(57)【要約】潜在性アンチトロンビンＩＩＩの製造方法が提供される。その方法は、硫酸イオンおよびグッド（Ｇｏｏｄ）の両性イオン緩衝液から選択される緩衝液の存在下での固有のアンチトロンビンＩＩＩの溶液のインキュベーションを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
硫酸イオンおよびグッド（Ｇｏｏｄ）の両性イオン緩衝液から選択される緩衝液の存在下での固有のアンチトロンビンＩＩＩの溶液のインキュベーションを含む、潜在性アンチトロンビンＩＩＩの製造方法。
【請求項２】
前記硫酸イオンが、硫酸アンモニウム、アルカリ金属硫酸塩、およびアルカリ土類硫酸塩から選択される塩として供給される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記硫酸塩が硫酸アンモニウムである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記硫酸イオンの濃度が０．５−２．０Ｍの範囲内である、請求項１−３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
硫酸イオン濃度が０．７−１Ｍの範囲内である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
硫酸イオン濃度が０．８−０．９Ｍの範囲内である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記緩衝液がＨＥＰＥＳ緩衝液を含む、請求項１−６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記緩衝液の濃度が１−２５ｍＭの範囲内である、請求項１−７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
緩衝液濃度が２．５−１０ｍＭの範囲内である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
緩衝液濃度が４−６ｍＭの範囲内である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ｐＨ値が６−９の範囲内である、請求項１−１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ｐＨ値が７−８の範囲内である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ｐＨ値が７．４−７．６の範囲内である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
病原菌、特に、ウイルスおよびプリオンの不活性化または除去のための処理を更に含む、請求項１−１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
固有のアンチトロンビンＩＩＩが、病原菌、特に、ウイルスおよびプリオンの不活性化または除去のために処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記処理が、化学的不活性化、熱不活性化、光不活性化、マイクロ波不活性化、およびナノ濾過除去から選択される方法の１つまたは組み合わせを含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、潜在性（ｌａｔｅｎｔ）アンチトロンビンＩＩＩの製造方法に関する。
【０００２】
発明の背景
アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ）は、総分子量５８．１ｋＤａの血漿糖蛋白質であり（レビング（Ｌｅｂｉｎｇ）ら、Ｖｏｘ Ｓａｎｇ． ６７、１１７−１２４、１９９４）、凝固カスケード中でセリンプロテアーゼを阻害するため、凝血の制御において、主要な役割を果たす。アンチトロンビンＩＩＩは、ＩＸａ、Ｘａ、ＸＩ、およびＸＩＩａ因子、ならびにトロンビンの阻害物質である。よって、ＡＴは、凝血カスケードの異なる段階において、凝血塊形成を制御する。血液中のＡＴ含有量の小さな変化は、血栓塞栓症の危険性の増加に関連する。ＡＴの濃縮物は、後天性または遺伝性アンチトロンビン欠乏を有する患者において、血栓塞栓性疾患の予防および治療に使用される。また、人体の多くの他のプロセスにおいて、例えば、血管形成および炎症反応において、ＡＴが効用を有することが報告されている。これらの生理学的プロセスにおけるＡＴの効用は、完全には理解されていない。
【０００３】
