(57)【要約】本発明は、共通の配列領域に属する新規な一群のα-アミラーゼおよび該α-アミラーゼと十分に類似するデンプン分解機能を有するタンパク質、その製造方法、ならびに、該デンプン分解タンパク質の種々の可能な用途、特に洗浄剤および浄化剤における用途に関する。さらに本発明は、単離されたゲノムＤＮＡから、特に微生物の収集物から単離されたＤＮＡから、新規α-アミラーゼを同定および製造するためのＰＣＲに基づく方法、ならびに、特定のプライマーオリゴヌクレオチドおよび該方法におけるその利用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
デンプン分解タンパク質であって、そのアミノ酸配列がアミノ酸配列部分を含んでなり、該部分の９８％、好ましくは９９％、特に好ましくは１００％が、配列番号２６３のコンセンサス配列によって、特に８〜９３位に対応するサブ領域によって示されるデンプン分解タンパク質。
【請求項２】
デンプン分解タンパク質であって、そのアミノ酸配列がアミノ酸配列部分を含んでなり、該部分が、配列番号３４〜配列番号２６２に示すアミノ酸配列のいずれかと、特に配列番号２６３のコンセンサス配列に従って８〜９３位に対応するサブ領域において、９８％、好ましくは９９％、特に好ましくは１００％同一であるデンプン分解タンパク質。
【請求項３】
デンプン分解タンパク質であって、そのアミノ酸配列がアミノ酸配列部分を含んでなり、該部分が、特に配列番号２６３のコンセンサス配列に従って８〜９３位に対応するサブ領域において、配列番号４５、８３、９７、９８、１０１、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、２３２、２３４、２３６、２３８、２３９および２４１に示すアミノ酸配列のいずれかと９８％、好ましくは９９％、特に好ましくは１００％同一であるか、または、各相同位置でこれら配列のいずれかに直接由来を求めることができるデンプン分解タンパク質。
【請求項４】
デンプン分解タンパク質であって、そのアミノ酸配列がアミノ酸配列部分を含んでなり、該部分が、配列番号２、４および２０８に示すアミノ酸配列のいずれかと、特に配列番号２６３のコンセンサス配列に従って８〜９３位に対応するサブ領域において、９５％、好ましくは９７.５％、特に好ましくは１００％同一であるデンプン分解タンパク質。
【請求項５】
デンプン分解タンパク質であって、そのアミノ酸配列が、個々の相同位置のそれぞれにおいて、２つの配列、すなわち配列番号６および配列番号８のどちらかに、好ましくは直接的に、保存的置換によって由来を求めることができるデンプン分解タンパク質。
【請求項６】
配列番号６に示すアミノ酸配列と、好ましくは３１〜４６１位において、少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有するデンプン分解タンパク質。
【請求項７】
配列番号６に示すアミノ酸配列と、好ましくは３１〜４６１位、特に好ましくは２１０〜３００位において、少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するデンプン分解タンパク質。
【請求項８】
配列番号６に示すアミノ酸配列と、好ましくは３１〜４６１位、特に好ましくは２１０〜３００位において、同一であるアミノ酸配列を有するデンプン分解タンパク質。
【請求項９】
配列番号８に示すアミノ酸配列と、好ましくは３０〜４４８位、特に好ましくは２００〜２９６位において、少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するデンプン分解タンパク質。
【請求項１０】
配列番号８に示すアミノ酸配列と、好ましくは３０〜４４８位、特に好ましくは２００〜２９６位において、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するデンプン分解タンパク質。
【請求項１１】
配列番号８に示すアミノ酸配列と、好ましくは３０〜４４位、特に好ましくは２００〜２９６位において、同一であるアミノ酸配列を有するデンプン分解タンパク質。
【請求項１２】
欠失突然変異によって得ることができる請求項１〜１１のいずれかに記載のデンプン分解タンパク質またはデンプン分解タンパク質の断片。
【請求項１３】
少なくともデンプン分解活性を付与する部分に、請求項１〜１２のいずれかに記載のタンパク質、特に請求項１〜１２のいずれかに記載の成熟タンパク質、特に配列番号２６３に従って８〜９３位に対応する部分を含んでなる、挿入突然変異によって得ることができるデンプン分解タンパク質またはデンプン分解キメラタンパク質。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載のタンパク質のデンプン分解誘導体。
【請求項１５】
少なくとも１つの抗原決定基を請求項１〜１４に記載のタンパク質または誘導体のいずれかと共有しているデンプン分解タンパク質または誘導体。
【請求項１６】
天然生物、特に微生物から得ることができることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれかに記載のデンプン分解タンパク質または誘導体。
【請求項１７】
微生物がグラム陽性細菌であることを特徴とする請求項１６に記載のデンプン分解タンパク質または誘導体。
【請求項１８】
グラム陽性細菌が放線菌目のいずれかの細菌であることを特徴とする請求項１７に記載のデンプン分解タンパク質または誘導体。
【請求項１９】
細菌がストレプトミセス属の種であることを特徴とする請求項１８に記載のデンプン分解タンパク質または誘導体。
【請求項２０】
細菌がストレプトミセス種Ｂ３２７＊またはストレプトミセス種Ｂ４００Ｂであることを特徴とする請求項１９に記載のデンプン分解タンパク質または誘導体。
【請求項２１】
デンプン分解タンパク質をコードする核酸であって、該デンプン分解タンパク質のアミノ酸配列がアミノ酸配列部分を含んでなり、該部分の９８％、好ましくは９９％、特に好ましくは１００％が、配列番号２６３のコンセンサス配列によって、特に８〜９３位に対応するサブ領域によって示されるデンプン分解タンパク質をコードする核酸。
【請求項２２】
デンプン分解タンパク質をコードする核酸であって、該デンプン分解タンパク質のアミノ酸配列がアミノ酸配列部分を含んでなり、該部分が、配列番号３４〜配列番号２６２に示すアミノ酸配列のいずれかと、特に配列番号２６３のコンセンサス配列に従って８〜９３位に対応するサブ領域において、９８％、好ましくは９９％、特に好ましくは１００％同一であるデンプン分解タンパク質をコードする核酸。
【請求項２３】
デンプン分解タンパク質をコードする核酸であって、該デンプン分解タンパク質のアミノ酸配列がアミノ酸配列部分を含んでなり、該部分が、特に配列番号２６３のコンセンサス配列に従って８〜９３位に対応するサブ領域において、配列番号４５、８３、９７、９８、１０１、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、２３２、２３４、２３６、２３８、２３９および２４１に示すアミノ酸配列のいずれかと９８％、好ましくは９９％、特に好ましくは１００％同一であるか、または、各相同位置でこれら配列のいずれかに直接由来を求めることができるデンプン分解タンパク質をコードする核酸。
【請求項２４】
デンプン分解タンパク質をコードする核酸であって、該デンプン分解タンパク質のアミノ酸配列がアミノ酸配列部分を含んでなり、該部分が、配列番号２、４および２０８に示すアミノ酸配列のいずれかと、特に配列番号２６３のコンセンサス配列に従って８〜９３位に対応するサブ領域において、９５％、好ましくは９７.５％、特に好ましくは１００％同一であるデンプン分解タンパク質をコードする核酸、特に好ましくは配列番号１または３に示すヌクレオチド配列を有する核酸。
【請求項２５】
デンプン分解タンパク質をコードする核酸であって、該デンプン分解タンパク質のアミノ酸配列が、個々の相同位置のそれぞれにおいて、２つの配列、すなわち配列番号６および配列番号８のどちらかに、好ましくは直接的に、保存的置換によって由来を求めることができるデンプン分解タンパク質をコードする核酸。
【請求項２６】
配列番号５に示すヌクレオチド配列と、好ましくは９１〜１３８３位において、特に好ましくは６２８〜９００位において、少なくとも８５％同一である配列を有する、デンプン分解タンパク質をコードする核酸。
【請求項２７】
配列番号５に示すヌクレオチド配列と、好ましくは９１〜１３８３位において、特に好ましくは６２８〜９００位において、少なくとも９２.５％同一である配列を有する、デンプン分解タンパク質をコードする核酸。
【請求項２８】
配列番号５に示すヌクレオチド配列と、好ましくは９１〜１３８３位において、特に好ましくは６２８〜９００位において、同一である配列を有する、デンプン分解タンパク質をコードする核酸。
【請求項２９】
配列番号７に示すヌクレオチド配列と、好ましくは８８〜１３７４位において、特に好ましくは５９８〜８８８位において、少なくとも８５％同一である配列を有する、デンプン分解タンパク質をコードする核酸。
【請求項３０】
配列番号７に示すヌクレオチド配列と、好ましくは８８〜１３７４位において、特に好ましくは５９８〜８８８位において、少なくとも９０％同一である配列を有する、デンプン分解タンパク質をコードする核酸。
【請求項３１】
配列番号７に示すヌクレオチド配列と、好ましくは８８〜１３７４位において、特に好ましくは５９８〜８８８位において、同一である配列を有する、デンプン分解タンパク質をコードする核酸。
【請求項３２】
請求項１２〜１５に記載のデンプン分解タンパク質または断片をコードする核酸。
【請求項３３】
配列番号９〜３３に示す配列のいずれか、特に配列番号９〜１２に示す配列のいずれかを有するオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
請求項１６〜２０に記載の生物のいずれかの中に天然に存在し、好ましくは該生物によりタンパク質合成に天然に利用されていることを特徴とする、デンプン分解タンパク質をコードする核酸。
【請求項３５】
配列表の配列番号２６３、好ましくは配列番号３４〜２６２、特に好ましくは配列番号２、４、６または８に記載のタンパク質またはタンパク質断片のいずれかをコードする核酸を含む天然生物。
【請求項３６】
微生物、好ましくは細菌、特に好ましくはグラム陽性細菌であることを特徴とする請求項３５に記載の生物。
【請求項３７】
グラム陽性細菌が、放線菌目のいずれかの細菌、特にストレプトミセス属のいずれかの細菌であることを特徴とする請求項３６に記載の生物。
【請求項３８】
ストレプトミセス属の細菌が、ストレプトミセス種３２７＊またはストレプトミセス種Ｂ４００Ｂ、特に２つの菌株ＤＳＭ１３９９０およびＤＳＭ１３９９１のどちらかであることを特徴とする請求項３７に記載の生物。
【請求項３９】
生物または核酸の収集物から新規なアミラーゼを同定および/または取得するためのＰＣＲに基づく方法であって、それぞれの場合に、可変性３'領域および既知アミラーゼの領域に高度に相同な５'領域を有するＰＣＲプライマーを使用することを特徴とする方法。
【請求項４０】
得られた遺伝子または遺伝子断片を配列決定することを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
免疫化学的方法で、既知アミラーゼのエピトープ、好ましくは請求項１〜２０のいずれかに記載のタンパク質または誘導体のエピトープが検定されるペプチドが、得られた遺伝子または遺伝子断片に由来することを特徴とする、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
デンプン分解活性への寄与が検定されるペプチド、好ましくは該ペプチドによって完全に発揮されるデンプン分解活性が検定されるペプチドが、得られた遺伝子または遺伝子断片に由来することを特徴とする、請求項３９〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
少なくとも１つのＰＣＲプライマーの３'領域が高度に可変性であり、そして/または少なくとも１つのＰＣＲプライマーの５'領域が、既知アミラーゼの領域に高度に相同であることを特徴とする、請求項３９〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
少なくとも１つのＰＣＲプライマーの５'領域が、保存されたアミラーゼドメインに対応する配列領域、好ましくはストレプトミセス・グリセウスα-アミラーゼのアミノ酸位置(Ａ)５８〜９１、(Ｂ)９４〜１４１、(Ｃ)１５５〜２０７、(Ｄ)２９５〜３４５、または(Ｅ)３９２〜４２７に対応する領域、特に好ましくは(αβ)８バレル構造のドメインβ４またはβ７のどちらかに対応する領域に由来することを特徴とする、請求項３９〜４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
請求項１〜２０のいずれかに記載のタンパク質または断片のアミノ酸配列のいずれかから導くことができる１つの、好ましくは２つのＰＣＲプライマーを使用することを特徴とする、請求項３９〜４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
請求項２１〜３４のいずれかに記載のヌクレオチド配列のいずれかから直接得られる１つの、好ましくは２つのＰＣＲプライマーを使用することを特徴とする、請求項３９〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
少なくとも１つのプライマーが、配列表の配列番号９〜３３に示す配列のいずれか、特に配列表の配列番号９〜１２に示す配列のいずれかを含むことを特徴とする、請求項３９〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
プライマーを、配列番号９と配列番号１０の組み合わせまたは配列番号１１と配列番号１２の組み合わせで使用することを特徴とする請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
使用するテンプレートＤＮＡが、生物、細胞培養物、分離物または培養された個々の菌株の単離された核酸であるか、または生物、細胞培養物、分離物、培養された個々の菌株もしくは単離された核酸の集合の単離された核酸であることを特徴とする、請求項３９〜４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
使用するテンプレートＤＮＡが、微生物、特に細菌、特に好ましくはグラム陽性細菌の単離された核酸であることを特徴とする、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
放線菌目の細菌、特にストレプトミセス属の細菌が関わることを特徴とする、請求項４９および５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
ストレプトミセス属の細菌が、ストレプトミセス種３２７＊またはストレプトミセス種Ｂ４００Ｂ、特に２つの菌株ＤＳＭ１３９９０およびＤＳＭ１３９９１のどちらかであることを特徴とする、請求項４９〜５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
得られた遺伝子または遺伝子断片を発現遺伝子ライブラリーに組み込み、次に、その発現遺伝子ライブラリーを、デンプン分解タンパク質またはデンプン分解タンパク質の断片について、好ましくは核酸のハイブリダイゼーションによって、または免疫化学的方法によって、または活性測定によって検定することを特徴とする、請求項３９〜５２のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
転写および翻訳制御要素、および所望であれば、陽性の場合に全体としてアミラーゼ活性の結果を与えるアミラーゼ遺伝子の１個または複数個の断片を提供する発現ベクター中に、単離されたＤＮＡを導入することを特徴とする、請求項３９〜５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
活性検定が、
(ａ)遺伝子ライブラリー、好ましくは全長遺伝子を含む遺伝子ライブラリーを、得られたＰＣＲ断片またはそれに由来するプローブを用いてスクリーニングする工程、
(ｂ)そのようにして同定された遺伝子または遺伝子断片を発現させる工程、および
(ｃ)該発現によって得られるタンパク質またはタンパク質断片のデンプン分解活性への寄与を測定する工程、
を含んでなることを特徴とする、請求項３９〜５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
ＰＣＲ後に得た核酸または全長遺伝子をクローニングベクターに組み込み、宿主細胞中に導入した後、活性検定を行うことを特徴とする、請求項３９〜５５のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
宿主細胞が、エシェリキア属、ストレプトミセス属およびバチルス属の菌株であることを特徴とする、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
共通のコンセンサス配列を有する少なくとも２種類のアミノ酸配列が、特に個々のドメイン、部分活性、構造要素または全長遺伝子および/またはタンパク質により得られるように、多くの異なるＰＣＲテンプレートで実行または反復される、請求項３９〜５７のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
コンセンサス配列に含まれる少なくとも２つの配列の配列一致度が少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、特に好ましくは少なくとも５０％であるようなコンセンサス配列が得られることを特徴とする、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
デンプン分解タンパク質を同定するための、好ましくは請求項３９〜５９のいずれかに記載の方法における、請求項１〜２０のいずれかに記載のタンパク質または誘導体の使用。
【請求項６１】
新規なアミラーゼを同定および/または取得するための、好ましくは請求項３９〜５９のいずれかに記載の方法における、請求項２１〜３４のいずれかに記載の核酸の使用。
【請求項６２】
別のタンパク質に融合または結合するための、特に新規な酵素の開発を行うための、請求項３９〜５９のいずれかに記載の方法によって得られるタンパク質の使用。
【請求項６３】
別の核酸に融合するための、特に新規な酵素を開発するための、請求項３７〜５７のいずれかに記載の方法によって得られる核酸の使用。
【請求項６４】
標的融合、特にアミノ酸配列の高度に相同な領域または核酸の共通する制限切断部位を利用するか、ＰＣＲに基づく融合による標的融合のための、請求項６２または６３に記載の使用。
【請求項６５】
ランダム組換え法、特にアミノ酸配列の高度に相同な領域または核酸の共通する制限切断部位を利用するか、ＰＣＲに基づく融合によるランダム組換え法のための、請求項６２または６３に記載の使用。
【請求項６６】
請求項２１〜３４のいずれかに記載の核酸領域を含むベクター。
【請求項６７】
請求項６６に記載のクローニングベクター。
【請求項６８】
請求項６６に記載の発現ベクター。
【請求項６９】
請求項１〜２０のいずれかに記載のタンパク質または誘導体のいずれかを、好ましくは請求項６８に記載の発現ベクターを用いて、発現させるかまたは発現させるように誘導することができる宿主細胞。
【請求項７０】
細菌、特に産生したタンパク質または誘導体を周囲培地中に分泌する細菌であることを特徴とする、請求項６９に記載の宿主細胞。
【請求項７１】
グラム陽性細菌であることを特徴とする請求項７０に記載の宿主細胞。
【請求項７２】
グラム陽性細菌がバチルス属、好ましくは、バチルス・リケニフォルミス種、バチルス・アミロリクエファシエンス種、バチルス・スブチリス種またはバチルス・アルカロフィルス種に属することを特徴とする、請求項７１に記載の宿主細胞。
【請求項７３】
放線菌目、特にストレプトミセス属、好ましくはストレプトミセス・リビダンス種、特に好ましくはストレプトミセス・リビダンスＴＫ２４、またはストレプトミセス種３２７＊もしくはストレプトミセス種Ｂ４００Ｂ、特に２つの菌株ＤＳＭ１３９９０またはＤＳＭ１３９９１のどちらかに属することを特徴とする、請求項７１に記載の宿主細胞。
【請求項７４】
グラム陰性細菌であることを特徴とする請求項７０に記載の宿主細胞。
【請求項７５】
エシェリキア属、好ましくはエシェリキア・コリ種、特に好ましくはエシェリキア・コリＪＭ１０９株、エシェリキア・コリＤＨ１００Ｂ株およびエシェリキア・コリＤＨ１２Ｓ株のいずれかに属することを特徴とする、請求項７４に記載の宿主細胞。
【請求項７６】
真核細胞、特に産生されたタンパク質を翻訳後修飾する真核細胞であることを特徴とする、請求項６９に記載の宿主細胞。
【請求項７７】
請求項１〜２０のいずれかに記載のタンパク質または誘導体を製造する方法であって、請求項２１〜３４のいずれかに記載の核酸を用いて、そして/または請求項６６〜６８のいずれかに記載のベクターを用いて、そして/または請求項６９〜７６のいずれかに記載の宿主細胞を用いて、または該タンパク質または誘導体を天然に産生する細胞、特に請求項３５〜３８のいずれかに記載の細胞を用いて製造する方法。
【請求項７８】
請求項１〜２０のいずれかに記載のタンパク質または誘導体を含むことを特徴とする、洗浄剤または浄化剤。
【請求項７９】
織物の製造において原材料または中間体を処理するための、特に綿布を糊抜きするための、請求項１〜２０のいずれかに記載のタンパク質または誘導体の使用。
【請求項８０】
デンプン液化、特にエタノール製造のための方法であって、請求項１〜２０のいずれかに記載のタンパク質または誘導体を使用することを特徴とする方法。
【請求項８１】
直鎖および/または短鎖のオリゴ糖を製造するための、請求項１〜２０のいずれかに記載のタンパク質または誘導体の使用。
【請求項８２】
シクロデキストリンを加水分解するための、請求項１〜２０のいずれかに記載のタンパク質または誘導体の使用。
【請求項８３】
多糖支持体またはシクロデキストリンから低分子量化合物を放出させるための、請求項１〜２０のいずれかに記載のタンパク質または誘導体の使用。
【請求項８４】
食品および/または食品成分を製造するための、請求項１〜２０のいずれかに記載のタンパク質または誘導体の使用。
【請求項８５】
動物用飼料および/または動物用飼料成分を製造するための、請求項１〜２０のいずれかに記載のタンパク質または誘導体の使用。
【請求項８６】
デンプン含有接着剤結合を溶解するための、請求項１〜２０のいずれかに記載のタンパク質または誘導体の使用。
【請求項８７】
請求項１〜２０のいずれかに記載のタンパク質または誘導体を使用することを特徴とする一時的結合方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共通する配列領域に属する新規な一群のα-アミラーゼ、および該アミラーゼと十分に類似するデンプン分解機能を有するタンパク質、その製造方法、ならびに該デンプン分解タンパク質の種々の可能な用途、特に洗浄剤および浄化剤における用途に関する。さらに本発明は、単離されたゲノムＤＮＡから、特に微生物の収集物から単離されたＤＮＡから、新規α-アミラーゼを同定および製造するためのＰＣＲに基づく方法、ならびに、特定のプライマーオリゴヌクレオチドおよび該方法におけるその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
α-アミラーゼ(Ｅ.Ｃ.３.２.１.１)は、デンプンおよびデンプン様ポリマー、例えばアミラーゼ、アミロペクチンまたはグリコーゲンなどの、ポリマー内部に位置するα-１,４-グリコシド結合を加水分解して、デキストリンおよびβ-１,６-分岐オリゴ糖を生成させる。α-アミラーゼは、２つの理由から、産業上利用されている酵素のなかでも最も重要なものの１つであると言える。すなわち、１つには、多くの基質分解酵素と同様に、α-アミラーゼは、通常、微生物によって周囲培地に放出されるので、発酵および精製により、比較的わずかな労力で、培養培地から産業的規模でα-アミラーゼを得ることができる。また１つには、アミラーゼは広い応用範囲で必要とされている。
【０００３】
α-アミラーゼの産業上の用途のうち最初に挙げられるのは、グルコースシロップの製造である。他の例には、洗浄剤および浄化剤における活性成分としての使用、織物の製造における原材料の処理への使用、接着剤を製造するためまたは糖含有食品もしくは糖含有食品成分を製造するための使用がある。
【０００４】
特によく産業上利用されているアミラーゼの例は、Novo Nordisk A/S(デンマーク、バグスバエルト)がTermamyl(登録商標)の商標名で供給しているバチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)α-アミラーゼである。バチルス・スブチリス(B. subtilis)およびバチルス・アミロリクエファシエンス(B. amyloliquefaciens)にそれぞれ由来し、米国出願ＵＳ１２２７３７４に開示されているアミラーゼも、同じ会社からBAN(登録商標)という名称で販売されている。
【０００５】
このアミラーゼ分子およびその近縁体には、それらの酵素特性を特定用途に合わせて最適化することを目的とする数多くの発明において、種々の分子生物学的改変を用いて改良が施されている。そのような最適化には、例えば、基質特異性、種々の反応条件における酵素の安定性、または酵素活性そのものに関係するものがある。ここで挙げることができるそのような最適化の例には以下の特許出願がある：織物の糊付けに関するＥＰ０４１０４９８およびデンプン液化に関するＷＯ９６/０２６３３。
【０００６】
単にわずか数種類の既知出発酵素を最適化することからなる開発では、達成しうる結果にも限界があると考えられるので、類似の酵素を求めて、他の天然供給源の徹底的な探索も並行して行われている。例えば、ピメロバクター(Pimelobacter)、シュードモナス(Pseudomonas)およびサーマス(Thermus)などに由来するデンプン切断酵素が、食品製造、化粧品および医薬品用(ＥＰ０６３６６９３)として同定されている。また、それぞれ高温および強酸性反応条件でのデンプン液化用(ＥＰ０７２７４８５およびＷＯ９６/０２６３３)に、例えば、リゾビウム(Rhizobium)、アルスロバクター(Arthrobacter)、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)およびミクロコッカス(Micrococcus)(ＥＰ０６２８６３０)、ピロコッカス(Pyrococcus)(ＷＯ９４/１９４５４)ならびにスルファロバス(Sulfolobus)から、同じタイプの酵素が同定されている。アルカリ性ｐＨで使用するために、バチルス種(Bacillus sp.)のアミラーゼ(ＷＯ９５/２６３９７およびＷＯ９７/００３２４)が見い出されている。さまざまなバチルス(Bacillus)属の細菌に由来する他のアミラーゼ(ＥＰ０６７０３６７)は、界面活性剤に対する感受性が低いことから、洗浄剤または浄化剤での使用に適している。
【０００７】
特定の応用分野のために行われる、天然供給源から単離された酵素のさらなる最適化は、例えば分子生物学的方法(例えば、ＵＳ５１７１６７３またはＷＯ９９/２０７６８に従う)によって、または化学修飾(ＤＥ４０１３１４２)によって行うことができる。例えば特許出願ＷＯ９９/４３７９３には、既知のNovamyl(登録商標)α-アミラーゼの改良が記載されており、ここでは、分子生物学的方法を用いていくつかの類縁分子を構築するために、Novamyl(登録商標)と既知のシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ(ＣＧＴアーゼ)との配列類似性が利用されている。これらの類縁分子は、ＣＧＴアーゼに特異的なコンセンサス配列(ボックス)と機能とが追加されているα-アミラーゼであるか、逆にα-アミラーゼの特徴を示す領域および機能が追加されているＣＧＴアーゼ、またはこれら２分子のキメラである。この改良の目的は、上記の用途に合わせてNovamyl(登録商標)を最適化することである。
【０００８】
