(57)【要約】分岐ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、コレステロール誘導脂質アンカー、および分岐ＰＥＩおよびコレステロール誘導脂質アンカーと共有結合的に連結する生物分解性リンカーを含む生物分解性、新規カチオンリポポリマー。そのような新規リポリマーの１つの例は、ポリ｛（エチレンイミン）−ｃｏ−［Ｎ−２−アミノエチル）エチレンイミン］−ｃｏ−［Ｎ−（Ｎ−コレステリルオキシカルボニル−（２−アミノエチル））エチレンイミン］｝（”ＰＥＡＣＥ”）である。本発明のカチオンリポポリマーは薬剤送達に使用することができ、局所あるいは全身投与の後に様々な器官および組織へ核酸あるいはいずれかのアニオン生物活性剤を送達するのに特に有用である。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方において、効率的に細胞にトランスフェクションするための本発明のカチオンリポポリマー遺伝子キャリアを調製および使用する方法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
分岐ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、脂質アンカー、および生物分解性リンカーを含む生物分解性非−毒性カチオンリポポリマーであって、生物分解性リンカーが分岐ＰＥＩおよびコレステロール誘導脂質アンカーと共有結合的に連結する、前記カチオンリポポリマー。
【請求項２】
分岐ＰＥＩが６００から２５，０００ダルトンの平均分子量を有する、請求項１のカチオンリポポリマー。
【請求項３】
分岐ＰＥＩ対脂質アンカーのモル比が好ましくは１：１から１：２０の範囲内にある、請求項１のカチオンリポポリマー。
【請求項４】
生物分解性リンカーがエステル結合である、請求項１のカチオンリポポリマー。
【請求項５】
脂質アンカーがコレステロール、Ｃ１２からＣ１８までの脂肪酸あるいは脂肪酸誘導体である、請求項１のカチオンリポポリマー。
【請求項６】
カチオンリポポリマーポリ｛（エチレンイミン）−ｃｏ−［Ｎ−２−アミノエチル）エチレンイミン］−ｃｏ−［Ｎ−（Ｎ−コレステリルオキシカルボニル−（２−アミノエチル））エチレンイミン］｝（”ＰＥＡＣＥ”）。
【請求項７】
分岐ＰＥＩの少なくとも１つの第１級アミンが０．５から２０Ｋダルトンの間の分子量を有するポリアルキレングリコールでグラフト化されており、そしてカチオン脂質が少なくとも５０％の非置換の遊離アミノ官能基を含有する、請求項１のカチオンリポポリマー。
【請求項８】
トランスフェリン、アシアロ糖タンパク、抗体、抗体フラグメント、低密度リポタンパク質、インターロイキン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、幹細胞因子、エリスロポエチン、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、アシアロオロソムコイド、マンノース−６−リン酸、マンノース、ＬｅｗｉｓＸおよびシリアルＬｅｗｉｓＸ、Ｎ−アセチルラクトサミン、ガラクトース、ラクトース、およびトロンボモジュリン、ポリミキシンＢおよびヘマグルチニンＨＡ２などの融合誘導因子、リソソーム刺激性因子（ｌｙｓｏｓｏｍｏｔｒｏｐｈｉｃ ａｇｅｎｔ）、および核局在シグナル（ｎｕｃｌｅｕｓ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）（ＮＬＳ）から成る群から選択される標的部分をさらに含む、請求項１のカチオンリポポリマー。
【請求項９】
標的部分がガラクトースあるいはラクトースである、請求項８のカチオンリポポリマー。
【請求項１０】
生物活性剤および請求項１から９のいずれか１つの生物分解性、非−毒性カチオンリポポリマーを含む、医薬的組成物。
【請求項１１】
前記の生物活性剤が核酸、タンパク質あるいはアニオン薬剤である、請求項１０の組成物。
【請求項１２】
カチオンリポポリマー対核酸の電荷比（＋／−）が５：１から１：１の範囲内にある、請求項１０の組成物。
【請求項１３】
ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、オレオイルパルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン（ジフェタノイルＰＥ）、ジエステロイル−、−パルミトイル−、−ミリストイルホスファチジルエタノールアミンおよびそれらの１−から３−重（ｆｏｌｄ）Ｎ−メチル化誘導体から成る群から選択される補助脂質をさらに含む、請求項１０の組成物。
【請求項１４】
カチオンリポポリマー対補助脂質の電荷比が４：１から１：２の範囲内にある、請求項１３の組成物。
【請求項１５】
動物に対して請求項１０から１４のいずれか１つの効果的な量の組成物を投与することを含む、温血動物内へ生物活性剤を送達する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は生物活性剤の送達に関する。さらに具体的には、本発明はＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、および薬剤などの生物活性剤を、それらの経膜的輸送を容易にすることおよび生物学的表面へのそれらの接着を亢進させることにより、送達するための組成物および方法に関する。それは特に、分岐ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、コレステロール誘導脂質アンカー、および分岐ＰＥＩおよびコレステロール誘導脂質アンカーに共有結合的に結合する生物分解性リンカーを含む新規カチオンリポポリマーに関する。そのような新規リポリマー（ｌｉｐｏｌｙｍｅｒ）の１つの例は、ポリ｛（エチレンイミン）−ｃｏ−［Ｎ−２−アミノエチル）エチレンイミン］−ｃｏ−［Ｎ−（Ｎ−コレステリルオキシカルボニル−（２−アミノエチル））エチレンイミン］｝（以下“ＰＥＡＣＥ”として言及される）である。本発明のカチオンリポポリマーは薬剤送達に使用することができ、特に核酸あるいはいずれかのアニオン生物活性剤の送達に有用である。
【０００２】
発明の背景
遺伝子治療は一般的に、遺伝子欠損を有する疾患の治療のためだけでなく、癌、心臓血管疾患および慢性関節リウマチなどの慢性疾患の治療および予防のためのストラテジーの開発においても有望なアプローチとして考えられている。しかし、核酸ならびに他のポリアニオン（ｐｏｌｙａｎｉｏｎｉｃ）物質は水溶液中に供給されるとヌクレアーゼにより急速に分解され、細胞取り込みの減弱を示す。１９５０年代中期の組織培養細胞における核酸の送達の方法を同定する初期の努力以来、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおける機能的なＤＮＡ、ＲＮＡ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドの送達を改善する方向への確実な進歩が行われた。
【０００３】
これまで使用された遺伝子キャリアには、ウイルス系（レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、あるいは単純ヘルペスウイルス）あるいは非ウイルス系（リポソーム、ポリマー、ペプチド、リン酸カルシウム沈澱およびエレクトロポレーション）が含まれる。ウイルスベクターは、非ウイルスベクターと比較すると高いトランスフェクション効率を有することを示すが、しかし分裂細胞のみを標的とすること、ランダムなＤＮＡ挿入、大きなサイズの治療遺伝子を運ぶそれらの容量が低いこと、複製の危険性、および可能性のある宿主免疫反応などのいくつかの障害ため、それらのｉｎ ｖｉｖｏでの使用は厳しく制限される。
【０００４】
ウイルスベクターと比較すると、非ウイルスベクターは容易に作成され、免疫反応の産生はより低いようであり、要求される複製反応もない。ポリカチオン（ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎｉｃ）ポリマーあるいはカチオン脂質のいずれかである安全および効率の良い非ウイルス遺伝子運搬ベクターの開発に焦点をあてる注目が増加している。ＤＮＡと相互作用してポリイオン（ｐｏｌｙｉｏｎｉｃ）複合体を形成するポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−オルニチンあるいはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのポリカチオンポリマーは、遺伝子送達での使用のために導入された。様々なカチオン脂質もＤＮＡと脂質複合体（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）を形成して、様々な真核細胞の効率的なトランスフェクションを誘導することが示された。そのような種類の合成ベクターの間では、カチオン脂質はトランスフェクション効率、生物分解性および低毒素性の点で優れている多くの誘導体を設計および合成できるため、広く使用されている。多くの様々なカチオン脂質が商業的に入手可能であり、いくつかの脂質は既に臨床現場で使用されている。それらの中で、カチオンコレステロール誘導体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの高いトランスフェクション効率のため非常に有用であることが知られている。このトランスフェクション活性の機序はまだ明らかでないが、それはおそらくＤＮＡ／脂質複合体と複合体上での過剰な正電荷を介した細胞表面との結合を含む。細胞表面結合複合体はおそらく吸収され、ＤＮＡはエンドサイティックコンパートメント（ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）から細胞の細胞質内へ放出される。
【０００５】
しかし、ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション技術をｉｎ ｖｉｖｏ適用に直接的に拡張することは実行できない。ｉｎ ｖｉｖｏ使用に関連して、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）あるいはリポフェクチンなどのジエーテル脂質の最も大きな障害は、それらが体の自然代謝産物ではなく、したがって生物分解性ではなく、それらは細胞に対して有毒であることである。加えて、カチオン脂質トランスフェクションは血清中に存在する因子により阻害され、従ってｉｎ ｖｉｖｏでの細胞内への遺伝子物質の導入にとっては非効率的な手段であることが報告された。
【０００６】
