(57)【要約】トランスフェリンまたはトランスコバラミンと抗原虫薬との複合体は、原虫感染症の治療に有用である。好適な抗原虫薬としては、アポトーシス誘導化合物、細胞毒性抗生物質、アルキル化剤、植物毒素及び変異細菌毒素が挙げられる。トランスフェリンまたはトランスコバラミンは、グルタルアルデヒドを用いて抗原虫薬に結合させることが好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
原虫感染細胞の治療方法であって、
前記細胞に、原虫感染細胞標的剤と、抗原虫薬とを含有する複合体の抗原虫有効量を投与することを含み、前記抗原虫薬は、アポトーシス誘導化合物、細胞毒性抗生物質、アルキル化剤、植物毒素及び変異細菌毒素からなる群から選択される方法。
【請求項２】
前記抗原虫薬は、ドキソルビシン、デフェロキサミン、メラーソプラル、エフロルニチン、ペンタミジン、キニーネ、メフロキン、アモジアキン、プリマキン、ピリメタミン、スルファドキシン、スルファジアジン、トリメトプリム、五価アンチモン、アムホテリシンＢ、リファンピン、メトロニダゾール、ケトコナゾール、ベンズニダゾール、ニフルティモックス、スラミン、リシン及び修飾ジフテリア毒素からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記原虫感染細胞ターゲッティング剤はトランスフェリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記原虫は、プラスモジウム種とトリパノソームとからなる群から選択される請求項２に記載の方法。
【請求項５】
原虫感染患者を治療する方法であって、前記患者に、原虫感染細胞ターゲッティング剤と抗原虫薬とを含有する複合体を有効量投与することからなり、前記抗原虫薬は、アポトーシス誘導化合物、細胞毒性抗生物質、アルキル化剤、植物毒素及び変異細菌毒素からなる群から選択される方法。
【請求項６】
前記原虫感染細胞ターゲッティング剤は、トランスフェリンとトランスコバラミンとからなる群から選択される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記抗原虫薬は、ドキソルビシン、デフェロキサミン、メラーソプラル、エフロルニチン、ペンタミジン、キニーネ、メフロキン、アモジアキン、プリマキン、ピリメタミン、スルファドキシン、スルファジアジン、トリメトプリム、五価アンチモン、アムホテリシンＢ、リファンピン、メトロニダゾール、ケトコナゾール、ベンズニダゾール、ニフルティモックス、スラミン、リシン及び修飾ジフテリア毒素からなる群から選択される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記原虫は、プラスモジウム種とトリパノソームとからなる群から選択される請求項５に記載の方法。
【請求項９】
複合体と担体とからなる、原虫感染症の治療に適した製剤組成物であって、前記複合体は、原虫感染細胞ターゲッティング剤と、抗原虫薬とからなる製剤組成物。
【請求項１０】
前記抗原虫薬は、ドキソルビシン、デフェロキサミン、メラーソプラル、エフロルニチン、ペンタミジン、キニーネ、メフロキン、アモジアキン、プリマキン、ピリメタミン、スルファドキシン、スルファジアジン、トリメトプリム、五価アンチモン、アムホテリシンＢ、リファンピン、メトロニダゾール、ケトコナゾール、ベンズニダゾール、ニフルティモックス、スラミン、リシン及び修飾ジフテリア毒素からなる群から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ターゲッティング剤は、トランスフェリンとトランスコバラミンとからなる群から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
さらに非複合抗原虫薬からなる請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ターゲッティング剤は、トランスフェリンである請求項９に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ターゲッティング剤は、ドキソルビシンである請求項９に記載の組成物。
【請求項１５】
ターゲッティング剤と抗原虫薬とからなる、実質均質な複合体。
【請求項１６】
前記抗原虫薬は、メラーソプラル、エフロルニチン、ペンタミジン、キニーネ、メフロキン、アモジアキン、プリマキン、ピリメタミン、スルファドキシン、スルファジアジン、トリメトプリム、五価アンチモン、アムホテリシンＢ、リファンピン、メトロニダゾール、ケトコナゾール、ベンズニダゾール、ニフルティモックス、スラミン、リシン及び修飾ジフテリア毒素からなる群から選択される請求項１５に記載の複合体。
【請求項１７】
前記ターゲッティング剤は、トランスフェリンとトランスコバミンとからなる群から選択される請求項１５に記載の複合体。
【請求項１８】
前記ターゲッティング剤は、トランスフェリンである請求項１５に記載の複合体。
【請求項１９】
抗原虫薬に対する原虫感染細胞の感受性を測定する試薬キットであって、それぞれが蛋白質ターゲッティング剤と抗原虫薬とを含有する２種類以上の複合体からなり、当該複合体同士が異なる抗原虫薬を有するものである試薬キット。
【請求項２０】
前記抗原虫薬は、メラーソプラル、エフロルニチン、ペンタミジン、キニーネ、メフロキン、アモジアキン、プリマキン、ピリメタミン、スルファドキシン、スルファジアジン、トリメトプリム、五価アンチモン、アムホテリシンＢ、リファンピン、メトロニダゾール、ケトコナゾール、ベンズニダゾール、ニフルティモックス、スラミン、リシン及び修飾ジフテリア毒素からなる群から選択される請求項１９に記載の試薬キット。
【請求項２１】
所定の抗原虫薬を有する複合体の製造方法であって、
当該製造方法が、
ａ）抗原虫薬溶液をリンカー分子溶液が過剰な分子に滴下して添加し、各抗原虫薬分子を薬物／リンカー組合せ中の１個のリンカー分子に結合させる工程と、
ｂ）当該薬物／リンカー組合せを蛋白質と反応させ、所定の抗原虫薬：蛋白質比を有する複合体を生成する工程と、からなる複合体の製造方法。
【請求項２２】