例えば特許出願ＷＯ９９/５７２５０では、洗浄剤および浄化剤での使用に適した酵素を、被洗浄物での有効酵素濃度を増加させる結合ドメインに、化学リンカーを介して連結することが教示されている。
【０００９】
最新の酵素開発指針の１つは、今までに得られたことのない特性を有する新規な酵素を得るために、互いに関連する既知タンパク質の要素をランダムな方法で組み合わせることからなる。そのような方法は「定方向進化(directed evolution)」という総称でも記載され、例えば以下の方法がこれに含まれる：ＳｔＥＰ法[Zhaoら(1998), Nat.Biotechnol., 第16巻, 258-261頁]、ランダムプライミング組換え[Shaoら(1998), Nucleic Acids Res., 第26巻, 681-683頁]、ＤＮＡシャフリング[Stemmer,W.P.C.(1994), Nature, 第370巻, 389-391頁)およびＲＡＣＨＩＴＴ[Coco,W.M.ら(2001), Nat.Biotechnol., 第19巻, 354-359頁]。
【００１０】
この種の方法による組換えでは、特定条件下でハイブリダイゼーションを達成するために、使用する各核酸上に十分に長い領域が存在する必要がある。アミノ酸レベルで互いに４５％を超える一致度を有する出発配列を、ハイブリダイゼーションの成功のために、また５０％を超える一致度を、相同組換えを起こすために、実用的とみなすべきである。互いに相同な少なくとも２種類の配列があれば、それだけで、該出発配列から組換えによって理論的に派生しうるすべての新規配列を包含する配列領域が規定される。そこから派生する核酸の組換えを、先行技術で確立された何らかの方法によって可能にすることができるのであれば、４５％未満の相同性を有する配列も使用することができる。
【００１１】
しかし、これらすべての開発にもかかわらず、現在産業上利用されているいくつかの無改変型または改良型の天然デンプン分解酵素に加えて、経験的に広い応用範囲を持ち、かつ特定用途向けの改良の出発点として、特にランダム組換え法において役立ちうる酵素を、さらに発見するという課題は、依然として残されている。
【００１２】
遺伝的に極めて多様な放線菌目のグラム陽性細菌、特にストレプトミセス属のグラム陽性細菌が、産業上の用途に適したデンプン分解タンパク質のために研究されたことは、今までほとんどない。この関連ではわずか２件の日本国特許出願が考えられるに過ぎない。特開昭６２-１４３９９９号公報には、洗浄剤または浄化剤での使用に適した、ストレプトミセス属の１種に由来するα-アミラーゼが開示されている。この生物、ストレプトミセス種(Strptomyces sp.)ＫＳＭ-９またはＦＥＲＭ Ｐ-７６２０は、自然生息地に由来し、アルカリ性培地中で生育する。上記の公報は、そのデンプン分解酵素を、酵素学的パラメーターと、洗浄剤および浄化剤における使用に関するその適性とによって説明しているに過ぎず、ＤＮＡ配列またはアミノ酸配列による説明はない。
【００１３】
特開２０００-６０５４６号公報に開示され、ストレプトミセス種ＴＯＴＯ-９８０５またはＦＥＲＭ ＢＰ-６３５９に由来する酵素は、ストレプトミセス種ＫＳＭ-９酵素と類似する酵素特性を有する。しかし、この出願でも、酵素は酵素学的パラメータを使って特徴づけられているに過ぎず、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列による特徴づけは為されていない。その結果、どちらのアミラーゼも、異種発現に利用したり、特定用途向けの選択および最適化に利用したりすることができない。なぜなら、伝統的な突然変異誘発法も定方向進化法(ＥＰ-ＰＣＲ、配列シャフリング、ファミリーシャフリング)も、対応する核酸配列に基づいているからである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって本発明は、主として、今までに記載されたことがなく、かつ考えられる産業上の用途にそれ自体が適しているか、または特定用途向けの改良を行う基礎として役立ちうる天然α-アミラーゼを同定するという目的に基づいている。
【００１５】
好ましくは、この目的は、互いに類縁関係にあって相同関係を示しうる複数のα-アミラーゼまたは複数のα-アミラーゼの部分配列を見い出すことによって達成されたとみなすべきである。なぜなら、そのような相同関係の表示によって、ある配列領域を導き出すことが可能であり、それはさらなる酵素を創製するための出発点として役立ちうるからである。可能な限り多様なα-アミラーゼ配列を発見することは、特に有益なはずである。なぜなら、それによって、相応に広い配列領域が開け、可能な変異の数もそれに応じて多くなるからである。また、その一方で、得られる配列間の相同性は、依然として、既知の方法による組換えが可能なほど十分に高くなければならない。好ましくは、少なくとも一部の配列が、それぞれアミノ酸レベルで互いに一致度５０〜６０％の相同性を有しているべきである。
【００１６】
目的の一部は、この種のα-アミラーゼをコードする核酸を取得することであった。なぜなら、生物工学的生産にも、これらの酵素の改良にも、これらの核酸は不可欠であるからである。
【００１７】
目的の別の部分は、上記のα-アミラーゼを天然に産生する生物を見い出すことであった。
【００１８】
目的の別の部分は、上記したようなα-アミラーゼのプールを提供する方法を見い出すことであった。
【００１９】
目的の別の部分として、取得したα-アミラーゼ、α-アミラーゼ断片、または得られたα-アミラーゼ遺伝子もしくはその断片は、新規な酵素の発見または開発に利用することができるはずである。
【００２０】
目的の別の部分は、見い出したα-アミラーゼまたは誘導しうるα-アミラーゼの生物工学的生産を可能にすることであった。
【００２１】
目的の別の部分は、見い出したα-アミラーゼについて、可能な産業上の用途を明確にすることであった。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
第１の目的は、本発明の第１の対象となるデンプン分解タンパク質であって、そのアミノ酸配列がアミノ酸配列部分を含んでなり、該部分の９８％、好ましくは９９％、特に好ましくは１００％が、配列番号２６３のコンセンサス配列によって、特に８〜９３位に対応するサブ領域によって示されるデンプン分解タンパク質によって達成される。これらには、配列表に配列番号３４〜２６２として示すアミノ酸配列を有するデンプン分解タンパク質、好ましくは実施例で述べる酵素、特にストレプトミセス種(Streptomyces sp.)Ｂ３２７＊およびＢ４００Ｂに由来する酵素、ならびに、それらと十分に類似する酵素またはそれらから自体公知の方法によって導くことができる酵素が包含される。好ましい代表例は、天然生物から、特に放線菌目の天然生物から、単離することができる。
【００２３】
上記の配列から相同関係の表示により、さらなる酵素の創製の出発点として役立ちうる配列領域を導き出すことができる。
【００２４】
第２に、本発明は、デンプン分解タンパク質をコードする核酸であって、該デンプン分解タンパク質のアミノ酸配列がアミノ酸配列部分を含んでなり、該部分の９８％、好ましくは９９％、特に好ましくは１００％が、配列番号２６３のコンセンサス配列によって、特に８〜９３位に対応するサブ領域によって示されるデンプン分解タンパク質をコードする核酸に関する。これに対応して、これらの核酸には、好ましくは、本発明の第１の対象である各タンパク質をコードする核酸が包含されるが、そのような遺伝子または遺伝子断片を見い出すための方法に使用することができる特定オリゴヌクレオチドも包含される(下記参照)。
【００２５】
第３に、本発明は、本発明の第１の対象であるタンパク質またはタンパク質断片をコードする核酸を含有する天然生物に関する。特に好ましいその態様は、それぞれＤＳＭ１３９９０およびＤＳＭ１３９９１として寄託されているストレプトミセス種３２７＊株およびストレプトミセス種Ｂ４００Ｂ株である。
【００２６】
第４に、本発明は、生物または核酸の収集物から新規なアミラーゼを同定および/または取得するためのＰＣＲに基づく方法であって、それぞれの場合に、可変性３'領域および既知アミラーゼの領域に高度に相同な５'領域を有するＰＣＲプライマーを使用することを特徴とする方法に関する。この種の方法はさまざまに設計することができ、随意の工程によって拡張することできる。それら随意の工程には、取得した遺伝子または遺伝子断片を配列決定する工程、免疫化学的方法によってまたはその生化学的特性によって特徴づけることができるペプチドを導き出す工程が包含される。さらなる態様は、プライマーが由来する領域の可変性または選択に関連したプライマーの設計に関する。特に、実施例で使用するプライマーは好ましい態様である。別の可能な態様は、ＰＣＲテンプレートとして役立つ物質の起源に関するものであり、放線菌目の収集物が好ましい。さらなる態様においては、ＰＣＲ産物を発現ライブラリーによって調べる。配列領域を規定するために利用しうる多数の類似産物をもたらす反応工程が特に好ましい。
【００２７】
第５に、本発明は、本発明の上記対象の方法によって得られるα-アミラーゼ、α-アミラーゼ断片、またはα-アミラーゼ遺伝子もしくはその断片を、そのまま新規プライマーのスクリーニングもしくは開発に使用することによって、または別のタンパク質もしくは遺伝子への融合もしくは連結に使用することによって、新規な酵素を発見または開発するための該α-アミラーゼ、α-アミラーゼ断片、またはα-アミラーゼ遺伝子もしくはその断片に関する。
【００２８】
第６に、本発明は、本発明の第２対象である核酸を有するベクター、そのようなベクターで形質転換された宿主細胞、ならびに、本発明の第１対象であるタンパク質または誘導体を製造するためのあらゆる生物工学的方法に関する。
【００２９】
第７に、本発明は、見い出されたα-アミラーゼの可能な産業上の用途に関する。これらには、本発明の第１対象であるタンパク質または誘導体を含むことを特徴とする洗浄剤または浄化剤、デンプン液化の方法、特にエタノールの製造方法、一時的結合方法、ならびに、種々の可能な使用、特に織物の製造における原材料または中間物の処理のための使用、特に綿布の糊抜きのための使用、直鎖および/または短鎖オリゴ糖の製造のための使用、シクロデキストリンの加水分解のための使用、多糖支持体またはシクロデキストリンからの低分子量化合物の放出のための使用、食品および/または食品成分の製造のための使用、動物用飼料および/または動物用飼料成分の製造のための使用、およびデンプン含有接着剤結合の溶解のための使用などが包含される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
タンパク質とは、本願では、天然アミノ酸から構成され、実質的に線状の構造を持ち、通常は３次元構造をとることによってその機能を発揮するポリマーを意味する。本願では、１９種類のタンパク質形成天然Ｌ-アミノ酸を国際的慣習により１文字および３文字記号で表す。
【００３１】
本願での酵素とは、特定の生化学的機能を発揮するタンパク質を意味する。デンプン分解タンパク質またはデンプン分解機能を有する酵素とは、多糖のα-１,４-グリコシド結合、特に多糖の内部に位置する結合を、加水分解するものを意味し、これはα-１,４-アミラーゼ(Ｅ.Ｃ.３.２.１.１)または略してα-アミラーゼとも呼ばれる。
【００３２】
多くのタンパク質は「プレタンパク質」として、すなわちシグナルペプチドを伴って、形成される。シグナルペプチドは、タンパク質のＮ末端部分であり、その機能は、通常、生成したタンパク質の、産生細胞からペリプラズムへのまたは周囲の培地への輸出および/またはその正しい折り畳みを確実にすることである。続いて、シグナルペプチドは、自然条件下でシグナルペプチダーゼにより、タンパク質の残りの部分から除去されるので、該タンパク質は、最初は存在していたＮ末端アミノ酸が存在しない状態で、その実際の触媒活性を発揮する。例えば、ストレプトミセス種Ｂ３２７＊由来の天然α-アミラーゼは、配列番号６に示すように、４６１アミノ酸長である。配列番号５に示すように、この酵素のシグナルペプチドは３０アミノ酸からなるので、成熟酵素は４３１アミノ酸の長さを有する。
【００３３】
成熟ペプチド、すなわちその生産後にプロセシングを受けた酵素は、それらが酵素活性を有することから、産業上の用途には、プレタンパク質よりも好ましい。
【００３４】
プロタンパク質は不活性前駆体型タンパク質である。シグナル配列を有する前駆体はプレプロタンパク質と呼ばれる。
【００３５】
核酸は、本願では、本来ヌクレオチドから構成され、情報担体として機能し、タンパク質または酵素の一次アミノ酸配列をコードする分子を意味する。核酸は一本鎖として、または該一本鎖に相補的な一本鎖として、または二本鎖として存在することができる。分子生物学的作業には、もともと耐久性が高い情報担体として核酸ＤＮＡが好ましい。これに対して、ＲＮＡは、自然環境で、例えば発現細胞中で、本発明を実施するために産生される。したがって本発明に不可欠なＲＮＡ分子も、本発明の態様である。
【００３６】
ＤＮＡの場合、両相補鎖の配列およびそれぞれについて可能な３つの読み枠のすべてを考慮しなければならない。異なるコドントリプレットが同じアミノ酸をコードしうるので、ある特定アミノ酸配列を、同一性が低い可能性もある複数の異なるヌクレオチド配列から導きうるという事実も考慮しなければならない(遺伝暗号の縮重)。さらに、これらのコドンの使い方は生物によって異なっている。これらの理由から、アミノ酸配列とヌクレオチド配列はどちらも保護範囲に含まれていなければならず、記載するヌクレオチド配列は、いずれの場合も、ある特定アミノ酸配列をコードする配列の一例であるにすぎないとみなすべきである。
【００３７】
１つのタンパク質に対応する情報単位を、本願では遺伝子ともいう。
【００３８】
当業者であれば、現在広く知られている方法、例えば化学合成またはポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)などを、分子生物学および/またはタンパク質化学の標準的方法と組み合わせることにより、既知のＤＮＡ配列および/またはアミノ酸配列に基づいて、適切な核酸から完全な遺伝子までを製造することができる。そのような方法は、例えば「Lexikon der Biochemie」(生化学辞典)[Spektrum Akademischer Verlag, ベルリン, 1999, 第1巻, 267-271および第2巻, 227-229頁]から既知である。
【００３９】
例えば自体公知の分子生物学的方法によって生じさせることができるヌクレオチド配列の変化は、突然変異と呼ばれる。変化の種類の応じて、例えば欠失、挿入または置換突然変異、または種々の遺伝子もしくは遺伝子の一部が互いに融合している変化(シャフリング)などが知られている。これらは遺伝子突然変異である。対応する生物は突然変異体と呼ばれる。突然変異した核酸から得られるタンパク質は変異体と呼ばれる。したがって、例えば欠失、挿入もしくは置換突然変異または融合は、欠失、挿入もしくは置換突然変異型遺伝子または融合遺伝子をもたらし、タンパク質レベルでは、対応する欠失、挿入もしくは置換変異体または融合タンパク質をもたらす。
【００４０】
断片とは、天然タンパク質または完全に翻訳された遺伝子に対応するタンパク質よりも小さい、あらゆるタンパク質またはペプチドを意味し、例えば合成的に得られるものであってもよい。これらの断片は、そのアミノ酸配列に基づいて、対応する完全タンパク質に関連づけることができる。それらは、例えば同じ構造をとったり、タンパク質分解活性を発揮したり、例えば基質の複合体化などの部分活性を発揮したりすることができる。出発タンパク質の断片と欠失変異体とは基本的にはよく似ているが、断片が比較的小さい部分を表すのに対して、欠失突然変異体は短い領域を、したがって個々の部分的機能を欠いているに過ぎない。
【００４１】
核酸レベルでは、部分配列は断片に相当する。
【００４２】
キメラタンパク質またはハイブリッドタンパク質とは、本願では、元々は同じ生物または異なる生物の異なるポリペプチド鎖に起源を有する複数の要素から構成されているタンパク質を意味する。この手法はシャフリングまたは融合突然変異誘発とも呼ばれる。そのような融合の目的としては、例えば融合相手であるタンパク質部分を利用して、特定の酵素機能を引き出すまたは改変することなどを挙げることができる。そのようなキメラタンパク質が１本のポリペプチド鎖からなっているか、それとも異なる機能を割り当てることができる複数のサブユニットからなっているかは、本発明では重要でない。後者の選択肢を実行するには、例えば１本のキメラポリペプチド鎖を、翻訳後または精製工程後に、特異的タンパク質分解切断により、複数のポリペプチド鎖に分解することができる。
【００４３】
挿入突然変異によって得られたタンパク質とは、自体公知の方法を使って、核酸断片またはタンパク質断片を出発配列中に挿入することによって得られた変異体を意味する。これらは、その基本的な類似性ゆえに、キメラタンパク質に分類されるべきである。キメラタンパク質との違いは、タンパク質全体の大きさに対する無改変タンパク質部分の大きさの比率だけである。このような挿入突然変異型タンパク質では、外来タンパク質の割合がキメラタンパク質の場合よりも低い。
【００４４】
逆位突然変異誘発、すなわち部分配列の反転は、欠失と挿入の両方の特殊な形態であるとみなすことができる。これは、元のアミノ酸配列から逸脱する、さまざまな分子部分の再編成にも当てはまる。このような再編成は、元のタンパク質の欠失変異体、挿入変異体およびシャフリング変異体とみなすことができる。
【００４５】
誘導体とは、本発明では、その純粋なアミノ酸鎖が化学修飾されているタンパク質を意味する。これらの誘導体化は、例えば宿主生物によるタンパク質生合成に関連して、生物学的に行うことができる。この場合には、分子生物学的方法を使用することができる。しかし、この誘導体化は、例えばアミノ酸側鎖の化学変換や、当該タンパク質に別の化合物を共有結合することなどによって、化学的に行うこともできる。そのような化合物は、例えば、二官能性化学化合物などを介して本発明のタンパク質に結合される他のタンパク質であってもよい。そのような修飾は、例えば基質特異性または基質への結合の強さに影響を及ぼしたり、結合相手の物質が阻害剤である場合には、酵素活性の一時的な阻害を引き起こしたりすることができる。これは例えば貯蔵期間などに役立ちうる。また、誘導体化は、高分子支持体への共有結合をも意味する。
【００４６】
抗血清または特定抗体との反応によって、タンパク質を、免疫学的に関連した一群のタンパク質にまとめることもできる。ある群の構成要素は、それらが１つの抗体によって認識される同じ抗原決定基を有するという点で識別される。
【００４７】
本発明では、酵素、タンパク質、断片および誘導体はすべて、明示的にそのように呼ぶ必要がない限り、「タンパク質」という一般名に包含される。
【００４８】
ベクターとは、本発明では、核酸からなり、かつ特徴的な核酸領域として特定遺伝子を含んでいる要素を意味する。ベクターは、該遺伝子を、数世代または数細胞分裂にわたって、ある種または細胞株中の残りのゲノムから独立して複製する安定な遺伝子要素として確立させることができる。ベクターは、特に細菌中で使用する場合は、特殊なプラスミド、すなわち環状遺伝子要素である。貯蔵に用いられるベクター(したがって特定の範囲で遺伝子操作にも用いられるベクター)である「クローニングベクター」と、対象とする遺伝子を宿主細胞中で確立させる機能を果たすベクター(すなわち問題のタンパク質を発現させることができるベクター)とは、遺伝子工学では区別される。後者のベクターは発現ベクターと呼ばれる。
【００４９】
例えば、一般利用が可能なデータベースなどに登録されている既知の酵素と比較することにより、検討中の酵素の酵素活性を、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列から推定することが可能になる。該活性は、実際の反応には関与しない他のタンパク質領域により、質的または量的に改変することができる。これは、例えば酵素の安定性、活性、反応条件または基質特異性などに関係することもあるであろう。
【００５０】
そのような比較は、検討中のタンパク質のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列中の類似する配列を互いに関係づけることによって行われる。これは相同関係の表示と呼ばれる。関係する位置を一覧表の形式で互いに関係づけることをアラインメントという。ヌクレオチド配列を解析する場合は、やはり両方の相補鎖およびそれぞれについて可能な３つの読み枠すべてを、遺伝暗号の縮重およびその生物に特異的なコドン使用頻度と共に、考慮しなければならない。一方、アラインメントは、コンピュータプログラムにより、例えばＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴアルゴリズムによって作成される。この手法は、例えばD.J.LipmanおよびW.R.Pearson (1985)[Science, 第227巻, 1435-1441頁]により記載されている。
【００５１】
比較配列中のすべての一致位置をまとめたものをコンセンサス配列という。
【００５２】
そのような比較により、比較配列間の類似性または相同性に関する言及も可能になる。これは一致率(％)、すなわち、同じ位置にある同一ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の割合として表される。相同性という用語の、より広い定義では、保存されたアミノ酸置換もこの値に含まれる。その場合は、これを類似率(％)という。そのような言及は、タンパク質または遺伝子全体についても、また個別の領域のみについても行うことができる。
【００５３】
アラインメントの作成は配列空間を規定する際の第１段階である。この仮想的な空間は、個々の位置での置換によって導かれるすべての配列(該アラインメントの関係する個々の位置に存在するすべての変異を考慮することによって得られる)を包含する。仮想的に可能な各タンパク質分子は、該配列空間中の点である。例えば、実質的に同一であって２つの異なる位置のみにそれぞれ２つの異なるアミノ酸を有する２つのアミノ酸配列は、４つの異なるアミノ酸配列からなる配列空間を生成する。ある空間の個々の配列にそれぞれに相同な配列が他にも見つかる場合は、極めて大きな配列空間が得られる。それぞれ対で存在する上述のような高い相同性により、極めて低い相同性を有する配列も、１つの配列空間に属すると認識することが可能になる。
【００５４】
異なるタンパク質の相同領域は、一次アミノ酸配列の一致によって認識することができる同じ機能を有する領域である。これは、極めて小さい領域「ボックス」(これは、わずか数アミノ酸からなり、通常は全体の活性にとって不可欠な機能を発揮する)における完全な一致までの範囲にわたる。相同領域の機能とは、完全なタンパク質が発揮する機能のうちごく小さい部分的機能、例えば、基質複合体または遷移複合体を生成するための個々の水素結合の形成などを意味する。
【００５５】
したがって、本発明のデンプン分解タンパク質という用語は、α-１,４-グリコシド結合を加水分解する純粋な機能(これは、推定触媒活性部位の数個のアミノ酸残基に起因すると考えられる)を有するものだけを意味するのではない。この用語は、さらに、α-１,４-グリコシド結合の加水分解を支えるすべての機能を包含する。そのような機能は、例えば、個々のペプチドにより、そしてタンパク質の１個または複数個の個別の部分により、実際に触媒活性を有する領域に作用することによって達成されうる。デンプン分解機能という用語は、そのような修飾機能のみをも包含する。なぜなら、１つには、本発明タンパク質のどのアミノ酸残基が加水分解を実際に触媒するかは必ずしもわからないからであり、また１つには、特定の個別機能を、最初から決定的に、触媒作用への関与から除外することができないからである。補助機能または部分活性には、例えば基質の結合、中間体または最終生成物の結合、加水分解活性に対する調節作用の活性化または阻害または媒介などが含まれる。これは、例えば、シグナルペプチド(その機能は、産生したタンパク質の細胞外への輸出および/またはその正しい折り畳みに関係し、それがなければ通常は機能的な酵素がインビボで産生されない)または活性部位から遠く離れた位置にある構造要素の形成であってもよい。しかし全体として、結果は、デンプンまたはデンプン様ポリマーのα-１,４-グリコシド結合の加水分解でなければならない。
【００５６】
これに従えば、例えば配列表の配列番号３４〜２６２に示すα-アミラーゼの断片は、デンプン分解タンパク質であるとみなすべきである。なぜなら、これらは本来、全体としてデンプンまたはデンプン様ポリマーのα-１,４-グリコシド結合を加水分解することができる、より大きなタンパク質の成分であるためである。
【００５７】
本願の範囲内では、スクリーニング(ハイブリダイゼーションスクリーニングまたはＤＮＡスクリーニング)と活性検定とを区別しなければならない。一般に、形質転換体の「スクリーニング」とは、所望の形質転換現象を起こしているクローンを同定するのに適した検出反応を意味する。これは通常、例えば、周知の青-白選択の場合のように、組換えが行われた後に、形質転換体が獲得した生化学的活性の検出、またはもはや存在しない生化学的活性の検出に対応している。この種の生化学的検出反応を、本願では活性検定という。
【００５８】
スクリーニングは、特定の核酸を含む遺伝子ライブラリーのスクリーニング、およびそれによって可能になる十分に類似する核酸配列の同定を指す。これは、先行技術から極めてよく知られているように、例えばサザンブロットまたはノーザンブロットハイブリダイゼーションなどによって行われる。しかしこの用語は、例えば、生物または核酸の収集物から新規な遺伝子を同定および/または取得するためのＰＣＲに基づく本発明の方法であって、可変性３'領域および既知遺伝子の対応する領域に高い相同性を有する５'領域を有するＰＣＲプライマーを使用することを特徴とする方法なども包含する。
【００５９】
酵素の性能とは、それぞれの場合に考慮される産業分野におけるその有効性を意味する。該性能は実際の酵素活性に基づくが、特定プロセスに関係する他の因子にも依存する。そのような因子には、例えば、安定性、基質結合、該基質を運搬する物質との相互作用、または他の成分との相互作用、特に相乗作用などが含まれる。したがって、例えばある酵素が洗浄剤または浄化剤への使用に適しているかどうかを検討するには、他の成分と共に製剤化された製剤の洗浄または浄化性能に対するその寄与を考慮する。さまざまな産業上の用途に合わせて、自体公知の分子生物学的技術、特に上述の技術によって、酵素を改良し最適化することができる。
【００６０】
以下の微生物は、１９７７年４月２８日に作成された微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて、２００１年１月１５日に、ＤＳＭＺ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(ドイツ、ブラウンシュワイク３８１２４、マシェロダー・ヴェク１ベー)に寄託されている。放線菌目/ストレプトミセス種Ｂ３２７＊(受託番号ＤＳＭ１３９９０)分離物および放線菌目/ストレプトミセス種Ｂ４００Ｂ(受託番号ＤＳＭ１３９９１)分離物。
【００６１】
本願によれば、上記の微生物は、特に、それらがα-アミラーゼの遺伝子を含んでいることを特徴とする(その完全ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列表の配列番号５および６ならびに配列番号７および８に示されている)。
【００６２】
上記の目的は、本発明が、α-アミラーゼの部分配列、すなわちアミラーゼに知られている(αβ)８バレル構造要素の一部によって規定される特定配列空間の標本とみなすべきである複数のα-アミラーゼを提供することによって達成される。該特定配列空間に属する部分を含むアミノ酸配列を有する任意のデンプン分解タンパク質および十分に類似するタンパク質が、本発明のアミラーゼである。
【００６３】
上記の配列空間を、図３および配列表の配列番号２６３に２種類の方法で、すなわち省略形として、または見い出されるすべての配列の組み合わせとして記載する。これは、デンプン分解タンパク質の１００個の位置からなる部分配列を示す。これらの位置のうち８６個で配列変異が起こる。例えば、図３の６位は、イソロイシンまたはロイシンであることができるアミノ酸Ｘ０で占められている。同じ情報は配列表にもコンセンサス配列の前に記載されており、その後に、考えうるすべての配列が人工コンセンサス配列にまとめられている。個々の位置のアミノ酸、例えば２８位のアミノ酸は、１つのアミノ酸で占められている場合も、２以上のアミノ酸の配列で占められている場合もある。
