(57)【要約】本発明は、グラム陽性細菌のゲノムを修飾する方法、該細菌、および新規ベクターに関する。本発明は詳しくは、条件付きで負に優性の作用を有する新規マーカー遺伝子を使用して、コリネバクテリア（corynebacteria）またはブレビバクテリア（brevibacteria）を修飾する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的生物中で複製しないプラスミドベクターであって
、以下の成分：
a）大腸菌（E. coli）の複製開始点、
b）１つ以上の遺伝子マーカー、
c）任意に、接合によりDNA移行を可能にする配列セクション（mob）、
d）標的生物の配列に相同的であり、標的生物中での相同的組換えを仲介する配列セクション、
e）プロモーターの制御下にあるバチルス・アミロリクエファシエンス（B. amyloliquefaciens）からのsacB遺伝子
を有するプラスミドベクター。
【請求項２】
遺伝子マーカーは抗生物質耐性を仲介する、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項３】
プロモーターは異種である、請求項１または２のいずれか１項に記載のプラスミドベクター。
【請求項４】
成分c)が存在する、請求項１から３のいずれか１項に記載のプラスミドベクター。
【請求項５】
抗生物質耐性は、カナマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、またはアンピシリン耐性である、請求項１から４のいずれか１項に記載のプラスミドベクター。
【請求項６】
異種プロモーターは、大腸菌（E. coli）またはコリネバクテリウム・グルタミカム（C. glutamicum）に由来する、請求項１から５のいずれか１項に記載のプラスミドベクター。
【請求項７】
異種プロモーターはtacプロモーターである、請求項１から６のいずれか１項に記載のプラスミドベクター。
【請求項８】
グラム陽性細菌株のマーカーの無い突然変異誘発法であって：
a）請求項１記載のベクターの提供、
b）グラム陽性細菌へのベクターの移行、
c）１つ以上の遺伝子マーカーの選択、
d）ショ糖含有培地中でトランスフェクトしたクローンを培養することによる、トランスフェクトしたグラム陽性細菌の１つ以上のクローンの選択
を含む方法。
【請求項９】
グラム陽性細菌株は、ブレビバクテリウムまたはコリネバクテリウム属に由来する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
DNA移行は接合またはエレクトロポレーションにより起きる、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項８から１０のいずれか１項に記載の工程c)までの方法により得られる細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グラム陽性細菌のゲノムを修飾する新規方法、これらの細菌、および新規ベクターに関する。本発明は詳しくは、細菌において条件付きで負に優性の作用を有する新規マーカー遺伝子を使用して、コリネバクテリア（corynebacteria）またはブレビバクテリア（brevibacteria）を修飾する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）は、グラム陽性の好気性細菌であり、これは（他のコリネバクテリア、すなわちコリネバクテリウム（Corynebacterium）およびブレビバクテリウム（Brevibacterium）種のように）、工業的に多くのファインケミカル製品の製造、および炭化水素の分解やテルペノイドの酸化にも使用される（総説については、例えば、The Procaryotes（第２巻）、Balows, A.ら編、Springer、中の Liebl (1992) "The Genus Corynebacterium"を参照されたい）。
【０００３】
コリネバクテリアで使用されるクローニングベクターと、コリネバクテリウム・グルタミカム（C. glutamicum）および関連するコリネバクテリウムやブレビバクテリウム種の遺伝子操作法とが利用できるため（例えば、Yoshihamaら、J. Bacteriol. 162 (1985) 591-597；Katsumataら、J. Bacteriol. 159 (1984) 306-311；およびSantamariaら、J. Gen. Microbiol. 130 (1984) 2237-2246）、例えば、これらの微生物を１つ以上のファインケミカル製品の製造体としてより良好でより効率的にするために、これらの微生物の遺伝子修飾が可能である（例えば、遺伝子の過剰発現）。
【０００４】
コリネバクテリアで複製可能なプラスミドの使用は、この点で、熟練者には公知の充分確立された技術であり、広く使用されており、文献に何度も記載されている（例えば、Deb, J.K.ら (1999) FEMS Microbiol. Lett. 175, 11-20を参照）。
【０００５】
同様に、ゲノムのDNA配列の修飾により、コリネバクテリアの遺伝子修飾が起きることが可能である。ゲノム中にDNA配列を導入することは可能（新たに導入される、および／または存在する配列のさらなるコピーの導入）であり、また、ゲノムからDNA配列セクションを欠失させることも可能（例えば、遺伝子または遺伝子の部分）であるが、ゲノム中で配列交換（例えば、塩基交換）を行うことも可能である。
【０００６】
ゲノムの修飾は、細胞中で好ましくは複製されないDNAを細胞に導入し、この導入したDNAを、ゲノム宿主DNAと組換え、ゲノムDNAを修飾することにより行うことができる。この方法は、例えば van der Rest, M.E.ら、(1999) Appl. Microbiol. Biotechnol. 52: 541-545 および本明細書に記載の文献に記載されている。
