(57)【要約】本発明は、哺乳動物のTob遺伝子及びそのコード産物、並に記憶減退と記憶喪失の診断と治療などの分野におけるその使用に関する。更に、本発明は、Tob蛋白質を含有する医薬組成物及び強壮剤、並に記憶の向上と記憶喪失の治療又は運動共調の促進に関わる薬剤のスクリーニングにおけるTobの使用にも関する。
2004522449.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個人の記憶喪失のなりやすさを診断する方法であって、
その個人のTob遺伝子、転写物及び／又は蛋白質を検出する過程、及び
それを正常なTob遺伝子、転写物及び／又は蛋白質と比較する過程
を含んで成り、存在する差異が、その個人が記憶喪失になる確率が正常集団よりも高いことを意味する、前記方法。
【請求項２】
ヒトTob遺伝子又は転写物を検出し、そしてそれと正常ヒトTob核酸配列との相対的な差異を検出する、請求項１の方法。
【請求項３】
記憶喪失の治療方法であって、安全でかつ有効な投与量の正常なTob蛋白質を、その治療を必要とする患者に対して使用する過程を含んでいる、前記方法。
【請求項４】
哺乳動物の記憶又は運動共調を改善する方法であって、安全でかつ有効な投与量のTob蛋白質を、それを必要とする患者に対して使用する過程を含んでいる、前記方法。
【請求項５】
哺乳動物のTob蛋白質又はその活性断片を含んでいる強壮剤。
【請求項６】
安全でかつ有効な投与量の哺乳動物のTob蛋白質及び医薬上許容できる担体を含んでいる医薬組成物。
【請求項７】
前記Tob蛋白質が、ヒト、ラット及びマウスの動物Tob蛋白質の群から選択される、請求項６の医薬組成物。
【請求項８】
記憶喪失のなりやすさを検出するための試薬キットであって、Tob遺伝子又は転写物の特異的な増幅のためのプライマー、又はTob蛋白質に特異的に結合する抗体を含んでいる、前記試薬キット。
【請求項９】
記憶喪失の治療用薬剤をスクリーニングする方法であって、
（１）Tob遺伝子のcDNAを発現ベクターに挿入し、それを哺乳動物細胞株にトランスフェクトしてTob蛋白質を発現する細胞株を用意する過程；
（２）過程（１）のTob蛋白質を発現する細胞株の培養液に試験化合物を添加して、Tob蛋白質の発現量の変化を検出する過程、
を含んで成り、Tob蛋白質の発現量の増加を促進する化合物が記憶喪失の治療のためにスクリーニングされた薬剤である、前記方法。
【請求項１０】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含んでいる単離されたTob蛋白質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物工学及び医学の分野に関する。具体的には、本発明は、哺乳動物のTob遺伝子とそのコード産物、並に記憶減退と記憶喪失の診断と治療などの分野におけるその使用に関する。また、本発明は、Tob蛋白質を含有する医薬組成物及び強壮剤、並に記憶の向上と記憶喪失の治療又は運動共調の促進に関わる薬剤のスクリーニングにおけるTobの使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ErbB-2遺伝子が受容体型蛋白質チロシンキナーゼ(RPTK)をコードすること、これが細胞の増殖と分裂に重要な役割を果たすことが既に知られている。その過剰発現により腫瘍が発生しうるが、その機序は未だ解明されていない。
1996年に日本人研究者が、ErbB-2遺伝子の産物であるp185erbB2と相互作用する新規の蛋白質分子、Tob（ErbB-2のトランスデューサー）を発見し、そしてヒトTob遺伝子のcDNA配列をクローン化した。Tobは、既知の抗複製遺伝子BTG-1と明らかに相同である。研究により、BTG-1と同様に、Tobも細胞増殖を抑制する作用を示すこと、しかしその作用はp185erbB2により対抗されることが示された。その後ヒト及びマウスにおいて次々にTob/BTG-1ファミリーに属する他のメンバーが発見されたが、それらの機能に関する研究は細胞複製の阻害に限定されていた。
【０００３】
学習と記憶は脳の基本機能である。高等動物において海馬は内側頭葉の脳構造であり、その破壊後には新しい記憶が形成されない。海馬のシナプスには非常に強い可塑性があり、長期増強(LTP)の形成と維持を誘導することができる。そしてもしLTPの誘導と維持に関わる任意の種類の蛋白質コード遺伝子をノックアウトすると、海馬におけるLTP現象はもはや存在せず、その動物は記憶を形成することができないであろう。従って海馬は、学習と記憶における重要な構造であり、LTPは記憶と学習のためのシナプス機構として作用する。このことは神経学者により既に広く認められている。
【発明の開示】
【０００４】
しかし記憶に関わり、そして記憶に影響を与える蛋白質としては、これまでにほんの数個しか知られていない。従ってこの分野では、記憶に関係する新規な蛋白質を発見し、そして記憶を改善し又は記憶喪失を治療することができる薬剤を開発及び改良することが不可欠である。
【０００５】
