(57)【要約】本発明に従い、新規の立体的に要求の厳しい金属インターカレーター類が提供される。これらの化合物は、二本鎖ポリヌクレオチドの塩基の間にインターカレートするが、塩基が完全に相補的でない場合、例えば、塩基対ミスマッチがある場合に限られる。化合物は十分に立体的要求が厳しいため、完全に相補的な二本鎖の塩基間のインターカレーションは有意性のあるほどには起こらない。これらのミスマッチインターカレーターは、DNAおよびRNAの欠陥を検出するため、DNAおよび／またはRNAの欠陥の存在または増加によって特徴付けられる障害を診断するため、ならびにそのような障害を治療するために有用である。さらに、化合物は比較的長波長および通常の太陽光の下での核酸の光分解切断を触媒することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式で表される化合物：
M（R1）（R2）（R3）3＋
式中、
Mは適当な光励起性金属であり、
R1およびR2はそれぞれ独立にエチレンジアミンもしくはその置換誘導体、または1から5環の置換もしくは無置換アリールもしくはヘテロアリールである配位子であり、かつ
R3は下記の構造を有する配位子である：
【化１】
2004522739.tif 000013
（式中、
R4およびR5は−Hまたは低級アルキルであり、
R6およびR7は一緒になって、各環が0から約3個のヘテロ原子を含む、少なくとも四つの環を含む置換または無置換の融合芳香環または芳香族複素環系を形成し；かつ該置換環上の置換基は−H、−R、ハロ、−OH、−OR、−NH2、−NHR、−NR2、−CN、−NO2、−SH、−SO3、−OSO3、−C（O）OH、−C（O）OR、−C（O）NH2、−C（O）NHR、−C（O）NR2、−SO3R、または−OSO3Rであり、ただし各Rは独立に低級アルキル、シクロアルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、またはフェニルである）。
【請求項２】
MがRh、Ru、Co、Fe、Cr、Cu、Zn、Cd、またはPbである、請求項1に記載の化合物。
【請求項３】
R1およびR2が二座配位子である、請求項1に記載の化合物。
【請求項４】
R1およびR2がそれぞれ独立に2，2’−ビピリジン、4，4’−ジメチル−2，2’−ビピリジン、または4，4’−ジアミド−2，2’−ビピリジンである、請求項3に記載の化合物。
【請求項５】
R3が、各環が0から約2個のヘテロ原子を含む、少なくとも四つの芳香環または芳香族複素環を含む、請求項1に記載の化合物。
【請求項６】
前記ヘテロ原子が窒素、酸素、または硫黄である、請求項5に記載の化合物。
【請求項７】
前記ヘテロ原子のそれぞれが窒素である、請求項6に記載の化合物。
【請求項８】
R3が：
【化２】
2004522739.tif 000014
である、請求項7に記載の化合物。
【請求項９】
R3が：
【化３】
2004522739.tif 000015
である、請求項7に記載の化合物。
【請求項１０】
核酸二本鎖における塩基対ミスマッチを検出する方法であって、該核酸二本鎖と下記の式を有する化合物とを含む錯体を形成する段階、および該錯体を信号の検出を可能にする条件に供する段階を含み、信号の存在により塩基対ミスマッチの存在が示される方法：
M（R1）（R2）（R3）3＋
式中、
Mは適当な光励起性金属であり、
R1およびR2はそれぞれ独立にエチレンジアミンもしくはその置換誘導体、または1から5環の置換もしくは無置換アリールもしくはヘテロアリールである配位子であり、かつ
R3は下記の構造を有する配位子である：
【化４】
2004522739.tif 000016
式中、
R4およびR5は−Hまたは低級アルキルであり、
R6およびR7は一緒になって、各環が0から約3個のヘテロ原子を含む、少なくとも四つの環を含む置換または無置換の融合芳香環または芳香族複素環系を形成し；かつ該置換環上の置換基は−H、−R、ハロ、−OH、−OR、−NH2、−NHR、−NR2、−CN、−NO2、−SH、−SO3、−OSO3、−C（O）OH、−C（O）OR、−C（O）NH2、  −C（O）NHR、−C（O）NR2、−SO3R、または−OSO3Rであり、ただし各Rは独立に低級アルキル、シクロアルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、またはフェニルである。
【請求項１１】
核酸二本鎖および化合物を切断条件に曝露する段階と、切断生成物の有無を調べる段階とをさらに含み、切断生成物の存在により塩基対ミスマッチが示される、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
MがRh、Ru、Co、Fe、Cr、Cu、Zn、Cd、またはPbである、請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物が、
MがRhまたはRuであり、
R1およびR2がそれぞれ2，2’−ビピリジンであり、かつ
R3が
【化５】
2004522739.tif 000017
である構造を有する、請求項10に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物が、
MがRhであり、
R1およびR2がそれぞれ2，2’−ビピリジンであり、かつ
R3が
【化６】
2004522739.tif 000018
である構造を有する、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
核酸二本鎖における塩基対ミスマッチを検出する方法であって、該核酸二本鎖と下記の式を有する化合物とを含む錯体を形成する段階、該錯体を切断条件に供する段階、および切断生成物の有無を調べる段階を含み、切断生成物の存在により塩基対ミスマッチが示される方法：
M（R1）（R2）（R3）3＋
式中、
Mは適当な光励起性金属であり、
R1およびR2はそれぞれ独立にエチレンジアミンもしくはその置換誘導体、または1から5環の置換もしくは無置換アリールもしくはヘテロアリールである配位子であり、かつ
R3は下記の構造を有する配位子である：
【化７】
2004522739.tif 000019
式中、
R4およびR5は−Hまたは低級アルキルであり、
R6およびR7は一緒になって、各環が0から約3個のヘテロ原子を含む、少なくとも四つの環を含む置換または無置換の融合芳香環または芳香族複素環系を形成し；かつ該置換環上の置換基は−H、−R、ハロ、−OH、−OR、−NH2、−NHR、−NR2、−CN、−NO2、−SH、−SO3、−OSO3、−C（O）OH、−C（O）OR、−C（O）NH2、  −C（O）NHR、−C（O）NR2、−SO3R、または−OSO3Rであり、ただし各Rは独立に低級アルキル、シクロアルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、またはフェニルである。
【請求項１６】
遺伝障害を診断する方法であって、請求項1に記載の化合物をそのような障害を有するかまたは有することが疑われる哺乳動物の細胞と接触させる段階、ならびに選択的に、該細胞を十分な光で処理して検出可能なシグナルおよび／またはポリヌクレオチド切断を引き起こす段階を含み、シグナルの検出またはポリヌクレオチド切断断片により遺伝障害が示される方法。
【請求項１７】
核酸二本鎖における塩基対ミスマッチによって特徴付けられる遺伝障害を有する被検者を治療する方法であって、それを必要とする被検者に請求項1に記載の化合物の有効量を投与する段階を含む方法。
【請求項１８】
化合物がそれに結合された細胞毒性分子を含む、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
核酸二本鎖における塩基対ミスマッチを検出する方法であって、該核酸二本鎖を請求項1に記載の化合物と共に含む錯体を形成する段階、該錯体を光切断条件に供する段階、および切断生成物の有無を調べる段階を含み、該切断生成物の存在により塩基対ミスマッチが示される方法。
【請求項２０】
塩基対ミスマッチが一塩基多型（SNP）である、請求項10、15、16、または19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
塩基対ミスマッチがグアニン−アデニン対形成である、請求項10、15、16、または19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
塩基対ミスマッチがアデニン−アデニン対形成である、請求項10、15、16、または19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
塩基対ミスマッチがグアニン−グアニン対形成、チミン−チミン対形成、シトシン−シトシン対形成、グアニン−チミン対形成、シトシン−チミン対形成、またはシトシン−アデニン対形成である、請求項10、15、16、または19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
核酸二本鎖における塩基対ミスマッチを検出するためのキットであって：
第一の容器が請求項1に記載の化合物を含む、内部に一つまたは複数の容器を含む輸送手段を含むキット。
【請求項２５】
もう一つの容器が対象となる遺伝子、遺伝子座、またはポリヌクレオチド配列に特異的なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む基質を含む、請求項24に記載のキット。
【請求項２６】
塩基対ミスマッチを有する二つの相補的なオリゴヌクレオチド鎖、および式M（R1）（R2）（R3）3＋の化合物を含む組成物。
【請求項２７】
下記の式を有する、複数の立体的に要求の厳しいインターカレート化合物：
M（R1）（R2）（R3）3＋
式中、
Mは適当な光励起性金属であり、
R1およびR2はそれぞれ独立にエチレンジアミンもしくはその置換誘導体、または1から5環の置換もしくは無置換のアリールもしくはヘテロアリールである配位子であり、かつ
R3は下記の構造を有する配位子である：
【化８】
2004522739.tif 000020
式中、
R4およびR5は−Hまたは低級アルキルであり、
R6およびR7は一緒になって、各環が0から約3個のヘテロ原子を含む、少なくとも四つの環を含む置換または無置換の融合芳香環または芳香族複素環系を形成し；かつ該置換環上の置換基は−H、−R、ハロ、−OH、−OR、−NH2、−NHR、−NR2、−CN、−NO2、−SH、−SO3、−OSO3、−C（O）OH、−C（O）OR、−C（O）NH2、  −C（O）NHR、−C（O）NR2、−SO3R、または−OSO3Rであり、ただし各Rは独立に低級アルキル、シクロアルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、またはフェニルである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府支援研究に関する声明
本発明は、米国国立衛生研究所、助成No.GM33309により全部または一部資金供給を受けた研究の結果であった。連邦政府は本特許において一定の権利を有しうる。
【０００２】
発明の分野
本発明は一般に、無機およびヌクレオチド化学の分野に関する。より具体的には、本発明は核酸配列における塩基対ミスマッチを検出するための立体的に要求の厳しいヌクレオチドインターカレート化合物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
