(57)【要約】ゲノムＤＮＡにおけるマイクロサテライト不安定性の分析に使用される方法およびキットを開示する。腫瘍といった生体物質において存在するマイクロサテライト不安定性ＤＮＡを検出するために使用可能な方法およびキットもまた開示する。本発明の方法およびキットは、特定種の癌といった、マイクロサテライト不安定性と関連する疾患を検出したり診断したりするのに使用可能である。
2004530406.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロサテライト遺伝子座の分析法であって：
ａ）少なくとも１つのモノヌクレオチド反復遺伝子座および少なくとも２つのテトラヌクレオチド反復遺伝子座を含む、ゲノムＤＮＡの少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを同時増幅するためのプライマーを提供し；
ｂ）ゲノムＤＮＡの少なくとも１つのサンプルからの少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを、該プライマーを用いてマルチプレックス増幅反応において同時増幅し、それにより増幅ＤＮＡフラグメントを産生し；そして
ｃ）該増幅ＤＮＡフラグメントのサイズを決定することからなるステップを含む、方法。
【請求項２】
該ゲノムＤＮＡが、ヒトゲノムＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも２つのテトラヌクレオチド反復遺伝子座が、ＦＧＡ、Ｄ１Ｓ５１８、Ｄ１Ｓ５４７、Ｄ１Ｓ１６７７、Ｄ２Ｓ１７９０、Ｄ３Ｓ２４３２、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ５Ｓ２８４９、Ｄ６Ｓ１０５３、Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ７Ｓ１８０８、Ｄ７Ｓ３０７０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ９Ｓ２１６９、Ｄ１０Ｓ１４２６、Ｄ１０Ｓ２４７０、Ｄ１２Ｓ３９１、Ｄ１７Ｓ１２９４、Ｄ１７Ｓ１２９９、およびＤ１８Ｓ５１からなる群から選ばれる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該少なくとも１つのモノヌクレオチド反復遺伝子座が、ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＭＯＮＯ−１１、およびＭＯＮＯ−１５からなる群から選ばれる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
該少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが：
ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＭＯＮＯ−１１、およびＭＯＮＯ−１５からなる群から選ばれる少なくとも２つのモノヌクレオチド反復遺伝子座；および
ＦＧＡ、Ｄ１Ｓ５１８、Ｄ１Ｓ５４７、Ｄ１Ｓ１６７７、Ｄ２Ｓ１７９０、Ｄ３Ｓ２４３２、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ５Ｓ２８４９、Ｄ６Ｓ１０５３、Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ７Ｓ１８０８、Ｄ７Ｓ３０７０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ９Ｓ２１６９、Ｄ１０Ｓ１４２６、Ｄ１０Ｓ２４７０、Ｄ１２Ｓ３９１、Ｄ１７Ｓ１２９４、Ｄ１７Ｓ１２９９、およびＤ１８Ｓ５１からなる群から選ばれる少なくとも３つのテトラヌクレオチド反復遺伝子座、からなる少なくとも５つのマイクロサテライト遺伝子座のセットである、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ａ）において提供されたプライマーのうちの少なくとも１つが：配列番号第１−６２で同定されたプライマー配列の群から選ばれる核酸配列を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが：ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＭＯＮＯ−１５、Ｄ１Ｓ５１８、Ｄ３Ｓ２４３２、Ｄ７Ｓ１８０８、Ｄ７Ｓ３０７０、Ｄ７Ｓ３０４６、およびＤ１０Ｓ１４２６からなる少なくとも９つのマイクロサテライト遺伝子座のセットである、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
該少なくとも９つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが：
遺伝子座がＢＡＴ−２５である場合、配列番号第１および配列番号第６０、
遺伝子座がＢＡＴ−２６である場合、配列番号第６１および配列番号第６２、
遺伝子座がＭＯＮＯ−１５である場合、配列番号第７および配列番号第８、
遺伝子座がＤ１Ｓ５１８である場合、配列番号第４９および配列番号第５０、
遺伝子座がＤ３Ｓ２４３２である場合、配列番号第１７および配列番号第５９、
遺伝子座がＤ７Ｓ１８０８である場合、配列番号第５１および配列番号第５２、
遺伝子座がＤ７Ｓ３０７０である場合、配列番号第５３および配列番号第５４、
遺伝子座がＤ７Ｓ３０４６である場合、配列番号第５５および配列番号第５６、および
遺伝子座がＤ１０Ｓ１４２６である場合、配列番号第５７および配列番号第５８、からなる群から選ばれる各遺伝子座に対してプライマーを少なくとも１つ用いて同時増幅される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを、ステップ（ｃ）において、蛍光標識された各遺伝子座に対してオリゴヌクレオチドプライマーを少なくとも１つ用いて同時増幅する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
該ゲノムＤＮＡの少なくとも１つのサンプルが、個体由来の正常な癌性でない生体物質起源のゲノムＤＮＡの第１のサンプル、および個体の腫瘍起源のゲノムＤＮＡの第２のサンプルを含み、該方法が：
ゲノムＤＮＡの第１のサンプルを同時増幅して産生された増幅ＤＮＡフラグメントのサイズを、ゲノムＤＮＡの第２のサンプルを同時増幅して産生された増幅ＤＮＡフラグメントのサイズと比較することによりマイクロサテライト不安定性を検出することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
該マイクロサテライト不安定性の結果が、予後腫瘍診断に使用される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
該マイクロサテライト不安定性の結果が、家族性腫瘍の素因診断に使用される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
該マイクロサテライト不安定性の結果が、消化器系のまたは子宮内膜の癌性腫瘍を検出するのに使用される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
該癌性腫瘍が、大腸癌由来の腫瘍である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ゲノムＤＮＡにおけるマイクロサテライト不安定性の検出法であって：
ａ）少なくとも１つのモノヌクレオチド反復遺伝子座および少なくとも２つのテトラヌクレオチド反復遺伝子座を含む、ゲノムＤＮＡの少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを同時増幅するためのプライマーを提供し；
ｂ）個体由来の正常な癌性でない生体物質起源のゲノムＤＮＡの第１のサンプルおよび該個体由来の第２の生体物質起源のゲノムＤＮＡの第２のサンプルからの少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを、該プライマーを用いて、別々のマルチプレックス増幅反応において同時増幅し、それにより第１のサンプルから第１の増幅ＤＮＡフラグメントおよび第２のサンプルから第２の増幅ＤＮＡフラグメントを産生し；そして
ｃ）第１の増幅ＤＮＡフラグメントのサイズを第２の増幅ＤＮＡフラグメントのサイズと比較して、第２のゲノムＤＮＡの少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のいずれかにおいて不安定性を検出することからなるステップを含む、方法。
【請求項１６】
ステップ（ａ）において提供されたプライマーが、ヒトゲノムＤＮＡのマイクロサテライト遺伝子座に対するプライマーである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
２つのテトラヌクレオチド反復遺伝子座が、ＦＧＡ、Ｄ１Ｓ５１８、Ｄ１Ｓ５４７、Ｄ１Ｓ１６７７、Ｄ２Ｓ１７９０、Ｄ３Ｓ２４３２、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ５Ｓ２８４９、Ｄ６Ｓ１０５３、Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ７Ｓ１８０８、Ｄ７Ｓ３０７０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ９Ｓ２１６９、Ｄ１０Ｓ１４２６、Ｄ１０Ｓ２４７０、Ｄ１２Ｓ３９１、Ｄ１７Ｓ１２９４、Ｄ１７Ｓ１２９９、およびＤ１８Ｓ５１からなる群から選ばれる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
該モノヌクレオチド反復遺伝子座が、ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＭＯＮＯ−１１、およびＭＯＮＯ−１５からなる群から選ばれる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが、ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＭＯＮＯ−１１、およびＭＯＮＯ−１５からなる群から選ばれる２つのモノヌクレオチド反復遺伝子座、およびＦＧＡ、Ｄ１Ｓ５１８、Ｄ１Ｓ５４７、Ｄ１Ｓ１６７７、Ｄ２Ｓ１７９０、Ｄ３Ｓ２４３２、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ５Ｓ２８４９、Ｄ６Ｓ１０５３、Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ７Ｓ１８０８、Ｄ７Ｓ３０７０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ９Ｓ２１６９、Ｄ１０Ｓ１４２６、Ｄ１０Ｓ２４７０、Ｄ１２Ｓ３９１、Ｄ１７Ｓ１２９４、Ｄ１７Ｓ１２９９、およびＤ１８Ｓ５１からなる群から選ばれる３つのテトラヌクレオチド反復遺伝子座を含む少なくとも５つのマイクロサテライト遺伝子座のセットである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ａ）において提供されたプライマーのうちの少なくとも１つが：配列番号第１−６２で同定されたプライマー配列の群から選ばれる核酸配列を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ａ）において提供された各遺伝子座に対するプライマーの少なくとも１つが蛍光標識されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも２つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが：ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＭＯＮＯ−１５、Ｄ１Ｓ５１８、Ｄ３Ｓ２４３２、Ｄ７Ｓ１８０８、Ｄ７Ｓ３０７０、Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ１０Ｓ１４２６を含む、少なくとも９つのマイクロサテライト遺伝子座のセットである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
該少なくとも９つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが：
遺伝子座がＢＡＴ−２５である場合、配列番号第１および配列番号第６０、
遺伝子座がＢＡＴ−２６である場合、配列番号第６１および配列番号第６２、
遺伝子座がＭＯＮＯ−１５である場合、配列番号第７および配列番号第８、
遺伝子座がＤ１Ｓ５１８である場合、配列番号第４９および配列番号第５０、
遺伝子座がＤ３Ｓ２４３２である場合、配列番号第１７および配列番号第５９、
遺伝子座がＤ７Ｓ１８０８である場合、配列番号第５１および配列番号第５２、
遺伝子座がＤ７Ｓ３０７０である場合、配列番号第５３および配列番号第５４、
遺伝子座がＤ７Ｓ３０４６である場合、配列番号第５５および配列番号第５６、および
遺伝子座がＤ１０Ｓ１４２６である場合、配列番号第５７および配列番号第５８、からなる群から選ばれる各遺伝子座に対して、プライマーを少なくとも１つ用いて同時増幅される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
該生体物質の第２のサンプルが：腫瘍組織、播種性細胞、糞便、血液細胞、血漿、血清、リンパ節、尿、および他の体液からなる群から選ばれる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
該マイクロサテライト不安定性の結果が、予後腫瘍診断に使用される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
該マイクロサテライト不安定性の結果が、家族性腫瘍の素因診断に使用される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
該マイクロサテライト不安定性の結果が、消化器系のまたは子宮内膜の癌性腫瘍を検出するのに使用される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
該癌性腫瘍が、大腸癌由来の腫瘍である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも１つのモノヌクレオチド反復遺伝子座の分析法であって：
ａ）ＭＯＮＯ−１１およびＭＯＮＯ−１５からなる群から選ばれるヒトゲノムＤＮＡの少なくとも１つのモノヌクレオチド反復遺伝子座に対するプライマーを少なくとも１つ提供し；
ｂ）個体由来の生体物質起源のゲノムＤＮＡサンプルからの少なくとも１つのモノヌクレオチド反復遺伝子座を、該少なくとも１つのプライマーを用いて増幅し、それにより増幅ＤＮＡフラグメントを産生し；そして
ｃ）該増幅ＤＮＡフラグメントのサイズを決定すること、からなるステップを含む、方法。
【請求項３０】
該少なくとも１つのモノヌクレオチド反復遺伝子座を：配列番号第５−８からなる群から選ばれた少なくとも１つのプライマーを用いて同時増幅する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
該少なくとも１つのモノヌクレオチド反復遺伝子座を、蛍光標識したオリゴヌクレオチドプライマーを少なくとも１つ用いて増幅する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
