(57)【要約】【課題】  血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼを速やかに生体膜に到達させ、生体膜の構成成分であるリン脂質の過酸化された部位を特異的に取り除くことができる手段を提供すること。【解決手段】  アンドログラホリドを有効成分とする血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ機能調整剤並びにこれを含有する皮膚外用剤および経口用組成物。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンドログラホリドを有効成分とすることを特徴とする血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ機能調整剤。
【請求項２】
血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼの細胞質から細胞の膜への移行促進するものである請求項１記載の血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ機能調整剤。
【請求項３】
酸化ストレス抵抗性を改善するものである請求項１記載の血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ機能調整剤。
【請求項４】
請求項１〜３の何れかに記載の血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ機能調整剤を含有する皮膚外用剤。
【請求項５】
請求項１〜４の何れかに記載の血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ機能調整剤を含有する経口用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ機能調整剤に関し、更に詳細には、アンドログラホリドを含有し、生体内での細胞質から細胞の膜への血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼの移行の促進や、酸化ストレス抵抗性を改善するなどの作用を有する血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ機能調整剤およびこれを含有する外用剤ないし経口用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
紫外線、環境汚染などの外的因子によって活性酸素が発生すると、過酸化脂質が作られることはよく知られている。この過酸化脂質は、炎症、老化、色素異常症などの様々な老化現象を引き起こすことも明らかとなってきた。そこで、このような老化現象を防止する目的で皮膚外用剤においては、ビタミンＣ、ビタミンＥなどの抗酸化物質を用いて、過酸化脂質の形成を未然に防ぐという予防的な方策がとられてきた。しかし、いったん形成された過酸化脂質に対する対処法については、検討が進んでいないのが現状である。
【０００３】
先に本発明者らは、生体には本来、これら過酸化脂質の害から生体を防御する為の様々な抗酸化機構が備わっていることに着目し検討した結果、これら生体内での抗酸化機構は加齢とともに低下し、活性酸素やフリーラジカル、紫外線照射等の酸化ストレスによる障害の修復に対して充分に対処できなくなり、障害が蓄積することを見出した。そして、過酸化脂質による皮膚障害の原因に血小板活性化因子アセチルハイドロラーゼという酵素の働きが大きく関与していることを突き止め、この酵素の活性を調整する剤を見出し、特許出願している（特許文献１参照）。
【０００４】
また、本発明者らは、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼが、生体膜の構成成分であるリン脂質のうち、過酸化された部位を特異的に取り除く働きがあること、つまり過酸化脂質による障害を修復すること、また、その機能が細胞の生命維持に重要であること、さらに、加齢につれて過酸化脂質修復機能が低下することを報告している(非特許文献１参照。)
【特許文献１】特開２００１−３２２９４８号公報
【特許文献２】特表２００３−５２２１６６号公報
【非特許文献１】２００３年香粧品科学会要旨集、第４２頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼが、上記活性を奏するためには、この酵素が生体膜に到達し、その構成成分であるリン脂質の過酸化された部位を特異的に取り除くことが必要であり、細胞質から細胞の膜への移行を促進させる手段の開発が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記した血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼの作用に着目し、この酵素の機能を調整し、皮膚などに適用した場合にその細胞質から細胞の膜への移行を促進しうる化合物を検索していたところ、アンドログラホリドという物質が優れた効果を有することを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち本発明は、アンドログラホリドを有効成分とすることを特徴とする血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ機能調整剤を提供するものである。
