(57)【要約】【課題】  少量の有効成分で優れた効力を有する植物病原性糸状菌防除剤を提供すること。【解決手段】  茶カテキン類とカフェインを有効成分として組み合わせてなることを特徴とする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
茶カテキン類とカフェインを有効成分として組み合わせてなることを特徴とする植物病原性糸状菌防除剤。
【請求項２】
茶カテキン類が少なくともエピガロカテキンガレートを含んでなることを特徴とする請求項1記載の植物病原性糸状菌防除剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少量の有効成分で優れた効力を有する植物病原性糸状菌防除剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物病害菌ファイトフィソラ  インフェスタンス（Phytophthora infestans：疫病菌）は1845〜1849年に発生したアイルランドにおけるジャガイモ疫病の原因菌であり、これによりアイルランドでは100万人以上におよぶ餓死者が発生した。さらに、ジャガイモ飢饉（Potato Famine）の影響はそれだけにとどまらず、200万人以上がアイルランドからアメリカ大陸に移住したといわれ、現在ではアメリカ合衆国の全人口の20%弱がアイルランド系である。アイルランド系アメリカ人からはJ. F. ケネディ、R. W. レーガンやW. J. クリントンなどの大統領が誕生するなど、結果的に疫病菌が人類の歴史に与えた影響は重大である。
植物の病虫害は食糧問題に直結する重大事であり、人類は古くからその防除について何らかの対策を講じてきた。1800年代から、除虫菊粉、デリス根、石灰硫黄合剤およびボルドー液が農薬として大量に生産され、広く流通した。日本にも1891年に除虫菊粉が輸入されたのを皮切りに諸外国で発明された農薬が導入された。
初期の農薬は、硫黄や銅などの無機物、除虫菊粉、デリス根など、天然に存在するものをほぼそのまま利用していた。しかし、第二次世界大戦に至る世界情勢の悪化を受け、除虫菊やデリス根などの農薬原料のアジア地域から欧米への輸送が困難になり、代替するものが必要となった。除虫菊の殺虫有効成分ピレトリンの構造が1924年に、デリス根の殺虫有効成分ロテノンの構造が1932年に解明されていたが、それらを合成するよりも安価かつ大量に製造できる化学物質の探索が進められた。
1939年にミュラーによってDDT（p,p'-ジクロロジフェニルトリクロロエタン）に殺虫活性があることが発見され、続いて1942年にスレードによりBHC（1,2,3,4,5,6-ヘキサクロロシクロヘキサン）のγ異性体に殺虫活性があることが発見された。これを契機として天然には存在しない物質を農薬として利用する時代が始まった。また、1944年には有機リン系農薬であるパラチオンが開発された。これらは強力な殺虫剤であったが、毒性が強く、人の中毒事故も多発した。
一方、第二次世界大戦後に除虫菊の殺虫有効成分ピレトリンの構造をもとに安定性、生産性、有効性などを改良した合成ピレノイドが多数開発され始めた。
1962年にレイチェル・カーソン女史が「サイレント・スプリング」を発表し、DDTなどの殺虫剤が自然界で分解されにくく、環境に蓄積し思わぬ害を招くことを訴えると、世界中で農薬の安全性に対する議論が起こった。これによりDDTやγBHCなどの古い農薬は姿を消し、高活性低毒性の新型剤にとって代わられていった。日本ではイモチ病の防除剤にセレサン石灰（水銀剤）が利用されていたが、非水銀化の要望が高まってきたこと、抗生物質ブラストサイジンSが発見されるなど代替薬剤が提供されるようになったことから、1969年には水銀剤とともにDDTやγBHCも水田での使用が禁止された。
日本では農薬は農薬取締法（1948年制定、1971年大幅改正、2003年改正）に従って取り扱われている。農薬は登録制であり、製品ごとに使用できる作物、種類、使用法などが定められている。2003年改正では無登録農薬の製造、販売が全面的に禁止されたが、原材料に照らし、農作物の他、人畜や水産動植物などに対して害をなすおそれが無いものとして天敵、重曹、食酢の3種類が特定防除資材（特定農薬）として指定されている。また、木酢などの植物由来の数種類の資材について薬効や安全性の評価が行われた経緯もあり、その他の植物抽出物についても特定防除資材候補として考慮されるものがある。
【０００３】
除虫菊やデリス根の殺虫効果は偶然に発見されたものであるが、多くの植物に種々の作用を持つ生理活性物質が含まれていることは明らかである。既に数々の植物の抽出物について検索が行われ、フェノール化合物、テルペノイド、アルカロイド、あるいはリグニンなどといった様々な植物由来成分に抗菌活性があることが示されてきている。例えば、特許文献1には甘草抽出物に抗真菌物質が含まれることが、特許文献2にはシソ科植物の抽出物に植物病害菌防除効果があることが述べられている。
マメ科植物であるデニスの根の殺虫成分であるロテノンはファイトアレキシンとしての機能を有するイソフラボノイドの1種である。イソフラボノイドは近年の健康志向から健康食品成分として注目されている物質であることは周知の通りであり、ロテノンは植物由来の安全性の高い殺虫成分である。
特許文献3には茶からの抽出物や茶から抽出分離して得られた茶カテキン類や茶サポニン類に植物病害菌の防除効果があることが述べられている。茶は人類が長年にわたり飲用に供してきた植物である。そのため、長年にわたる摂取接種によっても毒性がなく、安全性が確かである。また、非特許文献1にはカフェインを含有する植物は、虫害を防ぐためにカフェインを合成していると述べられており、非特許文献2ではタバコにカフェイン合成系遺伝子を導入することにより虫害から自己防衛するタバコを作ったと報告されている。しかし、カフェインの植物病害菌防除効果について言及した文献はない。
