(57)【要約】本発明は、特異的抗体の非存在下における目的の組換えタンパク質の定量のための方法、とくに異種遺伝子を発現する細胞クローンのスクリーニングに適する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞、体液、または下流プロセスから得られる画分中のヒスチジンタグポリペプチドの量を決定するための方法であって、
ａ）細胞において組換えヒスチジンタグポリペプチドを発現し、
ｂ）組換えヒスチジンタグポリペプチドを含む試料と抗Ｈｉｓ−タグ特異的抗体との混合物をインキュベーションし、該混合物を、モノマーもしくはポリマーのヒスチジンタグ、またはヒスチジンタグを含有する担体タンパク質でコートされた固相表面に適用し、
ｃ）該固相から該混合物を分離し、
ｄ）該固相に結合した抗Ｈｉｓ−タグ特異的抗体の量を検出および測定し、および
ｅ）該固相に結合した抗体の量から、該試料中のヒスチジンタグポリペプチドの量を決定することからなる方法。
【請求項２】
前記ポリペプチドがｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＥＳＴまたはオープンリーディングフレームを有するＤＮＡによってコードされる請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記試料が細胞溶解物および順化培地から選択される請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記ポリペプチドが真核細胞において産生される請求項１、２または３記載の方法。
【請求項５】
前記ポリペプチドが酵母または真菌において産生される請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドが植物細胞において産生される請求項４記載の方法。
【請求項７】
前記ポリペプチドが哺乳類細胞において産生される請求項４記載の方法。
【請求項８】
前記哺乳類細胞がＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳおよびＨｅＬａ細胞から選択される請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記ポリペプチドが原核細胞において産生される請求項１、２または３記載の方法。
【請求項１０】
前記ヒスチジン−タグが６つの連続するヒスチジンを含有する請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体が６つの連続するヒスチジンを含有するタグに特異的である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体がポリクローナル、モノクローナル、そのＦａｂ断片またはほかの断片である請求項１または１１記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体が標識される請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体が標識化二次抗体によって検出される請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
前記二次抗体が抗種ＩｇＧ特異的抗体である請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記標識が、放射線同位体、触媒、蛍光化合物、化学発光化合物、酵素および酵素基質からなる群より選択される請求項１３、１４または１５記載の方法。
【請求項１７】
前記固相に結合される抗体の検出が、ＨＲＰ−共役アフィニピュア  ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＨＲＰ）および基質溶液（ＯＰＤ）と反応させることによって行なわれる請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記固相がポリ−Ｌ−ヒスチジンでコートされる請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７記載の方法。
【請求項１９】
前記固相がマイクロタイタープレートである請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記ポリペプチドがＣ末端ドメインにヒスチジン付加されたものである請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリペプチドがＮ末端ドメインにヒスチジン付加されたものである請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリペプチドがＩＬ−１８ＢＰである請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１記載の方法。
【請求項２３】
タンパク質分解酵素に特異的な認識部位が、ヒスチジンタグタンパク質のヒスチジン−タグとポリペプチドとの間に挿入され、タグなしタンパク質への回復が可能である請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２記載の方法。
【請求項２４】
前記タンパク質分解酵素がＸａである請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記タンパク質分解酵素がカスパーゼ−８である請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
ａ）モノマーもしくはポリマーのヒスチジン−タグまたはヒスチジン−タグを含有する担体を結合した固相、
ｂ）抗Ｈｉｓ−タグ特異的抗体、
