(57)【要約】本発明は患者に対して薬剤又はワクチンを制御放出するための医薬品組成物及び方法であり、注射後相当期間にわたって薬剤や抗原のゆっくりした制御放出が続く。当該薬剤又はワクチンを糖ガラス製ミクロスフェアに入れ、次に無水液（ペルフルオロカーボンが好ましい）中に入れると、ワクチンは無水液に囲まれて溶解から保護される。この単純な非毒性の系は現在の注射器或いは現在又は将来の針なしのシステムで送達可能であり、費用がかからず信頼性があり、繰り返し注射する必要性を少なくすることにより非経口の薬剤送達や大衆的予防接種運動の助けとなる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者に注射する安定化した薬剤又はワクチンを含む医薬品組成物であって、
前記薬剤又はワクチンが可溶性ガラス製ミクロスフェアに入れられ、
前記可溶性ガラス製ミクロスフェアが生体適合性無水液に懸濁され、それにより無水液に囲まれたままで、前記薬剤又はワクチンが溶解から保護され、
注射後の長期間当該薬剤又はワクチンを患者の循環系にゆっくりと放出することで、薬剤が作用し又はワクチンが免疫応答を誘発する期間を長くする医薬品組成物。
【請求項２】
前記薬剤が、ホルモン、鎮痛薬、麻酔薬、麻薬拮抗薬、化学療法剤、免疫抑制剤、成長及び分化の調節剤及び因子、免疫調節剤、避妊薬、血管作用薬、抗凝血剤、心臓作用薬、抗炎症薬、中枢神経作用薬からなる群から選ばれる請求項１記載の医薬品組成物。
【請求項３】
前記ワクチンが、トキシン、トキソイド、生存又は死滅バクテリア、生存又は死滅ウイルス、生存又は死滅原生動物、組換えタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、多糖、リポタンパク質、脂質、組換えペプチド又は合成ペプチドからなる一群から選ばれる請求項１記載の医薬品組成物。
【請求項４】
前記可溶性ガラス製ミクロスフェアが、非還元糖、糖アルコール、金属カルボキシレート及びリン酸ガラスからなる群から選ばれる請求項１記載の医薬品組成物。
【請求項５】
前記非還元糖が、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオースからなる群から選ばれる請求項４記載の医薬品組成物。
【請求項６】
前記糖アルコールが、マンニトール、アラビニトール、イノシトール、グルシトール、ガラクチトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、グルコピラノシルソルビトール、グルコピラノシルマンニトールからなる群から選ばれる請求項４記載の医薬品組成物。
【請求項７】
前記生体適合性無水液が、無水親水性液、無水疎水性液、無水シリコーン液、無水ペルフルオロカーボンからなる群から選ばれる請求項１記載の医薬品組成物。
【請求項８】
前記ガラス製ミクロスフェアが、それが懸濁させている生体適合性無水液の密度に合うように当該ミクロスフェアの平均密度を上げるのに十分な量の不溶性生物適合性の高密度試薬を含む請求項１記載の医薬品組成物。
【請求項９】
前記不溶性生物適合性の高密度試薬が、リン酸カルシウム、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸バリウム、二酸化チタンからなる群から選ばれる請求項８記載の医薬品組成物。
【請求項１０】
前記ワクチンが破傷風トキソイドである請求項１記載の医薬品組成物。
【請求項１１】
前記ワクチンがアジュバントに吸着している請求項１０記載の医薬品組成物。
【請求項１２】
前記アジュバントが、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、又はリン酸カルシウムからなる群から選ばれる請求項１１記載の医薬品組成物。
【請求項１３】
前記ガラス製ミクロスフェアに入れた前記安定化破傷風トキソイドの調製を助けるために、リン酸カルシウム、トレハロース、塩化亜鉛、塩化マグネシウム、トリス緩衝液の溶液が加えられた請求項１０記載の医薬品組成物。
【請求項１４】
前記溶液をスプレードライして微粉末にした請求項１３記載の医薬品組成物。
【請求項１５】
前記粉末をペルフルオロカーボンに懸濁させて安定な懸濁液を調製した請求項１４記載の医薬品組成物。
【請求項１６】
前記ペルフルオロカーボンが、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロデカリン、ペルフルオロオクタン、ペルフルオロフェナントレンからなる群から選ばれる請求項１５記載の医薬品組成物。
【請求項１７】
有効量を投与したときに作用期間を長くする薬剤又はワクチンの処方方法であって、前記薬剤又はワクチンが、
前記薬剤又はワクチンを可溶性ガラス製ミクロスフェアに導入し、
前記可溶性ガラス製ミクロスフェアを生体適合性無水液に懸濁させ、それによって無水液に囲まれながら前記薬剤又はワクチンが溶解から保護されていて、そのため当該薬剤又はワクチンを患者の循環系にゆっくりと放出するようにすることによって処方される、薬剤又はワクチンの処方方法。
【請求項１８】
