(57)【要約】【課題】【解決手段】本発明は、界面に存在する分子を検出する方法であって、第二高調波活性部分で前記分子を標識することと、表面選択的な技術を用いて前記界面に存在する標識された前記分子を検出することとを備えた方法を提供する。本発明は、第二高調波活性部分と表面選択的技術とを用いて媒質中の分子を検出する方法、及び平面内の分子種の配向性を側定する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
界面に存在する分子を検出する方法であって、第二高調波活性部分で前記分子を標識することと、表面選択的な技術を用いて前記界面に存在する標識された前記分子を検出することとを備えた方法。
【請求項２】
前記表面選択的な技術が、第二高調波発生又は和調波発生である請求項１の方法。
【請求項３】
前記分子が、タンパク質、核酸、脂質、又は炭水化物である請求項１の方法。
【請求項４】
前記核酸が、リボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である請求項３の方法。
【請求項５】
前記分子が汚染物質である請求項１の方法。
【請求項６】
前記分子がナノ粒子又はポリマービーズの表面上に存在する請求項１の方法。
【請求項７】
前記第二高調波活性部分が、特異的な相互作用又は非特異的な相互作用によって、前記分子に結合されている請求項１の方法。
【請求項８】
前記特異的な相互作用が共有結合又は水素結合を含む請求項７の方法。
【請求項９】
前記非特異的相互作用が静電的相互作用を含む請求項７の方法。
【請求項１０】
前記第二高調波活性部分が、前記分子上のアミン基又はスルフヒドリル基に対して特異的である請求項１の方法。
【請求項１１】
前記第二高調波活性部分が個別の第二高調波活性標識を複数備え、各標識は各々が非線形感受率を有し、且つ前記第二高調波活性部分の総非線形感受率を増大させるために互いに一定の確定した配向性で相互に結合されている請求項１の方法。
【請求項１２】
前記界面が、膜、リポソーム、細胞表面、ウイルス表面、細菌表面、又はバイオセンサーに存在する請求項１の方法。
【請求項１３】
前記界面が、気−液界面、液−液界面、液−固界面、又は固−固界面である請求項１の方法。
【請求項１４】
前記気−液界面が、空気−水界面である請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記液−液界面が、油−水界面である請求項１３の方法。
【請求項１６】
前記液−固界面が、水−ガラス界面又はベンゼン−ＳｉＯ２界面である請求項１３の方法。
【請求項１７】
膜上の受容体へのタンパク質の結合を検出するための請求項１の方法の使用。
【請求項１８】
ウイルスの細胞への結合を検出するための請求項１の方法の使用。
【請求項１９】
界面におけるタンパク質−タンパク質相互作用を調べるための請求項１の方法の使用。
【請求項２０】
細胞−細胞相互作用を調べるための請求項１の方法の使用。
【請求項２１】
媒質中の分子を検出する方法であって、
（ａ）検出すべき前記分子と特異的に相互作用する第二高調波活性部分で表面を標識することと、
（ｂ）前記媒質に前記表面を曝露させることにより、前記表面に界面を作出することと、
（ｃ）発生した信号を表面選択的な技術を用いて測定することによって、前記界面に存在する前記第二高調波活性部分を検出することと、
（ｄ）前記分子が前記第二高調波活性部分と相互作用するときの前記信号の変化を検出することによって、前記媒質中の前記分子を検出することと、
を備えた方法。
【請求項２２】
前記表面が、ナノ粒子又はポリマービーズ上に存在する請求項２１の方法。
【請求項２３】
前記表面選択的な技術が、第二高調波発生又は和調波発生である請求項２１の方法。
【請求項２４】
前記分子が、汚染物質又は荷電種である請求項２１の方法。
【請求項２５】
前記汚染物質が、鉛又はポリ塩化ビフェニルである請求項２４の方法。
【請求項２６】
前記荷電種が塩素イオンである請求項２４の方法。
【請求項２７】
