(57)【要約】本発明は、生物学的分子間の多数の相互作用を同時に調べることを容易にするアレイ・システムを提供する。本発明の生体分子アレイは柔軟かつ汎用性のあるツールであり、生物学の研究者が細胞タンパク質の相互作用をハイスループットで調べることを可能にする。本発明のいくつかの実施態様では、生化学経路を分析するため、固定化された生体分子のアレイを形成するステップと、このアレイを溶液中の生体分子に曝露するステップと、固定化された生体分子の修飾を検出するステップ、および／または溶液中の生体分子の修飾を検出するステップ、および／または溶液中の生体分子が固定化された生体分子に結合したことを検出するステップとを含む方法と、そのためのアレイが提供される。
2004522935.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生化学経路を分析するための方法であって、
ａ）固定化された生体分子のアレイを形成するステップと；
ｂ）当該アレイを溶液中の生体分子に曝露するステップと；
ｃ）固定化された上記生体分子の修飾を検出するステップを含む方法において、
固定化された上記生体分子および／または溶液中の上記生体分子が、少なくとも１つの生化学経路の少なくとも２つの要素を含む方法。
【請求項２】
上記アレイが、少なくとも２つの異なったタイプの固定化された生体分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
溶液中の上記生体分子が、少なくとも２つの異なったタイプの生体分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記修飾に基づき、溶液中の少なくとも１つの生体分子の存在を検出するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記修飾に基づき、溶液中の少なくとも１つの生体分子の機能を同定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
上記修飾に基づき、溶液中の少なくとも１つの生体分子の存在量を定量するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
上記修飾に基づき、溶液中の少なくとも１つの生体分子の活性レベルを定性的および／または定量的に明らかにするステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
上記修飾に基づき、固定化された少なくとも１つの生体分子の活性レベルを定性的および／または定量的に明らかにするステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
上記修飾に基づき、固定化された少なくとも１つの生体分子の存在を検出するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
上記修飾に基づき、固定化された少なくとも１つの生体分子の機能を同定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
上記修飾に基づき、固定化された少なくとも１つの生体分子の存在量を定量するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
生化学経路を分析するための方法であって、
ａ）固定化された生体分子のアレイを形成するステップと；
ｂ）当該アレイを溶液中の生体分子に曝露するステップと；
ｃ）溶液中の上記生体分子の修飾を検出するステップを含む方法において、
固定化された上記生体分子および／または溶液中の上記生体分子が、少なくとも１つの生化学経路の少なくとも２つの要素を含む方法。
【請求項１３】
上記アレイが、少なくとも２つの異なったタイプの固定化された生体分子を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
溶液中の上記生体分子が、少なくとも２つの異なったタイプの生体分子を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
上記修飾に基づき、溶液中の少なくとも１つの生体分子の存在を検出するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
上記修飾に基づき、溶液中の少なくとも１つの生体分子の機能を同定するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
上記修飾に基づき、溶液中の少なくとも１つの生体分子の存在量を定量するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
上記修飾に基づき、溶液中の少なくとも１つの生体分子の活性レベルを定性的および／または定量的に明らかにするステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
上記修飾に基づき、固定化された少なくとも１つの生体分子の活性レベルを定性的および／または定量的に明らかにするステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
上記修飾に基づき、固定化された少なくとも１つの生体分子の存在を検出するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
上記修飾に基づき、固定化された少なくとも１つの生体分子の機能を同定するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
上記修飾に基づき、固定化された少なくとも１つの生体分子の存在量を定量するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
生化学経路を分析するための方法であって、
ａ）固定化された生体分子のアレイを形成するステップと；
ｂ）当該アレイを溶液中の生体分子に曝露するステップと；
ｃ）溶液中の上記生体分子が固定化された上記生体分子に結合したことを検出するステップを含む方法において、
固定化された上記生体分子および／または溶液中の上記生体分子が、少なくとも１つの生化学経路の少なくとも２つの要素を含む方法。
【請求項２４】
上記アレイが、少なくとも２つの異なったタイプの固定化された生体分子を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
溶液中の上記生体分子が、少なくとも２つの異なったタイプの生体分子を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
上記結合に基づき、溶液中の少なくとも１つの生体分子の存在を検出するステップをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
上記結合に基づき、溶液中の少なくとも１つの生体分子の、固定化された少なくとも１つの生体分子に対するアフィニティおよび／またはアビディティを同定するステップをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
上記結合に基づき、固定化された少なくとも１つの生体分子の、溶液中の少なくとも１つの生体分子に対するアフィニティおよび／またはアビディティを同定するステップをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
上記結合に基づき、溶液中の少なくとも１つの生体分子の存在量を定量するステップをさら含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
上記結合に基づき、固定化された少なくとも１つの生体分子の存在を検出するステップをさら含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
上記結合に基づき、固定化された少なくとも１つの生体分子の存在量を定量するステップをさら含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
固定化された生体分子のアレイであって、固定化されたこれら生体分子が、少なくとも１つの生化学経路の少なくとも２つの要素を含むアレイ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
ほとんどすべての生物活性は、細胞内におけるタンパク質同士の相互作用によって調節されている。タンパク質は、細胞の触媒であり、運動変換器であり、シグナル伝達体である。タンパク質は、細胞分裂、細胞増殖、細胞分化、細胞死を制御し、環境に対する細胞の応答を伝達する。したがって細胞プロセスを理解するためには、タンパク質の活動を観察し、細胞内におけるタンパク質同士の相互作用ネットワークを明らかにする必要がある。
【０００２】
研究者は、ヒトゲノムから３００，０００種類以上のタンパク質が翻訳されると考えている。生物学者は、長年にわたってこれらタンパク質同士の相互作用を理解しようと努力してきた。ポストゲノム時代においてこれらタンパク質すべてについての青写真が利用可能になったとき、生物学者は、原則として、より多くのタンパク質とその相互作用を研究できるようになるであろう。
【０００３】
かつては、生物学者が利用できるツールを用いた場合、こうした相互作用のうちの１つだけしか一度に研究することができなかった。というのも、タンパク質の多数の相互作用を観察できる分析ツールがなかったからである。タンパク質の相互作用を大量かつ並列に分析することが可能なシステムは非常に大きな価値があり、生物学における発見を加速することであろう。
【０００４】
細胞のシグナル伝達が分子レベルで理解できると、病気に関する見通しが大いによくなるであろう。このようなことがわかると、より効果的な診断ツールと、医薬品を開発するためのより合理的な方法が得られることになろう。生物学を分子レベルで理解するための出発点は、いくつかの生物についてあらゆる遺伝子を同定してその配列を明らかにすることであり、この方法はゲノミクスとして知られている。例えばヒトゲノム計画により、全部で１００，０００個あるヒトの遺伝子の配列が得られた。こうした配列決定の努力によって得られた大量の分子情報から、機能的ゲノミクスという分野が生まれている。
【０００５】
機能的ゲノミクスは、細胞の状態の違い（例えば病気の状態と病気でない状態）をメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のレベルにおける違いと関連づける。この方法により、多数の遺伝子相互間の機能的関係を明らかにすることができた。機能的ゲノミクスにおけるおそらく最も成功したツールは、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）アレイであろう。このアレイは、アフィメトリックス社、インサイト・ジェノミクス社、ジーン・ロジック社、ナノジェン社、アジレント社といった会社が市販している。
【０００６】
しかし機能的ゲノミクスは、ゲノム配列を利用して生物学を理解するための第一歩にすぎない。機能的ゲノミクスによって興味の対象である遺伝子を同定できるとはいえ、分子レベルの情報や、タンパク質が互いにどのように相互作用して細胞の振る舞いや生理を制御しているかは、機能的ゲノミクスからはわからない。例えば転写されたｍＲＮＡのレベルは、細胞内のタンパク質の量や性質を評価するための信頼できる指標ではない。ｍＲＮＡのレベルとタンパク質のレベルがこのように相関していないことには多くの原因がある。原因としては、例えば、選択的スプライシングなどによって１つの遺伝子から２つ以上のタンパク質が発現すること、タンパク質が翻訳後に修飾されること（例えばリン酸化、メチル化、アセチル化、脂質化、ファルネシル化、グリコシル化など）が挙げられる。さらに、ゲノミクスによってタンパク質同士の相互作用に関する直接的な情報を得ることはできない。このような直接的な情報の欠如は、翻訳後修飾に大きく支配されるシグナル伝達経路の分野において特に顕著である。
【０００７】
機能的プロテオミクスは新たに発展中の分野であり、細胞の状態の違いが発現したタンパク質のレベルの違いと直接関係している。プロテオミクス分析で現在利用されている方法（２Ｄ電気泳動（２ＤＥ）と質量分析）は、ハイスループット用に最適化されてはいない。また、これらの方法は、膜貫通タンパク質での利用には適しておらず、実施することが技術的に難しく、少量のタンパク質（例えばシグナル伝達経路のタンパク質）を検出する能力が限られているという限界も有する。機能的プロテオミクスを利用する際の１つの制約は、タンパク質とその相互作用を検出できる汎用性と柔軟性のある技術（例えばｃＤＮＡアレイ）が現在のところ利用できないことである。
【０００８】
タンパク質アレイは、生物学の研究者がハイスループットのアッセイを行なう際に使用する一般的なツールである。タンパク質アレイは、既知の生体分子がパターニングされたアレイであり、溶液中の複雑なタンパク質混合物の中から特定のタンパク質を分子レベルで認識することができる。タンパク質アレイに関してさまざまなアイディアが提案されている。最も一般的なものはモノクローナル抗体のアレイで構成されており、ｃＤＮＡアレイがｍＲＮＡを捕捉するのと同様の方法でモノクローナル抗体が特定のタンパク質と結合する。これ以外には、タンパク質と結合する化学物質のアレイを用いる方法がある。これらアレイを利用してタンパク質が単離されてきたが、タンパク質同士の相互作用を観察するのに有効なアレイ・システムはまだ存在していない。
【０００９】
そのため、タンパク質間相互作用を十分にハイスループットで研究するための柔軟で汎用性のあるツールとなるアレイ・システムが必要とされている。
【００１０】
発明のまとめ
本発明は、生体分子間の多数の相互作用を同時に観察することを容易にするアレイ・システムを提供する。本発明の生体分子アレイは柔軟で汎用性のあるツールであり、生物学の研究者は、このアレイを用いると、細胞内のタンパク質の相互作用をハイスループットで調べることが可能になろう。
【００１１】
