(57)【要約】本発明は、細胞への核酸の送達効率を高めるのに有用な方法および成分に関する。細胞は、好ましくは哺乳類の細胞である。本発明の方法は、トランスフェクトされる細胞の細胞骨格の許容性を向上させることが可能な薬剤を細胞に送達する工程からなる。更に、本発明の方法は、細胞のトランスフェクションの為の核酸送達系を細胞に提供することにより細胞への核酸の送達効率が高められる工程からなる。また、細胞への核酸の送達効率を高める為の成分、およびキットも含まれる。
2004530401.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞への核酸の送達効率を高める方法であり、
ａ）トランスフェクトされる該細胞の細胞骨格の許容性を向上させることのできる薬剤を、該細胞骨格の許容性を向上させるのに効果的な量を用いて細胞に供給する工程、および、
ｂ）該細胞にトランスフェクトする為の核酸送達システムを該細胞に供給することにより、該細胞への核酸の送達効率を高める工程
からなる方法。
【請求項２】
薬剤がタンパク質、またはポリペプチドをコードする単離された核酸であり、タンパク質、またはポリペプチドは、細胞で発現された場合、細胞にトランスフェクトする際の細胞骨格許容性を高めることが可能である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
核酸送達系が、薬剤を投与するのと同時に細胞へ投与される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
核酸送達系が、薬剤を投与する前に細胞へ投与される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
核酸送達系が、薬剤を投与した後に細胞へ投与される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
薬剤が、変性コラーゲン、あるいは、そのペプチドである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
薬剤が、サイモシンβ‐４（ＴＢ４）、またはそのペプチドである、請求項１記載の方法。
【請求項８】
薬剤が、テナシンＣ、またはそのペプチドである、請求項１記載の方法。
【請求項９】
薬剤が、テナシンＣ、およびＴＢ４からなる、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質が、テナシンＣ、ＴＢ４、およびそれらのペプチドから選ばれる一つ以上のものからなる、請求項２記載の方法。
【請求項１１】
単離された核酸が、プラスミドベクター、ウイルスベクター、および直線化した核酸からなる群より選択されたベクターを利用して細胞に供給される、請求項２記載の方法。
【請求項１２】
核酸送達系が、プラスミドベクター、ウイルスベクター、および直線化した核酸からなる群より選択されたベクターからなる、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
細胞にトランスフェクトする為の細胞骨格許容性の向上が、細胞を取り巻く環境、あるいは、細胞質内におけるＤＮＡａｓｅ Ｉ活性の抑制からなる、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
細胞にトランスフェクトする為の細胞骨格許容性を高めることが、そのトランスフェクトされる細胞を取り巻く環境、あるいは、その細胞質内における全体の電気陰性の電荷を減少させることからなる、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
細胞骨格許容性の向上が、細胞内のＧアクチンの量を増大させることからなる、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
Ｇアクチンの量の増大が、Ｆアクチンを解重合し、Ｇアクチンとすることからなる、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
薬剤が、細胞内のイオンチャンネルを調節できる化合物である、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
薬剤が、アクチン結合タンパクである、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
薬剤が、Ｇアクチンと結合することによりＧアクチンがタンパク質分解を受けにくくさせることのできる化合物である、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
化合物が、フッ化ベリリウム、およびカドミニウム塩からなる群より選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
Ｇアクチンの量が、ＴＢ４を直接的、または間接的に上方制御することにより増大される、請求項１５記載の方法。
【請求項２２】
ＴＢ４が、テナシンＣを誘発する基質上で細胞を増殖させることにより、間接的に上方制御されている、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
テナシンＣ誘発基質が、変性コラーゲン、またはそのペプチドである、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
薬剤が、テナシンＣ、およびＴＢ４受容体情報伝達経路における中間体の調節物質である、請求項１記載の方法。
【請求項２５】
薬剤が、サイトカラシンである、請求項１記載の方法。
【請求項２６】
薬剤が、トランスフェクトされる細胞の細胞骨格許容性の向上に効果的なデザインであるという特徴を持つＴＢ４プロモーター、細胞間相互作用に関与する分子、細胞間接着に関与する分子、および合成細胞外マトリックス分子からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項２７】
細胞への核酸送達効率を高める組成物であり、組成物が、ａ）許容性の向上に効果的な量によりトランスフェクトされる細胞における細胞骨格許容性を向上させることのできる薬剤、および
ｂ）細胞へトランスフェクトする為の核酸送達系
からなる組成物。
【請求項２８】
核酸送達系が、プラスミドベクター、ウイルスベクター、および直線化した核酸からなる群より選択される、請求項２７記載の組成物。
【請求項２９】
薬剤が、タンパク質、またはポリペプチドをコードする単離された核酸であり、細胞においてこのタンパク質、またはポリペプチドが発現した場合、そのトランスフェクトされる細胞の細胞骨格許容性を向上させることができる、請求項２７記載の組成物。
【請求項３０】
単離された核酸が、核酸送達系の構成成分である、請求項２９記載の組成物。
【請求項３１】
ポリペプチドが、ＴＢ４、テナシンＣ、およびそのペプチドからなる群より選択される、請求項２９記載の組成物。
【請求項３２】
薬剤が、ＴＢ４又はそのペプチド、テナシンＣ又はそのペプチド、アクチン解重合剤、サイトカラシン、ＴＢ４の調節物質、テナシンＣおよびＴＢ４受容体情報伝達経路における中間体の調節物質、核酸分解酵素阻害剤、および変性コラーゲン又はそのペプチドからなる群より選択される、請求項２７記載の組成物。
【請求項３３】
細胞への核酸送達効率を高めるキットであり、キットは
ａ）説明書、
ｂ）許容性の向上に効果的な量によりトランスフェクトされる細胞における細胞骨格許容性を向上させることのできる薬剤、および、
ｃ）核酸送達系からなる。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
連邦政府により援助された研究および開発に関する供述
本発明は、一部アメリカ合衆国政府からの資金（ＮＩＨ Ｇｒａｎｔ Ｎｏ． ＨＬ３８１１８）により援助されており、従って、アメリカ合衆国政府は、本発明に対してある種の権利を持ち得る。
【０００２】
発明の背景
遺伝子治療は、一般的にアンチセンスＤＮＡおよびＲＮＡ、リボザイム、ウイルス断片および機能的に有効な治療用遺伝子等を含む核酸を標的細胞へ送達する為の手法のことを意味すると解釈されている（Ｃｕｌｖｅｒ， １９９４， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ， Ｍａｒｙ Ａｎｎ Ｌｉｅｂｅｒｔ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ））。これらの核酸は、例えば、ｍＲＮＡの翻訳を抑制するアンチセンスＤＮＡのように、そのものが治療的であってもよく、あるいは、これらは、例えば、細胞機能を促進、抑制、増大、または置換する治療用タンパク質をコードしてもよい。
【０００３】
今日の遺伝子治療戦略の深刻な欠点は、生体外および生体内遺伝子治療法の両方において、上述したベクターと送達系の組合せが標的とする個体群の細胞の内部へ核酸を効率良く送達する能力が無いことである。１９９５年１２月に米国国立衛生研究所が報告書（“Ｒｅｐｏｒｔ ａｎｄ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｐａｎｅｌ ｔｏ Ａｓｓｅｓｓ ｔｈｅ ＮＩＨ Ｉｎｖｅｓｔｍｅｎｔ ｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ” （Ｏｒｋｉｎら １９９５， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ））を発表した。この報告書によると、効果的な遺伝子導入ベクターの不足により疾病治療の為の遺伝子治療法の開発が、部分的に抑制されていることが認識された。この報告書は、遺伝子送達用ベクターの改良に適用する更なる研究の必要性を認めた。
