(57)【要約】本発明は、上皮組織（皮膚、胃腸管、肺上皮などを含む）にわたる、薬物および他の薬剤の送達を増強するための組成物および方法を提供する。この組成物および方法はまた、内皮組織（血液脳関門を含む）にわたった送達に有用である。この組成物および方法は、非結合体化化合物と比較して、１つ以上の組織層にわたる、試薬に結合体化された化合物の送達を増強するために十分なグアニジノ側鎖部分およびアミジノ側鎖部分を有する、送達増強トランスポーターを使用する。この送達増強ポリマーとしては、例えば、好ましくは、約６残基長と約２５残基長との間であるポリ−アルギニン分子が挙げられる（図４４参照）。
2004530657.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物を動物の胃腸上皮に標的化する方法であって、該方法は、該化合物および送達増強トランスポーターを含む結合体を、該胃腸上皮に投与する工程を包含し、ここで：
ｉ．該化合物が、リンカーを介して該送達増強トランスポーターに結合され；そして、
ｉｉ．該送達増強トランスポーターが、５０未満のサブユニットを含み、そして、少なくとも５つのグアニジノ部分またはアミジノ部分を含み、これによって、該送達増強トランスポーターの非存在下での該化合物の輸送と比較して、該胃腸上皮への該結合体の送達が増大される、
方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記結合体の前記胃腸上皮への送達が、前記送達増強トランスポーターの非存在下における前記化合物の送達と比較して、少なくとも２倍増大される、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記結合体の前記胃腸上皮への送達が、前記送達増強トランスポーターの非存在下における前記化合物の送達と比較して、少なくとも１０倍増大される、方法。
【請求項４】
前記リンカーが、放出可能なリンカーである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記サブユニットがアミノ酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記結合体が、以下：
【化１】
2004530657.tif 000041
【化２】
2004530657.tif 000042
のような構造３、４または５からなる群より選択される構造を有し、ここで：
Ｒ１は、前記化合物を含み；
Ｘは、生物学的に活性な化合物上の官能基と結合部分上の末端官能基との間で形成された結合であり；
Ｙは、輸送部分上の官能基および結合部分上の官能基から形成された結合であり；
Ａは、ＮまたはＣＨであり；
Ｒ２は、水素、アルキル、アリール、アシルまたはアリルであり；
Ｒ３は、前記送達増強トランスポーターを含み、
Ｒ４は、Ｓ、Ｏ，ＮＲ６またはＣＲ７Ｒ８であり；
Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨＲ６であり；
Ｒ６は、水素、アルキル、アリール、アシルまたはアリルであり；
ｋおよびｍは１および２から各々独立して選択され；ならびに
ｎは１〜１０である、
方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、ここで、Ｘは、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−Ｃ（Ｓ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＳＯ２ＮＨ−、−ＳＯＮＨ−、ホスフェート、ホスホンネート、ホスフィンネート、およびＣＲ７Ｒ８からなる群より選択され、ここで、Ｒ７およびＲ８は、各々、Ｈおよびアルキルからなる群より独立して選択される、方法。
【請求項８】
前記結合体が構造３を含み、ＹはＮであり、そして、Ｒ２はメチル、エチル、プロピル、ブチル、アリル、ベンジルまたはフェニルである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
Ｒ２はベンジルであり；ｋ、ｍおよびｎが各々１であり、そして、Ｘが−ＯＣ（Ｏ）−である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記結合体は構造４を含み；Ｒ４はＳであり；Ｒ５はＮＨＲ６であり；そして、Ｒ６は水素、メチル、アリル、ブチルまたはフェニルである、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記結合体は構造４を含み；Ｒ５はＮＨＲ６であり；Ｒ６は水素、メチル、アリル、ブチルまたはフェニルであり；そして、ｋおよびｍは各々１である、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記結合体が、以下：
【化３】
2004530657.tif 000043
のような構造６を含み、ここで：
Ｒ１は、前記化合物を含み；
Ｘは、生物学的に活性な化合物上の官能基と結合部分上の末端官能基との間で形成された結合であり；
Ｙは、輸送部分上の官能基および結合部分上の官能基から形成された結合であり；
Ａｒは、オルト位またはパラ位に配置された結合化遊離基を有するアリール基であり、アリール基は置換されてもよいし、置換されなくてもよい；
Ｒ３は、前記送達増強トランスポーターを含み、
Ｒ４は、Ｓ、Ｏ，ＮＲ６またはＣＲ７Ｒ８であり；
Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨＲ６であり；
Ｒ６は、水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、アシルまたはアリルであり；
Ｒ７およびＲ８は、水素またはアルキルから独立して選択され；そして
ｋおよびｍは１および２から各々独立して選択される、
方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、ここで、Ｘは、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−Ｃ（Ｓ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＳＯ２ＮＨ−、−ＳＯＮＨ−、ホスフェート、ホスホンネート、ホスフィンネート、およびＣＲ７Ｒ８からなる群より選択され、ここで、Ｒ７およびＲ８は、各々、Ｈおよびアルキルからなる群より独立して選択される、方法。
【請求項１４】
Ｒ４はＳであり；Ｒ５はＮＨＲ６であり；そして、Ｒ６は水素、メチル、アリル、ブチルまたはフェニルである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記結合体が、少なくとも２つの送達増強トランスポーターを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
前記結合体が、頬に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記結合体が、坐薬として投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記送達増強トランスポーターが、非ペプチド骨格を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記送達増強トランスポーターは、該送達増強トランスポーター分子が天然に存在するタンパク質中で結合されるアミノ酸配列に結合されない、方法。
【請求項２０】
前記送達増強トランスポーターが、２〜２５のグアニジノ部分またはアミジノ部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記送達増強トランスポーターが、７と１５の間のグアニジノ部分を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記送達増強トランスポーターが、少なくとも６つの連続したグアニジノ部分および／またはアミジノ部分を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の方法であって、前記送達増強トランスポーターが、本質的に５〜５０のアミノ酸からなり、これらのアミノ酸の少なくとも５０％がアルギニンまたはそのアナログである、方法。
【請求項２４】
前記送達増強トランスポーターが、５〜２５のアルギニン残基またはそのアナログを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも１つのアルギニンが、Ｄ−アルギニンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記アルギニンの全てがＤ−アルギニンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記送達増強トランスポーターを含む前記アミノ酸の少なくとも７０％が、アルギニンまたはそのアナログである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記送達増強トランスポーターが、７つの連続したＤ−アルギニンからなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１に記載の方法であって、前記化合物は、炎症性腸疾患、結腸癌、潰瘍性大腸炎、胃腸潰瘍、便秘、ならびに、塩および水吸収の失調からなる群より選択される疾患のための治療薬である、方法。
【請求項３０】
請求項１に記載の方法であって、前記化合物は、免疫抑制剤、コルチコステロイド、緩下薬、抗生物質または抗腫瘍剤からなる群より選択される、方法。
【請求項３１】
前記化合物が、回腸（ｉｌｉｅｍ）および／または結腸に標的化される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、皮膚膜および上皮膜（例えば、皮膚、胃腸上皮および気管支上皮を含む）にわたる薬物および他の化合物の送達を増強する組成物および方法の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
経皮薬物送達または経粘膜薬物送達は、様々な理由のために、魅力的な薬物送達経路である。胃腸薬分解および肝臓の最初の通過効果が回避される。さらに、経皮薬物送達および経粘膜薬物送達は、制御された持続性送達に十分適している（例えば、Ｅｌｉａｓ、Ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ−Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ−Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｂｒｏｎａｕｇｈ  ＆  Ｍａｉｂａｃｈ  Ｅｄｓ．１〜１２頁、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９を参照のこと）。多くの適用について、薬物を投与する従来の方法は、薬物の非常に高い初濃度に起因して、最適でない。経皮送達は、より高い均一性、より遅い薬物の送達速度を可能にし得る。さらに、患者コンプライアンスは、このような送達方法は、使用が容易で、快適、簡便かつ非侵襲性なので、奨励される。
【０００３】
経皮送達および経粘膜送達のこれらの利点は、上被膜、皮膚の低浸透性（特に、薬物に対する）に起因して、多くの臨床的適用につながっていなかった。皮膚にわたる薬物の送達における困難は、皮膚の障壁特性に起因する。皮膚は、外部の不適環境に対する身体の境界を示す、構造的に複雑な薄膜である。皮膚は、表皮、真皮、皮下組織および付属（ａｄｅｎｅｘａｌ）構造（表皮の付属物）から構成される。表皮（皮膚の最外上皮組織）は、それ自身が、いくつかの層−−角質層、顆粒層、有棘層、および基底層から構成される。
【０００４】
環境から無傷の皮膚に移動し、そして、無傷の皮膚を進む化合物は、最初に、角質層（皮膚の最外層）に浸透しなければならなく、この角質層は、緻密で、そして、非常に角質化されている。角質層は、コレステロールおよび脂肪酸から構成される「膠（ｇｌｕｅ）」によって、一緒に緊密に結合される、ケラチン充填皮膚細胞のいくつかの層から構成される。角質層の厚さは、身体部位に依存して変化する。これは、薬学的薬剤に対する皮膚の不浸透性を生じる角質層の存在である。この角質層は、基底層から皮膚表面（ここで、細胞は、最終的に剥がれる）への細胞移動によって自然に形成される。表面への細胞の進行に伴い、この細胞は、次第に、より乾燥され、そして角質化される。角質層にわたる浸透は、一般に、皮膚にわたる薬物浸透の律速段階である。例えば、Ｆｌｙｎｎ，Ｇ．Ｌ．，Ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ−Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ−Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，前述、２７〜５３頁を参照のこと。
【０００５】
角質層を介した浸透の後、次いで、全身作用性薬物分子は、表皮、真皮に移動し、そしてこれらを通過し、最終的には、血流の毛細管壁を通過しなければならない。角質層の下に位置する表皮は、３つの層から構成される。これらの層の最外部は、顆粒層で、この顆粒層は、角質層に隣接して位置し、基底細胞およびケラチノサイトとは区別される細胞から構成され、これらの基底細胞およびケラチノサイトは、根底の層を形成し、獲得されたさらなるケラチンおよびより平坦な形状を有する。表皮のこの層の細胞は、顆粒を含み、この顆粒は、大部分がタンパク質フィラグリンから構成される。このタンパク質は、ケラチン複合体を形成するために、ケラチンフィラメントに結合すると思われている。細胞はまた、細胞を結合させるための「セメント」として機能する脂質を合成する。表皮（特に、顆粒層）は、アミノペプチダーゼのような酵素を含む。
【０００６】
表皮の次の外層は有棘層で、この主細胞はケラチノサイトであり、このケラチノサイトは、基底細胞層を含む基底細胞由来である。ランゲルハンス細胞（有棘層でもまた見出される）は、抗原提示細胞であり、従って、皮膚に移動する抗原に対する免疫応答の増大に関する。この層の細胞は、一般に、接触感受性皮膚炎に関する。
【０００７】
最内部の表皮層は、基底層すなわし基底細胞層であり、これらは、根底の真皮から基底細胞層を分離する薄基底膜に、半接着斑により結合される立方細胞の１つの細胞層からなる。基底層の細胞は、表皮の外部層の前駆物質として機能する、比較的未分化の増殖細胞である。基底細胞層としては、さらに、基底細胞、メラニン細胞が挙げられる。
【０００８】
真皮は、表皮の下で見出され、この表皮は、連結乳頭間隆起および真皮乳頭からなる基底膜によって、真皮から分離される。真皮自身は、２つの層（乳頭真皮および網状真皮）から構成される。この真皮は、以下を構成する：線維芽細胞、組織球、内皮細胞、脈管周囲マクロファージ、ならびに、樹状細胞、肥胖細胞、平滑筋細胞、ならびに、末梢神経の細胞およびそれらの器官内レセプター。真皮としては、コラーゲンおよびレチクリンのような線維物質、ならびに細胞間質（主に、グリコサミノグリカン（ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸およびデルマタン硫酸））が挙げられる。
【０００９】
いくつかの方法は、薬物の経皮輸送を増強することが提唱されている。例えば、化学エンハンサー（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ，Ｒ．Ｒ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｉｓｓｕｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅｓ；Ｈａｄｇｒａｆｔ  Ｊ．，Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ：１９８９  ２４７〜２８８頁）、イオン導入、および他のものが、使用されている。しかし、特に、皮膚にわたる薬物の送達を調査している、３０余りの長い研究にも関わらず、１２にも満たない薬物が、現在、例えば、皮膚用パッチ剤における経皮投与に利用可能であるにすぎない。
【００１０】
血液脳関門にわたる薬物および他の分子の輸送はまた、問題がある。血液脳関門を構成Ｓする脳毛細管は、内皮細胞自身の間で接着結合を形成する内皮細胞から構成される（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ２５５：７４〜８３（１９８６）；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，Ｗ．Ｍ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｒｅｖ．７：３１４〜３３０（１９８６））。内皮細胞、および、細胞を連結する緊密な細胞間連結は、血液から脳への多くの分子の受動的な移動に対する障壁を形成する。血液脳関門の内皮細胞は、飲小胞をほとんど有さず、この飲小胞は、他の組織においては、毛細管壁にわたる無差別な輸送をいくらか可能にし得る。血液脳関門はまた、細胞を貫通し、従って、薬物および他の分子の無制限の通過を可能にする連続的な裂孔またはチャネルによっても妨害されない。
【００１１】
従って皮膚、胃腸管、眼、および血液脳関門のような、上皮組織および内皮組織にわたる化合物（薬物を含む）の送達を増大する、改良された試薬および方法が必要である。本発明は、この必要性および他の必要性を満たす。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
本発明は、化合物を動物の胃腸上皮に標的化する方法を提供する。本方法は、化合物および送達増強トランスポーターを含む結合体を、胃腸上皮に投与する工程を包含する。送達増強トランスポーター（これはまた、本発明によって提供される）は、十分なグアジニノ部分またはアミジノ部分を有し、送達増強トランスポーターの非存在下での化合物の送達と比較して、胃腸上皮への結合体の送達を増大する。いくつかの実施形態において、胃腸上皮への結合体の送達は、送達増強トランスポーターの非存在下での化合物の送達と比較して、少なくとも２倍増大される。より好ましい実施形態において、結合体の胃腸上皮への送達は、送達増強トランスポーターの非存在下での化合物の送達と比較して、少なくとも１０倍増大される。送達増大トランスポーターおよび化合物は、代表的には、リンカーを介して結合される。さらに、この結合体は、化合物に連結された２つ以上の送達増強トランスポーターを含み得る。
【００１３】
代表的には、送達増強トランスポーターは、５０未満のサブユニットを含み、そして、少なくとも６つのグアニジノ部分およびアミジノ部分を含む。いくつかの実施形態において、このサブユニットはアミノ酸である。いくつかの実施形態において、送達増強トランスポーターは、６〜２５のグアニジノ部分またはアミジノ部分、ならびに、より好ましくは７と１５との間のグアニジノ部分、ならびになおさらに好ましくは、少なくとも６つの連続したグアニジノ部分および／またはアミジノ部分を有する。いくつかの実施形態において、送達増強トランスポーターは、本質的に５〜５０のサブユニットからなり、その少なくとも５０％は、グアニジノ残基またはアミジノ残基を含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、このサブユニットは、天然アミノ酸または非天然アミノ酸である。例えば、いくつかの実施形態において、送達増強トランスポーターは、５〜２５のアルギニン残基またはそのアナログを含む。例えば、トランスポーターは、７個の連続したＤ−アルギニンを含み得る。
【００１４】
いくつかの実施形態において、送達増強トランスポーターは、７〜１５のアルギニン残基またはアルギニンアナログを含む。送達増強トランスポーターは、少なくとも１つのアルギニン（これは、Ｄ−アルギニンである）を有し得、そして、いくつかの実施形態では、全てのアルギニンがＤ−アルギニンである。いくつかの実施形態において、アミノ酸の少なくとも７０％がアルギニンまたはアルギニンアナログである。いくつかの実施形態において、送達増強トランスポーターは、少なくとも５つの連続したアルギニンまたはアルギニンアナログを含む。送達増強トランスポーターは、非ペプチド骨格を含み得る。さらに、いくつかの局面において、トランスポーターは、送達増強分子が、天然に存在するタンパク質に結合されるアミノ酸配列に結合されない。
【００１５】
本発明の送達増強トランスポーターおよび方法は、薬物、診断剤、および目的の他の化合物を胃腸上皮に送達するのに有用である。本発明の方法および組成物は、化合物を特定の投与部位に送達するだけでなく、全身送達を提供するために使用される。いくつかの実施形態において、結合体は、頬に（ｂｕｃａｌｌｙ）または坐薬として投与される。この結合体の化合物は、疾患（例えば、炎症性腸疾患、結腸癌、潰瘍性大腸炎、胃腸潰瘍、便秘、ならびに、塩および水吸収の失調）に対する治療薬であり得る。従って、この化合物としては、免疫抑制剤、コルチコステロイド、緩下薬、抗生物質または抗腫瘍剤が挙げられ得る。本発明のいくつかの局面において、化合物は、回腸（ｉｌｉｅｍ）および／または結腸に標的化される。
【００１６】
上記で討論したように、送達される化合物は、リンカーによって送達増強トランスポーターに結合され得る。いくつかの実施形態において、このリンカーは、化合物が上皮組織および／もしくは内皮皮組織の１つ以上の層に移り、そして／または通過した後、生物学的活性形態で、送達増強トランスポーターからこの化合物を放出する、放出可能なリンカーである。いくつかの実施形態において、この化合物は、溶媒媒介切断によって、リンカーから放出される。結合体は、いくつかの実施形態において、酸性ｐＨで実質的に安定であるが、化合物は、実質的に、生理学的ｐＨで、送達増強トランスポーターから放出される。いくつかの実施形態において、この結合体の半減期は、皮膚または他の上皮組織もしくは内皮組織と接触するとき、５分と２４時間の間である。例えば、半減期は、皮膚または他の上皮組織もしくは内皮組織と接触するとき、３０分と２時間の間であり得る。
【００１７】
本発明の結合体構造の例としては、以下：
【００１８】
【化４】
2004530657.tif 000003
のような、３、４または５のような構造を有する結合構造が挙げられ、ここで、Ｒ１は化合物を含み；Ｘは、生物学的に活性な化合物上の官能基と結合部分上の末端官能基との間で形成された結合であり；Ｙは、輸送部分上の官能基および結合部分上の官能基から形成された結合であり；Ａは、ＮまたはＣＨであり；Ｒ２は水素、アルキル、アリール、アシルまたはアリルであり；Ｒ３は、送達増強トランスポーターを含み；Ｒ４は、Ｓ、Ｏ、ＮＲ６またはＣＲ７Ｒ８であり；Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、またはＮＨＲ６であり；Ｒ６は水素、アルキル、アリール、アシルまたはアリルであり；ｋおよびｍは、１および２から各々独立して選択され；そして、ｎは１〜１０である。
【００１９】
好ましくは、Ｘは、以下の：−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−Ｃ（Ｓ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＳＯ２ＮＨ−、−ＳＯＮＨ−、ホスフェート、ホスホネートホスフィネート、およびＣＲ７Ｒ８からなる群より選択され、ここで、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立してＨおよびアルキルからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、Ｓであり；Ｒ５は、ＮＨＲ６であり；そしてＲ６は、水素、メチル、アリル、ブチルまたはフェニルである。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、ベンジルであり；ｋ、ｍ、およびｎは、おのおの１であり、そしてＸはＯである。いくつかの実施形態において、構造３を含む結合体で、Ｙは、Ｎであり、およびＲ２は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、アリル、ベンジル、またはフェニルである。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、ベンジルであり；ｋ、ｍ、およびｎは、おのおの１であり、そしてＸは、−ＯＣ（Ｏ）−である。構造４を含む結合体のいくつかの実施形態において；Ｒ４は、Ｓであり；Ｒ５は、ＮＨＲ６であり；そしてＲ６は、水素、メチル、アリル、ブチルまたはフェニルである。構造４を含む結合体のいくつかの実施形態において；Ｒ５は、ＮＨＲ６であり；Ｒ６は、水素、メチル、アリル、ブチルまたはフェニルであり；そしてｋおよびｍは、各々１である。
【００２０】
本発明はまた、結合体を提供し、この結合体における生物学的薬剤からのリンカーの放出は、第１の、律速の分子内反応、続いて起こるリンカーの放出を起こすより速い分子内反応を含む。律速反応は、リンカーの置換基の適切な選択により、生理的ｐＨよりも高いかまたは低いｐＨにおいても安定であるようにされ得る。しかし、一旦、結合体が、上皮組織または内皮組織の１つ以上の層を横切って通過すると、リンカーは、薬剤から切断される。この型のリンカーを有する化合物の例は以下のような構造６である：
【００２１】
【化５】
2004530657.tif 000004
ここで、Ｒ１は、化合物を含み；Ｘは、生物学的に活性な化合物における官能基と連結部分における末端官能基との間に形成される連結であり；Ｙは、輸送部分における官能基および連結部分における官能基から形成される連結であり；Ａｒは、オルト配置またはパラ配置に配置されるラジカルが結合されたアリール基であり、このアリール基は、置換されたかまたは非置換であり得；Ｒ３は、送達増強トランスポーターを含み；Ｒ４は、Ｓ、Ｏ、ＮＲ６またはＣＲ７Ｒ８であり；Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨＲ６であり；Ｒ６は、水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、アシル、またはアリルであり；Ｒ７およびＲ８は、水素またはアルキルから独立して選択され；そして、ｋおよびｍは、それぞれ独立して１および２から選択される。
【００２２】
いくつかの実施形態において、Ｘは、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−Ｃ（Ｓ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＳＯ２ＮＨ−、−ＳＯＮＨ−、ホスフェート、ホスホネートホスフィネート、およびＣＲ７Ｒ８からなる群より選択され、ここで、Ｒ７およびＲ８は、各々独立して、Ｈおよびアルキルからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ４はＳであり；Ｒ５は、ＮＨＲ６であり；Ｒ６は、水素、メチル、アリル、ブチルまたはフェニルである。
【００２３】
好ましい実施形態において、本発明の組成物は、溶媒媒介型切断を受けやすいリンカーを含む。例えば、好ましいリンカーは、酸性のｐＨでは実質的に安定であるが、生理的ｐＨでは実質的に切断される。
【００２４】
（詳細な説明）
（定義）
「上皮組織」は、身体の表面、空間および腔の表面領域を覆う基本的な組織である。上皮組織は、主に、お互いに結合し、細胞によって代表的に生成される細胞外マトリックス（基底膜）にある上皮細胞で構成される。上皮組織は、細胞の形状に基づく３つの一般的な型を含む：扁平上皮、立方上皮および円柱上皮。扁平上皮（これは、肺および血管の輪郭となる）は、平らな細胞で作製される。立方上皮は、腎臓細管に並び、立方形状の細胞で構成されるが、円柱上皮細胞は、消化管に並び、円柱状の外見を有する。上皮組織はまた、その組織における細胞層の数に基づいて分類され得る。例えば、単純な上皮組織は、細胞の単一の層で構成され、これらの各々は基底膜上にある。「層状の」上皮組織は、お互いに積み重なったいくつかの組織で構成され；すべての細胞が基底膜と接触しているわけではない。「偽層状の」上皮組織は、すべて基底膜と接触するが、層状に見える細胞を有する。なぜなら、核が種々のレベルにあるからである。
【００２５】
用語「経上皮」送達または「経上皮」投与は、局所投与による、身体表面または組織（例えば、無傷な皮膚または粘膜）の１以上の層を介した浸透による薬剤の送達または投与をいう。従って、この用語は、経皮投与（例えば、経皮吸収）および経粘膜投与の両方を含むことが意図される。送達は、例えば、組織のより深い層までであり得、そして／または血流への送達であり得る。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、「送達増強」、「透過増強」または「浸透増強」は、上皮組織または内皮組織の１以上の層へ、そして上皮組織または内皮組織の１以上の層を横切って送達される化合物の送達量および／または送達速度における増加に関する。送達の増強は、動物またはヒトの皮膚または他の組織の１以上の層を通過する化合物の速度および／または量を測定することによって、観察され得る。送達増強はまた、化合物が送達される組織への深さにおける増加、および／または上皮組織もしくは他の組織の１つ以上の細胞型への送達の程度における増加（例えば、皮膚または他の組織の線維芽細胞、免疫細胞、および内皮細胞への増加した送達）を含み得る。このような測定は、例えば、米国特許第５，８９１，４６２号に記載されるような拡散細胞装置を用いることによって、容易に得られる。
【００２７】
皮膚または他の上皮膜もしくは内皮膜を通過する薬剤の送達および／または皮膚または他の上皮膜もしくは内皮膜中への薬剤の送達の量または速度は、時折、予め決定された領域の皮膚または他の組織を通過する化合物の量に関して定量され、これは、インタクトな破壊されていない成体の皮膚または粘膜組織の領域と規定される。この領域は一般に、約５ｃｍ２〜約１００ｃｍ２の範囲、より一般には約１０ｃｍ２〜約１００ｃｍ２の範囲、なおより一般には約２０ｃｍ２〜約６０ｃｍ２の範囲である。
【００２８】
用語「グアニジル」、「グアニジニル」および「グアニジノ」は、式−ＨＮ＝Ｃ（ＮＨ２）ＮＨ（非プロトン化型）を有する部分をいうために相互変換可能に使用される。例として、アルギニンは、グアニジル（グアニジノ）部分を含み、そしてまた２−アミノ−５−グアニジノ吉草酸またはα−アミノ−δ−グアニジノ吉草酸という。「グアニジウム」は、陽性に荷電した共役酸型をいう。用語「グアニジノ部分」としては、例えば、グアニジン、グアニジニウム、グアニジン誘導体（例えば、（ＲＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨＲ’）、一置換グアニジン、モノグアニド、モノグアニド、ビグアニド、ビグアニド誘導体（例えば、（ＲＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨＲ’）などが挙げられる。さらに、用語「グアニジノ部分」は、任意の１つ以上のグアニド単独または異なるグアニドの組合せを包含する。
「アミジニル」および「アミジノ」は、式Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ２）を有する部分をいう。「アミジニウム」は、陽性に荷電した共役酸形態をいう。
【００２９】
用語「トランス−障壁濃度（ｔｒａｎｓ−ｂａｒｒｉｅｒ）」または「トランス−組織濃度」は、特定の組成物が付加されている組織側の反対、または「トランス」である、上皮障壁組織または内皮障壁組織の１つ以上の層の側面に存在する化合物の濃度をいう。例えば、化合物が、皮膚に塗布される場合、皮膚の１つ以上の層を実質的に横切って測定された化合物の量は、化合物のトランス−障壁濃度である。
【００３０】
「生物学的に活性な薬剤」または「生物学的に活性な基質」は、細胞による取込みの際、細胞の構造、機能、または組成物における観察可能な変化を生じる化学基質（例えば、低分子、高分子、または金属イオン）をいう。観察可能な変化としては、１つ以上のｍＲＮＡの発現の増加または減少、１つ以上のタンパク質の発現の増加または減少、タンパク質または他の細胞成分リン酸化、酵素の阻害または活性化、結合対のメンバー間での結合の阻害または活性化、代謝物の合成増加または減少した、速度増加または減少した細胞増殖などが挙げられる。
【００３１】
用語「治療剤」、「治療組成物」および「治療基質」は、限定はないが、哺乳動物種の利益のために使用され得る任意の組成物をいう。このような薬剤は、例えば、イオン、有機低分子、ペプチド、タンパク質またはポリペプチド、オリゴヌクレオチド、およびオリゴ糖、の形態をとり得る。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、用語「高分子」は、以下によって例示されるがそれらに限定されない大分子（１０００ダルトンよりも大きなＭＷ）をいう：生物学的起源または合成起源のペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドをいう。
【００３３】
「有機低分子」は、１０００ダルトン未満または１０００ダルトンの分子量（ＭＷ）を有する炭素含有薬剤をいう。
【００３４】