第二高調波活性部分と分子間の相互作用が、抗体−抗原相互作用である請求項２１の方法。
【請求項２８】
前記媒質が一定量の検出すべき前記分子を含有し、前記分子が前記第二高調波活性部分と相互作用したときの前記信号の変化が定量的な変化であり、前記信号の変化から前記媒質中の前記分子の量を測定することができる請求項２１の方法。
【請求項２９】
平面内の分子種の配向性を測定する方法であって、
（ａ）前記種に特異的に結合する第二高調波活性部分で前記種を標識することと、
（ｂ）前記種について前記第二高調波活性部分の配向性を測定することと、
（ｃ）第二高調波光の偏光を測定して、前記平面に対する前記第二高調波活性部分の配向性を測定することと
（ｄ）工程（ｃ）で測定した前記表面に対する前記部分の配向性と工程（ｂ）で測定した前記種に対する前記部分の配向性とから前記平面内での前記種の配向性を測定することと、
を備えた方法。
【請求項３０】
前記種に対する前記第二高調波活性部分の配向性が、Ｘ線結晶構造解析を用いて測定される請求項２９の方法。
【請求項３１】
前記平面が、有機物質表面、無機物質表面、ポリマー物質表面、無機物表面、土表面、生物膜表面、及び合成膜表面からなる群から選択される請求項２９の方法。
【請求項３２】
前記分子種が、有機種、無機種、ポリマー種、タンパク質、脂質、核酸、及び炭水化物から選択される請求項２９の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本明細書に開示されている発明は、国立科学財団のグラントＣＨＥ−９６−１２６８５及びエネルギー省のグラントＤＥ−ＦＧ０２−９１ＥＲ及びＤＥ−ＦＧ０２−１４２２６による政府の援助を受けて為されたものである。従って、合衆国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
【発明の背景】
本出願を通じて、様々な文献が著者と年によって括弧内に参照されている。これらの参考文献の完全な引用は、特許請求の直前にある明細書の末尾に記されている。本明細書に記載され、本発明が属する技術分野をより完全に記述するために、これらの文献の開示内容全体を本出願に参考文献として援用する。
【０００３】
第二高調波発生（ＳＨＧ）は、界面領域を分子的スケールで研究するための強力な分光学的ツールであるが、今日まで、主として非生物学的な系に限定されてきた。しかしながら、最近、生物学的な研究の有用なモデルである支持体に支持された脂質膜系に存在するＳＨ活性部分の研究（Ｓａｌａｆｓｋｙ ａｎｄ Ｅｉｓｅｎｔｈａｌ，２０００ａ）や、表面近くの分極した水分子に対してタンパク質が有する間接的な効果を介した荷電界面へのタンパク質の吸着を検出する研究（Ｓａｌａｆｓｋｙ ａｎｄ Ｅｉｓｅｎｔｈａｌ，２０００ｂ）にもＳＨＧが適用されるようになった。界面に存在するタンパク質などの分子を直接検出することは、数多くの生物学的研究（例えば、膜若しくは細胞界面におけるタンパク質−受容体結合の研究、又はバイオセンサーの開発）において有用であるが、タンパク質のＳＨ断面積が本来的に少ないことが妨げとなっている。分子をＳＨＧによって検出するためには、界面で過分極率（ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｂｉｌｉｔｙ）及び正味の配向性（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）をＳＨ活性部分が保有しなければならない。ＳＨ活性な発色性補因子を含有しているタンパク質も一部にはあるが、それらの吸収は通常極めて弱いか、中心対称である。タンパク質中に存在する他のＳＨ活性源には、弱いＳＨ活性を有する芳香族アミノ酸側鎖がある。しかしながら、それらの配向性はタンパク質内で変化するので、ＳＨシグナルを減弱させる。
【０００４】
