(57)【要約】本発明のひとつの局面は、（ｉ）シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＣＥＬおよびＥＥＬのゲノム領域のタンパク質もしくはポリペプチドをコードする単離された核酸分子；（ｉｉ）ストリンジェントな条件下でこれらにハイブリダイズする核酸分子；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の核酸分子に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。本発明のＤＮＡ分子を含む発現ベクター、宿主細胞、およびトランスジェニック植物も開示される。別の局面は、単離されたタンパク質またはポリペプチドおよびこれらを含有する組成物に関する。本発明の核酸分子およびタンパク質を、植物に疾病耐性を付与するため、植物を非病原細菌によるコロニー形成に対して高感受性にするため、真核細胞死を引き起こすため、および癌性症状を治療するために使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６２、配列番号：６４、もしくは配列番号：６６のアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはポリペプチドをコードする；
（ｉｉ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４１、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：６１、配列番号：６３もしくは配列番号：６５に相補的な核酸配列を含むＤＮＡ分子に、０．９Ｍ ＳＳＣを含有する３７℃のハイブリダイゼーション媒質（ｍｅｄｉｕｍ）を含むストリンジェントな条件下でハイブリダイズする；または
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の核酸分子と相補的であるヌクレオチド配列を含む
ヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２】
配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６２、配列番号：６４、または配列番号：６６のアミノ酸配列を含むタンパク質またはポリペプチドをコードする、請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４１、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：６１、配列番号：６３、または配列番号：６５のヌクレオチド配列を含む、請求項２記載の核酸分子。
【請求項４】
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４１、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：６１、配列番号：６３または配列番号：６５に相補的な核酸配列を含むＤＮＡ分子に、０．９Ｍ ＳＳＣを含有する温度３７℃のハイブリダイゼーション媒質を含むストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、請求項１記載の核酸分子。
【請求項５】
核酸が、（ｉ）および（ｉｉ）の核酸分子に相補的であるヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の核酸分子。
【請求項６】
核酸がＤＮＡである、請求項１記載の核酸分子。
【請求項７】
請求項１記載の核酸分子によりコードされる、単離されたタンパク質またはポリペプチド。
【請求項８】
配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６２、配列番号：６４、または配列番号：６６のアミノ酸配列を含む、請求項７記載の単離されたタンパク質またはポリペプチド。
【請求項９】
担体および、請求項７記載のタンパク質またはポリペプチドを含有する組成物。
【請求項１０】
請求項６記載の異種ＤＮＡ分子が挿入されているベクターを含む、発現系。
【請求項１１】
異種ＤＮＡ分子が、センス方向で、かつ正しい読みとり枠で挿入されている、請求項１０記載の発現系。
【請求項１２】
請求項６記載の異種ＤＮＡ分子を含む、宿主細胞。
【請求項１３】
細菌細胞または植物細胞である、請求項１２記載の宿主細胞。
【請求項１４】
細菌細胞が、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）である、請求項１３記載の宿主細胞。
【請求項１５】
請求項６記載の異種ＤＮＡ分子を含む、トランスジェニック植物。
【請求項１６】
異種ＤＮＡ分子によりコードされたタンパク質またはポリペプチドを認識するＲ遺伝子を含む、請求項１５記載のトランスジェニック植物。
【請求項１７】
適合性非病原（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｎｏｎｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ）細菌の増殖を支援する、請求項１５記載のトランスジェニック植物。
【請求項１８】
請求項６記載のＤＮＡ分子を提供する段階；および、
ＤＮＡ分子の転写を生じるのに有効な条件下で、ＤＮＡ分子により植物細胞を形質転換する段階
を含む、トランスジェニック植物細胞を作製する方法。
【請求項１９】
ＤＮＡ分子の転写を生じるのに有効な条件下で、請求項６記載のＤＮＡ分子により植物細胞を形質転換する段階；および、
形質転換された植物細胞からトランスジェニック植物を再分化させる段階
を含む、トランスジェニック植物を作製する方法。
【請求項２０】
疾病耐性を付与するのに有効な条件下で、トランスジェニック植物が異種ＤＮＡ分子を発現する、植物に疾病耐性を付与する方法であり、以下の段階を含む方法：
植物細胞を、請求項６記載の異種ＤＮＡ分子により形質転換する段階；および
形質転換された植物細胞からトランスジェニック植物を再分化させる段階。
【請求項２１】
トランスジェニック植物が、異種ＤＮＡ分子によりコードされたタンパク質またはポリペプチドにより活性化されるＲ遺伝子を含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
処理された植物に疾病耐性を付与するのに有効な条件下で、請求項７記載のタンパク質またはポリペプチドで植物を処理する段階を含む、植物に疾病耐性を付与する方法。
【請求項２３】
処理する段階が、単離された形状のタンパク質またはポリペプチドの適用により実行される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
処理する段階が、タンパク質またはポリペプチドを分泌する非病原細菌の適用により実行される、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
非病原細菌によるコロニー形成に対してトランスジェニック植物を高感受性にするのに有効な条件下で、トランスジェニック植物が異種ＤＮＡ分子を発現する、非病原細菌によるコロニー形成に対して高感受性の植物を作製する方法であり、以下の段階を含む方法：
植物細胞を請求項６記載の異種ＤＮＡ分子により形質転換する段階；および
形質転換された植物細胞からトランスジェニック植物を再分化させる段階。
【請求項２６】
非病原細菌によるコロニー形成に対して処理された植物を感受性にするのに有効な条件下で、請求項７記載のタンパク質またはポリペプチドにより植物を処理する段階を含む、非病原細菌によるコロニー形成に対して高感受性の植物を作製する方法。
【請求項２７】
処理する段階が、単離された形状のタンパク質またはポリペプチドの適用により実行される、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
処理する段階が、タンパク質またはポリペプチドを分泌する非病原細菌の適用により実行される、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
真核細胞に細胞毒性シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）タンパク質を導入する段階を含み、該導入段階が細胞死を引き起こすのに有効な条件下で行われる、真核細胞死を引き起こす方法。
【請求項３０】
細胞毒性シュードモナスタンパク質が、ＨｏｐＰｓｙＡ、ＨｏｐＰｔｏＡ、またはＨｏｐＰｔｏＡ２である、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
真核細胞がインビトロである、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
真核細胞がインビボである、請求項２９記載の方法。
【請求項３３】
真核細胞が癌細胞である、請求項２９記載の方法。
【請求項３４】
癌細胞死を引き起こすのに有効な条件下で、細胞毒性シュードモナスタンパク質を患者の癌細胞へ導入し、これにより癌性症状を治療する段階を含む、癌性症状の治療法。
【請求項３５】
細胞毒性シュードモナスタンパク質が、ＨｏｐＰｓｙＡ、ＨｏｐＰｔｏＡ、またはＨｏｐＰｔｏＡ２である、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
導入段階が、細胞毒性シュードモナスタンパク質の患者への投与段階を含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
導入段階が、細胞毒性シュードモナスタンパク質をコードするＤＮＡ分子を含む標的化されたＤＮＡ送達系の患者への投与段階を含み、標的化されたＤＮＡ送達系が、ＤＮＡ分子を癌細胞へと送達し、細胞毒性シュードモナスタンパク質が癌細胞内で発現される、請求項３５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２０００年４月３日に出願された米国特許仮出願第６０／１９４，１６０号、２０００年８月１１日に出願された米国特許仮出願第６０／２２４，６０４号、および２０００年１１月１７日に出願された米国特許仮出願第６０／２４９，５４８号の恩典を主張しており、これらは全体が本明細書に参照として組入れられている。
【０００２】
本研究は、国立科学基金（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）の基金番号第ＭＣＢ−９６３１５３０号および米国農業省（ＵＳＤＡ）の国立研究機関競合助成金プログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ Ｇｒａｎｔｓ Ｐｒｏｇｒａｍ）の基金番号第９８−３５３０３−４４８８号の支援を受けている。米国政府は、本発明に一定の権利を有し得る。
【０００３】
発明の分野
本発明は、シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）の保存性エフェクター遺伝子座および交換可能なエフェクター遺伝子座のオープンリーディングフレームに相当する単離されたＤＮＡ分子、それらによりコードされた単離されたタンパク質、およびそれらの様々な用途に関する。
【０００４】
発明の背景
植物の病原菌であるシュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）は、その多様性および植物との宿主特異的相互作用が注目される（ＨｉｒａｎｏおよびＵｐｐｅｒ、１９９０）。特定の菌株は、様々な植物種中のその宿主範囲に基づいて少なくとも４０種の病原型のひとつに割当てられており、次に宿主の栽培品種中の示差的相互作用に基づいた品種に更に割当てられている。宿主植物において、細菌は典型的には、葉の細胞間隙内で高集団レベルまで増殖して、次に壊死的病変を形成する。非宿主植物または品種特異的耐性を伴う宿主植物においては、細菌は、病原体と接触し、植物細胞の過敏感反応（ＨＲ）、迅速な防御に関連したプログラムされた死を誘起する（ＡｌｆａｎｏおよびＣｏｌｌｍｅｒ、１９９７）。植物においてこれらの反応のいずれかを生じる能力は、ＩＩＩ型タンパク質分泌経路をコードするｈｒｐ（ＨＲおよびｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）遺伝子およびｈｒｃ（ＨＲおよびｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）遺伝子により、ならびにこの経路により植物細胞に注入されたエフェクタータンパク質をコードするａｖｒ（ａｖｉｒｕｌｅｎｃｅｃｅ）遺伝子およびｈｏｐ（Ｈｒｐ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｕｔｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子により指示されると考えられる（ＡｌｆａｎｏおよびＣｏｌｌｍｅｒ、１９９７）。これらのエフェクターは更に、可能性のある宿主におけるＨＲの引き金となるＲ遺伝子（以後ａｖｒと称す）サーベイランス系への寄生体を裏切ることがあり、このような遺伝子のための遺伝子（ｇｅｎｅ−ｆｏｒ−ｇｅｎｅ）（ａｖｒ−Ｒ）の相互作用に基づいた耐性に関する植物育種は、品種および示差的栽培品種の複雑な組合せを生じることがある（Ｋｅｅｎ、１９９０）。ｈｒｐ／ｈｒｃ遺伝子は、壊死を惹起するグラム陰性植物病原菌中で普遍的であると考えられ、これらは、Ｐ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）（Ｐｓｙ）６１、エルウィニア・アミロボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ）Ｅａ３２１、キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）ｐｖ．ベシカトリア（ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ）（Ｘｃｖ）８５−１０、およびラルストニア・ソラナセアラム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）ＧＭＩ１０００において配列決定されている（ＡｌｆａｎｏおよびＣｏｌｌｍｅｒ、１９９７）。これら４種の細菌のｈｒｐ／ｈｒｃ遺伝子クラスターは、それらの明確な遺伝子配置および調節成分に基づいて、２群に分けられる：Ｉ群（ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＥｒｗｉｎｉａ）ならびにＩＩ群（ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓおよびＲａｌｓｔｏｎｉａ）。これらの群の分布と細菌の系統発生の間の矛盾は、ｈｒｐ／ｈｒｃ遺伝子クラスターが水平獲得されており、その結果病原性島（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｉｓｌａｎｄ）（Ｐａｉ）を表していることのいくつかの証拠を提供している（ＡｌｆａｎｏおよびＣｏｌｌｍｅｒ、１９９７）。
【０００５】
Ｐａｉは、（ｉ）多くの毒性（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）遺伝子を含み、（ｉｉ）病原性菌株内に選択的に存在し、（ｉｉｉ）宿主細菌ＤＮＡと比べ異なるＧ＋Ｃ含量を有し、（ｉｖ）大きい染色体領域を占領し、（ｖ）直接反復配列に隣接することが多く、（ｖｉ）ｔＲＮＡ遺伝子および／または潜在可動性遺伝因子を境界として、（ｖｉｉ）不安定であるような、遺伝子クラスターとして定義されている（Ｈａｃｋｅｒら、１９９７）。一部のＰａｉは、同じ種において異なるゲノム位置へ挿入されている（Ｗｉｅｌｅｒら、１９９７）。残りは、複数の水平獲得（ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）を示すモザイク構造を表す（Ｈｅｎｓｅｌら、１９９９）。ＩＩＩ型分泌系をコードする遺伝子は、動物病原体サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＰａｉ内ならびにエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）種およびシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種の巨大プラスミド上に存在する。これらの生物における経路により分泌されたエフェクターをコードする遺伝子は、通常経路遺伝子に連結されている（Ｈｕｅｃｋ、１９９８）が、特筆すべき例外はｓｏｐＥであり、これはネズミチフス菌（Ｓ． ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のある単離体中のＳＰＩ１への明らかな連結を伴わない溶原性（ｔｅｍｐｅｒａｔｅ）ファージにより運搬される（Ｍｉｒｏｌｄら、１９９９）。３種のａｖｒ／ｈｏｐ遺伝子は、Ｐ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）においてｈｒｐ／ｈｒｃクラスターへ連結され；ａｖｒＥおよびいくつかの他のＨｒｐ調節性転写ユニットは、Ｐ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．トマト（ｔｏｍａｔｏ）（Ｐｔｏ）ＤＣ３０００のｈｒｐクラスターのｈｒｐＲ境界に連結され（ＬｏｒａｎｇおよびＫｅｅｎ、１９９５）；ａｖｒＰｐｈＥは、シュードモナス・ファセオリコラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｈａｓｅｏｌｉｃｏｌａ）（Ｐｐｈ）１３０２ＡのｈｒｐＹ（ｈｒｐＫ）に隣接し（Ｍａｎｓｆｉｅｌｄら、１９９４）；ならびに、ｈｏｐＰｓｙＡ（ｈｒｍＡ）は、Ｐｓｙ ６１のｈｒｐＫに隣接する（ＨｅｕおよびＨｕｔｃｈｅｓｏｎ、１９９３）ことが既に示されている。他のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ａｖｒ遺伝子は、ゲノム内またはプラスミド上のどこかに位置し（ＬｅａｃｈおよびＷｈｉｔｅ、１９９６）、これはＰｐｈ １４４９ＢのＰａｉとして説明されたａｖｒ遺伝子のプラスミドを有するグループを含む（Ｊａｃｋｓｏｎら、１９９９）。
【０００６】
Ａｖｒ、Ｈｏｐ、Ｈｒｐ、およびＨｒｃタンパク質は、植物および動物の両方における有望な治療的処置を表しているので、病原細菌においてＰａｉによりコードされたその他のタンパク質を同定して、これらのタンパク質の用途を確定することは望ましいと考えられる。
【０００７】
本発明は、当技術分野におけるこれらの欠点を克服するものである。
【０００８】
発明の概要
本発明のひとつの局面は、（ｉ）シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の保存性エフェクター遺伝子座（Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｌｏｃｉ；「ＣＥＬ」）および交換可能なエフェクター遺伝子座（Ｅｘｃｈａｎｇｅａｂｌｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｌｏｃｉ；「ＥＥＬ」）のゲノム領域のタンパク質またはポリペプチドをコードする単離された核酸分子、（ｉｉ）ストリンジェントな条件下でこれらにハイブリダイズする核酸分子、または（ｉｉｉ）前記（ｉ）および（ｉｉ）の核酸分子に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。本発明のＤＮＡ分子を含む発現ベクター、宿主細胞、およびトランスジェニック植物も示される。このような宿主細胞およびトランスジェニック植物を作出する方法も示される。
【０００９】
本発明の更なる局面は、本発明の核酸分子によりコードされた単離されたタンパク質またはポリペプチドに関する。このようなタンパク質を含有する組成物も示される。
【００１０】
更に別の本発明の局面は、植物に疾病耐性を付与する方法に関する。ある手法に従い、本方法は、植物細胞の本発明の異種ＤＮＡ分子による形質転換、および形質転換された植物細胞からのトランスジェニック植物の再分化により実行され、ここでトランスジェニック植物は、疾病耐性を付与するのに有効な条件下で、異種ＤＮＡ分子を発現している。別の手法に従い、本方法は、処理された植物に疾病耐性を付与するのに有効な条件下での、本発明のタンパク質またはポリペプチドによる植物の処置により実行される。
【００１１】
より更なる本発明の局面は、非病原細菌によるコロニー形成に対して高感受性である植物を作出する方法に関する。ひとつの手法に従い、本方法は、植物細胞の本発明の異種ＤＮＡ分子による形質転換、および形質転換された植物細胞からのトランスジェニック植物の再分化により実行され、トランスジェニック植物は、トランスジェニック植物を非病原細菌によるコロニー形成に高感受性を持つようにするのに有効な条件下で、異種ＤＮＡ分子を発現している。別の手法において、この方法は、処理された植物を非病原細菌によるコロニー形成に対して感受性にするのに有効な条件下での、本発明のタンパク質またはポリペプチドによる植物の処理により実行される。
【００１２】
別の本発明の局面は、真核細胞に、細胞毒性シュードモナスタンパク質を導入することによる、真核細胞死を引き起こす方法に関し、導入は、細胞死を引き起こすのに有効な条件下で行われる。
【００１３】
更なる本発明の局面は、癌細胞死を引き起こすのに有効な条件下で、細胞毒性シュードモナスタンパク質を、患者の癌細胞に導入し、これにより癌性症状を治療することによる、癌性症状の治療法に関する。
【００１４】
本発明の利点は、３種の要因からもたらされる。第一に、植物病原体エフェクタータンパク質は、極めて低レベルで真核生物の代謝における絶妙な変化を誘起するように進化して、これらの活性の少なくとも一部は、植物に加え哺乳類および他の生物に関連する可能性があるということの実質的かつ増大しつつある証拠が存在することである。例えば、Ｐｓｙ Ｂ７２８ａ ＥＥＬ由来のＯＲＦ５は、哺乳類のＭＡＰＫＫ防御シグナル伝達を阻害するような動物病原体相同体ＹｏｐＪと同じ活性部位を有すると考えられる植物病原体タンパク質であるキサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）ｐｖ．ベシカトリア（ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ）ＡｖｒＢｓＴに類似している（Ｏｒｔｈら、２０００）。第二に、Ｐ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）ＣＥＬおよびＥＥＬ領域は、エフェクタータンパク質遺伝子において豊富であり、このことは、これらの領域を、エフェクター遺伝子の生物学的予測（ｂｉｏｐｒｏｓｐｅｃｔｉｎｇ）のための実り多い標的としている。第三に、遺伝子およびタンパク質を植物および動物の細胞に送達する技術の迅速な開発が、タンパク質に基づく療法の効能を改善していることである。
【００１５】
発明の詳細な説明
シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．トマト（ｔｏｍａｔｏ）ＤＣ３０００のＣＥＬを含むＤＮＡ分子は、下記のヌクレオチド配列（配列番号：１）を有する。
2004522406.tif 000002
2004522406.tif 000003
2004522406.tif 000004
2004522406.tif 000005
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2004522406.tif 000009