いくつかの実施態様では、これらシステムを、医薬品その他の物質が１つまたは複数の生体分子に与える効果を調べるのに適した形態にする。いくつかの実施態様では、医薬品その他の物質が１つまたは複数の経路の１つまたは複数の生体分子に与える効果を分析する。このような実施態様では、生体分子および／または経路は既知でも未知でもよく、またその特性がわかっていてもわかっていなくてもよい。同様に、医薬品その他の物質は同定されていてもいなくてもよく、その特性がわかっていてもわかっていなくてもよい。
【００１２】
一実施態様では、これらシステムを、シグナル伝達経路と、酵素を媒介とした翻訳後修飾によって支配されるその他の生体プロセスを明らかにするのに適した形態にする。いくつかの実施態様では、本発明のアレイ・システムを、アレイの性能がハイスループットになるようにする。本発明のアレイ・システムの製造方法と使用方法が提供される。
【００１３】
この明細書では、“生物学的分子”と“生体分子”という用語は、同じ意味で使用することができる。これらの用語は意味が広く、一般に、生物系によって産生される有機分子またはそれ以外の生物学的分子や、生物系と接触させたときにその生物系に影響を与えたりその生物系を変化させたりすることのできる有機分子や、他の生物学的分子を修飾したり他の生物学的分子と結合したりできる有機分子がこれらの用語に含まれる。同様に、“生物系”も意味を広く考えるべきであり、例えば、有機体、有機系、器官、組織、細胞、インビトロで相互作用する生物学的分子がこの用語に含まれる。“生体分子”という用語には、生物系によって産生される無機分子またはそれ以外の生物学的分子や、生物系と接触させたときにその生物系に影響を与えたりその生物系を変化させたりすることのできる無機分子や、他の生物学的分子を修飾したり他の生物学的分子と結合したりできる無機分子も含まれる。この明細書で用いる“生体分子”には、例えば、無機ビタミン、ミネラル、毒素、医薬品、補因子を含めることができる。
【００１４】
生体分子の具体例として、オリゴ糖、多糖、オリゴペプチド、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドなどが挙げられる。オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドとしては、例えばＤＮＡやＲＮＡが挙げられる。生体分子には、有機化合物、有機金属化合物、有機化合物および有機金属化合物の塩、糖、アミノ酸、ヌクレオチド、脂質、炭水化物、医薬品、毒素、毒液、ステロイド、レクチン、ビタミン、ミネラル、代謝物、補因子、補酵素も含まれる。この明細書で使用する“医薬品”という用語は意味を広く解釈すべきであり、例えば、効果と安全性が確認されている医薬品や、生体分子のライブラリからランダムに取り出された医薬品候補や、両者の中間にある研究段階の医薬品が挙げられる。
【００１５】
生体分子としてはさらに、上記分子の誘導体が挙げられる。生体分子の誘導体としては、例えば、オリゴペプチド、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質の脂質誘導体およびグリコシル化誘導体が挙げられる。生体分子の誘導体に関するさらに別の具体例としては、オリゴ糖および多糖の脂質誘導体（例えばリポ多糖）が挙げられる。
【００１６】
生体分子は、同じと見なす基準の違いによってグループまたはクラスに分けて考えることができる。例えばタンパク質と脂質は生体分子の２つの異なるクラスであると考えることができる。さらに厳密に考えると、酵素と構造タンパク質は、タンパク質の異なる２つのクラスの実例である。さらに厳密に考えると、ペプチダーゼとキナーゼは酵素の異なる２つのクラスの実例である。この明細書では、このようにさまざまにグループ化したものを生体分子のクラスと呼ぶ。この明細書では、生体分子の“タイプ”とは、特定の１つの生体分子のことを指す。例えばプロテインキナーゼＡは、生体分子の１つのタイプである。同様に、プロテインキナーゼＣは、別のタイプの生体分子である。本発明のアレイは、１つ以上のタイプの生体分子を含むことができ、タイプの異なる生体分子は、同じクラスに属する生体分子からのものでも異なるクラスに属する生体分子からのものでもよい。
【００１７】
いくつかの実施態様では、本発明のアレイ・システムは、表面に固定化された生体分子を含んでいる。いくつかの実施態様では、生体分子の結合を容易にするために表面を活性化させたり、適合させたり、調整したり、修飾したりすることができる。
【００１８】
この明細書では、“アレイ”という用語は、一般に、結合アイランドまたは生体分子が所定の空間的配置にされたものを指す。表面に固定化された生体分子を含む本発明のアレイ・システムは、“生体分子アレイ”と呼ぶこともできる。生体分子が表面に結合するのを容易にするために活性化させたり、適合させたり、調節したり、修飾したりした表面を含む本発明のアレイは、“結合アレイ”と呼ぶこともできる。さらに、この明細書で用いる“アレイ”という用語は、表面に配置された複数アレイを指すのに用いることもできる。例えば、１つのアレイをコピーしたものが表面に複数あるような場合である。複数のアレイを有するこのような表面は、“複数アレイ”または“繰り返しアレイ”と呼ぶこともできる。この明細書で用いる“アレイ”という用語には、生体分子アレイ、結合アレイ、複数アレイ、およびこれらの任意の組み合わせが含まれ、意味としてそのどれが適切であるかは、文脈から明らかになろう。
【００１９】
本発明において有効な表面は、任意の形状およびサイズにすることができる。表面の具体例としては、チップ、連続表面、湾曲した表面、可撓性のある表面、フィルム、プレート、シート、チューブなどが挙げられる。表面は、面積が約１μｍ２〜約５００ｃｍ２であることが好ましい。本発明による表面の面積、長さ、幅は、実施するアッセイにおける条件に応じて変えることができる。考慮すべき事項として、例えば、取り扱いやすさ、表面を形成する材料の制約、検出システムの条件、堆積システムの条件（例えばアレイ形成装置）などが挙げられる。いくつかの実施態様では、表面の面積が約１０６ｃｍ２である。いくつかの実施態様では、表面の長さと幅が、標準的な９６（または３８４、１５３６、３４５６）ウエルのプレートと同様になっている。
【００２０】
本発明において有効な表面は、適切な任意の厚さにすることができる。本発明による表面の厚さは、実施するアッセイにおける条件に応じて変えることができる。考慮すべき事項として、例えば、取り扱いやすさ、表面を形成する材料の制約、検出システムの条件、堆積システムの条件（例えばアレイ形成装置）などが挙げられる。例えば検出にＳＰＲを用いる場合には、表面は一般に３０ｎｍ以下の厚さであることが好ましい。蛍光プレート読み取り装置を用いて読み取る表面はこれよりも厚くすることができ、厚さを例えば約１ｃｍにする。一般に、表面は厚さを約５０μｍ〜約２ｃｍにすることができる。
【００２１】
いくつかの実施態様では、結合アイランドまたは固定化された生体分子のグループまたはアレイを分離する物理的手段を用いることが望ましい。このような物理的分離により、異なるグループまたはアレイを、興味の対象であるさまざまな溶液に曝露することが容易になる。したがっていくつかの実施態様では、アレイを、９６、３８４、１５３６、３４５６個のマイクロウエルを有するプレートのウエルの中に配置する。このような実施態様では、ウエルの底部をアレイ形成用の表面として用いるか、あるいはアレイを別の表面に形成した後、ウエルの中に配置することができる。ウエルのない表面を用いるいくつかの実施態様では、表面に結合アイランドを形成するか、あるいは表面に生体分子を固定化し、これらアイランドまたは生体分子に対応する穴を設けたガスケットをその表面に配置することができる。このようなガスケットは、液体を漏らさないことが好ましい。ガスケットは、アレイ形成プロセスの任意のときに表面に配置し、グループまたはアレイを分離する必要がもはやなくなったときに除去することができる。例えば、「ポリマーゲル接触マスク、およびこのマスクを製造するための方法と鋳型」という名称のアメリカ合衆国特許出願番号第０９／７０５，１８７号を参照のこと。
【００２２】
いくつかの実施態様では、生体分子を別々の領域に固定化する。これら別々の領域は、生体分子が実質的に結合していない領域に囲まれていることが好ましい。別のいくつかの実施態様では、表面を適合させたり、調整したり、修飾したりすることにより、生体分子をこの表面の別々の領域に結合しやすくすることができる。この明細書では、生体分子の結合を容易にするために修飾する領域を“結合アイランド”または“結合領域”と呼ぶことができる。結合領域は、生体分子と結合しない領域または生体分子と結合しにくい領域によって囲まれるか、あるいは互いに分離されていることが好ましい。
【００２３】
いくつかの実施態様では、固定化された生体分子は、その固定化された生体分子の上に来る溶液からの生体分子と結合する。別の実施態様では、固定化された生体分子は、その固定化された生体分子の上に来る溶液中の生体分子を修飾するか、あるいはその溶液中の生体分子によって修飾される。別の実施態様では、本発明のアレイ・システムは、細胞内で起こるシグナル伝達プロセスを模倣する。さらに別の実施態様では、本発明のアレイ・システムは、シグナル伝達経路に関与する酵素（例えばキナーゼが挙げられるが、それだけに限定されるわけではない）の活性を調べるのに適した形態にする。さらに別の実施態様では、本発明のアレイ・システムは、溶液中の生体分子が、特定のクラスに属する生体分子の多数の要素と相互作用するのを調べるのに適した形態にする。いくつかの実施態様では、本発明のアレイ・システムは、従来のタンパク質チップよりも多くの生化学情報を提供する。
【００２４】
本発明のいくつかの実施態様では、生体分子を１つまたは複数の表面に固定化してアレイを形成する。生体分子は、その生体分子と結合することが可能な介在分子を用いて表面に固定化することができる。この明細書では、この介在分子は、“アフィニティ分子”と呼ぶこともできる。このような介在分子を表面に結合させるか、あるいは表面上に層にし、生体分子をこの介在分子に対して固定化する。介在分子を介して表面に固定化された生体分子は、“表面に固定化された生体分子”という表現に含まれる。同様に、表面への生体分子の固定化とは、表面への直接的固定化、あるいは介在分子を用いた固定化のことを意味し、意味としてそのどれが適切であるかは、文脈から明らかになろう。
【００２５】
１つ以上のタイプまたはクラスの生体分子を単一の表面に固定化することができる。いくつかの実施態様では、多数の異なる（例えば１０００の）タイプまたはクラスの生体分子を固定化する。別の実施態様では、より少数（例えば１００）のタイプまたはクラスの生体分子を固定化する。別の実施態様では、さらに少数（例えば１００以下）のタイプまたはクラスの生体分子を固定化する。さらに別の実施態様では、これよりもさらに少数（例えば１〜９９）のタイプまたはクラスの生体分子を固定化する。本発明の特定のアレイに固定化する生体分子のクラスまたはタイプの数は、実施するアッセイ、生体分子のサイズ、生体分子間の望ましい距離などの因子に基づいて選択することができる。
【００２６】
本発明のいくつかの実施態様では、生体分子が表面に容易に結合できるよう、その表面を修飾したり、適合させたり、調節したりする。このような調節には、他の分子と結合できる分子を表面に固定化したりその表面上に層にしたりする操作が含まれる。この明細書では、他の分子と結合できる分子は、“アフィニティ分子”と呼ぶことができる。アフィニティ分子としては、生体分子と結合できる分子や、生体分子に結合した特定の結合基と結合できる分子が挙げられる。このような結合基は、適切な任意の手段を通じて生体分子に結合させることができる。例えば、生体分子に元々存在している部分を結合基として利用したり、化学的に結合基を結合させたり、組み換えＤＮＡ技術を利用してそのような結合基を有する生体分子を製造したり、病気の進行プロセスにおいて結合基を生体分子と結合させたり、環境ストレス、医薬品、毒素などに曝露して結合基を生体分子と結合させたりする。アフィニティ分子は、生体分子全般と結合させること、あるいは１つ以上のクラスの生体分子または結合基に対して特異的になるようにすることが可能である。アフィニティ分子としては、さらに特異的なものも可能である。すなわち、アフィニティ分子は、ほんのいくつかのタイプまたは１つのタイプの生体分子または結合基とだけ結合するようにできる。
【００２７】
表面を調節して単一の表面に１つ以上のタイプまたはクラスの生体分子が固定化されるようにすることができる。いくつかの実施態様では、表面を調節して、多数の異なる（例えば１０００の）タイプまたはクラスの生体分子をその表面に固定化することができる。別の実施態様では、表面を調節して、より少数（例えば１００）のタイプまたはクラスの生体分子をその表面に固定化することができる。別の実施態様では、表面を調節して、さらに少数（例えば１００以下）のタイプまたはクラスの生体分子をその表面に固定化することができる。さらに別の実施態様では、表面を調節して、これよりもさらに少数（例えば１〜９９）のタイプまたはクラスの生体分子をその表面に固定化することができる。本発明の特別なアレイを製造するための生体分子のクラスまたはタイプの数は、実施するアッセイ、生体分子のサイズ、生体分子間の望ましい距離などの因子に基づいて選択することができる。
【００２８】
いくつかの実施態様では、生体分子をパターンまたはアレイにして表面に固定化する。別の実施態様では、生体分子がパターンまたはアレイとして固定化されるように表面を修飾したり、適合させたり、調節したりする。
【００２９】
いくつかの実施態様では、生体分子の性質ができるだけ変化しないような方法と材料を用いて、あるいは生体分子とその生体分子を固定化する表面の間の相互作用が最小になる方法と材料を用いて、生体分子を固定化する。このようないくつかの実施態様では、固定化は、表面に１つ以上の自己集合単分子膜（ＳＡＭ）を形成し、そのＳＡＭのいくつかまたはすべての上に生体分子を固定化することによって実現される。
【００３０】
