(57)【要約】本発明は、バラ植物体のミクロ繁殖およびバラ植物体のインビトロ開花についての組成物および方法に関する。若い苗条を誘発して、新芽を、ベンジルアデニン、オーキシン、炭素源としての２％スクロースを含む第１培養基を含有する閉鎖容器中でつくる。新芽を切りとり、小植物体の繁殖および増殖のための培養基上で培養する。ついで、小植物体を、チジアズロン、オーキシン、ミオイノシトールを含む花新芽誘発のための培養基に移し、ベンジルアデニンおよびオーキシンを含む小植物体伸長のための培養基上で培養し、最後に光ホルモンを有さない開花のための第５培養基中で培養する。あるいは、繁殖および増殖の後に小植物体を、ゼアチン、オーキシン、ミオイノシトールを含む花新芽誘発のための培養基に移し、ついで光ホルモンを有さない伸長および開花のための培養基上で培養する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
バラ植物体のミクロ繁殖およびその植物体からのバラ開花のための方法であって、
（ａ）成熟バラ植物体またはバラ植物組織培養物から若い苗条を無菌状態で調製し、
（ｂ）苗条を閉鎖容器中の第１培養基（第１培養基はサイトカイニン、オーキシン、炭素源としてのスクロースを含む）上で培養して、新芽をもつ外植体をつくり、
（ｃ）外植体から新芽を取りだし、
（ｄ）新芽を閉鎖容器中の第１培養基上で繁殖させて、新たに形成した新芽をもつ小植物体をつくり、
（ｅ）小植物体を閉鎖容器中の第１培養基上で増殖し、
（ｆ）増殖された小植物体を培養して、花新芽を閉鎖容器中の第２培養基（第２培養基は少なくとも１種のサイトカイニンおよびオーキシンを含む）上で誘発し、
（ｇ）花新芽をもつ小植物体を閉鎖容器中の第３培養基（第３培養基は炭素源としてのスクロースを含む）上で培養する
ことを含む方法。
【請求項２】
バラ植物体のミクロ繁殖およびその植物体からのバラ開花のための方法であって、
（ａ）成熟バラ植物体またはバラ植物組織培養物から若い苗条を無菌状態で調製し、
（ｂ）苗条を閉鎖容器中の第１培養基（第１培養基はベンジルアデニン、インドール酢酸およびナフタレン酢酸よりなる群から選ばれるオーキシン、炭素源としてのスクロースを含む）上で培養して、新芽をもつ外植体をつくり、
（ｃ）外植体から新芽を取りだし、
（ｄ）新芽を閉鎖容器中の第１培養基上で繁殖させて、新たに形成した新芽をもつ小植物体をつくり、
（ｅ）小植物体を閉鎖容器中の第１培養基上で増殖し、
（ｆ）増殖された小植物体を培養して、花新芽を閉鎖容器中の第２培養基（第２培養基はチジアズロン、カイネチン、炭素源としてのスクロース、ミオイノシトール、ナフタレン酢酸を含む）上で誘発し、
（ｇ）花新芽をもつ小植物体を培養して、伸長およびインビトロ開花を閉鎖容器中の第３培養基（第３培養基は炭素源としてのスクロース、ベンジルアデニン、インドール酢酸、ミオイノシトールを含む）上で誘発し、
（ｈ）伸長された小植物体を閉鎖容器中の第４培養基（第４培養基は炭素源としてのスクロースおよび抗生物質を含む）上で培養する、
ことを含む方法。
【請求項３】
第１培養基が濃度約１．０ｍｇ／Ｌ−約２．０ｍｇ／Ｌのベンジルアデニンを有し、スクロースの濃度が約２％である、請求項２の方法。
【請求項４】
第１培養基中のオーキシンが約０．０５ｍｇ／Ｌ−約０．２ｍｇ／Ｌのナフタレン酢酸である、請求項３の方法。
【請求項５】
第１培養基中のオーキシンが約０．１ｍｇ／Ｌのインドール酢酸である、請求項３の方法。
【請求項６】
第２培養基が濃度約０．１ｍｇ／Ｌ−約０．３ｍｇ／Ｌのチジアズロン、濃度約０．１ｍｇ／Ｌのカイネチン、濃度２５０ｍｇ／Ｌ−５００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール、濃度１．５％−３％のスクロースを有する、請求項２、３、４または５の方法。
【請求項７】
第２培養基が濃度約０．４ｍｇ／Ｌ−約０．５ｍｇ／Ｌのチジアズロン、濃度約４００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール、濃度約３％のスクロースを有する、請求項６の方法。
【請求項８】
第３培養基が濃度０．５−０．２ｍｇ／Ｌのベンジルアゼニン、濃度１ｍｇ／Ｌのインドール酢酸、濃度２５０ｍｇ／Ｌ−５００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール、濃度約３％のスクロースを有する、請求項６または７の方法。
【請求項９】
第４培養基が濃度約２％のスクロースを有し、抗生物質が濃度２０ｍｇ／Ｌ−５０ｍｇ／Ｌのアンピシリンである、請求項８の方法。
【請求項１０】
バラ植物体のミクロ繁殖およびその植物体からのバラ開花のための方法であって、
（ａ）成熟バラ植物体またはバラ植物組織培養物から若い苗条を無菌状態で調製し、
（ｂ）苗条を閉鎖容器中の第１培養基（第１培養基はベンジルアデニン、インドール酢酸およびナフタレン酢酸よりなる群から選ばれるオーキシン、炭素源としてのスクロースを含む）上で培養して、新芽をもつ外植体をつくり、
（ｃ）外植体から新芽を取りだし、
（ｄ）新芽を閉鎖容器中の第１培養基上で繁殖させて、新たに形成した新芽をもつ小植物体をつくり、
（ｅ）小植物体を閉鎖容器中の第１培養基上で増殖し、
（ｆ）増殖された小植物体を培養して、閉鎖容器中の第２培養基（第２培養基はゼアチン、炭素源としてのスクロース、ミオイノシトール、ナフタレン酢酸を含む）上で花新芽を誘発し、