可溶性ガラス製ミクロスフェアを調製するステップが、スプレードライ、空気乾燥、真空乾燥、エマルジョン凝固、沈殿化又は溶融化、及び微粉末に粉砕することからなる群から選ばれたステップを含む請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記微粉末が、ペルフルオロカーボンである生体適合性無水液に懸濁させている請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記ペルフルオロカーボンが、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロデカリン、ペルフルオロオクタン、ペルフルオロフェナンスレンからなる群から選ばれる請求項１９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概ね注射薬剤を制御放出する方法に関し、より詳細には注射後の長期間にわたり薬剤やワクチンを循環系に徐放することにより注射薬剤の作用期間又は免疫応答の誘発期間を延ばす、制御放出予防接種に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
保護された記憶免疫応答を生成するためには、現在では長期間にわたり複数回の予防注射が必要である。なぜなら、免疫系は初めて抗原と接触する際には適度に応答するのみで、繰り返し注射する必要があるからである。免疫は、適応プロセス又は学習プロセスであり、それ以降抗原に接触する度により強い抗体応答を引き起こす。応答は抗原の量が増加するのみでなく平均的親和性（抗原に対する抗体の付着又は結合の強度）も強くなる。親和性が増加するのは、高い親和性受容体をもつＢ細胞のみが選択的に誘発されて増殖し、抗原濃度が減少した免疫応答の後段で残存するからである。当然のことであるが、注射後の早い段階では抗原濃度が十分に高く、高親和性の受容体も低親和性の受容体も誘発される。繰り返し抗原を注射する場合、この増殖亢進及び「記憶」細胞としての残存により、特異性抗体を形成するＢリンパ球が極めて多数産生され、その結果、抗体量が増加する。
【０００３】
通常、ジフテリア、破傷風、百日咳（ＤＴＰ）に対する幼児期の予防接種の手順は、生後２カ月で初回ワクチンを投与し、生後４カ月で１回目の追加免疫注射を行い、生後６カ月で２回目の追加免疫注射を行い、１５〜１８カ月でもう一度投与し、推奨される最終投与を４〜６歳で行う（疾病対策予防センター、国家予防接種プログラム）。他のワクチンに対しても同様の手順が採られている。このようなワクチン注射は特に幼児にとって痛みや苦しみを生じ、それゆえ子供の養育者がその後の注射に子供を連れて来ないことがしばしばおきる。その結果、予防接種の手順に支障をきたし子供たちが疾病から適切に保護されなくなる。世界保健機関（ＷＨＯ）は、この遵守不履行が広く発生して大衆予防接種活動を危うくしていると認めていた。（Ｊｏｄａｒ  Ｌ．，Ａｇｕａｄｏ  Ｔ．，Ｌｌｏｙｄ  Ｊ．ａｎｄ  Ｌａｍｂｅｒｔ  Ｐ−Ｈ（１９９８）、「革命的な予防接種（Ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎｉｚｉｎｇ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｓ）」Ｇｅｎ．Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ  １８  ｐ．６．）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
この問題に対処するために、必要な注射回数を減らすための技術開発に相当な努力が払われてきた。その１つの手法が制御放出ワクチンであり、注射する度にその後の長期間ワクチンが循環系に徐放されて、免疫応答の誘発期間が長くなる。現在までの研究のほとんどは、ポリ乳酸／グリコロイドポリマーである生物腐食性プラスチックでミクロスフェアを作り、それでカプセル化した破傷風ワクチンに対するものである［Ｘｉｎｇ  Ｄ．Ｋ．Ｌ．，ＭｃＬｅｌｌａｎ  Ｋ．，Ｃｏｒｂｅｌ  Ｍ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｓｅｓａｒｄｉｃ  Ｄ．（１９９６）「生分解性ミクロスフェアから抽出された破傷風トキソイド抗原の評価（Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｔｅｔａｎｕｓ  ｔｏｘｏｉｄ  ｅｘｔｒａｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）」Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ２４，５７−６５］。注射後に生分解性プラスチックは体液中にゆっくり可溶化し、腐食した疎水性粒子からワクチンが徐々に放出される。しかし、そのワクチンが体内で不安定であることが分かって初期の成果は期待はずれであったが、更に新しい処方によってこれらの問題が解決され、破傷風ワクチンは現在この系でかなりよく機能している。その他の変性しやすいワクチンは、３７℃の体内に入ったプラスチック粒子中で安定ではない。他の制御放出ワクチンが現在使われていないのはこの理由による。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
