(57)【要約】【課題】日常的な診断及び／又は手術などにおいて、眼の硝子体を簡便に安全に観察し得る手段及び方法を提供する。【解決手段】蛍光ナノ粒子を含む眼の硝子体染色剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光ナノ粒子を含む眼の硝子体染色剤。
【請求項２】
蛍光ナノ粒子が、コア単層構造又はコア・シェル重層構造を有する、請求項１記載の染色剤。
【請求項３】
蛍光ナノ粒子が、半導体元素を含む、請求項１又は２記載の染色剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の染色剤を眼の硝子体に注入することを含む、眼の硝子体の染色方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト及び／又はヒト以外の動物の眼の硝子体を染色するために用いる染色剤及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、多くの眼科的疾患が硝子体の生理的及び／又は病理的変化と関連していることが解明されてきた。たとえば、加齢による硝子体の液化は網膜裂孔や網膜剥離を誘導し得るし、後部硝子体皮質前ポケットによって黄斑円孔や黄斑上膜が起こると考えられている。また、硝子体が黄斑部を牽引することによって引き起こされる黄斑症も存在する。これらの中には、重症化して終には失明をもたらす疾患もある。
【０００３】
そのため、硝子体の液化や混濁の状態、病変の有無を観察することは非常に重要である。しかし、硝子体は透明なゲル状物質により構成されているため、硝子体の観察は困難である。
【０００４】
硝子体を細隙灯顕微鏡、走査レーザ検眼鏡(Scanning Laser Ophthalmoscope；ＳＬＯ）、超音波診断装置、光干渉断層画像化装置（Optical Coherence Tomography；ＯＣＴ）、スペクトロスコピー（Spectroscopy）、動的光散乱測定装置（Dynamic Light Scattering；ＤＬＳ）で観察することは可能ではある(非特許文献１）が、どれをとってみても、硝子体を十分に、かつ容易に観察できるとは言い難い。
【０００５】
現在、眼科領域で使用されている染色物質には、トリアムシノロンアセトニド、インドシアニングリーン、フルオレセインナトリウム、ローズベンガル、リサミングリーン、スルフォローダミンなどがあるが、臨床で硝子体を染色するために用いられる物質はトリアムシノロンアセトニドのみである。
【０００６】
トリアムシノロンアセトニドは、硝子体観察用として使用するといっても硝子体手術時に使用することがほとんどであり、手術以外での使用は、その副腎皮質ホルモンとしての薬理作用を用いた治療薬としての硝子体注入が主である。したがって、硝子体観察用として用いられているとは言い難い。
【０００７】
しかも、トリアムシノロンアセトニドは白色であるため、硝子体中のWeiss Ringなどの生理的／病理的変化とコントラストがつきづらく、対象物の観察が困難になり易い。また、トリアムシノロンアセトニドは、粉状であるがために、硝子体に注入後も粒子が硝子体に点在した状態となり、粒子同士の連続性が乏しく、それゆえ観察像も粗くなるという欠点もある。さらに、近年、トリアムシノロンアセトニド注入後の眼圧上昇、白内障の発生・悪化、及び眼内炎などの副作用も報告されている。
【０００８】
蛍光ナノ粒子は、輝度が高く、光退色を起こし難い蛍光体として種々の応用が考えられており、細胞内マーカーなどとしても使用されてきている。
【０００９】
【非特許文献１】J. Sebag, Journal of Biomedical Optics January/February 2004 Vol. 9 No. 1 p38-46
【非特許文献２】Hoshino, A. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 314 (2004) pp.46-53