固定化される生体分子は、興味ある任意の供給源に由来するものが可能である。いくつかの実施態様では、固定化される生体分子は、細胞培養物の上清であるか、あるいはその上清に由来するものである。培養物中の細胞は、興味ある任意の供給源に由来するものが可能である。別のいくつかの実施態様では、固定化される生体分子は、細胞ライセートであるか、あるいはその細胞ライセートに由来するものである。細胞ライセートは、興味ある任意の供給源に由来するものが可能である。そのような供給源の具体例としては、培養物中の細胞、不死化した細胞系、生体または死体から直接に採取した細胞、組織、器官などが挙げられる。別の実施態様では、固定化される生体分子は、生体または死体から採取した体液であるか、あるいはその体液に由来するものである。そのような体液の具体例としては、血液、涙、唾液、胃腸液、羊水、骨髄、血漿、リンパ液、細胞外液、体液（ｓａｐ）、脳脊髄液、尿などが挙げられる。この明細書では、このような体液を“生理的体液”と呼ぶことができる。さらに別の実施態様では、固定化される生体分子は、タンパク質またはペプチドまたはそれ以外のライブラリであるか、あるいはそのライブラリに由来するものである。いくつかの実施態様では、固定化される生体分子として、医薬品または医薬品候補が挙げられる。興味の対象となる生体分子以外の生体分子を含むサンプルは、分画することによって興味の対象ではない生体分子を減らすか除去するかした後、本発明の結合アイランドに付着させる。しかし本発明のいくつかの実施態様では、このような分画化は不要である。というのも、結合アイランドが所定のタイプまたはクラスの生体分子に対して特異性を示すからである。
【００３１】
多くの実施態様では、固定化された生体分子または固定化される生体分子は、タンパク質である。１つ以上のタイプのタンパク質を表面に固定化することができる。いくつかの実施態様では、タンパク質の固定化を、そのタンパク質ができるだけ変性しないような方法と材料を用いて、あるいはそのタンパク質の活性ができるだけ変化しないような方法と材料を用いて、あるいはそのタンパク質とそのタンパク質が固定化される表面の間の相互作用が最小になるような方法と材料を用いて行なう。いくつかの実施態様では、これら生体分子は、シグナル伝達において重要な経路に関与するタンパク質である。
【００３２】
固定化された生体分子を有する表面は、表面に固定化されたこれら生体分子と結合したり、これら生体分子を修飾したり、これら生体分子によって修飾されたりする生体分子を含む溶液に曝露することができる。このような溶液は、“興味の対象となる溶液”と呼ぶことができる。いくつかの実施態様では、興味の対象である１つ以上のタイプまたはクラスの生体分子を溶液中に分散させる。いくつかの実施態様では、その溶液は、細胞培養物の上清であるか、あるいはその上清に由来するものである。培養物中の細胞は、興味ある任意の供給源に由来するものが可能である。いくつかの実施態様では、溶液は、細胞ライセートであるか、あるいはその細胞ライセートに由来するものである。細胞ライセートは、興味ある任意の供給源に由来するものが可能である。そのような供給源の具体例としては、培養物中の細胞、不死化した細胞系、生体または死体から直接に採取した細胞、組織、器官などが挙げられる。別の実施態様では、溶液は、生体または死体から採取した体液であるか、あるいはその体液に由来するものである。そのような体液の具体例としては、血液、涙、唾液、胃腸液、羊水、骨髄、血漿、リンパ液、細胞外液、体液、脳脊髄液、尿などが挙げられる。この明細書では、このような体液を“生理的体液”と呼ぶことができる。さらに別の実施態様では、溶液は、タンパク質またはペプチドまたはそれ以外のライブラリであるか、あるいはそのライブラリに由来するものである。いくつかの実施態様では、本発明のアレイを曝露する溶液は、医薬品または医薬品候補を含んでいる。
【００３３】
いくつかの実施態様では、固定化された生体分子および／または溶液中の生体分子は、生化学経路の要素である生体分子を含んでいる。生化学経路（この明細書では単に“経路”と呼ぶことができる）は、細胞が刺激を伝達するのに用いる時系列になった一連のプロセスまたは反応を含んでいる。このような刺激としては、例えば細胞の内部に伝達される外部刺激が挙げられる。このような刺激の別の例として、核の内部に伝達される細胞質ゾルへの刺激などが挙げられる。一般に、上記プロセスまたは反応のそれぞれには、２つ以上の生体分子の間で起こる一連の相互作用が含まれる。例えば１つの生体分子が別の生体分子を修飾し、修飾された生体分子が例えば活性化または不活性化される。所定の経路に関与する生体分子は、その経路の“要素”と呼ぶことができる。
【００３４】
この明細書で固定化された生体分子と興味の対象である溶液の間の相互作用に言及する場合には、その相互作用が、溶液中の生体分子と固定化された生体分子の間の相互作用であることに注意されたい。この明細書で生体分子同士の相互作用の検出に言及する場合には、生体分子相互の結合の検出、あるいは相互作用する１つ以上の生体分子に対する修飾の検出であることに注意されたい。この明細書では、生体分子間の“相互作用”という用語は、１つ以上の生体分子を結合させることと、その相互作用の結果として１つ以上の生体分子が修飾されることを簡潔に表現するために用いる。修飾の具体例としては、化学的修飾、構造的修飾、物理的修飾などが挙げられる。さらに、この明細書では、固定化された生体分子を興味の対象である溶液に曝露することと、興味の対象である溶液を固定化された生体分子に曝露することについて言及している。この２つは、固定化された生体分子と興味の対象である溶液を互いに接触させるという１つの概念を単に異なる方法で表わしたものである。ただし、これとは明らかに異なる記載をした場合は別である。
【００３５】
この明細書では、“溶液”という用語に、媒体のうち、その媒体中で、本発明の表面に固定化された生体分子に対して所定の位置に固定された基質に分子が結合していないすべての媒体が含まれる。そのような溶液の具体例として、液体、乳液、懸濁液、ゲル、泡などが挙げられる。
【００３６】
本発明のアレイを用いて研究することのできるタンパク質、他の生体分子、細胞系、細胞、生理的体液、ライブラリは、動物、植物、藻類、菌類、細菌、ウイルス、原生動物、興味の対象となる他の任意の生命形態などが含まれる供給源に由来するものが可能である。本発明のアレイは、化学的合成、酵素による合成、組み換えヌクレオチド技術、これ以外のインビトロ法によって産生されるタンパク質その他の生体分子を研究するのにも有効である。溶液が、体液、培養物の上清、ライブラリ、細胞ライセートであるか、あるいはこれらに由来する実施態様では、溶液として、ライブラリ全体、変質していない細胞ライセート、培養物の上清、体液が可能である。あるいはライブラリ、ライセート、上清、体液に対して他の分離法、分画法、特性決定法を適用し、アレイを曝露する溶液を製造する。
【００３７】
いくつかの実施態様では、細胞を興味の対象である医薬品または医薬品候補で処理した後、細胞を溶解させて本発明のアレイを細胞ライセートに曝露する。別の実施態様では、本発明のアレイと一体化したミニチュアの微小流体システムの中で細胞を培養する。次に、このようにして培養した細胞から放出された産物および／またはこの細胞のライセートを、細胞培養システムと一体化したアレイで分析する。細胞を培養し、溶解させ、アレイに曝露するとき、細胞を移動させる必要がない。
【００３８】
溶液中の生体分子と固定化された生体分子の間の結合、および／または溶液中の生体分子の修飾、および／または固定化された生体分子の修飾を、従来の検出技術を利用して検出する。いくつかの実施態様では、特定の修飾基を有する生体分子と反応するが、修飾されていない生体分子または別の修飾基を有する生体分子とは反応しない抗体を用い、特定の修飾基を検出する。１つ以上の異なる抗体が、対応する特異的標的と結合するのを評価することができる。２つ以上の抗体との結合を単一のアッセイで評価する実施態様では、異なる抗体に別々の標識を付けることができる。しかし抗体は、その抗体が結合する固定化された生体分子の位置に基づいて識別することもできるため、異なる標識は不要である。抗体に標識を付ける方法は、従来技術において周知である。興味の対象である分子と結合する一次抗体と、標識が付けてあって一次抗体と結合する二次抗体を利用することは、本発明を実施する上で有効な検出技術の一例である。具体例を挙げるならば、抗体は、放射性標識すること、あるいは蛍光タグで標識することなどが可能である。別の実施態様では、質量分析を利用して修飾された生体分子と修飾されていない生体分子を区別する。さらに別の実施態様では、表面プラズモン共鳴を利用して修飾された生体分子と修飾されていない生体分子を区別する。他の検出システムも従来技術で知られている。
【００３９】
本発明のアレイ・システムを用いて分子間の相互作用を明らかにすることができる。例えば本発明の方法とアレイを利用して酵素が生体分子に及ぼす効果を明らかにすることができる。また、本発明の方法とアレイを利用して酵素の阻害剤を同定すること、および／または酵素の阻害剤のキャラクテリゼーションを行なうことも可能である。さらに特別な実施例では、溶液中の生体分子とアレイに固定化された生体分子をうまく選択することによってシステムがシグナル伝達経路を再現し、酵素（例えばキナーゼ）、酵素の基質、酵素の阻害剤、これ以外の興味ある分子についてキャラクテリゼーションを容易に行なえるようにすることができる。別の実施例として、本発明の方法とアレイを利用すると、生体分子（例えば医薬品や毒素）が、有機体、器官、組織、細胞、経路、個々の生体分子に及ぼす効果を明らかにすることができる。さらに別の実施例として、本発明の方法とアレイを利用すると、医薬品間相互作用を明らかにすることができる。
【００４０】
この明細書でさらに詳しく説明することだが、本発明のアレイ・システムは、多数の相互作用を単一のアッセイでテストできるため、ハイスループット用である。同様に、本発明のアレイ・システムにより、異なる経路を同時に研究することが容易になる。本発明のアレイは、互いに関係のある経路や重なり合った経路を同時に研究するのに特に有効である。いくつかの実施態様では、本発明のアレイにより、互いに関係のない経路を同時に研究することが容易になる。一例として、１つの経路からの生体分子を１つの表面に配置し、別の経路からの生体分子を同じ表面の別の部分に配置した後、その表面を例えば細胞ライセートに曝露することができる。このようにすると、２つの異なる経路を表わす生体分子を同時に１つの細胞ライセートに曝露することができる。
【００４１】
結合アイランドまたは結合領域を含むアレイをキットに含めることができる。このようなキットが本発明の別の実施態様になる。このようなキットは、本発明によるアレイの結合アイランドまたは結合領域に固定化するための生体分子を調製するのに役立つ試薬や、固定化された生体分子に対する修飾を検出するのに役立つ試薬や、固定化された生体分子に興味の対象である溶液からの生体分子が結合したことを検出するのに役立つ試薬なども含むことができる。
【００４２】
同様に、固定化された生体分子を含むアレイをキットに含めることができる。このようなキットが本発明のさらに別の実施態様になる。このようなキットは、固定化された生体分子の修飾を検出するのに役立つ試薬や、固定化された生体分子に興味の対象である溶液からの生体分子が結合したことを検出するのに役立つ試薬も含むことができる。
【００４３】
詳細な説明
本発明のいくつかの実施態様では、生体分子を表面に固定化する。生体分子は、パターンまたはアレイとなるように固定化することが好ましい。好ましい実施態様では、固定化された生体分子をあるパターンに配置するが、そのとき、生体分子の個々の独立したスポットまたはアイランドが、実質的に生体分子が表面に固定化されていない領域に囲まれるようにする。別の実施態様では、生体分子が表面に固定化された個々の独立したアイランドを、異なる生体分子が表面に固定化された領域に直接隣り合うようにすることができる。
【００４４】
生体分子の固定化を容易にするために修飾したり、適合させたり、調節したりしてあるが、まだ生体分子を固定化していない表面は、本発明の別の実施態様になる。このようにして準備した表面は、固定化された生体分子を有する表面を製造する際の中間段階にすることもできる。表面は、生体分子がその上に固定化されてパターンまたはアレイを形成するようにすることが好ましい。好ましい実施態様では、表面は、固定化された生体分子があるパターンに配置されるようにするが、そのとき、生体分子の個々の独立したスポットまたはアイランドが、実質的に生体分子が表面に固定化されていない領域に囲まれるようにする。別の実施態様では、表面は、興味の対象である生体分子をその上に固定化した後に、その表面が、生体分子がその上に固定化された個々の独立したアイランドを含み、そのアイランドが、異なる生体分子が表面に固定化された領域に直接隣り合うようになっているようにする。
【００４５】
この明細書では、生体分子を結合させることのできるアイランドまたは領域を“結合アイランド”または“結合領域”と呼ぶことができる。結合アイランドまたは結合領域は、生体分子をその上に結合させることが“できる”。言い換えるならば、結合アイランドまたは結合領域は、生体分子に曝露されたときにその生体分子と結合するであろう。あるいは、結合アイランドまたは結合領域を修飾して、生体分子に曝露されたときにその生体分子と結合するようにできる。“結合アイランド”または“結合領域”という用語は、“できる”という表現なしで使用する場合には、生体分子が結合した領域、あるいは生体分子を結合させることのできる領域、あるいはその両方を意味する。“結合領域”および“結合アイランド”の意味は、文脈から明らかになろう。それぞれの結合領域または結合アイランドは、結合特異性が互いに異なっていてよい。したがってアイランドまたは領域は、すべての生体分子と結合できなくとも、結合アイランドまたは結合領域と見なすことができる。例えば所定の結合アイランドは、所定のクラスまたはタイプの生体分子と特異的に結合することができる。
【００４６】
生体分子は表面に直接結合することができるが、生体分子と結合して表面に固定化される介在分子か、あるいは生体分子と結合して表面上に層を形成する介在分子と結合することが好ましい。このような介在分子は表面に結合するか表面上に層をなし、生体分子はこの介在分子に固定化される。例えば後で説明するように、ＳＡＭ（自己集合単分子膜）を表面に形成し、このＳＡＭが、生体分子と結合するＳＡＭ形成分子（ＳＦＭ）を含むようにすることができる。生体分子と結合するＳＡＭの領域を“結合アイランド”または“結合領域”と呼ぶことができる。
