(57)【要約】本発明は、式Ｉ：【化１６】2004530405.tif 000020［式中、Ａｒは、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、トリフルオロメチルまたはハロで置換され得るＣ６またはＣ１０の芳香族基である。Ｒ５は、ハロまたは−Ｓ−Ｒ１であって、Ｒ１はＨまたはアセチルであり、Ｒ２はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである］の化合物のラセミ混合物を分割して所望のエナンチマーを得る方法を提供するものであって、該方法はＲ２がＣ１〜Ｃ６アルキルであるエステルの式Ｉの化合物をムコール・メイヘイ由来のリパーゼと反応させて該エステル結合を立体選択的に加水分解して酸を得て；そして、該酸を単離することを含み、該反応は容量比％が８０％〜９８％の有機相および残りの水相（これは、緩衝化することができる）を含む溶媒中で行なう。
2004530405.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2004530405.tif 000014
［式中、
ＡｒはＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、トリフルオロメチルまたはハロで置換され得るＣ６またはＣ１０芳香族基である。
Ｒ５はハロまたは−Ｓ−Ｒ１であって、Ｒ１はＨまたはアセチルであり、Ｒ２はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである］
の化合物のラセミ混合物を分割して所望のエナンチマーを得る方法であって、該方法は
Ｒ２がＣ１〜Ｃ６アルキルであるエステルの式Ｉの化合物をムコール・メイヘイ由来のリパーゼと反応させて該エステル結合を立体選択的に加水分解して酸を得て；そして、
該酸を単離する
ことを含み、
該反応は容量比％が８０％〜９８％の有機相および残りの水相（これは、緩衝化することができる）を含む溶媒中で行なう、
所望のエナンチマーを得る方法。
【請求項２】
（ａ）エナンチオ過剰率が少なくとも８８％である該酸の所望のエナンチオマーを得るのに、および（ｂ）リパーゼの酵素活性の少なくとも９０％を保存するのに有効であるように溶媒を選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
リパーゼを固体担体の粒子上に固定化する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
溶媒の有機成分は少なくとも８０％のｔ−ブタノール、アセトニトリルまたはアセトンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Ｒ１はアセチルである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
式Ｉ：
【化２】
2004530405.tif 000015
［式中、
ＡｒはＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、トリフルオロメチルまたはハロで置換され得るＣ６またはＣ１０の芳香族基であり；
Ｒ１はＨまたはアセチルであり；そして、
Ｒ２はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである］
の化合物の所望のエナンチオマーを立体選択的に製造する方法であって、該方法は
Ａｒ−ＣＨ２−Ｘ（ここで、Ｘは脱離基である）をＲ４−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒ２＊（ここで、Ｒ２＊およびＲ４は独立してＣ１〜Ｃ６アルキルである）と反応させ；
得られた式ＩＩ：
【化３】
2004530405.tif 000016
の化合物をハロゲン化試薬（これは、ハロゲン化部分としてＮ−ハロ置換のアミド、Ｎ−ハロ置換のイミド、Ｎ−ハロ置換のチオアミドまたはＮ−ハロ置換のチオイミドを含む）と反応させ、そして
該エステルを更に加水分解するかしないで、式ＩＩＩ：
【化４】
2004530405.tif 000017
（式中、Ｙは脱離基である）
の化合物を得て、
該式ＩＩＩの化合物をＺ−Ｓ−Ｒ１＊（ここで、Ｒ１＊はアセチルであり、ＺはＫ、Ｎａまたは他のカチオンである）と反応させて、式Ｉ＊：
【化５】
2004530405.tif 000018
の化合物を得て；そして、
以下の立体選択的な反応の１つを行う：
（ａ）
（１）式ＩＩＩの化合物をエステルに対して選択的である加水分解酵素と反応させ；
（２）所望の得られた酸を単離し；
（３）残りの式ＩＩＩの化合物をラセミ化し；そして
（４）残りのラセミ化した式ＩＩＩ＊の化合物について、（ａ）（１）および（ａ）（２）の工程を少なくとも１回更に反復して行なうか（ここで、Ｚ−Ｓ−Ｒ１＊との反応は、キラルな炭素の立体選択的な反転を伴って行なう）；あるいは、
（ｂ）
（１）式Ｉ＊の化合物をエステルに対して立体選択的である加水分解酵素と反応させ；
（２）所望の得られた酸を単離し；
（３）残りの式Ｉ＊の化合物をラセミ化し；そして
（４）残りのラセミ化した式Ｉ＊の化合物について、（ｂ）（１）および（ｂ）（２）の工程を少なくとも１回更に反復して行なう；
所望のエナンチオマーを立体選択的に製造する方法。
【請求項７】
式Ｉ＊の化合物を結晶化して、エナンチオ的な純度が増大した式Ｉ＊の化合物を得ることを更に含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
