(57)【要約】  【課題】カロテノイド、主にアスタキサンチンを大量に生産することができる微生物およびこれを用いたカロテノイド類の生産方法を提供する。  【解決手段】  培地１Ｌあたり７２０ｍｇ以上のカロテノイドを生産するカロテノイド生産性パラコッカス属細菌の育種により得られたカロテノイド生産性が向上した微生物およびこれを用いたカロテノイド類の生産方法を用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地１Ｌあたり７２０ｍｇ以上のカロテノイドを生産することを特徴とするカロテノイド生産性パラコッカス属細菌の育種により得られたカロテノイド生産性が向上した微生物。
【請求項２】
培地１Ｌあたり２５０ｍｇ以上のアスタキサンチンを生産することを特徴とするカロテノイド生産性パラコッカス属細菌の育種により得られたカロテノイド生産性が向上した微生物。
【請求項３】
前記微生物がカロテノイド生産性パラコッカス属細菌ＴＳＴＴ０５２株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６９０）であることを特徴とする請求項１ないし２のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項４】
カロテノイド類生産能を有する微生物を培養してカロテノイド類を製造する方法において、微生物を含む培養液中の炭素源濃度を低濃度に維持しつつ培養することを特徴とするカロテノイド類の生産方法。
【請求項５】
微生物が、パラコッカス属細菌Ｎ−８１１０６株またはその変異株であることを特徴とする請求項４に記載のカロテノイド類の生産方法。
【請求項６】
変異株がＴＳＴＴ０５２株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６９０）であることを特徴とする請求項４ないし５に記載のカロテノイド類の生産方法。
【請求項７】
培養液中の炭素源濃度を、１０ｇ／Ｌ以下に維持することを特徴とする請求項４から６のいずれかに記載のカロテノイド類の生産方法。
【請求項８】
培養液中の炭素源濃度を、培養中のいずれの時期においても炭素源の枯渇が生じない濃度に維持することを特徴とする請求項４〜７のいずれかに記載のカロテノイド類の生産方法。
【請求項９】
炭素源の枯渇が培養液中の炭素源濃度として０ｇ／Ｌであり、かつ培養する微生物の呼吸活性の低下を伴う状態であることを特徴とする請求項８に記載のカロテノイド類の生産方法。
【請求項１０】
培養液から発生する炭酸ガス量を測定し、当該測定値に基づき炭素源供給量を制御して培養液中の炭素源濃度を維持することを特徴とする請求項４〜９のいずれかに記載のカロテノイド類の生産方法。
【請求項１１】
培養液から発生する炭酸ガス量と培養液への炭素源供給量とが比例するように設定して、培養液中の炭素源濃度を制御することを特徴とする請求項４〜１０のいずれかに記載のカロテノイド類の生産方法。
【請求項１２】
カロテノイド化合物の代謝アナログであって増殖を阻害する化合物に対して耐性を示すカロテノイド生産性微生物変異株。
【請求項１３】
請求項１１記載の微生物によりカロテノイドを製造する方法。
【請求項１４】
カロテノイド化合物の代謝アナログによりカロテノイド生産性微生物を育種する方法。
【請求項１５】
カロテノイド生産性微生物の増殖能を向上させることを特徴とする請求項１３記載の育種方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規微生物およびそれを用いたカロテノイド、特にアスタキサンチンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アスタキサンチンは従来よりサケ・マス・マダイなどの養殖魚類の色揚げに用いられており、また近年ではその抗酸化作用から健康食品などへの利用が検討されている化合物である。アスタキサンチンは南極オキアミ等の甲殻類から抽出、或いは酵母や微細藻類などの培養により天然から得られるが、供給の安定性やコストの問題から現在では化学合成品が広く用いられている。しかしながら、化学合成品には製法由来の不純物、とくに合成反応に用いられる劇薬類の混入の不安があり、安全性の面から天然品の供給が望まれている。一方で、天然品には先に述べた供給の安定性やコストの問題があり、特に酵母や微細藻類の培養によって得られたものには副産物として脂肪酸エステル体が混在する問題があり、また細胞壁が硬いため、抽出に複雑な工程を経る必要があるという問題があった。
【０００３】
その改良として特開平７−１８４６６８号公報に海洋性アグロバクテリウム属（後に、パラコッカス属に属する細菌に再分類された（例えば、非特許文献１、２、３を参照）細菌Ｎ‐８１１０６（寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ‐１４０２３号））の培養により得る方法が開示されている（例えば特許文献１参照）。当該発明によれば、海洋性細菌を培養した後の菌体を回収した後、アセトンなどの有機溶媒と菌体を混和・攪拌するだけで容易にアスタキサンチンを抽出できるという利点がある。しかしながら、当該細菌を培養して得られるアスタキサンチンは培養液１リットルあたり０．１ｍｇ程度であり、生産量の向上が望まれていた。また、細菌の培養によるアスタキサンチンの製法としては特開２００１−３５２９９５号公報に土壌細菌を用いた製造法の記述があり、当該発明では１リットルあたり１２８ｍｇの製造例が報告されている（例えば特許文献２参照）。しかしながら、マスやマダイなど海産物の養殖に使用するためには、それらが生育する環境から得られた微生物を用いることが安全性の面から好ましいと考えられ、前述の海洋性微生物による製造法の改良が望まれていた。
【０００４】
これらの問題を解決するため、海洋性アグロバクテリウム属細菌Ｎ‐８１１０６（寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１４０２３号）を用いた変異育種により、培地１リットルあたり１９．４ｍｇのアスタキサンチンを生産するＴＳＵＧ１Ｃ１１（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４１６）株の取得を報告している（特許文献３参照）。その後更なる育種を経て、培地１リットルあたりアスタキサンチン２２０ｍｇ、総カロテノイド量４００ｍｇを生産するＴＳＮ１８Ｅ７（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４６）株の取得を報告している（特許文献３参照）。しかし、工業的な生産を考えると、より多くのアスタキサンチン等のカロテノイドを生産できることが好ましいことから、さらに生産性が向上した菌株が望まれていた。