任意の過剰リンカーを捕捉することをさらに含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記リンカーは、グルタルアルデヒド、ベンゾイルヒドラゾン、マレインイミド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドからなる群から選択される請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に生物作用物質の分野、より具体的には、寄生虫に感染している細胞の治療に好適な生物作用物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
原虫は、哺乳類の宿主内で感染と増殖とが可能な単細胞の真核生物である。原虫は、昆虫宿主を始めとする２つ以上のタイプの宿主を、生涯を通して利用する。寄生虫原虫は、世界中の感染症のかなりの部分を占める。原虫感染症の大部分は発展途上国で発生しているが、これらの感染症は、先進諸国中で移民や免疫抑制者の間で増えている。よく見受けられる寄生虫症には、マラリア、トリパノソーマ症及びシャーガス病がある。原虫感染症は、血液脳関門に浸透する有効な化学療法薬の不足や、当該療法薬の過剰な毒性、及び更に広がりを見せる当該療法薬に対する抵抗があり、問題となっている。原虫により引き起こされる寄生虫感染症治療のための、よく知られ且つ現に用いられている薬物には、メラーソプラル、エフロルニチン、クロロキン、キニーネ、メフロキン、アモジアキン、プリマキン、ピリメタミン、スルファドキシン、スルファジアジン、トリメトプリム、五価アンチモン、ペンタミジン、アムホテリシンＢ、リファンピン、メトロニダゾール、ケトコナゾール、ベンズニダゾール、ニフルティモックス、及びハロファントリンクがある。
【０００３】
薬物関連治療において、よく見られる２つの問題は、患者を衰弱させる薬物毒性問題と、より多くの薬物を必要とすることから薬物毒性問題を増大させて、しばしば死に至らしめる薬物耐性の問題がある。薬物毒性問題を解決する１つの方法は、疾患細胞のみを標的とするように薬物を送達することである。多くの研究者が、薬物送達のための抗体開発を研究中であり、この手法は有望でもある。しかしながら、抗体には問題がなくもない。例えば、抗体は正常組織と交差反応をすることが多く、また血管を損傷し（例えば、血管漏出症候群）、危険なアレルギー反応（例えば、アナフィラキシー）を引き起こす可能性がある。
【０００４】
特定の細胞に対して毒性である薬物を含む薬物送達による悪性細胞の治療法は、新しいものではない。特許文献１；特許文献２；特許文献３；特許文献４；および特許文献５は、ガン細胞の治療としてまたはガン細胞を造影するために、蛋白質、主にトランスフェリンに複合化された細胞毒性物質または放射性造影物質を記載している。
【０００５】
例えば、寄生虫感染のヒト宿主細胞などのストレスを受けている細胞は、鉄などの栄養物の送達増加を必要とし、その増加は、鉄の場合、トランスフェリンなどの栄養担体に提示する受容体数の増加によってなされることが知られている。ストレスを受けている細胞において栄養担体に対する受容体増加は比較的一定であり、間欠的に比較的少数の受容体を示すことが知られているストレスを受けていない細胞よりもけた違いに大きな数であることが知られている。上記に掲げた出版物およびその他のものは、ストレスを受けた細胞に対し造影物質または薬物またはその双方を送達するために、ガン含有細胞によって提示される、特にトランスフェリンに関する受容体数増加を利用することを開示している。
【０００６】
ストレスを受けた細胞の全てで、トランスフェリン受容体のアップレギュレーションがあるのか、また正常細胞の全てで、トランスフェリン受容体のダウンレギュレーションがあるのかを問うている研究はないが、多くの出所データにより、正常細胞の全てで、トランスフェリン受容体のダウンレギュレーションがあることが示唆されている。例えば、幼若赤血球（すなわち、正常赤芽球および細網赤血球）は、表面にトランスフェリン受容体を有するが、成熟赤血球は有さない（非特許文献１）。循環性単球でもまた、トランスフェリン受容体のアップレギュレーションはなく（非特許文献２）また、クッパー細胞などのマクロファージは、赤血球貪食というトランスフェリン非依存的方法により鉄の大部分を獲得する（非特許文献３）。実際、インビボ研究では、鉄が血漿トランスフェリンから細網内皮系にほとんど入らないことが示されている（非特許文献４）。マクロファージトランスフェリン受容体は、ガンマインターフェロンなどのサイトカイン類によりダウンレギュレートされ（非特許文献５）、細胞内寄生体を死滅させるための鉄制限機構としてダウンレギュレートされると推定されている（非特許文献６）。
【０００７】
休止リンパ球において、トランスフェリン受容体はダウンレギュレートされるのみならず、トランスフェリン受容体の遺伝子は測定不能である（非特許文献７）。対照的に、刺激されたリンパ球は、後期Ｇ１におけるトランスフェリン受容体をアップレギュレートする（非特許文献８）。受容体発現は、ｃ−ｍｙｃ癌原遺伝子の発現、次いでＩＬ−２受容体のアップレギュレーションに引き続き起こり（非特許文献９）、それに伴って鉄調節蛋白結合活性の測定可能な増加があり（非特許文献１０）、これによりトランスフェリン受容体ｍＲＮＡが安定化される（非特許文献１１）。これは、Ｔリンパ球およびＢリンパ球の双方に当てはまり（非特許文献１２）、またＩＬ−２依存性の応答である（非特許文献１３）。
【０００８】
マラリア
世界の人口のおよそ４０％がマラリアの危険に晒されている。即ち、約１００ヶ国で２０億人を超える人々が危険に晒されている（Ｇｉｌｌｅｓ、１９９１年、世界保健機関、ジュネーブ）。特に、感染しているのは発展途上国の子供たちである（非特許文献１４）。例えば、サハラ以南のアフリカでは毎年１００万人の子供たちがマラリアで死んでいる（非特許文献１５）。旅行、貿易及び観光の増加により、マラリアは発展途上国にまで広がっている（非特許文献１６）。これらの社会問題及び経済問題は、ベクトル制御の複雑さと、効果的なマラリアワクチンの問題のある開発とが重なったものである（非特許文献１７）。このように、抗マラリア薬はマラリア防御の砦であるが、薬物耐性熱帯マラリアの発生の広がりによって陳腐化しつつあり、安全で広く入手でき且つ安価な、クロロキンのような薬物がますます効かなくなってきている（非特許文献１８）。総合して考えると、以上の所見は、マラリアとの戦いにおける新たな薬物戦略が急務であることを示している。本発明は、抗マラリア薬計画のための新たな戦略を提供するものである。