理想的なトランスフェクション試薬は、細胞あるいは組織のいかなる機械的あるいは物理的な操作も必要とせずに高レベルのトランスフェクション活性を示すべきである。試薬は効果的な容量で非毒性であるか、あるいは毒性が最小限であるべきである。治療細胞に対するいかなる長期間の副作用を避けるために、それは生物分解性でもあるべきである。遺伝子キャリアをｉｎ ｖｉｖｏで核酸の送達に使用するとき、遺伝子キャリア自体が非毒性であり、およびそれらが非毒性産物に分解されることが必要である。未処理の遺伝子キャリアおよびその分解産物の毒性を最小にするために、遺伝子キャリアの設計は自然に発生する代謝産物に基づく必要がある。
【０００７】
Ｅｘｐａｎｄらに対する米国特許５，２８３，１８５（以下では‘１８５特許）は、適切なキャリア溶媒中で共脂質（ｃｏ−ｌｉｐｉｄ）を用いて、カチオン脂質３β［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−コレステロール）の混成脂質拡散を調製することを含む、細胞内への核酸の輸送を容易にする方法を開示する。’１８５特許で開示される方法は、リポソーム懸濁液の調製におけるハロゲン化溶媒の使用を含む。医薬的な適用のために、ハロゲン化溶媒の残余は導入後は調製物から実際には除去できない。米国特許５，７５３，２６２（以下では‘２６２特許）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの効果的なトランスフェクションを産生するために、脂質３β［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−コレステロール）の酸性塩、およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）あるいはジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）などの補助脂質（ｈｅｌｐｅｒ ｌｉｐｉｄ）を使用することを開示する。加えて、これらのカチオン脂質はｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子輸送では効率がより低いことが証明された。
【０００８】
ナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）は、それらが細胞以下（ｓｕｂ−ｃｅｌｌｕｌａｒ）のサイズのため、界面細胞取り込みを亢進し、それゆえ本当の意味での“局所的な薬理学的薬剤効果”を達成すると仮定されている。また、対応する遊離薬剤と比べると、（エンドサイトーシスのため）ナノ粒子に含有される薬剤の細胞取り込みは亢進されるであろうと仮定されてもいる。ナノ粒子は、癌療法での治療剤の腫瘍局在のための、細胞内標的化（抗ウイルスあるいは抗細菌剤）のための、細網内皮系に対する標的化（寄生虫感染）のための、（経口および皮下的経路による）免疫学的アジュバントとして、持続的薬剤作用を有する眼送達のための、および長期全身性薬剤療法のための薬剤キャリア系として調べられた。
【０００９】
以上のことから、遺伝子治療および薬剤送達のために非毒性、生物分解性で、およびナノ粒子、リポソーム、あるいはミセルを形成できる遺伝子キャリアを提供することが所望されることは評価されるであろう。本発明の新規遺伝子キャリアは、分岐ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、コレステロール誘導脂質アンカー、および分岐ＰＥＩおよびコレステロール誘導脂質アンカーと共有結合する生物分解性リンカーを含む新規カチオン性リポポリマーを含む。本発明のリポリマーは、薬剤送達、特に核酸の送達のためのカチオンリポソーム、あるいはカチオンミセル、他のアニオン生物活性分子あるいは両方の調製のために有用であり、細胞内への混和の後の代謝性分解を容易に受けやすくする。
【００１０】
発明の概要
本発明は、薬剤あるいは他の生物活性剤をそれを必要とする個体へ送達するため、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでの毒性を減少させた、生物分解性カチオンリポポリマーを提供する。
【００１１】
本発明はまた、細胞内へのより効果的なＤＮＡおよびＲＮＡなどのポリヌクレオチドの安定的かつ一過的なトランスフェクションを実行する核酸の送達のためのカチオンリポポリマーも提供する。
【００１２】
本発明の生物分解性、非毒素性カチオンリポポリマーは、分岐ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、コレステロール誘導脂質アンカー、および分岐ＰＥＩおよびコレステロール誘導脂質アンカーに共有結合的に結合する生物分解性リンカーを含む。好ましくは、分岐ＰＥＩの平均分子量は６００から２５，０００ダルトンの範囲内である。好ましくは、分岐ＰＥＩはエステル結合によりコレステロール誘導体と共役する。好ましくは、分岐ＰＥＩ対共役コレステロール誘導体のモル比は１：１から１：２０の範囲内である。
【００１３】
分岐ＰＥＩの分子量および分岐ＰＥＩ対共役コレステロール誘導体のモル比を調節することにより、得られたリポリマーは水溶性あるいは不溶性のいずれかとなりうる。例えば、水溶性リポポリマーを得るためには、分岐ＰＥＩの平均分子量は好ましくは１８００から２５，０００の範囲内であり、分岐ＰＥＩ対共役コレステロール誘導体のモル比は好ましくは１：１から１：５の範囲内である。不溶性リポポリマーを得るためには、分岐ＰＥＩの平均分子量は好ましくは６００から１８００の範囲内であり、分岐ＰＥＩ対共役コレステロール誘導体のモル比は好ましくは１：１から１：２の範囲内である。コレステロール誘導脂質アンカーは本発明において好ましいが、Ｃ１２からＣ１８飽和脂肪酸あるいは不飽和脂肪酸などの他の脂質親和性部分も使用されうる。
【００１４】
生物分解性リポポリマーは、比較的簡単および安価な方法で合成できる。これらのカチオンリポポリマーの発明は、核酸と共に分離したナノメーターサイズの粒子を自発的に形成することができ、それは従来リポフェクチンおよびポリエチレンイミンを用いて達成することができる以上に、哺乳類細胞株内において、より効率的な遺伝子トランスフェクションを促進することができる。本発明のリポポリマーは、動物細胞内への混和の後の代謝性分解を容易に受けやすくする。さらに、水溶性カチオンリポポリマーは、ＤＮＡ、タンパク質、疎水性あるいは親水性薬剤などの様々な生物活性剤の全身的な送達に特に有用な水性ミセル溶液を形成することができる。水不溶性リポポリマーは、局所的な薬剤送達に特に有用な補助剤（ｈｅｌｐｅｒ）と共にカチオンリポソームを形成することができる。従って、本発明の生物学的適合性および生物分解性カチオンリポポリマーは、哺乳類細胞のトランスフェクションのための、および遺伝子治療のｉｎ ｖｉｖｏでの適用のための一般的な試薬として使用するために改善された遺伝子キャリアを提供する。
【００１５】
本発明はさらに、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでのトランスフェクションにとって最も効果的な適した電荷比（リポポリマーの正電荷／核酸の負電荷）において、選択された核酸と複合体を形成する、新規カチオンリポポリマーを含むトランスフェクション製剤を提供する。特に、全身的な送達のためには、電荷比（＋／−）は好ましくは５／１から１／１である；局所的な送達のためには、電荷比（＋／−）は好ましくは３／１から０．５／１である。
【００１６】
本発明はまた、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの両方にて、哺乳類細胞に核酸をトランスフェクションする方法も提供する。方法は、上記したようにカチオンリポポリマーあるいはリポソーム：核酸複合体と細胞を接触させることを含む。一つの態様において、方法はカチオンリポポリマーあるいはリポソーム：核酸複合体を温血動物内へ全身的に投与することを利用する。好ましい態様において、トランスフェクションする方法は、カチオンリポポリマーあるいはリポソーム：核酸複合体の温血動物内へ静脈内投与することを利用する。特に好ましい態様において、方法は水溶性ＰＥＡＣＥ／ｐＤＮＡおよびＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥリポソーム／ｐＤＮＡ複合体を温血動物内へ静脈内注射することを含む。
【００１７】
発明の詳細な説明
生物活性剤の送達のための本組成物および方法を開示および記載する前に、本発明は、ここで開示される特定の構成、プロセスステップ、および物質に限定されず、そのような構成、プロセスステップ、および物質はいくらか変更するもしれないことを理解されるべきである。また、本発明の範囲は添付される請求項およびそれと均等なものによってのみ限定されるため、ここで用いられる用語は特定の態様のみを記載する目的で使用され、限定する意図はないことも理解されるべきである。
【００１８】
本明細書および添付される請求項で使用されるように、単数形“ａ”、“ａｎ”、および“ｔｈｅ”は、文脈で明らかにそうでないことを指示されないならば、複数の対象を含むことに注意しなければならない。このように、例えば、“糖”を含有するポリマーへの言及は２つあるいはそれ以上のそのような糖への言及を含み、“リガンド”への言及は１つあるいはそれ以上のそのようなリガンドへの言及を含み、“薬剤”への言及は２つあるいはそれ以上のそのような薬剤への言及を含む。
【００１９】
本発明を記載および請求項に記載する際に、次の用語は以下に設定される定義に従って使用されるであろう。
“トランスフェクションする”あるいは“トランスフェクション”は、特に細胞質および／または細胞核に関して、細胞の外の環境から内的な細胞環境への核酸の運搬を意味するべきである。いずれの特定の理論にも縛られずに、核酸は形態において、あるいはカプセル内に包まれた後、あるいは１つあるいはそれ以上のカチオン脂質／核酸複合体への付着後、あるいはそれとともに浮遊させて運ばれた後のいずれかで、細胞へ送達されうることが理解される。特定のトランスフェクションする事例は、核酸を細胞核へ送達する。核酸はＤＮＡおよびＲＮＡの両方ならびにその合成同種物を含む。そのような核酸には、ミスセンス、アンチセンス、ナンセンス、ならびにタンパク質産生ヌクレオチド、タンパク質およびペプチドおよび核酸産生を調節するオンおよびオフおよび速度制御ヌクレオチドが含まれる。特に、限定はしないが、それらはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ハイブリッド配列あるいは合成あるいは半合成配列および天然あるいは人工起源のものが含まれうる。加えて、核酸はサイズは様々であり、オリゴヌクレオチドから染色体までの範囲でありうる。これらの核酸は、ヒト、動物、植物、細菌、ウィルスなどの、起源のものでありうる。それらは当業者に知られるいずれかの技術により得ることができる。
【００２０】