DNA塩基対のミスマッチは、酵素の誤りまたはDNA損傷の結果として、遺伝子組み替えおよび複製の進行中に起こる。細胞には、遺伝暗号の完全性を保つために、これらの誤りを認識し、除去し、修復するための複雑なシステムが存在する。特定の疾患、特に癌において、これらの修復システムは失敗し、ミスマッチが患部細胞のDNA中に残存する。DNAにおける部位特異的ミスマッチを認識するための分子およびシステムの設計は、遺伝子スクリーニングおよび新しい化学療法剤の設計のいずれにとっても魅力的な実験ゴールである。既存の戦略には、単離ミスマッチ認識蛋白質、オリゴヌクレオチド−蛍光プローブ結合体のハイブリダイゼーション、電気泳動／DNAチップ法、および溶液または固相のいずれかで塩基接触性を解析する試薬による区別化学的切断を用いたアッセイが含まれる。これらの方法はどれも、研究上のミスマッチ検出にとって理想的ではなく、塩基対ミスマッチを疾患の選択的治療手段として用いるための戦略は存在しない。
【０００４】
したがって、ポリヌクレオチド二本鎖における部位特異的塩基対ミスマッチを認識するために有用な組成物および方法が必要とされている。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
本発明は、新規の立体的に要求の厳しい金属インターカレーター類の発見に基づいている。これらの化合物は、二本鎖ポリヌクレオチドの塩基の間にインターカレートするが、塩基が完全に相補的でない場合、例えば、塩基対ミスマッチがある場合に限られる。化合物は十分に立体的要求が厳しいため、完全に相補的な二本鎖の塩基間のインターカレーションは意味があるほどには起こらない。これらのミスマッチインターカレーターは、DNAおよびRNAの欠陥を検出するため、DNAおよび／またはRNAの欠陥の存在または増加によって特徴付けられる障害を診断するため、ならびにそのような障害を治療するために有用である。本発明の化合物は、SNP（一塩基多型）の発見のために有用である。化合物は、不完全な修復機構を有する細胞（例えば、様々な癌細胞）を標的とする細胞毒性物質の担体としても有用である。
【０００６】
式M（R1）（R2）（R3）3＋の新しい化合物類およびその誘導体が本明細書に記載される。本発明の化合物は、塩基対ミスマッチ存在下のヌクレオチド塩基の間にのみインターカレートし、したがって一塩基対ミスマッチを検出するために有用である。さらに、化合物は比較的長波長および通常の太陽光の下での核酸の光分解切断を触媒することができる。
【０００７】
本発明に従い、式M（R1）（R2）（R3）3＋の化合物およびその誘導体が提供される。
【０００８】
本発明のもう一つの局面において、塩基対ミスマッチを有する二つの相補的オリゴヌクレオチド鎖、および式M（R1）（R2）（R3）3＋の化合物を含む組成物が提供される。
【０００９】
本発明のさらなる局面において、ポリヌクレオチド二本鎖における塩基対ミスマッチの存在を調べる方法、DNAおよび／またはRNAの欠陥（例えば、塩基対ミスマッチ）の存在または存在の増加によって特徴付けられる遺伝的障害を診断する方法、DNAおよび／またはRNAの欠陥の存在または存在の増加によって特徴付けられる障害を治療する方法、ならびに物質を核酸二本鎖を損傷する能力についてスクリーニングする方法が提供される。
【００１０】
本発明のさらなる局面において、化合物は塩基対ミスマッチを標識または指示するために有用である。本発明のさらに他の局面において、化合物は塩基対ミスマッチを有するポリヌクレオチド二本鎖の切断を触媒することができる。本発明のさらなる局面において、化合物は核酸二本鎖における塩基対ミスマッチの存在によって特徴付けられる障害を診断および／または治療するために有用である。
【００１１】
発明の詳細な説明
本明細書に記載の方法および組成物は、(a)単純、(b)正確度、および(c)すべての一塩基ミスマッチを検出する能力の利点を有する突然変異／多型検出システムを提供する。本発明は、試料中の核酸二本鎖ミスマッチを検出する方法であって、正常または腫瘍細胞をミスマッチ修復不全についてスクリーニングするために有用な方法も提供する。そのようなアッセイは、特定の種類の病的状態、例えば癌に対する罹病性の診断において重要である。
【００１２】
ミスマッチは、本発明によれば、二つの鎖が100％相補的でない、ハイブリダイズされた核酸二本鎖である。完全な相同性の欠如は、欠失、挿入、逆位または置換によると考えられる。DNA−DNA、DNA−RNAまたはRNA−RNA二本鎖の間のミスマッチを、本発明の方法および化合物を用いて検出することができる。加えて、核酸二本鎖に結合している蛋白質の存在を、本発明の化合物および方法を用いて調べることができる。
【００１３】
コードおよび非コードDNA、ならびにRNAにおけるミスマッチを検出する能力は、いくつかの診断ならびに治療的状況において重要である。そのようなミスマッチは単一のヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドで起こることがあり、また遺伝子におけるフレームシフト、停止コドン、または置換から生じると考えられ、それぞれ独立にコードされた蛋白質を不活性にする。または、ミスマッチは無害の遺伝的変異体を示すこともあり、機能上検出可能な変化のない蛋白質産物を生じる（例えば、無害遺伝子多型）。八通りの一塩基ミスマッチが可能で、G:A、C:T、C:C、G:G、A:A、T:T、C:A、およびG:Tが含まれ、核酸鎖がRNAである場合にはUがTと置き換わる。例えば、ミスマッチを含む配列の鎖、すなわちヘテロ二本鎖の少なくとも一つがDNAまたはRNAの欠失、置換、挿入、転座、または逆位を含む場合、核酸ループが生じることもある。
【００１４】
多くのヒト疾患は遺伝子の一塩基対変化によって起こるため、塩基対ミスマッチおよび突然変異の解析は生物医学的研究および医学において重要な意味を持つ。例えば、三つのラス遺伝子の一つのコドン12、13または61の一塩基突然変異が著しい数のヒト癌で起こり、最も高い発生率は膵（90％）、結腸（50％）、および肺（30％）の腺癌、甲状腺腫瘍（50％）ならびに骨髄性白血病（30％）で認められる。（ボス（Bos）、Canc. Res.、49：4682〜4689、1989）。ヒト遺伝疾患のかなりの数が点突然変異によって引き起こされることが知られている。
【００１５】
本発明は、単一または複数の塩基対ミスマッチの存在および位置を調べるための、かさ高いインターカレート化合物を用いてのアッセイに基づく高感度で正確な方法を提供する。本発明は、点突然変異から生じる遺伝疾患の診断において特に有用である。例えば、多くの癌の原因はキナーゼ、増殖因子、レセプタ結合蛋白質および／または核蛋白質における点突然変異にまでさかのぼることができる。遺伝的障害から生じる他の疾患には、嚢胞性線維症、ブルーム症候群、サラセミア、および鎌状赤血球症が含まれる。加えて、DCC、NF-1、RB、p53、erbAおよびウィルムス腫瘍遺伝子などの癌に関連するいくつかの特定の遺伝子、ならびにabl、erbB、src、sis、ras、fos、mybおよびmycなどの様々な癌遺伝子が同定され、特定の突然変異について検査されている。
【００１６】
本発明は、単一または複数の点突然変異を検出する方法を提供する。塩基対ミスマッチまたは突然変異を検出するための、本発明の方法と他の既知の方法との間の一つの重要な差異は、本発明の方法はミスマッチの塩基スタッキングにおける差に基づいているということである。この方法は、ハイブリダイゼーションの熱力学的相違に依存する既存の方法とは対照的に、ハイブリダイズした二本鎖の配列組成とは無関係である。さらに、この方法は危険性がなく、安価で、広範な適用例において、単独または他のハイブリダイゼーション依存性の方法との組み合わせで用いることができる。
【００１７】
本発明は、試験する核酸の選択にも関する。いかなる核酸、DNAまたはRNAもこのミスマッチ検出法にかけることができる。試験する核酸は生物の全ゲノムに至るまでコードする天然または合成配列を含んでいてもよい。核酸はいかなる原料からも、例えば、プラスミド、クローニングされたDNAもしくはRNA、または細菌、酵母、ウイルス、オルガネラならびに植物および動物などの高等生物を含む任意の原料からの天然DNAもしくはRNAからも得ることができる。試料は、組織材料または血球、羊膜細胞、骨髄細胞、生検材料から得た細胞などを含む細胞から、例えばマニアティス（Maniatis）ら、分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）、Cold Spring Harbor Laboratory、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（1982）によって記載されている様々な技法によって抽出することができ、前記開示は参照として本明細書に組み込まれる。
【００１８】
または、最良の配列を公知の合成法によって調製することもできる。標準のDNAおよびRNA合成法については、例えば「DNAおよびRNAの合成と応用（Synthesis and Applications of DNA and RNA）」S.A.ナラン（S. A. Narang）編、Academic Press、1987、M.J.ゲイト（M. J. Gait）、「オリゴヌクレオチド合成（Oligonucleotide Synthesis）」、IRL Press、米国ワシントンD.C.、1984、および「オリゴヌクレオチドおよび類似体（Oligonucleotides and Analogues）」F.エクスタイン（F. Eckstein）編、IRL Press、米国ワシントンD. C.、1991を参照されたく、これらの開示は参照として本明細書に組み込まれる。要するに、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体は、公知の方法の固相合成によって都合よく合成することができる。好ましい態様において、固体支持体に共有結合によって固定されている、伸長しつつあるオリゴヌクレオチド鎖にモノマー単位を加える。典型的には、合成開始前に、第一のヌクレオチドを支持体に切断可能な結合によって連結する。オリゴヌクレオチド鎖の段階的伸長を、通常は3'から5'の方向に実施する。合成が完了すれば、前述の結合を加水分解することによってポリマーを支持体から切断し、支持体に最初に連結されたヌクレオチドは得られたオリゴマーの3'末端となる。Applied Biosystems, Incorporated 380Bなどの核酸合成機が市販されており、それらの使用は当業者によって、望みうる妥当な長さのほぼいかなるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を生成する際にも有効であると一般に理解されている。トリエステル、ホスホラミダイト、またはホスホン酸結合化学をこれらの合成機と共に用いて、所望のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を提供する。
【００１９】
二つのDNA、二つのRNA、または一つのDNAおよび一つのRNA分子のオリゴヌクレオチド鎖を、ハイブリダイゼーション条件下で接触させるために用いる方法および条件は、当技術分野において広く知られている。適当なハイブリダイゼーション条件は、当業者には公知の、実験室で用いるプロトコルを確立するための最適化法によって慣例的に決定することができる。例えば、アウスベル（Ausubel）ら、分子生物学における最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）、第1〜2巻、John Wiley & Sons（1989）；サンブルック（Sambrook）ら、「分子クローニング実験室マニュアル（Molecular Cloning A Laboratory Manual）第2版、第1〜3巻、Cold Springs Harbor Press（1989）；およびマニアティスら、分子クローニング：実験室マニュアル、Cold Spring Harbor Laboratory、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（1982）を参照されたく、これらの開示はすべて参照として本明細書に組み込まれる。例えば、温度、成分の濃度、ハイブリダイゼーションおよび洗浄時間、緩衝液の成分ならびにそれらのpHおよびイオン強度は変動しうる。