【非特許文献３】Hanaki, K. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 302 (2003) pp.496-501
【非特許文献４】Hoshino, A. et al., Nano Letters 2004, Vol. 4, No. 11, pp. 2163-2169
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、日常的な診断及び／又は手術などにおいて、眼の硝子体を簡便に安全に観察し得る手段及び方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、
〔１〕蛍光ナノ粒子を含む眼の硝子体染色剤；
〔２〕蛍光ナノ粒子が、コア単層構造又はコア・シェル重層構造を有する、前記〔１〕記載の染色剤；
〔３〕蛍光ナノ粒子が、半導体元素を含む、前記〔１〕又は〔２〕記載の染色剤；
〔４〕前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の染色剤を眼の硝子体に注入することを含む、眼の硝子体の染色方法、
を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、従来適切な観察方法がなかった硝子体を簡便に安全に観察することができ、硝子体の異常の有無及び程度などを容易に検出することができる。具体的には、本発明の染色剤は、無用な拡散を起こしにくく、残留性が低い、蛍光の持続時間が長い、透明でコントラストが高い染色が得られるので硝子体の変化が非常に見易い、などの利点を有する。したがって、本発明の染色剤及び染色法は、ヒト及び動物に対する眼科的診断・治療に際しても有用である。
【００１３】
本発明の染色剤は、赤色などの蛍光色を有し、輝度が高く、光退色をおこし難い蛍光体である蛍光ナノ粒子を使用しているため、硝子体内の生理的／病理的変化による病変などのコントラストがつきやすく対象物を確認し易い。また、硝子体自体や液化腔などの観察の際も、粒子が小さいため、きめ細かな観察像を得易い。さらに、濃度を調節することによって半透明にできるため、網膜など周囲の組織との相対的位置が確認しやすいという利点もある。これらの利点により硝子体手術の際に本発明の染色剤を用いると極めて安全な手術が可能となる。
【００１４】
本発明の染色剤を用いて硝子体を観察することにより、簡便、安全、正確に硝子体切除術を行うことができる。特に、硝子体手術においては、透明な硝子体が染色されることにより硝子体の視認性が格段に向上するだけでなく、眼内の他組織が透視できるため網膜・網膜血管・視神経乳頭・毛様体・水晶体後嚢などと、手術している硝子体との位置関係を把握することが容易となり、安全で正確な硝子体手術を施術できる。また、硝子体の創口への嵌頓や硝子体の牽引・接着など微細な硝子体の状況も容易に確認することができ、丁寧で合併症の少ない手術が可能となる。さらに、白内障手術などにより硝子体脱出がある際には、前房内に存在したり眼外に脱出した硝子体を容易に視認できるため、正確に判断し処理することが可能となる。
【００１５】
また、本発明の染色剤は、実際の手術のみではなく、動物モデルなどの硝子体を用いて、眼科の診断や手術の技術習得のために用いることもできる。
【００１６】
さらに、本発明の染色剤及び染色法は、医学、薬学、及び獣医学などの領域において、加齢、各種の疾患、症状、身体の状態などと眼の硝子体の状態との関係、治療又は予防処置と効果との関係などを研究するために使用することができ、研究用試薬・方法としても有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
蛍光ナノ粒子
本発明において使用される蛍光ナノ粒子は、ナノサイズの微細粒子であって、量子サイズ効果などによって蛍光を発し得るものであり、量子ドットと呼ばれるものを含む。
