(57)【要約】【課題】本発明は、新規ゼブラフィッシュを産生する方法を提供する。【解決手段】それらは、(a)自己交配によるトランスジェニックな蛍光ゼブラフィッシュの繁殖、(b)それらの親と異なるフェノタイプまたは行動パターンを示す新しいトランスジェニックな子孫のスクリーニングを含む。【選択図】図１
2007167059.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゼブラフィッシュを産生する方法であって、
(a)自己交配によるトランスジェニックな蛍光ゼブラフィッシュの繁殖；及び
(b)親と異なるフェノタイプまたは行動パターンを示す新しいトランスジェニックな子孫のスクリーニング
を含む方法。
【請求項２】
前記蛍光ゼブラフィッシュが、上流から下流に向かってアデノ関連ウイルスの逆方向末端反復(ITR-R)、アクチン遺伝子プロモーター、蛍光遺伝子、SV40ポリA、及びアデノ関連ウイルスの逆方向末端反復(ITR-L)を含む遺伝子フラグメントを使用するトランスフォームによって生産される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
子孫を産生するための自己交配による工程(b)の前記子孫の繁殖を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
異なるフェノタイプまたはパターンを有する魚を使用する工程(b)の前記子孫の繁殖を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記フェノタイプが、色、蛍光色、体形、体のサイズ、体の透明度、粒状の色、縞の色、ひれの形、ひれのサイズ、尾の形、尾のサイズ、目の色、目の形、及び蛍光個体における任意の観察できるフェノタイプの違いから成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記蛍光ゼブラフィッシュが、赤色蛍光ゼブラフィッシュである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ゼブラフィッシュが、白色ゼブラフィッシュである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記白色ゼブラフィッシュが、自己交配によって白色ゼブラフィッシュの純粋な株を産生するために使用される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記白色ゼブラフィッシュが、目を除く全体において真白色を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ゼブラフィッシュが、赤色ゴールデンゼブラフィッシュである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記赤色ゴールデンゼブラフィッシュが、蛍光遺伝子を発現していない、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記赤色ゴールデンゼブラフィッシュが、自己交配によって透明なゼブラフィッシュを産生するために使用される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記透明なゼブラフィッシュが、目で直接観察できる内臓を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法によって生産される、白色ゼブラフィッシュ。
【請求項１５】
目を除く全体における真白色によって特徴付けられる、請求項１４に記載の白色ゼブラフィッシュ。
【請求項１６】
小さく薄い鱗を有する、請求項１４に記載の白色ゼブラフィッシュ。
【請求項１７】
新規な種のゼブラフィッシュを産生するために使用される、請求項１６に記載の白色ゼブラフィッシュ。
【請求項１８】
前記ゼブラフィッシュが、蛍光遺伝子を使用するトランスフォームによって調製される請求項１７に記載の白色ゼブラフィッシュ。
【請求項１９】
前記蛍光遺伝子が、緑色蛍光遺伝子、赤色蛍光遺伝子、黄色蛍光遺伝子、橙色蛍光遺伝子、シアン蛍光遺伝子、及び青色蛍光遺伝子から成る群より選択される、請求項１８に記載の白色ゼブラフィッシュ。
【請求項２０】
前記ゼブラフィッシュが、赤色または緑色の蛍光性である、請求項１８に記載の白色ゼブラフィッシュ。
【請求項２１】
前記新規ゼブラフィッシュが、異なるフェノタイプまたは行動パターンを有する魚との交配によって調製される、請求項１７に記載の白色ゼブラフィッシュ。
