(57)【要約】本発明は、ＩＧＳ４３Ｇ−タンパク質共役受容体ファミリー、および該ＩＧＳ４３タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。また本発明はそのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの作用を阻害または活性化すること、該ポリヌクレオチドを含むベクター、そのようなベクターを含む宿主細胞、およびＩＧＳ４３−遺伝子が過剰発現されるか、誤発現されるか、不十分に発現されるか、または抑制される（ノックアウト−動物）非−ヒトトランスジェニック動物に関する。本発明はさらに、該Ｇ−タンパク質共役受容体ファミリーＩＧＳ４３のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用することができる化合物をスクリーニングする方法、およびＩＧＳ４３ポリペプチドおよびポリヌクレオチドおよびＩＧＳ４３受容体ファミリーに対するアゴニストまたはアンタゴニストの広範囲の障害の処置およびそのような状態の診断アッセイにおける使用に関する。本発明は特に、Ｇ−タンパク質共役受容体ファミリーＩＧＳ４３のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用することができる化合物のスクリーニング法、およびＩＧＳ４３ポリペプチドおよびポリヌクレオチドおよびＩＧＳ４３受容体ファミリーに対するアゴニストまたはアンタゴニストの子宮、腎臓、肺、気管、結腸、小腸、胃、乳腺、前立腺、精巣、中枢神経系、小脳および脊髄に関係する機能不全、障害または疾患の処置おける使用、およびそのような状態の診断アッセイに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号２によるＩＧＳ４３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｂ）ユトレヒト（オランダ国）のセントラアルビュロー ホーア シンメルカルチャーの寄託番号ＣＢＳ １０９７１４に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、特に配列番号１に対応するヌクレオチド配列；
ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列に少なくとも９５．５％（好ましくは少なくとも９６％）の配列同一性をその全長にわたり有するヌクレオチド配列；
ｄ）（ａ）または（ｂ）または（ｃ）のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列、
から成る群から選択される単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
ａ）配列番号２によるＩＧＳ４３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｂ）ユトレヒト（オランダ国）のセントラアルビュロー ホーア シンメルカルチャーの寄託番号ＣＢＳ １０９７１４に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、特に配列番号１に対応するヌクレオチド配列；
ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列に少なくとも９６％（好ましくは少なくとも９７％）の配列同一性をその全長にわたり有するヌクレオチド配列；
ｄ）（ａ）または（ｂ）または（ｃ）のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列、
から成る群から選択される単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
ａ）配列番号２によるＩＧＳ４３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｂ）ユトレヒト（オランダ国）のセントラアルビュロー ホーア シンメルカルチャーの寄託番号ＣＢＳ １０９７１４に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、特に配列番号１に対応するヌクレオチド配列；
ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列に少なくとも９７％（好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性をその全長にわたり有するヌクレオチド配列；
ｄ）（ａ）または（ｂ）または（ｃ）のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列、
から成る群から選択される単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
ａ）配列番号２によるＩＧＳ４３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｂ）ユトレヒト（オランダ国）のセントラアルビュロー ホーア シンメルカルチャーの寄託番号ＣＢＳ １０９７１４に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、特に配列番号１に対応するヌクレオチド配列；
ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列に少なくとも９８％（好ましくは少なくとも９９％）の配列同一性をその全長にわたり有するヌクレオチド配列；
ｄ）（ａ）または（ｂ）または（ｃ）のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列、
から成る群から選択される単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
上記ポリヌクレオチドが、配列番号２のＩＧＳ４３ポリペプチドをコードする配列番号１に含まれるヌクレオチド配列から成る、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
上記ポリヌクレオチドがその全長にわたり、配列番号１の配列またはユトレヒト（オランダ国）のセントラアルビュロー ホーア シンメルカルチャーの寄託番号ＣＢＳ １０９７１４に含まれるＤＮＡ挿入物の配列に少なくとも９５．５％同一であるヌクレオチド配列から成る、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
上記ポリヌクレオチドがその全長にわたり、配列番号１の配列またはユトレヒト（オランダ国）のセントラアルビュロー ホーア シンメルカルチャーの寄託番号ＣＢＳ １０９７１４に含まれるＤＮＡ挿入物の配列に少なくとも９６％同一であるヌクレオチド配列から成る、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
上記ポリヌクレオチドがその全長にわたり、配列番号１の配列またはユトレヒト（オランダ国）のセントラアルビュロー ホーア シンメルカルチャーの寄託番号ＣＢＳ １０９７１４に含まれるＤＮＡ挿入物の配列に少なくとも９７％同一であるヌクレオチド配列から成る、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
上記ポリヌクレオチドがその全長にわたり、配列番号１の配列またはユトレヒト（オランダ国）のセントラアルビュロー ホーア シンメルカルチャーの寄託番号ＣＢＳ １０９７１４に含まれるＤＮＡ挿入物の配列に少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列から成る、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
上記ポリヌクレオチドがその全長にわたり、配列番号１の配列またはユトレヒト（オランダ国）のセントラアルビュロー ホーア シンメルカルチャーの寄託番号ＣＢＳ １０９７１４に含まれるＤＮＡ挿入物の配列に少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列から成る、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
配列番号１のポリヌクレオチド、またはユトレヒト（オランダ国）のセントラアルビュロー ホーア シンメルカルチャーの寄託番号ＣＢＳ １０９７１４に含まれるＤＮＡ挿入物である、請求項５ないし１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドから成るハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項１４】
発現系がコンパチブルな宿主細胞中に存在する時、配列番号２のポリペプチドまたはユトレヒト（オランダ国）のセントラアルビュロー ホーア シンメルカルチャーの寄託番号ＣＢＳ １０９７１４に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるポリヌクレオチドと少なくとも９５．５％の同一性を有するアミノ酸配列から成るＩＧＳ４３ポリペプチドを生産することができる発現系を含んで成るＤＮＡまたはＲＮＡ分子。
【請求項１５】
発現系がコンパチブルな宿主細胞中に存在する時、配列番号２のポリペプチドまたはユトレヒト（オランダ国）のセントラアルビュロー ホーア シンメルカルチャーの寄託番号ＣＢＳ １０９７１４に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるポリヌクレオチドと少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列から成るＩＧＳ４３ポリペプチドを生産することができる発現系を含んで成るＤＮＡまたはＲＮＡ分子。
【請求項１６】
発現系がコンパチブルな宿主細胞中に存在する時、配列番号２のポリペプチドまたはユトレヒト（オランダ国）のセントラアルビュロー ホーア シンメルカルチャーの寄託番号ＣＢＳ １０９７１４に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるポリヌクレオチドと少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列から成るＩＧＳ４３ポリペプチドを生産することができる発現系を含んで成るＤＮＡまたはＲＮＡ分子。
【請求項１７】
発現系がコンパチブルな宿主細胞中に存在する時、配列番号２のポリペプチドまたはユトレヒト（オランダ国）のセントラアルビュロー ホーア シンメルカルチャーの寄託番号ＣＢＳ １０９７１４に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるポリヌクレオチドと少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列から成るＩＧＳ４３ポリペプチドを生産することができる発現系を含んで成るＤＮＡまたはＲＮＡ分子。
【請求項１８】
発現系がコンパチブルな宿主細胞中に存在する時、配列番号２のポリペプチドまたはユトレヒト（オランダ国）のセントラアルビュロー ホーア シンメルカルチャーの寄託番号ＣＢＳ １０９７１４に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるポリヌクレオチドと少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列から成るＩＧＳ４３ポリペプチドを生産することができる発現系を含んで成るＤＮＡまたはＲＮＡ分子。
【請求項１９】
請求項１４ないし１８のいずれか１項に記載の発現系を含んで成る宿主細胞。
【請求項２０】
酵母細胞である、請求項１９に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
動物細胞である、請求項１９に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
請求項１９ないし２１のいずれか１項に記載の細胞に由来するＩＧＳ４３受容体膜調製物。
【請求項２３】
請求項１９ないし２１に記載の宿主を、上記ポリヌクレオチドを生産するために十分な条件下で培養し、そして該培養からポリヌクレオチドを回収することを含んで成る、ＩＧＳ４３ポリペプチドの生産法。
【請求項２４】
細胞が適切な培養条件下でＩＧＳ４３ポリペプチドを生産できるように、請求項１４ないし１８のいずれか１項に記載の発現系で細胞を形質転換またはトランスフェクションすることを含んで成る、それらのＩＧＳ４３ポリペプチドを生産する細胞の生産法。
【請求項２５】
配列番号２のアミノ酸配列またはユトレヒト（オランダ国）のセントラアルビュロー ホーア シンメルカルチャーの寄託番号ＣＢＳ １０９７１４に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるポリヌクレオチドと、全長にわたり少なくとも９５．５％同一であるアミノ酸配列から成るＩＧＳ４３ポリペプチド。
【請求項２６】
配列番号２のアミノ酸配列またはユトレヒト（オランダ国）のセントラアルビュロー ホーア シンメルカルチャーの寄託番号ＣＢＳ １０９７１４に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるポリヌクレオチドと、全長にわたり少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列から成るＩＧＳ４３ポリペプチド。
【請求項２７】
配列番号２のアミノ酸配列またはユトレヒト（オランダ国）のセントラアルビュロー ホーア シンメルカルチャーの寄託番号ＣＢＳ １０９７１４に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるポリヌクレオチドと、全長にわたり少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列から成るＩＧＳ４３ポリペプチド。
【請求項２８】
配列番号２のアミノ酸配列またはユトレヒト（オランダ国）のセントラアルビュロー ホーア シンメルカルチャーの寄託番号ＣＢＳ １０９７１４に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるポリヌクレオチドと、全長にわたり少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列から成るＩＧＳ４３ポリペプチド。
【請求項２９】
配列番号２のアミノ酸配列またはユトレヒト（オランダ国）のセントラアルビュロー ホーア シンメルカルチャーの寄託番号ＣＢＳ １０９７１４に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるポリヌクレオチドと、全長にわたり少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列から成るＩＧＳ４３ポリペプチド。
【請求項３０】
配列番号２のアミノ酸配列またはユトレヒト（オランダ国）のセントラアルビュロー ホーア シンメルカルチャーの寄託番号ＣＢＳ １０９７１４に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるアミノ酸配列から成る、請求項２５ないし２９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
請求項２５ないし３０のいずれか１項に記載のＩＧＳ４３ポリペプチドに免疫特異的な抗体。
【請求項３２】
請求項２５ないし３０のいずれか１項に記載のＩＧＳ４３ポリペプチド受容体の活性または発現の強化が必要な個体の処置法であって；
（ａ）治療に効果的な量の該受容体に対するアゴニストを個体に投与し；かつ／または
（ｂ）配列番号２のＩＧＳ４３ポリペプチドまたはユトレヒト（オランダ国）のセントラアルビュロー ホーア シンメルカルチャーの寄託番号ＣＢＳ １０９７１４に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、全長にわたり少なくとも９５．５％の同一性を有するヌクレオチド配列；または該受容体活性をインビボで生産するような状態の該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列から成る単離されたポリヌクレオチドを個体に提供する、
ことを含んで成る上記方法。
【請求項３３】
請求項２５ないし３０のいずれか１項に記載のＩＧＳ４３ポリペプチド受容体の活性または発現の阻害が必要な個体の処置法であって；
（ａ）治療に効果的な量の該受容体に対するアンタゴニストを個体に投与し；かつ／または
（ｂ） 該受容体をコードするヌクレオチド配列の発現を阻害するポリヌクレオチドを個体に投与し；かつ／または
（ｃ）該受容体とそのリガンドについて拮抗する、治療に効果的な量のポリペプチドを個体に投与する、
ことを含んで成る上記方法。
【請求項３４】
請求項２５ないし３０のいずれか１項に記載のＩＧＳポリペプチドの発現または活性に関連する個体の疾患、または疾患に対する罹病性を診断するためのプロセスであって：
（ａ）該個体に由来するサンプル中の該個体のゲノム中の該ＩＧＳ４３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列中に突然変異が存在するか、または存在しないかを決定し；かつ／または
（ｂ）該個体に由来するサンプル中のＩＧＳ４３ポリペプチド発現の存在または量を分析する、
ことを含んで成る上記プロセス。
【請求項３５】