【０００５】
また、工業的な微生物の培養、特に大腸菌や酵母の培養において、必要な栄養源を一度に仕込んで行う回分培養法に比べて、培養中に培地成分を追加しながら培養する流加培養法により目的物や微生物菌体が高い収率で得られることがあることが知られている。ここで培養中に培地成分を追加することを流加と呼ぶ。流加培養は供給する栄養源の濃度を任意に、多くの場合は低い濃度に、制御ができる利点があり、高濃度基質により目的物の生産や増殖が阻害される場合や、アルコールや有機酸などの副生成物が生産される場合に、それらを抑制できるためである。特に培地成分のうち、グルコースのような糖類を高濃度とした場合に異化物抑制と呼ばれる目的物の生産が抑制されることや、メタノールやアルコール類を高濃度にした場合にはその毒性により微生物の増殖が抑制されることが良く知られている。また、グルコースを高濃度とした場合には、酵母の場合ではエタノールが、大腸菌の場合では酢酸が蓄積し、それらがそれぞれ２０ｇ／Ｌ又は５ｇ／Ｌを超えると副生成物により増殖が抑制されることが知られている。また、副生物の生産は増殖を抑制するだけでなく、目的物質の品質を低下させることや精製を困難にさせることになり好ましくないことである。しかしながらこれらの知見は、主に大腸菌や酵母の培養において観察される現象であり、当該発明の対象となるカロテノイド生産性微生物においては、栄養源の濃度が与える影響はこれまでまったく知られていなかった。
【０００６】
対象となる栄養源としては消費量が多い糖類などの炭素源があげられるが、その消費速度は微生物の生育状態により一定ではないため、培養中に炭素源の濃度を一定に維持するためには微生物の生育状態を何らかの方法でモニターしつつ、流加量を制御する必要がある。そのために種々の提案がなされている。例えば、酸素消費量を指標として炭素源を流加する方法が知られている。この方法では供給ガスおよび排気ガス中の酸素濃度差より酸素消費量が求められる。しかしながら酸素濃度の測定は比較的誤差が大きく、またレスポンスが遅いという欠点があり、培養中の微生物活性を精度良く推定できないため、予想を越えた変化が起きた場合には制御が困難になるという問題がある。排ガス組成の分析による方法としては呼吸商（ＲＱ）を指標として流加を行う方法も知られている。呼吸商は例えば酵母の培養において醗酵と呼吸の割合を示す指標であり、微生物の代謝状態を大きく反映するという利点がある（例えば、非特許文献４参照）。しかしながら酵母以外の微生物においてはその有効性は明らかではなく、また、呼吸商は供給ガスおよび排気ガスとの酸素濃度及び炭酸ガス濃度差から計算されるため、上記の酸素濃度測定の問題が存在するだけでなく、酸素濃度と炭酸ガス濃度の二つの指標の測定値からの計算が必要であり、データー処理が比較的複雑であるという問題があった。
【０００７】
その他の物理化学的指標として、ｐＨの変化や溶存酸素（ＤＯ）の変化を利用した方法があるが、これらはセンサーの応答速度等に問題があり、炭素源が枯渇した場合にはその修正へのレスポンスが遅く、枯渇によるストレスが生じて生物代謝活性に変化が生じる問題がある。オンライングルコース分析計による方法では、必要サンプル量、分析時間、精度、安定性、液性等の影響から長時間の安定制御に問題がある。オンラインレーザー濁度計による方法は菌体が高密度になると精度が低下するなどの問題があった（例えば、非特許文献５参照）。
【０００８】
以上のことから、新たな方法の提案が求められていただけでなく、これらは酵母や大腸菌を対象として開発された方法であるため、本願発明の対象となるカロテノイド生産性の細菌に対するこれらの指標の有効性は全く知られていないという問題があった。
【特許文献１】特開平７−１８４６６８号公報
【特許文献２】特開２００１−３５２９９５号公報
【特許文献３】特開２００５−５８２１６号公報
【非特許文献１】インターネット（海洋バイオテクノロジー研究所ホームページ）、株式会社  海洋バイオテクノロジー研究所、ＭＢＩＣ（菌株コレクションデータベース）、［ｏｎｌｉｎｅ］、掲載年月日不明、９ページ目の「ｃａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ」、「ｓｔｒａｉｎ  ｎａｍｅ」及び「１６ｓ」の項、  ［平成１７年６月８日検索］、インターネット：＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｃｏｄ．ｍｂｉｏ．ｃｏ．ｊｐ／ｍｂｉｈｐ／ｊ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ＞
【非特許文献２】インターネット（国立遺伝学研究所ホームページ）大学共同利用機関法人  情報・システム研究機構  国立遺伝学研究所  日本ＤＮＡデータバンク、”ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ”、［ｏｎｌｉｎｅ］、２００２年１０月８日、３ページ目の「ＯＲＩＧＩＮ」の項、［平成１７年６月８日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ＞
【非特許文献３】インターネット（米国Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈホームページ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、［ｏｎｌｉｎｅ］、２００２年１０月８日、４頁目の「Ｓｏｕｒｃｅ  ｏｒｉｇｉｎｅ」および「Ｆｅａｔｕｒｅｓ」の項、［２００５年１０月１８日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／＞
【非特許文献４】村山と竹本、東洋曹達研究報告第２８巻４９−５８頁、１９８４年
【非特許文献５】Ｙａｍａｎｅ，Ｔら，Ｊ．  ｏｆ  Ｆｅｒｍｅｎｔ．  Ｂｉｏｅｎｇ．，７５，４４３，１９９３年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、カロテノイド、主にアスタキサンチンを大量に生産することができる海洋性微生物の提供およびその微生物を用いたカロテノイドおよび／またはアスタキサンチンの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題に関し鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は、カロテノイド生産性パラコッカス属細菌の育種により得られることを特徴とする、菌体の高密度化によりカロテノイド生産性が向上したパラコッカス属細菌である。また、本発明は、そのような細菌を培養し、菌体又は培養液からカロテノイドを回収することを特徴とするカロテノイドの製造法である。すなわち、本発明は以下に関するものである。
