(57)【要約】バイオチップの製造方法および該方法により製造されるバイオチップが提供される。前記バイオチップ製造方法においては、末端にエポキシ基を有する放射状ポリエチレングリコール誘導体が低分子量親水性ポリマーと反応してマトリックスを形成し、プローブは前記マトリックスに共有結合して固体基板上に固定化される。前記バイオチップは、その表面から空間的に突出した３次元構造を有し、および改善されたチップ感度を有している。さらに、前記バイオチップは水溶液を用いて低コストで簡便に効率よく製造されうる。
2004522175.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
末端にエポキシ基を有する放射状ポリエチレングリコール誘導体、親水性ポリマー架橋剤およびプローブを水溶液中で混合して混合溶液を形成すること；および
前記混合溶液を基板上に塗布して前記プローブが基板上に固定化されたハイドロゲルを形成すること：
を含む、ハイドロゲルバイオチップの製造方法。
【請求項２】
前記混合は、末端にエポキシ基を有する放射状ポリエチレングリコール誘導体および前記親水性ポリマー架橋剤を混合してマトリックス溶液を形成すること；および前記マトリックスにプローブを添加してマトリックス溶液およびプローブ溶液を含有する混合溶液を形成することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記混合溶液の基板上への塗布は、約４０〜７０℃の温度で、および約６０％〜３０％の湿度で行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記親水性ポリマー架橋剤は約６０〜１０００００の平均分子量を有し、ヒドロキシ基、アミノ基、またはチオール基を有する放射状ポリエチレングリコール誘導体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記プローブは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、タンパク質、またはオリゴペプチドである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記基板の表面をアミン基を有するように処理することをさらに含む、請求項１または４に記載の方法。
【請求項７】
前記基板は、ガラス、石英、シリコン、プラスチック、ポリプロピレン、ポリカーボネート、および活性化アクリルアミドからなる群より選択される材料で形成される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法により製造されるハイドロゲルバイオチップ。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法により製造されたハイドロゲルバイオチップにプローブと結合する標的物質を含有する試料を塗布すること；および
前記プローブに特異的に結合した標的物質を検出すること：
を含む、プローブおよび標的物質間の結合を検出するための分析方法。
【請求項１０】
前記標的物質は、蛍光ラベル化された生体分子である、請求項９に記載の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明はバイオチップの製造方法に関し、より詳細には、ゲルマトリックスを用いることによるバイオチップの製造方法に関する。
【０００２】
背景技術
ヒトゲノムプロジェクトの完了により、遺伝病の診断、治療、および予防に必要な莫大な量の遺伝情報を提供するための効率的な方法への要求が非常に高まっている。ＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲｓの発展およびその自動化にもかかわらず、ヌクレオチドの配列決定のためのサンガー法は、いまだに厄介で操作が難しく、多くの時間、努力、および費用を要する。よって、大量の遺伝子を分析できる新規のヌクレオチド配列決定システムを開発するために多くの試みがなされている。
【０００３】
ＤＮＡチップとは、１平方インチ未満のマイクロアレイを指し、シリコン、表面修飾ガラス、ポリプロピレン、または活性化ポリアクリルアミドからなる固体表面上の数百個から数十万個の適切な位置でオリゴヌクレオチドプローブを固定化することにより形成され、各プローブは数個から数百個のヌクレオチドを含む。標的ＤＮＡ断片が前記ＤＮＡチップに結合すると、標的ＤＮＡ断片はＤＮＡチップ上に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブと相補的にハイブリダイズする。標的ＤＮＡのヌクレオチド配列を同定するために、前記ハイブリダイゼーションは光学的にまたは放射化学的に観測されて分析される。
