(57)【要約】【課題】血管内皮増殖因子ファミリーの新規なタンパク質をコードするヒトｃＤＮＡを提供、及びその利用。【解決手段】ＰＤＧＦファミリーの増殖因子の新規なメンバーであり、特に内皮細胞増殖および血管新生を刺激し、血管透過性を増大させる、ＶＥＧＦ−Ｄが記載される。また、それをコードするヌクレオチド配列、その生産方法、それに対する抗体およびその他のアンタゴニスト、それが発現するようにトランスフェクトまたはトランスフォームされた宿主細胞、それを含有する医薬組成物、そして医学上および診断上の適用におけるそれらの利用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５の９３〜２０１のアミノ酸残基からなるポリペプチド、または、少なくとも１のアミノ酸の置換または欠失を有する対応のポリペプチド、をコードする単離核酸分子であって、前記ポリペプチドが、細胞増殖、細胞分化、細胞遊走、細胞生存および血管透過性からなるグループから選択される少なくとも一つの内皮細胞生物活性を刺激する能力を有するか、あるいは、内皮細胞に結合する能力を有するが少なくとも一つの前記生物活性を刺激する能力を有さない、配列番号５の９３〜２０１のアミノ酸残基からなるポリペプチド、または、少なくとも１のアミノ酸の置換または欠失を有する対応のポリペプチド、をコードする単離核酸分子。
【請求項２】
ｃＤＮＡである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
ゲノムＤＮＡである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、更にアフィニティータグペプチド配列を有する、請求項１〜３のいずれかの核酸分子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか記載の核酸分子を有するベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項７】
配列番号５の９３〜２０１のアミノ酸残基からなるポリペプチド、または、少なくとも１のアミノ酸の置換または欠失を有する対応のポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、細胞増殖、細胞分化、細胞遊走、細胞生存および血管透過性からなるグループから選択される少なくとも一つの内皮細胞生物活性を刺激する能力を有するか、あるいは、内皮細胞に結合する能力を有するが少なくとも一つの前記生物活性を刺激する能力を有さない、配列番号５の９３〜２０１のアミノ酸残基からなるポリペプチド、または、少なくとも１のアミノ酸の置換または欠失を有する単離ポリペプチド。
【請求項８】
更にアフィニティータグペプチド配列を有する、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
請求項７に記載のポリペプチドに対して特異的な反応性を有する抗体。
【請求項１０】
前記抗体が、ポリクローナル抗体である請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体が、モノクローナル抗体である請求項９に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体が、ヒト化抗体である請求項９に記載の抗体。
【請求項１３】
前記抗体が、キメラ抗体である請求項９に記載の抗体。
【請求項１４】
前記抗体が、検出可能なラベルで標識されている請求項９〜１３のいずれかに記載の抗体。
【請求項１５】
請求項７または８に記載のポリペプチドを作る方法であって、前記方法が以下の工程：
ｉ）前記ポリペプチドをコードする核酸配列が発現するように、プロモーター配列に操作可能に結合した前記ポリペプチドをコードする核酸配列を有するベクターを有する宿主細胞を培養する工程；そして
ｉｉ）前記宿主細胞から、または、前記宿主細胞が培養される増殖培地から前記ポリペプチドを単離する工程、を有する方法。
【請求項１６】
請求項７または８のポリペプチドを単離する方法であって、下記の工程：
ｉ）前記ポリペプチドを発現する細胞からの前記ポリペプチドの放出を促進するために、前記細胞をヘパリンに曝す工程と、そして、
ｉｉ）そのようにして放出されたポリペプチドを精製する工程、
とを有する、方法。
【請求項１７】
請求項１〜４のいずれかに記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドを発現する能力のあるベクターを作る方法であって、前記方法が、前記核酸分子が少なくとも一つのプロモーターと作用するように結合する位置において、前記核酸分子をベクターに挿入する工程を有する、方法。
【請求項１８】
アンチセンスヌクレオチド配列を有するベクターであって、前記アンチセンスヌクレオチド配列が、請求項７または８に記載のポリペプチドをコードし、血管透過性、内皮細胞の増殖および内皮細胞分化から選択される少なくとも一つの生物活性を促進する、ゲノムＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、またはｃＤＮＡ配列の少なくとも一部に対して相補的であって、前記ベクターが前記少なくとも一つの活性を阻害するために使用可能である、アンチセンスヌクレオチド配列を有するベクター。
【請求項１９】
内皮細胞の増殖を生体外において刺激する方法であって、内皮細胞を増殖するのに有効な量の請求項７または８に記載のポリペプチドに接触させる工程を有する、内皮細胞の増殖を生体外において刺激する方法。
【請求項２０】
前記内皮細胞が、血管内皮細胞またはリンパ内皮細胞である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項７または８に記載のポリペプチド、および薬学で許容されるキャリアまたはアジュバントを有する、医薬組成物。
【請求項２２】
更に、ＶＥＧＦ，ＶＥＧＦ−Ｂ，ＶＥＧＦ−Ｃ，ＰｌＧＦ，ＰＤＧＦ，ＦＧＦおよびヘパリンからなるグループから選択される少なくとも一つの物質を有する、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
請求項９に記載の抗体、および薬学で許容されるキャリアまたはアジュバントを有する、医薬組成物。
【請求項２４】
前記抗体が、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、および、キメラ抗体からなるグループから選択される請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
請求項７または８に記載の第一のポリペプチド、および第二のポリペプチドからなる、タンパク質ダイマー。
【請求項２６】
前記タンパク質ダイマーがホモダイマーであり、前記第二のポリペプチドが、前記第一のポリペプチドと同じである、請求項２５に記載のタンパク質ダイマー。
【請求項２７】
前記タンパク質ダイマーがヘテロダイマーであり、前記第二のポリペプチドが、ＶＥＧＦ，ＶＥＧＦ−Ｂ，ＶＥＧＦ−Ｃ，ＰｌＧＦおよびＰＤＧＦからなるグループから選択される、請求項２５に記載のタンパク質ダイマー。
【請求項２８】
生物試料中における請求項７または８に記載のポリペプチドを検出する方法であって、前記試料を、前記ポリペプチドに結合する能力のある抗体に接触させる工程と、前記抗体の結合の発生を検出する工程とを有する、方法。
【請求項２９】
生体外におけるＶＥＧＦ受容体２の活性化方法であって、前記受容体を有する細胞を、前記受容体を活性化するのに有効な用量の請求項７または８に記載のポリペプチドに曝す工程を有する、生体外におけるＶＥＧＦ受容体２の活性化方法。
【請求項３０】
生体外におけるＶＥＧＦ受容体３の活性化方法であって、前記受容体を有する細胞を、受容体を活性化するのに有効な用量の請求項７または８に記載のポリペプチドに曝す工程を有する、生体外におけるＶＥＧＦ受容体３の活性化方法。
【請求項３１】
請求項９に記載の抗体と、前記抗体の結合を検出するための手段を有する、診断または予知のテストキット。
【請求項３２】
ポリメラーゼに作用するように結合する、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸分子に対して特異的なプライマーの対を有する、診断または予知のテストキットであって、前記ポリメラーゼがＤＮＡサンプルからの前記核酸分子を選択的に増幅することが可能となる、診断または予知のテストキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内皮細胞に対する増殖因子、そして具体的には新規な血管内皮増殖因子、その因子をコードするＤＮＡ、およびその因子を利用する、またはその因子に由来する、医薬および診断の組成物ならびに方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
血管新生は、組織の正常な成長および発達に必要とされる基礎的なプロセスであり、先在血管からの新しい毛細血管の増殖に関する。血管新生は、胚発生および正常な組織の成長、修復、および再生に関するだけでなく、女性の生殖周期、妊娠の確立と維持、および創傷と骨折の修復にも関与している。正常の個体において起こる血管新生の他に、血管形成の現象は、多くの病的プロセス、特に、腫瘍の増殖および転移、そして特に微小血管系の、血管増殖が増大するその他の状態、例えば、糖尿病性網膜症、乾癬、および関節症などに関係している。血管新生の阻害はこれらの病的プロセスの阻止または緩和において有用である。
【０００３】
一方で、血管新生（化）が確立または拡張するべき状況、例えば組織または臓器移植後、または虚血性心疾患および血栓性閉塞性動脈炎のような、組織の梗塞または動脈狭窄において側副循環の確立を刺激するためにおいては血管新生の促進が望ましい。
【０００４】
血管新生が、非常に多くの生理学的および病理学的なプロセスにおいて重大な役割を果たしているため、血管新生のコントロールに関与する因子について熱心に研究が行われてきた。多数の増殖因子が血管新生の調節に関与していることが示されている；これらには、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）そして肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）が含まれる。例えば、概説として、フォークマン（Folkman）他, “Angiogenesis”, J. Biol. Chem., 1992 267 10931-10934を参照。
【０００５】
内皮細胞−特異的増殖因子の特定のファミリーおよびそれらに対応する受容体は、主として内皮細胞の増殖および分化に対する刺激、および、分化した細胞の特定の機能についての、原因であると示唆されてきた。これらの因子はＰＤＧＦファミリーのメンバーであり、内皮受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を介して作用すると考えられる。これまでに４つの血管内皮増殖因子のサブタイプが同定されている。現在ではＶＥＧＦ−Ａとして知られている、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、いくつかのソースから単離されている。ＶＥＧＦ−Ａは、内皮細胞に対して高度に特異的な分裂促進活性を示し、血管新生を引き起こす連続した現象全体を刺激することができる。さらに、それは単球に対する強い化学遊走活性を有し、内皮細胞においてプラスミノーゲン活性化因子およびプラスミノーゲン活性化因子阻害剤を誘導することができ、そして微小血管の透過性にも影響を及ぼすことができる。後者の活性のために、それは、血管透過性因子（ＶＰＦ）と称されることもある。
【０００６】
ＶＥＧＦの単離および特性についてはレビューにおいて概説されている；  ファーララ(Ferrara) 他, “The Vascular Endothelial Growth Factor Family of Polypeptides” J. Cellular Biochem., 1991 47 212-218およびConnolly, “Vascular Permeability Factor: A Unique Regulator of Blood Vessel Function”, J. Cellular Biochem., 1991 47 219-223 を参照。
【０００７】
より最近には、３つの更なるＶＥＧＦファミリーのメンバーが同定された。これらはＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ２と命名されている。ＶＥＧＦ−Ｂは、Ludwig Institute for Cancer ResearchおよびThe University of Helsinkiによる国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０２９５７（ＷＯ９６／２６７３６）において記載されており、ＶＥＧＦ−Ｃは、ヨウコフ（Joukov）他, The EMBO Journal, 1996 15 290-298において記載されており、そしてＶＥＧＦ２は、Human Genome Sciences, Inc. による国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５２９１（ＷＯ９５／２４４７３）において記載されている。ＶＥＧＦ−Ｂは、ＶＥＧＦのものと非常によく似た血管形成およびその他の特性を有するが、ＶＥＧＦとは異なる組織において分布、発現している。具体的には、ＶＥＧＦ−Ｂは、心臓において非常に強く発現しており、そして肺においては弱くしか発現しておらず、これはＶＥＧＦの場合と逆である。これは、ＶＥＧＦとＶＥＧＦ−Ｂは、多くの組織において共発現(co-expressed)しているという事実にかかわらず、機能において異なっている可能性があるということを示唆している。
【０００８】
ＶＥＧＦ−Ｂは、細胞のレチノイン酸結合タンパク質タイプＩ（ＣＲＡＢＰ−Ｉ）と相互作用する可能性のある細胞タンパク質のためのスクリーニング法であった、酵母共ハイブリッド相互作用トラップスクリーニング技術を用いて単離された。その単離と特徴については、ＰＣＴ／ＵＳ９６／０２９５７およびオロフソン（Olofsson）他, Proc. Natl. Acad. Sci., 1996 93 2576-2581において詳細に記載されている。
【０００９】
ＶＥＧＦ−Ｃは、ＰＣ−３前立腺ガン細胞ライン（ＣＲＬ１４３５）の条件培地から、Ｆｔｌ４を発現するようにトランスフェクトされた細胞を用いた、内皮細胞−特異的受容体チロシンキナーゼＦｔｌ４のチロシンリン酸化を生じさせる培地の能力についてのスクリーニングによって単離された。ＶＥＧＦ−Ｃは、組換えＦｔｌ４を用いたアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製され、ＰＣ−３  ｃＤＮＡライブラリーからクローニングされた。その単離と特徴については、ヨウコフ（Joukov）他, The EMBO Journal, 1996 15 290-298において詳細に記載されている。
【００１０】
ＶＥＧＦ２は、高度に腫瘍形成性の(tumorgenic)、エストロゲン非依存性のヒト乳ガン細胞ラインから単離された。この分子はＰＤＧＦに対して約２２％のホモロジー、およびＶＥＧＦに対して３０％のホモロジーを有すると述べられているが、ＶＥＧＦ２をコードする遺伝子の単離方法については明らかではなく、生物活性のキャラクタリゼーションについては開示されていない。
【００１１】
血管内皮増殖因子はＰＤＧＦ−受容体ファミリーの受容体チロシンキナーゼに結合することによって作用していると考えられる。５つの内皮細胞−特異的受容体チロシンキナーゼ、即ち、Ｆｌｔ−１（ＶＥＧＦＲ−１）、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）、Ｆｌｔ４（ＶＥＧＦＲ−３）、ＴｉｅおよびＴｅｋ／Ｔｉｅ−２、が同定されている。これらのすべてがシグナル伝達のために必要な内因性のチロシンキナーゼ活性を有する。重要な、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｋ−１、ＴｉｅおよびＴｅｋ／Ｔｉｅ−２の血管形成と血管新生における特異的な役割は、マウス胚においてこれら受容体を不活性化するような標的化(targeted) 突然変異によって実証された。ＶＥＧＦＲ−１とＶＥＧＦＲ−２とは、ＶＥＧＦに高いアフィニティーで結合し、そしてＶＥＧＦＲ−１は、ＶＥＧＦ−Ｂおよび胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）にも結合する。ＶＥＧＦ−ＣはＦｌｔ４（ＶＥＧＦＲ−３）に対するリガンドであることが示され、そしてＶＥＧＦＲ−２も活性化する(ヨウコフ（Joukov）他, 1996)。Ｔｅｋ／Ｔｉｅ−２に対するリガンドは記載されている(Regeneron Pharmaceuticals, Inc.による国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９５／１２９３５（ＷＯ９６／１１２６９）)；しかしＴｉｅに対するリガンドはまだ同定されていない。
【００１２】