【０００９】
熱帯マラリア寄生虫は、その宿主の赤血球内で速く繁殖する。赤血球は、メロゾイト段階の寄生虫により侵入され、栄養型段階に成熟してそのＤＮＡを充分に複製し、４８時間以内に３２個の娘細胞を生成する。成長中のあらゆる細胞のように（非特許文献１９）、成長中の変形体は、ＤＮＡ合成のためのリボヌクレオチド還元酵素（非特許文献２０）や、ピリミジン合成のための鉄依存性酵素や、ＣＯ２固定やミトコンドリアの電子伝達（非特許文献２１）のような主要酵素の機能促進のために鉄分を必要とする。変形体の発達における鉄分の重要性は、体外モデル（非特許文献２２）及び体内モデル（非特許文献２３）の両方に示されているが、そこでは寄生虫の成長は鉄のキレート化により抑制される。最も広く研究されている鉄キレート化剤はディフェロキシミンであり、これは鉄分を強固に（即ち、１０３１／Ｍの親和力）結合させるシデロフォアまたはキレート化剤である（非特許文献２４）。重症の脳マラリア（例えば昏睡状態）に罹ったザンビアの子供たちに関する臨床研究によると、抗マラリア療法にデフェロキサミン（１日当たり１００ｍｇ）を加えた標準プログラムで治療が行なわれた患者は、抗マラリア療法にディフェロキサミンを加えなかった同じプログラムでの治療を受けた患者より速く回復したことが判った（非特許文献２５）。変形体の成長や発達において鉄分が果たす重要な役割という観点から、変形体はどのようにして鉄分を得るのか、また寄生虫は、鉄分を得るのに用いられる代謝経路を妨げる薬物で殺せるのかといったことに多くの研究がなされている。理論的には、変形体は自分らが住む赤血球内からも、鉄分を運ぶ血液中の通常の蛋白質である患者のトランスフェリンからも、いずれでも鉄分を摂取できる（非特許文献２６）。変形体が、赤血球から鉄分を得ることができるのは殆ど疑いが無い（非特許文献２７）。患者のトランスフェリンから鉄分を得るには、赤血球上にトランスフェリン受容体がなくてはならないが、正常成人の赤血球にはトランスフェリン受容体は現れない（非特許文献２８）。しかし、マラリアに感染した赤血球はトランスフェリンを結合させ（非特許文献２９）、熱帯マラリアに感染した赤血球の原形質膜中の１０２ｋＤ（非特許文献３０）及び９３ｋＤ（非特許文献３１）のトランスフェリン受容体を確認するデータが作成されている。これらの所見には異論がある（非特許文献３２）が、その後の実験で、受容体は坑変形体毒素を感染赤血球に運搬する程度まで機能を果たし、このような運搬はトランスフェリンに対する抗体によって阻害される（Ｓｕｒｏｌｉａ  ＆  Ｍｉｓｑｕｉｔｈ，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １９９６年；３９６：５７頁）。
【００１０】
トリパノソーマ症
トリパノソーマ症はトリパノソーマにより引き起こされる寄生虫感染症であり、トリパノソーマは、感染したツェツェ蝿に刺されてヒトに感染する原虫である（非特許文献３４）。患者に導入されると、トリパノソーマは血液中及びリンパ腺内に増殖するが、これが病気の初期である。この病気の後期になると、寄生虫が血液脳関門を行き来して、神経障害や一般に眠り病として知られる嗜眠を引き起こす（非特許文献３５）。治療しないまま放置すると、ヒト及び動物共にトリパノソーマ症は不治の病となる（非特許文献３６）。
【００１１】
異なるトリパノソーマ亜種によって引き起こされる感染形態には、臨床学的に見て２種類ある。第一に、トリパノソーマ・ブルーセイ・ガンビエンスは、進行した段階に達するのに数年かかる慢性疾患を引き起こす。第二に、トリパノソーマ・ブルーセイ・ローデシエンスは、数週間内に致命的となる急性疾患を引き起こす。どちらの病気もアフリカの風土病であり、トリパノソーマ・ブルーセイ・ガンビエンスの感染は今や疫病であり、サハラ以南のアフリカ３６ヶ国に住む６０００万人が危機にある（非特許文献３７）。加えて、トリパノソーマ症はアフリカ（非特許文献３８）やヒト（非特許文献３９）に限定されず、これらの病気の経済への影響は、国民経済に深刻な影響を与える（非特許文献４０）。
【００１２】
トリパノソーマ症の診断方法はこれまで、患者の病期の特定を目的としたものであったが、その理由は、血液やリンパ腺に限定して初期感染であれば、中枢神経系に関わる後期感染より毒性の少ない薬物での治療が可能だからである（非特許文献４１）。中枢神経系感染（即ち、眠り病）の治療薬には、現在２種類ある。最も安価で入手し易く、また最も有毒なのはメラーソプラルであるが、これは服用者の５〜７％に致命的な脳障害を誘発するヒ素薬剤である（非特許文献４２）。これらの問題は薬物耐性、低回答率、１０％もの高再発率によって悪化している（非特許文献４３）。毒性がより低く、より高価で入手困難な、メラーソプラルに代わるものはエフロルニチンであるが、これはポリアミン合成を妨げるオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤である（非特許文献４４）が、この分子は現在のところ、高価な抗癌剤として市販されている。
【００１３】
初期感染の治療には、現在更に２種類の薬物が入手できる。その内の１つであるペンタミジンは１９４１年に開発され、残りのスラミンは１９２０年に開発された。ペンタミジンは、エイズ患者に多く発生するニューモシスティスカリニ感染症にも効果があり、スラミンより４倍以上高価で、今のところはトリパノソーマ症にのみ用いられている。トリパノサイド活性を備える化合物は他にもある（非特許文献４５）が、これらの殆どは血液脳関門を越えないため、中枢神経系の感染症への有用性には限界がある。
【００１４】