（ｇ）花新芽をもつ小植物体を培養して、伸長およびインビトロ開花を閉鎖容器中の第３培養基（第３培養基は炭素源としてのスクロースおよび抗生物質を含む）上で誘発する、
ことを含む方法。
【請求項１１】
第１培養基が濃度約１．０ｍｇ／Ｌ−約２．０ｍｇ／Ｌのベンジルアデニンを有する、請求項１０の方法。
【請求項１２】
第１培養基中のオーキシンが約０．０５ｍｇ／Ｌ−約０．２ｍｇ／Ｌのナフタレン酢酸である、請求項１１の方法。
【請求項１３】
第１培養基中のオーキシンが約０．１ｍｇ／Ｌのインドール酢酸である、請求項１１の方法。
【請求項１４】
第２培養基が濃度約０．５ｍｇ／Ｌ−約１．０ｍｇ／Ｌのゼアチン、濃度２５０ｍｇ／Ｌ−５００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール、濃度１．５％−３％のスクロースを有する、請求項１０，１１，１２または１３の方法。
【請求項１５】
第２培養基が濃度約４００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール、濃度約３％のスクロースを有する、請求項１４の方法。
【請求項１６】
第３培養基が濃度約２％のスクロースを有し、抗生物質が濃度２０ｍｇ／Ｌ−５０ｍｇ／Ｌのアンピシリンである、請求項１５の方法。
【請求項１７】
各培養基が栄養培地をさらに含む、請求項１、２または１０の方法。
【請求項１８】
栄養培地が Ｇａｍｂｏｒｇ’ｓ Ｂ５ ビタミン類と組合された改変ＭＳ培地である、請求項１７の方法。
【請求項１９】
バラ植物体が Ｒｏｓａ ｈｙｂｒｉｄａ である、請求項１、２または１０の方法。
【請求項２０】
Ｒｏｓａ ｈｙｂｒｉｄａ が ＰＡＲＡＤＥ（登録商標）バラ変種よりなる品種から選ばれる、請求項１９の方法。
【請求項２１】
Ｒｏｓａ ｈｙｂｒｉｄａ が Ｏｒａｎｇｅ ＰＡＲＡＤＥ（登録商標）、Ｆｉｅｓｔａ ＰＡＲＡＤＥ（登録商標）、Ｓｃａｒｌｅｔ ＰＡＲＡＤＥ（登録商標）、Ｂｉａｎｃａ ＰＡＲＡＤＥ（登録商標）、Ｆｒｏｓｔｙ ＰＡＲＡＤＥ（登録商標）よりなる品種から選ばれる、請求項２０の方法。
【請求項２２】
バラ植物体の組織培養ミクロ繁殖のための培養基であって、約１．０−約２．０ｍｇ／Ｌのベンジルアゼニン、約１．０−約２．０ｍｇ／Ｌののインドール酢酸、炭素源としての約２％のスクロースを含む培養基。
【請求項２３】
バラ小植物体のミクロ繁殖のための培養基であって、約２．０ｍｇ／Ｌのベンジルアゼニン、約０．０５ｍｇ／Ｌののナフタレン酢酸、炭素源としての約２％のスクロースを含む培養基。
【請求項２４】
バラ植物体からの花新芽の誘発のための培養基であって、チジアズロン、カイネチン、ゼアチンよりなる群から選ばれる少なくとも１種のサイトカイニン；濃度約０．５ｍｇ／Ｌのナフタレン酢酸；炭素源としての約３％のスクロース；および約４００ｍｇ／Ｌのミオイノシトールを含む培養基。
【請求項２５】
栄養培地をさらに含む、請求項２２、２３または２４の培養基。
【請求項２６】
栄養培地が Ｇａｍｂｏｒｇ’ｓ Ｂ５ ビタミン類と組合された改変ＭＳ培地である、請求項２５の培養基。
【請求項２７】
濃度約０．４−０．５ｍｇ／Ｌのチジアズロン、濃度約０．５ｍｇ／Ｌのナフタレン酢酸、濃度約０．１ｍｇ／Ｌのカイネチン、炭素源としての約３％のスクロース；および約４００ｍｇ／Ｌのミオイノシトールを含むが、ゼアチンが培地中に存在しない、花新芽の誘発のための、請求項２６の培養基。
【請求項２８】
濃度約０．５−１．０ｍｇ／Ｌのゼアチン、濃度約０．５ｍｇ／Ｌのナフタレン酢酸、炭素源としての約３％のスクロース；および約４００ｍｇ／Ｌのミオイノシトールを含むが、チジアズロンおよびカイネチンが培地中に存在しない、花新芽の誘発のための、請求項２６の培養基。
【請求項２９】
バラ植物体が Ｒｏｓａ ｈｙｂｒｉｄａ である、請求項２４の培養基。
【請求項３０】
Ｒｏｓａ ｈｙｂｒｉｄａ が Ｏｒａｎｇｅ ＰＡＲＡＤＥ（登録商標）、Ｆｉｅｓｔａ ＰＡＲＡＤＥ（登録商標）、Ｓｃａｒｌｅｔ ＰＡＲＡＤＥ（登録商標）、Ｂｉａｎｃａ ＰＡＲＡＤＥ（登録商標）、Ｆｒｏｓｔｙ ＰＡＲＡＤＥ（登録商標）よりなる品種から選ばれる、請求項２９の培養基。
【請求項３１】
バラ品種のミクロ繁殖およびその植物体からのバラ開花のための方法であって、
（ａ）成熟バラ植物体またはバラ植物組織培養物から若い苗条を無菌状態で調製し、
（ｂ）苗条を閉鎖容器中の第１培養基（第１培養基はサイトカイニン、オーキシン、炭素源としてのスクロースを含む）上で培養して、新芽をもつ外植体をつくり、
（ｃ）外植体から新芽を取りだし、
（ｄ）新芽を閉鎖容器中の第１培養基上で繁殖させて、新たに形成した新芽をもつ小植物体をつくり、
（ｅ）小植物体を閉鎖容器中の第１培養基上で増殖し、
（ｆ）増殖された小植物体を第１培養基上で培養する
ことを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、植物栽培、植物クローニング、園芸の分野に関する。特に、本発明は、バラ植物体または組織培養物の栄養繁殖およびこの植物体または組織培養物から誘導されるバラのインビトロでの開花誘発に関する。さらに、本発明は、バラおよびその植物体の、インビトロでのミクロ繁殖、花新芽誘発、開花についての培地処方および効率的な方法に関する。
【０００２】
発明の背景