受容体Ｆｌｔ−４は胎児においては静脈およびリンパ内皮に発現しており、そして成人においては主にリンパ内皮に発現している(カイパイネン（Kaipainen）他, Cancer Res, 1994 54 6571-6577; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995 92 3566-3570)。ＶＥＧＦ−Ｃはリンパ内皮において第一の機能を有しており、血管新生と透過性の制御において、ＶＥＧＦと共有される第二の機能を有している可能性があるということが示唆されている(ヨウコフ（Joukov）他, 1996)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
血管内皮増殖因子ファミリーの新規なタンパク質をコードするヒトｃＤＮＡを提供、及びその利用を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
今回我々は血管内皮増殖因子ファミリーの新規なタンパク質をコードするヒト
ｃＤＮＡを単離した。ＶＥＧＦ−Ｄと称する、その新規なタンパク質は、このファミリーのその他のメンバーと構造的類似性を示す。
【００１５】
発明の概要
本発明は、概して、内皮細胞の増殖または分化を刺激および／または増強する能力を有する新規に単離された増殖因子、その新規な増殖因子をコードする単離ＤＮＡ配列、および診断および／または治療上の適用のために有用な組成物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
第１の側面によれば、本発明は、ＶＥＧＦ−Ｄと命名され、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−ＢおよびＶＥＧＦ−Ｃに構造的にホモロガスな(homologous)新規なポリペプチドをコードする、単離および精製された核酸分子を提供する。好適な実施態様において、前記核酸分子は配列番号１、配列番号４、配列番号６または配列番号７に示す配列を含むｃＤＮＡである。本発明のこの側面は、配列番号１、配列番号４、配列番号６または配列番号７のＤＮＡに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするような配列のＤＮＡ分子も包含する。好ましくは前記ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡ分子は、ＶＥＧＦ−Ｄのアミノ酸残基９３からアミノ酸残基２０１の部分をコードするものであり、任意に（随意にoptionally）ＦＬＡＧＴＭペプチドをコードするＤＮＡ配列に、作用するように結合される(operatively linked)。
【００１７】
好ましくは、前記ｃＤＮＡは、配列番号４、配列番号６または配列番号７に示す配列を有し、より好ましくは配列番号４に示す配列を有する。
【００１８】
第２の側面によれば、本発明は、下記の特徴的なアミノ酸配列：
Pro-Xaa-Cys-Val-Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Cys-Xaa-Gly-Cys-Cys（配列番号２）
を有するポリペプチドを提供する。前記ポリペプチドは内皮細胞の増殖を刺激する能力を有し、そして前記ポリペプチドは、配列番号３に示すアミノ酸配列、または、内皮細胞の増殖、分化、遊走または生存の内、少なくとも１つを刺激する能力を有する、そのフラグメントまたはアナログに実質的に対応するアミノ酸配列を含む。
【００１９】
これらの能力は、ここでは“ＶＥＧＦ−Ｄの生物活性”と称し、そして当業者に周知の方法によって簡単にテストすることができる。好ましくは前記ポリペプチドは、限定されるものではないが、血管内皮細胞および／またはリンパ内皮細胞の増殖または分化を含む、内皮細胞の増殖または分化を刺激する能力を有する。
【００２０】
より好ましくは、前記ポリペプチドは、配列番号５、配列番号８または配列番号９に示す配列を有し、そして最も好ましくは配列番号５に示す配列を有する。
【００２１】
本発明の前記ポリペプチドの、好適なフラグメントは、ＶＥＧＦ−Ｄのアミノ酸残基９３からアミノ酸残基２０１の部分であり、任意に（optionally）ＦＬＡＧＴＭペプチドに、結合される。前記フラグメントがＦＬＡＧＴＭに結合している例として、前記フラグメントは、本出願において定義されるＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃがある。
【００２２】
したがって、保存的な置換、挿入または欠失を有するが、依然としてＶＥＧＦ−Ｄの生物活性を保持しているポリペプチドは、明らかに本発明の範囲内に含まれることが理解されるべきである。当業者であれば、例えば部位特異的突然変異誘発の使用、または特異的な酵素による切断およびライゲーション等の、そのようなポリペプチドを作成するのに簡単に使用できる方法を熟知しているであろう。当業者はまた、ペプチド擬態性の化合物(peptidomimetic compounds)または、１以上のアミノ酸残基が非−自然発生のアミノ酸またはアミノ酸アナログによって置換されている化合物が、ＶＥＧＦ−Ｄの生物活性に要求される側面を保持している可能性があるということについても知っているであろう。そのような化合物は、簡単に作ることができ、また当業者に周知の方法によってテストすることができ、そしてまた、本発明の範囲内に含まれる。
【００２３】
さらに、ＶＥＧＦ−Ｄにおいて起こることが知られている、選択的スプライシングの結果生じるＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドの変異体(variant)形態、および、ＶＥＧＦ−Ｄをコードする核酸配列の自然発生の対立遺伝子変異体(allelic variant)は、本発明の範囲内に含まれる。対立遺伝子変異体は、当業者に周知であり、置換、欠失、または１以上のヌクレオチドの付加を含むが、その結果としてコードされるポリペプチドに何ら実質的な機能的変化を起こさない、別の(alternative)形態または核酸配列を表す。
【００２４】
本出願において使用される“ＶＥＧＦ−Ｄ”という用語は、配列番号３、配列番号５、配列番号８、配列番号９のポリペプチド、および本出願において定義するＶＥＧＦ−Ｄの生物活性を有する、それらのフラグメントまたはアナログを、集合的に指すものである。
【００２５】
そのようなＶＥＧＦ−Ｄの変異体形態は、修飾(modification)のためにＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドの、非−必須領域を標的化することによって調製することができる。これらの非−必須領域は、本出願の図面、特に図２および図１０において示される強く保存された領域の外側にあると予想される。具体的には、ＶＥＧＦを含む、ＰＤＧＦファミリーの増殖因子は二量体であり、そしてＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡおよびＰＤＧＦ−ＢはＮ−末端ドメイン、即ち、ＰＤＧＦ−様ドメインにおいて、８つのシステイン残基の完全な保存を示す(オロフソン（Olofsson）他, 1996; ヨウコフ（Joukov）他, 1996)。これらのシステインは分子内および分子間ジスルフィド結合に関与すると考えられている。更に、完全ではないが強く保存された更なるシステイン残基がＣ−末端ドメインにおいて存在する。分子内ジスルフィド結合によって形成された、各サブユニットの、ループ１、２および３は、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーの増殖因子に対する受容体への結合に関与している(アンダーソン（Andersson）他: Growth Factors, 1995 12 159-164)。本出願において示すように、以前から知られているＶＥＧＦファミリーのメンバーにおいて保存されたシステインは、ＶＥＧＦ−Ｄにおいても保存されている。
【００２６】
したがって、当業者であれば、提案されるいかなる変異体形態においてもこれらのシステイン残基は保存されるべきであるということ、そしてループ１、２および３に存在する活性部位も保存されるべきであるということを、よく理解するであろう。しかし、この分子のその他の領域は生物学的機能において重要性は低く、それゆえ修飾(modification)のための好適な標的を提供するということが期待され得る。修飾された(modified)ポリペプチドは、細胞増殖テストのようなルーチン活性アッセイ方法によってＶＥＧＦ−Ｄの生物活性を示す能力について簡単にテストすることができる。
【００２７】
修飾されたＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドの中には、内皮細胞に、即ちＶＥＧＦ−Ｄ受容体に結合する能力を有するが、内皮細胞の増殖、分化、遊走、または生存を刺激する能力を有さないようなものがあると考えられる。これらの修飾されたポリペプチドは、ＶＥＧＦ−Ｄの競合性または非競合性の阻害剤として作用することができると期待され、ＶＥＧＦ−Ｄ作用の阻止または低下が望ましいような状況において有用であると期待される。したがって、そのような受容体−結合性であるが、非−分裂促進性、非−分化誘導性、非−遊走誘導性、または非−生存促進性の、ＶＥＧＦ−Ｄの変異体も、本発明の範囲内に含まれ、本出願において“受容体−結合性だが、その他の点では不活性な変異体”と称する。
【００２８】
第３の側面によれば、本発明は、本発明のポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントをコードする、精製および単離された核酸を提供する。前記核酸はＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡのいずれでもよく、一本鎖でも二本鎖でもよい。前記核酸は、細胞または組織ソースから単離しても、または、組換えあるいは合成起源のものでもよい。遺伝暗号の縮重のために、各配列が、配列番号３、配列番号５、配列番号８または配列番号９に示すアミノ酸配列、それらの活性フラグメントまたはアナログ、または、受容体−結合性だがその他の点では不活性あるいは部分的に不活性なそれらの変異体、をコードするような、多くのコード配列が可能であるということを当業者であれば理解するであろう。
【００２９】
本発明の第４の側面は、本発明のｃＤＮＡまたは本発明の第３の側面による核酸を含むベクター、および、本発明の核酸またはベクターでトランスフォームまたはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。これらの細胞は、本発明のポリペプチドの発現のために特に好適であり、バキュロウイルスベクターでトランスフォームされた、ＡＴＣＣ(the American Type Culture Collection)から入手可能なＳｆ９細胞（ＡＴＣＣ  ＳＲＬ−１７１）のような昆虫細胞、および好適な発現プラスミドによってトランスフェクトされたヒト胚腎臓細胞ライン２９３ＥＢＮＡを含む。本発明の好適なベクターは、本発明による核酸が、１以上の適切なプロモーターおよび／またはその他の調節配列（制御配列）に、作用するように(operatively)結合される（connected)発現ベクターであり、そのようなベクターでトランスフォームまたはトランスフェクトされた適切な宿主細胞は、本発明のポリペプチドを発現することが可能となる。その他の好適なベクターは、哺乳動物細胞のトランスフェクションのため、または遺伝子治療のために好適な、アデノウイルスまたはレトロウイルスベクターまたはリポソームなどである。多くのそのようなベクターは当業者に周知である。
【００３０】
本発明はまた、本発明による核酸によってコードされるポリペプチドを発現させることができるベクターの製造方法を提供する。この方法は、上述したように、前記核酸を、１以上の適切なプロモーターおよび／またはその他の調節配列（制御配列）に、作用するように結合させる工程を含むものである。
【００３１】
本発明は更に、本発明によるポリペプチドの製造方法を提供する。この方法は、本発明の核酸またはベクターを宿主細胞中で発現させる工程、および前記宿主細胞または前記宿主細胞の増殖培地から前記ポリペプチドを単離する工程とを含むものである。本発明のこの側面の１つの好適な実施態様において、アフィニティークロマトグラフィーによる前記ポリペプチドの精製を促進するために、発現ベクターに更に、ＦＬＡＧＴＭまたはヘキサヒスチジン(hexahistidine)などのアフィニティータグをコードする配列を含ませる。
【００３２】
さらに別の側面において、本発明は、本発明のポリペプチドと特異的に反応する抗体を提供する。本発明のこの側面は、前述したＶＥＧＦ−Ｄの変異体形態、フラグメントおよびアナログに対して特異的な抗体を含む。そのような抗体は、ＶＥＧＦ−Ｄの阻害剤またはアゴニストとして、およびＶＥＧＦ−Ｄの検出および定量化のための診断剤として、有用である。ポリクローナル抗体もモノクローナル抗体も利用できる。モノクローナルおよびポリクローナル抗体は、当該技術分野における標準的方法を使用して、本発明のポリペプチドに対して産生することができる。ある種の目的のために、例えば、臨床状況においてＶＥＧＦ−Ｄの効果を阻害するためにモノクローナル抗体を使用するべき場合などでは、ヒト化モノクローナル抗体またはキメラモノクローナル抗体を使用するのが望ましいであろう。組換えＤＮＡ法を含む、これらの産生方法も、当業者に周知である。
【００３３】
本発明のこの側面はまた、ＶＥＧＦ−Ｄを認識し、そして適切に標識された抗体も含む。
【００３４】
本発明によるポリペプチドまたは抗体は、検出可能なラベル（標識）で標識して、診断目的のために利用することができる。同様にそのように標識された  本発明のポリペプチドは、それに対応する受容体をin situで同定するために使用することができる。ポリペプチドまたは抗体を、イメージングのために好適な、超−磁性の(supermagnetic)、 常磁性の、高電子密度の、エコジェニックの(ecogenic)、または放射性の作用剤と、共有結合で、または非−共有結合で、結合させることができる。診断アッセイにおける使用のために、放射性または非放射性ラベルを使用することができ、後者は酵素標識またはビオチン／アビジン系のラベルを含む。
【００３５】
本発明の臨床応用は、診断上の応用、創傷治癒、組織または臓器移植において、または、虚血性心疾患などの、組織梗塞または動脈狭窄における側副循環の確立のためにおける血管新生の促進、およびガンまたは糖尿病性網膜症の治療における血管新生の阻害を含む。ガンの生検材料におけるＶＥＧＦ−Ｄの定量化は、将来の転移のリスクの指標として利用できる。
【００３６】
ＶＥＧＦ−Ｄは、肺において高度に発現しており、そしてまた、それは血管透過性を増大させるので、ＶＥＧＦ−Ｄは様々な肺の病状に関連する。ＶＥＧＦ−Ｄアッセイは様々な肺の疾患の診断において利用することができる。ＶＥＧＦ−Ｄはまた、肺における血液循環および／または肺と血流との間のガス交換を改善するための、肺の疾患の治療において利用することができる。同様にＶＥＧＦ−Ｄは、心不全の場合において、心臓への血液循環およびＯ２ガス透過性を改善するために利用することができる。同様に、ＶＥＧＦ−Ｄは、慢性閉塞性気道疾患において、血流およびガス交換を改善するために利用することができる。
【００３７】
逆に、ＶＥＧＦ−Ｄアンタゴニスト（例えば、抗体および／または阻害剤）は、鬱血心不全などの、例えば肺において、血管透過性の増大によって生じる体液の蓄積に関連する病状を治療するために利用することができる。これはＶＥＧＦ−Ｄアンタゴニストが、体液の蓄積に対して反作用する（体液の蓄積を相殺する）ために、血管透過性を相殺する効果を及ぼすことによる。
【００３８】
ＶＥＧＦ−Ｄは小腸および大腸においても発現しており、ＶＥＧＦ−Ｄの投与は、その血液循環増大活性および血管透過性増大活性により、腸管における吸収不良症候群を治療するために利用することができる。
【００３９】
したがって、本発明は、血管新生および／または新血管新生を刺激するような治療を必要とする哺乳類において、血管新生および／または新血管新生を刺激する方法を提供する。この方法は、有効量の、ＶＥＧＦ−Ｄ、または、内皮細胞の増殖を刺激する能力を有するそのフラグメントまたはアナログを、哺乳類に投与する工程を含むものである。
【００４０】
ＶＥＧＦ−ＤをＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦおよび／またはヘパリンのうち１以上と同時に、あるいは共同させて任意に投与してもよい。
【００４１】
逆に、本発明は、血管新生および／または新血管新生を阻害するような治療を必要とする哺乳類において、血管新生および／または新血管新生を阻害する方法を提供する 。この方法は、有効量の、ＶＥＧＦ−Ｄアンタゴニストを、哺乳類に投与する工程を含むものである。前記アンタゴニストは、ＶＥＧＦ−Ｄの、その対応する受容体または標的細胞への結合を阻止することにより、あるいは、前記受容体からその細胞の作用部位へのシグナルトランスデューサーの活性化を阻止することにより、ＶＥＧＦ−Ｄの作用を阻止する薬剤であればいかなるものであってもよい。好適なアンタゴニストは、ＶＥＧＦ−Ｄに対する抗体；前述した、受容体−結合性であるが、非−分裂促進性のＶＥＧＦ−Ｄ変異体などの、競合性または非−競合性の、ＶＥＧＦ−ＤのＶＥＧＦ−Ｄ受容体への結合の阻害剤；およびＶＥＧＦ−ＤをコードするＤＮＡ配列の少なくとも１部分に対して相補的なアンチセンスヌクレオチド配列、を含むが、それらに限定されるものではない。
【００４２】