薬物の標的送達は、有効性を増加させる利点を有する一方、より少量の薬物を用いることにより、毒性を減じ、正常細胞に引き起こす損傷を少なくし、これら全てによって効果的にコストが減少し、患者医療の質も向上する。また標的送達により、薬物が細胞へ非特異的に入り込むことにより活性化される薬剤耐性が避けられる（非特許文献４６）。トランスフェリン−薬物複合体は、受容体特異的な経路を使用することにより特異的に細胞に入り込むため（非特許文献４７；非特許文献４８）、それらは、耐性細胞中の流出ポンプなどの薬物耐性機構の周縁でやりとりされる。寄生原虫の侵入によって病気に罹った細胞を選択的に標的にし、これを除去するための安価で効果のある薬剤に対する未だ満たされていない必要性がある。
【００１５】
【特許文献１】
米国特許第４，８８６，７８０号
【特許文献２】
米国特許第４，８９５，７１４号
【特許文献３】
米国特許第５，０００，９３５号
【特許文献４】
Ｆａｕｌｋへの米国特許第５，１０８，９８７号
【特許文献５】
Ｓｔｊｅｒｎｈｏｌｍらへの米国特許第４，５９０，００１号
【非特許文献１】
Ｌｅｓｌｅｙ  Ｊ、Ｈｙｍａｎ  Ｒ、Ｓｃｈｕｌｔｅ  ＲおよびＴｒｏｔｔｅｒ  Ｊ、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｏｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ」、  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、  １９８４年；８３：１４〜２５頁
【非特許文献２】
Ｔｅｓｔａ  Ｕ、Ｐｅｌｏｓｉ  ＥおよびＰｅｓｃｈｌｅ  Ｃ、「Ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ」、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｏｎｃｏｇｅｎ、１９９３年；４：２４１〜２７６頁
【非特許文献３】
Ｂｏｔｈｗｅｌｌ  ＴＡ、Ｃｈａｒｌｔｏｎ  ＲＷ、Ｃｏｏｋ  ＪＤおよびＦｉｎｃｈ  ＣＡ、「Ｉｒｏｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  Ｍａｎ」、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９７９年
【非特許文献４】
このレビューについて、Ｐｏｎｋａ  ＰおよびＬｏｋ  ＣＮ、「Ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１９９９年；３１：１１１１〜１１３７頁を参照
【非特許文献５】
Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＴＡ、Ｇｒａｙ  ＰＷおよびＡｄａｍｓ  ＤＯ、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｏｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｉｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇａｍｍａ」、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９８４年；８９：４７８〜４８８頁
【非特許文献６】
Ｂｙｒｄ  ＴＦおよびＨｏｒｏｗｉｔｚ  ＭＡ、「Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇａｍｍａ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ  ｂｙ  ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｉｒｏｎ」、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１９８９年；８３：１４５７〜１４６５頁
【非特許文献７】
Ｋｒｏｎｋｅ  Ｍ、Ｌｅｏｎａｒｄ  Ｗ、Ｄｅｐｐｅｒ  ＪＭおよびＧｒｅｅｎｅ  ＷＣ、「Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ」、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ、１９８５年；１６１：１５９３〜１５９８頁
【非特許文献８】
Ｇａｌｂｒａｉｔｈ  ＲＭおよびＧａｌｂｒａｉｔｈ  ＧＭ、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｏｎ  ｍｉｔｏｇｅｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ：ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｖｅｎｔｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９８３年；１３３：７０３〜７１０頁
【非特許文献９】
Ｎｅｃｋｅｒｓ  ＬＭおよびＣｏｓｓｍａｎ  Ｊ、「Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｔｏｇｅｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９８３年；８０：３４９４〜３４９８頁
【非特許文献１０】
Ｔｅｓｔａ  Ｕ、Ｋｕｈｎ  Ｌ、Ｐｅｔｒｉｎｉ  Ｍ、Ｑｕａｒａｎｔａ  ＭＴ、Ｐｅｌｏｓｉ  ＥおよびＰｅｓｈｌｅ  Ｃ、「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｒｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ｓ）ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｅｘｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｖｅｒｓｕｓ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、１９９１年；２６６：３９２５〜３９３０頁
【非特許文献１１】