【請求項２２】
請求項１に記載の方法によって生産される、透明なゼブラフィッシュ。
【請求項２３】
目で直接観察できる内臓を有することによって特徴付けられる、請求項２２に記載の透明なゼブラフィッシュ。
【請求項２４】
幼体から成体まで、生涯を通じての透明なフェノタイプの発現によって特徴付けられる、請求項２２に記載の透明なゼブラフィッシュ。
【請求項２５】
新規な種のゼブラフィッシュを調製するために使用される、請求項２２に記載の透明なゼブラフィッシュ。
【請求項２６】
前記新規な種のゼブラフィッシュが、異なるフェノタイプまたはパターンを有する魚との交配によって調製される、請求項２５に記載の透明なゼブラフィッシュ。
【請求項２７】
前記ゼブラフィッシュが、紫色ゴールデンゼブラフィッシュである、請求項２６に記載の透明なゼブラフィッシュ。
【請求項２８】
前記ゼブラフィッシュが、蛍光遺伝子を使用するトランスフォームによって調製される、請求項２５に記載の透明なゼブラフィッシュ。
【請求項２９】
前記蛍光遺伝子が、緑色蛍光遺伝子、赤色蛍光遺伝子、黄色蛍光遺伝子、橙色蛍光遺伝子、シアン蛍光遺伝子、及び青色蛍光遺伝子から成る群より選択される、請求項２８に記載の透明なゼブラフィッシュ。
【請求項３０】
前記ゼブラフィッシュが、緑色ゴールデンゼブラフィッシュである、請求項２８に記載の透明なゼブラフィッシュ。
【請求項３１】
請求項１に記載の方法によって生産される、赤色ゴールデンゼブラフィッシュ。
【請求項３２】
蛍光を発現していない、請求項３１に記載の赤色ゴールデンゼブラフィッシュ。
【請求項３３】
実験動物として白色ゼブラフィッシュまたは透明なゼブラフィッシュを含む、動物モデル。
【請求項３４】
疾患モデル、老化研究、薬剤スクリーニング、毒性のスクリーニング、胚発生、または器官の分化において使用される、請求項３３に記載の動物モデル。
【請求項３５】
視覚系モデル、比較研究における実験モデル、免疫モデル系、薬剤スクリーニング及びバリデーション、GATA転写因子モデル、発生モデル系、毒物学的及びトランスジェニック研究、トロンビンの発生過程での発現、薬理学的な動物モデル、微生物病理学の宿主モデル系、神経毒物学モデル、胚形成における骨髄発生のためのモデル、ヒト疾患モデル、または遺伝子研究モデル系において使用される、請求項３４に記載の動物モデル。
【請求項３６】
前記白色ゼブラフィッシュが、体色または色素のフェノタイプの研究において使用される、請求項３３に記載の動物モデル。
【請求項３７】
前記透明なゼブラフィッシュが、内臓の観察において使用される、請求項３３に記載の動物モデル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ゼブラフィッシュ及びその調製方法に関する。本発明は、新規動物モデルにも関する。
【背景技術】
【０００２】
観賞魚を賞賛し、飼育する事は、現代人にとって興味深いレジャー活動である。水槽に飼育されている魚を見つめ、餌を与えることは、水中のエキゾチックな海の世界という全く異なる世界に入り込む素晴らしい機会を人々に与える。各種の水草、砂、砂利、岩、及び幾つかの他の装飾は、共に、豪華、空想的、創造的、及び落ち着くシーンを構成する。水槽の幾つかの背景は、低木の多い森と共に堂々とした山がデザインされる。他には、外側に這い、独特な花及びハーブに似ている巻きひげ及び蔓を有する水草の小木立に満たされた素晴らしい庭としてデザインされる。光の効果の助けがあると、観賞魚は、各種の形及び像を示し、人々にうっとりする様な感情を提供する。人気のある観光リゾート、商業中心地、ホテル、及び観賞魚を提供する場所の様な多くのスポットが存在する。多くの家庭は、美しさ及び穏やかさのセンスを伝えるために、リビングルームまたは庭に金魚、エンゼルフィッシュ、熱帯魚の異なる種、及び海産魚の様な各種のペットの魚で装飾した各種のセットアップした水槽を配置している。
【０００３】
観賞魚は、鮮やかな色または独特な形を有する魚を意味する。これらの魚は、頻繁に、世界中に分配され、途方もなく大きな多様性を有する。魚のあるものは、淡水または海水において生存し、またあるものは、温帯または熱帯由来である。観賞魚の幾つかは、鮮やかな色または独特の形が知られている。そのあるものは、珍しいまたは貴重な種として知られている。国際的な観賞魚の市場では、観賞魚は、温帯の淡水魚、熱帯の淡水魚、または熱帯の海水魚として一般的に分類される。
【０００４】