請求項２５ないし３０のいずれか１項に記載のＩＧＳポリペプチドに対するアゴニストを同定する方法であって：
（ａ）ＩＧＳ４３ポリペプチドを生産する細胞を試験化合物と接触させ；そして
（ｂ）試験化合物がＩＧＳ４３ポリペプチドの活性化によりシグナルを生成するかどうかを決定する、
ことを含んで成る上記方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法により同定されるアゴニスト。
【請求項３７】
請求項２５ないし３０のいずれか１項に記載のＩＧＳポリペプチドに対するアンタゴニストを同定する方法であって：
（ａ）ＩＧＳ４３ポリペプチドを生産する細胞をアゴニストと接触させ；そして
（ｂ）該アゴニストにより生成されたシグナルが候補化合物の存在下で消失するかどうかを決定する、
ことを含んで成る上記方法。
【請求項３８】
請求項３７に記載の方法により同定されるアンタゴニスト。
【請求項３９】
ＩＧＳ４３ポリペプチドを発現する請求項２４に記載の方法により生産される組換え宿主細胞またはその膜。
【請求項４０】
遺伝的に改変された非ヒト動物の作出法であって：
ａ）アミノ酸配列である配列番号２またはユトレヒト（オランダ国）のセントラアルビュロー ホーア シンメルカルチャーの寄託番号ＣＢＳ １０９７１４に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列から成るポリヌクレオチドのコード部分を、高レベルの遺伝子発現または通常はその遺伝子が該動物中で発現されない細胞型中での発現を駆動することができる調節配列に連結し；あるいは
ｂ）アミノ酸配列である配列番号２またはユトレヒト（オランダ国）のセントラアルビュロー ホーア シンメルカルチャーの寄託番号ＣＢＳ １０９７１４に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列から成るポリヌクレオチドのコード部分を工作し、そしてアミノ酸配列である配列番号２またはユトレヒト（オランダ国）のセントラアルビュロー ホーア シンメルカルチャーの寄託番号ＣＢＳ １０９７１４に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする内因性の遺伝子である対立遺伝子が、完全にまたは部分的に不活性化するように、該配列を該動物のゲノムに再導入する、
工程を含んで成る上記方法。
【請求項４１】
請求項３５または３７に記載の方法、そして次いで同定された化合物を医薬的に許容されるキャリアーと混合することを含んで成る、医薬組成物の製造方法。
【請求項４２】
（ａ）請求項２５ないし３０のいずれか１項に記載のＩＧＳ４３受容体ポリペプチドに対する治療に効果的な量のアゴニスト；および／あるいは
（ｂ）配列番号２のＩＧＳ４３ポリペプチドまたはユトレヒト（オランダ国）のセントラアルビュロー ホーア シンメルカルチャーの寄託番号ＣＢＳ １０９７１４に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に、少なくとも９５．５％の同一性を全長にわたり有するヌクレオチド配列から成る単離されたポリヌクレオチド；またはインビボで該受容体活性を生産するような状態の該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
の、請求項２５ないし３０のいずれか１項に記載のＩＧＳ４３ポリペプチドの活性または発現の強化が必要な、ＩＧＳ４３受容体ポリペプチドの発現または活性に関連する疾患に罹患している個体を処置する薬剤を調製するための、使用。
【請求項４３】
（ａ）請求項２５ないし３０のいずれか１項に記載のＩＧＳ４３受容体ポリペプチドに対する治療に効果的な量のアンタゴニスト；および／または
（ｂ）請求項２５ないし３０のいずれか１項に記載のＩＧＳ４３受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を阻害する核酸分子；および／または
（ｃ）請求項２５ないし３０のいずれか１項に記載のＩＧＳ４３受容体ポリペプチドとそのリガンドについて拮抗する、治療に効果的な量のポリペプチド、
の、請求項２５ないし３０のいずれか１項に記載のＩＧＳ４３ポリペプチドの活性または発現の阻害が必要な、ＩＧＳ４３受容体ポリペプチドの発現または活性に関連する疾患に罹患している個体を処置する薬剤を調製するための、使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
説明
本発明は新規に同定されたポリヌクレオチド、それらによりコードされるポリペプチド、およびそのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、およびそれらの生産に関する。より詳細には、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドはＧ−タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）（今後、ＩＧＳ４３と呼ぶ）に関する。また本発明はそのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの作用を阻害または活性化する方法、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、そのようなベクターを含有する宿主細胞、およびＩＧＳ４３−遺伝子が過剰発現する、誤発現する、不十分に発現する（ｕｎｄｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）、および／または抑制される（ノックアウト動物）トランスジェニック動物に関する。本発明はさらに、該Ｇ−タンパク質共役受容体ＩＧＳ４３のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用することができる化合物のスクリーニング法に関する。
発明の背景
多くの医学的に重要な生物学的プロセスは、Ｇ−タンパク質および／または第２メッセンジャーが関与するシグナル伝達経路に参加するタンパク質により媒介されることは十分に確立されている：例えばｃＡＭＰ（Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，Ｎａｔｕｒｅ，１９９１，３５１：３５３−３５４）。本明細書ではこれらのタンパク質をＧ−タンパク質の経路に関与するタンパク質と称する。これらのタンパク質の幾つかの例には、アドレナリン作動薬およびドーパミンのようなＧＰＣ受容体（Ｋｏｂｉｌｋａ，Ｂ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８７，８４：４６−５０；Ｋｏｂｉｌｋａ，Ｂ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７，２３８：６５０−６５６；Ｂｕｎｚｏｗ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３６：７８３−７８７）、Ｇ−タンパク質自体、エフェクタータンパク質、例えばホスホリパーゼＣ、アデニル酸シクラーゼおよびホスホジエステラーゼ、およびアクチュエーター（ａｃｔｕａｔｏｒ）タンパク質、例えばプロテインキナーゼＡおよびプロテインキナーゼＣ（Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５２：８０２−８）を含む。
【０００２】
例えばシグナル伝達の１形態では、ホルモンがＧＰＣＲに結合すると、受容体がヘテロ三量体Ｇ−タンパク質と相互作用し、そしてグアニンヌクレオチド−結合部位からＧＤＰの解離を誘導する。正常な細胞濃度のグアニンヌクレオチドで、ＧＴＰはこの部位を即座に満たす。ＧＴＰのＧ−タンパク質のαサブユニットへの結合により、受容体からＧ−タンパク質の解離およびＧ−タンパク質のαおよびβγサブユニット内の解離を引き起こす。次いでＧＴＰを持つ形態は活性化アデニル酸シクラーゼに結合する。Ｇ−タンパク質自体により触媒されるＧＴＰのＧＤＰへの加水分解は（αサブユニットが本来のＧＴＰａｓｅ活性を保有する）、Ｇ−タンパク質を元の不活性な形態に戻す。αサブユニットのＧＴＰａｓｅ活性は、本質的にはオン／オフスイッチを制御する内部クロックである。αサブユニットのＧＤＰ結合形態はβγに高い親和性を有し、そして続くαＧＤＰとβγとの再会合により系は元の状態に戻る。このようにＧ−タンパク質は、受容体からエフェクターへのシグナルを渡す中間体として（この例ではアデニル酸シクラーゼ）、およびシグナルの期間を制御するクロックとしての２役をこなす。
【０００３】
Ｇ−タンパク質共役受容体の膜結合スーパーファミリーは、７つの推定上の膜貫通ドメインを有すると特徴づけられた。このドメインは細胞外または細胞質ループにより連結される膜貫通α−ヘリックスを表すと考えられている。Ｇ−タンパク質共役受容体には、ホルモン、ウイルス、増殖因子および神経受容体のような広い範囲の生物学的に活性な受容体を含む。
【０００４】
Ｇ−タンパク質共役受容体ファミリーには、ＣＮＳ障害を処置するために使用する神経弛緩薬に結合するドーパミン受容体を含む。このファミリーの他の員の例には限定するわけではないが、カルシトニン、アドレナリン作動性物質、神経ペプチドＹ、ソマトスタチン、ニューロテンシン、ニューロキニン、カプサイシン、ＶＩＰ、ＣＧＲＰ、ＣＲＦ、ＣＣＫ、ブラジキニン、ガラニン、モチリン、ノシセプチン、エンドセリン、ｃＡＭＰ、アデノシン、ムスカリン作動性物質、アセチルコリン、セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キニン、濾胞刺激ホルモン、オプシン、内皮分化遺伝子−１、ロドプシン、臭気物質およびサイトメガロウイルス受容体を含む。
【０００５】
ほとんどのＧ−タンパク質共役受容体は、機能的なタンパク質構造を安定化すると考えられているジスルフィド結合を形成する最初の２つの各細胞外ループ内に、１つの保存されたシステイン残基を有する。７回膜貫通領域は、ＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６およびＴＭ７と命名されている。ＴＭ５およびＴＭ６をつなぐ細胞質ループは、Ｇ−タンパク質結合領域の主要な成分となり得る。
【０００６】
ほとんどのＧ−タンパク質共役受容体は、第３細胞質ループおよび／またはカルボキシ末端内に可能なリン酸化部位を含む。β−アドレナリン受容体のように幾つかのＧ−タンパク質共役受容体については、プロテインキナーゼＡおよび／または特異的な受容体キナーゼによるリン酸化が受容体の脱感作を媒介する。
【０００７】
最近、カルシトニン−受容体様受容体のような特定のＧＰＣＲが、受容体活性修飾タンパク質（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＲＡＭＰ’ｓ）と呼ばれる小さいシグナル通過膜タンパク質と相互作用するかもしれないことが見いだされた。このＧＰＣＲと特定のＲＡＭＰとの相互作用は、どの天然のリガンドがＧＰＣＲ−ＲＡＭＰの組み合わせに関連する親和性を有し、そして複合体の機能的シグナル発信活性を調節するかを決定している（ＭｃＬａｔｈｉｎｅ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９８）３９３：３３３−３３９）。
【０００８】
幾つかの受容体に関しては、Ｇ−タンパク質共役受容体のリガンド結合部位は幾つかのＧ−タンパク質受容体膜貫通ドメインにより形成される親水性ソケットを含んで成ると考えられ、該ソケットはＧ−タンパク質共役受容体の疎水性残基により囲まれている。各Ｇ−タンパク質共役受容体の膜貫通ヘリックスの親水性側が内側に面し、そして極性のリガンド−結合部位を形成すると仮定されている。ＴＭ３は、ＴＭ３アスパラギン酸残基のようなリガンド−結合部位を有するので、幾つかのＧ−タンパク質共役受容体に深く関与してきた。ＴＭ５のセリン、ＴＭ６のアスパラギンおよびＴＭ６またはＴＭ７のフェニルアラニンまたはチロシンもリガンド結合に深く関与している。
【０００９】
Ｇ−タンパク質共役受容体は、ヘテロ三量体Ｇ−タンパク質により種々の細胞内酵素、イオンチャンネルおよびトランスポーターへ細胞内で共役することができる（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃ．Ｒｅｖ．，１９８９，１０：３１７−３３１）。異なるＧ−タンパク質α−サブユニットが優先的に特定のエフェクターを刺激して、細胞内で種々の生物学的機能をモジュレートする。Ｇ−タンパク質共役受容体の細胞質残基のリン酸化は、幾つかのＧ−タンパク質共役受容体のＧ−タンパク質共役の調節に重要なメカニズムとして同定された。Ｇ−タンパク質共役受容体は、哺乳動物宿主内の多数の部位に見いだされる。
【００１０】
受容体−主にＧＰＣＲクラスは、現在知られている薬剤の半分以上を導いた（Ｄｒｅｗｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９６，１４：１５１６）。これはこれらの受容体が治療の標的として確立された明白な歴史を有することを示す。本発明の新規ＩＧＳ４３ ＧＰＣＲは明らかに、これから一般に「疾患」と呼ぶ機能不全、障害または疾患の診断、防止、改善または修正に役割を果たすことができるさらなる受容体の同定および特性決定のために、従来技術における必要性を満たす。疾患には限定するわけではないが、統合失調症、強迫性障害（ＯＣＤ）、外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、恐怖症およびパニックのようなエピソード性の発作的不安（ｅｐｉｓｏｄｉｃ ｐａｒｏｘｙｓｍａｌ ａｎｘｉｅｔｙ：ＥＰＡ）障害、大鬱病性障害、双極性障害、パーキンソン病、全般性不安障害、自閉症、せん妄、多発性硬化症、アルツハイマー病／痴呆および他の神経変性疾患、重度の精神遅滞、ジスキネジー、ハンチントン病、ツレット症候群、チック、振せん、失調症、痙攣、食欲不振、過食症、発作、嗜癖／依存症／渇望、睡眠障害、癲癇、偏頭痛、注意欠陥／過活動性障害（ＡＤＨＤ）を含む精神的およびＣＮＳ障害；心不全、狭心症、不整脈、心筋梗塞、心肥大、低血圧症、高血圧−例えば本態性高血圧症、腎性高血圧症または肺高血圧症、血栓症、動脈硬化のような心血管疾患、大脳血管痙攣、クモ膜下出血、大脳虚血、大脳梗塞、末梢血管疾患、レーノー病、腎臓疾患−例えば腎不全；高脂血症；肥満；嘔吐；過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、炎症性腸症候群（ＩＢＤ）、食道逆流疾患（ＧＥＲＤ）、術後または糖尿病の胃不全麻痺のような胃排出遅延の運動障害および状態、および糖尿病、潰瘍−例えば胃潰瘍を含む胃腸障害；下痢；骨粗鬆症を含む他の疾患；炎症；細菌、真菌、原生生物およびウイルス感染のような感染、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２により引き起こされる感染；疼痛；癌；化学療法が誘導する損傷；腫瘍の浸潤；免疫障害；尿停留；喘息；アレルギー；関節炎；良性の前立腺肥大；内毒素ショック；敗血症；糖尿病の合併症；および婦人科の障害を含む。
【００１１】
特に本発明で記載する新規ＩＧＳ４３ ＧＰＣＲは、子宮、腎臓、肺、気管、結腸、小腸、胃、乳腺、前立腺、精巣、中枢神経系、小脳および脊髄に関係する機能不全、障害または疾患の診断、防止、改善または修正に重要な役割を果たすことができるさらなる受容体の同定および特性決定のために、従来技術における必要性を満たす。
発明の要約
１つの観点では、本発明はＩＧＳ４３ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび組換え材料およびそれらの生産法に関する。本発明の別の観点は、そのようなＩＧＳ４３ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび組換え材料の使用法に関する。そのような使用には、限定するわけではないが治療的標的として、および上記に挙げたような疾患の１つの処置のための使用を含む。特に使用には子宮、腎臓、肺、気管、結腸、小腸、胃、乳腺、前立腺、精巣、中枢神経系、小脳および脊髄に関係する機能不全、障害または疾患の処置を含む。
【００１２】
さらに別の観点では、本発明は本発明により提供される材料を使用してアゴニストおよびアンタゴニストを同定し、そしてＩＧＳ４３不均衡に関連する状態を同定した化合物を用いて処置する方法に関する。さらに本発明の別の観点は、不適切なＩＧＳ４３活性またはレベルに関連する疾患を検出するための診断アッセイに関する。本発明のさらに別の観点は、ＩＧＳ４３の異所性の発現または活性から生じる疾患に関するモデルとして機能する動物に基づく系に関する。
発明の説明
配列およびモチーフの内容における構造的および化学的類似性が、本発明のＩＧＳ４３ ＧＰＣＲおよび他のヒトＧＰＣＲ間に存在する。さらにＩＧＳ４３は子宮、腎臓、肺、気管、結腸、小腸、胃、乳腺、前立腺、精巣、中枢神経系、小脳および脊髄で発現する。したがってＩＧＳ４３は上に挙げた疾患において他の疾患よりも役割を果たすことを意味している。特にＩＧＳ４３は子宮、腎臓、肺、気管、結腸、小腸、胃、乳腺、前立腺、精巣、中枢神経系、小脳および脊髄に関係する機能不全、障害または疾患に役割を果たすことを意味する。
【００１３】
特に定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術の当業者により通常に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書に記載する方法および材料と同様か、または均等な任意の方法および材料を本発明の実践または教示に使用することができるが、好適な方法、デバイスおよび材料をこれから記載する。本明細書中に引用するすべての各刊行物は、各刊行物が本明細書で完全に説明されているかのように引用により本明細書に具体的かつ個別に包含されることを示すことにより引用により本明細書に編入する。