本出願は、「ＳＨＧ標識」という概念と技術を開示する。ＳＨＧ標識とは、ＳＨ活性でないか又は弱いＳＨ活性のみを有する目的の分子又は粒子に付着することができ、分子を界面で研究し易くする第二高調波活性部分（ｓｅｃｏｎｄ ｈａｒｍｏｎｉｃ−ａｃｔｉｖｅ ｍｏｉｅｔｉｅｓ）である。標識分子は、次いで、第二高調波発生又は和調波発生などの表面選択的な技術によって研究し得る。アミノ酸側鎖の一部として多くのタンパク質部分の表面上に存在する共通の化学的部分であるアミン又はスルフヒドリル基の何れかに対して特異的であるＳＨ活性部分を用いてタンパク質チトクロムｃを共有結合で標識することによって、前記技術を可読化することができる。蛍光標識による検出とは異なり、ＳＨＧ標識には、界面に位置し且つ正味の配向性を有する標識タンパク質のみが第二高調波信号に寄与し、標識タンパク質全体が信号に寄与するのではないという重要な利点がある。さらに、界面に位置する未標識の分子は検出できない。ＳＨＧ標識には、タンパク質−タンパク質、タンパク質−膜、及び細胞−細胞相互作用の研究を含む様々な生物的な用途を見出せるはずである。ＳＨＧ標識は、ナノ粒子表面やポリマー系（ポリマービーズ）などの他の系を研究するためにも使用することができる。次いで、標識されたナノ粒子又は標識されたポリマービーズは、例えば、周囲の媒質中に存在する分子のセンサーとして使用することができる。
【０００５】
【発明の概要】
本発明は、界面に存在する分子を検出する方法であって、第二高調波活性部分で前記分子を標識することと、表面選択的な技術を用いて前記界面に存在する標識された前記分子を検出することとを備えた方法を提供する。
【０００６】
本発明は、媒質中の分子を検出する方法であって、
（ａ）検出すべき前記分子と特異的に相互作用する第二高調波活性部分で表面を標識することと、
（ｂ）前記媒質に前記表面を曝露させることにより、前記表面に界面を作出することと、
（ｃ）発生した信号を表面選択的な技術を用いて測定することによって、前記界面に存在する前記第二高調波活性部分を検出することと、
（ｄ）前記分子が前記第二高調波活性部分と相互作用するときの前記信号の変化を検出することによって、前記媒質中の前記分子を検出することと、
を備えた方法も提供する。
【０００７】
本発明は、平面内の分子種の配向性を測定する方法であって、
（ａ）前記種に特異的に結合する第二高調波活性部分で前記種を標識することと、
（ｂ）前記種について前記第二高調波活性部分の配向性を測定することと、
（ｃ）第二高調波光の偏光を測定して、前記平面に対する前記第二高調波活性部分の配向性を測定することと、
（ｄ）工程（ｃ）で測定した前記平面に対する前記部分の前記配向性と工程（ｂ）で測定した前記種に対する前記部分の配向性とから前記平面内での前記種の配向性を測定することと、
を備えた方法を提供する。
【０００８】
【発明の詳細な記述】
本発明の理解を助けるために、以下の定義を記す。
【０００９】
本明細書で使用する「第二高調波」とは、基本光の二倍の周波数の光を意味する。「第二高調波活性部分」とは、基本光を照射したときに、基本光の第二高調波を発生する物質をいう。
【００１０】
前記の定義を念頭に置くと、本発明は、界面に存在する分子を検出する方法であって、前記分子を第二高調波活性部分で標識することと、表面選択的な技術を用いて前記界面に存在する標識された前記分子を検出することとを備えた方法に関する。
【００１１】
本発明の別の実施態様では、前記表面選択的な技術は、第二高調波発生又は和調波発生である。和調波発生（ＳＦＧ、ｓｕｍ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）とは、ある周波数（ω１）の光が別の周波数（ω２）の光と混合されて、和調波（ω１＋ω２）の反応を与える非線形的光学技術である（Ｓｈｅｎ，１９８４，１９８９）。ＳＦＧは、分子の特徴的な振動の遷移によって、表面に存在する分子を検出するのに特に有用であり、この場合、本質的には、可視及び赤外周波数のω１とω２を有する表面選択的赤外分光法である。
【００１２】