ｃ）陽性基準ヒスチジンタグポリペプチド、および
ｄ）取扱説明書
を含有する、ヒスチジンタグポリペプチドの競合イムノアッセイを行なうためのキット。
【請求項２７】
前記基準ポリペプチドがＩＬ−１８ＢＰ−Ｈｉｓ、ＢＩＤ−Ｈｉｓ、Ｓｐ  Ｌｙｔ  Ａ−ＨｉｓまたはＭｕｒＤ−Ｈｉｓから選択される請求項２６記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の組換えポリペプチドの定量方法および定量キット、ならびにそのような組換えポリペプチドを発現する細胞の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えタンパク質は、タンパク質の作用機序の決定、およびタンパク質−タンパク質相互作用またはタンパク質−核酸相互作用の探索などの多様な研究において用いられる多用途のツールに相当する。また、それらは抗体産生のための免疫原としてもしばしば用いられる。臨床では、組換えタンパク質は徐々に疾患の治療のための治療剤として用いられている。
【０００３】
異種系統（heterologous systems）で合成されたタンパク質は、特有の生物学的活性の分析、またはそのような活性とは無関係な分析のいずれかによって検出される。わずかではあるが、目的のタンパク質が、インビトロにおいて完全な細胞または抽出物で分析され得る酵素活性またはそのほかの生物学的活性を保持する場合がある。そのような分析は非常に有用であるけれども、以下のいくつかの実用的制限の１つをしばしば受ける。（ａ）そのような分析はおそらく、たとえば小規模の哺乳類培養物にて合成された少量のタンパク質の検出に対して充分に敏感でない、（ｂ）宿主細胞自身が、組換えタンパク質と同じ生物学的活性を示す内因性タンパク質、または組換えタンパク質と拮抗する内因性タンパク質のどちらかを発現し得る、（ｃ）組換えタンパク質の異種発現（heterologous expression）に関連する生物学的活性の決定は、そのタンパク質の正確な特異的活性の確立に充分でない。したがって、生物学的活性に無関係で、非常に少量のタンパク質の測定に充分に敏感な分析の開発が必要不可欠である。それらの分析のために選り抜かれた試薬は、異種タンパク質と反応する特異的抗体である。特異的抗体は、よく研究されたタンパク質に対しては商業的に入手可能である。また、特異的抗体は、精製タンパク質または商業的に入手可能なタンパク質で、適切な動物を免疫することによって産生できる。
【０００４】
抗原を定量するための免疫学的な方法は、優れた感度および特異性を提供し、研究および臨床的適用の双方で標準技術に成長している。タンパク質の定量の近代的な免疫化学的な方法はすべて、プラスチックなどの固体の表面に結合する標識分子（抗原または抗体）の量を、結合してない標識を洗い去ることによって測定する単純で正確な方法に基づいている。
【０００５】
標識分子が放射性同位体によって標識される場合、その分析はラジオイムノアッセイと呼ばれる。その標識分子はシンチレーション計数器において放射性崩壊事象を計測することによって定量される。比色、化学発光、蛍光、またはホスホメトリック（phosphometric）であり得るレポーター基質を切断できる酵素と、標識分子が共有結合される場合、その分析は固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）と呼ばれる。その標識分子は、その酵素が中性基質を着色または発光産物に変換する際の初速度を分光光度計で測定することによって定量され得る。
【０００６】
ＥＬＩＳＡは４つの見だし：直接、間接、サンドイッチおよび競合のもとに分類される（Crowther, J. R. (1995) Methods in Molecular Biology volume 42 pages 35-50）。直接標識抗原ＥＬＩＳＡでは、抗体を固相に吸着し、抗原を標識する。直接標識抗体ＥＬＩＳＡでは、固相に結合された抗原は酵素標識された抗体（たとえば、酵素との共役）と直接反応される。間接ＥＬＩＳＡでは、抗体は標識されず、酵素に共役した二次抗種特異的抗体が使用される。
【０００７】
直接サンドイッチＥＬＩＳＡでは、一次抗体は固相に結合され、試験抗原が添加され、結合された抗体に捕捉される。酵素に共役した別の二次抗体は、捕らえられた抗原を検出するために使用される。間接サンドイッチＥＬＩＳＡでは、二次抗体は標識されず、一次抗体と異なる動物種において産生され、三次抗種特異的標識抗体によって検出される。
【０００８】
競合ＥＬＩＳＡは三次抗体と競合する２つの反応体からなる。以下が競合ＥＬＩＳＡの例である。
【０００９】
直接標識抗体競合ＥＬＩＳＡでは、抗原を固相に吸着し、前滴定された共役抗体を添加するので、該抗原は飽和され、さらなる抗体との結合に利用できる遊離の認識部位はない。標識抗体が、固相に結合された抗原と反応できるほかの抗体（競合抗体）と混合されている場合、抗原と共役抗体との相互作用は混乱する。このような分析は、同一のタンパク質に対するモノクローナル抗体を比較するために使用できる。
【００１０】
直接抗原競合ＥＬＩＳＡでは、抗原を固相に吸着し、前滴定された共役抗体を添加するので、該抗原は飽和され、さらなる抗体との結合に利用できる遊離の抗原部位はない。この場合、標識抗体がほかの抗原（競合物）と混合されていれば、抗原と共役抗体との相互作用は混乱する。したがって、競合抗原が交差反応的である場合、標識抗体は固相に結合した抗原との反応に利用することができず、色の減少が観察される。このような分析は、抗原を定量するため、または同一抗体に対する２つの抗原の結合の相対的な親和性を比較するために使用される。
【００１１】
間接抗原／抗体競合ＥＬＩＳＡでは、抗体は標識されず、三次抗種特異的標識抗体によって検出される。
【００１２】
