(57)【要約】本発明は、日常的で再現性良く金属錯体を検出および定量するための高速液体クロマトグラフ分析方法に関する。この方法は、金属錯体含有溶液をカラムに装填し、カラムから該金属錯体を移動相で溶離し、ここで、該移動相は溶媒系中で配位アニオンの過剰の塩を含んでなり、金属錯体を検出器で検出する、ことを含んでなる。カラムから錯体を移動相で溶離すると、配位アニオン（適格性配位子）が金属上で有効な配位部位のために存在する他の全ての可能性ある配位子を打ち負かす金属錯体を生じる。本発明の方法に用いられる金属錯体は、異なった金属錯体、または同じ金属錯体の立体異性体であってよい。本発明の高速液体クロマトグラフ分析方法は、同一金属錯体のジアステレオマーの分離に好適である。更に、本発明は、金属錯体の光学異性体を分離するキラル高速液体クロマトグラフ分析方法も提供する。このキラル高速液体クロマトグラフ分析方法では、金属錯体の光学異性体の分離を達成するためにキラルカラムが用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属錯体含有溶液をカラムに装填し、ここで、該金属
錯体はスーパーオキシドジスムターゼ擬似化合物、ＭＲＩ造影向上剤、カタラーゼ擬似剤、およびペルオキシ亜硝酸分解触媒よりなる群から選ばれ、
カラムから該金属錯体を移動相で溶離し、ここで、該移動相は溶媒系中で配位アニオンの過剰の塩を含んでなり、
金属錯体を検出器で検出する、
ことを含んでなる高速液体クロマトグラフ分析方法。
【請求項２】
金属錯体が、スーパーオキシドジスムターゼ擬似化合物を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
金属錯体が、別の金属錯体を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
金属錯体が、同じ錯体の立体異性体を含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
金属錯体が、同じ錯体のジアステレオマーを含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
金属錯体が、同じ錯体の鏡像体を含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
金属錯体が、反応ストリームの生成物を含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
金属錯体が、ＦｅＩＩＩ（salen）錯体、ＦｅＩＩ（１，４，７，１０，１３−ペンタアザシクロペンタデカン）誘導体、ＦｅＩＩＩ（ポルフィリナート）錯体、ＭｎＩＩＩ（ポルフィリナート）錯体、ＭｎＩＩＩ（salen）錯体、およびＭｎＩＩ（１，４，７，１０，１３−ペンタアザシクロペンタデカン）錯体よりなる群から選ばれる請求項１に記載の方法。
【請求項９】
金属錯体が、ＭｎＩＩＩ（ポルフィリナート）錯体、ＭｎＩＩＩ（salen）錯体、およびＭｎＩＩ（１，４，７，１０，１３−ペンタアザシクロペンタデカン）錯体よりなる群から選ばれる請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
金属錯体が、ＭｎＩＩ（１，４，７，１０，１３−ペンタアザシクロペンタデカン）錯体を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
金属錯体が、ＭｎＩＩ（１，４，７，１０，１３−ペンタアザシクロペンタデカン）錯体の立体異性体を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
金属錯体が、以下の構造：
【化１】
2004522971.tif 000018
を有する金属錯体の立体異性体を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
金属錯体が、ＭｎＩＩ（１，４，７，１０，１３−ペンタアザシクロペンタデカン）錯体のジアステレオマーを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
金属錯体が、ＭｎＩＩ（１，４，７，１０，１３−ペンタアザシクロペンタデカン）錯体の鏡像体を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
鏡像体が、以下の構造：
【化２】
2004522971.tif 000019
および
【化３】
2004522971.tif 000020
から選ばれる請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
配位アニオンが、クロリドアニオン、チオシアナートアニオン、ステアレートアニオン、アセテートアニオン、トリフルオロアセテートアニオン、カルボキシレートアニオン、ホルメートアニオンまたはアジドアニオンを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
塩が、塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、テトラブチルアンモニウムクロリド、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸アンモニウム、チオシアン酸リチウム、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、アンモニウムトリフルオロアセテート、酢酸リチウム、ギ酸カリウム、ギ酸ナトリウム、ギ酸アンモニウム、ギ酸リチウム、シアン酸ナトリウム、シアン酸カリウム、シアン酸アンモニウム、カルボン酸カリウム、カルボン酸ナトリウム、ステアリン酸リチウム、ステアリン酸ナトリウム、アジ化ナトリウム、アジ化カリウムまたはアジ化リチウムを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
塩が、塩化ナトリウム、塩化リチウムまたはテトラブチルアンモニウムクロリドを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
塩が、チオシアン酸アンモニウム、チオシアン酸ナトリウムまたはチオシアン酸カリウムを含む請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
塩が、塩混合物を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
塩混合物が、塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、テトラブチルアンモニウムクロリド、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸アンモニウム、チオシアン酸リチウム、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、アンモニウムトリフルオロアセテート、酢酸リチウム、ギ酸カリウム、ギ酸ナトリウム、ギ酸アンモニウム、ギ酸リチウム、シアン酸ナトリウム、シアン酸カリウム、シアン酸アンモニウム、カルボン酸カリウム、カルボン酸ナトリウム、ステアリン酸リチウム、ステアリン酸ナトリウム、アジ化ナトリウム、アジ化カリウム、またはアジ化リチウムの２つ以上を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２２】
溶媒系が、一溶媒を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
溶媒が、アセトニトリル、ジオキサン、エタノール,メタノール,イソプロパノール,テトラヒドロフラン、または水を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
溶媒系が、溶媒混合物を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
溶媒混合物が、アセトニトリル、ジオキサン、エタノール、メタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、および水の中の２以上の混合物を含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
溶媒が、アセトニトリルおよび水を含む請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
溶媒が、メタノールおよび水を含む請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
塩が、移動相中に約０．００４Ｍ〜約６Ｍの濃度で存在する請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
塩が、移動相中に約０．１Ｍ〜約１Ｍの濃度で存在する請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
塩が、移動相中に約０．１５Ｍ〜約０．６Ｍの濃度で存在する請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
塩化ナトリウムが、移動相中に約０．１Ｍ〜約１Ｍの濃度で存在する請求項１８に記載の方法。
【請求項３２】
塩化ナトリウムが、移動相中に約０．３Ｍ〜約０．７Ｍの濃度で存在する請求項１８に記載の方法。
【請求項３３】
塩化ナトリウムが、移動相中に約０．４Ｍ〜約０．６Ｍの濃度で存在する請求項１８に記載の方法。
【請求項３４】
テトラブチルアンモニウムクロリドが、移動相中に約０．００５Ｍ〜約０．１５Ｍの濃度で存在する請求項１８に記載の方法。
【請求項３５】
テトラブチルアンモニウムクロリドが、移動相中に約０．０１Ｍ〜約０．１３Ｍの濃度で存在する請求項１８に記載の方法。
【請求項３６】
テトラブチルアンモニウムクロリドが、移動相中に約０．０５Ｍ〜０．１２５Ｍの濃度で存在する請求項１８に記載の方法。
【請求項３７】
移動相が、約０．１Ｍ〜約０．７Ｍの塩を含有する水中アセトニトリルを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