【０００４】
動物組織へ核酸を送達する為の多数の成分、および方法が知られている。この様な成分としては、「裸の」（即ち、非複合型）核酸、ポリリジンおよびリポゾーム形成型脂質等の陽イオン分子と複合体を形成した核酸、並びに、ウイルスベクターを含む。
【０００５】
裸の核酸は、多様な動物細胞に取込まれるが、これらを取込む細胞内外両方においてヌクレオチド鎖切断の対象となる。例えば、傷を受けた組織の中の細胞（例えば、切開した局所の内側を覆う細胞）は、裸の核酸を特に取込みやすい状態にあることが知られている。この様な細胞の例としては、繊維芽細胞、毛細管内皮細胞、毛細管周皮細胞、単核炎症細胞、分節核炎症細胞、および肉芽組織細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【０００６】
比較的ヌクレオチド鎖切断を受けにくい核酸類縁体の使用が知られている。これら類縁体は、例えば、核酸モノチオリン酸塩類縁体を含む。しかしながら、ある状況において、特に標的細胞ゲノムへの核酸の取込みが望まれる場合、核酸類縁体の使用は望ましくないと考えられる。液体に組織が浸されているという通常の状況においては、ベクターが組織の位置から流される可能性がある為裸のｎａｋｅｄ−核酸ベクターの標的を特定の動物組織とすることは、特に難しいと考えられる。
【０００７】
裸の核酸を徐放出する為の組成物は公知であるが、この様な組成物は他の裸の核酸ベクターと同様な多数の欠点を持ち、つまり、組成物から放出された核酸は所望の組織の細胞に効率良く取込まれず、組成物から放出されたこれらの核酸はヌクレオチド鎖切断を受けやすい。この様な組成物の例としては、生物分解性高分子マトリックス内の裸の核酸からなる組成物が含まれる。また、この様な組成物の別の欠点としては、これらの標的を特定の組織とし核酸の局所的な送達を達成することが困難であるという点である。この様な組成物は、一般には、所望の部位に注入する必要があるが、投与部位から他の部位へ流れることが可能な液体である。
【０００８】
標的細胞による核酸の取込み、または安定性を改善する為に化合物と複合体を形成させた核酸からなる多数のベクターが示されている。この様な化合物の例としては、リン酸カルシウム、およびジメチルアミノエチル‐デキストラン、ポリリジン又はボリブレン等のポリカチオン、並びに、臭化ジドシルメチルアンモニウムおよびリポフェクトアミン等のリポゾーム形成脂質が挙げられる。これら多くの化合物は、患者へ投与した場合に有毒、あるいは、望ましくない反応を引き起こす。したがって、これらの化合物の内のいずれかと複合体を形成する核酸からなる核酸ベクターは培養細胞へトランスフェクトする際に有用であり得るが、これらのベクターは動物組織内細胞への核酸送達においては有用でない。
【０００９】
一般にウイルスベクターは、最も効率的な核酸ベクターであると考えられている。組換複製能欠損ウイルスベクターは、生体内、および生体外両方における動物細胞への導入（即ち、感染）に使用されている。これらのベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターを含む。遺伝子導入においては、非常に優れた有効性を示すが、ウイルスベクターの使用に関する重大な欠点は、多くのウイルスベクターが分裂しない細胞に感染できないことである。また、ウイルス遺伝子ベクターの使用に関する別の深刻な問題は、この様なベクターを投与された患者において、それが免疫反応を引き起こす可能性である。ベクターを繰り返し、あるいは、持続的に投与すると、患者の免疫系は、急速にベクターを除去する為、この様な免疫反応は、ウイルスベクターの有効性を制限するものである。更に、ウイルスベクターによる細胞ゲノムへの遺伝子挿入は、その細胞において好ましくない変異を引き起こす可能性がある。ウイルス遺伝子ベクターに関する他の問題としては、トランスフェクトされた細胞において、ある期間適切に遺伝子発現を制御できないこと、有害なウイルス粒子を産生し、他の人間に伝染させる可能性、局所および全身毒性、望ましくない免疫原性、標的とする、または他の細胞代謝の意図しない破壊が含まれる。
【００１０】
上記の手法が開発されているにもかかわらず、当該分野においては、未だに核酸をトランスフェクトされる所望の細胞への核酸送達を促進する為に使用できる方法、および組成物が必要とされている。本発明は、この要求に応じるものである。
【００１１】
発明の簡単な概要
本発明は、核酸の細胞への送達効率を高める方法を含む。当該方法は、ａ）トランスフェクトされる細胞の細胞骨格の許容性を向上させることのできる薬剤を、細胞骨格許容性を高めるのに効果的な量を用いて細胞に供給する工程；およびｂ）細胞にトランスフェクトする為の核酸送達システムを細胞に供給することにより、細胞への核酸の送達効率を高める工程からなる。
【００１２】
ある一つの局面において薬剤とは、タンパク質、またはポリペプチドをコードする単離された核酸であり、そのタンパク質、またはポリペプチドは、細胞で発現された場合、細胞にトランスフェクトする際の細胞骨格許容性を高めることが可能である。
【００１３】
別の局面において核酸送達系は、薬剤を投与するのと同時に細胞へ投与される。
【００１４】
一つの態様において核酸送達系は、薬剤を投与する前に細胞へ投与される。
【００１５】
別の態様において核酸送達系は、薬剤を投与した後に細胞へ投与される。
【００１６】
また別の態様において薬剤は、変性コラーゲン、あるいは、そのペプチドである。
【００１７】
更に別の態様において薬剤は、サイモシンβ‐４（ＴＢ４）、またはそのペプチドである。
【００１８】
一つの局面において薬剤は、テナシンＣ（Ｔｅｎａｓｃｉｎ）、またはそのペプチドである。
【００１９】
別の局面において薬剤は、テナシンＣ、およびＴＢ４からなる。
【００２０】
一つの態様において、当該タンパク質は、テナシンＣ、ＴＢ４、およびそれらのペプチドから選択される一つ以上のものからなる。
【００２１】
別の態様において単離された核酸は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、および直線化した核酸からなる群より選択されたベクターを利用して細胞に供給される。
【００２２】
更なる態様において核酸送達系は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、および直線化した核酸からなる群より選択されたベクターからなる。
【００２３】
本発明の方法における一つの局面において細胞にトランスフェクトする為の細胞骨格許容性の向上は、細胞を取り巻く環境、あるいは、細胞質内におけるＤＮＡａｓｅ Ｉ活性の抑制からなる。
【００２４】
別の局面において、細胞にトランスフェクトする為の細胞骨格許容性を高めることは、その細胞を取り巻く環境、あるいは、その細胞質内における全体の電気陰性の電荷を減少させることからなる。
【００２５】
一つの局面において細胞骨格許容性の向上は、細胞内のＧアクチンの量を増大させることからなる。
【００２６】
別の局面においてＧアクチンの量の増大は、Ｆアクチンを解重合し、Ｇアクチンとすることからなる。
【００２７】
一つの態様において薬剤は、細胞内のイオンチャンネルを調節できる化合物である。
【００２８】
別の態様において薬剤は、アクチン結合タンパクである。
【００２９】
更なる形態において薬剤は、Ｇアクチンと結合することによりＧアクチンがタンパク質分解を受けにくくさせることのできる化合物である。
【００３０】
一つの局面において化合物は、フッ化ベリリウム、およびカドミニウム塩からなる群より選択される。
【００３１】
一つの態様においてＧアクチンの量は、ＴＢ４を直接的、または間接的に上方制御することにより増大される。
【００３２】
一つの局面においてＴＢ４は、テナシンＣを誘発する基質上で細胞を増殖させることにより間接的に上方制御されている。
【００３３】
一つの態様においてテナシンＣ誘発基質は、変性コラーゲン、またはそのペプチドである。
【００３４】
更なる態様において薬剤は、テナシンＣ、およびＴＢ４受容体情報伝達経路における中間体の調節物質である。
【００３５】
また、さらなる態様において薬剤は、サイトカラシンである。
【００３６】
また、別の態様において当該薬剤は、トランスフェクトされる細胞の細胞骨格許容性の向上に効果的なデザインであるという特徴を持つＴＢ４プロモーター、細胞間相互作用に関与する分子、細胞間接着に関与する分子、及び、合成細胞外マトリックス分子からなる群より選択される。
【００３７】
更に、本発明は細胞への核酸送達効率を高める組成物を含む。当該組成物は、ａ）許容性の向上に効果的な量によりトランスフェクトされる細胞における細胞骨格許容性を向上させることのできる薬剤、およびｂ）細胞へトランスフェクトする為の核酸送達系からなる。
【００３８】
一つの態様において核酸送達系は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、および直線化した核酸からなる群より選択される。
【００３９】
一つの局面において薬剤はタンパク質又はポリペプチドをコードする単離された核酸であり、細胞においてこのタンパク質又はポリペプチドを発現した場合、そのトランスフェクトされる細胞の細胞骨格許容性を向上させることができる。
【００４０】
また、別の局面において単離された核酸は、核酸送達系の構成成分である。
【００４１】
一つの態様においてポリペプチドは、ＴＢ４、テナシンＣ、およびそのペプチドからなる群より選択される。
【００４２】
別の態様において薬剤は、ＴＢ４又はそのペプチド、テナシンＣ又はそのペプチド、アクチン解重合剤、サイトカラシン、ＴＢ４の調節物質、テナシンＣおよびＴＢ４受容体情報伝達経路における中間体の調節物質、核酸分解酵素阻害剤、および変性コラーゲン又はそのペプチドからなる群より選択される。