バラは Ｒｏｓａｃｅａｅ Ｊｕｓｓ 科に属する植物である。この科は非常に大きく、１００以上の属があり、２０００以上の草本から木本に及ぶ種がある。多くの重要な食用および装飾用植物が Ｒｏｓａｃｅａｅ 科であって、例えば、イチゴ、リンゴ、アーモンド、サクラ、モモ、クロイチゴを含む。今日のバラの発生に関与する正確な種はわかっていない。大部分のバラ種は、北半球の温帯、特に中国南部および極東からヒマラヤおよびベンガルさらにエチオピア、および北極圏からニューメキシコにかけての北西アメリカに見られる。１８世紀末に極東からヨーロッパに持ち込まれた反復性すなわち多年生の開花バラ植物体は、中国、インド、日本における数え切れない世代での育種の結果である。バラは世界で最も人気の高い花のひとつである。バラは、切花、鉢植え植物、家庭菜園での代表的植物として、一般に栽培される。切花バラには種々の型があり、例えば、長茎標準、短茎標準、小花スィートハート、多花房バラなどを含む。
【０００３】
現在市販されているほとんどのバラの変種はハイブリドであり、主に後代における形質の分離のために、種子からの繁殖は容易に選択できない。ハイブリド切花バラの営業的繁殖は、特殊な苗条の挿木または接穂を確立している野生バラの根茎に接芽または接木することで通常実施される。小さい鉢植えバラについては、温室での植物体の挿木による無性繁殖が普通の方法である。上記方法と異なる方法は、ミクロ繁殖であって、腋芽繁殖またはインビトロ無性繁殖としても知られ、無菌状態で腋芽から植物を繁殖せしめる方法である。ミクロ繁殖は、所望の植物体を多くの遺伝的に画一の小植物体に迅速に繁殖せしめ得る利点がある。ミクロ繁殖から誘導される小植物体は、細菌、真菌、ウイルスの感染がなく、また有害昆虫による疾病も無い。ミクロ繁殖の方法は、関連植物体から外植体の調製、光ホルモンを補充した培地への外植体の培養、インキュベーション、真苗条の基準苗条（根を有する苗条）への回復を含む［Ｄｏｕｇｌａｓ， Ｉｎ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ６， Ｗ． Ｐｏｌｌａｒｄ， Ｊ． Ｍ． Ｗａｌｋｅｒ， ｅｄｓ． （１９９０）； Ｇｅｏｒｇｅ ａｎｄ Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｅｘｅｇｅｔｉｃｓ， Ｌｔｄ． Ｕ．Ｋ．， ｐ．３ （１９８４）； Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｔｈｏｒｐｅ， Ｉｎ： Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ， ｐ．４９−６５， Ｉ． Ｋ． Ｖａｓｉｌ， ｅｄ． （１９８６）］。ミクロ繁殖は、ある種の植物の多量繁殖について強力な費用効率的手段を提供する。この技術の重要な点は、繁殖される植物に有意の経済的価値を付加し得ることである。関連文献を調べると、現存の繁殖プロトコールは一般的にインビトロで小植物体の開花を誘発するのに非常に効率が悪い。効率は用いる植物によって異なるが、最もよい品種でも約１０％と低い。
【０００４】
最近、高さが７．５ｃｍ−２０ｃｍの鉢植えバラ変種が、その手頃な大きさおよび持ちの良さからして、切花バラに比して非常に好まれている。また、適当な費用で多数の花をつくる能力が鉢植えバラの人気をさらに高めている。小型バラ・ハイブリドの育種も世界中で行われている。例えば、米國のみでも３００以上の登録された小型バラ・ハイブリドが存在する。営業用小型バラ・ハイブリドの最も大きい育種者は、デンマークの Ｐｏｕｌｓｅｎ Ｒｏｓｅｒ ＡｐＳ（登録商標 ＰＡＲＡＤＥ）およびオランダの Ｄｅ Ｒｕｉｔｅｒ’ｓ Ｎｅｗ Ｒｏｓｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ である。鉢植え小型バラは、装飾的効果のために庭園、中庭、さらに家庭で展示される。しかし、鉢植え小型バラは、室内装飾に使用されるに、鉢内の土壌についての必要条件から主に来る制限がある。また、全平均的高さ１５−３０ｃｍ（鉢を含み）であることから、鉢植え小型植物はテーブルなどに置くのになお高すぎる。さらに、世界的に都市化が進行し、ますます多くの人々が家庭や職場などで充実した室内時間を過ごすようになっている。従って、清潔で手頃な大きさの、長持ちする多数の花をつけた装飾的な美しさのバラについて需要が存在する。
【０００５】
バラの営業的繁殖は、特殊な苗条挿木を確立している野生のバラの根茎に接芽または接木することで通常実施される。近年、組織培養によるバラの繁殖について多くの発表がなされている。それらの文献からすると、異なる種類およびタイプが様々な栄養物およびホルモンを必要としている。バラについての多くの営業育種者がなお伝統的な方法でバラ植物体を繁殖さしている。つる性バラ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｂｌａｚｅ について開発された培養基が３種の小型バラの顕著な生育を可能にしたが、すべてのハイブリド茶バラについてではない（Ｈａｓｅｇａｗａ， Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｓｏｃ． Ｈｏｒｔ． Ｓｃｉ． １９８０， １０５： ２１６−２２０）。さらに、Ｒ． ｈｙｂｒｉｄａ 品種 Ｔｒｏｐｉｃａｎａ および Ｂｒｉｄａｌ Ｐｉｎｋ を増殖するための植物成長調節物の必要条件が２つの古くからの世界的な種 Ｒ． ｄａｍａｓｃｅｎａ および Ｒ． ｃａｎｉｎａ とかなり相違している（Ｋｈｏｓｈ−Ｋｈｕｉ ａｎｄ Ｓｉｎｋ， Ｊ． Ｈｏｒｔ． Ｓｃｉ． １９８２， ５７， ３１５−３１９； Ｋｈｏｓｈ−Ｋｈｕｉ ａｎｄ Ｓｉｎｋ， Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ １９８２， １７， ３７１−３７６）。