用語「非ポリペプチド剤」および「非ポリペプチド治療剤」は、送達増強トランスポーターを含まず、そしてポリペプチド以外の生物学的活性剤である、結合体の部分をいう。非ポリペプチド剤の例は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、これはポリアルギニンペプチドに結合して、上皮組織または内皮組織の１つ以上の層中への送達および上皮組織または内皮組織の１つ以上の層を通過する送達を増強するための結合体を形成し得る。
【００３５】
本明細書中で使用される「サブユニット」は、より大きなポリマー化合物を形成するために結合されるモノマー単位である。アミノ酸のセットは、サブユニットの例である。各アミノ酸は、共通の骨格（−Ｃ−Ｃ−Ｎ−）、およびその側鎖において異なる種々のアミノ酸を共有する。この骨格は、ポリペプチド中で繰り返される。サブユニットは、ポリマー骨格におけるエレメントの最短の繰り返しパターンを表す。例えば、２つのアミノ酸のペプチドは、ペプチドとみなされない。なぜならば、２つのアミノ酸は、ポリマー骨格における最短の繰り返しパターンのエレメントを有さないからである。
【００３６】
用語「ポリマー」は、共有結合によって結合された２つ以上の同一または非同一のサブユニットの直鎖をいう。ペプチドは、ポリマーの例であり；ペプチドは、ペプチド結合（ｌｉｎｋａｇｅ）（アミド結合（ｂｏｎｄ））によって結合される同一または非同一のアミノ酸サブユニットからなり得る。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド」は、ペプチド結合によって結合された、Ｄ−アミノ酸もしくはＬ−アミノ酸、またはＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の混合物の単鎖からなる化合物をいう。一般に、ペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸残基を含み、そして約５０アミノ酸長未満である。Ｄ−アミノ酸は、本明細書中で小文字の１文字アミノ酸記号（例えば、ｒはＤ−アルギニン）によって、Ｌ−アミノ酸は、大文字の１文字アミノ酸記号（例えば、ＲはＬ−アルギニン）によって表される。ホモポリマーペプチドは、１文字アミノ酸記号、続いてそのペプチド中に連続して存在するアミノ酸の数によって表される（例えば、Ｒ７は、Ｌ−アルギニン残基からなるヘプタマーを表す）。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、用語「タンパク質」は、ペプチド結合によって連結された直状に整列されたアミノ酸からなる化合物をいうが、ペプチドとは対照的に、十分に規定された構造を有する。タンパク質は、ペプチドとは対照的に、一般に５０以上のアミノ酸の全員からなる。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド」は、少なくとも２つのアミノ酸残基のポリマーをいい、そしてこれは１つ以上のペプチド結合を含む。「ポリペプチド」は、ポリペプチドが、十分に規定された構造を有するか否かに関係なく、ペプチドおよびタンパク質を包含する。
【００４０】
（好ましい実施形態の説明）
本発明は、動物の上皮組織または内皮組織の１つ以上の層中ヘ、および動物の上皮組織または内皮組織の１つ以上の層を通過する、化合物（薬物、および他の生物学的に活性な化合物を含む）の移動を増強する組成物および方法を提供する。この方法は、組織を、送達増強トランスポーターと連結した目的の化合物を含む結合体と接触させる工程を包含する。本発明によって提供される送達増強トランスポーターは、１つ以上のインタクトな上皮組織の層および内皮組織の層中ならびに１つ以上のインタクトな上皮組織の層および内皮組織の層を通過する、結合体の送達を増加させるために十分なグアニジノ部分またはアミジノ部分を含む分子である。この方法および組成物は、薬物ならびに他の生物学的に活性な分子のトランス上皮送達およびトランス内皮送達に有用であり、そしてまた、画像化分子および診断分子の送達に有用である。本発明の方法および組成物は、それらの生物学的効果を示すトランス上皮輸送またはトランス内皮輸送を必要とし、かつ（送達増強トランスポーターまたはいくつかの他の改変体への結合なしで）それ自体では、このような組織を通過し、従って、生物学的活性を示すことができないか、またはほとんどできない化合物の送達に特に有用である。
【００４１】
本発明の送達増強トランスポーターおよび方法は、目的の化合物のトランス上皮組織送達およびトランス内皮組織送達を得るための既に利用可能な方法について重大な利点を提供する。このトランスポーターは、予め薬物を通さない組織を通過する薬物および他の薬剤の送達を可能にする。例えば、薬物の皮膚への送達は、以前２、３の化合物を除いて全てについてほぼ不可能であったのに対し、本発明の方法は皮膚のような上皮組織の第１の層の細胞だけでなく、皮膚の１つ以上の層を通過して化合物を送達し得る。血液脳関門はまた、薬物の輸送ならびに他の診断試薬および治療試薬の輸送に耐性であり；本発明の方法およびトランスポーターは、このような輸送を得るための手段を提供する。
【００４２】
送達増強トランスポーターは、送達増強トランスポーターの非存在下での化合物の送達と比較して、１つ以上のインタクトな上皮組織層および内皮組織の層中へ、および通過する結合体の送達を増加させる。いくつかの実施形態において、この送達増強トランスポーターは、ＨＩＶ−１のｔａｔタンパク質を用いて得られるトランスポーターにおいて結合体の送達を有意に増加させる（Ｆｒａｎｋｅｌら（１９９１）ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９１／０９９５８）。送達はまた、ｔａｔ基本領域（配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲを有する残基４９〜５７）を含むｔａｔタンパク質のより短いフラグメントの使用において、有意に増加される（Ｂａｒｓｏｕｍら（１９９４）  ＷＯ  ９４／０４６８６およびＦａｗｅｌｌら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：６６４−６６８）。好ましくは、本発明のトランスポーターを用いて得られる送達は、ｔａｔ残基４９〜５７で得られる送達よりも、２倍、なおより好ましくは６倍、なおより好ましくは１０倍、そしてなおより好ましくは２０倍より増加される。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、ｔａｔ残基４９〜５７を含まない。
【００４３】
同様に、本発明の送達増強トランスポーターは、培養されたニューロンによって迅速に内在化されるＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａのホメオドメイン由来の１６アミノ酸ペプチド−コレステロール結合体と比較して、増加した送達を提供し得る（Ｂｒｕｇｉｄｏｕら（１９９５）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１４：６８５−９３）。この領域（最小で４３〜５８残基）は、アミノ酸配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫを有する。Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘタンパク質ＶＰ２２（ｔａｔおよびＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａドメインのような）は、細胞中への輸送を増強することが以前から公知であるが、内皮膜および上皮膜中への輸送および内皮膜および上皮膜を通過する輸送を増強することは知られていない（ＥｌｌｉｏｔおよびＯ’Ｈａｒｅ（１９９７）Ｃｅｌｌ  ８８  ：２２３−３３；Ｄｉｌｂｅｒら（１９９９）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：１２−２１；Ｐｈｅｌａｎら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４４０−３）.現在好ましい実施形態において、送達増強トランスポーターは、ＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメインおよびＶＰ２２タンパク質と比較して有意に増加した送達を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメイン、ＶＰ２２タンパク質または８つ連続したアルギニンを含まない。
【００４４】
（送達増強トランスポーターの構造）
本発明の送達増強トランスポーターは、化合物の送達を増加させるために十分なグアニジノ部分および／またはアミジノ部分を有する分子であり、ここで送達増強トランスポーターは、上皮組織（例えば、皮膚または粘膜）あるいは内皮組織（例えば、血液脳関門）の１つ以上の層中およびこれらを横切って付着される。この送達増強トランスポーターは、一般にグアニジノおよび／またはアミジノの側鎖部分に付着する骨格構造を含む。いくつかの実施形態において、この骨格は、サブユニット（例えば、繰り返しのモノマー単位）からなるポリマーであり、この少なくともいくつかのサブユニットは、グアニジノ部分またはアミジノ部分を含む。
【００４５】
（Ａ．グアニジノ部分および／またはアミジノ部分）
送達増強トランスポーターは、代表的に少なくとも５つのグアニジノ部分および／またはアミジノ部分、そしてより好ましくは７つ以上のこのような部分を示す。好ましくは、送達増強トランスポーターは、２５またはそれよりも少ないグアニジノ部分および／またはアミジノ部分を有し、そしてしばしば、１５またはそれよりも少ないこのような部分を有する。いくつかの実施形態において、この送達増強トランスポーターは、本質的に５０またはそれよりも少ないサブユニット、からなり、そして本質的に２５以下、２０以下または１５以下のサブユニットからなり得る。送達増強トランスポーターは、５つのサブユニット程度に短く、この場合、全てのサブユニットは、グアニジノ側鎖部分またはアミジノ側鎖部分を含む。送達増強トランスポーターは、例えば、少なくとも６つのサブユニットを有し得、そしていくつかの実施形態において、少なくとも７つまたは１０のサブユニットを有し得る。一般に、少なくとも５０％のサブユニットは、グアニジノ側鎖部分またはアミジノ側鎖部分を含む。送達増強トランスポーターにおいて、より好ましくは、少なくとも７０％のサブユニット、およびいくつかの場合少なくとも９０％のサブユニットが、グアニジノ側鎖部分またはアミジノ側鎖部分を含む。
【００４６】
送達増強トランスポーター中のいくつかまたは全てのグアニジノ部分および／またはアミジノ部分は、連続し得る。例えば、送達増強トランスポーターは、６〜２５の連続した、グアニジノおよび／またはアミジノ含有サブユニットを含み得る。７つ以上の連続したグアニジノおよび／またはアミジノ含有サブユニットが、いくつかの実施形態において存在する。いくつかの実施形態において、グアニジノ部分を含む各サブユニットは、少なくとも６つ連続したアルギニン残基を含むポリマーによって例示されるように、連続である。
【００４７】
送達増強トランスポーターは、ペプチドによって例示される。アルギニン残基またはアルギニンのアナログは、グアニジノ部分を有するサブユニットを構築し得る。このようなアルギニン含有ペプチドは、全てのＤ−アミノ酸、全てのＬ−アミノ酸または混合されたＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸のいずれかからなり得、そしてさらなるアミノ酸、アミノ酸アナログ、またはアルギニン残基間の他の分子を含み得る。必要に応じて、送達増強トランスポーターはまた、非アルギニン残基を含み得、送達されるべき化合物は直接またはリンカーを介してのいずれかが付着される。送達増強トランスポーターにおける少なくとも１つのＤ−アルギニンの使用は、結合体をその生物学的標的へと輸送する間、トランスポーターの生物学的安定性を増強し得る。いくつかの場合、送達増強トランスポーターは、少なくとも約５０％のＤ−アルギニン残基であり、（ついでにこのサブユニットの全ては、Ｄ−アルギニン残基である）さらにより安定性のトランスポーターが使用される。送達増強トランスポーター分子が、ペプチドである場合、このトランスポーターは、送達増強トランスポーター分子を作製するアミノ酸が、天然に存在するタンパク質に付着するためのアミノ酸配列に付着しない。
【００４８】
好ましくは、この送達増強トランスポーターは、線状である。好ましい実施形態において、上皮組織の１つ以上の層中および上皮組織の１つ以上の層を横切って送達される薬剤は、送達増強トランスポーターの末端に付着する。いくつかの実施形態において、薬剤は、結合体を形成するために単一の輸送ポリマーに連結される。他の実施形態において、薬剤に連結した１つより多い送達増強トランスポーターまたは単一の送達増強トランスポーターに連結した複数の薬剤を含み得る。
【００４９】
より一般的には、各サブユニットが、以下のような高度に塩基性の側鎖部分を含むことが好ましい；（ｉ）１１よりも大きいｐＫａ、より好ましくは１２．５以上のｐＫａを有し、そして（ｉｉ）プロトン化状態で、共鳴安定化正荷電を共有する少なくとも２つのジャミナルなアミノ基（ＮＨ２）を含み、これらはこの部分に二座特性を与える。
【００５０】
グアニジノ部分またはアミジノ部分は、側鎖のリンカーによって骨格に連結されることによって骨格から離れて伸びる。この側鎖原子は、好ましくは、メチレン炭素原子として提供されるが、いつ以上の他の原子（例えば、酸素、硫黄または窒素）もまた存在し得る。例えば、骨格に対するグアニジノ部分を結合するリンカーは、以下のように示され得る：
【００５１】
【化６】
2004530657.tif 000005
これらの式において、ｎは、好ましくは、少なくとも２であり、そして好ましくは、２と７との間である。いくつかの実施形態において、ｎは、３である（構造１はアルギニン）。他の実施形態において、ｎは、４と６との間であり；最も好ましくは、ｎは、５または６である。例示された式における側鎖は、ペプチド骨格（すなわち、側鎖が、カルボニル基に対してα位にある炭素原子に結合する繰り返しアミド、サブユニット１）およびペプトイド骨格（すなわち、側鎖が、カルボニル基に対してβ位にある窒素原子に結合する繰り返しアミド、サブユニット２）に結合されるように示されるが、他の非ペプチド骨格はまた、本明細書中により詳細に議論されるように適切である。従って、類似の側鎖リンカーは、非ペプチド骨格（例えば、ペプトイド骨格）に結合し得る。
【００５２】
いくつかの実施形態において、送達増強トランスポーターは、連結したサブユニットからなり、少なくともいくつかは、グアニジノ部分および／またはアミジノ部分を含む。グアニジノ部分および／またはアミジノ部分を有する適切なサブユニットの例は、以下に記載される。
【００５３】
（アミノ酸）
いくつかの実施形態において、送達増強トランスポーターは、Ｄ−アミノ酸残基またはＬ−アミノ酸残基からなる。これらのアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸でもあり得るし、天然に存在しないアミノ酸でもあり得る。アルギニン（α−アミノ−δ−グアニジノ吉草酸）およびα−アミノ−ε−アミジノ−ヘキサン酸（等配電子のアミジノアナログ）は、適切なグアニジノ含有アミノ酸サブユニット、およびアミジノ含有アミノ酸サブユニットの例である。アルギニン中のグアニジニウム基は、約１２．５のｐＫａを有する。いくつかの好ましい実施形態において、トランスポーターは、少なくとも６つの連続したアルギニン残基からなる。
【００５４】
他のアミノ酸（例えば、α−アミノ−β−グアニジノ−プロピオン酸、α−アミノ−γ−グアニジノ−酪酸、またはα−アミノ−ε−グアニジノ−カプロン酸（骨格鎖とグアニジウニウムの中心炭素との間に、それぞれ２、３または５の側鎖リンカー原子を含む）もまた、使用され得る。
【００５５】
Ｄ−アミノ酸もまた、送達増強トランスポーターにおいて使用され得る。排他的にＤ−アミノ酸を含む組成物は、減少した酵素的分解の利点を有する。しかし、これらはまた、標的細胞内で大部分インタクトなまま維持され得る。このような安定性は、ポリマーがさらに結合される場合に、薬剤が生物学的に活性であるとすると、一般に問題ではない。結合体形態で不活性な薬剤について、作用部位で切断可能（例えば、細胞内の酵素媒介性切断または溶媒媒介性切断によって）なリンカーは、細胞またはオルガネラ中の薬剤の放出を促進するために結合体内に含まれるべきである。
【００５６】
さらに、輸送部分は、以下の式のアミノ酸オリゴマーである：（ＺＹＺ）ｎＺ、（ＺＹ）ｎＺ、（ＺＹＹ）ｎＺおよび（ＺＹＹＹ）ｎＺ。２００１年２月７日に出願された米国特許出願番号０９／７７９，６９３および２０００年２月１４日に出願された米国特許出願番号６０／１８２１６６を参照のこと。式中の「Ｚ」は、Ｄ−アルギニンまたはＬ−アルギニンである。「Ｙ」は、グアニジル部分またはアミジニル部分を含まないアミノ酸である。添え字「ｎ」は、２〜２５の範囲の整数である。
【００５７】
上記の輸送部分の式において、文字「Ｙ」は、天然のアミノ酸または非天然のアミノ酸を表す。このアミノ酸は、本質的に、アミノ基（ＮＨ２またはＮＨ−アルキル）およびカルボン酸基（ＣＯ２Ｈ）を（輸送部分への組込みの前に）有し、そしてグアニジル部分もアミジニル部分も含まない任意の化合物であり得る。このような化合物の例としては、Ｄ−アラニンおよびＬ−アラニン、Ｄ−システインおよびＬ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸およびＬ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸およびＬ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニンおよびＬ−フェニルアラニン、グリシン、Ｄ−ヒスチジンおよびＬ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシンおよびＬ−イソロイシン、Ｄ−リジンおよびＬ−リジン、Ｄ−ロイシンおよびＬ−ロイシン、Ｄ−メチオニンおよびＬ−メチオニン、Ｄ−アスパラギンおよびＬ−アスパラギン、Ｄ−プロリンおよびＬ−プロリン、Ｄ−グルタミンおよびＬ−グルタミン、Ｄ−セリンおよびＬ−セリン、Ｄ−スレオニンおよびＬ−スレオニン、Ｄ−バリンおよびＬ−バリン、Ｄ−トリプトファンおよびＬ−トリプトファン、Ｄ−ヒドロキシプロリンおよびＬ−ヒドロキシプロリン、Ｄ−チロシンおよびＬ−チロシン、サルコシン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸ならびにε−アミノカプロン酸が挙げられる。上記のそれぞれの式において、各Ｙは、輸送部分に存在する任意の他のＹから独立しているが、いくつかの実施形態において、全てのＹ基は、同じであり得る。
【００５８】
好ましい実施形態の１つの群において、輸送部分は、式（ＺＹＺ）ｎＺを有し、ここで、各「Ｙ」は、グリシン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸およびε−アミノカプロン酸から独立して選択され、「Ｚ」は、好ましくはＬ−アルギニンであり、そしてｎは、好ましくは、２〜５の範囲の整数である。より好ましくは、各「Ｙ」は、グリシンまたはε−アミノカプロン酸であり、そしてｎは３である。実施形態のこの群において、グリシンの使用は、輸送部分が、組成物全体が、組換え方法によって調製され得るような、ポリペプチド生物学的薬剤に直接融合されるか、または共有結合される組成物にとって好ましい。例えば、固相方法を用いて輸送部分が収集される実施形態において、ε−アミノカプロン酸が好ましい。
【００５９】
別の好ましい実施形態において、輸送部分は式（ＺＹ）ｎＺを有し、ここで各「Ｙ」は、好ましくはグリシン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸およびε−アミノカプロン酸から選択され、「Ｚ」は、好ましくはＬ−アルギニンであり、そしてｎは、好ましくは、４〜１０の範囲の整数である。より好ましくは、各「Ｙ」は、グリシンまたはε−アミノカプロン酸であり、そしてｎは６である。特定の実施形態の上記の群と同様に、グリシンの使用は、輸送部分が、組成物全体が組換え方法によって調製され得るような、ポリペプチド生物学的薬剤に直接融合されるか、または共有結合される組成物にとって好ましい。輸送部分の溶液または固相構築物について、ε−アミノカプロン酸が好ましい。
【００６０】
好ましい実施形態のなお別の群において、輸送部分は、式（ＺＹＹ）ｎＺを有し、ここで、各「Ｙ」は、好ましくは、グリシン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸およびε−アミノカプロン酸から選択され、「Ｚ」は、好ましくは、Ｌ−アルギニンであり、そしてｎは、好ましくは、４〜１０の範囲の整数である。より好ましくは、各「Ｙ」は、グリシンまたはε−アミノカプロン酸であり、そしてｎは６である。
【００６１】
好ましい実施形態のなお別の群において、輸送部分は、式（ＺＹＹＹ）ｎＺを有し、ここで、各「Ｙ」は、好ましくは、グリシン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸およびε−アミノカプロン酸から選択され、「Ｚ」は、好ましくはＬ−アルギニンであり、そしてｎは、好ましくは、４〜１０の範囲の整数である。より好ましくは、「Ｙ」はグリシンであり、そしてｎは６である。
【００６２】
他の実施形態において、それぞれのＹ基は、輸送部分の特定の所望の特性を増強するように選択される。例えば、より疎水性の特徴を有する輸送部分が所望される場合、各Ｙは、代表的に疎水性アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、フェニルグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン）として一緒にグループ化される、天然に存在するアミノ酸から選択され得る。同様に、いくつかのまたは全てのＹ基が親水性アミノ酸（例えば、リジン、セリン、スレオニン、グルタミン酸など）である場合、より親水性の特徴を有する輸送部分が、調製され得る。
【００６３】
当業者は、輸送部分が、より大きいポリペプチド内のポリペプチドフラグメントであり得ることを理解する。例えば、輸送部分は、この部分に隣接するさらなるアミノ酸をなお有する式（ＺＹＹ）ｎＺ（例えば、Ｘｍ（ＺＹＹ）ｎＺ−Ｘｐ、ここで、添え字ｍおよびｐは、０〜約１０の整数を表し、そして各Ｘは、独立して天然アミノ酸または非天然アミノ酸である）であり得る。
【００６４】
（他のサブユニット）
アミノ酸以外のサブユニットはまた、輸送ポリマー形成における使用のために選択され得る。このようなサブユニットとしては、ヒドロキシアミノ酸、Ｎ−メチル−アミノ酸アミノアルデヒドなどが挙げられ得るが、これらに限定されず、これらは還元されたペプチド結合を有するポリマーを生じる。他のサブユニット型が、次の節に議論されるような、選択された骨格の性質に依存して使用され得る。
【００６５】
（Ｂ．骨格）
送達増強トランスポーターに含まれるグアニジノ部分および／またはアミジノ部分は、一般に線状の骨格に結合される。この骨格は、炭素、窒素、酸素、硫黄およびこのリン骨格鎖原子の大部分は代表的に炭素からなる種々の原子型を含み得る。末端グアニジノ基またはアミジノ基を含む複数の側鎖部分が、骨格に結合される。隣接の側鎖部分間の間隔は、代表的に一定であるが、本発明において使用される送達増強トランスポーターはまた、骨格に沿って側鎖部分間の種々の間隔を含み得る。
【００６６】
より詳細な骨格リストとしては、Ｎ−置換アミド（ＣＯＮＲは、ＣＯＮＨ結合を置換する）、エステル（ＣＯ２）、還元されたケト−メチレン（ＣＯＣＨ２）またはメチレンアミノ（ＣＨ２ＮＨ）、チオアミン（ＣＳＮＨ）、ホスフィネート（ＰＯ２ＲＣＨ２）ホスホアミデートおよびホスホアミデートエステル（ＰＯ２ＲＮＨ）、レトロペプチド（ＮＨＣＯ）トランス−アルケン（ＣＲ＝ＣＨ）、フルオロアルケン（ＣＦ＝ＣＨ）、ジメチレン（ＣＨ２ＣＨ２）、チオエステル（ＣＨ２Ｓ）ヒドロキシエチレン（ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２）、メチレンオキシ（ＣＨ２Ｏ）、テトラゾール（ＣＮ４）、レトロチオアミド（ＮＨＣＳ）、レトロ還元された（ｒｅｔｒｏｒｅｄｕｃｅｄ）（ＮＨＣＨ２）、スルホンアミド（ＳＯ２ＮＨ）、メチレンスルホンアミド（ＣＨＲＳＯ２ＮＨ）、レロトスルホンアミド（ＮＨＳＯ２）、およびペプトイド（Ｎ−置換アミド）、およびマロネートサブユニットおよび／またはｇｅｍ−ジアミノ−アルキルサブユニットを有する骨格（例えば、Ｆｌｅｔｃｈｅｒら、（（１９９８）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９８：７６３）により概説され、そして本明細書中で引用される参考文献によって詳述される。前述の置換基の多くは、ほとんどα−アミノ酸から形成される骨格に対して、ほぼ等配電子が挙げられる。ポリマー骨格を生じる。
【００６７】
上記で意図されるように、ペプトイド骨格において、側鎖は、炭素原子よりもむしろ窒素原子の骨格に結合される。（例えば、Ｋｅｓｓｌｅｒ（１９９３）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３２：５４３；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎら（１９９２）Ｃｈｅｍｔｒａｃｔｓ−Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．４：８０；およびＳｉｍｏｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：９３６７を参照のこと）。適切なペプトイド骨格の例は、ポリ−（Ｎ−置換）グリシン（ポリ−ＮＳＧ）である。ペプトイドの合成は、例えば、米国特許第５，８７７，２７８号に記載される。用語が本明細書中で使用される場合、ペプトイド骨格を有するトランスポーターは、「非ペプチド」トランスポーターと考えられる。なぜならば、このトランスポーターは、天然に存在する側鎖位置を有するアミノ酸から構成されるからである。ペプトイド骨格を含む非ペプチド骨格は、増強された生物学的安定性（例えば、インビボでの酵素的分解に対する耐性）を提供する。
【００６８】
Ｃ．送達増強トランスポーターの合成
送達増強トランスポーターは、当該分野で公知の任意の技術により構築される。例示のペプチドポリマーは、合成的に、好ましくはペプチド合成機（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ４３３）を使用して作製され得るか、または当該分野で周知の方法により組み換え的に合成され得る。組み換え合成は一般的に、この送達増強トランスポーターが目的のポリペプチドまたはタンパク質と融合されるペプチドである場合に使用される。
【００６９】
Ｎ−メチルアミノ酸およびＮ−ヒドロキシアミノ酸は、固相ペプチド合成において、従来のアミノ酸に置き換えられ得る。しかし、還元性のペプチド結合を有する送達増強トランスポーターの産生は、還元性のペプチド結合を含む二量体アミノ酸の合成を必要とする。このような二量体は、標準的な固相合成手法を使用してポリマー内に組み込まれる。他の合成手法は周知であり、そして、例えば、Ｆｌｅｔｃｈｅｒら（１９９８）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９８：７６３、Ｓｉｍｏｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：９３６７、およびこれらの中に記載される引用文献の中に見出され得る。
【００７０】
本発明の送達増強トランスポーターは、１つ以上の（例えば、グリシン、アラニン、およびシステインのような）非グアニジノ／非アミジノサブユニット、またはリンカー（例えば、アミノカプロン酸基）の末端を有し得、それらはその対応する送達増強トランスポーターを含む結合体の、組織縦断層の輸送の度合に、有意には影響しない。また、任意の遊離アミノ末端基は、インビボのユビキチン化を避けるために、保護基（例えば、アセチル基またはベンジル基）でキャップされ得る。
【００７１】
このトランスポーターがペプトイドポリマーである場合、１つの合成方法は以下の工程を包含する：１）ペプトイドポリアミンを塩基およびピラゾール−１−カルボキシアミジンで処理して、混合物を提供する；２）この混合物を加熱し、次いで放置して冷ます；３）この冷ました混合物を酸性化する；そして４）この酸性化した混合物を精製する。好ましくは、工程１にて使用される塩基は炭酸塩（例えば、炭酸ナトリウム）であり、そして加熱工程２は、混合物を約２４時間と約４８時間の間にわたり約５０℃に加熱する工程を包含する。精製工程は、好ましくは、クロマトグラフィー（例えば、逆相ＨＰＬＣ）を含む。
【００７２】
Ｄ．生物学的に活性な薬剤との輸送ポリマーの結合
輸送される薬剤は、多くの実施形態に従って、送達増強トランスポーターと連結され得る。１つの実施形態において、この薬剤は、送達増強トランスポーターの末端との連結を介するか、または適切な連結基を介してその試薬の中の内部サブユニットとの連結を介するかのいずれかで、単一の送達増強トランスポーターと連結される。
【００７３】
第２の実施形態において、この薬剤は上記と同様の様式で、１つより多くの送達増強トランスポーターと結合される。この実施形他は、隣接細胞の架橋を導き得るため、余り好ましくない。
【００７４】
第３の実施形態において、この結合体は、送達増強トランスポーターの各々の末端と結合される２つの薬剤部分を含む。この実施形態に関して、その薬剤が１０ｋＤａ未満の分子量を有することが、現在好まれる。
【００７５】
先に述べた第１および第３の実施形態に関して、この薬剤は、一般的に、グアニジノ側鎖またはアミジノ側鎖が標的の膜と自由に相互作用するように、任意の一方のグアニジノ側鎖またはアミジノ側鎖とは結合されない。
【００７６】
本発明の結合体は、直接的な合成スキームにより調製され得る。さらに、これら結合体生成物は、通常は、長さおよび組成が実質的に均一であり、そのためこれら生成物は不均一な混合物よりも強力な効果の一貫性および再現性を提供する。
【００７７】
本発明の重要な局面に従って、任意の種々の型の生物学的に活性な薬剤との単一の送達増強トランスポーターの結合が、結合体中に巨大な疎水性部分の存在を必要とすらせずに、１層以上の上皮組織および内皮組織の中への、およびそれらを透過した、薬剤の取り込み割合を実質的に増強するのに十分であることが、本出願人らにより見出されている。実際に、巨大な疎水性部分を結合させることは、上皮組織または内皮組織を構成する細胞の脂質二重層への疎水性部分の接着に起因した、層横断輸送を有意に妨害し得るか、または阻害し得る。従って、本発明は、実質的な疎水性部分（例えば、脂質分子および脂肪酸分子）を含まない結合体を包含する。
【００７８】
本発明の送達増強トランスポーターは、化学的方法または組み換え方法により、生物学的に活性な薬剤と共有結合で結合され得る。
【００７９】
（１．化学的連結）
小有機分子および高分子のような生物学的に活性な薬剤は、当該分野で公知である多くの方法（例えば、Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．編、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９９１）参照のこと）を介して、（例えば、カルボジイミドを用いて）直接的に、または連結部分を介してのいずれかで、本発明の送達増強トランスポーターと連結され得る。特に、カルバメート結合、エステル結合、チオエーテル結合、ジスルフィド結合、およびヒドラゾン結合は、一般的に、形成が容易であり、そして大部分の適用に適している。エステル結合およびジスルフィド結合は、細胞膜を横断する物質の輸送の後、この結合が細胞質で直ちに分解されるべき場合に好まれる。
【００８０】
種々の官能基（ヒドロキシル、アミノ、ハロゲン、等）は、輸送ポリマーと生物学的に活性な薬剤を結合させるために使用され得る。生物学的に活性な薬剤の活性部位の一部であることが公知でない基は、特にポリペプチドまたはその任意の部分が送達後にこの物質と結合したままであるべき場合に、好ましい。
【００８１】
ポリマー（例えば、ＰＣＴ出願ＵＳ９８／１０５７１（公開番号  ＷＯ９８５２６１４）に記載されるように生成されたペプチド）は、一般的に、アミノ末端保護基（例えば、ＦＭＯＣ）を用いて作製される。このポリペプチドを合成樹脂から開裂させ、そしてその側鎖を脱保護するために使用される条件に残存し得る生物学的に活性な薬剤のために、このＦＭＯＣは、その薬剤が遊離のＮ末端アミンと連結され得るように、完成して樹脂に結合したポリペプチドのＮ末端から開裂され得る。このような場合に、結合される薬剤は、典型的に当該分野で周知の方法によって活性化されて、ポリマーのアミノ基とアミド結合またはカルバメート結合を効率的に生成する、活性エステル部分または活性カルボネート部分をそれぞれ生成する。無論、他の連結化学反応もまた使用され得る。
【００８２】
副反応を最小限にするよう役立てるため、グアニジノ部分およびアミジノ部分は、従来の保護基（例えば、カルボベンジルオキシ基（ＣＢＺ）、ジ−ｔ−ＢＯＣ、ＰＭＣ、Ｐｂｆ、Ｎ−ＮＯ２など）を使用して保護され得る。
【００８３】
