(57)【要約】本発明は、転移能を有する癌細胞を検出および単離する新規な方法および組成物に関する。本発明はさらに、かかる癌細胞の転移能を測定するアッセイおよび抗転移性を有する薬物を同定する薬物スクリーニングアッセイに関する。さらに本発明は、転移する癌細胞表面に発現されたセリン膜内在性プロテアーゼ［（ＳＩＭＰ）、セプラーゼおよびジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）からなる］の活性をモジュレートすることにより癌細胞の転移能を阻害する方法および組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における癌細胞の存在を検出する方法であって、
（ａ）  患者由来のサンプルを、接着分子で被覆されたマトリックスに接種し、
（ｂ）  この細胞接着マトリックスに癌細胞を接着させるのに十分な時間、該サンプルをインキュベートし、
（ｃ）  該マトリックスに結合した癌細胞の存在を検出する、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項２】
上記サンプルが血液サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記サンプルが組織サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記マトリックスがコラーゲン、フィブリンおよび綿繊維を含めて天然素材で構成されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
癌患者由来の癌細胞の転移能を調べる方法であって、
（ａ）  癌患者由来の癌細胞を、接着分子で被覆されたマトリックスに接種し、
（ｂ）  癌細胞による該マトリックスの接着、取り込みまたは浸潤を起こさせるのに十分な時間、癌細胞をインキュベートし、
（ｃ）  癌細胞による該マトリックスの接着、取り込みまたは浸潤を検出する、
ことを含んでなり、その際、該マトリックスの癌細胞接着、取り込みまたは浸潤の検出が転移能を有する癌細胞の指標となる、上記方法。
【請求項６】
癌細胞の転移能を阻害する薬剤を同定する方法であって、
（ａ）  癌細胞および試験薬剤またはビヒクル対照のいずれかを、接着分子で被覆されたマトリックスに接触させ、
（ｂ）  癌細胞による該マトリックスの接着および取り込みを起こさせるのに十分な時間、該マトリックスをインキュベートし、
（ｃ）  癌細胞による該マトリックスの接着および取り込みを検出する、
ことを含んでなり、その際、ビヒクル対照の存在下での癌細胞によるマトリックスの接着および取り込みに比べて、試験薬剤の存在下での癌細胞によるマトリックスの接着および取り込みが低下していることにより、転移形成を阻害する化合物が同定される、上記方法。
【請求項７】
上記マトリックスが蛍光タグで標識されている、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
上記マトリックスが放射性同位元素で標識されている、請求項５または６に記載の方法。
【請求項９】
請求項６に記載の方法を用いて同定される、癌細胞の転移活性を阻害する組成物。
【請求項１０】
セプラーゼ阻害剤を投与することを含んでなる、患者において癌細胞の転移活性を阻害する方法。
【請求項１１】
ジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤を投与することを含んでなる、患者において癌細胞の転移活性を阻害する方法。
【請求項１２】
癌細胞の転移能を阻害する核酸を同定する方法であって、
（ａ）  癌細胞サンプルへ核酸分子を導入し、
（ｂ）  該癌細胞サンプルを接着分子で被覆されたマトリックスに接種し、
（ｃ）  該マトリックスと癌細胞サンプルを、癌細胞による該マトリックスの接着および取り込みが起こるのに十分な時間インキュベートし、
（ｄ）  癌細胞によるマトリックスの接着および取り込みを検出する、
ことを含んでなり、その際、核酸分子を含まない癌細胞に比べて、核酸分子を含む癌細胞によるマトリックスの接着および取り込みが低下していることにより、癌細胞の転移能を阻害できる核酸分子が同定される、上記方法。
【請求項１３】
上記核酸分子がアンチセンス分子である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
上記アンチセンス分子がセプラーゼアンチセンス核酸である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
上記アンチセンス分子がジペプチジルペプチダーゼＩＶアンチセンス核酸である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
癌患者由来のサンプルから癌細胞を除去する方法であって、該サンプルを接着分子で被覆されたマトリックスに、癌細胞がその細胞接着マトリックスに接着するのに十分な時間、接触させることを含んでなる、上記方法。
【請求項１７】
上記サンプルが腹水、リンパ液、腫瘍または尿組織サンプルである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
患者の血液から癌細胞を除去する方法であって、該血液を接着分子で被覆されたマトリックスに、癌細胞がそのマトリックスに接着するのに十分な時間、接触させることを含んでなる、上記方法。
【請求項１９】
癌細胞を除去した血液が患者に再導入される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
患者の骨髄から癌細胞を除去する方法であって、該骨髄を接着分子で被覆されたマトリックスに、癌細胞がそのマトリックスに接着するのに十分な時間、接触させることを含んでなる、上記方法。
【請求項２１】
癌細胞を除去した骨髄が患者に再導入される、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
１．  緒言
本発明は、転移癌患者由来の血液、腹水および腫瘍組織から転移能を有する癌細胞を検出および単離する新規な方法に関する。本発明はさらに、癌細胞の検出および単離のための細胞接着マトリックスとして使用するための、ならびに転移癌患者による血液フィルターとして使用するための新規な組成物に関する。本発明の方法および組成物はまた、単離された癌細胞の転移能の判定や癌転移予防薬の同定のために設計されたアッセイにおいて使用可能である。さらに本発明は、転移癌細胞の表面に発現されたセリン膜内在性プロテアーゼ活性をモジュレートすることによる癌細胞の転移能の阻害に関する。本発明は患者の血液、腹水または腫瘍から単離された癌細胞がコラーゲンマトリックス材料に優先的に接着し、それを分解して取り込むという発見に基づく。さらに、セプラーゼおよびジペチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）サブユニットからなるセリン膜内在性プロテアーゼ（ＳＩＭＰ）が移動中の細胞表面上で活性化されることも見出した。
【０００２】
２．  発明の背景
従来の骨髄採取および白血球フェレーシス法を行う際の、転移癌患者の組織からの癌細胞分離に伴う問題が報告されている（Ｃａｍｐａｎａ， Ｄ．ら， Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｒｅｓｉｄｕａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ Ａｃｕｔｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ： Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃ Ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ， Ｂｌｏｏｄ， １９９５ Ｍａｒ １５， ８５（６）： １４１６−３４； Ｂｒｕｇｇｅｒ， Ｗ．ら， Ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ ｏｆ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ， Ｂｌｏｏｄ， ８３（３）： ６３６−４０， １９９４）。１人の患者から採取した単核細胞総数１００億個ほどには２５，０００から１２００万個の癌細胞が混在する。遺伝的マーキングにより、これらの癌細胞が再発の原因となることがわかってきている（Ｒｉｌｌ， Ｅ Ｒら， Ｄｉｒｅｃｔ Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ ｔｈａｔ Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ Ｃａｎ Ｒｅｔｕｒｎ ａ Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ Ｃｅｌｌｓ， Ｂｌｏｏｄ， ８４（２）： ３８０−３８３， １９９４）。
【０００３】
転移性疾患の癌患者の循環系中にも、多数の癌細胞が認められる。Ｇｌａｖｅｓ， Ｄ．， ＲＰ Ｈｕｂｅｎ， およびＬ． Ｗｅｉｓｓ（１９８８． Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ． ５７：３２−３５）は、腎細胞癌の手術直前に１０人の患者の腎静脈から血液サンプルを採取し、癌細胞が１０７から１０９個／日の割合で放出されていると推定した。これらの循環癌細胞がどのように転移に寄与するのかは依然として知られていない。数千分の１から数百万分の１の細胞というごくわずかな転移性循環癌細胞の小集団を同定することの困難さが主な障害となっている。循環癌細胞の大多数が宿主免疫により死滅していることは明らかである。例えば、抗体に基づく細胞分離法の信頼性が高い実験動物腫瘍モデルでは、移植可能なＢ１６黒色腫またはルイス肺癌の増殖中（約２０日間）、約１千万から１億個の腫瘍細胞が血液中に放出されると推定されるが、これら細胞のうち肺へ転移するのはマウスあたり１００個未満である（Ｇｌａｖｅｓ， Ｄ．， １９８３， Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ４８：６６５−６７３）。さらに、マウスまたはラットの循環系中に直接腫瘍細胞を導入した多くの実験では、かかる細胞が腫瘍小結節を形成する割合が０．０１％を上回るのは稀である。より一般的にはその効率は２桁以上低い。これらの実験結果から、原発腫瘍からの癌細胞の初期段階の放出は転移進行の限定因子ではないことが示唆される。なぜなら放出された癌細胞のうちのごくわずかなものだけが生存能力を有し、浸潤し、その結果転移するからである。転移のメカニズムを理解するため、かかる転移細胞を標的とする細胞分離システムおよび検出システムの開発が極めて重要である。
【０００４】
血液または体液から癌細胞を分離するいくつかの方法が知られている。かかる方法には、例えば、顕微解剖により癌細胞をひとつひとつ分離する方法（Ｓｕａｒｅｚ−Ｑｕｉａｎら， １９９９， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ２６：３２８−３５； ＢｅｌｔｉｎｇｅｒおよびＤｅｂａｔｉｎ， １９９８， Ｍｏｌ． Ｐａｔｈｏｌ ５１：２３３−６）、蛍光活性化セルソーティングを用いる抗体ベースの方法（Ｐｉｔｕｃｈ−Ｎｏｗｏｒｏｌｓｋａら， １９９８， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． １：５７３−８）、抗体で被覆した癌細胞を磁場を用いて磁性体上に分離する方法（Ｄｅｎｉｓら， １９９７， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ７４：５４０−４； Ｒａｃｉｌａら， １９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５−４５８９−９４）、または密度勾配で循環癌細胞を分離する方法（Ｓａｂｉｌｅら， １９９９， Ａｍ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈｏｌ． １１２：１７１−８）などがある。しかし、かかる癌細胞分離法は腫瘍特異的抗体が利用できるかどうか、または種々の癌細胞特有の浮遊密度と形態学に負うところが大きい。従って、造血細胞移植物から癌細胞を除去するための効率的な方法が大いに必要とされている（Ｇｕｌａｔｉ， Ｓ Ｃら， Ｒａｔｉｏｎａｌｅ ｆｏｒ Ｐｕｒｇｉｎｇ ｉｎ Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ， ２（４）：４６７−７１， １９９３）。
【０００５】
初期の実験において転移形成の初期段階で原発癌が新生細胞を循環系中に放出し始めることが示された（Ｆｉｄｌｅｒ ＩＪ， １９７３， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ９：２２３−２２７； Ｌｉｏｔｔａ ＬＡら， １９７４， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４：９９７−１００４）。癌細胞はひとたび循環系中に放出されると血管壁の下にある基底膜に接着し、隣接する結合組織に浸潤して微小転移巣形成を引き起こす（Ｌｉｏｔｔａ ら， １９９１， Ｃｅｌｌ ６４：３２７−３３６）。浸潤最前部の癌細胞と循環系に放出された癌細胞が転移性疾患の進行に決定的に関与していると考えられている。
【０００６】
この転移プロセスは複雑で、原発腫瘍からの癌細胞の逸脱、新しい場所への移動および新しい部位での増殖の確立が含まれる。転移を成功させるためには浸潤癌細胞が以下に示す転移性の性質を獲得しなければならない：（ｉ）原発癌から放出され、（ｉｉ）循環系中で生存し血管壁上で増殖し、（ｉｉｉ）コラーゲンマトリックスへ浸潤する（接着して、引き続いて分解して取り込む）能力を持ち、かつ（ｉｖ）血管外遊出、転移増殖および血管新生と連携する（Ｃｈａｍｂｅｒｓら， １９９８， Ｃａｎｃｅｒ ＆ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖｉｅｗ １７：２６３−２６９）。
【０００７】
このプロセスに関連するさまざまなステップは、細胞がリンパ管に逸脱しようと血管に逸脱しようと本質的に同じであり、それらは極めて重要な細胞の特徴、すなわち細胞浸潤性を必要とする。癌の浸潤には、浸潤癌細胞による細胞外マトリックス（ＥＣＭ）への接着ならびに分解および取り込みが必要であり、細胞のＥＣＭ中への転移または移動を伴う。このような細胞の活動は動的な膜流動性、ＥＣＭ接着および分解を示す、浸潤先端と呼ばれる隆起した膜上で起こる。最近、細胞表面のタンパク質分解においてジペチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）／ＣＤ２６およびセプラーゼ（ｓｅｐｒａｓｅ）を含むセリン膜内在性プロテアーゼ（ＳＩＭＰ）が関与するという新しい証拠が示された（Ｃｈｅｎ， Ｗ−Ｔ， １９９６， Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ４９：５９−７１）。
【０００８】
ＳＩＭＰのメンバーは、Ｎ末端に６個のアミノ酸を含む細胞質テイル、それに続いて２０個（セプラーゼ）または２２個（ＤＰＰＩＶ）のアミノ酸からなる膜貫通ドメイン、Ｃ末端に非古典的配位で触媒セリンを含有する触媒領域を構成する２００個のアミノ酸からなるストレッチを含んでなるＩＩ型膜貫通タンパク質である（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ， ＬＡ．ら， １９９７， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ． １３６１：１１−１９）。ＤＰＰＩＶは最後から２番目の位置にＬ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、またはＬ−アラニンのいずれかを有するオリゴペプチドからＮ末端ジペプチドを特異的に除去する。かかるペプチドには、ニューロペプチドＹおよび他のペプチドホルモンが含まれる（Ｈｅｉｎｓ， Ｊら， １９８８， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ９５４：１６１−１６９； Ｗａｌｔｅｒ， Ｒら， １９８０， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３０：１１１−１２６）。さらに、最近の報告では、ＤＰＰＩＶもセプラーゼ様ゼラチナーゼおよびエンドペプチダーゼ活性を有することが示され、これはコラーゲン分解におけるその関与を示唆するものである（Ｂｅｒｍｐｏｈｌ Ｆら， １９９８， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４２８：１５２−１５６）。さらに、ＤＰＰＩＶは小腸および腎臓上皮細胞の刷子縁膜上で構成的に発現され（ＹａｒｏｎおよびＮａｉｄｅｒ， Ｆ， １９９３， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２８：３１−８１； Ｍｏｒｉｍｏｔｏ Ｃ． およびＳｃｈｌｏｓｓｍａｎ ＳＦ， １９９４，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ ２：４−７）、またＴ細胞上では一過性に発現されるのでＤＰＰＩＶはＴ細胞活性化のマーカーとなりうる（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ Ｃ．およびＳｃｈｌｏｓｓｍａｎ ＳＦ， １９９４， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ ２：４−７）。
【０００９】
もともと１７０ｋＤａの膜結合型ゼラチナーゼとして同定されたセプラーゼは、極めて悪性の黒色腫ＬＯＸの浸潤先端で発現される（Ａｏｙａｍａ Ａ． およびＣｈｅｎ， Ｗ．Ｔ．， １９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８７：８２９６−８３００； Ｍｕｅｌｌｅｒ， ＳＣら， １９９９， Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７４：２４９４７−２４９５２； Ｍｏｎｓｋｙ， ＷＬら， １９９４， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５４：５７０２−５７１０）。この活性酵素はＬＯＸ細胞の細胞膜および放出小胞から単離された。セプラーゼは９７ｋＤａサブユニットのホモダイマーである（Ｐｉｎｅｉｒｏ−Ｓａｎｃｈｅｚ， ＭＬら， １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：７５９５−７６０１）。９７ｋＤａのサブユニットをコードするｃＤＮＡ由来の推定アミノ酸配列の分析から、９７ｋＤａのサブユニットはＤＰＰＩＶに相同であり、繊維芽細胞活性化タンパク質α（ＦＡＰα）と本質的に同一であることが明らかになった（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら， １９９７ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ． １３６１， １１−１９； Ｓｃａｎｌｏｎ， Ｍ．Ｊら， １９９４， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ９１：５６５７−５６６１）。ＦＡＰαは上皮癌の反応性間質繊維芽細胞上および創傷治癒時に発現されるが、成人組織においては発現されない（Ｇａｒｉｎ−Ｃｈｅｓａ Ｐ． ら， １９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８７：７２３５−７２３９）。
【００１０】