【０００７】
使用される形質転換マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）は、さらなる形質転換実験で再使用することができるため、このマーカーを再度欠失させることができることが有利である。これを行う１つの可能性は、条件付きで負に優性の作用を有するマーカー遺伝子を使用することである。
【０００８】
条件付きで負に優性の作用を有するマーカー遺伝子とは、ある条件下で宿主にとって不利（例えば、毒性）であるが、他の条件下ではこの遺伝子を有する宿主に対して悪影響の無い遺伝子を意味する。文献からの例は、酵母または真菌からのURA3遺伝子であり、これは、ピリミジン生合成に必須の遺伝子であるが、培地中に5-フルオロオロチン酸が存在すると、宿主にとって不都合である（例えば、DE19801120、Rothstein, R. (1991) Methods in Enzymology 194: 281-301を参照）。
【０００９】
「pop-out」とも呼ばれる、DNA配列を欠失させるための条件付きで負に優性の作用を有するマーカー遺伝子（例えば、使用される形質転換マーカー、および／またはベクター配列や他の配列セクション）の使用は、例えばSchaferら、(1994) Gene 145: 69-73 または Rothstein, R. (1991) Methods in Enzymology 194: 281-301に記載されている。
【００１０】
枯草菌（Bacillus subtilis）からのsacB遺伝子は、酵素レバンスクラーゼ（EC2.4.1.10）をコードし、Steinmetz, M.ら、(1983) Mol. Gen. Genet. 191: 138-144、および Steinmetz, M.ら、(1983) Mol. Gen. Genet. 200:220-228に記載されている。枯草菌（Bacillus subtilis）からのsacB遺伝子が、条件付きで負に優性の作用を有するマーカー遺伝子として適していることは公知である（Gay, P. ら、(1985) J. Bacteriology 164: 918-921, Schaferら(1994) Gene 145: 69-73、EP0812918、EP0563527、EP0117823）。この選択法は、sacB遺伝子を有する細胞が５％ショ糖の存在下で増殖できないという事実に基づく。細胞の増殖は、レバンスクラーゼの喪失後または不活性化後にのみ起きる。次に、枯草菌（Bacillus subtilis）からのsacB遺伝子を発現することができる数種類のグラム陽性細菌の、10％ショ糖に対する耐性が、Jager, W.ら（1992) J. Bacteriology 174: 5462-5465により記載された。さらに、枯草菌（B. subtilis）からのsacB遺伝子を用いて、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）中で、遺伝子破壊の選択または相同的組換えによる対立遺伝子交換を行うことが可能であることが証明されている（Schaferら、(1994) Gene 145: 69-73）。
【００１１】
バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）からのsacB遺伝子（Tangら (1990) Gene 96: 89-93）は、コリネバクテリア中で条件付きで負に優性の作用を有するマーカー遺伝子として使用するのに、驚くほど特に適していることがわかった。sacBを使用する選択性は、異種宿主生物中の遺伝子発現の効率に依存する。バチルス・アミロリクエファシエンス（B. amyloliquefaciens）からのsacB遺伝子発現の高い効率は、この遺伝子を、好んで使用される遺伝子としている。
【発明の開示】
【００１２】
本発明は、条件付きで負に優性の作用を有する新規マーカー遺伝子として、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）からのsacB遺伝子を使用して、コリネバクテリア中の遺伝子配列を修飾するための、新規かつ簡単な方法を開示する。これは、核酸分子（例えば、完全な遺伝子）のゲノム組み込み、破壊（例えば、欠失または完全な破壊）、および配列修飾（例えば、単一のまたは複数の点突然変異、完全な遺伝子交換）でもよい。好適な破壊は、所望の発酵産物の副産物の減少を引き起こすものであり、好適な組み込みは、発酵産物への所望の代謝を増強し、および／またはボトルネックを縮小または排除（脱ボトルネック）するものである。配列修飾の場合は、適切な代謝適応が好ましい。発酵産物は、好ましくはファインケミカル製品である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は特に、標的生物中で複製しないプラスミドベクターであって、以下の成分：
a）大腸菌（E. coli）の複製開始点、
b）１つ以上の遺伝子マーカー、
c）任意に、特に接合によりDNA移行を可能にする配列セクション（mob）、
d）標的生物の配列に相同的であり、標的生物中での相同的組換えを仲介する配列セクション、
e）プロモーターの制御下にあるバチルス・アミロリクエファシエンス（B. amyloliquefaciens）からのsacB遺伝子
を有するプラスミドベクターに関する。
【００１４】
この意味で標的生物は、そのゲノム配列が修飾される生物を意味する。
【００１５】
本発明はさらに、グラム陽性細菌株のマーカーの無い突然変異誘発法であって：
a）上記のベクターの提供、