【０００６】
成長条件を最適にするために、多くの研究が特定の成長調節物の濃度を変えることに焦点を当てている（Ｈａｓｅｇａｗａ、前出）。いくつかの研究が、他の無機および有機の成分、新芽の位置、温度、１日の照光時間、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ 成分濃度、移行間の培養週の効果について調べている（Ｋｈｏｓｈ−Ｋｈｕｉ ａｎｄ Ｓｉｎｋ、前出および Ｂｒｅｓｓａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｓｏｃ． Ｈｏｒｔ． Ｓｃｉ． １９８２， １０７， ９７９−９９０）。Ｄｏｂｅｒ ｅｔ ａｌ．の米国特許 ５，８４３，７８２ は、節を持つ茎を、サイトカイニン、オーキシン、ジベレリンを含有する第１培養基で、ついでサイトカイニン、オーキシン、ジベレリンを含有する第２培養基で培養して、土壌に移し変え得る開花バラ植物体を生産することを含むバラ植物体のミクロ繁殖法を開示している。
【０００７】
本発明は、土壌への移し変えや鉢の必要性なしに、小型バラ小植物体を繁殖し、および小型バラの生産のためのインビトロ開花を効率的に誘発するのに有用な新規の組成物および方法の開発を目的とする。好ましい実施態様において、本発明は、商業的および装飾的目的のために、閉鎖された容器において培養基上で開花されたバラを提供する。
本発明の背景を明らかにするために、または実施についての追加の詳細を提供するために、引用した公表文献などは、出典明示により本明細書の一部とする。
【０００８】
本発明の要約
ひとつの態様において、本発明は、バラ植物体またはその組織培養物の栄養繁殖および増殖についての方法を提供する。
別の態様において、本発明は、バラ植物体またはその組織培養物から誘導される増殖小植物体のインビトロ誘発開花についての方法を提供する。
別の態様において、本発明は、バラ植物体またはその組織培養物から誘導される増殖の小植物体のミクロ繁殖およびインビトロ開花についての組成物および方法を提供する。
【０００９】
ひとつの実施態様において、鉢植え植物体からのバラ苗条を、無機栄養物、ビタミン、サイトカイニン、オーキシン、炭素源としてのスクロースを含む第１培養基で、苗条から新芽が形成するまで培養する。新芽を苗条から切り、第１培養基を含有する閉鎖容器に約５０日間入れて、小植物体および新たな新芽をつくる。新たに形成された新芽を切り、第１培養基を含有する閉鎖容器に移し培養して、小植物体および新芽を増殖する。増殖工程の後、バラ新芽を切除し、再び培養して、第１培養基上で小植物体をつくる。
【００１０】
ひとつの好ましい実施態様において、小植物体を、無機栄養物、ビタミン、炭素源としてのスクロース、光ホルモンであるチジアズロン、サイトカイニンであるカイネチン、オーキシン、および選択的にミオイノシトールを含む第２培養基に移して、花新芽を誘発する。このプロトコールにおいて、花新芽の誘発の後に、小植物体を、無機栄養物、ビタミン、炭素源としてのスクロース、サイトカイニン、オーキシン、ミオイノシトールを含む伸長培地に移す。伸長後に、小植物体を、インビトロ開花のために無機栄養物、ビタミン、アンピシリンを含む培養基上で培養する。
【００１１】
他の実施態様において、一旦新芽を増殖し、ついで小植物体を、無機栄養物、ビタミン、炭素源としてのスクロース、サイトカイニンであるゼアチン、イノシトールを含む培養基に移し、花新芽を誘発する。このプロトコールにおいては、小植物体を、インビトロ開花のために無機栄養物、ビタミン、アンピシリンを含む培養基に直接移す。
【００１２】
図面の簡単な説明
本特許の出願書類は少なくとも１つの着色図面を含む。その着色コピーは、特許商標庁に必要な料金を支払うと入手できる。図１は、小型バラ品種の繁殖およびインビトロ開花に関与する種々の工程の完了に要する時間を表すフローチャートを示す。図２は、閉鎖容器におけるバラ小植物体インビトロ開花についての完全な写真を示す。図３は、バラ小植物体開花を有する棚上の閉鎖容器についての完全な写真を示す。
【００１３】
発明の詳細な記述
ひとつの態様において、本発明は、バラ植物体またはその組織培養物の栄養繁殖および増殖についての方法を提供する。
別の態様において、本発明は、バラ植物体またはその組織培養物から誘導される増殖の小植物体のインビトロ誘発開花についての方法を提供する。
別の態様において、本発明は、バラ植物体またはその組織培養物から誘導される増殖の小植物体のミクロ繁殖およびインビトロ開花についての組成物を提供する。
【００１４】
ひとつの実施態様において、鉢植え植物体からのバラ苗条を、無機栄養物、ビタミン、サイトカイニン、オーキシン、炭素源としてのスクロースを含む第１培養基で、苗条から新芽が形成するまで培養する。新芽を苗条から切り、第１培養基を含有する閉鎖容器に約５０日間入れて、小植物体および新たな新芽をつくる。新たに形成された新芽を切り、第１培養基を含有する閉鎖容器に移し培養して、小植物体を増殖する。増殖工程の後、バラ新芽を切除し、再び培養して、第１培養基上で追加の小植物体をつくる。
