(57)【要約】本発明は、障害のあるケラチノサイト活性に関連づけられる疾病を診断、予防および／または処置するために、ヒトまたはマウスからの中コンダクタンス型カルシウム活性化カリウムチャネルおよび／またはそれをコードする核酸を使用することに関する。本発明はまた、薬理学的活性物質を同定するためのそれの使用に関する。本発明はさらに、障害のあるケラチノサイト活性に関連づけられる疾病を診断、予防および／または処置するために、中コンダクタンス型カルシウム活性化カリウムチャネルのモジュレーターを使用することにも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患を診断、予防および／または処置するため、あるいは薬理学的活性物質を同定するための、配列番号３もしくは配列番号４の一方で表される少なくとも１種のポリペプチドまたはその機能性変異体か、これらをコードする核酸またはその変異体か、あるいは配列番号３もしくは配列番号４で表されるポリペプチドまたはその機能性変異体に対して向けられた少なくとも１種の抗体の使用。
【請求項２】
障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患が、創傷、特に乾癬であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
核酸が、そのアンチセンス配列の形で存在していることを特徴とする、請求項１および２のいずれかに記載の使用。
【請求項４】
機能性変異体が、融合タンパク質であることを特徴とする、請求項１および２のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患を診断、予防および／または処置するため、あるいは薬理学的活性物質を同定するための、少なくとも１種のベクターおよび／または少なくとも１種のノックアウト遺伝子構築体を宿す宿主細胞であって、配列番号３もしくは配列番号４で表されるポリペプチドまたはその機能性変異体をコードする核酸またはその変異体を含有するものの使用。
【請求項６】
宿主細胞が皮膚細胞であることを特徴とする、請求項５に記載の宿主細胞の使用。
【請求項７】
宿主細胞がケラチノサイトであることを特徴とする、請求項６に記載の宿主細胞の使用。
【請求項８】
障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患を診断および／または予防および／または処置するための、配列番号３もしくは配列番号４で表されるポリペプチドまたはその機能性変異体のモジュレーターの使用。
【請求項９】
モジュレーターが、配列番号３もしくは配列番号４で表されるポリペプチドまたはその機能性変異体に対して向けられた少なくとも１種の抗体を含有することを特徴とする、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
モジュレーターが阻害剤であることを特徴とする、請求項８または９に記載の使用。
【請求項１１】
阻害剤が、以下の一般式（Ｉ）に従った１，４−ジヒドロピリジン−３，５−ジカルボン酸の対称性もしくは非対称性誘導体
【化１】
2004530642.tif 000016
または医薬的に容認されるその塩、酸化物もしくは水和物であることを特徴とする、請求項１０に記載の使用
［式中、
Ｒは、アルキル基またはシクロアルキル基であり；これは、ハロゲンからなる群より選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができ；
あるいは、Ｒは、単環式または多環式アリール基であり、ここで該アリール基は、ハロゲン；トリフルオロメチル（−ＣＦ3）；ニトロ（−ＮＯ2）；シアノ（−ＣＮ）；アジド（−Ｎ3）；式−Ｓ（Ｏ）n−アルキル、−Ｓ（Ｏ）n−ＮＨ−アルキルもしくは−Ｓ（Ｏ）n−Ｎ−（アルキル）2の基（式中、ｎは、好ましくは０、１もしくは２であることができる）；アルキル基；シクロアルキル基；アルコキシ基；トリフルオロメチルオキシ基（−ＯＣＦ3）；カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）；式−ＣＯＯ−アルキルの基；カルバモイル基（−ＣＯＮＨ2）；および、式−ＣＯＮＨ−アルキルもしくはＣＯＮ（アルキル）2の基；から選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができ；
あるいは、Ｒは単複素環式または多複素環式基であり、ここで該複素環式基は、アルキル基、アルコキシ基、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、式−ＣＯＯ−アルキルの基、および／または式−ＣＯＯ−フェニルの基で、１回または１回より多く、置換されていることができ；
そして、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、互いに独立して、水素、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、フェニル基、フェニルアルキル基、フラニル基、フラニルアルキル基、ピリジル基またはピリジルアルキル基である］。
【請求項１２】
阻害剤が、以下の一般式（ＩＩ）に従ったクロトリマゾールの誘導体もしくは代謝物、
【化２】
2004530642.tif 000017
または医薬的に容認されるその塩、酸化物もしくは水和物であることを特徴とする、請求項１０に記載の使用
［式中、
Ｘは、ハロゲン、トリフルオロメチル基、ニトロ基またはシアノ基であり；
Ｒ5は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル基、アルキル基、シクロアルキル基、アルコキシ基またはアルキルオキシ基であり；
Ｒ6は、水素またはフェニル基であり、ここで該フェニル基は、ハロゲンおよびヒドロキシル基から選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができ；
Ｒ7は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル基、アルキル基またはアルコキシ基であり；
Ｒ8は、式−Ｙ−ＣＨ2−Ｒ9の基（式中、Ｙは、酸素（−Ｏ−）または硫黄（−Ｓ−）である）；式＝ＮＯ−ＣＨ2−Ｒ9の基；式−Ｏ−フェニル−ＣＨ＝ＣＨ2の基；式−ＣＨ2−ＣＨ（ＣＨ3）−Ｓ−フェニルの基（式中、該フェニル基は、ハロゲンおよびヒドロキシル基から選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができる）；あるいは、フェニル基、ここで、該フェニル基は、ハロゲンおよびヒドロキシル基から選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができる；であり、ここで、Ｒ9は、エテニル基（ＣＨ2＝ＣＨ−）；フェニル基、ここで該フェニル基は、ハロゲンおよびヒドロキシル基から選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができる；フェニル−Ｓ−フェニル基、式ＣＨ2−Ｏ−フェニルの基（式中、該フェニル基は、ハロゲンおよびヒドロキシル基から選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができる）；あるいは、一般式（ＶＩＩ）の基である
【化３】
2004530642.tif 000018
（式中、ＺはＳ、ＯまたはＮであり；そして、
Ｒ10は、水素、ハロゲン、またはヒドロキシル基である）］。
【請求項１３】
モジュレーターが、以下の一般式（ＩＩＩ）に従ったオキシム誘導体
【化４】
2004530642.tif 000019
または医薬的に容認されるその塩、酸化物もしくは水和物であることを特徴とする、請求項８に記載の使用
［式中、
Ｙは、酸素、硫黄またはアミノ基、好ましくは式ＮＨＲ13のアミノ基であり；
Ｒ11は、水素；アルキル基；シクロアルキル基；ヒドロキシル基；アルコキシ基；アシル基；フェニル基またはベンジル基、ここで該基、特に該フェニル基またはベンジル基は、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＮＯ2、−ＣＮ、アルキル基、シクロアルキル基、ヒドロキシル基およびアルコキシ基から選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができる；式ＣＨ2ＣＮの基；式ＣＨ2ＣＯ2Ｒ’の基（式中、Ｒ’は、水素またはアルキル基である）；式ＣＨ2ＣＯＮＲIVＲVの基（式中、ＲIVおよびＲVは、互いに独立して、水素またはアルキル基である）；あるいは、式−ＣＨ2Ｃ（＝ＮＯＨ）ＮＨ2の基であり；
Ｒ12は、水素；アルキル基；シクロアルキル基；フェニル基またはベンジル基であり、ここで該基、特に該フェニル基またはベンジル基は、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＮＯ2、−ＣＮ、アルキル基、シクロアルキル基、ヒドロキシル基およびアルコキシ基から選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができる；
Ｒ13は、水素；アルキル基；シクロアルキル基；フェニル基またはベンジル基であり、ここで該基、特に該フェニル基およびベンジル基は、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＮＯ2、−ＣＮ、アルキル基、シクロアルキル基、ヒドロキシル基およびアルコキシ基から選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができる；そして、
Ｒ14およびＲ15は、互いに独立して、水素；ハロゲン；−ＣＦ3；−ＮＯ2；−ＣＮ；アルキル基；アルコキシ基；フェニル基またはベンジル基、ここで該基、特に該フェニル基またはベンジル基は、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＮＯ2、−ＣＮ、アルキル基、シクロアルキル基、ヒドロキシル基およびアルコキシ基から選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができる；であるか、または、式−ＳＯ2ＮＲ’’Ｒ’’’の基（式中、Ｒ’’およびＲ’’’は、互いに独立して、水素またはアルキル基である）であり；
あるいは、Ｒ14およびＲ15は、一緒になって、追加的な４員〜７員縮合環を形成し、ここで該縮合環は、芳香族であるかまたは部分的に飽和していることができ、そして、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＮＯ2、−ＣＮおよび式−ＳＯ2ＮＲ’’Ｒ’’’の基（式中、Ｒ’’およびＲ’’’は、互いに独立して、水素またはアルキル基である）から選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができる］。
【請求項１４】
モジュレーターが、以下の一般式（ＩＶ）に従った化学化合物：
【化５】
2004530642.tif 000020
または医薬的に容認されるその塩、酸化物もしくは水和物であることを特徴とする、請求項８に記載の使用
［式中、
Ａは、酸素、硫黄または窒素であり；
Ｒ16は、水素；アルキル基；シクロアルキル基；ヒドロキシル基；アルコキシ基；アシル基；フェニル基またはベンジル基、ここで該基、特に該フェニル基またはベンジル基は、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＮＯ2、−ＣＮ、アルキル基、シクロアルキル基、ヒドロキシル基およびアルコキシ基から選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができる；式ＣＨ2ＣＮの基；式ＣＨ2ＣＯ2Ｒ’の基（式中、Ｒ’は、水素またはアルキル基である）；式ＣＨ2ＣＯＮＲIVＲVの基（式中、ＲIVおよびＲVは、互いに独立して、水素またはアルキル基である）；または、式−ＣＨ2Ｃ（＝ＮＯＨ）ＮＨ2の基であり；
Ｒ17は、水素；アルキル基；シクロアルキル基；フェニル基またはベンジル基であり、ここで該基、特に該フェニル基またはベンジル基は、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＮＯ2、−ＣＮ、アルキル基、シクロアルキル基、ヒドロキシル基およびアルコキシ基から選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができる；
Ｒ18、Ｒ19およびＲ20は、互いに独立して、水素；ハロゲン；−ＣＦ3；−ＮＯ2；−ＣＮ；アルキル基；アルコキシ基；フェニル基またはベンジル基、ここで該基、特に該フェニル基またはベンジル基は、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＮＯ2、−ＣＮ、アルキル基、シクロアルキル基、ヒドロキシル基およびアルコキシ基から選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができる；または、式−ＳＯ2ＮＲ’’Ｒ’’’の基（式中、Ｒ’’およびＲ’’’は、互いに独立して、水素またはアルキル基である）であり；
あるいは、Ｒ20は上記のように定義され、Ｒ18およびＲ19は、一緒になって、追加的な４員〜７員縮合環を形成し、ここで該縮合環は、複素環であることができ、芳香族であるかまたは飽和もしくは部分的に飽和していることができ、そして所望により、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＮＯ2、−ＣＮおよび式−ＳＯ2ＮＲ’’Ｒ’’’の基（式中、Ｒ’’およびＲ’’’は、互いに独立して、水素もしくはアルキル基である）から選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができる］。
【請求項１５】
モジュレーターが、１−エチル−２−ベンゾイミダゾリノンまたは５，６−ジクロロ−１−エチル−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾイミダゾル−２−オンであることを特徴とする、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
モジュレーターが、以下の一般式（Ｖ）に従った化学化合物
【化６】
2004530642.tif 000021
または医薬的に容認されるその塩、酸化物もしくは水和物であることを特徴とする、請求項８に記載の使用
［式中、
ＢおよびＣは、互いに独立して、式−（ＣＨ2）n−；式−（ＣＨ2）n−Ｙ’−（二方向の一方で）；または、式−（ＣＨ2）n−Ｙ’−（ＣＨ2）m−（この式中、ｎおよびｍは、互いに独立して、０、１、２、３または４であり、Ｙ’は、Ｏ、ＳまたはＮＲ’’’であり、ここでＲ’’’は、水素またはアルキル基である）の基であり：
Ｒ21およびＲ22は、互いに独立して、アルキル；アルケニル；アルキニル；シクロアルキル；アミノ；トリハロメチル；ニトロ；シアノ；フェニル；または、式ＯＲ’、−ＳＲ’、−Ｒ’ＯＲ’’、−Ｒ’ＳＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｓ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’（ＯＲ’’）、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ’（ＯＲ’’）、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’（ＳＲ’’）、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ’（ＳＲ’’）、−ＣＨ（ＣＮ）2、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＣＨ［Ｃ（Ｏ）Ｒ’］2、−ＣＨ［Ｃ（Ｓ）Ｒ’］2、−ＣＨ［Ｃ（Ｏ）ＯＲ’］2、−ＣＨ［Ｃ（Ｓ）ＯＲ’］2、−ＣＨ［Ｃ（Ｏ）ＳＲ’］2、−ＣＨ［Ｃ（Ｓ）ＳＲ’］2、ＣＨ2ＯＲ’、ＣＨ2ＳＲ’、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、もしくはＯＣ（Ｏ）Ｒ’の基であるか；
あるいは、不飽和、部分的飽和もしくは飽和の単環式もしくは多環式基；アラルキル基；またはヘテロアルキル基であり、ここで該単環式もしくは多環式基、アラルキル基またはヘテロアルキル基は、ハロゲン；トリハロメチル；アルキル；アルケニル；アルキニル；アミノ；ニトロ；シアノ；もしくはアミド；または、式−Ｒ’、−ＯＲ’、ＳＲ’、−Ｒ’ＯＲ’’、−Ｒ’ＳＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｓ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’もしくは−Ｃ（Ｓ）ＳＲ’の基；または、フェニル基もしくはフェノキシ基（ここで該基、特に該フェニル基もしくはフェノキシ基は、ハロゲン；トリハロメチル；アルキル；アルケニル；アルキニル；アミノ；ニトロ；シアノ；もしくはアミド；または、式−Ｒ’、−ＯＲ’、ＳＲ’、−Ｒ’ＯＲ’’、−Ｒ’ＳＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｓ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ’、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｒ’’もしくはＯＣ（Ｏ）Ｒ’の基；からなる基で、１回または１回より多く、置換されていることができる）；からなる基で、１回または１回より多く、置換されていることができ；
ここで、
Ｒ’およびＲ’’は、互いに独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシもしくはフェニル（適切な場合、置換されている）、または式ＮＲ’’’Ｒ’’’’の基（式中、Ｒ’’’およびＲ’’’’は、互いに独立して、水素またはアルキルである）から選択される基で、１回または１回より多く、置換されていることができ；
Ｒ23およびＲ24は、互いに独立して、アルキル；アルケニル；アルキニル；シクロアルキル；アミノ；トリハロメチル；ニトロ；シアノ；もしくは、フェニル；または、式ＯＲ’、−ＳＲ’、−Ｒ’ＯＲ’’、−Ｒ’ＳＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｓ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’（ＯＲ’’）、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ’（ＯＲ’’）、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’（ＳＲ’’）、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ’（ＳＲ’’）、−ＣＨ（ＣＮ）2、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＣＨ［Ｃ（Ｏ）Ｒ’］2、−ＣＨ［Ｃ（Ｓ）Ｒ’］2、−ＣＨ［Ｃ（Ｏ）ＯＲ’］2、−ＣＨ［Ｃ（Ｓ）ＯＲ’］2、−ＣＨ［Ｃ（Ｏ）ＳＲ’］2、−ＣＨ［Ｃ（Ｓ）ＳＲ’］2、ＣＨ2ＯＲ’、ＣＨ2ＳＲ’、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、もしくはＯＣ（Ｏ）Ｒ’の基であり；
ここで、
Ｒ’およびＲ’’は、互いに独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシもしくはフェニル、または、式ＮＲ’’’Ｒ’’’’の基（式中、Ｒ’’’およびＲ’’’’は、互いに独立して、水素またはアルキルである）であり；
あるいは、Ｒ23およびＲ24は、一緒になって、不飽和、部分的飽和もしくは完全飽和の単環式もしくは多環式基または単複素環式もしくは多複素環式基を形成し、ここで該単環式もしくは多環式基は、ハロゲン；トリハロメチル；アルキル；アルケニル；アルキニル；アミノ；ニトロ；シアノ；もしくはアミド；または、式−Ｒ’、−ＯＲ’、ＳＲ’、−Ｒ’ＯＲ’’、−Ｒ’ＳＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｓ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ’の基；または、フェニル基もしくはフェノキシ基（ここで該基、特に該フェニル基もしくはフェノキシ基は、ハロゲン；トリハロメチル；アルキル；アルケニル；アルキニル；アミノ；ニトロ；シアノ；もしくはアミド；または、式−Ｒ’、−ＯＲ’、ＳＲ’、−Ｒ’ＯＲ’’、−Ｒ’ＳＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｓ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ’、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｒ’’もしくはＯＣ（Ｏ）Ｒ’の基；からなる基で、１回または１回より多く、置換されていることができる）；からなる基で、１回または１回より多く、置換されていることができ；
ここで、
Ｒ’およびＲ’’は、互いに独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシ、フェニル、または、式ＮＲ’’’Ｒ’’’’の基（式中、Ｒ’’’およびＲ’’’’は、互いに独立して、水素またはアルキルである）である］。
【請求項１７】
モジュレーターが活性化剤であることを特徴とする、請求項８または９に記載の使用。
【請求項１８】
活性化剤が、以下の一般式（ＶＩ）に従ったイサチン誘導体
【化７】
2004530642.tif 000022
または医薬的に容認されるその塩、酸化物もしくは水和物であることを特徴とする、請求項１７に記載の使用
［式中、
Ｒ27は、水素；アルキル基；シクロアルキル基；アシル基；フェニル基またはベンジル基、ここで該基、特に該フェニル基またはベンジル基は、ハロゲン、−ＮＯ2、−ＣＮ、−ＣＦ3、アルキル基、シクロアルキル基、ヒドロキシル基およびアルコキシ基から選択される基で、１回または１回より多く、置換されていることができる；式−ＣＨ2ＣＮの基；式−ＣＨ2ＣＯ2Ｒ’の基（式中、Ｒ’は、水素またはアルキル基である）；式−ＣＨ2ＣＯＮＲIVＲVの基（式中、ＲIVおよびＲVは、互いに独立して、水素、アルキル、フェニル基またはベンジル基であり、ここで該フェニル基またはベンジル基は、ハロゲンおよび／またはアルキルで、１回または１回より多く置換されていることができ、あるいはＲIVおよびＲVは、それらが結合しているＮ原子と一緒になって４員〜７員単環式環を形成し、ここで該複素環式基は、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルキルオキシ、シクロアルキルオキシ、フェニルまたはベンジルから選択される基で、１回または１回より多く、置換されていることができる；または、式−ＣＨ2Ｃ（＝ＮＯＨ）ＮＨ2の基であり；
Ｒ28は、水素；アルキル基；シクロアルキル基；または式−ＣＨ2ＣＯ2Ｒ’の基（式中、Ｒ’は、水素またはアルキル基である）；であるか、あるいはフェニル基またはベンジル基であり、ここで該フェニル基またはベンジル基は、所望により、ハロゲン、−ＮＯ2、−ＣＮ、ＣＦ3、アルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルおよびアルコキシから選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができる；そして、
Ｒ29、Ｒ30、Ｒ31およびＲ32は、互いに独立して、水素；ハロゲン；−ＮＯ2；−ＣＮ；ＣＦ3；アルキル；アルコキシ基；フェニル基またはベンジル基、ここで該フェニル基またはベンジル基は、ハロゲン、−ＮＯ2、−ＣＮ、ＣＦ3、アルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルおよびアルコキシから選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができる；または、式−ＳＯ2ＮＲ’’Ｒ’’’の基（式中、Ｒ’’およびＲ’’’は、互いに独立して、水素もしくはアルキル基である）であり；
あるいは、Ｒ31およびＲ32は上記のように定義され、Ｒ29およびＲ30は、一緒になって、追加的な４員〜７員縮合環を形成し、ここで該縮合環は、芳香族であるかまたは部分的に飽和しているもしくは飽和していることができ、そして該縮合環は、ハロゲン、−ＮＯ2、−ＣＮ、ＣＦ3および式−ＳＯ2ＮＲ’’Ｒ’’’の基（式中、Ｒ’’およびＲ’’’は、互いに独立して、水素もしくはアルキル基である）から選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができる］。
【請求項１９】
障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患が、創傷、特に乾癬であることを特徴とする、請求項８〜１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患を診断するために、配列番号３で表されるかもしくは配列番号４で表される少なくとも１種のポリペプチドまたはその機能性変異体か、それをコードする少なくとも１種の核酸か、配列番号３もしくは配列番号４で表されるポリペプチドまたはその機能性変異体に対して向けられた少なくとも１種の抗体か、あるいは、請求項８〜１８の一項に記載の少なくとも１種のモジュレーターを、適切な添加剤および補助的物質と組み合わせることを特徴とする、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２１】
核酸が、プローブ、好ましくはＤＮＡプローブの形で用いられることを特徴とする、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患を予防および／または処置するために、配列番号３もしくは配列番号４で表される少なくとも１種のポリペプチドまたはその機能性変異体か、それをコードする少なくとも１種の核酸か、配列番号３もしくは配列番号４で表されるポリペプチドまたはその機能性変異体に対して向けられた少なくとも１種の抗体か、あるいは、請求項８〜１８の一項に記載の少なくとも１種のモジュレーターを、適切な添加剤および補助的物質と組み合わせることを特徴とする、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２３】
核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、干渉性低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、またはリボザイムであることを特徴とする、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患に関連して分析を行うための、支持材料上に固定されているアレイの使用であって、［脱文］、配列番号３もしくは配列番号４で表される少なくとも１種のポリペプチドまたはその機能性変異体か、それをコードする少なくとも１種の核酸か、あるいは、配列番号３もしくは配列番号４で表されるポリペプチドまたはその機能性変異体に対して向けられた少なくとも１種の抗体を含有することを特徴とする、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患を診断、予防および／または処置するための、ヒトまたはマウスの中コンダクタンス型(intermediate-conductance)カルシウム活性化カリウムチャネルおよび／またはそれらをコードする核酸の使用、ならびに、薬理学的活性物質を同定するためのそれらの使用に関する。これに加えて、本発明は、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患を診断、予防および／または処置するための中コンダクタンス型カルシウム活性化カリウムチャネルのモジュレーターの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの皮膚疾患は、障害のあるケラチノサイト活性に関連する。創傷治癒の間の皮膚における正常な生理学的過程を維持するためのケラチノサイトの重要性は、以下を一例として見直すことができる：創傷治癒過程は極めて複雑な過程であり、創傷領域での血液凝固、炎症細胞の補強、再上皮形成、および組織再構成の局面により特徴づけられる。血液凝固によりフィブリンマトリックスが形成し、これが、創傷により生じる空洞を満たして、細胞が移入(immigrate)できるマトリックスを提供する。その後、マトリックス中に沈着した化学誘引物質が、好中球および単球を補充し、炎症性反応を開始させる。次に、創傷を覆う保護上皮バリアを再度形成するために、再上皮形成の中心的工程がくる。これは、表皮細胞の大部分を構成しかつ皮膚にしか見いだされないケラチノサイトにより達成される。再上皮形成を実現するために、ケラチノサイトは細胞表面の［脱文(lacuna)］インテグリン組成物を変化させ、その結果として、それらの初期部位から離れて創傷の上に移動する(migrate)ことができる。そこで、それらは再接着し、増殖し、最終的に分化する。ケラチノサイトはマトリックスメタロプロテイナーゼおよびコラゲナーゼを分泌し、これらは、周囲組織中のタンパク質を分解し、それにより創傷組織中の移動を促進する。これに加えて、ケラチノサイトは、ＶＥＧＦ、ＫＡＦ、ＴＧＦ−βおよびＴＧＦ−αなどの成長因子を分泌する。これらの成長因子は、順次、細胞増殖および細胞外マトリックス成分の形成を刺激し、創傷床中への新規血管の成長を媒介する。これに続く、損傷後最長２年間存続しうる組織再構成の期間中に、コラーゲンの合成、コラーゲンの新たな分解、ケラチノサイトの鱗状(squamous)分化、および瘢痕形成の連続過程がある。