ここで使用されるように、用語“生物活性剤”あるいは“薬剤”あるいはいずれかの同様な用語は、所望される生物学的あるいは薬理学的効果を誘導する既に当該技術分野で知られる方法および／または本発明において教示される方法による投与に適した、いずれかの化学的あるいは生物学的物質あるいは化合物を意味し、それは（１）生物に予防的な効果を有することおよび感染の抑制などの所望されない生物学的効果を抑制すること、（２）疾患により引き起こされる状態を軽減すること、例えば疾患の結果として引き起こされる疼痛あるいは炎症を軽減すること、および／または（３）生物から疾患を軽減すること、減弱すること、あるいは完全に除去することのいずれかを含むが、それらには限定されなくてもよい。効果は、局所麻酔効果を提供するなどの局所的であってもよく、あるいはそれは全身的であってもよい。
【００２１】
本発明は、新規薬剤あるいは新たなクラスの生物活性剤を引き出さない。むしろ、本発明は、技術水準に存在するかあるいは後に活性剤として確立しうる、および本発明による送達に適している遺伝子あるいは他の生物活性剤の送達の組成物および方法に限定される。そのような物質には、通常体内に送達される広範なクラスの化合物が含まれる。一般的に、これには：ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびオリゴヌクレオチドなどの核酸；抗生物質および抗ウイルス剤などの抗感染薬；鎮痛剤および鎮痛剤コンビネーション；拒食症薬；抗寄生虫薬；抗関節炎薬；抗喘息剤；抗痙攣薬；抗うつ薬；抗糖尿病剤；止痢薬；抗ヒスタミン薬；抗炎症剤；抗片頭痛調製薬；制嘔吐剤；抗新生物薬；抗パーキンソン病剤；止痒剤；抗精神病薬；解熱剤；鎮痙薬；抗コリン薬；交感神経様作用薬；キサンチン誘導体；カリウム、カルシウムチャネルブロッカー、ベータ−ブロッカー、アルファ−ブロッカー、および抗不整脈薬を含む心臓血管製剤；抗高血圧薬；利尿薬および抗利尿薬；一般的、冠動脈、末梢性および脳を含む血管拡張薬；中枢神経刺激薬；血管収縮薬；鬱血除去薬を含む、咳嗽および風邪製剤；エストラジオールおよび副腎皮質ステロイドを含む他のステロイドを含むホルモン；睡眠薬；免疫抑制剤；筋弛緩薬；副交感神経遮断薬；精神刺激薬；鎮痛剤；および精神安定剤が含まれるが、それらには限定されない。本発明の方法により、あらゆる形態での薬剤、例えば、イオン化、非イオン化、遊離塩基、酸付加塩などは高分子量あるいは低分子量の薬剤で送達されるように、送達されうる。
【００２２】
ここで使用されるように、“効果的な量”は非毒性だが、しかしいずれの医学的治療に伴うであろう妥当な危険／利益比で、所望される局所的あるいは全身的効果および性能を十分に提供する核酸あるいは生物活性剤の量を意味する。
【００２３】
ここで使用されるように、“ペプチド”はいずれかの長さのペプチドを意味し、タンパク質を含む。用語“ポリペプチド”および“オリゴヌクレオチド”は、そうではないと特定のサイズが述べられなければ、いずれの特定の対象とするサイズの限定なくここで使用される。利用されうる典型的なペプチドは、オキシトシン、バソプレッシン、副腎皮質刺激ホルモン、上皮成長因子、プロラクチン、ルリベリンあるいは黄体形成ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン、インターフェロン、ガストリン、テトラガストリン、ペンタガストリン、ウロガストリン、セクレチン、カルシトニン、エンケファリン、エンドルフィン、アンギオテンシン、レニン、ブラジキニン、バシトラシン、ポリミキシン、コリスチン、チロシジン、グラミシジン、および合成類似体、修飾物および薬理学的に活性のあるそのフラグメント、モノクローナル抗体および可溶性ワクチンから成る群から選択されるものである。利用されうるペプチドあるいはタンパク質薬剤に対する唯一の限定は機能性のものである。
【００２４】
ここで使用されるように、炭水化物の“誘導体”には、例えば糖の酸性形態、例えばグルクロン酸；糖のアミン、例えばガラクトサミン；糖のリン酸塩、例えばマンノース−６−リン酸；などが含まれる。
【００２５】
ここで使用されるように、“リポソーム”は、水性コンパートメントを取り囲む単一ラメラあるいは複数ラメラの１または複数の二重膜（ｕｎｉ−ｏｒ ｍｕｌｔｉｌａｍｌｌａｒ ｂｉｌａｙｅｒ ｏｒ ｂｉｌａｙｅｒｓ）から成る顕微鏡的小胞を意味する。
【００２６】
ここで使用されるように、“投与”、および類似用語は、組成物が全身的に循環され、組成物が標的細胞と結合してエンドサイトーシスにより取り込まれるように、治療される個体へ組成物を送達することを意味する。このように、組成物は好ましくは、典型的には皮下、筋内、静脈内、あるいは腹腔内投与により全身的に個人に投与される。そのような使用のための注射可能物質は、液体溶液あるいは懸濁液のいずれかとしての従来の形態、あるいは注射前に液体中で溶液あるいは懸濁液としてあるいはエマルジョンとして調製するために適している固形で調製することができる。適した補形薬には、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどが含まれる；およびもし所望するなら、湿潤剤あるいは乳化剤、緩衝剤などのような少量の補助物質を加えることが可能である。
【００２７】
遺伝子治療の成功の基本は、全身的投与の後の安全性および有効性を有する遺伝子送達ビヒクルの開発である。Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）および３−β（Ｎ，Ｎ’’−ジメチルアミノエタンカルバモイルコレステロール）（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）などの早期の臨床試験にて使用された多くのカチオン脂質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは効率的な遺伝子運搬を示すが、動物での遺伝子運搬では効率が低下することが証明されている。Ｆｅｌｇｎｅｒ ＰＬ ｅｔ．ａｌ Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ： Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ， ｌｉｐｉｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４： ７４１３−７４１７ （１９８７）；およびＧａｏ， Ｘ． ａｎｄ Ｈｕａｎｇ Ｌ． （１９９１） Ａ ｎｏｖｅｌ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １７９：２８０−２８５参照。
【００２８】
カチオン脂質の一般的な構造は３つの部分を有する：（ｉ）リポソーム（あるいはミセル構造）の形成を補助しおよび細胞膜と相互作用をする、疎水性脂質アンカー；（ｉｉ）リンカー基；および（ｉｉｉ）プラスミドと相互作用してその凝集を導く、正電荷頭部基（ｈｅａｄ−ｇｒｏｕｐ）。単一の第３あるいは第４アンモニウム頭部基のいずれかをもつ、あるいはジアルキル脂質あるいはコレステロールアンカーに連結するプロトンを付加することができる（ｐｒｏｔｏｎａｔａｂｌｅ）ポリアミンを含有する多くの化合物が、様々な細胞型内へのトランスフェクションのために使用された。脂質アンカーと関連してポリアミン頭部基の方向は、トランスフェクション効率に大きく影響することが示された。Ｔ−形状カチオン脂質を生成するための第２アミンを通したカルバメート結合を介するコレステロール脂質アンカーとスペルミンあるいはスペルミジンの共役は、肺への遺伝子運搬に非常に効果的であることが示された。対して、コレステロールあるいはジアルキル脂質アンカーとスペルミンあるいはスペルミジンの共役による線形ポリアミン脂質の生成は、遺伝子運搬における効果がかなり低かった。
【００２９】
頭部基にプロトンを付加することができる３つのアミンを含有するカチオン脂質は、プロトンを付加することができる１つのアミンのみを含有するＤＣ−コレステロールよりも活性が高いことが示された。プロトンを付加することができるアミンの数に加えて、カチオン頭部基を有する疎水性脂質アンカーを架橋するリンカー基の選択も、遺伝子運搬活性に影響を与えることが示された。カルバメートリンカーと尿素、アミドあるいはアミンのいずれかとの置換は、トランスフェクション活性の感知できる程度の損失を引き起こした。ＰＥＩは遺伝子運搬に高い効果を示し、それはその分子量および電荷比に依存する。しかし、高分子量ＰＥＩは細胞および組織に対してとても有毒である。
【００３０】
本発明の生物分解性カチオンリポポリマーは、分岐ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、コレステロール誘導脂質アンカー、および分岐ＰＥＩおよびコレステロール誘導脂質アンカーに共有結合的に結合する生物分解性リンカーを含む。好ましくは、分岐ＰＥＩの平均分子量は６００から２５，０００ダルトンの範囲内である。分岐ＰＥＩは好ましくは、エステル結合によりコレステロール誘導体と共役する。そのような新規リポリマーの１つの例は、ポリ｛（エチレンイミン）−ｃｏ−［Ｎ−２−アミノエチル）エチレンイミン］−ｃｏ−［Ｎ−（Ｎ−コレステリルオキシカルボニル−（２−アミノエチル））エチレンイミン］｝（以下“ＰＥＡＣＥ”とする）である。ＰＥＡＣＥ中に含有されるＰＥＩの第１級、第２級および第３級アミンは、適したＤＮＡ濃縮に十分な正電荷を提供する。極性頭部基および疎水性脂質アンカーの間の結合は生物分解性であるが、生物学的環境で残存するには十分な強さである。コレステロール脂質アンカーおよびポリエチレンイミンの間のエステル結合はリポリマーの生物分解性を提供し、そして比較的低分子量の分岐ＰＥＩはリポポリマーの毒性を著しく減少させる。コレステロール誘導脂質アンカーは本発明では好まれるが、Ｃ１２からＣ１８までの飽和あるいは不飽和脂肪酸などの他の脂質親和性部分も使用されうる。
【００３１】
ＰＥＡＣＥなどの本発明の生物分解性カチオンリポポリマーは、核酸などのポリアニオン化合物に静電気的に引きつけられる１または複数のアミン基を有している。本発明のカチオンリポポリマーあるいはカチオンリポソームは、例えば小型の構造物の中でＤＮＡを濃縮する。これらのカチオンリポポリマーおよび核酸のそのような複合体は、投与と同時に、受容体媒介エンドサイトーシスを通して内在化される。加えて、リポポリマーあるいはリポソームの脂肪親和性基は、細胞の膜あるいはリポソーム内へのカチオン両親媒性化合物の挿入を可能にし、そしてカチオンアミン基のアンカーとして働き細胞の表面に接着する。本発明のリポポリマーは、（１または複数の）高い正電荷基および（１または複数の）疎水基の両方を有しており、それは遺伝子、薬剤、および他の生物活性剤の送達において細胞取り込みおよび組織取り込みを大きく亢進する。さらに、比較的低分子量の分岐ＰＥＩを使用することにより、ポリマーの潜在的な細胞毒性が減少し、トランスフェクション効率が増加する。