Ｓｅｉｓｅｒ  Ｃ、Ｔｅｘｉｅｉｒａ  ＳおよびＫｕｈｎ  ＬＣ、「Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍＲＮＡ」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、１９９３年；２６８：１３，０７４〜１３，０８０頁
【非特許文献１２】
Ｎｅｃｋｅｒｓ  ＬＭ、Ｙｅｎｏｋｉｄａ  ＧおよびＪａｍｅｓ  ＳＰ、「Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  Ｂ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ」、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９８４年；１３３：２４３７〜２４４１頁
【非特許文献１３】
Ｎｅｃｋｅｒｓ  ＬＭおよびＴｒｅｐｅｌ  ＪＢ、「Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ、１９８６年；４：４６１〜４７０頁
【非特許文献１４】
Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ他，Ｔｒａｎｓ  Ｓｏｃ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ  １９８７年；８１：４７８頁
【非特許文献１５】
世界保健機関、１９７４年、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５３７号
【非特許文献１６】
Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ＆ ｌｏｂｅｌ、 Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ  １９９０年；１１３：３２６頁
【非特許文献１７】
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【非特許文献１８】
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、マラリア、トリパノソーマ症及びシャーガス病（これはトリパノソーマブルズィによって起こり得る）等の寄生原虫感染症治療用物質を提供するものである。当該物質は、トランスフェリンまたはトランスコバラミン等のターゲッティング剤と、抗原虫薬とからなる複合体である。適した薬物には、ドキソルビシン、デフェロキサミン、メラーソプラル、エフロルニチン、ペンタミジン、キニーネ、メフロキン、アモジアキン、プリマキン、ピリメタミン、スルファドキシン、スルファジアジン、トリメトプリム、五価アンチモン、アムホテリシンＢ、リファンピン、メトロニダゾール、ケトコナゾール、ベンズニダゾール、ニフルティモックス、及びスラミンが含まれるが、これらに限定されない。本発明はまた、原虫感染した患者の治療方法と、前記複合体含有組成とを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上述した必要性は、感染細胞、特に原虫感染症でストレスを受けた細胞の治療用複合体によって満たされる。この複合体は、一実施例において、多数でまたは更に頻繁には、通常の感染していない細胞よりは原虫に感染した細胞で表される受容体に引き寄せられるターゲッティング剤と、抗原虫薬とを含む。
ターゲッティング剤は、細胞が原虫感染症からストレスを受けたときに多数またはより頻繁に現れる細胞の受容体に引き寄せられる物質なら何でもよい。好ましくは、ターゲッッティング剤はトランスフェリンである。
【００１８】
ターゲッティング剤に対する薬剤の付加は、少なくともターゲッティング剤が親和性増大により対応する受容体に配置された後まで、薬剤とターゲッティング剤との分離を防止する任意の機構であってよい。現在、トランスフェリン−ドキソルビシン複合体に関し、最もよく知られている付加の機構は、グルタルアルデヒドリンカーであるが、当のターゲッティング剤／薬剤の組合せにとって有用な任意の物質であってもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
複合化法の技術的内容は様々であり得るが、いずれの方法においてもその要件は、（ａ）原虫感染細胞との結合実験および死滅実験において活性であり、（ｂ）有意な数の正常細胞とは結合また死滅させない、特定の複合体を調製することである。これらの要件を鑑みて、トランスフェリンがターゲッティング剤として用いられた場合と、ドキソルビシンが坑原虫薬として用いられた場合とで、本発明による複合体の好ましい調製法は、以下の方法である：予め決められた分子比率を有する均質トランスフェリン−ドキソルビシン複合体の大量合成は、グルタルアルデヒド（ＧＬＵ）の反応性基２個のうちの１個と反応させるために、３’アミノ位にあるドキソルビシン（ＤＯＸ）のアミノ基のみを用いることにより量論的になされた。このように、第１ステップは、ＤＯＸの食塩水をＤＭＳＯなどの溶媒または他の好適な凍結保存剤を含有するＧＬＵの食塩水に、ＤＯＸ対ＧＬＵが１：１モル比の最終濃度になるまで滴下により加えた。得られたＤＯＸ−ＧＬＵの溶液を暗所で室温下３時間攪拌した。
【００２０】
予め決められた分子比率を有する均質トランスフェリン−アドリアマイシン複合体の大量合成は、グルタルアルデヒド（ＧＬＵ）の反応性基２個のうちの１個と反応させるために、３’アミノ位にあるドキソルビシン（ＤＯＸ）のアミノ基のみを用いることにより量論的になされた。このように、第１ステップは、ＤＯＸの食塩水をＤＭＳＯなどの溶媒または他の好適な凍結保存剤を含有するＧＬＵの食塩水に、ＤＯＸ対ＧＬＵが１：１モル比の最終濃度になるまで滴下により加えた。得られたＤＯＸ−ＧＬＵの溶液を暗所で室温下３時間攪拌した。
【００２１】
遊離ＤＯＸまたは遊離ＧＬＵのいずれも含まないＤＯＸ−ＧＬＵの最終溶液を生じるように、ＤＯＸとＧＬＵとのモル比は上記反応と同じである。しかし、１個のＧＬＵが２個のＤＯＸと反応してＤＯＸ−ＧＬＵ−ＤＯＸを生成する場合は、溶液中に遊離ＧＬＵの可能性があるが、一価のＤＯＸを二価のＧＬＵ溶液に滴下することにより生じる質量作用速度論によって、この可能性は最少化される。これらの反応物の容量は制限されないので、大量の均質ＤＯＸ−ＧＬＵが調製できる。