本発明はまた、生物試料（サンプル）中のＶＥＧＦ−Ｄを検出する方法を提供する。この方法は、前記試料を、ＶＥＧＦ−Ｄに結合する能力を有する試薬に接触させる工程、および結合を検出する工程を含むものである。好ましくは、ＶＥＧＦ−Ｄに結合する能力を有する試薬は、ＶＥＧＦ−Ｄに対する抗体であり、より好ましくはモノクローナル抗体である。好適な実施態様において、結合および／または結合の程度は検出可能なラベル手段によって検出される；好適なラベルは前述のものである。
【００４３】
ＶＥＧＦ−Ｄまたはアンタゴニストが治療の目的のために使用される場合、適用用量および経路は、治療されるものの状態に依存し、そして主治医または獣医の判断の自由（裁量）によるであろう。好適な経路は、皮下、筋肉内、または静脈内の注射、局所適用、インプラント、等を含む。ＶＥＧＦ−Ｄの局所適用は、ＶＥＧＦと同様の方法で行えばよい。
【００４４】
更に別の側面によると、本発明は、典型的にはテストキットの形態の、診断／予知（予後prognostic）の手段を提供する。例えば、本発明の１つの実施態様において、ＶＥＧＦ−Ｄに対する抗体および検出のための手段を含み、そしてより好ましくは、前記抗体とＶＥＧＦ−Ｄの間の結合を評価する工程を含む、診断／予知のテストキットを提供する。本発明による前記診断／予知の手段の、１つの好適な実施態様において、前記抗体または前記ＶＥＧＦ−Ｄのいずれかが検出可能なラベル（標識）で標識され、そして前記抗体または前記ＶＥＧＦ−Ｄのいずれかが基体(substrate) に結合され、そうすることによって前記抗体と前記ＶＥＧＦ−Ｄの間の結合の後に、前記基体(substrate) に付着したラベルの量を測定することによって、ＶＥＧＦ−Ｄ−抗体相互作用を調べることができる。本発明の特に好適な実施態様において、前記診断／予知の手段を、通常のＥＬＩＳＡキットとして提供することができる。
【００４５】
更に別の実施態様において、前記診断／予知の手段は、試験個体のＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子のゲノム配列構造を明らかにするための、ポリメラーゼ連鎖反応手段、および、この配列構造を、ＶＥＧＦ−Ｄ発現における何らかの異常が所与の疾患状態と関連しているか否かを明らかにするために、何らかの異常を検出する目的で、本出願において開示された配列構造と比較する工程を有するものとすることができる。
【００４６】
更なる側面によると、本発明は、試験対象における疾患状態と関連している可能性がある、試験対象のＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子構造における異常を検出する方法に関する。この方法は、前期試験対象からＤＮＡサンプルを用意する工程；前記ＤＮＡサンプルを、ポリメラーゼに作用するように結合したＶＥＧＦ−Ｄ  ＤＮＡに対して特異的なプライマーのセットと接触させ、ポリメラーゼ連鎖反応によって前記サンプルからのＶＥＧＦ−Ｄ  ＤＮＡを選択的に増幅する工程、および、前記サンプルからの前記増幅されたＶＥＧＦ−Ｄ  ＤＮＡのヌクレオチド配列を、配列番号１または配列番号４に示すヌクレオチド配列と比較する工程、を含むものである。本発明はまた、ポリメラーゼに作用するように結合したＶＥＧＦ−Ｄ  ＤＮＡに対して特異的なプライマー対を含むテストキットの提供も含むものであり、ここで前記ポリメラーゼはＤＮＡサンプルからのＶＥＧＦ−Ｄ  ＤＮＡを選択的に増幅する能力を有するものである。
【００４７】
本発明の別の側面は、ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチド、または、内皮細胞の増殖を促進するそのフラグメントまたはアナログ、または、それに対する抗体のいずれかを含む医薬組成物の提供に関する。ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドを含む組成物は、任意に、更にＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−ＢおよびＶＥＧＦ−Ｃ、および／またはヘパリンのうち一以上を含むものとすることができる。
【００４８】
更なる側面において、本発明は、ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドを含むタンパク質ダイマー、特にジスルフィド結合したダイマーに関する。本発明のタンパク質ダイマーは、ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドのホモダイマー、および、ＶＥＧＦ−Ｄと、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＰｌＧＦまたはＰＤＧＦとからなるヘテロダイマーの両方を含む。
【００４９】
本発明の更に別の側面によると、ＶＥＧＦ−Ｄの単離のための方法が提供され、この方法は、ＶＥＧＦ−Ｄを発現する細胞をヘパリンに曝して前記細胞からのＶＥＧＦ−Ｄの放出を促進する工程と、そのようにして放出されたＶＥＧＦ−Ｄを精製する工程とを含むものである。
【００５０】
本発明の別の側面は、ＶＥＧＦ−Ｄまたは内皮細胞の増殖を促進するそのフラグメントまたはアナログをコードするＤＮＡ配列の少なくとも一部に対して相補的なアンチセンスヌクレオチド配列を有する、ベクターの提供に関する。本発明の更に別の側面によると、アンチセンス配列を有するようなベクターは、ＶＥＧＦ−Ｄの発現を阻害するため、または少なくとも弱めるために、利用可能である。
【００５１】
ＶＥＧＦ−Ｄの発現を阻害するためのこのタイプのベクターの使用は、例えば、血管新生の用意のために、腫瘍がＶＥＧＦ−Ｄを産生する場合などの、ＶＥＧＦ−Ｄの発現が、疾患に関連しているような場合において好ましい。アンチセンスヌクレオチド配列を有するベクターでそのような腫瘍細胞をトランスフォーメーションすることにより、血管新生が抑制または遅延され、そしてその腫瘍の増殖を阻害、あるいは遅らせることになるであろう。
【００５２】
上述のような本発明のポリヌクレオチド、それらポリヌクレオチドのフラグメント、および、それらポリヌクレオチドの非−コード鎖とそれらに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするのに十分な類似性を有するそれらポリヌクレオチドの変異体は、すべて、その他の、非−ヒトの、ＶＥＧＦ−Ｄの哺乳類の形態をコードするポリヌクレオチドを、同定、精製、および単離するために有用である。したがって、そのようなポリヌクレオチドのフラグメントおよび変異体は、本発明の側面であると考えられる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は以下の通りである：５ｘＳＳＣ、２０ｍＭ  ＮａＰＯ４、ｐＨ６．８、５０％ホルムアミド中で４２℃でのハイブリダイゼーション；そして０．２ｘＳＳＣ中で４２℃での洗浄、である。ハイブリダイズさせる配列の長さおよびＧＣヌクレオチド塩基含量に基づいて、経験的にこれらの条件を変化させることが望ましいということ、およびそのような変化量を決定するための式が存在するということは、当業者に理解されている。例えば、サムブルック（Sambrook）他, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Second Edition, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory(1989)を参照。
【００５３】
更に、精製および単離された、その他の、非−ヒトの、哺乳類のＶＥＧＦ−Ｄの形態をコードするポリヌクレオチドもまた、それによってコードされるポリペプチド、そして非−ヒトＶＥＧＦ−Ｄ変異体に対して特異的に免疫反応性である抗体と同様に、本発明の側面である。したがって、本発明は、精製および単離された哺乳類のＶＥＧＦ−Ｄポリペプチド、そしてまた、そのようなポリペプチドをコードする精製および単離されたポリヌクレオチドを含むものである。
【００５４】
本発明の核酸およびポリペプチドは、合成的手段または組換え手段によって調製することができ、または、天然のソースから精製することができる、ということが明らかに理解されるであろう。
【００５５】
図面の簡単な説明
図１は、ヒトＶＥＧＦ−ＤとヒトＶＥＧＦ１６５（図１ａ）、ヒトＶＥＧＦ−ＤとヒトＶＥＧＦ−Ｂ（図１ｂ）、ヒトＶＥＧＦ−ＤとヒトＶＥＧＦ−Ｃ（図１ｃ）、そしてヒトＶＥＧＦ−ＤとヒトＰｌＧＦ（図１ｄ）の、配列間の比較を示す。箱は、ヒトＶＥＧＦ−Ｄと正確に一致する残基を示す。
図２は、ヒトＶＥＧＦ−Ｄ、ヒトＶＥＧＦ１６５、ヒトＶＥＧＦ−Ｂ、ヒト
ＶＥＧＦ−Ｃ、およびヒトＰｌＧＦの配列間の、配列アラインメントを示す。箱は、ＶＥＧＦ−Ｄ配列と正確に一致する残基を示す；そして、
図３は、ｃＤＮＡ配列（配列番号１）から予測した、ヒトＶＥＧＦ−Ｄのアミノ酸配列（配列番号３）を示す。箱は、Ｎ−結合型グリコシル化の可能性のある部位を示す。
図４は、市販のヒト肺ｃＤＮＡライブラリーからハイブリダイゼーションによって単離した、ヒトＶＥＧＦ−Ｄをコードする第２のｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列（配列番号４）を示す；このｃＤＮＡは、ヒトＶＥＧＦ−Ｄの全体のコード領域を含む。
図５は、図４のｃＤＮＡ配列から推定した(deduced) 、ヒトＶＥＧＦ−Ｄのアミノ酸配列（配列番号５）を示す。
図６は、市販のマウス肺ｃＤＮＡライブラリーからハイブリダイゼーションスクリーニングによって単離した、マウスＶＥＧＦ−Ｄ１をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号６）を示す。
図７は、図６と同じライブラリーから単離した、マウスＶＥＧＦ−Ｄ２をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号７）を示す。
図８は、マウスＶＥＧＦ−Ｄ１の推定アミノ酸配列（配列番号８）とマウス
ＶＥＧＦ−Ｄ２の推定アミノ酸配列（配列番号９）を示す。
図９は、マウスＶＥＧＦ−Ｄ１、マウスＶＥＧＦ−Ｄ２、およびヒトＶＥＧＦ−Ｄの推定アミノ酸配列間の、比較を示す。
図１０は、ヒトＶＥＧＦ−Ｄ、ヒトＶＥＧＦ１６５、ヒトＶＥＧＦ−Ｂ、ヒト
ＶＥＧＦ−Ｃ、およびヒトＰｌＧＦのアミノ酸配列間の配列アラインメントを示す；そして、
図１１は、ＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｄのいずれかを発現するＣＯＳ細胞からの条件培地を、Ｂａ／Ｆ３細胞において発現したキメラ受容体の細胞外ドメインに対して結合する能力についてテストした、バイオアッセイの結果を示す。
図１２は、ＶＥＧＦ−Ｄペプチドの免疫沈降およびウエスタンブロッティング分析の結果を示す。
（Ａ）ｐＥＦＢＯＳＶＥＧＦＤｆｕｌｌＦＬＡＧおよびｐＣＤＮＡ−１ＶＥＧＦ−ＡをＣＯＳ細胞にトランスフェクトし、生合成的に３５Ｓ−システイン／メチオニンで４時間標識した。これら培養からの上清を、Ｍ２ゲルまたはプロテインＡに結合したＶＥＧＦ−Ａに対する抗血清のいずれかで免疫沈降した。洗浄したビーズを等容量の２ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーで溶出し、ボイルした。サンプルを次に１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。星印（★）でマークしたレーンは、サンプルをジチオスレイトールで還元し、ヨードアセトアミドでアルキル化したものを示す。分子量マーカーが示されている。ｆＡおよびｆＢは、
ｐＥＦＢＯＳＶＥＧＦＤｆｕｌｌＦＬＡＧを発現するＣＯＳ細胞からの、Ｍ２ゲルによって免疫沈降された、４３ｋＤおよび２５ｋＤ種を示す。
（Ｂ）精製したＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃのウエスタンブロッティング分析である。
Ｍ２アフィニティーカラムから溶出した物質のアリコット（フラクション＃３、ＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃ）を、２ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーと混合し、そして１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した。タンパク質を次にニトロセルロースメンブランにトランスファーし、モノクローナル抗体Ｍ２またはコントロールのアイソタイプが一致した抗体（Ｎｅｇ）のいずれかで探索した(probed)。ブロットを、ヤギ抗−マウス−ＨＲＰ二次抗体および化学発光(ECL, Amersham)を使用して現像した。単量体のＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃ、およびこのペプチドの推定上の二量体形態（ＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃ”）を矢印で示す。分子量マーカーが示されている。
図１３は、ＶＥＧＦＲ２バイオアッセイを用いた、ＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃタンパク質の分析の結果を示す。組換えＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃ、およびＭ２アフィニティークロマトグラフィーによって精製した物質を、ＶＥＧＦＲ２バイオアッセイを用いて評価した。ＩＬ−３を除去するために洗浄されたバイオアッセイ細胞（１０４）を、ＣＯＳ細胞でトランスフェクトされたＶＥＧＦ−Ｄからの条件培地のアリコット、アフィニティーカラムからのフラクション＃１（ボイド容量）またはアフィニティーカラムからのフラクション＃３（ＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃを含有する）とともにインキュベートした。すべてのサンプルは初濃度２０％（即ち１／５）で、その後倍加希釈してテストした。細胞を１０％ＣＯ２の加湿雰囲気において３７℃で４８時間インキュベートした。細胞の増殖を、１μＣｉの３Ｈ−チミジンを添加し、そして４時間以上かけて取り込まれた量をカウントすることによって定量化した。
図１４は、ＶＥＧＦ−Ｄでトランスフォームされた組換えバキュロウイルスベクターで感染させたＨＦ細胞からの培養上清による、ＮＩＨ３Ｔ３細胞上のＶＥＧＦＲ３受容体（Ｆｌｔ４）のチロシンリン酸化の刺激を示す。
図１５は、図１４におけるものと同様に調製した培養上清による、ＰＡＥ細胞におけるＶＥＧＦＲ２受容体（ＫＤＲ）のチロシンリン酸化の刺激を示す。
図１６は、ウシの大動脈の内皮細胞（ＢＡＥ）に対するＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃの分裂促進効果を示す。ＢＡＥを、ＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃを含有するフラクション＃３、およびポジティブコントロールとしてテキストにおいて記載された精製ＶＥＧＦ−Ａを用いて処理した。増殖因子を添加していない培地を用いて得られた結果を、培地コントロールと示す。
【実施例】
【００５６】
本発明を図面および、以下の限定するものではない諸例に言及することによって詳細に説明する。
【００５７】
例１
ＶＥＧＦＲファミリーにおいて、オーファン受容体は知られていないため、ＶＥＧＦファミリーの更なるメンバーは見いだされないだろうと考えられてきた。さらに、我々は従来技術において、その他のそのようなファミリーメンバーが存在するであろうという示唆について何ら知らない。
【００５８】
核酸データベースのコンピューターサーチを、他のプロジェクトに付随して、サーチトピックスとしてＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−ＣおよびＰｌＧＦのアミノ酸配列を使用して行った。このサーチによっていくつかのｃＤＮＡ配列が同定された。これらの配列の１つである、GenBank登録番号Ｈ２４８２８は、ＶＥＧＦ−ＣのシステインリッチＣ−末端領域に似た構造のポリペプチドをコードしていた。この配列は、ＥＳＴデータベース(database of expressed sequence tags)（ｄｂＥＳＴ）から得たものであり、この明細書でこれを特定するためにＸＰＴと命名する。このＸＰＴｃＤＮＡは、”Soares Breast 3NbHBst”と称される、成人女性の乳房組織からのｍＲＮＡを用いて構築された、ヒトｃＤＮＡライブラリーから単離されたものである。確認できる限り、これは正常な乳房組織であった。世界中の研究所からｃＤＮＡライブラリーを集め、ｃＤＮＡクローンの配列を整え(array)、配列決定のために他の組織にそれらを提供している、the Integrated Molecular Analysis of Genome Expression Consortium(IMAGE Consortium)にしたがって、ＸＰＴ  ＤＮＡの配列決定を行った。
【００５９】
データベースにおいて示されたＸＰＴ配列は、４１９ヌクレオチド長であり、ＶＥＧＦ−ＣのＣ−末端の１００アミノ酸、即ちヨウコフ（Joukov）他 (1996)のナンバリング方法を用いると、およそ残基２５０から３５０、に類似したアミノ酸配列をコードしていた。同様にその他のタンパク質においてシステインリッチ領域がみられるが、これらは、例えば、ユスリカ類のChironomus tentansの唾液腺において合成される分泌絹−様タンパク質ｓｐ１８５のように、ＶＥＧＦファミリーとは機能において全く無関係のものである。このタンパク質は、バルビアニ環、即ち、ユスリカ唾液腺における多糸染色体にみられる、組織特異的染色体“パフ”に位置する、遺伝子ＢＲ３によってコードされるものである(Dignam and Case: Gene, 1990 88 133-140; ポールソン（Paulsson）他, J. Mol. Biol., 1990 211 331-349) 。ヨウコフ（Joukov）他 (1996)においては、ＶＥＧＦ−Ｃにおけるｓｐ１８５−様構造モチーフは、フォールディングされて独立したドメインになる可能性があり、それは生合成の後少なくとも部分的に切断されると考えられるということ、そしてＶＥＧＦのＣ−末端領域において、ｓｐ１８５型の少なくとも一つのシステインモチーフが存在するということが述べられている。
