(57)【要約】      （修正有）【課題】光の干渉縞を使用して試料を成分に分離する分析装置における、分析可能な試料のサイズが狭い範囲に限られるという課題と、短い流路で良い分離性能が得られないという課題を解決し、生物物質などの試料に化学的な修飾や標識を施すことなく精度の良い分離性能が得られる、マイクロ流体デバイスの使用に適した分析装置を提供する。【解決手段】  試料２２が分離用流路内に存在する分離プロセス期間において、光強度、つまり干渉縞の振幅を時間とともに変化させ、光強度の変化とは、小粒径試料の場合、試料の流れを往復させるとともに光干渉縞を点滅することであり、大粒径試料の場合、干渉縞の光強度を漸次低減することである。また光の波長より大きな試料には、回折格子を通る光が形成する干渉縞５５が使われる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
流路に照射される光の干渉縞からの作用により、前記流路内をキャリヤー液体とともに流れる試料を成分へ分離する分析装置であって、前記試料を成分へ分離するプロセス時間内に前記干渉縞の光強度を変化させる手段を備えることを特徴とする分析装置
【請求項２】
請求項１における分析装置は、前記キャリヤー液体の流れを繰り返し往復させる手段を備え、どちらか一方の流れ方向で光強度がゼロとなり、他方の流れ方向で任意の一定光強度となる２値の変化であることを特徴とする。
【請求項３】
請求項１における干渉縞は、前記キャリヤー液体が流れる方向と逆の方向へ移動する移動干渉縞であり、前記干渉縞の光強度の変化は漸次減少する変化であることを特徴とする。
【請求項４】
請求項１における干渉縞は、回折格子を通る光により形成される干渉縞であり、前記干渉縞の光強度の変化は漸次単調に減少する変化であることを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光の干渉縞を用いて試料を成分に分離する技術に係わり、特に、マイクロ流体デバイスを用いて生物物質を分離する分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
分析速度の向上、試料の少量化、装置の小型化などでの利点により、近年、多く用いられるようになったマイクロ流体デバイスでは、シンプルな構成でも比較的高い精度の分離が実現できる電気泳動クロマトグラフィーとその派生技術である電気浸透流クロマトグラフィー、さらには試料を修飾して帯電させるミセル動電クロマトグラフィーなど、キャピラリー電気泳動と総称される分析が主流となっている。これらの分離手法をマイクロ流体デバイスで用いる場合、一般には検出感度向上のために、試料の蛍光標識や試料に化学的修飾を施すことが多い。
【０００３】
しかしタンパク質や細胞などの生物物質を試料とした場合、化学的修飾や化学薬品の投入は、試料に自然状態とは異なる相を示させる可能性があり、また分析後の試料を元の状態で回収することが難しい。具体的に述べるならば、タンパク質の試料では添加物質の結合によるコンフォメーション変化や変質を生じるという課題があり、マイクロサイズの生物物質である白血球や血小板などの血球では、通常と異なる環境や物質の存在によるストレスが粘着能の活性化や血球自身の変形を生じさせるという課題がある。
【０００４】
さらにキャピラリー電気泳動では、精度の良い分離が可能な粒子の最大径は１５ｎｍ（分子量で約１Ｍダルトン）くらいであり、固定相と移動相を用いる通常の液体クロマトグラフィーは、大きな分子の分析が可能と言われる方法ではあるが、分析対象物質の大きさが３０ｎｍ（分子量で約１０Ｍダルトン）以上の径となると分離が難しくなる。しかし蛋白質のような生物物質では、１Ｍダルトンを超えるような巨大な高分子物質も数多く存在し、さらに大きな物質であるウイルスなども含め、大きな分子量の試料を少量でも精度良く分析する方法と装置が望まれている。