カップリング反応は、任意の多数の溶媒（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリジノン、ジクロロメタン、水など）の中での公知のカップリング法により実施される。例示的なカップリング試薬として、例えば、Ｏ−ベンゾトリアゾリルオキシテトラメチルウロニウム、ヘキサフルオロリン酸塩（ＨＡＴＵ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ブロモ−トリス（ピロリジノ）ホスホニウムブロミド（ＰｙＢｒｏＰ）、などが挙げられる。他の試薬としては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、４−ピロリジノピリジン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、などが含まれ得る。
【００８４】
（２．融合ポリペプチド）
本発明の送達増強トランスポーターは、当該分野で周知の方法に従って、目的のポリペプチドおよびその送達増強トランスポーターを含む融合タンパク質のベクターを構築することにより、組み換え方法により生物学的に活性なポリペプチド薬剤と結合され得る。一般的に、その送達増強トランスポーターの成分は、目的のポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に、必要に応じて短いペプチドリンカーを介して、結合される。
【００８５】
（３．放出可能なリンカー）
現在の好ましい実施形態において、生物学的に活性な薬剤は、特異的に開裂可能であるか、または放出可能である結合を使用して、送達増強トランスポーターと結合される。そのような結合の使用は、結合された送達増強トランスポーターが放出されるまで不活性である生物学的に活性な薬剤にとって、特に重要である。いくつかの場合において、送達増強トランスポーターと結合された薬物分子からなる結合体は、プロドラッグといわれ得、この場合、薬物からの送達増強トランスポーターの放出の結果、不活性型から活性型への薬物の転換を生じる。本明細書中で使用される場合、結合体の「開裂した」もしくは「開裂」、またはリンカーの「開裂した」もしくは「開裂」とは、トランスポーター分子からの生物学的薬剤の放出、それによる活性な生物学的薬剤の放出をいう。「特異的に開裂可能な」または「特異的に放出可能な」とは、トランスポーターが分解されること（例えば、タンパク質消化性の分解）よりもむしろ、開裂するトランスポーターと薬剤との間の結合をいう。
【００８６】
いくつかの実施形態において、この結合は容易に開裂可能な結合であり、インビボに見出される条件下で開裂することが可能であることを意味する。従って、上皮組織および／または内皮組織の１つ以上の層の中への、そしてその層を介した透過の際、薬剤は、送達増強トランスポーターから放出される。容易に開裂可能な結合とは、例えば、特異的な活性（例えば、エステラーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、ペプチダーゼ、など）を有する酵素により、または加水分解により開裂される結合である。この目的のために、カルボン酸エステルおよびジスルフィド結合を含むリンカーが時折好ましく、そこでは前者の基は酵素的にまたは化学的に加水分解され、そして後者の基は、例えばグルタチオンの存在下において、ジスルフィド交換により供給される。この結合は、結合が上皮組織または内皮組織の１つ以上の層中に存在することが公知である酵素的活性により開裂可能であるように、選択され得る。例えば、皮膚の顆粒層は、比較的高い濃度のＮ−ペプチダーゼ活性を有する。
【００８７】
特異的に開裂可能なリンカーは、トランスポーター分子上に設計され得る。例えば、プロテアーゼ認識部位、または他のそのような特異的に認識される酵素開裂部位を構成するアミノ酸は、トランスポーターを薬剤と連結するために使用され得る。あるいは、例えば、光または他の刺激への曝露により開裂可能である化学的リンカーまたは他の種類のリンカーは、目的の薬剤とトランスポーターを連結するために使用され得る。
【００８８】
送達される薬剤および送達増強トランスポーターが、特異的に開裂可能なリンカーまたは特異的に放出可能なリンカーにより連結される結合体は、半減期を有する。本文脈においてこの用語「半減期」とは、上皮膜または内皮膜にこの結合体を投与した後、結合体の半量が分離されて遊離の薬剤を放出するのに要する時間量をいう。いくつかの実施形態についての半減期は、代表的に５分と２４時間の間であり、そしてより好ましくは、３０分と２時間の間である。結合体の半減期は、本発明に従って、以下に記載されるように「調整」され得るか、または改変され得る。
【００８９】
いくつかの実施形態において、リンカーの開裂度合はｐＨ依存性である。例えは、リンカーは酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ６．５以下、より好ましくは約６以下、そしてさらにより好ましくは約５．５以下）において、薬剤と送達増強トランスポーターとの間の安定な連結を生成し得る。しかし、この結合体が生理学的なｐＨ（例えば、ｐＨ７以上、好ましくは約ｐＨ７．４）に置かれた場合、このリンカーは開裂を受けて薬剤を放出する。このようなｐＨ感受性は、例えば、プロトン化された場合（すなわち酸性ｐＨにて）、求核剤として作用しない官能基を含むことにより獲得され得る。より高い（例えば、生理学的な）ｐＨにて、この官能基はもはやプロトン化されず、従って求核剤として作用し得る。適切な官能基の例として、例えば、ＮおよびＳが挙げられる。当業者は、自己開裂が起こるｐＨをうまく調整するために、このような官能基を使用し得る。
【００９０】
別の実施形態において、この連結部分は自己犠牲を介して開裂される。輸送部分−生物学的に活性な化合物の結合体中のそのような連結部分は、生物学的に活性な化合物から遠位の求核剤（例えば、酸素、窒素および硫黄）および生物学的に活性な化合物に近位の開裂基（例えば、エステル、炭酸塩、カルバメート、およびチオカルバメート）を含む。開裂可能な基への求核剤の分子内攻撃の結果、共有結合の切断が生じ、それによって生物学的に活性な化合物から連結部分を放出する。
【００９１】
自己犠牲の連結部分を含む結合体の例（例えば、生物学的に活性な薬剤−Ｌ−輸送部分の結合体）は、構造３、４および５により表される：
【００９２】
【化７】
2004530657.tif 000006
ここで：Ｒ１は生物学的に活性な化合物であり；Ｘは、生物学的に活性な化合物上の官能基と、連結部分上の末端の官能基との間に生成される、連結であり；Ｙは輸送部分上の官能基および連結部分上の官能基から生成される連結であり；ＡはＮまたはＣＨであり；Ｒ２は水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、アクリルまたはアリルであり；Ｒ３は輸送部分であり；Ｒ４はＳ、Ｏ、ＮＲ６またはＣＲ７Ｒ８であり；Ｒ５はＨ、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨＲ６であり；Ｒ６は水素、アルキル、アリール、アクリルまたはアリルであり；Ｒ７およびＲ８は独立して水素またはアルキルであり；ｋおよびｍは独立して１または２のいずれかであり；そしてｎは１〜１０までの範囲の整数である。ＸおよびＹの連結の非限定的な例は、（いずれかの方向で）：−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−Ｃ（Ｓ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＳＯ２ＮＨ−、−ＳＯＮＨ−、リン酸エステル、ホスホネートおよびホスフィン酸エステルである。当業者は、生物学的薬剤がヒドロキシ官能基を有する場合、Ｘが好ましくは−ＯＣ（Ｏ）−または−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−であることを理解する。同様に、連結基が輸送部分のアミノ末端と結合される場合、Ｙは好ましくは−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＳＯ２ＮＨ−、−ＳＯＮＨ−または−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−などである。上に提供された各々の基において、ＮＨは簡略のために示されるが、各々の連結（ＸおよびＹ）は、置換された（例えば、Ｎ−アルキルまたはＮ−アシル）連結もまた含み得る。
【００９３】
構造３、実施例および好ましい実施形態により例示される連結基の第一の分岐は、式３ａに例示される：
【００９４】
【化８】
2004530657.tif 000007
ここで、波線は輸送部分との結合点および生物学的に活性な薬剤との結合点を示す。この連結基を含む結合体の調製は、実施例１９（図６）中に例示される。この実施例および図６において、シクロスポリンＡを無水クロロ酢酸で処理して、クロロ酢酸エステル６ｉ（図６中の番号付け）を生成し、次いでこれをベンジルアミンと結合させてＮ−ベンジルグリシン結合体６ｉｉを生成する。Ｂｏｃ保護された無水ジグリシンとのグリシン結合体の縮合は、酸６ｉｉｉを提供し、これをより反応性の高いＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル６ｉｖへと転換して、次いで輸送部分のアミノ末端と結合してアミド結合を生成する。当業者は、このＮ−ベンジル基が他の基（例えば、アルキル、アリール、アリルなど）と置換され得ること、またはメチレン基が、例えばエチレン、プロピレンなどと置き換えられ得ることを理解する。好ましくは、このメチレン基は、３ａに示されるように保持され、その結合をインビボで開裂し得る、適切な立体方向性または空間方向性を提供する（図６Ｂ参照のこと）。
【００９５】
従って、構造３について、以下の置換基が好ましい：ＡはＮであり；Ｒ２はベンジルであり；ｋ、ｍおよびｎは１であり；Ｘは−ＯＣ（Ｏ）−であり、そしてＹは−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−である。
【００９６】
構造４の結合は、式４ａにより例示される：
【００９７】
【化９】
2004530657.tif 000008
ここで、上記の様に、波線は、各々の輸送部分および生物学的に活性な薬剤との結合点を示す。式４ａの連結基を有する結合体の調製は、実施例２０〜２２中に示される。実施例１９（図３９のスキームを参照のこと）において、アシクロビルは無水α−クロロ酢酸でアシル化されてα−クロロ酢酸エステル３９ｉを生成する。Ｎ末端システイン残基を有するＤ−アルギニンの七量体との３９ｉの反応は、チオエーテル生成物３９ｉｉを提供する。あるいは、アシクロビルα−クロロ酢酸エステルとＣ末端システイン残基を有するＤ−アルギニンの七量体との間に生成される同様の結合を使用して、アシクロビルを輸送部分のＣ末端と結合し得る。この例において、そのシステイン残基は、Ｃ末端のアミドとしてｒ７輸送部分上に提供され、そしてこの結合は構造：
【００９８】
【化１０】
2004530657.tif 000009
を有する。
【００９９】
従って、好ましい実施形態の一群において、この結合体は式５により表され、ここで、Ｘは−ＯＣ（Ｏ）−であり；Ｙは−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−であり；Ｒ４はＳであり；Ｒ５はＮＨＲ６であり；そして添え字ｋおよびｍは各々１である。好ましい実施形態の別の群において、この結合体は式２により表され、ここで、Ｘは−ＯＣ（Ｏ）−であり；Ｙは−ＮＨＣ（Ｏ）−であり；Ｒ４はＳであり；Ｒ５はＣＯＮＨ２であり；そして添え字ｋおよびｍは各々１である。特に好ましい結合体は、Ｒ６が水素、メチル、アリル、ブチルまたはフェニルである結合体である。
【０１００】
適切に保護されたジカルボン酸またはジアミンもまた、特定の生物学的薬剤と共に有用であるが、式６中に示される結合体により表される連結基は、一般的にヘテロな二機能性の型（例えば、ε−アミノカプロン酸、セリン、ホモセリン、−ブチル酪酸など）である。
【０１０１】
構造６に関して、以下の置換基が好ましい：Ｒ５はＮＨＲ６であり（ここで、Ｒ６は水素、メチル、アリル、ブチルまたはフェニルである）；ｋは２であり；Ｘは−Ｃ（Ｏ）Ｏ−であり；そしてＹは−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−である。
【０１０２】
自己犠牲のリンカーは、代表的に、３７℃の、ｐＨ約７．４の水中で、約１０分と約２４時間の間の半減期を有する分子内開裂を受ける。好ましくは、この開裂の半減期は、３７℃で約７．４のｐＨでの水中で、約２０分と約４時間の間である。より好ましくは、この開裂の半減期は、３７℃で約７．４のｐＨでの水中で、約３０分と約２時間の間である。
【０１０３】
構造３を有する結合体に関して、当業者は、種々のＲ２置換基により開裂の半減期を調節し得る。増加または減少した大きさのＲ２を使用して、当業者は、それぞれより長い半減期またはより短い半減期を有する結合体を獲得し得る。構造３中のＲ２は、好ましくはメチル、エチル、プロピル、ブチル、アリル、ベンジルまたはフェニルである。
【０１０４】
自己犠牲のリンカー中に塩基性基または酸性基がある場合、当業者はしばしば結合体の溶液のｐＨに従って、開裂の半減期を調節し得る。例えば、構造３の骨格のアミン基は、酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ５．５）でプロトン化される。このアミンは、プロトン化される場合、分子内開裂を誘導する求核剤としては利用不可能である。しかし、生理学的ｐＨ（７．４）の媒質中への結合体の導入の際、このアミンは、半減期の有意な一部の時間に非プロトン化される。この開裂の半減期は、それに相応して減少する。
【０１０５】
１つの実施形態において、自己犠牲のリンカーの開裂は２段階で生じる：連結部分の一部の開裂を生じる、求核基の分子内反応；および、連結部分の残存部分の脱離である。この開裂の第１段階は、速度制限的であり、そしてｐＨ感受性および半減期についてうまく調整され得る。
【０１０６】
構造６は、輸送部分−生物学的に活性な化合物の結合体中に組み込まれる、２段階の自己犠牲の部分の例である：
【０１０７】
【化１１】
2004530657.tif 000010
ここで：Ｒ１は生物学的に活性な化合物であり；Ｘは、生物学的に活性な化合物上の官能基と、連結部分上の官能基との間の連結を表し；Ａｒは置換または非置換のアリール基であり（ここでそのメチレン置換基およびフェノールの酸素原子がお互いにオルトまたはパラのいずれかである）；Ｒ３は輸送部分であり；Ｒ４はＳ、Ｏ、ＮＲ６またはＣＲ７Ｒ８であり；Ｒ５はＨ、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨＲ６であり；Ｒ６は水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、アシルまたはアリルであり；Ｒ７およびＲ８は独立して水素またはアルキルであり；そしてｋおよびｍは独立して１または２のいずれかである。
【０１０８】
式６の結合体を生成するための適切な連結基の例は：
【０１０９】
【化１２】
2004530657.tif 000011
である。
【０１１０】
式６ａの連結基を含む結合体の構造は、実施例２３（図４１もまた参照のこと）中に提供される。この実施例（および図）において、２，４−ジメチル−４−ヒドロキシメチルフェノール（４１ｉ）のα−クロロ酢酸エステルは、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を使用してレチノイン酸（４１ｉｉ）とカップリングされ、中間体４１ｉｉｉを生じる。アルギニン七量体の輸送部分のＮ末端にあるシステイン残基との、４１ｉｉｉの続くカップリングにより、標的の結合体４１ｉｖを生じる。
【０１１１】
好ましくは、式６の結合体中に使用される連結基は、Ａｒが置換または非置換のフェニレン基であり；Ｒ４がＳであり；Ｒ５がＮＨＲ６であり（ここでＲ６は水素、メチル、アリル、ブチル、アセチルまたはフェニルである）；ｋおよびｍは１であり；Ｘは−Ｃ（Ｏ）Ｏ−であり；そしてＹは−Ｃ（Ｏ）Ｏ−または−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−である、基である。より好ましくは、Ｒ６は水素またはアセチルである。
【０１１２】
上記の連結基はアルギニン七量体を含む結合体に関して記載されているが、当業者はこの技術が本発明の「間隙の」アルギニン輸送部分との結合体に容易に適用されることを理解する。
【０１１３】
本発明の使用に対して、なお他に有用な連結基は、同時係属ＰＣＴ出願中に記載されている。例えば、同様の組成物（例えば、生物学的に活性な薬剤および輸送オリゴマー）に対する連結基を記載する、ＰＣＴ出願ＵＳ９８／１０５７１（公開番号  ＷＯ９８５２６１４）およびＵＳ００／２３４４０（公開番号  ＷＯ０１／１３９５７）を参照のこと。これら出願中に記載される連結技術は、本発明の組成物において、同様の様式で使用され得る。
【０１１４】
従って、実施形態の１群において、連結部分は、生物学的に活性な化合物から遠位の第一の開裂可能な基、および生物学的に活性な化合物に近位の第二の開裂可能な基を含む。第一の開裂可能な基の開裂は、第二の開裂可能な基と分子内で反応し得る求核剤を生成して、それによって生物学的に活性な化合物から連結部分を開裂させる。第一の基が開裂される方法の例として、光照射および酵素に媒介される加水分解が挙げられる。この方法論は、ＰＣＴ出願ＵＳ９８／１０５７１（公開番号  ＷＯ９８５２６１４）中に論じられる、種々の関連低分子の結合体に関して例示されている。
【０１１５】
１つのアプローチにおいて、結合体は、ＰＣＴ出願ＵＳ００／２３４４０（公開番号  ＷＯ０１／１３９５７）（ＰＣＴ出願ＵＳ９８／１０５７１（公開番号  ＷＯ９８５２６１４）もまた参照のこと）の図５Ａ中に図示されるように、ジスルフィド結合を含み得、この出願は、リンカーとして役立つＮ−アセチル保護されたシステイン基により、細胞傷害性薬剤の６−メルカプトプリンと連結された輸送ポリマーＴを包含する、結合体（Ｉ）を示す。従って、この細胞傷害性薬剤はジスルフィド結合により６−メルカプト基と結合されて、そしてこの輸送ポリマーはアミド結合を介してシステインカルボニル部分と結合される。還元またはジスルフィド交換によるジスルフィド結合の開裂は、遊離した細胞傷害性薬剤の放出を生じる。ジスルフィド含有結合体を合成する方法は、ＰＣＴ出願ＵＳ９８／１０５７１の実施例９Ａ中に提供される。そこで記載される生成物は、Ｎ−アセチル−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａリンカーにより６−メルカプトプリンと連結されるＡｒｇ残基の七量体を含み、ここでこのＡｌａ残基は、そのジスルフィドをチオールにより接近させるための追加のスペーサー、そして細胞内の開裂のための還元剤として含まれる。この例におけるリンカーもまた、アミド結合の使用を例示し、そしてこの結合は細胞内で酵素的に開裂され得る。
【０１１６】
別のアプローチにおいて、この結合体は、電磁照射への曝露で開裂する、光開裂可能なリンカーを含む。この方法論の適用は、メタ−ニトロベンゾエートの連結部分を介して６−メルカプトプリンに連結される輸送ポリマーＴを含む結合体（ＩＩ）を示す、ＰＣＴ出願ＵＳ００／２３４４０（公開番号  ＷＯ０１／１３９５７）の図５Ｂ中で、関連システムに対して提供される。ポリマーＴはベンゾエートカルボニル基とのアミド結合によりニトロベンゾエート部分と連結され、そして細胞傷害性薬剤はその６−メルカプト基を介してｐ−メチレン基と結合される。この化合物は、ＮａＯＣＨ３／メタノールの存在下で加熱しながら、６−メルカプトプリンをｐ−ブロモメチル−ｍ−ニトロ安息香酸と反応させ、続いてそのベンゾエートカルボン酸の輸送ポリマー（例えば、ポリマーと結合したγ−アミノ酪酸リンカーのアミノ基（例えば、ＰＣＴ出願ＵＳ９８／１０５７１の実施例９Ｂもまた参照のこと））とのカップリングにより、生成され得る。結合体の光照射は、メルカプトメチル部分にオルトであるニトロ基により、６−メルカプトプリンの放出を生じる。このアプローチは、特に生体の選択した領域への局所的な薬物活性化のため、当該分野で公知の光療法における利用を見出す。
【０１１７】
好ましい実施形態の一群では、以下のアプローチによって例示されるように、切断可能なリンカーは、生物学的に活性な薬剤からオリゴマーを切断するように協同し得る第１および第２の切断可能な基を含む。すなわち、切断可能なリンカーは、この薬剤に対して遠位にある第１の切断可能な基、およびこの薬剤に対して近位にある第２の切断可能な基を含み、その結果、第１の切断可能な基の切断は、第２の切断可能な基を切断するために分子内で反応し得る求核性部分を含むリンカー−薬剤結合体を生じ、それによってリンカーおよびポリマーから薬剤を放出する。
【０１１８】
再度、共有に係る同時係属中のＰＣＴ出願ＵＳ００／２３４４０（公開番号ＷＯ０１／１３９５７）を参照する。このＰＣＴ出願ＵＳ００／２３４４０において、図５Ｃは、抗癌剤である５−フルオロウラシル（５ＦＵ）に連結したトランスポーターポリマーＴを含む結合体（ＩＩＩ）を示す。この図において、連結は、改変されたリジル残基によって提供される。トランスポーターポリマーは、α−アミノ基に連結され、そして５−フルオロウラシルは、α−カルボニルを介して連結される。リジルε−アミノ基は、ｏ−ヒドロキシメチルニトロベンゼンのカルバメートエステルに修飾されており、これは、結合体内に第１の光不安定で切断可能な基を含む。光照射は、結合体からニトロベンゼン部分を切断し、また迅速に分解して遊離α−アミノ基（有効な求核剤）を与えるカルバメートを残す。α−アミノ基の、５−フルオロウラシル基に対するアミド連結との分子内反応は、５−フルオロウラシル基の放出と共に環化を導く。
【０１１９】
本発明において有用なさらに他のリンカーが、ＰＣＴ出願ＵＳ００／２３４４０（公開番号ＷＯ０１／１３９５７）において提供されている。特に、ＵＳ００／２３４４０の図５Ｄは、抗癌剤であるパクリタキセルの２’−酸素に連結した送達増強トランスポーターＴを含む結合体（ＩＶ）を例示する。この連結は、以下を含む連結部分によって提供される：（ｉ）送達増強トランスポーターに結合した窒素原子、（ｉｉ）窒素原子に対してパラ位に位置するリン酸モノエステル、および（ｉｉｉ）窒素原子に対してメタ位のカルボキシメチル基であり、これは、カルボキシレートエステル結合によってパクリタキセルの２’−酸素に結合される。結合体からのリン酸基の酵素的切断は、遊離したフェノールヒドロキシル基を与える。次いで、この求核基は、カルボキシレートエステルと分子内反応し、その生物学的標的に完全に結合し得る遊離パクリタキセルを放出する。ＰＣＴ出願ＵＳ９８／１０５７１の実施例９Ｃは、この型の結合体を調製するための合成プロトコールを記載している。
【０１２０】
さらに他の適切なリンカーが、ＰＣＴ出願ＵＳ００／２３４４０（公開番号ＷＯ０１／１３９５７）の図５Ｅにおいて例示されている。ここで提供されるアプローチにおいて、送達増強トランスポーターは、生物学的に活性な薬剤（例えば、パクリタキセル）に、アミノアルキルカルボン酸によって連結される。好ましくは、リンカーアミノ基は、３〜５個の鎖の原子（ｎ＝３〜５）、好ましくは、３個または４個のいずれかの鎖の原子（これらは、好ましくは、メチレン炭素として提供される）によって、リンカーカルボキシル炭素に連結される。図５Ｅに見られるように、リンカーアミノ基は、アミド結合によって送達増強トランスポーターに結合され、エステル結合によってパクリタキセル部分に結合される。アミド結合の酵素的切断は、送達増強トランスポーターを放出して、そして遊離した求核アミノ基を生成する。次いで、この遊離したアミノ基は、エステル基と分子内反応して、パクリタキセルからリンカーを放出し得る。
【０１２１】
別のアプローチにおいて、結合体は、あるｐＨで不安定であるが、別のｐＨで安定であるリンカーを含む。例えば、ＰＣＴ出願ＵＳ００／２３４４０（公開番号ＷＯ０１／１３９５７）の図６は、生理学的ｐＨで切断されるが、酸性ｐＨで安定であるリンカーを有する結合体を合成する方法を例示する。好ましくは、このリンカーは、約６．６〜約７．６のｐＨで水中において、切断される。好ましくは、このリンカーは、約４．５〜約６．５のｐＨで水中において安定である。
【０１２２】
（送達増強トランスポーターの使用）
送達増強トランスポーターは、治療的適用、予防的適用および診断的適用における使用を見出す。この送達増強トランスポーターは、１層以上の皮膚または他の上皮組織（例えば、胃腸、肺、眼など）内に、およびそれらを横切って、あるいは、血液脳障壁のような内皮組織を横切って、診断的または生物学的に活性な試薬を運搬し得る。この特性により、この試薬は、それらの生物学的効果を発揮するために１層以上の組織層を横切って浸透しなければならない薬剤を送達することによって状態を処置するために有用となる。
【０１２３】
さらに、本発明のトランスポーターはまた、フリン（ｆｕｒｉｎ）インヒビターとして、単独でかまたは別の治療剤もしくは他の化合物と組み合わせて使用され得る。例えば、種々のポリアルギニントランスポーターに加えて、本明細書中に記載される合成トランスポーター（ペプトイド、および天然には存在しないアミノ酸を含有する合成トランスポーターを含む）が、フリンを阻害するために使用され得る。例えば、Ｃａｍｅｒｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（４７）：３６７４１−９を参照のこと。フリンは、種々のプロタンパク質をそれらの活性成分へと変換するプロテアーゼである。フリンの阻害は、例えば、ビルレンスまたは複製をフリン活性に依存するウイルスによる感染を処置するために有用である。例えば、Ｍｏｌｌｏｙら、Ｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：２８−３５（１９９９）を参照のこと。
【０１２４】
同様に、本発明のトランスポーターは、カプテシンＣ（ｃａｐｔｈｅｓｉｎ  Ｃ）の有用なインヒビターである。例えば、特定のポリアルギニン化合物は、カプテシンＣのインヒビターである。例えば、Ｈｏｒｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７（１１）：３３３０−３３３６（２０００）を参照のこと。同様に、本発明のトランスポーター（合成アミノ酸を含有するものを含む）は、カプテシンＣを阻害するために有用である。
【０１２５】
本発明の１つの局面では、フリンインヒビターアッセイを使用して、さらなるトランスポーターについてスクリーニングし得る。例えば、候補のトランスポーター化合物を、標準的な競合アッセイを使用して、フリンまたはカプテシンＣに結合するその能力についてポリアルギニンと競合するその能力を試験し得る。あるいは、候補のトランスポーターは、Ｃａｍｅｒｏｎら（前出）およびＨｏｒｎら（前出）において考察されたように、フリンプロテアーゼ活性を阻害するその能力についてスクリーニングされ得る。次いで、特に活性な候補が、組織（例えば、上皮）中へのおよび／または組織（例えば、上皮）を横切るトランスポーターとして作用するその能力についてさらに試験され得る。
【０１２６】
本発明の組成物および方法は、ヒトのおよび獣医学的な治療の分野において、特に有用性を有する。一般的に、投与される用量は、エフェクター部位にｐＭ〜μＭの濃度の治療用組成物を送達するのに有効である。適切な用量および濃度は、治療用の組成物または薬物、意図される送達の部位、および投与の経路のような因子に依存し、これらの全ては、当該分野で周知の方法に従って経験的に導き出され得る。さらなる指針は、当該分野で公知であるように、用量を評価するための実験動物モデルを使用する研究から得られ得る。
【０１２７】
必要に応じて適切な薬学的賦形剤を伴う本発明の化合物の投与は、任意の受容された投与様式を介して実行され得る。従って、投与は、例えば、静脈内投与、局所的投与、皮下投与、経皮投与、筋肉内投与、経口投与、関節内投与、非経口投与、腹膜投与、鼻腔内投与または吸入であり得る。従って、投与の適切な部位として、皮膚、気管支、胃腸、肛門、膣、眼、および耳が挙げられるが、これらに限定されない。これらの処方物は、好ましくは、正確な用量の単回投与に適切な単位用量形態において、例えば、錠剤、丸剤、カプセル、散剤、溶液、懸濁液、エマルジョン、坐剤、保持浣腸（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｅｎｅｍａ）、クリーム、軟膏、ローション、エアロゾル、点眼剤などのような、固体、半固体、凍結乾燥した散剤、または液体投与形態の形態をとり得る。
【０１２８】
組成物は、代表的には、従来の薬学的キャリアまたは賦形剤を含み、さらに、他の医薬剤、キャリア、アジュバントなどを含み得る。好ましくは、この組成物は、本発明の化合物（単数または複数）の重量を基準に、約５％〜７５％であり、残りは適切な薬学的賦形剤からなる。適切な賦形剤は、当該分野で周知の方法（例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、第１８編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９０））によって、特定の組成物および投与の経路に合わせられ得る。
【０１２９】
経口投与のためには、このような賦形剤としては、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルク（ｔａｌｃｕｍ）、セルロース、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。この組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、散剤、持続性放出処方物などの形態をとり得る。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、丸剤、錠剤またはカプセルの形態をとり、このようにして、この組成物は、生物学的に活性な結合体と共に、以下のいずれかを含み得る：ラクトース、スクロース、リン酸二カルシウムなどのような希釈剤；デンプンまたはその誘導体のような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどのような潤滑剤；およびデンプン、アラビアゴム、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、セルロースおよびそれらの誘導体のような結合剤。
【０１３１】
処方物の活性化合物は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）キャリア（例えば、ＰＥＧ１０００［９６％］およびＰＥＧ４０００［４％］）中に配置される、約０．５％〜約５０％の本発明の化合物を含む坐剤中に処方され得る。
【０１３２】
液体組成物は、キャリア（例えば、生理食塩水（例えば、０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム）、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなど）中に化合物（約０．５％〜約２０％）、および任意の薬学的アジュバントを溶解または分散することによって調製され、例えば、静脈内投与のための溶液または懸濁液を形成し得る。この活性化合物はまた、保持浣腸に処方され得る。
【０１３３】
所望される場合、投与される組成物はまた、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤（例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、またはトリエタノールアミンオレアート）のような少量の非毒性補助物質を含み得る。
【０１３４】
局所投与の場合、組成物は、ローションまたは経皮パッチのような任意の適切な形式で投与される。吸入による送達の場合、この組成物は、乾燥散剤（例えば、吸入治療剤）として、または噴霧器を介する液体形態で、送達され得る。
【０１３５】
このような投与形態を調製するための方法は、公知であるか、または当業者に明らかである；例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｎｃｅｓ（前出）および同様の刊行物を参照のこと。投与される組成物は、どのような場合でも、本発明の教示に従って投与される際に処置される状態の軽減のために薬学的に有効な量の一定量のプロドラッグおよび／または活性化合物を含む。
【０１３６】
一般に、本発明の化合物は、治療的に有効な量、すなわち、処置をもたらすのに十分な用量で投与され、この用量は、処置される個体および状態に依存して変更する。代表的には、治療的に有効な１日の用量は、１日あたり、体重１ｋｇあたり０．１〜１００ｍｇの薬物である。ほとんどの状態が、１日あたり体重１ｋｇあたり約１〜約３０ｍｇ、すなわち７０ｋｇのヒトの場合、１日あたり、約７０ｍｇ〜２１００ｍｇの総用量の投与に応答する。
【０１３７】
結合体の安定性は、組成および送達増強トランスポーターの骨格および側鎖の立体化学によってさらに制御され得る。ポリペプチド送達増強トランスポーターの場合、Ｄ−異性体は、一般に内在性プロテアーゼに対して耐性があり、それ故に、血清および細胞内のより長い半減期を有する。それ故に、Ｄ−ポリペプチドポリマーは、より長い期間の作用が所望される場合に適切である。Ｌ−ポリペプチドポリマーは、プロテアーゼに対するそれらの感受性に起因して、より短い半減期を有し、それ故に、より短い作用効果を付与するために選択される。このことによって、副作用が観察されるとすぐに、治療を中止するこよによって、より容易に副作用が回避され得る。Ｄ−残基およびＬ−残基の混合物を含むポリペプチドは、中間安定性を有する。ホモ−Ｄ−ポリマーが、一般的に好ましい。