従って本発明の目的は、記憶に関係する蛋白質、即ちTob蛋白質、そして記憶減退と記憶喪失の診断、改善又は治療におけるその使用を提供することである。
本発明の別の目的は、Tob蛋白質を含有する医薬組成物及び強壮剤を提供することである。
【０００６】
本発明の１つ目の点として、個人の記憶喪失のなりやすさを診断する方法であって、
その個人のTob遺伝子、転写物及び／又は蛋白質を検出する過程、及び
それを正常なTob遺伝子、転写物及び／又は蛋白質と比較する過程
を含んで成る方法が提供される。
存在する差異は、その個人が記憶喪失になる確率が正常集団よりも高いことを意味する。
好ましくはヒトのTob遺伝子又は転写物を検出し、それを正常なヒトTob塩基配列と比較して差異を見つける。
【０００７】
本発明の２つ目の点として、記憶喪失の治療方法であって、安全でかつ有効な投与量の正常なTob蛋白質を、その治療を必要とする患者に対して使用する過程を含んでいる方法が提供される。
本発明の３つ目の点として、哺乳動物の記憶又は運動共調を改善する方法であって、安全でかつ有効な投与量のTob蛋白質を、それを必要とする患者に対して使用する過程を含んでいる方法が提供される。
本発明の４つ目の点として、哺乳動物のTob蛋白質又はその活性断片を含んでいる強壮剤が提供される。
【０００８】
本発明の５つ目の点として、安全でかつ有効な投与量の哺乳動物のTob蛋白質及び医薬上許容できる担体を含んでいる医薬組成物が提供される。好ましくは、上記Tob蛋白質は、ヒト、ラット及びマウスの動物Tob蛋白質の群から選択される。
本発明の６つ目の点として、記憶喪失のなりやすさを検出するための試薬キットであって、Tob遺伝子又は転写物の特異的な増幅のためのプライマー、又はTob蛋白質に特異的に結合する抗体を含んでいる試薬キットが提供される。
【０００９】
本発明の７つ目の点として、記憶喪失の治療用薬剤をスクリーニングする方法であって、
（１）Tob遺伝子のcDNAを発現ベクターに挿入し、それを哺乳動物細胞株にトランスフェクトしてTob蛋白質を発現する細胞株を用意する過程；
（２）過程（１）のTob蛋白質を発現する細胞株の培養液に試験化合物を添加して、Tob蛋白質の発現量の変化を検出する過程、
を含んで成る、ここでTob蛋白質の発現量の増加を促進する化合物が記憶喪失の治療のためにスクリーニングされた薬剤である、前記方法が提供される。
本発明の８つ目の点として、配列番号２に示すアミノ酸配列を含んでいる単離されたTob蛋白質が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本明細書では、技術用語「Tob蛋白質」と「Tobポリペプチド」とは交換可能であり、哺乳動物の海馬に特異的に発現し、かつそのアミノ酸配列が、ヒト、ラット又はマウスのTobのアミノ酸配列と80％超、好ましくは85％超、より好ましくは90％超相同であるポリペプチドを指す。また、本発明ではTobの活性断片及び保存的ポリペプチド又はその活性誘導体を用いることもできる。
【００１１】
広範かつ丹念な研究により、本発明者は、ラットTobのcDNA配列をクローン化したばかりでなく、種々の動物行動モデルを用いて、学習と記憶のプロセスにおけるTob遺伝子の機能をも研究した。偶然にも、Tobが記憶および運動共調に関係することが見出された。
【００１２】
ヒト及びマウスTob1遺伝子のcDNAの保存領域を参照して一対のプライマーを設計し、８週齢ラットのcDNAライブラリーからPCRによりDNA配列部分をクローン化した。配列決定の結果から、この配列は、長さが604 bpであり、そしてヒト及びマウスのTob1のcDNAの対応領域に各々91％及び90％相同であることが分かった（図１）。この配列部分をプローブとして、成熟ラット脳のcDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、ラットTob遺伝子のcDNAの全長をクローン化した。ノーザンブロットハイブリダイゼーションの結果から、ラットTob遺伝子の発現様式はヒト及びマウスと同様であった（図２）。インサイチュ・ハイブリダイゼーションの結果から、Tob遺伝子は、ラット海馬の神経細胞に特異的に発現していることが分かった（図３）。
【００１３】
ラットを実験動物として、水迷路や環境恐怖（状況への恐怖条件付け）などの行動実験モデルにより、Tob遺伝子の機能を測定した。Tob遺伝子のアンチセンス核酸を、海馬CA1領域の所定の位置に注入したところ、ラットTob遺伝子のアンチセンス核酸が、ラットの学習と記憶を有意に阻害すること（図６）、及びCA1領域のシナプスの長期増強(LTP)を阻害すること（図７）が見出された。
【００１４】
マウスを実験動物として、マウスTob遺伝子のアンチセンス核酸を、ハミルトンのマイクロシリンジを用いてマウスの側脳室に定期的に一定量注入した。また生理食塩水及びランダム配列核酸（スクランブル）を注入したコントロール群を作製した。次に、ステップダウン試験により実験群及びコントロール群を調べ、得られたデータに対して統計分析を行った。その結果から、実験群（Tobアンチセンス核酸注入）の記憶が、コントロール群と比較して有意に低下することが分かった。Tob遺伝子と学習及び記憶との関係を更に確かめるために、異なる系統の実験マウス９対を選択して、機能に関する再スクリーニングを行った。その結果から、Tob遺伝子のアンチセンス核酸が、全ての系統においてマウスの学習及び記憶を有意に阻害できることが分かった。
