(57)【要約】約０．００１％から約１０％のレチノイドを含む第一組成物；約０．０００１％から約５０％の少なくとも１つのレチノイドブースターを含む第二組成物；第一組成物を収容する第一区画であって、第一組成物が酸素と接触しないようにしておく区画；および第二組成物を収容する第二区画であって、第一区画と第二区画とが互いに接合されている区画から成る安定なスキンケア製品。【特許請求の範囲】
【請求項１】
約０．００１％から約１０％のレチノイドを含む第一組成物；
約０．０００１％から約５０％の少なくとも１つのレチノイドブースターを含む第二組成物；
第一組成物を収容する第一区画；および
第二組成物を収容する第二区画
から成り、
第一区画が第一組成物を酸素と接触しないようにしており、
第一区画と第二区画とが互いに接合されている
ことを特徴とする安定なスキンケア製品。
【請求項２】
第二組成物が、少なくとも２つのレチノイドブースターを、約０．０００１％から約５０％の量で含有することを特徴とする請求項１に記載の安定なスキンケア製品。
【請求項３】
レチノイドが第一効果を与え、レチノイドブースターが第一効果を高めることを特徴とする請求項１または２に記載の安定なスキンケア製品。
【請求項４】
第一区画がアルミニウム層を含むことを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の安定なスキンケア製品。
【請求項５】
第二区画が、第二組成物を酸素と接触しないようにしておくことを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の安定なスキンケア製品。
【請求項６】
第二区画がアルミニウム層を含むことを特徴とする請求項５に記載の安定なスキンケア製品。
【請求項７】
皮膚のコンディショニング方法であって、請求項１から６のいずれか一項に記載の製品を皮膚に局所的に塗布することを含む方法。
【請求項８】
皮膚に対するレチノイン酸効果の模倣方法であって、請求項１から６のいずれか一項に記載の製品を皮膚に塗布することを含む方法。
【請求項９】
皮膚のコンディショニングのための医薬品の製造における請求項１から６のいずれか一項に記載の安定なスキンケア製品の使用。
【請求項１０】
皮膚のコンディショニングのための請求項１から６のいずれか一項に記載の安定なスキンケア製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２区画パッケージにレチノイドとレチノイドブースター系とを含有する安定なスキンケア組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
レチノイド（例えばレチノールおよびレチニルエステル）は、化粧品に用いられる通常の成分である。レチノール（ビタミンＡ）は、人体に自然発生する内生化合物であり、正常な上皮細胞分化にとって必須である。天然および合成ビタミンＡ誘導体は、多様な皮膚障害の治療に広範囲に用いられており、皮膚の修復または再生剤として用いられてきた。レチノイン酸は、多様な皮膚の状態、例えばにきび、小じわ、乾癬、加齢斑、および変色を処理するために用いられて来た。例えばＶａｈｌｑｕｉｓｔ，Ａ．ら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．第９４巻、Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｄ．Ｂ．およびＣｕｎｌｉｆｆｅ、Ｗ．Ｊ．（１９９０）、４９６〜４９８ページ、Ｅｌｌｉｓ，Ｃ．Ｎ．ら、「皮膚におけるレチノールの薬理学（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｔｉｎｏｌｓ  ｉｎ  Ｓｋｉｎ）」、Ｂａｓｅｌ、Ｋａｒｇｅｒ、第３巻、（１９８９）、２４９〜２５２ページ、およびＰＣＴ特許出願第ＷＯ９３／１９７４３号参照。
【０００３】
しかしながらレチノールは、化粧品配合物中では特に不安定であるが、その理由は、レチノールが、酸化、熱不安定性、およびＵＶ誘発分解を含む多くの要因の結果として化学分解を受けることがあるからである。レチニルエステルも、レチノールよりも小さい程度であるが、これらの不安定性の影響を受けやすい。
【０００４】
皮膚へのレチノイドの効果は、レチノイドブースター分子の同時使用によって向上させることができる。しかしながらレチノイドブースター分子の全部ではなくてもその多くは、レチノールの不安定性も増す。したがってレチノイドとレチノイドブースター分子との両方を含む効果的なスキンケア組成物を有するために、レチノイドを単独で含む配合物に必要とされる程度よりも高い程度まで、ブースターを含むレチノイド配合物を保護する必要がある。
【０００５】
したがって単にレチノイドの安定性のみならず、レチノイド効果を高める活性物質の存在下におけるレチノイドの安定性についても問題がある。化粧品組成物におけるレチノイド安定性の問題を解決しようとするいくつかの方法が、先行技術に存在する。例えば組成物を供給するための多区画系は、本発明の譲受人に発行された米国特許第５，９１４，１１６号に記載されている。特にこの特許は、１つの区画にレチノイドが入っており、第二区画に第二効果を与える第二活性物質が入っている、二重皮膚効果を与えるための２つの異なる皮膚活性物質を分離するための２つの分かれた容器について記載している。
【０００６】
ジョンソン・アンド・ジョンソン社（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ）に譲渡された米国特許第５，９７６，５５５号は、レチノイド、乳化剤系、および共乳化剤を含む水中油型エマルジョンを含むスキンケア組成物を開示している。この特許は、この組成物が酸素と接触しないように組成物を保存するための容器の使用について記載している。この容器は、乳化剤系と共乳化剤のみを有するレチノイド組成物への使用のために記載されており、レチノイドブースターとの接触による分解からレチノイドを保護していない。
【０００７】
ロレアル社（Ｌ’Ｏｒｅａｌ）に譲渡された米国特許第５，８００，５９６号は、酸素またはＵＶ光に対して不浸透性の障壁と酸素捕捉装置とを有する調剤装置におけるレチノールを含む油中水型エマルジョンを開示している。この特許は、ブースターの使用、およびブースターの存在下におけるレチノイド安定性に関連した問題について教示も示唆もしていない。
【０００８】
上記の引例のいずれも、活性物質を強化するレチノイドの存在下におけるレチノイド組成物を安定化する必要性について、教示も示唆もしていない。したがって、二重目的の単一配合物化粧品が先行技術において開発されてはいるが、単独の、ならびにレチノイドブースターの存在下におけるレチノイド安定性の現存する問題を軽減する安定化粧品組成物に対するニーズが依然として存在する。
【０００９】
本発明は、下記の：
約０．００１％から約１０％のレチノイドを含む第一組成物；
約０．０００１％から約５０％の少なくとも１つのレチノイドブースターを含む第二組成物；
第一組成物を収容する第一区画であって、第一組成物が酸素と接触しないようにしておく区画；および
第二組成物を収容する第二区画であって、第一区画と第二区画とが互いに接合されている区画、
から成る安定なスキンケア製品を提供する。
【００１０】
本発明の組成物は、好ましい成分としてレチノイドを含んでいる。これは、レチニルエステル、レチノール、レチナール、およびレチノイン酸から選ばれ、好ましくはレチノールまたはレニチルエステルである。「レチノール」という用語には、レチノールの下記の異性体が含まれる。すなわち、オール−トランス−レチノール、１３−シス−レチノール、１１−シス−レチノール、９−シス−レチノール、３，４−ジデヒドロ−レチノール、３，４−ジデヒドロ−１３−シス−レチノール、３，４−ジデヒドロ−１１−シス−レチノール、３，４−ジデヒドロ−９−シス−レチノールである。好ましい異性体は、オール−トランス−レチノール、１３−シス−レチノール、３，４−ジデヒドロ−レチノール、９−シス−レチノールである。最も好ましくは、その幅広い商業的入手性によってオール−トランス−レチノールである。
【００１１】
