(57)【要約】本発明は、特には、その病因にＡＰＰが関与する神経変性症状において改変を受ける、ＡＰＰのカルボキシル末端部分の異化および／または代謝の断片、ＡＰＰ−Ｃ末端断片からなるマーカーを使用することを特徴とする、分析試料中における、ＡＰＰタンパク質の病的な改変を検出するための方法に関する。本発明は、アルツハイマー病などの変性病理における診断および治療への応用を有する。
2004522940.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析試料中のＡＰＰタンパク質の病的な改変を検出する方法であって、
該ＡＰＰがその病因に関与する、神経変性症状において、特異的改変を受けたＡＰＰのカルボキシ末端部分の異化および／または代謝の断片である、ＡＰＰ−Ｃ末端断片により構成されるマーカーを使用することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記断片は、該ＡＰＰのＣ末端部の１次構造は保持するが、電荷、等電点、溶解性の異なる変異体の形で存在している、該ＡＰＰの、異化および／または代謝の産物であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アルツハイマー進行の検出に使用され、
１４．５、１３．５、１２、１０．５、および９．５ｋＤａの５個の断片、ならびに、これらの断片、特には、ヒトまたは実験モデルにおける病的状態の間に、改変を受けるもの、を構成する、等電点電気泳動のイソ変異体を、ＡＰＰ機能不全マーカーとして使用することを含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
アルツハイマー進行の検出に使用され、
１４．５、１３．５、１２、１０．５、９．５、９、８．５、および６．５ｋＤａの８個の断片、ならびに、これらの断片、特には、ヒトまたは実験モデルにおける病的状態の間に、改変を受けるもの、を構成する、等電点電気泳動のイソ変異体を、ＡＰＰ機能不全マーカーとして使用することを含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
ヒトにおけるアルツハイマー進行の検出に使用され、
１４．５、１３．５、１２、１０．５、９．５、９、および６．５ｋＤａの断片から選択される１〜７個の断片、ならびに、これらの断片を構成する等電点電気泳動のイソ変異体を、ＡＰＰ機能不全マーカーとして使用することを含むことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
マウスにおけるアルツハイマー進行の検出に使用され、
１４．５、１３．５、１２、１０．５、９．５、９、８．５、および６．５ｋＤａの断片から選択される１〜８個の断片、ならびに、これらの断片を構成する等電点電気泳動のイソ変異体を、ＡＰＰ機能不全マーカーとして使用することを含むことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
細胞モデルにおけるアルツハイマー進行の検出に使用され、１３．５、１２、１０．５、９．５、９、８．５、および６．５ｋＤａの断片から選択される１〜７個の断片、ならびに、これらの断片を構成する等電点電気泳動のイソ変異体を、ＡＰＰ機能不全マーカーとして使用することを含むことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
該分析試料は、神経組織または神経細胞、非神経組織または非神経細胞、例えば、脳脊髄液、血液、その構成要素の全部または一部などの体液を包含することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体のセットを付加的に使用し、ＡＰＰ−Ｃ末端断片の病的な変成の翻訳後修飾、特には、リン酸化および／またはメチル化および／またはアセチル化および／またはグルコシル化型の修飾を検出することを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
使用されるポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体セットは、１４．５、１２、および１０．５ｋＤａ断片の発現物のリン酸化および変異の検出を可能にすることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
分析試料中で同定された断片にインデックスを割り当てることによって病状の程度を評価し、このインデックスは、基準系に関しては、インデックス０（ゼロ）は、健常組織における検出に、かつ、インデックス１００は、異常組織における検出に対応するように割り当てられることを特徴とする、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
アルツハイマー病における実験モデル、細胞または動物モデルを確立する、および／または有効性を確認するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法の応用。
【請求項１３】
アルツハイマー型神経変性病状に対して、有効な分子を薬理学的にスクリーニングするための、請求項１２に従って得られるモデルの使用。
【請求項１４】
ヒト組織および実験モデルにおける、アルツハイマー型神経変性病状の診断のための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法の応用。
【請求項１５】
ＡＰＰのカルボキシ末端領域に対するポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体のセットを含み、必要に応じて、該ＡＰＰ−Ｃ末端断片の病的な改変の翻訳後修飾、特には、リン酸化および／またはメチル化および／またはアセチル化および／またはグルコシル化型の修飾を検出するポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体のセットを含むことを特徴とする、ＡＰＰの病的な改変に対する診断キット。
【請求項１６】
免疫化学アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタン・ブロット、またはドット・ブロットを実施する上で必要な試薬または材料を含むことを特徴とする、請求項１５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病などの神経変性疾患におけるＡＰＰタンパク質（アミロイド前駆体タンパク質）の病的な改変（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を検出する手段に関する。
【０００２】
本発明は、より詳細には、かかる改変を検出する方法、それに供するキット、ならびにその治療および診断への応用に関する。
【０００３】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、知的機能の喪失、従って、進行性かつ不可逆な痴呆の発症をもたらす神経変性疾患である。この疾患は、加齢が主要な危険因子であるので、人口の高齢化につれ、将来の主要な問題の一つになりつつある。
【０００４】
観察される型のうちの９９％は、非家族性である。家族性常染色体優性型の場合、病的な変異が、第２１番染色体のＡＰＰ遺伝子上、ならびに第１４番と第１番染色体に見られるＰＳ１およびＰＳ２（プレセニリン（ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎｅ）１および２）遺伝子上で観察される。
【０００５】
二通りの変性プロセスがアルツハイマー病の特徴となっている。ＡＰＰタンパク質の機能不全に起因するアミロイド形成と、神経細胞内のタウ・タンパク質の蓄積に対応する神経原線維変性（ＮＦＤ）である。