【００４３】
本発明は、細胞への核酸送達効率を高めるキットを含む。キットは、ａ）説明書、ｂ） 許容性の向上に効果的な量によりトランスフェクトされる細胞における細胞骨格許容性を向上させることのできる薬剤、およびｃ）核酸送達系からなる。
【００４４】
本発明に関する前記の概要、および以下の詳細な説明は、添付の図面と照らし合わせて読むことにより、より良く理解されるだろう。
【００４５】
発明の詳細な説明
本発明は、細胞への核酸の送達効率を高める方法、および組成物に関する。本発明の方法は、トランスフェクトされる細胞の細胞骨格許容性を高めることのできる薬剤、並びに、トランスフェクトされる細胞への核酸の送達を促進する核酸送達系を使用することからなる。トランスフェクトされる細胞の細胞骨格許容性は、例えば、トランスフェクトされる細胞を取り巻く環境、またはその細胞質内における全体の電気陰性の電荷を減少させること、トランスフェクトされる細胞を取り巻く環境、または細胞質内における核酸分解酵素活性を抑制すること、またはトランスフェクトされる細胞内のＧアクチンの量を増大させることにより高めることができるが、これらは例であり、これらに限定されるものではない。細胞への核酸の送達効率を上げる方法を提供することにより、本発明の方法、および組成物は、哺乳類における遺伝子療法の治療的、および予防的応用の成功に立ちはだかる障害を乗り越える上で大変貴重なものとなる。
【００４６】
本発明は、遺伝子治療方針における治療の対象、または核酸をトランスフェクトされる所望の標的となり得る実質的にいかなる種類の細胞への核酸送達効率を上げるのにも有用である。本発明の方法、および組成物は、これにより、実質的に全ての遺伝子治療方針において大きな利点を提供する。現在のところ、これらの方針では、導入遺伝子の発現レベルが低いため、本発明の方法、および組成物は、哺乳類細胞へのプラスミドＤＮＡの送達効率を高める、あるいは、アデノ随伴ウイルス、およびレトロウイルスベクターによる哺乳類細胞への核酸の送達効率を高める際に特に有用である。更に、本発明は、トランスフェクトされる特定の細胞への核酸の組織特異的ｉｎ ｓｉｔｕ送達の効率を高めるのに有用である。その結果、トランスフェクト後に発現される治療用タンパク質は、疾病、または組織特異的である。
【００４７】
定義
ここで使用される以下に示す用語は、本項において関係付けられた意味を持つ。
【００４８】
ここで冠詞「一つの（ａおよびａｎ）」は、一つ以上（即ち、少なくとも一つ）の文法における冠詞の目的語を意味する。例えば、「一つの要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」とは一つの要素、または複数の要素を意味する。
【００４９】
ここで「細胞への核酸の送達効率を高める」とは、核酸をトランスフェクトする対象となる細胞において核酸の量、または存在する期間を増やすことを意味する。これは、一つ以上のいずれの方法によりもたらされてもよく、エピゾームの、または組込まれた核酸の発現を開始、保持、および持続させる工程、および発現する細胞の核への適切な核酸ベクターの輸送を容易にする工程を含むが、これらに限定されない。
【００５０】
ここで「トランスフェクトされる細胞の細胞骨格許容性を向上させる」とは、核酸を細胞にトランスフェクトする上で細胞骨格により示される一つ以上のいずれの生化学的、および生理学的障壁も直接的、または間接的に低下させることを意味する。これらの障壁の例としては、トランスフェクトされる細胞を取り巻く環境、あるいは、その細胞質内における全体の電気陰性の電荷、およびトランスフェクトされる細胞を取り巻く環境、あるいは、その細胞質内における核酸分解酵素の活性を含むが、これらに限定されない。
【００５１】
ここで、「核酸送達系」とは、当該分野において公知、あるいは、今後知られる細胞へ核酸を送達する為に使用できる如何なる組成物、または系であってもよい。このような系は、核酸の構造および機能を保持できる細胞に核酸を送達する為の如何なる組成物も含む。例えば、この様な系は、「裸の」（即ち、非複合型）核酸、ポリリジンおよびリポゾーム形成型脂質等の陽イオン分子と複合体を形成した核酸、プラスミドベクター、ウイルスベクター、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、およびバクテリオファージ等のベクター、および直線化した核酸を含むが、これらに限定されない。
【００５２】
ここで「ベクター」とは、単離された核酸からなる組成物であると共に、細胞の内部へ単離された核酸を送達する為に使用できる組成物である。
【００５３】
ここで「発現ベクター」とは、発現される塩基配列に発現制御配列が効果的に連結している組換えポリヌクレオチドからなるベクターを意味する。ここに記載されているベクターとは、具体的には、発現ベクターを含む。発現ベクターは、発現の為に十分なシス作用成分からなり、また、発現の為の他の要素は、宿主細胞、または生体外発現系により供給することができる。発現ベクターは、コスミド、プラスミド（例えば、裸のもの、またはリポゾーム内に含まれているもの）、および組換えポリヌクレオチドを含むウイルス等の当該分野において公知であるすべてのものを含む。
【００５４】
ここで「核酸」とは、任意の核酸を意味し、デオキシリボヌクレオシド、またはリボヌクレオシドであってもよく、また、ホスホジエステル結合又はホスホトリエステル、ホスホルアミダート、シロキサン、炭酸塩、カルボキシメチルエステル、アセトアミダート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホルアミダート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホルアミダート、架橋ホスホルアミダート、架橋メチレンホスホネート、ホスホロチオネート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート、架橋ホスホロチオネート又はスルホン結合、およびこれらの結合の組合せ等の改変した結合であってもよい。更に、核酸とは、具体的には、生物学的に存在する五つの塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン、およびウラシル）以外からなる核酸も含む。
【００５５】
ここで「単離された核酸」とは、自然に存在する状態においてその両脇に存在する配列から分離した核酸の部分、または断片を意味し、例えば、通常断片に隣接した配列、例えば、自然に存在するゲノムにおいて断片に隣接した配列から取り除いたＤＮＡ断片である。また、この用語は、核酸に自然に付随する他の構成成分、例えば、細胞内で核酸に自然に付随するＲＮＡ、またはＤＮＡ、またはタンパク質から十分に精製した核酸にも適用される。その結果、この用語は、例えば、ベクター、自律複製プラスミド、またはウイルス、あるいは、原核生物、または真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた組換えＤＮＡ、または他の配列から独立した別の分子（例えば、ＰＣＲ又は制限酵素消化により生成したｃＤＮＡ、ゲノムｃＤＮＡ、またはｃＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡを含む。また、更なるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の部分である組換えＤＮＡも含む。
【００５６】
ここで二つのポリヌクレオチドが「操作上関連している」とは、二つのポリヌクレオチドの内、少なくとも一つが、もう一方により特徴付けられる生理的効果を発揮できる様に核酸部分内に配置された一本鎖、または二本鎖核酸部分からなる二つのポリヌクレオチドを意味している。例えば、コード領域に操作上関連しているプロモーターは、コード領域の転写を促進させることができる。
【００５７】
ここで「プロモーター」とは、プロモーターに操作上関連した遺伝子産物の発現に必要とされる核酸配列を意味する。ある場合においてこの配列は、コアプロモーター配列となり、また、他の場合において、この配列はエンハンサー配列、および遺伝子産物を発現するために必要とされる他の調節性の要素も含み得る。プロモーターは、例えば、恒常的な、あるいは、誘導性プロモーターであり得る。
【００５８】
「恒常的」なプロモーターとは、遺伝子産物をコードする、または指定するポリヌクレオチドに操作上関連している場合、ヒト生細胞における遺伝子産物の生成を、誘導物質を必要とせずに引き起こす塩基配列である。
【００５９】
「誘導性」プロモーターとは、遺伝子産物をコードする、または指定するポリヌクレオチドに操作上関連している場合、ヒト生細胞における遺伝子産物の生成を、プロモーターに相当する誘導物質が細胞内に存在する場合にのみ十分に引き起こす塩基配列である。
【００６０】
ここで「薬学的に許容される担体」とは、少なくとも一つの薬剤、核酸送達系、およびその任意の構成成分と組み合わせた化学成分、また、組み合わせた後、適当な薬剤、核酸送達系、およびその任意の構成成分を哺乳類に投与するのに使用できる化学成分を意味する。
【００６１】
説明
本発明は、核酸でトランスフェクトすべき細胞に核酸を送達する効率を増強する方法を含む。本発明の方法は、細胞骨格許容性の増強に有効な量の、トランスフェクションにおける細胞の細胞骨格許容性を増強できる薬剤を、細胞に与えることを含む。該方法はまた、細胞を所望の核酸でトランスフェクトするための核酸送達系を細胞に与えることを含む。本発明の方法は、トランスフェクトする細胞に核酸を送達する効率の増強を提供する。
【００６２】
