(57)【要約】【課題】本発明は、ネコフォリスタチンを担体に固定化し、試料中のネコアクチビンAの存在の有無またはその存在量を感度よく測定するための測定方法および測定キットを提供することが課題である。【解決手段】ネコフォリスタチンを担体に固定化し、これに試料を接触させることにより、前記ネコフォリスタチンに特異的に結合する試料中のネコアクチビンＡの存在、非存在を決定する、あるいはその存在量を決定するネコアクチビンＡの測定方法およびネコフォリスタチンが固定化された担体、抗アクチビンＡ抗体と標識物質の複合体または、ネコフォリスタチンが固定化された微粒子よりなるネコアクチビンＡの測定キット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネコフォリスタチンを担体に固定化し、これに試料を接触させることにより、その試料中の前記ネコフォリスタチンに特異的に結合するネコアクチビンＡの存在、非存在を決定する、あるいはその存在量を決定するネコアクチビンＡの測定方法。
【請求項２】
ネコフォリスタチンが固定化された担体、抗アクチビンＡ抗体と標識物質の複合体を含むネコアクチビンＡの測定キット。
【請求項３】
ネコフォリスタチンが固定化された微粒子を含むネコアクチビンＡの測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ネコフォリスタチンを担体に固定化し、試料と接触させることにより、ネコフォリスタチンに特異的に結合するアクチビンＡを定量可能にするアクチビンＡの測定方法およびそれに用いる測定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
フォリスタチンは、分子量が約35,000〜32,000の糖蛋白質である。フォリスタチンにはアミノ酸数が３１５個および２８８個の２種類があり、そのどちらのフォリスタチンもアクチビンとの結合能を有し、下垂体培養細胞の卵胞刺激ホルモン（FSH）産生を抑制する作用を有している。
【０００３】
アクチビンには、アクチビンＡ、アクチビンＡＢ，アクチビンＢなどがあり、中でもアクチビンＡはサブユニットであるインヒビンβＡ（アミノ酸１１６個のポリペプチド鎖）２本からなるホモダイマー構造を有するタンパク質で、分子量は約25,000である。アクチビンはフォリスタチンと結合能を有し、下垂体培養細胞の濾胞刺激ホルモン（FSH）産生を促進する作用を有している（非特許文献１参照）。
【０００４】
特許文献１では、虚血性急性腎不全モデルにおいて、フォリスタチンおよびアクチビンＡが関係しており、アクチビンＡの亢進とともにフォリスタチンが障害をうける腎尿細管の再生に関与していることが報告されてる。すなわち、、虚血性急性腎不全を発症するとアクチビンＡの発現が亢進し、フォリスタチンの発現が抑制されることが示され、腎疾患ではアクチビンＡの亢進が予想される。（特許文献１）。
【０００５】
ところで腎疾患の診断には、血漿クレアチニン濃度測定や血漿リン濃度測定やタンパク尿測定などがあるが、これらの方法はいずれも直接腎疾患の有無を把握するための方法ではなく、依然として腎疾患に特異的な測定法が確立していない。
【０００６】
さらに、特許文献２にはアンドロゲン非依存性腫瘍の診断に際し、フォリスタチンを使用してアクチビンを検出することが開示されているが、３種あるアクチビンの中でもアクチビンＡＢとアクチビンＢを検出の対象にするものであって、アクチビンＡの検出に関しては何ら言及されておらず、またネコ由来のフォリスタチンやアクチビンに関しても何ら言及されていない。
【０００７】
したがって、ネコにおける腎疾患の診断に用い得るネコアクチビンＡの測定方法は未だ見出されていないのが現状である。
【非特許文献１】Helene H著：Proc.Natl.Acad.Sci.USA.、1988., 85、 p247-251
【特許文献１】特開2001-288111号公報（第  ２，３頁）
【特許文献２】国際公開第00/062809号パンフレット（請求項１５〜２２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ネコフォリスタチンを担体に固定化し、試料中のネコアクチビンＡの存在の有無またはその存在量を感度よく測定するための測定方法および測定キットを提供することが課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、担体、例えばイライザプレート（ELISA PLATE）や機能性高分子にネコフォリスタチンを固定化し、ネコ由来試料中のネコアクチビンＡが結合することを見出し本発明を完成するに至った。本発明は以下を提供する。
１．ネコフォリスタチンを担体に固定化し、これに試料を接触させることにより、前記ネコフォリスタチンに特異的に結合する試料中のネコアクチビンＡの存在、非存在を決定する、あるいはその存在量を決定するネコアクチビンＡの測定方法。
２．ネコフォリスタチンが固定化された担体、抗アクチビンＡ抗体と標識物質の複合体を含むネコアクチビンＡの測定キット。
３．ネコフォリスタチンが固定化された、微粒子および緩衝液よりなるネコアクチビンＡの測定キット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ネコアクチビンＡとの結合能を有しそのアンタゴニストとしての能力を有するネコフォリスタチンを担体に固定化し、試料、特にネコ由来生体試料を接触させることにより試料中のネコアクチビンＡと反応させ、そのネコアクチビンＡの存在の有無・存在量を感度よく測定することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（１．フォリスタチンについて）
本発明においてフォリスタチンは、主としてネコフォリスタチンの天然型および遺伝子組換え型のいずれをも包含するものであって、以下の(1)〜(3)の機能を有するものである。
(1)ネコの下垂体に作用して卵胞刺激ホルモンの基礎分泌を特異的に抑制する。
(2)黄体形成ホルモンの基礎分泌を抑制しない。
(3)アクチビンＡとの結合能を有しそのアンタゴニストとしての能力を有する。
【００１２】
ここで、アクチビンＡとの結合能を有するか否かは、アクチビンＡをラベルしたアクチビンのバインディング・アッセイによって確認することができる。
【００１３】