ＤＮＡ配列の有用性の増大、および新規遺伝子のクローニングのためには、それらの遺伝子産物に関する情報が制限されている場合、タンパク質の検出および精製のための新規ツールの開発が必要である。タンパク質の研究においてタグ配列の出現は、とりわけ特異的抗体が利用できない場合に組換えタンパク質の検出および精製を可能にすることによって、その効率的な取り扱いの助けとなっている。目的のタンパク質は、通常それ自身の機能を有しつつ、短いペプチドと融合（エピトープタグタンパク質）またはポリペプチドと融合（融合タンパク質）できる。
【００１３】
特別に設計されたタグの付加、または遺伝子工学により作製された標的遺伝子内の配列の修飾は、天然のまたは修飾タンパク質の有効な回復のために用いることができる下流プロセッシング（downstream processing）の新規な方法の開発を可能にする。
【００１４】
融合タンパク質を構築するために使用されるポリペプチドの例としては、β−ガラクトシダーゼ（およそ１２０ｋＤ）、グルタチオン−s−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ  およそ２６ｋＤ、Smith et al. 1988）およびマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ  およそ４４ｋＤ、Riggs P in Ausbel FM et al, eds. Current protocols in Molecular Biology 16.6.1）があげられる。融合タンパク質は、通常特異的抗体によっては検出されないが、酵素活性などの融合タンパク質の機能、または他のタンパク質と相互作用する能力によって検出される。
【００１５】
エピトープタグの例としては、ヒスチジンタグ（一連の６つの連続するヒスチジン、Janknecht et al. 1991）、ＦＬＡＧ（８アミノ酸エピトープ、ＲＯＣＨＥ）、ＶＳＶ−Ｇ（水胞性口炎ウイルス由来の１１アミノ酸エピトープ、ＲＯＣＨＥ）、プロテイン−Ｃ（ヒトプロテイン−Ｃの重鎖由来の１２アミノ酸エピトープ、ＲＯＣＨＥ）、およびｃ−ｍｙｃ（ヒトｃ−ｍｙｃ遺伝子タンパク質由来の１０アミノ酸エピトープ、ＲＯＣＨＥ）があげられる。エピトープタグタンパク質において、付加された配列は、通常それ自身では何の機能も持たない約３〜１２アミノ酸の短いペプチドである。そのエピトープタグの重要な性質は、たった１つのタグ特異的抗体によって認識され、結合される能力である。エピトープタグは、アミノ末端（Ｎ−末端）、カルボキシ−末端（Ｃ−末端）、またはタンパク質のコード領域内に設置できる。
【００１６】
広範囲にわたるエピトープが、タンパク質に付加するために使用されており、多くのタグ特異的抗体が商業的に入手可能である。特定の実験系のための最適なエピトープタグは、タグタンパク質の機能または細胞プロセシングに干渉せず、さらに免疫蛍光顕微鏡検査法またはほかの解析技術において、ウエスタンブロットでの強力な検出シグナルを発生するものである。
【００１７】
エピトープタグはＤＮＡレベルで組み込まれている。エピトープのコーディング配列を目的のタンパク質のコーディング配列に融合するために、単純な組換えＤＮＡ技術またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるオリゴヌクレオチド仲介突然変異誘発が用いられる。
【００１８】
タグタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、適切な転写および翻訳の調節配列を含有する発現ベクターに挿入しクローニングされる。該発現ベクターは適当な宿主（原核生物または真核生物の宿主）に導入される。
【００１９】
エピトープ付加（epitope tagging）を使用する通常の分析法は、ウエスタンブロッティング、免疫蛍光顕微鏡検査法、免疫沈降法（Sells and Cernoff, 1955, Chubet and Brizzard, 1996）、およびアフィニティークロマトグラフィーである。
【００２０】
エピトープ付加方法論の適する生物学的適用は、タンパク質のサイズ、細胞内での配置、存在度の決定（Molloy et al 1994, Canfield et al. 1996）、翻訳後の修飾のモニタリング、個々のタンパク質ドメインの機能解析、受容体結合および外因性タンパク質の内在化の研究（Brown et al. 1995）、ならびにタンパク質複合体内におけるタンパク質の同一性の確立（Zhou et al 1992）を含む。
【００２１】
最も広く使用されている分子付加法の１つは、典型的には５つまたは６つの連続するヒスチジン残基からなるヒスチジンタグとの融合分子としての組換えタンパク質の発現である（Hochuli 1988）。ヒスチジン残基を含有する得られるタンパク質は、固相支持体に結合されたイミノ二酢酸（ＩＤＡ）またはアンモニア酢酸（ＮＴＡ）のキレート複合体として固定された金属イオンの遊離配位部位をキレートする能力などの有用な性質を有する（Arnold 1991にて概説）。その能力は、ヒスチジンのイミダゾール部位により供与されるものである。とくに、ＩＤＡまたはＮＴＡにキレートされるＮｉ+2、Ｚｎ+2、Ｃｏ+2およびＣｕ+2が、研究下のタンパク質のアフィニティー精製のためのクロマトグラフマトリックスとして使用される。
【００２２】
金属に対するヒスチジン部位の親和性の開発に加えて、現在では抗体がヒスチジンタグの認識に利用できる（Lindner et al. 1997）。そのようなポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、ウエスタンブロットにおいて固定されたヒスチジンタグタンパク質の検出に使用される。
【００２３】