本発明の別の実施態様では、検出すべき前記分子はタンパク質、核酸、脂質、又は炭水化物である。別の実施態様では、前記核酸はリボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。別の実施態様では、前記ＤＮＡはゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡである。
【００１３】
別の実施態様では、検出すべき前記分子は、汚染物質又はその他の環境に重要な分子である。
【００１４】
別の実施態様では、前記分子は、ナノ粒子又はポリマービーズの表面上に存在する。
【００１５】
別の実施態様では、前記第二高調波活性部分は、特異的な相互作用又は非特異的な相互作用によって前記分子に結合される。別の実施態様では、前記特異的な相互作用には、共有結合又は水素結合が含まれる。別の実施態様では、前記第二高調波活性部分は、検出すべき前記分子上のアミン基又はスルフヒドリル基に対して特異的である。ある実施態様では、前記非特異的な相互作用には、静電的相互作用が含まれる。
【００１６】
ある実施態様では、前記第二高調波活性部分は、個別の第二高調波活性標識を複数備えており、各標識は各々が非線形感受率（ｎｏｎｌｉｎｅａｒ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）を有し、且つ前記第二高調波活性部分の総体非線形感受率を増大させるために、互いに一定の確定した配向性で相互に結合されている。
【００１７】
別の実施態様では、前記界面は、膜、リポソーム、細胞表面、ウイルス表面、細菌表面、又はバイオセンサーに位置する。別の実施態様では、前記界面は、気−液界面、液−液界面、液−固界面、又は固−固界面である。ある実施態様では、前記気−液界面は空気−水界面である。ある実施態様では、前記液−液界面は油−水界面である。別の実施態様では、前記液−固界面は水−ガラス界面又はベンゼン−ＳｉＯ２界面である。
【００１８】
本発明は、膜上の受容体へのタンパク質の結合を検出するための本発明に記載した全ての方法の使用を提供する。本発明は、ウイルスの細胞への結合を検出するための本発明に記載した全ての方法の使用も提供する。本発明は、さらに、界面におけるタンパク質−タンパク質相互作用又は細胞−細胞相互作用を研究するための本明細書に記載した全ての方法の使用を提供する。
【００１９】
本発明は、媒質（ｍｅｄｉｕｍ）中の分子を検出する方法であって、
（ａ）検出すべき前記分子と特異的に相互作用する第二高調波活性部分で表面を標識することと、
（ｂ）前記媒質に前記表面を曝露させることにより、前記表面に界面を作出することと、
（ｃ）発生した信号を表面選択的な技術を用いて測定することによって、前記界面に存在する前記第二高調波活性部分を検出することと、
（ｄ）前記分子が前記第二高調波活性部分と相互作用するときの前記信号の変化を検出することによって、前記媒質中の前記分子を検出することと、
を備えた方法を提供する。
【００２０】
前記方法の別の実施態様では、前記表面は、ナノ粒子又はポリマービーズ上に存在する。別の実施態様では、前記表面選択的な技術は、第二高調波発生又は和調波発生である。
【００２１】
別の実施態様では、検出すべき前記分子は汚染物質又は荷電種（ｃｈａｒｇｅｄ  ｓｐｅｃｉｅｓ）である。別の実施態様では、前記汚染物質は鉛又はポリ塩化ビフェニルである。ある実施態様では、前記荷電種は塩素イオンである。
【００２２】
ある実施態様では、前記第二高調波活性部分と検出すべき前記分子との前記相互作用は、抗体抗原相互作用である。
【００２３】
別の実施態様では、前記媒質は、一定量の検出すべき前記分子を含有し、該分子が前記第二高調波活性部分と相互作用したときの信号の変化が定量的変化であり、前記媒質中の前記分子の量は前記信号の変化から測定することができる。
【００２４】
本発明は、平面内の分子種の配向性を測定する方法であって、
（ａ）前記種に特異的に結合する第二高調波活性部分で前記種を標識することと、
（ｂ）前記種に対する前記第二高調波活性部分の配向性を測定することと、