ネコフォリスタチンのアミノ酸配列は常法により決定することができ、配列番号１および配列番号２の配列はその一例である。配列番号２の配列のＣ末端の２７アミノ酸残基を削除したものが配列番号１の配列となっている。上記の(1)〜(3)の機能が実質的に保持される限り、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列中の１もしくは数個のアミノ酸が欠失しても、他のアミノ酸に置換されても、あるいは１もしくは数個のアミノ酸が付加されてもよい。
【００１４】
ネコフォリスタチンは特開２００４−１０５１６６号公報記載の方法によって製造することができる。
【００１５】
産生されたネコフォリスタチンの分子量は、還元条件下、SDS-PAGEを行うことにより、約35,000〜32,000である。
【００１６】
（２．担体について）
本発明で使用される担体は、抗原抗体反応に使用される抗原や抗体の担体として使用されるものは特に制限なく使用することができる。例えばポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、スチレン−無水マレイン酸共重合体、ナイロン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライドなどの高分子物質、紙、ガラス、金属、アガロースおよびこれらの組合わせなどが考えられる。また、かかる不溶性担体の形状としても特に限定されたものではなく、例えばマイクロプレート、ディスクなどの平方状、ビーズなどの粒子状、試験紙などの管状、繊維状、膜状、セルなどの形状であってもよく、測定条件によって適宜変えることが可能である。さらにはラテックス微粒子等の微粒子を用いることが、ネコフォリスタチンを固定化した場合にこれとネコアクチビンＡが結合することにより凝集する性質を有する点で好ましい。上記において「微粒子」としては、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリアクリル酸エステル、などの合成有機高分子物質、細胞片などの天然有機高分子物質、ガラス、シリカ、カーボンなどの無機物質などからなるものをいう。
【００１７】
また、フォリスタチンを上記担体に固定化して固相試薬を得る方法にしてもタンパク質を担体に固定化するためのいかなる方法も使用できる。また、固定化する担体は、固定化量の増大を図るため表面処理されたものを用いることができる。例えば、（＋）電荷、（−）電荷を持つ不溶性担体などがあり、測定条件により適宜変えることが可能である。ネコフォリスタチンも他のタンパク質と同様両性イオンであるため、（＋）（−）の電荷がうち消し合う固有のpH（等電点）が存在する。ネコフォリスタチンが（＋）に荷電している場合は、（−）に荷電している固定化担体に吸着しやすく、ネコフォリスタチンが（−）に荷電している時は、（＋）に荷電している固定化担体に吸着しやすい。ネコフォリスタチンの電荷は溶解させている緩衝液のpHにより変動させることができる。例えば、pHが等電点以上の緩衝液を用いればネコフォリスタチンを（−）に荷電させることができ、pHが等電点以下の緩衝液を用いればネコフォリスタチンを（＋）に荷電させることができる。本発明においては、（＋）あるいは（−）電荷を持つ不溶性担体のどちらでも用いることができる。
【００１８】
（３．スペーサー）
（３−１．スペーサーについて）
本発明において、ネコフォリスタチンを担体に固定化するために、ネコフォリスタチンと担体間を連結する目的でスペーサーを用いることができる。また、スペーサーはタンパク質やペプチドを介したものであり、担体に結合可能でかつネコフォリスタチンの立体構造を維持することが可能なものである。
【００１９】
たとえば、タンパク質に結合する性質を有するペプチドはファージディスプレー法を用いて入手することができる。例えば、Hashiguchiらの文献（シューヘイ・ハシグチ（Shuhei Hashiguchi, et al.,）、ザ・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（the Journal of Biochemistry）,ヒューマン・エフシーイプシロンアールワンアルファー  スペシフィック・ヒューマン・シングル  チェイン・エフブイ（ｓｃＦＶ）・アンチボディ・ウイズ・アンタゴニスティック・アクティビティ・トゥワード・アイジーイー／エフシーイプシロンアールワンアルファー・バインディング（Human Fc varepsilon RIalpha-Specific Human Single-Chain Fv (scFv) Antibody with Antagonistic Activity toward IgE/Fc varepsilon RIalpha-Binding）、日本、２００３年、第１３３巻、ｐ．４３〜４９.）記載のファージディスプレー法によって得られたscFvは、ヒトエフシーイプシロン（Fcε）受容体を結合させるのに適している。
【００２０】
また、ネコフォリスタチンと結合し、しかも固定化したネコフォリスタチンとネコアクチビンＡ間の結合を妨げない分子、例えばプロテインエー（Protein A）などは、ネコフォリスタチンを担体に結合させるためのスペーサーとして利用できる。
【００２１】
（３−２．ペプチドで構成されるスペーサーについて）
本発明においてネコフォリスタチンと結合する分子であるスペーサーは、ペプチドで構成されていてもよい。本発明におけるペプチドは数個のアミノ酸で構成されているものをさし、好ましくは２〜５残基のアミノ酸が最適である。また、本発明において、ペプチドからなるスペーサーは環状構造を有さないものが最適である。すなわち、スペーサーが環状構造を有さないことにより、捕捉分子すなわちネコアクチビンＡを的確に捕捉できるためである。さらに、スペーサーであるペプチドを構成するアミノ酸としては、環状構造を有する可能性のある、芳香族アミノ酸、複素環アミノ酸および塩基性アミノ酸以外のアミノ酸である脂肪族アミノ酸、ヒドロキシアミノ酸、含硫アミノ酸および酸性アミノ酸が最適である。
【００２２】
（３−３．融合タンパク質を利用した結合方法）
