Ｃ−Ｃ」サブファミリーの一員は、マクロファージ炎症タンパク質−１α（「ＭＩＰ−１α」）である。これは、マクロファージ、Ｔ及びＢリンパ球、好中球、及び線維芽細胞などの細胞によって発現される。最近のある研究（Ｋａｒｐｕｓ， Ｗ． Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｎｎｕｎｏｌ． （１９９５）， Ｖｏｌ． １５５， ｐｐ． ５００３−５０１０、を見よ）は、多発性硬化症のマウス実験自己免疫脳脊髄炎（「ＥＡＥ」）モデルにおけるＭＩＰ−１αの役割についての強いｉｎ ｖｉｖｏのコンセプト確証を与えている。多発性硬化症はＴ及びＢリンパ球及びマクロファージに媒介される自己免疫疾患であり、中枢神経系における広範な炎症と白質の脱髄を生ずる。
【０００５】
この研究は、ＭＩＰ−１αに対する抗体が疾患の初発及び再発の発現を防ぎ、中枢神経系への単核細胞の浸潤を防ぐということを示した。抗体による治療はまた、進行している疾患の重篤性を改善することができた。これらの結果から、研究者たちは、ＭＩＰ−１αが多発性硬化症の病因で重要な役割を演じていると結論するに至った。別の研究（Ｇｏｄｉｓｋａ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９９５）， Ｖｏｌ． ５８， ｐｐ． １６７−１７６， を見よ）は、急性ＥＡＥの過程でＳＪＬマウス（ＥＡＥなどのＴｈ１疾患にかかりやすいマウスの系統）の病巣及び脊髄においてＭＩＰ−１αを含むいくつかのケモカインに関するｍＲＮＡのアップレギュレーションを実証した。
【０００６】
ＲＡＮＴＥＳはＣ−Ｃケモカイン・サブファミリーの別のメンバーである（ＲＡＮＴＥＳという名前は、タンパク質とその遺伝子の最初のいくつかの観測された特性と予測された特性の頭文字から導かれた：Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｕｐｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｔ ｃｅｌｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｅｓｕｍｅｄ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ）。多種多様な組織がＭＩＰ−１αと同様のパタンでＲＡＮＴＥＳを発現することが見出された。いくつかの研究から、リウマチ様関節炎の進行時におけるＲＡＮＴＥＳの異常産生を示す証拠が得られている（Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９９３）， Ｖｏｌ． ２６８， ｐｐ． ５８３４−５８３９， 及び、Ｓｎｏｗｄｅｎ， Ｎ． ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ （１９９４）， Ｖｏｌ． ３４３， ｐｐ． ５４７−５４８， を見よ）。
【０００７】
リウマチ様関節炎は慢性炎症疾患で、一部は記憶Ｔリンパ球及び単球の浸潤によって特徴づけられ、これは炎症組織から放出される走化性因子によって媒介されると考えられる。他の研究から、リウマチ様関節炎の病理生理学におけるＲＡＮＴＥＳの役割を示す強い証拠が得られている（Ｂａｒｎｅｓ， Ｄ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． （１９９８）， Ｖｏｌ． １０１， ｐｐ． ２９１０−２９１９， 及びＰｌａｔｅｒ−Ｚｙｂｅｒｋ， Ｃ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｌｅｔｔ． （１９９７）， Ｖｏｌ． ５７， ｐｐ． １１７−１２０， を見よ）。例えば、ラットのアジュバント誘発関節炎（「ＡＩＡ」）モデルでは、ＲＡＮＴＥＳに対する抗体がこの疾患の進展を大きく減少させた。
【０００８】
これらの研究やその他の研究は、多発性硬化症のＥＡＥモデルにおいてＭＩＰ−１αレベルが増加し、リウマチ様関節炎でＲＡＮＴＥＳレベルが増加しているという強い証拠を与えている（例えば、Ｇｌａｂｉｎｓｋｉ， Ａ． Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． （１９９７）， Ｖｏｌ． １５０， ｐｐ． ６１７−６３０； Ｇｌａｂｉｎｓｋｉ， Ａ． Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． （１９９７）， Ｖｏｌ． ２８８， ｐｐ． １８２−１９０； 及び、Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ， Ｒ． Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ． （１９９７）， Ｖｏｌ． ７７， ｐｐ． １７−２６， を見よ）。さらに、上述のように、これらのケモカインは、これらの疾患の病理生理学に関わっている主なタイプの細胞であるＴ細胞及び単球に対する化学誘引剤である。したがって、これらのケモカインのいずれかの活性を阻害する分子はこれらの疾患の治療に有益であり、したがって抗炎症剤として有益であろう。
【０００９】
また、ＲＡＮＴＥＳを器官移植の拒絶反応と結びつける強い証拠も得られている。器官移植の間質への単核細胞の浸潤が急性の細胞拒絶反応の特徴である。この細胞浸潤は主にＴ細胞、マクロファージ、及び好酸球から成る。急性腎同種異系移植片拒絶反応におけるＲＡＮＴＥＳの発現の研究では、ＲＡＮＴＥＳのｍＲＮＡ発現が浸潤する単核細胞及び尿細管上皮細胞で見られ、ＲＡＮＴＥＳ自体は拒絶移植片内部の微小血管の内皮表面に結合していることが見出された（Ｐａｔｔｉｓｏｎ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ （１９９４）， Ｖｏｌ． ３４３， ｐｐ． ２０９−２１１，及び、Ｗｉｅｄｅｒｍａｎｎ， Ｃ． Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． （１９９３）， Ｖｏｌ． ３， ｐｐ． ７３５−７３９， を見よ）。
【００１０】
ある最近の研究（Ｐａｔｔｉｓｏｎ， Ｊ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｈｅａｒｔ Ｌｕｎｇ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ． （１９９６）， Ｖｏｌ． １５， ｐｐ． １１９４−１１９９， を見よ）は、ＲＡＮＴＥＳが移植片のアテローム硬化にある役割を演ずる可能性を示唆している。正常な冠状動脈に比べてアテローム硬化が加速している動脈の単球細胞、筋繊維芽細胞、及び内皮細胞でＲＡＮＴＥＳのレベルの増加が、ｍＲＮＡとタンパク質の両方で、検出された。
【００１１】
ＲＡＮＴＥＳは、ケモカイン・レセプターＣＣＲ１とＣＣＲ５のリガンドであるから、循環する単核細胞上にあるこれらのレセプターは移植生物学における有用な治療ターゲットになるかもしれない。ＣＣＲ１遺伝子に標的の欠失を有するマウスの心臓移植モデルでＣＣＲ１レセプターの重要性が調べられた（Ｇａｏ， Ｗ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． （２０００）， Ｖｏｌ． １０５， ｐｐ． ３５−４４）。この研究で、同種異系移植片生存の４つの別々のモデルがＣＣＲ１（−／−）レシピエントによる有意な長期化を示した。あるモデルでは、ＣＣＲ１（＋／＋）マウスではわずかな効果しかなかったサイクロスポリンＡのレベルがＣＣＲ１（−／−）レシピエントでは恒久的な同種異系移植片の受容をもたらした。
【００１２】
最近、ある種の小さな分子がＲＡＮＴＥＳ及びＭＩＰ−１αの活性を阻害することによって非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質となり、したがって、抗炎症剤として有用であることが示された。ＰＣＴ公開特許出願ＷＯ９８／５６７７１、米国特許出願ＮＯ．０９／０９４，３９７（１９９８年６月９日出願）現在の米国特許第６，２０７，６６５号（２００１年３月２７日交付）、Ｈｅｓｓｅｌｇｅｓｓｅｒ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９９８）， Ｖｏｌ． ２７３， ｐｐ． １５６８７−１５６９２， Ｎｇ， Ｈ． Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． （１９９９）， Ｖｏｌ． ４２， ｐｐ． ４６８０−４６９４， Ｌｉａｎｇ， Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． （２０００ａ）， Ｖｏｌ． ３８９， ｐｐ． ４１−４９， 及び、Ｌｉａｎｇ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （２０００ｂ）， Ｖｏｌ． ２７５， ｐｐ． １９０００−１９００８，を見よ。これらの特許出願及び学術雑誌論文の記載は全体が参照によって本明細書に取り込まれる。
【００１３】
サイクロスポリン類は、菌類Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ ｉｎｆｌａｔｕｍ Ｇａｍｓならびに他の不完全菌類によって産生される中性脂質親和性サイクリック・オリゴペプチド（１１量体）のファミリーである。主な成分はサイクロスポリンＡであり、これはＴ細胞の活性化をブロックすることによって適応免疫応答を選択的に阻害する周知の、市販されている免疫抑制剤である（Ｋａｈａｎ， Ｂ． Ｄ． Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． （１９８９）， Ｖｏｌ． ３２１， ｐｐ． １７２５−１７３８， 及び、Ｖａｌａｎｔｉｎｅ， Ｈ．， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ． Ｐｒｏｃ． （２０００）， Ｖｏｌ． ３２， ｐｐ． ２７Ｓ−４４Ｓ， を見よ）。
【００１４】
サイクロスポリンＡは器官移植の成功における決定的な因子であるが、腎毒性、高血圧、真性糖尿病、及び移植後リンパ球増殖疾患など、サイクロスポリンＡに基づく免疫抑制と直接関連する長期的安全性に関する大きな問題が残っている。したがって、腎毒性がない量のサイクロスポリンＡを投与して望ましくない副作用を減らし、同時に慢性的な拒絶反応（心臓移植の場合、主に加速的な動脈硬化として現れる慢性同種異系移植片脈管病理として知られる）を避けるために必要な免疫抑制活性を維持できることが望ましい。
【００１５】
関連開示