移動相が、約０．１５Ｍ〜約０．６Ｍの塩を含有する水中メタノールを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
移動相が、約０．３Ｍ〜約０．７Ｍの塩化ナトリウムを含有するアセトニトリルを含む請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
移動相が、約０．０１Ｍ〜約０．１３Ｍのテトラブチルアンモニウムクロリドを含有する水中アセトニトリルを５〜１５％含む請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
移動相が、約０．０１Ｍ〜約０．１３Ｍのテトラブチルアンモニウムクロリドおよび約０．３Ｍ〜約０．７Ｍの塩化リチウムを含有する水中アセトニトリルを５〜１５％含む請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
移動相が、約０．４Ｍ〜約０．６Ｍの塩化ナトリウムを含有する水中アセトニトリルを５〜１０％含む請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
移動相が、約０．０５Ｍ〜約０．１２５Ｍのテトラブチルアンモニウムクロリドを含有する水中アセトニトリルを５〜１０％含む請求項１に記載の方法。
【請求項４４】
移動相が、約０．０５Ｍ〜約０．１２５Ｍのテトラブチルアンモニウムクロリドおよび約０．４Ｍ〜約０．６Ｍの塩化リチウムを含有する水中アセトニトリルを５〜１０％含む請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
移動相が、約０．１Ｍ〜約２．５Ｍのチオシアン酸アンモニウムを含有する水中メタノールを１〜５％含む請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
移動相が、約０．０５Ｍ〜約０．３Ｍのテトラブチルアンモニウムクロリドを含有する水中メタノールを１〜５％含む請求項１に記載の方法。
【請求項４７】
移動相が、約０．２Ｍ〜約０．３Ｍのチオシアン酸アンモニウムを含有する水中メタノールを１〜５％含む請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
移動相が、約０．０５Ｍ〜０．１５Ｍのテトラブチルアンモニウムクロリドを含有する水中メタノールを１〜５％含む請求項１に記載の方法。
【請求項４９】
カラムが、Ｃ１変性カラム、Ｃ３変性カラム、Ｃ４変性カラム、オクチル（Ｃ８）変性カラム、オクタデシル（Ｃ１８）変性カラム、Ｃ１８ポリマーカラム、フェニルカラム、およびアミノ−シアノカラムよりなる群から選ばれる請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
カラムが、オクタデシルカラム、フェニルカラム、およびアミノ−シアノカラムよりなる群から選ばれる請求項１に記載の方法。
【請求項５１】
カラムが、オクタデシルカラムを含む請求項１に記載の方法。
【請求項５２】
オクタデシルカラムが、YMC ODS-AQ S5 カラム（登録商標）、Vydac column（登録商標）、またはSymmetry Shield RP18 カラム（登録商標）を含む請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
カラムが、キラルカラムを含む請求項１に記載の方法。
【請求項５４】
キラルカラムが、セルロースカラムまたはPirkleカラムを含む請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
セルロースカラムが、Chiralcel-OD-RHカラム（登録商標）を含む請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
検出器が、ＵＶ検出器を含む請求項１に記載の方法。
【請求項５７】
金属錯体含有溶液をカラムに装填し、ここで、該金属錯体はスーパーオキシドジスムターゼ擬似化合物、ＭＲＩ造影向上剤、カタラーゼ擬似剤、およびペルオキシ亜硝酸分解触媒よりなる群から選ばれ、
カラムから該金属錯体を移動相で溶離し、ここで、該移動相は溶媒系中で配位アニオンの過剰の塩を含んでなり、移動相での溶離により配位子として配位アニオンを含有する金属錯体の実質的な形成が促進され、
金属錯体を検出器で検出する、
ことを含んでなる高速液体クロマトグラフ分析方法。
【請求項５８】
金属錯体が、スーパーオキシドジスムターゼ擬似化合物を含む請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
金属錯体が、ＦｅＩＩＩ（salen）錯体、ＦｅＩＩ（１，４，７，１０，１３−ペンタアザシクロペンタデカン）誘導体、ＦｅＩＩＩ（ポルフィリナート）錯体、ＭｎＩＩＩ（ポルフィリナート）錯体、ＭｎＩＩＩ（salen）錯体、およびＭｎＩＩ（１，４，７，１０，１３−ペンタアザシクロペンタデカン）錯体よりなる群から選ばれる請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
金属錯体が、ＭｎＩＩ（１，４，７，１０，１３−ペンタアザシクロペンタデカン）錯体を含む請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
金属錯体が、ＭｎＩＩ（１，４，７，１０，１３−ペンタアザシクロペンタデカン）錯体の立体異性体を含む請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
金属錯体が、下記構造：
【化４】
2004522971.tif 000021
を有する金属錯体の立体異性体を含む請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
塩が、塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、テトラブチルアンモニウムクロリド、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸アンモニウム、チオシアン酸リチウム、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、アンモニウムトリフルオロアセテート、酢酸リチウム、ギ酸カリウム、ギ酸ナトリウム、ギ酸アンモニウム、ギ酸リチウム、シアン酸ナトリウム、シアン酸カリウム、シアン酸アンモニウム、カルボン酸カリウム、カルボン酸ナトリウム、ステアリン酸リチウム、ステアリン酸ナトリウム、アジ化ナトリウム、アジ化カリウム、またはアジ化リチウムを含む請求項５７に記載の方法。
【請求項６４】
塩が、塩化ナトリウム、塩化リチウムまたはテトラブチルアンモニウムクロリド、チオシアン酸アンモニウムまたはチオシアン酸カリウムを含む請求項５７に記載の方法。
【請求項６５】
塩が、移動相中に約０．１Ｍ〜約１Ｍの濃度で存在する請求項５７に記載の方法。
【請求項６６】
塩が、移動相中に約０．１５Ｍ〜約０．６Ｍの濃度で存在する請求項５７に記載の方法。
【請求項６７】
カラムが、キラルカラムを含む請求項５７に記載の方法。
【請求項６８】
金属錯体含有溶液をカラムに装填し、ここで、該金属錯体はマンガン錯体および鉄錯体よりなる群から選ばれ、
カラムから該金属錯体を移動相で溶離し、ここで、該移動相は溶媒系中で配位アニオンの過剰の塩を含んでなり、
金属錯体を検出器で検出する、
ことを含んでなる高速液体クロマトグラフ分析方法。
【請求項６９】
金属錯体が、スーパーオキシドジスムターゼ擬似化合物、ＭＲＩ造影向上剤、カタラーゼ擬似剤、およびペルオキシ亜硝酸分解触媒よりなる群から選ばれる請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
金属錯体が、スーパーオキシドジスムターゼ擬似化合物を含む請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
金属錯体が、ＦｅＩＩＩ（salen）錯体、ＦｅＩＩ（１，４，７，１０，１３−ペンタアザシクロペンタデカン）誘導体、ＦｅＩＩＩ（ポルフィリナート）錯体、ＭｎＩＩＩ（ポルフィリナート）錯体、ＭｎＩＩＩ（salen）錯体、およびＭｎＩＩ（１，４，７，１０，１３−ペンタアザシクロペンタデカン）錯体よりなる群から選ばれる請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
金属錯体が、ＭｎＩＩＩ（ポルフィリナート）錯体、ＭｎＩＩＩ（salen）錯体、およびＭｎＩＩ（１，４，７，１０，１３−ペンタアザシクロペンタデカン）錯体よりなる群から選ばれる請求項６８に記載の方法。
【請求項７３】
金属錯体が、ＭｎＩＩ（１，４，７，１０，１３−ペンタアザシクロペンタデカン）錯体を含む請求項６８に記載の方法。
【請求項７４】
金属錯体が、ＭｎＩＩ（１，４，７，１０，１３−ペンタアザシクロペンタデカン）錯体の立体異性体を含む請求項６８に記載の方法。
【請求項７５】
金属錯体が、下記構造：
【化５】
2004522971.tif 000022
を有する金属錯体の立体異性体を含む請求項６８に記載の方法。
【請求項７６】
塩が、塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、テトラブチルアンモニウムクロリド、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸アンモニウム、チオシアン酸リチウム、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、アンモニウムトリフルオロアセテート、酢酸リチウム、ギ酸カリウム、ギ酸ナトリウム、ギ酸アンモニウム、ギ酸リチウム、シアン酸ナトリウム、シアン酸カリウム、シアン酸アンモニウム、カルボン酸カリウム、カルボン酸ナトリウム、ステアリン酸リチウム、ステアリン酸ナトリウム、アジ化ナトリウム、アジ化カリウム、またはアジ化リチウムを含む請求項６８に記載の方法。
【請求項７７】
塩が、塩化ナトリウム、塩化リチウム、テトラブチルアンモニウムクロリド、チオシアン酸ナトリウムまたはチオシアン酸カリウムを含む請求項６８に記載の方法。