【特許文献１】特開2001-48800号公報
【特許文献２】特開平10-164986号公報
【特許文献３】特開平5-139924号公報
【非特許文献１】水野幸一、2005年、秋田応用生命科学研究会第8回講演会要旨集（平成17年11月11日）
【非特許文献２】Uefuji, H. 他、2005年、Caffeine production in Tabacco Plants by simultaneous expression of three coffee N-methyltransferase and its potential as a pest repellant、Plant Molecular Biology、Vol. 59、pp. 221-227
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで本発明は、少量の有効成分で優れた効力を有する植物病原性糸状菌防除剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、茶カテキン類とカフェインを有効成分として組み合わせて用いることで、植物病原性糸状菌に対する優れた抗菌作用が得られることを見出した。
【０００６】
本発明は上記の知見に基づいてなされたものであり、本発明の植物病原性糸状菌防除剤は、請求項1記載の通り、茶カテキン類とカフェインを有効成分として組み合わせてなることを特徴とする。
また、請求項2記載の植物病原性糸状菌防除剤は、請求項1記載の植物病原性糸状菌防除剤において、茶カテキン類が少なくともエピガロカテキンガレートを含んでなることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、少量の有効成分で優れた効力を有する植物病原性糸状菌防除剤が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の植物病原性糸状菌防除剤は、茶カテキン類とカフェインを有効成分として組み合わせてなることを特徴とするものである。本発明の植物病原性糸状菌防除剤が効果を発揮する植物病原性糸状菌の種類としては、フザリウム（Fusarium）属、ビポラリス（Bipolaris）属、ドレクスレラ（Drechslera）属、アスペルギルス（Aspergillus）属などに属する糸状菌が挙げられる。本発明の適用対象となる植物病原性糸状菌の種類とその病原性の代表例を表1と表2に記載する。
【０００９】
【表１】
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【００１０】
【表２】
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【００１１】
本発明の植物病原性糸状菌防除剤の有効成分として機能する茶カテキン類は、茶の成分として含まれるカテキン（C）、ガロカテキン（GC）、カテキンガレート（Cg）、ガロカテキンガレート（GCg）、エピカテキン（EC）、エピガロカテキン（EGC）、エピカテキンガレート（ECg）、エピガロカテキンガレート（EGCg）などのカテキンを意味する。これらのカテキンは（+）体であっても（-）体であってもよい。また、これらのカテキンは単独で用いてもよいし、複数種類を混合して用いてもよい。茶カテキン類は、主にツバキ科ツバキ属に属するチャ（Camellia sinensis）から得られる葉、茎、木部、樹皮、根、実、種子のいずれかあるいはこれらの2種類以上の混合物もしくはそれらの粉砕物から水、熱水、有機溶媒、含水有機溶媒あるいはこれらの混合物などにより抽出することで得ることができる。茶カテキン類は、茶生葉あるいはその乾燥物から水、熱水、有機溶媒、含水有機溶媒あるいはこれらの混合物などを用いて得られる抽出物自体やこれを必要に応じて精製して得られる精製物であってもよい。茶カテキン類の精製物は、特公平1-44234号公報、特公平2-12474号公報、特公平2-22755号公報、特開平4-20589号公報、特開平5-260907号公報、特開平8-109178号公報などに記載された方法により得ることができ、例えば、茶葉を上記のような溶媒で抽出して得られた抽出物を、有機溶媒分画や吸着樹脂などを用いることで所望の程度に精製できる。茶カテキン類は市販されているものもあり、例えば、三井農林（株）製「ポリフェノン」を好適に用いることができる他、太陽化学（株）製「サンフェノン」や（株）伊藤園製「テアフラン」などを用いることもできる。茶カテキン類には少なくともエピガロカテキンガレートが含まれていることが望ましい。
【００１２】
本発明の植物病原性糸状菌防除剤の有効成分として機能するカフェインは、茶やコーヒー豆などに含まれるプリン誘導体であることは周知の通りである。カフェインは天然から単離・精製されたものであってもよいし、化学合成品であってもよい。
【００１３】
茶カテキン類とカフェインの好適な混合比率や混合濃度は、植物病原性糸状菌の菌種により異なるが、本発明の植物病原性糸状菌防除剤を液状剤とした場合、各々の有効成分を1ppm〜5000ppmの濃度範囲内において混合することで、両者の植物病原性糸状菌に対する相乗効果により優れた抗菌作用が得られる混合比率や混合濃度を見出すことができる。
【実施例】
【００１４】
以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明する。ただし、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００１５】