該生体物質が：腫瘍組織、播種性細胞、糞便、血液細胞、血漿、血清、リンパ節、尿、および他の体液からなる群から選ばれる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
増幅ＤＮＡフラグメントのサイズを、ヒト集団における当該遺伝子座で最も一般的に見られる対立遺伝子のサイズと比較することにより、少なくとも１つのモノヌクレオチド反復遺伝子座でマイクロサテライト不安定性を検出することを更に含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
個体由来の正常な癌性でない生体物質からのヒトゲノムＤＮＡのサンプルの少なくとも１つのモノヌクレオチド反復遺伝子座を増幅し、その結果生成する第２の増幅ＤＮＡフラグメントをステップ（ｂ）で得られた増幅ＤＮＡフラグメントと比較して、ステップ（ｃ）においてマイクロサテライト不安定性を検出することを更に含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
ヒトゲノムＤＮＡのマイクロサテライト遺伝子座を分析するためのキットであって：
ヒトゲノムＤＮＡの少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットであって、１つのモノヌクレオチド反復遺伝子座および２つのテトラヌクレオチド反復遺伝子座を含む当該セットを、同時増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーを有する１つの容器を含む、キット。
【請求項３６】
該２つのテトラヌクレオチド反復遺伝子座が、ＦＧＡ、Ｄ１Ｓ５１８、Ｄ１Ｓ５４７、Ｄ１Ｓ１６７７、Ｄ２Ｓ１７９０、Ｄ３Ｓ２４３２、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ５Ｓ２８４９、Ｄ６Ｓ１０５３、Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ７Ｓ１８０８、Ｄ７Ｓ３０７０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ９Ｓ２１６９、Ｄ１０Ｓ１４２６、Ｄ１０Ｓ２４７０、Ｄ１２Ｓ３９１、Ｄ１７Ｓ１２９４、Ｄ１７Ｓ１２９９、およびＤ１８Ｓ５１からなる群から選ばれる、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
該モノヌクレオチド反復遺伝子座が、ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＭＯＮＯ−１１、およびＭＯＮＯ−１５からなる群から選ばれる、請求項３５に記載のキット。
【請求項３８】
少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが、ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＭＯＮＯ−１１、およびＭＯＮＯ−１５からなる群から選ばれる２つのモノヌクレオチド反復遺伝子座、およびＦＧＡ、Ｄ１Ｓ５１８、Ｄ１Ｓ５４７、Ｄ１Ｓ１６７７、Ｄ２Ｓ１７９０、Ｄ３Ｓ２４３２、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ５Ｓ２８４９、Ｄ６Ｓ１０５３、Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ７Ｓ１８０８、Ｄ７Ｓ３０７０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ９Ｓ２１６９、Ｄ１０Ｓ１４２６、Ｄ１０Ｓ２４７０、Ｄ１２Ｓ３９１、Ｄ１７Ｓ１２９４、Ｄ１７Ｓ１２９９、およびＤ１８Ｓ５１からなる群から選ばれる３つのテトラヌクレオチド反復遺伝子座を含む少なくとも５つのマイクロサテライト遺伝子座のセットである、請求項３５に記載のキット。
【請求項３９】
該少なくとも２つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが：ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＭＯＮＯ−１５、Ｄ１Ｓ５１８、Ｄ３Ｓ２４３２、Ｄ７Ｓ１８０８、Ｄ７Ｓ３０７０、Ｄ７Ｓ３０４６、およびＤ１０Ｓ１４２６を含む、少なくとも９つのマイクロサテライト遺伝子座のセットである、請求項３５に記載のキット。
【請求項４０】
該オリゴヌクレオチドプライマーのうちの少なくとも１つが：
遺伝子座がＢＡＴ−２５である場合、配列番号第１および配列番号第６０、
遺伝子座がＢＡＴ−２６である場合、配列番号第６１および配列番号第６２、
遺伝子座がＭＯＮＯ−１５である場合、配列番号第７および配列番号第８、
遺伝子座がＤ１Ｓ５１８である場合、配列番号第４９および配列番号第５０、
遺伝子座がＤ３Ｓ２４３２である場合、配列番号第１７および配列番号第５９、
遺伝子座がＤ７Ｓ１８０８である場合、配列番号第５１および配列番号第５２、
遺伝子座がＤ７Ｓ３０７０である場合、配列番号第５３および配列番号第５４、
遺伝子座がＤ７Ｓ３０４６である場合、配列番号第５５および配列番号第５６、および
遺伝子座がＤ１０Ｓ１４２６である場合、配列番号第５７および配列番号第５８、からなる群から選ばれる、請求項３５に記載のキット。
【請求項４１】
該セットにある少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のそれぞれに対するオリゴヌクレオチドプライマー少なくとも１つが、蛍光標識されている、請求項３５に記載のキット。
【請求項４２】
該キットが、熱安定性ポリメラーゼを更に含む、請求項３５に記載のキット。
【請求項４３】
該キットが、正常な癌性でない生体物質から単離した第１のコントロールＤＮＡ、およびミスマッチ修復遺伝子が不足している生体物質からの第２のコントロールＤＮＡを更に含む、請求項３５に記載のキット。
【請求項４４】
該プライマーにより同時増幅されたマイクロサテライト遺伝子座のセットにおける不安定性が、予後の腫瘍診断において使用可能である、請求項３５に記載のキット。
【請求項４５】
該プライマーにより同時増幅されたマイクロサテライト遺伝子座のセットにおける不安定性が、家族性腫瘍の素因の診断に使用可能である、請求項３５に記載のキット。
【請求項４６】
該プライマーにより同時増幅されたマイクロサテライト遺伝子座のセットにおける不安定性が、消化器系のまたは子宮内膜の腫瘍の指標となる、請求項３５に記載のキット。
【請求項４７】
該マイクロサテライト不安定性が、大腸癌の指標となる、請求項４４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、米国国立衛生研究所からの米国政府中小企業技術革新研究プログラム助成（Ｓｍａｌｌ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｇｒａｎｔ）ＣＡ７６８３４−０２号を用いてなされた。米国政府は、本発明に対して特定の権利を留保する。
【０００２】
本発明の属する技術分野
本発明は、マイクロサテライト遺伝子座のような単純なタンデム反復を含有するゲノムＤＮＡの領域における不安定性の検出に関する。本発明は、特には腫瘍起源の細胞、組織、または体液由来のゲノムＤＮＡ中の１セットのマイクロサテライト遺伝子座における不安定性の有無に対するマルチプレックス分析に関する。本発明は、癌および癌の素因の検出および診断におけるマイクロサテライト不安定性分析の利用にも関する。
【０００３】
本発明の背景
ゲノムＤＮＡのマイクロサテライト遺伝子座は、親子鑑定、科学調査、及び癌の検出および診断を含むがこれに限定されない広範にわたる用途に対して分析されてきた。腫瘍細胞の１種以上において不安定な特定のマイクロサテライト遺伝子座で不安定性の存在に基づいて、癌が検出又は診断可能である。
【０００４】
マイクロサテライト遺伝子座は、長さが１〜５塩基対からなる反復単位である単純なタンデム反復を有するゲノムＤＮＡの１領域である。このような何百何千のマイクロサテライト遺伝子座が、ヒトゲノム中に分散している。マイクロサテライト遺伝子座は、最小の反復単位の長さに基づいて分類されている。例えば長さが１〜５塩基対の反復単位を有する遺伝子座は、「モノヌクレオチド」、「ジヌクレオチド」、「トリヌクレオチド」、「テトラヌクレオチド」、および「ペンタヌクレオチド」反復遺伝子座とそれぞれ称される。
【０００５】
哺乳類種由来のゲノムＤＮＡのような２倍体種のほとんどに対する正常なゲノムＤＮＡのマイクロサテライト遺伝子座はそれぞれ、各遺伝子座で２つの対立遺伝子から構成される。この２つの対立遺伝子は、相互に長さが同じであっても異なっていても可能であり、固体ごとに様々となり得る。マイクロサテライト対立遺伝子は、特定の固体およびその子孫において一定の長さで正常に維持される；しかし、その長さのマイクロサテライトにおいて不安定性が、幾つかの種類の腫瘍においては見られる（Ａａｌｔｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０： ８１２−８１５； Ｔｈｉｂｏｄｅａｕ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０： ８１６−８１９； Ｐｅｌｔｏｍａｋｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３： ５８５３−５８５５； Ｉｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｎａｔｕｒｅ ３６３： ５５８−５６１）。腫瘍におけるこの形態のゲノムの不安定性は、マイクロサテライト不安定性と言われ（これ以降、「ＭＳＩ」）、遺伝性の癌症候群である、遺伝性非腺腫症性大腸癌（これ以降、「ＨＮＰＣＣ」）の分子的特徴である。ＨＮＰＣＣにおけるＭＳＩの原因は、ＤＮＡ複製中に起こるエラーを復帰できない機能障害性ＤＮＡミスマッチ修復系であると考えられている（Ｆｉｓｈｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｃｅｌｌ ７５： １０２７−３８； Ｌｅａｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｃｅｌｌ ７５： ２１５−２５； Ｂｒｏｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｎａｔｕｒｅ ３６８： ２５８−６１； Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｎａｔｕｒｅ ３７１： ７５−８０； Ｍｉｙａｋｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １７： ２７１−２）。ＤＮＡ複製中の１つ以上の反復単位の挿入または欠失は、ミスマッチ修復なしに存続し、正常および腫瘍のＤＮＡサンプルから増幅したマイクロサテライト遺伝子座において見出される対立遺伝子のサイズを比較することにより長さの多形として検出可能である（Ｔｈｉｂｏｄｅａｕ ｅｔ ａｌ， １９９３， 上述）。
【０００６】
ＭＳＩは、ＨＮＰＣＣの９０％以上において、および散発性大腸腫瘍（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， １９９６ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ ２： １６９−１７４； Ｔｈｉｂｏｄｅａｕ ｅｔ ａｌ， １９９３， 上述； Ｉｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｎａｔｕｒｅ ３６３： ５５８−５６１； Ａａｌｔｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０： ８１２−８１６； Ｌｏｔｈｅ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３： ５８４９−５８５２）の１０〜２０％において見いだされている。しかしながら、ＭＳＩは、大腸腫瘍に限られるものではない。ＭＳＩは、膵臓癌（Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３： ５０８７−５０８９）、胃癌（Ｉｄ．； Ｐｅｌｔｏｍａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３： ５８５３−５８５５； Ｍｉｒｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５４：４１−４４； Ｒｈｙｕ ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ９： ２９−３２； Ｃｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５４： ４５９５−４５９７）、前立腺癌（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ９： ２９９９−３００３）、子宮内膜癌（Ｒｉｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３： ５１００−５１０３； Ｐｅｌｔｏｍａｋｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３： ５８５３−５８５５）、および胸部癌（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ９： ３６９５−３７００）においても検出されている。
【０００７】
ＨＮＰＣＣの遺伝的な根拠は、幾つかのＤＮＡミスマッチペア遺伝子（これ以降、「ＭＭＲ」）のうちの１つにおける生殖細胞系変異であると考えられている（Ｌｅａｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｃｅｌｌ ７５： １２１５−１２２５； Ｆｉｓｈｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｃｅｌｌ ７５： １０２７−３８； Ｌｅａｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｃｅｌｌ ７５： ２１５−２５； Ｂｒｏｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｎａｔｕｒｅ ３６８： ２５８−６１； Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｎａｔｕｒｅ ３７１： ７５−８０； Ｍｉｙａｋｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １７： ２７１−２； Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３： １６２５−１６２９）。ＨＮＰＣＣの親のうち、５０〜６０％が、２つのミスマッチ修復遺伝子、ＭＳＨ２およびＭＬＨ１において遺伝的な変異を保有していると報告されている（Ｋｏｌｏｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５９： ５０６８−５０７４）。更に、その腫瘍が高頻度のＭＳＩ（これ以降、「ＭＳＩ−Ｈ」）多形であることが報告により明らかなＨＮＰＣＣの場合の７０〜１００％は、これら２つの遺伝子において生殖細胞系変異を有する。ＭＳＨ６、ＭＳＨ３、ＰＭＳ１、およびＰＭＳ２遺伝子における幾つかの生殖細胞系変異が、ＨＮＰＣＣ親において報告されており、これらのミスマッチ修復遺伝子における遺伝的な変異が、ＨＮＰＣＣにおいて重要でない役割を果たしていることが示される（Ｐｅｌｔｏｍａｋｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｌｙ １１３： １１４６−１１５８； Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， １９９６ Ｎａｔ Ｍｅｄ ２： １６９−１７４； Ｋｏｌｏｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５９： ５０６８−５０７４）。機能修復蛋白なしに、複製の間に起こるエラーは、修復されずに高変異率をもたらし、腫瘍進行の可能性を増やす。
