(57)【要約】本発明は、ＭＣＨＲ１を機能的に発現する神経芽腫細胞系及び皮膚細胞癌細胞系、並びにＭＣＨＲ１活性を測定するためのそのような細胞の使用を特徴とする。機能的発現は、好ましくは、ＭＣＨＲ１を発現する組換え遺伝子を使用して、神経芽腫又は皮膚細胞癌において達成される。組換えＭＣＨＲ１遺伝子の存在は、ＭＣＨＲ１発現のレベルを増加させ、ＭＣＨＲ１活性の生成及び検出を容易にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能性メラニン凝集ホルモン受容体１（ＭＣＨＲ１）を発現する組換えＭＣＨＲ１遺伝子を含む神経芽腫細胞又は皮膚細胞癌。
【請求項２】
ヒト神経芽腫細胞である、請求項１の細胞。
【請求項３】
組換えＭＣＨＲ１遺伝子が、神経芽腫細胞ゲノム内に存在し、かつ外因性プロモーターと転写的に結合した内因性のＭＣＨＲ１をコードする核酸を含む、請求項２の神経芽腫細胞。
【請求項４】
外因性プロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項３の神経芽腫細胞。
【請求項５】
エクオリンをコードする組換え遺伝子をさらに含む、請求項３の神経芽腫。
【請求項６】
ＧＯＴＯ、ＣＨＰ−２１２、ＣＨＰ−２４３、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）、及びＳＨ−ＳＹ５Ｙからなる群より選択される、請求項３の神経芽腫細胞。
【請求項７】
ＳＣＣ−２５である、請求項１の細胞。
【請求項８】
内因性のＭＣＨＲ１をコードする核酸を外因性プロモーターと結合させる工程を含む方法により作製された、増加したＭＣＨＲ１発現を有する神経芽腫細胞又は皮膚細胞癌。
【請求項９】
プロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項８の細胞。
【請求項１０】
ＧＯＴＯ、ＣＨＰ−２１２、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）、ＣＨＰ−２４３、及びＳＨ−ＳＹ５Ｙからなる群より選択される神経芽腫細胞である、請求項８の細胞。
【請求項１１】
皮膚細胞癌である、請求項８の細胞。
【請求項１２】
ＳＣＣ−２５である、請求項１１の細胞。
【請求項１３】
ａ）該化合物を請求項１から１２のいずれかの細胞に供給する工程；及び
ｂ）ＭＣＨＲ１活性を測定する工程、を含む、化合物のＭＣＨＲ１活性に影響を与える能力を測定する方法。
【請求項１４】
工程（ａ）が、ＭＣＨＲ１アゴニストの存在をさらに含む、請求項１３の方法。
【請求項１５】
ＭＣＨＲ１アゴニストがヒトメラニン凝集ホルモンである、請求項１４の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、参照して本明細書に組み込まれる、２０００年１０月３１日出願の米国仮出願第６０／２４４，７００号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
（発明の背景）
本明細書に引用された参照は、特許請求の範囲に記載された発明に対する先行技術とは認められない。
【０００３】
視床下部に存在するニューロペプチドは、体重調節の媒介において主要な役割を果たしている（Ｆｌｉｅｒら，１９９８．Ｃｅｌｌ，９２，４３７〜４４０）。メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）は、ニューロペプチドＮＥＩ及びＮＧＥもコードする、より大きなプレプロホルモン前駆体の一部として視床下部において合成される環状の１９アミノ酸ニューロペプチドである（Ｎａｈｏｎら，１９９０．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．４，６３２〜６３７）。ＭＣＨは、最初、サケ下垂体において同定された。サカナにおいては、ＭＣＨは、メラニン凝集に影響を与え、従って皮膚着色に影響を与える。マス及びウナギにおいては、ＭＣＨは、ストレスにより誘導される、又はＣＲＦにより刺激されるＡＣＴＨ放出に関与していることも示されている（Ｋａｗａｕｃｈｉら，１９８３．Ｎａｔｕｒｅ  ３０５，３２１〜３２３）。
【０００４】
ヒトにおいては、脳内で発現される２個のＭＣＨをコードする遺伝子が同定されている（Ｂｒｅｔｏｎら，１９９３．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１８，２９７〜３１０）。哺乳動物において、ＭＣＨは、視床下部外側野の神経細胞形質を含む、食物摂取の調節に関与していることが示されている視床下部のニューロン細胞体、及び不確帯に主として局在していることが示されている（Ｋｎｉｇｇｅら，１９９６．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １７，１０６３〜１０７３）。
【０００５】