2004522406.tif 000010
いくつかの未定義のヌクレオチドが配列番号：１に存在するが、これらは遺伝子間領域に存在すると考えられる。シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．トマト（ｔｏｍａｔｏ）ＤＣ３０００のＣＥＬは、多くのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。このＣＥＬによりコードされた２種の産物はＨｒｐＷおよびＡｖｒＥであり、両方とも公知である。追加の１０種の産物は、図３に示したように、各々、ＯＲＦ１−１０により産生される。これらの多くのＯＲＦヌクレオチド配列およびそれらのコードされたタンパク質またはポリペプチド産物を以下に示す。
【００１６】
シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．トマト（ｔｏｍａｔｏ）ＤＣ３０００ ＣＥＬ由来のＯＲＦ３のＤＮＡ分子は、下記のヌクレオチド配列（配列番号：２）を有する。
2004522406.tif 000011
Ｐｔｏ ＤＣ３０００ ＣＥＬ ＯＲＦ３によりコードされたタンパク質またはポリペプチドは、下記のアミノ酸配列（配列番号：３）を有する。
2004522406.tif 000012
2004522406.tif 000013
2004522406.tif 000014
【００１７】
シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．トマト（ｔｏｍａｔｏ）ＤＣ３０００ ＣＥＬ由来のＯＲＦ４のＤＮＡ分子は、下記のヌクレオチド配列（配列番号：４）を有する。
2004522406.tif 000015
Ｐｔｏ ＤＣ３０００ ＣＥＬ ＯＲＦ４によりコードされたタンパク質またはポリペプチドは、下記のアミノ酸配列（配列番号：５）を有する。
2004522406.tif 000016
【００１８】
シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．トマト（ｔｏｍａｔｏ）ＤＣ３０００ ＣＥＬ由来のＯＲＦ５のＤＮＡ分子は、下記のヌクレオチド配列（配列番号：６）を有する。
2004522406.tif 000017
Ｐｔｏ ＤＣ３０００ ＣＥＬ ＯＲＦ５によりコードされたタンパク質またはポリペプチドであり、現在ＨｏｐＰｔｏＡとして公知のものは、下記のアミノ酸配列（配列番号：７）を有する。
2004522406.tif 000018
2004522406.tif 000019
2004522406.tif 000020
【００１９】
シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．トマト（ｔｏｍａｔｏ）ＤＣ３０００ ＣＥＬ由来のＯＲＦ６のＤＮＡ分子は、下記のヌクレオチド配列（配列番号：８）を有する。
2004522406.tif 000021
Ｐｔｏ ＤＣ３０００ ＣＥＬ ＯＲＦ６によりコードされたタンパク質またはポリペプチドは、下記のアミノ酸配列（配列番号：９）を有する。
2004522406.tif 000022
2004522406.tif 000023
【００２０】
シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．トマト（ｔｏｍａｔｏ）ＤＣ３０００ ＣＥＬ由来のＯＲＦ７のＤＮＡ分子は、下記のヌクレオチド配列（配列番号：１０）を有する。
2004522406.tif 000024
Ｐｔｏ ＤＣ３０００ ＣＥＬ ＯＲＦ７によりコードされたタンパク質またはポリペプチドは、下記のアミノ酸配列（配列番号：１１）を有する。
2004522406.tif 000025
2004522406.tif 000026
【００２１】
シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．トマト（ｔｏｍａｔｏ）ＤＣ３０００ ＣＥＬ由来のＯＲＦ８のＤＮＡ分子は、下記のヌクレオチド配列（配列番号：１２）を有する。
2004522406.tif 000027
Ｐｔｏ ＤＣ３０００ ＣＥＬ ＯＲＦ８によりコードされたタンパク質またはポリペプチドは、下記のアミノ酸配列（配列番号：１３）を有する。
2004522406.tif 000028
【００２２】
シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．トマト（ｔｏｍａｔｏ）ＤＣ３０００ ＣＥＬ由来のＯＲＦ９のＤＮＡ分子は、下記のヌクレオチド配列（配列番号：１４）を有する。
2004522406.tif 000029
Ｐｔｏ ＤＣ３０００ ＣＥＬ ＯＲＦ９によりコードされたタンパク質またはポリペプチドは、下記のアミノ酸配列（配列番号：１５）を有する。
2004522406.tif 000030
【００２３】
シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．トマト（ｔｏｍａｔｏ）ＤＣ３０００ ＣＥＬ由来のＯＲＦ１０のＤＮＡ分子は、下記のヌクレオチド配列（配列番号：１６）を有する。
2004522406.tif 000031
Ｐｔｏ ＤＣ３０００ ＣＥＬ ＯＲＦ１０によりコードされたタンパク質またはポリペプチドは、下記のアミノ酸配列（配列番号：１７）を有する。
2004522406.tif 000032
【００２４】
シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．トマト（ｔｏｍａｔｏ）ＤＣ３０００のＥＥＬを含むＤＮＡ分子は、下記のヌクレオチド配列（配列番号：１８）を有する。
2004522406.tif 000033
2004522406.tif 000034
2004522406.tif 000035
2004522406.tif 000036
いくつかの未定義のヌクレオチドが、配列番号：１８に存在するが、これらは遺伝子間領域に存在すると考えられる。シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．トマト（ｔｏｍａｔｏ）ＤＣ３０００のＥＥＬは、多くのＯＲＦを含む。このＥＥＬによりコードされた産物のひとつは、Ｐ．スタッツェリ（ｓｔｕｔｚｅｒｉ）由来のＴｎｐＡ’相同体である。追加の４種の産物は、各々、ＯＲＦ１−４により産生される。これらの多くのＯＲＦヌクレオチド配列およびそれらのコードされたタンパク質またはポリペプチド産物を以下に示す。
【００２５】
シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．トマト（ｔｏｍａｔｏ）ＤＣ３０００ ＥＥＬ由来のＯＲＦ１のＤＮＡ分子は、下記のヌクレオチド配列（配列番号：１９）を有する。
2004522406.tif 000037
Ｐｔｏ ＤＣ３０００ ＥＥＬ ＯＲＦ１によりコードされたタンパク質またはポリペプチドは、下記のアミノ酸配列（配列番号：２０）を有する。
2004522406.tif 000038
2004522406.tif 000039
【００２６】
シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．トマト（ｔｏｍａｔｏ）ＤＣ３０００ ＥＥＬ由来のＯＲＦ２のＤＮＡ分子は、下記のヌクレオチド配列（配列番号：２１）を有する。
2004522406.tif 000040
Ｐｔｏ ＤＣ３０００ ＥＥＬ ＯＲＦ２によりコードされたタンパク質またはポリペプチドは、下記のアミノ酸配列（配列番号：２２）を有する。
2004522406.tif 000041
【００２７】
シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．トマト（ｔｏｍａｔｏ）ＤＣ３０００ ＥＥＬ由来のＯＲＦ３のＤＮＡ分子は、下記のヌクレオチド配列（配列番号：２３）を有する。
2004522406.tif 000042
Ｐｔｏ ＤＣ３０００ ＥＥＬ ＯＲＦ３によりコードされたタンパク質またはポリペプチドは、下記のアミノ酸配列（配列番号：２４）を有する。
2004522406.tif 000043
Ｐ． シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．トマト（ｔｏｍａｔｏ）ＤＣ３０００ ＥＥＬ由来のＯＲＦ３は、変異された場合に、毒性を有意に低下することが現在示されている。より興味深いことに、過剰発現は、病変サイズを強力に増大する。従ってこのエフェクターは、生物学的に活性があり、症状形成において重要な役割があると考えられる。
【００２８】
シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．トマト（ｔｏｍａｔｏ）ＤＣ３０００ ＥＥＬ由来のＯＲＦ４のＤＮＡ分子は、下記のヌクレオチド配列（配列番号：２５）を有する。
2004522406.tif 000044
Ｐｔｏ ＤＣ３０００ ＥＥＬ ＯＲＦ４によりコードされたタンパク質またはポリペプチドは、下記のアミノ酸配列（配列番号：２６）を有する。
2004522406.tif 000045
2004522406.tif 000046
【００２９】
シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）Ｂ７２８ａのＥＥＬは、多くのＯＲＦを含む。これらのオープンリーディングフレームの中の２種は、他のシュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）変種のＥＥＬ中の相同体と同等でない可動性遺伝因子であると考えられる。追加の４種の産物は、各々、ＯＲＦ１−２およびＯＲＦ５−６から産生される。これらの多くのＯＲＦヌクレオチド配列、およびそれらのコードされたタンパク質またはポリペプチド産物を、以下に提供する。
【００３０】
シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）Ｂ７２８ａ ＥＥＬ由来のＯＲＦ１のＤＮＡ分子は、下記のヌクレオチド配列（配列番号：２７）を有する。
2004522406.tif 000047
Ｐｓｙ Ｂ７２８ａ ＥＥＬ ＯＲＦ１によりコードされたタンパク質またはポリペプチドは、下記のアミノ酸配列（配列番号：２８）を有する。
2004522406.tif 000048
2004522406.tif 000049
表１（実施例２参照）に示したように、このタンパク質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ分子は、ＡｖｒＰｐｈＣをコードするシュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．ファセオリコラ（ｐｈａｓｅｏｌｉｃｏｌａ）由来のヌクレオチド配列との有意な相同性を有している。
【００３１】
シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）Ｂ７２８ａ ＥＥＬ由来のＯＲＦ２のＤＮＡ分子は、下記のヌクレオチド配列（配列番号：２９）を有する。
2004522406.tif 000050
Ｐｓｙ Ｂ７２８ａ ＥＥＬ ＯＲＦ２によりコードされたタンパク質またはポリペプチドは、下記のアミノ酸配列（配列番号：３０）を有する。
2004522406.tif 000051
2004522406.tif 000052
表１（実施例２参照）に示したように、このタンパク質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ分子は、ＡｖｒＰｐｈＥをコードするシュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．ファセオリコラ（ｐｈａｓｅｏｌｉｃｏｌａ）由来のヌクレオチド配列との有意な相同性を有している。
【００３２】
シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）Ｂ７２８ａ ＥＥＬ由来のＯＲＦ５のＤＮＡ分子は、下記のヌクレオチド配列（配列番号：３１）を有する。
2004522406.tif 000053
Ｐｓｙ Ｂ７２８ａ ＥＥＬ ＯＲＦ５によりコードされたタンパク質またはポリペプチドは、下記のアミノ酸配列（配列番号：３２）を有する。
2004522406.tif 000054
2004522406.tif 000055
【００３３】
シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）Ｂ７２８ａ ＥＥＬ由来のＯＲＦ６のＤＮＡ分子は、下記のヌクレオチド配列（配列番号：３３）を有する。
2004522406.tif 000056
Ｐｓｙ Ｂ７２８ａ ＥＥＬ ＯＲＦ６によりコードされたタンパク質またはポリペプチドは、下記のアミノ酸配列（配列番号：３４）を有する。
2004522406.tif 000057
【００３４】
シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）６１のＥＥＬは、多くのＯＲＦを含む。このオープンリーディングフレームのひとつは、外膜タンパク質ＨｏｐＰｓｙＡをコードする。ＨｏｐＰｓｙＡをコードするＤＮＡ分子は、下記のヌクレオチド配列（配列番号：３５）を有する。
2004522406.tif 000058
ＨｏｐＰｓｙＡは、下記のアミノ酸配列（配列番号：３６）を有する。
2004522406.tif 000059
2004522406.tif 000060
【００３５】
ｓｈｃＡと称される残りのオープンリーディングフレームは、下記のヌクレオチド配列（配列番号：３７）を有するＤＮＡ分子である。
2004522406.tif 000061
コードされたタンパク質またはポリペプチドＳｈｃＡは、下記のアミノ酸配列（配列番号：３８）を有する。
2004522406.tif 000062
【００３６】
本発明は更に、前記ＤＮＡ分子およびタンパク質またはポリペプチドに加え、その他のシュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）病原型から単離されている様々な本発明のＤＮＡ分子の相同体に関する。例えば、多くのＡｖｒＰｐｈＥ、ＡｖｒＰｐｈＦ、およびＨｏｐＰｓｙＡ相同体が、シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）病原型から同定されている。
【００３７】
ＡｖｒＰｐｈＥ相同体をコードするシュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．アングラタ（ａｎｇｕｌａｔａ）由来のＤＮＡ分子は、下記のヌクレオチド配列（配列番号：３９）を有する。
2004522406.tif 000063
シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．アングラタ（ａｎｇｕｌａｔａ）のＡｖｒＰｐｈＥ相同体のアミノ酸配列（配列番号：４０）は、以下のものである。
2004522406.tif 000064
2004522406.tif 000065
このタンパク質またはポリペプチドは、ＧＣ含量約５７％、推定等電点約９．５、および推定分子量約４１ｋＤａである。
【００３８】
ＡｖｒＰｐｈＥ相同体をコードするシュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．グリシネア（ｇｌｙｃｉｎｅａ）由来のＤＮＡ分子は、下記のヌクレオチド配列（配列番号：４１）を有する。
2004522406.tif 000066
シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．グリシネア（ｇｌｙｃｉｎｅａ）のＡｖｒＰｐｈＥ相同体のアミノ酸配列（配列番号：４２）は、以下のものである。
2004522406.tif 000067
2004522406.tif 000068
このタンパク質またはポリペプチドは、ＧＣ含量約５７％、推定等電点約９．１、および推定分子量約４１ｋＤａである。
【００３９】
ＡｖｒＰｐｈＥ相同体をコードするシュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．タバシ（ｔａｂａｃｉ）由来のＤＮＡ分子は、下記のヌクレオチド配列（配列番号：４３）を有する。
2004522406.tif 000069
シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．タバシ（ｔａｂａｃｉ）のＡｖｒＰｐｈＥ相同体のアミノ酸配列（配列番号：４４）は、以下のものである。
2004522406.tif 000070
2004522406.tif 000071
このタンパク質またはポリペプチドは、ＧＣ含量約５７％、推定等電点約９．３、および推定分子量約４１ｋＤａである。
【００４０】
別のＡｖｒＰｐｈＥ相同体をコードするシュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．タバシ（ｔａｂａｃｉ）由来のＤＮＡ分子は、下記のヌクレオチド配列（配列番号：４５）を有する。
2004522406.tif 000072
コードされたＡｖｒＰｐｈＥ相同体は、下記の配列番号：４６のアミノ酸配列を有する。
2004522406.tif 000073
2004522406.tif 000074
【００４１】
ＡｖｒＰｐｈＥ相同体をコードするシュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．グリシネア（ｇｌｙｃｉｎｅａ）品種４由来のＤＮＡ分子は、下記のヌクレオチド配列（配列番号：４７）を有する。
2004522406.tif 000075
コードされたＡｖｒＰｐｈＥ相同体は、下記の配列番号：４８のアミノ酸配列を有する。
2004522406.tif 000076
2004522406.tif 000077
【００４２】
ＡｖｒＰｐｈＥをコードするシュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．ファセオリコラ（ｐｈａｓｅｏｌｉｃｏｌａ）Ｂ１３０株由来のＤＮＡ分子は、下記のヌクレオチド配列（配列番号：４９）を有する。
2004522406.tif 000078
コードされたＡｖｒＰｐｈＥ相同体は、下記の配列番号：５０のアミノ酸配列を有する。
2004522406.tif 000079
2004522406.tif 000080
【００４３】
ＡｖｒＰｐｈＥ相同体をコードするシュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．アングラタ（ａｎｇｕｌａｔａ）Ｐａ９株由来のＤＮＡ分子は、下記のヌクレオチド配列（配列番号：５１）を有する。
2004522406.tif 000081
コードされたＡｖｒＰｐｈＥ相同体は、下記の配列番号：５２のアミノ酸配列を有する。
2004522406.tif 000082
2004522406.tif 000083
【００４４】
ＡｖｒＰｐｈＥ相同体をコードするシュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．デルフィニー（ｄｅｌｐｈｉｎｉｉ）ＰＤＤＣＣ５２９株由来のＤＮＡ分子は、下記のヌクレオチド配列（配列番号：５３）を有する。
2004522406.tif 000084
コードされたＡｖｒＰｐｈＥ相同体は、下記の配列番号：５４のアミノ酸配列を有する。
2004522406.tif 000085
2004522406.tif 000086
【００４５】
Ｐ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．トマト（ｔｏｍａｔｏ）ＤＣ３０００ ＥＥＬ ＯＲＦ２の相同体をコードするシュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．デルフィニー（ｄｅｌｐｈｉｎｉｉ）ＰＤＤＣＣ５２９株由来のＤＮＡ分子は、下記のヌクレオチド配列（配列番号：５５）を有する。
2004522406.tif 000087
コードされたタンパク質またはポリペプチドは、下記の配列番号：５６のアミノ酸配列を有する。
2004522406.tif 000088
2004522406.tif 000089
【００４６】
ＡｖｒＰｐｈＦ相同体をコードするシュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．デルフィニー（ｄｅｌｐｈｉｎｉｉ）ＰＤＤＣＣ５２９株ＯＲＦ１由来のＤＮＡ分子は、下記のヌクレオチド配列（配列番号：５７）を有する。
2004522406.tif 000090
コードされたＡｖｒＰｈｐＦ相同体は、下記の配列番号：５８のアミノ酸配列を有する。
2004522406.tif 000091
【００４７】
シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．デルフィニー（ｄｅｌｐｈｉｎｉｉ）ＰＤＤＣＣ５２９株ＯＲＦ１由来のＤＮＡ分子は、ＡｖｒＰｐｈＦ相同体をコードして、下記のヌクレオチド配列（配列番号：５９）を有する。
2004522406.tif 000092
コードされたＡｖｒＰｐｈＦ相同体は、下記の配列番号：６０のアミノ酸配列を有する。
2004522406.tif 000093
2004522406.tif 000094
【００４８】
シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）２２６株由来のＤＮＡ分子は、ＨｏｐＰｓｙＡの相同体をコードして、下記のヌクレオチド配列（配列番号：６１）を有する。
2004522406.tif 000095
コードされたＨｏｐＰｓｙＡ相同体は、下記の配列番号：６２のアミノ酸配列を有する。
2004522406.tif 000096
2004522406.tif 000097
【００４９】
シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．アトロファシエンス（ａｔｒｏｆａｃｉｅｎｓ）Ｂ１４３株由来のＤＮＡ分子は、ＨｏｐＰｓｙＡの相同体をコードして、下記のヌクレオチド配列（配列番号：６３）を有する。
2004522406.tif 000098
コードされたＨｏｐＰｓｙＡ相同体は、下記の配列番号：６４のアミノ酸配列を有する。
2004522406.tif 000099
2004522406.tif 000100
【００５０】
シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．トマト（ｔｏｍａｔｏ）ＤＣ３０００株由来のＤＮＡ分子は、本明細書においてはＨｏｐＰｔｏＡ２と同定されたＨｏｐＰｔｏＡの相同体をコードして、下記のヌクレオチド配列（配列番号：６５）を有する。
2004522406.tif 000101
ｈｏｐＰｔｏＡ２はＣＥＬ内に存在しないが、これはここに前述のようにＣＥＬ ＯＲＦ５に相当しているｈｏｐＰｔｏＡ相同体として含まれる。このコードされたＨｏｐＰｔｏＡ２タンパク質またはポリペプチドは、下記の配列番号：６６のアミノ酸配列を有する。
2004522406.tif 000102
2004522406.tif 000103
【００５１】
先に同定したタンパク質またはポリペプチドの断片に加え、その他の細菌、特にグラム陰性病原菌のＥＥＬおよびＣＥＬ由来の完全長タンパク質の断片も、同じく、本発明において使用することができる。
【００５２】
適当な断片は、いくつかの手段により作出されうる。公知のタンパク質をコードする遺伝子のサブクローンは、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らの論文（１９８９）およびアウスーベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）らの論文（１９９４）に記されたような、遺伝子断片をサブクローニングするための従来の分子遺伝学的操作を用いて作出されうる。その後このサブクローンを、細菌細胞において、インビトロまたはインビボにおいて発現し、例えば病原体毒性に必要な産物として、活性について試験されうるような比較的小さいタンパク質またはポリペプチドを得る。
