(57)【要約】本発明は、酵素活性を検出する方法を特徴とする（例えば、磁気共鳴画像において）。一般的に、本方法は以下の段階を含む：（１）Ｘがキレート化された常磁性または超常磁性の金属原子またはイオンを有するキレート化剤部分を含み、Ｙがリンカー部分を含み（例えば、ＸとＺの間に共有結合性または非共有結合性化学結合を与えるため）、およびＺが重合性部分を含む、総称的構造Ｘ−Ｙ−Ｚを有する、単量体基質（例えば、酵素の存在下または酵素触媒反応の結果として重合可能である基質）を提供する段階；（２）該基質を標的組織に接触させる段階であり、該基質が重合を起こして常磁性または超常磁性重合体を形成し、その重合が細胞外基質中のまたは標的組織の細胞の表面に結合している酵素により触媒される段階；および（３）非重合基質の等価量と相対的な該重合体についての緩和性における増加を検出する段階。本発明はまた、基質組成物も特徴とする。
2004530408.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素活性を検出する方法であり、以下の段階を含む方法：
Ｘがキレート化剤部分およびキレート化された常磁性または超常磁性の金属原子またはイオンを含み、Ｙがリンカー部分を含み、かつＺが重合性部分を含む、式Ｘ−Ｙ−Ｚを含む単量体基質を供給する段階；
該基質を標的組織に接触させる段階であり、該基質が重合を起こして常磁性または超常磁性重合体を形成し、該重合が細胞外基質中のまたは標的組織の細胞の表面に結合している酵素により触媒される段階；および
非重合基質の等価量と相対的な、該重合体についての緩和性における増加を検出し、それにより酵素活性を検出する段階。
【請求項２】
常磁性または超常磁性の金属原子またはイオンが遷移金属の原子またはイオンである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
常磁性または超常磁性の金属原子またはイオンがランタニド原子またはイオンである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
重合性部分が、酵素の触媒活性の結果として化学的に修飾されて（１）Ｚともう一つの単量体基質または（２）Ｚと任意の他の重合体もしくはその酵素自身を含む反応中に存在する高分子のいずれかの間に共有結合性化学結合を形成することができる任意の化学基を含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
Ｚが酵素の触媒中心として適応されうる部分である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
Ｘが以下のものからなる群より選択される構造を含む、請求項１記載の方法：
１，４，７，１０−テトラアザシクロド−デカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸；
１，４，７，１０−テトラアザ−シクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸；
１，４，７−トリス（カルボキシメチル）−１０−（２’−ヒドロキシプロピル）−１，４，７，１０−テトラアゾシクロデカン；
１，４，７−トリアザシクロナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸；
１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラ−デカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸；
ジエチレントリアミン−五酢酸（ＤＴＰＡ）；
エチレンジシステイン；
ビス（アミノエタンチオール）カルボン酸；
トリエチレンテトラアミン−六酢酸；
エチレンジアミン−四酢酸（ＥＤＴＡ）；
１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸；
Ｎ−（ヒドロキシ−エチル）エチレンジアミン三酢酸；
ニトリロ三酢酸；および
エチレン−ビス（オキシエチレン−ニトリロ）四酢酸。
【請求項７】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つがＯＨであるという条件で、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５が、Ｈ；Ｒ６がＣ１〜Ｃ６の非置換型アルキルである、Ｒ６；ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ６；ＯＨ；または、Ｒ７およびＲ８がＨもしくはＲ６である、ＮＲ７Ｒ８からなる群より独立的に選択される、以下の構造をＺが含む、請求項１記載の方法：
2004530408.tif 000007
【請求項８】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４またはＲ５がＯＨ置換基と相対的にオルト位にあり、かつＯＨおよびＯＣＨ３からなる群より選択される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４またはＲ５がＯＨ置換基と相対的にメタ位にあり、かつＮＨＣ（Ｏ）Ｒ６およびＮＲ７Ｒ８からなる群より選択される、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
Ｙが、アミノ酸、２個〜６個のアミノ酸残基を含むオリゴペプチド、ヌクレオチド、２個〜６個のヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチド、Ｃ３〜Ｃ１２のアルキル基、ポリエチレンイミン、サッカライド、オリゴサッカライド、中鎖脂肪酸、ポリアミドアミン、ポリアクリル酸、およびポリアルコールからなる群より選択される構造を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
Ｙがアミノ酸または２個〜６個のアミノ酸残基を含有するオリゴペプチドを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
オリゴペプチドがグリシン残基を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
Ｒ１がＨ、ＯＨ、およびＯＣＨ３からなる群より選択される、以下の式を単量体基質が含む、請求項１記載の方法：
2004530408.tif 000008
【請求項１４】
酵素が標的部分へ共有結合的に連結され、該標的部分が標的組織の細胞の表面上の標的分子に結合されている、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
重合体が標的組織の細胞外基質中の１つもしくは複数の高分子に、または標的組織の細胞の表面に結合している、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
高分子が常磁性または超常磁性重合体、タンパク質、オリゴサッカライド、および細胞外基質中に存在するまたは標的組織の細胞の表面に結合しているポリヌクレオチドからなる群より選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
重合体がいずれの他の高分子にも結合していない、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
酵素がオキシドレダクターゼ、モノフェノールオキシダーゼ、モノフェノールモノオキシゲナーゼ、およびカテコールオキシダーゼからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
酵素がチロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質、リパーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼ、およびポリヌクレオチドホスホリラーゼからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
酵素がモノフェノールオキシダーゼまたはカテコールオキシダーゼである、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
オキシドレダクターゼがペルオキシダーゼおよびラッカーゼからなる群より選択される、請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
オキシドレダクターゼがラクトペルオキシダーゼおよび西洋わさびペルオキシダーゼからなる群より選択されるペルオキシダーゼである、請求項１８記載の方法。
【請求項２３】
標的部分が一次抗体、二次抗体、細胞接着分子、サイトカイン、細胞表面受容体分子、または前もって選択された結合パートナーを認識するそれらのフラグメントからなる群より選択される、請求項１４記載の方法。
【請求項２４】
酵素がペルオキシダーゼであり、かつ標的部分が一次抗体および二次抗体からなる群より選択される、請求項１４記載の方法。
【請求項２５】
標的組織がヒトまたは動物の新生血管系を含む、請求項１記載の方法。