【請求項７８】
塩が、移動相中に約０．１Ｍ〜約１．０Ｍの濃度で存在する請求項６８に記載の方法。
【請求項７９】
塩が、移動相中に約０．１５Ｍ〜約０．６Ｍの濃度で存在する請求項６８に記載の方法。
【請求項８０】
金属錯体を、配位アニオンの過剰の塩と水溶液中で化合させ、
金属錯体含有溶液をカラムに装填し、
カラムから該金属錯体を移動相で溶離し、ここで、該移動相は溶媒系中で配位アニオンの過剰の塩を含んでなり、
金属錯体を検出器で検出する、
ことを含んでなる金属錯体分析用の高速液体クロマトグラフ分析方法。
【請求項８１】
塩が、塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、テトラブチルアンモニウムクロリド、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸アンモニウム、チオシアン酸リチウム、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、アンモニウムトリフルオロアセテート、酢酸リチウム、ギ酸カリウム、ギ酸ナトリウム、ギ酸アンモニウム、ギ酸リチウム、シアン酸ナトリウム、シアン酸カリウム、シアン酸アンモニウム、カルボン酸カリウム、カルボン酸ナトリウム、ステアリン酸リチウム、ステアリン酸ナトリウム、アジ化ナトリウム、アジ化カリウム、またはアジ化リチウムを含む請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
塩が、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸アンモニウム、またはチオシアン酸リチウムを含む請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
金属錯体が、スーパーオキシドジスムターゼ擬似化合物、カタラーゼ擬似剤、ペルオキシ亜硝酸分解触媒、およびＭＲＩ造影剤よりなる群から選ばれる請求項８０に記載の方法。
【請求項８４】
金属錯体が、スーパーオキシドジスムターゼ擬似化合物を含む請求項８０に記載の方法。
【請求項８５】
金属錯体が、ＦｅＩＩＩ（salen）錯体、ＦｅＩＩ（１，４，７，１０，１３−ペンタアザシクロペンタデカン）誘導体、ＦｅＩＩＩ（ポルフィリナート）錯体、ＭｎＩＩＩ（ポルフィリナート）錯体、ＭｎＩＩＩ（salen）錯体、およびＭｎＩＩ（１，４，７，１０，１３−ペンタアザシクロペンタデカン）錯体よりなる群から選ばれる請求項８０に記載の方法。
【請求項８６】
金属錯体が、ＭｎＩＩ（１，４，７，１０，１３−ペンタアザシクロペンタデカン）錯体を含む請求項８０に記載の方法。
【請求項８７】
金属錯体含有溶液をカラムに装填し、
カラムから該金属錯体を移動相で溶離し、ここで、該移動相は溶媒系中で配位アニオンの過剰の塩を含んでなり、移動相での溶離により配位子として配位アニオンを含有する金属錯体の実質的な形成が促進され、
金属錯体を検出器で検出する、
ことを含んでなる高速液体クロマトグラフ分析方法。
【請求項８８】
金属錯体が、スーパーオキシドジスムターゼ擬似化合物、ＭＲＩ造影向上剤、カタラーゼ擬似剤、およびペルオキシ亜硝酸分解触媒よりなる群から選ばれる請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
金属錯体が、ＦｅＩＩＩ（salen）錯体、ＦｅＩＩ（１，４，７，１０，１３−ペンタアザシクロペンタデカン）錯体、ＦｅＩＩＩ（ポルフィリナート）錯体、ＭｎＩＩＩ（ポルフィリナート）錯体、ＭｎＩＩＩ（salen）錯体、およびＭｎＩＩ（１，４，７，１０，１３−ペンタアザシクロペンタデカン）錯体よりなる群から選ばれる請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
金属錯体が、下記構造：
【化６】
2004522971.tif 000023
を有する請求項８７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤および診断用途において有用性のある、金属錯体の分析的な検出および定量のための高速液体クロマトグラフ分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）酵素は、分子酸素の一電子還元生成物である遊離基スーパーオキシドの不均化を触媒する酵素である。遊離基スーパーオキシドの不均化は、分子酸素のこの一電子還元生成物を非ラジカルの分子酸素へ転換することに関わる。スーパーオキシドジスムターゼ酵素は、Ｃｕ／Ｚｎ、Ｆｅ、またはＭｎのいずれかを活性部位に有する酸化還元酵素の一類である。スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）擬似化合物は、スーパーオキシドジスムターゼ酵素の天然酵素機能を模倣する低分子量触媒である。このように、スーパーオキシドジスムターゼ擬似化合物はまた、スーパーオキシドの酸素および過酸化水素への転換を触媒し、多くの疾病や疾患における組織病理の一因になると信じられている有害な生物学的に生成したスーパーオキシド種を即座に排出する。このような疾病や疾患には、心筋梗塞或いは脳卒中などの後に起こる再潅流症、関節炎などのような炎症性疾患、およびパーキンソン病などのような神経疾患が含まれる。Chem Reviews, 1999 vol 99, No. 9, 2573-2587。
【０００３】
スーパーオキシドジスムターゼ擬似化合物は、有害なスーパーオキシドを不均化する能力を維持しながらも、安定性、活性および体内分布を高めるためにその化学特性を変更できる点で、スーパーオキシドジスムターゼ酵素自体より、いくつか利点がある。スーパーオキシドジスムターゼ擬似化合物は大きな注目の的となり、また、これを再潅流傷害、虚血性心筋、虚血後の神経障害、炎症、臓器移植および放射線障害を含む広範な疾病や疾患の治療用の治療剤として開発しようとする多大な努力の焦点となった。目下、治療剤として開発されつつあるスーパーオキシドジスムターゼ擬似剤の多くは、合成による低分子量でマンガンベースのスーパーオキシドジスムターゼ擬似化合物である。Chem Reviews, 2576。
【０００４】
スーパーオキシドジスムターゼ擬似化合物は、その金属が軸配位子に配位し得る金属錯体である。そのような金属錯体には、限定されるものではないが、金属ＭｎおよびＦｅの錯体が包含される。金属ＭｎおよびＦｅの錯体の多くはスーパーオキシドジスムターゼ活性を有さないが、治療上および診断上の用途に適用し得る特性を有している。このような治療および診断用途には、ＭＲＩ造影向上剤、ペルオキシ亜硝酸分解触媒、およびカタラーゼ擬似剤が含まれる。しかし、これらの金属錯体は、置換可能な配位子に配位可能な金属を有する構造上の類似性を共にしている。これらの金属錯体は、種々の配位子が怒り得る種類の混合物として水中に存在する。そのような混合物の実例は、Ｍ４０４０３により与えられるが、これはスキーム１に示されたように、窒素を含有する１５員の大環状配位子のＭｎ（ＩＩ）錯体である。この金属錯体の一形態はジクロロ錯体であり、水に溶解すると別の形態が生じ、そこではクロリドアニオンの一つが直ちに金属から解離して［Ｍｎ（Ｃｌ）（aquo）］＋錯体を生じる。水性溶媒系または潜在的なドナー原子を有する任意の溶媒における問題点は、錯体のＭｎ（ＩＩ）イオンへ軸方向に配位可能な種々の潜在的な配位子があることである。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって金属錯体を有する試料の分析を行う際、スキーム１に示されたような種々の錯体種が存在するためクロマトグラムは非常にブロードで未分離となる傾向がある。この現象により、標準的なＨＰＬＣ技術による金属錯体の同定と定量が極めて困難となる。従って、種々の疾患および診断剤治療において、金属錯体役割を治療学として開発する観点から、金属錯体を分析するための効果的で実効性のある高速液体クロマトグラフ分析方法に対する大きな必要性が存在する。
【化１】
2004522971.tif 000002
【０００５】
存在している更なる複雑さは、金属錯体の酸安定性の問題である。ｐＨが低下するに従って、錯体がプロトン化し不安定性に直面する速度が高まる。このことは、ＨＰＬＣを金属錯体の検出と定量の手段として用いることに対する特定の問題を提示している。なぜなら、逆相ＨＰＬＣに使用される移動相は、しばしば有機媒体と水との混合物をトリフルオロ酢酸と様々に組合せて含有するからである。トリフルオロ酢酸は、通例約０．１〜約０．５重量％の間で存在する。トリフルオロ酢酸が存在すると、錯体が解離する原因となる。この解離は、純度の解縛試験に使用されるそのような任意手法の可能性を打ち消してしまう。更に、トリフルオロ酢酸アニオンは、一部のトリフルオロアセテート錯体の形成を引き起こし、この錯体はクロロ錯体からの保持時間が異なり得るため、クロマトグラフ分析が混乱してしまう。このように、配位子置換の現象は金属錯体の酸不安定性と相まって、ＨＰＬＣを用いて金属錯体を検出、定量する取り組みに大きな難題を与えている。これらの課題と必要性は、驚くべきことに後述する本発明によって解決された。
【０００６】
分析的なＨＰＬＣは、化合物の同定、定量および分析に関する情報を含む試料化合物についての情報を得るための強力な手法である。ＨＰＬＣは特に、より大きな化合物の分析および液体クロマトグラフィーが不適当である無機イオンの分析のために特に用いられてきた。Skoog, D.A., West, M.A., Analytical Chemistry, 1986, p. 520。分析ツールとして、ＨＰＬＣは対象の特定化合物が固定相と移動相（溶媒は連続的にカラムへ適用される）に対する親和性の相違を活用するものである。固定相よりも移動相との相互作用が強い化合物は、カラムからの溶出がより速く、従って保持時間がより短くなる。対象化合物と固定相の相互作用を操作する目的で、移動相は変更され得る。順相ＨＰＬＣでは、固定相はシリカなどのように極性があり、移動相はヘキサンまたはイソプロピルエーテルなどのような無極性の溶媒である。逆相ＨＰＬＣでは、固定相は無極性で、しばしば炭化水素であり、移動相は比較的に極性の溶媒である。逆相充填材が市販されるようになった１９７４年以来、逆相ＨＰＬＣの適用数が成長し、逆相ＨＰＬＣは今や最も広く使用されているＨＰＬＣの種類である。逆相ＨＰＬＣの人気は、広範な種類の有機化合物を分離する能力によるものであり得る。逆相クロマトグラフィーは、反応混合物の同族化合物を分離するのに特に有用であり、従って、反応によって生成した種々の化合物を決定するための有用な分析ツールである。