【０００４】
ＤＮＡチップを用いると、ＤＮＡ分析システムの大きさが縮小され、ごくわずかな量の試料を用いた遺伝分析が可能となる。さらに、標的ＤＮＡの複数の配列が同時に分析され、それによって標的ＤＮＡの遺伝情報を低コストで簡便かつ迅速に提供できる。ＤＮＡチップは、大量の遺伝情報、および遺伝子の関連性を短時間で分析することができる。したがって、ＤＮＡチップは広範な応用性、例えば、遺伝的障害および癌の診断、変異体および病原体の検出、遺伝子発現分析、薬物発見などに対して、を有していると期待されている。さらに、ＤＮＡチップは、解毒性遺伝子を発見し、さらには遺伝子組換え技術に基づいて大規模に解毒薬を生産するための、微生物または汚染物質検出器として用いられうる。ＤＮＡチップは、医薬用作物または低脂肪肉の生産を含む多くの生物学的産業において重大な進歩をもたらしうる。
【０００５】
ＤＮＡチップは、その上に固定化されるプローブの種類によってオリゴチップおよびｃＤＮＡチップに分類される。製造方法によれば、ＤＮＡチップはリソグラフィーチップ、ピンタイプスポッティングチップ、インクジェットタイプスポッティングチップ、およびＤＮＡが電子工学的に基板上に組み込まれる電子アドレスＤＮＡチップに分類される。
【０００６】
第一世代のＤＮＡチップである、オリゴヌクレオチドが基板上に単層として接着される２次元（２Ｄ）チップでは、基板上に接着されたプローブのスポット間の変動のために、ハイブリダイゼーションの度合いを相対的に比較するに際してかなりの誤差が生じ、感度も低く、それによってハイブリダイズしたＤＮＡを検出するためには高価な共焦点蛍光顕微鏡を必要とする。さらに、化学反応を誘起するために固体基板の表面は有機溶媒および水溶液の混合液で処理される。
【０００７】
米国特許第５，７４４，３０５号は、光不安定性保護基を用いたフォトリソグラフィーにより製造される第一世代ＤＮＡチップの一例を開示している。第一世代ＤＮＡチップにおいては、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドのような様々なポリマーが基板上に配置される。
【０００８】
第一世代ＤＮＡチップの欠点を処理するために、以下の第二世代ＤＮＡチップが開発された。米国特許第５，７３６，２５７号および第５，８４７，０１９号はバイオチップの製造方法を開示しており、ここで基板上のヒドロキシル（ＯＨ）基はシランで処理されて基板上にビニル基の分子層を形成し、アクリルアミドの重合により該分子層上にネットワーク層が形成され、光を用いて活性化およびパターン化されて、該ネットワーク層が生体材料に結合する。これらの方法においては、ビニル基の分子層上に形成されたポリアクリルアミドの３−Ｄゲルネットワークにより、その上に固定化されたプローブの量的な変動が減少し、チップ感度が改善される。しかしながら、不都合なことに、コストが高く長時間の分析時間が必要とされる。
【０００９】
米国特許第５，５５２，２７０号、第５，７４１，７００号、および第５，７７０，７２１号は、オリゴヌクレオチドアレイマトリックスおよび固体基板を有する第二世代ＤＮＡチップを用いたＤＮＡ配列分析方法を開示している。前記マトリックスは、お互いに所定の間隔で離れている正方形ドット状のゲル層を介して固体基板に結合している。ＤＮＡチップの製造においては、約３０μｍ離れた２枚のガラススライド間にポリアクリルアミドゲルが塗布される。１００×１００×３０μｍ３の大きさを有する１枚のガラススライドが除去され、ゲルで被覆された残ったガラススライドは乾燥され、機械またはレーザーによりゲルが部分的に除去されて、ドット状に形成される。ゲル層のアミド基は、反応性のヒドラジド型に化学的に変換され、５’−末端にＮ−メチルウリジンを有するＤＮＡプローブはジアルデヒドに変換される。オリゴヌクレオチドプローブは、該プローブを反応性ゲルと反応させることにより３次元で基板上に固定化される。
【００１０】
前記ＤＮＡチップは１〜２日より長時間にわたる複数工程により製造され、各工程後には洗浄工程を有する。したがって、分析収率は反応条件の影響を受けやすく、標的ＤＮＡのゲル表面への不規則な吸着によりバックグラウンドノイズが増加する。
【００１１】