しかしながら、癌腫の場合、癌腫中または内皮細胞中でのＦＡＰαの発現は認められていない（Ｇａｒｉｎ−Ｃｈｅｓａら， １９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８７：７２３５−７２３９）。セプラーゼとＦＡＰαは主として活性部位セリンを含む高度に保存されたモチーフＧＸＳＸＧに隣接する４５アミノ酸残基のストレッチの点で相違する（Ｓｃａｎｌａｎら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：５６５７−５６６１； Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら， １９９７ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ． １３６１， １１−１９）。最近、選択的スプライシングされたセプラーゼのｍＲＮＡが新規なトランケート型２７ｋＤａセプラーゼイソフォームをコードするヒト黒色腫細胞系ＬＯＸから同定されたが、それは９７ｋＤａセプラーゼのカルボキシル末端の触媒領域とまさに正確にオーバーラップする（ＧｏｌｄｓｔｅｉｎおよびＣｈｅｎ， ２０００ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：２５５４−２５５９）。このスプライス変異体ｍＲＮＡは、セプラーゼ９７ｋＤａサブユニットの細胞質テイル、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインの膜近位−中心領域の部分（Ｖａｌ（５）からＳｅｒ（４１２））をコードする１２２３塩基対のエクソン領域のフレーム外欠失により生成される。セプラーゼはゼラチナーゼ活性とＧｌｙ−Ｐｒｏジペプチダーゼ活性の両方を示すが、トランケート型セプラーゼは後者のジペプチダーゼ活性のみを示すと考えられる。
【００１１】
コラーゲンリモデリングはマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）により媒介されるものと長い間考えられてきた。しかしながら、ＭＭＰ阻害薬（Ｍａｒｉｍａｓｔａｔ， ＡＧ３３４０）を脈管形成阻害薬（アンギオスタチンおよびエンドスタチン）とともに癌患者に試用したが、抗転移、抗浸潤効果の明らかな証拠は得られなかった。これらのデータは、腫瘍の浸潤最前部においてはＭＭＰに代わる他の酵素系が必要とされることを示している。
【００１２】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける癌細胞の浸潤性は腫瘍の転移能の直接的な指標となり得る。
患者の生存率と生活の質を最大限に高める癌治療法の開発において、細胞の浸潤表現型を知ることは重要である。また、癌の進行と転移を検出するための診断用ツールを製剤化するうえでそれを利用することも重要である。このため、癌腫の転移能の特徴である癌細胞の浸潤性の測定に多大な努力が注がれてきた。
【００１３】
細胞の浸潤性は、しばしばその細胞表面において細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分を分解しＥＣＭ断片を吸収するタンパク質分解活性によって推測される。かかる活性のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、接着、細胞表面タンパク質分解および膜流動性のような他の細胞表面現象によりしばしば困難をきたす。細胞浸潤性を測定するために設計された、ある特別なアッセイでは架橋ゼラチン基層の表面への蛍光標識または放射性標識したフィブロネクチン（または他のＥＣＭ成分）の共有結合が利用されている（Ｃｈｅｎら， １９８４， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９８：１５４６−１５５５； Ｃｈｅｎら， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ， ３１６：１５６−１５８； Ｃｈｅｎら， １９８９， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｚｏｏｌ． ２５１：１６７−１８５； Ｃｈｅｎら， １９９４， Ｊ． Ｔｉｓｓ． Ｃｕｌｔ． Ｍｅｔｈ． １６：１７７−１８１； Ｍｅｕｌｌｅｒら， １９８９， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０９：３４５５−３４６４）。この技術ではフィブロネクチンを標識して、上固定（ｏｖｅｒ−ｆｉｘｅｄ）タンパク質フィルムを被覆するのに使用される。このフィルムは次いでフィルム中の浸潤先端拡張部の増殖巣および表面のへこみによって細胞表面のタンパク質分解活性ならびに細胞浸潤表現型を測定するために使用される。しかしながら、このフィブロネクチン−ゼラチンフィルムアッセイは効果が限られている。なぜなら、（ｉ）従来の上固定タンパク質フィルムを使用している；（ｉｉ）大部分の培養腫瘍細胞系、繊維芽細胞および脈管形成内皮細胞などの中程度の浸潤性を有する細胞のタンパク質分解活性の検出には感度が不足している；（ｉｉｉ）架橋ゼラチン断片は癌細胞によって取り込まれない；および（ｉｖ）フィブロネクチンおよび架橋ゼラチン材料から三次元培養ゲル系を構築するのは困難なためである。従って、かかる細胞の浸潤性を測定するための信頼性の高い方法は、癌の臨床診断および治療用途の双方に大きな影響を及ぼすであろう。
【００１４】
本発明は、転移癌患者の血液、腹水および原発腫瘍組織から種々の形態の癌細胞を、ならびに健常ドナーの血液から内皮細胞を含む末梢血単核細胞を単離するための類のない、機能に基づく細胞分離法を提供する。さらに、本発明は、セプラーゼおよび／またはＤＰＰＩＶが浸潤癌細胞中で、また、悪性組織の活性化繊維芽細胞（または他の組織細胞）および発芽しつつある内皮細胞中で選択的に誘導される証拠を提供し、それにより腫瘍の浸潤と転移を阻害する薬物の開発のための標的を提供する。
【００１５】
３．  発明の概要
本発明は、癌患者の血液、腹水および／または組織から浸潤癌細胞を迅速かつ効率的に検出および選択する新規な癌細胞捕捉系に関する。末期癌患者では、いくつかの癌細胞が血液成分と結びついて大きな細胞集塊を形成していることがわかっている。かかる細胞の塊状化は末期癌に関連する臓器機能不全の一因となりうるものである。本発明は、転移性疾患の癌患者の血液中のかかる細胞を検出でき、また、患者の血液、腹水および／または組織からかかる細胞集塊、さらにはフリーで生存している個々の癌細胞を除去するのに使用できる組成物および方法を提供する。
【００１６】
癌細胞を単離および検出するためのこれまでの抗体法とは対照的に、本発明の細胞分離系は癌細胞の機能的性質、すなわち、細胞外マトリックスに接着し、それを分解し、さらに取り込む能力に基づいている。このように、本発明の細胞分離およびアッセイ系は、癌患者の血液、腹水および腫瘍組織中のごく小さな割合の生存、浸潤、および転移癌細胞を同定して単離するよう設計されている。富化した癌細胞集団を使用して、例えば、その転移能および最も有効な治療計画を調べることも可能である。富化した細胞は、癌ワクチン開発に向けて樹状細胞との融合にも使用しうる。
【００１７】
本発明は、転移癌患者による血液フィルターとして使用するための細胞接着マトリックスとして使用される、血液運搬接着分子（ｂｌｏｏｄ−ｂｏｒｎｅ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）で被覆されたコラーゲン、フィブリン、綿およびプラスチック繊維を含んでなる天然繊維組成物に関する。重合および解重合のサイクルによっていずれの形態にも容易に構成され、かつ容器表面に被覆しうるマトリックスの形成には、例えば、胎盤組織またはラット尾由来のＩ型コラーゲンが特に有用である。コラーゲンマトリックスは、限定されるものではないが、フィブロネクチン、ラミニンおよびビトロネクチンをはじめとする血液により運搬される種々の異なる接着分子で被覆される。個々の癌細胞または細胞クラスターとかかる細胞接着マトリックスとの接着が細胞単離の基礎となっている。
【００１８】
本発明の組成物を使用して、例えば、望まれない癌細胞を除去したり、骨髄移植でドナー細胞として使用するための血液または骨髄由来の造血前駆細胞を富化したりすることが可能である。さらに、本発明の細胞分離法により全血から異なる癌腫の特定の癌細胞を富化し、これをｅｘ ｖｉｖｏ増殖した後、樹状細胞と反応させて有効な腫瘍ワクチンを開発するために使用してもよい。さらに、患者から循環癌細胞を単離した後、これを一連のｉｎ ｖｉｔｒｏ化学療法計画に付すことが可能である。その結果として、有効な投薬量または薬物の組合せをその患者に投与できるようになろう。
【００１９】
本発明の組成物および方法によって、癌患者の血液、腹水および組織の浸潤癌細胞を検出および単離する迅速な方法が提供される。かかる癌としては、限定されるものではないが、前立腺癌、乳癌、大腸癌、肺癌、頭部頸部癌、脳癌、膀胱癌、リンパ腫、卵巣癌、腎および精巣癌、黒色腫、肝臓癌、膵臓癌、またはその他の胃腸癌が挙げられる。癌細胞は本発明の免疫細胞化学および細胞機能アッセイ、すなわち、コラーゲン分解および取り込みを用いて検出され、同定される。
【００２０】
本発明の方法は、癌の予後判定、治療的および外科的処置のモニタリングならびに早期発見に使用するための、癌患者の血液、腹水または腫瘍組織中の浸潤癌細胞を調べる高感度アッセイの開発に使用することが可能である。癌転移能を測定する感度および精度は、癌細胞の組織起源の判別、細胞の脈管形成能の測定、および白血球減少または補体結合の測定といった、当業者に公知のさらなるアッセイを用いてさらに高めることが可能である。
【００２１】
本発明の細胞接着マトリックスは、全血、バッフィーコート、末梢血幹細胞調製物または骨髄からの生存癌細胞の高収率で効率的な除去を可能にする癌細胞トラップを提供する。本発明の細胞分離法は、治療アフェレーシス法および白血球フェレーシス法（ここでは、汚染癌細胞を除去した自己血液の輸血が行われる）において使用することが意図される。本発明は、前立腺癌、乳癌、大腸癌、肺癌、頭部頸部癌、脳癌、膀胱癌、リンパ腫、卵巣癌、腎および精巣癌、黒色腫、肝臓癌、または膵臓癌、およびその他の胃腸癌患者の全血から癌細胞を除去するための非常に効率のよい方法を提供する。
【００２２】
転移を抑制し、それによって癌細胞の転移能をモジュレートすることが可能な薬剤のスクリーニングに使用しうるアッセイもまた提供する。かかるアッセイは、試験薬剤の存在下で細胞接着マトリックスを癌細胞サンプルと接触させた後に癌細胞のマトリックスへの接着、その分解または取り込みの検出および定量を行うものである。本発明のアッセイ系を使用して、有望な抗癌剤の効力を治療中にモニターすることも可能である。例えば、全血中の癌細胞の転移能を治療前または治療中に調べることも可能である。薬剤の効力は治療を通じて癌細胞の転移能を比較することにより追跡できる。癌浸潤性を低下させ、宿主免疫力を高め、癌増殖を抑制することが可能であり、かつ、正常組織細胞への影響がほとんどないか、全くないものが効力を示す薬剤である。例えば、かかる抗転移薬スクリーニングアッセイ系によって、遊走細胞がコラーゲンマトリックスに接着し、それを分解および浸潤する能力を阻止する、セプラーゼ−ＤＰＰＩＶ複合体に対するモノクローナル抗体およびペプチド阻害剤が同定される（図１３および１４）。さらに、かかるアッセイ系により、セプラーゼおよびＤＰＰＩＶに対するアンチセンスおよびリボザイム構築物が乳癌細胞の浸潤性を低下させうることが示された（図１９）。
【００２３】
セリン膜内在性プロテアーゼのモジュレーターを投与することを含んでなる、
癌細胞の転移能を阻害するための方法および組成物が提供される。本発明のこの態様は、セプラーゼおよびＤＰＰＩＶを含んでなる新規なプロテアーゼ複合体の形成がコラーゲンマトリックスへの細胞浸潤の必須条件であるという知見に基づいている。かかるプロテアーゼ阻害剤としては、限定されるものではないが、ＤＰＰＩＶおよびセプラーゼの活性を阻害しうるものが挙げられる。セプラーゼおよびＤＰＰＩＶ活性の活性化が細胞浸潤および移動の必須条件であるという知見により、癌細胞移動の阻害剤を同定するように設計された薬物スクリーニングアッセイの標的分子が提供される。
【００２４】
４．  図面の説明
図１Ａ−Ｂ．  細胞接着マトリックスの組成および調製。図１Ａ：  Ｉ型コラーゲンに基づく細胞接着マトリックスの調製を、マトリックス調製、細胞分離、および癌細胞の浸潤性の顕微鏡測定に関係する７つのステップで示している。図１Ｂ：  Ｉ型コラーゲンに基づく細胞接着マトリックスの、細胞による全コラーゲン分解のマイクロタイター測定における利用。癌細胞によるＢｏｄｉｐｙ−ローダミンコラーゲンマトリックスの分解および取り込みは、蛍光マイクロタイタープレートリーダーを用いて赤色蛍光の増強として測定される。下のグラフから、放出蛍光単位（ＲＦＵ）は細菌性コラーゲナーゼの存在下、３７℃で３０分間、各マイクロタイターウェルにオーバーレイしたＢｏｄｉｐｙ−ローダミンコラーゲンの量に比例することがわかる。
【００２５】
図２Ａ−Ｂ．  細胞接着マトリックスに基づく細胞分離およびアッセイ系の診断的および治療的用途。図２Ａ：  診断、治療または術後応答のモニタリング、および早期癌検出などの診断用途に使用しうる細胞分離およびアッセイ法の断面図。血液、腹水または組織細胞集団から癌細胞を単離し、検出し、特徴づける各ステップを示している。図２Ｂ：  治療および予防用途に使用しうる本発明の細胞分離およびアッセイ法の断面図。血液、腹水または組織細胞集団から癌細胞を単離し、培養するステップを示している。
【００２６】
図３Ａ−Ｆ．  患者および対照由来の血液サンプルの癌細胞分離解析。完全培地単独に、または対照健常ドナーおよび膀胱癌（ＢＬＣ）患者の血液にスパイクした蛍光タグ付きＨｓ５７８Ｔ乳癌細胞の代表例を示す。赤色蛍光タグ付きＨｓ５７８Ｔ乳癌細胞を３ｍｌの培地または血液サンプルに加え、細胞をマイクロタイターウェル中のコラーゲンマトリックスで捕捉し、１８時間培養した。示した画像はスーパーインポーズした蛍光照明により位相差顕微鏡を用いて撮影したものであり、マイクロタイターウェルの一部を示すものでしかない。図３Ａ：  培地単独に加えられたＨｓ５７８Ｔ乳癌細胞（５００細胞）の蛍光解析。概算で４９５個の細胞がマトリックスに接着して広がった明るいスポットとして認められた。図３Ｂ：  健常ドナーの血液にスパイクしたＨｓ５７８Ｔ乳癌細胞（５００細胞）の蛍光解析。概算で４１５個の赤色蛍光癌細胞がマトリックス基層に残留する培養物中で他の血液細胞（蛍光シグナルなし）の間に認められた。図３Ｃ：  健常ドナーの血液にスパイクしたＨｓ５７８Ｔ乳癌細胞（１９細胞）の蛍光解析。概算で１１個の赤色蛍光癌細胞がマトリックス基層に残留する培養物中で他の血液細胞（蛍光シグナルなし）の間に認められた。図３Ｄ：  ＢＬＣ患者の血液にスパイクしたＨｓ５７８Ｔ乳癌細胞（２００細胞）の蛍光画像。概算で１８２個のＨｓ５７８Ｔ乳癌細胞が循環ＢＬＣ細胞とともに癌患者の血液から捕捉された。Ｈｓ５７８Ｔ細胞は患者の単核血液細胞とともに集塊を形成しやすく、この画像では暗いスポットととして表れている。図３Ｅ：  ＢＬＣ患者の血液にスパイクした、マトリックスにより捕捉されたＨｓ５７８Ｔ乳癌細胞（１９細胞）の蛍光解析。概算で１６個の赤色蛍光癌細胞がそれ以外の血液細胞の間に認められ、視野には１個のＨｓ５７８Ｔ乳癌細胞が認められる。図３Ｆ：  図３Ｅに示すマトリックス捕捉Ｈｓ５７８Ｔ乳癌細胞と循環ＢＬＣ細胞の免疫蛍光解析。ここでは、Ｈｓ５７８Ｔ乳癌細胞と血液由来の４個の膀胱癌細胞がフルオレセイン結合抗サイトケラチンＰＣＫ抗体を用いて染色された。Ｈｓ５７８Ｔ乳癌細胞（図４Ｅでは赤色蛍光として示される）は緑色蛍光サイトケラチン標識された患者の血液由来の膀胱癌細胞の間に見ることができる。画像サイズＡ−Ｄ、６６２μｍ×４７８μｍ； 画像サイズＥ−Ｆ、３３１μｍ×２３９μｍ。
【００２７】
図４Ａ−Ｉ．  細胞接着マトリックスに接着した循環細胞。図４Ａ−Ｃ：  頭部頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮ）患者の血液中の１つの組織断片上で塊状化した循環細胞。細胞組織クラスターをコラーゲンマトリックスを用いて基層上に捕捉し、４日間（Ａのｄ４）、６日間（Ｂのｄ６）、および１３日間（Ｃのｄ１３）培養した。図４Ｄ：  転移性前立腺癌（ＰＣ）患者の血液中の１つの組織断片上で塊状化させ、３日間（ｄ３）培養した細胞。図４Ｅ：  転移性前立腺癌（ＰＣ）患者の、フィブリン繊維（フィブリン）上で塊状化させ、３日間（ｄ３）培養した循環癌細胞。図４Ｆ：  転移性前立腺癌（ＰＣ）患者の、プラスチックスクラップ（ｐｌａｓｔｉｃ）上で塊状化させ、３日間（ｄ３）培養した循環癌細胞。視野では大型の推定癌細胞がプラスチックスクラップに優先的に接着することがわかる。図４Ｇ：  Ｆと同じ培地で１２日間（ｄ１２）培養した循環細胞。視野では大型の推定癌細胞がプラスチックスクラップに優先的に接着することがわかる。図４Ｈ：  転移性前立腺癌（ＰＣ）患者の、精製綿（綿）上で塊状化させ、３日間（ｄ３）培養した循環細胞。図４Ｉ：  脳腫瘍（ＢＮ）患者の、精製綿（綿）上で塊状化させ、２０日間（ｄ２０）培養した推定癌細胞の増殖。画像サイズＡ−Ｇ、６６２μｍ×４７８μｍ； 画像サイズＨ−Ｉ、１３２４μｍ×９５６μｍ。
【００２８】
図５Ａ−Ｈ．  Ｉ型コラーゲンに基づく細胞接着マトリックスに接着した循環細胞。図５Ａ−Ｃ：  転移性膵臓癌（ＰｎＣ）患者の、Ｉ型コラーゲンマトリックスを用いて基層上に捕捉し、洗浄し、マトリックス上で５日間（Ａ）、９日間（Ｂ）、および１６日間（Ｃ）培養した細胞集塊。これらは、Ｉ型コラーゲンに基づく細胞接着マトリックスと、マトリックスに浸潤してプラスチック表面で増殖する癌細胞の位相差顕微鏡での観察結果を示すものである。癌細胞（ほとんどの健常ドナーの血液中には存在しない）は明確に区別される形態を有しており、培養下でその細胞サイズおよび数が増大する。一方、同時に単離された白血球は小さく、また、培養下でその数が減少する。図５Ｄ：  転移性膵臓癌（ＰｎＣ）患者の、Ｉ型コラーゲンマトリックスを用いて基層上に捕捉された循環細胞集塊。細胞をマトリックスから溶離し、プラスチック表面（ｐｌａｓｔｉｃ）上で完全培地にて７日間培養した。紡錘形の細胞が細胞コロニー周囲の上皮型癌細胞と会合している。図５Ｅ−Ｆ：  間質繊維芽細胞のＩ型コラーゲン基層への浸潤。頭部頸部扁平上皮細胞（ＨＮ）癌患者の腫瘍生検から細胞を分離し、単離した。形態学的に異なる２つの細胞型をマトリックス表面で単離した： ＨＮ扁平上皮細胞はマトリックス表面で静止状態にある（Ｅ）が、間質繊維芽細胞はコラーゲンゲルに浸潤しており（Ｆ）、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ３ＯＯ 倒立顕微鏡の微調整ダイアルでの測定では図５Ｅに見られるレベルより約８０μｍ下部にある。図５Ｇ：  Ｉ型コラーゲンに基づく細胞接着マトリックスの形態。マトリックスと、それに接着する、転移性大腸癌（ＣＣ）患者の血液から単離された癌細胞の透過電子顕微鏡での観察結果を示している。図５Ｈ：  図５Ｈに示すコラーゲン繊維の拡大図。構成されたコラーゲン繊維の透過電子顕微鏡での観察結果を示している。画像サイズＡ−Ｆ、６６２μｍ×４７８μｍ； 画像サイズＧ−Ｈ、バーの範囲で示す。
【００２９】
図６Ａ−Ｄ．  循環癌細胞の浸潤表現型の形態学的基準。図６Ａ−Ｂ：  転移性大腸癌（ＣＣ）患者の循環細胞集塊。細胞を新たに単離し、１日間（ｄ１）および９日間（ｄ９）培養した。これらは、Ｉ型コラーゲンに基づく細胞接着マトリックスの癌細胞によって生じた分解ホールと、異なる形態、すなわち、ｄ１（Ａ）では小型、ｄ９（Ｂ）では大型で上皮形態を有する癌細胞の特徴についての位相差顕微鏡での観察結果を示すものである。癌細胞は、培養下でその細胞サイズおよび数が増大する。一方、同時に単離された白血球は小さく、また、培養下でその数が減少する。さらに、紡錘形の細胞がコロニーの上皮型癌細胞と会合している（Ｂ）。図６Ｃ−Ｄ：  転移性胃癌（ＳＣ）患者の循環細胞集塊。細胞をＩ型コラーゲンマトリックスを用いて基層上に捕捉し、１９日間培養した。上皮型癌細胞がコラーゲンフィルムの分解ホール内のプラスチック表面で増殖する（Ｃ）か、またはコラーゲンフィルムの縁に一列に並んでいる（Ｄ）。画像サイズＡ−Ｂ、１３２４μｍ×９５６μｍ； 画像サイズＣ−Ｄ、６６２μｍ×４７８μｍ。
【００３０】
図７Ａ−Ｄ．  細胞分離法により単離された対照血液サンプル由来の細胞。図７Ａ：  ３９歳の健常ドナーの血液から単離された細胞およびそれらの下にあるＩ型コラーゲンマトリックス。培養７日後に生存する細胞はほとんどなく、マトリックス膜は無傷のままであった。図７Ｂ：  良性大腸腫瘍（ＣＴＮ）患者の血液から単離された細胞およびそれらの下にあるＩ型コラーゲンマトリックス。細胞はほとんど単離されず、マトリックス膜は無傷のままであった。図７Ｃ−Ｄ：  転移性乳癌（ＢＣ）患者の循環細胞およびそれらの下にあるＩ型コラーゲンマトリックス。化学療法化合物での治療中に血液サンプルを採取した。単離され、ｄ１（Ｃ）およびｄ４（Ｄ）培養で生存する細胞はほとんどなく、マトリックス膜は無傷のままであった。画像サイズＡ−Ｄ、６６２μｍ×４７８μｍ。
【００３１】