【００１１】
（１）培地１Ｌあたり７２０ｍｇ以上のカロテノイドを生産することを特徴とするカロテノイド生産性パラコッカス属細菌の育種により得られたカロテノイド生産性が向上した微生物。
（２）培地１Ｌあたり２５０ｍｇ以上のアスタキサンチンを生産することを特徴とするカロテノイド生産性パラコッカス属細菌の育種により得られたカロテノイド生産性が向上した微生物。
（３）前記微生物がカロテノイド生産性パラコッカス属細菌ＴＳＴＴ０５２株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６９０）であることを特徴とする（１）ないし（２）のいずれか１項に記載の微生物。
（４）カロテノイド類生産能を有する微生物を培養してカロテノイド類を製造する方法において、微生物を含む培養液中の炭素源濃度を低濃度に維持しつつ培養することを特徴とするカロテノイド類の生産方法。
（５）微生物が、パラコッカス属細菌Ｎ−８１１０６株またはその変異株であることを特徴とする（４）に記載のカロテノイド類の生産方法。
（６）変異株がＴＳＴＴ０５２株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６９０）であることを特徴とする（４）ないし（５）のいずれか１項に記載のカロテノイド類の生産方法。
（７）培養液中の炭素源濃度を、１０ｇ／Ｌ以下に維持することを特徴とする（４）から（６）のいずれかに記載のカロテノイド類の生産方法。
（８）培養液中の炭素源濃度を、培養中のいずれの時期においても炭素源の枯渇が生じない濃度に維持することを特徴とする（４）から（７）のいずれかに記載のカロテノイド類の生産方法。
（９）炭素源の枯渇が培養液中の炭素源濃度として０ｇ／Ｌであり、かつ培養する微生物の呼吸活性の低下を伴う状態であることを特徴とする（８）に記載のカロテノイド類の生産方法。
（１０）培養液から発生する炭酸ガス量を測定し、当該測定値に基づき炭素源供給量を制御して培養液中の炭素源濃度を維持することを特徴とする（４）から（９）のいずれかに記載のカロテノイド類の生産方法。
（１１）培養液から発生する炭酸ガス量と培養液への炭素源供給量とが比例するように設定して、培養液中の炭素源濃度を制御することを特徴とする（４）から（１０）のいずれかに記載のカロテノイド類の生産方法。
（１２）カロテノイド化合物の代謝アナログであって増殖を阻害する化合物に対して耐性を示すカロテノイド生産性微生物変異株。
（１３）（１２）記載の微生物によりカロテノイドを製造する方法。
（１４）カロテノイド化合物の代謝アナログによりカロテノイド生産性微生物を育種する方法。
（１５）カロテノイド生産性微生物の増殖能を向上させることを特徴とする（１４）に記載の育種方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の新規微生物により、養殖魚類の色揚げ用飼料などとして有用なアスタキサンチンをはじめとするカロテノイドを効率よく製造することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のカロテノイド生産性が向上した新規な微生物は、培地１Ｌあたり７２０ｍｇ以上のカロテノイドを生産することを特徴とするカロテノイド生産性パラコッカス属細菌ＴＳＮ１８Ｅ７株の育種により得られたカロテノイド生産性が向上した微生物、または培地１Ｌあたり２５０ｍｇ以上のアスタキサンチンを生産することを特徴とするカロテノイド生産性パラコッカス属細菌ＴＳＮ１８Ｅ７株の育種により得られたカロテノイド生産性が向上した微生物である。
【００１４】
さらに詳しくは、カロテノイド生産性が向上した新規な微生物としては、カロテノイド生産性パラコッカス属細菌ＴＳＴＴ００１株（受託機関名：特許生物寄託センター、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６７０）である。さらに、本発明においては、ＴＳＴＴ００１株のカロテノイド生産性を改良したＴＳＴＴ０３１株（受託機関名：特許生物寄託センター、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６８９）、ＴＳＴＴ０５２株（受託機関名：特許生物寄託センター、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６９０）である。  本発明の微生物は海洋性アグロバクテリウム属細菌（後に、パラコッカス属に属する細菌として再分類された）Ｎ−８１１０６株の育種により誘導されたパラコッカス属細菌ＴＳＮ１８Ｅ７株をさらに育種することにより誘導された新規な微生物である。Ｎ−８１１０６株は株式会社海洋バイオテクノロジー研究所により発見された微生物であり、特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１４０２３号として寄託されている。Ｎ−８１１０６株は細胞中にアスタキサンチンを主なカロテノイドとして蓄積するが、その他にβ−カロテン、β−クリプトキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、カンタキサンチン、３’−ヒドロキシエキネノン、シス−アドニキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチンなどの多様なカロテノイドを蓄積することも知られている（例えば、Ｙｏｋｏｙａｍａ  ａｎｄ  Ｍｉｋｉ（１９９５）、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、  １２８、１３９−１４４を参照）。
【００１５】
本発明の微生物はパラコッカス属細菌ＴＳＮ１８Ｅ７株の育種により誘導されるが、育種の方法としては自然突然変異により派生した優良菌株を選別していく方法などの他に、変異原物質や紫外線で細胞を処理することによって変異を加速させたのちに生産性が向上した菌株を選別していく方法や、以上の様な方法で得られた性質の異なる菌株同士を細胞融合させる方法など様々な方法を行うことが出来る。特に変異原物質を用いる方法は短期間に有用な菌株を得る方法として好ましく用いることが出来る。変異原物質としてはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、メタンスルホン酸エチル等の化合物が使用できる。
【００１６】