【０００３】
この創傷治癒過程の概要から、正常に進行する創傷治癒では、ケラチノサイト活性における複雑な空間的かつ経時的変化、例えば移動、増殖および分化が必要であることが、明らかである。したがって、ケラチノサイト活性における障害は、創傷治癒における障害およびその他の皮膚疾患を引き起こすことができる。機能不全性ケラチノサイトに関連付けられている疾患の例は、乾癬、接触皮膚炎、アトピー性湿疹、潰瘍、白斑症、過角化症、光線性角化症およびアクネである。
【０００４】
創傷治癒または瘢痕における障害、例えば肥厚性瘢痕またはケロイドの形成も、創傷が閉じた後に発生することがある。ケラチノサイト活性との関連が、これらの疾患の場合にも示唆されている。このように、熱傷創後に形成される肥厚性瘢痕に由来するケラチノサイトは、無傷皮膚に由来するケラチノサイトに比べ、より高い程度の増殖、分化および活性化を示すことが実証された。
【０００５】
皮膚疾患、障害のある創傷治癒および美容的欠陥は、老化期間中に現れる問題である。したがって、老人性皮膚(geriatric skin)とよばれるものは、表皮の菲薄化およびその結果として保護バリアの菲薄化を特徴とする。これに加えて、酵素的に活性なメラノサイトの数は、２５〜３０才以降のヒトでは１０年ごとに１０〜２０％減少し、結果的に放射線の被曝が増加する。これに関連して、老年皮膚(old skin)の色素沈着は、しばしば不均質である；色素沈着の局所損失および色素沈着過度の両方が観察される。これの原因は、特に、メラノサイト／ケラチノサイト相互作用の変化によるものとされてきた。頻発する色素病変の例は、黒子およびそばかすである。
【０００６】
皮膚疾患および創傷治癒、そしてその結果としての創傷治癒における障害の根底にある分子原理については、ほんのわずかしか知られていない。これは、皮膚およびそれに関連付けられる疾患が、非常に複雑であることに起因する。
【０００７】
したがって、創傷治癒障害に介入するために現在までに開発されている治療法は、特に満足できるものではない。確立されている治療の形は、創傷治癒の物理的支持（例えば、包帯、圧定布またはゲル剤）、あるいは皮膚組織、培養皮膚細胞および／またはマトリックスタンパク質の移植に限定される。近年、成長因子がその創傷治癒改善能力について試験されているが、従来の治療法を著しく改良するものではなかった。創傷治癒障害の診断は皮膚の視覚的分析にも基づいているが、創傷治癒期間中の遺伝子調節のより深い理解が今までのところ不十分なため、この分析は特別に有益なわけではない。
【０００８】
カリウムチャネルは、膜電位の調節において、およびその結果として副次的に活発化された分子の膜通過輸送においても、重要な役割を果たすタンパク質の不均質群を構成する。これに加えて、それらは、しばしば細胞増殖において役割を果たす（ＮｉｌｉｕｓおよびＤｒｏｏｇｍａｎｓ；１９９４，Ｎｅｗｓ  ｉｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃｉ．，９：１０５−１１０）。いくつかの場合、カリウムチャネルは、遺伝子学的に伝達可能な疾患に関連付けられてきた（Ｃｕｒｒａｎ，１９９８，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，９：５６５−５７２）。この事実、そしてまたｉｎ−ｖｉｔｒｏでのキャラクタリゼーションおよび高効率スクリーニング(high throughput screening)のための強力なアッセイ系の開発に用いることができるというカリウムチャネルの利点から、薬物を開発するための標的としてのカリウムチャネルの魅力は明らかである（Ｃｕｒｒａｎ，上記参照）。
【０００９】
カリウムチャネルのファミリーは非常に不均質な群であり、５種のサブファミリーに分類することができる：電圧活性化(voltage-activated)カリウムチャネル（Ｋｖ）、ＱＴ延長に関連するカリウムチャネル、内向き整流性カリウムチャネル、およびカルシウム活性化カリウムチャネルである。多数の発表で、電圧依存性カリウムチャネルが皮膚疾患の処置に適した標的として述べられているが（ＷＯ９９／０７４１１；ＷＯ９７／１８３３２；ＷＯ９９／２５７０３）、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患を処置するための薬物は今のところ開発されていない。
【００１０】
カルシウム活性化カリウムチャネルは、よく特徴づけされた３種のサブグループに分類される：小コンダクタンス型（ＳＫ）；中コンダクタンス型（ＩＫ）および大コンダクタンス型（ＢＫ）のカリウムチャネルである。これらのサブグループは、その電圧感受性およびカルシウム感受性、発現プロフィール、生物学的機能、ならびに薬理学的特性の点で異なる。
【００１１】
ＩＫチャネルの同族体は、ヒト（ｈＩK１またはｈｓｋ４；Ｉｓｈｉｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９７  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１１６５１−１１６５６；Ｊｏｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：１１０１３−１１０１８；ＷＯ９９／０３８８２；ＷＯ９８／１１１３９）およびマウス（ｍＩＫ１；Ｖａｎｄｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２１５４２−２１５５３）の両方で同定されている。それらは同じ特性を有するため、赤血球において電気生理学的および薬理学的にのみ特徴づけされたＧａｒｄｏｓチャネルは、ｈＩＫ１と同一であると推定される（Ｉｓｈｉｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９７  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１１６５１−１１６５６）。Ｇａｒｄｏｓチャネルは、病変した赤血球の脱水および体積に影響を及ぼすことにより、鎌状赤血球貧血の表現型を発現させる強度(strength)において重要な機能を果たす（Ｃｕｒｒａｎ、上記参照）。マウスにおいて、ＩＫチャネルをコードするｃＤＮＡが赤白血病細胞から単離されている（Ｖａｎｄｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照）。この研究では、ＥＳ細胞の赤血球系細胞への分化中にｍＩＫ１の発現が増加することが示された。これに加えて、イオンチャネル阻害剤を用いて、増殖および分化を阻害することができた。
【００１２】
ヒトの場合、ＩＫチャネルは、ＳＫチャネルとは対照的に、少数の細胞タイプおよび器官でのみ発現することが顕著である（ＷＯ９９／０３８８２；Ｉｓｈｉｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９７  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１１６５１−１１６５６；Ｊｏｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：１１０１３−１１０１８）：すべての刊行物で、発現が、電気的に興奮することができない器官、例えば胎盤および前立腺に限定されており、脳または心臓では発現が検出されないことが、示されている。これは、ヒトにおけるｈＩＫの発現が、血液（例えば、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球および赤血球）および脈管系（例えば、腎臓および腸間膜の内皮細胞ならびに脳内の毛管内皮細胞）の細胞に限定されるという論派に反映されている（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８７：４９６−５０３）（ＷＯ００／３４２４８）。ＩＫ１チャネルはまた、膀胱および結腸の細胞に発現することが示されている（Ｏｈｙａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．８４：９７−１００；Ｗａｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｐｆｌｕｅｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ．４３８：４３７−４４４）。これまでに、皮膚またはケラチノサイトにおいて、ｈＩＫ１またはｍＩＫ１の発現は検出されていない。
【００１３】
鎌状赤血球貧血をモジュレートするためにそれを利用するのに加え、ｈＩＫ１を、機能不全性白血球に関連する疾患の診断、予防または処置に用いることが提案されている（ＷＯ９９／２５３４７）。これに加えて、ＩＫチャネルの阻害剤は、下痢および嚢胞性線維症を処置するための薬物の開発に関連して用いられている。近年、医薬的に用いることができるＩＫ活性の特異的モジュレーターが、非常に多く開発されている（Ｓｙｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７８：Ｃ５７０−５８１；ＷＯ９９／２５３４７；ＷＯ００／３３８３４；ＷＯ００／３４２２８；ＷＯ００／３４２４８；ＷＯ００／３７４２２）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患に関係するポリペプチドおよび／またはそれらをコードする核酸であって、その使用が、診断、予防または処置を明確に改善するものを利用できるものを作成することと、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患に有効な医薬の同定および開発であった。
【００１５】
本発明の追加的目的は、本発明に従ったポリペプチドの活性のモジュレーターであって、そのモジュレーターの使用が、診断、予防または処置を明確に改善するものを提供することと、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患に有効な医薬の同定および開発であった。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
ケラチノサイトが、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患により皮膚に放出されるＡＴＰ、ブラジキニンおよびヒスタミンで刺激されると、そのケラチノサイトは長期にわたり過分極になることが見いだされた。意外なことに、この電気生理学的応答の媒体として、中コンダクタンス型カルシウム活性化カリウムチャネルを同定することができた。これは、これまでに皮膚またはケラチノサイト中に検出されたことがなく、障害のあるケラチノサイト活性にはじめて関連付けられた。これに加えて、中コンダクタンス型カルシウム活性化カリウムチャネルおよびカリウムチャネルの発現レベルならびに／または活性と、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患、特に創傷治癒障害および／もしくは乾癬の診断、予防ならびに／または処置との関連を、はじめて立証することができた。ポリペプチドおよびそれらをコードする核酸は、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患を診断（例えば兆候）、および／または処置（モジュレートなど）、および／または予防するためか、あるいは、薬理学的活性物質を同定するための、これまでに公知の標的に属していない。これは、完全に新規な治療アプローチが本発明から生じることを意味する。これに加えて、本発明に従ったポリペプチドのモジュレーター、例えば阻害剤または活性化剤は、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患の診断、予防および／または処置に用いられていない。これは、完全に新規な治療アプローチをもたらすことを意味する。
【００１７】
したがって、本目的は、ヒト（ｈＩＫ１またはｈＳＫ４；配列番号３；Ｉｓｈｉｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９７  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１１６５１−１１６５６；Ｊｏｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：１１０１３−１１０１８；ＷＯ９９／０３８８２；ＷＯ９８／１１１３９）もしくはマウス（ｍＩＫ１；配列番号４；Ｖａｎｄｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２１５４２−２１５５３）の中コンダクタンス型カルシウム活性化カリウムチャネルＩＫ１ポリペプチド、もしくはその機能性変異体、および／または、それらをコードする核酸、もしくはその変異体を、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患を診断、予防および／または処置するために、または薬理学的活性物質を同定するために用いることにより実現される。
【００１８】
これに加えて、本目的は、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患を診断、予防および／または処置するために、ＩＫ１活性のモジュレーターを用いることにより、実現される。
【００１９】
イオンチャネルまたはそれらをコードする核酸はどれも、これまでに、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患に関連させて、例えば障害のある創傷治癒に関連づけて報告されておらず、そのような関連が示唆されてもいない。したがって、これらの化合物を本発明に従って用いることができることは、意外であった。本発明に従って用いられるポリペプチドおよびそれらのｃＤＮＡの登録番号を、表１にあげる。
【００２０】
さらに、本発明に従ったポリペプチドのモジュレーターはどれも、これまでに、皮膚疾患に関連させて、例えば障害のある創傷治癒および／または乾癬に関連づけて報告されておらず、そのような関連が示唆されてもいない。したがって、これらの化合物を本発明に従って用いることができることは、意外であった。
【００２１】
これに加えて、本発明に従って用いることができるポリペプチドの活性のモジュレーターを、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患、特に創傷治癒障害および／または乾癬の診断、予防および／または処置に使用できることは、開示されていない。これは、本発明が、完全に新規な治療アプローチをもたらすことを意味する。
【００２２】
本発明に従って用いられるポリペプチドはさらに、それらが合成的に調製されるという事実を特徴とする。したがって、ポリペプチド全体またはその一部を、例えば古典的な合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ技術）を用いて、合成することができる。上記ポリペプチドの一部は、適切な遺伝子発現ライブラリーのスクリーニングに用いることができる抗血清を得て、本発明に従って用いることができるポリペプチドの機能性変異体をこの方法でさらに得るのに、とりわけ適している。
【００２３】
‘ケラチノサイト活性’は、調査中のケラチノサイトの増殖速度および分化度というパラメーターによって定義されるケラチノサイトの状態を意味するものとして理解される。当業者は、それらのパラメータを決定するための方法を熟知している（ｄｅ  ＦｒｉｅｓおよびＭｉｔｓｕｈａｓｈｉ，１９９５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．９：８９−９５；ＰｅｒｒｏｓおよびＷｅｉｇｈｔｍａｎ，１９９１，Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆ．２４：５１７−２３；ＳａｖｉｎｏおよびＤａｒｄｅｎｎｅ，１９８５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８５：２２１−６；Ｓｃｈｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １６７：１−１３；Ｆｒａｈｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２１１：４３−５０；Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ，Ｉｎｖｅｓｔ，Ｄｅｒｍａｔｏｌ，９８：３４３−５０）。分化度は、例えば、当業者が熟知している適切な染色液を用いて決定することができる。
【００２４】
‘障害のある’ケラチノサイト活性は、正常な無傷皮膚のケラチノサイトのケラチノサイト活性とは異なる、皮膚のケラチノサイトのケラチノサイト活性を意味するものとして理解される。例えば、‘障害のある’ケラチノサイトの活性は、上昇もしくは低下した増殖速度の結果として、あるいは、未熟な、促進された、減速したもしくは遅延した分化、または分化が存在しないことの結果として、正常なケラチノサイトの活性と区別することができる。障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患の例は、接触皮膚炎、アトピー性湿疹、白斑症、過角化症、光線性角化症、肥厚性瘢痕、ケロイド、黒子、そばかすおよび、老人性皮膚である。これに加えて、創傷、例えば正常に治癒する創傷および治癒しにくい創傷、特に潰瘍が、特に本発明の意味する範囲内で好ましい、障害のあるケラチノサイト活性を特徴とする疾患である。とりわけ好ましい疾患は、乾癬である。
【００２５】
‘調節’という用語は、例えば、ポリペプチドもしくはそれらをコードする核酸の量および／または活性が増大または低減することであって、この変化が、例えば、転写、翻訳および転写後または翻訳後のレベルで起こるのを可能にすることを意味するものとして、理解される。
【００２６】
‘機能性変異体’という用語は、ポリペプチドであって、例えば本発明に従って用いることができるポリペプチドのように障害のあるケラチノサイト活性に関連するもの、および／または、本発明に従って用いることができるポリペプチドの構造的特徴を示すものを意味するものとして、理解すべきである。
【００２７】
機能性変異体には、約１〜３００、好ましくは約１〜２００、特に好ましくは約１〜１５０、特に約１〜１００、特に１〜５０の異種アミノ酸の部分を有するＩＫチャネルの融合タンパク質も含まれる。その異種アミノ酸は、ＩＫチャネルのポリペプチド鎖に、Ｎ−末端もしくはＣ−末端でまたは挿入として、連結させることができる。さらに、本発明に従って用いることができるＩＫチャネルは、緑色蛍光タンパク質またはその変異体に、連結させることができる。
【００２８】
ポリペプチドの機能性変異体は、本発明に従って用いられるポリペプチドの一部であることもでき、少なくとも６アミノ酸の長さを有し、好ましくは少なくとも８アミノ酸の長さを有し、特に少なくとも１２アミノ酸の長さを有し、特に特に少なくとも２０アミノ酸の長さを有し、特に４０アミノ酸の長さを有し、もっとも好ましくは少なくとも８０アミノ酸の長さを有する。約１〜６０、好ましくは約１〜３０、特に約１〜１５、特に約１〜５アミノ酸のポリペプチドの欠失(deletion)も、含まれる。例えば、ポリペプチドの機能を著しく変えることなく、最初のアミノ酸であるメチオニンが欠けていることができる。
【００２９】
本発明の意味の範囲内で、‘機能性変異体’は、配列番号３または配列番号４のいずれかで表されるようなアミノ酸配列を有するＩＫチャネルの１種に対し配列相同性、特に約５０％、好ましくは約６０％、特に約７０％、とりわけ好ましくは約９０％、もっとも好ましくは９５％の配列同一性、を示すポリペプチドである。したがって、ヒトまたはマウス以外の生物、好ましくは、例えばサル、ブタおよびラットなどの非ヒトほ乳類に由来する、対応するポリペプチドも、これら機能性変異体の例である。その他の例は、異なる個体かまたは生物の異なる器官の遺伝子の異なる対立遺伝子によってコードされるポリペプチドである。
【００３０】
‘配列同一性’は、２種の配列間に存在する一致（＝正の％(% positive)）であって、例えばポリペプチド配列の場合はＢｌａｓｔＰ  ２．０．１を用い、例えばポリヌクレオチド配列の場合はＢｌａｓｔＮ  ２．０．１４を用い、フィルターを‘オフ’に設定して決定される一致（Ａｌｔｓｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）を意味するものとして理解される。例えば、２種のポリペプチドの類似性を決定するために、ＢｌａｓｔＰ  ２．０．１を、フィルターを‘オフ’に設定しＢＬＯＳＵＭを６２にして用いる。
【００３１】
機能性変異体には、例えば、胚組織などの非皮膚特異的細胞から単離される核酸によってコードされているが、ケラチノサイトでの発現後に、記載されている機能を保有するポリペプチドも含まれる。
【００３２】
あるポリペプチドが、本発明に従って用いることができるポリペプチドの機能性変異体であるか否かを立証するために、検討されるポリペプチドの活性を、本発明に従って用いることができ、配列番号３または配列番号４で表されるポリペプチドの活性と比較する機能試験を使用することが可能である。検討されるポリペプチドが配列同一性のレベルで機能性変異体の必要条件を満たすと仮定すると、検討されるポリペプチドは、機能試験でのその活性が、本発明に従って用いることができるポリペプチドの活性と同様または同一であるという結果になる場合、機能性変異体である。
【００３３】
これらの機能試験には、例えば、創傷において、検討されるポリペプチドをコードする核酸を含有する発現ベクターを適用すること、あるいは、検討される実際のポリペプチドか、検討されるポリペプチドに対して向けられた抗体か、またはアンチセンスポリヌクレオチドかを適用することが含まれる。例えば発現ベクターの場合、インキュベートした後、検討されるポリペプチドをコードする核酸または本発明に従って用いることができるポリペプチドをコードする核酸のいずれかを含有する異なる発現ベクターか、あるいは挿入物を含まない発現ベクターを投与したときに、創傷治癒の経過を比較する。例えば、これらの機能試験は、創傷治癒における障害に関連して、例えば、動物での治癒しにくい創傷、デキサメタゾンで処置した創傷または糖尿病性創傷に関連して、検討されるポリペプチドの活性に、適用することもできる。したがって、例えば、ウサギにおける治癒しにくい創傷へのＰＤＧＦ−ＡおよびＰＤＧＦ−Ｂポリペプチドの適用は、創傷の治癒での比較しうる改善をもたらした（Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．，２０００，９３：２３０−２３６）。比較試験は、皮膚疾患、例えば乾癬の場合に実施することができる。この場合、検討されるポリペプチドをコードする核酸を含有する発現ベクターか、検討される実際のポリペプチドか、検討されるポリペプチドに対して向けられた抗体か、またはアンチセンスオリゴポリヌクレオチドかを、例えば、ＳＣＩＤマウスに移植してあるヒト皮膚の患部をに適用し、そして、皮膚疾患の経過、例えば治癒を測定し、対照実験における皮膚疾患の経過と比較する。乾癬の場合、これには、例えば、マウス尾試験(mouse tail test)とよばれる抗増殖性調査が含まれていることができる。この場合、使用は、マウス尾の皮膚の正常な組織学的構造が、乾癬を患っているヒト皮膚の組織学的構造に非常に似ているという事実に起因する：したがって、尾皮膚は、鱗屑の下から毛綱(hair strands)が出てくるヒンジ領域とよばれるものを保有し；これらの部位で、皮膚はオルト角化性(orthokeratotic)であり、正常皮膚のような顆粒層を保有する。検討されるポリペプチドを加えた後、尾皮膚の組織学的切片を、顆粒層の形成、錯角化領域におけるオルト角化性組織の誘発、および表皮の厚さに関して測定する（Ｊａｒｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９７０，Ｂｒ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ８２：１８７−１９９）。この方法では、ヘマトキシリン／エオジンで染色した後の矢状断面を測定することにより、定量することもできる（Ｂｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｋｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５：４１−４８；Ｂｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｋｉｎ  Ｐｈａｒｍａｋｏｌ  ７：３２４−３３４）。これに加えて、検討されるポリペプチドの抗炎症作用を、オキサゾロンで浮腫を誘発させたマウスか、またはＤＮＦＢでアレルギー性皮膚反応を誘発させたブタに局所投与することにより、利用することができる（Ｍｅｉｎｇａｓｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｂｒ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １３７：５６８−５７６）。機能試験には、皮膚落屑の程度に対する、検討されるポリペプチドの作用の測定も包含される。このようにして、乾癬患者での経表皮水分損失（ＴＥＷＬ）の測定によ���、病理学的に変化した上皮層は水分に対するバリア機能を喪失していることが、実証される（Ｆｒｏｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ａｃｔａ  Ｄｅｒｍ  Ｖｅｎｅｒｏｌ  ６８：４６１−４６７、実施例参照）。
【００３４】
‘コードする核酸’という用語は、本発明に従って用いることができる単離しうる生物活性ポリペプチドかまたは前駆体を、コードするＤＮＡ配列をさす。ポリペプチドを、全長配列により、または、特異的活性、例えばイオンチャネル活性が保持される限り、コード配列の任意の一部により、コードすることができる。
【００３５】
本発明に従って用いることができる核酸の配列には、例えば遺伝暗号の縮退の結果として小さな変化が存在することができ、あるいは、翻訳されない配列を、核酸の５’末端および／または３’末端に、核酸の活性を著しく変えることなく付加することができることが、公知である。したがって、本発明には、上記核酸の‘変異体’とよばれるものも含まれる。
【００３６】
‘ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件’は、２．５×ＳＳＣ緩衝液中、６０℃でハイブリダイゼーションを行った後、より低い緩衝液濃度、例えば０．５×ＳＳＣ緩衝液中、３７℃でいくつかの洗浄工程を行い、かつハイブリダイゼーションが安定である、という条件を意味するものとして理解される。
【００３７】