ＷＯ００／６５０９７およびＷＯ００／２８９９は、イソシアネート（ＮＣＯ）基を有するハイドロゲルを用いた３−Ｄ ＤＮＡチップを開示している。前記ハイドロゲルは、脱水状態でガラス状であり水の存在下で膨張してゲルを形成する親水性ネットワークポリマーである。前記開示によれば、イソシアネート基はハイドロゲル自身の重合に加え、ハイドロゲルとプローブとの間の共有結合に関与していることが知られている。イソシアネート基を有するハイドロゲル、例えば、イソシアネート基を有するポリエチレンオキシドまたはイソシアネート基を有するポリエチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシドのコポリマー、および５’−末端にアミン基を有するプローブが水溶液中で混合され、前記プローブは３次元でゲル上に固定化され、ガラス表面上のアミノ基と反応し該プローブは基板上に接着する。
【００１２】
前記イソシアネート基はあまりにも速やかに加水分解されるため制御することができない。イソシアネート基の加水分解を回避するためには、ＤＮＡチップを低温で製造する必要がある。プローブと共有結合せず、ゲル重合にも関与しないイソシアネート基が加水分解されるにつれて、重合は促進され、粘度が増加してスポッティングピンが固形化する。また、二酸化炭素の発生により、スポッティングサイズの制御が困難になる。
【００１３】
発明の開示
本発明の目的は、感度が改善された、製造が容易なハイドロゲルバイオチップを提供することである。
【００１４】
本発明の他の目的は、感度が改善されたバイオチップの製造方法を提供することである。
【００１５】
本発明は、末端にエポキシ基を有する放射状ポリエチレングリコール誘導体、親水性ポリマー架橋剤およびプローブを水溶液中で混合して混合溶液を製造すること；および前記混合溶液を基板上に塗布して前記プローブが基板上に固定化されたハイドロゲルを形成すること：を含むハイドロゲルバイオチップの製造方法を提供する。
【００１６】
本発明に係るハイドロゲルバイオチップの製造方法は、末端にエポキシ基を有する放射状ポリエチレングリコール誘導体および親水性ポリマー架橋剤のマトリックスを形成すること、並びに、該マトリックスをプローブと反応させ、マトリックス−プローブ結合体を形成させることを含んでいてもよい。
【００１７】
本発明に係るハイドロゲルバイオチップの製造方法は、以下に詳細に記載されるであろう。
【００１８】
初めに、放射状ポリエチレングリコールが過量のエピクロロヒドリンおよび水酸化ナトリウムと反応し、末端にエポキシ基を形成する。次いで、架橋剤として、好ましくは親水性ヒドロキシ基、アミノ基、またはチオール基を有し、約６０〜１０００００の平均分子量を有する、低分子量親水性ポリマーを用いてマトリックスが形成される。末端に求核性基を有するプローブは、マトリックスに共有結合してマトリックス−プローブ結合体を形成する。マトリックスの形成およびマトリックス−プローブ結合体の形成は、連続してまたは同時に行われる。本明細書を通して用いられる「プローブ」の語は、標的物質と特異的に結合し、プローブと標的物質との間の結合を分析することで標的物質の特性を測定するのに有用な全ての物質を意味する。好ましくは、前記プローブは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）のような核酸、タンパク質、またはオリゴペプチドを含む。本発明で用いられる低分子量親水性ポリマーは、例えば、６０〜１０００００の平均分子量、を有するポリエチレングリコール、ポリエチレンアミン、ポリプロピレンオキシドおよびポリオールを含む。本明細書を通して用いられる「放射状ポリエチレングリコール」の語は、３以上の方向に配向した分枝を有し、それによって放射状の形状を有するＰＥＧ誘導体を意味する。よって、本発明の前記放射状ＰＥＧ誘導体は、架橋剤により架橋され、３次元ポリマーマトリックスを形成しうる。
【００１９】
本発明によれば、前記マトリックス−プローブ結合体はマイクロスポッティングにより、好ましくは基板表面がアミド基を曝露するように処理された、固体基板上に固定化され、本発明に係るハイドロゲルバイオチップを形成する。固体基板に適当な物質は、ガラス、石英、シリコン、プラスチック、ポリプロピレン、ポリカーボネート、および活性化アクリルアミド、などを含む。
【００２０】
本発明に係るハイドロゲルバイオチップの製造方法は、末端にエポキシ基を有する放射状ポリエチレングリコール、親水性架橋剤、およびプローブの混合溶液を調製すること、並びに該混合溶液を基板上に固定化することを含む。