注射用の安定な液体［（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｎ．Ｎｏ．０９／２７１，２０４「安定な注射液のための組成物と方法（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｔａｂｌｅ  ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  ｌｉｑｕｉｄｓ）」］を開発する過程で、無水オイル中又はペルフルオロカーボン液中に懸濁させた可溶性の糖ガラス製ミクロスフェア中での破傷風ワクチンの安定化処方を研究した。使用した安定化剤は糖アルコールであるマンニトールの可溶性ガラスであり、体内の水分と接触すると直ちに溶解して従来型の初回免疫投与としてワクチンを放出することが期待された。臨床前試験で、安定な液状製剤を１０匹のモルモットのグループに皮下注射した。調製直後（図１）、及びエージング促進処理を３７℃３カ月間して安定性を調べた後（図２）の乾燥ワクチンを試験した。
【０００６】
糖ガラス中で安定化させた乾燥ワクチンのアリコートを注射前に水に溶かして対照として使用し、同時に新鮮な原料ワクチンを標準の生物学的対照ワクチン製剤として使用した。抗体応答は注射の４、８、１２週間後に測定した。
【０００７】
すべての対照ワクチンでは、初回免疫後に抗体価が典型的な動態応答を示し、特に抗体レベルは４〜８週目でピークになり、１２週までに降下することが分かった。しかし、生体適合性無水液に懸濁させたガラス製ミクロスフェア中で安定化されたワクチンを両グループに注射すると、動物内の抗体レベルは注射後１２週間の全期間を通して上昇し続けた。破傷風トキソイドをモルモットに予防接種したときに今まで認められなかったこの結果は、抗体生成の動態にはっきりした変化があることを示していた。標準的なワクチンを繰り返し注射したモルモットの従来の抗体動態解析な結果と比較すると、本研究は抗原が制御放出されることを示していた。本研究では抗体レベルが１２週間目でも上昇していることから、標準的な可溶性ワクチンを多数回注射した後に認められる場合と同じように動物が保護されていることを示していた。
【０００８】
糖ガラスは不安定な生体分子に対して安定な環境を提供するのに有効であることが立証されたが、金属カルボキシレートや類似のガラス（「ガラスの徐放系（Ｓｌｏｗ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｖｉｔｒｅｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）」ＰＣＴ  Ｎｏ  ＷＯ  ９０／１１７５６）、リン酸ガラス（「ホスフェートガラス質セラミックの生物学的及び医学的応用（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｇｌａｓｓ  Ｃｅｒａｍｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ  ４，６９８，３１８）など他の水溶性ガラスは、糖ガラスと組み合わせるか単独でも（不安定生成物の安定化に用いる非晶性ガラス（「Ａｍｏｒｐｈｏｕｓ  ｇｌａｓｓｅｓ  ｆｏｒ  ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）」ＰＣＴ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ＷＯ  ９９／４７１７４）ガラス製ミクロスフェアとして処方でき、この系で使用するのに適した他の望ましい特性を有している。その１つは、水中でそれぞれ異なる溶解速度をもつ塩の混合物から調製することによって、ガラスの溶解速度を前もって決定できるということも含まれる（制御送達装置（「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）」ＵＳ  ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ  ５，２７０，０４８）。
【０００９】
生物適合性のある無水液中の安定な液状組成物は、最初２つの主要な課題、即ち薬剤又はワクチンを冷蔵保存する必要性と、現場で注射前に滅菌水に溶解する必要性を解決するために開発されたものである。この技術によってこうした問題が明らかに克服されているだけでなく、無水液中の組成物によって服薬遵守の問題も解決されるように思われる。本発明においては、便利で容易に注射できる安定なワクチンで、予防接種のすべての過程が一回の注射で賄われる。
【００１０】
安定化されたワクチンを含む可溶解ガラス製ミクロスフェアの幾分かは、無水液に囲まれていることによって体内水分による溶解から保護されていると仮定できる。それらは注射後のある時点で溶解してワクチンを放出し、そのワクチンは追加抗原刺激投与として作用し、実験の１２週間全体を通して抗体のレベルを上昇させる。
【００１１】
可溶抗原に比べ無水液の調製物では、４週間目の平均抗体レベルが低い。ワクチンを無水液の懸濁液として投与したグループでのこの早い時期での低い抗体価は、注射直後に少量の抗原しか放出されない結果であると考えられる。これは免疫開始の遅延の問題を示すものだと主張する人もいるかもしれないが、このような系における抗体の保護レベルは血液１ミリリットル当たり約０．１国際単位である。４週間目のモルモットで認められたレベルは１ミリリットル当たり１国際単位より高く、このような早い時期でもその保護レベルを十分に上回っていた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、オイル、シリコーン液、ペルフルオロカーボンなどの無水液中に懸濁させた可溶性ガラス製ミクロスフェアを用いた制御放出注射の組成物と方法であり、注射後の相当期間にわたりミクロスフェアがゆっくりと制御されつつ溶解し抗原を放出する。