また、小脳皮質におけるTob mRNAの特異的な発現から、Tob蛋白質が運動共調に関係することが示唆される（図４）。
【００１５】
蛋白質相同性の比較に基づくと、ヒトTob蛋白質は、マウス及びラットのTob蛋白質と高度に相同である（これらは90％超同一である）。哺乳動物のTob蛋白質の構造及び組織分布の特異性から、Tob蛋白質は、異なる哺乳動物において同一の機能、即ち記憶を向上し、かつ運動共調を促進する機能を有することが示唆される。従ってヒトTob蛋白質も同様にヒトの記憶及び運動共調に関係し、そしてヒトTob遺伝子及びその発現産物に基づいて設計された薬剤、並に診断法及び治療法は、ヒトの記憶喪失の診断及び治療に用いることができ、そして記憶を向上させ、かつ運動共調を促進することができる。
【００１６】
Tobヌクレオチドの全長配列又はその断片は、通常、PCR増幅法、組み換え法、又は人工合成法により得ることができる。PCR増幅法では、プライマーを、既知のヒトTob、マウスTob、又は本発明により公開されたラットTobのヌクレオチド配列、そして特にそのオープン・リーディング・フレーム配列に基づいて設計することができる。また、該配列を増幅及び獲得するための鋳型として、市販のcDNAライブラリーや当業者に周知の慣用的な方法により調製したcDNAライブラリーを用いることもできる。該配列がかなり長い場合には、通常、２回以上PCR増幅を行い、その異なる増幅により得られた断片を、正確に相互に順々に結合させることが必要となる。
【００１７】
該配列が得られたら直ぐに、組み換え法を用いて該配列を大量に得ることができる。これは、通常、該配列をベクター内へクローン化し、それを細胞へ導入し、そして慣用法に従って増殖した宿主細胞から該配列を分離することによる。
【００１８】
また、特にその断片の長さがかなり短い場合には、人工合成法により該配列を合成することもできる。非常に長い配列を含有する断片を得るためには、通常、まず多数の小さな断片を合成し、次にそれらを相互に結合する。
【００１９】
現在では、化学合成により、蛋白質をコードする本発明のDNA配列（又はその断片若しくは誘導体）を完全に得ることができる。次に、これらのDNA配列を、当業界で周知の、現存するあらゆる種類のDNA分子（又はベクター）内に導入し、そして細胞内に導入することができる。更に化学合成により、本発明の蛋白質の配列に変異を導入することもできる。
【００２０】
本発明で用いるTob蛋白質を、対応するコード配列を宿主細胞内に挿入し（直接導入又はTobコード配列を含有するベクターの導入）、そしてそのトランスフェクトされた細胞を、Tob蛋白質を発現する適当な条件下で培養し、次にTob蛋白質を単離及び精製することにより、得ることができる。
【００２１】
具体的には、本発明のTob蛋白質又はポリペプチドには多くの使用法がある。この様な使用には（限定でなく）Tob蛋白質機能の低下又は喪失により誘導される疾患（例えば記憶減退）の治療用薬剤としての直接的な使用、及びTob蛋白質機能を促進する抗体、ポリペプチド又は他のリガンドのスクリーニングにおける使用がある。ポリペプチドライブラリーのスクリーニングにおける発現した組み換えTob蛋白質の使用を応用して、ヒトTob蛋白質機能の活性化の点で治療価値を有するポリペプチド分子を探索することができる。
【００２２】
さて、本発明はまた、TobのDNA又はその断片によりコードされるポリペプチドに対して特異性を有するポリクローナル及びモノクローナル抗体、特にはモノクローナル抗体を含む。ここで「特異性」とは、その抗体がTob遺伝子産物又はその断片に結合できることを意味する。好ましくは、Tob遺伝子産物又はその断片に結合できる上記抗体が、他の無関係の抗原分子を認識及び結合しないことを意味する。本発明の抗体は、Tob蛋白質と結合し、かつそれを阻害することができる抗体分子を含み、そしてまたTob蛋白質機能に影響しない抗体も含む。
【００２３】
本発明は、完全なモノクローナル又はポリクローナル抗体だけでなく、免疫活性を有する抗体断片、例えばFab'又は(Fab)2断片、抗体重鎖、抗体軽鎖；あるいは埋め込み型(embedded)抗体、例えば齧歯類の抗体結合特異性を有するが、ヒト由来の抗体部分を依然として保持する抗体などを含む。
【００２４】