【００２１】
前記固定化は、例えば、約４０〜７０℃の温度で、約６０〜３０％の湿度で、好ましくは４０℃および６０％で、６０℃および４０％で、または７０℃および３０％で行われる。前記固定化の結果基板上に形成されるスポットパターンは、架橋剤の種類、並びに混合比、温度、および湿度のような反応条件に依存して変動する。本発明のこの特定の実施形態においては、上記したのと同様のポリエチレン誘導体、親水性ポリマー架橋剤、プローブ、および基板が適用される。
【００２２】
本発明は、上記のハイドロゲルバイオチップ製造方法により製造されるハイドロゲルバイオチップを提供する。本発明に係るハイドロゲルバイオチップは、固体基板、末端にエポキシ基を有する放射状ポリエチレングリコールと親水性ポリマー架橋剤との間の反応産物としての、該固体基板に共有結合したマトリックス、および該マトリックスに共有結合したプローブ、を含む。
【００２３】
本発明はまた、プローブに結合する標的物質を含む標的試料を本発明に係る方法により製造されたハイドロゲルバイオチップに塗布すること、およびプローブに特異的に結合した標的物質を検出することを含む、プローブと標的物質との間の結合を検出するための分析方法を提供する。標的物質を簡易に検出するために、蛍光色素のようなシグナル物質を用いて前記プローブをラベル化することが好ましい。プローブと標的物質との間の結合は、様々な方法、例えば、現在広範に用いられており、標的物質にラベル化されるシグナル物質の種類に応じて分類される、蛍光検出法、電気化学的検出法、質量検出法、電荷検出法、または光学検出法により検出されうる。
【００２４】
発明を実施するための最良の態様
以下の実施例を参照することにより、本発明はより詳細に記載されるであろう。以下の実施例は例示の目的のものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
【００２５】
実施例１：エポキシ基を有する放射状ポリエチレングリコールの合成
エピクロロヒドリン７．５ｍＬおよびテトラブチルアンモニウムブロマイド０．３２ｇをＮａＯＨ溶液２ｍＬ（５０重量％）に添加して攪拌し、ペンタエリスリトールエトキシレート１ｇを該混合液にゆっくり添加して室温で１８時間攪拌した。反応の完了は薄層クロマトグラフィーにより確認した。反応が完了していないときには、混合液をさらに６０℃で１時間攪拌した。次いで、水３０ｍＬを添加することにより反応産物を希釈し、塩化メチレン４０ｍＬにより３回抽出した。有機溶媒層を飽和ＮａＨＣＯ３４０ｍＬで３回洗浄し、無水ＭｇＳＯ４を添加し、低圧下で溶媒を除去した。次いで、得られた産物を真空下で２日間乾燥し、エピクロロヒドリン残渣を除去した。得られたエポキシ基を有する放射状ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体は、Ｈ−ＮＭＲ、および０．１Ｎ ＨＢｒ／氷酢酸を用いたエポキシ基の滴定により確認した。
【００２６】
実施例２：ジアミン架橋剤の合成
ＤＭＦ４０ｍＬにペンタ（エチレングリコール）ジ−トシレート５ｇ（９．２ｍｍｏｌ）を溶解し、該溶液にＮａＮ３４．２ｇ（６４．１ｍｍｏｌ）およびピリジン０．５ｍＬを順次添加し、１４０℃で１８時間攪拌した。低圧下で溶媒を除去した後、得られた産物に水２００ｍＬを添加して攪拌し、塩化メチレン１００ｍＬで抽出した。有機溶媒層をブライン１００ｍＬで３回洗浄し、無水ＭｇＳＯ４を添加し、低圧下で溶媒を除去した。次いで、得られた産物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＥＡ：ｎＨｅｘ＝１：２）にかけ、ジアジド中間産物を単離した。該中間産物をメタノール３０ｍＬに溶解し、１０％Ｐｄ−Ｃ（０．１当量）を添加し、その後水素ガスを用いて１８時間還元反応を行った。触媒はセライトパッドを用いて除去し、該パッドはエタノールを用いて洗浄した。濾液、およびパッドを洗浄するために用いたエタノールを混合し、低圧下で溶媒を除去してジアミン架橋剤を得た。
【００２７】
実施例３：架橋剤を用いたゲルマトリックス溶液の調製
（１）ジアミン架橋剤を用いたゲルマトリックス溶液の調製
実施例１において調製されたエポキシ基を有する放射状ＰＥＧ誘導体１００ｍｇに水４ｍＬを添加して攪拌した。実施例２において合成されたジアミン架橋剤５．８ｍｇを該混合液に添加し、室温で１８時間攪拌して液体状態で４℃で貯蔵した。
【００２８】
（２）架橋剤としてＰＥＧを用いたゲルマトリックス溶液の調製