熱帯の淡水の観賞魚は、大部分が川及び湖由来である。種の途方もなく大きな多様性のために、これらの地域由来のこれらの魚は、多様な特別な形及び異なるサイズ、驚くような色及び魅力的な美しさを有する。これらの魚の習性に従って、それらの多くは、3つの地方由来である。第一の地方は、コロンビア、パラグアイ、ギアナ、ブラジル、アルゼンチン、及びメキシコの様な南アメリカにおけるアマゾン川の領域の国々である。第二の地方は、タイ、マレーシア、インド、及びスリランカの様な東南アジアの国々である。及び第三の地方は、マラウィ湖、ビクトリア湖、及びタンゴニカ(tangonyika)湖の様なアフリカングレートレイク(African Great Lake)の付近の領域である。
【０００５】
ネオンテトラ、エンゼルフィッシュ、及びアロワナといった熱帯の観賞用の淡水魚の三つの良く知られた群が存在する。トラフィックライトフィッシュ(Traffic Light Fish)、ヘッドアンドテールライトテトラ、ニードルフィッシュ、カーディナルネオンテトラ、及びブラックネオンテトラの様なネオンテトラは、小さく、丈夫で、魅惑的、及び鮮やかな色である。ある種は、透明であり、観賞魚市場において人気がある。レッドレインボーエンゼルフィッシュ、ブルーレインボーエンゼルフィッシュ、ブルーバンドグリーンレインボーエンゼルフィッシュ(Blue Band Green Rainbow Angelfish)、ブラックエンゼルフィッシュ、セサミエンゼルフィッシュ(Sesame Angelfish)、ダックエンゼルフィッシュ(Duck Angelfish)、及びルビーアイダイヤモンドエンゼルフィッシュ(Ruby Eye Diamond Angelfish)の様なエンゼルフィッシュも、形及び色において際立って美しい。ネオンテトラと異なり、エンゼルフィッシュは、温帯で平常どおりに優雅な方法で泳ぎ、古代史における神に似ている。シルバーアロワナ、レッドアロワナ、ゴールデンアロワナ、及びブラックアロワナの様なアロワナは、「生きた化石」としても知られている第三の群である。この群の魚は、優雅に泳ぎ、一般的に穏やかである。それらは、観賞魚の取引において高価であり、人気がある。
【０００６】
観賞魚は、娯楽用の魚産業に属しており、商業的な漁業及び経済上の重要な問題の一部である。観賞魚の市場における需要は、世界中を通じて通常大きい。魚の株、特に人工的に産生されたもの、または特別な形及び素晴らしい美しさを有するものは、すぐに多くの消費者を惹きつける。そのため、観賞魚の商業は、今後、多くの売買を増大する。
【０００７】
科学的な分類では、ゼブラフィッシュは、より古いCypriniformes、Cyprinidae族、及びDanio属に分類される。ゼブラフィッシュは、本来南アジア由来であり、熱帯魚の最も一般的な種の1つである。ゼブラフィッシュは、細い魚雷の形状、並びに体の側面に青とシルバーの横縞を有する。ゼブラフィッシュは、全長約3から4cmまで成長し、頑丈な魚であると見なされており、容易に水質の過敏性が無いままでいられる。ゼブラフィッシュは、約3ヶ月で性的に成熟する。成熟したメスのゼブラフィッシュは、数日に一度、放卵する事ができる。ゼブラフィッシュの卵は、母体の外で受精され、発生する。これらの透明な胚性の卵は同時だけで無く、急速に成長する。胚性の卵の発生のための最も良い温度の範囲は、25℃と31℃の間である。
【０００８】
ゼブラフィッシュの胚の発生の機構は、哺乳動物と類似している。更に、全ての放卵の多くの卵、ゼブラフィッシュの卵は、自身を科学的な研究のための最も良いツールとする更なる他の特徴を有する。これらの特徴は、胚性の卵の透明性、母体の外での受精、及び泳ぎ、自身で食物を探すことができる稚魚が48から72時間以内に産生されうるという短い孵化の時間を含む。更に、卵は、顕微鏡の助けを使用して、容易に観察されうる。神経、筋肉、心臓、血流及び血液細胞の様な胚内部の器官が、拡大した際に、よく見える。メラトニンは、受精後、24時間程早くに生じる。基本的な体の色、並びに青及びシルバーの縞が、徐々に現れる。現在、ゼブラフィッシュは、全ての分野において科学的な研究のために広く使用されている重要な動物モデルである。
【非特許文献１】Bilotta et al., International Journal of Developmental Neuroscience, 2001, Vol.19(7):621-629
【非特許文献２】Metscher et al., Developmental Biology, 1999, Vol.210(1):1-14
【非特許文献３】Yoder et al., Microbes and Infection, 2002, Vol.4(14):1469-1478