‘変異体’という用語は、ＤＮＡ配列に相補的である任意のＤＮＡ配列であって、ストリンジェントな条件下で標準配列とハイブリダイズし、標準配列によってコードされるポリペプチドの活性に類似する活性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を意味する。
【００３８】
核酸の変異体は、本発明に従って用いられる核酸の一部であることもでき、少なくとも８ヌクレオチドの長さを有し、好ましくは少なくとも１８ヌクレオチドの長さを有し、特に少なくとも２４ヌクレオチドの長さを有する。
【００３９】
本発明に従って用いられる核酸は、好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ、特に二本鎖ＤＮＡである。さらに、核酸の配列は、それが少なくとも１種のイントロンおよび／または１種のポリＡ配列を含有することを、特徴とすることができる。本発明に従って用いられる核酸は、そのアンチセンス配列の形で使用することもできる。
【００４０】
さらに、本発明を実行するために、合成的に調製された核酸を用いることが可能である。したがって、例えば、本発明に従って用いることができる核酸を、配列番号１もしくは配列番号２で表されるｃＤＮＡ配列を用いて、および／または配列番号３もしくは配列番号４で表されるタンパク質配列を用いて（表１も参照のこと）遺伝暗号を参照しつつ（例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．＆Ｐｅｙｍａｎ，Ａ．（１９９０）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０，５４３−５８４，Ｎｏ．４参照）、例えばホスホトリエステル法により、化学的に合成することができる。
【００４１】
本発明に従って用いられる核酸配列の他の使用は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＺｈｅｎｇおよびＫｅｍｅｎｙ，１９９５，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１００：３８０−２；ＮｅｌｌｅｎおよびＬｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ，１９９３，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１８：４１９−２３；Ｓｔｅｉｎ，１９９２，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ６：９６７−７４）および／またはリボザイム（Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ，ｅｔ  ａｌ．１９９８，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５４：１１７５−２０２；Ｖａｉｓｈ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：５２３７−４２；Ｐｅｒｓｉｄｉｓ，１９９７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：９２１−２；ＣｏｕｔｕｒｅおよびＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１２：５１０−５）および／または干渉性低分子ＲＮＡ(small interfering RNA molecule)（ｓｉＲＮＡ）とよばれるもの（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００１；４１１：４９４−８）を構築する使用である。アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いると、上記核酸の安定性を低下させ、および／または上記核酸の翻訳を阻害することができる。同様のアプローチは、同じようにポリペプチドの量の低減をもたらすｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを用いるものである。このように、皮膚細胞中の対応する遺伝子の発現を、例えば、アンチセンス分子および／またはｓｉＲＮＡ分子および／またはリボザイムを用いることにより、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方で減少させることができる。したがって、これらのオリゴヌクレオチドは、治療薬としての使用に適切であることができる。この方策は、アンチセンスオリゴヌクレオチドがリポソームと複合体を形成しているとき、皮膚細胞、好ましくはケラチノサイトにとりわけ適している（Ｓｍｙｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０８：５２３−６；Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１２：６９９−７０５；Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１２：８８７−９２）。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡが、プローブまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いるのに好ましい。
【００４２】
本発明に従ったプローブを、適切な場合は適した添加剤および／または補助的物質と組み合わせてまたはそれと一緒に、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患の診断に用いることができる。
【００４３】
一般に、オリゴヌクレオチドは、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼにより、特に、細胞中に存在するＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅにより、迅速に分解される。したがって、高濃度の核酸が長期にわたり細胞中に維持されるように、核酸を修飾して分解に対して安定化することは、有利である（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：３９８９−９４；Ｄｕｄｙｃｚ，１９９５，ＷＯ９５／１１９１０；Ｍａｃａｄａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，ＷＯ９８／３７２４０；Ｒｅｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＷＯ９７／２９１１６）。典型的には、そのような安定化は、１個以上のインターヌクレオチドリン基を導入することにより、または１個以上の非リンインターヌクレオチドを導入することにより、得ることができる。
【００４４】
ＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎｎ（１９９０  Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０，５４４）は、適切な修飾インターヌクレオチドの概説を提供している（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：３９８９−９４；Ｄｕｄｙｃｚ，１９９５，ＷＯ９５／１１９１０；Ｍａｃａｄａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，ＷＯ９８／３７２４０；Ｒｅｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＷＯ９７／２９１１６も参照のこと）。本発明に従った使用の１種に用いることができる核酸中の修飾インターヌクレオチドホスフェート基および／または非リン架橋(non-phosphorus bridge)は、例えば、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、ホスホロジチオエートまたはリン酸エステルを含有し、非リンインターヌクレオチド類似体は、例えば、シロキサン架橋、カルボネート架橋、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート架橋および／またはチオエーテル架橋を含有する。この修飾が、本発明に従った使用の１種に用いることができる医薬組成物の耐久性を改善すべきであることも、意図するところである。
【００４５】
本発明の他の態様では、本発明に従って用いることができる核酸を、好ましくはシャトルベクター、ファージミド、コスミド、発現ベクターまたは遺伝子治療に有効なベクターの形で、ベクターを調製するために使用する。これに加えて、上記核酸を用いて、ノックアウト遺伝子構築体または発現カセットを調製することができる。
【００４６】
このように、本発明に従って用いることができる核酸は、ベクター、好ましくは発現ベクターまたは遺伝子治療に有効なベクター中に、存在することができる。遺伝子治療に有効なベクターは、好ましくは、上記核酸に機能的に連結している皮膚特異的またはケラチノサイト特異的調節配列を含有する。
【００４７】
一般に、該当する遺伝子を発現させるために、好ましくは、二本鎖ＤＮＡ、とりわけ好ましくは、ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域を用いる。この領域は、例えば、Ｋｏｚａｋ配列（Ｋｏｚａｋ，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：８１２５−４８）中に位置する最初の開始コドン（ＡＴＧ）で開始し、ＡＴＧと同じ読み枠中に位置する次の停止コドン（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）に至る。原核生物の場合、この領域は６ヌクレオチドの保存配列、すなわちＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列とよばれ（Ｓｈｉｎｅ  ＆  Ｄａｌｇａｒｎｏ，１９７５，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：２２１−３０）、開始コドンの数ヌクレオチド上流に位置する配列で開始する。
【００４８】
発現ベクターは、原核または真核発現ベクターであることができる。原核発現ベクターの例は、例えば、大腸菌での発現のためのｐＧＥＭまたはｐＵＣベクター誘導体であり、真核発現ベクターの例は、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでの発現のためのｐ４２６Ｍｅｔ２５およびｐ４２６ＧＡＬ１ベクター（Ｍｕｍｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２，５７６７−５７６８）、例えば、ＥＰ−Ｂ１−０１２７８３９またはＥＰ−Ｂ１−０５４９７２１に開示されている昆虫細胞での発現のためのバキュロウイルスベクター、ならびに、例えば、ほ乳類細胞での発現のためのＲｃ／ＣＭＶおよびＲｃ／ＲＳＶベクターまたはＳＶ４０ベクターであり、これらのすべては一般的に得ることができる。
【００４９】
一般に、発現ベクターはまた、所定の宿主細胞に適したプロモーター、例えば、大腸菌での発現のためのｔｒｐプロモーター（例えば、ＥＰ−Ｂ１−０１５４１３３参照）、酵母での発現のためのＭｅｔ  ２５、ＧＡＬ  １またはＡＤＨ２プロモーター（Ｒｕｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８，２６７４−２６８２；Ｍｕｍｂｅｒｇ、上記参照）、あるいは昆虫細胞での発現のためのバキュロウイルスポリヘドリンプロモーター（ｚ．１３  ＥＰ−Ｂ１−０１２７８３９参照）を含有する。真核細胞において、構成的で、調節可能で、組織特異的で、細胞周期特異的または代謝特異的である発現を可能にする調節要素は、例えば、ほ乳類細胞での発現に適している。本発明に従った調節要素は、プロモーター、アクチベーター、エンハンサー、サイレンサーおよび／またはリプレッサーの配列を含有する。
【００５０】
真核生物での構成的発現を可能にする適切な調節要素の例は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩまたはウイルスプロモーター、ＣＭＶエンハンサー、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターまたはＬＴＲプロモーター、例えば、ＭＭＴＶ（マウス乳がんウイルス；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２１４，２２８−２３２）に由来するもの、ならびに、その他のウイルスプロモーターおよび活性化物質の配列、例えば、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＳＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶ、ＨＴＬＶまたはＨＩＶに由来するもの、によって認識されるプロモーターである。
【００５１】
真核生物での誘導発現を可能にする調節要素の例は、テトラサイクリンオペレーターを適切なリプレッサーと組み合わせたものである（Ｇｏｓｓｅｎ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５，５１６−２０）。
【００５２】
本発明に従って用いられる遺伝子の発現は、好ましくは組織特異的プロモーターの制御下で起こり、皮膚特異的プロモーター、例えばヒトＫ１０プロモーター（Ｂａｉｌｌｅｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０．Ｃｅｌｌ  ６２：６９７−７０８）、ヒトＫ１４プロモーター（Ｖａｓｓａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：１５６３−６７）、またはウシサイトケラチンＩＶプロモーター（Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｗｏｏｌ  ａｎｄ  ｈａｉｒ（編集：Ｇ．Ｅ．Ｒｏｇｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．）、２８７−３０９頁。Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）がとりわけ好ましい。
【００５３】
真核生物での組織特異的発現を可能にする調節要素のその他の例は、特定の細胞タイプ、好ましくはケラチノサイトでのみ発現するタンパク質をコードする遺伝子に属するプロモーターまたはエンハンサーに由来するプロモーターまたは活性化物質の配列である。
【００５４】
真核生物での細胞周期特異的発現を可能にする調節要素の例は、以下の遺伝子のプロモーターである：ｃｄｃ２５、サイクリンＡ、サイクリンＥ、ｃｄｃ２、Ｅ２Ｆ、Ｂ−ｍｙｂおよびＤＨＦＲ（Ｚｗｉｃｋｅｒ  Ｊ．およびＭｕｅｌｌｅｒ  Ｒ．（１９９７）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１３，３−６）。
【００５５】
真核生物での代謝特異的発現を可能にする調節要素の例は、低酸素、グルコース欠乏、ホスフェート濃度または熱ショックにより調節されるプロモーターである。
空間的かつ時間的に制限されている発現を同時に可能にする調節要素の例は、融合タンパク質をコードする核酸であり、その核酸は、部位特異的組換え酵素Ｃｒｅに関する配列と、組織特異的プロモーターの制御下にある修飾されたエストロゲン受容体に関する配列の間に存在する。得られる組織特異的細胞質融合タンパク質は、エストロゲン類似体であるタモキシフェンの投与を受けて細胞核中に転位して、遺伝子発現に変化をもたらす組換えを生じることができる（Ｆｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９３：１０８８７−９０）。本発明に従って用いることができる核酸が、トランスフェクション、形質転換または感染により導入されるのを可能にし、それにより真核または原核細胞でのポリペプチドの発現を可能にするために、該核酸は、プラスミドとして、またはウイルスベクターもしくは非ウイルスベクターの一部として、存在することができる。この状況にとりわけ適したウイルスベクターは、以下のものである：バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびヘルペスウイルス。この状況にとりわけ適した非ウイルスベクターは、以下のものである：ヴィロソーム、リポソーム、カチオン性脂質およびポリリシン複合化ＤＮＡ。
【００５６】
遺伝子治療に有効なベクターの例は、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである（Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．３：４６６−７６；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２：５４９−５８）。単離した形の真核発現ベクターは、局所に適用した場合、裸のＤＮＡが皮膚細胞中に浸透することができるので、遺伝子治療での使用に適している（Ｈｅｎｇｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：２９１１−６；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１２：３７０−５）。
【００５７】
遺伝子治療に有効なベクターはまた、本発明に従って用いられる核酸をリポソームと複合体化することにより得ることができる。これは、このような方法で、非常に高い効率のトランスフェクション、特に皮膚細胞のトランスフェクションを実現できるためである（ＡｌｅｘａｎｄｅｒおよびＡｋｈｕｒｓｔ，１９９５，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．４：２２７９−８５）。リポフェクションでは、カチオン性脂質で構成される小さな単層リポソームを、リポソーム懸濁液の超音波処理により調製する。正の実効電荷が維持され、プラスミドＤＮＡがリポソームにより完全に複合体化するような比率で、ＤＮＡを、リポソームの表面上にイオン結合させる。Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７、上記参照）によって使用されたＤＯＴＭＡ（１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−トリメチルアンモニウムブロミド）およびＤＰＯＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）脂質混合物のほかに、非常に多くの新規脂質製剤がこれまでに合成されており、さまざまな細胞系統のトランスフェクションにおけるその効率について試験されてきた（Ｂｅｈｒ，Ｊ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６，６９８２−６９８６；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｊ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２５５０−２５６１；Ｇａｏ，Ｘ．＆  Ｈｕａｎｇ，Ｌ．（１９９１），Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１８９，１９５−２０３）。新規脂質製剤の例は、ＤＯＴＡＰ  Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムエチルスルフェートおよびＤＯＧＳ（ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ；ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）である。
【００５８】
細胞中への核酸の移行を増加させる補助的物質は、例えば、ＤＮＡに結合しているタンパク質もしくはペプチド、または核酸が細胞核内に輸送されるのを可能にする合成ペプチド−ＤＮＡ分子であることができる（Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６、２８２；Ｂｒａｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７，７８４）。補助的物質には、核酸が細胞の細胞質中に放出されるのを可能にする分子（Ｐｌａｎｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１２９１８；Ｋｉｃｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．８，２１３）、または、例えば、リポソーム（ＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎｎ（１９９０）上記参照）も含まれる。その他のとりわけ適した形の遺伝子治療ベクターは、本発明に従って用いられる核酸を金粒子に適用し、これらの粒子を組織中、好ましくは皮膚中、または細胞に、遺伝子銃とよばれるものを用いて発射することにより、得ることができる（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１１２：７７５−８１、Ｔｕｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１１：１８３−８）。皮膚が衝撃を与えられると、表皮の主要成分を構成する表皮細胞およびケラチノサイトが、優先的にトランスフェクトされる（Ｕｄｖａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７７：７４４−７５０；ＬｕおよびＧｏｌｄｓｍｉｔｈ，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ａｓｓｏｃ．Ａｍ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ，１０８：１６５−１７２）。
【００５９】
遺伝子治療に有効な他の形のベクターは、‘裸の’発現ベクターを生体適合性マトリックス、例えばコラーゲンマトリックス中に導入することにより、調製することができる。このマトリックスを、ケラチノサイト活性が障害を受けている皮膚中、例えば創傷中に導入すると、移入している細胞を発現ベクターでトランスフェクトして、本発明に従って用いられるポリペプチドをその細胞中に発現させることができる（ＧｏｌｄｓｔｅｉｎおよびＢａｎａｄｉｏ，ＵＳ  ５９６２４２７）。
【００６０】
また、遺伝子治療において上記核酸を用いる場合、ポリペプチドをコードする核酸の一部が、１種以上の非コード配列、例えば、イントロン配列、好ましくはそのポリペプチドのプロモーターと開始コドンとの間にあるもの、および／またはポリＡ配列、特に自然発生的ポリＡ配列もしくはＳＶ４０ウイルスポリＡ配列を、特に遺伝子の３’末端に含有するならば、これによりｍＲＮＡを安定化することができるので、有利である（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７４，９−１４およびＰａｌｍｉｔｅｒ，Ｒ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８，４７８−４８２）。
【００６１】
本発明はまた、配列番号３または配列番号４で表されるようなポリペプチドまたはその機能性変異体をコードする核酸またはその変異体を含み、少なくとも１種のベクターおよび／または少なくとも１種のノックアウト遺伝子構築体［脱文］、である宿主細胞、好ましくは皮膚細胞、特にケラチノサイトに関する。当業者は、例えば、ＵＳ  ５６２５１２２；ＵＳ  ５６９８７６５；ＵＳ  ５５８３２７８およびＵＳ  ５７５０８２５の米国特許から、ノックアウト遺伝子構築体を熟知している。
【００６２】
宿主細胞は、原核または真核細胞のいずれかであることができる；原核宿主細胞の例はＥ．ｃｏｌｉで、真核細胞の例はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび昆虫細胞である。
本発明に従った宿主細胞を、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患、特に創傷治癒障害および／または乾癬の診断、予防および／または処置に、あるいは薬理学的活性物質の同定に、用いることができる。
【００６３】
さらに好ましい形質転換された宿主細胞は、配列番号３または配列番号４で表されるようなポリペプチドまたはその機能性変異体をコードする、少なくとも１種の核酸またはその変異体を含有する、トランスジェニック非ヒト胚性幹細胞である。好ましい態様において、上記核酸は、ノックアウト遺伝子構築体または発現カセットまたは上記幹細胞に含有される。宿主細胞および／または幹細胞を形質転換し、トランスフェクトし、または感染させるための方法は、当業者に周知であり、例えば、エレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションを含む。
【００６４】
本発明はまた、少なくとも１種の上記ノックアウト遺伝子構築体または上記発現カセットを含有し、好ましくはゲノムに組み込まれている、トランスジェニック非ヒトほ乳類に関する。一般に、トランスジェニック動物は、組織特異的に高められており、かつ障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患、特に創傷治癒障害および／または乾癬の分析および／または診断に用いることができる、核酸および／またはポリペプチドの発現を示す。したがって、例えば、アクチビンＡ−トランスジェニックマウスは、改善した創傷治癒を示すが（Ｍｕｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，ＥＭＢＯ  Ｊ．１８：５２０５−１５）、主に負の(negative)ＫＧＦ受容体を含有するトランスジェニックマウスは、遅延した創傷治癒を示す（Ｗｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：８１９−２２）。
【００６５】
トランスジェニック動物、特にマウスの作製方法は、同様に、ＤＥ１９６２５０４９ならびに特許のＵＳ４７３６８６６；ＵＳ５６２５１２２；ＵＳ５６９８７６５；ＵＳ５５８３２７８およびＵＳ５７５０８２５により、当業者に公知である。そして、その方法は、例えば、胚または精母細胞内に発現ベクターを直接注入することによるか（上記参照）、胚性幹細胞に発現ベクターをトランスフェクトすることによるか（ＰｏｌｉｔｅｓおよびＰｉｎｋｅｒｔ：ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｐｉｎｋｅｒｔ中の１５〜６８頁，１９９４：Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：研究用ハンドブック，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，英国；Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ，１９９７，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，オランダ；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，Ｐｉｎｋｅｒｔ中の１１５〜１４６頁，１９９４，上記参照；Ｗｏｏｄ：Ｒｅｂｒｏｖｉｒｕｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｐｉｎｋｅｒｔ中の１４７〜１７６頁，１９９４，上記参照；Ｍｏｎａｓｔｅｒｓｋｙ：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｋｅｒｔ中の１７７〜２２０頁，１９９４，上記参照）、あるいは、分化した体細胞、例えば線維芽細胞から細胞核を単離した後、それらを脱核卵母細胞内に移転させる（ＭｃＣｒｅａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｎａｔｕｒｅ  ４０５：１００４−５）ことにより、作製することができるトランスジェニック動物に関係する。このようにして、公知のノックアウトマウスモデル、例えばｅＮＯＳ（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７７：Ｈ１６００−Ｈ１６０８）、Ｎｆ−１（Ａｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１２：８３５−４２）およびオステオポンチン（Ｌｉａｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：９６７−７１）ノックアウトマウスは、損なわれた創傷治癒を示す。