【００４７】
介在分子を用いて表面に固定化されている生体分子は、“表面に固定化された生体分子”という表現で表わされる。同様に、表面に生体分子を固定化するとは、表面に直接に固定化すること、あるいは介在分子を用いて固定化することを意味し、意味としてそのどれが適切であるかは、文脈から明らかになろう。
【００４８】
どの結合アイランドも、１つのタイプの生体分子の単一のコピーまたは多数のコピーがそのアイランド上に固定化されるように製造することができる。多くの実施態様では、結合アイランドは、独立した１つのアイランドの上に１つのタイプまたはクラスの生体分子を結合できるようにし、独立した第２のアイランドの上に異なるタイプまたはクラスの生体分子を結合できるように製造する。さらに別のタイプまたはクラスの生体分子を表面に結合させることのできる追加の独立したアイランドも表面に含めることができる。もちろん、単一のアイランドを用意してその上にさまざまなタイプまたはクラスの生体分子を結合させるようにすることもできる。
【００４９】
本発明の結合アイランドまたは結合領域の直径は、１００ミクロン以下であることが好ましい。より好ましいのは、本発明の結合アイランドまたは結合領域の直径が５０ミクロン以下になっていることである。より一層好ましいのは、本発明の結合アイランドまたは結合領域の直径が２０ミクロン以下になっていることである。最も好ましいのは、本発明の結合アイランドまたは結合領域の直径が５ミクロン以下になっていることである。本発明のアレイは、結合アイランドと結合アイランドの間にある非結合領域が０〜１００ミクロンになっていることが好ましい。より好ましいのは、結合アイランドと結合アイランドの間にある非結合領域が３０〜６０ミクロンになっていることである。結合アイランドと非結合領域のサイズは、アイランドの望ましい数、表面の面積、アイランドの望ましい配置、固定化された生体分子同士の望ましい近接度などを考慮して選択することができる。
【００５０】
上に説明したサイズの分子の複数のアイランドをアレイ状に配置することができる。このようなアレイは、９６、３８４、１５３６、３４５６個のウエルを有するマイクロウエル・プレートのウエルの中に配置するか、あるいはサイズと方向が９６、３８４、１５３６、３４５６個のウエルを有するマイクロウエル・プレートのウエルと同じである領域に配置することができる。結合アイランドの直径は極めて小さいため、多数の結合アイランドを各マイクロウエルの中に配置することができる。一例として、それぞれの直径が１００ミクロンで、約０〜６０ミクロンの非結合領域によって互いに隔てられた結合アイランドを含むアレイは、９６ウエルのプレートの単一のウエル（各ウエルは直径が約５ｍｍ）領域に約５００の結合アイランドを収容することができる。別の具体例として、それぞれの直径が２０ミクロンで、約０〜６０ミクロンの非結合領域によって互いに隔てられた結合アイランドを含むアレイは、９６ウエルのプレートの単一のウエル領域に約１４，０００の結合アイランドを収容することができる。
【００５１】
この明細書でさらに詳しく説明することだが、分子をこのようなサイズのアイランドにして堆積させることは、ソフト・リソグラフィ法によって実現することができる。例えば望ましいサイズの開口部を複数有するマスクを用い、分子を望ましいサイズのアイランドにして堆積させることができる。いくつかの実施態様では、別の方法（例えば、洗浄、滴下、スプレー、浸漬などが挙げられる）やアレイ形成装置を利用することと、本発明のアレイを使用することが、製造上有効である。
【００５２】
１つのタイプの生体分子の単一のコピーまたは複数コピーを任意のアイランドに固定化することができる。多くの実施態様では、独立した１つのアイランドの上に１つのタイプまたはクラスの生体分子を固定化し、独立した第２のアイランドの上に異なるタイプまたはクラスの生体分子を固定化する。追加の独立したアイランドの上にさらに別のタイプまたはクラスの生体分子を固定化することができる。もちろん、独立した２つ以上のアイランドの上に同じタイプまたはクラスの生体分子が固定化されていてもよい。同様に、単一の独立したアイランドの上に異なるタイプまたはクラスの複数の生体分子が固定されていてもよい。
【００５３】
生体分子の本発明のアイランドの直径は１００ミクロン以下であることが好ましい。さらに好ましいのは、生体分子の本発明のアイランドの直径が５０ミクロン以下になっていることである。より一層好ましいのは、生体分子の本発明のアイランドの直径が２０ミクロン以下になっていることである。最も好ましいのは、生体分子の本発明のアイランドの直径が５ミクロン以下になっていることである。生体分子をこのようなサイズのアイランドにして堆積させることは、ソフト・リソグラフィ法によって実現することができる。例えば望ましいサイズの開口部を複数有するマスクを用い、生体分子を望ましいサイズのアイランドにして堆積させることができる。上記のようなサイズの生体分子の多数のアイランドをアレイ状に配置することができる。このようなアレイは、適切な任意の構成に配置することができる。結合アイランドと非結合領域の構成は、アイランドの望ましい数、表面の面積、アイランドのサイズ、固定化された生体分子同士の望ましい近接度などを考慮して選択することができる。例えば、このようなアレイは、表面上で、形状とサイズが９６、３８４、１５３６、３４５６個のウエルを有するプレートのウエルと似ていてそれよりも大きなパターンに形成することができる。別の具体例として、アレイは、９６、３８４、１５３６、３４５６個のウエルを有するマイクロウエル・プレートのウエルの底面に配置することができる。
【００５４】
生体分子を固定化する表面は、不活性な材料、および／または非特異的な反応による生体分子（例えばタンパク質）の吸着が起こりにくい材料で形成することが好ましい。生体分子を容易に吸着しない材料を使用することが好ましいのは、非特異的な吸着によって分子が２つ以上の部位に吸着され、その結果としてその分子の特性が変化する可能性があるからである。タンパク質の場合には、非特異的吸着によってタンパク質が表面に固定化されて広げられると変性し、したがってその活性が低下、変化、消失する可能性が大きい。生体分子が表面に非特異的に吸着することにより、興味の対象である特定の生体分子を固定化する能力、および／または特定位置の生体分子を固定化する能力が大きく妨げられる可能性もある。生体分子が非常に付着しやすい表面ではなく、生体分子が付着しにくい表面を用いることが好ましい。
【００５５】
さらに、この明細書でさらに詳しく説明することだが、表面上の不活性であることが望ましい領域に不活性なＳＡＭを形成することにより、不活性ではない表面（生体分子が幾分か付着する表面）のすべてまたは一部を不活性にすることができる。不活性な表面としては、生体分子が実質的に付着しない表面が挙げられる。
【００５６】
この明細書では、付着が“実質的にない”とは、生体分子の非特異的付着または望ましからぬ付着のレベルが、調べようとしている相互作用の検出を妨げない程度であることを意味する。言い換えるならば、検出しようとする相互作用に関する信号対雑音比が、使用する検出システムを用いて検出可能な値以上に留まっているとき、非特異的結合の発生が“実質的にない”と言える。したがって、“実質的にない”の定義は、アレイの分解能や使用する検出法などの因子によって変化する。所定のシステムに関する“実質的にない”の定義は、定石的な実験によって経験的に決定することができる。例えば、表面を生体分子の溶液とともにインキュベートすることにより、その表面の結合をテストすることができる。結合のレベルを測定することができる。別の具体例として、（例えばＳＡＭの）結合アイランドのための領域と（例えばＳＡＭの）非結合領域のための領域を有する表面を生体分子の溶液とともにインキュベートすることができる。不活性な領域に結合する分子の数に対し、結合アイランドのための領域に結合する分子の数がどうなっているかの比を測定することができる。このような対照実験を異なるタイプの結合分子と異なる検出システムに対して無理なく行なうことができる。例えばＭｒｋｓｉｃｈ Ｍ．らのＡｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｔｒｕｃｔ．、第２５巻、５５〜７８ページ、１９９６年を参照のこと。
【００５７】
本発明のアレイを形成するための表面を形成するのに有効な材料の具体例としては、金、銀、白金、パラジウム、銅が挙げられる。本発明のアレイを形成するための表面を形成するのに有効な材料の別の具体例としては、ガラス、ケイ素、セラミック、プラスチックが挙げられる。最も好ましいのは、表面を金で形成するか、あるいは金でコーティングすることである。例えば金でコーティングしたシリコン・ウエハーは、本発明のいくつかの実施態様で表面として有効である。
【００５８】
生体分子は、従来技術で知られている適切な任意の方法で表面に固定化することができる。固定化は、生物学的分子にダメージを与えない方法で実施することが好ましい。例えば、ＵＶ光と有機溶媒を使用する際に生物学的分子にダメージを与えるのを避けることが好ましい。
【００５９】
生体分子を固定化する具体的な方法は、従来技術において公知である。そのような方法としては、アフィニティ捕獲、共有結合誘導体化（例えばＥＤＣ＋ＮＨＳを利用する）、直接カップリング、膜へのアンカー形成、ストレプトアビジン−ビオチンの利用、ニッケル・キレーション捕獲などが挙げられる。
【００６０】
本発明のアレイを製造するために生体分子を固定化する表面は、その表面にＳＡＭを形成することによって準備することが好ましい。それよりもはるかに好ましいのは、表面に１つ以上のタイプのＳＡＭ形成分子（ＳＦＭ）をパターンにして形成することである。最も好ましいのは、表面にＳＡＭ形成分子（ＳＦＭ）をソフト・リソグラフィ法によってパターン化された単層として形成することである。この明細書でさらに詳しく説明することだが、本発明のアレイを製造するのに有効なタイプのＳＦＭとして、生物学的分子と結合しないＳＦＭや、特定の生体分子または特定のタイプの生体分子と特異的に結合するＳＦＭなどが挙げられる。
【００６１】
本発明のアレイは、少なくとも１つの領域において上に生体分子が固定化された１つまたは複数のＳＡＭを有する表面を含んでいる。本発明のアレイは、上に１つまたは複数のＳＡＭが固定化されている表面のうち、ＳＡＭが、そのＳＡＭを形成するＳＦＭの少なくともいくつかが生体分子と結合できる少なくとも１つの領域を含んでいる表面も含んでいる。
【００６２】
適切な任意の方法を用い、表面を、あるいは表面に結合した分子または表面に形成された分子を、その表面に固定化する別の分子（例えば生体分子）に曝露することができる。適切な方法の具体例としては、ソフト・リソグラフィ、洗浄、滴下、スプレー、浸漬、微小流体デリバリー、アレイ形成装置を利用した堆積などが挙げられる。これらの方法は、本発明のアレイを製造する途中の多くの段階で有効である。例えばこれらの方法を用いて分子を表面に直接堆積させることが可能であるが、方法がこれだけに限定されるわけではない。堆積させることのできる分子としては、生体分子、生体分子と結合できる分子、生体分子と結合しにくい分子、生体分子と結合しない分子が挙げられる。別の実施例では、これらの方法が、表面上に層になるかその表面に結合している分子（例えばＳＦＭを形成するＳＡＭ）を、その表面に結合しているかその表面上に層になった分子に固定化することが望ましい別の分子（例えば生体分子）に曝露するのに有効である。さらに別の実施例では、これらの方法が、固定化された生体分子を興味の対象である溶液に曝露するのに有効である。
【００６３】
アレイ形成装置は、ゲノミクスとアレイに関する従来技術としてよく知られている。一般に、この装置は、サンプルを９６または３８４マイクロウエル・プレートから取り出し、サンプル間の空間的方向と分離状態を維持したまま、そのサンプルを基板または表面に堆積させるか、あるいは別のマイクロウエル・プレートのウエルの中に堆積させる。具体的なアレイ形成装置としては、ベックマン・インスツルメンツ社のバイオメック２０００と、ジーンマシーンズ社のオムニグリッドが挙げられる。アレイ形成装置を用いると、例えばタンパク質ライブラリからのタンパク質を本発明によるアレイの結合アイランドに移動させることができる。（この明細書に記載したような、また従来技術で知られている）アレイ形成装置を利用すると、例えば、異なるタイプのＳＦＣを９６ウエル・プレートの所定のウエル内の（あるいは基板上でサイズがそのようなウエルと同じ領域内の）５００スポットのそれぞれに移動させ、５００の結合アイランドを形成し、５００のアイランドのアレイ中でそれぞれのタイプの結合アイランドの位置をあらかじめ決めた状態にすることができる。望むのであれば、この手続きを９６ウエル・プレート内の９６個のウエル（あるいは基板上でサイズと方向がそのようなウエルと同じ９６の領域それぞれ）に対して繰り返すことにより、それぞれが所定の空間的方向性を持った異なる５００のタイプの結合アイランドのアレイを９６個コピーして作ることができる。同様の方法を用い、３８４ウエル・プレートの中または基板上に、１４，０００タイプの生体分子のアレイを製造することができる。
【００６４】
同様に、（この明細書に記載したような、また従来技術で知られている）アレイ形成装置を利用すると、異なるタイプの生体分子を９６ウエル・プレートの所定のウエル内の（あるいは基板上でサイズがそのようなウエルと同じ領域内の）５００スポットのそれぞれに移動させ、５００の結合アイランドを形成し、５００のアイランドのアレイ中でそれぞれのタイプの生体分子の位置をあらかじめ決めた状態にすることができる。望むのであれば、この手続きを９６ウエル・プレート内の９６個のウエル（あるいは基板上でサイズと方向がそのようなウエルと同じ９６の領域それぞれ）に対して繰り返すことにより、それぞれが所定の空間的方向性を持った異なる５００のタイプのタンパク質のアレイを９６個コピーして作ることができる。同様の方法を用い、３８４ウエル・プレートの中または基板上に、１４，０００タイプの生体分子のアレイを製造することができる。
【００６５】