【０００６】
ＡＰＰタンパク質の機能不全は、アルツハイマー病状のまさしく原因であるが、神経の変性および死の明確な原因は未だ解明されていない。
【０００７】
２つの仮説が提唱されている。最も普及している、第一の仮説によれば、ＡＰＰの切断産物である、３９〜４３のアミノ酸残基を含むＡβペプチドは、神経毒であり、ＮＦＤ連鎖反応の誘因である。
【０００８】
第二の仮説によれば、アミロイド斑の形態へのＡβペプチドの蓄積によって、並行してかつ副次的に変形される、該変性は、ＡＰＰ機能の喪失または獲得から引き起こされる。
【０００９】
変異されたＡＰＰあるいはＡＰＰ＋ＰＳＩ遺伝子を有するトランスジェニック・マウスのおかげで、アミロイド形成のモデル化が可能となっている。このマウスでは、進行的にアミロイド斑を発現させるものの、しかし、ＮＦＤは観察されない。このマウスは、Ａβペプチドの生成を阻害できる分子を試験するために、医薬業界で既に利用されている。その基本戦略は、Ａβペプチドの産生に関与する酵素を妨害することからなる。現在知られている、このタイプの酵素は、βおよびγセクレターゼである（１）。
【００１０】
アミロイド沈着物上に固着さえる分子も試験されている。この分子は、β構造の破壊剤（βシートブレーカー）または抗アミロイド化剤である（２）。
【００１１】
アミロイド・ペプチドに対するワクチン接種も評価段階にある（３）。
【００１２】
現時点では、アルツハイマー病に罹患したヒト組織内において、ＡＰＰタンパク質の有意、かつ確実な変異は、１−４２Ａβペプチド産生の増加、１−４２／１−４０Ａβ比の増加、ならびにその不溶沈着物およびアミロイド斑の形態の凝集以外は、発見されていない。
【００１３】
ｓＡＰＰとして知られる、ＡＰＰＮ末端部分の分泌物の変異も、ＡＰＰ上の７１５変異のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験で報告されている（４）。
【００１４】
本発明者らが実施した研究は、Ａβペプチドの検出とは結びつかないが、アルツハイマー病のヒト組織中、ならびに、実験モデル中において、特異的に検出可能である、ＡＰＰタンパク質の重要な改変に気付かせた。
【００１５】
これらの改変は、アルツハイマー病の影響を受けたヒト組織（中枢神経系、末梢の体液および組織）中で、ならびにＡＰＰの機能不全を伴う他の神経変性病状中において、明らかにされている。
【００１６】
該重要な改変は、定性的かつ定量的であり、Ａβペプチド産生の上流において、検出される。
【００１７】
同様な異常は、ＡＰＰ上の病的な変異、あるいは、変異ＡＰＰと変異プレセニリン１を有するトランスジェニック・マウスにおいても、多数見出される。
【００１８】
従って、本発明は、ＡＰＰの病的な改変の、特には、神経変性過程における、検出方法における、マーカーとしての、ヒト大脳組織内で観察されるこれら改変の利用に関する。
【００１９】
本発明は、特には、神経変性過程の診断およびモニタリング、動物モデルの開発、ならびに、ＡＰＰ病状に対して有効な薬物のスクリーニングに対する、これらマーカーの使用に関する。
【００２０】
本発明は、基準の系に対して設定されたインデックスの定義を含む、前記病状の評価方法にも関する。
【００２１】
分析試料中のＡＰＰタンパク質の病的な改変を検出する方法は、該ＡＰＰがその病因に関与する、神経変性症状において、特異的改変を受けたＡＰＰのカルボキシ末端部分の異化および／または代謝の断片、以降ＡＰＰ−Ｃ末端断片と称する、により構成されるマーカーを使用することを特徴とする。
【００２２】
本発明者らが実施した研究は、予期せぬことに、かかる断片をもたらす改変は、特には、アルツハイマー病の場合において、大脳領域中の変性過程の開始と進行に直接連結されていることを解明した。
【００２３】
問題の断片は、ＡＰＰ−Ｃ末端の一次構造を保持している、ＡＰＰの異化および／または代謝の産物であり、従って、このＡＰＰ−Ｃ末端部分に対する抗体によって認識されることが観測されている。
【００２４】
従って、本明細書および請求の範囲で使用する「断片」という用語は、実施例に記載されるように、これら変異体は、抗ＡＰＰ−Ｃ末端抗体で認識される程度に、例えば、リン酸化および／またはメチル化および／またはアセチル化および／またはグリコシル化などの、翻訳後修飾のために、電荷あるいは等電点が相違している変異体（ｃｈａｒｇｅ  ａｎｄ  ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｐｏｉｎｔ  ｖａｒｉａｎｔｓ）をも包含する。
【００２５】
これらは、特には、抗ＡＰＰ−Ｃ末端ポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体のセット、さらには、ＡＰＰ−Ｃ末端の病的改変体の翻訳後修飾に対する抗体のセットによる、免疫ブロットと検出を組み合わせた、１−Ｄ電気泳動（１次元電気泳動）または２−Ｄ電気泳動（２次元電気泳動）による、分析試料の生化学的分析により同定されえる断片である。
【００２６】
該電気泳動は、１次元および／または２次元とすることができる。
【００２７】
かかる断片は、病的な組織中において、特異的な改変を受ける。神経変性過程の進行に伴って、これら断片のうちの、特定のものの減少が、さらには、消失すらも、見出されている。同時に、これら断片のうちの、特定のものの、電荷の変異、ならびに溶解性の変化が、見出されている。
【００２８】
本発明は、特には、アルツハイマー化進行の診断のためにこの方法を適用することに関し、すなわち、ＡＰＰ機能不全マーカーとしての、１次元（１−Ｄ）電気泳動法で決定される、その分子量は、１４．５、１３．５、１２、１０．５、および９．５ｋＤａである、アルツハイマー化の過程中に改変を受ける、５個の主要な断片の利用に関する。便宜上、これらの断片を、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅの文字で表す。９ｋＤａ（Ｆ）のバンドも存在し、６．５ｋＤａのバンドも、より少くかつ変動する量であるが、存在することにも注記する。
【００２９】
消失する変異体は、Ａで表す１４．５ｋＤａの１−Ｄ電気泳動バンドに対応し、２−Ｄでは、１５ｋＤａと１４．５ｋＤａの２成分に分離され、１５ｋＤａ成分は、等電点が５．１３（１５／５．１３と表す）および１５／５．３７の、また、他方の成分は、１４．５／５．６４および１４．５／５．９５の、等電点変異体（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ）を含んでいる。１３．５／４．９４、ならびに１２．７／４．８；１２．７／５．２９の等電点変異体を含む、１３．５と１２．７ｋＤａの２成分に分離される、１３．５ｋＤａの電気泳動バンドＢに相当する断片も消失する。
【００３０】
アルツハイマー病の早期段階において、有用な断片も修飾を受ける。それらは、電気泳動変異体（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ）１５／４．５５、１４／５．２、１４／５．３７、１２．７／５．４５、１２．７／５．６４、１０．５／５．９１、１２．７／６．０５に相当する。これらの変異体は、初期マーカーとなる程度に、特に情報を与える。
【００３１】
アルツハイマー化中に出現する断片は、１１／４．９４、１０．５／５．３５、１０．５／７．５の等電点変異体を含む、２−Ｄでは、１１ｋＤａと１０．５ｋＤａの二成分に分離される、１０．５ｋＤａの１−Ｄ電気泳動バンド、ならびに、９．５ｋＤａ、ｐＩ５．７７の断片に相当する。
【００３２】
同時に、ＡＰＰ−Ｃ末端マーカーの溶解性の変化も、神経変性の病理過程の進展に伴って観察される。大脳組織のアルツハイマー化の間に、１４．５と１３．５の断片は、その溶解性の減少を示し、１０．５と９．５の断片は、その溶解性の増大を示す。