【０００５】
これらのマイクロ流体デバイスを用いた分離、分析における課題を解決する方法の１つとして、光干渉縞から働く光勾配力による制動力が試料の成分に応じて異なることを利用する、特許文献１で開示された方法が提案されている。この方法は試料を化学的に修飾あるいは標識をする処理が不要であり、比較的サイズの大きい粒子の分析が可能であり、レーザー光学系を用いた精密測定との関連付けが期待できる。しかし光勾配力は試料である個々の粒子や分子の体積に比例する力であるため、試料の粒子サイズが数十ｎｍよりも小さい物質に対する作用は極めて小さくなる。したがって大部分のタンパク質は分析できない。
【０００６】
また、特許文献２に述べられているように、光の干渉縞を用いる場合は干渉縞の幅（約３００ｎｍ）よりも大きい、あるいは、非干渉光を用いる場合は波長（約６００ｎｍ）よりも大きい粒子状の試料に対して、試料の１粒子内に最大光勾配となる部分が複数ヶ所に生じるため、光勾配力による制動効果が低下あるいは不安定となり精度の良い分析に不向きとなる。そのため細胞や血球、バクテリアなどのマイクロサイズの試料に適用することは難しい。
【０００７】
また、光勾配力による制動力の利用は、従来の液体クロマトグラフィーにおいて固定相に対する試料の吸着と脱離の時間差を利用するのと同じように、分離距離と分離時間が長いほど高い性能が得られる。しかしマイクロ流体デバイスでは流路の長さを充分に確保できないという制限があるため、短い流路内で高性能の分離、高精度の分析が得られる手法を求められている。
【特許文献１】特許公開平７−２４３１１
【特許文献２】特許公表２００４−５３０８７７
【特許文献３】特許公開２００４−３４７３３７
【非特許文献１】高木晋作、田中肇：「移動干渉縞による複雑流体の動的制御」，日本物理学会第５７回年次大会講演概要集，ｖｏｌ．５７，ｎｏ．１−２，ｐ．３０９（２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記のように、光の干渉縞を使用して試料を成分に分離する分析装置には、試料の粒子径が小さくなるほど分離性能が低下し、逆に光の波長よりも大きなマイクロサイズの試料でも分離性能が低下し、適用可能な試料サイズが狭い範囲に限られてしまうという課題がある。また、短い流路で精度の良い分離が得られないという課題がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、試料が分離用流路内に存在する分離プロセス期間において、時間の経過とともに干渉縞の光強度を変化させる手段を用いることにより、上記課題を解決するものである。さらに述べるならば、小粒径試料の作用を向上させる課題は、光干渉縞の点滅と試料の流れの往復により解決し、大粒径試料の分離性能を短距離流路で向上させる課題は、干渉縞の光強度の漸次低減により解決するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、光の干渉縞を使用して試料を成分に分離する分析装置における、分析可能な試料のサイズが狭い範囲に限られるという課題と、短い流路で良い分離性能が得られないという課題を解決し、生物物質などの試料に化学的な修飾や標識を施すことなく精度の良い分離性能が得られる、マイクロ流体デバイスの使用に適した分析装置を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明による光の干渉縞を用いた分離方法と、それに基づくマイクロ流体デバイスと分析装置を、図面を用いて詳細に説明する。
【実施例１】
【００１２】
光勾配力は光強度（あるいは電界の２乗）の勾配、屈折率の２乗（あるいは誘電率）、粒子の体積（あるいは粒子径の３乗）に比例する力で、バイオ研究の分野では、細胞やバクテリア、数十μｍの金粒子などをマニピュレートするレーザーピンセットとして利用されている。この光勾配力は粒子の体積（あるいは径の３乗）に比例するので、粒子径が１０ｎｍ以下のタンパク質分子のサイズとなると非常に弱くなり、熱ゆらぎ（ブラウン運動）より弱いために、レーザーピンセットのように完全に粒子を捕捉し続けることは難しくなる。