【００６０】
ヨウコフ（Joukov）他の図３は、ＶＥＧＦ−ＣのＣ−末端の、システインリッチ領域の最後の３分の２は、ＶＥＧＦまたはＰｌＧＦと整列化(align)せず、実際にＶＥＧＦまたはＰｌＧＦにおいては存在しないＶＥＧＦ−ＣのＣ−末端延長（部）と考えられるであろうということを示している。ＸＰＴによってコードされる配列はこの延長部と類似している。ＸＰＴ  ｃＤＮＡはその５’末端において切断されており（切形（truncated）であり）、そのためシステインリッチドメインに対してＮ−末端側の領域についてのアミノ酸配列は推定することも予想することも全く不可能であった。したがって、ＸＰＴ−由来の配列に類似しているＶＥＧＦ−Ｃの部分は、その他のＶＥＧＦファミリーのメンバーの間で保存されているＶＥＧＦ−Ｃの領域まで延長していない。
【００６１】
上述のように、全長ＸＰＴ核酸によってコードされるポリペプチドのＮ−末端領域（ｄｂＥＳＴにおいて報告されている切形（truncated）のＸＰＴ  ｃＤＮＡとは異なるので）が、ＶＥＧＦファミリーのメンバーのいずれか、特に、さらにＮ−末端の２５０アミノ酸を有する、ＶＥＧＦ−Ｃ、に対してなんらかのさらなるホモロジーを示すか否かを予想するのは不可能であった。例えば、全長ＸＰＴ核酸によってコードされる自然発生のタンパク質が、ユスリカ唾液腺タンパク質のヒトホモローグであるかもしれない。そうではなく、切形のＸＰＴ  ｃＤＮＡによってコードされるシステインリッチモチーフのタイプが、多くの構造ドメインと同様に、複数のタンパク質の間に広く分布しているかもしれない。例えば、システイン残基のクラスターは、金属結合、正確なタンパク質の折りたたみ（フォールディング）を促進するための分子内ジスルフィド結合の形成、または、タンパク質サブユニットから複合体の構築（アセンブリー）のための分子間ジスルフィド結合の形成に関与している可能性がある(Dignam and Chase, 1990)。切形のＸＰＴ  ｃＤＮＡが、ＶＥＧＦ−関連分子をコードする配列に由来するものであったかを判定するためには、より長いｃＤＮＡを単離する必要があった。
【００６２】
例２ ＶＥＧＦ−ＤをコードするｃＤＮＡのクローニング
ｄｂＥＳＴにおいて報告されているＸＰＴ  ｃＤＮＡのサンプルを、the IMAGE Consortiumによって得られたｃＤＮＡクローンの登録供給者である、ＡＴＣＣ(the American Type Culture Collection)から入手した。ＸＰＴ  ｃＤＮＡのアイデンティティ（同一性）を、ジデオキシチェーンターミネーション法(サンガー（Sanger）他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977 74 5463-5467)を使用したヌクレオチド配列決定によって確認した。
【００６３】
ＸＰＴ  ｃＤＮＡを、Clontechから購入した、ヒト乳房ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのハイブリダイゼーションプローブとして使用した。１つの陽性クローンが単離され、そしてこのクローンを次に両鎖について配列決定した。ヌクレオチド配列を編集し、そしてオープンリーディングフレームを同定した。この核酸配列を配列番号１に示す。この配列によってコードされるポリペプチドをＶＥＧＦ−Ｄと命名し、そして配列番号３に表示したその推定アミノ酸配列を、図３に示す。図３において、コンセンサス配列Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ、ただしＸは任意のアミノ酸、を有する、推定上のＮ−結合型グリコシル化部位を箱で囲って示してある。
【００６４】
例３ ＶＥＧＦ−Ｄの特性
ＶＥＧＦ−Ｄのアミノ酸配列を、ヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５，ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、およびＰｌＧＦのアミノ酸配列と比較した。これらの比較をそれぞれ、図１ａから１ｄに示す。配列ホモロジーの程度を計算したところ、配列内にアラインメント（整列化）の目的で導入された間隙を計算において考慮しない場合、ＶＥＧＦ−Ｄは、ＶＥＧＦと３１％同一であり、ＶＥＧＦ−Ｃと４８％同一であり、ＶＥＧＦ−Ｂと２８％同一であり、そしてＰｌＧＦと３２％同一である。したがって、確認された最も近い関係にあるタンパク質はＶＥＧＦ−Ｃであった。
【００６５】
The GenBank, EMBLおよびSwissProt核酸データベースでのコンピューターサーチではＶＥＧＦ−Ｄと同一の(identical)タンパク質配列は全く見られなかった。前述の配列アラインメントから予測されるように、これらのデータベースにおいてみられる、最も近い関係にあるタンパク質はＶＥＧＦ−Ｃであった。ｄｂＥＳＴのサーチも行ったが、ＶＥＧＦ−Ｄの完全なコード領域を包含する配列は全く見られなかった。ＶＥＧＦ−Ｄの配列は、WO96/11269に開示されているＴｉｅ−２リガンド１の配列とは無関係である。
【００６６】
検出されたホモロジーは単に、アミノ酸配列のレベルにおけるものにすぎないものであったということを留意することが重要である。したがって他のＶＥＧＦファミリーのメンバーをコードする核酸配列による低いストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションのような方法によって、ＶＥＧＦ−ＤをコードするｃＤＮＡまたはｇＤＮＡを単離するのは不可能であったであろう。
【００６７】
ＶＥＧＦ−Ｄは、ＶＥＧＦファミリーのすべてのメンバーの中でＶＥＧＦ−Ｃに最も近い関係にあるようである。ＶＥＧＦ−Ｄアミノ酸配列はＶＥＧＦ−Ｃにおいて見られるシステインリッチｓｐ８１５−様モチーフを含んでいるので、本発明のこのポリペプチドはリンパ内皮において重要な機能的役割を果たしている可能性がある。我々は提案されているいかなるメカニズムにも拘束される意図はないが、ＶＥＧＦ−ＣとＶＥＧＦ−Ｄとは、その上で内皮細胞が成長することが可能な絹−様マトリックスを構成している可能性があると考えられる。リンパ管は基底膜を有しておらず、したがって絹−様マトリックスが基底膜−様の物質を形成することが可能である。これは、細胞増殖の促進および／または細胞分化において重要である可能性があり、そして、ガン、特に転移、薬物療法、ガンの予後（予知）等に関連している可能性がある。
【００６８】
例４ ＶＥＧＦ−Ｄの生物学的特性
ＶＥＧＦ−ＤのｃＤＮＡ配列を使用して、ＶＥＧＦ−Ｄの推定アミノ酸配列、強塩基性、強酸性、疎水性および極性アミノ酸の数、分子量、等電点、ｐＨ７における電荷、およびタンパク質全体の組成分析を含む、コードされるポリペプチドの生化学的な特性を予想した。この分析はProteanタンパク質分析プログラム、バージョン1.20(DATASTAR)を使用して行った。これらの結果を以下の表１と表２とに要約する。表１はコドンの使用(codon usage)も示している。
【００６９】
【表１】
2007167072.tif 000002
【００７０】
【表１−１】
2007167072.tif 000003
【００７１】
【表２】
2007167072.tif 000004
【００７２】
【表２−１】
2007167072.tif 000005
【００７３】
この分析により、プロセシングされていないＶＥＧＦ−Ｄモノマーの分子量は３７キロダルトン（ｋＤ）であると予想される。これに比べて（完全にプロセシングされたペプチドに関する）実験による測定値は、ＶＥＧＦ−Ａモノマーについては２０から２７ｋＤであり、ＶＥＧＦ−Ｂモノマーについては２１ｋＤであり、そしてＶＥＧＦ−Ｃモノマーについては２３ｋＤである。
【００７４】
例５
例２に記載した、ＶＥＧＦ−Ｄに対するｃＤＮＡの最初の単離は、ヒト乳房ｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングによるものであった。そのようにして単離されたＶＥＧＦ−Ｄに対するｃＤＮＡクローンはただ１つだけだったので、他の別個に単離されたＶＥＧＦ−Ｄ  ｃＤＮＡとの比較によってｃＤＮＡの構造を確認することは不可能であった。この例で記載する研究は、更なるヒトＶＥＧＦ−Ｄ  ｃＤＮＡクローンの単離に関するものであり、ヒトＶＥＧＦ−Ｄ  ｃＤＮＡの構造を確認するために行われたものである。それに加えて、マウスＶＥＧＦ−Ｄ  ｃＤＮＡクローンを単離した。
【００７５】
Stratageneから購入した２つのｃＤＮＡライブラリー、１つはヒト肺からのもの、そして１つはマウス肺からのもの（それぞれカタログ番号９３７２１０、９３６３０７）、をＶＥＧＦ−Ｄ  ｃＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションスクリーニングのために使用した。例２に記載したヒトＶＥＧＦ−Ｄに対するｃＤＮＡのヌクレオチド１８１７から２４９５にわたるプローブを、テンプレートとしてＶＥＧＦ−Ｄ  ｃＤＮＡを含むプラスミドと、下記の２つのオリゴヌクレオチド：
５’−ＧＧＧＣＴＧＣＴＴＣＴＡＧＴＴＴＧＧＡＧ（配列番号１０）、
および、
５’−ＣＡＣＴＣＧＣＡＡＣＧＡＴＣＴＴＣＧＴＣ（配列番号１１）
を使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって作成した。
【００７６】
およそ２００万の組換えバクテリオファージを、前記２つのｃＤＮＡライブラリーのそれぞれから、このプローブでスクリーニングした。９つのヒトの、そして６つのマウスのＶＥＧＦ−Ｄに対するｃＤＮＡクローンが続いて単離された。
【００７７】
前記９つのヒトのＶＥＧＦ−Ｄに対するｃＤＮＡクローンのうち２つについてジデオキシチェーンターミネーション法(サンガー（Sanger）他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977 74 5463-5467)を使用して完全に配列決定した。この２つのｃＤＮＡは、ヒトＶＥＧＦ−Ｄのコード領域の全体を含んでおり、一方のクローンが他方よりも５’−末端において５ヌクレオチド長かったということを除いては同一であった。この短い方のｃＤＮＡのヌクレオチド配列を図４に示し、配列番号４に表示する。このｃＤＮＡから推定されるヒトＶＥＧＦ−Ｄ（ｈＶＥＧＦ−Ｄ）のアミノ酸配列は、３５４残基長であり、これを図５に示す；これを配列番号５に表示する。その他のヒトＶＥＧＦ−Ｄ  ｃＤＮＡクローンのうち５つの５’領域の配列も決定した。それぞれのクローンについて、キャラクタライズされた配列は、コード領域の翻訳開始部位からすぐに下流に１００ヌクレオチド以上のＤＮＡを含んでいた。すべてのケースにおいてこれらの領域の配列は、図４に示すヒトＶＥＧＦ−Ｄ  ｃＤＮＡの、対応する領域と同一であった。
【００７８】
６つのマウスのＶＥＧＦ−Ｄに対するｃＤＮＡクローンのすべてを完全に配列決定した。これらクローンの内、２つだけはＶＥＧＦ−Ｄのコード領域全体を含んでいた；その他のクローンは切形(truncated)であった。コード領域全体を有する２つのクローンのヌクレオチド配列は異なっており、異なるサイズのアミノ酸配列をコードしている。長い方のアミノ酸配列をｍＶＥＧＦ−Ｄ１と命名し、そして短い方の配列をｍＶＥＧＦ−Ｄ２と命名した。ｍＶＥＧＦ−Ｄ１およびｍＶＥＧＦ−Ｄ２をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を、それぞれ図６および図７に示す。
【００７９】
ｍＶＥＧＦ−Ｄ１およびｍＶＥＧＦ−Ｄ２に対する推定アミノ酸配列を図８に示す。これらの配列をそれぞれ、配列番号６，７，８および９に表示する。これらアミノ酸配列間の相違は：
ｉ）ｍＶＥＧＦ−Ｄ２との比較において、ｍＶＥＧＦ−Ｄ１には残基３０の後に５アミノ酸（ＤＦＳＦＥ）が挿入されていること；  
ｉｉ）ｍＶＥＧＦ−Ｄ１の残基３１７、およびｍＶＥＧＦ−Ｄ２の残基３１２の後の、Ｃ−末端の終わりの部分に完全な相違があり、その結果ｍＶＥＧＦ−Ｄ１がかなり長くなっていること、である。
【００８０】
マウスＶＥＧＦ−Ｄに対する４つの切形のｃＤＮＡのうち３つは、Ｃ−末端領域をコードしていたが、Ｎ−末端の５０アミノ酸をコードしていなかった。これら３つのｃＤＮＡのすべては、ｍＶＥＧＦ−Ｄ２のＣ−末端と同じ、ＶＥＧＦ−ＤのＣ−末端をコードしていた。その他の切形のｃＤＮＡは、ＶＥＧＦ−ＤのＮ−末端側の半分のみをコードしていた。このｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列は、ｍＶＥＧＦ−Ｄ２には見られないがｍＶＥＧＦ−Ｄ１には見られる、残基３０の直後の５アミノ酸、ＤＦＳＦＥを含有していた。
【００８１】
前述のように、この例において報告したヒトＶＥＧＦ−Ｄ  ｃＤＮＡクローンの全体の配列は、第２のヒトクローンの配列との比較によって確証された。さらに、コード領域の５’−末端の配列は５つの他のヒトＶＥＧＦ−Ｄ  ｃＤＮＡクローンにおいて同一であることが判明した。一方、例２において報告された配列は、ＶＥＧＦ−Ｄのコード領域のほとんどを含んでいるが、この領域の５’−末端付近が不正確であった。これはおそらくＶＥＧＦ−Ｄ  ｃＤＮＡがコード領域の５’−末端付近で切断され(truncated)、そしてその位置が他の未同定のｃＤＮＡと結合し、その結果、真のＶＥＧＦ−Ｄのコード配列の最初の３０コドンが欠失し、そしてメチオニン残基と置換したためであると考えられる。このメチオニン残基は、例２において示されたＶＥＧＦ−Ｄ配列のＮ−末端アミノ酸であるとされている。
【００８２】
マウスＶＥＧＦ−Ｄ１およびＶＥＧＦ−Ｄ２の推定アミノ酸配列のＮ−末端領域は、ヒトＶＥＧＦ−Ｄから推定されるものと非常によく似ている（図９を参照）。これはまた、ヒトＶＥＧＦ−Ｄに対する正確な推定アミノ酸配列がこの例において報告されたものであることを示している。ヒトＶＥＧＦ−ＤのＮ−末端の２５アミノ酸は、非常に疎水性の領域を形成しており、これは、この領域の部分がタンパク質分泌のためのシグナル配列である可能性があるという意見と一致するものである。図１０はヒトＶＥＧＦ−Ｄの配列と、ＶＥＧＦファミリーの増殖因子のその他のメンバー、即ちヒトＶＥＧＦ１６５（ｈＶＥＧＦ１６５）、ヒトＶＥＧＦ−Ｂ（ｈＶＥＧＦ−Ｂ）、ヒトＶＥＧＦ−Ｃ（ｈＶＥＧＦ−Ｃ）およびヒト胎盤増殖因子（ｈＰｌＧＦ）、の配列とのアラインメントを示す。アラインメント中の間隙を計算のために無視した場合、ヒトＶＥＧＦ−Ｄはアミノ酸配列において、ヒトＶＥＧＦ１６５と３１％同一であり、ヒトＶＥＧＦ−Ｂと２８％同一であり、ＶＥＧＦ−Ｃと４８％同一であり、そしてヒトＰｌＧＦと３２％同一であることが判明した。明らかに、ＶＥＧＦ−Ｃが、ＶＥＧＦ−Ｄに最も近い関係にあるこのファミリーのメンバーである。
【００８３】
マウスＶＥＧＦ−Ｄ１およびＶＥＧＦ−Ｄ２の配列における違いは、おそらくディファレンシャルｍＲＮＡスプライシングに起因する可能性が高い。ＶＥＧＦ−Ｄ１のＣ−末端の４１アミノ酸残基はＶＥＧＦ−Ｄ２において欠失しており、そしてＶＥＧＦ−Ｄ１配列とは近い関係にない９残基と置換されている。したがって、ＶＥＧＦ−Ｄ１のＣ−末端付近に存在する４つのシステイン残基はＶＥＧＦ−Ｄ２において欠失している。この変化によって、タンパク質の三次構造または四次構造が変わる可能性があり、また、細胞内または細胞外の環境におけるタンパク質の局在に影響を及ぼす可能性がある。ヒトＶＥＧＦ−ＤのＣ−末端はマウスＶＥＧＦ−Ｄ１のものに似ているが、マウスＶＥＧＦ−Ｄ２には似ていない。マウスＶＥＧＦ−Ｄ１の残基３０の後にあり、マウスＶＥＧＦ−Ｄ２にもヒトＶＥＧＦ−Ｄにも存在しない、小さな５アミノ酸の挿入がタンパク質のタンパク分解性プロセシングに影響している可能性がある。
【００８４】
ＶＥＧＦ−Ｄは、マウスとヒトの間で高度に保存されている。ヒトＶＥＧＦ−Ｄのアミノ酸残基の８５パーセントがマウスＶＥＧＦ−Ｄ１におけるものと同一である。これはおそらくタンパク質機能の保存を反映するものである。推定上のＶＥＧＦ−Ｄの機能はここで提案した。ヒトＶＥＧＦ−Ｄ  ｃＤＮＡのオルターナティブな形態は見つからなかったが、マウスＶＥＧＦ−ＤのｍＲＮＡの多様な形態を引き起こすＲＮＡスプライシングの異形(variation)が、ヒト組織においても起こっているかもしれないという可能性がある。
【００８５】
例６ ＶＥＧＦ−ＤのＣＯＳ細胞における発現
図４に示す配列のヌクレオチド１から１５２０に渡り、全体のコード領域を含んでいる、ＶＥＧＦ−Ｄに対するヒトｃＤＮＡのフラグメントを、哺乳類の発現ベクターｐＣＤＮＡ１−ａｍｐに挿入した。このベクターを用いて、以前に記載されたＤＥＡＥ−デキストラン法(アルッフォ（Aruffo）およびシード（Seed）, 1987)によってＣＯＳ細胞を一過性にトランスフェクトし、そしてその結果得られた条件細胞培養培地(conditioned cell culture media)を７日間のインキュベーション後に収集し、Amicon濃縮器（１０，０００分子量をカットオフするCentricon 10）を用いて、製造業者の指示に従って濃縮した。トランスフェクションのために用いたプラスミドはヒトＶＥＧＦ−Ｄのための発現コンストラクトと、ポジティブコントロールとして、マウスＶＥＧＦ−Ａ  ｃＤＮＡをｐＣＤＮＡ１−ａｍｐに挿入することによって作成したコンストラクトであった。条件培地を以下に記載するように２種類のバイオアッセイでテストし、そしてその結果はＣＯＳ細胞が実際に生物学的に活性の（有効な）ＶＥＧＦ−Ｄを発現および分泌していたということを実証するものである。