【非特許文献４】Sumanas et al., Drug Discovery Today: Targets, 2004,Vol.3(3):89-96
【非特許文献５】Heicklen-Klein et al., Seminars in Cell and Developmental Biology, 2005, Vol.16(1):95-106
【非特許文献６】Lele et al., Biotechnology Advances, 1996, Vol.14(1):57-72 ; Huuskonen et al., Toxicology and Applied Pharmacology, 2005, Vol 207(2):495-500
【非特許文献７】Jagadeeswaran et al., Blood Cells, Molecules, and Diseases, 1997, Vol.23(2):147-156
【非特許文献８】Goldsmith, Current Opinion in Pharmacology, 2004, Vol.4(5):504-512
【非特許文献９】Miller et al., Acta Tropica, 2004, Vol.91(1):53-68
【非特許文献１０】Linney et al., Neurotoxicol and Teratol, 2004, Vol.26(6):709-718
【非特許文献１１】Berman et al., Experimental Hematology, 2005,Vol.33(9):997-1006
【非特許文献１２】Dooley et al., Curr Opin Genetics & Develop, 2000, Vol.10(3):252-256
【非特許文献１３】Dlugos et al., Pharmacol Biochem Behav, 2003, Vol.74(2):471-480
【非特許文献１４】Chou et al., Transgenic Research, 2001, 10: 303-315
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、新規ゼブラフィッシュを産生する方法を提供する。それらは、(a)自己交配によるトランスジェニックな蛍光ゼブラフィッシュの繁殖、(b)それらの親と異なるフェノタイプまたは行動パターンを示す新しいトランスジェニックな子孫のスクリーニングの工程を含む。
【００１０】
本発明は、本発明の方法により、白色ゼブラフィッシュ、透明なゼブラフィッシュ、及び赤色ゴールデンゼブラフィッシュも提供する。
【００１１】
更に、本発明は、実験動物として白色ゼブラフィッシュまたは透明なゼブラフィッシュを含む動物モデルを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、新規ゼブラフィッシュを産生する方法を提供する。それらは、(a)自己交配によるトランスジェニックな蛍光ゼブラフィッシュの繁殖、(b)それらの親と異なるフェノタイプまたはパターンを示す新しいトランスジェニックな子孫のスクリーニングの工程を含む。
【００１３】
本発明で使用される蛍光ゼブラフィッシュは、上流から下流に向かって、アデノ関連ウイルスの逆方向末端反復(ITR-R)、アクチン遺伝子プロモーター、蛍光遺伝子、SV40ポリA、及びアデノ関連ウイルスの逆方向末端反復(ITR-L)を含む遺伝子フラグメントを使用するトランスフォームによって生産される。前記遺伝子フラグメントを以下に示す。
【００１４】
【化１】
2007167059.tif 000003
【００１５】
ここで、ITRは、アデノ関連ウイルスの末端反復配列由来である。1つの好ましい実施態様では、ゴールデンゼブラフィッシュのα-アクチン遺伝子プロモーター及び赤色蛍光遺伝子が、遺伝子フラグメントの構築のために選択される。この遺伝子フラグメントは、蛍光ゼブラフィッシュを調製するためにゴールデンゼブラフィッシュへトランスフォームされる。
【００１６】
本発明の方法では、前記フェノタイプは、色、蛍光色、体形、体のサイズ、体の透明度、粒状の色、縞の色、ひれの形、ひれのサイズ、尾の形、尾のサイズ、目の色、目の形、及び蛍光個体における任意の観察できるフェノタイプの違いから成る群より選択される。
【００１７】
更に、本発明の方法は、自己交配による工程(b)の子孫の繁殖を含み、子孫を産生する。
【００１８】
更に、本発明の方法は、異なるフェノタイプまたは行動パターンを有する魚を使用する工程(b)の子孫の繁殖を含み、子孫を産生する。
【００１９】
