(57)【要約】【課題】遺伝子発現抑制の特異性に優れ、リボヌクレアーゼによる分解も受けにくいピロール−イミダゾールポリアミド化合物に基づいたＴＧＦ−β活性抑制剤又はＴＧＦ−β関連疾患の治療薬の提供。【解決手段】Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトトランスフォーミング成長因子β１（以下ｈＴＧＦ−β１とも言う）プロモーターの以下に示す塩基配列−４５０〜−３１０（配列番号２）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなるＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトトランスフォーミング成長因子β１（以下ｈＴＧＦ−β１とも言う）プロモーターの以下に示す塩基配列−４５０〜−３１０（配列番号２）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなるＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
【請求項２】
更にβ−アラニン単位を含む請求項１記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
【請求項３】
前記標的領域がｈＴＧＦ−β１プロモーターの以下に示す塩基配列−４３０〜−４００（配列番号５）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項１又は２記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
【請求項４】
前記標的領域がｈＴＧＦ−β１プロモーターの以下に示す塩基配列−４１６〜−４１０（配列番号３）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項１又は２記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
【請求項５】
前記標的領域がｈＴＧＦ−β１プロモーターの以下に示す塩基配列−３８０〜−３５０（配列番号６）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項１又は２記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
【請求項６】
前記標的領域がｈＴＧＦ−β１プロモーターの以下に示す塩基配列−３７３〜−３６６（配列番号４）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項１又は２記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
【請求項７】
前記ピロールイミダゾールポリアミドの末端のカルボキシル基がアミドを形成している請求項１〜６のいずれか一項記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
【請求項８】
前記アミドがメチルアミノプロピルアミン又はＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミンとのアミドである請求項１〜７のいずれか一項記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
【請求項９】
前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される請求項１〜４のいずれか一項記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
【化１】
2007176795.tif 000008
【請求項１０】
前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される請求項１、２、５又は６記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
【化２】
2007176795.tif 000009
【請求項１１】
下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
【化３】
2007176795.tif 000010
又は
【化４】
2007176795.tif 000011
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はトランスフォーミング増殖因子ＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤及びＴＧＦ−β関連疾患の治療薬に関する。より詳細には特定の構造を有するピロールイミダゾールポリアミドを含んでなるＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
本態性高血圧症は脳卒中、虚血性心疾患及び腎硬化症等の重篤な合併症を引き起こすが、これらの合併症は、基本的には血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の過剰増殖による血管障害と関連しており、高血圧症の治療の対象となっている。また、狭心症、心筋梗塞の治療のために行われる経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）後の約４割に冠動脈の再狭窄が起こるが、今のところこれに対する有効な薬物療法がなく、循環器領域で大きな問題となっている。病理組織的には、高血圧症性血管疾患のような動脈増殖性疾患、血管形成術後の新生内膜形成及びアテローム性動脈硬化には、ＴＧＦ−βが関連していることが知られている。かかる病態における細胞増殖は種々の作用機構によって抑制することができると考えられるが、そのうちの１つが、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）発現を抑制することである。
【０００３】
ＴＧＦは当初、Ｍｏｌｏｎｙ肉腫ウイルス（ＭＳＶ）によりトランスフォームされたマウス３Ｔ３細胞が正常細胞を悪性に変える因子として見出され、主としてＴＧＦ−αとＴＧＦ−βに大別される。ＴＧＦ−βは、前駆体として合成された３９０〜４１２個のアミノ酸からなる分子量約４０，０００のタンパク質のＣ末端側の１１２個のアミノ酸からなる部分が、ジスルフィド結合を介して二量体（２５ｋＤａ）を構成して活性を持ったものである。
