(57)【要約】卵母細胞の受精で使用するためのマルチチャンバー・モジュールは、流体培地を保持するための第１チャンバー（３６）、精液を収容する第２チャンバー（５４）、および流体培地が第１チャンバー（３６）から流入するようになっている第３チャンバー（５２）であって、そこから流体培地が第２チャンバー（５４）内に進む第３チャンバーを含み、それにより、精子が流体のフローに逆らって動き、第２チャンバー（５４）から受精が起こる第３チャンバー（５２）に移動することを可能にしている。毛管流は、カップ形状のコンテナ（２４および４０）の向かい合う表面の間の放射状の通路（５１）で形成される。廃棄物チャンバー（３８）は第２チャンバー（５４）を囲んでいる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵母細胞の受精装置であって、
流体培地を保持する第１チャンバー、
精液を収容する第２チャンバー、および
流体培地が第１チャンバーから流入するようになっている第３チャンバーであって、そこから流体培地が第２チャンバーに入るようになっている第３チャンバー
を有し、それにより、精子を流体のフローに逆らって移動させて、第２チャンバーから、卵母細胞の受精が起こる第３チャンバーに移動させるマルチチャンバー・モジュールを含む、装置。
【請求項２】
第２および第３チャンバーがバリアー手段によって分離されていて、当該バリアー手段を介して流体が第３チャンバーから第２チャンバーへ移動し、且つ当該バリアー手段を介して精子が第２チャンバーから第３チャンバーへ移動するようになっている、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
バリアー手段が少なくとも１つの通路を第２チャンバーと第３チャンバーとの間で含む、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
バリアー手段が、分離手段によって間隔をあけられている１組の対向する面を含む、請求項２または３に記載の装置。
【請求項５】
分離手段が、対向する面のいずれか一方にある複数の扇形のリブを、それらの間にある通路とともに含む、請求項４に記載の装置。
【請求項６】
通路が深さ３０ミクロン程度のものである、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
第１チャンバーから第３チャンバーへの流体培地のフローの速度を制御する制御手段をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の装置。
【請求項８】
制御手段が、長手方向に延びるグルーブを周面に有するロッドを含み、ロッドが流体培地の通路内に配置されている、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
第２および第３チャンバーがカップ形状のコンテナによって規定されており、一方が他方の内部にあって、環状のフロー制限バリアーによって分離されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１０】
第２チャンバーと流体連通している廃棄物チャンバーをさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１１】
第２チャンバーと廃棄物チャンバーとの間に配置されたフィルター手段をさらに含む、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
体外受精の方法であって、
流体培地を保持する第１チャンバー、精液を収容する第２チャンバー、および卵母細胞の受精が起こるようになっている第３チャンバーを含むマルチチャンバー・モジュールを供給する工程；
第１チャンバーに流体培地を供給し、第１チャンバーから第３チャンバーを経由して第２チャンバーへ向かう流体培地のフローを形成する工程；
１または複数の卵母細胞を第３チャンバーに配置する工程；
精液を第２チャンバーに配置する工程；および
卵母細胞を受精させるために、第２チャンバー内の精液から運動精子だけを、流体培地のフローに逆らって第３チャンバーに移動させる工程
を含む方法。
【請求項１３】
マルチチャンバー・モジュールが請求項１〜１１のいずれか１項に記載のものである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
受精させた卵母細胞を第３チャンバーで培養することをさらに含む、請求項１２または請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
第３チャンバーから第１チャンバーへの流体培地の安定した状態のフローが存在する、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
単一のマルチチャンバー・モジュール内で、運動精子の分離、および分離した運動精子による卵母細胞の受精を実施することを含む、体外受精方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、該して、不妊治療に関し、特に体外受精（ＩＶＦ）のための装置および体外受精の方法に関する。より特には、本発明は、単一のデバイス中での効果的な精子の分離、受精、および培養に関する。