1つの好ましい実施態様では、前記蛍光ゼブラフィッシュは、赤色蛍光ゼブラフィッシュである。1つの好ましい実施態様では、前記子孫より選択される新規ゼブラフィッシュは、蛍光遺伝子を発現しない白色ゼブラフィッシュである。1つの更に好ましい実施態様では、前記白色ゼブラフィッシュは、自己交配によって白色ゼブラフィッシュの純粋な株を産生するために使用される。前記純粋な株は、白色ゼブラフィッシュのフェノタイプ及びパターンの発現を安定化する事ができる。本発明の白色ゼブラフィッシュは、目を除く全体における真白色に特徴付けられる。
【００２０】
1つの好ましい実施態様では、前記子孫より選択される新規ゼブラフィッシュは、蛍光遺伝子を発現しない赤色ゴールデンゼブラフィッシュである。1つの更に好ましい実施態様では、前記赤色ゴールデンゼブラフィッシュは、自己交配によって透明なゼブラフィッシュを産生するために使用される。本発明の透明なゼブラフィッシュは、目で内臓を直接観察する事によって特徴付けられる。
【００２１】
更に、本発明の方法は、前記白色ゼブラフィッシュへの蛍光遺伝子の導入を含む。前記白色ゼブラフィッシュは、全体において真白色であり、野生型ゼブラフィッシュの体の発現している深い青及びシルバーの縦の縞とは異なるため、白色ゼブラフィッシュにおいて導入される蛍光遺伝子または色素遺伝子は、特別な体色を有意及び効果的に発現する。1つの実施態様では、前記蛍光遺伝子は、緑色蛍光遺伝子、赤色蛍光遺伝子、黄色蛍光遺伝子、橙色蛍光遺伝子、シアン蛍光遺伝子、及び青色蛍光遺伝子から成る群より選択される。1つの好ましい実施態様では、前記蛍光遺伝子は、緑色蛍光遺伝子である。1つの好ましい実施態様では、前記蛍光遺伝子は、赤色蛍光遺伝子である。
【００２２】
本発明は、上記の様に生産される白色ゼブラフィッシュも提供する。前記白色ゼブラフィッシュは、目を除く全体において真白色を発現する事によって特徴付けられ、小さく薄い鱗を有する。1つの実施態様では、本発明の白色ゼブラフィッシュは、小さく薄い鱗、内臓から腹腔に至るシルバー及び白色の縞、並びに黒い目と共に全体において真白色を発現する。
【００２３】
本発明の白色ゼブラフィッシュは、新規ゼブラフィッシュを産生するために使用されうる。1つの実施態様において、前記新規ゼブラフィッシュは、遺伝子を使用するトランスフォームによって調製される。当該新規ゼブラフィッシュの薄い鱗及び真白色は、トランスフォームに使用される遺伝子の発現に有用である。前記トランスフォームに使用される遺伝子は、例えば、蛍光遺伝子、色素遺伝子、体色関連遺伝子、または魚体の表面に発現するパターンまたはフェノタイプに関連する他の遺伝子であるが、それらに制限されない。1つの好ましい実施態様では、前記新規ゼブラフィッシュは、蛍光遺伝子を使用するトランスフォームによって調製され、前記蛍光遺伝子は、緑色蛍光遺伝子、赤色蛍光遺伝子、黄色蛍光遺伝子、橙色蛍光遺伝子、シアン蛍光遺伝子、及び青色蛍光遺伝子から成る群より選択される。1つの更に好ましい実施態様では、前記新規ゼブラフィッシュは、赤色蛍光を有する白色ゼブラフィッシュであり、白色ゼブラフィッシュへの赤色蛍光遺伝子を使用するトランスフォームによって調製される。1つの更に好ましい実施態様では、前記新規ゼブラフィッシュは、緑色蛍光を有する白色ゼブラフィッシュであり、白色ゼブラフィッシュへの緑色蛍光遺伝子を使用するトランスフォームによって調整される。
【００２４】
他の実施態様では、前記新規ゼブラフィッシュは、異なるフェノタイプまたは行動パターンを有する魚との交配によって調整される。当該新規ゼブラフィッシュの薄い鱗及び真白色は、各種のフェノタイプの発現において有用である。この理由のために、前記白色ゼブラフィッシュは、例えば蛍光ゼブラフィッシュ、蛍光ゴールデンゼブラフィッシュ、蛍光ゼブラレオパード、ゴールデンゼブラフィッシュ、リトルゼブラ、レオパードダニオ、または他のゼブラフィッシュであるが、それらに制限されない異なるフェノタイプを有する魚との交配によって親と異なる新しいゼブラフィッシュを調製するために使用されうる。
【００２５】
本発明は、上記のように生産され、全体における透明の発現および目による直接観察に特徴付けられる透明なゼブラフィッシュも提供する。更に、前記透明なゼブラフィッシュは、幼体から成体まで生涯を通じて透明なフェノタイプの発現を示すことに特徴付けられうる。前記透明なフェノタイプは、成長の際にも消えない。1つの好ましい実施態様では、当該ゼブラフィッシュは、黒い目を除く全体において透明であり、前記体色は、ゼブラフィッシュの骨格筋の本来の色由来の透明なオレンジから黄色の色である。前記ゼブラフィッシュの内臓は、目で直接観察されうる。