【請求項２６】
標的組織が病的なまたは発生上のヒトまたは動物の組織を含む、請求項１記載の方法。
【請求項２７】
以下の段階を含む、磁気共鳴画像化法を用いて酵素活性を検出する方法：
Ｘがキレート化剤部分およびキレート化された常磁性または超常磁性の金属原子またはイオンを含み、Ｙがリンカー部分を含み、かつＺが重合性部分を含む、式Ｘ−Ｙ−Ｚを基質が含む、酵素の存在下においてまたは酵素触媒反応の結果として重合可能な単量体基質を提供する段階；
該基質を標的組織に接触させる段階であり、該基質が重合を起こして常磁性または超常磁性の重合体を形成し、該重合が細胞外基質中のまたは該標的組織の細胞の表面に結合している酵素により触媒される段階；および
非重合基質の等価量と相対的な該重合体についての緩和性における増加を検出し、それにより酵素活性を検出する段階。
【請求項２８】
Ｘがキレート化剤部分を含み、Ｙがリンカー部分を含み、かつＺが重合性部分を含む、式Ｘ−Ｙ−Ｚの化合物を含む組成物。
【請求項２９】
化合物が常磁性または超常磁性の金属原子またはイオンをさらに含む、請求項２８記載の組成物。
【請求項３０】
常磁性または超常磁性の金属原子またはイオンが遷移金属の原子またはイオンである、請求項２９記載の組成物。
【請求項３１】
常磁性または超常磁性の金属原子またはイオンがランタニド原子またはイオンである、請求項２９記載の組成物。
【請求項３２】
金属イオンが鉄イオン、ジスプロシウムイオン、ユーロピウムイオン、およびマンガンイオンからなる群より選択される、請求項２９記載の組成物。
【請求項３３】
金属イオンがガドリニウムイオンである、請求項２９記載の組成物。
【請求項３４】
酵素の触媒活性の結果として化学的に修飾されて（１）Ｚと式Ｘ−Ｙ−Ｚのもう一つの化合物、または（２）Ｚと任意の重合体もしくは高分子のいずれかの間に共有結合性化学結合を形成しうる任意の化学基を重合性部分が含む、請求項２８記載の組成物。
【請求項３５】
Ｚが酵素の触媒中心として適応されうる部分である、請求項２８記載の組成物。
【請求項３６】
Ｘが以下のものからなる群より選択される構造を含む、請求項２８記載の組成物：
１，４，７，１０−テトラアザシクロド−デカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸；
１，４，７，１０−テトラアザ−シクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸；
１，４，７−トリス（カルボキシメチル）−１０−（２’−ヒドロキシプロピル）−１，４，７，１０−テトラアゾシクロデカン；
１，４，７−トリアザシクロナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸；
１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラ−デカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸；
ジエチレントリアミン−五酢酸（ＤＴＰＡ）；
エチレンジシステイン；
ビス（アミノエタンチオール）カルボン酸；
トリエチレンテトラアミン−六酢酸；
エチレンジアミン−四酢酸（ＥＤＴＡ）；
１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸；
Ｎ−（ヒドロキシ−エチル）エチレンジアミン三酢酸；
ニトリロ三酢酸；および
エチレン−ビス（オキシエチレン−ニトリロ）四酢酸。
【請求項３７】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つがＯＨであるという条件で、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５が、Ｈ；Ｒ６がＣ１〜Ｃ６の非置換型アルキルである、Ｒ６；ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ６；ＯＨ；または、Ｒ７およびＲ８がＨもしくはＲ６である、ＮＲ７Ｒ８からなる群より独立的に選択される、以下の構造をＺが含む、請求項２８記載の組成物：
2004530408.tif 000009
【請求項３８】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４またはＲ５がＯＨ置換基と相対的にオルト位にあり、かつＯＨおよびＯＣＨ３からなる群より選択される、請求項３７記載の組成物。
【請求項３９】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４またはＲ５がＯＨ置換基と相対的にメタ位にあり、かつＮＨＣ（Ｏ）Ｒ６およびＮＲ７Ｒ８からなる群より選択される、請求項３７記載の組成物。
【請求項４０】
Ｙが、アミノ酸、２個〜６個のアミノ酸残基を含むオリゴペプチド、ヌクレオチド、２個〜６個のヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチド、Ｃ３〜Ｃ１２のアルキル基、ポリエチレンイミン、サッカライド、オリゴサッカライド、中鎖脂肪酸、ポリアミドアミン、ポリアクリル酸、およびポリアルコールからなる群より選択される構造を含む、請求項２８記載の組成物。
【請求項４１】
Ｙがアミノ酸または２個〜６個のアミノ酸残基を含有するオリゴペプチドを含む、請求項２８記載の組成物。
【請求項４２】
オリゴペプチドがグリシン残基を含む、請求項４１記載の組成物。
【請求項４３】
Ｒ１がＨ、ＯＨ、およびＯＣＨ３からなる群より選択される、以下の式を化合物が含む、請求項２９記載の組成物：
2004530408.tif 000010
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、生化学および磁気共鳴画像化法に関する。
【０００２】
発明の背景
高解像度および高感度をもつインビボでの分子発現の非侵襲性画像法は、臨床診断法および生物医学的研究において有用な道具になるものと思われる。検出可能な標識、例えば、放射性原子は、標的部分、例えば、分子標的（対象の分子）を特異的に結合する抗体に連結されうる。そのような標的は、分子標的を現す細胞または組織を画像化するために使用されうる。磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）は、非侵襲性画像化技術として確かな周知の利点を提供する。例えば、ＭＲＩは、単細胞レベル（２０ μｍ３〜４０ μｍ３の３Ｄ画素）にほぼ等しい、並はずれて高い解剖学的解像度を提供する可能性をもちうる。さらに、器械設計における最近の革新および造影剤の発達により、上記のレベルの解像度をインビボで非侵襲的に達成できることが示されている。インビボでのＭＲＩ研究の主な将来的方向の一つには、特異的分子（例えば、受容体）のマッピングおよびそれらの発現パターンを検出することを含む。
【０００３】
しかしながら、磁気的標識の存在に対するＭＲＩの本質的な低感度、およびその結果としての低いシグナル対バックグラウンド比により、細胞表面の受容体分子のような低量の分子標的の検出および画像化についてＭＲＩの実用性に限界があった。受容体特異的造影剤のＭＲＩは、常磁性金属標識の存在に対して相対的に低感度であることから検証されてきた。例えば、常磁性ガドリニウム複合体についての検出可能限界は、組織１グラムにつき約１００ μモルＧｄと見積もられている。それゆえ、標的化された磁気的標識からのＭＲＩシグナルを増幅する方法が必要とされる。
【０００４】
特異的ＭＲシグナルを増加させるために、多数の異なる増幅スキームが追求されてきた。最も一般には、増幅は、いくつかのシグナル発生常磁性陽イオンまたは超常磁性粒子を標的分子（例えば、受容体リガンド）へ共有結合的に付着させることにより達成される。しかしながら、標的に結合していない（血流中を循環するまたは非特異的に保持される）親和性分子は、水プロトン緩和時間の無差別の短縮により、高いバックグラウンドシグナルを発生しうる。非特異的シグナルが、低標的／バックグラウンド比により、その標的をわかりにくくしうる。これは、特に、血管の標的化の場合に関連している。
【０００５】
発明の概要
本発明は、酵素活性がキレート化されたガドリニウム（Ｇｄ）または他の金属により引き起こされた局所的プロトン緩和速度における減少を増幅するために使用されうるという知見に基づく。この増幅は金属原子またはイオンがキレート化されている単量体基質の酵素依存性重合に起因することが実証された。
【０００６】
この新事実に基づき、本発明は、酵素活性を検出する方法を特徴とする（例えば、磁気共鳴画像において）。一般的に、方法は以下の段階を含む：（１）Ｘがキレート化された常磁性または超常磁性の金属原子またはイオンを有するキレート化剤部分を含み、Ｙがリンカー部分を含み（例えば、ＸとＺの間に共有結合性または非共有結合性化学結合を与えるため）、およびＺが重合性部分を含む、総称的構造Ｘ−Ｙ−Ｚを有する、単量体基質（例えば、酵素の存在下または酵素触媒反応の結果として重合可能である基質）を供給する段階；（２）その基質を標的組織に接触させる段階であり、その基質が重合を起こして常磁性または超常磁性重合体を形成し、その重合が細胞外基質中のまたは標的組織の細胞の表面に結合している酵素により触媒される段階；および（３）非重合基質の等価量との相対的な、その重合体についての緩和性における増加を検出する段階。