（ｃ）第二高調波光の偏光（ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）を測定して、前記平面に対する前記第二高調波活性部分の配向性を測定することと、
（ｄ）工程（ｃ）で測定した前記表面に対する前記部分の前記配向性と工程（ｂ）で測定した前記種に対する前記部分の配向性とから前記平面内での前記種の配向性を測定することと、
を備えた方法を提供する。
【００２５】
該方法のある実施態様では、前記種に対する前記第二高調波活性部分の配向性は、Ｘ線結晶構造解析を用いて測定される。別の実施態様では、前記平面は、有機物質表面、無機物質表面、ポリマー物質表面、無機物表面（ｍｉｎｅｒａｌ ｓｕｒｆａｃｅ）、土表面（ｃｌａｙ ｓｕｒｆａｃｅ）、生物膜表面、及び合成膜表面からなる群から選択される。別の実施態様では、分子種は、有機種、無機種、ポリマー種、タンパク質、脂質、核酸、及び炭水化物からなる群から選択される。
【００２６】
本発明は、以下の実験の詳細を通じてさらに理解することができるであろう。しかしながら、当業者であれば、論述されている具体的な方法及び結果は、その後に記載されている特許請求の範囲においてより完全に記述されている本発明を例示したものにすぎないことが容易に理解できるであろう。
【００２７】
【実験の詳細】
空気−水界面に存在するＳＨＧ標識チトクロムｃを研究することによって、界面に存在する分子を検出するために、分子に第二高調波活性部分の付着させることを例示することができる。チトクロムｃのＸ線結晶構造は原子レベルの解像度で解明されているので、タンパク質の表面上に存在する様々なアミノ酸側鎖をランダムに又は選択的に標識するように実験を設計することができる。例えば、チトクロムｃ上には、表面システインが一つしか存在しないので、ゼロ角度技法（ｎｕｌｌ ａｎｇｌｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）によって、空気−水界面にあるシステイン抱合体の配向性を検出するためにＳＨＧを使用することができる。ＳＨ活性部分−タンパク質抱合体の空気−水界面への吸着の自由エネルギーも測定することができる。
【００２８】
＜理論的考察＞
界面からの第二高調波光の発生は、以下の式：
【数１】
2004522946.tif 000002
（ここで、Ｉ（２ω）及びＩ（ω）は、それぞれ、第二高調波及び基本光の強度、χ（２）は二次非線形感受率テンソル、ｅ（ω）及びｅ（２ω）は、フレスネル因子と光線の偏光ベクトルの積、ｃは光速であり、εは屈折率であり、Θは反射された高調波光と平面間の角度である（Ｈｅｉｎｚ，１９９１）。）
によって表すことができる。局所場効果を無視した表面非線形感受率χ（２）は、
【数２】
2004522946.tif 000003
（ここで、Ｎｓは界面に存在する単位面積当りの分子総数であり、＜α（２）＞は、これらの分子における非線形偏光率の配向分布にわたる平均である。）
である。式（２）は、ＲｅｉｄｅｒとＨｅｉｎｚ（１９９５）に従えば、より明確には、
【数３】
2004522946.tif 000004
（α（２）ｉ’ｊ’ｋ’は、分子の座標系における分子非線形偏光率を表し、Ｔｉλは実験室系と分子座標系を関連付ける変換テンソルであり、平均は界面に存在する分子の配向性分布にわたってとられる。）
と表すことができる。式１及び２から、第二高調波照射強度は、配列された分子の表面密度Ｎｓの二次式である。
【００２９】
分子にＳＨＧ標識を使用すると（標識当りの非線形偏光率αＬ（２））、標識の分布が標識の偏光率の配向性の平均を決定し、従って、ＳＨ強度を決定する。典型的には、標識は、同一の方向に配向していないので、ＳＨの強度は減少する。多くのランダムに分布した標識に至ると、ＳＨ強度はゼロに近づくことになる。従って、幾つかの標識から得られる正味のＳＨ信号を最大化するために、研究している分子に応じて標識比率を調整することができる。全体の超偏光率を最大化するために、互いに一定の確定した配向性で多数の個別の標識が相互に結合された「超標識（ｓｕｐｅｒ−ｌａｂｅｌ）」を使用することもできるであろう。前記分子は（それ故、標識は）、界面において正味の配向性を示し、非線形効果を与えなければならない。しかしながら、例えば、正味のタンパク質の配向性をもたらすタンパク質−受容体認識を用いて特異的な相互作用を検出する上では、この要件は利点であり得る。さらに、突然変異の導入によって、所定の位置にＳＨＧ標識を導入する目的で、タンパク質を特異的に加工することもできる。