【００１５】
花新芽誘発のための工程を含めることで、バラ植物体品種についての花効率を、以前に開示されている方法に比して非常に改善できることを発見した。この工程では、光ホルモンを増殖後の培養基に加える。また、インビトロ開花の効率増加が第１培養基において光ホルモンを必要としないことも発見した。さらに、ある場合には、花新芽誘発の後およびインビトロ開花の前に伸長工程（伸長培養基の成分として特に光ホルモンを含む）を加えると、先行技術に比してインビトロ開花の効率が増加することを発見した。ひとつの好ましい実施態様において、サイトカイニン、オーキシン、炭素源としてのスクロースを含む第１培養基における小植物体の増殖の後に、小植物体を、無機栄養物、ビタミン、炭素源としてのスクロース、光ホルモンであるチジアズロン、サイトカイニンであるカイネチン、オーキシン、ミオイノシトールを含む第２培養基に移して、花新芽を誘発する。このプロトコールにおいて、花新芽の誘発の後に、小植物体を、無機栄養物、ビタミン、炭素源としてのスクロース、サイトカイニン、オーキシン、ミオイノシトールを含む伸長培養基に移す。伸長後に、小植物体を植物伸長のために無機栄養物、ビタミン、オーキシンを含む培養基上で培養し、ついで伸長された小植物体をインビトロ開花のために無機栄養物、ビタミン、アンピシリンを含む培養基に移す。
【００１６】
他の実施態様において、一旦新芽を第１培養基で増殖し、ついで小植物体を、無機栄養物、ビタミン、炭素源としてのスクロース、光ホルモンであるゼアチン、オーキシン、ミオイノシトールを含む培養基に移して、花新芽を誘発する。ついで、小植物体を、インビトロ開花のために無機栄養物、ビタミン、アンピシリンを含む培養基に直接移す。
【００１７】
これらの方法の各々において、栄養繁殖および増殖から誘導されたバラ植物体は、本発明の培地で保存され、展示され得る開花バラであり得る。非開花の小植物体も追加の繁殖方法で使用できる。
【００１８】
バラ植物体の組織培養ミクロ繁殖のための培養基も本発明の実施態様であって、約１．０−約２．０ｍｇ／Ｌのベンジルアデニン、約０．０５−約０．１ｍｇ／Ｌのインドール酢酸またはナフタレン酢酸、約１．５−約２．０ｍｇ／Ｌの炭素源としてのスクロースを含む。好ましくは、培養基は約２．０ｍｇ／Ｌのベンジルアゼニン、約０．１ｍｇ／Ｌのオーキシン、２％のスクロースを含有する。本発明の培地はジベレリン酸を含有しない。
【００１９】
本発明方法によりつくられるバラ植物体は、開花バラを含み、本発明の範囲内にある。バラは、好ましくは Ｒｏｓｅ であり、最も好ましくは Ｏｒａｎｇｅ ＰＡＲＡＤＥ（登録商標）、Ｆｉｅｓｔａ ＰＡＲＡＤＥ（登録商標）、Ｓｃａｒｌｅｔ ＰＡＲＡＤＥ（登録商標）、Ｂｉａｎｃａ ＰＡＲＡＤＥ（登録商標）、Ｆｒｏｓｔｙ ＰＡＲＡＤＥ（登録商標）よりなる群から選ばれる品種である。
【００２０】
本発明はまた、本発明の培養基を含有する閉鎖容器に含有される節をもつバラの茎を含むバラ組織培養物に関する。このバラの茎は少なくとも１つの苗条を含み得、バラ組織培養物は開花バラなどのバラをつくり得る。バラ外植体も本発明の範囲である。バラ外植体は、節をもつバラの茎、節をもつバラの茎と少なくとも１つの苗条、バラ苗条から選択できる。バラ外植体は、培養基を含む閉鎖容器に入れて、開花バラなどのバラ植物体がつくられるまで、培養する。
【００２１】
本発明は、植物体が維持される時間で栄養または水の補給をしないで、培養中に残留し得る開花バラ植物体に特に関する。バラの花を閉鎖容器に入れると、典型的には１月以上維持できる。本発明における使用で考えられる閉鎖容器に関する唯一の制限は、水および鉱物、塩、ビタミンなどの栄養物を含有する固体培養基を漏らさないで容器を保持し得なければならないことである。特定の実施態様において、培養基は、容器中で成長するインビトロ培養の開花植物体の魅力を高めるために特に選択する１以上の染料も含み得る。ひとつの実施態様において、覆いと基体が一緒になって閉鎖容器をつくり、覆いと基体は、両者が通常の扱いや移動で分離しないように、また湿気が容器の内側に残留するように、接着している。覆いおよび所望により容器全体も高い透明性で澄明な材料でできており、そして容器の内表面に水が凝縮するのを防ぐ化学物質で容器の内側が被膜されているので、内側のインビトロ開花小植物体をはっきりと見ることができる。適当な材料には、ポリカルボネート、ポリ（メチルメタアクリレート）、ガラスがある。澄明性があり高熱（例えば、＞１６０℃）および圧（＞大気圧）に耐え得る他のいかなる材料も使用できる。この目的に使用できる抗もや化学物は、Ｓｉｃａｎｅｔｔ（登録商標）（Ａｎｆｏｒａ （ＳＶ）， Ｉｔａｌｙ）、Ｓｉｃｌａｉｒ（登録商標）（Ｎｅｔｔｏｙａｎｔ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）、抗静電剤（ＳＩ−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓ．Ａ．， Ｆｒａｎｃｅ 製）である。抗もや化学物は、容器の内側表面に直接噴霧する。本発明は、上記の組織培養ミクロ増殖法の２工程の各工程も対象とする。この一般的枠組みの中で、上記の成分、ベンジルアデニンおよびインドール酢酸またはナフタレン酢酸に加えて、本発明の培養基は栄養培地をさらに含む。