【００２２】
複合化反応の第２ステップは、ＤＯＸ−ＧＬＵをトランスフェリン（ＴＲＦ）の食塩水に滴下により加えることである。ＴＲＦは、鉄なし（アポトランスフェリン）または鉄飽和（ホロトランスフェリン）のいずれであってもよい。ＤＯＸ対ＴＲＦの所望のモル比はＴＲＦの容量を適切に調整することにより得られた。得られたＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸの溶液を暗所で室温下２０時間攪拌した。ＤＯＸとＧＬＵとの反応とは異なって、ＤＯＸ−ＧＬＵのＧＬＵ成分がＴＲＦ分子中のイプシロン−アミノリジン基数個のうち、任意の１個と反応できることから、ＤＯＸ−ＧＬＵとＴＲＦとの反応は１個の結合部位に制限されない。
【００２３】
ＴＲＦに結合したＤＯＸ分子数は第２ステップにて決定された。例えば、ＤＯＸ−ＧＬＵ対ＴＲＦの出発比が７．２：１．０であった場合、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸの最終溶液は、ＴＲＦ１分子当たり２．５分子のＤＯＸを含んだことになる。しかし、ＤＯＸ−ＧＬＵ対ＴＲＦの出発比が４．０：１．０であった場合、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸの最終溶液は、ＴＲＦ１分子当たり１．４分子のＤＯＸを含んだことになる。同様に、ＤＯＸ−ＧＬＵ対ＴＲＦの出発比が２．５：１．０であった場合、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸの最終溶液は、ＴＲＦ１分子当たり０．９分子のＤＯＸを含んだことになる。この方法で、ＤＯＸ対ＴＲＦの予め決められた比率で大量のＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸを必要に応じて提供できる。
【００２４】
当業者であれば、未反応リンカーと、反応生成物中のＤＯＸ−ＧＬＵ−ＤＯＸのような予期せぬ構造が少量あり得ることや、当該構造を除去することによって反応生成物を最適化するのが望ましいことが分かるであろう。エタノールアミンまたは、過剰リンカー除去に好適な別の薬物を反応生成物に添加し、遠心分離と透析を行なった後、このエタノールアミンまたは別の薬物を用いて過剰ＧＬＵと予期せぬ構造とを除去するようにしてもよい。ＤＯＸとＴＲＦとの反応は、理論的にはＧＬＵの全てを消費するが、利用できるＧＬＵのいずれとも結合させるために、エタノールアミンを最終反応混合物に加えた。この反応を暗所で３０分間続けた。最終溶液を、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、１００倍過剰の食塩水で６時間２回かつ同一過剰のＨｅｐｅｓ緩衝食塩水で３回透析し、得られたＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸ複合体を使用のために準備した。
【００２５】
複合体の生化学的特性決定：
ＨＰＬＣとポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸ複合体の均質性を測定できる。また、分光側光法を用いて、ＤＯＸ対ＴＲＦの分子比を決定できる。これらの方法により、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸ複合体の一貫した均質性が繰り返し明らかにされた。さらに、凝集物または断片がないため、これらの複合体を調製する上でクロマトグラフィーを必要としない。このことにより、収量を増大させ、コストを下げる大容量の均質トランスフェリン−薬物複合体の調製が可能となる。
【００２６】
トランスフェリン−薬物複合体の他のタイプにおけるＴＲＦおよびＤＯＸの損失により生じる費用が、使用の際の障害となっている。例えば、ＤＯＸおよびＴＲＦの収量は、薬物および／または蛋白質を変化させるチオール化などの方法を用いることにより減少する。収量はまた、溶媒系を用いることにより、および酸安定性結合および酸不安定性結合を調製するために使用されるクロマトグラフィーにより減少する。ＤＯＸとＴＲＦとの間のＧＬＵ結合は酸安定性であり、本発明に従って調製された有用な複合体の収量は高い。実際、他の方法と比較して、有用な複合体の収量は５倍増大する。
【００２７】
トランスフェリン−ドキソルビシン複合体の調製に対する以前から知られている手法はいずれも、トランスフェリン１分子当たりの薬物分子数の比率を予め決めた上で大量の均質複合体を生産することができない。さらに、この以前から知られている手法では、凝集物を除外し、均質複合体に富む分画を獲得するためにクロマトグラフィーが使用される。これらの方法は、収量を減少し、コストを増加させ、分子比率を予め決定する能力を欠く。
【００２８】
複合体は、単離されるとポリアクリルアミドゲル電気泳動により特性決定できることから分子量が測定され、蛋白質１分子当たりの薬物分子数を決定できる。他のシステムにおける薬物−蛋白質複合体を用いた経験により、機能的薬物−蛋白質比（非特許文献４９）は、蛋白質１分子当たり０．１〜４．０薬物分子であることが示されており、最近の未発表データの示唆するところでは、複合化の数が低くてもやはり極めて細胞毒がある一方、複合化の数が高い（例えば＞４．０）と不安定な複合体と結び付き易い。複合体特性におけるステップは、（ａ）複合体が感染細胞表面のトランスフェリン受容体に結合し、非感染細胞には結合しないかどうかを測定すること、及び（ｂ）複合体が原虫感染細胞を死滅させ、非感染細胞を死滅させないかどうかを測定することである。結合試験は、フローサイトメトリーを用いることより行うことができ、また死滅試験は、微量培養法を用いて行うことができ、感染細胞数を５０％死滅させるのに必要な薬物−蛋白質複合体中の薬物濃度と比較して、同数の感染細胞培養を死滅させるのに必要な遊離薬物濃度を決定する。他のシステムにおける薬物−蛋白質複合体を用いた経験により、薬物−蛋白質複合体中の薬物と比較して約１０倍以上の遊離薬物が、同数の感染細胞を死滅させるのに必要であることが示されている。例えば、トランスフェリン−ドキソルビシン複合体の投薬量は、１５０ポンド（６８ｋｇ）の人に対して２８日間当たり０．５〜５０ｍｇとされている。この投薬量は、２８日間の期間中に様々な間隔で少量ずつの投与とすることができる。複合体が有効であるためには、それが、非感染細胞を全く死滅させないかまたは最小限だけを死滅させるということが必要である。