【００３３】
かかる断片は、「アルツハイマー化を受けた（ａｌｚｈｅｉｍｅｒｉｚｅｄ）」と評される組織または細胞中において、改変を受ける。それらは、アルツハイマー病理に関与する、変異遺伝子または非変異遺伝子、あるいは遺伝子の組合せを保持しているトランスジェニック動物などの実験モデルにおいても、同様に改変を受けることがある。
【００３４】
ＡＰＰ−Ｃ末端マーカーにおいて観測されるような、ＡＰＰタンパク質の異化および代謝における、これらの相違は、神経細胞モデル（例えば、ＳＫＮＳＨ  ＳＹ５Ｙ系統、ＮＴ２系統、Ｋｅｌｌｙ系統などの神経芽細胞腫細胞）、グリア芽細胞腫系統（ＣＣＦ、Ｕ１１８、Ｔ９８）のみならず、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＴ−２９、Ｈｅｌａ系統など非神経細胞でも観察されることは、興味深く注目される。
【００３５】
各細胞系は、元来、それ独自のこれら断片の発現パターン（細胞モデルの全タンパク質に対する、発現された分子量１３．５、１２、１０．５、９．５、９、８．５、および６．５ｋＤａ断片の総量の変動；各断片間の相対比の変動）を有することも注目される。
【００３６】
これらのモデルでは、各モデルに特異的な挙動で、細胞系統の分化状態に応じて、断片Ａ〜Ｆの発現も変更を受ける。
【００３７】
これらの変動は、動物モデル、特には、可能な異なる構成（ＡＰＰ変異体および／またはＰＳ１あるいはＰＳ２変異体および／またはＰＳ１発現欠如）および／または変異もしくは非変異タウ遺伝子（１４．５、１３．５、１２、１０．５、９．５、９、８．５、および６．５ｋＤａ）を有するトランスジェニック・マウスにおいても観察される。
【００３８】
したがって、前記方法に用いられる分析試料には、神経組織もしくは細胞系統ならびに非神経組織もしくは細胞系統、例えば、脳脊髄液、血液、その構成要素の全部または一部などの体液（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｌｉｑｕｉｄｓ）が含まれ、それは、早期診断、患者における危険因子の評価、または治療モニタリングを容易とする。
【００３９】
これらの組織を、該検出方法における使用を目的として、ホモジナイズまたは、例えば、遠心分離によって、分画すると有益である。
【００４０】
上記方法は、レヴィー小体を伴う痴呆やアミロイド血管症などの、アルツハイマー病に関係する神経変性病状の鑑別診断にも利用される。
【００４１】
上述の検出方法は、病気と関連するタンパク質へのＡＰＰタンパク質の変異の指標を規定することを可能とする。
【００４２】
本発明は、特には、実施例に記載されるような、免疫化学的分析により分析試料中の神経変性の病理過程を評価する方法であって、インデックス０（ゼロ）は、健常組織における検出、インデックス１００は、異常組織における検出に相当する、基準の系を参照して、ヒトの、あるいはアルツハイマー病に関係している遺伝子変異を有するトランスジェニック・マウス、あるいは、天然型細胞系統、または前記遺伝子のトランスフェクト体に由来する、試験試料中において同定される断片にインデックスを割り当てることを特徴とする方法に関する。
【００４３】
かかるインデックスは、診断および治療上の利点を有する。それは、病的状態を迅速に反映することを可能とする。インデックス値は、実際に、アルツハイマー病を発症する危険があるか否かを判定することを可能とする。高いインデックスが得られたならば、臨床診断の裏付けに役立つ。
【００４４】
また、ＡＰＰの異化と代謝ならびにその調整に基づく治療処置の目的において、かかるインデックスの変異は、治療の効果をモニターすることを可能とする。
【００４５】
それは、アルツハイマー病または他の神経変性病状に対する様々な分子の効果を比較することを可能とする基準を構成し、該インデックスの変異は、被験分子の有効性ならびにその治療上の有用性の可能性を示す。
【００４６】
かかるインデックスの利用は、該疾患の要因となる早期の病因事象の解析においても利点を示し、新しい有効な分子の発見、ならびに新しい治療戦略の開発をもたらす。
【００４７】
このインデックスは、変性を遅くするために、さらには、新たな実験モデルを確立するために、変性を誘発する上でも、利用できることも特筆される。このインデックスは、当該細胞集団の消失を要する治療措置の範囲内において、特定とする変性を誘起することを可能とする情報をも提供する。
【００４８】
本発明にかかる方法は、加えて、ＡＰＰ−Ｃ末端断片の病的な変異の翻訳後修飾、特には、リン酸化および／またはメチル化および／またはアセチル化および／またはグルコシル化型の修飾を検出するための、ポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体のセットを使用すると有益である。
【００４９】
使用するポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体のセットは、１４．５、１２、１０．５ｋＤａ断片のリン酸化および発現の変動を明らかにすることができることが好ましい。
【００５０】
本発明にかかる検出方法は、アルツハイマー病の実験モデル、細胞、または動物モデルを確立する、ならびに有効性を検証するために、好適に利用することができる。該適合するモデルは、実施例に記載するように、ヒト組織において観察されるＡＰＰ−Ｃ末端断片の改変を再現する。
【００５１】
患者の選別性を改良することによって、有効な治療試験を確立する上で、それを役立たせることもできる。
【００５２】
大いに興味深い、別の使用は、アルツハイマー型の神経変性病状に対して効果的な薬物を選択するための薬理学的スクリーニングに関するものである。すなわち、選択される分子は、ＡＰＰ−Ｃ末端マーカーの諸特性の修復、またはそれらの物理化学的諸特性（溶解性、電荷）の修復へと導くことで、アルツハイマーの上記徴候を緩和できる点に特徴がある。
【００５３】
従って、本発明により、有用な分子の迅速で正当な薬理学的スクリーニングを実施することが可能となる。
【００５４】
本発明は、また、ＡＰＰのカルボキシ末端領域に対するポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体のセットを含むことを特徴とする、ＡＰＰの病的な変異の診断用キットにも関する。例えば、これら断片上のリン酸化、メチル化、アセチル化、またはグリコシル化の部位などの、ＡＰＰ−Ｃ末端断片上に位置する、病的な変異と関連している翻訳後修飾に対する抗体のセットの使用は、ＡＰＰ−Ｃ末端断片の病的な変異の立証と定量化に関する、付加的な情報を提供するので有益である。
【００５５】
２−Ｄ電気泳動によって示されるＡＰＰ−Ｃ末端断片の異種混交性は、リン酸化トレオニン６６８（ＡＰＰ６９５における番号で示すと）に対するリン依存性（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｄｅｐｅｎｄａｎｔ）ポリクローナル抗体により実証されるように、ＡＰＰ−Ｃ末端断片に共通する領域に位置する、リン酸化修飾によって、部分的には説明される。
【００５６】
それは、ＡＰＰ−Ｃ末端断片の特性（ｐｒｏｆｉｌｅ）を変更する、抗グリコシル化（ａｎｔｉ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）薬で示されるように、グリコシル化によっても生じる。メチル化およびアセチル化も、ＡＰＰ−Ｃ末端断片の病的な変異に関与する、二種類の翻訳後修飾である。実際、それらは、実質的にリジン残基上に局在しており、酸性化を、それに伴い、等電点の変化を引き起こす。
【００５７】
これらは、アルツハイマー病に関与する遺伝子による制御の結果でもある。この方法によって、タウタンパク質の過剰発現は、１３．５、９．５、および６．５ｋＤａバンドの比に影響することがある。
【００５８】