ヒスチジンタグタンパク質の定量のための方法はよく知られている。たとえば、ポリヒスチジンタグタンパク質を含む試料を、金属でコートされた表面（Reacti-Bind（商標） Metal Chelate Plates, Pierce）に供給する。非結合物質を洗い去ったのち、ヒスチジンタグタンパク質は、ヒスチジンタグに特異的な抗体によって、または代替的には西洋ワサビペルオキシダーゼのニッケル２＋活性化誘導体であるＩＮＤＩＡ（商標）  ＨｉｓＰｒｏｂｅ-ＨＲＰによって検出できる。このアプローチは特異性に欠け、ニッケルコートされた表面と、天然の配列にヒスチジンを含むタンパク質との非特異的結合を許すものである。
【００２４】
細菌によって発現された組換えタンパク質の定量のためのタグの使用は、ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＱＩＡＧＥＮ）で知られており、それは機能的に活性なタンパク質およびそのほかの改良された分析のための生体分子を固定するために６×ＨｉｓとＮｉ−ＮＴＡとの間の強い相互作用を利用するものである。６×ヒスチジンタグ生体分子は、細胞溶解物などの分子の複合混合物から選択的に捕捉され得る。生体分子は、均一な配向性（uniform orientation）で結合され、相互作用する相手に結合ドメインの最適な提示を提供することにより、より高い信号ノイズ比および確実で再現性のある結果となる。ｐＱＥ−１００  ＤｏｕｂｌｅＴａｇベクターから発現されたタンパク質は、Ｎ末端６×Ｈｉｓタグ、およびＣ末端Ｔａｇ・１００を有する。これら二重のタグタンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡ  ＨｉｓＳｏｒｂ細片およびプレートまたはＮｉ−ＮＴＡ  磁性アガロースビーズに６×Ｈｉｓタグにより慣習的に固定され、Ｔａｇ・１００抗体を用いて検出される。この方法は目的のタンパク質に特異的な抗体の必要性を排除するが、いまだにニッケルコートされた表面への、天然の配列に一連のヒスチジンを含有するタンパク質の非特異的結合を許すことによる特異性の欠如の制限を有する。さらに、２つのタグの存在は任意のタンパク質の立体配座または生物学的活性に影響しうる。
【００２５】
これまで、特異的抗体の非存在下で組換えポリペプチドを産生する細胞を検出することが可能な、一般的で、敏感で、特異的で、行なうのが定量的に容易で、そして効果的な方法は存在しない。
【００２６】
したがって、本発明に記載された方法は、特異的抗体が利用できない場合、たとえば新規遺伝子によってコードされるタンパク質の場合、組換えタンパク質の定量の分野における長年の問題を解決するものである。
【発明の開示】
【００２７】
本発明は、細胞、体液、または下流プロセスから得られる画分中のヒスチジンタグポリペプチドの量を決定するための方法であって、
ａ）細胞中において組換えヒスチジンタグポリペプチドを発現し、
ｂ）組換えヒスチジンタグポリペプチドと抗Ｈｉｓ−タグ特異的抗体とを含む試料の混合物をインキュベーションし、該混合物を、モノマーもしくはポリマーのヒスチジンタグ、またはヒスチジンタグを含有する担体タンパク質でコートされた固相表面に適用し、
ｃ）該固相から該混合物を分離し、
ｄ）該固相に結合した抗Ｈｉｓ−タグ特異的抗体の量を検出および測定し、および
ｅ）該固相に結合した抗体の量から、該試料中のヒスチジンタグポリペプチドの量を決定することからなる方法に関する。
【００２８】
測定される前記ポリペプチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＥＳＴまたはオープンリーディングフレームを有するＤＮＡによってコードされており、その試験試料は細胞溶解物および順化培地（condition medium）から選択される。
【００２９】
１つの実施態様において、前記ポリペプチドは、Ｃ末端またはＮ末端ドメインに６つの連続するヒスチジンを含有するヒスチジンタグに融合され、真核細胞および原核細胞において発現される。好ましい実施態様において、ポリペプチドはヒスチジンタグに融合され、酵母、真菌、植物、ＢＨＫ、ＣＯＳ、ＨｅＬａおよびＣＨＯ細胞から選択される真核細胞において産生される。
【００３０】
本発明の１つの局面において、抗体、ポリクローナル、モノクローナル、Ｆａｂ断片またはほかの任意の抗体断片が、それ自身が標識され得るか、あるいは標識された二次抗体が、その標識されていない一次抗体またはその断片を検出するために用いられ得る。１つの実施態様において、標識二次抗体は抗種ＩｇＧ特異的抗体である。標識は、放射線同位体、触媒、蛍光化合物、化学発光化合物、酵素および酵素基質からなる群より選択できる。好ましくは、一次抗体の検出は、ＨＲＰ共役アフィニピュア（HRP-conjugate AffiniPure）ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＨＲＰ）および基質溶液（ＯＰＤ）と反応させることによって行なわれる。
【００３１】
本発明のほかの局面において、タンパク質分解酵素、好ましくはＸａまたはカスパーゼ−８に特異的な認識部位は、タグなしタンパク質への回復を考慮して、ポリペプチドにおけるヒスチジンタグの近くに付加される。
【００３２】
本発明による方法は、たとえば、与えられる試料中のＩＬ−１８ＢＰの量の決定を可能にする。
【００３３】
本発明はまた、ａ）モノマーもしくはポリマーのヒスチジン−タグまたはヒスチジン−タグを含有する担体を結合した固相、ｂ）抗Ｈｉｓ−タグ特異的抗体、ｃ）陽性の基準ヒスチジンタグタンパク質、好ましくはＩＬ−１８ＢＰ−Ｈｉｓ、ＢＩＤ−Ｈｉｓ、Ｓｐ  Ｌｙｔ  Ａ−ＨｉｓまたはＭｕｒＤ−Ｈｉｓ、およびｄ）取扱説明書を含有するヒスチジンタグポリペプチドの競合イムノアッセイを行なうためのキットを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本発明は、試料中の組換えタンパク質の検出、および組換えタンパク質を産生する細胞の検出のための定量方法に関する。該方法は、原核生物系および真核生物系の両方において、新規タンパク質および／またはポリペプチドをコードする異種遺伝子を発現する細胞クローンの検出に適する。