【０１３８】
（Ａ．皮膚への適用）
本発明の送達増強トランスポーターは、生物学的に活性な薬剤および診断的な薬剤の皮膚を横切る送達を可能にする。驚くべきことに、このトランスポーターは、以前には薬物送達に対してほぼ浸透不可能な障壁であった角質層を横切って薬剤を送達し得る。角質層、すなわち皮膚の最外層は、コレステロールおよび脂肪酸からなる「糊剤（ｇｌｕｅ）」によって一緒に、しっかり結合される、死んだケラチン充填皮膚細胞のいくつかの層から構成される。一旦、この薬剤が本発明のトランスポーターによって角質層を通して送達されると、この薬剤は、角質層とともに表皮を構成する顆粒層、淡明層および胚芽層からなる生存可能な表皮に侵入し得る。本発明のいくつかの実施形態における送達は、表皮を通り、そして真皮（乳頭真皮および網様真皮の１つまたは両方を含む）に入る。
【０１３９】
皮膚の１層以上の層の貫入を得るこの能力は、抗細菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗増殖剤、免疫抑制剤、ビタミン、鎮痛剤、ホルモンなどのような化合物の効力を非常に増強し得る。莫大なこのような化合物は、当業者に公知である（例えば、ＨａｒｄｍａｎおよびＬｉｍｂｉｒｄ，Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９６を参照のこと）。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、薬剤は、上皮組織内に存在する血管内に送達され、それにより、全身的にこの薬剤の送達のための手段を提供する。送達は、濾胞内もしくは濾胞間、またはその両方のいずれかであり得る。皮膚の前処置は、結合体の送達に必要とされない。
【０１４１】
他の実施形態において、送達増強トランスポーターは、皮膚状態を処置し得る化粧品および薬剤を送達するために有用である。目的の皮膚内の標的細胞として、例えば、線維芽細胞、上皮細胞および免疫細胞が挙げられる。例えば、トランスポーターは、真皮内に見られる免疫細胞に対する抗炎症剤のような化合物を送達する能力を提供する。
【０１４２】
糖質コルチコイド（アドレノコルチコイドステロイド）は、皮膚を横切る送達が本発明の送達増強トランスポーターによって増強され得る化合物の１つである。本発明の結合体化した糖質コルチコイドは、例えば、炎症性皮膚疾患を処置するのに有用である。例示的な糖質コルチコイドとして、例えば、ヒドロコルチゾン、プレニゾン（ｐｒｅｎｉｓｏｎｅ（デルタゾン（ｄｅｌｔａｓｏｎｅ）））およびプレドリゾンロン（ｐｒｅｄｒｉｓｏｎｌｏｎｅ）（ハイデルタゾル（ｈｙｄｅｌｔａｓｏｌ））が挙げられる。特定の状態の例として、湿疹（アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎を含む）、水疱性疾患、コラーゲン脈管疾患、サルコイドーシス、スウィート病、壊疽性膿皮症、Ｉ型反応性らい病、毛細血管性血管腫、扁平苔癬、剥脱性皮膚炎、結節性紅斑、ホルモン異常（挫瘡および多毛症を含む）、ならびに毒性表皮壊死症、多形性紅斑、皮膚性Ｔ細胞リンパ腫、円板状エリテマトーデスなどが挙げられる。
【０１４３】
レチノイドは、１層以上の皮膚または他の上皮組織もしくは内皮組織内への送達およびそれらを横切る送達を増強するために、本発明の送達増強トランスポーターを使用し得る生物学的に活性な薬剤の別の例である。現在使用されるレチノイドとして、例えば、レチノール、トレチノイン、イソトレチノイン、エトレチナート、アチトレチン（ａｃｉｔｒｅｔｉｎ）、およびアロチノイド（ａｒｏｔｉｎｏｉｄ）が挙げられる。本発明の送達増強トランスポーターに結合したレチノイドを使用して処置可能である状態として、挫瘡、角質化障害、皮膚癌、前癌状態、乾癬、皮膚老化、円板状エリテマトーデス、硬化性粘液水腫、いぼ状表皮神経、角層下膿疱性皮膚炎、ライター症候群、いぼ、扁平苔癬、黒色表皮肥厚症、サルコイドーシス、グロヴァー病、汗孔角化症などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４４】
細胞傷害性薬物および免疫抑制薬物は、本発明の送達増強トランスポーターが有用であるさらなるクラスの薬物を構成する。これらの因子は、乾癬のような過剰増殖疾患、ならびに水疱性皮膚疾患および白血球破砕性血管炎のような免疫疾患を処置するために通常使用される。本発明の送達増強トランスポーターに結合し得るこのような化合物の例として、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、アザチオプリン、フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、６−チオクアニン（ｔｈｉｏｑｕａｎｉｎｅ）、ミコフェノレート（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ）、クロランブシル、ビニクリスチン（ｖｉｎｉｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンブラスチンおよびダクチノマイシン）が挙げられるが、これらに限定されない。他の例は、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、メクロロエタミン塩酸塩（ｍｅｃｈｌｏｒｏｅｔｈａｍｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、カルムスチンである。タキソール、タクロリムス（ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ）およびビンブラスチンは、ダプソンおよびスルファサラジンのように、有用な生物学的薬剤のさらなる例である。シクロスポリン、ＦＫ５０６（タクロリムス）、およびラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）（例えば、米国特許第５，９１２，２５３号）のようなアスコマイシン（ａｓｃｏｍｙｃｉｎ））、ならびにこのような化合物のアナログのような免疫抑制剤が、特に関心が高い（例えば、Ｍｏｌｌｉｎｓｏｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓｉｇｎ  ４（５）：３６７−３８０（１９９８）；米国特許第５，６１２，３５０号；同第５，５９９，９２７号；同第５，６０４，２９４号；同第５，９９０，１３１号；同第５，５６１，１４０号；同第５，８５９，０３１号；同第５，９２５，６４９号；同第５，９９４，２９９号；同第６，００４，９７３号および同第５，５０８，３９７号）。シクロスポリンとして、例えば、シクロスポリンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＧおよびＭが挙げられる。例えば、米国特許第６，００７，８４０号；および同第６，００４，９７３号を参照のこと。例えば、このような化合物は、乾癬、湿疹（アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎を含む）および円形脱毛症の処置に有用である。
【０１４５】
送達増強トランスポーターは、紅斑性狼瘡（円板状および全身性の両方）、皮膚筋炎、晩発性皮膚ポルフィリン症および多形光線疹のような状態を処置するために有用な薬剤と結合体化され得る。このような状態を処置するために有用な薬剤としては、例えば、キニーネ、クロロキン、ヒドロキシクロロキンおよびキナクリンが挙げられる。
【０１４６】
本発明の送達増強トランスポーターはまた、抗感染剤の経皮送達のために有用である。例えば、抗細菌剤、抗真菌剤および抗ウイルス剤が、送達増強トランスポーターに結合体化され得る。抗細菌剤は、挫瘡、皮膚感染などのような状態を処置するために有用である。抗真菌薬剤を用いて、体部白癬、足部白癬、爪真菌症、カンジダ症、でん風などを処置し得る。この結合体の送達増強特性に起因して、これらの結合体は、局所化した感染および広範に広がった感染の両方を処置するために有用である。抗真菌薬剤はまた、爪真菌症を処置するために有用である。抗真菌薬剤の例としては、イトラコナゾール、ミコナゾール（ｍｙｃｏｎａｚｏｌ）およびフルコナゾールのようなアゾール抗真菌剤が挙げられるがこれらに限定されない。抗ウイルス薬剤の例としては、アシクロビル、ファンシクロビル（ｆａｍｃｉｃｌｏｖｉｒ）およびバラシクロビル（ｖａｌａｃｙｃｌｏｖｉｒ）が挙げられるがこれらに限定されない。このような薬剤は、ウイルス性疾患（例えば、ヘルペス）を処置するために有用である。
【０１４７】
本発明の送達増強トランスポーターへの結合体化による送達の増強が望ましい、生物学的に活性な薬剤の別の例は、抗ヒスタミン剤である。これらの薬剤は、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、乾癬などに起因するかゆみのような状態を処置するために有用である。このような試薬の例としては例えば、テルフェナジン、アステミゾール、ロロタジン（ｌｏｒｏｔａｄｉｎｅ）、セチリジン、アクリバスチン、テメラスチン（ｔｅｍｅｌａｓｔｉｎｅ）、シメチジン、ラニチジン、ファモチジン、ニザチジンなどが挙げられる。三環系抗うつ剤もまた、本発明の送達増強トランスポーターを用いて送達され得る。
【０１４８】
表面抗乾癬薬物（ｔｏｐｉｃａｌ  ａｎｔｉｐｓｏｒｉａｓｉｓ  ｄｒｕｇ）もまた目的のものである。コルチコステロイド、カルシポトリエン（ｃａｌｃｉｐｏｔｒｉｅｎｅ）およびアントラリンのような薬剤は、本発明の送達増強トランスポーターに結合体化され得、そして皮膚に塗布され得る。
【０１４９】
本発明の送達増強トランスポーターはまた、皮膚および他の上皮組織の１以上の層内への、ならびに皮膚および他の上皮組織の１以上の層を通しての光化学療法剤の送達を増強するために有用である。このような化合物としては例えば、ソラレンなどが挙げられる。遮光剤成分もまた目的のものである；これらとしては、ｐ−アミノ安息香酸エステル、シナメートおよびサリシレート、ならびにベンゾフェノン、アントラニレート（ａｎｔｈｒａｎｉｌａｔｅｓ）およびアボベンゾンが挙げられる。
【０１５０】
疼痛軽減剤および局所麻酔剤は、本発明の送達増強トランスポーターへの結合体化が処置を増強し得る別のクラスの化合物を構成する。リドカイン、ブピバカイン、ノボカイン、プロカイン、テトラカイン、ベンゾカイン、コカインおよびオピエートはとりわけ、本発明の送達増強トランスポーターに結合体化され得る化合物である。関節または関節付近の皮膚への疼痛軽減剤の適用（例えば、慢性関節リウマチに罹患した患者における）もまた意図される。
【０１５１】
目的の他の生物学的薬剤としては例えば、ミノキシジル、角質溶解剤、破壊剤（例えば、ポドフィリン、ヒドロキノン、カプサイシン、マソプロコール、コルヒチンおよび金が挙げられる。
【０１５２】
慢性関節リウマチにおいて生じるような炎症性関節の処置もまた、本発明のトランスポーターに結合体化された、このような処置のために有用な化合物を用いて処置され得る。
【０１５３】
（Ｂ．胃腸投与）
本発明の送達増強トランスポーターはまた、胃腸投与による結合体化薬物の送達のために有用である。胃腸投与は、全身的に活性な薬物および胃腸上皮において作用する薬物の両方について用いられ得る。
【０１５４】
送達増強トランスポーターに結合体化した適切な試薬を用いて処置され得る胃腸状態の中でも、クローン病のような炎症性腸疾患がある（例えば、シクロスポリン、ＦＫ５０６およびアスコマイシン；アミノサリチル酸塩（例えば、スルファサラジンおよびメサラミン）；コルチコステロイド、例えば、プレドニゾンおよびメチルプレドニゾロン；免疫改変剤、例えば、アザチオプリン、６ＭＰ、メトトレキサート；ならびに抗生物質、例えば、メトロニダゾル、アンピシリン、シプロフロキサシンなど）。他の処置可能な胃腸状態としては、、潰瘍性大腸炎、胃腸の潰瘍、消化性潰瘍疾患、塩分および水分の吸収の失調（ｉｍｂａｌａｎｃｅ  ｏｆ  ｓａｌｔ  ａｎｄ  ｗａｔｅｒ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）（便秘、下痢または栄養失調を引き起こし得る）、異常増殖疾患などが挙げられる。潰瘍の処置としては例えば、胃酸分泌を減少させる薬物（例えば、Ｈ２ヒスタミンインヒビター（例えば、シメチジンおよびラニチジン）およびプロトン−カリウムＡＴＰａｓｅのインヒビター（例えば、ランソプラゾールおよびオメプラゾール））ならびにＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉに対する抗生物質が挙げられる。
【０１５５】
便秘の処置のために有用な化合物もまた、本発明のトランスポーターとの結合体において使用され得る。便秘を処置するために有用な化合物としては、例えば、ドキュセートナトリウム、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）１８８、デヒドロコール酸およびリシノール酸のような、界面活性剤緩下薬が挙げられる。例示的な界面活性剤緩下薬としては、例えば、フェノールフタレイン、ビサコジル、およびアントラキノン緩下薬（例えば、ダントロン）が挙げられる。
【０１５６】
抗生物質（特に、侵襲性の細菌（例えば、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａおよびＹｅｒｓｉｎｉａ）に対して作用する抗生物質）はとりわけ、本発明の送達増強トランスポーターに結合体化した場合に有用である生物学的に活性な薬剤である。このような化合物としては例えば、ノルフロキサシン、シプロフロキサシン、トリメトプリム、スルファメチロキサゾールなどが挙げられる。
【０１５７】
例えば、結腸癌の処置のために、抗新生物剤もまた本発明の送達増強トランスポーターに結合体化され得、そして胃腸経路によって投与され得る。これらとしては例えば、シスプラチン、メトトレキサート、タキソール、フルオロウラシル、メルカプトプリン、ドキソルビシン（ｄｏｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ブレオマイシン、ストレプトゾシン、マイトマイシンなどが挙げられる。
【０１５８】
経口投与されたトランスポーターまたは活性化合物の胃腸および結腸への送達のために、その化合物が胃腸（ＧＩ）管または結腸に送達されるまで、その化合物が放出されないように、その化合物をコーティングまたはカプセル化することが有利であり得る。ＧＩ管または結腸への送達のために有用な方法および組成物は、例えば、米国特許第６，１８３，４６６号および同第６，１２０，８０３号に記載されている。
【０１５９】
（Ｃ．気道投与）
本発明の送達増強トランスポーターはまた、気道を介した薬物の投与を増強するために使用され得る。鼻粘膜、下咽頭、ならびに大気道構造および小気道構造を含む、気道は、薬物吸収のための大きな粘膜表面を提供する。本発明の送達増強トランスポーターにより提供される上皮組織の１つ以上の層へおよび１つ以上の層を横切る、結合体化された薬剤の増強された浸透は、気道送達が他の送達方法よりも優れた利点の拡大をもたらす。例えば、低用量の薬剤は、しばしば、所望の効果を得るために必要とされ、局所的な治療効果が、より迅速に生じ得、そして薬剤の全身性の治療的血液レベルが、直ちに得られる。薬理学的活性の迅速な発生は、気道投与から生じ得る。さらに、気道投与は、一般的に、比較的副作用がわずかしかない。
【０１６０】
本発明のトランスポーターは、肺性状態の処置のために有用な生物学的薬剤を送達するために使用され得る。鼻投与によって処置可能な状態の例としては、例えば、喘息が挙げられる。これらの化合物としては、抗炎症剤（例えば、コルチコステロイド、クロモリン、およびネドクロミル）、気管支拡張薬（例えば、β２選択性アドレナリン作用性（ａｄｒｏｎｅｒｇｉｃ）薬物およびテオフィリン）、および免疫抑制薬物（例えば、シクロスポリンおよびＦＫ５０６）が挙げられる。他の状態としては、例えば、アレルギー性鼻炎（これは、グルココルチコイドで処置可能である）、および慢性閉塞性肺疾患（気腫）が挙げられる。肺性組織に作用し、そして本発明のトランスポーターを使用して送達され得る、他の薬物としては、βアゴニスト、肥満細胞安定剤、抗生物質、抗真菌剤および抗ウイルス剤、界面活性剤、血管作用薬、鎮痛薬ならびにホルモンが挙げられる。
【０１６１】
気道投与は、肺性状態の処置のためだけでなく、循環器系を介した離れた標的器官への薬物の送達のためにも有用である。多種多様なこのような薬物および診断剤は、本発明の送達増強トランスポーターへの結合体化の後、気道を通じて投与され得る。
【０１６２】
（Ｄ．血液脳関門を横切る薬剤の送達）
送達増強トランスポーターはまた、血液脳関門を横切った生物学的に活性な薬剤および診断剤の送達のために有用である。これらの薬剤は、虚血の処置（例えば、抗アポトーシス薬物の使用）のため、ならびに種々の状態（例えば、精神分裂病、パーキンソン病、痛み（例えば、モルヒネ、アヘン製剤））を処置するための神経伝達物質および他の薬剤を送達するために有用である。５−ヒドロキシトリプタミンレセプターアンタゴニストは、片頭痛および不安のような状態を処置するために有用である。
【０１６３】
（Ｅ．診断画像化剤および造影剤）
本発明の送達増強トランスポーターはまた、上皮組織および／もしくは内皮組織の１つ以上の層へか、または１つ以上の層を横切る、診断画像化剤ならびに造影剤の送達のために有用である。診断剤の例としては、放射能で標識化される物質（例えば、９９ｍＴｃグルコヘプトネート）、または磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）法で使用される物質（例えば、ガドリニウムドープしたキレート化剤（例えば、Ｇｄ−ＤＴＰＡ））が挙げられる。診断剤の他の例としては、細胞内で発現された場合に容易に検出可能なタンパク質（例えば、β−ガラクトシダーゼ、グリーン蛍光タンパク質、ルシフェラーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない）をコードするマーカー遺伝子が挙げられる。多種多様な標識（例えば、放射性核種、蛍光物質（ｆｌｕｏｒ）、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、リガンド（特に、ハプテン）など）が、使用され得る。
【０１６４】
（送達増強トランスポーターと共に有用な生物学的に活性な分子および診断分子）
送達増強トランスポーターは、診断的に使用する多種多様な生物学的に活性な薬剤および分子に結合体化され得る。
【０１６５】
（Ａ．低有機分子）
低有機分子治療剤は、本明細書中に記載されるような直鎖状ポリマー組成物に有利に連結されて、上皮組織もしくは内皮組織の１つ以上の層を横切った輸送を容易にし得るかまたは増強し得る。例えば、高度に荷電した薬剤（例えば、レボドパ（Ｌ−３，４−ジヒドロキシ−フェニルアラニン；Ｌ−ＤＯＰＡ））の送達は、本明細書中に記載されるような送達増強トランスポーターへの連結に役立ち得る。ペプトイド薬剤およびペプチド模倣薬剤はまた、企図される（例えば、Ｌａｎｇｓｔｏｎ（１９９７）ＤＤＴ  ２：２５５；Ｇｉａｎｎｉｓら、（１９９７）Ａｄｖａｎｃｅｓ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．２９：１）。また、本発明は、水溶液（例えば、血清および生理食塩水）に対して乏しい可溶性を有する低有機分子を送達するために有利である。従って、治療的効力がそれらの低い可溶性によって制限される化合物は、本発明に従ってより多くの用量で投与され得、そして細胞によるより高い取り込みレベルに起因して、非結合体化形態と比較して、結合体化形態においてモルベースでより有効であり得る。
【０１６６】
低分子の位相幾何学的表面の有意な部分は、しばしば、関与され、従って、生物学的活性に対して必要とされるので、特定の場合における結合体の低分子部分は、標的上皮組織を横切った後、生物学的活性を発揮するための低分子薬剤について、連結された送達増強トランスポーターおよびリンカー部分（存在する場合）から切断されることが必要であり得る。このような状況について、この結合体は、好ましくは、上皮組織を介して通過した後、遊離の薬物を放出するための切断可能なリンカーを含有する。
【０１６７】
図５Ｄおよび図５Ｅは、本発明の別の局面の例証であり、対応する非結合体化形態に関連して増強された透過性上皮（ｔｒａｎｓ−ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ）組織輸送速度を有する、タキサン抗癌結合体およびタキソイド抗癌結合体を含有する。この結合体は、特に、癌細胞の増殖を阻害するために有用である。タキサンおよびタキソイドは、細胞機能に有害な程度まで微小管の重合化を促進し（そして解重合を阻害し）、細胞複製を阻害し、そして最終的には細胞死をもたらすことによって、それらの抗癌作用を発揮すると考えられる。
【０１６８】
用語「タキサン」とは、パクリタキセル（図５Ｆ、Ｒ’＝アセチル、Ｒ’’＝ベンジル、登録商標「ＴＡＸＯＬ」としても知られる）、ならびに図５Ｇにおいて図示されるように、パクリタキセルのＡ環、Ｂ環、Ｃ環およびＤ環を含有する骨格コアを有する天然に存在するアナログ、合成アナログ、または生物工学アナログのことをいう。図５Ｆはまた、「ＴＡＸＯＴＥＲＥＴＭ」（Ｒ’＝Ｈ、Ｒ’’＝ＢＯＣ）の構造を示し、これは、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃにより販売されるパクリタキセルの幾分より可溶性の合成アナログである。「タキソイド」とは、図５Ｈに示されるように、パクリタキセルの基本的なＡ環、Ｂ環およびＣ環を含有するパクリタキセルの天然に存在するアナログ、合成アナログまたは生物工学アナログをいう。実質的な合成的および生物学的な情報は、Ｓｕｆｆｎｅｓｓ（１９９５）Ｔａｘｏｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐｐ．２３７−２３９、特に１２〜１４章、および引き続くパクリタキセルの文献において論評されるように、種々のタキサン化合物およびタキソイド化合物の合成および活性に関して利用可能である。さらに、宿主の細胞株は、例えば、Ｓｕｆｆｎｅｓｓの８章および１３章に記載されるような、特定の癌のタイプに対するこれらの化合物の抗癌活性を推定するために利用可能である。
【０１６９】
送達増強トランスポーターは、タキサンまたはタキソイドにおける任意の適切な連結部位を介してタキサン部分またはタキソイド部分に結合体化される。簡単には、この輸送ポリマーは、上記のような連結ストラテジーを用いて、Ｃ２’−酸素原子、Ｃ７−酸素原子を介して連結される。Ｃ７−酸素を介する輸送ポリマーの結合体化は、その位置に結合体化されるにも関わらず抗癌活性および抗腫瘍活性を有するタキサン結合体をもたらす。従って、このリンカーは、切断可能または非切断可能であり得る。Ｃ２’−酸素を介する結合体化は、抗癌活性を有意に減少させ、そのため、切断可能なリンカーが、この部位に対する結合体に関して好ましい。他の部位の連結（例えば、Ｃ１０）がまた、使用され得る。
【０１７０】
本発明のタキサン結合体およびタキソイド結合体が、タキソール（約０．２５μｇ／ｍＬ）およびタキソテール（６〜７μｇ／ｍＬ）と比較して改善された水溶性を有することが理解される。従って、大量の可溶化剤（例えば、「ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ  ＥＬ」（ポリオキシエチル化ヒマシ油）、ポリソルベート８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、「ＴＷＥＥＮ８０」としても知られる）、およびエタノール）が、必要でなく、その結果、典型的に、これらの可溶化剤に関連した副作用（例えば、アナフィラキシー、呼吸困難、高血圧、および潮紅）が、低減され得る。
【０１７１】
（Ｂ．金属）
金属は、実施例において例証されるように、本発明の送達増強トランスポーターに結合体化されたキレート剤（例えば、テキサフィリンまたはジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ））を使用して、上皮組織および内皮組織の１つ以上の層へおよび１つ以上の層を横切って、輸送され得る。これらの結合体は、画像化または処置のための金属イオンを送達するために有用である。例示的な金属イオンとしては、Ｅｕ、Ｌｕ、Ｐｒ、Ｇｄ、Ｔｃ９９ｍ、Ｇａ６７、Ｉｎ１１１、Ｙ９０、Ｃｕ６７、およびＣｏ５７が挙げられる。結合体候補物を用いる予備的な膜輸送研究は、以下の実施形態例の節において記載されるように、細胞ベースのアッセイを用いて実施され得る。例えば、ユーロピウムイオンを用いて、細胞取り込みは、時間分解蛍光測定によってモニターされ得る。細胞傷害性である金属イオンについて、取り込みは、細胞傷害性によってモニターされ得る。
【０１７２】
（Ｃ．高分子）
本発明の増強された輸送方法は、多数の高分子（例えば、タンパク質、核酸、多糖類、およびそれらのアナログが挙げられるが、これらに限定されない）について、上皮組織または内皮組織の１つ以上の層への輸送および１つ以上の層を横切った輸送を増強させるために特に適している。例示的な核酸としては、ＤＮＡおよびＲＮＡならびにそれらのアナログから形成されたオリゴヌクレオチドならびにポリヌクレオチドが挙げられ、これらは、相補的な標的（例えば、一本鎖標的または二本鎖標的に対するアンチセンス配列）へのハイブリダイゼーションのためにか、またはこの配列によってコードされる核酸転写物もしくはタンパク質を発現するために、設計された選択された配列を有する。アナログとしては、荷電した骨格アナログ、および好ましくは無電荷の骨格アナログ、例えば、ホスホネート（好ましくは、メチルホスホネート）、ホスホラミデート（Ｎ３’またはＮ５’）、チオホスフェート、無電荷のモルホリノベースのポリマー、およびタンパク質核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。このような分子は、例えば、酵素置換治療、遺伝子治療、およびアンチセンス治療のような種々の治療的レジメンにおいて使用され得る。
【０１７３】
例示の目的で、タンパク質核酸（ＰＮＡ）は、その骨格がデオキシリボース骨格と構造的に同形性であるＤＮＡのアナログである。この骨格は、核酸塩基が結合されるＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位から構成される。４つ全ての天然の核酸塩基を含有するＰＮＡは、ワトソン−クリック塩基対則に従う相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、そして塩基対認識に関して忠実なＤＮＡ模倣物である（Ｅｇｈｏｌｍら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：５６６−５６８）。ＰＮＡの骨格は、リン酸エステルでなくペプチド結合によって形成され、それをアンチセンス適用に対して十分に適応させる。この骨格が無電荷であるので、形成するＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖またはＰＮＡ／ＲＮＡ二重鎖は、通常よりも大きな熱安定性を示す。ＰＮＡは、それらがヌクレアーゼまたはプロテアーゼによって認識されないさらなる利点を有する。さらに、ＰＮＡは、標準的なｔ−Ｂｏｃ化学を用いる自動化ペプチド合成機で合成され得る。その結果、ＰＮＡは、本発明のトランスポーターポリマーに容易に連結される。
【０１７４】
上皮組織および内皮組織への輸送、ならびに上皮組織および内皮組織を横切る輸送が、本発明の方法を用いて増強され得る、アンチセンスオリゴヌクレオチドの例は、例えば、米国特許第５，５９４，１２２号に記載される。このようなオリゴヌクレオチドは、ヒト不全ウイルス（ＨＩＶ）を処置するために標的化される。アンチセンスオリゴヌクレオチドへのトランスポーターポリマーの結合体化は、例えば、非常に確立された方法に従って、スクシネートリンカーを介して、ペプチドとオリゴヌクレオチドの５’末端との間のアミド架橋を形成することによって達成され得る。ＰＮＡ結合体の使用は、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／１０５７１の実施例１１においてさらに例証される。この出願の図７は、実施例１１に詳述されるように、Ｔ細胞によってγ−インターフェロン（γ−ＩＦＮ）の分泌を阻害するためにＰＮＡ配列を含有する本発明の結合体で得られた結果を示す。示され得るように、このアンチセンスＰＮＡ結合体は、結合体が、約１０μＭを越えるレベルで存在する場合、γ−ＩＦＮの分泌をブロックするのに有効であった。対照的に、センスＰＮＡ結合体または非結合体化アンチセンスＰＮＡ単独では、阻害が観察されなかった。
【０１７５】
上皮組織または内皮組織の１つ以上の層を横切って輸送され得る別の分類の高分子は、タンパク質、および特に、酵素によって、例証される。治療的タンパク質としては、置換酵素が挙げられるが、これらに限定されない。治療的酵素としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アルグルセラーゼ（ａｌｇｌｕｃｅｒａｓｅ）（リソソームグルコセレブロシダーゼ欠損（ゴシェ病）を処置する使用のため）、α−Ｌ−イズロニダーゼ（ムコ多糖症Ｉを処置する使用のため）、α−Ｎ−アセチルグルコサミダーゼ（サンフィリポＢ症候群を処置する使用のため）、リパーゼ（膵機能不全症を処置する使用のため）、アデノシンデアミナーゼ（重篤な混合性免疫不全症候群を処置する使用のため）、およびトリオースホスフェートイソメラーゼ（トリオースホスフェートイソメラーゼ欠損に関連する神経筋機能不全を処置する使用のため）。
【０１７６】
さらに、そして本発明の重要な局面に従って、タンパク質抗原は、これらがペプチド中で分解される場合、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の細胞質ゾルの区画に送達され得る。次いで、このペプチドは、小胞体中に輸送され、ここで、これらは、発生期のＨＬＡクラスＩ分子と結合し、そして細胞表面上に提示される。このような「活性化」ＡＰＣは、クラスＩ限定抗原特異的細胞傷害性Ｔ−リンパ球（ＣＴＬ）の誘導因子として作用し得、次いで特定の抗原を提示する細胞の認識および破壊を進行させる。このプロセスを実施し得るＡＰＣとしては、特定のマクロファージ、Ｂ細胞および樹状細胞が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、タンパク質抗原は、腫瘍細胞に対して免疫応答を誘発するかまたは促進するための腫瘍抗原である。ＣＴＬの引き続く活性化を伴うＡＰＣの細胞質ゾルへの単離タンパク質または可溶性タンパク質の輸送は、例外的である。なぜなら、わずかな例外を除いて、単離タンパク質または可溶性タンパク質の注入が、ＡＰＣの活性化またはＣＴＬの誘導のいずれももたらさないからである。従って、本発明のトランスポーター増強組成物に結合体化される抗原は、インビトロまたはインビボで細胞性免疫グロブリン応答を刺激するように作用し得る。
【０１７７】
別の実施形態において、本発明は、有害な生物学的過程（例えば、微生物感染）を妨げるために細胞質ゾルへの免疫特異的な抗体または抗体フラグメントを送達するために有用である。最近の実験は、細胞内抗体が、植物細胞および哺乳動物細胞において有効な抗ウイルス剤であり得ることを示してきた（例えば、Ｔａｖｌａｄｏｒａｋｉら、（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６６：４６９；およびＳｈａｈｅｅｎら、（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：３３９２）。これらの方法は、典型的に、抗体の重鎖および軽鎖が、単一のポリペプチドとして合成される、一本鎖の可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）を使用してきた。可変性の重鎖および軽鎖は、通常、可撓性のリンカーペプチド（例えば、１５個のアミノ酸のペプチド）によって分離されて、高親和性リガンド結合部位を保持する２８ｋＤａの分子を生成する。この技術の広範な適用に対する主要な障害は、感染細胞中への取り込みの効率であった。しかし、ｓｃＦｖフラグメントへトランスポーターポリマーを連結することによって、細胞取り込みの程度は、増加され得、免疫特異的なフラグメントが結合して、重要な微生物成分（例えば、ＨＩＶ  Ｒｅｖ、ＨＩＶ逆転写酵素、およびインテグラーゼタンパク質）を無能にし得る。
【０１７８】
（Ｄ．ペプチド）
本明細書中に記載される増強された輸送方法によって送達されるペプチドとしては、エフェクターポリペプチド、レセプターフラグメントなどが挙げられるが、これらに限定されるべきでない。例としては、細胞内シグナルを媒介するタンパク質により使用されるリン酸化部位を有するペプチドが挙げられる。このようなタンパク質の例としては、プロテインキナーゼＣ、ＲＡＦ−１、ｐ２１Ｒａｓ、ＮＦ−κＢ、Ｃ−ＪＵＮ、および膜レセプター（例えば、ＩＬ−４レセプター）の細胞質テイル（ｔａｉｌ）、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、Ｖ７、ならびにＭＨＣクラスＩ抗原およびＭＨＣクラスＩＩ抗原が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７９】