当業者に周知のあらゆる方法により本発明の抗体を調製することができる。例えば、精製したTob遺伝子産物又は抗原性を有するその断片を動物に対して使用して、ポリクローナル抗体の生産を誘導することができる。同様に、Tob蛋白質又は抗原性を有するその断片を発現する細胞を用いて動物を免疫し、抗体を生産することができる。ハイブリドーマ技術を用いて、本発明のモノクローナル抗体を調製することができる(Kohler et al, Nature 256, 495, 1975; Kohler et al, Eur. J. Immunol. 6, 511, 1976; Kohler et al, Eur. J. Immunol. 6, 292, 1976; Hammerling et al, In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, NY, 1981参照)。本発明の種々の抗体を、例えばヒト、ラット又はマウスのTob遺伝子産物断片又はその機能領域を用いて慣用的な免疫技術により得ることができる。これらの断片又は機能領域は、組み換え法により調製し、又はポリペプチド合成装置により合成することができる。未修飾型のTob遺伝子産物に結合する抗体は、原核細胞（例えば大腸菌）により生産された遺伝子産物を動物に免疫することにより生産することができる。修飾された翻訳産物（例えば糖結合した又はリン酸化した蛋白質又はポリペプチド）に結合する抗体は、真核細胞（例えば酵母又は昆虫細胞）により生産された遺伝子産物を動物に免疫することにより得ることができる。
【００２５】
抗Tob蛋白質抗体は、生物検査試料においてTob蛋白質を検出するために、免疫組織化学技術において使用することができる。
Tob蛋白質又はポリペプチドに対して免疫性を有する動物、例えばモルモットやヒツジを用いてポリクローナル抗体を生産することができる。免疫応答を増強するために、多くの補助剤、例えば、限定でなくフロイントアジュバントなどを用いることができる。
【００２６】
あらゆる種類の慣用スクリーニング法において本発明の蛋白質を用いることにより、Tob蛋白質と相互作用する物質、例えば阻害剤、活性剤又はアンタゴニストをスクリーニングすることができる。スクリーニング時に、Tob蛋白質を生物学な分析系及び測定系に含有させることができ、そして化合物により影響を受けるTob蛋白質とその受容体との相互作用を測定することにより、その化合物がアンタゴニストであるかどうかを決定することができる。さらにまた、実験動物に対して試験化合物とTob蛋白質とを同時に使用し、そしてその動物の記憶の変化をコントロール群と比較することにより、その化合物がTob蛋白質の活性剤又はアンタゴニストであるかどうかを決定することもできる。
【００２７】
更に、Tob遺伝子のcDNAを発現ベクターに挿入し、それを哺乳動物細胞株にトランスフェクトすることにより、高度にTob蛋白質を発現する細胞株を調製することもでき、そしてこの細胞のTob蛋白質を標的として、Tob蛋白質に活性効果又は阻害効果を示す薬剤をスクリーニングすることができる。また、試験化合物を、そのTob蛋白質を発現する細胞株の培養液に加え、Tob蛋白質の発現レベルの変化を検出することができる。Tob蛋白質の発現を促進する化合物は、記憶喪失の治療のために選択しうる薬剤であり、そしてTob蛋白質の発現促進を阻害する化合物は、人が都合の悪い記憶を忘れることを助けるための薬剤として用いることができる。
【００２８】
本発明の蛋白質、その抗体、阻害剤、活性剤及びアンタゴニストは、治療（薬剤）に用いられる場合、異なった効果を与える。通常、これらの物質は、非毒性で、不活性で、かつ医薬上許容される水性担体媒体と共に調合される。その担体のｐＨは通常約５〜８であり、理想的には約６〜８であり、実際には添加する物質の性質及び治療を要する疾患に応じて変動しうる。適切に調製した医薬組成物は、慣用的な経路、例えば（限定でなく）筋肉内、静脈内、皮下、経口、又は局所的に投与することができる。
例えば記憶喪失などの疾患の治療では、正常なTobポリペプチドを直接に用いることができる。本発明のTob蛋白質を用いる場合、同時に、記憶喪失治療のための他の薬剤を用いることもできる。
【００２９】
また本発明は、安全かつ有効な投与量の本発明のTob蛋白質を、医薬上容認される担体又は賦形剤と共に含有する医薬組成物を提供する。このような担体は（限定でなく）塩水溶液、緩衝溶液、グルコース、水、グリセリン、エタノール、及びそれらの混合物を含む。医薬組成物は、その投与方法に適合するべきである。本発明の医薬組成物は注射剤にしてもよく、例えば慣用法により生理食塩水又はグルコース及び他の補助物質を含有する水溶液を用いて調製される。慣用法により錠剤又はカプセル剤型の医薬組成物を調製することができる。注射剤、溶液剤、錠剤又はカプセル剤のいずれにしろ、医薬組成物は無菌条件で調製されるべきである。活性成分の投与量は治療に有効な量であり、例えば１日あたり約0.1 μg/kg体重から約5 mg/kg体重までである。更に、本発明のポリペプチドを他の治療法と共に用いることもできる。
【００３０】
医薬組成物を使用する場合、安全かつ有効な投与量のTob蛋白質又はそのアンタゴニスト若しくは活性剤を哺乳動物に対して使用する。その場合、安全かつ有効な投与量は通常少なくとも約0.1 μg/kg体重である。またほとんどの状況では、約10 mg/kg体重以下である。該投与量は好ましくは約0.1 μg/kg体重〜約100 μg/kg体重である。実際の投与量を決定する場合、当然、投与経路や患者の健康状態などの要因も考慮されるべきである。これらのことは全て熟練医師の技術範囲に属する。