好ましい培地は、改変された Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ （ＭＳ）基本培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ．， Ｖｏｌ． １５， ｐｐ． ４７３−９７ （１９６２））である。改変ＭＳ培地は、Ｇａｍｂｏｒｇ’ｓ Ｂ５ ビタミン類（最終濃度１０ｍｇ／Ｌの塩酸チアミン、１ｍｇ／Ｌのニコチン酸、１ｍｇ／Ｌのピリドキシン、１００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール）を含有し、ｐＨ５．８、２％スクロースを有し、０．３０％フィタゲルでゲル化されたＭＳ培地である。好ましい実施態様において、これは、本明細書に記載の種々の光ホルモンなどの追加物が補充された培地である。
【００２２】
本発明の好ましい実施態様において使用されるオーキシンは、インドール酢酸およびナフタレン酢酸である。サイトカイニンには、チジアズロン、カイネチン、６−ベンジルアデニン、ゼアチンがある。
【００２３】
ベンジルアデニンは他の天然または合成のサイトカイニンで代用できる。このサイトカイニンは、６−ベンジルアミノプリン・リボシド、６−（γ−γ−ジメチルアリルアミノ）プリン、ＤＬ−ジヒドロゼアチン、ｔ−ゼアチン・リボシド、ゼアチン、Ｎ−（２−クロロ−４−ピリジル）−Ｎ’−フェニルウレア、Ｎ−ベンジル−９−（２−テトラヒドロピラニル）アデニン、カイネチン、カイネチン・リボシドなどよりなる群から選択できる。サイトカイニンは、単独または１以上の他のサイトカイニンと組合せて使用できる。インドール酢酸は他の天然または合成のオーキシンで代用できる。このオーキシンは、ナフタレン酢酸、インドール酪酸、ピクロラム、ジカムバなどよりなる群から選択できる。サイトカイニンは、濃度約０．０３−約０．３ｍｇ／ｌであり、単独または１以上の他のサイトカイニンと組合せて使用できる。培地は、ホルモン性成分が植物体の具体的な変種のために提供されるように改変できる。栄養物レベルは開花を誘発するときに基本培地において改変できる。例えば、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）培養基は、組織培養植物細胞の一般的な栄養および成長の必要条件を提供するものであって、当技術分野で知られているような他の通常の培養基または成長培地で代用できる。当業者は、使用される各成分の具体的な量が、培養されるバラのタイプに依存することを理解するであろう。典型的には、成分を最初は低レベルで用い、その量を必要に応じて増加して所望の作用を得る。
【００２４】
最適には、花新芽の誘発のための組成物および方法に加えられるチジアズロンの濃度は０．４−０．５ｍｇ／Ｌである。
最適には、ゼアチンの濃度は０．５−１．０ｍｇ／Ｌである。
【００２５】
ベンジルアデニンを増殖および栄養繁殖のための培地に加えるとき、最適濃度は約２ｍｇ／Ｌである。ベンジルアデニンを、誘発された花新芽をもつ小植物体の伸長のために使用される培地に加えるとき、最適濃度は約０．１ｍｇ／Ｌである。
【００２６】
ナフタレン酢酸が本発明の培地に加えられるオーキシンであるとき、その濃度は２ｍｇ／Ｌである。最適には、ナフタレン酢酸の濃度は０．０５−０．１ｍｇ／Ｌである。
【００２７】
インドール酢酸が本発明の培地に加えられるオーキシンであるとき、その濃度は０．０５−０．１ｍｇ／Ｌである。最適には、インドール酢酸の濃度は小植物体の増殖のために０．１ｍｇ／Ｌである。インドール酢酸を、誘発された花新芽をもつ小植物体の伸長のために使用される培地に加えるとき、最適濃度は約１．０ｍｇ／Ｌである。
【００２８】
ミクロ繁殖条件ついて種々の変更は当業者に明らかであろう。それには、適当な遺伝子型ならびに生理的および発生上の状態の植物体からの培養開始のためのドナー組織を選択することを含む。さらに、外植体源の変更、植物体変種、培養物を生育する物理的環境を本発明では考慮する。例えば、気体環境、温度、光条件を変えて、閉鎖容器中のバラ植物体の改善をなし得る。一般的に、花新芽誘発に最適の温度は＜２５℃である。適当なゲル化剤には、限定でないが、ゲランガム含有の ＰＨＹＴＡＧＥＬ （商標）、ゲランガム含有の ＧＥＬＲＩＴＥ （商標）、ゲランガム含有の ＡＧＡＲＧＥＬ （商標）など；寒天Ａ、Ｅ、Ｍ型高ゲル強度精製細菌性フレークなどの寒天；ＡＧＡＲＧＥＬ （商標）、寒天とＰＨＹＴＡＧＥＬ （商標）のブレンド；ＶＩＩ型などのアガロース；アルギニン酸；カラゲナン；トランスファーゲルまたはヒドロキシエチルセルロース等々がある。
【００２９】
バラ外植体は本発明の実施態様である。バラ外植体は、上記の培養基を含む閉鎖容器に入れて、バラ植物体例えば開花バラ植物体がつくられるまで、培養し得る。外植体は、限定でないが、バラ属などの植物体から得ることができる。それには、限定でないが、ハイブリドバラ Ｒｏｓａ ｈｙｂｒｉｄａ、例えば、 Ｏｒａｎｇｅ ＰＡＲＡＤＥ（登録商標）、Ｆｉｅｓｔａ ＰＡＲＡＤＥ（登録商標）、Ｓｃａｒｌｅｔ ＰＡＲＡＤＥ（登録商標）、Ｂｉａｎｃａ ＰＡＲＡＤＥ（登録商標）、Ｆｒｏｓｔｙ ＰＡＲＡＤＥ（登録商標）などの品種；Ｒｏｓａ ｄａｍａｓｃｅｎａ、Ｒｏｓａ ｍｕｌｔｉｆｌｏｒａ、Ｒｏｓａ ｇａｌｌｉｃａ などがある。本発明の組織培養法は、閉鎖容器中でバラ外植体を培養することを含む。この容器には、限定でないが、ペトリ皿、試験管、フラスコ、エンデンドルフ管、乳児食ジャー、缶詰ジャーなどの、本発明の方法において本発明のバラ植物体の成長を支持し得る閉鎖容器がある。