ソフト・リソグラフィは、フォトリソグラフィに代わる方法として開発された製造技術であり、ミクロレベルでのパターニングに特に有効である。ソフト・リソグラフィは、特徴的なサイズが約１ミクロン〜約１ｍｍの生物材料をパターニングすること、あるいはそのパターンを複製することに用いられている。ソフト・リソグラフィは、生物材料のアレイのパターニングを行なうのにも理想的であり、そのままでＳＡＭ技術とも相性がよい。ソフト・リソグラフィの生体適合性は、多くの生物材料にとって有害な有機溶媒またはＵＶ光を使用せずに実施できることに由来する。
【００６６】
ソフト・リソグラフィ法は、従来のマイクロ製造技術と比べると、資本の投下がほとんど必要なく、元々低コストの材料を使用している。さらに、以下に説明するように、ソフト・リソグラフィを利用すると、タンパク質アレイを現在のドラッグ・デリバリー・システムと一体化することが可能である。適切な任意のソフト・リソグラフィ法を利用して本発明のＳＡＭをパターニングすることができる。
【００６７】
ソフト・リソグラフィにおける共通要素は、移動または複製すべき特徴的形状を含むポリマー鋳型である。一実施態様では、このパターン転写用要素は、マスターの表面でポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）の液体前躯体を成形し、それを硬化させて固体にし、それをマスターから取り出すことによって製造される。このＰＤＭＳ製レプリカは、化学“インク”を移動させるためのスタンプとして、あるいは材料を堆積させるためのステンシル・マスクとして、あるいは立体構造を形成するための鋳型として用いることができる。微小接触印刷（ＭＣＰ）は、ソフト・リソグラフィ法の一例である。ＭＣＰを利用したＳＡＭの形成について、この明細書で説明する。しかしＭＣＰを利用して他の分子を堆積させてパターニングすることができるのは明らかであろう。また、別のソフト・リソグラフィ法を利用してＳＡＭや他の分子を堆積させてパターンを形成できるのも明らかであろう。
【００６８】
ＳＡＭを形成するための微小接触印刷（ＭＣＰ）では、ＰＤＭＳ表面の凹凸にＳＡＭ形成分子（ＳＭＦ）（例えばアルカンチオール）が“インク”として入り、基板の表面と接触する。“インク”が基板の表面に移動し、ＰＤＭＳに刻印された表面の凹凸を写し取ったパターンになったＳＡＭが形成される。１００ｎｍ〜１ｍｍの範囲の特徴的形状をＭＣＰによって製造することができる。
【００６９】
ソフト・リソグラフィを利用して本発明のアレイを多くのタイプの表面に製造することができる。例えば、ソフト・リソグラフィを利用すると、硬い表面、柔らかい表面、平坦な表面、湾曲した表面に分子をパターニングすることができる。ソフト・リソグラフィを利用すると、小さな表面積（例えば１ｍｍ２）や大きな表面積（例えば数ｃｍ２）に高分解能のアレイを形成し、さまざまなサイズ（例えばｃｍ、ｍｍ、μｍ、ｎｍ）の特徴的形状を作り出すことができる。
【００７０】
特性が最もよくわかっているＳＡＭは、金の表面にアルカンチオール（一端にチオールすなわち−ＳＨ基を備え、他端に先頭基（Ｘ）を備える炭化水素）によって形成されたものである。銀、パラジウム、白金、銅は、アルカンチオールＳＡＭで用いるのに適した表面の別の例である。表面とチオールの間に金属−イオウ結合が形成されることによりこれらＳＡＭが形成され、その結果として炭化水素鎖が結晶のように稠密に充填された状態になる。表面の性質は、表面に露出する炭化水素の先頭基（Ｘ）が化学的・生化学的性質を変化させる能力から生じる。例えば、先頭基としてＣＦ３を有するＳＡＭは、テフロン表面のような挙動を示すのに対し、先頭基としてＣＯＯＨを有するＳＡＭは、ガラス表面のような濡れ特性を示す。ソフト・リソグラフィ法は、ＳＡＭを使用するソフト・リソグラフィ法も含め、アメリカ合衆国特許第５，５１２，１３１号、第５，６２０，８５０号、第５，７７６，７４８号、第５，９７６，８２６号に詳しく記載されている。これら特許の内容はすべて、参考としてこの明細書に組み込まれている。図１と図２も参照のこと。
【００７１】
いくつかの好ましい実施態様では、さまざまなタイプのＳＦＭを表面にパターンにして配置し、パターニングされたＳＡＭを形成する。そのときパターンの各部分は異なる結合特性を有する。特に好ましいいくつかの実施態様では、そのパターンに生体分子と結合できるＳＦＭの領域またはアイランドが含まれる。単一の結合アイランドを含むＳＦＭは、すべてが同じ特異性を持っているために同じ生体分子と結合すること、あるいはそれぞれが異なる特異性を持っているために異なる生体分子と結合することができる。同様に、生体分子と結合するさまざまなＳＦＭは、すべてが同じ特異性を持っているために同じ生体分子と結合すること、あるいはそれぞれが異なる特異性を持っているために異なる生体分子と結合することができる。
【００７２】
結合アイランドは、生体分子と結合できないＳＦＭの領域、あるいは生体分子と結合しにくいＳＦＭの領域によって囲まれていることが好ましい。このような領域（“非結合領域”とも呼ばれる）は、生体分子とアレイの非特異的な結合を減らすか阻止することができるために有用である。生体分子が表面に非特異的に吸着されると、興味の対象である特定の生体分子を固定化する能力および／または生体分子を特定の位置に固定化する能力が大いに低下する可能性がある。このような非結合領域は、適切な任意の方法用いて作ることができる。非結合領域は、例えば生体分子が結合しないか、生体分子が非常に低いアフィニティしか持たないＳＡＭを形成するなどの方法によって作り出すことができる。
【００７３】
このようなパターニングは、望むサイズのパターンを製造できる任意のパターニング法を用いて実現することが可能である。例えば、このようなパターニングは、ソフト・リソグラフィ、洗浄、あるいはソフト・リソグラフィと洗浄の組み合わせによって実現することができる。洗浄が有効な場合には、別の同様な方法、例えば滴下、スプレー、浸漬などを用いることもできる。ソフト・リソグラフィによるパターニングの一例では、ＭＣＰや従来技術で知られている他のソフト・リソグラフィ法などの適切な方法を用い、第１のＸ基（Ｘ１）を適切な表面に付着させる。次に、第２のＸ基（Ｘ２）を有するＳＦＭを、ＭＣＰや従来技術で知られている他のソフト・リソグラフィ法などの適切な方法を用い、表面のうちでＸ１を有するＳＦＭで覆われていない領域に付着させる。Ｘ２を有するＳＦＭを、表面のうちでＸ１を有するＳＦＭで覆われていない領域に付着させるには、表面を、Ｘ２を有するＳＦＭで洗浄するという方法によることも可能である。すると表面のうちでＸ１を有するＳＦＭで覆われていない領域にＳＡＭが形成される。追加のＸ基を有する追加のＳＦＭをこのような追加の製造プロセスを通じて同様にして付着させることができる。表面へのＳＦＭの付着は、表面をＳＦＭで洗浄することによっても実現できる。
【００７４】
有効な実施態様の一例では、ＳＡＭ技術を利用して９６ウエル・プレートの所定のウエル内の（あるいは基板上でサイズがそのようなウエルと同じ領域内の）５００スポットのそれぞれにＳＡＭを形成することにより、所定の位置に５００の結合アイランドを形成することができる。望むのであれば、この手続きを９６ウエル・プレート内の９６個のウエル（あるいは基板上でサイズと方向がそのようなウエルと同じ９６の領域それぞれ）に対して繰り返すことにより、それぞれが所定の空間的方向性を持った異なる５００のタイプの結合アイランドのアレイを９６個コピーして作ることができる。同様の方法を用い、３８４ウエル・プレートの中または基板上に、１４，０００タイプの結合アイランドのアレイを製造することができる。
【００７５】
一実施態様では、ＳＡＭ結合アイランドはすべて、同じＳＦＭを含んでいる。すなわち、各結合アイランドは、同じタイプまたはクラスの生体分子と結合することができる。このような実施態様は、例えばアレイ形成装置を用いて特定の生体分子を各結合アイランドに移動させる場合に有効である。この場合、各結合アイランドは、移動した生体分子の任意のものまたはすべてと結合できるが、生体分子同士は混合しない。というのも、分離がアレイ形成装置によって維持されており、それぞれのタイプの生体分子が所定の結合アイランドに結合するからである。別の実施態様では、結合アイランドは、異なるタイプまたはクラスの生体分子に対して特異性を有するＳＦＭを含むことができる。このような実施態様は、生体分子の供給源が、あらかじめ分画または区分していない生物サンプルである生体分子を洗浄によって結合アイランドのアレイに付着させる場合に特に有効である。言い換えるならば、このような実施態様は、本発明のアレイが分離機能とともに固定化機能と局在化機能（すなわち生体分子を所定の位置に保持する）を実現することが望ましい用途において特に有効である。
【００７６】
洗浄、滴下、スプレー、浸漬、ＭＣＰなどの方法を用いて結合アイランドを非結合領域で囲むことができる。次に、ソフト・リソグラフィ、アレイ形成装置、洗浄、滴下、スプレー、浸漬、ＭＣＰなどの方法を用いて生体分子を結合アイランドに固定化する。異なるタイプの生体分子を、９６ウエル・プレートの所定のウエル内の（あるいは基板上でサイズがそのようなウエルと同じ領域内の）５００スポットのそれぞれに固定化し、５００アイランドのアレイ中でそれぞれのタイプの生体分子の位置をあらかじめ決めた状態にすることができる。望むのであれば、この手続きを９６ウエル・プレート内の９６個のウエル（あるいは基板上でサイズと方向がそのようなウエルと同じ９６の領域それぞれ）に対して繰り返すことにより、それぞれが所定の空間的方向性を持った異なる５００のタイプのタンパク質のアレイを９６個コピーして作ることができる。同様の方法を用い、３８４ウエル・プレートの中または基板上に、１４，０００タイプの生体分子のアレイを製造することができる。
【００７７】
この明細書では、生体分子と結合するＸ基は“結合Ｘ基”と呼ぶことができ、結合Ｘ基を有するＳＦＭは“結合ＳＦＭ”と呼ぶことができる。同様に、この明細書では、生体分子と結合しないＸ基または生体分子と結合しにくいＸ基は、“不活性Ｘ基”と呼ぶことができ、不活性Ｘ基を有するＳＦＭは“不活性ＳＦＭ”と呼ぶことができる。
【００７８】
所定のＸ基は、ＳＦＭを表面に付着させるときに特異性を有する可能性がある。あるいは、Ｘ基を有するＳＦＭを付着させると、Ｘ基が修飾または誘導体化されてその結合特性が変化する可能性がある。したがって、結合ＳＦＭには、不活性なＸ基を有するＳＦＭや、ＳＡＭを形成するときには最終的に望ましい特異性とは異なっているがＳＦＭが一部に含まれるアレイを形成する途中のある時点で結合特性を変えることのできるＸ基を有するＳＦＭが含まれることが理解できよう。同様に、不活性なＳＦＭには、生体分子と結合するがＳＦＭが一部に含まれるアレイを形成する途中のある時点で不活性にされるＸ基を有するＳＦＭが含まれる。したがって、“不活性”と“結合”は、ＳＦＭが一部を形成するアレイの製造が完了した後のＳＦＭの結合能力を意味する。
【００７９】
好ましい実施態様では、２〜４０個の炭素原子の炭化水素鎖を有するアルカンチオールＳＦＭを使用する。生体分子と結合するＸ基を末端に有するＳＦＭの場合、炭化水素鎖は８〜３０個の炭素原子を有することが好ましい。より好ましい炭素原子の数は１４〜１８個であり、最も好ましいの炭素原子の数は１６個である。炭化水素鎖とＸ基の間に３〜６個のエチレングリコール（ＥＧ）基を備え、Ｘ基がヒドロキシ（−ＯＨ）基またはメチル（−ＣＨ３）基であるＳＦＭを用い、生体分子と結合しない表面を形成することができる。生体分子と結合しないＳＦＭは、炭素原子が３〜３０個の炭化水素鎖を有することが好ましい。より好ましい炭素原子の数は１０〜１４個であり、最も好ましいの炭素原子の数は１１個である。
【００８０】
いくつかの実施態様では、結合ＳＦＭだけの領域は、単一の生体分子とその生体分子の２つ以上の部位で結合することになる（すなわち非特異的結合）。その結果、生体分子が変性したり、生体分子の活性または特性が変化または消失したりすることがしばしばある。したがって、好ましい実施態様では、単層の生体分子を表面に固定化してこれら生体分子がその生体分子の１ヶ所だけで結合するようにし、非特異的な結合を回避する。
【００８１】
この目的は、生体分子と結合するＸ基を有するＳＦＭ（“結合ＳＦＭ”）と、生体分子と結合しないＸ基を有するＳＦＭ（“不活性ＳＦＭ”）の両方を用い、不活性ＳＦＭのごく近傍に結合ＳＦＭを有する結合アイランドまたは結合領域を作り出すことによって実現することができる。この配置にすると、生体分子を結合ＳＦＭに特異的に結合させる一方で、生体分子の他の部分が他のＳＦＭと非特異的に結合することが避けられる。結合ＳＦＭと結合ＳＦＭの間のスペースは、結合ＳＦＭと不活性ＳＦＭを点在させることによって作り出すことができる。このように結合ＳＦＭと不活性ＳＦＭを点在させることは、例えば、結合ＳＦＭと不活性ＳＦＭの両方を混合したものを、表面にアイランドのパターンを印刷するときに使用する“インク”として用い、ＭＣＰによって実現することができる。しかし不活性ＳＦＭに対する結合ＳＦＭの割合が重要である。検出はアッセイ・システムと検出システムにも依存するが、この比が大きすぎると非特異的結合の量が大きくなりすぎて興味ある事象を検出できなくなる可能性がある。検出はアッセイ・システムと検出システムにも依存するが、この比が小さすぎると、結合する生体分子の数が少なすぎて興味ある事象を検出できなくなる可能性がある。所定のアッセイ・システムと検出システムに対し、経験的方法によって適切な比を選択することができる。例えば、不活性ＳＦＭに対してさまざまな比で結合した結合アイランドが不活性ＳＡＭの領域で囲まれたものを表面に形成し；生体分子をそのアイランドに結合させ；表面を、固定化された生体分子に結合させるか、そうでない場合には固定化された生体分子を修飾する生体分子の溶液に曝露し；各アイランドに対する非特異的結合の程度を測定し；修飾が検出可能であるかどうかを各アイランドについて明らかにすることができる。一般に、不活性ＳＦＭに対する結合比は、約０．１％と約１０〜２０％の間の値である。いくつかの実施態様では、比が約１〜２％だと非特異的結合と検出可能な修飾の量が非常に少なくなる（実質的にない）可能性がある。
【００８２】