細胞は、好ましくは、哺乳動物の組織内にあり、それはどのような種類の細胞でもよいので、したがって、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞である。ヒト細胞は好ましくは、細胞外マトリックスに結合した細胞である（すなわち循環している細胞ではない）が、循環している細胞の前駆体も好ましい。このような好ましい細胞の例は、患部組織または臓器の患部細胞または正常細胞、全種類の腫瘍細胞、全種類の幹細胞を含む全種類の前駆細胞、ワクチン接種目的で（すなわちＤＮＡワクチンを使用して）トランスフェクトしようとする細胞、および培養液中で増殖した細胞系を含む。
【００６３】
送達すべき核酸は、天然または合成のどのような種類の核酸でもよい。本発明は、使用する核酸の性質により限定されるものではない。核酸は、ウイルス、細菌、動物または植物源であり得る。核酸はＤＮＡでもＲＮＡでもよく、二本鎖、一本鎖または部分的二本鎖形で存在し得る。さらに、核酸は、ウイルスまたは他の巨大分子の一部として見出され得る（例えば、アデノウイルスの形のポリリシンによるＤＮＡの縮合を記載したファスベンダー（Ｆａｓｂｅｎｄｅｒ）ら， １９９６， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：６４７９−８９参照）。
【００６４】
本発明に有用な核酸は、例示であって限定するものではないが、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、例えばアンチセンスＤＮＡおよび／またはＲＮＡ；リボザイム；遺伝子療法用のＤＮＡ；ウイルスＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含むウイルスフラングメント；ＤＮＡおよび／またはＲＮＡキメラ；ｍＲＮＡ；プラスミド；コスミド；ゲノムＤＮＡ；ｃＤＮＡ；遺伝子フラグメント；一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、超らせんＤＮＡおよび／または三重ラセン体ＤＮＡを含む、様々なＤＮＡ構造形などを含む。核酸は、大量の核酸の調製に典型的に使用される任意の従来の手段により調製し得る。例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡは、当分野で周知の方法により、商業的に入手可能な試薬および合成機を使用して化学合成し得る（例えば、ガイト（Ｇａｉｔ）、１９８５、「オリゴヌクレオチド合成：実践的なアプローチ（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」（英国オックスフォード所在ＩＲＬプレス）。ＲＮＡは、ＳＰ６５（ＷＩ州マジソン所在プロメガ社）などのプラスミドを使用してインビトロ転写を介して高収率で作成し得る。
【００６５】
例えば、ヌクレアーゼの安定性向上が望ましい環境では、ヌクレオシド間連鎖が修飾されている核酸が好ましくあり得る。修飾されたヌクレオシド間連鎖を含む核酸も、当分野で周知の試薬および方法を使用して合成し得る。例えば、ホスホネートホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデートメトキシエチルホスホルアミデート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、ジイソプロピルシリル、アセトアミデート、カルバメート、ジメチレン−スルフィド（−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２）、ジメチレン−スルホキシド（−ＣＨ２−ＳＯ−ＣＨ２）、ジメチレン−スルホン（−ＣＨ２−ＳＯ２−ＣＨ２）、２’−Ｏ−アルキル、および２’−デオキシ−２’−フルオロホスホロチオエートヌクレオシド間連鎖を含む核酸の合成法は当分野で周知である（ウルマン（Ｕｈｌｍａｎｎ）ら， １９９０， Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． ９０：５４３−５８４；シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）ら， １９９０， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ３１：３３５およびそこに引用されている文献を参照）。
【００６６】
核酸は、当分野で周知の任意の適切な手段により精製し得る。例えば、核酸を、逆相またはイオン交換ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィーまたはゲル電気泳動により精製できる。勿論、当業者は、精製法は一部には精製しようとするＤＮＡのサイズにも依存することを認識しているであろう。
【００６７】
天然または修飾された遺伝子配列（すなわち、天然タンパク質をコードする遺伝子配列とは異なる配列を有する遺伝子）を含む核酸が本発明により包含される。これらの修飾された遺伝子配列は、点変異により引き起こされた修飾、遺伝子コード縮重または天然の対立遺伝子変異体に起因する修飾、ならびに、遺伝子工学、すなわちヒトの手により導入されたさらなる修飾を含む。
【００６８】
コードされているタンパク質またはポリペプチドの機能的特性が変化するように設計されている変化をヌクレオチド配列に導入する技術は、当分野で周知である。このような修飾は、塩基の欠失、挿入または置換、従って、アミノ酸配列の変化を含む。変化させて、タンパク質の活性を増加させ、その生物学的安定性または半減期を増加させ、そのグリコシル化パターン等を変化させることができる。該タンパク質をコードしているヌクレオチド配列に対するすべてのこのような修飾が、本発明に包含される。
【００６９】
本発明の方法において、トランスフェクションにおける細胞の細胞骨格許容性を増強できる薬剤は、例示であって限定的なものではないが、とりわけ、薬物、薬学的組成物、核酸、オリゴヌクレオチド、遺伝子、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを含む任意の化合物であり得る。
【００７０】
薬剤は、任意の天然源または合成源から得ることができる。例えば、薬剤が天然タンパク質または核酸である場合、薬剤は、以下のいかなる１つ以上の方法により調製できる。薬剤は、当業者に既知である、生体材料からタンパク質または核酸を単離または精製する任意の方法を使用して、生体材料（例えば生物学的液体または組織試料）から単離できる。このような方法は、例えば、ドイチャー（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ）ら（編、１９９０、「タンパク質精製指針（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、サンディエゴのＨａｒｃｏｕｒｔ Ｂｒａｃｅ Ｊｏｖａｎｏｖｉｃｈ）に記載されている。
【００７１】
あるいは、薬剤は、その組換えバージョンを調製することによっても得ることができる（すなわち、遺伝子工学技術を使用することにより、組換えタンパク質または組換え核酸を得、これはその後、上記したように単離または精製できる）。さらに、該薬剤は、合成的に、例えば、当業者に既知の任意の合成法によりタンパク質または核酸を化学合成することにより得ることができる。その後、合成された薬剤は、当分野で既知の任意の方法により精製できる。
【００７２】
本発明の方法の１つの好ましい態様において、薬剤は変性コラーゲンまたはそのペプチドである。コラーゲンは、どのような種類のコラーゲンでもよい。好ましくは、コラーゲンは、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の基質、より好ましくはＭＭＰ−２の基質であり得る種類のものである。好ましいコラーゲンの例は、Ｉ型コラーゲンである。そのペプチドは、ＭＭＰ加水分解結合部位による作用を受けるに十分なサイズのあらゆるペプチドであり得る。
【００７３】
別の好ましい態様において、薬剤は、アクチン結合タンパク質またはそのペプチドである。サイモシンは、以前に記載されているアクチン結合タンパク質の１ファミリーである（例えば、ロウ（Ｌｏｗ）ら， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７８ （２）：１１６２−１１６６；セーファー（Ｓａｆｅｒ）ら， １９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：２５３６−２５４０；ロウ（Ｌｏｗ）ら， １９８５， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １１６：２４８−２５５；およびＮａｃｈｍｉａｓ， １９９３， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５：５６−６２参照）。好ましいアクチン結合タンパク質は、サイモシンｂ−４（ＴＢ４）またはそのペプチドである。ＴＢ４は、哺乳動物の最も豊富な細胞内アクチン結合タンパク質である。ＴＢ４は、Ｇ−アクチンのプールの維持、創傷治癒、遊走および血管形成などの細胞機能に関与しているアクチン結合タンパク質である。ＴＢ４の構造および細胞機能は、例えば、ロウ（Ｌｏｗ）ら， １９８５， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １１６：２４８−２５５およびＮａｃｈｍｉａｓ， １９９３， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５：５６−６２に総説されている。
【００７４】