b）グラム陽性細菌へのベクターの移行、
c）１つ以上の遺伝子マーカーの選択、
d）ショ糖含有培地中でトランスフェクトしたクローンを培養することによる、トランスフェクトしたグラム陽性細菌の１つ以上のクローンの選択
を含む方法、および
工程c)までのこの方法により得られる細菌に関する。
【００１６】
プロモーターは好ましくは、バチルス・アミロリクエファシエンス（B. amyloliquefaciens）に対して異種であり、特に、大腸菌（E. coli）またはコリネバクテリウム・グルタミカム（C. glutamicum）由来であり、さらに特にtacプロモーターである。
【００１７】
標的生物で交換される配列は、特に、ファインケミカル製品の産生収率を上昇させるものである。このような遺伝子の例は、WO 01/0842、843および844、WO 01/804と805、WO 01/2583に記載されている。
【００１８】
標的生物中へのDNAの移行は、特に接合またはエレクトロポレーションにより可能になる。接合により標的生物中に移行されるDNAは、これを可能にする特殊な配列セクションを含む。このようないわゆるmob配列とその使用は、例えば、Schafer, A.ら(1991) J. Bacteriol. 172: 1663-1666に記載されている。
【００１９】
遺伝子マーカーは、選択可能な性質を意味する。抗生物質耐性、特にカナマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、またはアンピシリンに対する耐性が好ましい。
【００２０】
ショ糖含有培地は、特に５％未満、および10％（重量％）未満のショ糖を有する培地を意味する。
【００２１】
標的生物は、本発明の方法により遺伝子修飾される生物を意味する。好適な意味は、グラム陽性細菌であり、特にブレビバクテリウムまたはコリネバクテリウム属からの細菌株である。コリネバクテリアは、本発明の意味において、コリネバクテリウム種、ブレビバクテリウム種およびマイコバクテリウム（Mycobacterium）種を意味する。コリネバクテリウム種とブレビバクテリウム種が好ましい。コリネバクテリウム種とブレビバクテリウム種の例は、ブレビバクテリウム・ブレビス（Brevibacterium brevis）、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・ジフテリアエ（Corynebacterium diphtheriae）、コリネバクテリウム・ラクトフェルメンタム（Corynebacterium lactofermentum）である。マイコバクテリウム（Mycobacterium）種の例は、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、らい菌（Mycobacterium leprae）、ウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）である。
【００２２】
特に、以下の表に記載の株が好ましい。
表：コリネバクテリウムとブレビバクテリウム株：
【表１】
2004522450.tif 000002
2004522450.tif 000003
2004522450.tif 000004
2004522450.tif 000005
ATCC：アメリカンタイプカルチャーコレクション（ロックビル、メリーランド州）
FERM：醗酵研究所（千葉、日本）
NRRL：ARSカルチャーコレクション、ノーザンリージョナルリサーチラボラトリー（Northern Regional Research Laboratory）、（Peoria、イリノイ州、アメリカ合衆国）
CECT：コレクチオンエスパノラデカルチボスチポ（Colecciion Espanol de Cultivos Tipo）（バレンシア、スペイン）
NCIMB：ナショナルコレクションオブインダストリアルアンドマリーンバクテリア社（National Collection of Industrial and Marine Bactreia）（Aberdeen、英国）
CBS：セントラルブローフォアシメルクルチュアズ（Centraalbureau voor Schimmelcultures）（Baarn、オランダ）。
【００２３】
次に、こうして作成される変異体を使用して、ファインケミカル製品を製造するか、またはコリネバクテリウム・ジフテリアエ（C. diphtheriae）の場合は、弱毒化もしくは非病原性生物を用いてワクチンを製造することができる。ファインケミカル製品とは、有機酸（タンパク質性および非タンパク質性の両方を含む）、ヌクレオチドとヌクレオシド、脂質と脂肪酸、ジオール、炭水化物、芳香族化合物、ビタミンと補助因子、および酵素を意味する。
【００２４】
用語「ファインケミカル」は当技術分野では理解されている用語であり、生物により生産された分子を含み、限定されるものでないが、製薬、農業、及び化粧品産業などの様々な産業に応用される。