送達増強トランスポーターがまたペプチドである場合、合成は、上記に記載されるように、自動化ペプチド合成機を使用してか、または融合ペプチドをコードするポリヌクレオチドが産生される組換え方法のいずれかによって合成され得る。
【実施例】
【０１８０】
（実施例）
以下の実施例は、例証するために提供されるが、本発明を限定しない。
【０１８１】
（実施例１）
（ヌードマウスの皮膚へのＤ−アルギニンのビオチン化ポリマーの浸透）
この実施例は、ポリアルギニン七量体が、濾胞ならびに濾胞間の両方で、皮膚の層へ、および皮膚の層を横切って、そして真皮内へ、結合体化ビオチンを送達し得ることを示す。
【０１８２】
（方法）
ビオチン化ペプチドを、固相技術、ならびにＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３３ペプチド合成機によって市販のＦｍｏｃアミノ酸、樹脂、および試薬（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ、およびＢａｃｈｅｍ  Ｔｏｒｒｅｎｃｅ，ＣＡ）を使用して合成した。Ｆａｓｔｍｏｃサイクルを、カップリング試薬としてＨＢＴＵ／ＨＯＢｔの代わりに、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）で使用した。ペプチドのアミノ末端へのビオチンの付加の前に、アミノカプロン酸（ａｃａ）を、結合体化し、そしてスペーサーとして作用させた。このペプチドを、１時間〜１２時間の間、９６％トリフルオロ酢酸、２％トリイソプロピルシラン、および２％フェノールを用いて樹脂から切断した。より長い反応時間は、アルギニンのポリマーからＰｄｆ保護基を完全に除去するために必要であった。その後、ペプチドを、樹脂から濾過して、ジエチルエーテルを用いて沈殿させ、逆相カラムＨＰＬＣ（Ａｌｌｔｅｃｈ  Ａｌｔｉｍａ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ．）を使用して精製し、そしてエレクトロスプレー質量分析法またはマトリクス支援レーザー脱離質量分析法のいずれか（Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を使用して特徴付けた。
【０１８３】
リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に溶解した、アミノカプロン酸スペーサー（ｂｉｏ  ｒ７）を用いてアミノ末端に共有結合的に連結したビオチンを有する、変動させた濃度（１ｍＭ〜１０μＭ）のＤ−アルギニンの七量体を、麻酔したヌードマウスの背中に塗布した。サンプル（１００μｌ）を、賦形剤なしで液体として塗布し、ＶａｓｅｌｉｎｅＴＭ障壁による分散を防ぎ、そして１５分間浸透させた。この期間の最後に、この動物を、屠殺して、皮膚の関連切片を、切除し、封入剤（ＯＣＴ）中に包埋し、そして凍結した。凍結切片（５ミクロン）を、低温槽を用いて切除し、スライド上に収集し、そして蛍光標識化ストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で染色した。このスライドを、４℃で１０分間アセトン中で固定し、風乾し、５分間ＰＢＳ中に浸し、５分間正常ヤギ血清でブロックし、そして５分間ＰＢＳで洗浄した。この切片を、３０μｇ／ｍｌの蛍光標識化ストレプトアビジンを用いた３０分間のインキュベーションにより染色し、ＰＢＳで洗浄し、２分間ヨウ化プロピジウム（１μｇ／ｍｌ）で対比染色し、そしてこの切片を、ＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄＴＭ封入剤で封入した。スライドを、蛍光顕微鏡によって分析した。対応する研究を、フルオレセイン−ストレプトアビジンではなくストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼを用いて実施した。ビオチン化ペプチドを、西洋ワサビペルオキシダーゼ基質ジアミノベンザジンを用いた切片の処理、および光学顕微鏡を用いた可視化によって可視化した。
【０１８４】
（結果）
ビオチン化アルギニン七量体を、表皮へおよび表皮を横切って、ならびに真皮へ、通過させた。視野の全ての細胞の細胞質ゾルおよび核は、蛍光性であり、実質的に、切片中のヌードマウス皮膚の全ての細胞への浸透を示す。染色パターンは、濾胞および濾胞間の両方であり、予期しない輸送に一致した。さらに、ポジティブな細胞は、乳頭真皮および細網真皮で明らかであった。対照的に、染色は、ビオチン単独、またはリン酸緩衝化生理食塩水単独で処理したマウスにおいて明らかでなかった。
【０１８５】
（実施例２）
（正常Ｂａｌｂ／Ｃマウスの皮膚へのＤ−アルギニンのビオチン化ポリマーの浸透）
ＰＢＳ中に溶解した、アミノカプロン酸スペーサー（ｂｉｏ  ｒ７）を用いてアミノ末端に共有結合的に連結したビオチンを有する、変動させた濃度（１ｍＭ〜１００μＭ）のＤ−アルギニンの七量体を、麻酔したＢａｌｂ／Ｃマウスの鼡径部の皮膚に塗布した。サンプル（１００μｌ）を、賦形剤中の液体として塗布し、ＶａｓｅｌｉｎｅＴＭ障壁による分散を防ぎ、そして３０分間浸透させた。この期間の最後に、この動物を、屠殺して、皮膚の関連切片を、切除し、封入剤（ＯＣＴ）中に包埋し、そして凍結した。凍結切片を、実施例１に記載されるように、低温槽を用いて切除し、スライド上に収集し、そして蛍光標識化ストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で染色した。スライドを、蛍光顕微鏡によって分析した。
【０１８６】
（結果）
ヌードマウス由来の皮膚と同様に、ビオチン化アルギニン七量体を、表皮へおよび表皮を横切って、ならびに真皮へ、通過させた。視野の全ての細胞の細胞質ゾルおよび核は、蛍光性であり、実質的に、切片中のヌードマウス皮膚の全ての細胞への浸透を示す。染色パターンは、濾胞および濾胞間の両方であり、予期しない輸送に一致した。さらに、ポジティブな細胞は、乳頭真皮および細網真皮で明らかであった。対照的に、染色は、ビオチン単独、またはリン酸緩衝化生理食塩水単独で処理したマウスにおいて明らかでなかった。
【０１８７】
（実施例３）
（ヌードマウス上へ移植した正常なヒト皮膚へのＤ−アルギニンのビオチン化ポリマーの浸透）
ＰＢＳ中に溶解した、アミノカプロン酸スペーサー（ｂｉｏ  ｒ７）を用いてアミノ末端に共有結合的に連結したビオチンを有する、変動させた濃度（１ｍＭ〜１００μＭ）のＤ−アルギニンの七量体を、ＳＣＩＤマウスの背中上のヒト包皮移植片に塗布した（例えば、Ｄｅｎｇら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１３８８−１３９１；Ｋｈａｖａｒｉら（１９９７）Ａｄｖ．Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．１５：２７−３５；ＣｈｏａｔｅおよびＫｈａｖａｒｉ（１９９７）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：８９５−９０１を参照のこと）。サンプル（１００μｌ）を、賦形剤中の液体として塗布し、ＶａｓｅｌｉｎｅＴＭ障壁による分散を防ぎ、そして１５分間浸透させた。この期間の最後に、動物を、屠殺して、皮膚の関連切片を、切除し、封入剤（ＯＣＴ）中に包埋し、そして凍結した。凍結切片を、実施例１に記載されるように、低温槽を用いて切除し、スライド上に収集し、そして蛍光標識化ストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で染色した。スライドを、蛍光顕微鏡によって分析した。
【０１８８】
（結果）
ヌードマウスおよび正常マウス由来の皮膚と同様に、ビオチン化アルギニン七量体を、ヒトの皮膚の、表皮へおよび表皮を横切って、ならびに真皮へ、通過させた。視野の全ての細胞の細胞質ゾルおよび核は、蛍光性であり、表皮および真皮へ、ならびに表皮および真皮を通した浸透を示す。強力な染色が、２０×および４０×の倍率で観察された。染色パターンは、濾胞および濾胞間の両方であり、予期しない輸送に一致した。さらに、ポジティブな細胞は、乳頭真皮および細網真皮で明らかであった。対照的に、染色は、ビオチン単独、またはリン酸緩衝化生理食塩水単独で処理したマウスにおいて明らかでなく、そして非常にわずかな染色が、低倍率または高倍率のいずれかで、ビオチン化アルギニン五量体結合体とともに観察された。
【０１８９】
（実施例４）
（プラスチックラップまたはローション賦形剤を用いるヌードマウスの皮膚へのＤ−アルギニンのビオチン化ポリマーの増加された浸透）
アミノカプロン酸スペーサー（ｂｉｏ  ｒ７）を用いてアミノ末端に共有結合的に連結したビオチンを有する、変動させた濃度（１ｍＭ〜１００μＭ）のＤ−アルギニンの七量体を、ＰＢＳ中に溶解し、そして等容量のＬｕｂｒｉｄｅｒｍＴＭと混合した。次いで、このローション混合物を、ヌードマウスの背中に塗布し、そして３０分間、６０分間、および１２０分間浸透させた。代替的に、サンプル（１００μｌ）を、賦形剤なしの液体として塗布し、ＶａｓｅｌｉｎｅＴＭでシールされたサンプルにわたってプラスチックラップを覆うことによって蒸発するのを防いだ。このサンプルを、３０分間、６０分間、および１２０分間浸透させた。この期間の最後に、動物を、屠殺して、皮膚の関連切片を、切除し、封入剤（ＯＣＴ）中に包埋し、そして凍結した。凍結切片を、実施例１に記載されるように、低温槽を用いて切除し、スライド上に収集し、そして蛍光標識化ストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で染色した。スライドを、蛍光顕微鏡によって分析した。
【０１９０】
（結果）
ローションおよびプラスチックラップの両方とも、賦形剤なしでの染色と比較して増加した取り込みをもたらした。ローションは、結合体の増強された取り込みにおいてプラスチックラップよりもより効果的であった。ビオチン化アルギニン五量体を、表皮細胞層の細胞質ゾルおよび核の両方、濾胞および濾胞間の両方に到達する、いくつかの皮膚層へおよび皮膚層を横切って、通過させた。さらに、ポジティブな細胞は、乳頭真皮および細網真皮で明らかであった。
【０１９１】
（実施例５）
（ヌードマウスの皮膚へのＤ−アルギニンのビオチン化五量体、ビオチン化七量体、およびビオチン化九量体へ結合体化されたシクロスポリンの浸透）
（方法）
（Ａ．送達増強トランスポーターへのシクロスポリンの連結）
（１．α−クロロアセチルシクロスポリンＡ誘導体の調製）
α−アセチルシクロスポリンＡ誘導体を、図１に示されるように調製した。シクロスポリンＡ（１５２．７ｍｇ、１２７μｍｏｌ）およびクロロ酢酸無水物（２２１．７ｍｇ；１３００μｍｏｌ）を、Ｎ２雰囲気下乾燥フラスコ中に配置した。ピリジン（１．０ｍＬ）を、添加し、そしてこの溶液を５０℃（油浴）まで加熱した。１６時間後、この反応を、室温まで冷却して、水（４．０ｍＬ）でクエンチした。得られた懸濁液を、ジエチルエーテル（Σ１５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を、ＭｇＳＯ４で乾燥した。減圧下での溶媒の濾過およびエバポレーションは、黄色オイルを与え、これを、シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィー（溶出剤：ＥｔＯＡｃ／ヘキサン：４０％〜８０％）によって精製し、１３６ｍｇ（１０６．４μｍｏｌ、８３％）の所望の産物を得た。
【０１９２】
（２．トランスポーター分子へのカップリング）
システイン含有ペプチドのα−クロロアセチルシクロスポリンＡ誘導体へのカップリングについての一般的手順を図２に示す。
【０１９３】
（ａ．標識ペプチド）
シクロスポリンＡ誘導体および標識ペプチド（１当量）を、Ｎ２雰囲気下でＤＭＦに溶解した（約１０ｍｍｏｌのシクロスポリンＡ誘導体／１ｍＬ  ＤＭＦ）。ジイソプロピルエチルアミン（１０当量）を添加し、そして室温での攪拌を、全ての出発物質が消費されるまで（通常１６時間後）続けた（図３）。溶媒を真空で除去し、そして粗製反応生成物を水に溶解し、そして逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）（溶離液：水／ＭｅＣＮ＊ＴＦＡ）により精製した。生成物を以下の収率で得た
【０１９４】
【化１３】
2004530657.tif 000012
（ｂ．非標識ペプチド）
ペプチド（３４．７ｍｇ、１５．３μｍｏｌ）およびシクロスポリンＡ誘導体（１９．６ｍｇ、１５．３μｍｏｌ）を、Ｎ２雰囲気下でＤＭＦ（１．０ｍＬ）に溶解した（図４）。ジイソプロピルエチルアミン（１９．７ｍｇ、１５３μｍｏｌ）を添加し、そして室温での攪拌を続けた。１２時間後、溶媒を真空で除去した。粗製物質を水に溶解し、そしてＲＰ−ＨＰＬＣ（溶離液：水／ＭｅＣＮ＊ＴＦＡ）で精製し、純粋な生成物（２４．１ｍｇ、６．８ｍｍｏｌ、４４％）を得た。
【０１９５】
（Ｂ．皮膚を横切る輸送の分析）
ＰＢＳに溶解した種々の濃度（１ｍＭ〜１００μＭ）の、Ｄ−アルギニンのビオチン化した五量体、七量体または九量体（ｂｉｏ  ｒ５、ｂｉｏ  ｒ７、またはｂｉｏ  ｒ９）のいずれかに結合体化されたシクロスポリンを、ヌードマウスの背部に塗布した。サンプル（１００μｌ）を、賦形剤中の液体として塗布し、そしてＶａｓｅｌｉｎｅＴＭバリアにより分散を防ぎ、そして３０分、６０分および１２０分間浸透させた。この期間の終わりに、動物を屠殺し、皮膚の関連切片を切除し、封入剤（ＯＣＴ）中に包埋し、そして凍結した。凍結された切片を、クリオスタットを使用して切断し、スライド上に集め、そして蛍光標識ストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で実施例１に記載のように染色した。スライドを蛍光顕微鏡により分析した。
【０１９６】
（結果）
Ｄ−アルギニンのビオチン化七量体および九量体とのシクロスポリンの結合体は、ヌードマウスの皮膚の表皮に有効に進入し、そして表皮を横切って真皮中に進入した。対照的に、アルギニンの五量体とシクロスポリンとの間の結合体を使用すると、ほとんど取り込みは見られず、ＰＢＳコントロールでは染色は全く見られなかった。視野中の全ての細胞の細胞質ゾルおよび核は、蛍光性であり、表皮および真皮への浸透および表皮および真皮を通過する浸透を示していた。染色パターンは、小胞および小胞間の両方の予期しない輸送と一致していた。さらに、ポジティブな細胞は、乳頭真皮および網状真皮において明白であった。これらの結果は、十分なグアニジニル基が送達増強トランスポーターに含まれる場合にのみ顕著な取り込みを実証する。
【０１９７】
（実施例６）
（Ｄ−アルギニン七量体がヒト皮膚に浸透し得ることの実証）
ヒト皮膚とマウス皮膚とは、多数の点で有意に異なり、ヒト表皮は、かなり厚い。Ｄ−アルギニン七量体／シクロスポリンＡ（ｒ７  ＣｓＡ）結合体もまたヒト皮膚に浸透し得るか否かを決定するために、ビオチンｒ７  ＣｓＡを、ＳＣＩＤマウスの背部上に移植されたヒト全厚皮膚に塗布した。マウス皮膚のように、結合体シクロスポリンＡは、ヒト表皮および真皮に浸透した。蛍光は、ビオチン化ペプチド単独に曝露された組織における細胞の細胞質ゾルおよび核の両方において観察されたが、ビオチンｒ７  ＣｓＡで染色された切片では、蛍光の大部分は細胞質ゾルであり、シクロスポリンＡの公知の細胞質標的に対するｒ７  ＣｓＡの結合と一致した。
【０１９８】
（実施例７）
（シクロスポリンＡ−トランスポーター結合体が真皮のＴ細胞に進入することの実証）
（方法）
放出可能なＲ７−ＣｓＡ結合体によるＩＬ−２分泌の阻害。Ｊｕｒｋａｔ細胞（５×１０４）を、種々の濃度の放出可能でないＲ７−ＣｓＡ結合体または放出可能なＲ７−ＣｓＡ結合体またはＣｓＡと共に３７℃でインキュベートして、ＰＭＡおよびイオノマイシンでの刺激の前にＣｓＡの活性形態を放出させた。続いて、１０ｎｇ／ｍｇのＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および１μＭのイオノマイシン（ＣＡｌＢｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を添加することによりＴ細胞を刺激して、ＩＬ−２を産生させた。培養物を、３７℃で一晩インキュベートし、そして上清を収集し、そして蛍光ＥＬＩＳＡを使用してＩＬ−２を測定した。手短には、プレートを４μｇ／ｍｌの抗ヒトＩＬ−２抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）でコーティングし、１０％ＦＢＳを含むＰＢＳで１時間室温にてブロックし、洗浄し、そして上清を添加し、そして１時間インキュベートした。培地を除去し、そしてビオチン化抗ヒトＩＬ−２（１．６μｇ／ｍｌ）を、１時間で添加した、このプレートを洗浄し、次いでユーロピウム標識ストレプトアビジン（０．０４ｎｇ／ｍｌ）を１時間で添加した。もう１度洗浄した後、増強溶液を添加し、そして得られる蛍光を、Ｗａｌｌａｃプレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して測定した。
【０１９９】
（結果）
ビオチン化Ｄ−アルギニン七量体−シクロスポリン（ｒ７  ＣｓＡ）結合体がインビボで炎症性皮膚内の浸潤性Ｔ細胞に到達するか否かを決定するために、ビオチンｒ７  ＣｓＡを、実験的に誘導された接触皮膚炎を有するマウスの背部上の炎症部位に塗布した。炎症性皮膚を、ローダミン標識ヤギ抗マウスＣＤ３で染色して、Ｔ細胞を局在化し、そしてフルオレセイン標識ストレプトアビジンで染色してビオチンｒ７  ＣｓＡを局在化した。ビオチンｒ７  ＣｓＡは、種々の他の細胞（おそらく他の炎症性細胞および内在する繊維芽細胞に相当する）に加えて、組織中の全てのＣＤ３［＋］Ｔ細胞において見出された。これらのデータは、ビオチンｒ７  ＣｓＡが、炎症した皮膚に浸透して重要な標的Ｔリンパ球に到達するということを示す。
【０２００】
（実施例８）
（アルギニンの短いオリゴマーおよびＣｓＡの放出可能な結合体の合成、インビトロでの活性およびインビボでの活性）
シクロスポリンＡの２級アルコールの修飾は、その生物学的活性の有意な損失を生じる。例えば、Ｒ．Ｅ．Ｈａｎｄｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２６，５４４−７（１９８４）を参照のこと。結果として、細胞への輸送後のその結合体からの遊離シクロスポリンＡの放出を確実にするために、シクロスポリンＡを、図１０に示すように、ｐＨ感受性リンカーを介してオリゴアルギニントランスポーターに結合した。得られた結合体は、酸性ｐＨでは安定であるが、ｐＨ＞７では、シクロスポリンＡに隣接するカルボニルへの遊離アミンの付加を含む分子内環化を受け（図６）、これは、修飾されていないシクロスポリンＡの放出をもたらす。
【０２０１】
放出可能な結合体の設計における別の修飾は、Ｌ−アルギニン（Ｒ）の使用であり、トランスポーター中にＤ−アルギニン（ｒ）は使用しなかった。この結合体の最大の安定性、従って蛍光によるその位置の決定における精度を確実にするために、オリゴ−Ｄ−アルギニントランスポーターを組織学的実験に用いた一方で、Ｌ−アルギニンのオリゴマーを、その生物学的半減期を最小にするために放出可能な結合体の設計に組み込んだ。その設計と一致して、得られる放出可能な結合体は、酸性ｐＨでは安定であるが、血清の非存在下での生理学的ｐＨでは不安定であることが示された。ｐＨ７．４のＰＢＳ中のこの放出可能なシクロスポリンＡ結合体の半減期は、９０分であった。
【０２０２】
（結果）
シクロスポリンＡの放出可能なグアニジノ−七量体結合体は、インビトロでＰＭＡおよびイオノマイシンで刺激されたヒトＴ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ）によるＩＬ−２分泌を阻害することにより、生物学的に活性であることが示された。Ｒ．Ｗｉｓｋｏｃｉｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３４，１５９９−６０３（１９８５）を参照のこと。この結合体は、ＰＭＡ／イオノマイシンの添加の１２時間前に加えられ、そして用量依存性阻害が、放出可能なＲ７  ＣｓＡ結合体により観察された。ｔ−Ｂｏｃ保護基（これは、環化および結果としての活性薬物の放出を防ぐ）を保持していることにより放出可能な結合体と異なる、放出可能でないアナログ（図６）では、この阻害は観察されなかった。放出可能なＲ７シクロスポリン結合体のＥＣ５０は、アルコールに溶解されて放出可能な結合体と同時に加えられたＣｓＡより約２倍高かった。
【０２０３】
放出可能なＲ７  ＣｓＡ結合体を、接触皮膚炎のマウスモデルを使用して機能的活性についてインビボでアッセイした。１％の放出可能なＲ７  ＣＳＡ結合体での処理は、耳の炎症において７３．９％±４．０の減少を生じた（図７）。炎症の減少は、未処置の耳では全く見られず、処置された耳において見られた効果が、局所的でありかつ全身的ではないということを示していた。０．１％および０．０１％のＲ７−ＣｓＡで処置されたマウスの耳においてより低い阻害が観察され（それぞれ、６４．８％±４．０および４０．９％±３．３）、この効果が力価測定が可能であることを実証した。フッ素化コルチコステロイドポジティブコントロールでの処置は、耳腫大における減少（３４．１％±６．３）を生じたが、０．１％の放出可能なＲ７  ＣｓＡについて観察された減少より有意に低かった（図７）。未修飾のシクロスポリンＡ、ビヒクル単独、Ｒ７、または放出可能でないＲ７  ＣｓＡで処置されたマウスのいずれにおいても炎症の減少は観察されなかった。
【０２０４】
（実施例９）
（銅−ＤＴＰＡ−ｒ７複合体およびガドリニウム−ＤＴＰＡ−ｒ７複合体のヌードマウスの皮膚への浸透）
（方法）
１．金属錯体の調製
工程１−銅−ジエチレントリアミン五酢酸錯体（Ｃｕ−ＤＴＰＡ）の調製
炭酸銅（１０ｍｍｏｌ）およびジエチレントリアミン五酢酸（１０ｍｍｏｌ）を、水（１５０ｍＬ）に溶解した（図８）。１８時間後、この溶液を、遠心分離して固体を除去した。この青色溶液を、デカントし、そして凍結乾燥して青色粉末を得た（収率＞９０％）。
【０２０５】
工程２−ＤＴＰＡトランスポーターの調製
Ｃｕ−ＤＴＰＡを、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＡＢＩ  ４３３Ａ）を使用してアミノカプロン酸スペーサーを介してトランスポーターに連結した（図９）。この材料を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（４０ｍＬ）、トリイソプロピルシラン（１００μＬ）およびフェノール（１００μＬ）で１８時間処理することにより樹脂から切断した。この樹脂を、濾別し、そしてこのペプチドをジエチルエーテル（８０ｍＬ）を加えることにより沈殿させた。この溶液を遠心分離し、そして溶媒をデカントして除いた。粗製固体を、水／アセトニトリル勾配を使用する逆相ＨＰＬＣにより精製した。ＴＦＡでの処理は、Ｃｕ２＋イオンの損失を生じ、これを再挿入する必要があった。
【０２０６】
ＤＴＰＡ−ａｃａ−Ｒ７−ＣＯ２Ｈ（１０ｍｇ，０．００６３ｍｍｏｌ）および硫酸銅（１．６ｍｇ，０．００６３ｍｍｏｌ）を、水（１ｍＬ）に溶解した。１８時間穏やかに攪拌させ、そして凍結乾燥して生成物を白色粉末（１０ｍｇ）として得た。
【０２０７】
（２．皮膚を横切る輸送の分析）
金属ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）錯体を、等モル量の金属塩とＤＴＰＡとを水中で１８時間混合することにより形成した。この時間の終わりに、この溶液を遠心分離し、凍結し、そして凍結乾燥した。乾燥した粉末を質量分析法で特徴付けし、そして固相ペプチド合成に使用した。この金属−ＤＴＰＡ錯体を、ペプチド合成に使用される固相樹脂にまだ結合されているＤ−アルギニンまたはＬ−アルギニンのポリマーに結合させた。この金属−ＤＴＰＡ錯体を、アミノカプロン酸スペーサーを使用して結合した。トリフルオロ酢酸中のペプチド−ＤＴＰＡ−金属複合体の切断が金属を放出したことを除いて、固相ペプチド合成技術は、実施例１に記載されている。ＨＰＬＣ精製およびペプチド−ＤＴＰＡ複合体の凍結乾燥後に金属を置換する。この金属の置換には、ペプチド−アミノカプロン酸−ＤＴＰＡ複合体と共に等モル量の金属塩をインキュベーションすること、およびその後の凍結乾燥が含まれる。
【０２０８】
種々の濃度（１μＭ〜１ｍＭ）のＣｕ−ＤＴＰＡ−ａｃａ−ｒ７複合体を、ヌードマウスの腹部領域に１５分、３０分および４５分間塗布した。コントロールとして、等モル量のＣｕ−ＤＴＰＡ錯体をこの腹部領域にスポッティングした。このインキュベーション時間の終わりに、これらのサンプルを単純に拭き取り、そしてＣｕ−ＤＴＰＡ−ａｃａ−ｒ７複合体をスポッティングした皮膚では強い青色が明らかであり、そしてＣｕ−ＤＴＰＡ単独をスポッティングした皮膚では強い青色が見られなかった。１ｍＭの塗布の場合、３日間青色の色素が見られ、時間と共に減少したが、この期間の間ずっと明白であった。
【０２０９】
種々の濃度（１μＭ〜１ｍＭ）のＧｄ−ＤＴＰＡ−ａｃａ−ｒ７複合体を、ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾静脈中に１００μｌで注射する。Ｇｄの分布は、磁気共鳴画像化を使用して実時間で観察される。この色素の分布は、血流全体で明らかであり、肝臓、脾臓、腎臓および心臓に入る。ウサギの頸動脈に注射される場合、この色素は、血液脳関門を横切って見られる。
【０２１０】
（実施例１０）
（Ｄ−アルギニンのビオチン化五量体、七量体、および九量体に結合体化されたヒドロコルチゾンの、ヌードマウスの皮膚への浸透）
（方法）
（Ａ．送達増強トランスポーターへのヒドロコルチゾンの連結）
（工程１−無水クロロ酢酸を用いたヒドロコルチゾンのアシル化）
ヒドロコルチゾン（２００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）および無水クロロ酢酸（１１３ｍｇ、０，６６ｍｍｏｌ）のピリジン（５ｍＬ）溶液を、室温で２時間攪拌した（図１０）。溶媒を留去し、そして粗生成物を、溶離液として５０％ヘキサン／酢酸エチルを使用してシリカでクロマトグラフした。白色固体として生成物を単離した（１３９ｍｇ、５８％）。
【０２１１】
（工程２−トランスポーターへの連結）
ヒドロコルチゾンのクロロ酢酸エステル（０．０１３７ｍｍｏｌ）、システイン残基を含むトランスポーター（０．０１３７）、およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（０．０２７４ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１ｍＬ）溶液を、１８時間室温で撹拌した（図１１）。この物質を水／アセトニトリル勾配を用いて、逆相ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥して白色粉末を得た。
【０２１２】
ｒ５結合体−１２ｍｇ獲得（２９％単離収率）
ｒ７結合体−２２ｍｇ獲得（５５％単離収率）
Ｒ７結合体−１３ｍｇ獲得（３３％単離収率）
（Ｂ．皮膚を横断する輸送の分析）
ＰＢＳに溶解された様々な濃度（１ｍＭ〜１００μＭ）の、Ｄ−アルギニンのビオチン化五量体、七量体、または九量体（ｂｉｏ  ｒ５、ｂｉｏ  ｒ７、またはｂｉｏ  ｒ９）のいずれかに結合体化したヒドロコルチゾンを、ヌードマウスの背中に塗布した。サンプル（１００μｌ）を、賦形剤内の液体として塗布し、そして、ＶａｓｅｌｉｎｅＴＭバリアによって分散することを妨げ、３０分、６０分、および１２０分間浸透させた。この期間の終わりに、動物を屠殺し、皮膚の関連切片を切除し、封入剤（ＯＣＴ）で包埋し、凍結させた。凍結切片を、クリオスタットを用いて切断し、スライド上に収集し、そして、実施例１に記載されるように、蛍光標識したストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で染色した。スライドを、蛍光顕微鏡によって分析した。
【０２１３】
（結果）
Ｄ−アルギニンのビオチン化七量体とヒドロコルチゾンとの結合体は、ヌードマウスの皮膚の表皮の中へおよび表皮を横切って、そして、皮膚の真皮の中へ効率良く入った。対照的に、アルギニンの五量体とヒドロコルジゾンとの間の結合体では、ほとんど取り込みが見られず、そして、ＰＢＳコントロールでは、全く染色が見られなかった。視野における全ての細胞の細胞質および核は蛍光性であり、表皮および真皮中に浸透し、そして、表皮および真皮を通ることを示した。この染色パターンは、小胞および小胞間の両方であった未予知の輸送と一致していた。さらに、陽性細胞は、乳頭真皮および網状真皮において明らかであった。これらの結果は、十分なグアニジル基が、送達増強トランスポーターに含まれる場合のみ、目立った取り込みを示す。
【０２１４】
（実施例１１）
（Ｄ−アルギニンのビオチン化五量体、七量体、および九量体に結合体化したタキソールのヌードマウスの皮膚への浸透）
（方法）
（１．Ｃ−２’活性化タキソール誘導体のビオチン標識ペプチドへの結合体化）
（Ｃ−２’誘導体の合成）
タキソール（４８．７ｍｇ、５７．１μｍｏｌ）を、Ｎ２雰囲気下で、ＣＨ２Ｃｌ２（３．０ｍＬ）中に溶解した。溶液を０℃に冷却した。ベンジル−（ｐ−ヒドロキシベンゾエート）のクロロホルメート（２００ｍｍｏｌ（２．０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中）、ベンジル−（ｐ−ヒドロキシベンゾエート）およびジホスゲンから新しく調製した）のストック溶液を、０℃で添加し、そして、その温度での撹拌を５時間続け、その後、溶液を室温まで温めた（図１２）。撹拌をさらに１０時間続けた。溶媒を真空中で除去し、そして、粗物質を、シリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーによって精製し（溶離液：ＥｔＯＡｃ／ヘキサン３０％〜７０％）、所望のタキソールＣ−２’炭酸塩を得た（３６．３ｍｇ、３２．８μｍｏｌ、５７．４％）。
【０２１５】
（ビオチン標識ペプチドへのカップリング）
ビオチン化標識ペプチドへのカップリング手順を図１３に示す。タキソール誘導体およびビオチン標識ペプチド（１．２当量）を、Ｎ２雰囲気下で、ＤＭＦ中で溶解した（約１０μｍｏｌ／ｍＬ  ＤＭＦ）。ジイソプロピルエチレンアミン（ＤＭＦ中１．２当量）およびＤＭＡＰ（ＤＭＦ中０．３当量）のストック溶液を添加し、そして、全出発物質が消費されるまで室温での撹拌を続けた。１６時間後、溶媒を真空下で除去した。粗反応物混合物を水に溶解し、そして、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し（溶離液：水／ＭｅＣＮ＊ＴＦＡ）、示される収率の結合体を生成した：
Ｂ−ａｃａ−ｒ５−Ｋ−タキソール：３．６ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ、２０％。
【０２１６】
Ｂ−ａｃａ−ｒ７−Ｋ−タキソール：９．８ｍｇ、３．０１ｍｍｏｌ、４４％。
【０２１７】
Ｂ−ａｃａ−ｒ９−Ｋ−タキソール：１９．４ｍｇ、５．１ｍｍｏｌ、６７％。
【０２１８】
（未標識Ｃ−２’カルバメート：）
タキソール誘導体（１２．４ｍｇ、１１．２μｍｏｌ）および未標識ペプチド（２７．１ｍｇ、１３．４μｍｏｌ）を、Ｎ２雰囲気下で、ＤＭＦ（１．５ｍＬ）に溶解した（図１４）。ジイソプロピルエチレンアミン（１．７ｍｇ、１３．４μｍｏｌ）をＤＭＦ中にストック溶液として添加して、次いで、ＤＭＦ中にストック溶液としてＤＭＡＰ（０．６８ｍｇ、５．６μｍｏｌ）を添加した。室温での撹拌を、全ての出発物質が消費されるまで続けた。１６時間後、溶媒を真空下で除去した。粗物質を水中に溶解し、そして、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し（溶離液：水／ＭｅＣＮ＊ＴＦＡ）、所望の生成物を得た（１６．５ｍｇ、５．９μｍｏｌ、５３％）。
【０２１９】
（他のＣ−２’結合体）
タキソール誘導体（８．７ｍｇ、７．８５μｍｏｌ）をＥｔＯＡｃ（２．０ｍＬ）に溶解した。Ｐｄ／Ｃ（１０％、４．０ｍｇ）を添加し、反応フラスコをＨ２で５回パージした（図１５Ａ）。水素雰囲気下で撹拌を７時間続けた。Ｐｄ／Ｃをろ過し、そして、溶媒を真空下で除去した。この方法で獲得された粗物質（６．７ｍｇ、６．５８μｍｏｌ、８４％）は、純粋であって、次の工程でさらなる精製なしで使用され得た。
【０２２０】
遊離酸タキソール誘導体（１８．０ｍｇ、１７．７μｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２．０ｍＬ）に溶解した。ジシクロヘキシルカルボジイミド（４．３ｍｇ、２１．３μｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（０．１ｍＬ）中にストック溶液として添加した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２．０ｍｇ、１７．７μｍｏｌ）をＤＭＦ（０．１ｍＬ）にストック溶液として添加した（図１５Ｂ）。室温で撹拌することを１４時間続けた。この溶媒を真空下で除去し、そして得られた粗物質をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーによって精製し（溶離液：ＥｔＯＡｃ／ヘキサン４０％〜８０％）、所望の生成物を得た（１３．６ｍｇ、１２．２μｍｏｌ、６９％）。
【０２２１】