実施例A：植物病原性糸状菌に対する抗菌活性のin vitroの評価
（実験方法）
1．実験に用いた植物病原性糸状菌の菌株
Fusarium oxysporum（IFO 31631）
Fusarium solani（IFO 9955）
Bipolaris brizae（NBRC 100197）
Aspergillus oryzae var. oryzae（CBS 100925）
Chaetomium globosum（IFO 31387）
Mucor hiemalis f. hiemalis（CBS 201.65）
Penicillium expansum（NBRC 5854）
Rhizopus stolonifer var. stolonifer（IFO 30816）
Alternaria solani（NBRC 7516）
Cochliobolus sativus（NBRC 100193）
Colletotrichum acutatum（NBRC 32849）
Exserohilum monoceras（NBRC 100161）
Helminthosporium zonatum（NBRC 7521）
Leptospharulina briosiana（NBRC 9925）
Pyrenophora graminea（NBRC 7507）
いずれも培養はPDA培地を用いて行い、培養温度は25℃とした。それぞれの病原性は表1と表2を参照のこと。
【００１６】
2．実験に用いた有効成分
茶カテキン類として三井農林（株）製のエピガロカテキンガレート（EGCg）を用いた。カフェインはナカライテスク（株）より購入した。EGCgおよびカフェインは、培地中の終濃度が125，250，500，750，1000，2000および4000ppmとなるように調整して実験を行った。
【００１７】
3．評価方法
植物病原性糸状菌に対する抗菌活性の評価は、個々の有効成分を所定の濃度で含むPDA平板培地を作製し、その中央に植物病原性糸状菌を接種した直径8mmのペーパーディスクを載置して25℃で7日間培養した後、生育抑止率を以下の数式により求めることで行った。
生育阻止率(%)＝[(C−8)−(T−8)]×100÷(C−8)
C：有効成分を添加しない寒天上に生育した生育コロニー直径（コントロール）
T：有効成分を添加した寒天上に生育した生育コロニー直径
【００１８】
4．相乗効果の判別法
相乗効果の有無を解析するため、Calcusyn programのChou-Talalayの組み合わせ指標（CI）式に従って処理した（(1) Chou, J. and Chou, T-C. Dose-effect analysis with microcomuputers: Quantitation of ED50, LD50, synergism, antagonism low-dose risk, receptor-ligand binding and enzyme kinetics. Manual and Software, Biosoft, Cambidge, U.K., 1987.、(2) Chou, J. Quantitation of synergism and antagonism of two or more drugs by computerized analysis. In Synergism and Antagonism in Chemotherapy (Chou, T-C. and Rideout, D. C., eds) pp223-244, Academic Press, San Diego, 1991）。CI値の算出にはEGCgとカフェインをそれぞれ単独で用いた場合の濃度と生育阻止率の関係を求める必要があり、その計算式としてCalcusyn programの以下の数式を用いた。
fa/fu=(D/Dm)m
D：有効成分(EGCgまたはカフェイン)の量
Dm：50%の生育阻止効果を示す物質量
fa：生育阻止率
fu：100−fa
m：量曲線の湾曲具合を示す指数
上記の式においてEGCgとカフェインが植物病原性糸状菌に対して抗菌作用を示した場合、以下の数式に従ってCI値を算出した。
CI=[(D)1/(Dx)1]+[(D)2/(Dx)2]
(D)1,(D)2：X%阻害するときのEGCgとカフェインの濃度の組み合わせ
(Dx)1,(Dx)2：X%阻害するときのEGCgとカフェインの単独での濃度
上記の数式では一般にCI＜1は相乗効果、CI＝1は相加効果、CI＞1は対立効果として定義される。
【００１９】
（実験結果）
それぞれの植物病原性糸状菌に対する抗菌作用を表3〜表17にそれぞれ示す。表から明らかなように、EGCgとカフェインの濃度の組み合わせによって相乗効果に強弱はあるものの、両者を有効成分として組み合わせることによる相乗効果を見出すことができた（下線を付した太字部分）。
【００２０】
【表３】
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【００２１】
【表４】
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【００２２】
【表５】
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【００２３】
【表６】
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【００２４】
【表７】
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【００２５】
【表８】