ある最近の腎移植研究では、ペプチド・ケモカイン・レセプター拮抗物質Ｍｅｔ−ＲＡＮＴＥＳは、低量のサイクロスポリンＡといっしょに投与したとき、主に浸潤する単球の数を減らすことによって、間質の炎症を含め腎の傷害を著しく減少させた（Ｇｒｏｎｅ， Ｈ． Ｊ． ｅｔ ａｌ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ． （１９９９）， Ｖｏｌ． １３， ｐｐ． １３７１−１３８３）。この研究は、ＲＡＮＴＥＳが、単核細胞上の特異的ケモカイン・レセプターを活性化することによって同種異系移植片の拒絶反応で重要な役割を演ずるという理論を裏付ける。
【００１６】
公開欧州特許出願１０００６２６（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、移植された器官、組織、又は細胞の拒絶反応を治療又は防止するために、ペプチド・ケモカイン・レセプター拮抗物質、Ｍｅｔ−ＲＡＮＴＥＳ、をサイクロスポリンと一緒に使用するやり方を開示している。
【００１７】
発明の要約
本発明は、哺乳類における心臓移植の拒絶反応の治療に有用な薬剤組成物に向けられたものであり、この組成物は１又は複数の薬理的に受容できる賦形剤、治療的に有効な量の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質、及び腎毒性が生じない量のサイクロスポリンＡを含む。特に、本発明は哺乳類における移植の拒絶反応の治療に有用な薬剤組成物に向けられたものであり、この組成物は１又は複数の薬理的に受容できる賦形剤、腎毒性が生じない量のサイクロスポリンＡ、及び治療的に有効な量の、米国特許第６，２０７，６６５号に開示された化合物から選択された非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質を含む。
【００１８】
本発明はまた、哺乳類における心臓移植の拒絶反応の治療に有用な薬剤組成物をそれを必要とする哺乳類に投与する方法に向けられており、この組成物は１又は複数の薬理的に受容できる賦形剤、治療的に有効な量の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質、及び腎毒性が生じない量のサイクロスポリンＡを含む。特に、本発明は、哺乳類における心臓移植の拒絶反応の治療に有用な薬剤組成物をそれを必要とする哺乳類に投与する方法に向けられており、この組成物は１又は複数の薬理的に受容できる賦形剤、腎毒性が生じない量のサイクロスポリンＡ、及び治療的に有効な量の、米国特許第６，２０７，６６５号に開示された化合物から選択された非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質を含む。
【００１９】
本発明はまた、哺乳類における心臓移植の拒絶反応を治療する方法に向けられており、この方法は、１又は複数の薬理的に受容できる賦形剤、治療的に有効な量の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質、及び腎毒性が生じない量のサイクロスポリンＡを含む薬剤組成物をそれを必要とする哺乳類に投与するステップを含む。特に、本発明は、哺乳類における心臓移植の拒絶反応を治療する方法に向けられており、この方法は、１又は複数の薬理的に受容できる賦形剤、腎毒性が生じない量のサイクロスポリンＡ、及び治療的に有効な量の、米国特許第６，２０７，６６５号に開示された化合物から選択された非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質を含む薬剤組成物をそれを必要とする哺乳類に投与するステップを含む。
【００２０】
発明の詳細な説明
Ａ．  定義
本明細書及び添付された特許請求の範囲で用いられる場合、別に指定されない限り、以下の用語は次に記す意味を有する：
「アミノカルボニル」は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２ラジカルを指す。
「フェニル」は、ヒドロキシ、ハロ、アルキル、ハロアルキル、アルコキシ、アルケニル、ニトロ、シアノ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルカルボニル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、及びアミノカルボニルから成る群から選択された１又は複数の置換基によって任意に置換されたベンゼン・ラジカルを指す。
【００２１】
「薬理的に受容できる塩」は、酸及び塩基付加塩の両方を含む。
「薬理的に受容できる酸付加塩」は、遊離塩基の生物学的有効性と性質を保持し、生物学的にも他の形でも望ましくないものではなく、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、などの無機酸、及び酢酸、プロピオン酸、ピルビン酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、などの有機酸、で形成される塩を指す。
【００２２】
「薬理的に受容できる塩基付加塩」は、遊離酸の生物学的有効性と性質を保持し、生物学的にも他の形でも望ましくないものではない塩を指す。これらの塩は遊離酸に無機塩基又は有機塩基を付加して調製される。無機塩基から誘導される塩はナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム塩、などを含むがそれだけに限定されない。好ましい無機塩はアンモニウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、及びマグネシウム塩、である。有機塩基から誘導される塩には次のようなものの塩があるが、それだけに限定されない：第一級、第二級、及び第三級アミン、天然に見られる置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、及び塩基性イオン交換樹脂、例えば、
【００２３】
イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、トリメタミン、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラブアミン、コリン、ベテイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロマイン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、ポリアミン樹脂、などの塩。特に好ましい有機塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、コリン、及びカフェインである。
【００２４】
「ウレイド」は、化学式−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ２のラジカルである。
上の定義及び例から、置換アルキル基を含むラジカルでは、その上の置換はアルキル基のどの炭素で行われても良いことが理解される。
「心臓移植拒絶反応」は、本発明においては、心臓移植の急性又は慢性の手術後の拒絶反応で特徴づけられる疾患状態を指し、以下の状態を含む：初期移植片不全、初期急性拒絶反応、初期全身拒絶反応、及び後期慢性同種異系移植片血管病理（初期と後期は、それぞれ、移植後６ヶ月乃至１年未満とそれを超えるものと定義される）。
【００２５】
「哺乳類」は、ヒト及び家畜化された動物、例えば、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウサギ、などを含む。
「腎毒性が生じない量」は、ヒトにおける心臓移植拒絶反応を治療するのに治療的に有効な量であって、血清クレアチニンの増加、タンパク尿の増加、水分保持の増加、糸球体濾過率の減少、及びナトリウムとカリウム排出の減少、によって特徴づけられる腎毒性という望ましくない副作用と結びつかないサイクロスポリンＡの量を指す。
【００２６】
「同時に」とは、単一の調剤の中に２つの活性な成分、すなわち、治療的に有効な量の本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質と腎毒性が生じない量のサイクロスポリンＡ、を１又は複数の薬理的に受容できる賦形剤の存在下で含む薬剤組成物を使用することを指す。
【００２７】
「順次に」とは、本発明の薬剤組成物を、各々が２つの活性な成分、すなわち、治療的に有効な量の本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質と腎毒性が生じない量のサイクロスポリンＡ、の１つを１又は複数の薬理的に受容できる賦形剤と共に含む２つの異なる調剤によって使用することを指す。２つの調剤は、それを必要とする哺乳類に異なる時間に投与される。
【００２８】
本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質は、その構造に不斉炭素原子を有してもよい。したがって、非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質は単一の立体異性体として、ラセミ化合物として、及び鏡像異性体とジアステレオマーの混合物として存在しうる。したがって、これらの単一立体異性体、ラセミ化合物、及びそれらの混合物は全て本発明の範囲内にあるものとされる。非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質内部のいくつかの炭素原子の絶対配置が分かっている場合、それは該当する絶対配置表記Ｒ又はＳで示される。表記「ｔｒａｎｓ」は、Ｒ１ａ置換基がピペラジン平面の反対側にあることを表示するために用いられる。表記「ｃｉｓ」は、Ｒ１ａ置換基がピペラジン平面の同じ側にあることを表示するために用いられる。
【００２９】
ここで用いられる本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質の命名法は、米国特許第６，２０７，６６５号に記載されているように本発明の範囲内にあると考えられる非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質がピペラジン誘導体と呼称されているＩ．Ｕ．Ｐ．Ａ．Ｃ．システムの変形である。
【００３０】
「治療的に有効な量」とは、非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質、好ましくは下に記載されるような化学式（Ｉ）の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質、の量であってそれを必要とする哺乳類、好ましくはヒト、に投与されたときに心臓移植拒絶反応の下で定義されるような治療を実現するに十分な量を指す。「治療的に有効な量」となる本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質の量は、用いる非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質、拒絶反応の深刻さ、及び治療されるヒトの年齢によって異なるが、通常の技能を有する当業者であれば自分の知識と本明細書の開示を考慮して決定することができる。