不活性ＳＦＭに対する最適な結合比は、この明細書に記載したガイドラインを用いて実験的に決定することができる。さらに詳細には、比がわかったさまざまなＳＦＭを有するアイランドを印刷し、生体分子を結合させる。次に、表面プラズモン共鳴などの方法を用いるとアイランドを分析することができる。生体分子の完全な単層を備え、生体分子の非特異的な結合はないアイランドが配置された場合には、そのアイランドのためのインクを製造するのに用いた比が、不活性ＳＦＭに対する最適の結合比であることがわかる。最適な比は、生体分子が何であるかによって異なること、また利用するＳＦＭのタイプによっても異なることが理解できよう。さらに、いくつかの応用では、例えば完全な単層よりもまばらになった生体分子層が望ましいことも理解できよう。この場合には、やはり上記の方法を用いることにより、不活性ＳＦＭに対する結合比に関し、望ましい条件を作り出す上で最適な値を明らかにすることができる。
【００８３】
この明細書では、結合ＳＦＭと不活性ＳＦＭの両方を含んでいて生体分子が結合する領域を形成するアイランドまたは領域を、“結合アイランド”または“結合領域”と呼ぶことができる。
【００８４】
異なるいくつかのシステムを用いてＸ基を有するＳＦＭに生体分子を固定化することができる。一例として、ＥＤＳ−ＮＨＳを用いて生体分子とＳＦＭの間に共有結合を形成することができる。別の例として、ビオチンと結合するアミノ基を末端に有するＳＦＭを製造することができる。このビオチンが、今度はストレプトアビジンと結合する。次に、ビオチニル化された生体分子がＳＦＭのストレプトアビジンに強く結合することになる。さまざまな結合システムを用いると、表面の特定の独立した領域にさまざまな生体分子を固定化するのが容易になる。
【００８５】
１つ以上の生体分子を単一の表面に固定化することができる。いくつかの実施態様では、異なる多数（例えば１０００種類）の生体分子を固定化する。別の実施態様では、これよりも少数（５０種類以下）の生体分子を固定化する。
【００８６】
アレイを形成するために表面に固定化される生体分子（“固定化された生体分子”とも呼ばれる）としては、研究しようとする任意の生体分子が可能である。固定化される生体分子としては、炭水化物、核酸、タンパク質、ポリペプチド、脂質などが挙げられる。同様に、固定化された生体分子に対して曝露される生体分子としては、研究しようとする任意の生体分子が可能である。このような生体分子（この明細書では“溶液中の生体分子”とも呼ばれる）としては、炭水化物、核酸、タンパク質、ポリペプチド、脂質などが挙げられる。
【００８７】
特に好ましい実施態様では、パターニングされた結合アイランドを含むＳＡＭを生成させる。このとき、アイランドは、不活性ＳＦＭに対する結合比が最適になっており、結合アイランドと結合アイランドの間の領域に不活性ＳＦＭが含まれている。そのため、生体分子が結合アイランドと結合アイランドの間の領域に結合することはない。
【００８８】
いくつかの実施態様では、溶液中の単一のタイプの生体分子を、固定化された生体分子に曝露する。別の実施態様では、固定化された生体分子に曝露する溶液は、２つ以上のタイプの生体分子を含んでいる。いくつかの実施態様では、固定化された生体分子に曝露する溶液は、２つ以上のクラスの生体分子を含んでいる。本発明の実施態様で有効な生体分子としては、性質がわかっている生体分子と、性質がわかっていない生体分子の両方が挙げられる。本発明の実施態様で有効な生体分子としては、機能または活性がわかっている生体分子と、機能または活性がわかっていない生体分子の両方が挙げられる。この明細書では、機能または活性がわかっていない生体分子を、“キャラクテリゼーションされていない”と呼ぶことができる。
【００８９】
溶液中の医薬品、毒素、およびこれ以外の生体分子としては、既知の単一の生体分子、あるいは既知の生体分子の混合物が可能である。すなわち溶液の組成をあらかじめ決定することができる。同様に、生体分子の活性または特性は既知であってもよいし、生体分子はキャラクテリゼーションされていなくてもよい。別の実施態様では、溶液の組成はキャラクテリゼーションされていなくても未知であってもよい。すなわち、溶液中の生体分子は性質がわかっていなくても、活性または機能がわかっていなくてもよい。さらに別の実施態様では、固定化された生体分子に曝露する溶液の組成は、一部がキャラクテリゼーションされていてもよい。すなわち、組成の一部がわかっていてもよい。例えば、溶液中のいくつかの生体分子が同定され、および／またはキャラクタリゼーションされ、それ以外の生体分子は同定されていない、および／またはキャラクタリゼーションされていない状態が可能である。溶液中のいくつかの生体分子またはすべての生体分子が同定されていない、および／またはキャラクタリゼーションされていない実施態様の具体例としては、溶液が細胞ライセートである実施態様、溶液が細胞ライセートに由来する実施態様、溶液がライブラリ（例えばタンパク質ライブラリ）である実施態様、溶液がライブラリに由来する実施態様などが挙げられる。
【００９０】
溶液中の生体分子と同様、固定化された生体分子は、同定された生体分子と同定されていない生体分子の両方と、キャラクタリゼーションされた生体分子とキャラクタリゼーションされていない生体分子の両方を含むことができる。多くの実施態様では、既知でキャラクタリゼーションされた生体分子が表面に固定化されて本発明のアレイを形成する。
【００９１】
いくつかの実施態様では、固定化される生体分子を、興味の対象である特定の第２の生体分子を修飾することがわかっているもの、あるいはその第２の生体分子と結合することがわかっているものの中から選択する。このような実施態様では、固定化された生体分子を用いて溶液中に他の生体分子（例えば細胞培養物の上清、細胞ライセート、生理的体液、タンパク質ライブラリ）が存在しているかどうかをスクリーニングすることができる。
【００９２】
いくつかの実施態様では、固定化される生体分子と溶液中の生体分子をうまく選択することにより、溶液中の１つ以上の生体分子が、表面に固定化された１つ以上の生体分子に及ぼす効果を明らかにすることができる。同様に、生体分子をうまく選択することにより、表面に固定化された１つ以上の生体分子が溶液中の１つ以上の生体分子に及ぼす効果を明らかにすることができる。さらに、生体分子をうまく選択することにより、生体分子間の相互作用を明らかするすることもできる。このような効果および相互作用としては、ある生体分子が別の生体分子に結合することや、生体分子を別の生体分子で活性化すること、抑制すること、修飾することなどが挙げられる。修飾としては、リン酸化、脱リン酸化、メチル化、アセチル化、脂質化、ファルネシル化グリコシル化、プレニル化、ユビキチン化、ヒドロキシル化、脱ヒドロキシル化、カルボキシル化、脱カルボキシル化、ニトロシル化、酸化、還元、水素化、脱水素化などが挙げられる。修飾に関するこれ以外の具体例としては、アロステリック転移、加水分解、解糖、タンパク質分解、代謝、異化変性が挙げられる。生体分子に対するこれらの修飾ならびにこれ以外の修飾は、本発明の実施態様を利用して調べることができる。
【００９３】
固定化される生体分子は、興味ある任意の供給源に由来するものが可能である。いくつかの実施態様では、固定化される生体分子は、細胞培養物の上清であるか、あるいはその上清に由来するものである。培養物中の細胞は、興味ある任意の供給源に由来するものが可能である。別のいくつかの実施態様では、固定化される生体分子は、細胞ライセートであるか、あるいはその細胞ライセートに由来するものである。細胞ライセートは、興味ある任意の供給源に由来するものが可能である。そのような供給源の具体例としては、培養物中の細胞、不死化した細胞系、生体または死体から直接に採取した細胞、組織、器官などが挙げられる。別の実施態様では、固定化される生体分子は、生体または死体から採取した体液であるか、あるいはその体液に由来するものである。そのような体液の具体例としては、血液、涙、唾液、胃腸液、羊水、骨髄、血漿、リンパ液、細胞外液、体液、脳脊髄液、尿などが挙げられる。この明細書では、このような体液を“生理的体液”と呼ぶことができる。さらに別の実施態様では、固定化される生体分子は、標的タンパク質またはそれ以外のライブラリであるか、あるいはそのライブラリに由来するものである。いくつかの実施態様では、固定化される生体分子として、医薬品または医薬品候補が挙げられる。興味の対象となる生体分子以外の生体分子を含むサンプルは、分画することによって興味の対象ではない生体分子を減らすか除去するかした後、本発明の結合アイランドに付着させる。しかし本発明のいくつかの実施態様では、このような分画化は不要である。というのも、結合アイランドが結合特異性を示すからである。
【００９４】
いくつかの実施態様では、これら生体分子は、タンパク質である。１つ以上のタイプのタンパク質を表面に固定化することができる。いくつかの実施態様では、タンパク質の固定化を、そのタンパク質ができるだけ変性しないような方法と材料を用いて、あるいはそのタンパク質の活性ができるだけ変化しないような方法と材料を用いて、あるいはそのタンパク質とそのタンパク質が固定化される表面の間の相互作用が最小になるような方法と材料を用いて行なう。いくつかの実施態様では、これら生体分子は、シグナル伝達において重要な経路に関与するタンパク質である。
【００９５】
固定化された生体分子を有する表面は、固定化されたこれら生体分子と反応したり、これら生体分子を修飾したり、これら生体分子によって修飾されたりする生体分子を含む溶液に曝露することができる。このような表面は、“興味の対象となる溶液”と呼ぶことができる。いくつかの実施態様では、興味の対象である１つ以上のタイプまたはクラスの生体分子を溶液中に分散させる。いくつかの実施態様では、その溶液は、細胞培養物の上清であるか、あるいはその上清に由来するものである。培養物中の細胞は、興味ある任意の供給源に由来するものが可能である。いくつかの実施態様では、溶液は、細胞ライセートであるか、あるいはその細胞ライセートに由来するものである。細胞ライセートは、興味ある任意の供給源に由来するものが可能である。そのような供給源の具体例としては、培養物中の細胞、不死化した細胞系、生体または死体から直接に採取した細胞、組織、器官などが挙げられる。別の実施態様では、溶液は、生体または死体から採取した体液であるか、あるいはその体液に由来するものである。そのような体液の具体例としては、血液、涙、唾液、胃腸液、羊水、血漿、骨髄、リンパ液、細胞外液、脳脊髄液、尿などが挙げられる。この明細書では、このような体液を“生理的体液”と呼ぶことができる。さらに別の実施態様では、溶液は、標的タンパク質またはそれ以外のライブラリであるか、あるいはそのライブラリに由来するものである。いくつかの実施態様では、本発明のアレイを曝露する溶液は、医薬品または医薬品候補を含んでいる。興味の対象となる生体分子以外の生体分子を含むサンプルは、分画することによって興味の対象ではない生体分子を減らすか除去するかした後、本発明の結合アイランドに付着させる。しかし本発明のいくつかの実施態様では、このような分画化は不要である。というのも、結合アイランドが結合特異性を示すからである。
【００９６】
この明細書では、“溶液”という用語に、媒体のうち、その媒体中で、本発明の表面に固定化された生体分子に対して所定の位置に固定された基質に分子が結合していないすべての媒体が含まれる。
【００９７】
本発明のアレイを用いて研究することのできるタンパク質、医薬品、毒素、他の生体分子、細胞系、細胞、生理的体液、ライブラリは、動物、植物、藻類、菌類、細菌、ウイルス、原生動物、興味の対象となる他の任意の生命形態などが含まれる供給源に由来するものが可能である。本発明のアレイは、化学的合成、酵素による合成、組み換えヌクレオチド技術、これ以外のインビトロ法によって産生されるタンパク質その他の生体分子を研究するのにも有効である。溶液が、体液、培養物の上清、ライブラリ、細胞ライセートであるか、あるいはこれらに由来する実施態様では、溶液として、ライブラリ全体、変質していない細胞ライセート、培養物の上清、体液が可能である。あるいはライブラリ、ライセート、上清、体液に対して他の分離法、分画法、特性決定法を適用し、アレイを曝露する溶液を製造する。
【００９８】
いくつかの実施態様では、細胞を興味の対象である医薬品または医薬品候補で処理した後、細胞を溶解させて本発明のアレイを細胞ライセートに曝露する。別の実施態様では、本発明のアレイと一体化したミニチュアの微小流体システムの中で細胞を培養する。次に、このようにして培養した細胞から放出された産物および／またはこの細胞のライセートを、細胞培養システムと一体化したアレイで分析する。細胞を培養し、溶解させ、アレイに曝露するとき、細胞を移動させる必要がない。
【００９９】
いくつかの実施態様では、本発明のアレイ・システムを用い、経路（例えばシグナル伝達経路）、フィードバック制御システム、細胞間シグナル伝達経路を調べる。本発明のアレイを用いて調べることができる経路の具体例をこの明細書に記載してあるが、具体例がそれだけに限定されるわけではない。多くのタイプの生体分子を単一のアレイに固定化して他の生体分子を含む溶液に曝露できるため、中間体または最終生成物としての生体分子に関して検出値が変化したことや検出値に変化がないことをもとにして、生体分子間の複雑な相互作用を研究することができる。例えば、溶液中のある特定の生体分子（Ａ）を、固定化された別の生体分子（Ｂ）または溶液中の別の生体分子（Ｂ）で活性化または不活性化することができる。一実施例では、タンパク質Ａ、Ｂ、Ｃが１つの経路の一部に関与していることがわかっている。さらに詳細には、活性なＡがＢを活性化し、活性なＣがＡを活性化することが知られている。本発明のアレイの一例では、不活性なＡと不活性なＢが固定化され（したがって互いに反応することはできない）、活性なＡと、活性なＣと、経路の潜在的な阻害剤とを含む溶液に曝露される。固定化されたＡが溶液中のＣによって活性化された場合には、この溶液中にＣの阻害剤が存在していないことがわかる。固定化されたＢが溶液中のＡによって活性化された場合には、この溶液中にＡの阻害剤が存在していないことがわかる。逆に、固定化されたＡが活性化されない場合には、この溶液がＣの阻害剤を含んでいることがわかる。固定化されたＢが活性化されない場合には、この溶液がＡの阻害剤を含んでいることがわかる。活性化のパターン、あるいは活性化されないことを分析すると、経路のうちのどこに潜在的な阻害剤（ただし、その阻害剤が、実際に、経路中で調べている部分の阻害剤になっている場合）が作用するかを明らかにすることができる。単一のアレイ上に多数の生体分子を固定化できるため、多数の経路を同時に調べることが容易になる。