育種方法の一例をあげると、予め培養して得られたパラコッカス属細菌ＴＳＮ１８Ｅ７株の菌体をこれらの化合物の水溶液に懸濁して一定時間放置した後に遠心分離などの方法で菌体を回収して変異原物質を除去する。その後平板培地上で培養し、優良菌株のコロニーを選択する。コロニーの選択は色調の濃いコロニーを選択・分離し、液体培養を行い、次いで、菌体からカロテノイドを抽出してカロテノイド生成量や組成をＨＰＬＣなどで分析し、生産性の向上した菌株を絞り込むことにより優良な菌株を得ることができる。
【００１７】
しかしながら、一方で上記のように化学物質を用いてランダムに変異を導入する場合、菌株の育種を行う毎に望ましくない変異が導入され細菌の生育能が低下してしまうことがある。他方で、変異育種を繰返すことによりカロテノイドの生産が細胞内において過剰となり、過度な調節が起こり生育能が低下することもある。これらの現象はともに発酵生産の観点から望ましくない。本発明者らは、育種に用いる変異株分離用平板培地にカロテノイドの構造類縁体である代謝アナログを所定量添加することにより親株と同等あるいは親株に対して生育能の上昇したカロテノイド生産菌株を得ることを見出した。すなわち、平板培地に代謝アナログを添加することにより、培地上にスプレッドした菌株は代謝アナログを細胞内に取り込み、カロテノイド高蓄積環境下と同等となり、ほとんどの菌株は生育能が減少しコロニーを形成することができない。一方で、コロニーを形成するカロテノイドの代謝アナログ耐性株は、カロテノイドが一定量細胞内に蓄積した場合においても良好に生育する菌株である。
【００１８】
一般に、微生物では代謝物質が一定量生産されると、その物質がフィードバック等の調節を受けるため一定以上生産することができなくなる。細胞を構成している物質がそれぞれの量で調和しているからである。これに対して、微生物の育種は所望の物質の生産性を向上させるなど、細胞内の調和を乱す取り扱いである。すなわち、育種を繰返すことにより所望物質の合成能が著しく向上し、細胞内において、一定量を超える所望物質の生産が続くと微生物自体の生育能が極端に減少することがある。この機構を解除する方法として代謝アナログ存在下において生育する代謝アナログ耐性株を分離すればよい。
【００１９】
本発明において代謝アナログ耐性を獲得させる微生物としては、カロテノイド代謝アナログにより増殖を阻害される微生物であれば良く、パラコッカス属に属する細菌を例示することができる。
代謝アナログとしてはカロテノイドに対するアナログ性を有すればよく、α−ヨノン（α−ｉｏｎｏｎｅ）、β−ヨノン（β−ｉｏｎｏｎｅ）等を挙げることができる。平板培地に添加する濃度は育種対象の微生物に対して生育阻害実験等を行い、適当な濃度を設定すれば良い。好ましくは終濃度０．０１〜１０００  ｍＭ、さらに好ましくは１〜１０  ｍＭである。
本発明において、優良菌株は適当な菌株を評価し決定することができる。固体培地を利用した場合には、任意のコロニーをピックアップし、液体培養を行い、増殖能、カロテノイド生産能を評価することにより評価可能である。
【００２０】
本発明の方法で使用された微生物は従来方法として知られている栄養培地中で培養することができる。培養工程で使用される菌株は、公知方法に従って、画線培養プレートから発酵容器に移すことができる。好適な方法は、寒天平板培地、斜面寒天培地およびフラスコ培養液を用いた方法である。
【００２１】
なお、本発明に用いる培地としては、細菌が増殖しカロテノイドを生産し得るものであればいずれを使用してもよく、炭素源には廃糖蜜、グルコース、フルクトース、マルトース、ショ糖、デンプン、乳糖、グリセロール、酢酸などが、窒素源にはコーンスティープリカー、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粕等の天然成分や、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩等やグルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン等のアミノ酸類が、無機塩にはリン酸１ナトリウム、リン酸２ナトリウム、リン酸１カリウム、リン酸２カリウム等のリン酸塩や塩化ナトリウムなどが、金属イオンには塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸第１鉄、硫酸第２鉄、塩化第１鉄、塩化第２鉄、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、塩化カルシウム・２水和物、硫酸カルシウム、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化銅、硫酸マンガン、塩化マンガンなどが、ビタミン類として酵母エキスやビオチン、ニコチン酸、チアミン、リボフラビン、イノシトール、ピリドキシン等が使用できる。
【００２２】
本発明のアスタキサンチン等のカロテノイドを製造せしめる条件での新規微生物の培養の条件については、いずれの一般方法を用いて実施してもよい。本方法の好適な実施態様としては、培養は培養液中で行うことが好ましい。この液内培養に関しては通常の液内培養で用いられる条件を使用してもよい。好適には、培養温度１０から３５℃に、培地のｐＨを６から９の範囲に設定し、２０から２００時間発酵させるのが好ましい。培養温度については培養初期、中期、後期に区別してそれぞれの段階で温度を変えてもよい。本発明の栄養培地を使用した好適な条件は、培養温度２０から２８℃、ｐＨが約７．０、培養時間が５０から１５０時間である。
【００２３】
本微生物の培養においては糖濃度を低濃度かつ枯渇しない条件に維持することで、微生物の生育阻害や有機酸などの副生成物の生産が抑制され、カロテノイドが良好に生産される。また流加量の制御においては微生物の呼吸によって生じる炭酸ガスの発生量に比例して流加量を調節することで、培養液中の炭素源を簡便な方法で枯渇を防ぎつつ低濃度に維持できる。
【００２４】
本発明においては微生物を含む培養液中の炭素源濃度を低濃度に維持しつつ培養するものであることから、前記した炭素源等の培地成分を任意の濃度に仕込んで培養を開始し、微生物の増殖により消費されて目的の濃度になった後、別途調製した高濃度の溶液をポンプ等で培養液に流加する。このとき炭素源としてグルコースを用いる場合、好ましい開始時の濃度は０〜２０ｇ／Ｌである。また流加用のグルコース溶液の濃度は、培養液の液量の増加が抑えられるため高濃度であることが好ましく、３００〜９００ｇ／Ｌの溶液が使用される。
【００２５】
培養時の炭素源の濃度は以下の流加式（１）に基づいて流加用の溶液を培養液内に送液することにより、目的の濃度に制御される。
Ｆ＝Ａ×ｆ×（ＣＣＯ２ｏｕｔ−ＣＣＯ２ｉｎ）      （１）