ネコフォリスタチンとスペーサー分子の連結は、それぞれを構成するタンパク質を融合させた融合タンパク質を慣用の遺伝子操作によって作成することで達成できる。すなわちフォリスタチンにスペーサーペプチドを融合させる。本発明で用いられる用語「融合」とは、両タンパク質間をペプチド結合で結合させることを意味する。通常、ネコフォリスタチンをコードしたDNAの前後または途中にタンパク質もしくはペプチドをコードするDNAを挿入し、そのDNAを用いて融合タンパク質を作製するが、他の方法、たとえば、化学合成によっても融合タンパク質は得られる。
【００２３】
融合による結合においては、遺伝子さえあれば容易に慣用の遺伝子操作によってネコフォリスタチンとスペーサー分子を結合でき、遺伝子を組み込んだ発現ベクターは容易に複製可能であり、何度でも再現性よくネコフォリスタチンとスペーサー分子が同一部位に融合したタンパク質を作成できる。そのため、結合部位を制御する必要が無く、後述の共有結合を形成させた結合に比べて、融合による結合は互いに同一の分子種及び同一の分子数かつ同じ立体構造を有したフォリスタチンを作成することができる点で有効な手段の一つとして挙げられるのである。
【００２４】
（３．４  スペーサーと連結したネコフォリスタチンを担体に固定化する方法）
上記のようにして得られたスペーサーと連結したネコフォリスタチンを担体に固定化する方法としては、担体への物理的吸着、又はそれ自体既知の通常用いられている方法により化学的に結合させればよい。
【００２５】
（４．ネコアクチビンＡとの接触方法）
本発明における捕捉対象物質であるネコアクチビンＡは、サブユニットであるインヒビンβA（アミノ酸１１６個のポリペプチド鎖）２本からなるホモダイマー構造を有するタンパク質で、分子量は約25,000である。ネコアクチビンＡはネコフォリスタチンと結合能を有し、その生物活性である骨髄性白血病細胞株K562細胞を用いたヘモグロビン放出活性が、ネコフォリスタチンにより抑制される。
【００２６】
本発明の測定方法に用いる試料としては、上記ネコアクチビンＡの存在が疑われる、もしくはその存在量を定量したい試料であり、この試料としてはネコから採取した血液、血清、尿等ネコ由来生物学的試料の他、これらネコ由来生物学的試料中のネコアクチビンＡを定量する際等に用いる検量線を得るために所定のネコアクチビンＡを添加した標準液等が挙げられる。これらは緩衝液等で希釈されていてもよい。
【００２７】
本発明の測定方法では上記試料を担体に固定化したネコフォリスタチンに添加し、室温下で反応させることにより試料中のネコアクチビンＡを検出することができる。
【００２８】
（５．検出方法）
（５−１．抗体−標識物質複合体を用いた検出）
マイクロプレートなどの平方状、ビーズなどの粒子状、試験紙などの管状、繊維状、膜状、セルなどの形状を有する担体に固定化されたネコフォリスタチン分子に結合したネコアクチビンＡの定量には、抗アクチビン抗体と標識物質の複合体（以下「抗体−標識複合体」と称する場合もある）による検出を適用することができる。
【００２９】
すなわち、ネコアクチビンＡが試料中に存在すればネコフォリスタチンと結合し、そのネコアクチビンを捕捉する抗アクチビン抗体と標識物質の複合体を接触させ、標識物質の定量を行うことによりネコアクチビンＡの量を測定する方法である。標識物質としては酵素、発光物質、蛍光物質などが一般に使用される。酵素としては例えばペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリフォスファターゼ、β−D−ガラクトシダーゼなどが挙げられる。発光物質としては例えばイソルシノール、ルシゲニンなどが挙げられる。また、蛍光物質としては、フルオレセインニソチオシアネート、フィコビリプロテインが挙げられる。
【００３０】
上記抗アクチビン抗体と標識物質とを複合する方法としては、主に架橋剤を用いる。
抗アクチビン抗体中のSH基にマレイミドを有する架橋剤を用いることにより、標識物質である酵素と抗体を比較的温和な条件で結合することができる。具体的には抗アクチビン抗体をペプシンで処理するとともに、適当な緩衝液でpHを中性以上にする。次に標識物質をEMCSで処理することによりマレイミド基を導入し、両者を中性以上のpH下で混合して複合させる。
【００３１】
本発明の測定方法においては、ネコフォリスタチンを固定化した担体に試料および抗体−標識複合体を添加して反応させるが、標識物質として酵素を使用する場合、ネコフォリスタチン、試料、抗体−標識複合体を反応させた後、標識物質として用いた酵素の活性を測定するために、基質を使用することが望ましく、必要に応じて発色剤も使用可能である。
【００３２】
例えば酵素としてHRPを使用する場合、基質として過酸化水素、ペルオキシダーゼアビジンなどを使用し、発色剤として２．２アビジンを使用することが好ましい。また酵素としてアルカリフォスファターゼを使用する場合は、基質としてニトロフェニルフォスフェートなどを使用することが好ましく、さらに酵素としてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを使用する場合には、基質としてp-ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、フルオレセイン−ジ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、４−メチルウンベリフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドなどを使用するのが好ましい。また発光剤としては、２．２アジノジ[３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸]アンモニウム塩(ABTS)、４−アミノアンチピリン、３．３．５．５−テトラメチルベンジジンなどを使用するのが好ましい。
【００３３】
ネコフォリスタチン、試料、抗体−標識複合体を反応させた後、酵素活性を測定するためこれに基質を添加して反応させる。この反応を所定時間実施、反応が進行した段階で、反応停止剤を使用してその反応を停止させる。使用する反応停止剤としては例えば硫酸などの公知の薬剤を使用することができる。得られた反応液は、所定の波長でその吸光度が測定されて、標識物質の酵素活性を測定する。例えば、標識酵素がアルカリフォスファターゼの場合、p-ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを反応させて遊離したｐ−ニトロフェノールを波長４１５nmで比色定量することによって、該複合体中のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を測定することができる。この場合試料中のネコアクチビンＡの含有量が多いほど酵素活性は高く測定される。