【０００４】
ＴＧＦ−βは、細胞の成長と発生を調節する蛋白質の一つのファミリーを構成し（非特許文献１）、血管、血小板、肝臓、腎臓、心筋、肺、膵臓、皮膚、胎盤、骨髄などの種々の組織で産生され、細胞の増殖、細胞外マトリックスの形成、免疫能の調節作用をもつ。
【０００５】
ＴＧＦ−βは殆んどの細胞に対して増殖抑制に働くが、線維芽細胞、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）などの間葉系細胞に対しては二相性増殖作用をもつ。つまりこれらの細胞では通常状態では増殖抑制に働くが、炎症、機械的ストレスなどが加わると増殖刺激に働く。これらのことから、ＴＧＦ−βはＶＳＭＣ増殖と細胞外マトリクス形成を促進することにより血管傷害後の新生内膜形成に関与している。ＴＧＦ−βはまた、動脈硬化症の病巣の形成にも関与している。このような情報に基づいて、ＴＧＦ−βの効果を調節することに向けられた局所血管療法が上記の血管増殖性疾患の軽減に有効と考えられる。
【０００６】
また、ＴＧＦ−βは経皮的腎動脈形成術後の腎動脈の再狭窄にも関与していると考えられている。これらの事実から、本発明のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制薬は、上記の各種血管増殖・狭搾性疾患に対する治療薬として有効である。
【０００７】
また、肝臓の繊維化の過程で、肝星細胞は細胞外マトリックス産生において重要な役割を果たしている（非特許文献２）。星細胞の活性化はＴＧＦ−β１により行われ、更に活性化星細胞により、障害肝では炎症細胞からのＴＧＦ−β１の分泌が引き起こされる。同時に活性化星細胞のＴＧＦ−β１受容体発現が亢進し、ＴＧＦ−β１によるオートクライン機序により細胞外マトリックス蛋白を増加させる（非特許文献３）。これらの事実から、本発明のＴＧＦ−β１遺伝子発現抑制剤は、上記の各種肝疾患に対する治療薬としても有効であると合理的に考えることができる。
【０００８】
また、ＩｇＡ腎症、巣状糸球体硬化症、半月体形成性腎炎、巣状硬化型ループス腎炎、びまん性増殖性ループス腎炎、糖尿病性腎症、高血圧性腎硬化症等の腎疾患のモデル動物、又は糸球体腎炎や糖尿病性腎症患者の腎生検組織でＴＧＦ−βの発現が細胞外基質と並行して増加している（非特許文献４、非特許文献５）また同時にBorderらは、抗ＴＧＦ−βをＴｈｙ−１腎炎ラットに投与すると、腎糸球体の細胞外基質の蓄積を抑制することを報告した（非特許文献５）。これらの事実から、本発明のＴＧＦ−β１遺伝子発現抑制剤は、上記の各種腎疾患に対する治療薬としても有効であると合理的に考えることができる。
【０００９】
また、動物の心筋梗塞モデルにおいては、瘢痕形成期の梗塞巣で、ＴＧＦ−βの発現が持続的に亢進し、心筋繊維化の促進に関与している（非特許文献６）。これらの事実から、本発明のＴＧＦ−β１遺伝子発現抑制剤は、心筋梗塞後の心筋繊維化に対する治療薬としても有効であると合理的に考えることができる。
【００１０】
また、肺繊維症モデル動物に抗ＴＧＦ−β抗体やＴＧＦ−β可溶性レセプターを投与することにより肺繊維症が改善する（非特許文献７）。これらの事実から、本発明のＴＧＦ−β１遺伝子発現抑制薬は、肺繊維症に対する治療薬としても有効であると合理的に考えることができる。
【００１１】
また、ヒト慢性膵炎におけるＴＧＦ−β１の高発現については多数報告されているが、再発性急性膵炎のモデル動物に組換えＴＧＦ−βを投与すると、膵の炎症部分の繊維化やフィブロネクチンｍＲＮＡの高発現を引き起こし、逆に膵炎のモデル作成時にＴＧＦ−β１の中和抗体を投与すると、細胞外マトリックスの産生及びＩ・ＩＩＩ型コラーゲンやフィブロネクチンのｍＲＮＡ発現が抑制されることが明らかにされている（非特許文献８）。これらの事実から、本発明のＴＧＦ−β１遺伝子発現抑制剤は、慢性膵炎における繊維化に対する治療薬としても有効であると合理的に考えることができる。
【００１２】
また、強皮症の原因としＴＧＦ−βが提唱され、森らは皮膚繊維化モデルマウスにおいて、ＴＧＦ−βが皮膚繊維化を誘導することを報告した（非特許文献９）。これらの事実から、本発明のＴＧＦ−β１遺伝子発現抑制剤は、各種皮膚繊維化疾患に対する治療薬としても有効であると合理的に考えることができる。
【００１３】
また、骨髄繊維症の患者の巨核球ではＴＧＦ−β  ｍＲＮＡの発現が亢進しており（非特許文献１０）、血小板内ＴＧＦ−β濃度は高値（非特許文献１１）で、患者の血漿中ＴＧＦ−β濃度は有意に高い（非特許文献１２）と報告されている。Ｒａｍｅｓｈｗａｒらによると骨髄繊維症の患者の単球は粘着によってＮＦ−ｋが活性化してＩＬ−１産生を誘導し、ＩＬ−１はＴＧＦ−β産生を亢進させて骨髄の繊維化を惹起している（非特許文献１３）。これらの事実から、本発明のＴＧＦ−β１遺伝子発現抑制剤は、骨髄繊維症に対する治療薬としても有効であると合理的に考えることができる。
【００１４】
また、男性型前頭部脱毛患者の培養細胞系において、男性ホルモンが皮膚乳頭細胞からＴＧＦ−β１が誘導され、このＴＧＦ−β１が表皮細胞増殖を抑制させることが報告されている（非特許文献１４）。これらの事実から、本発明のＴＧＦ−β１遺伝子発現抑制剤は、男性型前頭部脱毛に対する治療薬としても有効であると合理的に考えることができる。
【００１５】
逆遺伝学による遺伝子機能の不活性化の手法は、ある特定の遺伝子の機能を解析するために用いられるものであるが、一方でウイルス感染、癌、及び遺伝子の異常発現に基づくその他の疾病の治療にも大きな可能性を開いている。すなわち、遺伝子機能の不活性化を、相同的組換えによりＤＮＡレベルで、又はアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドやリボザイムによりＲＮＡレベルで実施することができることが知られている。しかし、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドやリボザイムの手法は、ターゲットとする配列に制約があり、組織、細胞への移行が悪く、リボヌクレアーゼにより分解されやすいという課題があった。
【００１６】