式Ｉ＊の化合物の異性体純度は少なくとも９８％ｅｅである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ａ（３）およびｂ（３）のラセミ化の工程は触媒量のテトラアルキルアンモニウムハライドと反応させることを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
ハロゲン化試薬はＮ，Ｎ−ジブロモ−５，５−ジメチルヒダントインである、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
ハロゲン化試薬はＮ，Ｎ−ジクロロ−５，５−ジメチルヒダントインである、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
式ＩＩ：
【化６】
2004530405.tif 000019
（式中、Ｒ２およびＲ４は独立してＣ１〜Ｃ６アルキルである）
の化合物の製造法であって、該方法は
少なくとも５当量のＲ４−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒ２をＡｒＣＨ２Ｃｌ（ここで、ＡｒはＣ１〜Ｃ６アルキルまたはハロで置換され得るＣ６またはＣ１０の芳香族基である）と反応させることを含み、
該反応は、該反応体、および１．２モル当量よりも少ないナトリウム、カリウムまたはリチウムのＣ２〜Ｃ６アルコキシドの塩基供給源（対応するアルコール中で提供され得る）を本質的に含む溶液中で行なう、
式ＩＩの化合物の製造法。
【請求項１３】
塩基供給源のアルコキシド濃度は少なくとも３Ｍである、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（背景技術）
最近の数年間にわたって、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性または中性エンドペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．２４．１１； ＮＥＰ）阻害活性を有する化合物が、特許および技術文献において報告されている。両方の阻害活性を有する別の化合物が同定されている。これらの二重インヒビター化合物は特に高血圧、うっ血性心不全および腎臓病の処置において心臓血管薬物として関心が持たれている。これらの化合物はまた、血管性ペプチダーゼ、二重メタロプロテアーゼ、ＮＥＰ／ＡＣＥまたはＡＣＥ／ＮＥＰインヒビターとも呼ばれる。
【０００２】
オマパトリラットは、現在臨床的な評価が調べられている血管性ペプチダーゼインヒビターである。オマパトリラットは、その臨床的な名前として［［４Ｓ−［４α（Ｒ＊），７ａ，１０ａβ］］オクタヒドロ−４−［（２−メルカプト−１−オキソ−３−フェニルプロピル）アミノ］−５−オキソ−７Ｈ−ピリド［２，１−ｂ］［１，３］チアゼピン−７−カルボン酸を有し、構造式：
【化７】
2004530405.tif 000003
を有する。
【０００３】
オマパトリラットは、その製造法、および心臓血管性疾患の処置におけるその使用が、ロブル（Ｒｏｂｌ）による米国特許第５，５０８，２７２号によって開示されている。
【０００４】
ゲモパトリラットは臨床的な名前として［Ｓ−（Ｒ＊，Ｒ＊）］−ヘキサヒドロ−６−［（２−メルカプト−１−オキソ−３−フェニルプロピル）アミノ］−２，２−ジメチル−７−オキソ−１Ｈ−アゼピン−１−酢酸を有し、このものは現在臨床的な評価を調べられている別の血管性ペプチターゼインヒビターである。この化合物は構造式：
【化８】
2004530405.tif 000004
を有する。この化合物の、その製造法、および心臓血管性疾患の処置におけるその使用は、カラネウィスキー（Ｋａｒａｎｅｗｓｋｙ）らによる米国特許第５，５５２，３９７号において開示されている。オマパトリラットおよびゲモパトリラットを含めた血管性ペプチターゼの製造法はクロネンタル（Ｋｒｏｎｅｎｔｈａｌ）らによるＷＯ ９９／３５１４５において開示されており、オマパトリラットおよびオマパトリラット中間体の製造法はゴドフリー（Ｇｏｄｆｒｅｙ）らによる米国特許第６，１６６，２２７号および第６，２４８，８８２号、モニオット（Ｍｏｎｉｏｔ）らによる米国特許第６，１６２，９１３号、ハンソン（Ｈａｎｓｏｎ）らによる米国特許第６，１４０，０８８号、並びにパテル（Ｐａｔｅｌ）らによるＷＯ ００／１４２６５に開示されている。他のオマパトリラット中間体の製造法は、タオカ（Ｔａｏｋａ）らによる米国特許第６，１７４，７０７号、タナカ（Ｔａｎａｋａ）らによる米国特許第６，１７４，７１１号、並びにボエステン（Ｂｏｅｓｔｅｎ）らによる米国特許第６，１３３，００２号および第６，２２２，０５２号に開示されている。
【０００５】
それらの血管性ペプチダーゼインヒビター中に含有されているチオアリールおよびチオで置換された酸分子の製造法は費用が高い。例えば、非天然アミノ酸（例えば、Ｄ−フェニルアラニン）は立体配置の保持（ジアゾ化条件を使用）および適当なチオ含有の中間体ヘの立体特異的な反転を伴って、α−ハライドヘ変換することができる。しかしながら、エナンチオ的に純粋なＤ−フェニルアラニンは高価である。安価な出発物質から所望のエナンチマーを得る方法が必要とされている。
【０００６】
水性緩衝液中でリパーゼを立体選択的に用いて所望の２−アセチルチオ−３−フェニルプロピオン酸エステルを製造する方法は、ＪＰ２０００−２３６９３Ａに記載されている。しかしながら、特に所望し得る酵素であるムコール・メイヘイ（ｍｕｃｏｒ Ｍｅｉｈｅｉ）から得るリパーゼを用いて有用なｅ．ｅ．値は得られてはなく、このものはノボ  ノルディスクバイオテック社（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．）（これはまもなくノボザイム社（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ， Ｉｎｃ．）となるであろう）によってリポザイム（Ｌｉｐｏｚｙｍｅ）ＩＭとして市販されている。より高いｅ．ｅ．値が得られ、且つ該酵素の再使用を可能とする改良法が必要とされている。