２００、４００、６００、および１５００の分子量を有するＰＥＧを、それぞれ２Ｎ ＮａＯＨ水溶液に溶解して氷浴中で攪拌し、異なるＰＥＧ架橋剤溶液を得た。
【００２９】
次いで、実施例１において調製されたエポキシ基を有する放射状ＰＥＧ誘導体の一部を、カーボネート緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ９．１）に溶解した。該溶液に調製されたＰＥＧ架橋溶液をゆっくり添加し、室温で３時間攪拌した。反応の完了後、反応産物を塩化メチレンで抽出し、低圧下で溶媒を除去して４℃で貯蔵した。
【００３０】
比較のために、１０００００の分子量を有するＰＥＧ架橋溶液を用いてゲルマトリックス溶液を調製し、固体の反応産物を得た。ゲル透過クロマトグラフィーの結果、該固体産物はマトリックス材料ではなく、５〜６のエポキシ基を有するダイマーであると同定された。したがって、本発明においては、１０００００未満の分子量を有するＰＥＧが架橋剤として用いられうるということは明らかである。
【００３１】
実施例４：ゲルマトリックス−ＤＮＡ結合体溶液のスポッティングによるバイオチップの製造
実施例３において調製されたゲルマトリックス溶液に、エポキシ基を有する放射状ＰＥＧ、架橋剤、およびオリゴヌクレオチドを４：１：４の当量比で含有するオリゴヌクレオチドプローブを添加し、３７℃で攪拌し、１４時間放置してマトリックス−ＤＮＡ結合体のスポッティング溶液を得た。
【００３２】
アミン基を露出するように表面を処理されたガラス基板に、該スポッティング溶液をスポッティングにより塗布し、湿式チャンバー内に３７℃で４時間放置した。標的核酸がガラス表面の不要な部分に付着するのを防止するため、ガラス基板上の非スポッティング部分にあるアミン基が負に荷電するようにさらなる反応を行なった。これはバックグラウンドノイズを制御するために必須の段階であり、得られたチップは乾燥機内で貯蔵した。
【００３３】
実施例５：チップ試験
チップ性能試験においては、多重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅された、肝細胞核因子−１α（ＨＮＦ−１α）の完全長の野生型遺伝子およびＨＮＦ−１αのエクソン９の５６１３番目のヌクレオチドの直後（３’−末端方向）へのヌクレオチドＡの挿入により得られたヘテロ接合変異体が、プローブとハイブリダイズすべき標的ヌクレオチドとして用いられた。標的ヌクレオチドのＰＣＲにおいては、標的ヌクレオチドを蛍光的にラベル化するために、Ｃｙ３−ｄＵＴＰを添加した。
【００３４】
プローブとしては以下のオリゴヌクレオチド（配列番号１〜３４）を用いた。
【００３５】
標的ヌクレオチドをプローブとハイブリダイズさせるために、０．１％６ＳＳＰＥＴ（０．１％トリトンＸ−１００を含有する食塩水ナトリウムリン酸ＥＤＴＡ緩衝液）中の２０ｎＭ標的ヌクレオチド溶液およびマトリックス−ＤＮＡ結合体をチップ上に固定化し、３７℃で１６時間反応させた。０．０５％６ＳＳＰＥＴおよび０．０５％３ＳＳＰＥＴを用いて順次それぞれ５分間室温でチップを洗浄し、室温で５分間空気乾燥し、スキャナー（Ｅｘｏｎ Ｃｏ．， ＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂ）によりスキャンした。
【００３６】
配列番号１：ｔｇａａｃｔｔＴｇｇａｃｔｔｃ−ＨＮＦ−１α遺伝子のプロモーター領域と相補的なプローブであって、プローブ配列の中央のＴは野生型プロモーターの４３２番目の塩基と対をなし、その両側にあるプローブ配列は４３２番目の塩基の両側にある配列と完全に一致する。
【００３７】
配列番号２：ｔｇａａｃｔｔＧｇｇａｃｔｔｃ−野生型プロモーターの４３２番目の塩基において点突然変異（Ａ→Ｃ）を有する、標的ヌクレオチドと相補的なプローブである。
【００３８】
配列番号３：ｇｔｔｔｔｇｇＧｇｇｇｇｃａｇ−ＨＮＦ−１α遺伝子のプロモーター領域と相補的なプローブであって、プローブ配列の中央のＧは野生型プロモーター５９２番目の塩基と対をなし、その両側にあるプローブ配列はプロモーター５９２番目の塩基の両側にある配列と完全に対をなす。
【００３９】
配列番号４：ｇｔｔｔｔｇｇＣｇｇｇｇｃａｇ−野生型プロモーターの５９２番目の塩基において点突然変異（Ｃ→Ｇ）を有する、標的ヌクレオチドと相補的なプローブである。
【００４０】
配列番号５：ｔｇｃａｇｃｔＧｇｃｔｃａｇｔ−ＨＮＦ−１α遺伝子のエクソン１領域と相補的なプローブであって、プローブ配列の中央のＧは野生型エクソン１の７３３番目の塩基と対をなし、その両側にあるプローブ配列はエクソン１の７３３番目の塩基の両側にある配列と完全に対をなす。