【００６４】
示したコンセンサス配列は、１〜７位および９４〜１００位には極めて低い変異のみを有する。これは、この配列を同定するために開発したＰＣＲに基づく方法(この方法については以下に詳述し実施例でも説明する)に起因するものである。すなわち、これらの部分配列は、増幅に使用したプライマーが結合するＤＮＡ領域に対応する。この結合を行う条件のストリンジェンシーに応じて、異なるヌクレオチド配列も結合し増幅されるであろう。したがって、選択性が比較的低ければ、得られるＤＮＡ産物はこれらの部位でもテンプレートと完全には一致しない。そのため保護範囲は、特に、示したコンセンサス配列の８〜９３位に対応するサブ領域がその対象になる。
【００６５】
配列空間を記述するこのコンセンサス配列は、相同関係の表示が可能な２３１のα-アミラーゼの部分配列に基づいている。これらの部分配列は、配列表の配列番号２、４および配列番号３４〜２６２に記載されており、指定した個々の位置におけるそれらの変異によって上記の配列空間を規定する。
【００６６】
この種のコンセンサス配列の導出を以下に例示する。技術的な詳細は、それぞれ本願の実施例に見い出すことができる。
【００６７】
例えば、放線菌目のさまざまな属[ストレプトミセス(Streptomyces)、サーモモノスポラ(Thermomonospora)など]のグラム陽性真正細菌のα-アミラーゼ(Ｅ.Ｃ.３.２.１.１)の配列は、一般利用が可能なデータベースから取得することができる。それらを、例えばアラインメントの作成などによって比較すれば、種間で保存されている配列領域を同定することができる。広い配列空間は、可変配列領域に隣接する保存領域を検出することによって得られる。これらの保存領域は配列アンカーとも呼ばれる。なぜなら、可変配列領域はそれらを介して利用できるようになるからである。図１で強調表示されているブロックＡ〜Ｅは、保存配列ブロックとして同定された。それらのアミノ酸配列から、より好ましくはそれらのヌクレオチド配列からＰＣＲプライマーを導くことができ、それらのＰＣＲプライマーはフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして、いずれの場合もＰＣＲが可変領域を含むような形で、互いに向き合っているべきである。
【００６８】
適切なＰＣＲ用テンプレートとしては、例えば土壌試料から分離された既知または未知の細菌分離物のゲノムＤＮＡ調製物を挙げることができる。それらは、後に純粋なＰＣＲ産物および純粋な酵素が得られるように、純粋培養として利用可能であるべきである。この種の試料は単に自然界から採取して、適切な単細胞生物が増殖する特定の条件(例えばｐＨ、通気、資化可能基質、本来なら毒性である化合物の存在、照明など)を適用することによって培養することができ、増殖した適切な単細胞生物を、自体公知の方法によって分離し、適切な条件下でさらに培養することができる。
【００６９】
以下に挙げる論文は、放線菌類およびストレプトミセス科の菌を分離する方法を概説している：
・Nueesch (1965)「Isolierung und Selektionierung von Actinomyceten」Zbl.Bakt.I., Supplement 1, p.234-252；
・WilliamsおよびCross (1971)「Actinomyces」；Norris,J.R., Ribbons,D.W.編, 「Methods in Microbiology」(Acad. Press, ロンドン), Volume 4, p.295-334；
・WilliamsおよびWellington (1982)「Principles and Problems of selective Isolation of Microbes」；Bullock,J.D., Nisbet,L.J., Win-Stanley,D.J.編「Bioactive Microbial Products: Search and Discovery」(Acad. Press, ロンドン), p.9-26；および
・WellingtonおよびCross (1983)「Taxonomy of antibiotic-producing actinomyces and new approaches for their selective isolation」, Progr.Industr.Microbiol., Volume 17, p.7-36。
【００７０】
実施例では、ストレプトミセス属の特性を有する放線菌目分離物の適切な収集物を使用した。この実施例では、分離を土壌試料から始めて、付随微生物叢を抑制するために抗生物質ニスタチンを添加して行った。
【００７１】
陽性結果は、対応するＰＣＲ混合物から、特にプライマーの組み合わせＧＥＸ０２４(フォワード)/ＧＥＸ０２６(それぞれ配列番号９および１０)を用いて得られた。これらのプライマーは、配列領域Ｃ(ＧＥＸ０２４)およびＤ(ＧＥＸ０２６)(図１)から導かれたものであり、論文「Alpha-Amylase family: molecular biology and evolution」[Janecek,S. (1997), Prog.Biophys.Mol.Biol. 67(1), p.67-97)に規定されている(αβ)８バレル構造のアミラーゼドメインβ４およびβ７に対応する。上記のプライマーは、検定したすべての分離物の約３００ｂｐ長のＰＣＲ産物を与えた。
【００７２】
上記のＰＣＲ産物を配列決定した。推定アミノ酸配列を、配列表の配列番号２、４および３４〜２６２に列挙する。これらの部分配列を、ＧｅｎＢａｎｋ酵素データベース[米国国立衛生研究所、国立バイオテクノロジー情報センター(ＮＣＢＩ)、米国メリーランド州ベセスダ]の登録配列と比較すると、これらの部分配列はすべてアミラーゼ部分配列であることが確認される。この比較の結果を表１に示す。この表には、各場合について、見い出された部分配列について最も類似しているデータベース登録配列およびそれら２つの配列間の相同性の程度をも記載する。
【００７３】
表１：２３１個の個々の配列およびＧｅｎＢａｎｋ(ＮＣＢＩ；リリース１２１.０)中の最も近い類縁配列に対する一致率(ＦＡＳＴＡプログラムにより２００１年２月２日に決定)
【表１−１】
2004530442.tif 000002
【表１−２】
2004530442.tif 000003
【表１−３】
2004530442.tif 000004
【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
2004530442.tif 000007
【表１−７】
2004530442.tif 000008
【００７４】
データベースに登録されている配列との比較から、最も類似しているタンパク質は９７％の相同性を有することがわかる。ストレプトミセス種Ｂ１０５３のα-アミラーゼの場合、最も類似するタンパク質は受託番号Ｍ１８２４４の酵素であり、これはストレプトミセス・リモスス(Streptomyces limosus)のα-アミラーゼである。ストレプトミセス種Ｂ１０４３ＡおよびＢ３９２Ａの酵素の場合は、受託番号ＡＬ３５２９５６の酵素[ストレプトミセス・セリカラー(Streptomyces coelicolor)Ａ３(２)のα-アミラーゼ]である。また、ストレプトミセス種Ｂ１０４７Ａ１のα-アミラーゼの場合は、受託番号Ｚ８５９４９の酵素であり、これはストレプトミセス・リビダンス(Streptomyces lividans)のα-アミラーゼＢである。
【００７５】
これら２３１個の配列のアラインメントが可能である。本願実施例では、そのようなアラインメントの１つを、Clustal X(登録商標)プログラム、バージョン１.６４ｂ[標準設定；Thompson,J.D., Higgins,D.G.およびGibson,T.J. (1994)「CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position specific gap penalties and weight matrix choice」, Nucleic Acids Res., 第22巻, 4673-4680頁に記載]を用いて作成した。上述したように、コンセンサス配列は、図３および配列番号２６３に２種類の表現方法で記載されている。
【００７６】
このコンセンサス配列、したがって可変性アミノ酸によって規定される対応する配列空間は、天然供給源から得られた２３１個の個々の配列に基づいている。該配列空間は、計算上、約１０５１種類のアミノ酸配列を含み、それらはすべて、該コンセンサス配列によって記述される。一方、これらの配列のいずれかに対して９７％を超える一致を示す相同領域を有するアミラーゼは今まで知られていない。
【００７７】
したがって、このコンセンサス配列は全く新規なα-アミラーゼ群を規定する。それは図１に示した２つの保存領域ＣとＤの間に位置する領域を示す。この領域は、二次構造要素、すなわち、S.Janecekの論文 (1997)[Prog.Biophys.Mol.Biol. 67(1), p.67-97]に規定されている(αβ)８バレル構造のドメインβ４およびβ７であり、α-アミラーゼ酵素ファミリーに特有かつ必要な構造要素と考えられる。なぜなら、これは、分子の他の機能的部分、特に活性部位の最適な空間配置を保証するからである。
【００７８】
しかしそれとは無関係に、新たに見い出されるまたは作成される配列には、ドメインの異なる再編成も考えられる。したがって、配列番号２６３のコンセンサス配列によって記述することができる部分配列を任意の位置に含むα-アミラーゼも、すべて本発明の態様である。
【００７９】
上記の配列空間内のアミノ酸配列は望ましい程度に一致している。例えば、ストレプトミセス種Ｂ３２７＊およびＢ４００Ｂのα-アミラーゼの２つの部分配列は、アミノ酸レベルで５７％の一致度で互いに相同である。全体では、２３１個の個々の配列のうちの２つについて決定される最小値はアミノ酸レベルで一致度３２％であり、最大値は９９％であった。したがって、見い出された各配列は、該配列空間内の他のどの配列に対しても少なくとも３２％は一致している。一部の値がこの値よりもかなり高いことは、表１の値に基づいて推定することができる通りである。これは、同じ既知タンパク質がさまざまな配列に最も類似していることが多いことがわかったからである。
【００８０】
使用する配列間のアミノ酸レベルで３０％を超える相同性は、ランダム組換え[例えば、Zhaoら(1998), Nat.Biotechnol., Volume 16, p.258-261、Shaoら(1998), Nucleic Acids Res., Volume 26, p.681-683またはStemmer,W.P.C.(1994), Nature, Volume 370, p.389-391に従って]によって新規な酵素を得る方法に必要であると考えられ、４５％を超える値が有利である。この配列空間、特に実際に開示するその標本の提供により、十分な配列相同性を有する関連配列のプールが提供され、それにより、用途に応じたさらなる最適化を定方向進化によって行うことが可能になる。一方、その多様性からは、例えば至適温度または外部からの影響に対する安定性などに関して、さまざまなデンプン分解特性が示唆される。
【００８１】
上記の配列空間またはそれに由来する群、いわば配列サブ空間に属するあらゆる分子を、上記の方法のために選択することができる。これは、どのくらいの数の変異体を作成すべきか、または特定のサブ領域だけを変異させるべきかどうかに依存する。該空間に属する配列のうち２つだけでも、独立した配列(サブ)空間が規定される。
【００８２】
コンセンサス配列では、個々の位置、例えばアミノ酸２８の位置などに、２個以上のアミノ酸からなる配列が許されること、また４５位または７０位などの他の位置は空いていてもよいことから、１００個のアミノ酸位置によって定義されるこのコンセンサス配列内でも、パーセンテージが整数でない相同性が得られる場合がある。
【００８３】
このため、デンプン分解タンパク質であって、そのアミノ酸配列がアミノ酸配列部分を含んでなり、該部分の９８％、より好ましくは９８.２５％、９８.５％、９８.７５％、９９％、９９.２５％、９９.５％、９９.７５％、特に好ましくは１００％が、配列番号２６３のコンセンサス配列によって規定されるあらゆるデンプン分解タンパク質が、本発明による特許請求の対象である。上述のように、これは、特に８〜９３位に対応するサブ領域に当てはまる。
【００８４】
この議論は、特に、デンプン分解タンパク質であって、そのアミノ酸配列がアミノ酸配列部分を含んでなり、該部分の９８％、より好ましくは９８.２５％、９８.５％、９８.７５％、９９％、９９.２５％、９９.５％、９９.７５％、特に好ましくは１００％が、配列番号３４〜配列番号２６２に示すアミノ酸配列のいずれかと、特に配列番号２６３のコンセンサス配列に従って８〜９３位に対応するサブ領域にわたって同一であるデンプン分解タンパク質に当てはまる。
【００８５】
関連部分配列を、上記のタンパク質について上記のように決定し、配列表に記載する。表１に示したデータベース検索により、表示した部分配列のいずれかを含むα-アミラーゼは今まで知られていないという結果を得た。見い出された相同性で最も高い値は９７％であった(上記参照)。これらのアミノ酸配列は１つの配列空間を規定し、その配列空間も保護範囲に包含される。すなわち、該配列空間の各点は、本発明の部分配列であり、所期の目的の解決手段である。
【００８６】
特に、コンセンサス配列中で、常にそれぞれヒスチジンおよびロイシンで占められている明らかに高度に保存された１１位および７５位の一方または両方に、保存された置換を有する酵素は、保護範囲に包含される。該置換には、塩基性アミノ酸リジン、アルギニンまたはプロリンのいずれかによるヒスチジンの置換、および/または、脂肪族アミノ酸グリシン、アラニン、バリンまたはイソロイシンのいずれかによるロイシンの置換が含まれる。
【００８７】
上記の配列空間のα-アミラーゼは、該α-アミラーゼをコードする上記遺伝子を、プライマーのペアーＧＥＸ０２４/ＧＥＸ０２６と共に、ＰＣＲにおけるテンプレートとして使用して、配列番号２６３のコンセンサス配列によって規定することが可能な断片であって配列表に示す部分配列のいずれかと同一である断片を増幅しうることを特徴とする。ＰＣＲの性質のゆえに、８〜９３位のサブ領域は、この断片にとって特に特徴的である。
【００８８】
このことを、以下のストレプトミセス種の菌株：Ｂ１０１Ａ、Ｂ１１４Ｃ、Ｂ１３４、Ｂ１３５Ａ、Ｂ１３８Ａ、Ｂ１５２Ａ、Ｂ１５３(Ｂ)、Ｂ１５６Ｂ、Ｂ１５７Ｃ、Ｂ１５８Ａ、Ｂ１６０Ｂ、Ｂ１６１Ａ、Ｂ３７３、Ｂ３７５、Ｂ３８０、Ｂ３９０、Ｂ３９２ＡおよびＢ３９４について実施例１に示す。さまざまな自然生息地から得た上記の放線菌目分離物のゲノムＤＮＡのＰＣＲ産物の配列決定と、対応するアミノ酸配列の推定とにより、配列表に以下の番号：４５、８３、９７、９８、１０１、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、２３２、２３４、２３６、２３８、２３９および２４１で示す配列を得た。
【００８９】
表１からわかるように、ストレプトミセス種Ｂ３９２Ａ株のアミラーゼは、コンセンサス配列の領域内で、既知α-アミラーゼに対して、本明細書に列挙したアミラーゼの中で最も高い相同性を有している。この相同性は、ストレプトミセス・セリカラーＡ３(２)のα-アミラーゼ(データベース登録配列ＡＬ３５２９５６)に対して９７％である。これらのアミノ酸配列は、配列番号２６３のコンセンサス配列によって規定される配列空間のサブ空間であって、好ましい保護範囲に包含される配列空間を規定する。したがって、該配列空間の各点は、本発明の部分配列であり、所期の目的の好ましい解決手段である。
【００９０】
換言すると、あるサブ領域内で配列番号２６３のコンセンサス配列との相同関係を示すことができるアミノ酸配列であって、その領域内にこれら３つの配列のいずれかにおいて対応する位置にあるアミノ酸だけを有するアミノ酸配列を有するα-アミラーゼは、いずれも特許請求の対象である。これによれば、それらは、上記部分の各位置において、上記配列のいずれかに由来を求めることができる。
【００９１】
このため、デンプン分解タンパク質であって、そのアミノ酸配列がアミノ酸配列部分を含んでなり、該部分が、上記配列のいずれかに対して９８％、より好ましくは９８.２５％、９８.５％、９８.７５％、９９％、９９.２５％、９９.５％、９９.７５％、特に好ましくは１００％同一であるか、または、各相同位置でこれら配列のいずれかに直接由来を求めることができるデンプン分解タンパク質は、いずれも本発明による特許請求の対象である。上述のように、これは特に、８〜９３位に対応するサブ領域に当てはまる。
【００９２】
実施例では、ストレプトミセス種のＢ３２７＊、Ｂ４００ＢおよびＢ３２７株のα-アミラーゼをさらに詳しく調べる。コンセンサス配列(配列番号２６３)に対応するこれらのアミラーゼのサブ領域を、配列表の配列番号２、４および２０８に示す。データベース検索によって決定すると、ストレプトミセス種Ｂ３２７Ｂのα-アミラーゼは、これらのアミラーゼのいずれに対しても、最も高度な相同性を有することが表１からわかる。この相同性は、ストレプトミセス・グリセウス(Streptomyces griseus)のα-アミラーゼ(データベース登録配列Ｘ５７５６８)に対して９４％の一致度である。
【００９３】
該アミノ酸配列は、配列番号２６３のコンセンサス配列によって規定される配列空間のサブ空間であって、特に好ましい保護範囲に包含される配列空間を規定する。したがって該配列によって規定される配列空間の各点は、本発明の部分配列であり、所期の目的の特に好ましい解決手段である。それらは、配列番号２６３のコンセンサス配列に対応する領域全体のアラインメントにより、連続するアミノ酸位置において、それぞれ上記出発配列のいずれかで同じ部位にあるアミノ酸を用いて導くことができる。
【００９４】
このため、デンプン分解タンパク質であって、そのアミノ酸配列がアミノ酸配列部分を含んでなり、該部分が、これらの配列のいずれかと９５％、より好ましくは９６％、９６.５％、９７％、９７.５％、９８％、９８.５％、９９％、９９.５％、特に好ましくは１００％同一であるデンプン分解タンパク質はいずれも、本発明による特許請求の対象である。上述のようにこれは特に、８〜９３位に対応するサブ領域に当てはまる。
【００９５】
例えば、図５のアラインメントからわかるように、ストレプトミセス種Ｂ３２７＊およびＢ４００Ｂ株のα-アミラーゼは、そのアミノ酸配列の全長にわたって、互いに５７％の一致度で相同である。この値から見て、これらは、デンプン分解タンパク質の新規な配列を作成するためのランダム法に特に適しているようである。
【００９６】
これら２つのデンプン分解酵素は、それぞれ配列番号６および８に示すその全アミノ酸配列により、完全タンパク質に対応する別個の配列空間を規定する。関連する位置に示されたアミノ酸の組換えによってこれら２つの配列から導くことができるこの空間の他の構成員も、本発明の目的を満たす。それらは、図５に対応するアラインメントにより、２つの出発配列のどちらかの相同な部位に位置するアミノ酸が占めている上記位置のそれぞれによって、推定することができる。
【００９７】
本発明によれば、ここで保存性置換も可能なはずである。それらには、以下のアミノ酸群内での置換が含まれる：
・脂肪族アミノ酸：Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ；
・硫黄含有アミノ酸：Ｃ、Ｍ；
・芳香族アミノ酸：Ｆ、Ｙ、Ｗ；
・ヒドロキシル基含有アミノ酸：Ｓ、Ｔ；
・酸アミド基含有アミノ酸：Ｎ、Ｑ；
・酸性アミノ酸：Ｄ、Ｅ；
・塩基性アミノ酸：Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｐ。
【００９８】
２つの出発配列のいずれかに直接由来を求めることができるアミノ酸位置、すなわち指定された２つのアミノ酸の一方と同一であるアミノ酸位置は、上記の保存性置換よりも好ましい。
【００９９】
したがって、個々の相同位置で、保存的置換により、好ましくは直接的に、ストレプトミセス種Ｂ３２７＊およびＢ４００Ｂの２つの配列のどちらかに由来を求めることができるアミノ酸配列を有するデンプン加水分解タンパク質はいずれも、本発明の保護範囲に包含される。
【０１００】
所期の目的は、好ましくは、配列番号６に示すアミノ酸配列に、３１〜４６１位が、特に好ましくは２１０〜３００位が、少なくとも９３％同一であるアミノ酸配列を有するデンプン分解タンパク質によって達成される。該アミノ酸配列は、ストレプトミセス種Ｂ３２７＊放線菌目分離物に由来する本発明のα-アミラーゼのアミノ酸配列である。
【０１０１】
本願の実施例４は、完全な遺伝子を含むそのような配列を取得する方法を、詳しく例示する。この目的を達成するには、発現遺伝子ライブラリーを作製するのが好都合である。すなわち、特別な遺伝子を見い出そうとする出発生物のゲノムＤＮＡを断片化し、分離された宿主生物内で発現させる。
【０１０２】
遺伝子、少なくとも放線菌目のα-アミラーゼ遺伝子は、実施例４に示すように、異種宿主生物エシェリキア・コリ(Escherichia coli)で発現クローニングを行うことによって、クローニングし、単離することができる。Horinouchiら[Horinouchi,S., Uouzumi,T., Beppu,T.(1980)「Cloning of Streptomyces DNA into Escherichia coli: Absence of Heterospecific Gene Expression of Streptomyces Genes in E. coli」, Agric.Biol.Chem., Volume 44(2), p.367-381]によれば、エシェリキア・コリ(E. coli)宿主生物では放線菌類由来のプロモーターの異種認識を前提とすることはできない。したがって、外来の誘導性プロモーター、例えばＩＰＴＧ(イソプロピルチオガラクトシド)による誘導が可能なエシェリキア・コリｌａｃオペロンのβ-ガラクトシダーゼプロモーター(ｌａｃプロモーター)などを使用する方が得策である。したがって、ｌａｃＩｑ遺伝子型を有する宿主菌株(例えばＪＭ１０９)では、該プロモーターの制御下にある遺伝子の発現を、ＩＰＴＧの添加によって誘導することができる。
【０１０３】
エシェリキア・コリのＪＭ１０９株、ＤＨ１０Ｂ株およびＤＨ１２Ｓ株は、放線菌目に由来するα-アミラーゼのクローニングおよびその活性依存的検出に適していることがわかった。なぜなら、これらはｍａＩＳによってコードされるペリプラスム酵素を有する[Freundlieb,S., Boos,W.(1986)「Alpha-amylase of Escherichia coli, mapping and cloning of the structural gene, maIS, and identification of its product as a periplasmic protein」, J.Biol.Chem. 261(6), p.2946-2953]が、実験条件ではアミラーゼの有意な放出を示さなかったからである。(グラム陰性)のエシェリキア・コリＪＭ１０９株、ＤＨ１０Ｂ株およびＤＨ１２Ｓ株も、(グラム陽性)の放線菌目のアミラーゼ遺伝子のリボソーム結合部位(シャイン・ダルガノ配列)を認識し、アミノ末端シグナル配列を認識し、細胞外に輸送して、成熟酵素を産生する点に関して、適切な宿主であることがわかった。ストレプトミセス属のアミラーゼの発現も宿主細胞にとって無毒であることは、明らかであった。
【０１０４】
したがって、実施例４では、放線菌目分離物のうち、研究しようとする株から精製したゲノムＤＮＡを部分切断し、遺伝子の予想サイズに対して適度なサイズ範囲を、適切に線状化したプラスミドベクターに連結しなければならない。各遺伝子ライブラリーに関して作製すべきクローンの最小数は、平均インサートサイズおよび所望するゲノムのカバー率に基づく。放線菌目α-アミラーゼの場合、得られたインサートサイズは３〜５ｋｂ、取得すべきクローンの数は４０,０００であった。
【０１０５】
ゲノムライブラリーを作成する代わりに、ｍＲＮＡ、すなわち実際に発現される遺伝子に基づくｃＤＮＡライブラリーを構築することもできる。しかし、出発生物中で低くまたは弱く発現しているに過ぎない遺伝子の場合は、ゲノムライブラリーの方が陽性結果をもたらす可能性が高い。
【０１０６】
得られたクローンを、起こっている組換えに関して、例えば既知の青/白選択法によって検定し、最終的には目的のタンパク質の発現に関して検定する。本実施例では、α-アミラーゼをその酵素活性によって検出した。しかし他にも、例えば免疫化学的検出や、既知プローブを使ったハイブリダイゼーションによるスクリーニングなどを考えることができる。
【０１０７】
宿主細胞中で発現しているとしてもその発現が弱い遺伝子には、後者の選択肢は、特に適している。この目的には、例えば、実施例１〜３に記載のＰＣＲによって得ることができるような核酸断片を使用することができる。配列表に示す部分配列またはプライマー配列に基づいて得ることができるプローブも好適でありうる。アミノ酸配列をヌクレオチド配列に逆翻訳する際には、特定のコドン使用頻度を考慮すべきである。このコドン使用頻度は、遺伝子ライブラリーを作成する際に使用した出発生物に依存する。
【０１０８】
次に、陽性結果を示すクローンから対応するＤＮＡ配列を、自体公知の方法によって得ることができる。さらに前記のクローンは、これ以降に行われるすべてのクローニング、修飾などの出発点になる。
【０１０９】
ストレプトミセス種Ｂ３２７＊放線菌目分離物(実施例２参照)について、この方法で得られた完全ＤＮＡ配列およびそこから導き出したアミノ酸配列を、配列表の配列番号５および６に示す。
【０１１０】
ストレプトミセス種Ｂ３２７＊のα-アミラーゼ(配列番号５)のオープンリーディングフレームは、翻訳を開始するためにバリンではなくメチオニンに翻訳されるＧＴＧ開始コドンから始まる。これは配列表の「misc_feature」欄にも示されている。すなわち１〜３位について、特徴「INIT_MET」が適用される。また、リボソーム結合部位に対応する配列、すなわちシャイン-ダルガノ配列は、該開始コドンの上流１０ヌクレオチド以内に位置する。
【０１１１】
全体として、遺伝子は、合計４６１アミノ酸をコードする１３８６ヌクレオチドを含む。これらのうち最初の３０アミノ酸は、分泌酵素に予想することができる通り、グラム陽性細菌の典型的なシグナル配列であると予測される。これは、配列表(配列番号５)では、９１〜１３８３に適用される特徴「mat_peptide」によって示されている。なぜなら、この領域は成熟タンパク質をコードしているからである。アミノ酸配列(配列番号６)において、２０１〜３００位は、ＰＣＲタイピング(実施例３)でプライマー対ＧＥＸ０２４/ＧＥＸ０２６を使って増幅された領域に対応する。
【０１１２】
ストレプトミセス種Ｂ３２７＊α-アミラーゼの天然タンパク質および成熟タンパク質ならびに対応するヌクレオチド配列に関して得られたＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を使用し、最も類似する登録配列を調べるために、以下のデータベースを検索した：Ｇｅｎｐｅｐｔ/ＧｅｎＢａｎｋ[米国国立衛生研究所、国立バイオテクノロジー情報センター(ＮＣＢＩ)、米国メリーランド州ベセスダ]およびＳｗｉｓｓ-Ｐｒｏｔ[Geneva Bioinformatics (GeneBio) S.A、スイス・ジュネーブ；http://www/genebio.com/sprot.html]。検索は、異なる日に、それぞれ英国ケンブリッジのＥＭＢＬ-欧州バイオインフォマティクス研究所(ＥＢＩ)のサーバー(http://www.ebi.ac.uk)を通して行った。配列比較は、ＦＡＳＴＡ法[W.R.Pearson, D.J.Lipman, PNAS (1988) 85, p.2444-2448]に従って、すなわちＦａｓｔａ３プログラム(行列ｂｌｏｓｕｍ６２およびデフォルトパラメータ)を用いて行った。結果を表２に示す。
【０１１３】
表２：ストレプトミセス種Ｂ３２７＊α-アミラーゼの天然(完全)タンパク質および成熟タンパク質(リーダーペプチドなし)のアミノ酸配列ならびに対応するＤＮＡ配列を使用し、ＥＭＢＬサーバーを通して、それぞれＦＡＳＴＡプログラムを用いて行った、Ｇｅｎｐｅｐｔ/ＧｅｎＢａｎｋおよびＳｗｉｓｓ-Ｐｒｏｔデータベースの検索結果