【００１３】
完全な捕捉は難しい小さな粒子でも、統計的にある時間比率だけ光干渉縞への捕捉と離脱を繰り返し、しかも小さめの分子は短め（大きめの分子は長め）の捕捉時間比率となる。そのため流れの場においては、干渉縞領域内での速度が粒子の小さい順に速い（速度が、大き目の分子＜小さ目の分子＜キャリヤー液体）あるいは、干渉縞領域を横断する時間は粒子の小さい順に短い（横断時間が、大き目の分子＞小さ目の分子＞キャリヤー液体）という効果が現れるので、粒子のサイズによる分離が可能である。つまりクロマトグラフィーに例えるならば、光干渉縞が固定相、キャリヤー液体が移動相に相当する役割を担う。
【００１４】
しかしタンパク質サイズの粒子の領域では、光勾配力で生じる速度差あるいは時間差は非常に小さいため、長い分離時間あるいは長い分離流路が必要となるが、長い距離に渡って光強度（光量）が強く均一な干渉縞を形成することは困難であり、また流路の長さに制限があるマイクロ流体デバイスでの使用には適さない。
【００１５】
本発明の実施例１は、キャリヤー液体を駆動する電気浸透流の方向を印加電圧の極性変更で逆転させ、電気浸透流の方向に合わせて光（干渉縞）をオンオフさせるという、共に電気的制御が可能な操作を組み合わせ、また繰り返させることにより、短距離の流路で長い分離流路と同じ効果が得られるプロセスを実現する。特に、数十ｎｍ以下のタンパク質サイズの粒子や分子を分離し分析する用途に適している。
【００１６】
図１に本発明の実施例１による分析装置の構成例を示す。マイクロ流体デバイス１０の流路の入口側には、試料リザーバー１１と、キャリヤー液体リザーバー１２、さらに試料リザーバーには試料を送り出すための送液ポンプ１３が接続されている。マイクロ流体デバイス１０の流路の出口側には、廃液容器１４が接続されている。
【００１７】
また、マイクロ流体デバイス１０で分離した試料成分の通る位置に合わせて検出装置３５が設置されており、この検出装置３５にはデータ収集解析装置３６が接続され、このデータ収集解析装置３６には、プロセス制御装置３１が接続され、このプロセス制御装置３１には、光源用電源３３が接続されている。さらに本実施例では、マイクロ流体デバイス１０の流路を流れるキャリヤー液体を電気浸透流で駆動するための電気浸透流駆動用電源３２が、プロセス制御装置３１に接続されている。
【００１８】
図２に、本発明の実施例１によるマイクロ流体デバイスの概略平面図を示す。マイクロ流体デバイスの主要部は、分離部４７と分析部４８、およびそれらに先行する試料流入口４１とキャリヤー流入口４２と、およびそれらに後続する２つの廃液流出口４３、４４とからなる一般的な十字状の流路が使われる。キャリヤー流入口４２と廃液流出口４４には、それぞれ電気浸透流用電極４５、４６が設置されており、この２つの電極間に図１における電気浸透流駆動用電源３２から直流電圧が印加されると、電気浸透流れによってメイン流路４９の内部をキャリヤー液体が流れる。
【００１９】
次に図３、図４、図５を用いて本実施例１の動作を説明する。実施例１では、試料がタンパク質であるとして説明する。図３は実施例１における試料導入までの説明図である。図３（ａ）で示すように、全体プロセスがスタートすると、試料流入口から図１における送液ポンプ１３の圧力により試料２２が流入する。試料２２がメイン流路４９との交差部分を横切ったら、図３（ｂ）に示すように、メイン流路４９の上流末端に設けられた電気浸透流用電極４５と、メイン流路４９の下流末端に設けられた電気浸透流用電極４６の間に電気浸透流駆動用電源３２で設定された直流電圧が印加され、交差点内に存在した試料だけがプラグ状に切り取られ、メイン流路４９の分離部の方へと移動を開始する。