【０００７】
無極性の固定相を創造するために、シリカまたは合成ポリマーベースの吸着剤が炭化水素で変性される。最も普及している結合相は、Ｃ１、Ｃ４、Ｃ８およびＣ１８である。トリメチルクロロシラン（Ｃ１）およびブチルジメチルクロロシラン（Ｃ４）で変性されたシリカベースの吸着剤は、ＨＰＬＣにおいて主にタンパク質分離または精製に関しある程度の適用がある。これらの吸着剤は大きな極性相互作用を示す。オクチル（Ｃ８）およびオクタデシル（Ｃ１８）変性の吸着剤は、最も広く用いられるシリカベース吸着剤であり、全てのＨＰＬＣ分離のほぼ８０％はこれらの吸着剤で開発された。
【０００８】
逆相ＨＰＬＣにおける最重要のパラメータは、移動相である。ＨＰＬＣに使用される移動相のタイプは、試料中の検体の保持特性に大きな影響を有することになり、移動相の組成を変更するとクロマトグラフ分析者が混合物中の対象化合物の保持時間を所望の値に調節することになる。この能力は、ＨＰＬＣ法に柔軟性を与える。逆相クロマトグラフィーにおける移動相は極性がある必要があり、また、検体分子にとっての吸着部位に合理的な競争を与える必要もある。逆相ＨＰＬＣ中の溶離成分として通常使用される溶媒は、アセトニトリル、ジオキサン、エタノール、メタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、および水である。高分子量の生物学的化合物の逆相ＨＰＬＣでは、溶媒アセトニトリル、イソプロパノールまたはプロパノールが最も頻繁に用いられる。分解能改良のための普及した移動相への添加剤には、リン酸とアミンと全フッ素置換カルボン酸、とりわけトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の混合物が含まれる。
【０００９】
ＨＰＬＣは特定の対象化合物が固定相および移動相に対して有する親和性の相違を利用する。その物理特性の相違に基づき化合物を分離するために、この現象を利用し得る。このようにして、ＨＰＬＣは、立体異性体、ジアステレオマー、光学異性体、鏡像立体異性体、および不純物を分離するために用い得る。立体異性体は、その原子が間隙を介して配向している点のみで互いに相違する分子である。特別な立体異性体を特徴付ける原子の特定配置は、その光学的立体配置として知られ、既知の順序付け規則、例えば、＋または−のいずれか（ＤまたはＬ）および／またはＲまたはＳにより知られている。立体異性体は一般に光学異性体またはジアステレオマーの２タイプに分類される。光学異性体は、互いに鏡像関係の立体異性体である。光学異性体は、更に、相互に重ね合わすことのできない鏡像立体異性体と、相互に重ね合わすことのできる鏡像立体異性体に分類し得る。相互に重ね合わすことのできる鏡像立体異性体はメソ化合物として知られる。ジアステレオマーは、互いに鏡像関係にない立体異性体である。ジアステレオマーは、異なる物理特性、例えば融点、沸点、所定溶媒への溶解性、密度、屈折率などを有する。ジアステレオマーは、通常、従来法、例えば分溜、分別晶出、またはＨＰＬＣを含むクロマトグラフィーによって、難なく互いに分離が可能である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、光学異性体は、その物理特性が同一であるが故に特別な難題を提示する。これらは一般的には、特にラセミ混合物の形態の場合には、従来法によって分離できない。例えば、これらは、その沸点が同一であるが故に分溜によって分離できず、また、その溶解性が同一であるが故に分別晶出によって分離することができない（溶媒が光学活性でなければ）。これらは、吸着剤上で等しく保持されるが故にＨＰＬＣのような従来のクロマトグラフィーによって分離することもできない（吸着剤が光学活性でなければ）。対掌性の固定相を用いたＨＰＬＣ法は、光学異性体の分離に対する極めて一般的なアプローチである。立体異性体のラセミ混合物の分離が可能であるためには、不斉相が異性体の一つとジアステレオマー錯体を形成する必要があり、または他のタイプの立体特異性相互作用を有する必要がある。不斉認識の正確なメカニズムは未だ完全には理解されていない。逆相ＨＰＬＣでは、通常タイプの不斉結合相は不斉空孔相である。
【００１１】
ジアステレオマーと光学異性体をＨＰＬＣによって分離し得る能力は、合成スキームの成功を評価する有用な能力である。生成物試料の光学異性純度を評価する手法として立体異性体を分離するのが望ましいことがしばしばある。ここに列挙された全ての文献は、ここに言及することによって完全に明細書中へ組み込まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、日常的で再現性良く金属錯体を検出および定量するための高速液体クロマトグラフ分析方法を指向するものである。この方法は、金属錯体含有溶液をカラムに装填し、カラムから該金属錯体を移動相で溶離し、ここで、該移動相は溶媒系中で配位アニオンの過剰の塩を含んでなり、金属錯体を検出器で検出する、ことを含んでなる。カラムから錯体を移動相で溶離すると、配位アニオン（適格性配位子）が金属上で有効な配位部位のために存在する他の全ての可能性ある配位子を打ち負かす金属錯体を生じる。このように、この配位子の役割は、質量作用の原理により、全ての有効な配位子部位を占有し、一つの化学種（one species）を創作することである。本発明の方法に用いられる金属錯体は種々の金属錯体であり得、または同じ金属錯体の立体異性体であってよい。このように、本発明のＨＰＬＣ法は、同じ金属錯体のジアステレオマーの分離に好適である。
【００１３】
本発明の別の態様は、金属錯体の光学異性体を分離するためのキラルＨＰＬＣ法を指向するものである。このキラルＨＰＬＣ法では、金属錯体の光学異性体分離を達成するため、キラルカラムが用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、方法１を用いたＭ４０４０３のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２】図２は、方法２を用いたＭ４０４０３のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３】図３は、方法３を用いたＭ４０４０３のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３ａ】図３ａは、方法３を用いたＭ４０４０３および関連化合物のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４】図４は、方法４を用いたＭ４０４０３のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４ａ】図４ａは、方法４を用いたＭ４０４０３および関連化合物のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５】図５は、方法１を用いたＭ４０４０１のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図６】図６は、種々のＮａＣｌでのＭ４０４０１のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図７】図７は、方法２を用いたＭ４０４０１のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図８】図８は、方法３を用いたＭ４０４０１のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図９】図９は、方法４を用いたＭ４０４０１のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図９ａ】図９ａは、Ｍ４０４０１と関連化合物との混合物のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１０】図１０は、ホルメートアニオンを用いたＭ４０４０３−（ＨＣＯＯ−）２のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１１】図１１は、アセテートアニオンを用いたＭ４０４０３−（ＣＨ３ＣＯＯ−）２のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１２】図１２は、Ｍ４０４０３のジアステレオマーのＨＰＬＣ分析である。
【図１３】図１３は、Ｍ４０４０３およびＭ４０４１９ビス（チオシアナート）光学異性体のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の方法は、金属錯体の金属上で配位子部位に結合することになる過剰の配位対イオンを移動相に与える。金属錯体を含有する溶液をカラム上に充填し、金属錯体を移動相で溶出する。過剰の対イオンを含有させることによって、移動相で溶出する間に単一化学種を生じるよう反応を推進し、その結果、ただ単一化学種の配位子、すなわち対イオン、を金属錯体の金属に結合させ、金属の配位子結合部位の全て或いは実質的に全てをこの一つの対イオンで占有する。単一化学種の形成をスキーム２に示す。存在する金属錯体の単一化学種を形成すると、他の錯体化学種の干渉を受けずに、金属錯体を検出器によって信頼性良く検出できる。この検出がもたらすクロマトグラム上のピークは、実施例１（伝統的な移動相）および実施例２（過剰の配位アニオン塩を含有する移動相）で実証されるように、伝統的な移動相を用いた際のクロマトグラム分析法から得られるものよりシャープで分解が良い。
【００１６】
【化２】2004522971.tif 000003
【００１７】