【００３０】
本発明の方法によりつくられるバラも、開花バラを含み、本発明の範囲内にある。バラ植物体を閉鎖容器に入れることができる。バラ組織培養物および植物体も本発明の範囲内にある。バラ組織培養物は、開花バラなどのバラをつくり得る。
【００３１】
閉鎖容器中のバラを用いて、花の色および形についての新しい品種をスクリーンし得る。例えば、植物体を、バラのカルス、外植体、腋芽の組織培養において変異処置を行い得る。変異されたバラ植物体は、本発明の培養物中で生育し、変えられた花の色、形、疾病耐性、成長能、寒暖感受性およびその他の有益な特性を有する植物体についてスクリーンできる。さらに、本発明はまた、培養におけるバラ植物体の交差受粉を可能にする。例えば、花が視覚的に発生した雌雄の器官を含有するので、この花を、同じ花に由来する花粉または他の植物体に由来する花粉で受粉せしめ得る。あるいは、花をインビトロで繁殖せしめ、装飾目的のために清潔な透明の容器に保存し、展示し得る。
【００３２】
一般的方法
本明細書において、下記の用語および略号を用いる。
ベンジルアデニンはサイトカイニン型の植物ホルモンである。
ゼアチンはサイトカイニン型の植物ホルモンである。
ナフタレン酢酸または２−ナフチル酢酸はオーキシン型の植物ホルモンである。
インドール酢酸または３−インドール酢酸は植物ホルモンである。
【００３３】
用語サイトカイニンは植物ホルモンを意味する。低濃度で、これらの有機物質は根細胞の伸長を促進する。
用語オーキシンは植物ホルモンを意味する。低濃度で、これらの有機物質は、苗条の伸長を促進し、他の特殊な成長作用を調節する。オーキシンには、３−（３−インドリル）−プロピオン酸（ＩＰＡ）、アブシシン酸（ＡＢＡ）、２，４−Ｄ、ナフタレン酢酸、ＧＡ３がある。
【００３４】
用語「品種」は、天然に生じた変種と区別できるような、営業上価値ある園芸的に誘導された変種を意味する。
本明細書での用語「ミクロ繁殖」は、植物体のインビトロ無性クローン性再生産を意味する。ここでは、多数の新苗条を親植物体の誘発された新芽から、植物ホルモン、鉱物、ビタミン、炭水化物を適当な濃度で含有する培地での培養により、短い期間で得ることができる。
【００３５】
下記の培地を本発明の実施に用いた。
ＲＭＳ０：完全強の Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ Ｓｋｏｏｇ 無機栄養物および Ｇａｍｂｏｒｇ’ｓ Ｂ５ ビタミン類（最終濃度１０ｍｇ／Ｌの塩酸チアミン、１ｍｇ／Ｌのニコチン酸、１ｍｇ／Ｌのピリドキシン、１００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール）を含有し、ｐＨ５．８、２％スクロースを有し、０．３０％フィタゲルでゲル化された改変ＭＳ培地である。異なる発生段階で種々の光ホルモンを培地に補充し得る。
【００３６】
ＲＭＳ１：２ｍｇ／Ｌの６−ベンジルアデニンおよび０．０５ｍｇ／Ｌのナフタレン酢酸が補充されたＲＭＳ０。
ＲＭＳ２：３％スクロースを有し、０．４−０．５ｍｇ／Ｌのチジアズロン、０．０５ｍｇ／Ｌのナフタレン酢酸、０．１ｍｇ／Ｌのカイネチン、４００ｍｇ／Ｌのイノシトールが補充されたＲＭＳ０。
【００３７】
ＲＭＳ３：３％スクロースを有し、０．５−１．０ｍｇ／Ｌのゼアチン、０．０５ｍｇ／Ｌのナフタレン酢酸、４００ｍｇ／Ｌのイノシトールが補充されたＲＭＳ０。
ＲＭＳ４：３％スクロースを有し、０．１ｍｇ／Ｌのベンジルアデニン、１．０ｍｇ／Ｌのインドール酢酸、４００ｍｇ／Ｌのイノシトールが補充されたＲＭＳ０。
ＲＭＳ５：２％スクロースを有し、２ｍｇ／Ｌのベンジルアデニンおよび０．１ｍｇ／Ｌのインドール酢酸が補充されたＲＭＳ０。
【００３８】
母株からの外植体の取得
好ましい実施態様において、腋芽をもつ若い苗条を外植体として使用する。外植体が培地において細菌および真菌の感染をもたないことを確実にするために、外植体は使用前に滅菌された表面である。多くの滅菌法が培養の外植体の調製のために利用可能である。その技法に、少なくとも１つの滅菌剤を含有する溶液に浸すことがある。滅菌剤には、次亜塩素酸ナトリウム、次亜塩素酸カルシウム、塩化第二水銀、エチルアルコールなどがある。
【００３９】
本発明の好ましい方法において、成熟植物体からの長さ１０−１２ｃｍの若い苗条を外側の葉から剥がし、最初に流水で洗い、ついで０．１％ＨｇＣｌ２で５−１０分間滅菌し、流水で３０分間以上完全に洗う。ついで、苗条を１０−１５％ ＣｌｏｒｏｘＲ（５．２５％次亜塩素酸ナトリウムを含有）溶液に５−１０分間浸す。最後に、苗条を無菌蒸留水で４−６回すすぐ。あるいは、若い苗条をバラ植物体組織培養物から、当技術分野で周知の技法を用いて誘導できる。組織培養物から得られた若い苗条を、成熟植物体から調製された若い苗条の代わりに使用することも本発明の範囲内にある。
【００４０】
小植物体の形成
外植体を固体培地に入れ、光強度４５００−５５００ルックス（太陽光線型の光で提供する）で１６時間培養する。小植物体を上記照光条件で曝露するとき、温度を２３℃に保つ。あるいは、光源を除去し、小植物体を１９℃で保持する。全苗条をＲＭＳ１［２ｍｇ／Ｌの６−ベンジルアデニンおよび０．０５ｍｇ／Ｌのナフタレン酢酸が補充されたＲＭＳ０］で培養する。外植体は徐々に緑になり、１０−１５日後に常に新たな新芽を形成する。小植物体の増殖のために、この時点で苗条から新芽を切る。