【００５３】
別の手法において、タンパク質の一次構造に関する知識に基づいて、タンパク質をコードする遺伝子の断片を、タンパク質の特定の部分を示すように選択された特定のプライマーセットと共に、ＰＣＲ技法を用いて合成できる（Ｅｒｌｉｃｈら、１９９１）。次にこれらを、先に説明されたように細菌細胞由来の切断されたタンパク質またはポリペプチドの発現に適当なベクターへクローニングすることができる。
【００５４】
代わりの方法として、タンパク質断片を、キモトリプシンもしくはブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテイナーゼＡ、またはトリプシンのようなタンパク質分解酵素による完全長タンパク質の消化により作出することができる。様々なタンパク質分解性酵素は、特定のタンパク質のアミノ酸配列に基づいて、異なるタンパク質を異なる位置で切断すると考えられる。タンパク質分解により生じる断片の一部は、活性毒性タンパク質またはポリペプチドでありうる。
【００５５】
化学合成も、適当な断片の作出に使用することができる。このような合成は、生成されるポリペプチドに関する公知のアミノ酸配列を使用し実行される。あるいは、完全長タンパク質を高温および高圧に曝すことにより、断片が作製されると考えられる。次にこれらの断片は、通常の方法（例えば、クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離されうる。
【００５６】
変種を、同じく（または代わりに）、例えば、そのポリペプチドの特性、二次構造およびヒドロパシー的性質には最小の影響を有するようなアミノ酸の欠失または付加により修飾することができる。例えばポリペプチドは、タンパク質の転移を翻訳時または翻訳後に指示するようなタンパク質のＮ末端で、シグナル（またはリーダー）配列に結合することができる。更にポリペプチドは、ポリペプチドの合成、精製、または同定を容易にするために、リンカーまたは他の配列に結合することができる。
【００５７】
本発明において使用されるタンパク質またはポリペプチドは、常法により、好ましくは精製された形状で生成される（好ましくは純度が少なくとも約８０％、より好ましくは９０％）。典型的には、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、組換え宿主細胞の増殖培地へと分泌される（以下で考察する）。あるいは、本発明のタンパク質またはポリペプチドは生成されるが、増殖培地へは分泌されない。このような場合、タンパク質を単離するために、組換えプラスミドを保有する宿主細胞（例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ）を繁殖し、超音波、熱または化学処理により溶菌して、このホモジネートを遠心分離し、細菌デブリを除去する。次に上清を、連続硫酸アンモニウム沈降に供する。本発明のタンパク質またはポリペプチドを含む画分は、適宜サイズ化されたデキストランまたはポリアクリルアミドカラムにおけるゲル濾過に供され、このタンパク質が分離される。必要ならば、このタンパク質画分を、更にＨＰＬＣにより精製することができる。
【００５８】
その他のＥＥＬおよびＣＥＬのタンパク質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を、細菌の病原性島の部分をクローニングするためのＰＣＲに基づく方法を用いて同定することができる。基本的に、ＰＣＲに基づく戦略は、ｈｒｐＫおよびｔＲＮＡｌｅｕ遺伝子由来の保存配列（または他の保存性境界配列）の病原性島のＥＥＬ介在領域のクローニングのためのプライマーとしての使用に関連している。図２Ｂ−Ｃに示されたように、ｈｒｐＫおよびｔＲＮＡｌｅｕ遺伝子は、多様なシュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）変種の間で高度に保存されている。ＥＥＬのサイズに応じて、追加のプライマーが、当初得られたｃＤＮＡ配列から調製され、クローンの回収および、段階的方式でのＥＥＬの運用（ｗａｌｋ ｔｈｒｏｕｇｈ）を可能にする。完全長コード配列がＰＣＲ段階から得られないならば、適当な制限酵素を使用し、完全長コード配列を調製するために、コンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）を集成することができる。同様のＰＣＲに基づく方法を、ＣＥＬ内のオープンリーディングフレームをコードするクローンを得るために用いることができる。図３に示したように、多様なシュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）病原型のＣＥＬは、多くの保存性ドメインを含む。更にｈｒｐ／ｈｒｃドメインの公知の配列であるｈｒｐＷ、ＡｖｒＥ、またはｇｓｔＡを使用し、プライマーを調製することができる。
【００５９】
前述のＰＣＲに基づく方法を用いて、多くのＤＮＡ配列が、プライマーの供給源として利用された。このようなＤＮＡ分子のひとつは、シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．トマト（ｔｏｍａｔｏ）ＤＣ３０００のｔＲＮＡｌｅｕ遺伝子から単離されており、これは下記のヌクレオチド配列（配列番号：６７）を有する。
2004522406.tif 000104
適当なプライマーを供給するために使用することができるような追加のＤＮＡ分子は、シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）Ｂ７２８ａのｔＲＮＡｌｅｕ遺伝子に由来し、これは下記のヌクレオチド配列（配列番号：６８）を有する。
2004522406.tif 000105
別のＤＮＡ分子は、シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．トマト（ｔｏｍａｔｏ）ＤＣ３０００のｑｕｅＡ遺伝子から単離され、これは下記のヌクレオチド配列（配列番号：６９）を有する。
2004522406.tif 000106
ＤＮＡ分子は、ＱｕｅＡをコードし、これは下記のアミノ酸配列（配列番号：７０）を有する。
2004522406.tif 000107
2004522406.tif 000108
【００６０】
その他のＥＥＬおよびＣＥＬのタンパク質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を、このようなＤＮＡ分子がストリンジェントな条件下で、先に同定されたＤＮＡ分子にハイブリダイズするかどうかを決定することによっても同定することができる。適当なストリンジェンシー条件の例は、ハイブリダイゼーションが温度約３７℃で、０．９Ｍクエン酸ナトリウム（「ＳＳＣ」）緩衝液を含むハイブリダイゼーション媒質を用いて行われ、その後０．２×ＳＳＣ緩衝液を用いて３７℃で洗浄されるような条件である。より高いストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション条件または洗浄条件のいずれかの温度を上昇することによるか、もしくはハイブリダイゼーションまたは洗浄の媒質のナトリウム濃度を増加することにより容易に達成することができる。非特異的結合も、例えば、タンパク質含有溶液による膜のブロック、ハイブリダイゼーション緩衝液への異種のＲＮＡ、ＤＮＡ、およびＳＤＳの添加、ならびにＲＮａｓｅによる処理などのような、多くの公知の技術のいずれかひとつを用いて制御することができる。洗浄条件は、典型的には、ストリンジェンシーで、またはそれ以下で、行われる。高ストリンジェンシー条件の例は、１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．２％フィコール、０．２％ポリビニルピロリドン、０．２％ウシ血清アルブミン、および５０μｇ／ｍｌ大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＤＮＡを含有するハイブリダイゼーション媒質における、温度約４２℃〜約６５℃、最大約２０時間までのハイブリダイゼーションの実行段階、ならびにそれに続く０．２×ＳＳＣ緩衝液中で約４２℃〜約６５℃で実行された洗浄段階を含む。
【００６１】
先に同定されたＤＮＡ分子と比較して保存された置換基を含み、従って先に同定されたものと同じタンパク質またはポリペプチドをコードするような核酸分子も本発明に包含されている。更に相補配列も、本発明に包含されている。
【００６２】
本発明の核酸はＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかであり、これは先に同定した本発明のＤＮＡ分子を用いて、容易に調製することができる。
【００６３】
エフェクタータンパク質またはポリペプチドの送達は、処置される宿主および使用される材料に応じて、（１）安定したもしくはプラスミドにコードされた導入遺伝子として用いられる；（２）アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）もしくはウイルスベクターにより一過的に発現される；（３）機能性異種ＩＩＩ型分泌系を発現する無力化した（ｄｉｓａｒｍｅｄ）病原体もしくは組換え非病原細菌のＩＩＩ型分泌系により送達される；または、（４）局所適用、その後のＴＡＴタンパク質形質導入ドメインが媒介した自然発生的細胞取り込みにより送達されるなどの、いくつかの方法で達成することができる。これらは各々、以下に考察している。
【００６４】
タンパク質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を、通常の組換えＤＮＡ技術を用いて細胞に組込むことができる。一般にこれは、ＤＮＡ分子の、そのＤＮＡ分子が異種であるような、すなわち通常存在しないような、発現系への挿入に関連している。異種ＤＮＡ分子は、発現系またはベクターへ、適当なセンス方向でかつ正確な読みとり枠で挿入される。このベクターは、挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含む。
【００６５】
コーエン（Ｃｏｈｅｎ）およびボイヤー（Ｂｏｙｅｒ）の米国特許第４，２３７，２２４号は、制限酵素切断およびＤＮＡリガーゼによるライゲーションを用いる、組換えプラスミドの形の発現系の作製を開示している。その後これらの組換えプラスミドは、形質転換により導入され、組織培養において増殖した原核生物および真核細胞を含む単細胞培地において複製される。
【００６６】
組換え遺伝子は更に、ワクシニアウイルスのようなウイルスにも導入される。組換えウイルスは、プラスミドのウイルスに感染した細胞へのトランスフェクションによっても作製されうる。
【００６７】
適当なベクターは、下記のウイルスベクター、例えばλベクター系ｇｔ１１、ｇｔＷＥＳ．ｔＢ、Ｃｈａｒｏｎ４、およびプラスミドベクター、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１Ｏ８４、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＬＧ３３９、ｐＲ２９０、ｐＫＣ３７、ｐＫＣ１０１、ＳＶ４０、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋／−またはＫＳ＋／−（「Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社クローニング系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」カタログ（１９９３）参照、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ、これは本明細書に参照として組入れられている。）、ｐＱＥ、ｐＩＨ８２１、ｐＧＥＸ、ｐＥＴシリーズ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、１９９０）を含むが、これらに限定されない。組換え分子を、細胞へ、形質転換により、特に形質導入、接合、動態化（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）または電気穿孔により導入することができる。ＤＮＡ配列は、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らの論文（１９８９）に記されているような、当技術分野における標準のクローニング手法により、ベクターへクローニングされる。
【００６８】
様々な宿主−ベクター系を用いて、タンパク質コード配列（または複数）を発現することができる。第一に、このベクター系は、使用した宿主細胞と共存性がなければならない。宿主−ベクター系は以下を含むが、これらに限定されない：バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡにより形質転換された細菌；微生物、例えば酵母ベクターを含む酵母；ウイルス（例えばワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）で感染された哺乳類細胞系；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞系；および、細菌で感染された植物細胞。これらのベクターの発現エレメントは、それらの強度および特異性が変動する。利用された宿主−ベクター系に応じて、多くの適当な転写および翻訳エレメントの中のひとつを使用することができる。
【００６９】
様々な遺伝的シグナルおよびプロセシング（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）事象が、遺伝子発現の多くのレベルを制御する（例えば、ＤＮＡ転写およびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）翻訳）。
【００７０】
ＤＮＡの転写は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を指示しそれによりｍＲＮＡ合成を促進するようなＤＮＡ配列であるプロモーターの存在に左右される。真核生物プロモーターのＤＮＡ配列は、原核生物プロモーターのものとは異なる。真核生物プロモーターおよび付随する遺伝的シグナルは、原核生物系においては認識されないか、もしくは機能せず、更に原核生物プロモーターは、真核細胞において認識されずかつ機能しない。
【００７１】
同様に、原核生物におけるｍＲＮＡの翻訳は、真核生物のシグナルとは異なる適当な原核生物シグナルの存在に左右される。原核生物におけるｍＲＮＡの効率的翻訳は、ｍＲＮＡ上にシャイン・ダルガーノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ；「ＳＤ」）配列と称されるリボソーム結合部位を必要とする。この配列は、タンパク質のアミノ末端メチオニンをコードする、通常ＡＵＧである開始コドンの前に位置したｍＲＮＡの短いヌクレオチド配列である。このＳＤ配列は、１６Ｓ ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）の３’末端と相補的であり、ｒＲＮＡと二本鎖形成することにより、ｍＲＮＡのリボソームへの結合を促進し、リボソームの正確な位置決定を可能にすると考えられる。遺伝子発現の最小化の検証については、ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）およびローアー（Ｌａｕｅｒ）の論文（１９７９）を参照のこと。
【００７２】
プロモーターの「強度」（すなわち、それらの転写促進能）は、変動する。クローニングした遺伝子の発現を目的として、高レベルの転写を得、これにより遺伝子を発現するためには、強力なプロモーターを使用することが望ましい。利用した宿主細胞系に応じて、多くの適当なプロモーターのいずれかひとつを使用することができる。例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、そのバクテリオファージ、またはプラスミドにおいてクローニングする場合、Ｔ７ファージプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、リボソームＲＮＡプロモーター、コリファージλおよび、ｌａｃＵＶ５、ｏｍｐＦ、ｂｌａ、ｌｐｐ等を含むが、これらに限定されないその他のＰＲおよびＰＬプロモーターなどのようなプロモーターを使用し、隣接するＤＮＡセグメントの高レベル転写を指示することができる。加えて、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃＵＶ５（ｔａｃ）プロモーターまたは他の大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）プロモーターは、組換えＤＮＡにより作製されうり、もしくは他の合成ＤＮＡ技術を用いて、挿入された遺伝子の転写を提供されうる。
【００７３】
特に誘導されない限りは、プロモーターの作用を阻害するような細菌宿主細胞株および発現ベクターを選択することができる。ある操作において、特異的インデューサーの追加は、挿入されたＤＮＡの効率的転写に必要である。例えば、ｌａｃオペロンは、ラクトースまたはＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）の添加により誘導される。様々な他のオペロン、例えばｔｒｐ、ｐｒｏなどは、異なる制御下にある。
【００７４】
更に特定の開始シグナルが、原核細胞における効率的な遺伝子の転写および翻訳に必要である。これらの転写および翻訳開始シグナルは、各々、遺伝子特異的ｍＲＮＡおよび合成されたタンパク質の量により測定される「強度」を変動しうる。プロモーターを含むＤＮＡ発現ベクターは、様々な「強力」な転写および／または翻訳開始シグナルのいずれかの組合せも含みうる。例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）における効率的翻訳は、リボソーム結合部位を提供するために、開始コドン（「ＡＴＧ」）の５’側に約７塩基〜９塩基のＳＤ配列を必要とする。従って、宿主細胞リボソームにより利用することができるいずれかのＳＤ−ＡＴＧ組合せを使用できる。このような組合せは、コリファージλのｃｒｏ遺伝子またはＮ遺伝子、または大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）トリプトファンＥ遺伝子、Ｄ遺伝子、Ｃ遺伝子、Ｂ遺伝子またはＡ遺伝子からのＳＤ−ＡＴＧ組合せを含むが、これらに限定されない。加えて、組換えＤＮＡまたは合成ヌクレオチドの組込みに関連した他の技術により作製されたＳＤ−ＡＴＧ組合せのいずれかを使用することができる。
【００７５】
単離されたポリペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡ分子が発現系へクローニングされたならば、これを宿主細胞へ組込むことは容易である。このような組込みは、ベクター／宿主細胞系に応じて、前述の形質転換の様々な形により行うことができる。適当な宿主細胞は、細菌、ウイルス、酵母、哺乳類細胞、昆虫、植物などを含むが、これらに限定されない。
【００７６】
組換え宿主細胞にとって、コードされたタンパク質またはポリペプチドを分泌することは望ましいので、宿主細胞も、機能性ＩＩＩ型分泌系を有することが好ましい。ＩＩＩ型分泌系は宿主細胞に対して異種でありうる（Ｈａｍら、１９９８）か、もしくは宿主細胞は天然にＩＩＩ型分泌系を有しうる。天然にＩＩＩ型分泌系を含む宿主細胞は、多くの病原性グラム陰性菌、例えばエルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）種、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）種などを含む。他のＩＩＩ型分泌系が公知であり、更に他のものが継続して同定されている。エフェクタータンパク質またはポリペプチドの送達のために利用されうる病原細菌は、公知の技術、すなわち前述のような技術により無力化されることが好ましい。あるいは、宿主細胞または増殖培地からのエフェクタータンパク質またはポリペプチドの単離を、前述のように実行することができる。
【００７７】
本発明の別の局面は、本発明のタンパク質またはポリペプチドを発現しているトランスジェニック植物ならびにそれらの作出法に関する。
【００７８】
ＤＮＡ分子を単離された植物細胞または組織もしくは植物全体において発現するためには、植物の発現可能なプロモーターが必要である。いずれかの植物の発現可能なプロモーターを、その起源、すなわち、ウイルス、細菌、植物などとは無関係に利用することができる。限定的ではない２種の適当なプロモーターは、ノパリンシンターゼプロモーター（Ｆｒａｌｅｙら、１９８３）およびカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Ｏ’Ｄｅｌｌら、１９８５）を含む。これらのプロモーターは両方とも、それらの調節制御下で、コード配列の構成性発現を生じる。
【００７９】
構成性発現は、一般にＤＮＡ分子の発現に適しているが、一過性または組織調節した発現も望ましく、その場合望ましい発現を達成するためにいずれかの調節性プロモーターを選択できることは当業者には明らかである。典型的には、一過性または組織調節性プロモーターは、発生のある段階でのみまたは特定の組織においてのみ発現されるＤＮＡ分子と共同で使用されると考えられる。
【００８０】
一部の植物においては、病原体浸漬またはストレスに対して反応するようなプロモーターの使用も望ましいと考えられる。例えば、特定の植物病原体による感染に反応してタンパク質またはポリペプチドの発現を制限することが望ましいと考えられる。病原体誘導可能なプロモーターの一例は、ジャガイモ由来のｇｓｔ１プロモーターであり、これは本明細書に参照として組入れられているストリットマイヤー（Ｓｔｒｉｔｔｍａｙｅｒ）らの米国特許第５，７５０，８７４号および第５，７２３，７６０号に開示されている。
【００８１】
単離された植物細胞または組織もしくは植物全体におけるＤＮＡ分子の発現も同じく、適当な転写終結およびｍＲＮＡのポリアデニル化を必要としている。植物細胞または組織における使用に適した３’調節領域のいずれかを、第一および第二のＤＮＡ分子に機能的に連結することができる。多くの３’調節領域が植物において機能することは公知である。３’調節領域の例は、ノパリンシンターゼ３’調節領域（Ｆｒａｌｅｙら、１９８３）およびカリフラワーモザイクウイルス３’調節領域（Ｏｄｅｌｌら、１９８５）を含むが、これらに限定されない。
【００８２】
プロモーターおよび３’調節領域は、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らの論文（１９８９）に記されたような周知の分子クローニング技術を用いて、容易にＤＮＡ分子へライゲーションすることができる。
【００８３】