【０００８】
また本発明は、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ機能調整剤を含有する外用剤および経口用組成物を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、アンドログラホリドの作用により、生体中での血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（以下、「ＰＡＦアセチルヒドロラーゼ」と略すことがある）の機能を調整することができ、細胞内でＰＡＦアセチルヒドロラーゼの細胞質から細胞の膜への移行を促進することができる。また、アンドログラホリドは生体内での酸化ストレス抵抗を改善することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明において、有効成分として用いるアンドログラホリドは、下記式（１）で示される既知の化合物である。
【化１】
2007176934.tif 000002
【００１１】
この化合物は、例えばキツネノマゴ科植物である穿心蓮（センシンレン；Andrographis  paniculata）より抽出・精製するか、市販品を購入することにより容易に得ることができる。
【００１２】
アンドログラホリドを得るための具体的な抽出・精製方法としては、乾燥した穿心蓮を粉砕し、メタノール、ヘキサン等で順次抽出して抽出物を得、これを更にカラムクロマトグラフィ等で精製する方法を例示することができる。また、市販品の具体例としては、和光純薬、アルドリッチ社、シグマ社、カルバイオケム社より供給されている「アンドログラホリド」を例示することができる。
【００１３】
本発明で使用するアンドログラホリドとしては、上記した抽出・精製品、合成品および市販品のいずれを用いても良く、アンドログラホリドを含有する植物の抽出物等を用いても良い。
【００１４】
上記アンドログラホリドを含むアンドログラホリド誘導体は、既に抗癌剤、抗ウイルス薬、抗マラリヤ薬、抗細菌薬、肝保護薬、免疫調節薬等として使用できるものがあることは報告されている（特許文献２）。しかしながら、上記のＰＡＦアセチルヒドロラーゼの機能を調整することができることについては、全く報告されていない。
【００１５】
本発明のＰＡＦアセチルヒドロラーゼ機能調整剤は、上記アンドログラホリドを有効成分として含有する外用剤ないし経口用組成物として調製されるものである。
このうち、外用剤としては、医薬部外品、化粧品等の皮膚外用剤が例示され、経口用組成物としては、医薬品、医薬部外品、飲食物（機能性食品を含む）等が例示される。
【００１６】
このＰＡＦアセチルヒドロラーゼ機能調整剤を、ＰＡＦアセチルヒドロラーゼが細胞質から細胞の膜へ移行することを促進させる移行促進剤として使用する場合は、特に限定されるものではないが一般的な外用製剤組成中に、０.００００００１〜５質量％（以下、単に「％」と略す）程度、好ましくは、０.０００１〜１％程度のアンドログラホリドを配合すればよい。
【００１７】
また、ＰＡＦアセチルヒドロラーゼ機能調整剤を、酸化ストレス抵抗性改善のために、酸化ストレス抵抗性改善剤として用いる場合には、摂取する動物（人を含む）の状態や配合する他の物質にもよるが、一般的には、経口用組成物中に、１日当たり０.０１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、０.１〜５０ｍｇ／ｋｇ程度のアンドログラホリドを配合すればよい。これを製剤中の含量からいえば、一般的な医薬製剤組成中に、０.００００００１〜５％程度、好ましくは、０.０００１〜１％程度のアンドログラホリドの配合量とすればよい。この酸化ストレス抵抗性改善剤は、抗酸化機能が低下した動物に好適に用いることができる。具体的には、加齢に伴い抗酸化機能が低下した動物に用いることができ、人であれば１５歳以上が好ましく、３５歳以上に特に好ましく用いられる。
【００１８】
上記したように、本発明のＰＡＦアセチルヒドロラーゼ機能調製剤は、医薬品、医薬部外品、化粧料、飲食物（機能性食品を含む）等の種々の目的に有効成分として用いることができる。特に、本発明のＰＡＦアセチルヒドロラーゼ機能調製剤を、医薬部外品、化粧品等の皮膚外用剤として使用した場合は、皮膚細胞中でのＰＡＦアセチルヒドロラーゼの機能を調整することができ、細胞内でＰＡＦアセチルヒドロラーゼの細胞質から細胞の膜への移行を促進することができ、紫外線、環境汚染などの外的因子によって生成した過酸化脂質にともなう、炎症、老化、色素異常症などの様々な現象を防止し得ることができるものである。
【００１９】
本発明のＰＡＦアセチルヒドロラーゼ機能調製剤は、アンドログラホリドを単独で有効成分として用いることができるが、これを一種又は二種以上の添加剤と混合しても良い。
【００２０】
必要に応じて添加される添加剤としては、皮膚用化粧料や外用医薬品の製剤や、経口用組成物に一般的に用いられる、水（精製水、温泉水、深層水等）、アルコール、油剤、界面活性剤、金属セッケン、ゲル化剤、粉体、アルコール類、水溶性高分子、皮膜形成剤、樹脂、紫外線防御剤、包接化合物、抗菌剤、香料、消臭剤、塩類、ｐＨ調整剤、清涼剤、動物・微生物由来抽出物、植物抽出物、血行促進剤、収斂剤、抗脂漏剤、美白剤、抗炎症剤、活性酸素消去剤、細胞賦活剤、保湿剤、キレート剤、角質溶解剤、酵素、ホルモン類、ビタミン類等が挙げられる。本発明製剤の調製は、常法に従って行うことができ、前記添加剤の配合量も本発明の効果を損なわない範囲で、常法に従って決定することができる。