【００３５】
その方法の第１工程は、ｃＤＮＡ配列、ゲノムＤＮＡ、またはポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する新規遺伝子もしくはＥＳＴと、通常４つまたはそれ以上の連続するヒスチジン残基からなるヒスチジンタグをコードするＤＮＡ配列との融合からなる。該タグは、コードされた目的のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合できる。必要に応じて、Ｘａ（国際公開第００／６１７６８号パンフレット）などの部位特異的タンパク質分解酵素によって認識される配列を、インビトロにおけるＸａ切断およびタグなしタンパク質への回復を可能にするために、タグの間に挿入できる。あるいは、使用されるタンパク質分解酵素は、カスパーゼ−８、システイン  アスパラギン酸−特異的プロテアーゼ（Nicholson DW et al. 1997, Salvesen GS et al. 1997, Cohen GM 1997）である。カスパーゼの切断部位はテトラペプチド配列（Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｄ）によって定義され、切断は通常アスパラギン酸の下流で起こる。
【００３６】
あるいは、もしそのタグがそのタンパク質の活性に影響しないのであれば、タグは遺伝子のコーディング領域に配置することができる。または、内因性で天然の一連のヒスチジン残基もまた、タグとして使用できる。
【００３７】
ヒスチジンタグ融合タンパク質の産生を目的に設計されている発現ベクターは、商業的に入手可能である。それらのベクターは、クローニングサイトの上流または下流にヒスチジンタグをコードする。あるいは、そのヒスチジンタグは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、たとえば目的のＤＮＡの増幅のために使用するプライマーにヒスチジンタグ配列を組み込ませることによって、目的の遺伝子に融合され得る。ＰＣＲ増幅ＤＮＡ融合産物は、転写および翻訳のための適切な調節シグナルを含有する発現ベクターに挿入され、クローニングされ得る。目的のタグタンパク質は、目的のヒスチジンタグタンパク質のＤＮＡ配列を運ぶ適切な発現ベクターでトランスフェクト、形質転換、または感染された適当な宿主細胞において発現および培養できる。産生される組換えタンパク質は、可溶性、不溶性（封入体）、細胞内、ペリプラズムであるか、培地に分泌される。
【００３８】
その方法の第２次工程は、競合イムノアッセイによる、組換えタンパク質の定量からなる（図１における概要図参照）。この分析において、試料中、通常トランスフェクトされた細胞の上清中のヒスチジンタグタンパク質は、ヒスチジンコートされた固相表面、たとえば９６穴マイクロタイタープレートへの抗ヒスチジン特異的抗体の結合と競合する。
【００３９】
トランスフェクトされた細胞によって産生されるヒスチジンタグポリペプチドのよりよい定量のために、競合イムノアッセイにおいて使用される試薬の最適な濃度、たとえば抗Ｈｉｓ−タグ特異的抗体およびプレートをコートするために使用されるヒスチジンの最適な濃度を決定する。所望の最適な抗体およびヒスチジンの濃度は、抗体が固相表面に結合されたヒスチジンによって飽和される濃度であり、遊離する抗体が抗原とのさらなる結合に利用可能でない濃度である。
【００４０】
試料中のヒスチジンタグタンパク質の量は、プレインキュベーションまたは（前記したように最適な濃度で）抗Ｈｉｓ−タグ特異的抗体と試料とを混合することによって測定される。抗体と試験される試料との混合物が、ヒスチジンコートされたプレートに供給され、ついでインキュベーションされる。インキュベーションののち、プレートは洗浄され、固相に結合した抗体の検出を、標識抗体を用いて直接的に、または１次抗体のＩｇＧ部分に対して特異的な二次標識抗体を用いて間接的に、もしくは標識タンパク質Ａ／Ｇによって達成できる。
【００４１】
プレートに結合した抗体の量は、試料中のヒスチジンタグタンパク質の濃度に反比例する。ヒスチジン−タグと融合した、商業的に入手可能な、または研究所内で精製される関連のないタンパク質を、試料中に存在するヒスチジンタグタンパク質の量の評価に必要な用量応答曲線を作製するための基準タンパク質として使用し得る。あるいは、より正確な定量のために、目的の関連ヒスチジンタグタンパク質の一部も、たとえばニッケルカラムにおいてアフィニティー精製し、基準として使用され得る。
【００４２】
競合アッセイのために使用される固相、たとえば９６穴マイクロタイタープレートは、各タイプのヒスチジン試薬、たとえばポリヒスチジン、ヒスチジンタグモノマー、オリゴマーおよび／または担体と結合したヒスチジンタグで、活性化およびコートできる。活性化プラスチックプレートは商業的に入手可能である。
【００４３】
抗Ｈｉｓ−タグ特異的抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであることができ、Ｆａｂ断片などの抗体断片によって務められることができ、それらは商業用または研究所内で作製され得る。
【００４４】
試験試料は、細胞培養物の上清、細胞溶解物、体液（たとえば、動物または個人にヒスチジンタグタンパク質が注入されたもの）などの粗調製物であってもよく、または下流の精製工程から得られる画分であってもよい。
【００４５】