かかる化合物としては、酒石酸、イタコン酸、及びジアミノピメリン酸などの有機酸、タンパク質原性及び非タンパク質原性（proteinogenic and non-proteinogenic）の両方のアミノ酸、プリン及びピリミジン塩基、ヌクレオシド、及びヌクレオチド（例えば、Kuninaka, A. (1996) 「ヌクレオチド及び関係化合物（Nucleotides and related compounds）」, p.561-612, in Biotechnology vol.6, Rehmら編, VCH: Weinheim、及びその参考文献に記載）、脂質、飽和及び不飽和両方の脂肪酸（例えば、アラキドン酸）、ジオール（例えば、プロパンジオール、及びブタンジオール）、炭水化物（例えば、ヒアルロン酸及びトレハロース）、芳香族化合物（例えば、芳香族アミン、バニリン、及びインジゴ）、ビタミン及び補因子（Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A27, 「ビタミン（Vitamins）」, p.443-613 (1996) VCH: Weinheim、及びその参考文献；ならびにOng, A.S., Niki, E. & Packer, L. (1995) 「栄養、脂質、健康、及び疾病（Nutrition, Lipids, Health, and Disease）」, the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia, and the Society for Free Radical Research - Asia（1994年9月1-3日、マレーシア、ペナン市にて開催）予稿集, AOCS Press, (1995)に記載）、酵素、ポリケチド（Caneら, (1998) Science 282:63-68）、ならびにGutcho (1983) Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086とその参考文献に記載された全ての他の化学品が挙げられる。これらのファインケミカルの代謝及び用途をさらに以下に説明する。
【００２５】
Ａ．アミノ酸代謝と用途
アミノ酸は、全てのタンパク質の基本構造単位としての役割を果たし、従って全生物において細胞が正常に機能を達成する上で必須なものである。用語「アミノ酸」は当技術分野では理解されている。20種のタンパク質原性アミノ酸はタンパク質の構造単位となり、タンパク質中でペプチド結合により連結されているのに対して、非タンパク質原性アミノ酸（数百種が知られている）は通常、タンパク質中に見られない（Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, p. 57-97 VCH: Weinheim (1985)を参照）。アミノ酸は、D-またはL-の光学コンフィギュレーションであってもよいが、一般的にはL-アミノ酸が天然タンパク質中に見出される型である。原核細胞及び真核細胞における20種のタンパク質原性アミノ酸のそれぞれの生合成と分解経路は特性はよく決定されている（例えば、Stryer, L. Biochemistry, 第3版, 578-590頁 (1988)を参照）。生合成が複雑であるので一般的に栄養要求のある「必須」アミノ酸と名づけられたアミノ酸（ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、及びバリン）は、簡単な生合成経路により、残りの11種の「非必須アミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セリン、及びチロシン）」へ容易に転化される。高等動物はこれらのアミノ酸のいくつかを合成する能力を保持するが、通常のタンパク質合成が起こるために、必須アミノ酸を食事から補給しなければならない。
【００２６】
タンパク質生合成におけるそれらの機能とは別に、これらのアミノ酸はそれ自身が重要な化学品であり、多くが食品、飼料、化学品、化粧品、農業、及び製薬産業に様々な用途を有することがわかっている。リシンは、ヒトだけでなく家禽及びブタなどの単胃動物の栄養上重要なアミノ酸である。グルタミン酸は、調味料（グルタミン酸モノナトリウム、MSG）として最も一般的に利用され、かつ食品産業全体でアスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、及びシステインと同様に広く利用されている。グリシン、L-メチオニン及びトリプトファンは全て製薬産業において利用されている。グルタミン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、アルギニン、プロリン、セリン及びアラニンは製薬及び化粧品産業の両方に用途がある。トレオニン、トリプトファン、及びD/L-メチオニンは一般的な食品添加物である（Leuchtenberger, W. (1996) 「アミノ酸-技術的生産と用途（Amino aids - technical production and use）」, p.466-502 in Rehmら (編) Biotechnology vol.6, chapter 14a, VCH: Weinheim）。さらに、これらのアミノ酸は、Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, p. 57-97, VCH: Weinheim, 1985に記載のN-アセチルシステイン、S-カルボキシメチル-L-システイン、(S)-5-ヒドロキシトリプトファン、及びその他の合成アミノ酸及びタンパク質の合成用前駆体として有用であることがわかっている。
【００２７】
これらを生産する能力のある細菌などの生物におけるこれらの自然アミノ酸の生合成は、特性がよく決定されている（細菌のアミノ酸生合成とそれらの調節の総説については、Umbarger, H.E.(1978) Ann. Rev. Biochem. 47: 533-606を参照）。グルタミン酸は、クエン酸サイクルの中間物であるα-ケトグルタル酸の還元アミノ化により合成される。次いでグルタミン、プロリン、及びアルギニンがそれぞれグルタミン酸から生産される。セリンの生合成は、3-ホスホグリセリン酸（解糖の中間物）に始まる３ステッププロセスであり、酸化、トランスアミノ化、及び加水分解ステップの後にこのアミノ酸を得る。システインとグリシンの両方はセリンから生産される；すなわち、前者はホモシステインのセリンとの縮合により、かつ後者はセリントランスヒドロキシメチラーゼが触媒する反応において側鎖β炭素原子のテトラヒドロ葉酸への転移によって生産される。