【００２１】
前記した皮膚外用剤の形態については、特に限定されず、乳液、クリーム、化粧水、美容液、パック、洗顔料、メーキャップ化粧料等の皮膚用化粧料に属する形態；シャンプー、ヘアートリートメント、ヘアースタイリング剤、養毛剤、育毛剤等の頭髪化粧料に関する形態；及び分散液、軟膏、エアゾール、貼付剤、パップ剤、リニメント剤等の外用医薬品の形態のいずれであってもよい。また、前記経口用組成物の形態についても特に限定されない。
【実施例】
【００２２】
以下、試験例、製剤例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例等に何ら限定されるものではない。
【００２３】
試  験  例  １
ＰＡＦアセチルハイドロラーゼの細胞質から細胞の膜への移行性の評価：
ヒト新生児皮膚由来線維芽細胞を、１０％牛胎児血清含有ダルベッコ変法イーグル培地（ニッスイ社製）にて５日間培養する。次いで、アンドログラホリド（注１）１μｇ／ｍＬ又はカテキン  ５μｇ／ｍＬを添加し、２４時間培養後、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド(シグマ社製)を添加する。更に３時間培養後、細胞を回収し破砕した。この細胞破砕物を、１０００００×ｇで６０分超遠心し、細胞質画分と膜画分に分画する。これらの画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロッティング法によりＰＡＦアセチルヒドロラーゼを検出し、それぞれの画分の蛋白量を定量した。細胞の膜画分と細胞質画分でのＰＡＦアセチルヒドロラーゼの蛋白量の比（細胞の膜画分の蛋白量／細胞質画分の蛋白量）から、ＰＡＦアセチルハイドロラーゼの細胞質から細胞の膜への移行性を評価した。この結果を表１に示した。
※注１：アンドログラホリドはカルバイオケム（Calbiochem）社製
（純度９５％以上）のものをそのまま用いた。
【００２４】
【表１】
2007176934.tif 000003
【００２５】
試  験  例  ２
酸化ストレス抵抗性の測定方法：
ヒト新生児皮膚由来線維芽細胞を１０％牛胎児血清含有ダルベッコ変法イーグル培地（ニッスイ社製）にて培養し、ほぼコンフルエントになったところで、試験例１で用いたのと同じアンドログラホリド  １μｇ／ｍＬ又はカテキン  ５μｇ／ｍＬを添加し、２４時間培養した。その後、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド(シグマ社製)を０〜８００μＭ添加し、更に４時間培養し、ＭＴＴアッセイで細胞生育率を測定した。この結果を図１に示した。
【００２６】
表１及び図1より、抗酸化剤として汎用されているカテキンを使用した場合とアンドログラホリドを使用した場合の比較では、カテキンを使用した場合では細胞の酸化ストレスに対する抵抗性を上げることができなかったのに対し、アンドログラホリドを使用した場合はＰＡＦアセチルハイドロラーゼの細胞の膜への移行を高めることで酸化された膜を修復し、酸化ストレス抵抗性を高めることが確認された。
【００２７】
試  験  例  ３
酸化ストレス抵抗性の測定方法：
試験例２と同様の酸化ストレス抵抗性の測定を、ヒト肝細胞由来のＨｅｐＧ２細胞を用いて行った。まず、ＨｅｐＧ２細胞を９６穴マイクロプレートに、各ウエルあたり２．５×１０４細胞（１００μｌ）で分注し、定着させた。次いで、各ウエルに試験例１で用いたのと同じアンドログラホリドを最終濃度が６．３μＭとなるようにして２５μｌ添加し、さらに４４時間培養を行った。その後、過酸化化合物であるｔ−ブチルヒドロペルオキシド（t-butyl  hydroperoxide：ｔ−ＢＨＰ）を最終濃度が０〜１ｍＭとなるように添加し、３時間後の細胞生存率を測定した。この結果を図２に示した。なお、細胞生存率はＷＳＴ−１染色法を用いて、ｔ−ＢＨＰ無添加対照を１００％として算出した。
【００２８】
図２より、アンドログラホリドの使用により、酸化ストレス抵抗性を高めることができることが確認された。
【００２９】
製  剤  例  １
乳液（水中油型）：
表２に示す組成及び下記製法により乳液を調製し、シワや肌荒れに対する抑制・改善効果（皮膚障害改善効果）を以下に示す試験方法により試験、評価した。結果も表２併せて示した。
【００３０】
【表２】
2007176934.tif 000004
【００３１】
（  製  法  ）
Ａ：成分（７）〜(１１)、(１４)を加熱混合し、７０℃に保つ。
Ｂ：成分（１）〜（６）および（１３）を加熱混合し、７０℃に保つ。
Ｃ：ＢにＡを加えて混合し、均一に乳化する。
Ｄ：Ｃを室温まで冷却し、成分（１２）を加えて均一混合し、乳液を得た。
【００３２】
（  試験方法  ）
被験乳液１品につき２２歳から４０歳の女性１５名をパネルとし、毎日、朝と夜の２回、洗顔後に被験乳液の適量を顔面に塗布してもらった。試験は１２週間行った。塗布による皮膚障害改善効果を以下の基準によって評価、判定した。
【００３３】
（  評価基準  ）
＜評  価＞      ＜内      容＞
有    効    肌のシワや肌荒れが目立たなくなった。
やや有効    肌のシワや肌荒れが目立たなくなった。
無    効    使用前と変化なし。
（  判定基準  ）
＜判  定＞      ＜内      容＞
◎        有効とやや有効を合わせた人数が１０名以上