薬理学的及び遺伝学的な証拠は、ＭＣＨの主な作用様式が、摂食の促進（食欲刺激（ｏｒｅｘｉｇｅｎｉｃ））であることを示唆している。絶食させたマウス及びラット、ｏｂ／ｏｂマウス、並びにニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）の遺伝子がノックアウト（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）されたマウスにおいては、ＭＣＨ  ｍＲＮＡがアップレギュレートされている（Ｑｕら，１９９６．Ｎａｔｕｒｅ  ３８０，２４３〜２４７、及びＥｒｉｃｋｓｏｎら，１９９６．Ｎａｔｕｒｅ  ３８１，４１５〜４１８）。ＭＣＨの中枢への注射（ＩＣＶ）は、食物摂取を刺激し、ＭＣＨは、αメラニン細胞刺激ホルモン（αＭＳＨ）により見られる食欲低下（ｈｙｐｏｐｈａｇｉｃ）効果に拮抗する（Ｑｕら，１９９６．Ｎａｔｕｒｅ  ３８０，２４３〜２４７）。ＭＣＨ欠損マウスは、痩せており、食欲が低下しており、かつ増加した代謝率を有している（Ｓｈｉｍａｄａら，１９９８．Ｎａｔｕｒｅ  ３９６，６７０〜６７３）。
【０００６】
ＭＣＨの作用は食物摂取の調整に限定されておらず、視床下部−下垂体軸に対する効果が報告されている（Ｎａｈｏｎ，１９９４．Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．８，２２１〜２６２）。ＭＣＨは、ストレスにより誘導される視床下部からのＣＲＦ及び下垂体からのＡＣＴＨの放出を調整しうるため、ＭＣＨは、ストレスに対する身体応答に関与している可能性がある。さらに、ＭＣＨニューロン系は、生殖又は母性の機能に関与している可能性がある。
【０００７】
いくつかの参照が、ＭＣＨに結合することが示されている受容体（ヒトＭＣＨＲ１）を記載している（Ｃｈａｍｂｅｒｓら，１９９９．Ｎａｔｕｒｅ  ４００，２６１〜２６５；Ｓａｉｔｏら，１９９９．Ｎａｔｕｒｅ  ４００，２６５〜２６９；Ｂａｃｈｎｅｒら，１９９９．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４５７，５２２〜５２４；Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら，１９９９．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２６１，６２２〜６２６；及びＬｅｍｂｏら，１９９９．Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１，２６７〜２７１）。
【０００８】
（発明の概要）
本発明は、ＭＣＨＲ１を機能的に発現する神経芽腫細胞系及び皮膚細胞癌細胞系、並びにＭＣＨＲ１活性を測定するためのそのような細胞の使用を特徴とする。機能的発現は、好ましくは、ＭＣＨＲ１を発現する組換え遺伝子を使用して、神経芽腫又は皮膚細胞癌において達成される。組換えＭＣＨＲ１遺伝子の存在は、ＭＣＨＲ１発現のレベルを増加させ、ＭＣＨＲ１活性の生成及び検出を容易にする。
【０００９】
従って、本発明の第一の面は、機能性ＭＣＨＲ１を発現する組換えＭＣＨＲ１遺伝子を含む神経芽腫又は皮膚細胞癌を記載する。機能性ＭＣＨＲ１は、ＭＣＨ刺激により検出可能なシグナルを与える。組換えＭＣＨＲ１遺伝子は、ゲノムの一部であってもよいし、又はゲノム外に存在してもよい。
【００１０】
ＭＣＨＲ１遺伝子は、ＭＣＨＲ１をコードする核酸、及び機能的発現のために必要とされる制御因子を含有している。機能的発現に有用な制御因子の例には、プロモーター、ターミネーター、リボソーム結合部位、及びポリアデニル化領域が含まれる。ＭＣＨＲ１をコードする核酸は、連続的であってもよいし、又は１個以上のイントロンを含有していてもよい。
【００１１】
組換えＭＣＨＲ１遺伝子は、ＭＣＨＲ１をコードし、かつ天然には相互に関連していない１個以上の領域を含有している。組換えＭＣＨＲ１遺伝子の例には、天然にはコーディング核酸と関連していない制御配列と共に存在するＭＣＨＲ１をコードするヒト核酸配列を含有しているもの；及び天然には存在しないコーディング領域を含有しているものが含まれる。非天然のコーディング領域は、天然に存在するコーディング核酸には存在しないヌクレオチドの組み合わせを１個以上含有している。組換え遺伝子は、（１個以上の）イントロンを含んで、又は含まずに、作製されうる。
【００１２】
本発明のもう一つの面は、内因性のＭＣＨＲ１をコードする核酸を、外因性プロモーターと結合させる工程を含む方法によって作製された、増加したＭＣＨＲ１発現を有している神経芽腫又は皮膚細胞癌を記載する。その方法は、天然のＭＣＨＲ１遺伝子と同じ染色体位置を有する組換えＭＣＨＲ１遺伝子を生成させる。
【００１３】
本発明のもう一つの面は、化合物のＭＣＨＲ１活性に影響を与える能力を測定する方法を記載する。その方法は、（ａ）ＭＣＨＲ１を発現する神経芽腫又は皮膚細胞癌に化合物を供給する工程；及び（ｂ）ＭＣＨＲ１活性を測定する工程を含む。
【００１４】
本発明のその他の特徴及び利点は、種々の例を含む、本明細書に提供されるさらなる記載より明らかとなる。提供された例は、本発明の実施において有用な種々の成分及び方法論を例示する。例は、特許請求の範囲に記載された発明を制限するものではない。本開示に基づき、当業者であれば、本発明の実施に有用なその他の成分及び方法論を特定し、利用することができる。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
ＭＣＨＲ１転写物を産生し、かつＭＣＨＲ１活性を測定するための適当な環境を提供することができるヒト神経芽腫細胞系及び皮膚細胞癌細胞系が、ここにおいて特定される。ＭＣＨＲ１を発現するヒト細胞系は、天然にＭＣＨＲ１を発現するヒト細胞環境を提供する。
【００１６】