【０００７】
その上、当該分野はリポザイムＩＭ酵素を用いる立体選択性からの粗生成物を精製して医薬用途に適当であろう生成物（＞９８．５％ｅｅ）を得る方法に関する詳細は全くない。このための方法が必要とされる。
【０００８】
また、回収された未反応のエステルを再使用する方法については全く示されていない。該回収されたエステルを再使用しない場合には、費用はひどく高くなるであろう。未反応エステルの再使用法もまた望まれる。
【０００９】
（発明の概要）
本発明は、式Ｉ：
【化９】
2004530405.tif 000005
［式中、
ＡｒはＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、トリフルオロメチルまたはハロで置換され得るＣ６またはＣ１０芳香族基である。
Ｒ５はハロまたは−Ｓ−Ｒ１であって、Ｒ１はＨまたはアセチルであり、Ｒ２はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである］
の化合物のラセミ混合物を分割して所望のエナンチマーを得る方法であって、該方法は
Ｒ２がＣ１〜Ｃ６アルキルであるエステルの式Ｉの化合物をムコール・メイヘイ由来のリパーゼと反応させて該エステル結合を立体選択的に加水分解して酸を得て；そして、
該酸を単離する
ことを含み、
該反応は容量比％が８０％〜９８％の有機相および残りの水相（これは、緩衝化することができる）を含む溶媒中で行なう。
【００１０】
本発明の別の態様は、式Ｉ：
【化１０】
2004530405.tif 000006
［式中、
ＡｒはＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、トリフルオロメチルまたはハロで置換され得るＣ６またはＣ１０の芳香族基であり；
Ｒ１はＨまたはアセチルであり；そして、
Ｒ２はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである］
の化合物の所望のエナンチオマーを立体選択的に製造する方法であって、該方法は
Ａｒ−ＣＨ２−Ｘ（ここで、Ｘは脱離基である）をＲ４−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒ２＊（ここで、Ｒ２＊およびＲ４は独立してＣ１〜Ｃ６アルキルである）と反応させ；
得られた式ＩＩ：
【化１１】
2004530405.tif 000007
の化合物をハロゲン化試薬（ここで、これはハロゲン化部分としてＮ−ハロ置換のアミド、Ｎ−ハロ置換のイミド、Ｎ−ハロ置換のチオアミドまたはＮ−ハロ置換のチオイミドを含む）と反応させ、そして
該エステルを更に加水分解するかしないで、式ＩＩＩ：
【化１２】
2004530405.tif 000008
（式中、Ｙは脱離基である）
の化合物を得て、
該式ＩＩＩの化合物をＺ−Ｓ−Ｒ１＊（ここで、Ｒ１＊はアセチルであり、ＺはＫ、Ｎａまたは他のカチオンである）と反応させて、式Ｉ＊：
【化１３】
2004530405.tif 000009
の化合物を得て；そして、
以下の立体選択的な反応の１つを行う：
（ａ）
（１）式ＩＩＩの化合物をエステルに対して選択的である加水分解酵素と反応させ；
（２）所望の得られた酸を単離し；
（３）残りの式ＩＩＩの化合物をラセミ化し；そして
（４）残りのラセミ化した式ＩＩＩ＊の化合物について、（ａ）（１）および（ａ）（２）の工程を少なくとも１回更に反復して行なうか（ここで、Ｚ−Ｓ−Ｒ１＊との反応は、キラルな炭素の立体選択的な反転を伴って行なう）；あるいは、
（ｂ）
（１）式Ｉ＊の化合物をエステルに対して立体選択的である加水分解酵素と反応させ；
（２）所望の得られた酸を単離し；
（３）残りの式Ｉ＊の化合物をラセミ化し；そして
（４）残りのラセミ化した式Ｉ＊の化合物について、（ｂ）（１）および（ｂ）（２）の工程を少なくとも１回更に反復して行なう。
【００１１】
該方法は更に、式Ｉ＊の化合物を結晶化してエナンチオ的な純度が増大した式Ｉ＊の化合物を得ることを含み得る。好ましい態様において、該式Ｉ＊の化合物の異性体純度は少なくとも９８％ｅｅである。
【００１２】
該方法は更に、ａ（３）およびｂ（３）のラセミ化工程において触媒量のテトラアルキルアンモニウムハライドと反応させることを含み得る。
【００１３】
該方法の好ましい態様において、ハロゲン化試薬はＮ，Ｎ−ジブロモ−５，５−ジメチルヒダントインである。別の好ましい態様において、該ハロゲン化試薬はＮ，Ｎ−ジクロロ−５，５−ジメチルヒダントインである。
【００１４】
更なる態様において、本発明は式ＩＩ：
【化１４】
2004530405.tif 000010
（式中、Ｒ２およびＲ４は独立してＣ１〜Ｃ６アルキルである）
の化合物の製造法を提供するものであって、該方法は
少なくとも５当量のＲ４−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒ２をＡｒＣＨ２Ｃｌ（ここで、ＡｒはＣ１〜Ｃ６アルキルまたはハロで置換され得るＣ６またはＣ１０の芳香族基である）と反応させることを含み、
該反応は、該反応体、および１．２モル当量よりも少ないナトリウムまたはカリウムのＣ２〜Ｃ６アルコキシドの塩基供給源（対応するアルコール中で提供され得る）を本質的に含む溶液中で行なう。好ましい態様において、塩基供給源のアルコキシド濃度は少なくとも３Ｍである。
【００１５】
（詳細な記載）