【００３１】
「治療する」又は「治療」とは、本明細書で用いる場合、哺乳類、好ましくはヒト、における心臓移植拒絶反応の治療を意味し、以下を含む：
（ｉ）拒絶反応が哺乳類、好ましくはヒト、において、特にその哺乳類における心臓移植の前、又は、の後に起こることを防止すること；
（ｉｉ）その状態を阻止する、すなわち、拒絶反応の進展を止めること；又は
（ｉｉｉ ）その状態を緩和する、すなわち、拒絶反応を後退させること。
【００３２】
Ｂ．  好ましい実施の形態
「発明の要約」において上述した薬剤組成物のうち、好ましいグループの薬剤組成物は非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質が次の化学式（Ｉ）から、単一立体異性体又はそれらの混合物として、又は薬理的に受容できるその塩として、選択される化合物である組成物を含む：
【００３３】
【化４】
2004530630.tif 000002
【００３４】
ここで：
Ｒ１ａは、アルキル又はヒドロキシアルキルから成る群から独立に選択される１又は複数の置換基であり；
Ｒ２は、４−位置のフッ素であり；
Ｒ３は、４−位置で塩素によって、２−位置でアミノカルボニル、ウレイド、又はグリシナミドによって置換されたフェニルであり；
Ｒ４は、−Ｏ−であり；
Ｒ５は、メチレンであり；そして
Ｒ６は、−Ｃ（Ｏ）Ｃ−である。
【００３５】
このグループの薬剤組成物のうち、好ましいサブグループの薬剤組成物は非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質が：
（２Ｒ，５Ｓ）−１−（（４−クロロ−２−（アミノカルボニル）フェノキシ）メチル）カルボニル−２，５−ジメチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン；
（ｔｒａｎｓ）−１−（（４−クロロ−２−（グリシナミド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２，５−ジメチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン；
（２Ｒ）−１−（（４−クロロ−２−（ウレイド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２−メチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン；
（ｔｒａｎｓ）−１−（（４−クロロ−２−（ウレイド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２，５−ジメチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン；
（２Ｒ，５Ｓ）−１−（（４−クロロ−２−（ウレイド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２，５−ジメチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン；及び
（２Ｒ，５Ｓ）−１−（（４−クロロ−２−（グリシナミド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２，５−ジメチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン、
から成る群から選択される組成物を含む。
【００３６】
このグループの薬剤組成物のうち、別の好ましいサブグループの薬剤組成物は非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質が（２Ｒ）−１−（（４−クロロ−２−（ウレイド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２−メチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジンである組成物を含む。
このサブグループの薬剤組成物のうち、好ましいクラスの薬剤組成物はそれを必要とする哺乳類がヒトである組成物を含む。
【００３７】
上で「発明の要約」で述べた投与の方法のうち、好ましいグループの方法は、非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質とサイクロスポリンＡがそれを必要とする哺乳類に対して同時に又は順次に投与される方法を含む。
このグループの方法のうち、好ましいサブグループの方法は、非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質が化学式（Ｉ）から、単一立体異性体又はそれらの混合物として、又は薬理的に受容できるその塩として、選択される化合物である方法を含む：
【００３８】
【化５】
2004530630.tif 000003
【００３９】
ここで：
Ｒ１ａは、アルキル又はヒドロキシアルキルから成る群から独立に選択される１又は複数の置換基であり；
Ｒ２は、４−位置のフッ素であり；
Ｒ３は、４−位置で塩素によって、２−位置でアミノカルボニル、ウレイド、又はグリシナミドによって置換されたフェニルであり；
Ｒ４は、−Ｏ−であり；
Ｒ５は、メチレンであり；そして
Ｒ６は、−Ｃ（Ｏ）Ｃ−である。
【００４０】
このサブグループの方法のうち、好ましいクラスの方法は、非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質が：
（２Ｒ，５Ｓ）−１−（（４−クロロ−２−（アミノカルボニル）フェノキシ）メチル）カルボニル−２，５−ジメチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン；
（ｔｒａｎｓ）−１−（（４−クロロ−２−（グリシナミド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２，５−ジメチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン；
（２Ｒ）−１−（（４−クロロ−２−（ウレイド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２−メチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン；
【００４１】
（ｔｒａｎｓ）−１−（（４−クロロ−２−（ウレイド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２，５−ジメチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン；
（２Ｒ，５Ｓ）−１−（（４−クロロ−２−（ウレイド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２，５−ジメチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン；及び
（２Ｒ，５Ｓ）−１−（（４−クロロ−２−（グリシナミド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２，５−ジメチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン、
から成る群から選択されるものを含む。
【００４２】
このサブグループの方法のうち、別の好ましいクラスの方法は、非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質が（２Ｒ）−１−（（４−クロロ−２−（ウレイド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２−メチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジンである方法を含む。
このクラスの方法のうち、好ましいサブクラスの方法は、それを必要とする哺乳類がヒトである方法を含む。
上で「発明の要約」において述べた治療の方法のうち、好ましいグループの方法は、非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質が化学式（Ｉ）から、単一立体異性体又はそれらの混合物として、又は薬理的に受容できるその塩として、選択される化合物である方法を含む：
【００４３】
【化６】
2004530630.tif 000004
【００４４】
ここで：
Ｒ１ａは、アルキル又はヒドロキシアルキルから成る群から独立に選択される１つ以上の置換基であり；
Ｒ２は、４−位置のフッ素であり；
Ｒ３は、４−位置で塩素によって、２−位置でアミノカルボニル、ウレイド、又はグリシナミドによって置換されたフェニルであり；
Ｒ４は、−Ｏ−であり；
Ｒ５は、メチレンであり；そして
Ｒ６は、−Ｃ（Ｏ）Ｃ−である。
【００４５】
このグループの方法のうち、好ましいサブグループの方法は、非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質が：
（２Ｒ，５Ｓ）−１−（（４−クロロ−２−（アミノカルボニル）フェノキシ）メチル）カルボニル−２，５−ジメチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン；
（ｔｒａｎｓ）−１−（（４−クロロ−２−（グリシナミド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２，５−ジメチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン；
【００４６】
（２Ｒ）−１−（（４−クロロ−２−（ウレイド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２−メチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン；
（ｔｒａｎｓ）−１−（（４−クロロ−２−（ウレイド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２，５−ジメチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン；
（２Ｒ，５Ｓ）−１−（（４−クロロ−２−（ウレイド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２，５−ジメチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン；及び
（２Ｒ，５Ｓ）−１−（（４−クロロ−２−（グリシナミド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２，５−ジメチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン
から成る群から選択される方法を含む。
【００４７】