レチニルエステルは、レチノールのエステルである。「レチノール」という用語は上に規定されている。本発明における使用に適しているレチニルエステルは、レチノールのＣ１〜Ｃ３０エステル、好ましくはＣ２〜Ｃ２０エステル、最も好ましくはＣ２、Ｃ３、およびＣ１６エステルであるが、その理由は、これらがさらに普通に入手しうるからである。レチニルエステルの例には次のものが含まれるが、これらに限定されるわけではない。すなわち、レチニルパルミテート、レチニルホルメート、レチニルアセテート、レチニルプロピオネート、レチニルブチレート、レチニルバレレート、レチニルイソバレレート、レチニルヘキサノエート、レチニルヘプタノエート、レチニルオクタノエート、レチニルノナノエート、レチニルデカノエート、レチニルウンデカノエート、レチニルラウレート、レチニルトリデカノエート、レチニルミリステート、レチニルペンタデカノエート、レチニルヘプタデカノエート、レチニルステアレート、レチニルイソステアレート、レチニルノナデカノエート、レチニルアラキドネート、レチニルベヘネート、レチニルリノレエート、レチニルオレエートである。
【００１２】
本発明に用いるのに好ましいエステルは、レチニルパルミテート、レチニルアセテート、およびレチニルプロピオネートから選ばれるが、その理由は、これらが最も商業的入手性が高く、したがって最も安価だからである。レチニルリノレエートおよびレチニルオレエートも、これらの有効性によって好ましい。
【００１３】
レチノールまたはレチニルエステルは、本発明の組成物において、第一組成物中に約０．００１％から約１０％、好ましくは約０．０１％から約１％の量で、最も好ましくは約０．０１％から約０．５％の量で用いられる。
【００１４】
レチノイドは、下記チャート１に記載されたメカニズムにしたがって、皮膚中で酵素的にレチノイン酸に転換されると考えられる。
【００１５】
【表１】
2004522729.tif 000002
【００１６】
驚くべきことに、あるいくつかの化合物は、ＡＲＡＴ／ＬＲＡＴ、レチナールレダクターゼ、ＣＲＡＢＰＩＩ、およびレチノイン酸酸化（この後者のものは、シトクロムＰ４５０系によって触媒される）を阻害し、一方で、あるいくつかの他の化合物はレチノールデヒドロゲナーゼを増強することが発見された。これらの化合物は集合的に、本明細書において「ブースター」と呼ばれ、上のチャート１に見られるようにグループＢ１からグループＢ５として符号化される。これらのブースターは、単独で、または互いに組合わせて、レチノイン酸への転換に有効なレチノール量を増すことによって、およびレチノイン酸の分解を阻害することによって、レチノイドの作用を増強する。これらのブースターは、レチノイド（例えばレチノール、レチニルエステル、レチナール、レチノイン酸）とともに作用し、後者は皮膚中に内生的に存在する。しかしながらこれらの好ましい組成物は、性能を最適化するために、ブースターと共存してこの組成物中にレチノイドを含有している。
【００１７】
本発明は部分的には、少なくとも１つのブースター化合物を組成物の約０．０００１重量％から約５０重量％、好ましくは約０．００１重量％から１０重量％、最も好ましくは０．００１重量％から約５重量％含む第二組成物であって、この化合物が、１０ｍＭの単独または組合わされた濃度で、生体内トランスグルタミナーゼアッセイにおいて、トランスグルタミナーゼを５０％以上まで阻害する組成物と、化粧品として許容しうるビヒクルとを含んでいる。
【００１８】
本発明の組成物中に含まれているブースターは、下記のものから成る群から選ばれる：
（ａ）２つのブースターであって、どちらもＢ２；Ｂ３；Ｂ４から成る同じ群から選ばれるもの；
（ｂ）下記のものから成る群から選ばれるブースターの二元的組合わせ：
Ｂ１／Ｂ２；Ｂ１／Ｂ３；Ｂ１／Ｂ４；Ｂ１／Ｂ５；Ｂ２／Ｂ３；Ｂ２／Ｂ４；Ｂ２／Ｂ５；Ｂ３／Ｂ４；Ｂ３／Ｂ５；Ｂ４／Ｂ５；
（ｃ）下記のものから成る群から選ばれるブースターの三元的組合わせ：
Ｂ１／Ｂ２／Ｂ３；Ｂ１／Ｂ２／Ｂ４；Ｂ１／Ｂ２／Ｂ５；Ｂ１／Ｂ３／Ｂ４；Ｂ１／Ｂ３／Ｂ５；Ｂ１／Ｂ４／Ｂ５；Ｂ２／Ｂ３／Ｂ４；Ｂ２／Ｂ３／Ｂ５；Ｂ２／Ｂ４／Ｂ５；Ｂ３／Ｂ４／Ｂ５；
（ｄ）下記のものから成る群から選ばれるブースターの四元的組合わせ：
Ｂ１／Ｂ２／Ｂ３／Ｂ４；Ｂ１／Ｂ２／Ｂ３／Ｂ５；Ｂ１／Ｂ２／Ｂ４／Ｂ５；Ｂ１／Ｂ３／Ｂ４／Ｂ５；Ｂ２／Ｂ３／Ｂ４／Ｂ５；および
（ｅ）ブースターの５つのグループの組合わせ：Ｂ１／Ｂ２／Ｂ３／Ｂ４／Ｂ５。
【００１９】
好ましい組成物は、異なる群（すなわち前記群（ｂ）から（ｅ））からの少なくとも１つのブースターを含む。しかしながら、異なる群から選ばれたブースターのあらゆる組合わせはまた、所望の増強効果のために本発明の組成物において用いられてもよい。
【００２０】
本発明にブースターとして含まれる化合物はまず、下記のセクション２．１から２．７に記載されているような特異的酵素に対する試験管内ミクロソームアッセイを、このような化合物が表Ａに挙げられているある濃度において合格する能力に基づいて選ばれる。ついでこの化合物は（単独または別のブースターと組合わせて）、１０ｍＭの個別濃度または組合わされた濃度において、下記の試験管内トランスグルタミナーゼアッセイに付される。このような組合わせが、トランスグルタミナーゼを５０％以上まで阻害するならば、その場合には、これは本発明における使用に適している。ブースターが個別にテストされ、このトランスグルタミナーゼアッセイに合格するならば、その場合には、これはこのトランスグルタミナーゼアッセイに合格する別のブースターまたは組合わせと組合わされてもよい。
【００２１】
本発明による好ましい組成物は、１０ｍＭの個別濃度において、トランスグルタミナーゼを５０％以上まで阻害するブースターの組合わせを含んでいる。
【００２２】
本明細書において用いられている「コンディショニング」という用語は、乾燥肌、にきび、光損傷肌、小じわの外見、加齢斑、老化肌の予防および処理、角質層の柔軟性の増加、肌の色を明るくすること、皮脂分泌の制御、および一般的な肌の品質の向上を意味する。この組成物は、皮膚の落屑および表皮分化を改良するために用いられてもよい。
【００２３】
ブースターは、下記のセクション２．１から２．７に記載されている試験管内ミクロソームアッセイに合格する化合物である。本発明の化合物は、表Ａに挙げられた濃度において阻害するかまたは向上させる。少なくとも表Ａに上げられている幅広い％までの酵素である。
【００２４】
【表２】
2004522729.tif 000003
2004522729.tif 000004
【００２５】
本発明の組成物にこの化合物を含めることの適切さを決定するために用いられた試験管内ミクロソームアッセイは、次のとおりである。
【００２６】
１．材料
オール−トランス−レチノール、オール−トランス−レチノイン酸、パルミトイル−ＣｏＡ、ジラウロイルホスファチジルコリン、ＮＡＤ、およびＮＡＤＰＨは、シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）から購入された。これらのミクロソームアッセイのためのレチノイドの保存溶液は、ＨＰＬＣグレードアセトニトリル中で調製された。ＨＰＬＣ分析用のオールレチノイド標準保存溶液は、エタノール中で調製され、−７０℃においてＮ２雰囲気下に保存され、保存から取り出された時、暗室灯下に氷上に維持された。その他の薬品および阻害剤は、化粧品材料供給業者または化学会社、例えばアルドリッチ社（Ａｌｄｒｉｃｈ）またはインターナショナル・フレーバーズ・アンド・フレグランシーズ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｌａｖｏｒｓ  ａｎｄ  Ｆｒａｇｒａｎｃｅｓ）から商品として入手可能であった。
【００２７】
２．方法
２．１  ＲＰＥミクロソームの単離（Ｊ．Ｃ．Ｓａａｒｉ  ＆  Ｄ．Ｌ．Ｂｒｅｄｂｅｒｇ、「レチナール色素上皮におけるＣｏＡおよび非ＣｏＡ依存性レチノールエステル化（ＣｏＡ  ａｎｄ  Ｎｏｎ−ＣｏＡ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｒｅｔｉｎｏｌ  Ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）」、Ｊ．Ｂｉｌｌ．Ｃｈｅｍ．２６３、８０８４〜８０９０（１９８８）から修正された）。
【００２８】