本発明は医薬を得るのに重要な中間体のうちの所望のエナンチマーを立体選択的に製造する方法に関する。
【００１６】
本発明は、アリールおよびチオで置換された酸の酵素による分割方法に関する。加えて、酵素基質であるアリールおよびチオで置換された酸誘導体の製造法を開示する。
【００１７】
本発明の方法は、概要において上記の通り、式Ｉ、Ｉ＊、ＩＩおよびＩＩＩを参照する通り記載する。ＡｒはＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル（Ｃ１〜Ｃ３が好ましい）、トリフルオロメチルまたはハロで置換され得るＣ６またはＣ１０の芳香族基である。Ｒ５はハロまたは−Ｓ−Ｒ１であって、Ｒ１はＨまたはアセチルである。Ｒ２はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキル（Ｃ１〜Ｃ３が好ましい）である。Ｒ４はＣ１〜Ｃ６アルキル（Ｃ１〜Ｃ３が好ましい）である。Ｒ２＊はＣ１〜Ｃ６アルキル（Ｃ１〜Ｃ３が好ましい）である。
【００１８】
本発明を、反応式Ｉを参照する通り、記載することができる。
【化１５】
2004530405.tif 000011
【００１９】
例えば、３−アリール−２−アセチルチオで置換されたプロパン酸（１）の製造についての全反応を、反応式Ｉに例示する。最初に、アセト酢酸アルキル（またはいずれかの他のβ−ケトエステル）をベンジルクロリド（２）（またはその置換されたアナログ）を用いてアルキル化してケトエステル（３）を得る。ハロゲン化−脱アセチル化反応は、３を２−ハロ−３−アリールプロパン酸エステル（４）ヘ変換するのに有効である。４をチオアセテート塩を用いて直接的に処理することにより、ラセミの２−アセチルチオ−３−アリールプロパン酸アルキル（５）を得る。この段階で、５の酵素による分割は有効であり得る。例えば、エステル５のエナンチオ選択的な加水分解反応により、酸１のＳ−異性体を優れたエナンチオ選択性で得る。１を未反応のＲ−エステル５Ｒから簡便に分離することができる。本発明はまた、未反応のＲ−エステル（５Ｒ）を再利用して、酵素による分割工程についてのラセミ基質の更なる供給源を与える方法をも提供する。本発明の別の態様において、酵素による分割工程は、α−ハロエステル４の段階で行なう。この場合に、Ｒ−ハロエステルのエナンチオ選択的な加水分解反応に最適であって、そしてＲ−ハロ酸（６）を与えるように、酵素条件および反応条件を選択する。６をチオアセテート塩を用いた立体配置の反転を伴って置換して、１を得ることができる。再び、酵素による分割工程からの未反応エステル（４Ｓ）を再利用して、加水分解反応のための更なるラセミ基質を与える方法を提供する。
【００２０】
２−アリールメチルアセト酢酸アルキル（３）は、出願人が開発した最適条件を用いてアセト酢酸アルキルのアルキル化によって簡便に且つ高収率で製造することができる。アセト酢酸エチルおよびベンジルクロリドを用いて、出願人は過剰量のアセト酢酸エチルの存在下で、いずれの溶媒（このものは、商業的に入手可能な試薬であるエトキシナトリウムの濃溶液である該エタノールを除く）を加えずに、高収率および排他的なモノＣ−アルキル化選択性を与える。本反応を行なうための他の方法は、通常、触媒の使用（ブランドストローム（Ｂｒａｎｄｓｔｒｏｍ）， Ａ．およびジュングレン（Ｊｕｎｇｇｒｅｎ）， Ｕ．によるＡｃｔａ Ｃｈｅｍ． Ｓｃａｎｄ． １９６９， ２３， ２２０４； ドュルスト（Ｄｕｒｓｔ）， Ｈ． Ｄ．およびリーベスカインド（Ｌｉｅｂｅｓｋｉｎｄ）， Ｌ． によるＪ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， １９７４， ３９， ３２７１）または無機担体の使用（ラヌ（Ｒａｎｕ）， Ｂ， Ｃ．およびバール（Ｂｈａｒ）， Ｓ． Ｊ．によるＪ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ． １９９２， ｌ， ３６５）を必要とする。加えて、本発明において使用する好ましい方法は、１つ以上の制限（例えば、毒性物質、困難且つ時間を要する操作、および／または比較的に低い収率の物質の使用）を避ける。例えば、相間移動触媒を使用しないアセト酢酸エチルとベンジルクロリドとの好ましくない反応において、アルキル化反応はベンゼン中で８時間還流後に中位の２５％収率を与える（デュルスト，Ｈ． Ｄ．およびリーベスカインド， Ｌ．によるＪ． Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ．， １９７４， ３９， ３２７１）。本発明の好ましい反応条件により、反応性の低いベンジルクロリドを使用することが可能になり、高収率を得る。多量スケールの製造において出発物質として、高価なベンジル化試薬（例えば、ベンジルブロミド）に対して高価でないベンジルクロリド（および、通常はアリールメチルブロミドに対してアリールメチルクロリド）を使用することは有利である。
【００２１】
アルキル化反応のための適当な塩基としては、例えばナトリウム、カリウムまたはリチウムのアルコキシド（例えば、ナトリウムエトキシド）、Ｋ２ＣＯ３またはＮａＨを含む。アルキルエステルの対応するナトリウム、カリウムまたはリチウムのアルコキシドは、該反応にとって好ましい塩基であり、エステルの反応を損ない（ｐｌａｇｕｅ）得るエステル交換反応を避ける。アルカリ金属のアルコキシド塩基の便利な供給源は、商業的に入手可能であるかまたは容易に製造される対応するアルコール溶液であることが多い。これらのアルコキシドは、例えばＣ１〜Ｃ６アルコキシドのナトリウム、カリウムまたはリチウム塩を含む。この塩基供給源の溶液の濃度は、少なくとも３Ｍである。アリールメチルクロリドに対してわずかにモル過剰量の塩基（例えば、１．２モル当量）を使用する。