このグループの方法のうち、別の好ましいサブグループの方法は、非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質が（２Ｒ）−１−（（４−クロロ−２−（ウレイド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２−メチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジンである方法を含む。
このサブグループの方法のうち、好ましいクラスの方法は、それを必要とする哺乳類がヒトである方法を含む。
このサブグループの方法のうち、別の好ましいクラスの方法は、非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質とサイクロスポリンＡがそれを必要とする哺乳類に対して同時に又は順次に投与される方法を含む。
【００４８】
Ｃ．  本発明の組成物の有用性
ここに開示される薬剤組成物は、哺乳類、好ましくはヒト、における心臓移植拒絶反応を治療するのに有用である。
サイクロスポリンＡは、移植後の第１年目の移植片不全、急性拒絶反応及び全身拒絶反応を管理するのに非常に有効であることが示されている。しかし、サイクロスポリンＡの長期的な維持での使用は、慢性同種異系移植片の血管病理の管理には有効であるが、腎毒性、高血圧、真性糖尿病、及び移植後リンパ増殖疾患などの副作用と直接結びつく。
【００４９】
ある種のケモカイン又はそのレセプターの活性の阻害が有効である可能性が器官移植の動物モデルで示されている。上述したように、ある最近のラットにおける腎移植研究で、ケモカイン・レセプター拮抗物質Ｍｅｔ−ＲＡＮＴＥＳは、低用量のサイクロスポリンＡと共に投与された場合、主に浸潤する単球の数を減らすことによって間質の炎症などの腎傷害を著しく減少させた（Ｇｒｏｎｅ， Ｈ． Ｊ． ｅｔ ａｌ．， （１９９９），前出）。
【００５０】
別の研究では、ＣＣＲ１レセプターの重要性が、ＣＣＲ１が標的として欠失しているマウスにおける心臓移植モデルで調べられた（Ｇａｏ， Ｗ． ｅｔ ａｌ．， （２０００），前出）。この研究では、同種異系移植片生存の４つの別々のモデルが、ＣＣＲ１（−／−）レシピエントによる有意な長期化を示した。あるモデルでは、ＣＣＲ１（＋／＋）マウスではわずかな効果しかなかったサイクロスポリンＡのレベルがＣＣＲ１（−／−）レシピエントでは恒久的な同種異系移植片の受容をもたらした。
【００５１】
これらの研究に基づくと、ＣＣＲ１レセプターによって作用するケモカインＲＡＮＴＥＳが器官移植において重要な役割を演ずるという強い証拠がある。本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質はＲＡＮＴＥＳの活性を阻害することが示されている。したがって、本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質は器官移植拒絶反応、特に心臓移植拒絶反応、を治療するのに役立つ。
【００５２】
以下でさらに詳しく説明するように、本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質は、サイクロスポリンＡとの組み合わせで、哺乳類における心臓移植拒絶反応の治療に予期されない結果を示した。特に、治療的に有効な量の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質と腎毒性が生じない量のサイクロスポリンＡの組み合わせは、サイクロスポリンＡの望ましくない腎毒性作用なしに心臓移植拒絶反応を治療できることをはっきりと示している。
【００５３】
Ｄ．  本発明の化合物の試験
本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質がＣＣＲ１レセプターによって作用するケモカインＭＩＰ−１α又はＲＡＮＴＥＳの活性を阻害するということを示すために、上で記載したいくつかのｉｎ ｖｉｔｒｏ分析を用いることができる。例えば、米国特許第６，２０７，６６５号、及びＨｅｓｓｅｌｇｅｓｓｅｒ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， （１９９８）， 前出、Ｎｇ， Ｈ． Ｐ． ｅｔ ａｌ．， （１９９９）， 前出、Ｌｉａｎｇ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， （２０００ａ）， 前出、及びＬｉａｎｇ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， （２０００ｂ）， 前出、を見よ。
【００５４】
米国特許第６，２０７，６６５号で開示された非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質、すなわち、（２Ｒ）−１−（（４−クロロ−２−（ウレイド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２−メチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン、とラットＣＣＲ１レセプターとの結合は実施例１に記載されるｉｎ ｖｉｔｒｏ結合分析によって調べられた。その結果は図１に示されている。変位結合研究のスキャッチャード分析は、この非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質の結合性が１２１±６０ｎＭであること（図１を見よ）を明らかにした。すなわち、ヒトのＣＣＲ１レセプター（Ｋｊ＝１ｎＭ）に比べてラットＣＣＲ１レセプターでは約１００倍も効果が小さい。さらに、この非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質は、同じようなＫｊのラットＣＣＲ１レセプターから放射性標識されたＲＡＮＴＥＳを競合的に変位させることができた。
【００５５】
以下で実施例２と図２に記述されるカルシウム流量分析を行うことによって、この同じ非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質はラットＣＣＲ１レセプターの機能的ｉｎ ｖｉｔｒｏ拮抗物質であることが示された。５０ｎＭのＭＩＰ−１αによって誘発される細胞内Ｃａ２＋＋ 濃度の一時的上昇は、ラットＣＣＲ１レセプター発現細胞を１００ｎＭの非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質（図２の「化合物」）と共に前培養することによって阻害された。これらのデータは、この非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質が、ヒトのＣＣＲ１レセプターに比べてラットＣＣＲ１レセプターに対して阻害物質としての効力は低いが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ でのラットＣＣＲ１レセプターとの結合に関しては効果的に競合することができ、効力ある機能的な拮抗物質であることをはっきりと示した。
【００５６】
以下で実施例３と図３で記述されるように、本発明のある非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質について薬物動力学研究がラットで行われた。この非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質を皮下投与してから１，４，及び７日後のピーク血漿レベルは１２から２７μＭの間で変動した（図３）。吸収は比較的速く、顕著な血漿レベルが薬剤への曝露の１５ 分後に観測された。８ 時間後の薬剤の血漿レベルは約１ 乃至２ μＭであった。
【００５７】
血漿半減期は２ から３ 時間の間であった。反復される皮下投与によって非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質のクリアランス又は蓄積が強められるパタンはないように思われたが、測定されたすべての日に薬剤吸収の速さと度合いにかなりの変動が見られた。これらの研究によって、本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質を１ 日３ 回５０ ｍｇ／ｋｇで皮下投与すると２４時間にわたって十分な薬剤レベルが得られるということが示された。
【００５８】
哺乳類の心臓移植拒絶反応の治療における本発明の薬剤組成物の有用性を実証するために用いることができるｉｎ ｖｉｖｏ分析は、ラット異所心臓移植拒絶反応モデルである（例えば、Ｎｉｓｃｏ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９９４）， Ｖｏｌ． １５２， ｐｐ． ３７８６−３７９２， ａｎｄ Ｏｎｏ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｔｈｏｒａｃ． Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｓｕｒｇ． （１９６９）， Ｖｏｌ． ５７， ｐｐ． ２２５−２２９， を見よ）。本発明の薬剤組成物は、以下の実施例４で記述されるｉｎ ｖｉｖｏ 分析でテストされた。その結果は図４に示されている。この分析で、同種異系移植片の生存時間の増加は、ドナーＡＣＩ移植片を与えられたレシピエントＬｅｗｉｓラットの心臓移植拒絶反応の減少に対応する。
【００５９】
非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質、すなわち、（２Ｒ）−１−（（４−クロロ−２−（ウレイド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２−メチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン（図４の「化合物」）、だけを溶剤で与えられた動物の平均の同種異系移植片生存時間は、８．８±１．２日であったが、これに対して溶剤処理された動物（図４の「対照」）では６．８±０．８日であった。本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質で治療された動物の平均同種異系移植片生存時間は、対照群の生存時間に対して０．０５レベルで統計的に有意であった。生存テストの対数順位分析では、対照と比較した非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質を受けた動物に関してｐ＝０．００４８という値が得られた。
【００６０】