【００８６】
例７ ＶＥＧＦ−ＤがＶＥＧＦ受容体−２に結合する能力についてのバイオアッセイ
例５において示したように、ＶＥＧＦ−ＤはＶＥＧＦファミリーの他のメンバーに、一次構造において近い関係にある。このタンパク質ファミリーのメンバーのほとんどは、内皮細胞に対して、（細胞）分裂促進性(mitogenic)および／または走化性を有する(ケック（Keck）他, 1989; リョン（Leung）他, 1989; ヨウコフ（Joukov）他, 1996; オロフソン（Olofsson）他, 1996)。さらに文献に記載された最初のＶＥＧＦファミリーのメンバーであるＶＥＧＦ−Ａ（以前はＶＥＧＦとして知られていた）は、血管透過性の強力な誘導物質（インデューサー）である(ケック（Keck）他, 1989)。タンパク質の構造は、タンパク質の機能の重要な決定要因であるので、ＶＥＧＦ−Ｄも内皮細胞に対して分裂促進性であるか、または血管透過性を誘導する(induce)可能性があると考えられる。したがって、ヒトＶＥＧＦ−Ｄをバイオアッセイにて、それが、ＶＥＧＦ−Ａによって活性化されると分裂（促進）シグナルを引き起こすと考えられている内皮細胞−特異的受容体である、ＶＥＧＦ受容体−２（ＶＥＧＦＲ２；Ｆｌｋ−１としても知られている）(ストローン（Strawn）他, 1996)に結合する能力についてテストした。
【００８７】
ＶＥＧＦＲ２に結合する増殖因子の検出のためのバイオアッセイは、因子-依存性の細胞ラインＢａ／Ｆ３において開発(develop)されており、我々の以前の特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／１６７５５において記載されている。これらの細胞はインターロイキン−３（ＩＬ−３）の存在下で成長する；しかし、この因子を除去すると、結果として４８時間以内に細胞死が起こる。もし増殖刺激を送達する能力のあるその他の受容体がＢａ／Ｆ３細胞にトランスフェクトされたら、それら細胞は、ＩＬ−３を含まない培地において細胞が成長する場合、その受容体を活性化する特異的な増殖因子によって救出（レスキュー）され得る。受容体−型チロシンキナーゼの特定のケースにおいては（例えば、ＶＥＧＦＲ２）、受容体チロシンキナーゼの細胞外ドメインとエリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）の膜貫通および細胞質内ドメインとを含むキメラ受容体が利用可能である。この場合、キメラ受容体の細胞外ドメインに結合するリガンド（例えば、ＶＥＧＦ）による刺激により、結果としてＥｐｏＲ細胞質内ドメインを介するシグナル伝達、およびそれに続いてＩＬ−３を含まない増殖培地における前記細胞ラインの救出（レスキュー）が起こる。この研究において使用する、マウスＶＥＧＦＲ２の細胞外ドメインとマウスＥｐｏＲの膜貫通および細胞質内ドメインとからなるキメラ受容体のコンストラクションとバイオアッセイ自体について以下に記載する。
【００８８】
プラスミドコンストラクション
ｉ）キメラＶＥＧＦＲ２受容体を産生するためのプラスミドのコンストラクション
マウスＶＥＧＦＲ２の細胞外ドメインをコードするＤＮＡと、他のタンパク質ドメインをコードするＤＮＡとを簡単に結合することが可能となるようなプラスミドコンストラクトを得るために、部位特異的突然変異誘発を使用して、マウスＶＥＧＦＲ２の、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの移行部（ジャンクション）をコードするｃＤＮＡの位置に、ＢｇｌＩＩ制限酵素部位を生成した。エルリッヒス（Oelrichs）他 (1993)によって記載されたマウスＶＥＧＦＲ２  ｃＤＮＡの全長クローンを哺乳類発現ベクターｐＣＤＮＡ１−ａｍｐ中に、ＢｓｔＸＩ制限酵素部位を利用してサブクローニングした。一本鎖ＵＴＰ＋ＤＮＡをＭ１３複製起点（ori領域）を使用して生成し、そしてこれをテンプレートとして使用して、所望の位置にＢｇｌＩＩ部位を含むマウスＶＥＧＦＲ２  ｃＤＮＡを生成した。この変更した(altered) ＶＥＧＦＲ２  ｃＤＮＡを含むプラスミドをｐＶＥＧＦＲ２Ｂｇｌと命名した。キメラＶＥＧＦＲ２受容体を産生するために、あらゆる受容体の膜貫通および細胞質内ドメインをコードするＤＮＡフラグメントをｐＶＥＧＦＲ２ＢｇｌのＢｇｌＩＩ部位に挿入することができる。
【００８９】
ｉｉ）ＶＥＧＦＲ２／ＥｐｏＲキメラ受容体のコンストラクション
マウスＥｐｏＲ  ｃＤＮＡを発現ベクターｐＣＤＮＡ１−ａｍｐ中にサブクローニングし、そして突然変異誘発のためのテンプレートとして一本鎖ＤＮＡを生成した。ＥｐｏＲの、膜貫通ドメインと細胞外ドメインとの移行部（ジャンクション）をコードする位置において、ＥｐｏＲ  ｃＤＮＡに、ＢｇｌＩＩ制限酵素部位を挿入し、このＤＮＡフラグメントが、ｐＶＥＧＦＲ２Ｂｇｌ中のＶＥＧＦＲ２細胞外ドメインをコードする前記の変更した(modified)ｃＤＮＡに直接ライゲーションできるようにした。さらにＥｐｏＲの細胞質内ドメインにおけるＢｇｌＩＩ部位を、無変化の（サイレントな）単一ヌクレオチド置換によって除いた。ＥｐｏＲの膜貫通ドメインと細胞質内ドメインをコードするＤＮＡフラグメントを用いて、次に、ＶＥＧＦＲ２の膜貫通ドメインと細胞質内ドメインをコードする、ｐＶＥＧＦＲ２Ｂｇｌの部分と置換した。このようにしてＶＥＧＦＲ２の細胞外ドメインと、ＥｐｏＲの膜貫通および細胞質内ドメインとからなるキメラ受容体をコードする、単一の読み枠が生成した。
【００９０】
このキメラ受容体をコードするＤＮＡフラグメントを発現ベクターｐＢＯＳにサブクローニングし、そしてプラスミドｐｇｋ−ｎｅｏとともに、１：２０の比でＢａ／Ｆ３細胞ラインに、共−トランスフェクトした。ＶＥＧＦＲ２−ＥｐｏＲタンパク質を発現する細胞を、ＶＥＧＦＲ２細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ  ４Ｈ３）を用いたフローサイトメトリー解析によって選抜した。このモノクローナル抗体は、１９９４年２月１０日に出願されたオーストラリア特許出願第ＰＭ３７９４号に記載されている。高レベルのＶＥＧＦＲ２−ＥｐｏＲを発現する細胞ラインを、細胞を、５μｇ／ｍｌのＭＡｂ  ４Ｈ３、または、２５ｎｇ／ｍｌの組換えＶＥＧＦ中にて成長させることによって選抜した。高レベルのＶＥＧＦＲ２−ＥｐｏＲを発現する細胞ラインを、Ｂａ／Ｆ３−ＮＹＫ−ＥｐｏＲと命名し、バイオアッセイのために使用した。
【００９１】
バイオアッセイ
前述のＢａ／Ｆ３−ＮＹＫ−ＥｐｏＲ細胞を、すべてのＩＬ−３を除去するためにＰＢＳ中で３回洗浄し、１３．５μｌの培地当たり１０００細胞の濃度となるように再懸濁し、そして６０穴テラサキプレートの各ウェル当たり１３．５μｌのアリコットに分けた。トランスフェクトされたＣＯＳ細胞からの条件培地を次に細胞培養培地中に希釈した。内皮細胞受容体Ｔｉｅ２の細胞外ドメインとＥｐｏＲの膜貫通および細胞質内ドメインとからなるキメラ受容体を発現する細胞を非−応答性コントロール細胞ラインとして用いた。細胞を４８−９６時間インキュベートし、その間に細胞培養培地単独でインキュベートした細胞は死に、その他のウェル（即ちＣＯＳ細胞−条件培地の存在下のもの）においてみられた相対的な生存／増殖を、ウェル当たりに存在する生細胞を数えることによってスコアした。
【００９２】
発現プラスミドで一過性にトランスフェクトされたＣＯＳ細胞からの条件培地を３０倍濃縮し、そしてＶＥＧＦＲ２バイオアッセイに使用した。ｐＣＤＮＡ１−ａｍｐでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞からの濃縮された条件培地をネガティブコントロールとして使用した。
【００９３】
結果を図１１に示す。ここでインキュベーション培地中の３０倍濃縮されたＣＯＳ細胞−条件培地のパーセンテージ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）に対して、４８時間のインキュベーション後のウェルにおける生細胞の数がプロットされている。明らかにＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｄのいずれかを含有する条件培地はこのアッセイにおいて細胞の生存を促進する能力があり、これはこれら両方のタンパク質がＶＥＧＦＲ２に結合してそれを活性化することができることを示唆していた。
【００９４】
例８ 血管透過性アッセイ
例６のように調製して３０倍に濃縮されたヒトＶＥＧＦ−Ｄを、麻酔されたモルモット（アルビノ／白色、３００−４００ｇ）において行ったＭｉｌｅｓ血管透過性アッセイ(マイルズ（Miles）およびマイルズ（Miles）, 1952) においてテストした。ｐＣＤＮＡ１−ａｍｐでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞からの濃縮された条件培地を再びネガティブコントロールとして使用した。モルモットを抱水クロラールで麻酔した（３．６ｇ／１００ｍｌ；体重１０ｇ当たり０．１ｍｌ）。次にこれら動物の背中をクリッパーで注意深く剪毛した。動物に対してエバンスブルー色素（ＭＴ  ＰＢＳ中０．５％、０．５ｍｌ）の心臓内注入を２３Ｇ針を使用して行い、そして次に１００−１５０μｌの濃縮されたＣＯＳ細胞−条件培地を皮内に注射した。１５−２０分後これら動物を殺し(sacrificed)、そして背中の皮膚の層を切除して下にある血管を露出させた。定量化のためにそれぞれの注射部分を切除しそして２−５ｍｌのホルムアミド中で４５℃に加熱した。その結果得られた血管外遊出した色素を含有する上清を、次に６２０ｎｍで分光光度的に調べた。
【００９５】
動物１については、３０倍濃縮されたＶＥＧＦ−Ａ条件培地の注射に起因する６２０ｎｍでの吸光度は０．１７８であり、３０倍濃縮されたＶＥＧＦ−Ｄ条件培地の注射に起因する６２０ｎｍでの吸光度は０．１１４であり、そして３０倍濃縮されたｐＣＤＮＡ１−ａｍｐでトランスフェクトされた細胞からの培地の注射に起因する６２０ｎｍでの吸光度は０．００４であった。動物２については、３０倍濃縮された培地を皮内注射の前に細胞培養培地中で４倍希釈した。ＶＥＧＦ−Ａ条件(conditioned)サンプルに起因する６２０ｎｍでの吸光度は０．１４１であり、ＶＥＧＦ−Ｄ条件サンプルに起因する６２０ｎｍでの吸光度は０．１１６であり、ネガティブコントロールとして血清含量を整合したサンプルに起因する６２０ｎｍでの吸光度は０．０１７であった。ＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｄの存在下で両方の動物について観察された、色素の血管外遊出の増強は、これらタンパク質の両方が血管透過性を強く誘導することを示すものであった。
【００９６】
ここで記載されたデータはＶＥＧＦ−Ｄが分泌タンパク質であり、ＶＥＧＦ−Ａの様に、ＶＥＧＦＲ２に結合してＶＥＧＦＲ２を活性化し、血管透過性を誘導することができるということを示している。
【００９７】
例９ 内部ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドの生理活性
ＶＥＧＦ−Ｄの推定アミノ酸配列は、他のすべてのＶＥＧＦファミリーのメンバーの配列に類似した中央部分を含んでいる（図１０におけるアラインメントに示すように、ヒトＶＥＧＦ−Ｄアミノ酸配列のおよそ残基１００から１９６）。したがってＶＥＧＦ−Ｄの生理活性の部分は、この保存領域に存在するであろうと考えられていた。この仮説についてテストするために、ＶＥＧＦ−Ｄの生合成について研究し、そしてヒトＶＥＧＦ−Ｄの前記保存領域を哺乳動物細胞において発現させ、精製し、そして以下に記載するバイオアッセイにおいてテストした。
【００９８】
プラスミドコンストラクション
ヒトＶＥＧＦ−Ｄの残基９３から２０１の部分をコードするＤＮＡフラグメント、即ちＮ−末端およびＣ−末端領域を除去したもの、をテンプレートとして全長ヒトＶＥＧＦ−Ｄ  ｃＤＮＡを含むプラスミドを使用して、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅した。増幅されたＤＮＡフラグメントは、その配列をヌクレオチドシークエンシングによって確認し、そして発現ベクターｐＥＦＢＯＳＳＦＬＡＧに挿入し、それによって生じたプラスミドをｐＥＦＢＯＳＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃと命名した。ｐＥＦＢＯＳＳＦＬＡＧベクターは、インターロイキン−３（ＩＬ−３）遺伝子由来のタンパク質分泌のためのシグナル配列およびＦＬＡＧＴＭオクタペプチドをコードするＤＮＡを含んでいる。
【００９９】
ＦＬＡＧＴＭオクタペプチドは、Ｍ２モノクローナル抗体(IBI/Kodak)等の市販の抗体によって認識されることができる。ＶＥＧＦ−Ｄ  ＰＣＲフラグメントを、ＩＬ−３シグナル配列がＦＬＡＧＴＭ配列のすぐに上流となり、そしてＦＬＡＧＴＭ配列がＶＥＧＦ−Ｄ配列のすぐに上流となるように、そのベクターに挿入した。３つの配列すべてが同じ読み枠内となり、そのため哺乳動物細胞へのｐＥＦＢＯＳＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃのトランスフェクションの結果として起こるｍＲＮＡの翻訳により、そのＮ−末端にＩＬ−３シグナル配列を有し、続いて、ＦＬＡＧＴＭオクタペプチドおよびＶＥＧＦ−Ｄ配列が並ぶタンパク質が生じるであろう。シグナル配列の切断と引き続いて起こる細胞からのタンパク質の分泌により、Ｎ−末端に隣接してＦＬＡＧＴＭオクタペプチドがタグ付加されたＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドが生じるであろう。このタンパク質をＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃと命名した。
【０１００】
さらに、ヒトＶＥＧＦ−Ｄの全長コード配列が、ＦＬＡＧＴＭオクタペプチドの配列がＶＥＧＦ−Ｄのコード配列のすぐ下流となり、そしてＶＥＧＦ−Ｄのコード配列と同じ読み枠となるようにｐＥＦＢＯＳＩＦＬＡＧに挿入された、ｐＥＦＢＯＳＶＥＧＦＤｆｕｌｌＦＬＡＧと称する第２のプラスミドを構築した。プラスミドｐＥＦＢＯＳＩＦＬＡＧはＩＬ−３シグナル配列を有さず、したがってＶＥＧＦ−Ｄ／ＦＬＡＧ融合タンパク質の分泌はＶＥＧＦ−Ｄのシグナル配列によって行われた。ｐＥＦＢＯＳＶＥＧＦＤｆｕｌｌＦＬＡＧはＣ−末端にＦＬＡＧＴＭオクタペプチドがタグ付加された全長のＶＥＧＦ−Ｄを哺乳動物細胞中で発現させるようにデザインされた。このタンパク質をＶＥＧＦＤｆｕｌｌＦＬＡＧと命名し、これはＶＥＧＦ−Ｄ生合成の研究にとって有用である。
【０１０１】
ＶＥＧＦ−Ｄの翻訳後プロセシングについての分析
ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドがプロセシングされて成熟した完全に活性のあるタンパク質となるか否かを調べるため、ｐＥＦＢＯＳＶＥＧＦＤｆｕｌｌＦＬＡＧをＣＯＳ細胞に一過性にトランスフェクトした(アルッフォ（Aruffo）およびシード（Seed）, 1987)。ＣＯＳ細胞中での発現、そしてその後の３５Ｓ−メチオニン／システインでの生合成ラベリングおよびＭ２ゲルでの免疫沈降によって、およそ４３ｋＤ（ｆＡ）および２５ｋＤ（ｆＢ）の種が示された（図１２Ａ）。これらのバンドは、ＶＥＧＦ−Ｄは切断されてＣ−末端フラグメント（ＦＬＡＧＴＭがタグ付加）および内部ペプチド（ほぼＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃタンパク質に対応する）を生じるという考えに一致する。免疫沈降の還元（Ｍ２★）によっていくらかｆＡバンドが還元され、これは２つのフラグメントの間のジスルフィド結合の可能性を示すものである。
【０１０２】
内部ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドの発現および精製
プラスミドｐＥＦＢＯＳＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃを用いて、以前に記載されたＤＥＡＥ−デキストラン法(アルッフォ（Aruffo）およびシード（Seed）, 1987)によってＣＯＳ細胞に一過性にトランスフェクトした。その結果得られる条件細胞培養培地（およそ１５０ｍｌ）を、７日間のインキュベーションの後収集し、Ｍ２モノクローナル抗体を結合させた樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーにかけた。簡単に説明すると、前記培地を、１ｍｌのＭ２抗体カラムに、およそ４時間、４℃でバッチ式に流した。カラムを次に１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌで十分に洗浄し、その後同じバッファー中で２５μｇ／ｍｌの遊離のＦＬＡＧＴＭペプチドで溶出した。その結果得られた物質を以下に記載するバイオアッセイにおいて使用した。
【０１０３】