活性化タキソール誘導体（１４．０ｍｇ、１２．６μｍｏｌ）およびペプチド（３０．６ｍｇ、１５．１μｍｏｌ）を、Ｎ２雰囲気下で、ＤＭＦ（３．０ｍＬ）に溶解した（図１５Ｃ）。ＤＭＦ（０．１ｍＬ）中にストック溶液として、ジイソプロピルエチレンアミン（１．９４ｍｇ、１５．１μｍｏｌ）を添加して、次いで、０．１ｍＬのＤＭＦ中にストック溶液としてＤＭＡＰ（０．７６ｍｇ、６．３μｍｏｌ）を添加した。室温での撹拌を、全ての出発物質が消費されるまで続けた。２０時間後、溶媒を真空下で除去した。粗物質を水に溶解し、そして、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し（溶離液：水／ＭｅＣＮ＊ＴＦＡ）、１：６の比率（それぞれ、カーボネート対カルバメート）で２種類の示されるタキソール結合体を生成した。
【０２２２】
（２．皮膚を横断する輸送の分析）
ＰＢＳに溶解された様々な濃度（１ｍＭ〜１００μＭ）の、Ｄ−アルギニンのビオチン化五量体、七量体、または九量体（ｂｉｏ  ｒ５、ｂｉｏ  ｒ７、またはｂｉｏ  ｒ９）のいずれかに結合体化したタキソールを、ヌードマウスの背中に適用した。サンプル（１００μｌ）を、賦形剤内の液体として適用し、そして、ＶａｓｅｌｉｎｅＴＭ障壁によって分散することを妨げ、３０分、６０分、および１２０分間浸透させた。この期間の終わりに、動物を屠殺し、皮膚の関連切片を切除し、封入剤（ＯＣＴ）で包埋し、凍結させた。凍結切片を、クリオスタットを用いて切り出し、スライド上に収集し、そして、実施例１に記載されるように、蛍光標識したストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で染色した。スライドを、蛍光顕微鏡によって分析した。
【０２２３】
（結果）
Ｄ−アルギニンのビオチン化七量体および九量体とタキソールとの結合体は、ヌードマウスの皮膚の表皮の中へおよび皮膚の表皮を横断して真皮の中へ効率的に進入した。対照的に、アルギニンの五量体とタキソールとの間での結合体では、ほとんど取り込みが見られず、そして、ＰＢＳコントロールでは、全く染色が見られなかった。視野における全ての細胞の細胞質および核が蛍光性であり、表皮および真皮中への浸透、および表皮および真皮の通過を示す。この染色パターンは、小胞および小胞間の両方の予期しない輸送と一致していた。さらに、陽性細胞は、乳頭状および網状真皮において明らかであった。これらの結果は、十分なグアニジル基が、送達増強トランスポーターに含まれる場合のみ、目立った取り込みを示す。
【０２２４】
（実施例１２）
（タキソールおよび送達増強トランスポーターのｐＨ放出可能なリンカーとの結合体）
この実施例は、生理学的ｐＨに曝される際、送達増強トランスポーターから薬物を放出するリンカーによって、薬物に連結された送達増強トランスポーターを有するプロドラッグを合成するための一般的なストラテジーの使用を実証する。一般的には、薬物上の適切な部位は、α−クロロアセチル残基を有するように誘導体化される。次に、塩素が、保護されていないアミンを保有するシステイン残基のチオールと置換される。このスキームを、図１６に示す。
【０２２５】
（方法）
（タキソール−２’−クロロアセチルの合成）
タキソール（８９．５ｍｇ、１０４．９μｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（３．５ｍＬ）に溶解した。Ｎ２雰囲気下で、溶液を０℃以下に冷却した。無水α−クロロ酢酸（１９．７ｍｇ、１１５．４μｍｏｌ）を添加し、ＤＩＥＡ（１４．８ｍｇ、１１５．４μｍｏｌ）を続いて添加した。溶液を室温に昇温させた。薄層クロマトグラフィー（ｔｌｃ）分析が、出発物質の完全な消費を示した後、溶媒を真空下で除去し、そして、粗物質をシリカゲルでフラッシュクロマトグラフィーによって精製し（溶離液：ＥｔＯＡＣ／Ｈｅｘ２０％〜５０％）、所望の物質を得た（９９．８ｍｇ、定量的）（図１７）。
【０２２６】
【化１４】
2004530657.tif 000013
（タキソールの送達増強トランスポーターへの連結）
ペプチド（４７．６ｍｇ、２２．４μｍｏｌ）を、Ｎ２雰囲気下でＤＭＦ（１．０ｍＬ）に溶解した。ＤＩＥＡ（２．８ｍｇ、２２．４μｍｏｌ）を添加した。ＤＭＦ（１．０ｍＬ）中のタキソール−２’−クロロ酢酸（２０．８ｍｇ、２２．４μｍｏｌ）の溶液を添加した。室温での撹拌を６時間続けた。０．１％ＴＦＡ（１．０ｍＬ）を含む水を添加し、サンプルを凍結し、溶媒を凍結乾燥した。粗物質をＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した（溶離液：水／ＭｅＣＮ＊０．１％ＴＦＡ：８５％〜１５％）。この反応のスキームを図１８に示す。
【０２２７】
（関連結合体の合成）
上記に概要を述べた結合体の条件を用いて、示される３つのさらなる結合体を合成した。
【０２２８】
（細胞傷害性アッセイ）
タキソール結合体を、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウム−ブロミド（ＭＴＴ）染色還元における細胞傷害性について試験した。結果（図２０に示す）は、易ｐＨ放出可能なリンカーを有するｒ７に結合したタキソール（ＣＧ  １０６２；図１９に示される構造においてＲ＝Ａｃ）は、タキソール単独、または難ｐＨ放出可能なリンカーを有するｒ７に結合されたタキソール（ＣＧ  １０４０；図１９に示される構造においてＲ＝Ｈ）のいずれかよりも、有意により細胞障害性であることを示す。
【０２２９】
（実施例１３）
（Ｔａｔ４９〜５７由来の蛍光標識ペプチドの構造−機能関係）
（方法）
（概要）Ｒｉｎｋアミド樹脂およびＢｏｃ２ＯをＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍより購入した。ジイソプロピルカルボジイミド、ブロモ酢酸、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ−ＮＣＳ）、エチレンジアミン、１，３−ジアミノプロパン、１，４−ジアミノブタン、１，６−ジアミノヘキサン、トランス−１，６−ジアミノシクロヘキサン、およびピラゾール−１−カルボキシアミジンを全てＡｌｄｒｉｃｈ（登録商標）より購入した。全ての溶媒および他の試薬を、販売元より購入し、そして、さらなる精製なしで使用した。モノ−Ｂｏｃアミンを、文献の手順（クロロホルム中で、１０当量のジアミンのおよび１当量のＢｏｃ２Ｏ、次いで未反応のジアミンを除去するための水でのワークアップ）を用いて、市販ジアミンより合成した（３４）。
【０２３０】
【化１５】
2004530657.tif 000014
（ペプチド合成のための一般的な手順）Ｔａｔ４９〜５７（ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）（Ｔａｔ４９〜５７由来の短縮化およびアラニン置換ペプチド）、アンテナペディア４３〜５８（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）、ならびにアルギニン（Ｒ５〜Ｒ９）およびｄ−アルギニン（ｒ５−ｒ９）のホモポリマーを、ペプチドカップリング試薬としてＨＡＴＵを用いる標準的な固相Ｆｍｏｃ化学（３５）を使用して、自動ペプチド合成機（ＡＢＩ４３３）により調製した。フルオレセイン部分を１２時間、ＤＭＦ（１０ｍＬ）におけるフルオレセインイソチオシアネート（１．０ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（５ｍｍｏｌ）を使用して樹脂結合ペプチド（１．０ｍｍｏｌ）を処理することによって、アミノヘキサン酸スペーサーを介して付着させた。樹脂からの切断を、９５：５  ＴＦＡ／トリイソプロピルシランを用いて達成した。減圧下における溶媒の除去は、冷エーテルで粉砕した原油を与える。従って、得られた粗混合物を遠心分離し、デカンテーションによってエーテルを除去し、そして、得られたオレンジ色の固体を、逆相ＨＰＬＣ（０．１％ＴＦＡ中、Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ）によって精製した。生成物を、凍結乾燥によって単離し、そして、エレクトロスプレー質量分析によって特徴付けた。ペプチドの純度は、分析用逆相ＨＰＬＣ（０．１％ＴＦＡ中、Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ）によって決定される場合、９５％を超えた。
【０２３１】
合成された全てのペプチドおよびペプトイドは、アミノヘキサン酸スペーサーのアミノ基に共有結合されるフルオレセイン部分（ＦＩ）を有するＮ末端アミノ基に付着されたアミノヘキサン（ａｈｘ）酸部分を含む。全てのペプチドおよびペプトイドのカルボキシル末端は、カルボキサアミドである。
【０２３２】
（細胞の取り込みアッセイ）アルギニンホモポリマーおよびグアニジン置換ペプトイドをそれぞれ、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ  ７．２）中で溶解し、そして、それらの濃度を４９０ｎｍ（ε＝６７，０００）におけるフルオレセインの吸収によって決定した。濃度を決定するためのこの方法の精度は、選択されたサンプルの秤量およびＰＢＳ緩衝液の既知の量においてそれらを溶解することによって確立される。ＵＶ分光法によって決定された濃度は、手動で秤量された量に相関する。Ｊｕｒｋａｔ細胞（ヒトＴ細胞株）、マウスＢ細胞（ＣＨ２７）、またはヒトＰＢＬ細胞を、１０％胎仔ウシ血清およびＤＭＥＭ中で増殖し、そして、これらのそれぞれを細胞の取り込み実験について使用した。様々な量のアルギニンおよびグアニジン置換ペプトイドのオリゴマーを、２％ＦＣＳ／ＰＢＳ（組み合わせて総量２００μＬ）中の約３×１０６細胞に添加し、そして、マイクロタイタープレート（９６ウェル）に配置し、そして、２３℃または４℃で、様々な時間でインキュベートした。マイクロタイタープレートを遠心分離し、そして、細胞を単離し、ＰＢＳ（３×２５０μＬ）で洗浄し、５分間３７℃で０．０５％トリプシン／０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡでインキュベートし、冷ＰＢＳで洗浄し、そして、０．１％ヨウ化プロピジウムを含むＰＢＳ中で再懸濁した。この細胞を蛍光フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析し、そして、ヨウ化プロピジウムを使用して染色した細胞を、分析から除外した。示されるデータは、収集された５０００細胞についての平均蛍光シグナルである。
【０２３３】
（アジ化ナトリウムを使用した細胞の取り込みの阻害）使用された細胞を、蛍光性ペプチドの添加の前に２％ＦＣＳ／ＰＢＳ緩衝液中に０．５％アジ化ナトリウムを使用して３０分間プレインキュベートし、そして、その細胞をＰＢＳ緩衝液中の０．５％アジ化ナトリウムを使用して洗浄することを除き、以前に記載されるようにアッセイを行なった。細胞の取り込みの全てのアッセイを、アジ化ナトリウムの存在下および非存在下で並行して行なった。
【０２３４】
（細胞の取り込み速度アッセイ）細胞を、マイクロタイタープレート（９６ウェル）において２％ＦＣＳ／ＰＢＳ（５０μｌ）中で３連で、４℃で、０．５、１、２、および４分間、インキュベートしたのを除き、アッセイを上記のように行なった。２％ＦＣＳ／ＰＢＳ（５ｍＬ）中にサンプルを希釈することによって、反応をクエンチした。次いで、このアッセイをワークアップし、そして、以前に記載されたように、蛍光フローサイトメトリーによって分析した。
【０２３５】
（結果）
短いアルギニンリッチペプチドの細胞の取り込みのための構造的必要を決定するために、一連のＴａｔ４９〜５７の蛍光標識短縮アナログを、標準的な固相化学用いて、合成した。例えば、Ａｔｈｅｒｔｏｎ、Ｅ．ら、ＳＯＬＩＤ−ＰＨＡＳＥ  ＰＥＰＴＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（ＩＲＬ：Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌ．１９８９）を参照のこと。フルオレセイン部分をアミノ末端のアミノヘキサン酸スペーサーを介して付着した。次いで、これらの蛍光標識ペプチドがＪｕｒｋａｔ細胞に入る能力を、蛍光活性化細胞仕分け（ＦＡＣＳ）を用いて分析した。試験されたペプチド構築物は、
【０２３６】
【化１６】
2004530657.tif 000015
であった。細胞表面結合と内部移行との間の差異を、アジ化ナトリウムの存在下および非存在下における並行の組のアッセイを行なうことによって、完全に達成した。アジ化ナトリウムは、エネルギー依存の細胞の取り込みを阻害するが、細胞表面結合は阻害しないので、２つのアッセイの間の蛍光の差異は、内部移行から生じる蛍光の量を提供した。
【０２３７】
アミノ末端（Ｔａｔ５０〜５７）またはカルボシキル末端（Ｔａｔ４９〜５６）のいずれか由来のアルギニン残基の欠失は、親配列（Ｔａｔ４９〜５７）と比較して、細胞内蛍光の８０％の喪失を生じた。１アミノ酸短縮アナログに由来する、カルボキシル末端からのＲ−５６のさらなる欠失（Ｔａｔ４９〜５５）は、細胞内蛍光のさらなる６０％の喪失を生じたが、アミノ末端由来のＫ−５０の欠失（Ｔａｔ５１〜５７）は、内部移行の量をさらに減少しなかった。これらの結果は、Ｔａｔ４９〜５７の短縮アナログが、Ｊｕｒｋａｔ細胞へのフルオレセインの細胞外送達において有意に効果が低く、アルギニン残基が、リジン残基よりも細胞の取り込みにより貢献するようであることを示す。
【０２３８】
個々のアミノ酸残基の細胞の取り込みへの貢献を決定するために、Ｔａｔ４９〜５７のそれぞれの部分でのアラニン置換を含むアナログを合成し、そして、ＦＡＣＳ分析によって合成した（図２２）。以下の構築物を試験した：
【０２３９】
【化１７】
2004530657.tif 000016
。Ｔａｔ４９〜５７の非荷電グルタミン残基のアラニン（Ａ−５４）との置換は、細胞内部移動における緩やかな減少を生じた。他方、陽イオン残基のそれぞれのアラニン置換は、細胞の取り込みの７０〜９０％の喪失を個別に産生した。これらの場合では、アラニンと、リジン（Ａ−５０、Ａ−５１）またはアルギニン（Ａ−４９、Ａ−５２、Ａ−５５、Ａ−５６、Ａ−５７）の置換は、取り込みを減少させる際に類似の効果を有した。
【０２４０】
トランスポーターペプチドのキラリティーが重要であるか否かを決定するために、対応するｄ−（ｄ−Ｔａｔ４９〜５７）、レトロ−ｌ−（Ｔａｔ５７〜４９）およびレトロ−逆異性体（ｄ−Ｔａｔ５７〜４９）を合成し、そして、ＦＡＣＳアッセイによって分析した（図２３）。重要なことには、全ての３アナログは、Ｊｕｒｋａｔ細胞に入る際、Ｔａｔ４９〜５７よりもより効果的であった。これらの結果は、ペプチド骨格のキラリティーが細胞の取り込みが重要でないことを示した。興味深いことには、Ｔａｔ４９〜５７において見出される１つのアルギニンおよび２つのリジンの代わりに、アミノ末端に位置する３つのアルギニン残基を有するレトロ−ｌアイソマー（Ｔａｔ５７〜４９）は、取り込み増加したことを示した。従って、アミノ末端における残基は重要であるようであり、そして、アルギニンは、内部移行について、リジンよりもより効果的である。非天然のｄ−ペプチドの改善した細胞の取り込みは、アッセイで使用された２％ＦＣＳ（胎仔ウシ血清）におけるタンパク質分解に対するそれらの増加した安定性に起因するようである。血清が除去される場合、ｄ−ペプチドおよびｌ−ペプチドは、予想されるように等価であった。
【０２４１】
これらの最初の結果は、アルギニン含有量が、Ｔａｔ４９〜５７の細胞の取り込みについて主な原因であることを示す。さらに、これらの結果は、アルギニンの短いオリゴマーが、細胞に入る際、リジン、オルニチン、およびヒスチジンの対応する短いオリゴマーよりもより効果的であることを実証した、本発明者らの以前の結果と一貫していた。確立されていなかったことは、アルギニンホモオリゴマーが、Ｔａｔ４９〜５７よりもより効果的であるか否であった。この点に関して、Ｔａｔ４９〜５７を、ｌ−アルギニン（Ｒ５−Ｒ９）およびｄ−アルギニン（ｒ５−ｒ９）オリゴマーと比較した。Ｔａｔ４９〜５７は、陽イオン性残基を含むが、その細胞内部移行は、Ｒ６およびＲ７との間の内部移行であり（図２４）、このことは６つのアルギニン残基の存在が、細胞の取り込みについて最も重要な因子であることを示す。重要なことに、７−９アルギニン残基を含む結合体は、Ｔａｔ４９〜５７よりもより優れた取り込みを示した。
【０２４２】
これらのアルギニンオリゴマーおよびＴａｔ４９〜５７の細胞に入る能力を定量的に比較するために、ミカエリス−メンテン速度分析を行なった。細胞の取り込みの速度は、３０、６０、１２０および２４０秒間、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるペプチドのインキュベーション（３℃）後に決定した（表１）。結果のＫｍ値は、ｒ９およびＲ９が、Ｔａｔ４９〜５７よりもそれぞれ、約１００倍および２０倍速い速度で、細胞に入ることを明らかにした。比較のために、アンテナペンディア（Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）４３〜５９をまた分析し、そして、Ｔａｔ４９〜５７より約２倍速く細胞に入ることを示したが、ｒ９およびＲ９よりも有意に遅かった。
【０２４３】
【表１】
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（実施例１４）
（Ｔａｔ４９−５７のペプチド模倣アナログの設計および合成）
（方法）
ペプトイドポリアミン合成の一般的手順。ペプトイドを、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎによって開発された文献の手順に従って、樹脂を混合するために、フリッティングしたガラス装置および窒素の正圧を使用して、手動で合成した。例えば、Ｍｕｒｐｈｙ，Ｊ．Ｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５，１５１７−１５２２（１９９８）；Ｓｉｍｏｎ，Ｒ．Ｊら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，９３６７−９３７１（１９９２）；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ，Ｒ．Ｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４，１０６４６−１０６４７（１９９２）を参照のこと。Ｆｍｏｃ置換Ｒｉｎｋアミド樹脂（０．２ｍｍｏｌ）の、２０％ピペリジン／ＤＭＦ（５ｍＬ）での３０分間（２×）の処理により、遊離樹脂結合アミンを得、これをＤＭＦ（３×５ｍＬ）で洗浄した。この樹脂を、ＤＭＦ（５ｍＬ）中のブロモ酢酸（２．０ｍｍｏｌ）の溶液で３０分間処理した。この手順を繰り返した。次いで、この樹脂を洗浄し（３×５ｍＬ  ＤＭＦ）、そしてＤＭＦ（５ｍＬ）中のモノ−Ｂｏｃジアミン（８．０ｍｍｏｌ）の溶液で１２時間処理した。これら２つの工程を、所望の長さのオリゴマーが得られるまで繰り返した（注記：ＤＭＦ中のモノ−Ｂｏｃジアミンの溶液を、収率を明らかに低下させることなく再利用し得た）。次いで、この樹脂を、ＤＭＦ中のＮ−Ｆｍｏｃ−アミノヘキサン酸（２．０ｍｍｏｌ）およびＤＩＣ（２．０ｍｍｏｌ）で１時間処理し、そしてこれを繰り返した。次いで、Ｆｍｏｃを、２０％ピペリジン／ＤＭＦ（５ｍＬ）で３０分間処理することによって、除去した。この工程を繰り返し、そしてこの樹脂をＤＭＦ（３×５ｍＬ）で洗浄した。次いで、遊離アミン樹脂を、ＤＭＦ（５ｍＬ）中のフルオレセインイソチオシアネート（０．２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（２．０ｍｍｏｌ）で１２時間処理した。次いで、この樹脂をＤＭＦ（３×５ｍＬ）およびジクロロメタン（５×５ｍＬ）で洗浄した。この樹脂からの切断を、９５：５  ＴＦＡ／トリイソプロピルシラン（８ｍＬ）を使用して達成した。減圧下での溶媒の除去により、粗製油を得、これを冷エーテル（２０ｍＬ）で粉砕した。このように得た粗製混合物を遠心分離し、エーテルをデカンテーションによって除去し、そして得られる橙色固体を、逆相ＨＰＬＣ（０．１％  ＴＦＡ中Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ）により精製した。この生成物を、凍結乾燥によって単離し、そして電子スプレー質量分析によって、そして選択され場合には１Ｈ  ＮＭＲ分光法によって、特徴付けた。
【０２４４】
ペプトイドポリアミンの過グアニジニル化（Ｐｅｒｇｕａｎｉｄｉｎｙｌａｔｉｏｎ）のための一般的手順。脱イオン水（５ｍＬ）に溶解したペプトイドアミン（０．１ｍｍｏｌ）の溶液を、炭酸ナトリウム（１つのアミン残基あたり５当量）およびピラゾール−１−カルボキサミジン（１つのアミン残基あたり５当量）で処理し、そして２４〜４８時間５０℃に加熱した。次いで、この粗製混合物を、ＴＦＡ（０．５ｍＬ）で酸性化し、そして逆相ＨＰＬＣ（０．１％ＴＦＡ中Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ）で直接精製した。この生成物を、電子スプレー質量分析によって特徴付け、そして凍結乾燥によって単離し、そして逆相ＨＰＬＣによってさらに精製した。このグアニジン置換したペプトイドの純度は、分析逆相ＨＰＬＣ（０．１％  ＴＦＡ中Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ）によって決定した場合に、９５％より高かった。
【０２４５】
（結果）
Ｔａｔ４７−５９の細胞取り込みについて決定した構造−機能関係を利用して、本発明者らは、アルギニンオリゴマーの側鎖の１，４骨格間隔を保存するが、ステレオジェン中心が欠けているオリゴグリシン骨格を有するポリグアニジンペプトイド誘導体のセットを設計した。アルギニン様側鎖をアミド窒素に組み込むこれらのペプトイドを、これらのタンパク分解に対する予測される抵抗性、ならびに合成の潜在的な容易さおよび有意に低い費用に起因して、選択した。（Ｓｉｍｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：９３６７−９３７１（１９９２）；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１０６４６−１０６４７（１９９２））さらに、ラセミ化（頻繁に、ペプチド合成において遭遇する）は、ペプトイド合成においては問題ではない；そして「亜モノマー（ｓｕｂ−ｍｏｎｏｍｅｒ）」ペプトイドアプローチは、側鎖スペーサーの容易な改変を可能にする。Ｔａｔ４９−５７のオリゴウレア（ｏｌｉｇｕｒｅａ）およびペプトイド−ペプチドハイブリッド（Ｈａｍｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：３５４８−３５５３（１９９７））誘導体の調製は、以前に報告されているが、これらの細胞取り込みは、明白には研究されなかった。
【０２４６】
所望のペプトイドを、ペプトイドに対する「亜モノマー」アプローチ（Ｓｉｍｏｎら；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら）を使用して調製し、続いてアミノヘキサン酸スペーサーを介して、フルオレセイン部分をアミン末端に結合させた。固相樹脂からの切断の後に、このように得られた蛍光標識したポリアミンペプトイドを過剰のピラゾール−１−カルボキサミジン（Ｂｅｒｎａｔｏｗｉｃｚら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５７：２４９７−２５０２（１９９２）および炭酸ナトリウムで処理することによって、良好な収率（６０〜７０％）でポリグアニジンペプトイドに転換した（図２５に示すように）。以前に報告された、単離されたＮ−Ａｒｇユニットを含むペプトイドの合成は、ペプトイド合成の前のＮ−Ａｒｇモノマーの合成（５〜７工程）および特殊化されかつ高価なグアニジン保護基（Ｐｍｃ、Ｐｂｆ）の使用に依存した（Ｋｒｕｉｊｔｚｅｒら、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．４：１５７０−１５８０（１９９８）；Ｈｅｉｚｍａｎｎら、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．７：３２８−３３２（１９９４））。本明細書で報告される化合物は、過グアニジニル化工程を使用して調製される、ポリグアニジニル化ペプトイドの最初の例を提示する。この方法は、対応するポリアミンからのポリグアニジニル化化合物への容易なアクセスを提供し、そして過グアニジニル化ホモオリゴマーの合成のために、特に有用である。さらに、この方法は、高価な保護基（Ｐｂｆ、Ｐｍｃ）の使用を排除する。新規のトリフリル（ｔｒｉｆｌｙｌ）置換グアニル化剤を使用する、ペプチド基質の過グアニジニル化のさらなる例が、最近報告された（Ｆｅｉｃｈｔｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６３：８４３２−８４３９（１９９８））。
【０２４７】
蛍光標識されたポリグアニジンＮ−ａｒｇ５ペプトイド、ポリグアニジンＮ−ａｒｇ７ペプトイド、ポリグアニジンＮ−ａｒｇ９ペプトイドの細胞取り込みを、Ｊｕｒｋａｔ細胞およびＦＡＣＳ分析を使用して、対応するｄ−アルギニンペプチドｒ５、ｒ７、ｒ９（類似のタンパク分解性特性）と比較した。Ｎ−ａｒｇ５、Ｎ−ａｒｇ７、Ｎ−ａｒｇ９を含む細胞の内側で測定した蛍光の量は、ｒ５、ｒ７、ｒ９に関して見出される量に類似して、グアニジン残基の数に比例した：Ｎ−ａｒｇ９＞Ｎ−ａｒｇ７＞Ｎ−ａｒｇ５（図２６）。さらに、Ｎ−ａｒｇ５ペプトイド、Ｎ−ａｒｇ７ペプトイド、Ｎ−ａｒｇ９ペプトイドは、対応するペプチドｒ５、ｒ７、ｒ９と比較して、わずかに低い量の細胞侵入のみを示した。これらの結果は、Ｔａｔ４９−５７またはアルギニンオリゴマーのペプチド骨格に沿った水素結合が、細胞取り込みのために必要とされる構造的エレメントではなく、そしてオリゴマーのグアニジン置換ペプトイドが、アルギニンに富むペプチドの代わりに、分子トランスポーターとして利用され得ることを実証する。アジ化ナトリウムの添加は、インターナリゼーションを阻害し、このことは、ペプトイドの細胞取り込みもまたエネルギー依存性であることを示した。
【０２４８】
（実施例１５）
（細胞取り込みに対する側鎖長の効果）
Ｎ−ａｒｇペプトイドが効果的に細胞膜と交差することを確認した後に、細胞取り込みに対する側鎖長（メチレンの数）の効果を調査した。所定の数のグアニジン残基（５、７、９）については、細胞取り込みは、側鎖長に比例した。より長い側鎖を有するペプトイドは、より効率的な細胞取り込みを示した。グアニジンヘッド基と骨格との間に６つのメチレンスペーサーを有する９マーペプトイドアナログ（Ｎ−ｈｘｇ９）は、対応するｄ−アルギニンオリゴマー（ｒ９）より顕著により高い細胞取り込みを示した。取り込みの相対的順序は、Ｎ−ｈｘｇ９（６メチレン）＞Ｎ−ｂｔｇ９（４メチレン）＞ｒ９（３メチレン）＞Ｎ−ａｒｇ９（３メチレン）＞Ｎ−ｅｔｇ９（２メチレン）であった（図２７）。注記として、Ｎ−ｈｘｇペプトイドは、対応するｄ−アルギニンオリゴマーよりさらに大きな、顕著に高い細胞取り込みを示した。対応するヘプタマーおよびペンタマーの細胞取り込みもまた、同じ相対的傾向を示した。Ｎ−ｈｘｇペプトイドに含まれる側鎖がより長いほど、インターナリゼーションの量がさらに１つ多いグアニジン残基を含む対応するｄ−アルギニンオリゴマーに匹敵するような程度まで、細胞取り込みが改善された（図２８）。例えば、Ｎ−ｈｘｇ７ペプトイドは、ｒ８に匹敵する細胞取り込みを示した。
【０２４９】
細胞取り込みの増加が、増加した長さの側鎖に起因したのか、またはそれらの疎水性の性質に起因したのかを確認するために、シクロヘキシル側鎖を含むペプトイドのセットを合成した。これらを、Ｎ−ｃｈｇ５ペプトイド、Ｎ−ｃｈｇ７ペプトイド、Ｎ−ｃｈｇ９ペプトイドと呼ぶ。これらは、Ｎ−ｈｘｇペプトイドと同じ数の側鎖炭素を含むが、異なる自由度を有する。興味深いことに、Ｎ−ｃｈｇペプトイドは、以前にアッセイされたペプトイド（Ｎ−ｅｔｇペプトイドを含む）の全てよりも、ずっと低い細胞取り込み活性を示した（図２９）。従って、直鎖アルキルスペーサー基（ｓｐａｃｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）の、コンホメーションの可撓性および立体的に妨害されない性質が、効率的な細胞取り込みのために重要である。
【０２５０】
（考察）
ノナペプチドＴａｔ４９−５７は、以前に、原形質膜を通して効率的に転座することが示された。この研究の目的は、この効果のための構造的基礎を決定すること、およびこの情報を使用してより単純かつより効果的な分子トランスポーターを開発することであった。この目的のために、フルオレセイン標識に結合体化した、Ｔａｔ４９−５７の短縮型誘導体およびアラニン置換誘導体を調製した。これらの誘導体は、Ｔａｔ４９−５７と比較して非常に減少した細胞取り込みを示し、このことは、Ｔａｔ４９−５７のカチオン性残基の全てが、効率的な細胞取り込みのために必要とされることを示す。カチオン性オリゴマーの短いオリゴマーに関する本発明者らの以前の研究と比較した場合に、これらの知見は、アルギニンのオリゴマーが、Ｔａｔ４９−５７より優れており、そして確かにより容易かつ費用効率的に調製され得ることを示唆した。短いアルギニンオリゴマーとＴａｔ４９−５７との比較は、前者のメンバーが、実際に、より効率的に細胞に取り込まれることを示した。これは、初めて、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｏｎの速度論分析によって、さらに定量され、この分析は、Ｒ９およびｒ９オリゴマーが、Ｔａｔ４９−５７に関して見出される値より３０倍および１００倍大きなＫｍ値を有することを示した。
【０２５１】
本発明者らのペプチドの研究において明らかとなった、グアニジノヘッド基の重要性およびオリゴマーキラリティーの明らかな不感受性を考慮して、本発明者らは、新規な一連のポリグアニジンペプトイドを設計し、そして合成した。アルギニン側鎖を組み込むペプトイドであるＮ−ａｒｇ５、Ｎ−ａｒｇ７、Ｎ−ａｒｇ９は、対応するｄ−アルギニンペプチドｒ５、ｒ７、ｒ９に匹敵する細胞取り込みを示した。このことは、ペプチド骨格に沿った水素結合および骨格キラリティーが、細胞取り込みのために必須ではないことを示す。この観察は、これらのペプトイド、アルギニンオリゴマー、およびＴａｔ４９−５７（これらは全て、深く埋め込まれた骨格およびグアニジニウム優性表面を有する）の分子モデルと一致する。分子モデルは、これらの構造的特性が、ペプトイド骨格とグアニジノヘッド基との間に異なるアルキルスペーサーを有するオリゴマーにおいて、様々な程度で保持されることを、さらに明らかにする。従って、骨格と側鎖との間に２−（Ｎ−ｅｔｇ）、４−（Ｎ−ｂｔｇ）、および６−ａｔｏｍ（Ｎ−ｈｘｇ）のスペーサーを組み込む一連のペプトイドを調製し、そして細胞取り込みについて、Ｎ−ａｒｇペプトイド（３原子スペーサー）およびｄ−アルギニンオリゴマーと比較した。側鎖の長さは、細胞侵入に対して、劇的な影響を有した。細胞取り込みの量は、Ｎ−ｈｘｇ＞Ｎ−ｂｔｇ＞Ｎ−ａｒｇ＞Ｎ−ｅｔｇの順で、側鎖の長さに比例した。細胞取り込みは、グアニジンヘッド基と骨格との間のアルキルスペーサーユニットの数が増加する場合に、改善された。重要なことに、Ｎ−ｈｘｇ９は、ｒ９より優れており、後者は、Ｔａｔ４９−５７より１００倍良好であった。この結果により、本発明者らは、グアニジノ基と骨格との間により長いオクチルスペーサー（Ｎ−ｏｃｇ）を含むペプトイド誘導体を調製した。溶解度に関する問題点に起因して、本発明者らは、これらの化合物を試験しなかった。
【０２５２】
過グアニジニル化ペプチドと過グアニジニル化ペプトイドとの両方が、効率的に細胞に侵入するので、グアニジンヘッド基（骨格とは独立している）は、明らかに、細胞取り込みの重大な構造的決定因子である。しかし、いくつか（６より大きい）のグアニジン部分が分子の足場に存在することは、細胞内への能動的な移送のためには十分ではない。なぜなら、Ｎ−ｃｈｇペプトイドは、細胞内に効率的に転座しなかったからである。従って、グアニジンヘッド基の重要性に加えて、細胞取り込みのために重要な構造／コンホメーション要件が存在する。
【０２５３】
要約すると、この研究は、Ｔａｔ４９−５７が細胞に侵入する能力に影響を与える、一連の構造的特徴（配列の長さ、アミノ酸組成、およびキラリティーを含む）を同定した。これらの特徴は、一連の新規ペプトイドの設計のための設計図を提供し、これらのうちの１７のメンバーが合成され、そして細胞取り込みに関してアッセイされた。重要なことには、Ｎ−ｈｘｇ９トランスポーターは、細胞取り込みが、ｒ９より優れており、これは、Ｎ−ｂｔｇ９に匹敵することが見出された。従って、これらのペプトイドトランスポーターは、Ｔａｔ４９−５７より実質的に良好であることが示された。この研究は、ペプチド骨格およびその骨格に沿った水素結合が、細胞取り込みのために必要ではないこと、グアニジノヘッド基が、他のカチオン性サブユニットより優れていること、ならびに最も重要なことには、骨格とヘッド基との間のアルキル鎖の伸長が、優れたトランスポーターを提供することを、確認した。より良好な取り込み性能に加えて、これらの新規ペプトイドは、Ｔａｔ４９−５７より優れたいくつかの利点（費用効果、アナログの合成の容易さ、およびプロテアーゼ安定性を含む）を与える。これらの特性は、それらの有意な水溶性（＞１００ｍｇ／ｍＬ）とともに、これらの新規ペプトイドが、薬物、薬物候補および他の薬剤の、細胞内への分子送達のための効果的なトランスポーターとして働き得ることを示す。
【０２５４】
（実施例１６）
（イトラコナゾール−トランスポーター結合体の合成）