【００１８】
蛍光ナノ粒子は、蛍光波長より短波長であれば励起が可能であり、連続励起時には約３０分程度又はそれ以上にわたって安定に蛍光を発することができるように耐光性に優れている。また、従来の有機蛍光物質に比して高輝度であるという特徴を有する。波長蛍光波長は粒径に依存し、小さいものほど短波長の蛍光を発する。したがって、本発明において使用される蛍光ナノ粒子は、好ましくは、後述するような元素の原子１０〜１０４個、さらに好ましくは１０２〜１０３個程度からなっており、粒径は一般に１〜１００ｎｍ、好ましくは１〜２０ｎｍ、さらに好ましくは２〜１０ｎｍ程度である。
【００１９】
蛍光ナノ粒子は、一般的には、基本的に半導体元素から構成されるが、非金属元素、金属元素などを含むもの又はそれらからなるものであってもよい。また、構造としては、蛍光ナノ粒子は、コア単層構造（即ち、粒子全体が均質である）であってもよく、コア・シェル重層構造（即ち、粒子が２層以上の異なる層を有する）であってもよい。コア・シェル重層構造の蛍光ナノ粒子の例としては、金属ナノ結晶の核（コア）と、遷移金属のコーティング（シェル）とを有する量子ドットが挙げられる。
【００２０】
たとえば、コアの材料としては、１種以上のII族金属元素（亜鉛、カドミウム、水銀、銅など）と１種以上のVI族元素（セレン、硫黄、酸素など）との組合せ；１種以上のIII族元素（ホウ素、アルミニウム、ガリウム、インジウムなど）と１種以上のＶ族元素（窒素、リンなど）との組合せ；及び１種以上のIV族元素（炭素、ケイ素、ゲルマニウム、スズ、鉛）、からなる群から選択される１種又は２種以上の組合せが挙げられる。これらの材料には遷移金属元素からなる微量添加剤が含有されていてもよい。シェルの材料としては、硫化亜鉛、酸化亜鉛、インジウム、ガリウム、ケイ素、リンなどが挙げられる。
【００２１】
コア・シェル重層構造の蛍光ナノ粒子は、シェル層の外側にさらに付加的な層（コーティング層）を有していてもよい。たとえば、このような付加的な層の機能としては、粒子表面に水溶性を付与したり、金属の溶出を防止することなどが挙げられ、また、材質としては、各種ポリマー（ＰＥＧ、アミノ酸、オリゴペプチド及びその誘導体など）、ガラス被膜（シランコートなど）などが挙げられ、層の厚さとしては、一般にいずれも約１０ｎｍ以下である。また、コーティング層が多いと、蛍光が明るくなるので好都合であるが、一般にはコーティング層としては１〜４層程度である。
【００２２】
このような蛍光ナノ粒子としては各種のものが市販されているので、適宜選択して市販品を使用してもよい。市販品としては、たとえば「ＱＤｏｔ」（商品名；Quantum Dot Corporation社）、「ＥｖｉＤｏｔｓ」（商品名；Evident Technologies社）などが挙げられる。製造方法としては、公知のいずれの方法を用いてもよい。このような方法としては、たとえば、ＣＶＤ法、レーザー法、スパッタ法などの気相法；噴霧法、アルコキシド法、逆ミセル法などの液相法などが挙げられる。
【００２３】
本発明の染色剤に使用する蛍光ナノ粒子を製造する場合、一例としては以下のような方法が挙げられる。まず、上記のような原料物質を、トリ−ｎ−オクチルホスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）などを含有する配位溶媒中に分散させ、上記原料物質の微粒子をＴＯＰＯでミセル化（ＴＯＰＯミセル）する。次いで、ＴＯＰＯミセルをアルゴンガス封入条件下で加熱して、ＴＯＰＯミセル内の原料物質の微粒子を成長させ、表面にＴＯＰＯが固定された蛍光ナノ粒子を作製する。なお、この状態の蛍光ナノ粒子は、トルエンやテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）などの有機溶媒に可溶である。
【００２４】