【００２６】
本発明の透明なゼブラフィッシュは、新規ゼブラフィッシュを調製するために使用されうる。1つの実施態様では、前記新規ゼブラフィッシュは、異なるフェノタイプまたは行動パターンを有する魚との交配によって調製される。他の実施態様では、前記新規ゼブラフィッシュは、トランスジェニック技術によって調製される。
【００２７】
本発明の透明なゼブラフィッシュの無色の発現は、トランスフォームに使用される遺伝子の発現に有用であって、前記トランスフォームに使用される遺伝子は、蛍光遺伝子、色素遺伝子、体色関連遺伝子、体の表面上のフェノタイプに関する遺伝子、及び特に魚体内で発現するトランスフォームに使用される遺伝子を含む。
【００２８】
1つの実施態様では、前記新規ゼブラフィッシュは、蛍光遺伝子を使用するトランスフォームによって調製される。1つの好ましい実施態様では、前記トランスフォームされる遺伝子は、緑色蛍光遺伝子、赤色蛍光遺伝子、黄色蛍光遺伝子、橙色蛍光遺伝子、シアン蛍光遺伝子、及び青色蛍光遺伝子から成る群より選択される蛍光遺伝子である。1つの更に好ましい実施態様では、前記新規ゼブラフィッシュは、前記透明なゼブラフィッシュへの緑色蛍光遺伝子の導入によって調製される緑色ゴールデンゼブラフィッシュである。
【００２９】
透明な体色のために、前記新規ゼブラフィッシュは、例えば、蛍光ゼブラフィッシュ、蛍光ゴールデンゼブラフィッシュ、蛍光ゼブラレオパード、ゴールデンゼブラフィッシュ、リトルゼブラ、レオパードダニオ、または他のゼブラフィッシュであるが、それらに制限されない異なるフェノタイプまたはパターンを有する魚との交配によって、透明なゼブラフィッシュより調製される。1つの好ましい実施態様では、前記新規ゼブラフィッシュは、前記透明なゼブラフィッシュと紫色ゼブラフィッシュの交配によって調製される紫色ゴールデンゼブラフィッシュである。
【００３０】
本発明は、上記の様に調製され、蛍光を発現しない赤色ゴールデンゼブラフィッシュも提供する。
【００３１】
観賞用の使用に加え、本発明のゼブラフィッシュは、細胞シグナリングまたは胚発生研究の様な医薬研究または他の生物学的領域の研究に広く応用されうる。
【００３２】
更に、本発明は、実験動物として白色ゼブラフィッシュまたは透明なゼブラフィッシュを含む動物モデルを提供する。前記動物モデルは、疾患モデル、老化研究、薬剤スクリーニング、毒性のスクリーニング、胚発生、または器官の分化において使用される。1つの実施態様では、前記白色ゼブラフィッシュ及び透明なゼブラフィッシュは、上記の方法によって調製されうる。
【００３３】
詳細に記載すると、本発明の動物モデルは、視覚系モデル(Bilotta et al., International Journal of Developmental Neuroscience, 2001, Vol.19(7):621-629 )、比較研究における実験モデル(Metscher et al., Developmental Biology, 1999, Vol.210(1):1-14)、免疫モデル系(Yoder et al., Microbes and Infection, 2002, Vol.4(14):1469-1478)、薬剤スクリーニング及びバリデーション(Sumanas et al., Drug Discovery Today: Targets, 2004,Vol.3(3):89-96)、GATA転写因子モデル(Heicklen-Klein et al., Seminars in Cell and Developmental Biology, 2005, Vol.16(1):95-106)、発生モデル系、毒物学的及びトランスジェニック研究(Lele et al., Biotechnology Advances, 1996, Vol.14(1):57-72 ; Huuskonen et al., Toxicology and Applied Pharmacology, 2005, Vol 207(2):495-500)、トロンビンの発生過程での発現(Jagadeeswaran et al., Blood Cells, Molecules, and Diseases, 1997, Vol.23(2):147-156)、薬理学的な動物モデル(Goldsmith, Current Opinion in Pharmacology, 2004, Vol.4(5):504-512)、微生物病理学の宿主モデル系(Miller et al., Acta Tropica, 2004, Vol.91(1):53-68)、神経毒物学モデル(Linney et al., Neurotoxicol and Teratol, 2004, Vol.26(6):709-718)、胚形成における骨髄発生のためのモデル(Berman et al., Experimental Hema