【００３１】
Tob蛋白質のポリヌクレオチドも多くの治療目的に用いることができる。Tob蛋白質の無発現や異常／不活性Tob蛋白質の発現を原因とする細胞の複製、発生又は代謝における異常を治療するために、遺伝子治療技術を用いることができる。Tob遺伝子の組み換えウイルスベクターを構築する方法は、現存文献(Sambrook et al)に記載されている。また、組み換えヒトTob遺伝子をリポソーム内に封入し、それを細胞内に導入することもできる。
【００３２】
ポリヌクレオチドを組織又は細胞に挿入する方法には、該ポリヌクレオチドを直接に体内の組織に注射する方法、あるいは先ず該ポリヌクレオチドを、ベクター（例えばウイルス、バクテリオファージ又はプラスミド）を用いてインビトロで細胞に導入し、次にその細胞を体内に導入する方法などがある。
【００３３】
本発明はまたTob蛋白質レベルの定量的及び位置的測定を用いた診断法及び検査法にも関する。これらの検査は当業界で周知であり、FISH法やラジオイムノアッセイ法などである。これらの検査により測定されたTob蛋白質レベルを用いて、種々の疾患におけるTob蛋白質の重要性を説明し、そしてTob蛋白質が関与する疾患を診断することができる。
【００３４】
試料中にTob蛋白質が存在するかどうかを検出する１つの方法は、Tob蛋白質の特異的抗体を検出することであり、例えば、試料をTob蛋白質の特異的抗体に接触させ、そして抗体複合体が形成されるかどうかを観察することである。その様な抗体複合体の形成は、Tob蛋白質が試料中に存在することを意味する。
【００３５】
Tob蛋白質のポリヌクレオチドを、Tob蛋白質に関係する疾患の診断と治療に用いることができる。診断では、Tob蛋白質のポリヌクレオチドを用いて疾患中のTob蛋白質の発現やTob蛋白質の異常発現を検出することができる。従ってTob蛋白質の発現が異常であるかどうかを決定するために、TobのDNA配列を用いて生物検査試料のハイブリダイゼーションを行うことができる。ハイブリダイゼーション技術には、サザンブロット法、ノーザンブロット法、及びインサイチュ・ハイブリダイゼーション法などがある。これらの技法は公知であり、成熟した技術であり、そして相当の試薬キットを全て商業的に入手できる。本発明のポリヌクレオチドは、その一部又は全部を、マイクロアレイ又はDNAコア（遺伝子コアとも称す）に固定されたプローブとして用いることができる。それらを用いて組織や遺伝子診断において異常な遺伝子発現を分析することができる。またTob特異的プライマーを用いてRNAポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によりインビトロ増幅を行うことにより、Tob遺伝子の転写産物を検出することもできる。
【００３６】
Tob蛋白質に関係する疾患の診断において、Tob遺伝子の変異の検出を用いることもできる。Tob蛋白質の変異には、点変異、転位、欠失、組み換え、そしてその他正常野生型Tob DNA配列と比較したあらゆる異常がある。変異を検出するために、現行技術、例えばサザンブロット、DNA配列決定、PCR及びインサイチュ・ハイブリダイゼーションを用いることができる。また、変異は蛋白質の発現に影響することがあるので、ノーザンブロット法やウエスタンブロット法を用いて遺伝子に変異があるかどうかを間接的に決定することもできる。
【００３７】
本発明のTob蛋白質は、記憶減退や障害患者の治療ばかりでなく、正常者の記憶の向上のためにも用いることができる。従ってまた本発明は、哺乳動物のTob蛋白質又はその活性断片を含有する強壮薬(tonics)も提供する。本発明の強壮薬は、慣用的な強壮薬の製法に従って、哺乳動物のTob蛋白質又はその活性断片を適当な稀釈剤又は食物などと混合することにより調製することができる。この強壮薬の好ましい剤型は錠剤、顆粒剤、及び経口製剤である。
【００３８】
本発明を、以下に実施例と共に更に説明する。これらの実施例は本発明を説明するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。以下の実施例では実際の条件下での実験方法を示していない。それらは、通常慣用的な条件で、例えばSambrook et al, Molecular Cloning: Laboratory Handbook (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載の条件で、又は製造業者が薦める条件で行われる。
【実施例１】
【００３９】
ラットTob cDNA配列の獲得
ヒト及びマウスTob遺伝子のcDNAの保存領域を参照してPCRのためにプライマーを設計し、８週齢ラット脳のcDNAライブラリー（慣用的な方法により構築した）からDNA配列部分をクローン化した。この配列部分をプローブとして、８週齢ラット脳のcDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、ラットTob遺伝子の全長cDNAをクローン化した。配列決定の結果から、このcDNAの長さは2024 bpであり、その実際の配列は配列番号１に示す通りであった。このオープン・リーディング・フレーム(ORF)は146 bpから1243 bpまでであり、コードされるラットTob蛋白質は365アミノ酸を有した。この配列は次の通りである。