網膜および房水が除去されている５０個の凍結された二等分ウシ眼球を、米国ネブラスカ州（ＮＥ，ＵＳＡ）、リンカーンのＷ．Ｌ．ローソン社（Ｗ．Ｌ．Ｌａｗｓｏｎ  Ｃｏ．，Ｌｉｎｃｏｌｎ）から入手した。これらの眼を一晩解凍し、着色された虹彩膜を、ピンセットで剥がして除去した。各々の眼球を、絵筆またはゴム冠ポリスマンを用いて、黒い色素細胞をこすって、２×０．５ｍＬの冷たい緩衝液（０．１Ｍ  ＰＯ４／１ｍＭ  ＤＴＴ／０．２５Ｍスクロース、ｐＨ７）で洗浄した。この細胞懸濁液を虹彩膜に添加し、懸濁液を、テフロン攪拌棒を用いてビーカーで数分間攪拌した。懸濁液を、目の粗いフィルター（スペクトラ（Ｓｐｅｃｔｒａ）／Ｐｏｒ  ９２５μ細孔サイズポリエチレンメッシュ）を通して濾過して大きい粒子を除去し、その結果生じた黒く着色された懸濁液を、モーター駆動テフロンホモジナイザーを備えたグラス−コル（Ｇｌａｓ−Ｃｏｌ）を用いて均一化した。この細胞ホモジェネートを、２０，０００ｇで３０分間遠心分離した（１４，０００ＲＰＭにおける２．５×１０ｃｍ管にＳＳ３４ローターを有するソルバール（Ｓｏｒｖａａｌ）モデルＲＣ−５Ｂ遠心分離機）。その結果生じた上澄み液を、１５０，０００ｇにおいて６０分間、さらなる遠心分離に付した（４０，０００ＲＰＭにおける１３×５１ｍｍ管にＳＷ５０．１ローターを有するベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）モデルＬ８０超遠心分離機）。その結果生じたペレットを、ヒート・システムズ・ウルトラソニックス社（Ｈｅａｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．）モデルＷ１８５Ｄソニファイヤー・セル・ディスラプター（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ）を用いて、約５ｍＬ  ０．１Ｍ  ＰＯ４／５ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７緩衝液中に分散し、その結果生じたミクロソーム分散液を、小さい管中にアリコートし、−７０℃で保存した。これらのミクロソームのタンパク質濃度は、ＢＳＡを標準として用い、バイオラッド・ダイ（ＢｉｏＲａｄ  Ｄｙｅ）結合アッセイを用いて測定した。
【００２９】
２．２  ラット肝臓ミクロソームの単離（Ｒ．Ｍａｒｔｉｎｉ  ＆  Ｍ．Ｍｕｒｒａｙ、「ラット肝臓ミクロソームレチノイン酸４−ヒドロキシル化へのＰ４５０  ３Ａ酵素の参加（Ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐ４５０  ３Ａ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎ  Ｒａｔ  Ｈｅｐａｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  Ａｃｉｄ  ４−Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ）」、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３０３、５７−６６（１９９３））。
【００３０】
約６グラムの凍結ラット肝臓（アキュリット・ケミカル・アンド・サイエンティフィック社（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐ．）からのハーラン・スプラーグ・ドーリー（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）ラットから入手したもの）を、ブリンクマン・ポリトロン（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）を用いて、０．１Ｍトリス／０．１Ｍ  ＫＣｌ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／０．２５Ｍスクロース、ｐＨ７．４緩衝液３容積中に均一化した。その結果生じた組織懸濁液を、前記のモーター駆動テフロンホモジナイザーにおいてさらに均一化した。その結果生じたホモジェネートを、１０，０００ｇにおいて３０分間、２０，０００ｇにおいて３０分間、および３０，０００ｇにおいて１５分間連続的に遠心分離し、その結果生じた上澄み液を、１０５，０００ｇにおいて８０分間超遠心分離した。このペレットを前記のように約５ｍＬの０．１Ｍ  ＰＯ４／０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４緩衝液中に超音波処理し、−７０℃でアリコートとして保存した。タンパク質濃度は、前記のように測定した。
【００３１】
２．３  ＡＲＡＴおよびＬＲＡＴ活性についてのアッセイ（Ｂ１を認定するため）
下記手順は、Ｊ．Ｃ．Ｓａａｒｉ  ＆  Ｄ．Ｌ．Ｂｒｅｄｂｅｒｇ、「ウシレチナール色素上皮ミクロソームのＡＲＡＴおよびＬＲＡＴ活性（ＡＲＡＴ  ＆  ＬＲＡＴ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９０、１５６−１６３（１９９０）に記載されている方法の修正方法である。下記緩衝液を調製し、４℃で保存した：０．１Ｍ  ＰＯ４／５ｍＭ  ジチオトレイトール、ｐＨ７．０（ＰＯ４／ＤＴＴ）。アッセイ当日に、緩衝液１ｍＬあたり２ｍｇのＢＳＡを添加して、ＰＯ４／ＤＴＴ／ＢＳＡ使用緩衝液を生じた。１ｍＭレチノール基質を、アセトニトリル中で調製し、窒素ガス下−２０℃でアンバービンに保存した。使用緩衝液（アリコートとして保存されているもの）中の４ｍＭパルミトイル−ＣｏＡの溶液およびエタノール中の４ｍＭジラウロイルホスファチジルコリンの溶液を調製し、−２０℃で保存した。阻害剤は、Ｈ２Ｏ、エタノール、アセトニトリル、またはＤＭＳＯ中の１０ｍＭ保存溶液として調製した。急冷溶液は、５０μｇ／ｍＬブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）を含む純粋エタノールを用いて調製し、５０μｇ／ｍＬ  ＢＨＴを含むヘキサン溶液を、抽出のために用いた。
【００３２】
２ドラムガラスビンに、下記のものを順序よく添加する。５００μＬの総容積を生じるためのＰＯ４／ＤＴＴ／ＢＳＡ緩衝液、５μＬアシルドナー（４ｍＭパルミトイル−ＣｏＡおよび／またはジラウロイルホスファチジルコリン）、５μＬ阻害剤または溶媒ブランク（１０ｍＭ保存溶液またはその他の希釈液）、ついで約１５μｇのＲＰＥミクロソームタンパク質（約１ｍｇ／ｍＬミクロソームタンパク質アリコート約１５μＬ）。３７℃で５分間インキュベートして、反応温度を平衡させ、ついで５μＬの１ｍＭレチノールを添加する。これらのビンに蓋をし、５秒間渦巻き攪拌し、３７℃で３０から９０分間インキュベートする。０．５ｍＬエタノール／ＢＨＴを添加して反応を急冷する。３ｍＬヘキサン／ＢＨＴを添加してレチノイドを抽出し、これらの管を数秒間数回渦巻き攪拌し、これらの管を低速で５分間遠心分離して、これらの層を素早く分離する。上部ヘキサン層をきれいなビンの中に取り出し、前記のように別の３ｍＬヘキサン／ＢＨＴでこの水性層を再抽出する。これらのヘキサン層を組合わせ、加熱されたアルミニウムブロック上で窒素ガス流下、３７℃で乾燥することによってヘキサンを蒸発させる。ＨＰＬＣ分析まで、この乾燥残渣を−２０℃で保存する。下記のようなＨＰＬＣシグナルの統合によって、それぞれＡＲＡＴおよびＬＲＡＴ活性について、レチニルパルミテートおよびレチニルラウレートの量を定量化する。
【００３３】
このインキュベーション溶液が４０μＭアシルドナー、１００μＭまたはそれ以下の阻害剤、１０μＭレチノール、約３０μｇ／ｍＬミクロソームタンパク質、および約０．１Ｍ  ＰＯ４、ｐＨ７／５ｍＭ  ＤＴＴ／２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含むことに注目のこと。レチノールの添加後のすべての工程は、暗闇または暗室灯下で実施した。
【００３４】
２．４  レチノールデヒドロゲナーゼ活性についてのアッセイ（Ｂ２を認定するため）
下記の保存溶液を調製した：
５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４緩衝液、滅菌濾過されたもの；
ＤＭＳＯ中１０ｍＭオールトランスレチノール（シグマＲ７６３２）；
滅菌水中２００ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート、ナトリウム塩（ＮＡＤＰ）（シグマＮ０５０５）；