定義
以下の定義は本明細書で頻繁に使用される特定の用語の理解を助けるために提供する。
【００１４】
「ＩＧＳ４３」とはとりわけ、配列番号２で説明されるアミノ酸配列から成るポリペプチド、またはそれらの変異体を称する。
【００１５】
「受容体活性」または「受容体の生物学的活性」とは、類似する活性または改善された活性または望ましくない副作用が低下したこれらの活性を含む該ＩＧＳ４３の代謝的または生理学的機能を称する。または該ＩＧＳ４３の抗原性および免疫原性活性を含む。
【００１６】
「ＩＧＳ４３−遺伝子」は、配列番号１で説明するヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチドまたは各変異体、例えばそれらの対立遺伝子変異体および／またはそれらの相補体を称する。
【００１７】
本明細書で使用する「抗体」は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ、単鎖抗体およびヒト化抗体、ならびにＦａｂまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物を含むＦａｂフラグメントを含む。
【００１８】
「単離された」とは、自然な状態から「人の手により」改変された、および／または自然な環境から分離されたことを意味する。すなわち「単離された」組成物または自然に存在する物質が「単離された」ならば、それはその元の環境から変えられたか、または取り出され、あるいは両方である。例えば生きている動物中で自然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離されて」いないが、その自然な状態で同時に存在する材料から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書で使用する用語のように「単離されて」いる。
【００１９】
「ポリヌクレオチド」は一般に、非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを称する。「ポリヌクレオチド」には限定するわけではないが、単−および二本−鎖−ＤＮＡ、単−および二本−鎖領域の混合であるＤＮＡ、単−および二本−鎖−ＲＮＡ、単−および二本−鎖領域の混合であるＲＮＡ、単鎖であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含んで成るハイブリッド分子、またはより典型的には二本−鎖または単−および二本−鎖領域の混合を含む。さらに「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含んで成る三本−鎖領域を含んでもよい。用語ポリヌクレオチドはまた、安定性もしくは他の理由から１以上の修飾塩基を含むＤＮＡもしくはＲＮＡおよび修飾された骨格を持つＤＮＡもしくはＲＮＡを含む。「修飾された」塩基には、例えばトリチル化された塩基およびイノシンのような通常ではない塩基を含む。種々の修飾をＤＮＡおよびＲＮＡに作成することができる：すなわち「ポリヌクレオチド」は、典型的に自然に見いだされるようなポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、ならびにウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」は、比較的短いポリヌクレオチド、しばしばオリゴヌクレオチドと呼ぶものも包含する。
【００２０】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合、すなわちペプチド等配電子体により互いに連結された２以上のアミノ酸を含んで成る任意のペプチドまたはタンパク質を称する。「ポリペプチド」は短鎖を称し、通例はペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと呼ばれ、より長い鎖は一般にタンパク質と、および／またはそれらの組み合わせと称する。ポリペプチドは２０個の遺伝子にコードされたアミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。「ポリペプチド」には翻訳後プロセッシングのような自然なプロセスにより、または当該技術分野で周知である化学的修飾法によるいずれかで修飾されたアミノ酸配列を含む。そのような修飾は基本的な教科書およびより詳細な技術論文、ならびに詳細で長文な研究論文に十分に記載されている。修飾はポリペプチドのいかなる場所でも起こることができ、それらにはペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含む。同じ種類の修飾が上記のポリペプチド中の幾つかの部位で同じか、または変動する程度で存在し得ると考えられるだろう。また上記のポリペプチドは多くの種類の修飾を含むこともできる。ポリペプチドはまたユビキチン化の結果として分枝してもよく、そしてポリペプチドは分枝を含むか、または含まない環式でもよい。環式、分枝および分枝した環式ポリペプチドは、翻訳後の自然なプロセスから生じるか、または合成法により作ることができる。修飾にはアセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合；架橋結合、環化、ジスルフィド結合の形成、ジメチル化、共有架橋結合の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のような転移−ＲＮＡが媒介するアミノ酸のタンパク質への付加およびユビキチン化を含む。例えば、タンパク質−構造および分子的性質（ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ）、第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．フリーマン アンド カンパニー（Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ニューヨーク、１９９３およびＷｏｌｄ，Ｆ．，翻訳後タンパク質修飾：展望および考察（Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ）、タンパク質の翻訳後の共有修飾（ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮ）の第１〜１２頁、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編集、アカデミック出版（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９８３；Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，「タンパク質修飾および非タンパク質コファクターの分析（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｆａｃｔｏｒｓ）」、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９９０）１８２：６２６−６４６およびＲａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．，「タンパク質合成：翻訳後修飾および加齢（Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ）」、Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９２）６６３：４８−６２を参照にされたい。
【００２１】
本明細書で使用する用語「変異体」は、参照とするポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、本質的な生物学的、構造的、調節的または生物化学的特性のような本質的特性を保持するそれぞれポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。ポリヌクレオチドの典型的な変異体は、別の参照とするポリヌクレオチドとヌクレオチド配列が異なる。変異体のヌクレオチド配列中の変化は、参照ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変えても変えなくてもよい。ヌクレオチド変化は、以下に記載するように参照配列によりコードされるポリペプチド中にアミノ酸置換、付加、欠失、融合および短縮化を生じ得る。ポリペプチドの典型的な変異体は、別の参照とするポリペプチドとアミノ酸配列が異なる。一般に参照ポリペプチドの配列および変異体が全体的に極めて類似し、多くの領域で同一であるように差異が限定されている。変異体および参照ポリペプチドは、１以上の置換、付加および欠失を任意に組み合わせることによりアミノ酸配列を変えることができる。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝子暗号によりコードされてもされなくてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は、対立遺伝子変異体のように自然に発生するものであることができ、あるいは自然に生じるとは知られていない変異体でもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの自然には存在しない変異体は、突然変異誘発法により、または直接合成により作ることができる。
【００２２】
「同一性」とは、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度である。一般に配列は最高の順序の対合が得られるように並べられる。「同一性」自体は当該技術分野で認識されている意味を有し、そして公開されている技法を使用して計算することができる。例えば：（コンピューターの使用による分子生物学（ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＮＡＬ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ）、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編集、オックスフォード大学出版、ニューヨーク、１９８８；バイオコンピューティング：情報科学および遺伝子プロジェクト（ＢＩＯＣＯＭＰＵＴＩＮＧ：ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ ＡＮＤ ＧＥＮＯＭＥ ＰＲＯＪＥＣＴＳ）、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編集；アカデミック出版、ニューヨーク、１９９３；配列データのコンピューター分析（ＣＯＭＰＵＴＥＲ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＯＦ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＤＡＴＡ）、第１部、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編集、ヒューマナ（Ｈｕｍａｎａ）出版、ニュージャージー、１９９４；分子生物学における配列分析（ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ）、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、アカデミック出版、１９８７；および配列分析プライマー（ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＰＲＩＭＥＲ）、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編集、Ｍ ストックトン（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ）出版、ニューヨーク、１９９１）を参照にされたい。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の同一性を測定するための多数の方法が存在するが、用語「同一性」は当業者に周知である（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ Ｌｉｐｔｏｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．（１９８８）４８：１０７３）。２つの配列間の同一性または類似性を決定するために通常使用される方法は、限定するわけではないが大型コンピューターの指針（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ）、Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ、編集、アカデミック出版、サンディエゴ、１９９４およびＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ Ｌｉｐｔｏｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．（１９８８）４８：１０７３に記載されているものを含む。同一性および類似性を決定するための方法は、コンピュータープログラムにコード化される。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好適なコンピュータープログラム法には限定するわけではないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８４）１２（１）：３８７）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＩＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）２１５：４０３）を含む。用語「相同性」は用語「同一性」に置き換えることができる。
【００２３】
具体的説明として、例えば配列番号１の参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の「同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列が配列番号１の参照ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチドあたり最高５個のヌクレオチドの差異を含んでもよいということを除き、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることを意図している。換言すると、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中の最高５％のヌクレオチドが削除されるか、別のヌクレオチドと置換されるか、または全ヌクレオチドの任意の５％までのヌクレオチド数を参照配列に挿入することができ、あるいは参照配列中の全ヌクレオチドの５％までのヌクレオチド数に、欠失、挿入および置換の組み合わせがあってよい。これらの差異は参照ヌクレオチド配列の５’または３’末端位置で、またはこれらの末端位置間の任意の場所で、参照配列中のヌクレオチド間で個々に、または参照配列内の１以上の連続する群に散在して生じてもよい。
【００２４】
同様に、例えば配列番号２の参照アミノ酸配列に対して少なくとも９５％の「同一性」を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ポリペプチド配列が配列番号２の参照アミノ酸の１００アミノ酸あたり最高５個のアミノ酸の改変を含んでもよいということを除き、ポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列と同一であることを意図している。換言すると、参照のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参照配列中、最高５％のアミノ酸残基が削除されるか、別のアミノ酸と置換されるか、または参照配列中、全アミノ酸残基の任意の５％までのアミノ酸数を参照配列に挿入することができる。これらの参照配列の改変は参照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位置で、またはこれらの末端位置間の任意の場所で、参照配列中の残基間で個々に、または参照配列内の１以上の連続する群に散在して生じてもよい。
本発明のポリペプチド