【０００７】
本明細書に用いられる場合、「非重合基質の等価量」とは、特定の分子サイズまたは質量を有する重合体により表される単量体基質分子の数を意味する。
【０００８】
本発明における使用のための単量体基質へ組み込まれうるキレート化部分の例には、以下のものが含まれる：１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）；１，４，７，１０−テトラアザ−シクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸；１，４，７−トリス（カルボキシメチル）−１０−（２’−ヒドロキシプロピル）−１，４，７，１０−テトラアゾシクロデカン、１，４，７−トリアザシクロナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸；および１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラ−デカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸；ジエチレントリアミン−五酢酸（ＤＴＰＡ）；トリエチレンテトラアミン−六酢酸；エチレンジアミン−四酢酸（ＥＤＴＡ）；ＥＧＴＡ；１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸；Ｎ−（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸；ニトリロ三酢酸；およびエチレン−ビス（オキシエチレン−ニトリロ）四酢酸。
【０００９】
常磁性または超常磁性の金属原子またはイオンは、例えば、常磁性性質をもつ遷移金属もしくはランタニドの原子またはイオンでありうる（例えば、Ｆｅ３＋、Ｇｄ３＋、Ｄｙ３＋、Ｅｕ３＋、Ｍｎ２＋）。
【００１０】
適するリンカー部分の例は以下のものを含む：アミノ酸、オリゴペプチド（例えば、２個〜６個のアミノ酸残基を有するオリゴペプチド）、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド（例えば、２個〜６個のヌクレオチド残基を有するオリゴヌクレオチド）、Ｃ３〜Ｃ１２のアルキル基、ポリエチレンイミン、サッカライド、オリゴサッカライド、中鎖脂肪酸、ポリアミドアミン、ポリアクリル酸、およびポリアルコール。本発明のいくつかの態様において、リンカー部分は、アミノ酸または２個〜６個のアミノ酸残基を含むオリゴペプチドを含みうる。このように、本発明の特定の態様において、単量体基質は以下の構造をもちうり、Ｒ１はＨ、ＯＨ、またはＯＣＨ３である：
2004530408.tif 000003
【００１１】
本明細書に用いられる場合、「重合性部分」とは、酵素の触媒活性の存在下においてまたは結果として化学的に修飾されて、（１）その修飾された重合性部分と本発明のもう一つの基質、または（２）修飾された重合性部分と（限定されるものではないが）その酵素自身を含む、その反応の間に存在する任意の他の高分子との間に共有結合性化学結合を形成しうる任意の化学基（例えば、フェノール部分または修飾されたヌクレオチド）でありうる。本明細書に用いられる場合、「化学的に修飾される」とは、電子の付加または離脱を含む、電子密度の任意の再編成にかけられることを意味する。
【００１２】
本発明における使用のための単量体基質へ組み込まれうる重合性部分の例は、フェノール部分および酵素の触媒中心に適応されうる他の部分（例えば、適するサイズ、形、および官能基を有する化学的構造であり、官能基は、例えば、水素結合の供与体および／もしくは受容体、疎水性および／もしくは親水性基、芳香族環、ならびに／または、基質と酵素間に水素結合、ファンデルワールスの相互作用、イオン結合、および／もしくはパイスタッキングもしくは他の相互作用を形成するために適切な他の官能基である；そのようなパラメーターは、限定されるものではないが、コンピューターに基づく分子モデリングおよびコンピューター的方法を含む、既知または未来の方法を用いて同定されうる）を含む。
【００１３】
特定の態様において、例えば、重合性部分は、以下のようなフェノール部分でありうる：
2004530408.tif 000004
上記式において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つがＯＨであるという条件で、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、独立的に、Ｈ；Ｒ６がＣ１〜Ｃ６の非置換型アルキルである、Ｒ６；ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ６；ＯＨ；または、Ｒ７およびＲ８がＨもしくはＲ６である、ＮＲ７Ｒ８でありうる。
【００１４】
本発明のいくつかの態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４またはＲ５は、ＯＨ置換基と相対的にオルト位にあり、かつＯＨまたはＯＣＨ３のいずれかである。他の態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４またはＲ５は、ＯＨ置換基と相対的にメタ位にあり、かつＮＨＣ（Ｏ）Ｒ６またはＮＲ７Ｒ８のいずれかである。
【００１５】
単量体基質の重合を触媒するために使用される酵素は、いくつかの場合、標的部分に共有結合的に連結されうり、かつその標的部分は、次には、細胞間基質内またはその標的組織の細胞の表面上の標的分子に非共有結合的に結合しうる。いくつかの態様において、酵素は、オキシドレダクターゼ、例えば、ラクトペルオキシダーゼおよび西洋わさびペルオキシダーゼのようなペルオキシダーゼ、またはラッカーゼである。代替の態様において、酵素は、モノフェノールオキシダーゼ、モノフェノールモノオキシゲナーゼ、またはカテコールオキシダーゼである。典型的なモノフェノールオキシダーゼは、チロシナーゼである。
【００１６】
有用な標的部分の例は、一次抗体、二次抗体、細胞接着分子、サイトカイン、細胞表面受容体分子、または前もって選択された結合パートナーを認識するそれらのフラグメントである。一次抗体および二次抗体は好ましい標的部分である。
【００１７】
上記の化合物Ｘ−Ｙ−Ｚを含む組成物もまた、キレート化された金属原子もしくはイオンの含有または非含有において、本発明の局面と考えられる。
【００１８】
別途定義されないかぎり、本明細書に用いられるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の技術者により一般に理解されるのと同じ意味をもつ。矛盾する場合には、本出願が、定義を含めて、支配するものとする。本明細書に記述されるすべての刊行物、特許および他の文献は、参照として組み入れられている。
【００１９】
本明細書に記載されるものに類似または等価の方法および材料は、本発明の実施または試験において用いられうるが、好ましい方法および材料は下に記載されている。材料、方法および実施例は例示のみを目的とするもので、限定するものではない。本発明の他の性質および利点は、詳細な記載および特許請求の範囲から明らかであると思われる。
【００２０】
本発明の詳細な説明
本発明は、実験動物またはヒトの患者の組織において、非侵襲性検出および選択された「マーカー」酵素活性の画像化のために使用されうるＭＲＩ法を特徴とする。方法の根本原理は、キレート化された（超）常磁性の金属または金属酸化物により発揮される局所的プロトン緩和速度への効果（Ｔ１およびＴ２の緩和時間における減少）の増強である。この増強は、キレート化された（超）常磁性の金属または金属酸化物を含む単量体基質がマーカー酵素により触媒される重合を起こす場合、生じる。非重合基質の等価量との相対的な、重合生成物に関連する緩和時間の減少（緩和性の増加）は、酵素活性部位でのＭＲＩシグナルの増幅に変換する。
【００２１】
本発明の機構の理論に縛られるつもりはないが、重合生成物は、回転相関時間（τｒ） が単量体基質のそれと相対的に増加するため、緩和性の増加が生じると本発明者らは考えている。
【００２２】
本発明の方法に使用される単量体基質は、４つの基本的成分：３つの構造部分：（１）キレート化部分、（２）リンカー部分、および（３）重合性部分を含む。第４の成分は、結合している常磁性または超常磁性の金属原子または金属酸化物である。３つの構造部分のそれぞれは、別々の機能を果たす。キレート化部分は、常磁性または超常磁性の金属原子または金属酸化物を結合するまたはキレート化する。フェノール部分は、マーカー酵素により触媒されるフリーラジカル重合反応に関与する電子供与体として働く。リンカー部分は、キレート化部分と重合性部分との間に化学結合を与え、そのため、重合性部分が重合を起こす場合、キレート化部分は、その結合している常磁性または超常磁性標識と共に、付随して重合される。
【００２３】