植物細胞を本発明のＤＮＡ分子により形質転換するひとつの手法は、宿主細胞の微粒子銃（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）（微粒子銃形質転換（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）としても公知）である。これはいくつかの方法のひとつで達成することができる。最初に、細胞における、不活性粒子または生物学的活性粒子の噴射が関与する。この技術は、サンフォード（Ｓａｎｆｏｒｄ）らの米国特許第４，９４５，０５０号、第５，０３６，００６号、および第５，１００，７９２号に開示されている。一般にこの手法は、細胞の外側表面を貫通してその内部に取り込まれるのに有効な条件下での、細胞における、不活性粒子または生物学的活性粒子の噴射が関与している。不活性粒子が使用される場合、粒子を異種ＤＮＡを含むベクターで被覆することにより、ベクターを細胞へ導入できる。あるいは、標的細胞がベクターにより取り囲まれ、その結果ベクターが、粒子の伴流（ｗａｋｅ）により細胞へと運搬される。生物学的活性粒子（例えば、ベクターおよび異種ＤＮＡを含む乾燥した細菌細胞）も、植物細胞へ噴射することができる。現在公知のものおよび今後開発されるものを含むその他の粒子衝撃法の変法も使用することができる。
【００８４】
ＤＮＡ分子を植物細胞へ導入する別法は、ＤＮＡ分子を含む、ミニ細胞、細胞、リソソームまたはその他の融合可能な脂質表面を持つ本体のいずれかである他の実体と、プロトプラストの融合である（Ｆｒａｌｅｙら、１９８２）。
【００８５】
ＤＮＡ分子を更に、電気穿孔により植物細胞へ導入することもできる（Ｆｒｏｍｍら、１９８５）。この技術において、植物プロトプラストは、ＤＮＡ分子を含むプラスミドの存在下で電気穿孔される。電界強度が高い電気インパルスは、生体膜を可逆的に透過し、プラスミドを導入する。電気穿孔された植物のプロトプラストは、細胞壁を再構築し、分裂して再分化する。
【００８６】
ＤＮＡ分子の植物細胞への導入の別法は、植物細胞の、ＤＮＡ分子により予め形質転換されたアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはアグロバクテリウム・リゾジーンズ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）による感染である。当技術分野において公知の適当な条件下で、形質転換された植物細胞は生育され、苗条または根を形成して、更に植物体へと成長する。一般にこの手法は、植物組織の細菌懸濁液による接種、および組織の抗生物質を含まない再分化培地における２５℃〜２８℃での４８時間〜７２時間のインキュベーションに関連している。
【００８７】
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）は、グラム陰性菌であるファミリーリゾビアセエ（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）属の代表である。その種は、クラウンゴール（Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）および毛根病（Ａ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）に寄与している。クラウンゴール腫瘍および毛根の植物細胞は、これらの細菌によってのみ異化代謝されるオパインとして公知のアミノ酸誘導体の産生を誘導する。オパインの発現に寄与している細菌遺伝子は、キメラ発現カセットのための制御エレメントの都合の良い供給源である。加えて、オパインの存在をアッセイすることにより、形質転換された組織を同定することができる。
【００８８】
本発明のＤＮＡ分子のような異種遺伝子配列は、適当な植物細胞へ、Ａ．ツメファシエンス（ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラスミドまたはＡ．リゾジーンズ（ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）のＲｉプラスミドにより導入することができる。このＴｉまたはＲｉプラスミドは、植物細胞へ、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）による感染時に伝播され、植物ゲノムへ安定して組込まれる（Ｓｃｈｅｌｌ、１９８７）。
【００８９】
形質転換に適した植物組織は、葉組織、根組織、分裂組織、接合体および体細胞胚、および葯を含む。
【００９０】
形質転換後、その形質転換された植物細胞を、選択して再分化することができる。
【００９１】
好ましくは、形質転換された細胞は最初に、例えば、宿主細胞へ本発明のＤＮＡ分子と同時に導入される選択マーカーを用いて、同定される。適当な選択マーカーは、例えばカナマイシン耐性のような、抗生物質耐性をコードするマーカーを含むが、これらに限定されない（Ｆｒａｌｅｙら、１９８３）。多くの抗生物質耐性マーカーが当技術分野において公知であり、その他のものが継続的に同定されつつある。いずれか公知の抗生物質耐性マーカーを、本発明に従い、形質転換および形質転換された宿主細胞の選択に使用することができる。細胞または組織は、抗生物質を含有する選択培地において生育され、これにより一般に抗生物質耐性マーカーを発現している形質転換体のみが、生育し続ける。
【００９２】
組換え植物細胞または組織が得られたならば、それから完全に生育した植物を再分化することが可能になる。従って本発明の別の局面は、プロモーターが、卵菌類（ｏｏｍｙｃｅｔｅ）による植物の感染に反応して、第一のＤＮＡ分子の転写を誘導するような、本発明のＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物に関する。好ましくは、このＤＮＡ分子は、本発明のトランスジェニック植物のゲノムに安定して挿入される。
【００９３】
培養されたプロトプラストからの植物再分化は、エバンス（Ｅｖａｎｓ）らの論文（１９８３）ならびにバシル（Ｖａｓｉｌ）らの論文（１９８４および１９８６）に記されている。
【００９４】
実践的に全ての植物が培養された細胞または組織から再分化され得ることは公知であり、これはコメ、コムギ、オオムギ、ライムギ、綿花、ヒマワリ、ピーナッツ、トウモロコシ、ジャガイモ、サツマイモ、マメ、エンドウ、チコリ、レタス、エンダイブ、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリ、カブ、ラディッシュ、ホウレンソウ、タマネギ、ニンニク、ナスビ、ペッパー、セロリ、ニンジン、スカッシュ、カボチャ、ズッキーニ、キュウリ、リンゴ、ナシ、メロン、イチゴ、ブドウ、ラズベリー、パイナップル、ダイズ、タバコ、トマト、サトウモロコシ、およびサトウキビの主な種の全てを含むが、これらに限定されない。
【００９５】
再分化の手段は、植物の種毎に変動するが、一般に形質転換されたプロトプラストの懸濁液または形質転換された外植片を含むペトリ皿が最初に提供される。カルス組織が形成され、苗条がカルスから誘導され、その後発根され得る。あるいは、胚形成が、カルス組織において誘導される。これらの胚は、天然の胚のように発芽し、植物体を形成する。この培養培地は、一般に様々なアミノ酸およびホルモン、例えばオーキシンおよびサイトカインなどを含有すると考えられる。更に培地にグルタミン酸およびプロリンを添加することも、特にトウモロコシおよびアルファルファのような種にとっては、有利である。効率的再分化は、培地、遺伝子型、および培養履歴によって左右されると考えられる。これら３種の変量が管理されるならば、その結果通常再分化は再現性がありかつ反復可能である。
【００９６】
ＤＮＡ分子が安定してトランスジェニック植物に組込まれた後、有性交雑によるかまたは栽培品種の調製により、これを別の植物体に移すことができる。有性交雑に関して、多くの標準の育種技術のいずれかを、交雑される種に応じて使用することができる。栽培品種は、当業者に公知の通常の農学的手法に従い繁殖することができる。
【００９７】
圧倒的多数の細菌病原体により惹起された疾病は、限定された病変を生じる。すなわち、全てが病原体にとって好都合に作用した（例えば、エフェクターのひとつのＲ遺伝子の検出のために過敏感反応の引き金とならない）場合であっても、この寄生性の過程は依然２、３日後に防御の引き金となり、これは次に伝播（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）による感染を停止する。従って、寄生を進行させるのと正に同じエフェクターが、最終的に防御の引き金とならなければならない。その結果、これらのエフェクターの未熟な発現は、より早期（すなわち、感染前）に植物防御の「スイッチを入れる」と考えられ、植物を、エフェクタータンパク質が得られた特定の細菌または多くの病原体のいずれかに対して耐性にする。この手法の利点は、これが天然の産物に関連して、植物が病原体エフェクタータンパク質に対して高感受性であると考えられることである。
【００９８】
ひとつの態様に従い、本発明の異種ＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物が提供される。好ましくは、この異種ＤＮＡ分子は、植物病原体ＥＥＬに由来する。この異種ＤＮＡ分子がトランスジェニック植物において発現される場合、植物の防御が活性化され、このトランスジェニック植物へ疾病耐性を付与する。このトランスジェニック植物は更に、異種ＤＮＡ分子のタンパク質またはポリペプチド産物により活性化されるようなＲ遺伝子を含むこともできる。このＲ遺伝子は、植物中に天然に生じるか、または異種性にその中に挿入することができる。多くのＲ遺伝子が、様々な植物種において同定されており、これは下記を含むが、これらに限定されない：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＲＰＳ２、ＲＰＭ１、およびＲＰＰ５；トマト由来のＣｆ２、Ｃｆ９、Ｉ２、Ｐｔｏ、およびＰｔｆ；タバコ由来のＮ；亜麻由来のＬ６およびＭ；コメ由来のＸａ２ｌ；および、サトウダイコン由来のＨｓ１ｐｒｏ−１。本発明のトランスジェニック植物における植物防御の刺激は、疾病耐性を付与することに加えて、生育および昆虫に対する耐性の同時増強を生じうると考えられている。
【００９９】
別の態様に従い、トランスジェニックまたは非トランスジェニックの植物は、本発明のタンパク質またはポリペプチドにより処理される。処理は、タンパク質またはポリペプチドを植物に適用する様々な形を含むことが意図されている。エフェクターポリペプチドまたはタンパク質が植物に適用されるような本発明の態様は、以下を含むような多くの方法で実行することができる：１）単離されたタンパク質（またはこれを含有する組成物）の適用、または２）疾病を引き起さずかつ本発明のエフェクタータンパク質をコードする遺伝子で形質転換された細菌の適用。後者の態様において、エフェクタータンパク質は、このエフェクタータンパク質をコードするＤＮＡ分子を含有する細菌を散布することにより、植物に適用され得る。このような細菌は、タンパク質が植物細胞に接触することができるようにタンパク質を分泌または輸送することが可能であることが好ましい。これらの態様において、タンパク質は、インプランタ（ｉｎ ｐｌａｎｔａ）で細菌により産生される。
【０１００】
このような局所的使用は、典型的には、形質導入ドメインを含むエフェクター融合タンパク質を用いて実施され、これはエフェクタータンパク質の細胞への形質導入ドメインが媒介した自然発生的取り込みを可能にする。基本的には、これは、標準のｒＤＮＡ技術による１１アミノ酸のペプチド
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の、エフェクタータンパク質のＮ末端への融合により実行され、得られるタグ付きタンパク質は、未知の過程により細胞へ取り込まれる。このペプチドは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＴＡＴタンパク質のタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）である（Ｓｃｈｗａｒｚｅら、２０００）。その他のＰＴＤも公知であり、この目的に使用されると考えられる（Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ、２０００）。
【０１０１】
エフェクタータンパク質が植物に局所適用される場合、これは、例えば水、水溶液、スラリー、または乾燥粉末の形状で担体を含有する組成物として適用される。この態様において、組成物は、約５ｎＭを上回る本発明のタンパク質を含有する。
【０１０２】
本組成物は、必須ではないが、肥料、殺虫剤、殺真菌剤、殺線虫剤、およびそれらの混合物を含む追加の添加剤を含有することができる。適当な肥料は、（ＮＨ４）２ＮＯ３を含む。適当な殺虫剤の例はマラチオン（Ｍａｌａｔｈｉｏｎ）である。有用な殺真菌剤はキャプタン（Ｃａｐｔａｎ）である。
【０１０３】
その他の適当な添加剤は、緩衝剤、湿潤剤、コーティング剤、および場合によっては研磨剤を含む。これらの材料を用いて、本発明の過程を促進することができる。
【０１０４】
本発明の別の局面において、植物病原体ＣＥＬ産物の機能を破壊することが可能である転写産物もしくはタンパク質またはポリペプチドをコードする異種ＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物が提供される。ＣＥＬ遺伝子は、特に発病において重要であるので、ＣＥＬ遺伝子はグラム陰性病原菌の中で、特に種の系統にそって高度に保存されていることから、植物におけるそれらの産物の機能の破壊は、広範な耐性を生じうる。ＣＥＬ産物の機能を破壊することができるタンパク質またはポリペプチドの例は、通常の技術によりＣＥＬ産物に対して生じたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。この抗体は、単離されると、配列決定され、これをコードする核酸が合成される。このような核酸、例えばＤＮＡは、植物の形質転換に使用することができる。
【０１０５】
高感受性であるように、かつしたがって、バイオテクノロジー的目的のために非病原細菌の増殖を支持するように、トランスジェニック植物を更に遺伝子操作することもできる。多くの植物の病原細菌が、植物葉内部の環境を変更し、その結果非病原細菌が増殖できることは公知である。この能力は、病原体エフェクタータンパク質により引き起された植物における変化に基づくと考えられる。従って、適当なエフェクター遺伝子を発現しているトランスジェニック植物を、これらの目的に使用することができる。
【０１０６】
ある態様において、本発明の異種ＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物は、トランスジェニック植物が適合性非病原細菌（すなわち、様々なＣｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｓｓｐ．のような非病原性内部寄生菌）の増殖の支援を可能にする、１種以上のエフェクタータンパク質を発現する。適合性非病原細菌は天然に生じることができ、または組換体であることができる。好ましくは、非病原細菌は組換体であり、１種以上の有用な産物を発現している。従って、トランスジェニック植物は、望ましい産物を生産するための植物工場（ｇｒｅｅｎ ｆａｃｔｏｒｙ）となる。望ましい産物とは、植物の栄養の品質を増強することができる産物または単離された形が望ましい産物を含むが、これらに限定されない。単離された形が望ましい場合は、この産物は、植物組織から単離されうる。望ましい産物を発現する非病原細菌と発現しないものとの間の競合を防止するために、組換え非病原細菌の必要物（ｎｅｅｄｓ）を目的に合わせることが可能であり、その結果これらのみが、本発明の特定のエフェクタータンパク質またはポリペプチドを発現している植物組織において生存することが可能である。
【０１０７】
本発明のエフェクタータンパク質またはポリペプチドは、寄生生物に有利であるように代謝経路をシフトすることにより、および細胞死経路を活性化または抑制することにより、植物の生理を変更すると考えられる。従ってこれらは更に、効率的に栄養素含量を変更して老化を遅延または引き起こすのに有用な道具も提供する。これらの可能な作用の全てについて農業的用途がある。
【０１０８】
更なる本発明の局面は、ＣＥＬおよびＥＥＬの診断的用途に関する。このＣＥＬ遺伝子は、グラム陰性菌、特に病原性グラム陰性菌（Ｐ． ｓｙｒｉｎｇａｅなど）に普遍的であるのに対して、ＥＥＬ配列は、菌株特異的であり、特に脅威であるような菌株の存在、起源および移動（および検疫通過による伝播の制限）を追跡するために使用することができる「毒性遺伝子フィンガープリント」を提供する。ＣＥＬおよびＥＥＬは、シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）の様々な病原型において同定されているが、ほとんど全てのグラム陰性病原体は、ＣＥＬ遺伝子およびＥＥＬ遺伝子の相同性に基づいて同定、識別および分類されうると予想される。
【０１０９】
ある態様において、より高い配列同一性がより密接な関係を示す、２種の細菌の間の関係を決定する方法は、これら２種の細菌のＣＥＬの核酸並置またはアミノ酸並置の比較、およびその後のこれら２種の細菌の関係の決定により実行される。ＣＥＬは、２種の個別の細菌種の関係の決定に特に有用である。
【０１１０】
別の態様において、より高い配列同一性がより密接な関係を示す、２種の細菌の間の関係を決定する方法は、これら２種の細菌のＥＥＬの核酸並置またはアミノ酸並置の比較、およびその後のこれら２種の細菌の関係の決定により実行される。ＥＥＬは、単独の細菌種のふたつの病原型の関係の決定に特に有用である。
【０１１１】
細菌種および／または病原型の関係を決定する方法が与えられたならば、これらの方法を、植物育種プログラムと共に利用することができる。特定の生育領域において蔓延している病原体の「毒性遺伝子フィンガープリント」を検出することにより、前述のようなトランスジェニック栽培品種の開発、または蔓延する病原体に対して耐性であるような現存する植物栽培品種の同定が可能になる。
【０１１２】
前述の用途に加え、本発明の別の局面は、動物、好ましくはヒト、イヌ、マウス、ラットを含むが、これらに限定されない哺乳類のための、遺伝子およびタンパク質に基づく療法に関する。Ｐ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）Ｂ７２８ａ ＥＥＬ ＯＲＦ５タンパク質（配列番号：３２）は、ＡｖｒＲｘｖ／ＹｏｐＪタンパク質ファミリーの一員である。ＹｏｐＪは、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）ＩＩＩ型分泌系によりヒト細胞へ注入され、そこでこれはある種のタンパク質リン酸化酵素の機能を破壊し、サイトカイン放出を阻害してプログラムされた細胞死を促進する。多くの病原体エフェクタータンパク質（すなわち、Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅエフェクタータンパク質）の標的は、真核生物に普遍的であり、その結果様々な可能性のある有用な機能を有すると考えられる。実際に、Ｐ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）Ｈｒｐ病原性島における２種のタンパク質は、酵母において発現された場合には毒性がある。これらは、Ｐ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）ＥＥＬ由来のＨｏｐＰｓｙＡおよびＰ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．トマト（ｔｏｍａｔｏ）ＤＣ３０００ ＣＥＬ由来のＨｏｐＰｔｏＡである。これは、普遍的真核生物標的の概念を裏付けている。
【０１１３】
従って本発明の更なる局面は、真核細胞への細胞毒性シュードモナスタンパク質の導入により実施されるような真核細胞死を引き起こす方法に関する。細胞毒性シュードモナスタンパク質は、好ましくはＨｏｐＰｓｙＡ（例えば、配列番号：３６（Ｐｓｙ６１）、６２（Ｐｓｙ２２６）、または６４（ＰｓｙＢ１４３））、ＨｏｐＰｔｏＡ（配列番号：７）、またはＨｏｐＰｔｏＡ２（配列番号：６６）である。処理されうる真核細胞は、インビトロまたはインビボのいずれかであってよい。真核細胞をインビボにおいて処理する場合、多くの様々なタンパク質またはＤＮＡの送達系を使用し、エフェクタータンパク質を標的真核細胞へ導入することができる。
【０１１４】
理論に縛られるわけではないが、少なくともＨｏｐＰｓｙＡエフェクタータンパク質はそれらの細胞毒性作用をＭａｄ２相互作用を介して発揮し、紡錘体形成の細胞チェックポイントを破壊する（下記参照）と考えられている。
【０１１５】
このタンパク質またはＤＮＡの送達系は、適当な賦形剤または安定剤を含み得る、薬学的に許容できる担体中の送達系を含む薬学的組成物の形で提供されうる。剤形は、例えば散剤、液剤、懸濁剤、または乳剤のような固形または液体の形であることができる。典型的にはこの組成物は、約０．０１％〜９９％、好ましくは約２０％〜７５％の活性化合物（または複数）を、担体、賦形剤、安定剤などと共に含有すると考えられる。
【０１１６】
本発明の組成物は、好ましくは、薬学的担体を含む生理的に許容できる希釈剤中のこれらの物質の溶液または懸濁液により注射可能なまたは局所塗布される投薬形態で投与される。このような担体は、滅菌した液体、例えば水および油を含み、界面活性剤ならびにアジュバント、賦形剤または安定剤を含む他の薬学的かつ生理的に許容できる担体を添加してもしなくても良い。油の例は、石油、動物性油、植物性油、または合成油を起源とするもの、例えばピーナッツ油、ダイズ油、または鉱油である。一般に、水、生理食塩水、水性デキストロースおよび関連した糖溶液、ならびにグリコール、例えばプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールが、液体担体として、特に注射可能な液体として好ましい。
【０１１７】
あるいは、エフェクタータンパク質を同じく、加圧したエアゾール容器内に、常用のアジュバントを含む、例えばプロパン、ブタン、またはイソブタンなどの炭化水素噴射剤のような適当な噴射剤と共に封入した溶液または懸濁液により送達することができる。本発明の物質は更に、ネブライザー（ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ）またはアトマイザー（ａｔｏｍｉｚｅｒ）のような非加圧式で投与することもできる。
【０１１８】
実施される治療に応じて、本発明の化合物を、経口的、局所的、経皮的、非経口的、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、点鼻注入、腔内または膀胱内への注入、眼内、動脈内、病巣内、もしくは鼻、喉または気管支などの粘膜への塗布により投与することができる。
【０１１９】
本発明の範囲内の組成物は、意図された目的を達成するのに有効な量の本発明の化合物が含まれるような、全ての組成物を含んでいる。個々の必要性は異なるので、各成分の有効量の最適範囲の決定は、当業者の範囲内である。
【０１２０】
エフェクタータンパク質を細胞へ送達するひとつの手法は、リポソームの使用に関する。基本的に、これは、送達されるべきエフェクタータンパク質を含むリポソームを提供し、次に標的細胞をリポソームと、エフェクタータンパク質を細胞へ送達するのに条件下で接触することに関連する。
【０１２１】
リポソームは、水相を封入している１個以上の同心円に並んだ脂質二重層で構成された小胞である。これらは、通常は漏出性ではないが、穴または孔が膜に生じた場合、膜が溶解または崩壊した場合、または膜の温度が相転移温度まで上昇した場合には、漏出性となる。リポソームによる薬物送達の現行法は、リポソーム担体が最終的に透過可能となりかつ標的部位において封入した薬物を放出することを必要としている。これは、例えばリポソーム二重層が、生体内の様々な物質の作用により、時間をかけて崩壊するような受動的様式で達成され得る。あらゆるリポソーム組成物は、循環系においてまたは生体内の他の部位において特徴のある半減期を有し、その結果リポソーム組成物の半減期を制御することにより、二重層が崩壊する速度は若干調節され得ると考えられる。
【０１２２】