適切な溶媒中４０ｍＭテスト化合物（水、緩衝液、エタノール、クロロホルム、またはＤＭＳＯ）；
５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４緩衝液（４μｇ／μｌ）中ラット肝臓ミクロソームの１：１０希釈液。
【００３５】
ネジ蓋を備えた２ドラムガラスビンに、下記のものを順序よく添加する：
４００μｌの最終容積を生じるための緩衝液；
２５μｌ希釈ミクロソーム（最終＝１００μｇ）−対照のための煮沸したミクロソームを用い、テストサンプルのために通常のミクロソームを用いる；
２００ｍＭ  ＮＡＤＰ  ４μｌ（最終＝２ｍＭ）；
４０ｍＭテスト化合物１μｌ（最終＝１００μＭ）；
１０ｍＭレチノール８μｌ（最終＝２００μＭ）。
【００３６】
３７℃振とう水浴中で４５分間ガラスビンをインキュベートする。各ガラスビンに、５００μｌの氷冷エタノールを添加し、反応を急冷する。レチノイドを氷冷ヘキサンで２回抽出する（１抽出あたり２．７ｍｌ）。第一抽出の間、各サンプルにおける抽出効率を監視する手段として、各々のガラスビンにレチニルアセテート（９００μＭ保存溶液５μｌ）を添加する。サンプルを１０秒間渦巻き攪拌し、その後ベックマンＧＳ−６Ｒ遠心分離機において、１０００ｒｐｍ、５℃で５分間静かに遠心分離した。レチノイドを含む上部ヘキサン層は、きれいな２ドラムガラスビンへの各々の抽出後、水性層から除去する。静かな窒素ガス流下、ヘキサンを蒸発除去する。ＨＰＬＣ分析まで乾燥残渣を−２０℃で保存する。
【００３７】
２．５  レチナールレダクターゼ活性についてのアッセイ（Ｂ３を認定するため）
すべての保存溶液は、下記のような置換えを行なって前記のように調製した：
ＤＭＳＯ中１０ｍＭオールトランスレチナルデヒド（シグマＲ２５００）−レチノールの代わりに；
２００ｍＭ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート、還元形態、滅菌水中四ナトリウム塩（ＮＡＤＰＨ）（シグマＮ７５０５）−ＮＡＤＰの代わりに。
【００３８】
ネジ蓋を備えた２ドラムガラスビンに、下記のものを順序よく添加する：
４００μｌの最終容積を生じるための緩衝液；
２５μｌ希釈ミクロソーム（最終＝１００μｇ）−対照のための煮沸したミクロソームを用い、テストサンプルのために通常のミクロソームを用いる；
２００ｍＭ  ＮＡＤＰＨ  ４μｌ（最終＝２ｍＭ）；
４０ｍＭテスト化合物１μｌ（最終＝１００μＭ）；
１０ｍＭレチナルデヒド３μｌ（最終＝７５μＭ）。
【００３９】
上に詳細に記載されたものと同じインキュベーションおよび抽出手順にしたがう。
【００４０】
２．６  ＣＲＡＢＰＩＩアンタゴニストについてのアッセイ（Ｂ４を認定するため）
２．６．１．ＣＲＡＢＰＩＩの合成
ａ．発現系
遺伝子ＣＲＡＢＰＩＩを、ｐＥＴ２９ａ−ｃ（＋）プラスミド（ノバゲン社（Ｎｏｖａｇｅｎ））中でクローンした。このクローン遺伝子は、強力なバクテリオファージＴ７転写および翻訳シグナルの制御下にあった。Ｔ７ポリメラーゼ源は、ホスト細胞Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ノバゲン社）によって供給された。この後者のものは、ＩＰＴＧの存在によって誘発された、ｌａｃＵＶ５制御下にあるＴ７ポリメラーゼの染色体コピーを有する。このプラスミドは、製造業者のプロトコル（ノバゲン社）にしたがった形質転換によって、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞に転移された。
【００４１】
ｂ．誘発
これらの形質転換細胞の一晩培養物を、５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含む２ｘＹＴ中に１：１００希釈した。これらの細胞は、６００ｎｍにおけるＯＤが０．６から０．８に達するまで、３７℃において振とうしながら培養させた。ついでＩＰＴＧを、１ｍＭの最終濃度まで添加し、この培養物を、さらに２時間インキュベートした。これらの細胞は、室温において１０分間５０００ｇで遠心分離によって採集した。このペレットを−２０℃で保存した。
【００４２】
２．６．２．精製
精製は、Ｎｏｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ｌｉ、１９９７に記載されている方法にしたがって実施した。
【００４３】
ａ．溶解
この凍結ペレットを室温で解凍し、新たに調製された溶解緩衝液（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、１０％（ｗ／ｖ）スクロース、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）ナトリウムアジド、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、２．５ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、２．５ｍＭベンズアミジン、６μｇ／ｍＬ  ＤＮａｓｅ）１〜２ペレット容積中に再懸濁した。溶解物を室温で３０分間インキュベートした。それ以上の溶解は、音波処理によって実施した（１０，０００ｐｓｉにおける６回の３０秒バーストと、氷上の５回の３０秒遅延を交互に）。この溶解物の不溶フラクションを、４℃で１時間１５０００ｒｐｍにおける遠心分離によって除去し、上澄み液を−２０℃で保存する。
【００４４】
ｂ．セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ３００上のゲル濾過
工程ａからの上澄み液を、室温においてセファクリルＳ−３００（ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））の２．５×１００ｃｍカラム上に載せた。溶離緩衝液は、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、０．０５％ナトリウムアジドであった（緩衝液Ａ）。流量は２ｍＬ／分であった。回収された２−ｍＬフラクションを、２８０ｎｍにおける紫外線吸光度についてチェックした。ピークを示すフラクションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、ＣＲＡＢＰＩＩの存在について調べた。
【００４５】
ｃ．アニオン交換クロマトグラフィー
ＣＲＡＢＰＩＩを含む２ｍＬのゲル濾過フラクションを、第四アミンアニオン交換カラムＦＰＬＣ（高速タンパク質液体クロマトグラフィー）型モノＱ（ファルマシア社）上に載せた。ＣＲＡＢＰＩＩは、１００％緩衝液Ａから３０％緩衝液Ｂまでの勾配緩衝液（１００％緩衝液Ｂ＝緩衝液Ａ＋２５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を用いて、室温で２０分間にわたって溶離した。１ｍＬフラクションを毎分回収した。もう一度、ＣＲＡＢＰＩＩの存在をＳＤＳ−ＰＡＧＥによってチェックした。ＣＲＡＢＰＩＩを４℃で保存し、その後ガラスビンプラットホームアタッチメント（エドワーズ・ハイ・バキュアム・インターナショナル社（Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｈｉｇｈ  Ｖａｃｕｕｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））を備えたマイクロモデュリョ（Ｍｉｃｒｏｍｏｄｕｌｙｏ）１．５Ｋを用いて凍結乾燥した。これらの乾燥サンプルを、結合アッセイに用いるまで室温で保存した。
【００４６】
ｄ．ＣＲＡＢＰＩＩの存在の検出
ＣＲＡＢＰＩＩの発現および精製は、７％から１５％ポリアクリルアミドゲル（バイオラッド社）上の変性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて確認した。１０μｌのサンプルと、２×負荷緩衝液（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、４％ＳＤＳ、０．２％ＢＰＢ、２０％グリセロール、１ｍＭ  ＤＴＴ）１０μｌとを混合し、加熱（８０℃で２分間）によって変性した。これらのサンプルを、１×トリス−グリシン緩衝液（バイオラッド社）中に浸漬されたゲル上に載せ、定電流（２５ｍＡ）を室温で１時間加えた。クーマシーブルー染色後、タンパク質を、ベンチマーク予備染色タンパク質ラダー（ギブコ社（ＧｉｂｃｏＢＲＬ））を用いて確認された分子量にしたがって同定した。