様々なキレート化部分が知られており、過度の実験をすることなく、本発明に有用な単量体基質へと組み入れられうる。さらに、新規なキレート化部分が将来、発見される可能性があり、本発明に使用されうる。好ましくは、キレート化部分は、常磁性または超常磁性の金属原子または金属酸化物と共有結合を形成しない。好ましい態様において、キレート化部分は、Ｆｅ３＋、Ｇｄ３＋、Ｄｙ３＋、Ｅｕ３＋、Ｍｎ２＋または他の有用な金属もしくは金属酸化物との、熱力学的および動力学的に安定な、非共有結合性配位複合体またはイオン複合体を形成する。
【００２４】
本発明に有用な単量体基質への組み込みに適する多数のキレート化部分が、当技術分野において知られている。本発明に有用なキレート化部分の例には以下のものが含まれる：
１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）；
１，４，７，１０−テトラアザ−シクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸；
１，４，７−トリス（カルボキシメチル）−１０−（２’−ヒドロキシプロピル）−１，４，７，１０−テトラアゾシクロデカン；
１，４，７−トリアザシクロナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸；
１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラ−デカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸；
ジエチレントリアミン−五酢酸（ＤＴＰＡ）；
トリエチレンテトラアミン−六酢酸
エチレンジアミン−四酢酸（ＥＤＴＡ）；
１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸；
Ｎ−（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸；
ニトリロ三酢酸；および
エチレン−ビス（オキシエチレン−ニトリロ）四酢酸。
【００２５】
重合性部分は、酵素依存性重合を起こす任意の生体適合性部分でありうる。典型的な重合性部分は、フェノール部分、修飾されたヌクレオチド部分、およびサッカライド部分である。マーカー酵素および重合性部分は、機能的適合性について選択される、すなわち、重合性部分は、マーカー酵素により基質として認識される。
【００２６】
本明細書に用いられる場合、「フェノール部分」とは、フェノール環を含む部分を意味する。本明細書に用いられる場合、「フェノール環」とは、少なくとも１つの環位がヒドロキシル（ＯＨ）基で置換されており、かつ少なくとも１つの環位が置換されていないという条件で、他の環位が選択的に置換されているフェニル環である。フェノール環は、特定の条件下で、フリーラジカル重合反応に関与しうる。
【００２７】
好ましいフェノール部分は、Ｒ１がＨ、ＯＨまたはＯＣＨ３である、以下の構造をもつ：
2004530408.tif 000005
フェノール部分において多数の構造的変異が許容される。例えば、パラ位の一方での前記の置換に加えて、他方のパラ位も同様に、例えばＨ、ＯＨまたはＯＣＨ３で置換されうる。両方のパラ位が置換されている場合、その置換は同じまたは異なりうる。もう一つの変異において、アミノ基またはアミド基が、フェノール環上のメタ位で置換されている。フェノール環上の様々の可能な置換の効果は、その置換の同定およびその環上でのそれらの相対的位置に基づき、公知の有機化学の原理に従って、当業者により予測されうる。例えば、Ｌ． Ｇ． ウェード， Ｊｒ．（Ｌ． Ｇ． Ｗａｄｅ， Ｊｒ．）、１９８８、「有機化学（ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、プレンティスホール社（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ， Ｉｎｃ．）、エングルウッドクリフス（Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ Ｃｌｉｆｆｓ）、ＮＪ、６６６〜６６９を参照。例えば、メタ位（ヒドロキシル基と相対的な）でのアミノ基は強く活性化している、すなわち、それがその環をより良い電子供与体にさせ、かつ従って、より反応性にさせる。
【００２８】
周知の化学に基づき、本発明において、フェノール部分からの電子の損失によりフェノールのフリーラジカルが発生する時にフェノールの重合が起こることは、予想される。これは、例えば、２つのフェノール部分の各々がペルオキシダーゼにより触媒される反応Ｈ２Ｏ２→２Ｈ２Ｏにそれぞれに１個の電子を提供する時、起こる。その後、２つのフェノールのフリーラジカルは、お互いに反応して共有結合性連結を形成する。フェノールのフリーラジカルは、不対電子が芳香族環上の、加えて酸素上の異なる位置に存在する、いくつかの共鳴の形を含む。これは、様々な連結でのフリーラジカルの共有結合的カップリングを引き起こし、異なる重合生成物の混合物を生じさせる。フェノールの重合反応およびペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、およびチロシナーゼのような酵素の機構に関する情報は、当技術分野において公知である。例えば、アッカラ（Ａｋｋａｒａ）ら、１９９４， Ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃｓ ２：３３１〜３３９；ソーンダーズ（Ｓａｕｎｄｅｒｓ）ら、１９６３、「ペルオキシダーゼ（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）」、バターワース（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ）、ワシントン， ＤＣ；アッカラ（Ａｋｋａｒａ）ら、１９９１， Ｊ． Ｐｏｌｙｍｅｒ． Ｓｃｉ． ２９：１５６１〜１５７４；クレスティニ（Ｃｒｅｓｔｉｎｉ）ら、２０００， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ８：４３３〜４３８；グエラ（Ｇｕｅｒｒａ）ら、２０００， Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ． Ｔｅｃｈｎｏｌ． ２６：３１５〜３２３を参照。
【００２９】
本発明を実施することにおいて、重合生成物の正確な構造の知識は必要ではない。理論に縛られることを望まないが、本発明の操作は、単量体基質と重合生成物間の原子の緩和性における違いに関連しており、重合体でのサブユニット残基のいずれの特定の構造配列にも依存しないと考えられている。重合生成物は、多数の、異なって枝分かれしている重合体の混合物であることが予想される。
【００３０】
重合生成物における基質残基の構造配置は、通常、知られていないが、重合体分子あたりの残基の数の範囲は、例えば、サイズ排除（ゲル濾過）クロマトグラフィーによるインビトロの反応において測定されうる。特定の基質／酵素の組み合わせを利用するそのようなインビトロの試験は、インビボで形成されるであろう重合体のサイズに関して有用な予測を行うために使用されうる。重合体あたりの正確な残基の数（または残基の数の範囲）は重要ではないが、好ましくは、生成混合物は、長さが６、７、８、１０、１２または１４残基までの範囲である重合体を含む。一般的に、より長い重合体が好ましい。本発明の好ましい態様において、単量体基質は以下のように選択される：（１）単量体もその結果生じる重合体も、画像化のために使用される量において有意な毒性を示さない、および（２）単量体もその結果生じる重合体の両方とも、単量体が患者に投与された後、何時間から何日間の範囲内で排出されるまたは生物学的に分解される。
【００３１】
リンカー部分について、その機能はただ、キレート化部分を重合性部分に結合することであるため、厳密な構造的必要条件はない。いったん単量体基質に組み込まれたならば、リンカー部分は、いずれの化学反応またはいずれの特定の結合相互作用にも関与する必要はない。このように、リンカー部分は、主として、合成の便宜、立体障害の欠如、および生物分解性性質のような要素に基づいて選択または設計されうる。１個または複数、例えば、２個〜６個のＬ−アミノ酸を含むリンカー部分が好ましいが、その理由は、それらのカルボキシル基およびアミノ基は単量体基質の合成での使用に都合が良く、そのペプチド結合は生物分解性であり、かつそのポリペプチド分解生成物は非毒性であるからである。かさのあるまたは反応性の側鎖をもたないことから、グリシンおよびアラニンのようなアミノ酸は好ましいアミノ酸である。
【００３２】
本発明は、単量体基質における３つの別個の構造部分に関して本明細書に記載されているが、キレート化部分とリンカー部分の間、および／またはリンカー部分と重合性部分の間に、明らかに限定された境界線があるわけではないことを当業者は認識しているものと思われる。例えば、図１に示される単量体基質において、リンカー部分のグリシン残基と重合性部分のフェノール環との間に２つのメチレン基がある。それらのメチレン基がリンカー部分の一部としてみなされるのかまたは重合性部分の一部としてみなされるのかは、本質的に恣意的である。さらに、リンカー部分は、必ずしも別途の合成試薬を表していないことを当業者は認識しているものと思われる。例えば、図１に示される単量体基質において、リンカー部分の１つのグリシン残基は、グリシンメチル−ＤＯＴＡトリ−ｔＢｕエステル試薬に由来し、かつ他方のグリシン残基は、チラミンまたはドーパミンに由来する。