【００３４】
（５−２．微粒子の凝集反応による検出）
担体として微粒子、例えばラテックス微粒子を使用する場合は、微粒子表面に固定化されたネコフォリスタチンとネコ由来試料中のネコアクチビンが反応し結合することにより、微粒子同士の凝集がおこり、その変化を光学的に測定することによりネコアクチビンの量を測定することが可能である。すなわち、凝集反応はプラスチック又はガラスセル内で行い、セル外部から波長440-1000nmから選ばれる波長の光又は白色光を照射し、吸光度の変化又は散乱光の強度を測定することにより、予め作成した検量線から試料液内のネコアクチビンＡが算出される。
【００３５】
一方で、抗体−標識物質複合体も組み合わせることも可能であり、ネコアクチビンを捕捉する抗体に結合した標識物質、例えば酵素などの発色・発光の程度によってもネコアクチビンの量を測定することができる。
【００３６】
（６．ネコアクチビンＡ測定キット）
上記反応及び測定工程等を含むネコアクチビンＡの存在・非存在及びその存在量を測定するために用いるキットは、それ自体既知の方法により調製可能である。
【００３７】
本発明におけるネコアクチビンＡの測定キットは、ネコフォリスタチンが固定化された担体、抗アクチビンＡ抗体と標識物質の複合体を含むネコアクチビンＡの測定キット、あるいはネコフォリスタチンが固定化された微粒子を含むネコアクチビンＡの測定キットが挙げられる。
【００３８】
これらのキットには、さらに、上記したネコフォリスタチンを固定化した担体の他、緩衝剤、塩化ナトリウム、ネコアクチビンＡ標準物（ネコアクチビンＡを定量するために用いる検量線を得るための標品）等から選択される試薬を含んでいてもよい。ネコフォリスタチンが固定化された微粒子を含む測定キットの場合には、緩衝液、ネコアクチビンＡ標準物を含んでいてもよい。また、任意の要素として試料希釈液、洗浄液、なども含むことができる。
【実施例】
【００３９】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。
【００４０】
参考例１
ネコフォリスタチン遺伝子のクローニング
（１）ネコcDNAのファージライブラリー調製
ネコ腎由来細胞CRFKを150cm2フラスコで３〜４日培養し、5×107cellsの細胞沈殿物を調製した。mRNA isolation kit（ストラタジーン社）によりmRNAを調製した。すなわち、CRFKの沈殿物にグアニジン・チオシアネートを含む変性溶液を加え、21Gニードルで混入したDNAをせん断した。次に溶出緩衝液を加え遠心を行い、その上清を得た。得られた上清をオリゴdTセルロースカラムにアプライし、カラムの洗浄を行った後、予め68℃に加温しておいた溶出緩衝液によりポリ（A）RNAを溶出した。次に得られたポリ(A)RNAを用いて、ZAP-DNA Synthesis kit（東洋紡社）によりcDNAファージライブラリーを合成した。すなわちキットのマニュアルに従い２本鎖cDNAを合成し、さらにエコアールワン（EcoRＩ）/ノットワン（NotＩ）アダプターを連結した。次にユニザップエックスアールベクター（Uni-ZAP XR  vector）に連結した後、ギガパックスリーパッケージングエキストラクト（GigapackIIIpackaging extract）（ストラタジーン社）を用いてパッケージングを行い、組換え体ファージライブラリーを作製した。
【００４１】
（２）ネコフォリスタチン遺伝子のクローニング
ヒトフォリスタチンのN末端およびC末端の塩基配列（文献１）をもとに、配列番号６と配列番号７の２種類のプライマーをDNAシンセサイザーにて合成した。上記（１）のCRFKcDNAを0.5mLのマイクロチューブに１μLを入れ、各プライマー20pmol、20mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)、1.5mM MgSO4、25mM KCl、50μM各ｄＮＴＰ、ポリメラーゼ（KOD）を添加し、全量50μLとした。DNAの変性条件94℃,30秒、プライマーのアニーリング条件を60℃，30秒、プライマーの伸張条件を68℃,１分の各条件でバイオラッド社製DNAサーマルサイクラーを用いて、35サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約900bpのDNA断片を常法(文献２)に従って調製した。
【００４２】
このDNA断片をpUC108（アマシャムファルマシア社）にDNA ライゲーションキット（Ligation kit Ver.2）を用いて連結した。これを用いて常法に従って大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドDNAを常法により調製した。次にこのプラスミドにPCR断片が挿入されていることを前述と同条件のPCRおよびエコアールワン（EcoRＩ）およびヒンディスリー（HindIII）による制限酵素処理により確認し、ABI PRISM 377XL(アプライドバイオシステムズ)により、ビッグダイターミネーターサイクルシーケンス（BigDye Terminator Cycle Sequencing）法（文献３）でネコフォリスタチンと思われるDNAの塩基配列を決定した。この配列を配列番号３に示す。また、この配列を含む、900bpのDNA断片にロッシュダイアグノティス社製のDIG DNA ラベリングキット（Labeling kit）を用いてDIG標識し、プローブを作製した。上記（１）で作製した組換え体ファージライブラリーを大腸菌XL1Blue MRF’上でプラークとして形成させ、日本ロシュ社製のナイロンメンブレンに常法に従って転写した。転写したナイロンメンブレンは、DNAの固定を行った後、2mg/mLプロテイナーゼK溶液中に浸し、37℃１時間インキュベートした。さらにそのナイロンメンブレンを、最終濃度20ng/mLになるようにプローブを加えたディグイージーハイブ（DIG EASY HYB）（ロシュダイアグノティス社製）中に入れ、42℃で1晩インキュベートを行い、ハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたナイロンメンブレンを、２×SSC(30mMNaCl、3mMクエン酸ナトリウム)、0.1%SDS中５分、２回洗浄を行い、さらに0.5×SSC(7.5mMNaCl、0.75mMクエン酸ナトリウム)、0.1%SDS中65℃下、15分、２回洗浄を行った。