この実施例は、送達増強トランスポーターを、トリアゾール構造を含む化合物に結合させるための一般的なストラテジーの１つの適用を提供する。このスキーム（アルギニン（ｒ７）送達増強トランスポーターへのイトラコナゾールの結合を例として使用する）を、図３０に示す。このスキームにおいて、ＲはＨまたはアルキルであり、ｎは１または２であり、そしてＸはハロゲンである。
【０２５５】
この反応は、ハロゲン（例えば、Ｂｒ、Ｆｌ、Ｉ）またはメチルエステルを有するアシル基を結合するために、トリアゾール環の窒素の四量化の使用を含む。化合物３を、ＨＰＬＣによって単離した。Ｄ２Ｏ中でのプロトンＮＭＲは、イトラコナゾールおよびトランスポーターのピークを明らかにした。
【０２５６】
メチルエステルは、７０％以上の収率を提供したが、Ｂｒ−プロピオン酸／エステル対を使用して得られた収率は、４０〜５０％であった。次いで、このアシル誘導体は、送達増強トランスポーターのアミンと反応して、結合体を形成する。あるいは、ハロゲン化アシル基が、アミド結合を介して最初にトランスポーター分子に結合し得、その後、薬物化合物との反応が実施される。
【０２５７】
（実施例１７）
（ＦＫ５０６結合体の調製）
この実施例は、ＦＫ５０６が、送達増強トランスポーターに結合される結合体の調製を記載する。２つの異なるリンカーを使用し、これらの各々は、生理学的ｐＨ（ｐＨ５．５〜７．５）でＦＫ５０６を放出したが、より酸性のｐＨでより長い半減期を有した。これらのスキームを、図３１ＡおよびＢに図示する。
【０２５８】
（リンカー１：６−マレイミドカプロンヒドラジドトリフルオロアセテート（スキームＩおよびＩＩ））
無水メタノール（５ｍＬ）中のＦＫ５０６（１）（０．１ｇ、１２４．４μｍｏｌ）、６−マレイミドカプロンヒドラジドトリフルオロアセテート（２）（０．１２６ｇ、３７３．２μｍｏｌ）およびトリフルオロ酢酸（触媒、１μＬ）の溶液を、室温で３６時間攪拌した。この反応物を薄層クロマトグラフィーによってモニタリングし、出発物質のほぼ完全な消失を示した［ＴＬＣ溶媒系−ジクロロメタン（９５）：メタノール（５）、Ｒｆ＝０．３］。この反応混合物を乾燥するまで濃縮して、酢酸エチル（２０ｍＬ）中に溶解させた。有機層を水および１０％重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、次いで硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、そして濃縮した。残渣を溶出液としてジクロロメタン（９６）：メタノール（４）を使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、ヒドラゾン３（０．１１６ｇ、９２％）を得た。
【０２５９】
無水ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）中の上記ヒドラゾン（３）（０．０２５ｇ、２４．７μｍｏｌ）、トランスポーター（１×Ｂａｃａｒ９ＣＣＯＮＨ２・９ＴＦＡ、Ｂａｃａｒ７ＣＣＯＮＨ２・７ＴＦＡ、ＢａｃａＣＣＯＮＨ２、ＮＨ２ｒ７ＣＣＯＮＨ２・８ＴＦＡ、ＮＨ２Ｒ７ＣＣＯＮＨ２・８ＴＦＡ）およびジイソプロピルエチルアミン（１×）の溶液を、窒素下で３６時間室温で攪拌し、この時点で、ＴＬＣは、出発ヒドラゾンの完全な消失を示した。溶媒を反応混合物からエバポレートし、そして残渣を、トリフルオロ酢酸緩衝化水およびアセトニトリルを使用する逆相ＨＰＬＣによって精製した。
【０２６０】
種々のトランスポーターとの結合体の収率は、以下：
【０２６１】
【化１８】
2004530657.tif 000018
である。
【０２６２】
全ての生成物の構造を、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルおよびＴＯＦ  ＭＳ分析によって確認した。
【０２６３】
（リンカー２：２−（２−ピリジニルジチオ）エチルヒドラジンカルボキシレート（スキームＩＩＩおよびＩＶ））
無水メタノール（５ｍＬ）中のＦＫ５０６（１）（０．１ｇ、１２４．４μｍｏｌ）、２−（２−ピリジニルジチオ）エチルヒドラジンカルボキシレート（９）（０．０９１ｇ、３７３．２μｍｏｌ）およびトリフルオロ酢酸（触媒、１μＬ）の溶液を、室温で１６時間攪拌した。この反応物を薄層クロマトグラフィーによってモニタリングし、出発物質のほぼ完全な消失を示した［ＴＬＣ溶媒系−酢酸エチル、Ｒｆ＝０．５］。この反応混合物を乾燥するまで濃縮して、酢酸エチル（２０ｍＬ）中に溶解させた。有機層を水および１０％重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、次いで硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、そして濃縮した。残渣を溶出液としてジクロロメタン（９７）：メタノール（３）を使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、ヒドラゾン１０（０．０９１ｇ、７１％）を得た。
【０２６４】
（実施例１８）
（胃腸管におけるトランスポーターの差示的取り込み）
（方法）
（胃腸吸収プロトコル）
Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＮＹ）から購入した８週齢および１０週齢の雌Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスに対して実験を行った。マウスをＮｅｍｂｕｔａｌで麻酔し、腹部に沿って正中切開を行った。腸を測定し、所望の区画の両端で縫合によって結紮し、そしてビオチン化ペプチドを管腔中に注入した（約１００λ／インチ）。１５分のインキュベーション後、この組織を取り出し、そして管腔をＰＢＳで穏やかに洗浄した。
【０２６５】
ＣｅｌｌＧａｔｅトランスポーターが、口腔の扁平上皮に進入し得るか否かを決定するために、マウスをＮｅｍｂｕｔａｌで麻酔し、その頭部を一方向に傾け、そしてその口にビオチン化ペプチドの溶液を配置した。１５分後、液体をピペットによって除去した。
【０２６６】
（胃腸管領域の組織学的切片の調製）
ビオチン化ペプチドとのインキュベーションの直後に、麻酔したげっ歯類動物を頸部脱臼によって屠殺し、そして結紮した胃腸管の区画を取り出した。種々の区画の管腔を、プラスチック先端のシリンジを使用してＯＣＴで満たし、ＯＣＴを満たしたボートに浸漬し、そして２−メチル−ブタン／ドライアイス溶液中ですばやく凍結させた。凍結切片を僅かに温め、そして２ｍｍの厚さの矢状切断を、鋼鉄のかみそりの刃を使用して行った。切片をＯＣＴ型に配置し、そして２−メチル−ブタン／ドライアイス溶液中ですばやく凍結させた。切片（５μｍ）を、クリオスタット上で切断し、アセトン中で４℃で１０分間固定し、そして風乾させた。ＰＢＳ中で５分間の再水和後、切片を正常ウマ血清でブロッキングし、洗浄し、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（２０μｇ／ｍｌ）と共に３０分間インキュベートし、洗浄し、そしてヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含む取り付け媒体を用いて取り付けた。
【０２６７】
（組織培養）
Ｃａｃｏ−２細胞をＡＴＣＣから獲得し、解凍し、そしてペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミンおよび１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ中で、コンフルエント（＞２５０，０００細胞／ｃｍ２）になるまで３〜５日間増殖させ、次いで数継代サイクルにわたって、６０，０００細胞／ｃｍ２で継代した。継代数２５〜２９を、Ｓｎａｐｗｅｌｌ  １２ｍｍ直径０．４ミクロン孔サイズのポリカーボネート膜（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｎ．Ｙ．）上に、膜１枚当たり６０，０００細胞でプレートし、そして少なくとも２１日間増殖させ、培地を一日おきに交換した。
【０２６８】
（Ｃａｃｏ−２細胞における細胞取り込み）
懸濁物中の細胞へのＤ−アルギニンの蛍光オリゴマーの透過を分析するために、単層をトリプシン（０．０５％溶液４．５ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ  Ｒａｐｉｄｓ、ＭＩ）で処理し、個々の細胞懸濁物をスピンダウンした。細胞を再懸濁し、計数し、そして種々の濃度のＦｌ  ａｃａ  ｒ５、Ｆｌ  ａｃａ  ｒ７、Ｆｌ  ａｃａ  ｒ９、Ｆｌ  ａｃａ  ｋ９（５０〜０．８μＭ）で５分間処理し、洗浄し、４００λ  ＰＢＳ、２％ＥＢＳ、４０ｎｇＰＩ／ｍｌ中に再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。
【０２６９】
蛍光ペプチドが単層の一部のＣａｃｏ−２細胞に進入する能力を分析するために、細胞を、ｌａｂ−ｔｅｋ  ｆｌａｓｋｅｔｔｅ顕微鏡スライド（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔ．、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ）において、６０，０００細胞／ｍｌの密度で４ｍｌ中に播種し、そして培地を一日おきに交換しながら２１日間増殖させた。一旦単層が確立されると、これを１００μＭ  Ｆｌ  ａｃａ  ｒ９  ＣＯＮＨ２と共に５分間インキュベートした。この単層を、引き続いてＰＢＳ／２％ＦＢＳで２回洗浄して、標識ペプチドを除去し、蛍光顕微鏡を使用して分析した。
【０２７０】
（単層のＣａｃｏ−２細胞を横切る輸送）
短いＤ−アルギニンのオリゴマーが、Ｃａｃｏ−２細胞の単層を横切り得るか否かを分析する実験を、電位固定増幅器およびＥａｓｙｍｏｕｎｔ並行水平拡散チャンバ（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、再循環水浴に接続された９５％酸素５％二酸化炭素ガスリフトシステムと共に使用して、実行した。
【０２７１】
電流測定値（Ｉ２−Ｉ１）を、試験化合物の添加の１０分前を含めて、５分間隔で取り、単層がインタクトであることを保証した。ゼロ時間で、試験化合物を適切な濃度で添加し、そして測定値を記録した。測定値を６０分間にわたって５分間隔でとり、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）および短絡電流（Ｉｓｃ）を、これらの値から引き続いて計算した。
【０２７２】
（合成化学）
（シクロスポリンＡ）
この研究において使用したＣｓＡ結合体の詳細は、以前に記載されている（Ｒｏｔｈｂａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６、１２５３  ２０００）。図６もまた参照のこと。簡潔には、ＣｓＡを、図６Ａに示されるｐＨ感受性リンカーを介して、Ｄ−アルギニン七量体に結合体化した。得られた結合体は、酸性ｐＨで安定であるが、７より高いｐＨでは、ＣｓＡに隣接するカルボニルに対する遊離アミンの付加を含む分子内環化を受けて（図６Ｂ）、未修飾ＣｓＡの放出を生じる。
【０２７３】
（タキソール）
タキソールを、無水α−クロロ酢酸で処理し、Ｃ−２’クロロアセチル誘導体１２を実質的に定量的な収率で生じた。
【０２７４】
【化１９】
2004530657.tif 000019
【０２７５】
【化２０】
2004530657.tif 000020
ハロゲンを、Ｎ−末端（Ｌ）システイン含有Ｄ−アルギニン七量体のチオールによって置換した。結合体化をＤＩＥＡの存在下でＤＭＦ中で室温にて実行した。最終生成物をＲＰ−ＨＰＬＣによって単離し、そして凍結乾燥させてＴＦＡ塩（これは、非常に吸湿性であり、そして水に容易に溶解した）を得た。
【０２７６】
化合物１３をＣ２’エステルカルボニルへのＮ末端窒素の求核攻撃を介してタキソールを放出するように設計した。この窒素のプロトン化状態は、この機構に重要である。なぜなら、遊離アミンのみがこの放出を行い得るからである。さらに、両方の結合体は、単純なエステル加水分解に対して感受性にする、共通のα−ヘテロ原子置換されたアセテート部分を共有する。これは、さらなる放出経路を提供する。
【０２７７】
（結腸内注入）
約２００〜３００ｇの雌のＷｉｓｔｅｒラット（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ、Ｇｉｌｒｏｙ、ＣＡ）を麻酔し、その腹部を剃毛し、正中切開を行い、そして各動物の上行結腸において１．５インチの切片を、縫合によって結紮した。タキソールおよびシクロスポリン（５ｍｇ／ｋｇ）を１：１ｖ／ｖのＣｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ：エタノール混合物中の溶液として注入したが、一方、等モル量のｒ７結合体を、ＰＢＳ中で注入した。全ての場合において、注入される容積は、約５００λであった。結腸を腔に戻し、そして切開を縫合を使用して閉じた。
【０２７８】
血液サンプルを、ゼロ時間（薬物注入前）および実験の持続期間の間３０分毎に尾部静脈から採取し、そして９０分後に終了した１匹の動物以外、実験的に決定した。凝固を、１００λの０．５％  ＥＤＴＡを含むガラス管に血液を移すことによって阻害し、そしてこの血液を凍結させた。
【０２７９】
（全血からの薬物抽出およびＨＰＬＣ  ＭＳ  ＭＳ分析）
タキソールまたはシクロスポリンのいずれかを、文献の手順の改変を使用して全血から抽出した。簡潔には、全血（１００λ）を、５ｍｌのジエチルエーテルを含むネジキャップ付のガラス管に移した。このサンプルを２分間にわたって激しくボルテックスし、遠心分離し、そしてドライアイス／メタノール中で凍結させた。エーテル層を別のガラス管に移し、そしてエーテルをエバポレートした。シクロスポリンの場合、残渣を１．５ｍｌのメタノール、水、アセトニトリル（３：２：１）に再懸濁したが、タキソールについては、残渣を１．５ｍｌのメタノール：アセトニトリル（１：１）に再懸濁した。サンプルをＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒシリーズ２００自動サンプラー中に配置し、そしてＳｈｉｍａｚｕ  ＨＰＬＣシステムに接続されたＣ１８逆カラム上に７０℃で引き続いて注入し、７０％メタノール、３０％水性蟻酸アンモニウム緩衝液で溶出し、そして溶出液をＰＥ  Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  ３０００タンデム質量分析器で分析した。既知の量のシクロスポリンＡ（１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ）またはタキソール（１〜１０００ｎｇ／ｍｌ）のいずれかを全血に添加し、そして以前に記載されたように抽出して、標準曲線を得た。シクロスポリンＡを、２つの遷移（１２２０〜１２０３ダルトンおよび１２２０〜１００ダルトンの両方）によってモニタリングした。１２２０種は、シクロスポリンＡ＋アンモニアに対応し、１２０３はプロトン化シクロスポリンであるが、１００は既知のフラグメントである。タキソールを２つの遷移（８７２〜８５５ダルトンおよび８７２〜１１０ダルトンの両方）によってモニタリングした。８７２種は、タキソールのアンモニウム付加物に対応し、８５５は、プロトン化親化合物であるが、１１０は、第二の四極子において優勢に見られるフラグメントである。
【０２８０】
サンプル中のシクロスポリンＡおよびタキソールの総量を、標準曲線によって確立された値と適切なピークの積分面積を比較することによって決定した。
【０２８１】
（結果）
（胃腸管におけるトランスポーターの差示的取り込み）
短いＤ−アルギニンのオリゴマーは、懸濁物中で増殖した広範な種々の細胞株の原形質膜を迅速かつ効率的に通過することが示された。さらに、これらは、局所的に適用される場合に複数層の皮膚を透過し、静脈内に注入される場合に静脈および動脈の複数層の内皮細胞および平滑筋細胞を透過し、そして吸入される場合には複数層の肺組織を透過することが示されている。これらの化合物が、胃腸管の非角質化上皮に進入し得るか否かを決定するために、断食マウスの小腸および大腸の区画を結紮し、そしてＤ−アルギニンのビオチン化九量体（ｂｉｏ  ａｃａ  ｒ９  ＣＯＮＨ２）の溶液（１００μＭ）を注入した。１５分間の曝露後、組織の適切な区画を解剖し、凍結し、切片化し、そしてストレプトアビジンフルオレセインで染色して、ビオチン化ペプチドの位置を規定し、そしてヨウ化プロピジウムで切片中の全ての核を対比染色した。
【０２８２】
マウス十二指腸の管腔に注入された場合、バックグラウンドを超えて検出可能な染色は観察されなかった。乏しい染色はまた、ビオチン化ペプチドを空腸に注入した場合に見られた。複数の切片を走査した場合、検出可能な染色は、いくつかの絨毛の先端で見られた。均質な染色の第一の徴候は、回腸の切片を分析した場合に観察された。染色は、微絨毛の先端に局在し、そして陰窩の細胞には及ばなかった。回腸の全ての切片において見られたが、観察された蛍光は、皮膚、肺、または動脈もしくは静脈の内皮細胞において以前に観察された強度レベルには到達しなかった。
【０２８３】
小腸の比較的乏しい染色は、結腸領域が試験された場合に見られた染色とは、顕著に異なった。大腸の上行区画および横行区画の両方において、ビオチン化アルギニン九量体は、局所的に適用された場合、絨毛の全ての表面領域を染色し、いくつかの細胞層を透過し、表皮および真皮の強い染色を想起させた。さらに、陰窩の細胞は、結腸区画において強く染色され、そしてこの区画の全厚みの透過についての証拠が、いくつかの領域において観察された。
【０２８４】
組織学的分析は、胃腸管の非角質化上皮層へのｂｉｏ  ｒ９の取り込みが、胃の幽門からの距離と共に増大する取り込みを伴って、有意に変化したことを実証した。回腸において観察された染色は、空腸において観察された染色よりも強く、空腸において観察された染色は、十二指腸において観察された染色よりも強かった。最も強い染色は、結腸の上行領域および横行領域において見られた。本発明を特定の理論または機構に限定することを意図しないが、上皮を裏打ちする粘膜の組成および量が、差示的染色における重要な因子であり得るというのが１つの理論である。
【０２８５】
（Ｃａｃｏ−２細胞への細胞取り込み）
Ｃａｃｏ−２細胞（市販のヒト結腸細胞）を、種々の量の蛍光標識したＤ−アルギニンの五量体、七量体および九量体（Ｆｌ  ａｃａ  ｒ５、Ｆｌ  ａｃａ  ｒ７、Ｆｌ  ａｃａ  ｒ９）またはリジン九量体（Ｆｌ  ａｃａ  ｋ７）と共に懸濁物中でインキュベートし、そしてフローサイトメトリーによって分析し、種々の他の懸濁細胞において以前に見られたパターン（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５６、３１８（２０００））と類似のパターンが観察された（図３２）。蛍光ペプチドの取り込みは、アルギニン含量と共に増大し、ｒ９はｒ７より効率的であり、ｒ７はｒ５よりも効率的であった。全てのアルギニンポリマーは、リジン九量体よりもより効率的に細胞に進入した。蛍光の速度、相対量、および延長した時間（数時間）にわたる内在化した蛍光ペプチドの見かけの流出の欠如の両方は、リンパ球を用いたより初期の実験を想起させた。
【０２８６】
細胞が懸濁物中に存在した場合にのみ見られたＣａｃｏ−２細胞への短いアルギニンオリゴマーの迅速な透過が、人為的結果ではないことを確認するために、Ｆｌ  ａｃａ  ｒ９  ＣＯＮＨ２（５０μＭ）を顕微鏡スライド上に単層として増殖したＣａｃｏ−２細胞と共に５分間インキュベートし、洗浄し、そして蛍光顕微鏡によって分析した。懸濁細胞のフローサイトメトリーと一致して、単層中の実質的に全ての細胞は、５分後に蛍光であった。
【０２８７】
ペプチドがＣａｃｏ−２細胞に迅速に進入する能力を、拡散チャンバ中の膜として単層のＣａｃｏ−２細胞を配置し、そしてこれを、タキソールと異なる長さのアルギニンオリゴマーとの間の蛍光トランスポーター薬物結合体に曝露することによって、しっかりと確立した。種々の濃度のタキソール結合体（５０〜０．０８μＭ）を、頂端側に添加し、そして３分間、単層のＣａｃｏ−２細胞に曝露した。この膜を装置から取り外し、細胞をトリプシン処理し、そして得られた細胞懸濁物をフローサイトメトリーによって分析した（図３３）。ペプチド単独と同様に、薬物結合体は、迅速かつ効率的に単層を含む細胞に進入し、そしてより多いアルギニンを含む結合体がより効率的であった。
【０２８８】
本発明の理論を限定することを意図しないが、これらの実験は、フルオレセインまたは治療薬物（例えば、タキソール）のいずれかと結合体化した短いアルギニンオリゴマーが、懸濁物中に存在する場合および単層で増殖した場合の両方において、迅速にＣａｃｏ−２細胞に進入するという仮説の強力な支持を提供する。
【０２８９】
（Ｃａｃｏ−２単層を横切る輸送）
腸上皮の管腔膜を横切ることは、送達された（例えば、頬投与される）薬物の血中レベルを増大させるために必要である。このトランスポーターが腸上皮を横切り得るか否かを決定するために、単層のＣａｃｏ−２細胞を培養物中で増殖させ、そして市販の拡散チャンバ中に膜として配置する。膜の完全性を、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）が、１００Ωｃｍ２よりいつも大きいことを実証することによって、実証した（図３４）。膜がインタクトであり、細胞間に有意な空間が存在しない場合にのみ、このような安定な抵抗パターンが観察される。
【０２９０】
膜が生存性かつ連続であることのさらなる証拠は、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ（２００μＭ）はこの単層を横切って運搬されなかったが、一方でヒドロコルチゾンが刊行された報告と一致する量で輸送されたことであった（図３５）。
【０２９１】
４〜１５サブユニットの範囲のＤ−アルギニンまたはＬ−アルギニンの種々の蛍光オリゴマーが、多数の膜を用いた複数の実験において頂部チャンバに配置された場合、基底外側のチャンバへは有意に輸送されなかった（図３５）。
【０２９２】
一緒に考えて、本明細書中に示されるデータは、送達された化合物（例えば、フルオレセインまたはタキソールのいずれか）に結合体化した短いアルギニンオリゴマーが、Ｃａｃｏ−２細胞単層に迅速に進入するが、Ｃａｃｏ−２細胞単層を横切って輸送されないというモデルと一致する。このモデルはまた、本発明のトランスポーターが、エンドソームによってＣａｃｏ−２細胞に進入せず、結腸上皮を横切って輸送され、十分理解された経路によって基底外側に排泄されることを意味する。ＣｅｌｌＧａｔｅトランスポーターは、細胞質ゾルに直接進入するようであり、そして基底外側での高い流出速度を有さないようである。
【０２９３】
（直腸内注入後の薬物血中レベルの測定）
単独、またはタキソールもしくはシクロスポリンのいずれかと結合した場合のいずれかの、フルオレセインで標識した短いアルギニンオリゴマーは、インビトロで単層のＣａｃｏ−２細胞を横切ることができなかったが、この細胞株は、結腸のインビボの挙動を正確に模倣していないかもしれない。さらに、短いアルギニンオリゴマーとのインキュベーション後に結腸組織において見られた蛍光パターンは、このペプチドが、血管新生が生じることが公知の層に透過したことを実証した。
【０２９４】
本発明のトランスポーターが、経口投与された薬物の送達を増強し得るか否かを決定するために、シクロスポリンＡおよびタキソールの放出可能な結合体を、直腸内に注入し、そして生じた、放出された薬物の血中レベルを、ＬＣ  ＭＳ  ＭＳによって測定した。
【０２９５】
第一の実験を、リン酸緩衝化生理食塩水中に溶解された等モル量の放出可能なＣｓＡのｒ７結合体と比較して、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ：エタノール中のＣｓＡ５ｍｇ／ｋｇの結腸内注入後のＣｓＡ血中レベルを測定するために設計した。親薬物の場合、血中レベルは３０分後に約２５ｎｇ／ｍｌのＣｓＡにまで上昇し、次いで基準レベルに近いレベルまで迅速に低下した（図３６）。９０分後には動物が死亡したので、さらなるデータは獲得しなかった。対照的に、等モル量のＣｓＡ−ｒ７結合体を注入した場合、血中の検出可能なレベルのＣｓＡは、３時間後にのみ観察された（図３６）。短いアルギニンオリゴマーに結合体化された場合に変更されたＣｓＡの薬物動態が再現性があるかどうかを決定するために、第三のラットに、１０ｍｇ／ｋｇ相当の水溶性放出可能結合体を注入した。この動物の血中のＣｓＡ取り込み速度は、５ｍｇ／ｋｇのこの結合体を注入した動物と類似した。より多くの結合体を投与すると、３０分で小さい増大が見られたが、より多い量は、血中に２時間後にのみ現れ、血中レベルは３時間後に４５ｎｇ／ｍｌに達した。全体的パターンは、この結合体を注入した２匹の動物において類似であった。両方の場合において、循環中で測定されたＣｓＡの全体量は、ＣｓＡを注入した場合よりも有意に多かった。
【０２９６】
ＣｓＡ結合体の半減期は、約９０分であり、これは、親化合物と比較した、血中ＣｓＡの出現の遅延と一致した。この事実を、結腸の円柱上皮における迅速かつ効率的な取り込み、およびＣｓＡまたはタキソールの放出不能な結合体がインビトロで単層の結腸細胞を横切ることができないことを実証する組織学的データと合わせて、この現象を説明する理にかなった簡潔なモデルを導く。本発明を特定の機構または理論に限定することを意図しないが、この結合体は、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ中で注入されたＣｓＡよりもかなり効率的かつより迅速に結腸の円柱上皮に進入するが、結合体が加水分解されるまで上皮細胞中に保持され、そして毛細管を囲む内皮細胞を横切らないようである。一旦放出されると、ＣｓＡは、血中に自由に拡散するか、または能動的に輸送された。
【０２９７】
この仮説を試すために、タキソールおよび異なる２つのｒ７−タキソール結合体を結腸に注射し、そして薬物の血中レベルを３０分間隔で測定した。２つのｒ７−タキソール結合体は、有意に異なる半減期（１０分および５時間）を有し、そしてこの薬物結合体の加水分解が、循環での薬物の出現における律速段階であるという仮説を試すために使用された。本当であるならば、この前提は、１０分の半減期を有するｒ７−タキソール結合体が、上皮においてタキソールを放出し、その結果、３０分の時点で循環において検出され得ることを予測した。対照的に、タキソールは、より安定なｒ７結合体（ｔ１／２＝５時間）から放出されるべきではなく、そして実験の間に採取した血液サンプル中で検出されるべきではなかった。
【０２９８】
この前提は、血液中のタキソールの出現によって支持された（図３７）。タキソールの検出可能レベルは、結腸中に注射された場合、２．５時間まで血液中に現われず、４時間および５．５時間に引き続いて波を有した。時間の関数として、血液中のタキソールの変動レベルは、そのパターンが、物質のいくらかを隔離し、かつ徐放性ビヒクルとして作用するＣｒｅｍｏｐｈｏｒ能力を合理化するという公開された研究に一致する。対照的に、不安定で、水溶性であるタキソールのｒ７結合体（１３）を投与した場合、２００ｎｇ／ｍｌより多いタキソールを、最も早い時点（３０分）で観察し、１時間まで増加し続け、この時点でのレベルが５時間までゆっくり減少する。予測されるように、より安定で水溶性のタキソールｒ７結合体（１４）の注射は、５時間内ではタキソールの有意な血中レベルを生じなかった。これらのデータは、本発明のトランスポーターが結腸上皮に侵入するが横切らないという仮説を支持する。これらは、水溶性を劇的に改善することによって、そして結腸における結合体の取り込み速度を増加することによって、薬物の経口バイオアベイラビリティーを改善し得る。血流への薬物の最終的な送達は、生体膜を介する薬物の固有の拡散能力、および結合体から放出の速度に基づくようである。
【０２９９】
（考察）
本明細書中に記載される実験における有意な発見は、ペプチドが十二指腸の上皮に入ることができなことである。これは、細胞型または組織に入らないトランスポーターの第１の例を表す。胃の幽門からさらに伸長した組織の取り込みの増加パターンは、興味深く、インヒビターの勾配（例えば、負に荷電した粘液）におそらく起因するようである。小腸の上部領域を染色するような不全は、結腸における激しい染色とは対照的に明確（ｉｎ  ｓｔａｒｋ）であり、本発明のトランスポーターが、結腸への治療剤の選択的送達のために使用され得るという推測を導く。結腸の全ての内腔表面が強度の蛍光を発するのみでなく、染色パターンはまた、ビオチン化化合物が、複数の細胞層に浸透し得、そして組織の血管化領域に到達し得ることを示し、このことは、トランスポーターが、血流中への輸送を増強するはずであることを示唆する。
【０３００】
しかし、結腸細胞株（Ｃａｃｏ−２）の単層を用いる別の研究は、代替の機構を示唆する。Ｃａｃｏ−２系において、トランスポーターは単層に迅速に侵入したが、単層を横断しなかった。細胞および組織への高速での輸送（しかし、細胞および組織からの制限された流出速度）を示すトランスポーターの例がいくつか存在する。これは、現在までに試験された全ての懸濁細胞株についての場合であり、最も研究された細胞株は、ヒトＴ細胞株（Ｊｕｒｋｅｔ）である。短いオリゴマーのＤ−アルギニンは、これらの細胞に迅速に侵入し、そして非常に低い退出速度を示し、３７℃で１時間のインキュベーション後、蛍光シグナルの５％未満を失う。この現象のなおより関連性のある例としては、放出可能なＣｓＡ  ｒ７結合体での複数の局所処置を受けるマウスの血流中で測定された、低レベルのＣｓＡである。結腸についての場合のように、ＣｓＡ結合体のビオチン化アナログで処理された皮膚の切片における染色パターンによって、薬物が真皮の高度に血管化した領域へ浸透したことを確立した。さらに、モノクローナル抗体を用いての染色は、高度に蛍光を発した真皮において顕著な細胞型の１つの毛細管の内皮細胞であったことを確立した。にもかかわらず、これらの動物の血液中のＣｓＡの検出可能なレベルは、１日に２回適用される４％の軟膏での処理の１０日後でもなお観察されなかった。この観察は、裏づけに乏しい（ａｎｅｃｄｏｔａｌ）、この報告においてより研究された結果と一致する。
【０３０１】
皮膚、肺および心血管系中の複数の細胞層に侵入し、そして続いて抜け出すペプチドの能力は、これらのペプチドがリンパ球またはＣａｃｏ−２細胞から抜け出す能力がないことに対して顕著に対称的である。特定の理論または機構に本発明を限定することを意図することなく、１つの差異は、タイトジャンクション、および組織構造において固有の他の膜構造によって結合されている細胞であって、これらの構造を介してペプチドが迅速に浸透する細胞であるが、懸濁液中、およびおそらく血流に接する側の内皮細胞の膜のの個々の細胞は、これらの特徴を欠損する。タイトジャンクションまたはギャップジャンクションのような構造が、トランスポーターの退出を可能にするために周囲の脂質を改変する場合、次いで、トランスポーターは、組織（皮膚または結腸）を通して迅速に拡散されるはずであるが、血流中へは輸送されない。この仮説との一致は、循環におけるタキソールおよびＣｓＡの出現速度の変化を説明するため、この報告において構築されたモデルである。このモデルにて、アルギニンの短いオリゴマーは、結腸の円柱上皮または頬の扁平上皮への取り込みを非常に促進したが、血流中に薬物を輸送しなかった。観察された血中レベルは、結合体の加水分解後の、循環への上皮からの薬物の拡散、または能動輸送の結果であった。
【０３０２】
（実施例１８）
（トランスポーター結合体の頬送達）
タキソールおよびＣｓＡの頬送達は、濃縮した溶液（２５０λの５ｍｇ／ｋｇ）を（その側面に）横たわる麻酔されたラットの口腔へ添加する工程を包含する。血液サンプルを、０時間（薬物注射前）および実験の継続時間の間、３０分毎に尾静脈から採取し、経験的に測定した。血液を１００λの０．５％ＥＤＴＡを含むガラス管に移すことによって、凝固を阻害し、そして血液を凍結した。
【０３０３】
口腔の扁平上皮層に侵入するトランスポーターの能力を、試験した。マウスを麻酔し、その頭を切り取り（ｔｉｐ）、その結果、ビオチン化ｒ９溶液を投与し得た。この動物を、この位置で１５分間維持し、その時点で屠殺し、そして舌および頬を解剖し、凍結し、切片化し、ストレプトアビジン−フルオレセインで染色し、そしてプロピジウムヨウ素で対比染色した。頬および舌の両方おいて、ビオチン化ペプチドは、複数の内皮層に迅速にかつ効率的に浸透し、そして組織の内部層へと深く浸透し皮膚の表皮および真皮の両方の染色を連想させる。
【０３０４】
第２の実施例において、ラットを麻酔し、そしてＣｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ：エタノール１：１中のタキソールおよびＣｓＡ（５ｍｇ／ｋｇ）の両方の溶液、またはＰＢＳ中で等モルの、これらの薬物に対応するｒ７結合体を、実験の継続時間の間、動物の頬袋中で単純にインキュベートした。ＬＣ  ＭＳを使用して、タキソールおよび早放性ｒ７結合体のみの血中レベルを測定した。口腔に投与した場合に血液中にタキソールが出現する量および動力学の両方（図３８）は、結腸中に注射した場合と異なった。タキソール結合体の頬投与は、ほとんど効果がないようであり、結腸内注射と比較して８分の１未満の量のタキソールが循環中に観察さた。別の差異は、改変されていない薬物の出現速度である。口腔に投与される場合、タキソールは最初の時点よって血流中までに出現するが、結腸注射において、検出可能な量のタキソールは、数時間にわたって出現しない。頬投与での循環中の、タキソールの出現におけるタキソールとｒ７−タキソール結合体との間に差異は存在しないが、結合体が使用される場合、約２倍ほど多い物質が、循環に到達する。