【００３３】
本発明の実施において、一般的に、キレート化部分は交換可能であり、フェノール部分は交換可能であり、およびリンカーは交換可能である。このように、キレート化部分、フェノール部分およびリンカーの多数の異なる組み合わせは、本発明の範囲内である。
【００３４】
その３つの構造部分のそれぞれは、商業的に得られうる、または通常の有機化学的合成方法に従って合成されうる。その３つの部分の適する共有結合性連結は、当業者により、過度の実験もなく、通常の方法を用いて行われうる。
【００３５】
マーカー酵素は、キレート化された（超）常磁性の金属または金属酸化物を含む単量体基質の重合を触媒する能力がある任意の酵素でありうる。これは、マーカー酵素が与えられた単量体基質との適合性について選択される、または単量体基質が与えられたマーカー酵素の型との適合性について設計されることを意味する。例えば、マーカー酵素は、鋳型非依存性ＲＮＡまたはＤＮＡポリメラーゼでありうり、単量体基質は、重合可能なヌクレオチド誘導体でありうる。または、マーカー酵素は、オキシドレダクターゼでありうり、単量体基質は、そのオキシドレダクターゼによる酸化に基づく重合を起こす電子供与体でありうる。有用なオキシドレダクターゼには、過酸化水素−オキシドレダクターゼ（Ｅ．Ｃ． １．１１．１．７）、ラクトペルオキシダーゼ、および西洋わさびペルオキシダーゼのようなペルオキシダーゼを含む。
【００３６】
ペルオキシダーゼが使用される場合、本発明の方法は、画像化される組織において過酸化水素の適当な量を供給することを含む。過酸化水素は直接的に供給されうる。または、それは、インサイチューで、例えば、グルコースオキシダーゼを用いて発生されうる。過酸化水素がインサイチューで酵素的に発生させられる場合には、その発生させる酵素は、直接的に投与されうる（前もって形成された酵素として）、または組織へ導入された適する核酸ベクターから組織において発現されうる。
【００３７】
原則として、マーカー酵素は、画像化される組織において自然に発生する内在性酵素でありうる。しかしながら、典型的には、マーカー酵素は標的部分へ連結される外来性酵素である。標的部分は、画像化される組織においてマーカー酵素の選択的蓄積を引き起こす。一般的に、標的部分は、細胞外基質中に、または画像化される組織に見出される１つまたは複数の細胞型の表面上に露出される分子に選択的に結合する。有用な標的部分の例は、細胞表面のタンパク質または炭水化物に対して向けられる抗体である。または、標的部分は、例えば、細胞接着分子、サイトカイン、細胞表面受容体分子、またはその意図された結合パートナーを認識するそれらのフラグメントでありうる。いくつかの態様において、標的部分およびマーカー酵素は、共有結合的に連結されて、単一の分子を形成する。例えば、ペルオキシダーゼ酵素は、通常のカップリング反応を用いて、一次標的抗体へ共有結合的にカップリングされうる。他の態様において、マーカー酵素は、二次標的部分、例えば、一次抗体などの一次標的部分を認識する二次抗体に、カップリングされる。この方法は、通常の「サンドイッチＥＬＩＳＡ」技術の適応を表す。
【００３８】
重合生成物を生じる酵素触媒反応は、酸化還元反応に限定されない。多くの酵素（ポリメラーゼ）が個々の単量体間の化学結合の形成を触媒する。
【００３９】
下記の実施例により実証されるように、本発明者らは、磁気共鳴画像化シグナル増幅（ＭＲＡＭＰ）に利用されうる常磁性緩和現象を観察しかつ特徴づけた。その効果は、ペルオキシダーゼ触媒性過酸化水素還元の間、電子供与体として働くフェノールに共有結合されたキレート化部分に保持された常磁性ガドリニウムを使用して観察された。過酸化水素自身の代わりに、例えば、グルコースのグルコースオキシダーゼ媒介性酸化の結果として過酸化水素を生成するグルコースオキシダーゼおよびグルコースの混合物を含む、過酸化水素系もまた用いられた。単量体は、単量体基質の約８残基を含む常磁性重合体への急速な縮合を起こした。縮合の結果として、原子緩和性（ＲＩ／Ｇｄ）の２．５倍〜３倍の増加を生じた。その観察された緩和効果は、より高いガドリニウム原子緩和性（ｒ１またはｒ２）を生じる生成物を含む磁気部分の回転相関時間τｒの増加により説明されるものと思われる。基質単量体の縮合は、磁気共鳴画像法による酵素活性の検出を場所的（定性的）および定量的の両方の面で促進した。ペルオキシダーゼのナノモル量を検出することにおいてのＭＲＡＭＰの可能性は、酵素結合免疫吸着検定法形式で実証された。ＭＲＡＭＰは、さらに、ＩＬ−１β処理の内皮細胞の表面上のＥ−セレクチン発現を検出することに利用された。
【００４０】
オキシドレダクターゼ（例えば、ペルオキシダーゼ（供与体：過酸化水素オキシドレダクターゼＥ．Ｃ． １．１１．１．７）、またはラクトペルオキシダーゼ）は、電子の供与体としての常磁性基質（ＡＨ）を用いる過酸化物の還元を触媒するであろうと、本発明者らは仮定した（反応１）。本発明者らはまた、酸化された供与体は、その後、より大きな常磁性重合体へと重合する（オリゴマー形成する）であろうと予測した（反応２）。
２ＡＨ ＋ ［Ｅ Ｈ２Ｏ２］ → ２［＊Ａ］ ＋ ２Ｈ２Ｏ ＋ Ｅ  （反応１）
ｎ［＊Ａ］ → ［Ａ］ｎ  （反応２）
【００４１】
本発明者らは、オキシドレダクターゼが、チラミン−およびドーパミン−結合のキレート化されたガドリニウムを酸化して重合体形成へ導くことを実証した。本発明者らは、結果として原子緩和性の２．７倍〜３．５倍の増加を生じることを観察し、この緩和現象がＭＲＩを使用する視覚性マーカー酵素活性に利用されうることを実証した。
【００４２】
実施例
本発明は、さらに、以下の実施例により例示される。実施例は、例示的目的のみのために提供され、少しでも本発明の範囲または内容を限定することの意にとられるべきではない。
【００４３】
実施例１：基質合成
グリシルメチル−ＤＯＴＡ、トリｔＢｕエステルを使用して、２ ｍｌ ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中でジシクロヘキシルカルボジイミド（図１）の１．１倍モル過剰量の存在下で、２４時間、等モル量（０．２５ ｍモル）を反応させることにより、グリシンのカルボキシル基をチラミンまたはドーパミン（ヒドロキシチラミン）のアミノ基へ連結させた。反応混合物は、グラスファイバーフィルターを通して濾過され、１００ ｍｌ クロロホルム中に溶解され、そして水で洗浄された。生成物は、減圧蒸発により回収され、５０ ％ トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で１時間処理された。脱保護された酸は、ジエチルエーテルで洗浄され、減圧蒸発により乾燥された。粗製のチラミニル−またはヒドロキシチラミニル−グリシルメチルＤＯＴＡは、Ｇｄクエン酸の等モル量の溶液中（ｐＨ ３．５）に溶解され、７５℃で１時間、アルゴン下で加熱され、そして０．１ ％ ＴＦＡ中でのアセトニトリルの勾配により溶出されるＶｙｄａｃ Ｃ−１８ ＨＰＬＣカラムを使用することにより精製された。２８０ ｎｍでの主なピークは収集されて、乾燥された。マトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）による遊離酸の分析より、５９４の質量（ｍ／ｚ）が示された（計算上は５９３）。精製されたガドリニウム塩の分析により、モノガドリニウム塩の形成に対応するｍ／ｚ ７４８が示された。
【００４４】
実施例２：細胞培養
ヒト臍静脈内皮細胞（内皮生物学、ブリガムアンドウィミンズホスピタル（Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）、ボストン、ＭＡ）は、通常の技術を用いて単離された（例えば、Ｓａｂａら、Ｓｅｒｉｅｓ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ６：４５６を参照）。細胞は、ゼラチンで覆われたプラスチック上に蒔かれ、内皮増殖サプリメント含有の内皮基本培地（ＥＤＭ）（クロンティクス（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ））の１０ ％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ）で培養された。ヒト組換え体ＩＬ−１β（１０ ｐｇ／ｍｌ）での細胞の処理は、３７℃で、４時間、行われた。ＩＬ−１βで処理された細胞の表面上でのＥ−セレクチンの発現は、モノクローナルの抗−ヒトＥセレクチン抗体Ｈ１８／７（病理学血管研究部門（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｅｐｔ． ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）、ブリガムアンドウィミンズホスピタル（Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）、ボストン、ＭＡ）、続いて抗−マウス−ローダミン結合体（ピアスケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ． Ｃｏ．））を用いる蛍光顕微鏡法により立証された。