１つの観点では、本発明はＩＧＳ４３ポリペプチド（ＩＧＳ４３タンパク質を含む）に関する。ＩＧＳ４３ポリペプチドには配列番号２のポリペプチドおよびユトレヒト（オランダ国）のセントラアルビュロー ホーア シンメルカルチャー（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）に２００１年８月３０日に寄託された寄託番号ＣＢＳ １０９７１４に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに配列番号２のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、およびユトレヒト（オランダ国）のセントラアルビュロー ホーア シンメルカルチャーに２００１年８月３０日に寄託された寄託番号ＣＢＳ １０９７１４に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、および配列番号２の配列および／またはユトレヒト（オランダ国）のセントラアルビュロー ホーア シンメルカルチャーの寄託番号ＣＢＳ １０９７１４に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドの配列とその全長にわたり少なくとも８０％の同一性、そしてより一層好ましくは該アミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性、そしてさらに一層好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドを含む。さらに少なくとも９７％、特に少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドが高度に好ましい。またＩＧＳ４３ポリペプチドに含まれるのは、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはユトレヒト（オランダ国）のセントラアルビュロー ホーア シンメルカルチャーの寄託番号ＣＢＳ １０９７１４に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドにその全長にわたり少なくとも８０％同一性、そしてより好ましくは配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性、そしてさらに一層好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドである。さらに少なくとも９７％、特に少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドが高度に好適である。好ましくはＩＧＳ４３ポリペプチドは受容体の少なくとも１つの生物学的活性を現す。
【００２５】
特に好適であるのは、配列番号２のアミノ酸配列またはユトレヒト（オランダ国）のセントラアルビュロー ホーア シンメルカルチャーの寄託番号ＣＢＳ １０９７１４で寄託されたＤＮＡ挿入物によりコードされるポリペプチドに対して、その全長にわたり少なくとも９５．５％の同一であるアミノ酸配列から成る単離されたＩＧＳ４３ポリペプチドである。
【００２６】
本発明のさらなる態様では、ＩＧＳ４３ポリペプチドは融合タンパク質のようなより大きなタンパク質の部分でもよい。分泌またはリーダー配列、プロ−配列、多ヒスチジン残基のような精製の助けとなる配列、抗原性ペプチドタグ（ヘムアグルチニン（ＨＡ）タグのような）検出の助けとなる配列、または組換え生産中の安定性のためのさらなる配列を含むさらなるアミノ酸配列を包含することが有利となることが多い。
【００２７】
ＩＧＳ４３ポリペプチドのフラグメントも本発明に含まれる。フラグメントは前述のＩＧＳ４３ポリペプチドのアミノ酸配列の一部と同じであるがすべてではないアミノ酸配列を有するポリペプチドである。ＩＧＳ４３ポリペプチドのように、フラグメントは独立している（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）か、または一部または領域を形成する大きなポリペプチド内に含まれてもよく、最も好ましくは１つの連続する領域である。本発明のポリペプチドフラグメントの代表例には、例えばＩＧＳ４３ポリペプチドのおよそのアミノ酸数１〜２０；２１〜４０、４１〜６０、６１〜８０、８１〜１００；および１０１から末端であるフラグメントを含む。この内容において「およそ」にはいずれかの末端または両末端の数個、５、４、３、２または１個のアミノ酸によるより大きいまたは小さい特に列挙した範囲を含む。
【００２８】
好適なフラグメントには、ＩＧＳ４３ポリペプチドのアミノ酸配列を有する例えば短縮化ポリペプチドを含むが、アミノ末端を含む一連の残基の欠失、またはカルボキシル末端を含む一連の残基の欠失、または１つがアミノ末端を含み、もう１つがカルボキシル末端を含む２つの一連の残基の欠失は除く。また好適であるのは、アルファ−ヘリックスおよびアルファ−ヘリックス形成領域、ベータ−シートおよびベータ−シート形成領域、回転および回転形成領域：コイルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、アルファ両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、柔軟領域、表面形成領域、基質結合領域および高抗原性指数領域を含んで成るフラグメントのような構造的または機能的性質を特徴とするフラグメントである。他の好適なフラグメントは生物学的に活性なフラグメントである。生物学的に活性なフラグメントは受容体活性を媒介するものであり、類似活性または改善された活性を持つもの、または望ましくない活性が低下しているものを含む。また動物、特にヒト内で抗原性または免疫原性であるフラグメントも含む。
【００２９】
このように本発明のポリペプチドは、配列番号２の配列および／またはユトレヒト（オランダ国）のセントラアルビュロー ホーア シンメルカルチャーの寄託番号ＣＢＳ １０９７１４に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドいずれかと少なくとも８０％の同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または対応するフラグメントに少なくとも８０％の同一性を有するそれらのフラグメントを含む。好ましくはこれらポリペプチドフラグメントのすべては、抗原的活性を含む受容体の生物学的活性を保持している。定めた配列およびフラグメントの変異体も本発明の一部を構成する。好適な変異体は、保存的アミノ酸置換により参照（ｒｅｆｅｒｅｎｔｓ）から変化するものであり、すなわち同様な特性の別の残基への置換である。典型的なそのような置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ間：ＳｅｒおよびＴｈｒ間；酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕ間；ＡｓｎおよびＧｌｎ間；塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇ間；または芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙｒ間である。特に好適であるのは、数個、５〜１０個、１〜５個または１〜２個のアミノ酸置換、欠失または付加の任意の組み合わせの変異体である。
【００３０】
本発明のＩＧＳ４３ポリペプチドは、任意の適当な様式で調製することができる。そのようなポリペプチドには、単離された自然に存在するポリペプチド、組換え的に生産されたポリペプチド、合成的に生産されたポリペプチドまたはこれらの方法の組み合わせにより生産されたポリペプチドを含む。そのようなポリペプチドの調製法は、当該技術分野では周知である。
本発明のポリヌクレオチド
本発明のさらなる観点は、ＩＧＳ４３ポリヌクレオチドに関する。ＩＧＳ４３ポリヌクレオチドには、ＩＧＳ４３ポリペプチドおよびフラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチド、およびそれらに緊密に関連しているポリヌクレオチドを含む。より具体的には、本発明のＩＧＳ４３ポリヌクレオチドは配列番号２のＩＧＳ４３ポリペプチドをコードすることができるような配列番号１に含まれるヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド、配列番号１の特定の配列を有するポリヌクレオチドおよびユトレヒト（オランダ国）のセントラアルビュロー ホーア シンメルカルチャーの寄託番号ＣＢＳ １０９７１４で寄託されたＤＮＡ挿入物に本質的に対応するポリヌクレオチドを含む。
【００３１】
ＩＧＳ４３ポリヌクレオチドはさらに、配列番号２のＩＧＳ４３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にその全長にわたり少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド、配列番号１のヌクレオチド配列にその全長にわたり少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド、およびユトレヒト（オランダ国）のセントラアルビュロー ホーア シンメルカルチャーの寄託番号ＣＢＳ １０９７１４で寄託されたＤＮＡ挿入物に本質的に対応するポリヌクレオチドを含む。
【００３２】
これに関して、少なくとも９０％の同一性のポリヌクレオチドが特に好適であり、そして少なくとも９５％の同一性のポリヌクレオチドが特別に好適である。さらに少なくとも９７％の同一性を持つポリヌクレオチドは高度に好適であり、そして少なくとも９８〜９９％のの同一性を持つポリヌクレオチドが最も高度に好適であり少なくとも９９％が最高に好適である。またＩＧＳ４３ポリヌクレオチドに含まれるのは、増幅に使用可能なまたはプローブまたはマーカーとして使用するための条件下でハイブリダイズするために、配列番号１に含まれるヌクレオチド配列またはユトレヒト（オランダ国）のセントラアルビュロー ホーア シンメルカルチャーの寄託番号ＣＢＳ １０９７１４で寄託されたＤＮＡ挿入物に十分な同一性を有するヌクレオチド配列である。本発明はそのようなＩＧＳ４３ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドも提供する。
【００３３】
特に好適であるのは：
１．配列番号２によるＩＧＳ４３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
２．ユトレヒト（オランダ国）のセントラアルビュロー ホーア シンメルカルチャーの寄託番号ＣＢＳ １０９７１４で寄託されたＤＮＡ挿入物によりコードされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、特に配列番号１に対応するヌクレオチド配列；
３．その全長にわたり、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５．５％（好ましくは少なくとも９６％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列；
４．（ａ）または（ｂ）または（ｃ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
から成る群から選択される単離されたＩＧＳ４３ポリヌクレオチドである。
【００３４】
本発明のＩＧＳ４３は、公のデータベースのＢＬＡＳＴ調査の結果により示されるＧ−タンパク質共役受容体ファミリーの他のタンパク質に構造的に関連する。表２のアミノ酸配列（配列番号２）は、ラットのＧＰＣＲ ＲＴＡと最も類似していた（３２７の並べた残基にわたり８５％の同一性；Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ 受け入れ番号Ｐ２３７４９）。特許明細書では、欧州特許出願公開第１０６７１８２号のＳｅｑ Ｉｄ ３２２が恐らくＧ−タンパク質共役受容体に関するタンパク質を与えている。このタンパク質は１６アミノ酸長いが、他はＩＧＳ４３タンパク質と同一である。すなわち本発明のＩＧＳ４３ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、中でもとりわけそれらの相同的なポリペプチドおよびポリヌクレオチドと同様な生物学的機能／特性を有すると期待され、それらの用途は当業者には明らかである。
【００３５】
本発明のポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡのような自然の供給源から得ることができる。特に特定のＧＰＣＲ遺伝子サブファミリー内の保存領域をコードする縮重ＰＣＲプライマーを設計することができる。縮重ＰＣＲプライマーを使用したゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡに関するＰＣＲ増幅反応により、検討中の遺伝子ファミリーの幾つかの員（既知および新規の両方）の増幅がもたらされるだろう（ゲノムの鋳型を使用する時、縮重プライマーは同じエキソン内に位置しなければならない）。（Ｌｉｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９，２４４：５６９−５７２）。本発明のポリヌクレオチドは、周知の、そして市販されている技法を使用して合成することもできる（例えばＦ．Ｍ．Ａｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０００、分子生物学の現在の手法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｉｇｙ））。
【００３６】
配列番号２のＩＧＳ４３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１に含まれるポリペプチドをコードする配列（ヌクレオチド番号３２〜１０１２）に同一であることができ、あるいはそれは異なるヌクレオチド配列でもよく、これは遺伝子暗号の重複（縮重）の結果として、配列番号１に含まれるポリペプチドをコードする配列に比べて改変を示すかもしれないが、配列番号２のポリペプチドをコードする。
【００３７】
本発明のポリヌクレオチドがＩＧＳ４３ポリペプチドの組換え生産に使用される時、ポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドまたはそれらのフラグメントに関するコード配列をそれ自体により；成熟ポリペプチドまたはフラグメントに関するコード配列を、リーダーまたは分泌配列、プレ−もしくはプロ−もしくはプレプロ−タンパク質配列、または他の融合ペプチド部分をコードするような他のコード配列を持つリーディングフレイム中に含むことができる。例えば融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列をコードすることができる。本発明の観点の特定の好適な態様では、マーカー配列はｐＱＥベクター（キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）社）により提供され、そしてＧｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：８２１−８２４に記載されているヘキサ−ヒスチジンペプチド、またはＨＡタグである。ポリヌクレオチドは、転写された非翻訳配列、スプライシングおよびポリアデニレーションシグナル、リボソーム結合部位およびｍＲＮＡを安定化する配列のような非コード５’および３’配列を含むこともできる。
【００３８】
さらに好適な態様は、数個の、５〜１０個の、１〜５個の、１〜３個の、１〜２個のまたは１個のアミノ酸残基が任意の組み合わせで置換、欠失、または付加された配列番号２のＩＧＳ４３ポリペプチドのアミノ酸配列を含んで成るＩＧＳ４３変異体をコードするポリヌクレオチドである。
【００３９】
本発明のポリヌクレオチドは、限定するわけではないがクローニング、プロセッシングおよび／または遺伝子産物の発現の修飾を含む様々な目的にＩＧＳ４３コード配列を改変するために、当該技術分野で一般的に知られている方法を使用して工作することができる。無作為な断片化によるＤＮＡシャッフリング（ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）および遺伝子フラグメントのＰＣＲによる再集成および合成オリゴヌクレオチドを使用して、ヌクレオチド配列を工作することができる。例えばオリゴヌクレオチドが媒介する部位特異的突然変異誘発法を使用して、アミノ酸置換を生じる突然変異を誘導し、新たな制限部位を作り、修飾（例えばグリコシル化またはリン酸化）パターンを改変し、コドンの優先を変え、スプライス変異体等を生じることができる。
【００４０】
本発明はさらに、本明細書の上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。これに関して、本発明は特にストリンジェントな条件で上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書で使用するように用語「ストリンジェントな条件」とは、配列間に少なくとも８０％、そして好ましくは少なくとも９０％、そしてより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９７％、特に少なくとも９９％の同一性が存在すれば起こるハイブリダイゼーションを意味する。
【００４１】
配列番号１に含まれるヌクレオチド配列またはそれらのフラグメントと同一、または十分に同一である本発明のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブとして使用して、ＩＧＳ４３をコードする完全長のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離し、およびＩＧＳ４３遺伝子に高い配列類似性を有する他の遺伝子（ヒト以外の種に由来する相同体およびオーソログをコードする遺伝子を含む）のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離することができる。当業者はそのようなハイブリダイゼーション法を十分に知っている。典型的にはこれらのヌクレオチド配列は参照と８０％同一、好ましくは９０％同一、より好ましくは９５％同一である。プローブは一般に少なくとも５個のヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも８個のヌクレオチド、そしてより好ましくは少なくとも１０個のヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも１２個のヌクレオチド、特に少なくとも１５個のヌクレオチドを含んで成るだろう。最も好ましくはそのようなプローブは少なくとも３０個のヌクレオチドを有し、そして少なくとも５０個のヌクレオチドを有するだろう。特に好適なプローブは、３０から５０ヌクレオチドの間の範囲であろう。