【００６６】
同様に、本発明に従って用いることができる核酸は、ターゲッティングベクターとよばれるものの中に組み込まれる［脱文］ことができ（Ｐｉｎｋｅｒｔ，１９９４，上記参照）［脱文］胚性幹細胞のトランスフェクションおよび相同的組換えの後、例えば、ノックアウトマウスを作製することができる。ノックアウトマウスは、一般に、ヘテロ接合マウスとしては減少した核酸の発現を示すが、ホモ接合マウスはもはや核酸の発現を示さない。本発明に従って用いられる遺伝子の、例えば皮膚特異的細胞、特にケラチノサイトでＣｒｅ−ｌｏｘＰ系（ｓｔａｔ３ノックアウト、Ｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  １９９９  １８：４６５７−６８）を用いての発現における組織特異的な減少は、この関連でとりわけ好ましい。例えば、このようにして作製されるトランスジェニックおよびノックアウト細胞または動物を、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患、例えば創傷の分析に、用いることができる。しかしながら、それらは、薬理学的活性物質か、または遺伝子治療において活性なベクターをスクリーニングおよび同定するために用いることもできる。
【００６７】
本発明はまた、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患、特に創傷治癒障害および／または乾癬を診断および／または予防および／または処置するため、あるいは適切な宿主細胞内で薬理学的活性物質を同定するための、ポリペプチドの調製方法に関し、その方法は、上記核酸を用いることを特徴とする。
【００６８】
ポリペプチドを、例えば、当業者に周知の方法を用いて、上記で既に説明したような適切な発現系において上記核酸を発現させることにより調製する。適切な宿主細胞の例は、Ｅ．ｃｏｌｉ株のＤＨＳ、ＨＢ１０１もしくはＢＬ２１；酵母株のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ；鱗翅目の昆虫細胞系統、例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａからのもの；または、動物細胞のＣＯＳ、Ｖｅｒｏ、２９３、ＨａＣａＴおよびＨｅＬａであり、これらのすべては、一般的に入手可能である。
【００６９】
本発明はまた、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患を診断および／または予防および／または処置するため、あるいは、適切な宿主細胞内で薬理学的活性物質を同定するための、融合タンパク質の調製方法に関し、その方法では、上記核酸を用いる。
【００７０】
本発明の他の態様において、本発明に従って用いることができるポリペプチドの機能性変異体は、融合タンパク質、すなわち配列番号３もしくは配列番号４で表される少なくとも１種のポリペプチドを含有する融合タンパク質またはその機能性変異体である。これらの融合タンパク質は、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患、特に創傷治癒障害および／または乾癬を診断、予防および／または処置するため、あるいは、薬理学的活性物質を同定するために、用いることができる。
【００７１】
上記ポリペプチドを含有する融合タンパク質をこの関連において調製し、ここで、その融合タンパク質は、それ自体がすでに上記ポリペプチドの機能を示すか、あるいは、融合部分が除かれた後にのみ特異的機能が機能的に活性になる。特に、これらの融合タンパク質には、約１〜３００、好ましくは約１〜２００、とりわけ好ましくは約１〜１５０、特に約１〜１００、特に約１〜５０の異種アミノ酸が含まれる。そのようなペプチド配列の例は、例えばＥ．ｃｏｌｉガラクトシダーゼに由来することができる原核生物のペプチド配列である。これに加えて、ウイルスペプチド配列、例えばバクテリオファージＭ１３からのものをこの方法で用いて、当業者が熟知しているファージディスプレイ法のための融合タンパク質を調製することも可能である。
【００７２】
融合タンパク質のためのペプチド配列の他の好ましい例は、融合タンパク質の検出を容易にするペプチドである；これらには、例えば、緑色蛍光タンパク質またはその変異体が含まれる。
【００７３】
上記タンパク質を精製するために、追加的ポリペプチド（タグ）を接着することが可能である。適切なタンパク質タグにより、例えば、マトリックスへの高親和性吸収；複合体を著しい程度で溶出させることのない、適切な緩衝液でのストリンジェントな洗浄；および、これに続く、吸収された複合体の選択的溶出；を実現することが可能になる。当業者に公知のタンパク質タグの例は、（Ｈｉｓ）6タグ；Ｍｙｃタグ；ＦＬＡＧタグ；ヘマグルテイニン(hemagluteinin)タグ；グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ；親和性キンチン結合(chintin-binding)タグまたはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグを含有するインテインである。これらのタンパク質タグは、タンパク質のＮ−末端、Ｃ−末端および／またはその内部に位置することができる。
【００７４】
本発明はまた、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患、特に創傷治癒障害および／または乾癬を診断、予防および／または処置するため、あるいは、薬理学的活性物質を同定するための、抗体、好ましくはポリクローナルまたはモノクローナル抗体の調製方法に関する。その方法では、ポリペプチドもしくはその機能性等価物、またはその一部分を、少なくとも６アミノ酸を含有し、好ましくは少なくとも８アミノ酸を含有し、特に少なくとも１２アミノ酸を含有するものを（１以上）、本発明に従って用いる。
【００７５】
その方法は、当業者に周知の方法を用いて、ほ乳類、例えばウサギを、上記ポリペプチドまたはその前記一部分で、適切な場合は、例えばフロイントアジュバントおよび／または水酸化アルミニウムゲルの存在下で、免役することにより、達成される（例えば、Ｄｉａｍｏｎｄ，Ｂ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ（１９８１）Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１３４４−１３４９参照）。免疫反応の結果として動物内に形成されたポリクローナル抗体は、その後、血液から容易に単離して、例えばカラムクロマトグラフィーにより、周知の方法を用いて精製することができる。モノクローナル抗体は、例えば、Ｗｉｎｔｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎの公知の方法（Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３４９，２９３−２９９）を用いて、調製することができる。
【００７６】
本発明はまた、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患、特に創傷治癒障害および／または乾癬を分析、診断、予防および／または処置するため、あるいは、薬理学的活性物質を同定するための、抗体に関する。その抗体は、上記ポリペプチドまたはその機能性変異体に対して向けられており、そして、ウシ血清アルブミンなどの適切な担体に結合することにより、上記ポリペプチド、ならびにそのポリペプチドの上記一部分（それ自体が免疫原であるか、もしくは免疫原になることができる部分、またはそれらの免疫原性が向上した部分のいずれか）と特異的に反応する。この抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかである；好ましくはモノクローナル抗体である。本発明に従って、抗体という用語はまた、組換えにより調製され、かつ所望により修飾されている抗体またはその抗原結合部、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、多機能性抗体、二重特異性抗体、オリゴ特異性(oligospecific)抗体、一本鎖抗体、Ｆ（ａｂ）フラグメントまたはＦ（ａｂ）2フラグメントを意味するものとして理解される（例えば、ＥＰ−Ｂ１−０３６８６８４、ＵＳ４８１６５６７、ＵＳ４８１６３９７、ＷＯ８８／０１６４９、ＷＯ９３／０６２１３、ＷＯ９８／２４８８４参照）。
【００７７】
本発明はまた、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患、特に創傷治癒障害および／または乾癬、とりわけ好ましくは乾癬を、診断および／または予防および／または処置するための、配列番号３もしくは配列番号４で表されるポリペプチドまたはその機能性変異体に対して向けられた抗体の使用に関する。
【００７８】
したがって、ＴＧＦ−β１に対して向けられたモノクローナル抗体を局所に注入すると、動物モデルにおいて創傷治癒を改善することができる（Ｅｒｎｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｕｔ  ３９：１７２−５）。
【００７９】
本発明はまた、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患を、診断および／または予防および／または処置するための、配列番号３もしくは配列番号４で表されるポリペプチドまたはその機能性変異体、好ましくは配列番号３または配列番号４で表されるポリペプチドの、活性のモジュレーターの使用に関する。
【００８０】
本発明の意味の範囲内において、‘モジュレーター’という用語は、化学的な物質、化合物、組成物および混合物であって、本発明に従ったイオンチャネルＩＫの活性に、モジュレーターがそれを開くか（＝活性化する）または閉めるか（＝阻害する）という点において影響を及ぼすものを包含する。さらに、モジュレーターは、チャネル活性の速度論をモジュレートすることができる。モジュレーターは、イオンチャネルの活性を阻害する阻害剤であることができ、または、イオンチャネルの活性を活性化する活性化剤であることができる。
【００８１】
これに加えて、“モジュレーター”という用語はまた、配列番号３もしくは配列番号４で表されるポリペプチドまたはその機能性変異体の発現をモジュレートする化合物、組成物および混合物を包含する。例えば、転写または翻訳レベルで、モジュレートすることができる。本発明に従って用いることができるポリペプチドの量を増加させる物質は活性化剤であり、本発明に従って用いることができるポリペプチドの量を減少させる物質は阻害剤である。
【００８２】
チャネル活性の決定方法は、文献により当業者に公知である。例えば、ＩＫチャネルをｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写および注入により卵母細胞に発現させて、イオンチャネル活性がパッチクランプ法を用いて測定されている（ＷＯ９８／１１１３９；Ｇｅｒｌａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：５８５−５９８；Ｋｈａｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：１４８３８−１４８４９）。さらに、ＩＫチャネルをヒト細胞系統に発現させて、パッチクランプ法を用いて分析することができる（ＷＯ００／３７４２２；ＷＯ９９／２５３４７）。このようにして内因的に発現させたＩＫチャネルを保有する細胞を調査することも、可能である（Ｇｅｒｌａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：５８５−５９８）。内因的に、またはトランスフェクションにより、皮膚細胞、例えばケラチノサイトに発現させたＩＫチャネルを、類似の方法で用いることができる。チャネルのモジュレーターの同定に適したその他の方法の例は、放射性Ｒｕ+フラックス試験系、および電圧依存性染料を用いる蛍光試験系である（Ｖｅｓｔｅｒｇａａｒｄ−Ｂｏｇｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．８８：６７−７５；Ｄａｎｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｍｅｔｈ．２５：１８５−１９３；Ｈｏｌｅｖｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９４，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．１３７：５９−７０）。例えば、ＦＬＩＰＲ（蛍光画像プレートリーダー）試験系を用いることが可能である（ＷＯ９９／２５３４７）。ＩＫチャネルを通過するカリウム流に対するある物質の阻害または活性化作用を試験するための試験系は、その物質を、ＩＫチャネル−発現細胞に接触している溶液に加えることにより、実施することができる（例えば、Ｂｌａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２３：７１８−７２０；Ｐａｒｋ，１９９４，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，４８１：５５５−５７０）。
【００８３】
一般に、チャネルの活性は、電流か、イオン流か、または電流もしくはイオン流の二次的作用を測定することにより、決定することができる。イオンチャネルの活性のモジュレーターは、電流またはイオン流を変更する。このようにして、試験される物質のモジュレーター特性を研究することができる。
【００８４】
チャネルを通過するカチオン流における変化は、例えば、イオン濃度の変化を決定することにより直接的に、または、イオンの放射能標識により膜電位を測定することにより間接的に、検出することができる。無傷の細胞または器官に対するモジュレーターの影響が検出されている場合、非常に幅広い二次的な生理学的作用を測定することが可能である。考えうる作用は、転写変化、細胞体積における変化、細胞の代謝における変化、ホルモンの放出などである（ＷＯ９８／１１１３９）。ＷＯ９９／２５３４７には、ＩＫチャネルに対するモジュレーター作用に関する化学物質のスクリーニング方法が開示されている。
【００８５】
配列番号３または配列番号４で表されるポリペプチドの公知のモジュレーターはどれも、これまでに、障害のあるケラチノサイト活性に関連する皮膚疾患、特に創傷治癒障害および／または乾癬と関連を有することが、例えば障害のある創傷治癒に関連づけて報告されておらず、そのような関連も示唆されていない。したがって、これらの化合物を本発明に従って用いることができることは、意外であった。
【００８６】
本発明の他の態様において、モジュレーターは阻害剤である。
本発明に従って、ＩＫチャネルをモジュレートするために、配列番号３もしくは配列番号４で表されるポリペプチドまたはその機能性変異体に対して向けられた、少なくとも１種の抗体を用いることが可能である。これに関連して、抗体は、本発明に従って用いることができるポリペプチドの活性に対し、阻害作用または活性化作用を有することができる。
【００８７】
ＩＫチャネル活性の阻害剤は、例えば、ＷＯ９９／２５３４７に開示されている。例えば、一般式（Ｉ）に従った１，４−ジヒドロピリジン−３，５−ジカルボン酸の対称性もしくは非対称性誘導体：
【００８８】
【化１】
2004530642.tif 000002
【００８９】
または医薬的に容認されるその塩、酸化物もしくは水和物を、使用することが可能である
［式中、
Ｒは、アルキル基またはシクロアルキル基であって、ハロゲン、好ましくはＦまたはＣｌで置換されていてもよいものであり；
あるいは、Ｒは、単環式または多環式アリール基であり、ここでそのアリール基は、ハロゲン、特にＦもしくはＣｌ；トリフルオロメチル（−ＣＦ3）；ニトロ（−ＮＯ2）；シアノ（−ＣＮ）；アジド（−Ｎ3）；式−Ｓ（Ｏ）n−アルキル、−Ｓ（Ｏ）n−ＮＨ−アルキルもしくは−Ｓ（Ｏ）n−Ｎ−（アルキル）2の基（式中、ｎは、好ましくは０、１もしくは２であることができる）；アルキル基；シクロアルキル基；アルコキシ基；トリフルオロメチルオキシ基（−ＯＣＦ3）；カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）；式−ＣＯＯ−アルキルの基；カルバモイル基（−ＣＯＮＨ2）；および、式−ＣＯＮＨ−アルキルもしくはＣＯＮ（アルキル）2の基；から選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができ；
あるいは、Ｒは単複素環式または多複素環式基であり、ここでその複素環式基は、アルキル基、アルコキシ基、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、式−ＣＯＯ−アルキルの基、および／または式−ＣＯＯ−フェニルの基で、１回または１回より多く、置換されていることができ、ここで好ましいヘテロ原子は、Ｎ、ＳおよびＯであり；
そして、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、互いに独立して、水素、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、フェニル基、フェニルアルキル基、フラニル基、フラニルアルキル基、ピリジル基またはピリジルアルキル基であって、ハロゲン、好ましくはＦまたはＣｌで置換されていてもよいものである］。
【００９０】
好ましい態様は、一般式（Ｉ）の阻害剤であって、Ｒが、Ｃ3-7シクロアルキル基、特にシクロヘキシル基であるか；フェニル基、好ましくは一置換フェニル基（ここでそのフェニル基は、ハロゲン、トリフルオロメチル（−ＣＦ3）、ニトロ（−ＮＯ2）およびシアノ（−ＣＮ）からなる群より選択される置換基で、１回または１回より多く［脱文］）であるか；
または、Ｒが、ピリジル基もしくはジヒドロピリジル基（ここでこの基は、式−ＣＯＯ−アルキルの基または−ＣＯＯ−フェニルの基で一置換されていることができる）である、阻害剤を使用するものである。
【００９１】
その他の好ましい態様では、一般式（Ｉ）に従った阻害剤であって、Ｒが、２−ニトロフェニル基、３−ニトロフェニル基、４−ニトロフェニル基、２−トリフルオロメチルフェニル基、３−トリフルオロメチルフェニル基、４−トリフルオロエチルフェニル基、２−シアノフェニル基、３−シアノフェニル基または４−シアノフェニル基であるか；
あるいは、Ｒが、２−ピリジル、４−ピリジル、３−ピリジル；１，２−もしくは１，４−もしくは１，６−ジヒドロ−２−ピリジル基；１，２−もしくは１，４−もしくは１，６−ジヒドロ−３−ピリジル基；または、１，２−もしくは１，４−もしくは１，６−ジヒドロ−４−ピリジル基（ここでそのピリジルまたはジヒドロピリジル基は、Ｃ1-6アルキル、式−ＣＯＯ−Ｃ1-6−アルキルの基または式−ＣＯＯ−フェニルの基で、一置換されていることができる）である、阻害剤の使用が可能である。
【００９２】
その他の好ましい態様では、一般式（Ｉ）のモジュレーターであって、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4が、互いに独立して、Ｃ1-6−アルキル、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチルまたはイソブチルであるモジュレーターを使用する。
【００９３】
好ましい態様は、一般式（Ｉ）の阻害剤を使用する態様であって、その阻害剤が、一般式（Ｉ）に従った１，４−ジヒドロピリジン−３，５−ジカルボン酸の非対称性誘導体であるものである。好ましい非対称性誘導体は、１，４−ジヒドロピリジン−３，５−ジカルボン酸（Ｉ）の非対称性Ｃ1-6−アルキル誘導体である。例えば、以下の物質の使用が可能である：
エチルメチル  １，４−ジヒドロ−２，６−ジメチル−４−（２−ニトロフェニル）−ピリジン−３，５−ジカルボキシレート；
プロピルメチル  １，４−ジヒドロ−２，６−ジメチル−４−（２−ニトロフェニル）−ピリジン−３，５−ジカルボキシレート；
エチルメチル  １，４−ジヒドロ−２，６−ジメチル−４−（３−ニトロフェニル）−ピリジン−３，５−ジカルボキシレート。
【００９４】
その他の好ましい態様は、一般式（Ｉ）で表される１，４−ジヒドロピリジン−３，５−ジカルボン酸の対称性誘導体を使用する態様である。好ましい化合物は、１，４−ジヒドロピリジン−３，５−ジカルボン酸の対称性Ｃ1-6−アルキル誘導体を含有する。例えば、本発明に従って、以下の物質の使用が可能である：
ジメチル  １，４−ジヒドロ−２，６−ジメチル−４−（２−ニトロフェニル）−ピリジン−３，５−ジカルボキシレート（ニフェジピン）；
ジエチル  １，４−ジヒドロ−２，６−ジメチル−４−（２−ニトロフェニル）−ピリジン−３，５−ジカルボキシレート。
【００９５】
その他の態様では、本発明に従って、一般式（ＩＩ）に従ったクロトリマゾールの誘導体もしくは代謝物（ＷＯ９９／２５３４７も参照のこと）であるか、
【００９６】
【化２】
2004530642.tif 000003
【００９７】
または医薬的に容認されるその塩、酸化物もしくは水和物である阻害剤を、使用することが可能である
［式中、
Ｘは、ハロゲン、特にＦもしくはＣｌであるか、またはトリフルオロメチル基、ニトロ基もしくはシアノ基であり；
Ｒ5は、水素であるか、ハロゲン、特にＦもしくはＣｌであるか、またはヒドロキシル、アルキル基、シクロアルキル基、アルコキシ基もしくはアルキルオキシ基（適切な場合、ハロゲン、好ましくはＦまたはＣｌで置換されている）であり；
Ｒ6は、水素またはフェニル基であり、ここでそのフェニル基は、ハロゲン、好ましくはＦまたはＣｌ、およびヒドロキシルから選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができ；
Ｒ7は、水素であるか、ハロゲン、好ましくはＦもしくはＣｌであるか、またはヒドロキシル、アルキルもしくはアルコキシ（適切な場合、ハロゲン、好ましくはＦまたはＣｌで置換されている）であり；
Ｒ8は、式−Ｙ−ＣＨ2−Ｒ9の基（式中、Ｙは、酸素（−Ｏ−）または硫黄（−Ｓ−）である）；式＝ＮＯ−ＣＨ2−Ｒ9の基；式−Ｏ−フェニル−ＣＨ＝ＣＨ2の基；式−ＣＨ2−ＣＨ（ＣＨ3）−Ｓ−フェニルの基（式中、そのフェニル基は、ハロゲン、好ましくはＦまたはＣｌ、およびヒドロキシルから選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができる）；あるいは、フェニル基、ここでそのフェニル基は、ハロゲン、好ましくはＦまたはＣｌ、およびヒドロキシルから選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができる；であり、ここで、Ｒ9は、エテニル基（ＣＨ2＝ＣＨ−）；フェニル基、ここでそのフェニル基は、ハロゲン、好ましくはＦまたはＣｌ、およびヒドロキシル基から選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができる；フェニル−Ｓ−フェニル基；式ＣＨ2−Ｏ−フェニルの基（式中、そのフェニル基は、ハロゲン、好ましくはＦまたはＣｌ、およびヒドロキシル基から選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができる）；あるいは、一般式（ＶＩＩ）の基である
【００９８】
【化３】
2004530642.tif 000004
【００９９】
（式中、ＺはＳ、ＯまたはＮであり；そして、Ｒ10は、水素またはハロゲン、好ましくはＦもしくはＣｌであるか、またはヒドロキシル基である）］。
以下の誘導体および代謝物を用いることが好ましい：
２−クロロフェニル−４−ヒドロキシフェニルフェニルメタン；２−クロロフェニルビスフェニルメタン；２−クロロフェニルビスフェニルメタノール；３−（１−［２，４−ジクロロフェニル］エトキシメチル）−２−クロロチオフェン；Ｏ−（２，４−ジクロロベンジル）−２，４−ジクロロアセトフェノンオキシム；１−（２，４−ジクロロ）−１−（４−（フェニルチオ）ベンジルオキシ）エタン；１−（２，４−ジクロロフェニル）−１−１−（アリルオキシ）−エタン；１−（２，４−ジクロロフェニル）−１−（４−クロロベンジルチオ）エタン；１−（２，４−ジクロロフェニル）−１−（２，４−ジクロロベンジルオキシ）エタン；１−（２，４−ジクロロフェニル）エチル−２，６−ジクロロベンジルエーテル；１−（２−［４−クロロフェノキシ］エチルオキシ）−１−（２，４−ジクロロフェニル）プロペン；１−（２，４−ジクロロフェニル）エチル−（４−クロロフェニル）メチルエーテル；３−クロロベンジル−２−ビニルフェニルエーテルおよび１−（４−クロロフェニル）−３−（２，６−ジクロロフェニルチオ）ブタン。
【０１００】
文書ＷＯ９９／２５３４７には、ｈＩＫ１の阻害剤として働き、本発明に従って用いることができる、その他の物質が開示されている。例は、イミダゾール誘導体のミコナゾール、エコナゾール、ブトコナゾール、オキシコナゾール、スルコナゾールおよびチオコナゾール；トリアゾール誘導体のフルコナゾール、テルコナゾールおよびイトラコナゾール；ニトロイミダゾール誘導体のメトロニダゾール、チニダゾール、ニモラゾール(nimorazole)、オルニダゾールおよびベンズニダゾールである。
【０１０１】
本発明に従って用いることができる他の適切なモジュレーターは、一般式（ＩＩＩ）に従ったオキシム誘導体（ＷＯ００／３４２２８参照）：
【０１０２】
【化４】
2004530642.tif 000005
【０１０３】
または医薬的に容認されるその塩、酸化物もしくは水和物である
［式中、
Ｙは、酸素、硫黄またはアミノ基、好ましくは式ＮＨＲ13のアミノ基であり；
Ｒ11は、水素；アルキル基；シクロアルキル基；ヒドロキシル基；アルコキシ基；アシル基；フェニル基またはベンジル基、ここでその基、特にそのフェニル基またはベンジル基は、ハロゲン、特にＦもしくはＣｌと、−ＣＦ3、−ＮＯ2、−ＣＮ、アルキル基、シクロアルキル基、ヒドロキシル基およびアルコキシ基とから選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができる；式ＣＨ2ＣＮの基；式ＣＨ2ＣＯ2Ｒ’の基（式中、Ｒ’は、水素またはアルキル基である）；式ＣＨ2ＣＯＮＲIVＲVの基（式中、ＲIVおよびＲVは、互いに独立して、水素またはアルキル基であり、適切な場合はハロゲンで置換されいる）；あるいは、式−ＣＨ2Ｃ（＝ＮＯＨ）ＮＨ2の基であり；
Ｒ12は、水素；アルキル基；シクロアルキル基；フェニル基またはベンジル基であり、ここでその基、特にそのフェニル基またはベンジル基は、ハロゲン、特にＦもしくはＣｌと、−ＣＦ3、−ＮＯ2、−ＣＮ、アルキル基、シクロアルキル基、ヒドロキシル基およびアルコキシ基とから選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができる；
Ｒ13は、水素；アルキル基；シクロアルキル基；フェニル基またはベンジル基であり、ここでその基、特にそのフェニル基またはベンジル基は、ハロゲン、特にＦもしくはＣｌと、−ＣＦ3、−ＮＯ2、−ＣＮ、アルキル基、シクロアルキル基、ヒドロキシル基およびアルコキシ基とから選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができる；そして、
Ｒ14およびＲ15は、互いに独立して、水素；ハロゲン、特にＦもしくはＣｌ；−ＣＦ3；−ＮＯ2；−ＣＮ；アルキル基；アルコキシ基；フェニル基またはベンジル基、ここでその基、特にそのフェニル基またはベンジル基は、ハロゲン、特にＦもしくはＣｌと、−ＣＦ3、−ＮＯ2、−ＣＮ、アルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルおよびアルコキシとから選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができる；であるか、または、式−ＳＯ2ＮＲ’’Ｒ’’’の基（式中、Ｒ’’およびＲ’’’は、互いに独立して、水素またはアルキル基である）であり；