式（１）中、Ｆは炭素源流加速度（単位：ｇ／ｍｉｎ）を意味する。Ａの値は係数（単位：ｇ／Ｌ）であり、使用する醗酵槽やガス分析計の機種、そして微生物の種類や生育状態に応じて設定される定数である。本定数は予備実験で求めた値にもとづき、微生物の生育状態に応じて、適宜適切な値に設定を変更していくことが好ましい。一般的に培養の初期では高い値となり、後期では低い値となる。ｆは発酵槽に供給する空気の通気量（単位：Ｌ／ｍｉｎ）であり、１分間あたりの空気の流量を示す通気量ｆの値も任意に設定されるが、通常０．１〜５．０ＶＶＭ（培養液１Ｌに対して０．１〜５．０Ｌ／ｍｉｎ）が好ましく用いられる。ＣＣＯ２ｏｕｔは排気ガス中の炭酸ガス濃度（単位：容量％）、ＣＣＯ２ｉｎは供給ガス中の炭酸ガス濃度（単位：容量％）を表す。
【００２６】
本発明においては、培養液中の炭素源濃度を低濃度に維持するものであるが、その濃度としては、流加により制御される目的の濃度は炭素源が枯渇せず、また１０ｇ／Ｌを越えない濃度が好ましく、より好ましくは６ｇ／Ｌ以下の濃度である。炭素源濃度が１０ｇ／Ｌを超えた状態で培養を行うと有機酸が副成物として生産されることがあり、目的物であるカロテノイドに混入して品質を低下させるため好ましくないだけでなく、多量に蓄積した場合には微生物の生育やカロテノイドの生産を抑制する可能性がある。特に１００ｇ／Ｌを超えると生育やカロテノイドの生産が大きく阻害される。
【００２７】
炭素源の枯渇は、微生物の種類や生育の状態により影響が異なるが、カロテノイド生産菌の培養においてはその培養初期から中期に枯渇が生じると、生育やカロテノイド生産への阻害が生じる可能性がある。枯渇した状態が継続する期間も影響があり、数分間の枯渇であれば大きな影響はないが、１０分間以上枯渇してＤＯが上昇した状態が継続すると、カロテノイドの生産が抑制される。
【００２８】
枯渇が生じたことを見分ける方法については特に限定は無いが、呼吸活性の低下により知ることができる。呼吸活性の低下は、例えば培養液の溶存酸素濃度（ＤＯ）の上昇、排ガス中の酸素濃度の上昇や炭酸ガス濃度の低下、ｐＨの上昇として現れる。特にＤＯを好適な指標とすることができる。炭素源の濃度が十分に維持されている場合には、微生物の呼吸により酸素が消費されるためＤＯは酸素飽和濃度より低い値に維持されるが、炭素源の枯渇により微生物の呼吸活性が低下してＤＯが急激に上昇するためである。
【００２９】
枯渇を防ぐため、ＤＯの急激な上昇に連動させて炭素源を追加することもできる。排ガス組成やｐＨを枯渇の指標として用いる場合にはＤＯを指標とした場合に比較して応答が遅い傾向があるのでより注意が必要となる。ここで炭素源濃度が０ｇ／Ｌの場合でも呼吸活性の低下が生じていない場合は枯渇した状態ではない。かかる状況は菌体の消費速度と炭素源の補給速度が一致している場合に生じる。この場合は炭素源濃度が０ｇ／Ｌであっても、微生物の代謝状態を良好に維持するために必要な炭素源は補給されており、生育およびカロテノイド生産ともに良好に進行する。
【００３０】
本発明においては、培養液から発生する炭酸ガス量を測定し、この測定値に基づき炭素源供給量を制御して培養液中の炭素源濃度を維持してカロテノイド類を効率的に生産することができる。
【００３１】
炭素源の流加の指標とする炭酸ガス濃度の分析法には特に限定は無く、例えば培養液から発生する炭酸ガス量を測定するにおいては、通常市販されている培養装置用の排ガス分析計を用いることができる。
【００３２】
また、培養液から発生する炭酸ガス量の測定値に基づき炭素源供給量を制御するには、例えばデータ処理用の各種装置等を用い、当該データ処理装置が受けた炭酸ガス量測定値信号を適切な制御式に基づいて送液ポンプへ送液量を決定する信号を転送することで制御する等の方法が例示できる。
【００３３】
さらに具体的には、データ処理の効率化のためにパーソナルコンピューター等のデータ処理装置へのデータ転送が可能な装置を例示することができ、また、炭素源の送液量の制御方法にも特に限定はなく、排ガス中の炭酸ガス濃度の分析値より前記した式（１）に基づいて遂次適切な送液量を計算して送液ポンプ流速を修正しつつ連続的に炭素源を供給することもでき、また一定の流速に設定したポンプを間歇的に動作させることにより、任意に設定した期間内の平均送液量が式（１）により求められる目的の送液速度に一致するように制御することもできる。例えば、培養液から発生する炭酸ガス量と培養液への炭素源供給量とが比例するように設定して、培養液中の炭素源濃度を制御する制御方式が例示できる。これらの制御は手動で行うこともでき、パーソナルコンピューターや専用の制御装置を解して自動的に行うこともできる。
【００３４】
本発明におけるカロテノイドの分析方法は、菌体または培養液から安定に効率良く回収されれば特に限定はなく、例えば抽出溶媒としてはメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジクロロメタン、クロロフォルム、ジメチルフォルムアミド、ジメチルスルフォキシド等がよい。抽出されたカロテノイドの定量は、各種カロテノイドが分離され定量性に優れる高速液体クロマトグラフィーにより行うことが好ましい。
【００３５】
培養後に、菌体又は培養液からカロテノイドおよび／またはアスタキサンチンを回収するには、たとえば、遠心分離操作等により培養液から菌体を分離し、適当な有機溶媒によりそれぞれから抽出すればよい。有機溶媒はメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジクロロメタン、クロロフォルム、ジメチルフォルムアミド、ジメチルスルフォキシド等が挙げられる。好適にはアセトンを例示できる。さらには、液体クロマトグラフィー等を利用して高純度に分離、精製することも可能である。液体クロマトグラフィーの分離原理としてはイオン交換、疎水性相互作用、分子ふるい等を挙げることができる。好ましくは、逆相クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィーである。または、超臨界流体抽出によって細胞から抽出する。
【００３６】
あるいは、培養終了後、菌体を培地から、例えば、遠心分離操作、デカンテーションまたはろ過等の方法を用いて分離してもよい。得られた菌体は、使用し易い粘度にまで水を加えてスラリーとする。アスタキサンチン等のカロテノイド類の分解を防ぐためには、このスラリー中適当な添加剤を加えてもよい。添加剤としてはアスコルビン酸等の酸化防止剤を例示することができるが、こららに限定されない。その後、調製スラリーを例えばガラスビーズ、ジルコニアビーズを用いた破砕機または高圧ホモジナイザーを使用して均一化し、後に使用するために乾燥しておく。好ましい乾燥法はスプレー乾燥法である。
【００３７】
この菌体を、例えば、このまま養殖魚等の飼料中へ添加してもよい。または、前述したように極性溶媒等により抽出して使用してもよい。アスタキサンチン等のカロテノイドを抽出した後に残った、色素をほとんど含まない細胞体は、家禽を飼育するうえで理想的な蛋白質およびビタミン類の供給源として使用することができる。