【００４２】
ヒト以外の種に由来する相同体およびオーソログを含むＩＧＳ４３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得るための１つの態様は、適当なライブラリーを配列番号１またはそれらのフラグメントを有する標識したプローブを用いてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でスクリーニングし、そして該ポリヌクレオチド配列を含む完全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離する工程を含んで成る。そのようなハイブリダイゼーション法は当業者には周知である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は上記定義の通りであるか、または５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハーツ溶液、１０％硫酸デキストラン（重量／容量）、および２０マイクログラム／ｍｌ変性、剪断サケ精子ＤＮＡを含んで成る溶液中で４２℃で一晩インキューベーションし、続いてフィルターを約６５℃で０．１×ＳＳＣ中で洗浄する条件である。
【００４３】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、研究試薬ならびに動物およびヒトの疾患に対する処置および診断を見いだすための材料として使用することができる。
ベクター、宿主細胞、発現
また本発明は本発明のポリヌクレオチド（１つまたは複数）を含んで成るベクター、および本発明のベクターにより遺伝的に工作された宿主細胞および組換え法による本発明のポリペプチドの生産に関する。無細胞翻訳系を使用して、本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを用いてそのようなタンパク質を生産することもできる。
【００４４】
組換え生産に関して、宿主細胞を遺伝的に工作して本発明のポリヌクレオチドに関する発現系またはそれらの部分を包含することができる。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，分子生物学の基本的方法（ＢＡＳＩＣ ＭＥＴＨＯＤ Ｓ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ）（１９８６）およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，モレキュラークローニング：ア ラボラトリーマニュアル（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ）、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、（１９８９）のような多くの標準的な研究用マニュアルに記載されているリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、切屑（ｓｃｒａｐｅ）付加、衝撃導入または感染のような方法により行うことができる。
【００４５】
適当な宿主の代表例には、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の細胞ような細菌細胞；酵母細胞およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞のような真菌細胞；ショウショウバエＳ２およびスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３およびＢｏｗｅｓのメラノーマ細胞のような動物細胞；および植物細胞を含む。
【００４６】
多種の発現ベクター系を使用することができる。中でもそのような系には、染色体、エピソームおよびウイルスに由来する系、例えば細菌のプラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入要素、酵母染色体要素、バキュロウイルス、ＳＶ４０のようなパホーウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鳥類ポックス ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスのようなウイルスに由来するベクター、およびコスミドおよびファジェミドのようなプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝子材料に由来するそれらの組み合わせから派生するベクターを含む。発現系は発現を調節ならびに発生する制御領域を含むことができる。一般に宿主中でポリペプチドを生産するためにポリヌクレオチドを維持し、増やし、または発現するために適する任意の系またはベクターを使用することができる。適当なヌクレオチド配列を、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，モレキュラークローニング、ア ラボラトリーマニュアル（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＯＬＯＮＩＮＧ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ）（同上）に説明されているような様々な周知かつ日常的な技法により発現系に挿入することができる。
【００４７】
翻訳されたタンパク質の小胞体内腔への、細胞周辺腔への、または細胞外環境への分泌には、適当な分泌シグナルを所望のポリペプチドに包含させることができる。これらのシグナルはポリペプチドに対して内因性であるか、またはヘテロロガスなシグナル、すなわち異なる種に由来することができる。
【００４８】
ＩＧＳ４３ポリペプチドをスクリーニングアッセイで使用するために発現させる場合、一般にポリペプチドを細胞の表面に生産させることが好ましい。この場合、細胞をスクリーニングアッセイで使用する前に回収することができる。ＩＧＳ４３ポリペプチドの親和性または機能的活性が受容体活性修飾タンパク質（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＲＡＭＰ）により修飾される場合、最も有望には細胞表面での関連するＲＡＭＰの同時発現（ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）が好適であり、そしてしばしば必要である。またこの場合、スクリーニングアッセイに使用する前にＩＧＳ４３ポリペプチドおよび関連するＲＡＭＰを発現している細胞を回収することが必要である。ＩＧＳ４３ポリペプチドが培地に分泌される場合、培地はポリペプチドを回収し、そして精製するために回収することができる：細胞内に生産される場合、細胞はポリペプチドを回収する前に最初に溶解されなければならない。ＩＧＳ４３ポリペプチドを発現している膜は当業者に周知な方法に回収することができる。一般にそのような方法には、ＩＧＳ４３ポリペプチドを発現している細胞を回収し、そして限定するわけではないがポッタリングのような方法により細胞を均一化することを含む。膜は１または数回、懸濁液を洗浄することにより回収することができる。
【００４９】
ＩＧＳ４３ポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ハイドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む周知方法により組換え細胞カルチャーから回収し、そして精製することができる。最も好ましくは高性能液体クロマトグラフィーを精製に使用する。ポリペプチドが単離または精製中の変性した時に、タンパク質のリフォールディングに関する周知の技法を使用して活性な立体配座に再生することができる。
診断アッセイ
また本発明は診断用試薬として使用するためのＩＧＳ４３ポリヌクレオチドの使用に関する。機能不全に関係するＩＧＳ４３遺伝子の突然変異した形態の検出は、ＩＧＳ４３の不十分な発現、過剰発現または改変した発現をもたらす疾患または疾患に対する罹病性の診断を加え、または定めることができる診断用ツールを提供する。またこの場合、関連する受容体活性修飾タンパク質の同時発現が所望する診断アッセイの質を得るために要求され得る。ＩＧＳ４３遺伝子に突然変異を持つ個体を、種々の技法によりＤＮＡレベルで検出することができる。
【００５０】
診断用の核酸は、血液、尿、唾液、組織生検または倍検材料のような個体の細胞から得ることができる。ゲノムＤＮＡは検出に直接使用してもよく、または分析前にＰＣＲまたは他の増殖法を使用することにより酵素的に増幅してもよい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡも類似様式で使用することができる。欠失および挿入は、正常な遺伝子型と比較して増幅産物のサイズの変化により検出することができる。点突然変異は、増幅したＤＮＡを標識したＩＧＳ４３ヌクレオチド配列にハイブリダイズさせることにより同定することができる。完全に対合する配列は、ＲＮａｓｅ消化により、または融解温度の差異により誤対合した二本鎖から識別することができる。ＤＮＡ配列の差異は、変性剤を含むかまたは含まないゲル中でのＤＮＡ配列の電気泳動の移動度の変化により、または直接的なＤＮＡシークエンシングにより検出することもできる。例えばＭｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０：１２４２を参照にされたい。特別な位置での配列の変化も、ＲＮａｓｅおよびＳ１保護のようなヌクレアーゼ保護アッセイまたは化学的開裂法により明らかにすることができる。Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８５：４３９７−４４０１を参照にされたい。別の態様では、ＩＧＳ４３ヌクレオチド配列またはそれらのフラグメントを含んで成るオリゴヌクレオチドプローブの列を構築して、例えば遺伝子突然変異の効率的スクリーニングを行うことができる。整列技法（ａｒｒａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｍｅｔｈｏｄｓ）は周知であり、そして一般的な応用性を有し、そして遺伝子発現、遺伝子連結および遺伝子変動性を含む分子遺伝学における種々の問題に取り組むことができる。（例えばＭ．Ｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ ２７４，ｐｐ６１０−６１３（１９９６））。
【００５１】
診断アッセイはしばしば、記載した方法によりＩＧＳ４３遺伝子における突然変異の検出を通して、とりわけ上に挙げた疾患に対する罹病性を診断または決定するためのプロセスを提供する。特に診断アッセイは、記載した方法によりＩＧＳ４３遺伝子における突然変異の検出を通して、子宮、腎臓、肺、気管、結腸、小腸、胃、乳腺、前立腺、精巣、中枢神経系、小脳および脊髄に関係する機能不全、障害または疾患に対する罹病性を診断または決定するためのプロセスを提供する。
【００５２】
さらに中でも上記の疾患は、ＩＧＳ４３ポリペプチドまたはＩＧＳ４３ ｍＲＮＡレベルが異常に低下または上昇した個体に由来するサンプルを測定することを含んで成る方法により診断することができる。特に子宮、腎臓、肺、気管、結腸、小腸、胃、乳腺、前立腺、精巣、中枢神経系、小脳および脊髄に関係する機能不全、障害または疾患は、ＩＧＳ４３ポリペプチドまたはＩＧＳ４３ ｍＲＮＡのレベルが異常に低下または上昇した個体に由来するサンプルからの測定を含んで成る方法により診断することができる。
【００５３】
低下または上昇した発現は、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護、ノーザンブロッティングおよび他のハイブリダイゼーション法のようなポリヌクレオチドの定量に関して当該技術分野で周知な方法を使用してＲＮＡレベルで測定することができる。宿主に由来するサンプル中のＩＧＳ４３のようなタンパク質のレベルを決定するために使用できるアッセイ技法は、当業者には周知である。そのようなアッセイ法には、ラジオイムノアッセイ、競合的−結合アッセイ、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイを含む。
【００５４】
別の観点では、本発明はとりわけ上に挙げた疾患の１つに対する疾患または罹病性に関する診断キットに関する。特に本発明は子宮、腎臓、肺、気管、結腸、小腸、胃、乳腺、前立腺、精巣、中枢神経系、小脳および脊髄に関係する機能不全、障害または疾患に関する診断キットに関する。
【００５５】
キットは：
（ａ）ＩＧＳ４３ポリヌクレオチド、好ましくは配列番号１のヌクレオチド配列、またはそれらのフラグメント；および／または
（ｂ）（ａ）の配列に相補的なヌクレオチド配列；および／または
（ｃ）ＩＧＳ４３ポリペプチド、好ましくは配列番号２のポリペプチド、またはそれらのフラグメント；および／または
（ｄ）ＩＧＳ４３ポリペプチド、好ましくは配列番号２のポリペプチドに対する抗体；および／または
（ｅ）ＩＧＳ４３ポリペプチドの関連する生物学的または抗原的特性に必要なＲＡＭＰポリペプチド、
を含んで成ることができる。
【００５６】
そのようなキットにおいて、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）は実質的な成分を含んで成ることができると考える。
染色体アッセイ
本発明のヌクレオチド配列は染色体の同定にも価値がある。この配列は個々のヒト染色体上の特定の位置を特異的に標的とし、そしてハイブリダイズすることができる。本発明による染色体に対する関連配列のマッピングは、これらの配列を遺伝子が関連する疾患と関連づける重要な第１工程である。いったん配列が正確な染色体位置にマップされれば、染色体上の配列の物理的な位置を遺伝子マップのデータと相関させることができる。そのようなデータは例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋのヒトにおけるメンデルの遺伝（Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ）（ジョンズ ホプキンス大学ウェルチメデカルライブラリーを通してオンラインで入手可能）に見い出される。次に同じ染色体領域上にマップされた遺伝子と疾患との間の関係は、系統分析を通して同定される（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝（ｃｏｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ））。
【００５７】
影響を受けた、および影響を受けていない個体間のｃＤＮＡまたはゲノム配列における差異も決定することができる。突然変異が影響を受けた個体の幾つかまたはすべてで観察されるが、正常な個体では観察されないならば、この突然変異はおそらく疾患の原因であろう。
抗体
本発明のポリペプチドまたはそれらのフラグメントまたはそれらの同族体またはそれらを発現する細胞は、必要ならば関連するＲＡＭＰと一緒に免疫原として使用して、ＩＧＳ４３ポリペプチドに免疫的に特異的な抗体を生成することもできる。「免疫特異的な」という用語は、抗体が従来技術における他の関連するポリペプチドに対する親和性よりも本発明のポリペプチドに対して実質的により大きな親和性を有することを意味する。
【００５８】
ＩＧＳ４３ポリペプチドに対して生成した抗体は、ポリペプチドまたはエピトープを持つフラグメント、同族体または細胞を動物、好ましくは非ヒトに日常的なプロトコールを使用して投与することにより得ることができる。モノクローナル抗体の調製には、連続する細胞系の培養により生産される抗体を提供する任意の技術を使用することができる。例にはハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５−４９７）、トリオーマ法、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ （１９８３）４：７２）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，モノクローナル抗体および癌治療（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ）、第７７−９６頁、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ社、１９８５）を含む。
【００５９】
上記抗体はポリペプチドを発現しているクローンを単離または同定するために、あるいはアフィニティクロマトグラフィーによりポリペプチドを精製するために使用することができる。
【００６０】
ＩＧＳ４３ポリペプチド自体に対する、またはＩＧＳ４３ポリペプチド−ＲＡＭＰ複合体に対する抗体もとりわけ上記の疾患を処置するために使用することができる。特にＩＧＳ４３ポリペプチド自体に対する、またはＩＧＳ４３ポリペプチド−ＲＡＭＰ複合体に対する抗体は、子宮、腎臓、肺、気管、結腸、小腸、胃、乳腺、前立腺、精巣、中枢神経系、小脳および脊髄に関係する機能不全、障害または疾患を処置するために使用することができる。