単座配位子に配位可能な金属を有する任意の金属錯体を、本発明において用いることができる。このような金属錯体の具体例には、限定されるものではないが、金属ＭｎおよびＦｅの錯体が含まれる。本発明の金属錯体は、治療および診断の用途を有することが好ましい。このような治療および診断用途には、限定されるものではないが、スーパーオキシドジスムターゼ擬似化合物、ＭＲＩ造影向上剤、ペルオキシ亜硝酸分解触媒、およびカタラーゼ擬似剤としての使用が含まれる。本発明での使用に好ましい金属錯体は、スーパーオキシドジスムターゼ擬似化合物である。このようなスーパーオキシドジスムターゼ擬似化合物の具体例には、限定されるものではないが、金属ＭｎおよびＦｅの下記錯体が含まれる。鉄ベースのスーパーオキシドジスムターゼ擬似には、限定されるものではないが、ＦｅＩＩＩ（salen）錯体、ＦｅＩＩＩ（１，４，７，１０，１３−ペンタアザシクロペンタデカン）誘導体およびＦｅＩＩＩ（ポルフィリナート）錯体が含まれる。マンガンベースのスーパーオキシドジスムターゼ擬似化合物には、限定されるものではないが、マンガン（ＩＩ）またはマンガン（ＩＩＩ）を有する金属錯体が含まれる。マンガンベースのスーパーオキシドジスムターゼ擬似化合物の具体例には、ＭｎＩＩＩ（ポルフィリナート）錯体、ＭｎＩＩＩ（salen）錯体、およびＭｎＩＩ（１，４，７，１０，１３−ペンタアザシクロペンタデカン）誘導体が含まれる。ＭｎＩＩ（１，４，７，１０，１３−ペンタアザシクロペンタデカン）誘導体は、本発明で使用するために更に好ましい。本発明で好ましく用いられるＭｎＩＩ（１，４，７，１０，１３−ペンタアザシクロペンタデカン）誘導体の具体例には、限定されるものではないが、下記のスキーム３に示したようなＭ４０４０３およびＭ４０４０１が含まれる。
【００１８】
更に、全ての上記金属錯体の立体異性体を、本発明の方法において用いることができる。同金属錯体のジアステレオマーもまた、本発明の方法により検出および分離することができる。生成物試料の化学的および光学的純度の評価手段として立体異性体を分離することがしばしば望ましいので、金属錯体は反応ストリームの生成物をも含み得る。上記に言及した任意の金属錯体の光学異性体は、キラルＨＰＬＣ法において、金属錯体の光学異性体の分離のために用いることができる。
【００１９】
【化３】2004522971.tif 000004
【００２０】
該配位子は、金属錯体の金属カチオンに結合する配位アニオンである。配位アニオンは、スーパーオキシドジスムターゼ擬似化合物のための軸配位子として機能し得る。このようなアニオンの具体例には、限定されるものではないが、クロリドアニオン、チオシアナートアニオン、ステアレートアニオン、アセテートアニオン、トリフルオロアセテートアニオン、カルボキシレートアニオン、ホルメートアニオン、またはアジドアニオンが含まれる。好ましいアニオンにはクロリドアニオン、チオシアナートアニオン、およびホルメートアニオンが含まれる。より好ましいアニオンはクロリドアニオンである。本発明のキラルＨＰＬＣの態様におけるより好ましいアニオンはチオシアナートアニオンである。過剰に存在する場合、チオシアナートアニオンは錯体の配位金属、優先的にはクロリドアニオンに結合する。過剰のチオシアナートアニオンにより、スキーム４に示したようにＭ４０４０３およびＭ４０４１９のビス（チオシアナート）錯体が生成する。
【００２１】
【化４】2004522971.tif 000005
【００２２】
アセテートアニオンを配位アニオンとしてＭ４０４０３と共に使用した具体例を下記スキーム５に示す。スキーム６は、ホルメートアニオンを配位アニオンとしてＭ４０４０３と共に使用例を説明したものである。
【００２３】
【化５】2004522971.tif 000006
【００２４】
【化６】2004522971.tif 000007
【００２５】
配位アニオンは、配位アニオンの塩により供給される。クロリドアニオン塩には、限定されるものではないが、塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、またはテトラアルキルアンモニウムクロリドが含まれる。好ましいクロリドアニオン塩には、塩化ナトリウム、塩化リチウムおよびテトラブチルアンモニウムクロリドが含まれる。チオシアナートアニオンの塩には、限定されるものではないが、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸アンモニウム、またはチオシアン酸リチウムが含まれる。チオシアナートアニオンの好ましい塩にはチオシアン酸ナトリウムおよびチオシアン酸カリウムが含まれる。アセテートアニオンの塩には、限定されるものではないが、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、アンモニウムトリフルオロアセテートおよび酢酸リチウムが含まれる。アセテートアニオンの好ましい塩には酢酸アンモニウムが含まれる。ホルメートアニオンの塩には、限定されるものではないが、ギ酸カリウム、ギ酸ナトリウム、ギ酸アンモニウムおよびギ酸リチウムが含まれる。ホルメートアニオンの好ましい塩にはギ酸アンモニウムが含まれる。シアナートアニオンの塩には、限定されるものではないが、シアン酸ナトリウム、シアン酸カリウム、またはシアン酸アンモニウムが含まれる。カルボン酸アニオンの塩には、限定されるものではないが、カルボン酸カリウム、カルボン酸アンモニウムおよびカルボン酸ナトリウムが含まれる。ステアリン酸アニオンの塩には、限定されるものではないが、ステアリン酸リチウムおよびステアリン酸ナトリウムが含まれる。アジドアニオンの塩には、限定されるものではないが、アジ化ナトリウム、アジ化カリウム、およびアジ化リチウムが含まれる。移動相に添加される塩は、これらの塩の任意の混合物であってもよい。具体例には、テトラブチルアンモニウムクロリドと塩化リチウムの混合物が含まれる。
【００２６】
溶媒系は、ＨＰＬＣ法に使用される任意の溶媒を包含し得る。溶媒系は、配位アニオンの塩が溶媒系に溶解し得る限り、単一溶媒または混合溶媒を包含し得る。好適な溶媒の具体例には、限定されるものではないが、アセトニトリル、ジオキサン、エタノール、メタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、および水が含まれる。本発明の全ての態様にとって好ましい溶媒には、アセトニトリル、イソプロパノール、プロパノール、水、およびメタノールが含まれる。より好ましい溶媒は、アセトニトリル、水およびメタノールである。好適な溶媒混合物は、例えば、アセトニトリルと水の混合物、またはメタノールと水の混合物であり得る。本発明のキラルＨＰＬＣの態様にとって、より好ましい溶媒はメタノールである。
【００２７】
過剰の塩および任意にｐH調節用の塩基または酸を含有する溶媒系は、移動相を構成する。移動相の組成は、本発明の方法を成功させるために重要である。配位アニオンの塩の量は、配位アニオンが、金属錯体の金属上の実質的に全て、好ましくは全ての置換可能な配位子結合部位を飽和させるために十分過剰である必要があり、移動相で溶出する間に単一化学種の形成を推進する。単一化学種、すなわち塩の配位アニオンが配位子を構成した錯体、の実質的な形成は、その量の単一化学種であり、移動層中に塩を用いないか不十分量の塩を用いたＨＰＬＣに比べて、クロマトグラムにおいて高い分解能と改善されたピーク形状が得られる。高い分解能と改善されたピーク形状は、実施例２に関する図２のクロマトグラムに例証され、金属錯体が解離することなく現れる必要がある。移動層中に塩を用いないか不十分量の塩を用いたＨＰＬＣによるクロマトグラムの例は、実施例１による図１に示す。
【００２８】
配位アニオンの塩は、移動相中に過剰量で存在する。移動相における塩の濃度は、移動相の組成および用いる塩の特定種に応じて、かなり変化し得る。移動相中の塩濃度の上限は、移動相中の塩の溶解性によって設定される。移動相中の塩濃度の下限は、実質的に配位アニオンのみを配位子として有する金属錯体の形成を引き起こすのに十分な配位アニオン量を与える塩濃度により設定される。移動相中の塩濃度の下限は、少なくとも、化学量論量より大きい。好ましくは、塩は、単一化学種の形成を最大化する濃度で移動相中に存在する。しかし、一般に、移動相中の塩濃度は、約０．００４Ｍ〜約６Ｍの間で変化する。好ましくは、移動相中の塩濃度は、約０．１Ｍ〜約１Ｍの間で変化する。より好ましくは、移動相中の塩濃度は、約０．１５Ｍ〜約０．６Ｍの間で変化する。
【００２９】
これらの範囲は、移動相中に用いる塩の種類に応じて異なる。例えば、移動相中の塩化ナトリウム濃度は約０．１Ｍ〜約１Ｍ  ＮａＣｌで変動する。好ましくは、移動相中の塩化ナトリウム濃度は、約０．３Ｍ〜約０．７Ｍの範囲である。より好ましくは、移動相中の塩化ナトリウム濃度は、約０．４〜約０．６Ｍの範囲である。移動相中の塩化リチウム濃度は、約０．１Ｍ〜約１Ｍ  ＮａＣｌの範囲である。好ましくは、移動相中の塩化リチウム濃度は、約０．３Ｍ〜約０．７Ｍの範囲である。より好ましくは、移動相中の塩化リチウム濃度は、約０．４Ｍ〜約０．６Ｍの範囲である。移動相中のテトラブチルアンモニウムクロリド濃度は、約０．００５Ｍ〜約０．１５Ｍの範囲である。好ましくは、移動相中のテトラブチルアンモニウムクロリド濃度は、約０．０１Ｍ〜約０．１３Ｍの範囲である。より好ましくは、移動相中のテトラブチルアンモニウムクロリド濃度は、約０．０５Ｍ〜約０．１２５Ｍの範囲である。
【００３０】
移動相は、本発明で用いられる金属錯体および本発明で用いられるカラムに適したｐＨを有する必要がある。本発明で用いられる金属錯体に適したｐＨとは、金属錯体が安定なｐＨ、すなわち、金属錯体の解離を引き起こさないｐＨである。本発明の方法に用いられるカラムに適したｐＨとは、カラムが安定で適切に機能するｐＨである。移動相のｐＨは、塩基または酸の添加によって調節し得る。ｐＨ調節の必要性は、使用する特定の金属錯体、使用するカラムの種類および移動相の組成を含む多くのファクターに依存する。このように、移動相のｐＨは、２〜１４のどこでもあり得る。
【００３１】