治療的に有効な量の本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質、すなわち、（２Ｒ）−１−（（４−クロロ−２−（ウレイド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２−メチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン、と腎毒性が低い量（２．５ｍｇ／ｋｇ）のサイクロスポリンＡによって動物を治療した分析が行われた。２．５ｍｇ／ｋｇのサイクロスポリンＡだけを与えられた動物（図４の「Ｃｓ２．５」）の平均同種異系移植片生存時間は７．３ ± ０．５ 日であったが、これに対して同じプロトコルでさらに非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質によって治療された動物（図４の「Ｃｓ２．５＋化合物」）ではそれが１７．５ ± ５．９ 日であった。
【００６１】
治療的な量、１０ｍｇ／ｋｇ、のサイクロスポリンＡを与えられた動物（図４の「Ｃｓ１０」）の平均同種異系移植片生存時間は１２．９ ± ０．７ 日であったが、これに対して同じプロトコルでさらに非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質によって治療された動物（図４の「Ｃｓ１０＋化合物」）ではそれが１８．４ ± ５．４ 日であった。２．５又は１０ｍｇ／ｋｇのサイクロスポリンＡプラス非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質で治療された動物の平均生存時間は、２．５又は１０ ｍｇ／ｋｇのサイクロスポリンＡだけで治療された動物の平均生存時間に対して、それぞれｐ＝０．０００９ 及び ｐ＝０．０１４８ で統計的に有意であった。
【００６２】
以下で実施例５と図５で記述される浸潤する単球についての光学顕微鏡観察と免疫組織検査はこれらの生存データを裏付けた。移植から３日後、上述したような本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質とサイクロスポリンＡを組み合わせた治療によって（図５の「化合物−サイクロスポリンＡ」）、拒絶反応スコアは顕著に減少した。免疫抑制されない移植では、密な単核の浸潤巣が観測された。多くの心筋細胞が空胞化するか壊死していた。組織内の浮腫が目立っていた。サイクロスポリンＡで治療されたラットでは、炎症細胞の浸潤物は減少したが、依然としてはっきり認められ、特に心筋細胞が巣状に壊死した細静脈のまわりではっきり認められた。
【００６３】
非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質だけで治療されたラットは、巣状の単核細胞浸潤物を示し、それは免疫抑制されない移植片で見られるものと同様な形態で目立っていた。非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質とサイクロスポリンＡの両方で治療された動物は、心臓形態が良く保存され、単核細胞の浸潤はまばらであった。免疫抑制されない移植片では密な単核細胞の浸潤物の多くの細胞は心筋細胞と密接にくっついた単球／マクロファージであった。サイクロスポリンＡで治療されたラットでは、炎症を起こしている細胞浸潤は主にＥＤ−１陽性細胞で構成されていた。
【００６４】
非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質で治療された動物では、単核細胞の浸潤は著しく変動していた：細静脈のまわりにあまり濃くない単球の浸潤区域が見られた。非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質とサイクロスポリンＡを組み合わせた治療は、同種異系のラット心臓への単球／マクロファージの浸潤の劇的な減少をもたらした。これらの研究からのデータによれば、サイクロスポリンＡと組み合わせて投与された本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質は、非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質又はサイクロスポリンＡだけの場合と比べて、心臓移植における効力にはっきりした相乗効果による増加をもたらした。
【００６５】
非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質とサイクロスポリンＡの組み合わせは、心臓移植の生存率にはっきりした相乗効果による増加をもたらしたが、認められた効果は、薬剤の組み合わせの相乗作用というよりも、薬／薬相互作用で血中サイクロスポリンＡレベルが安定したことによるものである可能性が残っていた。以下で実施例６と図６に記述されるように、本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質、すなわち、（２Ｒ）−１−（（４−クロロ−２−（ウレイド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２−メチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン、が存在しないとき又は存在するときのラットにおけるサイクロスポリンＡの血中レベルを測定する薬理動力学研究が行われた。
【００６６】
時間−濃度曲線を見ると、非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質で治療されたラット（図６の「化合物」）でサイクロスポリンＡの血中半減期がわずかに長くなっているように思われた。しかし、対にしたグループの統計的解析は、計算された２つのパラメータの間に有意な差は何もないということを示した（ＡＵＣに関するＰ値＝０．２２４、Ｔ１／２に関するＰ値＝ｏ．３１７）。したがって、本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質とサイクロスポリンＡの組み合わせで治療されたラットにおける心臓移植の生存率のはっきりした相乗効果による増加の根拠として、薬／薬相互作用の可能性は排除できる。
【００６７】
同種異系ラット心臓移植片への単球／マクロファージ浸潤の劇的な減少が、少なくとも一部、ＣＣＲ１レセプターによって作用するケモカインの阻害によるものであるかどうかをはっきりさせるためにｉｎ ｖｉｔｒｏ 付着及びローリング分析が行われた。以前の研究は、３０分間外因的なＲＡＮＴＥＳで前培養された後ＲＡＮＴＥＳに結合したＩＬ−１β活性化された内皮細胞への単球細胞の付着が増加することを示していた（Ｇｒｏｎｅ， Ｈ． Ｊ． ｅｔ ａｌ．， 前出）。単離されたヒト血液単球が、増加する量の本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質、すなわち、（２Ｒ）−１−（（４−クロロ−２−（ウレイド）フェノキシ）メチル）カルボニル−２−メチル−４−（４−フルオロベンジル）ピペラジン、によって処理され、微小血管内皮細胞への付着が以下の実施例７と図７に記述されるように行われた。
【００６８】
ＩＬ−１β活性化された微小血管内皮細胞へのＲＡＮＴＥＳに媒介された耐剪断性の付着は、非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質によって用量依存的に阻害された（図７Ａの「化合物」）。単球の制止の逆尺度として用いられる、ローリング相互作用をする又は維持することが認められた単球のパーセンテージも、非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質によって用量依存的に阻害された（図７Ａの「化合物」）。これらのデータは、動物の心臓移植拒絶反応の治療において本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質とサイクロスポリンＡの組み合わせが真の相乗効果を発揮しているという考えを強く裏付ける。
【００６９】
Ｅ．  本発明の組成物の投与
本発明の薬剤組成物の投与は、任意の受容される投与モード又は同様の用途に使われる物質を用いて行うことができる。すなわち、投与は、例えば、経口的に、経鼻的に、非経口的に、局所的に、経皮的に、又は肛門によって、固形、半固形、凍結乾燥粉末、の形、又は液体投薬の形態で、例えば錠剤、座薬、ピル、ソフト弾性及びハード・ゼラチン・カプセル、粉末、溶液、懸濁液、又はエアロゾル、などの形で、好ましくは精密投薬の簡単な投与に適した単位投与量形態で、行うことができる。組成物は、通常の製薬的な担体又は賦形剤と、活性物質としての本発明の化合物を含み、さらに、他の医薬物質、製薬物質、担体、アジュバント、等を含むことがある。
【００７０】
一般に、意図する投与モードによって、この薬剤組成物は約１乃至９９重量％の組成物の活性成分、すなわち、非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質又は薬理的に受容できるその塩、及びサイクロスポリンＡ、を含み、９９乃至１重量％の適当な製薬的な賦形剤を含む。好ましくは、組成物は約５乃至７５重量％の活性成分であって、残りが適当な製薬的な賦形剤である。
【００７１】
好ましい投与ルートは、好適な１日の投薬量が定められている経口ルートであり、その量は心臓移植拒絶反応の激しさに応じて調整できる。そのような経口投与では、本発明の薬剤組成物は１又は複数の通常用いられる製薬的な賦形剤を取り込んで、例えば製薬等級のマンニトール、ラクトース、スターチ、ゼラチン化スターチ、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウム・サッカリン、タルカム、セルロース・エーテル誘導体、グルコース、ゼラチン、蔗糖、クエン酸、没食子酸プロピル、などによって形成される。そのような組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、粉末、持続放出性調剤、などの形を取る。
【００７２】
好ましくは、この薬剤組成物は、カプセル、キャプレット又は錠剤、の形を取り、したがって、ラクトース、蔗糖、リン酸二カルシウム、などの希釈剤；ナトリウム・クロスカルメロースやその誘導体などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑剤；及びスターチ、ガム・アカシア、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、セルロース・エーテル誘導体、などの結合剤、も含む。
本発明の薬剤組成物はまた、例えば、体の中でゆっくり溶解する担体、例えば、ポリオキシエチレングリコールとポリエチレン・グリコール（ＰＥＧ）、例えば、ＰＥＧ１０００（９６％）とＰＥＧ４０００（４％）、に入れた約０．５％乃至約５０％の活性成分を用いて座薬に調合することもできる。
【００７３】
液体の薬剤として投与できる組成物は、例えば、本発明の薬剤組成物（約０．５％乃至約２０％）と任意の製薬アジュバントを担体、例えば、水、食塩水、水性ブドウ糖、グリセリン、エタノール、などに溶解、分散するなどして、溶液又は懸濁液にすることで調製できる。