【０００２】
（発明の背景）
標準的なヒトのＩＶＦ処置においては、鉱物油の下で微量の培地中で、前処理（もしくは調製）した精子とともに卵母細胞（または卵子もしくは卵）を１６時間培養（インキュベーション）することが、実用的な理由のために本来行われていた。これは一般的に、前核が観察される時間に対応する。しかしながら、卵母細胞と精子とを一晩かけて共培養することは生理学的でなく、精子の代謝老廃物が受精卵に悪影響（帯硬化を含む）を及ぼし、その結果、着床を害し、妊娠率を減ずる可能性がある。
【０００３】
ＩＶＦに最も一般的に用いられている精子の前処理技術としては、「スイムアップ」および「パーコール」が挙げられ、それらは化学薬品、洗浄、および遠心分離を伴う。これらの技術は、精子にある種のダメージをもたらすことがある。濃度勾配法および「スイムアップ」法が含まれる。これらの方法は、遠心分離または化学薬品の使用を伴うことがある。ＡｉｔｋｅｎおよびＣｌａｒｋｓｏｎは、精子にダメージを与えて生殖能力を損なうことがある反応性酸素種の生成が、遠心力によってもたらされることを示してきた。（Ｒ．Ｊ．ＡｉｔｋｅｎおよびＪ．Ｓ．Ｃｌａｒｋｓｏｎ、「Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．」１９９１；６：第１７３〜１７６頁）「パーコール」は研究室での研究のセッティングでは広く使用されており、その臨床上の利用はある不都合を伴っている。あるバッチは、高いレベルのエンドトキシンを含んでいることが判明した。エンドトキシンは、バッチを臨床上使用するのに不適当なものとする（Ｃ．Ｙ．ＡｎｄｅｒｓｅｎおよびＪ．Ｇｒｉｎｓｔｅｄ「Ｊ．Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｒｅｐｒｏｄ．  Ｇｅｎｔ．」１９９７；１４：第６２４〜６２８頁）。１９９６年の後半に、「パーコール」は、精子分離培地として臨床的に使用することから撤退させられた（Ｇｕｎｅｅｔ  Ｍａｋｋａｒら、「Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．」１９９９；７２：第７９６頁〜第８０２頁）。
【０００４】
精子が流体のフロー中に置かれると、運動精子（または運動能力を有する精子）は急速に整列して、フローに逆らって泳ぐことが報告されている（Ｆ．Ａｂｅｄ．「精子の運動能力に関する現象の新しい発見：精子はフローに逆らって泳ぐ（Ｔｈｅ  ｎｅｗ  ｆｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ  ｉｎ  ｓｐｅｒｍ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ：ｔｈｅ  ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ  ｓｗｉｍｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｆｌｏｗ）」−「体外受精および生殖補助（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」から、Ｖ．ＧｏｍｅｌおよびＰ．Ｃ．Ｋ．Ｌｅｕｎｇ編、Ｍｏｎｄｕｚｚｉ  Ｅｄｉｔｏｒｅ，１９９７：第１３〜１５頁）。非運動性の鈍い精子は他の細胞成分とともに下流側に流されて、運動精子から離れる。多くの哺乳動物の子宮内膜の細胞に繊毛が存在することが示されている。繊毛の流れは卵管および子宮の両方において同じ方向に動き、外子宮口に向って延びている。この流れは２つの機能を果たしていると予想され得る。第一に、このフローは精子のガイドとして作用し、正しい運動パラメータを有する精子を卵管のアンプルにて受精の位置に向かわせる。第二に、このフローは受精の位置に達することができる精子の質を最適化する自然の選択メカニズムとして作用する。
【０００５】
（発明の概要）
本発明の目的は、生殖補助技術および処置のために、特にＩＶＦ処置において、１つの容器において精子を前処理（または調製）することができ、且つ、受精をも達成することができるようにするために、精子がフローに逆らって整列するという公知の現象を利用することである。
【０００６】
本発明によれば、卵母細胞（または卵子もしくは卵）の受精のための装置であって、流体培地（または流動性を有する培地もしくは媒体）を保持する第１チャンバー、精液を収容する（または受ける）第２チャンバー、および流体培地が第１チャンバーから流入するようにされた第３チャンバーであって、当該第３チャンバーから流体培地が第２チャンバー内に入るようにされている第３チャンバーを有し、それにより、精子が流体の流れに逆らって移動し、第２チャンバーから第３チャンバーに移動させられて、そこで卵母細胞の受精（または媒精）が起こるようになっているマルチチャンバー・モジュールを含む装置が提供される。
【０００７】
好ましい態様において、第２および第３チャンバーはバリアー手段によって分離されていて、流体は当該バリアーを通過して第３チャンバーから第２チャンバーに流れるようになっており、また、当該バリアーを経由して、精子は第２チャンバーから第３チャンバーに移動するようになっている。