しかし、本発明の好ましい金属錯体にとっては、ｐＨは６〜８の間が好ましい。ｐＨが６〜８の間であると錯体の解離が最小化される。プロトンを使った錯体解離は、それによって金属錯体がプロトン化し、このプロトン化によって一層容易に解離が進む現象である。その錯体は、低いｐＨ値でよりプロトン化が起こり易い。より好ましくは、移動相のｐＨは約６．０〜約７．５の間である。更に好ましくは、移動相のｐＨは約６．４〜約７．２の間である。移動相のｐＨは、任意の適切な塩基を用いてこのような好ましい値に調節し得る。好適な塩基の具体例には、限定されるものではないが、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カリウム、および水酸化アンモニウムが含まれる。好ましくは、塩基のカチオンが移動相中で塩のカチオンに相当する。例えば、塩化ナトリウムを含有する溶媒系での使用に好適な塩基であれば、水酸化ナトリウムである。同様に、テトラブチルアンモニウムクロリドを含有する移動相での使用に好適な塩基であれば、水酸化アンモニウムである。移動相中の塩基量は、移動相を適切なｐＨに調節するのに要する量である。
【００３２】
このように、好適な移動相の具体例は、約０．１Ｍ〜約０．７Ｍの間の塩を含有しｐＨが約６〜約８の間である水中アセトニトリルである。別の好適な移動相は、約０．１５Ｍ〜約０．６Ｍの間の塩を含有しｐＨが約６〜約８である１〜５％水中メタノールである。好ましい移動相は、約０．３Ｍ〜約０．７Ｍの塩化ナトリウムを含有しｐＨが約６．０〜約７．５であるアセトニトリルである。別の好ましい移動相は、約０．０１Ｍ〜約０．１３Ｍの間のテトラブチルアンモニウムクロリドを含有しｐＨが約６．０〜約７．５の間である５〜１５％水中アセトニトリルである。更に別の好ましい移動相は、約０．０１Ｍ〜約０．１３Ｍの間のテトラブチルアンモニウムクロリドと約０．３Ｍ〜約０．７Ｍの間の塩化リチウムとの混合物を含有しｐＨが約６．０〜約７．５の間である５〜１５％水中アセトニトリルである。
【００３３】
より好ましい移動相は、約０．４Ｍ〜約０．６Ｍの間の塩化ナトリウムを含有しｐＨが約６．４〜約７．２の間である５〜１０％水中アセトニトリルである。別の好ましい移動相は、約０．０５Ｍ〜約０．１２５Ｍの間のテトラブチルアンモニウムクロリドを含有しｐＨが約６．４〜約７．２である５〜１０％水中アセトニトリルである。更に別の好ましい移動相は、約０．０５Ｍ〜約０．１２５Ｍのテトラブチルアンモニウムクロリドと約０．４Ｍ〜約０．６Ｍの間の塩化リチウムとの混合物を含有しｐＨが約６．４〜約７．２である５〜１０％水中アセトニトリルである。
【００３４】
本発明のキラルＨＰＬＣの態様にとって好ましい移動相には、約０．１Ｍ〜約２．５Ｍの間のチオシアン酸アンモニウムを含有する１〜５％水中メタノールが含まれる。別の好ましい移動相は、約０．０５Ｍ〜約０．３Ｍの間のテトラブチルアンモニウムクロリドを含有する１〜５％水中メタノールである。キラルＨＰＬＣの態様にとってより好ましい移動相は、約０．２Ｍ〜約０．３Ｍの間のチオシアン酸アンモニウムを含有する１〜５％水中メタノールである。別のより好ましい移動相は、約０．０５Ｍ〜約０．１５Ｍの間のテトラブチルアンモニウムクロリドを含有する１〜５％水中メタノールである。
【００３５】
分析方法の第１段階では、金属錯体を含有する溶液をカラム上に装填する。装填は、注入または金属錯体含有溶液をカラムに装填する他の好適な手段によって行い得る。好ましくは、金属錯体含有溶液は、注射器を通じた注入によりカラムに装填される。注入の方法は、手動でよいし或いは自動化されていてもよい。注入のための金属錯体の前処理には、幾通りかの方法が存在する。好ましくは、金属錯体を直接、移動相中に溶解する。しかし、金属錯体の溶解性に応じて、金属錯体を溶媒中へ溶解してよく、次いで移動相をそこへ添加してよい。混合ステップを達成する別の方法は、移動相中に存在するのと同じ配位アニオンの塩と一緒に金属錯体を溶媒に溶かし、次いで移動相で希釈することである。金属錯体が溶解し得る好適な溶媒には、メタノール、エタノール、およびプロパノールのような有機溶媒が含まれる。金属錯体を溶解し得る溶媒は、移動相中の溶媒系を構成する溶媒或いは複数溶媒と同じである必要はない。しかし、金属錯体を溶解し得る溶媒は、移動相中の溶媒系を構成する溶媒或いは複数溶媒と同じであることが好ましい。このように、金属錯体含有溶液は移動相、金属錯体を溶解する溶媒、または更に移動相で希釈された金属錯体を溶解する溶媒であり得る。
【００３６】
本発明のキラルＨＰＬＣおよびアキラルＨＰＬＣの両態様の方法における追加的な任意ステップは、金属錯体を移動相と結合させる前に、ただ一種の配位アニオンを配位子として含む金属錯体を形成することである。金属錯体の単一化学種を生じさせるために過剰の配位アニオン塩を金属錯体と水溶液中で結合させることによって、単一化学種が形成される。過剰の配位アニオン塩を水溶液へ添加した後、溶液を撹拌して均一溶液を形成する。撹拌によって、金属錯体の金属の配位子結合部位の全てを配位アニオンにより占有し単一化学種を形成することを確実とする。撹拌は、均一溶液となるまで、数分から数時間の期間に渡り継続する。例えば、過剰のチオシアン酸カリウムを水中で金属錯体と結合させることによって、ビス（チオシアナート）錯体を金属錯体から形成し得る。得られた溶液または懸濁液を塩化メチレンで抽出すると金属錯体のチオシアナート錯体が生じる。次いで金属錯体は、ビス（チオシアナート）錯体として溶媒系でチオシアナート塩と結合させ得る。
【００３７】
本発明の方法における使用に好適な固定相には、ＨＰＬＣ法に通常使用されるカラムが含まれる。金属錯体を上手く分離することが可能であれば、いかなるＨＰＬＣカラムでも利用し得る。カラムは典型的には直径が２〜５ｍｍの範囲であり、粒度は３〜１０ｍｍの範囲である。好適なカラムの具体例には、Ｃ１変性カラム、Ｃ３変性カラム、Ｃ４変性カラム、オクチル（Ｃ８）変性カラム、オクタデシル（Ｃ１８）変性カラム、Ｃ１８高分子カラム、フェニルカラム、およびアミノ−シアノカラムが含まれる。好ましい種類のカラムには、オクタデシル変性カラム、フェニルカラム、およびアミノ−シアノカラムが含まれる。より好ましい種類のカラムには、オクタデシル変性カラムが含まれる。このような、より好ましいオクタデシル変性カラムには、Waters Corporationから入手可能なYMC ODS-AQ S5カラム（登録商標）、Vydacから入手可能なVydacカラム（登録商標）、およびWaters Corporationから入手可能なSymmetry Shield RP18カラム（登録商標）が含まれる。
【００３８】
本発明のキラルＨＰＬＣの態様では、キラル固定相を用いる必要がある。ＨＰＬＣに利用されるどの種のキラルカラムであっても、金属錯体の光学異性体を上手く分離できる限り、本発明に用いることができる。高速液体クロマトグラフィーに用いるキラルカラムは、本発明において好ましく使用される。上述のように、好ましいカラムは、典型的には直径が２〜５ｍｍの範囲であり、粒度は３〜１０ｍｍの範囲である。好適なキラル固定相の具体例には、セルロースベースのカラムおよびPirkleカラムが含まれる。好ましいキラルカラムは、Chiral Technology から入手可能なChiralcel-OD-RHカラム（登録商標）である。
【００３９】
カラムから錯体を移動相で溶離すると、配位アニオン（適格性配位子）が金属上で有効な配位部位のために存在する他の全ての可能性ある配位子を打ち負かす金属錯体を生じる。特定のクロマトグラフィー実験の目的に合うように、溶離の間に移動相の組成を変更することが可能である。よって、定組成溶離または勾配溶離を本発明の方法で利用できる。移動相は、決められた流速でカラムに通される。これらのファクターを評価し、ＨＰＬＣ法の目的にとって妥当な流速に到達することは、当業者によってなし得る。化合物がカラムから溶離する速度は、金属錯体のカラムへの親和性に対する移動相への親和性に依存する。この速度は同様に、本発明のカラムの種類、移動相の組成、およびカラムを通る移動相の流速に依存する。カラムにとっての適切な流速は、カラムの性質に依存し、それにはカラム長および耐圧性、カラムから溶離されている特定の金属錯体、および移動相の組成が含まれる。一般的には、流速は約０．１〜約１０．０ｍｌ／分の範囲であり得る。好ましい流速は、約０．５〜約３ｍｌ／分の間である。例えば、２５ｃｍのSymmetryShield RP18カラム（登録商標）では、典型的な流速は約０．５〜約２ｍｌ／分の範囲である。好ましい流速は、約０．９〜約１．２ｍｌ／分の間である。長さ５ｃｍのYMC ODS-AQ S5カラム（登録商標）では典型的な流速は、０．５〜４ｍｌ／分の範囲である。YMC ODS-AQ S5カラム（登録商標）での好ましい流速は、２〜３ｍｌ／分の範囲である。
【００４０】
金属錯体をカラムから溶離した後、化合物を検出器により検出する。検出は、ＨＰＬＣ処理の目的に合うよう適切な任意の検出器によって行うことができる。検出は、“オンライン”検出器または“オフライン”検出器によって行ってよい。ここで使用されるような“オンライン”検出器とは、カラムに直接連結して金属錯体をカラムから溶離しながら検出する検出器である。ここで使用されるような“オフライン”検出器とは、カラムには直接連結しないが、金属錯体を回収し手動で検出器へ転送後に検出する検出器である。このように、検出は手動であっても自動化されていてもよい。オンライン検出器は、本発明で好ましく用いられる。金属錯体用に好適な検出器の具体例には、限定されるものではないが、屈折率検出器、放射化学検出器、電気化学検出器、および質量分析検出器が含まれる。紫外・可視吸収検出器は、本発明のクロマトグラム法での使用にとって好ましい種類の検出器である。紫外・可視吸収検出器には、固定波長検出器、可変波長検出器、およびダイオードアレイ検出器が含まれる。固定波長検出器では、一つの波長、典型的には２５４または２６４ｎｍで測定を行う。可変波長検出器では一度に一波長で測定を行うが、ダイオードアレイ検出器では波長スペクトルの測定を同時に行う。固定波長ＵＶ検出器が、本発明において好ましく用いられる。
【００４１】
高速液体クロマトグラフィーの手順は、当業者にとって馴染み深い分析方法として広く用いられている。特定のＨＰＬＣ手順にとっての適切な装置とパラメータを選択し、また、特定の実験目的に合うよう手順を適切に変更することは、当業者によって難なく行われる。本発明のキラルＨＰＬＣ態様ではキラルカラムを利用することを条件として、本発明の各態様の方法は任意のＨＰＬＣマシンで使用され得る。本発明の方法は、溶媒およびカラムの選択に依存して、順相または逆相ＨＰＬＣのいずれかで使用し得る。更に、本発明の方法は、いかなる特定のスケールにも限定されないが、本方法は、高速液体クロマトグラフィーで使用される場合と同様の大きさの金属錯体試料サイズを用いて操作を行うことが好ましい。