【００３２】
分岐ＰＥＩ上のアミン基も、直接アミン基と、あるいは標的リガンド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのリンカーなどを用いて、スペーサー分子を介してのいずれかで共役することができる。ＰＥＧは、接着する分子の免疫原性を抑制することが知られているＦＤＡ−承認ポリマーである。好ましくは、一部の有用なアミン基のみがリガンドあるいはスペーサ／リガンドにカップリングされて、そのためリポポリマーの正味の電荷は正である。好ましくは、ＰＥＧの平均分子量は０．５から２０Ｋダルトンの範囲内であり、そしてさらに好ましくは０．５から５Ｋダルトンの範囲内である。
【００３３】
リポポリマーと共役する標的リガンドは、リポポリマー−核酸／薬剤複合体を、特異的な標的細胞に結合させ、そしてそのような細胞（腫瘍細胞、肝細胞、造血細胞など）内に浸透させる。標的リガンドはまた細胞間標的エレメントでもよく、核酸／薬剤の運搬はある好ましい細胞コンパートメント（ミトコンドリア、核など）に向かって導かれることができる。好ましい態様において、リガンドはアミノ基とカップリングする糖部分でもよい。そのような糖部分は好ましくは、ガラクトース、グルコース、フコース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マンノース、セロビオース、ニトロース、トリオース、デキストロース、トレハロース、マルトース、ガラクトサミン、グルコサミン、ガラクツロン酸、グルクロン酸、およびグルコン酸などのモノ−あるいはオリゴ−糖である。
【００３４】
カチオン脂質を有する糖の酸性誘導体の共役は最も好ましい。本発明の好ましい態様において、ラクトバイオニック酸（ｌａｃｔｏｂｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−グルコン酸）はリポポリマーとカップリングする。ラクトースのガラクトシル単位は肝細胞に都合のよい標的分子を提供するが、それはこれらの細胞上のガラクトース受容体の高い親和性および結合活性（ａｖｉｄｉｔｙ）のためである。
【００３５】
使用できるリガンドの他の型には、抗体あるいは抗体フラグメント、細胞受容体、成長因子受容体、サイトカイン受容体、トランスフェリン、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、アシアロオロソムコイド、マンノース−６−リン酸（単球）、マンノース（マクロファージ、いくつかのＢ細胞）、ＬｅｗｉｓＸおよびシリアルＬｅｗｉｓＸ （内皮細胞）、Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｔ細胞）、ガラクトース（結腸癌細胞）、およびトロンボモジュリン（マウス肺内皮細胞）、ポリミキシンＢおよびヘマグルチニンＨＡ２などの融合誘導因子、リソソーム刺激性因子（ｌｙｓｏｓｏｍｏｔｒｏｐｈｉｃ ａｇｅｎｔ）、Ｔ−抗原などの核局在シグナル（ｎｕｃｌｅｕｓ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）（ＮＬＳ）などのペプチドが含まれる。
【００３６】
本発明の利点は、粒子サイズおよび電荷密度が容易に調節される遺伝子キャリアを提供することである。粒子サイズはトランスフェクション効率、細胞毒性、およびｉｎ ｖｉｖｏで標的となる組織をしばしば決定するため、粒子サイズの調節は遺伝子送達系の最適化にとって重要である。一般的に、組織内への遺伝子送達粒子の効果的な浸透を可能にするためには、遺伝子送達粒子のサイズはウイルスのサイズを超えるべきではない。本発明では、粒子サイズはコレステロールに連結する様々な数のリジンアミドを使用することにより変えることができ、それは逆にその核酸複合体の粒子サイズを決定する。
【００３７】
本発明の好ましい態様において、粒子サイズはカチオンリポポリマー組成物および成分の混合比に依存して約８０から２００ ｎｍの範囲であろう。注射時の様々なサイズの粒子、ナノスフェア、およびミクロスフェアは、注射される粒子のサイズに依存して体の様々な器官に蓄積することが知られている。例えば、直径１５０ ｎｍ未満の粒子は肝臓の内皮の洞様フェネストレーション（ｆｅｎｅｓｔｒａｔｉｏｎ）を通過することができ、全身的投与後には脾臓、骨髄、およびことによると腫瘍組織に局在することができる。直径およそ０．１から２．０μｍの粒子の静脈内、動脈内、あるいは腹腔内注射は、細網内皮系のマクロファージによる血流からの粒子の早急なクリアランスを導く。本発明の新規カチオンリポポリマーを使用して、調節された粒子サイズの分散をつくることができ、それはここに記載する様式にて器官を標的とすることができる。
【００３８】
現在請求の範囲に記載されている組成物は、肝細胞の表面上のガラクトシル受容体により媒介される肝細胞内へのエンドサイトーシスによる選択された核酸の送達に効果的である、と信じられている。他の細胞への核酸の運搬は、その選択された受容体を有する細胞と選択された糖の適合により実行されうる。例えば、本発明の炭水化物−共役カチオン脂質は、マクロファージをトランスフェクションするためのマンノース、Ｔ細胞をトランスフェクションするためのＮ−アセチルラクトサミン、および結腸癌細胞をトランスフェクションするためのガラクトースから調製することができる。
【００３９】
本発明のカチオンリポポリマーは、生物分解性および両親媒性である高い正電荷を持つカチオン脂質、すなわち親水性分岐ＰＥＩおよび疎水性コレステロール誘導体を提供し、そこでは親水性ポリカチオンＰＥＩは負電荷を持つ核酸あるいは他の生物活性剤と複合体を形成し、および薬剤−ローデット（ｌｏａｄｅｄ）カチオン脂質の細胞取り込みを増加させる。親水基は分岐ＰＥＩであってもよく、その場合には分岐ＰＥＩの平均分子量が６００から２５，０００ダルトンの範囲内である。疎水基は好ましくはコレステロールあるいはその誘導体である。好ましくは、分岐ＰＥＩはエステル結合によりコレステロール誘導体と共役する。好ましくは、分岐ＰＥＩ対共役コレステロール誘導体のモル比は１：１から１：２０の範囲内である。
【００４０】
分岐ＰＥＩの分子量および分岐ＰＥＩ対共役コレステロール誘導体のモル比を調整することにより、得られたリポリマーは水溶性あるいは水不溶性のいずれかとなりうる。例えば、本発明の水溶性リポポリマーを得るためには、分岐ＰＥＩの平均分子量は好ましくは１８００から２５，０００の範囲内であり、分岐ＰＥＩ対共役コレステロール誘導体のモル比は好ましくは１：１から１：５の範囲内である。本発明の不溶性リポポリマーを得るためには、分岐ＰＥＩの平均分子量は好ましくは６００から１８００の範囲内であり、分岐ＰＥＩ対共役コレステロール誘導体のモル比は好ましくは１：１から１：２の範囲内である。
【００４１】
水溶性カチオンリポポリマーは水中で分散可能でありカチオンミセルを形成して、そしてそれにより、それを使用して高温あるいは極端なｐＨの使用を必要とすることなく、ポリペプチドおよびオリゴヌクレオチドなどの水溶性薬剤については形成中に有機溶剤への薬剤の暴露を必要とすることなく、持続的な薬剤放出製剤をつくることができる。そのような生物分解性カチオンリポポリマーはまた、薬剤の持続的な連続放出注射可能形式の製作にとっても有用である。それらは非常に効率的な分散剤として作用でき、そして注射により投与することで脂肪親和性薬剤の持続的な放出を与えることができる。
【００４２】
さらに、本発明の水不溶性リポポリマーは単独で、あるいは好ましくは、補助脂質と組み合わせて、ヒトあるいは動物の体の特定の器官への遺伝子送達のためのカチオンリポソーム製剤の形態にて使用されうる。中性の補助脂質の使用は、電荷比（アミン／リン酸）が低いときに特に有利である。好ましくは、補助脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、オレオイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン（ジフェタノイルＰＥ）、ジエステロイル−、−パルミトイル−、および−ミリストイルホスファチジルエタノールアミンならびにそれらの１−あるいは３−重（ｆｏｌｄ）Ｎ−メチル化誘導体から成る群から選択される構成員である。好ましくは、リポポリマーおよび補助脂質のモル比は４：１から１：２までの範囲内であり、そしてさらに好ましくは２：１から１：１までの範囲内である。本組成物のトランスフェクション効率を最適にするために、補形薬として水および補助脂質としてジフィタノイルＰＥを使用するのが好ましい。さらに、電荷比（＋／−）は好ましくは、全身的送達に関しては５／１から１／１および局所的送達に関しては３／１から０．５／１である。この比率は、使用するポリマー、アジュバントの存在、核酸、標的細胞および使用する投与の様式に従って当業者により変えられることもある。
【００４３】
リポソームは、他の手順によるトランスフェクションに通常は抵抗性である多くの細胞型でうまく使用された。リポソームは、遺伝子、薬剤、放射線療法剤、酵素、ウイルス、転写因子、およびアロステリックエフェクターを様々な培養細胞株および動物に導入するために、効果的に使用された。さらに、いくつかの研究により、リポソームの使用は全身的送達の後の自己免疫反応、毒性あるいは生殖腺局在化に関連しないことが示唆される。Ｎａｂｅｌ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｗｉｔｈ ＤＮＡ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ３：６４９−６５６，１９９２ｂ参照。
【００４４】
カチオンリポソームおよびミセルは、核酸以外の物質の細胞内送達に関して良いことが知られているため、本発明のカチオンリポポリマーにより形成されるカチオンリポソームあるいはミセルは、核酸以外、例えば、タンパク質および様々な医薬的薬剤あるいは生物活性剤などの物質の細胞送達に使用されることができる。それゆえ、本発明は、治療が細胞内への物質の運搬を含む限り、様々な疾患状態を治療するための方法を提供する。特に、次の疾患状態の治療は本発明の範囲内に含まれる：癌、感染性疾患、炎症性疾患および遺伝性疾患。
【００４５】
本発明のカチオンリポポリマーは、送達される生物活性剤の細胞性結合および取り込みを改善し、上で述べたように、既知のカチオン脂質に関連する問題を克服することを示す。例えば、生物分解性カチオンリポポリマーＰＥＡＣＥは、体内で容易に加水分解あるいはＰＥＩおよびコレステロールに変換される。ＰＥＩは、その低分子量のため、循環から容易に放出されるであろうし、そこではコレステロールは自然に発生する分子である。腎排出を受けそして遺伝子発現に必要な期間の間は不活性である分解産物は、小さな非毒性分子である。分解は簡単な加水分解的および／または酵素的反応による。酵素的分解は、リソソームなどのある細胞小器官にて顕著でありうる。分解に必要な時間は、分子量およびカチオン脂質に対して行われる修飾に依存して、数日から数ヶ月まで変化しうる。