精製されたＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃを検出するためにＭ２アフィニティーカラムから溶出されたフラクションをウエスタンブロット分析にかけた。カラムフラクションのアリコットを２ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーと混ぜボイルして１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにローディングした。分離したフラクションをニトロセルロースメンブランにトランスファーし、そして非−特異的結合部位を、Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌ／Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＳＴ）および１０％脱脂粉乳(BLOTTO)中でのインキュベーションによりブロッキングした。メンブランを次に３μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体Ｍ２またはコントロール抗体とともに室温で２時間インキュベートし、その後ＴＳＴ中で十分に洗浄した。次にメンブランを二次ヤギ抗−マウスＨＲＰ−結合抗血清とともに室温で１時間インキュベートし、その後ＴＳＴバッファー中で洗浄した。タンパク質種の検出は化学発光試薬(ECL, Amersham)を用いて行った（図１２Ｂ）。
【０１０４】
非還元条件下において分子量およそ２３ｋＤの種（ＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃ）が、Ｍ２抗体によって検出された。これは、この内部フラグメントに対する予想分子量（１２，８００）にＮ−結合型グリコシル化を足したものと一致する；ＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃは２つの潜在的Ｎ−結合型グリコシル化部位を含んでいる。およそ４０ｋＤの種も検出されたが、これは前記２３ｋＤタンパク質（ＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃ）の非−共有結合性のダイマーを表すものである可能性がある。
【０１０５】
バイオアッセイ
ポリペプチドがＶＥＧＦ受容体−２に結合する能力についてのバイオアッセイに関しては例７において詳細に記載されている。Ｍ２アフィニティーカラムから溶出したＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃタンパク質を含有するフラクションのアリコットを培地で希釈し、そして以前に記載されたようにＶＥＧＦＲ２バイオアッセイにおいてテストした。精製ＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃタンパク質を含有することが示された（図１２Ｂ）、アフィニティーカラムからのフラクション＃３は、この精製フラクションの希釈度１／１００まで、バイオアッセイ細胞ラインの増殖を誘導する明らかな能力を示した（図１３）。それに対して、アフィニティーカラムのボイド容量（フラクション＃１）は活性を示さず、一方オリジナルのＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃ条件培地は弱い活性しか示さなかった。
【０１０６】
血管透過性アッセイ(マイルズ（Miles）およびマイルズ（Miles）, 1952)は例８において簡単に記載されている。精製ＶＥＧＦＤ△Ｎ△ＣのアリコットおよびＭ２アフィニティーカラムのボイド容量のサンプル（ネガティブコントロール）を培地と混合し、モルモットの皮膚に、皮内注入（注射）した。注射部位の皮膚の領域を切除し、そして血管外遊出した色素を溶出させた。精製ＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃの注入に起因する６２０ｎｍにおける血管外遊出した色素の吸光度は０．１３１±０．００９であった。それに対してボイド容量のサンプルの注入に起因する吸光度値は０．０９２±０．０２０であった。したがってＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃは血管透過性を誘導したが、その効果は僅かな(marginal)ものでしかなかった。
【０１０７】
ＶＥＧＦＲ２に結合する能力があること、および、全長ＶＥＧＦ−Ｄに比べて血管透過性の誘導が低いということから、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃは競合阻害によって、ＶＥＧＦ−Ｄによる血管透過性の誘導を相対的に低下させるといえるかもしれない。この意味において、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃフラグメントは、血管透過性の誘導に関してＶＥＧＦ−Ｄに対するアンタゴニストであると考えられる可能性がある。
【０１０８】
要約
２つの要因によって我々は活性の促進についてＶＥＧＦ−Ｄの内部フラグメントを探索することにした。まず第１に、ＶＥＧＦファミリーのその他のすべてのメンバーとアミノ酸ホモロジーを示すのは、ＶＥＧＦ−Ｄの中央部分であるということがある。第２に、ＰＤＧＦ−ＢＢ等の他の増殖因子では内部生理活性ポリペプチドの生成を引き起こすタンパク分解性プロセシングが起こるということがある。更にＣＯＳ細胞中の全長ＶＥＧＦ−Ｄタンパク質について見られる活性は、ＶＥＧＦ−ＡをトランスフェクトされたＣＯＳ細胞からの条件培地に対応するものよりも低かった。
【０１０９】
成熟ＶＥＧＦ−Ｄ配列は、ＦＡＡ∧ＴＦＹおよびＩＩＲＲ∧ＳＩＱＩで切断され、残基９２−２０５内に含まれるフラグメントに由来するであろうということが予想された。ＣＯＳ細胞中で発現させたＶＥＧＦ−ＤｆｕｌｌＦＬＡＧ  の免疫沈降分析から、ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドの、これらの部位における内部タンパク分解性切断物(cleavage)と一致する種が生じていた。したがって、Ｎ−末端およびＣ−末端領域が除去された（ＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃ）、切形(truncated)形態のＶＥＧＦ−Ｄが、ＣＯＳ細胞中で産生および発現されていた。このタンパク質をＭ２抗体を用いて同定および精製した。ＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃタンパク質は、ＶＥＧＦ−Ｄの９２−２０５フラグメント内のペプチドを認識する、Ａ２抗体によっても検出された（ここでは示されていない）。ＶＥＧＦＤ△Ｎ△ＣをＶＥＧＦＲ２バイオアッセイおよびＭｉｌｅｓ血管透過性アッセイによって評価したところ、ＶＥＧＦＲ２の細胞外ドメインとのクロスリンクを検出するようにデザインされたバイオアッセイにおいて、ＶＥＧＦＲ２受容体に結合してそれを活性化することが示された。Ｍｉｌｅｓアッセイにおけるこのポリペプチドによる血管透過性の誘導は、ＶＥＧＦ−Ａの効果とは対照的に最低限のものであった。
【０１１０】
例１０ ＶＥＧＦ−ＤのＶＥＧＦＲ−３に対する結合および活性化
組換えＶＥＧＦ−Ｄの産生のために、ヒトＶＥＧＦ−Ｄ  ｃＤＮＡをバキュロウイルスシャトルベクターにクローニングした。無修飾のＶＥＧＦ−Ｄ  ｃＤＮＡ（“全長ＶＥＧＦ−Ｄ”と称する）を含む、バキュロウイルスシャトルベクターの他に、ＶＥＧＦ−Ｄ  ｃＤＮＡが以下のように修飾された２種のバキュロウイルスシャトルベクターを構築した。
【０１１１】
一つのコンストラクト（“全長ＶＥＧＦ−Ｄ−Ｈ６”と称する）においては、Ｃ−末端にヒスチジンタグを付加した。もう一方のコンストラクトにおいては、推定上のＮ−末端およびＣ−末端のプロペプチドを除去し、メリチンシグナルペプチドをイン・フレームにてＮ−末端に融合させ、そして残りのＶＥＧＦホモロジードメインのＣ−末端にヒスチジンタグを付加した（“△Ｎ△Ｃ−ＭＥＬｓｐ−ＶＥＧＦ−Ｄ−Ｈ６”と称する）。
【０１１２】
前記３つのコンストラクトのそれぞれについて、２または３の独立のトランスフェクションの、バキュロウイルスのクローンを増幅した。Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ （ＨＦ）細胞の上清を、高いタイターのウイルスストックでの感染の４８時間後に収集した。上清を、ＮａＯＨでｐＨ７に調整し、一容量のＤ−ＭＥＭ（０．２％ ＦＣＳ）で希釈した。
【０１１３】
ヨウコフ（Joukov）他, 1996に記載されているように、サンプルをＮＩＨ３Ｔ３細胞上のＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ４受容体）のチロシンリン酸化を刺激する能力についてテストした。感染していない細胞の上清と、ＶＥＧＦＲ−３のチロシンリン酸化を刺激しない、ＶＥＧＦ−Ｃの短い(short)スプライスバリアントで感染させた細胞の上清とを、ネガティブコントロールとして使用した。△Ｎ△Ｃ−ｍｅｌＳＰ−ＶＥＧＦ−Ｄ−Ｈ６と同じ様に修飾したＶＥＧＦ−Ｃをポジティブコントロールとして使用した。結果を図１４に示す。
【０１１４】
１２５および１９５ｋＤの新しいバンドの出現は、受容体のリン酸化、したがって受容体の活性化を示す。
【０１１５】
例１１ ＶＥＧＦ−ＤのＶＥＧＦＲ−２に対する結合および活性化
例１０において記載されているように組換えＶＥＧＦ−Ｄの産生のために、修飾および無修飾のヒトＶＥＧＦ−Ｄ  ｃＤＮＡをバキュロウイルスシャトルベクターにクローニングした。
【０１１６】
前記３つのコンストラクト、全長ＶＥＧＦ−Ｄ、全長ＶＥＧＦ−Ｄ−Ｈ６、および△Ｎ△Ｃ−ｍｅｌＳＰ−ＶＥＧＦ−Ｄ−Ｈ６のそれぞれについて、２または３の独立のトランスフェクションの、バキュロウイルスのクローンを増幅した。Ｈｉｇｈ  
Ｆｉｖｅ（ＨＦ）細胞の上清を、高いタイターのウイルスストックでの感染の４８時間後に収集した。上清を、ＮａＯＨでｐＨ７に調整し、一容量のＤ−ＭＥＭ（０．２％  ＦＣＳ）で希釈した。
【０１１７】
ヒスチジンタグ付加されたタンパク質によって条件づけられた(conditioned)上清について、ヨウコフ（Joukov）他, 1996にしたがって、ＫＤＲ受容体のチロシンリン酸化を刺激する能力についてテストした。ＫＤＲは、ｆｌｋ１（ＶＥＧＦＲ２）のヒトホモローグである。
【０１１８】
感染していない細胞の上清と、ＫＤＲを刺激しない、ＶＥＧＦ−Ｃ  １５６Ｓミュータントで感染させた細胞の上清とを、ネガティブコントロールとして使用した。ＶＥＧＦ１６５と△Ｎ△Ｃ−ｍｅｌＳＰ−ＶＥＧＦ−Ｄ−Ｈ６と同じ様に修飾したＶＥＧＦ−Ｃとをポジティブコントロールとして使用した。結果を図１５に示す。
【０１１９】
およそ２１０ｋＤの新しいバンドの出現は、受容体のリン酸化、したがって受容体の活性化を示す。
【０１２０】
例１２ ＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子発現の分析
ヒトおよびマウス胚におけるＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子発現のパターンをキャラクタライズするために、ＶＥＧＦ−Ｄ  ｃＤＮＡを、ポリアデニル化されたヒトＲＮＡのノーザンブロット分析、およびマウス胚を用いたin situハイブリダイゼーション分析のための、ハイブリダイゼーションプローブとして使用した。
【０１２１】
成人(adult human)における遺伝子発現
図４（配列番号４）に示すヒトＶＥＧＦ−Ｄ  ｃＤＮＡの、ＥｃｏＲＶ部位から３’−末端にわたる（ヌクレオチド９１１から２０２９）１．１ｋｂフラグメントをMegaprime  ＤＮＡラベリングシステム(Amersham)を用いて製造業者の指示に従って、［α−３２Ｐ］ｄＡＴＰで標識した。このプローブを用いて、再び製造業者の指示に従って、ヒト多組織ノーザンブロット(Clontech)を、ハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。これらのブロットは、見かけ上病気を患っていない成人の組織から得られたポリアデニル化されたＲＮＡを含むものであった。標識されたブロットのオートラジオグラフィーにより、ＶＥＧＦ−Ｄ  ｍＲＮＡは、心臓、肺、および骨格筋において最も大量であることが明らかになった。
【０１２２】
ＶＥＧＦ−Ｄ  ｍＲＮＡは、脾臓、卵巣、小腸および大腸においては中程度に豊富であり、そして腎臓、膵臓、胸腺、前立腺および精巣においては少量であった。脳、胎盤、肝臓または末梢血白血球からのＲＮＡにおいては、ＶＥＧＦ−Ｄ  ｍＲＮＡは検出されなかった。、ＶＥＧＦ−Ｄ  ｍＲＮＡが検出された組織のほとんどにおいては転写産物のサイズは２．３ｋｂであった。唯一の例外は骨格筋であり、２．３ｋｂと２．８ｋｂの２種のＶＥＧＦ−Ｄ転写産物が検出された。骨格筋において２．３ｋｂの転写産物の方が、２．８ｋｂの転写産物よりも大量であった。
【０１２３】
マウス胚における遺伝子発現
マウスＶＥＧＦ−Ｄ  ｍＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡプローブを生成するために、図７（配列番号７）に示すマウスＶＥＧＦ−Ｄ２  ｃＤＮＡを、転写ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋(Stratagene)に挿入した。その結果得られたプラスミドを制限酵素（制限エンドヌクレアーゼ）ＦｏｋＩで完全に(to completion)消化し、そしてＴ３ＲＮＡポリメラーゼを用いたin vitro転写反応のためのテンプレートとして使用した。この転写反応は、ＶＥＧＦ−Ｄ２  ｃＤＮＡ（図７）の３’−末端から、最も３’−末端に近いＦｏｋＩ切断部位にわたる領域（ヌクレオチド１１３５から７００）に対して、配列において相補的なＶＥＧＦ−Ｄ  ｍＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡプローブを生じさせるものであった。このアンチセンスＲＮＡプローブを、交尾後１５．５日のマウス胚から作成したパラフィン包埋した組織切片と、高いストリンジェンシーにてハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションと洗浄は、本質的に以前に記載されたものと同様であった(アーヘン（Achen）他, 1995)。
【０１２４】
洗浄と乾燥の後、スライドを６日間オートラジオグラフィーフィルムに露光した。
【０１２５】
オートラジオグラフィーフィルムの現像により、ＶＥＧＦ−Ｄ  ｍＲＮＡは、交尾後１５．５日の胚の発生中の肺に局在していることが明らかになった。肺におけるこのＶＥＧＦ−Ｄ  ｍＲＮＡに対するシグナルは、強く、そして高度に特異的なものであった。センスプローブでのコントロールハイブリダイゼーションでは、肺においてもその他の組織においても検出可能なバックグラウンドは見られなかった。
【０１２６】
要約
ＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子は成人において広く発現しているが、確実に遍在性に発現している訳ではない。最も強い発現は、心臓、肺および骨格筋において検出された。交尾後１５．５日のマウス胚において、強い特異的なＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子発現が肺において検出された。これらのデータは、ＶＥＧＦ−Ｄが肺の発達において役割を果たしている可能性があること、および肺におけるＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子発現が、少なくともヒトでは成体においても持続していることを示唆している。成人における他の組織での遺伝子発現は、ＶＥＧＦ−Ｄがその他の成体組織において別の機能を果たしているということを示唆している。
【０１２７】
例１３ ＶＥＧＦ−Ｄは内皮細胞に対して（細胞）分裂促進性である
ＶＥＧＦファミリーのタンパク質のいくらかのメンバー、すなわちＶＥＧＦ−Ａ(リョン（Leung）他, 1989)およびＶＥＧＦ−Ｂ(オロフソン（Olofsson）他, 1996)は、内皮細胞に対して（細胞）分裂促進性である。内皮細胞に対するＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃの分裂促進能力をテストするために、このタンパク質を例９に記載されているように発現させ、アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。ＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃを含有する、Ｍ２アフィニティーカラムから溶出した、フラクション＃３を、５％血清を含む細胞培養培地中で１０分の１に希釈し、そして１０％血清を含む培地中で増殖させたウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥ）に与えた。ＢＡＥは、ＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃの添加の前日にウェル当たり１０，０００細胞の密度で２４−穴シャーレに播いておき、このポリペプチドの添加の３日後、細胞をトリプシンによって解離させ、数えた。ポジティブコントロールとしてこの実験に精製ＶＥＧＦ−Ａを用いた。結果を図１６に示す。細胞培養培地にフラクション＃３を添加することにより、インキュベーションの３日後のＢＡＥの数は２．４倍に増加し、この結果はＶＥＧＦ−Ａについて得られたものに匹敵するものであった。明らかにＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃは内皮細胞に対して分裂促進性である。