【０００８】
反復ＤＮＡは、複製におけるエラーに特に感度が高く、それゆえ機能障害性ミスマッチ修復系は、マイクロサテライト領域における広範にわたる改変によるものである。機能的なミスマッチ修復系をもたない酵母細胞の研究により、モノ−、ジ−、トリ−、テトラ−、およびペンタ−ヌクレオチド反復において、変異率がそれぞれ２８００、２８４、５２、および１９倍高いことを示した（Ｓｉａ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７： ２８５１−２８５８）。ミスマッチ修復遺伝子における変異は、腫瘍形成において直接的な役割を果たすが、むしろＤＮＡ複製エラーを存続させることにより作用すると考えられている。ミスマッチ修復欠損細胞は、高変異率を有し、これらの変異が腫瘍形成に関与する遺伝子において起こるならば、その結果、癌の進行がもたらされ得る。ＭＳＩ陽性の腫瘍は、増殖制御、アポトーシス、およびＤＮＡ修復（例えば、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＢＡＸ、ＩＧＦＩＩＲ、ＴＣＦ４、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６）に関与する数個の遺伝子のコード化領域におけるモノヌクレオチド反復での体細胞性のフレームシフト変異を保有することが見いだされている（Ｐｌａｎｃｋ ｅｔ ａｌ．， ２０００ Ｇｅｎｅｓ， Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ＆ Ｃａｎｃｅｒ ２９：３３−３９； Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， １９９８ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｓｈ ５８： ９９７−１００３； Ｇｒａｄｙ ｅｔ ａｌ．， １９９９ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５９： ３２０−３２４； Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， １９９５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８： １３３６−１３３８； Ｐａｒｓｏｎｓ ｅｔ ａｌ．， １９９５ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５５： ５５４８−５５５０）。最も一般的に改変された遺伝子座は、ＴＧＦＢＲＩＩであり、ＭＳＩ−Ｈ大腸腫瘍の９０％以上が遺伝子中に存在する１０塩基のポリアデニン反復における変異を含むことが見出されている（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， １９９５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８： １３３６−１３３８）。
【０００９】
ミスマッチ修復遺伝子が関与するにも関わらずＨＮＰＣＣ腫瘍のほとんどすべてにおいて、ＭＳＩが起こる。ＭＳＩは、腫瘍形成の早期に起こることも示されている。これらの２つの要因は、ＭＳＩ分析はＨＮＰＣＣの検出用の優れた診断テストとするのに役立つ。更に、ＭＳＩ分析は、更に遺伝的にテストするためのＨＮＰＣＣ親の可能性を同定するための有益なプレスクリーニングテストとしての役割を果たすことが可能である。ＭＳＩの発生が良好な予後と相関することから（Ｂｅｒｔａｒｉｏ ｅｔ ａｌ．， １９９９ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８０： ８３−７）、散発性大腸癌のＭＳＩ分析も所望される。
【００１０】
ＨＮＰＣＣを診断に関して長年にわたる問題の１つは、ＨＮＰＣＣを有するヒト由来の大腸腫瘍の生検が、散発性大腸腫瘍と病理学的に同じに見え、病理現象の診断を困難にしていることである。ＨＮＰＣＣの患者については、予後診断、治療および追跡治療は困難となるであろうから、より明確な診断法を見出すことが重要である。しかしながら、変異に対する既知のホットスポットのない大きな遺伝子である少なくとも５つの既知のＭＭＲ遺伝子があるため、ＨＮＰＣＣ患者における変異検出は依然として困難なままである。直接的な遺伝子の配列決定が、やはり最も正確な変異検出法であるが、手間がかかりかつ経費もかさむ（Ｔｅｒｄｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９ Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ９４： ２３５４４−２３５６０）。更に、検出される多くの変異が、ミスマッチ修復蛋白の機能には全く影響を及ぼさない無害な多形であり得るため、高感度および高特異性は配列決定だけでは得にくいことがあり得る。
【００１１】
マイクロサテライト遺伝子座のＤＮＡ分析は、特定の種類の癌の検出に利用する血液テストの開発を理論的には可能にする。腫瘍ＤＮＡが血液循環中に遊離されて、多数の異なる種類の癌において血漿および血清中に特に高濃度で存在することが早期の研究で示された（Ｌｅｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９７７ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ３７： ６４６−６５０； Ｓｔｒｏｕｎ ｅｔ ａｌ．， １９８９ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ４６： ３１８−３２２）。それ以降、数種の異なる腫瘍由来の血液中に遊離されたＤＮＡが、ポリメラーゼ鎖反応（これ以降「ＰＣＲ］）を用いてマイクロサテライトＤＮＡ分析により検出されている（Ｈｉｂｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８： １４０５−１４０７； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５： ２２９７−２３０３； Ｋｏｐｒｅｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， １９９９ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５： １９６１−１９６５； Ｆｕｊｉｗａｒａ ｅｔ ａｌ．， １９９９ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５９： １５６７−１５７１； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２： １０３３−１０３４； Ｇｏｅｓｓｌ ｅｔ ａｌ．， １９９８ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８： ４７２８−４７３２； Ｍｉｏｚｚｏ ｅｔ ａｌ．， １９９６ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５６： ２２８５−２２８８）。
【００１２】
癌患者由来の血液中で検出された最初の腫瘍特異的な遺伝子配列は、変異型Ｋ−ｒａｓ遺伝子である（Ｖａｓｉｏｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｂｒ． Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ ８６： ７７４−７７９； Ｓｏｒｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ． Ｂｉｏｍａｒｋ． Ｐｒｅｖ． ３： ６７−７１； Ｓｏｒｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６： ２１２９−２１３７； Ａｎｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１２： １１１４−１１２０）。更に最近、頭部および頸部の扁平上皮細胞癌（Ｎａｗｒｏｚ ｅｔ ａｌ．， １９９６ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ ２： １０３５−１０３７）および小細胞肺癌（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ ２： １０３３−１０３５）起源の血漿および血清由来の可溶性の腫瘍ＤＮＡにおけるマイクロサテライト不安定性の検出が示されている。これらの成功は、他の多くの癌種由来の循環している腫瘍ＤＮＡにおけるマイクロサテライト不安定性の探求を促進した。Ｈｉｂｉらは、マイクロサテライトマーカーを用いて大腸患者由来の血清ＤＮＡにおける遺伝的な改変の存在を探求した（Ｈｉｂｉ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， １９９８ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８： １４０５−１４０７）。Ｈｉｂｉらはまた、大腸癌患者における初期腫瘍の８０％が、ＭＳＩおよび／またはヘテロ接合性の消失（これ以降、「ＬＯＨ」）を呈することを報告しており、別の種類の変異は下記に示される。ペア血清のＤＮＡにおいては、マイクロサテライト又はＬＯＨ変異は全く検出されなかった。しかしながら、同一のＫ−ｒａｓ変異が対応する腫瘍および血清ＤＮＡにおいて見いだされ、血中に腫瘍ＤＮＡが存在することを示している（Ｉｄ．）。
【００１３】
循環している腫瘍細胞および微小転移の検出はまた、予後および治療に重要な意味を持ち得る。播種性の腫瘍細胞が非常に少数存在するために、それらは、１０，０００〜１００，０００個の正常細胞のうち１つの腫瘍細胞を検出することしかできない従来の免疫細胞学的テスト（Ｇｈｏｕｓｓｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５： １９５０−１９６０）で簡単に検出されない。ＤＮＡまたはＲＮＡにおける腫瘍特異的な異常のＰＣＲ増幅に基づいたより高感度の分子技術が、潜在的な（隠れた）腫瘍細胞の検出を非常に容易にしている。１００万の正常細胞中にある１つの腫瘍細胞をルーチンで検出することが可能なＰＣＲに基づいたテストは、白血病、リンパ腫、メラノーマ、神経芽細胞種、および様々な種類の癌において循環している腫瘍細胞および微小転移の同定のために考案されている（Ｉｄ．）。
【００１４】
播種性腫瘍細胞の検出のターゲットのほとんどは、ｍＲＮＡであった。しかしながら、上述で示すように大腸癌において、Ｋ−ｒａｓ変異を含む、ＤＮＡターゲットの幾つかがうまく利用されてきた。幾つかの種類の腫瘍細胞におけるマイクロサテライト不安定性の存在により、その不安定性により作られるこれらの腫瘍特異的変異が潜在的な腫瘍細胞のＰＣＲベースの検出に対するターゲットとして作用し得る可能性を高めている。
【００１５】
ＭＳＩをいかに正確に特定し、的確に定量するかについての大きな議論がある（Ｂｏｌａｎｄ， １９９８ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８： ５２４８−５２５７）。様々な腫瘍におけるＭＳＩの頻度に関する報告は、非常に様々である。例えば、膀胱癌におけるＭＳＩの頻度については、様々な研究で３％〜９５％のＭＳＩの範囲が報告されている（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｚｕｌｕｅｔａ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３： ２８−３０； Ｍａｏ ｅｔ ａｌ．， １９９６ ＰＮＡＳ ９１： ９８７１−９８７５）。ＭＳＩを特定するうえでの１つの問題は、それが腫瘍特異的であり、かつ遺伝子座依存性でもあることである（Ｂｏｌａｎｄ， １９９８ 上述）。従って、１つの研究において特定の腫瘍型について見られるＭＳＩの頻度は、分析される腫瘍の数、検定される遺伝子座の数、ＭＳＩを有するとして腫瘍を記録するためにどれぐらいの遺伝子座が改変される必要があるか、および分析にどの特定の遺伝子座が含められるか次第である。これらの問題を解決する手助けをするために、米国国立癌研究所は、この分野を再検討して統一するにＭＳＩに関するワークショップに資金援助した。このワークショップの結果、５つのマイクロサテライトのパネルが、当該分野における今後の研究のための参照パネルとして推奨された。このパネルには、２つのモノヌクレオチド遺伝子座、ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、および３つのジヌクレオチド遺伝子座、Ｄ５Ｓ３４６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ１７Ｓ２５０が含まれていた。
【００１６】
腫瘍サンプルのＭＳＩ分析における１つの特定の問題は、特定のマーカーに対する正常な対立遺伝子のうちの１つがＬＯＨのために欠落しているときに起こり、そのマーカーに対しては他の新規なフラグメントは全く存在しない（ｉｄ．）。これが本当のＬＯＨ、あるいはシフトした対立遺伝子が残留している野生型の対立遺伝子と一緒に移動したＭＳＩのどちらを示しているのか簡単には識別できない。このような場合において、ＭＳＩに関するＮＣＩワークショップからは、それをＭＳＩと呼ぶべきではないと推奨している。この種の問題を最小限に抑える１つの方法は、大腸腫瘍における低頻度のＬＯＨを呈する遺伝子座を使用することである。
【００１７】
疾患の処置および予後診断を決定するために使用される臨床診断アッセイは、そのテストが非常に正確（偽陰性が低い）で特異的（偽陽性率が低い）であることが要求される。多くの有益なマイクロサテライト遺伝子座が、ＭＳＩをテストするために同定され、推奨されてきた（Ｂｏｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．， １９９８ 上述）。しかしながら、最も有益なマイクロサテライト遺伝子座でさえも、１００％の感度で１００％特異的ではない。個別のマーカーを用いて感度の不足を相補するために、検出度を上昇させるのに多数のマーカーを使用することができる。多数のマーカーを分析するのに必要となる労力の増量は、マルチプレックス化により相殺可能である。マルチプレックス化により、１つのチューブにおける１セットの遺伝子座の同時増幅および分析が可能となり、完全な分析に必要とされるＤＮＡの総量を減らすことがしばしば可能である。特定の種類の癌に対するＭＳＩアッセイの特異性を高めるために、米国国立研究所ワークショップ（上記参照）で特定された５つの非常に有益なマイクロサテライト遺伝子座のパネルを改変して、同等に有効な他の遺伝子座を置換したり付加することが推奨されている（Ｂｏｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．， １９９８ 上述、ｐ５２５０）。より多くの数の遺伝子座を増幅および分析して得られるより多くの情報の結果、テストの結果を解釈するうえでの信頼性および精度が高まる。