フェニルアラニン及びチロシンは、解糖及びペントースリン酸経路の前駆体エリトロース4-リン酸及びホスホエノールピルビン酸から、プレフェネート（prephenate）合成後の最後の２ステップだけが異なる９ステップ生合成経路で合成される。トリプトファンもこれらの２分子から出発して生産されるが、その合成は11ステップ経路である。チロシンもフェニルアラニンから、フェニルアラニンヒドロキシラーゼが触媒する反応で合成することができる。アラニン、バリン、及びロイシンは全て、解糖最終産物であるピルビン酸の生合成産物である。アスパラギン酸は、クエン酸サイクルの中間物であるオキサロ酢酸から作られる。アスパラギン、メチオニン、トレオニン、及びリシンは、それぞれアスパラギン酸の転化により生産される。イソロイシンはトレオニンから作られる。複雑な９ステップ経路により、活性化糖である5-ホスホリボシル-1-ピロリン酸からヒスチジンの生産が行われる。
【００２８】
細胞のタンパク質合成必要量を超えるアミノ酸は貯蔵できないので、その代わりに分解して細胞の主要代謝経路用の中間物を提供する（総説は、Stryer, L. Biochemistry 3rd ed. Ch. 21 「アミノ酸分解と尿素サイクル（Amino Acid Degradation and the Urea Cycle）」p. 495-516 (1988)を参照）。細胞は望ましくないアミノ酸を有用な代謝中間物に転化することはできるが、アミノ酸生産はエネルギー、前駆体分子、及びそれらを合成する酵素を消費する。従って、特定のアミノ酸の存在がそれ自身の生産を遅くするかまたは全体を停止するように作用して、フィードバック阻害によりアミノ酸合成を調節することは驚くに当たらない（アミノ酸生合成経路におけるフィードバック機構の総説はStryer, L. Biochemistry, 3rd ed. Ch. 24: 「アミノ酸の生合成とヘム（Biosynthesis of Amino Acids and Heme）」 p. 575-600 (1988)を参照）。従って、任意の特定のアミノ酸の産出量は細胞内に存在するアミノ酸の量によって制限される。
【００２９】
２．１．ビタミン、補因子、及び栄養薬代謝及び利用
ビタミン、補因子、及び栄養薬には、高等動物が合成する能力を失っているので摂取しなければならない他の分子グループがあるが、これらは細菌などの他の生物により容易に合成される。これらの分子は、それ自身が生物活性物質であるか、または様々な代謝経路で電子担体もしくは中間物として役立ちうる生物学的に活性な物質の前駆体である。それらの栄養価とは別に、これらの化合物はまた、着色剤、酸化防止剤、及び触媒または他の加工補助剤として重要な産業上の価値がある（これらの化合物の構造、活性、及び産業的応用の概観は、例えば、Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 「ビタミン（Vitamins）」 vol. A27, p. 443-613, VCH: Weinheim, 1996を参照）。用語「ビタミン」は当技術分野では理解されていて、生物が通常機能を果たすのに必要であるが、前記生物が自分自身で合成できない栄養分が挙げられる。ビタミンのグループは補因子及び栄養薬化合物を包含しうる。用語「補因子（cofactor）」は、通常の酵素活性が起こるために必要な非タンパク質化合物が挙げられる。かかる化合物は有機物であってもまたは無機物であってもよい；本発明の補因子分子は好ましくは有機物である。用語「栄養薬（nutraceutical）」は、植物及び動物、特にヒトにおいて健康上有益である食品補充物が挙げられる。かかる分子の例は、ビタミン、抗酸化剤、及びまたある特定の脂質（例えば、ポリ不飽和脂肪酸）である。
【００３０】
これらを生産しうる細菌などの生物におけるこれらの分子の生合成は、ほとんど特性が決定されている（Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 「ビタミン（Vitamins）」 vol. A27, p.443-613, VCH: Weinheim, 1996；Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons；Ong, A.S., Niki, E. & Packer, L. (1995) 「栄養、脂質、健康、及び疾病（Nutrition, Lipids, Health, and Disease）」, the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia, and the Society for Free Radical Research - Asia（1994年9月1-3日、マレーシア、ペナン市にて開催）予稿集, AOCS Press: Champaign, IL X, 374 S）。
【００３１】
チアミン（ビタミンＢ1）はピリミジンとチアゾール部分の化学的カップリングにより生産される。リボフラビン（ビタミンＢ2）はグアノシン-5'-三リン酸(GTP)及びリボース-5'-リン酸から合成される。リボフラビンは、順に、フラビンモノヌクレオチド（FMN）及びフラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）の合成に利用される。「ビタミンＢ6」とまとめて名付けられた化合物のファミリー（例えば、ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサ-5'-リン酸、及び市販されるピリドキシン塩酸塩）は全て、共通の構造単位、5-ヒドロキシ-6-メチルピリジンの誘導体である。パントテネート（パントテン酸、(R)-(+)-N-(2,4-ジヒドロキシ-3,3-ジメチル-1-オキソブチル)-β-アラニン）は、化学合成によるかまたは発酵よって生産することができる。パントテネート生合成の最終ステップはβ-アラニンとパントイン酸のATP駆動による縮合からなる。パントイン酸への転化、β-アラニンへの転化、及びパントテン酸への縮合の生合成ステップに関わる酵素は既知である。パントテネートの代謝活性型は補酵素Ａであり、その生合成は５つの酵素ステップで進行する。パントテネーアト、ピリドキサール-5'-リン酸、システイン及びATPが補酵素Ａの前駆体である。これらの酵素はパントテネートの形成だけでなく、(R)-パントイン酸、(R)-パントラクトン、(R)-パンテノール（プロビタミンＢ5）、パンテテイン（及びその誘導体）及び補酵素Ａの生産も触媒する。