【００４７】
ウエスタンブロットを用いて、ＣＲＡＢＰＩＩの存在を確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離されたタンパク質を、バイオラッドカセットを用いて、イモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）−Ｐ転移膜（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））上に転移させた。この転移は、１×トリス−グリシン緩衝液（バイオラッド社）＋１０％メタノール中で行なわれた。電流（６０ｍＡ）を３時間加えて、タンパク質をこの膜を通って移動させた。その後、この膜を、室温で１時間１×ＴＢＳ中５％ドライミルクで遮断し、一晩４℃において同じ緩衝液中で、ＣＲＡＢＰＩＩへの一次抗体（マウス抗クローン５−ＣＲＡ−Ｂ３の１／１０００希釈液）でプローブした。翌日、この膜をＰＢＳで洗浄し（３×５分間）、ついで室温で１時間、二次抗体、ペルオキシダーゼ複合抗マウス抗体（ＥＣＬＴＭ、アマーシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ））の１：２０００希釈液でインキュベートした。この膜を１×ＰＢＳで洗浄し（３×５分間）、ＥＣＬ検出キットを用いて、製造業者の指示（アマーシャム社）にしたがってタンパク質を検出した。
【００４８】
精製ＣＲＡＢＰＩＩの濃度は、ＢＳＡキット（ピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ））を用いて測定した。
【００４９】
２．６．３．放射能結合アッセイ
２２０ｐモルのＣＲＡＢＰＩＩを、総容積７０μＬ中に１５ｐモルの放射性オールトランスレチノイン酸（ＮＥＮ）を有する２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．４中でインキュベートした。競合アッセイのために、もう１つの過剰リガンド（６６７０：１、６７０：１、または７０：１）を、このミックスに添加した。反応は、暗闇で室温において１時間行なわれた。結合オールトランスレチノイン酸から未結合オールトランスレチノイン酸を分離するために、６ｋＤカットオフミニクロマトグラフィーカラム（バイオラッド社）を用いた。保存緩衝液を、マイクロプレックス（Ｍｉｃｒｏｐｌｅｘ）マニホールドを用いて、製造業者の指示にしたがって（ファルマシア社）処分した。これらのサンプルをカラム上に載せ、分離は３０分間にわたって重力によって行なわれた。ＣＲＡＢＰＩＩに結合したレチノイン酸（「ＲＡ」）は、濾過物中に現われたが、一方、遊離ＲＡはカラムに残留した。この濾過物の放射能を、シンチレーションカウンターによって測定した。
【００５０】
２．７  ＮＡＤＰＨ依存性レチノイン酸酸化についてのアッセイ（Ｂ５を認定するため）
下記手順は、Ｒ．Ｍａｒｔｉｎｉ  ＆  Ｍ．Ｍｕｒｒａｙ、「ラット肝臓ミクロソームレチノイン酸４−ヒドロキシル化へのｐ４５０  ３Ａ酵素の参加（Ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐ４５０  ３Ａ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎ  Ｒａｔ  Ｈｅｐａｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  Ａｃｉｄ  ４−Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ）」、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３０３、５７−６６（１９９３）に記載されている方法の修正方法である。
【００５１】
下記のアッセイ緩衝液を調製し、４℃で保存する：０．１Ｍ  ＰＯ４／０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４。アッセイ当日、緩衝液中６０ｍＭ  ＮＡＤＰＨ溶液を調製する。阻害剤保存溶液、酸性化エタノール／ＢＨＴ急冷溶液、およびヘキサン／ＢＨＴを上記のように調製する。１ｍＭレチノイン酸使用溶液を、エタノールで１５ｍＭ保存溶液の（ＤＭＳＯ中）希釈によって調製した。
【００５２】
２ドラムガラスビンに、次のものを順序正しく添加する：最終容積５００μＬを生じるためのアッセイ緩衝液、２０μＬ  ６０ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、５μＬの阻害剤または溶媒ブランク、ついで約２ｍｇのラット肝臓ミクロソームタンパク質。
【００５３】
３７℃で５分間インキュベートし、ついで５μＬの１ｍＭレチノイン酸使用溶液を添加する。３７℃で６０分間インキュベーションを続行するが、ガラスビンに蓋をしない。その理由は、酸化プロセスには、ＮＡＤＰＨに加えて分子Ｏ２が必要だからである。酸性化エタノール／ＢＨＴで急冷し、前記のようにヘキサン／ＢＨＴで抽出する。下記のようにＨＰＬＣシグナルの統合によって、急速に溶離する極性レチノイン酸代謝物を定量化する（４−オキソレチノイン酸であると推測される）。
【００５４】
レチノイン酸の添加後のすべての工程は、暗闇あるいは暗室灯下で実施されることに注目のこと。最終インキュベーション溶液は、２．４ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、１００μＭまたはそれ以下の阻害剤、１０μＭレチノイン酸、約４ｍｇ／ｍＬラット肝臓ミクロソームタンパク質、および約０．１Ｍ  ＰＯ４／０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含んでいる。
【００５５】
個々のレチノイドのＨＰＬＣ分析
ＨＰＬＣによるレチノイド定量化のためのサンプルは、１００μＬのメタノールを用いて残渣を各ガラスビン中に溶解して調製した。この溶液を、１ｍＬのシェルガラスビンの中の１５０μＬのガラスの円錐管に移し替え、きっちりと蓋をし、ウオーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）７１５オートサンプラー（Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ）の中に入れた。６０μＬのアリコートを直ちに注入し、レチノイド含量について分析した。
【００５６】
クロマトグラフィー機器は、ウオーターズ６００勾配制御器／ポンプ、ウオーターズ９９６光ダイオードアレイ検出器、およびウオーターズ４７４走査蛍光検出器から成っていた。２つのＨＰＬＣプロトコルを、レチノイド分析のために用いた。ＡＲＡＴおよびＬＲＡＴアッセイの場合、レチノールとレチノールエステルとの分離は、ウオーターズ３．９×３００ｍｍ  Ｃ１８ノバパック（ＮｏｖａＰａｋ）逆相分析カラム、および１０分間、流量１ｍＬ／分に調節された８０：２０（ｖ／ｖ）メタノール／ＴＨＦ無勾配移動相を有するウオーターズ・セントリー（Ｓｅｎｔｒｙ）・ノバパックＣ１８ガードカラムを用いて実施した。この溶出液を、３２５ｎｍにおける吸光度および３２５ｅｘ／４８０ｅｍにおける蛍光について監視した。Ａ．Ｂ．Ｂａｒｕａ、「水溶性化合物：グルクロニドの分析（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｗａｔｅｒ−Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ：Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅｓ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８９、１３６−１４５（１９９０）によって記載された勾配系の修正例を用いて、レチノールおよびレチノイン酸酸化アッセイのためにレチノイド酸とアルコールとを分離するために、より短いウオーターズ３．９×１５０ｍｍ  Ｃ１８ノバパック逆相分析カラムおよびウオーターズ・セントリー・ノバパックＣ１８ガードカラムを用いた。この系は、１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む６８：３２（ｖ／ｖ）メタノール／水から４：１（ｖ／ｖ）メタノール：ジクロロメタンまでの２０分間の直線状勾配、ついで流量１ｍＬ／分における５分間の維持から成っていた。このカラム溶出液を、３００ｎｍから４００ｎｍまで監視した。