【００４５】
実施例３：ペルオキシダーゼ触媒反応および画像化
１０ μＭ〜５０ μＭの濃度の基質ＩおよびＩＩは、１０ ｍＭ リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または０．０５ Ｍ リン酸ナトリウム ｐＨ ６．８中のペルオキシダーゼ（０．１ ｎＭ〜１００ ｎＭ）および過酸化水素の過剰量（３．５ ｍＭ）により処理された。いくつかの態様において、過酸化物発生系（５ ｍＭ グルコース、グルコースオキシダーゼおよびラクトペルオキシダーゼ）を用いた。阻害研究において、２ ｍＭ Ｇｄを含まない基質、チラミン、ドーパミン、またはメチルドーパミンが、競合的阻害剤として添加された。その反応は、４００ ｎｍでの分光測光法およびＮＭＲ分光測定法（ミニスペック１２０ブルカー（Ｍｉｎｉｓｐｅｃ １２０ Ｂｒｕｋｅｒ））によりモニターされた。磁気共鳴画像法は、１．５ Ｔシグナ（Ｓｉｇｎａ）ＧＥシステムおよび表面またはニーコイルを用いて行われた。反転−回復パルス配列（ＴＥ １１ ｍｓ／ＴＲ １０００ ｍｓ／ＴＩ ５０ ｍｓ〜６００ ｍｓ）は、ＴＩ測定に使用された。スピンエコー配列（ＴＥ １３ ｍｓ／ＴＲ ４００ ｍｓ／２ ＮＥＸ、マトリックス２５６ ｘ １６０）は、シグナル増幅の磁気共鳴画像法に最適であった。磁気共鳴シグナル強度は、関心領域への接近方法および１６ビットのＴＩＦＦ画像を用いて測定された。平均ピクセル値は、スチューデントのｔ検定を用いて比較された。
【００４６】
実施例４：ペルオキシダーゼ結合体媒介性触媒反応のＭＲＩ
Ｈ１８／７モノクローナルの抗−ヒトＥセレクチン抗体のＦａｂ２’フラグメントは、ペプシン消化を用いて調製され、その後精製された。Ｆａｂ２’−フラグメントのジゴキシゲニン（ＤＩＧ）ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＨＳＥ）（ロシュモレキュラーダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））での標識化は、販売者の使用説明書に従って行われた。ＤＩＧ−標識化抗体の１ ｎｇ〜１０００ ｎｇは、９６ウェルのプレート（ヌンク（Ｎｕｎｃ））で０．０１ Ｍ 炭酸ナトリウム（ｐＨ ９）で連続的に希釈され、３７℃で、一晩、吸着させた。ウェルをＢＳＡ溶液でブロックして０．１ ％ ツウィーン２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗浄し、そして抗−ＤＩＧ抗体−ペルオキシダーゼ結合体（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）、１：１０００に希釈）をＰＢＳ−Ｂ中に１時間、ウェルでインキュベートした。洗浄されたウェルは、０．４ ｍＭ 基質ＩまたはＩＩ および過酸化水素（３．５ ｍＭ）の２００ μｌで満たされ、画像化の前に、３０分間、インキュベートされた。細胞（２００万個／試料）は、ＩＬ−１β、抗−ＥセレクチンＤＩＧ−標識化Ｆａｂ２’−フラグメント、および抗−ＤＩＧ抗体−ペルオキシダーゼで連続して処理された。細胞懸濁液は、ＰＢＳ中に調製され、基質は上記のように使用された。細胞は、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）チューブにペレット化され、その後、上記のように画像化された。対照試料は、ＩＬ−１β処理を用いないことにより、または処理された細胞での一次抗体の非存在下において、調製された。磁気共鳴シグナル強度は、上記のように定量され、水溶性Ｇｄ溶液のそれと比較された。
【００４７】
実施例５：酵素媒介性酸化および緩和現象
過酸化水素の過剰量の存在下におけるチラミニル−ＤＯＴＡ（Ｇｄ）、Ｉ、またはヒドロキシチラミニル−ＤＯＴＡ（Ｇｄ）、ＩＩの酸化の反応動力学は、分光測光法を用いて研究された。両方のガドリニウム標識化基質の場合における４００ ｎｍでの吸光度の増加は急速で、両方の基質の効率的な酸化を示しており、類似した仮−一次反応動力学定数：ｋ１ａｐｐ ＝ ０．０１２５ ｓ−１ （Ｉ）および０．０１３ ｓ−１ （ＩＩ）を示した。
【００４８】
分光測光法と並行して、２０ ＭＨｚ（０．４７ Ｔ）および６０ ＭＨｚ（１．５ Ｔ）でのＨ１ ＮＭＲ緩和測定法を用いることにより行われた緩和時間変化（Ｔ１およびＴ２）の測定は、酵素の添加後、緩和時間において相伴って急速な減少を示した。ガドリニウムの濃度に対して緩和データをプロットすることにより、基質Ｉの場合２倍（０．４７ Ｔで）および２．７倍（１．５ Ｔ）、ならびに基質ＩＩの場合３．５倍（０．４７ Ｔで）の１／Ｔ１および１／Ｔ２の上昇が測定された（表１）。ペルオキシダーゼのみの存在下における基質のインキュベーションは、ガドリニウム緩和性の少しの測定可能な変化も生じなかった。緩和性における増加がＤＯＴＡ（Ｇｄ）複合体からのガドリニウム陽イオンの解離の結果であるかどうかを見出すために、Ｔｙｒ−ＤＯＴＡ（Ｇｄ）またはドーパミン−ＤＯＴＡ（Ｇｄ）をキレックス−１００（Ｃｈｅｌｅｘ−１００）樹脂で処理し、ペルオキシダーゼが添加されない対照とそれを比較した。処理の前および後において、基質溶液のＴ１緩和時間に違いは観察されなかった。
【００４９】
【表１】緩和性の増強
2004530408.tif 000006
【００５０】
原子緩和性において観察された変化が、高分子量の生成物の生成に関連しているのかどうかを調べるために、反応混合物を１０分から１時間までの範囲内での異なる時間においてインキュベートし、サイズ排除ＨＰＬＣを用いて反応生成物を分析した。その後、溶出特性をペルオキシダーゼの非存在下における対照基質のそれと比較した（図２）。ペルオキシダーゼ媒介性触媒反応の前および後における溶出特性の比較より、明らかに、６ ｋＤａ〜７ ｋＤａ分子（中央値＝６．８ ｋＤａ）に対応する流体力学的半径をもつより高い分子量の生成物の形成が示された。その測定された質量は、その生成物が８個の酸化された基質単量体の縮合の結果として形成されたことを示唆している。これは、反応生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析により確認された。
【００５１】
縮合生成物の分子量が基質の初期濃度に依存しているかどうかを決定するために、基質濃度を変えたが（１０ μＭ〜６０ μＭ）、最終の縮合生成物の溶出時間において変化は観察されなかった。最後に、チラミン、ドーパミン、メチル−ドーパミンまたはチロシンと同様の非標識化基質の等モル量の添加は、初期に観察されるガドリニウム緩和性に影響を及ぼさなかった。
【００５２】
実施例６：磁気共鳴画像化法
最初のＭＲＩ実験は、常磁性基質の酵素媒介性転換の可視化の可能性を試験するために計画された。ペルオキシダーゼおよびその基質の存在下または非存在下における、基質の異なる希釈を含むチューブのアレイが、この実験に使用された。ペルオキシダーゼおよび過酸化物を含む試料における磁気共鳴シグナルの増強は、スピンエコーＴ１重みつきの配列を適用した後に、明らかに見ることができた。磁気共鳴シグナルの中央値１．６倍の増強が、ペルオキシダーゼ処理後、０．０５ ｍＭ〜０．４ ｍＭのガドリニウム濃度範囲において測定された（図４）。反応混合物のシグナル強度は、より高い原子緩和性のため、水溶性ガドリニウム溶液標準より、明るかった。
【００５３】
ペルオキシダーゼの存在に対する増幅反応の感度を測定するために、０．１ ｍＭ〜０．２ ｍＭ基質ＩまたはＩＩを含む反応混合物において酵素の濃度を変えた（図４）。どちらの場合においても、１ ｎｇより多い量（例えば、２００ μｌの容量において１０ ｎｇのペルオキシダーゼ）が、明らかに見ることができる緩和効果を生じた。
【００５４】
実験の次のシリーズにおいて、ＭＲＡＭＰがＥＬＩＳＡ様アッセイ法においてモデルリガンドを検出するために利用されうるかどうかを測定した。ジゴキシゲニンで共有結合的に標識されたモデルタンパク質（モノクローナル抗体のＦａｂ２’フラグメント）の異なる量を９６ウェルプレートの表面に吸着させ、抗−ジゴキシゲニン−ペルオキシダーゼ結合体の存在下でインキュベートした。ＭＲＡＭＰアッセイ法の感度は、基質ＩＩを使用することにより最適化されることを見出した（１ ｎｇ抗体フラグメントが閾値で検出される）（図５）。標準的ＥＬＩＳＡアッセイ法の感度も同様で、また閾値量として１ ｎｇを示した。
【００５５】
後者の実験より、細胞の表面上の特異的抗原の発現の検出を含むさらなるＭＲＩの可能性が示唆された。インターロイキン−１β処理に対する応答としてヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の表面上でのＥセレクチンの高特異的発現を含むモデル系を利用した。最初に、Ｅ−セレクチンは実際に、細胞表面上で特異的に発現されることを実証した。抗−Ｅ−セレクチンＦａｂ’２の結合は、蛍光標識化二次抗体を使用する顕微鏡法により実証されているように、１Ｌ−１β処理の細胞の場合においてのみ高特異的かつ検出可能であった。酵素媒介性磁気共鳴シグナル増強は、１Ｌ−１β、続いてジゴキシゲニン標識化抗体および抗−ｄｉｇ−ペルオキシダーゼで処理された細胞の沈澱物においてのみ検出された。対照、未処理の細胞または抗−Ｅ−セレクチン抗体とインキュベートされない１Ｌ−１β処理の細胞において、バックグラウンドシグナルを越える増強は見られなかった。細胞表面に結合している酵素により引き起こされる特異的磁気共鳴増強は、典型的には、２倍であり、５０ μＭ ガドリニウム仮想のシグナル強度と等価であった。