【００４１】
配列番号６：ｔｇｃａｇｃｔＡｇｃｔｃａｇｔ−野生型エクソン１の７３３番目の塩基において点突然変異（Ｃ→Ｔ）を有する、標的ヌクレオチドと相補的なプローブである。
【００４２】
配列番号７：ｇｃａｃｔｇｇＧｔｇａｇｃｃｇ−ＨＮＦ−１α遺伝子のエクソン１領域と相補的なプローブであって、プローブ配列の中央のＧは野生型エクソン１の８０６番目の塩基と対をなし、その両側にあるプローブ配列はエクソン１の８０６番目の塩基の両側にある配列と完全に対をなす。
【００４３】
配列番号８：ｇｃａｃｔｇｇＡｔｇａｇｃｃｇ−野生型エクソン１の８０６番目の塩基において点突然変異（Ｃ→Ｔ）を有する、標的ヌクレオチドと相補的なプローブである。
【００４４】
配列番号９：ｃａａｇｇｇｇＧａｇｔｃｃｔｇ−ＨＮＦ−１α遺伝子のエクソン１領域と相補的なプローブであって、プローブ配列の中央のＧは野生型エクソンの８５６番目の塩基と対をなし、その両側にあるプローブ配列はエクソン１の８５６番目の塩基の両側にある配列と完全に対をなす。
【００４５】
配列番号１０：ｃａａｇｇｇｇＡａｇｔｃｃｔｇ−野生型エクソン１の８５６番目の塩基において点突然変異（Ｃ→Ｔ）を有する、標的ヌクレオチドと相補的なプローブである。
【００４６】
配列番号１１：ｃｇｇｔｃｇａＧｇｇｇａｇｃｔ−ＨＮＦ−１α遺伝子のエクソン１領域と相補的なプローブであって、プローブ配列の中央のＧは野生型エクソン１の８７５番目の塩基と対をなし、その両側にあるプローブ配列はエクソン１の８７５番目の塩基の両側にある配列と完全に対をなす。
【００４７】
配列番号１２：ｇｇｃｇｇｔｃＧａｇｃｔｇｇｃ−野生型エクソン１の８７５番目から８７９番目の塩基までの５塩基が欠失される突然変異を有する標的ヌクレオチドと相補的なプローブである。
【００４８】
配列番号１３：ａｃｃａｔｃｔＴｃｇｃｃａｃａ−ＨＮＦ−１α遺伝子のエクソン２領域と相補的なプローブであって、プローブ配列の中央のＴは野生型エクソン２の１７７８番目の塩基と対をなし、その両側にあるプローブ配列はエクソン２の１７７８番目の塩基の両側にある配列と完全に対をなす。
【００４９】
配列番号１４：ａｃｃａｔｃｔＣｃｇｃｃａｃａ−野生型エクソン２の１７７８番目の塩基において点突然変異（Ａ→Ｇ）を有する、標的ヌクレオチドと相補的なプローブである。
【００５０】
配列番号１５：ｃａｃａａｃａＴｃｃｃａｃａｇ−ＨＮＦ−１α遺伝子のエクソン２領域と相補的なプローブであって、プローブ配列の中央のＴは野生型エクソン２の１８１２番目の塩基と対をなし、その両側にあるプローブ配列はエクソン２の１８１２番目の塩基の両側にある配列と完全に対をなす。
【００５１】
配列番号１６：ｃａｃａａｃａＡｃｃｃａｃａｇ−野生型エクソン２の１８１２番目の塩基において点突然変異（Ａ→Ｔ）を有する、標的ヌクレオチドと相補的なプローブである。
【００５２】
配列番号１７：ｇｃｇｇｇｃｃＧｃｃｃｔｇｔａ−ＨＮＦ−１α遺伝子のエクソン２領域と相補的なプローブであって、プローブ配列の中央のＧは野生型エクソン２の１９１０番目の塩基と対をなし、その両側にあるプローブ配列はエクソン２の１９１０番目の塩基の両側にある配列と完全に対をなす。
【００５３】
配列番号１８：ｇｃｇｇｇｃｃＡｃｃｃｔｇｔａ−野生型エクソン２の１９１０番目の塩基において点突然変異（Ｃ→Ｔ）を有する、標的ヌクレオチドと相補的なプローブである。
【００５４】
配列番号１９：ａｃｃｔｃｔｃＧｃｔｇｃｔｔｇ−ＨＮＦ−１α遺伝子のエクソン２領域と相補的なプローブであって、プローブ配列の中央のＧは野生型エクソン２の１９４０番目の塩基と対をなし、その両側にあるプローブ配列はエクソン２の１９４０番目の塩基の両側にある配列と完全に対をなす。
【００５５】
配列番号２０：ａｃｃｔｃｔｃＡｃｔｇｃｔｔｇ−野生型エクソン２の１９４０番目の塩基において点突然変異（Ｃ→Ｔ）を有する、標的ヌクレオチドと相補的なプローブである。
【００５６】
配列番号２１：ａａｇｇｇｇｃＧｇａｇｇａａｃ−ＨＮＦ−１α遺伝子のエクソン３領域と相補的なプローブであって、プローブ配列の中央のＧは野生型エクソン３の２６５９番目の塩基と対をなし、その両側にあるプローブ配列はエクソン３の２６５９番目の塩基の両側にある配列と完全に対をなす。
【００５７】
配列番号２２：ａａｇｇｇｇｃＡｇａｇｇａａｃ−野生型エクソン３の２６５９番目の塩基において点突然変異（Ｃ→Ｔ）を有する、標的ヌクレオチドと相補的なプローブである。