【００５７】
これらのプロトコルは、各アッセイにとって適切なレチノイド酸、アルコール、アルデヒド、および／またはエステルを明白に解明する能力、および分離の相対的迅速性に基づいて選ばれた。ＨＰＬＣによる個々のレチノイドの同定は、未知のピークの保持時間と、有用な真正レチノイド標準の保持時間との正確なマッチ、および有用な真正レチノイドに対する未知のピークのＵＶスペクトル分析（３００ｎｍから４００ｎｍ）に基づいていた。
【００５８】
トランスグルタミナーゼアッセイにおけるさらなるテストに適したブースターには、下記表Ｂ１からＢ５に挙げられたブースターが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００５９】
【表３】
2004522729.tif 000005
2004522729.tif 000006
2004522729.tif 000007
2004522729.tif 000008
【００６０】
【表４】
2004522729.tif 000009
【００６１】
【表５】
2004522729.tif 000010
【００６２】
【表６】
2004522729.tif 000011
【００６３】
【表７】
2004522729.tif 000012
【００６４】
ブースターまたはこれらの組合わせは、下記のトランスグルタミナーゼアッセイにおいてトランスグルタミナーゼ（以後「Ｔｇａｓｅ」）を、１０ｍＭの濃度において少なくとも５０％まで阻害する。
【００６５】
【表８】
2004522729.tif 000013
【００６６】
トランスグルタミナーゼアッセイおよびケラチン生成細胞分化
表皮中の末端分化プロセスの間、角質化包膜（ＣＥ）として知られているタンパク質の１５ｎｍ厚さの層が、細胞周辺部の内側表面上に形成される。このＣＥは、多くの別個のタンパク質から構成されており、これらのタンパク質は、表皮中に発現された少なくとも２つの異なるトランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）の作用によって触媒されたＮε−（Ｙ−グルタミル）リシンイソジペプチド結合の形成によって互いに架橋されている。ＴＧａｓｅ  Ｉは、この表皮の分化層、特に顆粒層中に豊富に発現されるが、未分化基底表皮中には存在しない。したがってＴＧａｓｅＩは、さらに分化された状態を示す高いＴＧａｓｅ  Ｉレベルを有する表皮ケラチン生成細胞分化の有用なマーカーである。ＴＧａｓｅ  Ｉ抗体を用いるＥＬＩＳＡベースのＴＧａｓｅ  Ｉアッセイを用いて、下記実施例における培養ケラチン生成細胞の分化の状態を評価した。
【００６７】
ケラチン生成細胞（前記のように培養されたもの）を、２００μｌ培地中１ウエルあたり４，０００から５，０００細胞の密度で、９６ウエルプレート中において培養した。２から３日間のインキュベーション後、または細胞が約５０％密集成長するまで、この培地を、テスト化合物を含む培地に変えた（１テストあたり５つの複製）。これらの細胞をさらに９６時間培養し、その後この培地を吸引し、これらのプレートを−７０℃で保存した。プレートをフリーザーから取り出し、これらの細胞を２００μｌの１×ＰＢＳで２回洗浄した。これらの細胞を、室温（Ｒ／Ｔ）において１時間、ＴＢＳ／５％ＢＳＡ（洗浄緩衝液、ウシ血清アルブミン）でインキュベーションした。次に、ＴＧａｓｅ一次抗体を添加した：洗浄緩衝液中１：２０００希釈した５０μｌのモノクローナル抗−ＴＧａｓｅＩＡｂ  Ｂ．Ｃ．。この一次抗体を３７℃で２時間インキュベートし、ついで洗浄緩衝液で６回濯ぎ洗いを行なった。ついで細胞を、３７℃で２時間、洗浄緩衝液中に１：４，０００希釈された５０μｌの二次抗体（Ｆａｂ断片、アマーシャム社から得られるペルオキシダーゼ複合抗マウスＩｇＧ）でインキュベート、ついで洗浄緩衝液で３回濯ぎ洗いを行なった。洗浄緩衝液での濯ぎ洗いに続いて、これらの細胞をＰＢＳで３回濯ぎ洗いした。比色展開のために、これらの細胞を、暗闇で（アルミニウムホイル下）、室温で正確に５分間、１００μｌ基質溶液（４ｍｇのｏ−フェニレンジアミンおよび１０ｍｌ  ０．１Ｍクエン酸塩緩衝液ｐＨ５．０中３．３μｌ  ３０％  Ｈ２Ｏ２）でインキュベートした。反応は、５０μｌの４Ｎ  Ｈ２ＳＯ４の添加によって停止した。サンプルの吸光度を、９６ウエルプレートＵＶ分光光度計で４９２ｎｍにおいて読取った。５つの複製のうち４つを両方の抗体で処理し、５つ目の複製をＴＧａｓｅバックグラウンド対照として用いた。ＴＧａｓｅレベルを測定し、パーセンテージ対照として表示した。
【００６８】
トランスグルタミナーゼレベルを測定し、前記表のＢ１からＢ５において下記のどちらかとして表示した：
（ｉ）％（ブースター＋レチノール阻害／対照阻害）−％（ＲＯＨ阻害／対照阻害）、これは、レチノール単独よりも優れた、ブースター＋レチノール誘発ＴＧａｓｅ阻害の追加の効果を測定する；あるいは
（ｉｉ）多ブースター濃度の阻害効果が調べられた時のＩＣ５０値として。これは１０−７Ｍの一定のレチノール濃度と組合わせた場合に、ＴＧａｓｅを５０％阻害するブースターの濃度を提供する。
【００６９】
本発明においてベンチマークとして用いられるのはＩＣ５０値である。
【００７０】
【表９】
2004522729.tif 000014
2004522729.tif 000015
【００７１】
２区画パッケージ
上で考察されているように、レチノイドを含む組成物は一般に不安定であり、化学分解を受けることがある。さらには、ブースターはレチノイド効果を向上させるのに有利であるが、驚くべきことに、同時にレチノイドの化学的不安定性にも寄与することが発見された。ブースター誘発のレチノール不安定化は、両方の成分が単一配合物に含まれている時に、高められたレチノイド組成物の全体の有効性を劇的に減少させる。
【００７２】
したがってレチノイド崩壊に対して保護する一方で、なおもレチノイドブースターの有利な効果を与えるために、本発明は、第一区画にレチノイドを含んでいる第一組成物、および第二区画に少なくとも１つのレチノイドブースターを含んでいる第二組成物が入っている２区画パッケージを提供する。第一組成物は皮膚に第一効果を与えるが、一方、第二組成物は、第一効果の作用を高めるかまたは向上させる働きをする。
【００７３】
この２区画パッケージは、２つの別々の容器において第一組成物と第二組成物とを供給するという目的が達成されるかぎり、当業者に知られた様々な方法で設計されていてもよい。１つの実施態様において、この２区画パッケージは、隣接して付着された２つのつぼまたはビンの形態にある。第二実施態様において、この２区画パッケージは、ビン／つぼの内部を第一区画と第二区画とに分けている区域を有する単一のビン／つぼの形態にある。これらの組成物が別々に保持されているかぎり、他の実施態様も本発明の範囲内にあると考えられる。
【００７４】
最小限の酸素浸透性第一区画
上で考察されているように、レチノイド組成物は、酸素の存在下に分解を受けやすい。したがって本発明は、安定化第一組成物を維持するのを助けるために、最小限に酸素浸透性である２区画パッケージの第一区画を提供する。その場合レチノイドを含む第一組成物は、使用者による使用前は酸素と接触しないようにされている。
【００７５】
最小限の酸素浸透性区画は、当業者に知られている多様な方法で構成することができる。具体的には本発明の組成物は、酸素または空気と直接接触状態にあってはならず、酸素がこの包装の外壁を通って漏れ出ないように防ぐべきである。光に対して不透明であり、酸素に対して不浸透性の包装が用いられてもよい。例えばこの包装の壁用として、またはこの包装の内側のライニングとして、アルミニウムが用いられてもよい。
【００７６】
追加の実施態様において、第一区画と第二区画との両方は、第一組成物と第二組成物との両方の分解を軽減するために、最小限に酸素浸透性であるように構成される。
【００７７】
化粧品として許容しうるビヒクル
本発明による製品はまた、この組成物が皮膚に付けられる時にその分配を促進するように、第一組成物と第二組成物とのどちらかまたはその両方において、活性成分用の希釈剤、分散剤、またはキャリヤーとして作用するための、化粧品として許容しうるビヒクルも含んでいる。