図８Ａ−Ｌ．  蛍光標識コラーゲンを用いた細胞浸潤表現型の細胞分離およびアッセイ系、および上皮マーカーに対する抗体を用いた循環癌細胞の免疫細胞化学。乳癌（ＢＣ， Ａ−Ｃ）、頭部頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮ， Ｄ−Ｆ）、大腸癌（ＣＣ， Ｇ−Ｉ）、前立腺癌（ＰＣ， Ｋ）患者と、健常ドナー（対照， Ｌ）の血液、ならびにＨｓ５７８Ｔ乳癌細胞系（Ｈｓ５７８Ｔ， Ｊ）から細胞を誘導した。細胞をローダミン−コラーゲンマトリックスを用いて基層上に捕捉し、１日間（ｄ１）または６３日間（ｄ６３）培養した。図８Ａ−Ｃ：  乳癌（ＢＣ）患者の循環癌細胞の浸潤表現型マーカーとしての取り込まれたローダミン−コラーゲンブロッチ（ｂｌｏｔｃｈ）。細胞をマトリックスに１８時間接種し、試験用に固定した。背景にある多数の白血球の中で、個々のおよびクラスターの推定癌細胞（Ａに示す位相差画像、ＰＨ）は、Ｃｏｌ＋（Ｂに示す赤色蛍光）の印をつけたローダミン−コラーゲン断片を取り込むことがわかった。パネルＣに示すスーパーインポーズした画像は、ローダミン−コラーゲンスポットと推定癌細胞との厳密なマッチングを示している。これらから患者の血液１ｍｌ当たり２，０６７個のＣｏｌ＋細胞と計測される。図８Ｄ−Ｆ：  頭部頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮ）患者の循環癌細胞の浸潤表現型マーカーとしての取り込まれたローダミン−コラーゲンブロッチ。推定癌細胞の大きいクラスターおよび各細胞（Ｄの位相差画像、ＰＨ）は、広域サイトケラチンサブユニットについて陽性に抗体染色された細胞（ＥのＰＣＫ＋）およびローダミン−コラーゲンＣｏｌ＋をロードされた細胞（Ｆの赤色蛍光）と同じ位置を占めることがわかった。これらから患者の血液１ｃ．ｃ．当たり各々２０，８１４個のＰＣＫ＋細胞および１８，００３個のＣｏｌ＋細胞と計測される。Ｃｏｌ＋細胞数に比べてＰＣＫ＋細胞数が多い理由として、抗体染色に陽性であり、かつ細胞接着マトリックスに接着する生存力の低い癌細胞が存在するためであると考えられる。図８Ｇ−Ｉ：  大腸癌（ＣＣ）患者の循環癌細胞の浸潤表現型マーカーとしての取り込まれたローダミン−コラーゲンブロッチ。推定癌細胞のクラスターおよび各細胞（Ｇの微分干渉画像）を上皮表面抗原に対する抗体で標識した（ＥＳＡ＋； Ｇの赤色染色）。ＥＳＡ＋細胞は内皮マーカー因子ＶＩＩＩに対する抗体で染色されたもの（Ｆ８＋； Ｈの緑色蛍光細胞）およびローダミン−コラーゲン断片を取り込んだものＣｏｌ＋ （Ｉの赤色蛍光細胞）と同じ位置を占めることがわかった。これらから患者の血液１ｍｌ当たり各々２，２８４個のＥＳＡ＋、７，３０８個のＦ８＋、および１，９７８個のＣｏｌ＋細胞と計測される。Ｃｏｌ＋またはＥＳＡ＋細胞数に比べてＦ８＋細胞数が多い理由として、血液中に正常内皮細胞が存在するためであると考えられる。図８Ｊ：  癌（上皮）マーカー対照としての、抗ＰＣＫ抗体で染色したＨｓ５７８Ｔ乳癌細胞系。図８Ｋ：  ６３日間（ｄ６３）培養し、ＥＳＡ＋染色したＰＣ細胞。これらの大型細胞は複数の核を有し、その直径が大きくＧのｄ１細胞の５倍を超えていることに着目されたい。図８Ｌ：  健常ドナー由来の血液細胞を１日間（ｄ１）培養した後に無傷のままであったローダミン−コラ���ゲンマトリックス。画像サイズＡ−Ｃ、１３２４μｍ×９５６μｍ； 画像サイズＤ−Ｆ、３３１μｍ×２３９μｍ； 画像サイズＧ−Ｌ、６６２μｍ×４７８μｍ。
【００３２】
図９Ａ−Ｌ．  循環癌細胞の脈管形成性。頭部頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮ、Ａ−Ｃ； Ｉ−Ｊ）、大腸癌（ＣＣ、Ｄ−Ｆ）および前立腺癌（ＰＣ、Ｇ−Ｈ）患者の血液から細胞を誘導した。細胞をコラーゲンマトリックスを用いて基層上に捕捉し、１〜１１日間（ｄ１またはｄ１１と記載）培養した。図９Ａ−Ｃ：  Ｆ８＋について強く標識された（Ｂ）、およびコラーゲン断片Ｃｏｌ＋を取り込んだ（Ｃ）、ＨＮ細胞の大きなクラスターおよび７個の各細胞（Ａに示す位相差画像）。位相差（ＰＨ）画像（Ａ）で示されるＨＮ細胞は、Ｆ８抗体に陽性反応を示す同じ視野内にあるもの（Ｂ）およびローダミン−コラーゲンマトリックスを取り込んだもの（Ｃ）と密接に会合している。これらから患者の血液１ｃ．ｃ．当たり各々４２，４９５個のＦ８＋および１５，６１１個のＣｏｌ＋細胞と計測される。Ｃｏｌ＋細胞数に比べてＦ８＋細胞数が多い理由として、血液中にＦ８＋内皮細胞が存在しているためである。図９Ｄ−Ｆ：  Ｃｏｌ＋ＣＣ細胞に相当するＣＤ３１＋およびＦ８＋細胞のサブセット。ローダミン−コラーゲンマトリックス上の細胞を内皮細胞マーカーＣＤ３１に対する抗体および内皮マーカー因子ＶＩＩＩ（Ｆ８）に対するフルオレセイン結合抗体で標識した。鮮紅色に染色されたＣＤ３１＋細胞とＣＣ細胞との会合は微分干渉（ＤＩＣ）画像（Ｄ）にて確認される。同じ視野内にあるＣＣ細胞はＦ８抗体に陽性反応を示し（Ｅ）、また、これらはローダミン−コラーゲンマトリックスを取り込んだ（Ｆ）。これらから患者の血液１ｃ．ｃ．当たり各々ｌｌ，６９３個のＣＤ３１＋、６，５７７個のＦ８＋および２，５５８個のＣｏｌ＋細胞と計測される。Ｃｏｌ＋細胞数に比べてＣＤ３１＋およびＦ８＋細胞数が多い理由として、血液中にＣＤ３１＋およびＦ８＋内皮細胞が存在していることが考えられる。図９Ｇ−Ｈ：  アセチル化ＬＤＬを取り込むＰＣ細胞。微分干渉（ＤＩＣ）画像（Ｇ）にて確認される鮮紅色に染色された上皮表面抗原（ＥＳＡ）陽性細胞は、フルオレセイン−ＬＤＬ（Ｈ）の取り込みを示す。これらから患者の血液１ｃ．ｃ．当たり各々９，７４４個のＥＳＡ＋および３４，１０５個のＬＤＬ＋細胞と計測される。ＥＳＡ＋細胞数に比べてＬＤＬ＋が多い理由として、アセチル化ＬＤＬを取り込む別の内皮細胞が存在していることが考えられる。図９Ｉ−Ｊ：  アセチル化ＬＤＬを取り込む初代培養ＨＮ細胞。三重フルオレセイン−Ｒｈｏｄｙｍｅｎｉａ−Ｈｏｅｃｈｓｔ画像（Ｊ）にて確認されるように、中心に向かう１個の特定の細胞だけがフルオレセイン−ＬＤＬおよびローダミン−コラーゲンの両方を取り込んでいることから、この細胞が１２日間培養した後に浸潤表現型を保持する細胞であることが示されることに着目されたい。図９Ｋ−Ｌ：  コラーゲンゲル上の循環ＣＣ細胞による毛管網状構造の発達。網状構造の形成（Ｋ）およびコード様構造（Ｌ）は循環ＣＣ細胞をＩ型コラーゲンゲル（厚さ０．５ｍｍ）上にプレートした後２日目に観察された。画像サイズＡ−Ｃ； Ｇ−Ｊ、３３１μｍ×２３９μｍ； 画像サイズＤ−Ｆ； Ｋ−Ｌ、６６２μｍ×４７８μｍ。
【００３３】
図１０Ａ−Ｌ：  培養下での循環癌細胞の免疫癌死滅および増殖。コラーゲンマトリックスを用いて大腸癌（ＣＣ、Ａ−Ｅ）、前立腺癌（ＰＣ、Ｆ−Ｉ）、または膀胱癌（ＢＬＣ、Ｊ−Ｌ）患者の血液から細胞を単離し、１０〜２０％のヒト血漿を含有する培地で培養した。図１０Ａ−Ｃ：  Ｆ８＋／Ｃｏｌ＋ ＣＣ細胞とクラスター化するＣＤ３４＋末梢血幹細胞。鮮紅色に染色されたＣＤ３４＋細胞とＣＣ細胞との会合は微分干渉（ＤＩＣ）画像（Ａ）にて確認される。同じ視野内にあるＣＣ細胞はＦ８抗体に陽性反応を示し（Ｂ）、また、これらはローダミン−コラーゲンを取り込んだ（Ｃ）。これらから患者の血液１ｃ．ｃ．当たり各々１１１，０８２個のＣＤ３４＋、７，６７３個のＦ８＋および２，５５８個のＣｏｌ＋細胞と計測される。Ｃｏｌ＋細胞数に比べてＣＤ３４＋およびＦ８＋数が多いのは、血液中にＣＤ３４＋幹細胞およびＦ８＋内皮細胞が存在するためである。図１０Ｄ−Ｅ：  Ｃｏｌ＋ ＣＣ細胞とクラスター化するＣＤ４５＋白血球。ローダミン−コラーゲンマトリックス上で単離された細胞を白血球共通抗原ＣＤ４５に対する抗体で標識した。鮮紅色に染色されたＣＤ４５＋白血球とＣＣ細胞との会合はＤＩＣ画像（Ｄ）にて確認される。同じ視野内にあるＣＣ細胞はローダミン−コラーゲンマトリックスの取り込みを示した（Ｅ）。これらから患者の血液１ｃ．ｃ．当たり各々１２５，６７０個のＣＤ４５＋白血球および１，８２７個のＣｏｌ＋細胞と計測される。図１０Ｆ−Ｉ：  良好な予後と判定された前立腺癌（ＰＣ）患者由来の免疫および癌細胞クラスターの細胞溶解の連続写真。癌細胞の大半が白血球により攻撃され、１日培養した後にはばらばらになった（Ｆ−Ｈ）。しかし、白血球はかかる培養７日後に消滅し、数個のＰＣコロニーが残った（Ｉ）。図１０Ｊ−Ｌ：  同一患者由来の自己免疫血漿による膀胱癌（ＢＬＣ）細胞の細胞溶解。ＢＬＣ細胞をその癌患者の血液由来の１０％自己血漿（Ｊ−Ｋのａｕ．血漿）、または健常ドナーに由来するもの（Ｌのｎ．血漿）の存在下で培養した。ＢＬＣ細胞は２日目に溶解して自己血漿含有培地（Ｊ−Ｋのａｕ．血漿）が褐変したが、正常血漿含有培地（Ｌのｎ．血漿）では６週間を超えても生存していた。これらのことから補体性細胞溶解における自己癌抗体の役割が示され、転移に対する宿主免疫が明らかになった。画像サイズＡ−Ｌ； ６６２μｍ×４７８μｍ。
【００３４】
図１１Ａ−Ｂ．  セプラーゼおよびＤＰＰＩＶについてのゲル濾過カラムクロマトグラフィーおよび免疫ブロット。図１１Ａ：  ＷＧＡ精製した、ＷＩ３８細胞由来の界面活性剤可溶性タンパク質をＳｅｐｈａｒａｓｅ１２（Ｐｈａｒｍａｃａｌ−ＬＫＢ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， Ｎ．Ｊ．）のゲル濾過カラムで分離した。カラムの較正に使用したタンパク質標準品は、ビタミンＢ−１２（ｌ．３５ｋＤａ）、ミオグロビン（１７ｋＤａ）、卵アルブミン（４４ｋＤａ）、γグロブリン（１５８ｋＤａ）、カタラーゼ（２３２ｋＤａ）、フェリチン（４４０ｋＤａ）、およびチログロブリン（６７０ｋＤａ）であった。図１１Ｂ：  セプラーゼおよびＤＰＰＩＶに対するｍＡｂを用いた免疫ドットブロット法により画分を解析した。セプラーゼおよびＤＰＰＩＶは、２００ｋＤａ（画分１７）、４４０ｋＤａ（画分１４）、および６７０ｋＤａ（画分１３）の範囲に見出され、このことから４４０〜６７０ｋＤａの大きさのセプラーゼ−ＤＰＰＩＶ複合体が存在することが示唆される。
【００３５】
図１２Ａ−Ｄ．  ＷＩ３８ヒト胚性肺繊維芽細胞由来のセプラーゼ−ＤＰＰＩＶ複合体の特徴づけ。図１２Ａ：  表面ビオチン化ＷＩ３８繊維芽細胞の免疫沈降（Ｉｐ）。セプラーゼ（Ｄ２８）およびＤＰＰＩＶ（Ｅ１９）に対する両ｍＡｂにより、１７０および２００ｋＤａにそれぞれセプラーゼおよびＤＰＰＩＶを示す２つの大きなバンドを有するＲＩＰＡ可溶化タンパク質複合体が同定された。図１２Ｂ：  Ｉｐおよび免疫ブロット法（Ｉｂ）により確認されたセプラーゼ−ＤＰＰＩＶ複合体。ＷＩ３８ ＲＩＰＡ溶解物から単離されたセプラーゼ−またはＤＰＰＩＶ−免疫沈降物が、β１またはβ３インテグリンブロットではなく、セプラーゼ−またはＤＰＰＩＶ−免疫ブロットにおいて確認された。このことから、プロテアーゼ複合体がＲＩＰＡにおいてβ１およびβ３インテグリンとは会合しないことが示唆される。図１２Ｃ：  セプラーゼ−ＤＰＰＩＶ複合体のゼラチン分解活性。プロテアーゼ複合体をＣａ＋＋の不在下、２ｍＭ ＥＤＴＡの存在下でゼラチンザイモグラフィーにより解析した。セプラーゼおよびＤＰＰＩＶ免疫単離物（Ｉｐ）はどちらも１７０ｋＤａゼラチナーゼ（セプラーゼ）活性を示した。図１２Ｄ：  複合体のＤＰＰＩＶプロリン特異的ペプチダーゼ活性。蛍光Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＡＦＣ（７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン）基質オーバーレイアッセイにより、セプラーゼおよびＤＰＰＩＶ免疫単離物（Ｉｐ）はどちらも同じペプチダーゼ活性を示した。αｖ、α２、α６もしくはβ３インテグリンまたは対照免疫単離物には活性は認められなかった。
【００３６】
図１３Ａ−Ｅ．  コラーゲンゲルにおける細胞移動および創傷により活性化されたＷＩ３８繊維芽細胞によるコラーゲン分解。図１３Ａ：  細胞単層に創傷を与えて１時間（ａ、ｂ、ｃ）および１８時間（ｄ、ｅ、ｆ）後のＷＩ３８の形態（細胞の生存中に写真撮影）。パネルａおよびｄ： 創傷縁部と細胞を含まないガラス表面との境界面のＷＩ３８の位相差コントラスト。紡錘形細胞が１８時間（ｄ）の時点でコラーゲン繊維上に移動したことがわかる。パネルｂおよびｅ： パネルａおよびｄと同じ視野での蛍光コラーゲンゲル。１時間（ｂ）の時点ではＴＲＩＴＣ標識コラーゲンの均一層が見られるが、１８時間（ｅ）の時点では活性化された移動性細胞によって創傷縁部に蛍光コラーゲンの局所的除去が起こっている。パネルＣおよびｆ：左および中央のパネルの顕微鏡によるスーパーインポーズ画像。バー＝ｌＯμｍ。図１３Ｂ：  阻害性ｍＡｂ Ｅ１９（ＤＰＰＩＶに対する）による細胞移動の用量依存的阻害。対照ｍＡｂ Ｃ３７（細胞表面糖タンパク質ｇｐ−９Ｏに対する）による阻害は見られない。各抗体に対し２４時間単層創傷モデルを用いて３回ずつ試験を行った。最初の創傷縁部からの細胞進行の領域を測定することにより細胞移動を定量した。値は平均±ＳＤである。図１３Ｃ：  細胞移動についての抗体阻害の逆転。すべての抗体、ｍＡｂ Ｅ１９（ＤＰＰＩＶに対する）およびｍＡｂ Ｃ３７（ｇｐ−９Ｏに対する）を１ｍｌ当たり５μｇで適用した。３日後、抗体を除去し、抗体阻害効果を逆転させた。図１３Ｄ：  創傷により活性化された細胞による蛍光コラーゲンゲルの局所的除去についてのヒストグラム。コラーゲン分解を移動性細胞による蛍光コラーゲン除去領域として測定した。ｍＡｂ Ｅ１９（ＤＰＰＩＶに対する）は移動性細胞によるコラーゲン除去を阻害したが、対照ｍＡｂ Ｃ３７（抗ｇｐ−９０）は阻害しなかった。すべての抗体を１ｍｌ当たり５μｇで適用した。各抗体に対し３回ずつ試験を行った。値は平均±ＳＤである。図１３Ｅ：  低密度培養下の移動性細胞によるコラーゲン分解。コラーゲン分解を移動性ＷＩ３８細胞によるコラーゲンゲルからの蛍光コラーゲンペプチドの放出により測定した。蛍光ペプチド放出の陽性対照として細菌性コラーゲナーゼを用いた。すべての抗体を１ｍｌ当たり５μｇで適用した。各抗体に対し３回ずつ試験を行った。値は平均±ＳＤである。
【００３７】
図１４Ａ−Ｂ．  コラーゲン基層上でのＷＩ３８細胞の接着および広がりは、主として、β１インテグリンを媒介としている。ＤＰＰＩＶによる媒介は見られない。図１４Ａ：  ｍＡｂ Ｃ２７（β１インテグリンに対する）によるコラーゲン基層上でのＷＩ３８細胞広がりの阻害。ｍＡｂ Ｅ１９（ＤＰＰＩＶに対する）またはｍＡｂ Ｃ３７（抗ｇｐ−９０）による阻害は見られない。図１４Ｂ：  ｍＡｂ Ｃ２７（β１インテグリンに対する）によるコラーゲン基層へのＷＩ３８細胞接着の阻害。ｍＡｂ Ｅ１９（ＤＰＰＩＶに対する）またはｍＡｂ Ｃ３７（抗ｇｐ−９０）による阻害は見られない。各値は独立した３回の測定の平均±Ｓ．Ｄ．である。２回反復試験で同様の結果が得られた。
【００３８】
図１５．  コラーゲンゲルを移動するＷＩ３８細胞の浸潤先端におけるセプラーゼおよびＤＰＰＩＶの共局在。Ｉ型コラーゲンゲルを移動するＷＩ３８細胞の浸潤先端（矢印で示す）の位相差画像（ａ）。ＤＰＰＩＶに対するＴＲＩＴＣ−ｍＡｂ Ｅ１９で直接標識した浸潤先端（矢印で示す）におけるＤＰＰＩＶの免疫蛍光画像（ｂ）。セプラーゼに対するＦＩＴＣ−ｍＡｂ Ｄ２８で直接標識した浸潤先端（矢印で示す）におけるセプラーゼの免疫蛍光画像（ｃ）。コラーゲンゲルを移動するＷＩ３８繊維芽細胞の浸潤先端（矢印で示す）にセプラーゼおよびＤＰＰＩＶが共局在することを示す、パネルｂおよびＣのスーパーインポーズ画像（ｄ）。バー＝１Ｏμｍ。
【００３９】
図１６．  パラフィン包埋した腫瘍組織の連続切片の免疫組織化学により示される、ヒト悪性乳癌の結合組織細胞におけるセプラーゼおよびＤＰＰＩＶの分布。セプラーゼおよびＤＰＰＩＶはともに浸潤性乳癌に隣接する結合組織の繊維芽細胞様細胞中に存在している。離れた正常組織のものには存在していない（示されていない）。矢印は陽性の褐色を示す、繊維芽細胞のセプラーゼまたはＤＰＰＩＶ染色を指している。癌細胞のクラスターもセプラーゼ（中央および下のパネルの大きい細胞集塊）およびＤＰＰＩＶ（上のパネルの大きい細胞集塊）に対し陽性である。乳癌および隣接する正常組織のパラフィン切片を同じスライドに載せ、セプラーゼに対するｍＡｂ Ｄ８（中央および下のパネル）またはＤＰＰＩＶに対するｍＡｂ Ｅ２６（上のパネル）で染色した。バー＝１００μｍ。
【００４０】
図１７．  治癒中のヒト歯肉創傷部の粘膜細胞におけるセプラーゼおよびＤＰＰＩＶの分布。３日（ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｇ）および７日（ｅ、ｆおよびｈ）経過した治癒中の粘膜創傷の凍結切片を、ヘマトキシリンおよびエオシン（ａおよびｅ）で、セプラーゼに対するＴＲＩＴＣ−ｍＡｂ Ｄ２８（ｂ−ｄ、およびｆ）で、またはＤＰＰＩＶに対するｍＡｂ Ｅ１９、続いてＴＲＩＴＣ抗ラット二次抗体（ｇおよびｈ）で染色した。３日経過した創傷（ａ−ｄ、およびｇ）では、結合組織（ＣＴ）にセプラーゼ抗体（ｂ、ｃ、およびｄ）およびＤＰＰＩＶ抗体（ｇ）で強く染色された細胞が存在していた。共焦顕微鏡画像から、結合組織では繊維芽細胞様細胞の糸状仮足（矢印）および細胞体の形態をとる浸潤先端にセプラーゼが分布していることがわかる（パネルｄ）。７日経過した創傷（ｅ、ｆおよびｈ）では、創傷肉芽組織（ＧＴ）にセプラーゼ染色が認められたが（ｆ）、ＤＰＰＩＶについては認められなかった（ｈ）。点線は肉芽組織と結合組織との境界を示している。Ｅは創傷上皮； ＣＴは結合組織； ＦＣはフィブリン塊； およびＧＴは肉芽組織を示している。バー＝２００μｍ。
【００４１】
図１８．  ヒト悪性乳腺管癌の浸潤最前部にある微細血管内皮細胞、繊維芽細胞、および癌細胞におけるセプラーゼおよびＤＰＰＩＶの共局在。ホルムアルデヒド固定し、パラフィン包埋したヒト悪性乳腺管癌サンプルを連続切片にし、ｍＡｂ Ｄ８を用いた褐色染色によりセプラーゼ分布（左の３つのパネル）を、ｍＡｂ Ｅ２６を用いて隣接切片におけるＤＰＰＩＶ分布（右の３つのパネル）を示した。上の２つのパネルは、腫瘍部位から約２ｃｍ離れたところにある正常乳房組織を示す。上皮細胞（白抜きの矢印）、繊維芽細胞（黒の矢印）および内皮細胞（白抜きの矢尻）では、セプラーゼおよびＤＰＰＩＶ染色に陰性であることがわかった。中央の２パネルは、低分化型（悪性度の高い）癌細胞の浸潤状態を示したシートである。このシートでは、腫瘍細胞（橙色の白抜きの矢印）、繊維芽細胞（橙色の矢印）、およびいくつかの内皮細胞（橙色の白抜きの矢尻）で、セプラーゼおよびＤＰＰＩＶの強い褐色細胞染色が示されているが、いくつかの大きい血管壁細胞（黒色の白抜きの矢印）には染色がなされていない。上および中央のパネルにある矢印は、１００μｍのスケールを示す。下の２つのパネルは低分化型（悪性度の高い）腫瘍細胞の浸潤状態を低倍率で示したシートである。このシートでは、腫瘍細胞（橙色の白抜きの矢印）、繊維芽細胞（橙色の矢印）、およびいくつかの内皮細胞（橙色の白抜きの矢尻）で、セプラーゼおよびＤＰＰＩＶの強い褐色細胞染色が示されている。視野内の大部分の腫瘍細胞から、セプラーゼおよびＤＰＰＩＶが浸潤最前部の腫瘍細胞で特異的に発現されることがわかるが、視野中央に示される腫瘍の中心部のものには存在していない。下のパネルの矢印は８００μｍのスケールを示す。
【００４２】
図１９．  ＭＤＡ−ＭＢ−４３６細胞のプロテアーゼ発現とコラーゲン分解能との関係。
Ａ：  セプラーゼおよびＤＰＰＩＶを特異的に発現するＭＤＡ−ＭＢ−４３６細胞による蛍光コラーゲンペプチドの放出。コラーゲン分解を、親細胞（Ｐａｒｅｎｔ）、ベクターでトランスフェクトした細胞（ｐＡ１１）、セプラーゼｃＤＮＡでトランスフェクトした細胞（ｐＡ１５）およびＤＰＰＩＶリボザイムでトランスフェクトした細胞（ｐＺ８）による蛍光コラーゲンペプチドの放出により測定した。各々、３回ずつ試験を行った。値は平均±ＳＤである。星印”＊”は、ｐＡ１５セプラーゼセンスおよびｐＺ８ ＤＰＰＩＶリボザイムトランスフェクト細胞が親およびｐＡ１１ベクタートランスフェクト細胞に比べてｐ＜０．０５であることを示している。Ｂ：  上記ＭＤＡ−ＭＢ−４３６細胞におけるセプラーゼおよびＤＰＰＩＶの示差的発現。細胞をＲＩＰＡバッファーで抽出し、ｍＡｂ Ｄ８（抗セプラーゼ）およびｍＡｂ Ｆ４（抗ＤＰＰＩＶ）を用いて免疫ブロットを行った。
【００４３】
５．  発明の開示
本発明は、癌患者由来のサンプルから生存能がある浸潤性かつ転移性の癌細胞小集団を単離および検出する細胞接着マトリックスを形成するための新規な方法に関する。特に、癌細胞の単離および検出にコラーゲンマトリックス系を使用する方法を説明する。以下の小節に記載する本発明はさらに、癌の転移能を測定するための新規な高感度ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイに関する。このアッセイの重要な特徴として、血液、骨髄、腹水、体液、および腫瘍組織に含まれる癌細胞、またはあらゆる確立された癌細胞系に応用可能であることが挙げられる。
【００４４】