受動薬物放出に対して、能動的薬物放出は、リポソーム小胞における透過性の変化を誘導する物質の使用に関連する。リポソーム膜は、リポソーム膜近傍の環境が酸性になった時に不安定化されるように構築することができる（例えば、本明細書に参照として組入れられている、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８４：７８５１（１９８７）；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８：９０８（１９８９）を参照のこと）。例えばリポソームが標的細胞により形質膜陥入された（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｅｄ）場合、これらは、リポソームを不安定化して薬物放出を生じると考えられる酸性エンドソームへと経路が定められている。
【０１２３】
あるいは、リポソーム膜を化学的に修飾することができ、その結果酵素が膜上にコーティングとして配置され、これがリポソームをゆっくり不安定化する。薬物放出の制御は最初に膜に配置された酵素濃度によって左右されるので、薬物放出を「要求に応じて」薬物送達を達成するように変調または変更する真の効果的方法は存在しない。リポソーム小胞が標的細胞に接触するや否や、これが呑食され、かつｐＨの低下が薬物放出をもたらすという点で、ｐＨ感受性リポソームにも同じ問題が存在する。
【０１２４】
このリポソーム送達系を更に、能動的標的化を介して（例えば、リポソーム小胞の表面への抗体またはホルモンの組込みにより）、標的器官、組織、または細胞に蓄積させることもできる。これは、公知の方法に従い行うことができる。
【０１２５】
様々な種類のリポソームを、バンガム（Ｂａｎｇｈａｍ）ら（１９６５）；スー（Ｈｓｕ）らの米国特許第５，６５３，９９６号；リー（Ｌｅｅ）らの米国特許第５，６４３，５９９号；ホーランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）らの米国特許第５，８８５，６１３号；ジャウ（Ｄｚａｕ）らの米国特許第５，６３１，２３７号；および、ローリー（Ｌｏｕｇｈｒｅｙ）らの米国特許第５，０５９，４２１号に従い調製することができる。
【０１２６】
エフェクタータンパク質を送達する別の手法は、複合されたエフェクタータンパク質の酵素分解を避けるために安定化されるようなポリマーへの所望のエフェクタータンパク質の複合に関する。この種の複合されたタンパク質またはポリペプチドは、エキューリブ（Ｅｋｗｕｒｉｂｅ）の米国特許第５，６８１，８１１号に開示されている。
【０１２７】
タンパク質またはポリペプチドを送達する更に別の手法は、ハートライン（Ｈｅａｒｔｌｅｉｎ）らの米国特許第５，８１７，７８９号に開示されているキメラタンパク質の調製に関する。キメラタンパク質は、リガンドドメインおよび、例えば、本発明のエフェクタータンパク質を含む。このリガンドドメインは、標的細胞上に位置した受容体に特異的である。従ってキメラタンパク質が経静脈的に送達されるかさもなければ血液またはリンパ液に導入された場合、キメラタンパク質は標的化された細胞に吸着して、標的化された細胞はキメラタンパク質を取り込み、これは、エフェクタータンパク質が細胞チェックポイント制御メカニズムを不安定化させるのを可能にし、細胞毒性作用をもたらす。
【０１２８】
標的細胞における本発明のエフェクタータンパク質の異種発現を達成することが望ましい場合、所望のエフェクタータンパク質をコードするＤＮＡ分子が細胞へ送達され得る。基本的には、これは、エフェクタータンパク質をコードする核酸分子を提供すること、および次に細胞内でエフェクタータンパク質を発現するのに有効な条件下で核酸分子を細胞へ導入することを含む。好ましくは、これは、核酸分子の、細胞へ導入される前の、発現ベクターへの挿入により達成される。
【０１２９】
エフェクタータンパク質の異種発現に関して哺乳類細胞が形質転換される場合、アデノウイルスベクターを使用することができる。アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルは、バークナー（Ｂｅｒｋｎｅｒ）（１９８８）およびローゼンフィールド（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ）ら（１９９１）の論文に示されたように、迅速に調製されかつ利用されうる。アデノ随伴ウイルス遺伝子送達ビヒクルは、遺伝子を細胞へ送達するために構築されかつ使用されうる。インビトロにおけるアデノ随伴ウイルス遺伝子送達ビヒクルは、チャテルジー（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ）ら、１９９２；ワルシュ（Ｗａｌｓｈ）ら、１９９２；ワルシュ（Ｗａｌｓｈ）ら、１９９４；フロッテ（Ｆｌｏｔｔｅ）ら、１９９３ａ；ポナチャガン（Ｐｏｎｎａｚｈａｇａｎ）ら、１９９４；ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、１９９４；エイナーハンド（Ｅｉｎｅｒｈａｎｄ）ら、１９９５；ルオ（Ｌｕｏ）ら、１９９５；および、ゾー（Ｚｈｏｕ）ら、１９９６に記されている。これらのビヒクルのインビボ使用は、フロッテ（Ｆｌｏｔｔｅ）ら、１９９３ｂおよびカプリット（Ｋａｐｌｉｔｔ）ら、１９９４に記されている。別の種類のアデノウイルスベクターは、ウィッカム（Ｗｉｃｋｈａｍ）らの米国特許第６，０５７，１５５号；ボート（Ｂｏｕｔ）らの米国特許第６，０３３，９０８号；ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）らの米国特許第６，００１，５５７号；チェンバレン（Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ）らの米国特許第５，９９４，１３２号；コチャネック（Ｋｏｃｈａｎｅｋ）らの米国特許第５，９８１，２２５号；スプーナー（Ｓｐｏｏｎｅｒ）らの米国特許第５，８８５，８０８号；および、キュリール（Ｃｕｒｉｅｌ）の米国特許第５，８７１，７２７号に開示されている。
【０１３０】
感染型形質転換系を形成するように修飾されているレトロウイルスベクターも、所望のエフェクタータンパク質をコードする核酸を標的細胞へ送達するために使用することができる。このような種類のレトロウイルスベクターのひとつは、クリーグラー（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ）らの米国特許第５，８４９，５８６号に開示されている。
【０１３１】
使用した感染型形質転換系とは無関係に、特定の細胞型へと核酸を送達するために標的化されなければならない。例えば、核酸の腫瘍細胞への送達に関して、腫瘍細胞感染の可能性を増大するように、高力価の感染型形質転換系を、腫瘍部位内に直接注入することができる。その後感染した細胞は、所望のエフェクタータンパク質、例えばＨｏｐＰｔｏＡ、ＨｏｐＰｓｙＡ、またはＨｏｐＰｔｏＡ２を発現し、細胞機能を破壊して、細胞毒性作用を生じる。
【０１３２】
特に好ましいのは、癌性症状を治療するための本発明のエフェクタータンパク質の使用である（すなわち、感染される真核細胞は癌細胞である）。これは、癌細胞分裂を阻害するのに有効な条件下で、細胞毒性シュードモナスタンパク質を患者の癌細胞へ導入し、これにより癌性症状を治療することにより行うことができる。
【０１３３】
導入により、エフェクタータンパク質が、患者へ、好ましくは癌細胞へ標的送達するような組成物の形状で投与されることが意図されている。あるいは、ＤＮＡに基づく療法を用いる場合、癌細胞が標的化されかつそこでエフェクタータンパク質が発現されるように、標的ＤＮＡ送達系を患者へ投与することにより導入が実行されることが意図されている。
【０１３４】
実施例
下記の実施例は、例証を意図しているが、決して本発明の範囲を限定することは意図していない。
【０１３５】
材料および方法
細菌株、培養条件、プラスミド、およびＤＮＡ操作技術：
Ｐ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）の多様性の異なるレベルを表している３種の実験的に取扱いやすい菌株：Ｐｓｙ ６１、Ｐｓｙ Ｂ７２８ａ、およびＰｔｏ ＤＣ３０００について調べた。（ｉ）Ｐｓｙ ６１は、そのコスミドｐＨＩＲ１１にクローニングされたそのｈｒｐ遺伝子クラスターが蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｉｌ）のような非病原細菌に必要な全ての遺伝子を含み、タバコにおいてＨＲを誘起してＨｒｐ系により豊富に分泌される未知の機能を伴うタンパク質であるＨｒｐＺハルピンを培養物中に分泌する、マメの弱い病原体である（Ａｌｆａｎｏら、１９９６）。ｐＨＩＲ１１ ｈｒｐクラスターは、完全に配列決定されており（図１）（ＡｌｆａｎｏおよびＣｏｌｌｍｅｒ、１９９７）、クラスターの左端の超可変領域のｈｏｐＰｓｙＡ遺伝子は、Ａｖｒ表現型を有し、Ｈｒｐ経路を移動して、タバコ細胞において発現された場合に細胞死を誘起するようなタンパク質をコードすることが示されている（ＡｌｆａｎｏおよびＣｏｌｌｍｅｒ、１９９７；Ａｌｆａｎｏら、１９９７；ｖａｎ Ｄｉｊｋら、１９９９）。（ｉｉ）Ｐｓｙ Ｂ７２８ａは、６１株と同じ病原型であるが、これは、高度に毒性でありかつ圃場において着生菌の適応度および病原性（マメの茶斑）におけるＨｒｐ系の役割を研究するためのモデルである（Ｈｉｒａｎｏら、１９９９）。（ｉｉｉ）Ｐｔｏ ＤＣ３０００は、病原型シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）株から高度に分岐されているようなアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）およびトマト（ｔｏｍａｔｏ）の良く研究された病原体（細菌の小斑点（ｓｐｅｃｋ）を生じる）である。ｒＲＮＡオペロンＲＦＬＰパターンの分析は、ＰｔｏおよびＰｓｙは関連が弱くかつ別個の種と考えられることを示している（ＭａｎｃｅａｕおよびＨｏｒｖａｉｓ、１９９７）。従って、本発明者らは、同じ病原型の２種の菌株を高度に分岐した病原型の菌株と比較することができた。
【０１３６】
Ｐｓｙ ６１（Ｐｒｅｓｔｏｎら、１９９５）、Ｐｓｙ Ｂ７２８ａ（Ｈｉｒａｎｏら、１９９９）、およびＰｔｏ ＤＣ３０００（Ｐｒｅｓｔｏｎら、１９９５）の供給源を有するように、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）およびＰ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）株を培養する条件が説明されている（ｖａｎ Ｄｉｊｋら、１９９９）。大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＤＨ５αにおけるクローニングおよびＤＮＡ操作は、常法（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９４）に従い、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）、ｐＲＫ４１５（Ｋｅｅｎら、１９８８）、およびコスミドｐＣＰＰ４７（ＢａｕｅｒおよびＣｏｌｌｍｅｒ、１９９７）を用いて行った。Ｐｔｏ ＤＣ３０００およびＰｓｙ Ｂ７２８ａのゲノムＤＮＡのコスミドライブラリーは、既に構築されている（Ｃｈａｒｋｏｗｓｋｉら、１９９８）。オリゴヌクレオチド合成およびＤＮＡ配列決定は、コーネルバイオテクノロジーセンター（Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ）において行った。Ｐｔａ ＤＣ３０００ ｈｒｐ／ｈｒｃクラスターのヌクレオチド配列は、Ｐｓｙ ６１のｈｒｐＫ遺伝子とのハイブリダイゼーションに基づいてゲノムコスミドライブラリーから選択したコスミドであるｐＣＰＰ２４７３のサブクローンを用いて決定した。Ｐｓｙ Ｂ７２８ａ ｈｒｐ／ｈｒｃクラスターのヌクレオチド配列は、ｐＣＰＰ２３４６およびｐＣＰＰ３Ｏ１７のサブクローンを用いて決定した。これらのコスミドは、６１のｈｒｐＣオペロンとのハイブリダイゼーションに基づいてゲノムライブラリーから選択した。Ｐｓｙ ６１ ＥＥＬ領域の左側は、下記のプライマーを用いたＰＣＲにより、ｐＢＳＫＳＩＩ＋ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩ部位にクローニングした：
ｑｕｅＡにおいて開始されかつＸｈｏＩ部位を含む配列番号：７１
2004522406.tif 000110
；ｈｏｐＰｓｙＡにおいて開始されかつＥｃｏＲＩ部位を含む配列番号：７２
2004522406.tif 000111
。Ｐｆｕポリメラーゼを、全てのＰＣＲ実験に使用した。ＤＮＡ配列データは、ＤＮＡＳｔａｒ Ｐｒｏｇｒａｍ社（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）により管理および分析し、データベースは、ＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰ、およびＢＬＡＳＴＮプログラムにより検索した（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７）。
【０１３７】
変異体構築および分析：
Ｐｔｏ ＤＣ３０００ Ｈｒｐ Ｐａｉにおける巨大な欠失を、既報のように、ｐＲＫ４１５内のΩＳｐＲカセットのいずれかの側の制限部位への境界断片のサブクローニング、組換えプラスミドのＤＣ３０００への電気穿孔、ならびにその後のマーカー交換変異体の選択および検索により構築した（Ａｌｆａｎｏら、１９９６）。下記の左側および右側（図２および図３）の欠失境界断片を使用した（残留遺伝子断片と共に記す）：ＣＵＣＰＢ５１１０左側ｔｇｔ−ｑｕｅＡ−ｔＲＮＡ−Ｌｅｕ−ＯＲＦ４’（ＯＲＦ４の２７ｂｐ）および右側ＯＲＦ１’−ｈｒｐＫ（ＯＲＦ１の３９６ｂｐ）；ならびに、ＣＵＣＰＢ５１１５左側ｈｒｐＳ’−ａｖｒＥ’（ａｖｒＥの２５６９ｂｐ）および右側ＯＲＦ６（ＯＲＦ６開始コドンの上流１５６ｂｐ）。後者の断片は、下記のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：
ＯＲＦ５−０ＲＦ６遺伝子間領域において開始されかつＸｂａＩ部位を含む配列番号：７３
2004522406.tif 000112
；ＯＲＦ６において開始されかつＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む配列番号：７４
2004522406.tif 000113
。変異体構築は、既報（Ｃｈａｒｋｏｗｓｋｉら、１９９８）の条件を用いたサザンハイブリダイゼーションにより確認した。変異体のＡｖｒＰｔｏを分泌する能力は、抗ＡｖｒＰｔｏ抗体および既報（ｖａｎ Ｄｉｊｋら、１９９９）のような細胞画分のイムノブロット分析により決定した。変異体ＣＵＣＰＢ５１１５は、コスミドｐＣＰＰ４７のＯＲＦ２からＯＲＦ１０までを持つｐＣＰＰ３Ｏ１６で補完され、既報（Ｃｈａｒｋｏｗｓｋｉら、１９９８）のように、ヘルパー株大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＤＨ５α（ｐＲＫ６００）を用いた三親交配（ｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ ｍａｔｉｎｇ）により、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＤＨ５αから導入された。
【０１３８】
Ｔ７発現分析：
Ｐｔｏ ＤＣ３０００ ＥＥＬのタンパク質産物を、既報（Ｈｕａｎｇら、１９９５）のように、ベクターｐＥＴ２１および大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）を用いた、Ｔ７ポリメラーゼ依存型発現により分析した。下記のプライマーセットを、ｐＢＳＫＳＩＩ＋内のｔｇｔからｈｒｃＶまでを含むＢａｍＨＩ断片を持つ、ｐＣＰＰ３Ｏ９１由来の各ＯＲＦのＰＣＲのために使用した：
ＯＲＦ１、各々、配列番号：７５および７６
2004522406.tif 000114
；ＯＲＦ２、各々、配列番号：７７および７８
2004522406.tif 000115
2004522406.tif 000116
；ＯＲＦ３、各々、配列番号：７９および８０
2004522406.tif 000117
；ＯＲＦ４、各々、配列番号：８１および８２
2004522406.tif 000118
；ｔｎｐＡ、各々、配列番号：８３および８４
2004522406.tif 000119
。
【０１３９】
植物バイオアッセイ法：
タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ． ｃｖ． Ｘａｎｔｈｉ）およびトマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ Ｍｉｌｌ． ｃｖｓ． ＭｏｎｅｙｍａｋｅｒおよびＲｉｏ Ｇｒａｎｄｅ）を、温室条件下で生育し、その後ＨＲおよび毒性アッセイ法のために、２５℃、白昼光および補助的ハロゲンランプを照射して維持した。細菌を、適当な抗生物質を補充したＫｉｎｇ培地Ｂ寒天上で一晩増殖させ、５ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．６）中で懸濁し、その後ＨＲアッセイ法のためには１０８ｃｆｕ／ｍｌで、および病原性アッセイ法のためには１０４ｃｆｕ／ｍｌで、針のないシリンジを用いて被験植物の葉へ浸潤させた（Ｃｈａｒｋｏｗｓｋｉら、１９９８）。全てのアッセイ法を、異なる植物由来の葉について少なくとも４回反復した。トマト葉における細菌増殖は、浸漬した領域からコルクボーラーでディスク（ｄｉｓｋ）を切り出す段階、およびＫｏｎｔｅｓ Ｐｅｌｌｅｔ Ｐｅｓｔｌｅ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）により組織を５ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．６）０．５ｍｌ中で細分する段階、およびその後ホモジネートを、５０μｇ／ｍｌリファンピシンおよび２μｇ／ｍｌシクロヘキシミドが入ったＫｉｎｇ培地Ｂ寒天上に希釈播種して細菌集団を決定する段階によりアッセイした。３個の葉試料からの平均およびＳＤを、各時点で決定した。ＤＣ３０００およびＣＵＣＰＢ５１１０のインプランタにおける相対増殖を、４回の個別の実験により同様にアッセイして、ＤＣ３０００、ＣＵＣＰＢ５１１５、およびＣＵＣＰＢ５１１５（ｐＣＰＰ３０１６）の相対増殖を、３回の個別の実験においてアッセイした。ＤＣ３０００により達成された最終集団レベルは実験間で変動したが、野生型に対する変異体の集団レベルは、下記に説明した代表的実験においてと同じであった。
【０１４０】
実施例１−Ｐｓｙ ６１、Ｐｓｙ Ｂ７２８ａ、およびＰｔｏ ＤＣ３０００のｈｒｐ／ｈｒｃ遺伝子クラスターの比較
Ｐｓｙ Ｂ７２８ａおよびＰｔｏ ＤＣ３０００由来のｈｒｐ／ｈｒｃクラスターが、先に特徴付けられたＰｓｙ ６１のｈｒｐ／ｈｒｃクラスターと同様に組織化されているかどうかを決定するために、ｈｒｐ／ｈｒｃ挿入物を持つ２種のコスミドを部分的に特徴決定した。ｐＣＰＰ２３４６は、Ｂ７２８ａのｈｒｐ／ｈｒｃクラスター全体を持ち、ｐＣＰＰ２４７３は、ＤＣ３０００のｈｒｐ／ｈｒｃクラスターの左半分を持つ。ＤＣ３０００ ｈｒｐ／ｈｒｃクラスターの右半分は、既に特徴付けられている（Ｐｒｅｓｔｏｎら、１９９５）。これらのコスミドに由来したいくつかのサブクローンの末端の配列決定は、Ｂ７２８ａおよびＤＣ３０００ ｈｒｐ／ｈｒｃクラスターのフィンガープリントを提供し、これは両方が６１株のように配列されていることを示した（図１）。しかし、Ｂ７２８ａは、ｈｒｃＵおよびｈｒｐＶの間に、バクテリオファージλ遺伝子Ｅａ５９（２３％のアミノ酸同一性；Ｅ＝２ｅ−７）およびＥａ３１（３０％のアミノ酸同一性；Ｅ＝６ｅ−８）との相同体を含む３．６ｋｂ挿入物を含み（Ｈｅｎｄｒｉｘら、１９８３）、Ｂ７２８ａ ｈｒｃＵ ＯＲＦは、３６個の追加のコドンを含む。マメに対して高度に毒性であるようないくつかのＰｓｙ株においてこのサイズの可能性のある挿入は、先にＲＦＬＰ分析により示された（Ｌｅｇａｒｄら、１９９３）。Ｂ７２８ａ ｈｒｐ／ｈｒｃ領域および隣接配列（左側４ｋｂおよび右側１３ｋｂ）を含むコスミドｐＣＰＰ２３４６は、蛍光菌（Ｐ． ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）に、Ｂ７２８ａ ＨｒｐＺハルピンを培養物中に分泌させ、タバコ葉においてＨＲを誘起させるのを可能にするが、しかし集密な壊死は、蛍光菌（Ｐ． ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）（ｐＨＩＲ１１）の場合よりもより緩徐に生じた（データは示さず）。更に内部参照を用いて、Ｐｓｙ ６１およびＢ７２８ａ ｈｒｐ／ｈｒｃ遺伝子クラスターの同系性（ｒｅｌａｔｅｄｎｅｓｓ）を試験するために、Ｂ７２８ａ ｈｒｐＡ遺伝子を配列決定した。ＰｓｙおよびＰｔｏにおいて配列決定されたｈｒｐ／ｈｒｃ遺伝子のｈｒｐＡは、Ｈｒｐ線毛（ｐｉｌｕｓ）の主要サブユニットをコードする（Ｒｏｉｎｅら、１９９７）が、これは最も保存性が少ない（２８％のアミノ酸同一性）（Ｐｒｅｓｔｏｎら、１９９５）。しかし、６１株およびＢ７２８ａ株のｈｒｐＡ遺伝子は、１００％同一であり、このことはこれらの菌株の密接な関係およびそれらのＨｒｐ系を更に裏付けている。
【０１４１】
実施例２−ｈｒｐＫおよびｔＲＮＡＬｅｕ間のＨｒｐ Ｐａｉにおける交換可能なエフェクター遺伝子座（ＥＥＬ）の同定
Ｐｒｙ ６１、Ｐｓｙ Ｂ７２８ａ、およびＰｔｏ ＤＣ３０００のＨｒｐ Ｐａｉの左側の配列分析から、これらの菌株におけるｈｒｐＫ配列の高い割合の同一性は、ｈｒｐＫ停止コドン後の３ヌクレオチドで突然終結して、その後異なる介在ＤＮＡ ２．５ｋｂ（Ｐｓｙ ６１）、７．３ｋｂ（Ｐｓｙ Ｂ７２８ａ）、または５．９ｋｂ（Ｐｔｏ ＤＣ３０００）の後に、ｔＲＮＡＬｅｕ、ｑｕｅＡ、およびｔｇｔ配列近傍で回復されることが示された（図２）。この領域のＰｓｙ ６１株およびＢ７２８ａ株の間の差異は、特に驚異的である。Ｐ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）Ｈｒｐ Ｐａｉのこの領域は、高頻度でこの遺伝子座で交換されると考えられる完全に異なるエフェクタータンパク質遺伝子を含むので（下記表１）、ＥＥＬと称された。これに関して、（ｉ）Ｂ７２８ａ ＥＥＬ中のＯＲＦ２は、Ｐｐｈ １３０２Ａにおいて、ｈｒｐＫ（ｈｒｐＹ）のすぐ下流の異なる位置にある、ａｖｒＰｐｈＥの相同体である（Ｍａｎｓｆｉｅｌｄら、１９９４）、（ｉｉ）ｈｏｐＰｓｙＡ（ｈｒｍＡ）は、いくつかのＰｓｙ株においてのみ存在する（ＨｅｕおよびＨｕｔｃｈｅｓｏｎ、１９９３；Ａｌｆａｎｏら、１９９７）、および（ｉｉｉ）Ｂ７２８ａ ＥＥＬ中のＯＲＦ５は、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）ＡｖｒＢｓＴに類似して、ＡｖｒＲｘｖファミリーに特徴的な複数のモチーフを有するタンパク質を予測する（Ｃｉｅｓｉｏｌｋａら、１９９９）ことは、注目に値する。ゲノム平均と異なるＧ＋Ｃ含量は、水平伝播（ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）された遺伝子の顕著な特徴であり、これら３種のＥＥＬにおけるＯＲＦのＧ＋Ｃ含量は、Ｐ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）に関する平均である５９％〜６１％よりもかなり少ない（Ｐａｌｌｅｒｏｎｉら、１９８４）（下記表１）。これらはまた、ｈｒｐＫ（６０％）およびｑｕｅＡ（６３％〜６４％）よりも少ない。Ｐｔｏ ＤＣ３０００ ＥＥＬにおけるＯＲＦからは、公知のエフェクタータンパク質に類似した産物は予想されないが、Ｔ７ポリメラーゼ依存型発現により、ＯＲＦ１、ＯＲＦ３、およびＯＲＦ４について予想されたサイズ範囲内の産物が明らかになった。更にＯＲＦ１タンパク質は、Ｐ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）Ａｖｒタンパク質を分泌するエルウィニア・クリサンセミ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）Ｈｒｐ系を発現する、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）（ｐＣＰＰ２１５６）によりｈｒｐ依存様式で分泌される（Ｈａｍら、１９９８）。これらのＥＥＬにおけるいくつかのＯＲＦは、ＨｒｐＬ活性化されたプロモーターを示すＨｒｐボックスの前に位置し（図１）（ＸｉａｏおよびＨｕｔｃｈｅｓｏｎ、１９９４）、介在Ｒｈｏ独立ターミネーター配列またはプロモーターの欠損は、ＤＣ３０００のＯＲＦ１ならびにＢ７２８ａのＯＲＦ１およびＯＲＦ２が、各々のｈｒｐＫ遺伝子の上流のＨｒｐＬ活性化されたプロモーターから発現されることを示唆している。