【００７８】
水以外のビヒクル、または水に加えてのビヒクルには、液体または固体エモリエント、溶剤、湿潤剤、増粘剤、および粉末を含めることができる。特に好ましい非水性キャリヤーは、ポリジメチルシロキサンおよび／またはポリジメチルフェニルシロキサンである。この発明のシリコーンは、２５℃において約１０センチストークスから１０，０００，０００センチストークスの粘度を有するものであってもよい。特に望ましくは、低粘度シリコーンと高粘度シリコーンとの混合物である。これらのシリコーンは、ジェネラル・エレクトリック社（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ）から商標ビカシル（Ｖｉｃａｓｉｌ）、ＳＥ、およびＳＦとして、ダウ・コーニング社（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）から２００および５５０シリーズとして入手しうる。この発明の組成物に用いることができるシリコーンの量は、この組成物の５重量％から９５重量％、好ましくは２５重量％から９０重量％の範囲にある。
【００７９】
任意皮膚効果物質および化粧品添加剤
本発明の第一組成物および第二組成物のうちのどちらか１つまたは両方において、油中水型エマルジョンあるいは水中油型エマルジョンを供給するための乳化剤とともに、主として、用いられる乳化剤の平均親水性親油性比（ＨＬＢ）に応じて、油または油性物質が存在してもよい。
【００８０】
様々な種類の活性成分が、本発明の第一化粧品組成物および第二化粧品組成物のどちらか１つまたは両方に存在してもよく、これらは下に記載されている。活性物質は、エモリエント以外、および単にこの組成物の物理的特徴を改良する成分以外の、皮膚または毛髪効果剤として規定される。このカテゴリーに限定されるわけではないが、一般的な例には、日焼け止め剤、皮膚を明るくする作用物質、日焼け剤が含まれる。
【００８１】
日焼け止め剤は、紫外線光を遮断するために通常用いられている物質を含む。化合物の例は、ＰＡＢＡ誘導体、シンナメート、およびサリチレートである。例えばオクチルメトキシシンナメートおよび２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン（オキシベンゾンとしても知られている）を用いることができる。オクチルメトキシシンナメートおよび２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノンは、それぞれ商標パーソル（Ｐａｒｓｏｌ）ＭＣＸおよびベンゾフェノン−３という商品として入手しうる。
【００８２】
エマルジョンに用いられる日焼け止め剤の正確な量は、日光のＵＶ放射線から望まれる保護の程度に応じて変えることができる。
【００８３】
もう１つの好ましい任意成分は、必須脂肪酸（ＥＦＡ）、すなわち、すべての細胞の原形質膜形成にとって必須である脂肪酸から選ばれる。ケラチン生成細胞において、ＥＦＡ欠乏は細胞を超増殖性にする。ＥＦＡの補足がこれを補正する。ＥＦＡはまた、表皮の脂質生合成も向上させ、表皮のバリアー形成のための脂質を供給する。これらの必須脂肪酸は好ましくは、リノール酸、Ｙ−リノレン酸、ホモ−Ｙ−リノレン酸、コロンビン酸、エイコサ−（ｎ−６，９，１３）−トリエン酸、アラキドン酸、Ｙ−リノレン酸、チムノドン酸、ヘキサエン酸、およびこれらの混合物から選ばれる。
【００８４】
多くの場合、本発明の化粧品組成物中にエモリエントが組込まれる。このようなエモリエントのレベルは、総組成物の約０．５重量％から約５０重量％、好ましくは約５重量％から３０重量％であってもよい。エモリエントは、例えばエステル、脂肪酸、およびアルコール、ポリオール、および炭化水素などの一般的な化学カテゴリーに分類することができる。
【００８５】
エステルは、モノ−またはジ−エステルであってもよい。脂肪ジ−エステルの許容しうる例には、ジブチルアジペート、ジエチルセバケート、ジイソプロピルジメレート、およびジオクチルスクシネートが含まれる。許容しうる分枝鎖脂肪エステルには、２−エチル−ヘキシルミリステート、イソプロピルステアレート、およびイソステアリルパルミテートが含まれる。許容しうる三塩基性酸エステルには、トリイソプロピルトリリノレエート、およびトリラウリルシトレートが含まれる。許容しうる直鎖脂肪エステルには、ラウリルパルミテート、ミリスチルラクテート、オレイルユルケート（ｅｕｒｃａｔｅ）、およびステアリルオレエートが含まれる。好ましいエステルには、ココカプリレート／カプレート（ココ−カプリレートとココ−カプレートとのブレンド）、プロピレングリコールミリスチルエーテルアセテート、ジイソプロピルアジペート、およびセチルオクタノエートが含まれる。
【００８６】
適切な脂肪アルコールおよび酸には、１０個から２０個の炭素原子を有する化合物が含まれる。特に好ましくは、例えばセチル、ミリスチル、パルミチンアルコールおよびステアリルアルコール、およびパルミチン酸およびステアリル酸である。
【００８７】
エモリエントとしての役目を果たしうるポリアルコールには、直鎖状および分枝鎖状アルキルポリヒドロキシル化合物がある。例えばプロピレングリコール、ソルビトール、およびグリセリンが好ましい。同様に、ポリマーポリオール、例えばポリプロピレングリコールおよびポリエチレングリコールも有用であろう。ブチレンおよびプロピレングリコールも、浸透向上剤として特に好ましい。
【００８８】
エモリエントとしての役目を果たしうる炭化水素の例は、１２個から３０個の炭素原子の炭化水素鎖を有するものである。具体例には、鉱油、石油ゼリー、スクアレン、およびイソパラフィンが含まれる。
【００８９】
本発明の化粧品組成物中の機能成分のもう１つのカテゴリーは、増粘剤である。増粘剤は通常、この組成物の０．１重量％から２０重量％、好ましくは約０．５重量％から１０重量％の量で存在する。増粘剤の例は、Ｂ．Ｆ．グッドリッチ社（Ｂ．Ｆ．Ｇｏｏｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ）から商標カルボポル（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）として入手しうる架橋ポリアクリレート物質である。ガム、例えばキサンタン、カラゲーナン、ゼラチン、カラヤ、ペクチン、およびイナゴマメガムなどを用いることができる。ある一定の条件下、増粘機能はシリコーンまたはエモリエントとしても役立つ物質によって得ることができる。例えば１０センチストークス以上のシリコーンガムおよび例えばグリセロールステアレートなどのエステルは、二重の機能を有する。
【００９０】
本発明の化粧品の第一化粧品組成物および第二化粧品組成物のうちの１つまたは両方に、粉末を組込んでもよい。これらの粉末には、チョーク、タルク、フラー土、カオリン、デンプン、スメクタイト粘土、化学的に変性されたマグネシウムアルミニウムシリケート、有機的に変性されたモンモリロナイト粘土、水和アルミニウムシリケート、ヒュームドシリカ、アルミニウムデンプンオクテニルスクシネート、およびこれらの混合物が含まれる。
【００９１】
その他の添加剤微量成分も同様に、本発明の化粧品の第一組成物および第二組成物のうちの１つまたは両方に組込まれてもよい。これらの成分には、着色剤、乳白剤、および香料が含まれてもよい。これらの物質の量は、この組成物の０．００１重量％から２０重量％までの範囲であってもよい。
【００９２】
本発明の化粧品の第一組成物および第二組成物は主として、ヒトの皮膚への局所使用のための製品として、特に皮膚のコンディショニングおよび平滑化のため、および小じわの寄ったまたは老化した肌の外見を予防または減少させるための作用物質として意図されている。
【００９３】
使用中、少量、例えば１ｍｌから５ｍｌの第一組成物を、適切な容器またはアプリケーターから皮膚の暴露区域に塗布し、ついで必要であればこれを、手または指または適切な器具を用いて皮膚の上に伸ばすか、および／または皮膚の中にすり込む。同時に、少量、例えば１ｍｌから５ｍｌの第二組成物を、適切な容器またはアプリケーターから皮膚の暴露区域に塗布し、必要であればこれも同様に、手または指または適切な器具を用いて皮膚の上に伸ばすか、および／または皮膚の中にすり込む。したがって望まれるトリートメント効果の強度に応じて、第一組成物および第二組成物は、単独で、または同時に、または連続的に用いられてもよい。