【００４６】
さらに、ナノ粒子あるいはマイクロスフェア複合体は、本発明のカチオンリポポリマーおよび核酸あるいは他の負電荷を有する生物活性剤から簡単な混合により形成されうる。本発明のカチオンリポポリマーの脂肪親和性基（コレステロール誘導体）により、細胞の膜内へのカチオン両親媒性物質の挿入が可能となる。それはカチオンアミン基のアンカーとして働いて細胞の表面に接着し、トランスフェクションされた細胞によるカチオンキャリア／核酸複合体の取り込みを亢進させる。そのため、本発明のカチオン遺伝子キャリアは、既知のカチオン遺伝子キャリアと比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方において改善されたトランスフェクション効率を提供する。
【００４７】
次の実施例により、当業者は本発明の実行の方法をより明確に理解できるであろう。本発明は好ましい特定のその態様と併せて記載された一方で、続くものは本発明の範囲を説明することを目的としており限定はしないことを理解すべきである。本発明の他の観点は、本発明に関係する当業者には明らかであろう。
【００４８】
次のものは実施例中で使用される全ての化学的化合物および試薬の入手源の一般的な開示である。
６００、１２００および１８００ Ｄａのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）はＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ， ＰＮ）から購入した；コレステリルクロロ蟻酸はＡｌｄｒｉｃｈ， Ｉｎｃ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ， ＷＩ）から購入した；２−ジオレオイルｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）はＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ， ＡＬ）から購入した；トリエチルアミン（ＴＥＡ）；無水塩化メチレン；クロロホルム；エチルエーテル、およびアセトンはＳｉｇｍａ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）から購入した。
【００４９】
【実施例】
実施例１
水不溶性ＰＥＡＣＥの合成
この実施例は水不溶性ＰＥＡＣＥの調製を説明する。
１グラムのＰＥＩ（Ｍｗ：１２００ダルトン）を、１５ ｍＬ無水塩化メチレンおよび１００μｌのトリエチルアミン（ＴＥＡ）の混合液に溶解した。氷上で３０分間撹拌した後、１．２ ｇのコレステリルクロロ蟻酸溶液をゆっくりＰＥＩ溶液に加えて、そして混合液を氷上で一晩撹拌した。結果としての産生物（ＰＥＡＣＥ）をエチルエーテルを加えて沈澱させた後、遠心分離をして続いてさらにエチルエーテルおよびアセトンを用いて洗浄した。ＰＥＡＣＥを最終濃度が０．０８ｇ／ｍＬとなるようにクロロホルムに溶解した。上の反応の概略図は図１に示す。合成および精製の後、ＰＥＡＣＥはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＦ ＭＳおよび１Ｈ ＮＭＲを使用して特徴付けした。
【００５０】
水不溶性ＰＥＡＣＥ １２００のＮＭＲの結果は次の通りである：図２Ａで説明されるように、１Ｈ ＮＭＲ（２００ ＭＨｚ， ＣＤＣ１３）、δ ０．６（コレステロール由来のＣＨ３の３ Ｈ ）；δ２．５（ＰＥＩのバックボーン由来の−ＮＨＣＨ２ＣＨ２−の２３０ Ｈ）；δ３．１（ＰＥＩの側鎖由来の＝Ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２の７２ Ｈ）；δ５．３（コレステロール由来の＝Ｃ＝ＣＨ−Ｃ−の１ Ｈ）。δ０．８、−δ１．９で現れるもう一つのピークはコレステロールである。ＰＥＩと共役するコレステロールの量は約４０％であると決定された。ＰＥＡＣＥのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析解析は、図２Ｂで説明されるように、約１６００の分子量を示した。ピークは８００から２７００で現れ、大部分のピークは１６００付近であり、それは１２００ ＤａのＰＥＩおよび４１４のコレステロール（塩化物を除く）が合成のために使用されたので予想される。これにより、合成されたＰＥＡＣＥ １２００の大部分は１／１モル比のコレステロールおよびＰＥＩであり、いくつかは共役していないかあるいは２／１（コレステロール／ＰＥＩ）のモル比で共役しているかのどちらかであることが示唆される。
【００５１】
実施例２
水溶性ＰＥＡＣＥの合成
この実施例は水溶性ＰＥＡＣＥの調製を説明する。
３グラムのＰＥＩ（Ｍｗ：１８００ダルトン）を、１０ ｍＬ無水塩化エチレンおよび１００μｌのトリエチルアミンの混合液中で３０分間撹拌した。１グラムのコレステロールクロロ蟻酸を５ ｍｌの氷冷した無水塩化メチレンに溶解して、そして３０分間ゆっくりとＰＥＩ溶液を加えた。混合液は氷上で１２時間撹拌して、結果としての産生物はロータリーエバポレータ中で乾燥させた。その粉末を５０ ｍｌの０．１Ｎ ＨＣｌに溶解した。水性溶液を１００ ｍＬの塩化メチレンで３回抽出して、そしてガラスマイクロファイバーフィルターを通して濾過した。産生物は溶媒蒸発により濃縮して、多量の過剰なアセトンを用いて沈澱させて、そして減圧下で乾燥させた。産生物はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析および１Ｈ ＮＭＲを使用して解析して、そして使用するまで−２０℃で保存した。
【００５２】
水溶性ＰＥＡＣＥ １８００のＮＭＲの結果は次の通りである：図３Ａで説明されるように、１Ｈ ＮＭＲ（５００ ＭＨｚ Ｄ２Ｏ＋１，４−ジオキサン−ｄ６）、δ ０．８（コレステロール由来のＣＨ３の２．９ Ｈ ）；δ２．７（ＰＥＩのバックボーン由来の−ＮＨＣＨ２ＣＨ２−の５９．６ Ｈ）；δ３．２（ＰＥＩの側鎖由来の＝Ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２の８０．８ Ｈ）；δ５．４（コレステロール由来の＝Ｃ＝ＣＨ−Ｃ−の０．４ Ｈ）。δ０．８、−δ１．９でのもう一つのピークはコレステロールである。ＰＥＩと共役するコレステロールの量は約４７％であると決定された。ＰＥＡＣＥのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析解析は約２２００の分子量を示した。図３Ｂで説明されるように、ピークは１０００から３５００で現れ、大部分のピークは２２００付近であった。予想される位置が２４００であるため、１塩化物３５はＰＥＩ １８００＋コレステリルクロロ蟻酸４４９から除去される。これにより、合成されたＰＥＡＣＥ １８００の大部分は１／１モル比のコレステロールおよびＰＥＩであり、いくつかは共役していないかあるいは２／１（コレステロール／ＰＥＩ）のモル比で共役しているかのどちらかであることが示唆される。
【００５３】
実施例３
第２級アミン基を使用したＰＥＡＣＥの合成
５０マイクロリッターのＰＥＩを氷上で２ ｍＬの無水メチレンに溶解した。そして、２００μＬのベンジルクロロ蟻酸をゆっくりと反応混合物に加えて、溶液を氷上で４時間撹拌した。撹拌の後、１０ ｍＬの塩化メチレンを加えて、溶液を１５ ｍＬの飽和ＮＨ４Ｃｌで抽出した。水を硫酸マグネシウムを使用して塩化メチレン相から除去した。溶液量を減圧下で減少させ、産生物（ＣＢＺ保護ＰＥＩと呼ぶ）をエチルエーテルを用いて沈澱させた。５０マイクログラムの第１級アミンＣＢＺ保護ＰＥＩを塩化メチレンに溶解して、１０ ｍｇのコレステロールクロロ蟻酸を加えて、そして溶液を氷上で１２時間撹拌した。産生物（ＣＢＺ保護ＰＥＡＣＥと呼ぶ）をエチルエーテルで沈澱させて、アセトンで洗浄して、そしてハロゲンドナーとして、Ｈ２下で触媒としてパラジウム活性化炭素を含有するＤＭＦ中に溶解させた。混合液を室温で１５時間撹拌して、Ｃｅｌｉｔｅ（Ｒ）を用いて濾過して、そして溶液量をロータリーエバポレータで減少させた。産生物は最終的にエチルエーテルを用いた沈殿物から得た。
【００５４】
実施例４
グリコシル化ＰＥＡＣＥの合成
２００ミリグラムのＰＥＩをＤＭＦ中に溶解した８ ｍｇのα−Ｄ−グルコピラノシルフェニルイソチオシアネートを使用してグリコシル化した。グリコシル化、マンノシル化およびラクトシル化ＰＥＡＣＥを合成するため、α−Ｄ−ガラクトピラノシルフェニルイソチオシアネート、α−Ｄ−マンノピラノシルフェニルイソチオシアネート、α−Ｄ−ラクトピラノシルフェニルイソチオシアネートを各々使用した。溶液は１ Ｍ Ｎａ２ＣＯ３を加えることによりｐＨ ９に調節して、室温で１２時間インキュベーションした。グルコシル化ＰＥＩを２日間５ ｍＭ ＮａＣｌに対して透析した。結果としての物質の量は減圧下で減少させて、アセトンを用いて沈澱させた。実施例２に記載したように、乾燥（Ｎ２下で）マンノシル化ＰＥＩを塩化メチレンに溶解して、コレステリルクロロ蟻酸を用いて反応させた。
【００５５】
実施例５
葉酸ＰＥＡＣＥ共役の合成
２００ミリグラムのＰＥＩを、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を含有するジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で溶解した１０ ｍｇの葉酸を用いて共役させた。撹拌をしながらの１２時間の後、産生物（葉酸−ＰＥＩ）をＦＰＬＣを用いて精製した。溶液を２日間脱イオン水に対して透析した。結果としての物質の量は減圧下で減少させて、アセトンを用いて沈澱させた。結果としての物質をＮ２の下で乾燥させた。実施例２に記載したように、乾燥葉酸ＰＥＩを塩化メチレン中に溶解して、コレステリルクロロ蟻酸を用いて反応させた。
【００５６】
実施例６
ＲＧＤ ＰＥＡＣＥ共役の合成