標識は、抗体またはタンパク質Ａ／Ｇに結合する酵素を用いて行なわれ、比色、蛍光または化学発光の特異的基質によって視覚化される。あるいは、その抗体またはタンパク質Ａ／Ｇは放射性によって標識され得る。さらに、ビオチンは、リジン残基を通して、化学的に抗体またはタンパク質Ａ／Ｇに結合し得る。標識化ストレプトアビジンは、ビオチンの存在を検出するために使用され得る。
【００４６】
本発明による方法は、組換え標的のハイスループットスクリーニングを促進し、発現ライブラリーでトランスフェクションしたのちに組換えタンパク質を発現する細胞において標的タンパク質のみをスクリーニングすることによって、試験試料の数をしぼり得る。たとえば、トランスフェクションの前にヒスチジンタグをコードする配列に融合した発現ライブラリー由来のｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞のプールを、一時的な発現ののち、前記競合ヒスチジン−タグアッセイを用いて試験することができる。所望の標的を発現する細胞プールの選択ののち、組み換えポリペプチドを安定に発現する細胞を選択することが可能な好適な選択条件下で、細胞の増殖を行なうことができる。ついで、与えられたプールにおける非産生細胞から産生者を選別および救出するために、希釈技術、および前記競合アッセイによって組換えヒスチジンタグポリペプチドの存在を試験された単一細胞派生系列の上清を制限することによって、単一細胞をプールから単離できる。
【００４７】
特異的抗体が利用できない場合、本発明による方法は、タグなし組換えポリペプチドの産生細胞クローンの開発の促進、およびその下流の精製の簡易化のためにも適用され得る。たとえば、数マイクログラムのタグポリペプチドは、産生クローンの上清からのアフィニティー精製によって回収され、前記のように単離され、タグなし組換えタンパク質を産生するために作製された細胞クローンの開発に必要とされる特異的抗体の精製に使用される。
【００４８】
ヒスチジンタグタンパク質自身は、新規タンパク質の治療的な価値およびその作用機序を調査するために使用され得る。
【００４９】
本発明は、また、１）最適な量のポリヒスチジンでプレコートされた９６穴プレート、２）抗ヒスチジン抗体、３）最適な抗体およびポリヒスチジンの濃度の滴定のための取扱説明書、４）精製されたヒスチジンタグタンパク質基準、および５）用量応答曲線の作製のための指示を含有する組換えタンパク質の定量のためのキットを提供する。該キットは、随意、洗浄緩衝液、ＨＲＰ−共役アフィニティーピュアヤギ抗マウスＩｇＧ、および基質液、アフィニティー精製のためのニッケルカラム、ならびにヒスチジンタグの融合物を作製するための適当なベクターを含む。
【００５０】
本発明は、以下の制限のない実施例によって説明される。
【実施例１】
【００５１】
ヒスチジンタグの組換えタンパク質への融合
６つの連続するヒスチジンを含有するヒスチジンタグ（Ｈｉｓ×６）を、遺伝的に、ＩＬ−１８ＢＰタンパク質のＣ末端、ＢＩＤのＮ末端、Ｓｐ  Ｌｙｔ  ＡのＣ末端、およびＭｕｒＤのＣ末端に、ＰＣＲを用いて融合した（これらの４つのタンパク質の機能は表１に簡単に記載している）。増幅したＤＮＡのＰＣＲ断片を、当技術分野で既知の一般的な遺伝子工学手法（Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publications and Wiley Interscience, New York, NY, 1987-1995）により、適切な発現ベクターに挿入した。ヒスチジンタグタンパク質を、従来の原核生物系または真核生物系において発現させ、ニッケルカラム（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いてアフィニティー精製した。
【００５２】
【表１】
2004530872.tif 000002
【実施例２】
【００５３】
競合ＥＬＩＳＡに必要な試薬の最適濃度の決定
マイクロタイタープレート（９６穴プレート）に、ポリ−Ｌ−ヒスチジン（シグマ、Ｃａｔ．＃Ｐ−２５３４Ｈ2Ｏ中）の濃度を増加させながら１００μｌを供給し、４℃で１６時間インキュベーションした。ついで、そのプレートを、３００μｌ／穴の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（本明細書中では洗浄緩衝液と呼ぶ）で３回洗浄し、２００μｌ／穴の、Ｈ2Ｏ中で１：１０に希釈されたＢＳＡ希釈液／ブロッキング溶液濃縮物（blocking solution concentrate）（ＫＰＬ、Ｃａｔ＃ ５０−６１−０１）で３７℃で１時間（または４℃で１６時間）振とうしながら遮断した。ついで、そのプレートを洗浄緩衝液で４回洗浄した。
【００５４】
ヒスチジンタグＨｉｓ×６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓより購入）に対する特異的抗体を、アッセイ緩衝液（ＢＳＡ希釈液／ブロッキング溶液濃縮物、ＫＰＬ、Ｃａｔ＃ ５０−６１−０１、Ｈ2Ｏ中で１：１５で希釈）で順次希釈した。抗体の各希釈を、様々な濃度のポリ−ヒスチジンでコートされた９６穴プレートに供給し、振とうしながら３７℃で１時間インキュベーションした。ついで、そのプレートを３００μｌ／穴の洗浄緩衝液で４回洗浄し、１００μl／穴の、アッセイ緩衝液中で１：１０，０００で希釈したＨＲＰ−共役アフィニピュア  ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＨＲＰ）で、振とうしながら３７℃で１時間インキュベーションした。過剰な抗体を洗浄によって除去したのち、検出基質溶液を着色するまで添加した。１２５μｌ／穴の４Ｎ  ＨＣｌを添加することによって、反応を停止した。吸光度を、４０５ｎｍの基準波長とともに、ＥＬＩＳＡリーダーにおいて４９２ｎｍで測定した。プレートをコートするために使用したポリ−ヒスチジン濃縮物の関数として、ＯＤ曲線を各濃度の抗Ｈｉｓ−タグ特異的抗体について作製した（図１）。その滴定は、ポリ−ヒスチジンの濃度が上昇しても獲得値に何の影響も与えない、高ポリ−ヒスチジン濃度での安定期を示す。安定は、完全に抗体がポリ−ヒスチジンで飽和される領域を表わし、これは抗体が制限されていることを示す。競合ＥＬＩＳＡ用に選択される抗体の希釈度は、６２．５ｎｇ／ｍｌであり、プレートをコートするために使用されるポリ−ヒスチジンの濃度は５μｇ／ｍｌであった。