【００２０】
一つの特定の適用において、本発明の方法および化合物は、核酸配列における突然変異を同定または評価するためのミスマッチ検出法を提供する。突然変異は生物の遺伝子材料の配列における遺伝的変化であり、遺伝性疾患または癌などの致命的欠陥を引き起こしうる（モドリッチ（Modrich）、Science 266：1959〜1960、1994）。そのため、突然変異検出法は、特に医学診断においてますます重要性を獲得しつつある。突然変異はDNA配列決定によって非常に正確に位置を特定することができる（サンガー（Sanger）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74：5463〜5467、1977）が、この方法は比較的時間がかかり、高価である。
【００２１】
本発明は、一つの態様において、インビトロで野生型を突然変異体配列とアニーリングした後に得られる二本鎖DNAのミスマッチによって突然変異を評価する方法および化合物を提供する。「ヘテロ二本鎖」なる用語は、二つのアニーリングした相補的核酸鎖（例えば、試験核酸および基準核酸のアニーリングした鎖）の間に形成される構造であるが、一つまたは複数のミスマッチのために第一の鎖の一つまたは複数のヌクレオチドが第二の向かい合う相補鎖のヌクレオチドと適当に塩基対形成することができない構造を意味する。異なる種類のヘテロ二本鎖の例には、一つまたは複数のヌクレオチドの交換、および挿入または欠失突然変異を示すものが含まれる。本明細書において用いられる場合、「相補的」なる用語は、二つの核酸、例えばDNAまたはRNAが、マッチしたワトソン−クリック塩基対を形成して、二本鎖領域を生じることができる、一連の連続するヌクレオチドを含むことを意味する。したがって、DNAまたはRNAの一つの鎖のアデニンは向かい合う相補的DNA鎖のチミンまたは向かい合う相補的RNA鎖のウラシルと対を形成する。対を形成している領域は「二本鎖」と呼ぶ。二本鎖はホモ二本鎖またはヘテロ二本鎖のいずれであってもよい。
【００２２】
本発明に従い、下記の式を有する化合物が提供される：
M（R1）（R2）（R3）3＋
式中、
Mは適当な光励起性金属であり、
R1およびR2はそれぞれ独立にエチレンジアミンもしくはその置換誘導体、または1から5環の置換もしくは無置換アリールもしくはヘテロアリールである配位子であり、かつ
R3は下記の構造を有する配位子である：
【化９】
2004522739.tif 000002
式中、
R4およびR5は−Hまたは低級アルキルであり、
R6およびR7は一緒になって、各環が0から約3個のヘテロ原子を含む、少なくとも四つの環を含む置換または無置換の融合芳香環または芳香族複素環系を形成し；かつ
該置換環上の置換基は−H、−R、ハロ、−OH、−OR、−NH2、−NHR、−NR2、−CN、−NO2、−SH、−SO3、−OSO3、−C（O）OH、−C（O）OR、−C（O）NH2、  −C（O）NHR、−C（O）NR2、−SO3R、または−OSO3Rであり、ただし各Rは独立に低級アルキル、シクロアルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、またはフェニルである。
【００２３】
本発明の実施における使用が企図される適当な金属には、例えばRh、Ru、Co、Fe、Cr、Cu、Zn、Cd、またはPbが含まれる。
【００２４】
本発明の実施における使用が企図される配位子R1およびR2上の置換基には、例えばアルキル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、−OH、−OR、−NH2、−NHR、−NR2、−CN、−NO2、−SH、−SO3、−OSO3、−C（O）OH、−C（O）OR、−C（O）NH2、  −C（O）NHR、−C（O）NR2、−SO3R、または−OSO3Rが含まれ、ただし各Rは独立に低級アルキル、シクロアルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、またはフェニルである。
【００２５】
特定の態様において、配位子R1およびR2には5−フェナントロリル置換基が含まれる。
【００２６】
特定の態様において、配位子R1およびR2上の置換基には、例えばペプチド、ポリペプチド、核酸、ヌクレオシド、ヌクレオチドなども含まれる。
【００２７】
好ましい態様において、MはRhであり、R1およびR2はそれぞれ独立に2，2’−ビピリジン、4，4’−ジメチル−2，2’−ビピリジン、または4，4’−ジアミド−2，2’−ビピリジンであり、R3は下記の構造を有する配位子である：
2004522739.tif 000003
式中、R4およびR5は−Hであり、R6およびR7は一緒になって、各環が0から約2個のヘテロ原子を含む、少なくとも四つの環を含む融合芳香環または芳香族複素環系である。
【００２８】
特に好ましい態様において、R3は下記の構造を有する：
【化１０】
2004522739.tif 000004
【００２９】
さらにもう一つの好ましい態様において、R3は下記の構造を有する：
【化１１】
2004522739.tif 000005
【００３０】
最も好ましい態様において、MはRhであり、R1およびR2はそれぞれ2，2’−ビピリジンであり、かつR3は下記の構造を有する：
【化１２】
2004522739.tif 000006
【００３１】
本明細書において用いられる「立体的に要求の厳しいインターカレート化合物」または「立体的に要求の厳しいインターカレート物質」という用語は、正常または非ミスマッチ二本鎖ポリヌクレオチドの塩基の間には実質的にインターカレートすることはできないが、誤りおよび／または損傷を有する二本鎖ポリヌクレオチドの塩基の間にインターカレートすることができる化合物を意味する。標識物質は、以下に定義される検出可能な標識を有する、立体的に要求の厳しいインターカレート物質である。「切断」物質は、それがインターカレートしているポリヌクレオチド二本鎖を切断する、または切断を触媒することができる、立体的に要求の厳しいインターカレート物質である。「光切断」化合物または物質は、それがインターカレートしているポリヌクレオチドの光分解を触媒することができる、立体的に要求の厳しいインターカレート物質である。
【００３２】
本明細書において用いられる場合、「損傷」および「誤り」なる用語は、ポリヌクレオチド二本鎖の「正常」または非ミスマッチもしくは理想的構造からの逸脱を意味する。「理想的」構造では、すべての塩基が相補的塩基と対を形成し、主鎖中にニック、切断、またはギャップはまったく生じない。「誤り」とは、塩基が非相補的塩基と対を形成している、または塩基がその位置に存在しない（塩基欠落（absic））、または一つの鎖の配列中にギャップが存在する（例えば、二つの鎖が異なる数の塩基を有し、対形成していない部分が鎖の末端に生じているのではない）状態を意味する。「誤り」には、単純な塩基対ミスマッチ、例えば変性DNA試料が実質的に（完全ではない）相補的なオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズしているものが含まれる。すなわち、このプローブおよび標的は一つまたは複数の塩基で相補性から逸脱している可能性がある。「損傷」とは、二本鎖の立体構造が、例えば主鎖のニック、T-T二量体化などによって混乱している状態を意味する。
【００３３】
ヒトにおいて、それぞれの細胞分裂は約60億のDNA塩基対の複製を必要とする。ほとんどの誤りはDNA修復酵素によって検出され、修正される。しかし、DNA修復酵素はある種の癌では不活性または無効である。これらの癌は、細胞一個あたりの塩基対ミスマッチの数が正常よりも多く存在することで診断することができる。ポリヌクレオチドの損傷または誤りによって特徴付けられる「状態」または「障害」は、ポリヌクレオチド二本鎖における損傷および／または誤りの存在またはそのレベル、比率、もしくは濃度の上昇によって識別することができる。ポリヌクレオチドの損傷および／または誤りの増加は、対照と比較して、または「正常」な個体について確立された公知の、もしくは過去に測定された比率と比較して評価することができる。
【００３４】
核酸のミスマッチ修復の過程も、大腸菌などの微生物や、より最近ではヒトを含む哺乳動物におけるシステムの解明と共に、近年になって大きな関心が寄せられている。例えば、細胞の生活環において核酸への継続的細胞損傷；例えば、放射線、またはアルキル化剤および酸化剤への曝露、自発的加水分解ならびに複製中の誤りによる損傷が生じる。そのような損傷は、細胞分裂前に修復されなければならない。いくつかの異なる細胞修復システムおよびこれらのシステムに関与する様々な成分がある。一つの成分の代表はミスマッチ修復グリコシラーゼとして知られているDNA修復酵素類である。これらの酵素はDNAのミスマッチをアルデヒドを含む塩基欠落部位に変換する。これらの塩基欠落部位は、他の方法によっても生じうる。例えば、これらは自発的に生じることもあり、またはシトシンからウラシルへの脱アミノ化と、続くウラシルグリコシラーゼによるウラシルの除去後にも生じることがある。細胞ごとにほぼ10,000の塩基欠落部位が生じると推定されている。最後に、塩基欠落部位は電離放射線、反応性酸素中間体、抗生物質、ブレオマイシン−鉄錯体、ネオカルジノスタチンまたはアルキル化剤（メタンスルホン酸メチル、硫酸ジメチルなど）などのDNA損傷物質によって生じる。DNA複製中にDNAポリメラーゼは未修復の塩基欠落部位の対側にアデニンを主に挿入するため、これらの部位は致命的または前駆型変異原損傷となりうる。損傷物質によって互いに数塩基対以内に生じた、間隔が近接した塩基欠落部位は、修復を妨害することがあり、または二本鎖切断もしくは他の複雑な多重損傷部位に酵素的に変換されうるため、これらは特に重大な損傷群であると考えられる。そのような複雑な形のDNA損傷は細胞にとって克服するのが特に難しいと考えられる。DNA損傷による塩基欠落部位を調べるための、塩基欠落部位の全数の定量が報告されている。本発明の化合物および使用法は、ミスマッチ修復異常を有する細胞の同定に適している。さらに、修復システム異常を有する癌細胞などの細胞に細胞毒性化合物を送達するために、細胞毒性化合物を本発明の化合物に結合または連結することもできる。
【００３５】
被検者において癌または他の病気による塩基対ミスマッチ関連状態の存在が確認されているため、被検者における薬剤の治療効果を高めるために、本発明の化合物をリシンA鎖または癌化学療法剤などの細胞毒性物質に連結または結合させて、被検者に投与することができる。被検者を放射線療法によって治療する場合には、化学増感剤または放射線調節剤などの治療調節剤も有用な治療薬でありうる。例えば、放射線調節剤は放射線増感剤であってもよく、腫瘍を放射線の効果に対して増感するために、特定の本発明の化合物と共に投与することができる。
【００３６】