本発明の「細胞接着マトリックス」は、全血、バッフィーコート、末梢血幹細胞調製物または骨髄からの生存癌細胞の高収率かつ効率的な除去が可能な癌細胞トラップを提供する。本発明の細胞分離法は、癌診断目的、例えば、早期発見、治療および術後応答のモニタリング、ならびに癌進行の予後診断に使用しうる。
また、本発明の細胞分離法は、癌細胞トラップとしての血液フィルター、遺伝および細胞遺伝解析、新規な薬物標的探索、ならびに癌ワクチン開発における使用をはじめとする癌の予防および治療目的にも使用しうる。
【００４５】
本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ系はさらに、抗転移活性を有する薬剤を同定するスクリーニング方法も提供する。かかる薬剤は癌患者の癌細胞の転移による拡散を阻害するのに使用しうる。さらに、このアッセイは抗転移能を有する核酸分子のスクリーニングにも使用しうる。例えば、アンチセンスおよびリボザイム分子をそれらの転移阻害能についてスクリーニングできる。本発明のさらにもう１つの実施形態によれば、セプラーゼまたはＤＰＰＩＶの活性を測定して癌細胞の転移能を判定することができる。
【００４６】
５．１  本発明のマトリックス
本発明は、癌患者由来のサンプルから癌細胞を単離および検出するのに使用しうる新規な天然の細胞接着マトリックス系を提供する。本発明の天然細胞接着マトリックスは、限定されるものではないが、フィブロネクチン、ラミニンおよびビトロネクチンをはじめとする血液により運搬される細胞接着成分に対して特異的な結合親和性を有している。本発明は、転移性疾患の患者の循環系中に存在する癌細胞が組織断片に付着して大きい細胞クラスターを形成することができ、このことは、天然の構造的スカフォードが血液運搬接着分子と高い親和性を有しており、そのため、転移癌細胞の付着を促進することを示している、という知見に基づいている。さらに、Ｉ／ＩＩＩ型コラーゲン、フィブリン、精製綿をはじめとする天然繊維、および組織培養プラスチックの機械的引掻面が癌細胞の接着を促進する血液運搬接着成分を選択的に吸着することが見出された。
【００４７】
本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏ生存ヒト細胞を検出および単離するための細胞基層として使用する、コラーゲン繊維、フィブリンゲル、精製綿またはプラスチック繊維を含んでなる細胞接着マトリックスを包含するものであり、これらの細胞としては、限定されるものではないが、癌、内皮および組織細胞が挙げられる。種々の市販のコラーゲン材料、限定されるものではないが、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏ． （Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）より購入できるヒト胎盤Ｉ型コラーゲン； およびＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ （Ｂｅｃｔｏｎ ａｎｄ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）から入手可能なラット尾Ｉ型コラーゲンなどを使用してコラーゲンマトリックスを製造することが可能である。コラーゲンを発現する細菌、酵母または哺乳動物細胞をはじめとする組換え宿主細胞から得られるような、いずれの形態の組換えコラーゲンを使用してもよい。
【００４８】
Ｉ型コラーゲンは、重合および解重合のサイクルによっていずれの形態にも容易に構成および再構成され、容器表面を被覆することが可能である。例えば、Ｉ型コラーゲン単量体は０．３ｍｇ／ｍｌを超える濃度で、天然のｐＨ、中温（２５〜３７℃）および生理食塩水含有媒体の条件下で重合すること、ならびにコラーゲン繊維はｐＨ２〜４、低温（２〜１０℃）、および低塩媒体の条件で解重合することがよく知られている（Ｋｌａｓｓｏｎ， Ｓ．Ｃ．ら、１９８６， Ｃｏｌｌ． Ｒｅｌａｔ． Ｒｅｓ． ６：３９７）。かかる細胞接着マトリックスは体液中の癌細胞捕捉用のマイクロキャピラリー、細胞単離カラム、組織培養プレート、またはマイクロメッシュの壁の内側を覆うように形成することが可能である。
【００４９】
本発明のマトリックススカフォードは、限定されるものではないが、コラーゲン、フィブリンおよび精製綿をはじめとする天然繊維からなってよい。これらのマトリックススカフォードの一般特性は、それらの表面が、限定されるものではないが、フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびラミニンをはじめとする血液運搬接着分子との親和性を有することである。マトリックススカフォードを、全血、血漿または血清中に存在する細胞接着分子で被覆すると、高密度細胞集団からの癌細胞および組織細胞の接着を助ける接着面が提供される。これらの集団は血液、リンパ、骨髄および腫瘍組織から誘導され、多くの異なる細胞タイプが含まれる。
【００５０】
コラーゲンマトリックスの製造方法について本出願で詳細に説明する。血漿の抗凝血薬含有率を引き下げることによりフィブリン繊維を含むマトリックススカフォードを容器表面に作製した。動物またはヒト血漿をまず、ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で１０〜２０％に希釈し、細胞単離容器またはウェルに加えた。この容器またはウェルをＣＯ２インキュベーター中、３７℃で３０分間インキュベートし、容器表面でフィブリン繊維を重合させた。精製綿繊維を１０〜２０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ中に単純に懸濁させ、細胞接着分子で被覆するための細胞培養ウェルに接種した。同様に、１０〜２０％ウシ血清含有ＤＭＥＭに懸濁させてガラスおよびプラスチック繊維を細胞接着分子で被覆した。細胞培養プレートをエッペンドルフペプチドチップでスクラップにし、マトリックススカフォードとして作製した。全血またはバッフィーコートをマトリックススカフォードに適用する場合には、マトリックススカフォードへ細胞接着分子を前もって被覆する必要がないことに留意すべきである。しかし、全血またはバッフィーコートは、細胞分離手順の間、凝血が起こらないように抗凝血薬で処理しなければならない。詳細には、血液またはバッフィーコートを、同量の０．５ｍＭ ＥＤＴＡ含有媒体または５０単位／ｍｌのヘパリンを含有する１０％抗凝血薬クエン酸デキストロース（ＡＣＤ； Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， ＩＬ）で予め希釈した。
【００５１】
コラーゲンマトリックスに結合した癌細胞の検出を容易にし、かつ、かかる細胞の転移能を測定するため、マトリックスを、限定されるものではないが、蛍光色素、ビオチン、着色色素、および放射性プローブをはじめとする種々の異なる薬剤で標識することが可能である。例えば、コラーゲン繊維は色素との直接結合により標識することができ、これによりコラーゲンの重合部位を標識化から保護することが可能である。コラーゲン繊維は、この方法で標識されたものでも、または非標識のものでも可溶性コラーゲン単量体へと容易に分解でき、続いて、これを容器表面でいずれの形態へも集合させることが可能である。コラーゲンの標識に好ましい色素としては、消光−蛍光色素であるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ．から入手可能なＢｏｄｉｐｙ−ローダミンまたはフルオレセイン色素が挙げられる。図１Ａおよび１Ｂで示すように、Ｂｏｄｉｐｙ−ローダミンの蛍光シグナルは２種類の色素分子がコラーゲン上で密着して存在すると弱くなる（黄色）が、コラーゲンが酵素により分解または切断されて２種類の色素分子が離れると増強される（赤色）。マトリックスの標識法は、当業者には十分に公知なものである。また、細胞毒性化合物をかかるコラーゲン繊維に結合させることにより、特定の癌細胞へ薬物を送達する新規なビヒクルが得られる。例えば、細胞毒素を結合させたコラーゲンミクロスフェアを癌患者に注入することで癌細胞の特異的な死滅を果たすことが可能である。
【００５２】
マトリックススカフォード表面は血液運搬接着分子でさらに被覆される。マトリックスの被覆には、種々の市販されている血液運搬接着分子を含有する溶液、限定されるものではないが、ウシ血清、ウシ胎児血清（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）； ヒト血清（Ｓｉｇｍａ）； ならびにヒト血漿フィブロネクチン、ラミニンおよびビトロネクチン（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）など、を使用することが可能である。マトリックススカフォード表面は１０〜２０％のウシ血清、ウシ胎児血清、ヒト血清（もしくは血漿）、または０．０１〜０．５ｍｇ／ｍｌのヒト血漿フィブロネクチン、ラミニンおよびビトロネクチンのいずれかを用いる接着分子で被覆することが可能である。
【００５３】
本発明は、非常に望ましい目的、すなわち、細胞分離系による癌患者の転移形成を予防および介入する方法の提供を果たすものである。特に、本発明は、癌患者由来の癌細胞を単離する方法であって、
（ａ）  上記患者由来の癌細胞サンプルを細胞接着マトリックスに接種し、
（ｂ）  このマトリックスに癌細胞を接着させ、その後、非接着細胞を除去するのに十分な時間、癌細胞サンプルをインキュベートし、さらに
（ｃ）  マトリックスに結合した癌細胞をｅｘ ｖｉｖｏ増幅する、
ことを含んでなる方法を包含する。
【００５４】
本発明の細胞分離法は、限定されるものではないが、体液、例えば、循環血液、尿、骨髄、髄および胸膜液、腹水、唾液； 分離した腫瘍組織標本； ならびに培養腫瘍細胞を含めて、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ起源のいずれかの所望の癌細胞集団の単離に使用しうる。所望の癌細胞集団の例としては、限定されるものではないが、前立腺癌、乳癌、大腸癌、脳癌、肺癌、頭部頸部癌、卵巣癌、膀胱癌、腎および精巣癌、黒色腫、リンパ腫、肝臓癌、膵臓癌、およびその他の胃腸癌の癌細胞が挙げられる。特に、種々の癌由来の所望の癌細胞集団としては、肺癌細胞、肺腺癌細胞、結腸腺癌細胞、腎臓癌細胞、直腸腺癌細胞、回腸盲腸腺癌細胞、胃腺癌、膵臓癌、肝臓癌細胞、肝細胞癌細胞、前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、乳癌、卵巣奇形癌、メラニン欠乏性黒色腫細胞、悪性黒色腫細胞、子宮頸部、喉頭および口部起源の扁平上皮細胞癌； グリア芽腫細胞、子宮内膜腺癌、星状細胞腫、バーキットリンパ腫細胞、ならびに非ホジキンリンパ腫細胞が挙げられる。
【００５５】
マトリックスに結合した癌細胞の存在は、新生細胞の機能、免疫表現型、および細胞形態の特徴を用いることを含む種々の方法を使用して、検出することが可能である。さらに、細胞による標識コラーゲンマトリックスの取り込みに基づいて、結合したどのような細胞も検出することができる。
【００５６】
５．２  本発明の治療的および予防的用途
本発明は、例えば、所望でない癌細胞を除去するために、また、骨髄移植でドナー細胞として使用する血液または骨髄由来の造血前駆細胞を富化するために使用しうる細胞分離法を提供する。細胞分離法に続けて、上皮マーカーなどの癌腫エピトープと反応する抗体、または抗ＣＤ３１もしくは抗ＣＤ３４などの内皮細胞と反応する抗体を使用して、癌または内皮細胞集団各々を富化することが可能である。
【００５７】
特定の実施形態では、本発明の細胞分離法によりヒト全血から異なる癌由来の癌細胞を富化し、これをｅｘ ｖｉｖｏ増幅に付した後、これを樹状細胞との反応に使用し、記載された方法（Ｂｒｕｇｇｅｒら， １９９９， Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ８７２：３６３−３７１）を含む手法を用いて有効な腫瘍ワクチンを開発することができる。
【００５８】
本発明のもう１つの実施形態では、癌患者から循環癌細胞を単離した後、これを一連のｉｎ ｖｉｔｒｏ化学療法計画に付して特定の治療の効果を調べることが可能である。その結果として、有効量または組合せ薬物をその患者に投与できるようになる（デザイナードラッグ）。
【００５９】
本発明のもう１つの実施形態では、癌細胞を選択的に死滅させるために細胞毒素を結合させたコラーゲンミクロスフェアを転移癌患者に注入することが可能である。ｉｎ ｖｉｖｏ癌細胞の特異的な接着および毒性コラーゲンの介入によって新規な治療を提供する。
【００６０】
さらに、本発明は、転移癌患者による血液フィルター用の細胞接着マトリックスとして使用される、限定されるものではないが、血液運搬接着分子で被覆されたコラーゲン、フィブリン、綿およびプラスチック繊維をはじめとする繊維組成物もまた提供する。かかる細胞接着マトリックスの使用では、細胞接着マトリックス中への患者血液の潅流を必要とする。血液潅流プロトコールでは、患者の血液を採取して、細胞接着マトリックスと接触させて輸送する。かかる輸送の間に患者の血液に存在する癌細胞が細胞接着マトリックスに優先的に接着され、患者の循環系から除去される。
【００６１】
細胞接着マトリックスを作製するため、コラーゲンまたは上記の材料を、限定されるものではないが、体液中の癌細胞捕捉用のカラム、組織培養プレート、マイクロキャピラリー、またはマイクロメッシュなどの容器内に形成させる。この容器には患者血液を保持容器の中を通過させるための１つの流出入口が備わっている。本発明の特定の実施形態では、動作可能なように通常の蠕動ポンプと連結させた血液流入ラインを備えた保持容器内に細胞接着マトリックスを形成させうる。さらに、血液流出ラインも備えられる。流出入ラインは、例えば、患者の前腕に移植される好適な動静脈瘻に連結される。また、アフェレーシスされる末梢血を、細胞接着マトリックスによる上記の癌細胞単離と共に使用することが可能である。白血球数が１．ｔｉｍｅｓ．ｌ０．ｓｕｐ．９／Ｌ以上に回復した後にアフェレーシスを開始した。アフェレーシスまたは白血球フェレーシスはＣｏｂｅ Ｓｐｅｃｔｒａ Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｌａｋｅｗｏｏｄ， Ｃｏｌｏ．）を用いて８０ｍ１／分の速度で２００分間行うことができる（全量１６Ｌ）。本発明の細胞接着マトリックスの使用により、転移性の高い癌細胞を有する患者の循環系から癌細胞を除去できる新規な方法が提供される。
【００６２】
５．３  癌細胞の転移能を測定するアッセイ
転移能の高い癌を有する患者を同定する方法を提供することが本発明の１つの目的である。本発明は、コラーゲンに基づく細胞接着マトリックス系を使用して、患者の癌細胞の浸潤能、すなわち、コラーゲンマトリックスに接着し、分解し、さらに取り込む能力を検出することによる転移能の判定に関する。癌細胞の脈管形成性、細胞の生存力および増殖の検出および測定によって、癌の予後に向けたさらなる新規な戦略が立てられる。
【００６３】
本明細書において記載する細胞分離およびアッセイ法は種々の診断に使用しうる。これらの用途としては、早期発見、治療および術後応答のモニタリング、ならびに癌進行の予後診断の際の形態学的、分子的、生化学的または免疫学的アッセイが挙げられる。例えば、循環癌細胞からＲＮＡを調製し、これをリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＤＮＡマイクロアレイ解析および遺伝子発現の網羅的解析（ＳＡＧＥ）に付して、癌の診断マーカーまたは転移を制御する薬物標的となる示差発現遺伝子を同定することができる。さらに、プロテオミクス解析により単離された癌細胞のタンパク質プロファイリングを行って、新規な転移マーカーおよび薬物標的を発見することが可能である。癌の転移能を判定する目的で、単離された癌細胞の上皮特異的抗原、セプラーゼおよびＤＰＰＩＶ抗原または内皮細胞マーカーを染色し、これを定量して存在する癌細胞数を調べてもよい。単離された癌細胞を、通常の癌の病理学的評価として形態学的に評価してもよい。単離された癌細胞を無菌条件下で培養し、細胞遺伝学的解析に付して染色体異常および変異決定因子の存在を検出してもよい。単離された癌細胞を、ＤＮＡマイクロアレイ、ＰＣＲおよびＦＩＳＨを使用して、より感度の高い変異検出用の分子プローブと反応させてもよい。このように、この方法によって、かかる判定のためにこれまで依存してきた侵襲的かつ高価な外科的処置を利用しなくてすむ。
【００６４】
本発明は、非常に望ましい目的、すなわち、癌患者の予後評価をする、および転移癌が発生しやすい素因を有する患者を同定する方法の提供を果たすものである。特に、本発明は、本発明の細胞接着マトリックスを使用して、患者から単離された癌細胞の転移能を調べる機能アッセイを包含する。
【００６５】
特に、本発明は、癌患者由来の癌細胞の転移能を調べる方法であって、
（ａ）  癌患者由来の癌細胞サンプルを細胞接着マトリックスに接種し、
（ｂ）  癌細胞によるマトリックスへの接着、それに沿った移動またはその取り込みを起こさせるのに十分な時間、癌細胞サンプルをインキュベートし、
（ｃ）  癌細胞によるマトリックスへの接着、それに沿った移動またはその取り込みを検出する、
ことを含んでなり、その際、マトリックスの癌細胞接着、移動または取り込みの検出が転移能を有する癌細胞の指標となる、上記方法を包含する。
【００６６】
本発明のアッセイには、癌細胞を接種するための、人工的に生み出したマトリックスの作製が必要である。マトリックスに接種しうる細胞としては、限定されるものではないが、血液細胞、癌細胞系および癌患者の腫瘍由来の細胞、すなわち生検腫瘍組織などを含めて、哺乳動物腫瘍由来の細胞が挙げられる。
【００６７】
癌細胞をマトリックスに接種したら、接着、取り込みまたは浸潤を起こさせるのに十分な時間マトリックスをインキュベートする。接種時間は接種する癌細胞の転移能に応じて変更する。
【００６８】
インキュベーション後、マトリックスへの癌細胞接着および／または癌細胞によるマトリックスの取り込みを種々の方法を用いて検出する。例えば、コラーゲンマトリックスを、例えば、蛍光色素、ビオチン、着色色素、および放射性プローブなどの薬剤で標識してもよい。癌細胞によりマトリックスが取り込まれることで細胞の標識化がなされる。標識マーカーを表示している癌細胞の検出は、当業者には十分に公知であり、限定されるものではないが、蛍光顕微鏡法、蛍光励起セルソーティング（ＦＡＣＳ）法またはシンチレーションカウンター放射能測定をはじめとする種々の方法を用いて行うことができる。かかる標識を用いることで、マトリックス材料の細胞接着および取り込みレベルを定量でき、細胞の転移能を調べることが可能である。
【００６９】
さらに、本発明のマトリックスを用いて単離された癌細胞の転移能は、当業者には十分に公知な種々のアッセイを用いてもまた調べられる。例えば、癌細胞サンプルを標識アセチル化低密度リポタンパク（ａｃＬＤＬ＋）とともにインキュベートし、毛管網状構造を形成させるためコラーゲンゲル上に接種するか、または癌細胞による内皮表現型の獲得の測定を可能にするのに十分な時間、限定されるものではないが、ＣＤ３１＋、Ｆｌｋ１＋、および因子ＶＩＩＩ（Ｆ８＋）をはじめとする、内皮細胞マーカーに対する抗体で染色することが可能である。また、癌細胞のアポトーシスへの進行性を、アポトーシスアッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ．）を用いて測定してもよい。癌細胞生存力、免疫細胞（白血球、Ｔ細胞およびキラー細胞）との会合および細胞性または補体性細胞融解への抵抗性の測定を可能にするのに十分な時間、癌細胞クラスターを、限定されるものではないが、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ８、およびＣＤ４をはじめとする、白血球マーカーに対する抗体と反応させてもよい。また、単離された癌細胞を１０〜２０％ヒト血漿含有組織培養培地で１〜５週間増殖させて、癌細胞にクローンを形成させることにより、培養下の癌細胞のコロニー形成能も調べることができる。
【００７０】
本発明のアッセイ系を使用して、有望な抗癌剤の効力を治療中にモニターすることも可能である。例えば、癌細胞の転移能を治療前または治療中に調べることも可能である。薬剤の効力は治療を通じて癌細胞の数または転移能を比較することにより追跡できる。コラーゲンマトリックスの検出可能な癌細胞接着、分解または取り込みレベル、癌細胞生存力、およびコロニー形成能を低下させることが可能であるものが効力を示す薬剤である。
【００７１】
５．４  抗転移薬を同定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイ
本発明はさらに、原発腫瘍から転移形成部位への癌細胞の拡散を阻害することが可能な薬剤を同定するスクリーニングアッセイを提供する。本発明によれば、薬剤をそれらの癌細胞転移を阻害する能力についてスクリーニングすることができる。抗転移薬を同定する目的での本発明のアッセイの使用では、試験薬剤は癌細胞とともにコラーゲンマトリックスに同時接種される。試験薬剤の存在下での癌細胞によるコラーゲンマトリックスの接着、取り込みおよび／または分解を、ビヒクル対照の存在下でのコラーゲンマトリックスの接着、取り込みおよび／または分解と比較する。その際、抗転移薬は癌細胞によるコラーゲンマトリックスの接着、取り込みおよび／または分解を阻害できるものとして同定される。
【００７２】
特に、本発明は、癌細胞の転移を阻害する薬剤を同定する方法であって、
（ａ）  癌細胞サンプルおよび試験薬剤またはビヒクル対照のいずれかを細胞接着マトリックスに接種し、
（ｂ）  癌細胞によるマトリックスの接着、分解および／または取り込みを起こさせるのに十分な時間、マトリックスをインキュベートし、
（ｃ）  癌細胞によるマトリックスの接着および／または取り込みを検出する、
ことを含んでなり、その際、ビヒクル対照の存在下で検出された癌細胞数に比べて、試験薬剤の存在下での癌細胞によるコラーゲンマトリックスの接着、取り込みおよび／または分解が低下していることで、転移形成を阻害する化合物が同定される、上記方法を包含する。
【００７３】
本発明によりスクリーニングしうる薬剤としては、限定されるものではないが、原発腫瘍から転移形成部位への癌細胞の拡散を阻害することが可能な、無機化合物、ペプチド、抗体およびそのフラグメント、ならびに他の有機化合物（例えば、ペプチドミメティックス）が挙げられる。薬剤としては、限定されるものではないが、可溶性ペプチドなどのペプチド、例えば、ランダムペプチドライブラリーのメンバー（例えば、Ｌａｍ， Ｋ．Ｓ．ら， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４； Ｈｏｕｇｈｔｅｎ， Ｒ．ら， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４−８６を参照）、およびコンビナトリアルケミストリーにより誘導されるＤ−および／またはＬ−型アミノ酸、ホスホペプチドから作製された分子ライブラリーのメンバー（限定されるものではないが、ランダムまたは部分縮重指令ホスホペプチドライブラリーのメンバーなど； 例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇ， Ｚ．ら， １９９３， Ｃｅｌｌ ７２：７６７−７７８を参照）が挙げられる。
【００７４】
本明細書に記載するものなどのアッセイにより同定された薬剤は、例えば、移動および浸潤を可能にする癌細胞の特性を確認したり、癌患者の転移形成を阻害したりするために有用である。スクリーニングで同定した化合物の効力を調べるアッセイを動物転移形成モデル系で試用することが可能である。かかるモデル動物は癌転移治療に有効と考えられる薬物、医薬、治療および介入の確認をするための試験基体として使用されうる。
【００７５】
本発明のアッセイを使用して、癌細胞の転移能を阻害しうる核酸配列をスクリーニングしてもよい。かかる核酸分子としては、タンパク質コード配列またはアンチセンス配列を含んでなる分子が挙げられる。エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム介在トランスフェクション、またはウイルス感染などの方法によりアッセイ前に核酸分子を癌細胞に導入することができる。
【００７６】
本発明によれば、ＤＰＰＩＶおよびセプラーゼをはじめとする、セリン膜内在性プロテアーゼ活性をモジュレートすることによって癌細胞の転移能をモジュレートする薬剤をスクリーニングするのにこのアッセイ系を使用することが可能である。このためには、ＤＰＰＩＶおよびセプラーゼを内部発現する細胞を使用して薬剤をスクリーニングすることが可能である。また、２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、繊維芽細胞などの細胞系を、スクリーニングに使用するためにＤＰＰＩＶおよびセプラーゼを発現するように遺伝子操作する。好ましくは、ＤＰＰＩＶおよびセプラーゼを発現するように遺伝子操作した宿主細胞を、例えば、化学的変化、生理学的変化、生物学的変化または表現型変化により測定して、アッセイのエンドポイントとして使用する。
【００７７】
かかる細胞系を使用する場合、ＤＤＰＩＶおよびセプラーゼを発現する細胞を試験化合物またはビヒクル対照に暴露する。暴露後、ＤＤＰＩＶおよびセプラーゼプロテアーゼ活性の発現および／または活性を測定するために細胞をアッセイする。例えば、暴露後、細胞溶解物をゼラチン分解活性（セプラーゼ）、またはＨ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリドまたはアミノメチルクマリン（ＤＰＰＩＶおよびセプラーゼ）およびＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリドまたはアミノメチルクマリン（セプラーゼ）などのプロリンに隣接するリン酸化残基を含有する基質（Ｋａｓｐａｒｉら， １９９６）についてアッセイすることが可能である。試験化合物がＤＰＰＩＶおよび／またはセプラーゼプロテアーゼ活性レベルをビヒクル対照で処置した細胞に認められるレベルよりも低いレベルに低下させうることで、試験化合物がＤＤＰＩＶおよびセプラーゼプロテアーゼ活性を阻害することが示される。
【００７８】
さらに、アッセイを使用してＤＤＰＩＶとセプラーゼとの相互作用をアンタゴナイズすることによりタンパク質複合体の活性を阻害する薬剤を同定してもよい。かかる薬剤を同定するために、ＤＰＰＩＶおよびセプラーゼタンパク質を試験化合物の存在および不在下でインキュベートし、その後、複合体形成の検出を行う。複合体形成の減少により、ＤＰＰＩＶとセプラーゼとの相互作用をアンタゴナイズしうる薬剤の存在が示される。
【００７９】
本発明の１つの態様では、可溶性ＤＤＰＩＶおよびセプラーゼを組換えにより発現させ、標識し、無細胞アッセイに使用して、ＤＰＰＩＶとセプラーゼとの相互作用を阻害する化合物を同定することができる。かかるアッセイでは、ＤＤＰＩＶまたはセプラーゼのいずれかを、当業者には十分に公知な手段により試験管またはマイクロタイターウェルなどの固相支持体に結合させることが可能である。その後、固相支持体上でＤＰＰＩＶまたはセプラーゼとの相互作用を阻害するそれらの能力について試験薬剤をアッセイする。
【００８０】
５．５  組成物および使用
本発明は、癌患者の血液および／または組織から浸潤癌細胞を迅速かつ効率的に検出および選択する新規な癌細胞捕捉系に関する。本発明は、細胞接着マトリックスとして使用される、血液運搬接着分子で被覆されたコラーゲン、フィブリン、綿およびプラスチック繊維を含んでなる繊維組成物に関する。本発明はさらに、癌患者の転移細胞の存在を検出するための、また転移癌患者の血液を濾過するためのかかる被覆繊維の使用に関する。癌患者に投与しうる細胞接着マトリックスには、上記第５．ｌ．−５．２．節に記載したものが含まれる。
【００８１】
本発明はさらに、本発明の細胞接着マトリックスにより単離することが可能な細胞組成物を提供する。かかる細胞組成物は、転移能を有する腫瘍細胞の小さなサブ集団、および末期癌に関連する臓器機能不全の一因となりうる血液中の癌細胞クラスターを含んでなる。富化した癌細胞の集団を使用して、例えば、新規な薬物標的、関係する遺伝的欠陥、その転移能および最も有効な治療計画を調べることも可能である。富化した細胞は、癌ワクチン開発に向けて樹状細胞との融合にも使用しうる。
【００８２】
本発明は、癌細胞の転移活性を調節する薬剤の投与による、癌などの増殖障害の治療を提供する。癌患者に投与しうる化合物には、上記第５．３．節に記載したアッセイを使用して同定された薬剤が含まれる。
【００８３】
本発明の特定の実施形態では、組織浸潤表現型に必要とされる重要なプロテアーゼが同定された。例えば、セプラーゼおよびＤＰＰＩＶなどのセリン膜内在性プロテアーゼの活性化が組織細胞移動および浸潤に必要であることがわかったため、癌細胞の転移活性の阻害にかかるプロテアーゼの阻害剤を使用することができる。かかる阻害剤としては、セプラーゼまたはＤＰＰＩＶに免疫特異的な抗体が挙げられる（図１３Ａ−Ｅ）。また、セプラーゼまたはＤＰＰＩＶのアンチセンスＲＮＡまたはリボザイムを発現するベクターの癌細胞へのトランスフェクションを使用して癌細胞の転移能を低下させてもよい（図１９）。
【００８４】
さらに、プロテアーゼ阻害剤を投与して原発腫瘍から転移形成部位への癌細胞の拡散を阻害してもよい。第７節、実施例２に示すように、ＤＰＰＩＶ阻害剤、すなわち、抗ＤＰＰＩＶ抗体によって癌細胞移動を阻害することができた。腫瘍細胞の体内の別の場所への転移を伴う癌は、癌細胞の移動および組織浸潤を阻害する薬剤の投与により治療される。かかる癌としては、例えば、乳癌および前立腺癌などの癌腫が挙げられる。
【００８５】
癌細胞転移の予防に使用するために同定された化合物は、ヒトで試験する前に、限定されるものではないが、イヌ、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギなどの好適なモデル動物系で試用することが可能である。ｉｎ ｖｉｖｏ試験では、ヒトへの投与に先立ち、当技術分野では公知のどのようなモデル動物系を使用してもよい。
【００８６】
特定の実施例では、癌患者の癌細胞が高い転移能を有すると判定された患者に癌転移を阻害する化合物を投与する。転移能が高いことは、例えば、血液サンプル（または患者由来の生検組織）を取得し、本発明の細胞分離およびアッセイ系を用いて単離された癌細胞の転移能をアッセイすることにより容易に検出することが可能である。
【００８７】
本発明は、細胞の転移能を阻害する有効量の化合物を被験体に投与することにより癌を治療する方法を提供する。好ましい態様では、被験体が動物であり、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトである。
【００８８】
本発明はさらに、本発明の細胞接着マトリックスまたはその単離された細胞成分と結合可能な医薬組成物を提供する。かかる組成物は、治療上有効な量の、癌細胞の移動および浸潤を制御することが可能な化合物と製薬上許容される担体とを含んでなる。特定の実施形態おいて「製薬上許容される」とは、動物、より詳しくはヒトに使用するために、連邦政府または州政府の規制当局によって認可された、または米国薬局方もしくは一般的に認められた薬局方のリストに記載された、という意味である。「担体」とは、化合物とともに投与される希釈剤、助剤、賦形剤、またはビヒクルをいう。かかる医薬担体は、無菌の液体、例えば水やオイル（落花生油、大豆油、鉱物油、胡麻油などの石油、動物、植物起源のものまたは合成によるもの）でありうる。医薬組成物を静脈投与する場合、好ましい担体は水である。また、食塩水ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液を液体担体として、特に注射液に使用することも可能である。
【００８９】
６．  実施例： 脈管形成および転移に関与する循環癌細胞の単離
以下に記載するデータから、新規な細胞接着マトリックス細胞分離およびアッセイ法により転移性疾患の癌患者の末梢血から生存癌細胞を単離することが可能であり、さらにこれらの細胞が脈管形成および転移を起こさせるのに必要な分子的決定因子を獲得していることが立証される。原発腫瘍由来の細胞に比べ、かかる生存循環癌細胞は転移能を有する小さなサブセットの癌細胞集団に相当する。
【００９０】
６．１  材料および方法
６．１．１  血液サンプルの採取
ｉｎ ｖｉｖｏ起源から採取した血液または細胞を、細胞がそれらの生存能を失わないように、それらの採取後、比較的短時間内に細胞単離に供する。癌細胞の単離を最適に維持するため、血液、腹水または組織サンプルを４℃で保存し、採取後２４時間以内に使用することが好ましく、最も好ましくは、４時間以内である。１回当たり約１０〜２０ｍｌの血液を抗凝血薬としてリチウムヘパリンを含有するバキュテイナー採血管（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ｔｕｂｅ）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， 緑色トップ、各管に７ｍｌずつ収容する）に採取した。患者のカルテから患者年齢、性別、診断日、治療的介入、臨床状態、および生検報告を調べた。施設内治験審査委員会によりプロトコールの承認を受けた。
【００９１】
６．１．２  血液または腫瘍組織からの癌細胞の単離
コラーゲン重合溶液を調製し、これを容器基層へのゲル化直前に氷上で所定の濃度、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中１〜２ｍｇ／ｍｌコラーゲンに調整した（図１Ａ）。特に、Ｉ型コラーゲン溶液（ラット尾Ｉ型コラーゲン、４．０ｍｇ／ｍｌ， Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｂｅｃｔｏｎ ａｎｄ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）を同量のＤＭＥＭと４℃で混合した。この混合物を４℃で９６ウェルマイクロタイターまたは６ウェル培養プレート（Ｎｕｎｃ， Ｉｎｃ．， Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ， ＩＬ）の底に薄層としてオーバーレイした（ｏｖｅｒｌａｉｄ）。コラーゲン繊維のゲルを形成させるため、プレートを３７℃で３０分間インキュベートし、コラーゲン層を重合させた。
【００９２】
６．１．３  血液、腹水または腫瘍組織からの癌細胞の単離
細胞集団から癌細胞を分離するため、コラーゲンマトリックスをまず、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）と、１０％子ウシ血清、１５％Ｎｕ−血清（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１単位／ｍｌペニシリン、および１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ１６４０との１：１混合物からなる細胞培養培地で被覆した。しかしながら、癌細胞は全血から直接単離することが可能であり、その場合には血液中に存在する接着分子をさらに被覆する必要はない。
【００９３】
サンプルを４℃で血漿および細胞単離処理に付した。血液サンプルを遠心分離して血漿を採取し、細胞ペレットを２％のウシ血清および０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳで原体積に希釈した後、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて分画して単核細胞を回収した。細胞接着マトリックスへの接着性の違いにより単核細胞画分を生存および浸潤癌細胞にさらに選別した。手短に言えば、単核細胞を完全培地（血液と同量）に懸濁した。一部の単核細胞、すなわち、コラーゲンマトリックスで被覆した９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェル当たり０．１ｍｌまたは６ウェル組織培養プレート（ＮＵＮＣ）の各ウェル当たり１〜１０ｍｌ、を１５分〜１時間接種した。培養物を培地で穏やかに洗浄し、非接着細胞を除去した。免疫細胞化学および機能アッセイに向け、処理に付す前にマイクロタイタープレート中の細胞を１２〜２４時間培養した。細胞分離研究では、マトリックスに接着した細胞をその後、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（ＧＩＢＣＯ）に５分間懸濁するか、または単にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で十分に洗浄した。洗浄液中の細胞を６ウェル組織培養プレートに移し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１２時間〜２４日間培養した。白血球数が高い患者、すなわち、リンパ腫または白血病患者の場合、単核細胞画分を６ウェル組織培養プレートの１つのウェルに対し１ｍｌ当たり細胞１００万〜２００万個になるまで完全培地で希釈する必要があることに注意すべきである。癌細胞の回収はマトリックスでの細胞密度に依存する（以下を参照）。細胞の生存能をトリパンブルー排除法またはアポトーシスアッセイによって評価した。
【００９４】
あるいは、Ｉ型コラーゲンまたは精製綿で作製したフィルターなどの細胞接着マトリックスで被覆した細胞培養ビーズに通すことで、全血から直接生存および浸潤癌細胞が得られる。精製綿またはコラーゲンで被覆したビーズを滅菌３０ｍｌピペットに充填し、同量の０．５ｍＭ ＥＤＴＡ含有培地または５０単位ヘパリン／ｍＬを含有する１０％の抗凝血薬クエン酸デキストロース（ＡＣＤ； Ｂａｋｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， ＩＬ）で予め希釈した１０ｍｌごとの血液に対し、０．１ｍｌのコラーゲン被覆ビーズを使用した。１０％のヒト血漿または血清含有培地でカラムを予備洗浄した。１分間当たり０．１〜０．７ｍｌの流量で、上記の基層方法から誘導される細胞と類似した特徴を共有する細胞の捕捉がなされる。
【００９５】
６．１．４  コラーゲンマトリックスの標識および細胞浸潤表現型の測定
重合部位を妨害しないように、ビオチン、フルオレセインまたはローダミンで標識する前にコラーゲンを重合させた。その後、標識したコラーゲン繊維を酸性水（ｐＨ２．０）中で可溶化したが、実験条件下で容易に重合してコラーゲン繊維に戻ることができた。特に、１０ｍｌのＩ型コラーゲン溶液（ラット尾Ｉ型コラーゲン、４ｍｇ／ｍｌ、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｂｅｃｔｏｎ ａｎｄ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）を１０ｍｌのＤＭＥＭと混合し、４℃で１０ｃｍ組織培養プレートに加えた。プレートを３７℃で３０分間インキュベートし、コラーゲン繊維を重合させた（ゲル）。ゲルを３０ｍｌのカップリングホウ酸バッファー、ｐＨ９．３（Ｓｉｇｍａ）で３０分間洗浄した後、３ｍｇのスルホ−ＮＳＨ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）、フルオレセインイソチオシアネート Ｉ ヒドロクロリド（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ Ｉｎｃ， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ， ＯＨ）または１ｍｇのＢｏｄｉｐｙ−ローダミンまたはフルオレセイン色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ．）を含有する３０ｍｌのホウ酸バッファーとともに振盪機で２５℃でインキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄してコンジュゲーションを停止させ、次いで、５０ｍｌのＰＢＳでの２日間の洗浄、さらに５０ｍｌの蒸留水でのさらに２日間の洗浄を行った。標識コラーゲン繊維を酸性水（０．０２Ｎ酢酸）中で可溶化し、最終濃度を１ｍｇ／ｍｌとした。標識コラーゲン単量体を同量の非標識のコラーゲン溶液と混合し、２倍容量のＤＭＥＭでさらに希釈し、容器表面にオーバーレイして薄層を形成し、さらに３７℃で３０分間インキュベートしてゲルを形成させた。
【００９６】
標識コラーゲンマトリックスで１６ウェルマイクロタイタープレート−ガラススライド（９６ウェルマイクロタイタープレートフォーマット中； Ｌａｂ−Ｔｅｋ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ）または６ウェル組織培養プレート（ＮＵＮＣ）を被覆した。一部の単核細胞、すなわち、９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェル当たり０．ｌｍｌまたは６ウェル組織培養プレート（ＮＵＮＣ）の各ウェル当たり１．６ｍｌをかかる基層に接種し、１５分〜１時間培養して接着細胞を捕捉した。非接着細胞を洗浄した後、細胞を標識マトリックス上で１２〜２４時間増殖させ、図１Ａ、１Ｂで示すようにＳＯＮＹ ＤＣ５０００ Ｃａｔ Ｅｙｅ イメージングシステムと連動するＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ３００ 倒立光学顕微鏡またはＷｉｎｄｏｗｓソフトウェアコンピューター解析用のＳＯＦＴｍａｘＰＲＯ １．２Ｆと連動するＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ｆＭａｘ蛍光マイクロプレートリーダーを用いて細胞浸潤性を測定した。まず、上記のＢｏｄｉｐｙ−蛍光コラーゲン基層を１６ウェル培養チャンバーに調製し、マトリックスにより単離する細胞の浸潤性の特性決定のための細胞培養および顕微鏡画像解析条件を最適化した（図１Ａ）。次いで、基体調製物を９６ウェルマイクロタイタープレート型に向けて最適化した。最適化パラメーターには、サンプル処理能の実施可能性、および定量精度に対する解像度が含まれる。