【００２２】
これらの反応条件がアセト酢酸エチルを除く、式：Ｒ４−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒ２の他のアルキルβ−ケトエステルにとって有用であることは、当該分野の当業者によって認められ得る。これらのβ−ケトエステルとしては、例えばＲ４およびＲ２が独立してＣ１〜Ｃ６アルキル、好ましくはＣ１〜Ｃ３アルキルである化合物を含む。その上、ベンジルクロリドに加えて、他のアリールメチルクロリド（これは、Ｃ６もしくはＣ１０のアルキルまたはハロで置換されたアリールメチルクロリド基を含む）を使用することができる。その上、該アリール分子はＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはハロ基で置換することができる。これらのアリールメチルクロリド基は例えば、ベンジルおよびナフチルメチルクロリドのアナログを含む。アリールメチルクロリドに対して大モル過剰量のアセト酢酸アルキルを使用するのが好ましく、少なくとも５倍過剰量であることが好ましい。例えば、出発物質であるアセトアセテートの過剰量を、減圧下で分別蒸留によって簡便に回収することができ、そして該反応に再使用することができる。アルキル化反応の収率は少なくとも９５％であって、少なくとも９９％であることがより好ましい。
【００２３】
ケトエステル３を、ハロゲン化／脱アセチル化の順序を用いてα−ハロエステル４に変換する。２−ベンジルアセト酢酸エチルのブロモ化−脱アセチル化による２−ブロモ−３−ベンゼンプロパノエートを得る反応は、Ｎ−ハロスクシンイミドを用いて報告されている。出願人は、本反応において高価なブロモ化試薬であるＮ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）が安価な試薬であるＮ，Ｎ−ジブロモ−５，５−ジメチルヒダントイン（ＤＢＤＭＨ）によって有効に置きかえることができることを発見した。その低価格に加えて、両方の臭素原子がブロモ化−脱アセチル化の変換反応に使用されて、更にその費用の効果に寄与することができる。比較収率は、ＮＢＳを使用した反応においてＤＢＤＭＨを使用して得ることができる。生成物４を、例えば真空蒸留によって反応混合物から簡便に単離することができる。該反応の収率は少なくとも８０％であることが好ましい。
【００２４】
同様に、Ｎ，Ｎ−ジクロロ−５，５−ジメチルヒダントイン（ＤＣＤＭＨ）を対応するα−クロロ生成物を得るための反応におけるＮ−クロロスクシンイミドに対して置きかえることができることは、当該分野の当業者によって認めることができる。クロロ化試薬であるＤＣＤＭＨの使用により、対応するブロモ化試薬であるＤＢＤＭＨと同様な経済上の利点を得る。ハロ部分を供与するのに有効な他のＮ−ハロ−アミド、−イミド、−チオアミドまたは−チオイミド（これは、環状のハロ−アミド、−イミド、−チオアミドまたは−チオイミドを含む）を使用することもできる。好ましいＮ−ハロ−アミド、−イミド、−チオアミドまたは−チオイミド（これは、環状のハロ−アミド、−イミド、−チオアミドまたは−チオイミドを含む）は、部分：−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｘ）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｘ）−（ここで、ハロ部分であるＸはクロロまたはブロモである）を含む化合物である。
【００２５】
α−ハロエステル４は、チオアセテート塩を用いてα−アセチルチオエステル中間体５に変換することができる。いずれかのカチオンを含有するチオアルカノイル塩を用いると、アンモニウム（これは、アルキルアンモニウムを含む）塩または金属塩を含む変換反応に有用であり得る。金属アルカリ塩（例えば、ナトリウムおよびカリウム塩）が好ましい塩である。
【００２６】
中間体エステル５を酵素による加水分解反応を用いてエナンチオ選択的に加水分解して、Ｓ−酸１を未反応Ｒ−エステル５Ｒと一緒に得ることができる。１態様において、該リパーゼを固体担体の粒子上に固体化する。ムコール属由来のリパーゼ（例えば、ノボ  ノルディスク（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）社製のリポザイムＩＭ）が本基質を用いた加水分解反応に特に十分に適合することを見出した。出願人によって見出されたこの酵素条件および最適な反応条件を使用して、例えば９６％以上のエナンチオ過剰率（ｅ．ｅ．）で、且つ例えば７５％以上の（消費されたエステル基準）高収率の生成物を得ることができる。
【００２７】
酵素の選択を除く他の反応条件もまた酵素による分割における高いエナンチオ選択性にとって重要である。該反応条件は、いくつかの変数（例えば、基質の濃度、溶媒、ｐＨおよびインキュベート時間を含む）によって変えることができる。表１にまとめる通り、基質の濃度、溶媒およびインキュベート時間が加水分解反応の収率およびエナンチオ選択性に及ぼす効果は、スクリーニング法を用いることによって評価することができる。加えて、アルキル分子をアセトアセテート（またはいずれかのβ−ケトエステル）に変える効果は、この同じ方法を用いて評価することができる。該反応は、キラルなＨＰＬＣ分析によって簡便に分析されて加水分解生成物の変換率および光学純度を測定することができる。典型的なキラルＨＰＬＣは、例えばキラルセルＡＤ（ダイセル化学社）を用い、移動相をヘキサン：エタノール：トリフルオロ酢酸（９８：２：０．１％）とし、流速を１ｍＬ／分とし、そしてＵＶ検出を２３０ｎｍとする。
【表１】
2004530405.tif 000012
【００２８】