【０１２８】
例１４ ヒト染色体上のＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子の局在
ヒト染色体上のＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子の局在化のためのハイブリダイゼーションプローブを作成するために、ヒトゲノムＤＮＡライブラリー(Clontech)から、ＶＥＧＦ−ＤのヒトゲノムＤＮＡクローンを単離した。ゲノムライブラリーを、標準的方法(サムブルック（Sambrook）他, 1989)を用いて、図４に示すヒトＶＥＧＦ−Ｄ  ｃＤＮＡでのハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。そのようにして単離したクローンの１つは、ヒトＶＥＧＦ−Ｄ  ｃＤＮＡからの配列に由来する多数のオリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションにより、ＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子の部分を含んでいることが示された。およそ１３ｋｂのサイズの、このゲノムクローンの領域をアガロースゲルから精製し、ビオチン−１４−ｄＡＴＰでニックトランスレーションによって標識し、そして２人の正常ヒト男性からの（分裂）中期(metaphase)に対して最終濃度２０ｎｇ／μｌにてin situでハイブリダイズさせた。蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法を以前に記載されたもの(カレン（Callen）他, 1990)から以下の点において改変した。つまり、染色体をよう化プロピジウム（対比染色として）とＤＡＰＩ（染色体同定のため）で分析の前に染色した。中期標本のイメージ（像）を、the CytoVision Ultra image collection and enhancement system(Applied Imaging Int. Ltd.)を用いて、冷却ＣＣＤカメラで捕らえた。ＦＩＳＨシグナルとＤＡＰＩ結合パターンを分析のために組み合わせた(merged)。
【０１２９】
一人目の正常男性からの１５の中期(metaphases)を蛍光シグナルについて調べた。中期のうち１０は、Ｘ染色体のバンドｐ２２．１の、１つの染色分体上（３細胞）または両方の染色分体上（７細胞）にシグナルを示した。これら１５の中期において、全部で９の非−特異的バックグラウンドドット(dots)が観察された。二人目の正常男性からの１５の中期に対するプローブのハイブリダイゼーションからも同様の結果が得られ、その際、シグナルは７細胞においては１つの染色分体上、そして４細胞においては両方の染色分体上に、Ｘｐ２２．１において観察された。結論を述べると、ヒトＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子はＸ染色体のバンドｐ２２．１上に位置している。
【０１３０】
例１５ マウス染色体上のマウスＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子の局在
ＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子のマウス染色体の位置を、以前に記載されているように(コープランド（Copeland）およびジェンキンス（Jenkins）, 1991)、（Ｃ５７ＢＬ／６ＪｘMus Spretus）Ｆ１雌とＣＢ７ＢＬ／６７雄とを交配することによって得られた子孫を用いた種間戻し交雑分析によって決定した。この種間戻し交雑マッピングパネルは、すべての常染色体およびＸ染色体の間に広く分布する、２４００以上の遺伝子座についてタイプされている(コープランド（Copeland）およびジェンキンス（Jenkins）, 1991)。Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびM. SpretusのＤＮＡをいくつかの酵素で消化し、そして情報源である(informative) 制限断片長多型（ＲＦＬＰ）について、本質的に記載されたように(ジェンキンス（Jenkins）他, 1982)、１．３ｋｂのマウスＶＥＧＦ−Ｄ  ｃＤＮＡプローブを用いてサザンブロットハイブリダイゼーションによって分析した。ＴａｑＩで消化したＣ５７ＢＬ／６Ｊ  ＤＮＡにおいて、７．１、６．３、４．７、２．５および２．２ｋｂのフラグメントが検出され、そしてＴａｑＩで消化したM. Spretus  ＤＮＡにおいて、７．１、３．７、２．７、および２．２ｋｂの主要なフラグメントが検出された。同時分離した、３．７および２．７のＴａｑＩM. Spretus  特異的フラグメントの存在または不在は戻し交雑したマウスにおいて伴った(followed)。マッピングの結果は、ＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子が、Ｂｉｋ、ＤｘＰａｓＩおよびＰｔｍｂ４に連鎖（リンク）して、マウスＸ染色体の末端領域に位置するということを示す。８９のマウスにおいてはすべてのマーカーについて分析したが、１３３のマウスはいくつかのマーカーの対についてタイプした。それぞれの遺伝子座を、追加のデータを用いて組換え頻度について対の組み合わせにおいて分析した。各遺伝子座の対について分析したマウスの総数に対する、組換え染色体を示すマウスの総数の比、および最も確からしい遺伝子順序は以下の通りである：セントロメア−Ｂｔｋ−１４／１２１―ＤｘＰａｓＩ―３／９９―ＶＥＧＦ−Ｄ―５／１３３−Ｐｔｍｂ４。Map Manager(version 2.6.5)を用いて算出した組換え頻度［遺伝的距離として、センチモルガン（ｃＭ）±標準誤差にて表現した］は、−Ｂｔｋ−１１．６＋／−２．９―ＤｘＰａｓＩ―３．０＋／−１．７―ＶＥＧＦ−Ｄ―３．８＋／−１．７−Ｐｔｍｂ４である。Ｂｔｋ、ＤｘＰａｓＩ、およびＰｔｍｂ４を含む、ＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子に連鎖した遺伝子座についてのプローブおよびＲＦＬＰの記載は、以前に報告されたものである(ハックフリガー（Hacfliger）他, 1992; ホロウェイ（Holloway）他, 1997)。
【０１３１】
我々は、我々のＸ染色体の種間（遺伝学的）地図と、多くのクローニングされていない突然変異の地図位置を報告している複合性のマウス連鎖地図（The Jackson Library, Bar Harbor, MEに維持されているコンピュータ処理したデータベースである、Mouse Genome Databaseから提供されたもの）とを比較した。内皮細胞分裂促進因子の遺伝子座における変化に関して予期されるであろう、マウスの表現型の突然変異を欠くものである、複合性の（遺伝学的）地図の領域にＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子を、（染色体上に）位置づけた。マウスＸ染色体の末端領域は、ヒト染色体の短腕と、ホモロジー領域を共有している(Mouse Genome Database)。マウスにおけるこの間隔でのＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子の配置は、ヒトホモローグが染色体上でＸｐ２２に位置するであろうということを示唆している。これは、このヒト遺伝子がＸｐ２２．１に局在するとした我々のＦＩＳＨ分析と一致する。
【０１３２】
多数の疾患状態が、ヒトにおいて、Ｘｐ２２．１およびこの領域のすぐ周囲の位置に位置づけられた未知の遺伝子における突然変異によって引き起こされる。これらの疾患状態には、カルマン症候群、眼球白子症（Ｎｅｔｔｌｅｓｈｉｐ−Ｆａｌｌｓ型）、眼球白子症および感音系難聴、Ｐａｒｔｉｎｇｔｏｎ症候群、脊椎骨異形成症（遅発型）、網膜色素変性症１５、性腺形成異常症（ＸＹ  女性型）、Ｎａｎｃｅ−Ｈｏｒａｎ白内障−歯症候群、網膜分離症、シャルコー-マリー-ツース病、Ｆ−細胞産生、低マグネシウム血症、毛包性角化症ｓｐｉｎｕｌｏｓａ  ｄｅｃａｌｖａｎｃｅ、コフィン-ローリー症候群、角膜類皮腫、低リン酸塩血症、無ガンマグロブリン血症、エカルディ症候群、遺伝性低リン酸血症II、精神薄弱（非−異形）、オピッツＧ症候群、色素障害（網状）、ｄｏｓａｇｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ性転換、副腎形成不全、網膜色素変性症−６、難聴−４（先天性感音性）、およびウィルソン−ターナー症候群が含まれる。これらの疾病状態に関与する遺伝子の位置は、Johns Hopkins University (USA)のDr. Victor McKusickおよびその同僚によって編集されたOMIM遺伝子地図に示されている。
【０１３３】
ＶＥＧＦ−Ｄの機能の判定のためのバイオアッセイ
ＶＥＧＦ−Ｄが、内皮細胞に対する機能、血管新生および創傷治癒に関して、ＶＥＧＦと類似の活性を有するか否かを評価するための他のアッセイを行った。受容体結合分布研究の結果によっては更なるアッセイを行ってもよいであろう。
【０１３４】
Ｉ．内皮細胞に対する機能についてのアッセイ
ａ）内皮細胞増殖
内皮細胞増殖アッセイを、例えばファーララ（Ferrara）およびヘンゼル（Henzel） (1989), ゴスポダロヴィッツ（Gospodarowicz）他(1989),および／またはクラッフェイ（Claffey）他, Biochim. Biophys. Acta, 1995 1246 1-9の方法などの、当業者に周知の方法によって行う。
【０１３５】
ｂ）細胞接着アッセイ
多形核顆粒球の内皮細胞に対する接着に関するＶＥＧＦ−Ｄの効果についてテストする。
【０１３６】
ｃ）走化性
標準的なボイデンチャンバー(BoydenChamber) 走化性アッセイを用いて、走化性に関するＶＥＧＦ−Ｄの効果についてテストする。
【０１３７】
ｄ）プラスミノーゲン活性化因子アッセイ
ペッパー（Pepper）他 (1991)の方法を用いて、内皮細胞を、プラスミノーゲン活性化因子およびプラスミノーゲン活性化因子阻害剤の産生に関するＶＥＧＦ−Ｄの効果についてテストする。
【０１３８】
ｅ）内皮細胞遊走アッセイ
モンテサノ（Montesano）他 (1986)に記載されているようにして、内皮細胞の遊走および管（チューブ）の形成を刺激するＶＥＧＦ−Ｄの能力についてアッセイする。別法として、ヨウコフ（Joukov）他 (1996)によって記載された三次元コラーゲンゲルアッセイまたは改変ボイデンチャンバー(Boyden Chamber)におけるゼラチン化メンブラン(グレイザー（Glaser）他, 1980)を用いてもよい。
【０１３９】
ＩＩ．血管新生アッセイ
リョン（Leung）他 (1989)に記載されているようにして、ニワトリ漿尿膜における血管形成応答を誘導するＶＥＧＦ−Ｄの能力についてテストする。別法としてラスティネジャド（Rastinejad）他 (1989)のラット角膜アッセイを用いてもよい；これはin vivo血管新生アッセイについて受け入れられている方法であり、その結果はその他のin vivoシステムにすぐに移行可能である。
【０１４０】
ＩＩＩ．創傷治癒
創傷治癒を刺激するＶＥＧＦ−Ｄの能力について、シリング（Schilling）他 (1959)によって記載され、ハント（Hunt）他 (1967)によって利用された、使用可能な臨床的に最も関連性のあるモデルにおいてテストする。
【０１４１】
ＩＶ．造血系  
造血系に特異的な細胞集団を用いた多様なin vitro およびin vivoのアッセイが当業者に知られているが、以下にその概要を述べる。具体的には、蛍光活性化セルソーターで精製した細胞を用いた多様なin vitroマウス幹細胞アッセイが特に便利である。
【０１４２】
ａ）再増殖幹細胞
これらは致死照射されたマウスの骨髄を再増殖させることができ、そしてＬｉｎ−、Ｒｈｈ１，Ｌｙ−６Ａ／Ｅ＋、ｃ−ｋｉｔ＋の表現型を有する細胞である。ＶＥＧＦ−Ｄを、これらの細胞単独と、またはその他の因子とともに、共−インキュベーションし、その後３Ｈ−チミジン取り込みによる細胞の増殖の測定を行うことによってテストする。
【０１４３】
ｂ）後期段階幹細胞
これらは比較的弱い骨髄再増殖能力を有するが、Ｄ１３  ＣＦＵ−Ｓを産生することができる細胞である。これらの細胞はＬｉｎ−、Ｒｈｈ１，Ｌｙ−６Ａ／Ｅ＋、ｃ−ｋｉｔ＋の表現型を有する。ＶＥＧＦ−Ｄを、これらの細胞とともに一定期間インキュベートし、致死照射されたレシピエントに注入し、そしてＤ１３脾コロニーの数を数える。
【０１４４】
ｃ）前駆(progenitor)-濃縮細胞
これらはin vitroで単一の増殖因子に応答し、Ｌｉｎ−、Ｒｈｈ１，Ｌｙ−６Ａ／Ｅ＋、ｃ−ｋｉｔ＋の表現型を有する細胞である。このアッセイは、ＶＥＧＦ−Ｄが直接的に造血前駆細胞に対して作用することができるか否かを示すものである。ＶＥＧＦ−Ｄをこれらの細胞とともに寒天培養においてインキュベートし、そして７−１４日後に存在するコロニーの数を数える。
【０１４５】
Ｖ．アテローム性動脈硬化症
平滑筋細胞はアテローム性動脈硬化症の発達または惹起において重大な役割を果たしており、それはそれらの表現型が収縮性から合成の状態へと変化することを必要とする。マクロファージ、内皮細胞、Ｔリンパ球および血小板はすべて、平滑筋細胞の増殖および表現型の変調に影響を与えることによって、アテローム斑の発達において役割を果たしている。その中において異なる細胞タイプが対の(opposite)カバーグラスに播かれる、改変Ｒｏｓｅチャンバーを使用したin vitroアッセイは、多細胞の環境における平滑筋細胞の増殖速度および表現型の変調を測定するものであり、それを用いてＶＥＧＦ−Ｄの平滑筋細胞に対する効果が評価される。
【０１４６】
ＶＩ．転移
転移を阻害するＶＥＧＦ−Ｄの能力について、例えばカオ（Cao）他(1995)の方法を使用して、ルイス肺癌モデルを用いてアッセイする。
【０１４７】
ＶＩＩ．その他の細胞タイプにおけるＶＥＧＦ−Ｄ
他の細胞タイプ、例えば肝臓細胞、心筋およびその他の細胞、内分泌細胞そして骨芽細胞（造骨細胞）の、増殖、分化そして機能に対するＶＥＧＦ−Ｄの効果は、in vitro培養による３Ｈ−チミジン取り込みなどの当業者に周知の方法によって簡単にアッセイすることができる。これらおよびその他の組織におけるＶＥＧＦ−Ｄの発現は、ノーザンブロッティングおよびハイブリダイゼーション等の技術、またはin situハイブリダイゼーションによって判定することができる。
【０１４８】
ＶＩＩＩ．ＶＥＧＦ−Ｄ変異体(variant)およびアナログの作成
ＶＥＧＦ−Ｄは、ＰＤＧＦファミリーの増殖因子のメンバーであり、ＰＤＧＦファミリーのその他のメンバーと高度なホモロジーを示す。ＶＥＧＦ−Ｄはこのファミリーの増殖因子に特有の８つの保存されたシステイン残基を含む。これらの保存されたシステイン残基は、システインノット構造を作る、鎖内ジスルフィド結合、およびＰＤＧＦファミリーの増殖因子のメンバーの特徴であるタンパク質ダイマーを作る、鎖間ジスルフィド結合を形成する。ＶＥＧＦ−Ｄは、タンパク質チロシンキナーゼ増殖因子受容体と相互作用する。
【０１４９】
受容体への結合およびその結果としての活性のために必要とされる、タンパク質の構造および活性部位について、ほとんどまたはまったく知られていないタンパク質とは対照的に、ＶＥＧＦ−Ｄの活性のあるミュータントのデザインは、ＰＤＧＦファミリーの増殖因子のメンバーの、活性部位および重要なアミノ酸について多くの知見が得られているという事実によって大幅に促進される。
【０１５０】
ＰＤＧＦファミリーの増殖因子のメンバーの、構造／活性の関係を明らかにする既発表論文には、以下のものが含まれる。ＰＤＧＦについて：エストマン（Oestman）他, J. Biol. Chem., 1991 266 10073-10077; アンダーソン（Andersson）他, J. Biol. Chem., 1992 267 11260-1266; エフナー（Oefner）他, EMBO J., 1992 11 3921-3926; フレミング（Flemming）他, Molecular and Cell Biol., 1993 13 4066-4067およびアンダーソン（Andersson）他, Growth Factors, 1995 12 159-164;そしてＶＥＧＦについて：キム（Kim）他, Growth Factors, 1992 7 53-64; ペトジェンス（Poetgens）他, J. Biol. Chem., 1994 269 32879-32885およびクラッフェイ（Claffey）他, Biochem. Biophys. Acta, 1995 12461-9。これらの出版物から、８つの保存されたシステイン残基のために、ＰＤＧＦファミリーの増殖因子のメンバーは、特徴的なノットのある折りたたみ構造および二量体化を示し、その結果、二量体化した分子のそれぞれの端において３つの露出されたループ領域が形成され、そこにおいて活性受容体結合部位が位置していると予想され得るということが明らかである。
【０１５１】