機能性ＭＣＨＲ１を発現する細胞は、ＭＣＨＲ１に対する活性を有する化合物のスクリーニング、ＭＣＨＲ１に対する化合物の効果の測定、及びＭＣＨＲ１活性の効果の測定のための系を提供する。神経芽腫又は皮膚細胞癌におけるＭＣＨＲ１発現は、好ましくは、内因性のＭＣＨＲ１をコードする核酸を活用するか、又は外因性のＭＣＨＲ１をコードする核酸を提供する組換えＭＣＨＲ１遺伝子を使用して、増加させられる。
【００１７】
ＭＣＨＲ１活性を調整する化合物は、ＭＣＨＲ１活性をさらに研究するための道具としての利用、及び患者において有益な結果を達成するための薬剤としての利用を含む、多様な異なる用途を有している。ＭＣＨＲ１活性の調整の有益な効果には、体重減少、体重増加、癌治療（例えば、結腸癌又は乳癌）、疼痛軽減、糖尿病治療、ストレス軽減、及び性機能障害治療のうちの１個以上が含まれる。
【００１８】
ＭＣＨＲ１活性の調整には、受容体における応答の惹起、及びＭＣＨＲ１のアゴニスト又はアンタゴニストにより惹起される応答の改変が含まれる。一般的に、ＭＣＨ受容体アンタゴニスト、及び活性に負の影響を与えるアロステリック調整剤は、体重減少を達成するため、癌（例えば、結腸癌又は乳癌）を治療するため、疼痛を軽減させるため、ストレスを軽減させるため、又は性機能障害を治療するために使用されうる。そして、ＭＣＨ受容体アゴニスト、及び活性に正の影響を与えるアロステリック調整剤は、体量増加を生じさせるために使用されうる。
【００１９】
患者は、哺乳動物、好ましくはヒトである。患者との言及は、疾患又は障害の存在を必ずしも示さない。患者という用語には、予防的に処置される対象、及び疾患又は障害に罹患している対象が含まれる。
【００２０】
好ましくは、ＭＣＨＲ１活性は、糖尿病を治療するため、体重減少を得るため、又は重量増加を得るために調整される。糖尿病は、例えば、耐糖能の増強及びインスリン抵抗性の減少のうちのいずれか又は両方によって治療されうる。
【００２１】
過剰体重は、高血圧、糖尿病、異常脂質血症、心臓血管疾患、胆石、骨関節炎、及びいくつかの型の癌を含む種々の疾患に寄与する要因である。体重減少の誘起は、例えば、そのような疾患の可能性を軽減させるため、そしてそのような疾患の治療の一部として、使用されうる。体重減少は、例えば、食欲の軽減、代謝率の増加、脂肪摂取の軽減、又は炭水化物欲求の軽減のうちの１個以上によって達成されうる。
【００２２】
重量の増加は、体重減少を伴う疾患もしくは障害を有しているか、又は体重減少を伴う治療を受けている患者に、特に有用である。体重減少を伴う疾患又は障害の例には、拒食症、エイズ、るいそう、悪液質、及び老人性虚弱が含まれる。体重減少を伴う治療の例には、化学療法及び放射線療法が含まれる。
【００２３】
ＭＣＨＲ１
本発明において利用されるＭＣＨＲ１には、配列番号１及びその異型により提供されるアミノ酸配列を有する天然に存在するヒトＭＣＨＲ１が含まれる。ＭＣＨＲ１の異型は、配列番号１と実質的に同一のアミノ酸配列を有しており、かつＭＣＨ受容体活性を有している。配列番号１の異型の例には、天然に存在する対立遺伝子異型、及び人工的に作製された突然変異体が含まれる。
【００２４】
配列番号１及び天然に存在するコーディング核酸配列は、最初、ソマトスタチン様受容体「ＳＬＣ−１」として同定された（Ｌａｋａｙｅら，１９９８．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  ＡＣＴＡ  １４０１：２１６〜２２０）。その後、ＳＬＣ−１がＭＣＨＲ１であることが示された。ＭＣＨＲ１をコードするｃＤＮＡ及びゲノム配列は、配列番号２及び３によって提供される。
【００２５】
一般的に、配列番号１の異型は、少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％の配列番号１との配列同一性を有し；且つ／又は配列番号１からのアミノ酸修飾を１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個、含有している。アミノ酸修飾は、付加、欠失、及び置換である。
【００２６】
ポリペプチドの配列類似性は、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９７．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５，３３８９〜３４０２（参照して本明細書に組み込まれる））によって決定されうる。一つの実施形態において、配列類似性は、以下のパラメーター：置換行列：ＢＬＯＳＵＭ６２、一塩基当たりのギャップコスト：１１、及びラムダ比（Ｌａｍｂｄａ  ｒａｔｉｏ）：１を用いたｔＢＬＡＳＴｎ探索プログラムを使用して決定される。
【００２７】
ＭＣＨＲ１の人工異型は、異型をコードする核酸を導入することにより、細胞において作製されうる。異型をコードする核酸配列は、配列番号１をコードする核酸配列を改変させることにより入手されうる。特定のコドンの特定のアミノ酸への翻訳は、当分野において周知である（例えば、Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ，１１９頁，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０参照）。
【００２８】
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＵ
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドンＵＧＣ、ＵＧＵ
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドンＧＡＣ、ＧＡＵ
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：コドンＧＡＡ、ＧＡＧ
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドンＵＵＣ、ＵＵＵ
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドンＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＵ
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドンＣＡＣ、ＣＡＵ
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドンＡＵＡ、ＡＵＣ、ＡＵＵ
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン：コドンＡＡＡ、ＡＡＧ
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドンＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＡ、ＣＵＣ、ＣＵＧ、ＣＵＵ
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドンＡＵＧ
Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン：コドンＡＡＣ、ＡＡＵ
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドンＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＵ
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドンＣＡＡ、ＣＡＧ
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドンＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＵ
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドンＡＧＣ、ＡＧＵ、ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧ、ＵＣＵ
Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン：コドンＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＵ
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドンＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、ＧＵＵ
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドンＵＧＧ
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドンＵＡＣ、ＵＡＵ
機能性異型を作製するための配列番号１に対する変化は、経験的に決定されうる。ＭＣＨ受容体活性を測定するための技術は、当分野において周知である。
【００２９】
ＭＣＨ受容体活性を保持していると予想される配列番号１の機能性異型を作製する一つの方法は、アミノ酸Ｒ基の違いを考慮に入れる。Ｒ基は、物理的サイズ、電荷、及び疎水性のようなアミノ酸の種々の特性に影響を与える。アミノ酸は、以下のような異なるグループに分類されうる。中性かつ疎水性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、及びメチオニン）；中性かつ極性（グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、及びグルタミン）；塩基性（リシン、アルギニン、及びヒスチジン）；並びに酸性（アスパラギン酸及びグルタミン酸）。
【００３０】
一般的に、異なるアミノ酸の置換においては、類似の特性を有しているアミノ酸を交換することが好ましい。バリンとロイシンとの置換、アルギニンとリシンとの置換、及びアスパラギンとグルタミンとの置換のような特定のグループ内の異なるアミノ酸の置換が、ポリペプチド機能の変化を引き起こさないための優れた候補である。
【００３１】
異なるアミノ酸グループ外での変化もなされうる。好ましくは、そのような変化は、置換されるアミノ酸のポリペプチド内位置を考慮に入れてなされる。例えば、アルギニンは、その長い脂肪族側鎖のため、グルタミン酸よりも自由にポリペプチド内部の非極性アミノ酸と置換されうる（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，１９８７〜１９９８，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３３  Ａｐｐｅｎｄｉｘ  １Ｃ参照）。