【００２０】
ほぼ同時に、光源用電源３３から電圧を供給されてレーザー５１が点灯し、ハーフミラー５２で２ビームに分割され、ミラー５３を経て、プリズム５４により鋭角の角度で交差させられたレーザー光は、分離部で干渉縞５５を形成する。
【００２１】
プラグ状の試料が、図４（ａ）のように分離部の干渉縞へ達し、分離部の干渉縞を通過し始めると、干渉縞から試料であるタンパク質へ光勾配力が作用して、試料は分離し始める。しかしタンパク質サイズでは、その効果は非常に小さいため、干渉縞を１回通過した図４（ｂ）の状態だけでは、明確なバンド構造を形成するクロマトグラムを得るのは難しい。
【００２２】
そこで、図４（ｃ）のように電気浸透流駆動用電源の極性を逆にして、光干渉縞を消去した状態で、試料プラグをスタート点近くまで戻す。この操作により、タンパク質分子の種類によって異なる電荷量の違いと電気泳動の作用により生じた分離の分はキャンセルされ、光勾配力による分離の分だけが残される。
【００２３】
図５（ａ）のようにして何度か同じ分離プロセスを繰り返すと、試料プラグは充分に分離したバンド構造が現れた図５（ｂ）の状態になり、最後に図５（ｃ）のようにして、分子の大きい順から検出部４８を通過し、バンド構造を形成した試料のクロマトグラムが検出装置３５により検出される。
【００２４】
本発明による実施例１は、光が電気的にオンオフ可能であることと、電気泳動流れが電圧の極性の逆転により往復可能であることを利用し、同じ流路を何度も往復を繰り返すことで、短い流路での分離を可能にする。そのとき、往復の一方向だけ分離のための干渉縞を形成する、つまり干渉縞の光強度を２値で変化させる手段を担う光源用電源３３により、分離の効果を累積させる点に特徴がある。また、電気浸透流駆動と同時に生じる電気泳動による分離効果は、極性反転による往復の駆動によりキャンセルさせることができる。
【実施例２】
【００２５】
数十ｎｍから数百ｎｍまでのサイズの粒子では、光勾配力の作用は金属粒子をトラップする程の強さであるが、樹脂や生物物質などの有機高分子を完全にトラップする程には強くない。しかし１０ｎｍ以下の粒子に比較すれば、熱拡散係数はかなり小さくなり、光干渉縞が生じている領域から脱出するための時間も長くなる。一方、特許文献３や非特許文献１に報告されているように、このサイズ範囲の粒子の熱拡散速度よりも遅い速度で移動する移動干渉縞を照射すると、干渉縞が移動する方向へ粒子が移動する。
【００２６】
したがって数十ｎｍから数百ｎｍまでの粒子サイズの生物物質試料、例えばウイルスなどを分散した溶液が流れる流路に、流れの方向と逆に移動する移動干渉縞を照射すると、干渉縞は試料に対してフィルターのように作用する。つまり、干渉縞はキャリヤー液体を通過させるが、試料物質を通過させず、干渉縞前面に蓄積する。蓄積する試料にはキャリヤー液体からの粘性抗力も働くため干渉縞前面の薄い領域に閉じ込められ、濃縮される。
【００２７】
この状態で干渉縞の光強度を漸次減少させると、光勾配力の作用が比較的弱い小さい粒子から順に光干渉縞領域を通過できるようになり、試料の大きさに応じた分離が実現する。干渉縞を通過する試料分子の持つ熱ゆらぎ（ブラウン運動）で生じる速度分布は、流れと逆の方向に移動する移動干渉縞が試料分子を押し戻す効果により、狭い速度分布へと圧縮される。そのため、光強度に対する通過粒子の頻度分布は、シャープなスペクトルを示す。
【００２８】
本発明の実施例２は、干渉縞の光強度を漸次減少する変化により、制御可能な可変フィルターとして動作させ、短い流路での分離プロセスを実現する。さらに移動干渉縞が試料を濃縮し、熱拡散を抑制する効果を持つため、高精度の分離と分析ができるという特徴がある。特に、粒子径が数十ｎｍから数百ｎｍの範囲の生物物質、例えばウイルスなどの分析用途に適している。
【００２９】