ワルデル（Ｗａｒｄｅｌｌ）ら（バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） ３６、１３１３３−１３１４２、１９９７）によって最初に特徴付けられた、特別な状態のアンチトロンビンＩＩＩは、潜在型（Ｌ−ＡＴ）として知られている。Ｌ−ＡＴおよび選択的にエラスターゼ切断された変異体が、強い抗血管形成活性を有すること、さらに、ヒト神経芽細胞腫細胞系を皮下注射されたマウスにおいて、腫瘍成長を抑制することが示された（オレイリー（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２８５、１９２６−１９２８、１９９９、およびＷＯ ００／２００２６）。従って、Ｌ−ＡＴは、潜在的なヒトの抗がん剤と考えられるはずである。しかし、この潜在的薬剤の臨床評価は、まだ行われていない。
【０００４】
アフィニティークロマトグラフィーによるＡＴの精製は、当分野で知られているように、固相結合リガンドとして、精製ヘパリンを用いて行われる。ミラー−アンダーセン（Ｍｉｌｌｅｒ−Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ）ら（トロンボシス・リサーチ（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ） ５、４３９−４５２、１９７４）には、ヒトＡＴを精製するためにヘパリン−セファロースを使用することが開示されている。このクロマトグラフィーシステムは、ＡＴとＬ−ＡＴとの分離のためにも有用であり、ここでは、チャン（Ｃｈａｎｇ）およびハーパー（（Ｈａｒｐｅｒ）（トロンボシス・アンド・ヘモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ） ７７、３２３−３２８、１９９７）によって記載されているように、ＡＴに対してＬ−ＡＴに対するヘパリンのアフィニティーが減少することにより、２つの成分を分けることが可能になる。疎水性相互作用クロマトグラフィーは、固有の（ｎａｔｉｖｅ）状態のＡＴと潜在型（ｌａｔｅｎｔ ｆｏｒｍ）のＡＴとの分離のために使用された（カールソン（Ｋａｒｌｓｓｏｎ）、Ｇおよびウインゲ（Ｗｉｎｇｅ）、Ｓ． （２００１） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ． ２１：１４９−１５５）。
【０００５】
潜在型ＡＴの誘導は、あらかじめ、ワルデル（Ｗａｒｄｅｌｌ）ら（上記）に記載されているように行われ、彼らは、１５時間、６０℃で、０．２５Ｍのクエン酸塩、１０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．４、の中で、ＡＴをインキュベートすることによって、５０−６０％のＬ−ＡＴを得た。
【０００６】
６０℃において、培地または緩衝液のみの中で、固有のアンチトロンビンＩＩＩをインキュベートする際に、重合した蛋白質の凝集体が形成されることがある。これらの凝集体の存在は、潜在性アンチトロンビンＩＩＩの高い収率には不利であり、できるだけ回避すべきである。
【０００７】
そこで、本発明の目的は、固有の（ｎａｔｉｖｅ）アンチトロンビンＩＩＩ、ＡＴ、の溶液から、潜在性（ｌａｔｅｎｔ）アンチトロンビンＩＩＩ、Ｌ−ＡＴを製造するための方法であって、従来技術の方法より高い収率で所望の生成物を与える方法を提供することである。
【０００８】
本発明の更なる目的は、ＡＴからのＬ−ＡＴの製造方法であって、ＡＴ重合物の凝集体の生成を最小限に保つ方法を提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、ＡＴをＬ−ＡＴへ転換するための、そのような方法であって、通常入手可能な薬剤および緩衝溶液が使用され、かつ、インビトロで行われる方法を提供することである。
【００１０】
本発明の更に別の目的は、ＡＴからＬ−ＡＴを製造するための方法であって、Ｌ−ＡＴの工業的製造のために、容易にスケールアップされる方法を提供することである。
【００１１】
発明の要約
本発明の上記の目的および他の目的は、請求項に規定された方法によって達成される。従って、硫酸イオンおよびグッド（Ｇｏｏｄ）の両性イオン緩衝液から選択される緩衝液の存在下での固有のアンチトロンビンＩＩＩの溶液のインキュベーションを含む方法が提供される。驚くべきことに、これらのインキュベーション条件により、従来技術の方法（特に、ワルデル（Ｗａｒｄｅｌｌ）らのクエン酸塩条件）で得られるものより、はるかに高い収率で、工程からＬ−ＡＴを回収することができ、一方、可能性がある凝集の問題が回避されることが見出された。
【００１２】
図面の説明
図１：０−２Ｍの塩化ナトリウム勾配を用いたアンチトロンビンのヘパリンアフィニティークロマトグラフィー（５−６０分）。蛋白質の注入量は、試料Ａ−Ｂに対して１００μｇ、試料Ｃ−Ｄに対して１５０μｇであった。加熱処理をしなかった対照のＡＴ試料Ａ以外（実施例では試料７）のすべての試料を、６０℃で１６時間インキュベートした。試料Ｂ（実施例では試料６）は、ワルデル（Ｗａｒｄｅｌｌ）によって、即ち、０．５Ｍのクエン酸塩中で、インキュベートした。試料Ｃ（実施例では試料２）およびＤ（実施例では試料１）は、それぞれ、０．９Ｍと０．８Ｍの硫酸アンモニウムを含む、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４の中で、インキュベートした。２２分で溶出した、低アフィニティーヘパリン結合ピークの積分により、試料Ｂ、Ｃ、およびＤそれぞれに対して、全積分領域の４４％、７１％、および８９％が得られた。