【００９７】
６．１．５  その他の細胞機能アッセイ
製造マニュアル（Ｌ−３４８５， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， ＯＲ， ＵＳＡ）に記載されるように、アセチル化低密度リポタンパク質（ａｃＬＤＬ）Ｂｏｄｉｐｙ ＦＬ コンジュゲートを用いて内皮細胞活性についての機能アッセイを行った。マトリックス上で同時に単離された、アポトーシスを起こしたまたは壊死状態の血液細胞を分離するため、固定する前にＶｙｂｒａｎｔ アポトーシスアッセイキット ＃５ Ｈｏｅｃｈｓｔ／ヨウ化プロジジウム （Ｖ−１３２４４， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， ＯＲ， ＵＳＡ）を用いて細胞を染色した。
【００９８】
６．１．６  細胞系および培養
ヒト乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４３６およびＨｓ５７８ＴをＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）から入手し、ヒトメラニン欠乏性黒色腫細胞系ＬＯＸをＯｙｓｔｅｉｎ Ｆｏｄｓｔａｄ教授（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｔｈｅ Ｎｏｒｗｅｇｉａｎ Ｒａｄｉｕｍ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｏｓｌｏ， Ｎｏｒｗａｙ）から入手した。細胞をダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）と、１０％の子ウシ血清、５％のＮｕ−血清（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１単位／ｍｌペニシリン、および１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ１６４０との１：１混合物中で培養した。これらの細胞を使用して免疫細胞化学的検出のための試薬を評価し、さらに機能アッセイの感度を決定した。
【００９９】
６．１ ７  免疫細胞化学のためのサンプル調製
白血球および末梢血組織細胞との比較により血液中の形質転換上皮細胞を計数するために、１６ウェルチャンバーのあるガラススライド（Ｌａｂ−Ｔｅｋ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ）を被覆した標識コラーゲンマトリックスで捕捉し、同じ基層上で、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１２〜２４時間培養した、癌患者の血液由来の単核細胞を免疫細胞化学用に固定した。この研究に使用した一次ｍＡｂには、ヒト上皮特異的抗原（ＥＳＡ； クローンＶＵ−１Ｄ９， ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ， ＣＡ， ＵＳＡ； ＳＩＧＭＡ， ＭＳ， ＵＳＡ）、Ｍｕｃ−１上皮膜糖タンパク質（Ｍｕｃ−ｌ； クローンＥ２９， ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）、サイトケラチン４、５、６、８、１０、１３および１８（ＰＣＫ； クローンＣ−１１， ＳＩＧＭＡ， ＭＳ， ＵＳＡ）； ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ−１内皮細胞マーカー（ＣＤ３１； クローンＪＣ／７０Ａ， ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）、Ｆｌｋ−１、血管内皮増殖因子の受容体（Ｆｌｋ−１， クローンｓｃ−６２５１， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， ＵＳＡ）、ＶＥ−カドヘリン内皮マーカー（ＶＥ−ｃａｄ； クローンｓｃ ９９８９， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， ＵＳＡ）； ＣＤ３４末梢血幹細胞マーカー（ＣＤ３４； クローン５８１， Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， ＵＳＡ）、ＣＤ４５白血球共通抗原（ＣＤ４５； クローンＴ２９／３３， ＤＡＫＯ， Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＣＤ８サプレッサーＴ細胞マーカー（ＣＤ８； クローンｃ８／１４４Ｂ， ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）、ＣＤ４３Ｔ細胞マーカー（ＣＤ４３； クローン８４−３Ｃ１， ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）、前立腺特異的酸ホスファターゼ（ＰＳＡＰ； クローンＰＡＳＥ／４ＬＪ， ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ； クローンＥＲ−ＰＲ８， ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）、ｃ−ｅｒｂＢ−２／Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ癌タンパク質（ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）（ｅｒＢ−２； クローンｅ２−４００１ ＋ ３Ｂ５， ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）、ｃ−ｅｒｂＢ−２（クローンＴＡＢ２５０， Ｚｙｍｅｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）、ＣＡ １９−９／シアリル ルイス（ｓｉａｌｙｌ Ｌｅｗｉｓ）ＧＩ 腫瘍マーカー（ＣＡｌ９−９； クローン１２１ ＳＬＥ， ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）、またはｐ５３腫瘍サプレッサータンパク質（ｐ５３； クローンＤＯ−７ ＋ ＢＰ５３−１２， ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）を認識するマウスｍＡｂが含まれる。さらに、Ｍｕｃ−１上皮細胞マーカーに対するフルオレセインコンジュゲート抗体（ＤＡＫＯ， Ｄｅｎｍａｒｋ）および第ＶＩＩＩ因子内皮マーカーに対するヤギ抗体のフルオレセインコンジュゲート（Ｆ８； Ａｔｌａｎｔｉｃ）を、その他の細胞マーカーに対する上記の一次抗体に加えて使用して癌細胞および内皮細胞各々を二重染色した。さらに、本発明者らの研究室で作製したラットｍＡｂ Ｄ２８（セプラーゼ（ｓｅｐｒａｓｅ）に対する）、Ｅ１９、Ｅ２６（ＤＰＰＩＶに対する）およびＣ２７（β１インテグリンに対する）を使用した。
【０１００】
抗体染色には、２％のＢＳＡで３０分間非特異的結合部位をブロッキングした後に一次抗体および／またはフルオレセイン−Ｆ８もしくは−Ｍｕｃ−１をスライドに加えることが含まれる。サンプルを室温で２０分間インキュベートし、ＰＢＳで５分間２回洗浄し、次いで、二次ウサギ抗マウスＩｇ（Ｚ０２５９， Ｄａｋｏ）にさらに２０分間曝露した。３回以上洗浄した後、サンプルをアルカリ性ホスファターゼ−抗アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰＡＡＰ）マウスＩｇ複合体とともに１５分間インキュベートした。最後に、酵素−基質［ＮｅｗＦｕｃｈｓｉｎ（Ｄａｋｏ）］を加えた結果、赤色の沈殿物が生じた。このデータは、ＳＯＮＹ ＤＣ５０００ Ｃａｔ Ｅｙｅ イメージングシステムと連動するＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ３００ 倒立光学顕微鏡を用いて記録したものであり、後の参照用にコンピューターサーバーに保存した。
【０１０１】
６．１．８  フローサイトメトリー解析のためのサンプル調製
６ウェル組織プレートを被覆した標識コラーゲンマトリックスで捕捉される、血液中の形質転換上皮細胞を計数するために、マトリックス基層から放出される単核細胞をフローサイトメトリーにより製造業者の推薦する手順に従って解析した。免疫細胞化学に関与する手順と同様に、固定する前にＶｙｂｒａｎｔ アポトーシスアッセイキット ＃５ Ｈｏｅｃｈｓｔ／ヨウ化プロジジウム（Ｖ−１３２４４， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， ＯＲ， ＵＳＡ）を用いた染色により細胞をアポトーシスまたは壊死について決定した。簡単に言えば、単核細胞を、サイトケラチン４、５、６、８、１０、１３、１８に対するフルオレセイン（ＦＩＴＣ）コンジュゲートマウスｍＡｂ Ｃ１１（ＰＣＫ； Ｓｉｇｍａ）またはＭｕｃ−１に対するフルオレセイン−抗体（ＤＡＫＯ）、フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート抗ＣＤ３ｌ内皮マーカー（ＣＤ３１； Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）およびペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）標識抗ＣＤ４５（ＣＤ３１； Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を含有する溶液で１５分間染色した。インキュベートし、洗浄した後、回収した細胞を０．５ｍｌのバッファーに再懸濁し、サンプルをＦＡＣＳｃａｎまたはＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で解析した。
【０１０２】
６．２  結果
６．２．１  細胞接着マトリックスを用いた癌細胞の単離： 血液運搬細胞接着分子の役割
表Ｉでは、ＬＯＸヒト悪性黒色腫細胞および頭部頸部癌患者から単離された癌細胞の、ヒト血漿フィブロネクチン、ラミニンおよびビトロネクチン、ならびにヒトおよびウシ血清の存在下での種々の天然繊維表面への接着を示している。ヒト癌細胞の接着を種々の量の精製血清タンパク質（１ウェル当たり０．１〜１μｇ）または１０％血清のいずれかで被覆した９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ， Ｉｎｃ．， Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ， ＩＬ）でアッセイし、記載のように行った（Ｎｏｍｉｚｕ ら， １９９５）。天然繊維の細胞接着性は、マイクロタイターウェルの１．２７ｍｍ２の領域に依然として接着したままである領域内の細胞数を計数して決定した。ヒトもしくはウシ血清またはフィブロネクチン ＋ ラミニン ＋ ビトロネクチンの存在下で、ＬＯＸ黒色腫細胞はプレーンなプラスチックよりも精製コラーゲン、フィブリン、および綿繊維、ならびにラインドプラスチック表面との接着性に優れており、さらに依然として接着したままである細胞数がより多い（表１）。同様に、頭部頸部癌細胞もプレーンなプラスチックよりも精製コラーゲン、フィブリン、および綿繊維、ならびにラインドプラスチック表面との接着性に優れており、さらに依然として接着したままである細胞数がより多い（表２）。これらの結果から、細胞接着マトリックス表面が血液運搬接着分子に対する結合親和性を介して癌細胞接着に影響を与えていることが示唆される。
【０１０３】
【表１】
2004522937.tif 000002
【０１０４】
細胞、１ウェル当たり４×１０３個（マイクロタイターウェルの１．２７ｍｍ２の領域に依然として接着したままである領域内の細胞数を計数した）を、１０％のヒト血清（Ｓｉｇｍａ）、１０％のウシ血清（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）、またはヒト血漿フィブロネクチン ＋ ラミニン ＋ ビトロネクチン（ＦＮ＋ＬＭ＋ＶＮ； Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）で、各々１０μｇ／ｍｌの濃度で被覆した９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ， Ｉｎｃ．， Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ， ＩＬ）中の種々のマトリックス表面に接種した。タンパク質で被覆しなかったウェルを陰性対照として使用した。以下に記載の手順に従ってＩ型コラーゲン繊維をマイクロタイターウェルの底に形成した。マイクロタイターウェルのダルベッコ改変イーグル培地中で２０％のヒト血漿を凝固させてフィブリン繊維を形成させた。また、精製綿繊維をダルベッコ改変イーグル培地に再懸濁し、マイクロタイターウェルに接種した。「ラインドプラスチック」（ｌｉｎｅｄ ｐｌａｓｔｉｃ）とは、マイクロタイターウェルの表面をエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）ペプチドチップでスクラップにしたものを示す。各値は独立した３回の実験の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【０１０５】
【表２】
2004522937.tif 000003
【０１０６】
細胞、１ウェル当たり２×１０３個（マイクロタイターウェルの１．２７ｍｍ２の領域に依然として接着したままである領域内の細胞数を計数した）を、１０％のヒト血清（Ｓｉｇｍａ）、１０％のウシ血清（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）、またはヒト血漿フィブロネクチン ＋ ラミニン ＋ ビトロネクチン（ＦＮ＋ＬＭ＋ＶＮ； Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）で、各々１０μｇ／ｍｌの濃度で被覆した９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ， Ｉｎｃ．， Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ， ＩＬ）中の種々のマトリックス表面に接種した。タンパク質で被覆しなかったウェルを陰性対照として使用した。以下に記載の手順に従ってＩ型コラーゲン繊維をマイクロタイターウェルの底に形成した。マイクロタイターウェルのダルベッコ改変イーグル培地中で２０％のヒト血漿を凝固させてフィブリン繊維を形成させた。また、精製綿繊維をダルベッコ改変イーグル培地に再懸濁し、マイクロタイターウェルに接種した。「ラインドプラスチック」とは、マイクロタイターウェルの表面をエッペンドルフペプチドチップでスクラップにしたものを示す。各値は独立した３回の実験の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【０１０７】
６．２．２  細胞分離法の感度
ヒト浸潤性乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４３６およびＨｓ５７８Ｔ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）を使用して細胞分離法の感度を決定し、さらに免疫細胞化学的検出のための試薬を評価した（以下を参照）。これらの乳癌細胞を蛍光色素でタグ付けし、単離手順の感度を決定した。図３Ａ〜Ｇは、ＰＫＨ２６赤色蛍光細胞リンカー（Ｓｉｇｍａ）でタグ付けした、種々の数のＨｓ５７８Ｔ乳癌細胞を加えた、正常および膀胱癌血液サンプルの解析を示している。示されるように、癌細胞はその他の血液細胞との識別が可能である。乳癌細胞の回収は頻度範囲、１ｍｌの健常ドナーの血液（１ｍｌ当たり単核細胞１０００万〜２０００万個）にスパイクしたＨｓ５７８Ｔ細胞１〜５００個、にわたり一致しており、回収率は７５〜１００％であった。しかしながら、Ｈｓ５７８Ｔ乳癌細胞を単核細胞が１ｍｌ当たり１０００万個未満である膀胱癌ドナーの血液にスパイクした場合、Ｈｓ５７８Ｔ細胞の回収率は９５〜１００％であった。このことから細胞密度がマトリックスへの細胞接着の限定要因であることが示唆された。さらに、１９個の赤色蛍光タグ付Ｈｓ５７８Ｔ細胞を１ｍｌの膀胱癌ドナーの血液にスパイクした場合には、単離されたＨｓ５７８Ｔおよび膀胱癌細胞の双方が抗サイトケラチン抗体Ｃ１１での陽性染色により確認された（図３Ｅ〜３Ｆ）。１ｍｌの血液中に１６個の蛍光タグ付Ｈｓ５７８Ｔ細胞および４６８個の膀胱癌細胞が検出された。これらの結果から、マトリックス捕捉方法による感度レベルは血液１ｍｌ当たり生存癌細胞１個であり、回収率は８５％に達しうることが示唆される。
【０１０８】
６．２．３  細胞接着マトリックスを用いた癌細胞単離
血液中の癌細胞の検出では、１６ウェルチャンバーのあるガラススライド（Ｌａｂ−Ｔｅｋ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ）または９６ウェル培養プレート（Ｎｕｎｃ）上に被覆され、続いて血液運搬接着分子を含有する子ウシ血清とともにインキュベートするローダミン−コラーゲン溶液の薄層が、「マトリックス」の好ましい実施形態である。１．６ｍｌの全血から誘導したバッフィーコート中の単核細胞を同アリコート（各々０．１ｍｌ）に１６ウェルチャンバーのあるガラススライドの各ウェルに接種し、３７℃で１０分〜１８時間インキュベートし、コラーゲンマトリックスへの接着性の違いにより癌細胞を選択する。
【０１０９】
図４Ａ〜Ｄでは、かかるＩ型コラーゲンに基づく細胞接着マトリックスを用いた組織断片を有する循環癌クラスターの単離を示している。頭部頸部扁平上皮細胞癌（図４Ａ〜Ｃ）および前立腺癌（図４Ｄ）を含む進行性転移性疾患の患者の血液では種々の大きさを有する細胞クラスターが共通して認められた。ＩＩＩ〜ＩＶ期癌患者の血液には、血液１ｃｍ３当たり数百〜２万個に至る多数の癌細胞クラスターが存在すると予想されている。しかしながら、健常ドナーまたは初期癌患者の血液にはかかる細胞クラスターは全く見られない。さらに、フィブリン繊維（図４Ｅ）、プラスチックスクラップ（図４Ｆ〜Ｇ）、精製綿繊維（図４Ｈ〜Ｉ）、およびＩ型コラーゲン繊維（図５Ａ〜Ｈ）は、培養下で増殖し、上皮細胞形態を示す循環癌細胞を捕捉する。これらの材料の表面は、腫瘍細胞の接着および拡散を順に促進する血液運搬細胞接着分子を吸収する（上記の表ＩＩを参照）。このプロセスでの細胞接着分子の役割を、フィブロネクチン、ビトロネクチン、およびラミニンに対するポリクローナル抗体とともに被覆コラーゲンマトリックスをインキュベートすることでさらに証明した。この処理により、マトリックスの細胞捕捉能は低下した。
【０１１０】
図５Ａ〜Ｈでは、血液運搬細胞接着分子の存在下での循環細胞とそれらの下部にあるＩ型コラーゲンに基づく細胞接着マトリックスの形態を示している。これらの癌細胞は接触後１０分〜６０分以内に優先的にコラーゲンマトリックスに接着する。次いで、それらはマトリックスを分解および取り込み、平らな基層に穴を形成した後、プラスチック表面上を移動し、さらに増殖する（図５Ａ〜Ｄ； ６Ａ〜Ｄ）。かかる癌細胞はほとんどの健常ドナー（図７Ａ）、良性疾患の患者（図７Ｂ）、または化学療法を受けている癌患者（図７Ｃ〜Ｄ）の血液には存在しない。新しく単離される循環癌細胞の大きさは小さいが、マトリックス上で同時に単離された大部分の単核血液細胞よりは比較的大きい（図６Ａ）。これらの推定癌細胞は急速に増殖してサイズがより大きくなり、培養４日以内に上皮形態をとる（図５Ａ〜Ｄ； ６Ａ〜Ｄ）。しかしながら、同時に単離された白血球は小さく、また、培養によってその数は減少する（図５Ａ〜Ｄ）。また、細胞接着マトリックスを用いて頭部頸部生検の扁平上皮細胞癌（ＳＣＣＨＮ）から単離された少数の癌細胞（図５Ｅ〜Ｆ）しか循環癌細胞の浸潤表現型または増殖特性を示さなかった。このことは循環癌細胞が転移する癌細胞集団の特異なサブセットを表すことを示唆している。かかるＳＣＣＨＮ組織では、それらはコラーゲンゲルに浸潤し、培養下で増殖する繊維芽細胞である（図５Ｅ〜Ｆ）。細胞分離系は循環系でまたは実験操作により損傷を受けた細胞を捕捉するものではなく、依然として生存している細胞、すなわち、接着能力を保持する細胞を捕捉するものであることに注目すべきである。