本発明の実施例２による分析装置の構成およびマイクロ流体デバイスの概略は、実施例１と同様、図１と図２である。
【００３０】
以下に図６、図７を用いて実施例２の動作を説明する。図６は実施例２における試料導入までの説明図であるが、その動作は実施例１の場合とほぼ同様である。つまり図６（ａ）で示すように、全体プロセスがスタートすると、試料流入口から流入した試料２２が、図６（ｂ）に示すように、メイン流路４９との交差部分を横切った分だけプラグ状に切り取られ、メイン流路４９を分離部の方へと移動を開始する。
【００３１】
ほぼ同時に、光源用電源３３から電流を供給されてレーザー５１が点灯し、ハーフミラー５２で２本のビームに分割されるが、ここで実施例１と異なる点は、２本のビームのうち一方に周波数シフター５６が挿入されている点である。周波数シフターを通過するビームと他の経路のビームはミラー５３を経て、プリズム５４により鋭角の角度で交差し、分離部で移動干渉縞５７を形成する。
【００３２】
プラグ状の試料が、図７（ａ）のように分離部の移動干渉縞の前面に到達すると、移動干渉縞から押し返される力と、逆方向に働くキャリヤー液体からの粘性抗力に挟まれ、薄い領域内に圧縮されて濃縮される。移動干渉縞の光強度が徐々に降下して分離プロセスが開始すると、図７（ｂ）のように小さめの試料成分から順に移動干渉縞を通過し、試料は図７（ｃ）のような、粒子径の小さい順に並んだバンド構造を形成し、検出装置３５によりクロマトグラムが検出される。
【００３３】
本発明による実施例２は、移動干渉縞が制御可能な可変フィルターとしての働きを持つ点に着目し、移動干渉縞の光強度を漸次減少するように変化させる手段を担う光源用電源３３により、短い流路での分離を可能にする。また、分離プロセスが始まる前に移動干渉縞前面で試料が濃縮される効果や、移動干渉縞が熱拡散を抑制する効果により高精度の分離と分析を実現する。
【実施例３】
【００３４】
１μｍから１０μｍ程度のサイズの粒子は、２つのビームを交差させて生じさせる光干渉縞の縞間隔よりも大きいため、上述の実施例１や実施例２の方法で精度の良い分離や分析を行うのは難しくなる。一方、このサイズの粒子では光勾配力の作用は強くなるので、実施例２で必要とした程の光強度は不要であり、また、ほとんどブラウン運動の影響は受けなくなるので移動干渉縞である必要もない。
【００３５】
そこで本発明による実施例３では、間隔の広い干渉縞の形成が可能な回折格子を使う。回折格子を使うことで光源はレーザーを使う必要が無くなり通常のランプの使用が可能になる。また、精度の良い位置あわせなどが不要となるため、アラインメントの楽な光学系を使うことができる。
【００３６】
本発明の実施例３は、上述のような違いはあるが、実施例２と同様に干渉縞の光強度を徐々に降下させる分離プロセスで分析を実現する。特に、粒子径が１μｍから１０μｍ程度の範囲の生物物質、例えば細胞、血球、バクテリアなどを分離し分析する用途に適している。
【００３７】
本発明の実施例３による分析装置の構成およびマイクロ流体デバイスの概略は、実施例１、実施例２と同様、図１と図２である。
【００３８】
以下に図８、図９を用いて実施例３の動作を説明する。本実施例では、試料は血球として説明する。図８は実施例３における試料導入までの説明図であるが、その動作は実施例１、実施例２の場合とほぼ同様である。つまり図８（ａ）で示すように、全体プロセスがスタートすると、試料流入口から流入した試料２２が、図８（ｂ）に示すように、メイン流路４９との交差部分を横切った分だけプラグ状に切り取られ、メイン流路４９を分離部の方へと移動を開始する。
【００３９】
図９（ａ）に示すように試料が分離領域内に到達すると、光源用電源３３から電圧を供給されてランプ６１が点灯し、レンズ６２、フィルター６３、回折格子６４を通過した光は、分離部で干渉縞６５を形成し、試料を分離領域内にトラップする。
【００４０】