【００３２】
組換えＭＣＨＲ１遺伝子
組換えＭＣＨＲ１遺伝子は、神経芽腫又は皮膚細胞癌におけるＭＣＨＲ１発現のレベルを増加させ、それによりＭＣＨＲ１活性の生成及び検出を容易にするために使用されうる。組換えＭＣＨＲ１遺伝子を作製するための方法には、内因性ＭＣＨＲ１遺伝子を改変する方法、及びＭＣＨＲ１遺伝子又はコーディング領域を宿主細胞へ導入する方法が含まれる。
【００３３】
内因性ＭＣＨＲ１遺伝子の改変による組換え遺伝子の作製には、ＭＣＨＲ１コーディング領域と天然には関連していないプロモーター又はエンハンサーのような制御因子の使用；及び天然に存在するコーディング核酸には存在しないヌクレオチドの組み合わせを１個以上含有している非天然のコーディング領域の使用が含まれる。外因性プロモーターの例には、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（「ＣＭＶ」）、α−ＭＨＣプロモーター、ＰｒＰ（プリオンプロモーター）、強力なニューロンプロモーター、及びＴｈｙ−１プロモーターが含まれる。
【００３４】
天然には存在しないコーディング領域は、遺伝暗号の縮重に基づき作製されうる。所望により、ＭＣＨＲ１をコードする核酸は、コドン出現頻度を適合させるため、遺伝暗号に基づき改変されうる。
【００３５】
組換え染色体遺伝子を作出するために使用されうる技術は、当分野において周知である（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，１９８７〜１９９８参照）。外因性核酸は、相同的組み換えターゲティング配列を使用してＭＣＨＲ１遺伝子へとターゲティングされうる。ＭＣＨＲ１遺伝子への挿入のための相同的組み換えターゲティング配列には、コーディング領域及び非コーディング領域が含まれる。
【００３６】
ＣＭＶプロモーターのような外因性プロモーターは、標準的な技術を使用して、ＭＣＨＲ１核酸と機能的に結合されうる。例えば、ＧＯＴＯ  ＭＣＨＲ１ゲノム配列を、プラスミド・ベクターへとクローニングすることができる。コーディング配列の上流のＭＣＨＲ１プロモーター領域（２から３ｋｂ）を、ｌｏｘＰ−ネオマイシン−ｌｏｘＰ遺伝子を含有しているＣＭＶプロモーターカセットに交換することができる。得られたプロモーター交換ベクターは、相同的組み換えにとって十分なＣＭＶプロモーターカセットに隣接するＭＣＨＲ１ゲノム配列を有している。次いで、ベクターをＧＯＴＯ細胞へと電気穿孔することができる。ネオマイシン耐性クローンを選択し、プロモーター交換の成功に関してゲノム・サザン分析により確認することができる。ネオマイシン遺伝子は、プロモーター活性に対する可能性のある妨害を軽減させるため、ｌｏｘＰにより媒介される組み換えによって除去することができる。
【００３７】
ＭＣＨＲ１遺伝子又はコーディング配列の宿主への導入は、ＭＣＨＲ１コーディング領域又は遺伝子を、宿主ゲノムへ挿入することにより、又は独立に複製するベクターの使用により、達成されうる。宿主ゲノムへ核酸を挿入するための技術には、特定の領域への挿入のためのターゲティング及び選択を含むもの、並びにランダムな挿入を含むものが含まれる。
【００３８】
機能アッセイ
ＭＣＨＲ１活性を測定するための技術には、ＭＣＨＲ１の細胞内コンフォメーションの変化の検出、Ｇタンパク質活性の測定、及び細胞内メッセンジャーのレベルの測定が含まれる。Ｇｉ、Ｇｓ、及びＧｑのような異なるＧタンパク質の活性を測定するアッセイは、当分野において周知の技術を使用して実施されうる。ＭＣＨＲ１活性は、好ましくは、Ｇｉ又はＧｑいずれかの活性を測定することによりアッセイされる。
【００３９】
Ｇｉ及びＧｓの活性は、黒色素胞アッセイ、ｃＡＭＰ生成のアッセイ、ｃＡＭＰ蓄積の阻害のアッセイ、細胞内酸性化、及び３５Ｓ−ＧＴＰ結合のアッセイのような技術を使用して測定されうる。ｃＡＭＰは、ラジオイムノアッセイのような種々の技術を使用して測定されてもよいし、ｃＡＭＰ応答性遺伝子レポータータンパク質によって間接的に測定されてもよい。
【００４０】
Ｇｑ及びＧｉの活性は、細胞内Ｃａ２＋及び細胞内酸性化の検出のような技術を使用して測定されうる。Ｃａ２＋を測定するために利用されうる当分野において周知の技術の例には、Ｆｕｒａ−２のような色素の使用、及びエクオリンのようなＣａ２＋生物発光感受性レポータータンパク質の使用が含まれる（Ｂｕｔｔｏｎら，１９９３．Ｃｅｌｌ  Ｃａｌｃｉｕｍ  １４，６６３〜６７１、及びＦｅｉｇｈｎｅｒら，１９９９．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４，２１８４〜２１８８（いずれも、参照して本明細書に組み込まれる））。
【００４１】
機能アッセイは、個々の化合物を使用して実施されてもよいし、又は種々の化合物を含有している調製物を使用して実施されてもよい。１個以上の化合物がＭＣＨＲ１活性に影響を与える、種々の化合物を含有している調製物は、ＭＣＨＲ１活性に影響を与える（１個以上の）化合物を同定するため、より小さな化合物グループに分類されうる。本発明の一つの実施形態において、少なくとも１０個の化合物を含有している被検調製物が、機能アッセイにおいて使用される。
【００４２】
ＭＣＨＲ１発現細胞系
ＭＣＨＲ１転写物を発現することができるヒト細胞系には、神経芽腫及び皮膚細胞癌が含まれる。種々の神経芽腫細胞系及び扁平上皮癌の能力が、後述の実施例に例示される。扁平上皮癌は、皮膚細胞癌の一例を提供する。皮膚細胞癌に関する本発明の異なる実施形態において、皮膚細胞癌は、扁平上皮癌又は角化細胞癌である。