ナイロンメンブレンをCDP-Starによる化学発光により陽性プラークの検出を行った。すなわち、洗浄したナイロンメンブレンをブロッキング溶液（ロシュダイアグノティス社製）に室温下30分以上インキュベートした後、アルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体（ロシュダイアグノティス社製）を含むブロッキング溶液内に入れてさらに30分インキュベートした。抗体溶液を捨て、洗浄バッファー(100ｍＭマレイン酸、150mMNaCl、0.3%Tween20)で15分間、各２回ずつナイロンメンブレンを洗浄し、検出バッファー（100mMTris-HCl(pH9.5)、100mMNaCl）内に溶解させたCDP-Starをナイロンメンブレンに処理し、５分間室温で、さらに15分間37℃下でインキュベートした。得られたナイロンメンブレンをX-ray Filterに露光し、陽性シグナルを有するプラークを常法に従い再スクリーニングした。３回のスクリーニングの結果、陽性シグナルを有する１個の組換え体ファージを得た。この組換え体ファージよりインビボエキシジョン（in vivo exision）法により、組換えプラスミドを含む大腸菌を得た。この大腸菌を培養し、常法に従いプラスミドを調製し、ABI PRISM 377XL(アプライドバイオシステムズ)により、ビッグ代ターミネーターサイクルシーケンス（BigDye Terminator Cycle Sequencing）法（文献３）でネコフォリスタチンDNAの塩基配列（配列番号５）を決定した。
【００４３】
得られたネコフォリスタチン遺伝子のホモロジー検索の結果、Equus caballus（ウマ）：95%、O aries（ヒツジ）：94%、Bos taurus（ウシ）：94%、Homo sapiens（ヒト）：94%、Rattus norvegicus（ラット）：91%、Mus musculus（マウス）：90%であった。
【００４４】
参考例２
ネコフォリスタチンの生産
（１）ネコフォリスタチン組換えウイルスの調製
発現ベクターpVL1392を制限酵素ビージーエルツー（BglII）及びエコアールワン（EcoRＩ）で切断し、ウシ由来アルカリフォスファターゼで末端を脱リン酸化し、調製した。一方、ネコフォリスタチンDNA断片は配列番号８と配列番号９の２種類の切断部位(BglII及びEcoRＩ)およびアミノ酸配列グリシン・セリン・セリンを付加したプライマーを作製し、実施例１（２）で調製したネコフォリスタチンDNAを鋳型として、DNAの変性条件94℃,30秒、プライマーのアニーリング条件を60℃，30秒、プライマーの伸張条件を68℃,１分の各条件でバイオラッド社製DNAサーマルサイクラーを用いて、35サイクル反応させた。エタノール沈殿後、制限酵素で切断し、１％アガロースゲル電気泳動にて約１kbpのDNA断片を調製した。
【００４５】
このDNA断片をT4 ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した後、pVL1392にDNA ライゲーションキット（Ligation kit Ver.2）を用いて連結した。これを用いて常法に従い大腸菌に形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドDNAを常法により調製した。次にこのプラスミドとAcNPVと共に昆虫細胞Sf9に常法に従いコ・タランスフェクションを行い、ネコフォリスタチンを発現する組換えウイルスを得た。
【００４６】
さらに、作製した発現プラスミド中のネコフォリスタチンDNAの塩基配列を確認した。
【００４７】
（３）昆虫細胞Ｓｆ９でのネコフォリスタチンの発現
上記（２）で得られた組換えウイルスを27℃下培養したSf9に感染させた。27℃下５日間培養し、培養上清を回収した後2,000G,10分遠心しその上清を回収した。
【００４８】
（４）ネコフォリスタチンの活性測定
上記（３）で生産されたネコフォリスタチンの活性測定は以下のようにして行った。K562細胞を用いてアクチビンＡによるヘモグロビン放出作用の抑制を確認した(文献４)。
【００４９】
96穴プレートに骨髄性白血病細胞株K562細胞（2×10５cells/mL）を、10%
ウシ胎児血清（FBS）を含むRPMI-1640培地（ギブコ社製液体培地）により、ネコアクチビンＡ非存在下または存在(20ng/mL)下、ネコフォリスタチン非存在下または存在下４日間培養を行った。次に細胞をリン酸緩衝液（PBS）により２回洗浄し、滅菌した水50uLに懸濁し、遠心操作により上清画分40μLを得た。得られた上清に0.5mg/mL オルトフェニレンジアミン と0.03%過酸化水素を含むクエン酸緩衝液200μLを加え、暗下15分処理した。その後2.5M硫酸を50μL加え、490nmの吸光度の測定を行った。その結果を図１に示す。図１は、各例における吸光度を示したグラフである。ネコフォリスタチン存在下有意にヘモグロビン産生の抑制が見られた。
【００５０】
（５）ネコフォリスタチンの精製
ａ． 陽イオン交換担体によるネコフォリスタチンの精製
上記（３）で得られた培養上清を、予め20mMリン酸緩衝液で平衡化した陽イオン交換担体であるSP Sepharoseに導入し、再度20mMリン酸緩衝液を用いて洗浄を行った。次に０〜１Ｍ塩化ナトリウムを含有する20mMリン酸緩衝液を用いてステップワイズ法による溶出を行い得られた溶出液を用いてイムノブロッティング並びに上記（４）による方法で活性測定を行ったところ、0.5M塩化ナトリウムを含む画分でネコフォリスタチンを検出した。
【００５１】
ｂ．  ヘパリン担体によるネコフォリスタチンの精製
上記ａで得られた溶出液を、予め0.2M塩化ナトリウムを含む20mMリン酸緩衝液で平衡化したヘパリン担体に導入し、再度0.2M塩化ナトリウムを含む20mMリン酸緩衝液を用いて洗浄を行った。次に0.2M〜１Ｍ塩化ナトリウムを含有する20mMリン酸緩衝液を用いてステップワイズ法による溶出を行い得られた溶出液を用いてイムノブロッティング並びに上記（４）による方法で活性測定を行ったところ、0.８M塩化ナトリウムを含む画分でネコフォリスタチンを検出した。得られたネコフォリスタチン溶液を０．９％ＮａＣｌを含むpH8.0のグリシン緩衝液で限外濾過し、濃度１ｍｇ／ｍＬ(10mL)のネコフォリスタチンを調製した。