我々はＮ−末端を有するＲＧＤペプチドとして、環状ＮＨ２−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＣＯ−ＮＨ２を使用する。ＲＧＤペプチドは、Ｆ−ｍｏｃ化学を用いた固相ペプチド合成方法を使用して合成した。環状化は室温で一晩ｐＨ ８．０で１ ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ中の０．０１ Ｍ Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］を使用して行い、そしてＨＰＬＣを用いて精製した。ＰＧＤペプチドの１モルのＮ−末端アミン基をＤＭＳＯ中で２モルのＮ−サクシンイミジル３（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）と反応させ、エチルエーテルを用いて沈澱させた（ＰＧＤ−ＰＤＰ）。２００ミリグラムのＰＥＩを室温で２時間ＤＭＳＯ中、７ミリグラムのＳＰＤＰと反応させた。結果としての物質（ＰＥＩ−ＰＤＰ）を０．１ Ｍ（−）１，４−ジチオ−Ｌ−スレイトール（ｔｈｒｅｉｔｏｌ）（ＤＴＴ）を用いて、続いて分離バイオ−スピンカラム（ｂｉｏ−ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ）で処理した。ＰＧＤ−ＰＤＰをＤＭＦに溶解して、そしてＰＥＩ−ＰＤＰ溶液に対して加えた。１２時間の撹拌の後、結果としての物質（ＲＧＤ−ＰＥＩ）をＦＰＬＣで精製した。結果としての溶液は２日間脱イオン水に対して透析を行い、続いてロータリーエバポレータを使用して量を減少させた。結果としての物質は、多量の過剰なアセトンを用いて沈澱させた。乾燥ＲＧＤ−ＰＥＩは、実施例２に記載したようにコレステリルクロロ蟻酸を用いて反応させた。
【００５７】
実施例７
リポソームの調製
ＰＥＡＣＥおよびＤＯＰＥをモル比１／１、１／２および２／１で塩化メチレンに溶解して、そして１００−ｍＬ円底フラスコに加えた。透明な溶液を６０分間３０℃でロータリーエバポレータで回転させて、薄い半透明な脂質フィルムを得た。フラスコをパンクチャード−パラ−フィルムで覆い、脂質フィルムを減圧下で一晩乾燥させた。フィルムを５ ｍＬの滅菌水で水和して、ＰＥＡＣＥについて５ ｍＭの最終濃度を与えた。水和化フィルムを６０分間ボルテックスをして、１０−ｍＬ押出し機（Ｌｉｐｅｘ Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ， ＢＣ）を使用して孔サイズ０．４μｍのポリカーボネートフィルターを通して押し出した。
【００５８】
実施例８
プラスミドの増幅および精製
この実施例は、実施例７で調製したリポソームと複合体を形成させるためのＤＮＡの調製を説明する。プラスミドｐＣＭＶ−ルシフェラーゼ（ｐＣＭＶ−Ｌｕｅ）をレポーター遺伝子として使用し、そしてｐｍＩＬ−１２（マウスインターロイキン−１２、あるいはｍＩＬ−１２遺伝子を運ぶプラスミド）を治療遺伝子として使用した。ｍＩＬ−１２のｐ３５およびｐ４０サブ−ユニットを、内在リボゾームエントリー部位（ＩＲＥＳ）により分けられる、２つの独立した転写ユニットから発現させて、そして単一プラスミド、ｐＣＡＧＧに挿入した。このベクターは、ハイブリッドサイトメガロウイルス誘導エンハンサー（ＣＭＶ−ＩＥ）およびチキンβ−アクチンプロモーターの調節の下でｍＩＬ−１２をコードする。全てのプラスミドをＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α株細胞で増幅して、そしてＱＩＡＧＥＮ ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔｓ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ）により単離して精製した。プラスミド精製度および完全性を１％アガロースゲル電気泳動し、続いてエチジウムブロマイド染色で確認して、ｐＤＮＡ濃度を２６０ ｎｍでの紫外線（ＵＶ）吸光度により測定した。
【００５９】
実施例９
水溶性ＰＥＡＣＥ／ｐＤＮＡおよびＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥ／ｐＤＮＡ複合体の調製
この実施例は、水溶性ＰＥＡＣＥ／ｐｃＤＮＡおよびＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥ／ｐＤＮＡ複合体の形成を説明する。
実施例２で調製された水溶性ＰＥＡＣＥ、実施例７で調製されたＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥリポソーム、および実施例８で調製されたｐＤＮＡを別々に各々２５０μｌの量まで５％グルコースで希釈して、そしてｐＤＮＡ溶液を穏やかなボルテックスの下でリポソームに加えた。複合体形成は室温で３０分間、進行させた。遺伝子運搬に対する電荷比の効果を調べるために、水溶性ＰＥＡＣＥ／ｐｃＤＮＡおよびＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥ／ｐＤＮＡ複合体を１／１から５／１（＋／−）の電荷比範囲で調製した。複合体形成の後に、ＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥ／ｐＤＮＡ複合体のオスモル濃度およびｐＨを測定した。結果は表１に示す。
【００６０】
いくつかの電荷比で製剤化した水溶性ＰＥＡＣＥ／ｐＤＮＡおよびＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥリポソーム／ｐＤＮＡ複合体を、粒子サイズおよび複合体のζ電位を測定するためにキュベット内で５回希釈した。試料の電気泳動度はＺｅｔａＰＡＬＳ（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｒｐ．， Ｈｏｌｔｓｖｉｌｌｅ， ＮＹ）を用いて１５°の定常角にて３７℃、ｐＨ ７．０および６７７ ｎｍの波長で測定した。ゼータ電位はＳｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ式に基づいて電気泳動度から計算した。電気泳動度の決定の後、試料を平均粒子サイズ測定に供した。
【００６１】
水溶性ＰＥＡＣＥ／ｐＤＮＡ複合体の平均粒子サイズは、５％グルコースにて３／１（＋／−）の比で製剤化されたＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥ／ｐＤＮＡのそれよりもかなり小さかった（４２ ｎｍ対２２１ ｎｍ）。全体的に、これらの複合体は狭い粒子サイズ分布を有した。ＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥリポソーム／ｐＤＮＡ複合体の場合、電荷比の増加に伴う粒子サイズの減少があった：１／１、３／１および５／１（＋／−）電荷比で各々４３０、２２１および１９３ ｎｍ。
【００６２】
【表１】
2004522809.tif 000002
【００６３】
これらの複合体のゼータ電位は８から４７ ｍＶの範囲内にあり、電荷比（＋／−）の増加に伴って増加した。これらの複合体のオスモル濃度は３３１〜３５９ ｍＯｓｍの範囲内にあり、対して４％グルコース中で製剤化した複合体のそれは約３１０ ｍＯｓｍであった。
【００６４】
実施例１０
ゲルリターデイションアッセイおよびＤＮＡ保護アッセイ
水溶性ＰＥＡＣＥおよび水不溶性ＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥリポソームの酵素的分解からｐＤＮＡを濃縮および保護する能力が、この実施例で評価される。概略すると、水溶性ＰＥＡＣＥおよびＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥリポソームは、２９０〜３００ ｍＯｓｍでオスモル濃度を調節するために５％グルコース（ｗ／ｖ）グルコースの存在下で、０．５／１から５／１までの範囲の様々な電荷比（＋／−）にてｐＤＮＡと複合体を形成させた。複合体を１％アガロースゲル上で電気泳動した。図４Ａおよび図４Ｂで説明するように、正電荷を有するＰＥＡＣＥはＤＮＡの糖バックボーン上で負電荷を有するリン酸イオンと強力な複合体をつくる。電荷比（＋／−）が１／１に達したとき、遊離ＤＮＡは認められなかった。
【００６５】
水溶性ＰＥＡＣＥおよびＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥリポソームの酵素的分解からｐＤＮＡを保護するの能力は、ＤＮａｓｅ保護アッセイにより評価される。２０マイクログラムのｐＤＮＡを様々な電荷比で水溶性ＰＥＡＣＥあるいはＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥリポソームと複合体を形成させて、３０分間環境条件でインキュベーションした。ＤＮａｓｅ Ｉ（２７３ユニット）を製剤に加えて、そして試料を３７℃で以前に規定した期間、インキュベーションした。０、５、１５、および６０分のインキュベーション後、５０μｌの試料をエッペンドルフチューブ内に取り、穏やかなボルテックスの下で５０μｌの１００ ｍＭ ＥＤＴＡと混合してＤＮａｓｅを不活性にした。ヘパリン（１６２ユニット／ｍｇ ＤＮＡ）を加えて、水溶性ＰＥＡＣＥあるいはＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥリポソームからｐＤＮＡを解離した。ヘパリンを２０分間混合液と反応させて、そして試料を電気泳動のため１％アガロースゲル上でロードした。
【００６６】
水溶性ＰＥＡＣＥあるいはＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥリポソームは両方とも、３／１（＋／−）電荷比でＤＮａｓｅの存在下で６０分のインキュベーション後までヌクレアーゼによる分解からプラスミドを保護することができた。図５は、水溶性ＰＥＡＣＥが３７℃で２時間のインキュベーションの後でさえＤＮＡを保護できたことを説明する。プラスミドＤＮＡは、電荷比３／１（＋／−）にてＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥリポソームと複合体を形成したとき、完全に濃縮されて球状粒子を形成した。これらの複合体の粒子サイズは約２００〜３００ ｎｍ（表１）であった。脂質−媒介遺伝子運搬における細胞性機序の理解は限定されているにもかかわらず、ナノメートルスケールのレベルでの複合体形成は一般的に、細胞内への脂質／ＤＮＡ複合体の侵入にとって必要条件であると考えられている。
【００６７】
実施例１１
細胞毒性
この実施例は、広い範囲の電荷比にわたりＣＴ−２６細胞でＭＴＴアッセイを使用して細胞毒性に関してテストした水溶性ＰＥＡＣＥ／ｐＣＭＶ−ＬｕｃおよびＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥリポソーム／ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ複合体を説明する。Ｔ． Ｍｏｓｍａｎｎの“Ｒａｐｉｄ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｓｕｒｖｉｖａｌ： Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙｓ”（６５ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ５５−６３ （１９８３））により最初に記載されたＭＴＴ比色分析アッセイは、参考文献によりここに援用される。