【００１３】
本発明並びにその他の目的をよりよく理解するために、添付した図面と共に以下の記述を参照する。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲に示す。
【００１４】
図１に示した実施形態では、第０日にモルモット１０匹のグループにワクチン０．５ｍｌを注射し、４、８、１２週間後に採血した。第一群には、製造者（Ｍｅｄｅｖａ  ｂａｔｃｈ  Ｔ０２２）からの新鮮な液体ワクチンを動物に注射した。新鮮なワクチンを注射した動物体内の平均抗体価は乾燥ワクチンを注射したグループより高く、乾燥プロトコルによる免疫原性の損失が示唆される。別の１０匹の動物に対して乾燥して糖ガラス製ミクロスフェア粉体に入れたワクチンを直前に再水和して注射し、それを第二群として示した。第三群は、乾燥して糖ガラス製ミクロスフェア粉体に入れたワクチンをスクワラン油０．５ｍｌに懸濁させて注射した動物を示している。第四群は、乾燥して糖ガラス製ミクロスフェア粉体に入れたワクチンをペルフルオロデカリン０．５ｍｌに懸濁させて注射した動物を示している。最後に、第五群ではワクチンを含まない糖ガラス製ミクロスフェア粉体をスクワラン０．５ｍｌに懸濁させて動物に注射し、第六群ではワクチンを含まない糖ガラス製ミクロスフェア粉体をペルフルオロデカリン０．５ｍｌに懸濁させて動物に注射した。水性ワクチンを注射した動物の最初の２つのグループの抗体価が注射後１２週目で低下したのに対し、オイル又はＰＦＣに入れたワクチンを注射したグループの抗体価は１２週目でも低下しなかった。担体組成物のみを注射した動物の第五、第六グループでは抗体応答は全くなかった。
【００１５】
図２に、第０日にワクチン０．５ｍｌを注射し４、８、１２週間後に採血した１０匹のモルモットのグループの平均抗体価を測定した実施形態を示す。第一群では、４℃で３カ月間保存されていた製造者からの新鮮な液体ワクチンを動物に注射した。３７℃３カ月間保存していた製造者からの新鮮な液体ワクチンを別のグループの動物に注射し、それを第二群として示す。第三群は、乾燥して糖ガラス製ミクロスフェア粉体に入れ、３７℃３カ月間保存した直前に再水和したワクチンを注射した動物を示す。第四群は、乾燥して糖ガラス製ミクロスフェア粉体に入れスクワラン０．５ｍｌに懸濁させ、注射前に３７℃３カ月間スクワラン中で保存したワクチンを注射した動物を示している。最後に第五群は、乾燥して糖ガラス製ミクロスフェア粉体に入れペルフルオロデカリン０．５ｍｌに懸濁させ、注射前に３７℃３カ月間ＰＦＣ中で保存したワクチンを注射した動物を示している。この特定の実施形態において、新鮮なワクチンを投与した動物の抗体価は乾燥ワクチンを投与したグループより高く、乾燥プロトコルによる免疫原性の損失が幾分あったことを示している。湿ったまま或いは乾燥して３７℃で保存した水性ワクチンを注射した動物の２つのグループの抗体価は、注射後８及び１２週間目で低下したが、オイル又はＰＦＣ中のワクチンを注射した２つのグループの抗体価は１２週間を通して上昇し続けた。
【００１６】
試験管実験からは、ＰＦＣに懸濁させたガラス製ミクロスフェアからの即時の放出が起こるかもしれないことが示唆されていた。その実験は、水溶性色素（Ｍｏｒｄａｎｔ  Ｂｌｕｅ  ９）を糖ガラス製ミクロスフェアに入れ、１０ｗ／ｖ％でペルフルオロデカリンに懸濁させるものであった。この不透明な濃い青色の懸濁液０．５ｍｌを水１．５ｍｌに加えると、ＰＦＣ懸濁液は試験管の底に沈み、上には透明な水の層ができた。ヴォルテックスで約１分間激しく撹拌した後更に１分間静置すると上部の水層は濃い透明な青色になりＰＦＣ層は無色透明になった。不透明なものが透明になったことで、ＰＦＣ液に懸濁させていた粒子が完溶したことが示された。青色がＰＦＣから水層に移動したことにより、すべての親水性色素が予想通り水に溶解したことも示された。
【実施例１】
【００１７】
ワクチンのモデルとして簡単にアッセイできるタンパク質を使い上記結果を確認する。酵素アルカリホスファターゼを選び、次の水溶液を調製した。
【００１８】
アジュバント級リン酸カルシウム、１０ｗ／ｖ％（Ｓｕｐｅｒｐｈｏｓ  Ｋｅｍｉ  ａ／ｓ）；トレハロース、１０ｗ／ｖ％；ＺｎＣｌ２、１ｍＭ；ＭｇＣｌ２、１ｍＭ；トリス塩酸緩衝液５ｍＭ中のアルカリホスファターゼ２０Ｕ／ｍｌ、ｐＨ７．６。
【００１９】
可溶性のアルカリホスファターゼを不溶性のリン酸カルシウムに吸着させるために、懸濁液を３７℃で１０分間よく撹拌した。懸濁液の少量のアリコートを遠心分離して懸濁液からリン酸カルシウムを沈降させ、上澄液をサンプリングし、ｐ−ニトロフェニルホスフェートを基質とし波長４０５ｎｍで酵素反応速度を測定することにより、吸着量を測定した。残りの懸濁液はスプレー乾燥して微粉末にした。この粉末を再水和した後に酵素の脱着を上記のようにして上澄中で測定した。粉末を２０ｗ／ｖ％でペルフルオロフェナンスレンに懸濁させ、安定な懸濁液が得られることが分かった。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