【００３０】
＜方法＞
極めてＳＨ活性であることが示されているオキサゾール色素の誘導体であるアミン及びスルフヒドリル特異的色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ；Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を、それぞれ、表面のリジン又はシステインアミノ酸の何れかを介してチトクロムｃに共有結合させた。チトクロムｃ（ウマの心臓、Ｓｉｇｍａ）は、そのヘム補因子を介して生物の電子伝達反応に関与する分子量約１２ｋＤａの可溶性球状タンパク質である。該タンパク質は、結晶構造の研究から（コード１ＨＲＣ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｎｋ；１．９オングストロームの解像度）、アシル化色素の標的となる表面に露出した１９個のリジン側鎖アミノ基と単一の表面スルフヒドリル基（システイン１７）とを有している。該タンパク質は、ｐＨ７で＋９の総電荷を有し、６０デバイの最大基底状態双極子モーメント（標準的なプログラムとＣｈａｒｍ電荷セット（Ｃｈａｒｍ ｃｈａｒｇｅ ｓｅｔ）を用いることによって算出した）を有している。チトクロムｃには、オキサゾールピリジニウムのアミン又はスルフヒドリル選択的誘導体の何れか（両者とも正の＋１電荷を保有しており、所定の操作と以前の研究（Ｓａｌａｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ，１９９６）に従い、大規模な透析によって精製された。）を共有結合によって標識した。スルフヒドリル特異的な色素は、１−（２，３−エポキシプロピル）−４−（５−（４−メトキシフェニル）オキサゾール−２−イル）ピリジニウムトリフルオロメタンスルホネート（ＰｙＭＰＯエポキシド）であり、アミン特異的な色素は、１−（３−スクシンイミジルオキシカルボニル）ベンジル−４−（５−（４−メトキシフェニル）オキサゾールー２−イル）ピリジニウムブロマイド（ＰｙＭＰＯ，ＳＥ）であった。非共有結合的に結合した色素は、反応性を有しないオキサゾール色素を用いた対照実験によって確かめたところによると、その後の透析工程によって完全に除去することができる。標識の程度は、タンパク質−色素抱合体の吸収スペクトルを測定することによって決定することができる。色素誘導体はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓから入手し、親化合物は中性ｐＨにおいて極めて強いＳＨ活性を有することが示されており（Ｓａｌａｆｓｋｙ ａｎｄ Ｅｉｓｅｎｔｈａｌ，２０００）、後者は生物学的な研究にとって重要である。タンパク質は、蒸留水（スルフヒドリル特異的反応）又はｐＨ８．３の炭酸水素ナトリウム（アミン特異的）中で、５：１のモル比（色素：タンパク質）で色素と反応させた。第二高調波発生の設定は、以前、詳細に記した（Ｅｉｓｅｎｔｈａｌ，１９９６；及びその中の参考文献）。簡潔に述べると、アルゴンイオンレーザーの光線（１０．５Ｗ）をチタンサファイアモードロックレーザー（Ｔｓｕｎａｍｉ）の空洞の中に誘導する。約１５０ｆｓのパルス持続時間、８２ＭＨｚの繰り返し数における出力（８００−８３４ｎｍに調整可能）を基本光として使用した。表面法線に対して７０°の角度で、水表面（テフロン皿に入れた二回蒸留水）の反射平面上に基本光を誘導し、フィルターによって試料の後ろで除去した。色素の二光子蛍光は、緑がかった黄色の白熱として、容易に見ることができるが、約１３０ｎｍのＳｔｏｋｅｓシフトのために、スペ���トル的には２ωの波長から十分に離れている。さらに、この反射の設定では、放射された光の一部のみを集めるので、検出される蛍光の量がさらに減少する。第二高調波光を集め、単色光分光器中に集光する。全ての実験において、基本光の偏光は、レーザーテーブルの法線に対して４５°に設定した。光電子増倍管を用い、単光子計測モードで検出を行った。