tology, 2005,Vol.33(9):997-1006)、ヒト疾患モデル(Dooley et al., Curr Opin Genetics & Develop, 2000, Vol.10(3):252-256)、または遺伝子研究モデル系(Dlugos et al., Pharmacol Biochem Behav, 2003, Vol.74(2):471-480)において使用される。
【００３４】
本発明の動物モデルでは、前記白色ゼブラフィッシュは、体色または色素のフェノタイプの研究において使用される、それらは、例えば、メラノーマの研究であるが、これに限らない。
【００３５】
本発明の動物モデルでは、透明なゼブラフィッシュは、心臓、腎臓、胃、腸、または肝臓の様な内臓の観察において使用される。特別な性質のために、前記透明なゼブラフィッシュは、研究に応用される事ができ、例えば、心不全、不整脈、若しくは先天性心臓疾患を含む心臓疾患、多嚢胞性肝疾患、若しくは腎不全を含む腎臓疾患、結腸癌、運動障害、吸収不良、若しくは糖尿病を含む胃腸疾患、またはアルコール、感染、若しくは毒による肝硬変、肝臓障害、若しくは肝臓の壊死を含む肝臓疾患であるが、それらに制限されない。
【００３６】
本発明の動物モデルは、実験動物として白色ゼブラフィッシュまたは透明なゼブラフィッシュを含む。特に、前記白色ゼブラフィッシュまたは前記透明なゼブラフィッシュは、外来性の遺伝子を使用するトランスフォームまたは遺伝子変異の実施のために使用されうる。
【実施例】
【００３７】
以下の実施例は、制限する事が無く、単に本発明の各種の態様及び特徴の代表例である。
【００３８】
材料：赤色蛍光ゼブラフィッシュ（TK-2蛍光ゼブラ-レッド、プロダクト名：TK-2赤色蛍光Elf）はTaikong Corp.より得られた。ゴールデンゼブラフィッシュの野生型の株は、遺伝子操作のために使用された。サンゴ赤色蛍光タンパク質(RFP)をコードする遺伝子の前記ゴールデンゼブラフィッシュへの導入後、トランスジェニックな魚は、骨格筋より赤色の蛍光を発する事が可能となり、体の表面上に金色の縦縞を有する。
【００３９】
（実施例１）
白色ゼブラフィッシュの調製
TK-2赤色蛍光Elf
↓選択
F1子孫由来の白色ゼブラフィッシュ
↓自己交配
純粋な種の白色ゼブラフィッシュ
【００４０】
1.オス及びメスの赤色蛍光ゼブラフィッシュを交雑し、F1子孫を産生した。
2.蛍光遺伝子を発現することが無い。白色に近い皮のフェノタイプを有する白色ゼブラフィッシュを、F1子孫より選択した。
3.選択されたオス及びメスのF1白色ゼブラフィッシュを交雑した。F2子孫の白色ゼブラフィッシュを再び選択し、更なる1から2世代のために自己交配した。
4.フェノタイプの安定な発現を有する純粋な種の白色ゼブラフィッシュを選択し、保存した。
純粋な種の白色ゼブラフィッシュは、真白色、小さく薄い鱗、背骨の下に散りばめられた白色の粒、黒い目、及び6cmの最大の長さを有する（図１）。図１では、長くて細い形状を有するオスの白色ゼブラフィッシュの画像を示した。前記メスの白色ゼブラフィッシュは、一般的にサイズにおいてより大きく、豊満な腹部を有した。メスの白色ゼブラフィッシュとオスのものを区別するための他の明らかな特徴は存在しない。
【００４１】
（実施例２）
白色ゼブラフィッシュからの蛍光ゼブラフィッシュの調製
(A)方法
1.受精した白色ゼブラフィッシュの胚の収集：暗サイクルが開始する前の午後11時に水槽における別々のネットによって、ゼブラフィッシュを収集及び単離した。翌朝、明サイクルが開始している間に15-20分おきに卵を収集した。各時点において約30-40個の卵を注入の対象とする事ができた。一回の実験で、約250-300個の胚に注入した。
【００４２】
2.プラスミドDNAの調製：制限酵素によって、蛍光遺伝子を含むプラスミドDNAを消化した。全てのプラスミドDNA(8.1kb)が線状化されている事の確認のために、少量の消化したプラスミドDNAをアガロース電気泳動の対象とした。細胞質マイクロインジェクションのために、線状化したプラスミドDNAをフェノール:クロロホルム(1:1)を使用して抽出し、エタノールを使用して沈殿させ、乾燥し、濃度10μg/mlのPBSに溶解した。
【００４３】