【００５８】
配列番号２３：ｇａｇｇａａｃＣｇｔｔｔｃａａ−ＨＮＦ−１α遺伝子のエクソン３領域と相補的なプローブであって、プローブ配列の中央のＣは野生型エクソン３の２６６７番目の塩基と対をなし、その両側にあるプローブ配列はエクソン３の２６６７番目の塩基の両側にある配列と完全に対をなす。
【００５９】
配列番号２４：ｇａｇｇａａｃＴｇｔｔｔｃａａ−野生型エクソン３の２６６７番目の塩基において点突然変異（Ｇ→Ａ）を有する、標的ヌクレオチドと相補的なプローブである。
【００６０】
配列番号２５：ｃａｃｃｔｃｃＧｔｇａｃｇａｇ−ＨＮＦ−１α遺伝子のエクソン４領域と相補的なプローブであって、プローブ配列の中央のＧは野生型エクソン４の３２９７番目の塩基と対をなし、その両側にあるプローブ配列はエクソン４の３２９７番目の塩基の両側にある配列と完全に対をなす。
【００６１】
配列番号２６：ｃａｃｃｔｃｃＡｔｇａｃｇａｇ−野生型エクソン４の３２９７番目の塩基において点突然変異（Ｃ→Ｔ）を有する、標的ヌクレオチドと相補的なプローブである。
【００６２】
配列番号２７：ｔａｇａｃａｃＧｃａｃｃｔｃｃ−ＨＮＦ−１α遺伝子のエクソン４領域と相補的なプローブであって、プローブ配列の中央のＧは野生型エクソン４の３３０５番目の塩基と対をなし、その両側にあるプローブ配列はエクソン４の３３０５番目の塩基の両側にある配列と完全に対をなす。
【００６３】
配列番号２８：ｔａｇａｃａｃＡｃａｃｃｔｃｃ−野生型エクソン４の３３０５番目の塩基において点突然変異（Ｃ→Ｔ）を有する、標的ヌクレオチドと相補的なプローブである。
【００６４】
配列番号２９：ｃａａｃｃｇｇＣｇｃａａａｇａ−ＨＮＦ−１α遺伝子のエクソン４領域と相補的なプローブであって、プローブ配列の中央のＣは野生型エクソン４の３３３２番目の塩基と対をなし、その両側にあるプローブ配列はエクソン４の３３３２番目の塩基の両側にある配列と完全に対をなす。
【００６５】
配列番号３０：ｃａａｃｃｇｇＴｇｃａａａｇａ−野生型エクソン４の３３３２番目の塩基において点突然変異（Ｇ→Ａ）を有する、標的ヌクレオチドと相補的なプローブである。
【００６６】
配列番号３１：ｃｃｔｇａｇａＴｇｃｃｇｇｃｇ−ＨＮＦ−１α遺伝子のエクソン９領域と相補的なプローブであって、プローブ配列の中央のＴは野生型エクソン９の５６１３番目の塩基と対をなし、その両側にあるプローブ配列はエクソン９の５６１３番目の塩基の両側にある配列と完全に対をなす。
【００６７】
配列番号３２：ｃｃｔｇａｇａＴｔｇｃｃｇｇｃ−野生型エクソン９の５６１３番目の塩基の直後にＡ塩基の挿入突然変異を有する、標的ヌクレオチドと相補的なプローブである。
【００６８】
配列番号３３：ｔｇｇｃｇｃｔＧａｇｃｃｇｇｔ−ＨＮＦ−１α遺伝子のエクソン９領域と相補的なプローブであって、プローブ配列の中央のＧは野生型エクソン９の５６８８番目の塩基と対をなし、その両側にあるプローブ配列はエクソン９の５６８８番目の塩基の両側にある配列と完全に対をなす。
【００６９】
配列番号３４：ｔｇｇｃｇｃｔＧａｇａｇｃｃｇ−野生型エクソン９の５６８８番目の塩基の直後にＴおよびＣ塩基の挿入突然変異を有する、標的ヌクレオチドと相補的なプローブである。
【００７０】
プローブと標的ヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーション反応後のスキャニング結果を、図１および２に示す。図１は、ＨＮＦ−１αの完全長の野生型遺伝子を標的ヌクレオチドとして用いた場合である。図２は、ＨＮＦ−１α遺伝子のエクソン９領域の５６１３番目のヌクレオチドの直後にヌクレオチドＡが挿入することにより得られたヘテロ接合変異体を標的ヌクレオチドとして用いた場合である。
【００７１】
図１および２において、同じプローブがそれぞれ６スポットずつチップ上にスポットされ、最上列においては左から右へ配列番号１、２、３、および４のプローブがスポットとして固定化された。その次の行においては、配列番号５、６、７、および８のプローブが同様に固定化された。同様の方法により、配列番号３４までの残りのプローブがチップ上にスポットされた。ここで、スポット径は１７０±５μｍであり、スポット間隔は３７５μｍに調節した。
【００７２】
変動係数（ＣＶ）として測定すると、同一プローブ群におけるスポット間の変動は８％、チップ間の変動は１０．６％であった。２５〜３０％のスポット間の変動係数を有する従来の２Ｄチップと比較すると、本発明において適用された３Ｄ固定化技術は、プローブ間の誤差を減少させるのに効果的であることが判明した。ＣＶは、標準偏差の算術平均値に対する百分率として表現される。