出願人は、酵素による加水分解反応において有機溶媒および緩衝液（または水）の溶媒混合物を使用することにより、緩衝液のみの場合よりもより良い選択性を得ることを見出した。緩衝液に対する有機溶媒の比率は、９８：２または９５：５〜５０：５０であり、９８：２〜８０：２０であることが好ましい。出願人は、有機溶媒および緩衝液の混合物を使用して得た高い収率および高いｅ．ｅ．に加えて、溶媒混合物を使用することにより、加水分解酵素の活性の有意な低下なしで該酵素を回収することができることも見出した。言い換えれば、該酵素を該反応混合物から回収することができ、そして別の加水分解反応のバッチランに再使用することができる。ある態様においては、該酸の所望のエナンチオマーのエナンチオ過剰率を少なくとも８８％だけ与え、および該リパーゼの酵素活性を少なくとも９０％だけ保存するのに有効であるように、溶媒を選択する。酵素活性の少なくとも９０％が、４を越える加水分解のバッチサイクルで保存されることが好ましい。該有機溶媒はアセトニトリル；ケトン（例えば、アセトン）；またはアルコール（例えば、ｔ−ブタノールおよびイソプロパノール）であり得る。好ましい有機溶媒としては、アセトニトリル、アセトンおよびｔ−ブタノールを含む。
【００２９】
本発明の酵素反応において有用な緩衝液は、例えば緩衝化の範囲が４〜８である緩衝液を含む。有用な緩衝液としては、例えば酢酸緩衝液、テトラボレート緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ、トリス−ＨＣｌまたはクエン酸緩衝液を含む。この酵素による分割に最適なｐＨ値は使用する酵素に依存するが、４〜８であることが好ましく、４〜６であることがより好ましい。好ましい緩衝液は、ｐＨが約４である０．２Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液である。
【００３０】
該反応温度は５℃〜７０℃の範囲であり得て、１５℃〜３７℃であることが好ましい。
【００３１】
本発明は、酵素、酸１および加水分解反応からの未反応エステル５Ｒの簡便な回収法を提供する。該酵素は、例えば有機溶媒および緩衝液の混合物を用いたろ過および洗浄によって回収される。該酵素は、加水分解反応において再使用するのに適当である。該酸１および未反応エステル５Ｒは、該ろ液から回収することができる。該ろ液は、例えば真空蒸留によって濃縮されて、該酸１および該未反応エステル５Ｒの混合物を得る。該混合物を、アルカリ性水溶液および有機溶媒（例えば、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ））の間で分配する。相分離後に、該未反応エステル５Ｒを有機相の濃縮によって回収する。該水溶液を酸性とし、有機溶媒を用いて抽出する。この有機抽出物をブラインを用いて洗浄し、濃縮してＳ−酸１を得る。
【００３２】
本発明の別の態様において、粗生成物１の精製法を提供する。粗生成物１のｅｅは、溶媒の混合物から結晶化することによって改善することができる。該粗生成物のｅｅは、例えば少なくとも９５％まで、好ましくは少なくとも９８％まで改善することができる。例えば、該粗生成物のｅｅが８８％である場合には、該粗生成物から収率が６５％で９９％よりも大きいｅｅにまで改善され得ることが好ましい。好ましい結晶化溶媒は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルエーテルおよびＣ５〜Ｃ７アルカンの混合物を含む。特に好ましい溶媒は、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）およびヘプタンの混合物を含む。
【００３３】
酵素による加水分解反応のための未反応エステル５Ｒの再使用は、５Ｒのラセミ化によって更なる量の該基質のラセミ体５を得ることによって達成することができる。５のラセミ混合物を与えるいずれかの方法は、５Ｒのラセミ化（これは、エピマー化タイプの反応および触媒量の求核体（例えば、ハライド）を用いた置換反応を含む）に使用することができる。回収された５Ｒおよび触媒量のハライド塩の混合物を加温することは、該チオアセテートエステルをラセミ化する好ましい方法である。特に、テトラアルキルハライド（例えば、テトラブチルアンモニウムブロミド）はラセミ化工程のための触媒として最も好ましい。
【００３４】
本発明の別の態様において、ハロ酸エステル４の酵素による加水分解反応は、Ｒα−ハロ酸６をエナンチオ選択的に与える。この経路は、Ｓα−チオアセテート１ヘの直接的な変換に適当な非ラセミのキラル中間体を与える。適当な酵素および溶媒は、スクリーニング法（表２を参照）を用いた加水分解反応においてスクリーニングすることができる。例えば、サブチリシンＢＰＮ（シグマ製）、中性プロテアーゼＮ（アマノ（Ａｍａｎｏ）製）およびリポザイムＩＭ（ノボ  ノルディスク製）は、出願人の反応条件を用いて特に良い結果を与える。ある態様においては、リパーゼを固体担体の粒子上に固定化する。この酵素による加水分解反応に適当な溶媒は、有機溶媒および緩衝水溶液の混合物である。該混合物中の有機溶媒のパーセンテージは、２０〜９５％の範囲であることが好ましく、３０％〜６０％の範囲であることがより好ましい。この反応に有用な有機溶媒としては、例えばアセトニトリル；ケトン（例えば、アセトンおよびシクロヘキサノン）；環状エーテル（例えば、テトラヒドロフランおよび１，４−ジオキサン）；およびアルコール（例えば、ｔ−ブタノールおよびイソプロパノール）を含む。
【表２】
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【００３５】