○        有効とやや有効を合わせた人数が５名から９名
△        有効とやや有効を合わせた人数が１名から４名
×        有効とやや有効を合わせた人数が０名
【００３４】
表２から明らかなように、薬剤未添加、抗酸化剤として汎用されているカテキンとアンドログラホリドを比較した結果、未添加及びカテキンに比べ、アンドログラホリドは優れたシワ・肌荒れ改善効果を示すことが明らかとなった。以上の結果より、アンドログラホリドはＰＡＦアセチルハイドロラーゼの細胞の膜への移行性を高めることで酸化された膜を修復し、酸化ストレス抵抗性を高めることが実証された。
【００３５】
製  剤  例  ２
化  粧  水  ：
下記成分（３）〜（５）及び（８）〜（１０）を混合溶解した溶液と、下記成分（１）、（２）、（６）、（７）及び（１１）を混合溶解した溶液とを混合して均一にし、化粧水を得た。
（  成  分  ）                                              （％）
（１）グリセリン                                            ５.０
（２）１,３-ブチレングリコール                              ６.５
（３）ポリオキシエチレン（２０Ｅ.Ｏ.）ソルビタン            １.２
モノラウリン酸エステル
（４）エチルアルコール                                      ８.０
（５）アンドログラホリド（注１）                            ０.００１
（６）乳酸                                                  ０.０５
（７）乳酸ナトリウム                                        ０.１
（８）パラメトキシケイ皮酸−２−エチルヘキシル              ３.０
（９）防腐剤                                                適  量
（１０）香料                                                適  量
（１１）精製水                                              残  量
※注１：試験例１と同じものを用いた。
【００３６】
調製した化粧水は、製剤例１の乳液と同様に、優れたシワ・肌荒れ改善効果を示すものであった。
【００３７】
製  剤  例  ３
飲  料  ：
下記成分（１）〜（５）を成分（６）に溶解し、１２０ｍＬずつ褐色瓶に分注した後にレトルト殺菌（１２１℃、１５分）し、アンドログラホリド含有飲料を得た。
（  成  分  ）                                                （％）
（１）アンドログラホリド（注１）                            ０.２５
（２）ホエーペプチド（注２）                                １.７７
（３）アスコルビン酸ナトリウム                              ０.１２
（４）ショ糖                                                ２.６５
（５）クエン酸                                              ０.２１
（６）精製水                                                ９５.０
※注１：試験例１と同じものを用いた。
※注２：ＤＶＭ  ＪＡＰＡＮ社製  ＷＥ８０Ｂ
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明のＰＡＦアセチルヒドロラーゼ機能調整剤は、ＰＡＦアセチルヒドロラーゼの細胞質から細胞の膜への移行を促進し、また、酸化ストレス抵抗性を改善するものである。従ってこのものは、医薬品、医薬部外品、化粧料、経口用組成物等の分野に利用可能であり、特に外用医薬品、医薬部外品、化粧料等の皮膚外用剤として利用することにより、紫外線、環境汚染などの外的因子によって生成した過酸化脂質にともなう、様々な現象を防止し得るものである。
【００３９】
より具体的には、本発明のＰＡＦアセチルヒドロラーゼ機能調整剤は、抗酸化機能が低下した動物、例えば加齢に伴い抗酸化機能が低下した人を含む動物の抗酸化機能を向上させることができる。更に、本発明のＰＡＦアセチルヒドロラーゼ機能調整剤は、しみ、そばかす等の異常な色素沈着、皮膚の炎症などを予防または改善しうる皮膚外用剤として、あるいは血小板活性化因子に起因する疾患、例えば喘息、滲出性中耳炎、出血性大腸炎、成人性呼吸促迫症候群などの予防・治療用の医薬や生化学試薬としても利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】試験例２の酸化ストレス抵抗性の測定結果を示す図面である。
【図２】試験例３の酸化ストレス抵抗性の測定結果を示す図面である。                                                                           以  上
【図１】
2007176934.tif 000005
【図２】
2007176934.tif 000006