【０００８】
このバリアーは、チャンバーの間に１つまたは複数の通路を含み得る。
【０００９】
モジュールはまた、好ましくは、第１チャンバーから第３チャンバーへの流体のフローの速度を制御する制御手段を含む。
【００１０】
好ましい態様において、第２および第３のチャンバーはカップ形状のコンテナによって規定され、一方が他方の内部にあって、チャンバーは環状のフロー制限バリアーによって分離されており、当該バリアーを経由して流体が流れるようになっている。
【００１１】
好ましくは、モジュールは、廃棄物が例えばフィルター手段を介して第２のチャンバーから流入できる、廃棄物チャンバーを含む。
【００１２】
また、本発明によれば、受精のための精子を前処理する方法であって、第１チャンバーを流体培地で満たすことにより、第１チャンバーから第３チャンバーを経由して第２チャンバーに向かう流体培地のフローをマルチチャンバー・モジュール内に形成すること、卵母細胞（または卵子もしくは卵）を第３チャンバーに添加すること、および精液を第２チャンバーに添加することを含み、それにより運動精子が流体のフローに逆らって第２チャンバーから第３チャンバーに移動させて、卵母細胞に受精させる方法が提供される。
【００１３】
好ましくは、第１チャンバーから第２チャンバーへの流体培地のフローは、安定した状態の流体培地のフローが第３のチャンバーから第２のチャンバーへと進むように制御される。
【００１４】
受精した卵母細胞の培養は、引き続いて第３チャンバー内で行うことができる。
【００１５】
また、本発明によれば、単一のマルチチャンバー・モジュール内で運動精子の分離、および分離した運動精子による卵母細胞の受精を行うことを含む、ＩＶＦ法が提供される。
【００１６】
好ましくは、当該方法は、同じモジュール内で引き続き培養することを含む。
【００１７】
本発明の装置および方法は、常套の方法に対して幾つかの利点を有する。処理は化学薬品の使用も遠心機も必要としないために、本発明は精子にダメージを与えない。前処理プロセスは迅速であって、且つシンプルである。精子の分離プロセスは、直接観察下にあり、容易に制御することができる。モジュールは、実験装置を必要とすることなく、医師により使用され得る。また、本発明のモジュールを使用することは、精子を分離するのに役立つだけでなく、精子を洗い、したがって、いずれの遠心分離プロセスも必要としない。
【００１８】
本発明は、添付した図面を参照して、より詳細に説明される。幾つかの図面を通じて、同じ参照番号は同じ部品を指す。
【００１９】
（好ましい形態の詳細な説明）
図面を参照するに、本発明のマルチチャンバー・モジュールは一般に１０で示される。モジュールは実質的に円筒形状であり、外周壁１２、ベース１４、および上側壁１６を有している。それは好ましくはプラスチック材料から成る。水平方向の分割壁１８が外周壁１２から半径方向に内側に延びており、当該分割壁は、その半径方向（または放射状）の内面にて、上側壁１６に結合している上方向に延びる垂直壁２０として連続する。壁２０の真下に、２４で示されるカップ形状のコンテナの外周壁２２がある。このコンテナ２４は、周縁に沿ってステップの付いたベース２６を有する。コンテナ２４の外周壁２２の上側のエッジは、垂直壁２０の底から、それらの間に円周状のスロットを規定するように、間隔をあけられている。このスロットは、メンブラン・フィルター２８によって塞がれている。フィルターは、１．３〜３．５ミクロンの範囲内にある数値よりも小さい物質だけ、好ましくは３ミクロン未満の物質だけの通過を許容するようなものであることが好ましい。カップ形状のコンテナ２４は、例えば、モジュールのベース１４に設けられた支持部材３０で、モジュール内で支持されている。支持部材３０の内側は、モジュールの外壁１２のポート３２と接続している。
【００２０】
コンテナ２４のベース２６を貫通する開口部３４が、その中央に隣接して形成される。開口部３４はバルブ３５を介して導出ポート３２と連絡している（図２）。導出ポート３２と組み合わされる（または関連させられる）バルブはまた、壁１２、１８および２０および上側壁１６によって規定されるチャンバー３６につながれている。このチャンバー３６は本明細書において、培地チャンバー、即ち、流体培地を保持するチャンバーと称される。
【００２１】
培地チャンバー３６の下に位置し、コンテナ２４のベースの下に延びるチャンバー３８は、本明細書では、廃棄物チャンバーと称される。通気孔（図示せず）が廃棄物チャンバーの外壁１２の上側部分を貫通するように設けられる。
【００２２】
カップ形状のコンテナ２４の内部には、外周壁４２、底壁４４、直立した内壁４６、および貫通した中央開口部５０を有する上側壁４８を有するカップ形状の部材４０が配置されている。カップ形状の部材４０の底壁４４およびコンテナ２４のベース２６は、向かい合う面のいずれか一方にある複数の扇型のリブ（図示せず）（例えば等間隔の４つのリブ）によって、間隔をあけて保持されている。これは、例えば深さが３０ミクロンのオーダーのリブの間で半径方向の通路５１を与える。２つのカップ形状の部材２４、４０をこのように配置することは、本明細書で受精チャンバーと称される、中央の円筒形のチャンバー５２を開口部３４の上方にもたらし、また、壁４２の外側に、本明細書では精液チャンバーと称される外側環状チャンバー５４をもたらす。