【００４０】
2004522449.tif 000003
相同性比較から、ヒト、マウス及びラットのTobは非常に高い相同性を示すことが分かる。
【００４１】
１．cDNAの相同性
ラットTob1遺伝子のcDNAは、DNAレベルでヒト及びマウスのTob1 cDNAと各々90％及び93％相同である。
２．蛋白質の相同性
ラットTob1蛋白質は、アミノ酸レベルでヒト及びマウスのTob1蛋白質と各々97％及び95％相同である。
【実施例２】
【００４２】
Tobの組織分布
ノーザンブロット法：種々のラット組織から総RNAを抽出し、ゲル電気泳動により変性を行った後、RNAをナイロン膜に転写し、そしてα-32P-dATP標識プローブにより膜に対してハイブリダイゼーションを行った。最終的にハイブリダイゼーションの結果を、オートラジオグラフィーにより表示した。これにより種々の組織において標的遺伝子の発現分布が見出された。
ノーザンブロットハイブリダイゼーションの結果から、ラットTob1遺伝子の発現様式はヒト及びマウスと同様であることが分かる（図２）。
【実施例３】
【００４３】
Tobの脳内分布
インサイチュ・ハイブリダイゼーション：
慣用的な方法に従って、該動物の脳組織試料をパラホルムアルデヒド中で固定した後、これをパラフィンに埋め込み、そして切片を調製した。この組織切片に対して、パラフィン除去、再水和、固定、消化、後固定、及びプレハイブリダイゼーションの行程を行った。ジゴキシン標識プローブによりハイブリダイゼーションを行った後、アルカリホスファターゼ結合抗ジゴキシン抗体を用いて、脳内の標的遺伝子の分布を測定した。
インサイチュ・ハイブリダイゼーションの結果から、Tob1遺伝子は、ラットの海馬の神経細胞に特異的に発現していることが分かる（図３）。これは、マウスにおけるTob遺伝子の分布と同様である（図４）。
【実施例４】
【００４４】
モーリス水迷路実験
Ｉ．実験装置及び環境
迷路直径＝150 cm、高さ＝45 cm；
プラットフォーム直径＝10 cm、水面下の深さ＝約2 cm；
ビデオカメラ、サンプリング装置及びソフト；
水温24〜27℃、ラットが水面下に隠されたプラットフォームを視認できないようにラットに無害な色素を添加した。
【００４５】
II．実験用の動物及び核酸配列
体重180g〜210gの雄SDラット。これを３群に分けた。Tobアンチセンス核酸配列群８匹；ランダム核酸配列群８匹；及びブランクコントロール群（10匹）。
2004522449.tif 000004
【００４６】
III.手術
カテーテルを、ラットの海馬のCA1領域内に両側から移植した。これを用いてこの行動実験において薬剤投与を行った。手術の７〜12日後、訓練のためにラットをモーリス水迷路に入れた。
IV．薬剤投与
行動訓練の６時間前に、薬剤をCA1領域に投与した。Tobアンチセンス配列及びランダム配列の濃度は共に1 nmol/μLであり、その投与量はCA1領域片側あたり1.5 μLであった。
【００４７】
Ｖ．訓練方法
各訓練セッションにおいて、ラットを、水迷路内の４つの位置に（図５に示す）ランダムに、タンクの壁に向くように置いた（しかし４つの各位置から出発する機会を均等にする）。ラットに水中で60秒間探索させ、もしラットがプラットフォームを見つけたら、プラットフォーム上に30秒間滞在させた。その後ケージに戻し、30秒間休ませた後、次の訓練セッションを行った。もしラットがプラットフォームを見つけられなかったら、ラットを手でプラットフォームに導き、そこに60秒間保持した後、次の訓練セッションを始めた。訓練は２ステップで行った。各ラットを６回連続のセッションにより訓練した後、１時間休憩させた。それから次の訓練ステップを行い、合計12回の訓練セッションを行った。ラットがプラットフォームを見つけるために要した時間を記録した。
【００４８】
VI．試験方法
１．隠したプラットフォームによる試験方法
ラットの記憶維持能力を測定するために、訓練の48時間後に試験を行った。試験は合計３回行い、各機会に一定の位置からラットを出発させた。同じく、ラットに水中で60秒間探索させた。もしラットが60秒以内にプラットフォームを見つけたら、直ぐにケージに戻し、60秒間休ませた後、次の試験を始めた。もしラットが規定の60秒以内にプラットフォームを見つけられなかったら、ラットをプラットフォームに導き、そこに30秒間保持した後、ケージに戻し、30秒間休ませた後、次の試験を始めた。同じく、ラットがプラットフォームを見つけるために要した時間を記録した。
【００４９】
２．露出したプラットフォームによる試験方法