一方、アンチセンス試薬やリボザイムのような（デオキシ）リボヌクレオチド試薬とは異なり、ピロールイミダゾールポリアミド（以下、Ｐｙ−Ｉｍポリアミドとも言う）類が、ＤＮＡの塩基配列を特異的に認識し、特定遺伝子の発現を細胞外からコントロールすることができることが報告されている。
【００１７】
ピロールイミダゾールポリアミドは一群の合成小分子であり、芳香族環であるＮ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）及びＮ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）から構成されている（非特許文献１５−１７）。Ｐｙ及びＩｍは連続してカップリングし折りたたむことによりγ−アミノ酪酸の存在下でＵ字型のコンフォメーションを採ることができる。本発明に係るピロールイミダゾールポリアミドにおいて、Ｎ−メチルピロール単位（Ｐｙ）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）及びγ−アミノ酪酸単位（γリンカーとも言う）は互いにアミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）で連結されており、その一般構造及び製造方法は公知である（特許文献１〜３）。
【００１８】
このような合成ポリアミドは二重らせんＤＮＡの副溝（マイナーグルーブ）中の特定の塩基対に高い親和性と特異性を以って結合することができる。塩基対の特異的認識はＰｙとＩｍとの１対１の対形成に依存している。即ち、ＤＮＡの副溝内でのＵ字型コンフォメーションにおいて、Ｐｙ／Ｉｍ対はＣ−Ｇ塩基対を標的とし、Ｉｍ／ＰｙはＧ−Ｃ塩基対を標的とし、そしてＰｙ／ＰｙはＡ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対の両方を標的とする（非特許文献１６−１７）。最近の研究によればＡ−Ｔ縮合はＰｙ／Ｐｙ対の一つのピロール環を３−ヒドロキシピロール（Ｈｐ）で置換した結果としてＨｐ／Ｐｙが優先的にＴ／Ａ対に結合することによって克服することができることがわかっている（非特許文献１８）。
【００１９】
一般的には転写の開始が遺伝子制御の重要なポイントであると考えられている。転写の開始には遺伝子プロモータ領域において特異的な認識配列に結合する転写因子をいくつか必要とする。副溝中のポリアミドは、もし転写因子が遺伝子発現において重要であれば、転写因子の結合を遮断して遺伝子の調節に干渉する可能性がある。この仮説はインビトロ及びインビボの実験で証明されている。ジンクフィンガーの認識部位（ＴＦＩＩＩＡの結合部位）の内部に結合した８員環Ｐｙ−Ｉｍポリアミドは５ＳＲＮＡ遺伝子の転写を阻害した（非特許文献１９）。ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）プロモータ中の転写因子配列に隣接する塩基対に結合するポリアミド類は、ヒト細胞におけるＨＩＶ−１複製を阻害する。これらの配列にはＴＡＴＡボックス、リンパ系エンハンサー因子ＬＥＦ−１配列、及びＥＴＳ−１配列が包含される（非特許文献２０）。これとは対照的に、ポリアミドはまた、リプレッサー因子を遮断することによって、又は生来の転写因子を置換することによって、遺伝子発現を活性化する（非特許文献２１−２３）。ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＵＬ１２２仲介初期タンパク質２（ＩＥ８６）は、プロモータにＲＮＡポリメラーゼＩＩを補充することを遮断し、その関連遺伝子の転写を抑制する（非特許文献２１）。合成ポリアミドはＩＥ８６の抑制を遮断しその対応遺伝子の発現を開放することができる（非特許文献２２）。Ｍａｐｐらにより設計されたポリアミドは人工転写因子として作用し、遺伝子転写反応を仲介する（非特許文献２３）。
【００２０】
【特許文献１】特許第３０４５７０６号
【特許文献２】特開２００１−１３６９７４
【特許文献３】ＷＯ  ０３／０００６８３  Ａ１
【非特許文献１】Piek et al.、FASEB J,13,2105-2124(1999)
【非特許文献２】Bataller R et al,Gastroenterology 118,1149,2000
【非特許文献３】渡辺久剛ら、現代医療、第３５巻（第２号）、２００３年
【非特許文献４】Yamamoto T et al:Kidney Int 49:461,1996
【非特許文献５】Border WA et al:Kidney Int 51:1388,1997
【非特許文献６】Ono et al:Circulation 98:149,1998
【非特許文献７】Giri SN al:Thorax 1993
【非特許文献８】槙野  直彦他：現代医療Vol.35,No.2,2003
【非特許文献９】Mori et al:J Cell Physiol 181:153,1999
【非特許文献１０】Reilly J et al:Clin Haematol:11751-767,1998
【非特許文献１１】Martyre M C et al:Br J Haematol 77:80-86,991
【非特許文献１２】Rameshwar P et al:Am J Haematol 59:133-142,1998
【非特許文献１３】Rameshwar et al:J Immunol 165:2271-2277,2000
【非特許文献１４】Shigeki et al:FASEB J 16:1967-1969,2002
【非特許文献１５】Trauger et al:Nature.1996;382:559-61.
【非特許文献１６】White et al:Chem Biol.1997;4:569-78.
【非特許文献１７】Dervan:Bioorg Med Chem.2001;9:2215-35.
【非特許文献１８】White at al:Nature.1998;391:468-71.
【非特許文献１９】Gottesfeld et al:Nature.1997;387:202-5.
【非特許文献２０】Dickinson et al:Proc Natl Acad Sci U S A.1998;95:12890-5.
【非特許文献２１】Lee et al:Proc Natl Acad Sci U S A.1996;93:2570-5.
【非特許文献２２】Dickinson et al:Biochemistry.1999;38:10801-7.