あるいは、Ｒ14およびＲ15は、一緒になって、追加的な４員〜７員縮合環を形成し、ここでその縮合環は、芳香族であるかまたは部分的に飽和していることができ、そして、ハロゲン、特にＦもしくはＣｌと、−ＣＦ3、−ＮＯ2、−ＣＮおよび式−ＳＯ2ＮＲ’’Ｒ’’’の基（式中、Ｒ’’およびＲ’’’は、互いに独立して、水素またはアルキル基である）とから選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができる］。
【０１０４】
本発明に従って用いることができるモジュレーターの好ましい態様において、Ｒ11は、水素またはアルキル基である。その他の好ましい態様では、Ｒ12は、水素、アルキル基またはベンジル基もしくはフェニル基であり、ここでそのフェニル基もしくはベンジル基は、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＮＯ2、−ＣＮ、アルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルおよびアルコキシから選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができる。
【０１０５】
その他の好ましい態様において、Ｙは、酸素または式ＮＨＲ13のアミノ基であり、ここでＲ13は、水素、アルキル、ベンジルまたはアセチルである。
その他の好ましい態様において、Ｒ14およびＲ15は、互いに独立して、水素、ハロゲン、アルキルまたはアルコキシである。
【０１０６】
その他の好ましい態様において、Ｒ14およびＲ15は、一緒になって、追加的な６員縮合環を形成し、ここでその縮合環は、芳香族であるかまたは部分的に飽和していることができ、その縮合環は、ハロゲン、特にＦもしくはＣｌと、−ＣＦ3、−ＮＯ2、−ＣＮおよび式−ＳＯ2ＮＲ’’Ｒ’’’の基（式中、Ｒ’’およびＲ’’’は、互いに独立して、水素もしくはアルキル基である）とから選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができる。
【０１０７】
とりわけ好ましい態様において、以下のオキシム誘導体を、本発明に従ったモジュレーターとして用いることが可能である：
２−アルドキシモ−１−ナフトール；２−アルドキシモ−５，６−ジメチルフェノール；２−アルドキシモ−５，６−ジクロロフェノール；Ｏ−ベンジル−２−ホルミル−５，６−ジクロロフェノールオキシム；Ｏ−メチル−２−ホルミル−５，６−ジクロロフェノールオキシム；２−アルドキシモ−５，６，７，８−テトラヒドロ−１−ナフトール；１−ヒドロキシ−２−アセトナフトンオキシム；１−メトキシ−２−アセトナフトンオキシム；Ｏ−エチル−１−メトキシ−２−アセトナフトンオキシム；１−エトキシ−２−アセトナフトンオキシム；１−ベンジルオキシ−２−アセトナフトンオキシム；２−ヒドロキシ−３，４−ジメチルアセトフェノンオキシム；２−メトキシ−３，４−ジメチルアセトフェノンオキシム；２−ヒドロキシ−３，４−ジメトキシアセトフェノンオキシム；２，３，４−トリメトキシアセトフェノンオキシム；１−ヒドロキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−アセトナフトンオキシム；１−メトキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−アセトナフトンオキシム；１−（２−プロピルオキシ）−２−アセトナフトンオキシム；Ｎ−（２−アセチルフェニル）アセトアミドオキシム。
【０１０８】
その他の態様において、一般式（ＩＶ）に従った化学化合物（ＷＯ００／３４２４８参照）
【０１０９】
【化５】
2004530642.tif 000006
【０１１０】
または医薬的に容認されるその塩、酸化物もしくは水和物を、本発明に従ったモジュレーターとして用いることが可能である
［式中、
Ａは、酸素、硫黄または窒素であり；
Ｒ16は、水素；アルキル基；シクロアルキル基；ヒドロキシル基；アルコキシ基；アシル基；フェニル基またはベンジル基、ここでその基、特にそのフェニル基またはベンジル基は、ハロゲン、特にＦもしくはＣｌと、−ＣＦ3、−ＮＯ2、−ＣＮ、アルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルおよびアルコキシとから選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができる；式ＣＨ2ＣＮの基；式ＣＨ2ＣＯ2Ｒ’の基（式中、Ｒ’は、水素またはアルキル基である）；式ＣＨ2ＣＯＮＲIVＲVの基（式中、ＲIVおよびＲVは、互いに独立して、水素またはアルキル基である）；または、式−ＣＨ2Ｃ（＝ＮＯＨ）ＮＨ2の基であり；
Ｒ17は、水素；アルキル基；シクロアルキル基；フェニル基またはベンジル基であり、ここでその基、特にそのフェニル基またはベンジル基は、ハロゲン、特にＦもしくはＣｌと、−ＣＦ3、−ＮＯ2、−ＣＮ、アルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルおよびアルコキシとから選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができる；
Ｒ18、Ｒ19およびＲ20は、互いに独立して、水素；ハロゲン、特にＦもしくはＣｌ；−ＣＦ3；−ＮＯ2；−ＣＮ；アルキル基；アルコキシ基；フェニル基またはベンジル基、ここでその基、特にそのフェニル基またはベンジル基は、ハロゲン、特にＦもしくはＣｌと、−ＣＦ3、−ＮＯ2、−ＣＮ、アルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルおよびアルコキシとから選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができる；または、式−ＳＯ2ＮＲ’’Ｒ’’’の基（式中、Ｒ’’およびＲ’’’は、互いに独立して、水素もしくはアルキル基であり、適切な場合、好ましくはＦもしくはＣｌで置換されている）であり；
あるいは、Ｒ20は上記のように定義され、Ｒ18およびＲ19は、一緒になって、追加的な４員〜７員縮合環を形成し、ここでその縮合環は、ヘテロ原子が好ましくはＮ、ＳまたはＯである複素環であることができ、芳香族であるかまたは飽和もしくは部分的に飽和していることができ、そして所望により、ハロゲン、特にＦもしくはＣｌと、−ＣＦ3、−ＮＯ2、−ＣＮおよび式−ＳＯ2ＮＲ’’Ｒ’’’の基（式中、Ｒ’’およびＲ’’’は、互いに独立して、水素もしくはアルキル基である）とから選択される置換基で[脱文]］。
【０１１１】
好ましい態様において、Ｒ16は、水素またはアルキル基である。その他の好ましい態様では、Ｒ17は、水素またはアルキル基である。その他の好ましい態様では、Ｒ19、Ｒ20およびＲ18は、互いに独立して、水素またはアルキル基である。
【０１１２】
本発明に従って、とりわけ好ましいのは、１−エチル−４，５−ジクロロベンゾイミダゾロン、１，３−ジエチル−４，５−ジクロロベンゾイミダゾロン、３−エチル−５−クロロベンゾオキサゾロン、ならびに活性化剤の１−エチル−２−ベンゾイミダゾリノン（１−ＥＢＩＯ）、１−エチル−４，５−ジクロロ−２−ベンゾイミダゾリノン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４３：２６６４）、５，６−ジクロロ−１−エチル−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−オン（ＤＣＥＢＩＯ；Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ；２９６：６００−１１）およびクロルゾキサゾン（Ｓｙｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７８：Ｃ５７０−Ｃ５８１）の使用である。
【０１１３】
その他の好ましい態様では、Ｒ18およびＲ19が一緒になって５員または６員縮合環を形成している式（ＩＶ）に従ったモジュレーターを使用する。ここでその環は、複素環式であることができ；これに加えて、その環は、芳香族であるかまたは飽和もしくは部分的に飽和していることができ、そしてその環は、所望により、ハロゲン、特にＦもしくはＣｌと、−ＣＦ3、−ＮＯ2、−ＣＮおよび式−ＳＯ2ＮＲ’’Ｒ’’’の基（式中、Ｒ’’およびＲ’’’は、互いに独立して、水素もしくはアルキル基であり、適切な場合、特にＦもしくはＣｌで置換で置換されている）とからなる群より選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができる。
【０１１４】
とりわけ好ましいのは、１，３−ジエチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフト［１，２−ｄ］イミダゾリノン、１−エチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフト［１，２−ｄ］イミダゾリノン；３−エチルナフト［１，２−ｄ］オキサゾリノン；３−エチルナフト［１，２−ｄ］イミダゾリノン；３−エチルキノリノ［５，６−ｄ］イミダゾリノンおよび３−ベンジル−（２，１，３−チアジアゾロ）−［４，５−ｇ］ベンゾイミダゾロンの使用である。
【０１１５】
さらに、一般式（Ｖ）に従った化学化合物（ＷＯ００／３７４２２参照）：
【０１１６】
【化６】
2004530642.tif 000007
【０１１７】
または医薬的に容認されるその塩、酸化物もしくは水和物を、本発明に従ったモジュレーターとして用いることができる
［式中、
ＢおよびＣは、互いに独立して、式−（ＣＨ2）n−；式−（ＣＨ2）n−Ｙ’−（二方向の一方で）；または、式−（ＣＨ2）n−Ｙ’−（ＣＨ2）m−（この式中、ｎおよびｍは、互いに独立して、０、１、２、３または４であり、Ｙ’は、Ｏ、ＳまたはＮＲ’’’であり、ここでＲ’’’は、水素またはアルキル基である）であり；
Ｒ21およびＲ22は、互いに独立して、アルキル；アルケニル；アルキニル；シクロアルキル；アミノ；トリハロメチル、特にトリフルオロメチルもしくはトリクロロメチル；ニトロ；シアノ；フェニル；または、式ＯＲ’、−ＳＲ’、−Ｒ’ＯＲ’’、−Ｒ’ＳＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｓ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’（ＯＲ’’）、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ’（ＯＲ’’）、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’（ＳＲ’’）、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ’（ＳＲ’’）、−ＣＨ（ＣＮ）2、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＣＨ［Ｃ（Ｏ）Ｒ’］2、−ＣＨ［Ｃ（Ｓ）Ｒ’］2、−ＣＨ［Ｃ（Ｏ）ＯＲ’］2、−ＣＨ［Ｃ（Ｓ）ＯＲ’］2、−ＣＨ［Ｃ（Ｏ）ＳＲ’］2、−ＣＨ［Ｃ（Ｓ）ＳＲ’］2、ＣＨ2ＯＲ’、ＣＨ2ＳＲ’、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、もしくはＯＣ（Ｏ）Ｒ’の基であるか；
あるいは、不飽和、部分的飽和もしくは飽和の単環式もしくは多環式基；アラルキル基；またはヘテロアルキル基であり、ここでその単環式もしくは多環式基、アラルキル基またはヘテロアルキル基は、ハロゲン、特にＦもしくはＣｌ；トリハロメチル、特にトリフルオロメチルもしくはトリクロロメチル；アルキル；アルケニル；アルキニル；アミノ；ニトロ；シアノ；もしくはアミド；または、式−Ｒ’、−ＯＲ’、ＳＲ’、−Ｒ’ＯＲ’’、−Ｒ’ＳＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｓ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’もしくは−Ｃ（Ｓ）ＳＲ’の基；または、フェニル基もしくはフェノキシ基（ここでその基、特にそのフェニル基もしくはフェノキシ基は、ハロゲン、特にＦもしくはＣｌ；トリハロメチル、特にトリフルオロメチルもしくはトリクロロメチル；アルキル；アルケニル；アルキニル；アミノ；ニトロ；シアノ；もしくはアミド；または、式−Ｒ’、−ＯＲ’、ＳＲ’、−Ｒ’ＯＲ’’、−Ｒ’ＳＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｓ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ’、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｒ’’もしくはＯＣ（Ｏ）Ｒ’の基；からなる基で、１回または１回より多く、置換されていることができる）；からなる基で、１回または１回より多く、置換されていることができ；
ここで、
Ｒ’およびＲ’’は、互いに独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシもしくはフェニル（適切な場合、特にＦもしくはＣｌで置換されている）、または式ＮＲ’’’Ｒ’’’’の基（式中、Ｒ’’’およびＲ’’’’は、互いに独立して、水素またはアルキルである）であり；
Ｒ23およびＲ24は、互いに独立して、アルキル；アルケニル；アルキニル；シクロアルキル；アミノ；トリハロメチル、特にトリフルオロメチルもしくはトリクロロメチル；ニトロ；シアノ；フェニル；または、式ＯＲ’、−ＳＲ’、−Ｒ’ＯＲ’’、−Ｒ’ＳＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｓ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’（ＯＲ’’）、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ’（ＯＲ’’）、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’（ＳＲ’’）、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ’（ＳＲ’’）、−ＣＨ（ＣＮ）2、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＣＨ［Ｃ（Ｏ）Ｒ’］2、−ＣＨ［Ｃ（Ｓ）Ｒ’］2、−ＣＨ［Ｃ（Ｏ）ＯＲ’］2、−ＣＨ［Ｃ（Ｓ）ＯＲ’］2、−ＣＨ［Ｃ（Ｏ）ＳＲ’］2、−ＣＨ［Ｃ（Ｓ）ＳＲ’］2、ＣＨ2ＯＲ’、ＣＨ2ＳＲ’、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、もしくはＯＣ（Ｏ）Ｒ’の基であり；
ここで、
Ｒ’およびＲ’’は、互いに独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシ、フェニル、または式ＮＲ’’’Ｒ’’’’の基であり、ここで、Ｒ’’’およびＲ’’’’は、互いに独立して水素またはアルキルであり、適切な場合は、特にＦもしくはＣｌで置換されている；
あるいは、Ｒ23およびＲ24は、一緒になって、不飽和、部分的飽和もしくは完全飽和の単環式もしくは多環式基または単複素環式もしくは多複素環式基を形成し、ここで、ヘテロ原子は、好ましくはＮ、ＳまたはＯであり、その単環式もしくは多環式基は、ハロゲン、特にＦもしくはＣｌ；トリハロメチル、特にトリフルオロメチルもしくはトリクロロメチル；アルキル；アルケニル；アルキニル；アミノ；ニトロ；シアノ；もしくはアミド；または、式−Ｒ’、−ＯＲ’、ＳＲ’、−Ｒ’ＯＲ’’、−Ｒ’ＳＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｓ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ’の基；または、フェニル基もしくはフェノキシ基（ここでその基、特にそのフェニル基もしくはフェノキシ基は、ハロゲン、特にＦもしくはＣｌ；トリハロメチル、特にトリフルオロメチルもしくはトリクロロメチル；アルキル；アルケニル；アルキニル；アミノ；ニトロ；シアノ；もしくはアミド；または、式−Ｒ’、−ＯＲ’、ＳＲ’、−Ｒ’ＯＲ’’、−Ｒ’ＳＲ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｓ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ’、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｒ’’もしくはＯＣ（Ｏ）Ｒ’の基；からなる基で、１回または１回より多く、置換されていることができる）；からなる基で、１回または１回より多く、置換されていることができ；
ここで、
Ｒ’およびＲ’’は、互いに独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシ、フェニル、または式ＮＲ’’’Ｒ’’’’の基であり、ここで、Ｒ’’’およびＲ’’’’は、互いに独立して、水素またはアルキルであり、適切な場合は、特にＦもしくはＣｌで置換されている］。
【０１１８】
本発明に従って用いることができるモジュレーターの好ましい態様は、一般式（ＶＩＩＩ）に従ったリンゴ酸エステル誘導体
【０１１９】
【化７】
2004530642.tif 000008
【０１２０】
または医薬的に容認されるその塩、酸化物もしくは水和物である
［式中、
Ａ、Ｂ、Ｒ21およびＲ22は、上記のように定義され、Ｒ25およびＲ26は、互いに独立して、水素、アルキル、シクロアルキル（適切な場合、特にＦもしくはＣｌで置換されている）、または式ＮＲ’’’Ｒ’’’’の基（式中、Ｒ’’’およびＲ’’’’は、互いに独立して、水素またはアルキルであり、適切な場合、特にＦもしくはＣｌで置換されている）である］。
【０１２１】
その他の好ましい態様において、上記のようなリンゴ酸エステル誘導体であって、Ｒ25およびＲ26が、一緒になって６〜９員環を形成して、ジエステル誘導体を生成するものの使用が可能である。
【０１２２】
本発明に従ってとりわけ好ましいのは、ＩＫ活性のモジュレーターとして以下のリンゴ酸誘導体を使用することである：
ジエチル−２−（４−フルオロフェニル）−２−（３−ピコリル）マロネート；
ジエチル−２−（４−ニトロフェニル）−２−（２−ピコリル）マロネート；
ジエチル−２−（４−ニトロフェニル）−２−（４−ピコリル）マロネート；
ジエチル−２−フェニル−２−（３−ピコリル）マロネート；ジエチル−２−（５−クロロ−２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル）−２−（３−ピコリル）マロネート；ジエチル−２−ベンジル−２−（３−ピコリル）−マロネート；ジエチル−２−（４−ニトロフェニル）−２−［（ベンゾトリアゾール−１−イル）メチル］マロネート；ジエチル−２−（２−チエニル）−２−（２−ピコリル）マロネート；ジエチル−２−（４−（アセチルアミノ）フェニル）−２−（２−ピコリル）マロネート；ジエチル−２−（４−ベンゾイルアミノ）フェニル）−２−（２−ピコリル）マロネートおよび２−（４−ニトロフェニル）−２−（２−ピコリル）マロノニトリル。
【０１２３】
一般式Ｖに従ったその他の物質で、本発明に従った使用がとりわけ好ましいものは、２−（３−フェノキシフェニル）ブチロニトリル；２−（２−クロロフェニル）ブチロニトリル；ジシクロプロパン（４−クロロフェニル）カルビノール；エチル−１−（４−クロロフェニル）シクロペンタン−１−カルボキシレートおよび１−（４−クロロフェニル）−１−（３−メチル−５−オキサジアゾリル）シクロペンタンである。
【０１２４】
その他の態様において、本発明に従って用いることができるモジュレーターは、ＩＫ活性の活性化剤として働く。
以下の一般式（ＶＩ）に従ったイサチン誘導体（ＷＯ００／３３８３４も参照のこと）
【０１２５】
【化８】
2004530642.tif 000009
【０１２６】
または医薬的に容認されるその塩、酸化物もしくは水和物を、本発明に従った活性化剤として用いることができる
［式中、
Ｒ27は、水素；アルキル基；シクロアルキル基；アシル基；フェニル基またはベンジル基、ここでその基、特にそのフェニル基またはベンジル基は、ハロゲン、特にＦもしくはＣｌと、−ＮＯ2、−ＣＮ、−ＣＦ3、アルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルおよびアルコキシとから選択される基で、１回または１回より多く、置換されていることができる；式−ＣＨ2ＣＮの基；式−ＣＨ2ＣＯ2Ｒ’の基（式中、Ｒ’は、水素またはアルキル基であり、適切な場合、特にＦもしくはＣｌで置換されている）；式−ＣＨ2ＣＯＮＲIVＲVの基（式中、ＲIVおよびＲVは、互いに独立して、水素、アルキル（適切な場合、特にＦもしくはＣｌで置換されている）、フェニル基またはベンジル基であり、ここでそのフェニル基またはベンジル基は、ハロゲンおよび／またはアルキルで、１回または１回より多く置換されていることができ、あるいはＲIVおよびＲVは、それらが結合しているＮ原子と一緒になって４員〜７員単環式環を形成し、ここでその複素環式基は、ハロゲン、特にＦもしくはＣｌか、アルキル、シクロアルキル、アルキルオキシ、シクロアルキルオキシ、フェニルまたはベンジルから選択される基で、１回または１回より多く、置換されていることができる；あるいは、式−ＣＨ2Ｃ（＝ＮＯＨ）ＮＨ2の基である。
【０１２７】
Ｒ28は、水素；アルキル基；シクロアルキル基；式−ＣＨ2ＣＯ2Ｒ’の基（式中、Ｒ’は、水素またはアルキル基である）；であるか、あるいはフェニル基またはベンジル基であり、ここでそのフェニル基またはベンジル基は、所望により、ハロゲン、特にＦもしくはＣｌと、−ＮＯ2、−ＣＮ、ＣＦ3、アルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルおよびアルコキシとから選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができる；そして、
Ｒ29、Ｒ30、Ｒ31およびＲ32は、互いに独立して、水素；ハロゲン、特にＦもしくはＣｌ；−ＮＯ2；−ＣＮ；ＣＦ3；アルキル；アルコキシ基；フェニル基またはベンジル基、ここでそのフェニルまたはベンジル基は、ハロゲン、特にＦもしくはＣｌと、−ＮＯ2、−ＣＮ、ＣＦ3、アルキル、シクロアルキル、ヒドロキシルおよびアルコキシとから選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができる；または、式−ＳＯ2ＮＲ’’Ｒ’’’の基（式中、Ｒ’’およびＲ’’’は、互いに独立して、水素もしくはアルキル基であり、適切な場合、特にＦもしくはＣｌで置換されている）であり；
あるいは、Ｒ31およびＲ32は上記のように定義され、Ｒ29およびＲ30は、一緒になって、追加的な４員〜７員縮合環を形成し、ここでその縮合環は、芳香族であるかまたは部分的に飽和しているもしくは飽和していることができ、そしてその縮合環は、ハロゲン、特にＦもしくはＣｌと、−ＮＯ2、−ＣＮ、ＣＦ3および式−ＳＯ2ＮＲ’’Ｒ’’’の基（式中、Ｒ’’およびＲ’’’は、互いに独立して、水素またはアルキル基であり、適切な場合、特にＦもしくはＣｌで置換されている）とから選択される置換基で、１回または１回より多く、置換されていることができる］。
【０１２８】
好ましい態様において、式（ＶＩ）中のＲ27は、水素；Ｃ1-6アルキル基；フェニル基；ベンジル基；式−ＣＨ2ＣＯ2Ｒ’の基（式中、Ｒ’は、水素またはＣ1-6アルキル基であり、適切な場合、特にＦもしくはＣｌで置換されている）；式−ＣＨ2ＮＨ−Ｚの基（式中、Ｚは、フェニルまたはベンジル基であり、これらのフェニルまたはベンジル基は、ハロゲン、特にＦもしくはＣｌで、１回または１回より多く、置換されていることができる）；または、式ＣＨ2ＣＯ−Ｙ’’の基（式中、Ｙ’’は、少なくとも１個の窒素原子をヘテロ原子として含有する複素環式の６員単環式基であり、Ｃ1-6アルキル基またはフェニル基で、１回または１回より多く、置換されていることができる）である。Ｙ’’は、好ましくはピペリジニル基またはピペラジニル基である。
【０１２９】
その他の好ましい態様において、式（ＶＩ）中のＲ28は、水素、Ｃ1-6アルキル基、フェニル、ベンジル、または式−ＣＨ2ＣＯＯＨの基である。
その他の好ましい態様において、Ｒ29、Ｒ30、Ｒ31およびＲ32は、互いに独立して、水素、Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌ、ＮＯ2、ＣＮ、ＣＦ3またはＣ1-6アルキル（適切な場合、特にＦもしくはＣｌで置換されている）である。
【０１３０】
本発明に従って用いることができるとりわけ好ましいモジュレーターは、以下のものである：５，７−ジニトロ−１−メチル−１Ｈ−インドール−２，３−ジオン−３−（Ｏ−メチルオキシム）；５−ブロモ−７−ニトロ−１Ｈ−インドール−２，３−ジオン−３−オキシム；５−ブロモイサチン−３−オキシム；５，６−ジクロロ−１−メチルイサチン−３−オキシム；４，５−ジクロロイサチン−３−オキシム；４，５−ジクロロ−１−メチルイサチン−３−オキシム；Ｏ−メチル−４，５−ジクロロ−１−メチルイサチン−３−オキシム；ベンゾイサチン−３−オキシム；６，７−ジクロロイサチン−３−オキシム；Ｏ−メチル−６，７−ジクロロイサチン−３−オキシム；Ｏ−メチル−６，７−ジクロロ−１−メチルイサチン−３−オキシム；６，７−ジクロロ−１−メチルイサチン−３−オキシム；Ｏ−ｔ−ブチル−６，７−ジクロロイサチン−３−オキシム；Ｏ−（（４−フェニルピペラジン−１−イル）カルボニルメチル）−６，７−ジクロロイサチン−３−オキシム；６−フルオロ−７−メトキシイサチン−３−オキシム；Ｏ−（４−クロロベンジルアミノ）メチル−６，７−ジクロロイサチン−３−オキシム；６，７−ジフルオロイサチン−３−オキシム；６，７−ジメチルイサチン−３−オキシム；５，６−ジクロロイサチン−３−オキシム；Ｏ−カルボキシメチル−５−ブロモイサチン−３−オキシム；Ｏ−（エトキシカルボニルメチル）−５−ブロモイサチン−３−オキシム；Ｏ−（カルボキシメチル）−６，７−ジクロロイサチン−３−オキシム；Ｏ−（カルボキシメチル）−６，７−ジクロロイサチン−３−オキシム；６−クロロ−７−メチルイサチン−３−オキシム；６−フルオロ−７−メチルイサチン−３−オキシム。
【０１３１】
本発明に従って用いることができるその他のモジュレーターはゾキサゾラミンであり、これはｈＩＫ１の活性化剤として働く（Ｓｙｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ａｍ．Ｊ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７８：Ｃ５７０−Ｃ５８１）。
【０１３２】
本発明の意味の範囲内において、ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子である。とりわけ好ましいハロゲンは、ＦまたはＣｌである。
本発明の意味の範囲内において、アルキル基は、非分枝状または分枝状で一価の飽和炭化水素鎖である。炭化水素鎖は、好ましくは、１〜１２個の炭素原子（Ｃ1-12−アルキル）、特に１〜６個の炭素原子（Ｃ1-6−アルキル；低級アルキル）を含有し、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、第三級ペンチル、ヘキシルおよびイソヘキシルを含有する。さらにより好ましい態様では、アルキルはＣ1-4アルキル基であり、ブチル、イソブチル、第二級ブチルおよび第三級ブチルを含有する。とりわけ好ましい態様では、アルキルはＣ1-3アルキル基であり、特に、メチル、エチル、プロピルまたはイソプロピルであることができる。
【０１３３】
本発明の意味の範囲内において、シクロアルキル基は、環状アルキル基、好ましくは３〜７個の炭素原子を含有するもの（Ｃ3-7−シクロアルキル）であり、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルを含む。
【０１３４】
本発明の意味の範囲内において、アルコキシ基は‘アルキル−Ｏ−’基であり、ここで、アルキルは先に定義したとおりである。