この加水分解反応の温度は５℃〜７０℃の範囲であり、１５℃〜３７℃が好ましい。生成物６のｅｅは、少なくとも８０％であることが好ましい。
【００３６】
次いで、エナンチオ的に純粋な６をチオアセテート塩を用いて且つラセミα−ブロモエステル４についての上記の条件を用いて、α−中心の反転を伴って１に直接に変換することができる。
【００３７】
最初の回収反応におけるα−チオアセチルエステル５Ｒの回収と同様に、該加水分解反応からの未反応Ｓα−ハロエステル４Ｓの回収を提供する。未反応エステル４Ｓの再使用は、４Ｓの回収およびラセミ化によって有効となり得る。該未反応エステル４Ｓを、未反応のα−チオアセテートエステル５Ｒについての上記と同じ方法によって簡便に回収することができる。該酵素についての更なる基質４のラセミ混合物を与えるいずれかの方法は、ラセミ化の工程に使用することができる。これらの方法は、エピマー化タイプの反応および触媒量の求核体（例えば、ハライド）を用いた置換反応を含む。ハロエステル４Ｓおよび触媒量のハライド塩の混合物を加温することは、ハロエステルエステルをラセミ化する好ましい方法である。特に、テトラアルキルハライド（例えば、テトラブチルアンモニウムブロミド）は、ラセミ化工程の触媒として最も好ましい。
【００３８】
本発明は反応式１に参照する通り記載されているが、本発明の請求項および要約に記載されている式のさまざまな化合物が本発明の方法において使用したり、または製造することができることに注意する。本発明の他の化合物を製造するのに必要とされる反応式１の化合物のアナログは、当該分野の当業者にとって認めることができるであろう。
【００３９】
以下の実施例は更に本発明を例示するものであるが、当然にいかなる形でもその範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【００４０】
実施例１  ２−ベンジルアセト酢酸エチルの製造
オーバーヘッドスターラー、冷却器、滴下ろうとおよび温度計を備えた１Ｌの４つ口丸底フラスコに、アセト酢酸エチル（２０７．３ｇ）を加えた。エトキシナトリウム／エタノール（２１重量％、１１３．１ｇ）の溶液を、２０〜２５℃で加えた。該反応混合物を１５分間撹拌した。次いで、塩化ベンジル（３９．１４ｇ、０．３０９２ｍｏｌ）を滴下ろうとを通して１５分間かけて滴下した。得られた反応混合物を８０℃まで２〜３時間加熱し、その後に室温まで冷却した。水（３００ｍＬ）を該反応混合物に加え、分液ろうと中で相分離した。生成物を酢酸エチル（２５０ｍＬ×３）を用いて抽出した。該有機相を合わせて飽和塩化アンモニウム溶液（６００ｍＬ）を用いて洗浄した。乾燥および溶媒の蒸発後に、該未反応の出発物質および生成物を真空分別蒸留によって、分離し、単離した。該回収した出発物質は秤量して１３７．１ｇであった。回収率は８２％であった。生成物である２−ベンジルアセト酢酸エチルは６４．２ｇ、９４％収率であった。
【００４１】
実施例２  Ｎ−ブロモスクシンイミドを用いた２−ブロモ−３−ベンゼンプロパン酸エチルの製造
オーバーヘッドスターラー、滴下ろうと、冷却器および温度計を備えた２Ｌの４つ口丸底フラスコに、エトキシナトリウム／エタノール（２１重量％、１６１．８ｇ）を窒素下、２０〜２５℃で加えた。２−ベンジルアセト酢酸エチル（１０３．１ｇ、０．４５４ｍｏｌ）を滴下した。得られた溶液を２０〜２５℃で３０分間撹拌した。次いで、該反応混合物をドライアイス／アセトン浴を用いて−３５℃まで冷却した。Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ；９７．９５ｇ、０．５４５ｍｏｌ）を数回に分けて３０分間かけて加えた。添加が終わった後に、該反応混合物を−３５℃で１時間かけて撹拌し、その後に２０〜２５℃まで昇温させて、そのものを更に２時間撹拌した。次いで、該反応液を水（４００ｍＬ）を用いてクエンチし、酢酸エチル（６００ｍＬ）を加えた。相分離し、該生成物を該水相から酢酸エチル（４００ｍＬ×３）を用いて抽出した。該有機相を合わせて飽和炭酸水素ナトリウム（４００ｍＬ×２）、水（４００ｍＬ×２）およびブライン（５００ｍＬ）を用いて洗浄した。溶媒を除去した後に、該生成物（粗、１３２ｇ）を減圧下で蒸留した。２−ブロモ−３−ベンゼンプロパン酸エチル（９７．７ｇ）を収率が８３．７％で得た。
【００４２】
実施例３  （Ｎ，Ｎ−ジブロモ−５，５−ジメチルヒダントインを用いた２−ブロモ−３−ベンゼンプロパン酸エチルの製造
オーバーヘッドスターラー、滴下ろうと、冷却器および温度計を備えた１００ｍＬの３つ口丸底フラスコに、エトキシナトリウム／エタノール（２１重量％、０．８１ｇ）を窒素下、２０〜２５℃で加えた。２−ベンジルアセト酢酸エチル（０．４８ｇ、２．１９ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた溶液を２０〜２５℃で３０分間撹拌した。次いで、該反応混合物をドライアイス／アセトン浴を用いて−３５℃まで冷却した。Ｎ，Ｎ−ジブロモ−５，５−ジメチルヒダントイン（ＤＢＤＭＨ；０．３２ｇ、１．０９ｍｍｏｌ）を数回に分けて３０分間かけて加えた。添加が終わった後に、該反応混合物を−３５℃で１時間かけて撹拌し、その後に２０〜２５℃まで昇温させて、そのものを更に１時間撹拌した。次いで、該反応液を水（３ｍＬ）を用いてクエンチし、酢酸エチル（３ｍＬ）を加えた。相分離し、該生成物を該水相から酢酸エチル（５ｍＬ）を用いて抽出した。該有機相を合わせて飽和炭酸水素ナトリウム（５ｍＬ）およびブライン（５ｍＬ）を用いて洗浄した。溶媒を除去した後に、２−ブロモ−３−ベンゼンプロパン酸エチル（０．４６ｇ）を収率が８１％で得た。
【００４３】
実施例４  酵素による光学活性な２−アセチルチオ−３−ベンゼンプロパン酸の製造