【実施例３】
【００５５】
競合ＥＬＩＳＡ；種々のヒスチジンタグ組換えタンパク質を使用する用量曲線の作製
競合ＥＬＩＳＡの概要図を図２に示す。事前に滴定された抗Ｈｉｓ−タグ特異的抗体（図２）を、競合試料（ヒスチジンタグ組換えタンパク質を含む）でインキュベーションする。非複合抗体を、ポリ−ヒスチジンコートされたプレートにおいて検出する。
【００５６】
ポリ−ヒスチジンコートされたプレートに対する抗Ｈｉｓ−タグ特異的抗体の結合に対するコンペティターとして、４つの異なるヒスチジンタグタンパク質に関する用量応答曲線を、以下のようにして作製した。実施例１由来の各ヒスチジンタグタンパク質を、アッセイ緩衝液での一連の希釈に供した（実施例２）。各希釈試料（１００μｌ）を、Ｈｉｓ×６（１００μｌ）に特異的なモノクローナル抗体６２．５ｎｇ／ｍｌとともに、振とうしながら３７℃で３０分間プレインキュベーションした。ついで、プレインキュベーションした試料をヒスチジンコートされたプレート（５μｇ／ｍｌのポリ−ヒスチジンでコート）に移し、振とうしながら３７℃で１時間インキュベーションした。このインキュベーション期間ののち、そのプレートを３００μｌ／穴の洗浄緩衝液で４回洗浄し、１００μｌ／穴のＨＲＰ−共役アフィニピュア  ヤギ抗マウスＩｇＧ（アッセイ緩衝液中で１：１０，０００で希釈されたＨＲＰ）とともに、振とうしながら３７℃で１時間インキュベーションした。過剰な抗体の洗浄ののち、ＨＲＰに対する基質を着色するまで添加した。１２５μｌ／穴の４Ｎ  ＨＣｌを添加することによって、反応を停止した。吸光度（ＯＤ）を、４０５ｎｍの基準波長で、ＥＬＩＳＡリーダーにおいて４９２ｎｍで測定した。陰性対照（抗体を除くすべての試薬）の吸光度によってバックグラウンド値を提供した。平均Ｏ．Ｄ．は２回の測定から算出した。
【００５７】
図３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄに示すグラフは、４つの異なる組換えタンパク質（コンペティター）の濃度の関数として、吸光度のロジット−ログ  プロット（logit-log plots）を示す。その曲線はＳ字状の外観を示す。得られたＯＤはコンペティター（ヒスチジンタグタンパク質）の濃度に反比例することが分かる。１００％の競合（最低ＯＤ）は、競合する組換えタグタンパク質、たとえばＩＬ−１８ＢＰ−Ｈｉｓが大過剰にあるとき観察され、０％の競合（最高ＯＤ）は、コンペティターが存在しない場合またはコンペティターが検出できない量（約１００ｎｇ／ｍｌ未満）であるとき観察される。これらの結果は、この方法によってヒスチジンタグタンパク質の定量が可能であることを示す。
【実施例４】
【００５８】
粗調製物中のヒスチジンタグＩＬ−１８ＢＰの定量
競合方法によるヒスチジンタグＩＬ−１８ＢＰの定量が、粗調製物において可能かどうか試験するために、増殖培地（１０％血清補充ＤＭＥＭ）またはアッセイ緩衝液（対照群）に溶解された、同濃度のヒスチジンタグＩＬ−１８ＢＰ（０．００、０．７５、１．５０および３．００）を競合アッセイに供した。増殖培地の存在または非存在下のアッセイで得られたタンパク質の量を比較した。表２は、増殖培地の存在または非存在下で同様の結果が得られることを示し、このことはヒスチジンタグＩＬ−１８ＢＰの定量が粗調製物において可能であることを示す。粗調製物の例はＩＬ−１８ＢＰ分泌細胞培養物の順化培地である。
【００５９】
【表２】
2004530872.tif 000003
【実施例５】
【００６０】
Ｅｌｉｓａ競合アッセイによって促進された新規タンパク質をコードする異種遺伝子を過剰発現するＣＨＯ細胞クローンの単離
ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞を、哺乳動物発現ベクター（一方はＤＨＦＲをコードする発現ベクター、他方はヒスチジンタグ配列に融合された目的のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するＤＮＡ配列を含有する発現ベクター）で同時にトランスフェクトする。ポリペプチドが発現することを確認するために、トランスフェクションより３日後、一時的な発現を競合ＥＬＩＳＡによって測定する（実施例３）。産生されたヒスチジンタグタンパク質の相対量を比較することによって、のちのクローン開発のために、最適な細胞トランスフェクション群を選択する。細胞トランスフェクションをＤＨＦＲ選択に供し、耐性クローンを単離する。さまざまなクローンによる組換えタンパク質産生のレベルを、競合ＥＬＩＳＡによってモニターする（実施例３）。遺伝子増幅のために、最も高い産生クロ−ンを選択する。その選択はＤＨＦＲ選択およびＭＴＸの濃度増加によって達成される。遺伝子増幅ののち、最適な産生細胞を選択し、競合イムノアッセイを用いてＭＴＸ回収ののちの産生の安定性を試験する。ＭＴＸの非存在下で、増殖において安定なレベルの組換えタンパク質を発現する細胞を、クローニングのために選択する。最適なクローンを、組換えポリペプチドの産生のために選択する。
【００６１】
［参考文献］
Arnold, F. H. (1991). "Metal-affinity separations: a new dimension in protein processing." Biotechnology (N Y), 9(2), 151-6.