分離プロセスが開始し、干渉縞の光強度が徐々に降下すると、図９（ｂ）のように小さめの試料成分である血小板（２μｍ程度）、赤血球（８μｍ程度）、白血球（１０μｍ程度）の順に干渉縞のトラップから解放され、最後に図９（ｃ）のようにして、試料成分が小さい順に並んだバンド構造が形成され、検出装置により粒度分布や成分比などが検出される。
【００４１】
本発明による実施例３は、実施例２と同じように、干渉縞の光強度を漸次減少するように変化させる手段を担う光源用電源３３により、小さめの試料成分から順に光トラップを離脱する効果を使用し、短い流路での分離を可能にする。ただし、回折格子を通る光により形成される干渉縞を使い、２つのレーザービームの交差では得られない広い縞間隔の干渉縞を形成することで、光の波長よりも大きなサイズの試料の分離と分析を可能にした点に特徴がある。
【００４２】
（変形例）
本発明による実施例では試料を粒子の大きさで分離する例を述べたが、光勾配力は試料の大きさだけでなく、形状や誘電率などの他の性質にも依存する。したがって本発明による分析装置の分析対象となる性質は、試料となる粒や分子の大きさだけに限らず、分離が可能な物理的性質であれば何であっても構わない。
【００４３】
また本実施例では、干渉縞の光強度を変化させる手段として電圧源と可変抵抗の直列接続によりレーザーやランプへ供給する電流を制御する例を示したが、本発明の主旨によれば干渉縞の強度が変化すればよいので、光源であるレーザー光強度を直接制御する他の手段、さらには、通過する光量を制御する手段でもよく、光が流路に達するまでの光学系のどこの位置で制御しても構わない。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
以上述べたように本発明による分離方法は、生物物質などの試料に化学修飾や蛍光標識を施すことなく自然状態のまま分析する用途に有効であり、特に、マイクロ流体デバイス内で数ｎｍのタンパク質に相当するサイズから数μｍの細胞や血球、バクテリアに相当するサイズまで、広い範囲の生物物質を精度良く分離する分析装置の用途に適している。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明の実施例による分析装置の全体構成例を示す図
【図２】本発明の実施例によるマイクロ流体デバイスの概略平面図
【図３】実施例１における試料導入までの説明図
【図４】実施例１における分離開始と流路往復の説明図
【図５】実施例１における分離累積と成分検知の説明図
【図６】実施例２における試料導入までの説明図
【図７】実施例２における試料濃縮と成分分離の説明図
【図８】実施例３における試料導入までの説明図
【図９】実施例３における試料捕捉と成分分離の説明図
【符号の説明】
【００４６】
１０  マイクロ流体デバイス
１１  試料リザーバー
１２  キャリヤー液体リザーバー
１３  送液ポンプ
１４  廃液容器
２１  キャリヤー液体
２２  試料
２３  小さい試料成分
２４  大きい試料成分
３１  プロセス制御装置
３２  電気浸透流駆動用電源
３３  光源用電源
３４  レーザー光学系
３５  検出装置
３６  データ収集解析装置
４１  試料流入口
４２  キャリヤー流入口
４３  廃液流出口
４４  廃液流出口
４５  電気浸透流用電極
４６  電気浸透流用電極
４７  分離部
４８  検出部
４９  メイン流路
５１  レーザー
５２  ハーフミラー
５３  ミラー
５４  プリズム
５５  干渉縞
５６  周波数シフター
５７  移動干渉縞
６１  ランプ
６２  レンズ
６３  フィルター
６４  回折格子
６５  干渉縞
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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