これらの抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタン・ブロット、ドット・ブロットなど、免疫化学的アッセイにおいて、使用することができる。従って、本発明にかかるキットは、かかるアッセイを実施する上で必要な要素をも含むと便利である。
【００５９】
本発明の別の特徴および利点は、それぞれ後述する内容を示す図１〜１６を参照して、以下の実施例において、明らかにする。
材料と方法
抗体
ＡＰＰ−Ｃ末端−Ｃ１７ポリクローナル抗体の製作
ＡＰＰのカルボキシ末端部分に対するポリクローナル抗体を、Ｖａｉｔｕｋａｉｔｉｓ等（５）により記述された免疫プロトコルに従って製作した。ニュージーランド・ラビットを、そのカルボキシ末端に相当する、ヒトＡＰＰ配列の最後の１７アミノ酸を含んでなるペプチドで免疫した。該ペプチドは、共有結合で卵白アルブミンに結合させた。免疫源２００μｇを２週ごとに注射した。注射前に、最初の感作では、フロイント完全アジュバント１容を免疫源溶液に添加し、また、後続の感作では、完全アジュバントに代えて、フロイント不完全アジュバントを用いた。４回目の注射の後１週目、ならびに、後続の各注射後の１週目に、採血した。血液凝固と、２０００ｇで１０分間の遠心分離の後、純粋な血清が得られた。グリセロール１容をこの血清に添加し、この混合物を−２０℃で保存した。
【００６０】
ＡＰＰ−Ｃ末端−Ｃ１７抗体の精製
免疫化に使用したペプチド１ｍｇを、製造者の指示書に従って、ＮＨＳ−Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）マトリックス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に結合させた。該担持済みマトリックスを、２×結合緩衝液（ｐＨ８．０のトリス  ５０ｍＭ；ＮａＣｌ  ３００ｍＭ；Ｔｗｅｅｎ−２０  ０．１％（ｖ／ｖ））１容中に希釈した純粋血清２００μｌに接触させ、４℃で終夜軽く撹拌した。該溶液全てを、ＰＤ−１０カラムに載せた。該マトリックスを、上記結合緩衝液１０容で洗浄した。精製済み抗体は、ｐＨ３．５のアセテート緩衝液２容によって溶出させた。そのタンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ社のＢＣＡタンパク質定量化キットを用いて決定した。
【００６１】
ＡＰＰ−６６８Ｐポリクローナル抗体の製作
ＡＰＰ−Ｃ末端−Ｃ１７に対して使用したと同じプロトコルに従って、Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−（リン酸化）Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕの配列に相当する合成ペプチドに対する抗体を製作した。この抗体は、上記免疫源を認識するが、同一配列を持つが、リン酸化されていないペプチドは認識しない。
【００６２】
標本
ヒトおよびネズミの大脳組織の標本
ヒト大脳組織は、以前よりモニターしていた患者に由来するもので、（６）に記載されている。剖検または生検によって取得し、−８０℃で保存した、この大脳組織標本は、解剖図録を用いて解剖し、次いで、１×１−Ｄ溶解緩衝液（ｐＨ６．８の５０ｍＭトリス−ＨＣｌ；  ４ｍＭ  ＥＤＴＡ；  ＳＤＳ  ５％（ｗ／ｖ）、グリセロール  １０％（ｖ／ｖ）、β−メルカプトエタノール  ２％（ｖ／ｖ）、ブロモフェノールブルー  ０．０５％）１０容中で、テフロン（登録商標）ポッター（ｐｏｔｔｅｒ）を用いて、１−Ｄ分析用にホモジナイズした。該試料は、１０分間、１００℃で処理し、その後、使用するまで−８０℃に維持した。２−Ｄ分析の場合、該組織を、１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ６．８緩衝液中でホモジナイズし、次いで、それに２×２−Ｄ緩衝液（尿素  ７Ｍ；チオ尿素  ２Ｍ；０．４％  Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅｓ（登録商標）３〜１０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ８％（ｖ／ｖ）、ジチオスレイトール  １０ｍＭ、ブロモフェノールブルー  ０．１％）１容を添加し、使用するまで−８０℃で保存した。げっ歯動物の大脳組織標本の場合、動物の死後、速やかに脳を摘出し、ヒトの標本と同様の方法で処理した。
【００６３】
使用したネズミの系統
ネズミ大脳組織の標本を、ヒト大脳組織の標本と同じプロトコルに従い調製した。大脳組織の標本を、非トランスジェニック・マウス、および野生型ヒトＡＰＰ遺伝子（ＡＰＰｗｔ）または６７０番と６７１番のコドンに変異のあるヒトＡＰＰ遺伝子（ＡＰＰｓｗ）を有するトランスジェニック・マウスから採取した。このＡＰＰの変異は、スウェーデン型変異（Ｓｗｅｄｉｓｈ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）（７）として知られる、家族性アルツハイマー病と関連がある。非トランスジェニック・マウス、およびＡＰＰｗｔ、ＡＰＰｓｗ遺伝子を有する異系統のトランスジェニック・マウスを含む別の標本も使用した。Ｈｓｉａｏ  Ｋ．等（８）が開発したトランスジェニック・マウスと同様のネズミ大脳組織の標本も使用した。
【００６４】
タンパク質分画後の大脳組織の試料
大脳組織標本を、１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ６．８緩衝液中１／１０（ｗ／ｖ）の比でホモジナイズし、次いで、４℃で１時間、１００，０００ｇで遠心分離した。その上清（Ｆ１）を確保し、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．５％（ｖ／ｖ）を含む同一緩衝液中で再度ホモジナイズしたペレットを、それに添加した。遠心分離後、Ｆ２画分と称する、可溶なＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００画分を保存する。追加の抽出および遠心分離工程を、同一緩衝液中同一条件下で実施して、Ｆ２’画分を作製する。次いで、このペレットを、素早く１−Ｄ溶解緩衝液（下記参照）中に取り、Ｆ３画分とする。
【００６５】
用いた生化学的手法に従って、使用時に、以下の対応する緩衝液を上清に添加した：１次元（１−Ｄ）電気泳動分析用には、２×１−Ｄ溶解緩衝液（ｐＨ６．８の１００ｍＭ  トリス−ＨＣｌ；  ＥＤＴＡ  ８ｍＭ；  ＳＤＳ  １０％（ｗ／ｖ）；  グリセロール  ２０％（ｖ／ｖ）；  β−メルカプトエタノール  ４％（ｖ／ｖ）、ブロモフェノールブルー  ０．１％（ｖ／ｖ））１容、２次元（２−Ｄ）電気泳動分析用には、２−Ｄ溶解緩衝液（尿素  ７Ｍ；  チオ尿素  ２Ｍ；  ０．４％  Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅｓ（登録商標）３〜１０％（ｗ／ｖ）；  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ４％（ｖ／ｖ）；  ジチオスレイトール  １０ｍＭ；  ブロモフェノールブルー  ０．１％）１容。
【００６６】
免疫沈降
ＡＰＰ−Ｃ末端断片を免疫沈降するために、Ｆ２画分を使用する。Ｆ２画分１００μｌを、ＮＰ．４０１％を含む１０ｍＭ  トリスＨＣｌ  ｐＨ７．４緩衝液（免疫沈降緩衝液）３００μｌ中に希釈した。１０μｌのＡＰＰ−Ｃ末端−Ｃ１７抗体またはＡＰＰ６６８Ｐ抗体を添加し、その混合物を撹拌下４℃で終夜インキュベートする。プロテインＡ固定アガロース・ビーズ（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｆｉｘｅｄ  ｏｎ  ａｇａｒｏｓｅ  ｂｅａｄｓ）（Ｐｉｅｒｃｅ）４０μｌを該溶液に添加し、その混合物を撹拌下４℃で１時間インキュベートする。そのアガロース・ビーズを免疫沈降緩衝液中で３回洗浄し、次いで、ＳＤＳ緩衝液５０μｌで処理して、ＡＰＰ−Ｃ末端断片を遊離させ、遠心分離上清中に回収した。次いで、該ＡＰＰ−Ｃ末端断片は、トリス−トリシンゲル上で電気泳動後、免疫ブロット法により分析した。