【表２】
2004530442.tif 000009
【０１１４】
タンパク質レベルでは、ストレプトミセス種Ｂ３２７＊のα-アミラーゼは、ＧｅｎＢａｎｋデータベース登録配列Ｕ５１１２９に最も相同であり、その相同性は天然タンパク質の配列全体で一致度８０％、成熟タンパク質で８２.４％である。最も類似しているこの酵素は、ストレプトミセス・アルブス(Streptomyces albus)α-アミラーゼである。これに対し、Ｓｗｉｓｓ-Ｐｒｏｔデータベースの検索では、ベストヒットとして登録配列Ｐ２７３５０に関してそれぞれ一致度７８.７％および８１.２％の値が得られた。この登録配列は、ストレプトミセス・サーモビオラセウス(Streptomyces thermoviolaceus)α-アミラーゼである。図５に、ストレプトミセス種Ｂ３２７＊およびストレプトミセス・アルブスのα-アミラーゼのアミノ酸配列のアラインメントを示す。この図では、これらの配列をそれぞれＵ５１１２９およびＢ３２７＊と呼んでいる。
【０１１５】
したがって、配列番号６に示すアミノ酸配列と少なくとも８５％、より好ましくは８７.５％、９０％、９２.５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、特に好ましくは１００％同一であるアミノ酸配列を有するデンプン分解タンパク質はいずれも、本願の特許請求の対象である。これは好ましくは、成熟タンパク質の３１〜４６１位に当てはまる(すなわち、これを既知配列から推定することができる限り)。
【０１１６】
上記の一致度は、一致度９５％を超えるより好ましい態様の、好ましくは３１〜４６１位に、特に好ましくは２１０〜３００位に当てはまる。なぜなら、図３および配列番号２６３のコンセンサス配列に対応する後者のアミノ酸領域に最も類似することがわかった配列は、既に表１にも示したように、該領域に９２％同一であるデータベース登録配列であるからである。この登録配列はＹ１３３３２、すなわちストレプトミセス種ＴＯ１のα-アミラーゼである。
【０１１７】
本発明の目的は、特に、配列番号６に示すアミノ酸配列と、好ましくは３１〜４６１位において、特に好ましくは２１０〜３００位において同一であるアミノ酸配列を有するデンプン分解タンパク質によって達成される。
【０１１８】
ストレプトミセス種Ｂ３２７＊に見い出されるこのタンパク質は、実施例５および６で詳しく例示するように、さまざまな宿主細胞で異種発現させることができる。例えば、それ自体は測定可能な量のアミラーゼを液体培地中に分泌しないストレプトミセス・リビダンスＴＫ２４などを使用することができる。適切な発現ベクターの例は、発現ベクターｐＡＸ５ａ[Fass S.H., Engels,J.W. 1996, 「Influence of Specific Signal Peptide Mutations on the Expression and Secretion of the alpha-Amylase Inhibitor Tendamistat in Streptomyces lividans」, J.Blol.Chem., Volume 271 (Number 25), p.15244-15252；図６)である。このベクターにおける発現は、構成的ｅｒｍＥプロモーターの制御下にある。また、例えばエシェリキア・コリＤＨ１２Ｓなどにおける発現も可能である。
【０１１９】
実施例６では異種生物において産生させたこのタンパク質の酵素特性を調べる。これによれば、ストレプトミセス種Ｂ３２７＊α-アミラーゼの活性は４１.３℃で最大になる。該アミラーゼは、その活性で決定すると、弱酸性〜中性ｐＨの範囲で最も安定である。ＳＤＳを含まない媒質中よりも、低ＳＤＳ含量の媒質中の方が活性である。二価陽イオンのキレート剤の存在下では、活性はわずかに低下する。これらの特性から、ストレプトミセス種Ｂ３２７＊のα-アミラーゼは、産業的利用にとって、興味深い候補である。分子生物学的方法によるこの酵素の改良は、上に定義した類似性の範囲内で、本発明の保護範囲に包含される。
【０１２０】
このデンプン分解タンパク質の工業的利用について、例示を目的として以下により詳しく説明する。
【０１２１】
本発明のα-アミラーゼは、ストレプトミセス種Ｂ３２７＊のα-アミラーゼについて上述した方法と同じ方法で、放線菌目分離物Ｂ４００Ｂからも得ることができた。このＢ４００Ｂ由来のα-アミラーゼの全ＤＮＡ配列と、それから導かれるアミノ酸配列とを、配列表の配列番号７および８に示す。
【０１２２】
このヌクレオチド配列のオープンリーディングフレームは、全部で１３７７ヌクレオチドを含む。これはＴＴＧ開始コドンから始まるが、このコドンは、ストレプトミセス種Ｂ３２７＊の対応する酵素の場合と同様に、翻訳を開始するためにロイシンではなくメチオニンとして翻訳される。これは、配列表(配列番号７)の「misc_feature」欄にも示されている。すなわち１〜３位に特徴「INIT_MET」が適用される。また、隣接する領域には、リボソーム結合部位が含まれている。
【０１２３】
最初の２９アミノ酸は、(プロ酵素の)輸出シグナル配列であると予測されるので、成熟タンパク質はアミノ酸配列ＴＰＰＧＥから始まる。このことは、配列表(配列番号７)において、８８〜１３７４位に適用される特徴「mat_peptide」によって示されている。なぜなら、この領域は成熟タンパク質をコードしているからである。配列番号８は全アミノ酸配列が記載されており、成熟タンパク質は３０位から始まっている。２００〜２９６位は、ＰＣＲタイピング(実施例３)でプライマー対ＧＥＸ０２４/ＧＥＸ０２６を用いて増幅された領域に対応する。このタンパク質は４５８個のアミノ酸を含む。
【０１２４】
この酵素と、この酵素をコードするＤＮＡとを、Ｂ３２７＊株の酵素と同じデータベース検索にかけた。その検索の結果を表３に要約する。
【０１２５】
表３：ストレプトミセス種Ｂ４００Ｂα-アミラーゼの天然(完全)タンパク質および成熟タンパク質(リーダーペプチドなし)のアミノ酸配列ならびに対応するＤＮＡ配列を使用し、ＥＭＢＬサーバーを通して、それぞれＦＡＳＴＡプログラムを用いて行った、Ｇｅｎｐｅｐｔ/ＧｅｎＢａｎｋおよびＳｗｉｓｓ-Ｐｒｏｔデータベースの検索結果
【表３】
2004530442.tif 000010
【０１２６】
タンパク質レベルでは、ストレプトミセス種Ｂ４００Ｂのα-アミラーゼは、ＧｅｎＢａｎｋデータベース登録配列Ｕ０８６０２に最も相同であり、その相同性は天然タンパク質の配列全体で一致度７６.８％、成熟タンパク質で７７.７％である。最も類似しているこの酵素は、ストレプトミセス種(ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ８６０２)のα-アミラーゼである。これに対し、Ｓｗｉｓｓ-Ｐｒｏｔデータベースの検索では、ベストヒットとしてデータベース登録配列Ｐ０８４８６に関してそれぞれ一致度７１.６％および７２.２％の値が得られた。この登録配列は、ストレプトミセス・ハイグロスコピカス(Streptomyces hygroscopicus)のα-アミラーゼである。図５に、ストレプトミセス種Ｂ４００Ｂおよびストレプトミセス種(ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ８６０２)のα-アミラーゼのアミノ酸配列のアラインメントを示す。この図では、これらの配列をそれぞれＵ０８６０２およびＢ４００Ｂと呼んでいる。
【０１２７】
したがって、配列番号８に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％、より好ましくは８２.５％、８５％、８７.５％、９０％、９２.５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、特に好ましくは１００％同一であるアミノ酸配列を有するデンプン分解タンパク質はいずれも、本願の特許請求の対象である。
【０１２８】
これは、好ましくは、成熟タンパク質の３０〜４４８位に当てはまる(すなわち、これを既知配列から推定ることができる限り)。
【０１２９】
これは、特に好ましくは２００〜２９６位に当てはまる。なぜなら、図３および配列番号２６３のコンセンサス配列に対応するこのアミノ酸領域に最も類似することがわかった配列は、既に表１にも示したように、該領域に７４.２％しか一致しないデータベース登録配列(Ｍ１５５４０)であり、これもまたストレプトミセス・ハイグロスコピカスα-アミラーゼである。これは、ＥＭＢＬ登録配列Ｍ１５５４０がＳｗｉｓｓ-Ｐｒｏｔの登録配列Ｐ０８４６８に対応するからである。
【０１３０】
本発明の目的は、特に、配列番号８に示すアミノ酸配列と、好ましくは３０〜４４８位において、特に好ましくは２００〜３９６位において同一であるアミノ酸配列を有するデンプン分解タンパク質によって達成される。
【０１３１】
ストレプトミセス種Ｂ４００Ｂに見い出されるこのタンパク質は、実施例４および５で詳しく例示するように、また、ストレプトミセス種Ｂ３２７＊のアミラーゼに関して既に上述したように、例えばストレプトミセス・リビダンスやエシェリキア・コリなどのさまざまな宿主細胞で異種発現させることができる。したがってこれは、例示を目的として以下に詳しく説明するように、あらゆる工業的用途に利用することができる。
【０１３２】
本発明のさらなる態様は、上述したタンパク質のいずれかから誘導することができる、デンプン分解タンパク質の断片、または欠失突然変異によって得られうるデンプン分解タンパク質である。
【０１３３】
これには、例えば、基質の複合体化に寄与する断片、または加水分解に必要な構造要素の形成に寄与する断片などが包含される。それらは例えば個々のドメインでありうる。そのような断片は製造費用が少なくて済んだり、出発分子が持っている不利かもしれない特定の特徴(例えば活性低下調節機構と考えられるもの)をもはや持たなかったり、より有利な活性プロフィールを発揮したりすることができる。この種のタンパク質断片は、非生合成的に、例えば化学的に製造することもできる。この種の方法は、例えば「Lexikon der Biochemie」(生化学辞典)[Spektrum Akademischer Verlag, ベルリン, 1999, 第2巻, 194-196頁]などによって知られている。例えば化学合成は、合成後に化学修飾を行う場合に有利になることもある。
【０１３４】
デンプン分解欠失変異体の作製は、例えば阻害領域を欠失させるのに有用と思われる。これは、欠失だけでなく、該タンパク質の応用範囲の特殊化および拡大をもたらしうる。
【０１３５】
ＷＯ９９/５７２５０によれば、例えば、本発明のタンパク質またはその一部にペプチドリンカーまたは非ペプチドリンカーを介して他のタンパク質の結合ドメインを付加し、それによって基質の加水分解をより効果的にすることが可能である。同様に、二機能性タンパク質を得るために、本発明のデンプン分解タンパク質を、例えばプロテアーゼに連結することも可能である。
【０１３６】
プレタンパク質からＮ末端アミノ酸を切り離すことによって得られうるタンパク質およびシグナルペプチドも、天然に産生される断片または欠失突然変異型タンパク質とみなすことができる。この種の切断機構を用いて、シグナルペプチダーゼによって認識される特定配列領域により組換えタンパク質にまず特異的切断部位を付与することができる。したがって、本発明のタンパク質をインビトロで活性化および/または不活化することができる。また、１５個以下の連続するアミノ酸、より好ましくはそれぞれ１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２個以下の連続するアミノ酸、および１個のアミノ酸からなる個々の領域を、欠失によって分子から除去することも可能である。これは、洗浄性能に対する寄与がそれによって低下しない場合、またはそれどころか改善される場合には、とりわけ好都合である。
【０１３７】
上記の説明によれば、それぞれ配列番号６の２１０〜３００位および配列番号８の２００〜２９６位と、上に示した相同性値の範囲内で、完全にまたは部分的に一致する部分を含む断片または欠失変異体がさらに好ましく、上に示した相同性値の範囲内で図３および配列番号２６３のコンセンサス配列の８〜９３位に対応する部分を含むものが特に好ましい。
【０１３８】
本発明の目的は、さらに、挿入突然変異によって得られうるデンプン分解タンパク質によって、または少なくともデンプン分解活性を付与する部分に上述したタンパク質のいずれか、特に対応する成熟タンパク質、特に上述したタンパク質のうちの配列番号２６３の８〜９３位に対応する部分を含むデンプン分解キメラタンパク質によっても達成される。
【０１３９】
本発明によれば、融合によって得られるタンパク質は、最も広い意味でデンプン分解性である機能またはα-１,４-グリコシド結合の加水分解を支える機能を有するか、それらをもたらすか、またはそれらを改変するように意図される。この機能は、本発明のタンパク質に由来する分子部分であってその分子部分について上に述べた類似性の範囲内にある分子部分によって、発揮または改変されうる。
【０１４０】
そのような分子部分は、それらのコンセンサス配列または他の成分に由来する酵素に相同なボックスによって認識することができる部分であってよい。そのような領域は、通常その酵素に特徴的な酵素機能を付与し、さまざまなドメインに、すなわちタンパク質分子全体に分布することができる。したがって本発明は、その構成のゆえに、その全アミノ酸および/またはヌクレオチド配列では、本発明の類似性の範囲に関して上に定義したものよりも低い一致度を必要に応じて有しているが、融合によって導入される領域の少なくとも１つにおいて該領域に帰属させることができ、この部分では上に規定した相同性範囲に含まれるアミラーゼと同じ機能を発揮するような、キメラタンパク質にも関係する。
【０１４１】
これは、配列番号６または８から導くことができるタンパク質に当てはまるが、配列番号２６３に示したコンセンサス配列以外の領域にも当てはまる。なぜなら、実施例１に示すように、この配列はとりわけα-アミラーゼの高度に可変的な領域を定義しているからである。
【０１４２】
基本的な類似性ゆえに、上述したデンプン分解タンパク質の挿入突然変異によって得られる変異体にも、同じことが言える。挿入突然変異誘発の目的は、特に、本発明タンパク質の個々の特性を、他のタンパク質の特性と組み合わせることである。相同性によって上述した配列に由来を求めることができる領域が、適切な相同性値を有し、得られた変異体が該領域のゆえに広い意味でデンプン分解機能を有するのであれば、本発明のタンパク質またはキメラタンパク質は、挿入突然変異によって得ることができる。
【０１４３】
したがって例えば、基質との相互作用を増大させるために、ＷＯ９９/５７２５０の記載を応用して、上述の酵素をセルロース結合ドメインにカップリングすることができる。同様にして、例えば、他の洗浄または浄化活性酵素を本発明のアミラーゼに融合することも可能である。これに関連して、融合がＮまたはＣ末端で行われるか、挿入によって行われるかは、基本的には重要でない。
【０１４４】
上述したタンパク質のデンプン分解誘導体とは、それ自身がデンプン分解活性を有するか、内部α-１,４-グリコシド結合の加水分解を支えるタンパク質であって、上に示した類似性の範囲内にあるタンパク質から、化学的または生物学的に、特に分子生物学的修飾によって誘導されるタンパク質を意味する。好ましい出発分子に対応する誘導体がさらに好ましい。
【０１４５】
これらの分子は、特に、化学的カップリングによって、低分子量化合物から、またはポリマーから得ることができる分子である。そのような修飾の目的は、例えばＷＯ００/２２１０３の記載によればアレルゲン作用の低減、ＷＯ９９/５８６５１によれば酵素パラメータの最適化、ＥＰ１０８８８８７によれば安定性の増加などであってよい。タンパク質は、例えばＷＯ００/２６３５４などの記載を応用することにより、グリコシル化によって修飾することもできる。
【０１４６】
タンパク質の取得、処理または調製に依存して、これらのタンパク質は、該タンパク質の天然産生体から得られた場合は特に、さまざまな他の物質を伴いうる。次にこれは、それとは無関係に、例えばその貯蔵安定性を増大させるために、他の特定物質と意図的に混合される場合もある。したがって誘導体とは、上述したタンパク質の任意の調製物も意味する。これは、それらが実際に特定の調製物において該酵素活性をもたらすかどうかとも無関係である。なぜなら、貯蔵中は活性があったとしても低い活性でしかなく、使用時にのみ該活性をもたらすことが望まれる場合があるからである。これは、例えばタンパク質のフォールディング状態によって制御されることもあり、１つまたは複数の付随物質の可逆的結合によって、または別の制御機構によってもたらされることもある。
【０１４７】
本発明のタンパク質は、貯蔵中は特に、例えば物理的影響、酸化またはタンパク質分解による変性、分解または不活化などから、安定剤によって保護することができる。互いを補完または増強し合う安定剤の組み合わせも使用されることが多い。
【０１４８】
安定剤の１つの群は、可逆的プロテアーゼ阻害剤、例えばベンズアミジン塩酸塩およびロイペプチン、ホウ砂、ホウ酸、ボロン酸、それらの塩またはエステル、ペプチドアルデヒドまたは純粋なペプチド阻害剤、例えばオボムコイドまたは特異的スブチリシン阻害剤などである。さらによく知られている酵素安定剤は、モノ-、ジ-、トリエタノール-および-プロパノールアミンなどのアミノアルコール類、Ｃ１２までの脂肪族カルボン酸、ジカルボン酸、低級脂肪族アルコール、その他、特にポリオール、例えばグリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコールまたはソルビトールなどである。また、例えば酢酸カルシウムやギ酸カルシウムなどのカルシウム塩、マグネシウム塩、多種多様なポリマー、例えばリグニン、セルロース、エーテル類、ポリアミド類または水溶性ビニルコポリマーも、酵素調製物を特に物理的影響またはｐＨ変動に対して安定化するために使用される。例えば亜硫酸ナトリウムまたは還元糖などの還元剤および酸化防止剤は、酸化的分解に対するタンパク質の安定性を増大させる。
【０１４９】
本発明の目的は、上述のタンパク質または誘導体の１つと、少なくとも１個の抗原決定基を共有しているデンプン分解タンパク質または誘導体によっても達成される。
【０１５０】
タンパク質の純粋なアミノ酸配列だけではなく、二次元構造要素および三次元フォールディングも、酵素活性を発揮するには極めて重要である。例えば、互いに一次構造が明確に異なるドメインでも、空間的に実質上一致する構造を形成し、よって同一の酵素挙動を可能にすることができる。そのような二次構造中の共通する特徴は、通常は、対応する抗原決定基として、抗血清または純粋な抗体もしくはモノクローナル抗体によって認識される。したがって免疫化学的交差反応により、構造的に互いに類似しているタンパク質または誘導体を検出し、分類することが可能になる。第２に、本発明のアミラーゼが適切な製剤、例えば洗浄剤または浄化剤の中で、実際に活性であることは、免疫学的交差反応によって容易に検出することができる。
【０１５１】
したがって、本発明の保護範囲は、特に、デンプン分解活性を持ち、一次構造の相同性によってではなく、その免疫化学的関係によって、上に定義した本発明のタンパク質または誘導体に帰属させることができるタンパク質または誘導体も包含する。
【０１５２】
逆に、本発明のタンパク質または誘導体を、類縁アミラーゼ遺伝子またはアミラーゼを取得、同定または研究するために使用することもできる。これは、例えば、発現遺伝子ライブラリーをスクリーニングする場合などに適切な領域に対する抗体を使用する分子生物学的方法によって行うことができる。
【０１５３】
上に定義したデンプン分解タンパク質または誘導体を天然の供給源から得ることができる場合、本発明の目的は、好ましくは、それらのデンプン分解タンパク質によって達成される。天然の供給源には、自然生息地の試料、大規模培養物、細胞培養物、分離物または培養単一生物が含まれる。微生物が好ましい。なぜなら微生物は先行技術で確立された方法によって培養することができ、タンパク質を得るために直接使用するか、または分子生物学的方法の出発点として使用することができるからである。
【０１５４】
しかし、これらは、そのタンパク質またはそのＤＮＡを自然生息地から単離し、自体公知の方法によって解析することができるが、それ自体は培養ができない訳ではないとしても困難である生物であってもよい。そのような生物の混合物も考えられる。いずれの場合も、制御可能な条件下でデンプン分解タンパク質を産生し、そのタンパク質を周囲の培地に放出する菌株が好ましい。
【０１５５】
好ましい微生物は、とりわけそのタンパク質合成機構および輸出機構ゆえに、グラム陽性細菌であり、なかでも放線菌目のグラム陽性細菌が好ましい。なぜなら、とりわけ本願の実施例に記載する情報により、放線菌目のグラム陽性細菌には利用することができる適切な方法があるからである。実施例で述べるように、本願の基礎をなすデンプン分解タンパク質の配列は、特に配列番号２６３のコンセンサス配列の部分については、放線菌目から決定された。
【０１５６】
ストレプトミセス属の種から取得できることを特徴とするデンプン分解タンパク質または誘導体がさらに好ましい。なぜなら例えば、その大半がストレプトミセス属である放線菌目の微生物分離物の収集物には、２００を超えるα-アミラーゼおよびその天然産生株が見い出され、それらは本願により利用できるようになったからである。なかでも、ＤＳＭＺ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)に受託番号ＤＳＭ１３９９０およびＤＳＭ１３９９１として寄託されている分離物または種であるストレプトミセス種Ｂ３２７＊およびストレプトミセス種Ｂ４００Ｂが好ましい。なぜならこれらから、本発明タンパク質の特に好ましい２つの態様が得られたからである。それら２つの態様のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を配列表の配列番号５〜８に示す。
【０１５７】
放線菌目の一部は２以上のα-アミラーゼを産生することができる。その場合は、その生化学的特性を互いに補完し合う可能性がある複数のα-アミラーゼの天然産生株を培養するのが有利であろう。これは、例えば広い作用範囲を有する酵素カクテルの製造に利用することができる。したがってこの種の菌株は本発明の特に有利な態様の特徴をなす。
【０１５８】
配列番号３４〜配列番号２６２は、上記および実施例１で説明するように、特定ＰＣＲ産物から得られるアミノ酸配列を表している。これらは、数百株の放線菌目分離物の収集物から単離された核酸をテンプレートとして、ポリメラーゼ連鎖反応でプライマー対ＧＥＸ０２４(配列番号９)/ＧＥＸ０２６(配列番号１０)およびＧＥＸ０２９(配列番号１１)/ＧＥＸ０３１(配列番号１２)と反応させることによって得られた。配列番号２６３のコンセンサス配列における８〜９３位は、プライマーＧＥＸ０２４とＧＥＸ０２６の間に位置するので、これらは見い出された配列の特徴を特に示しているとみなすことができる。したがって、これらの領域をコードする核酸も相応に好ましい態様の特徴をなす。図３および配列番号２６３に示したコンセンサス配列は、これら個々の配列から導かれたものであり、１つの配列空間を規定している。したがって本発明は、実質的に該コンセンサス配列によって示すことができる部分を含むアミラーゼを提供する。
【０１５９】
したがって対応する核酸も、以下の理由から、本発明の目的にとっての解決手段であり、したがって本発明の別個の対象であるとみなさなければならない。すなわち第１に、対応する遺伝子が利用できる場合、タンパク質は分子生物学的に取り扱うことができるようになる。これは、同定および特徴づけ、突然変異誘発から生物工学的生産まで当てはまる。生物毎に異なるコドン使用頻度によって派生するヌクレオチド配列およびリボ核酸も包含される。なぜなら、機能的酵素はそれらからも得ることができるからである。対応する核酸は、アミラーゼ遺伝子を取得、同定または研究するために使用することもできる。したがって、例えば、遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために対応するプローブを設計することができる。
【０１６０】
第２に、実施例で詳述する、当該のα-アミラーゼを発見するための上記の方法は、ＰＣＲに基づいており、したがって対応する核酸に基づいている。配列表には、とりわけ好ましい２つのα-アミラーゼのヌクレオチド配列を示す(配列番号１、３、５および７)。残りの配列をコードする核酸は自体公知の方法によって推定することができる。
【０１６１】
したがって、デンプン分解タンパク質をコードする核酸であって、該デンプン分解酵素のアミノ酸配列がアミノ酸配列部分を含んでなり、該部分の９８％、より好ましくは９８.２５％、９８.５％、９８.７５％、９９％、９９.２５％、９９.５％、９９.７５％、特に好ましくは１００％が配列番号２６３のコンセンサス配列によって、特に８〜９３位に対応するサブ領域によって示されるデンプン分解タンパク質をコードする核酸を特許請求されている。
【０１６２】
コンセンサス配列に基づいて可能な変異体をコードする核酸は、広く知られている方法によって製造することができる。例えば、「Lexikon der Biochemie」(生化学辞典)[Spektrum Akademischer Verlag, ベルリン, 1999]の第１巻の２６７〜２７１頁にはＤＮＡの新規の合成法が、また第２巻の２２７〜２２９頁にはポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)が紹介されている。配列は、広く知られているアミノ酸の暗号化システムに従い、特定の属に特有なコドン使用頻度を適宜使用して、前もって決定することができる。さらに、配列番号１および３に示すＤＮＡ配列を、所望する本発明の変異に対応する上記配列の位置に、対応する点突然変異を導入することによって、他のヌクレオチド配列を合成するための出発点として使用することもできる。
【０１６３】
この目的には、例えば、Fritsch、SambrookおよびManiatisのマニュアル「Molecular cloning: a laboratory manual」[Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク, 1989]から知られている一般的で便利な方法をすべて使用することができる。実施例５に示すように、ＰＣＲは、ＤＮＡ中に個々の塩基置換を導入するためにも使用することができる。
【０１６４】
別の可能性は、上述し実施例でも説明するように、自然界から得た分離物または既知株の核酸に対してＰＣＲを行うことにより、配列番号２６３のコンセンサス配列によって示される派生アミノ酸配列を有する新規な遺伝子または遺伝子断片を発見することである。
【０１６５】
Ｂ３２７＊およびＢ４００Ｂ由来のα-アミラーゼに基づいて実施例に例示するように、部分配列に属する全長遺伝子は、例えば発現クローニング、遺伝子ライブラリーのスクリーニングまたは同等の工程によって見い出すことができる。これらの工程には、例えばα-アミラーゼ欠失突然変異体を有する発現ベクターへのゲノムＤＮＡまたはcＤＮＡのクローニングが含まれる。中間クローニングステップにはストレプトミセス属またはバチルス属の種が好ましい。
【０１６６】
先行技術においてタンパク質工学という用語のもとに挙げられる遺伝子生化学およびタンパク質生化学的方法も、ヌクレオチド配列に基づいている。そのような方法は、本発明のタンパク質を、さまざまな用途に関して、例えば点突然変異誘発や他の遺伝子の配列との融合などによって、さらに最適化するために使用することができる。
【０１６７】
本発明の目的は、好ましくは、配列番号３４〜配列番号２６２に示すアミノ酸配列のいずれかと、特に配列番号２６３のコンセンサス配列に従って８〜９３位に対応するサブ領域で、９８％、より好ましくは９８.２５％、９８.５％、９８.７５％、９９％、９９.２５％、９９.５％、９９.７５％、特に好ましくは１００％同一である部分を含むアミノ酸配列を有するデンプン分解タンパク質をコードする核酸によって達成される。
【０１６８】
上述した配列空間の規定は、一面においては、アミラーゼ活性をうまく測定できたタンパク質またはタンパク質断片の具体例でもある上記α-アミラーゼに基づいていた。さらに、表１に要約するように、これらのタンパク質断片のいずれかと９７％を超えて一致するタンパク質は、今までのところ知られていない。