【００１３】
図２：１２．５％のポリアクリルアミドを含む均質なゲルを用いた、アンチトロンビン試料の固有の電気泳動。試料の量は、１レーン当たり蛋白質０．５μｇであり、操作後、ゲルを銀で染色した。レーン７以外のすべての試料を、６０℃で１６時間インキュベートした。
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すべてのレーン番号は、下記実施例に記載の試料番号に対応する。
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明は、その固有の状態のアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴと呼ぶ）の溶液から開始する、潜在性アンチトロンビン（Ｌ−ＡＴと呼ぶ）の製造方法を提供する。ＡＴは、記載したようなヘパリン−セファロースクロマトグラフィーによって、血液血漿から単離され得る。本発明によれば、その後、ＡＴは、硫酸イオンおよび緩衝液の存在下でインキュベートされる。インキュベーションの温度および時間は、当業者によって容易に決定され得るが、約６０℃で約１６時間のような、通常の低温殺菌条件が、良好に作用することがわかった。
【００１５】
硫酸イオンは、好ましくは硫酸塩の状態で供給される。ここでは、アルカリ金属硫酸塩、アルカリ土類硫酸塩、または硫酸アンモニウムの使用が好ましい。硫酸アンモニウムを使用することが、特に好ましい。本発明による方法において適当な硫酸イオン濃度は、０．５−２．０Ｍの範囲であり、好ましくは０．７−１Ｍの範囲であり、０．８−０．９Ｍの間の濃度が最も好ましい。
【００１６】
インキュベーション混合物の別の成分は、グッドの（Ｇｏｏｄ）の両性イオン緩衝液から選ばれる緩衝液である（グッド（Ｇｏｏｄ）ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） ５、４６７−４７７、１９６６）。本発明の方法において、示されているどの緩衝液を使用するかは、過度の実験なしに、緩衝液が以下の要件の大部分またはすべてを満たすべきであるという点に留意して、決定され得る：それは、約６−約９の間のｐＫａ値を示し、水中で最大溶解度を示し、かつ、他の溶媒中で最小溶解度を示すべきであり、最小の塩効果をもたらすべきであり、使用される実験条件において安定であるべきであり、かつ、可視または紫外スペクトル領域において、（分光測光を妨げないように）光を吸収しないべきである。ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、およびＰＩＰＥＳのような緩衝液を含むグッド（Ｇｏｏｄ）の両性イオン緩衝液は、典型的には、所望の特徴を示す。本発明による方法では、ＨＥＰＥＳを使用することが特に好ましい。広範に使用されているトリス緩衝液は、本発明の目的には適当ではない。好ましい緩衝液濃度は、ある程度、選択される緩衝液に依存するが、典型的には、１−２５ｍＭの範囲にあり、より好ましくは２．５−１０ｍＭ、最も好ましくは４−６ｍＭの範囲にある。
【００１７】
上記のように、インキュベーション反応のｐＨは、ｐＨ６−ｐＨ９の間にあるべきであり、好ましくはｐＨ７−ｐＨ８の間、最も好ましくはｐＨ７．４−ｐＨ７．６の間にあるべきである。
【００１８】
先に概略を述べた条件下でのＡＴのインキュベーションの後、残りのＡＴからこうして得られたＬ−ＡＴの分離が、好ましくは、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーを用いて行われる。Ｌ−ＡＴは、ＡＴよりも低いヘパリンに対する結合アフィニティーを示し、かなり早く溶出し、そして、２つの形のアンチトロンビンＩＩＩの容易な分離を可能にする。
【００１９】
こうして得られたＬ−ＡＴの調製物は、特に、ウイルスおよびプリオンである病原菌の不活性化または除去のための処理に付されることが有利である。これは、当分野で既知の不活性化または除去のための数種の方法の１つを用いるか、またはそのような方法を組み合わせて用いる方法のどの段階でも行うことができる。そのような方法の例には、化学的不活性化、熱不活性化、光不活性化、マイクロ波不活性化、およびナノ濾過除去が含まれる。ＷＯ９６／００２３７に記載されているような、高塩濃度のデッドエンド濾過工程単独または他の工程との組み合わせは、特に好ましい。病原菌の除去および不活性化は、アンチトロンビンＩＩＩ分子が、固有の状態である場合に、Ｌ−ＡＴへの転換前に行うこともできる。