本発明の意味の範囲内において、アミノ基は、第一級（−ＮＨ2）、第二級（−ＮＨ−Ｒ）または第三級アミノ基（−Ｎ−Ｒ’Ｒ’’）であることができ、ここでＲ’およびＲ’’は、互いに独立して、先に定義したとおりのアルキルである。
【０１３５】
本発明の意味の範囲内において、アシル基は、カルボキシル基またはアルキルカルボニル基であり、ここで、アルキルは先に定義したとおりである。好ましいアシル基の例は、カルボキシル、アセチルおよびプロピオニルである。
【０１３６】
本発明の意味の範囲内において、アルケニル基は、１個以上の二重結合を含有する炭素鎖であり、ジエン、トリエンおよびポリエンを含む。好ましい態様において、本発明のアルケニル基は、２〜６個の炭素原子を含有する（Ｃ2-6−アルケニル）。とりわけ好ましいアルケニル基は、エテニル；１，２もしくは２，３−プロペニル；または、１，２−、２，３−もしくは３，４−ブテニルである。
【０１３７】
本発明の意味の範囲内において、アルキニル基は、１個以上の三重結合を含有する炭素鎖を意味し、ジイン、トリインおよびポリインを含む。好ましい態様において、本発明の
アルキニル基は、２〜６個の炭素原子を含有する（Ｃ2-6−アルキニル）。とりわけ好ましいアルキニル基は、エチニル；１，２もしくは２，３−プロピニル；または、１，２−、２，３−もしくは３，４−ブチニルである。
【０１３８】
本発明の意味の範囲内において、アミド基は、式Ｒ’−ＣＯ−ＮＨ−またはＲ’−ＣＯ−Ｎ（アルキル）−の置換基であり、ここで、Ｒ’は、水素または上記のように定義されるアルキル基である。好ましいアミド基の例は、ホルムアミド、アセトアミドおよびプロピオンアミドである。
【０１３９】
本発明の意味の範囲内において、単環式または多環式アリール基は、単環式または多環式芳香族炭化水素基である。好ましいアリール基の例は、フェニル、ナフチルおよびアントラセニルである。
【０１４０】
本発明の意味の範囲内において、不飽和単環式または多環式基は、単環式または多環式アルキル基、すなわち単環式または多環式芳香族炭化水素鎖である。好ましい部分的飽和単環式基の例は、シクロペンタ−２，４−ジエン−１−イリデンである。
【０１４１】
本発明の意味の範囲内において、アラルキル基は、上記のように定義されるアリール基であって、そのアリール基が、上記のように定義されるアルキル基に連結しているものである。好ましいアラルキル基の例は、ベンジルである。
【０１４２】
本発明の意味の範囲内において、単環式または複素環式基は、１個以上のヘテロ原子を環構造内に含有する単環式または多環式化合物である。好ましいヘテロ原子は、窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）および硫黄（Ｓ）を含有する。１以上の環構造が、芳香族（すなわち、ヘテロアリール）であるか、または飽和もしくは部分的に飽和していることができる。好ましい単環式基は、５員および６員複素環式基を含有する。好ましい単環式複素環式基の例は、フラン−２−イル；フラン−３−イル；２−、４−または５−イミダゾリル；３−、４−、または５−イソオキサゾリル；１−、２−、３−ピリジニル；および１−または２−チエニルを含有する。好ましい飽和または部分的飽和単環式複素環式基の例は、１，３，５，６，２−ジオキサジアジニル；ピペラジニル；ピペリジニル；１，２−、１，３−または１，４−ピラニル；およびピロリジニルを含有する。好ましい芳香族複素環式基の例は、アクリジニル、カルバゾリル、インダゾリル、キノリニルまたはベンゾフラニルを含有する。
【０１４３】
本発明の意味の範囲内において、ヘテロアルキル基は、先に定義したとおりの単複素環式または多複素環式基であって、その複素環式基が、上記のように定義されるアルキル基に連結しているものを意味する。
【０１４４】
本発明に従って用いることができるとりわけ好ましいモジュレーターは、ｈＩＫ４活性化剤の１−ＥＢＩＯ（１−エチル−２−ベンゾイミダゾリノン）、ＤＣＥＢＩＯ（５，６−ジクロロ−１−エチル−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾイミダゾル−２−オン）のほか、ｈＩＫ１の活性化剤として働くベンゾオキサゾロン、クロルゾキサゾンおよびゾキサゾラミンである（Ｓｙｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７８：Ｃ５７０−Ｃ５８１）。これに加えて、ＷＯ００／３３８３４では、イサチン誘導体がｈＩＫ１の活性化剤として開示されている。例は、５−ブロモイサチン−３−オキシムおよび５，６−ジクロロ−１−メチルイサチン−３−オキシムである。
【０１４５】
ｈＩＫ４のとりわけ好ましい阻害剤は、カリブドトキシン(charybdotoxin)およびクロトリマゾールである（Ｋｈａｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１４８３８−１４８４９）。ＷＯ９９／２５３４７には、ｈＩＫ１の阻害剤として働く追加的物質が開示されている。例は、イミダゾール誘導体のミコナゾール、エコナゾール、ブトコナゾール、オキシコナゾール、スルコナゾールおよびチオコナゾール；トリアゾール誘導体のフルコナゾール、テルコナゾールおよびイトラコナゾール；ならびに、ニトロイミダゾール誘導体のメトロニダゾール、チニダゾール、ニモラゾール、オルニダゾールおよびベンズニダゾールである。これに加えて、その文書には、１，４−ジヒドロピリジン−３，５−ジカルボン酸の誘導体、例えば、エチルメチル  １，４−ジヒドロ−２，６−ジメチル−４−（２−ニトロフェニル）ピリジン−３，５−ジカルボキシレート、ならびに、クロトリマゾール誘導体、例えば、２−クロロフェニル−４−ヒドロキシフェニルフェニルメタンが、開示されている。
【０１４６】
本発明に従って用いられるモジュレーターは、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患、特に創傷治癒障害、とりわけ好ましくは乾癬を、診断および／または予防および／または処置するために、用いることができる。障害のあるケラチノサイト活性に関連する好ましい疾患は、接触皮膚炎、アトピー性湿疹、白斑症、過角化症、光線性角化症、肥厚性瘢痕、ケロイド、黒子、そばかす、および老人性皮膚である。とりわけ好ましい疾患は、創傷、例えば、正常に治癒する創傷および治癒しにくい創傷、特に、潰瘍と、そしてまた乾癬である。
【０１４７】
本発明はまた、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患、特に創傷治癒障害、とりわけ好ましくは乾癬を処置するための医薬の製造方法に関する。その方法では、本発明に従って用いることができる少なくとも１種の核酸、本発明に従って用いることができる少なくとも１種のポリペプチド、本発明に従って用いることができる少なくとも１種の抗体、および／または本発明に従って用いることができる少なくとも１種のモジュレーターを、適切な添加剤および補助的物質と組み合わせる。
【０１４８】
乾癬の場合、すなわち、本発明に従って、イオンチャネルの活性のモジュレーター、例えば、イオンチャネルの活性の活性化剤またはイオンチャネルの活性の阻害剤を、使用することが好ましい。モジュレーターの例は、ＤＣＥＢＩＯ、ゾキサゾラミン、クロルゾキサゾン、１−ＥＢＩＯおよび特異的抗体である。これに加えて、乾癬の場合、本発明に従って、ＩＫチャネルの量のダウンレギュレーションをもたらす核酸、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡまたはリボザイムが好ましい。
【０１４９】
創傷治癒、特に潰瘍の場合、ＩＫチャネルの量を、例えば、本発明に従って用いることができるポリペプチドをコードする核酸を用いて遺伝子治療的処置を実行することにより、増加させることが好ましい。
【０１５０】
本発明はさらに、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患、特に創傷治癒障害および／または乾癬、とりわけ好ましくは乾癬を処置するために、この方法により製造された医薬に関する。その医薬は、配列番号３もしくは配列番号４で表される少なくとも１種のポリペプチドか、この配列をコードする１種の核酸か、本発明に従って用いることができる少なくとも１種の抗体か、あるいは、本発明に従って用いることができる少なくとも１種のモジュレーターを、適切な場合は、適した添加剤および補助的物質と一緒に、含んでなる。
【０１５１】
本発明はさらに、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患を処置するために、この医薬を使用することに関する。
障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患は、従来の手法、例えば、本発明に従った医薬を含有する包帯、絆創膏、湿布またはゲル剤を用いて、処置することができる。このように、適切な添加剤または補助的物質、例えば、生理的食塩液；脱塩水；安定剤；プロテイナーゼ阻害剤；ゲル製剤、例えば、白色ワセリン、低粘性パラフィンおよび／または蜜蝋など、を含んでなる医薬を、局所的または局部的に適用して、疾患に対する影響を迅速かつ直接的に発揮させることが可能である。さらに、本発明に従った医薬は、適切な場合、リポソーム複合体または金粒子複合体の形で、皮膚表面の患部に同様に局所的または局部的に適用することができる。これに加えて、その処置は、本発明に従った医薬が、時間で制御された方式で放出されるのを可能にする、経皮吸収治療システム（ＴＴＳ）を用いて達成することができる。ＴＴＳは、例えば、ＥＰ０９４４３９８Ａ１、ＥＰ０９１６３３６Ａ１、ＥＰ０８８９９２３Ａ１およびＥＰ０８９２４９３Ａ１に、開示されている。しかしながら、本発明に従った医薬での処置はまた、経口剤形、例えば錠剤またはカプセル剤を用いるか、粘膜、例えば、鼻または口腔の粘膜を経由させるか、あるいは、皮下に埋め込まれるディスポジトリー(dispository)の形で、達成することができる。
【０１５２】
医薬の好ましい態様は、ケラチノサイトの活性を低下させることを意図して、乾癬の予防および／または処置に用いられる。これに関連するとりわけ好ましい態様は、本発明に従って、適切なモジュレーターおよび／または抗体を用いて、ｈＩＫ１チャネルの（電気生理学的）活性を阻害することである。
【０１５３】
とりわけ好ましい態様は、本発明に従って用いることができるモジュレーターを含んでなる薬物を投与することである［脱文］そのモジュレーターの活性形の形で達成することができる。好ましくは、所望により医薬的に許容しうる塩の形であってもよいモジュレーターの活性形を含んでなる組成物を、１種以上の適切な添加剤および補助的物質、例えば、アジュバント、担体材料および緩衝溶液、ならびに希釈剤、例えば、生理的食塩液；脱塩水；安定剤；プロテイナーゼ阻害剤；ゲル製剤、例えば、白色ワセリン、低粘性パラフィンおよび／または蜜蝋；など（これらは、創傷治癒に対する影響を迅速かつ直接的に発揮させるために、局所適用にとりわけ適している）と一緒に、投与する。
【０１５４】
好ましい態様は、ｈＩＫ１チャネルポリペプチドまたはその機能性変異体に対して向けられた抗体または抗体フラグメントの、本発明に従った医薬としての使用である。
その他のとりわけ好ましい態様は、本発明に従って、ｈＩＫ１ポリペプチドをコードする核酸の発現を減少させることである。
【０１５５】
本発明に従った医薬としての核酸の好ましい態様は、アンチセンスヌクレオチド（上記参照）およびリボザイム（ＷＯ９９／１５７０３）、そしてまた干渉性低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とよばれるものによって表される。後者は、配列特異的に、かつ転写後に、遺伝子発現をダウンレギュレーションする二本鎖ＲＮＡ分子である（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−４９８）。
【０１５６】
医薬の他の好ましい態様は、創傷治癒障害を予防および／または処置するために、例えば、本発明に従ったポリペプチドまたはそのポリペプチドをコードする核酸（１以上）を投与することにより用いられる。
【０１５７】
裸の形か、遺伝子治療に有効な上記ベクターの１種の形か、またはリポソームもしくは金粒子と複合体化している形にある、記載されている核酸を含んでなる医薬は、ヒトにおける遺伝子治療の実施での使用に特に適している。医薬賦形剤は、例えば、好ましくは、約６．０〜８．０、好ましくは約６．８〜７．８のｐＨ、特に約７．４のｐＨおよび／または約２００〜４００ｍＯｓｍ／Ｌ、好ましくは約２９０〜３１０ｍＯｓｍ／Ｌのモル浸透圧濃度を有する生理学的緩衝溶液である。これに加えて、その医薬賦形剤は、適切な安定剤、例えば、ヌクレアーゼ阻害剤、好ましくはＥＤＴＡなどの金属イオン封鎖剤、および／または当業者が熟知しているその他の補助的物質を、含んでなることができる。
【０１５８】
記載されている核酸、適切な場合、上記でより詳細を記載しているウイルスベクターの形であるか、またはリポソーム複合体もしくは金粒子複合体としての核酸は、習慣的に、創傷領域に局所または局部的に投与する。
【０１５９】
本発明に従った医薬の好ましい態様は、ポリペプチドそれ自体を、適切な添加剤または補助的物質、例えば、生理的食塩液；脱塩水；安定剤；プロテイナーゼ阻害剤；ゲル製剤、例えば、白色ワセリン、低粘性パラフィンおよび／もしくは蜜蝋；などと一緒に投与して、創傷治癒に対する影響を迅速かつ直接的に発揮させることである。
【０１６０】
本発明に従った医薬の他の好ましい態様は、適切な担体材料、例えば、デキストランマトリックス（ＵＳ５９８８８８参照）のような生体適合性材料で構成されるマイクロキャリアとよばれるものを用いて、本発明に従ったポリペプチドを発現する自己由来および同種異系細胞を移植することである。
【０１６１】
本発明はさらに、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患、特に創傷治癒障害および／または乾癬を診断するための診断薬の製造方法に関する。その方法は、配列番号１および２で表される少なくとも１種の核酸か、配列番号３および４で表される少なくとも１種のポリペプチドか、または本発明に従った少なくとも１種のモジュレーターを、適切な場合は、適した添加剤および補助的物質と一緒に用いることを特徴とする。
【０１６２】
本発明はまた、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患、特に創傷治癒障害および／または乾癬を診断するための診断薬に関する。その診断薬は、配列番号１および２で表される少なくとも１種の核酸か、配列番号３および４で表される少なくとも１種のポリペプチドか、または本発明に従った少なくとも１種のモジュレーターを、適切な場合は、適した添加剤および補助的物質と一緒に、含んでなる。
【０１６３】
例えば、本発明に従い、上記核酸の１種を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（実施例３、４、５；例えばＥＰ０２００３６２に従ったＰＣＲ診断）、または実施例２でより詳細に記載するＲＮａｓｅプロテクションアッセイに基づき、診断薬を調製することが可能である。これらの試験は、上記核酸と、相補的対向鎖(counterstrand)、通常は対応するｍＲＮＡとの、特異的ハイブリダイゼーションに基づいている。これに関連して、上記核酸を、例えばＥＰ００６３８７９に記載されているように、修飾することもできる。好ましくは、適切な試薬を用いる周知の方法を使用して上記ＤＮＡフラグメントを、例えば、α−Ｐ32−ｄＣＴＰを用いて放射性標識するか、または、ビオチンもしくはジゴキシゲニンを用いて非放射性標識した後、これを、単離したＲＮＡ、好ましくは、例えばセルロースまたはナイロンで構成される適切な膜に予め結合させてあるもの、と共にインキュベートする。分析したＲＮＡの量が各組織試料で同じである場合、結果として、プローブによって特異的に結合しているｍＲＮＡの量を決定すること、および、これを健常組織に由来するｍＲＮＡの量と比較することが可能である。あるいは、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いて、組織切片中のｍＲＮＡの量を決定することもできる（例えば、Ｗｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６８９６−９００参照）。
【０１６４】
したがって、本発明に従った診断薬はまた、障害のあるケラチノサイト活性に関連する考えうる疾患の確実な診断を可能にするために、対応する遺伝子の発現強度に関して組織試料をｉｎ  ｖｉｔｒｏで具体的に測定するのに用いることができる（実施例２、３、４および５）。そのような方法は、障害の早期予測にとりわけ適している。これにより、治療を予防的に用い、素因を分析することが可能になる。したがって、創傷を受けた後に創傷治癒障害を示した老年マウスの無傷皮膚では、対照マウスの無傷皮膚、特に若年マウスの無傷皮膚と比較して、遺伝子ｍＩＫ１の発現が、創傷のない状態においてすでに増加している。このように、ｍＩＫ１遺伝子が発現する強度により、無傷の組織における創傷治癒障害をなお予測することが可能になる（実施例３、表２）。
【０１６５】
本発明に従ったその他の診断薬は、本発明に従って用いることができるポリペプチド、または上記でより詳細に記載しているその免疫原性部分を含んでなる。例えば、ポリペプチドまたはその一部であって、好ましくは、例えばニトロセルロースもしくはナイロンで構成されている固相に結合しているものを、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、調査する体液、例えば創傷分泌物と接触させて、このようにして例えば自己免疫抗体との反応を可能にして調べることができる。その後、抗体／ペプチド複合体を、例えば標識した抗ヒトＩｇＧ抗体または抗ヒトＩｇＭ抗体を用いて、検出することができる。標識は、例えば、呈色反応を触媒する酵素、例えばペルオキシダーゼである。その後、呈色反応を用いて、存在する自己免疫抗体の存在および量を、簡単かつ迅速に検出することができる。
【０１６６】
その他の診断薬は、本発明に従った抗体それ自体を含んでなる。これらの抗体を用いて、例えば、組織試料を簡単かつ迅速に調査して、当該ポリペプチドが、高められた量で存在するか否かを検出し、それにより、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患が存在しうることの指標を得ることができる。この場合、本発明に従った抗体を、例えば、すでに上記したような酵素で標識する。それにより、特異的抗体／ペプチド複合体を、酵素的呈色反応を通して、簡単に、それと同時に迅速に、検出することができる。
【０１６７】
本発明に従ったその他の診断薬は、プローブ、好ましくはＤＮＡプローブ、および／またはプライマーを含んでなる。このことにより、本発明に従って用いることができる核酸を、例えば、それらを遺伝子ライブラリー、例えば創傷特異的遺伝子ライブラリーから単離して得るのに適したプローブを使用することの、さらなる可能性が開かれる（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，第８章，８．１〜８．８１頁，第９章，９．４７〜９．５８頁および第１０章，１０．１〜１０．６７頁参照）。
【０１６８】
適切なプローブの例は、約１００〜１０００ヌクレオチドの長さを有する、好ましくは約２００〜５００ヌクレオチドの長さを有する、特に約１００〜４００ヌクレオチドの長さを有するＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントである。その配列は、配列表の配列番号３もしくは配列番号４で表されるポリペプチド配列もしくはその変異体から、および／または、指定のデータベース登録［脱文］配列番号１もしくは配列番号２で表されるｃＤＮＡ配列もしくはその変異体を用いて、導き出すことができる（実施例２も参照のこと）。
【０１６９】
あるいは、導き出した核酸配列を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応のためのプライマーとして用いるのに適したオリゴヌクレオチドを、合成することが可能である。これらのプライマーは、本発明に従って用いることができる核酸もしくはその一部を、ｃＤＮＡ、例えば皮膚特異的ｃＤＮＡから、単離して増幅するのに用いることができる（実施例２、３、４および５）。適切なプライマーの例は、約１０〜１００ヌクレオチドの長さを有する、好ましくは約１０〜５０ヌクレオチドの長さを有する、特に約１０〜３０ヌクレオチドの長さを有するＤＮＡフラグメントである。その配列は、配列番号３〜配列番号４で表されるポリペプチドから、および／または、配列番号１もしくは配列番号２で表されるｃＤＮＡ配列を用いて、導き出すことができる（実施例３、４および５）。
【０１７０】
本発明はまた、障害のあるケラチノサイト活性に関係する疾患、特に創傷治癒障害および／または乾癬に関連する薬理学的活性物質を見いだすための試験の制作方法に関する。その方法は、試験を制作するために、配列番号１および２で表される少なくとも１種の核酸か、配列番号３および４で表される少なくとも１種のポリペプチドか、または本発明に従った少なくとも１種の抗体もしくは少なくとも１種のモジュレーターを（１以上）、適切な場合は適した添加剤および補助的物質と一緒に用いることを、特徴とする。
【０１７１】
本発明の意味の範囲内において、‘薬理学的活性物質’という用語は、適した条件下で、適切な場合は適した添加剤および補助的物質と一緒に、上記核酸、ポリペプチドまたは抗体と相互作用することができる、分子、化合物および／または組成物ならびに物質混合物のすべてを意味するものとして理解される。考えうる薬理学的活性物質は、単純な化学的有機もしくは無機分子または化合物であり、それらはまた、ペプチド、タンパク質またはその複合体を含有することができる。それらの相互作用に起因して、薬理学的活性物質は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、核酸、ポリペプチドまたは抗体の機能（１以上）に影響を発揮するか、あるいは上記核酸、ポリペプチドまたは抗体に単に結合するか、あるいは、それらと共に、共有結合的または非共有結合的に、他の相互作用を開始することができる。特に、薬理学的活性物質は、上記チャネル活性をモジュレートすることができる物質である。
【０１７２】
これに加えて、本発明は、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患に関連して薬理学的に活性な物質を同定するための試験を含有する。その試験には、本発明に従った少なくとも１種の核酸、少なくとも１種のポリペプチドまたは少なくとも１種のモジュレーターが、適切な場合は適した添加剤および補助的物質と一緒に、含まれる。
【０１７３】
適した系は、例えば、表皮または皮膚細胞、特にケラチノサイトを、選択マーカー遺伝子および上記核酸を含有する発現ベクターと共に、安定して形質転換することにより、作製することができる。この方法では、細胞内での上記核酸の発現を、ｉｎ  ｖｉｖｏでの病理学的に障害のある発現に対応するように変更する。この目的のために、本発明に従って用いることができる核酸を含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを、使用することも可能である。したがって、これらの系では、本出願書類中に記載するような障害のある生理学的過程において遺伝子の発現挙動を熟知するのに、とりわけ有利である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞の病理学的挙動は、この方法でしばしば模倣することができ、細胞の正常な挙動を回復させかつ治療的可能性を保有する物質の探索が可能である。
【０１７４】
例えば、一般に入手可能なＨａＣａＴ細胞、および発現ベクターｐＣＭＶ４（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：８２２２−９）は、これらの試験系に適している。これに関連して、アンチセンスＲＮＡとのハイブリダイゼーションにより、対応する遺伝子のｍＲＮＡの細胞中の機能性濃度が上昇または低下するように、本発明に従って用いることができる核酸を、センス指向(orientation)またはアンチセンス指向のいずれかで発現ベクターに組み込むことができる。形質転換および安定なトランスフォーマントを選択した後、培地中の細胞は、一般に、対照細胞と比較して変更が生じている増殖挙動、移動挙動および／または分化挙動を示す（１以上）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのこの挙動は、生物の再生過程における対応する遺伝子の機能としばしば相関し（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｒｅｓ．２８９：３５２−９；Ｍｉｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １４：１５５５５−６１；Ｃｈａｒｖａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｅｘｐ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ７：１８４−９０；Ｍｙｔｈｉｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０：１７０７−１３；Ｗｅｒｎｅｒ，１９９８，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．９：１５３−６５）、実施しやすい簡単な試験を用いて検出することができ、その結果、これに基づき、薬理学的活性物質を同定するための試験系を構築することが可能である。したがって、細胞の増殖性挙動を、例えば、標識ヌクレオチドを細胞のＤＮＡに組み入れることによるか（例えば、ｄｅ  ＦｒｉｅｓおよびＭｉｔｈｕｈａｓｈｉ，１９９５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．９：８９−９５；ＰｅｒｒｏｓおよびＷｅｉｇｈｔｍａｎ，１９９１，Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆ．２４：５１７−２３；ＳａｖｉｎｏおよびＤａｒｄｅｎｎｅ，１９７５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８５：２２１−６参照）、細胞を特異的染料で染色することによるか（Ｓｃｈｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １６７：１−１３）、または免疫学的方法を用いることにより（Ｆｒａｈｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２１１：４３−５０）、非常に迅速に立証することができる。移動は、移動指数試験（Ｃｈａｒｖａｔ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照）および比較試験系（Ｂｅｎｅｓｔａｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｎｅｔ．２０：１０９−１９，Ｊｕｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １６０：７３−９）を用いて、容易に検出することができる。適切な分化マーカーの例は、ケラチン６、１０および１４と、ロリクリンおよびインボルクリンであり（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ，Ｉｎｖｅｓｔ，Ｄｅｒｍａｔｏｌ，９８：３４３−５０）、それらの発現は、例えば、一般に入手可能な抗体を用いて容易に検出することができる。
【０１７５】