【００３２】
微生物中の前駆体分子ピメロイル-CoAからのビオチン生合成は詳細に研究されていて、これに関わる複数の遺伝子が同定されている。対応するタンパク質の多くはFe-クラスター合成にも関わることがわかっていて、タンパク質のnifSクラスのメンバーである。リポ酸はオクタン酸から誘導され、エネルギー代謝における補酵素として役立ち、その際、これはピルビンデヒドロゲナーゼ複合体及びα-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体の一部分になる。フォレート(folate)類は全て葉酸の誘導体である物質グループであって、葉酸は、順にL-グルタミン酸、p-アミノ安息香酸及び6-メチルプテリンから誘導される。代謝中間物グアノシン-5'-三リン酸(GTP)、L-グルタミン酸及びp-アミノ安息香酸から出発する葉酸及びその誘導体の生合成は、ある特定の微生物については詳細に研究されている。
【００３３】
コリノイド（コバラミン及び特にビタミンＢ12など）及びポルフィリンはテトラピロール環系を特徴とする化学品グループに属する。ビタミンＢ12の生合成は非常に複雑であるのでまだ完全に特性は決定されていないが、関わりのある多くの酵素と基質が現在知られている。ニコチン酸（ニコチネート）及びニコチンアミドはピリジン誘導体であり、「ナイアシン（niacin）」とも呼ばれる。ナイアシンは重要な補酵素であるNAD（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）及びNADP（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）ならびにそれらの還元型の前駆体である。
【００３４】
これらの化合物の大量生産は、ほとんど、細胞に無関係な化学合成に依存してきたが、リボフラビン、ビタミンＢ6、パントテネート、及びビオチンなどの複数のこれらの化学品は微生物の大規模培養によっても生産されている。ただビタミンＢ12だけは合成が複雑であるため、発酵により生産されている。in vitro手法は際立った材料の投入と時間を要し、しばしば大きな費用がかかる。
【００３５】
Ｃ．プリン、ピリミジン、ヌクレオシド及びヌクレオチド代謝と用途
プリン及びピリミジン代謝遺伝子ならびにそれらの対応するタンパク質は、腫瘍疾患とウイルス感染症の治療にとって重要な標的である。用語「プリン」または「ピリミジン」は、核酸、補酵素、及びヌクレオチドの構成要素である窒素原性塩基を含む。用語「ヌクレオチド」は、窒素原性塩基、ペントース糖類（RNAの場合、糖はリボースであり；DNAの場合、糖はD-デオキシリボースである）、及びリン酸からなる核酸分子の塩基構造単位を含む。用語「ヌクレオシド」はヌクレオチドの前駆体となる分子であるが、ヌクレオチドが有するリン酸部分を欠く。これらの分子の生合成、またはそれらを動員して核酸分子を形成するのを阻害することにより、RNA及びDNA合成を阻害することが可能であり；癌細胞を標的としてこの活性を阻害することにより、腫瘍細胞の分裂しかつ複製する能力を阻害することができる。さらに、核酸分子を形成しないでむしろエネルギー貯蔵（すなわち、AMP）としてまたは補酵素（すなわちFAD及びNAD）として作用するヌクレオチドが存在する。
【００３６】
複数の文献は、プリン及び／またはピリミジン代謝に影響を与えることによるこれら化学品の医療用の利用を記載している（例えば、Christopherson, R.I.及びLyons, S.D. (1990) 「化学治療剤としてのde novoピリジン及びプリン生合成の強力インヒビター（Potent inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis as chemotherapeutic agents）」 Med. Res. Reviews 10:505-548）。プリン及びピリミジン代謝に関わる酵素の研究は、例えば、免疫阻害剤または抗増殖剤として使用しうる新薬の開発に重点が置かれてきた（Smith, J.L., (1995) 「ヌクレオチド合成の酵素（Enzymes in nucleotide synthesis）」 Curr. Opin. Struct. Biol. 5:752-757；(1995) Biochem Soc. Transact. 23:877-902）。しかし、プリンとピリミジン塩基、ヌクレオシドとヌクレオチドは他の用途もある：すなわち、複数のファインケミカルの生合成における中間物（例えば、チアミン、S-アデノシル-メチオニン、フォレート、またはリボフラビン）として、細胞用エネルギー担体（例えば、ATPまたはGTP）として、ならびに化学品それ自身で通常使われる風味（flavor）増進剤（例えば、IMPまたはGMP）としてまたは複数の医療用（例えば、Kuninaka, A. (1996) 「ヌクレオチドと関係化合物（Nucleotides and Related Compounds）」 in Biotechnology vol. 6, Rehmら, 編. VCH: Weinheim, p. 561-612を参照）としてである。また、プリン、ピリミジン、ヌクレオシド、またはヌクレオチド代謝に関わる酵素は、殺菌剤、除草剤及び防虫剤を含む作物保護用化学品を開発する際の標的として、ますます役立っている。