【００４３】
種々の神経芽腫細胞系及び皮膚細胞癌のＭＣＨＲ１転写物を発現する能力は、これらの型の細胞系が、ＭＣＨＲ１を発現することができるメンバーを含有していることの証拠となる。ＭＣＨＲ１転写物を発現することができるさらなる神経芽腫細胞系及び皮膚細胞癌細胞系は、例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳ）及びヘルスサイエンス研究資源バンク（Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｂａｎｋ）（大阪（Ｏｓａｋａ），日本）のような寄託機関に存在する神経芽腫細胞系及び皮膚細胞癌細胞系の、ＭＣＨＲ１転写物を発現する能力を測定することにより、ルーチンの実験を使用して、同定されうる。
【００４４】
ＭＣＨＲ１活性の調整
本願をガイドとして使用して、ＭＣＨＲ１活性を調整することができる化合物を入手し、ＭＣＨＲ１活性化の影響をさらに調査するための研究道具として、又は患者において有益な効果を達成するための治療剤として使用することができる。有益な効果は、例えば、体重減少、体重増加、癌（例えば、結腸癌又は乳癌）の治療、疼痛軽減、糖尿病治療、ストレス軽減、又は性機能障害の治療のうちの１個以上を達成するために、ＭＣＨＲ１に対する活性を有する化合物を使用することにより入手されうる。
【００４５】
体重の改変は、体重不足患者における体重増加、又は体重過多患者における体重減少に特に有用である。さらに、例えば、家畜を、体重を増加させるため処理することができる。体重不足患者には、「正常な」体重範囲又はボディマス指数（「ＢＭＩ」）の下限より約１０％以下、２０％以下、又は３０％以下、少ない体重を有している者が含まれる。体重過多患者には、「正常な」体重範囲又はＢＭＩの上限より約１０％以上、２０％以上、３０％以上、又は５０％以上、多い体重を有している者が含まれる。「正常な」体重範囲は、当分野において周知であり、患者の年齢、身長、及び体型のような要因を考慮に入れている。
【００４６】
ＢＭＩとは、身長／体重比の尺度である。それは、体重（キログラム）を、身長（メートル）の二乗で除したものを計算することにより決定される。ＢＭＩの「正常な」範囲は、１９から２２である。
【００４７】
ＭＣＨＲ１調整化合物は、キットとして提供されうる。そのようなキットは、典型的には、投与のための剤形中に活性化合物を含有している。剤形は、１日１から６回のような規則的な間隔で、１日以上の期間、患者へ投与された場合に、有益な効果が得られるよう十分な量の活性化合物を含有している。好ましくは、キットは、有益な効果を達成するための剤形の用法、及び指定された期間に摂取すべき剤形の量を示す説明書を含有している。
【００４８】
治療的適用のための投薬
一般的な薬学的投与の指針は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１８版，Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９０、及びＭｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  第２版，Ｂａｎｋｅｒ及びＲｈｏｄｅｓ編，マーセルデッカー社（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）１９９０（いずれも、参照して本明細書に組み込まれる）に提供されている。
【００４９】
適切な官能基を有するＭＣＨＲ１活性化合物は、酸性塩又は塩基性塩として調製されうる。薬学的に許容される塩（水又は油に可溶性又は分散可能な生成物の形態）には、従来の無毒の塩、又は無機もしくは有機の酸もしくは塩基より形成された第四級アンモニウム塩が含まれる。そのような塩の例には、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩（ｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｎｅｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩（ｈｅｍｉｓｕｌｆａｔｅ）、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモエート（ｐａｍｏａｔｅ）、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシレート（ｔｏｓｙｌａｔｅ）、及びウンデカン酸塩のような酸付加塩；並びにアンモニウム塩、ナトリウム塩及びカリウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミンのような有機塩基との塩、並びにアルギニン及びリシンのようなアミノ酸との塩のような塩基性塩が含まれる。
【００５０】