【００７３】
図１に示すように、野生型プローブ（すなわち、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、および３３）の固定化されたスポットは、変異体プローブ（すなわち、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、および３４）の固定化されたスポットと比較して強い蛍光強度を示した。したがって、標的ヌクレオチドとして用いられたＨＮＦ−１αの完全長の野生型遺伝子は、変異を有しない野生型プローブの塩基とハイブリダイズしている。
【００７４】
図２に示すように、野生型プローブ（すなわち、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、および３３）の固定化されたスポットについても、図１に類似の結果が観察された。しかしながら、変異体プローブの一つである配列番号３２のプローブの固定化されたスポットは、図１の結果とは異なり強い蛍光強度を示した。ＨＮＦ−１α遺伝子のエクソン９領域の５６１３番目のヌクレオチドの直後へのヌクレオチドＡの挿入変異は、容易に同定されうる。
【００７５】
実施例６：基板上に直接形成されたマトリックスを用いたバイオチップの製造
本発明によれば、マトリックスは、基板とは別の容器中において製造されうるだけではなく、基板上に直接形成されうる。
【００７６】
カーボネート緩衝液（０．２５ｍＭ、ｐＨ９．５）中において、オリゴヌクレオチドプローブ（５’−ｔｇｔｔｃｔｃｔｔｇｔｃｔｔｇ−３’：配列番号３５）、実施例１において調製されたエポキシ基を有する放射状ポリエチレン誘導体、および実施例２において調製されたジアミン架橋剤を、１：８：８の比で混合した。オリゴヌクレオチドの濃度は４００μＭを超えないように調節した。次いで、該混合溶液を同体積のＤＭＳＯと混合し、アミド基を露出するように処理されたガラス表面にスポッティングにより塗布した。スポッティング後、該バイオチップを６０℃の温度および４０％の湿度のオーブン内に置いて１時間インキュベートし、その後無水コハク酸を用いて後処理を行なった。該後処理は、ガラス表面上の未反応のアミノ基、エポキシ基を有する放射状ＰＥＧ誘導体のエポキシ基およびプローブのアミノ基の非特異的反応を防止するためである。
【００７７】
得られたバイオチップ上において、プローブと標的ヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーション反応を行った。チップ表面のスキャニングの結果を図３に示す。ここで、用いられた標的ヌクレオチドは、プローブに相補的な人工オリゴヌクレオチドであった。図３において、「Ｃ」は本実施例において製造されたバイオチップのものであり、「Ｂ」は実施例４において製造されたバイオチップのものであり、「Ａ」はガラス基板上にＤＮＡ溶液のみをスポッティングすることにより製造されたバイオチップのものである。図３から明らかなように、バイオチップ「Ｃ」はバイオチップ「Ｂ」よりも５〜７倍強い蛍光強度を示し、バイオチップ「Ａ」はバイオチップ「Ｂ」よりも２〜３倍強い蛍光強度を示した。
【００７８】
上記したように、本発明によれば、表面から空間的に突出した構造を有する３Ｄバイオチップが製造され、チップ感度も飛躍的に増加する。さらに、本発明に係るバイオチップは、水溶液を用いて低コストで簡便に、かつ効率よく製造されうる。
【００７９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、肝細胞核因子（ＨＮＦ−１α）の完全長の野生型遺伝子を標的ヌクレオチドとして用いる場合の、ハイブリダイゼーションの結果を示す写真である。
【図２】図２は、ＨＮＦ−１α遺伝子のエクソン９の５６１３番目のヌクレオチドの直後のヌクレオチドＡの挿入により得られたヘテロ接合変異体を標的ヌクレオチドとして用いる場合の、ハイブリダイゼーションの結果を示す写真である。
【図３】図３は、本発明の実施例６において製造されたバイオチップへの標的ヌクレオチドのハイブリダイゼーションの後に行なわれた蛍光スキャニングの結果を示す写真である。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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