3.マイクロインジェクション：線状化したプラスミドDNAを5×PBSを含むフェノールレッドと混合し、終濃度を調節した。ゼブラフィッシュマイクロインジェクター（ドラモンド）に調製したプラスミドDNAを装填し、直径10μmマイクロピペットを注入に使用した。各細胞段階の胚の動物極に約2.3nlのプラスミドDNAを注入した。
【００４４】
4.受精した胚の培養：マイクロインジェクションした受精した胚を蒸留水を使用して洗浄し、28.5℃でインキュベートした。24時間後、緑色蛍光の発現のために、蛍光顕微鏡の下で胚を観察した。緑色蛍光を発する能力を有するもののみ保存した。
【００４５】
(B)緑色蛍光ゼブラフィッシュの調製
緑色蛍光遺伝子を含むプラスミドpα-EGFPITR(Taikong Corp., Chou et al., Transgenic Research, 2001, 10: 303-315)をNotI制限酵素を使用して線状化した。これに続く調製工程は、方法(A)の記載と同様である。
【００４６】
図２では、蛍光ゼブラフィッシュの画像を示した。図２(A)では、緑色蛍光を有するオスの白色ゼブラフィッシュの画像を示し、図２(B)では、緑色蛍光を有するメスの白色ゼブラフィッシュの画像を示した。
【００４７】
(C)赤色蛍光ゼブラフィッシュの調製
赤色蛍光遺伝子を含むプラスミドpα-DsRedITR(Taikong Corp., TW 227735B)をNotI制限酵素を使用して線状化した。これに続く調製工程は、方法(A)の記載と同様である。
【００４８】
図２では、蛍光ゼブラフィッシュの画像を示した。図２(C)は、赤色蛍光を有するオスの白色ゼブラフィッシュの画像を示し、図２(D)では、赤色蛍光を有するメスの白色ゼブラフィッシュの画像を示した。
【００４９】
図２は、全身で蛍光遺伝子を発現する白色ゼブラフィッシュ由来の蛍光ゼブラフィッシュを明らかに示した。白色ゼブラフィッシュは、体に深い青の縞を有する野生型の株とは異なるため、白色ゼブラフィッシュは、明らか、穏やか、及び良い蛍光を発する能力を有する蛍光ゼブラフィッシュを産生するための使用に適切であった。
【００５０】
（実施例３）
透明なゼブラフィッシュの調製
1.オス及びメスの赤色蛍光ゼブラフィッシュを交雑し、F1子孫を産生した。
2.蛍光遺伝子の発現を有さない赤色ゴールデンゼブラフィッシュをF1子孫より選択した。
3.F1子孫より選択したオス及びメスの赤色ゴールデンゼブラフィッシュを交雑した。生産した子孫を選択し、更なる１から２世代のために自己交配した。透明な体を有する子孫のみを選択した。
4.フェノタイプの安定な発現を有する純粋な種の透明なゼブラフィッシュのみ選択し、保存した。
【００５１】
図４では、透明なゼブラフィッシュの調整過程を示した。図３では、透明なゼブラフィッシュの画像を示した。黒い目を除いて、魚全体が黄色っぽい皮を発現し、内臓が直接観察された。魚の最大の長さは、6cmだった。
【００５２】
本発明は、当業者が作成及び使用するのに十分なほど詳細に記載され、例示されているが、各種の別法、変形例、及び改良が、本発明の精神及び範囲を逸脱しない事は明らかであろう。
【００５３】
当業者は、本発明を対象に実施し、記載の結果、利点、及びその固有のものを得ることに十分に適応する事を直ちに評価する。前記胚、動物、並びにそれらを生産するための過程及び方法は、好ましい実施態様の代表例であり、典型例であり、本発明の範囲を制限することを意図しない。その変形例及び他の使用は、当業者の気づくところであろう。これらの変形例は、本発明の精神の内に含まれ、特許請求の範囲によって既定される。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図1は、変異型白色ゼブラフィッシュの画像である。
【図２】図２は、緑色及び赤色の蛍光ゼブラフィッシュの画像である。(A)緑色蛍光を有するオスの白色ゼブラフィッシュ。(B)緑色蛍光を有するメスの白色ゼブラフィッシュ。(C)赤色蛍光を有するオスの白色ゼブラフィッシュ。(D)赤色蛍光を有するメスの白色ゼブラフィッシュ。
【図３】図３は、変異型の透明なゼブラフィッシュの画像である。
【図４】図４は、透明なゼブラフィッシュを産生する過程である。F0親は、赤色蛍光ゼブラフィッシュである。F1子孫は、赤色ゴールデンゼブラフィッシュである。F2子孫は、赤色ゴールデンゼブラフィッシュ（左図）及び透明なゼブラフィッシュ（右図）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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