別の好ましい態様において、薬剤は、テナシンＣまたはそのペプチドである。テナシンＣは、本発明の組成物で本明細書に記載したタンパク質である。１つの側面において、薬剤は、テナシンＣおよびＴＢ４の両方を含む。
【００７５】
１つの好ましい側面において、本発明の方法の薬剤は、テナシンＣまたはそのペプチド、アクチン結合タンパク質、例えばＴＢ４またはそのペプチド、アクチン脱重合剤、サイトカラシン、ＴＢ４のモジュレーター、テナシンＣおよびＴＢ４受容体シグナル伝達経路の中間体のモジュレーター、ヌクレアーゼ阻害剤、および変性コラーゲンまたはそのペプチドからなる群から選択した薬剤である。サイトカラシンは、真核細胞でアクチン重合および微小管会合に影響を及ぼすことが知られる一連のカビ代謝物である。それらは、５００ダルトン範囲の分子量を有するヘテロ機能的生物有機化合物であり、一般に、ジメチルスルホキシドおよび関連溶媒に溶解する。サイトカラシンの使用は、例えば、ブラドキー（Ｂｒａｄｋｅ）ら， １９９９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３：１９３１−１９３４およびクーパー（Ｃｏｏｐｅｒ）、１９８７， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０５：１４７３−１４７８に記載されている。
【００７６】
１つの態様において、薬剤は、トランスフェクトしようとする細胞中で発現されると、トランスフェクションにおける細胞の細胞骨格許容性を増強できる、タンパク質またはポリペプチドをコードする単離核酸である。好ましくは、単離核酸は、テナシンＣ、ＴＢ４およびそのペプチドの１つ以上をコードする。
【００７７】
薬剤は、細胞に、単独で、例えば「裸」核酸または精製タンパク質などの「裸」形で与えても、あるいは、送達に適したベヒクルで、例えば、例示であって限定ではないが、カチオン性分子もしくはリポソーム形成脂質との複合体で、または、ベクターの一成分もしくは薬学的組成物の一成分として配合して与えてもよい。そのようなベヒクルは当分野で公知であり、本明細書において考察している。
【００７８】
薬剤は、細胞に、直接的に、例えば薬剤を細胞と接触させることにより与えても、または、間接的に、例えば任意の生物学的方法の作用により与えてもよい。例示であって限定ではないが、エンドサイトーシス、受容体標的化、天然または合成細胞膜フラグメントとのカップリング、電気穿孔法などの物理的手段、放出制御フィルムまたはナノ粒子もしくはマイクロ粒子などのポリマー性担体と薬剤を合わせること、ベクターの使用、細胞を囲む組織または液体に薬剤を注入すること、細胞膜を横切る薬剤の単純拡散、あるいは細胞膜を横切る任意の能動的もしくは受動的輸送機序を含む、細胞への薬剤の進入を達成するほぼどの方法を使用してもよい。
【００７９】
トランスフェクションにおける細胞の細胞骨格許容性の増強に有効な量の薬剤を細胞に与える。有効量は、薬剤を細胞に与えた場合に、有効量の薬剤を与えられていない他の点では同一な細胞と比べて、トランスフェクションにおける細胞の細胞骨格許容性を向上する、薬剤の量である。例えば、有効量は、約１ピコグラム〜約１００ミリグラムの薬剤の範囲であり得る。
【００８０】
所望の核酸を含む核酸送達系は、細胞骨格許容性を増強する薬剤を与えるのと同時に、細胞に与えても、または、薬剤を与える前または後に与えてもよい。
【００８１】
核酸送達系は、本明細書に記載した核酸送達系のどれでもよいか、または当分野で既知または既知となるその他のものでもよい。様々な核酸送達系が、例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク；およびアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、１９９４、「分子生物学の現在のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク）に記載されている。該核酸送達系は、例示であって限定的ではないが、「裸」核酸などの「裸」形で、あるいは、送達に適したベヒクルで、例えば、カチオン性分子もしくはリポソーム形成脂質との複合体で、または、ベクターの一成分もしくは薬学的組成物の一成分として配合されている、所望の核酸を含む。
【００８２】
核酸送達系は、細胞に、直接的に、例えばそれを細胞と接触させることにより与えても、または、間接的に、例えば任意の生物学的方法の作用により与えてもよい。例示であって限定ではないが、エンドサイトーシス、受容体標的化、天然または合成細胞膜フラグメントとのカップリング、電気穿孔法などの物理的手段、放出制御フィルムまたはナノ粒子もしくはマイクロ粒子などのポリマー性担体と核酸送達系を合わせること、ベクターの使用、細胞を囲む組織または液体に核酸送達系を注入すること、細胞膜を横切る核酸送達系の単純拡散、あるいは細胞膜を横切る任意の能動的もしくは受動的輸送機序により、核酸送達系を細胞に与えることができる。さらに、ウイルスベクターの抗体関連標的化および抗体媒介固定などの技術を使用して、核酸送達系を細胞に与えてもよい。
【００８３】
１つ以上の核酸送達系または薬剤を与えるためのベヒクルとしてベクターを使用する場合、ベクターは当業者に既知のいかなる種類でもよい。好ましくは、ベクターはプラスミドベクター、ウイルスベクターまたは直線化された核酸である。直線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物に結合されたポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを含むがこれに限定されない、数多くのベクターが当分野で知られている。従って、「ベクター」なる語は、自律複製プラスミドまたはウイルスを含む。この語はまた、例えば、ポリリシン化合物、リポソーム等の、細胞への核酸の導入を促進する、非プラスミドおよび非ウイルス化合物を含むものとする。ウイルスベクターの例は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター等を含むがこれに限定されない。
【００８４】
本発明の方法の１つの態様において、核酸送達系は、薬剤を与えるのと同時に細胞に与えられている。この態様において、薬剤は、核酸送達系と同時に取込んでも、または、異なるベヒクルで同時に与えてもよい。薬剤を与えるのに適切なベヒクルは上記に考察されている。あるいは、薬剤は、核酸送達系を与えるのと同時に、ベヒクルを使用することなく細胞に与えてもよい。ベヒクルを使用することなく薬剤を与えるのに適した方法は本明細書で考察されている。
【００８５】
別の態様において、核酸送達系は、薬剤を細胞に与える前に細胞に与えられる。
【００８６】
さらなる態様において、核酸送達系は、薬剤を細胞に与えた後に細胞に与えられる。
【００８７】
好ましくは、薬剤および／または核酸送達系は、薬剤および／または核酸送達系の組織特異的取込みが可能となるような方法で与えられる。好ましい技術は、包帯または経皮送達系などの組織または臓器局在化装置の使用、血管または尿カテーテルなどの侵襲性装置の使用、および薬物送達能を有し拡張装置またはステント埋込みとして構成されるステントなどのインターベンショナル装置の使用を含む。
【００８８】
本発明の１つの側面において、薬学的組成物として配合した少なくとも１つの薬剤および核酸送達系が、細胞に与えられる。薬剤および核酸送達系は、同じ薬学的組成物中に一緒に配合しても、別々に異なる薬学的組成物中に配合してもよい。また、薬剤の成分群も、同じ薬学的組成物中に一緒に配合しても、別々に異なる薬学的組成物中に配合してもよい。同様に、核酸送達系の成分群も、同じ薬学的組成物中に一緒に配合しても、別々に異なる薬学的組成物中に配合してもよい。薬学的組成物は、薬学的に許容される担体、ならびに、細胞骨格許容性の増強に有効な量の、トランスフェクションにおける細胞の細胞骨格許容性を増強できる少なくとも１つの薬剤、核酸送達系、およびその任意の成分を含む。
【００８９】
本発明の実施に有用な薬学的組成物を投与して、所望の細胞に、０．１ナノグラム／ｋｇ／日〜１００ミリグラム／ｋｇ／日の用量の薬剤および／または核酸送達系を送達し得る。１つの態様において、本発明は、トランスフェクトしようする細胞を含む哺乳動物の組織で、適切な薬剤および／または核酸送達系の濃度が０．１マイクロモル〜１００マイクロモルとなる投与量を哺乳動物に投与することを想定する。
【００９０】
本発明の方法において有用である薬学的組成物は、当業者に既知の薬学的組成物における投与経路のいずれかにより、哺乳動物に投与し得る。例示であって限定ではないが、薬学的組成物は、哺乳動物に、経口製剤で全身的に、注射により非経口的に、トランスフェクトしようとする細胞を含む特定の組織に直接投与することにより局所的に、あるいは、イオン泳動適用、並びに、磁場、超音波エネルギーまたは核エネルギーなどの外部エネルギー源を通した活性化を使用することによるなどの特定の標的組織へのインサイチュー送達技術の使用により投与できる。
【００９１】
薬学的に許容される担体並びに薬剤および／または核酸送達系またはその成分に加えて、該薬学的組成物は、薬物投与を増強および促進することが知られる他の成分も含み得る。ナノ粒子、リポソーム、再閉赤血球、および免疫をベースとした系などの、他の可能な製剤も、本発明の方法に記載の適切な薬剤および／または核酸送達系の投与に使用し得る。
【００９２】
本発明の方法の１つの態様において、トランスフェクションにおける細胞の細胞骨格許容性の増強は、トランスフェクトしようとする細胞の周辺の環境または細胞質におけるＤＮＡアーゼＩ活性の阻害を含む。ＤＮＡアーゼＩ活性は、ヌクレアーゼの活性の阻害について当分野で既知の任意の方法により阻害できる。
【００９３】