【００６８】
ＣＴ−２６マウス結腸腺癌細胞を、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）、１００ Ｕ／ｍＬペニシリン、１００ Ｕ／ｍＬストレプトマイシン、および５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンが追加されたＲＰＭＩ １６４０培地中にて３７℃および加湿５％ ＣＯ２で増殖させてそして維持した。
【００６９】
ＣＴ−２６細胞を４，０００細胞／ウェルでＲＰＭＩ（１０％ ＦＢＳ）と共に９６ウェルプレートに播種して、一晩インキュベーションした（３７℃、５％ ＣＯ２）。８０％コンフルエントに達した後、０．６４μｇのｐＤＮＡを様々な水溶性ＰＥＡＣＥ／ｐＤＮＡあるいはＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥ／ｐＤＮＡ電荷比で加え、４８時間インキュベーションした（３７℃、５％ ＣＯ２）。インキュベーションの後、リン酸緩衝食塩水中の２５μｌの３−［４，５ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）原液を各々のウェルに加えて、最終濃度をウェル毎に０．５ ｍｇ／ｍＬ ＭＴＴとした。プレートをさらに４時間インキュベーションした。培地を除去して、１５０μｌのＤＭＳＯを加えてホルマザン結晶を溶解した。プレートはＥＬＩＳＡプレートリーダーにて５７０ ｎｍで分光光度法的に読み込んだ。相対細胞（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｅｌｌ）（％）を次の方程式に従って計算した：
生存率（％） ＝ ［ＯＤ５７０（試料）／ ＯＤ５７０（対照）］×１００
ここでは、ＯＤ５７０（対照）はＰＢＳ緩衝剤のみで処理したウェル由来の測定値を表し、ＯＤ５７０（試料）は様々な電荷比でＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥ／ｐＤＮＡの量を変えて処理したウェル由来の測定値を表す。
【００７０】
商業的に入手可能なカチオンリポソーム（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ）／ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ複合体（５／１， ｗ／ｗ）およびポリ（Ｌ−リジン）（ＰＬＬ）を比較のために使用した。ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬は、膜濾過水中のポリカチオン脂質２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）（ＭＶ ８６７）および中性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）（ＭＷ ７４４）の３：１（ｗ／ｗ）リポソーム製剤である。その化学的構造に基づいて、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥは２つの第１級アミン、２つの第２級アミンおよび１つの第４級アミンを有しており、全体で分子毎に５つの正電荷となる。続く計算は、５／１（ｗ／ｗ）はＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ／ｐＤＮＡ複合体に関する６．８２３／１（＋／−）に対応することを示す。（＋／−）電荷比による正規化の後、このように我々は、図６Ａで説明するように、７／１（ｗ／ｗ）電荷比で調製される水溶性ＰＥＡＣＥ／ｐＤＮＡは細胞に対して毒性がなかったこと、一方ＰＥＩ（ｍｗ ２５０００ダルトン）およびＳｕｐｅｒｆｅｃｔの両方は細胞に対して毒性を有していたことを確認した。同様に、ＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥリポソーム／ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ複合体は、７／１（＋／−）および以下の電荷比で製剤化されるとき、細胞に対する毒性はより低くなった。対して、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ／ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ複合体は、図６Ｂで説明するように、細胞に対する毒性は非常に強かった。
【００７１】
本発明のカチオンリポポリマーの重要な特徴は、至適トランスフェクションに必要とされる濃度での細胞に対するその比較的低い毒性であり、というのも細胞毒性は多くのカチオン両親媒性物質の適用の際の主要な障壁の一つであるからである。リポフェクチンおよびＰＥＩなどの商業的に入手可能なカチオン脂質および合成ポリカチオンポリマーのいくつかの毒性は、それらの非−天然、非−生物分解性的な性質にあった。結果から、本発明のリポポリマーの天然の特性および生物分解性は、細胞毒性の低下および生物学的適合性の改善をもたらすことが示唆される。
【００７２】
実施例１２
ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション
この実施例では、５％（ｗ／ｗ）グルコース中での異なる電荷比で製剤化される水溶性ＰＥＡＣＥ／ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ、ＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥリポソーム／ｐＣＭＶ−ＬｕｃおよびＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥ リポソーム／ｐｍＩＬ−１２複合体を、ＣＴ−２６結腸癌細胞株でのそれらのトランスフェクション効率について評価した。
【００７３】
ルシフェラーゼ遺伝子の場合、ＣＴ−２６細胞をＲＰＭＩ １６４０培地を含有する１０％ ＦＢＳ中に４×１０５細胞／ウェルで６ウェル組織培養プレートに播種した。細胞は、０．５／１（＋／−）から０．５／１から５／１（＋／−）までの電荷比の範囲の様々な電荷比で調製された水溶性ＰＥＡＣＥ／ｐＤＮＡあるいはＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥリポソーム／ＤＮＡ複合体を用いてトランスフェクションした後の２４時間以内に８０％コンフルエントに達した。ロードしたＤＮＡの全量は２．５μｇ／ウェルで一定に維持して、トランスフェクションは血清の非存在下で行った。細胞はＣＯ２インキュベーター内で５時間、複合体の存在下でインキュベーションした後、１０％ ＦＢＳを含有する２ ｍｌのＲＰＭＩ １６４０で置換してさらに３６時間インキュベーションした。細胞は、冷ＰＢＳで洗浄した後、１×溶解（ｌｙｓｉｓ）緩衝剤（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を使用して溶解した。総タンパク質アッセイは、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）を使用して行った。ルシフェラーゼ活性は、９６ウェルプレートルミノメーター（Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ， Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ， ＶＡ）を使用して相対光単位（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ）（ＲＬＵ）に関して測定した。ルシフェラーゼの最終値はＲＬＵ／ｍｇ総タンパク質に関して報告した。ネイキッド（ｎａｋｅｄ）ＤＮＡおよび未処理の培養の両方を、各々陽性対照および陰性対照として使用した。図７Ａで説明するように、水溶性ＰＥＡＣＥのトランスフェクション効率はＰＥＩよりも高かった。ＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥリポソーム／ｐＤＮＡ複合体の場合、トランスフェクション効率は電荷比およびＰＥＡＣＥ／ＤＯＰＥモル比に依存しており、図７Ｂで説明するように、ＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥ（２／１モル／モル）リポソーム／ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ複合体で最高であった。
【００７４】
ｍＩＬ−１２遺伝子の場合、ＣＴ−２６細胞を１０％ ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ １６４０培地中に２×１０６細胞／フラスコで７５ ｃｍ２フラスコに播種した。細胞は、０．５／１（＋／−）から５／１（＋／−）までの範囲の様々な電荷比で調製されたＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥリポソーム／ｐｍＩＬ−１２複合体を用いてトランスフェクションした後の２４時間以内に８０％コンフルエントに達した。ロードしたＤＮＡの全量は１５μｇ／フラスコで維持して、トランスフェクションは血清の非存在下で行った。細胞はＣＯ２インキュベーター内で５時間複合体の存在下でインキュベーションさせた後、１０％ ＦＢＳを含有する１０ ｍｌのＲＰＭＩ １６４０で置換した。その後、細胞をさらに３６時間インキュベーションした。培養上清を、製造業者が示唆するように酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを使用してｍＩＬ−１２ ｐ７０およびｐ４０についてアッセイした。様々な電荷比の勾配を使用したとき、ルシフェラーゼトランスフェクションと同様な結果が認められた。ＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥリポソーム／ｐｍＩＬ−１２複合体（３／１， ＋／−）のｍＩＬ−１２レベルは実質的に、ネイキッドｐｍＩＬ−１２あるは非−トランスフェクション試料よりも高かった。