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【００２６】
【表９】
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【００２７】
【表１０】
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【００２８】
【表１１】
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【００２９】
【表１２】
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【００３０】
【表１３】
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【００３１】
【表１４】
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【００３２】
【表１５】
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【００３３】
【表１６】
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【００３４】
【表１７】
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【００３５】
実施例B：植物病原性糸状菌に対する抗菌活性のin vivoの評価
（実験方法）
1．実験に用いた植物病原性糸状菌の菌株（南アフリカ国Pretoria大学の菌株保存施設より入手）と宿主植物
Fusarium oxysporum            ・・・  キュウリ
Fusarium solani               ・・・  キュウリ
Phytophthora capsici          ・・・  トマト
Pythium F-group               ・・・  レタス
Sclerotinia sclerotiorum      ・・・  レタス
Sclerotium rolfsii            ・・・  トマト
いずれも培養はPDA培地を用いて行い、培養温度は25℃とした。
【００３６】
2．実験に用いた有効成分
茶カテキン類として表18に示す組成を有する三井農林（株）製の「ポリフェノンG」（以下PPGと略称する）を用いた。カフェインはSigma社より購入した。
【００３７】
【表１８】
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【００３８】
3.評価方法
（a）土壌接種用糸状菌の調製
6種類の糸状菌をPDA平板培地に接種し、25℃で平板（直径9cm）が完全に覆い尽くされるまで培養した。200gのキビの種を150mlの水に漬けて24時間放置し、滅菌バッグに移して120℃で45分間高圧蒸気滅菌した。この種子混合液に新鮮な0.5cm片の糸状菌を接種、混合して土壌接種用糸状菌とした。これは6種の糸状菌それぞれについて調製した。
【００３９】
（b）糸状菌感染土壌の調製
表面土壌と植え込み土壌を上記の条件で滅菌した後に1:1の比率で混合した。調製した土壌接種用糸状菌を10（F. oxysporum）、10（F. solani）、7（P. capsici）、10（Pythium F-group）、5（S. sclerotiorum）および2（S. rolfsii）%m/vの比率で土壌とそれぞれ混合し、感染土壌を調製した。
【００４０】
（c）宿主植物の調製
キュウリ、レタスおよびトマトの種はHygrotec社（Pretoria, South Africa）より購入した。キュウリの種は滅菌したバーミキュライトを用いて25℃で予備発芽させ、土壌に植え替え、2週間半栽培した。トマトとレタスの種は発芽後、5週間種苗会社（Multiplant, Brits, South Africa）で栽培した。
【００４１】
（d）接種試験
感染土壌を700mLのプラスティックポットに入れ、それぞれの植物苗を移植し、100mLの表19に示した各種溶液で処理した。土壌感染、移植および溶液処理は一日の内に実施した。灌水は一日おきに実施した。液肥は一週間おきに与えた。栽培開始から二週間後に、再度1ポットあたり100mLの各種溶液で処理した。各組み合わせは8連で実施し、二回繰り返した。27日後に苗を土壌より抜き、根をきれいに水で濯いだ。その後、根と地上部に切断し、それぞれの収量（重量）を測定した。無作為に選んだ72株の10mm程度の根を選択培地に静置し、土壌に感染させた糸状菌の存在率を調べた。選択培地としてはF. solani、F. oxysporumおよびS. sclerotiorum用にRose Bengal平板培地を、Pythium F-group用にBNPRA平板培地を、P. capsici用にBNPRAH平板培地を、S. rolfsii用に0.05g/Lのrifampicin添加PDA平板培地を用いた。この結果を根の病害発生率とした。また、24株の根の病害発生率をもとに根の腐敗評価を四段階で行った（0=健全、1=25%腐敗、2=50%腐敗、および4=100%腐敗）。
【００４２】
【表１９】
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【００４３】
（実験結果）
それぞれの糸状菌について、根と地上部の収量測定結果を図1〜図6に（図中のアルファベットは生育状態を意味する：aが最も生育が良く順次生育が低下する）、根の病害発生率調査結果を表20〜表22に、根の腐敗評価結果を表23〜表25に示す。