【００２０】
【実施例】
本発明は、以下の非限定的な実施例により、更に説明される。
実施例
９５％超のＡＴ純度の実験用試料を、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ストークホルム（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ）、スエーデンの血漿生成物から得た。この試料を、既知の方法（ミラー−アンダーセン（Ｍｉｌｌｅｒ−Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ）ら、上記）によって調製し、潜在型アンチトロンビンの誘導のために使用した。
【００２１】
Ｌ−ＡＴの調製
ＡＴの実験用試料を、以下の溶液に移した：
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【００２２】
上記のすべての緩衝液を、室温で、所望のｐＨに調整した；１ＭのＨＣｌを、試料６の調整のために使用し、一方、１Ｍの水酸化ナトリウムを、他のすべての試料のｐＨ調整のために使用した。
【００２３】
ＡＴを、最終濃度６ｍｇ／ｍｌで、６０℃で１６時間、ガラス管中の溶液（試料１−１３）中でインキュベートし（冷蔵庫中で約８℃に保った試料７以外）、小型ゲル濾過カラム（ＮＡＰ−５ アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）、スエーデン）を用いて、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、５０ ｍＭ 塩化ナトリウムを含む、ｐＨ ７．４の溶液へ移した。
【００２４】
試料中のＬ−ＡＴの形成を、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーによって分析し、凝集体の存在を、固有の電気泳動によって分析した。
【００２５】
ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー
この方法は、チャン（Ｃｈａｎｇ）およびハーパー（Ｈａｒｐｅｒ）（上記）に基づいて行われた。ＴＳＫヘパリン（登録商標）（トーソーハース（Ｔｏｓｏｈａａｓ）、シュトゥットガルト（Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ）、ドイツ、７．５ ｉ．ｄ． ｘ ７５ ｍｍ、１０ μｍ、１０００ Å）を具備したＨＰＬＣを使用した。溶出バッファーは、２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ ７．４（緩衝液Ａ）および２Ｍの塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ ７．４（緩衝液Ｂ）であった。線形勾配をかけた（０％ Ｂを０−５分、０−１００％ Ｂを５−６０分、０％ Ｂを６０−９０分）。流速は０．４ｍｌ／ｍｉｎであり、２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって検出を行った。
【００２６】
固有のポリアクリルアミドゲル電気泳動
１２．５％のポリアクリルアミド均質ファスト（Ｐｈａｓｔ）（登録商標）ゲル（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）、スエーデン）を用いて、推奨されている運転パラメーターを用いて、電気泳動を行った。各レーンに、０．５μｇの蛋白質を含む１μｌを載せた。５０％のエタノール、１０％の酢酸および４０％の水を含む、わずかに強い固定溶液を用いた以外は、ファルマシア＆アップジョーン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎ）（ファストシステム（Ｐｈａｓｔ Ｓｙｓｔｅｍ）？、テクニカルノート（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｎｏｔｅ） Ｎｏ ２、ファストゲル？分離培地による二次元電気泳動（Ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｗｉｔｈ ＰｈａｓｔＧｅｌ？ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａ）、ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジーＡＢ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＡＢ）、ウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）、スエーデン）からのパンフレットに従って、ジアミノ銀染色を行った。
【００２７】
アンチトロンビン活性