【００３７】
細菌におけるこれらの化合物の代謝の特性は決定されている（総説については例えば、Zalkin, H.及びDixon, J.E. (1992) 「de novoプリンヌクレオチド生合成（de novo purine nucleotide biosynthesis）」, in Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, vol.42, Academic Press:, p.259-287；及びMichal, G. (1999) 「ヌクレオチド及びヌクレオシド（Nucleotides and Nucleosides）」 Chapter 8 in: Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Wiley: New Yorkを参照）。プリン代謝は重点研究の対象となっていて、細胞の正常な機能達成にとって本質的なものである。高等動物におけるプリン代謝の障害は、痛風などの重篤な疾患を引き起こしうる。プリンヌクレオチドはリボース-5-リン酸から、中間物化合物イノシン-5'-リン酸（IMP）を経由する一連のステップで合成されて、グアノシン-5'-一リン酸（GMP）またはアデノシン-5'-一リン酸（AMP）の生産が得られ、それらからヌクレオチドとして利用される三リン酸型が容易に形成される。これらの化合物はエネルギー貯蔵としても利用され、その分解は細胞内の多くの異なる生化学プロセスに対するエネルギーを提供する。ピリミジン生合成は、リボース-5-リン酸からウリジン-5'-一リン酸（UMP）の形成により進行する。UMPは、次に、シチジン-5'-三燐酸（CTP）に転化される。これらの全てのヌクレオチドのデオキシ型は、ヌクレオチドの二リン酸リボース型からヌクレオチドの二リン酸デオキシリボース型への１ステップ還元反応で生産される。リン酸エステル化すると、これらの分子はDNA合成に加わることができる。
【００３８】
Ｄ．トレハロース代謝と用途
トレハロースは、α,α-1,1連鎖で結合された２つのグルコース分子からなる。通常、食品産業において、甘味剤、乾燥もしくは凍結食品用添加剤として、及び飲料中に利用される。しかし、これはまた、製薬、化粧品及びバイオ技術産業においても応用される（例えば、Nishimotoら, (1998) 米国特許第5,759,610号；Singer, M.A.及びLindquist, S. (1998) Trends Biotech. 16:460-467；Paiva, C.L.A.及びPanek, A.D. (1996) Biotech. Ann. Rev. 2:293-314；ならびにShiosaka, M. (1997) J. Japan 172:97-102を参照）。トレハロースは多数の微生物由来の酵素により生産され、自然において周辺媒質中に放出されており、それから当技術分野で既知の方法を用いて採集することができる。
【実施例】
【００３９】
この方法はまた、他の細菌を用いて同様に行うことができる。
【００４０】
実施例１：バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）ATCC23844からのゲノムDNAの調製
バチルス・アミロリクエファシエンス（B. amyloliquefaciens）ATCC23844の培養物を、LB培地を含む三角フラスコ中で37℃で一晩増殖させた。次に、細菌を遠心分離してペレットにした。１ｇの湿った細胞ペレットを２mlの水に再懸濁し、この260μlをHybaidマトリックスチューブ#RYM-61111（ゲノムスターキット（Genome Star Kit）、#GC-150）中に移した。これらのチューブは、すでに650μlのフェノール（TEバッファー（pH7.5）で平衡化してある）、上記キットからの650μlのバッファー１、130μlのクロロホルムを含有していた。細胞を、回転設定4.0でリボライザー（Ribolyser）（Hybaid、#6000220/110）中で15秒破砕させ、次に４℃で10,000rpmで５分遠心分離した。次に、650μlの上清を2.0mlのエッペンドルフ容器に移し、２μlのRNAse（10mg/ml）と混合した。次に、37℃で60分インキュベーションを行った。次に、この溶液に、1/10容量の3M 酢酸Na（pH5.5）と２容量の100％エタノールを加え、これを注意深く混合した。次に４℃で13,000rpmで10分遠心分離して、DNAを沈殿させた。ペレットを70％エタノールで洗浄し、空気中で乾燥した。乾燥後、DNAペレットを水に取り、比色計で測定した。
【００４１】
実施例２：PCRによるバチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）（ATCC23844）からのレバンスクラーゼ（sacB）の遺伝子のPCRクローニング
PCRによるバチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）（ATCC23844）からのレバンスクラーゼの遺伝子のクローニングに使用することができるプライマーオリゴヌクレオチドは、レバンスクラーゼについて公表された配列（例えば、ジーンバンク（GenBank）エントリーX52988）に基づいて規定することができるものである。PCRは当業者に公知の方法で行われ、例えば、Sambrook, J.ら、(1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、またはAusubel, F.M.ら、(1994) "Current Protocols in Molecular Biology", ジョンワイリーアンドサンズ（John Wiley and Sons）に記載されている。タンパク質をコードする配列とコード配列の17bpの5'（リボゾーム結合部位）とからなるレバンスクラーゼの遺伝子（sacB遺伝子）は、PCRの間に制限エンドヌクレアーゼ（例えば、BamHI）の末端切断部位が提供され、次にPCR産物は、制限エンドヌクレアーゼの適当な切断部位を有する適当なベクター（例えば、大腸菌（E. coli）プラスミドpUC18）中にクローン化される。PCRにより遺伝子をクローニングするこの方法は、当業者に公知であり、例えば、Sambrook, J.ら、(1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、またはAusubel, F.M.ら、(1994) "Current Protocols in Molecular Biology", ジョンワイリーアンドサンズ（John Wiley and Sons）に記載されている。バチルス・アミロリクエファシエンス（B. amyloliquefaciens）からのsacB遺伝子がクローン化されていることを、既知の配列を用いて配列分析（例えば、実施例３に記載）により証明することができる。PCR反応のために以下のプライマーが使用された：
プライマー１：
5'-GCGGCCGCCAGAAGGAGACATGAACATGAACATCAAAAAATTGTAAAACAAGCC-3'
プライマー２： 5'-ACTAGTTTAGTTGACTGTCAGCTGTCC-3'
実施例３：コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032におけるsacB介在ショ糖感受性の試験
バチルス・アミロリクエファシエンス（B. amyloliquefaciens）からのsacB遺伝子をまず、異種プロモーターの制御下に置いた。このために、大腸菌（E. coli）のtacプロモーターを、実施例２に記載したようにPCR法によりクローン化した。このために以下のプライマーが使用された：
プライマー３： 5'-GGTACCGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGC-3'
プライマー４： 5'-GCGGCCGCTTCTGTTTCCTGTGTGAAATTG-3'
次に、tacプロモーターとsacB遺伝子を、共通のNotI制限エンドヌクレアーゼ切断部位を介して融合させ、大腸菌（E. coli）とコリネバクテリウム・グルタミカム（C. glutamicum）の両方で複製可能であり、かつカナマイシン耐性を付与するシャトルベクター中の、AspIとSpeI切断部位を用いてクローン化した。コリネバクテリウム・グルタミカム（C. glutamicum）にDNA移行（例えば、WO 01/02583を参照）し、カナマイシン耐性コロニーを選択後、これらのコロニーのうち約20を、10％ショ糖を含有するまたはショ糖を含有しない寒天平板上に平行に画線した。この選択には、CMプレート（プレートあたり10g/l グルコース、2.5g/l NaCl、２g/l 尿素、10g/l ポリペプトン、５g/l 酵母エキス、５g/l 肉エキス、22g/l 寒天、pHは2M NaOHで6.8にする：26％強度のIPTG ４μl）が適しており、30℃でインキュベートした。sacB遺伝子が発現したクローンを、ショ糖不含プレート上でのみ一晩増殖させた。
【００４２】
実施例４：コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）からのddh遺伝子の不活性化
コリネバクテリウム・グルタミカム（C. glutamicum）のddh遺伝子（Ishinoら (1987) Nucleic Acids Res. 15:3917）の5'末端の適当な配列セクションと、ddh遺伝子の3'末端の適当な配列セクションは、公知のPCR法により増幅することができる。生じる生成物が機能的ddh遺伝子を持たないように、２つのPCR産物を公知の方法で融合させることができる。ddh遺伝子のこの不活性型と、バチルス・アミロリクエファシエンス（B. amyloliquefaciens）からのsacB遺伝子は、pSL18（Kim, Y.H. とH.-S. Lee (1996) J. Microbiol. Biotechnol. 6: 315-320）中にクローン化して、ベクターpSl18sacBaΔddhを得ることができる。この方法は、当業者に公知である。コリネバクテリウムへのこのベクターの移行は、当業者に公知であり、例えば接合または電気穿孔法により可能である。
【００４３】
組み込み体の選択は、カナマイシンを用いて行うことができ、「pop-out」の選択は、実施例２に記載したように行うことができる。ddh遺伝子に不活性化は、例えばDdh活性の欠如により証明することができる。Ddh活性は、公知の方法（例えば、Misonoら (1986) Agric. Biol. Chem. 50: 1329-1330）により測定することができる。
【国際公開パンフレット】
2004522450.tif 000006
2004522450.tif 000007
2004522450.tif 000008
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004522450.tif 000029
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