ラセミの２−アセチルチオ−３−ベンゼンプロパン酸エチル（１０（１０．０）または１００．０ｍｇ）を、ムコール・メイヘイ（ノボ製）由来の固定化リパーゼ（１０ｍｇ）を含む９０％ｔｅｒｔ−ブタノール（１０００μＬ）および１０％の２００ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ４．０）に加えた。ガラス容器を密封し、室温で０〜４０時間撹拌した。その一部（３０μＬ）を取り出して変換および光学純度を確認した。該一部をキラルＨＰＬＣカラム（キラルセルＡＤ、ダイセル化学社製）（移動相はヘキサン：エタノール：トリフルオロ酢酸（９８：２：０．１％）を使用）を用いて分析した。流速は１ｍＬ／分とし、検出は２３０ｎｍとした。この実験をも上記の通り、９０％アセトニトリル、アセトン、イソプロパノール中で行なった。他のラセミエステル（ブチル、イソブチルおよびトリフルオロエチル）をまた評価した。表１（上記）に記載の結果を得た。
【００４４】
実施例５  酵素による２−アセチルチオ−３−ベンゼンプロパン酸エチルの分割
オーバーヘッドスターラーおよびシリンジポンプを備えた５００ｍＬの３つ口丸底フラスコに、０．２Ｍ  ＮａＯＡｃ（６０ｍＬ、ｐＨ  ５）、ｔ−ＢｕＯＨ（２４０ｍＬ）の溶液に加え、次いでムコール・メイヘイ（ノボ製）由来の固定化リパーゼ酵素（３．０ｇ）を加えた。２−アセチルチオ−３−ベンゼンプロパン酸エチル（３０．０ｇ、溶媒（１５ｍＬ）を用いて希釈）を９時間かけてシリンジポンプを用いて加えた。添加後に、該反応混合物をｒｔで１３時間撹拌した。該酵素をろ過して除き、ｔ−ＢｕＯＨおよび０．２Ｍ  ＮａＯＡｃ（２×２０ｍＬ、容量比が８０：２０）を用いて洗浄した。該ろ液中の溶媒を減圧下で除去した。該濃縮したろ液をＭＴＢＥ（２００ｍＬ）および水（１５０ｍＬ）と一緒に混合し、２Ｎ  ＮａＯＨを用いてｐＨを７．５にまで調節した。相分離し、該エステルを該水相からＭＴＢＥ（３×１００ｍＬ）を用いて抽出した。溶媒を除去した後に、２−アセチルチオ−３−ベンゼンプロパン酸エチル（１９．２ｇ）を収率が６３．９％で回収した。ｐＨが７．５である該水相にＭＴＢＥ（２００ｍＬ）を加え、１０％Ｈ２ＳＯ４を用いてｐＨを２にまで調節した。相分離し、該酸を該水相からＭＴＢＥ（３×１００ｍＬ）を用いて抽出した。該有機相を合わせてブライン（２×１５０ｍＬ）を用いて洗浄し、大気圧下、５５℃でいくらか蒸留した。更に溶媒を除去した後に、（Ｓ）−２−アセチルチオ−３−ベンゼンプロパン酸（８．３ｇ）を収率が３１．１％（ｅｅ：８８．４％）で得た。
【００４５】
実施例６  （Ｓ）−２−アセチルチオ−３−ベンゼンプロパン酸の結晶化
溶媒の除去後に得た粗（Ｓ）−アセチルチオ−３−ベンゼンプロパン酸（８．２９ｇ、８８．４％）を、ＭＴＢＥ（４ｍＬ、１．４ｍＬ／ｇ）に溶解した。次いで、該酸のＭＴＢＥ溶液を４５℃まで加熱した。ヘプタン（２５ｍＬ）を、該温かい溶液が濁るまで滴下した。該スラリーに（Ｓ）−アセチルチオ−３−ベンゼンプロパン酸の結晶をシードし、撹拌せずにｒｔまでゆっくりと冷却した。ヘプタン（１５ｍＬ）の添加を撹拌しながら３０分間かけて続けた。氷／水浴中で冷却後に、該固体（５．５ｇ）を真空ろ過によって集めて、冷ヘプタンを用いて洗浄した。該精製した（Ｓ）−アセチルチオ−３−ベンゼンプロパン酸をＨＰＬＣによって分析して、純度および％ｅｅを測定した（純度は９８．２％、ｅｅは９８．７％、収率は６６％であった）。
【００４６】
実施例７  テトラブチルアンモニウムブロミドを用いた未反応の２−アセチルチオ−３−ベンゼンプロパン酸エチルのラセミ化
オーバーヘッドスターラー、冷却器および温度計を備えた２５０ｍＬの３つ口丸底フラスコに、２−アセチルチオ−３−ベンゼンプロパン酸エチル（４７．３ｇ、Ｒ−酸：Ｓ−酸＝１：１．７）およびテトラブチルアンモニウムブロミド（６．４ｇ、１０ｍｏｌ％）溶液を加えた。該エステル／臭化物の混合物を５０℃で２．５時間加熱した。該臭化物塩をろ過して除き、ＭＴＢＥ（３×１００ｍＬ）を用いて洗浄した。溶媒を減圧下で除去した後に、該ラセミ化した２−アセチルチオ−３−ベンゼンプロパン酸エチル（４７．６ｇ、Ｒ−酸：Ｓ−酸＝１：１．２）を少量の残留溶媒と一緒に本質的に１００％収率で回収した。
【００４７】
定義
本出願の目的のために、以下の用語は以下に記載するそれぞれの意味を有する。
・ハロ  ハロは、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを意味する。ハロ部分はクロロまたはブロモであることが好ましい。
【００４８】
本明細書に引用する全ての刊行物および文献（これは、特許および特許出願を含むが、これらに限定されない）は、各個々の刊行物または文献を本明細書中に引用することによって十分に記載されたものとして包含すると具体的に且つ個別に示す場合には、本明細書の一部を構成する。本出願が優先権を主張するいずれかの特許出願もまた、刊行物および文献として上記の様式でその全ては本明細書の一部を構成する。
【００４９】
本発明は好ましい態様を強調して記載しているが、該好ましい装置および方法の改変を使用することができ、そして本発明を本明細書中に具体的に記載される以外に実施することができることは、当該分野の当業者にとって明らかであろう。従って、本発明は以下の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および精神の範囲内に包含される全ての改変を含む。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004530405.tif 000045
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