即ち、酵素の９２％がリン酸カルシウムアジュバントに吸着していた（表１）。結局、トレハロースのガラス製ミクロスフェアに入れＰＦＣに懸濁させた後に、酵素活性のアッセイにより酵素すべてが回収された。これらを、上記青色色素の例と同様に水に再溶解させた。
【００２２】
この実験で、ＰＦＣに懸濁させたガラス製ミクロスフェアは、試験管中で水と混合すると速やかに溶解することが示唆され、これらの調製物が生体中でも同様に抗原を急速に放出するであろうことが示唆された。明らかにこれは正しくない。驚くべきことに、注射後の相当な期間にわたって抗原がゆっくりと制御放出されると思われる。この系における抗原の放出は、フロイント完全アジュバントなど動物で使用するある種のオイル主剤のアジュバントの液体エマルジョンで起きると考えられる放出と類似していた。フロイントアジュバントのミネラルオイル層に分散した抗原溶液の液滴から抗原がゆっくりと漏れ出すことが、この方法で免疫化した動物の体内で免疫応答が大きく増幅される原因と考えられている［Ｆｒｅｕｎｄ  Ｊ．「活性免疫の解釈（Ｓｏｍｅ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）」Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １  ２９１（１９４７）］。無水の生体適合液体に懸濁させた糖ガラス製ミクロスフェア中で安定化された抗原で予防注射した後、類似の結果が得られている。フロイントアジュバントとこの系との主な相違点は、前者が抗原水溶液の液滴をオイルに加えた液体エマルジョンであり、したがって本質的に不安定であるのに対し、後者は安定化された乾燥固体がガラス製ミクロスフェアに入った懸濁液であって、本質的に安定である点である。付言するなら、フロイントアジュバントは激しい痛みを伴うのでヒトに使用するには適さないが［１９７５年１０月６日から１０日までジュネーブで行われた「ＷＨＯ科学グループ会議でのアジュバントの免疫学的報告（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ａ  ＷＨＯ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｇｒｏｕｐ  ｍｅｅｔｉｎｇ）」１９７６］、ここで使用しているＰＦＣ組成物は非毒性である。注射後に即時性及び遅延性の刺激や炎症を起こさない。したがって、単回投与ワクチンとしてヒト特に子供へ使用を展開していくのに理想的であり、刺激性がないのは思いがけない利点であった。可溶性ガラス製ミクロスフェア中で安定化された活性物質の放出をこうした組成によって制御できることは、当然のことながらワクチンに限定されない。多種多様な他の薬剤でも治療上の効果を上げるには繰り返し注射することが必要である。実際、非経口薬剤で単回投与で有効なものは例外的である。各場合において、活性分子が可溶性ガラス中の固溶体から体液内の遊離液中に放出される速度は正確に制御する必要があり、異なる活性分子それぞれで相違するはずである。
【００２３】
多様な無水の生体適合液体がこの系に使用できるが、化学的物理的に高い安定性、無毒性、低い粘度及び表面張力、高い密度をもつことから、ＰＦＣが好ましい。
【００２４】
【表２】
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【００２５】
フッ素化される特定の親炭化水素分子に応じて、多種多様なＰＦＣ液を得ることができる。組織から血流中に吸収され、体内から呼気で排出される速度は、体温でのＰＦＣ蒸気圧の関数である可能性が高い。蒸気圧は、一般に分子量に比例する（表２）。特定のＰＦＣを注意深く選択することで、制御放出速度をかなりの範囲で変えることができる可能性が高い。ＰＦＣ液は互いに混合できるので、ＰＦＣ液の適当な混合液を選択することにより、放出速度を正確に固定することができる。
【００２６】
密度調整剤として使用されるリン酸カルシウムは、水に不溶で、高度に水和した微細コロイド状懸濁液を形成し、これは水溶液からの大量の高分子、特にタンパク質と可逆的に結合することができる。こうした研究で使用される破傷風トキソイドワクチン中に存在する抗原のかなりの部分は、そのワクチンにもともと使用されていた水酸化アルミニウムアジュバントと、密度調整剤として使用されるリン酸カルシウム懸濁液の双方に結合していた。これらの無機コロイドに結合したタンパク質抗原は、動物の研究で見られた持続放出の貯蔵庫として働く。放出グラフでの遅延の程度は、対照としてワクチンを水の懸濁液とした場合より、ＰＦＣ液の懸濁液とした場合の方がはるかに大きいと思われる。このことから非水性ＰＦＣ液が無機コロイドからの放出速度を制御する決定的な要素であることが示唆される。タンパク質が無機コロイドに結合するのではなく、ガラス製ミクロスフェア内の固溶体中で遊離した状態にある場合に、やはりＰＦＣ液からの持続放出が起こるかどうかを立証するには更に実験をする必要があろう。
【００２７】
このような処方物中にリン酸カルシウムを使用することは、糖ガラス製ミクロスフェアの密度をＰＦＣ液と一致させることに加えて、更なる利点がある。骨自体の無機質部分はリン酸カルシウムのヒドロキシアパタイトという形で構成されているので、この添加剤の化学的性質は生体適合性で非毒性である。リン酸カルシウムをこのように注射しても局部的に非毒性で注射部位から徐々に可溶化しかつ／又は最終的にはリンパ節から局所的に排出されて過剰分が残ることはないと考えても差し支えない。