望むならば、本発明の薬剤組成物はまた、少量の補助物質、例えば、加湿薬や乳化剤、ｐＨ緩衝剤、酸化防止剤、など、例えばクエン酸、ソルビタン・モノローリエート、トリエタノールアミン・オリエート、ブチル化ヒドロキシトルエン、等を含むこともできる。
【００７４】
上述の組成物を調製するのに使用できる実際の方法は公知であるか又は当業者には明らかである；例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄ．， （Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ， １９９０）を見よ。いずれにしても、投与される薬剤組成物は１又は複数の薬理的に受容できる賦形剤、心臓移植拒絶反応の治療のための治療的に有効な量の本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質及び腎毒性が生じない量のサイクロスポリンＡを含む。
【００７５】
本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質、好ましくは化学式（Ｉ）の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質、の治療的に有効な量は、用いる特定の化合物；化合物の代謝安定性と作用の長さ；患者の年齢、体重、一般的健康、性別、及び食事；投与のモードと時間；排出の速さ；拒絶反応プロセスの激しさ；及び治療される宿主；など、いろいろな因子によって異なる。一般に、治療的に有効な１日の投薬量は、１日に体重１ｋｇあたり約１４．３ｍｇの化学式（Ｉ）の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質；好ましくは１日に体重１ｋｇあたり約０．７ｍｇ乃至約１０ｍｇ；最も好ましくは１日に体重１ｋｇあたり約１．４ｍｇ乃至約７．２ｍｇ、である。例えば、７０ｋｇの人に投与する場合、投薬量は１日あたり約１０ｍｇ乃至約１．０ｇの非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質；好ましくは１日あたり約５０ｍｇ乃至約７００ｍｇ、最も好ましくは１日あたり約１００ｍｇ乃至約５００ｍｇ、である。
【００７６】
Ｆ．  本発明の組成物の調製
本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質は、米国特許第６，２０７，６６５号に記載されている方法に従って調製される。
本発明のサイクロスポリン類は、菌類Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ ｉｎｆｌａｔｕｍ Ｇａｍｓならびに他の不完全菌類によって産生される中性脂質親和性サイクリック・ペプチド（１１量体）である。これらは研究用に入手できる。現在、ヒトの器官移植拒絶反応の治療にサイクロスポリンＡの２つの調剤、Ｓａｎｄｉｍｍｕｎｅ（商標）とＮｅｏｒａｌ（商標）、が用いられている。
【００７７】
以下の実施例は、本発明の実施を助けるためのガイドとして提供されるものであり、本発明の範囲を限定することを意図していない。
実施例１．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ 分析
非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質のｉｎ ｖｉｔｒｏ 結合分析
この分析は、本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質、好ましくは化学式（Ｉ）の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質、のラットＣＣＲ１レセプターとの結合に関する結合性を実証する。
【００７８】
反応物質と溶液：
ケモカイン：      ＭＩＰ−１αとＲＡＮＴＥＳ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）
細胞：            ラット末梢血液の単核細胞（ＰＢＭＣ）がＬｅｗｉｓラットの全血からＡｃｃｕ−Ｐａｑｕｅ ＴＭ（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ．）の密度勾配遠心分離によって単離された。
リガンド：        Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ からの１２５Ｉ−ＭＩＰ−１αと１２５Ｉ−ＲＡＮＴＥＳ（比放射能は２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、２５μＣｉ／バイアル）が１ ｍＬ のＨ２Ｏ中で再構成された。
分析緩衝液：      １３０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｎＣｌ２、５０ｍＭのＴｒｉｓ、３０μｇ／ｍｌのバシトラシン、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ ７．４
【００７９】
洗浄緩衝液：      リン酸緩衝液（ＰＢＳ）
本発明の化合物：  化合物のストック溶液は１００％ＤＭＳＯ中で１ｍＭであった。分析における最高濃度は１０μＭであったが、化合物の効力によって変えられる。最高濃度からの１：３系列の希釈が分析緩衝液によって行われた。普通、各化合物の６つの濃度をスクリーニングして投与量カーブを生成し、それからＫｊ値を決定した。
【００８０】
分析手順：
分析は９６ウエルＶ型底部マイクロタイタ・プレートで全体積１００μＬで行われた。
ラットＰＢＭＣはＰＢＳで１回洗浄し、分析緩衝液に約０．２乃至１．０×１０６細胞／ｍＬに再懸濁させた。細胞はいろいろな濃度の標識されないＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳ、又は化合物の存在下又は不在下で４℃で３０分間１２５Ｉ−ＭＩＰ−１α又は１２５Ｉ−ＲＡＮＴＥＳと共に培養された。
【００８１】
反応は、細胞懸濁液からアリクオットを取り出し、Ｈｅｓｓｅｌｇｅｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９８）， 前出、に記載されているようにシリコン／パラフィン・オイル混合物を通した遠心分離によって緩衝液から細胞を分離することで終結された。
非特異的結合は、１００ｎＭ又は１μＭの標識されないＭＩＰ−１α又はＲＡＮＴＥＳの存在下で決定された。分析における化合物の濃度は、普通、１：３希釈で１０μＭから３０ｎＭまでであり、もっと効力の強い化合物の濃度は効力に応じてもっと低かった。
【００８２】
計算：
６つの濃度点による各化合物の投与量カーブが生成され、コンピュータ・プログラムＩＧＯＲ （Ｗａｖｅｍｅｔｒｉｃｓ）によって結合データをカーブにあてはめて結合性と部位の数を決定した。
本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質は、この分析でテストしたとき、ラットＣＣＲ１レセプターと結合するその結合性をはっきりと示した。
【００８３】
実施例２．Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ 分析：カルシウム流量
非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質の機能的ｉｎ ｖｉｔｒｏ 分析
ＣＣＲ１ レセプターは、そのリガンド、ＭＩＰ−１αとＲＡＮＴＥＳ、の結合に対して細胞内遊離カルシウムを可動化して応答するので、蛍光染料Ｆｕｒａ−２を用いるカルシウム流量分析によって生物的活性を測ることができる。以下の分析では、本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質がこの生物的活性をブロックする能力が測定された。
【００８４】
プロトコル：
１）  ラットＰＢＭＣ が実施例１で記述されたように単離され、遠心法でペレット化され、Ｈａｎｋｓ Ｃａ２＋ （５０ ｍＬ Ｈａｎｋｓ， １．０ ｍＬ １Ｍ Ｈｅｐｅｓ， １．６ ｍＬ ５００ ｍＭ ＣａＣｌ２， ｐＨ ７．４）に再懸濁された。細胞はこの媒質で２回洗浄された。
２）  細胞は媒質に、最終濃度１．２５ μＭのＦｕｒａ−２ ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）（ストック溶液は５０μＬのＤＭＳＯに５０μｇのＦｕｒａ−２ を溶解して調製された）の存在下で密度１ × １０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ で再懸濁された。
【００８５】
３）  細胞は３７℃で３０分間いろいろな濃度の本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質の存在下又は不在下で培養された。細胞は、上述のように遠心法で洗浄されてＦｕｒａ−２が除去された。細胞は１ × １０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ で再懸濁された。次に、細胞はキュベットに一定量（２．０ ｍＬ）が取り分けられ，ＰＴＩ Ｄｅｌｔａｓｃａｎ Ｍｏｄｅｌ ４０００ 蛍光分光計に入れられた。細胞は５０ ｎＭ ＭＩＰ−１α（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）によって刺激され、Ｃａ２＋ の放出が蛍光分光計によって時間の関数として測定された。
【００８６】
４）  データは、１００ μＬの０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ を加えて（最大値に関して）、次に１００ μＬ の５００ ｍＭ ＥＧＴＡ； ｐＨ ８．５ によって（最小値に関して）放出されるｎＭ Ｃａ２＋ について補正された。
本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質は、この分析でテストしたとき、ラットＣＣＲ１ レセプターへのＭＩＰ−１αの結合に応答するＣａ２＋ 可動化を阻害する能力をはっきりと示した。
【００８７】
実施例３．Ｉｎ Ｖｉｖｏ 分析
Ｌｅｗｉｓ ラットにおける薬理動力学研究
体重が２００から２５０ｇの成熟した雄の、ＳＰＦ Ｌｅｗｉｓ （ＲＴ１ｌ）ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ， Ｂｏｓｔｏｎ）がこの研究で使用された。
４０％ サイクロデキストリンの溶液が、１リットルの無菌プラスチックびんにサイクロデキストリン（４００ｇ， Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えて調製された。緩衝されない塩化ナトリウムと塩化カリウムだけを含む塩水が加えられ、混合物を振とうし一晩攪拌して溶解させた。
【００８８】