【０１１１】
コラーゲンマトリックスの厚さは、光学顕微鏡および透過型電子顕微鏡測定により測定したところ、推定約１００μｍであった（図５Ｅ〜Ｈ）。アセンブルされたコラーゲンにより混合細胞集団、すなわち、組織生検由来の血液または細胞懸濁物から１０分〜１時間以内に癌細胞を捕捉することが可能である。マトリックスにより捕捉された細胞は１〜２週間のインキュベーション中にマトリックスにさらに浸潤しうるが、マトリックスの表面上には増殖しない非浸潤細胞も幾分残っている（図５Ｅ〜Ｆ）。アセンブルされたコラーゲン繊維は直径７０ｎｍの細いストリングであり、それらがコラーゲン結合パターンを欠いていることを除いてｉｎ ｖｉｖｏのコラーゲン束状構造のものと外見が類似している（図５Ｇ〜Ｈ）。
【０１１２】
６．２．４  循環癌細胞の機能的特徴および免疫表現型的特徴
マトリックスにより捕捉された上皮細胞の機能的特徴および免疫表現型的特徴は新生物細胞のものと一致する。これらの細胞の浸潤表現型の測定では、ローダミン−コラーゲンマトリックスを用いて癌患者の血液から単離した細胞を、ローダミン−コラーゲン基層に接着し、それを分解して取り込む細胞の能力について解析した。図８Ａ〜Ｉでは、推定癌細胞が広範なコラーゲン分解／取り込み活性（Ｃｏ１＋）を示し、これらの細胞が癌細胞に特有の免疫学的および形態学的特徴も示すことを示している（以下を参照）。
【０１１３】
癌細胞の性質を決定するために、ローダミン−コラーゲンマトリックスを用いて癌患者の血液から単離した細胞を、それらの可能性のある上皮起源について上皮特異的抗原（ＥＳＡ）、上皮膜抗原（Ｍｕｃ−１）、およびサイトケラチン４、５、６、８、１０、１３および１８（ＰＣＫ）に対する抗体を用いる免疫細胞化学により解析した。ＥＳＡ＋、Ｍｕｃ−１＋、またはＰＣＫ＋に陽性反応を示すこれらの細胞は上皮起源のものであり、それゆえ、それらの転移性の性質と一致している。マトリックス上では、富化された癌細胞を含む接着細胞が、上皮、癌腫、内皮、末梢血幹細胞、または白血球に対するものなどの細胞型特異的モノクローナル抗体で染色される。上皮細胞マーカーで陽性に標識される接着細胞（図８Ｅ、Ｇ、Ｊ、Ｋ）、およびコラーゲン断片を取り込んだ接着細胞、Ｃｏ１＋（図８Ｂ、Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ）、を癌細胞と同定する。循環癌細胞は大部分の健常ドナー（図８Ｌ）、良性疾患の患者、または化学療法を受けている癌患者の血液にはほとんど存在しない。本明細書に記載する免疫細胞化学的解析と同様に、マトリックスから放出された、癌患者の血液由来の単核細胞を蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）解析に供することが可能である。
【０１１４】
６．２．５  循環癌細胞による内皮細胞表現型の獲得
循環系中の転移癌細胞には、浸潤の他、明らかに新たな脈管形成性が含まれる。細胞接着マトリックスを用いて癌患者の血液から単離された循環癌細胞は確かに内皮的特徴を獲得している。これらの頭部頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮ、図９Ａ〜Ｃ； ９Ｉ〜Ｊ）、大腸癌（ＣＣ、図９Ｄ〜Ｅ）および前立腺癌（ＰＣ、図９Ｇ〜Ｈ）細胞はＣｏｌ＋であり（図９Ｃ、Ｆ）、フォンビルブランド因子または第ＶＩＩＩ因子（Ｆ８）（図９Ｂ、Ｅ）およびＣＤ３１（図９Ｄ）を含む内皮細胞マーカーについて染色され、アセチル化低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の取り込み（図９Ｈ、Ｊ）ならびに上皮表面抗原（図９Ｇ中のＥＳＡ）により内皮細胞能力を発現する。さらに、内在化された単離癌細胞をフルオレセイン−ＬＤＬで標識した後、厚さ０．５ｍｍのコラーゲンゲルにプレーティングすると、それらによって細胞網状構造および管様構造の形成を含む増強された内皮分化が示された（図９Ｋ、Ｌ）。これらの構造は主としてＬＤＬ標識癌細胞で構成されていた。さらに、循環癌細胞は、先に発現した上皮マーカーを欠損することなく血管内皮増殖因子Ｆｌｋ−１およびＶＥ−カドヘリンの受容体の発現を含むさらなる内皮的特徴を示す。この脈管形成性は、腫瘍組織に残存する細胞ではなく、循環系に侵入する癌細胞に限られたものである。脈管形成表現型のかかる空間的制限が、遊出し、コロニーを形成し、さらに微小転移巣の形成へと至る脈管形成に協力する循環癌細胞の明確に区別される機能的能力を反映する。
【０１１５】
６．２．６  培養下の循環癌細胞の免疫癌死滅および増殖
循環癌細胞は白血球共通抗原ＣＤ４５およびＴ細胞マーカーＣＤ８を発現する白血球（ＷＢＣ）とともにクラスターを形成する。細胞接着マトリックスにより、望みのある予後と判定された癌患者から免疫および癌細胞複合体のかかるクラスターを容易に単離することができた。循環癌細胞全数により転移形成能が示されうるが、細胞傷害性ＷＢＣと相互作用する癌細胞の計測（図１０Ａ〜Ｉ）または自己免疫抗癌抗体介在補体性細胞溶解（図１ＯＪ〜Ｌ）によって転移に対する宿主免疫が示される。良好な予後と判定されたこれらの癌患者では、白血球により大部分の癌細胞が攻撃され、１日培養した後には分解され、数個のコロニーだけが増殖した（図１０Ｆ〜Ｉ）。また、抗癌抗体介在補体性細胞溶解はほとんどの癌細胞に起こりうるものである。ここでは、癌細胞のかかる死滅を、健常ドナー由来（図１０Ｌ）のものではなく、その同じ癌患者の血液由来（図１０Ｊ〜Ｋ）の１０％の自己血漿の存在下で単離ＢＬＣ細胞を培養することにより立証した。結果として生じた癌細胞の細胞溶解は、溶解した細胞の暗く見える相の材料の形態学的外見により測定することが可能である（図１０Ｊ〜Ｋ）。重要なこととして、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ製のアポトーシスおよび細胞溶解キットを用いた蛍光染色により測定したところ、血液から新しく単離された約９７％の細胞がアポトーシス細胞である。２ヶ月間の培養増殖が可能な癌細胞もあるが、大部分の癌細胞はそれらが単離された直後にアポトーシスまたは細胞溶解を示し、このことにより宿主免疫により癌細胞が死滅することが示される。１週間後には大部分のＷＢＣが培養物から消滅しているが、癌細胞クラスターまたはコロニーは残っている（図１０Ｆ〜Ｌ）。このように、免疫死滅に抵抗する生存および浸潤癌細胞の計測が、高度の悪性腫瘍を保持する患者の最も有力な指標となるであろう。
【０１１６】
６．２．７  循環癌細胞の計測
細胞分離法を用いて単離した循環癌細胞を、それらの浸潤活性、上皮性、脈管形成性、および上記の宿主免疫に対する抵抗力について分析した。ＳＯＮＹ ＤＫＣ５ＯＯＯ ３ＣＣＤ イメージングシステムでコンピューター処理するＮｉｋｏｎ倒立顕微鏡を用いて結果を記録した。全血またはバッフィーコートに存在する癌細胞の計測は本明細書に記載するこの細胞分離およびアッセイ法により最高の感度および解像度が与えられる。前立腺癌、乳癌、大腸癌、肺癌、頭部頸部癌、脳癌、膀胱癌、リンパ腫、腎および精巣癌、肝臓癌、または膵臓癌およびその他の胃腸癌患者の２００を超える血液サンプルが調べられた。Ｃｏｌ＋、ＬＤＬ＋、ＥＳＡ＋、Ｍｕｃ−１＋、ＰＣＫ＋、Ｆ８＋、またはＣＤ３１＋細胞と定義される循環癌細胞は転移性疾患の癌患者由来の全血１ｍｌ当たり２，０００〜２０，０００個のオーダーである。この研究から、転移する可能性のある癌患者の循環系中に８００万〜８０００万個の生存癌細胞が存在していると推測される。これはこれまでの抗体に基づくアプローチよりも解像度が１００倍以上高い（Ｒａｃｉｌａ， Ｅ．， Ｅｕｈｕｓ， Ｄ．， Ｗｅｉｓｓ， Ａ．Ｊ．， Ｒａｏ， Ｃ．， ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ， Ｊ．， Ｔｅｒｓｔａｐｐｅｎ， Ｌ．Ｗ．， およびＵｈｒ， Ｊ．Ｗ．， １９９８，「血液中の癌細胞の検出および特性決定（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｃｅｌｌ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ）」． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９５， ４５８９−４５９４）。しかしながら、この研究で推定された転移細胞数はこれまでの調査で報告された循環癌細胞全体の０．１％にすぎない（Ｇｌａｖｅｓ ら， １９８８， Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ５７：３２−３５）。
【０１１７】
７．  実施例： コラーゲンマトリックス上での繊維芽細胞移動の調節は新規な細胞表面プロテアーゼ複合体に依存する
以下に記載するデータは、移動中の繊維芽細胞の浸潤先端（ｉｎｖａｄｏｐｏｄｉａ）でのセプラーゼおよびジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）を含むセリン膜内在性プロテアーゼ（ＳＩＭＰ）からなる新規なプロテアーゼ複合体の形成がコラーゲンマトリックス上での細胞浸潤および移動に関係していることを実証する。
【０１１８】
７．１  材料および方法
７．１．１  細胞培養
ヒト胚性肺繊維芽細胞系ＷＩ３８およびヒト乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４３６をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）から入手した。ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）と、１０％の子ウシ血清、５％のＮｕ−血清（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１単位／ｍｌペニシリン、１０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、および１ｍＭピルビン酸ナトリウムを補足したＲＰＭＩ１６４０との１：１混合物で細胞を培養した。ラットｍＡｂ Ｅ２６、Ｅ１９およびＦ４はヒト胎盤ＤＰＰＩＶに対して誘導されたものであり、ラットｍＡｂ Ｄ８およびＤ２８はヒト胎盤セプラーゼに対するものであり（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ＬＡ ら， １９９７， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ． １３６１：１１−１９； Ｐｉｎｅｒｅｉｒｏ−Ｓａｎｃｈｅｚ， ＭＬ ら， １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２： ７５９５−７６０１； ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１３３６６）、ｍＡｂ Ｃ２７はヒト黒色腫β１インテグリンに対して誘導されたものであり、また、ラットｍＡｂ Ｃ３７は細胞表面糖タンパク質 ｇｐ−９０に対して誘導されたものである（Ｍｅｕｌｌｅｒ， ＳＣ．ら， １９９９， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：２４９４７−２４９５２）。マウス抗αｖインテグリンおよび抗β３インテグリンｍＡｂはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（各々クローンＬ２３０、カタログ番号ＨＢ８４４８およびクローンＡＰ−３、カタログ番号ＨＢ２４２）からのものであった。
【０１１９】
７．１．２  セプラーゼ−ＤＰＰＩＶ複合体の単離
ＷＩ３８細胞を水和したＩ型コラーゲンフィルム（０．２ｍｇ／ｍｌのラット尾Ｉ型コラーゲン、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｂｅｃｔｏｎ ａｎｄ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）上に接種し、９０％の集密状態になるまで培養した。ＷＩ３８単層の表面ビオチン化を製造業者の使用説明書に従い、Ｓｕｆｆｏ−ＮＳＨ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）を用いて行った。溶解物を回収するため、各培養プレートをＰＢＳで３回洗浄し、１２５ ｌ／ｃｍ２のＲＩＰＡ溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．５）中１．２５％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ）で抽出した。抽出は回転式振盪機（Ｂｅｌｌｃｏ Ｏｒｂｉｔａｌ Ｓｈａｋｅｒ， Ｖｉｎｅｌａｎｄ， ＮＪ）で２５℃、２５ｒｐｍで２時間行った。細胞層およびバッファーを除去し、５０ｍｌ円錐管に移し、４℃でさらに３時間回転攪拌しながらインキュベートした。この抽出物を４℃、１０，０００×ｇで２０分間の遠心分離により清澄化し、この上清を免疫沈降反応に使用した。
【０１２０】
免疫親和性マトリックスを調製するため、膜タンパク質に対する精製ラットｍＡｂ（２．５ｍｇ）を１ｍｌのＣＮＢｒ−セファロース ４ＭＢ（Ｐｈａｒｍａｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）とカップリングさせた。０．２５ｍｌのｍＡｂ−ビーズを使用し、４℃で一晩回転攪拌しながら２５ｍｌの細胞抽出物から複合体を免疫沈降させた。２５ｍｌの抽出バッファーで３回洗浄した後、カップリングした抗体−抗原複合体を有するビーズを０．１％のグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．４）バッファー（ビーズと同量）に再懸濁し、さらにサンプルを４℃で５分間インキュベートした。直ちに、サンプルをＡｍｉｃｏｎフィルターインサート（０．４５ｍ ４００ｌ容量）に移し、エッペンドルフマイクロフュージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）で４℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ビーズ濾液を２Ｍ Ｔｒｉｚｍａ塩基を加えて中和した。単離されたタンパク質複合体のサブユニット組成を決定するため、表面ビオチン化複合体の免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによりそれらのタンパク質プロフィールについて解析し、ニトロセルロース膜に移し、ＨＰＲ−ストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）およびＥＣＬシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を用いて検出した。また単離されたタンパク質複合体を免疫ブロット（抗セプラーゼ、抗ＤＰＰＩＶ、抗β１および抗β３インテグリンｍＡｂを用いる）、ゼラチンザイモグラフィー（セプラーゼゼラチナーゼ活性の検出）、および記載のＤＰＰＩＶ基質膜オーバーレイ（ｏｖｅｒｌａｙ）（Ｐｉｎｅｒｅｉｒｏ−Ｓａｎｃｈｅｚ， ＭＬ ら， １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２： ７５９５−７６０１； ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１３３６６）にも使用した。タンパク質がビーズから完全溶離したことを試験するため、Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（ビーズと同量）を加え、サンプルをマイクロ波により加熱した（低設定、各３０秒で２サイクル、次に中間設定で３０秒間を１サイクル）。その後、直ちにサンプルを４℃で遠心分離した。
この濾液を上記のアッセイに供した。
【０１２１】
７．１．３  コラーゲン繊維の標識
重合部位を妨害しないように、ビオチン、フルオレセインまたはローダミンで標識する前にコラーゲンを重合させた。その後、標識したコラーゲン繊維を酸性水（ｐＨ２．０）中で可溶化したが、実験条件下で容易に重合してコラーゲン繊維に戻ることができた。特に、１０ｍｌのＩ型コラーゲン溶液（ラット尾Ｉ型コラーゲン、４．６６ｍｇ／ｍｌ、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｂｅｃｔｏｎ ａｎｄ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）を１０ｍｌのＤＭＥＭと４℃で混合した。この混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、コラーゲン繊維を重合させた（ゲル）。ゲルを３０ｍｌのカップリングホウ酸バッファー、ｐＨ９．３（Ｓｉｇｍａ）で３０分間洗浄した後、３ｍｇのスルホ−ＮＳＨ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）、フルオレセインイソチオシアネート Ｉ ヒドロクロリド（ＦＩＴＣ）、またはテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ Ｉｎｃ， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ， ＯＨ）を含有する３０ｍｌホウ酸バッファーとともに振盪機で２５℃でインキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄してコンジュゲーションを停止させ、次に、５０ｍｌのＰＢＳでの２日間の洗浄、さらに５０ｍｌの蒸留水でのさらに２日間の洗浄を行った。標識コラーゲン繊維を酸性水（０．０２Ｎ酢酸）に可溶化し、最終濃度を１ｍｇ／ｍｌとした。標識コラーゲン単量体を同量のＤＭＥＭまたはｐ−バッファー（５０ｍＭ 重炭酸アンモニウムバッファー中３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．４）と混合し、さらに３７℃で３０分間インキュベートしてゲル形成させた。
【０１２２】
７．１．４  細胞移動および蛍光コラーゲン分解アッセイ
単層創傷培養物をオーバーレイする蛍光コラーゲン繊維を使用して、創傷閉鎖中のコラーゲンゲルにおける細胞移動を調べた。ＷＩ３８細胞を２−ウェルチャンバーのあるカバースリップ（Ｌａｂ−Ｔｅｋ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ）で集密状態になるまで増殖させた。ピペットチップで単層を引っ掻き、創傷縁部を作製した。次いで、培地をＤＭＥＭ中のＴＲＩＴＣ−コラーゲン（６００ｇ／ｍｌ； ５０ｌ／ウェル）と取換え、この培養物をＣＯ２インキュベーター中、３７℃で３０分間ゲル化させた。次いで、血清または阻止ｍＡｂ（３００ｌ／ウェル）を含有する培地を加え、リアルタイムで細胞移動およびコラーゲン分解に及ぼすそれらの影響を位相差および蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ 倒立顕微鏡）を使用して観察した。ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ ｌ．６２ｂ４／ｆａｔ解析プログラムを用いて移動性細胞による細胞移動および蛍光コラーゲン除去の領域を測定することで細胞移動およびコラーゲン分解を定量した。
【０１２３】
移動性細胞によるコラーゲン分解を測定するためにマイクロタイター形式の上記アッセイが開発された。９６ウェル組織培養プレート（Ｎｕｎｃ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ）中に、まず、５０ ｌ／ウェルのＴＲＩＴＣ−コラーゲン溶液（６００ｇ／ｍｌ）を装填し、この溶液を３７℃のインキュベーター中で３０分間ゲル化させた。次いで、ＴＲＩＴＣ−コラーゲンゲルに５０ ｌ／ウェルの、２×１０５細胞およびｍＡｂ（５０ｇ／ｍｌ）を含有するＴＲＩＴＣ−コラーゲン溶液をオーバーレイし、この培養物をＣＯ２インキュベーター中、３７℃で３０分間ゲル化させた。次いで、培養物に１ウェル当たり１５０ｌの新鮮培地を補足した。総ての培地をフェノールレッドを含まずに調製した。時々、各ウェルから１００ｌの培地を取り出し、蛍光マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ｆＭａｘ： 蛍光マイクロプレートリーダー）を励起波長５４４ｎｍおよび蛍光波長５９０ｎｍで用いてＴＲＩＴＣ−コラーゲンペプチドの放出を測定した。ロイシンの取り込みを利用して、１５０ ｌ／ウェルの２Ｃｉ／ｍｌ３Ｈ−ロイシンを含有する培地を培養物に添加するという培養条件において細胞の代謝活性を測定した。この際、細胞−コラーゲン層を５ｍｌのシンチレーション液に可溶化し、シンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ ＬＳ−７５００）で計数した。