【００２８】
こうしたことが起こる前では、注射部位でのリン酸カルシウムの沈着が免疫化の正のマーカーとして働き、Ｘ線やＭＲＩさらにはおそらく超音波や磁気測定などの医学的造影技術によって検出可能である。免疫を既に受けた患者をはっきりと確認できることは、地域での記録保存が不完全であったり患者自身の免疫履歴の知識が不完全である場合、疾病根絶計画で大変重要になることがある。硫酸バリウム、二酸化チタン、その他の不溶性高密度無機沈殿物、或いはそれらの限定された範囲の混合物など他の密度調整物質で代用することにより、別々の密度調整剤を含む異なるワクチンを、一義的に示すことが可能になるかもしれない。そうなれば、正確な免疫履歴が比較的表層的な医学的造影法又は検出法で検出可能になる可能性がある。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態と思われることについて説明してきたが、本発明の精神から逸脱することなく、本発明に他の様々な変更及び修正を加えることができることが当分野の技術者には理解されよう。本発明の真の範囲に含まれるかかる変更や修正のすべてを特許請求するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】第０日にワクチン０．５ｍｌを注射し、４、８、１２週間後に採血した１０匹のモルモットのグループの平均抗体価を示す図である。
【図２】第０日にワクチン０．５ｍｌを注射し、４、８、１２週間後に採血した１０匹のモルモットのグループの平均抗体価を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年10月14日(2003.10.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体適合性無水液に懸濁されたミクロスフェア中に薬剤を含む医薬品組成物であって、
前記ミクロスフェアは不溶性生物適合性の高密度試薬を、ミクロスフェアの密度がそれらが懸濁されている液の密度に合うような量で含有する上記医薬品組成物。
【請求項２】
前記生体適合性無水液が、ペルフルオロカーボン液である請求項１記載の医薬品組成物。
【請求項３】
前記ミクロスフェアが、高水和リン酸カルシウムゲル及び安定化糖溶液の乾燥混合物を含むガラス製ミクロスフェアである請求項１記載の医薬品組成物。
【請求項４】
前記ガラス製ミクロスフェアが、非還元糖、糖アルコール、金属カルボキシレート及びリン酸ガラスからなる群から選ばれる構成要素を含む請求項３記載の医薬品組成物。
【請求項５】
前記非還元糖が、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオースからなる群から選ばれる構成要素であって、
前記糖アルコールが、マンニトール、アラビニトール、イノシトール、グルシトール、ガラクチトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、グルコピラノシルソルビトール、グルコピラノシルマンニトールからなる群から選ばれる構成要素である、
請求項４記載の医薬品組成物。
【請求項６】
前記薬剤が、ホルモン、鎮痛薬、麻酔薬、麻薬拮抗薬、化学療法剤、免疫抑制剤、免疫調節剤、避妊薬、血管作用薬、抗凝血剤、心臓作用薬、抗炎症薬及び中枢神経作用薬からなる群から選ばれる構成要素である請求項１記載の医薬品組成物。
【請求項７】
前記生体適合性無水液が、無水親水性液、無水疎水性液、無水シリコーン液、無水ペルフルオロカーボンからなる群から選ばれる構成要素である請求項１記載の医薬品組成物。
【請求項８】
前記不溶性生物適合性の高密度試薬が、リン酸カルシウム、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸バリウム、二酸化チタンからなる群から選ばれる請求項３記載の医薬品組成物。
【請求項９】
前記ガラス製ミクロスフェア中の安定化された薬剤の製剤化のために、リン酸カルシウム、トレハロース、塩化亜鉛、塩化マグネシウム、トリス緩衝液の溶液をさらに含む請求項３記載の医薬品組成物。
【請求項１０】
前記溶液をスプレードライして微粉末にした請求項９記載の医薬品組成物。
【請求項１１】
前記粉末をペルフルオロカーボンに懸濁させて安定な懸濁液を調製した請求項１０記載の医薬品組成物。
【請求項１２】
前記ペルフルオロカーボンが、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロデカリン、ペルフルオロオクタン及びペルフルオロフェナントレンからなる群から選ばれる構成要素である請求項１１記載の医薬品組成物。
【請求項１３】
生体適合性無水液に懸濁された糖及びリン酸カルシウムのミクロスフェア中に薬剤を含む請求項１記載の医薬品組成物であって、前記ミクロスフェア中に含有されるリン酸カルシウムの量は、ミクロスフェアの密度がそれらが懸濁されている液の密度に合うような量である上記医薬品組成物。
【請求項１４】
前記生体適合性無水液が、ペルフルオロカーボン液である請求項１３記載の医薬品組成物。
【請求項１５】
有効量で投与したときに作用期間を長くするように薬剤を処方する方法であって、
前記薬剤を、高水和リン酸カルシウムゲル及び安定化糖溶液の混合物を乾燥して形成された、糖及びリン酸カルシウムのガラス製ミクロスフェアに導入し、及び