【非特許文献２３】Mapp et al:Proc Natl Acad Sci U S A.2000;97:3930-5.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
先に述べたアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドやリボザイムの手法は、ターゲットとする配列に制約があり、組織、細胞への移行が悪く、リボヌクレアーゼにより分解されやすいという課題があった。これまでに、ｈＴＧＦ−βの遺伝子塩基配列に結合するピロール−イミダゾールポリアミドを用いたＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤又はＴＧＦ−β関連疾患の治療薬についての報告はない。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明者らは、ヒトＴＧＦ−βのプロモータの特定の領域に特異的に結合してヒトＴＧＦ−β遺伝子の発現を阻害することができるピロールイミダゾールポリアミドの開発とその薬理効果について鋭意研究した。そこで、本発明者らは、ヒトトランスフォーミング成長因子−β１（ｈＴＧＦ−β１）遺伝子の発現を阻害することができ、且つ治療薬として役立ち得る化合物を得るべく、ｈＴＧＦ−β１プロモータの様々な断片を標的とするポリアミド類のうち、プロモータ領域の−４５０〜−３１０の領域のうち、ＡＰ１結合領域を含む領域、好ましくは−４３０〜−４００の領域又は−３８０〜−３５０の領域、より好ましくは−４１６〜−４１０の領域又は−３７３〜−３６６の領域に結合する化合物が、ｈＴＧＦ−β１プロモータの活性を有意に阻害し、培養ヒト血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）においてｈＴＧＦ−β１遺伝子の発現をダウンレギュレートすることを見出し、本発明をなすに至った。
【００２３】
即ち、本発明は以下の通りである。
（１）Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトトランスフォーミング成長因子β１（以下ｈＴＧＦ−β１とも言う）プロモーターの以下に示す塩基配列−４５０〜−３１０（配列番号２）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなるＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
（２）更にβ−アラニン単位を含む上記（１）記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
（３）前記標的領域がｈＴＧＦ−β１プロモーターの以下に示す塩基配列−４３０〜−４００（配列番号５）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記（１）又は（２）記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
（４）前記標的領域がｈＴＧＦ−β１プロモーターの以下に示す塩基配列−４１６〜−４１０（配列番号３）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記（１）又は（２）記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
（５）前記標的領域がｈＴＧＦ−β１プロモーターの以下に示す塩基配列−３８０〜−３５０（配列番号６）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記（１）又は（２）記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
（６）前記標的領域がｈＴＧＦ−β１プロモーターの以下に示す塩基配列−３７３〜−３６６（配列番号４）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記（１）又は（２）記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
（７）前記ピロールイミダゾールポリアミドの末端のカルボキシル基がアミドを形成している上記（１）〜（６）のいずれか一項記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
（８）前記アミドがメチルアミノプロピルアミン又はＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミンとのアミドである上記（１）〜（７）のいずれか一項記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
（９）前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される上記（１）〜（４）記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
【化１】
2007176795.tif 000002
（１０）前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される上記（１）、（２）、（５）又は（６）記載のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤。
【化２】
2007176795.tif 000003
（１１）下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
【化３】
2007176795.tif 000004
又は
【化４】
2007176795.tif 000005
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、遺伝子発現を特異的に抑制することができるので化学療法剤のような副作用がなく、また化合物であるのでリボヌクレアーゼにより分解されるという欠点もない、ＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤を得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明に係るピロールイミダゾールポリアミドにおいて、Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ−アミノ酪酸単位（γリンカーとも言う）は互いにアミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）で連結されており、その一般構造及び製造方法は公知である（例えば、特許文献１〜３参照）。
【００２６】