【００５６】
実施例７：メラニンにおけるドーパミン−ＤＯＴＡ（Ｇｄ）の取り込みによるチロシナーゼの検出
マウスメラノーマ細胞（Ｂ１６メラニン欠乏性メラノーマ、Ｂ１６−Ｆ１０、ＰＣ１、およびＰＣ１Ａ）は、１０ ｃｍの皿に、５０万細胞／プレートで、１０ ％ ＦＣＳ、ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に蒔かれた。半合流で（８０ ％）、培地は、２５ μＭ アスコルビン酸ナトリウムの存在下で１ ｍＭ ドーパミン−ＤＯＴＡ、Ｇｄ塩で補充された。様々な時間点において、細胞は、トリプシン処理により収集され、ハンクス液における４０ ％ ハイパック（Ｈｙｐａｑｕｅ）−１０７７の段階を通過することにより洗浄され、０．２ ｍｌチューブに沈澱され、そして細胞沈澱物のＴ１およびＴ２の緩和時間における変化は、表面コイルでの３を使用する１．５ Ｔシグナ（Ｓｉｇｎａ）臨床画像化ＭＲシステムを用いて測定された。
【００５７】
実施例８：５−環位においてアリルアミノ−ＤＯＴＡ（Ｇｄ）で置換されたｄＵＴＰまたはＵＤＰの合成
ＧｌｙＭｅＤＯＴＡ、トリ−ｔ−ＢｕエステルおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドの等モル量（２５ μモル）は、１ ｍｌ ＤＭＦ中、アルゴン下４時間、ジシクロヘキシルカルボジイミドの１．１モル過剰量で処理された。ジシクロヘキシル尿素の沈澱物は濾過により除去され、ＤＭＦは減圧下で除去された。５−アリルアミノ−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸または５−アリルアミノ−２’−ウリジン−５’−二リン酸（２５ μモル）は、ジオキサン：水（１：１）およびＧｌｙ−ＭｅＤＯＴＡの混合物に溶解され、トリ−ｔＢｕ ＨＳＥエステルが添加された。混合物は、１８時間インキュベートされ、７０ ％ ＴＦＡ（容量単位で）で処理された。室温で３時間後、混合物は、減圧下で乾燥され、水に溶解され、そしてクロロホルムで抽出された。水相は収集され、水中での５０ μモル Ｇｄクエン酸と混合された。反応混合物は、６０℃で２時間、保持され、そしてｐＨ ６、水中、酢酸アンモニウムの０．０２ Ｍ〜１ Ｍ勾配で溶出されるヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ）−４０００ ＰＥ１７ ＨＰＬＣカラムを使用して精製された。三リン酸（第三の主な２６０ ｎｍ正のピーク）または二リン酸（第二のピーク）を含む画分は、収集されて、恒量へと凍結乾燥された。
【００５８】
実施例９：ＤＮＡポリメラーゼＩを用いるニックトランスレーション（ＮＴ）標識化−−常磁性ＤＮＡの調製
個々のＮＴ反応シリーズは、以下の試薬を使用してＰＣＲチューブ（０．２ ｍｌ）に設定された：標識するための５ μｇ ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ二本鎖プラスミドＤＮＡ（濃度ｃ ＞ １ μｇ／μｌ）、ＤＯＴＡ（Ｇｄ）−ｄＵＴＰ １ ｎモル／μｌ；ｄＮＴＰ（定型的なヌクレオチド）：ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、各０．５ ｍＭ、ｄＴＴＰ ０．１ ｍＭ 、ＮＴ反応緩衝液１０ ｘ （０．５ Ｍ トリス ｐＨ ８、５０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）、 ＤＴＴ ０．１ Ｍ、水に希釈された１：２０００の希釈度の ＤＮアーゼ（保存溶液３ ｍｇ／ｍｌ）、ＤＮＡポリメラーゼ ５ Ｕ／μｌ（例えば、ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）；ＥＤＴＡ（０．５ Ｍ、ｐＨ ８．０）。５０ μｌ反応混合物は、氷上で調製され、ＤＮＡの５ μｌが使用される１つのＮＴ反応に対して以下のものを使用した；５ μｌ ＮＴ（１０ ｘ）；５ μｌ ＤＴＴ；５ μｌ ｄＮＴＰ；２ μｌ ＤＯＴＡ（Ｇｄ）−ｄＵＴＰ；１ μｌ ＤＮアーゼＩ；１ μｌ  ＤＮＡポリメラーゼ；水で５０ μｌにする。混合物は、１５℃で０．２５時間〜３時間、インキュベートされ、その後、２．５ μｌ ＥＤＴＡ（０．５ Ｍ、ｐＨ ８．０）で停止された。対照混合物は、緩衝液中にＥＤＴＡを含むように調製された。Ｔ１変化は、１．５ Ｔシグナ（Ｓｉｇｎａ）ＭＲ画像化システムを用いてモニターされた。
【００５９】
実施例１０：ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントにより操作されるＤＮＡのランダムプライマー常磁性標識化
個々のランダムプライマー標識化反応シリーズは、以下の試薬を使用してＰＣＲチューブ（０．２ ｍｌ）に設定された：１０ μｌ ＤＮＡ鋳型（１００ ｎｇ〜１ μｇ）；５ Ｘ 反応緩衝液中の１０ μｌ ランダムプライマー、容量を４０ μｌまで増加させるため脱イオン水が加えられた。これらのチューブの内容物は、混合され、遠心沈澱された。チューブは、沸騰水浴で５分〜１０分間、加熱され、そして氷上で冷却された。以下の成分はその後添加された：３ μｌ 非放射性ラベリングミックス（Ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｍｉｘ）（０．５ ｍＭ）；２ μｌ １ｍＭ ＤＯＴＡ（Ｇｄ）−ｄＵＴＰ；および１ μｌ クレノウフラグメント、エキソ−（５ Ｕ／反応）。
【００６０】
チューブは、３７℃で０時間〜２０時間、インキュベートされた。反応は、１ μｌ ０．５ Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ ８．０を用いて終結された。時間依存性Ｔ１変化は、１．５ Ｔシグナ（Ｓｉｇｎａ）ＭＲ画像化システムを用いてモニターされた。
【００６１】
実施例１１：耐熱性ＤＮＡポリメラーゼにより操作されるＰＣＲ標識化−−常磁性ＤＮＡ断片の合成
混合物は、以下の試薬を使用して調製された：１ μｌ〜２ μｌ ＤＮＡ鋳型（０．１ ｎｇ〜１００ ｎｇ ｐＣＭＶ−ＧＦＰプラスミドＤＮＡ）；１０ ｘ ＰＣＲ緩衝液の２．５ μｌ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））；１ μｌ プライマー（保存液からの２０ μＭ〜５０ μＭ前進および逆ＧＦＰ増幅プライマー）；０．２５ μｌ ｄ（ＡＣＧ）ＴＰ（各３３．３ ｍＭ）；０．７ μｌ ５ ｍＭ ｄＴＴＰ；０．３ μｌ〜１．６ μｌ １ ｍＭ ＤＯＴＡ（Ｇｄ）−ｄＵＴＰ；０．２ μｌ〜０．４ μｌ Ｔａｑ ポリメラーゼ（５ Ｕ／μｌ保存液）；および水で２５ μｌにする。ＰＣＲは、以下のスキームを用いて実行された：１〜２サイクル：４５秒／９４℃ − ４５秒／１５℃ − １２分／３７℃；５サイクル：４０秒／９４℃ − ４５秒／３７℃ − ４分／６６℃；２４サイクル：４０秒／９４℃ − ４５秒／５４℃ − ４分／６６℃。対照反応混合物はＰＣＲにかけられなかった。反応はＰＣＲの異なる相で停止され、Ｔ１変化は、室温で１．５ Ｔシグナ（Ｓｉｇｎａ）ＭＲ画像化システムを用いてモニターされた。
【００６２】
実施例１２：逆転写（反応はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより操作される）。鋳型としてｍＲＮＡを用いる常磁性ＤＮＡの合成
全ＲＮＡは、標準的プロトコールに従い、ＲＮＡ ＳＴＡＴ−６０を用いて、９Ｌ−ＧＦＰ細胞から抽出された。抽出されたＲＮＡは、最終的にＲＮアーゼを含まない滅菌水の２０ μｌに溶解される前に、０．２ Ｍ 塩化ナトリウムおよび無水エタノールの２容積の存在下で再沈澱された。以下の試薬は氷上で混合された：８．０ μｌ ５ Ｘ ファーストストランドバッファー（Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ）（スーパースクリプトＩＩ（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ）、ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））；１．５ μｌ 固着されたｍＲＮＡプライマー（５’−Ｔ２０ １００ ｐモル／μｌ）；３．０ μｌ ２０ ｍＭ ｄＮＴＰ−ｄＴＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰの各６．７ ｍＭ）；３．０ μｌ ２ ｍＭ ｄＴＴＰ；３．０ μｌ ２ ｍＭ ＤＯＴＡ（Ｇｄ）−ｄＵＴＰ；４．０ μｌ ０．１ Ｍ ＤＴＴ；１０ μｇ 全ＲＮＡおよび水で４０ μｌにする。標識化反応は、６５℃で５分間、その後４２℃で５分間、インキュベートされた。逆転写酵素（スーパースクリプトＩＩ（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ）、ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））の２００ Ｕが添加され、混合物は、４２℃で２時間、インキュベートされた。Ｔ１変化は、室温で１．５ Ｔシグナ（Ｓｉｇｎａ）ＭＲ画像化システムを用いてモニターされた。