【００３１】
＜結果と解釈＞
空気と水の界面から発生した２ωのピークにおけるＳＨ光の強度は５０±１２カウント／秒と測定された。チトクロムｃは空気と水の界面に吸着することは、これまでに示されている（Ｋｏｚａｒａｃ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。チトクロムｃ（色素標識なし）を水相に加えても、５〜１０ｍＭの濃度でさえ、界面からのＳＨ強度は不変であるか又は僅かに減衰するにすぎないので、ヘム大環状高分子は中心対称性が高いことから予想されるように、χ（２）過程を通じ、ヘム補因子はＳＨ信号に対してあまり寄与していないことを示している。この知見は、ＳＨ信号に対して影響を与えずに、基本波長がヘム吸収の間に調整されるというこれまでの研究とも合致している。
【００３２】
色素−タンパク質抱合体の典型的な吸収スペクトルが、タンパク質及び色素のスペクトルとともに図１に示されている。図１では、チトクロム（ｃｙｔ）ｃはアミン反応性を有するオキサゾール誘導体に抱合されており、タンパク質のヘム基と色素の既知の吸光係数を用いると、標識の程度はおよそ１．５：１モル（色素：ｃｙｔ）である（それぞれ、４１２ｎｍで９．５×１０４  Ｍ−１ｃｍ−１、４１５ｎｍで２．６×１０５  Ｍ−１ｃｍ−１）。サブフェーズにある１５μＭの濃度で、空気−水界面に存在するアミン標識されたタンパク質は、１０４ｃｐｓオーダーの２ωシグナルを与える（図２）。色素蛍光の尾部が約４８０ｎｍに見えるが、ＳＨピークに比べてかなり規模が小さい。システイン標識されたチトクロムｃのＳＨシグナルも測定され（図２）、アミン抱合体のシグナルよりも小さく、約１０３ｃｐｓのオーダーであったが、アミン抱合体のシグナルと同様に２ωピークを示している。抱合体の吸収スペクトルから測定されたところによれば、色素：タンパク質の標識比が小さいので（０．４：１、およそタンパク質一つおきに一つの色素）、このことは予期されることである。
【００３３】
システイン抱合体中の色素分子の配向性は、ゼロ角度技法（Ｓａｌａｆｓｋｙ ａｎｄ Ｅｉｓｅｎｔｈａｌ、２０００；Ｈｉｃｋｓ，１９８６）を用いて測定した。該抱合体によって生じたＳＨ光は、分析器を表面法線から３０°の角度に設定することによって、完全にゼロにすることが可能であり、単一の超偏光率要素（ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｂｉｌｉｔｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）及び色素分布におけるデルタ関数を仮定すると、色素分子は法線から５２°で配向していることに相当する。色素の配向性は界面に対して測定されるので、実験室系におけるタンパク質の配向性を求めるには、タンパク質の表面上での色素の配向という仮定を行わなければならない。Ｘ線結晶構造の調査から、色素の主結合軸（そして、おそらくはＳＨ活性な軸）がタンパク質表面に対して法線を成すように前記色素が配向していると仮定すると、システインのスルフヒドリル基がほとんどヘムの平面中に位置しているので、ヘム平面が空気−水界面に対する法線と約３０°の角度となるように、チトクロムｃが配向していることになる。水サブフェーズに少量の前記抱合体を加えることによって、空気−水界面におけるシステイン抱合体の吸着等温線も測定した（図３）。データをＬａｎｇｍｕｉｒの等温線にフィッティングさせることによって（Ｅｉｓｅｎｔｈａｌ，１９９６）、空気−水界面への前記抱合体の吸着の自由エネルギーは、ΔＧ＝−１１ｋｃａｌ／モルであると求めることができ、このことは表面活性が強いことを示している。しかしながら、前記抱合体に対して用いられた濃度（１−１５μＭ）で、オキサゾール色素のみ（＋１電荷）を水相に加えても、バックグラウンドのＳＨ信号には検出可能な変化は生じなかった。ずっと高い濃度（０．５ｍＭ超）の色素で初めてＳＨ信号を検出することが可能であり、数千ｃｐｓの強度であった（図４）。従って、空気−水界面へのチトクロムの吸着の自由エネルギーは、遊離オキサゾール色素の自由エネルギーより有意に大きい。