【００１８】
マルチプレックスＭＳＩ分析は、精度およびＭＳＩのフェノタイプの識別の問題を解決するが、更に複雑になると分析を更に難しくなり得る。例えば、マイクロサテライト遺伝子座を、マルチプレックス形式で同時増幅および分析すると、データ解釈の容易さおよび精度に影響を与える因子が、はるかに不可欠なものとなる。正確なデータ解釈に影響を与える主要な因子の１つは、ＰＣＲ中にマイクロサテライト遺伝子座で発生するスタッター（ｓｔｕｔｔｅｒ）の量である（Ｂａｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｍｍ， １９９８ Ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｉｎ ＤＮＡ ２：３−６； Ｐｅｒｕｃｈｏ， １９９９ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｃｈ ５９： ２４９−２５６）。スタッター産物とは、ＰＣＲ工程により作り出されるコアの反復単位の倍数で主要な対立遺伝子とサイズが異なるマイナーなフラグメントである。マイクロサテライト遺伝子座において見られるスタッターの量は、コアの反復単位の長さと反比例の関係にある傾向がある。従って、スタッターは、モノ−およびジ−ヌクレオチドの反復遺伝子座に関して最も多く示され、トリ−、テトラ−、およびペンターヌクレオチドの反復に関してはそれほどでもない（Ｂａｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｍｍ， １９９８ 上述）。マルチプレックスにおいて低スタッターの遺伝子座を使用すると、この問題は大いに減少される。しかしながら、特定の反復型内でさえスタッターの割合は非常に多様となり得るので、低スタッターの遺伝子座を選ぶ際には遺伝子座の注意深い選択がなおも必要である（Ｍｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．， １９９９ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ４４： １−１５）。
【００１９】
マイクロサテライトマルチプレックス系が、遺伝子型同定、マッピング研究およびＤＮＡ分類の用途における使用のために最初開発された。これらのマルチプレックス系は、１つの反応で多数のマイクロサテライト遺伝子座の同時増幅、次にその結果生成する増幅対立遺伝子のサイズの検出を可能とするようにデザインされている。ＤＮＡ分類分析に対して、多数のマイクロサテライト遺伝子座の使用により、１つの遺伝子座上で一致する確立は劇的に上昇する。一致する確立は、ランダムに選んだ個体と同一のＤＮＡパターンを見いだすまでに調査しなければならない個体の数を定義するＤＮＡ分類において使用される一般的な統計値である。例えば、一致する確立が２．７４ｘ１０８分の１である８つの遺伝子座のマルチプレックス系（ＧｅｎｅＰｒｉｎｔ（登録商標） ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ（登録商標） １．２ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｐｒｏｍｅｇａ）に比べて、４つの遺伝のマルチプレックス系（ＧｅｎｅＰｒｉｎｔ（登録商標） ＣＴＴｖ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｐｒｏｍｅｇａ）は、アフリカ系アメリカ人集団において一致する確立は、２５２．４分の１である（議事録：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｆｅｂ． ９−１４， １９９８）， Ｓｃｈｕｍｍ， Ｊａｍｅｓ Ｗ． ｅｔ ａｌ．， ｐ．５３， Ｂ８８； Ｉｄ． Ｇｉｂｓｏｎ， Ｓａｎｄｒａ Ｄ． ｅｔ ａｌ．， ｐ．５３， Ｂ８９； Ｉｄ．， Ｌａｚａｒｕｋ， Ｋａｔｈｅｒｉｎｅ ｅｔ ａｌ．， ｐ． ５１， Ｂ８３； Ｓｐａｒｋｅｓ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．， １９９６ Ｉｎｔ Ｊ Ｌｅｇａｌ Ｍｅｄ １０９： １８６−１９４）。ＤＮＡ分類に対して他の市販で入手可能なマルチプレックス系としては、ＡｍｐＦｌＳＴＲ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（登録商標）およびＡｍｐＦｌＳＴＲ ＣＯｆｉｌｅｒ（登録商標）（ＡｍｐＦｌＳＴＲ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（登録商標） ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｍａｎｕａｌ（１９９７）， ｉ−ｖｉｉｉおよび１−１〜１−１０； およびＡｍｐＦｌＳＴＲ ＣＯｆｉｌｅｒ（登録商標） ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｕｓｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ（１９９８）， ｉ−ｉｉｉおよび１−１〜１−１０、両方ともＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐにより公表）が挙げられる。ＤＮＡ分類に対するマルチプレックスに加えて、僅かなマルチプレックスマイクロサテライト系が、癌といった疾病の検出のために開発されてきた。このような系の１つが、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓの「ＨＮＰＣＣマイクロサテライト不安定性テスト」により開発され、そのテストにおいては５つのＭＳＩ遺伝子座（ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ５Ｓ４３６、Ｄ１７Ｓ２５０、およびＤ２Ｓ１２３）が同時増幅、および分析される。更なる系、特にはＭＳＩに対して高感度、および分析の容易性および精度のために低スタッターを示す更なる遺伝子座を含む系が必要とされる。
【００２０】
本発明の材料と方法は、様々な種類の組織、細胞および、体液を含む、様々な起源由来のヒトゲノムＤＮＡの特定のマイクロサテライト遺伝子座のマルチプレックス分析に使用するためにデザインされている。本発明は、既存の技術を超える大きな改良が示され、識別力、精度、およびＭＳＩ遺伝子座の分析および癌といった当該遺伝子座での変異に関連した病気の診断に対する処理能力のパワーの上昇がもたらされる。
【００２１】
本発明の概要
本発明は、マイクロサテライト遺伝子座またはマイクロサテライト遺伝子座のセットを増幅、および分析するための方法およびキットを提供する。本発明はまた、腫瘍組織または癌細胞起源のヒトゲノムＤＮＡの多数のマイクロサテライト遺伝子座を同時に増幅することによりヒトにおいて癌を検出する方法およびキットも提供する。
【００２２】
１つの態様において、本発明は、マイクロサテライト遺伝子座を分析する方法を提供し：（ａ）少なくとも１つのモノヌクレオチド反復遺伝子座および少なくとも２つのテトラヌクレオチド反復遺伝子座を含む、ゲノムＤＮＡの少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを同時増幅するためのプライマーを提供し：（ｂ）ゲノムＤＮＡのサンプルからの少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを、該プライマーを用いてマルチプレックス増幅反応において同時増幅し、それにより増幅ＤＮＡフラグメントを産生し：（ｃ）該増幅ＤＮＡフラグメントのサイズを決定する、ことを含む。
【００２３】
別の態様において、本発明は、少なくとも２つの異なるゲノムＤＮＡサンプルの少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを同時に増幅する方法を提供し、第１のサンプルは、個体由来の正常な癌性でない生体物質起源であり、第２のサンプルは、個体由来の第２の生体物質起源である。このヒトゲノムＤＮＡの少なくとも２つのサンプルが、少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットにおける各遺伝子座に対するプライマーを用いて、別々のマルチプレックス増幅反応において同時増幅される。その２つのマルチプレックス反応の結果増幅されたＤＮＡフラグメントのサイズを相互に比較して、ヒトゲノムＤＮＡの第２のサンプルの少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のいずれかにおける不安定性を検出する。
【００２４】
本発明の別の実施態様は、ＭＯＮＯ−１１およびＭＯＮＯ−１５からなる群から選ばれたヒトゲノムＤＮＡの少なくとも１つのモノヌクレオチド反復遺伝子座の分析法である。ＭＯＮＯ−１１およびＭＯＮＯ−１５からなる群から選ばれた少なくとも１つのモノヌクレオチド反復遺伝子座の分析法は：（ａ）少なくとも１つのモノヌクレオチド反復遺伝子座のプライマーを少なくとも１つ提供し；（ｂ）その少なくとも１つのプライマーを用いて、個々のヒト被験者由来の生体物質起源のゲノムＤＮＡのサンプルからモノヌクレオチド反復遺伝子座を少なくとも１つ増幅し、それにより、増幅ＤＮＡフラグメントを産生し；そして（ｃ）その増幅ＤＮＡフラグメントのサイズを決定する、ことからなるステップを含む。その増幅ＤＮＡフラグメントのサイズを、ヒト集団において当該遺伝子座で最も一般的に見られる対立遺伝子のサイズと比較することにより、増幅ＤＮＡフラグメントを分析して少なくとも１つのモノヌクレオチド反復遺伝子座でマイクロサテライト不安定性を検出するのが好ましい。別法としては、個体由来の正常な癌性でない生体物質からのヒトゲノムＤＮＡサンプルのモノヌクレオチド反復遺伝子座を少なくとも１つ増幅するために当該方法が使用され、マイクロサテライト不安定性は、その結果増幅されたＤＮＡフラグメントをステップ（ｂ）で得られるものと比較することにより検出される。
本発明の別の実施態様は、個々の被験者から単離されたＤＮＡにおけるマイクロサテライト不安定性の検出用キットであり、１つのモノヌクレオチド遺伝子座および２つのテトラヌクレオチド遺伝子座を含む少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを同時に増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーを有する１つの容器からなる。
【００２５】
本発明の方法およびキットの様々な実施態様は、上述で簡単に示されているが、腫瘍細胞または癌細胞におけるＭＳＩの検出での使用に適している。特に、本発明の方法またはキットは、ＭＯＮＯ−１１およびＭＯＮＯ−１５からなる群から選ばれた少なくとも１つのモノヌクレオチド反復遺伝子座、または組織または体液といった生体物質、好ましくは腫瘍細胞または癌細胞由来の含有ＤＮＡを含むまたは懸濁した生体物質由来のゲノムＤＮＡの少なくとも１つのサンプルの少なくとも１つのモノヌクレオチド遺伝子座および少なくとも２つのテトラヌクレオチド遺伝子座を含む少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを増幅するのに使用可能である。単型または準単型（ｑｕａｓｉ−ｍｏｎｏｍｏｒｐｈｉｃ）の遺伝子座、例えばＭＯＮＯ−１１およびＭＯＮＯ−１５に対しては、その結果生成されるパターンを、その遺伝子座で標準的なパターンを有する集団における任意の個体由来の正常のＤＮＡを増幅することにより作成されるパターンと比較可能である。しかしながら、肯定的な結果がＭＳＩではなくて、生殖細胞系変異を反映しないことを確実にするために、腫瘍ＤＮＡが得られるのと同一の個体の正常組織由来のＤＮＡを使用するのが好ましい。
【００２６】
当該方法およびキットは、個体の正常組織由来のＤＮＡのマルチプレックス増幅の結果を同一の個体からの他の生体物質由来のＤＮＡのマルチプレックス増幅の結果を比較するために使用可能でもある。正常細胞との比較により腫瘍細胞中のＭＳＩを検出するための本発明の方法のこの特定の実施態様の使用は、図１に示されている。具体的には、図１は、ポリメラーゼ鎖反応（「ＰＣＲ」）においてプライマー対（「プライマーＡ」および「プライマーＢ」）により増幅し、次にキャピラリー電気泳動を用いてサイズにより増幅した対立遺伝子の分離し、そしてＧｅｎｅＳｃａｎ（登録商標）ソフトウェアを用いて分画して増幅対立遺伝子をプロットしたテトラヌクレオチド反復（ＧＡＴＡ）を示している。正常ＤＮＡ由来の増幅ＤＮＡのプロットにおいては、２つの対立遺伝子および小さなスタッターのピークしか現われないものの、増幅された腫瘍ＤＮＡのプロットにおいては、２つの対立遺伝子のピークに加えて３つのＭＳＩのピークが現われることが、注目される。
【００２７】
本発明の特別な特性の利点および更なる理解は、以下に続く図面、好ましい実施態様の詳細な説明、および添付の請求項を審査する際に得られるであろう。図面は説明と表示のみの目的であって、本発明を制限することを明確にする目的がないことは、はっきりと理解されるべきである。
【００２８】
図面の簡単な説明
図１は、マイクロサテライト不安定性分析を示す図である。図は、同一のゲノムＤＮＡの２つの対立遺伝子上のテトラヌクレオチド遺伝子座に対してアニールされたプライマー対の図、および正常対腫瘍組織起源のＤＮＡのテトラヌクレオチド遺伝子座の増幅産物のキャピラリー電気泳動の結果のプロットの表である。腫瘍組織由来の増幅ＤＮＡのプロットにおいて、ＭＳＩピークが示されている。
図２は、観察されるスタッターの量に対するマイクロサテライト反復単位の長さの影響を示す図である。図は、ゲノムＤＮＡの２つの異なる対立遺伝子上のテトラヌクレオチド反復遺伝子座に対してアニールされたプライマー対の図、および増幅されて、ゲルまたはキャピラリー電気泳動により分画化された様々な個体由来のヒトゲノＤＮＡから増幅されたモノ−、ジ−、トリ−、テトラ−、およびペンタ−ヌクレオチド反復遺伝子座の蛍光スキャンおよびプロットのセットを含む。
【００２９】
図３は、低スタッターのテトラヌクレオチド反復遺伝子座が高スタッターのジヌクレオチド反復遺伝子座よりも解釈が容易であることを示した図である。図は、正常対腫瘍組織起源の２つの異なるＤＮＡサンプルのセットの２つのテトラヌクレオチドおよび２つのジヌクレオチド反復遺伝子座の増幅産物のキャピラリー電気泳動の結果のプロットである。
図４は、選択されたテトラヌクレオチドおよびペンタヌクレオチド反復遺伝子座内のスタッターの量の変動を示した図である。図は、１３種のテトラヌクレオチドおよび５種のペンタヌクレオチド反復遺伝子座において見られるスタッターの割合の変動を示すプロットである。四角はスタッターの割合の平均を、線は各遺伝子座について見られるスタッターの範囲を示している。
【００３０】
図５は、マイクロサテライト不安定性の頻度に対するテトラヌクレオチド反復マーカーのスクリーニングの結果を示している。全部で２７３個のマーカーのうち、特定の％ＭＳＩを呈するマイクロサテライト遺伝子座の数をプロットしている。例えば、およそ１５の遺伝子座が、評価されたＭＳＩ−Ｈ腫瘍サンプルの１００％が改変されていた。