【０１００】
経路の研究に本発明のアレイ・システムを用いる実施態様では、その経路の一部を構成することがわかっている生体分子、あるいはその経路の一部を構成すると考えられている生体分子を、アレイに固定化する。このようにすると、興味の対象である溶液と、固定化された生体分子のそれぞれとの相互作用を同時に調べることができる。これら実施態様のうちのいくつかでは、特定の経路に関する生体分子の空間配置すなわちアレイを、表面上で２回以上繰り返す。個々のアレイは、物理的な障壁によって他のアレイと分離することが好ましい。すると、興味の対象である２種類以上の溶液と、固定化された生体分子の間の相互作用を同時に調べることができる。
【０１０１】
いくつかの実施態様では、本発明のアレイ・システムを用いて特定のクラスの生体分子を調べる。本発明のアレイを用いて研究できるクラスの生体分子の具体例をこの明細書で説明する。研究するクラスの生体分子は、個々の実施態様において、望みのままに広く定義することも狭く定義することもできる。例えば、多くのタイプのキナーゼを単一のアレイに固定化することができる。多くのタイプの生体分子を単一のアレイに固定化して他の生体分子を含む溶液に曝露することができるため、興味の対象である特定の溶液中の生体分子と、固定化された多くのタイプの生体分子の間の相互作用を同時に調べることができる。
【０１０２】
いろいろなクラスの生体分子の研究に本発明のアレイ・システムを用いる実施態様では、特定のクラスに属することがわかっている１つ以上のタイプの生体分子、あるいは特定のクラスに属すると考えられる１つ以上のタイプの生体分子を単一のアレイに固定化する。このようにすると、興味の対象である溶液と、固定化された生体分子のそれぞれとの間の相互作用を同時に調べることができる。これら実施態様のうちのいくつかでは、特定の経路に関する生体分子の空間配置すなわちアレイを、表面上で２回以上繰り返す。個々のアレイは、物理的な障壁によって他のアレイと分離することが好ましい。すると、興味の対象である２種類以上の溶液と、固定化された生体分子の間の相互作用を同時に調べることができる。
【０１０３】
一例として、１つのクラスの生体分子の要素を含むアレイを用いて医薬品候補の特異性を調べることができる。例えば、ある生体分子が、標的となるキナーゼに効果を及ぼすことがわかっており、したがってその生体分子がよい医薬品候補である場合、その医薬品候補が他のキナーゼに効果を及ぼすかどうかと、その医薬品候補が他のキナーゼにどのような効果を及ぼすかを知ることが望ましかろう。目的とする標的に対して非常に特異的な医薬品を同定することは有効である。というのも、一般に、その医薬品の投与に伴う副作用は、特異性のより小さい医薬品に伴う副作用と比べて大きく減少するからである。
【０１０４】
興味の対象がタンパク質であるいくつかの実施態様では、生体分子が固定化されたアレイを、これらタンパク質に対して特異的な酵素と、これら酵素に対する潜在的な促進剤または阻害剤とを含む溶液に曝露する。固定化された基質の溶液中の酵素による翻訳後修飾は、その修飾に対して特異的な抗体を用いて検出する。固定化されたタンパク質の変換状態を観察することにより、サンプル中の酵素の活性を明らかにすることができる。このアレイは、（酵素が触媒となって増幅されたシグナルを出すため）低濃度の酵素の存在を検出できるという利点を有する。
【０１０５】
１つのアレイに生体分子を２つだけパターニングすることにより、１回の実験で２倍の生化学情報を得ることができる。例えば、一連の実験を行なわなくても１回の実験で阻害剤の特異性と効率を明らかにすることができる。この考え方は、より多数の基質へも容易に拡張することができる。例えば、ＭＡＰＫファミリーのいくつか（ＥＲＫ１〜ＥＲＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、ｐ５７ ＭＡＰＫ）を１つのアレイにパターニングすることができよう。多くのシグナル伝達経路が入り組んでいるが、研究者は、本発明のアレイ・システムにより、１回の実験でこの入り組んだシグナル伝達経路を調べることができよう。このようにより複雑なアレイを用いると、多数の経路に対する阻害剤をスクリーニングすることができるため、スクリーニングの速度が大いに向上するであろう。１つのアレイ上の数百または数千という標的に対してスクリーニングを行なうというのは、実験を数百回または数千回ではなく、１回だけ行なうことを意味する。
【０１０６】
溶液中の生体分子またはアレイに固定された生体分子の修飾または結合は、従来技術で知られている検出法を利用して検出することができる。そうした方法の具体例としては、免疫法（例えば競合結合アッセイ、サンドイッチ・アッセイ）；共焦点スキャナー、共焦点顕微鏡、ＣＣＤをベースとしたシステムなどの装置と、蛍光、蛍光偏光（ＦＰ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、全反射蛍光（ＴＩＲＦ）、蛍光相関分光（ＦＣＳ）などの方法とを用いた蛍光検出法；測光／分光法；表面に吸着される材料の質量変化を測定することのできる表面プラズモン共鳴；放射性同位元素を用いた方法（放射性同位元素結合や、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ））；質量分析法（例えばＭＡＬＤＩ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）；タンパク質フィルムの厚さを測定する光学的方法である偏光解析法；表面に吸着される材料の質量を測定する非常に感度のよい方法である水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）法；走査プローブ顕微鏡（例えばＡＦＭやＳＥＭ）；電気化学法、インピーダンス法、アコースティック法、マイクロ波法、ＩＲ／ラマン検出法が挙げられる。例えば、Ｍｅｒｅ Ｌ．らの『ミニチュア化したＦＲＥＴアッセイと微小流体学：超ハイスループット・スクリーニングにおいてカギとなる要素』、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ． Ｔｏｄａｙ、第４巻（８）、３６３〜３６９ページ、１９９９年と、この論文中に引用されている参考文献；Ｌａｋｏｗｉｃｚ Ｊｒ．の『蛍光分光の原理』、第２版、プレナム・プレス社、１９９９年を参照のこと。
【０１０７】
例えばいくつかの実施態様では、特殊な修飾がなされた生体分子と反応するが、修飾されていない生体分子やそれ以外の修飾がなされた生体分子とは反応しない抗体を用い、特定の修飾を検出する。１つ以上の抗体に対する結合を調べることができる。１つ以上の抗体に対する結合を１回のアッセイで調べる実施態様では、異なる抗体に異なる標識を付けるとよい。抗体への標識法は従来技術において周知である。標識法としては、例えば、抗体に放射性標識したり蛍光タグを付けたりすることができる。別の実施態様では、質量分析を利用して修飾された生体分子と修飾されていない生体分子を区別する。
【０１０８】
所定の１つのタイプまたは多数のタイプの生体分子の多数のコピーを本発明による特定のアイランドに収容できるため、多くの用途と利点が生まれる。例えば、固定化された２つ以上の生体分子を、互いの間の相互作用がない状態にして、１回のアッセイで使用することができる。別の具体例として、変化を検出する生体分子が固定化される生体分子となる実施態様では、所定の特定の生体分子がアレイ上のどこに位置しているかを正確に知ることができるため、こうした変化の検出が容易になる。例えば、所定の特定の生体分子がアレイ上のどこに位置しているかを正確に知ることができるため、１つの検出システムで２つ以上の効果を検出することができる。例えば、さまざまな生体分子を検出するための抗体や生体分子同士を区別する抗体と結合できる、かなり多いが限られた数の蛍光色素が存在している。したがって、１回のアッセイで限られた数の抗体しか使用しなくても、どの抗体が対応する標的と結合したかを区別する能力を維持することができる。本発明のアレイ・システムでは、固定化された生体分子がタイプごとに空間的に限定された位置に存在している。したがって、所定の１つの蛍光色素を用いて２つ以上の抗体に標識することができる。というのも、同じ色素で標識された特異性が異なる抗体は、アレイ上の位置に基づいて互いに区別できるからである。同様に、質量変化を検出する方法を利用する場合には、（１）１つ以上の特定のタイプの生体分子それぞれの位置と、（２）興味の対象である１つ以上の溶液のうちのどれがアレイ上の所定の位置にある所定のタイプの生体分子に曝露されるかがわかると、検出した質量変化が、興味の対象である特定の溶液に曝露された特定のタイプの生体分子によるものであることがわかる。
【０１０９】
結合アイランドまたは結合領域を含むアレイをキットに含めることができる。このようなキットが本発明の別の実施態様になる。このようなキットは、本発明によるアレイの結合アイランドまたは結合領域に固定化するための生体分子を調製するのに役立つ試薬や、固定化された生体分子に対する修飾を検出するのに役立つ試薬や、固定化された生体分子に興味の対象である溶液からの生体分子が結合したことを検出するのに役立つ試薬なども含むことができる。
【０１１０】
同様に、固定化された生体分子を含むアレイをキットに含めることができる。このようなキットが本発明のさらに別の実施態様になる。このようなキットは、固定化された生体分子の修飾を検出するのに役立つ試薬や、固定化された生体分子に興味の対象である溶液からの生体分子が結合したことを検出するのに役立つ試薬も含むことができる。
【０１１１】
本発明を実施する上で有効な実験室の器具やそれ以外の装置も本発明のキットに含めることができる。
【０１１２】
本発明の方法とアレイにより、多数の異なる分子相互作用を同時に研究することができる。このように同時に研究できることには多くの利点がある。利点として、例えば、ハイスループットになること、自動化が容易になること、同時処理によりサンプル同士の比較がしやすくなることなどが挙げられる。一例として、本発明の方法を用いると、９６ウエル・プレートの所定のウエル内の（あるいは基板上でサイズがそのようなウエルと同じ領域内の）５００の結合アイランドのそれぞれに異なるタイプの生体分子を固定化し、５００アイランドのアレイにおいてそれぞれのタイプの生体分子の位置をあらかじめ決めた状態にすることができる。望むのであれば、この手続きを９６ウエル・プレート内の９６個のウエル（あるいは基板上でサイズと方向がそのようなウエルと同じ９６の領域それぞれ）に対して繰り返すことにより、それぞれが所定の空間的方向性を持った異なる５００タイプの生体分子のアレイを９６個コピーして作ることができる。このような実施態様では、９６の異なる生体分子の溶液のうちの１つを９６ウエルのそれぞれに入れる（あるいは基板上でサイズと方向がそのようなウエルと同じ９６の領域それぞれに載せる）ことにより、異なる５００タイプの生体分子に対して同時に９６の異なる処理を行なうことができる。
【０１１３】
ＭＣＰやアレイ形成装置などの方法を用いて表面に結合ＳＡＭのパターンを形成することができる。洗浄、滴下、スプレー、浸漬、ＭＣＰなどの方法を用いて結合アイランドを非結合領域で囲むことができる。一実施態様では、結合ＳＡＭのアイランドのすべてが同じＳＡＭを含んでいる。すなわち、結合アイランドのそれぞれが同じタイプまたはクラスの生体分子と結合することができる。このような実施態様は、例えば、アレイ形成装置を用いて特定の生体分子を各結合アイランドに移動させる場合に有効であろう。この場合、各結合アイランドは移動した任意の生体分子またはすべての生体分子と結合するが、生体分子が混合することはない。その理由は、第１にアレイ形成装置によって分離した状態が維持されていること、第２に、それぞれのタイプの生体分子が所定の結合アイランドと結合することにある。別の実施態様では、結合アイランドごとに、異なるタイプまたはクラスの生体分子に対して特異的なＳＦＭを含むことができる。このような実施態様は、生体分子を洗浄またはそれと同様の方法で結合アイランドのアレイに付着させる場合に特に有効であろう。それは、例えば、生体分子の供給源が、あらかじめ分画または区分していない生物サンプルの場合である。言い換えるならば、このような実施態様は、本発明のアレイが分離機能とともに固定化機能と局在化機能（すなわち所定の位置に生体分子を保持する機能）を実現することが望ましい用途で特に有効である。
【０１１４】
いくつかの実施態様では、単一のタイプの生体分子と結合しているか、あるいは結合するようにした２つ以上の結合アイランドを含むアレイを製造することが望ましかろう。同様に、いくつかの実施態様では、２つ以上のタイプの生体分子と結合しているか、あるいは結合できるアイランドを製造することが望ましかろう。
【０１１５】
これら実施態様では、本発明の他のいくつかの実施態様におけるのと同様、多数の生体分子（約５００）を、環境条件が異なっていて他の生体分子の混合物を含む９６の異なる溶液に同時に曝露することができる。９６ある溶液のそれぞれが５００種類の生体分子のそれぞれに及ぼす効果は、この明細書に記載した方法で評価することができる。アレイを製造すること、興味の対象である溶液にアレイを曝露すること、溶液と固定化された生体分子が互いの間に及ぼす効果を測定または観察することは、すべて、ハイスループットにすることと自動化することが可能なプロセスである。
【０１１６】
本発明のアレイ・システムは、ドラッグ・デリバリーに応用される。その応用として、一次スクリーニング、二次スクリーニング、標的の有効性確認が挙げられる。１つのアレイ上でいくつかのタンパク質間相互作用を調べることができるというのは、医薬品候補を単一の伝達経路中のいくつかの潜在的な標的に対してスクリーニングできることを意味する。医薬品間相互作用と、その相互作用が細胞、生体経路、生体分子に及ぼす効果も、本発明の方法とアレイを用いて調べることができる。医薬品の発見において一次スクリーニングからのヒットの特異性をチェックするのに必要なタイプのカウンター・アッセイも、本発明のアレイを用いて行なうことができる。本発明のアレイは多重化されているため、医薬品を発見する際のスクリーニング時間を短縮し、治療法の開発速度を上げることができよう。阻害剤をスクリーニングするためのキナーゼをベースとしたアレイは、例えばガンその他の疾患の診断や、農業分野のバイオテクノロジー（ＡｇＢｉｏ）で利用される。本発明のアレイは、診断においても役立つ。