前記ガラス製ミクロスフェアを生体適合性無水液に懸濁させ、前記ガラス製ミクロスフェアの密度が前記溶液の密度に合うようにし、それによって当該薬剤を患者の循環系にゆっくりと放出することができる、
上記方法。
【請求項１６】
前記生体適合性無水液が、ペルフルオロカーボン液である請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
スプレードライ、空気乾燥、真空乾燥、エマルジョン凝固、沈殿化又は溶融化、及び微粉末に粉砕することをさらに含む請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記微粉末が、ペルフルオロカーボンであって当該粉末に密度が合っている生体適合性無水液に懸濁させている請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記ペルフルオロカーボンが、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロデカリン、ペルフルオロオクタン及びペルフルオロフェナンスレンからなる群から選ばれる構成要素を含む請求項１８記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
すべての対照ワクチンでは、初回免疫後に抗体価が典型的な動態応答を示し、特に抗体レベルは４〜８週目でピークになり、１２週までに降下することが分かった。しかし、生体適合性無水液に懸濁させた、糖及びリン酸カルシウムのガラス製ミクロスフェア中で安定化されたワクチンを両グループに注射すると、動物内の抗体レベルは注射後１２週間の全期間を通して上昇し続けた。破傷風トキソイドをモルモットに予防接種したときに今まで認められなかったこの結果は、抗体生成の動態にはっきりした変化があることを示していた。標準的なワクチンを繰り返し注射したモルモットの従来の抗体動態解析な結果と比較すると、本研究は抗原が制御放出されることを示していた。本研究では抗体レベルが１２週間目でも上昇していることから、標準的な可溶性ワクチンを多数回注射した後に認められる場合と同じように動物が保護されていることを示していた。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
糖ガラス（例えば、スクロース、トレハロース、ラフィノース及びスタキオースなどの非還元糖、並びに、マンニトール、アラビニトール、イノシトール、グルシトール、ガラクチトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、グルコピラノシルソルビトール及びグルコピラノシルマンニトールなどの糖アルコール）は不安定な生体分子に対して安定な環境を提供するのに有効であることが立証されたが、他の水溶性ガラス（「ガラスの徐放系（Ｓｌｏｗ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｖｉｔｒｅｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）」ＰＣＴ  Ｎｏ  ＷＯ  ９０／１１７５６）及びリン酸ガラス（「ホスフェートガラス質セラミックの生物学的及び医学的応用（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｇｌａｓｓ  Ｃｅｒａｍｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ  ４，６９８，３１８）は、糖ガラスと組み合わせるか単独でも（不安定生成物の安定化に用いる非晶性ガラス（「Ａｍｏｒｐｈｏｕｓ  ｇｌａｓｓｅｓ  ｆｏｒ  ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）」ＰＣＴ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ＷＯ  ９９／４７１７４）ガラス製ミクロスフェアとして処方でき、この系で使用するのに適した他の望ましい特性を有している。その１つは、水中でそれぞれ異なる溶解速度をもつ塩の混合物から調製することによって、ガラスの溶解速度を前もって決定できるということも含まれる（制御送達装置（「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）」ＵＳ  ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ  ５，２７０，０４８）。上記に引用された破傷風トキソイドワクチンにおいて、ガラス製ミクロスフェアの密度と、それらが懸濁されているペルフルオロカーボン液の密度とを合わせるのに使用されたリン酸カルシウムは高水和ゲルであってもよく、その結果、リン酸及び糖ガラスのガラスをこれらのミクロスフェア中に生成させる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