【０１６９】
各配列について推定されるヌクレオチド配列は、突然変異工程、特に最適化工程に容易に導入することができ、また、完全配列を得るためのスクリーニングに使用することができる。これを、Ｂ３２７＊およびＢ４００Ｂのα-アミラーゼに基づいて、実施例に例示する。対応する陽性結果を、配列表の配列番号１３〜配列番号２４２に開示する断片のそれぞれについて期待することができる。ここで生じうる単一の陰性結果は、株特異的な特徴に帰することができる。したがって例えば、関与する遺伝子は、重複によって生成した後、突然変異によって不活化された遺伝子、または未知の理由で生細胞中では活性化されない遺伝子であると考えられる。
【０１７０】
したがって、配列番号１３〜配列番号２４２に開示する断片をコードする各核酸も、本発明の基礎をなす目的に対する別の解決手段である。これは少なくとも完全なα-アミラーゼへの手がかりになり、該完全なα-アミラーゼを、配列番号２６３のコンセンサス配列に対応する領域に関して特徴づける。
【０１７１】
本発明のこの対象のさらに好ましい態様は、デンプン分解タンパク質をコードする核酸であって、該アミノ酸配列がアミノ酸配列部分を含んでなり、該部分が、特に配列番号２６３のコンセンサス配列で８〜９３位に対応するサブ領域において、配列番号４５、８３、９７、９８、１０１、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、２３２、２３４、２３６、２３８、２３９および２４１に示すアミノ酸配列のいずれかと、９８％、より好ましくは９８.２５％、９８.５％、９８.７５％、９９％、９９.２５％、９９.５％、９９.７５％、特に好ましくは１００％同一であるか、または、各相同位置でこれら配列のいずれかに直接由来を求めることができるデンプン分解タンパク質をコードする核酸である。
【０１７２】
実施例１では、２組のプライマー対ＧＥＸ０２４/ＧＥＸ０２６およびＧＥＸ０２９/ＧＥＸ０３１を用いて得られるＤＮＡのＰＣＲ産物を、ストレプトミセス種の以下の分離物または菌株：Ｂ１０１Ａ、Ｂ１１４Ｃ、Ｂ１３４、Ｂ１３５Ａ、Ｂ１３８Ａ、Ｂ１５２Ａ、Ｂ１５３(Ｂ)、Ｂ１５６Ｂ、Ｂ１５７Ｃ、Ｂ１５８Ａ、Ｂ１６０Ｂ、Ｂ１６１Ａ、Ｂ３７３、Ｂ３７５、Ｂ３８０、Ｂ３９０、Ｂ３９２ＡおよびＢ３９４から得た。図２はそのゲル電気泳動分画を表す。その配列決定および対応するアミノ酸配列の導出により、上記のアミノ酸配列を得た。
【０１７３】
したがって上に定義した類似性の範囲内にある部分を有するタンパク質をコードする核酸はいずれも本発明のこの対象の態様である。上述のように、これは特に、配列番号２６３のコンセンサス配列における８〜９３位に対応するサブ領域に当てはまる。
【０１７４】
本発明のこの対象のさらに好ましい態様は、デンプン分解タンパク質をコードする核酸であって、該アミノ酸配列がアミノ酸配列部分を含んでなり、該部分が、特に配列番号２６３のコンセンサス配列における８〜９３位に対応するサブ領域で、配列番号２、４および２０８に示すアミノ酸配列と、９５％、より好ましくは９６％、９６.５％、９７％、９７.５％、９８％、９８.５％、９９％、９９.５％、特に好ましくは１００％同一であるデンプン分解タンパク質をコードする核酸、特に好ましくは配列番号１または３に示すヌクレオチド配列を有する核酸である。
【０１７５】
実施例６では、上記部分配列によって得られる完全タンパク質を、その生化学的特性について調べた。したがって、それらは、産業プロセスでの使用に、または産業プロセスに関係するさらなる最適化に、有望な候補であると思われる。本発明のこの対象の核酸配列から出発して得ることができるタンパク質にも、同様の性質が期待される。
【０１７６】
特に好ましい態様は、個々の相同位置で、保存性アミノ酸置換により、好ましくは直接的に、２つの配列、すなわち配列番号６または配列番号８のどちらかに由来を求めることができるアミノ酸配列を有するデンプン分解タンパク質をコードする核酸である。
【０１７７】
既に上述したように、これら２つのアミノ酸配列は、該２つの配列に指定されているアミノ酸配列の保存性置換または直接採用により、本発明のさらなる態様を包含する配列空間を規定する。したがって対応する核酸も本発明の態様である。
【０１７８】
アミノ酸配列の再参照が必要である。なぜなら、２つの指定ヌクレオチド配列から一方または他方の核酸塩基を直接採用することによってコドンに相違が生じ、その結果、アミノ酸レベルでは非保存性置換が起こるかもしれないからである。保護範囲は、同じ配列空間に属するタンパク質をコードするヌクレオチド配列だけを包含する。それらは、関連コドンを採用することによって、または同じアミノ酸をコードするコドン(同義コドン)もしくは上記の群に従って保存性アミノ酸をコードするコドンで置換することによって得られる。
【０１７９】
本発明のこの対象の好ましい態様は、ストレプトミセス種Ｂ３２７＊のα-アミラーゼ遺伝子に十分に類似している核酸である。なぜなら、それらは、実施例６で特徴づけたα-アミラーゼと同じ程度に有望な酵素をコードすること、またはそれを最適化する方法に導入することが期待されるからである。
【０１８０】
表２から、ＤＮＡレベルで最も類似している遺伝子は、遺伝子バンクに受託番号Ｕ５１１２９として登録されているストレプトミセス・アルブス由来のα-アミラーゼ遺伝子であることがわかる。この遺伝子は、配列番号５に示す完全配列に関して８３.５％同一であり、成熟タンパク質をコードしている部分に関して８４.８％同一である。
【０１８１】
この部分は、配列番号５に示す配列のヌクレオチド９１〜１３８３によってコードされている。ヌクレオチド６２８〜９００はコンセンサス配列のアミノ酸(図３および配列番号２６３)に対応する。
【０１８２】
したがって、デンプン分解タンパク質をコードする核酸であって、配列番号５に示すヌクレオチド配列と、好ましくは９１〜１３８３位で、特に好ましくは６２８〜９００位で、少なくとも８５％同一である配列を有する核酸は、本発明のこの対象の好ましい代表例として特許請求される。
【０１８３】
より好ましくは、デンプン分解タンパク質をコードする核酸であって、配列番号５に示すヌクレオチド配列と、好ましくは９１〜１３８３位で、特に好ましくは６２８〜９００位で、少なくとも８７.５％、９０％、９２.５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％同一である配列を有する核酸が特許請求される。
【０１８４】
本発明のこの対象の好ましい態様は、ストレプトミセス種Ｂ４００Ｂのα-アミラーゼ遺伝子に十分に類似している核酸である。なぜなら、それらは、実施例６で特徴づけたα-アミラーゼと同じ程度に有望な酵素をコードすること、またはそれを最適化する方法に導入されることが期待されるからである。
【０１８５】
表３から、ＤＮＡレベルで最も類似している遺伝子は、ストレプトミセス種α-アミラーゼ(ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０８６０２)の遺伝子である。これら２つの配列は、天然タンパク質をコードする配列の全体にわたって８１.９％同一であり、成熟タンパク質の配列については８２.６％同一である。
【０１８６】
成熟タンパク質は、配列番号７に示す配列のヌクレオチド８８〜１３７４によってコードされている。ヌクレオチド５９８〜８８８はコンセンサス配列(図３及び配列番号２６３)のアミノ酸に対応する。
【０１８７】
したがって、デンプン分解タンパク質をコードする核酸であって、配列番号７に示すヌクレオチド配列と、好ましくは８８〜１３７４位で、特に好ましくは５９８〜８８８位で、少なくとも８５％同一である配列を有する核酸は、本発明のこの対象の好ましい代表例として特許請求される。
【０１８８】
より好ましくは、デンプン分解タンパク質をコードする核酸であって、配列番号７に示すヌクレオチド配列と、好ましくは８８〜１３７４位で、特に好ましくは５９８〜８８８位で、少なくとも８５％、８７.５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％同一である配列を有する核酸が特許請求される。
【０１８９】
本発明のこの対象の同様に好ましい態様は、上に定義したデンプン分解タンパク質または断片のいずれかをコードする核酸である。
【０１９０】
これには、その配列の全長にわたってではなく個々の領域において上に定義した類似性の範囲内にある変異体も含まれる。これらには例えば、上述のように、挿入もしくは欠失突然変異、キメラタンパク質またはタンパク質断片によって得られるヌクレオチド配列が含まれる。また、個々のサブ領域に対する「アンチセンスコンストラクト」も、本発明の態様である。なぜなら、それらはデンプン分解タンパク質に関する配列情報をもたらすことができ、デンプン分解活性を調節するために使用することができるからである。
【０１９１】
自体公知の分子生物学的方法によって得ることができる突然変異体としては、特に、特異的一塩基置換もしくはランダム点突然変異、個別塩基もしくは部分配列の欠失、他の遺伝子もしくは遺伝子断片もしくは他の酵素との融合、挿入、シャフリング突然変異、または逆位をもつものが挙げられる。この種の突然変異または改変は、特定用途のための特定の態様を表す。
【０１９２】
この種の突然変異誘発は標的特異的に行うか、またはランダム的方法によって行うことができる。これは、例えば、クローン化された遺伝子を活性に関してスクリーニングおよび/または選択するための後続の方法と組み合わせることができる。突然変異によって得られた遺伝子は、それらが広い意味でデンプン分解タンパク質をコードしており、上に定義した類似性の範囲内にあるのであれば(特に、後者については、相同で機能的に関連する領域において)、本明細書に記載する発明の保護範囲の対象である。
【０１９３】
上記の説明および実施例１から明らかなように、上記の方法を使用することにより、それらが図３または配列番号２６３のコンセンサス配列によって示される部分を含むデンプン分解タンパク質を産生するという事実によって、数多くの生物を特徴づけることができる。
【０１９４】
したがって、配列表の配列番号２６３で定義されるタンパク質またはタンパク質断片のいずれかをコードする核酸を含む天然生物はいずれも、本発明の別個の対象である。それらは自体公知の方法、特に本願に記載する方法によって自然生息地から分離し、培養することができる。生物学的特徴づけに加えて、それらは、実施例１に記載のＰＣＲプライマー対の一方、特にプライマー対ＧＥＸ０２４/ＧＥＸ０２６を使用することにより、図３または配列番号２６３のコンセンサス配列によって示すことができる派生アミノ酸配列をもたらす増幅産物を、それらのゲノムＤＮＡに基づいて取得することができるという事実によって同定することもできる。
【０１９５】
この方法によって、配列表の配列番号３４〜２６２に示す配列のいずれか、特に好ましくは配列番号２、４、６または８に示す配列のいずれかと一致するアミノ酸配列を導き出すことのできる天然生物が好ましい。
【０１９６】
これは、すべての生物、例えば真核細胞、例えば細胞培養物に由来するもの、または主として単細胞真菌類、例えば酵母などに当てはまる。
【０１９７】
これは、好ましくは微生物、好ましくは細菌、特に好ましくはグラム陽性細菌に当てはまる。
【０１９８】
グラム陽性細菌のなかでは、放線菌目のものが好ましく、特にストレプトミセス属のものが好ましい。
【０１９９】
さらに、これらのなかでは、２つの種すなわちストレプトミセス種Ｂ３２７＊およびストレプトミセス種Ｂ４００Ｂが好ましく、２つの株ＤＳＭ１３９９０またはＤＳＭ１３９９１のどちらかである場合が特に好ましい。
【０２００】
上述したように、また実施例でも説明するように、特別に開発した方法により、さまざまな本発明のα-アミラーゼが得られた。したがってその方法は、本発明の別個の対象を構成する。
【０２０１】
すなわち、生物または核酸の収集物から新規なアミラーゼを同定および/または取得するためのＰＣＲに基づく方法であって、それぞれ可変性３'領域と既知アミラーゼの領域に高度に相同な５'領域とを有するＰＣＲプライマーを使用することを特徴とする方法を特許請求する。
【０２０２】
ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)法は先行技術で確立されており、例えば、「Lexikon der Biochemie」(生化学辞典)[Spektrum Akademischer Verlag, ベルリン, 1999]の第２巻の２２７〜２２９頁などに記載されている。これは、第１段階として、二本鎖ＤＮＡテンプレートを高温で融解させること、(２)融解させた開いたＤＮＡのうち、ハイブリダイゼーションするのに十分な相同性を有する部分に、短い一本鎖ＤＮＡ分子、いわゆるプライマーまたはプライマーオリゴヌクレオチドを、低温で結合させること、そして(３)この短いＤＮＡ分子を天然のＤＮＡ合成の場合と同様に５'末端から３'末端に中温度で伸長させることに基づいている。これにより、第１サイクルでは、最初に融解させた開いたＤＮＡ中の２つのプライマー結合部位の間に位置するＤＮＡ領域を２コピー生成する。(４)例えば熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使うことによって可能になるようなサイクル反応プロセスでは、サイクル数を増やすほど、２つのプライマー配列によって挟まれたＤＮＡ領域にまたがる同一ＤＮＡ分子の数が指数的に増加する。
【０２０３】
本発明の方法は、可変的な３'部分と、既知アミラーゼのＤＮＡおよび/またはアミノ酸領域に高度に相同な５'領域とを特徴とするＰＣＲ用の新規プライマーによって特徴づけられる。プライマーの５'領域は、好ましくは、相同関係の表示が可能なさまざまなアミラーゼを使って、タンパク質レベルで、また好ましくはＤＮＡレベルで配列を比較したときに、保存されている領域であることが見い出され、かつ相同関係を表示した該遺伝子またはタンパク質の可変領域に隣接して位置する領域である。この種の割り当てを例えば図１に示す。
【０２０４】
この方法で定義される３'プライマー領域と５'プライマー領域との境界は、相同関係の表示によって見い出される保存されたアミラーゼ領域と可変的アミラーゼ領域との境界に一致する。不確かな場合は、合成(下記参照)により多様性が生じた部分から可変領域が始まる。
【０２０５】
これに関連して、高い相同性とは、上記プライマーが、その５'領域で、(ａ)既知酵素またはコンセンサス配列の考慮中の領域と１００％一致していること、または(ｂ)一致度が１００％未満である場合も、ＰＣＲサイクルのハイブリダイゼーション期に、同様に相同関係の表示が可能なテンプレートＤＮＡと、配列比較によって示唆された領域でハイブリダイズして、ＰＣＲのさらなる過程でＤＮＡ合成反応が可能になるように、個々の位置でなお十分な一致度を持っていることを意味する。
【０２０６】
可変的プライマーまたは縮重ＰＣＲプライマーは、それぞれ所定の位置に、一つの特定ヌクレオチドではなく、選択した２、３または４種類のヌクレオチドのランダムな混合物を有するので、その全長ではないプライマーのアイデンティティが変化する。得られたプライマープールの可変度は、可変的な個々の位置の数と共に指数的に増加する。これらの変異は、自体公知の方法によるプライマーの合成時、特に化学合成時に導入することができる。これには、特定位置にヌクレオチドを組み込む時に、該試薬を純粋なヌクレオチドとしてではなく、ヌクレオチド混合物として使用する必要がある。このようにして、同一の５'領域をもつ多くのプライマーを作製する。それらは、特定の可変領域に統計上考えられるすべてのヌクレオチドを含む数多くのサブ集団に分かれる。
【０２０７】
上記の新規プライマーは、デンプン分解タンパク質の遺伝子配列の存在下で、該タンパク質に対応する生成物バンドをもたらす。これらはその間にある可変領域を利用できるようにするので、配列アンカーとも呼ばれる。
【０２０８】
本発明のＰＣＲに使用されるテンプレートは、任意のＤＮＡ調製物であってよい。１つの試料に必要な作業量は比較的少ないので、複数の反応混合物を並行して設定することができる。したがって本発明の方法は、自体公知の方法によって多数の生物から調製した核酸の収集物をスクリーニングするのにとりわけ適している。先行技術に十分な記載があるように、ＰＣＲがそのように設計されているのであれば、テンプレートはｃＤＮＡであってもよいし、さらにはｍＲＮＡ調製物であってもよい。
【０２０９】
反応過程の一変形では、縮重プライマーを第１反応サイクルだけに加え、そして/または第１サイクル後は、本発明にとって重要なプライマーの定常領域に対応するプライマーを加える。第３の選択肢は２つの別個のＰＣＲを行うことである。このようにして、テンプレートの関連遺伝子要素を、縮重プライマーを使って第１サイクルで濃縮した後、それ以降のサイクルで特異的に増幅する。
【０２１０】
特にＰＣＲを行う際の上述した可能性の選択またはさらなる変更は、例えば、プライマー結合の選択性またはこの方法で増幅しうる遺伝子要素を含有するテンプレートとして使用するＤＮＡの頻度などに依存する。ＰＣＲの選択性は、自体公知の方法で、反応条件によって調節することができる。例えば低温では、プライマーは、同一でないそして/または低い相同性しか持っていないＤＮＡ領域とハイブリダイズし、高温では選択性が増加する。このようにして、高度に相同な領域でさえ今までに知られているアミラーゼ遺伝子と完全には一致しないα-アミラーゼ配列を入手することができる。一方、プライマー結合は、アミラーゼをコードしていない遺伝子の割合が、所望の産物と比較して優勢にならないほど非特異的であってはならない。最適条件は、反応条件を変えることによって、個別に決定しなければならない。
【０２１１】
可能な変動が多いことは、多くのさまざまな課題、例えばさまざまな出発ＤＮＡ収集物に適応することを可能にし、本発明の方法を新規なアミラーゼ配列を発見するための極めて柔軟な手段にする。
【０２１２】
この最適化は、関連核酸の収集物に由来するＤＮＡ配列を調べる際に、好ましくは、多様ではあるが互いに一定の相同性(上記参照)に達しない訳ではない多くのα-アミラーゼ配列を取得すべきであるという背景で行われる。なぜなら、それらを次いで、配列空間を規定するために使用することができ、例えばシャフリングなどのランダム突然変異誘発法に使用することができるからである。
【０２１３】
このようにして、プライマーの組み合わせＧＥＸ０２９/ＧＥＸ０３１および特にＧＥＸ０２４/ＧＥＸ０２６は、実施例１における放線菌目由来のＤＮＡの収集物に最適であることがわかった。
【０２１４】
得られたＰＣＲ産物は、完全なアミラーゼ配列の検索に使用される。したがって、このＰＣＲは、遺伝子ライブラリーまたは単離された核酸の収集物から特定の遺伝子または遺伝子断片を同定するためのスクリーニング工程である。得られたＰＣＲ断片または対応する遺伝子(個々の位置でのそれらの変動をすべて含む)は、配列空間を構成する。また、それらは、このようにしてタイピングされる。なぜなら、それらは、この共通配列により、特定酵素タイプの標本であるとみなすことができるからである。
【０２１５】
このスクリーニングは、全体の多様性を、デンプン分解活性を有する特定酵素をコードしている遺伝子の配列空間まで縮小する。この配列空間は、それが該酵素の遺伝子の可能な限り大きな配列多様性を含んでいる場合に、特に重要である。
【０２１６】
プライマーを構築する際にも考慮すべき好ましい目標として、特定酵素領域、例えば酵素的に興味深い特定ドメインなどについて変動空間を得ることを挙げることができる。これらは通常、特定の部分活性をもたらすドメイン、例えば構造要素または酵素的に活性なアミノ酸などである。そのような配列空間を形成する断片を、他の既知酵素または酵素断片に融合させることができる。またそれらを、新規な酵素を開発するための進化技術に導入することもできる。さまざまな断片をランダムに組み換えるそのような進化技術は、例えば特許出願ＷＯ９８/０５７６４、ＷＯ９７/３５９６６、ＥＰ５９０６８９およびＥＰ２２９０４６などに例示されている。この種のＰＣＲに基づく方法は、例えばＷＯ９８/４２８６２に記載のＳｔＥＰ法である。
【０２１７】
ＰＣＲ産物に可能な別の用途は、上記ＰＣＲによって得たＤＮＡ断片またはその一部をプローブにして行われる遺伝子ライブラリーのスクリーニングである。この目的には、特に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して、高い相同性または低い相同性を有する配列を検出できるハイブリダイゼーション方法が、先行技術で確立されている。このようにして、類似するデンプン分解タンパク質の配列を同定することができる。
【０２１８】
ＰＣＲ断片およびそれと共に得られる配列情報そのものを、遺伝子全体を同定、単離またはクローニングするためのＰＣＲおよび/または配列に基づく他の方法の出発点として使用してもよい。この目的には、例えばインバースＰＣＲ、Ａ-ＰＣＲ(アンカーＰＣＲ)またはプライマーウォーキングなどが先行技術に記載されている。このようにして得られる全長遺伝子は、例えば発現ベクターへのクローニング後に、最終的にそれらのデンプン切断活性について活性測定法で試験される。
【０２１９】
これらの方法はすべて、可能な中間工程を経て得られる遺伝子またはタンパク質のデンプン分解活性に関するその後の測定法に、有用な形で関連づけることができる。これらの変形は、本発明のこの対象の好ましい態様を特徴づける。
【０２２０】
本発明のこの対象の１つの態様においては、得られた遺伝子または遺伝子断片を配列決定する。
【０２２１】
上記の配列決定により、得られた断片のアイデンティティに関する情報が得られるであろう。なぜなら、上述したように、本方法はＰＣＲ条件の選択性に依存するからである。例えば、低選択性条件の場合、産生されたＰＣＲ産物は、非特異的プライマー結合のゆえに、擬陽性結果をもたらす可能性がある。したがって随意に行われる産物の配列決定により、不必要な作業を避けることができる。大きいＰＣＲ産物は、プライマーウォーキング法を応用して、例えば実施例４で全長遺伝子に対して行ったような方法で、配列決定することができる。
【０２２２】
一方、相同関係の表示、データベース検索および配列空間の規定は、実施例１〜３に示すように、遺伝子の一部から得られるＰＣＲ産物でも行うことができる。特定ＰＣＲ産物の生成は、個々の菌株または種もしくは属などの、より大きな群を特徴づけ、１つの分類特徴になりうる。これは該菌株を培養する際に有用な補助になる。
【０２２３】
本発明の方法の１つの態様は、得られた遺伝子または遺伝子断片からペプチドを取得して、それらを免疫化学的方法によって既知アミラーゼのエピトープについて検定することを特徴とする。
【０２２４】
これに適した例も本発明のＰＣＲの産物である。したがって例えば、スクリーニングは、取得したペプチドに基づいて自体公知の方法で合成された抗体を使って行うことができる。本願が開示するデンプン分解タンパク質および誘導体は、特に好ましい態様に利用することができる。
【０２２５】
配列決定または免疫化学的方法の代わりに、またはそれらに加えて、α-アミラーゼをその酵素活性によって同定することもできる。
【０２２６】
すなわち、得られた遺伝子または遺伝子断片からペプチドを取得し、それをデンプン分解活性への寄与について、好ましくは該ペプチドが完全に発揮するデンプン分解活性について検定することを特徴とする方法が好ましい。この目的を達成するために、遺伝子ライブラリーのスクリーニングによって得たＰＣＲ産物または全長遺伝子を、例えば実施例５に示すように、クローニングによって発現させることができる。
【０２２７】
特に適切なプライマーの選択によって得られるような、とりわけ長いＰＣＲ断片は、発現クローニングの過程で、発現ベクターに直接クローニングすることができ、したがってベクターに他の部分配列を与える必要がない。次に、得られたクローンを、例えばデンプン含有寒天平板への植菌などによって、デンプン加水分解活性について検定する。
【０２２８】
好ましい態様では、少なくとも１つのプライマーの３'領域が高度に可変性または高度に縮重しており、そして/または少なくとも１つのプライマーの５'領域が既知アミラーゼのある領域に高度に相同である。
【０２２９】
高度に可変性のプライマーとは、例えば、８重、１６重、６４重、９６重、１２８重またはそれ以上に縮重したプライマーまたは中間の多様性を有するプライマーを意味する。定常５'領域と構築に使用したコンセンサス配列との相違が、核酸塩基２個を超えないか、好ましくは核酸塩基１個を超えない場合に、プライマーは高度に相同であるとみなされ、完全に同一な配列が特に好ましい。
【０２３０】
図１に基づいて得られるプライマーを、実施例１の表３および配列表の配列番号９〜３３に挙げる。いずれの場合も、可変性位置を、例えばＷＩＰＯ標準ＳＴ.２５などに記載されている一般に使用される一文字記号によって示している。したがって例えば、プライマーＧＥＸ０２４(配列番号９)は、２つの位置に、記号「ｓ」および「ｒ」を有する。これらは、それぞれｇまたはｃ(ｓの場合)およびｇまたはａ(ｒの場合)を意味することができる。したがって、このプライマーは４重に縮重している。同様にして、例えばプライマーＧＥＸ０２６(配列番号１０)の縮重度も４重であり、プライマーＧＥＸ０２９(配列番号１１)の場合は９６重、そしてプライマーＧＥＸ０３１(配列番号１２)の場合は８重であることがわかる。
【０２３１】
本発明の方法は、複数のアミラーゼ間で保存されており、本発明のプライマーの定常領域を構築するために利用することができ、よって配列アンカーとなる領域を、同定することができるという事実に基づいている。適切なプライマーを実施例１に挙げる。図１はそれらの位置を特定の保存領域との関係で表している。
【０２３２】
したがって、少なくとも１つのＰＣＲプライマーの５'領域が、保存されたアミラーゼドメインに対応する配列領域、好ましくはストレプトミセス・グリセウス(Streptomyces griseus)α-アミラーゼのアミノ酸位置(Ａ)５８〜９１、(Ｂ)９４〜１４１、(Ｃ)１５５〜２０７、(Ｄ)２９５〜３４５、または(Ｅ)３９２〜４２７に対応する領域、特に好ましくは(αβ)８バレル構造のドメインβ４またはβ７の１つに対応する領域に由来することを特徴とする本発明の方法が好ましい。
【０２３３】
実施例１では放線菌目ＤＮＡに対して後者を用いて成功した。
【０２３４】
配列表に記載の本願により提供されるアミノ酸配列を、対応するプライマーを合成するために使用することができる。これは、例えば、保存された領域には位置しないがサブ集団中に共通部分配列として現れる領域、例えば配列番号２６３のコンセンサス配列の個々の標本にも当てはまる。
【０２３５】
本発明の第１の対象のタンパク質または断片のアミノ酸配列のいずれかから導くことができる１つの、好ましくは２つのＰＣＲプライマーを使用することを特徴とする方法が好ましい。
【０２３６】
一方、本発明の第２の対象のヌクレオチオド配列のいずれかから直接得られる１つの、好ましくは２つのＰＣＲプライマーを使用することを特徴とする方法が好ましい。なぜなら、これらは、そのコドン使用頻度ゆえに、放線菌目または他のグラム陽性細菌から配列を増幅するのに特に適しているに違いないヌクレオチド配列を、既に持っているからである。
【０２３７】
これらのなかでは、少なくとも１つのプライマーが配列表の配列番号９〜３３に示す配列のいずれか、特に配列表の配列番号９〜１２に示す配列のいずれかを含むことを特徴とする方法が好ましい。
【０２３８】
そしてまた、これらのなかでは、配列番号９と配列番号１０との組み合わせ、または配列番号１１と配列番号１２との組み合わせで、プライマーを使用することを特徴とする方法が好ましい。なぜなら、実施例１に示すように、これらを使用して、多数のα-アミラーゼの取得に成功することができたからである。
【０２３９】
本発明の方法は、個々の試料に対して行うことができる。しかしその一方で、使用するテンプレートＤＮＡが、例えば生物、細胞培養物、分離物または培養された個々の菌株を含む生物学的に有用な任意の収集物であってよい複数試料の単離された核酸であるか、または生物、細胞培養物、分離物、培養された個々の菌株もしくは単離された核酸の集合の単離された核酸であることを特徴とする方法が好ましい。
【０２４０】
単離された核酸は、試料、例えば野外分離物などから精製することができ、これにより、例えば分離工程を避けることができる。このようにして、極めて広範囲のさまざまな生物学的供給源を、本発明のスクリーニングにかけることができる。
【０２４１】