【００５２】
参考例３
ネコアクチビンＡについて
（１）ネコインヒビンβA遺伝子のクローニング
ヒトインヒビンβAの塩基配列（文献５）をもとに、配列番号 15と配列番号16の２種類のプライマーをDNAシンセサイザーにて合成した。参考例１のCRFKcDNAを0.5mLのマイクロチューブに１μLを入れ、各プライマー20pmol、20mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)、1.5mM MgSO４、25mM KCl、50μM各dNTP、DNAポリメラーゼ（東洋紡社製KOD）を添加し、全量50μLとする。DNAの変性条件94℃,30秒、プライマーのアニーリング条件を60℃，30秒、プライマーの伸張条件を68℃,１分の各条件でBio-RAD社製DNAサーマルサイクラーを用いて、35サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約300bpのDNA断片を常法(文献６)に従って調製した。
【００５３】
このDNA断片をpUC108（アマシャムファルマシア社）にDNAライゲーションキット（Ligation kit Ver.2）を用いて連結した。これを用いて常法に従って大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドDNAを常法により調製した。次にこのプラスミドにPCR断片が挿入されていることを前述と同条件のPCRおよびエコアールワン（EcoRＩ）およびヒンディスリー（HindIII）による制限酵素処理により確認し、ABI PRISM 377XL（アプライドバイオシステムズ）により、ビッグダイターミネーターサイクルシーケンス（BigDye Terminator Cycle Sequencing）法（文献７）でヒトやマウスなどのインヒビンβAとのホモロジーを確認し、ネコインヒビンβAと推定されるDNAの塩基配列を決定した。
【００５４】
この配列を配列番号11に示す。また、この配列を含む、300bpのDNA断片にロッシュダイアグノティス社製のディグＤＮＡラベリングキット（DIG DNA Labeling kit）を用いてDIG標識し、プローブを作製した。  次にネコ腎由来細胞CRFKを150cm2フラスコで３〜４日培養し、5×107cellsの細胞沈殿物を調製した。mRNA 抽出キット（ストラタジーン社）によりmRNAを調製した。すなわち、CRFKの沈殿物にグアニジン・チオシアネートを含む変性溶液を加え、21Gニードルで混入しているDNAをせん断した。次に溶出緩衝液を加え遠心を行い、その上清を得た。得られた上清をオリゴdTセルロースカラムにアプライし、カラムの洗浄を行った後、予め68℃に加温しておいた溶出緩衝液によりポリ（A）RNAを溶出した。次に得られたポリ(A)RNAを用いて、ザップDNA合成キット（ZAP-DNA Synthesis kit）（東洋紡社）によりcDNAファージライブラリーを合成した。すなわちキットのマニュアルに従い２本鎖cDNAを合成し、さらにエコアールワン（EcoRＩ）/ノットワン（NotＩ）アダプターを連結した。次にユニザップエクスアールベクター（Uni-ZAP XR  vector）に連結した後、ギガパックスリーパッケージングエキストラクト（GigapackIIIpackaging extract）（ストラタジーン社）を用いてパッケージングを行い、組換え体ファージライブラリーを作製した。この組換え体ファージライブラリーを大腸菌XL1Blue MRF’上でプラークとして形成させ、ロシュダイアグノティス社製のナイロンメンブレンに常法に従って転写した。転写したナイロンメンブレンは、DNAの固定を行った後、2mg/mLプロテイナーゼK溶液中に浸し、37℃１時間インキュベートした。さらにそのナイロンメンブレンを、最終濃度20ng/mLになるように前記プローブを加えたディグイージハイブ（DIG EASY HYB）（ロシュダイアグノティス社製）中に入れ、42℃で1晩インキュベートを行い、ハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたナイロンメンブレンを、２×SSC(30mMNaCl、3mMクエン酸ナトリウム)、0.1%SDS中５分、２回洗浄を行い、さらに0.5×SSC(7.5mMNaCl、0.75mMクエン酸ナトリウム)、0.1%SDS中65℃下、15分、２回洗浄を行った。ナイロンメンブレンをCDP-Starによる化学発光により陽性プラークの検出を行った。すなわち、洗浄したナイロンメンブレンをブロッキング溶液（ロシュダイアグノティス社製）に室温下30分以上インキュベートした後、アルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体（ロシュダイアグノティス社製）を含むブロッキング溶液内に入れてさらに30分インキュベートした。抗体溶液を捨て、洗浄バッファー(100ｍＭマレイン酸、150mMNaCl、0.3%Tween20)で15分間、各２回ずつナイロンメンブレンを洗浄し、検出バッファー（100mMTris-HCl(pH9.5)、100mMNaCl）内に溶解させたCDP-Starをナイロンメンブレンに処理し、５分間室温で、さらに15分間37℃下でインキュベートした。得られたナイロンメンブレンをX-ray Filterに露光し、陽性シグナルを有するプラークを常法に従い再スクリーニングした。３回のスクリーニングの結果、陽性シグナルを有する１個の組換え体ファージのプラークを得た。この組換え体ファージよりin vivo exision法により、組換えプラスミドを含む大腸菌を得た。この大腸菌を培養し、常法に従いプラスミドを調製し、ABI PRISM 377XL(アプライドバイオシステムズ)により、ビッグダイターミネーターサイクルシーケンス（BigDye Terminator Cycle Sequencing）法でヒトやマウスなどのインヒビンβAとのホモロジーを確認し、３‘末端側を含むネコインヒビンβA DNAの部分塩基配列（配列番号13）を決定した（但し、この塩基配列には、プライマーに用いたヒトインヒビン部分配列により一部置換されている）。