ハンデランド（Ｈａｎｄｅｌａｎｄ）ら（Ｓｃａｎｄ Ｊ． Ｈａｅｍａｔｏｌ． ３１、４２７−４３６、１９８３）に従って、トロンビン発色性ペプチド基質（Ｓ−２２３８）（クロモゲニックス（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）、モルンダル（Ｍｏｌｎｄａｌ）、スエーデン）を用いて、試料２（０．９Ｍの硫酸アンモニウム中でインキュベーション）を、生物学的ＡＴ活性に関して分析した。検定溶液は、トロンビン、ヘパリン、発色性基質、および試料からなり、かつ、インキュベーション後の応答を、４０５ｎｍでの吸光度における変化として記録した。
【００２８】
結果
ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーにより、３９分（約０．９Ｍの塩化ナトリウム）で固有のＡＴが溶出し、メインの潜在型のピークが、２２分（約０．３Ｍの塩化ナトリウム）で溶出した（図１Ａ−１Ｂ）。低ヘパリン結合ピークの積分により、ワルデル（Ｗａｒｄｅｌｌ）の方法によって調製された試料（試料６）について、４４％の収率が示されたのに対し（図１Ｂ）、０．９Ｍおよび０．８Ｍの硫酸アンモニウム中でのインキュベーション（それぞれ試料２および１）により、それぞれ、全積分領域の７１％および８９％が得られた（図１Ｃ−１Ｄ）。表１は、さらに高い（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）濃度の硫酸アンモニウム／ＨＥＰＥＳまたはより高いｐＨ値において、形成されるＬ−ＡＴの割合が減少することを示す。
【００２９】
リン酸塩／ＮａＣｌ中で６０℃でインキュベートされたＡＴの固有の（ｎａｔｉｖｅ）電気泳動（試料８）により、凝集体が強く形成され、わずかな蛋白質だけが、単量体の状態で残った（図２、レーン８）。ワルデル（Ｗａｒｄｅｌｌ）に従ってインキュベートされたＡＴ（図２、レーン６）、ならびに、インキュベートされなかったＡＴ（図２、レーン７）は、凝集体を与えなかった。０．５Ｍの硫酸アンモニウムにおけるインキュベーション（試料１０）は、強い凝集をもたらし（図２、レーン１０）、一方、０．８Ｍ（試料１）は、わずかな凝集体のみを与えた（図２、レーン１）。０．９−２．０Ｍの濃度の硫酸アンモニウム（試料２−５）からは、目に見える凝集体は得られなかった（図２、レーン２−５）。ｐＨ７．０では、多数の凝集体が観察され（図２、レーン１２）、一方、ｐＨ７．８では、より少量の凝集体が得られた（データ１は示していない）。
【００３０】
試料２におけるアンチトロンビン活性検定（０．９Ｍの硫酸アンモニウムを使用）により、残存した、本来の特異的活性の３４％が示された；これは、アフィニティークロマトグラフィーによる同じ試料の分析における、高アフィニティーヘパリン結合ＡＴの２９％の収率と比較されるべきである（表１）。
【００３１】
【表１】
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１実施例による
＊固有の電気泳動によって分析した場合に目に見える凝集体なし（図２参照）
【００３２】
実験の結論
０．８Ｍまたは０．９Ｍの硫酸アンモニウムを含む５ｍＭのＨＥＰＥＳ中での６０℃における１６時間のＡＴのインキュベーションにより、それぞれ、約８５−９０％および７０−７５％のＡＴが、潜在型に転換された。固有の電気泳動は、硫酸アンモニウム０．８Ｍにおいて、少量の凝集体を示し、０．９Ｍでは、目に見える凝集体を示さなかった。精製工程において、そのような少量の凝集体を、ゲル濾過または類似の技術によって、容易に除去することができる。
【００３３】
硫酸アンモニウムを用いる、ＡＴのＬ−ＡＴへの転換に最適な濃度は、０．８−０．９Ｍである。０．７−１Ｍの間での転換での、良好な結果が得られ、０．５−２Ｍの間でも、良好な結果が得られる場合がある。Ｌ−ＡＴの形成のためには、７．４付近のｐＨで、０．５−２．０Ｍ、好ましくは０．８−０．９Ｍの硫酸アンモニウム、および、２５ｍＭまでの、好ましくは１０ｍＭ以下のＨＥＰＥＳを用いる方法が、最も好ましい結果を与えることがわかった。硫酸アンモニウム／ＨＥＰＥＳの濃度が増加するか、または、ｐＨ値が高くなると、形成されたＬ−ＡＴの割合が減少するであろう。また、凝集体の形成を防止するためには、低すぎる硫酸アンモニウム濃度または低すぎるｐＨ値を用いないことが必要である。
【図面の簡単な説明】
【図１】０−２Ｍの塩化ナトリウム勾配を用いたアンチトロンビンのヘパリンアフィニティークロマトグラフィー（５−６０分）。
【図２】１２．５％のポリアクリルアミドを含む均質なゲルを用いた、アンチトロンビン試料の固有の電気泳動。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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