野外分離物を取得することに代えて、一般利用が可能な保存機関からさまざまな株を入手することもできる。それらは遺伝子改変生物、好ましくは微生物の収集物であってもよい。また、保存機関(ＤＳＭＺ、ＡＴＣＣ、ＣＢＳ)から得たさまざまな菌株を上記の方法によって研究することもできる。
【０２４２】
本発明の方法は、例えば真核生物、特にヒトから作製された細胞培養物にも適用することができる。これは、例えば得られる酵素を特定の生理作用のゆえに使用しようとする場合、または該酵素が特に高い許容性を有するべき場合などに有用であり、この後者は化粧品への応用に特に当てはまる。
【０２４３】
この種の収集物は、好ましくは、主として真菌、酵母、細菌またはシアノバクテリアなどの単細胞生物の収集物である。細菌が好ましい。なぜならこれらは、先行技術で確立された微生物学的および遺伝学的方法に、最も容易に利用することができるからである。これらのうち、グラム陽性細菌であるものが特に好ましい。なぜならこれらは、新規に合成したタンパク質を周囲培地に輸出する能力を有するので、産業上の用途に最も近いからである。
【０２４４】
上記の説明および本願の実施例によれば、以下の方法が、記載する順に好ましい：使用するテンプレートＤＮＡが、微生物、好ましくは細菌、特に好ましくはグラム陽性細菌の単離された核酸分子であることを特徴とする方法；放線菌目の構成員、特にストレプトミセス属の構成員が関わることを特徴とする方法；およびストレプトミセス属の構成員がストレプトミセス種３２７＊またはストレプトミセス種Ｂ４００Ｂ、特に２つの株ＤＳＭ１３９９０およびＤＳＭ１３９９１のどちらかであることを特徴とする方法。
【０２４５】
好ましい方法は、得られた遺伝子または遺伝子断片を発現遺伝子ライブラリーに導入し、次にそれをデンプン分解タンパク質またはデンプン分解タンパク質の断片に関して検定することを特徴とする。そのような検定では、好ましくは、核酸のハイブリダイゼーション、免疫化学的方法、または活性検定が行われる。実施例４にそのような発現クローニングを説明する。
【０２４６】
ハイブリダイゼーションは、例えば、Fritsch、SambrookおよびManiatisのマニュアル「Molecular cloning: a laboratory manual」[Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク, 1989]に記載されている既知の方法で、既知アミラーゼの核酸をプローブとして使用することにより、それに実質上相補的な配列を遺伝子ライブラリー中に同定する目的で行われる。望ましい相同性の程度は、ここでは、反応条件、すなわちストリンジェンシーの選択によって制御することができる。同定された本発明の配列は、既知アミラーゼとの相同性によって認識することができ、活性検定は陽性対照として役立つ。
【０２４７】
ライブラリーに含まれる遺伝子の発現を既にもたらすライブラリーを、その遺伝子産物に基づいて検定する。これに適するのは既知α-アミラーゼに対する抗体であり、見い出された産物を、同様にそのデンプン分解活性について調べなければならない。これらの方法も先行技術で確立されている。別の選択肢として、実施例に示すように、発現ライブラリーの単離された細胞を、デンプン含有寒天平板に適用することにより、それらの活性について直接検定することもできる。その場合、陽性クローンは、それらの溶解ハローによって認識することができる。
【０２４８】
ある態様の方法は、転写および翻訳制御要素、および所望であれば、陽性の場合の全体としての結果がアミラーゼ活性であるようにアミラーゼ遺伝子の１個または複数個の断片を提供する発現ベクターに、単離されたＤＮＡを導入することを特徴とする。
【０２４９】
これに適するのは、特に、得られた断片が完全な酵素を与えるような形で組換えられているベクターである。これは、欠失を含んでいて断片のクローニングがその欠失をちょうど打ち消すような形になっている遺伝子を含む発現ベクターを用いて実施することができる。この態様は、短すぎて検出可能なデンプン分解活性をコードすることができないＰＣＲ断片に特に適している。
【０２５０】
特に好ましいのは、単離された核酸をスクリーニングするための本発明のＰＣＲに続いて行われる活性測定方法であって、以下の３工程からなる方法である：
(ａ)遺伝子ライブラリー、好ましくは全長遺伝子を含む遺伝子ライブラリーを、得られたＰＣＲ断片またはそれに由来するプローブを用いてスクリーニングする工程、
(ｂ)そのようにして同定された遺伝子または遺伝子断片を発現させる工程、および
(ｃ)該発現によって得られるタンパク質またはタンパク質断片のデンプン分解活性への寄与を測定する工程。
【０２５１】
上記の遺伝子ライブラリーは、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーであると好都合であろう。同じライブラリーに対して本発明のＰＣＲと活性検定とを行うことができる。
【０２５２】
スクリーニングという用語は、先行技術で確立されたスクリーニング、特に、核酸とのハイブリダイゼーションにより、ライブラリーを上述のように検定することを意味する。この場合、既知アミラーゼの部分配列ではなく、本発明のＰＣＲによって得られた部分配列を使用する。そうすれば、遺伝子ライブラリーのスクリーニングは、対応する完全アミラーゼ遺伝子を含むクローンを同定するのに役立つ。
【０２５３】
先行技術から知られている代替法では、得られたＰＣＲ断片を、インバースＰＣＲもしくはアンカーＰＣＲ(ａ-ＰＣＲ)またはプライマーウォーキングによる配列決定に出発点として使用することを含んでなる。
【０２５４】
ＰＣＲによって得た核酸または全長遺伝子をクローニングベクターに組み込み、宿主細胞中に導入した後、活性検定を行う方法が好ましい。これらは、上述の配列決定および/またはさらなるクローニング工程(発現ベクターへのクローニングを含む)に、より容易に利用することができる。
【０２５５】
この目的に使用される宿主細胞は、好ましくは、エシェリキア属、ストレプトミセス属またはバチルス属の菌株である。
【０２５６】
本発明の方法は、個々の配列に関して行われるだけでなく、相同関係の表示が可能であって、配列空間の規定に利用することができる多数の配列を得るためにも行われ、その配列空間がまた特定アミノ酸配列を表す。なぜなら、本発明の方法の目標は、類似するさまざまなタンパク質を同定することであるからである。したがって、ＰＣＲ産物から導くことができるアミノ酸配列はいずれも考慮されるべきである。
【０２５７】
したがって、共通のコンセンサス配列を有する少なくとも２種類のアミノ酸配列が、特に、個々のドメイン、部分活性、構造要素または全長遺伝子および/またはタンパク質により得られるように、数多くの異なるＰＣＲテンプレートで実行または反復される方法が好ましい。
【０２５８】
これらの研究の目標は、配列空間の個々の標本が、該配列空間をランダム突然変異誘発法および酵素開発法(例えば、シャフリング突然変異誘発法)に導入しうるような相同性および多様性の比を有するような、配列空間を作成することである。
【０２５９】
すなわち、含まれる少なくとも２つの配列の配列一致度が、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、特に好ましくは少なくとも５０％であるようなコンセンサス配列が得られることを特徴とする方法が好ましい。
【０２６０】
本発明の別の対象は、本願が提供するタンパク質または核酸配列をさらなるα-アミラーゼを発見するために利用できるということである。
【０２６１】
すなわち、デンプン分解タンパク質を同定するための、好ましくは本発明の第４の対象による方法で同定するための、本発明の第１の対象によるタンパク質または誘導体の使用が特許請求されている。
【０２６２】
それらは、例えば、本発明の方法のための対応するプライマーを得るために使用することができる。また、発現ライブラリーの免疫化学的スクリーニング用の抗体を作製するための上記方法にも使用することができる。
【０２６３】
本発明の第２の対象による核酸も、新規なアミラーゼを、好ましくは本発明の第４の対象による方法で同定および/または取得するために使用することができる。
【０２６４】
それらは、例えば、本発明のＰＣＲ用のプライマーを開発するためのテンプレートとして役立ちうる。また、発現ベクター中に欠失突然変異体として使用して、該ベクターへのクローニングが発現の補完につながるようにすることもできる。
【０２６５】
本発明の方法によって得られるタンパク質の可能な用途は、特に、新規な酵素を開発するための、別のタンパク質への融合または結合によって生じる。この方法で、例えば、化学的カップリングによって多機能酵素を製造することができる。
【０２６６】
本発明の方法によって得られる核酸の可能な用途は、特に、新規な酵素を開発するために、別の核酸への融合にそれらを使用することによって生じる。これは、特定配列の特異的融合によって行うか、またはランダム組換え法によって行うことができる。
【０２６７】
アミノ酸配列の高度に相同な領域、核酸の共通する制限切断部位を利用するか、またはＰＣＲに基づく融合による、特異的融合のためのこの種の用途が好ましい態様である。
【０２６８】
別の可能性は、特に、アミノ酸配列の高度に相同な領域、核酸の共通する制限切断部位を利用することによるか、またはＰＣＲに基づく融合による、ランダム組換え法における使用である。
【０２６９】
アミノ酸配列の高度に相同な領域(通常は保存されている機能保持領域である)は、ＰＣＲプライマー(場合により縮重プライマー)のアンカーとして役立ちうる。２つの異なる遺伝子の核酸の共通する制限切断部位は、ＤＮＡレベルでの直接融合を可能にする。さまざまな遺伝子領域を組み合わせるには、先行技術で確立された方法、およびさまざまな態様を含む本発明の方法をどれでも利用することができる。
【０２７０】
本発明の第２の対象の核酸領域のいずれかを含むベクターは、本発明の別の対象に包含される。
【０２７１】
そのようなベクターは、当該遺伝子または対応するタンパク質の分子生物学的および生化学的研究、本発明の改良、ならびに、本発明のタンパク質の増幅および製造にとって好ましい出発点である
【０２７２】
適切なベクターは、細菌プラスミド、ウイルス、またはバクテリオファージから誘導しうるが、多種多様な起源の要素をも含むことができる。それぞれの場合に存在する他の遺伝子要素を用いて、ベクターは、関連宿主細胞中で自分自身を数世代にわたって安定な単位として確立させることができる。本発明によれば、ベクターが自分自身を独立した単位として染色体外に確立させるか、それとも染色体に組み込まれるかは、ここでは重要でない。先行技術で知られている数多くの系から選択される系は、個々の場合に依存する。決定因子としては、例えば達成できるコピー数、利用できる選択系、なかでもとりわけ、抗生物質に対する耐性、または該ベクターを取り込むことができる宿主細胞の培養可能性などを挙げることができる。
【０２７３】
クローニングベクターは、本発明のこの対象の好ましい態様である。
【０２７４】
このクローニングベクターは、興味ある遺伝子の貯蔵、生物学的増幅または選択に加えて、例えば制限酵素地図の作成または配列決定などによる当該遺伝子の特徴づけにも適している。クローニングベクターも本発明の好ましい態様である。なぜなら、クローニングベクターは可搬型かつ貯蔵型の本発明ＤＮＡであるからである。クローニングベクターは、細胞とは関係しない分子生物学的技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応などの好ましい出発点でもある。
【０２７５】
発現ベクターは、本発明のこの対象の好ましい態様である。
【０２７６】
この発現ベクターは、適切な遺伝子要素のゆえに、タンパク質の産生に最適化された宿主生物中で複製することができ、それに含まれている遺伝子を発現させることができる。好ましい態様は、発現に必要な遺伝子要素を自らがすべて保持している発現ベクターである。プロモーターは遺伝子の転写を調節する。プロモーターの例は、当該遺伝子の上流に元々存在する天然プロモーターである。しかし、本発明の遺伝子ではほとんどの場合、該プロモーターが知られていると想定することはできないので、導入遺伝子を調節するために、遺伝子融合によって他の既知のプロモーターを供する態様が好ましい。この場合、プロモーターは、宿主細胞のプロモーター、改変プロモーター、あるいは異なる生物に由来する全く異なるプロモーターであることができる。好ましい態様は、培養条件を変化させるか、特定の化合物を添加することによって、例えば細胞密度または特異的因子などによって調節することができる発現ベクターである。
【０２７７】
発現ベクターは、特定の遺伝子要素に依存して、異種または同種のタンパク質発現を可能にする。また、タンパク質生合成をインビトロで模倣する無細胞発現系も本発明の態様である。そのような発現系は先行技術でも確立されており、クローニングまたは発現ベクター中に供された遺伝子に基づいている。
【０２７８】
本発明のこの対象には、本発明のタンパク質または誘導体を、好ましくは適切な発現ベクターを用いて、発現させるかまたは発現させるように誘導することができる宿主細胞が含まれる。
【０２７９】
本発明のデンプン分解酵素を生細胞でインビボ合成させるには、対応する遺伝子を宿主細胞中に導入すること、すなわちその形質転換が必要である。適切な宿主細胞は、基本的に任意の生物、すなわち原核生物、真核生物または藍色植物である。例えば、発現ベクターによる形質転換およびその安定な樹立などの点で、遺伝的に取り扱いが容易である宿主細胞が好ましい。また、好ましい宿主細胞は、微生物学的および生物工学的な取り扱いやすさを特徴とする。これは、例えば培養しやすさ、高い増殖速度、発酵培地に関する要求の低さ、良好な産生速度、および外来タンパク質の分泌などに関係する。個々の例に最適な発現系は、先行技術に従って利用できる多種多様な系から、実験的に決定することが必要になることが多い。
【０２８０】
好ましい態様は、例えば発現ベクター上に供することができるか、あるいは当該細胞中に最初から存在することができる遺伝子調節要素のゆえに、タンパク質産生速度を調節することができる宿主細胞である。この細胞における発現は、例えば、活性化剤として使用される化学物質の制御された添加によって、または培養条件を変化させることによって、または特定の細胞密度に到達したときに誘導されうる。これにより、目的とするタンパク質の極めて経済的な産生が可能になる。
【０２８１】
この実験原理の変形は、追加の遺伝子、例えば他のベクター上に供された遺伝子が、本発明のタンパク質の産生に影響を及ぼすような発現系である。この追加遺伝子は、修飾遺伝子産物であってもよいし、また、例えばそのデンプン分解機能に影響を与えるために、本発明のタンパク質と一緒に精製されることを意図したものであってもよい。それらは、例えば、他のタンパク質または酵素、阻害剤、またはさまざまな基質との相互作用に影響を及ぼす要素であることができる。
【０２８２】
ある好ましい態様では、宿主細胞は、細菌、特に産生したタンパク質または誘導体を周囲の培地中に分泌する細菌であることを特徴とする。
【０２８３】
好ましい宿主細胞は原核細胞または細菌細胞である。細菌は、通常、真核生物と比較して、世代時間が短く、培養条件に対する要求が低いことを特徴とする。そのため、本発明のタンパク質を得るための費用効果の高い方法を確立することができる。
【０２８４】
グラム陽性細菌であることを特徴とする宿主細胞が好ましい態様である。
【０２８５】
グラム陽性細菌、例えばバチルスもしくは放線菌類または放線菌目の他の標本などは、外膜を持たないので、分泌されたタンパク質が細胞を取り囲む栄養培地中に直ちに放出され、発現された本発明のタンパク質は、その培地から、別の好ましい態様に従って直接精製することができる。
【０２８６】
バチルス(Bacillus)属、好ましくは、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)種、バチルス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)種、バチルス・スブチリス(Bucillus subtilis)種またはバチルス・アルカロフィルス(Bacillus alcalophilus)種に属することを特徴とする宿主細胞が好ましい態様である。
【０２８７】
上記の宿主細胞は樹立されたグラム陽性発現系である。
【０２８８】
他の放線菌(Actinomycetales)目、特にストレプトミセス(Streptomyces)属、好ましくはストレプトミセス・リビダンス(Streptomyces lividans)種、特に好ましくはストレプトミセス・リビダンス(S. lividans)ＴＫ２４、またはストレプトミセス種(Streptomyces sp.)３２７＊もしくはストレプトミセス種(Streptomyces sp.)Ｂ４００Ｂ、特に２つの菌株ＤＳＭ１３９９０またはＤＳＭ１３９９１のどちらかに属することを特徴とする宿主細胞が好ましい態様である。
【０２８９】
上述のように、または実施例に記載するように、本発明のタンパク質の特に好ましい態様は、上記の属および上記の種の標本からそれぞれ得られた。コドン使用頻度が類似していることから、上記の標本は、本発明により提供される遺伝子および遺伝子断片を発現させるのにも特に適している。
【０２９０】
これらは、それら自身の遺伝子を発現させる場合には、同種タンパク質発現を可能にする。この同種タンパク質発現は、産生されるタンパク質に対して、翻訳に関連する天然の修飾反応が、自然界で進行する修飾と同じように行われるという利点を持ちうる。これは例えば、既存の内在遺伝子またはその本発明の修飾物を該細胞中に、例えば複数コピー導入するベクターの導入によって行うことができる。
【０２９１】
グラム陰性細菌であることを特徴とする宿主細胞が好ましい態様である。
【０２９２】
生物工学的生産の実験は、そのほとんどが、例えばエシェリキア・コリやクレブシエラ(Klebsiella)などのグラム陰性細菌を用いて得られている。また、これらの細菌は、多数のタンパク質を細胞周辺腔、すなわち細胞を包む２つの膜に挟まれた区画に分泌する。これを特定用途に利用することができる。しかしその一方で、グラム陽性細菌によって産生された酵素の細胞外空間への特異的放出が好ましい場合もある。これを行う方法は、例えば国際特許出願ＰＣＴ/ＥＰ０１/０４２２７に、「Verfahren zur Herstellung rekombinanter Proteine durch gram-negative Bakterien」(グラム陰性細菌による組換えタンパク質の製造方法)という名称で記載されている。
【０２９３】
エシェリキア(Escherichia)属、好ましくはエシェリキア・コリ(Escherichia coli)種、特に好ましくはエシェリキア・コリ(E. coli)ＪＭ１０９株、エシェリキア・コリ(E. coli)ＤＨ１００Ｂ株またはエシェリキア・コリ(E. coli)ＤＨ１２Ｓ株に属することを特徴とする宿主細胞が好ましい。
【０２９４】
上記の菌株は、一般利用が可能な研究用および生産用の樹立株である。実施例６で得た放線菌目遺伝子の異種発現にエシェリキア・コリＤＨ１２Ｓ株を使用して成功した。これにより、検出可能なα-アミラーゼ活性を有するタンパク質を得ることが可能になった。
【０２９５】
別の態様は、真核細胞であること、特に産生されたタンパク質を翻訳後修飾するものであることを特徴とする宿主細胞である。
【０２９６】
これらの例は、真菌、またはサッカロミセス(Saccharomyces)もしくはクルイベロミセス(Kluyveromyces)などの酵母である。これは例えば、タンパク質に対して、特にその合成に関連して、この種の系によって可能になる修飾を加えようとする場合には、特に有利になりうる。そのような修飾には、例えば膜アンカーまたはオリゴ糖などの低分子量化合物の結合などが含まれる。
【０２９７】
本発明のこの対象の別の態様は、本発明のタンパク質または誘導体を製造する方法である。この目的には、本発明の核酸を使用し、さらに所望であれば、適切なベクターを使用し、そして/または適切な宿主細胞を使用するか、または該タンパク質を天然に産生する細胞を使用する。これらのうち、上述の天然生物が上記のように好ましい。
【０２９８】
既に上述した要素はいずれも、本発明のタンパク質を製造するための方法と組み合わせることができる。これに関連して、可能性のある工程の組み合わせを、本発明の各タンパク質について数多く考えることができる。これらはいずれも、本発明の基礎をなす思想を実施するものである。すなわち、デンプン分解機能によって、またそれと同時に、配列表に示す配列に対する高度な相同性によって規定されるあるタイプのタンパク質の標本を、対応する遺伝子情報を利用して量的に製造することを実施するものである。実際の個々の例では、最適な方法を実験的に決定しなければならない。
【０２９９】
基本的に、ここでの手順は以下の通りである。ＤＮＡの形態にある本発明の核酸を適切な発現ベクターにライゲーションする。これを宿主細胞中に、例えば、適切な遺伝子要素の制御下にある遺伝子から産生されるタンパク質を周囲の栄養培地に輸出するか、または該タンパク質を細胞内に蓄積する、培養が容易な細菌株の細胞中に導入する。これを調節する要素は、例えば発現ベクターによって供することができる。本発明のタンパク質は、周囲の培地から、または細胞を破壊して宿主細胞そのものから、例えば沈殿やクロマトグラフィーなどの複数の精製工程を経て精製することができる。当業者であれば、実験室規模で実験的に最適化された系を、大量生産に移行させることができる。
【０３００】
本発明のアミラーゼに可能な産業上の使用は本発明の別の対象である。なぜなら、本発明の基礎をなす目的は、さまざまな産業プロセスに適したアミラーゼを提供することであったからである。これらのプロセスのうち最も重要なものを以下に説明する。
【０３０１】
産業界で確立されている、デンプン分解酵素に可能な数多くの用途は、例えばH.Uhligによる著書「Industrial enzymes and their applications」[Wiley-Verlag, ニューヨーク, 1998]などの便覧で論じられている。以下の比較は、最終的な一覧と理解すべきではなく、可能な産業上の用途の抜粋である。類似性の範囲内にある個々のタンパク質が、その酵素特性、すなわちデンプン分解特性のゆえに、本願には明記していない追加の可能な用途に適していると判明した場合は、その可能な用途は、ここに本発明の保護範囲に包含されるものとする。
【０３０２】
ある態様では、本発明は、本発明のタンパク質または誘導体を含むことを特徴とする洗浄剤および浄化剤に関する。
【０３０３】
デンプン分解酵素の用途として重要な分野は、織物または固体表面、例えば食器、床または工具などを浄化するための洗浄剤または浄化剤における活性成分としての用途である。これらの用途では、デンプン分解活性は、炭水化物含有汚染、特にデンプンに基づく汚染を加水分解的に溶解するか、または基礎物質からはぎ取る機能を果たす。この場合、該酵素は単独で、適切な媒質に入れて、あるいは洗浄剤もしくは浄化剤に入れて適用することができる。このために選択すべき条件、例えば温度、ｐＨ、イオン強度、酸化還元比、または機械的影響などは、特定の浄化課題に対して、すなわち汚染および支持物質に対して最適化すべきである。例えば、洗浄剤および浄化剤にとって通常の温度範囲は、手作業のための１０℃から、４０℃および６０℃を経て、機械作業用または産業用の９５℃までである。好ましくは、当該の製剤の成分も互いに調和させる。現在の洗濯機および食器洗浄機では、温度が通常は連続的に調節できるので、任意の中間温度も含まれる。他の条件も同様に、当該製剤の他の成分により、特定の浄化用途に対して、極めて多様に設定することができる。
【０３０４】
好ましい本発明の製剤は、このようにして定義できる条件のいずれかにおいて、当該製剤の洗浄または浄化性能が、本発明のデンプン分解酵素の添加により、該酵素を含まない製剤と比較して、改善されることを特徴とする。この点で、洗浄剤または浄化剤の洗浄および/または浄化性能を改善することができるデンプン分解タンパク質を、本発明の製剤に導入するのが好ましい。
【０３０５】
さらに好ましい製剤は、デンプン分解酵素および他の成分が相乗作用的に汚染を取り除くことを特徴とする。これは、例えば該製剤の他の成分、例えばデンプン分解タンパク質の加水分解産物を可溶化する界面活性剤によって行われる。本発明のタンパク質は、産業消費者または産業使用者用の製剤にも、個人消費者用の製品にも使用することができる。先行技術で確立された提供方法および/または便利な提供方法は、すべて本発明の態様である。
【０３０６】
本発明の製剤では、アミラーゼを、例えば以下の各成分または数成分と混合する：陰イオン、陽イオンおよび/または非イオン界面活性剤、ビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、漂白触媒、酵素、例えばプロテアーゼ、他のアミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼまたはオキシダーゼなど、安定剤、特に酵素安定剤、溶媒、増粘剤、研磨物質、染料、香料、退色防止剤、移染防止剤、制泡剤、腐食防止剤、特に銀保護剤、蛍光増白剤、抗微生物物質、ＵＶ保護剤および先行技術から知られる他の成分。
【０３０７】
好ましい製剤は、０.０００００１〜５重量％、より好ましくは０.００００１〜４重量％、０.０００１〜３重量％、０.００１〜２重量％または０.０１〜１重量％のデンプン分解タンパク質または誘導体を含むことを特徴とする。
【０３０８】
好ましい製剤は、２以上の相を含むことを特徴とする。これらには、固形製剤、特に少なくとも２つの固形成分(特に、粉末、顆粒または押出物)が、全体に緩く混合されている製剤、または少なくとも２つの固形成分が、特に接合圧縮工程により互いに結合している製剤を含めることができる。また、少なくとも１つの相が、アミラーゼ感受性材料(特にデンプン)を含んでいるか、または少なくとも部分的に該材料で取り囲まれているか、コーティングされていてもよい。
【０３０９】
同様に好ましい製剤は、全体として液体、ゲル様またはペースト様であることを特徴とする。好ましくは、そのなかのタンパク質および/またはそのなかの酵素の少なくとも１つおよび/またはそのなかの他の成分の少なくとも１つは、個別に存在するか、または他の成分と一緒に、好ましくはマイクロカプセル(特に好ましくはアミラーゼ感受性材料でできたマイクロカプセル)に封入された状態で存在する。
【０３１０】
好ましい態様では、製剤の他の成分のいずれかによって、デンプン分解活性が改変され、特に安定化され、そして/または製剤の洗浄もしくは浄化性能への寄与が強化される。
【０３１１】
これらの議論によれば、少なくとも一部が本発明のα-アミラーゼに基づいているか、好ましくは本発明の製剤を使用する洗浄または浄化プロセスはいずれも、本発明の態様である。
【０３１２】
織物または硬質面を洗浄または浄化するための、本発明のα-アミラーゼまた好ましくは本発明の製剤の使用も、本発明の態様である。
【０３１３】
別の態様は、織物の製造における原材料または中間体を処理するための、特に綿布の糊抜きを行うための、本発明のタンパク質または誘導体の使用である。
【０３１４】
織物、例えば綿に基づく織物の製造における原材料および中間体には、その製造およびさらなる処理に際して、仕上がりを改善するために、デンプンが供される。紡績糸、中間体および織物に適用されるこの方法は糊付けと呼ばれる。本発明のデンプン分解タンパク質は、このデンプン含有保護層を除去(糊抜き)するのに適している。
【０３１５】
さらに別の態様は、デンプン液化の方法、特にエタノールの製造方法であって、その方法に本発明のタンパク質または誘導体を使用することを特徴とする方法である。
【０３１６】
デンプンを液化するには、水または緩衝液に浸漬したデンプンをデンプン分解酵素と共にインキュベートすることにより、多糖をより小さい部分に切断し、最終的には主としてマルトースまで切断する。本発明の酵素が、その生化学的特性のゆえに、対応する製造プロセスに容易に適応させることができるのであれば、上述のようなプロセスまたはその一部には、本発明の酵素を使用するのが好ましい。例えば、同じ反応条件を要求する他の酵素に加えて、それらを一段階で導入すべき場合などが、これに当てはまる。本発明のデンプン分解タンパク質は、関心の焦点が該タンパク質そのものによって生成する生成物にある場合は、特に好ましい。デンプン液化は、エタノールまたはそれから得られる二次製品(例えば酢酸)を製造するための多段階プロセスの一段階であってもよい。
【０３１７】