この実験で、ＰＦＣに懸濁させたガラス製ミクロスフェアは、試験管中で水と混合すると速やかに溶解することが示唆され、これらの調製物が生体中でも同様に抗原を急速に放出するであろうことが示唆された。明らかにこれは正しくない。驚くべきことに、注射後の相当な期間にわたって抗原がゆっくりと制御放出されると思われる。この系における抗原の放出は、フロイント完全アジュバントなど動物で使用するある種のオイル主剤のアジュバントの液体エマルジョンで起きると考えられる放出と類似していた。フロイントアジュバントのミネラルオイル層に分散した抗原溶液の液滴から抗原がゆっくりと漏れ出すことが、この方法で免疫化した動物の体内で免疫応答が大きく増幅される原因と考えられている［Ｆｒｅｕｎｄ  Ｊ．「活性免疫の解釈（Ｓｏｍｅ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）」Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １  ２９１（１９４７）］。無水の生体適合液体に懸濁させた糖ガラス製ミクロスフェア中で安定化された抗原で予防注射した後、類似の結果が得られている。フロイントアジュバントとこの系との主な相違点は、前者が抗原水溶液の液滴をオイルに加えた液体エマルジョンであり、したがって本質的に不安定であるのに対し、後者は安定化された乾燥固体がガラス製ミクロスフェアに入った懸濁液であって、本質的に安定である点である。付言するなら、フロイントアジュバントは激しい痛みを伴うのでヒトに使用するには適さないが［１９７５年１０月６日から１０日までジュネーブで行われた「ＷＨＯ科学グループ会議でのアジュバントの免疫学的報告（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ａ  ＷＨＯ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｇｒｏｕｐ  ｍｅｅｔｉｎｇ）」１９７６］、ここで使用しているＰＦＣ組成物は非毒性である。注射後に即時性及び遅延性の刺激や炎症を起こさない。したがって、単回投与ワクチンとしてヒト特に子供へ使用を展開していくのに理想的であり、刺激性がないのは思いがけない利点であった。可溶性ガラス製ミクロスフェア中で安定化された活性物質の放出をこうした組成によって制御できることは、当然のことながらワクチンに限定されない。多種多様な他の薬剤でも治療上の効果を上げるには繰り返し注射することが必要である。実際、非経口薬剤で単回投与で有効なものは例外的である。各場合において、活性分子が可溶性ガラス中の固溶体から体液内の遊離液中に放出される速度は正確に制御する必要があり、異なる活性分子それぞれで相違するはずである。
その他の薬剤には、ホルモン、鎮痛薬、麻酔薬、麻薬拮抗薬、化学療法剤、免疫抑制剤、成長及び分化の調節剤及び因子、免疫調節剤、避妊薬、血管作用薬、抗凝血剤、心臓作用薬、抗炎症薬及び中枢神経作用薬がある。組成物及び使用方法は同様に、ワクチン、例えばトキシン、トキソイド、生存又は死滅バクテリア、生存又は死滅ウイルス、生存又は死滅原生動物、組換えタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、多糖、リポタンパク質、脂質、及び組換えペプチド又は合成ペプチドに適している。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
密度調整剤として使用されるリン酸カルシウムは、水に不溶で、高度に水和した微細コロイド状懸濁液として形成され、これは水溶液からの大量の高分子、特にタンパク質と可逆的に結合することができる。こうした研究で使用される破傷風トキソイドワクチン中に存在する抗原のかなりの部分は、そのワクチンにもともと使用されていた水酸化アルミニウムアジュバントと、密度調整剤として使用されるリン酸カルシウム懸濁液の双方に結合していた。これらの無機コロイドに結合したタンパク質抗原は、ガラス状構成分としてガラス製ミクロスフェア中に導入されるが、動物の研究で見られた持続放出の貯蔵庫として働く。放出グラフでの遅延の程度は、対照としてワクチンを水の懸濁液とした場合より、ＰＦＣ液の懸濁液とした場合の方がはるかに大きいと思われる。このことから非水性ＰＦＣ液が無機コロイドからの放出速度を制御する決定的な要素であることが示唆される。タンパク質が無機コロイドに結合するのではなく、ガラス製ミクロスフェア内の固溶体中で遊離した状態にある場合に、やはりＰＦＣ液からの持続放出が起こるかどうかを立証するには更に実験をする必要があろう。
選択的な密度適合試薬は、他の不溶性生体適合性の高密度化合物、例えばリン酸カルシウム、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸バリウム及び二酸化チタンである。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
このような処方物中にリン酸カルシウムを使用することは、糖ガラス製ミクロスフェアの密度をＰＦＣ液と一致させることに加えて、更なる利点がある。そのリン酸カルシウムからの高水和コロイドにおいて、安定化糖との乾燥で混合された高密度ガラスが形成され、分散した不溶性の高密度粒子を含有することなく均一である。骨自体の無機質部分はリン酸カルシウムのヒドロキシアパタイトという形で構成されているので、この添加剤の化学的性質は生体適合性で非毒性である。リン酸カルシウムをこのように注射しても局部的に非毒性で注射部位から徐々に可溶化しかつ／又は最終的にはリンパ節から局所的に排出されて過剰分が残ることはないと考えても差し支えない。




【国際調査報告】
2004522764.tif 000028
2004522764.tif 000029