好ましくは、ＤＮＡアーゼＩ活性は、細胞のＧ−アクチンレベルの増強により阻害される。
【００９４】
別の側面において、ＤＮＡアーゼＩ活性は、細胞をトランスフェクトして、Ｇ−アクチンのＤＮＡアーゼＩ結合領域を過剰発現させることにより阻害される。この態様において、トランスフェクションにおける細胞の細胞骨格許容性を増強できる薬剤は、Ｇ−アクチンのＤＮＡアーゼＩ結合領域をコードする遺伝子を含む単離核酸であり、アデノウイルスベクターまたはプラスミドベクターなどのベクターの一成分として細胞に与えられる。アクチン遺伝子のＤＮＡアーゼＩ結合領域をコードする遺伝子は、当分野で既知の標準的な技術を使用して容易に同定およびクローニングできる。例えば、ＤＮＡアーゼＩ結合領域は、Ｇ−アクチンタンパク質の合成ペプチドマッピングまたは欠失マッピングを使用して単離できる。ペプチドマッピングにおいて、一連の合成ペプチドを調製し、Ｇ−アクチンと競合するＤＮＡアーゼＩとの結合についてインビトロで試験する。結合をＧ−アクチンと競合する特異的ペプチドを同定し、細胞におけるＤＮＡアーゼＩ活性の阻害について試験する。その後、同定したペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを、標的細胞において該ペプチドをトランスフェクトし過剰発現させるために、発現ベクターにクローニングする。
【００９５】
Ｇ−アクチンのＤＮＡアーゼＩ結合領域の過剰発現によって、競合的阻害によりＤＮＡアーゼＩ活性は阻害される。過剰発現されたＧ−アクチンのＤＮＡアーゼＩ結合領域は、細胞に存在するＤＮＡアーゼＩと結合し、これにより、ＤＮＡアーゼＩによる、細胞にトランスフェクトしようとする核酸の分解は阻止される。この競合的阻害によってＤＮＡアーゼＩ活性は阻害され、こうして、細胞にトランスフェクトしようとする核酸の分解は阻止される。
【００９６】
上記の方法に加えて、Ｇ−アクチンのＤＮＡアーゼＩ結合領域は、トランスフェクションにおける細胞の細胞骨格許容性を増強できる薬剤の獲得について本明細書に考察したいずれかの方法により得ることができる。１つの側面において、Ｇ−アクチンのＤＮＡアーゼＩ結合領域は、精製または組換えポリペプチドの形の薬剤として、細胞に投与する。
【００９７】
本発明の方法の別の態様において、トランスフェクションにおける細胞の細胞骨格許容性の増強は、トランスフェクトしようとする細胞の周囲の環境または細胞質の全体的な負電荷を低減させることを含む。
【００９８】
好ましくは、トランスフェクトしようとする細胞の周囲の環境または細胞質の全体的な負電荷の低減は、細胞中のＧ−アクチンレベルの増強させることを含む。細胞中のＧ−アクチンレベルは、当業者に既知の任意の方法により増強できる。細胞中のＧ−アクチンレベルの増強は、細胞中の相対的タンパク質レベルの評価について当分野で既知の任意の方法により評価できる。該方法は、例えば、ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ法、および特異的結合アッセイの使用を含む。例えば、ＤＮＡアーゼＩへのＧ−アクチンの結合量を検出する（ブリックスタッド（Ｂｌｉｃｋｓｔａｄ）ら， １９７８， Ｃｅｌｌ １５：９３２−９４３参照）アッセイは市販されている（ＣＯ州デンバー所在サイトスケルトン社）。
【００９９】
１つの側面において、細胞中のＧ−アクチンレベルは、Ｆ−アクチンからＧ−アクチンへの移行を増強することにより増強される。この移行の増強について当業者に既知の任意の方法を使用できる。１つの態様において、細胞中のＧ−アクチンレベルの増強は、Ｆ−アクチンからＧ−アクチンへの脱重合を含む。１つの側面において、アクチン結合タンパク質を使用して、Ｆ−アクチンをＧ−アクチンに脱重合する。アクチン結合タンパク質の使用により、Ｆ−アクチンからＧ−アクチンへの脱重合が起こることが当分野で知られている。この態様において好ましいアクチン結合タンパク質はＴＢ４である。アクチン結合タンパク質（ＴＢ４、プロフィリン、ゲルソリン、ビリン（ｖｉｌｉｎ）、アクチン脱重合因子｛ＡＤＦ｝およびコフィリンを含む）およびＦ−アクチンからＧ−アクチンへの脱重合におけるその役割は、十分に研究されており、例えば、ソーン（Ｓｏｈｎ）ら， １９９４， ＢｉｏＥｓｓａｙｓ １６：４６５−４７２；セーファー（Ｓａｆｅｒ）ら， １９９４， ＢｉｏＥｓｓａｙｓ １６：４７３−４７９；マツダイラ（Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ）ら， １９９８， Ｃｅｌｌ ５４：１３９−１４０；およびホーキンス（Ｈａｗｋｉｎｓ）ら， １９９３， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：９９８５−９９９３に記載されている。
【０１００】
別の側面において、Ｆ−アクチンからＧ−アクチンへの脱重合は、イオンチャネルをベースとしたアクチン重合の制御を操作することにより行なう。例えば、細胞の細胞骨格許容性を増強できる薬剤は、細胞中のイオンチャネルを変調する上で効果的な化合物であり得る。収縮性タンパク質会合は、細胞内の活動電位を介した電気的−機械的事象により刺激されることが当分野で知られている。従って、例えば、イオンチャネル遮断剤として効果的である化合物を使用したイオンチャネル遮断を使用して、アクチン重合を妨害でき、これにより細胞中のＧ−アクチンレベルを増強できる。
【０１０１】
別の態様において、本発明の方法は、細胞中のＧ−アクチンレベルを増強させることを含み、ここで薬剤は、Ｇ−アクチンと結合すると、Ｇ−アクチンがタンパク質分解をより受けにくくすることのできる化合物である。該化合物は、Ｇ−アクチンと結合すると、該化合物に結合していない他の点では同一のＧ−アクチン分子よりも、Ｇ−アクチンがタンパク質分解をより受けにくくする、薬物、金属塩、ペプチドまたはタンパク質などの任意の化合物であり得る。好ましい化合物は、フッ化ベリリウム（例えば、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６９：１１８５２−１１８５８参照）およびカルシウム塩（例えば、１９９６， Ｔｏｘ． Ａｐｐｌ． Ｐｈａｒｍ． １３９：１１５−１２１参照）を含む。
【０１０２】
本発明の方法の別の態様において、細胞中のＧ−アクチンレベルの増強は、ＴＢ４の発現を直接的または間接的にアップレギュレートすることを含む。ＴＢ４の発現の直接的なアップレギュレートは、ＴＢ４をコードする遺伝子の発現を駆動するプロモーターに直接作用することにより、ＴＢ４の発現を増強することを意味する。例えば、ＴＢ４の発現は、トランスフェクションにおける細胞の細胞骨格許容性を増強できる薬剤として、トランスフェクトしようとする細胞中でＴＢ４を過剰発現するためのベクターの一成分としてＴＢ４をコードする単離核酸を、細胞に与えることにより、直接アップレギュレートできる。ベクターは、本明細書に記載または当業者に既知のどの種類でもよい。ＴＢ４の発現を増強するように設計されたベクターは、誘導性プロモーターまたは構成性プロモーターを含み、ここで、どちらのプロモーターも、それが作動可能に連結した遺伝子の発現を高いレベルで駆動する。この状況で有用な構成性プロモーターの非限定的な例は、サイトメガロウイルス最初期プロモーターである。誘導性プロモーターの非限定的な例は、テトラサイクリンプロモーターであり、これは、このプロモーターを含む細胞にテトラサイクリンを添加すると、プロモーターが作動可能に連結した遺伝子の発現を高いレベルで誘導する。これらおよび他のプロモーターは当分野で公知であり、例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク；アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、１９９４、「分子生物学の現在のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク；およびゲルハード（Ｇｅｒｈａｒｄｔ）ら編、１９９４、「一般および分子細菌学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）」、米国微生物学会、ワシントンＤ．Ｃ．に記載されている。
【０１０３】
１つの側面において、薬剤は、ＴＢ４プロモーター、細胞間相互作用に関与する分子、細胞間接着に関与する分子、およびトランスフェクションにおける細胞の細胞骨格許容性の増強に有効な設計特徴を有する合成細胞外マトリックス分子構築物からなる群から選択される。薬剤は、トランスフェクションにおける細胞の細胞骨格許容性を増強することにより、細胞への核酸の送達効率を増強する、１つ以上の設計特徴を取込むことができる。このような設計の特徴は、例示であって限定的なものではないが、以下：ａ）アクチン状態の制御（すなわち、脱重合状態、すなわちＦ−アクチンよりも好ましい状態であるＧ−アクチンを優先するアクチン重合状態を制御）；ｂ）Ｆ−アクチンからＧ−アクチンへの移行を促進する、本明細書に記載した任意のアクチン結合タンパク質の使用；ｃ）１つ以上のアクチン結合タンパク質の発現の制御：ｄ）１つ以上の外来性組換えアクチン結合タンパク質またはそのペプチドの使用；ｅ）Ｆ−アクチンをＧ−アクチンに脱重合できるサイトカラシンＤなどの、１つ以上の外来性アクチン操作剤の使用；およびｆ）ＲＧＤ受容体を介してシグナル伝達し、ＴＢ４などのアクチン結合タンパク質をアップレギュレートする、テナシンＣなどの１つ以上の細胞外マトリックスタンパク質を使用することによる、細胞外マトリックス制御の発揮を含み得る。
【０１０４】