【００６７】
ＣＨＯ（ハムスター）またはＳＫＮＳＨ  ＳＹ５Ｙ（ヒト）培養細胞試料
細胞は、野生型ヒトＡＰＰ遺伝子またはスウェーデン型変異を有するヒトＡＰＰ遺伝子を用いて、安定した形でトランスフェクトする。細胞のペレットを、１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ６．８緩衝液中に取り、次いで、超音波にかけた。使用前に、（１−Ｄまたは２−Ｄ）実験に対応する、２×溶解緩衝液１容を試料に添加する。１−Ｄ分析の場合、該試料を１０分間１００℃にする。
【００６８】
ヒト白血球の試料
ヒト白血球の調製：
血液１０ｍｌをＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）管中に採集する。遠心分離を１５分間、４５００ｒｐｍ（毎分の回転数）で実施する。血漿を除去する。管に、赤血球の溶解用の溶液（溶解溶液：ＮＨ４ＣＯ３  ０．９１ｍＭ、ＮＨ４Ｃｌ  ０．１３２ｍＭ）を、その２／３まで満たす。該管を静かに撹拌し、５℃に冷却した水浴中に置く。４０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離を実施し、上清を除去する。同じ方法に従って、白血球のペレットを、前記溶解溶液で２回洗浄する。次いで、該ペレットの水分を除去し、２４時間以内に使用するか、あるいは輸送または後日使用するために−２０℃で凍結させる。
【００６９】
白血球のペレットを、１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ６．８緩衝液中に取り、次いで、超音波にかける。使用前に、（１−Ｄまたは２−Ｄ）実験に対応する、２×溶解緩衝液１容を、該試料に添加する。１−Ｄ分析の場合、試料を１０分間１００℃にする。
【００７０】
電気泳動法
１−Ｄ電気泳動
Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩＸｉ  Ｃｅｌｌ  電気泳動システム（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて、製造者の指示書に従って実験を実施した。
【００７１】
Ｌａｅｍｍｌｉ（９）によって記述された、ゲル製造用プロトコルに従って、また、ＳｃｈａｇｇｅｒおよびＶｏｎ  Ｊａｇｏｗ（１０）によって記述された泳動条件下で、１−Ｄ電気泳動を実施した。濃縮ゲルは、４％のアクリルアミドを含有し、使用した分離ゲルは、１６．５％のアクリルアミドを含有する。泳動は、トリス−トリシン緩衝液中で行う。使用した泳動プログラムは、以下の通りである：１時間  ３０Ｖ一定、次いで、４５ｍＡで１６時間。
【００７２】
各ウェルには、等量（約１００μｇ／ウェル）のタンパク質を載せた。
【００７３】
２−Ｄ電気泳動
１次元
製造元の指示に従って、ｐＨ３〜１０の勾配をカバーしている、ＩＰＧ  Ｓｔｒｉｐ（登録商標）として知られるプレキャスト・ゲル・ストリップを用いて、１次元、すなわちフォーカシング（ｆｏｃｕｓｉｎｇ）を実施する。等電点フォーカシングに使用する材料は、Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＥＦ  Ｃｅｌｌシステム（Ｂｉｏｒａｄ）である。
【００７４】
１×再水和緩衝液（尿素  ７Ｍ、チオ尿素  ２Ｍ、ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００  ４％、ＣＨＡＰＳ  ０．５％、ｐＨ３〜１０のＰｈａｒｍａｌｙｔｅｓ（登録商標）  ０／２％（ｗ／ｖ）、ＤＴＴ  １０ｍＭ、オレンジＧ  ０．０１％）を、タンパク質２５０μｇに添加して、使用用の４００μｌとする。該試料４００μｌを、装置中に設置したストリップに載せる。これを１時間静置して、受動的に再水和させ、次いで、５０Ｖ／ストリップで１０時間保ち、能動的に再水和させ、次いで、製造者の指示書に従って、前記プログラムを開始する。フォーカシング後、このストリップを使用するか、−８０℃で保存する。
【００７５】
２次元
使用前に、ストリップを１−Ｄ緩衝液（ｐＨ６．８のトリス  ５０ｍＭ；グリセロール  １０％（ｖ／ｖ）；β−メルカプトエタノール  ２％（ｖ／ｖ）；ＳＤＳ  ２％（ｗ／ｖ）；ブロモフェノールブルー  ０．０５％（ｗ／ｖ））中で３０分間平衡化し、次いで、アクリルアミド  １６．５％の１−Ｄ分離ゲル上に置く。該ストリップを、アガロース１％（ｗ／ｖ）溶液で回収する。その後の手順は、単一の１−Ｄ電気泳動と同じである。
【００７６】
メンブレンへの転写と免疫ブロット法
転写
Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ（登録商標）セミドライ転写システムを用いて、製造者（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）の指示書に従って、転写を実施した。タンパク質は、０．８ｍＡ／ｃｍ２でＨｙｂｏｎｄ（登録商標）ＥＣＬ  ニトロセルロース・メンブレン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）に転写した。
【００７７】
免疫ブロット法
該メンブレンを、スキムミルク５％（ｗ／ｖ）を含有する緩衝液（ｐＨ８．０のトリス  １５ｍＭ；ＮａＣｌ  １５０ｍＭ；Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０  ０．５％（ｖ／ｖ））中で６０分間インキュベートし、次いで、スキムミルクは含まず、０．５％に代えて、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０を０．１％含有する同じ緩衝液で洗浄する。
【００７８】
該メンブレンを、インキュベーション緩衝液（ｐＨ８．０のトリス  １５ｍＭ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ−２０  ０．１％（ｖ／ｖ）、スキムミルク３％（ｗ／ｖ））中で、最終希釈度１／２０００（ｖ／ｖ）に希釈されるＡＰＰ−Ｃ末端−Ｃ１７抗体と共に、室温で２時間、または４℃で終夜インキュベートする。
【００７９】
メンブレンを、スキムミルクを含まないインキュベーション緩衝液中で３回各１０分間洗浄する。
【００８０】
次いで、該メンブレンを、Ｒａｉｆｏｒｔペルオキシダーゼを結合させた抗ウサギヤギ免疫グロブリンと共に、スキムミルクを含まないインキュベーション緩衝液中、最終希釈度１／４０００（ｖ／ｖ）で、室温で１時間インキュベートする。そのメンブレンを、スキムミルクを含まないインキュベーション緩衝液中で３回各１０分間洗浄し、ＥＣＬ（登録商標）化学ルミネッセンス・キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、製造者の指示書に従って、その免疫反応性ポリペプチドを呈色させる。
結果
ＡＰＰの異化および／または代謝による切断の概念的な概要を、図１（Ａ）に、また、利用した抗体のエピトープの位置を、図１（Ｂ）に示す。
【００８１】
ヒト大脳組織の１−Ｄ分析
１−Ｄ分析の方法の欄に記載されるように調製した、ヒト大脳組織の試料を載せ、分析した。電気泳動分離は、上述のトリス−トリシン条件で行った。ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ（登録商標）１−Ｄ  Ｅｌｉｔｅ  ソフトウェア（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、この断片の分子量を決定するために、検定済みの分子量マーカー（Ｂｉｏｒａｄ）を併行して載せた。