例えば、ピロールイミダゾールポリアミドはＦｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）を用いた固相法（固相Ｆｍｏｃ法）による自動合成法によって簡便に製造することができる（特許文献３）。固相Ｆｍｏｃ法によれば、ピロールイミダゾールポリアミドの末端をカルボン酸残基として固体担体から切り出すことができるので、種々の官能基を分子末端に導入してピロールイミダゾールポリアミドの誘導体を作成することもできる。例えば、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、ブレオマイシン、エンジイン化合物、ナイトロジェンマスタード、これらの誘導体等、ＤＮＡに対してアルキル化能を有する化合物を必要に応じて導入することもできる。固相Ｆｍｏｃ法は市販のタンパク（ペプチド）合成機を用いる自動合成法であるため、天然に存在するタンパク質や非天然タンパク質とピロールイミダゾールポリアミドとの共役体（コンジュゲート）を合成することもできる。また、Ｆｍｏｃ法はｔ−ＢＯＣ法に比べて反応条件が緩和であるため、タンパク質以外の有機化合物（酸性条件下で不安定な官能基を有する化合物をも含む）の導入も可能である。例えば、ピロールイミダゾールポリアミドとＤＮＡやＲＮＡ（又はそれらの誘導体）との共役体を自動的に合成することも可能である。
【００２７】
上記公知のＦｍｏｃ法等によれば、末端にカルボキシル基を有するピロールイミダゾールポリアミドを合成することができる。その具体例としては、例えば、末端にβ−アラニン残基（β−アミノプロピオン酸残基）やγ−アミノ酪酸残基を有するピロールイミダゾールポリアミド等が挙げられる。末端にβ−アラニン残基又はγ−アミノ酪酸残基を有するピロールイミダゾールポリアミドは、例えば、それぞれＦｍｏｃでアミノ基を保護した、アミノピロールカルボン酸、アミノイミダゾールカルボン酸、β−アラニン又はγ−アミノ酪酸を担持した固相担体を用い、ペプチド合成機を使用して固相Ｆｍｏｃ法により合成することができる。
【００２８】
アミノピロールカルボン酸の具体例としては、例えば、４−アミノ−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−メチル−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−エチル−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−プロピル−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−ブチル−２−ピロールカルボン酸等が挙げられる。アミノイミダゾールカルボン酸の具体例としては、例えば、４−アミノ−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−メチル−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−エチル−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−プロピル−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−ブチル−２−イミダゾールカルボン酸等が挙げられる。
【００２９】
固相Ｆｍｏｃ法によれば、例えば、ピロールイミダゾールポリアミドとＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）との共役体を合成することもできる。ＦＩＴＣは従来から抗体の蛍光標識試薬として知られているので、得られる共役体は、当該ピロールイミダゾールポリアミドが特定のＤＮＡ配列を認識することを証明するために用いることができる。
【００３０】
本発明のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤は、Ｎ−メチルピロール単位（Ｐｙ）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ｈＴＧＦ−β１プロモーターの塩基配列−４５０〜−３１０（配列番号２）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含む。
【００３１】
通常ＤＮＡのらせんの骨格は２種類の溝をつくり、広くて深い溝を主溝（メジャーグルーブ）、狭くて浅い溝を副溝（マイナーグルーブ）と呼んでいる。ここで上記ピロールイミダゾールポリアミドは、特定の塩基対がつくる副溝（マイナーグルーブ）に高い親和性と特異性を以って非共役結合的に結合することができる。この時の結合は、副溝のＣ−Ｇ塩基対に対してはピロールイミダゾールポリアミドのＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応している。そして、ピロールイミダゾールポリアミド分子中のγ−アミノ酪酸単位の部位で分子が折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとる。
【００３２】
副溝の塩基対とピロールイミダゾールポリアミドのＰｙとＩｍの対が上述のように対応していないと、副溝とピロールイミダゾールポリアミドとの結合が不十分となる。このように、副溝の塩基対とＰｙ−Ｉｍ対が上述のように対応していないピロールイミダゾールポリアミドを本願ではミスマッチ又はミスマッチポリアミドと呼ぶ。
【００３３】
ｈＴＧＦ−β１遺伝子調節領域の塩基配列は図１及び配列番号１に示す通りである（Journal of Biological Chemistry, Vol.264, No.1, 402-408 (1989)）。
本発明のピロールイミダゾールポリアミドＧＢＰ１１０５及びＧＢＰ１１０６は下記に示す通りである。
【化５】
2007176795.tif 000006
又は
【化６】
2007176795.tif 000007
【００３４】
ＧＢＰ１１０５は、分子式Ｃ７６Ｈ９４Ｎ３０Ｏ１５、分子量１６６７．７５を有し、その標的配列はｈＴＧＦ−β１遺伝子調節領域の−４５０〜−３８０の領域のうち、ＡＰ１結合領域を含む−４３０〜−４００（配列番号５）の領域であり、直接的にはｇａｃｔｃｔｃ（−４１６〜−４１０）（配列番号３）の７塩基に結合することにより、ｈＴＧＦ−β１遺伝子の発現を抑制する。
【００３５】
ＧＢＰ１１０６は、分子式Ｃ８８Ｈ１０６Ｎ３４Ｏ１７、分子量１９１２．００を有し、その標的配列はｈＴＧＦ−β１遺伝子調節領域の−３８０〜−３１０の領域のうち、ＡＰ１結合領域を含む−３８０〜−３５０（配列番号６）の領域であり、直接的にはｇｔｇｔｃｔｃ（−３７３〜−３６６）（配列番号４）の８塩基に結合することにより、ｈＴＧＦ−β１遺伝子の発現を抑制する。
【００３６】
Ｐｙ−Ｉｍポリアミドはインビトロ研究では一般的な又は組織特異的な転写因子の有効な阻害剤又は活性化剤である（非特許文献１９〜２３）。特異的なポリアミドでショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）を発育させると、特に毒性もなく機能的表現型を獲得したり喪失したりするが、これはポリアミドが特異的に遺伝子発現を制御した結果である（Janssen et al:Mol Cell.2000;6:1013-24, Janssen at al:Mol Cell.2000;6:999-1011.）。本発明者らはｈＴＧＦ−β１プロモータの特定の領域を標的とするＰｙ−Ｉｍポリアミド類を合成した。これらのポリアミドは核内に４８時間以上特に消失することもなく安定に滞留した。アンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムと比較して、ポリアミドはよりすぐれた透過性（低濃度、トランスフェクション媒体不要）とより高い安定性を培養ｈＶＳＭＣにおいて示した。ポリアミドの高い透過性と安定性は遺伝子治療法のための真核細胞の核への理想的な薬剤アプローチを提供するものである。