動物
本発明の別の観点は、ＩＧＳ４３の異常型（ａｂｅｒｒａｎｔ）の発現または活性から生じる障害のモデルとして機能する非ヒト動物に基づく系に関する。非ヒト動物に基づくモデル系は、さらにＩＧＳ４３遺伝子の活性を特徴付けるためにも使用することができる。そのような系はとりわけ上記の疾患のようなＩＧＳ４３に基づく障害を処置することができる化合物を同定するために計画されたスクリーニング法の一部として利用することができる。特にこの系は子宮、腎臓、肺、気管、結腸、小腸、胃、乳腺、前立腺、精巣、中枢神経系、小脳および脊髄に関係するＩＧＳ４３に基づく機能不全、障害または疾患を処置することができる化合物を同定するために計画されたスクリーニング法の一部として利用することができる。
【００６１】
このように動物に基づくモデルは、ＩＧＳ４３の異常型の発現または活性の障害を処置するために効果的となり得る医薬化合物、治療および介入を同定するために使用することができる。加えてそのような動物モデルは、動物個体のＬＤ５０およびＥＤ５０を決定するためにも使用することができる。これらのデータを使用して有望なＩＧＳ４３障害の処置のインビボ効力を決定することができる。異常型のＩＧＳ４３発現または活性に基づくＩＧＳ４３に基づく障害の動物に基づくモデル系には、非組換え動物ならびに組換え的に工作されたトランスジェニック動物の両方を含む。
【００６２】
ＩＧＳ４３障害に関する動物モデルには、例えば遺伝子モデルを含むことができる。ＩＧＳ４３に基づく障害様の症状を現す動物モデルは、例えば当業者に周知なトランスジェニック動物を作出する技法に関連して上記に記載したようなＩＧＳ４３配列を利用することにより工作することができる。例えばＩＧＳ４３配列は目的の動物のゲノム中に導入し、そして過剰発現および／または誤発現させるか、あるいは内因性のＩＧＳ４３配列が存在するならば、それらを過剰発現、誤発現させるか、またそうではなくＩＧＳ４３遺伝子発現を不十分に発現させるかまた不活性化するために破壊することができる。
【００６３】
ＩＧＳ４３遺伝子配列を過剰発現または誤発現するために、ＩＧＳ４３遺伝子配列のコード部分を高レベルの遺伝子発現、または遺伝子が目的の動物種中で通常は発現されない細胞型中での発現を駆動できる調節配列に連結することができる。そのような調節領域は当業者には周知であり、そして過度な実験を行わずに利用することができる。
【００６４】
内因性のＩＧＳ４３遺伝子配列の不十分な発現には、目的の動物のゲノムに再導入した時に内因性のＩＧＳ４３遺伝子の対立遺伝子が不活性化または「ノックアウト」されるように、そのような配列を単離し、そして工作することができる。好ましくは工作されたＩＧＳ４３遺伝子配列は、内因性のＩＧＳ４３配列が工作されたＩＧＳ４３遺伝子配列の動物ゲノムへの組み込みで破壊されるように、遺伝子ターゲッティングを介して導入される。
【００６５】
限定するわけではないがマウス、ラット、ウサギ、リス、モルモット、ブタ、ミニ−ブタ、ヤギおよび非ヒト霊長類、例えばヒヒ、サルおよびチンパンジーを含む任意の種の動物を使用して、ＩＧＳ４３関連障害の動物モデルを作出することができる。
【００６６】
当該技術分野で既知の技術を使用してＩＧＳ４３導入遺伝子を動物に導入して、トランスジェニック動物の創始系（ｆｏｕｎｄｅｒ ｌｉｎｅ）を作出する。そのような技法には限定するわけではないが前核マイクロインジェクション（Ｈｏｐｐｅ，Ｐ．Ｃ．，ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ，Ｔ．Ｅ．，１９８９，１９８９、米国特許第４，８７３，１９１号明細書）；レトロウイルスが媒介する遺伝子の生殖細胞系への転移（ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：６１４８−６１５２，１９８５）；胚性幹細胞への遺伝子ターゲッティング（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ５６：３１３−３２１，１９８９）；胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３−１Ｂ１４，１９８３）；および精子が媒介する遺伝子転移（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ５７；７１７−７２３，１９８９）等を含む。そのような技法の総説は、Ｇｏｒｄｏｎ、トランスジェニック動物（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ）、Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７１−２２９，１９８９を参照にされたい。
【００６７】
本発明は、すべてのそれらの細胞中にＩＧＳ４３導入遺伝子を持つトランスジェニック動物、ならびにそれらすべての細胞ではないが幾つかの細胞中に導入遺伝子を持つ動物、すなわちモザイク動物を提供する。（例えばＪａｋｏｂｏｖｉｔｓにより記載された技法、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．４：７６１−７６３，１９９４を参照にされたい）導入遺伝子は１つの導入遺伝子またはコンカテマー、例えば頭から頭の直列（ｔａｎｄｅｍ）または頭から尾への直列として組み込むことができる。導入遺伝子は例えばＬａｓｋｏ ｅｔ ａｌ．の教示に従い、特定の細胞型中に選択的に導入され、そして活性化され得る（Ｌａｓｋｏ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６２３２−６２３６，１９９２）。
【００６８】
そのような細胞型に特異的な活性化に必要な調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そして当業者には明らかであろう。
【００６９】
ＩＧＳ４３導入遺伝子が内因性ＩＧＳ４３遺伝子の染色体部位に組み込まれることが望まれる時、遺伝子ターゲッティングが好適である。簡単に説明すると、そのような技術が利用される時、目的の内因性ＩＧＳ４３遺伝子に相同的な幾つかのヌクレオチド配列を含むベクター（例えばマウスＩＧＳ４３遺伝子のヌクレオチド配列）を、内因性ＩＧＳ４３遺伝子または遺伝子の対立遺伝子のヌクレオチド配列に染色体配列との相同的組換えを介して組み込み、そしてその機能を破壊するように計画する。導入遺伝子は選択的に特定の細胞型に導入することもでき、これにより例えばＧｕ ｅｔ ａｌ．（Ｇｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．−Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：１０３−１０６，１９９４）の教示に従いその細胞型のみの目的の内因性遺伝子を不活性化する。そのような細胞型に特異的な不活性化に必要な調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そして当業者には明らかであろう。
【００７０】
いったんトランスジェニック動物が作出されれば、組換えＩＧＳ４３遺伝子の発現およびタンパク質は標準的な技法を使用してアッセイすることができる。初期のスクリーニングはサザンブロット分析またはＰＣＲ法により行い、導入遺伝子の組み込みが起こったかどうかについてアッセイするために動物組織を分析する。トランスジェニック動物の組織中のＩＧＳ４３導入遺伝子のｍＲＮＡ発現のレベルも、限定するわけではないが動物から得た組織サンプルのノーザンブロット分析、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析およびＲＴ−ＰＣＲを含む技法を使用して評価することができる。標的の遺伝子を発現しているサンプルは、目的の標的遺伝子導入遺伝子産物に特異的な抗体を使用して免疫細胞化学的に評価することもできる。容易に検出可能なレベルでＩＧＳ４３遺伝子ｍＲＮＡまたはＩＧＳ４３導入遺伝子ペプチドを発現するＩＧＳ４３トランスジェニック動物（標的遺伝子産物エピトープに対する抗体を使用して免疫細胞化学的に検出される）は、次にさらに特徴的なＩＧＳ４３に基づく障害の症状を現す動物を同定するために評価することができる。
【００７１】
いったんＩＧＳ４３トランスジェニック創始動物が作出されれば（すなわち、目的の細胞または組織中でＩＧＳ４３タンパク質を発現し、そして好ましくはＩＧＳ４３に基づく障害の症状を現す動物）、それらを育種し、同系交配し、異系交配し、または交雑して特定の動物コロニーを作成する。そのような育種法には限定するわけではないが；別の系統を樹立するために１以上の組み込み部位を持つ創始動物を異系交配すること；各ＩＧＳ４３導入遺伝子の付加的な発現の効果により、より高レベルで目的とするＩＧＳ４３導入遺伝子を発現する混合ＩＧＳ４３トランスジェニックを作出するために別の系統を同系交配すること；発現を増し、そしてＤＮＡ分析による可能な動物のスクリーニングの必要性を排除する両方のために、ヘテロ接合性トランスジェニック動物を交配して、所定の組み込み部位に関してホモ接合性の動物を作出すること；別のホモ接合系を交配して混合ヘテロ接合およびホモ接合系統を作出すること；ＩＧＳ４３導入遺伝子の発現およびＩＧＳ４３−様症状の発症に対する対立遺伝子の修飾効果を調査するために、動物を異なる同系交配遺伝的バックグラウンドに育種することを含む。１つのそのような取り組みは、上記のようなＩＧＳ４３に関連する障害様の症状を現すＦ１世代を作出するために、ＩＧＳ４３トランスジェニック創始動物と野生型の種とを交配する。次いでホモ接合性の標的遺伝子トランスジェニック動物が生存可能であると判明すれば、ホモ接合系を作出するためにＦ１世代を同系交配することができる。
ワクチン
本発明の別の観点は哺乳動物中で免疫学的応答を誘導するための方法に関し、この方法はとりわけ上記の疾患の１つから該動物を保護するために、抗体および／またＴ細胞免疫応答を生じるために十分な能力のあるＩＧＳ４３ポリペプチド、またはそれらのフラグメントを必要ならばＲＡＭＰポリペプチドと一緒に哺乳動物に（例えば接種により）投与することを含んで成る。特に本発明は哺乳動物中で免疫学的応答を誘導するための方法に関し、この方法は子宮、腎臓、肺、気管、結腸、小腸、胃、乳腺、前立腺、精巣、中枢神経系、小脳および脊髄に関係する機能不全、障害または疾患から該動物を保護するために、抗体および／またＴ細胞免疫応答を生じるために十分な能力のあるＩＧＳ４３ポリペプチド、またはそれらのフラグメントを必要ならばＲＡＭＰポリペプチドと一緒に哺乳動物に（例えば接種により）投与することを含んで成る。
【００７２】
さらに本発明の別の観点は、哺乳動物に免疫学的応答を誘導する方法に関し、この方法はそのような免疫学的応答を誘導し、疾患から該動物を保護するための抗体を生じるために、ＩＧＳ４３ポリペプチドの発現を支配するベクターを介してＩＧＳ４３ポリペプチドを送達することを含んで成る。
【００７３】
本発明のさらなる観点は、哺乳動物宿主に導入した時に、該哺乳動物にＩＧＳ４３ポリペプチドに対する免疫学的応答を誘導する免疫学的／ワクチン製剤（組成物）に関し、ここで組成物はＩＧＳ４３ポリペプチドまたはＩＧＳ４３遺伝子を含んで成る。そのような免疫学的／ワクチン製剤（組成物）は、治療用の免疫学的／ワクチン製剤または予防用の免疫学的／ワクチン製剤のいずれかでよい。ワクチン製剤はさらに適当なキャリアーを含んで成ることができる。ＩＧＳ４３ポリペプチドは胃内で分解され得るので、非経口的（皮下、筋肉内、静脈内、皮内等の注射を含む）に投与することが好ましい。非経口投与に適する製剤には、酸化防止剤、バッファー、静菌剤および製剤を受容体の血液と等張性にする溶質を含むことができる水性および非水性滅菌注射溶液；および沈殿防止剤または粘性付与剤を含むことができる水性および非水性懸濁液を含む。製剤は単位用量または多用量容器、例えば密閉したアンプルおよびバイアル中に与えることができ、そして使用直前に滅菌液体キャリアーの添加のみを必要とする凍結乾燥条件で保存することができる。ワクチン製剤は、水中油系および当該技術分野で既知の他の系のような製剤の免疫原性を強化するアジュバント系も含むことができる。投薬容量はワクチンの比活性に依存し、そして日常的な実験により容易に決定することができる。
スクリーニングアッセイ
本発明のＩＧＳ４３ポリペプチドは、受容体に結合し、そして本発明の受容体ポリペプチドを活性化するか（アゴニスト）または活性化を阻害する（アンタゴニスト）化合物のスクリーニングプロセスに使用することができる。すなわち本発明のポリペプチドは、例えば細胞、無細胞調製物、化学的ライブラリーおよび天然産物の混合物中の低分子物質およびリガンドの結合を評価するために使用することができる。これらの物質およびリガンドは自然な物質およびリガンドでよく、または構造的もしくは機能的模造物でもよい。
【００７４】
ＩＧＳ４３ポリペプチドは病理を含む生物学的機能の原因である。したがって一方ではＩＧＳ４３を刺激し、そしてもう一方ではＩＧＳ４３の機能を阻害することができる化合物および薬剤を見いだすことが望ましい。一般にアゴニストは、とりわけ上記の疾患のような状態の治療および予防目的に使用される。特にアゴニストは、子宮、腎臓、肺、気管、結腸、小腸、胃、乳腺、前立腺、精巣、中枢神経系、小脳および脊髄に関係する機能不全、障害または疾患の治療および予防目的に使用される。
【００７５】
アンタゴニストは、とりわけ上記の疾患のような状態の種々の治療および予防目的に使用され得る。特にアンタゴニストは、子宮、腎臓、肺、気管、結腸、小腸、胃、乳腺、前立腺、精巣、中枢神経系、小脳および脊髄に関係する機能不全、障害または疾患の種々の治療および予防目的に使用され得る。
【００７６】
一般にそのようなスクリーニング手順には、本発明の受容体ポリペプチドをそれらの表面に発現し、そしてもし必須ならばそれらの表面にＲＡＭＰを同時発現する適切な細胞を生産することが関与する。そのような細胞には哺乳動物、酵母、ショウジョウバエおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する細胞を含む。受容体を発現している細胞（または発現した受容体を含む細胞膜）を次いで試験化合物と接触させて結合、または機能的応答の刺激もしくは阻害を観察する。
【００７７】
１つのスクリーニング技法には、受容体の活性化により引き起こされる細胞外ｐＨ、細胞内ｐＨまたは細胞内カルシウムの変化を測定する系で本発明の受容体を発現する細胞の使用を含む（例えばトランスフェクトしたＣＨＯ細胞）。この技法では、化合物は本発明の受容体ポリペプチドを発現している細胞と接触させることができる。次いで第２メッセンジャー応答、例えばシグナル伝達、ｐＨ変化またはカルシウムレベルの変化を測定して、有望な化合物が受容体を活性化または阻害するかどうかを決定する。
【００７８】
別の方法には、ｃＡＭＰ蓄積および／またはアデニル酸シクラーゼ活性のような受容体が媒介するシグナルのモジュレーションを決定することにより受容体インヒビターをスクリーニングすることが関与する。そのような方法には真核細胞を本発明の受容体でトランスフェクトして、細胞表面上に受容体を発現させることが関与する。次いで細胞を本発明の受容体のアゴニストに、有望なアンタゴニストの存在下で暴露する。有望なアンタゴニストが受容体に結合し、そしてこれが受容体の結合を阻害すれば、アゴニストが媒介するシグナルがモジュレートされるだろう。
【００７９】
本発明の受容体のアゴニストまたはアンタゴニストを検出する別の方法は、米国特許第５，４８２，８３５号明細書に記載されている酵母に基づく技術である。
【００８０】
このアッセイは候補化合物の結合を簡単に試験することができ、ここで受容体を持つ細胞への接着が候補化合物に直接または間接的に結合する標識の手段により、あるいは標識した競合物との競合が関与するアッセイで検出される。さらにこれらのアッセイは、候補化合物が表面に受容体を持つ細胞に対して適当な検出系を使用して、受容体の活性化により生成されるシグナルを生じるかどうかを試験することができる。活性化のインヒビターは一般に既知のアゴニストの存在下でアッセイされ、そして候補化合物の存在によるアゴニストによる活性化に及ぼす効果が観察される。
【００８１】
さらにアッセイは候補化合物をＩＧＳ４３ポリペプチドを含有する溶液と混合して混合物を形成し、混合物中のＩＧＳ４３活性を測定し、そして混合物のＩＧＳ４３活性を標準と比較する工程を単に含んで成るものでよい。
【００８２】
ＩＧＳ４３ ｃＤＮＡ、タンパク質およびタンパク質に対する抗体を使用して、細胞中のＩＧＳ４３ ｍＲＮＡおよびタンパク質の生産に及ぼす加えた化合物の効果を検出するアッセイを形成することもできる。例えばＥＬＩＳＡは、分泌したか、または細胞に付随するＩＧＳ４３タンパク質レベルをモノクローナルおよびポリクローナル抗体を使用して当該技術分野で標準的な方法により測定するために構築することができ、そしてこれを使用して適当に操作された細胞または組織からＩＧＳ４３の生産を阻害または強化することができる作用物質（それぞれアンタゴニストまたはアゴニストとも呼ばれる）を見いだすことができる。スクリーニングアッセイを行うための標準的方法は、当該技術分野で周知である。
【００８３】
有望なＩＧＳ４３アンタゴニストの例には、抗体、または場合によりＩＧＳ４３のリガンドに極めて近いオリゴヌクレオチドまたはタンパク質、例えばリガンドのフラグメント、または受容体に結合するが応答は誘導しないような、受容体の活性が防止される低分子を含む。
【００８４】
このように別の観点では、本発明はＩＧＳ４３ポリペプチドに関するアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質、酵素等；またはＩＧＳ４３ポリペプチドの生産を低下し、増加し、かつ／または強化する化合物を同定するためのスクリーニングキットに関し、このキットは：