【００８２】
電気泳動で分離されたタンパク質の転写、ならびにＡＰＰ−Ｃ末端−Ｃ１７抗体による免疫ブロットを、上述の通りに実施した。結果を、図２のＡ１に示す。
【００８３】
正常組織の分析
コントロールのヒト大脳組織においては、見掛けの分子量が、Ａ  １４．５ｋＤａ；Ｂ  １３．５ｋＤａ；Ｃ  １２ｋＤａ；Ｄ  １０．５ｋＤａ；Ｅ  ９．５ｋＤａのＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥと名付ける６本のバンドが、ＡＰＰ−Ｃ末端−Ｃ１７ポリクローナル抗体により見出される。それらは、ヒト大脳生検組織およびコントロール被験者の死後大脳組織の双方において検出される（図２、Ａ２；レーン  １：生検；レーン  ２および３：剖検）。各試料の死後の経過時間を、時間（ｈ）で示す。断片の特性は、死後の期間では、改変を受けないことに注意されたい。従って、該５個の断片は、死後に産生されることがある異化酵素活性に由来したものではない。
【００８４】
アルツハイマー病の様々な段階にある患者由来の組織の分析
Ａ）アルツハイマー化中における、ＡＰＰ−Ｃ末端断片の量の減少
図２Ｂは、同一試料および同一免疫ブロットにおける、１９９９年のＤｅｌａｃｏｕｒｔｅ等の分類によるタウ病因（ｔａｕ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）（図２、Ｂ１）の、ならびにコントロール被験者（レーン１および２）および２人のアルツハイマー病患者（レーン３〜６）におけるＡＰＰ−Ｃ末端断片（図２、Ｂ２）の分析を示す。海馬（Ｈｉｐ、レーン１、３、５）および後頭皮質（Ｏｃ、レーン２、４、６）の二ヵ所の大脳領域を調べた。疾患に伴う、ＡＰＰ−Ｃ末端断片の減少が認められる。この消失は、神経変性的な損傷の重篤さと相関する。実際に、ＡＰＰ−Ｃ末端断片は、６９、６４、および６０ｋＤａのタウ病因性タンパク質のトリプレットの存在（Ｄｅｌａｃｏｕｒｔｅ等（６））によって示される（図２、Ｂ１）、タウ病因により侵襲された領域中では消失する（図２、Ｂ２）ことは注目される。
【００８５】
多数の患者の統計学的研究から、タウ異常の程度によって示される病理過程の進行と、分析される大脳組織標本中のＡＰＰ−Ｃ末端断片量の減少との間に、極めて高い相関があることが判明している。
【００８６】
ＡＰＰ−Ｃ末端量を、コントロール・ケース（Ｃｔｒｌ）、痴呆はないがアルツハイマー病に特徴的な病変部を持つ患者に相当する前臨床（ｉｎｆｒａｃｌｉｎｉｃａｌ）ケース（ｉｎｆｒａＡＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）の臨床ケース、およびアルツハイマー病の家族性常染色体優性ケース（ＦＡＤ．ＡＤ）（図２、Ｃ）の４グループの患者の皮質において、決定した。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ非母数統計検定は、コントロールＣｔｒｌと対比すると、ｉｎｆｒａＡＤおよびＡＤグループが有意に減少することを示している（ｉｎｆｒａＡＤ：ｐ＜０．０３；ＡＤ  ｐ＜０．００２）。ＡＰＰ−Ｃ末端の平均減少量は、コントロールグループと比較して、ｉｎｆｒａＡＤグループでは、１／１．５倍に、ＡＤグループでは、１／１．７倍に減少する。ｉｎｆｒａＡＤとＡＤグループの間では、ＡＰＰ−Ｃ末端減少量には有意な相違はない。これは、このＡＰＰ−Ｃ末端の減少は、アルツハイマー医学的病理の初期の現象であることを示している。
【００８７】
コントロール患者の側頭皮質内のタウ異常と、アルツハイマー病の様々な段階とに対する、ＡＰＰ−Ｃ末端の発現レベルと間の相関の統計学的研究を実施した（図２、Ｄ）。研究対象の各患者の皮質中にて検出されるＡＰＰ−Ｃ末端の量と、側頭皮質内ならびに後頭皮質内の、それぞれのタウ異常の様々な程度との間に有意な相関が認められる。
線形回帰
2004522940.tif 000003
Ｂ）アルツハイマー化過程中のＡＰＰ−Ｃ末端断片の変異
ＡＰＰ−Ｃ末端断片は、二相において抽出することが好ましい：非イオン性界面活性剤  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００含有緩衝液溶液（Ｆ２画分）、ならびにイオン性界面活性剤  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）含有溶液（Ｆ３）（図３、Ａ）。
【００８８】
大脳組織のアルツハイマー化において、ＡＰＰ−Ｃ末端断片の溶解性における、特異的な変化が観測される（図３Ｂ）。Ｆ２画分中においては、分子量９．５（断片Ｅ）および１０．５ｋＤａ（断片Ｄ）のＡＰＰ−Ｃ末端断片の溶解性が増大し、Ｆ３画分中においては、分子量１３．５（断片Ｂ）および１４．５ｋＤａ（断片Ａ）のＡＰＰ−Ｃ末端断片の不溶性が増大することが認められた。
【００８９】
正常および病的なヒト大脳組織の２−Ｄ分析
３人の患者に対する結果を、図４（Ａ〜Ｃ）に示す。
【００９０】
−アルツハイマー型大脳病変部のない１コントロール患者（Ｄｅｌａｃｏｕｒｔｅ等（６）による段階０）（図４Ａ）
−アルツハイマー病の臨床段階の極初期にある１患者（Ｄｅｌａｃｏｕｒｔｅ等（６）による段階６）（図４Ｂ）。
【００９１】
矢印は、ＡＰＰ−Ｃ末端−Ｃ１７ポリクローナル抗体を用いて検出されるスポットを示す。それらの分子量は、１−Ｄ免疫ブロットで観察される値とほぼ同じである。それらの等電点は、ｐＨ４．５〜７．５の範囲にある。
【００９２】
アルツハイマー病の進行に伴う、該スポットの分布における変異が注目される（図４、Ｃ）。アルツハイマー病のさらに進んだ段階にある患者では、その断片をもはや検出することができないので、この手法で研究することはできない。
【００９３】
２−Ｄ分析によって検出されるＡＰＰ−Ｃ末端の変異体を、Ｙ軸は、分子量を、Ｘ軸は、等電点を示す、２次元の較正されたグリッド上に模式的に図示する（図４、Ｃ）。分子量および等電点の内部標準を用いて、全体を較正した。該等電点のコントロールは、γ−エノラーゼ（４７／４．９４）、α−アクチン（４２／５．２９）、およびα−エノラーゼ（４７／６．９９）である。５．５４および８．０５の等電点は、大脳組織内部の標準である。
【００９４】
図４の概略図には、コントロール被験者、前臨床疾患ステージにあるアルツハイマー病患者、およびアルツハイマー病の初期臨床ステージにあるアルツハイマー病患者のヒト大脳組織中の、ＡＰＰ−Ｃ末端−Ｃ１７抗体を用いて検出されるＡＰＰ−Ｃ末端断片の２Ｄプロファイルを重ねて示す。健常ならびに罹患組織中の両者で観察される、該スポット、すなわち、様々な２−Ｄ等電点変異体は、白抜きの丸で示されている。健常組織に特異的なスポットは、斜線入りの丸で、アルツハイマー化組織に特異的なスポットは、黒丸で示される。
【００９５】
アルツハイマー病中に改変を受けた、スポットの分子量および等電点の値を表１に示す。
【００９６】
ネズミ大脳組織の１−Ｄ分析
ヒトＡＰＰの異化および／または代謝の特異性をより明らかにするために、ラット、非トランスジェニック・マウス、ならびに、野生型ヒトＡＰＰ遺伝子（ＡＰＰｗｔ）またはスウェーデン型変異を有する遺伝子（ＡＰＰｓｗ）によるトランスジェニック・マウスにおいて、ＡＰＰ−Ｃ末端産物を（ヒト大脳組織と同様のやり方で）分析した。ヒト大脳組織のプロファイル（図５Ａ、レーン４）と比較して、コントロールおよびトランスジェニック・マウスのＡＰＰ−Ｃ末端断片の免疫マーキングを、図５Ａに示す。
【００９７】