ＴＢ４の発現は、トランスフェクションのための細胞の細胞骨格許容性を増強できる薬剤であるテナシンＣ誘導基質を細胞に与えることにより、間接的にアップレギュレートできる。テナシンＣ誘導基質は、テナシンＣの発現および細胞外沈着を誘導できる任意の基質である。ＴＢ４の間接的なアップレギュレートは、ＴＢ４をコードする遺伝子の発現を駆動するプロモーターに作用する中間体（すなわちテナシンＣ）の発現の増加を通して、ＴＢ４の発現を増加することを意味する。テナシンＣのアップレギュレートにより、ＴＢ４の発現がアップレギュレートされる。いずれかの特定の理論にとらわれたくはないが、テナシンＣは、適切な受容体（特異的インテグリン）との相互作用、特異的プロテインキナーゼ活性の関与する細胞内シグナル伝達、転写因子によるＴＢ４のプロモーターの活性化、および翻訳後会合を通して、ＴＢ４をアップレギュレートすると考えられている。テナシンＣは、血管、創傷および腫瘍を含む、再形成中の組織内に豊富に発現されているタンパク質である。テナシンＣは、細胞遊走および増殖関連事象を調節し、血管平滑筋の形状を変化させ、増殖因子受容体クラスター形成およびリン酸化を促進することにより血管平滑筋細胞の増殖応答を増幅する。
【０１０５】
好ましくは、テナシンＣ誘導基質は、変性コラーゲン、そのペプチドまたはテナシンＣ受容体である。細胞にテナシン誘導基質を与えることにより、テナシンＣプロモーターの作用を通して、結果としてテナシンＣはアップレギュレートされる。
【０１０６】
好ましくは、変性コラーゲンまたはそのペプチドを含む培地上で細胞を増殖することにより、細胞にテナシンＣ誘導基質が与えられる。
【０１０７】
本発明の方法の別の態様において、細胞中のＧ−アクチンレベルの増強は、トランスフェクションにおける細胞の細胞骨格許容性を増強できる薬剤である、テナシンおよびＴＢ４受容体シグナル伝達経路の中間体のモジュレーターを細胞に与えることによる、間接的なＴＢ４の発現のアップレギュレートを含む。モジュレーターはどのような化合物でもよく、例示であって限定的ではないが、薬物、ペプチドまたはタンパク質であり得る。テナシンＣおよびＴＢ４受容体シグナル伝達経路の中間体を図５に示し、細胞膜受容体（インテグリン）、初期シグナル伝達エレメント（発癌遺伝子産物、例えばＳｒｃおよびＲａｓ）、Ｇタンパク質関連シグナル伝達におけるＧＴＰアーゼ活性、マイトジェン関連キナーゼ活性化（ＭＡＰＫ経路）、転写制御（Ｅｒｋ１等）およびＴＢ４プロモーターのアップレギュレートを含む。
【０１０８】
好ましくは、モジュレーターは、ＴＢ４発現を増加させるための、細胞内のシグナル伝達を増強する上で効果的である。好ましいモジュレーターの例は、チロシンリン酸化タンパク質、ｅｇｒ−１およびＡＰ−１などのＭＭＰを調節する因子を含む。
【０１０９】
本発明はまた、細胞への核酸の送達効率を増強する組成物を含む。本発明の組成物は、細胞への核酸の送達効率を増強するための、上記に考察した本発明の方法に有用である。本発明の組成物は、トランスフェクションにおける細胞の許容性の増強に有効な量の、トランスフェクションにおける細胞の細胞骨格許容性を増強できる薬剤を含む。さらに、本発明の組成物は、細胞をトランスフェトするための核酸送達系を含む。本発明の組成物の成分群は、本発明の方法で上記したものと同じである。
【０１１０】
核酸は、本明細書に記載したいかなる種類の核酸でもよい。細胞はいかなる種類の細胞でもよく、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくは本発明の方法で本明細書に記載した種類のヒト細胞である。薬剤は、本発明の方法で本明細書に記載した、トランスフェクションにおける細胞の細胞骨格許容性を増強するいかなる薬剤でもよい。
【０１１１】
１つの好ましい側面において、本発明の組成物中の薬剤は、テナシンＣまたはそのペプチド、アクチン結合タンパク質、例えばＴＢ４またはそのペプチド、アクチン脱重合剤、サイトカラシン、ＴＢ４のモジュレーター、テナシンＣおよびＴＢ４受容体シグナル伝達経路の中間体のモジュレーター、ヌクレアーゼ阻害剤、および変性コラーゲンまたはそのペプチドからなる群より選択した薬剤である。サイトカラシンは、真核細胞でアクチン重合および微小管会合に影響を及ぼすことが知られる、一連のカビ代謝物である。それらは、５００ダルトンの範囲の分子量を有するヘテロ機能的生物有機化合物であり、一般に、ジメチルスルホキシドおよび関連溶媒に溶解する。サイトカラシンの使用は、例えば、ブラドキー（Ｂｒａｄｋｅ）ら， １９９９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３：１９３１−１９３４およびクーパー（Ｃｏｏｐｅｒ）， １９８７， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０５：１４７３−１４７８に記載されている。
【０１１２】
別の好ましい態様において、薬剤は、細胞中で発現されると、トランスフェクションにおける細胞の細胞骨格許容性を増強できる、タンパク質またはポリペプチドをコードする単離核酸である。好ましくは、単離核酸によりコードされるタンパク質またはポリペプチドは、ＴＢ４、テナシンＣおよびそのペプチドの１つ以上である。
【０１１３】
１つの側面において、本発明の組成物中の薬剤の量は、約１ピコグラム〜約１００ミリグラムの範囲である。例えば、薬剤が組換えテナシンＣである場合、テナシンＣは、標的細胞において約１〜５０マイクログラム／ミリリットルの局所濃度となる量で、組成物に存在する。また例えば、薬剤が組換えＴＢ４である場合、ＴＢ４は、標的細胞において約０．１〜約１００マイクログラム／ミリリットルの局所濃度となる量で組成物に存在する。
【０１１４】
核酸送達系は、本発明の方法で本明細書に記載したいかなる核酸送達系でもよい。好ましくは、核酸送達系はプラスミドベクター、ウイルスベクターまたは直線化核酸である。
【０１１５】
本発明の組成物が、トランスフェクションにおける細胞の細胞骨格許容性を増強できるタンパク質またはポリペプチドをコードする単離核酸を薬剤として含む場合、単離核酸は、細胞のトランスフェクトに使用したのと同じ核酸送達系の一成分でも、別の核酸送達系の一成分でもよい。例えば、単離核酸は、細胞をトランスフェクトするのと、核酸を送達するのとで同じ核酸送達系として使用したプラスミドベクターに取込んだ、遺伝子または遺伝子の一部であり得る。この態様において、プラスミドベクターは、別々の調節可能なプロモーターをもつ複数の発現領域（例えば、テナシンＣまたはＴＢ４をコードする領域｛すなわち単離核酸｝またはそのペプチドと、目的の機能的タンパク質をコードする領域）を有する。従って、構築物は、目的の機能的遺伝子を含む「機能的」領域、ならびに、トランスフェクトしようとする細胞中で発現されると、トランスフェクションにおける細胞の細胞骨格許容性を増強できるタンパク質またはポリペプチドをコードする単離核酸を含む「増強」領域を含む。類似の構築物を、本明細書に記載したウイルスベクターおよび他のいずれかの核酸送達系を使用して設計できる。
【０１１６】
本発明はまた、細胞への核酸の送達効率を増強するキットを含む。該キットは、細胞への核酸の送達効率を増強する、本発明の方法におけるキットの使用を記載した説明書を含む。本明細書に使用したような「説明書」は、指定された使用における本発明の方法または組成物の有用性を伝えるために使用できる、刊行物、記録、図、または任意の他の表現媒体を含む。本発明のキットの説明書は、例えば、組成物を含む容器に貼り付けても、組成物を含む容器と共に出荷してもよい。あるいは、説明書および組成物はレシピエントにより共同で使用されるという意図で、説明書は容器とは別に出荷してもよい。
【０１１７】
キットは、トランスフェクションにおける細胞の細胞骨格許容性を増強できる薬剤も含む。薬剤は、本明細書に記載した任意の薬剤であり得、トランスフェクションにおける細胞の細胞骨格許容性を増強するのに有効な量で存在する。好ましくは、薬剤は、変性コラーゲンまたはそのペプチド、テナシンＣまたはそのペプチドおよびそれをコードする単離核酸、ならびにｍＴＢ４またはそのペプチドおよびそれをコードする単離核酸からなる群より選択される。
【０１１８】
キットはまた、核酸送達系も含む。核酸送達系は、本明細書に記載したいかなる核酸送達系でもよい。
【０１１９】
本発明を、ここで、以下の実施例を参照して説明する。これらの実施例は、単に説明のために提供され、いかなる場合にも本発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、むしろ、本明細書に提供した教示の結果として明白となる任意およびすべての変形を包含するものである。
【０１２０】
実施例１
本実施例に記載した実験の目的は、核酸を用いたトランスフェクションにおいて細胞の細胞骨格許容性を増強すると仮説づけられている形状への細胞形状の顕著な変化を誘発できる、変性コラーゲンが、細胞のトランスフェクション度の増強に効果的であるかどうかを確認することであった。これらの実験の結果により、変性コラーゲンは、細胞への核酸の送達効率の増強に効果的であり、従って細胞で観察されたトランスフェクション度の増加に効果的であることが示された。
【０１２１】
変性コラーゲンおよび天然原線維Ｉ型コラーゲン上で増殖したラット心房平滑筋細胞（Ａ１０細胞）を研究した。アクチンストレス線維の再配向を伴う、星状から伸長という細胞形状の変化が観察された。これらの細胞を、カチオン性脂質（リポフェクタミン（登録商標））と複合体を形成した核標的化ｂ−ガラクトシダーゼプラスミド（ＣＭＶプロモーター）でトランスフェクトした場合、変性コラーゲン（ＴＢ４がアップレギュレートされると仮説づけらている配合）上で増殖した細胞の２０％より多くの細胞（図１および２）が成功裏にトランスフェクトされ、一方、天然コラーゲン上で増殖した細胞はほとんど全くトランスフェクションを示さなかった。定量的なｂ−ガラクトシダーゼエンザイモグラフィー（図３）により、これらの結果が、ＧＦＰ（緑蛍光タンパク質）ＤＮＡによるトランスフェクションと同様に確認された。