図６は、マイクロサテライト不安定性の頻度に対するペンタヌクレオチド反復マーカーのスクリーニングの結果を示したものである。図は、９個のＭＳＩ−Ｈのセット及び３０個のＭＳＳ腫瘍のセットにおける８種のテトラヌクレオチド反復遺伝子座のそれぞれについて見られる％ＭＳＩをプロットしたものである。
【００３１】
図７は、ＭＯＮＯ−１５マーカーを用いたマイクロサテライト不安定性分析である。図は、４例の異なる個体起源の正常および腫瘍サンプルのペアの４種セット由来のＤＮＡのＭＯＮＯ−１５遺伝子座の増幅産物のキャピラリー電気泳動から作成されたプロットである。
図８は、９つの遺伝子座のＭＳＩマルチプレックスを用いた５９の大腸癌サンプルにおける％ＭＳＩである。９つの遺伝子座ＭＳＩマルチプレックス（Ｄ１Ｓ５１８、Ｄ３Ｓ２４３２、Ｄ７Ｓ１８０８、Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ７Ｓ９０７０、Ｄ１０Ｓ１４２６、ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、およびＭＯＮＯ−１５）を用いて５９の大腸癌サンプル（２９のＭＳＨおよび３０のＭＳＩ−ＬまたはＭＳＳサンプル）において見られる％ＭＳＩのプロットである。
【００３２】
図９は、９つの遺伝子座ＭＳＩ多型を用いた蛍光マルチプレックスマイクロサテライト分析である。図は、図８で使用された９つの遺伝子座ＭＳＩマルチプレックスを用いて正常で癌性ではないヒトゲノムのマルチプレックス増幅産物のキャピラリー電気泳動から作成されたプロットである。
図１０は、９つの遺伝子座のＭＳＩマルチプレックスを用いた大腸癌サンプルにおけるマイクロサテライト不安定性の検出を示す図である。図は、図８で使用された９つの遺伝子座のＭＳＩマルチプレックスを用いて、正常および大腸腫瘍サンプルのペア由来のＤＮＡのマルチプレックス増幅産物のキャピラリー電気泳動から作成されたプロットである。
【００３３】
図１１は、異なる個人からの正常および大腸癌サンプルの対の異なるサンプルを用いて作成された、９つの遺伝子座のＭＳＩマルチプレックスを用いた大腸癌サンプルにおけるマイクロサテライト不安定性の検出を示す図が、図１０で示されるプロットと同じ型であることを示している。
図１２は、９つの遺伝子座のＭＳＩマルチプレックスを用いた胃癌サンプルにおけるマイクロサテライト不安定性の検出を示す図である。図は、図８で使用された９つの遺伝子座のＭＳＩマルチプレックスを用いて、正常および胃癌の腫瘍サンプルのペア由来のＤＮＡのマルチプレックス増幅産物のキャピラリー電気泳動から作成されたプロットである。
図１３は、９つの遺伝子座のＭＳＩマルチプレックスを用いたパラフィン包埋組織のマイクロサテライト分析を示す図である。図は、図８で示される９つの遺伝子座のＭＳＩマルチプレックスを用いて、パラフィン包埋組織由来のＤＮＡの多型増幅産物のキャピラリー電気泳動から作成されたプロットである。
【００３４】
本発明の詳細な説明
Ａ．定義
以下に示す定義は、本発明を記述し定義するために使用されるように、以下に示す用語の範囲および詳細の明確で一貫した理解の提供を支援することが意図されている。
本明細書で使用される、「対立遺伝子」なる用語は、特定の染色体配置（遺伝子座）での遺伝子またはＤＮＡ配列の幾つかの選択的形態の１つをいう。常染色体遺伝子座のそれぞれで個々に２つの対立遺伝子を有し、１つは父親から遺伝子１つは母親から遺伝する。
【００３５】
本明細書で使用される、「増幅する」なる用語は、例えばゲノムＤＮＡといった核酸のある特定の遺伝子座の多数のコピーを作成する工程をいう。増幅は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓａｉｋｉ， Ｒ． Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， １９８５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０： １３５０−１３５４）、転写ベースの増幅（Ｋｗｏｈ， Ｄ． Ｙ．， ａｎｄ Ｋｗｏｈ， Ｔ． Ｊ．， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｏｃｔｏｂｅｒ， １９９０）、および鎖置換増幅（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒ， Ｇ． Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， １９９２ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃｄ． Ｓｃｉ．， Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９： ３９２−３９６）を含むがそれらに限定されない多数の既知の手段の任意の１つを用いて達成可能である。
本明細書で使用される、「同時増幅する」なる用語は、１回の増幅反応において、同じ容器中で２以上の遺伝子座の多数のコピーを作成する工程をいう。
【００３６】
本明細書で使用される、「ＤＮＡ多型」なる用語は、集団の中の特定の遺伝子座に対して２以上の対立遺伝子が存在することをいう。本明細書で使用される、「座」または「遺伝子座」なる用語は、個々の遺伝子またはＤＮＡの配列の位置を特定する固有の染色体配置をいう。本明細書で使用される、「遺伝子座特異的なプライマー」なる用語は、一定の遺伝子座またはその相補的な鎖と少なくともその遺伝子座の１つの対立遺伝子に対して特異的にハイブリダイズし、増幅法において使用される条件下で他のＤＮＡ配列とは効率的にハイブリダイズされないプライマーをいう。
【００３７】
本明細書で使用される、「ヘテロ接合性の消失」（これ以降、「ＬＯＨ」）なる用語は、個体が継続的にヘテロ接合性であるためのマーカーについてのアッセイにより検出される１つの染色体上での対立遺伝子の消失をいう。具体的には、特定の被検者からのゲノムＤＮＡの２種のサンプル、１つのサンプルは、正常な生体物質起源であって、他方は腫瘍または前癌状態の組織起源のサンプルの増幅においてＬＯＨを見ることができる。正常な生体物質由来のＤＮＡが２つの異なる長さの増幅対立遺伝子を産生し、腫瘍サンプルが同じ遺伝子座での２種の長さの増幅対立遺伝子のうちの１つだけを産生するならば、その腫瘍はＬＯＨを示す。
【００３８】
本明細書で使用される、「マイクロサテライト遺伝子座」なる用語は、（１）〜（７）、より好ましくは（１）〜（５）、最も好ましくは（１）〜（４）の塩基対の短くて反復型の配列要素を全長内に含むゲノムＤＮＡの領域をいう。マイクロサテライト遺伝子座内で少なくとも１度反復された各配列は、本明細書においては「反復単位」という。各マイクロサテライト遺伝子座は、好ましくは７個の反復単位、より好ましくは少なくとも１０個の反復単位、最も好ましくは少なくとも１２個の反復単位を含む。
【００３９】
本明細書で使用される、「マイクロサテライト不安定性」（これ以降、「ＭＳＩ」）なる用語は、特定の被験者の特定の組織、細胞、体液から得られるゲノムＤＮＡの対立遺伝子が全長においてマイクロサテライト遺伝子座で変化する遺伝的不安定性の形態をいう。具体的には、特定の被験者由来のゲノムＤＮＡの２種のサンプル、例えば健常および癌性の組織由来のＤＮＡの増幅の際にＭＳＩを見ることが可能で、正常のサンプルは１または２つの異なる長さの対立遺伝子を産生し、腫瘍サンプルは、当該遺伝子座で対立遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＤＮＡの正常サンプルの増幅対立遺伝子と長さの異なる増幅対立遺伝子を産生する。ＭＳＩは一般的には、マイクロサテライト遺伝子座での少なくとも１つの反復単位の挿入または欠失の結果として現れる。
【００４０】
本明細書で使用される、「ＭＳＩ−Ｈ」なる用語は、高頻度のＭＳＩを有するとして腫瘍を分類するのに使用される用語である。ＨＮＰＣＣの検出において使用される１９９８年に米国国立癌研究所でＨＮＰＣＣに関するワークショップにより選ばれた５つのマイクロサテライト遺伝子座といった５つのマイクロサテライト遺伝子座を分析する場合、その遺伝子座のうちの少なくとも２つが不安定性を示すときには、腫瘍はＭＳＩ−Ｈとして分類される（Ｂｏｌａｎｄ， １９９８ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８： ５２４８−５２５７）。５つ以上のマイクロサテライト遺伝子座を分析する場合、腫瘍起源のゲノムＤＮＡのマイクロサテライト遺伝子座の少なくとも３０％が不安定であると見出されるときには、腫瘍はＭＳＩ−Ｈとして分類される。
【００４１】
本明細書において使用される「ＭＳＩ−Ｌ」なる用語は、低頻度のＭＳＩを有するとして腫瘍を分類するのに使用される用語である。ＨＮＰＣＣの検出において使用される１９９８年に米国国立癌研究所でＨＮＰＣＣに関するワークショップにより選ばれた５つのマイクロサテライト遺伝子座といった５つのマイクロサテライト遺伝子座を分析する場合、その遺伝子座の１つだけが不安定性を示すときには、腫瘍はＭＳＩ−Ｌとして分類される。５つ以上のマイクロサテライト遺伝子座が分析される場合、腫瘍起源のゲノムＤＮＡのマイクロサテライト遺伝子座の３０％未満が不安定であると見出されるときには、腫瘍はＭＳＩ−Ｌとして分類される。ＭＳＩ−Ｌ型の腫瘍は、ＭＳＩ−Ｈ型の腫瘍より潜在的に別の分子的原因を有する明確な当然遺伝子誘発因子フェノタイプを示すと考えられている（Ｔｈｉｂｏｄｅａｕ， １９９８； Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６５： １２９１−１２９８）。ＭＳＩ−ＨおよびＭＳＩ−Ｌフェノタイプを正確に区別するために、５つ以上のマイクロサテライトマーカーが分析されることが推奨されている（Ｂｏｌａｎｄ， １９９８， 上述； Ｆｒａｚｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９０ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６： ４９７−５０５）。
【００４２】
本明細書で使用される、「ＭＳＳ」なる用語は、どのマイクロサテライト遺伝子座も不安定性を示さないときの、マイクロサテライト安定性である腫瘍をいう。ＭＳＩ−ＬとＭＳＳとの区別は、５つよりも有意に多い数のマーカーを使用するときにだけ達成可能でもある。この目的で、および上述のようにＭＳＩ−ＨとＭＳＩ−Ｌの区別をより明確にする目的で、米国国立癌研究所は、更に１９のモノ−およびジ−ヌクレオチド反復遺伝子座の使用を推奨した（Ｂｏｌａｎｄ， １９９８， 上述）。
本明細書で使用される、「ＭＳＩ−Ｌ／Ｓ」なる用語は、ＭＳＩ−ＬかＭＳＳのいずれかとして分類されたすべてをいう。
本明細書で使用される、「マイクロサテライトマーカー」なる用語は、マイクロサテライト反復およびその反復領域に隣接する核酸配列を含むゲノムＤＮＡのフラグメントをいう。
【００４３】
本明細書で使用される、「単型」なる用語は、１つの対立遺伝子パターンのみが、集団のすべての構成要素の正常なゲノムＤＮＡにおいて存在することが見出されたゲノムＤＮＡの遺伝子座をいう。
本明細書で使用される、「ヌクレオチド」なる用語は、ＤＮＡ分子の塩基単位をいい、ホスファチジル骨格および４つの塩基、アデニン（「Ａ」）；チミン（「Ｔ」）；グアニン（「Ｇ」）；およびシトシン（「Ｃ」）のうちの１つからなる１単位を含む。
本明細書で使用される、「ポリメラーゼ鎖反応」または「ＰＣＲ」なる用語は、変性、プライマーを用いたアニーリング、およびＤＮＡポリメラーゼを用いた伸長のサイクルを、およそ１０６倍またはそれ以上に目的のＤＮＡのコピーの数を増幅するために使用する技術をいう。核酸を増幅するためのポリメラーゼ鎖反応工程は、米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号に示され、これらは当該工程の詳細を出典明示で本明細書の一部とする。
【００４４】
本明細書で使用される、「プライマー」なる用語は、１本鎖オリゴヌクレオチドまたはＤＮＡフラグメントをいい、ＤＮＡポリメラーゼ酵素を用いるポリマー化の部位としてプライマーの３’末端が作用するようにして目的のＤＮＡの遺伝子座のストランドとハイブリダイズする。
本明細書で使用される、「プライマー対」なる用語は、目的のＤＮＡ分子の対向するストランド、増幅されるべきヌクレオチド配列に隣接する目的のＤＮＡ領域にハイブリダイズするプライマー対をいう。
本明細書で使用される、「プライマー部位」なる用語は、プライマーがハイブリダイズする目的のＤＮＡの区域をいう。
【００４５】
本明細書で使用される「準単型」なる用語は、１つの対立遺伝子パターンのみが、集団のほとんどすべての構成要素の正常なゲノムＤＮＡにおいて存在することが見出されたゲノムＤＮＡの遺伝子座をいう。
本明細書で使用される、「スタッター」なる用語は、マイクロサテライト遺伝子座の増幅後に見られるマイナーなフラグメントをいい、主要なフラグメントまたは対立遺伝子よりも小さい１以上の反復単位長さである。それは、増幅工程中のＤＮＡポリメラーゼのずれ現象に起因する結果と考えられている（Ｌｅｖｉｎｓｏｎ ＆ Ｇｕｔｍａｎ， １９８７ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｌｇｙ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ４： ２０３； Ｓｃｈｌｏｔｔｅｒｅｒ ａｎｄ Ｔａｕｔｚ， １９９２ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０： ２１１）。
【００４６】
Ｂ．増幅または同時増幅されるべき遺伝子座の選択
本明細書に説明され示された本発明の各実施態様において増幅または同時増幅されるＭＳＩ遺伝子座の少なくとも１つは、モノヌクレオチド反復遺伝子座である。そのような遺伝子座は、機能障害性ＤＮＡミスマッチ修復系（Ｐａｒｓｏｎｓ．， １９９５， 上述）により腫瘍において非常に改変しやすく、そのようなと遺伝子座は特に癌および機能障害性ＤＮＡミスマッチ修復系に関係した他の疾病の検出に有益となることを示している。リサーチャーの１グループは、１つのモノヌクレオチド反復遺伝子座、ＢＡＴ−２６を増幅し、分析することにより、１６０例の腫瘍サンプルのうちの１５９例（９９．４％の精度）のＭＳＩ−Ｈ状態を正確に確認することが可能であることを報告した（Ｈｏａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５７： ３００−３０３）。
【００４７】
ＢＡＴ−２６を含むいくつかのモノヌクレオチド反復遺伝子座は、準単型特性を有するとしても特定されている。単型または準単型特性により、正常サンプルからのＰＣＲ産物は、一般的にはすべて同じサイズであり、腫瘍サンプルにおけるいかなる改変も容易に特定されることから、正常／腫瘍ペアの比較がより簡単になる。
【００４８】
ゲノムＤＮＡの分析においてモノヌクレオチド反復遺伝子座を用いることに対する主要な欠点は、そのような任意の遺伝子座の増幅の結果、増幅反応中に非常に多くの様々な長さの外来性のＤＮＡの増幅フラグメント、すなわち「スタッター」が産生することである。反復単位を更に長くするにつれて増幅される遺伝子座産物においてそのような人為産物（ａｒｔｉｆａｃｔ）の存在は少なくなっていく。反復単位の長さと外来性の増幅フラグメントとの間の関係の説明には図２が参照される。図２は、ペンタヌクレオチドからモノヌクレオチド反復遺伝子座へと反復単位長さが減少するにつれて、スタッター人為的産物が増えることを示している。