Botting, C. H., and Randall, R. E. (1995). "Reporter enzyme-nitrilotriacetic acid-nickel conjugates: reagents for detecting histidine-tagged proteins." Biotechniques, 19 (3), 362-3.
Goel, a., Beresford, G. W., Colchler, D., Pavlinkova, G., Booth, B. J. M., Baranowska- Kortylewicz, J. and K. B., Surinder (2000)."Divalent Forms of CC49 Single-Chain Antibody Constructs in Pichia pastoris: Expression, Purification, and Characterizationl" J. Biochem. 127,829-36.
Hochuli, E. (1988). "Large-scale chromatography of recombinant proteins." J Chromatogr, 444,293-302.
Janknecht, R., de Martynoff, G., Lou, J., Hipskind, R. A., Nordheim, A., and Stunnenberg, H. G. (1991). "Rapid and efficient purification of native histidine-tagged protein expressed by recombinant vaccinia virus." Proc Natl Acad Sci U S A, 88(20), 8972-6.
Lindner, P., Bauer, K., Krebber, A., Nieba, L., Kremmer, E., Krebber, C., Honegger, A., Klinger, B., Mocikat, R., and Pluckthun, A. (1997)."Specific detection of his-tagged proteins with recombinant anti-His tag scFv-phosphatase or scFv-phage fusions." Biotechniques, 22(1), 140-9.
Nygren, P. A., Stahl, S., and Uhlen, M. (1994). "Engineering proteins to facilitate bioprocessing." Trends Biotechnol, 12(5), 184-8.
Smith, D. B., and Johnson, K. S. (1988). "Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase." Gene, 67(1), 31-40.
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本発明による競合ＥＬＩＳＡの概要図を示す。
【図２】競合ＥＬＩＳＡにおいて使用されるべき試薬の最適濃度を決定するための、抗ヒスチジン（６×Ｈｉｓ）特異的Ｍａｂおよびコーティング抗原（ポリ−ヒスチジン）の滴定を示す。抗ヒスチジン特異的Ｍａｂ（ＯＤとして示す）のポリ−ヒスチジンコートされたプレートへの結合を、抗体濃度の機能として、マイクロタイタープレートをコートするために使用されるポリ−ヒスチジンの様々な濃度（０．１２５、０．２５、０．５および１μｇ／ｍｌ）で試験した。
【図３】図３Ａは、ＩＬ−１８ＢＰ−Ｈｉｓ阻害ＥＬＩＳＡに関する用量応答曲線を示す。用量応答曲線は、以下のようにして得た：１００μｌの一連の希釈コンペティター、ＩＬ−１８ＢＰ−Ｈｉｓ（０．１９μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ）および１００μｌのＭａｂ（６２．５ｎｇ／ｍｌ）を混合し、ポリ−ヒスチジンコートされたプレートにおいてインキュベーションした。インキュベーションののち、そのプレートを洗浄し、プレートに結合した抗体をＨＲＰ−共役アフィニピュア  ヤギ抗マウスＩｇＧおよびその特異的基質を使用して検出した。グラフは、競合するＩＬ−１８ＢＰ−Ｈｉｓ濃度（μｇ／ｍｌ）の関数として、吸光度（４９２ｎｍでのＯ．Ｄ．）のロジット−ログプロットを表わす。Ｏ．Ｄ．は、２回の測定の平均として算出された。図３Ｂは、ＢＩＤ−Ｈｉｓ阻害ＥＬＩＳＡに関する用量応答曲線を示す。用量応答曲線を、コンペティターとしてＢＩＤ−Ｈｉｓを使用し、図３Ａに記載されるようにして得た。図３Ｃは、Ｓｐ  Ｌｙｔ  Ａ−Ｈｉｓ阻害ＥＬＩＳＡに関する用量応答曲線を示す。用量応答曲線を、コンペティターとしてＳｐ  Ｌｙｔ  Ａ−Ｈｉｓを使用し、図３Ａに記載されるようにして得た。図３Ｄは、Ｍｕｒ  Ｄ−Ｈｉｓ阻害ＥＬＩＳＡに関する用量応答曲線を示す。用量応答曲線を、コンペティターとしてＭｕｒ  Ｄ−Ｈｉｓを使用し、図３Ａに記載されるようにして得た。
【図１】
2004530872.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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