その後、作製したＴＯＰＯ固定粒子をＴＨＦに溶解させて８５℃に加温し、そこにエタノール、クロロホルムなどの極性溶媒に溶解させた親水性化合物（たとえばアミノ酸、オリゴペプチド、アリール及びその誘導体など；ここで、誘導体としては、アミド化、脱アミン化、脱カルボン酸化、及び／又はビオチン化などを行ったものが挙げられる）を滴下させ、１２時間程度還流させる。次に、ＮａＯＨ水溶液を加え、加熱してＴＨＦを蒸発させ、濾過及びカラムなどを用いて未反応物の除去、目的物の精製及び濃縮を行うことで、表面に親水性化合物が固定された親水性の蛍光ナノ粒子を製造する。
【００２５】
染色剤
本発明の染色剤の必須成分は、上記のような蛍光ナノ粒子のみである。染色剤は、付加的な成分として、担体を含有することが好ましい。担体としては、水、生理食塩水、各種緩衝液（ＰＢＳ、Ｔｒｉｓ緩衝液など）、細胞培養用培地（Ｄ−ＭＥＭ、ＨＢＳＳなど）、又は輸液（乳酸リンゲル液など）のような水性液体が挙げられる。本発明において使用する場合、上記のような蛍光ナノ粒子は、担体中に、０．００１〜１００μＭ、好ましくは１〜１００ｎＭ程度の濃度で含有させると取り扱いがしやすくなる。
一般的な使用においては、このような溶液の形態の染色剤を、１回あたり１００〜２５０μＬ程度使用する。この量は、適用対象の動物種又は眼球の大きさなどによって適宜調節することができる。また、蛍光ナノ粒子の量は多いほど蛍光が強くなるが、多過ぎても少なすぎても見にくいため、染色剤の量は適宜調節する。
【００２６】
染色方法
使用に際しては、上記のような染色剤を、眼の毛様体扁平部の位置に相当する強膜（経毛様体扁平部）や角膜（経角膜）から、注射針（たとえば２７ゲージ）などで硝子体腔内に刺入したり、その他の方法（点眼、経静脈など）で眼内に注入する。注入後、眼内に拡散した蛍光ナノ粒子によって染色された硝子体を、細隙灯顕微鏡や手術用顕微鏡などで観察する。細隙灯顕微鏡で観察する際は、前置レンズなどを使用してもよい。引き続き、異常組織や病変が認められた部分は、切除・吸引することができる。
【実施例】
【００２７】
染色剤の製造
蛍光ナノ粒子（水性コロイド量子ドット）は、以下のようにして製造した。まず、アルゴン気流下、トリ−ｎ−オクチルホスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）（関東化学）７．５ｇに、ステアリン酸（関東化学）２．９ｇ、ｎ−テトラデシルホスホン酸（ＡＶＯＣＡＤＯ）６２０ｍｇ、及び酸化カドミニウム（Ｗａｋｏ）２５０ｍｇを加え、３７０℃に加熱混合した。これを２７０℃まで自然冷却させた後、予めトリブチルフォスフィン（関東化学）２．５ｍＬにセレン（ＳＴＲＥＭ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ）２００ｍｇを溶解させた溶液を加え、減圧乾燥し、ＴＯＰＯで被覆されたＣｄＳｅ微粒子を得た。
【００２８】
次いで、得られたＣｄＳｅ微粒子に、ＴＯＰＯ  １５ｇを加えて加熱し、引き続き２７０℃でトリオクチルホスフィン（アルドリッチ）１０ｍＬにジエチルジチオカルバミン酸亜鉛（東京化成）１．１ｇを溶解した溶液を加え、表面にＴＯＰＯが固定された、ＣｄＳｅのナノ結晶をコアとし、ＺｎＳをシェルとする蛍光ナノ粒子（以下で「ＴＯＰＯ固定量子ドット」という）を得た。なお、この状態の量子ドットは、トルエンやテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）等の有機溶媒に可溶である。
【００２９】
その後、作製したＴＯＰＯ固定量子ドットをＴＨＦに溶解させて８５℃に加温し、そこにエタノールに溶解させたＮ−［（Ｓ）−３−メルカプト−２−メチルプロピオニル］−Ｌ−プロリン（１００ｍｇ；シグマ社）を滴下させ、１２時間程度還流させた。１２時間還流後、ＮａＯＨ水溶液を加え、２時間、９０℃で加熱してＴＨＦを蒸発させた。得られた未精製の量子ドットを、限外濾過（「Ｍｉｃｒｏｃｏｎ」、Millipore社）及びセファデックスカラム（「ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ  Ｇ−２５Ｃｏｌｕｍｎｓ」、Amersham Biosciences社）を用いて精製と濃縮とを行うことで、量子ドットの表面にＮ−［（Ｓ）−３−メルカプト−２−メチルプロピオニル］−Ｌ−プロリンが固定された親水性量子ドットを製造した。