別の態様は、直鎖および/または短鎖オリゴ糖を製造するための、本発明のタンパク質または誘導体の使用である。
【０３１８】
本発明のデンプン分解タンパク質は、その酵素活性ゆえに、比較的短時間のインキュベーション時間後に、デンプン様ポリマーから、主として高分子量のオリゴ糖、例えばマルトヘキサオース、マルトヘプタオースまたはマルトオクタオースなどを生成する。インキュベーション時間を長くすると、より低分子量のオリゴ糖、例えばマルトースまたはマルトトリオースなどの割合が反応生成物中に増加する。一定の反応生成物に特に関心がある場合は、本発明のタンパク質の適切な変異体を使用し、そして/またはそれに応じて反応条件を設定することができる。これは、例えば特定の物理的特性だけを有する溶液、懸濁液またはゲルを生成させる場合などのように、純粋な化合物ではなく類似する化合物の混合物が重要である場合には、特に魅力的である。
【０３１９】
別の態様は、シクロデキストリンを加水分解するための、本発明のタンパク質または誘導体の使用である。
【０３２０】
シクロデキストリンは、α-１,４-グリコシド結合した環状多糖であり、なかでも、それぞれ６、７および８個のグルコースモノマーからなるα-、β-およびγ-シクロデキストリン(それぞれシクロヘキサアミロース、シクロヘプタアミロースおよびシクロオクタアミロースともいう)は、経済的に最も重要である。これらは、例えば芳香剤、香味剤または医薬活性物質などの疎水性ゲスト分子との包接化合物を形成することができ、その包接化合物からは、必要時にゲスト分子を再び放出させることができる。例えば、適当な製品における成分の使用分野(例えば、食品製造用、医薬用または化粧品用)に依存して、そのような包接化合物は最終消費者にとって重要である。したがって、シクロデキストリンからの成分の放出は、本発明のタンパク質の可能な用途である。
【０３２１】
別の態様は、多糖担体またはシクロデキストリンから低分子量化合物を放出させるための、本発明のタンパク質または誘導体の使用である。
【０３２２】
本発明のデンプン分解タンパク質は、その酵素活性のゆえに、他のα-１,４-グリコシド結合多糖からも、低分子量化合物を遊離させることができる。これは、シクロデキストリンに関して言えば、分子レベルで起こるし、より大きな系、例えばマイクロカプセルの形で封入された成分などでも起こりうる。例えばデンプンは、貯蔵時に反応混合物中に所定量で導入することを意図した酵素などの化合物を封入するために、先行技術で確立された材料である。そのようなカプセルからの制御された放出プロセスを、本発明のデンプン分解酵素によって支援することができる。
【０３２３】
別の態様は、食品および/または食品成分を製造するための、本発明のタンパク質または誘導体の使用である。
【０３２４】
同様に、動物用飼料および/または動物用飼料成分を製造するための、本発明のタンパク質または誘導体の使用も、本発明の態様である。
【０３２５】
デンプンまたはデンプン由来の炭水化物が食品または動物用飼料成分としての役割を果たす場合はいつでも、これらの物品の製造にデンプン分解活性を利用することができる。この活性は、ポリマー状の糖に対するモノマーまたはオリゴマーの割合を増加させて、例えばその食品の味、消化性または稠度などに利益をもたらしうる。これは、特に動物用飼料を製造する際に要求されることがあるが、例えば果汁、ワインまたは他の食品の製造において、ポリマー状の糖の割合を減らすべき場合および甘みおよび/または易溶性糖類の割合を増加させるべき場合にも要求されることがある。デンプン液化および/またはエタノール製造に関して上述した可能な用途は、この原理の産業上の変形であると考えることができる。
【０３２６】
またアミラーゼは、老化として知られるパン菓子製品の食味の喪失も妨害する(老化防止効果)。この目的には、焼く前に生地にアミラーゼを加えておくとよい。したがって、本発明の好ましい態様は、本発明のタンパク質をパン菓子製品の製造に使用する態様である。
【０３２７】
別の態様は、デンプン含有接着剤結合を溶解するための、本発明のタンパク質または誘導体の使用である。
【０３２８】
本発明のタンパク質または誘導体を使用することを特徴とする一時的結合方法も、本発明の態様である。
【０３２９】
デンプンは、他の天然物質と共に、紙の製造ならびに異なる紙および厚紙の結合に、既に何世紀にもわたって結合剤として使用されてきた。これは、例えば図画および書物に関係する。長時間が経過すると、例えば湿気などの好ましくない影響により、そのような紙は波打ったり、完全な破壊にもつながりかねない破損が起こったりする。そのような紙および厚紙を修復するには接着層の溶解が必要になる場合があるが、これは本発明のデンプン分解タンパク質を使用することによってかなり容易になる。
【０３３０】
デンプンまたはセルロースなどの植物ポリマーおよびそれらの水溶性誘導体は、とりわけ接着剤または糊として使用される。この目的には、該ポリマーをまず水中で膨潤させ、次に、接着しようとする材料に塗布してから、乾燥させることにより、該材料を基材に結合させる。そのような水性懸濁液に、結果として得られる糊の接着特性に影響を与える目的で、本発明の酵素を加えることができる。しかし、この機能の代わりに、またはこの機能に加えて、乾燥後に、長期間(例えば数年)にわたって、不活性な形で接着すべき材料上に留まらせるために、本発明の酵素を糊に加えることもできる。その場合は、後に酵素を活性化して溶解させるために、環境条件を特異的に変化させること、例えば湿らせることができる。このようにして、接着した材料を基材から、より容易に再びはがすことができる。この方法では、本発明の酵素が、そのデンプン分解活性のゆえに、一時的結合法における分離剤として、または接着した材料をはがすための「スイッチ」として作用する。
【実施例】
【０３３１】
実施例１：α-アミラーゼの可変配列領域を増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチドの構築
放線菌目のさまざまな属(Streptomyces、Thermomonosporaなど)のα-アミラーゼの既知配列(Ｅ.Ｃ.３.２.１.１)について、ＧｅｎＢａｎｋ[米国国立衛生研究所、国立バイオテクノロジー情報センター(ＮＣＢＩ)、米国メリーランド州ベセスダ；１９９８年１１月更新]と比較することにより、できるだけ可変的な配列領域に隣接している潜在的に保存されている可能性がある配列領域を同定した。同定された保存配列ブロックは、図１に強調表示したブロックＡ〜Ｅである。これらは以下のアミノ酸位置に広がっている：Ａ：５８〜９１、Ｂ：９４〜１４１、Ｃ：１５５〜２０７、Ｄ：２９５〜３４５、Ｅ：３９２〜４２７。これらの領域の配列に基づいて、表４に列挙するオリゴヌクレオチドを本発明のプライマーとして設計した。その配列を配列表の配列番号９〜３３に示す。α-アミラーゼ遺伝子中の保存された配列ブロックＡ〜Ｅと対比したそれらの位置を、ストレプトミセス・グリセウス(Streptomyces griseus)α-アミラーゼ(ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ５７５６８)を例にして、図１に図示する。これらは、上記遺伝子に対するその向きにより、フォワードプライマーとリバースプライマーとに区別することができる。
【０３３２】
表４：放線菌目の標本の部分α-アミラーゼ配列を増幅するためのＰＣＲプライマー
(それぞれ図１で使用した名称、本願の配列表での対応する番号、および当該アミラーゼ遺伝子に対するプライマーの向きを示す。)
【表４】
2004530442.tif 000011
【０３３３】
使用したテンプレートは、それぞれ純粋培養物として存在する、さまざまな土壌試料からの既知および未知の細菌分離物から、標準的方法によって得たゲノムＤＮＡ調製物である。プライマーはいずれの場合も、フォワードプライマーとリバースプライマーとを組み合わせて、各ＰＣＲに使用した。ＰＣＲ産物を後述するようにアガロースゲル電気泳動によって分画し、それを全長遺伝子のスクリーニングに使用した。
【０３３４】
ＰＣＲ反応混合物には、プライマーの組み合わせＧＥＸ０２４(フォワード)/ＧＥＸ０２６(リバース)およびＧＥＸ０２９(フォワード)/ＧＥＸ０３１(リバース)を含有するものを含めた。これらは配列領域Ｃ(ＧＥＸ０２４およびＧＥＸ０２９)およびＤ(ＧＥＸ０２６およびＧＥＸ０３１)に由来する(図１)。これらの領域は、論文「Alpha-Amylase family: molecular biology and evolution」[Janecek,S. (1997), Prog.Biophys.Mol.Biol. 67(1), p.67-97]に定義されている(αβ)８バレル構造のアミラーゼドメインβ４およびβ７に対応する。これら４本のプライマーのヌクレオチド配列を、配列表の配列番号９〜配列番号１２に示す。
【０３３５】
これら４本のプライマーは、細菌分離物の単離された核酸とのＰＣＲ混合物において、再現性のあるサイズを有する断片を生成させた。図２に、２０個の無作為に選択した放線菌目分離物の調製物から、図２Ａではプライマー対ＧＥＸ０２４/ＧＥＸ０２６を用いて、また図２Ｂではプライマー対ＧＥＸ０２９/ＧＥＸ０３１を用いて得られた増幅産物の典型的なサイズ解析を示す。ＰＣＲ条件は実施例２に示す。反応後に、いずれの場合も、反応液量の１/１０を濃度２.５％のアガロースゲルで分画した。反応混合物は、以下の表に列挙するストレプトミセス種の菌株に基づく。
【０３３６】
表５：プライマー対ＧＥＸ０２４/ＧＥＸ０２６およびＧＥＸ０２９/ＧＥＸ０３１により図２に記載するＰＣＲ産物を与えるストレプトミセス種の菌株
【表５】
2004530442.tif 000012
【０３３７】
どちらのプライマー対を使用しても、３００ｂｐバンドに対応するＤＮＡ断片が増幅された。他にも約５００ｂｐの断片が一部の反応混合物に認められた。どちらの産物も配列決定によりα-アミラーゼ配列と同定された(実施例２参照)。上に列挙し、配列表にも記載した他のプライマーは、これより低い選択性を示した。
【０３３８】
配列表に挙げた菌株はすべて同じ結果をもたらした。特に上記の３００ｂｐバンドはすべての菌株で再現性があった。検定した試料からこの方法で得ることができたすべての断片、特に３００ｂｐ断片は、相同関係を表示することができた。これらは、特にプライマー領域で、必ずしも完全にではないものの、かなりの一致を示し、それは、本発明の方法でそれらを同定するには十分であった。これらは、配列表の配列番号２６３および図３にも示すように、互いの配列変異により、デンプン分解タンパク質群のなかに配列変動空間を規定する。
【０３３９】
実施例２：放線菌類からのゲノムＤＮＡの取得ならびにα-アミラーゼ遺伝子配列のＰＣＲに基づく増幅およびクローニング
本発明の方法の利用可能性を、一般的な微生物学的方法によって土壌試料から得た数百株の放線菌目分離物からなる収集物で検討した。これらはそれぞれ個別の培養菌株であった。
【０３４０】
この実施例では、土壌試料から出発して、標準的方法により、付随微生物叢を抑制するために５０μｇ/ｍｌニスタチンを添加したＧＹＭ培地(４.０ｇ/Ｌグルコース、４.０ｇ/Ｌ酵母エキス、１０ｇ/Ｌ麦芽エキス)、２.０ｇ/Ｌ ＣａＣＯ３、１０ｇ/Ｌ寒天、ｐＨ７.２)を用いて分離を行った。
【０３４１】
菌株の培養
５０μｌの胞子懸濁液を含む５ｍｌのＧＨＰＦ培地(１０ｇ/Ｌグルコース、５ｇ/Ｌカゼイン由来ペプトン、５ｇ/Ｌ肉エキス、５ｇ/Ｌ酵母エキス、０.７４ｇ/Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ｐＨ７.２)を接種することにより、それぞれ株特異的な温度(２８℃〜５０℃)および２００ｒｐｍの振盪速度で、放線菌類の菌株を増殖させた。
【０３４２】
十分量の菌糸体が形成された後、２００ｍｌのＹＥＭＥ培地(３ｇ/Ｌ酵母エキス、５ｇ/Ｌバクトトリプトン、３ｇ/Ｌ麦芽エキス、１０ｇ/ＬのＤ(＋)グルコース、３４０ｇ/Ｌショ糖、ｐＨ７.２；オートクレーブ後に、５ｍＭ ＭｇＣｌ２および株特異的に０.５〜２０ｇ/Ｌのグリシンを添加)に、前培養液全体を接種し、バッフル付きの１リットルフラスコ中、１７０ｒｐｍで振盪しながら、同じ温度で３日間培養した。
【０３４３】
ＤＮＡの単離
ＤＮＡを調製するために、いずれの場合も、２０％(v/v)グリセロールで洗浄した菌糸体１ｇを、２ｍｇ/ｍｌのリゾチームを添加した３ｍｌのＴＥ２５Ｓ緩衝液[２５ｍＭトリス(ｐＨ８.０)、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、０.３Ｍショ糖]に再懸濁し、３７℃で３０分間反転し、４ｍｌの２×カービー(Kirby)ミックス[２％ＳＤＳ、１２０ｇ/Ｌの４-アミノサリチル酸ナトリウム、１００ｍＭトリス(ｐＨ８.０)、６％フェノール(５０ｍＭトリス/ｐＨ８.０で飽和させ、０.１％ヒドロキシキノリンを添加したもの)]を添加した後、さらに１０分間反転した。次に、水相を、順次８ｍｌおよび３ｍｌのフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(２５：２４：１)で、それぞれ１０分間反転した後、２５００×ｇで遠心分離することによって、２回抽出した。１/１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム(非緩衝液)と０.６体積のイソプロパノールとを加えて穏やかに反転することによってＤＮＡを沈殿させ、ＤＮＡを巻き取り、７０％エタノールで５回精製した。ペレットを３ｍｌのＨＥ緩衝液[１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ(ＮａＯＨでｐＨ８.０)、１ｍＭ ＥＤＴＡ]にとり、５０〜５５℃で１時間インキュベートし、４℃で終夜溶解した。
【０３４４】
必要に応じて、ＤＮＡに付随していて増幅反応を阻害する可能性のある成分を除去するために、さらにもう一段階の精製工程を行うことができる。最初はＰＣＲ産物を何も生成しなかった一部のＤＮＡ調製物には、これが必要であった(下記参照)。この場合は、ＤＮＡ調製物中の阻害成分の影響を、希釈(１：１００まで)によって、またはＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製カラム(Qiagen, ドイツ・ヒルデン)で製造者の指示に従って精製することによって停止させる必要があった。
【０３４５】
翌日、ＤＮＡを、４０μｇ/ｍｌのＲＮａｓｅＡ(熱失活)および０.５ｍｇ/ｍｌプロテイナーゼＫで、それぞれ１時間、逐次的に３７℃で処理した。次に、水相を同体積のフェノール/クロロホルム/イソプロパノール(２５：２４：１)で抽出し、１０分間反転し、２５００×ｇで遠心分離し、前日と同様に沈殿させ、巻き取った後、洗浄し、１ｍｌのＨＥ緩衝液に溶解した。
【０３４６】
本発明のＰＣＲによるアミラーゼ配列の増幅
アミラーゼ配列を特徴づける前に、アミラーゼ配列をまずポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)によって増幅した。このＰＣＲは、ＨｏｔＳｔａｒ Ｔａｑポリメラーゼ(Qiagen, ドイツ・ヒルデン)とアミラーゼ特異的プライマー(実施例１、表３)とを使用して行った。これには、いずれの場合も、上記の方法によって単離された４μlのゲノムＤＮＡを、２００μＭのｄＮＴＰ類(ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰのそれぞれ)、２０ｐモルの各フォワードプライマーおよびリバースプライマー、２.５ＵのＨｏｔＳｔａｒ Ｔａｑポリメラーゼ(Qiagen, ドイツ・ヒルデン)の存在下で使用し、１×ＰＣＲ緩衝液を合計５０μｌの液量で使用した。サイズが２８０〜５００ｂｐの断片を以下のサイクルで増幅した：９５℃で１５分を１サイクル、それぞれ９０℃で３０秒、６０℃で３０秒および７２℃で３０秒を４０サイクル、７２℃で７分を１サイクル。
【０３４７】
特にプライマー対ＧＥＸ０２４/ＧＥＸ０２６は、配列決定でアミラーゼに対する相同性を示す３００ｂｐ産物に関して、すべてのゲノムＤＮＡで一定した結果をもたらした(実施例１参照)。一部のＤＮＡ調製物では、最初は何の産物を生成しなかった。この場合は、ＤＮＡ調製物中の阻害成分の影響を、希釈(１：１００まで)によって、またはＱＩＡｑｕｉｃｋ(登録商標)ＰＣＲ精製カラム(Qiagen, ドイツ・ヒルデン)で、製造者の情報に従って精製することによって停止させる必要があった。
【０３４８】
プライマーの組み合わせＧＥＸ０２４/ＧＥＸ０２６を用いて得られたバンド(約３００ｂｐ)を、Ｑｉａｇｅｎ(ドイツ・ヒルデン)のＱＩＡＥＸ II(登録商標)キットを用いて溶出させ、ＴＯＰＯ ＴＡ(登録商標)キット(Invitrogen, オランダ・フローニンゲン)を用いて、製造者の指示に従ってｐＣＲ２.１-ＴＯＰＯ(登録商標)ベクターにクローニングすることにより、各バンドを配列決定した。ライゲーション産物を使ってエシェリキア・コリ-ＴＯＰ(登録商標)１０Ｆ(Invitrogen, オランダ・フローニンゲン)を形質転換した。アンピシリン(１００μｇ/ｍｌ)、ＩＰＴＧ(１００ｍＭ)、Ｘ-Ｇａｌ(４０ｍｇ/ｍｌ)を含むＬＢ培地で組換えクローンを青/白選択した後、白クローンのプラスミドＤＮＡを、微量調製した後に、ＥｃｏＲＩによる制限酵素解析でＤＮＡインサートについてチェックした。
【０３４９】
ＤＮＡインサートを有するプラスミドの配列は、ＡｍｐｌｉＴａｑ-ＦＳ-Ｂｉｇ-Ｄｙｅ(登録商標)ターミネーターキット(Perkin Elmer, ドイツ・ヴァイターシュタット)を利用し、２００〜５００ｎｇのプラスミドＤＮＡ、１０ｐモルのプライマー(ＴｏｐｏＦ：5'-GCTCGGATCCACTAGTAACG-3'およびＴｏｐｏＲ:5'-CTCTAGATGCATGCTCGAG-3')、４μｌのプレミックスを、合計２０μｌの液量で使用し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ(登録商標)３１０(Perkin Elmer, ドイツ・ヴァイターシュタット)で、製造者の指示に従って、常法により解析した。得られたＤＮＡ配列を常法により概念的にアミノ酸配列に書き換え、ＢｌａｓｔＸ、ＢｌａｓｔＮおよびＢｌａｓｔＰアルゴリズムを用いて、利用できるＧｅｎＢａｎｋ登録配列と比較したところ、α-アミラーゼ遺伝子の部分配列であると同定された。得られた各部分配列について、公開データベースに登録されているデンプン分解タンパク質のうち、それぞれに当該配列と最も高い相同性を有するものを、表１に示す。見い出された部分配列を、配列表の配列番号２、４および３４〜２６２に列挙し、それらを組み合わせて図３および配列番号２６３のコンセンサス配列を得た。
【０３５０】
プライマー対ＧＥＸ０２４/ＧＥＸ０２６を用いて同様に増幅された部分配列であって、配列表の配列番号１〜４に示すものに、特に注目すべきである。対応する菌株をストレプトミセス種Ｂ３２７＊(配列番号１および２)ならびにストレプトミセス種Ｂ４００Ｂ(配列番号３および４)と名付けた。放線菌目分離物であるストレプトミセス種Ｂ３２７＊から得られる部分配列は、プライマー領域を含めて３０２塩基対からなり、１００個のアミノ酸をコードしている。放線菌目分離物であるストレプトミセス種Ｂ４００Ｂから得られる部分配列は、プライマー領域を含めて２９３塩基対からなり、９７個のアミノ酸をコードしている。
【０３５１】
実施例３：微生物純粋培養分離物のタイピングおよびα-アミラーゼ遺伝子配列のクローニング
α-アミラーゼのＤＮＡ配列を、上述のように、実施例２で言及した放線菌株のすべてから、本発明のＰＣＲにより、プライマーＧＥＸ０２４/ＧＥＸ０２６を用いて増幅した後、クローニングし、配列決定した。こうして、配列表の配列番号２、４および３４〜２６２に列挙する全部で２３１のα-アミラーゼ部分配列が見い出された。ここに挙げる個々のストレプトミセス種の菌株、例えばストレプトミセス種Ｂ３２７＊およびストレプトミセス種Ｂ４００Ｂは、プライマー対ＧＥＸ０２４/ＧＥＸ０２６を用いたＰＣＲにより、適切なサイズと配列表に示す部分アミラーゼ配列とを有する断片をそこから増幅することができるという事実によって特徴づけることができる。
【０３５２】
アラインメントプログラムＣｌｕｓｔａｌ Ｘ(登録商標)バージョン１.６４ｂ[標準設定；Thompson,J.D., Higgins,D.G.およびGibson,T.J.(1994), 「CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position specific gap penalties and weight matrix choice」, Nucleic Acids Res., volume 22, p.4673-4680に記載]を用いて、上記の配列から、コンセンサス配列を導き出した。上記の配列は、この共通配列を介して、ある特定タイプのアミラーゼの標本であるとみなすことができる。このコンセンサス配列を、図３と配列表の配列番号２６３に、二通りの表現方法で示す。このコンセンサス配列の位置は、プライマー対ＧＥＸ０２４/ＧＥＸ０２６によるＢ３２７＊株のＰＣＲ産物の配列に基づいて規定した(１００アミノ酸；配列番号２)。
【０３５３】
コンセンサス配列中で実質的に不変にみえるアミノ酸位置１〜８および９３〜１００は、ＰＣＲプライマー配列(ＧＥＸ０２４/ＧＥＸ０２６)によって指定されている。実施したＰＣＲの選択性のゆえに、これらの領域にはわずかな変動しか見い出されなかった。よりストリンジェントな条件(特に高いアニーリング温度)を使用すれば、陽性結果の数、すなわちプライマー領域内でプライマーと完全に一致する配列の数は少なくなる。これに対し、出発ＤＮＡの複雑さゆえに、ストリンジェンシーの低い条件ほど、アガロースゲルでの分離がより困難な産物の生成量が増える。産物のなかで、もはやアミラーゼをコードしていない配列の割合が増加する。
【０３５４】
その他では、検定した全てのアミラーゼ断片にわたって、列挙した配列中で保存されているのは、１１位のアミノ酸残基ヒスチジンと７５位のロイシンだけである。一部の断片は、２８位に単一のアミノ酸ではなく、複数のアミノ酸からなる配列を含んでいる。これらも、図３および配列番号２６３、ならびに、問題にしている個別の配列のそれぞれに示す。この個別の配列は、ストレプトミセス種Ｂ３４７株(配列番号２１２)の部分配列ＴＡＧＧＥ、ストレプトミセス種Ｂ３６１株(配列番号２０４)の部分配列ＴＳＧＡＥ、およびストレプトミセス種Ｂ４００６Ｂ株(配列番号２４６)の部分配列ＹＰＡＷＧＧＧＫである。また、一部の断片は、２９、４５、４６、６６、７０、８１、８２、８３または９１位にどのアミノ酸も有していないので、その個別の番号付けはコンセンサス配列の番号付けとはわずかに異なっている。これらの断片には、例えばストレプトミセス種Ｂ３４７、Ｂ３６１およびＢ１０５９の断片が含まれる。
【０３５５】
示した配列は、上記の表１からわかるように、既知のα-アミラーゼに対して約４５％〜９７％の配列一致度を有している。これらの配列も、一部にかなりの変動を示す。例えば、ストレプトミセス種Ｂ３２７＊とＢ４００Ｂのα-アミラーゼに見い出されるアミノ酸配列は、互いに５７％しか一致しない。
【０３５６】
実施例４：発現遺伝子ライブラリーの活性スクリーニングによる、α-アミラーゼをコードする完全長遺伝子配列の検出
異種宿主生物エシェリキア・コリ、すなわちＤＨ１２Ｓ株での選択発現クローニングにより、放線菌目から完全α-アミラーゼ遺伝子をクローニングし、単離した。使用したプロモーターは、ｌａｃオペロンのＩＰＴＧ(イソプロピルチオガラクトシド)誘導性β-ガラクトシダーゼプロモーター(ｌａｃプロモーター)である。このプロモーターを、ｐＵＣ１８プラスミドベクター[ＧｅｎＢａｎｋ(米国国立衛生研究所、国立バイオテクノロジー情報センター(ＮＣＢＩ)、米国メリーランド州ベセスダ)；受託番号Ｌ０８７５２；図４]に供した。
【０３５７】
特定の菌株のための発現遺伝子ライブラリーの作製
実施例２に従って取得した、放線菌目の特定の菌株に由来する精製ゲノムＤＮＡを、制限酵素ＡｃｉＩで消化し、３〜５ｋｂのサイズ範囲を、制限酵素ＡｃｃＩで線状化したｐＵＣ１８プラスミドベクター(図４)にライゲーションした。平均インサートサイズを４ｋｂ、推定放線菌類ゲノムサイズを８Ｍｂとすると、所望する５倍というゲノムカバー率から、一次クローンは２０,０００個という数字になる。発現はプラスミド上のｌａｃプロモーターから始まるが、インサートはそれぞれ２つの向きで組み込まれうるので、この数字は少なくとも４０,０００クローンまで増加し、これを各遺伝子ライブラリーについて得るクローンの最小数とした。
【０３５８】
放線菌類由来のゲノムＤＮＡの調製用部分消化に関する最適な制限切断パラメータは、必要であれば製造者の指示に従って、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)を含む１×緩衝液中、６μｇのＤＮＡと、１μｇのＤＮＡにつき０.１〜０.４Ｕの濃度の制限酵素(ＡｃｉＩ)とを用いて、１５μｌの総液量で、まず制限切断速度測定を行うことによって決定した。そのために、反応混合物を、まず酵素なしで３７℃に加熱した。次に、制限エンドヌクレアーゼを添加することによって、その反応を開始させた。０〜１０分の所定の間隔で、それぞれ１.５μｌの反応混合物を、氷上の１×停止緩衝液[６×：１０ｍＭトリス(ｐＨ７.０)、２０％グリセロール、０.１％ＳＤＳ]に加え、濃度０.７％のアガロースゲルで解析することにより、各ＤＮＡ調製物について、部分消化に最適な制限切断時間を個別に決定した。この時間は平均で４〜５分であった。
【０３５９】
調製用部分消化は、上述のように、ただし６０μｇの染色体放線菌ＤＮＡと先に最適化した量の酵素とを使って反応混合物の量を１０倍にし、それぞれ個別に決定した時間にわたって行った。１×停止緩衝液の添加によって反応を停止した後、混合物を濃度０.７％のアガロースゲルで電気泳動的に分画し、サイズが３〜５ｋｂのＤＮＡを含むゲル領域を切り出し、２時間の電気溶出によって４℃で透析チューブ中に単離した。１/１０体積の３Ｍ酢酸ナトリウムと２.５体積のエタノールとを使ってＤＮＡを沈殿させ、少量に取り出した後、小さい断片をさらに除去するために、２回目のゲル電気泳動にかけ、次に電気溶出を行い、再び濃縮した。
【０３６０】
プラスミドベクターｐＵＣ１８とのライゲーションは、１×リガーゼ緩衝液中、製造者の指示に従ってＣＩＡＰ(ウシ胸腺由来のアルカリホスファターゼ)で脱リン酸化しておいた１５０ｎｇのＡｃｃＩ線状化ｐＵＣ１８ベクターと、４５０ｎｇの部分切断ゲノムＤＮＡ、および適当量のリガーゼ(ここでは４００ＮＥＢ単位)を用いて、２０μｌの総液量中、１６℃で終夜行った。
【０３６１】
コンピテントなエシェリキア・コリＤＨ１２Ｓ細胞(Gibco Life Technologies, ドイツ・カールスルーエ)を、電気形質転換法によって形質転換した。この目的を達成するために、１μｌのライゲーション混合物と３０μｌの細胞とを混合し、氷上、エレクトロポレーションセル中で１分間インキュベートし、エレクトロポレーション装置[ＢＴＸ(登録商標)ＥＣＭ３９９, Genetronics Inc., 米国カリフォルニア州サンディエゴ]中、製造者の指示に従って処理した。直ちに１ｍｌのＳＯＣ培地[２％バクトトリプトン、０.５％酵母エキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２.５ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７.０(ＮａＯＨで調節)、オートクレーブ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４およびＭｇＣｌ２ならびに２０ｍＭのＤ(＋)グルコースを補足]に移した後、３７℃で１時間の休止期を置いてから、平板に播種した。
【０３６２】
生成した一次形質転換体の総数およびインサート保持クローンの数を、試験平板培養での青/白選択法で決定することによって、遺伝子ライブラリーの品質を試験した。この目的を達成するために、１μｌおよび１０μｌのライゲーション混合物をそれぞれ、アンピシリン、ＩＰＴＧ、Ｘ-Ｇａｌを含むＬＢ培地(上述のとおり)に播種し、３７℃で終夜インキュベートした。試験平板培養の少なくとも１０個の白色コロニーからプラスミドを単離し、適切な制限酵素消化を行った後、ゲル電気泳動でサイズを解析することにより、実際にクローニングされたインサートサイズを確認した。
【０３６３】
遺伝子ライブラリーの活性検定