【０１１７】
本発明のアレイは、生命科学の研究分野で生体内の経路を研究するツールとしても非常に有用である。本発明の方法とアレイを用いて調べることができる経路の具体例としては、成長／増殖／分化／ガン経路（例えばｓｒｃ経路）、インテグリン・スカフォールド／ＦＡＫにより活性化される経路、マイトジェン活性化プロテイン・キナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードなどが挙げられる。ＭＡＰＫカスケードの具体例としては、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路、ＰＫＣ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路、ＭＡＰＫへのシグナル伝達を行なうＧタンパク質結合受容体経路、ｐ３８ ＭＡＰＫ経路、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ経路が挙げられる。本発明の方法とアレイを用いて調べることができる経路の別の具体例としては、アポトーシス経路（例えばカスパーゼシグナル伝達経路、ｐ５３経路）、抗アポトーシス経路（例えばＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＢＡＤ経路、Ｂｃｌ−２経路）、翻訳制御経路（例えばｅＩＦ−２、ｅＩＦ−４、ｐ７０ Ｓ６キナーゼを調節する経路）、Ｗｎｔシグナル伝達経路、ＰＫＣ経路などが挙げられる。本発明の方法とアレイを用いて調べることができる経路のさらに別の具体例としては、リン脂質（ジアシルグリセロール／ＩＰ３）とＣａ２＋によって調節されるシグナル伝達経路（例えばＰＫＣ活性化ＭＡＰＫ、転写因子ＮＫ−ｋＢのＰＫＣ活性化、Ｃａ２＋／カルモジュリン活性化系（例えばＣａＭキナーゼＩＩファミリー経路））；ｃＡＭＰ媒介経路（例えばＰＫＡやＰＫＡ／ＣＲＥＢによるグリコーゲンの代謝調節）；ｃＧＭＰ媒介経路などが挙げられる。本発明の方法とアレイを用いて調べることができる経路のさらに別の具体例としては、細胞サイクル／チェックポイント制御経路（例えばサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）経路、Ｇ１／Ｓチェックポイント経路（例えばＣＤＫ４／６−サイクリンＤ、ＣＤＫ２−サイクリンＥ、Ｒｂ）、Ｇ２／Ｍ ＤＮＡ損傷チェックポイント経路（例えばｃｄｃ２−サイクリンＢキナーゼ））；致死受容体シグナル伝達経路（例えばＦａｓ／ＴＮＦＲ活性化カスパーゼ経路）；ミトコンドリアによるアポトーシスの制御と関係した経路；サイトカイン活性化経路；走化性と関係した経路；増殖因子活性化経路；イオンチャネル活性化経路、Ｇタンパク質結合受容体活性化経路、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）活性化経路などが挙げられる。ストレス活性化経路（例えば環境ストレスと炎症性サイトカインによって活性化されるｐ３８ ＭＡＰＫ経路）；環境ストレス、炎症性サイトカイン、増殖因子、ＧＰＣＲアゴニストによって活性化されるＳＡＰＫ／ＪＮＫシグナル伝達カスケード（例えばＲｈｏファミリー（Ｒａｃ、Ｒｈｏ、Ｃｄｃ４２）によって活性化されるものや、さまざまな因子（ｃ−ｊｕｎ、ＡＴＦ２、ｐ５３など）の活性化）も、本発明の方法とアレイを用いて調べることができる。本発明の方法とアレイを用いて調べることができる経路のさらに別の具体例としては、Ｊａｋ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路（例えばＩＬ−６受容体ファミリー経路）；ＩＬ−２受容体経路；ＴＧＦ−βスーパーファミリーシグナル伝達経路；細胞骨格経路（例えばＲｈｏサブファミリー（Ｒｈｏ、Ｒａｃ、ｃｄｃ４２）の調節によるアクチンの再構成）；凝固経路；呼吸経路；合成経路（例えばタンパク質合成経路、炭水化物合成経路、脂肪合成経路、脂質合成経路、ステロイド合成経路）；代謝経路（例えばグルコース合成経路、グリコーゲン産生経路、インスリン依存性経路）；異化経路；電子伝達に関係する経路；補体カスケードに関係する経路；免疫応答経路（例えば炎症経路）；アレルギー誘起経路；発生経路；細胞分化経路などが挙げられる。
【０１１８】
本発明の方法とアレイを用いて調べることができるタイプの生体分子の具体例として、タンパク質、ポリペプチド、炭水化物、脂質、ポリヌクレオチド、小分子、ステロイドなどと、これらの修飾形または誘導体が挙げられる。本発明の方法とアレイを用いて調べることができるクラスのタンパク質の具体例として、酵素（例えば、キナーゼ、ホスファターゼ、フリパーゼ、エステラーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リパーゼグリコシルトランスフェラーゼ、グリコシダーゼ、シンターゼ、ヒドロゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、カルボキシラーゼ、デカルボキシラーゼ、プロテアーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、グリコシダーゼ、ファルネシルトランスフェラーゼ、イソペプチダーゼ）；メチル化、脱メチル化、アセチル化、脱アセチル化、脂質化、脱脂質化、プレニル化、脱プレニル化、ユビキチン化、脱ユビキチン化、ヒドロキシル化、脱ヒドロキシル化、ニトロシル化、脱ニトロシル化、アロステリック転移、加水分解、解糖、電子伝達、呼吸、生体異物処理、代謝、異化変性を行なう酵素；受容体、転写因子、構造タンパク質などと、これらの誘導体（例えば糖タンパク質や糖脂質など）が挙げられる。
【０１１９】
本発明のアレイ・システムを用いて他の生体プロセス（例えば生体異物の代謝）を調べることもできる。例えば、シトクロムＰ４５０のイソ酵素のアレイをインビトロでのＡＤＭＥ−ｔｏｘの研究に使用し、インビボでのＡＤＭＥ−ｔｏｘの研究で用いる高価な化合物の数を減らすことができる。本発明のアレイは、ＡＤＭＥの吸収、分布、代謝、排泄の研究にも用いることができる。
【０１２０】
この明細書で参照したあらゆる出版物、特許、特許出願は、参考として、それぞれの内容がこの明細書の中に記載されているのかのごとくに組み込まれている。
【０１２１】
このように本発明をいくつかの好ましい実施態様を参照して説明したからには、当業者であれば、この明細書と実施例を考察することによって他の実施態様も簡単に思いつくであろう。この明細書は、実施例も含め、単なる例示であることに注意されたい。
【０１２２】
実施例１
（末端にＥＧ３を有するチオールの背景の中に）末端にＣＯＯＨを有するチオールをＥＤＣ／ＮＨＳカップリングと、ビオチン−アミンと、ストレプトアビジンとを用いてあらかじめ微小接触印刷してある表面に、チロシンキナーゼの基質としてビオチニル化されたペプチドのアレイを固定化した。図４を参照のこと。次に、ｐ６０ｃ−ｓｒｃ（キナーゼであるｓｒｃファミリーのうちの１つ）とＡＴＰを含む溶液をアレイ上に置き、酵素により、リン酸基を基質のチロシン残基に付加した。次に、チロシンリン酸基と特異的に結合する一次抗体をアレイ上でインキュベートした。次に、一次抗体が認識するフルオレセインで標識した二次抗体をアレイ上でインキュベートした。次に、結合した二次抗体からの蛍光を、立方体のフルオレセインを備えた蛍光顕微鏡を用いて検出した（励起４８０ｎｍ；放出５３０ｎｍ）。
【０１２３】
この実験と３つの対照実験（酵素なし；基質なし；末端にＣＨ３を有するＳＡＭを微小接触印刷したもの）から、キナーゼという酵素によってリン酸基がアレイ上に付加されることがわかった。この結果を図５に示してある。
【０１２４】
実施例２
キナーゼの基質となるように設計した多数のペプチド（１０〜１０００個の範囲）を、適切なロボット式液体供給法を利用して結合ＳＡＭアイランドを有する表面の上にアレイ状にする。ペプチド群のいくつかのアレイは、“アレイのアレイ”を生み出す。ペプチドを表面に固定化した後、その表面を洗浄する。次に、１つのキナーゼ、または所定のキナーゼ群を発現している細胞のライセートのいずれかと、ＡＴＰと、塩と、緩衝液とを含む溶液を、あらかじめ形成したペプチド・アレイと接触させる。多数の異なる溶液またはライセートをテストする場合には、それぞれの溶液を“アレイのアレイ”内の個々のアレイに供給する。
【０１２５】
固定化されたペプチドをキナーゼでリン酸化させる（一般に３７℃にて３０分間）。次に、基板を８ｍＭのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液と、０．０１％トゥイーン−２０（界面活性剤）を含むトリス緩衝生理緩衝液の中で洗浄する。次に、ペプチドがどの程度リン酸化されたかを、抗リン特異抗体と、現像したときに色彩または蛍光が現われる二次抗体を用いて検出する。
【０１２６】
次に、測光スキャナーまたは蛍光スキャナーを用い、アレイの各要素がどの程度リン酸化されたかを定量する。このデータからリン酸化の“フィンガープリント”が得られ、それを解析することにより、テストしたサンプル（アレイ状になったペプチドのこのサンプルに対する活性はわかっている）中の特定のキナーゼの活性がわかる。したがってこの方法は、個々の経路におけるキナーゼの活性を細胞ライセートから直接明らかにする手段を提供する。キナーゼ阻害剤も研究することができる。図６を参照のこと。
【０１２７】
実施例３
本発明のアレイは、Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＭＡＰＫ経路を調べるのにも使用できよう。このセリン／トレオニン・リン酸化カスケードがＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）を活性化し、増殖と分化を開始させる。この経路の概略を図３に示してある。この経路の阻害剤を抗ガン剤や抗炎症剤として用いる研究が進められている。このアレイでは、この経路に関係する２つのタンパク質が表面に固定化される。すなわち、不活性なＭＥＫと不活性なＭＡＰＫである。タンパク質アレイの上の溶液は、活性なＲａｆ酵素とＭＥＫ酵素のほか、この経路の潜在的な阻害剤とＡＴＰを含んでいる。このアレイは、溶液に含まれるＲａｆおよび／またはＭＥＫの潜在的な阻害剤に曝露される。アレイ上のアッセイ用溶液をインキュベートした後、ＭＥＫとＭＡＰＫのリン酸化された残基に対して特異的な抗体をアレイ上でインキュベートする。固定化された酵素がＲａｆまたはＭＥＫによってリン酸化されるのをこの阻害剤が妨げるのであれば、抗体は結合せず、したがって洗浄後に抗体が検出されることはなかろう。阻害剤の特異性と効率に応じ、異なった蛍光スポットが現われることになる。
【０１２８】
図３では、固定化されたＭＥＫとＭＡＰＫを含む４つのアレイが、ＭＥＫおよび／またはＲａｆの潜在的なさまざまな阻害剤を含む４つの溶液（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）のうちの１つに曝露される。観察されるリン酸化パターンに基づくと、溶液ＡはＲａｆの活性な阻害剤もＭＥＫの活性な阻害剤も含んでいないこと、溶液ＢはＲａｆの阻害剤を含んでいるがＭＥＫの阻害剤は含んでいないこと、溶液ＣはＭＥＫの阻害剤を含んでいるがＲａｆの阻害剤は含んでいないこと、溶液ＤはＲａｆの阻害剤とＭＥＫの阻害剤の両方を含んでいることがわかる。
【０１２９】
実施例４
適切なロボット式液体供給法により、シグナル伝達経路のリン酸化された個々の要素と特異的に結合する多数の抗体（一般に１００以上）を表面にアレイ状にする。例えば、抗リンＭＡＰＫ、抗リンＭＥＫ、抗リンＭＥＫＫを表面にアレイ状にする。次に、あらかじめシグナル伝達カスケードを活性化した細胞ライセート、あるいはあらかじめ所定の遺伝子をノックアウトした細胞ライセートを、抗体アレイに曝露する。インキュベーションの後、抗体アレイに対する結合度を適切な検出法（例えばＳＰＲやＥＬＩＳＡ）で読み取る。リン−タンパク質が対応する抗体に結合した量は、シグナル伝達カスケードの個々の要素の活性度を表わしている。
【０１３０】
実施例５
反応性ＳＡＭを、特定の酵素に対する基質となるペプチドを含む溶液でコーティングする。インキュベーションすることによってペプチドを固定化した後、表面を洗浄する。次に、１つまたはいくつかの細胞ライセートを、表面、ＡＴＰ、塩、緩衝液とともにインキュベートする。次にペプチドのリン酸化の程度をリン特異抗体を用いて調べると、細胞ライセート中のキナーゼの活性を定量することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、アルカンチオールの微小接触印刷を利用して金の表面に生体分子アレイを構成する方法の概略図である。アレイのパターンは、印刷に使用するスタンプ面の凹凸構造に応じて異なる。
【図２】
図２は、自己集合単分子膜（ＳＡＭ）の分子構造に関する概略図である。ＳＡＭを形成する分子部分の機能を矢印の右側に示してある。
【図３】
図３には、Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＭＡＰＫ経路（左）と、この経路の阻害剤を分析するのに使用できる本発明のアレイ（右）の概略図が含まれる。
【図４】
図４は、アレイで使用する表面に、基質となる生体分子としてペプチドを固定化する方法の一例を示した概略図である。
【図５】
図５は、図４に示した固定化されたペプチドのアレイを用いたアッセイにより得られた結果を示している。
【図６】
図６は、固定化されたキナーゼの基質の多重化生体分子アレイの図である。このアレイは、経路の分析に用いることができよう。この図からわかるように、キナーゼとキナーゼ阻害剤の混合物を添加する。リン酸化された基質に対する蛍光標識抗体とともにこのアレイをインキュベートすると、どの基質がリン酸化されたかを検出することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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