【００４１】
増殖
小植物体の増殖は、全植物体材料を幼時または再幼時成長植物体から、典型的には分裂組織材といわれる根または苗条の頂端での急速に分裂する細胞の成長点または成長領域で、小植物体材料を取得するプロセスである。苗条材料を上記したホルモンおよび栄養培地に入れて、新たな新芽をもつ小植物体を徐々に形成する外植体をつくる。個々の新芽をこの外植体から取り出し、同じホルモンおよび栄養培地で培養して、単独の全苗条から複数の小植物体をつくる。このような単独の親からの植物体の無性再生産は、親と同じ遺伝特性を持つ植物子孫のクローニングを可能にする。切除された新芽をＲＭＳ１培地に移し、約５０日培養する。上記方法の使用で、新芽が小植物体に成長すると、新たな新芽が小植物体上で形成する。新たに形成した新芽を、小植物体の繁殖および増殖のために、切って新しいＲＭＳ１培地に移す。増殖率は外植体の最初の数から通常４−７倍である。
【００４２】
花新芽誘発
花新芽誘発は、営業的規模でのインビトロ開花にとって非常に重要である。本発明において考えられる花新芽誘発法には２方法がある。
【００４３】
ひとつの実施態様において、増殖後の花新芽の誘発に、増殖された小植物体を閉鎖容器中のＲＭＳ２上で培養する。誘発培養を約５０日続ける。この工程の後に、小植物体をＲＭＳ４含有の閉鎖容器に移し、伸長工程を約１５−３０日続ける。伸長後、小植物体を、２０ｍｇ／Ｌ−５０ｍｇ／ＬのアンピシリンをもつＭＳ０に移す。通常、１０日−２０日で開花する。
【００４４】
別の好ましい実施態様において、増殖後の花新芽の誘発に、増殖された小植物体を閉鎖容器中のＲＭＳ３上で約５０日間培養する。誘発後、小植物体を、２０ｍｇ／Ｌ−５０ｍｇ／ＬのアンピシリンをもつＭＳ０に直接移す。通常、１５日−２０日で開花する。
【００４５】
実施例
本発明を下記の実施例で詳記する。この実施例は説明のためのものであって、いかなる場合も発明を制限する意図を持たない。当技術分野でよく知られている標準的な技術および具体的に上記した技術を使用する。
【００４６】
実施例１
この実施例は、チジアズロン増加培地での花新芽の誘発を明らかにする。成熟植物体からの腋芽をもつ若い苗条を外植体として用いた。バラ外植体を固体培地に置き、光強度４５００−５５００ルックス（太陽光線型の光で提供する）で１６時間培養した。温度を光照射で２３℃に、光照射なしで１９℃で保持した。全苗条をＲＭＳ１で培養した。外植体が徐々に緑になり、新たな新芽を１０−１５日後に形成した。この新芽を苗条から切った。増殖された小植物体（＞２倍の増殖）をＲＭＳ２で培養して、花新芽を誘発した。花新芽誘発後、小植物体を伸長培地にインビトロ開花のために移した。小植物体を伸長培地ＲＭＳ４で１５−３０日間培養し、ついで濃度２０−５０ｍｇ／ＬのアンピシリンをもつＭＳ０に移した。アンピシリンをもつＭＳ０に移した後１０−２０日で開花した。４０−５０％の小植物体が花をつけ、８０％以上の花が正常の形態であった。咲かない小植物体を繁殖に戻すことができる。培養した花の保存期間は２５℃以下で１か月間以上であった。
【００４７】
実施例２
この実施例は、ゼアチン増加培地での花新芽の誘発を明らかにする。成熟植物体からの腋芽をもつ若い苗条を外植体として用いた。バラ外植体を固体培地に置き、光強度４５００−５５００ルックス（太陽光線型の光で提供する）で１６時間培養した。温度を光照射で２３℃に、光照射なしで１９℃で保持した。増殖された小植物体（＞２倍の増殖）をＲＭＳ３で培養した。花新芽誘発後、花新芽をもつ小植物体を濃度２０−５０ｍｇ／Ｌのアンピシリンを有するＭＳ０に直接移した。アンピシリンをもつＭＳ０に移した後１５−２０日後に開花した。４０−５０％の小植物体が花をつけ、８０％以上の花が正常であった。咲かない小植物体を繁殖に戻すことができる。培養した花の保有期間は２５℃以下で１か月間以上であった。
【００４８】
実施例３
品種 Ｆｉｅｓｔａ ＰＡＲＡＤＥ（登録商標）、Ｓｃａｒｌｅｔ ＰＡＲＡＤＥ（登録商標）、Ｂｉａｎｃａ ＰＡＲＡＤＥ（登録商標）、Ｆｒｏｓｔｙ ＰＡＲＡＤＥ（登録商標）のバラ植物体を外植体として使用し、上記の組成物および方法を用い生育した。ナフタレン酢酸の代わりにインドール酢酸を含有する増殖培地ＲＭＳ５をＲＭＳ１の代わりに使用した。増殖され、本発明のインビトロ開花法にかけられた小植物体の３０％以上が正常な花をもつ小植物体であった。
【００４９】
本発明の方法および組成物は、多様な実施態様の形態を有すると理解されるべきであって、本明細書ではそのいくつかを開示したにすぎない。当業者には、他の実施態様が存在し、本発明の精髄から逸脱しないことが明らかであろう。すなわち、記述された実施態様は説明のためのものであって、制限を構成するものではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】小型バラ品種の繁殖およびインビトロ開花に関与する種々の工程の完了に要する時間を表すフローチャートを示す。
【図２】閉鎖容器におけるバラ小植物体インビトロ開花についての完全な写真を示す。
【図３】バラ小植物体開花を有する棚上の閉鎖容器についての完全な写真を示す。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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