まず、遺伝子ライブラリーのデンプン分解能を測定した。そのために、１％可溶性デンプン(Merck, ドイツ・ダルムシュタット, カタログ番号１２５２)を含むＬＢ寒天を使用した。この培地では、デンプンを分解する能力を有するクローンを、溶解ハローによって同定することができる。これには、平板を２〜４週間にわたって、その平板が濁るまで、４℃に保存する必要があった。その後、デンプンの分解は、その平板のコロニーの周囲での透明化として、目に見えるようになった。また、Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ(登録商標)３Ｂ-Ａ(Aldrich, ドイツ・タウフキルヘン)で標識した可溶性デンプン(約０.６％w/v)も使用した[Biely,P., Mislovicova,D., Markovic,０., Kalac,V.(1988), 「A new chromogenic substrate for assay and detection of alpha-amylase」Anal. Biochem., volume 172(1), p.176-179]。この場合、デンプンの破壊は、陽性クローンの領域における赤みがかった寒天の退色によって検出することができる。どちらの場合も、使用に先立って、平板を、プロモーターを誘導するためのＩＰＴＧ(１００ｍＭ)および形質転換体に選択圧をかけるためのアンピシリン(１００μｇ/ｍｌ)と混合した。
【０３６４】
いずれの場合も、生成したライブラリーの力価に応じて、平板(直径１４ｃｍ)１枚あたり約１０,０００コロニーを含む所定の体積の形質転換混合物を、ガラスビーズを使って均等に播種した(一次平板培養)。３７℃で１６時間インキュベートした後、アミラーゼの発現と放出のために平板を２８℃でさらに２４〜４８時間インキュベートした。２８℃でのインキュベーションは、通常、デンプンの分解を視覚化するには不可欠である。ここでは、改善されたタンパク質フォールディングおよび細胞外膜の透過化が役割を果たしうる[Stathopoulos,C., Georgiou,G., Earhart,C.F.(1996), 「Characterization of Escherichia coli expressing an Lpp'OmpA(46-159)-PhoA fusion protein localized in the outer membrane」, Appl.Microbiol.Biotechnol., volume 45(1-2), p.112-119]。したがって、これはいずれの場合も産生されたα-アミラーゼの放出を伴い、輸出されなかった細胞質アミラーゼを検出するために、細胞溶解を追加して行う必要はなかった。
【０３６５】
同じデンプン平板での新たな(二次)平板培養によって、一次平板培養のハロー領域からコロニーを分離した後、アミラーゼを生成する単一コロニーを新たなハロー形成に基づいて選択した。写真記録用には、クローンの確保後に、デンプン非含有領域(分解ハロー)を明確に視覚化するために、５０％ルゴール液(Merck, ドイツ)でデンプン平板を染色することが有用であることがわかった。
【０３６６】
図７は適切に染色されたデンプン含有ＬＢＡｍｐ-寒天平板を示す。この平板には、二次平板培養の陽性クローンの懸濁液がそれぞれ滴下されている。
【０３６７】
個々のクローンの分離
微量調製[Ｑｉａｇｅｎ(ドイツ・ヒルデン)製キットを製造者の指示に従って使用]によって得た陽性クローンのプラスミドＤＮＡを、ＥｃｏＲＩまたはＳａｃＩ/ＨｉｎｄIIIによる制限酵素解析でインサートサイズについて調べた後、配列決定した。ここでは、先行技術から知られている「プライマーウォーキング」法によって最終的に全配列を得るために、まずインサート隣接Ｍ１３プライマー(Ｍ１３フォワード：5'-GTAAAACGACGGCCAG-3'；Ｍ１３リバース：5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3')を使用した。この手法の原理は、決定された配列から出発して、次々と新規な配列決定プライマーを導き、隣接するまだわかっていない領域の配列決定にそれらのプライマーを使用し、その領域からさらに次の配列決定プライマーを導くことができるというものである。
【０３６８】
２つの放線菌目分離物ストレプトミセス種Ｂ３２７＊およびストレプトミセス種Ｂ４００Ｂ分離物(実施例２参照)について、このようにして得た完全ＤＮＡ配列およびそれから導かれるアミノ酸配列を、配列表の配列番号５および６ならびに配列番号７および８にそれぞれ示す。
【０３６９】
ストレプトミセス種Ｂ３２７＊およびストレプトミセス種Ｂ４００Ｂの２つの完全α-アミラーゼと、２００１年１月２４日の時点で、ＧｅｎＢａｎｋ[米国国立衛生研究所、国立バイオテクノロジー情報センター(ＮＣＢＩ)、米国メリーランド州ベセスダ]に見い出されたそれらにもっとも類似するアミラーゼ配列とのアラインメントを、図５に示す。後者の配列は、１つはストレプトミセス・アルブスα-アミラーゼ、受託番号Ｕ５１１２９であり、これはストレプトミセス種Ｂ３２７＊とタンパク質全体にわたって８０％同一である。一方、ストレプトミセス種α-アミラーゼ(ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ８６０２)はストレプトミセス種Ｂ４００Ｂとタンパク質全体にわたって７６.８％同一である。
【０３７０】
実施例５：原核発現系でのα-アミラーゼの異種発現
クローニングしたα-アミラーゼの生化学的特性を特徴づけるには、それを可溶型としてより大量に製造すべきである。ストレプトミセス種Ｂ３２７＊、ストレプトミセス種Ｂ４００Ｂおよび放線菌目分離物ストレプトミセス種Ｂ３２７Ｂの完全アミラーゼ遺伝子について、この特徴づけを行った。使用した発現宿主は、ストレプトミセス・リビダンスＴＫ２４である。使用したベクターはｐＡＸ５ａ(図６)であり、この場合、発現は構成的ｅｒｍＥプロモーターの制御を受ける。
【０３７１】
クローニングに必要なＳｐｅＩ部位とＥｃｏＲＩ切断部位を導入するために、また比較的稀なコドンであり、それゆえに比較的翻訳されにくい可能性があるＢ３２７＊(ＧＴＧ)およびＢ４００Ｂ(ＴＴＧ)のアミラーゼ遺伝子の開始コドンをＡＴＧで置き換えるために、適切に改変されたプライマーを用いてＰＣＲを行った。したがって、例えばストレプトミセス種３２７＊の完全α-アミラーゼのクローニングには、
【化１】
2004530442.tif 000013
を使用した。ここでは、新規な非相補的ヌクレオチドを小文字で表す。フォワードプライマーでは、制限酵素ＳｐｅＩの認識部位と開始コドンに下線を引き、シャイン・ダルガノ配列は太字で強調している。リバースプライマーでは、制限酵素ＥｃｏＲＩの認識部位に下線を引き、停止コドン(逆向き)を太字で強調している。遺伝子ライブラリーから単離したゲノムクローンを、テンプレートとして利用した。
【０３７２】
Ｐｆｘ Ｐｌａｔｉｎｕｍポリメラーゼを用いて生成させたＰＣＲ産物を、ベクターｐＣＲＢｌｕｎｔ II ＴＯＰＯ(Invitrogen, オランダ・フローニンゲン)にサブクローニングした後、放線菌発現ベクターｐＡＸ５ａへの定方向挿入を、ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩ制限切断部位を用いて行った。次に、ストレプトミセス・リビダンスＴＫ２４のプロトプラスト形質転換を、Kieserら[Kieser,T., Bibb,M.J., Buttner,M.J., Chater,K.F., Hopwood,D.A.(2000), 「PEG-assisted transformation of Streptomyces protoplasts with plasmid DNA. Rapid small-scale procedure.」:「Practical Streptomyces Genetics」中, The John Innes Foundation(発行者), Crows, 英国ノリッジ]に従って行い、形質転換体を選択再生培地Ｒ２ＹＥに播種した。この培地は以下の成分からなる：選択的抗生物質として、７５μｇ/ｍｌのチオストレプトンを含むＨ２Ｏ １Ｌに対してショ糖１０３ｇ、Ｋ２ＳＯ４ ０.２５ｇ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０.１２ｇ、グルコース１０ｇ、Ｄｉｆｃｏカザミノ酸(Difco, ドイツ・ハイデルベルグ)１００ｍｇ、濃度０.５％(w/v)のＫＨ２ＰＯ４溶液１０ｍｌ、濃度３.６８％(w/v)のＣａＣｌ２溶液８０ｍｌ、Ｌ-プロリン１.５ｍｌ、ＴＥＳ緩衝液[ｐＨ７.２；２-{[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アミノ}エタンスルホン酸)１００ｍｌ、微量元素溶液(４０ｍｇ/Ｌ ＺｎＣｌ２、２００ｍｇ/Ｌ ＦeＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ/Ｌ ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ/Ｌ ＭｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ/Ｌ Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ/Ｌ (ＮＨ４)６ＭＯ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ]０.２ｍｌ、および濃度１０％(w/v)のＤｉｆｃｏ酵母エキス(Difco, ドイツ・ハイデルベルグ)５ｍｌ。
【０３７３】
ＮＢＳＡインジケーター平板[８ｇ/ＬのNeutrient Broth Difco、１５ｇ/ＬのAgar Serva、１.５％(w/v)の可溶性デンプンMerck #1252、ｐＨ８.０；製造者 Difco, ドイツ・ハイデルベルク；Serva, ドイツ・ハイデルベルク；Merck, ドイツダルムシュタット]に再播種し、デンプン分解ハローの出現に基づいて認識されるアミラーゼ陽性クローンを同定した後、酵素活性を有する上清を得るために液体培養法での培養を行った。そのために、まず５ｍｌの前培養を、続いて５０ｍｌの主培養を、バッフル付きの３００ｍｌエルレンマイヤーフラスコで、７５μｇ/ｍｌのチオストレプトンを含むＧＹＭ培地(４ｇ/Ｌグルコース、４ｇ/Ｌ酵母エキス、１０ｇ/Ｌ麦芽エキス、２ｇ/Ｌ ＣａＣＯ３)を用いて、それぞれ１６時間および４日間培養した。２,５００ｇで１５分間の遠心分離とそれに続く濾過(０.４５μｍ)で細胞塊を除去することにより、アミラーゼ含有培養上清を得て、それを直ちに測定にかけるか、または液体窒素で急速冷凍してから、−２０℃の冷凍庫で保存した。
【０３７４】
実施例６：α-アミラーゼ標本のデンプン分解活性の特徴づけ
ストレプトミセス種Ｂ３２７＊およびＢ４００Ｂから得た本発明の２つのα-アミラーゼに、基本的にデンプン分解活性が検出されることは、既に実施例４で説明した。ここでは、実施例５に従って異種生物を用いて調製した酵素の酵素特性を、より詳しく調べる。
【０３７５】
酵素特性の特徴づけ
用途との関連で酵素を選択する際の根拠になりうる酵素特性の特徴づけは、α-アミラーゼの多種多様な応用分野に関して行われる。この場合、酵素は、実施例４および５ならびに上述の手順に従って遺伝子配列のクローニングと異種発現とを行うことによって、製造することができる。
【０３７６】
デンプン分解活性は、ジニトロサリチル酸測定法(ＤＮＳＡ測定法)を用いて測定した。ここでは、複合デンプン基質の加水分解が多糖の還元末端の増加に基づいて測定され、未反応のＤＮＳＡ試薬の５４０ｎｍにおける吸光度が加水分解活性に関する尺度となる。
【０３７７】
測定は、ＰＣＲサーモサイクラー用９６ウエルプレート[０.２ｍｌ「薄壁(thin-wall)プレート」＃３４１６、ＭＰＢ(Molecular BioProducts, 米国サンディエゴ)]の試料ウエルおよびブランクウエルに、それぞれ２５μｌの基質溶液[１８０ｍＭトリス-マレイン酸緩衝液(ｐＨ８.６)中または１８０ｍＭ対応測定緩衝液中の１％可溶性デンプンＭｅｒｃｋ分析用]を導入し、サーモサイクラーブロック中、５０℃または特定の測定温度で５分間プレインキュベートすることによって行った。各ウエルに２０μｌの酵素溶液を加えた後、基質を５０℃または特定の測定温度で１５分間転化させた。６５μｌのＤＮＳＡ試薬(８.８ｇのジニトロサリチル酸、２５０ｇの酒石酸カリウムナトリウム、６.３ｇの二亜硫酸ナトリウム、３３４ｍｌの４.５％(w/v)ＮａＯＨ、９１５ｍｌのＨ２Ｏ)を試料ウエルおよびブランクウエルに加え、２０μｌの酵素溶液をブランクウエルに加えた後、１００℃に予熱しておいたサーモブロックに測定プレートを直ちに移し、１００℃で２０分間インキュベートした。前もって９６ウエル測定プレート(ＰＳマイクロプレート、９６ウエル＃６５５１０１、Greiner)に導入しておいた２００μｌのＨ２Ｏにそれぞれ６０μｌのアッセイ混合物を移し、次いでマイクロタイタープレート分光測光計(Spectramax 190, Molecular Devices, 米国サニベール)を用いて、Ｈ２Ｏを基準にして５４０ｎｍでの吸光度を測定することにより、試料を測定した。いずれの場合も３回の測定を行った。評価は、３つのブランクウエルの平均を、３つの試料ウエルの平均から差し引くことによって行った。
【０３７８】
温度安定性および温度プロファイル
温度安定性は、組換え法で得たα-アミラーゼの溶液をさまざまな温度で１５分間プレインキュベートした後、５０℃および１００ｍＭトリス-マレイン酸(ｐＨ８.６)で上述の手順に従って残存活性を測定することによって決定した。ストレプトミセス種Ｂ３２７Ｂ由来のα-アミラーゼの最大安定性は４５℃であることがわかったが、６１℃まで温度を上昇させても影響は比較的わずかであり、残存活性は８０％を超えていた。他の結果を表６に要約する。４５℃での最適値を１００％とした。
【０３７９】
表６：ストレプトミセス種Ｂ３２７＊由来のα-アミラーゼの温度安定性
【表６】
2004530442.tif 000014
【０３８０】
温度プロファイルは、さまざまな温度および１００ｍＭトリス-マレイン酸緩衝液(ｐＨ８.６)で、上述の手順に従って反応を行うことによって測定した。ストレプトミセス種Ｂ３２７＊由来のα-アミラーゼの最大活性は４１.３℃で得られた。さらに温度を上げると、この酵素では、明確な活性の喪失が起こった(表７参照)。これに対し、ストレプトミセス種Ｂ３２７Ｂアミラーゼの活性は、測定した温度範囲の全域にわたって比較的一定であった(表８参照)。
【０３８１】
表７：ストレプトミセス種Ｂ３２７＊由来のα-アミラーゼの温度プロファイル
【表７】
2004530442.tif 000015
【０３８２】
表８：ストレプトミセス種Ｂ３２７Ｂ由来のα-アミラーゼの温度プロファイル
【表８】
2004530442.tif 000016
【０３８３】
ストレプトミセス種Ｂ３２７Ｂのα-アミラーゼが、ストレプトミセス種Ｂ３２７＊のα-アミラーゼよりも広い温度範囲にわたって、また高温まで安定であることが明らかである。したがって、本発明が提供するデンプン分解酵素は、その温度感受性がかなり多様であることを特徴とする。
【０３８４】
ｐＨ変動に対する安定性
ｐＨ範囲６.０〜８.０のデンプン基質溶液を、それに合わせて調節した１８０ｍＭトリス-マレイン酸緩衝液、およびｐＨ８.６以上については、１８０ｍＭグリシン-ＮａＯＨ緩衝液と混合することにより、さまざまなｐＨ条件下で、α-アミラーゼの活性を測定した。基質溶液を希釈した後、所望のｐＨ値ならびに１００ｍＭトリス-マレイン酸緩衝液および１００ｍＭグリシン-ＮａＯＨ緩衝液の緩衝液濃度を、測定条件下で得た。緩衝液系の影響は、ｐＨ８.６での測定を両方の緩衝液系で行うことによって打ち消した。特定ｐＨ値でのデンプン分解活性は上述のように５０℃で測定した。得られた結果を下記の表９に要約する。ストレプトミセス種Ｂ３２７＊およびＢ３２７に由来する２つのα-アミラーゼのｐＨ６.５における活性をそれぞれ１００％とした。この値に対する相対値が以下に示す各値である。
【０３８５】
表９：ストレプトミセス種Ｂ３２７＊および放線菌目の分離物ストレプトミセス種Ｂ３２７Ｂに由来するデンプン分解酵素のアルカリ性ｐＨ値におけるデンプン分解活性
【表９】
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【０３８６】
ストレプトミセス種Ｂ３２７＊のα-アミラーゼと比較すると、ストレプトミセス種Ｂ３２７のα-アミラーゼは、アルカリ性のより高い媒質中で、より安定であり、また極めて高いｐＨ値まで、より高い安定性およびより高いデンプン分解活性を有している。
【０３８７】
界面活性剤に対する安定性
２組の活性測定を行うことにより、界面活性剤に対する安定性を決定した。第１に、α-アミラーゼを、０.０１８％(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)を含むデンプン基質溶液と共に、上述のようにプレインキュベートして、希釈後の測定混合物中のＳＤＳ濃度が０.０１％になるようにした。ここでも５０℃および１００ｍＭトリス-マレイン酸緩衝液(ｐＨ８.６)で活性を測定した。これらの値をそれぞれ１００％とすると、調べたα-アミラーゼはどちらもＳＤＳの不存在下では、それより低い活性を有する。すなわち、ストレプトミセス種Ｂ３２７＊のアミラーゼは、ＳＤＳが存在しないと９４.２％の活性を有し、ストレプトミセス種Ｂ３２７Ｂは８９％の活性を有する。これは、新規なα-アミラーゼ群の無作為に選択した標本が、多くの用途に典型的な界面活性剤濃度の存在下で十分に安定であることを示している。
【０３８８】
無作為に選択した酵素を、デンプン基質溶液(１％デンプン)を含む３.６ｍＭ ＣａＣｌ２と共に、または１.８ｍＭ ＥＤＴＡを含むデンプン基質溶液と共にインキュベートすることにより、安定化作用を有する可能性がある二価陽イオンの存在下およびキレート剤の存在下での酵素活性をそれぞれ特徴づけた。したがって、上述のように行った測定における最終濃度は、それぞれ２ｍＭ Ｃａ２＋および１ｍＭ ＥＤＴＡになる。ここでも５０℃および１００ｍＭトリス-マレイン酸緩衝液(ｐＨ８.６)で、残存活性を測定した。
【０３８９】
２ｍＭ ＣａＣｌ２における両酵素の活性をそれぞれ１００％とすると、ストレプトミセス種Ｂ３２７＊のα-アミラーゼの活性は、１ｍＭ ＥＤＴＡの存在下では９１％に低下した。ストレプトミセス種Ｂ３２７Ｂのα-アミラーゼの活性は、１ｍＭ ＥＤＴＡの存在下では５７％まで低下する。これは、両酵素が、界面活性剤およびキレート剤の存在下で、比較的高い残存活性を有することを示している。しかし、キレート剤が存在する場合の活性が異なることからわかるように、どちらの酵素もこれらの影響に対して明確に異なる多様な形で反応する。
【０３９０】
この実施例の結果は、まず第１に、見い出された本発明の酵素が、そのＤＮＡおよびタンパク質配列のゆえにα-アミラーゼであるとみなされるべきであるばかりでなく、実際にデンプン切断活性を持っていることを示している。反応条件に対する要件が、調べた両酵素で異なることは、本発明が、基本的な相同性に加えて個別の相違をも有する広範なデンプン分解酵素を提供するものであるという事実の証拠であるとみなすことができる。
【０３９１】
図面の説明
図１は、放線菌目α-アミラーゼ配列から導いた、α-アミラーゼ(グリコシルヒドロラーゼファミリー１３、Ｅ.Ｃ.３.２.１.１)における、潜在的に保存されているアミノ酸配列のブロック(「配列アンカー」Ａ〜Ｅ)の位置、および表３に列挙し配列表に示す本発明にとって重要なＰＣＲプライマーの相対的な位置を示すものである(実施例１)。
例として、ストレプトミセス・グリセウスのα-アミラーゼ[ＧｅｎＢａｎｋ(米国国立衛生研究所、国立バイオテクノロジー情報センター(ＮＣＢＩ)、米国メリーランド州ベセスダ)、受託番号Ｘ５７５６８]のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を示す。これらの配列は、それぞれ５６７アミノ酸および１７０１ｂｐからなり、以下のアミノ酸位置に広がる保存されたドメインＡ〜Ｅを有する：Ａ：５８〜９１、Ｂ：９４〜１４１、Ｃ：１５５〜２０７、Ｄ：２９５〜３４５、Ｅ：３９２〜４２７。
【０３９２】
図２は、プライマーの組み合わせＧＥＸ０２４/ＧＥＸ０２６(図２Ａ)およびＧＥＸ２９/ＧＥＸ０３１(図２Ｂ)を用いて放線菌ＤＮＡで行った本発明ＰＣＲの反応生成物のサイズ解析を示すものである(実施例１)。
ここで使用したテンプレートは、無作為に選択した以下のストレプトミセス種の２０菌株から調製したゲノムＤＮＡである：
１：Ｂ１０１Ａ、２：Ｂ１１４Ｃ、３：Ｂ１３４、４：Ｂ１３５Ａ、５：Ｂ１３８Ａ、６：Ｂ１５２Ａ、７：Ｂ１５３Ｂ、８：Ｂ１６１Ａ、９：Ｂ１５６Ｂ１、１０：Ｂ１５７Ｃ、１１：Ｂ１５８Ａ、１２：Ｂ１６０Ｂ、１３：Ｂ１６１Ａ、１４：Ｂ３７３、１５：Ｂ３７５、１６：Ｂ３８０、１７：Ｂ３９０、１８：Ｂ３９２Ａ、１９：Ｂ３９２Ａ、２０：Ｂ３９４。
反応産物(反応液量の１/１０)をそれぞれ濃度２.５％のアガロースゲルで分画した。両方とも部分的に存在する約３００ｂｐおよび約５００ｂｐの産物は、配列決定によりアミラーゼ配列であると確認された。マーカー(Ｍ)：１００ｂｐのＤＮＡラダー(単位ｂｐ、上から下に３０００、２０００、１５００、１２００、１０３１、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００)。
【０３９３】
図３は、ストレプトミセス属の２３１の菌株から得たα-アミラーゼのコンセンサス配列(配列番号２、４および３４〜２６２)ならびに各位置での対応する変異を示すものである(実施例３)。
このコンセンサス配列は、プログラムＣｌｕｓｔａｌ Ｘ(登録商標)バージョン１.６４ｂ[標準設定；Thompson,J.D., Higgins,D.G.およびGibson,T.J.(1994), 「CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position specific gap penalties and weight matrix choice」, Nucleic Acids Res., volume 22, p.4673-4680に記載]を用いたアラインメントに基づいている。アミノ酸位置１〜７および９４〜１００は、実施したＰＣＲの選択性に依存して、実質上、ＰＣＲプライマー配列(ＧＥＸ０２４/ＧＥＸ０２６およびＧＥＸ０２９/０３１)によって定まっている。これは、配列番号２６３に示すコンセンサス配列の代替表現である。
【０３９４】
図４は、発現遺伝子ライブラリーに使用したプラスミドベクターｐＵＣ１８の概略図である[ＧｅｎＢａｎｋ(米国国立衛生研究所、国立バイオテクノロジー情報センター(ＮＣＢＩ)、米国メリーランド州ベセスダ)、受託番号Ｌ０８７５２；実施例４]。
ＡｃｉＩで断片化したストレプトミセスゲノムＤＮＡを挿入するために、このベクターをそれぞれ、制限酵素ＡｃｃＩで線状化した。ORI：複製起点；lacI：ｌａｃ-リプレッサー遺伝子；lacZ-alpha：β-ガラクトシダーゼのα-ペプチドの遺伝子；AmpicillinR：β-ラクタマーゼのアンピシリン耐性遺伝子。
【０３９５】
図５は、ストレプトミセス種Ｂ３２７＊およびストレプトミセス種Ｂ４００Ｂに由来する本発明の２つの完全α-アミラーゼと、２００１年１月２４日時点でＧｅｎＢａｎｋ[米国国立衛生研究所、国立バイオテクノロジー情報センター(ＮＣＢＩ)、米国メリーランド州ベセスダ]に見い出される最も類似するα-アミラーゼ配列とのアラインメントを示すものである(実施例４)。
後者のα-アミラーゼは、Ｂ３２７＊のα-アミラーゼのアミノ酸配列と、完全タンパク質の全長にわたって、８０％同一であるストレプトミセス・アルブスα-アミラーゼ(Ｕ５１１２９)、および同様に、ストレプトミセス種Ｂ４００Ｂと７６.８％同一であるストレプトミセス種α-アミラーゼ(Ｕ０８６０２)である(表２および３を参照)。
【０３９６】
図６は、ストレプトミセス・リビダンスＴＫ２４中でアミラーゼを発現させるために使用したプラスミドベクターｐＡＸ５ａの概略図である(実施例５)。
図中、pUC19 ori：エシェリキア・コリにおける複製起点；AmpicillinR：アンピシリン耐性遺伝子(β-ラクタマーゼ)；ThiostreptonR：チオストレプトン耐性遺伝子；pIJ101 Replicon：ストレプトミセスにおける複製起点；ermE：S. erythreaのermE up プロモーター[Fass S.H., Engels,J.W. 1996, 「Influence of Specific Signal Peptide Mutations on the Expression and Secretion of the alpha-Amylase Inhibitor Tendamistat in Streptomyces lividans」, J.Biol.Chem., Volume 271 (Number 25), p.15244-15252]。テンダミスタット(tendamistat)配列を置き換えることにより、ＳｐｅＩ(５'末端)およびＥｃｏＲＩ(３'末端)認識部位を用いて、クローニングしようとする遺伝子をｐＡＸ５ａに挿入し、そこで構成的ｅｒｍＥプロモーターから発現させることができる。
【０３９７】
図７は、エシェリキア・コリ中で異種発現させた後の、ストレプトミセス種Ｂ３２７＊およびストレプトミセス種Ｂ４００Ｂに由来する本発明α-アミラーゼのデンプン分解活性の検出を示すものである。
対応する遺伝子配列をエシェリキア・コリ中で異種発現させ(実施例４)、１％可溶性デンプンを含むＬＢＡｍｐ-寒天平板に形質転換宿主細胞を塗布し、次にルゴール液を用いてその平板を染色することにより、導入された遺伝子配列を発現させる細胞のコロニーを、分解ハローによって認識することができる。
この図では、以下の形質転換混合物からの単離によって得たクローン試料を塗布した：
１．陽性対照(ｐＵＣ１８中にストレプトミセス・グリセウスα-アミラーゼを含む発現株)；
２．陰性対照(ＤＮＡインサートを含まないｐＵＣ１８)；
３．ストレプトミセス種Ｂ４００ＢのゲノムＤＮＡを含むアミラーゼ陽性クローンの試料；
４および５．同じ形質転換で得たストレプトミセス種Ｂ３２７＊の２つのゲノムクローンの試料；
６〜８．同じ形質転換で得たストレプトミセス種Ｂ３２７の３つのゲノムクローンの試料；
９〜１２．同じ形質転換で得たストレプトミセス・グリセウスの４つのゲノムクローンの試料。
【図面の簡単な説明】
【０３９８】
【図１】放線菌目α-アミラーゼ配列から導いたα-アミラーゼにおける、潜在的に保存されているアミノ酸配列のブロックの位置、および表３に列挙し配列表に示す本発明にとって重要なＰＣＲプライマーの相対的な位置を示す図である。
【図２】プライマーの組み合わせＧＥＸ０２４/ＧＥＸ０２６(図２Ａ)およびＧＥＸ２９/ＧＥＸ０３１(図２Ｂ)を用いて放線菌ＤＮＡで行った本発明ＰＣＲの反応生成物のサイズ解析を示す図である。
【図３−１】ストレプトミセス属の２３１の菌株から得たα-アミラーゼのコンセンサス配列ならびに各位置での対応する変異を示す図（その１）である。
【図３−２】ストレプトミセス属の２３１の菌株から得たα-アミラーゼのコンセンサス配列ならびに各位置での対応する変異を示す図（その２）である。
【図３−３】ストレプトミセス属の２３１の菌株から得たα-アミラーゼのコンセンサス配列ならびに各位置での対応する変異を示す図（その３）である。
【図３−４】ストレプトミセス属の２３１の菌株から得たα-アミラーゼのコンセンサス配列ならびに各位置での対応する変異を示す図（その４）である。
【図４】発現遺伝子ライブラリーに使用したプラスミドベクターｐＵＣ１８の概略図である
【図５】ストレプトミセス種Ｂ３２７＊およびストレプトミセス種Ｂ４００Ｂに由来する本発明の２つの完全α-アミラーゼと、２００１年１月２４日時点でＧｅｎＢａｎｋに見い出される最も類似するα-アミラーゼ配列とのアラインメントを示す図である。
【図６】ストレプトミセス・リビダンスＴＫ２４中でアミラーゼを発現させるために使用したプラスミドベクターｐＡＸ５ａの概略図である。
【図７】エシェリキア・コリ中で異種発現させた後の、ストレプトミセス種Ｂ３２７＊およびストレプトミセス種Ｂ４００Ｂに由来する本発明α-アミラーゼのデンプン分解活性の検出を示す図である。
【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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