【００３７】
最近までＰｙ−Ｉｍポリアミドの開発はプロモータ配列における転写因子−ＤＮＡ複合体の構造的特性に基づいていた。ＴＡＴＡボックス含有プロモータ中の配列を標的とする効率的な方法は、ＴＡＴＡボックスに隣接する塩基対に結合するよう設計することであろう。ＴＡＴＡボックスはほとんどのタンパク質コード遺伝子において転写開始部位の上流２５〜３５塩基対に位置している。転写介在因子Ｄ（ＴＡＦＩＩＤ）はＴＡＴＡボックスに特異的に結合するＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）を含んでおり、コアプロモータにおける他の転写関与因子を採用してプレ開始コンプレックス（ＰＩＣ）を形成する。ＰＩＣは遺伝子転写を開始してアクチベータ又はサプレッサと相互作用して遺伝子発現を調節する。ＴＢＰも二重らせんＤＮＡの副溝（マイナーグルーブ）に結合するので（Lee et al:Cell.1991 Dec 20;67(6):1241-50, Starr et al:Cell.1991;67:1231-40, Courey et al:Cell.1988;55:887-98）、合成ポリアミドはＴＡＴＡ結合タンパク質の結合部位を競合的に占有し、遺伝子転写に干渉する。様々なプロモータで設計したポリアミドの成功例のうちで、ＴＡＴＡボックスを標的とするものが常に機能することが知られている（非特許文献２０、２１）。
【００３８】
ＴＡＴＡボックスもイニシエーター領域（Ｉｎｒ）も含んでいない種類のプロモータもある（Javahery et al:Mol Cell Biol.1994;14:116-27;Lo et al:Gene.1996 Dec 5;182(1-2):13-22;Romeo et al:Gene.1997;189:289-95.）。高度に発現し特化された遺伝子のプロモータはＴＡＴＡボックスを有している傾向にあるが、ハウスキーピング遺伝子のプロモータにはそれが欠如している傾向がある。ＴＡＴＡのないプロモータは、低レベルで発現される遺伝子や、増殖の間に厳密なダウンレギュレーションを要求する遺伝子にとっては必要かもしれないが、そのメカニズムはなお今後の研究を要する。ｈＴＧＦ−β１プロモータはこの種類に属する。これは転写開始部位の上流の様々な領域にいくつもの陽性及び陰性の配列を含んでいる（Kim et al:J Biol Chem.1989;264:402-8.）。転写開始部位の近傍にはいくつかのＳＰ−１配列と二つのＡＰ−１配列が存在する。様々なウイルス性及び細胞性プロモータがＳＰ−１タンパク質によって活性化されるので、プロモータがＳＰ−１により刺激されるためには単一のＳＰ−１配列で十分のようである（Kadonaga et al:Cell.1987;51:1079-90, Courey et al:Cell.1988;55:887-98）。ＡＰ−１配列はＪｕｎホモダイマー又はＦｏｓ／Ｊｕｎヘテロダイマー複合体のいずれかからなるＡＰ−１転写因子に応答する。ＡＰ−１配列を介してＴＰＡ、ｖ−ｓｒｃ遺伝子産物及びｈＴＧＦ−β１自身のようないくつかの物質がｈＴＧＦ−β１遺伝子の発現を刺激する（Kim et al:J Biol Chem.1989;264:7041-5, Kim et al:J Biol Chem.1989;264:19373-8, Kim et al:Mol Cell Biol.1990;10:1492-7, Birchenall-Roberts et al:Mol Cell Biol.1990;10:4978-83）。
【００３９】
ＳＰ−１及び／又はＡＰ−１配列がｈＴＧＦ−β１遺伝子発現の活性化を仲介すると仮定されている。重要なポリアミドは応答性の転写因子の結合を遮断するために、異なるＡＰ−１及びＳＰ−１配列に隣接する塩基対を標的とするように設計されている。しかし、これらのポリアミドがｈＴＧＦ−β１プロモータの活性を阻害することができるか、又は活性化することができるかを示すに十分なデータはない。これらの結果は、設計したポリアミドがＤＮＡ等の副溝（マイナーグルーブ）中で占有する位置が不適切だったためかもしれない。本発明者らは標的配列をｈＴＧＦ−β１プロモータの上流にまで拡張した。一つのポリアミドはｈＴＧＦ−β１プロモータを標的としており、これはインビトロでプロモータの活性を阻害し、培養ｈＶＳＭＣではｈＴＧＦ−β１  ｍＲＮＡとタンパク質を阻害することが示されている。ＴＡＴＡボックスを含むコアプロモータからは転写を抑制する転写リプレッサーは見つかってはいるが、ＴＡＴＡのないプロモータからは見つかっていない（Aso et al:EMBO J.1994;13:435-45, Mack et al:Nature.1993;363:281-3, Merino et al:Nature.1993;365:227-32）。ほとんどの哺乳類遺伝子の発現はプロモータとエンハンサー配列に結合した莫大な数のタンパク質の作用の組合せに依存している傾向が高いので、今回の結果を説明する最も簡単なモデルは、本発明のピロールイミダゾールポリアミドが転写因子−ＤＮＡ相互作用を遮断し、ｈＴＧＦ−β１プロモータ活性に対して阻害効果を示すということである。
【００４０】
プロモータ領域における転写因子の調節以外に、他の因子も遺伝子発現に影響を与えている可能性もある。これらの因子はクロマチンパッキング、ポリアデニレーション、スプライシング、ｍＲＮＡ安定性、翻訳開始等を包含するものである（Berger et al:Mol Cell.2001;5:263-8, McKeown Annu Rev Cell Biol.1992;8:133-55, Decker et al:Trends Biochem Sci.1994;19:336-40, Kozak Annu Rev Cell Biol.1992;8:197-225）。合成ポリアミドはヌクレオソームの位置関係から標的部位に接近することができ、特異的配列を標的とすることによりクロマチンの縮合・脱縮合構造に影響を与えている可能性がある（Gottesfeld et al:J Mol Biol.2002;321:249-63;Gottesfeld et al:J Mol Biol.2001;309:615-29.）。ピロールイミダゾールポリアミドがヘテロクロマチン褐色サテライトを開き、ＧＡＦの結合を可能とし、その結果ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにおける表現型の変化を引き起こしているということが証明されている。ピロールイミダゾールポリアミドは容易に合成し、興味のある配列を標的とするように設計することができるので、ゲノムの機能研究や最終的にはｈＴＧＦ−β１遺伝子阻害や活性化のような遺伝子治療に有用である。
