(57)【要約】本発明は、細胞における翻訳に影響を与える活性物質のスクリーニングにおいて用いる為のベクター系に関連する。前記ベクター系は、医薬産業、医薬及び分子生物学において用いるの為に適している。前記ベクター系は、検出カセットに対して５´側に実質上位置するが、任意的には、検出カセットの３´側又は内側にも位置する翻訳調節エレメントからなる。前記系は更に、２つ以上のタンパク質レポーター構築体を様々な読み枠でコードする検出カセットを含んで成り、前記レポーター構築体は、細胞から放出される為のシグナル配列及び抗原部位であって、それによって固定化されて特異的に検出されて良い様々な抗原部位を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性物質のスクリーニングをする為のベクター系であって、前記ベクター系は、
−本質的に検出カセットの５´側に位置するが、任意に検出カセットの３´側又は内側にも位置して良い、翻訳の調節エレメント;
−異なる読み枠にある２つ以上のタンパク質レポーター構築体をコードする、検出カセット;
を含んで成り、ここで前記レポーター構築体は、
−細胞から放出される為のシグナル配列、及び
−レポータータンパク質の固定化及び示差的検出を可能にする様々な抗原部位
を含む、
活性物質のスクリーニングをする為のベクター系。
【請求項２】
前記ベクター系が、検出法を改変する為の、誘導された調節エレメントと代替のレポーター遺伝子、例えばGFP遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子が連結されていることを特徴とする、請求項１に記載の、活性物質のスクリーニングをする為のベクター系。
【請求項３】
図１に記載の、活性物質のスクリーニングをする為のベクター系（TCRS）。
【請求項４】
前記構築体が一過的又は恒常的な方法で細胞中に組み込まれ、その後当該細胞が物質に曝露され、そして当該構築体由来の生成されるレポーター量が測定及び比較されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の、活性物質をスクリーニングする方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のベクター系を含む、活性物質のスクリーニングにおいて用いる為の細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞での翻訳に影響を与える活性物質のスクリーニングにおいて用いる為のベクター系に関連する。本発明の応用分野には、医薬産業、医薬及び分子生物学分野が挙げられる。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質を形成する為にメッセンジャーRNAの翻訳を調節することは、重要な生物学的調節過程であり、その調節の解除は多くの疾患の原因になる。細胞中でのタンパク質翻訳の調節の病理を扱う論文が既にいくつか有る。
【０００３】
例えば、腸癌では、真核生物の翻訳の開始因子eIF−４Eの発現が増加していることが発見されている（Rosenwaldら、１９９９;Oncogen １８,２５７０）。この開始因子は、真核生物のmRNAの５´側に位置するCAP構造に結合し、翻訳の開始において重要な役割を果たす。これまで証明されたように、eIF−４Eの過剰発現が、げっ歯動物の正常な細胞の腫瘍細胞への形質転換をもたらした。そしてそれはヒトの細胞が形質転換する要因を増大することにつながる。一方で、eIF−4Eを取り除くことによりras発ガン遺伝子による形質転換は抑制され、発ガンにおける翻訳調節の基本的な役割を果たすことが示唆される。このような背景において、翻訳調節の基本的役割をすると考えられるmTORキナーゼは、発ガン遺伝子P３KとAktによる形質転換において重要な役割を果たすことが最近分かった（Aokiら、２００１;PNAS ９８、１３６）。翻訳の調節は、腫瘍形成とは別に、代謝症候群の一因にもなる。例えば、EIF２AK３の突然変異は、常染色体劣性「Wolcott−Rallison」症候群の原因として同定された（Delepineら、２０００;Gen.２５,４６）。前記EIF２AK３遺伝子は、翻訳のeIF２α開始因子のリン酸化反応を起こすキナーゼをコードする。代謝、胚発生、細胞の分化及び感染防御おける翻訳の他の多くの機能が現在周知であり、そして最近刊行された書籍「Translation Control of Gene Expression」（著者、Sonenberg, Hershey and Mathews, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, N.Y.、２０００;ISSN ０２７０−１８４７；３９）に総説されている。
【発明の開示】
【０００４】
本発明は、細胞中での翻訳過程を迅速に観察することを可能にするベクター系を開発する目的に基づいている。
【０００５】
本発明は、メインクレーム、好適な実施態様を示すサブクレームに従って実施される。
【０００６】