本明細書において用いられる場合、「アリール」なる用語は、一つから約五つの環を有し、そのうちの少なくとも半分が芳香族である部分を意味する。例示的アリール基には、フェニル、ナフチル、ビフェニル、テルフェニル、2−フェニル−ナフチル、アントリル、フェナントリル、フルオレニル、インダニル、コラントレニル、アセフェナントレニルなどが含まれるが、これらに限定されることはない。
【００３７】
本明細書において用いられる場合、「ヘテロアリール」なる用語は、環ごとに一つまたは複数、好ましくは約三つ以下のヘテロ原子を有するアリール部分を意味する。ヘテロ原子には、例えば、酸素、硫黄、窒素、ホウ素、およびリンが含まれる。例示的ヘテロアリール基には、ピリジル、ピラジニル、インドリル、シンノリニル、カルバゾリル、アクリジニル、キナゾリニル、プリニル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、キノリル、フェノチアジニルなどが含まれる。
【００３８】
「置換アリール」および「置換ヘテロアリール」なる用語は、少なくとも一つの置換基をさらに有する、前述のアリールおよびヘテロアリール部分を意味する。置換アリールおよび置換ヘテロアリールは、環ごとに約四つ以下、好ましくは環ごとに約三つ以下の置換基を有することが好ましい。適当な置換基には、−H、−R、ハロ、−OH、−OR、−NH2、−NHR、−NR2、−CN、−NO2、−SH、−SO3、−OSO3、−C（O）OH、−C（O）OR、−C（O）NH2、  −C（O）NHR、−C（O）NR2、−SO3R、または−OSO3Rが含まれ、ただし各Rは独立に低級アルキル、シクロアルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、またはフェニルである。
【００３９】
「ハロ」なる用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードを意味する。
【００４０】
「アルキル」なる用語は、完全に飽和の分枝または非分枝炭化水素部分を意味する。「低級アルキル」なる用語は、一個から約六個の炭素原子を有するアルキル部分を意味する。適当な低級アルキル基には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ブト−2−イル、ヘキシルなどが含まれる。
【００４１】
「シクロアルキル」なる用語は、一つから三つの環を有し、かつ環構造中に三個から約九個の炭素原子を含む、飽和炭化水素基を意味する。適当なシクロアルキル部分には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、3−メチルシクロヘキシル、ビシクロオクチル、ノルボルニルなどが含まれる。
【００４２】
「アルケニル」なる用語は、二重結合を含むが、三重結合は含まない、直鎖、分枝、または環状炭化水素基を意味する。「低級アルケニル」なる用語は、二個から約六個の炭素原子を有するアルケニル基を意味する。適当な低級アルケニル部分には、ビニル、アリル、2−ブテニル、シクロヘキセニルなどが含まれるが、これらに限定されることはない。
【００４３】
「アルキニル」なる用語は、三重結合を含む、直鎖、分枝、または環状炭化水素基を意味する。「低級アルキニル」なる用語は、二個から約六個の炭素原子を有するアルキニル基を意味する。適当な低級アルキニル部分には、アセテニル、2−プロピニル、3−ブチニルなどが含まれるが、これらに限定されることはない。
【００４４】
「アリールアルキル」とは、アリール環に結合されたアルキル残基を意味する。例はベンジル、フェネチルなどである。
【００４５】
「ヘテロアリールアルキル」とは、ヘテロアリール環に結合されたアルキル残基を意味する。例には、例えばピリジニルメチル、ピリミジニルエチルなどが含まれる。
【００４６】
「bpy」なる用語は2，2’−ビピリジンを意味する。
【００４７】
「phen」なる用語は1，10−フェナントロリンを意味する。
【００４８】
「有効量」なる用語は、十分なエネルギーの光に当てた場合に、塩基ミスマッチを有するポリヌクレオチド二本鎖の切断を引き起こすのに必要な化合物の量を意味する。最小有効量は、反応条件およびミスマッチに関与する塩基の同一性に応じて変動しうるが、一般にはヌクレオチド：化合物＝約100：1から約1：1の比の範囲である。特定の適用例のための有効量は、用いる条件によって変動しうるが、日常的な実験だけを用いて決定することができる。
【００４９】
本明細書において用いられる場合、「標識」なる用語は、検出可能であるか、または検出可能な信号を提供するよう操作することができる部分を意味する。適当な検出可能標識には、3H、14Cなどの放射性原子、蛍光体、発色団、高電子密度試薬、同位体標識、色素生産性、発光、および蛍光反応などの信号反応を触媒することができる酵素、結合配位子、切断分子などが含まれる。「結合配位子」は、標識化合物または固体支持体に結合可能な部分である、例えば、検出可能な標識はポリヌクレオチド二本鎖を固体支持体に結合することができる部分を含んでいてもよく、ただしポリヌクレオチドは、例えばPCRまたはハイブリダイゼーションアッセイによって直接検出することができる。または、結合配位子は検出可能な標識を含むもう一つの化合物、例えば酵素標識抗体に結合することもできる。切断分子はポリヌクレオチドを切断する、またはその切断を触媒することができる。これは、例えば表面に結合された錯体から二本鎖ポリヌクレオチドの一方の末端を遊離することにより、標識としてはたらくことができる。この遊離された末端を、例えば切断前に鎖の末端を標識することによって検出することができ、または支持体に結合されている、新しく切断された末端を検出することもでき、その場合例えば二本鎖を切断前に末端保護し、次いで末端保護基非存在下で酵素分解にかける。
【００５０】
「切断条件」なる用語は、本発明の化合物の有効量存在下、塩基ミスマッチを有するポリヌクレオチド二本鎖の少なくとも一方の鎖で切断を引き起こすのに十分な反応条件を意味する。「光切断条件」とは、光切断化合物または物質の有効量存在下、ポリヌクレオチドの光分解を引き起こすのに十分な条件である。
【００５１】
「変異原物質」なる用語は、DNAおよび／またはRNAの損傷または誤りを引き起こすことができる物理的、化学的、または生物学的物質を意味する。公知の変異原物質の例には、電離放射線、紫外線、2−アミノプリン、5−ブロモウラシル、ヒドロキシルアミン、亜硝酸、エタンスルホン酸エチル、ニトロソアミン、ナイトロジェンマスタード、アクリジン、プロフラビンなどが含まれる。
【００５２】
「塩基スタッキング混乱」なる用語は、例えば塩基対ミスマッチ、その認識部位への蛋白質結合、塩基欠落部位、バルジ、またはオリゴヌクレオチド付加物を形成する任意の他の実体などの、塩基スタッキングにおける混乱を引き起こすいかなる事象も意味する。
【００５３】
「塩基フリッピング」なる用語は、それによって標的核酸塩基が二重らせんから飛び出し、その塩基を反応に利用可能とする過程を意味する。
【００５４】
「変性」なる用語は、それによってオリゴヌクレオチド二本鎖がもはや水素結合による塩基対を形成せず、一本鎖の分子へと分離される過程を意味する。変性法は当業者には公知で、熱変性およびアルカリ変性が含まれる。
【００５５】
「ハイブリダイズされた」なる用語は、完全に塩基対を形成していることもあれば、していないこともある、互いに結合された二本の核酸鎖を意味する。
【００５６】
「インターカレート可能部分」なる用語は、二本鎖オリゴヌクレオチドの隣接塩基対の間に部分挿入およびスタッキング可能な、平面芳香族または芳香族複素環部分を意味する。これらの部分は小分子でもよく、または蛋白質などのより大きい実体の一部であってもよい。
【００５７】
「損傷」なる用語は、DNAまたはRNAの構造における異常な変化を意味する。損傷はDNAまたはRNAにおける突然変異およびミスマッチを含んでいてもよく、自然に生じるものでも、非自然に生じるものであってもよい。
【００５８】
「ミスマッチ」なる用語は、100％相補的でない、ハイブリダイズされた二本鎖内の核酸塩基を意味する。ミスマッチには、ワトソン−クリックの塩基対A：TまたはG：Cではない、DNAの相補鎖上に位置する二つのヌクレオチド塩基間のいかなる不正な対形成も含まれる。完全な相同性の欠如は、欠失、挿入、逆位、置換またはフレームシフト突然変異によると考えられる。
【００５９】
「突然変異」なる用語は、DNA内の配列再編成を意味する。最も一般的な一塩基突然変異は、一つのプリンまたはピリミジンの他との置換（例えば、AとGもしくはCとT、またはその逆）を含み、「トランジション」と呼ばれる種類の突然変異である。他の頻度の低い突然変異には、プリンがピリミジンに取って代わるか、またはその逆の「トランスバージョン」、および複製過程のある段階でそれぞれ少数（1、2または3個）のヌクレオチドの付加または欠損がDNA二本鎖の一方の鎖で起こる「挿入」または「欠失」が含まれる。そのような突然変異は、二つのヌクレオチドのうちの一つの挿入／欠失の場合、遺伝暗号の蛋白質への翻訳に影響することから、「フレームシフト」突然変異としても知られている。より大きい配列再編成を含む突然変異も起こることがあり、遺伝医学において重要でありうるが、前述の類の突然変異に比べて発生率は比較的低い。
【００６０】
「ヌクレオシド」なる用語は、リボース、デオキシリボース、またはその誘導体もしくは類似体のいずれかであるペントース糖に連結された窒素複素環塩基を意味する。「ヌクレオチド」なる用語は、窒素複素環塩基、ペントース糖、および一つまたは複数のリン酸塩または他の主鎖形成基を含む、ヌクレオシドのリン酸エステルに関し、これはオリゴヌクレオチドのモノマー単位である。ヌクレオチド単位はグアニン（G）、アデニン（A）、シトシン（C）、チミン（T）、またはその誘導体などの一般的な塩基を含んでいてもよい。ペントース糖はデオキシリボース、リボース、またはそれに取って代わる基であってもよい。
【００６１】
「ヌクレオチド類似体」、「修飾塩基」、「塩基類似体」、または「修飾ヌクレオシド」なる用語は、それらの天然の相手と同様に機能するが、構造的に改変されている部分を意味する。
【００６２】
「オリゴヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」なる用語は、ホスホロジエステルまたは他の主鎖形成基によって結合された天然の複素環塩基およびペントフラノシルと等価の基から、特定の配列を形成して結合された複数のヌクレオチドを意味する。
【００６３】
「オリゴヌクレオチド類似体」または「修飾オリゴヌクレオチド」なる用語は、天然のオリゴヌクレオチドと同様に機能するが、非天然部分を有する組成物を意味する。オリゴヌクレオチド類似体または修飾オリゴヌクレオチドは、当技術分野における使用が公知の、変更された糖部分、変更された塩基、両方とも変更された糖および塩基、または変更された糖間結合を有していてもよい。
【００６４】
ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、プローブおよび／またはプライマーの標的配列へのハイブリダイゼーションは、公知かつ当技術分野において認められた塩基対形成性に従い、アデニンがチミンまたはウラシルと塩基対を形成し、グアニンがシトシンと塩基対を形成するように進行する。ヌクレオチドに第二のヌクレオチドと塩基対を形成させるヌクレオチドの性質は相補性と呼ばれる。したがって、アデニンはチミンおよびウラシルの両方に相補的であり、逆も同じである。同様に、グアニンはシトシンに相補的であり、逆も同じである。その全長にわたって標的配列に相補的であるヌクレオチドは、標的配列に完全に相補的である、完全にマッチしている、または全面的に相補的であると言われ、逆も同じである。オリゴヌクレオチドおよびその標的配列は、二つの配列における大多数の塩基が相補的であるが、一つまたは複数の塩基が非相補的、またはミスマッチである、関連配列を有することもある。そのような場合、配列は互いに実質的に相補的であると言われる。オリゴヌクレオチドおよび標的配列の配列が一つ以外のすべてのヌクレオチドの位置で相補的であるような場合、オリゴヌクレオチドおよび標的配列は互いに単一ヌクレオチドミスマッチを有する。