塩水を加えて、全体積を１ リットルにした。溶液は０．４５ μｍ のフィルターで濾過して無菌ボトルに入れ、ラベルを付けて４℃で貯蔵した。サイクロデキストリン中の２５ ｍｇ／ｍｌ の化合物の溶液が、塩水中４０％のサイクロデキストリンに化合物を溶解して調製された。混合物を振とうし、次に２５０ μＬの濃塩酸を加えた。混合物を攪拌して溶解させた。溶解の完了後（１時間）、溶液のｐＨ を測定し、１ Ｍ ＫＯＨ を加えてｐＨ を４．５ に上げた。溶液は０．４５ μｍ のフィルターで濾過して４℃で貯蔵した。
【００８９】
本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質は４０％サイクロデキストリン／塩水の溶剤で調製され、ラットは７日間皮下投与された（１日３回５０ ｍｇ／ｋｇ）。血液サンプルはＥＤＴＡを含むチューブで心臓穿刺によっていろいろな時間に集められ、遠心分離され、血漿を凍結貯蔵して、後に薬剤レベルを分析した。
血漿サンプルは、ＵＶ 検出法を用いるＨＰＬＣ 又はＨＰＬＣ−ＭＳ（陽イオン・モードで動作するエレクトロ・スプレー・モード）によって分析された。本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質の濃度は、血漿で作成し同一の条件で分析された校正カーブによって決定された。これらの分析では、関連化合物が内部標準として用いられた。
【００９０】
ＨＰＬＣ−ＵＶ 法
１）  １００ μＬ アリクオットの血漿サンプルを、一定量の内部標準を含む２００ μＬ の氷温酸性メタノール（１％ 酢酸）に加え、良く攪拌した。
２）  生じたタンパク質析出を５０００ × ｇ の遠心分離で取り除き、上澄みを集めた。
３）  平行して、対照血漿サンプルをいろいろな量の、普通０．３ から２５ μＭ の範囲の本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質でスパイク（ｓｐｉｋｅ）し、上のように処理した。
４）  上澄みを真空蒸発器で蒸発・乾燥させ、１：２ メタノール：水（０．１％ ＴＦＡ を含む）で再構成し、３０秒攪拌し、遠心分離で沈澱を除去した。
【００９１】
５）  得られた上澄みをＹＭＣ ＡＱ ＯＤＳ 逆相カラムに注入し、勾配ＨＰＬＣ 条件の下で１ ｍＬ／分という低い流量で分析した。ＵＶ 検出器は２３０ ｎｍ にセットされた。
６）  勾配条件は次の通りであった：最初、溶媒Ａ ２２％ 溶媒Ｂ ７８％； ２分、溶媒Ａ ２２％ 溶媒Ｂ ７８％； ３３分、溶媒Ａ ４５％ 溶媒Ｂ ５５％； ３７分、溶媒Ａ ８０％ 溶媒Ｂ ２０％； ４７分、溶媒Ａ ８０％ 溶媒Ｂ ２０％； ４９分、最初の条件に戻る。
７）  内部標準のピークと化合物の間のピーク面積比を、標準曲線の濃度範囲にわたって計算し、この比を用いて校正曲線を作成した。問題の化合物の濃度は、化合物と内部標準のピークのピーク面積比を計算することによってこの曲線から求めた。
【００９２】
ＨＰＬＣ−ＭＳ 法
１）  用いた方法は上で述べたと同様であるが、ただしサンプル調製はメタノール析出段階でストップし、勾配法の代わりにｓｈｏｒｔ ｉｓｏｃｒａｔｉｃ 法を用いた。
２）  ＦＩＳＯＮＳ ＶＧ Ｐｌａｔｆｏｒｍ 単一四重極装置をエレクトロ・スプレー入口を３．５７ ｋＶ にして用いた。ＹＭＣ ＡＱ ＯＤＳ 逆相カラムを１ ｍＬ／分という流量で用い、全体は２１４ ｎｍ のＵＶ 検出器へ流れた。
３）  流れを分けて５０ μＬ／分を質量分析器へ流入させた。クロマトグラムはサンプルあたりの全ランタイム７．５ 分にわたって５０ μＬをカラムに注入して集めた。イオンは単一イオン正電離モードで集めた。
４）  測定は、イオン電流の下の面積を積分し（対照本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質及び内部標準）、上述のように校正曲線を生成素ｒことによって行った。
本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質は、この分析によってテストしたとき、２４ 時間にわたってラット血漿中で十分な薬剤レベルをはっきりと示した。
【００９３】
実施例４．Ｉｎ Ｖｉｖｏ 分析
異所心臓移植拒絶反応（Ｌｅｗｉｓ ｏｒ ＡＣＩ ラット）
この研究では、体重が２００ 乃至２５０ ｇ の成熟した雄のＳＰＦ ＡＣＩ （ＲＴ１ａ）ラットとＬｅｗｉｓ （ＲＴ１ｌ） ラットが、それぞれ、ドナー及びレシピエントとして用いられた。Ｏｎｏ ａｎｄ Ｌｉｎｄｓａｙ （Ｏｎｏ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， （１９６９）， 前出）の方法の変形（Ｎｉｓｃｏ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．， （１９９４）， 前出）を用いて、血管系がある心臓同種異系移植片が異所的にレシピエント・ラットの腹部に移植された。ドナーの心臓の上行大動脈からレシピエントの腹部大動脈へ、そしてドナーの肺動脈からレシピエントの下大静脈へ、ドナーの静脈と肺静脈を結紮した後、端−側面吻合が行われた。腹部の同種異系移植片は毎日触診して移植片の機能を評価し、触診できる心室収縮が停止したときに拒絶反応は完全であると見なした。
【００９４】
ＡＣＩ ラットの心臓同種異系移植片が、レシピエントのＬｅｗｉｓ ラットの腹部に移植され、この動物には以下のいずれかが与えられた：４０％ サイクロデキストリンｓ．ｃ． を１日３回；４０％ サイクロデキストリンｓ．ｃ． に５０ ｍｇ／ｋｇ の本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質を１日３回；栄養によってオリーブ・オイル中サイクロスポリンＡ１０ ｍｇ／ｋｇ を１日１回４ 日間；栄養によってオリーブ・オイル中サイクロスポリンＡ２．５ ｍｇ／ｋｇ を１日１回研究期間の間；栄養によってオリーブ・オイル中サイクロスポリンＡ１０ ｍｇ／ｋｇ を１日１回４ 日間プラス４０％ サイクロデキストリンｓ．ｃ． に５０ ｍｇ／ｋｇ の本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質を１日３回；又は、栄養によってオリーブ・オイル中サイクロスポリンＡ２．５ ｍｇ／ｋｇ を１日１回研究期間の間プラス４０％ サイクロデキストリンｓ．ｃ． に５０ ｍｇ／ｋｇ の本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質を１日３回。移植された心臓は、研究期間の間、毎日拒絶反応の徴候が評価された。
本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質は、この分析でテストしたとき、サイクロスポリンＡと組み合わせて与えられた場合心臓移植片の生存時間を顕著に延ばすことができる能力をはっきりと示した。
【００９５】
実施例５．Ｉｎ Ｖｉｖｏ 分析
組織学、免疫組織化学、及び形態学
移植された心臓が深麻酔の下で取り出され、速やかに血液を吸い取り、重量を測り、組織学及び免疫組織化学検査に必要な処理を行った。器官は、１−ｍｍ の薄片に切り、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ ７．３５ （ＰＢＳ： ９９ ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４， １０８ ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４， と ２４８ ｍＭ ＮａＣｌ）中４％ ホルムアルデヒド中で２４ 時間浸漬固定、又はメタカーン（ｍｅｔｈａｃａｒｎ）中８ 時間固定してパラフィンに包埋した。光学顕微鏡検査を、ｐｅｒｉｏｄｉｃ ａｃｉｄ−Ｓｃｈｉｆｆ 又はＧｏｌｄｎｅｒ−Ｅｌａｓｔｉｃａ で染色した３ μｍ 切片について行った。光学顕微鏡検査は移植から３ 日後の同種異系心臓移植片について行った。
【００９６】
ＥＤ１ モノクローナル抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ／Ｃａｍｏｎ）をメタカーン固定しパラフィン包埋した組織で用いてラット単球／マクロファージ細胞を染色した。アルカリ・ホスファターゼ抗アルカリ・ホスファターゼ検出システムを用いて視覚化した（Ｄａｋｏ）。同種異系心臓移植片のＥＤ−１ 陽性単球／マクロファージの免疫組織学検査のためのこの染色は移植から３ 日後に行われた。
【００９７】
ラットの同種異系心臓移植片における組織病理的な拒絶反応はＢｉｌｌｉｎｇｈａｍ （Ｂｉｌｌｉｎｇｈａｍ， Ｍ． Ｅ． Ｉｎ： Ｃａｒｄｉａｃ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， ｐｐ． １３３−１５２， Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ， Ｂｏｓｔｏｎ， １９９０）に従って等級付けされた。弱い急性拒絶反応（スコア：１）は、まばらな間質性浸潤がしばしば血管周縁スペースで目立つということで特徴づけられる。中程度の急性拒絶反応（スコア：２）は、中程度に密な心筋細胞周縁の単核細胞浸潤であって心筋細胞の一部が壊死していることで特徴づけられる。強い急性拒絶反応（スコア：３）は、密な単球浸潤で心筋細胞が巣状に出血し置換しており壁内動脈にときどき内皮炎症が見られるのが特徴である。拒絶反応スコアが全ての組織ブロックについて計算され、拒絶反応プロセスが巣状になるのに応じて移植された心臓のいろいろなブロックから平均スコアが計算された。
【００９８】
本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質は、この分析でテストしたとき、サイクロスポリンＡと組み合わせて与えられた場合、拒絶反応スコア及び単球の移植片浸潤を顕著に減少させた。
【００９９】
実施例６．Ｉｎ Ｖｉｖｏ 分析
ラットにおける血中サイクロスポリンＡレベル
Ｌｅｗｉｓ カニューレ挿入ラット（グループあたり６匹）に、オリーブ・オイルで希釈されたサイクロスポリンＡ（Ｎｅｏｒａｌ Ｏｒａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ， Ｓａｎｄｏｚ， Ｅａｓｔ Ｈａｎｎｏｖｅｒ， ＮＪ）２．５ ｍｇ／ｋｇ の単一投与、又は同じサイクロスポリンＡの単一投与に続いて４０％ サイクロデキストリン中の本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質５０ ｍｇ／ｋｇ を１ 日３ 回ｓ．ｃ．注射、のどちらかが与えられた。投薬後いろいろな時刻にＥＤＴＡ を凝固防止剤として用いて全血が集められた。
【０１００】
血漿サイクロスポリンＡレベルがＣｙｃｌｏ−Ｔｒａｃ ＳＰ−Ｗｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ ｋｉｔ （ＤｉａＳｏｒｉｎ， Ｓｔｉｌｌｗａｔｅｒ， ＭＮ）を用い、基本的にメーカーの支持に従って測定された。分析の前にメタノール抽出ステップが、標準、対照、及びサンプルについて行われた。メタノール抽出物はＩ１２５−標識されたサイクロスポリン・トレーサーと結びつけられた。サイクロスポリンＡに対して特異的なマウス・モノクローナル抗体とロバ抗マウス抗体の混合物が単一の試薬として加えられた。１ 時間の培養の後、チューブを遠心分離し、デカントし、カウントした。ペレットの放射能はサンプル中のサイクロスポリンＡの濃度に逆比例した。