ＭＣＨＲ１活性化合物は、経口、鼻腔内、注射、及び経粘膜を含む、種々の経路を使用して投与されうる。懸濁液として経口投与される活性要素は、薬学的製剤化の分野において周知の技術に従い調製することができ、増量のための微晶質セルロース、懸濁化剤としてのアルギン酸又はアルギン酸ナトリウム、粘性増強剤としてのメチルセルロース、及び甘味剤／香味剤を含有していてもよい。即放性錠剤として、これらの組成物は、微晶質セルロース、第二リン酸カルシウム、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、及び乳糖、及び／又はその他の賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、希釈剤、及び滑沢剤を含有していてもよい。
【００５１】
鼻腔内エアロゾル又は吸入によって投与される場合、組成物は、薬学的製剤化の分野において周知の技術に従い調製されうる。製剤成分の例には、生理食塩水溶液、ベンジルアルコールもしくは他の適当な保存剤の利用、生物学的利用能を増強するための吸収促進剤、フルオロカーボン、及び／又はその他の可溶化剤もしくは分散剤が含まれる。
【００５２】
化合物は、静脈内（ボーラス及び点滴の両方）、腹腔内、皮下、閉塞を伴う、もしくは伴わない局所、又は筋肉内の形態で投与されてもよい。注射により投与される場合には、注射可能な溶液又は懸濁液が、マンニトール、１，３−ブタンジオール、水、リンゲル溶液、もしくは等張塩化ナトリウム溶液のような適当な無毒の非経口的に許容される希釈剤もしくは溶媒、又は合成のモノグリセリドもしくはジグリセリドを含む無菌の低刺激性の硬化油、及びオレイン酸を含む脂肪酸のような、適当な分散剤もしくは湿潤剤及び懸濁化剤を使用して製剤化されうる。
【００５３】
坐剤の形態で直腸内投与される場合、組成物は、常温においては固体であるが、直腸腔内では液体化及び／又は溶解して薬物を放出する、カカオ脂、合成グリセリドエステル、又はポリエチレングリコールのような適当な非刺激性の賦形剤と、薬物を混合することにより調製されうる。
【００５４】
治療的適用のための適当な投薬計画は、患者の年齢、体重、性別、及び医学的状態；治療される状態の重度；投与経路；患者の腎機能及び肝機能；並びに利用される特定の化合物を含む、当分野において周知の要因を考慮して選択されうる。
【００５５】
毒性を示すことなく効能を与える範囲内の薬物濃度の達成における最適な精度は、標的部位への薬物のアベイラビリティの動力学に基づく計画を必要とする。
これは、薬物の分布、平衡、及び排除の考慮を含む。患者のための１日用量は、
１日当たり成人患者１人当たり０．０１ｍｇから１，０００ｍｇの間と予想される。
【００５６】
（実施例）
本発明の種々の特徴をさらに例示するため、以下に実施例を提供する。実施例も、本発明の実施のための有用な方法論を例示する。これらの実施例は、特許請求の範囲に記載された発明を制限しない。
【００５７】
実施例１：種々の細胞系におけるＭＣＨＲ１発現
種々のヒト細胞系がＭＣＨＲ１のｍＲＮＡを発現するか否かを決定するため、ＲＴ−ＰＣＲ実験を実施した。ｏｌｉｇｏ−ｄＴキット（Ｐｏｌｙ（Ａ）Ｐｕｒｅ，Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を使用して、精製されたポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡを培養細胞から単離した。およそ１μｇの単離されたｍＲＮＡを使用したＲＴ−ＰＣＲを、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，ＭＤ）を使用して、本質的に製造業者の指示に従い実施した。ＰＣＲのサイクリング条件は：９４℃１分（１サイクル）、９４℃３０秒、次いで７２℃４分（４サイクル）；９４℃３０秒、次いで７０℃４分（４サイクル）；９４℃３０秒、次いで６８℃４分（２５サイクル）；及び６８℃１０分（１サイクル）であった。ＰＣＲプライマーは、エキソン１とエキソン２の間の単一イントロンの片側のｍＲＮＡスプライスジャンクションと隣接するよう、ヒトＭＣＨＲ１  ＤＮＡ配列に基づき選択した。順向きセンスプライマーは、配列番号４：ＡＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＡＧＣＣＴＣＧＣＴＧＣＴＧ、配列番号５：ＧＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＴＣＴＧＡＴＧＧＣ、及び配列番号６：ＧＧＣＣＣＣＧＡＴＡＡＣＣＴＣＡＣＴＴＣＧＧＣなる配列を有していた。逆向き（アンチセンス）プライマーは、配列番号７：ＧＡＧＧＡＧＡＴＣＴＡＣＴＡＣＣＧＡＧＡＧＧ、配列番号８：ＧＣＣＣＡＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＴＣＡＴＧ、及び配列番号９：ＧＴＧＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＡＧＧＴＡＧＡＧＧＴＣなる配列を有していた。
【００５８】
増幅産物を、アガロースゲル電気泳動に供し、ヒトＭＣＨＲ１放射標識プローブを用いてサザンブロットした。プローブは、ランダムプライマー法により３２Ｐで標識した。ハイブリダイゼーション後洗浄のストリンジェンシーは、６５℃、１×ＳＳＣであり、その後、フィルターを乾燥させ、−７０℃で３時間Ｘ線フィルムに感光した。結果を、表１に示す。
【００５９】
【表１】
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【００６０】