大脳組織ホモジネートの同スポット量を、各電気泳動ウェル中に導入した。ＡＰＰ−Ｃ末端断片を、ＡＰＰ−Ｃ末端−Ｃ１７ポリクローナル抗体を用いて検出した。図５のレーン１は、トランスフェクトされていないマウス（負のコントロール）の分析結果に対応し、レーン２は、ＡＰＰｗｔヒト遺伝子の単一コピーを有するマウスに対応し、レーン３は、ＡＰＰｓｗヒト変異遺伝子を有するトランスジェニック・マウスに対応し、レーン４は、コントロールのヒト大脳組織に対応する。矢印は、検出された電気泳動バンドの分子量を示す。
【００９８】
コントロールのマウスまたはＡＰＰｗｔ遺伝子の単一コピーを有するものは、基本的に４個のＡＰＰ−Ｃ末端断片を産生し、一方、ＡＰＰｓｗ遺伝子を有するマウスおよび正常ヒト大脳組織は、１４．５、１３．５、１２、１０．５、および９．５ｋＤａの分子量を有する５個のＡＰＰ−Ｃ末端断片を産生することが注目される。
【００９９】
これらの結果は、５匹の非トランスジェニック・マウス、野生型ヒトＡＰＰ遺伝子を有する２匹のトランスジェニック・マウス、およびＡＰＰｓｗ遺伝子を有する５匹のトランスジェニック・マウスで検証された。
【０１００】
図５Ｂのレーン１〜３は、ＡＰＰ−Ｃ末端−Ｃ１７抗体を用いた、様々なＡＰＰｓｗトランスジェニック・マウス系統の免疫ブロットの結果を示し（図５、レーン１〜３）、その中には、Ｈｓｉａｏ等（８）によって記述されたリファレンスのＡＰＰｓｗ系統（レーン３）が示される。従って、該ＡＰＰｓｗトランスジェニック・マウスは、本明細書に記載されるように、特定のプロファイルを体系的に有している。
【０１０１】
マウス大脳組織のＡＰＰ−Ｃ末端断片の２−Ｄ分析
ヒト大脳組織に対して、上で記載した（図４）と同様の操作を実施する。従って、コントロール・マウス（図６Ａ）、ＡＰＰｗｔマウス（図６Ｂ）、ならびにＡＰＰｓｗマウス（図６ｃ）において観察される、様々な変異体を特徴づけることが可能である。ＡＰＰｓｗマウスにおける変異体の発現に亢進が認められ、また、特定の変異体においては、プロファイルの変異が認められる（図６）。これらの分子量および等電点の値は、図７Ａおよび表３に示す。
【０１０２】
細胞モデルにおけるヒトＡＰＰの改変の１−Ｄ分析
−非神経モデル
野生型ヒトＡＰＰ遺伝子（ＡＰＰｗｔ）またはＡＰＰｓｗ遺伝子を安定した形でトランスフェクトしたＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞を、上述のプロトコルに従って分析した。図８の結果は、ＡＰＰｗｔまたはＡＰＰｓｗ遺伝子によるトランスジェニック・マウス由来の大脳組織と比較して、ＣＨＯ細胞のＡＰＰ−Ｃ末端断片を示す。
【０１０３】
ＡＰＰｗｔ  ＣＨＯ細胞（図８、レーン３）では、見掛けの分子量  １６、１４．５、１３．５、１２、１０．５、および９．５ｋＤａの６本のバンドが検出される。主要なバンドは、１６、１４．５、１３．５、および９．５ｋＤａのバンドである。ＡＰＰｓｗ  ＣＨＯ細胞（図８、レーン４）では、シグナル全体、特に１６、１３．５、および９．５ｋＤａ断片で減少が観測される。
【０１０４】
ＡＰＰｗｔ（レーン１）およびＡＰＰｓｗ（レーン２）トランスジェニック・マウスの大脳組織のホモジネートとの比較は、ＣＨＯ細胞中において検出されるバンドは、１６ｋＤａのバンドを除き、該大脳組織のバンドと共通していることが示す。
【０１０５】
ＣＣＦ、Ｕ１１８、およびＴ９グリア細胞系統は、１３．５、１２、１０．５、９．５、９、および８．５ｋＤａの６本のバンドを具えるプロファイルを有し、９．５から８．５ｋＤａまでの３本のバンドが強いことが認められる（図８Ｂ）。同様なプロファイルは、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、およびＡＰＰｓｗでトランスフェクトされたＳＹ−５Ｙ細胞系統で観測されている（図８Ｂ）。
【０１０６】
その他、ＨＴ−２９上皮細胞系統は、１４．５、１３．５、１２、１０．５、９．５および９ｋＤａの６本のバンドのプロファイルを有する（図８：ＨＴ−２９）。該９ｋＤａのバンドは、ＨＴ−２９上皮細胞では分離しており、グリコシル化ならびにグリコシル化タンパク質の配向を阻害するベンジル−Ｏ−ＧａｌＮａｃで処理した後に、より強くなる。これは、グリコシル化が、ＡＰＰ−Ｃ末端の発現およびプロファイルを制御している、翻訳後修飾であることを示唆する。従って、この修飾は、アルツハイマー化中のＡＰＰ−Ｃ末端分子の病的な変異の研究において、考慮すべき重要な要素である。
【０１０７】
−神経モデル
非トランスフェクト細胞と対比させて、ＡＰＰｓｗ、ＡＰＰｗｔ、変異ＰＳ１、およびタウ遺伝子を安定した形でトランスフェクトしたヒト神経芽細胞腫細胞（ＳＫＮＳＨ−ＳＹ５Ｙ）を分析した。結果を図９に示す。非トランスフェクト細胞では、ＡＰＰ−Ｃ末端シグナルは、１０．５ｋＤａバンドに対応する（図９：未変性）。一方、１３．５、１２、１０．５、９．５、９、および８．５ｋＤａの６個の断片が、ＡＰＰｓｗでトランスフェクトした未分化（ｎｏｎ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ）ＳＫＮＳＨ細胞中で全て同定されている（図９：ＡＰＰｓｗ）。６本のバンドのプロファイルは、ＡＰＰｗｔをトランスフェクトした細胞にも見られる（図９：野生型）。変異ＰＳ１遺伝子のＳＹ５Ｙ細胞へのトランスフェクトは、５本のバンドの増大、その際、強い９．５ｋＤａのバンドが増大し、γ−セクレターゼの作用によって遊離される、６．５ｋＤａ断片の増加を誘起する。
【０１０８】
Ｋｅｌｌｙ細胞、さらには変異ＡＰＰまたはＰＳ１遺伝子をトランスフェクトしたＳＫＮＳＨ細胞、ＮＴ２細胞、ｈＮＴ細胞などの、他の未変性神経細胞系も、未変性ＳＫＮＳＨタイプのプロファイルを有する。
【０１０９】
ＳＹ５Ｙ細胞を１４日にわたり分化させると、６．５ｋＤａのγバンドの出現と、１０．５ｋＤａのバンドの減少を伴う、プロファイルの変化が誘起される。同一条件下で、３Ｒタウ遺伝子をトランスフェクトした細胞および未分化細胞では、「βセクレターゼ」断片の遊離が増大するのに対応して、１３．５ｋＤａバンドが出現する。これらの分化細胞では、６．５ｋＤａのγバンドの消失が観測される。
【０１１０】
これは、遺伝子が、ＡＰＰ−Ｃ末端断片の発現および相対的分布を変化させることが可能であることを示している。従って、これらのモデルは、ヒト大脳組織において観察されるように、ＡＰＰ−Ｃ末端断片の病的な変化のモデルとなる可能性を有している。
【０１１１】
ヒト白血球ＡＰＰ−Ｃ末端断片の分析
ヒト白血球のペレットを、（医薬または病院の）分析室において利用される標準プロトコルに従って調製した。このペレットを、上述と同様に処理し、ＡＰＰ−Ｃ末端−Ｃ１７抗体を用いた免疫ブロット法によって分析した。この結果は、図１０Ａに示し。レーン１〜５はコントロールに対応し、レーン６〜１１はアルツハイマー病に罹患した患者由来の試料に対応する。性別と年齢を示す（図１０Ａ：性別、年齢）。
【０１１２】
ＡＰＰ−Ｃ末端−Ｃ１７抗体は、分子量  １４ｋＤａ、１０．５ｋＤａ、および９．５ｋＤａの３個の断片を検出する。
【０１１３】
コントロール被験者およびアルツハイマー病と診断された患者由来の白血球の対比１−Ｄ分析は、（ヒト大脳組織の研究と同様に）コントロール被験者の白血球（レーン１〜５）と比較して、患者の白血球中におけるＡＰＰ−Ｃ末端断片の減少（レーン６〜１１）を立証することを可能とする。
【０１１４】
白血球のＡＰＰ−Ｃ末端断片の変異体は、２−Ｄでも分析された（図１０Ｂ）。検出された各スポットの分子量と等電点の値を図７Ｃおよび表２に示す。
【０１１５】
様々な免疫プローブ（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｂｅｓ）を用いたＡＰＰ−Ｃ末端断片の特定