【００４２】
このように、本発明の各態様において、存在する金属錯体（または複数の金属錯体）の単一化学種が信頼性良く生成し、その結果、金属錯体の検出および定量を他の錯体の干渉を受けずに行うことが可能なＨＰＬＣ法が提供される。下記の実施例は、説明を意図したものであって、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００４３】
実施例１〜８の実験
薬品、溶媒および原料
検討に用いた全ての溶媒は、ＨＰＬＣグレードまたは相当品であった。全ての薬品は、ＡＣＳ試薬グレードまたは相当品であった。
ＨＰＬＣシステムおよびデータ分析
ＨＰＬＣクロマトグラム分析は、Gilsonシステム（Model 306 ポンプ、Model 155 UV-V 検出器、Model 215 液体ハンドラー、ユニポイントソフトウェア、Win98）、Varianシステム（Model 310 ポンプ、Model 340 UV-V 検出器、Model 410 オートサンプラー Star Workstation、Win98）またはSSIシステム（Acuflowシリーズ IV ポンプ、Acutect 500 UV-V 検出器、Alcott Model 718 オートサンプラー、HP Model 3395 積分器）を用いて行った。
【００４４】
実施例１
方法１を用いたＭ４０４０３のＨＰＬＣ分析
【化７】2004522971.tif 000008
方法１：
分析カラム：Waters YMC ODS-AQ S5 120Å (4.6 × 50 mm)；
系Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸／H2O；
系Ｂ：０．０８％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル；
グラジエント：１０〜５０％の系Ｂ／１０分；
流速：３ｍｌ／分；
検出器波長：２６５
１ｍｇを１ｍｌの水に溶かし１ｍｌの系Ａで希釈することによって調製したＭ４０４０３の原液２０μｌを注入した。方法１を用いたＭ４０４０３のＨＰＬＣクロマトグラムを図１に示す。
【００４５】
実施例２
方法２を用いたＭ４０４０３のＨＰＬＣ分析
方法２：
分析カラム：Waters YMC 9DS-AQ S5 120Å (4.6 × 50 MM)；
系Ａ：０．５ＮのＮａＣｌ水溶液；
系Ｂ：１：４水／ＣＨ３ＣＮ；
グラジエント：１０〜５０％の系Ｂ／９分；
流速：３ｍＬ／分；
検出器波長：２６５ｎｍ
１ｍｇを１ｍｌの系Ａに溶かすことにより調製したＭ４０４０３の原液２０μｌを注入した。方法２を用いたＭ４０４０３のＨＰＬＣクロマトグラムを図２に示す。
【００４６】
実施例３
方法３を用いたＭ４０４０３のＨＰＬＣ分析
方法３：
分析カラム：Waters Symmetry Shield RP18, 5 μｍ, 250 × 4.6 mm；
移動相：アセトニトリル：０．１２５Ｍテトラブチルアンモニウムクロリド（水中）（ｐＨ６．５），５％：９５％Ｈ２０（ｖ／ｖ）；
流速：１ｍＬ／分；
検出波長：２６５ｎｍ
１ｍｇを１ｍｌの移動相に溶かすことにより調製したＭ４０４０３の原液２０μｌを注入した。方法３を用いたＭ４０４０３のＨＰＬＣクロマトグラムを図３に示す。
方法３を用いたＭ４０４０３および関連化合物のＨＰＬＣクロマトグラムを図３ａに示す。方法３により、Ｍ４０４０２（Ｍ４０４０３のビスイミン）、Ｍ４０４１４（Ｍ４０４０３のモノイミン）およびＭ４０４７５（Ｍ４０４０３の遊離配位子）の分離が可能となる（図３ａのクロマトグラムを参照）。
【００４７】
実施例４
方法４を用いたＭ４０４０３のＨＰＬＣ分析
方法４：
分析カラム：Waters Symmetry Shield RP18, 5 μｍ, 250 × 4.6 mm；
移動相：アセトニトリル：０．１２５Ｍテトラブチルアンモニウムクロリドおよび０．５ＭのＬｉＣｌ（水中）（ｐＨ６．５），５％：９５％Ｈ２０（ｖ／ｖ）；
流速：１ｍＬ／分；
検出波長：２６５ｎｍ
１ｍｇを１ｍｌの系Ａに溶かすことにより調製したＭ４０４０３の原液２０μｌを注入した。方法４を用いたＭ４０４０３のＨＰＬＣクロマトグラムを図４に示す。
方法４を用いたＭ４０４０３および関連化合物のＨＰＬＣクロマトグラムを図４ａに示す。方法４により、Ｍ４０４０２（Ｍ４０４０３のビスイミン）、Ｍ４０４１４（Ｍ４０４０３のモノイミン）およびＭ４０４７５（Ｍ４０４０３の遊離配位子）並びにＭ４０４０３の全ジアステレオマーの分離が可能となる（図４ａのクロマトグラムを参照）。
【００４８】
実施例５
方法１を用いたＭ４０４０１のＨＰＬＣ分析
【化８】2004522971.tif 000009
方法１：
分析カラム：Waters YMC ODS-AQ S5 120Å (4.6 × 50 mm)；
系Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸／Ｈ２Ｏ；
系Ｂ：０．０８％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル；
グラジエント：１０〜５０％の系Ｂ／１０分；
流速：３ｍｌ／分；
検出器波長：２６５
１ｍｇを１ｍｌの水に溶かすことにより調製したＭ４０４０１の原液２０μｌを注入した。方法１を用いたＭ４０４０１のＨＰＬＣクロマトグラムを図５に示す。
【００４９】
実施例６
種々のＮａＣｌ濃度でのＨＰＬＣ
Ｍ４０４０１のＨＰＬＣを種々のＮａＣｌ濃度で行った。
分析カラム：Waters YMC 9DS-AQ S5 120 A (4.6 × 50 mm)：
系Ａ：（Ａ）Ｈ２Ｏ（ＮａＣｌなし）；（Ｂ）０．０１ＭのＮａＣｌ（水中）；（Ｃ）０．５ＭのＮａＣｌ（水中）；
系Ｂ：アセトニトリル；
グラジエント：０〜１００％の系Ｂ／１０分；
フロー：３ｍｌ／分；
検出器波長：２６５ｎｍ
１ｍｇを１ｍｌの系Ａに溶かすことにより調製したＭ４０４０１の原液２０μｌを注入した。種々のＮａＣｌ濃度を用いたＭ４０４０１のＨＰＬＣクロマトグラムを図６に示す。
【００５０】
実施例７
方法２を用いたＭ４０４０１のＨＰＬＣ分析
方法２：
分析カラム：Waters YMC ODS-AQ S5 120Å (4.6 × 50 MM)；
系Ａ：０．５ＮのＮａＣｌ水溶液；
系Ｂ：１：４水／ＣＨ３ＣＮ；
グラジエント１：１０〜５０％の系Ｂ／９分；
流速：３ｍＬ／分；
検出器波長：２６５ｎｍ
１ｍｇを１ｍｌの系Ａに溶かすことにより調製したＭ４０４０３の原液２０μｌを注入した。
方法２を用いたＭ４０４０１のＨＰＬＣクロマトグラムを図７に示す。方法２により、Ｍ４０４７２（Ｍ４０４０１のビスイミン）、Ｍ４０４７３（Ｍ４０４０１のモノイミン）およびＭ４０４０３の遊離配位子およびＭ４０４０１の２つの異性体（Ｍ４０４０６、Ｍ４０４０４）の分離が可能となる。
【００５１】
実施例８
方法３を用いたＭ４０４０１のＨＰＬＣ分析
方法３：
分析カラム：Waters Symmetry Shield RP18, 5 m, 250 × 4.6 mm；
移動相：アセトニトリル：０．１２５Ｍテトラブチルアンモニウムクロリド／Ｈ２０（ｐＨ６．５），５：９５％Ｈ２０（ｖ／ｖ）；
流速：１ｍＬ／分；
検出波長：２６５ｎｍ
方法３を用いたＭ４０４０１のＨＰＬＣクロマトグラムを図８に示す。方法３により、Ｍ４０４７２（Ｍ４０４０１のビスイミン）、Ｍ４０４７３（Ｍ４０４０１のモノイミン）およびＭ４０４０３の遊離配位子およびＭ４０４０１の２つの異性体（Ｍ４０４０６、Ｍ４０４０４）の分離が可能となる。
【００５２】
実施例９
方法４を用いたＭ４０４０１のＨＰＬＣ分析
方法４：
分析カラム：Waters Symmetry Shield RP18, 5μｍ, 250 × 4.6 mm；
移動相：アセトニトリル：０．１２５Ｍテトラブチルアンモニウムクロリドおよび０．５ＭのＬｉＣｌ（水中）（ｐＨ６．５），５：９５％Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ）；
流速：１ｍＬ／分；
検出波長：２６５ｎｍ；
１ｍｇを１ｍｌの移動相に溶かすことにより調製したＭ４０４０１の原液２０μｌを注入した。方法４を用いたＭ４０４０１のＨＰＬＣクロマトグラムを図９に示す。
方法４を用いたＭ４０４０１および関連化合物のＨＰＬＣクロマトグラムを図９ａに示す。方法４により、Ｍ４０４７２（Ｍ４０４０１のビスイミン）、Ｍ４０４７３（Ｍ４０４０１のモノイミン）、Ｍ４０４０３の遊離配位子およびＭ４０４０１の２つの異性体（Ｍ４０４０６、Ｍ４０４０４）の分離が可能となる。
【００５３】
実施例１０
ホルメートアニオンを用いたＭ４０４０３−（ＨＣＯＯ−）２のＨＰＬＣ
ホルメートアニオンを用いてＭ４０４０３のＨＰＬＣを採った。
分析カラム：Waters YMC 9DS-AQ S5 120 A (4.6 × 50 mm)；
系Ａ：０．０２５Ｍギ酸アンモニウム（水中）；
系Ｂ：１：４＝０．１２５Ｍギ酸アンモニウム（水中）／アセトニトリル；
グラジエント：０〜１００％の系Ｂ／１０分；
フロー：３ｍｌ／分
検出器波長：２６５ｎｍ
１ｍｇを１ｍｌの系Ａに溶かすことにより調製したＭ４０４０３−（ホルメート）２の原液２０μｌを注入した。
方法４を用いたＭ４０４０３−（ＨＣＯＯ−）２のＨＰＬＣクロマトグラムを図１０に示す。
【００５４】
実施例１１
アセテートアニオンを用いたＭ４０４０３−（ＯＡｃ）２のＨＰＬＣ
アセテートアニオンを用いてＭ４０４０３のＨＰＬＣを採った。
分析カラム：Waters YMC 9DS-AQ S5 120 A (4.6 × 50 mm)；
系Ａ：０．０２５Ｍ酢酸アンモニウム（水中）；
系Ｂ：１：４＝０．１２５Ｍ酢酸アンモニウム（水中）／アセトニトリル；
グラジエント：０〜１００％の系Ｂ／１０分；
フロー：３ｍｌ／分；
検出器波長：２６５ｎｍ
１ｍｇを１ｍｌの系Ａに溶かすことにより調製したＭ４０４０３−（ＯＡｃ）２の原液２０μｌを注入した。
Ｍ４０４０３−（ＯＡｃ）２のＨＰＬＣクロマトグラムを図１１に示す。
【００５５】