【００４９】
しかしながら、モノヌクレオチド遺伝子座が単型または準単型である場合、大量のスタッターの存在中でさえも、ＭＳＩを示す対立遺伝子のサイズのシフトを容易に検出することが可能である。遺伝子座が準単型である場合、一集団の中における当該遺伝子座で最も一般的に見られる対立遺伝子のサイズに対してマイクロサテライト不安定性を示す疑いのある、腫瘍組織または体液といった個々の生体物質由来のゲノムＤＮＡから増幅された対立遺伝子の比較により、サイズのシフトが検出可能である。この特徴により、１本鎖または標準的な対立遺伝子パターンのパネルを使用して個々の結果を分析し、個人の特定のゲノムＤＮＡにおいてマイクロサテライト不安定性を検出するために個人から採取されねばならないサンプルの量を最小限に抑えることが可能となる。
【００５０】
本発明の方法において、またはキットを用いて増幅されたマイクロサテライト遺伝子座の少なくとも１つは、好ましくはものヌクレオチド反復遺伝子座であり、より好ましくは準単型のモノヌクレオチド反復遺伝子座である。本発明の方法およびキットにおいて使用するために選ばれるモノヌクレオチド反復遺伝子座は、癌性の生体物質中では不安定であるが、正常な生体物質中では不安定でないのが好ましい。ＢＡＴ−２５およびＢＡＴ−２６は、遺伝性非腺腫症性大腸癌の大腸腫瘍の特性においてＭＳＩの特定に有益なモノヌクレオチド反復遺伝子座として特定されている（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， １９９８ Ｇｅｎｅｓ， Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ＆ Ｃａｎｃｅｒ ２１： １０１−１０７； Ｄｉｅｔｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５７： ４７４９−４７５６； Ｈｏａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５７： ３００−３０３）。ＭＯＮＯ−１１およびＭＯＮＯ−１５として本明細書で特定される２つの更なる遺伝子座は、配列情報の公的にコンピューター化されたデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ）を探索して同定され、当該遺伝子座については、上述で特定される好ましい特性を有することが見出された。本発明で使用するのに好適なモノヌクレオチド反復遺伝子座の特定のための探索は、実施例２において説明される。本発明の方法およびキットにおいて使用するのに好適な他のモノヌクレオチド反復遺伝子座を同定するのに、同様の技術が使用可能となった。
【００５１】
本発明の方法に従って、または本発明のキットを用いて増幅または同時増幅されたモノヌクレオチド反復遺伝子座は、準単型であって、特定の用途に関係する種類の組織において不安定性を示すのが好ましい。ＭＯＮＯ−１１およびＭＯＮＯ−１５は、本発明の方法およびキットにおいて特に有益である。両方の遺伝子座とも準単型であって、幾つかの癌性の腫瘍組織において不安定性を示す。少なくとも１つ、より好ましくは少なくとも２つのモノヌクレオチド反復マイクロサテライト遺伝子座が本発明の方法において増幅または同時増幅される。
【００５２】
少なくとも１つのモノヌクレオチド反復遺伝子座および少なくとも２つのテトラヌクレオチド反復遺伝子座を、本発明の方法およびキットを示す少なくとも幾つかの実施態様に従って同時増幅され、分析される。テトラヌクレオチド反復遺伝子座は、比較的短い反復単位を有するマイクロサテライト遺伝子座と比較して、特にモノおよびジヌクレオチド遺伝子座と比較して、増幅時に遺伝的にほとんどスタッター人為産物を産生しない（例えば、図２参照）。そのような人為産物は、シフトした対立遺伝子が第２の対立遺伝子のスタッター部位で発生するならば、ＭＳＩと区別が困難となり得る。従って、解釈に関する問題、およびデータ解釈を可能にするために準単型である必要性は、モノヌクレオチド反復遺伝子座についてと同様に存在しない。実際、個々の被験者内で安定であれば、集団において非常に多型であるテトラヌクレオチド反復遺伝子座を使用することさえ可能である。そのような遺伝子座は、一般的にはＤＮＡ分類に使用される。
【００５３】
本発明の任意の方法において、または任意のキットを用いて増幅されるべきいかなる遺伝子座とも同様に、テトラヌクレオチド反復遺伝子座は、目的の生体物質の種類以外の個々のＤＮＡにおいて安定であることに基づいて選ばれるのが好ましい。本発明の方法およびキットにおいて使用される好ましいテトラヌクレオチド反復遺伝子座としては：ＦＧＡ、Ｄ１Ｓ５１８、Ｄ１Ｓ５４７、Ｄ１Ｓ１６７７、Ｄ２Ｓ１７９０、Ｄ３Ｓ２４３２、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ５Ｓ２８４９、Ｄ６Ｓ１０５３、Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ７Ｓ１８０８、Ｄ７Ｓ３０７０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ９Ｓ２１６９、Ｄ１０Ｓ１４２６、Ｄ１０Ｓ２４７０、Ｄ１２Ｓ３９１、Ｄ１７Ｓ１２９４、Ｄ１７Ｓ１２９９、およびＤ１８Ｓ５１が挙げられる。
【００５４】
上述と同じ好ましい基準を有する更なるモノヌクレオチドまたはテトラヌクレオチドが、上述の少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを用いて同時増幅されるのが好ましい。しかしながら、モノヌクレオチド反復またはテトラヌクレオチド反復遺伝子座以外のマイクロサテライト遺伝子座が、本発明の方法に従って、またはキットを用いて同時増幅され、分析される少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットに含まれ得ると考えられる。
【００５５】
本発明の方法に従って、またはキットを用いて同時増幅され、分析される遺伝子座および遺伝子座のセットの選択の好ましい方法は、以下の明細書において更に議論される。しかしながら、本発明の方法および材料がいったん開示されると、本発明の方法およびキットにおいて使用される遺伝子座、プライマー対、および増幅技術の選択の更なる方法が、当業者に対し示唆される可能性がある。そのような方法はすべて、添付の請求の範囲の範疇であるものと意図される。
【００５６】
Ｃ．遺伝子座の更なるスクリーニング
本発明の方法またはキットが、疾病の処置および予後診断を決定するために使用される臨床診断アッセイにおいて使用されることになる場合、それが非常に正確（偽陰性が低い）で特異的（偽陽性率が低い）である結果をもたらすようにデザインされる。有益なマイクロサテライト遺伝子座が、好ましくはスクリーニングにより、より好ましくは非常に大規模なスクリーニングにより特定される（実施例１および２参照）。しかしながら、最も有益なマイクロサテライト遺伝子座でさえも、１００％の感度で１００％特異的ではない。
【００５７】
癌性腫瘍といった、特定の疾患と関係する組織におけるＭＳＩの存在の検出時の個々のマーカーの強度は、多数のマーカーをマルチプレックス化することにより多大に増大させることが可能となる。より多数の遺伝子座を増幅し、分析することにより得られる情報の増加の結果、テスト結果の解釈における信頼性および精度が増す。癌といった疾患を検出したり、診断したりするうえで必要とされる感度を得るために、５以上の非常に有益なマイクロサテライト遺伝子座を分析することが推奨されてきた（Ｂｏｌａｎｄ， １９９８ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８： ５２４８−５２５７）。マイクロサテライト遺伝子座のマルチプレックス化は、複数の遺伝子座のすべてを同時に増幅および分析させることによりＭＳＩ分析を更に簡単にする一方、増幅に必要とされるしばしば限られたＤＮＡの量を減少させる。
【００５８】
ＭＳＩ決定における別の一般的な問題は、低率のマイクロサテライトマーカーしか（＜３０％）が腫瘍に改質しない中間型のＭＳＩフェノタイプの発生に関連する（Ｂｏｌａｎｄ， １９９８， 上述）。これらの低ＭＳＩの腫瘍は、ＭＳＩ−Ｈ腫瘍よりも潜在的に異なる分子原因を有する別個の突然変異誘発遺伝子フェノタイプを示すと考えられている（Ｔｈｉｂｏｄｅａｕ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０： ８１６−８； Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６５： １２９１−１２９８； Ｋｏｌｏｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９ Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ５９： ５０６８−５０７４； Ｗｉｊｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９ Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２３： １４２−１４４）。しかしながら、ＭＳＩ−ＬとＭＳＳ腫瘍との間に本当に違いがあるかどうかは明らかではない。診断の目的で、ＭＳＩ−ＬおよびＭＳＳ腫瘍は、一般的には１つの安定なフェノタイプのクラスとして考えられている。ＭＳＩ−ＨとＭＳＩ−Ｌフェノタイプを正確に区別するために、多数のマイクロサテライトマーカーが分析されることが推奨されている（Ｂｏｌａｎｄ， １９９８； Ｆｒａｚｅｒ， １９９９， 上述）。
【００５９】
遺伝子座がマルチプレックス増幅反応で同時増幅され分析されることになる場合、データ解釈の容易さおよび精度を含めて、更なる因子が考慮に入れられる。正確なデータ解釈に影響を及ぼす主要な因子の１つは、ＰＣＲ中にマイクロサテライト遺伝子座で発生するスタッターの量である。ジヌクレオチドの様な比較的短い反復型よりも非常に少ないスタッターを示す（図２）ために、本発明の方法に従って、およびキットを用いて分析されるＭＳＩマルチプレックスに含めるためにテトラヌクレオチド反復遺伝子座が選ばれた。しかしながら、スタッターの％は特定の反復型内でさえ大きく変動し得る（図４）ために、低スタッターの遺伝子座を選ぶ際には、遺伝子座の注意深い選択がなおも必要である。目的の疾患の生体物質における高度な不安定性のために、個々の分析用におよびＭＳＩマルチプレックス化に含めるために、モノヌクレオチド反復遺伝子座が選ばれた。
【００６０】
ＬＯＨの発生は、本発明の方法またはキットにおいて増幅され、分析されるべきＭＳＩ遺伝子座の選択における別の因子である。ＬＯＨは、マイクロサテライトマーカーに対して他の新規なフラグメントが存在しない場合にＭＳＩの指標としてそのマーカーでなくなった正常な対立遺伝子の誤認の結果起こり得る。具体的には、これがシフトした対立遺伝子が残りの野生型の対立遺伝子と一緒に移動した本当のＬＯＨまたはＭＳＩを示しているかどうか容易には区別できない。上述の問題を最小限に抑えるために、本発明の方法およびキットにおいて使用するために選択されたマイクロサテライトマーカーは、好ましくは低頻度のＬＯＨ、好ましくは約２０％にしか過ぎないＬＯＨ、より好ましくは約１４％にしか過ぎないＬＯＨ、更に好ましくは約３％にしか過ぎないＬＯＨを呈する。
【００６１】
マイクロサテライトマーカーが必要とされる上述の属性（すなわち、高感度、高特異性、低スタッター、低ＬＯＨ）のすべてを有することは、比較的稀な出来事である。診断テストに使用されるべきＭＳＩ分析系の閾値は、更に高くなり、様々なサンプル由来の少量のＤＮＡを用いた１つのアッセイにおいて多数の遺伝子座からの強力で再現性のある結果が必要とされ、ＭＳＩ−ＬとＭＳＩ−Ｈのフェノタイプを区別することが可能となる。本発明で使用するのに好ましいとして上述の明細書で特定された特に好ましいモノおよびテトラヌクレオチドのすべては、上述の明細書で示される、診断分析に使用するために好適なＭＳＩ遺伝子座のそれぞれの閾値を満たしていることが見出されている。
本発明の遺伝子座の好ましいマルチプレックス分析法で、およびキットを用いて増幅した特に２つの基本的な種類のＭＳＩ遺伝子座に対して更なる遺伝子座選択域が、以下に示されている。
【００６２】
Ｄ．プライマーのデザイン
本発明の方法およびキットを示す各実施態様において、１以上のマイクロサテライト遺伝子座に対するプライマーが提供されている。各遺伝子座に対して少なくとも１つのプライマーが、より好ましくは各遺伝子座に対して少なくとも２つのプライマーが提供され、少なくとも２つのプライマーについては、その遺伝子座に隣接するプライマー対の形態となっている。そのプライマーがマルチプレックス増幅反応において使用される場合には、サイズがオーバーラップしない、またはサイズがオーバーラップすれば、オーバーラップしている対立遺伝子間を区別することが可能な方法で標識化した多数の同時増幅した遺伝子から増幅対立遺伝子を産生するプライマーおよび増幅条件を選択するのが好ましい。
【００６３】
好ましくは本発明の方法に従って同時増幅した個々の遺伝子座の増幅に好適なプライマーが、以下の明細書の実施例４、表９で提供される。９つの遺伝子座の好ましいマルチプレックスにおいて使用するのに好適なプライマー（すなわち、ＢＡＴ−２５、Ｄ１０Ｓ１４２６、Ｄ３Ｓ２４３２、ＢＡＴ−２６、Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ７Ｓ３０７０、ＭＯＮＯ−１５、Ｄ１Ｓ５１８、およびＤ７Ｓ１８０８）が、実施例６、表１１に示されている。このマルチプレックスおよび他のマルチプレックスをデザインするための指針が、以下に提供されている。本発明の範疇にある同じ遺伝子座または他の遺伝子座のセットを増幅するのに好適な他のプライマーが、当業者によって決定可能であるとが考えられている。
【００６４】
Ｅ．ＭＳＩマルチプレックスのデザインおよびテスト
本発明のマイクロサテライト遺伝子座のマルチプレックス分析法は、好ましくはサイズがオーバーラップしない、またはより好ましくはサイズがオーバーラップする様々な遺伝子座由来の対立遺伝子を区別可能とする方法で標識化された多数の同時増幅遺伝子座からの増幅対立遺伝子を産生するために遺伝子座の適当なセット、プライマー、および増幅プロトコールを選択することを考慮する。遺伝子座の組み合わせは、上述の２つの理由のいずれかのために、または組合せにおいて、遺伝子座の１以上が十分な生成量を産生しない、あるいは正式な対立遺伝子を示さないフラグメントがこの反応において産生されるために、却下されてもよい。
【００６５】
以下に示す因子は、本発明のマルチプレックスにおいてどの遺伝子座が含まれるかを決定する際に考慮にいれることが好ましい。マイクロサテライトのマルチプレックスを効率的にデザインするために、各遺伝子座での対立遺伝子に対するサイズ範囲が決定される。いかなるオーバーラップも別の遺伝子座で不安定として不適切に特定される１つの遺伝子座由来の対立遺伝子に起因し得ることから、この情報は、様々な遺伝子座すべての間の対立遺伝子の分離を容易にするために使用される。
【００６６】