【０１０１】
４−パラメータのロジスティック・カーブ適合プログラムを用いて結合の程度を濃度の対数に対してプロットすることによって校正曲線が得られた。サイクロスポリンＡ濃度は標準のカーブから内挿された。
本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質は、この分析でテストしたとき、ラットの全血におけるサイクロスポリンの排出半減期にあまり影響を及ぼさなかった。
【０１０２】
実施例７．Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ 分析：単球の付着とローリング
非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質の機能的ｉｎ ｖｉｔｒｏ 分析
本質的に（Ｇｒｏｎｅ， Ｈ． Ｊ． ｅｔ ａｌ．， （１９９９）， 前出、及び Ｗｅｂｅｒ， Ｋ． Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９９９）， Ｖｏｌ． ２９， ｐｐ． ７００−７１２）に記述されているような層流分析によって単球と内皮の相互作用が調べられた。ヒトの真皮微小血管内皮細胞がペトリ皿でコンフルエンスまで育成され、１０ ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１βで１２ 時間刺激されるか、又は未処理で残された。研究の前に、細胞は１０ ｎｇ／ｍｌ の ＲＡＮＴＥＳ で３０ 分間前培養された。プレートは、平行壁フロー・チャンバの下方の壁として組み立てられ、２０× 及び４０× 位相差対物レンズを備えたＯｌｙｍｐｕｓ ＩＭＴ−２ 倒立顕微鏡のステージに載置された。
【０１０３】
ヒト血液の単球はＮｙｃｏｄｅｎｚ 高浸透圧勾配遠心分離によって単離され、分析緩衝液（１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ， ０．５％ ＨＳＡ， ｐＨ ７．４）に５ × １０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ に再懸濁された。分析の少し前に、Ｍｇ２＋ とＣａ２＋ の濃度が１ｍＭ に調整された。細胞懸濁液は、分析の間３７ ℃の加熱ブロックに保たれ、フロー・チャンバへ１．５ ｄｙｎ／ｃｍ２の速さで５ 分間潅流された。阻害実験では、単球はいろいろな濃度の本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質又はＤＭＳＯ 対照と共に３７℃で１０分間前培養された。しっかりと付着している細胞の数は、少なくとも５つの視野で、長時間積分ＪＶＣ ３ＣＣＤビデオカメラ及びＪＶＣ ＳＲ ９００ Ｅ ビデオレコーダーで記録した画像を分析してカウントされた。結果は、ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２で表された。付着の逆尺度として低剪断でローリングする単球の数が、５分間の最後の３０秒で評価され、分析された視野内の全相互作用のパーセンテージで表された。
【０１０４】
本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質は、この分析でテストしたとき、活性化された内皮細胞への単球の付着を阻害し、ローリングを行う又は続ける単球のパーセンテージを増加させた。
【０１０５】
実施例８．
この実施例は、経口投与のための代表的な本発明の薬剤組成物の調製を例示する：
Ａ．  成分 ％ ｗｔ．／ｗｔ．
活性成分                        ２０．０％
ラクトース                      ７９．５％
ステアリン酸マグネシウム        ０．５％
上記成分を混合し、各１００ ｍｇ を含む堅い外皮のゼラチン・カプセルに調剤する。１カプセルがほぼ１日の全投与量になる。
【０１０６】
Ｂ．  成分 ％ ｗｔ．／ｗｔ．
活性成分                        ２０．０％
ステアリン酸マグネシウム        ０．９％
スターチ                        ８．６％
ラクトース                      ６９．６％
ＰＶＰ （ポリビニルピロリドン）    ０．９％
ステアリン酸マグネシウムを除く上記成分を合体させて造粒液体として水を用いて顆粒にする。調合したものを乾燥し、ステアリン酸マグネシウムと混合し、適当な錠剤成形機で錠剤に形成する。
【０１０７】
Ｃ．  成分
活性成分                        ０．１ ｇ
プロピレン・グリコール          ２０．０ ｇ
ポリエチレン・グリコール４００    ２０．０ ｇ
ポリソルベート８０                １．０ ｇ
水                              ｑ．ｓ． １００ ｍＬ
活性成分がプロピレン・グリコール、ポリエチレン・グリコール４００、ポリソルベート８０ に溶解される。次に十分な量の水を加えて攪拌して溶液１００ ｍＬ とし、それを濾過してびんに詰める。
【０１０８】
Ｄ．  成分 ％ ｗｔ．／ｗｔ．
活性成分                        ２０．０％
ピーナッツ・オイル              ７８．０％
Ｓｐａｎ ６０                         ２．０％
上記成分を溶かし、混合し、ソフト弾性カプセルに充填する。
【０１０９】
Ｅ．  成分 ％ ｗｔ．／ｗｔ．
活性成分                        １．０％
メチル又はカルボキシメチル・セルロース  ２．０％
０．９％ 食塩水                     ｑ．ｓ． １００ ｍＬ
活性成分をセルロース／食塩水溶液に溶かし、濾過し、びん詰めにして使用する。
【０１１０】
実施例９．
この実施例は、非経口投与のための代表的な本発明の薬剤組成物の調製を例示する：
成分
活性成分                        ０．０２ ｇ
プロピレン・グリコール          ２０．０ ｇ
ポリエチレン・グリコール４００    ２０．０ ｇ
ポリソルベート８０                １．０ ｇ
０．９％ 食塩水                     ｑ．ｓ． １００ ｍＬ
活性成分がプロピレン・グリコール、ポリエチレン・グリコール４００、ポリソルベート８０ に溶解される。次に十分な量の０．９％ 食塩水を加えて攪拌してＩ． Ｖ．溶液１００ ｍＬ とし、これを０．２ μｍ の膜フィルターで濾過して無菌条件で包装する。
【０１１１】
実施例１０．
この実施例は、座薬の形態の代表的な本発明の薬剤組成物の調製を例示する：
成分 ％ ｗｔ．／ｗｔ．
活性成分                        １．０％
ポリエチレン・グリコール１０００    ７４．５％
ポリエチレン・グリコール４０００    ２４．５％
成分が一緒に溶かされ、スチーム・バスで混合され、全重量２．５ ｇ を入れる型に注がれる。
【０１１２】
実施例１１．
この実施例は、ガス注入のための代表的な本発明の薬剤組成物の調製を例示する：
成分 ％ｗｔ．／ｗｔ．
微細化された活性成分            １．０％
微細化されたラクトース          ９９．０％
成分は粉砕され、混合され、投薬ポンプを備えた注入器にパッケージされる。
【０１１３】
実施例１２．
この実施例は、噴霧器の形態での代表的な本発明の薬剤組成物の調製を例示する：
成分 ％ｗｔ．／ｗｔ．
活性成分                        ０．００５％
水                              ８９．９９５％
エタノール                      １０．０００％
活性成分はエタノールに溶解され、水と混合される。次に、調合したものは投薬ポンプを備えた噴霧器にパッケージされる。
【０１１４】
実施例１３．
この実施例は、エアロゾルの形態での代表的な本発明の薬剤組成物の調製を例示する：
成分 ％ｗｔ．／ｗｔ．
活性成分                        ０．１０％
噴射剤１１／１２                    ９８．９０％
オレイン酸                      １．００％
活性成分はオレイン酸と噴射剤に分散される。得られた混合物は次に計量バルブを取り付けたエアロゾル容器に注入される。
【０１１５】
本発明をその特定の実施形態について説明してきたが、本発明の真の精神と範囲から逸脱することなくいろいろな変更を加えたり、同等物を代替したりできるということは当業者には理解されるであろう。さらに、多くの変更を行って個々の状況、材料、物質の組成、プロセス、プロセスのステップ（単数又は複数）を、本発明の目的、精神、及び範囲に適合させることができる。これらの変更はすべて添付された特許請求の範囲内にあるように意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質がラットＣＣＲ１発現細胞と放射性標識されたＭＩＰ−１αの結合に及ぼす効果を示す。
【図２】
図２は、本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質がラットＣＣＲ１発現細胞におけるＭＩＰ−１αに誘発される細胞内Ｃａ２＋の上昇に及ぼす効果を示す。
【図３】
図３は、ラットにおける長期皮下投与の後の本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質の血漿濃度を示す。
【図４】
図４は、本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質とサイクロスポリンＡの組み合わせがラットにおける同種異系心臓移植の生存に及ぼす効果を示す。
【図５】
図５は、本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質とサイクロスポリンＡの組み合わせが同種異系心臓移植を受けてから３日後のラットの拒絶反応スコアに及ぼす効果を示す。
【図６】
図６は、本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質がラットにおけるサイクロスポリンＡの血漿レベルに及ぼす効果を示す。
【図７】
図７は、本発明の非ペプチドＣＣＲ１レセプター拮抗物質が活性化された内皮細胞への単球の付着に及ぼす効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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