実施例１２
アセテートアニオンを用いたＭ４０４０３−（ＯＡｃ）２のＨＰＬＣ
スーパーオキシドジスムターゼ擬似化合物Ｍ４０４０３のジアステレオマーを分離するためのＨＰＬＣ法。スキーム５〜９に示したように４つの立体異性体混合物を調製し（パートＡ）、次いで、これらを逆相高速液体クロマトグラフィーで分離した（パートＢ）。
［パートＡ：Ｍ４０４０３の立体異性体の合成］
Ｍ４０４０３を、その単一異性体、テトラ−アミン前駆体Ｍ４０４００からスキーム７に示した反応で合成する。
【化９】2004522971.tif 000010
【００５６】
Ｍ４０４０３の種々の立体異性体を、Ｍ４０４０３中にキラル炭素中心を与える１，２−ジアミノシクロヘキサンの種々の異性体から合成する。セット１の（Ｒ，Ｒ＋Ｒ，Ｓ）Ｍ４０４０３立体異性体混合物を調製するために使用される１，２−ジアミノシクロヘキサン異性体をスキーム６に示す。同様に、セット２の（Ｒ，Ｒ＋Ｓ，Ｓ）Ｍ４０４０３立体異性体混合物を調製するために使用される１，２−ジアミノシクロヘキサン異性体をスキーム７に示す。セット３の（Ｒ，Ｓ＋Ｒ，Ｓ）Ｍ４０４０３立体異性体混合物を調製するために使用される１，２−ジアミノシクロヘキサン異性体をスキーム８に示す。セット４の（Ｓ，Ｓ＋Ｒ，Ｓ）Ｍ４０４０３立体異性体混合物を調製するために使用される１，２−ジアミノシクロヘキサン異性体をスキーム９に示す。スキーム６〜９に示すように、Ｍ４０４０３ジアステレオマーは、鋳型環化とその後に続く水素化ホウ素ナトリウムでの還元によって調製される。
【化１０】2004522971.tif 000011
【化１１】2004522971.tif 000012
【化１２】2004522971.tif 000013
【化１３】2004522971.tif 000014
【００５７】
【表１】2004522971.tif 000015
【００５８】
［パートＢ：立体異性体混合物の分離］
薬品、原料および方法
テトラブチルアンモニウムクロリド水和物（９８％，３４，５８５−７）をAldrich Chemical Companyから購入した。塩化ナトリウム（９９．６％，Ｓ−９８８８）をSigma Chemical Companyから購入した。他の全ての溶媒（特記のない限りＨＰＬＣグレード）および試薬をFisher Scientificから購入し、その最高グレードが入手可能であった。SymmetryShield（登録商標）RP18カラム（4.6 mm × 250 mm, 5 μｍ粒度）およびその相当する保護カラムをWaters Corporationから購入した。
【００５９】
逆相ＨＰＬＣ実験
標準溶液の調製
ＨＰＬＣ移動相Ａは、０．１２５Ｍのテトラブチルアンモニウムクロリド（ＴＢＡＣ）および０．５ＭのＬｉＣｌから構成される水溶液であり、テトラブチルアンモニウムクロリド水和物（３６．９９ｇ）および固体ＬｉＣｌ（２１．２ｇ）を１Ｌの容量フラスコへ添加し、ミリポア水で容積希釈し、数回フラスコをひっくり返して均一溶液を得ることによって調製した。得られた溶液を０．４５μｍのナイロンフィルターで使用前に濾過した。移動相ＢはＨＰＬＣグレードのアセトニトリルであった。各ジアステレオ異性体セットのＨＰＬＣ−ＵＶ用試料を、〜３．０ｍｇ／ｍＬの濃度で、０．５ＭＬｉＣｌ／ＭｅＯＨ：移動相Ａの５０：５０混合物中で調製した。
【００６０】
クロマトグラフ分析条件
ＨＰＬＣ実験に用いたカラムは、SymmetryShield RP18カラム（登録商標）、4.6 mm × 250 mm, 5 μｍ粒度（Waters Corporation）であった。分離は、９５％移動相Ａおよび５％アセトニトリル（複式ポンプシステムでの移動相B）から成る移動相を用いた定組成フロー条件で行った。流速は１．０ｍＬ／分で１５分の実行時間を用い、検出波長は２６５ｎｍであった。各試料の注入体積は２０μＬであった。
図１２は、セット１〜４のジアステレオマー混合物のＨＰＬＣ分析のから得られたクロマトグラムを含む。セット１〜４のジアステレオマー混合物のＨＰＬＣ分析から得られた予想結果を表１にまとめた。セット１（Ｒ，Ｒ＋Ｒ，Ｓ）Ｍ４０４０３立体異性体混合物のＨＰＬＣ分析から得られるクロマトグラムは、合計６個の立体異性体が生成しているにも関わらず、５個のみのピークを示した。しかし、生成した６個の立体異性体のうち、化合物５および６は鏡像異性的な関係にある。その結果、それらは同じ吸着特性を有し、１個のピークとして溶離する。
セット２（Ｒ，Ｒ＋Ｒ，Ｓ）Ｍ４０４０３立体異性体混合物のＨＰＬＣ分析の結果得られるクロマトグラムは、合計３個の立体異性体が生成しているにも関わらず、２個のみのピークを示す。生成した３個の立体異性体のうち、化合物１および８は鏡像異性的な関係にある。その結果、それらは同じ吸着特性を有し、１個のピークとして溶離する。
同様に、セット３（Ｒ，Ｓ＋Ｒ，Ｓ）Ｍ４０４０３立体異性体混合物のＨＰＬＣ分析の結果得られるクロマトグラムは、合計３個の立体異性体が生成しているにも関わらず、２個のみのピークを示す。生成した３個の立体異性体のうち、化合物５および６は鏡像異性的な関係にあり、１個のピークとして溶離する。
セット４（Ｓ，Ｓ＋Ｒ，Ｓ）Ｍ４０４０３立体異性体混合物のＨＰＬＣ分析の結果得られるクロマトグラムは、合計６個の立体異性体が生成しているにも関わらず、５個のみのピークを示す。生成した６個の立体異性体のうち、化合物５および６は鏡像異性的な関係にあり、１個のピークとして溶離する。
【００６１】
実施例１３
下記のキラルＨＰＬＣ法を、全Ｒおよび全Ｓの光学異性体Ｍ４０４０３およびＭ４０４１９を分離するために用いた。
【化１４】2004522971.tif 000016
錯体は、スキーム１０に示すように、ＫＳＣＮで、配位子交換反応によってその相当するビス（チオシアナート）形態にまず転換される。次いで、得られたＭ４０４０３およびＭ４０４１９（ＳＣＮ）２誘導体を、キラルＨＰＬＣによって分離した。
【化１５】2004522971.tif 000017
【００６２】
薬品、原料および方法
Ｍ４０４０３およびＭ４０４１９のビス（チオシアナート）錯体の各調製
Ｍ４０４０３（ＳＣＮ）２：
Ｍ４０４０３錯体（５．０ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）を１．０ｍＬのＨ２Ｏに溶解した。この溶液へ、ＫＳＣＮ（４９．０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）をその濃度が０．５Ｍとなるように添加した。ＫＳＣＮを添加すると、直ちに白色沈殿が生成した。室温で６０分間激しく撹拌して反応させ、得られた懸濁液をＣＨ２Ｃｌ２（３×１．０ｍＬ）で抽出した。次いで、結合したＣＨ２Ｃｌ２抽出物をＭｇＳＯ４上で乾燥し、濾過し、蒸発させて白色固体生成物を産出した。生成物をＭｅＯＨ（２．５ｍＬ）に溶解し、注入前に、ＭｅＯＨ溶液の分割量を１：１の割合でＨＰＬＣ移動相（０．２６ＭのＮＨ４ＳＣＮ／ＭｅＯＨ）と混合した。
Ｍ４０４１９（ＳＣＮ）２：
Ｍ４０４１９錯体（５．０ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）を１．０ｍＬのＨ２Ｏに溶解した。この溶液へ、ＫＳＣＮ（４９．０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）をその濃度が０．５Ｍとなるように添加した。ＫＳＣＮを添加すると直ちに白色沈殿が生成した。室温で６０分間激しく撹拌して反応させ、得られた懸濁液をＣＨ２Ｃｌ２（３×１．０ｍＬ）で抽出した。次いで、結合したＣＨ２Ｃｌ２抽出物をＭｇＳＯ４上で乾燥し、濾過し、蒸発させて白色固体生成物を産出した。生成物をＭｅＯＨ（２．５ｍＬ）に溶解し、注入前に、ＭｅＯＨ溶液の分割量を１：１の割合でＨＰＬＣ移動相（０．２６ＭのＮＨ４ＳＣＮ／ＭｅＯＨ）と混合した。
【００６３】
標準溶液の調製
ＨＰＬＣ移動相は、ＮＨ４ＳＣＮのＭｅＯＨ中での０．２Ｍ溶液であり、２．０ｇのＮＨ４ＳＣＮを１００ｍＬのＭｅＯＨ（ＨＰＬＣグレード）へ添加することにより調製した。移動相溶液を、使用前に、０．４５μｍのナイロンフィルター（Ｏｓｍｏｎｉｃｓ）で濾過した。
【００６４】
クロマトグラフ分析条件
キラルＨＰＬＣ実験に用いたカラムは、Chiralcel OD-RH カラム、4.6mm × 150 mm, 5 μｍ 粒度（Chiral Technologies）であった。分離は、単純定組成フローを用いて０．５ｍＬ／分の速度で行った。検出波長は２６５ｎｍ、各試料の注入体積は２０μＬであった。
Ｍ４０４０３およびＭ４０４１９のビス（チオシアナート）光学異性体のキラルＨＰＬＣプロファイルを図１３に示す。Ｍ４０４３−（ＳＣＮ）２およびＭ４０４１９（ＳＣＮ）２光学異性体のキラルＨＰＬＣプロファイルを別々にプロファイルＡおよびＢに示す。プロファイルから明らかなように、全Ｒ Ｍ４０４０３−（ＳＣＮ）２光学異性体は保持時間（ｔＲ）が６．８分であるが、その全Ｓ Ｍ４０４１９−（ＳＣＮ）２鏡像は保持時間が６．５分である。次いで、光学異性体を同時注入実験によって分析し、それらが本当にこれらのクロマトグラフ分析条件で分解したことを確認した。同時注入の光学異性体について得られたＨＰＬＣプロファイルをプロファイルＣに示す。光学異性体は約0.3分で分離され、その結果、当初の結果を確認した。
【図１】
2004522971.tif 000024
【図２】
2004522971.tif 000025
【図３】
2004522971.tif 000026
【図３ａ】
2004522971.tif 000027
【図４】
2004522971.tif 000028
【図４ａ】
2004522971.tif 000029
【図５】
2004522971.tif 000030
【図６】
2004522971.tif 000031
【図７】
2004522971.tif 000032
【図８】
2004522971.tif 000033
【図９】
2004522971.tif 000034
【図９ａ】
2004522971.tif 000035
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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