その他の適切な試験系は、ツーハイブリッド系とよばれるものを用いた、相互作用の同定に基づく（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｔｅｒｇｌａｎｚ，１９９４，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０，２８６−２９２；ＣｏｌａｓおよびＢｒｅｎｔ，１９９８  ＴＩＢＴＥＣＨ，１６，３５５−３６３）。この試験では、細胞を、本発明に従って用いることができるポリペプチドと転写因子（Ｇａ１４またはＬｅｘＡなど）からのＤＮＡ結合ドメインとで構成される融合タンパク質を発現させる発現ベクターで形質転換する。これに加えて、形質転換細胞はレポーター遺伝子を含有し、そのプロモーターは、対応するＤＮＡ結合ドメインと結合するための部位を含有する。既知もしくは未知のポリペプチドと、活性化ドメイン、例えばＧａ１４もしくはヘルペスウイルスＶＰ１６からのものとで構成される第２の融合タンパク質を発現させる、その他の発現ベクターを形質転換することにより、その第２の融合タンパク質が本発明に従って用いることができるポリペプチドと相互作用する場合、レポーター遺伝子の発現を大幅に増加させることができる。この発現の増加を、例えば、第２の融合タンパク質を構築するために再生組織からｃＤＮＡライブラリーを調製することにより、新規な薬理学的活性物質の同定に用いることができる。これに加えて、この試験系は、本発明に従って用いることができるポリペプチドと既知の薬理学的活性物質との相互作用を阻害する物質のスクリーニングに、用いることができる。これらの物質は、本発明に従って用いることができるポリペプチドと薬理学的活性物質とを発現させる細胞において、レポーター遺伝子の発現を減少させる（ＶｉｄａｌおよびＥｎｄｏｈ，１９９９，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７：３７４−８１）。このようにして、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患を処置するために用いることができる新規活性化合物を、迅速に同定することが可能である。
【０１７６】
本発明に従って用いることができるポリペプチドの薬理学的活性物質は、ＳＥＬＥＸなどの選択法を用いて単離した核酸であることもできる（Ｊａｙａｓｅｎａ，１９９９，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５：１６２８−５０；ＫｌｕｇおよびＦａｍｕｌｏｋ，１９９４，Ｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．２０：９７−１０７；Ｔｏｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，ＵＳ５５８９２８１参照）。ＳＥＬＥＸ法では、典型的に、異なる一本鎖ＲＮＡ分子の大きなプールから、高親和性のポリペプチドに結合する分子（アプタマー）を、繰り返し増幅および選択することにより単離する。アプタマーは、それらの鏡像形、例えばＬ−リボヌクレオチドとして、合成および選択することもできる（Ｎｏｌｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１１１６−９；Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１１１２−５）。このようにして単離した形は、自然に発生するリボヌクレアーゼにより分解されず、したがってよりすぐれた安定性を保有するという利点を有する。
【０１７７】
本発明はまた、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患に関連して分析を行うための、支持材料上に固定されているアレイ(array)の作製方法に関する。その方法では、本発明に従った少なくとも１種の核酸、少なくとも１種のポリペプチド、または少なくとも１種の抗体が、作製に用いられる。
【０１７８】
そのようなアレイを、光に不安的な保護基と組み合わせてスポッティング(spotting)、印刷または固相化学により作製する方法は、例えば、ＷＯ８９／１０９０７７、ＷＯ９０／１５０７０、ＷＯ９５／３５５０５およびＵＳ５７４４３０５に開示されている。
【０１７９】
本発明はさらに、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患、特に創傷治癒障害および／または乾癬に関連して分析を行うための、支持材料上に固定されているアレイに関する。そのアレイは、本発明に従った少なくとも１種の核酸および／または少なくとも１種のポリペプチドおよび／または少なくとも１種の抗体を含有していることを、特徴とする。本発明に従ったアレイは、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患、特に創傷治癒障害および／または乾癬に関連して分析を行うために、用いることができる。
【０１８０】
本発明はさらに、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患、特に創傷治癒障害および／または乾癬に関連して分析を行うための、ＤＮＡチップおよび／またはタンパク質チップの作製方法に関する。その方法は、配列番号１および２で表される少なくとも１種の核酸か、配列番号３および４で表される少なくとも１種のポリペプチドか、または上記のような少なくとも１種の抗体を作製に用いることを、特徴とする。
【０１８１】
そのようなＤＮＡチップおよび／またはタンパク質チップを、光に不安的な保護基と組み合わせてスポッティング、印刷または固相化学により作製する方法は、例えば、ＷＯ８９／１０９０７７、ＷＯ９０／１５０７０、ＷＯ９５／３５５０５およびＵＳ５７４４３０５に開示されている。
【０１８２】
本発明はさらに、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患、特に創傷治癒障害および／または乾癬に関連して分析を行うための、ＤＮＡチップおよび／またはタンパク質チップに関する。そのＤＮＡチップおよび／またはタンパク質チップは（１以上）、配列番号１と２で表される少なくとも１種の核酸、および／または配列番号３と４で表される少なくとも１種のポリペプチド、および／または本発明に従った少なくとも１種の抗体を含有していることを、特徴とする。ＤＮＡチップは、例えばＵＳ５８３７８３２に開示されている。
【０１８３】
本発明はさらに、指標および治療のための医薬、ここでその医薬は、本発明に従って用いることができる核酸、本発明に従って用いることができるポリペプチド、または本発明に従って用いることができるモジュレーター、および、適切な場合は、適した添加剤または補助的物質を含んでなる；ならびに、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患、特に創傷治癒障害および／または乾癬を処置するためのそのような医薬の製造方法、ここでその方法では、配列番号１および２で表される本発明に従って用いることができる核酸か、配列番号３および４で表される本発明に従って用いることができるポリペプチドか、または本発明に従って用いることができるモジュレーターを、医薬的に許容しうる賦形剤と共に製剤する；に関する。
【０１８４】
すべての請求項の文言を、本明細書の記載中に参考として援用する。
以下の表および図、ならびに以下の実施例は、本発明をより詳細に説明することを意図したものにすぎず、これを限定するものではない。
表
表１は、本発明に従って用いることができるｈＩＫ１ポリペプチドおよび核酸、ならびにそれらのデータベース登録番号を列挙する。
【０１８５】
表２は、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患の一例として、マウスにおける異なる創傷治癒状態に関連づけてＴａｑＭａｎ分析により決定した、ｍＩＫ１発現の差次的調節(differential regulation)を示す。
【０１８６】
表３は、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患の一例として、創傷治癒に関連づけてＴａｑＭａｎ分析により決定した、ｍＩＫ１発現の差次的調節の速度論を示す。
表４は、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患の一例として、ヒトにおける２種の異なる創傷治癒（正常創傷治癒および潰瘍）においてＴａｑＭａｎ分析により決定した、ｍＩＫ１発現の差次的調節を示す。
【０１８７】
表５は、ＴａｑＭａｎ分析により決定した、ヒトの異なる器官におけるｈＩＫ１の発現プロフィールを示す。
ｍＩＫ１およびｈＩＫ１のポリペプチド配列、ならびにそれらをコードする核酸は、配列番号１〜配列番号４に表されているとおりである。
【０１８８】
実施例に用いたオリゴヌクレオチドおよびポリペプチドは、配列番号５〜配列番号１３に表されているとおりである。
【実施例】
【０１８９】
実施例１：中コンダクタンス型カルシウム依存性カリウムチャネルｈＩＫ１は、ＡＴＰ、ブラジキニンまたはヒスタミンでの刺激後、１−ＥＢＩＯでモジュレートされた長期間持続するケラチノサイトの過分極を仲介する。
【０１９０】
創傷治癒に特異的なシグナルの形質導入に実質的に関係するイオンチャネルを同定するために、ＨａＣａＴ細胞を電気生理学的に調査した。抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン、１００U／ｍＬ）を加えておいた、１０％  ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含有するＤＥＭ中で、ＨａＣａＴケラチノサイトを繁殖させた。Ｃａ2+の最終濃度は、１．８ｍＭであった。その細胞を、コンフルエントな細胞培養が発達するまでインキュベートした；その後、培地を標準的浴溶液(standard bath solution)（ＳＢＳ；１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ；２ｍＭ  ＣａＣｌ2；２ｍＭ  ＭｇＣｌ2；２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＨＥＰＥＳ；１０ｍＭ  Ｄ−グルコース；ｐＨ  ７．４）と取り替え、皿を倒立顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ，Ｚｅｉｓｓ）で検査した。パッチピペットを、２工程引取法（two-step pulling method）を用いて、水平引取装置（ＤＭＺ、Ｚｅｉｔｚ）でボロシリケート製の小管から作製した。その後、そのピペットに、１３５ｍＭのグルコン酸カリウム、１０ｍＭのＫＣｌ、１．６ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、０．７３ｍＭのＣａＣｌ2、１．０３ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＥＧＴＡ、１４ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＮａＨＥＰＥＳおよび１００ｍｇのナイスタチン／ｍＬを含有し；ｐＨ  ７．２である溶液を満たした（溶液中のＣａ2+活性＝１０-7Ｍ）。これらのパッチピペットの抵抗は、その浴中で５〜８ＧΩであった。そのＧΩ範囲での密封を作り出した後（典型的には１．５〜２ＧΩ）、増幅器を電流クランプモードに切り換えた。膜電位は３５分以内に安定値に達した。Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００増幅器をＴＬ−１  Ｌａｂｍａｓｔｅｒ  ＩｎｔｅｒｆａｃｅおよびＡＸＯＴＡＰＥソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）と組み合わせて用いて、電気生理学的シグナルを記録し、増幅し、デジタル化した。統計的分析（Ｂｏｎｆｅｒｒｉ試験後比較(post-test comparison)を伴う一方向ＡＮＯＶＡ）を、Ｇｒａｐｈｐａｄ  ｐｒｉｓｍ  ２．０を用いて実施した。
【０１９１】
‘ケージ化ＩＰ3’（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の閃光分解により細胞内Ｃａ2+濃度が上昇した実験では、パッチクランプ記録を、１２０ｍＭのグルコン酸カリウム、２０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＮａＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＮａ2ＡＴＰ、０．３ｍＭのＮａＧＴＰ（ｐＨ  ７．２）および１０〜１０ｍＭの‘ケージ化ＩＰ3’を含有するピペット溶液を用いて、ホールセル配置(whole-cell configuration)で実施した。ホールセル記録の５〜７分後、顕微鏡の落射蛍光口に接続したキセノンアーク灯（７５Ｗ；励起フィルター；３３０±４０ｎｍ）を用いて発生させたＵＶ光の閃光により、ＩＰ３を放出させた。ＵＶ光ビームを、４０倍の位相差対物レンズによりケラチノサイト上に集中させた。閃光の持続期間（１ｓ）を、Ｕｎｂｌｉｔｚシャッター（Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ａｓｓｏｃ．）を用いて設定した。
【０１９２】
細胞をインキュベートした溶液全体を交換した実験では、記録チャンバーの体積を１ｍＬに低減させるために、いくつかの内向き流束ラインと１本の外向き流束ラインを保有する円錐形プレキシグラスホルダーを培養皿中に置いた。液体の流入は重力依存性であるので、電磁バルブで制御した。流出は、真空ポンプを用いて陰圧をかけることにより達成した。視覚的に観察しつつ、遠隔制御された磁気制御Ｙ管系（外向き流束管の直径：１００μｍ）を用いて調査中のケラチノサイトに物質を直接加えた。
【０１９３】
電気生理学的記録を、有孔パッチを用いて、コンフルエントな単層に成長していたＨａＣａＴ細胞で実施した。電流固定モードにおいて、ケラチノサイトの平均膜電位は、制御された条件下で−４２±１ｍＶであった（ｎ＝７６）。ＨａＣａＴ細胞をＡＴＰ（１〜１０００μＭ）で潅流すると、膜電位に二相性の変化が生じ、この変化は、短期間の一過性脱分極と、これに続く顕著で長時間持続する過分極からなっていた（図１Ａ）。ＡＴＰ濃度が≧１０μＭのとき、強い過分極はＡＴＰの添加後少なくとも５分間持続し、一部のケラチノサイトでは、過分極がさらに観察期間の全期間中（最長２０分間）維持された。この観察は、ＡＴＰの濃度における変化が、膜電位に、したがってケラチノサイトの活性に、長期間持続する変化をもたらすことを実証している。
【０１９４】
１μＭのＡＴＰを添加した後の過分極は、溶液の洗い出しにより迅速に反転しうる過程を表していた（ｎ＝９）。１０μＭのＡＴＰを添加した場合、３０±２ｍＶの過分極（ｎ＝２８）が観察された。ケラチノサイトにブラジキニン（１０μＭ、ｎ＝３）またはヒスタミン（１００μＭ、ｎ＝４）を加えると、量的および速度論的に事実上同一の応答が測定された。これは、物質ＡＴＰ、ヒスタミンおよびブラジキニンが、同じエフェクター系を調節することを示している（図１Ｂ）。
【０１９５】
３種の細胞外メディエーターはすべて、ケラチノサイトにおけるホスホイノシチド代謝を刺激する能力を有することが公知であるので（Ｔａｌｗａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．９３：２４１−２４５；Ｐｉｌｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：４２−５１；Ｒｏｓｅｎｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｒｅｓ．２８５：３９３−３９６）、ＩＰ3の形成とこれに続く細胞質ゾルＣａ2+濃度の上昇が、シグナル伝達経路の一部であるか否かを決定するための調査を実施した。これを行うために、‘ケージ化−ＩＰ3’（１０〜１００μＭ）を入れておいたケラチノサイトを用いて、ホールセル記録を実施した。調査した細胞のすべて（ｎ＝７）において、閃光分解により‘ケージ化−ＩＰ3’が突然ＩＰ3に変換されると、迅速な一過性脱分極と、これに続く過分極が起こることが、観察された（図１Ｃ）。ＩＰ3に誘導された二相性の電圧変化は、１μＭのＡＴＰを加えた後に観察される電圧変化と、非常に正確に符合していた。３種のアゴニスト、すなわちＡＴＰ、ヒスタミンおよびブラジキニン、ならびにＩＰ3により引き起こされる電気生理学的応答間の著しい類似性は、膜電圧における二相性変化が、ＩＰ3−感受性貯蔵物からのＣａ2+の流動化により媒介されたことを示唆している。
【０１９６】
３種の細胞外媒体ならびにＩＰ3に媒介されるシグナル経路は、他のシグナルのカスケードも活性化することができうるので、アデニルシクラーゼ（ＡＣ）またはプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の刺激が、ＡＴＰに媒介される電気生理学的応答を模倣するかまたはそれに影響を与えるかを決定するために、調査を実施した。
【０１９７】
ＨａＣａＴ細胞をＡＣ活性化剤のフォルスコリン（１０μＭ）で３〜１０分間前処理すると、静止電位およびＡＴＰ添加後（ｎ＝５）に観察される電圧変化のいずれに対しても、作用はみられなかった。ＰＫＣをホルボールエステルＰＭＡ（６０ｎｇ／μＬ）で刺激すると−３２±２ｍＶの緩慢な脱分極が起こったが、ＡＴＰの作用に対する影響はなかった（ｎ＝４）。ＰＫＣをカルホスチン(calphostin)Ｃ（５０ｎＭ）で阻害すると、今度は−５８±３ｍＶの弱い過分極がもたらされたが、同様に、電圧においてＡＴＰが媒介する変化に対する作用はなかった。
【０１９８】
カルシウム依存性カリウムチャネルは、この顕著で長期間持続する変化を引き起こしうるものの候補として考えられる。この変化は、シグナル分子のＡＴＰ、ヒスタミンおよびブラジキニンでの刺激後に、膜電位においてはじめて実証された。過分極をもたらすイオンチャネルを同定するために、ＡＴＰに媒介される電気生理学的作用に対するさまざまなＫ+遮断薬の影響の調査を実施した。カリブドトキシン（ＣｈＴｘ；Ａｌｏｍｏｎｅ  Ｌａｂｓ）は、ＡＴＰに媒介される過分極の用量依存性の阻害を引き起こした。図２Ａが示すように、ＣｈＴｘ（１０〜１００ｎＭ、ｎ＝１５）を添加すると、迅速な脱分極の再分極が遅延し、過分極が妨げられた。ＣｈＴｘを１００ｎＭの濃度で用いたとき（ｎ＝４）、再分極は完全に妨げられ、膜電位は、ＡＴＰを添加している間は脱分極されたプラトーのままであった。１μＭのクロトリマゾール（ｎ＝３；図２Ｂ）で、同じ作用が観察された。ＡＴＰに媒介される過分極を測定した後にＣｈＴｘ（１００ｎＭ）を加えた場合、ＡＴＰがなお存在してるにもかかわらず、過分極の完全な逆転が観察された（ｎ＝２；図２Ｃ）。試験したその他のＫ＋チャネル遮断薬（ＴＥＡ、Ｂａ2+およびベラパミル）はどれも、ＡＴＰでの処理中のプラトーに類似の脱分極を引き起こさなかった。末端が分化しているケラチノサイトにおいてＫ+流を阻害するベラパミル（１０〜１００μＭ）（Ｍａｕｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍ．，１０８：８６４−８７０）は、ＡＴＰの過分極作用に対する影響を有していなかった（−７３±１ｍＶへの過分極、ｎ＝３）。クロトリマゾールおよびカリブドトキシンによって阻害されるＫ+チャネルは、電圧非依存性のカルシウム活性化カリウムチャネルである。同一性をさらに一層明確にするために、調査を実施して、中コンダクタンス型カルシウム活性化カリウムチャネルｈＩＫ１の特異的活性化剤である１−ＥＢＩＯが（Ｓｙｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２７８：Ｃ５７０−５８１）、ＡＴＰに媒介される過分極を模倣することができるか否かを決定した。図２Ｄが示すように、１−ＥＢＩＯ（１ｍＭ；トクリス）は、迅速かつ強力な−８３±３ｍＶへの過分極を引き起こした（ｎ＝３）。１−ＥＢＩＯの存在下でＡＴＰ（１０μＭ）を加えると、典型的な一過性の脱分極が観察されたが、この脱分極は、制御された条件下に比べはるかに強い（図１Ａ参照）。これは、膜を横断する電圧の上昇に起因する塩化物イオンおよびカチオンの増加した流れによって、説明できることである。さらに、１−ＥＢＩＯの誘導体、すなわちＤＣＥＢＩＯ（５，６−ジクロロ−１−エチル−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾイミダゾル−２−オン）は、ＨａＣａＴ細胞の脱分極を導き出すことができ、これは、１−ＥＢＩＯによって導き出される脱分極より３００〜１０００倍強いことが観察された。この結果は、ＤＣＥＢＩＯをはるかに低濃度で用いて、１−ＥＢＩＯで実現したものと同じ電気生理学的作用を実現することができ（約３００〜１０００倍低濃度）、したがって、ＤＣＥＢＩＯがｈＩＫ１チャネルのとりわけ好ましいモジュレーターであることを、示している。
【０１９９】
したがって、はじめて、ケラチノサイト中のｈＩＫ１を検出し、ケラチノサイト活性におけるその役割を実証することができた。これは、ポリペプチドｈＩＫ１およびそれをコードする核酸、ならびにそのチャネルのモジュレーターが、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患、特に創傷治癒障害および／または乾癬に用いられることに適していることを、実証している。
実施例２：ＨａＣａＴ細胞におけるｈＩＫ１の発現、および分化しているケラチノサイトにおけるｈｓｋ４（＝ＩＫ１）の差次的調節の検出
ｈＩＫ１の発現および活性がケラチノサイト内で調節されるか否かを調査するために、検査を実施して、ケラチノサイトの活性がｈＩＫ１の発現に相関するか否かを決定した。
【０２００】
このために、増殖中のサブコンフルエント細胞、ちょうどコンフルエンスに達した細胞および休止細胞（コンフルエンス後４日目）の分析を実施した。これらケラチノサイトの活性を、ケラチン１０の分化に特異的な発現を用いて決定した。これを行うために、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、−２０℃のアセトン／メタノール（１：１）で２０分間固定した。内因性ペルオキシダーゼを、室温で１％  Ｈ2Ｏ2で遮断した。非特異的結合部位をＰＢＳ中の３％  ＢＳＡで飽和させた後、細胞を、ＰＢＳ中の３％  ＢＳＡ中で１：５００に希釈したマウス抗Ｋ１０抗体（ＤＡＫＯ）中、４℃で一晩インキュベートし、次にＰＢＳで３回およびＰＢＳ中の３％  ＢＳＡで１回洗浄した。ペルオキシダーゼが結びついた抗マウス抗体を用いて室温中で２時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで３回およびｄｄＨ2Ｏで１回洗浄した。その後、ペルオキシダーゼ基質キットと、色素産生性基質としての３−アミノ−９−エチルカルバゾール（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とを用いて、細胞を染色した。増殖中の細胞、およびちょうどコンフルエンスに達した細胞は、染色を示さなかったが、コンフルエント後の細胞の大部分は染色されたことがわかった（図３）。分化特異的なケラチン１０遺伝子の発現は、休止細胞の大部分が、部分的に分化した細胞からなることを示していた（Ｆｕｃｈｓ，１９８８，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．４：２７７−２８１；Ｒｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，４０：４２−５４）。
【０２０１】
標準的方法を用いて、並行して成長させた増殖中、コンフルエントおよびコンフルエント後の細胞からＲＮＡを単離し（ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ，１９８７，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１５６−１５９）、ｈＩＫ１を検出するためにＲＮａｓｅプロテクションアッセイを実施した（Ｗｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６８９６−６９００）。
【０２０２】
簡単には：ＰＣＲで増幅した遺伝子フラグメントを  転写ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳＩＩ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングし、そのプラスミドを直線化した(linearized)。その後、Ｔ３またはＴ７ポリメラーゼおよび32Ｐ−ＵＴＰ（８００Ｃｉ／ｍｏｌ）を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアンチセンス転写物(transcript)を作製した。各場合において、２０μｇのＲＮＡを、１０００００ｃｐｍの標識アンチセンス転写物と共に、４２℃で一晩ハイブリダイズさせた。２０μｇのｔＲＮＡを、陰性対照として用いた。その後、そのハイブリッドを、ＲＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ  Ｔ１を用いて３０℃で１時間消化した。保護されたフラグメントを、５％アクリルアミド／８Ｍ尿素ゲルで分画し、オートラジオグラフィーにより分析した。ｈＩＫ１を検出するために、ヒトｈＩＫ１遺伝子のヌクレオチド７４０〜１００４に相補的なリボプローブ（配列番号５）を用いた。実験結果を図４に示す。ｈＩＫ１は、増殖中の細胞（列‘１’）およびちょうどコンフルエントに達した細胞（列‘２’）で強く発現したが、コンフルエント後の部分的分化細胞（列‘３’）ではその量が著しく減少した。陰性対照の場合、シグナルは観察されなかった（‘ｔＲＮＡ’列）。放射能標識のための対照かつ大きさの標準として、１０００ｃｐｍのハイブリダイゼーション用プローブを‘プローブ’列に与えた。したがって、独立した実験からのＲＮＡを用いて３回繰り返した結果は、ＨａＣａＴケラチノサイトにおける分化の開始はｈＩＫ１  ｍＲＮＡの減少を伴っており、よって、ケラチノサイト活性とｈＩＫ１発現の間に関連があることを示している。
実施例３：マウス創傷におけるｍＩＫ１の差次的発現
皮膚は非常に複雑な系であり、その細胞組成は、例えば疾患期間中、空間的および時間的変化を受ける。さらに、細胞の活性は、例えば他の細胞との相互作用により変化する。したがって、皮膚における過程は、簡単な細胞系によって十分に模倣させることができない。ＩＫ１が、皮膚および細胞培養での生理学的過程における細胞活性の調節に重要な役割を果たすことを確かめるために、マウスｍＩＫ１（配列番号２）の発現を、創傷治癒およびさまざまな創傷治癒状態を例としてみなす創傷のパンチ生検で、モニタリングした。その調査は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ５７００でのＴａｑＭａｎ分析により達成した。正常治癒１日目の創傷および無傷皮膚は、等張食塩液で処置した１０週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスから、はさみで切断することにより得た。治癒しにくい創傷を保有するマウスからの組織を得るために、創傷を与える前に、ＢＡＬＢ／ｃマウスをデキサメタゾン（体重１ｋｇあたり等張食塩液中のデキサメタゾン０．５ｍｇを腹腔内（ｉ．ｐ．）に１日２回、５日間）で処置した。使用した対照は、上記のように等張食塩液で処置してあるマウスからの無傷皮膚であった。若年マウスおよび老年マウスからの組織を得るために、４週齢および１２週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスからの無処置１日目の創傷および無傷皮膚試料を用いた。糖尿病を伴うマウス（ｄｂ／ｄｂマウス）からの創傷組織および無傷皮膚は、１０週齢のＣ５７Ｂ／Ｋｓ  ｄｂ／ｄｂ／Ｏｌａマウスから、無処置１日目の創傷および無傷皮膚をはさみで切断して分離することにより得た。この実験では、Ｃ５７Ｂ／ＫＳ野生型マウスを対照動物として用いた。無傷皮膚および無処置１日目の創傷は、これら後者の動物からも得た。
【０２０３】