【０３０５】
（実施例１９）
この実施例は、ｐＨ感受性連結基を用いる、輸送部分にへのシイクロスポリンの結合体化を説明する（図６Ａおよび図９Ｂを参照のこと）。
【０３０６】
この実施例において、シクロスポリンを、無水クロロ酢酸を用いてそのα−クロロ酢酸エステルに変換し、６ｉを得る（図６を参照のこと）。次いで、このエステル６ｉをベンジルアミンで処理し、６ｉｉを得る。アミンとＢｏｃ−保護無水イミノニ酢酸との反応は、酸６ｉｉｉを提供し、次いで、これを、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化エステル（６ｉｖ）に変換する。Ｌ−アルギニン７量体との６ｉｖのカップリングは、ＢＯＣ−保護結合体６ｖを提供し、これを、確立された方法に従ってＢＯＣ保護基を除去することによって結合体６ｖｉに変換し得る。
【０３０７】
例えば、グリシン、ε−アミノカプロン酸またはγ−アミノブチル酪酸によって分離されたアルギニン基を有する輸送部分は、この実施例およびオリゴアルギニン輸送基を示す以下の実施例において、アルギニン７量体の代わりに使用され得る。
【０３０８】
（実施例２０）
この実施例は、輸送部分へのアシクロビルの結合体化を説明する。
【０３０９】
ａ．ｒ７ＣＯＮＨ２へのアシクロビルの結合体化
この実施例は、連結基を介するｒ７ＣＯＮＨ２へのアシクロビルの結合体化を説明する：
【０３１０】
【化２１】
2004530657.tif 000021
ｉ）アシクロビルα−クロロエステルの調製：
【０３１１】
【化２２】
2004530657.tif 000022
ジメチルホルムアミド（９ｍＬ）中のアシクロビル（１００ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノプリジン（５．４ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）および無水クロロ酢酸（２２６ｍｇ、１．３２ｍｏｌ）の溶液を、室温にて１８時間撹拌した。ジメチルホルムアミドを、エバポレートによって除去した。粗生成物を、逆相ＨＰＬＣ（２２ｍｍ×２５０ｍｍ  Ｃ−１８カラム、０．１％トリフルオロ酢酸での５〜２５％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ勾配、２１４ｎｍおよび２５４ｎｍ  ＵＶ検出）によって精製し、そして凍結乾燥した。生成物を白色粉末として得た（６２ｍｇ、４７％）。
【０３１２】
【化２３】
2004530657.tif 000023
ｉｉ）Ｈ２Ｎ−Ｃ−ｒ７−ＣＯＮＨ２へのアシクロビルａ−クロロエステルの結合体化
【０３１３】
【化２４】
2004530657.tif 000024
ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）中のアシクロビルα−クロロエステル（７ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）、Ｈ２Ｎ−Ｃ−ｒ７−ＣＯＮＨ２（５０ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（６．４μＬ、０．０３６ｍｍｏｌ）の溶液を、１８時間撹拌した。ジメチルホルムアミドを、エバポレートによって除去した。粗生成物を、逆相ＨＰＬＣ（２２ｍｍ×２５０ｍｍ  Ｃ−１８カラム、０．１％トリフルオロ酢酸での５〜２５％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ勾配、２１４ｎｍおよび２５４ｎｍ  ＵＶ検出）によって精製し、そして凍結乾燥した。所望の生成物を白色粉末として得た（２４ｍｇ、６９％）。
【０３１４】
【化２５】
2004530657.tif 000025
収率を、１．５モル当量よりもむしろ１０モル当量のジイソプロピルエチルアミンを使用することによって増加し得た。生成物を、白色粉末として再び得た（７９％）。
【０３１５】
【化２６】
2004530657.tif 000026
ｂ．ｒ５−Ｃｙｓ−ＣＯＮＨ２のビオチン含有誘導体へのアシクロビルの結合体化
【０３１６】
【化２７】
2004530657.tif 000027
反応を、上記の実施例において提供される合成技術を用いて、上記に説明されたように行った。
【０３１７】
ｉ）ビオチン−アミノカプロン酸−ｒ５−Ｃｙｓ（アシクロビル）−ＣＯＮＨ２を、白色粉末として得た（３６％）。
【０３１８】
【化２８】
2004530657.tif 000028
同様に、
ｉｉ）ビオチン−アミノカプロン酸−ｒ７−Ｃ（アシクロビル）−ＣＯＮＨ２−を白色粉末として得た（３３％）。
【０３１９】
【化２９】
2004530657.tif 000029
（実施例２１）
この実施例は、輸送部分へのヒドロコルチゾンの結合体化を説明する。
【０３２０】
ａ．ｒ７ＣＯＮＨ２へのヒドロコルチゾンの結合体化
ｉ）ヒドロコルチゾンａ−クロロエステルの調製：
【０３２１】
【化３０】
2004530657.tif 000030
乾燥ＴＨＦ中のヒドロコルチゾン（５００ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ）、スカンジウムトリフレート（４０８ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）および無水クロロ酢酸（７０８ｍｇ、４．１４ｍｍｏｌ）の溶液を、ジメチルアミノピリジン（５０６ｍｇ、４．１４ｍｍｏｌ）に添加した。ジメチルアミノピリジンの添加の際に、この溶液は明黄色に変化した。３０分後、この溶媒をエバポレートし、そして粗物質を酢酸エチル（１００ｍＬ）中へと取り上げた。酢酸エチル層を１．０Ｎ  ＨＣｌおよびブラインで洗浄した。この有機相を回収し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）そしてエバポレートし、白色固体として生成物を得た（５３３ｍｇ、８８％）。
【０３２２】
【化３１】
2004530657.tif 000031
ｉｉ）Ｒ’ＮＨ−Ｃｙｓ−ｒ７−ＣＯＮＨ２へのカップリング
【０３２３】
【化３２】
2004530657.tif 000032
ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）中のヒドロコルチゾンα−クロロエステル（３１ｍｇ、０．０７１ｍｍｏｌ）、Ｈ２Ｎ−Ｃ−ｒ７−ＣＯＮＨ２（１５０ｍｇ、０．０７１ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（１５μＬ、０．０８５ｍｍｏｌ）の溶液を、１８時間撹拌した。ジメチルホルムアミドを、エバポレートした。粗生成物を、逆相ＨＰＬＣ（２２ｍｍ×２５０ｍｍ  Ｃ−１８カラム、０．１％トリフルオロ酢酸での５〜３０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ勾配、２１４ｎｍおよび２５４ｎｍ  ＵＶ検出）によって精製し、そして凍結乾燥した。所望の生成物を白色粉末として得た（２５ｍｇ、１４％）。
【０３２４】
【化３３】
2004530657.tif 000033
１．２モル当量よりもむしろ１０モル当量のジイソプロピルエチルアミンを使用することによって、黄色粉末として所望の生成物を得た（収率５２％）。
【０３２５】
【化３４】
2004530657.tif 000034
ｂ．ｒ５−Ｃｙｓ−ＣＯＮＨ２のビオチン−含有誘導体へのヒドロコルチゾンの結合体化−ＣＯＮＨルアミン２
【０３２６】
【化３５】
2004530657.tif 000035
反応を、上記の実施例において提供される合成技術を用いて、上記に説明されたように行った。
【０３２７】
ｉ）ビオチン−アミノカプロン酸−ｒ５−Ｃ（ヒドロコルチゾン）−ＣＯＮＨ２−
１．２モル当量よりもむしろ１０モル当量のジイソプロピルエチルアミンを使用した。白色粉末を得た（６５％）。
【０３２８】
【化３６】
2004530657.tif 000036
ｉｉ）ビオチン−アミノカプロン酸−ｒ７−Ｃ（ヒドロコルチゾン）−ＣＯＮＨ２−
１．２モル当量よりもむしろ１０モル当量のジイソプロピルエチルアミンを使用した。白色粉末を得た（３６％）。
【０３２９】
【化３７】
2004530657.tif 000037
（実施例２２）
この実施例は、輸送部分へのタキソール結合体化を説明する。
【０３３０】
ａ．ｒ７−ＣＯＮＨ２へのタキソールの結合体化
この実施例は、タキソール結合体の調製への上記で概説した方法論の適用を説明する（図１２を参照のこと）。
【０３３１】
ｉ）タキソールａ−クロロ酢酸エステルの調製
【０３３２】
【化３８】
2004530657.tif 000038
タキソールを、無水α−クロロ酢酸で処理し、基本的に定量的な収率で、Ｃ−２’クロロアセチル誘導体１２ｉを得た。
【０３３３】
ｉｉ）タキソール結合体の形成
【０３３４】
【化３９】
2004530657.tif 000039
クロロ酢酸エステルのハロゲン分子を、アルギニンの７量体を含むＮ−末端（Ｌ）システインのチオールによって置換した。インビボにおけるプロテアーゼによるトランスポーター実体の分解を避けるために、Ｄ−アルギニンを構造単位（ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｕｎｉｔ）として使用した。結合体化反応を、ジイソプロピルエチルアミンの存在下、ＤＭＦ中、室温にて実行した。最終生成物を、ＲＰ−ＨＰＬＣによって単離し、そして白色粉末に凍結乾燥した。ネイティブな結合体（Ｒ＝Ｈ）が、システイン（第）一級アミンでそのＴＦＡ塩として単離したことに注意することは重要である。この結合体は、一般的に非常に吸湿性であり、そして水に容易に溶解する。
【０３３５】
結合体（ここで、Ｒ＝Ｈ）を、Ｃ２’エステルカルボニル上のＮ−末端窒素の求核攻撃を介して親薬物を放出するように設計した。遊離アミンのみがこの放出を可能にするので、この窒素のプロトン化状態はこの機構に対して重要である。さらに、両方の結合体は、単純なエステル加水分解に感受性である両方の結合体を作製する、共通のα−ヘテロ炭子を置換した酢酸部分を共有する。結合体は、さらなる放出経路を提供する。
【０３３６】
（実施例２３）
この実施例は、輸送部分に活性試薬を連結する２つの方法を説明する。例証は、ポリ−Ｄ−Ａｒｇ誘導体に連結されたレチノイン酸誘導体を提供するが、他の生物学的薬剤と本発明の輸送部分との間の連結に適用され得る。
【０３３７】
ａ．アルデヒド官能基を有する生物学的薬剤との間の連結
この実施例は、Ｄ−アルギニン（Ｈ２Ｎ−ｒ９−ＣＯ２Ｈ・１０ＴＦＡ）のナノマーと全てのｔｒａｎｓ−レチナールまたは１３−ｃｉｓ−レチナールのいずれかとの間の結合体の調製を説明する。図４０は、反応の略図を提供する。図４０において見られるように、４Åのモレキュラーシーブの存在下、ＭｅＯＨ中での、いずれか一方のレチナールとＨ２Ｎ−ｒ９−ＣＯ２Ｈ・１０ＴＦＡとの、室温にて４時間の縮合は、レチナールアルデヒドとアミノ末端基との間でのＳｃｈｉｆｆベース型連結の形成を生じる。結合体の精製を、モレキュラーシーブを濾過し、そして減圧下でメタノールを除去することによって達成し得る。
【０３３８】
ｂ．ｒ７−ＣＯＮＨ２へのレチノイン酸の結合体化
この実施例は、連結基を用いてレチノイン酸とｒ７−ＣＯＮＨ２との間の結合体の調製を説明する。
【０３３９】
【化４０】
2004530657.tif 000040
ここで、結合体の調製は、図４１中で概略されるスキームに従う。このスキームにおいて、レチノイン酸（４１ｉｉ）を４−ヒドロキシメチル−２，６−ジメチルフェノール（４１ｉ）のクロロ酢酸エステルと初めに合わせ、４１ｉｉｉとして示される結合体を得た。ジシクロヘキシルカルボジイミドおよび触媒量の４−ジメチルアミノピリジンの存在下での、塩化メチレン中の４１ｉとレチノイン酸との組み合わせは、５２〜５７％の収率でレチノイド誘導体４１ｉｉｉを提供した。ジイソプロピルエチルアミン（ＤＭＦ、室温、２ｈ）の存在下での、４１ｉｉｉとＨ２ＮＣｙｓ−ｒ７ＣＯＮＨ２・８ＴＦＡとの縮合は、所望の結合体化生成物４１ｉｖを提供する。
【０３４０】
（実施例２４）
この実施例は、輸送部分にアシクロビルのような活性な薬剤を連結する方法を説明する。図４２を参照のこと。
【０３４１】
アシクロビル（１当量）を、窒素雰囲気下で、乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解した。無水クロロ酢酸（ｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ）（１当量）、ピリジン（１当量）およびＤＭＡＰ（０．２５当量）を、撹拌しながら引き続き反応に添加した。この反応を、室温にてさらに４時間撹拌させた。この反応を、減圧下、溶媒の除去によって停止した。この残渣を、塩化メチレン中に溶解し、そして飽和塩化アンモニウム水溶液、続いて飽和重炭酸アンモニウム水溶液およびブラインで洗浄した。有機層を、減圧下で濃縮し、そして残渣をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、アシクロビルクロロアセチルエステルを得た。
【０３４２】
得られたクロロアセチルエステルを、窒素雰囲気下で、乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解した。この溶液を急速に撹拌しながらＨｕｎｉｇ’ｓ塩基（１当量）およびＡｃＨＮ−Ｃ−ａｃａ−Ｒ８−ＣＯＮＨ２＊８ＨＣｌに添加した。この反応を、全ての開始物質が消費されたことをＴＬＣ分析が同定するまで進めさせる（ｃａ  ２時間）。この反応を、減圧下、溶媒の除去によって停止した。この残渣を、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、所望のアシクロビル結合体を得た。
【０３４３】
（実施例２５）
この実施例は、輸送部分にアシクロビルのような活性な薬剤を連結する方法を説明する。図４３を参照のこと。
【０３４４】
ジスホスゲン（０．５当量）を、乾燥塩化メチレン中に溶解し、そして−１０℃まで冷却した。この溶液に、塩化メチレン中の溶液としてトリエチルアミン（１当量）を添加した。この混合物を、１５分間撹拌し、この時点でアシクロビルを塩化メチレン中の溶液としてこの反応物に添加した。この反応物を、室温にてさらに４時間、撹拌させた。この反応物を、飽和塩化アンモニウム水溶液でクエンチし、続いて飽和重炭酸アンモニウム水溶液およびブラインで洗浄した。有機層を、減圧下で濃縮し、そして残渣をシリカゲルを通す迅速な濾過によって精製し、アシクロビルクロロホルメートを得た。るえるブたしたンの接合体オチンがんゆう
クロロホルメートを、窒素雰囲気下で、乾燥塩化メチレンに溶解した。メルカプトエタノール（１当量）を、乾燥塩化メチレン溶液として、この反応物に添加した。この反応物を、窒素雰囲気下で１０時間撹拌させた。この溶液を、減圧下で濃縮し、高真空下に２４時間配置し、残ったメルカプトエタノールを除去した。この得られたメルカプトエチルカーボネートを、さらに精製することなく使用した。
【０３４５】
カーボネート（１当量）を、ＤＭＦ／水に溶解した。急速に撹拌しながら、この溶液に活性化ペプチドＮＰＹｓ−ＣＲ＊−ＣＯＮＨ２＊８ＨＣｌ（１当量）を添加した。明黄色が即時に発色し、そしてこの反応物を室温にてさらに５時間撹拌させた。この反応物を、ＲＰ−ＨＰＬＣによって直接的に精製し、所望のアシクロビル結合体を得た。
【０３４６】
（実施例２６）
この実施例は、輸送部分にコルチコイドステロイドのような活性な薬剤を連結する方法を説明する。図４４を参照のこと。
【０３４７】
（プレドニゾロンα−クロロエステル−）
乾燥ＴＨＦ中のプレドニゾロン（１．３８ｍｍｏｌ）、スカンジウムトリフレート（０．８３ｍｍｏｌ）および無水クロロ酢酸（４．１４ｍｍｏｌ）の溶液に、ジメチルアミノピリジン（４．１４ｍｍｏｌ）を添加した。この溶液は、ジメチルアミノピリジンの添加で明黄色に変化した。３０分後、この溶媒をエバポレートし、そして粗物質を酢酸エチル（１００ｍＬ）へと取り上げた。この酢酸エチル層を、１．０Ｎ  ＨＣｌおよびブラインで洗浄した。この有機相を回収し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そしてエバポレートして生成物を白色固体として得た。
【０３４８】
Ｈ２Ｎ−Ｃ（プレドニゾロン）−ｒ８−ＣＯＮＨ２：  ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）中のプレドニゾロンα−クロロエステル（１当量）、Ｈ２Ｎ−Ｃ−ｒ８−ＣＯＮＨ２（１当量）およびジイソプロピルエチルアミン（１．２当量）の溶液を、１８時間撹拌した。ジメチルホルムアミドを、エバポレートした。この粗生成物を、逆相ＨＰＬＣ（２２ｍｍ×２５０ｍｍ  Ｃ−１８カラム、０．１％トリフルオロ酢酸での５〜１０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ勾配、２１４ｎｍおよび２５４ｎｍ  ＵＶ検出）によって精製し、そして凍結乾燥し、９ＴＦＡ塩を得た。次いで、この物質をイオン交換クロマトグラフィーに供し、プレドロニゾン結合体（９  ＨＣｌ塩）を黄褐色固体として得た。
【０３４９】
本明細書中に記載される実施例および実施形態が、例示の目的のみのためであり、そしてその権利において、様々な改変または変化が、当業者に示唆されかつ本出願の精神および権限ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれることは、理解される。本明細書中に引用されるすべての出版物、特許および特許出願は、全ての目的のための参考として本明細書中に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０３５０】
【図１】図１は、α−クロロアセチルシクロスポリンＡ誘導体の調製のための反応スキームを示す。
【図２】図２は、システイン含有ペプチドのα−クロロアセチルシクロスポリンＡ誘導体とのカップリングのための一般的な手順を示す。
【図３】図３は、シクロスポリンＡ誘導体のビオチン標識ペプチドへのカップリングのための反応スキームを示す。
【図４】図４は、シクロスポリンＡ誘導体の標識していないペプチドとのカップリングのための反応スキームを示す。
【図５Ａ】図５Ａ〜Ｈは、切断可能なリンカーの種々の型を示し、これらのリンカーは、送達増強トランスポーターの生物学的に活性な薬剤または他の目的の分子との連結のために使用され得る。図５Ａは、ジスルフィド結合の例を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、光切断可能な（ｐｈｏｔｏｃｌｅａｖａｂｌｅ）リンカーを示す。このリンカーは、電磁放射への曝露によって切断される。
【図５Ｃ】図５Ｃは、切断可能なリンカーとして使用される修飾されたリジル残基を示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、送達増強トランスポーターＴが、抗癌剤パクリタキセルの２’酸素に連結された、結合体を示す。連結部分は、以下を含む（ｉ）送達増強トランスポーターに付着した窒素原子、（ｉｉ）窒素原子に対しパラ位に位置するリン酸モノエステル、および（ｉｉｉ）窒素原子に対しメタ位のカルボキシメチル基（このカルボキシルメチル基は、カルボン酸エステル連結によってパクリタキセルの２’酸素に結合されている）。
【図５Ｅ】図５Ｅは、アミノアルキルカルボン酸による、送達増強トランスポーターの生物学的に活性な薬剤（例えば、パクリタキセル）への架橋であり；リンカーアミノ基は、アミド連結によって送達増強トランスポータに結合され、そして、エステル連結によってパクリタキセル部分に結合される。
【図５Ｆ】図５Ｆおよび図５Ｇは、パクリタキセルおよび「ＴＡＸＯＴＥＲＥＴＭ」（Ｒ’＝Ｈ、Ｒ’’＝ＢＯＣ）についての構成骨格原子の化学構造および従来の番号付けを示す。
【図５Ｇ】図５Ｇは、タキソイド（ｔａｘｏｉｄ）化合物についての一般的な化学構造および環原子番号付けを示す。
【図６】図６は、Ｌ−アルギニンの七量体とシクロスポリンＡとの間の化学結合体についての合成スキーム（パネルＡ）、およびそのｐＨ依存性化学放出（パネルＢ）を示す。α−クロロエステル（６ｉ）を、置換をするためにヨウ化ナトリウムの存在下でベンジルアミンを用いて処理し、２級アミン（６ｉｉ）を得る。アミン（６ｉｉ）を、無水物（６）を用いて処理し、そして得られた粗酸（６ｉｉｉ）を、その対応するＮＨＳエステル（６ｉｖ）に変換した。次いで、エステル（６ｉｖ）を、へプタ−Ｌ−アルギニンのアミノ末端とカップリングし、Ｎ−Ｂｏｃ保護されたＣｓＡ結合体（６ｖ）を得る。最後に、ギ酸を用いるＢｏｃ保護基の除去によって、ＨＰＬＣ精製の後、そのオクタトリフルオロ酢酸塩として結合体（６ｖｉ）を得た。
【図７】図７は、放出可能なＲ７  ＣｓＡによる接触皮膚炎マウスにおける炎症の阻害を示す。Ｂａｌｂ／ｃマウス（６〜７週）に、アセトンオリーブオイル中の０．７％ＤＮＦＢ（９５：５）を１００μｌ腹部に塗布した。３日後、動物の両耳を、アセトン中の０．５％  ＤＮＦＢで再刺激した。再刺激の１時間後、５時間後、および２０時間後に、ビヒクルのみ、１％  Ｒ７ペプチドのみ、１％  ＣｓＡ、１％  放出不可能なＲ７  ＣｓＡ、０．０１％／０．１％／１．０％  放出可能なＲ７  ＣｓＡ、およびフッ化ステロイド陽性コントロール０．１％  トリアムシノロンアセトニドのいずれかで、マウスを処置した。耳の炎症を、再刺激の２４時間後に、バネを装着したキャリパーを用いて測定した。炎症の減少の百分率を、以下の式：（ｔ−ｎ）／（ｕ−ｎ）（ここで、ｔ＝処置した耳の厚さ、ｎ＝正常な未処置の耳の厚さ、およびｕ＝いかなる処置もしていない炎症した耳の厚さである）を用いて計算した。各群において、Ｎ＝２０動物である。
【図８】図８は、銅−ジエチレントリアミンペンタ酢酸錯体（Ｃｕ−ＤＴＰＡ）の調製のための手順を示す。
【図９】図９は、Ｃｕ−ＤＴＰＡをアミノカプロン酸を介してトランスポーターに連結するための手順を示す。
【図１０】図１０は、ヒドロコルチゾンの無水クロロ酢酸でのアシル化のための反応を示す。
【図１１】図１１は、アシル化ヒドロコルチゾンをトランスポーターに連結するための反応を示す。
【図１２】図１２は、タキソールのＣ−２’誘導体の調製のための反応を示す。
【図１３】図１３は、タキソール誘導体をビオチン標識ペプチドにカップリングするための反応の概略を示す。
【図１４】図１４は、標識していないペプチドをタキソールのＣ−２’誘導体にカップリングするための反応を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、他のＣ−２’タキソール−ペプチド結合体の形成のための反応スキームを示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、他のＣ−２’タキソール−ペプチド結合体の形成のための反応スキームを示す。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、他のＣ−２’タキソール−ペプチド結合体の形成のための反応スキームを示す。
【図１６】図１６は、薬物または他の生物学的因子がｐＨ−放出可能なリンカーによって送達増強トランスポーターに連結される結合体を合成するための、一般的なストラテジーを示す。
【図１７】図１７は、タキソール２’−クロロアセチル誘導体を合成するためのプロトコルの概略図を示す。
【図１８】図１８は、タキソール２’−クロロアセチル誘導体が、アルギニン七量体送達増強トランスポーターに連結されるストラテジーを示す。
【図１９】図１９は、図１８に図示される反応条件を用いて作製され得る、３つのさらなるタキソール−ｒ７結合体を示す。
【図２０】図２０は、タキソールおよび２つの異なるリンカーを用いる、３日間のＭＴＴ細胞傷害性アッセイの結果を示す。
【図２１】図２１は、以下のものの短縮型アナログのＦＡＣＳ細胞取り込みアッセイを示す：Ｔａｔ４９〜５７（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）、Ｔａｔ４９〜５６（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＱＲＲ）、Ｔａｔ４９〜５５（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＱＲ）、Ｔａｔ５０〜５７（Ｆｌ−ａｈｘ−ＫＫＲＲＱＲＲＲ）、およびＴａｔ５１〜５７（Ｆｌ−ａｈｘ−ＫＲＲＱＲＲＲ）。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度（１２．５μＭを示す）のペプチドとともに２３℃で１５分間インキュベートした。
【図２２】図２２は、以下のもののアラニン置換アナログのＦＡＣＳ細胞取り込みアッセイを示す：Ｔａｔ４９〜５７：Ａ−４９（Ｆｌ−ａｈｘ−ＡＫＫＲＲＱＲＲＲ）、Ａ−５０（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＡＫＲＲＱＲＲＲ）、Ａ−５１（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＡＲＲＱＲＲＲ）、Ａ−５２（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＡＲＱＲＲＲ）、Ａ−５３（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＡＱＲＲＲ）、Ａ−５４（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＡＲＲＲ）、Ａ−５５（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＱＡＲＲ）、Ａ−５６（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＱＲＡＲ）、およびＡ−５７（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＡ）。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度（１２．５μＭを示す）のペプチドとともに２３℃で１２分間インキュベートした。
【図２３】図２３は、Ｔａｔ４９〜５７のｄ−異性体およびｒｅｔｒｏ−異性体：ｄ−Ｔａｔ４９−５７（Ｆｌ−ａｈｘ−ｒｋｋｒｒｑｒｒｒ）、Ｔａｔ５７−４９（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＲＲＱＲＲＫＫＲ）、およびｄ−Ｔａｔ５７−４９（Ｆｌ−ａｈｘ−ｒｒｒｑｒｒｋｋｒ）のＦＡＣＳ細胞取り込みアッセイを示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度（１２．５μＭを示す）のペプチドとともに、２３℃で１５分間インキュベートした。
【図２４】図２４は、一連のアルギニンオリゴマーおよびＴａｔ４９−５７：Ｒ５（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＲＲＲＲ）、Ｒ６（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＲＲＲＲＲ）、Ｒ７（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＲＲＲＲＲＲ）、Ｒ８（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＲＲＲＲＲＲＲ）、Ｒ９（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ）、ｒ５（Ｆｌ−ａｈｘ−ｒｒｒｒｒ）、ｒ６（Ｆｌ−ａｈｘ−ｒｒｒｒｒｒ）、ｒ７（Ｆｌ−ａｈｘ−ｒｒｒｒｒｒｒ）、ｒ８（Ｆｌ−ａｈｘ−ｒｒｒｒｒｒｒｒ）、ｒ９（Ｆｌ−ａｈｘ−ｒｒｒｒｒｒｒｒｒ）のＦＡＣＳ細胞取り込みを示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度（１２．５μＭを示す）のペプチドとともに２３℃で４分間インキュベートした。
【図２５】図２５は、グアニジン置換ペプトイドの調製を示す。
【図２６】図２６は、ポリグアニジンペプトイドおよびｄ−アルギニンオリゴマーのＦＡＣＳ細胞取り込みを示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度（１２．５μＭを示す）のペプトイドおよびペプチドとともに２３℃で４分間インキュベートした。
【図２７】図２７は、ｄ−アルギニンオリゴマーおよびポリグアニジンペプトイドのＦＡＣＳ細胞取り込みを示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度（１２．５μＭを示す）の蛍光標識したペプトイドおよびペプチドとともに２３℃で４分間インキュベートした。
【図２８】図２８は、ｄ−アルギニンオリゴマーおよびＮ−ｈｘｇペプトイドのＦＡＣＳ細胞取り込みを示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度（６．３μＭを示す）の蛍光標識したペプトイドおよびペプチドとともに２３℃で４分間インキュベートした。
【図２９】図２９は、ｄ−アルギニンオリゴマーおよびＮ−ｃｈｇペプトイドのＦＡＣＳ細胞取り込みを示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度（１２．５μＭを示す）の蛍光標識したペプトイドおよびペプチドとともに２３℃で４分間インキュベートした。
【図３０】図３０は、送達増強トランスポーターをトリアゾール環構造を含む薬物に結合するための一般的なストラテジーを示す。
【図３１Ａ】図３１Ａおよび図３１Ｂは、ＦＫ５０６が送達増強トランスポーターに結合された結合体を作製するための合成スキームを示す。
【図３１Ｂ】図３１Ａおよび図３１Ｂは、ＦＫ５０６が送達増強トランスポーターに結合された結合体を作製するための合成スキームを示す。
【図３２】図３２は、Ｃａｃｏ−２細胞に効果的に導入された、アルギニン（リジンではない）の短いオリゴマーを示す。Ｃａｃｏ−２細胞を、示される各ペプチドと、異なる濃度でインキュベートし、洗浄し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。取り込みは、アジ化ナトリウムを含むプレインキュベーションによって阻害され得、取り込みが、エネルギー依存性であったことを実証する。
【図３３】図３３は、蛍光性タキソールまたはＤ−アルギニンの七量体（ｒ７）もしくはデカマー（ｒ１０）のいずれかとの放出不可能な蛍光性タキソール結合体に曝露されたＣａｃｏ−２細胞の測定された蛍光を示す。
【図３４】図３４は、本報告において記載される実験の持続時間の間での１００オームｃｍ２より大きい安定な経上皮電気抵抗の測定により、Ｃａｃｏ−２単層の完全性を実証する。
【図３５】図３５は、Ｃａｃｏ−２細胞単層を介する輸送１時間後の拡散装置の基底外側チャンバーにおけるＦｌ  ａｃａ  ｒ５、Ｆｌ  ａｃａ  ｒ９、ルシファーイエロー、またはヒドロコルチゾンのいずれかの蓄積を示す。
【図３６】図３６は、結腸内注射後、３０分間隔のＬＣ  ＭＳ  ＭＳにより測定されたラットにおけるＣｓＡの血中レベルを示す。ＣｓＡを、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  Ｅｌ：エタノール  １：１の中において投与し、一方、ＣｓＡ結合体を、ＰＢＳの中において投与した。ＣｓＡ結合体（ＣＧＣ１０７２）のＰＢＳ中、ｐＨ７．４、３７℃での半減期は１．５時間であった。
【図３７】図３７は、結腸内注射後、３０分間隔のＬＣ  ＭＳ  ＭＳにより測定されたラットにおけるタキソールの血中レベルを示す。タキソールを、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ：エタノール  １：１の中において投与し、一方、２つのタキソール結合体を、ＰＢＳの中において投与した。遅延して放出する結合体（１４）のＰＢＳ中、ｐＨ７．４、３７℃での半減期は、５時間であったが、速放性結合体（１３）の半減期は、１０分であった。実施例１８を参照のこと。
【図３８】図３８は、口腔送達後、３０分間隔のＬＣ  ＭＳ  ＭＳにより測定されたラットにおけるタキソールの血中レベルを示す。タキソールを、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  Ｅｌ：エタノール  １：１の中において投与し、一方、タキソール結合体を、ＰＢＳの中において投与した。結合体（１３）のＰＢＳ中、ｐＨ７．４、３７℃での半減期は、１０分であった。
【図３９】図３９は、Ｎ末端システイン基を介すｒ７−アミドに対するアシクロビルの結合体を描く。ビオチン含有トランスポーターとの結合体もまた、示す。
【図４０】図４０は、レチナールとｒ９との間に形成される結合体を示す（スペーシングアミノ酸なしで示す）。
【図４１】図４１は、レチノール酸−ｒ９結合体の調製における切断可能なリンカーの使用を描く。
【図４２】図４２は、アシクロビルのような活性薬剤のトランスポーター部分への連結方法を描く。
【図４３】図４３は、アシクロビルのような活性薬剤のトランスポーター部分への連結方法を描く。
【図４４】図４４は、コルチコイドステロイドのような活性な薬剤のトランスポーター部分への連結方法を描く。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ｃ】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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