【０１２２】
関連実験において、細胞内ＴＢ４の増加したものへと細胞骨格変化を促進し、従って、Ｇ−アクチンを増加させる、環境を創造した。ラット心房平滑筋細胞（Ａ１０細胞）を、天然コラーゲンまたは変性Ｉ型ウシコラーゲン（３７℃、ｐＨ７．４でゲル化）上で増殖させ、その後、変性Ｉ型ウシコラーゲン（ｐＨ３．０で１時間１００℃で変性）上で増殖した細胞と比較し、培養プレート上でフィルムとして乾燥させた。天然コラーゲン上で増殖した細胞は星状配置を示し、ｂ−ガラクトシダーゼプラスミドＤＮＡおよびリポフェクタミン（登録商標）を使用したリポフェクション後には、ほとんどまたは全くトランスフェクションを実証しなかった。これに対し、変性コラーゲン上で増殖した細胞（両方共に同じ細胞数を使用して）は伸長した形態を示し、２０％を超える細胞のトランスフェクトを実証した。定量的酵素アッセイにより、発現の増強が確認された（図３）。Ａ１０細胞を使用した独立的なＧＦＰ実験（図２）によりこの結果が確認された。
【０１２３】
実施例２
本実施例に記載した実験の目的は、テナシンＣ自体が、核酸を用いたトランスフェクションにおける細胞の細胞骨格許容性を増強し、これにより、天然コラーゲンのみの上で増殖した細胞に比べて、テナシンＣを含む天然コラーゲン上で増殖した細胞のトランスフェクション度が増加し得るかどうかを確認することであった。これらの実験の結果により、テナシンＣ自体が、細胞への核酸の送達効率の増強に効果的であり、従って、トランスフェクション度は増加することが示された。
【０１２４】
Ａ１０細胞を、０、１５および５０マイクログラム／ミリリットルのテナシンＣを含む、天然Ｉ型コラーゲン上で増殖した。細胞を、ｐ−ＥＧＦＰ−Ｎ３（緑蛍光タンパク質）プラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、０、１５および５０マイクログラム／ミリリットルのテナシンＣを含む天然Ｉ型コラーゲン上で増殖した細胞の蛍光（それぞれ図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃ）を評価した。１５マイクログラム／ミリリットルのテナシンＣを含む天然Ｉ型コラーゲン上で増殖した細胞の明視野顕微鏡写真（図４Ｄ）も撮影した。図４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄに示したように、テナシンＣを、天然Ｉ型コラーゲン上で増殖した細胞に与えることにより、用量依存的なＧＦＰ発現の増加により証明されるように、Ａ１０細胞のトランスフェクションは用量依存的に増加した。
【０１２５】
テナシンＣの非存在下で天然Ｉ型コラーゲン上で増殖した細胞は、ほとんど全くトランスフェクションを示さなかった（図４Ａ）。これに対し、１５マイクログラム／ミリリットルのテナシンＣを含む天然Ｉ型コラーゲン上で増殖した細胞は、トランスフェクションの増加を示し（図４Ｂ）、５０マイクログラム／ミリリットルのテナシンＣを含む天然Ｉ型コラーゲン上で増殖した細胞は、最も高いトランスフェクション度を示した（図４Ｃ）。明視野顕微鏡写真（図４Ｄ）により、１５マイクログラム／ミリリットルのテナシンＣを含む天然Ｉ型コラーゲン上で増殖した細胞は、実験操作法の後に、美しいコラーゲン線維配列および正常な細胞形態を有することが示された。
【０１２６】
実施例３
本実施例に記載した実験の目的は、サイトカラシンＤが、核酸を用いたトランスフェクションにおける細胞の細胞骨格許容性を増強し、これにより、サイトカラシンＤを与えられなかった細胞に比べて、サイトカラシンＤを与えられた細胞のトランスフェクション度は増加し得るかどうかを確認することであった。サイトカラシンＤは、Ｆ−アクチンをＧ−アクチンに脱重合することが知られている薬剤である。本実験の結果により、サイトカラシンＤ自体が、細胞への核酸の送達効率の増強に効果的であり、従ってトランスフェクション度の増加に効果的であることが示された。
【０１２７】
Ａ１０細胞を、天然Ｉ型コラーゲン上で増殖した。細胞を、上記のように、ｐ−ＥＧＦＰ−Ｎ３（緑蛍光タンパク質）プラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。リポフェクション直後、最終濃度１ナノモルのサイトカラシンＤを３０分間細胞に加えるか、一晩インキュベートしながら細胞に加えるか、または全く加えなかった（対照）。対照細胞、サイトカラシンＤで３０分間処理した細胞、および一晩インキュベートしながらサイトカラシンＤで処理した細胞の蛍光（それぞれ図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃ）を評価した。対照細胞、サイトカラシンＤで３０分間処理した細胞、および一晩インキュベートしながらサイトカラシンＤで処理した細胞の明視野顕微鏡写真も撮影した（それぞれ図７Ａ、７Ｂ、および７Ｃ）。
【０１２８】
図６に示したように、トランスフェクション直後に、天然Ｉ型コラーゲン上で増殖した細胞にサイトカラシンＤを与えることにより、ＧＦＰ発現の時間依存的な増加により証明されたように、Ａ１０細胞のトランスフェクションは時間依存的に増加した。サイトカラシンＤを与えられなかった細胞に比べて、有意により高いトランスフェクションが、サイトカラシンＤを与えられた細胞により示された。サイトカラシンＤに３０分間暴露した直後、細胞形状の顕著な変化が観察され（図７）、対照細胞に比べてトランスフェクションの増加が示された。一晩サイトカラシンＤに暴露することにより、より丸い細胞形状および顕著により多い量のトランスフェクションがもたらされた。この実験結果により、リポフェクション直後に、サイトカラシンＤを細胞に与えることによる、Ｆ−アクチンからＧ−アクチンへの脱重合の強制は、細胞への核酸の送達効率の増強に効果的であり、従って、トランスフェクション度の増加に効果的であった。
【０１２９】
各および全特許、特許出願、および本明細書に引用した刊行物は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【０１３０】
本発明は、具体的な態様を参照して開示したが、本発明の他の態様および変形も、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、当業者により考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、すべての該態様および等しい変形を含むものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ａ、およびＢからなり、二つの図はそれぞれ、プラスミド核標的β‐ガラクトシダーゼを使用しトランスフェクトした後、４８時間が経過し、天然コラーゲン、および変性コラーゲン上に増殖したＡ１０細胞を示す。
【図２】Ａ、およびＢからなり、二つの図はそれぞれ、プラスミドＤＮＡ ｐ−ＥＧＦＰ−Ｎ３ （ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）をトランスフェクトした後、２４時間が経過し、天然コラーゲン、および変性コラーゲン上に増殖したＡ１０細胞の蛍光を示す。
【図３】β‐ガラクトシダーゼプラスミドＤＮＡおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＲを使用したリポフェクションの後、天然コラーゲン、および変性コラーゲン上に増殖した動脈平滑筋細胞の定量的β‐ガラクトシダーゼ酵素造影法の結果を示すグラフである。
【図４】Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤからなり、ｐ−ＥＧＦＰ−Ｎ３（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）プラスミドＤＮＡをトランスフェクトした後、２４時間が経過し、０、１５、および５０μｇ／ｍｌのテナシンＣを含む天然Ｉ型コラーゲン上に増殖したＡ１０細胞の蛍光（それぞれＡ、Ｂ、およびＣ）、及び１５μｇ／ｍｌのテナシンＣを含む天然Ｉ型コラーゲン上に増殖したＡ１０細胞を写した明視野顕微鏡写真（Ｄ）を示す一連の図である。
【図５】テナシンＣ（ＴＮ−Ｃ）、およびサイモシンβ−４の受容体情報伝達経路における多様な中間体を示す模式図である。
【図６】Ａ、Ｂ、およびＣからなり、ｐ−ＥＧＦＰ−Ｎ３（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）プラスミドＤＮＡをトランスフェクトした後、天然Ｉ型コラーゲン上に増殖したＡ１０細胞の蛍光を示す一連の図である。トランスフェクトした直後、細胞にはサイトカラシンＤを与えなかった（Ａ）、または３０分間サイトカラシンＤを与えた（Ｂ）、あるいは、細胞をサイトカラシンＤと共に終夜培養した（Ｃ）。
【図７】Ａ、Ｂ、およびＣからなり、ｐ−ＥＧＦＰ−Ｎ３（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）プラスミドＤＮＡをトランスフェクトした後、天然Ｉ型コラーゲン上に増殖したＡ１０細胞を写した明視野顕微鏡写真を示す一連の図である。トランスフェクトした直後、細胞にはサイトカラシンＤを与えなかった（Ａ）、または３０分間サイトカラシンＤを与えた（Ｂ）、あるいは、細胞をサイトカラシンＤと共に終夜培養した（Ｃ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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