【０１４２】
これら３種の菌株のＥＥＬは、更に挿入配列、トランスポゼース（ｔｒａｎｐｏｓａｓｅ）、ファージインテグラーゼ遺伝子、およびプラスミドに相同な配列も含む（下記図２および表１）。Ｐｓｙ Ｂ７２８ａ ＯＲＦ５およびＯＲＦ６のオペロンは、いくつかのａｖｒ遺伝子を保持するＰｐｈプラスミド内のものに類似した配列（Ｊａｃｋｓｏｎら、１９９９）、およびこの領域内のＩＳエレメントを介してプラスミド組込みを示唆しているプラスミドに典型的に認められる挿入エレメントに相同な配列（ＳｚａｂｏおよびＭｉｌｌｓ、１９８４）に左側で境を接している。Ｐｓｙ Ｂ７２８ａ ＯＲＦ３およびＯＲＦ４は、病原性大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株によるＬＥＥ Ｐａｉの水平獲得に関与した配列に対する類似性を示している（Ｐｅｒｎａら、１９９８）。これらのＰｓｙ Ｂ７２８ａ ＯＲＦは、Ｈｒｐボックスの前になく、エフェクタータンパク質をコードしている可能性はない。
【０１４３】
2004522406.tif 000120
ａ病原型の（ｐａｔｈｏｖｅｒ）略号は、普遍的ａｖｒ命名法に関するビビアン（Ｖｉｖｉａｎ）およびマンスフィールド（Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ）の論文の推奨（１９９３）に対応する。
【０１４４】
ＥＥＬの左側境界は、多くのｔＲＮＡＬｅｕ遺伝子ならびに大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ｑｕｅＡおよびｔｇｔキュエオシン（ｑｕｅｕｏｓｉｎｅ）生合成遺伝子に類似した配列を含む（予想された産物において約７０％のアミノ酸同一性）。ＥＥＬ配列は、Ｐ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｔＲＮＡ配列の３’末端で終結し、これはＰａｉに典型的である（Ｈｏｕ、１９９９）。実際に同一のｔｇｔ−ｑｕｅＡ−ｔＲＮＡＬｅｕ配列が、蛍光シュードモナス属菌（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄ）群でもある緑膿菌（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ１のゲノムに認められている（ｗｗｗ．ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ．ｃｏｍ）。しかしＰＡＯ１は植物病原体ではなく、この緑膿菌（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のｔＲＮＡＬｅｕは、いずれのＩＩＩ型分泌系遺伝子にもＨｒｐ Ｐａｉの他の遺伝子にも連結していない（図２）。従って、これは先祖のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ゲノムにおけるＨｒｐ Ｐａｉの挿入点であることは明らかである。
【０１４５】
実施例３−Ｐｓｙ Ｂ７２８ａおよびＰｔｏ ＤＣ３０００におけるＨｒｐ Ｐａｉの右側に位置した保存性エフェクター遺伝子座（ＣＥＬ）の同定
ＤＣ３０００におけるｈｒｐＲの右側領域に関する以前の研究は、２個の転写ユニットで構成されたａｖｒＥ遺伝子座の存在（ＬｏｒａｎｇおよびＫｅｅｎ、１９９５）、ｈｒｐＲを越える最初の４種の転写ユニットの５’配列（ＬｏｒａｎｇおよびＫｅｅｎ、１９９５）、ならびに第二のハルピンをコードするｈｒｐＷ遺伝子としての第四の転写ユニットの同一性（Ｃｈａｒｋｏｗｓｋｉら、１９９８）を示した。Ｐｔｏ ＤＣ３０００におけるｈｒｐＲの右側の最初の１４個のＯＲＦのＤＮＡ配列は、この研究において完了して、Ｐｓｙ Ｂ７２８ａにおける対応する領域が、部分的に配列決定された（図３）。ＥＥＬ同様、この領域は、推定エフェクター遺伝子、例えばａｖｒＥを含む（ＬｏｒａｎｇおよびＫｅｅｎ、１９９５）。ＥＥＬとは異なり、この領域のＯＲＦは、ｈｒｐ／ｈｒｃ遺伝子の値に近似した平均Ｇ＋Ｃ含量５８．０％を有し、この領域は公知の可動性遺伝因子に類似した配列を含まず、これはＰｓｙとＰｔｏの間で保存されていると考えられる（図３）。Ｂ７２８ａおよびＤＣ３０００において配列決定されたこの領域の比較は、最初の７個のＯＲＦが同じに配列され、平均で７８％のＤＮＡ配列同一性を有することを示す。従ってこの領域には、ＣＥＬの名称が与えられた。
【０１４６】
ＣＥＬの正確な境界は決定されておらず、Ｈｒｐ ＰａｉのＥＥＬ境界において反復される配列は見つかっていない。上流Ｈｒｐボックスの存在に基づいて、ＯＲＦ７およびＯＲＦ８はＣＥＬの一部である可能性がある（図３）。しかし、次のＯＲＦの産物が細菌ＧｓｔＡタンパク質ファミリーと相同性を示しており（例えば、２０４アミノ酸にわたるＥ． ｃｏｌｉ ＧｓｔＡとの２８％同一性；Ｅ＝１ｅ−８）（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、１９９７）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ活性は非病原性である蛍光シュードモナス属菌において共通である（Ｚａｂｌｏｔｏｗｉｃｚら、１９９５）ので、ＯＲＦ１Ｏを越える領域はＣＥＬ内ではないと考えられる。この領域におけるｇａｌＰ相同体（不完全配列に基づいて、Ｅ． ｃｏｌｉ ＧａｌＰに対して２５６アミノ酸にわたる３８％の同一性；Ｅ＝２ｅ−４２）（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、１９９７）の存在は、これがＣＥＬを越えていることを更に示している。
【０１４７】
Ｂ７２８ａおよびＤＣ３０００におけるこの領域のいくつかの他の特徴は注目に値する。（ｉ）低い配列同一性（４４％）により識別されるが、ｈｒｐＲＳオペロンの発現に影響を及ぼすステムループ構造を形成できるような３個の逆方向反復配列を含む、１ｋｂの遺伝子間領域を、両株共、ｈｒｐＲとＯＲＦ１の間に有する。（ｉｉ）ＯＲＦ１は、Ｅ． ｃｏｉｌムレイン溶解性トランスグリコシラーゼＭｌｔＤとほとんど類似している（３２４個のアミノ酸について３８％の同一性；Ｅ＝４ｅ−５６）。（ｉｉｉ）ＯＲＦ２は、候補シャペロン、Ｅ．アミノボーラ（ａｍｙｌｏｖｏｒａ）ＤｓｐＦと１３０アミノ酸について４２％の同一性を有する（Ｅ＝９ｅ−２４）（Ｂｏｇｄａｎｏｖｅら、１９９８ａ；Ｇａｕｄｒｉａｕｌｔら、１９９７）。（ｉｖ）ＯＲＦ５タンパク質は、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）（ｐＣＰＰ２１５６）によりｈｒｐ依存様式で分泌されるが、ΩＳｐｒカセットの変異は、タバコでのＨＲ誘起またはトマトの病原性のいずれに対してもほとんど作用しない（Ｃｈａｒｋｏｗｓｋｉ、未発表）。（ｖ）最後に、この領域の６個のオペロンは、Ｈｒｐボックスに先行し（ＬｏｒａｎｇおよびＫｅｅｎ、１９９５）（図３）、これは公知のＰ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）のａｖｒ遺伝子の特徴である（Ａｌｆａｎｏら、１９９６）。従って、ＣＥＬは複数の候補エフェクターを保持する。
【０１４８】
実施例４−病原性におけるＥＥＬおよびＣＥＬの役割の研究
ＤＣ３０００において、ｈｒｐＫとｔＲＮＡＬｅｕ（ＥＥＬ）の間の全てのＯＲＦがΩＳｐｒカセットと交換されるような変異を構築した（図２）。このＰｔｏ変異体ＣＵＣＰＢ５１１０を、タバコにおいてＨＲを誘起する能力およびトマトにおいて疾病を引き起こす能力について試験した。この変異体は、ＨＲを誘起する能力および疾病症状を生じる能力を維持していたが、トマトにおいて親株と同じくらい高い集団レベルに到達することはできなかった（図４Ａ）。
【０１４９】
ＤＣ３０００において、ａｖｒＥからＯＲＦ５（ＣＥＬ）がΩＳｐｒカセットと交換されたような変異を構築した。これは、部分的に特徴付けられかつエフェクターをコードしうるＣＥＬ ＯＲＦの全てを欠損していた。このＰｔｏ変異体ＣＵＣＰＢ５１１５は依然としてタバコにおいてＨＲを誘起したが、組織崩壊は約５時間遅延していた（図４Ｃ）。濃度１０４ｃｆｕ／ｍｌで浸漬した場合に、この変異体はトマトにおいて全く疾病性状を引き起さず、インプランタでの増殖が大きく低下した（図４Ｂ）。しかしこの変異体は、ＰｔｏＳ（感受性）およびＰｔｏＲ（耐性）リオグランデ（Ｒｉｏ Ｇｒａｎｄｅ）トマト株に関連した試験において、野生型とは識別不能であるトマトＰｔｏ Ｒ遺伝子に依存したＨＲを誘起した。ＯＲＦ２からＯＲＰ１０を保持するプラスミドｐＣＰＰ３０１６は、ＣＵＣＰＢ５１１５の疾病症状を引き起こす能力を完全に回復して、トマト葉において増幅する変異体の能力を一部回復した（図４Ｂおよび４Ｅ）。Ｐｔｏ ＤＣ３０００におけるｈｒｐ／ｈｒｃクラスターの欠失は、ＨＲおよび病原性の表現型を廃した（Ｃｏｌｌｍｅｒら、２０００）。Ｐｔｏ変異体ＣＵＣＰＢ５１１０およびＣＵＣＰＢ５１１５における大きな欠失がＨｒｐ分泌機能を破壊しないことを確認するために、本発明者らは、これらの変異体、ＤＣ３０００ ｈｒｐ／ｈｒｃ欠失変異体および野生型ＤＣ３０００の、シグナルペプチドを欠損しているβ−ラクタマーゼで構成した細胞質マーカーを保持しながら、培養物中にＡｖｒＰｔｏを産生して分泌する能力を比較した。培養物中に分泌されかつインプランタで宿主細胞へ注入された良く研究されたエフェクタータンパク質であるため、ＡｖｒＰｔｏは、この試験の理想的対象を提供する（ＡｌｆａｎｏおよびＣｏｌｌｍｅｒ、１９９７；ｖａｎ Ｄｉｊｋら、１９９９）。ｈｒｐ／ｈｒｃ欠失クラスター変異体のみが、ＡｖｒＰｔｏ産生および分泌を損なっていた（図５）。
【０１５０】
前述の研究に基づいて、Ｐ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｈｒｐ／ｈｒｃ遺伝子は、ＥＥＬ、ｈｒｐ／ｈｒｃ遺伝子クラスター、およびＣＥＬの３種の個別の遺伝子座を有するＨｒｐ Ｐａｉの一部である。ＥＥＬは、交換可能なエフェクター遺伝子を有して、宿主植物の寄生適合度（ｐａｒａｓｉｔｉｃ ｆｉｔｎｅｓｓ）に対して量的寄与のみを生じている。このｈｒｐ／ｈｒｃ遺伝子座は、Ｈｒｐ分泌系をコードして、エフェクタータンパク質送達、寄生および病原性に必要である。ＣＥＬは、Ｈｒｐ分泌機能に認識できる寄与をもたらさないが、寄生適合度には強力に寄与してトマトにおけるＰｔｏ病原性には必要である。Ｐ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）のＨｒｐ Ｐａｉは、動物病原体が持つＰａｉのいくつかの特性を有し（Ｈａｃｋｅｒら、１９９７）、これは、ｔＲＮＡ遺伝子座に連結した巨大な（約５０ｋｂ）染色体領域における多くの毒性関連遺伝子（いくつかは比較的低いＧ＋Ｃ含量を有する）の存在および密接に関連した種における対応する遺伝子座の不在を含む。加えて、Ｈｒｐ ＰａｉのＥＥＬ部分は、不安定であり、可動性遺伝因子に関連した多くの配列を含む。
【０１５１】
ＥＥＬは、公知のＰａｉの新たな特徴であり、これは様々な植物宿主とＰ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）株の寄生適合度への細かい調節（ｆｉｎｅ−ｔｕｎｉｎｇ）に関連していると考えられる。Ｐ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）株の密接な関係株および疎遠な関係株を比較することにより、本発明者らが、この遺伝子座の高い不安定性およびその境界配列の対照的に高い保存性を確立することができた。本発明者らは、ＰｓｙおよびＰｔｏ ＥＥＬにおいてファージ、挿入配列、およびプラスミドに関連した断片を認め、最近、その他の３種のＰ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）株の対応する領域内において挿入配列が報告された（ＩｎｏｕｅおよびＴａｋｉｋａｗａ、１９９９）ため、単独のメカニズムでは高い不安定性を説明することができない。Ｈｒｐ ＰａｉにおけるｔＲＮＡＬｅｕとｈｒｐＫ配列の間のＥＥＬ局在のメカニズムまたは意義も不明である。Ｐｔｏ ＤＣ３０００は、そのゲノムの他の場所に位置する（Ｒｏｎａｌｄら、１９９２）少なくとも１個の他のエフェクター遺伝子ａｖｒＰｔｏを保持し、多くのＰ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）ａｖｒ遺伝子はプラスミド上に位置し（ＬｅａｃｈおよびＷｈｉｔｅ、１９９６）、ＥＥＬ ＯＲＦは、広範なエフェクター遺伝子（例えば、ａｖｒＲｘｖファミリー）と希と考えられるエフェクター遺伝子（例えば、ｈｏｐＰｓｙＡ）の混合を表している。ＥＥＬ ＯＲＦのＧ＋Ｃ含量は、残りのＨｒｐ ＰａｉおよびＰ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）ゲノムのそれよりも顕著に低い。Ｈｒｐ Ｐａｉの非ＥＥＬ部分におけるある種の遺伝子、例えばｈｒｐＡは、高度に分岐しているが、これらは高いＧ＋Ｃ含量を有して、これらが個別に残りのＨｒｐ Ｐａｉから水平伝播した証拠はない。ＥＥＬの（および、他のＰ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）ａｖｒ遺伝子の）ＯＲＦの比較的低いＧ＋Ｃ含量は、これらの遺伝子が、単にＰ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）よりも、病原細菌のより広いプールから水平獲得されたことを示唆している（Ｋｉｍら、１９９８）。実際、遺伝子のａｖｒＲｘｖファミリーは、広範な植物および動物病原体において発見されている（Ｃｉｅｓｉｏｌｋａら、１９９９）。Ｐｔｏ ＤＣ３０００ ＥＥＬ欠失、またはＰｓｙ ６１におけるｈｏｐＰｓｙＡ（ｈｒｍＡ）の変異（Ｈｕａｎｇら、１９９１）の寄生適合度に対する弱い作用は、個々のａｖｒ遺伝子の変異の典型であり、エフェクタータンパク質系における冗長性（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）に起因する（ＬｅａｃｈおよびＷｈｉｔｅ、１９９６）。
【０１５２】
ｈｒｐＫおよびＣＥＬ ＯＲＦ１の機能は不明であるが、考察に値する。これらの２種のＯＲＦは、ｈｒｐおよびｈｒｃ両遺伝子を含むオペロンのｈｒｐＬおよびｈｒｐＲ非限定クラスター（ｄｅｌｉｍｉｔｅｄ ｃｌｕｓｔｅｒ）のすぐ外側にあり、これによりＨｒｐ Ｐａｉの３種の領域が空間的に区別される（図１〜図３）。ｈｒｐＫ変異体は、変動可能なＨｒｐ表現型を有し（Ｍａｎｓｆｉｅｌｄら、１９９４；Ｂｏｚｓｏら、１９９９）、Ｐｓｙ Ｂ７２８ａ ｈｒｐＫ変異体は依然ＨｒｐＺを分泌しており（Ａｌｆａｎｏ、未発表）、このことはＨｒｐＫは、エフェクタータンパク質であり得ることを示唆している。しかしながら、Ｐｓｙ ６１およびＰｔｏ ＤＣ３０００のＨｒｐＫタンパク質は７９％の同一性を有し、従って多くのＨｒｐ分泌系成分よりもより多く保存されている。ｈｒｐＫは、Ｐｓｙ Ｂ７２８ａおよびＰｔｏ ＤＣ３０００において他のエフェクター遺伝子を含むオペロン内にあると考えられることも注目に値する。対照的に、ＣＥＬ ＯＲＦ１は、細菌のペプチドグリカン層を通る系の侵入（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）を促進することにより、Ｈｒｐ分泌機能に（弱くまたは過剰に）寄与していると考えられる。このＯＲＦ１産物は、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＭｌｔＤと極めて相同であり、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）遺伝子であるｉｐｇＦの産物とリゾチーム様ドメインを共有しており（Ｍｕｓｈｅｇｉａｎら、１９９６）、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）遺伝子は同じくＩＩＩ型分泌系およびエフェクタータンパク質をコードする遺伝子座の間に位置している（Ａｌｌａｏｕｉら、１９９３）。ＰｔｏおよびＳ． ｆｌｅｘｎｅｒｉにおけるこれらの遺伝子の変異は明らかな表現型を有さず（ＬｏｒａｎｇおよびＫｅｅｎ、１９９５；Ａｌｌａｏｕｉら、１９９３）、これはペプチドグリカン加水分解酵素をコードする遺伝子の典型である（ＤｉｊｋｓｔｒａおよびＫｅｃｋ、１９９６）。
【０１５３】
対応するオペロンが個別に破壊されているＤＣ３０００変異体においては病原性が保持されているため、ＣＥＬにおいてａｖｒＥ−ＯＲＦ５が欠失したＰｔｏ変異体ＣＵＣＰＢ５１１５における病原性の喪失は驚きである（ＬｏｒａｎｇおよびＫｅｅｎ、１９９５；Ｃｈａｒｋｏｗｓｋｉら、１９９８）。この領域の可能性のある機能およびその構成遺伝子の保存の評価において、ａｖｒＥは、試験したダイズ栽培品種全てにおいてＰ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．グリシネア（ｇｌｙｃｉｎｅａ）に無毒性（ａｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）を付与する点および病原性に必要であるＥ．アミノボーラ（ａｍｙｌｏｖｏｒａ）の相同体（ｄｓｐＥ）を有する点で、Ｐｔｏにおいて認められた他のａｖｒ遺伝子とは異なることに注意しなければならない（ＬｏｒａｎｇおよびＫｅｅｎ、１９９５；Ｂｏｇｄａｎｏｖｅら、１９９８ｂ）。ＣＥＬは病原性に必要であるが、変異体は依然ＡｖｒＰｔｏを分泌しているため、ＩＩＩ型エフェクタータンパク質分泌には必須ではない。変異体が、依然として非宿主タバコおよびＰｔｏＲ耐性トマト株においてＨＲを誘起して、この領域を欠いているｐＨＩＲ１１はいくつかのＡｖｒタンパク質の移入が可能であると考えられるため、同じく、エフェクタータンパク質の植物細胞へのＩＩＩ型移入において必須の役割を果たしていないように見える（Ｇｏｐａｌａｎら、１９９６；Ｐｉｒｈｏｎｅｎら、１９９６）。分岐している病原型ＰｓｙおよびＰｔｏにおけるこの領域の保存、ならびに疾病におけるその重要性は、ＣＥＬ産物が病原性の共通の必須の様相に重複して関連しうることを示唆している。
【０１５４】
ｈｒｐ／ｈｒｃ遺伝子、ＣＥＬにおける遺伝子、およびＰ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）全ゲノムＤＮＡの類似したＧ＋Ｃ含量およびコドン使用は、Ｈｒｐ ＰａｉがＰ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）の進化の初期に獲得されたことを示唆している。しかしＥＥＬ領域は、その多くの病原型、品種、および菌株へのＰ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）の照射において早期に同様に発生されたが、先に考察した見かけの不安定性は、この遺伝子座における進行中の迅速な進化を示唆している。実際、多くのＰ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）ａｖｒ遺伝子が、それらの遺伝子座とは関わりなく、可動性遺伝子的エレメントと関連している（Ｋｉｍら、１９９８）。従って、Ｐ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）におけるＨｒｐ媒介性病原性は、分岐する病原型の中で普遍的である遺伝子のセットによって、および例え同じ病原型であっても株間で変動する別のセットによって、集合的に左右されると考えられる。後者は、宿主Ｒ遺伝子サーベイランス系を回避しつつ、寄生を促進するための反対の選択圧に対して反応して獲得され、喪失されると考えられる。
【０１５５】
実施例５−ＨｏｐＰｓｙＡエフェクターのためのＩＩＩ型シャペロンとしてのＳｈｃＡの役割
暫定的にｓｈｃＡと称されるｈｏｐＰｓｙＡ上流のＯＲＦは、予想された分子量のタンパク質産物をコードする。Ｐ．ｓ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）６１におけるｈｏｐＰｓｙＡ遺伝子の上流のＯＲＦ（当初ＯＲＦ１と称される）は、各々、緑膿菌（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）およびペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）のＩＩＩ型エフェクター遺伝子に隣接する遺伝子である、ｅｘｓＣおよびＯＲＦ７と配列同一性を共有している（ＦｒａｎｋおよびＩｇｌｅｗｓｋｉ、１９９１；Ｐｅｒｒｙら、１９９８）。これらのＯＲＦはいずれも実験的にシャペロンをコードすることは示されていないが、これらがＩＩＩ型シャペロンが有することが多い特性を共有することが注目される（Ｃｏｒｎｅｌｌｉｓら、１９９８）。これらの特性のひとつは、シャペロン遺伝子それ自身の位置である（図１および図６）。シャペロン遺伝子は、シャペロンが相互作用しているエフェクタータンパク質をコードする遺伝子に隣接することが多い。更に、ｓｈＡも、ＩＩＩ型シャペロンの他の共通の特徴を共有している：そのタンパク質産物は比較的小さく（約１４ｋＤａ）、これは酸性ｐＩを有して、両親媒性α−ヘリックスであると推定されたＣ末端領域を有する。ｓｈｃＡ機能の評価を始めるために、最初にｓｈｃＡはタンパク質産物をコードするかどうかを決定した。ｓｈｃＡをＦＬＡＧエピトープをコードする配列にインフレームで融合した構築体を、ＰＣＲを用いて調製した。この構築体ｐＬＶ２６は、推定リボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含むｓｈｃＡの上流のヌクレオチド配列を含んでいる。ＤＨ５αＦ’ＩＱ（ｐＬＶ２６）培養物を、濃厚培地において増殖して、ＩＰＴＧにより適当な密度に誘導した。全細胞ライゼートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離して、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたイムノブロットにより分析した。ｐＬＶ２６によりコードされたＳｈｃＡ−ＦＬＡＧを、ベクターＲＢＳ由来のＳｈｃＡ−ＦＬＡＧを生じる構築体と比較することにより、ｓｈｃＡの上流の固有のＲＢＳは、翻訳についてコンピテントである（図７）と結論した。従ってｓｈｃＡ ＯＲＦは、タンパク質産物をコードする正統（ｌｅｇｉｔｉｍａｔｅ）遺伝子である。
【０１５６】