【００５５】
（２）５’RACE法によるネコインヒビンβA遺伝子５’末端のクローニング
（１）で得られたネコインヒビンβAの部分塩基配列をもとに、配列番号17と配列番号18と配列番号19の3種類のプライマーをDNAシンセサイザーにて合成した。上記（１）のCRFKmRNAを0.5mLのマイクロチューブに２μLを入れ、５’レースキット（RACE kit）(ギブコ社製)を用いてネコインヒビンβAの５’側末端を含むDNAを調製した。すなわち、CRFKmRNAおよびRNaseを不活化するためのDEPC水、プライマー25pmol（配列番号17）を加え、70℃10分間処理した。次に氷上で１分間おき、10×PCR Buffer、25mM MgCl２、10mM dNTP、0.1M DTTをそれぞれ添加し42℃で１分加温した。次にSuperScriptIIRTを添加し、さらに42℃で30分処理し続けて70℃15分処理して、cDNAへの逆転写を行った。最後にRNaseMixを加え37℃で20分処理を行ってRNAを分解した。こうして得られたサンプルを用いて、スピンカートリッジにより逆転写されたcDNAの精製を行った。すなわち、結合緩衝液(6M NaI)をサンプルに添加し、スピンカートリッジにセットした後13,000G、20秒遠心を行った。400μL 洗浄緩衝液で洗浄を繰り返し、さらに70%エタノールで洗浄を加えた後、予め65℃に熱しておいた滅菌水を加えて13,000G、20秒遠心を加えた。溶出したサンプル10μL、DEPC処理水6.5μL、tailing Buffer5μL、2mMdCTP2.5μLを混合し、94℃、3分処理した後、氷上で1分静置した。次に５’RACE kit(ギブコ社製)のターミネーターデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（terminal deoxynucleotidyl transferase）1μLを加え、３７℃10分処理し、さらに65℃、10分処理して、後述のアダプタープライマーと塩基配列が相補的な塩基配列を前記ｃDNA５’末端に付加させた。得られたサンプルを用いて、プライマー20pmol（配列番号18）およびアダプタープライマー20pmol、20mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)、1.5mM MgSO４、25mM KCl、50μM各ｄＮＴＰ、KODを添加し、全量50μLとした。DNAの変性条件94℃,30秒、プライマーのアニーリング条件を62〜50℃，30秒、プライマーの伸張条件を68℃,１分の各条件でバイオラッド社製DNAサーマルサイクラーを用いて、35サイクル反応させた。得られたPCR産物を用いてプライマー20pmol（配列番号19）およびアダプタープライマー20pmol、20mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)、1.5mM MgSO４、25mM KCl、50μM各ｄＮＴＰ、KODを添加し、全量50μLとした。DNAの変性条件94℃,30秒、プライマーのアニーリング条件を62〜50℃，30秒、プライマーの伸張条件を68℃,１分の各条件でBio-RAD社製DNAサーマルサイクラーを用いて、35サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約400bpのDNA断片を常法に従って調製した。
【００５６】
このDNA断片をpUC108（アマシャムファルマシア社）にDNA ライゲーションキット（Ligation kit Ver.2）を用いて連結した。これを用いて常法に従って大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドDNAを常法により調製した。次にこのプラスミドにPCR断片が挿入されていることを前述と同条件のＰＣＲにより確認し、ABI PRISM 377XL(アプライドバイオシステムズ)により、ビッグダイターミネーターサイクルシーケンス（BigDye Terminator Cycle Sequencing）法で５’末端を含むネコインヒビンβAのDNAの一部と推定される塩基配列を決定した（配列番号14）。
【００５７】
（３）ネコインヒビンβAのcDNA配列
上記の（１）および（２）により、決定された塩基配列をつき合わせて、ネコインヒビンβAのcDNA完全配列が明らかになった（配列番号１0）。
【００５８】
得られた得られたネコインヒビンβA遺伝子のホモロジー検索の結果、Equus caballus（ウマ）：91%、O aries（ヒツジ）：90%、Porcine（ブタ）：93%、Homo sapiens（ヒト）：90%、Rattus norvegicus（ラット）：88%、Mus musculus（マウス）：88%であった。
【００５９】
参考例４
（ネコアクチビンＡの生産）
（１）ネコインヒビンβAトランスファーベクターの調製およびトランスフェクション
ネコインヒビンβADNA断片は配列番号20と配列番号21の２種類のプライマー（それぞれ、制限酵素ゾーワン（XhoＩ）及びエコアールワン（EcoRＩ）の切断部位に相当する塩基配列を有する）を作製し、参考例２（３）で調製したcDNA断片を鋳型とし、DNAの変性条件94℃,30秒、プライマーのアニーリング条件を60℃，30秒、プライマーの伸張条件を68℃,１分の各条件でBio-RAD社製DNAサーマルサイクラーを用いて、35サイクル反応させた。エタノール沈殿後、１％アガロースゲル電気泳動にて約1.3kbpのDNA断片を調製した。このDNA断片をT4 ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した後、予めスマワン（SmaＩ）処理し、脱リン酸化処理したpUC108に挿入した。これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。さらに、作製したプラスミド中のネコインヒビンβADNAの塩基配列を確認した。
【００６０】