【００３８】
実施例
以下、実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３９】
（実施例１）代謝アナログβ−ヨノンに対する増殖能評価
パラコッカス属細菌ＴＳＮ１８Ｅ７株を表１において示す液体培地５ｍｌに植菌し、２５℃、１５０ｒｐｍで１日間振とう培養を行った。この培養液を表１に示す培地で適当に希釈し、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させたβ−ヨノン（アルドリッチ社製）を添加した表２に示す組成の平板培地にスプレッドした。β−ヨノンは終濃度０．０１、１、２、５、１０ｍＭとなるようにそれぞれ添加した。次いで、ＴＳＮ１８Ｅ７株が播かれた平板培地を２５℃で５日間培養した。目視により出現したコロニーをカウントし、β−ヨノン濃度に対するＴＳＮ１８Ｅ７株の増殖能を評価した。結果、ＴＳＮ１８Ｅ７株は１ｍＭ以上のβ−ヨノン存在下では増殖阻害を引き起こし、コロニーの形成を確認することができなかった。β−ヨノン耐性株を分離するには培地中のβ−ヨノン濃度は終濃度１ｍＭが妥当であると判断した。
【００４０】
【表１】
2007181449.tif 000002
【００４１】
（実施例２）変異導入および優良菌株の作製
実施例１と同様に、ＴＳＮ１８Ｅ７株を表１において示す培地５ｍｌに植菌し、試験管中、２５℃、１５０ｒｐｍで１日間振とう培養を行った。この培養液のうち１ｍｌを１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、１５，０００回転、１０分間の遠心分離により菌体を回収した。この菌体をｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（緩衝液Ａ）１ｍｌに懸濁し、次いで３ｍｇ／ｍｌのＮ‐メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアジニジン（以下ＮＴＧと略記する）水溶液１０μｌを加え、３０〜６０分間静置した。その後、遠心分離して上清を除去し、緩衝液Ａに再懸濁する操作を２回繰返してＮＴＧを除去した。さらに、０．５ｍｌ緩衝液Ａに菌体を懸濁し、表１に示す培地３ｍｌに植菌して４〜５時間培養した。得られた培養液を適度に希釈し、表２に示す組成の平板培地上に終濃度１ｍＭとなるようにＤＭＳＯ溶解のβ−ヨノンを添加し、希釈した培養液を塗布して２５℃で５日間培養した。生育したコロニーのうち赤色の強いものを選別し、表１に示す組成の培地で２５℃、１００ｒｐｍで７日間振とう培養を行った。この培養液を経時的に分析し、カロテノイド生産性が向上した菌株の選定を行った。
【００４２】
【表２】
2007181449.tif 000003
【００４３】
（実施例３）変異株の評価  
実施例２で得られた菌株をランダムに選択し、表１において示す培養液５ｍｌに植菌し、２５℃、１日間培養後した。次いで、表１に示した組成の培地６０ｍｌを１００ｍｌ容バッフル付三角フラスコに入れ滅菌し、先に培養した培養液２ｍｌを植菌した。２５℃で７日間振とう（１００ｒｐｍ）培養後、培養液を適宜抜き取り、濁度（ＯＤ６６０  ｎｍ）およびカロテノイドの定量を行った。定量は、まず、培養液１ｍｌを１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブに入れ、１５，０００回転、５分間遠心分離して菌体ペレットを得ることにより行った。この菌体に２０μｌの純水に懸濁し、次いで２００μｌのジメチルフォルムアミドおよび５００μｌのアセトンを加え振とうしてカロテノイドを抽出した。この抽出液を１５，０００回転、５分間遠心分離により残渣を除去後、ＴＳＫｇｅｌ−ＯＤＳ８０ＴＭカラム（東ソー社製）を用いた高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣと略記する）で各種カロテノイドを定量した。なお、カロテノイドの分離はＡ液として純水とメチルアルコールの５：９５の混合溶媒、Ｂ液としてメチルアルコールとテトラヒドロフランの７：３の混合溶媒を用い、１ｍｌ／ｍｉｎの流速で、Ａ液を５分間カラムに通過させた後、同じ流速においてＡ液からＢ液へ５分間の直線濃度勾配溶出を行い、さらにＢ液を５分間通過させることにより行った。アスタキサンチン濃度は４７０ｎｍの吸光度をモニターし、既知濃度のアスタキサンチン試薬（シグマ社製）で作成した検量線より濃度を算出した。算出後、アスタキサンチン生産量を評価し、変異株のなかからカロテノイド生産量および増殖能が向上した新規変異株ＴＳＴＴ００１株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６７０）を得た。
【００４４】
図１にＮ−８１１０６株、変異導入前の株であるＴＳＮ１８Ｅ７株、ＴＳＴＴ００１株の培養経過を示した。ＴＳＴＴ００１株はＴＳＮ１８Ｅ７株に対して最大ＯＤ値が約２倍向上した。さらに、ＴＳＴＴ００１株は野生株であるＮ−８１１０６株より高い増殖性を示した。また、図２および図３に培養１４４時間および１６８時間のカロテノイド生成パターン（ＨＰＬＣチャート）を示す。このＨＰＬＣチャートよりカロテノイド生成量を定量できる。本実験操作により、培地１Ｌあたりアスタキサンチンは最大２０．９ｍｇ、総カロテノイドは最大３１．５ｍｇ生産することができた。なお、総カロテノイドとはアスタキサンチン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、β−カロテン、フェニコキサンチン、アドニキサンチンである。
【００４５】
（実施例４）発酵槽での新規微生物の培養およびカロテノイドの定量  
表３に示す培地３００ｍｌにＴＳＴＴ００１株を植菌し、５００ｍｌ容バッフル付き三角フラスコを用いて２５℃、１００ｒｐｍで１日間振盪培養を行った培養液を前々培養液とした。次いで、表４に示す培地１００ｍｌにこの前々培養液を３ｍｌ植菌し、５００ｍｌ容バッフル付き三角フラスコを用いて２５℃、１００ｒｐｍで１日間振盪培養を行った。この培養液を前培養液とした。次いで、表５に示す培地３．０Ｌを全容５．０Ｌ発酵槽（エイブル社製）に入れ、１２１℃、２０分間で滅菌後、得られた前培養液を４０ｍｌ植菌し約１２０時間培養した。発酵槽の操作は次のようにした。まず、発酵槽の設定温度は２２℃、ｐＨは７．０〜７．２とし、ｐＨの調整は２Ｎの水酸化ナトリウムおよび１５％のアンモニア水溶液を適宜添加することにより行った。また、発酵槽の攪拌速度は、培養開始時には３００ｒｐｍとし、培養が進むにつれて徐々に攪拌速度を上げ、培養１２０時間において３７０ｒｐｍまで上昇させた。培養過程に発生する炭素源不足は、６０％グルコースを適宜添加することにより補った。グルコース濃度は、１０ｇ／Ｌで培養を開始し、５ｇ／Ｌ以下に減少後にグルコースの追加を開始して、０．５〜５ｇ／Ｌとなるように調節した。