ｓｈｃＡの細菌−植物相互作用に対する作用を試験するために、ｓｈｃＡ変異を、コスミドｐＨＩＲ１１上に保持された最小限のｈｒｐ／ｈｒｃクラスターにおいて構築した。ｐＨＩＲ１１に交換したｓｈｃＡ変異マーカーを有することには、際だった利点がある。主なもののひとつは、ｐＨＩＲ１１依存型ＨＲはＨｏｐＰｓｙＡの植物細胞への送達を必要とするので（Ａｌｆａｎｏら、１９９６；Ａｌｆａｎｏら、１９９７）、ＨＲアッセイ法を、ＨｏｐＰｓｙＡが植物細胞へ移入されているかどうかを決定するためのスクリーニングとして使用できることである。染色体ｓｈｃＡ変異体により、他のＨｏｐタンパク質は植物細胞の内部へと送達されると考えられる。これらのタンパク質の一部は、Ｒ遺伝子に基づく植物サーベイランス系により認識され、ＨｏｐＰｓｙＡ送達における何らかの欠損のＨＲマスキングを開始すると考えられる。ｓｈｃＡ中に非極性ｎｐｔＩＩカートリッジを含むような、ｐＨＩＲ１１誘導体であるｐＬＶ１０を保持する大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＭＣ４１００は、タバコにおいてＨＲを誘起することができなかった（図８）。このことは、ｓｈｃＡが、ＨｏｐＰｓｙＡの植物細胞への移入に必要であることを示唆している。ＨｏｐＰｓｙＡが培養物へ分泌されたかどうかを決定するために、非病原性蛍光菌（Ｐ． ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）５５の培養物を増殖した。この細菌は、ｐＨＩＲ１１、ｐＣＰＰ２０８９（ＩＩＩ型分泌を欠損しているｐＨＩＲ１１誘導体）、またはｐＬＶ１Ｏのいずれかを保持していた。代表的結果を図８に見ることができる。ｓｈｃＡは、ＨｏｐＰｓｙＡエフェクタータンパク質の培養物中のＩＩＩ型分泌に必要であったが、ｐＨＩＲ１１によりコードされたＨｒｐ系により分泌される別のタンパク質であるＨｒｐＺ分泌には不要であった。これらの結果は、ＩＩＩ型分泌の欠損は、ＨｏｐＰｓｙＡに特異的であり、ＨｏｐＰｓｙＡのシャペロンをコードするｓｈｃＡと一致することを示唆している。これらの結果から、ｈｏｐＰｓｙＡ遺伝子の上流のＯＲＦは、ｓｈｃＡ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｏｐ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｆｏｒ ＨｏｐＰｓｙＡ）と命名され、この命名システムは、研究者が原型エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）ＩＩＩ型系におけるシャペロンのために使用した命名システムと一致している。
【０１５７】
実施例６−植物において発現されたｈｏｐＰｓｙＡの細胞毒性作用
インプランタにおけるｈｏｐＰｓｙＡ ＤＮＡの一過性発現は、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）において細胞死を誘導するが、Ｎ．ベンサミアナ（ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、マメ、またはアラビドプシスにおいては誘導しない。タバコの懸濁細胞中で生成された場合と同様に、ＨｏｐＰｓｙＡがタバコ葉に細胞死を誘導するかどうかを決定するために、ｈｏｐＰｓｙＡ遺伝子をアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴ−ＤＮＡ上に送達する形質転換系を使用した（Ｒｏｓｓｉら、１９９３；ｖａｎ ｄｅｎ Ａｃｋｅｒｖｅｋｅｎら、１９９６）。この送達系は、植物葉全体の一過性の形質転換のための微粒子銃よりも、より良くはたらく。これらの実験のために、ベクターｐＴＡ７００２をロックフェラー（Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ）大学のナム−ハイ・チュア（Ｎａｍ−Ｈａｉ Ｃｈｕａ）氏とその同僚のご厚意により入手し、使用した。このベクターの独自の特性は、グルココルチコイド受容体の調節メカニズムを用いた誘導可能な発現系を含むことである（Ｐｉｃａｒｄら、１９８８；ＡｏｙａｍａおよびＣｈｕａ、１９９７；ＭｃＮｅｌｌｉｓら、１９９８）。ｐＴＡ７００２は、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン、ヘルペスウイルスタンパク質ＶＰ１６のトランス活性化ドメイン、およびラットのグルココルチコイド受容体の受容体ドメインからなるキメラ転写因子をコードする。更にこのベクターには、複数のクローニング部位の上流のＧＡＬ４上流活性化配列（ＵＡＳ）を含むプロモーターも含まれる。従ってＧＡＬ４−ＵＡＳを含むプロモーターの下流にクローニングされた遺伝子は、グルココルチコイドにより誘導されるが、これについては合成グルココルチコイドであるデキサメタゾン（ＤＥＸ）が市販されている。ｈｏｐＰｓｙＡを、ＧＡＬ４−ＵＡＳの下流にＰＣＲクローニングした。いくつかの異なる被験植物の植物葉を、ｐＴＡ７００２：：ｈｏｐＰｓｙＡを保持するアグロバクテリウム（Ａｒｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に浸漬して、４８時間後、これらの植物にＤＥＸを噴霧した。Ｎ．タバカム（ｔａｂａｃｕｍ）のみが、ｈｏｐＰｓｙＡのＤＥＸ誘導性一過性発現に反応し、ＨＲを誘起した（図１３Ａ）。対照的に、Ｎ．ベンサミアナ（ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）は、ＤＥＸ誘導後に明らかな反応を生じなかった（図１３Ｂ）。更に、マメ科植物（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｌ．「Ｅａｇｌｅ」）（データは示さず）およびシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）生態型Ｃｏ１−１（図１３）におけるｈｏｐＰｓｙＡの一過性発現は、ＨＲを生じなかった。これらの結果は、マメ科ｃｖ．イーグル（Ｅａｇｌｅ）、アラビドプシスＣｏ１−１、およびＮ．ベンサミアナ（ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）は、ＨｏｐＰｓｙＡを認識することができる抵抗タンパク質を欠いていることを示唆している。ＨｏｐＰｓｙＡは通常マメの病原体であるＰ．ｓ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）６１において産生されるので、マメにおいて一過的に発現されたＨｏｐＰｓｙＡへの明らかな防御反応の欠如が予想された。しかしＨｏｐＰｓｙＡの一過性発現がどのようにしてアラビドプシスに作用するかについては若干不明点がある。しかし、アラビドプシス病原体であるＰ．ｓ．トマト（ｔｏｍａｔｏ）ＤＣ３０００は、プローブとしてｈｏｐＰｓｙＡを用いたＤＮＡゲルブロットに基づいてｈｏｐＰｓｙＡ相同体を有すると考えられるので、ＨｏｐＰｓｙＡは、アラビドプシスのＲタンパク質によっては認識されない（すなわち、ＨＲは産生されない）ということが予想された（Ａｌｆａｎｏら、１９９７）。従って、これらの植物（マメ、アラビドプシス、およびＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）は、植物病原性におけるＨｏｐＰｓｙＡの細菌の意図した役割の探索に理想的な植物である。
【０１５８】
Ｐ．ｓ．ｐｖ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）６１は、Ｈｒｐ（ＩＩＩ型）タンパク質分泌系により、培養物中にＨｏｐＰｓｙＡを分泌する。Ｐ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）Ａｖｒタンパク質ＡｖｒＢおよびＡｖｒＰｔｏは、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）において発現されたコスミドｐＣＰＰ２１５６上に保持された機能性Ｅ．クリランセミ（ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）ｈｒｐクラスターによりコードされたＩＩＩ型分泌系により分泌されることがわかっているので（Ｈａｍら、１９９８）、Ｐ．ｓ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）６１に保持された固有のＨｒｐ系による直接の培養物中のＨｏｐＰｓｙＡ分泌の検出を試験した。ｈｒｐ脱抑制しているフルクトース最小培地において２２℃で増殖させたＰ．ｓ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）６１培養物を、遠心分離により細胞結合した画分と上清画分に分離した。上清画分中に存在するタンパク質を、ＴＣＡ沈降により濃縮して、細胞結合試料および上清試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解して、抗ＨｏｐＰｓｙＡ抗体を用いたイムノブロットにより分析した。野生型Ｐ．ｓ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）６１由来の上清画分からのＨｏｐＰｓｙＡシグナルを検出した（図１４）。重要なことに、ＨｏｐＰｓｙＡは、Ｈｒｐ分泌を欠損しているＰ．ｓ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）６１−２０８９から得た上清画分には検出されず、これは、上清中のＨｏｐＰｓｙＡシグナルは特異的にＩＩＩ型タンパク質分泌に起因することを示唆している（図１４）。第二の対照として、両菌株は、Ｎ末端シグナルペプチドを欠損している成熟型β−ラクタマーゼをコードして、細胞溶解マーカーを提供しているｐＣＰＰ２３１８を含んだ。β−ラクタマーゼは、これらの試料の細胞結合画分においてのみ検出され、このことは明確に、細胞溶解が顕著なレベルで生じないことを示している（図１４）。ＨｏｐＰｓｙＡはＩＩＩ型分泌系により培養物中に分泌されるという事実、およびＨｏｐＰｓｙＡの無毒性活性は、それが植物細胞において発現された場合にのみ生じるという事実は、ＨｏｐＰｓｙＡはＩＩＩ型経路により植物細胞へ送達されることを強力に裏付けている。
【０１５９】
ＨｏｐＰｓｙＡは、マメにおけるＰ．ｓ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）６１の生育に、例え少量であっても検出可能な経路で寄与している。マメ組織におけるＰ．ｓ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）６１の増幅に対するＨｏｐＰｓｙＡ変異の作用が報告されている（Ｈｕａｎｇら、１９９１）。これらのデータは、ＨｏｐＰｓｙＡは、Ｐ．ｓ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）６１をマメにおいて増幅する能力にはほとんど寄与しないことを本質的に示している。Ｐ．ｓ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）６１ ｈｏｐＰｓｙＡ変異体は、マメの葉においては、野生株と同様には増殖しなかった（図１５）。これらの結果は以前に報告されたデータと全く対立するので、このことは予想外であった。この矛盾に関するひとつの理論的説明は、先の報告は主に、そのインプランタでの生育におけるｈｒｐ変異体が示している主要表現型に焦点を当てており、ＨｏｐＰｓｙＡがＩＩＩ型で分泌されたタンパク質であるという発見以前のものであるということである。従って初期の実験では、ＨｏｐＰｓｙＡがマメ組織におけるＰ．ｓ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）６１の増殖に対して有すると思われる、より何回な作用を見落とした可能性がある（Ｈｕａｎｇら、１９９１）。本明細書において示されたデータは、ＨｏｐＰｓｙＡがＰ．ｓ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）の病原性に寄与することを裏付け、Ｐ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）由来のＨｏｐの大部分は病原性にわずかに寄与するという仮説に一致している。様々なａｖｒ遺伝子およびｈｏｐ遺伝子に欠損がある変異体についての強力な病原性表現型の欠如は、ａｖｒ／ｈｏｐ遺伝子の重複性の可能性または植物の共進化を通じてのいずれかひとつのＨｏｐタンパク質への依存性の低下に起因しうる。実際、植物細胞へ送達される植物病原体のＩＩＩ型で送達されたタンパク質は、それ自身が毒性タンパク質であることはないが、むしろ発病の進行に重要である植物の反応を抑制することができる（Ｊａｋｏｂｅｋら、１９９３）。これらの反応は、防御反応または植物内のそのままの状態（例えば、細胞周期）を維持するというような、より一般的な過程でありうる。
【０１６０】
実施例７−ＨｏｐＰｓｙＡの分子相互作用
ＨｏｐＰｓｙＡは、酵母ツーハイブリッド系においてアラビドプシスＭａｄ２タンパク質と相互作用する。ＨｏｐＰｓｙＡの病原性標的を決定するために、酵母ツーハイブリッド系を、アラビドプシスから作製したｃＤＮＡライブラリーと共に使用した（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ、１９８９；ＦｉｎｌｅｙおよびＢｒｅｎｔ、１９９４）。この酵母ツーハイブリッド系において、関心のあるタンパク質（「餌（ｂａｉｔ）」）とＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメインの間の融合を、酵母試験菌株に形質転換した。転写活性化ドメインへの融合を形成するベクターにおいて、ｃＤＮＡ発現ライブラリーを構築した。このライブラリーを、ひとまとめに試験菌株へと形質転換して、「餌」のパートナーをコードするクローンを、転写活性化ドメインをＤＮＡ結合ドメインに隣接させ、その結果ＬＥＵ２選択マーカー遺伝子の転写を開始するそれらの能力によって選択した。ＬＥＵ２マーカーを活性化する候補の第二ラウンドのスクリーニングは、同じくｌａｃＺレポーター遺伝子を活性化するそれらの能力に頼った。餌構築体は、完全長ＨｏｐＰｓｙＡ−ＬｅｘＡ融合体、ＬｅｘＡに融合したＨｏｐＰｓｙＡのカルボキシ末端の半分、およびＬｅｘＡに融合したＨｏｐＰｓｙＡのアミノ末端の半分に相当した酵母ベクターｐＥＧ２Ｏ２において、ｈｏｐＰｓｙＡにより最初に作製して、これらの構築体を各々ｐＬＶ２３、ｐＬＶ２４、およびｐＬＶ２５と称した。しかし、ｐＬＶ２３は酵母にとって致死性であり、またｐＬＶ２５は、それ自身において（すなわち、活性化ドメイン存在せず）比較的多量のｌａｃＺレポーター遺伝子を活性化した。従って、ｐＬＶ２３およびｐＬＶ２５は両方とも、酵母ツーハイブリッド系によるタンパク質相互作用物（ｉｎｔｅｒａｃｔｏｒ）のスクリーニングには使用されなかった。ｌｅｘＡに融合したｈｏｐＰｓｙＡの３’部位を含むｐＬＶ２４は、ｌａｃＺレポーター遺伝子を自己活性化せず、またｐＪＫ１０１を用いたｌａｃＺ抑制アッセイ法に基づいて、ｐＬＶ２４により作出された「ＨｏｐＰｓｙＡ−ＬｅｘＡ融合体」が核に局在すると考えられるため、ｐＬＶ２４は酵母ツーハイブリッド系における餌として使用するのに適当な構築体であることが証明された。加えて、このベクターを有する酵母培養物において抗ＨｏｐＰｓｙＡ抗体によるイムノブロットを行うことにより、ｐＬＶ２４がＨｏｐＰｓｙＡに相当する適当なサイズのタンパク質を産出することが確認された。
【０１６１】
酵母ツーハイブリッドベクターｐＪＧ４−５中のｐＬＶ２４およびアラビドプシスｃＤＮＡライブラリーを用いて一次スクリーニングを行った。３種の個別のスクリーニングから、ＨｏｐＰｓｙＡとの数百種の推定相互作用物が同定され、各々は異なる程度まで２種のレポーター系を活性化した。これらの推定陽性酵母株を再スクリーニングし、判定基準をガラクトース存在下でｌａｃＺレポーターおよびＬＥＵ２遺伝子の両方を強力に誘導した相互作用物に限定した場合、ＨｏｐＰｓｙＡのＣ末端半分と相互作用するタンパク質をコードしたｐＪＧ４−５誘導体を含むと考えられる約５０種の酵母株が同定された。プローブとして選択されたｐＪＧ４−５誘導体からＰＣＲ増幅された挿入物を用いたＤＮＡゲルブロットは、これらの推定陽性の各々をグループ化することを可能にした。強力なＨｏｐＰｓｙＡ相互作用物をコードするｐＪＧ４−５誘導体のおよそ５０％は、同じグループに属した。この挿入物を含むｐＪＧ４−５誘導体であるｐＬＶ１１６を配列決定した。ｐＬＶ１１６内に含まれたこの挿入物の推定アミノ酸配列は、酵母、ヒト、カエル、およびトウモロコシにおいて発見されたＭａｄ２相同体（ｍｉｔｏｔｉｃ ａｒｒｅｓｔ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）と高いアミノ酸同一性を共有していた。更に他のＭａｄ２タンパク質とのアミノ酸比較に基づいて、ｐＬＶ１１６は、完全長ｍａｄ２ ｍＲＮＡに相当するｃＤＮＡ挿入物を含んでいる。下記表２は、現在データベースにある全てのＭａｄ２相同体とのアミノ酸同一性の割合（％）を示している。
【０１６２】
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＊比較は、Ｇｅｎｂａｎｋに存在する配列を用いて、ＤＮＡＳｔａｒ社（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）においてＭＥＧＡＬＩＧＮプログラムを用いて行った。略号およびアクセッション番号は以下の通りである：
アラビドプシス：シロイヌナズナ（Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ）Ｃｏ１−０（本試験）；トウモロコシ：トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）（ＡＡＤ３０５５５）；ヒト：ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）（ＮＰ＿００２３４９）；マウス：マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（ＡＡＤ０９２３８）；カエル：アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）（ＡＡＢ４１５２７）；分裂酵母：シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）（ＡＡＢ６８５９７）；出芽酵母：サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｐ４０９５８）。
【０１６３】
予想外のことだが、アラビドプシスＭａｄ２タンパク質の配列は、このデータベースにおいて説明された唯一の植物Ｍａｄ２相同体であるトウモロコシのＭａｄ２により近似していた。トウモロコシＭａｄ２は、アラビドプシスＭａｄ２と約８２％の同一性を有する。図１６Ａ−Ｂは、ロイシン欠乏プレートおよびＸ−Ｇａ１を含むプレート上の、ｐＬＶ２４およびｐＪＧ４−５、ｐＥＧ２Ｏ２およびｐＬＶ１１６、またはｐＬＶ２４およびｐＬＶ１１６のいずれかを含む酵母株を示し、これはＨｏｐＰｓｙＡおよびＭａｄ２の両方が存在する場合にのみ、β−ガラクトシダーゼおよびＬＥＵ２活性が誘導されることを示唆している。ｍａｄ２を生じるｃＤＮＡライブラリーは多くの様々な酵母ツーハイブリッドスクリーニングに使用され、ｍａｄ２クローンはそれまでは単離されていないことに注意することは重要である。従って図１６Ａ−Ｂに示された結果は、ｃＤＮＡライブラリーの性質上作出された人工物（ａｒｔｉｆａｃｔ）を説明していないと考えられる。更に様々なＭａｄ２相同体が、特定のタンパク質と相互作用することが公知であり、これらの相同体のひとつが、餌として紡錘体チェックポイントのタンパク質を用いた酵母ツーハイブリッドスクリーニングにより単離された（Ｋｉｍら、１９９８）。これは二つの理由により再保証されている。第一に他のＭａｄ２相同体は、非特異的に「付着性」タンパク質であるようには見えない。第二に、これらは、タンパク質−タンパク質相互作用により細胞過程を変調すると考えられる。
【０１６４】
Ｍａｄ２は、真核生物の細胞周期の重要な段階である、有糸分裂時の分裂中期から後期への移行を制御するレギュレーターであるため、前述の結果は非常に有望なものである。真核生物の細胞周期は、細胞周期の他の相が開始され得る前のより早い事象の完了に左右される。例えば有糸分裂が生じる前に、ＤＮＡ複製は完了する。細胞周期におけるこれらの依存の一部は、変異により軽減することができ、細胞周期が正常に進行していることを確認するチェックポイントを表している（ＨａｒｔｗｅｌｌおよびＷｅｉｎｅｒｔ、１９８９）。ホイト（Ｈｏｙｔ）らならびにリー（Ｌｉ）およびミュレー（Ｍｕｒｒａｙ）の個別の画期的研究において、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において適所に、染色体分離に必要な紡錘体集合が完了したかどうかをモニターするチェックポイントが存在することを発見した（Ｈｏｙｔら、１９９１；ＬｉおよびＭｕｒｒａｙ、１９９１）。このいわゆる紡錘体チェックポイントは、微小管重合を妨害する薬物を含有する培地に播種された野生型酵母細胞の有糸分裂は停止したが、ある種の変異体は分裂後期へと進行したことが観察された時に発見された。これらの最初の報告により、紡錘体チェックポイントに関連した６種の異なる必須でない遺伝子が同定された：ベンズイミダゾールにより阻害されない出芽（ｂｕｄｄｉｎｇ ｕｎｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ）についてｂｕｂ１−３、および有糸分裂停止欠損について（ｍｉｔｏｔｉｃ ａｒｒｅｓｔ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）ｍａｄ１−３と命名した。これらの遺伝子の変異は、紡錘体集合の異常を無視して、とにかく有糸分裂を試みる。この年以降数年間に、紡錘体チェックポイントが他の真核生物において保存されたことが示され、紡錘体チェックポイントで生じていることのより良い像を生じるという多くの利点が生じた（Ｇｌｏｔｚｅｒ、１９９６；ＲｕｄｎｅｒおよびＭｕｒｒａｙ、１９９６）。
【０１６５】
分裂中期から後期への移行（更には他の細胞周期の移行）に必要とされるのは、ユビキチンタンパク質分解経路である。分裂後期への侵入を阻害するタンパク質（例えば、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＰｄｓ１）は、後期促進複合体（ＡＰＣ）によりユビキチン経路による分解のためにタグを付けられる（Ｋｉｎｇら、１９９６）。これらのタンパク質が２６Ｓプロテオソームにより分裂された時のみ、細胞は、後期へと移行する。ＡＰＣはどのようにして分解のための後期阻害因子をタグ付けする時を知るかは十分解明されてはいないが、これにはいくつかの重要な利点がある（Ｅｌｌｅｄｇｅ、１９９６；Ｅｌｌｅｄｇｅ、１９９８；Ｈａｒｄｗｉｃｋ、１９９８）。Ｍａｄ２タンパク質およびＢｕｂ１タンパク質リン酸化酵素は、これらの領域が微小管に付着しない場合には動原体に結合することが示されている（Ｃｈｅｎら、１９９６；ＬｉおよびＢｅｎｅｚｒａ、１９９６；ＴａｙｌｏｒおよびＭｃＫｅｏｎ、１９９７；Ｙｕら、１９９９）。従ってこれらのタンパク質は、全ての染色体は分離の準備ができた紡錘糸に結合していないというシグナルを若干中継すると考えられる。Ｍａｄ１は、紡錘体チェックポイントが活性化された時に過剰リン酸化を生じるようなリンタンパク質をコードしており、Ｍａｄ１の過剰リン酸化は、機能的Ｂｕｂ１、Ｂｕｂ３、およびＭａｄ２タンパク質に依存している（ＨａｒｄｗｉｃｋおよびＭｕｒｒａｙ、１９９５）。このチェックポイントにおいて必要な別のタンパク質はＭｐｓ１であり、これは、ＢｕｂおよびＭａｄタンパク質全てに依存した方法で過剰発現された場合に、紡錘体チェックポイントを活性化するタンパク質リン酸化酵素であり、このことはＭｐｓ１は紡錘体チェックポイントにおいて非常に早期に作用することを示している（Ｈａｒｄｗｉｃｋら、１９９６）。