F. oxysporumの試験において、いずれの試験区においても市販の農薬に比べて同等、あるいは効果のあるものはなかった（図1、表20左、表23左）。
F. solaniの試験において、地上部の収量はPPG20g/L+カフェイン2.5g/L処理区およびPPG25g/L+カフェイン3g/L処理区で最も高く、無感染のコントロールの収量と同等であった。根の収量はPPG20g/L+カフェイン2.5g/L処理区で最も高かった。これらのいずれの収量も市販の農薬処理区の収量よりも有意に高かった。根の病害発生率はPPG25g/L+カフェイン3g/L処理区（23.19%）、PPG20g/L+カフェイン2.5g/L処理区（28.33%）の順で低かった。上記組み合わせにおいて、根の腐敗スコアは0であった（図2、表20右、表23右）。
P. capsiciの試験において、地上部の収量はPPG12.5g/L+カフェイン1.25g/L処理区で最も高かったが、この濃度の根の収量は有意に低かった。根の収量はPPG7.5g/L+カフェイン0.75g/L処理区で最も高かった。これらのいずれの収量も無感染のコントロールの収量よりも10〜15%ほど高かった。根の病害発生率はカフェイン1.5g/L処理区で最も低かった（12.36%）。PPGとカフェインの組み合わせにおいて、感染させたコントロールと比較して22.36〜44.58%の病害発生率の減少が見られ、また、根の腐敗スコアは市販の農薬処理区と同様、0であった（図3、表21左、表24左）。
Phthium F-groupの試験において、地上部と根、共にPPG2.5g/L+カフェイン0.25g/L処理区およびPPG5g/L+カフェイン0.5g/L処理区で最も高い収量であった。これらの濃度において、地上部および根の収量は無感染のコントロールの収量と同等であった。根の病害発生率はPPG12.5g/L+カフェイン1.25g/L処理区で最も低く（3.61%）、市販農薬と同等であった。一方、根の腐敗スコアはPPG2.5g/L+カフェイン0.25g/L処理区およびPPG5g/L+カフェイン0.5g/L処理区で0で、市販の農薬（0.96）よりも低かった（図4、表21右、表24右）。
S. sclerotiorumの試験において、地上部の収量はPPG10g/L処理区で最も高かった。根の収量はPPG10g/L処理区でも比較的高かったが、PPG25g/L+カフェイン3g/L処理区の方が高かった。根の病害発生率はPPG25g/L+カフェイン3g/L処理区で5.00%で、感染させたコントロールと比較して87.36%、市販農薬と比較して23.75%の病害発生率の減少が認められた。また、PPGとカフェインの組み合わせの根の腐敗スコアは優れた値を示した（図5、表22左、表25左）。
S. rolfsiiの試験において、地上部と根、共にPPG5g/L+カフェイン1g/L処理区で高い収量で、地上部の収量は無感染のコントロールの収量よりも高かった。一方、根の病害発生率はPPG20g/L+カフェイン2.5g/L処理区で最も低く（29.31%）、市販農薬（35.97%）よりも低かった。一方、根の腐敗スコアはPPG15g/L+カフェイン2g/L処理区およびPPG20g/L+カフェイン2.5g/L処理区で非常に低かった（図6、表22右、表25右）。
以上の結果から、茶カテキン類とカフェインは各々単独でも抗糸状菌活性を有するが、両者を適当な濃度で組み合わせた場合、より低濃度で抗糸状菌活性を示すことがわかった。
【００４４】
【表２０】
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【００４５】
【表２１】
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【００４６】
【表２２】
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【００４７】
【表２３】
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【００４８】
【表２４】
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【００４９】
【表２５】
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【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明は、少量の有効成分で優れた効力を有する植物病原性糸状菌防除剤を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】実施例Bにおける各種試験区におけるF. oxysporumを感染させた土壌に定植したキュウリの根および地上部の収量を示すグラフ。
【図２】同、各種試験区におけるF. solaniを感染させた土壌に定植したキュウリの根および地上部の収量を示すグラフ。
【図３】同、各種試験区におけるP. capsiciを感染させた土壌に定植したトマトの根および地上部の収量を示すグラフ。
【図４】同、各種試験区におけるPythium F-groupを感染させた土壌に定植したレタスの根および地上部の収量を示すグラフ。
【図５】同、各種試験区におけるS. sclerotiorumを感染させた土壌に定植したレタスの根および地上部の収量を示すグラフ。
【図６】同、各種試験区におけるS. rolfsiiを感染させた土壌に定植したトマトの根および地上部の収量を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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