モノヌクレオチドでない反復遺伝子座により示されるスタッターの量も；遺伝子座により示されるスタッターがデータ解釈の容易さおよび精度における主要な因子となり得ることから、考慮に入れられるのが好ましい。モノヌクレオチドでない反復遺伝子座のそれぞれについて存在するスタッターレベルを決定するために集団研究を実施するのが好ましい。上述に示すように、テトラヌクレオチド反復マーカーは、ジヌクレオチドのような比較的短い種類よりも非常に低いスタッターを示し、それゆえＭＳＩアッセイにおいて正確に記録可能である（図２および３）（Ｂａｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｍｍ， １９９８ Ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｉｎ ＤＮＡ ２（２）： ３−６）。低スタッターを示すと知られているテトラおよびペンタヌクレオチド反復遺伝子座といったマイクロサテライト遺伝子座のクラス内でさえ、スタッターの割合が反復型内で顕著に変動可能であることを留意すべきである（図３；図２もまた参照）（Ｍｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．， １９９９， 上述）。
【００６７】
少なくとも１つのモノヌクレオチドおよび少なくとも２つのテトラヌクレオチド反復遺伝子座は、本発明の方法に従って、またはキットを用いて同時増幅されたＭＳＩ遺伝子座のマルチプレックスに含まれるけれども、更なるモノヌクレオチドおよび／またはテトラヌクレオチド反復遺伝子座がそのマルチプレックスに含まれることが可能である。上述の閾値と同じまたは同等の閾値を満たすモノまたはテトラヌクレオチド反復遺伝子座以外のマイクロサテライト遺伝子座を、そのマルチプレックスに含めることもまた考慮される。
【００６８】
本発明に従った分析されたマルチプレックスは、好ましくは少なくとも３つのＭＳＩ遺伝子座のセットを含む。好ましくは少なくとも５つのＭＳＩ遺伝子座のセット、更により好ましくは少なくとも９つの遺伝子座のセットを含む。そのマルチプレックスが少なくとも９つの遺伝子座のセットである場合、それは以下に示す遺伝子座のセットであるのが最も好ましい：ＢＡＴ−２５、Ｄ１０Ｓ１４２６、Ｄ３Ｓ２４３２、ＢＡＴ−２６、Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ７Ｓ３０７０、ＭＯＮＯ−１５、Ｄ１Ｓ５１８、およびＤ７Ｓ１８０８。このマルチプレックスにおいて使用するのに好適なプライマーのリストは、以下の実施例６の表１１に提供される。
【００６９】
材料および方法の巧みな組み合わせといった別の因子が、ＭＳＩ遺伝子座のマルチプレックスをデザインする際に考慮に入れられることも考えられる。そのような更なる因子の決定は、本明細書に開示された以下の選択法およびガイドラインにより、および本発明の当業者に既知の技術を用いることにより決定可能である。具体的には、プライマー対配列を選択するために、および含まれる遺伝子座のすべてが増幅され得る平衡を特定するプライマー濃度を調節するために、以下の明細書に記載された好ましいＭＳＩ遺伝子座およびＭＳＩ遺伝子座のセットを特定するのに同じまたはほぼ同様の技術が使用可能である。言い換えると、本発明の方法および材料がいったん開示されると、本発明の方法およびキットで使用される遺伝子座、プライマー対、および増幅技術を示す様々な方法が当業者に示唆される可能性がある。そのような方法はすべて、本発明の請求項の範疇とすることが意図されている。
【００７０】
Ｆ．ゲノムＤＮＡの起源
本発明の方法に従って増幅または同時増幅されるゲノムＤＮＡは、個々の被験者、好ましくは哺乳類、より好ましくは犬、猫、馬、羊、マウス、ラット、ウサギ、サル、またはヒト由来、更により好ましくはヒトまたはマウス由来、および最も好ましくはヒト由来の生体物質起源である。生体物質は、ゲノムＤＮＡを含有する被験者由来の任意の組織、細胞、または生物流体であり得る。生体物質は、腫瘍細胞、播種性細胞、糞便、血液細胞、血漿、血清、リンパ節、尿、および他の体液からなる群から選ばれるのが好ましい。
【００７１】
生体物質は、ホルマリン中に固定され、パラフィン中に包埋された組織サンプルの形態（これ以降、「ＰＥＴ」）となり得る。生検からの組織サンプルは、一般的には長期間保存用にＰＥＴとして保管される。ホルマリンは、組織サンプル内に壊れにくくし得る架橋結合を作りだし、その結果、時にＤＮＡ収率が低くなる。ホルマリン固定し、パラフィン包埋したサンプルに関する別の問題は、比較的長いフラグメントの増幅であり、問題があることがしばしばである。そのようなサンプル由来のＤＮＡがマルチプレックス増幅反応において使用される場合には、フラグメントのサイズが大きくなるにつれて、ピーク高さの有意な減少が見られる。本発明のマイクロサテライト分析法およびキットは、ＰＥＴ組織サンプル由来のＤＮＡを増幅し、分析するためにデザインされるのが好ましい（本発明の方法を用いる当該サンプルの増幅の説明については実施例７参照）。
【００７２】
本発明の方法またはキットが、腫瘍の分析または検出に使用される場合、分析されるゲノムＤＮＡの少なくとも１つのサンプルは、腫瘍起源である。ＭＯＮＯ−１１またはＭＯＮＯ−１５といった単型または準単型の遺伝子座が増幅される場合は、その結果生成される増幅対立遺伝子のサイズは、一般的な集団において遺伝子座で最も一般的に見られる対立遺伝子のサイズに匹敵し得る。本発明の方法およびキットは、同じ個体由来のＤＮＡの少なくとも異なる２つのサンプルで同時増幅することにより腫瘍を診断したり検出したりするために使用されるのが好ましく、その２つのサンプルのうちの１つは、正常で癌性でない生体物質起源である。
本発明は、本発明の範囲を制限する方法により解釈されない以下に続く実施例で更に説明される。
【００７３】
実施例１：ＭＳＩの頻度についてのマイクロサテライトマーカーのスクリーニング
この実施例において、ＭＳＩを検出するために、腫瘍から単離されたＤＮＡにおけるマイクロサテライトマーカーを、正常な組織または細胞から単離されたＤＮＡにおけるマイクロサテライトマーカーと比較した。具体的には、ペアの正常／腫瘍ＤＮＡサンプルからマイクロサテライト遺伝子座を増幅し、遺伝子型を同定した。腫瘍ＤＮＡサンプルにおいて、同一の個体由来の正常サンプルにおいては見られなかった１以上の異なる対立遺伝子が存在するならば、ＭＳＩ陽性と記録された。ＭＳＩに対する特定のマーカーの相対感度を決定するために、変化の頻度についてジヌクレオチド、テトラヌクレオチド、およびペンタヌクレオチド反復マイクロサテライトマーカーを分析した。この実施例で使用された特定の方法についての詳細な説明は、以下の明細書において提供される。
【００７４】
組織およびＤＮＡの単離
３９人の患者に対する適合する正常（血液）および新生組織サンプルを、Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ（これ以降、「ＣＨＴＮ」）（Ｏｈｉｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｃｏｌｕｍｂｕｓ， ＯＨ）から得た。外科的切除後、組織サンプルを液体窒素中で冷凍し−７０℃で保存した。血液サンプルを吸引チューブを用いて静脈穿刺により回収した。血液および固体組織からのＤＮＡ抽出は、標準的なフェノール／クロロホルム法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）または製造プロトコールに従ってＱＩＡａｍｐ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒｉｔａ， ＣＡ）を用いるかのいずれかにより実施した。
【００７５】
ＰＣＲおよびマイクロサテライト分析
蛍光標識した２７５のマイクロサテライト遺伝子座由来のプライマーを、サンプルの正常／腫瘍ペア由来のテンプレートＤＮＡを増幅するために使用した。Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＣＨＬＣ／Ｗｅｂｅｒ Ｈｕｍａｎ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｓｅｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０からの２４５のテトラヌクレオチド反復マーカーを評価した（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， ＡＬ）。テトラヌクレオチドおよびペンタヌクレオチド反復マーカーに対する更なるプライマーのセットを、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）から得た（ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ（登録商標） １６ Ｓｙｓｔｅｍ が、Ｄ３Ｓ１３５８、ＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｐｅｎｔａ Ｅ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１６Ｓ５３９、ＣＳＦ１ＰＯ、Ｐｅｎｔａ Ｄ、ｖＷＡ、Ｄ８Ｓ１１７９、ＴＰＯＸ、およびＦＧＡ遺伝子座を含有する）。ペンタヌクレオチド反復マーカー、ＴＰ５３、Ｐｅｎｔａ Ａ、Ｐｅｎｔａ Ｂ、Ｐｅｎｔａ Ｃ、Ｐｅｎｔａ Ｄ、Ｐｅｎｔａ Ｅ、Ｐｅｎｔａ Ｆ、およびＰｅｎｔａ Ｇは、公的なデータベースからの配列データを用いて特注合成した（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）。比較目的で含まれるジヌクレオチドマーカー（Ｄ８Ｓ２５４、ＮＭ２３、Ｄ１８Ｓ３５、Ｄ５Ｓ３４６、ＴＰ５３ｄｉ、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ１Ｓ２８８３、Ｄ３Ｓ１６１１、Ｄ７Ｓ５０１）は、ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｍｓ（現在は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｇｒｏｕｐ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡとして営業している）から得た。
【００７６】
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｈｕｍａｎ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｓｅｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０からのマーカーを、マルチプレックス化して、以下に示す１０μｌのＰＣＲ反応液中でＤＮＡを２．５ｎｇ用いてＭＳＩについてスクリーニングした。他の遺伝子座は、以下に示すように２５μｌのＰＣＲ反応液中でＤＮＡを１ｎｇ用いてモノプレックスとして評価した。特に以下で示す場合以外は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（登録商標） ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００ Ｔｈｅｒｎｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いる際と同じ条件下ですべてのマーカーをＰＣＲ増幅した。ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ（登録商標） １６ Ｓｙｓｔｅｍ（技術マニュアルＴＭＤ第０１２番、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）からのマイクロサテライトマーカーおよびマイクロサテライトＲＥＲアッセイ系（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， 現在の Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｒｅｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡからの製品資料参照）からのジヌクレオチド反復マーカーを以下の製造プロトコールに従って分析した。
【００７７】
【表１】
2004530406.tif 000003
【表２】
2004530406.tif 000004
【表３】
2004530406.tif 000005
【００７８】
１μｌのＰＣＲ産物（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ マーカーを１Ｘ ＧｏｌｄＳＴ★Ｒ ＰＣＲバッファーで最初に１：４に希釈した）を、１μｌのＩｎｔｅｒｎａｌ Ｌａｎｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）および２４μｌの脱イオン化ホルムアミドと混合した。サンプルを９５℃で３分間加熱することにより変性させ、すぐに氷上で３分間氷冷した。増幅フラグメントの分離および検出は、以下の設定値を用いる使用者マニュアルにおいて推奨されている標準的なプロトコールを従って、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標） ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒで実施した：注入時間５秒、注入電圧１５ｋＶ、ラン電圧１５ｋＶ、ラン温度６０℃、およびラン時間２８分。
【００７９】
アッセイの解釈
正常および腫瘍の対立遺伝子サイズの同定は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）からの適切なエレクトロフェログラムを検討し、各遺伝子座について主要なピークを決定することにより達成した。それぞれが特定のマーカーに対してホモ接合性であるかまたはヘテロ接合性であるか次第である正常サンプルにおける各遺伝子座に対して１つまたは２つのピークまたは対立遺伝子が存在可能である。正常および腫瘍のペアに対する対立遺伝子パターンまたは遺伝子型を比較して、同一個体由来の正常サンプルには見られなかった１以上の異なる対立遺伝子が腫瘍ＤＮＡサンプル中に存在すれば、ＭＳＩ陽性と記録した。
【００８０】
評価したサンプル間およびマーカー間で、広範囲に及ぶ改変の頻度が見られた。ＭＳＩに関するＮＣＩワークショップにおいて推奨されたガイドライン（Ｂｏｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．， １９９８）を用いて、サンプルを改変の頻度に基づいて２つの群に分別した。腫瘍サンプルにおいてマーカーの３０〜４０％が改変を示しているサンプルをＭＳＩ−Ｈとして、＜３０〜４０％はＭＳＩ−Ｌとして分類した。改変のないサンプルは、マイクロサテライト安定性（ＭＳＳ）として分類した。ＭＳＩフェノタイプのこの定義に基づいて、９つのサンプルがＭＳＩ−Ｈとして分類され、残りの３０個がＭＳＩ−ＬまたはＭＳＳのいずれかとして分類された。
【００８１】
テトラ−およびペンタ−ヌクレオチド反復遺伝子座は、上述でスクリーニングされた遺伝子座のうち最小量のスタッターを呈した。テトラ−およびペンタ−ヌクレオチド反復遺伝子座で見られた％スタッターの結果のプロットについては図４参照。テトラヌクレオチド反復マーカーも、改変の頻度は様々であり、ＭＳＩ−Ｈ群においてＭＳＩは０〜１００％の範囲であった（図５）。一般的に、ペンタヌクレオチドマーカーは、低レベルのＭＳＩを示した（図６）。Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＭＮ）からの２０の正常／腫瘍の大腸癌サンプルを用いた更なる評価のために、ＣＨＴＮサンプルを用いてＭＳＩに対して高感度（ＭＳＩ−Ｈサンプルについて８８％＞のＭＳＩ）および高特異性（ＭＳＩ−ＬおよびＭＳＳサンプルについて８％＜のＭＳＩ）を示すマイクロサテライトマーカーを選択した（実施例５参照）。