【００２９】
マラリアの治療
薬物耐性（非特許文献５０）及び薬物毒性（非特許文献５１）は、マラリア治療における大きな問題であることから、本発明の目的は、鉄分を得るときにプラスモジアが用いる経路を活用するようにした、坑マラリア薬標的送達のためのリガンド−受容体方法を提供することである。一実施例において、リガンドはヒトのトランスフェリンであり、受容体はプラスモジウムトランスフェリン受容体であり、薬物は鉄キレート化剤（非特許文献５２）でもある細胞毒ドキソルビシンか、またはシデロフォアデフェロキサミン（デスフェリオキサミンまたはＤｅｓｐｈｅｒａｌとしても知られる）である。デスフェリオキサミンは、ヒドロキサメート系の水溶性鉄キレート化剤である（非特許文献５３）。その分子は、ニトロベジルジアゾールやＮ−アントラニル酸メチル等の分子を備え、鉄キレート化の特性を損なうことなく誘導体化された末端ＮＨ２を有する（非特許文献５４）。
【００３０】
トリパノソーマ症の治療
細胞増殖抑制複合物を血液脳関門全体にわたって輸送できる担体は必要である。通常のプラズマ蛋白質トランスフェリンは、血液脳関門の微小循環を構成する内皮細胞上のトランスフェリン受容体に作用することによって、この仕事を行なうことが判っている（非特許文献５５）。例えば、神経成長因子を備えるトランスフェリン複合体は、血液から脳へ輸送されることが判っており（非特許文献５６）、本発明の目的は、血液脳関門全体の血液から中枢神経系へ輸送可能で、トリパノソーマ症の前記と後期両方の効果的な治療法を提供する、トランスフェリンを備える細胞増殖抑制薬物を提供せんとするものである。
【００３１】
血液脳関門全体への効果的な細胞増殖抑制薬物輸送手段であることに加えて、トランスフェリンは、トリパノソーマルプラズマ細胞膜に存在するトランスフェリン受容体を対象とすることが可能である（非特許文献５７）。ヒトのトランスフェリン受容体のように、トリパノソーマル受容体は鉄分によって転写後に調整される（非特許文献５８）。トリパノソームはそれぞれ約３０００の受容体を含む。これらの受容体はプラズマ細胞膜ヘのアンカーとなるグリコシルホスファチジルイノシトールが連結したヘテロ二量体であり、プラズマ細胞膜ではヘテロ二量体は鞭毛ポケットの、変異表面糖蛋白質の海に集中している（非特許文献５９）。トリパノソームには鉄分が必要であるが、鉄分を自己の宿主のトランスフェリンから得る（非特許文献６０）。このように、静脈内投与されたトランスフェリンの細胞増殖抑制薬物複合体は、中枢神経系を含めて体内中を循環し、トリパノソーマルトランスフェリン受容体によって結合され、細胞増殖抑制特性を発揮する。
【００３２】
本発明は、病気の前期であるか後期であるかを問わず、またどのトリパノソーム種に感染しているのかに関係無く、感染者のトリパノソームへ細胞毒を標的送達させるのに用いられる薬物−蛋白質複合体である。薬物の標的送達は本発明で可能であるが、その理由は、薬物−蛋白質複合体内の好適な蛋白質はトランスフェリンであり、トリマノソーマはその表面にトランスフェリン受容体を有するからこれが適切なためである（非特許文献６１）。また、薬物−トランスフェリン複合体中の薬物は、公知の細胞増殖抑制剤か、またはドキソルビシン等の細胞毒でもよい。トランスフェリン受容体は、ガン細胞の表面上にあるとき（非特許文献６２）には通常は、通常の成人の静止細胞表面には存在しない（非特許文献４９）。このように、トリパノソーマ症患者の正常細胞の殆どは感染しておらず、細胞傷害性トランスフェリン複合体によって除去される唯一の細胞は、血液中であるか、リンパ液中であるか、中枢神経系中であるかに拘わらずトリパノソームである。
【００３３】
患者のトリパノソームへの標的薬物送達を示す一つの方法は、血中鉄を輸送するトランスフェリンの利用に焦点を当てることである。トランスフェリンは、血漿からの単離、商品提供者、または組換え技術（非特許文献６３）により得ることができる。薬物蛋白質複合体を形成するために、トランスフェリン分子は、細胞増殖抑制薬または抗レトロウィルス薬と結合させて調製するような方法で変更しなければならない。薬物は、メラーソプラルなどのヒ素剤、ドキソルビシンなどの細胞毒性抗生物質、またはエフロルニチンなどのポリアミン合成阻害剤であってよいが、リシンなどの植物毒素、修飾ジフテリア毒素などの変異細菌毒素など、任意の化合物を使用することができる（非特許文献６４）。
【００３４】
グルタルアルデヒドカップリング（非特許文献６５）、ジスルフィドカップリング（非特許文献６６）またはベンゾイルヒドラジンカップリング（非特許文献６７）などの幾つかのカップリング法が、トランスフェリンと他の分子とを結合させるために用いられてきた。多様なカップリング法は、広範囲な細胞毒性薬とトランスフェリンとの複合化を可能にし、薬物とトランスフェリン分子との永続的結合または解離可能な結合のいずれかを生じさせる（非特許文献６８）。カップリング反応後、必要であればクロマトグラフィー法を用いることにより、薬物−蛋白質複合体を未結合薬物と遊離蛋白質から分離できる。
【００３５】
本発明は、送達蛋白質であるトランスフェリンに関して記載したが、感染細胞の受容体部位に結合できる他の蛋白質が体内に存在することが知られている。受容体部位が感染細胞で活性化され、非感染細胞では不活性である場合、このような受容体部位に結合する任意の蛋白質または他の化合物を、本発明に使用される薬物を送達するために使用できる。このような結合蛋白質の１つの例としては、ビタミン、特にビタミンＢ１２をヒト体内細胞のトランスコバラミン受容体に送達するトランスコバラミンがある（非特許文献６９）。他の例としては、限定しないが、セルロプラスミン、ビタミン結合蛋白質、ホルモン、サイトカイン、リポ蛋白質、及び成長因子が含まれる。