この試験は、他の全ての実験が終了した後に行った。この試験は、水面上に露出させたプラットフォームを用いて行った。この目的は、ラットが、プラットフォームを発見する能力に影響を与える何らかの認識障害を有するかどうかを観察することである。試験は合計３回行い、各回に一定の位置からラットを出発させたが、露出したプラットフォームの位置はランダムに変更した。各試験毎に、先ずラットを馴らすためにプラットフォームに30秒間乗せ、それから水中の一定の位置に置き、60秒間探索させた。もしラットが60秒以内にプラットフォームを見つけたら、直ぐにケージに戻し、60秒間休ませた後、次の試験を始めた。もしラットがプラットフォームを見つけられなかったら、ラットを水から取り出し、ケージに戻し、60秒間休ませた後、次の試験を受けさせた。実験結果から、各群のラットは、プラットフォーム上で30秒間馴らした後、全て迅速にプラットフォームを発見した。各群間に有意差は認められなかった。
【００５０】
VII.実験結果
実験結果を図６に示す。Ｘ軸は訓練セッションの数、及び48時間での記憶測定であり、Ｙ軸はラットがプラットフォームを発見するために要した時間（３回の訓練セッション又は試験の平均値）である。Tob遺伝子のアンチセンス核酸配列を両側の海馬のCA1領域に注入した後、モーリス水迷路におけるラットの学習速度の有意な低下が認められた。そしてこれに対応して48時間での記憶維持能力も低下した。
【実施例５】
【００５１】
海馬CA1領域の長期増強(LTP)の電気生理学的な記録
この実施例では、Tob遺伝子のアンチセンス配列、ランダム配列核酸又は生理食塩水を、ラットの海馬CA1領域に注入し、そしてCA1領域シナプスの長期増強(LTP)に対する効果を観察した。次に海馬シナプスの可塑性の角度から、学習と記憶に対するTob遺伝子の作用を調べた。
【００５２】
Ｉ．実験用の動物及び核酸配列
体重200g〜250gの雄SDラット。これを３群に分けた。Tobアンチセンス核酸配列群８匹；ランダム核酸配列群８匹；及び生理食塩水コントロール群６匹。
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【００５３】
II．手術
各ラットをウレタン（1250 mg/kg体重を腹腔内に注射した）により麻酔した。次にラットを３次元位置同定器に固定した。頭皮を切開し、頭蓋骨の表面を洗浄した。直径1.5 mmの２つの穴を、各々P4.9L3.8とP3.4L2.8の位置にドリルで開けた。P4.9L3.8の穴は刺激電極を挿入するために用い、P3.4L2.8の穴は記録電極の挿入のために用いた。室温を25度に保ち、動物の体温を37度に維持した。
【００５４】
III.刺激電極と記録電極
刺激電極は同心円状の円筒型の電極であり、ステンレス鋼ニードルチューブ内に１本のラッカー塗装した電線を有し、ニードルチューブの内径及びラッカー塗装した電線の直径は0.2 mmであった。記録電極は単極電極であり、１本の直径0.2 mmのラッカー塗装した電線から成った。この記録電極と１本のステンレス鋼チューブ（外径0.7 mm、内径0.4 mm）とを一緒に貼り付けた。薬剤注入用のニードルを、このステンレス鋼チューブに通して記録部位に到達させた。
【００５５】
IV．電位の記録
１．電極の配置：
刺激電極を海馬のシェファーチャネル(Shaffer channel)に配置し、記録電極をCA1領域に配置した。単一パルスの方形波（波幅50 μs）によりシェファーチャネルを刺激し、CA1において最適の興奮性シナプス後電位(EPSP)を記録した。
【００５６】
２．薬剤の投与方法：
薬剤注入用ニードルを、記録電極の横のステンレス鋼チューブ内に通して、記録部位まで挿入した。濃度1.0 nmolのアンチセンス配列核酸1.0 μL、又は濃度1.0 nmolのランダム配列核酸1.0 μL、又は生理食塩水1.0 μLを、0.2 μL/minの速度で記録部位に注入した。９時間後、更に1.0 μLを注入した。
【００５７】
３．最適な刺激強度の選択：
単一パルスの方形波（波幅50 μs）によりシェファーチャネルを刺激した。刺激強度を弱から強まで(100〜800 μA)調整した。異なる刺激強度毎にEPSPを記録し、刺激に対する応答強度のグラフを描いた。最適な刺激強度は、最大のEPSP応答を生じる刺激強度の２／３とした。
【００５８】
４．電位の記録：
２回目の注入の2.5時間後、最適な強度の単一パルス(50 μs)によりシェファーチャネルを刺激し、CA1領域においてEPSP応答を記録した。30分間連続して１分毎に１回、刺激と記録を行った。次にシェファーチャネルを強く直接に刺激した（5 μs間隔での連続20パルスを、30秒間隔で合計３回行うことにより刺激する）。この強直接刺激の後、前と同じく最適な強度の単一パルス(50 μs)によりシェファーチャネルを刺激し、CA1領域においてEPSP応答を記録した。６時間連続して１分毎に１回、刺激と記録を行った。上記の強直接刺激を行う適当な時間は、最初の薬剤投与の12時間後及び２回目の薬剤投与の３時間後である。６時間の記録が終了した後、シェファーチャネルの強直接刺激を同じパラメータで再び行った。それから再び最適な強度の単一パルス(50 μs)によりシェファーチャネルを刺激し、CA1領域においてEPSP応答を記録した。１時間連続して１分毎に１回、刺激と記録を行った。
【００５９】
Ｖ．データ処理及び分析