【００４６】
【表３】
2007181449.tif 000004
【００４７】
【表４】
2007181449.tif 000005
【００４８】
【表５】
2007181449.tif 000006
【００４９】
図４にＯＤ、アスタキサンチン生成量および総カロテノイド生産量の経時変化を示す。図の通り、培養の経過時間と共に、総カロテノイド、アスタキサンチンの生産量が増加し、培養１２０時間時点での各カロテノイドの量を定量すると、表６のようになる。本実験操作により、培地１Ｌあたりアスタキサンチンは２５０ｍｇ、カロテノイドは７２０ｍｇを生産することができた。
【００５０】
【表６】
2007181449.tif 000007
【００５１】
（実施例５）パラコッカス属細菌ＴＳＴＴ００１株への変異導入および優良菌株の作製  
実施例１と同様に、ＴＳＴＴ００１株を表１において示す培地５ｍｌに植菌し、試験管中、２５℃、１５０ｒｐｍで１日間振とう培養を行った。この培養液のうち１ｍｌを１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、１５，０００回転、１０分間の遠心分離により菌体を回収した。この菌体をｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（緩衝液Ａ）１ｍｌに懸濁し、次いで３ｍｇ／ｍｌのＮ‐メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアジニジン（以下ＮＴＧと略記する）水溶液１０μｌを加え、３０〜６０分間静置した。その後、遠心分離して上清を除去し、緩衝液Ａに再懸濁する操作を２回繰返してＮＴＧを除去した。さらに、０．５ｍｌ緩衝液Ａに菌体を懸濁し、表１に示す培地３ｍｌに植菌して４〜５時間培養した。得られた培養液を適度に希釈し、表２に示す組成の平板培地上に希釈した培養液を塗布して２５℃で５日間培養した。生育したコロニーのうち赤色の強いものを選別し、表１に示す組成の培地で２５℃、１００ｒｐｍで７日間振とう培養を行った。この培養液を経時的に分析し、カロテノイド生産性が向上した菌株の選定を行った。
【００５２】
実施例３と同様にアスタキサンチン等のカロテノイド生産量を評価し、ＴＳＴＴ００１株より生産性が向上した変異株のなかからＴＳＴＴ０３１株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６８９）、ＴＳＴＴ０５２株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６９０）を得た。表７に、培養終了後のアスタキサンチン等のカロテノイド生産量を示す。表７の通り、ＴＳＴＴ０３１株、ＴＳＴＴ０５２株は親株であるＴＳＴＴ００１株より有意にアスタキサンチン等のカロテノイド生産が向上した優良株である。
【００５３】
【表７】
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【００５４】
（実施例６）ＴＳＴＴ０５２の培養において炭酸ガス濃度に比例してグルコース供給量を制御することでグルコースを０〜６ｇ／Ｌに維持した流加培養
表８に示した組成の培地３００ｍｌを５００ｍｌ容のバッフル付き三角フラスコに入れ１２１℃、２０分間で滅菌後、Ｎ−８１１０６株の変異株の一つであるＴＳＴＴ０５２株（受託番号：ＦＥＲＭ−２０６９０として寄託）を植菌し、２５℃で１日間、毎分１００回転の振とう速度で前々培養を行なった。
【００５５】
【表８】
2007181449.tif 000009
【００５６】
次いで表９に示した組成の培地１００ｍｌを５００ｍｌ容のバッフル付き三角フラスコに入れ１２１℃、２０分間で滅菌し、上記培養液５ｍｌを植菌して２５℃で約１８時間、毎分１００回転の振とう速度で前培養した。
【００５７】
【表９】
2007181449.tif 000010
【００５８】
さらに、表１０に示す組成の培地からグルコースと金属塩を除いたもの約１．４Ｌを３Ｌの発酵槽に入れ、１２１℃、２０分間で滅菌後、グルコースと金属塩を補充し、さらに前培養の培養液９０ｍｌを添加し本培養を開始した。培養温度は２２℃、ｐＨは７．０〜７．４とした。培養時ｐＨは微生物の増殖に伴って低下するので１０％アンモニア水の添加により所定範囲に制御した。また空気を１．８Ｌ／ｍｉｎの速度で通気した。炭素源の流加には７００ｇ／Ｌのグルコースを使用した。培養装置はエイブル社のＢＭＳ−０３ＰＩを、排ガス分析装置はエイブル社のＤＥＸ−２５６２を使用した。
【００５９】
【表１０】
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【００６０】
グルコース濃度を維持するため、パーソナルコンピューターを介し、エイブル社の培養制御プログラムを用いて、流加式（１）に基づいて流加ポンプを間歇的に動作させることにより行った。流加にはワトソン・モーロー社の定量ポンプ１０１Ｕ（低速型）を使用し、流速は０．３ｇ／ｍｉｎに設定した。また式（１）のＡの値は培養開始時から４８時間までを９．５、以降は８．０に設定した。培養中はグルコース分析計（装置名；ＹＳＩ社２７００）を用いて定期的にグルコース濃度を測定した。微生物の増殖は培養液の６６０ｎｍの濁度により測定した。１２０時間培養を行ったところ、培養液の濁度は３６０に達した。予め求めた濁度と菌体密度の相関式より、菌体収量は９０ｇ／Ｌと求められた。また、グルコース濃度は培養の期間を通じて約３ｇ／Ｌに維持されたが、１２０時間目において５ｇ／Ｌ程度に蓄積する傾向が認められたため、この時点で一度流加を停止し、０ｇ／Ｌまで消費させた後に流加を再開した。この培養の結果を図５に示した。
【００６１】
培養２４時間目から培養終了までの期間中、溶存酸素濃度は０％飽和付近に維持された（図６）。このことは、培養中にグルコースの枯渇なく維持されたことを示す。
【００６２】
培養期間中の排ガス中の炭酸ガス濃度と流加速度の推移を図７に示した。なお、ここでは流加速度を５分間の平均流速として示した。流加速度はＣＯ２濃度の推移と良好な一致を示した。また、図８にはグルコース消費速度の推移も示した。グルコースの流加速度の推移は消費速度の推移によく一致していた。この結果と図３に示したグルコース濃度の推移より、本方法によるグルコース濃度制御の有効性を確認した。
【００６３】