神経芽腫細胞系ＧＯＴＯ、ＣＨＰ−２１２、ＣＨＰ−２４３、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）、及びＳＨ−ＳＹ５Ｙが、ヒトＭＣＨＲ１をコードするｍＲＮＡを産生することが見い出された。さらに、扁平上皮癌細胞系ＳＣＣ−２５が、ヒトＭＣＨＲ１をコードするｍＲＮＡを産生することが見い出された。
【００６１】
実施例２：神経芽腫細胞系におけるＭＣＨ受容体活性
神経芽腫細胞が機能性ＭＣＨＲ１のための環境を提供するか否かを検討するため、エクオリン生物発光アッセイを利用して、ＧＯＴＯ細胞を使用してＭＣＨ受容体活性を測定した。エクオリン生物発光アッセイは、Ｇｑ、Ｇ１１、及びＧｉからなるＧａタンパク質サブユニット・ファミリーを介して共役し、ホスホリパーゼＣの活性化、細胞内カルシウムの動員、及びプロテインキナーゼＣの活性化をもたらすＧタンパク質共役型受容体の活性を測定するために使用されうる。エクオリンを一過性発現するＧＯＴＯ細胞における機能性ＭＣＨＲ１発現の測定を、マッキントッシュパワーＰＣ６１００のために設計されたカスタムソフトウェアによってコントロールされたＬｕｍｉｎｏｓｋａｎ  ＲＴ照度計（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して実施した。
【００６２】
ＧＯＴＯ細胞（トランスフェクションの１８時間前にＴ７５フラスコ内に播かれた１．２×１０７個の細胞）に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００法（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して、ヒトＭＣＨＲ１プラスミドＤＮＡ及びエクオリンｃＤＮＡをトランスフェクトした。ヒトＭＣＨＲ１プラスミドＤＮＡは、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ−３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に挿入されたヒトＭＣＨＲ１受容体をコードするオープンリーディングフレームｃＤＮＡ（配列番号２）を含有していた。エクオリン発現プラスミドは、ｐｃＤＮＡ−３に挿入された、エクオリンのｃＤＮＡを含有していた（Ｂｕｔｔｏｎら，１９９３．Ｃｅｌｌ  Ｃａｌｃｉｕｍ  １４，６６３〜６７１）。およそ４０時間の発現の後、ＥＣＢ緩衝液（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ［ｐＨ＝７．４］、５ｍＭグルコース、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）の中で、還元条件下（３００μＭ還元型グルタチオン）で、１時間、細胞内のアポエクオリンにセレンテラジン（１０μＭ）をチャージした。細胞を採集し、ＥＣＢ培地で１回洗浄し、５００，０００細胞／ｍｌ又は１，０００，０００細胞／ｍｌで再懸濁させた。
【００６３】
１００μｌのＭＣＨ、又は対照応答のためのリゾホスファチジル酸を、細胞懸濁液（５×１０４細胞又は１００，０００細胞に相当）に注入した。リゾホスファチジル酸は、ＧＯＴＯ細胞上に存在するＰＬＣ活性化と共役している天然のｅｄｇ受容体を誘発する。光放射積分値を、０．５秒単位で３０秒間、記録した。次いで、溶解緩衝液（最終濃度０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）２０μＬを注入し、光放射積分値を、０．５秒単位で１０秒間、記録した。各ウェルの「応答分率」の値を、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶解応答を含む総発光積分値に対する、初期のチャレンジに対する応答積分値の比を得ることにより計算した。結果を、表２に示す。
【００６４】
【表２】
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【００６５】
ＧＯＴＯ細胞へのリポーター遺伝子エクオリンのトランスフェクションは、ヒトＭＣＨＲ１をコードするｃＤＮＡを共感染させた場合に、生物発光応答を惹起するために１μＭ  ＭＣＨを使用した機能性ＭＣＨＲ１の検出を許容した。この観察は、ＭＣＨＲ１を発現する神経芽腫細胞が、ＭＣＨＲ１遺伝子を発現するための適切な宿主細胞であることを示す。外因性ＭＣＨＲ１の非存在下では、バックグラウンド（緩衝液ＥＣＢのみの注入）を超えるシグナルは観察され得ず、このことは、ＧＯＴＯ細胞に天然に存在するＭＣＨＲ１のレベルが、利用された条件を使用した検出を許容するには不十分であることを示唆している。１μＭリゾホスファチジル酸（ＬＰＡ）の適用により惹起された対照応答は、カルシウム動員と関連しているＧＯＴＯ細胞上のｅｄｇ受容体（Ｉｍら，２０００．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，１４２８１〜１４２８６）の存在を示唆している。
【００６６】
その他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内に含まれる。いくつかの実施形態を示し記載したが、本発明の本旨及び範囲から逸脱することなく、様々な修飾を行うことが可能である。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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