本発明に係るＰｙ−Ｉｍポリアミドは転写開始領域からは遠位の上流において設計することができ、これがｈＴＧＦ−β１遺伝子の発現に対する阻害効果を示す。
【実施例】
【００４１】
Ｉ．材料及び方法
（１）ｈＴＧＦ−β１プロモータに対応するＰｙ−Ｉｍポリアミドの設計
Ｐｙ−Ｉｍポリアミドとして、ｈＴＧＦ−β１プロモータの−４１６〜−４１０又は−３７３〜−３６６の塩基対に結合するように、上記のようなＧＢＰ３１０２又はＧＢＰ３１０３を設計した。
【００４２】
（２）Ｆｍｏｃ法を用いたＰｙ−Ｉｍポリアミドのマシンアシスト（機械補助）自動合成
ピロールイミダゾールポリアミドのマシンアシスト自動合成を、連続フローペプチド合成機Ｐｉｏｎｅｅｒ（商標）（アプライドバイオシステムズ）を用いて０．１ｍｍｏｌスケール（２００ｍｇのＦｍｏｃ−β−アラニン−ＣＬＥＡＲ酸レジン、０．５０ｍｅｑ／ｇ、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．）で実施した。自動固相合成はＤＭＦ洗浄、Ｆｍｏｃ基の２０％ピペリジン／ＤＭＦによる除去、メタノール洗浄、ＨＡＴＵ及びＤＩＥＡ（それぞれ４当量）の存在下でのモノマーとの６０分間のカップリング、メタノール洗浄、必要に応じて無水酢酸／ピリジンによる保護、及び最終的なＤＭＦ洗浄からなっている。Ｐｙ−Ｉｍポリアミドは一般に中程度の収率（１０−３０％）で得られた。
【００４３】
ＦＩＴＣカップリング：  ４倍過剰のフルオレセイン（０．４０ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（ＨＡＴＵなし）をＤＭＦに溶解したものをカラムを通して６０分間フラッシュした。
一般的手順：  Ｆｍｏｃ−β−アラニン−Ｗａｎｇ樹脂のＦｍｏｃ基を除去した後、樹脂をメタノールで連続的に洗浄した。カップリング工程をＦｍｏｃアミノ酸で実施し、次いでメタノールでの洗浄を行った。これらの工程を全配列が導入されるまで何度も繰返した。カップリング工程を終えた後、必要に応じてＮ末端アミノ基を保護するか又はＦＩＴＣでカップリングし、ＤＭＦで洗浄し、反応容器を取りはずした。
【００４４】
カルボン酸としての分解：  合成ポリアミドを冷エチルエーテル沈澱により分解工程（９１％ＴＦＡ−３％／ＴＩＳ−３％ＤＭＳ−３％水の混合物５ｍｌ／樹脂０．１ｍｍｏｌ）の後に単離した。
アミンとしての分解：  合成ポリアミドを冷エチルエーテル沈澱により分解工程（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミン５ｍｌ／樹脂０．１ｍｍｏｌ、５０℃、一晩）の後に単離した。
精製：  最終精製は、１０ｍｌ／ｍｉｎの流速の分析用ＲＰ−ＨＰＬＣで、緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ／水又は０．１％ＡｃＯＨ／水）中Ｂ（アセトニトリル）の直線勾配を用いて、３５０ｎｍのＵＶ検出により行った。ＧＢＰ１１０５及びＧＢＰ１１０６のＲＰ−ＨＰＬＣのチャートを図２（ａ）及び（ｂ）にそれぞれ示す。
【００４５】
（３）ｈＶＳＭＣ細胞培養
ｈＶＳＭＣ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）を１０％仔ウシ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ変性Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）にて培養した。細胞をＣａ２＋，Ｍｇ２＋フリーのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中０．０５％トリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でのトリプシン処理により継代し、７５−ｃｍ２組織培養フラスコで培養した。培地は４〜５日毎に交換し、５〜１０継代の間の細胞について実験を行った。
（４）培養ｈＶＳＭＣにおけるＦＩＴＣ−標識ポリアミド類のインキュベーション
継代ｈＶＳＭＣを１０５／ｃｍ２の密度で２４時間、２４ウェルのフラスコで培養した。ＦＩＴＣ標識ポリアミドを１０−９Ｍの濃度で培地に直接添加し、蛍光顕微鏡で１時間ごとに観察した。
【００４６】
（５）ゲルシフトアッセイ
オリゴヌクレオチドを合成し、アニーリングして、ｈＴＧＦ−β１プロモーターの塩基対に対応する１２種の二本鎖オリゴヌクレオチドとした。二本鎖ＤＮＡを［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰを用いたＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで標識し、３７℃で１５分間、結合緩衝液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．９，２５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２５ｍＭ  ＥＤＴＡ，２５ｍＭ  ＤＴＴ，１００ｍＭ  ＫＣｌ）中でポリアミド又はミスマッチポリアミドとともにインキュベートした。得られた複合体を２０％ポリアクリルアミドゲルにより電気泳動し、オートラジオグラフィーで可視化した。
【００４７】
（６）ＲＮＡ抽出及び成長因子ｍＲＮＡのための逆転写反応、ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイ
培養細胞をＰＢＳで洗浄し、１０００μＬのＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に溶解し、１００μＬのクロロホルムと混合し、遠心分離し、上部水相を等体積のイソプロパノールと混合してＲＮＡを沈澱させた。ＲＮＡペレットを５００μＬの７５％エタノールで二回洗浄し、乾燥後、１０μｌのＴＥ緩衝液に溶かした。６５℃で１５分間変性させた後、ＲＮＡ試料を室温で４５分間、０．５ｍｌのＤＮアーゼ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．３，５０ｍＭ  ＫＣｌ，２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中、０．５Ｕ  ＤＮアーゼ（Ｇｉｂｃｏ）で処理した。ＤＮアーゼは０．５ｍＬ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡを添加し、９８℃で１０分間加熱することによって不活化した。
【００４８】