本発明の中心課題は、下記の更なる詳細を特徴とするだろう新規組換えレポータープラスミド構築体(ベクター系)である。それは、多くのモジュールからなる。これらのモジュールは、ｉ）翻訳の開始又はリボソームの機能に影響を与える調節エレメントとして、ii)調節過程の検出及び(翻訳に対する転写など)内部平衡を生じさせる為に、iii ）高試料流速により、より簡単に測定 (細胞からの翻訳産物の分泌及びミクロスケール上での固定化、抽出、並びに抗原標識を用いることでの検出) する為に用いられる。
１． 構築体には翻訳の調節エレメントが含まれる。これらのエレメントは、本質的に検出カセットの５´側に位置する(下を参照のこと)が、検出カセットの３´側又は内側にも位置して良い。この調節エレメントは、検出カセット内でコードされる様々なタンパク質レポーター構築体の示差的発現を調節する。
２． 前記構築体には検出カセットが含まれる。前記検出カセットは同じ又は異なる読み枠にある２つ以上のタンパク質レポーター構築体をコードする。翻訳の開始が示差的であることによりレポーターの量が変動し、これが示差翻訳を反映する。対照的に、翻訳の一般的な修飾をもたらす調節過程により、レポーター発現が均一に変動する。両方の調節形態は、計算に含まれて良くそして数学モデルに組み合わされて良く、従って、コンピューター制御による結果の評価及び方法の自動化が可能になる。
３． 前記レポーター構築体には、細胞から放出される為のシグナル配列が含まれる。従って、レポータータンパク質は細胞溶出物中又は上清中で測定されて良い。このような後者の特性は、有力な活性物質のハイスループット分析において特に有用である。
４． 前記レポーター構築体には、レポータータンパク質の固定化及び示差的検出を可能にする様々な抗原部位が含まれる。レポータータンパク質を固定化するのに１つの抗原部位が用いられ、それぞれのレポータータンパク質における異なる別のレポータータンパク質を示差的に検出する為に他の抗原部位が用いられる(実施例１を参照のこと)。
【０００７】
このようなモジュラー構造の組換えレポータープラスミド構築体である、翻訳調節レポーター系(TCRS)を用いることで、物質が、翻訳の示差的開始過程並びに翻訳中の様々な過程に影響を及ぼすその活性について調べられる。前記TCRS構築体は、一過性又は恒常的な方法で細胞中に組み込まれる。この後、細胞が物質にさらされ、そして構築体から生じる生成レポーター量が測定及び比較される。得られたデータは翻訳調節の方法を評価する為に用いられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の系は、翻訳調節過程に影響を与えそして疾患の薬理学的な修正に用いることができうる活性物質の迅速な検出及び至適化の為の基礎を供する助となる。更に、この系は、翻訳調節過程の科学的な分析の為に適している。
【０００９】
例を参考にすることにより、本発明は更なる詳細を以下に示されて良い。
【実施例】
【００１０】
実施例１
示されているものは、以下の特性を有する本発明の前記構築体の試作品である(図１を参照のこと)。
【００１１】
真核生物発現ベクターは、下記の構造を有する。βグロブリンmRNAに由来する約５０塩基対のリーダー配列を含む。これには、３´方向において、翻訳調節エレメントとして「κ」開始部位を含むラットC／EBPα遺伝子の上流オープンリーディングフレーム(uORF)が続く。これには、２つのレポーター遺伝子PR及びSRを含む検出カセットが続く。「A」はPR読み枠の開始部位を示す。PRには１次レポータータンパク質(PR)の放出をもたらすシグナル配列(プレプロトリプシン)が含まれる。FLAG配列及び血球凝集素（HA）エピトープが抗原エピトープとして続く。血球凝集素エピトープはレポータータンパク質を固定化するのに用いられる。SRは、開始部位（B）からコードを開始される。SRは、PRに対して３´方向に１ヌクレオチドシフトしている。読み枠がシフトすることで、リボソームが「A」から読み取りを開始する場合にはセンスSR産物が生じない。対照的に、Bからの開始ではPRとは異なる２次レポータータンパク質（SR）がもたらされる。PR同様、SRはN末端にプレプロトリプシンシグナル配列を有する。その隣はジーン１０抗原エピトープ及びHAエピトープである。どちらのレポーター構築体も、３´重複部で終結している。A開始部位又はB開始部位から始まるレポータータンパク質の発現は、調節エレメント（uORF、κ）による影響を受ける。
【００１２】
実施例２
構築体（図１）を細胞にトランストランスフェクションし、そしてレポータータンパク質を２４時間後と４８時間後にそれぞれ測定する。見かけ上、所望の特性（大きさ、分泌、抗原特性）を有するレポータータンパク質が生産される。類似構築体であるが、翻訳調節エレメントを欠く構築体により生産されるレポータータンパク質の量は、TCRSで生産されたものとは異なる。従って、本発明のTCRS構築体は、調節エレメントを介して翻訳に影響を与える物質のハイスループットスクリーニングで用いる為に適している。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
（原文記載なし）
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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