【００８２】
実施例２：モノヌクレオチド反復遺伝子座の同定および特性評価
ＭＳＩフェノタイプを決定する際のモノヌクレオチド反復遺伝子座の高度に有益な特性のために、我々はまた、ＭＳＩアッセイに対するマーカーの新しい起源としてヒトゲノムのポリ（Ａ）領域を検討した。これを達成するために、モノヌクレオチド反復を、（Ａ）３０（Ｎ）３０配列についてのＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ｅｔ ａｌ．， １９９０ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０２−４１０）調査を用いてＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から同定した。高頻度のｍＲＮＡヒットを削減し、確実にフランキング配列がＰＣＲに対するプライマーをデザインするために利用可能とするために、（Ｎ）３０配列をを加えた。次に、ポリ（Ａ）反復を含む領域を増幅するために、Ｏｌｉｇｏ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ６．０（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ， ＭＮ）を用いて、フランキングプライマーを３３のＧｅｎＢａｎｋ ＤＮＡ配列に対してデザインした。遺伝子座の評価は、９個のＭＳＩ−Ｈおよび３０個のＭＳＳ大腸癌サンプルおよびそれに相当する正常ＤＮＡサンプルを用いて実施した。ＰＣＲ、検出、および分析についてのプロトコールは、実施例１に示されている。
【００８３】
２つの特性が、新しい遺伝子に対してスクリーニングされた。第１に、ＭＳＩ−Ｈ群においてＭＳＩが検出でき、ＭＳＳ群において検出できないかについて、遺伝子座をスクリーニングした。第２に、単型またはほぼ単型（偽単型）であることに基づいて、遺伝子座を選択した。新しい遺伝子座の単型の特性は、５つの人種集団（アフリカ系アメリカ人、アジア系アメリカ人、白人系アメリカ人、ヒスパニック系アメリカ人、インディアン系アメリカ人）からの９６サンプルの遺伝子型を同定することにより決定した。３３のモノヌクレオチド反復遺伝子座のスクリーニングにより、ＭＳＩに対して高感度を示し（表４および図７）、相対的にホモ接合性で単型である（表５）４つの新しいモノヌクレオチド反復遺伝子座（ＭＯＮＯ−３、ＭＯＮＯ−１１、ＭＯＮＯ−１５、およびＭＯＮＯ−１９）が明らかとなった。当該各遺伝子座で検出されたホモ接合性および単型の程度は表５に示されている。
【００８４】
【表４】
2004530406.tif 000006
【表５】
2004530406.tif 000007
【００８５】
実施例３：集団研究
集団研究を実施し、アフリカ系アメリカ人個人からの９３サンプルを、上述の実施例１および２において示された研究においてマルチプレックス化の候補として選択された好ましいマイクロサテライト遺伝子座を用いて遺伝子型を同定した。用いた増幅条件については下の表６および上の表３参照。この研究において増幅され、分析された遺伝子座のリストについては下の表７参照。更に、プールされたヒト多様性ＤＮＡサンプルおよびコントロールのＣＥＰＨ ＤＮＡ、１３３１−１および１３３１−２（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ， Ｃａｍｄｅｎ， ＮＪ）を、このスクリーニング集団に含めた。すべての人種グループにおいて見出される最も多様な遺伝子を含有するアフリカ系アメリカ人のサンプルを用いた。
【００８６】
２２の異なるマイクロサテライトマーカーを有する９６のサンプルのスクリーニングを容易にするために、選ばれたマーカーを３つの小さな群にマルチプレックス化した。下に示す条件を用いて個々のＤＮＡサンプルを増幅するために、マルチプレックス化プライマーのセットを使用した。
【表６】
2004530406.tif 000008
【００８７】
集団研究の結果を表７に要約する。対立遺伝子のサイズ範囲を決定するために各遺伝子座について最小および最大の対立遺伝子のサイズを同定した。スタッターの割合（％）を計算するために、スタッターバンドのピーク高さを本当の対立遺伝子により産生するピーク高さで割って、次に１００を乗じた。各遺伝子対について最小および最大のスタッター値、ならびに２０のランダムなサンプルから組み合わせた平均のスタッターの割合（％）を計算した。
【表７】
2004530406.tif 000009
【００８８】
実施例４：ＭＳＩマルチプレックスのデザイン
スタッターが最小で、ＬＯＨの発生が最も低いＭＳＩに対して高感度であるマルチプレックスＭＳＩアッセイ系を開発するために、下の表８に示す閾値を、ＭＳＩ分析において使用される可能性のある候補として上述の実施例において特定された遺伝子座をスクリーニングするために使用した。
【表８】
2004530406.tif 000010
下の表９に示された遺伝子座を、上の表８において示した特異性を満たす遺伝子座として同定した。
【表９】
2004530406.tif 000011
【００８９】
実施例５：ミスマッチ修復遺伝子の分析
マルチプレックスＭＳＩアッセイを開発する際に使用されるＭＳＩ−Ｈ腫瘍サンプルにおけるＭＳＩの根本的な原因を決定するために、ＭＬＨ１およびＭＳＨ２遺伝子についての蛋白発現レベルを検定した。８つのＭＳＩ−Ｈサンプル由来のパラフィン包埋組織の免疫組織化学分析を、Ｔｈｉｂｏｄｅａｕ ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８， １７１３−１７１８）で示されるように実施した。ＭＬＨ１およびＭＳＨ２遺伝子における蛋白発現の欠損が、高レベルのＭＳＩを呈する腫瘍サンプルにおいて予想され、機能障害性ミスマッチ修復系の指標となる。
【００９０】
ＭＳＩ−Ｈ腫瘍サンプルについての免疫組織学アッセイの結果を表１０に示す。
【表１０】
2004530406.tif 000012
【００９１】
実施例６：ＭＳＩマルチプレックスアッセイの開発およびバリデーション
本発明の方法に従って分析されるべきマルチプレックスをデザインする際に利用するために、最良の遺伝子座がいったん選ばれると、マルチプレックスＰＣＲに関する問題および遺伝子座間での非相補性を克服することは必要となる。このことは、注意深いプライマーデザインおよび、１セットのＰＣＲ条件を用いる同時増幅可能な遺伝子座を見つけるための大規模な試行錯誤が必要とされた。ぶつかる問題としては以下に示すことが挙げられた：（１）１回のＰＣＲ反応で多数のオリゴが混合される場合に起こるプライマー−プライマー相互作用、（２）特定の遺伝子での配列の制約によるプライマーデザインの制限（例えば、ＤＮＡ配列により許容されるアンプリコンの最小サイズ、プライマーの最適以下の％ＧＣ、均一なＰＣＲ条件下ですべてのプライマーに対してＴｍのバランスをとるのが困難であること、非特異的な増幅を最小限に抑えるために所望の温度プロファイルを有するプライマーを見出すことが困難であること、プライマーのヘアピン形成および自己二量化、ヒトゲノムにおける他の反復配列との相同性）、および（３）２５０ｂｐの制限されたサイズ範囲内での９個の遺伝子座すべての分離を可能にするマルチプレックスデザイン。
【００９２】
実施例１〜５に記載された３００近いマイクロサテライトマーカーの大規模な評価に基づいて、好ましいＭＳＩマルチプレックスアッセイ用に９つの遺伝子座が選ばれた（表１１）。３つの遺伝子座は、モノプレックス反復（ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、およびＭＯＮＯ−１５）で、６つはテトラヌクレオチド反復（Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ１０Ｓ１４２６、Ｄ１０Ｓ２４７０、Ｄ７Ｓ３０７０、Ｄ１７Ｓ１２９４、Ｄ７Ｓ１８０８）であった。これらの遺伝子座は腫瘍サンプルにおいてＭＳＩを決定するのに既知の最もよく知られた遺伝子座のセットを示している。この好ましい９つの遺伝子座のマルチプレックスを用いる２９のＭＳＩ−Ｈおよび３０のＭＳＩ−ＬまたはＭＳＳの大腸癌サンプルについてのＭＳＩ分析の結果は、図８に要約されている。
【００９３】
ＭＳＩマルチプレックスの典型的な例が、図９に示されている。画像は、選択された９個すべてのマイクロサテライト遺伝子座を同時増幅し、その後ＡＢＩ ３１０ ＣＥのいてＰＣＲ産物を分離することにより作成した。１つのキャピラリー（またはゲルレーン）中での９個すべてのマイクロサテライト遺伝子座の分離は、遺伝子座がサイズにおいてまたは異なる蛍光色素を使用することによりオーバーラップしないようにしたマルチプレックスをデザインすることにより達成した。様々なマルチプレックス遺伝子座に対するサイズ範囲は、以下に示すプロトコールに従ってＭＳＩマルチプレックスを用いてアフリカ系アメリカ人個人由来の９３サンプルの遺伝子型を同定することにより決定した。更に、プールされたヒト多様性ＤＮＡおよびコントロールのＣＥＰＨ ＤＮＡ、１３３１−１および１３３１−２（Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）を、スクリーニング集団に含めた。すべての人種グループにおいて見出される最も多様な遺伝子を含有するアフリカ系アメリカ人のサンプルを用いた。
【表１１】
2004530406.tif 000013
【００９４】
ＭＳＩマルチプルアッセイのプロトコール
同一個体から得た正常および腫瘍組織由来のテンプレートＤＮＡを、製造プロトコールに従って、ＱＩＡａｍｐ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒｔｉａ， ＣＡ）を用いて精製した。２５μｌの反応容量中で２ｎｇのテンプレートＤＮＡを、下の表１２に詳細を示したプロトコールを用いて、上述の表３で示したサイクルプロファイルを用いてＰＣＲ増幅した。
【表１２】
2004530406.tif 000014
【００９５】
１μｌのＰＣＲ産物を１μｌのＩｎｔｅｒｎａｌ Ｌａｎｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）および２４μｌの脱イオン化ホルムアミドと混合した。サンプルを９５℃で３分間加熱することにより変性させ、すぐに氷上で３分間氷冷した。増幅フラグメントの分離および検出は、以下の設定値を用いる使用者マニュアルにおいて推奨されている標準的なプロトコールを従って、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標） ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒで実施した：
【表１３】
2004530406.tif 000015
【００９６】
正常および腫瘍の対立遺伝子サイズの同定は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）からの適切なエレクトロフェログラムを検討し、各遺伝子座について主要なピークを決定することにより達成した。それぞれが特定のマーカーに対してホモ接合性であるかまたはヘテロ接合性であるか次第である正常サンプルにおける各遺伝子座に対して１つまたは２つのピークまたは対立遺伝子が存在可能である。正常および腫瘍のペアに対する対立遺伝子パターンまたは遺伝子型を比較して、同一個体由来の正常サンプルには見られなかった１以上の異なる対立遺伝子が腫瘍ＤＮＡサンプル中に存在すれば、ＭＳＩ陽性と記録した。ＭＳＩ分析についてデザインされたマルチプレックスを用いて得た結果の典型的な例が、大腸癌については図１０および１１に、そして胃癌については図１２に示されている。
【００９７】
実施例７：ＭＳＩマルチプレックスを用いたＰＥＴサンプル由来のＤＮＡの増幅  好ましいマルチプレックスのために選ばれたマイクロサテライト遺伝子座を、ホルマリン固定し、パラフィン包埋したサンプルからのＤＮＡの増幅能力を評価した。以下に示す修正した製造指示書に従って、ＱＩＡａｍｐ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒｉｔａ， ＣＡ）を用いて、ＰＥＴブロックから切り取った１０ミクロン立方の切片からＤＮＡを抽出した。７０℃に予熱した１００μｌのＱＩＡＧＥＮ ＡＥバッファーをカラムに添加し、５分間インキュベートし、遠心分離し、その後、第２の溶出液に対してカラムに再度アプライした。２μｌ（１００μｌのうち）の精製されたＤＮＡ溶液を、ＰＣＲ反応に対するテンプレートとして使用した。実施例６に記載の９つの遺伝子座マルチプレックス化プライマーを、ＰＥＴサンプルからＤＮＡを増幅するために使用した。その結果、ＭＳＩマルチプレックスが、難しくて一般的に使用されるＰＥＴサンプルからＤＮＡを増幅可能であることが示された（図１３）。
【００９８】
以上本発明は、ある程度具体的に示され例示されてきたものの、当業者には、記載の内容に変形、追加、および省略を含む様々な修正が成され得ることが理解されよう。従って、これらの修正もまた本発明に包含され、添付の請求項を適法に許容可能である最も広い解釈により専ら本発明の範囲が制限されることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、マイクロサテライト不安定性分析を示す図である。
【図２】図２は、観察されるスタッターの量に対するマイクロサテライト反復単位の長さの影響を示す図である。
【図３】図３は、低スタッターのテトラヌクレオチド反復遺伝子座が高スタッターのジヌクレオチド反復遺伝子座よりも解釈が容易であることを示したエレクトロフェログラムである。
【図４】図４は、選択されたテトラヌクレオチドおよびペンタヌクレオチド反復遺伝子座内のスタッターの量の変動を示した図である。
【図５】図５は、マイクロサテライト不安定性の頻度に対するテトラヌクレオチド反復マーカーのスクリーニングの結果を示したグラフである。
【図６】図６は、マイクロサテライト不安定性の頻度に対するペンタヌクレオチド反復マーカーのスクリーニングの結果を示したグラフである。
【図７】図７は、ＭＯＮＯ−１５マーカーを用いたマイクロサテライト不安定性分析を示すエレクトロフェログラムである。
【図８】９つの遺伝子座ＭＳＩマルチプレックスを用いて、５９の大腸癌サンプル（２９のＭＳＨおよび３０のＭＳＩ−ＬまたはＭＳＳサンプル）において見られる％ＭＳＩをプロットしたグラフである。
【図９】９つの遺伝子座ＭＳＩ多型を用いた蛍光マルチプレックスマイクロサテライト分析を示すエレクトロフェログラムである。
【図１０】９つの遺伝子座ＭＳＩマルチプレックスを用いた大腸癌サンプルにおけるマイクロサテライト遺伝子座の検出を示すエレクトロフェログラムである。
【図１１】９つの遺伝子座のＭＳＩマルチプレックスを用いた大腸癌サンプルにおけるマイクロサテライト不安定性の検出を示すエレクトロフェログラムである。
【図１２】９つの遺伝子座のＭＳＩマルチプレックスを用いた胃癌サンプルにおけるマイクロサテライト不安定性の検出を示すエレクトロフェログラムである。
【図１３】９つの遺伝子座のＭＳＩマルチプレックスを用いたパラフィン包埋組織のマイクロサテライト分析を示すエレクトロフェログラムである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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