ＡβペプチドのＮ末端に対する抗体は、βセクレターゼの切断断片の位置特を可能とする。それは、ＦＣＡ１８抗体である（４）。白血球の１４ｋＤａ断片は、この抗体によって検出され、それが、βセクレターゼによって作製されるＡＰＰ−Ｃ末端断片であることを示唆している（図１１Ｂ）。大脳組織においては、２本のバンドＡ（１４．５ｋＤａ）とＢ（１３．５ｋＤａ）は、Ａβペプチドの５〜１１部分に対するモノクローナル抗体（Ａｂｅｔａ、ＧｍｂＨ、ハイデルベルク、ドイツ）である、ＷＯ２によって認識され、また、バンドＢは、ＦＣＡ１８によって検出される。このことは、バンドＡおよびＢが、βセクレターゼ領域の濃度に応じた、切断によって産生されることを示している（図１参照）。さらに、データベース調査（例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）から、分子量９．５ｋＤａ（図１１）、等電点６．９９のＡＰＰ−Ｃ末端断片は、図１に示すように、αセクレターゼ断片に相当することが示される。従って、アルツハイマー病に伴い、改変を受ける、白血球のこの２つの主要なＡＰＰ−Ｃ末端断片が同定された（図１１、ＡおよびＢ）。
【０１１６】
また、５個の断片Ａ〜Ｃに共通な特定部位は、特異的な改変を受ける場合がある。従って、例えば、リン酸化トレオニン６６８を特異的に認識するポリクローナル抗体は、バンドＡ、Ｃ、およびＤを選択的に認識する。本明細書に記載されている方法により、変性過程に関連している、翻訳後修飾を特定することが可能になる。従って、それは、ＡＰＰ−Ｃ末端断片の病的な変異に対する診断キットを有利にもたらす、新たな免疫ツールの開発を可能とするものである。
【０１１７】
ＡＰＰ−Ｃ末端断片のリン酸化は、その病的な変異における決定要素である。
【０１１８】
ＡＰＰ−Ｃ末端の代謝およびリン酸化の改変が、アルツハイマー病で起こる。コントロール被験者およびアルツハイマー病患者の大脳組織のＡＰＰ−Ｃ末端を、ＡＰＰ−Ｃ末端−Ｃ１７抗体を用いて免疫沈降させると、１４．５、１３．５、１２、１０．５、および９．５ｋＤａ（断片Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥ）の５個の断片が、トリス−トリシンゲル中で同一抗体を用いた電気泳動後に見出される（図１３、レーン１および２）。この免疫沈降ＡＰＰ−Ｃ末端断片を、子ウシ腸アルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化し（図１３、レーン３および４）、次いで、同じプロトコルに従ってＡＰＰ−Ｃ末端−Ｃ１７抗体を用いて検出した。１３．５、１０．５、および９．５ｋＤａの、３個の主要な断片が、コントロールのホモジネート中に検出される。これら３個の断片は、アルツハイマーのホモジネート中でも検出される。しかし、この１３．５ｋＤａ断片の量は少量で、一方、１０．５および９．５ｋＤａ断片は多量である。この結果は、αセクレターゼ切断による、これらの断片の蓄積と、それに、それらのより高いリン酸化を示している。
【０１１９】
リン酸化指数の変化は、特には、抗リン酸化トレオニン６６８抗体を用いて実証される（図１３、レーン５および６）。トレオニン６６８上のリン酸化されたＡＰＰ−Ｃ末端断片は、トリス−トリシンゲル中での電気泳動後、ＡＰＰ−Ｃ末端−Ｃ１７抗体を用いて免疫沈降し検出される。１４．５、１２、および１０．５断片がコントロールのホモジネート中に検出される。アルツハイマーのホモジネート中では、多量に検出されるのは実質的に１２．５および１０．５の断片である。この結果が、ＡＰＰ−Ｃ末端断片ＣおよびＤがよりリン酸化され、かつアルツハイマー病の初期段階で多量にリン酸化され、同時に、断片Ａは、６６８部位で全くまたはほんの僅かしかリン酸化されないことを確認する。
【０１２０】
要点のまとめ
本発明の実施の上で、特に情報価値のある変異体を、表にまとめて示す（図１４〜１６）。これら様々な変異体は、神経組織中、ならびに非神経組織、特には、リンパ球中の双方における、ＡＰＰの病的な変異を検出するための極めて有用なマーカーを構成する。
【０１２１】
ＡＰＰ−Ｃ末端断片のトレオニン、セリン、チロシン上のリン酸化（図１）は、ＡＰＰ−Ｃ末端の全般的なプロフィールに寄与する。まず、特には、リン酸化トレオニン６６８によって示されるように、これら様々なＡＰＰ−Ｃ末端断片のリン酸化指数に違いが観測される（図１１および１３）。次いで、脱リン酸化ＡＰＰ−Ｃ末端断片のプロファイルが変化し、特には、１４．５ｋＤａバンドが消失し、従って、その新たなプロファイルは、ＡＰＰｓｗをトランスフェクトしたＳＫＮＳＨ細胞モデルのそれとに類似している（図１３）。
【０１２２】
さらに、ＡＰＰ−Ｃ末端断片の脱リン酸化は、特には、ＡＰＰ−Ｃ末端断片のαセクレターゼ切断産物に対応する、バンドＣ、Ｄ、Ｅの蓄積（図１３）を伴う正常組織とアルツハイマー組織との間のプロファイル変化を説明する。従って、脱リン酸化は、重要な翻訳後の現象であり、ＡＰＰ−Ｃ末端断片の病的な変異のマーカーである。
【０１２３】
この改変は、その細胞モデルによって示されるように（図９）、アルツハイマー病に関与する遺伝子によってその発現が変化を受ける、６．５ｋＤａのγセクレターゼ断片においても反映される。
【０１２４】
ＡＰＰ−Ｃ末端断片の検出は、ヒト神経組織（図１２Ａ：ヒト大脳組織）またはヒト非神経組織（図１２Ｂ：ヒト  リンパ球）、ならびに実験動物（図１２Ｃ：ＡＰＰｓｗおよびＡＰＰｗｔトランスジェニック・マウス由来の大脳組織）、または細胞、神経（図１２Ｄ：神経芽細胞腫細胞）、または非神経（ＣＨＯ細胞、ＣＯＳなど）のモデルに適用可能な、病的変異の指標の定義を可能とする。この指標は、０（健常組織）から１００％（アルツハイマー化病的組織）まで変化する（図１２）。
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【図１】
ＡＰＰ−Ｃ末端断片の切断を概念的に示す図と、利用した抗体のエピトープの位置を示す図である。
【図２】
ヒト大脳組織の（１−Ｄ）ウェスタン・ブロットの結果（図２（Ａ）と図２（Ｂ））と、ＡＰＰ−Ｃ末端断片のアッセイ結果（図２（Ｃ）と図２（Ｄ））を示す写真である。
【図３】
ヒト大脳組織分画のウェスタン・ブロットの結果（図３（Ａ）と図３（Ｂ））を示す写真である。
【図４】
ヒト大脳組織の（２−Ｄ）ウェスタン・ブロットの結果（図４（Ａ）〜図４（Ｃ））を示す写真である。
【図５】
トランスジェニック・マウス大脳組織の（ｌ−Ｄ）ウェスタン・ブロットの結果（図５（Ａ）と図５（Ｂ））を示す写真である。
【図６】
マウス大脳組織の（２−Ｄ）ウェスタン・ブロットの結果を示す写真である。
【図７】
マウス大脳組織中（図７（Ａ））、ヒト大脳組織中（図７（Ｂ））、ならびにヒト  リンパ球中（図７（Ｃ））のＡＰＰ−Ｃ末端断片の２−Ｄプロファイルを合成した結果を示す図である。
【図８】
ＷＴおよびＳＷマウスの大脳組織、ＡＰＰｗｔおよびＡＰＰｓｗを有する非神経細胞系統のウェスタン・ブロットの結果を示す写真である。
【図９】
ＡＰＰｗｔ、ＡＰＰｓｗ、変異ＰＳ１、３Ｒタウ、または４Ｒタウをトランスフェクトした、またはトランスフェクトしていない神経型細胞系統と、ヒト大脳組織とを比較したウェスタン・ブロットの結果を示す写真である。
【図１０】
ヒト  リンパ球のｌ−Ｄ分析結果（図１０（Ａ））と２−Ｄ分析結果（図１０（Ｂ））を示す図である。
【図１１】
抗Ａβ−Ｎ末端抗体、ＡＰＰ−Ｃ末端抗体、およびリン依存性ＡＰＰ−Ｃ末端抗体によるＡＰＰ−Ｃ末端断片の同定の結果を示す図である。
【図１２】
病的な変性のインデックスを示す図である。
【図１３】
ＡＰＰ−Ｃ末端の病的な変性体に対するリン酸化の影響を示す図である。
【図１４】
本発明にかかる変異体の一覧表を示す。
【図１５】
本発明にかかる変異体の一覧表を示す。
【図１６】
本発明にかかる変異体の一覧表を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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