ＲＮＡを、ディスパーサーを用いて、１／１００容量部の２−メルカプトエタノールを加えておいたＲＮＡｃｌｅａｎ緩衝液（ＡＧＳ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）中でその生検をホモジナイズして単離した。その後、１−ブロモ−３−クロロプロパンの存在下、水で飽和した酸性フェノールを用いて２回フェノール処理することにより、ＲＮＡを抽出した。その後、イソプロパノール沈殿およびエタノール沈殿を実施して、ＲＮＡを７５％エタノールで洗浄した。その後、ＲＮＡをＤＮａｓｅ  Ｉでの消化に付した。このために、２０μｇのＲＮＡ（ＤＥＰＣ処理水で５０μＬに）を、５．７μＬの転写緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）、１μＬのＲＮａｓｅ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ；４０Ｕ／μＬ）および１μＬのＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｒｏｃｈｅ；１０Ｕ／μＬ）を用いて、３７℃で２０分間インキュベートした。次に、１μＬのＤＮａｓｅ  Ｉをもう一度加え、その混合物を３７℃でさらに２０分間インキュベートした。次に、そのＲＮＡをフェノール処理し、エタノールで沈殿させ、洗浄した。上記で列挙したすべての工程は、ＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネート）で処理した溶液または液体（ただし、後者は、反応性アミノ基を含有しないという条件が付く）で実施した。その後、ｃＤＮＡを、抽出したＲＮＡから調製した。これは、１×ＴａｑＭａｎ  ＲＴ緩衝液（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、５．５ｍＭのＭｇＣｌ2（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、各場合において５００μＭ  ｄＮＴＰ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、２．５μＭランダムヘキサマー（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、１．２５ＵのＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素／μＬ（５０Ｕ／μＬ、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．４ＵのＲＮａｓｅ阻害剤／μＬ（２０Ｕ／μＬ、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、２０μＬのＲＮＡ（５０ｎｇ／μＬ）およびＤＥＰＣ処理水（１００μＬの体積にするため）の存在下で行った。ＲＮＡを加えた後、そして十分に混合した後、その混合物を２本の０．２ｍＬ管に等分し（各場合において５０μＬ）、温度サイクラー中で逆転写を実施した（２５℃で１０分間；４８℃で３０分間および９５℃で５分間）。
【０２０４】
続いて、‘ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ’（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いる定量的ＰＣＲにより、ｃＤＮＡを定量した。このとき、ｍＩＫ１のｃＤＮＡの量を決定するために、三重測定（各場合においてｍＩＫ１プライマーおよびＧＡＰＤＨプライマーを用いて）を実施した。三重測定それぞれの保存溶液は、全体積５７μＬ中に、３７．５μＬの２×‘ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ’、０．７５μＬのＡｍｐＥｒａｓｅ  ＵＮＧ（１Ｕ／μＬ）および１８．７５μＬのＤＥＰＣ処理水を含有していた。各三重測定について、各１．５μＬのフォワードプライマーおよびバックワードプライマー（ｍＩＫ１プライマー１（配列番号６）およびｍＩＫ１プライマー２（配列番号７））を、先に最適化した濃度比で、５７μＬの保存溶液に加えた。各場合、６０μＬの保存溶液／プライマー混合物を１５μＬのｃＤＮＡ溶液（２ｎｇ／μＬ）と混合し、全体を３つのウェルに等分した。これと並行して、ＧＡＰＤＨを決定するためのプライマー（配列番号１２および配列番号１３）を含有する保存溶液を対照標準として調製し、さらに１５μＬの同じｃＤＮＡ溶液と混合し、３つのウェルに等分した。これに加えて、ＧＡＰＤＨのＰＣＲに関する標準曲線を構築するために、異なるｃＤＮＡ溶液を希釈系列として調製した（４ｎｇ／μＬ；２ｎｇ／μＬ；１ｎｇ／μＬ；０．５ｎｇ／μＬおよび０．２５ｎｇ／μＬ）。各場合において、ＧＡＰＤＨを決定するために、これらｃＤＮＡ溶液の１５μＬ容量を６０μＬの保存溶液／プライマー混合物と混合し、３つのウェルに等分した。ｍＩＫ１のＰＣＲに関する標準曲線を同様に構築した；ＧＡＰＤＨの標準曲線の場合と同じ希釈を用いた。ｃＤＮＡを含まないＰＣＲ混合物を、対照として役立てた。各場合において、１５μＬのＤＥＰＣ溶液を、各場合６０μＬのｍＩＫ１およびＧＡＤＰＨ保存溶液／プライマー混合物に加え、混合物の全体を、各場合３つのウェルに等分した。アッセイ混合物を、ＧｅｎｅＡｍｐ  ５７００で増幅させた（５０℃で２分間；９５℃で１０分間の後、９６℃で１５秒間および６０℃で２分間を３サイクル；その後、９５℃で１５秒間および６０℃で１分間を３７サイクル）。
【０２０５】
ＧＡＰＤＨ対照標準に対するｍＩＫ１の相対的存在量を決定することにより、分析を達成した。これを行うために、希釈系列に関するＣT値をＰＣＲアッセイ混合物中のｃＤＮＡ量（転写ＲＮＡのｎｇ）の対数に対してプロットして最初に標準曲線を構築し、直線の傾き（ｓ）を決定した。その後、ＰＣＲの効率（Ｅ）は、以下のように得られる：Ｅ＝１０-1/s−１。したがって、調査中であるｍＩＫ１のｃＤＮＡ種（Ｙ）の、ＧＡＰＤＨに対する相対的存在量（Ｘ）は：Ｘ＝（１＋ＥGAPDH）CT(GAPDH)／（１＋ＥY）CT(Y)である。その後、１０週齢のＢＡＬＢ／ｃ対照動物の無傷皮膚、またはＣ５７Ｂ／Ｋｓ対照動物の無傷皮膚からのｃＤＮＡの量を１に等しくすることにより、数値を標準化した。さまざまな創傷治癒状態にあるｍＩＫ１の発現における相対的変化を、表２にまとめる。マウスでのすべての創傷治癒状態において、無傷皮膚と比較して、ｍＩＫ１発現の増加が観察されたことがわかる。対照動物の創傷、および若年マウスで十分に治癒した創傷において、それぞれ係数３および係数４での著しいアップレギュレーションが測定されたが、老年マウスにおける創傷では、弱く無視しうる発現増加しか観察されなかったことが、顕著な特徴であった。対照動物に比べてあまり目立たない発現増加（係数２．２）が、治癒しにくいデキサメタゾン処置創傷でも観察された。このことにより、マウスの創傷では、創傷治癒がｍＩＫ１発現の著しい増加を伴っており、そして、より老年の動物またはデキサメタゾン処置動物の創傷において広範囲で起こりうる障害のあるケラチノサイト活性は、ｍＩＫ１発現の減少を特徴とすることができる、という事実が強調される。したがって、一般に、ＩＫ１の発現および／または活性をモジュレートする、好ましくは増加させることは、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患の処置または予防に有利であることができる。
【０２０６】
障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患の診断、予防および／または処置に適した時点を決定するために、創傷治癒の異なる時点で採取したマウスの生検材料でｍＩＫ１の発現を決定した。この実験では、創傷生検材料、および１０週齢の対照マウスの無傷皮膚生検材料を、創傷後１時間、７時間、１５時間、２４時間、３日、５日、７日および１４日目に、上記のようにはさみで切断することにより得た。ＲＮＡを組織から単離し、生検材料中のｍＩＫ１の相対的量を決定した。この場合、創傷後７時間ですでに、ｍＩＫ１発現の著しいアップレギュレーションを観察できたことがわかる（表３）。ｍＩＫ１の発現は、無傷皮膚と比較して、観察期間の最後（創傷後１４日目）まで上昇したままであった。これは、創傷治癒の経過全体にわたるｍＩＫ１発現の調節が、創傷治癒の最適な進行に極めて重要であることを示している。任意の時点に、診断を実施することができ、あるいは予防および／または処置を開始することができるので、このことにより、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患の診断、予防および／または処置にＩＫ１がとりわけ適していることが強調される。
実施例４：ヒトの創傷におけるｈＩＫ１の差次的発現
マウスは、ヒトでの創傷治癒を調査するための適切なモデル系であることが判明している。それにもかかわらず、創傷治癒を例としたときにマウスで観察される、本発明に従って用いることができる核酸の差次的発現を、ヒトでも検出可能であるか否かを確認するものとした。これを行うために、４ｍｍまたは６ｍｍのパンチを用いて、健常な自発的被験者の無処置の無傷皮膚、１日目の創傷または５日目の創傷から、皮膚試料を採取した。各場合１４人の自発的被験者から採取した生検材料を、各群の場合（無傷皮膚、１日目の創傷および５日目の創傷）にプールした。これに加えて、無傷皮膚、創底および創端のパンチ生検を、同時に、慢性静脈性潰瘍（ｕｌｃｅｒａ  ｃｒｕｒｉｓ  ｖｅｎｏｓｕｍ）を患っている患者で採取した。各場合６人の自発的被験者からの生検材料を、各群の場合（無傷皮膚、創端および創底）にプールした。生検材料をボールミルを用いて粉砕し、実施例３に記載したように、続いてＲＮＡを粉砕生検から実施例３に記載したように単離し、その後、ＲＮＡをＤＮａｓｅ  Ｉで消化させた後、ｃＤＮＡに転写する。また、創傷治癒に関係するｃＤＮＡを、実施例３に記載されているように定量した。実験結果を表４にまとめる。ｈＩＫ１を分析するための増幅用プライマー
【０２０７】
【化９】
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【０２０８】
を、ヒトＧＡＤＰＨ（ＧｅｎｅＢａｎｋ：Ｍ１７８５１）およびヒトｈＩＫ１（配列番号１）の公知の配列に基づき選択した。定量するために、１０ｎｇの逆転写されたＲＮＡ全体からのｃＤＮＡを、アッセイにつき２５μＬの総体積で増幅した。ＰＣＲを、製造元の使用説明書（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，１９９８）に従って実施した。ＣT値を分析し、これから、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡに対するｈＩＫ１  ｍＲＮＡの頻度を算出した。実験結果を表４に示す。ヒトの１日目の創傷におけるｈＩＫ１  ｍＲＮＡの量は、無傷皮膚と比較してほんのわずかに増加したが、ｈＩＫ１の発現における減少が創傷後５日目に測定された。これは、例えば、ケラチノサイトの分化が増加した結果とすることができる（実施例２参照）。一方、ケラチノサイト活性が著しく障害を受けている潰瘍患者の創底では、無傷皮膚と比較して発現の減少を観察することができない。これは、ケラチノサイト活性の調節が、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患を回避するのに極めて重要であり、したがって、ｈＩＫ１が適切な治療標的であることを、実証している。したがって、一般に、ＩＫ１の発現および／または活性をモジュレートする、好ましくは増加させることは、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患を処置または予防するために用いるのに有利であることができる。好ましくは、ＩＫ１の発現は、皮膚の創傷、特に潰瘍において増加すべきである。
実施例５：異なる器官でのｈＩＫ１の局在化
ｈＩＫ１は、異なるヒト組織で発現することがすでに示されている（Ｉｓｈｉｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９７；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１１６５１−１１６５６；Ｊｏｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９７；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１１０１３−１１０１８；ＷＯ９９／０３８８２）。発現が、電気的興奮性でない器官、例えば胎盤および前立腺に限定されており、脳または心臓では発現が検出されていないことは、注目に値する。これは、ヒトにおけるｈＩＫ１の発現が、血液および脈管系の細胞に限定されるという論派に反映されている（ＷＯ００／３４２４８）。非興奮性器官で選択的に発現するため、心血管系合併症の危険性が低いと想定されるので、このチャネルのモジュレーターは、多様な投与形での非常に多くの疾患のための適切な薬剤としてみなされる。非常に多くの発表で、組織または細胞におけるｈＩＫ１の局在化が扱われているにもかかわらず、皮膚での発現は、ヒトまたはその他のほ乳類のいずれにおいても、これまでに実証されていない。
【０２０９】
ｈＩＫ１が他の器官に関連して皮膚に発現するか否かと、その量を調査するために、成人のヒト提供者から得た器官特異的な全ＲＮＡプール（ＢｉｏＣｈａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．）を使用した：全腎臓ＲＮＡを５人の提供者から単離した一方、全肺ＲＮＡを５人の提供者から、全脂肪組織ＲＮＡを４人の提供者から、全肝臓ＲＮＡを５人の提供者から、全脳ＲＮＡを５人の提供者から、全心臓ＲＮＡを５人の提供者から、全脾臓ＲＮＡを２人の提供者から、全骨格筋ＲＮＡを５人の提供者から、そして全小腸ＲＮＡを５人の提供者から単離し、続いてこれらの全ＲＮＡをＤＮａｓｅ  Ｉで消化し、器官に従って別々にプールした。その後、これらの器官からの全ＲＮＡ、および実施例４でのようにして得た皮膚からの全ＲＮＡを用いて、実施例３に記載したようにＴａｑＭａｎ分析を実施し、ＧＡＤＰＨ  ｍＲＮＡに対するｈＩＫ１  ｍＲＮＡの頻度を決定した。それらの器官におけるｈＩＫ１  ｍＲＮＡの相対的量を表５に示す。意外にも、ｈＩＫ１が皮膚で発現することを、はじめて実証することができた。これに加えて、ｈＩＫ１は、例えば肺および脾臓においてと比較しうる程度に、皮膚で発現することが観察された。ｈＩＫ１の比較的強い発現が、後者２種の器官で検出されている（ＷＯ９９／０３８８２）。これに加えて、意外なことに、ｈＩＫ１が脳、心臓および骨格筋に発現することを、実証することができた。従来の技術に矛盾するこの結果は、おそらく、ＴａｑＭａｎ分析の感度が、従来の技術で用いられているノーザンブロット分析の感度より高いという事実に起因する。従って、この実験は、本発明の二つの観点を強調する。一方において、ｈＩＫ１の発現は、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患を診断、予防および／または処置するために、ｈＩＫ１遺伝子、タンパク質、およびその活性のモジュレーターの使用を可能にするための必要条件である。他方、興奮性器官におけるｈＩＫ１の発現が意外にも実証されたことは、一般的意見に反して、心血管系合併症が、例えば経口投与に関連して起こりうることを示している。対照的に、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患、特に創傷治癒障害および／または乾癬の予防および／または処置は、好ましくは局所的に処置すべきである。これは、この投与形により、ケラチノサイトとの直接的かつ特異的な接触が確実になるためである。したがって、ｈＩＫ１、それをコードする核酸および／またはその活性のモジュレーターを使用することは、これらの疾患を予防および／または処置するときに、とりわけ有利である。
実施例６：ｈＩＫ１活性の活性化および阻害はともに、ケラチノサイト活性への影響を発揮する
ここでは、ＩＫチャネルのモジュレーターが、ケラチノサイト活性を調節できることを実証することを意図する。
【０２１０】
分化に対するモジュレーターの影響を、ｈＩＫ１活性化剤１−ＥＢＩＯ（Ｓｙｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２７８：Ｃ５７０−Ｃ５８１）を例として調査した。これのために、ＨａＣａＴ細胞を培地中で２日間成長させた。その後、１ｍＭの１−ＥＢＩＯ（トクリス）を、増殖中のサブコンフルエント細胞を含有する培地に加え、全体を３日間インキュベートした。次に、ケラチノサイトの分化を、実施例２に示したように、Ｋ１０抗体での免疫染色により調査した。１−ＥＢＩＯを加えていない対照細胞の大部分が、部分的に分化することがわかった。これは、実施例２でのように、抗Ｋ１０抗体を用いた免疫染色により実証された。染色細胞の割合は、１−ＥＢＩＯの存在下でインキュベートした細胞の場合に著しく低下した。
【０２１１】
これらの観察を、ウェスタンブロット分析により確認した。これのために、１ウェルあたり５×１０5個のＨａＣａＴ細胞を、６ウェルプレート中の培地中で成長させた。翌日、その培地を、異なる濃度の１−ＥＢＩＯまたは２−アミノ−５−クロロベンゾオキサゾール（ゾキサゾラミン（Ａｌｄｒｉｃｈ））を含有する培地と取り替えた。培地中の１％  ＤＭＳＯを、溶媒対照として用いた（列‘Ｃ’）。培地を毎日取り替えて、細胞を４日間インキュベートした。４日後、細胞溶解産物中のタンパク質濃度を決定した（ＢＣＡ  Ａｓｓａｙ、Ｐｉｅｒｃｅ）。その後、免疫ブロット法を用いて、異なる溶解産物からの等量のタンパク質を、ケラチノサイト分化マーカーのインボルクリン（１：５００、Ｓｉｇｍａ）ならびにケラチン１および１０（１：２５０、Ｐｒｏｇｅｎ）と比較した（図６）。２種のｈＩＫ１活性化剤、すなわち１−ＥＢＩＯおよびゾキサゾラミンが、ＨａＣａＴ細胞の分化、したがってケラチノサイト活性を、用量依存性で阻害することを、明らかに見いだすことができる。
【０２１２】
増殖に対するＩＫ１の活性化剤の影響を、１−ＥＢＩＯおよびゾルキサゾラミン(zolxazolamine)（上記参照）を用いて調査した。最初に、ＨａＣａＴ細胞の成長速度に対する異なる濃度の１−ＥＢＩＯの影響を、血清の存在下および非存在下で測定した。この目的のために、１ウェルあたり５×１０4個のＨａＣａＴ細胞を、９６ウェルプレートで５日間にわたりケラチノサイト増殖培地（ＫＧＭ）中で培養して、細胞周期を同調させた。これに続いて、ＫＧＭ中の異なる濃度の１−ＥＢＩＯ（図７および８参照）存在下、血清の非存在下（図７）および存在下（図８）で、２日間のインキュベーションを行った。ＫＧＭ／１０％  ＦＣＳを増殖のための陽性対照として用いる一方、ＩＫ１活性化剤のゾキサゾラミンを１−ＥＢＩＯの作用についての比較として、１ｍＭの濃度で用いた。ＫＧＭ中の１％  ＤＭＳＯを、溶媒対照として用いた。ブロモジデオキシウリジン（ＢｒＤＵ）の取り込みにより細胞増殖を測定し、製造元の使用説明書（‘Ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ，ＢｒＤＵ，Ｒｏｃｈｅ）に従って細胞分裂を測定した。ＢｒＤＵの取り込みを、４５０ｎｍでの吸収を決定することにより定量した。図７および８では、各場合において吸収（Ａ［４５０ｎｍ］）を増殖速度の尺度としてＹ軸上にプロットする。より大きな吸収は、より進んだ増殖を反映している。２種のＩＫ１活性化剤１−ＥＢＩＯおよびゾキサゾラミンの、血清処理細胞と無処理細胞の間での比較は、まず第一に、２種の活性化剤が単独では細胞増殖を刺激できないことを明確に示している（図７）。これに加えて、両活性化剤は、血清に誘導される増殖を阻害することができ、その結果としてケラチノサイト活性をモジュレートすることができる（図８）。これに関して、細胞の形態は変わらずに維持される、すなわち、細胞は静止状態を‘持続’し、アポトーシスの徴候はないことを、述べておくべきである。図８はまた、ｈＩＫ１活性化剤の１−ＥＢＩＯによりもたらされた阻害は用量依存性であり、そのもっとも強い作用を１ｍＭの濃度で示すことを、示している。
【０２１３】
ｈＩＫ１チャネル阻害剤のクロトリマゾールおよびカリブドトキシンの作用を調査するために、１０μＭのクロトリマゾール、２００ｎＭのカリブドトキシン（ＣｈＴｘ）または１ｍＭの１−ＥＢＩＯのいずれか（１以上）を、サブコンフルエントに成長している細胞に加え、１ウェルあたりの細胞数を毎日決定した。
【０２１４】
図５（ｎ＝３）からわかるように、２種の阻害剤のうち１種の添加およびｈＩＫ１活性化剤の添加は、ともに増殖を阻害したが、モジュレーターを加えていない対照細胞の成長は、損なわれずに維持された。所定の濃度でクロトリマゾールおよび１−ＥＢＩＯを添加すると、完全な阻害が起こった；対照的に、２００ｎＭのカリブドトキシンを加えたときに、遅延しただけの成長が観察された。
【０２１５】
実験結果は、ｈＩＫ１チャネルのモジュレーターが、ケラチノサイト活性の両パラメーター、すなわち増殖および分化に、同時に影響を及ぼすことを示している。興味深いことに、このことは、活性化剤と阻害剤の両方に、同様に適合する：添加は、増殖および分化の阻害をもたらす。これは、細胞周期におけるイオンチャネルの公知の役割により、説明することができる：おそらく、より大きな開口局面と閉鎖局面の両方が、細胞周期を通過するのに必要とされる。その結果、イオンチャネルの活性の持続的活性化および持続的阻害はともに増殖の阻害を引き起こすため、実験の観察に対応する。分化に対する比較しうる作用を、同等の方法で推論することができる。ケラチノサイトの分化および増殖をともに阻害するモジュレーターの発見は、完全に新規な活性化合物を開発する可能性をはじめて提供する。ｈＩＫ１の異なる活性をモジュレートすると、障害のあるケラチノサイト活性に関連する疾患を処置および／または予防するための、特別かつ完全に新規な治療の可能性を結果としてもたらすことができる。したがって、例えば、ｈＩＫ１の活性をモジュレートすることは、乾癬の処置にとりわけ正確に有利である。ここで、その疾患は、細胞の過増殖と分化細胞の減少したアポトーシスとの組み合わせに起因する。とりわけ好ましいのは、より低濃度で用いることができるモジュレーターの誘導体、例えば、１−ＥＢＩＯのジクロロ誘導体としてのＤＣＥＢＩＯ（５，６−ジクロロ−１−エチル−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾイミダゾル−２−オン）である。これに対応して、ＩＫチャネルの量の増加は、ケラチノサイトの増殖を刺激することを目的とする創傷治癒障害の処置に好ましい。これは、例えば、本発明に従って用いることができるＩＫチャネルをコードする核酸を含有する遺伝子治療ベクターを用いた遺伝子治療により、達成することができる。
【０２１６】
本発明に従った組成物および方法は、多くの異なる方法で修正することができることが、当業者には明らかであろう。したがって、本発明は、請求項およびそれらの等価物の保護された範囲内に入るこれらの変更および変形も網羅すべきものとする。
【０２１７】
優先権出願ＤＥ１００６５４７５．４は２０００年１２月２８日に出願し、優先権出願ＵＳ６０／２７７４５３は２０００年３月２０日に出願した。本明細書で引用したすべての刊行物を、その全体を参考として本明細書中に援用する。
【０２１８】
【表１】
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【０２１９】
【表２】
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【０２２０】
【表３】
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【０２２１】
【表４】
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【０２２２】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【０２２３】
【図１−１】図１は、ＵＶに誘導される閃光分解の前後に、（Ａ）異なる濃度のＡＴＰ、（Ｂ）１０μＭのブラジキニンまたは１００μＭのヒスタミン、（Ｃ）‘ケージ化ＩＰ3’に対するＨａＣａＴケラチノサイトの電気生理学的応答としてパッチクランプ分析により決定した、膜電位（Ｖｍ）におけるｍＶでの変化を示す図である。
【図１−２】図１は、ＵＶに誘導される閃光分解の前後に、（Ａ）異なる濃度のＡＴＰ、（Ｂ）１０μＭのブラジキニンまたは１００μＭのヒスタミン、（Ｃ）‘ケージ化ＩＰ3’に対するＨａＣａＴケラチノサイトの電気生理学的応答としてパッチクランプ分析により決定した、膜電位（Ｖｍ）におけるｍＶでの変化を示す図である。
【図２】図２は、膜電位（Ｖｍ）におけるｍＶでの変化として、パッチクランプ分析により決定した、ＡＴＰに誘導される電気生理学的応答に対する、ｈＩＫ１の異なるモジュレーターの影響を示す図である。（Ａ）ＡＴＰ添加前にさまざまな濃度でカリブドトキシンを添加、（Ｂ）ＡＴＰ添加前にクロトリマゾール（１μＭ）を添加、（Ｃ）ＡＴＰ添加後にカリブドトキシン（１００ｎＭ）を添加、（Ｄ）ＡＴＰ添加前に１−ＥＢＩＯ（１ｍＭ）を添加。
【図３】図３は、ちょうどコンフルエントになったとき（コンフルエント）、コンフルエント後２日目（コンフルエント後２ｄ）、コンフルエント後４日目（コンフルエント後４ｄ）およびコンフルエント後６日目（コンフルエント後６ｄ）のＨａＣａＴ細胞の、抗Ｋ１０抗体を用いた免疫染色を示す図である。
【図４】図４は、増殖中（列‘１’）、ちょうどコンフルエントになったとき（列‘２’）、およびコンフルエント後４日目（列‘３’）のＨａＣａＴケラチノサイトにおいて、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイにより決定した、ｈＩＫ１の量をオートラジオグラフとして示す図である。１０００ｃｐｍのハイブリダイゼーション用プローブを、‘プローブ’の列に与える。‘ｔＲＮＡ’列は、陰性対照を含有する。
【図５−１】図５は、ＨａＣａＴケラチノサイトの増殖に対する、ｈＩＫ１のさまざまなモジュレーターの影響を示す図である（ｎ＝３）。対照として、各溶媒のみを培地に加えた細胞を使用した。クロトリマゾール（１０μＭ）および１−ＥＢＩＯ（１ｍＭ）により増殖は完全に阻害されたが、カリブドトキシン（２００ｎＭ）の添加により増殖は遅延した。
【図５−２】図５は、ＨａＣａＴケラチノサイトの増殖に対する、ｈＩＫ１のさまざまなモジュレーターの影響を示す図である（ｎ＝３）。対照として、各溶媒のみを培地に加えた細胞を使用した。クロトリマゾール（１０μＭ）および１−ＥＢＩＯ（１ｍＭ）により増殖は完全に阻害されたが、カリブドトキシン（２００ｎＭ）の添加により増殖は遅延した。
【図５−３】図５は、ＨａＣａＴケラチノサイトの増殖に対する、ｈＩＫ１のさまざまなモジュレーターの影響を示す図である（ｎ＝３）。対照として、各溶媒のみを培地に加えた細胞を使用した。クロトリマゾール（１０μＭ）および１−ＥＢＩＯ（１ｍＭ）により増殖は完全に阻害されたが、カリブドトキシン（２００ｎＭ）の添加により増殖は遅延した。
【図６】図６は、１０００μＭの１−ＥＢＩＯ（列１および２）、１００μＭの１−ＥＢＩＯ（列３および４）、１μＭの１−ＥＢＩＯ（列５および６）、１０００μＭのゾキサゾラミン（列７および８）、１００μＭのゾキサゾラミン（列９および１０）、１μＭのゾキサゾラミン（列１１および１２）の影響下、ならびに対照（列‘Ｃ’；１％  ＤＭＳＯ／ＤＭＥＭ）で、ＨａＣａＴケラチノサイトにおいて免疫ブロット法により検出した、ケラチノサイト分化のタンパク質マーカー、すなわちインボルクリン、ケラチン１（Ｋ１）およびケラチン１０（Ｋ１０）の量を示す図である。
【図７】図７は、血清の添加を伴わないＨａＣａＴケラチノサイトの増殖に対する、異なる濃度のｈＩＫ１活性化剤１−ＥＢＩＯの影響を示す図である。増殖の尺度として、ＢｒＤＵの組入れを、４５０ｎＭでの吸収（Ａ［４５０ｎｍ］）を測定することにより決定した。より進んでいる増殖は、より高い吸収に反映される。血清の影響下で成長した細胞（‘ＫＧＭ−１０％ＦＣＳ’列）を、増殖対照として用いた。その他のｈＩＫ１活性化剤、すなわちゾキサゾラミン（‘１０００μＭ  Ｚｏｘ’列）を、１−ＥＢＩＯの作用と比較するために用いた。活性化剤を含まないか、または溶媒ＤＭＳＯのみを含んでいる陰性対照を、それぞれ“ＫＧＭ”および‘ＫＧＭ  ＤＭＳＯ’と標識する。
【図８】図８は、血清に誘導されたＨａＣａＴケラチノサイトの増殖に対する、異なる濃度のｈＩＫ１活性化剤１−ＥＢＩＯの影響を示す図である（‘ＤＭＥＭ−１０％  ＦＣＳ’列）。増殖の尺度として、ＢｒＤＵの組入れを、４５０ｎＭでの吸収（Ａ［４５０ｎｍ］）を測定することにより決定した。より進んでいる増殖は、より高い吸収に反映される。活性化剤を含まないＤＭＥＭ／１０％  ＦＣＳ中のＤＭＳＯを、溶媒のための陰性対照として用いた（‘ＤＭＳＯ’列）。ＤＭＥＭ／１０％  ＦＣＳ中のｈＩＫ１活性化剤ゾキサゾラミンを、陽性対照として用いた（‘１０００μＭ  Ｚｏｘ’列）。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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