等量のＲＮＡ（１μｇ／２０μＬ）を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．３）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  デオキシＮＴＰ類、及び２．５μＭランダムヘキサマー中、２．５Ｕ／２０μＬトリ骨髄芽腫ウイルス逆転写酵素（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いて一本鎖ｃＤＮＡ中に逆転写させた。２μＬの希釈ｃＤＮＡ生成物を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０２５Ｕ／μＬ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）及び上流センスプライマー及び下流アンチセンスプライマーの各々０．２μＭとともに混合し合計２５μＬとした。センスプライマー（５’−ＡＴＣＡＧＡＧＣＴＣＣＧＡＧＡＡＧＣＧＧＴＡＣＣ−３’）（配列番号７）及びアンチセンスプライマー（５’−ＧＴＣＣＡＣＴＴＧＣＡＧＴＧＴＴＡＴＣＣＴＧ−３’）（配列番号８）をｈＴＧＦ−β１  ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅に使用した。ヒト１８ＳリボゾームＲＮＡについてセンスプライマー（５’−ＴＣＡＡＧＡＡＣＧＡＡＡＧＴＣＧＧＡＣＧ−３’）（配列番号９）及びアンチセンスプライマー（５’−ＧＧＡＣＡＴＣＴＡＡＧＧＧＣＡＴＣＡＣＡ−３’）（配列番号１０）を内部対照として使用した。ＰＣＲをサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ，ＣＡ）で行った。ＰＣＲ条件は９４℃２分の初期変性、次いで３０サイクルの変性９４℃１分、アニーリング５８℃１分、伸張７２℃１分を行い、最後に７２℃１０分の伸張反応を行うものであった。１８Ｓ ｒＲＮＡについてのプライマーによるＰＣＲを内部対照として各反応中に含ませた。ゲノムＤＮＡがＰＣＲによって増幅しないことを確認するために、逆転写酵素なしプライマーセットありの対照ＲＴ−ＰＣＲ実験を行った。反応のいずれにおいても生成物は増幅しなかった。ｍＲＮＡの半定量的分析のために、ＰＣＲ産物がゲル上で検出可能になったサイクル数を種々の試料間で比較した。連続した１０倍希釈のｃＤＮＡ（１００、１０及び１ｎｇ）を増幅した。ＰＣＲ産物はｃＤＮＡの量を増加していくとより早いサイクルの段階で検出可能となった。標的ｍＲＮＡの各々に対応するＰＣＲ産物の量は２０〜３５サイクルで直線的に増加した。ＰＣＲ産物の定量は、Ｂｉｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて行った。
【００４９】
（７）統計解析
結果は平均値±ＳＥＭで表現した。平均値間の差の有意性はスチューデントｔ検定 により評価した。０．０５未満のｐ値を有意であるとした。
【００５０】
ＩＩ．結果
（１）合成ポリアミドの二本鎖オリゴヌクレオチドへの結合
ゲルシフトアッセイによりＧＢ１１０５及びＧＢＰ１１０６の標的配列への結合を検討した。それぞれのピロールイミダゾールポリアミドの標的配列を含む１１塩基のセンス、アンチセンスのオリゴヌクレオチドを作成し、これをアニーリングさせて標的部位の二本鎖ＤＮＡを作成し、これとそれぞれのピロールイミダゾールポリアミドとをインキュベートした。これらをポリアクリルアミドゲルで電気泳動してピロールイミダゾールと標的配列との結合性を検討した。ＧＢＰ１１０５及びＧＢＰ１１０６ともに二本鎖ＤＮＡ（ＤＳ）にピロールイミダゾールポリアミド（Ｐｙ−Ｉｍ）を加えると、ＤＳのみのレーンと比べ泳動度が低下し、高分子化したことが示唆され、ＤＳとＰｙ−Ｉｍとの結合が証明された。結果を図３に示す。
【００５１】
（２）  ＧＢＰ１１０５によるＴＧＦ−β１メッセンジャーＲＮＡの発現抑制効果
腎臓由来の培養ヒトメサンギウム細胞を培養し、１ｘ１０−６ＭのＰＭＡ（12‐O‐tetradecanoylpholbol‐13‐acetate）を添加して刺激し、Ｐｙ−Ｉｍ（ＧＢＰ１１０５）を加えてそのＴＧＦ−β１メッセンジャーＲＮＡの発現抑制効果を検討した。
細胞はサブコンフルエントの状態で無血清培地に交換して２４時間培養し、１ｘ１０−６ＭのＰＭＡと各濃度のＰｙ−Ｉｍを加えてさらに１２時間無血清で培養した。細胞はguanidium thiocyanate法にてメッセンジャーＲＮＡを分離し、avian myeloblastoma virus reverse transcriptaseにより逆転写を行い、ＰＣＲ法にて増幅した。ＰＣＲ産物はAgilent Bioanalyzerにより定量した。ＴＧＦβ１遺伝子、１８Ｓ  ｒＲＮＡに対する特異的プライマーを作成してＰＣＲを行い、ＴＧＦβ１遺伝子発現量は１８ｓにて補正した。
ＴＧＦβ１遺伝子発現量は１ｘ１０−６ＭのＰＭＡ刺激により２０％増加し、ＧＢＰ１１０５添加により１ｘ１０−６Ｍで最大５０％以下に抑制された（図４）。
【００５２】
（３）  ＧＢＰ１１０６によるＴＧＦ−β１メッセンジャーＲＮＡの発現抑制効果
腎臓由来の培養ヒトメサンギウム細胞を培養し、１ｘ１０−６ＭのＰＭＡ（12‐O‐tetradecanoylpholbol‐13‐acetate）を添加して刺激し、Ｐｙ−Ｉｍ（ＧＢＰ１１０６）を加えてそのＴＧＦ−β１メッセンジャーＲＮＡの発現抑制効果を検討した。
細胞はサブコンフルエントの状態で無血清培地に交換して２４時間培養し、１ｘ１０−６ＭのＰＭＡと各濃度のＰｙ−Ｉｍを加えてさらに１２時間無血清で培養した。細胞はguanidium thiocyanate法にてメッセンジャーＲＮＡを分離し、avian myeloblastoma virus reverse transcriptaseにより逆転写を行い、ＰＣＲ法にて増幅した。ＰＣＲ産物はAgilent Bioanalyzerにより定量した。ＴＧＦβ１遺伝子、１８Ｓ  ｒＲＮＡに対する特異的プライマーを作成してＰＣＲを行い、ＴＧＦβ１遺伝子発現量は１８ｓにて補正した。
ＴＧＦβ１遺伝子発現量は１ｘ１０−６ＭのＰＭＡ刺激により２０％増加し、ＧＢＰ１１０６添加により１ｘ１０−６Ｍで最大５０％以下に抑制された（図５）。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明のＴＧＦ−β遺伝子発現抑制剤はＴＧＦ−βの産生が関与する疾病の治療薬として利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ヒトＴＧＦ−β１遺伝子の調節領域の塩基配列を示す。
【図２】本発明のピロールイミダゾールポリアミドＧＢＰ１１０５及びＧＢＰ１１０６のＲＰ−ＨＰＬＣチャート（ａ）及び（ｂ）をそれぞれ示す。
【図３】Ｐｙ−Ｉｍポリアミド−オリゴヌクレオチド錯体のゲルシフトアッセイを示す。
【図４】ＧＢＰ１１０５によるＴＧＦ−β１メッセンジャーＲＮＡの発現抑制効果を示すグラフである。
【図５】ＧＢＰ１１０６によるＴＧＦ−β１メッセンジャーＲＮＡの発現抑制効果を示すグラフである。
【配列表フリーテキスト】
【００５５】
配列番号７  センスプライマー
配列番号８  アンチセンスプライマー
配列番号９  センスプライマー
配列番号１０  アンチセンスプライマー
【図２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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