（ａ）ＩＧＳ４３ポリペプチド、好ましくは配列番号２のＩＧＳ４３ポリペプチド；
（ｂ）ＩＧＳ４３ポリペプチド、好ましくは配列番号２のＩＧＳ４３ポリペプチドを発現している組換え細胞；
（ｃ）ＩＧＳ４３ポリペプチド、好ましくは配列番号２のＩＧＳ４３ポリペプチドを発現している細胞膜；または
（ｄ）ＩＧＳ４３ポリペプチド、好ましくは配列番号２のＩＧＳ４３ポリペプチドに対する抗体、
を含んで成る。
【００８５】
そのようなキットにおいて、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）は実質的な成分を含んで成ることができる。
予防および治療法
本発明はＩＧＳ４３活性の過剰な、および不十分な量の両方に関係する異常な状態を処置する方法を提供する。
【００８６】
ＩＧＳ４３の活性が過剰である場合、幾つかの取り組みを利用できる。１つの取り組みは、個体にこれまでに記載したインヒビター化合物（アンタゴニスト）を医薬的に許容できるキャリアーと一緒に、ＩＧＳ４３へのリガンドの結合を遮断することにより、またはＲＡＭＰポリペプチドまたは第２シグナルとの相互作用を阻害することにより活性化を阻害するために効果的な量で投与することを含んで成り、それにより異常な状態を緩和する。
【００８７】
別の取り組みでは、内因性ＩＧＳ４３と競合してリガンドに結合することができる可溶性状態のＩＧＳ４３ポリペプチドを投与してもよい。そのような競合物の典型的な態様には、ＩＧＳ４３ポリペプチドのフラグメントを含んで成る。
【００８８】
さらに別の取り組みでは、内因性ＩＧＳ４３をコードする遺伝子の発現を発現−遮断法を使用して阻害することができる。既知のそのような技法には、内部で生成された、または別個に投与されたいずれかのアンチセンス配列の使用が関与する。例えばＯ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ（１９９１）５６：５６０、遺伝子発現のアンチセンスインヒビターとしてのオリゴデオキシヌクレオチド（Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、ＣＲＣ出版、ボカ ラトン、フロリダ、米国（１９８８）を参照にされたい。あるいは遺伝子と三重ヘリックスを形成するオリゴヌクレオチドを供給することができる。例えばＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９７９）６：３０７３；Ｃｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４１：４５６；Ｄｅｒｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５１：１３６０を参照にされたい。これらのオリゴマーはそれ自体を投与することができ、あるいは関連するオリゴマーをインビボで発現させることができる。合成アンチセンスまたは三重オリゴヌクレオチドは、修飾塩基または修飾骨格を含んで成ることができる。後者の例にはメチルホスホネート、ホスホロチオエートまたはペプチド核酸骨格を含む。そのような骨格は、ヌクレアーゼによる分解からの保護を提供するためにアンチセンスまたは三重オリゴヌクレオチドに包含され、そして当該技術分野では周知である。これらのまたは他の修飾骨格を用いて合成されたアンチセンスおよび三重分子も、本発明の部分を構成する。
【００８９】
さらにＩＧＳ４３ポリペプチドの発現は、ＩＧＳ４３ ｍＲＮＡ配列に対して特異的なリボザイムを使用することにより防止することができる。リボザイムは天然または合成であり得る触媒的に活性なＲＮＡである（例えばＵｓｍａｎ，Ｎ， ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ（１９９６）６（４），５２７−３３）。合成リボザイムは選択した位置でＩＧＳ４３ ｍＲＮＡを特異的に開裂するように設計され、これによりＩＧＳ４３ ｍＲＮＡの機能的ポリペプチドへの翻訳を防止する。リボザイムは、ＲＮＡ分子中に通常見いだされるような天然のリボースリン酸骨格および天然の塩基を用いて合成することができる。あるいはリボザイムは例えば２’−Ｏ−メチル ＲＮＡのような非天然の骨格を使用して合成してリボヌクレアーゼ分解から保護することができ、そして修飾塩基を含んでもよい。
【００９０】
ＩＧＳ４３およびその活性の不十分な発現に関連する異常な状態を処置するために、幾つかの取り組みを利用することができる。１つの取り組みは個体に治療に効果的な量のＩＧＳ４３を活性化する化合物、すなわち上記のアゴニストを医薬的に許容されるキャリアーと組み合わせて投与し、これにより異常な状態を緩和する。あるいは遺伝子治療を使用して、個体中の関連する細胞によるＩＧＳ４３の内因性の生産を行ってもよい。例えば本発明のポリヌクレオチドを上記の複製欠損レトロウイルスベクター中での発現用に工作してもよい。次いでレトロウイルス発現構築物を単離し、そして次にパッケージング細胞が目的遺伝子を含む感染性のウイルス粒子を生産するように、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入するパッケージング細胞に導入することができる。これらの生産細胞はインビボで細胞を工作して、インビボでポリペプチドを発現させるために個体に投与することができる。遺伝子治療の概観は、ヒトの分子遺伝学（Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）の第２０章、遺伝子治療および他の分子遺伝学に基づく治療的取り組み（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ−ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ）（およびそこに引用されている参考文献）、Ｓｔｒａｃｈａｎ Ｔ． ａｎｄ Ｒｅａｄ Ａ．Ｐ．，ＢＩＯＳ サイエンテフィック出版社（１９９６）を参照にされたい。
【００９１】
上記の任意の治療法は、そのような治療が必要な例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サルおよび最も好ましくはヒトを含む任意の個体に適用することができる。
製剤および投与
可溶性状態のＩＧＳ４３ポリペプチドのようなペプチド、およびアゴニストおよびアンタゴニストペプチドまたは低分子は、適当な医薬的キャリアーと組み合わせて配合することができる。そのような製剤は治療に効果的な量のポリペプチドまたは化合物、および医薬的に許容されるキャリアーまたは賦形剤を含んで成る。製剤は投与様式に適するべきであり、そして当該技術分野では周知である。本発明はさらに本発明の上記組成物の１以上の成分で満たされた１以上の容器を含んで成る医薬用包装物およびキットに関連する。
【００９２】
本発明のポリペプチドおよび他の化合物は、単独でまたは治療用化合物のような他の化合物と組み合わせて使用することができる。
【００９３】
医薬組成物の全身投与を好適な形態には、注射、典型的には静脈内注射を含む。皮下、筋肉内または腹腔内のような他の注射経路も使用できる。全身投与用の別の手段には、胆汁酸塩またはフシジン酸または他の界面活性剤のような浸透剤を使用する経粘膜および経皮投与を含む。さらに腸溶性またはカプセル化された製剤に適切に配合されれば、経口投与も可能である。
【００９４】
必要な投薬用量範囲はペプチドまたは化合物の選択、投与の経路、製剤の性質、個体の状態の性質、および医師の判断に依存する。適当な投薬用量は、０．１〜１００μｇ／ｋｇの個体の範囲である。しかし必要な投薬用量は、利用できる化合物の種類および種々の投与の経路の異なる効力の観点から広い変動が予想される。例えば経口投与は静脈内注射による投与よりも高い投薬用量が予想される。これらの投薬用量レベルにおける変動は、当該技術分野では十分に理解されているように至適化のための標準的な経験的な日常的作業により調整することができる。
【００９５】
処置に使用するポリペプチドは、上記のよく「遺伝子治療」と呼ばれる処置のモダリティーにおいて個体中で内因的に生成することもできる。すなわち例えば個体に由来する細胞は、例えばレトロウイルスプラスミドベクターの使用によりポリペプチドをコードするためのＤＮＡまたはＲＮＡのようなポリヌクレオチドを用いてエクスビボで工作することができる。この細胞を個体に導入する。
【００９６】
以下の実施例は本発明をより詳細にさらに具体的に説明することのみを意図し、したがってこれらの実施例は本発明の範囲をとのようにも限定するとは見なされない。
【００９７】
【実施例】
実施例１  新規Ｇタンパク質−共役受容体をコードするｃＤＮＡのクローニング
未完成の高処理量ゲノムＤＮＡ配列（ｈｔｇｓ）の公的なドメインのデータバンクで、我々は新規Ｇタンパク質−共役受容体（ＧＰＣＲ）を有力にコードするゲノム配列（受け入れｎ゜ＡＣ０１９１２４）を同定した。我々はこの新規ＧＰＣＲをＩＧＳ４３と呼ぶ。このゲノム配列が機能的遺伝子を表すのかどうかを、ヒトの組織からこのｃＤＮＡをクローン化することにより調査することに決定した。ヒト精巣のｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡ（クローンテック：Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ｃａｔ＃６５３５−１）を最初にＤＮＡｓｅＩ（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理してゲノムＤＮＡの残る痕跡を破壊し、次いでＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素（ライフテクノロジーズ）をこれらの酵素の供給元に推薦されるプロトコールに従い使用して逆転写を介してｃＤＮＡに転換した。ＰＣＲプライマーは、推定上のＩＧＳ４３コード配列を増幅するために設計した。第１のＰＣＲ反応（５０μｌ容量）は精巣ｃＤＮＡ鋳型（５０ｎｇのＤＮＡｓｅＩで処理し、そして逆転写したヒトｐｏｌｙＡ（＋）精巣ＲＮＡから生じた）上で、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）＃２０３２０３）を使用して、前方および逆プライマーであるそれぞれＩＰ１４，９２３（配列番号３）およびＩＰ１４，９２５（配列番号４）を用いてキアジェンにより推薦される条件下で行った。ＰＣＲ反応に関しては、反応試験管を９５℃に１５分間加熱し、そして次いで３５ サイクルの変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（５５℃、３０秒）および抽出（７２℃、９０秒）に供した。最後に７２℃で１０分間の伸長を行った。２．５μｌの第１ＰＣＲ反応物は、キアジェンのＨｏｔＳｔａｒＴａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ネスティド前方および逆プライマーであるそれぞれＩＰ１４，９２４（配列番号５）およびＩＰ１４，９２６（配列番号６）を用いた第２のＰＣＲ反応に鋳型として使用した。クローニング部位をネスティドプライマーに加えて、その後の都合良いサブクローニングを可能とした。ネスティドＰＣＲ反応に関する循環条件は第１ＰＣＲの条件と同一であったが、３０サイクルのみを行った。ＰＣＲ反応産物はアガロースゲル電気泳動により分析し、そしてエチジウムブロマイドで染色した。第１ＰＣＲ反応産物は幾つかのバンドのスメアとしてゲル上に現れた。しかしネスティドＰＣＲ反応は約１０５０ｂｐの強い顕著なＤＮＡフラグメントを生成した。ｍｏｃｋ逆転写（逆転写反応にＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ酵素を加えなかった）したＲＮＡを使用した時、ＤＮＡ産物が得られなかったのは、１０５０ｂｐフラグメントがｃＤＮＡから生じたことを示していた。この±１０５０ｂｐフラグメントをＱＩＡＥＸ（商標）ＩＩ精製キット（キアジェン）を使用してゲルから精製し、そして供給元（ｐＧＥＭ−Ｔ系、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））により薦められる手順に従いｐＧＥＭ−Ｔベクターに連結した。次いで組換えプラスミドを使用してコンピテントなＤＨ５ｓｘＦ’バクテリアを形質転換した。形質転換した細胞は、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、ＩＰＴＧ（０．５ｍＭ）およびＸ−ｇａｌ（５０μｇ／ｍ��）を含有するＬＢ寒天培地にまいた。プラスミドＤＮＡは、ＢｉｏＲｏｂｏｔ（商標）９６００核酸精製システム（キアジェン）を使用して個々の白色コロニーのミニ−カルチャーから精製し、そしてシークエンシングした。精製したプラスミドＤＮＡについてのＤＮＡシークエンシング反応は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（商標）ＢｉｇＤｙｅ（商標）ターミネーターサイクルシークエンシングレディ反応キット（ＰＥアプイドバイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を用い、挿入フランキングおよび内部（ＩＰＴＧ特異的）プライマーを使用して行った。サイクルシークエンシング反応生成物は、ＥｔＯＨ／ＮａＯＡｃ沈殿を介して精製し、そしてＡＢＩ ３７７自動化シークエンサー（ＰＥアプイドバイオシステムズ）に付加した。クローンＨＢ６１２７が、３２７アミノ酸のタンパク質をコードする１０５７ｂｐのＤＮＡ配列を含んだ。我々はこのＤＮＡ配列およびコードされたタンパク質を、それぞれＩＧＳ４３ＤＮＡ（配列番号１）およびＩＧＳ４３ＰＲＯＴ（配列番号２）と称する。ＩＧＳ４３ＤＮＡ配列は、ＡＣ０１９１２４ゲノム配列内で最初に同定された範囲に９７％同一であった（１０５７個の並んだヌクレオチド中に２４個の誤対合が見いだされた）。これは恐らくＡＣ０１９１２４の配列データが単に草案の質であったという事実によるのだろう。ＩＧＳ４３ＰＲＯＴ配列に関しては、今日までのタンパク質データバングおよび翻訳されたＤＮＡデータバングの相同性の範囲を、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．［１９９７］，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）を使用して実行した。これらの調査により、ＩＧＳ４３ＰＲＯＴ配列はラットＧＰＣＲ ＲＴＡに最も類似することが示された（３２７個の並んだ残基にわたり８５％の同一性；スイスポートの受け入れｎ゜Ｐ２３７４９）。欧州特許出願公開第１０６７１８２号明細書のＳｅｑ Ｉｄ ３２２では、可能性のあるＧ−タンパク質共役受容体のタンパク質を与えている。このタンパク質は１６アミノ酸長いが、他はＩＧＳ４３タンパク質と同一である。
【００９８】
【表１】
2004522421.tif 000002
【００９９】
表３：ＩＧＳ４３ ｃＤＮＡをクローン化するために使用したオリゴヌクレオチドプライマーの全体像。ネスティッドプライマーに加えたクローニング部位（ＩＰ１４，９２４についてはＢａｍＨＩ制限部位およびＩＰ１４，９２６についてはＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を意図する）には下線を付す。プライマーＩＰ１４，９２４内のＢａｍＨＩ制限部位の設計における誤りにより［“ＧＧＡＴＣＣ”の代わりに“ＧＧＡＴＴＣ”］、このＢａｍＨＩ制限部位は機能しない。
実施例２  哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）ｈＩＧＳ４３の構築
ヒトＩＧＳ４３タンパク質の完全なコード配列を含むプラスミドｐＧＥＭ−ＴｈｓＩＧＳ４３を持つ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＢ６１２７株を、ＬＢ寒天プレート（１００μｇのアンピシリン／ｍｌを含む）上に再度まいた後に再クローン化し、そしてインノジェネティクス（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）の菌株コレクション（ＩＣＣＧ４５５５）およびオランダ国、ヒトレヒトのセントラアルビュロー ホーア シンメルカルチャー（受け入れｎ゜１０９７１４）の両方に寄託した。再クローン化した単離物から調製したプラスミドＤＮＡを再度シークエンシングし、そして以前に決定したＩＧＳ４３ＤＮＡコンセンサス配列と同一であることが分かった。
【０１００】
完全なＩＧＳ４３コード配列を含む±１０７０ｂｐＤＮＡフラグメントを、ｐＧＥＭ−ＴｈｓＩＧＳ４３プラスミド鋳型からオリゴヌクレオチドプライマーＩＰ１５，３３２（配列番号７）およびＩＰ１５，３３３（配列番号８）を使用してＰＣＲ増幅した。５’末端でオリゴヌクレオチドＩＰ１５，３３２（配列番号７）およびＩＰ１５，３３３（配列番号８）は、それぞれＫｐｎＩおよびＸｂａＩクローニング部位を含んだ。増幅したＰＣＲフラグメントはＫｐｎＩ／ＸｂａＩ消化し、そしてゲルから精製した。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）プラスミド発現ベクター（インビトロゲン）をＫｐｎＩ／ＸｂａＩ消化し、そして直線化した５３６２ｂｐのベクターフラグメントをゲルから精製した。直線化したプラスミドベクターおよびＰＣＲフラグメントを連結し、そしてライゲーション混合物をコンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αＦ’株に熱ショックにより形質転換した。形質転換した細菌をＬＢ寒天培地（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む）にまき、そして３７℃で一晩インキューベーションした。個々の細菌コロニーを選択し、そして１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地中で一晩培養した。プラスミドＤＮＡを調製し、そしてＤＮＡ配列分析を介して分析した。１つのクローンをインノジェネティクスの菌株コレクションにＩＣＣＧ４６９４として寄託した（プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｈＩＧＳ４３を持つ）。