【００２３】
上述したように、培地チャンバー３６は、開口部３４を介して受精チャンバー５２と連絡している。培地チャンバー３６と受精チャンバー５２との間の通路は、この通路で略直角に配置されている導出ポート３２と組み合わされたバルブを有し、実質的にＬ字型である。バルブ３５はキャップ５５を有する。通路の水平部分には、その周面に長さ方向に延びるグルーブ５８を有するプラスチック材料のロッド５６が配置されており（図２）、そのグルーブに沿って流体培地はチャンバー３６から開口部３４に移動して、従って、受精チャンバー５２内に移動することができる。ロッドにおけるグルーブ５８は、チャンバー３６からチャンバー５２への流体のフローの速度を制御する作用をする。
【００２４】
本発明のモジュールを使用する方法を説明する。培地チャンバー３６は、シリンジを用いて温かい培地で満たされる。培地は前もって調製して、５％ＣＯ２中で３７℃に十分に平衡させる必要がある。それから、シリンジをバルブ３５に取り付け、吸引力を作用させることによって、チャンバー３６から受精チャンバー５２に向かう培地のフローが開始する。受精チャンバー５２を培地により満たした後で、モジュールを３７℃、５％ＣＯ２にて培養器に配置する。卵胞の吸引時に、卵母細胞が同定され、それは滅菌ピペットを用いて卵胞液および考えられ得る血液の汚染物から取り出される。卵母細胞が開口部５０を経由して受精チャンバー５２内に挿入され、モジュールは培養器に戻される。
【００２５】
精液の液化のために約２０分割り当てられる。精液が液化しない場合には、それは２３ゲージのニードルまたは細いパスツールピペットを通過させる必要がある場合がある。精液は注意深く精液チャンバー５４の周囲に置かれる。モジュールはそれからインキュベータの内部に再度配置される。インキュベーション期間の間、運動精子は毛管流によって流体のフローに逆らって移動する。この流体のフローは、受精チャンバー５２から精液チャンバー５４に向って半径方向の通路５１を経由して、既に開始している（図３）。したがって、運動精子は、受精チャンバーに近づく。このプロセスは、運動精子についてのみ生じる。換言すれば、非運動性の精子はフローの速度に耐えることができず、受精チャンバーに到達できない。オーバーフローする（または溢れる）培地は、精液チャンバーに移動する。メンブラン・フィルター２８の存在に基づいて、精液チャンバーから廃棄物チャンバー３８への漏れは全く無いであろう。精漿だけがメンブラン・フィルター２８を通過する。受精した卵母細胞は、精子を添加してから、約１５〜２０時間後に、受精の検査に付される。この目的のために、卵子は別の皿に移されて、削剥ピペットを用いて卵子から卵丘細胞および冠細胞が取り除かれる。評価の後、受精した卵子はモジュール内でさらに１日続けて培養してよい。
【００２６】
正常な精子は流体のフローに逆らって移動し、バリアーを通過する。このメカニズムは、最も資質のある精子を選択するのに役立ち、流体のフローよりも速く移動することができる精子が受精チャンバー５２に到達するのを許容するのみである。
【００２７】
上述の方法において、連続的なフローに基づいて、廃棄物は連続的に洗い流され、培地の新しいフローが同時に供給される。
【００２８】
精子を前処理する目的は、運動精子を精漿、非運動性の鈍い精子、他の細胞成分およびバクテリアから分離することである。これらの要素はすべて、受精に悪影響を及ぼし得ることが示されてきた。加えて、本発明の方法は、常套の方法と比較して幾つかの利点を有する：
−本発明は精子がフローに逆らって整列する現象を利用する。
−デバイスは、女性の生殖管を通過する精子の移動をまねている。精液チャンバーは膣として作用し、受精チャンバーと精液チャンバーとの間の通路５１は子宮頸として作用し、受精チャンバーは卵管（受精位置）として作用する。
−処理は遠心分離または化学薬品を必要としないため、モジュールは精子にダメージを与えない。
−この方法によれば、分離プロセスとしての精子の前処理は必要でない。
−当該方法は迅速且つシンプルである。
−精子の分離プロセスは、直接観察下にあり、容易に制御することができる。他の方法は、目に見えない（またははっきりしない、もしくは隠される）傾向にあり、プロセスを実施している間、ほとんど又は全く制御されず、精子の質は、プロセスの終わりまで評価できない。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、本発明の受精モジュールの好ましい態様の一部切り欠き断面図である。
【図２】図２は、図１に示すモジュールの流体フロー制御手段の拡大図である。
【図３】図３は、図１に示すモジュールの受精用チャンバーと精液用のチャンバーとの間の通路の拡大図である。
【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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