【００６５】
ハイブリダイゼーション条件は当業者には公知で、比較的広い範囲内で変動しうる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーとは、ハイブリダイゼーション条件がミスマッチヌクレオチドを含むハイブリッドの形成を嫌う程度を意味し、これにより完全にマッチしたハイブリッドまたはより少ないミスマッチを含むハイブリッドの形成を促進する。すなわち、ストリンジェンシーがより高いということは、ミスマッチを含むハイブリッドに対する耐容性がより低いということになる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する因子には、温度、pH、イオン強度、ならびにホルムアミドおよびジメチルスルホキシドなどの有機溶媒の濃度が含まれるが、これらに限定されることはない。当業者には公知のとおり、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは高い温度、低いイオン強度、および低い溶媒濃度によって高まる。例えば、アウスベルら、前記；サンブルックら、前記；M.A.イニス（Innis）ら編、PCRプロトコル（PCR Protocols）、Academic Press、サンディエゴ、1990；B.D.ヘイムズ（Hames）ら編、核酸ハイブリダイゼーション：実用的アプローチ（Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach）、IRL Press、オックスフォード、1985；およびヴァンネス（van Ness）ら、（1991）Nucleic Acids Res. 19：5143〜5151を参照されたい。漸進的に高くなるストリンジェンシー条件の例は次のとおりである：ほぼ室温で2×SSC／0.1％SDS（ハイブリダイゼーション条件）；ほぼ室温で0.2×SSC／0.1％SDS（低ストリンジェンシー条件）；約42ECで0.2×SSC／0.1％SDS（中等度ストリンジェンシー条件）；および約68ECで0.1×SSC（高ストリンジェンシー条件）。洗浄は、これらの条件の一つだけ、例えば高ストリンジェンシー条件を用いて行うことができ、または各条件を、例えばそれぞれ10〜15分間、前述の順に、前述の段階のいくつか、もしくは全てを繰り返して用いることもできる。しかし、前述のとおり、至適条件は関与する特定のハイブリダイゼーション反応に応じて変動することになり、経験的に決定することができる。
【００６６】
したがって、オリゴヌクレオチドとその標的配列との間のハイブリッド（二本鎖）の形成において、オリゴヌクレオチドを溶液中で標的配列を含むポリヌクレオチドと共に、ハイブリダイゼーションに有利な温度、イオン強度、pHなどの条件、すなわちハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする。ハイブリダイゼーション条件は、いくつかの状況においては、ハイブリダイズする配列中に一つまたは複数のミスマッチを有する核酸対に比べて、完全にマッチした配列を有する二つの核酸の間のハイブリダイゼーションに有利であるように選択する。他の状況では、より少ないミスマッチを有する核酸の間のハイブリダイゼーションに有利であるような、ミスマッチ配列間でのハイブリダイゼーションを可能にするハイブリダイゼーション条件を選択する。
【００６７】
オリゴヌクレオチドの標的配列へのハイブリダイゼーションの程度は、ハイブリダイゼーション強度としても知られており、当技術分野において公知の方法によって評価される。好ましい方法は、ハイブリッド二本鎖のTmを求める方法である。これは、二本鎖の溶液の温度を徐々に高め、二本鎖の変性を、例えば変性に伴う塩基対のスタッキング解除によって増大する紫外線吸光度でモニターすることにより達成される。Tmは一般に、変性に伴う紫外線吸光度の推移の温度中点と定義される。または、Tmが既知である場合、所望の二本鎖のTmよりも低く、望ましくない二本鎖のTmよりも高いハイブリダイゼーション温度（固定したイオン強度、pHおよび溶媒濃度で）を選択することもできる。この場合、ハイブリダイゼーションの程度の評価は単純にハイブリダイズされたプローブの存在を試験することによって達成される。
【００６８】
「ストリンジェントな条件」なる用語は、プローブオリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドに、完全に相補的である場合にのみ結合することになる、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション条件（一般には温度、濃度、および変性剤の組み合わせ）を意味する。「非ストリンジェントな条件」とは、一つまたは複数の塩基対ミスマッチの存在を耐容するハイブリダイゼーション条件、すなわち実質的に相補的なポリヌクレオチドがハイブリダイズする条件である。実質的に相補的なポリヌクレオチドは、厳密な相補性と、5％以上の塩基の位置で異なっているか、または一塩基対ミスマッチとして少数を含むこともある。
【００６９】
核酸ハイブリダイゼーション反応において、特定のレベルのストリンジェンシーを達成するために用いる条件は、ハイブリダイズする核酸の性質に応じて変動することになる。ハイブリダイゼーション条件を選択する際には、例えば、核酸のハイブリダイズする領域の長さ、相補性の程度、ヌクレオチド配列組成（例えば、GC対AT含量）、および核酸の種類（例えば、RNA対DNA）を考慮することができる。さらに考慮する点は、核酸の一つが、例えばフィルター上に固定されているかどうかということである。
【００７０】
漸進的に高くなるストリンジェンシー条件の例は次のとおりである：ほぼ室温で2×SSC／0.1％SDS（ハイブリダイゼーション条件）；ほぼ室温で0.2×SSC／0.1％SDS（低ストリンジェンシー条件）；約42℃で0.2×SSC／0.1％SDS（中等度ストリンジェンシー条件）；および約68℃で0.1×SSC（高ストリンジェンシー条件）。洗浄は、これらの条件の一つだけ、例えば高ストリンジェンシー条件を用いて行うことができ、または各条件を、例えばそれぞれ10〜15分間、前述の順に、前述の段階のいくつか、もしくは全てを繰り返して用いることもできる。しかし、前述のとおり、至適条件は関与する特定のハイブリダイゼーション反応に応じて変動することになり、経験的に決定することができる。
【００７１】
その最も基本的な形態において、本発明は試験ポリヌクレオチド試料、好ましくはDNAにおいて、一塩基対ミスマッチまたはヌクレオチドの欠失もしくは付加を有するヘテロ二本鎖の存在を検出するために有用な方法および組成物を目的とする。
【００７２】
本明細書に記載の技術は、哺乳動物の疾患（癌および様々な遺伝疾患）に関与するDNA突然変異および多型、ならびにそれらの治療のための治療薬開発を促進する突然変異を検出するために非常に有用である。または、この方法は法医学的適用または商業的（例えば、農業の）種における有用な形質の特定のためにも有用である。
【００７３】
本発明の方法は、ヘテロ二本鎖を調製しうるいかなる突然変異体および野生型核酸対のためにも有用である。本発明の方法の使用の非限定的例には、遺伝疾患、遺伝性または先天性代謝異常に関連する疾患、嚢胞性線維症、ハンチントン舞踏病、筋ジストロフィ、血友病、サラセミア、鎌状赤血球貧血、神経線維腫症、およびすべての悪性腫瘍などの他の遺伝障害を含む、疾患に関連する突然変異の検出が含まれる。本発明の方法の他の有用な適用には、インビトロ突然変異生成の産物のスクリーニングおよび検出、新しい疾患遺伝子の同定、ミニ−もしくはマイクロサテライトDNA、または制限断片結合多型（RFLP）などの多型などの新しい遺伝マーカーの同定、およびSNPの検出が含まれる。本発明の方法は、例えばヒトゲノムプロジェクトの活動から得られたヒト核酸配列を用いての配列情報および突然変異の確認；ヒトで新しく単離された遺伝子座における多型の評価；ならびに、染色体DNAの物理的および遺伝学的地図を作製するために有用な、DNA配列多型を含む遺伝マーカーの確立を含む、基本的な医学研究においても有用である。これらの特徴は、植物、ヒトを含む動物、および微生物（ウイルスを含む）に対して適当に適用することができる。
【００７４】
組換えDNA技術および細胞生物学の一般原理を示し、核酸の単離および取り扱い、核酸の変性およびアニーリング、ハイブリダイゼーションアッセイなどの条件を記載している標準的参考文献には下記が含まれる：サンブルック、J.ら、分子クローニング：実験室マニュアル、第2版、Cold Spring Harbor Press、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1989；アルバース、B.（Albers, B.）ら、細胞の分子生物学（MOLECULAR BIOLOGY OF THE CELL）、第2版、Garland Publishing, Inc.、ニューヨーク州ニューヨーク、1989；ワトソン、J.D.（Watson, J. D.）ら、遺伝子の分子生物学（MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE）、第IおよびII巻、Benjamin/Cummings Publishing Co., Inc.、カリフォルニア州メンローパーク、1987；ダーネル、J.E.（Darnell, J. E.）ら、分子細胞生物学（MOLECULAR CELL BIOLOGY）、Scientific American Books, Inc.、ニューヨーク州ニューヨーク、1986；レウィン、B.M.（Lewin, B. M.）、遺伝子II（GENES II）、John Wiley & Sons、ニューヨーク州ニューヨーク、1985、これらの参考文献はその全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【００７５】
本発明の一つの局面は、「正常な」ポリヌクレオチド二本鎖の塩基の間にインターカレートするには立体的に要求が厳しすぎるが、損傷または誤り存在下で二本鎖の塩基の間にインターカレートすることができる、インターカレート化合物を調製することができるという発見に基づいている。そのような化合物は、ポリヌクレオチドの損傷または誤りの存在を示す、ポリヌクレオチドの損傷または誤りによって特徴付けられる状態を診断する、損傷または誤りのあるポリヌクレオチドを分離または単離する、およびポリヌクレオチドの損傷または誤りによって特徴付けられる状態を治療するために有用である。
【００７６】