【００３０】
得られた親水性量子ドット水溶液（８００ｎＭ）を生理食塩水で希釈し、２０ｎＭ親水性量子ドット／生理食塩水溶液を、染色剤として以後の実験に使用した。
【００３１】
本発明の染色剤を用いた硝子体観察及び硝子体切除術
上記で製造した染色剤０．１〜０．１５ｍＬを、２７ゲージの針を用いて毛様体扁平部を通じて、ブタの摘出眼の硝子体腔に注入した。なお、加齢したブタ眼（８歳、大ヨークシャー種、雌）及び若いブタ眼（６ヶ月、食用雑種（デュロック、ランドレース、ヨークシャー、バークシャーの雑種））を用いた。その後、硝子体を細隙灯顕微鏡で観察し、本発明の染色剤を用いない場合と比較した。さらに、眼の硝子体切除を行った。
【００３２】
観察結果
染色剤を注入すると、直後に染色剤は硝子体腔中に拡散した。染色剤中の蛍光ナノ粒子から発光された蛍光（赤色）によって硝子体の構造が反射され、細隙灯顕微鏡によって容易に硝子体の所望の部位を観察することができ、硝子体の状態の詳細が判別できた。蛍光は、３０分以上安定に持続した。
【００３３】
若年ブタでは、硝子体がしっかりしており、硝子体腔に液化によるポケット（後部硝子体皮質前ポケット）や後部硝子体剥離を認めず、硝子体腔が均一透明に見えた。
【００３４】
一方、加齢ブタでは、上記のような加齢による生理的変化が進行しており、特に後部硝子体剥離が視神経乳頭部に発生すると乳頭の輪郭に接着していた硝子体が剥がれ、それが乳頭輪郭状（即ちリング状）の白色混濁（Weiss Ring）として視神経乳頭付近の硝子体腔に認められた。この顕微鏡写真を図１に示す。図１において、中央に見える棒状の光（矢印（Ａ）で示す）はスリットランプの光である。白丸の中にある構造物（矢印（Ｂ）で示す）はWeiss Ringである。本発明によれば、Weiss Ringを明確に識別することが可能である。なお、今回は発見されなかったが、一般に、上記とは逆に、そのWeiss RingとWeiss Ringに連続する後部硝子体皮質が細隙灯顕微鏡で観察されれば後部硝子体剥離が発生していると考えてよい。
【００３５】
細隙灯顕微鏡による観察の際に透明な硝子体の中に存在するWeiss Ringを探し出すことは困難であるが、本発明の染色剤を使用した場合は、硝子体が染色されているため白色のWeiss Ringとコントラストがついて、とても発見しやすくなった。また、Weiss Ringと連続する後部硝子体皮質は、Weiss Ringから上下左右に少しずつスキャンしながら確認していくのであるが、透明であるので見失い易い。しかし、これも硝子体が染色されているとWeiss Ringからの連続性を確認し易くなった。
【００３６】
硝子体切除術
硝子体切除術は、経毛様体的に潅流ポートと２個のサイドポートを作製し、ライトガイドと硝子体カッターをサイドポートから硝子体腔に刺入して施術した。
本発明の染色剤を用いた場合は、染色された硝子体がライトガイドの照明によって照らされて容易に視認され、また、硝子体の染色の程度を半透明にしておいたため、周囲の網膜・毛様体などとの位置関係も把握し易く、安全に硝子体を切除することが可能であった。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、本発明の染色剤によって染色した加齢ブタの眼の硝子体の、細隙灯顕微鏡による観察像（写真）である。中央に見える棒状の光（矢印（Ａ）で示す）はスリットランプの光である。白丸の中にある構造物（矢印（Ｂ）で示す）はWeiss Ringである。
【図１】
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