【００６３】
実施例１３：常磁性ＤＮＡのターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）−媒介性合成
５ Ｘ 反応緩衝液の１０ μを含む５０ μｌの反応混合物へと添加された：（１ Ｘ 反応緩衝液：２０ ｍＭ トリス酢酸 ｐＨ ７．９；５０ ｍＭ 酢酸カリウム、１ ｍＭ ＣｏＣｌ２、０．１ ｍＭ ＤＴＴ、０．０１ ％ トリトンＸ−１００、１０ μＭ オリゴ（ｄＴ）１０）、加えて ｄＴＴＰ（またはｄＡＴＰ）を０．２ ｍＭまで、および３ μｌ ２ ｍＭ ＤＯＴＡ（Ｇｄ）−ｄＵＴＰ。ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの４０ユニットが添加されて、反応混合物は３７℃で３０分間、インキュベートされた。反応は、７０℃まで加熱することにより停止され、その後４０℃まで冷却され、そして緩和性が測定された。対照反応は、加熱処理された酵素を含んだ。
【００６４】
実施例１４：ポリヌクレオチドホスホリラーゼ（ポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼ）により触媒される重合を用いる常磁性ポリリボヌクレオチドの合成
５０ ｍＭ トリス酢酸中の０．５ ｍＭ ５−ＤＯＴＡ（Ｇｄ）アリルアミド−置換型ウリジン−５’−二リン酸；５０ ｍＭ ＮａＣｌ；６．７ ｍＭ ＵＤＰ、６．７ ｍＭ ＭｇＣｌ２；および０．１ ｍＭ ＭｎＣｌ２、ｐＨ ８．５を大腸菌由来のポリヌクレオチドホスホリラーゼの存在下で（４０ ＰＫ ユニット）、３７℃で３０分間、反応させた。反応は、連続的に、５分間毎にＴ１変化を測定することによりモニターされた。
【００６５】
他の態様
多数の本発明の態様が記載された。それにもかかわらず、本発明の意図および範囲から逸脱することなく、様々な改変が成されうることは理解されるものと思われる。例えば、２つまたはそれ以上のキレート化部分を単一の単量体基質分子へ組み入れることができる。それゆえに、他の態様は、特許請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図１】酵素反応性の常磁性単量体基質の合成のために用いられる合成経路である。
【図２】重合反応生成物のサイズ排除分析の結果を要約するクロマトグラムである。
【図３】ペルオキシダーゼ処理前（白丸）、およびペルオキシダーゼ処理後（黒丸）の様々なＧｄ濃度でのチラミン−［１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカンＮ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸ガドリニウム塩］（チラミン−ＤＯＴＡ（Ｇｄ））のＭＲＩからのデータを要約するグラフである。これらのデータは、ガドリニウム濃度およびペルオキシダーゼ依存性重合へのシグナル強度の依存を示す。
【図４】ペルオキシダーゼ量の相関としての磁気共鳴シグナル強度の増強を示すグラフである。丸−ドーパミン−ＤＯＴＡ（Ｇｄ）；四角−チラミン−ＤＯＴＡ（Ｇｄ）。画像化は、スピンエコー（ＳＥ）配列を用いて検出される１．５ Ｔ（シグナ（Ｓｉｇｎａ）ＧＥ）、４００ μＭ １ ％ ウシ胎児血清、０．００５ ％ Ｈ２Ｏ２で行われた。
【図５】ＤＩＧ標識化抗体量の相関としての磁気共鳴−ＥＬＩＳＡシグナル強度を示すグラフである。丸−ドーパミン−ＤＯＴＡ（Ｇｄ）；四角−チラミン−ＤＯＴＡ（Ｇｄ）。画像化は、ＳＥ配列を用いて検出される１．５ Ｔ（シグナ（Ｓｉｇｎａ）ＧＥ）、４００ μＭ １ ％ ウシ胎児血清、０．００５ ％ Ｈ２Ｏ２で行われた。
【図６】１．５ Ｔでのヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のＭＲＩを示す写真から関心領域（ＲＯＩ）内の対応するピクセルシグナル強度分布（ＳＩ）の信頼区間を示すグラフである。画像１は、５０ μＭ Ｇｄの陽性対照溶液を示す。画像２は、ＩＬ−１β、抗−Ｅ−セレクチン−ＤＩＧ抗体および抗−ＤＩＧペルオキシダーゼ結合体、続いて４００ μＭ Ｔｙｒ−ＤＯＴＡ（Ｇｄ）（１時間、室温）で処理されたＨＵＶＥＣ細胞を示す。画像３は、ＩＬ−１β刺激を受けない対照ＨＵＶＥＣ細胞を示す。画像４は、抗−Ｅ−セレクチン−ＤＩＧ抗体を伴わず、ＩＬ−１β刺激を受ける対照ＨＵＶＥＣ細胞を示す。
【図１】
2004530408.tif 000011
【図２】
2004530408.tif 000012
【図３】
2004530408.tif 000013
【図４】
2004530408.tif 000014
【図５】
2004530408.tif 000015
【図６】
2004530408.tif 000016
【国際公開パンフレット】
2004530408.tif 000017
2004530408.tif 000018
2004530408.tif 000019
2004530408.tif 000020
2004530408.tif 000021
2004530408.tif 000022
2004530408.tif 000023
2004530408.tif 000024
2004530408.tif 000025
2004530408.tif 000026
2004530408.tif 000027
2004530408.tif 000028
2004530408.tif 000029
2004530408.tif 000030
2004530408.tif 000031
2004530408.tif 000032
2004530408.tif 000033
2004530408.tif 000034
2004530408.tif 000035
2004530408.tif 000036
2004530408.tif 000037
2004530408.tif 000038
2004530408.tif 000039
2004530408.tif 000040
2004530408.tif 000041
2004530408.tif 000042
2004530408.tif 000043
2004530408.tif 000044
2004530408.tif 000045
2004530408.tif 000046
2004530408.tif 000047
2004530408.tif 000048
2004530408.tif 000049
2004530408.tif 000050
2004530408.tif 000051
2004530408.tif 000052
2004530408.tif 000053
2004530408.tif 000054
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004530408.tif 000055
2004530408.tif 000056
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004530408.tif 000057
2004530408.tif 000058
2004530408.tif 000059
2004530408.tif 000060
2004530408.tif 000061
2004530408.tif 000062
2004530408.tif 000063
2004530408.tif 000064
2004530408.tif 000065
2004530408.tif 000066
2004530408.tif 000067
2004530408.tif 000068
2004530408.tif 000069
2004530408.tif 000070
2004530408.tif 000071
2004530408.tif 000072
2004530408.tif 000073
2004530408.tif 000074
2004530408.tif 000075
2004530408.tif 000076
2004530408.tif 000077
2004530408.tif 000078
2004530408.tif 000079
2004530408.tif 000080
2004530408.tif 000081
2004530408.tif 000082
2004530408.tif 000083
2004530408.tif 000084
2004530408.tif 000085
2004530408.tif 000086
2004530408.tif 000087
2004530408.tif 000088
2004530408.tif 000089
2004530408.tif 000090
2004530408.tif 000091
2004530408.tif 000092
2004530408.tif 000093
2004530408.tif 000094
2004530408.tif 000095
【国際調査報告】
2004530408.tif 000096