本プラスミドを２種類の制限酵素(ゾーワン（XhoＩ）及びエコアールワン（EcoRＩ）)で処理し、電気泳動法によりネコインヒビンβADNA断片を得た。一方、哺乳動物細胞用トランスファーベクター（pOPRSVI/MCS）（ストラタジーン社製）を制限酵素ゾーワン（XhoＩ）及びエコアールワン（EcoRＩ）で切断し、調製した。こうして得られたネコインヒビンβADNA断片と切断されたベクターにDNA ライゲーションキット（Ligation kit Ver.2）を用いて連結させた。この連結させたベクターを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。さらに、作製したプラスミド中のネコインヒビンβADNAの塩基配列を確認した。次にこのプラスミドをチャイニーズハムスター卵巣細胞株（CHO-K1）細胞にトランスフェクション試薬（GenePORTERTransfection Reagent）を用いてトランスフェクションを行った。
【００６１】
（２）CHO-K1でのネコアクチビンＡの発現
上記（１）で得られた細胞を、３７℃下４〜５日間培養を行い、その培養上清を回収し、12,000rpm、20分間遠心を行い、ネコアクチビンＡを含む上清画分を得た。
【００６２】
（３）ネコアクチビンＡの活性測定
上記（２）で生産されたネコアクチビンＡの活性測定は以下のようにして行った。すなわちアクチビンＡによる骨髄性白血病細胞株K562細胞のヘモグロビン放出により行った。（文献８）96穴プレートにK562細胞（2×10５cells/mL）を10%FBSを含むRPMI-1640培地により、（３）で得られたアクチビンＡを含む培養上清非存在下または存在下、４日間培養を行う。次に細胞をPBSにより２回洗浄し、滅菌した水50μLに懸濁し、遠心操作により上清画分40μLを得る。得られた上清に0.5mg/mL オルトフェニレンジアミン と0.03%過酸化水素を含むクエン酸緩衝液200μLを加え、暗下15分処理した。その後2.5M硫酸を50μL加え、490nmの吸光度の測定を行った。その結果を図２に示す。図２は、各例における吸光度を示すグラフである。ネコアクチビンＡ存在下の方の実施サンプル（アクチビンＡ）は、非存在下の方のコントロールサンプル（コントロール）に比べて有意にヘモグロビンの誘導を行った。
【００６３】
参考文献
１．Uenoら：Proc Natl Acad SciUSA.1984. 84. 8282-86
２．Molecular Cloning .Cold Spring Harbor Laboratory.New York.1982
３．Takabeら：Mol Cell Biol.1988 .8 .466-472
４．Jennieら：Endcrinology.1993.132.2732-34
５．Mason AJら：Nature.1985. 318. p659-663
６．Molecular Cloning .Cold Spring Harbor Laboratory.New York.1982
７．Takabeら：Mol Cell Biol.1988 .8 .466-472
８．Jennieら：Endcrinology.1993.132.2732-34。
【００６４】
（実施例）
１．ネコフォリスタチンの担体への固定化
上記で調製した濃度１ｍｇ／ｍＬ(10mL)のネコフォリスタチンを含み、かつ０．９％ＮａＣｌを含むpH8.0のグリシン緩衝液条件下、ラテックス微粒子(immutexG5302,日本合成ゴム社製)１０ｍｇと混合し４℃一晩物理吸着させた。次に、17000rpm、15分間遠心処理を実施し、未吸着のネコフォリスタチン画分を除去した。ラテックス微粒子を１ｍｇ/mLの濃度になるようにエマルジョン18溶液に懸濁した。本溶液を１０ｃｃに懸濁し、１−シクロヘキシル−3−（２−モルフォリノエチル）カルボジイミドメト−P−トルエンスルホン酸（メルク社製）を０．１ｍLを添加し、4℃下20時間攪拌した。次にこの反応液を１７０００ｒｐｍで15分間遠心し、さらに0.05%エマルジョンを含む２０ｍMホウ酸緩衝液（ｐH9）により３ｍｇ／ｍＬの濃度で再懸濁した。
【００６５】
２．ラテックス微粒子の凝集性
ネコアクチビンＡをコントロールとし、正常ネコ血清を用いて希釈したネコアクチビンＡの標準液（０，１，１０，１００，１０００ng/mL）を調製した。ネコフォリスタチンを固定化したラテックス微粒子および固定していないラテックス微粒子を用意し、それぞれ500μg/mLに希釈した。希釈溶液は、2%ポリエチレングリコール6000、0.5MNaCl、0.05%エマルジョン16を含む50mMTris-HCl緩衝液(pH8)で行った。次にネコアクチビンＡ標準液50μL、ラテックス微粒子100μＬ、希釈液350μＬを加え、室温にて１時間反応させた。その後、散乱光強度をレーザーネフェロメーターにて測定した。その結果を図３に示す。図３はネコフォリスタチンを固定化したラテックス微粒子にネコアクチビンＡを反応させた際の散乱光強度を示したグラフであり、これによりラテックス微粒子の凝集程度がわかる。グラフ中、フォリスタチン（＋）はネコフォリスタチンを担体に吸着させた場合のネコアクチビンの吸着量を示しており、吸着量は濃度依存的であるのに対し、フォリスタチン（―）は  担体にネコフォリスタチンが固定化されていないため、ネコアクチビンＡが吸着することがないため、ネコアクチビンＡが検出されていない事を示す例である。すなわち、ネコアクチビンＡは担体に物理吸着することなく、ネコフォリスタチンに特異的に結合しているものと考えられる。また、フォリスタチンを固定化したラテックス微粒子では10ng/mL以下のネコアクチビンＡで凝集を示したことから、高い感度を有しているものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
ネコフォリスタチンを固定化した担体にネコ由来試料を接触させ、試料中のネコアクチビンＡの測定方法および測定キットは、ネコアクチビンＡの亢進が予想される慢性腎疾患の新たな診断方法になる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１は、ネコフォリスタチンを用いたアクチビンＡによるヘモグロビン放出作用の抑制を示すグラフである。
【図２】図２は、ネコアクチビンＡを用いたヘモグロビン誘導を示すグラフである。
【図３】図３は、ネコフォリスタチンを固定化したラテックス微粒子にネコアクチビンＡを反応させた際の散乱光強度を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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