この情報に基づいて、バイオテクノロジー技術分野に習熟した当業者は、ノットのある折りたたみ配列および二量体化の原因である８つのシステイン残基を保存することによって、およびタンパク質構造のループ１、ループ２、ループ３領域におけるおそらく受容体配列である配列を保存するか、または保存的なアミノ酸置換のみを行うことによっても、ＶＥＧＦ−Ｄ活性を高い確率で保持するＶＥＧＦ−Ｄミュータントをデザインすることができる。
【０１５２】
タンパク質構造において、特異的に標的とする部位における所望の（突然）変異の形成はタンパク質化学者の技術の蓄積において標準的な技術であると考えられる(クンケル（Kunkel）他, Methods in Enzymol., 1987 154 367-382)。ＶＥＧＦに関するそのような部位特異的突然変異誘発の例は、ペトジェンス（Poetgens）他, J. Biol. Chem., 1994 269 32879-32885およびクラッフェイ（Claffey）他, Biochim. Biophys. Acta, 1995 12461-9において見ることができる。事実、部位特異的突然変異誘発は、非常に一般的なものであるのでそのような方法を容易にするキットは市販されている（例えばPromega 1994-1995 Catalog., Pages 142-145）。
【０１５３】
ＶＥＧＦ−Ｄミュータントの内皮細胞増殖活性は、よく確立されているスクリーニング手法によってに簡単に確認することができる。例えば、クラッフェイ（Claffey）他,( Biochim. Biophys. Acta, 1995 1246 1-9)によって記載されている内皮細胞有系分裂アッセイに類似の手法を利用することができる。同様に、その他の細胞タイプの増殖、細胞分化およびヒトの転移に対するＶＥＧＦ−Ｄの効果は、当業者に周知の方法を用いてテストすることができる。
【０１５４】
本発明を明瞭化および理解の目的でかなり詳細に記載したが、この明細書において開示した発明の概念の範囲から逸脱することなく、ここに記載した態様および方法に対する様々な改変および変更を行うことができるということは、当業者にとって明らかであろう。
【０１５５】
ここで引用した文献を以下の頁においてリストし、この記載により、それらは参考文献として本出願にその内容が合体される。
【０１５６】
参考文献
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ホロウェイ，エイ，ジェイ（Holloway. A.J.）, デラ，エヌ，ジー（Della N.G.）, フレッチャー，シー，エフ（Fletcher, C.F.）, ラーガエスパーダ，ディ，エイ（Largaespada, D.A.）, コープランド，エヌ，ジー（Copeland, N.G.）, ジェンキンス，エヌ，エイ（Jenkins, N.A.）およびバウテル，ディ，ディ，エル（Bowtell D.D.L.）
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ジェンキンス，エヌ，エイ（Jenkins, N.A.）, コープランド，エヌ，ジー（Copeland, N.G.）, テイラー，ビー，エイ（Taylor, B.A.）およびリー，ビー，ケイ（Lee, B.K.）
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キム，ケイ，ジェイ（Kim, K.J.）, リー，ビー（Li, B.）, ホウク，ケイ（Houck, K.）, ウィナー，ジェイ（Winner, J.）およびファーララ，エヌ（Ferrara, N.）
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クンケル，ティ，エイ（Kunkel, T.A.）, ロバーツ，ジェイ，ディ（Roberts, J.D.）およびザクアー，アール，エイ（Zakour, R.A.）
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リョン，ディ，ダブリュ（Leung, D.W.）, カチアネス，ジー（Cachianes, G.）, クアン，ダブリュ‐ジェイ（Kuang, W-J.）, ゲッデル，ディ，ヴィ（Goeddel, D.V.）およびファーララ，エヌ（Ferrara, N.）
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モンテサノ，アール（Montesano, R.）, ヴァッサリ，ジェイ，ディ（Vassalli, J.D.）, ベアード，エイ（Baird, A.）, ジルミン，アール（Guillemin, R.）およびオーチ，エル（Orci, L.）
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エフナー，シー（Oefner, C.）, ダーシー，エイ（D’Arcy, A.）, ウィンクラー，エフ，ケイ（Winkler, F.K.）, エッジマン，ビー（Eggimann, B.）およびホサング，エム（Hosang, M.）
EMBO Journal, 1992 11 3921-3926
エルリッヒス，アール，ビー（Oelrichs, R.B.）, ライド，エイチ，エイチ（Reid, H.H.）, バーナード，オー（Bernard, O.）, ジーミッキ，エイ（Ziemiecki, A.）およびウィルクス，エイ，エフ（Wilks, A.F.）
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エストマン，エイ（Oestman, A.）, アンダーソン，エム（Andersson, M.）, ヘルマン，ユー（Hellman, U.）およびヘルディン，シー‐エイチ（Heldin, C-H.）
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オロフソン，ビー（Oloffson, B.）, パジュソラ，ケイ（Pajusola, K.）, カイパイネン，エイ（Kaipainen, A.）, フォン・ユーラー，ジー（von Euler, G.）, ヨウコフ，ヴィ（Joukov, V.）, サクセラ，オー（Saksela, O.）, オーパナ，エイ（Orpana, A.）, ペッターソン，アール，エフ（Pettersson, R.F.）, アリタロ，ケイ（Alitalo, K.）およびエリクソン，ユー（Eriksson, U.）
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ペッパー，エム，エス（Pepper, M.S.）, ファーララ，エヌ（Ferrara, N.）, オーチ，エル（Orci, L.）およびモンテサノ，アール（Montesano. R.）
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ペトジェンス，エイ，ジェイ（Poetgens, A.J.）, ルブセン，エヌ，エイチ（Lubsen, N.H.）, ファン・アルテナ，エム，シー（van Altena, M.C.）, ヴァーミューレン，アール（Vermeulen, R.）, バッカー，エイ（Bakker, A.）, ショーンメイカーズ，ジェイ，ジー，ジー（Schoenmakers, J.G.G.）, ルイター，ディ，ジェイ（Ruiter, D.J.）およびデ・ワール，アール，エム，ダブリュ（de Waal, R.M.W.）
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サムブルック，ジェイ（Sambrook, J.）, フリッチュ，イー，エフ（Fritsch, E.F.）およびマニアティス，ティ（Maniatis, T.）
Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York
シリング（Schilling）他
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ストローン，エル，エム（Strawn, L.M.）, マクマホン，ジー（McMahon, G.）, アップ，エイチ（App, H.）, シュレック，アール（Schreck, R.）, クックラー，ダブリュ，アール（Kuchler, W.R.）, ロンギ，エム，ピー（Longhi, M.P.）, フイ，ティ，エイチ（Hui, T.H.）, タン，シー（Tang, C.）, レヴィツキー，エイ（Levitzki, A.）, ガジット，エイ（Gazit, A.）, チェン，アイ（Chen, I.）, ケリ，ジー（Keri, G.）, オルフィ，エル（Orfi, L.）, リソー，ダブリュ（Risau, W.）, フラメ，アイ（Flamme, I.）, ユルリッチ，エイ（Ullrich, A.）, ヒルス，ケイ，ピー（Hirth, K.P.）およびショーヴァー，エル，ケイ（Shawver, L.K.）
Cancer Res., 1996 56 3540-3545
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１ａ】ヒトＶＥＧＦ−ＤとヒトＶＥＧＦ１６５の配列間の比較を示す図であって、箱は、ヒトＶＥＧＦ−Ｄと正確に一致する残基を示す。
【図１ｂ】ヒトＶＥＧＦ−ＤとヒトＶＥＧＦ−Ｂの配列間の比較を示す図であって、箱は、ヒトＶＥＧＦ−Ｄと正確に一致する残基を示す。
【図１ｃ】ヒトＶＥＧＦ−ＤとヒトＶＥＧＦ−Ｃの配列間の比較を示す図であって、箱は、ヒトＶＥＧＦ−Ｄと正確に一致する残基を示す。
【図１ｄ】ヒトＶＥＧＦ−ＤとヒトＰｌＧＦの配列間の比較を示す図であって、箱は、ヒトＶＥＧＦ−Ｄと正確に一致する残基を示す。
【図２】ヒトＶＥＧＦ−Ｄ、ヒトＶＥＧＦ１６５、ヒトＶＥＧＦ−Ｂ、ヒトＶＥＧＦ−Ｃ、およびヒトＰｌＧＦの配列間の配列アラインメントを示す図であって、箱は、ＶＥＧＦ−Ｄ配列と正確に一致する残基を示す。
【図３】ｃＤＮＡ配列（配列番号１）から予測した、ヒトＶＥＧＦ−Ｄのアミノ酸配列（配列番号３）を示す図であって、箱は、Ｎ−結合型グリコシル化の可能性のある部位を示す。
【図４】市販のヒト肺ｃＤＮＡライブラリーからハイブリダイゼーションによって単離した、ヒトＶＥＧＦ−Ｄをコードする第２のｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列（配列番号４）を示す図であって、このｃＤＮＡは、ヒトＶＥＧＦ−Ｄの全体のコード領域を含む。
【図５】図４のｃＤＮＡ配列から推定した(deduced) 、ヒトＶＥＧＦ−Ｄのアミノ酸配列（配列番号５）を示す図。
【図６】市販のマウス肺ｃＤＮＡライブラリーからハイブリダイゼーションスクリーニングによって単離した、マウスＶＥＧＦ−Ｄ１をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号６）を示す図。
【図７】図６と同じライブラリーから単離した、マウスＶＥＧＦ−Ｄ２をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号７）を示す図。
【図８】マウスＶＥＧＦ−Ｄ１の推定アミノ酸配列（配列番号８）とマウスＶＥＧＦ−Ｄ２の推定アミノ酸配列（配列番号９）を示す図。
【図９】マウスＶＥＧＦ−Ｄ１、マウスＶＥＧＦ−Ｄ２、およびヒトＶＥＧＦ−Ｄの推定アミノ酸配列間の比較を示す図。
【図１０】ヒトＶＥＧＦ−Ｄ、ヒトＶＥＧＦ１６５、ヒトＶＥＧＦ−Ｂ、ヒトＶＥＧＦ−Ｃ、およびヒトＰｌＧＦのアミノ酸配列間の配列アラインメントを示す図。
【図１１】ＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｄのいずれかを発現するＣＯＳ細胞からの条件培地を、Ｂａ／Ｆ３細胞において発現したキメラ受容体の細胞外ドメインに対して結合する能力についてテストした、バイオアッセイの結果を示す図。
【図１２ａ】ＶＥＧＦ−Ｄペプチドの免疫沈降およびウエスタンブロッティング分析の結果を示す図であって、ｐＥＦＢＯＳＶＥＧＦＤｆｕｌｌＦＬＡＧおよびｐＣＤＮＡ−１ＶＥＧＦ−ＡをＣＯＳ細胞にトランスフェクトし、生合成的に３５Ｓ−システイン／メチオニンで４時間標識し、これら培養からの上清を、Ｍ２ゲルまたはプロテインＡに結合したＶＥＧＦ−Ａに対する抗血清のいずれかで免疫沈降した。洗浄したビーズを等容量の２ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーで溶出し、ボイルした。サンプルを次に１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、星印（★）でマークしたレーンは、サンプルをジチオスレイトールで還元し、ヨードアセトアミドでアルキル化したものを示し、分子量マーカーが示されており、ｆＡおよびｆＢは、ｐＥＦＢＯＳＶＥＧＦＤｆｕｌｌＦＬＡＧを発現するＣＯＳ細胞からの、Ｍ２ゲルによって免疫沈降された、４３ｋＤおよび２５ｋＤ種を示す。
【図１２ｂ】精製したＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃのウエスタンブロッティング分析の結果を示す図であって、Ｍ２アフィニティーカラムから溶出した物質のアリコット（フラクション＃３、ＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃ）を、２ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーと混合し、そして１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、タンパク質を次にニトロセルロースメンブランにトランスファーし、モノクローナル抗体Ｍ２またはコントロールのアイソタイプが一致した抗体（Ｎｅｇ）のいずれかで探索した(probed)。ブロットを、ヤギ抗−マウス−ＨＲＰ二次抗体および化学発光(ECL, Amersham)を使用して現像し、単量体のＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃ、およびこのペプチドの推定上の二量体形態（ＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃ”）を矢印で示し、分子量マーカーが示されている。
【図１３】ＶＥＧＦＲ２バイオアッセイを用いた、ＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃタンパク質の分析の結果を示す図であって、組換えＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃ、およびＭ２アフィニティークロマトグラフィーによって精製した物質を、ＶＥＧＦＲ２バイオアッセイを用いて評価し、ＩＬ−３を除去するために洗浄されたバイオアッセイ細胞（１０４）を、ＣＯＳ細胞でトランスフェクトされたＶＥＧＦ−Ｄからの条件培地のアリコット、アフィニティーカラムからのフラクション＃１（ボイド容量）またはアフィニティーカラムからのフラクション＃３（ＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃを含有する）とともにインキュベートし、すべてのサンプルは初濃度２０％（即ち１／５）で、その後倍加希釈してテストしたものであり、細胞を１０％ＣＯ２の加湿雰囲気において３７℃で４８時間インキュベートした。細胞の増殖を、１μＣｉの３Ｈ−チミジンを添加し、そして４時間以上かけて取り込まれた量をカウントすることによって定量化した。
【図１４】ＶＥＧＦ−Ｄでトランスフォームされた組換えバキュロウイルスベクターで感染させたＨＦ細胞からの培養上清による、ＮＩＨ３Ｔ３細胞上のＶＥＧＦＲ３受容体（Ｆｌｔ４）のチロシンリン酸化の刺激を示す図。
【図１５】図１４におけるものと同様に調製した培養上清による、ＰＡＥ細胞におけるＶＥＧＦＲ２受容体（ＫＤＲ）のチロシンリン酸化の刺激を示す図。
【図１６】ウシの大動脈の内皮細胞（ＢＡＥ）に対するＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃの分裂促進効果を示す図であって、ＢＡＥを、ＶＥＧＦＤ△Ｎ△Ｃを含有するフラクション＃３、およびポジティブコントロールとしてテキストにおいて記載された精製ＶＥＧＦ−Ａを用いて処理したものであり、増殖因子を添加していない培地を用いて得られた結果を、培地コントロールとして示す。
【図１ａ】
2007167072.tif 000006
【図１ｂ】
2007167072.tif 000007
【図１ｃ】
2007167072.tif 000008
【図１ｄ】
2007167072.tif 000009
【図２】
2007167072.tif 000010
【図３】
2007167072.tif 000011
【図４】
2007167072.tif 000012
【図５】
2007167072.tif 000013
【図６】
2007167072.tif 000014
【図７】
2007167072.tif 000015
【図８】
2007167072.tif 000016
【図９】
2007167072.tif 000017
【図１０】
2007167072.tif 000018
【図１１】
2007167072.tif 000019
【図１２ａ】
2007167072.tif 000020
【図１２ｂ】
2007167072.tif 000021
【図１３】
2007167072.tif 000022
【図１４】
2007167072.tif 000023
【図１５】
2007167072.tif 000024
【図１６】
2007167072.tif 000025
【配列表】
2007167072000001.app