【００３４】
これらの結果は、他の実験にもＳＨＧ標識を使用できることを示唆している。例えば、界面に適切な分子基盤（支持された脂質二重層系）を設計することによって、例えば、膜でのタンパク質−タンパク質相互作用を研究するためにそれらを使用し得る。さらに、非平面（例えば、直径が基準光の波長λに近いリポソーム）で、ＳＨ光を発生させることもできるので（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ａｎｄ Ｅｉｓｅｎｔｈａｌ，１９９８参照）、リポソーム又は生物の細胞表面に関する研究に用途を見出すこともできるかもしれない。
【００３５】
本出願は、二次高調波発生などの表面選択的な技術によって界面に位置する分子を研究するために、目的の分子をＳＨ活性部分で標識する「ＳＨＧ標識」という概念を提示した。本技術の例として、空気−水界面に位置する色素−タンパク質抱合体を研究するために、タンパク質チトクロムｃをアミン及びスルフヒドリル特異的ＳＨ活性色素で共有結合により標識した。前記色素のＳＨ活性故に、界面にある該タンパク質を容易に検出することができる。もし標識されていなければ、該タンパク質を検出することはできない。このように、ＳＨＧ標識を用いて、界面に位置する任意の目的のタンパク質を研究することができるであろう。必要とされる条件に従って、該標識の化学的特異性、そのＳＨ断面積（ＳＨ ｃｒｏｓｓ−ｓｅｃｔｉｏｎ）、又はその吸収及び共鳴波長を変化させることができる。タンパク質用のＳＨＧ標識は、支持体で支持された膜、リポソーム、又は細胞の界面でのタンパク質−受容体の結合を研究する上でも有用であることが明らかになるはずである。ＳＨＧ標識は、核酸、脂質、炭水化物、ナノ粒子、及びポリマー系を含むその他の分子を研究する上でも有用であろう。
【００３６】
【参考文献】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
ＳＨ活性部分（色素）（オキサゾール誘導体）、チトクロム（ｃｙｔ）ｃ及び色素−ｃｙｔ  ｃ（アミン）抱合体の吸収スペクトル。ＳＨ活性部分は、タンパク質表面上のアミン基に共有結合されており、吸光度と公知の吸光係数から、前記抱合体中において１．５：１（色素：タンパク質）モル比で結合している。
【図２】
バルク濃度が約１５μＭで、空気−水界面に位置するｃｙｔ  ｃ−アミン抱合体（１．５：１  色素：タンパク質のモル比、実線）、ｃｙｔ  ｃ−システイン抱合体（０．４：１  色素：タンパク質のモル比、黒菱形の線）のＳＨ強度スペクトル。基本周波数を８０４ｎｍに設定すると、スペクトルは特徴的な２ωのピークを示す。アミン抱合体のスペクトルには二光子蛍光の尾部が見られる。ＩＳＨ（ｃｐｓ）は、カウント毎秒で表したＳＨ光の強度である。
【図３】
誤差線を付したシステイン−ｃｙｔ  ｃ抱合体の吸着等温線（ＳＨ強度対バルク［抱合体］）。曲線をＬａｎｇｍｕｉｒの吸着モデルにフィッティングし、これから、吸着の自由エネルギーΔＧ＝−１１ｋｃａｌ／モルと、界面に存在する吸着物（ａｂｓｏｒｂａｔｅ）の数を求めた。
【図４】
空気−水界面に位置するオキサゾール色素のみのＳＨ強度スペクトル。バルクの色素濃度は約７００μＭである。最大ＳＨ強度は、システイン抱合体のものと同等であるが、色素のバルク濃度は、システイン又はアミン抱合体の何れよりも、約４０倍大きい。従って、（二光子）蛍光のバックグラウンドはずっと大きい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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