本発明の一つの局面は、標的ポリヌクレオチドとプローブオリゴヌクレオチドとの間の相違の存在を調べる方法である。プローブと標的との間の塩基ミスマッチを検出するための、これまでの方法は、プローブおよび標的が完全に相補的であり、それ以外ではない場合にのみハイブリダイゼーションが起こるような、ハイブリダイゼーション条件（例えば、温度および濃度）（「ストリンジェントな条件」）の微妙な調節に頼っていた。しかし、立体的に要求の厳しいインターカレート化合物を用いて、塩基対ミスマッチを有するポリヌクレオチド二本鎖を直接標識することができ、したがって非ストリンジェントな条件、中等度にストリンジェントな条件、または高ストリンジェントな条件下でプローブと標的との間の完全な相補性欠如を直接検出することができる。したがって、本発明の一つの態様において、標的ポリヌクレオチドを含む試料が提供され、これを非ストリンジェントな条件、中等度にストリンジェントな条件、または高ストリンジェントな条件下でプローブオリゴヌクレオチドと接触させ、標識された立体障害のあるインターカレート化合物と接触させ、かつ生成した二本鎖核酸を標識または切断産物の存在について検査する。この方法は他の用途の中でも特に、例えば遺伝性の相違および／または遺伝的欠陥の存在を診断する、疾患または疾患のリスク（例えば、新生物および／または癌などの細胞増殖性障害）を診断する、病原生物の異なる株を識別する、父系を確立する、被検者のDNAと法医学試料において見いだされたDNAとを識別するために用いることができる。試料／標的ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖の形態で提供することができるが、好ましくはプローブオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの前に変性する。プローブオリゴヌクレオチドは、約8〜10塩基の短いものであってもよく、または数千塩基の長いものであってもよい。事実、プローブは標的ポリヌクレオチドと同等の長さまたはそれよりも長くてもよい。
【００７７】
解析される試料は、いかなる興味対象の媒質中であってもよく、一般には医学的、獣医学的、環境的、栄養的、または工業的に重要な試料である。ヒトおよび動物の検体ならびに生物学的液体は特に、これらが核酸またはそれから核酸を調製することができる細胞を含むことを前提として、本発明の方法によって解析することができる。好ましい原料には、血液、精子、他の組織（特に腫瘍組織または細胞）、乳、尿、脳脊髄液、痰、糞便、肺吸引物、咽頭拭い液、性器拭い液および滲出液、直腸拭い液、ならびに鼻咽頭吸引物が含まれる。したがって、解析中の核酸、好ましくはDNAは、血球、腫瘍組織、培養中の細胞、またはいかなる組織も含むいかなる原料からも得ることができ、ヒトを含むいかなる種からも得ることができる。
【００７８】
この方法は、洗浄および精製を単純化するために、標的、プローブ、またはインターカレート化合物を固体支持体に結合することによって容易にすることができる。したがって、例えば、表面に固定されたプローブを有する固体支持体（マイクロウェル形式のプレート、ディップスティック、膜および他の表面など）を提供することができる。望まれる場合には、プローブの相補的部分をスペーサーに結合して、プローブが支持体表面から離れて標的ポリヌクレオチドと相互作用可能にすることもできる。試料ポリヌクレオチドを支持体上に加える、またはスポットし、非ストリンジェントな条件下でプローブとハイブリダイズさせる。次いで、表面を洗浄していかなるハイブリダイズしていない原料も除去し、立体的に要求の厳しいインターカレート物質と接触させ、再度洗浄していかなる結合していない化合物も除去する。プローブおよび標的が厳密に相補的である場合、立体的に要求の厳しいインターカレート化合物は結合せず、信号は現れない。少なくとも一つの塩基対ミスマッチが存在する場合、化合物はインターカレートし検出可能な信号を提供する。選択的に、切断物質、例えば本発明の光切断物質を用いて、結合した二本鎖を切断条件に曝露し、いかなる遊離されたオリゴヌクレオチドも溶出し、かつ得られた断片を、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）でサイズ分けすることにより、塩基対ミスマッチの存在を検出することもできる。プローブ配列および遊離された断片のサイズを知っていれば、塩基対ミスマッチの位置を決定することが可能になる。
【００７９】
本発明のもう一つの態様において、遺伝子発現のアレイによる解析などの、オリゴヌクレオチドのアレイを用いる方法においてオリゴヌクレオチドを用いる。本態様において、異なる既知の配列のオリゴヌクレオチドの並んだアレイを、一つまたは複数の試験ポリヌクレオチド、核酸または核酸集団に対するハイブリダイゼーションのプラットフォームとして用いる。興味対象遺伝子の所与の領域の野生型配列およびすべての可能な突然変異体配列を含むオリゴヌクレオチドをアレイ上に配置することができる。アレイを被検者または生物検体由来のDNAまたはRNAにハイブリダイゼーション条件下で曝露し、続いてアレイを立体障害のある本発明のインターカレート物質に接触させることにより、興味対象遺伝子の野生型または突然変異体状態を調べることが可能になる。例えば、米国特許第5,492,806号；第5,525,464号；第5,556,752号；および特許協力条約国際公開公報第92/10588号および第96/17957号を参照されたい。インターカレート物質は核酸ミスマッチ（例えば、T-T、C-C、A-A、A-C、G-Tなど）の部位でのみインターカレートすることになる。この技術により、完全に相補的な配列および単一ヌクレオチドの相違を有する配列の識別が可能になる。アレイ構築のための材料には、ニトロセルロース、ガラス、シリコンウェーハ、光ファイバーおよび当業者には公知のものなどのアレイ構築に適した他の材料が含まれるが、これらに限定されることはない。
【００８０】
本発明の方法によって検出することができる突然変異の種類には、同型接合および異型接合突然変異の両方が含まれる。異型接合性とは、DNAの相同染色体対の一方において、配列の相違が存在すること意味する。状況に応じて、そのような配列の相違は一般に突然変異（「異型接合性突然変異」）または所与の遺伝子座のもう一つの「対立遺伝子」とも呼ばれる。定義によれば、異型接合性は複相生物のDNAにのみ存在する。
【００８１】
しかし、試料中のDNA分子集団の中でのいかなる検出可能な配列の相違も、本発明の立体障害のあるインターカレート化合物を用いてスクリーニングまたは検出することができるミスマッチまたは誤対合ヘテロ二本鎖を生成することになるため、本発明の方法は異型接合または複相生物の試験に限定されることはない。すなわち、本発明の方法による同型接合突然変異の検出の基本的原理は、ウイルスもしくは最近DNA配列または他の非複相DNA種にも適用可能である。
【００８２】
本発明のもう一つの局面において、細胞中に存在するDNA損傷または誤りを、そのDNAを標識した立体的に要求の厳しいインターカレート化合物と接触させ、化合物が細胞中のDNAに結合するかどうかを調べることによって検出する方法が提供される。この方法は、DNA修復または誤り修正酵素の先天的欠損、癌などの、DNA損傷および／または誤り増大によって特徴付けられる状態を検出または診断するために有用である。さらに、この方法は、他の化合物の所与の宿主細胞に対する突然変異効果を、例えば宿主細胞集団の「自然な」誤り／損傷率を調べ、宿主細胞集団を変異原性である可能性がある物質に曝露し、細胞を標識した立体的に要求の厳しいインターカレート化合物に接触させ、かつ化合物が細胞中のDNAに結合するかどうかを調べることによって評価および定量するために有用である。
【００８３】
細胞内標識は標準的手段、例えば、標識したインターカレート化合物の蛍光を検出することによって検出することができる。本発明の化合物と共に用いるのに適した検出可能な標識またはタグは、当業者には公知で、放射性同位体、発色団、蛍光体、化学発光および電気化学発光物質、磁気標識、免疫学的標識、配位子ならびに酵素標識が含まれるが、これらに限定されることはない。または、切断化合物を用いて、いかなるインターカレートされたDNAも切断することもできる。次いで細胞を溶解し、得られたDNA断片のサイズを調べる（そして対照と比較する）ことができる。
【００８４】
立体的に要求の厳しいインターカレート化合物は、既知のインターカレート化合物および原理から出発し、化合物が正常なポリヌクレオチド二本鎖にインターカレートできなくなるまで、化合物に立体的にかさ高い基を付加することによって調製することができる。そのような化合物は、多数の立体的に要求の厳しい化合物である可能性があるものを含むライブラリを提供し、基板に多数の正常な二本鎖および多数の損傷または誤りのある二本鎖（例えば、一つまたは複数の塩基ミスマッチ、好ましくはいくつかの異なる配列のミスマッチを有する二本鎖）を提供することによって、スクリーニングすることができる。化合物をまず正常な二本鎖に適用し、インターカレートするすべての化合物を除外する。次いで、残りを損傷二本鎖に適用し、インターカレートする化合物を分離および／または同定して、立体的に要求の厳しいインターカレート化合物を提供する。この化合物群は、化合物−二本鎖錯体を十分なエネルギーの光に様々な時間曝露し、光分解によって遊離したいかなる化合物も同定することにより、光分解活性についてさらにスクリーニングすることもできる。したがって、一つの態様において、本発明は本明細書に記載の一般式M（R1）（R2）（R3）3＋を有する立体的に要求の厳しいインターカレート化合物のライブラリを提供する。
【００８５】
立体的に要求の厳しいインターカレート化合物は、当技術分野において公知の様々な方法によって標識することができる。例えば、化合物は放射性原子または高電子密度試薬を取り込むことによって調製することができる。または、化合物は蛍光体、発色団、スピンラベル、酵素、抗体または配位子などと結合することもできる。さらに、いくつかの立体的に要求の厳しいインターカレート化合物は本質的に着色または蛍光性であり、したがって「自己標識」されている。加えて、いくつかの立体的に要求の厳しいインターカレート化合物はインターカレートすると（溶液状態に比べて）蛍光または色素のピークのシフトを示す。そのような化合物は、化合物を加え、インターカレートした化合物を示す色素または蛍光ピークの出現について試料をモニターすることにより、損傷または誤りを含むポリヌクレオチド二本鎖を検出するためのアッセイで用いることができる。
【００８６】
活性のある立体的に要求の厳しいインターカレート化合物は、相当数のポリヌクレオチドの誤りまたは損傷部位の存在によって特徴付けられる状態を診断および治療するために用いることができる。診断は、化合物を細胞中に導入するか、または核酸を細胞から抽出することにより、核酸試料を標識した立体的に要求の厳しいインターカレート化合物と接触させることによって達成される。生成物を存在する誤りまたは損傷の数または量について調べ、対照試料または確立された基準もしくは閾値と比較する。例えば、生検試料を得、細胞を溶解して核酸を抽出し、標識化合物を核酸に加え、試料を結合した標識の存在について調べる。結合した標識は二本鎖の損傷または誤りを示す一方で、結合した標識がない場合、または結合した標識の量がノイズ程度である場合は、正常な二本鎖を示す。
【００８７】
癌などの、局在的な領域の損傷または誤りのある二本鎖によって特徴付けられる状態または障害は、活性のある立体的に要求の厳しいインターカレート化合物を用いて治療することができる。細胞内に入ると、化合物はDNAの損傷またはミスマッチ部位にインターカレートする。ある場合には、塩基間にインターカレートした化合物の存在が、アポトーシスまで、およびアポトーシスを含む細胞活動を誘発するのに十分であることもある。正常なDNAは影響を受けない。結合が十分でない場合には、化合物がインターカレートしているDNAを光分解するのに十分な照明に細胞を曝露する。DNA光分解は、アポトーシスを含む、様々な細胞のメカニズムを誘発し、したがって影響を受けた細胞を除去する。本発明の化合物の、そのような使用のための適切性を、下記の実施例に示す方法を用いて、またはさらに裸のDNAオリゴヌクレオチドの代わりに形質転換された細胞株もしくは臨床腫瘍試料を用いる光切断滴定を行うことにより、解析することができる。
【００８８】