培養終了後のカロテノイドの生成量を分析すると、培養液１ＬあたりＡｘが５３８ｍｇ生産されていたほか、アドニキサンチンが（６９ｍｇ）、フェニコキサンチン（３６１ｍｇ）、カンタキサンチン（２６１ｍｇ）、エキネノン（１１９ｍｇ）そしてβ−カロテン（７ｍｇ）が生成していた。そのほかにもゼアキサンチン等と推定されるカロテノイドが検出されたが、少量であり同定・定量できなかった。これらの合計である総カロテノイドの生産量は培養液１Ｌあたり１３２０ｍｇだった。培養上清中の有機酸生成量を分析すると、０．０３  ｇ／Ｌの乳酸のみが検出されたにすぎなかった。
【００６４】
すなわち、本願発明の新規菌株であるＴＳＴＴ０５２株の培養において、６ｇ／Ｌ以下のグルコース存在下で培養を開始し、培養装置外部から高濃度のグルコースを流加しつつ培養し、かつその流加速度を排ガス中の炭酸ガス濃度に比例制御することで、培養中にグルコース消費速度の変化に追随して流下できるためグルコース濃度を一定に維持することが可能であり、その結果後述の比較例に示すような過剰なグルコースによる生産阻害を回避して、高収量にアスタキサンチンを初めとするカロテノイド類を生産することが可能であることが判明した。
【００６５】
（比較例１）高濃度グルコース（１３０ｇ／Ｌ）での回分培養
培養開始時のグルコース濃度を１３０ｇ／Ｌとし、流加を行わなかったことを除いて、実施例６と同様に培養を行った。この際の微生物の増殖とグルコース濃度の推移を図９に、溶存酸素濃度の推移を図１０に示すが、増殖速度が顕著に低下し、１５０時間の培養後の濁度は１００程度（乾燥菌体２５ｇ／Ｌに相当）に留まった。また、Ａｘ生産量は７５ｍｇ／Ｌに留まり、そのほか、フェニコキサンチン（９１ｍｇ／Ｌ）、カンタキサンチン（６７ｍｇ／Ｌ）、エキネノン（５８ｍｇ／Ｌ）が検出されたのみであり、いずれのカロテノイドも低収率にしか得られなかった。また培養液中には約１ｇ／Ｌの酒石酸が副生成物として蓄積していた。本結果より、高濃度のグルコースにより、本微生物の生育、カロテノイド生産ともに阻害されるだけでなく、製品の品質低下の原因となる有機酸の生成が促進することが判明した。すなわち、当該明細書に開示の方法でグルコース濃度を低濃度に維持して培養することの有効性が確認された。
【００６６】
（実施例７）天然株の培養において炭酸ガス濃度に比例してグルコース供給量を制御することでグルコースを０〜６ｇ／Ｌに維持した流加培養天然株（Ｎ−８１１０６）を用いたことを除き実施例３と同様に培養を行った。８０時間培養後の６６０ｎｍの濁度は１５０（乾燥菌体５０ｇ／Ｌに相当）だった。カロテノイドの生産量は、アスタキサンチン５２ｇ／Ｌ、アドニキサンチン４８ｇ／Ｌ、フェニコキサンチン５ｇ／Ｌ、カンタキサンチン４ｇ／Ｌ、エキネノン２ｇ／Ｌに過ぎなかった。培養液のグルコース濃度は実施例３と同様に０〜６ｇの間に維持された。実施例３との比較すると天然株の生産性は低いものであり、本願発明の新規菌株であるＴＳＴＴ０５２株が著しく高いカロテノイド生産性を有することが確認された。
【００６７】
しかしながら、後述の比較例２に示す天然株を高濃度のグルコース存在下で回分培養した場合に比較した場合、カロテノイド生産性は約１．６倍高いものであった。即ち、天然株の培養においても、本願発明に開示する方法でグルコース濃度を０〜６ｇ／Ｌに維持することで生産性が向上することが確認された。
【００６８】
（比較例２）天然株の回分培養
天然株（Ｎ−８１１０６）を用い、グルコース濃度を５０ｇ／Ｌとしたことを除き比較例１と同様に培養を行った。８０時間培養を行ったのちの６６０ｎｍの濁度は９０（乾燥菌体３０ｇ／Ｌに相当）にすぎなかった。また、カロテノイド生産量は、アスタキサンチン２９ｇ／Ｌ、アドニキサンチン２２ｇ／Ｌ、フェニコキサンチン２ｇ／Ｌ、カンタキサンチン３ｇ／Ｌ、エキネノン１ｇ／Ｌに過ぎなかった。天然株においても高濃度のグルコースは増殖のみならずカロテノイドの生産を阻害することが確認された。すなわち、本明細書に開示する流加方法を適用することで、ＴＳＴＴ０５２株には及ばないものの、野生株においても生産性が向上することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明によれば、アスタキサンチンをはじめとするカロテノイドを効率よく製造することが可能になる。アスタキサンチンをはじめとするカロテノイドは飼料・食品用色素、抗酸化剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】野生株であるＮ−８１１０６株、親株であるＴＳＮ１８Ｅ７と対比した本菌株のＯＤ経時変化を示すグラフ。
【図２】培養１４４時間のカロテノイド生成パターンを示すＨＰＬＣチャート。
【図３】培養１６８時間のカロテノイド生成パターンを示すＨＰＬＣチャート。
【図４】アスタキサンチン生成量および総カロテノイド生成量の経時変化を示すグラフ。
【図５】グルコース濃度を０〜６ｇ／Ｌに自動制御した培養パターンにおける微生物の増殖とグルコース濃度を示す図であり、図中、Ｘ軸（横軸）は時間（単位は時間）を示し、Ｙ軸（縦軸）の内、●は微生物の増殖量を示す６６０ｎｍにおける吸光度（単位は任意単位）、○はグルコース濃度（単位はｇ／Ｌ）を示す。
【図６】グルコース濃度を０〜６ｇ／Ｌに自動制御した培養パターンにおける溶存酸素濃度を示す図であり、図中、Ｘ軸（横軸）は時間（単位は時間）を示し、Ｙ軸（縦軸）は溶存酸素濃度（ＤＯ）（単位は容量％）を示す。
【図７】グルコース濃度を０〜６ｇ／Ｌに自動制御した培養パターンにおける排ガス中の炭酸ガス濃度とグルコース流加速度を示す図であり、図中、Ｘ軸（横軸）は時間（単位は時間）を示し、Ｙ軸（縦軸）の内、実線（図中の下側）はグルコースの流加速度（単位はｇ／Ｌ・ｈｒ）、破線（図中の上側）は炭酸ガス濃度（単位は容量％）を示す。
【図８】グルコース濃度を０〜６ｇ／Ｌに自動制御した培養パターンにおけるグルコース消費速度を示す図であり、図中、Ｘ軸（横軸）は時間（単位は時間）を示し、Ｙ軸（縦軸）のうち●はグルコース消費速度（単位はｇ／Ｌ・ｈｒ）、破線は●の分布から推測された真のグルコース消費速度（単位はｇ／Ｌ・ｈｒ）を示す。
【図９】グルコースを高濃度（１３０ｇ／Ｌ）として回分培養を行った場合の培養パターンにおける微生物の増殖とグルコース濃度を示す図であり、図中、Ｘ軸（横軸）は時間（単位は時間）を示し、Ｙ軸（縦軸）の内、●は微生物の量を示す６６０ｎｍにおける吸光度（単位は任意単位）、○はグルコース濃度（単位はｇ／Ｌ）を示す。
【図１０】回分培養における溶存酸素濃度を示す図であり、図中、Ｘ軸（横軸）は時間（単位は時間）を示し、Ｙ軸（縦軸）は溶存酸素濃度（ＤＯ）（単位は容量％）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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