【００９４】
製品形態および包装
本発明の外用皮膚トリートメント組成物は、ローション、流動クリーム、クリーム、またはジェルとして配合することができる。
【００９５】
方法
レチノール（トウイーン８０中５０％）を、約５０％水性エタノール中に溶解し、標準９６ウエル分光光度計を用いて９６ウエルプレート中２００μｌ容積で測定された時に約０．６の３６０ｎｍにおけるＯＤを生じる溶液を生じた。
【００９６】
約０．１％の濃度、および暗闇で室温において６０時間の直後に上記のように測定されたＯＤ３６０において、ブースター分子を添加した。プレートからの溶剤の蒸発により増加したレチノール濃度の原因を説明するために、６０時間後にＯＤに修正を加えた（０．８５で割る）。
【００９７】
【表１０】
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テストされたブースターは、レチノールの不安定性において顕著な増加を引起こした。
【００９８】
このことによって、ブースターが用いられた時に、レチノール単独の場合に必要とされるものと比較して、かなり良好な安定性をレチノールに与える配合／包装の選択を用いる必要がある。
【実施例１】
【００９９】
トランスグルタミナーゼ発現の相乗作用阻害が、Ｂ１およびＢ５活性化合物とレチノールとの組合わせによって発生したかどうかを立証するために、レチノールの存在下に個々にテストされた時に、これらの活性化合物の用量応答プロフィール（ＩＣ５０値を含む）を決定することが肝要である。このデータは、レチノールの存在下における活性化合物の混合物の相乗作用を確認することを可能にするために、各活性化合物の適切な最大限以下の阻害濃度を決定するために用いられた。２つの化合物の相乗作用を証明するために、多くてもせいぜいＩＣ２０であるようなテストのための濃度、換言すればトランスグルタミナーゼ発現のレチノール阻害を個々に２０％高める化合物濃度を選択することが肝要である。このような２つの化合物は、４０％の付加的阻害を有すべきである。濃度を決定するためにこの戦略を用いることによって、試験中のこれら２つの化合物の相乗作用を検出するために、さらなるトランスグルタミナーゼ阻害のために４０％から１００％のウインドウを残す。さらに難しい濃度基準は、単独ではトランスグルタミナーゼの高められたレチノール阻害を示さない化合物の濃度を選択する。しかしながらこの研究において本発明者らは、さらに難しい基準を選んだ。本発明者らは、最小限に効果的なトランスグルタミナーゼの阻害的濃度よりも１０倍および１００倍も低い化合物の濃度を選んだ。このように非常に低い濃度を用いた相乗作用の組合わせの確認は、最も効果的な相乗作用の組合わせが確認されたことを意味する。
【０１００】
下記表におけるデータは、最小限に阻害的な化合物の濃度よりも２対数低い化合物の濃度を表わす。これらは、Ｂ１／Ｂ５の組合わせの研究に用いられた濃度であった。
【０１０１】
【表１１】
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【０１０２】
Ｂ１およびＢ５活性化合物とレチノールとの組合わせによるトランスグルタミナーゼ発現の相乗作用阻害を調査するために、化合物の選択された組合わせを、上記表に示された濃度においてテストした。下記のデータが得られた。
【０１０３】
【表１２】
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【０１０４】
Ｂ１／Ｂ５の組合わせの有効性は、２つの種類に分けられる。すなわち、特に効果的な組合わせ（上の表中の太字）とほとんど効果的でない組合わせ（太字でない）である。あるいくつかのＢ１／Ｂ５の組合わせが他の組合わせよりも良好な作用を発揮することは、意外であった。ほとんど効果のない組合わせは、（ｉ）脂肪酸アミド＋アゾール、（ｉｉ）ヒドロキシ脂肪酸アミド＋アゾール、および（ｉｉｉ）ナリンゲニン／ケルセチン＋アゾールであった。効果的な組合わせは、下記の種類からのＢ５ブースターと組合わされたＢ１ブースターを含んでいた。すなわち、脂肪ヒドロキシエチルイミダゾリン界面活性剤、環式脂肪族不飽和化合物、多環式トリテルペン、ｎ−置換脂肪酸アミドである。
【０１０５】
本発明は本明細書において、ある具体性をもって、およびこれらのあるいくつかの好ましい実施態様を参照して記載されてはいるが、当業者なら、本発明の範囲および精神の範囲内にあり、かつ実施することができる、記載されている発明の多くの変形例、修正例、および置換例が分かるであろう。これら全ての修正例および変形例は、本明細書に記載され、かつ特許請求されている本発明の範囲内にあり、これらの発明は、特許請求の範囲によってのみ限定され、かつこのような特許請求の範囲は合理的であるかぎり幅広く解釈されるものとする。この出願全体において、様々な出版物が引用されている。これらの出版物の各々の全体が、参照により本明細書に組込まれる。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年8月6日(2003.8.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レチニルエステル、レチノール、レチナール、およびそれらの混合物から成る群から選択されるレチノイドを約０．００１％から約１０％含んでなる第一組成物と、
シトラール、シトロネロール、コカミドＤＥＡ、デマセノン、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、ゲラニオール、１８ｂ−グリセルレチン酸、８−ＯＨ  キノリン、Ｎ−ラウロイルサルコシン、リナロール、リナロールアミドＤＥＡ、アルファイオネンおよびアマニ油から成る群から選択される少なくとも１つのレチノイドブースターを約０．０００１％から約５０％含んでなる第二組成物と、
第一組成物を収容する第一区画と、
第二組成物を収容する第二区画
とから成り、第一区画が第一組成物を酸素と接触しないように保っており、第一区画と第二区画とが互いに接合しており、それによって、第二組成物と接触することによって引き起こされることが考えられる第一組成物の化学的分解を回避していることを特徴とする、安定なスキンケア製品。
【請求項２】
第二組成物が、少なくとも２つのレチノイドブースターを、約０．０００１％から約５０％の量で含有することを特徴とする請求項１に記載の安定なスキンケア製品。
【請求項３】
レチノイドが第一効果を与え、レチノイドブースターが第一効果を高めることを特徴とする請求項１または２に記載の安定なスキンケア製品。
【請求項４】
第一区画がアルミニウム層を含むことを特徴とする請求項１から３のうちのいずれか一項に記載の安定なスキンケア製品。
【請求項５】
第二区画が、第二組成物を酸素と接触しないようにしておくことを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の安定スキンケア製品。
【請求項６】
第二区画がアルミニウム層を含むことを特徴とする請求項５に記載の安定なスキンケア製品。
【請求項７】
第一組成物が、レチニルエステル、レチノール、レチナール、およびそれらの混合物から成る群から選択されるレチノイドを約０．０１％から約１％含んでなることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の安定なスキンケア製品。
【請求項８】
レチノイドブースターがクリンバゾール (climbazole) であることを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の安定なスキンケア製品。
【請求項９】
皮膚のコンディショニング方法であって、請求項１から８のいずれか一項に記載の製品を皮膚に局所的に塗布することから成る方法。
【請求項１０】
皮膚に対するレチノイン酸効果の模倣方法であって、請求項１から８のいずれか一項に記載の製品を皮膚に塗布することから成る方法。
【請求項１１】
皮膚のコンディショニングのための医薬品の製造における請求項１から８のいずれか一項に記載の安定なスキンケア製品の使用。
【請求項１２】
皮膚のコンディショニングのための請求項１から８のいずれか一項に記載の安定なスキンケア製品。
【国際調査報告】
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