立体的に要求の厳しいインターカレート化合物は、経口または非経口、例えば注射、吸入、経皮などによって投与することができ、インビボまたはエクスビボで投与することもできる。例えば、本発明の化合物を用いて、患者に骨髄を再導入する前（例えば、放射線療法の後）に骨髄から腫瘍細胞を除去することもできる。化合物は全身または局所に、例えば留置カテーテル、制御放出または徐放性植え込み物、ミニポンプなどを介して投与することができる。または、化合物はエアロゾルとして製剤し、肺および気管に投与することもできる。
【００８９】
化合物は、例えば液剤、懸濁剤などの液体剤形、好ましくは正確な用量の一回投与に適した単位剤形に製剤することができる。液体剤形は、注射または注入によって、点鼻薬またはエアロゾルとして投与することができる。または、活性化合物をクリームまたは軟膏組成物として調製し、局所適用することもできる。もう一つの代替法として、シリコンなどの合成高分子や、ゼラチンおよびセルロースなどの天然高分子を用いて、バルクまたは顕微鏡レベルのいずれかでカプセル化することによる、これらの物質の制御放出によって送達を行うこともできる。放出速度は、拡散速度を制御するために用いる高分子系を適当に選択することにより、制御することができる（ランガー、R.S.（Langer, R. S.）およびペッパス、N.A.（Peppas, N. A.）、Biomaterials（1981）2：201）。ゼラチンおよびセルロースなどの天然高分子は、およそ数分から数時間でゆっくり溶解するが、シリコンは数ヶ月の間、完全なまま残存する。組成物は、通常の薬学的担体または賦形剤、および一つまたは複数の活性化合物を含むことになる。加えて、組成物は他の医学的物質、薬学的物質、担体、補助剤などを含んでいてもよい。
【００９０】
投与する化合物の量は、当然のことながら、治療している被検者、苦痛の重症度、投与様式、投与頻度、および処方する医師の判断に応じて変動することになる。適当な濃度は、当業者であれば、日常的実験だけを用いて決定することができる。投与頻度は、望ましくは一時間に一回から一ヶ月に一回の範囲、好ましくは8回／日から二日に一回、より好ましくは一日に1から3回の範囲である。例えば水、食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなどの担体中に、一つまたは複数の活性化合物および選択的な薬学的補助剤を含む軟膏は、例えばワセリン、ラード、またはラノリンなどの基剤を用いて調製することができる。
【００９１】
液化薬学的組成物は、例えば、水、食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなどの担体中に、前述の活性化合物および選択的な薬学的補助剤を溶解、分散、および同様の操作をし、それによって溶液または懸濁液を形成して調製することができる。
【００９２】
本発明は、本明細書に記載の方法を実施するために有用なキットまたは試薬システムも目的とする。そのようなキットは、本明細書に記載の方法によるアッセイを実施するために必要とされる基本的要素を含む試薬の組み合わせを含む。試薬システムは市販の包装された形態で、試薬の適合性が許す場合には組成物もしくは混加物として、試験装置の形態で、またはより典型的には試験キット、すなわち必要な試薬を保持し、通常はアッセイを行うための説明書を含む、一つまたは複数の容器、装置などの包装された組み合わせとして提供される。本発明のキットは、本明細書に記載の様々なアッセイ形式を実行するための、いかなる形態および組成物も含むことができる。
【００９３】
すべての場合に、試薬システムは(1)立体障害のある本発明のインターカレート物質、および(2)アッセイを実施する際に有用な追加の試薬を含むことになる。キットは、選択的に、試験する遺伝子、遺伝子座、またはポリヌクレオチド配列に特異的なオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを含む基板を含んでいてもよい。本発明のキットは、核酸二本鎖と本発明のインターカレート物質との相互作用が起こる緩衝液、および溶液の成分などの補助的化学物質をさらに含むことができる。
【００９４】
下記の実施例は、当業者のための指標として提供するもので、本発明をいかなる様式でも限定すると解釈されることはない。すべての製品は製造者の指示に従って用いられ、実験は特に記載がない限り標準的条件下で行われる。
【００９５】
実施例
一般的考察  NMR試験（1Hおよび13C NMR、2D-COSY、1Hおよび13C NMR-HETCORならびにデカップリング実験）は、General Electric QE Plus 300 MHZ装置で、溶媒を内部標準に用いて実施した。電子スペクトルはVarian Cary 2200およびBeckmann DU 7400 UV/vis分光光度計で測定した。質量分析データは、カリフォルニア州リバーサイドのカリフォルニア大学（FABおよびエレクトロスプレー）およびコロラド州フォートコリンズのコロラド州立大学生物学部、Macromolecular Resources Center（MALDIおよびエレクトロスプレー）の質量分析設備で収集した。CDスペクトルはJasco J-500A分光偏光計で測定した。高性能液体クロマトグラフィ（HPLC）はRainin Microsorb-MV C18 100 AカラムのHP 1050系（液相1.0mL/分、45分間で0.1％トリフルオロ酢酸／水から100％アセトニトリルの直線勾配）により実施した。薄層クロマトグラフィはシリカゲルIB-Fプレート（J.T. Baker）で行った。
【００９６】
特に記載がない限り、市販の化学物質は供給されたままで用いた。RhCl3．2H20はJohnson & MattheyまたはAldrichから、9，10−フェナントレンキノン、（＋）−KSb−酒石酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸、ならびにセファデックスカチオンおよびアニオン交換樹脂はAldrichから、［Rh（NH3）5Cl］Cl2はPfaltz+Bauerから、分光分析品質のMeCNはMerckから、クリセンはAcros Chemicalsから入手した。d8−2，2’−ビピリジンはスイス、フリブールのフリブール大学、P.ベルサー（P. Belser）氏およびA.フォンゼレウスキー（A. von Zelewsky）氏から親切にも御供与いただいた。5，6−クリセン−キノン（グリーブ、V.S.（Greabe, V. C.）およびホニグスバーガー、F.（Honigsberger, F.）、Justus Liebigs Ann. Che77Z.（1900）311：257〜65）および［Rh（NH3）6］（CF3SO3）3（カーチス、N.J.（Curtis, N. J.）ら、1983、J. Anz. Chenz. Soc.（1983）105：5347〜53）は報告されている方法に従って調製した。
【００９７】
ベンゾフェナンジンキノンおよび［Rh（bpy）2phzi］Cl3の合成のための反応スキームを図3に示す。
【００９８】
実施例1
ロジウムアミン中間体の合成
（A）合成および特徴分析  rac−［Rh（phen）2（NH3）2］（PF6）3
ビス（アミン）ビス（フェナントロリン）ロジウム（III）を、文献（ギドニー、P.M.（Gidney, P. M.）ら、1972、J Chem. Soc.、Dalton Trans.2621〜28）の記載に従い、下記の変更を加えて調製した。［Rh（phen）2Cl2］Clの塩化物配位子をニートのトリフルオロメタンスルホン酸中で終夜撹拌することにより置換した（ディクソン、N.E.（Dixon, N. E.）ら、1990、Inorg. Synth. 28：71〜76）。褐色味をおびた溶液を冷却したジエチルエーテルに注意深く加えた。ベージュ色の沈殿を、遠心分離またはろ過のいずれかによって分離し、濃アンモニア溶液に溶解し、15〜30分間還流した。錯体がPF6塩として沈殿し、対イオンをセファデックスQAE-A25アニオン交換カラム上で塩化物に交換し、最後にセファデックスSP-C25カチオン交換カラムで、MeCN／水（1：1）中0．05M  MgCl2で溶出することにより精製した。錯体を含む分画をTLCで確認し、混合し、濃縮し、NH4PF6を加えることにより無色結晶として沈殿させた。収率：53％。
2004522739.tif 000007
【００９９】
鏡像異性体の分離  ラセミ混合物（150mg）を、暗室条件下、長さ150cm（d＝3cm）のセファデックスCM-C25イオン交換カラム上で0．15M（＋）−酒石酸カリウムアンチモン水溶液で溶出することにより分離した（キーン、F.R.（Keene, F. R.）、1997、Coord Chem. Rev. 166：121〜159）。カラムを脱イオン水で洗浄し、次いで平らな表面に注意深く吹き出した。樹脂を20に等分し、暗所でMeCN／水（1：1）により独立に溶出した。金属錯体を含む分画をTLCで確認した。ΔおよびΛ鏡像異性体は、生成物を含まない6分画で分離され、Λ鏡像異性体が最初に溶出された。Λ異性体の分画をロータリーエバポレーターで濃縮し、次いで250mLに希釈した。Δ異性体分画は全量を250mLとし、いずれの場合も吸収分光分析によって濃度を求めた。Λ異性体について得られたΔε値はΔ試料の値よりもおよそ15％低く、ロータリーエバポレーターによる蒸発中の加熱が部分的ラセミ化を引き起こしたことが明らかとなった。
【０１００】
Δ−［Rh（phen）2（NH3）2］Cl3：CD（アセトニトリル／水（1：1）、1.93×10-5M）：225(27)266(44)、280(-80)、304(-16)。
【０１０１】
Λ−［Rh（phen）2（NH3）2］Cl3：CD（アセトニトリル／水（1：1）、2.51×10-5M）：227(-19)、266(-40)、280(70)、303(14)。
【０１０２】
（B）［Rh（bpy）2（NH3）2］Cl3：
錯体を、化合物をPF6塩として沈殿させる代わりに蒸発によって単離した以外は、rac−［Rh（phen）2（NH3）2］（PF6）3について前述したものと同じ方法に従って合成した。
収率：94％。
【０１０３】
2004522739.tif 000008
【０１０４】
（C）［Rh（phen）2（NH3）4］Cl3．［Rh（phen）Cl4］（H3O＋）を、文献（マッケンジー、E.D.（McKenzie, E. D.）、およびプローマン、R.A.（Plowman, R. A.）、1970、J. Inorg Nucl. Chem. 32：199212；ブルームヘッド、J.H.（Broomhead, J. H.）、および（グラムリー、W.（Grumley, W.）、1971、Inorg. Chem. 10：2002〜2009）に記載のとおりに調製した。塩化物配位子をニートのトリフルオロメタンスルホン酸中で終夜処理することにより、トリフルオロメタンスルホン酸塩に交換した（ディクソンら、1990、前記）。褐色味をおびた溶液を冷却したジエチルエーテルに注意深く加えた。ベージュ色の沈殿を、遠心分離またはろ過のいずれかによって分離し、濃アンモニア溶液に溶解し、30分間還流した。溶液を冷却し、次いで蒸発乾固させた。
2004522739.tif 000009
【０１０５】
実施例2
ロジウムインターカレート化合物の合成