【０１０１】
ＩＣＣＧ４６９４株から調製したプラスミドＤＮＡであるｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｈＩＧＳ４３のＤＮＡ配列分析では、挿入物がＩＧＳ４３ＤＮＡコンセンサスｃＤＮＡ配列と完全に同一であることが示された。
実施例３  定量的なＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を介した種々のヒト組織中のＩＧＳ４３ ｍＲＮＡの発現分析
ヒトＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）およびＩＧＳ４３ ｍＲＮＡの絶対発現レベルは、リアルタイムの定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイ（Ｑ−ＰＣＲ）で、Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ（商標）装置（ロッシュ ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））および遺伝子特異的ＰＣＲプライマーおよびヒトＲＮＡサンプルについてＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して決定した。ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに関するｍＲＮＡレベルはｃＤＮＡ合成の効率に関する対照として、そして種々のＲＮＡサンプルについてのＰＣＲ増幅を測定した。
【０１０２】
ｃＤＮＡは種々のヒト組織の全ＲＮＡ（クローンテックのヒトＲＮＡパネル ｃａ＃Ｋ４０００−１、Ｋ４００１−１、Ｋ４００２−１、Ｋ４００３−１およびＫ４０００４−１）から、またはヒト脳の種々のサブ領域に由来するｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ（クローンテックのｃａ＃６５８０．１、６５７５．１、６５４３．１、６５７４．１、６５７７．１、６５７８．１および６５８２．１）のいずれかから逆転写を介して合成した。逆転写の前に、混入している可能性のあるゲノムＤＮＡを破壊するために、供給元により推薦される手順に従いＲＮＡをＤＮＡｓｅＩ（ライフテクノロジーズ ｃａ＃１８０６８−０１５）で処理した。ＤＮＡｓｅＩ反応はＥＤＴＡ（最終濃度＝２．３ｍＭ）を加え、そして６５℃で１０分間加熱することにより停止した。ＤＮＡｓｅＩで処理したＲＮＡ（５μｇの全ＲＮＡまたは９４５ｎｇのｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡのいずれか）を２．５μｇのｏｌｉｇｏ（ｄＴ）（ライフテクノロジーズ＃１８４１８−０１２）にアニールし、そしてＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ 逆転写酵素（キアジェン：１００μｌの反応容量；３７℃で１時間）を使用して逆転写に供した（＝ＲＴ＋−反応）。逆転写酵素は９３℃で５分間インキューベーションすることにより不活性化した。ＤＮＡｓｅ処理したＲＮＡの一部は逆転写にかけず、そして対照として使用して残るゲノムＤＮＡの存在を確認した（ＲＴ−−反応）。
【０１０３】
全ＲＮＡサンプルのＲＴ−−反応におけるゲノムＤＮＡの不存在に関する対照として、ヒトβ２−ミクログロブリンＤＮＡに特異的なＰＣＲ増幅反応を行った。ＰＣＲ反応は２．５μｌのＧｅｎｅＡｍｐ（商標）１０×ＰＣＲバッファー（アプライドバイオシステムズ）、２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．５μｌのＲＴ−ｃＤＮＡ合成反応、各５ｐｍｏｌのＰＣＲプライマーであるＩＰ３，９８１（配列番号９）およびＩＰ３，９８２（配列番号１０）および１．２５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（アプライドバイオシステムズ ｃａｔ＃Ｎ８０８−０２４４）を含む２５μｌの反応容量で行った。９５℃で１０分間の最初のインキューベーション後、反応は以下のように３０回循環させた：９４℃で１分間の変性、５５℃で１分間のアニーリングおよび７２℃で１分間の伸長。最後に７２℃で１０分間伸長させた。陽性対照として、５０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（クローンテック＃６５５１−１）を使用した。予想される長さのアンプリコンはゲノムＤＮＡ鋳型から得たが、陰性対照（Ｈ２Ｏ）からもＲＴ−サンプルからも得られなかった（ＩＰ３，９８１／ＩＰ３９８２プライマー対は６１６ｂｐイントロンに広がるという事実から、予想されるアンプリコンの長さは、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡについてそれぞれ２６９ｂｐおよび８８５ｂｐである）。ＲＴ−ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡサンプルは、０．８μｌのＲＴ−ｃＤＮＡ合成反応を使用してＧＡＰＤＨ特異的Ｑ−ＰＣＲを介してゲノムＤＮＡの存在について分析した（以下を参照にされたい）。ＧＡＰＤＨ特異的シグナルは得られなかった。我々は合成したｃＤＮＡがゲノムＤＮＡを含まないと結論した。
【０１０４】
Ｑ−ＰＣＲ反応は、１×ＴａｑＭａｎ（商標）ユニバーサルＰＣＲマスターミックス（アプライドバイオシステムズ ｃａｔ＃４３０４４３７）、０．１２ｍｇ ＢＳＡ／ｍｌ、９００ｎＭのＧＡＰＤＨまたはＩＧＳ４３特異的な前方および逆プライマー（ＧＡＰＤＨについてはＩＰ１５．５２９（配列番号１１）／ＩＰ１５，５３１（配列番号１２）、そしてＩＧＳ４３についてはＩＰ１７，０８０（配列番号１３）／ＩＰ１７，０８１（配列番号１４））、２５０ｎＭの遺伝子特異的ＴａｑＭａｎプローブ（それぞれＧＡＰＤＨについてはＩＰ１５，５３０（配列番号１５）、そしてＩＧＳ４３についてはＩＰ１７，０８２（配列番号１６））および１．６μｌの全ＲＮＡ ＲＴ＋またはｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＴ＋ｃＤＮＡ合成反応物を含む２０μｌの反応容量で行った。１×ＴａｑＭａｎ（商標）ユニバーサルＰＣＲマスターミックスは、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｍｐＥｒａｓｅ（商標）ウラシルＮ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）、ｄＵＴＰを含むｄＮＴＰｓ、受動的参照（ｐａｓｓｉｖｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）１および最適化バッファー成分を含んだ。特異的プライマーおよびＴａｑＭａｎプローブは、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）ソフトウェア（アプライドバイオシステムズ）で設計した。遺伝子特異的な標準曲線は、直線化ｐＧＥＭ−ＴｈｕＧＡＰＤＨ（完全長のヒトＧＡＰＤＨ ｃＤＮＡを含む）またはｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｈＩＧＳ４３プラスミド（ＩＣＣＧ４６９４）の１／１０連続希釈（１０８〜１０２コピー／反応）で確立した。ＰＣＲ反応はＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ（商標）装置中のガラス毛細管キュベット中で行った。５０℃で２分間の最初のインキューベーション（ＡｍｐＥｒａｓｅ ＵＮＧ反応を行う）、続いて９５℃で１０分間のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（商標）ＤＮＡポリメラーゼの活性化を行った後、反応を以下のように５０回循環した：９５℃で１５秒間の変性、そして６０℃で６０秒間のアニーリング／伸長（ＧＡＰＤＨおよびＩＧＳ４３の両方について）。サンプルの定量は、Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒソフトウェアバージョン３．０を使用して行った。
【０１０５】
【外１】
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【０１０６】
ＩＧＳ４３ ｍＲＮＡは子宮で最も豊富に発現されることが分かった（±６９，０００コピー／ｎｇ ｍＲＮＡ）（図２）。重要なレベル（約１０，０００から２０，０００コピー／ｎｇ ｍＲＮＡ）は、腎臓、肺、気管、結腸、小腸、胃、乳腺、前立腺および精巣でも見いだされた。比較的少ないレベルが、小脳および脊髄とは別に中枢神経系で見いだされた。
【０１０７】
【表２】
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【０１０８】
表４：使用したオリゴヌクレオチドプライマーおよびＴａｑｍａｎプローブの全体像。実施例４  ＩＧＳ４３トランスフェクト細胞の構築
ＩＧＳ４３のリガンドを同定するために、チャイニーズハムスター卵母（ＣＨＯ）細胞をＩＧＳ４３オーファン受容体のｃＤＮＡで安定にトランスフェクトする。ＩＧＳ４３受容体のＧ−タンパク質共役メカニズムは未だに未知であるので、ＧＰＣＲの「ユニバーサルアダプター」として知られているＧ−タンパク質Ｇα１６（ＣＨＯ−Ｋ１−Ｇα１６、モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ））を発現する特異的なＣＨＯ−細胞種を使用する（Ｍｉｌｌｉｇａｎ Ｇ．ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１７：２３５−７）。この細胞系もミトコンドリアを標的としてアポ−エクオリンを安定に発現する。
【０１０９】
材料には：ＩＧＳ４３−ｐｃＤＮＡ３．１ベクター；ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ トランスフェクション試薬（キアジェン）；成長培地：１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、ギブコ ＢＲＬ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、ヒグロマイシンＢ ４００μｇ／ｍｌを補充したＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ ＩＩ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ） ＢＲＬ）；選択−培地：１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、ヒグロマイシンＢ ４００μｇ／ｍｌおよびゲネチシン ５００μｇ／ｍｌを補充したＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ ＩＩ（ギブコ ＢＲＬ）；ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ キット（キアジェン）、ＤＮａｓｅＩ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、２Ｕ／μｌ）、ＳｕｐｅｒＳｕｃｒｉｐｔＩＩ（ギブコ ＢＲＬ）、ＳｕｐｅｒＳｕｃｒｉｐｔＩＩ２００Ｕ（ギブコ ＢＲＬ）を含む。
【０１１０】
ＣＨＯ−Ｋ１−Ｇα１６／ｍｔＡＥＱ細胞は、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（キアジェン）を用いて製造元に記載されたようにトランスフェクトする。トランスフェクションは２４ウェルプレート中で行う。成長−培地中で２４時間後、培地を取り出し、そして選択−培地と交換する。選択−培地中でコンフルエンシーになるまで成長させた後、ポリクローナルを２４ウェルプレートに１回通す。
【０１１１】
ポリクローナルの選択は、Ｑ−ＰＣＲにより行う。ＲＮＡは、モノクローナル（２４ウェルプレートから１つのコンフルエントなウェル）をＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ キット（キアジェン）を用いて供給されたプロトコールに従い単離する。ＲＮＡをＤＮａｓｅ（アンビオン、２Ｕ／μｌ）で、サンプルあたり１Ｕで処理する。ＲＮＡサンプルの半分は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（ギブコ、ＢＲＬ）を使用してＲＴ−ＰＣＲに使用する。プライマーのアニーリングは、ＲＮＡおよびｏｌｉｇｏ−ｄＴ１６（０，６μＭ）を用いて６５℃〜１５℃で１０分間行う。各０，４３ｍＭのｄＮＴＰ、ＤＴＴ １０ｍＭ、２０Ｕ ＲＮａｓｉｎ（プロメガ、４０Ｕ／ｍｌ）およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ ２００Ｕ（ギブコ ＢＲＬ、２００Ｕ／μｌ）を含む第１鎖バッファー（ギブコ ＢＲＬ）を３０μｌの最終容量になるまで加え、続いて４２℃で１時間インキューベーションする。
【０１１２】
Ｑ−ＰＣＲは、Ｑ−ＰＣＲプライマーに特異的なＩＧＳ４３受容体を用いて行う。ＰＣＲ産物の量は、ｄｓＤＮＡに結合するＳｙｂｒ Ｇｒｅｅｎの蛍光を測定することにより各サイクル後に決定する。ＩＧＳの相対的発現レベルは、染色体ＤＮＡの４種の希釈の標準曲線と関連づける。相対的な定量をハウスキーピング遺伝子であるベータチューブリンに対して標準化する。
【０１１３】
２つの最高のポリクローナルを使用して、モノクローナルを得る。細胞は限界希釈にまく。モノクローナルの選択は先に記載したようにＱ−ＰＣＲにより行う。６個の最高のモノクローナルをＴ７５フラスコ中でコンフルエンシーになるまで成長させ、そして１０％ＤＭＳＯを含有する成長培地中で凍結する。
実施例５  リガンドの探査
特定のＧ−タンパク質共役受容体を発現しているＣＨＯ−Ｋ１−Ｇα１６／ｍｔＡＥＱ細胞は実施例４に記載したように成長させ、そして多数の化合物ライブラリーのスクリーニングに使用する。化合物は１または１０μＭの濃度で試験する。エクオリンのスクリーニングアッセイでは、ＡＴＰ（１０μＭ）またはジギトニン（５０μＭ）を陽性対照として使用する。スクリーニングは、以下に記載するようにＭｉｃｒｏＢｅｔａ Ｊｅｔ１４５０（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））を使用して半自動的に行う。
【０１１４】
いったん化合物が見い出されれば、シグナル活性を示すことは第２エクオリン実験で確認される。続いてそれらをさらに用量−依存的実験で特性決定する。
【０１１５】
ＩＧＳ４３受容体およびアポ−エクオリンを発現しているＣＨＯ−Ｋ１−Ｇα１６細胞を使用してリガンドを見いだすことができなければ、Ｇ−タンパク質Ｇα１６無しの対応する細胞を類似様式（実施例４を参照にされたい）で生育し、続いて化合物を試験する。
【表３】
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【表４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
種々のヒト組織中のＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ発現のＱ−ＰＣＲ分析。報告された値（＃コピー／ｎｇ ｍＲＮＡ）は、２回のＱ−ＰＣＲアッセイの平均を表す（独立して調製されたｃＤＮＡについての各アッセイ）。ｍＲＮＡは全ＲＮＡの２％を表し、そしてｃＤＮＡ合成は１００％の効率であったと予想された。真の効率は恐らく２０〜５０％に近いので、実際のコピー数は２〜５倍と低くなるだろう。“＊”を記した組織についてはｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを使用したが、すべての他の組織は全ＲＮＡを使用した。
【図２】
種々のヒト組織中のＩＧＳ４３ ｍＲＮＡ発現のＱ−ＰＣＲ分析。報告された値（＃コピー／ｎｇ ｍＲＮＡ）は、１回の測定である。ｍＲＮＡは全ＲＮＡの２％を表し、そしてｃＤＮＡ合成は１００％の効率であったと予想された。真の効率は恐らく２０〜５０％に近いので、実際のコピー数は２〜５倍と低くなるだろう。“＊”を記した組織についてはｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを使用したが、すべての他の組織は全ＲＮＡを使用した。
【表５】2004522421.tif 000007
【表６】2004522421.tif 000008
【表７】2004522421.tif 000009
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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