【００７５】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスフェクションされた試料のＥＬＩＳＡ結果を補足するために、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行い、トランスフェクションされた腫瘍細胞内のｍＩＬ−１２についてｍＲＮＡ転写を検出した。トランスフェクションの後、全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｑｉａｇｅｎキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．， Ｖａｌａｎｃｉａ， ＣＡ）を使用して単離した。試料をグアニジンイソチオシアネートの存在下で溶解およびホモジナイズして、そしてＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔＴＭ逆転写酵素キット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）を使用して逆転写させた。逆転写された試料は、Ｔａｑポリメラーゼコアキット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）を使用してＰＣＲ技術により増幅した。ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ｐ３５サブユニットならびにβ−アクチンプロモーターおよびｐＣＡＧＧＳを検出した。５’から３’まで合成されるプライマーは次の通りである：各々、ｐｍＩＬ−１２（ｐ３５）に関して、５’−ＧＴＣ ＴＣＣ ＣＡＡ ＧＧＴ ＣＡＧ ＣＧＴ ＴＣＣ−３’上流および５’−ＣＴＧ ＧＴＴ ＴＧＧ ＴＣＣ ＣＧＴ ＧＴＧ ＡＴＧ−３’下流。β−アクチンに関して、５’−ＡＴＧ ＧＴＧ ＧＧＡ ＡＴＧ ＧＧＴ ＣＡＧ ＡＡＧ−３’上流および５’−ＣＡＣ ＧＣＡ ＧＣＴ ＣＡＴ ＴＧＴ ＡＧＡ ＡＧＧ−３’下流。ｐＣＡＧＧＳに関して、５’−ＧＣＣ ＡＡＴ ＡＧＧ ＧＡＣ ＴＴＴ ＣＣＡ Ｔ−３’上流および５’−ＧＧＴ ＣＡＴ ＧＴＡ ＣＴＧ ＧＧＣ ＡＴＡ ＡＴＧ−３’下流プライマー。ＰＣＲサイクルリング条件は次の通りである：９５℃で１５秒間の変性、５６℃で１５秒間のアニーリング、および７２ ℃で３０秒間の伸長。全３５サイクルを産物増幅のために行った。ＰＣＲ産物は、１％アガロースゲルを使用した電気泳動により分離した。ｍＩＬ−１２ ｐ３５ ｍＲＮＡ由来のＰＣＲ産物の予想されるサイズは２９７ ｂｐであり、そしてβアクチンに関しては１５０ ｂｐであった。
【００７６】
図８で説明するように、ＲＴ−ＰＣＲの結果は、ｍＲＮＡレベルでのｍＩＬ−１２ ｐ３５産生はｍＩＬ−１２ ｐ４０とジスルフィド結合を形成することによるｍＩＬ−１２ ｐ７０の形成を誘導するには十分であることを示す。β−アクチン対照により、ｍＩＬ−１２遺伝子発現は実際にｍＩＬ−１２をコードするプラスミド由来であり、細胞によるｍＩＬ−１２の内在性産生由来でないことが確認された。ＲＴ−ＰＣＲから得たバンドは、もしｍＩＬ−１２ ｐ３５およびｍＩＬ−１２ ｐ４０の相対的産生が互いに近ければ、タンパク質レベルでのｍＩＬ−１２発現はかなり高いはずであり、トランスフェクションされたＣＴ−２６細胞から分泌されたｍＩＬ−１２ ｐ７０も非常に高いはずであることが示唆される。
【００７７】
実施例１３
ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子発現
水溶性ＰＥＡＣＥ／ｐＤＮＡおよび水不溶性ＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥリポソーム／ｐＤＮＡ複合体の粒子サイズおよび表面電荷に依存して、全身的投与の後に肺、肝臓、脾臓などの大半の主要器官および末梢腫瘍（ｄｉｓｔａｌ ｔｕｍｏｒ）へ送達することができる。肝細胞への効果的な遺伝子送達のため、これらの複合体は血中で安定しなければならず、それらの粒子サイズは洞様肝内皮を通っての管外遊出のため１００ ｎｍ以下であり、そしてディッセ腔にアクセスすべきである。これらの粒子はまた、肝細胞受容体への結合、および受容体−媒介エンドサイトーシスを介した内在化を促進するため、ガラクトースあるいはラクトースなどの特定のリガンドを有しているべきである。ｉｎ ｖｉｖｏでの適用のために、６０〜１５０ ｎｍサイズの水溶性ＰＥＡＣＥ／ｐＤＮＡおよびＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥリポソーム／ｐＤＮＡ複合体を産生することが可能であった。
【００７８】
この実施例は、遺伝子キャリアとして本発明のＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥカチオンリポソームを使用するｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子発現を説明する。それは、注射量として１５０μｌを使用する０．２５ ｍｇ ＤＮＡ／マウスの用量で全身的に投与した後の、マウスの肺内へのプラスミドｐｍＩＬ−１２の運搬および発現を記載する。それは、特に遺伝子治療の適用にとって、本発明に従ったカチオンリポソーム組成物の特に有利な特性を説明する。
【００７９】
ＣＴ−２６結腸腺癌細胞をＢＡＬＢ／ｃマウス内に静脈内注射して肺転移を生成させて、静脈内注射したＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥリポソーム／ｐｍＩＬ−１２複合体のｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子運搬効率を評価した。ＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥリポソーム／ｐｍＩＬ−１２複合体の静脈内注射の４８時間後に、肺を回収して、小片に切り刻んで、２４時間再−培養して、そして培養上清をＥＬＩＳＡにより解析した。ｍＩＬ−１２産生は肺で高かった。ｍＩＬ−１２の最も重要な特性の一つは、大量のｍＩＦＮ−γの産生を誘導する能力である。そのため、我々はまたｍＩＬ−１２により誘導されるｍＩＦＮ−γのレベルも測定した。ＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥリポソーム／ｐｍＩＬ−１２複合体は、ネイキッドｐｍＩＬ−１２あるいはＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥリポソームに比べてより高いｍＩＦＮ−γのレベルを産生した。
【００８０】
水溶性ＰＥＡＣＥ／ｐＤＮＡ複合体は小さなサイズのため、我々はこれらの複合体が腫瘍内（ｉｎｔｒａ−ｔｕｍｏｒａｌ）遺伝子送達ならびに肝細胞および末梢腫瘍への全身的送達にとって特に有用であると期待する。血漿タンパクとの結合を最小にするために、小サイズポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を水溶性ＰＥＡＣＥのＰＥＩ頭部基に付けることができる。
【００８１】
このように、教示される様々な態様で、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、および薬剤などの生物活性剤を、それらの経膜的輸送を容易にすることあるいはそれらの生物学的表面への接着を亢進させることにより、送達するための新規カチオンリポポリマーを含む組成物およびその使用の方法が開示された。明らかな性質の様々な変更および修飾は本発明の精神から離れずに行われうることは、当業者にとって既に明白であろうし、そして全ての変更および修飾は、添付の請求項により定義されるように本発明の範囲内にあることが認識される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ポリ｛（エチレンイミン）−ｃｏ−［Ｎ−２−アミノエチル）エチレンイミン］−ｃｏ−［Ｎ−（Ｎ−コレステリルオキシカルボニル−（２−アミノエチル））エチレンイミン］｝（“ＰＥＡＣＥ”）に関する合成スキームを説明する。
【図２】図２は、１Ｈ ＮＭＲスペクトル（図２Ａ）およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル（図２Ｂ）による不溶性ＰＥＡＣＥ １８００の化学構造および分子量を説明する。
【図３】図３は、１Ｈ ＮＭＲスペクトル（図３Ａ）およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル（図３Ｂ）による水溶性ＰＥＡＣＥ １８００の化学構造および分子量を説明する。
【図４】図４は、水溶性ＰＥＡＣＥ／ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ複合体（図４Ａ）およびＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥリポソーム／ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ複合体（図４Ｂ）のゲルリターデイションアッセイを説明する。
【図５】図５は、水溶性ＰＥＡＣＥ／ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ複合体のＤｎａｓｅ保護アッセイを説明する。
【図６】図６は、水溶性ＰＥＡＣＥ／ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ複合体（図６Ａ）およびＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥリポソーム／ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ複合体（図６Ｂ）によるトランスフェクション後のＣＴ−２６結腸腺癌細胞の生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）アッセイを説明する。
【図７】図７は、水溶性ＰＥＡＣＥ／ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ複合体（図７Ａ）およびＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥリポソーム／ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ複合体（図７Ｂ）によるトランスフェクション後の培養ＣＴ−２６結腸腺癌細胞におけるルシフェラーゼ活性アッセイを説明する。
【図８】図８は、ＰＥＡＣＥ：ＤＯＰＥリポソーム／ｐｍＩＬ−１２複合体によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのトランスフェクション後のＣＴ−２６結腸腺癌細胞のＲＴ−ＰＣＲアッセイを説明する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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