（A）典型的調製において、Rh（III）出発物質（50mg）をMeCN／水（3：1）、NaOH中0．1M（32mL）に溶解した。この混合物に1等量以上の、例えば9，10−フェナントレンキノンを加えて立体障害のない対照DNA光切断化合物を生成するか、または5，6−クリセンキノン（chrysi）またはベンゾフェナンジンジイミン（phzi）を加えて立体障害のあるインターカレート化合物を生成する。常に撹拌しながら、反応を室温で約18時間進行させた。希塩酸で中和し、水（500mL）を加えた後、反応混合物を0．05M  MgCl2中で平衡化したセファデックスSP−C25イオン交換カラムに添加した。生成物を0．05〜0．5M  MgCl2の勾配溶出により精製し、橙色生成物のバンドを集めた。分画をWaters Sep-Pak 5g Cl8カートリッジで濃縮し、大量の水で洗浄した。金属錯体をカートリッジから最少量のMeCN／水（1：1）中0.1％TFAで溶出し、凍結乾燥により乾固させた。
【０１０６】
rac［Rh（phen）2（phi）Cl3
この橙色化合物を前述の概略に従って調製した。収率：86％。特徴分析データは文献データとよく一致していた（パイル、A.M.（Pyle, A. M.）ら、1990、Inorg. Chemin. 29：4487〜4495）。
【０１０７】
Δ−［Rh（phen）2（phi）］（PF6）3
水酸化ナトリウム（0.6g）をΔ−［Rh（phen）2（NH3）2］Cl3（18.4mg、0.037mmol）を含むMeCN／水（1：1）（100mL）に溶解した。アセトニトリル（50mL）中の9，10−フェナントレンキノン（8mg、0.038mmol）を加え、混合物を室温で撹拌した。時々一定量（400μL）を取り出し、MeCN／水（1：1）中1．16M  HCl（100μL）と混合した。これらの試料を続いてHPLCで分析した。1日後、反応混合物を希塩酸で中和し、約20mLまで濃縮した。NH4PF6（1g）で錯体を沈殿させ、セライト上に回収した。残渣を最少量のアセトニトリルに溶解し、蒸発乾固させた。収量：26.1mg（64％）。特徴分析データ（1H NMR、MS、CD、UV/vis）は報告されているデータ（パイル、A.M.（Pyle, A. M.）ら、1990、J. Am. Chem. Soc. 112：9432〜9434）とよく一致しているが、CD分光分析でわずかに高いΔε値が観察された。
【０１０８】
CE（アセトニトリル、1.47×10-5M）：261(99)、275(-179)、346(-24)。
【０１０９】
rac−［Rh（bpy）2（phi）］（PF6）3
この生成物は［Rh（bpy）2（NH3）23＋から出発して合成した。特徴分析データは報告されているデータ（シトラニ、A.（Sitlani, A.）、およびバートン、J.K.（Barton, J. K.）、1994、Biochemistry 33：12100〜12108）とよく一致している。
【０１１０】
rac［Rh（bpy）2（chrysi）］Cl3
［Rh（bpy）2（NH3）2］（PF6）3（195.5mg、0.22mmol）および5，6−クリセンキノン（56.8 mg、0.22 mmol）を大気条件下でアセトニトリル（15mL）に素早く撹拌しながら溶解した。水酸化ナトリウム水溶液（5mL、0．4M）を加え、蒸発を防ぐため、反応容器に栓をした。3時間後、0．4M塩酸（5〜6mL）を加えて反応を停止させた。混合物を前述のとおりに希釈し、精製し、単離した。収量：28mg（83％）。
2004522739.tif 000010
【０１１１】
（B）鏡像異性体の分離
錯体の鏡像異性体をセファデックスSP-C25カラム上で0．15M  （＋）−Ksb酒石酸塩／水で溶出して分離した（Keene、1997、前記）。分離した橙色の分画は、Λ異性体がより速く溶出されており、これらを集めてWaters Sep-Pak 5 g C18カートリッジで濃縮した。水洗後、残渣を最少量のMeCN／水（1：1）に溶解し、蒸発乾固させた。
【０１１２】
Δ−［Rh（bpy）2（chrysi）］Cl3：CD（水、7.76×10-6M）：233(34)264 (26)、286(-12)、308(-42)、318(-100)、341(6)。
【０１１３】
Λ−［Rh（bpy）2（chrysi）］Cl3：CD（水、7.76×10-6M）：233 (-34)264(-26)、286(12)、308(42)、318(100)、341(-6)。
【０１１４】
rac−［Rh（d8−bpy）2（chrysi）］Cl3：この錯体は前述のとおりであるが、重水素化2，2’−ビピリジンを用いて合成した。
【０１１５】
rac−［Rh（phen）2（chrysi）］Cl3：この化合物はrac［Rh（bpy）2（chrysi）Cl3と同様に調製した。収率：77％。
【０１１６】
rac−［Rh（phen）（phi）2］Cl3：この橙色化合物は［Rh（phen）（NH3）4]Cl3および2当量の9，10−フェナントレンキノンから、前述の概略に従って調製した。生成物をセファデックスSP-C25カチオン交換カラム上で、数滴の希HClで酸性化した1．0M  MgCl2で溶出して精製した。収率：54％。特徴分析データは文献とよく一致していた（シトラニ、1994、前記）。
【０１１７】
rac−［Rh（phen）（chrysi）2］Cl3：この橙／褐色化合物は［Rh（phen）（NH3）4］C13および5当量のクリセンキノンから前述のとおりに調製し、［Rh（phen）（phi）2］C13について記載した方法を用いて精製した。収率：48％。
【０１１８】
rac−［Rh（phen）（phi）（chrysi）］Cl3：［Rh（phen）（NH3）4］（CF3SO3）3（17mg、0.021mmol）をアセトニトリル（9.6mL）、水（2.0mL）、およびNaOH溶液（1．6M、1.2mL）中、9，10−フェナントレンキノン（5.4mg、0.026mmol）と混合した。室温で60分間撹拌した後、5，6−クリセンキノン（9.9mg、0.039mmol）を加えた。20時間後、希塩酸で中和することにより反応を停止した。生成物をセファデックスSP-C25カチオン交換カラム上で、0．05〜0．5M  MgCl2の勾配で溶出して精製した。赤色生成物のバンドを集め、分画をWaters Sep-Pak、5 g Cl8カートリッジで濃縮し、大量の水で洗浄した。金属錯体をカートリッジから最少量のMeCN／水（1：1）中0.1％TFAで溶出し、凍結乾燥して乾固させた。収量：14mg（75％）。
【０１１９】
1H NMR（D2O、300MHZ）：8.94、8.36、8.08、7.80、および7.60に中心を持つ複雑な多重線。積分は所望の生成物に一致していた。
【０１２０】
MS（エレクトロスプレー）：745.3（18、M+-3C1)、744.3（75、M+-3CI-lH)、743.2（100、M+- 3C1-2H）。
【０１２１】
実施例3
光切断
下記の配列を有する一組のDNA二本鎖を調製した：
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式中、XおよびYは変動してA-T、G-C、および次のミスマッチを提供する：C-C、C-A、T-T、A-A、T-C、T-G、G-A、およびG-G。オリゴヌクレオチドはすべて標準的ホスホラミダイト化学を用いて調製し、逆相HPLCで精製した。オリゴヌクレオチドはγ-32P ATP（Dupont-NEN）およびT4ポリヌクレオチドキナーゼ（New England Biolabs）で5'-末端標識した。
【０１２２】
二本鎖（10μM）をΔまたはΛ［Rh（bpy）2（chrysi）］3＋（50mMトリス、20mM NaOAc、18mM NaCl、pH7.0中1μM）と共に11分間インキュベートし、次いでOriel HgXeアークランプを用い、365nmで13分間照射した。生成物をPAGE（20％、変性）で分析し、Molecular Dynamics Phosphorimagerを用いて画像化した。最も強い切断強度は、Δ鏡像異性体でC-C-ミスマッチを含む二本鎖に対して観察された。ここで、切断はミスマッチ部位の3'側で起こった。強度は低いが、同様の切断が、他のピリミジン−ピリミジンミスマッチT-TおよびT-Cで観察された。C-A、すなわち切断される一つのプリン−ピリミジンミスマッチは異なるパターンを示した。強い切断が、ミスマッチCおよびミスマッチ部位の3'側の隣接する塩基で明らかであった。他の認められているミスマッチとは異なり、C-Aの3'側での切断により、異なるゲル移動度を有する二つの生成物、多分化学的に異なるポリマー末端の結果としての生成物が生じる。A-Aの切断も特徴的であった。Δ鏡像異性体は、その部位の3'側の塩基での強い切断、およびA-A部位自体での少量の切断を促進する。A-AミスマッチはΛ鏡像異性体によって切断される唯一の対でΔ異性体に比べると弱い切断である。
【０１２３】
同様のシステムに対する他のDNA光切断実験は、 Δ−［Rh（bpy）2（chrysi）］3＋によるDNA切断はミスマッチ部位の5'および3'側の塩基（配列番号：1のT/Aおよび配列番号：4のC/G）によって影響されることを示した。これらの塩基が系統的に変更された場合、光切断はミスマッチ配列コンテキスト（context）の組み合わせ104のうち83（80％）で観察された。
【０１２４】
実施例4
光切断滴定
次の配列を用いて一つのC-Cミスマッチを有するヘアピンDNAオリゴヌクレオチドを合成した：
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ヘアピンを、前述の実施例2に記載のとおり、Δ−［Rh（bpy）2（chrysi）］3＋により313nmまたは365nmのいずれかで7.5から15分間光切断した。ヘアピンDNA濃度は、Rh錯体をDNA濃度の0.10×で用いた場合、3×10-10Mから1×10-4Mまで変動した。切断生成物を20％変性ポリアクリルアミドゲルを通して溶出し、Molecular Dynamics PhosphorimagerおよびImageQuantソフトウェアを用いて解析した。切断はヘアピンの両側のC-Cミスマッチの3'側で観察され、末端標識に最も近い切断バンドだけを定量した。複数の試験からのデータを正規化し（白丸）、標準の単一結合部位結合モデル（実線）にあてはめた。
【０１２５】
熱力学的結合定数は8.4(.+-.1.0)×105M-lと求められた。他のミスマッチ部位での同様のDNA光切断滴定により、Δ−［Rh（bpy）2（chrysi）］3＋の親和性は1×107から3×105M-lの間であると推定されている。選択性のレベルを調べるために、Δ−［Rh（bpy）2（chrysi）］3＋のB-型DNAへの平均結合定数も求めた。33量体での光切断はヘアピンと正確に一致し、非標識25量体B-DNAとの競合滴定により、4(.+-.2)×104M-1なる非特異的結合親和性の平均値が得られた。
【０１２６】
前述の発明は、明確性および理解のための説明および実例として幾分詳細に記載しているが、当業者であれば本発明の開示を鑑みて、特許請求の範囲または精神から逸脱することなく、本発明に対し特定の変更および改変を加えうることを理解すると思われる。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】本発明の二つの立体的に要求の厳しい金属インターカレーター 、［Rh（bpy）2chrysi］（BC）および［Rh（bpy）2phzi］（BZ）の塩基対ミスマッチ検出能力の比較試験結果を示す図である。
【図２】本発明の化合物［Rh（bpy）2phzi］Cl3の線画およびそのCDCl3中での1H NMRスペクトルを示す図である。
【図３】ベンゾフェナンジンキノン（phzi）および本発明の化合物［Rh（bpy）2phzi］Cl3合成のための反応スキームを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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