連続した５又は10回の記録におけるEPSP波形に対して平均オーバーレイを実行し、その平均オーバーレイを計算した後、EPSP電位の上昇相の勾配を計算した。強直接刺激前のEPSP勾配の平均値を100%として、強直接刺激の前後の各時点のEPSP勾配を計算した。時間に対するEPSP勾配のグラフを描いた。
【００６０】
VI．実験結果
実験結果を図７に示す。Tob遺伝子のアンチセンス核酸を注入した後、CA1領域における該シナプス電位の長期増強(LTP)は、ランダム配列によるコントロール群又は生理食塩水によるコントロール群のLTPに比べて有意に弱かった。このことは、CA1のTob遺伝子が、長期増強の誘導及び維持に関わることを示す。
【実施例６】
【００６１】
ステップダウン試験におけるマウスの記憶に対する所定のTob遺伝子の効果
ステップダウン行動を検査するためにステップダウン法（ステップダウン試験）を用いることができる(Chen Shuangshuang, Guan Linchu, Bao Shimin, Jin Meilei, Comparative Study on Open Space Behaviour and Memory in Four Breeds of Mice, Psychological Science 1994 Vol.17, No. 1, pp. 39-41)。この実験装置は20 x 28 x 30 cmの透明プラスチック箱であり、その底は金属製のサーキットボードであり、左コーナーに安全エリアとして8 x 8 x 1.5 cmのプラットフォームが置いてあった。実験開始前に、先ず訓練を行った。一匹のマウスを実験箱に入れ、１分間自由に運動させ、その後穏やかにマウスを小さなプラットフォーム上に追い立て（通常マウスは急いでプラットフォームから降りる）、そしてマウスがプラットフォーム上に完全に登った時から、マウスが降りた時までの秒数（潜時）を記録した。これを連続３回繰り返した。その後再びマウスを小さなプラットフォーム上に追い立て、直ぐに実験箱の底のサーキットボードに電流を通した(50 V, 0.5 mA)。マウスが再度プラットフォームから飛び降り、電気ショックを受けた後、マウスはショックを避けるためにプラットフォーム上に飛び戻るだろう。その時点でマウスは訓練されたと見なされた。そのマウスを取り出し、飼育ケージに入れた。訓練の24時間後、マウスを再び実験箱のプラットフォーム上に置き、実験箱の底のサーキットボードに電流を通した。マウスが小さなプラットフォームに置かれた時から降りた時までの時間（秒）を記録した。訓練の48時間後、同様の方法で一回間隔を記録した。該動物の記憶行動をより良く観察及び評価するために、該当文献に従って訓練の回数及び48時間後の観察を増やした。
【００６２】
この実施例では、群１としてBALB/cマウス＋生理食塩水を用い、群２としてBALB/cマウス＋ランダム配列核酸を用い、そして群３〜９として異なる系統のマウス＋Tobアンチセンス配列核酸を用いた。このTobアンチセンス核酸配列及びランダム核酸配列は実施例４のものと同じであった。
【００６３】
この結果を図８Ａ（24時間）及びＢ（48時間）に示す。アンチセンス核酸実験群は、コントロール群に比べて有意な記憶の低下を示し、それは全ての系統においてマウスの学習及び記憶を有意に阻害することができた。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は、ヒト、マウス及びラットのTob蛋白質の保存領域の比較を示す。この図では、humantobはヒトTobを、mousetobはマウスTobを、そしてrattobはラットTobを指す。
【図２】図２は、ラットTobのmRNAの発現パターンである。レーン１〜９は各々脳、海馬、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、筋肉及び脾臓を指す。
【図３】図３は、海馬におけるラットTobのmRNAの分布図である。TobのmRNAは主に海馬のDG, CA1及びCA3領域に検出される。
【図４】図４は、脳におけるマウスTobのmRNAの分布図である。TobのmRNAは主に海馬及び小脳皮質に検出される。
【図５】図５は水迷路の概略図であり、その中の「Ｏ」は隠されたプラットフォームの位置を示す。
【図６】図６は、モーリス水迷路におけるラットの学習と記憶の維持に対する、Tob遺伝子のアンチセンス配列核酸の効果を示す。
【図７】図７は、コントロール群及びアンチセンス核酸群のラット海馬のCA1領域において記録したLTPを示す。
【図８】Tobアンチセンス核酸配列による９種類の系統のマウスの記憶に対する効果が、全てのケースでネガティブであることを示す。群１はBALB/cマウス＋生理食塩水を、群２はBALB/cマウス＋Tobランダム配列を、そして群３〜９は種々の系統のマウス＋Tobアンチセンス配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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