【００３６】
本発明による複合体は、有効量で動物に投与される。原虫感染症治療において、有効量は、原虫量を減じるための有効量を含む。複合体の投与量は、患者の年令、体重および病状、及び抗原虫薬の薬物動態を考慮して決定できる。有効な治療に要する複合体量は、抗原虫薬単独使用に要する量よりも少量となり、用いられる抗原虫薬次第である。例えば、トランスフェリン−ドキソルビシン複合体の投与量は、１５０ポンド（６８ｋｇ）の人に対し０．５ｍｇから５０ｍｇの間となる見込みである。投与量は、様々な間隔でより少用量を投与でき、必要であれば繰り返すこともできる。
【００３７】
本発明の薬剤組成物は、限定しないが、経口、局所、直腸、眼、膣などの多くの経路、例えばエアゾールの使用による肺経路、または、限定しないが、筋肉内、皮下、腹腔内、動脈内、静脈内などの非経口的経路により投与できる。前記組成物は、単独で投与できるか、または標準的な製剤実施に従って製剤的に許容できる担体または賦形剤と組合せることができる。経口投与様式では、組成物を錠剤、カプセル剤、ロゼンジ剤、トローチ剤、散剤、シロップ剤、エリキシル剤、水溶液剤、懸濁液剤などの形態で使用できる。非経口投与では通常、複合体の滅菌溶液を調製し、溶液のｐＨを好適に調整し、緩衝化する。静脈内使用では、溶質の総濃度を制御して、製剤を等張にする必要がある。眼投与では、軟膏または点眼液を、アプリケータまたは点眼びんなどの当業界に知られた眼送達系により送達できる。肺投与では、希釈剤および／または担体が、エアゾールの形成を可能にするため適切であるように選ばれる。本発明の複合体は、輸液または注射液により非経口的、すなわち静脈内または腹腔内に投与されることが好ましい。
【００３８】
本件文書で用いられているように、「実質的に均質の複合体」という用語は、複合体をそれ以上解毒しなくても、蛋白質二量体、重合体または会合体を除去するのに使用可能なことを意味する。
【００３９】
本発明の好ましい実施態様を以下に記載する。修飾および変更が可能であり、それらの全ては特許請求の範囲内に入ることを意図していることは、以下の記載を読めば、通常の当業者にとって明らかとなろう。
【実施例１】
【００４０】
複合体の調製
予め分子比率で決められた均質トランスフェリン−ドキソルビシン複合体の大量合成は、グルタルアルデヒド（ＧＬＵ）の反応性基２個のうちの１個と反応させるために、３’アミノ位にあるドキソルビシン（ＤＯＸ）のアミノ基のみを用いることにより量論的になされた。第１ステップは、氷冷水浴中でＧＬＵをＤＭＳＯに滴下により加えることであった。次に、ＤＯＸの食塩水をＧＬＵ＋ＤＭＳＯの食塩水に、ＤＯＸ対ＧＬＵが１：１モル比の最終濃度になるまで滴下により加えた。得られたＤＯＸ−ＧＬＵの溶液を暗所で室温下３時間攪拌した。
【００４１】
遊離ＤＯＸも遊離ＧＬＵも含まないＤＯＸ−ＧＬＵの最終溶液を生じさせるように、ＤＯＸとＧＬＵとのモル比は上記反応と同じである。しかし、１個のＧＬＵが２個のＤＯＸと反応してＤＯＸ−ＧＬＵ−ＤＯＸを生成する場合は、溶液中に遊離ＧＬＵの可能性があるが、一価のＤＯＸを二価のＧＬＵ溶液に滴下して加えることによって生じる質量作用速度論によって、この可能性は最少化される。これらの反応物の容量は制限されないので、大量の均質ＤＯＸ−ＧＬＵが調製できる。
【００４２】
複合化反応の第２ステップは、ＤＯＸ−ＧＬＵをトランスフェリン（ＴＲＦ）の食塩水に滴下により加えることであった。ＴＲＦは、鉄なし（アポトランスフェリン）または鉄飽和（ホロトランスフェリン）のいずれであってもよい。ＤＯＸ対ＴＲＦの所望のモル比はＴＲＦの容量を適切に調整することにより得られた。得られたＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸの溶液を暗所で室温下２０時間攪拌した。ＤＯＸとＧＬＵとの反応とは異なって、ＤＯＸ−ＧＬＵのＧＬＵ成分がＴＲＦ分子中のイプシロン−アミノリジン基数個のうち、任意の１個と反応できることから、ＤＯＸ−ＧＬＵとＴＲＦとの反応は１個の結合部位に制限されない。
【００４３】
ＴＲＦに結合したＤＯＸ分子数は第２ステップにて決定された。例えば、ＤＯＸ−ＧＬＵ対ＴＲＦの出発比が７．２：１．０であった場合、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸの最終溶液は、ＴＲＦ１分子当たり２．５分子のＤＯＸを含んだことになる。しかし、ＤＯＸ−ＧＬＵ対ＴＲＦの出発比が４．０：１．０であった場合、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸの最終溶液は、ＴＲＦ１分子当たり１．４分子のＤＯＸを含んだことになる。同様に、ＤＯＸ−ＧＬＵ対ＴＲＦの出発比が２．５：１．０であった場合、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸの最終溶液は、ＴＲＦ１分子当たり０．９分子のＤＯＸを含んだことになる。この方法で、ＤＯＸ対ＴＲＦの予め決められた比率で大量のＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸを必要に応じて提供できる。
【００４４】
複合体製造の最適化においては、エタノールアミンが添加され、次いで遠心分離および透析が行なわれた。ＤＯＸとＴＲＦとの反応は、理論的にはＧＬＵの全てを消費するが、利用できるＧＬＵのいずれとも結合させるために、エタノールアミンを最終反応混合物に加えた。この反応を暗所で３０分間続けた。最終溶液を、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、１００倍過剰の食塩水で６時間２回、かつ同一過剰のＨｅｐｅｓ緩衝食塩水で３回透析し、得られたＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸ複合体を使用のために準備した
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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