セプラーゼおよびＤＰＰＩＶを構成的に発現する乳癌系ＭＤＡ−ＭＢ−４３６の安定したトランスフェクタントが得られた。プラスミドｐＡ１１（ｐＣＲ３．１ベクター単独）、ｐＡ１５（ベクター＋全長セプラーゼ）、およびｐＺ８（ＤＰＰＩＶリボザイム構築物）を製造業者の使用説明書に従い、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いてＭＤＡ−ＭＢ−４３６細胞にトランスフェクトした。選択培地は３００ｇ／ｍｌの濃度でＧ４１８を含有した。
【０１２４】
７．１．５  セプラーゼおよびＤＰＰＩＶの免疫蛍光標識
ＷＩ３８細胞をコラーゲンゲルで培養し、固定し、記載のようにセプラーゼに対するローダミンコンジュゲートｍＡｂＤ２８およびＤＰＰＩＶに対する蛍光コンジュゲートｍＡｂ Ｅ２６（Ｍｅｕｌｌｅｒ， ＳＣら， １９９９， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：２４９４７−２４９５２）を用いて単一ステップで免疫標識した。染色されたサンプルを落射蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）下、Ｚｅｉｓｓ ＰｈｏｔｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅＩＩＩ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ， Ｉｎｃ．）でＰｌａｎａｐｏ ２５／１．２または６３／１．４対物レンズを用いて写真撮影した。
【０１２５】
７．１．６  ヒト歯肉創傷および浸潤性ヒト乳癌
ヒト歯肉生検はトゥルク大学（ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｕｒｋｕ）（フィンランド）から入手した。２人の健康なボランティアに口腔粘膜の全厚創傷を作製し、創傷３、７、１４および２８日後に生検を回収した。生検直後に、新鮮な組織塊をＨｉｓｔｏｐｒｅｐ（登録商標）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）にマウントし、即液体窒素で凍結した。凍結切片（６ｍ）を切断し、−２０℃のアセトンで５分間固定し、−７０℃で保存した。ルーチンの組織学のために、その切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。免疫組織化学的染色では、切片を０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ； Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍ．Ｏ．）を含有するＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ／ＢＳＡ中のセプラーゼに対するローダミンコンジュゲートｍＡｂ Ｄ２８とともに加湿チャンバー内、４℃で１６時間インキュベートした。その後、切片をＰＢＳ／ＢＳＡおよび水で洗浄し、短時間風乾し、シアノアクリレートグルー（ｇｌｕｅ）（Ｋｒａｚｙ Ｇｌｕｅ， Ｂｏｒｄｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ ＬＴＤ）を使用してマウントした。
【０１２６】
染色をＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ ２０ 光学、蛍光および共焦点顕微鏡を使用して調べ、ＭＣ ８０ Ｚｅｉｓｓ顕微鏡カメラを用いて写真撮影した。対照染色はローダミンコンジュゲート二次抗体を用いて行ったが、特異的な染色は認められなかった。浸潤性ヒト乳癌の免疫組織化学染色を記載のとおり行った（Ｋｅｌｌｙ Ｔ ら， １９９８， Ｍｏｄ． Ｐａｔｈｏｌ． １１：８５５−８６３）。
【０１２７】
７．２  結果
示されたデータにより、ＬＯＸヒト悪性黒色腫細胞におけるセプラーゼ（Ｐｉｎｅｉｒｏ−Ｓｎａｃｈｅｚ ＭＬ， １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：７５９５−７６０１）と同様に、ＷＩ３８ヒト胚性繊維芽細胞における大部分のセプラーゼおよびＤＰＰＩＶが、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４、０．１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有するＲＩＰＡバッファー、およびオクチルグルコシドを含む非イオン性界面活性剤中、ならびにＷＧＡ−アガロースアフィニティー精製材料中では＞４００ｋＤａの複合体として存在していたことが示される。＞４００ｋＤａの複合体はＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ゲル濾過クロマトグラフィーではボイドボリューム画分に溶出した。ＷＧＡ−精製材料を単離し、続けてＳｕｐｅｒｏｓｅ １２ ゲル濾過液体クロマトグラフィーに供すると、主要な形態として、約２００ｋＤａ（画分１７）、４４０ｋＤＡ（画分１４）、および６７０ｋＤａ（画分１３）が示された（図１１Ａ）。セプラーゼが９７ｋＤａサブユニットを、そして、ＤＰＰＩＶが１１０ｋＤａ単量体を含有すること、さらにセプラーゼおよびＤＰＰＩＶの双方が非イオン性界面活性剤中では二量体である（１０）ことより、ゲル濾過データから４４０〜６７０ｋＤａの大きさのセプラーゼ−ＤＰＰＩＶ複合体が存在することが示唆される（図１１Ｂ）。
【０１２８】
ｍＡｂ Ｄ２８（セプラーゼに対する）およびｍＡｂ Ｅ１９（ＤＰＰＩＶに対する）を用いた免疫沈降では、表面ビオチン化したＷＩ３８細胞の抽出物において２つの主要な、密度が類似したバンドを同定した（図１２Ａ）。ｍＡｂ Ｄ２８またはＥ１９によって交差免疫沈降された２つのバンドはセプラーゼおよびＤＰＰＩＶ二量体各々を示している。サンプルを１％のＳＤＳ中で可溶化しかつ煮沸しないＳＤＳゲルでは、２００ｋＤａの上方つまり比較的遅いバンドがＤＰＰＩＶとして、１７０ｋＤａに移動する下方つまり比較的速いバンドがセプラーゼとして、各々免疫ブロットにより同定された（図１２Ｂ）。サンプルのＳＤＳ可溶化後のＳＤＳゲルでは３５０〜４００ｋＤａのヘテロマー会合物は検出されなかった（図１２Ａ、１２Ｂ）。このことから、ヘテロマー会合物が２つの安定した２００ｋＤａ ＤＰＰＩＶおよび１７０ｋＤａセプラーゼの二量体各々に解離したことが示唆される。ＲＩＰＡ細胞抽出物に関する３回の独立した実験では、セプラーゼおよびＤＰＰＩＶの安定した会合がセプラーゼおよびＤＰＰＩＶに対するｍＡｂを用いて検出されたが、β１およびβ３インテグリンに対するものでは検出されなかった（図１２Ａ、１２Ｂ）。さらに、かかるヘテロマー複合体は免疫的に単離された複合体のタンパク質分解活性により立証された。セプラーゼまたはＤＰＰＩＶ各々を認識するｍＡｂ Ｄ２８またはｍＡｂ Ｅ１９のいずれかを用いるアフィニティ精製によりＷＩ３８ ＲＩＰＡ抽出物から抗原を単離した。溶離物を１７０ｋＤａ（セプラーゼ）ゼラチナーゼ（図１２Ｃ）および２００ｋＤａ（ＤＰＰＩＶ）プロリン特異的ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（図１２Ｄ）について分析した。ゼラチンザイモグラフィーでは、抗セプラーゼｍＡｂ Ｄ２８（図１２Ｃ、ＩＰ： セプラーゼ）または抗ＤＰＰＩＶ ｍＡｂ Ｅ１９（図１２Ｃ、ＩＰ： ＤＰＰＩＶ）の免疫沈降物において１７０ｋＤａゼラチナーゼ活性が検出された。単離されたＤＰＰＩＶ二量体にはゼラチナーゼ活性がなく、ＤＰＰＩＶ抗体を用いたゼラチンザイモグラムで１７０ｋＤａバンドが同定されたことから複合体中にセプラーゼが存在することが示される。同様に、ＤＰＰＩＶ基質オーバーレイアッセイでは、抗セプラーゼｍＡｂ Ｄ２８（図１２Ｄ、ＩＰ： セプラーゼ）または抗ＤＰＰＩＶ ｍＡｂ Ｅ１９（図１２Ｄ、ＩＰ： ＤＰＰＩＶ）の免疫沈降物において２００ｋＤａプロリン特異的ジペプチジル−アミノペプチダーゼ活性が検出された。αｖ、α２、α６もしくはβ３インテグリン、または対照免疫沈降物にはＤＰＰＩＶ活性の１７０ｋＤａゼラチナーゼは全く認めることができなかった。これらの結果からも、セプラーゼおよびＤＰＰＩＶはＳＤＳバッファー中ではホモ二量体であるが、これらは熱（＞６０℃）および酸に感受性で、これらの単量体サブユニットへの解離に向かうという先の観察が確認される。よって、プロテアーゼ複合体は同量のセプラーゼおよびＤＰＰＩＶタンパク質（図１１Ａ、１１Ｂ、１２Ａ、１２Ｂ）を含有しており、１７０ｋＤａゼラチナーゼおよび２００ｋＤａ ＤＰＰＩＶジペプチジル−アミノペプチダーゼ活性（図１２Ｃ、１２Ｄ）を誘導するのに等しく有効であったことがわかる。
【０１２９】
コラーゲンゲルでの細胞移動および可能性のあるコラーゲン分解におけるセプラーゼ−ＤＰＰＩＶ複合体の役割を調べるため、本発明者らは形態学的試験用の細胞単層創傷モデルに、また生化学的研究用の希薄な培養物に薄層のコラーゲンをオーバーレイした（図１３）。コラーゲンゲルでの細胞移動および細胞による局部的なコラーゲン除去は、細胞移動／コラーゲン除去の領域を位相差および蛍光顕微鏡とともに画像解析を用いて計測して測定した（図１３Ａ〜１３Ｄ）。創傷閉鎖モデルにｍＡｂ Ｅ１９（ＤＰＰＩＶに対する）を加えると細胞移動（図１３Ｂ、１３Ｃ）および細胞による局部的なコラーゲン除去（図１３Ｄ）が阻止されたが、一方クラスが適合したｍＡｂ（ＩｇＧ）を添加しても阻止されなかった（図１３Ｂ、ｌ３Ｃ、１３Ｄ）。ｍＡｂ Ｅ１９の量を増やすと阻止が増大され（図１３Ｂ）、Ｅ１９を除去すると抗体阻止効果が逆転しうるため、このｍＡｂに毒性はなかった（図１３Ｃ）。さらに、活性化細胞による局部的コラーゲン分解を、９６ウェルプレートで希薄な培養物としてのＷＩ３８細胞により蛍光コラーゲン繊維から放出される蛍光ペプチドを分光蛍光分析を用いて計数することにより定量した（図１３Ｅ）。希薄な培養物における細胞は「移動の接触阻害」が少ないことから移動性であることが知られている（Ｃｈｅｎ， Ｗ−Ｔ， １９７９， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８１：６８４−６９１）。移動性ＷＩ３８細胞は４日以内では時間依存性コラーゲン分解を示した。さらに、ｍＡｂ Ｅ１９（ＤＰＰＩＶに対する）は移動性細胞によるコラーゲン分解を阻止したが、一方対照ｍＡｂ Ｃ３７（抗ｇｐ−９０）は阻止しなかった（図１３Ｅ）。これらのデータからコラーゲンゲルでの細胞移動および創傷により活性化された繊維芽細胞によるコラーゲン分解におけるセプラーゼ−ＤＰＰＩＶ複合体の役割が示される。
【０１３０】
ＤＰＰＩＶはコラーゲン（Ｂａｕｖｏｉｓ Ｂ， １９８８， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２５２：７２３−７３１； Ｈａｎｓｋｉ Ｃ， １９８８， Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． １７８：６４−７２； Ｌｏｓｔｅｒ Ｋ．， １９９５， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２１７：３４１−３４８）またはフィブロネクチン（Ｃｈｅｎｇ， ＨＣ １９９８， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：２４２０７−２４２１５； Ｊｏｈｎｓｏｎ ＲＣ ら， １９９３， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２１：１４２３−１４３２； Ｐｉａｚｚａ， ＧＡ ら， １９８９， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．： ２６２：３２７−３３４）に対する接着受容体であることが示されていたので、ｍＡｂ Ｅ１９（ＤＰＰＩＶに対する）のコラーゲンゲルでの細胞移動および移動性細胞によるコラーゲン分解への阻止効果が、接着活性へのその影響によるものであるか否かを検討した。図１４は、コラーゲン繊維へのインテグリン接着と平行した比較により、ｍＡｂ Ｅ１９（ＤＰＰＩＶに対する）はコラーゲンゲルでの細胞移動および移動性細胞によるコラーゲン分解を阻止するが、一方コラーゲン基層上でのＷＩ３８細胞の拡散（図ｌ４Ａ）およびコラーゲン基層への接着（図１４Ｂ）には作用しないことを示している。しかしながら、ｍＡｂ Ｃ２７（β１インテグリンに対する）はコラーゲン基層上でのＷＩ３８細胞の拡散およびコラーゲン基層への接着を阻止するが、ｍＡｂ Ｅ１９（ＤＰＰＩＶに対する）またはｍＡｂ Ｃ３７（抗ｇｐ−９０）は阻止しない（図１４Ａおよび１４Ｂ）。これらのことから、β１インテグリンがセプラーゼ−ＤＰＰＩＶ複合体の基体結合に関与するＷＩ３８細胞における主要なコラーゲン受容体でありうることが示される。
【０１３１】
セプラーゼおよびＤＰＰＩＶが移動性細胞の浸潤先端で会合することを立証するため、二重標識免疫蛍光実験を行った（図１５）。コラーゲンゲルにおいて移動する細胞の浸潤先端（ａ）がセプラーゼに対するＴＲＩＴＣ−ｍＡｂ Ｄ２８（ｂ）またはＤＰＰＩＶに対するＦＩＴＣ−ｍＡｂ Ｅ２６（ｃ）で陽性染色されることが認められた。スーパーインポーズ画像でもセプラーゼおよびＤＰＰＩＶがコラーゲンゲルにおいて移動するＷＩ３８繊維芽細胞の浸潤先端に共局在化していることが示される（ｄ）。
【０１３２】
かかるセプラーゼおよびＤＰＰＩＶの共局在化が見出されうるか否かを調べるため、ホルムアルデヒドで固定し、パラフィンで包埋したヒト乳癌組織の連続切片（図１６および１８）でｉｎ ｖｉｖｏ免疫組織化学実験を行った。浸潤最前部の腫瘍細胞と同様に、ヒト浸潤性乳癌の結合組織細胞はセプラーゼに対するｍＡｂ Ｄ２８またはＤＰＰＩＶに対するｍＡｂ Ｅ２６と強く反応を示した（図１６、矢印）。しかし、離れた正常組織の結合組織細胞ではかかるセプラーゼおよびＤＰＰＩＶ染色は検出されなかった（図１８）。セプラーゼ−ＤＰＰＩＶ発現は癌浸潤に応答した結合組織細胞の活性化と関係があり、さらにセプラーゼおよびＤＰＰＩＶがこれらの活性化組織細胞、ならびに浸潤性癌細胞において共局在化すると考えられる。
【０１３３】
培養下のヒト臍帯平滑筋細胞とは異なり（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ＬＡ ら， １９９７， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ． １３６１：１１−１９）、セプラーゼおよびＤＰＰＩＶの双方は、間葉細胞の間に優先的に分布するが、胎盤および臍帯を含むヒト胚組織の分化した筋細胞および大きい血管の内皮細胞には分布しない。間質繊維芽細胞でのセプラーゼおよびＤＰＰＩＶ発現がｉｎ ｖｉｖｏで創傷閉鎖中に誘導されるか否かを調べるため、ヒト歯肉粘膜−創傷閉鎖の免疫組織化学を検討した（図１７）。創傷後３日目にセプラーゼおよびＤＰＰＩＶの強い発現が結合組織細胞で見られた（ｂ〜ｄ、ｇ）。隣接する正常粘膜組織では免疫反応が全く見られなかった。フィブリン凝塊領域および上皮組織では特異的反応が全く見られなかった。共焦点顕微鏡により、ｉｎ ｖｉｖｏでの浸潤先端の存在を示す結合組織細胞の突出部にセプラーゼ（ｄ）およびＤＰＰＩＶが局在化していることが示される。その後、創傷後７日目では、肉芽組織の中央にあるほんの数個の細胞だけが抗セプラーゼ抗体（ｆ）と反応性であった。しかし、抗ＤＰＰＩＶ抗体（ｈ）と反応性ではなかった。１週間後、結合組織細胞からセプラーゼおよびＤＰＰＩＶ染色が消失し、さらに、１４または２８日経過した創傷細胞は抗体とも反応しなかった。このデータから、セプラーゼおよびＤＰＰＩＶが繊維芽細胞、内皮細胞および癌細胞における活性化酵素であり、それらが細胞移動に必要な局部的なコラーゲン分解に関係していることが示される。
【０１３４】
細胞トランスフェクション実験を用いてセプラーゼおよびＤＰＰＩＶの細胞表面会合を調べた。セプラーゼ−ＤＰＰＩＶ複合体を構成的に発現するＭＤＡ−ＭＢ−４３６乳癌細胞を使用した。セプラーゼを過剰発現するかまたはＤＰＰＩＶもしくはセプラーゼ産生に欠陥のある細胞をそれらのコラーゲン分解およびコラーゲンゲルでの移動性活性について調べた（図１９）。親またはベクタートランスフェクト細胞（図１９Ａ； 親、ｐＡｌｌ）と比べ、セプラーゼをコードするプラスミドｐＡ１５でトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−４３６ 細胞ではＴＲＩＴＣ−コラーゲンペプチド放出の増大が観察され（図１９Ａ、ｐＡ１５）、ＤＰＰＩＶ特異的リボザイムをコードする構築物でトランスフェクトした細胞ではペプチド放出の減少が認められた（図１９Ａ、ｐＺ８）。また、セプラーゼの過剰発現がＤＰＰＩＶのわずかな減少と関係しているとも考えられる。またＤＰＰＩＶリボザイムでトランスフェクトした細胞は検出可能なＤＰＰＩＶを産生せず、実質的にセプラーゼが減少した（図１９Ｂ）。
【０１３５】
本発明は、本明細書に記載する特定の実施形態による範囲に限定されるものではなく、これらの特定の実施形態は本発明の各々の態様を単に例示するものであり、さらに機能的に同等の方法および構成要素が本発明の範囲内にある。実際には、本明細書で示しかつ説明したものに加えて、本発明の種々の変形は当業者ならば上述の説明および添付の図面から明らかとなるだろう。かかる変形は添付の特許請求の範囲内に入るものと意図される。本明細書では種々の刊行物を引用しているが、これらは参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
細胞接着マトリックスの組成および調製を示す。
【図２】
細胞接着マトリックスに基づく細胞分離およびアッセイ系の診断的および治療的用途を示す。
【図３】
患者および対照由来の血液サンプルの癌細胞分離解析を示す。
【図４】
細胞接着マトリックスに接着した循環細胞を示す。
【図５】
Ｉ型コラーゲンに基づく細胞接着マトリックスに接着した循環細胞を示す。
【図６】
循環癌細胞の浸潤表現型の形態学的基準を示す。
【図７】
細胞分離法により単離された対照血液サンプル由来の細胞を示す。
【図８】
蛍光標識コラーゲンを用いた細胞浸潤表現型の細胞分離およびアッセイ系、および上皮マーカーに対する抗体を用いた循環癌細胞の免疫細胞化学を示す。
【図９】
循環癌細胞の脈管形成性。頭部頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮ、Ａ−Ｃ； Ｉ−Ｊ）、大腸癌（ＣＣ、Ｄ−Ｆ）および前立腺癌（ＰＣ、Ｇ−Ｈ）患者の血液から細胞を誘導した。細胞をコラーゲンマトリックスを用いて基層上に捕捉し、１〜１１日間（ｄ１またはｄ１１と記載）培養した。
【図１０】
培養下での循環癌細胞の免疫癌死滅および増殖。コラーゲンマトリックスを用いて大腸癌（ＣＣ、Ａ−Ｅ）、前立腺癌（ＰＣ、Ｆ−Ｉ）、または膀胱癌（ＢＬＣ、Ｊ−Ｌ）患者の血液から細胞を単離し、１０〜２０％のヒト血漿を含有する培地で培養した。
【図１１】
セプラーゼおよびＤＰＰＩＶについてのゲル濾過カラムクロマトグラフィーおよび免疫ブロットを示す。
【図１２】
ＷＩ３８ヒト胚性肺繊維芽細胞由来のセプラーゼ−ＤＰＰＩＶ複合体の特徴づけを示す。
【図１３】
コラーゲンゲルにおける細胞移動および創傷により活性化されたＷＩ３８繊維芽細胞によるコラーゲン分解を示す。
【図１４】
コラーゲン基層上でのＷＩ３８細胞の接着および広がりは、主として、β１インテグリンを媒介としており、ＤＰＰＩＶによる媒介は見られないことを示す。
【図１５】
コラーゲンゲルを移動するＷＩ３８細胞の浸潤先端におけるセプラーゼおよびＤＰＰＩＶの共局在を示す。
【図１６】
パラフィン包埋した腫瘍組織の連続切片の免疫組織化学により示される、ヒト悪性乳癌の結合組織細胞におけるセプラーゼおよびＤＰＰＩＶの分布を示す。
【図１７】
治癒中のヒト歯肉創傷部の粘膜細胞におけるセプラーゼおよびＤＰＰＩＶの分布を示す。
【図１８】
ヒト悪性乳腺管癌の浸潤最前部にある微細血管内皮細胞、繊維芽細胞、および癌細胞におけるセプラーゼおよびＤＰＰＩＶの共局在を示す。
【図１９】
ＭＤＡ−ＭＢ−４３６細胞のプロテアーゼ発現とコラーゲン分解能との関係を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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