【０１６６】
研究された様々なＭａｄ２相同体のデータに基づいて、Ｍａｄ２は紡錘体チェックポイントにおいて中心的役割を有すると考えられる。Ｍａｄ２のアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵抽出物への添加は、ＡＰＣのユビキチンリガーゼ活性の阻害による、サイクリンＢ分解の阻害および有糸分裂停止を生じる（Ｌｉら、１９９７）。分裂酵母由来のＭａｄ２の過剰発現は、紡錘体チェックポイントの活性化により、有糸分裂停止を生じる（Ｈｅら、１９９７）。抗Ｍａｄ２抗体の哺乳類細胞培養物への導入が、微小管作用物（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ｄｒｕｇ）の非存在下で分裂後期への早期移行を生じるがゆえに、これはＭａｄ２が正常な細胞周期に関連していることを示している。いくつかの報告が、様々なＭａｄ２相同体がＡＰＣと直接相互作用することを示唆している（Ｌｉら、１９９７；Ｆａｎｇら、１９９８；Ｋａｌｌｉｏら、１９９８）。サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるＣｄｃ２０と称される別のタンパク質は、ＡＰＣに結合し、特定の細胞周期期間のＡＰＣ活性化に必要であり、Ｍａｄ２がこれに結合する（Ｈｗａｎｇら、１９９８；Ｋｉｍら、１９９８；Ｌｏｒｃａら、１９９８；ＷａｓｓｍａｎｎおよびＢｅｎｅｚｒａ、１９９８）。これらの興味深い知見の全てから新たに出現する像は、Ｍａｄ２がＣｄｃ２０へ結合することにより、ＡＰＣの阻害因子として作用しうることを示す。Ｍａｄ２が存在しない場合、Ｃｄｃ２０はＡＰＣに結合し、これがＡＰＣを活性化し、分裂後期への移行の阻害因子を分解する。図１２は、Ｍａｄ２の関与に焦点を当てかつサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の紡錘体チェックポイントタンパク質と称するものを用いた紡錘体チェックポイントのまとめを示している。
【０１６７】
植物の紡錘体チェックポイント：細菌病原体の可能性のある標的
動物由来の多くの細胞周期のタンパク質は、植物の場合と相同である（Ｍｉｒｏｎｏｖら、１９９９）。実際、紡錘体チェックポイントの存在することの早期の手掛かりのひとつは、最初に植物において成された。注目される知見は、それらの紡錘体への付着において遅れをとった染色体は、分裂後期への移行において遅延を生じるということである（ＢａｊｅｒおよびＭｏｌｅ−Ｂａｊｅｒ、１９５６）。更にｍａｄ２が、最近トウモロコシから単離され、有糸分裂下にある植物細胞におけるＭａｄ２タンパク質の局在は、他の系におけるＭａｄ２の局在と一致している（Ｙｕら、１９９９）。公表された会議の報告に基づいて、アラビドプシス由来のＡＰＣ成分をコードする遺伝子が、最近クローニングされた（Ｉｎｚｅら、１９９９）。従って植物において機能的紡錘体チェックポイントが保存されていると思われる。先に示したデータは、酵母ツーハイブリッド系において、Ｐ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）ＨｏｐＰｓｙＡタンパク質が、アラビドプシスＭａｄ２タンパク質と相互作用することを示している。
【０１６８】
細菌性植物病原体の病原性の戦略は、植物の細胞周期を変更することが可能である。最近デュアン（Ｄｕａｎ）らは、Ｘ．シトリ（ｃｉｔｒｉ）由来のａｖｒ遺伝子のａｖｒＢｓ３ファミリーの一員であるｐｔｈＡが柑橘類で発現され、細胞肥大（ｅｎｌａｒｇｅｍｅｎｔ）および細胞分裂を惹起し、これが植物細胞周期に関連していることを報告した（Ｄｕａｎら、１９９９）。ＨｏｐＰｓｙＡがＭａｄ２を標的とするならば、病原性に対する少なくとも２種の可能性のある利点が想定される。成熟葉の植物細胞は静止期であるので、これらの細胞へのＨｏｐＰｓｙＡ送達のひとつの利点は、これがそれとＭａｄ２との相互作用を通じて細胞分裂を引き起し得ることである。これは、抗Ｍａｄ２抗体は、哺乳類細胞において分裂後期の早期開始を引き起こすという知見と一致している（Ｇｏｒｂｓｋｙら、１９９８）。病原体に近いより多くの植物細胞が、アポプラスト（ａｐｏｐｌａｓｔ）において利用可能な栄養素を増加し得る。第二の潜在的利点は、ＨｏｐＰｓｙＡが若い葉において活発に分裂している植物細胞へ送達される場合に生じる。ＨｏｐＰｓｙＡのこれらの葉の植物細胞への送達は、それとＭａｄ２との相互作用を通じて、紡錘体チェックポイントを狂わせることがある。これらの細胞は、それらの染色体分離をより多く誤る傾向があり、一部の細胞において、これは死を生じ、細胞内容物は究極的にはアポプラストへ漏出し、病原体へ栄養素を提供する。
【０１６９】
実施例８−酵母において発現されたＨｏｐＰｔｏＡおよびＨｏｐＰｓｙＡの細胞毒性作用
ｈｏｐＰｔｏＡ（配列番号：６）およびｈｏｐＰｓｙＡ（配列番号：３５）を両方とも最初にｐＦＬＡＧ−ＧＴＣ（Ｋｏｄａｋ社）へクローニングし、ＦＬＡＧエピトープとのインフレーム融合体を作出したが、これは抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体によるタンパク質産生のモニタリングを可能にした。次にＦＬＡＧタグ付き遺伝子を、酵母シャトルベクターｐ４１５ＧＡＬ１においてＧＡＬ１プロモーターの制御下でクローニングした（Ｍｕｍｂｅｒｇら、１９９４）。これらのサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｅｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の調節可能なプロモーターは、転写活性および異種発現の比較を可能にした。この組換えプラスミドをウラシル栄養要求酵母ＦＹ８３３／４株へ形質転換し、プラスミド上のＵＲＡ３遺伝子の存在に基づいて、ＳＣ−Ｕｒａ（ウラシル欠乏合成完全培地）上での増殖を選択した。次に形質転換体を、２％ガラクトース（これはＨｏｐＰｓｙＡおよびＨｏｐＰｔｏＡの発現を誘導する）または２％グルコースのいずれかを含有するＳＣ−Ｕｒａ培地プレート上に画線した。２％ガラクトースを補充したプレート上では増殖が見られなかった。この作用は反復試験において観察され、空ベクター対照において、ｐ４１５ＧＡＬ１に同様にクローニングした４種の別のエフェクターにおいて、またはガラクトースの代わりにラフィノースを使用した場合には観察されなかった。ＦＬＡＧタグ付きの無毒Ａｖｒタンパク質を用いて、予想されたように、これらの遺伝子が、ガラクトース含有プレート上において示差的に発現されることを確認した。重要なことに、ＨｏｐＰｓｙＡによる毒性作用は、コード遺伝子が、ｐ４１５ＧＡＬ１よりも実質的に低レベルで外来遺伝子を発現しているｐ４１６ＧＡＬＳへ再クローニングされた場合に認められた。
【０１７０】
参考文献
本明細書で引用されたかまたはさもなければ以下に列記した参考文献の各々は、明白に、その全体が本明細書に参照として組入れられている。
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【０１７１】
本発明は例証を目的として詳述されているが、このような詳細は単に例証のためであり、添付の「特許請求の範囲」に定義された本発明の精神および範囲から逸脱しない限りは、当業者により変更を行うことができることが理解されなければならない。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｐｓｙ ６１、Ｐｓｙ Ｂ７２８ａ、およびＰｔｏ ＤＣ３０００のＨｒｐ Ｐａｉ内のｈｒｐ／ｈｒｃ遺伝子の保存された配置を説明する略図である。Ｂ７２８ａおよびＤＣ３０００において配列決定された領域を、６１株配列の下側に線で示している。公知の調節遺伝子には影を付けている。矢印は転写の方向を示し、小さい四角はＨｒｐボックスの存在を意味する。三角は、Ｂ７２８ａ ｈｒｐ／ｈｒｃ領域内のファージ遺伝子を含む３．６ｋｂ挿入物を意味する。
【図２】Ｐｔｏ ＤＣ３０００、Ｐｓｙ Ｂ７２８ａ、およびＰｓｙ ６１のＥＥＬ、緑膿菌（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｐａ）のｔｇｔ−ｑｕｅＡ−ｔＲＮＡＬｅｕ遺伝子座、ならびにＥＥＬ境界配列を示している。図２Ａは、それらのｈｒｐＫ配列と整列化した３種のＰ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）株のＥＥＬの略図、およびＰａ ＰＡ０１中のｔｇｔ−ｑｕｅＡ−ｔＲＮＡＬｅｕ遺伝子座との比較である。矢印は転写の方向を示し、小さい四角はＨｒｐボックスの存在を意味する。影付き領域は保存されており、斜線領域は可動性遺伝因子を意味して、白い四角は互いに完全に似ていない遺伝子を意味する。図２Ｂは、ｔＲＮＡＬｅｕとの境界における、ＤＣ３０００（ＤＣ）（配列番号：８５）、Ｂ７２８ａ（Ｂ７）（配列番号：８６）、および６１（配列番号：８７）のＥＥＬの配列のアラインメントであり、保存性ヌクレオチドを上部の四角に示した。図２Ｃは、ｈｒｐＫとの境界の、ＤＣ３０００（ＤＣ）（配列番号：８８）、Ｂ７２８ａ（Ｂ７）（配列番号：８９）、および６１（配列番号：９０）のＥＥＬの配列のアラインメントであり、保存性ヌクレオチドを上部の四角に示した。
【図３】Ｐ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）のＨｒｐ Ｐａｉ ＣＥＬの略図である。Ｐｔｏ ＤＣ３０００ ＣＥＬを、下側に並置された配列決定されたＰｓｙ Ｂ７２８ａの対応する断片と共に示した。コード領域における配列決定された断片のヌクレオチド同一性は、７２％〜８３％の範囲内であった。矢印は転写方向を示し、小さい四角はＨｒｐボックスの存在を意味する。
【図４】ＥＥＬ（ＣＵＣＰＢ５１１０）およびＣＥＬ（ＣＵＣＰＢ５１１５）欠失を保持するＰｔｏ変異体の植物相互作用の表現型を示す。図１４Ａは、ＤＣ３０００およびＣＵＣＰＢ５１１０のトマトの生育を示すグラフである（平均およびＳＤ）。図１４Ｂは、ＤＣ３０００、ＣＵＣＰＢ５１１５、およびＣＵＣＰＢ５１１５（ｐＣＰＰ３０１６）のトマトの生育を示すグラフである（平均およびＳＤ）。図１４Ｃは、１０７ｃｆｕ／ｍｌのＤＣ３０００およびＣＵＣＰＢ５１１５を用いた浸潤の２４時間後のタバコ葉組織中のＨＲ崩壊を示す画像である。図１４Ｄは、１０４ｃｆｕ／ｍｌのＣＵＣＰＢ５１１５の接種の４日後のトマト葉における疾病症状の不在を示す画像である。図１４Ｅは、１０４ｃｆｕ／ｍｌのＣＵＣＰＢ５１１５（ｐＣＰＰ３Ｏ１６）の接種の４日後のトマト葉における野生型に典型的疾病症状を示す画像である。
【図５】Ｈｒｐ Ｐａｉの３種の主要領域に影響する欠失を含むＰｔｏ ＤＣ３０００誘導体によるＡｖｒＰｔｏ分泌を示すイムノブロット分析の画像である。細菌を、Ｈｒｐ誘導最小培地（ｐＨ５．５）において２２℃でＯＤ６００が０．３５となるまで増殖させ、次に細胞結合（Ｃ）画分および上清（Ｓ）画分へと遠心分離により分離した。次に上清画分を負荷前に細胞結合画分に対して３倍濃縮した以外は、説明されたように、タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解し、ブロットして、ＡｖｒＰｔｏおよびβ−ラクタマーゼに対する抗体で免疫染色した（ＭａｎｃｅａｕおよびＨａｒｖａｉｓ、１９９７）。Ｐｔｏ ＤＣ３０００、ＣＵＣＰＢ５１１５（ＣＥＬ欠失）、ＣＵＣＰＢ５１１４（ｈｒｐ／ｈｒｃ欠失）、およびＣＵＣＰＢ５１１０（ＥＥＬ欠失）は全て、ｐＣＰＰ２３１８を保持し、これは細胞質マーカーとしてシグナルペプチドを伴わずにβ−ラクタマーゼを発現している。
【図６】図１と比べ拡大した、Ｐｓｙ６１のＨｒｐ ＰａｉのＥＥＬにおけるｓｈｃＡおよびｈｏｐＰｓｙＡオペロンの組織を示している。図６Ａにおいて、ｓｈｃＡおよびｈｏｐＰｓｙＡは、白い四角として示されている。Ｈｒｐ Ｐａｉの境界は、灰色の四角として示されたｔＲＮＡＬｅｕおよびｑｕｅＡ遺伝子である。５’側切断されたｈｒｐＫ遺伝子は、ハッチ付きの四角で示されている。矢印は転写の予想される方向を示して、黒い四角は、ｓｈｃＡの上流の推定ＨｒｐＬ依存型プロモーターの存在を意味する。図６Ｂは、Ｐｓｙ ６１へｓｈｃＡ ＯＲＦマーカー交換した欠失変異の構造を概略的に示している。黒いバーは、追加された制限酵素部位にそって増幅された領域を示して、各々は図６Ａに示した対応するＤＮＡ領域と整列化されている。斜線付きの四角は、機能的非極性ｓｈｃＡ Ｐｓｙ ６１変異体の作出において使用された転写および翻訳のターミネーターが欠如したｎｐｔＩＩカセットを示している。ＥｃｏＲＩ、Ｅ；ＥｃｏＲＶ、Ｖ；ＸｂａＩ、Ｘ；およびＸｈｏＩ、Ｘｈ。
【図７】ｓｈｃＡがタンパク質産物をコードすることを示すイムノブロット画像である。ｐＬＶ９は、ｓｈｃＡ ＯＲＦがクローニングされてＦＬＡＧエピトープに融合され、翻訳がベクターリボソーム結合部位（ＲＢＳ）により指示されるような、ｐＦＬＡＧ−ＣＴＣの誘導体である。ｐＬＶ２６は、ｓｈｃＡコード領域およびその本来のＲＢＳ部位を含む増幅産物を含む。ｐＦＬＡＧ−ＣＴＣ（対照）、ｐＬＶ９、またはｐＬＶ２６のいずれかを保持する大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＤＨ５α培養物をＯＤ６００が０．８になるまで増殖させ、次に１００μｌアリコートを採取し、遠心分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液中に再懸濁し、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＦＬＡＧ抗体およびアルカリホスファターゼに結合した二次抗体によるイムノブロット分析に供した。
【図８】Ｐｓｙ ６１ ｓｈｃＡ変異体ＵＮＬＶ１０２がＨｏｐＰｓｙＡおよびｓｈｃＡを分泌せず、トランスに提供されたｓｈｃＡがこの欠損を補完することを示すイムノブロット画像である。Ｐｓｙ ６１培養物を、ｈｒｐ脱抑制培地において２２℃で増殖させ、細胞結合（Ｃ）画分および上清（Ｓ）画分に分離した。細胞結合画分を、最初の培養物体積に対して１３．４倍に濃縮して、上清画分を１００倍に濃縮した。実験手法の項に記したように、これらの試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロット分析に供して、ＨｏｐＰｓｙＡおよびβ−ラクタマーゼ（Ｂｌａ）を、抗ＨｏｐＰｓｙＡ抗体または抗β−ラクタマーゼ抗体のいずれかで検出し、その後アルカリホスファターゼに結合した二次抗体により検出した。イムノブロットの画像を、ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｌ Ｄｏｃ ２０００ ＵＶ蛍光ゲルドキュメンテーションシステムを付属のＱｕａｎｔｉｔｙ １ソフトウェアと共に用いて捕捉した。
【図９】ｓｈｃＡはＨｏｐＰｓｙＡのＩＩＩ型分泌に必要とされるが、ＨｒｐＺを分泌しないことを示すイムノブロット画像である。蛍光菌（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）５５培養物を、ｈｒｐ脱抑制培地において増殖させて、細胞結合（Ｃ）画分および上清（Ｓ）画分へ分離した。細胞結合画分を、最初の培養物体積に対して１３．４倍に濃縮して、上清画分を１００倍に濃縮した。実験手法の項に記したように、これらの試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロット分析に供して、ＨｏｐＰｓｙＡおよびＨｒｐＺを、抗ＨｏｐＰｓｙＡ抗体または抗ＨｒｐＺ抗体のいずれかで検出し、その後アルカリホスファターゼに結合した二次抗体により検出した。イムノブロットの画像は、ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｌ Ｄｏｃ ２０００ ＵＶ蛍光ゲルドキュメンテーションシステムを付属のＱｕａｎｔｉｔｙ １ソフトウェアと共に用いて捕捉した。
【図１０】機能的非極性ｓｈｃＡ変異を含むｐＨＩＲ１１誘導体を保持する蛍光菌（Ｐ． ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）５５は、ＨｏｐＰｓｙＡを植物細胞へ移入する能力が損なわれていることを示す、一連のタバコ葉の４枚の画像である。蛍光菌（Ｐ． ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）５５培養物を、キング（Ｋｉｎｇ）Ｂにおいて一晩増殖させ、５ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．６）中でＯＤ６００が１．０となるよう懸濁して、タバコ葉パネルに浸漬させた。ｐＨＩＲ１１誘導性ＨＲは、植物細胞内部のＨｏｐＰｓｙＡの移入に起因しているので、低下したＨＲは、ＨｏｐＰｓｙＡが典型的ＨＲを誘導するのに十分な位良好には送達されないことを示している。葉パネルを、２４時間後に入射光線により写真撮影した。
【図１１】ＳｈｃＡはＨｏｐＰｓｙＡへ結合することを示すイムノブロット画像である。ｐＬＮ１（ＨｏｐＰｓｙＡ）またはｐＬＮ２（ＳｈｃＡ−ＦＬＡＧ、ＨｏｐＰｓｙＡ）を保持するＰｓｙ ６１ ｓｈｃＡ変異体ＵＮＬＶ１０２の超音波処理した培養物（超音波処理）から得た可溶性タンパク質試料を、抗ＦＬＡＧ Ｍ２親和性ゲル（ゲル）と混合した。このゲルを、ＴＢＳ緩衝液で洗浄し（洗浄）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液と混合し、超音波処理試料および洗浄試料と共に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロット分析に供した。実験手法に記したように、ＨｏｐＰｓｙＡおよびＳｈｃＡ−ＦＬＡＧを、抗ＨｏｐＰｓｙＡ抗体または抗ＦＬＡＧ抗体で検出し、その後のアルカリホスファターゼに結合した二次抗体により検出した。
【図１２】サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における紡錘体チェックポイントを説明する概略図である。紡錘体チェックポイントは、微小管に異常がある場合に、動原体から放出されたシグナルにより活性化される。このシグナルは、様々な方法で反応するような紡錘体チェックポイント成分により若干受け取られる。Ｍａｄ２は、Ｃｄｃ２Ｏに、そのユビキチンリガーゼ活性を阻害するＡＰＣで結合すると考えられる。Ｍａｄ２が存在しない（および紡錘体に損傷を及ぼしうる）場合、ＡＰＣは活性があり、これはユビキチンタンパク質分解経路による分解のためのＰｄｓ１および他の分裂後期阻害因子をマークし、分裂後期を保証する。
【図１３】トランスジェニック性に発現されたＨｏｐＰｓｙＡの、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）ｃｖ．キサンチ（Ｘａｎｔｈｉ）、ニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、およびシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）に対する作用を示している。図１３Ａは、ｐＴＡ７００２：：ｈｏｐＰｓｙＡを有するまたは有さない、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＧＶ３１０１に浸漬されたＮ．タバカム（ｔａｂａｃｕｍ）ｃｖ．キサンチ（Ｘａｎｔｈｉ）およびＮ．ベンサミアナ（ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の葉を示している。図１３Ｂは、Ａ．ツメファシエンス（ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）＋／− ｐＴＡ７００２：：ｈｏｐＰｓｙＡで浸漬されたシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）Ｃｏ１−１を示している。図１３Ａ−Ｂに示した全ての植物について、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）浸漬の４８時間後に、植物にグルココルチコイドであるデキサメタゾン（ＤＥＸ）を噴霧した。画像は、ＤＥＸ処理後２４時間で撮影した。Ａ．ｔ．＝アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）；ｐＡ＝ｐＴＡ７００２：：ｈｏｐＰｓｙＡ。
【図１４】Ｐｓｙ ６１（ｐＣＰＰ２３１８）またはｈｒｐ変異体、Ｐｓｙ ６１−２０８９（ｐＣＰＰ２３１８）の培養物中のＨｏｐＰｓｙＡおよびβ−ラクタマーゼの分布を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの画像である。細菌培養物をｈｒｐ脱抑制培地において２２℃で増殖させて、細胞結合（Ｃ）画分および上清（Ｓ）画分へ分離した。細胞結合画分を、最初の培養物体積に対して１３．４倍に濃縮して、上清画分は１００倍に濃縮した。これらの試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロット分析に供して、ＨｏｐＰｓｙＡおよびβ−ラクタマーゼを、抗ＨｏｐＰｓｙＡ抗体または抗β−ラクタマーゼ抗体のいずれかで検出し、その後アルカリホスファターゼに結合した二次抗体により検出した。Ｐｓｓ野生型＝シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）６１（ｐＣＰＰ２３１８）；Ｐｓｓ ｈｒｃＣ＝シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）６１−２０８９（ｐＣＰＰ２３１８）。
【図１５】マメの葉における、野生型シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）およびｈｏｐＰｓｙＡ変異体の増加する能力を示すグラフである。値は、２回の独立した接種における植物粉砕葉からの平均プレート数を示している。野生型（●）、シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）６１；ｈｏｐＰｓｙＡ変異体（○）、シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ｐｖ．シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）６１−２０７０。
【図１６】酵母ツーハイブリッドアッセイ法におけるＨｏｐＰｓｙＡおよびＭａｄ２の相互作用を示している。図１６Ａは、グルコース（Ｇｌｃ）またはガラクトース（Ｇａｌ）のいずれかによるβ−ガラクトシダーゼ活性についてチェックするための、ｐＬＶ２４（ｐＥＧ２Ｏ２：：’ｈｏｐＰｓｙＡ）およびｐＪＧ４−５（魚（ｆｉｓｈ）ベクター）、ｐＬＶ２４およびｐＬＶ１１６（ｐＪＧ４−５：：ｍａｄ２）、またはｐＥＧ２０２（餌ベクター）およびｐＬＶ１１６のいずれかを含む酵母ＥＧＹ４８株の、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘｇａｌ）を含有する培地における培養物を示す。β−ガラクトシダーゼ活性は、ＨｏｐＰｓｙＡおよびＭａｄ２の両方の存在下においてのみ示された。図１６Ｂは、同じ酵母株のＧｌｃまたはＧａｌのいずれかの糖を有する最小培地ロイシン欠乏プレートにおける培養物を示している。１＝ＥＧＹ４８（ｐＬＶ２４、ｐＪＧ４−５）；２＝ＥＧＹ４８（ｐＬＶ２４、ｐＬＶ１１６）；３＝ＥＧＹ４８（ｐＥＧ２Ｏ２、ｐＬＶ１１６）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004522406.tif 000363
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